(57)【要約】【課題】血液中のがん細胞を親水性ポリマー層に捕捉し、免疫ペルオキシダーゼ法で染色する場合において、親水性ポリマーを溶解させることなく、血液中の内因性ペルオキシダーゼを不活性化できるがん細胞の染色方法を提供することを目的とする。【解決手段】血液中のがん細胞を親水性ポリマー層に捕捉する工程と、過酸化水素及びアジ化ナトリウムを用いて、前記血液中の内因性ペルオキシダーゼを不活性化する工程と、前記がん細胞を免疫ペルオキシダーゼ法によって染色する工程とを含むがん細胞の染色方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液中のがん細胞を親水性ポリマー層に捕捉する工程と、
過酸化水素及びアジ化ナトリウムを用いて、前記血液中の内因性ペルオキシダーゼを不活性化する工程と、
前記がん細胞を免疫ペルオキシダーゼ法によって染色する工程とを含むがん細胞の染色方法。
【請求項２】
前記免疫ペルオキシダーゼ法は、直接免疫ペルオキシダーゼ法である請求項１記載のがん細胞の染色方法。
【請求項３】
前記血液は、濃縮処理を施したものである請求項１又は２記載のがん細胞の染色方法。
【請求項４】
前記血液は、治療前の患者から採取したものである請求項１〜３のいずれかに記載のがん細胞の染色方法。
【請求項５】
前記親水性ポリマー層は、下記式（Ｉ）で表されるポリマー及びポリ（メタ）アクリロイルモルホリンからなる群より選択される少なくとも１種の親水性ポリマーで形成されている請求項１〜４のいずれかに記載のがん細胞の染色方法。
【化１】
2020141616.tif 000006
（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基、Ｒ２はアルキル基を表す。ｍは１〜５、ｎは繰り返し数を表す。）
【請求項６】
前記親水性ポリマー層は、下記式（Ｉ−１）で表される化合物及び（メタ）アクリロイルモルホリンからなる群より選択される少なくとも１種の親水性モノマーと、他のモノマーとの共重合体で形成されている請求項１〜４のいずれかに記載のがん細胞の染色方法。
【化２】
2020141616.tif 000007
（式中、Ｒ１、Ｒ２、ｍは前記と同様。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液中のがん細胞の染色方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん細胞が発生するとやがて、血液・体液中に出て来ることが知られており、血液中に出て来たがん細胞は、血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）と呼ばれている。そして、この血中循環腫瘍細胞を調べることによるがんの治療効果の確認、予後寿命、投与前の抗がん剤の効果予測、がん細胞の遺伝子解析を用いた治療方法の検討、等が期待されている。
【０００３】
ＣＴＣの捕捉方法として、例えば、特許文献１では、親水性ポリマー層にＣＴＣを捕捉する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１８−５０５４８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１では、親水性ポリマー層に捕捉したがん細胞を、蛍光抗体法によって染色し、観察している（特許文献１の［００５３］）。しかしながら、蛍光抗体法は、１０日〜２週間程度で染色が消失してしまう、観察時のバックグラウンドの影響が大きい、暗視野顕微鏡を用いるため背景組織の観察が困難である、といった点で改善の余地があった。
【０００６】
そこで、本発明者らが他の染色方法を検討したところ、酵素抗体法の一種である免疫ペルオキシダーゼ法に着目した。免疫ペルオキシダーゼ法では、ペルオキシダーゼ（酵素）で標識された抗体をがん細胞（抗原）に結合させた後、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）等の基質とペルオキシダーゼとを反応させることで、がん細胞を染色する。この方法は、蛍光抗体法と比較して、染色を長時間保持できる、観察時のバックグラウンドの影響が小さい、明視野顕微鏡を用いるため背景組織の観察が容易、といった利点がある。しかしながら、本発明者らが更に検討を進めたところ、以下の課題を見出した。
【０００７】
血液中のがん細胞を免疫ペルオキシダーゼ法で染色する場合、予め、血液中のペルオキシダーゼ（内因性ペルオキシダーゼ）を不活性化（ブロック）する必要がある。この不活性化は、通常、過酸化水素及びメタノールを用いて実施されるが、特許文献１に記載されたポリ２−メトキシエチルアクリレート（ＰＭＥＡ）等の親水性ポリマーは、メタノールで溶解する。そのため、特許文献１の方法において、蛍光抗体法の代わりに免疫ペルオキシダーゼ法を適用した場合、メタノールによって親水性ポリマーが溶解し、親水性ポリマー層に捕捉されたがん細胞が流れ出てしまうという点で改善の余地があった。
【０００８】
本発明は、前記課題を解決し、血液中のがん細胞を親水性ポリマー層に捕捉し、免疫ペルオキシダーゼ法で染色する場合において、親水性ポリマーを溶解させることなく、血液中の内因性ペルオキシダーゼを不活性化できるがん細胞の染色方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記課題を解決すべく本発明者らが更に検討を進めた結果、メタノールに代えてアジ化ナトリウムを用いることで、親水性ポリマーを溶解させることなく、血液中の内因性ペルオキシダーゼを不活性化できることを見出し、本発明に想到した。
すなわち、本発明は、血液中のがん細胞を親水性ポリマー層に捕捉する工程と、過酸化水素及びアジ化ナトリウムを用いて、前記血液中の内因性ペルオキシダーゼを不活性化する工程と、前記がん細胞を免疫ペルオキシダーゼ法によって染色する工程とを含むがん細胞の染色方法に関する。
【００１０】
前記免疫ペルオキシダーゼ法は、直接免疫ペルオキシダーゼ法であることが好ましい。
【００１１】
前記血液は、濃縮処理を施したものであることが好ましい。
【００１２】
前記血液は、治療前の患者から採取したものであることが好ましい。
【００１３】
前記親水性ポリマー層は、下記式（Ｉ）で表されるポリマー及びポリ（メタ）アクリロイルモルホリンからなる群より選択される少なくとも１種の親水性ポリマーで形成されていることが好ましい。
【化１】
2020141616.tif 000002
（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基、Ｒ２はアルキル基を表す。ｍは１〜５、ｎは繰り返し数を表す。）
【００１４】
前記親水性ポリマー層は、下記式（Ｉ−１）で表される化合物及び（メタ）アクリロイルモルホリンからなる群より選択される少なくとも１種の親水性モノマーと、他のモノマーとの共重合体で形成されていることが好ましい。
【化２】
2020141616.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２、ｍは前記と同様。）
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、血液中のがん細胞を親水性ポリマー層に捕捉する工程と、過酸化水素及びアジ化ナトリウムを用いて、前記血液中の内因性ペルオキシダーゼを不活性化する工程と、前記がん細胞を免疫ペルオキシダーゼ法によって染色する工程とを含むがん細胞の染色方法であるため、親水性ポリマーを溶解させることなく、血液中の内因性ペルオキシダーゼを不活性化できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例で染色されたがん細胞の顕微鏡画像。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、血液中のがん細胞を親水性ポリマー層に捕捉する工程（捕捉工程）と、過酸化水素及びアジ化ナトリウムを用いて、前記血液中の内因性ペルオキシダーゼを不活性化する工程（不活性化工程）と、前記がん細胞を免疫ペルオキシダーゼ法によって染色する工程（染色工程）とを含むがん細胞の染色方法である。
【００１８】
上記方法では、血液中の内因性ペルオキシダーゼを不活性化する際、従来使用されていたメタノールに代えて、アジ化ナトリウムを使用する。これにより、親水性ポリマーを溶解させることなく、内因性ペルオキシダーゼを不活性化できる。そして、免疫ペルオキシダーゼ法によってがん細胞の染色を行うことで、蛍光抗体法と比較して、がん細胞やその背景組織の観察が容易であり、かつ長期保存が可能な試料を調製することができる。
【００１９】
以下、上記方法を工程毎に説明する。
【００２０】
（捕捉工程）
この工程では、血液中のがん細胞を親水性ポリマー層に捕捉する。これは、例えば、血液と親水性ポリマー層とを接触させることで実施できる。
【００２１】
親水性ポリマー層には、がん細胞は捕捉されるが、赤血球、白血球、血小板等の血球細胞は捕捉（吸着）されにくい。そのため、血液と親水性ポリマー層とを接触させた後に所定時間放置し、次いで、必要に応じてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等で洗浄することで、がん細胞を選択的に親水性ポリマー層に捕捉することができる。
【００２２】
血液と親水性ポリマー層との接触方法は特に限定されないが、例えば、親水性ポリマー層への血液の注入、滴下、噴霧等が挙げられる。
【００２３】
血液は、親水性ポリマー層に接触させる前に、濃縮処理を施すことが好ましい。濃縮処理により、血球細胞を減少させ、血液中のがん細胞の割合を高めることで、より多くのがん細胞を親水性ポリマー層に捕捉させることができる。濃縮処理の方法は特に限定されないが、遠心分離が好ましく、濃度勾配遠心分離がより好ましい。濃度勾配遠心分離は、例えば、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ社のＯｎｃｏＱｕｉｃｋ（登録商標）によって行うことができる。
【００２４】
なお、手術や化学療法等の治療を行った場合、通常、血液中のがん細胞は減少する。そのため、より多くのがん細胞を捕捉するためには、治療前の患者から採取した血液を使用することが好ましい。
【００２５】
親水性ポリマー層（親水性ポリマーにより形成される層）は、所定の基材に形成できる。基材としては、ポリアクリル酸メチル、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸等のアクリル樹脂（ポリアクリル樹脂）、シクロオレフィン樹脂（ポリシクロオレフィン）、カーボネート樹脂（ポリカーボネート）、スチレン樹脂（ポリスチレン）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）等のポリエステル樹脂、ポリジメチルシロキサン、ソーダ石灰ガラス、ほうケイ酸ガラス等のガラス、等が挙げられる。
【００２６】
親水性ポリマー層（親水性ポリマーにより形成される層）の膜厚は、好ましくは１０〜５００ｎｍ、より好ましくは３０〜４００ｎｍ、更に好ましくは５０〜３５０ｎｍである。上記範囲内に調整することで、がん細胞に対する選択的捕捉性が良好となる。
【００２７】
親水性ポリマーは、親水性を有するものを適宜選択できる。例えば、１種又は２種以上の親水性モノマーの単独重合体及び共重合体、１種又は２種以上の親水性モノマーと他のモノマーとの共重合体等が挙げられる。前記単独重合体、共重合体としては、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸エステル、ポリアクリロイルモルホリン、ポリメタクリロイルモルホリン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド等が挙げられる。
【００２８】
親水性モノマーは、親水性基を有する各種モノマーを使用できる。親水性基は、例えば、アミド基、硫酸基、スルホン酸基、カルボン酸基、水酸基、アミノ基、アミド基、オキシエチレン基等、公知の親水性基が挙げられる。
【００２９】
親水性モノマーの具体例としては、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸エステル、（メトキシエチル（メタ）アクリレート等のアルコキシアルキル（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート等のヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート）、（メタ）アクリルアミド、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体（（メタ）アクリロイルモルホリン等）、などが挙げられる。なかでも、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸エステル、アルコキシアルキル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリロイルモルホリンが好ましく、アルコキシアルキル（メタ）アクリレートがより好ましく、２−メトキシエチルアクリレートが特に好ましい。
【００３０】
他のモノマーは、親水性ポリマーの作用効果を阻害しない範囲内で適宜選択すれば良い。例えば、スチレン等の芳香族モノマー、酢酸ビニル、温度応答性を付与できるＮ−イソプロピルアクリルアミドなどが挙げられる。
【００３１】
なかでも、親水性ポリマーとしては、下記式（Ｉ）で表されるポリマー及びポリ（メタ）アクリロイルモルホリンからなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。
【化３】
2020141616.tif 000004
（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基、Ｒ２はアルキル基を表す。ｍは１〜５、ｎは繰り返し数を表す。）
【００３２】
Ｒ２のアルキル基の炭素数は、１〜１０が好ましく、１〜５がより好ましい。なかでも、Ｒ２は、メチル基又はエチル基が特に好ましい。ｍは、１〜３が好ましい。ｎ（繰り返し単位数）は、１５〜１５００が好ましく、４０〜１２００がより好ましい。
【００３３】
また、親水性ポリマーとして、下記式（Ｉ−１）で表される化合物及び（メタ）アクリロイルモルホリンからなる群より選択される少なくとも１種の親水性モノマーと、他のモノマーとの共重合体も好適に使用できる。
【化４】
2020141616.tif 000005
（式中、Ｒ１、Ｒ２、ｍは前記と同様。）
【００３４】
親水性ポリマー層が形成された基材は、特開２０１８−５０５４８号公報に記載の方法等、公知の手法により、基材表面の全部又は一部に親水性ポリマー溶液・分散液をコーティングすることで、製造することができる。このような基材として、例えば、マルチウェルプレート、スライドチャンバー（チャンバー付スライドガラス）等が挙げられる。
【００３５】
親水性ポリマー層には、予め、フィブロネクチンを吸着させていてもよい。フィブロネクチンが吸着した親水性ポリマー層に血液を接触させることで、親水性ポリマー層により多くのがん細胞を捕捉することが可能となる。
【００３６】
捕捉工程後は、必要に応じて、ホルムアルデヒド等によるがん細胞の組織の固定化や、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ（オクチルフェノールエトキシレート）等の非イオン性界面活性剤によるがん細胞の細胞膜の透過処理等を実施した後、不活性化工程に移行する。
【００３７】
（不活性化工程）
この工程では、過酸化水素及びアジ化ナトリウムを用いて、前記血液中の内因性ペルオキシダーゼを不活性化する。これは、例えば、捕捉工程を経た親水性ポリマー層を、過酸化水素及びアジ化ナトリウムの混合液と接触させ、所定の時間（５〜３０分程度）反応させることで実施できる。反応は、遮光下、室温（１〜３０℃程度）で行うことが好ましい。
【００３８】
親水性ポリマー層と上記混合液との接触方法は特に限定されないが、例えば、親水性ポリマー層への上記混合液の注入、滴下、噴霧等が挙げられる。また、親水性ポリマー層が形成された基材を上記混合液中に浸漬させてもよい。
【００３９】
上記混合液は、例えば、蒸留水にアジ化ナトリウムを溶解させた後、過酸化水素水溶液と混合することで調製することができる。上記混合液において、過酸化水素の濃度やアジ化ナトリウムの濃度は特に限定されず、不活性化を達成できる範囲で適宜変更可能である。
【００４０】
不活性化工程後は、必要に応じて、洗浄や、血清ブロッキング等を実施した後、染色工程に移行する。
【００４１】
（染色工程）
この工程では、がん細胞を免疫ペルオキシダーゼ法で染色する。免疫ペルオキシダーゼ法には、直接免疫ペルオキシダーゼ法（直接法）、間接免疫ペルオキシダーゼ法（間接法）の二種類がある。直接免疫ペルオキシダーゼ法は、ペルオキシダーゼで標識した一次抗体により、抗原抗体反応を一度だけ行うものであり、間接免疫ペルオキシダーゼ法は、標識していない一次抗体で抗原抗体反応を行った後、ペルオキシダーゼで標識した別の抗体で更に抗原抗体反応を行うものである。
【００４２】
間接免疫ペルオキシダーゼ法は、発色のシグナルを増幅させることができるが、抗原抗体反応を実施する都度洗浄が必要で、洗浄によって親水性ポリマー層に捕捉されたがん細胞が離脱してしまうおそれがあり、また、処理に時間がかかる。一方、直接免疫ペルオキシダーゼ法は、抗原抗体反応を一度しか行わないため、洗浄の回数が少なく、また、間接免疫ペルオキシダーゼ法と比較して、短時間で処理できる。そのため、上記方法では、直接免疫ペルオキシダーゼ法で染色することが好ましい。
【００４３】
直接免疫ペルオキシダーゼ法は、例えば、不活性化工程を経た親水性ポリマー層に、ペルオキシダーゼが結合した抗体（一次抗体）を添加し、所定の時間（１５〜６０分程度）反応させてから、洗浄した後、発色基質を更に添加し、所定の時間（１〜１０分程度）反応させることで実施できる。これらの反応は、遮光下、室温（１〜３０℃程度）で行うことが好ましい。
【００４４】
抗体は、がん細胞と反応し、血球細胞と反応しないものであればよく、ＥｐＣＡＭ、ＣＫ等を使用できる。細胞膜の透過処理が不要となるという点からは、ＥｐＣＡＭが好ましい。
また、抗体に結合させるペルオキシダーゼは、西洋わさび由来のペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等を使用できる。
【００４５】
発色基質としては、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、Ｃｏ−ＤＡＢ等を使用することができる。
【００４６】
染色工程後、必要に応じて、洗浄、ヘマトキシリン等による対比染色（後染色、核染色）、脱水、封入等を実施することで、がん細胞が染色された試料が得られる。
【００４７】
得られた試料は、がん細胞やその背景組織の観察が容易であり、かつ長期保存が可能である。そのため、この試料を観察することで、がん細胞の確定診断を簡便に行うことができる。
【実施例】
【００４８】
実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【００４９】
（検査器具の作製）
ＡＩＢＮ（アゾビスイソブチロニトリル）を用いて、２−メトキシエチルアクリレートを８０℃で６時間熱重合し、ポリ２−メトキシエチルアクリレートを作製した（分子量Ｍｎ：約１５０００、Ｍｗ：約５００００）。そして、得られたポリ２−メトキシエチルアクリレートの０．２５Ｗ／Ｖ％メタノール溶液を作製した。
チャンバー付スライドガラスに、作製したポリ２−メトキシエチルアクリレート溶液（０．２５Ｗ／Ｖ％）を注入し、乾燥させることで、親水性ポリマー層を作製した。ＴＥＭ観察で測定した親水性ポリマー層の膜厚は１３５ｎｍであった。
次いで、ポリ２−メトキシエチルアクリレートがコーティングされた部分（親水性ポリマー層）にフィブロネクチンを吸着させ、４０℃で１時間放置した後、ＰＢＳで洗浄することで、検査器具を作製した。
【００５０】
（実施例）
大腸がんの患者から採取した血液を、ＯｎｃｏＱｕｉｃｋを用いて遠心分離し、がん細胞を分離（濃縮）した。次いで、がん細胞を含む分画を検査器具に注入し、室温で一晩放置した後、ＰＢＳで洗浄することで、がん細胞を選択的に親水性ポリマー層に捕捉した。
【００５１】
検査器具を乾燥させた後、１０Ｖ／Ｖ％ホルムアルデヒド水溶液に浸漬させ、室温で１０分間放置した。その後、ＰＢＳで洗浄した。
【００５２】
蒸留水２００ｍｌにアジ化ナトリウム２００ｍｇを溶解させた後、３０Ｖ／Ｖ％過酸化水素水溶液と混合した。得られた混合液中に検査器具を浸漬させ、遮光下、室温で１０分間放置して反応させることで、内因性ペルオキシダーゼを不活性化した。その後、ＰＢＳで洗浄した。
【００５３】
Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社のＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  Ｅｌｉｔｅ  Ｋｉｔを用いて作製した血清を検査器具に滴下し、血清ブロッキングを実施した。
【００５４】
ＨＲＰ（標識）が結合したＥｐＣＡＭ（抗体）をＰＢＳで希釈し、２００μｌずつ検査器具に滴下した。室温下で３０分間滴下し続けた後、ＰＢＳで洗浄した。次いで、ＤＡＢ（発色基質）を検査器具に滴下し、４分間放置して反応させることで、がん細胞を染色した。その後、流水で２分間洗浄した。
【００５５】
後染色（核染色）のため、ヘマトキシリンを検査器具に滴下し、１５秒放置した。その後、流水で３分間洗浄した。
【００５６】
水溶性の封入剤で封入することで、試料を作製した。
【００５７】
得られた試料を顕微鏡で観察し、図１に示す顕微鏡画像を得た。図１中の矢印で示した部分が、茶褐色に染色されたがん細胞である。
【図１】
2020141616.tif 000008