(57)【要約】【課題】本発明は、化粧用組成物およびその製造方法に関する。【解決手段】本発明の化粧用組成物は、当該化粧用組成物を使用するヒト対象から得た皮膚片より分離した真皮線維芽細胞の培養上清液を含む、ここにおいて、当該培養上清液は、真皮線維芽細胞を採取した対象と同一のヒト由来の血液から得られた血清含有培地を用いて真皮線維芽細胞を培養した培養上清液である。本発明の製造方法は、（ｉ）当該化粧用組成物を使用するヒト由来の真皮線維芽細胞を培養し、継代する、ここで当該血清は、真皮線維芽細胞を採取した対象と同一のヒト由来の血液から得られたものである；（ｉｉ）（ｉ）で得られた培養物の培養上清液を回収する；（ｉｉｉ）回収した培養上清液を濃縮する；そして、（ｉｖ）ベース化粧品に、（ｉｉｉ）で濃縮した培養上清液を添加する；工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
化粧用組成物であって、当該化粧用組成物を使用するヒト対象から得た皮膚片より分離した真皮線維芽細胞の培養上清液を含む、
ここにおいて、当該培養上清液は、真皮線維芽細胞を採取した対象と同一のヒト由来の血液から得られた血清含有培地を用いて真皮線維芽細胞を培養した培養上清液である、
前記化粧用組成物。
【請求項２】
培養上清液が、濃縮された培養上清液である、請求項１に記載の化粧用組成物。
【請求項３】
培養上清液を、３％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）で含む、請求項１または２に記載の化粧用組成物。
【請求項４】
化粧水、乳液、クリームである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化粧用組成物。
【請求項５】
真皮線維芽細胞の培養上清液を含む化粧用組成物の製造方法であって、以下の工程：
（ｉ）当該化粧用組成物を使用するヒト由来の真皮線維芽細胞を血清含有培地を用いて培養し、継代する、ここで当該血清は、真皮線維芽細胞を採取した対象と同一のヒト由来の血液から得られたものである；
（ｉｉ）（ｉ）で得られた培養物の培養上清液を回収する；
（ｉｉｉ）回収した培養上清液を濃縮する；
（ｉｖ）ベース化粧品に、（ｉｉｉ）で濃縮した培養上清液を添加する；
を含む、前記方法。
【請求項６】
工程（ｉ）において、少なくとも２回継代することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｉ）における最終回の継代が、培地４０ｍＬあたり０．６〜１．５×１０６細胞で播種し、コンフルエントになるまで培養することを含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｉｉｉ）が、培養上清液を１．５〜３０倍濃縮することを含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｉｖ）が、培養上清液をベース化粧品の重量に対して３％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）で添加することを含む、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｉ）の前に、ヒト由来の真皮線維芽細胞を、以下の工程：
（ａ）ヒト対象より得た皮膚片をプロテアーゼ処理して表皮と真皮を分離する； 
（ｂ）真皮を細切し、シャーレ中で培養して真皮線維芽細胞を伸展させる；
により得ることを含む、請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｉ）で使用する真皮線維芽細胞が、当該化粧用組成物を使用するヒトから採取後、凍結保存された後のものである、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真皮線維芽細胞の培養上清液を含む化粧用組成物およびその製造方法に関する。本発明はまた、真皮線維芽細胞の培養上清液を含む組成物を皮膚に適用することを含む美容方法、化粧用組成物の製造のための真皮線維芽細胞の培養上清液の使用、および美容方法における使用のための真皮線維芽細胞の培養上清液に関する。
【背景技術】
【０００２】
美容医療の分野における再生医療の一つとして「肌の再生医療」が知られている（非特許文献１〜６）。肌の再生医療は、患者の皮膚の一部から分離した肌細胞（真皮線維芽細胞）を培養し、培養した細胞を患者の皮膚に移植する技術である。真皮線維芽細胞は、コラーゲン、エラスチンおよびヒアルロン酸といった皮膚を構成するタンパク質を形成する細胞であり、加齢と共に減少することが知られている。真皮線維芽細胞の移植は、小じわの低減、ハリの向上といった皮膚の外観や状態の改善または向上に効果を示すものである。
【０００３】
一方、真皮線維芽細胞を培養した際に生じる培養上清液については、特段の用途は見出されておらず、従来廃棄されてきた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Watson, D., et al.,  Arch Facial Plast Surg., 1999 Jul-Sep; 1(3):165-70.
【非特許文献２】Weiss, R.A., et al., Dermatol Surg., 2007 Mar; 33(3):263-8.
【非特許文献３】Boss, W.K. Jr, et al., Clin Plast Surg., 2000 Oct; 27(4):613-26.
【非特許文献４】Boss, W.K. Jr, et al., Ann Plast Surg., 2000 May; 44(5):536-42.
【非特許文献５】Zhao, Y., et al., Cell Transplant., 2008; 17(7):775-83.
【非特許文献６】北條元治ら、形成外科、53（10）：1087〜1093、2010年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、真皮線維芽細胞の培養上清液を含む化粧用組成物およびその製造方法を提供する。本発明はまた、真皮線維芽細胞の培養上清液を含む組成物を皮膚に適用することを含む美容方法、化粧用組成物の製造のための真皮線維芽細胞の培養上清液の使用、および美容方法における使用のための真皮線維芽細胞の培養上清液を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本件の発明者は、真皮線維芽細胞の培養液に注目し、研究を開始した。鋭意検討の結果、化粧品に真皮線維芽細胞の培養上清液を添加することで、保湿効果が高く、皮膚の状態および外観を改善する化粧用組成物が得られることを見いだした。当該知見に基づいて、本発明は完成された。
【０００７】
すなわち、一態様において、本発明は以下のとおりであってよい。
［１］化粧用組成物であって、当該化粧用組成物を使用するヒト対象から得た皮膚片より分離した真皮線維芽細胞の培養上清液を含む、
ここにおいて、当該培養上清液は、真皮線維芽細胞を採取した対象と同一のヒト由来の血液から得られた血清含有培地を用いて真皮線維芽細胞を培養した培養上清液である、
前記化粧用組成物。
【０００８】
［２］培養上清液が、濃縮された培養上清液である、上記［１］に記載の化粧用組成物。
［３］培養上清液を、３％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）で含む、上記［１］または［２］に記載の化粧用組成物。
【０００９】
［４］化粧水、乳液、クリームである、上記［１］〜［３］のいずれか１項に記載の化粧用組成物。
［５］真皮線維芽細胞の培養上清液を含む化粧用組成物の製造方法であって、以下の工程：
（ｉ）当該化粧用組成物を使用するヒト由来の真皮線維芽細胞を血清含有培地を用いて培養し、継代する、ここで当該血清は、真皮線維芽細胞を採取した対象と同一のヒト由来の血液から得られたものである；
（ｉｉ）（ｉ）で得られた培養物の培養上清液を回収する；
（ｉｉｉ）回収した培養上清液を濃縮する；
（ｉｖ）ベース化粧品に、（ｉｉｉ）で濃縮した培養上清液を添加する；
を含む、前記方法。
【００１０】
［６］工程（ｉ）において、少なくとも２回継代することを含む、上記［５］に記載の方法。
［７］工程（ｉ）における最終回の継代が、培地４０ｍＬあたり０．６〜１．５×１０６細胞で播種し、コンフルエントになるまで培養することを含む、上記［５］または［６］に記載の方法。
【００１１】
［８］工程（ｉｉｉ）が、培養上清液を１．５〜３０倍濃縮することを含む、上記［５］〜［７］のいずれか１項に記載の方法。
［９］工程（ｉｖ）が、培養上清液をベース化粧品の重量に対して３％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）で添加することを含む、上記［５］〜［８］のいずれか１項に記載の方法。
【００１２】
［１０］工程（ｉ）の前に、ヒト由来の真皮線維芽細胞を、以下の工程：
（ａ）ヒト対象より得た皮膚片をプロテアーゼ処理して表皮と真皮を分離する； 
（ｂ）真皮を細切し、シャーレ中で培養して真皮線維芽細胞を伸展させる；
により得ることを含む、上記［５］〜［９］のいずれか１項に記載の方法。
【００１３】
［１１］工程（ｉ）で使用する真皮線維芽細胞が、当該化粧用組成物を使用するヒトから採取後、凍結保存された後のものである、上記［５］〜［１０］のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、保湿効果が高く、皮膚の状態および外観を向上または改善する新たな化粧用組成物を提供するものである点で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１−１】図１−１は、濃縮肌細胞由来成分を含む化粧品（グラフ中、「上清あり」と表記する）と当該成分を含まない化粧品（グラフ中、「上清なし」と表記する）についてアンケート調査を行った結果を示すグラフである。肌の乾燥、保湿感、小じわ、ハリ弾力、たるみ、明るさ、しみ、および肌荒れについての結果を示す。
【図１−２】図１−２は、図１−１の続きであり、毛穴、柔らかさ、キメ、およびノリについての結果を示すグラフである。
【図２−１】図２−１は、真皮線維芽細胞の３回目の継代培養における上清中の代謝物（グルコース（Glc）、ラクトース（Lac）、グルタミン（Gln）、アンモニア（NH3）、グルタミン酸（Glu））の増減を評価した結果を示すグラフである。丸で囲った数字は検体番号を示す。
【図２−２】図２−２は、真皮線維芽細胞の３回目の継代培養における上清中の各種イオン（カルシウムイオン（Ca）、マグネシウムイオン（Mg）、ナトリウムイオン（Na））の増減を評価した結果を示すグラフである。丸で囲った数字は検体番号を示す。
【図３】図３は、実施例１および２示す方法で真皮線維芽細胞を培養（５％血清含有ＨＦＤＭ−１（＋）中での培養）際に真皮線維芽細胞からコラーゲンが産生されていることを確認したグラフである。
【図４】図４は、若年層（３０歳未満）の対象から採取した皮膚と、高年層（７０歳以上）の対象から採取した皮膚の検体由来の真皮線維芽細胞を、ＨＦＤＭ−１（＋）（株式会社細胞科学研究所）を用いて培養して得られた細胞増殖能（倍化時間）を示した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下に本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
【００１７】
＜化粧用組成物＞
一態様において、本願は、真皮線維芽細胞の培養上清液を含む化粧用組成物である。当該化粧用組成物は、ベース化粧品に真皮線維芽細胞の培養上清液を添加したものである。
【００１８】
ベース化粧品は、特に限定されないが、化粧水（ローション）、乳液（スキンミルク）、クリーム、美容液、ジェル、パック、ムースであってもよい。ベース化粧品の組成は特に限定されず、化粧品として許容される成分であればいかなる成分を含むものであってもよい。ベース化粧品に含まれることが好ましい成分としては、例えば、アスペルギルス／（コメ／コメヌカ）発酵液、アスコルビルグルコシド、パルミチン酸アスコルビルリン酸３Ｎａ、トリペプチド−３、オリゴペプチド−６、カプロオイルテトラペプチド−３、オリゴペプチド−３４、ヘキサペプチド−３、トリフルオロアセチルトリペプチド−２、等が挙げられる。
【００１９】
真皮線維芽細胞の培養上清液は、ヒト由来の真皮線維芽細胞をヒト線維芽細胞の培養に適した培地中で培養した培養物の培養上清液またはその濃縮液である。培地は特に限定されないが、以下の＜化粧用組成物の製造方法＞の項目において説明する特徴を有する培地であってもよく、例えばＨＦＤＭ−１（＋）（株式会社細胞科学研究所）であってもよい。培地は、血清含有培地である。
【００２０】
真皮線維芽細胞の培養上清液は、得られた化粧用組成物を使用する対象から得た皮膚片より分離した真皮線維芽細胞の培養上清液またはその濃縮液である。また、その際、培養に用いる血清含有培地は、前記対象と同一対象由来の血液から得られた血清を含んでいてもよい。好ましくは、当該培養上清液は、真皮線維芽細胞を採取した対象と同一のヒト由来の血液から得られた血清含有培地を用いて真皮線維芽細胞を培養した培養上清液である。このように化粧用組成物を使用する対象自身の皮膚から得られた真皮線維芽細胞の培養上清液を用いること、並びに、細胞培養培地として、得られた化粧用組成物を使用する対象から得た血清を含有する培地を用いることで、化粧品に対象自身の細胞から作られる成分を添加したオーダーメイドの化粧品を提供することができる。このようなオーダーメード化粧品は、より効果が高く、より安全で、そして、当人に馴染みやすい化粧品となり得る。
【００２１】
別の態様において、本願の化粧用組成物に含まれる真皮線維芽細胞の培養上清液は、濃縮された培養上清液である。培養上清液の濃縮率は、特に限定されないが、１．５〜３０倍、２〜２０倍、２〜１５倍、５〜１５倍、５〜１０倍であってもよい。
【００２２】
本願の化粧用組成物に含まれる真皮線維芽細胞の培養上清液またはその濃縮液の量は特に限定されないが、例えばベース化粧品の重量に対して２〜１５％（ｗ／ｗ）、３〜１０％（ｗ／ｗ）、３〜７％（ｗ／ｗ）３〜５％（ｗ／ｗ）であってもよい。
【００２３】
真皮線維芽細胞の培養上清液には、以下：アルギニン塩酸塩、アスパラギン酸、システイン塩酸塩、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン塩酸塩、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、ビオチン、塩化コリン、葉酸、ナイアシンアミド、リボフラビン、チアミン塩酸塩、トコフェロール、アラキドン酸、コレステロール、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、チミジン、グルコース、ピルビン酸ナトリウム、コハク酸、および組換え体ヒトＥＦＧ、からなる群より選択される１以上の成分が含まれていてもよい。真皮線維芽細胞の培養上清液に含まれる成分は、真皮線維芽細胞を培養することにより、真皮線維芽細胞から分泌される成分に由来するものであってもよいし、培地成分に由来するものであってもよい。
【００２４】
本願の化粧用組成物は、下記「化粧用組成物の製造方法」において説明する方法により製造してもよい。
＜化粧用組成物の製造方法＞
一態様において本願は、真皮線維芽細胞の培養上清液を含む化粧用組成物の製造方法であって、以下の工程：
（ｉ）当該化粧用組成物を使用するヒト由来の真皮線維芽細胞を培養し、継代する、ここで当該血清は、真皮線維芽細胞を採取した対象と同一のヒト由来の血液から得られたものである；
（ｉｉ）（ｉ）で得られた培養物の培養上清液を回収する；
（ｉｉｉ）回収した培養上清液を濃縮する；
（ｉｖ）ベース化粧品に、（ｉｉｉ）で濃縮した培養上清液を添加する；
を含む、前記方法に関する。
【００２５】
ヒト由来の真皮線維芽細胞は、ヒト対象より採取した皮膚片より分離した真皮線維芽細胞をそのまま用いてもよく、凍結保存された真皮線維芽細胞を用いてもよい。
真皮線維芽細胞をヒト対象より採取した皮膚片より分離する場合、以下の工程：
（ａ）ヒト対象より得た皮膚片をプロテアーゼ処理して表皮と真皮を分離する；
（ｂ）真皮を細切し、シャーレ中で培養して真皮線維芽細胞を伸展させる；
により、真皮線維芽細胞を得ることができる。ここで、工程（ａ）に用いるプロテアーゼは表皮と真皮を分離可能なプロテアーゼであれば特に限定されないが、例えばディスパーゼ（登録商標）Ｉ（三光純薬株式会社）等を使用できる。工程（ｂ）の真皮線維芽細胞の伸展は、細切した真皮をヒト線維芽細胞の培養に適した培地中で培養することにより行う。ヒト線維芽細胞の培養に適した培地として、例えば、工程（ｉ）に使用するものとして以下に記載するものを用いることができる。
【００２６】
凍結保存された真皮線維芽細胞を用いる場合、凍結された細胞を当業者に公知の手法により解凍して用いることができる。例えば、ヒートブロックによる急速解凍により凍結保存された真皮線維芽細胞を解凍して使用することができる。また、凍結保存された真皮線維芽細胞は、上記工程（ｉ）で培養した真皮線維芽細胞の一部を凍結保存することにより得てもよい。その際、凍結保存する真皮線維芽細胞の継代数は特に限定されず、少なくとも１回継代培養したものであればよい。真皮線維芽細胞の凍結保存は、当業者に公知の手法のいずれかを用いて行うことが可能であるが、例えば、実施例１の工程（３−２）に記載の手法により行ってもよい。
【００２７】
真皮線維芽細胞は、好ましくは、当該化粧用組成物を使用するヒト対象が、若年層の間に採取した皮膚由来の真皮線維芽細胞を用いる。若年層とは、好ましくは、４０代以下、３０代以下、２０代以下である。若年層の対象から採取した皮膚検体由来の真皮線維芽細胞を培養した場合、高齢になってから採取した皮膚検体由来の真皮線維芽細胞を培養したた場合よりも、高い細胞増殖能を得られる。即ち、効果の高い化粧用組成物の提供が可能となる。化粧用組成物の製造において、凍結保存された真皮線維芽細胞を用いることが可能なため、当人が若年層のうちに皮膚を採取して真皮線維芽細胞を得て、後に、必要な時に解凍して化粧品組成物の製造のために使用することができる。凍結保存可能な期間は特に限定されない、非限定的に、凍結保存は、３か月以上、６ヶ月以上、１年以上、３年以上、５年以上、１０年以上、１５年以上、２０年以上、３０年以上可能である。
【００２８】
真皮線維芽細胞は、好ましくは、１０歳以上、１５歳以上、２０歳以上のヒト対象から採取する。
工程（ｉ）において、真皮線維芽細胞の培養は、当業者に公知の手法のいずれかにより行ってもよい。培地は、ヒト線維芽細胞の培養に適した培地であれば特に限定されない。ヒト線維芽細胞の培養に適した培地は、以下の成分：
・アミノ酸として、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、およびトレオニンからなる群より選択される１以上の成分；
・ビタミン類として、アスコルビン酸、ビオチン、塩化コリン、葉酸、ナイアシンアミド、Ｄ−パントテン酸カルシウム、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ１２、およびビタミンＥからなる群より選択される１以上の成分；
・核酸として、チミジン；および／または
・その他の成分として、グルコース、ピルビン酸ナトリウム、および／またはコハク酸；
を含むものであってもよい。好ましくは、ヒト線維芽細胞の培養に適した培地は、さらに以下の成分：
・脂質として、アラキドン酸、コレステロール、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸からなる群より選択される１以上の成分；および／または
・タンパク質として、組換え体ヒトＥＧＦ、および／または組換え体ヒトインスリン；
を含むものであってもよい。このような培地としては、例えばＨＦＤＭ−１（＋）（株式会社細胞科学研究所）を利用することができる。
【００２９】
また、一態様において、培地は、好ましくは、血清含有培地である。血清含有培地に含まれる血清の種類は特に限定されないが、好ましくは培養する真皮線維芽細胞を採取した対象と同一対象由来の血液から得られたものであってもよい。培地中に含まれる血清の量は、特に限定されないが、例えば、０．５〜２０％（ｖ／ｖ）、１〜１５％（ｖ／ｖ）、３％〜１５％（ｖ／ｖ）、５％〜１０％（ｖ／ｖ）であってもよい。
【００３０】
培養は、例えば、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で行ってもよい。また、培養は平板培養で行っても、浮遊培養で行ってもよい。好ましくは平板培養で行う。
工程（ｉ）において、真皮線維芽細胞を継代する回数に特に限定はないが、好ましくは、少なくとも２回、または少なくとも３回行う。継代培養は、培養スケールの拡大、および不純物の除去を目的に行うものであるので、その回数に上限はない。しかしながら、継代数が増加すると化粧用組成物の製造コストも増大することに鑑みれば、継代数の上限は５回、７回、または１０回であってもよい。ここで、凍結保存された真皮線維芽細胞を用いて化粧用組成物を製造する場合において、継代数は、細胞の解凍後の培養についての継代数である。
【００３１】
工程（ｉ）における培養スケールは特に限定されないが、好ましくは最終回の継代が、培地４０ｍＬあたり０．６〜１．５×１０６細胞で播種し、コンフルエントになるまで培養することを含んでもよい。２２５ｃｍ２フラスコにおいて、０．６〜１．５×１０６細胞を４０ｍＬの培地に播種して培養する場合、約４日間の培養でコンフルエントに達する。
【００３２】
工程（ｉｉ）では、工程（ｉ）で得られた培養物の培養上清液を回収するが、工程（ｉ）で得られた培養物とは、工程（ｉ）の最終回の継代の培養物を意味する。培養上清の回収は、当業者に公知の手法のいずれかにより行うことができる。平板培養である場合、培養上清の回収はピペットによる吸引によって行ってもよい。浮遊培養である場合、培養上清の回収は培養液の遠心分離後、培養上清のデカントにより行ってもよい。
【００３３】
工程（ｉｉｉ）の培養上清液の濃縮は、当業者に公知の手法のいずれかにより行うことができる。例えば、限外ろ過膜付チューブに培養上清液を入れて遠心することにより、培養上清液を濃縮することができる。培養上清液の濃縮率は、特に限定されないが、１．５〜３０倍、２〜２０倍、２〜１５倍、５〜１５倍、５〜１０倍であってもよい。
【００３４】
工程（ｉｖ）において、工程（ｉｉｉ）で得た濃縮した培養上清液をベース化粧品に添加する。濃縮した培養上清液をベース化粧品に添加した後は、均一になるように混合する。ベース化粧品については、化粧用組成物の項目において上述したとおりである。濃縮した培養上清液は、ベース化粧品の重量に対して２〜１５％（ｗ／ｗ）、３〜１０％（ｗ／ｗ）、３〜７％（ｗ／ｗ）３〜５％（ｗ／ｗ）で添加してもよい。
【００３５】
＜美容方法等＞
一態様において、本願は、真皮線維芽細胞の培養上清液を含む組成物を対象の皮膚に適用することを含む美容方法を提供する。真皮線維芽細胞の培養上清液を含む組成物は、上述した本願の化粧用組成物であってもよい。組成物は、１日１回または１日２回、皮膚に適用する。組成物を使用する期間は、特に限定されないが、７日間以上、１４日間以上、１ヶ月以上、あることが好ましい。使用期間の上限は特にない。
【００３６】
本願の美容方法は、皮膚の状態および外観を改善し、または向上させるための方法である。ここで、皮膚の状態および外観の改善または向上とは、肌の乾燥の改善、肌の保湿感の向上、小じわの改善（低減）、ハリ弾力の向上、たるみの改善（低減）、肌の明るさの向上、しみの改善（目立たなくなる）、肌荒れの改善、毛穴の改善（目立たなくなる）、柔らかさの向上、キメの向上、および化粧のりの向上、からなる群より選択される１以上の状態の改善または向上を意味する。
【００３７】
別の態様において本願は、化粧用組成物の製造のための真皮線維芽細胞の培養上清液の使用を提供する。また別の態様において本願は、美容方法における使用のための真皮線維芽細胞の培養上清液を提供する。「美容方法」および「真皮線維芽細胞の培養上清液」の用語の定義については上述のとおりである。
【実施例】
【００３８】
以下に本発明の実施例を説明する。本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって限定されない。
実施例１：化粧用組成物の製造（１）／皮膚片からの製造
以下（１）〜（７）の手順により、化粧用組成物を製造した。
【００３９】
（１）皮膚片の酵素処理および細切
（１−１）皮膚片の酵素処理
以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）の操作は、安全キャビネット内にて室温下で行った。
【００４０】
（ｉ）被験者の同意を得て採取した皮膚片を、滅菌済みピンセットを用いて、１％イソジン（登録商標）溶液（株式会社明治）を含む５０ｍＬ遠沈管（ポリプロピレン製）に入れた。皮膚片を１％イソジン（登録商標）溶液（２０ｍＬ）中で穏やかに１分間振盪した。遠沈管を蓋が下となるように転倒させ、皮膚片を蓋内側に付けた後、遠沈管を元の向きに戻した。
【００４１】
（ｉｉ）滅菌済みピンセットを用いて、皮膚片を２０ｍL生理食塩水を含む５０ｍＬ遠沈管に移した。皮膚片を生理食塩水中で激しく１５秒間撹拌した。遠沈管を蓋が下となるように転倒させ、皮膚片を蓋内側に付けた後、遠沈管を元の向きに戻した。
【００４２】
（ｉｉｉ）滅菌済みピンセットを用いて、皮膚片を１．５ｍＬディスパーゼ（登録商標）Ｉ溶液（三光純薬株式会社、GD81060）を含む１５ｍＬ遠沈管（ポリプロピレン製）に移した。但し、皮膚片が大きい場合は、２等分など適宜分割した上で移した。
【００４３】
（ｉｖ）３７℃で１〜１．５時間インキュベートした。１５〜３０分おきに反応液をゆっくりと撹拌した。表皮が剥がれにくい場合はインキュベート時間を延長した。
（１−２）皮膚片の細切
（ｉ）上記工程（１−１）終了後、遠沈管を蓋が下となるように転倒させ、皮膚片を蓋内側に付けた後、遠沈管を元の向きに戻した。滅菌済みピンセット２本を用いて、蓋の上で表皮と真皮を分離した。表皮が剥がれにくい場合は、皮膚片をディスパーゼ（登録商標）Ｉ溶液中に戻し、３７℃でさらに１０分間反応させた後、分離した。
【００４４】
（ｉｉ）真皮を２０ｍＬ生理食塩水を含む５０ｍＬ遠沈管に移し、生理食塩水中で激しく１５秒間撹拌した。遠沈管を蓋が下となるように転倒させ、真皮を蓋内側に付けた後、遠沈管を元の向きに戻した。
【００４５】
（ｉｉｉ）５０ｍＬ遠沈管に、ＨＦＤＭ−１（＋）（株式会社細胞化学研究所、型番2102P10、以下、実施例において「ＨＦＤＭ」と表記する）  ３６ｍＬと被験者の非働化血清  ４ｍＬを加え、１０％ヒト血清培地を作成した。１０ｃｍ培養ディッシュに、１０％ヒト血清培地をディッシュ１枚あたり１０ｍＬずつ分注し、底面を培地で覆った後、約８ｍＬをピペットに吸い戻し、新しい遠沈管に移した。
【００４６】
（ｉｖ）真皮を上記の培養ディッシュに移し、（ｉｉｉ）で準備した培養ディッシュ上で約１ｍｍ四方に細切した。皮膚片の浮きが多い場合には、３７℃のＣＯ２インキュベーター内でしばらく静置した。（ｉｉｉ）で新しい遠沈管に移した培地を培養ディッシュに戻し、全量を１０ｍＬとした。皮膚片の一部を参考品として保存するために、セルバンカー１ｍＬに皮膚片２片を加えて浮遊させ、クライオチューブを４℃に予冷したバイセルに入れた。培養ディッシュは３７℃のＣＯ２インキュベーター内で６日間培養した。
（２）細胞の継代（１回目）
（ｉ）上記工程（１−２）の培養ディッシュの培養上清を１ディッシュあたり数ｍＬピペットで吸引し、遠沈管に回収する。残りの培養上清も吸引し、廃棄した。
【００４７】
（ｉｉ）ＤＰＢＳ（Life technologies社、型番14190-2335）  ４ｍＬをピペットで皮膚片に水流が当たらないようにディッシュに加え、底面をＤＰＢＳで浸した。ピペットでＤＰＢＳを吸引して廃棄し、それぞれのディッシュにピペットでTryple Select（life technologies社、型番12563-029）  ３ｍＬを加え、インキュベーターにて３７℃で酵素処理を行った。約２〜３分の処理後、顕微鏡で観察し、細胞の剥離開始が観察されなければ処理時間を延長した。顕微鏡下で細胞の剥離開始が観察された後、ディッシュ内の細胞／Tryple Select懸濁液をピペットで吸引し、ディッシュ表面に滴下することで、可能な限り多くの細胞を剥離させた。
【００４８】
（ｉｉｉ）細胞浮遊液を工程（ｉ）の遠沈管に回収した。細胞回収後のディッシュにＨＦＤＭ  ４ｍＬを加えて共洗いし、前記の遠沈管に回収した。細胞浮遊液を４℃、３３０×ｇ（１３００ｒｐｍ）で６分間遠心した。
【００４９】
（ｉｖ）細胞回収後のディッシュに１０％血清含ＨＦＤＭ  １０ｍＬを加え、インキュベーターに戻した。皮膚片の浮きが多い場合には、１０％血清含むＨＦＤＭ  ２ｍＬを加えて一時的に静置し、皮膚片をディッシュ表面に接着させ、その後８ｍＬ加え全量を１０ｍＬにした。細胞の回収が少ない場合は、再度このディッシュから同様の手順にて細胞を回収する。
【００５０】
（ｖ）工程（ｉｉｉ）の遠心後のペレットにＨＦＤＭを２ｍＬ加えて細胞を再浮遊させた。細胞浮遊液の細胞数を測定した。細胞浮遊液にＨＦＤＭを加え、１ｍＬあたりの細胞数が０．６〜１．５×１０６細胞以上となるように調整した。
【００５１】
（ｖｉ）２２５ｃｍ２フラスコにＨＦＤＭ  ３７ｍＬ、血清２ｍＬを加えた。細胞浮遊液をフラスコへ１ｍＬずつ播種する。細胞を播種したフラスコを３７℃のＣＯ２インキュベーターへ入れ、フラスコ内の細胞密度がほぼ飽和状態に達するまで（約４日間）培養した。
【００５２】
（３）保管細胞（Ｐ）の保存、および細胞の継代（２回目）
（３−１）フラスコからの細胞の回収
（ｉ）２２５ｃｍ２フラスコ内の１フラスコあたり１０ｍＬの培養上清を遠沈管に回収し、残りは廃棄した。
【００５３】
（ｉｉ）ピペットでＤＰＢＳ  １０ｍＬをフラスコに加え、ゆっくりとフラスコを揺すった。ＤＰＢＳをデカントにて除去後、再度ＤＰＢＳ  １０ｍＬを用いて洗浄した。ＤＰＢＳをデカントにて除去後、新しいピペットで３７℃に保温してあるTriple Select  １０ｍＬを加え、３７℃のインキュベーターにて酵素処理を行った。約２〜３分間の処理後、顕微鏡で観察し、細胞の剥離開始が観察されなければ処理時間を延長した。顕微鏡下で細胞の剥離開始が観察された後に、フラスコの側面をたたいて、フラスコ底面からすべての細胞を剥離した。
【００５４】
（ｉｉｉ）細胞／Triple Select懸濁液を工程（ｉ）の遠沈管に回収した。細胞回収後のフラスコにＨＦＤＭ  １０ｍＬを加え、フラスコに付着した細胞を取りきるように共洗いし、前記遠沈管に回収した。
【００５５】
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の細胞浮遊液を４℃、３３０×ｇ（１３００ｒｐｍ）で６分間遠心した。遠心後のペレットにＨＦＤＭを１フラスコあたり３ｍＬ加えて細胞を再浮遊させた。細胞浮遊液の細胞数を測定した。継代する分の細胞を別のチューブに分けた。通常は、０．６〜１．５×１０６／２２５ｃｍ２フラスコで継代する。
【００５６】
（３−２）保管細胞（Ｐ）の保存
（ｉ）クライオチューブ１本あたりの細胞数が２．０〜２．５×１０６／チューブになるよう、本数および細胞数を決定した。
【００５７】
（ｉｉ）上記工程（３−１）（ｉｖ）で取り分けた後の細胞浮遊液に、合わせて２０ｍＬになるようにＤＰＢＳを加えた。細胞浮遊液を４℃、３３０×ｇ（１３００ｒｐｍ）で６分間遠心した。ＤＰＢＳをデカントにて除去した。
【００５８】
（ｉｉｉ）クライオチューブ１本あたり１ｍＬのセルバンカーを加えて、細胞を再浮遊させた。クライオチューブに細胞懸濁液を１ｍＬずつ分注した。クライオチューブを４℃に予冷したバイセルに入れた。バイセルを−８０℃で保存した。一晩、保存後、液体窒素にて長期保存する。保存は半永久的に可能である。このように保存した細胞を保管細胞（Ｐ）と表記する。
【００５９】
（３−３）細胞の継代（２回目）
２２５ｃｍ２フラスコに血清２ｍＬ、及びＨＦＤＭ３７ｍＬを加えた。上記工程（３−１）（ｉｖ）で取り分けた後の遠心後のペレットに、播種予定フラスコ１枚あたり１ｍＬのＨＦＤＭを加えた。細胞浮遊液を２２５ｃｍ２フラスコへ１ｍＬずつ播種した。２２５ｃｍ２フラスコを３７℃のＣＯ２インキュベーターへ入れ、フラスコ内の細胞密度がほぼ飽和状態に達するまで（約４日間）培養した。
（４）細胞の継代（３回目）および細胞培養上清の回収
（ｉ）上記（３−１）および（３−３）と同様に、フラスコからの細胞の回収および細胞の継代培養（３回目）を行った。
【００６０】
（ｉｉ）（ｉ）の培養物について、培養上清を化粧品原材料としてボトルに回収した。
（５）低濃度濃縮肌細胞由来成分の調製
（ｉ）限外ろ過膜付チューブ（日本ポール株式会社、オメガブレン、型番J52041）の上部に７０％アルコールを２０ｍＬ加え、４℃、３０００×ｇで５分間遠心した。遠心後、チューブの上部に残った液とメンブレンを通ったアルコールをデカントで廃液ボトルに捨てた。アルコールをデカントにて除去後、ＤＰＢＳを２０ｍＬ加え、４℃、３０００×ｇで５分間遠心した。遠心後、チューブの上部に残った液とメンブレンを通ったＤＰＢＳをデカントで廃液ボトルに捨てた。
【００６１】
（ｉｉ）工程（４）（ｉ）で回収した培養上清を洗浄したチューブの上部に２０ｍＬ加え、４℃、３０００×ｇで遠心した。概ね、１時間１５分の遠心で２倍、２時間の遠心で４倍の濃縮倍率が得られるが、所望の濃縮倍率になるように遠心の時間は適宜調製した。遠心終了後、各チューブの上部に残った濃縮された培養上清をセルストレイナーに通し、５０ｍＬ遠沈管に回収した。
【００６２】
（ｉｉｉ）濃縮倍率１．５〜１０倍未満の濃縮液を、「低濃度濃縮肌細胞由来成分」とした。濃縮液は、遠沈管に分注し、−８０℃で約１年保管した。
（６）高濃度濃縮肌細胞由来成分の調製
（ｉ）工程（５）（ｉ）と同様に、限外ろ過膜付チューブを洗浄した。
【００６３】
（ｉｉ）工程（４）（ｉ）で回収した培養上清を洗浄したチューブの上部に２０ｍＬ加え、４℃、３０００×ｇで遠心した。概ね、３時間の遠心で１０倍の濃縮倍率が得られるが、所望の濃縮倍率になるように遠心の時間は適宜調製した。１０倍濃縮より濃縮する場合は、１０倍濃縮になったら新しい限外ろ過膜チューブ１本につき２０ｍＬ以内になるようにまとめて所望の濃縮倍率になるまで遠心を行う。１０倍濃縮以下の場合、遠心終了後、各チューブの上部に残った濃縮された培養上清をセルストレイナーに通し、５０ｍＬ遠沈管に回収した。
【００６４】
（ｉｉｉ）濃縮倍率１０倍以上の濃縮液を、「高濃度濃縮肌細胞由来成分」とした。濃縮液を、−８０℃で約１年保管した。
（７）濃縮肌細胞由来成分のベース化粧品への添加
工程（５）または（６）で得られた濃縮液を、ベース化粧品（化粧水、乳液、クリーム）に添加して、化粧用組成物を得た。当該濃縮液は、ベース化粧品が化粧水、乳液、またはクリームのいずれである場合も、３〜１０％の割合となるように添加した。
【００６５】
実施例２：化粧用組成物の製造（２）／保管細胞（Ｐ）からの製造
以下（１）〜（７）の手順により、化粧用組成物を製造した。
（１）細胞の解凍
実施例１、工程（３−２）の保管細胞（Ｐ）を解凍する。
【００６６】
（ｉ）遠沈管にクライオチューブ本数×９ｍＬのＨＦＤＭを入れておいた。
（ｉｉ）Ｐ２保管細胞が入っている凍結クライオチューブを３７℃ヒートブロックにて急速解凍した。解凍した細胞浮遊液を吸引し、ピペットの先を上記（ｉ）の遠沈管の液面につけて細胞浮遊液を注ぎ込み、ピペッティングし、細胞懸濁液とした。同じピペットで細胞懸濁液を１ｍＬ吸引し、細胞回収後のクライオチューブを数回ピペッティングすることで共洗いし、細胞を遠沈管に回収した。
【００６７】
（ｉｉｉ）細胞懸濁液を４℃、３３０×ｇ（１３００ｒｐｍ）で６分間遠心した。遠心後のペレットにＨＦＤＭ（播種予定フラスコ枚数×１ｍＬ）を加えて細胞を再浮遊させる。細胞浮遊液の細胞数を測定した。
【００６８】
（２）フラスコへの播種（細胞の継代（１回目））
（ｉ）下記表１に従い、播種細胞数を決定した。
【００６９】
【表１】
2020063192.tif 000002
【００７０】
（ｉｉ）下記表２に従い、各種フラスコに血清及びＨＦＤＭを加えた。
【００７１】
【表２】
2020063192.tif 000003
【００７２】
（ｉｉｉ）上記工程（１−１）（ｉｉｉ）で得た細胞浮遊液にＨＦＤＭを加え、１ｍＬあたりの細胞数が播種細胞数になるように調製した。細胞浮遊液を各種フラスコへ１ｍＬずつ播種した。各腫フラスコを３７℃のＣＯ２インキュベーターへ入れ、フラスコ内の細胞密度がほぼ飽和状態に達するまで（４〜６日間）培養した。
【００７３】
（３）保管細胞（Ｐ）の保存、および細胞の継代（２回目）
上記工程（２）の培養物を用い、実施例１の工程（３）と同様の手順を行った。
（４）細胞の継代（３回目）および細胞培養上清の回収
実施例１の工程（４）と同様の手順を行った。
【００７４】
（５）低濃度濃縮肌細胞由来成分の調製
実施例１の工程（５）と同様の手順を行った。
（６）高濃度濃縮肌細胞由来成分の調製
実施例１の工程（６）と同様の手順を行った。
【００７５】
（７）濃縮肌細胞由来成分のベース化粧品への添加
実施例１の工程（７）と同様の手順を行い、化粧用組成物を得た。
実施例３：化粧品の評価
公募による３１名のモニターを対象に、濃縮肌細胞由来成分を含むまたは当該成分を含まない化粧用組成物（化粧水、乳液、およびクリーム）について、各モニターが直近に使用していた化粧品との比較について、アンケート調査を行った。濃縮肌細胞由来成分を含む化粧用組成物として、真皮線維芽細胞の培養上清液の２倍濃縮液を５％（ｗ／ｗ）で含む化粧用組成物を用いた。アンケート調査のために、各モニターは評価対象の化粧用組成物を２週間連用した。３１名のうち、１６名は濃縮肌細胞由来成分を含まない化粧品についての使用感を評価し、１５名は当該成分を含む化粧品についての使用感を評価した。それぞれの群は無作為に分け、また各モニターには評価している化粧品が濃縮肌細胞由来成分を含むか否かは開示しなかった。
【００７６】
結果を以下の表３−１および表３−２、ならびに図１−１および図１−２に示す。
【００７７】
【表３−１】
2020063192.tif 000004
【００７８】
【表３−２】
2020063192.tif 000005
【００７９】
濃縮肌細胞由来成分を含む化粧用組成物は、特に、肌の乾燥、保湿感、といった項目において、改善されたという評価が多かった。肌荒れ、くすみ、毛穴、に対する効果を実感したという評価も、濃縮肌細胞由来成分を含む化粧用組成物の方が多かった。また、総合的に他の人に勧めたいという評価も、濃縮肌細胞由来成分を含む化粧用組成物の方が多かった。
【００８０】
実施例４：培養上清液の評価（１）−代謝物および各種イオン
被験者３名の検体について、実施例１または２と同様に真皮線維芽細胞を培養し、工程（４）の３回目の継代培養を５日間行った。培養液を１日毎にサンプリングし、培養上清液中の代謝物（グルコース（Glc）、ラクトース（Lac）、グルタミン（Gln）、アンモニア（NH3）、グルタミン酸（Glu））および各種イオン（カルシウムイオン（Ca）、マグネシウムイオン（Mg）、ナトリウムイオン（Na））の増減を、Cedex Bio（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて評価した。真皮線維芽細胞を播種していない培地をコントロールとした。また、培養５日後の培養上清液の２倍濃縮液についても各種代謝物およびイオンの量を同様に評価した。
【００８１】
結果を図２−１および図２−２に示す。ここで、培養上清の濃縮液については、比較を容易にする観点から、濃縮前の濃度に換算した値を示している。
グルコース、グルタミン酸については培養日数の経過とともに減少する傾向が見られた。ラクトース、グルタミン酸、アンモニアについては、培養日数の経過とともに増加する傾向が見られた。各種イオンについては、培養前後でその量に変化はなかった。また、培養上清液を濃縮しても、培養上清中に含まれる代謝物や各種イオンの成分が失われることはないことを確認した。
【００８２】
実施例５：培養上清液の評価（２）−コラーゲン産生
実施例１または２と同様に５％血清含有ＨＦＤＭ−１（＋）培地で真皮線維芽細胞を培養し、工程（４）の３回目の継代培養まで行った。また、比較例として、同様の継代培養を１０％血清含有ＭＥＭα培地で行った。３回目の継代培養の上清液に含まれるコラーゲン量を評価した。
【００８３】
結果を図３に示す。真皮線維芽細胞の培養にＨＦＤＭを用いた場合、細胞が産生・分泌するコラーゲン量が多いことが確認された。
ここで、ＨＦＤＭ−１（＋）培地は線維芽細胞の培養に適した培地であるのに対し、ＭＥＭα培地は広く哺乳類細胞の培養に用いられる培地である。成分の違いの一例としては、前者は組換え体ヒトＥＧＦまたは組換え体ヒトインスリンなどのタンパク質や脂質成分を含む点が挙げられる。
【００８４】
実施例６：真皮線維芽細胞の皮膚採取時の年齢別の細胞増殖能
若年層（３０歳未満）の対象から採取した皮膚３例と、高年層（７０歳以上）の対象から採取した皮膚３例の検体由来の真皮線維芽細胞を、実施例１または２と同様に培養した。具体的には、工程（４）の３回目の継代培養まで行い、細胞増殖能（倍化時間）を評価した。
【００８５】
倍化時間＝ｔｌｏｇ２／（ｌｏｇＮ２−ｌｏｇＮ１）
（ｔ：培養日数；Ｎ１：細胞播種数；Ｎ２：細胞回収数）
結果を表４及び図４に示す。
【００８６】
【表４】
2020063192.tif 000006
【００８７】
若年時（３０歳未満）の対象から採取した皮膚検体由来の真皮線維芽細胞を培養した場合、高年時（７０歳以上）の対象から採取した皮膚検体由来の真皮線維芽細胞を培養した場合よりも、細胞増殖能が向上していることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明の真皮線維芽細胞の培養上清液を含む化粧用組成物は、保湿効果が高く、皮膚の状態および外観を改善する新たな化粧用組成物を提供するものである。特に、対象自身の皮膚から得られた真皮線維芽細胞の培養上清液を用いるオーダーメイド化粧品は、自身の肌質に合う化粧品を求める消費者のニーズを満たすものとして、新たな市場を開拓するものである。
【図１−１】
2020063192.tif 000007
【図１−２】
2020063192.tif 000008
【図２−１】
2020063192.tif 000009
【図２−２】
2020063192.tif 000010
【図３】
2020063192.tif 000011
【図４】
2020063192.tif 000012