(57)【要約】【課題】リコンビナーゼポリメラーゼ増幅を多重化するための方法の提供。【解決手段】本開示は、迅速な多重リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）反応のための方法および試薬ならびに多重ＲＰＡ反応産物を検出するための改良された方法を提供する。さらに、本開示は、ＲＰＡプロセス間の繰り越し汚染を排除するための新規方法を提供する。より詳細には、本発明は、容易に多重化できるプロセスにおいて核酸を迅速かつ効率的に増幅させるための新規なリコンビナーゼポリメラーゼ増幅プロトコールを含む核酸増幅の方法を提供する。【選択図】図１３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００５年７月２５日に出願された米国特許出願第６０／７０２，５３３号および２００５年１０月１８日に出願された米国特許出願第６０／７２８，４２４号より優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）は、酵素を利用して合成オリゴヌクレオチドプライマーを二本鎖ＤＮＡ内のそれらの相補的パートナーへマッチさせるＤＮＡ増幅プロセスである（Ａｒｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｅｍｐｌｅ、２００２年２月２１日に提出された米国特許出願第６０／３５８，５６３号）。ＲＰＡは、細胞ＤＮＡ複製および修復機構の構成要素に依存している。インビトロＤＮＡ増幅のためにこの機構の一部を使用するという考えはしばらくの間は存続していたが（Ｚａｒｌｉｎｇら、特許文献１）、この概念は、主として大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ｒｅｃＡタンパク質を含むリコンビナーゼ機能の分野における長年の研究の歴史にもかかわらず実用的技術へは変換されていなかったが、近年になってようやくＤＮＡの感受性増幅を許容するインビトロ条件が決定されるに至った（Ｐｉｅｐｅｎｂｕｒｇら、２００４年９月１日に提出された米国特許出願第１０／９３１，９１６号、さらにＰｉｅｐｅｎｂｕｒｇら、ＰｌｏｓＢｉｏｌｏｇｙ  ２００６）。
【０００３】
ＲＰＡは、ＤＮＡ増幅の伝統的方法に比して多数の優れた長所を提供する。これらの長所には、任意の初期の熱もしくは化学融解の必要の欠如、絶対温度制御の必要を伴わずに低い定温で作用する能力、ならびに完全反応液（標的を欠如する）を乾燥状態で保存できるという観察所見が含まれる。これらの特性は、ＲＰＡがポータブル型の正確かつ機器を使用しない核酸検出試験を開発するための独創的に強力なツールであることを証明している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第５，２２３，４１４号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の簡単な説明）
本発明は、容易に多重化できるプロセスにおいて核酸を迅速かつ効率的に増幅させるための新規なリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）プロトコールを含む核酸増幅の方法に関する。
【０００６】
本発明の１つの実施形態は、複数のＲＰＡを単一反応（単一試験管）内において同時に実施できる、そして結果を同時に検出できる方法に向けられる。以下では最初に単一ＲＰＡ反応について記載し、次に前記反応を多重化する方法について記載する。
【０００７】
本発明の１つの態様は、容易に検出可能なアンプリマー（ＲＰＡ反応の産物である増幅した核酸）を生成するＲＰＡの方法に向けられる。ＲＰＡプロセスは、ＤＮＡの第１および第２鎖を含む二本鎖標的核酸分子を増幅させた。工程（ａ）は、第１、第２および第３核タンパク質プライマーを形成するために、リコンビナーゼ因子を、第１および第２核酸
プライマーならびに１つまたは複数の非相補的もしくは修飾された内部残基を含む第３伸長ブロック化プライマーと接触させる工程を含んでいる。工程（ｂ）は、結果として前記第１核タンパク質プライマーおよび前記第１核タンパク質プライマーの３’末端が前記３’末端間の標的核酸の第３部分を同一標的核酸分子上で相互に向けて方向付けるように第１および第２核タンパク質プライマーを前記二本鎖標的核酸と接触させ、それにより前記第１鎖の第１部分で前記第１核タンパク質プライマーと前記ＤＮＡの第１鎖との間で第１二本鎖構造を形成する（Ｄループを形成する）、および前記第２鎖の第２部分で前記第２核タンパク質プライマーと前記ＤＮＡの第２鎖との間で第２二本鎖構造を形成する（Ｄループを形成する）工程を含んでいる。工程（ｃ）は、核酸の第３部分を含む内部領域を備える第１増幅された標的核酸を生成するために、１つまたは複数のポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて前記第１核タンパク質プライマーおよび第２核タンパク質プライマーの３’末端を伸長させる工程を含んでいる。工程（ｄ）は、ヌクレアーゼの存在下で前記増幅させた標的核酸の第３部分で第３二本鎖構造を形成する（Ｄループを形成する）ために、前記増幅された標的核酸を前記第３核タンパク質プライマーと接触させる工程であって、このとき前記ヌクレアーゼは、第３の５’プライマーおよび第３の３’伸長ブロック化プライマーを形成するために前記第３二本鎖構造の形成後にのみ前記非相補的内部残基を特異的に切断する工程を含んでいる。工程（ｄ）は、前記第１核酸プライマーおよび前記第３の５’プライマーを含む第２二本鎖増幅核酸を生成するために、１つまたは複数のポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて前記第３の５’プライマーの３’末端を伸長させる工程を含んでいる。ＲＰＡ反応は、所望の程度の第２二本鎖増幅核酸が達成されるまで継続される。このプロセスは、任意の関連実施形態とともに、多重ＲＰＡ反応（以下で記載する）のために使用できることに留意されたい。
【０００８】
リコンビナーゼ因子は、例えば、ｕｖｓＸ、ＲｅｃＡおよびそれらの機能的アナログであってよい。さらに、ＲＰＡ反応は、ｕｖｘＹ、ｇｐ３２、一本鎖結合タンパク質およびその他の通常のＲＰＡ試薬の存在下で実施できる。ＲＰＡを実施する方法は、例えば、２００２年２月２１日に提出された米国特許出願第６０／３５８，５６３号、２００３年、２００３年２月２１日に提出された米国特許出願第１０／３７１，６４１号、２００４年９月１日に提出された米国特許出願第１０／９３１，９１６号および２００５年４月１１日に提出されたＰＣＴ／ＩＢ２００５／００１５６０（ＷＯ２００５／１１８８５３）に開示されている。
【０００９】
このＲＰＡ反応において使用されるヌクレアーゼは、第３伸長ブロック化プライマーがＤＮＡにハイブリダイズする場合は優先的に非相補的残基もしくは修飾された内部残基を特異的に切断して二本鎖構造を形成するはずである。ヌクレアーゼは、プライマーがリコンビナーゼもしくはＳＳＢに付着するかどうかとは無関係に、伸長ブロック化プライマーが一本鎖形である場合には非相補的残基もしくは修飾された内部残基を切断しないことが好ましい。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼは、ＤＮＡグリコシラーゼもしくはＡＰエンドヌクレアーゼである。修飾された内部残基がウラシルもしくはイノシンである場合は、好ましいヌクレアーゼは、各々グリコシラーゼもしくはヒポキサンチン−ＤＮＡグリコシラーゼである。ヌクレアーゼは、さもなければ二本鎖構造内で非相補的残基の１領域（すなわち、バブル）を形成するミスマッチの性質によって非相補的塩基を認識できる。この場合には、ヌクレアーゼは、非相補的残基間の塩基ミスマッチを認識し、非相補的塩基でプライマーを切断する。
【００１０】
本発明のプロセスのいずれかで使用されるヌクレアーゼは、ＤＮＡグリコシラーゼもしくはＡＰエンドヌクレアーゼであってよい。ヌクレアーゼは、前記第１伸長ブロック化プライマーと前記標的核酸との間の塩基ミスマッチを認識することおよび標的核酸を切断せずに塩基ミスマッチで伸長ブロック化プライマーを切断することとによって機能できる。または、ヌクレアーゼは、損傷した残基、無塩基性部位もしくは無塩基性部位模擬体、ま
たは合成オリゴヌクレオチド内に組み込まれる可能性がある任意の他の修飾を認識できる。ヌクレアーゼは、例えば、ｆｐｇ、Ｎｔｈ、ＭｕｔＹ、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＭ、大腸菌ＭＵＧ、ヒトＭＵＧ、ヒトＯｇｇ１、脊椎動物Ｎｅｉ様（Ｎｅｉｌ）グリコシラーゼ、Ｎｆｏ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、ウラシルグリコシラーゼ、ヒポキサンチン−ＤＮＡならびにそれらの機能的アナログおよびホモログであってよい。機能的アナログおよびホモログは、任意の哺乳動物、細菌もしくはウイルス起源であってよい。追加の例として、修飾された塩基がイノシンである場合は、ヌクレアーゼはヒポキサンチン−ＤＮＡグリコシラーゼであってよい；修飾された塩基がウラシルである場合は、ヌクレアーゼはウラシルグリコシラーゼであってよい。好ましい実施形態では、これらのヌクレアーゼは大腸菌由来であってよい。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼは大腸菌Ｎｆｏもしくは大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩであり、修飾された内部残基はテトラヒドロフラン残基もしくはリンカー基である。「リンカー」（炭素リンカーもしくは「スペーサー」とも呼ばれる）は、１つの糖の３’位を（通常は）また別の糖の５’位へ結合させるために使用される炭素含有鎖である。共通スペーサーは、約３、６、９、１２もしくは１８炭素鎖を含んでいてよいが、任意の数の炭素鎖であってもよい。炭素−酸素−炭素連鎖は、おそらくは疎水性を減少させるために、これらのスペーサー内で共通である。ＮｆｏおよびエキソヌクレアーゼＩＩＩ（およびホモログ）は、スペーサーに結合したヌクレオチドの３’末端上の糖３’−Ｏ−Ｃ連鎖を認識してそれを切断することができる。例えば、Ｃ１８スペーサー（１８−Ｏ−ジメトキシトリチルヘキサエチレングリコール、１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、米国バージニア州スターリング、製品番号１０−１９１８−９０）を参照されたい。
【００１１】
本明細書で使用するオリゴヌクレオチド内の「無塩基性残基」は、オリゴヌクレオチド鎖内の分子フラグメント（ＭＦ）を意味するが、このとき分子フラグメントは、分子フラグメントに隣接する塩基が相互から、同一距離、またはあたかもＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、もしくはＵのいずれかのリボフラノースもしくはデオキシリボフラノース糖が無塩基性残基の代わりに存在しているかのように、事実上同一距離だけ離れているような方法でリボフラノースもしくはデオキシリボフラノース糖の長さを近似させる。無塩基性残基は、天然Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、もしくはＵにおけるようにリボフラノースもしくはデオキシリボフラノース環を組み込むことができる。しかし、無塩基性残基は、塩基、または無塩基性残基含有オリゴヌクレオチドを用いて形成される二本鎖の逆鎖に基づいてその塩基と相互作用できる他の分子を含有していない。そこで、無塩基性残基は、アプリンもしくはアピリミジン構造、塩基アナログ、またはホスフェート骨格のアナログであってよい。無塩基性置換は、アミド結合によって連結されたＮ−（２−アミノエチル）−グリシンから構成することもできる。好ましい実施形態では、無塩基性残基は、テトラヒドロフランもしくはＤ−スペーサー（テトラヒドロフランの１タイプ）である。Ｄ−スペーサーおよびテトラヒドロフランはどちらも効果的には１’および２’位のどちらもＯＨ残基が欠如するデオキシリボース糖である。通常は、ＤＮＡ内の真の無塩基性残基の１’位はその塩基が通常は付着しているその位置でヒドロキシルを有するであろうが、これは環形が開環アルデヒド形（以下を参照）と相互転換し、次にβ脱離のプロセスによって分解し得るので不安定性である。このヒドロキシルの除去は、オリゴヌクレオチドへ容易に合成される安定形を導く。テトラヒドロフランタイプの無塩基性部位および無塩基性残基としてのそれらの使用は知られている。テトラヒドロフランは、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（米国バージニア州スターリング）から試薬を注文することによって合成中にオリゴヌクレオチド内に挿入できる。
【００１２】
１つまたは複数の非相補的もしくは修飾された内部残基は、これが第１伸長ブロック化プライマーの５’最末端もしくは３’最末端残基ではないために内部にある。好ましい実施形態では、１つまたは複数の非相補的内部残基は、プライマーの５’もしくは３’残基から少なくとも１０残基離れている。より好ましい実施形態では、１つまたは複数の非相
補的内部残基は、プライマーの５’もしくは３’残基から少なくとも１５、または少なくとも２０残基離れている。
【００１３】
１つまたは複数の非相補的内部残基は、１つまたは複数の非相補的残基を用いてオリゴヌクレオチドプライマーを合成する工程によって導入できる。非相補的残基は、二本鎖構造内でその対応する残基とワトソン・クリック（Ｗａｔｓｏｎ  Ｃｒｉｃｋ）塩基対（水素結合）を形成しない任意の残基である。例えば、プライマーと標的核酸との間でワトソン・クリック塩基対を形成するために特定の場所で「Ｔ」が必要とされる場合は、「Ａ」の使用は「Ａ」が非相補的となることを引き起こすであろう。また別の例として、下記の二本鎖構造内の中間の塩基の各々は非相補的塩基である。
【００１４】
【化１】
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二本鎖核酸内の非相補的塩基の存在が二本鎖核酸内でバブルを生成するであろうことは知られている。１つの非相補的もしくは修飾された内部残基が本発明の方法とともに機能するために十分である場合は、２つ以上の非相補的もしくは修飾された内部残基を使用できる。２つ以上が使用される場合は、それらはオリゴヌクレオチド上で相互に隣接してよい、またはそれらは離れていてよい。ヌクレアーゼがミスマッチもしくは非相補的場所で標的核酸を切断する場合は、標的ＤＮＡはテンプレートとしてプライマーを用いてｄＮＴＰおよびポリメラーゼによって迅速に修復されることに留意されたい。このために、この反応は本開示のプロセスには影響を及ぼさないであろう。
【００１５】
第１伸長ブロック化プライマーの１つまたは複数の非相補的内部残基は、修飾された内部残基であってよい。修飾された内部残基は、二本鎖核酸構造内でその対応する塩基とワトソン・クリック塩基対合構造を形成できない任意の化学構造（残基）であってよい。２つ以上の非相補的内部残基が使用される場合は、それらは非相補的内部残基もしくは修飾された内部残基の混合物であってよい。用語「修飾された内部残基」には、さらに少なくとも、例えばウラシルもしくはイノシンなどの、「Ａ」、「Ｇ」、「Ｃ」もしくは「Ｔ」ではない任意の残基である、ＤＮＡ内で通常は見いだされない任意の残基が含まれる。
【００１６】
修飾された内部残基は、イノシン、ウラシル、８−オキソグアニン、チミングリコール、もしくは無塩基性部位模擬体であってよい。好ましい無塩基性部位模擬体には、テトラヒドロフラン残基もしくはＤ−スペーサー（オリゴヌクレオチド合成中に５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−１’，２’−ジデオキシリボース−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイトを使用する産物として生成できる）が含まれる。
【００１７】
伸長ブロック化プライマーはその３’末端でブロックされるので、通常は相補的テンプレートの存在下でさえポリメラーゼおよびｄＮＴＰによって伸長させることはできない。プライマーをブロックする方法はよく知られており、少なくとも、ブロック化３’ヌクレオチドの包含が含まれる。ブロック化３’ヌクレオチドは、例えば、ポリメラーゼ伸長を妨害するブロック基を含有していてよい。一般に、ブロック基は、３’糖残基の３’もしくは２’部位に付着させられるが、他の付着場所も可能である。最も一般的な３’ブロック法の１つは、オリゴヌクレオチドの３’末端にジデオキシ糖を配置する方法である。ブロック基は、例えば、検出可能標識であってよい。
【００１８】
検出可能標識は、現行方法を用いて検出できる任意の成分として規定されている。これらの標識には、少なくとも、蛍光体（蛍光分子、蛍光色素とも呼ばれる）、酵素、クエンチャー、酵素阻害剤、放射性標識、結合対のメンバー、ジゴキシゲニン残基、ペプチド、およびそれらの組み合わせが含まれる。
【００１９】
「結合対のメンバー」は、第１および第２成分の１つであることを意味するが、このとき前記第１および前記第２成分は相互に対する特異的結合親和性を有する。本発明において使用するために適切な結合対には、抗原／抗体（例えば、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）／抗ＤＮＰ、ダンシル−Ｘ−抗ダンシル、フルオレセイン／抗フルオレセイン、ルシファー・イエロー／抗ルシファー・イエロー、ペプチド／抗ペプチド、リガンド／受容体およびローダミン／抗ローダミン）、ビオチン／アビジン（もしくはビオチン／ストレプトアビジン）およびカルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）／カルモジュリンが含まれるが、それらに限定されない。その他の適切な結合対には、例えば、ＦＬＡＧ−ペプチド（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号７）［Ｈｏｐｐら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ６：１２０４  １２１０（１９８８）］；ＫＴ３エピトープペプチド（Ｍａｒｔｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：１９２  １９４（１９９２））；チューブリンエピトープペプチド（Ｓｋｉｎｎｅｒら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ  ２６６：１５１６３  １５１６６（１９９１））；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ（Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８７：６３９３  ６３９７（１９９０））などのポリペプチドおよび各々それらに対する抗体が含まれる。一般に、好ましい実施形態では、結合対パートナーの小さい方は立体的考察が重要な可能性があるので検出可能標識として機能する。上記に加えて、ＲＰＡ反応の核酸およびヌクレオチドのいずれかを検出可能標識で標識することができる。
【００２０】
検出可能標識が使用される本発明のＲＰＡプロセスのいずれかにおいては、検出可能標識はＲＰＡ反応の進行（アンプリマーの生成）を監視するために使用できる。１つの態様では、プライマーが標識されると、監視する工程はアンプリマー内の標識を検出する工程を含むことができる。アンプリマーは使用されるプライマーより大きいと予想されるであろうから、検出は、例えばゲル電気泳動および適切なサイズのアンプリマーの検出を含むことができる。または、標識されたアンプリマーは、カラムクロマトグラフィ（スピンカラム、プッシュカラムなどを含む）などのより迅速なプロセスによって標識されたプライマーにより分離することができる。本発明のＲＰＡ法は高度の特異性および低いアーチファクト産生（高いシグナル対ノイズ比）を有するので、監視する工程は、検出可能標識に付着したヌクレオチドを用いてＲＰＡを実行する工程および高分子量核酸（長さが１００塩基長を超える核酸）に付着した標識の量を測定する工程を含むことができる。例えば、放射性ｄＮＴＰを使用することができ、ＲＰＡ反応の進行は、高分子量ＤＮＡ内への放射線の組み込み後に監視することができる。高分子量ＤＮＡ内へのヌクレオチドの組み込みを監視する技術には、ゲル電気泳動、サイズ排除カラム（例、従来型、スピンおよびプッシュカラム）および酸沈降法が含まれる。
【００２１】
第１核酸プライマーおよび第３の５’プライマーが各々相違する検出可能標識で標識されると、増幅産物（第２二本鎖増幅核酸）は両方の標識を備える唯一の核酸種であろう。この二重標識核酸種は、様々な手段によって検出できる。１つの好ましい方法では、増幅産物は、フローストリップを用いて検出できる。１つの好ましい実施形態では、１つの検出可能標識は１つの色を生成し、第２標識は固定化抗体によって認識されるエピトープである。両方の標識を含有する産物は固定化抗体に付着し、固定化抗体の場所で１つの色を生成するであろう。この検出法に基づくアッセイは、例えば、全ＲＰＡ反応に適用できるフローストリップ（ディップスティック）法であってよい。陽性増幅は、フローストリップ上で１つのバンドを生成するであろうが、陰性増幅はいずれのカラーバンドも生成しないであろう。
【００２２】
３種のプライマーを用いるＲＰＡ増幅プロセスを多重化できる（本明細書では多重ＲＰＡと呼ぶ）ことを留意されたい。すなわち、上記で考察したような３プライマーを用いる多重ＲＰＡプロセスは同一反応（試験管）内で実施できる。多重ＲＰＡは、１つまたは複数の標的核酸を用いて実施できる。各プロセスは、１つまたは複数の標的核酸の相違する領域に対して特異的である第１および第２核酸プライマーの相違する組み合わせを用いて実施される。好ましい実施形態では、多重ＲＰＡプロセスが同一反応内で実施される場合は、各ＲＰＡプロセスは同一標識を備えるが必ずしも同一配列を備えない第１核酸を使用する。さらに、各プロセスは、第２検出可能標識を備える同一の第３伸長ブロック化プライマーを使用する。この方法で、第１検出可能標識および第２検出可能標識の両方を備える二本鎖核酸産物の蓄積を測定することによって、各ＲＰＡプロセスの累積増幅を測定できる。
【００２３】
多重ＲＰＡは、数多くの目的に有用である。例えば、複数の病原体がＰＲＡによって直接増幅するには小さ過ぎる共通核酸配列を共有する可能性がある。さらに、共通核酸配列は各生体内で相違するフランキング配列を有しているので、この共通核酸配列を複数の生体において増幅させる単一セットのＲＰＡプライマーを設計することはできない。上述したような多重ＲＰＡのプロセスを用いると、１つの反応において複数のＲＰＡプライマーの組み合わせを使用することができるが、このとき各組み合わせは１つの生体内で共通核酸配列を増幅させ、この共通核酸配列は付随して共通第３プライマー（第３伸長ブロック化プライマー）によって増幅させられるであろう。複数の病原体を検出するように設計されたプライマー組み合わせを備える多重ＲＰＡは、例えば、各菌株内の共通配列（例、ｍｅｃ２）を増幅かつ検出することによってメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ）菌株を検出するためのアッセイにおいて使用できる。本発明の多重ＲＰＡを使用することによって、同時ＲＰＡ増幅により複数の遺伝子座（ＤＮＡ配列）を検出できる。好ましい実施形態では、少なくとも２つの同時ＲＰＡが１つのＲＰＡ内で実施される。より好ましい実施形態では、少なくとも３つ、少なくとも５つ、少なくとも７つもしくは少なくとも１０のＲＰＡ反応を同一試験管内で実施できる。
【００２４】
そこで、本発明のまた別の態様は、１つの反応において１より多くのＲＰＡプロセスを実施する工程を含むＲＰＡの多重方法に向けられる。各個別反応は、３種のプライマーを用いてＲＰＡについて上述したように実施される。手短には、各反応は、（ａ１）第１、第２および第３核タンパク質プライマーを形成するために、リコンビナーゼ因子を、第１および第２核酸プライマーならびに非相補的もしくは修飾された内部残基を含む第３伸長ブロック化プライマーと接触させる工程と；（ａ２）結果として前記第１核タンパク質プライマーおよび前記第１核タンパク質プライマーの３’末端が前記３’末端間の標的核酸の第３部分を同一標的核酸分子上で相互に向けて方向付けるように、第１および第２核タンパク質プライマーを前記二本鎖標的核酸と接触させ、それにより前記第１鎖の第１部分で前記第１核タンパク質プライマーと前記ＤＮＡの第１鎖との間で第１二本鎖構造を形成
する、および前記第２鎖の第２部分で前記第２核タンパク質プライマーと前記ＤＮＡの第２鎖との間で第２二本鎖構造を形成する工程と；（ａ３）核酸の第３部分を含む内部領域を備える第１増幅された標的核酸を生成するために、１つまたは複数のポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて前記第１核タンパク質プライマーおよび第２核タンパク質プライマーの３’末端を伸長させる工程と；（ａ４）ヌクレアーゼの存在下で前記増幅させた標的核酸の第３部分で第３二本鎖構造を形成するために、前記増幅された標的核酸を前記第３核タンパク質プライマーと接触させる工程であって、このとき前記ヌクレアーゼは、第３の５’プライマーおよび第３の３’伸長ブロック化プライマーを形成するために前記第３二本鎖構造の形成後にのみ前記非相補的もしくは修飾された内部残基を特異的に切断する工程と；（ａ５）前記第１核酸プライマーおよび前記第３の５’プライマーを含む第２二本鎖増幅核酸を生成するために、前記第３の５’プライマーの３’末端を伸長させる工程と；（ａ６）所望の程度の第２二本鎖増幅核酸が達成されるまで（ａ２）〜（ａ５）の繰り返しを通して反応を継続する工程と、を含んでいる。本プロセスでは、各ＲＰＡプロセスは、第１および第２核酸プライマーの相違する組み合わせを用いて実施されるが、各プロセスは同一の第３伸長ブロック化プライマーを用いて実施される。
【００２５】
各ＲＰＡプロセスは第１および第２核酸プライマーの相違する組み合わせを有するであろうが、それでもまだプライマーはＲＰＡプロセス間で共用できることを留意されたい。例えば、ＲＰＡプロセス１はプライマー１および２を使用できるが、ＲＰＡプロセス２はプライマー２および３を使用できる。そこで、ＲＰＡプロセス１およびＲＰＡプロセス２は、同一プライマー（プライマー２）を共用する。
【００２６】
伸長ブロック化プライマー（例、第３伸長ブロック化プライマー）を含む任意のＲＰＡプロセスでは、プライマーは１つまたは複数の検出可能標識をさらに含むことができ、ＲＰＡの進行はこのプライマー上で検出可能標識を監視することによる第２方法で監視できる。検出可能標識は、蛍光体、酵素、クエンチャー、酵素阻害剤、放射性標識、結合対の一方のメンバーおよびそれらの組み合わせであってよい。蛍光体もしくはクエンチャーが使用される場合、その付着は蛍光体−ｄＴアミダイト残基もしくはクエンチャー−ｄＴアミダイト残基によってでよい。
【００２７】
好ましい実施形態では、第３伸長ブロック化プライマーは蛍光体およびクエンチャーを含んでいる。蛍光体とクエンチャーとは、０〜２塩基、０〜５塩基、０〜８塩基もしくは０〜１０塩基、３〜５塩基、６〜８塩基、または８〜１０塩基離れている。さらに、蛍光体とクエンチャーとは、伸長ブロック化プライマーが標的核酸にハイブリダイズする場合よりも伸長ブロック化プライマーがハイブリダイズしない場合の方が長い距離離れていてよい。さらに、蛍光体およびクエンチャーは、蛍光体およびクエンチャーがヌクレアーゼによる修飾された内部残基の切断に続いて分離される限り、非相補的もしくは修飾された内部残基に付着させることができる。好ましい蛍光体には、フルオレセイン、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡが含まれ、好ましいクエンチャーにはダーククエンチャー（例、Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １、Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ２、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １およびＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ２）が含まれる。
【００２８】
このＲＰＡプロセスの方法の１つの長所は、これを例えば１４℃〜２１℃、２１℃〜２５℃、２５℃〜３０℃、３０℃〜３７℃、または４０℃〜４３℃などの低温で実施できる点である。これらの温度条件下では、反応は６％〜８％のＰＥＧなどの１％〜１２％のＰＥＧの存在下において促進される。
【００２９】
本発明の方法のいずれかのために伸長ブロック化プライマーを使用することのまた別の長所は、反応の進行をリアルタイムで監視できる点にある。監視する工程は、例えば、ＲＰＡ反応における蛍光を測定する工程を含んでいてよい。本方法では、蛍光体およびクエ
ンチャーは、クエンチャーが蛍光体からの蛍光を防止するようにプライマー上で十分に近い距離に（本明細書で開示するように１０残基未満離れて）配置される。しかし、第３伸長ブロック化プライマーがヌクレアーゼによって切断されると、クエンチャーは蛍光体から引き離され、プライマーは蛍光性になる。これは、単に蛍光体に蛍光を励起させることができる光源を使用し、光学検出器を用いてクエンチャーから引き離されている蛍光体からの任意の蛍光を検出することによるリアルタイムでのＲＰＡの監視を可能にする。
【００３０】
本開示のＲＰＡ反応のいずれかのための、伸長ブロック化プライマーを含むプライマーは、長さが２〜１００残基、例えば長さが１２〜３０残基、長さが１２〜４０残基、長さが１２〜５０残基、もしくは１２〜６０残基、長さが３０〜４０残基、長さが４０〜４５残基、または長さが４５〜５０残基であってよい。好ましい実施形態では、プライマーは、長さが３０〜１００、３５〜１００、４０〜１００または４５〜１００であってよい。最も好ましい実施形態では、プライマーは、長さが３０〜６０、３５〜６０、４０〜６０または４５〜６０である−これらのプライマーは任意のＲＰＡ反応において使用することができ、３０℃未満、１５℃未満もしくは２０℃未満でのＲＰＡ反応のために特に好ましい。３０を超える、３５を超える、４０を超える、４５を超える、または５０塩基を超えるプライマー長は、３０℃以下で実施されるＲＰＡプロセスのために好ましい。分子生物学の分野においては、核酸のサブユニットは「塩基」もしくは「残基」と呼ばれると理解されている。例えば、ＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドの構造および長さは、塩基（キロベース）、塩基対もしくは残基で言及される。
【００３１】
本発明のＲＰＡ反応のいずれも、１４℃〜２１℃、２１℃〜２５℃、２５℃〜３０℃、３０℃〜３７℃、３８℃から４０℃または４０℃〜４８℃で実施できる。本出願人らは、ＲＰＡ反応が１％〜１２％のＰＥＧの存在下では２５℃で最適であることを見いだした。好ましくは、ＰＥＧの濃度は、例えば７〜８％のように、６〜９％である。これらの最適ＲＰＡ条件は、本出願において開示したＲＰＡ反応および一般にすべてのＲＰＡ反応に適合する。
【００３２】
本発明の典型的なＲＰＡ反応では、標的核酸の少なくとも１本の鎖は少なくとも１０７倍、少なくとも１０８倍または少なくとも１０９倍増幅させられる。
【００３３】
本発明のＲＰＡ方法のいずれについても、標的核酸が一本鎖であってよいことは理解されている。一本鎖核酸は、例えば、ランダムプライマーのハイブリダイゼーションおよびそれに続くポリメラーゼによる伸長を含む、当技術分野において知られている方法によって二本鎖核酸へ転換させることができる。さらに、ＲＰＡ反応は一本鎖標的核酸を用いて直接的に実施できるが、これは第１工程においてＲＰＡプライマーが前記一本鎖標的核酸にハイブリダイズして、（第１伸長ブロック化プライマーの場合にはヌクレアーゼの存在下で）ポリメラーゼによる伸長はその後のＲＰＡのための二本鎖標的核酸を生成するであろうからである。さらに、特異的プライマーは一本鎖標的核酸へハイブリダイズするためにＲＰＡ反応の開始時に加えることができ、そしてＲＰＡ反応内に既に存在するポリメラーゼを用いた伸長によって一本鎖標的核酸を二本鎖標的核酸へ転換させることができる。
【００３４】
バックグラウンドおよび汚染を減少させるためには、本発明のＲＰＡ反応のいずれもｄＮＴＰミックス内のｄＵＴＰを用いて実施できる。本発明者らは、驚くべきことに、ＲＰＡは、ウラシルグリコシラーゼが不活性化される前に第１期間の間はｄＵＴＰおよび活性ウラシルグリコシラーゼの存在下で実施できることを見いだした。この第１期間は、好ましくは２０分間未満、１０分間未満、５分間未満または２分間未満である。さらに、ウラシルグリコシラーゼは、第１期間中の任意の時点に加えることができる。すなわち、ＲＰＡ反応はウラシルグリコシラーゼを用いずにｄＵＴＰ（およびその他のｄＮＴＰ）を用いて開始することができ、ウラシルグリコシラーゼは第１期間中の任意の時点に加えること
ができる。
【００３５】
第１期間の後に、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤がＲＰＡ反応に加えられ、残りのＲＰＡ反応のために−所望の程度の増幅が達成されるまで、この反応は継続させられる。重要なことに、このプロセスはウラシルグリコシラーゼの温度に基づく不活性化を伴わずに実施される。この反応におけるウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ファージＰＢＳ１ウラシルグリコシラーゼ阻害剤もしくは枯草菌ファージＰＢＳ２ウラシルグリコシラーゼ阻害剤であってよい。ｄＵＴＰが使用される場合は、本開示の任意のＲＰＡに対して、ｄＮＴＰは、（１）ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰまたは（２）ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰから構成されてよい。好ましい実施形態では、ｄＵＴＰが使用される場合は、ｄＮＴＰ混合物はｄＴＴＰを含有していない。ｄＵＴＰおよびウラシルグリコシラーゼをＲＰＡ反応の第１部分に加えることによるこのバックグラウンドを減少させる方法は、任意のタイプのＲＰＡへの一般的適合可能性を有している。さらに、本方法は、本発明のＲＰＡプロセスのいずれかと組み合わせることができる。
【００３６】
本発明のまた別の態様は、増加したシグナル対ノイズ比を備えるＤＮＡの第１および第２鎖を含む二本鎖標的核酸分子のＲＰＡを実施する方法に関する。工程Ａでは、第１および第２核タンパク質プライマーを形成するために、リコンビナーゼ因子が（１）修飾された内部残基であってよい１つまたは複数の非相補的もしくは修飾された内部残基を含む第１伸長ブロック化プライマー、および（２）第２核酸プライマーと接触させられる。
【００３７】
工程Ｂでは、結果として前記第１鎖の第１部分で第１核タンパク質プライマーおよび前記ＤＮＡの第１鎖との間で第１二本鎖構造（第１Ｄループの部分）が形成されるように、第１および第２核タンパク質プライマーはヌクレアーゼおよび二本鎖標的核酸と混合される（接触させられる）。さらに、前記第２鎖の第２部分で前記第２核タンパク質プライマーおよび前記ＤＮＡの第２鎖との間で第２二本鎖構造（第２Ｄループの一部）もまた形成される。第１伸長ブロック化プライマーおよび前記第２核酸プライマーの３’末端は、同一の二本鎖標的核酸分子上で相互に向けて方向付けられる。ヌクレアーゼは、プライマーが二本鎖構造を形成した後にのみ、第１伸長ブロック化プライマー内の１つまたは複数の非相補的もしくは修飾された内部残基を特異的に認識して切断する。ヌクレアーゼによる切断後、第１伸長ブロック化プライマーは、第１の５’プライマーおよび第１の３’伸長ブロック化プライマーの２種のプライマーに切断される。ブロック基は第１伸長ブロック化プライマーの３’末端上に存在するので、第１の５’プライマーはブロックされないが第１の３’伸長ブロック化プライマーはブロックされてポリメラーゼによって伸長させることはできない。
【００３８】
工程Ｃでは、増幅された標的核酸を生成するために、第１の５’プライマーおよび第２核タンパク質プライマーの３’末端は１つまたは複数のポリメラーゼおよびｄＮＴＰ（例、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰの混合物）を用いて伸長させられる。増幅された標的核酸は一本鎖（例えば置換された鎖）または二本鎖であってよい。さらに、一本鎖増幅された標的核酸は、ハイブリダイズして二本鎖標的核酸を形成できる。さらに、本開示のＲＰＡ系は、一本鎖増幅された標的核酸（以下で考察する）または二本鎖標的核酸のどちらも増幅させることができるので、一本鎖もしくは二本鎖増幅された標的核酸の産生はＲＰＡの転帰に影響を及ぼさないであろう。
【００３９】
工程Ｂおよび工程Ｃは、所望の程度の増幅が達成されるまで繰り返される。ＲＰＡ反応は、試薬が消費し尽くされない限り、無際限に持続し続ける。１ラウンドの増幅の産物（増幅された標的核酸）は、ＲＰＡのその後のラウンドのためのインプットとして機能する。そこで、ＲＰＡ反応は、所望温度で反応液のインキュベーションを単に継続することに
よって継続することができる。さらに、本明細書に開示したＲＰＡ反応は温度感受性ではないので、この反応は温度変動がある場合でさえ継続することができる。例えば、ＲＰＡ反応試験管は、水浴中で、卓上で（室温）、または実験担当者のポケット内（例えば、現場で作業する場合）でさえ実施できる。そこで、ＲＰＡ反応は、５０℃未満、４０℃未満、３７℃未満、３０℃未満、２５℃未満、または２０℃未満で実施できる。
【００４０】
好ましい実施形態では、第１伸長ブロック化プライマーは、１つまたは複数の検出可能標識をさらに含んでいる。検出可能標識が蛍光体もしくはクエンチャーである場合、それは各々蛍光体−ｄＴアミダイト残基もしくはクエンチャー−ｄＴアミダイト残基によって伸長ブロック化プライマーへ付着させることができる。その他の付着もまた可能であり、広範囲に知られている。
【００４１】
また別の好ましい実施形態では、伸長ブロック化プライマーは、蛍光体およびクエンチャーの両方を含んでいる。蛍光体とクエンチャーとは、０〜２塩基、０〜５塩基、０〜８塩基または０〜１０塩基離れていてよい。当然ながら、蛍光体とクエンチャーとは、それらが引き離されるまではこの組み合わせが蛍光性ではないように十分に相互に近いことが好ましい。蛍光体とクエンチャーとは、プライマーが標的核酸にハイブリダイズする場合よりも核タンパク質プライマー内で長い距離離れているのが好ましい。これは、付着したタンパク質（リコンビナーゼおよび／またはＳＳＢタンパク質）の作用がハイブリダイズしていないプライマーから伸長する傾向を示すために可能である。
【００４２】
また別の態様では、蛍光体もしくはクエンチャーのいずれかを修飾された内部残基に付着させることができ、蛍光体とクエンチャーとは、ヌクレアーゼによる修飾された内部残基の切断後に引き離すことができる。
【００４３】
本発明の方法のためには任意の蛍光体が機能できるが、フルオレセイン、ＦＡＭおよびＴＡＭＲＡが好ましい蛍光体である。好ましいクエンチャーは、例えば、Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １、Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ２、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １もしくはＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ２であってよいダーククエンチャーである。
【００４４】
本発明のまた別の態様は：（ａ）第１および第２鎖を含む二本鎖標的核酸分子を生成するために、第１核酸プライマーを前記一本鎖標的核酸へハイブリダイズさせ、１つまたは複数のポリメラーゼおよびｄＮＴＰによって前記プライマーを伸長させる工程と；（ｂ）第１および第２核タンパク質プライマーを形成するために、リコンビナーゼ因子を、非相補的内部残基を含む第１伸長ブロック化プライマー、および第２核酸プライマーと接触させる工程と；（ｃ）結果として前記第１伸長ブロック化プライマーおよび前記第２核酸プライマーの３’末端を同一の二本鎖標的核酸分子上で相互に向けて方向付けるように、第１および第２核タンパク質プライマーをヌクレアーゼおよび前記二本鎖標的核酸と接触させ、それにより前記第１鎖の第１部分で前記第１核タンパク質プライマーと前記ＤＮＡの第１鎖との間の第１二本鎖構造および前記第２鎖の第２部分で前記第２核タンパク質プライマーと前記ＤＮＡの第２鎖との間の第２二本鎖構造を形成する工程であって、このとき前記ヌクレアーゼは、第１の５’プライマーおよび第１の３’伸長ブロック化プライマーを形成するために、前記第１二本鎖構造が形成された後にのみ前記修飾された非相補的内部残基を特異的に切断する工程と；（ｄ）増幅された標的核酸分子を生成するために、１つまたは複数のポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて前記第１の５’プライマーおよび第２核タンパク質プライマーの３’末端を伸長させる工程と；（ｅ）所望の程度の増幅が達成されるまで、（ｃ）および（ｄ）の繰り返しを通して反応を継続する工程と、を含む一本鎖標的核酸分子をＤＮＡ増幅させるＲＰＡプロセスに向けられる。上記で説明したように、第１核酸プライマーは第１伸長ブロック化プライマー、前記第２核酸プライマー、第
１核タンパク質プライマーまたは第２核タンパク質プライマーであってよい。当然ながら、第１プライマーが第１伸長ブロック化プライマーである場合は、工程（ａ）はヌクレアーゼの存在下で実施されなければならない。さらに、出発物質として一本鎖核酸標的ＤＮＡを使用する任意のＲＰＡ反応は、標的核酸が二本鎖であり二本鎖増幅によって増幅させられるであろう中間段階を必然的に経由することに留意されたい。
【００４５】
本発明のまた別の態様は、長さが１２〜１００残基の伸長ブロック化プライマーであるＲＰＡのためのプライマーに向けられるが、このときこのプライマーは１つまたは複数の修飾された内部残基を含んでいる。このプライマーは、本出願のいずれかで記載された、それらの任意の変種を含む伸長ブロック化プライマーのいずれかであってよい。手短には、修飾された内部残基は、ウラシル残基、イノシン残基、８−オキソグアニン、チミングリコール、無塩基性部位模擬体およびそれらのアナログからなる群から選択される。無塩基性部位模擬体は、テトラヒドロフラン残基もしくは５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−１’，２’−ジデオキシリボース−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイト（一般には「Ｄ−スペーサー」として知られる）およびそれらのアナログであってよい。
【００４６】
プライマーは伸長ブロック化されており、ポリメラーゼ（例、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）およびｄＮＴＰによって伸長させることができない。プライマーを伸長からブロックする方法は知られており、本開示においてもまた記載されている。手短には、プライマーはブロック化３’残基を有していてよい。ブロック化３’残基は、ブロック部分であってよい。任意で検出可能標識を含んでいてよいブロック部分は、プライマーの３’最末端の２’もしくは３’部位に付着させることができる。例えば、ブロック化３’残基は、２’３’−ジデオキシヌクレオチドであってよい。
【００４７】
また別の実施形態では、プライマーは、１つまたは複数の検出可能標識を含んでいる。検出可能標識は、蛍光体、酵素、クエンチャー、酵素阻害剤、放射性標識、結合対の一方のメンバーおよびそれらの組み合わせであってよい。より好ましい実施形態では、プライマーは蛍光体およびクエンチャーの両方を含んでいる。クエンチャーは、蛍光体の蛍光を抑制するために蛍光体に接近していてよい。例えば、蛍光体とクエンチャーとの間隔は、０〜２塩基、０〜５塩基、０〜８塩基、０〜１０塩基、３〜５塩基、６〜８塩基、および８〜１０塩基であってよい。好ましい実施形態では、蛍光体とクエンチャーとは、伸長ブロック化プライマーが標的核酸にハイブリダイズする場合よりも伸長ブロック化プライマーがハイブリダイズしない（しかしリコンビナーゼおよび／または一本鎖結合タンパク質に付着している）場合の方が長い距離離れている。蛍光体およびクエンチャーは、本開示に記載した蛍光体のいずれかである蛍光体およびクエンチャーを含むがそれらに限定されない、一緒に作用することが知られている任意の蛍光体およびクエンチャーであってよい。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
ＤＮＡの第１鎖および第２鎖を含む標的核酸分子をＤＮＡ増幅させるＲＰＡプロセスであって：
（ａ）リコンビナーゼ因子を第１核酸プライマーおよび第２核酸プライマーならびに１つまたは複数の非相補的もしくは修飾された内部残基を含む第３伸長ブロック化プライマーと接触させて、第１核タンパク質プライマー、第２核タンパク質プライマーおよび第３核タンパク質プライマーを形成させる工程と；
（ｂ）該第１核タンパク質プライマーおよび該第２核タンパク質プライマーを該二本鎖標的核酸と接触させ、それにより、該第１核タンパク質プライマーと該ＤＮＡの第１鎖の第１部分の該第１鎖との間で第１二本鎖構造を形成させ、そして該第２核タンパク質プライマーと該ＤＮＡの第２鎖の第２部分の該第２鎖との間で第２二本鎖構造を形成させ、そ
の結果、該第１核タンパク質プライマーおよび該第１核タンパク質プライマーの３’末端が、該３’末端間に標的核酸の第３部分を有して同一標的核酸分子上で相互に向けて方向付けられる工程と；
（ｃ）１つまたは複数のポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて該第１核タンパク質プライマーおよび該第２核タンパク質プライマーの３’末端を伸長させて、該核酸の第３部分を含む内部領域を備える第１の増幅された標的核酸を生成する工程と；
（ｄ）該増幅された標的核酸を該第３核タンパク質プライマーと接触させて、ヌクレアーゼの存在下で該増幅させた標的核酸の第３部分で第３二本鎖構造を形成する工程であって：このとき該ヌクレアーゼは、該第３二本鎖構造の形成後にのみ該非相補的内部残基を特異的に切断して、第３の５’プライマーおよび第３の３’伸長ブロック化プライマーを形成する工程と；
（ｅ）１つまたは複数のポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて該第３の５’プライマーの３’末端を伸長させて、該第１核酸プライマーおよび該第３の５’プライマーを含む第２二本鎖増幅核酸を生成する工程と；
（ｆ）所望の程度の第２二本鎖増幅核酸が達成されるまで、（ｂ）と（ｅ）とを繰り返して反応を継続する工程と、を含むプロセス。
（項目２）
前記第１二本鎖構造は第１Ｄループの一部であり、前記第２二本鎖構造は第２Ｄループの一部である、項目１に記載のプロセス。
（項目３）
前記ヌクレアーゼは、ＤＮＡグリコシラーゼもしくはＡＰエンドヌクレアーゼである、項目１に記載のプロセス。
（項目４）
前記修飾された内部残基は、ウラシル残基もしくはイノシン残基である、項目１に記載のプロセス。
（項目５）
前記ヌクレアーゼは前記ウラシル残基もしくは前記イノシン残基を認識し、前記第３伸長ブロック化プライマーを該ウラシル残基もしくは該イノシン残基において切断する、項目４に記載のプロセス。
（項目６）
前記ヌクレアーゼは前記第３伸長ブロック化プライマーの非相補的塩基と前記標的核酸との間の塩基ミスマッチを認識し、該第３伸長ブロック化プライマーを該非相補的塩基において切断する、項目１に記載のプロセス。
（項目７）
前記ヌクレアーゼは、ｆｐｇ、Ｎｔｈ、ＭｕｔＹ、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＭ、大腸菌ＭＵＧ、ヒトＭＵＧ、ヒトＯｇｇ１、脊椎動物Ｎｅｉ様（Ｎｅｉｌ）グリコシラーゼ、ウラシルグリコシラーゼ、ヒポキサンチン−ＤＮＡグリコシラーゼならびにそれらの機能的アナログからなる群から選択される、項目１に記載のプロセス。
（項目８）
前記ヌクレアーゼは大腸菌Ｎｆｏもしくは大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩであり、前記修飾された残基はテトラヒドロフラン残基もしくは炭素リンカーである、項目１に記載のプロセス。
（項目９）
前記修飾された内部塩基は、８−オキソグアニン、チミングリコール、無塩基性部位模擬体からなる群から選択される、項目１に記載のプロセス。
（項目１０）
前記無塩基性部位模擬体は、テトラヒドロフラン残基またはＤ−スペーサーである、項目９に記載のプロセス。
（項目１１）
前記第３伸長ブロック化プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長に抵抗性である
ブロック化３’残基を含む、項目１に記載のプロセス。
（項目１２）
前記ブロック化３’残基は、ポリメラーゼによる前記プライマーの伸長を防止するブロック部分を含む、項目１１に記載のプロセス。
（項目１３）
前記ブロック部分は、３’残基の糖の３’部位または２’部位に付着させられる、項目１２に記載のプロセス。
（項目１４）
前記ブロック部分は、検出可能標識である、項目１２に記載のプロセス。
（項目１５）
前記検出可能標識は、蛍光体、酵素、クエンチャー、酵素阻害剤、放射性標識、結合対の一方のメンバーおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目１４に記載のプロセス。
（項目１６）
前記ブロック化３’残基は、ジデオキシヌクレオチドである、項目１１に記載のプロセス。
（項目１７）
前記第１核酸プライマーは第１検出可能標識を含み、前記第３伸長ブロック化プライマーは第２検出可能標識を含む、項目１に記載のプロセス。
（項目１８）
前記第１検出可能標識と前記第２検出可能標識とは相違しており、前記第２二本鎖増幅核酸の産生は、単一の二本鎖ＤＮＡ分子上の該第１検出可能標識および該第２検出可能標識の存在を検出することによって監視される、項目１７に記載のプロセス。
（項目１９）
前記第２二本鎖増幅核酸の産生は、第１抗体が前記第１検出可能標識に結合し、第２抗体が前記第２検出可能標識に結合するサンドイッチアッセイによって検出される、項目１８に記載のプロセス。
（項目２０）
前記第３伸長ブロック化プライマーは１つまたは複数の検出可能標識をさらに含む、項目１に記載のプロセス。
（項目２１）
前記プロセスは、前記第３伸長ブロック化プライマー上の前記検出可能標識を検出することによってＲＰＡ反応の進行を監視する工程をさらに含む、項目２０に記載のプロセス。
（項目２２）
前記検出可能標識は、蛍光体、酵素、クエンチャー、酵素阻害剤、放射性標識、結合対の一方のメンバーおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目２０に記載のプロセス。
（項目２３）
前記蛍光体は、蛍光体−ｄＴアミダイト残基によって前記第３伸長ブロック化プライマーに付着させられる、項目２２に記載のプロセス。
（項目２４）
前記クエンチャーは、クエンチャー−ｄＴアミダイト残基によって前記第３伸長ブロック化プライマーに付着させられる、項目２２に記載のプロセス。
（項目２５）
前記第３伸長ブロック化プライマーは蛍光体およびクエンチャーを含む、項目２２に記載のプロセス。
（項目２６）
前記蛍光体と前記クエンチャーとは０〜２塩基離れている、項目２５に記載のプロセス。
（項目２７）
前記蛍光体と前記クエンチャーとは０〜５塩基離れている、項目２５に記載のプロセス。
（項目２８）
前記蛍光体と前記クエンチャーとは０〜８塩基離れている、項目２５に記載のプロセス。
（項目２９）
前記蛍光体と前記クエンチャーとは０〜１０塩基離れている、項目２５に記載のプロセス。
（項目３０）
前記蛍光体と前記クエンチャーとは、前記伸長ブロック化プライマーが前記標的核酸にハイブリダイズする場合よりも、該伸長ブロック化プライマーがハイブリダイズしない場合の方が長い距離離れている、項目２５に記載のプロセス。
（項目３１）
前記蛍光体または前記クエンチャーは、非相補的もしくは修飾された内部残基に付着させられ、該蛍光体および該クエンチャーは、前記ヌクレアーゼによる修飾された内部残基の切断に続いて分離される、項目２５に記載のプロセス。
（項目３２）
前記蛍光体は、フルオレセイン、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡの群から選択される、項目２５に記載のプロセス。
（項目３３）
前記クエンチャーはダーククエンチャーである、項目２５に記載のプロセス。
（項目３４）
前記ダーククエンチャーは、Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １、Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ２、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １およびＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ
Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ２からなる群から選択される、項目３３に記載のプロセス。
（項目３５）
前記第１プライマー、前記第２プライマーもしくは前記第３伸長ブロック化プライマーは、長さが１２〜３０残基である、項目１に記載のプロセス。
（項目３６）
前記第１プライマー、前記第２プライマーもしくは前記第３伸長ブロック化プライマーは、長さが１２〜４０残基である、項目１に記載のプロセス。
（項目３７）
前記第１プライマー、前記第２プライマーもしくは前記第３伸長ブロック化プライマーは、長さが１２〜６０残基である、項目１に記載のプロセス。
（項目３８）
前記プロセスは、１４℃〜２１℃の温度で実施される、項目１に記載のプロセス。
（項目３９）
前記プロセスは、２１℃〜２５℃の温度で実施される、項目１に記載のプロセス。
（項目４０）
前記プロセスは、２５℃〜３０℃の温度で実施される、項目１に記載のプロセス。
（項目４１）
前記プロセスは、３０℃〜３７℃の温度で実施される、項目１に記載のプロセス。
（項目４２）
前記プロセスは、４０℃〜４３℃の温度で実施される、項目１に記載のプロセス。
（項目４３）
前記プロセスは、前記標的核酸の少なくとも第３部分を少なくとも１０７倍増幅させる、項目１に記載のプロセス。
（項目４４）
前記プロセスは、１％〜１２％のＰＥＧの存在下で実施される、項目１に記載のプロセ
ス。
（項目４５）
前記プロセスは、６％〜８％のＰＥＧの存在下で実施される、項目１に記載のプロセス。
（項目４６）
前記ｄＮＴＰはｄＵＴＰを含み、前記ＲＰＡプロセスは２０分間未満の第１期間にわたりウラシルグリコシラーゼの存在下で実施され、該プロセスは該第１期間後にウラシルグリコシラーゼ阻害剤の存在下で実施される、項目１に記載のプロセス。
（項目４７）
前記プロセスは、前記ウラシルグリコシラーゼの温度に基づく不活性化を伴わずに実施される、項目４６に記載のプロセス。
（項目４８）
前記ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、枯草菌ファージＰＢＳ１ウラシルグリコシラーゼ阻害剤または枯草菌ファージＰＢＳ２ウラシルグリコシラーゼ阻害剤である、項目４６に記載のプロセス。
（項目４９）
前記ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰからなる、項目４６に記載のプロセス。
（項目５０）
前記ｄＮＴＰはｄＴＴＰを含有していない、項目４６に記載のプロセス。
（項目５１）
１つの反応において１つまたは複数の二本鎖標的核酸上で１より多くのＲＰＡプロセスを実施する工程を含むＲＰＡの多重プロセスであって、各プロセスが以下の工程：
（ａ）リコンビナーゼ因子を第１核酸プライマーおよび第２核酸プライマーならびに１つまたは複数の非相補的もしくは修飾された内部残基を含む第３伸長ブロック化プライマーと接触させて、第１核タンパク質プライマー、第２核タンパク質プライマーおよび第３核タンパク質プライマーを形成させる工程と；
（ｂ）該第１核タンパク質プライマーおよび該第２核タンパク質プライマーを該二本鎖標的核酸と接触させ、それにより、該第１核タンパク質プライマーと該ＤＮＡの第１鎖の第１部分の該第１鎖との間で第１二本鎖構造を形成させ、そして該第２核タンパク質プライマーと該ＤＮＡの第２鎖の第２部分の該第２鎖との間で第２二本鎖構造を形成させ、その結果、該第１核タンパク質プライマーおよび該第１核タンパク質プライマーの３’末端が、該３’末端間に標的核酸の第３部分を有して同一標的核酸分子上で相互に向けて方向付けられる工程と；
（ｃ）１つまたは複数のポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて該第１核タンパク質プライマーおよび該第２核タンパク質プライマーの３’末端を伸長させて、該核酸の第３部分を含む内部領域を備える第１増幅された標的核酸を生成する工程と；
（ｄ）該増幅された標的核酸を該第３核タンパク質プライマーと接触させて、ヌクレアーゼの存在下で該増幅させた標的核酸の第３部分で第３二本鎖構造を形成する工程であって：このとき該ヌクレアーゼは、該第３二本鎖構造の形成後にのみ該非相補的内部残基を特異的に切断して、第３の５’プライマーおよび第３の３’伸長ブロック化プライマーを形成する工程と；
（ｅ）１つまたは複数のポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて該第３の５’プライマーの３’末端を伸長させて、該第１核酸プライマーおよび該第３の５’プライマーを含む第２二本鎖増幅核酸を生成する工程と；
（ｆ）所望の程度の第２二本鎖増幅核酸が達成されるまで、（ｂ）と（ｅ）とを繰り返して反応を継続する工程と；を含み、
このとき各ＲＰＡプロセスは、該第１核酸プライマーおよび該第２核酸プライマーの相違する組み合わせを用いて実施され、各プロセスは同一の第３伸長ブロック化プライマーを用いて実施されるプロセス。
（項目５２）
前記１より多くのＲＰＡプロセスは、少なくとも２つの別個のＲＰＡプロセスを含む、項目５１に記載のプロセス。
（項目５３）
前記１より多くのＲＰＡプロセスは、少なくとも４つの別個のＲＰＡプロセスを含む、項目５１に記載のプロセス。
（項目５４）
前記１より多くのＲＰＡプロセスは、少なくとも５つの別個のＲＰＡプロセスを含む、項目５１に記載のプロセス。
（項目５５）
前記１より多くのＲＰＡプロセスは、少なくとも７つの別個のＲＰＡプロセスを含む、項目５１に記載のプロセス。
（項目５６）
前記１より多くのＲＰＡプロセスは、少なくとも１０の別個のＲＰＡプロセスを含む、項目５１に記載のプロセス。
（項目５７）
前記修飾された内部残基は、ウラシル残基またはイノシン残基である、項目５１に記載のプロセス。
（項目５８）
前記第２二本鎖増幅核酸の形成を検出して、前記１より多くのＲＰＡプロセスのいずれかの累積増幅を決定する工程をさらに含む、項目５１に記載のプロセス。
（項目５９）
各ＲＰＡプロセスの前記第１核酸プライマーは同一の第１検出可能標識で標識され、前記第３伸長ブロック化プライマーは第２検出可能標識で標識され、および前記検出する工程は該第１検出可能標識および該第２検出可能標識の両方を含む二本鎖核酸を検出する工程を含む、項目５１に記載のプロセス。
（項目６０）
前記第２二本鎖増幅核酸の産生は、第１抗体が前記第１検出可能標識に結合し、第２抗体が前記第２検出可能標識に結合するサンドイッチアッセイによって検出される、項目５９に記載のプロセス。
（項目６１）
前記ヌクレアーゼはＤＮＡグリコシラーゼもしくはＡＰエンドヌクレアーゼである、項目５１に記載のプロセス。
（項目６２）
前記ヌクレアーゼは前記第３伸長ブロック化プライマーの非相補的塩基と前記標的核酸との間の塩基ミスマッチを認識し、該第３伸長ブロック化プライマーを該非相補的塩基で切断する、項目５１に記載のプロセス。
（項目６３）
前記ヌクレアーゼは、ｆｐｇ、Ｎｔｈ、ＭｕｔＹ、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＭ、大腸菌ＭＵＧ、ヒトＭＵＧ、ヒトＯｇｇ１、脊椎動物Ｎｅｉ様（Ｎｅｉｌ）グリコシラーゼ、ウラシルグリコシラーゼ、ヒポキサンチン−ＤＮＡグリコシラーゼならびにそれらの機能的アナログからなる群から選択される、項目５１に記載のプロセス。
（項目６４）
前記ヌクレアーゼは大腸菌Ｎｆｏもしくは大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩであり、前記修飾された残基はテトラヒドロフラン残基もしくは炭素リンカーである、項目５１に記載のプロセス。
（項目６５）
前記修飾された内部塩基は、８−オキソグアニン、チミングリコール、または無塩基性部位模擬体からなる群から選択される、項目５１に記載のプロセス。
（項目６６）
前記無塩基性部位模擬体は、テトラヒドロフラン残基またはＤ−スペーサーである、項目６５に記載のプロセス。
（項目６７）
前記無塩基性部位模擬体は、テトラヒドロフラン残基またはＤ−スペーサーである、項目６６に記載のプロセス。
（項目６８）
前記第３伸長ブロック化プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長に抵抗性であるブロック化３’残基を含む、項目５１に記載のプロセス。
（項目６９）
前記ブロック化３’残基は、ポリメラーゼによる前記プライマーの伸長を防止するブロック部分を含む、項目６８に記載のプロセス。
（項目７０）
前記ブロック部分は、３’残基の糖の３’部位または２’部位に付着させられる、項目６９に記載のプロセス。
（項目７１）
前記ブロック化３’残基は、ジデオキシヌクレオチドである、項目７０に記載のプロセス。
（項目７２）
ＤＮＡの第１鎖および第２鎖を含む二本鎖標的核酸分子をＤＮＡ増幅させるＲＰＡプロセスであって、以下の工程：
（ａ）リコンビナーゼ因子を第１核酸プライマーおよび第２核酸プライマーと接触させて、第１核タンパク質プライマーおよび第２核タンパク質プライマーを形成させる工程と；
（ｂ）該第１核タンパク質プライマーおよび該第２核タンパク質プライマーを該二本鎖標的核酸と接触させ、それにより、該第１核タンパク質プライマーと該ＤＮＡの第１鎖の第１部分の該第１鎖との間で第１二本鎖構造を形成させ、そして該第２核タンパク質プライマーと該ＤＮＡの第２鎖の第２部分の該第２鎖との間で第２二本鎖構造を形成させ、その結果、該第１核タンパク質プライマーおよび該第２核タンパク質プライマーの３’末端が、同一の二本鎖標的核酸分子上で相互に向けて方向付けられる工程と；
（ｃ）１つまたは複数のポリメラーゼならびにｄＮＴＰおよびｄＵＴＰを用いて該第１核タンパク質プライマーおよび第２核タンパク質プライマーの３’末端を伸長させて、増幅された標的核酸分子を生成する工程と；
（ｄ）ウラシルグリコシラーゼの存在下で２０分間以内の第１期間にわたり（ｂ）および（ｃ）を繰り返すことで反応を継続する工程と；
（ｅ）所望の程度の増幅が達成されるまで、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤の存在下で、（ｂ）および（ｃ）の繰り返しを通して反応を継続する工程と、を含むプロセス。
（項目７３）
前記第１期間は１０分間以内である、項目７２に記載のプロセス。
（項目７４）
前記第１期間は５分間以内である、項目７２に記載のプロセス。
（項目７５）
前記第１期間は２分間以内である、項目７２に記載のプロセス。
（項目７６）
前記ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、枯草菌ファージＰＢＳ１ウラシルグリコシラーゼ阻害剤または枯草菌ファージＰＢＳ２ウラシルグリコシラーゼ阻害剤である、項目７２に記載のプロセス。
（項目７７）
前記ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰからなる、項目７２に記載のプロセス。
（項目７８）
前記ｄＮＴＰはｄＴＴＰを含有していない、項目７２に記載のプロセス。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ゲノム遺伝子座を標的とするプライマーの場合に、プライマーを伸長させると反応動態が加速されることを示している実験データを示した図である。
【図２】２５℃、２３℃、２０℃、および１７℃で臭化エチジウムを用いて、ＤＮＡをゲル検出可能標識へ増幅させるのに成功するのは長い（４５マー）および迅速なプライマーだけであることを示している実験結果の図である。
【図３】２５℃での増幅動態が３７℃での速度のほぼ半分であることを示した図である。この図はさらに、ＰＥＧレベルが速度および特異性（ＰＥＧ濃度が高くなるとプライマーのアーチファクトが増加する）の両方に影響を及ぼすことも示している。
【図４】ヒトアポリポタンパク質Ｂ遺伝子座のためのプライマーであるＡｐｏＢ４およびＡｐｏ３００は、長さが各々３３および３２残基である場合にしか迅速な動態を示さず、反応動態（３７℃で）は鎖延長によって加速されないことを示している。
【図５】ヒトアポリポタンパク質Ｂ遺伝子座のためのプライマーであるＡｐｏＢ４およびＡｐｏ３００は、３’末端が伸長しているかどうかとは無関係に、２５℃で増幅を示すことを示した図である。
【図６】枯草菌ファージ由来のＵＮＧ阻害剤ペプチドは、ＵＮＧの熱変性の必要を回避する繰り越し汚染系のために大腸菌ＵＮＧと組み合わせて使用できることを示した図である。
【図７】（ａ）ＦＡＭ蛍光体、（ｂ）ディープダーククエンチャー、（ｃ）無塩基性部位模擬体、および（ｄ）ブロック化３’末端を含むリアルタイム検出プローブが特異的産物蓄積を監視するためにＲＰＡ反応における極めて優れた特性を提供することを示している実験データの図である。
【図８】第３プローブ検出系の開発を示した図である。蛍光データは、標準化のプロセスおよび蛍光の対数をプロットすることを通して最適に解釈できる可能性がある。
【図９】サンドイッチアッセイのために高いシグナル対ノイズ比を入手するための可逆的ブロック化プライマーを示した図である。Ｎｆｏ酵素によって分割された後にのみ活性であるブロック化された分割可能なプローブを用いて構成されたＲＰＡ反応は、ラテラルフロー試験ストリップ上で直接的に分析できる。
【図１０】院内スーパーバグＭＲＳＡのための二重プローブ増幅／検出系の開発を示している実験結果の図である。
【図１１】コントロールＭＳＳＡ  ＤＮＡ配列のプローブをベースとするリアルタイム検出を示した図である。
【図１２】ＲＰＡプロセスの略図である。
【図１３】フローストリップ上に２種の抗原性標識を含有する複合体を固定化して検出するための特異的抗体の使用を示した図である。
【図１４】ヒトＳｒｙ遺伝子座のためのプライマーを用いたＲＰＡ反応のポリアクリルアミドゲル電気泳動を示した図である。
【図１５】ヒトアポリポタンパク質Ｂ遺伝子座のためのプライマーを用いたＲＰＡ反応のアガロースゲル電気泳動を示した図である。
【図１６】ＲＰＡを支持するために必要な最小オリゴヌクレオチドサイズの調査を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
（発明の詳細な説明）
ＲＰＡでは、特異的ＤＮＡフラグメントの等温増幅は、対向オリゴヌクレオチドプライマーをテンプレートＤＮＡに結合させ、ポリメラーゼによるそれらの伸長によって達成される（図１Ａ）。標的テンプレートの包括的融解を必要とするＰＣＲとは相違して、ＲＰ
Ａは、二本鎖ＤＮＡを走査して同族部位での鎖交換を促進するためにリコンビナーゼ−プライマー複合体を使用する。生じた構造は、置換されたテンプレート鎖と相互作用し、それによって分子鎖移動によるプライマーの放出を防止する一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）によって安定化させられる。リコンビナーゼは、この場合には枯草菌の大きなフラグメントＰｏｌｌ（Ｂｓｕ）（Ｏｋａｚａｋｉら、１９６４を参照）であるＤＮＡポリメラーゼを置換する鎖へ接近可能なオリゴヌクレオチドの３’末端を分解して残し、そしてこれにプライマー伸長が続く。指数関数的増幅は、このプロセスの周期的反復によって遂行される。
【００５０】
本開示では、本発明者らは、基本的ＲＰＡプロセスより優れた数多くの改善を証明した。第１に、本発明者らは、標準条件を修飾すると、ＲＰＡは２５℃もしくは３０℃で効率的に実施できることを見いだした。これらの反応温度は、１時間未満で結果の得られる、装置を使用しないＲＰＡ試験を可能にする。
【００５１】
第２に、本発明者らは、ＲＰＡ反応においてＤＮＡ修復酵素を使用することによってＲＰＡ反応の感受性および特異性を向上させた。本試験では、本発明者らは、これらの酵素がＲＰＡの効率および忠実性に影響を及ぼすかどうかを判断するために、ＲＰＡ反応において広範囲の以前に同定された修復酵素を直接的に使用した。本発明者らは、プライマーのアーチファクトは、ＲＰＡにおいては主として、プライマーによって形成された短命ヘアピン構造の異常な伸長によって、またはおそらくプライマーダイマーを形成することによって発生するという仮説を立てている（２００５年４月１１日に提出されたＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００１５６０）。そのようなイベントはおそらくまれではあろうが、典型的には約１０１２〜１０１３分子である反応内でのオリゴヌクレオチドの高濃度は、標的テンプレート核酸（すなわち増幅対象の核酸）の濃度が低い場合には有意な程度のそのようなイベントを促進する傾向を示すであろう。これらの副反応は、限定数の３’残基だけがサンプルＤＮＡの部分と相同であるハイブリダイゼーション産物からの伸長の低忠実度に起因して、あまり関連していない配列が複合ＤＮＡサンプルから増幅されるＰＣＲにおいてしばしば報告される副反応とは本質的には相違していることに留意されたい。ＲＰＡでは、本発明者らは、主要なリコンビナーゼ媒介性対合には有意な領域にわたり有意な相同性を必要とすること、そしてむしろ一本鎖ＤＮＡは使用された相当に低い温度で発生するスナップバックイベントを通してアーチファクトへ主として感受性である種であると考えている。この違いのために、ＰＣＲにおいてプライマーのアーチファクトを減少させる方法は、ＲＰＡ反応では必ずしも機能しない。この違いは、任意の標的核酸の不在下でさえこの系で生成されたバックグラウンドノイズを減少させるために以下で説明するアプローチおよびメカニズム、ならびに競合的プライマーノイズを減少させることによりこれが感受性を増加させる方法を理解するために重要である。
【００５２】
本発明者らは、本明細書において、３’−ブロック基（ビオチン、ｄｄＣ残基、またはその他）を用いて意図的に修飾された、そして大まかに中心に位置する修飾された（もしくは不在の）塩基を含有するプライマーの使用を開示する。内部に配置された修飾は修復エンドヌクレアーゼ酵素にとってヌクレアーゼ標的となったが、これは、最初に標的に対合して安定性二本鎖を生成し、次に酵素によってプロセッシングされる場合にのみプライマーを分割して２種の別個のプライマーを生成できるであろう。新規娘プライマーの１つ（すなわち、最も相対的に５’に位置する）が自由に伸長可能な３’ヒドロキシル基を有する、または引き続いて有するようにプロセッシングできる場合は、それは続いてポリメラーゼ基質として機能することができよう。これとは対照的に、相対的に３’に配置された娘オリゴヌクレオチドは元のブロック修飾を保持し、ポリメラーゼ基質として機能することはできないであろう。ニックもしくは単一ヌクレオチドギャップにより分離された２つの二本鎖ハイブリッドを形成するためのオリゴヌクレオチドの分割への依存性は、３’−ブロック基の存在に起因して分割されていないプライマーが一過性折り返し構造内に間
違って伸長する機会がほとんど、もしくは全く生じないので、ＲＰＡ系にノイズ減少を加える。本発明者らは、２種の標識されたＤＮＡプライマーが物理的に連結したかどうかを単に判定することによって微量ＤＮＡサンプルを検出かつ水から識別できることを証明することによって、本明細書でプライマーノイズを減少させるためこのアプローチの有用性を証明する。そのような単純なアッセイの可能性は、ＲＰＡが安価で、ディスポーザブルの、装置を使用しないＤＮＡテストの開発における強力なツールであることを表している。
【００５３】
最後に本発明者らは、専有的リアルタイム蛍光プローブの開発に上記の二本鎖特異的ヌクレアーゼ系を採用した。本発明者らは、効果的な蛍光プローブの設計は、ＰＣＲ法におけるなどの他の報告された系と比較してＲＰＡ系では全く相違するであろうと予想した。これはなぜか。本発明者らは、２つの重要な相違する領域を同定した。第１に、プローブ上の官能基の組織化は、ＲＰＡ反応環境と他の増幅系の環境との間の極めて大きな相違に起因して、おそらく必然的に相違するであろう。初期の研究は、ＲＰＡ反応環境が他の核酸増幅反応において遭遇する環境とは基本的かつ臨界的に相違することを証明した。一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質およびリコンビナーゼタンパク質の量を満たすことは、修飾されていない骨格を備えるオリゴヌクレオチドがランダムコイル構造を作用しないことを保証する。ＤＮＡ結合タンパク質は、これらのタンパク質Ｂ形ＤＮＡの大まかには１．５倍の長さのフィラメントを備える核タンパク質フィラメントに染み込んでいるので、相当に「広がって」おり、剛性である（Ｙａｎｇら、２００１；Ｓｃｈｅｅｒｈａｇｅｎら、１９８５；Ｋｕｉｌ  ＭＥら、１９９０）。結果として、一次配列内では離れている蛍光体およびクエンチャーに共有結合したプローブはそれでもまた頻回なランダムアプローチに起因してクエンチするであろうという推定は正しくない。ＲＰＡプローブが他の記載された系におけるプローブとは極めて相違する第２の重要な領域は、プローブのプロセッシングに使用される酵素に関する。本発明者らは実験によって、本明細書に記載したＰｏｌＩクラスの酵素の５’エキソヌクレアーゼドメインを用いるアプローチ（いわゆる「Ｔａｑｍａｎ法」）が、おそらくこれらの酵素のＦＬＡＰエンドヌクレアーゼ活性に起因して、ＲＰＡと不適合に思われることを見いだした（Ｋａｉｓｅｒら、１９９９）。本発明者らはさらに、分子ビーコンもしくはサソリプローブなどの他の系が同様に（ＲＰＡ条件における短い二本鎖アンカーの不安定性のために）おそらく実用的ではないと予測した。その代わりに、本発明者らは、本明細書において二本鎖状況においてのみ骨格の分割を引き起こす、修飾された塩基によって分離される蛍光体およびクエンチャー成分を相互に接近させて配置することによって極めて優れたリアルタイムＲＰＡプローブを構成することが可能であることを証明する。このアプローチは、リアルタイム定量的検出および多重化の詳細を、他の方法を用いる最新技術と整列させるので、ＲＰＡプロセスに極めて大きな価値を付け加えることを約束する。詳細には、これは、サンプル中の標的核酸分子の絶対数を判定するため、単一分子検出を可能にする特異性および感受性を増加させるため、およびさらに数個の標的の多重分析も許容するためのアプローチを提供する。これらの特性はすべてが本方法を用いると、ゲル電気泳動、または実験的介入を必要とする他のアプローチの必要を伴わずに達成することができ、それどころか反応は専用機器によって継続的かつ自動的に監視することができる。ＲＰＡプロセスをこれらの高度に忠実な検出アプローチと結合した場合の能力を例示するために、本発明者らは、超高感受性の内部制御された、病原性菌株の複���かつ多様な性質、および多重化する必要のために、困難な標的である院内病原体ＭＲＳＡについての試験を開発した。
【００５４】
以下では、本発明の各態様についてより詳細に記載する。
【００５５】
（低温ＲＰＡ）
ＲＰＡ反応は、ＲＰＡ反応に含まれる酵素に最適な温度を反映して、約３７℃で最適に機能する。３７℃は研究室内では容易に達成されるが、３０℃もしくは２５℃で効率的に
機能できるＲＰＡ反応はＲＰＡの有用性を増加させ、３７℃でのインキュベートを利用できない現場条件下でのリアルタイム増幅を可能にするであろう。
【００５６】
プライマーの長さがＲＰＡ効率に影響を及ぼすかどうかを決定するために、ＲＰＡ反応を相違する長さのプライマー対を用いて３７℃で実施した（図１）。図１に示した実験の結果は、プライマーを延長させることによってプライマーの「速度」を強化できることを示している。図１のパネルＡは、ＲＰＡ増幅のためにＢｓＡ１およびＢｓｂ３プライマーが標的とする枯草菌遺伝子座でのプライマー組織化を示している。プライマーＢｓＡ１およびＢｓＢ３（各々、３０および３１残基）、またはＲＰＡ反応に使用された標的との適切なホモログを保持している伸長を含有している誘導体。パネルＢは、３８℃へ設定した加熱ステージを備えるＢＩＯＴＥＫ  Ｆｌｘ−８００マイクロプレートリーダーで監視された増幅動態の結果を示している。ＳＹＢＲグリーンを使用してＤＮＡ蓄積を評価した。正確な反応条件および成分濃度は以下のとおりである：１０コピー／μＬ；１０ｍＭの酢酸マグネシウム；５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．９）；１００μＭのｄＮＴＰ；６００ｎｇ／μＬのｇｐ３２；１２０ｎｇ／μＬのｕｖｓＸ；３０ｎｇ／μＬのｕｖｓＹ；３００ｎＭのオリゴ；５％のＣａｒｂｏｗａｘ  ２０Ｍ；１：５０，０００のＳＹＢＲグリーン；１００ｍＭの酢酸カリウム；２０ｍＭのホスホクレアチン；１００ｎｇ／ｍＬのＣＫ（クレアチンキナーゼ）；３ｍＭのＡＴＰ。
【００５７】
本発明のいずれかのためのプライマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、モルホリノ骨格核酸、ホスホロチオレート骨格核酸およびそれらの組み合わせから生成することができる。この場合のそれらの組み合わせとは、１つまたは複数の他の塩基に結合した１つまたは複数の塩基を含有していてよい単一核酸分子を意味する。これらの分子の好ましい濃度は、２５ｎＭ〜１，０００ｎＭの範囲内にあってよい。１つの好ましい実施形態では、プライマーは、その３’末端の２つの塩基間で非ホスフェート連鎖を含有していてよく、３’〜５’ヌクレアーゼ活性に対して耐性である。
【００５８】
本発明者らの結果は、プライマーが長くなると運動速度の漸増が生じることを証明しており、実際にプライマーが３０／３１マーから４５マーへ長くなると、本明細書で使用した条件（１０ｍＭのマグネシウム、５％のＣａｒｂｏｗａｘ  ２０Ｍ）下では閾値検出までの増幅時間が大まかに３５分間から２５分間へ約１０分間短縮された。この実験の結果に基づいて、本発明者らは、緩徐な動態を備えるプライマーはプライマー長を増加させることによって強化できると結論する。
【００５９】
本発明者らはさらに、プライマー長が低温で実施されるＲＰＡに影響を及ぼすかどうかについても調査した。ＲＰＡは、少なくとも２つの理由から低温では機能しない可能性がある。第１に，例えば、反応の成分の１つが所定温度未満で機能するのを停止する場合は、所定温度未満でのＲＰＡ反応の機能の突然かつ劇的な停止が発生する可能性がある。例えば、Ｃａｒｂｏｗａｘは低温では相転移を経験して所望方法で機能を停止する可能性がある。第２に、反応速度は単純に進行性で緩徐化し、緩徐な酵素触媒反応および拡散を反映して倍加時間は長くなる可能性がある。第２の場合には、プライマー「速度」は、反応がおそらくＡＴＰなどの反応成分の枯渇に関して「時間との競争」になるであろうから極めて重要になるであろう。
【００６０】
本発明者らの仮説を試験するために、本発明者らは、図１に示したものと同一のフラグメントを、しかし２５℃で増幅させることを試みた。図２に示した結果は、迅速な動態を備えるプライマーが典型的な周囲温度（室温）でＤＮＡを増幅できることを示している。図１で使用したプライマーを使用して枯草菌ゲノムから特異的フラグメントを増幅させた。図２Ａは、プライマーの略配置図を示している。図２Ｂは、２５℃では４５マーだけが検出可能なレベルへ増幅することを示している。使用した条件は次のとおりであった：５
０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．４）、１００ｍＭの酢酸カリウム、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、２ｍＭのＤＴＴ、７．５％のＰＥＧ化合物（Ｃａｒｂｏｗａｘ−２０Ｍ）、３ｍＭのＡＴＰ、２５ｍＭのホスホクレアチン、１００ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、７００ｎｇ／μＬのｇｐ３２、１６０ｎｇ／μＬのｕｖｓＸ、４０ｎｇ／μＬのｕｖｓＹ、２００μＭのｄＮＴＰ、３００ｎＭの各オリゴヌクレオチド。反応時間、９０分間。開始時コピー密度２コピー／μＬ、反応量５０μＬ。図２Ｃは、２３℃では４５マーだけがＤＮＡを増幅させ、４５マーを使用した場合には検出可能なレベルへの増幅が２０℃および１７℃でも発生できるが、回収された増幅産物は漸減したことを示している。使用した条件：５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．４）、１００ｍＭの酢酸カリウム、１４ｍＭの酢酸マグネシウム、２ｍＭのＤＴＴ、７．５％のＰＥＧ化合物（Ｃａｒｂｏｗａｘ−２０Ｍ）、３ｍＭのＡＴＰ、５０ｍＭのホスホクレアチン、１００ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、６５０ｎｇ／μＬのｇｐ３２、１２５ｎｇ／μＬのｕｖｓＸ、４０ｎｇ／μＬのｕｖｓＹ、２００μＭのｄＮＴＰ、３００ｎＭの各オリゴヌクレオチド。反応時間、１２０分間。開始時コピー密度１コピー／μＬ、反応量２０μＬ。
【００６１】
図２から明らかなように、１７℃という低温でさえ約１０１０倍の特異的増幅が観察された。検出所要時間は２時間以内であった。２３℃以下で実施した実験では、２０コピーのゲノムＤＮＡしか添加されず、一部の微量繰り越し汚染が水コントロールから明確に証明されていたが（図示していない）、臭化エチジウム色素を用いた場合の目に見える産物の達成（１７℃で２０ｎｇと推定された）は、約１０９倍、もしくは３０サイクルの増幅レベルを示唆している。重要なことに、高レベルの「ノイズ」は出現していないが、本発明者らは同定されていない性質の１つの追加の迅速に移動する余分なバンド（きっとおそらく、伝統的なプライマーダイマー、または産物に関連する一本鎖ＤＮＡ）を観察した。
【００６２】
相違する濃度のＰＥＧ下での、２５℃での４５マーのプライマーの速度挙動は、図３に示されている。図３では、図１および２に使用された４５マーのプライマーが２５℃で枯草菌ゲノムのフラグメントを増幅させるために使用された。図３Ａは、使用されたプライマー対の配置を示している。図３Ｂは、アガロースゲル電気泳動および反応終点でのサンプルの臭化エチジウム染色を示している。予想されたバンド（＊）に、より高いＰＥＧ濃度（＃）での追加のバンドが付随している。図３Ｃは、ＳＹＢＲグリーンを用いて監視した増幅反応の動態を示している。使用した条件は次のとおりであった：５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．４）、１００ｍＭの酢酸カリウム、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、２ｍＭのＤＴＴ、指示したＰＥＧ化合物（Ｃａｒｂｏｗａｘ−２０Ｍ）、３ｍＭのＡＴＰ、２５ｍＭのホスホクレアチン、１００ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、６５０ｎｇ／μＬのｇｐ３２、１６０ｎｇ／μＬのｕｖｓＸ、４０ｎｇ／μＬのｕｖｓＹ、２００μＭのｄＮＴＰ、３００ｎＭの各オリゴヌクレオチド、ストックからの１：５０，０００のＳＹＢＲグリーン。反応時間、１２０分間。開始時コピー密度、１０コピー／μＬ、反応量５０μＬ。
【００６３】
４％レーンにおけるシグナルの欠如は、おそらく実験誤差に起因する。これらの結果は、高いＰＥＧ濃度はある点までは動態を加速させることができるが、その後は動態および全反応挙動／転帰の一部の阻害が観察されることを証明している。この場合には、正しい長さの増幅核酸の量を最適化するためには７％もしくは８％のＰＥＧが最適であった。ＰＥＧ濃度がより高くなると、高速で移動する異常なバンドの進行性優勢が生じる。８％のＰＥＧの存在下では、検出は２５℃では約３７分間で観察され、これは約１分２５秒間の倍加時間に相当する。５％のＰＥＧでは、約５４分間で検出が行われた（これは２分間の倍加時間に相当する）。２５℃でのこの反応は、図１に示した実験のほぼ半分の速度である（検出時間は２７分間であり、そして倍加時間は１分間である）。これに基づいて、本発明者らは、ＲＰＡ反応速度が温度が１０℃低下する毎にほぼ半分になると推定する。さらに、ＡＴＰなどの限定された試薬プールに起因して、検出可能な産物形成は、温度、プ
ライマーの活性、および産物の長さに依存してインキュベーション時間とは無関係に限定される可能性がある。本発明者らの試験結果は、効果的な低温ＲＰＡは、迅速な動態を示す、そして反応において律速ではないプライマーを用いると改善されることを示唆している。
【００６４】
図３の実験は、ヒトアポリポタンパク質Ｂ遺伝子を標的とするプライマーを用いて繰り返し、その結果は図４に示されている。図４Ａは、ヒトアポリポタンパク質Ｂ遺伝子座を標的とするプライマーの配置を示している。図示したように３種のプライマー対を使用したが、重複するプライマーは共通の５’末端を共有していたが、３’末端は相違していた。（Ｂ）３８℃での増幅の動態。指示したプライマー対を用いた反応は、ＳＹＢＲグリーン色素を用いてリアルタイムで監視した。開始時標的コピー数は、ヒトＤＮＡの１コピー／μＬまたは１００コピー／μＬのいずれかであった。反応条件は次のとおりであった：５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．９）、１００ｍＭの酢酸カリウム、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、２ｍＭのＤＴＴ、５％のＰＥＧ化合物（Ｃａｒｂｏｗａｘ−２０Ｍ）、３ｍＭのＡＴＰ、２５ｍＭのホスホクレアチン、１００ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、６００ｎｇ／μＬのｇｐ３２、１２０ｎｇ／μＬのｕｖｓＸ、３０ｎｇ／μＬのｕｖｓＹ、１００μＭのｄＮＴＰ、３００ｎＭの各オリゴヌクレオチド、ストックからの１：５０，０００のＳＹＢＲグリーン。反応時間、６０分間。反応量、５０μＬ。
【００６５】
ヒトアポリポタンパク質Ｂ遺伝子座のためのプライマーは、プライマー伸長を伴わずに迅速な動態を示す。この場合におけるＳＹＢＲグリーンを用いた速度試験は、ＲＰＡプライマーがより長くなっても速度上昇が見いだされないことを明らかにした。本明細書で使用したＡｐｏＢ４およびＡｐｏ３００プライマーは、短い場合でさえ、それらが反応において速度制限因子ではない程度まで高速行動を有している。おそらく、この反応では、ポリメラーゼの速度が現在はこの反応の主要な速度制限因子であり、より活性な（長い）プライマーは総合的な速度の利益を達成できない。本発明者らの仮説に一致して、本発明者らは、アポリポタンパク質Ｂプライマーの全部が２５℃で予測された産物を生成することを見いだしている（図５）。図５Ａは、使用したプライマーの配置を示している点で図４Ａと同一である。図５Ｂは、指示したプライマー対を用いて２５℃で実施されたＲＰＡ反応のゲル電気泳動を示している。各場合に、０もしくは１０コピー／μＬのコピー数を試験した。使用した条件は、ＳＹＢＲグリーンを排除した以外は図４における条件と同様であった。この場合には、アーチファクトバンドは見られない−これは、低温ではＲＰＡ反応に「ノイズ」が有意に付随しないという考えを支持している。
【００６６】
（バクテリオファージＰＢＳ２由来のＵＮＧ阻害剤を用いた汚染制御）
ＲＰＡ反応は、繰り越し汚染を制御するための方法としてのｄＵＴＰの使用と適合する。初期の実験データに関する補足説明は、この反応を開始するためにはウラシルグリコシラーゼ酵素を熱不活性化しなければならなかったことである。これはＲＰＡとの２つの不適合問題を有する。第１に、熱不活性化は、ＲＰＡ試薬が熱安定性ではないために完全ＲＰＡ反応液もまた不活性化するであろう。第２に、熱不活性化は、サーマルサイクリングの回避というＲＰＡの１つの目標と一致しない。
【００６７】
上記の理由から、本発明者らは、汚染制御を実行するためのまた別の技術的方法の調査に取り組んだ。枯草菌ファージＰＢＳ１（Ｓａｖｖａ  ａｎｄ  Ｐｅａｒｌ，１９９５を参照）およびＰＢＳ２（Ｗａｎｇ，  Ｚ．  ａｎｄ  Ｍｏｓｂａｕｇｈ，  Ｄ．Ｗ．（１９８９）を参照）が大腸菌および枯草菌ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼの特異的小ペプチド阻害剤を有する（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｓｂａｕｇｈ，１９８８）ことは知られている。それらは、固有のＤＮＡがｄＴＴＰではなくむしろｄＵＴＰを用いて合成されるので、高度に有効な系を必要とする。本発明者らは、阻害剤ペプチドをコードするＰＢＳ２
ＤＮＡ塩基配列をクローニングし、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグを用いて大腸菌内で発
現させた。本発明者らは、さらにまた大腸菌ウラシルグリコシラーゼ遺伝子をクローニングし、それをＣ末端ヘキサヒスチジンを用いて発現させた。本発明者らは、これらのタンパク質調製物を使用して、繰り越し汚染系をそれらと一緒に使用できるかどうか試験した。図６は、そのようなアプローチの妥当性を確認する、実施された実験の例を示している。図６では、テンプレートの開始時標的コピー数は、使用されたヒトＤＮＡの８００コピーであった。反応条件は次のとおりであった：５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．４）、１００ｍＭの酢酸カリウム、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、２ｍＭのＤＴＴ、５％のＰＥＧ化合物（Ｃａｒｂｏｗａｘ−２０Ｍ）、３ｍＭのＡＴＰ、２５ｍＭのホスホクレアチン、１００ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、６００ｎｇ／μＬのｇｐ３２、１２５ｎｇ／μＬのｕｖｓＸ、３０ｎｇ／μＬのｕｖｓＹ、１００μＭのｄＮＴＰ、３００ｎＭの各オリゴヌクレオチド（ＳＲＹ８およびＳＲＹ９プライマー）。反応時間、７５分間。反応量、５０μＬ。大腸菌を使用した場合はＵＮＧを１５０ｎｇ／μＬで使用し、ＵＮＧ阻害剤は１４０ｎｇ／μＬで使用した。汚染は、研究室用液体処理装置内ではこのアプリコンについて存在する真性の繰り越し汚染であった。反応は、ポリメラーゼ以外の全増幅成分を用いて確立された。反応１〜４はゲノムテンプレートＤＮＡを有しており、反応５および６は汚染物質だけを含有していた。サンプルは、サンプル２、３、４、および６ではＵＮＧを用いて５分間にわたり処理した。サンプル２、４、および６ではＵＮＧ阻害剤を５分後に加えた。全部の場合に、５分間のインキュベーション期間が終了した後に、ＵＮＧを含めて、もしくは含まずに、そしてその後のＵＮＧ阻害剤の添加を行って、もしくは行わずに、ＤＮＡ合成を開始させるためにポリメラーゼを加えた。この実験では、本発明者らは：（１）大腸菌ＵＮＧはｄＵＴＰ基質を含有するＲＰＡ反応を阻害するであろう、（２）阻害剤ペプチドの共含有はこの阻害を克服する、（３）ｄＵＴＰ含有汚染物質は最初に大腸菌ＵＮＧを用いて、次に阻害剤を用いて処理されるとアンプリコン生成が抑制されるが、それでもまだ真性テンプレートは有効であることを証明する。使用した条件下では、本発明者らは、反応液内にＵＮＧが存在する場合には頑丈性／産物レベルのある程度減少する証拠を見いだした。しかし本発明者らは、この系をより最適に構成できると予測している。
【００６８】
（ＲＰＡ反応のためのリアルタイム蛍光プローブ）
ＤＮＡ（もしくはＲＮＡ）配列を検出する際のＲＰＡプロセスの多数の可能性のある適用は、リアルタイムフォーマットで適用することから利益が得られるであろう。ＲＰＡはすでに、ＳＹＢＲグリーンなどのマイナーグルーブ結合色素と結び付けると有効であることが証明されている（２００５年４月１１日に提出されたＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００１５６０）。しかし、反応挙動を評価するためにＤＮＡ蓄積のそのような一般的インジケータを使用することには潜在的限界がある。第１に、これらの色素は形成された様々な産物間を識別できないので、増幅反応を多重化する能力がない。例えば数多くの臨床試験では、偽陰性を排除するために内部増幅コントロールを含める必要があるであろう。第２に、ＲＰＡ反応はサンプル中に標的が存在しない場合でさえ一部のＤＮＡ合成が場合によっては発生する範囲で、ほとんどの他のＤＮＡ増幅プロセスと類似である。結果として、蛍光検出の現行方法に基づいて数コピーの標的核酸の存在と核酸のコピーの不在とを識別することは困難もしくは不可能になることがある。
【００６９】
これらの問題に応えて、本発明者らは、ＲＰＡ反応を監視するための蛍光に基づく専有的プローブ系を開発した。本発明者らは、大腸菌ＰｏｌＩクラスのポリメラーゼに関連する５’−３’ヌクレアーゼを用いて調査した。このヌクレアーゼは、５’ヌクレアーゼ、もしくは「Ｔａｑｍａｎ」アッセイとして知られるＰＣＲのための蛍光プローブ法において使用されている。本発明者らは、５’−３’ヌクレアーゼドメインを保持している枯草菌ＰｏｌＩおよび大腸菌ＰｏｌＩ酵素のどちらもＲＰＡ反応を支持しないことを見いだした。再考の結果、本発明者らは、これらのヌクレアーゼはＦＥＮ１  ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼファミリーの構造的／機能的ホモログであり、きっとおそらく構造特異的エンド
ヌクレアーゼである（Ｋａｉｓｅｒら）ために、これが発生すると考える。本発明者らは、これらの酵素は、鎖置換合成中に置換された鎖を漸進的に消化するので、したがってＤＮＡ増幅を阻害するのだと考える。
【００７０】
本発明者らは、ｆｐｇ、Ｎｔｈ、Ｎｆｏ、およびより近年は大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩとして知られる、ＤＮＡ修復に関係している大腸菌グリコシラーゼ酵素およびＡＰエンドヌクレアーゼに特に焦点を当てて注目した。重要なことに、これらの酵素は、塩基修飾が発生している位置で、および決定的には二本鎖ＤＮＡの状況においてのみ損傷した塩基を取り除く、および／またはＤＮＡ骨格を切断するであろう。これらの酵素は全部が、ＲＰＡ環境において高特異性でそのような適切な二本鎖ＤＮＡ分子を切断することができる（用途を参照）。オリゴヌクレオチドの本体内に修飾された塩基（各々、８−オキソグアニン、チミングリコール、もしくは無塩基性部位模擬体）および３’末端上の追加の別個の伸長ブロック基（３’−ｄＲ−ビオチンによって提供される）を含有する試験プローブを使用した。これらの酵素および潜在的にすべての他の修復／プロセッシング酵素についての明白な展望にもかかわらず、本発明者らは、以下の理由から大腸菌ＮｆｏおよびエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素の挙動に焦点を当てた。第１に、本発明者らは、ｆｐｇ、Ｎｔｈ、およびＮｆｏタンパク質を試験したときに、プローブプロセッシングに成功する程度はテトラヒドロフラン残基（ＴＨＦ−無塩基性部位模擬体）を含有し、Ｎｆｏによってプロセッシングされたプローブについてが最高であることを観察した。第２に、Ｎｆｏ、および機能的に類似である大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩは、単一ヌクレオチドギャップで分離された２つの小さなオリゴヌクレオチドに分割するからであるが、このとき形成される新規３’末端はニックで開始できる鎖置換ポリメラーゼによって伸長できる。この特性は、ＴＨＦ／ＮｆｏもしくはＴＨＦ／エキソヌクレアーゼＩＩＩプロセッシング系に、蛍光プローブプロセッシングへの適用を超えて拡大する多様な用途を付与する（他の無塩基性部位模擬体、または真性無塩基性部位もまた使用できることを留意されたい）。
【００７１】
以前の報告はさらに、増幅プロセスの状況において、無塩基性部位もしくは他のブロック残基を使用する潜在的使用を例示しているが、その好ましい意図はＰＣＲもしくはＬＣＲ反応の状況において熱安定性ヌクレアーゼを用いて残基を除去することであった（本明細書では‘６０７号特許と記載する、米国特許第５，７９２，６０７号を参照）。しかし、本発明者らが使用したアプローチは、‘６０７号特許のアプローチとは明らかに異なっている。‘６０７号特許では、無塩基性部位は極めて広範囲の選択範囲内の修飾基１メンバーであると記載されており、企図された増幅オリゴヌクレオチドの３’末端に優先的に配置され、そしてポリメラーゼによる基質認識もしくは触媒反応を効果的に防止することによって可逆性３’糖修飾基として機能するように設計されている。その意図は、ＰＣＲおよびＬＣＲ技術には減少した頻度にもかかわらずオリゴヌクレオチドプライマーの３’領域に対する限定された相同性を共有する配列を備えるハイブリッドを形成する傾向があるために、サンプルＤＮＡ中で増幅系が意図されない標的を増幅する傾向を減少させることにある。さらに、極めて重要なことに、‘６０７号特許では、この基質認識を妨害する修飾は標的依存方法で特異的に修正されることが意図されている。そのような活性は、３’糖残基由来の基を「洗練する」ことのできるエンドヌクレアーゼＩＶなどの物質の活性によって実施できるであろう。しかし、極めて疑いようなく、本明細書に記載したプロセスでは、ＴＨＦ残基は、初期オリゴヌクレオチド／テンプレートハイブリッドが真性基質として認識されることを防止する３’糖に対する伸長ブロック修飾剤として機能しない。実際に、ＴＨＦ残基は、オリゴヌクレオチドの３’最末端に位置する代わりに、ポリメラーゼの基質標的（すなわち、テンプレートＤＮＡ上にハイブリダイズしたプライマーの３’末端領域）から離れたオリゴヌクレオチドの本体内に配置されている。本開示における主要な動機は、プライマーの折り返しアーチファクトから発生するノイズを防止することである。そこで、その代わりに、この場合にはエンドヌクレアーゼ活性によるＴＨＦ残基のプロセッシングは、ポリメラーゼの基質認識を妨害する修飾の「補正」とは相違するイ
ベントにおいて真性二本鎖の状況におけるオリゴヌクレオチド骨格の切断を引き起こす。本発明者らは、本明細書ではさらに３’末端伸長ブロック修飾について記載するが、しかしこれらはこの場合には「補正された」修飾ではなく、‘６０７号特許におけるような３’末端ヌクレオチドから必ずしも除去されない。その代わりに、本明細書に記載した場合には、本発明者らは、２つの別個の実体である未修正３’−ブロック基および中央に位置する無塩基様残基を使用するであろうが、後者はニック構造およびそれらの一方だけがポリメラーゼ基質である２種の独立娘アニール化プライマーを生成するためにＡＰエンドヌクレアーゼによって切断できる。
【００７２】
図７は、蛍光感知プローブを使用してＲＰＡ反応における特異的アンプリコンの蓄積についてアッセイされた実験の結果を示している。図７Ａは、プローブの概略構造を示している。このプローブは、市販で入手できるフルオレセイン−ｄＴもしくはＤＤＱ２−ｄＴアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、米国バージニア州スターリン）を使用することによって合成中に組み込まれた、内部塩基で標識された蛍光体およびクエンチャー（フルオレセインおよびディープダーククエンチャーＩＩ）を有している。
【００７３】
ＴＨＦ残基は、これらの修飾された塩基間のヌクレオチド位置で挿入された。プローブは、３’−ｄＲ−ビオチン基の存在によってブロックされた。図７Ｂは、プローブ配列を示している：
【００７４】
【化２】
2020120678.tif 000004
このプローブは、プライマーＪ１およびＫ２によって生成されたアンプリコン内に含有される枯草菌ＳｐｏＯＢ遺伝子座の一部と相同である。蛍光体およびクエンチャーは、それらを市販で入手できるアミダイト上に直接的に組み込むことができるように配列内のＴ残基上にあるように設計された。図７Ｃは、蛍光増加によって監視される増幅およびプローブ切断動態を示している。増幅反応は、様々な濃度の標的枯草菌ゲノムＤＮＡを用いて確立された。反応は氷上で確立され、次に３８℃に設定したステージを備えるＢＩＯＴＥＫ  Ｆｌｘ８００マイクロプレートリーダー内でインキュベートされた。増幅条件は次のとおりである：開始時標的コピー数は指示したとおりであった。反応条件：５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．９）、１００ｍＭの酢酸カリウム、１２ｍＭの酢酸マグネシウム、２ｍＭのＤＴＴ、５％のＰＥＧ化合物（Ｃａｒｂｏｗａｘ−２０Ｍ）、３ｍＭのＡＴＰ、２５ｍＭのホスホクレアチン、１００ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、９００ｎｇ／μＬのｇｐ３２、１２０ｎｇ／μＬのｕｖｓＸ、３０ｎｇ／μＬのｕｖｓＹ、１８０μＬのＮｆｏ、１００μＭのｄＮＴＰ、４５０ｎＭのＫ２プライマー、１５０ｎＭのＪ１プライマー、１００ｎＭのプローブ。反応時間、６０分間。反応量、２０μＬ。
【００７５】
感知プローブは、（ａ）１０塩基未満（効率的クエンチングを保証するため）および（ｂ）切断可能な部位（ＴＨＦ残基）によって分離された蛍光体およびクエンチャーを有するように設計された。この場合には、一次アンプリコンは枯草菌ＳｐｏＯＢ遺伝子座からフラグメントを増幅させるためにプライマーＪ１およびＫ２を用いて生成した。ＲＰＡ反応は、以下の方法で本発明者らの通常の条件から修飾した。第１に、その全体構造および配列を図の下方部分に示したプローブを含めた。第２に、増幅プライマーは、プローブに対して相補的配列が定常状態過剰となるようにプローブに対向する増幅プライマーが相当に過剰であるような濃度で偏らせた。最後に、Ｎｆｏ酵素を反応に含めた。反応は標準３８４ウエルマイクロプレート内で２０μＬ量で実施し、ＢＩＯ−ＴＥＫ  Ｆｌｘ８００プレートリーダー内の４８５／５２５の励起／検出フィルターを用いて蛍光を監視した。本
発明者らは、蛍光のテンプレート依存性増加があることを観察した。蓄積が開始する時点はコピー数に依存性であり、１時間の反応監視時間の終了時の全蛍光レベルも同様であった。
【００７６】
図８では、この実験が繰り返された。図８Ａは生蛍光データを示しており、図８Ｂは標準化した蛍光シグナルを示している。任意の所定時点での水コントロール中に存在する蛍光シグナルを他の全サンプル中蛍光シグナルから減じた。全サンプルは、測定可能な蛍光が上昇する前の期間に基づく共通ベースラインへそれらを調整することによって相互に標準化した。図８Ｃでは、標準化した蛍光データの対数をプロットし、図８Ｄでは蛍光シグナルの閾値交差の時間（約２．６に設定）を開始時コピー数に対してプロットした。
【００７７】
この場合に、本発明者らは、水コントロール中のシグナルに対してサンプルを標準化した結果を示し、次に標準化した蛍光シグナルの対数をプロットした結果を示した。本発明者らは、２．５以上の蛍光シグナルは陽性シグナルを構成すると規定した。ＳＹＢＲグリーンを用いた場合に通常観察される状況とは対照的に、低コピーサンプルを水から識別するのは容易であることに留意されたい。水サンプル中のわずかな蛍光の増加はほぼ確実に、研究室内で幅広く取り扱われている特定のアンプリコンに関連するわずかな繰り越し汚染に起因する。
【００７８】
本開示のクエンチャーに関して、クエンチャーは必ずしも蛍光体である必要はないことは理解されている。ドナーの発光（ダーククエンチャー）と重複する非蛍光発色団を使用できる。そのような場合には、転移したエネルギーは熱として放散する。
【００７９】
Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １、Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ２、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １およびＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ２などの高効率ダーククエンチャーは知られており、市販で入手できる（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カリフォルニア州ノバート）。当技術分野において知られているように、ダーククエンチャーの高いクエンチング効率および天然蛍光の欠如は、１つのオリゴヌクレオチド上への蛍光体およびクエンチャーの付着を可能にし、そのようなオリゴヌクレオチドが溶液中に存在する場合は蛍光を発しないことを保証する。
【００８０】
本発明のポリヌクレオチドと一緒に使用するために適合する蛍光体およびクエンチャーは、当業者であれば容易に決定できる（さらに、Ｔｇａｙｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １６：４９−５３（１９９８）；Ｍａｒｒａｓら、Ｇｅｎｅｔ．  Ａｎａｌ．：Ｂｉｏｍｏｌｅｃ．  Ｅｎｇ．  １４：１５１−１５６（１９９９）も参照されたい）。多くの蛍光体およびクエンチャーは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社（オレゴン州ユージーン）またはＢｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（カリフォルニア州ノバート）から市販で入手できる。本発明において使用できる蛍光体の例には、フルオレセインならびにＦＡＭ、ＶＩＣ、およびＪＯＥなどのフルオレセイン誘導体、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、クマリンおよびクマリン誘導体、ルシファー・イエロー、ＮＥＤ、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、テトラクロロ−６−カルボキシフルオロセイン、５カルボキシローダミン、シアニン色素などが含まれるが、それらに限定されない。クエンチャーには、ＤＡＢＳＹＬ、４’−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−マレイミド（ＤＡＢＭＩ）、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ、Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １、およびＤａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ２が含まれるが、それらに限定されない。蛍光体およびクエンチャーを核酸に結合させる方法は、当技術分野においてよく知られている。
【００８１】
本発明者らは、ＲＰＡ反応環境において蛍光プローブ系を実行することに成功し、プローブの一般構造を確立した。この知識を用いると、任意のアンプリコンを検出するためのプローブを開発することは、そして代替蛍光体の賢明な選択によって、一度に２つ以上の増幅を多重化することは容易なはずである。これを証明するために、本発明者らは、英国内ではメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、もしくは略してＭＲＳＡとして知られる抗生物質耐性黄色ブドウ球菌病原体に対する多重試験を開発した。
【００８２】
（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出）
ＭＲＳＡは、黄色ブドウ球菌ゲノム内の特定の場所で耐性カセットであるｍｅｃＡカセットを統合することによって抗生物質耐性を発生した一群の黄色ブドウ球菌株を含んでいる。同一の一般ゲノム統合部位が常に使用されるが、正確な統合部位接合部およびカセットの方向付けは変動する可能性がある。この変動にもかかわらず、独立単離菌は代表的な統合構造を備える限定数の一般群に分離することができる。この複雑性に加えて、増幅プライマーおよびプローブの有効性を弱める可能性がある菌株間の塩基多型性の存在に起因してまた別の困難が発生する。そこでＭＲＳＡ病原体は、単一試験における臨床標本中で一般に見いだされる菌株の９０％超を捕捉するためにはｍｅｃＡ耐性カセット統合遺伝子座の３つの構造的に相違する変化の検出に適応する、そして一部の一般多形を説明することが必要であるので、複合標的を表している。さらに、アンプリコンは、増幅させた任意のｍｅｃＡ配列が黄色ブドウ球菌ゲノムの状況内にあり、非関連性細菌中には存在しなかったことを保証するために、統合カセット内の１つの群にわたっていることが必要である。
【００８３】
一般ＭＲＳＡ菌株の９０％超についてのＲＰＡ試験を構成するために、本発明者らは、図１０に例示したプライマー設計戦略を開発した。図１０は、多重試験環境におけるＭＲＳＡ対立遺伝子のリアルタイム検出を描出している。図１０Ａは、ＲＰＡプローブ原理の略図である。シグナル生成は、二本鎖特異的Ｎｆｏによるプローブ切断に左右される。図１０Ｂは、図２Ｃ〜Ｆおよび３Ｃにおいて使用した標的に比較したプライマーおよびプローブの配置を示している。標的部位ｓｃｃＩＩＩおよびｏｒｆＸへ非関連配列を結合させたＰＣＲフラグメントは、内部コントロールとして機能した。図１０Ｃは、プライマーセットｏｒｆＸ／ｓｃｃＩＩＩを用いたＲＰＡ反応のプローブシグナルを示している。１０４（黒色、反応１〜３）、１０３（赤色、４〜６）、１００（黄色、７〜９）、１０（緑色、１０〜１２）または２コピー（紫色、１３〜１７）もしくは水（青色、１８〜２０）でのＭＲＳＡＩＩＩ  ＤＮＡは、テンプレートとして機能した。図１０Ｄは、コピー数が線形関係を明らかにしているテンプレートの対数に対して図２Ｃにおける反応１〜１２における増幅の開始時間（２．５閾値を通過したと規定した）のプロットを示している。（Ｅ）多重ＲＰＡアプローチは、同一反応内での相違するＭＲＳＡ対立遺伝子および内部コントロールの検出を可能にする。１０コピーでのＭＲＳＡＩ（緑色）、ＭＲＳＡＩＩ（紺青色）、ＭＲＳＡＩＩＩ  ＤＮＡ（赤色）もしくは１０４コピーでのＭＳＳＡ  ＤＮＡ（青色、陰性コントロール）または水（黄色、青緑色）はテンプレートとして機能した（各テンプレート条件について３つずつ）。（Ｆ）図２Ｅにおける反応に含まれた５０コピーの内部コントロールＤＮＡの検出。陰性コントロールは水（青緑色）を含有していた。ＲＰＡ反応は、次のとおりに実施した：リアルタイムＲＰＡは蛍光体／クエンチャープローブの存在下でプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ  Ｆｌｘ−８００）内で実施した。反応は３７℃で９０分間実施した。条件は、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．９）、１００ｍＭの酢酸カリウム、１４ｍＭの酢酸マグネシウム、２ｍＭのＤＴＴ、５．５％のＣａｒｂｏｗａｘ  ２０Ｍ、２００μＭのｄＮＴＰ、３ｍＭのＡＴＰ、５０ｍＭのホスホクレアチン、１００ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、２０ｎｇ／μＬのＢｓｕであった。ｇｐ３２／ｕｘｓＸ／ｕｖｓＹ（単位ｎｇ／μＬ）の濃度は９００／１２０／３０であった。プライマーは、２６５ｎＭのｓｃｃＩ／ＩＩ、２６５ｎＭのｓｃｃＩＩＩ、７０ｎＭのｏｒｆＸ
を使用した。反応量は２０μＬであった。
３種のプローブを使用した：
【００８４】
【化３】
2020120678.tif 000005
ここで（Ｔ）はｄＴ−ＴＡＭＲＡ、（Ｆ）はｄＴ−フルオレセイン、（Ｈ）はＴＨＦ、（ｑ１）はｄＴ−ＢＨＱ１、（ｑ２）はｄＴ−ＢＨＱ２、（ｑ３）はｄＴ−ＤＤＱ１である。プローブは、６０ｎＭのＳＡＴａｍｒａ１（ＭＲＳＡＩＩＩ実験）もしくは４５ｎＭのＳＡＴａｍｒａ１、４５ｎＭのＳＡＴａｍｒａ２、６０ｎＭのＢＳＦｌｃ（多重実験）を使用した。Ｎｆｏは２００ｎｇ／μＬで使用した。励起／検出は、４８５／５２５ｎｍ（ＳｙｂｒＧｒｅｅｎＩ、ＢＳＦｌｃ）または５３０／５７５ｎｍ（ＳＡＴａｍｒａ１／２）で実施した。測定値は、３０秒間もしくは４５秒間（多重実験）毎に入手した。蛍光プローブデータは、水コントロールおよび調整した増幅前ベースライン値に対して標準化した。読み出し値の対数を反応時間に対してプロットした。
【００８５】
手短には、統合カセット領域の外側にある黄色ブドウ球菌ゲノムＤＮＡを認識するために単一プライマーを設計し、ｏｒｆＸと名付けた。さらにｍｅｃカセットに特異的な２種のプライマーを設計したが、これら（ｓｅｃ  Ｉ／ＩＩ）のうちの１つは２種の菌株変種から遺伝子座を増幅させるために使用でき、第２（ｓｅｃ  ＩＩＩ）は第３変種から遺伝子座を増幅させるために使用できる。アンプリコンのためには、一般単一ヌクレオチド多形の原因となる２つの残基が相違している２種のプローブを使用する。これらのＭＲＳＡプローブはどちらも、蛍光体としてＴＡＭＲＡを使用する。最後に、反応液内にはｏｒｆｘおよびｓｃｃＩＩＩプライマーに縮合させた非関連性枯草菌ゲノムＤＮＡフラグメントの固有のセグメントを含んでいるコントロールアンプリコンが含められ、このアンプリコンを感知するためには第３のプローブを使用できる（ＢＳＦｌｃ、およびこれは図７に記載の実験で使用された同一プローブであり、フルオレセインおよびディープダーククエンチャーＩを含有している）。図１０のパートＡは、再びアンプリコンとハイブリッドを形成するプローブをプロセッシングすることにより反応において増加した蛍光を発生させるための戦略を例示している。パートＣでは、１つのＭＲＳＡゲノムＤＮＡテンプレートの検出が、非多重化環境では広い濃度範囲にわたって証明されている。パートＥは、３つのタイプのＭＲＳＡの各（約）１０コピーが単一反応マスターミックスを用いて個別に検出された実験の結果を示している。パートＦではフルオレセインチャネル内でコントロール配列によって生成されたシグナルが示されており、本発明者らは、コントロールＤＮＡを含有するそれらの全サンプルの判定が陽性であると判断できる。
【００８６】
これらの実験には、相当に高濃度（１０４コピー）の非耐性黄色ブドウ球菌ＤＮＡを含有するコントロール反応が含まれている。十分満足できることに、これらのサンプルは陽性とは判定されないが、これは黄色ブドウ球菌配列ならびにｍｅｃＡカセット両方について厳密な要件があることを示している。このコントロールＤＮＡが機能的であること、そしてコピー濃度が指示されたとおりであることを保証するために、ｏｒｆＸプライマーおよびｍｓｓａと名付けられた第２の黄色ブドウ球菌特異的プライマーの組み合わせを使用するコントロール反応においてＤＮＡを使用した。この場合には、プローブが黄色ブドウ
球菌ゲノムの共通区画を認識するので、同一プローブを使用できる。図１１には、これらの非耐性菌株特異的プライマーを用いて実施された実験の結果を観察することができ、コントロールＭＳＳＡ  ＤＮＡが実際にいかに有効であるか、そしてコピー数についての定量的分析の適切な応答を示しているかを見ることができる。図１１は、リアルタイム定量的ＲＰＡ反応におけるＭＳＳＡ  ＤＮＡの検出を示している。プライマーセットｏｒｆＸ／ｍｓｓａおよびプローブＳＡＴａｍｒａ２を用いるＲＰＡ反応のプローブシグナル。図１１Ａは、テンプレートとして機能した１０４（黒色、反応１〜３）、１０３（赤色、４〜６）、１００（黄色、７〜９）、１０（緑色、１０〜１２）もしくは２コピー（紫色、１３〜１７）または１０４コピーでのＭＲＳＡＩ  ＤＮＡ（灰色、反応１８〜２０）もしくは水（青色、２１〜２３）でのＭＳＳＡ  ＤＮＡの測定を示している。反応条件は、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．９）、１００ｍＭの酢酸カリウム、１４ｍＭの酢酸マグネシウム、２ｍＭのＤＴＴ、２００μＭのｄＮＴＰ、３ｍＭのＡＴＰ、２０ｍＭのホスホクレアチン、１００ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、５％のＣａｒｂｏｗａｘ２０Ｍ、９００ｎｇ／μＬのｇｐ３２、１２０ｎｇ／μＬのｕｖｓＸ、３０ｎｇ／μＬのｕｖｓＹおよび２０ｎｇ／μＬのＢｓｕであった。オリゴヌクレオチドは、５００ｎＭのｍｓｓａ、１００ｎＭのｏｒｆＸおよび６０ｎＭのＳＡＴａｍｒａ２を使用した。ＭＳＳＡ標的は極めて低い濃度でさえ増幅するが、陰性コントロール（ＭＲＳＡＩ）はシグナルを生成しない。図１１Ｂは、コピー数が線形関係を明らかにしているテンプレートの対数に対して反応１〜１２における増幅の開始時間（２．５閾値を通過したと規定）のプロットを示している。
【００８７】
（伸長可能な３’末端の酵素的生成に続くプライマーの結合による微量核酸の検出）
ＲＰＡは、ポータブル型で機器不要の、または軽量な機器によるＤＮＡ試験の開発にとって理想的に適合する。しかしそのような試験は、増幅が発生したかどうかを決定するために安価で使用法が簡便なアプローチを使用するのが理想的であろう。伝統的には、規定サイズの産物が蓄積したかどうかを判定するためにはゲル電気泳動が使用されている。または、蛍光プローブを使用できる。いずれの場合においても、分析を実施するためにはかなり大きなハードウエアが必要とされるので、これは適切な装置を有していないエンドユーザーが本試験を使用することを妨害する。
【００８８】
他のアプローチを使用して、ＤＮＡ増幅が発生したか否かを決定することができる。１つの便宜的な、ハードウエアを使用しないアプローチは、２種の標識された遺伝子特異的プライマーが共通ＤＮＡ二本鎖内で結合したかどうかをインテロゲートすることによってアンプリコンの存在が判定される、サンドイッチアッセイを実施する方法である。これは、１種の増幅プライマーをビオチンなどの標識で、そして対向するプライマーをＦＡＭなどの第２標識で標識することによって達成できる。２種の標識されたプライマーが結合したかどうかを決定するためには、様々なアプローチを使用できる。例えば従来型のラテラルフロー・ストリップアッセイ（例えば、欧州特許ＥＰ０８１０４３６Ａ１を参照）では、２種の抗体（またはオリゴヌクレオチド標識の１つに高親和性で結合するストレプトアビジンなどの他の成分）が使用される。１つの抗体は、ラインもしくはスポットでフローメンブレン上に固定化されるであろう。もう１つの抗体は、コロイド状金、ラテックス粒子などの可視粒子に結合させられる。この場合には希釈もしくは未希釈増幅反応であるサンプルが、抗体結合可視粒子が事前に沈着しているサンプルパッドに適用されると、可視粒子は標識したオリゴヌクレオチドの１つと安定性に結合される。次にサンプル全体が毛細管作用によってメンブレンの上方に移動し、それが流動するにつれて、もう１種の標識されたプライマーは固定化抗体上に「捕捉」される。標識されたプライマーが二本鎖内で共結合しない場合は、メンブレン上に「捕捉された」抗体は他のプライマーと結合している可視粒子とは結合しない。しかし、それらが増幅の結果として結合している場合は、可視粒子はラインもしくはスポット上に捕捉され、そして可視シグナルが蓄積する。プライマーの結合について評価するためには他のアプローチを構成できる。
【００８９】
サンドイッチアッセイなどの単純な結合アッセイを用いる場合の１つの問題は、所望の標的の真正増幅が発生しない限りプライマーが結合しないという必要条件である。何らかの望ましくない結合は、偽陽性シグナルを発生させるであろう。しかしそのような明確な状況は、特に標的が豊富ではない場合には、大多数の増幅方法についてはまれである。例えば、ＰＣＲ法においてはプライマーダイマー、もしくは他のアーチファクトが、最適化とは関係なく、ある程度蓄積する傾向を示す。ＲＰＡもまた上記で詳述したようにプライマー関連性アーチファクトの蓄積に悩まされ、これらはＲＰＡとそのような単純な読み出しとの直接組み合わせを妨害する可能性がある。実際に、この一般的問題は、サンドイッチアッセイが現在利用できる高感受性／特異性ＤＮＡ試験において広汎には実施されていないことの理由の一部を実証している可能性がある。ＰＣＲ産物蓄積を評価するために販売されているそれらの市販で入手できるラテラルフローシステム（例、Ｍｉｌｅｎｉａ社製のＧｅｎｌｉｎｅ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  Ｄｉｒｅｃｔ試験ストリップ）は、便宜的ではなく、ＤＮＡ合成を通してのプライマーの異常な共結合を回避するために、反応が実施された後に追加のプローブプライマーを産物へハイブリダイズさせる最終工程を必要とする。
【００９０】
本発明者らは、ラテラルフロー・ストリップへ直接的に添加することにより、または将来的には他の類似方法によって、真正標的増幅の容易な評価を許容するためのＲＰＡ反応を構成した。陽性および陰性サンプル間の明確な識別を達成するために、本発明者らは、大腸菌ＮｆｏもしくはエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素によって分割される標識されたプライマーを使用して２種のプライマーを生成したが、それらの１つは鎖延長させることができる。これは、オリゴヌクレオチドの３’末端をブロックし、オリゴヌクレオチド合成中に、酵素に対して分解標的として作用するオリゴヌクレオチドにおいて、本明細書ではＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（米国バージニア州スターリング）から入手できる「Ｄ−スペーサー」と呼ばれる５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−１’，２’−ジデオキシリボース−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイトを使用してＴＨＦ残基もしくは産物を個別に組み込む工程によって達成される。ＮｆｏもしくはエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素がプライマーを切断／分割する前の安定性二本鎖形成への依存性は、このプライマーと他の標識された対向プライマーとの異常な結合が発生しない、または検出閾値未満へ低下するようにめったに起こらないことを保証する。
【００９１】
図９は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ｍｅｃ２カセットを含有するＥＭＲＳＡ  １６菌株）由来、または非耐性参考菌株（ＭＳＳＡ）由来のＤＮＡを３種のプライマーの存在下で増幅させた実験からのデータを示している。この実験は、ラテラルフローアッセイもしくは他の単純なサンドイッチ検出スキームのために適合する高いシグナル対ノイズ比増幅戦略が実行可能であることを示している。図９Ａは、プライマーの略配置図を示している。一番左のプライマー、およびプローブは、黄色ブドウ球菌ゲノム内に存在する、および同様に黄色ブドウ球菌ＭＳＳＡ参考菌株ならびに下流ｍｅｃＩＩカセットインサートを含有するＭＲＳＡ１６菌株内に存在する配列を認識する。一番右の増幅プライマーは、ｍｅｃＩＩカセット内の配列に対して特異的であり、非耐性黄色ブドウ球菌ゲノム内では見いだされない。一番右のプライマーは５’末端がビオチン成分で標識されているが、プローブは５’−ＦＡＭ成分で標識されている。プローブは３’ｄｄＣでブロックされており、内部ＴＨＦ残基を含有している。図９Ｂでは、増幅反応は次の条件を用いて確立された：５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．９）、１００ｍＭの酢酸カリウム、１４ｍＭの酢酸マグネシウム、２ｍＭのＤＴＴ、５％のＰＥＧ化合物（Ｃａｒｂｏｗａｘ−２０Ｍ）、３ｍＭのＡＴＰ、２５ｍＭのホスホクレアチン、１００ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、６００ｎｇ／μＬのｇｐ３２、１２５ｎｇ／μＬのｕｖｓＸ、３０ｎｇ／μＬのｕｖｓＹ、２７０μＭのＮｆｏ、１００μＭのｄＮＴＰ、１００ｎＭのＯＲＦＸ４５ｂプライマー、１００ｎＭのｓｃｃＩＩ−３５−２−バイオプライマー、５０ｎＭプローブのＯＲＦＸｐ
ｒｏｂｅ２。反応時間、６０分間。反応量、３０μＬ。反応温度３７℃。コピー数は、１，０００コピーのＭＳＳＡ  ＤＮＡもしくは１，０００コピーのＭＲＳＡ１６  ＤＮＡ、または水であった。６０分後、１μＬの反応液を５μＬのＰＢＳ／３％のＴｗｅｅｎ−２０で希釈し、１００μＬのＰＢＳ／３％のＴｗｅｅｎ−２０（Ｍｉｌｅｎｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔ：Ｇｅｎｌｉｎｅ  ｈｙｂｒｉ−ｄｅｔｅｃｔ  ＭＧＨＤ１）を用いてＭｉｌｅｎｉａ社製の市販のラテラルフロー試験ストリップのサンプルパッドに塗布した。
【００９２】
この場合には、プライマー中２種が主要増幅プライマー対として機能し、第３のプライマーがプローブとして機能する。プローブは、分割標的として、ならびに５’末端でＦＡＭ標識として作用するために３’ブロック基および別個の内部ＴＨＦ残基を含有している。プローブは、ビオチン残基で標識されている主要増幅プライマーの１つに対向する。真正アンプリコンしか蓄積していなければ、プローブはＮｆｏによってニック／分割され、伸長させられ、したがって２種の標識されたプライマーを結合させる安定性ハイブリッドを形成するであろう。この方法で確立されたＲＰＡ増幅が耐性および非耐性菌株由来のＤＮＡ上で実施された実験の結果は図示されている。少量の反応液（１μＬ）を次に５μＬのラテラルフロー・ランニングバッファー（３％のＴｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝食塩液）と混合し、市販のラテラルフロー・ストリップ（Ｍｉｌｅｎｉａ−ｇｅｒｍａｎｙ社）へ直接的に塗布した。約１〜２分後、ストリップをシグナルについて評価し、写真を撮影した。試験は、明白に陽性を陰性から識別している。
【００９３】
他のプロセッシング酵素をそのようなアプローチで使用できる。詳細には、大腸菌ｆｐｇ、Ｎｔｈ、およびエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素、他のｐｈｙｌａ由来のホモログ、大腸菌ＭｕｔＹ、ＭｕｔＳおよびＭｕｔＭなどの塩基ミスマッチ修復酵素、大腸菌ＭＵＧ、ヒトＭＵＧ、Ｏｇｇ１、および脊椎動物Ｎｅｉ様（Ｎｅｉｌ）グリコシラーゼ。上記の修復酵素の任意の組み合わせもまた使用できる。特に、大腸菌Ｎｆｏ（エンドヌクレアーゼＩＶ）、および大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩは、ホスホジエステラーゼ活性を有しており、他のグリコシラーゼ／リアーゼの切断産物の伸長不可能な３’末端を伸長可能な３’−ヒドロキシル残基へプロセッシングできることに留意されたい。
【００９４】
本開示のいずれかに言及したすべての特許、特許出願および参考文献は、全体として参考して組み込まれる。
【００９５】
以下では、本発明を実施例によってより詳細に記載する。実施例は本発明の例示であり、決して本発明を限定することは意図していない。
【実施例】
【００９６】
（実施例１：核酸配列）
（タンパク質およびＤＮＡ）
ｕｖｓｘ、ｕｖｓｙ、ｇｐ３２、ＢｓｕおよびＮｆｏについてのコーディング配列は、ゲノムＤＮＡ（ＤＳＭＺ社、ドイツ国）から増幅させ、ヘキサヒスチジンタグ（ｕｖｓＹ、ＢｓｕおよびＮｆｏについてはＮ末端、ｕｖｓＸおよびｇｐ３２についてはＣ末端）へ縮合させ、適切な発現ベクター内へクローニングした。過剰発現および精製は、ニッケル−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて標準プロトコールによって実施した。黄色ブドウ球菌対立遺伝子は、ＥＭＲＳＡ−３（ＳＣＣｍｅｃタイプＩ；ＭＲＳＡＩ）、ＥＭＲＳＡ−１６（ＭＲＳＡＩＩ）、ＥＭＲＳＡ−Ｉ（ＭＲＳＡＩＩＩ）および野生型ＭＳＳＡであった。以下に提供した追加の配列情報を参照されたい。
【００９７】
（プライマー配列）
【００９８】
【化４】
2020120678.tif 000006
【００９９】
【化５】
2020120678.tif 000007
【０１００】
【化６】
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【０１０１】
【化７】
2020120678.tif 000009
（本明細書中で使用されたＭＳＳＡ対立遺伝子およびＭＲＳＡ対立遺伝子ならびにプライマーの配列）
プライマーの標的部位は、太字／下線が引かれており、プローブ結合部位は、太字／斜字体である。
【０１０２】
【化８】
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【０１０３】
【化９】
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【０１０４】
【化１０】
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（実施例２：ＲＰＡ反応の速度）
ＲＰＡプロセスの略図は図１２Ａに示されている。リコンビナーゼ／プライマーフィラメントは、テンプレートＤＮＡを相同配列（赤色／青色）について走査する。鎖置換に続いて、置換された鎖はｇｐ３２（緑色）によって結合され、プライマーはＢｓｕポリメラーゼ（青色）によって伸長させられる。対向するプライマーの繰り返しの結合／伸長イベントは、指数関数的ＤＮＡ増幅を生じさせる。
【０１０５】
リコンビナーゼ／プライマーフィラメント形成の動態は、図１２Ｂに示されている。ＡＴＰの存在下では、ｕｖｓＸ（灰色）はオリゴヌクレオチド（赤色、上）へ協調的に結合する。ＡＴＰ加水分解が起こると、核タンパク質複合体は分解し（左）、ｕｖｓＸはｇｐ３２（緑色、右）によって置換される可能性がある。ｕｖｓＹおよびＣａｒｂｏｗａｘ２０Ｍの存在は、リコンビナーゼ付加に好都合なように平衡を移動させる。
【０１０６】
典型的なＲＰＡ反応の結果は、ＳＴＲマーカーのためのプライマーを用いたＲＰＡ反応のＰＡＧＥである図１２Ｃに示されている。２つの個体（１／２、父／息子）由来のゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用した。ときどき（Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１６Ｓ５３９）、全長産物の低レベル量のダイマー形（星印）を観察することができる。
【０１０７】
ＲＰＡ反応をリアルタイムで監視する能力は、図１２Ｄに示されている。図１２Ｄでは、枯草菌ＳｐｏＢ遺伝子座のためのプライマーを用いたリアルタイムＲＰＡが、反応液の蛍光を監視することによって監視された。新生産物内へのＳｙｂｒＧｒｅｅｎＩの挿入後の蛍光が検出される。５×１０５（黒色）、５×１０４（赤色）、５×１０３（黄色）、５００（緑色）もしくは５０コピー（紫色）での枯草菌ＤＮＡまたは水（青色）がテンプレートとして機能した。増幅の開始は、開始時テンプレートコピー数の対数に線形に依存する（差込図を参照；時間（増殖曲線の中点）対、対数［テンプレート濃度］）。
【０１０８】
（実施例３：ラテラルフロー・ストリップを用いたＲＰＡアンプリコンの検出）
本発明者らは、ＲＰＡアンプリコンを検出するためにラテラルフロー・ストリップテクノロジーを使用する方法を考案した。この方法は、特異的抗体を使用して、２種の抗原性標識を含有する複合体を固定化かつ検出する（図１３Ａ）。手短には、標的核酸は２種の相違するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅させられるが、このとき各プライマーは相違する標識もしくは抗原を有する。そこで、生成したすべてのアンプリコンは２種の標識もしくは抗原に結合するであろう（すなわち、二重標識アンプリコン）。
【０１０９】
二重標識アンプリコンの存在を検出するためには、これらのアンプリコンを含有することが疑われるサンプル、２種の標識中の１つ（この場合には、この標識は抗原である）を認識する抗体に結合させた可視（金）粒子中に浸漬したパッド（図１３Ｃ）。複合体は、次にメンブレンを通ってバッファー流中を移動し、追加の固定化された抗体が第２抗原（Ｉｄ．）を捕捉する。抗原がＤＮＡ二本鎖中で結合させられると、ストリップ上の規定の場所に着色されたラインが現れる。本発明者らのプローブ検出系の変形では、本発明者らは、ＲＰＡアンプリコン中のビオチン−およびＦＡＭ−担持オリゴヌクレオチドを結合す
ることによってそのような二重抗原複合体を作製した（図３Ｂ）。５’−ビオチン化プライマーおよびその対向する対応物は、プローブ結合のための標的の十分な増幅を保証する。５’−ＦＡＭ標識、内部ＴＨＦおよび３’−ブロック基を含むプローブは、結合するとＮｆｏによって切断され、Ｂｓｕによる鎖延長のための３’ＯＨ基質を生成する。プローブ残余の伸長は、それとビオチン標識鎖との相互作用を安定化させ、ビオチンおよびＦＡＭ両方を含有するアンプリコンを生成する。ＴＨＦ／３’−ブロックは、Ｎｆｏによる真生二本鎖のプロセッシングは臨界的なプルーフリーディング工程を付け加えるので、プライマーアーチファクトを含有するビオチン／ＦＡＭの産生を防止する。サンプルをラテラルフロー・ストリップに適用した後に、ビオチン／ＦＡＭアンプリコンはＦＡＭ検出ライン上に可視シグナルを発生するであろうが、結合した複合体を作製できないＲＰＡ反応は可視シグナルを発生しないであろう。本発明者らは、図１０Ｅに使用した１つのアプローチに類似する多重アプローチを使用して、１０コピーの３つのＭＲＳＡ対立遺伝子各々を検出してそれらをＭＳＳＡから識別した（図３Ｃ）。
【０１１０】
数多くの研究および臨床適用は、本明細書に開示したＲＰＡおよび様々な検出方法を使用することから利益を得ることができよう。例えば、ＲＰＡは、非研究室用器具を開発するための重要な突破口を提供する。ハンドヘルド型機器もしくは完全に機器を使用しないＤＮＡ検出システムと統合すれば、ＲＰＡは、様々な病原体のための簡便な試験システムならびに他の適用のための現場用キットを可能にするであろう。
【０１１１】
（材料および方法）
（タンパク質およびＤＮＡ）
ｕｖｓｘ、ｕｖｓｙ、ｇｐ３２、ＢｓｕおよびＮｆｏについてのコーディング配列は、ゲノムＤＮＡ（ＤＳＭＺ、ドイツ）から増幅させ、ヘキサヒスチジンタグ（ｕｖｓＹ、ＢｓｕおよびＮｆｏについてはＮ末端、ｕｖｓＸおよびｇｐ３２についてはＣ末端）へ縮合させ、適切な発現ベクター内へクローニングした。過剰発現および精製は、ニッケル−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて標準プロトコールによって実施した。
【０１１２】
ヒトＤＮＡは血液から精製し（Ｗｉｚａｒｄ−Ｇｅｎｏｍｉｃ精製キット、Ｐｒｏｍｅｇａ社）、枯草菌ＤＮＡはＡＴＣＣ（米国）から入手し、黄色ブドウ球菌ＤＮＡはＪｏｄｉ  Ｌｉｎｄｓａｙ氏から贈答された。黄色ブドウ球菌対立遺伝子は、ＥＭＲＳＡ−３（ＳＣＣｍｅｃタイプＩ；ＭＲＳＡＩ）、ＥＭＲＳＡ−１６（ＭＲＳＡＩＩ）、ＥＭＲＳＡ−１（ＭＲＳＡＩＩＩ）および野生型ＭＳＳＡ（１２）であった。配列についての補遺情報を参照されたい。
【０１１３】
（ＲＰＡ条件）
反応は３７℃で６０分間、または指示したように実施した。標準条件は、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．４）、８０ｍＭの酢酸カリウム、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、２ｍＭのＤＴＴ、５％のＣａｒｂｏｗａｘ  ２０Ｍ、２００μＭのｄＮＴＰ、３ｍＭのＡＴＰ、２０ｍＭのホスホクレアチン、１００ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、２０ｎｇ／μＬのＢｓｕであった。対照的に、ＭＲＳＡの増幅は、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．９）、１００ｍＭの酢酸カリウム、１４ｍＭの酢酸マグネシウムで実施した；多重実験でのＣａｒｂｏｗａｘ２０Ｍは５．５％であった。ｇｐ３２／ｕｘｓＸ／ｕｖｓＹの濃度（単位：ｎｇ／μＬ）は、６００／２００／６０（ＳＴＲ実験）、６００／１２０／３０（枯草菌実験）または９００／１２０／３０（ＭＲＳＡ実験）であった。プライマーは、５００ｎＭのｓｃｃＩＩＩ、１００ｎＭのｏｒｆＸ（ＭＲＳＡＩＩＩ実験）もしくは２６５ｎＭのｓｃｃＩ／ＩＩ、２６５ｎＭのｓｃｃＩＩＩ、７０ｎＭのｏｒｆＸ（多重実験）または２４０ｎＭのＢｉｏｓｃｃｌ／ＩＩ、２４０ｎＭのＢｉｏ−ｓｃｃＩＩＩ、１２０ｎＭのｏｒｆＸ（ラテラルフロー・ストリップ実験）を使用したＭＲＳＡ増幅を除いて、各３００ｎＭで使用した。反応量は、ＳＴＲ実験（４０μＬ）および枯草菌実験（５０μＬ）を除
いて、２０μＬであった。
【０１１４】
（リアルタイムモニタリング）
リアルタイムＲＰＡは、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎＩ（１：５００００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ社）または蛍光体／クエンチャープローブ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社）の存在下で、プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ  Ｆｌｘ−８００）内で実施した。３種のプローブを使用した：
【０１１５】
【化１１】
2020120678.tif 000013
ここで（Ｔ）はｄＴ−ＴＡＭＲＡ、（Ｆ）はｄＴ−フルオレセイン、（Ｈ）はＴＨＦ、（ｑ１）はｄＴ−ＢＨＱ１、（ｑ２）はｄＴ−ＢＨＱ２、（ｑ３）はｄＴ−ＤＤＱ１である。プローブは、６０ｎＭのＳＡＴａｍｒａ１（ＭＲＳＡＩＩＩ実験）もしくは４５ｎＭのＳＡＴａｍｒａ１、４５ｎＭのＳＡＴａｍｒａ２、６０ｎＭのＢＳＦｌｃ（多重実験）を使用した。Ｎｆｏは２００ｎｇ／μＬで使用した。励起／検出は、４８５／５２５ｎｍ（ＳｙｂｒＧｒｅｅｎＩ、ＢＳＦｌｃ）または５３０／５７５ｎｍ（ＳＡＴａｍｒａ１／２）で実施した。測定値は、３０秒間もしくは４５秒間（多重実験）毎に入手した。蛍光プローブデータは、水コントロールおよび調整した増幅前ベースライン値に対して標準化した。読み出し値の対数を反応時間に対してプロットした。
【０１１６】
（ラテラルフロー・ストリップ検出）
ラテラルフロー・ストリップ実験のためには２種のプローブを各７５ｎＭで使用した：
【０１１７】
【化１２】
2020120678.tif 000014
ｓｃｃＩ／ＩＩおよびｓｃｃＩＩＩの５’−ビオチン化形をプライマーとして利用した。製造業者の取扱説明書にしたがって、各反応液（２０μＬ）に対して１μＬを５μＬのランニングバッファー（ＰＢＳ／３％のＴｗｅｅｎ）で希釈し、ＨｙｂｒｉＤｅｔｅｃｔ−ストリップ（Ｍｉｌｅｎｉａ社）へ直接塗布した。
【０１１８】
ラテラルフロー・ストリップ検出の結果は、図１３Ｃに示されている。反応液は、テンプレートとして（左から右へ）１０コピーのＭＲＳＡＩＩＩ、１０コピーのＭＲＳＡＩＩ、１０コピーのＭＲＳＡＩもしくは１０，０００コピーのＭＳＳＡ（陰性コントロール）を含有していた。陽性シグナルは、最初の３つの反応において発生する（矢印）。
【０１１９】
（実施例４：ＲＰＡのための最適条件の分析）
（ＲＰＡ条件）
ＲＰＡは、リコンビナーゼ−オリゴヌクレオチド複合体の形成を支持する反応環境の確立に依存する。このプロセスはＡＴＰ依存性であるので（Ｆｏｒｍｏｓａら、１９８６）、持続性活性のためにエネルギー再生システムを必要とする。この実験では、本発明者らは、それらが増幅性能に及ぼす影響を決定するためにＲＰＡ反応混合液の重要な成分を滴
定した。結果は、図１４に示されている。図１４は、ヒトＳｒｙ遺伝子座のためのプライマーを用いたＲＰＡ反応のポリアクリルアミドゲル電気泳動を示している。反応は、３７℃で１２０分間にわたり実施し、所定の成分が試験下にある場合を除いて、３００ｎＭのプライマーｓｒｙ３およびｓｒｙ４、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．４）、８０ｍＭの酢酸カリウム、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、２ｍＭのＤＴＴ、３ｍＭのＡＴＰ、２００μＭのｄＮＴＰ、２０ｍＭのホスホクレアチン、１００ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、５％のＣａｒｂｏｗａｘ２０Ｍ、６００ｎｇ／μＬのｇｐ３２、２００ｎｇ／μＬのｕｖｓＸ、６０ｎｇ／μＬのｕｖｓＹおよび２０ｎｇ／μＬのＢｓｕを含有していた。この特定標的を効果的に増加させるためのｇｐ３２（図１４Ａ）、ｕｖｓＹ（図１４Ｂ）、ｕｖｓＸ（図１４Ｃ）、Ｃａｒｂｏｗａｘ２０Ｍ（図１４Ｄ）、ＡＴＰ（図１４Ｅ）およびＢｓｕ（図１４Ｆ）の最適量を決定した。（Ｇ）ＡＤＰ−（Ｒ）−Ｓおよび（Ｈ）ＡＴＰ−（ｃ）−Ｓは反応を阻害する。１，５００コピー／μＬのヒトＹ染色体ＤＮＡは３０μＬ（１サンプルに付き同等の１０μＬ反応量をゲル上に装填した）の反応液中でテンプレートとして機能した。
【０１２０】
ＲＰＡは、相当に広範囲の試薬濃度にわたって確実に作用することが実証された。しかし本発明者らは、最適反応条件が様々なプライマー対間で変動すること、このために個別に規定しなければならないことを見いだした。
【０１２１】
（プライマーの必要条件）
本発明者らは、ＲＰＡを使用して広範囲の標的を増幅させた。プライマーの設計は配列組成自体の制限を明らかにしなかったが、オリゴヌクレオチドがＲＰＡに適合するために所定のパラメーターが満たされなければならない。本発明者らは、これらのパラメーターを図１５に示した実験において調査した。図１５は、ヒトアポリポタンパク質Ｂ遺伝子座のためのプライマーを用いたＲＰＡ反応のアガロースゲル電気泳動を示している。プライマーＡｐｏＢ４は、指示したサイズの産物を生成できる対向するプライマーと結合された。反応は３７℃で１２０分間実施し、使用した条件は、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．４）、８０ｍＭの酢酸カリウム、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、２ｍＭのＤＴＴ、３ｍＭのＡＴＰ、２００μＭのｄＮＴＰ、２０ｍＭのホスホクレアチン、１００ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、５％のＣａｒｂｏｗａｘ２０Ｍ、６００ｎｇ／μＬのｇｐ３２、１２５ｎｇ／μＬのｕｖｓＸ、２５ｎｇ／μＬのｕｖｓＹおよび２０ｎｇ／μＬのＢｓｕであった。４５０コピーのヒトＤＮＡを３０μＬ（１サンプルに付き同等の１０μＬ反応量をゲル上に装填した）の反応液中でテンプレートとして使用した。３００ｂｐアンプリコンの一部を２×および３×ユニット長へ変換させて一部のヘアピン媒介性産物複製が発生したことに留意されたい（＊）。ＲＰＡは１，５００ｂｐ以上のアンプリコンを生成できなかった。この実験は、使用した条件下でのアンプリコンサイズがほぼ１ｋｂに限定されることを証明している。
【０１２２】
ヒトゲノムＤＮＡ内の３つの独立遺伝子座（アポリポタンパク質Ｂ、ＳＴＲ  Ｄ１８Ｓ５１、Ｓｒｙ）のためのプライマーを用いたＲＰＡ反応のポリアクリルアミドゲル電気泳動が示されている。プライマーは、指示したように２５、２８、もしくは＞３１塩基であった。反応は３７℃で１２０分間実施した。使用した条件は、５０ｍＭのＴｒｉｓ／Ｃｌ（ｐＨ８．４）、８０ｍＭの酢酸カリウム、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、２ｍＭのＤＴＴ、３ｍＭのＡＴＰ、２００μＭのｄＮＴＰ、２０ｍＭのホスホクレアチン、１００ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、５％のＣａｒｂｏｗａｘ２０Ｍ、６００ｎｇ／μＬのｇｐ３２、２００ｎｇ／μＬのｕｖｓＸおよび６０ｎｇ／μＬのｕｖｓＹ、および２０ｎｇ／μＬのＢｓｕポリメラーゼであった。３，０００コピーの標的は３０μＬ（１サンプルに付き同等の１０μＬ反応量をゲル上に装填した）の反応液中でテンプレートとして使用した。ＲＰＡを支持するためには＞２８塩基のプライマー長が必要とされるという所見は、様々なオリゴヌクレオチドサイズでｕｖｓＸ−オリゴヌクレオチドフィラメントのＡＴＰ
加水分解活性を調査した報告書と良好に一致している（Ｈｕｌｅｔｓｋｙら、２００４を参照）。
【０１２３】
プライマーの最小長は、約３０ヌクレオチドであることが実証された（図１６）。本発明者らは、それらの対応物に比較して配列は相違するが長さおよび位置は類似であるオリゴヌクレオチドの性能における変動性を観察した。特定のＲＰＡプライマーの品質にヌクレオチド配列が及ぼす影響を支配する法則は、現時点では調査中である。
【０１２４】
（コントロールＤＮＡ）
図２Ｃに示した実験において陰性コントロールとして機能する野生型黄色ブドウ球菌ＤＮＡ（ＭＳＳＡ）（Ｅｎｒｉｇｈｔら、２００２；Ｈｕｌｅｔｓｋｙら、２００４を参照）は、プライマー対であるｏｒｆＸ／ｍｓｓａと結合した場合にＲＰＡのためのテンプレートとして機能する（図１６）。
【０１２５】
（参考文献）
【０１２６】
【化１３】
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【０１２７】
【化１４】
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【０１２８】
【化１５】
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【０１２９】
【化１６】
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【０１３０】
【化１７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年6月9日(2020.6.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)少なくとも１つのリコンビナーゼ、
(b)少なくとも１つのポリメラーゼ、
(c)標的核酸
(d)第１および第２核酸プライマー、及び
(e)３’末端に伸長ブロック基を含む伸長ブロック化オリゴヌクレオチド、
該標的核酸に非相補的な、少なくとも１つの内部残基、
テトラヒドロフラン残基及びＤ−スペーサーからなる群から選択される修飾された内部残基、及び蛍光体及びクエンチャー、
を含む組成物。
【請求項２】
さらにヌクレアーゼを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ヌクレアーゼが、ＤＮＡグリコシラーゼ又はＡＰエンドヌクレアーゼである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
少なくとも１つの内部残基がウラシル又はイノシン残基である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
３’末端の伸長ブロック基がポリメラーゼ伸長を阻害する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
少なくとも１つのリコンビナーゼが、少なくとも１つのプライマーと接触する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
さらに密集剤を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
さらに一本鎖結合タンパク質及び／又はリコンビナーゼ負荷タンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
リコンビナーゼがUvsXであり、一本鎖結合タンパク質がgp32であり、及びリコンビナーゼ負荷タンパク質がUvsYである、請求項８に記載の組成物。
【外国語明細書】
2020120678000001.pdf