(57)【要約】【課題】心系統内の特定の細胞型、特に、心室細胞へと分化する前駆体細胞に偏向した心前駆体細胞を同定するマーカー；ｉｎ  ｖｉｖｏで心室筋細胞へと分化する心室前駆体を単離し、それによって、心機能を増強するための心室前駆体または心室筋細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ移植を可能にするための方法および組成物を提供する。【解決手段】本発明は、ヒト心前駆体細胞を単離するための細胞表面マーカーとしてのＪａｇｇｅｄ１（ＪＡＧ１）またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４（ＦＺＤ４）の使用を記載する。さらに、これらのヒト心前駆体細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、それらが心室筋細胞へと優勢に分化するように、心室系統に偏向する。即ち、これらの心前駆体細胞は、それらが心室系統に偏向され、したがって、ヒト心室前駆体（ＨＶＰ）細胞であるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの条件下で培養され得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１４年８月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／０４０，８９２号、および２０１５年７月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／１９４，０１６号に対して優先日の利益を主張する。これらの仮出願の内容はその全体が参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
主に心筋梗塞によって引き起こされる心不全は、世界中で成人および小児の両方における死亡の主要原因であり、世界中で指数関数的に増加している（Ｂｕｉ，  Ａ．Ｌ．ら（２０１１年）Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ８巻：３０〜４１頁）。この疾患は、心筋傷害中に起こる心室筋の喪失によって主に発生し（Ｌｉｎ，  Ｚ．およびＰｕ，  Ｗ．Ｔ．（２０１４年）Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．  ６巻：２３９ｒｖ１頁）、成体の心臓が再生応答を開始する無視できるほどの能力によって悪化する（Ｂｅｒｇｍａｎｎ，  Ｏ．ら（２００９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４巻：９８〜１０２頁；Ｓｅｎｙｏ，  Ｓ．Ｅ．ら（２０１３年）Ｎａｔｕｒｅ  ４９３巻：４３３〜４３６頁）。心臓移植は治癒上有効であり得るが、ヒト心臓臓器ドナーを入手できる可能性は著しく限定されているため、純粋で成熟した機能的なヒト心室筋組織の再生可能な供給源への広範な満たされていない臨床的な必要性が生じている（Ｓｅｇｅｒｓ，  Ｖ．Ｆ．Ｍ．およびＬｅｅ，  Ｒ．Ｊ．（２００８年）Ｎａｔｕｒｅ  ４５１巻：９３７〜９４２頁；Ｓｐａｔｅｒ，  Ｄ．ら（２０１４年）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １４１巻：４４１８〜４４３１頁）。
【０００３】
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、損傷したまたは病気の心臓における機能の潜在的な臨床的回復のために、多数の機能的心筋細胞を生成する潜在力を提供する。心機能を改善するためおよび／または損傷した心筋を富化もしくは再生するための、心臓中への幹細胞の移植が提案されている（例えば、米国特許出願公開第２００４０１８００４３号を参照のこと）。成体幹細胞が成長因子タンパク質による処置と組み合わせて投与される組合せ治療もまた、提案されている（例えば、米国特許出願公開第２００５０２１４２６０号を参照のこと）。
【０００４】
心臓中への細胞移植は、心機能を改善し心臓組織を再生するための有望なアプローチを提供するが、どの型の細胞を移植するかという問いが、かなりの調査の対象となってきた。心組織を再生する際の使用について調査された細胞の型には、骨髄細胞（例えば、Ｏｒｌｉｃ，  Ｄ．ら（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ  ４１０巻：７０１〜７０５頁；Ｓｔａｍｍ，  Ｃ．ら（２００３年）Ｌａｎｃｅｔ  ３６１巻：４５〜４６頁；Ｐｅｒｉｎ，  Ｅ．Ｃ．ら（２００３年）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０７巻：２２９４〜２３０２頁を参照のこと）、成体幹細胞（例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ，  Ｋ．Ａ．ら（２００１年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０７巻：１３９５〜１４０２頁を参照のこと）、骨髄由来間葉系幹細胞（例えば、Ｂａｒｂａｓｈ，  Ｉ．Ｍ．ら（２００３年）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０８巻：８６３頁；Ｐｅｔｔｉｎｇｅｒ，  Ｍ．Ｆ．およびＭａｒｔｉｎ，  Ｂ．Ｊ．（２００３年）Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．  ９５巻：９〜２０頁を参照のこと）、骨髄間質細胞（Ｂｉｔｔｉｒａ，  Ｂ．ら（２００３年）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ．  Ｓｕｒｇ．  ２４巻：３９３〜３９８頁）、間葉系幹細胞および胎児心筋細胞の組合せ（例えば、Ｍｉｎ，  Ｊ．Ｙ．ら（２００２年）Ａｎｎ．  Ｔｈｏｒａｃ．  Ｓｕｒｇ．  ７４巻：１５６８〜１５７５頁を参照のこと）ならびに骨髄由来単核細胞および骨髄由来間葉系幹細胞の組合せ（例えば、米国特許出願公開第２００８００３８２２９号を参照のこと）が含まれる。移植用の心幹細胞を生成するための、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの成体哺乳動物心筋細胞の脱分化もまた、提案されている（例えば、米国特許出願公開第２０１０００９３０８９号を参照のこと）。
【０００５】
心機能を改善し心臓組織を再生するための細胞移植のアプローチにおける顕著な進歩は、心筋細胞、心平滑筋および心内皮細胞を生じさせることが可能な多分化能性心前駆体細胞のファミリーの同定および単離であった（Ｃａｉ，  Ｃ．Ｌ．ら（２００３年）Ｄｅｖ．  Ｃｅｌｌ．  ５巻：８７７〜８８９頁；Ｍｏｒｅｔｔｉ，  Ａ．ら（２００６年）Ｃｅｌｌ  １２７巻：１１５１〜１１６５頁；Ｂｕ，  Ｌ．ら（２００９年）Ｎａｔｕｒｅ  ４６０巻：１１３〜１１７頁；米国特許出願公開第２００６０２４６４４６号）。これらの心前駆体細胞は、ＬＩＭホメオドメイン転写因子Ｉｓｌｅｔ１（Ｉｓｌ１）の発現を特徴とし、したがって、Ｉｓｌ１＋心前駆体細胞と呼ばれる（同書）。対照的に、Ｉｓｌ１は、分化した心細胞では発現されない。Ｉｓｌ１よりも分化のより後期で現れる、Ｉｓｌ１＋心前駆体細胞のさらなるマーカーが記載されており、これには、Ｎｋｘ２．５およびｆｌｋ１が含まれる（例えば、米国特許出願公開第２０１００１６６７１４号を参照のこと）。
【０００６】
Ｉｓｌ１＋心前駆体細胞の更新および分化は、Ｗｎｔ／ベータ−カテニンシグナル伝達経路によって調節されることが示されている（例えば、Ｑｙａｎｇ，  Ｙ．ら（２００７年）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．  １巻：１６５〜１７９頁；Ｋｗｏｎ，  Ｃ．ら（２００７年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０４巻：１０８９４〜１０８９９頁を参照のこと）。これは、多能性幹細胞がＩｓｌ１＋系統に入るように誘導するための方法、およびＷｎｔシグナル伝達のモジュレーションを介したＩｓｌ１＋集団の拡大増殖のための方法の開発をもたらしている（例えば、Ｌｉａｎ，  Ｘ．ら（２０１２年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０９巻：Ｅ１８４８〜５７頁；Ｌｉａｎ，  Ｘ．ら（２０１３年）Ｎａｔ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  ８巻：１６２〜１７５頁；米国特許出願公開第２０１１００３３４３０号；米国特許出願公開第２０１３０１８９７８５号を参照のこと）。
【０００７】
ヒト多能性幹細胞は大きな有望性を有するが、重要な課題は、多様な心細胞の単なる分化から、大規模の純粋な３Ｄ心室筋肉組織をｉｎ  ｖｉｖｏで形成することへと移る能力であり、これは最終的に、血管新生、細胞外マトリックスのアセンブリおよび整列、ならびに成熟化を必要とする。その目的のために、心細胞の多様な集団（房、心室、ペースメーカー）が、人工の脱細胞化マトリックスとカップリングされており（Ｍａｓｕｍｏｔｏ，  Ｈ．ら（２０１４年）Ｓｃｉ．  Ｒｅｐ．  ４巻：５７１６頁；Ｏｔｔ，  Ｈ．Ｃ．ら（２００８年）Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １４巻：２１３〜２２１頁；Ｓｃｈａａｆ，  Ｓ．ら（２０１１年）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６巻：ｅ２６３９７頁）、脈管細胞および導管（Ｔｕｌｌｏｃｈ，  Ｎ．Ｌ．ら（２０１１年）Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．  １０９巻：４７〜５９頁）ならびにｍｉｃｒｏＲＮＡのカクテル（Ｇａｍａ−Ｇａｒｖａｌｈｏ，  Ｍ．ら（２０１４年）Ｃｅｌｌｓ  ３巻：９９６〜１０２６頁）が研究されてきたが、その目標は依然としてとらえどころがない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／０２１４２６０号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００８／００３８２２９号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１０／００９３０８９号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００６／０２４６４４６号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２０１０／０１６６７１４号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２０１１／００３３４３０号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２０１３／０１８９７８５号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂｕｉ，  Ａ．Ｌ．ら（２０１１年）Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ８巻：３０〜４１頁
【非特許文献２】Ｌｉｎ，  Ｚ．およびＰｕ，  Ｗ．Ｔ．（２０１４年）Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．  ６巻：２３９ｒｖ１頁
【非特許文献３】Ｂｅｒｇｍａｎｎ，  Ｏ．ら（２００９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４巻：９８〜１０２頁
【非特許文献４】Ｓｅｎｙｏ，  Ｓ．Ｅ．ら（２０１３年）Ｎａｔｕｒｅ  ４９３巻：４３３〜４３６頁
【非特許文献５】Ｓｅｇｅｒｓ，  Ｖ．Ｆ．Ｍ．およびＬｅｅ，  Ｒ．Ｊ．（２００８年）Ｎａｔｕｒｅ  ４５１巻：９３７〜９４２頁
【非特許文献６】Ｓｐａｔｅｒ，  Ｄ．ら（２０１４年）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １４１巻：４４１８〜４４３１頁
【非特許文献７】Ｏｒｌｉｃ，  Ｄ．ら（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ  ４１０巻：７０１〜７０５頁
【非特許文献８】Ｓｔａｍｍ，  Ｃ．ら（２００３年）Ｌａｎｃｅｔ  ３６１巻：４５〜４６頁
【非特許文献９】Ｐｅｒｉｎ，  Ｅ．Ｃ．ら（２００３年）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０７巻：２２９４〜２３０２頁
【非特許文献１０】Ｊａｃｋｓｏｎ，  Ｋ．Ａ．ら（２００１年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０７巻：１３９５〜１４０２頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
心前駆体細胞のマーカーとしてのＩｓｌ１の同定は大きな進歩であったが、Ｉｓｌ１は細胞内タンパク質であることから、大量の生存細胞を単離する際の使用のためには適切なマーカーではない。むしろ、細胞表面マーカーがなおも必要とされている。さらに、マーカーとしてのＩｓｌ１は、心系統内の複数の細胞型へと分化することができる集団を同定し、したがって、心系統内の特定の細胞型、特に、心室細胞へと分化する前駆体細胞に偏向した心前駆体細胞を同定するマーカーがなおも必要とされている。したがって、心筋細胞を優勢に生じさせ、心筋原性（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｇｅｎｉｃ）前駆体細胞の迅速な単離および大規模拡大増殖を可能にする、心前駆体細胞のさらなるマーカー、特に、心前駆体細胞の細胞表面マーカーが、当該分野でなおも大いに求められている。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏで心室筋細胞へと分化する心室前駆体を単離し、それによって、心機能を増強するための心室前駆体または心室筋細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ移植を可能にするための方法および組成物が、当該分野でなおも大いに求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ヒト心前駆体細胞を単離するための細胞表面マーカーとしてのＪａｇｇｅｄ１（ＪＡＧ１）またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４（ＦＺＤ４）の使用を記載する。さらに、これらのヒト心前駆体細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、それらが心室筋細胞へと優勢に分化するように、心室系統に偏向する。即ち、これらの心前駆体細胞は、それらが心室系統に偏向され、したがって、ヒト心室前駆体（ＨＶＰ）細胞であるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの条件下で培養され得る。さらに、対象において心臓の心室領域中に導入される場合、これらの前駆体細胞は、それらの心室プログラミングに従って機能する心室筋細胞へと、ほぼ排他的に分化する。特に、本明細書で提供されるヒト心室前駆体細胞は、これらの細胞が純粋な３Ｄの血管新生した機能的かつ成熟した心室細胞壁を正常マウスの腎臓または心臓の表面上にｉｎ  ｖｉｖｏで構築できる、細胞自律的経路を利用し、それによって、臓器ごとのｉｎ  ｖｉｖｏ組織操作を可能にする。
Ｉｓｌｅｔ１（ＩＳＬ１）をマーカーとして使用して、ＨＶＰを生成するための拡張可能な２ステップ培養プロトコールが開発され、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）からの数十億の純粋なＨＶＰの生成および精製を可能にする細胞表面マーカー（ＪＡＧ１／ＦＺＤ４）が、同定されている。これらのＨＶＰは、４週間目のヒト胎児心臓の心室腔においても同定され得る。
【００１２】
本明細書で提供される心室前駆体細胞の移植は、移植の５カ月後までに、力を生み、カテコールアミンに対して応答し、自動能を喪失し、Ｔ管を含み、成体桿状細胞の肥大性成長を示すことができる、大きいサイズ（例えば、マウス心臓のサイズの２倍）の、純粋で機能的かつ成熟したヒト心室筋臓器を生じる。したがって、ヒト心室形成（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）は、本明細書で提供される精製されたＩＳＬ１／ＪＡＧ１／ＦＺＤ４ヒト心室前駆体によって駆動される細胞自律的経路を介して達成され得る。本明細書で提供されるこれらのＨＰＶは、マウス−ヒトキメラにおけるヒト心疾患の新たなｉｎ  ｖｉｖｏモデル、および心疾患に対する臓器ごとの再生治療戦略の開発を可能にする。
【００１３】
心室前駆体細胞の重要な細胞表面マーカーのこの同定は、細胞の容易かつ迅速な単離を可能にする。さらに、細胞の拡大増殖および心室系統偏向のための培養条件の決定は、心室前駆体細胞のクローン性集団の大きい培養物（十億またはそれ超の細胞）の調製を可能にする。これらの細胞は、例えば、対象における損傷した心臓、特に、心室領域における損傷において機能を改善するために使用され得る。これらの前駆体細胞は、ｉｎ  ｓｉｔｕでの心室細胞への分化のためにｉｎ  ｖｉｖｏで移植され得るか、またはあるいは、心室筋細胞を含む心筋パッチは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるその後の移植のために前駆体からｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製され得る。これらの細胞は、例えば、試験化合物の心毒性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性スクリーニングアッセイにおいて、ならびに心成熟化および分化において使用される関連する経路を同定するための生化学的研究のためにも、使用され得る。
【００１４】
したがって、本発明は、ヒト心室前駆体細胞を精製された形態で初めて提供するものである。これらのヒト心室前駆体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの心室筋細胞への分化が可能である。これらの前駆体細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで多数の細胞へと拡大増殖され得、心臓の心室領域中にｉｎ  ｖｉｖｏで移植される場合、これらは、心室筋細胞へと本質的に排他的に分化する。なおさらに、これらの細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで異なる部位へと遊走する能力を有し、ｉｎ  ｖｉｖｏで移植される場合、これらの細胞は、心室細胞としてそれらが行うようにプログラムされたことを行う（単純に収縮する心筋細胞とは対照的に）。したがって、これらの心室前駆体細胞は、心室機能を増強するためにネイティブ組織にグラフトされ得、新たな心室組織中へと脈管構造を呼び込む能力を有する。
【００１５】
頑強な心分化プロトコールと組み合わせてＲＮＡ−ｓｅｑ技術を使用して、ｈＰＳＣ分化の異なる時点におけるゲノム規模レベルでの転写的発現を実施した。これらの実験は、ｈＰＳＣ由来のＩｓｌ１＋心筋原性前駆体細胞についての細胞表面マーカーとしての、Ｊａｇｇｅｄ１およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４の同定をもたらした。心筋原性前駆体細胞上での、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＩｓｌ１およびＪａｇ１の共発現、またはＩｓｌ１およびＦｒｚｄ４の共発現が実証された。さらに、Ｊａｇ１およびＩｓｌ１は、４週目のヒト胎児心臓においてｉｎ  ｖｉｖｏで共発現されることが実証されている。なおさらに、マウスにおける正常または傷害された心臓中への精製されたヒトＩｓｌ１＋Ｊａｇ１＋心筋原性前駆体細胞の移植後、富化されたヒトＩｓｌ１＋Ｊａｇ１＋細胞は、ｃＴｎＴ＋心筋細胞を生じさせ、このことは、Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋前駆体細胞の心筋原性性質を実証している。これらのｉｎ  ｖｉｖｏ移植研究において、より大きいグラフトが、正常心臓と比較して、Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋心筋原性前駆体細胞を移植した傷害された心臓において観察され、このことは、心筋細胞再生のためのＩｓｌ１＋Ｊａｇ１＋心筋原性前駆体細胞の能力を実証している。
【００１６】
なおさらに、ＲＮＡ−ｓｅｑ実験は、ブラキュリを発現する中胚葉細胞についての以下のマーカー：ＦＺＤ１０、ＣＤ４８、ＣＤＩＤ、ＣＤ８Ｂ、ＩＬ１５ＲＡ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＳＦ１３、ＩＣＯＳＬＧ、ＳＥＭＡ７Ａ、ＳＬＣ３Ａ２、ＳＤＣ１およびＨＬＡ−Ａ；ならびに心中胚葉ｍｅｓｐ１陽性細胞についての以下のマーカー：ＣＸＣＲ４、ＡＮＰＥＰ、ＩＴＧＡ５、ＴＮＦＲＳＦ９、ＦＺＤ２、ＣＤＩＤ、ＣＤ１７７、ＡＣＶＲＬ１、ＩＣＡＭ１、ＬＩＣＡＭ、ＮＧＦＲ、ＡＢＣＧ２、ＦＺＤ７、ＴＮＦＲＳＦ１３ＣおよびＴＮＦＲＳＦ１Ｂ；ならびに心前駆体細胞についての以下のマーカー：ＰＤＧＦＲＡ、ＬＩＦＲ（ＣＤ１１８）、ＴＮＦＳＦ９およびＦＧＦＲ３、を含む、さらなる潜在的な表面マーカーを同定した。これらのさらなる心前駆体マーカーのいずれかが、分化の異なる段階において前駆体を単離するために、本発明の方法において使用され得る。特に、心前駆体マーカーＰＤＧＦＲＡ、ＬＩＦＲ（ＣＤ１１８）、ＴＮＦＳＦ９またはＦＧＦＲ３は、心筋原性前駆体の単離のために、本明細書に記載されるように、ＪＡＧ１およびＦＺＤ４と類似の様式で使用され得る。
【００１７】
したがって、一態様では、本発明は、ヒト心室前駆体細胞を単離するための方法であって、
ヒト心前駆体細胞を含む細胞の培養物を、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の１つまたは複数の薬剤と接触させるステップ；および
Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４反応性陽性細胞を非反応性細胞から分離することによって、ヒト心室前駆体細胞を単離するステップ
を含む、方法に関する。
【００１８】
一実施形態では、これらのヒト心前駆体細胞は、Ｊａｇｇｅｄ１と反応性の薬剤およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤の両方と接触させることによって、Ｊａｇｇｅｄ１およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４反応性陽性細胞を非反応性細胞から分離する。
【００１９】
好ましくは、これらのヒト心前駆体細胞は、Ｉｓｌｅｔ１＋ヒト心前駆体細胞である。別の実施形態では、細胞の培養物を、Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤とも接触させ；Ｊａｇｇｅｄ１反応性／Ｉｓｌｅｔ１反応性陽性細胞、またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４反応性／Ｉｓｌｅｔ１反応性細胞を、非反応性細胞から分離することによって、心室前駆体細胞を単離する。細胞の培養物を、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤ならびにＩｓｌｅｔ１と反応性の薬剤と、同時に接触させてもよい。あるいは、細胞の培養物を、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤と接触させる前に、Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤と接触させてもよい。あるいは、細胞の培養物を、Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤と接触させる前に、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤と接触させてもよい。別の実施形態では、これらのヒト心室前駆体細胞は、それらが心室マーカーＭＬＣ２ｖを発現するように、さらに培養および分化される。
【００２０】
別の態様では、本発明は、ヒト心室前駆体細胞を単離するための方法であって、
心前駆体細胞を生成する条件下でヒト多能性幹細胞を培養して、培養された細胞集団を取得するステップ；
培養された細胞集団を、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の１つまたは複数の薬剤と接触させるステップ；および
Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４反応性陽性細胞を非反応性細胞から分離することによって、ヒト心室前駆体細胞を単離するステップ
を含む、方法に関する。
【００２１】
一実施形態では、これらのヒト心前駆体細胞は、Ｊａｇｇｅｄ１と反応性の薬剤およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤の両方と接触させることによって、Ｊａｇｇｅｄ１およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４反応性陽性細胞を非反応性細胞から分離する。
【００２２】
一実施形態では、細胞の培養物を、Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤とも接触させ；Ｊａｇｇｅｄ１反応性／Ｉｓｌｅｔ１反応性陽性細胞、またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４反応性／Ｉｓｌｅｔ１反応性陽性細胞を、非反応性細胞から分離することによって、ヒト心室前駆体細胞を単離する。細胞の培養物を、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤ならびにＩｓｌｅｔ１と反応性の薬剤と、同時に接触させてもよい。あるいは、細胞の培養物を、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤と接触させる前に、Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤と接触させてもよい。あるいは、細胞の培養物を、Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤と接触させる前に、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤と接触させてもよい。別の実施形態では、これらのヒト心室前駆体細胞は、それらが心室マーカーＭＬＣ２ｖを発現するように、さらに培養および分化される。
【００２３】
ヒト心室前駆体細胞を単離するための方法では、Ｊａｇｇｅｄ１またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４に結合する種々の型の薬剤が、Ｊａｇｇｅｄ１またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤として使用され得る。例えば、一実施形態では、Ｊａｇｇｅｄ１またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤は、抗Ｊａｇｇｅｄ１抗体または抗Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４抗体、例えば、モノクローナル抗体である。別の実施形態では、Ｊａｇｇｅｄ１またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤は、可溶性Ｊａｇｇｅｄ１リガンドまたはＦｒｉｚｚｌｅｄ４リガンド、例えば、Ｊａｇｇｅｄ１リガンド融合タンパク質またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４リガンド融合タンパク質である。例えば、Ｊａｇｇｅｄ１と反応性の薬剤は、Ｊａｇｇｅｄ１リガンドＮｏｔｃｈ−１、例えば、可溶性Ｎｏｔｃｈ−１融合タンパク質（例えば、Ｎｏｔｃｈ−１／Ｉｇ融合タンパク質）を含み得る。
【００２４】
ヒト心室前駆体細胞を単離するための方法では、種々の型の分離方法が、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４反応性陽性細胞（またはＪａｇｇｅｄ１／Ｉｓｌｅｔ１もしくはＦｒｉｚｚｌｅｄ４／Ｉｓｌｅｔ１反応性陽性細胞）を非反応性細胞から分離するために使用され得る。例えば、一実施形態では、これらの反応性陽性細胞は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）によって非反応性細胞から分離される。別の実施形態では、これらの反応性陽性細胞は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ：ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｓｏｒｔｉｎｇ）によって非反応性細胞から分離される。
【００２５】
さらに別の態様では、本発明は、ヒト心室前駆体細胞のクローン性集団を取得する方法であって、
単一のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞を単離するステップ；および
この細胞が少なくとも１×１０９細胞まで拡大増殖されるような条件下で、この単一のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞を培養することによって、ヒト心室前駆体細胞のクローン性集団を取得するステップ
を含む、方法に関する。
【００２６】
一実施形態では、この単一のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞は、初期培養の時点においてＩｓｌｅｔ１陽性、Ｎｋｘ２．５陰性およびｆｌｋ１陰性である。この単一のＪａｇｇｅｄ１＋またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞は、上記したものなどの方法（例えば、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳ）によって単離され得る。この単一のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞は、上記したものなどのＪａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の試薬（例えば、抗Ｊａｇｇｅｄ１抗体、抗Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４抗体、可溶性Ｊａｇｇｅｄ１リガンドまたは可溶性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４リガンド、例えば、リガンド融合タンパク質）を使用して単離され得る。さらなる培養および分化の際に、ヒト心室前駆体細胞のクローン性集団は、心室マーカーＭＬＣＶ２を発現し得る。
【００２７】
好ましい実施形態では、この単一のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞は、この細胞が心室分化に偏向するような条件下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養される。例えば、この単一のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞は、心前駆体培養（ＣＰＣ）培地（２０％ノックアウト血清代替物、２．５ｍＭ  ＧｌｕｔａＭａｘおよび１００μｇ／ｍｌ  ビタミンＣを補充した８０％アドバンストＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で培養され得、これが、ＭＬＣ２ｖ心室マーカーを発現する心室細胞への、これらの細胞の分化を可能にする。種々の実施形態では、この単一のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞は、例えば、少なくとも１×１０９細胞、少なくとも２×１０９細胞、少なくとも５×１０９細胞または少なくとも１０×１０９細胞のクローン性集団まで、拡大増殖される。
【００２８】
したがって、別の態様では、本発明は、単離されたＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞のクローン性集団に関する。種々の実施形態では、このクローン性集団は、例えば、少なくとも１×１０９細胞、少なくとも２×１０９細胞、少なくとも５×１０９細胞または少なくとも１０×１０９細胞を含む。好ましい実施形態では、このクローン性集団は、少なくとも１×１０９のＪａｇｇｅｄ１＋ヒト心室前駆体細胞または少なくとも１×１０９のＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞を含む。
【００２９】
さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載されるＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞を使用して、対象において心機能を増強する方法に関する。例えば、一実施形態では、本発明は、対象において心機能を増強する方法であって、Ｊａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞のクローン性集団、例えば、少なくとも少なくとも１×１０９細胞、少なくとも２×１０９細胞、少なくとも５×１０９細胞または少なくとも１０×１０９細胞のクローン性集団を含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。一実施形態では、このクローン性集団は、対象の心臓中に直接投与される。例えば、このクローン性集団は、対象の心臓の心室領域中に直接投与され得る。一実施形態では、対象に投与される医薬組成物は、三次元マトリックス上に製剤化されたクローン性集団、例えば、心室筋細胞を含む心筋パッチを含む。この対象は、心機能の増強を必要とする対象、例えば、心筋梗塞に罹患している対象または先天性心臓障害を有する対象である。
【００３０】
さらに別の態様では、本発明は、ヒト心室組織を生成するための方法であって、
Ｊａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞を、非ヒト動物の臓器中に移植するステップ；および
ヒト心室組織が生成されるように、これらの前駆体細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで成長させるステップ
を含む、方法に関する。
【００３１】
この非ヒト動物は、例えば、免疫不全マウスであり得る。この臓器は、例えば、腎臓（例えば、細胞は、腎臓被膜下に移植される）または心臓であり得る。一実施形態では、これらの細胞は、以下の細胞マーカーパターン：（ｉ）心中胚葉形成のピーク後；（ｉｉ）Ｉｓｌｅｔ−１発現のピーク時；（ｉｉｉ）ＮＫＸ２．５発現のピーク前；（ｉｖ）下流遺伝子ＭＥＦ−２およびＴＢＸ−１発現のピーク前；ならびに（ｖ）分化した収縮タンパク質遺伝子の発現前のうち１、２、３、４または５つが存在するときに、移植される。一実施形態では、これらの細胞は、ヒト心室前駆体細胞を生成するための条件下におけるヒト多能性幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の５日目から７日目の間（５日目および７日目を含む）で移植される。別の実施形態では、これらの細胞は、ヒト心室前駆体細胞を生成するための条件下におけるヒト多能性幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の６日目に移植される。この方法は、非ヒト動物中で生成されたヒト心室組織を回収するステップをさらに含み得る。
【００３２】
本発明のなお別の態様では、本明細書に記載されるヒト心室前駆体細胞は、試験化合物の心毒性を評価するためのスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。したがって、本発明は、試験化合物の心毒性についてスクリーニングする方法であって、
Ｊａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋心室前駆体細胞を提供するステップ；
細胞を試験化合物と接触させるステップ；および
細胞に対する試験化合物の毒性を測定するステップ
を含み、これらの細胞に対する試験化合物の毒性は、試験化合物の心毒性を示す、方法を提供する。細胞に対する試験化合物の毒性は、例えば、細胞生存度、または細胞の他の生理学的パラメーターを判定することによって、測定され得る。
ヒト心室前駆体細胞を生成するための培養方法もまた提供される。例えば、一実施形態では、本発明は、ヒト心室前駆体（ＨＶＰ）を生成する方法であって、
心中胚葉マーカーを発現する細胞が生成されるように、ＣＨＩＲ９８０１４を含む培地中でヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を培養するステップ、および
ＨＶＰが生成されるように、Ｗｎｔ−Ｃ５９を含む培地中で、心中胚葉マーカーを発現する細胞を培養するステップ
を含む、方法を提供する。
【００３３】
本発明の他の特色および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ヒト心室前駆体細胞を単離するための方法であって、
心前駆体細胞を含むヒト細胞の培養物を、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の１つまたは複数の薬剤と接触させるステップ；および
Ｊａｇｇｅｄ１反応性陽性細胞および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４反応性陽性細胞を非反応性細胞から分離することによって、ヒト心室前駆体細胞を単離するステップ
を含む、方法。
（項目２）
ヒト細胞の前記培養物を、Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤とさらに接触させ；Ｊａｇｇｅｄ１反応性／Ｉｓｌｅｔ１反応性陽性細胞、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４反応性／Ｉｓｌｅｔ１反応性陽性細胞またはＪａｇｇｅｄ１反応性／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４反応性／Ｉｓｌｅｔ１反応性陽性細胞を、非反応性細胞から分離することによって、ヒト心室前駆体細胞を単離する、項目１に記載の方法。
（項目３）
ヒト細胞の前記培養物を、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の１つまたは複数の薬剤ならびに前記Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤と、同時に接触させる、項目２に記載の方法。
（項目４）
ヒト細胞の前記培養物を、前記Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の１つまたは複数の薬剤と接触させる前に、前記Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤と接触させる、項目２に記載の方法。
（項目５）
ヒト細胞の前記培養物を、前記Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤と接触させる前に、前記Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の１つまたは複数の薬剤と接触させる、項目２に記載の方法。
（項目６）
前記Ｊａｇｇｅｄ１と反応性の薬剤が抗Ｊａｇｇｅｄ１抗体であり、かつ／または前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤が抗Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４抗体である、上述の項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記Ｊａｇｇｅｄ１またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤が、可溶性Ｊａｇｇｅｄ１リガンド融合タンパク質または可溶性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４リガンド融合タンパク質である、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記Ｊａｇｇｅｄ１リガンドがＮｏｔｃｈ−１である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記Ｊａｇｇｅｄ１反応性陽性細胞および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４反応性陽性細胞が、蛍光活性化細胞選別によって前記非反応性細胞から分離される、上述の項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記ヒト心室前駆体細胞が、ＭＬＣ２ｖ陽性になるように、さらに培養および分化される、上述の項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
ヒト心室前駆体細胞を単離するための方法であって、
心前駆体細胞を生成する条件下でヒト多能性幹細胞を培養して、細胞の培養物を取得するステップ；
前記細胞の培養物を、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の１つまたは複数の薬剤と接触させるステップ；および
Ｊａｇｇｅｄ１反応性陽性細胞および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４反応性陽性細胞を非反応性細胞から分離することによって、ヒト心室前駆体細胞を単離するステップ
を含む、方法。
（項目１２）
前記細胞の培養物を、Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤とさらに接触させ；Ｊａｇｇｅｄ１反応性／Ｉｓｌｅｔ１反応性陽性細胞、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４反応性／Ｉｓｌｅｔ１反応性陽性細胞またはＪａｇｇｅｄ１反応性／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４反応性／Ｉｓｌｅｔ１反応性陽性細胞を、非反応性細胞から分離することによって、ヒト心室前駆体細胞を単離する、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記細胞の培養物を、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の１つまたは複数の薬剤ならびに前記Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤と同時に接触させる、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記細胞の培養物を、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の１つまたは複数の薬剤と接触させる前に、前記Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤と接触させる、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記細胞の培養物を、前記Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤と接触させる前に、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の１つまたは複数の薬剤と接触させる、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
前記Ｊａｇｇｅｄ１と反応性の薬剤が抗Ｊａｇｇｅｄ１抗体であり、かつ／または前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤が抗Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４抗体である、項目１１から１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記Ｊａｇｇｅｄ１またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤が、可溶性Ｊａｇｇｅｄ１リガンド融合タンパク質または可溶性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４リガンド融合タンパク質である、項目１１から１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記Ｊａｇｇｅｄ１リガンドがＮｏｔｃｈ−１である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記Ｊａｇｇｅｄ１反応性陽性細胞および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４反応性陽性細胞が、蛍光活性化細胞選別によって前記非反応性細胞から分離される、項目１１から１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記ヒト心室前駆体細胞が、ＭＬＣ２ｖ陽性になるように、さらに培養および分化される、項目１１から１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
ヒト心室前駆体細胞のクローン性集団を取得するための方法であって、
単一のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞を単離するステップ；および
前記細胞が少なくとも１×１０９細胞まで拡大増殖されるような条件下で、前記単一のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞を培養することによって、ヒト心室前駆体細胞のクローン性集団を取得するステップ
を含む、方法。
（項目２２）
前記単一のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞が、初期培養の時点においてＩｓｌｅｔ１陽性、Ｎｋｘ２．５陰性およびｆｌｋ１陰性である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記単一のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞が、蛍光活性化細胞選別によって単離される、項目２１または項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記単一のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞が、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の１つまたは複数の試薬を使用して単離される、項目２１から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記Ｊａｇｇｅｄ１またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の試薬が、抗Ｊａｇｇｅｄ１抗体または抗Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４抗体である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記単一のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞が、心前駆体培養（ＣＰＣ）培地中で培養される、項目２１から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記単一のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞が、前記細胞が心室分化に偏向するような条件下で培養される、項目２１から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記単一のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞が、少なくとも１０×１０９細胞まで拡大増殖される、項目２１から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
項目２１から２８のいずれか一項に記載の方法によって取得される、少なくとも１×１０９のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞のクローン性集団。
（項目３０）
項目２１から２８のいずれか一項に記載の方法によって取得される、少なくとも１０×１０９のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞のクローン性集団。
（項目３１）
対象において心機能を増強する方法であって、項目２９に記載のクローン性集団を含む医薬組成物を、前記対象に投与するステップを含む、方法。
（項目３２）
前記クローン性集団が、前記対象の心臓中に直接投与される、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記対象が、心筋梗塞に罹患している、項目３１または３２に記載の方法。
（項目３４）
前記対象が、先天性心臓障害を有する、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記クローン性集団が、前記対象の心臓の心室領域中に直接投与される、項目３１から３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記医薬組成物が、二次元または三次元マトリックス上に製剤化された前記クローン性集団を含む、項目３１から３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
ヒト心室組織を生成するための方法であって、
Ｊａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞を、非ヒト動物の臓器中に移植するステップ；および
ヒト心室組織が生成されるように、前記前駆体細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで成長させるステップ
を含む、方法。
（項目３８）
前記非ヒト動物が免疫不全マウスである、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記臓器が、腎臓または心臓である、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
以下の細胞マーカーパターン：（ｉ）心中胚葉形成のピーク後；（ｉｉ）Ｉｓｌｅｔ−１発現のピーク時；（ｉｉｉ）ＮＫＸ２．５発現のピーク前；（ｉｖ）下流遺伝子ＭＥＦ−２およびＴＢＸ−１発現のピーク前；ならびに（ｖ）分化した収縮タンパク質遺伝子の発現前のうち１、２、３、４または５つが存在するときに、前記細胞が移植される、項目３７に記載の方法。
（項目４１）
前記細胞が、ヒト心室前駆体細胞を生成するための条件下におけるヒト多能性幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の５日目から７日目の間（５日目および７日目を含む）で移植される、項目３７に記載の方法。
（項目４２）
前記細胞が、ヒト心室前駆体細胞を生成するための条件下におけるヒト多能性幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の６日目に移植される、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
試験化合物の心毒性についてスクリーニングする方法であって、
Ｊａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞を提供するステップ；
前記細胞を前記試験化合物と接触させるステップ；および
前記細胞に対する前記試験化合物の毒性を測定するステップ
を含み、前記細胞に対する前記試験化合物の毒性が、前記試験化合物の心毒性を示す、方法。
（項目４４）
ヒト心室前駆体（ＨＶＰ）を生成する方法であって、
心中胚葉マーカーを発現する細胞が生成されるように、ＣＨＩＲ９８０１４を含む培地中でヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を培養するステップ、および
ＨＶＰが生成されるように、Ｗｎｔ−Ｃ５９を含む培地中で、前記心中胚葉マーカーを発現する細胞を培養するステップ
を含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）からヒトＩｓｌ１＋心筋原性前駆体細胞を生成するための例示的な培養プロトコールの模式図である。
【００３５】
【図２】図２は、Ｉｓｌ１、Ｎｋｘ２．５およびｃＴｎ１の発現を示す、ｈＰＳＣの心分化の間のタンパク質発現のウエスタンブロット分析の結果である。ＧＡＰＤＨを対照として使用した。
【００３６】
【図３】図３は、分化の６日目における細胞上のＩｓｌ１の発現を示す、心筋原性前駆体細胞のフローサイトメトリー分析の結果である。
【００３７】
【図４】図４は、分化の６日目における細胞上のＩｓｌ１およびＪａｇ１の共発現を示す、心筋原性前駆体細胞の二重染色フローサイトメトリー分析の結果である。
【００３８】
【図５】図５は、ＦＺＤ４の発現を示す、ｈＰＳＣの心分化の間のタンパク質発現のウエスタンブロット分析の結果である。ＧＡＰＤＨを対照として使用した。
【００３９】
【図６】図６は、分化の５日目における細胞上のＩｓｌ１およびＦＺＤ４の共発現を示す、心筋原性前駆体細胞の二重染色フローサイトメトリー分析の結果である。
【００４０】
【図７】図７は、ヒト心室前駆体（ＨＶＰ）細胞の生成、心室筋細胞へのそれらの最終的な分化、それらの抗体精製および移植におけるそれらの使用の模式図である。
【００４１】
【図８】図８Ａ〜Ｂは、臓器ごとの組織操作のための、腎被膜中への（図８Ａ）または心筋内での（図８Ｂ）ＨＰＶの移植の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明は、Ｊａｇｇｅｄ１およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４が心室前駆体細胞についての細胞表面マーカーであるという発見に基づいて、ヒト心筋原性前駆体細胞、特に、心室系統に偏向した細胞を単離する方法、ならびにかかる前駆体細胞の単離されたクローン性集団を提供する。これらの心室前駆体細胞についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの使用もまた提供される。
【００４３】
本発明がより容易に理解され得るように、最初に特定の用語を定義する。さらなる定義は、詳細な説明を通じて示される。
【００４４】
本明細書で使用する場合、用語「Ｊａｇｇｅｄ１」、「Ｊａｇ１」および「ＪＡＧ１」は、相互交換可能に使用されて、当該分野で公知の、例えば、Ｏｄａ，  Ｔ．ら（１９９７年）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４３巻：３７６〜３７９頁；Ｏｄａ，  Ｔ．ら（１９９７年）Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  １６巻：２３５〜２４２頁；Ｌｉ，  Ｌ．ら（１９９８年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、８巻：４３〜５５頁；Ｂａｓｈ，  Ｊ．ら（１９９９年）ＥＭＢＯ  Ｊ．、１８巻：２８０３〜２８１１頁；およびＪｏｎｅｓ，  Ｅ．Ａ．ら（２０００年）Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｇｅｎｅｔ．  ３７巻：６５８〜６６２頁に記載されたタンパク質を指す。Ｊａｇｇｅｄ１タンパク質の非限定的な例は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｐ７８５０４．３に示されるアミノ酸配列を有するヒトタンパク質である。
【００４５】
本明細書で使用する場合、用語「Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４」、「Ｆｚｄ４」および「ＦＺＤ４」は、相互交換可能に使用されて、当該分野で公知の、例えば、Ｋｉｎｋｏｓｈｉ，  Ｈ．ら（１９９９年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．、２６４巻：９５５〜９６１頁；Ｔａｎａｋａ，  Ｓ．ら（１９９８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５巻：１０１６４〜１０１６９頁；およびＲｏｂｉｔａｉｌｌｅ，  Ｊ．ら（２００２年）Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．、３２巻：３２６〜３３０頁に記載されたタンパク質を指す。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４タンパク質の非限定的な例は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｑ９ＵＬＶ１に示されるアミノ酸配列を有するヒトタンパク質である。
【００４６】
本明細書で使用する場合、用語「幹細胞」は、広い意味で使用され、これには、伝統的な幹細胞、前駆体細胞、プレ前駆体細胞、予備細胞などが含まれる。用語「幹細胞」または「前駆体」は、本明細書で相互交換可能に使用され、増殖が可能であり、分化したまたは分化可能な（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｂｌｅ）娘細胞を次に生じさせ得る多数の母細胞を生成する能力を有するより多くの前駆体細胞を生じさせることが可能な、未分化細胞を指す。娘細胞自身は、親の発生潜在力を有する１つまたは複数の細胞もまた保持しつつ、増殖し、１つまたは複数の成熟細胞型へと引き続いて分化する後代を生じるように誘導され得る。その結果、用語「幹細胞」とは、特定の状況下では、より特殊化したまたは分化した表現型へと分化する能力または潜在力を有し、特定の状況下では、実質的に分化することなしに増殖する能力を保持する、細胞を指す。一実施形態では、用語前駆体または幹細胞とは、その子孫（後代）が、しばしば異なる方向で、分化によって、例えば、胚性細胞および組織の進行性の多様化において生じるように完全に個々の特徴を獲得することによって、特殊化する、一般化された母細胞を指す。細胞分化は、多くの細胞分裂を介して典型的には生じる複雑なプロセスである。分化した細胞は、それ自身多分化能性細胞に由来する多分化能性細胞に由来し得る、などである。これらの多分化能性細胞の各々は、幹細胞とみなされ得るが、各々が生じさせ得る細胞型の範囲は、かなり変動し得る。一部の分化した細胞もまた、より大きい発生潜在力の細胞を生じさせる能力を有する。かかる能力は、天然であり得、または種々の因子による処理により人工的に誘導され得る。多くの生物学的例では、幹細胞は、１超の別個の細胞型の後代を生じ得るので、「多分化能性」でもあるが、これは、「幹細胞性」には必要とされない。自己更新性は、幹細胞の定義の他の古典的な一部であり、これは、この文書で使用される場合重要である。理論上、自己更新性は、２つの主要な機構のいずれかによって生じ得る。幹細胞は、非対称に分裂し得、一方の娘は、幹状態を保持し、他方の娘は、一部の別個の他の特定の機能および表現型を発現する。あるいは、集団中の幹細胞の一部は、２つの幹へと対称に分裂し得、したがって、集団中の一部の幹細胞は全体として維持されるが、集団中の他の細胞は、分化した後代のみを生じる。公式には、幹細胞として始まる細胞は、分化した表現型に向かって進行し得るが、次いで、「逆転」し、幹細胞表現型を再発現する可能性がある、しばしば「脱分化」と呼ばれる用語である。
【００４７】
用語「前駆体細胞」は、分化によってそれが生じさせ得る細胞と比較して、より原始的な（例えば、完全に分化した細胞よりも、発生の経路または進行に沿ったより早いステップにある）細胞表現型を有する細胞を指すために、本明細書で使用される。しばしば、前駆体細胞は、顕著なまたは非常に高い増殖潜在力もまた有する。前駆体細胞は、発生経路、ならびに細胞が発生および分化する環境に依存して、複数の別個の分化した細胞型または単一の分化した細胞型を生じさせ得る。
【００４８】
用語「多能性」とは、本明細書で使用する場合、異なる条件下で３つ全ての胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）に特徴的な細胞型へと分化する能力を有する細胞を指す。多能性細胞は、例えば、ヌードマウスおよび奇形腫形成アッセイを使用して、３つ全ての胚葉へと分化するそれらの能力によって、主に特徴付けられる。多能性は、胚性幹（ＥＳ）細胞マーカーの発現によっても明らかになるが、多能性についての好ましい試験は、３つの胚葉の各々の細胞へと分化する能力の実証である。一部の実施形態では、多能性細胞は、未分化細胞である。
【００４９】
用語「多能性」または「多能性状態」とは、本明細書で使用する場合、３つ全ての胚性胚葉：内胚葉（腸組織）、中胚葉（血液、筋肉および血管を含む）および外胚葉（例えば、皮膚および神経）へと分化する能力を有し、典型的には、長期間、例えば、１年超または３０継代超にわたってｉｎ  ｖｉｔｒｏで分裂する潜在力を有する細胞を指す。
【００５０】
用語「多分化能性」とは、「多分化能性細胞」に言及して使用する場合、３つ全ての胚葉由来の細胞の全てではないが一部へと分化することができる細胞を指す。したがって、多分化能性細胞は、部分的に分化した細胞である。多分化能性細胞は、当該分野で周知であり、多分化能性細胞の例には、成体幹細胞、例えば、造血幹細胞および神経幹細胞などが含まれる。多分化能性とは、幹細胞が、所与の系統中の多くの型の細胞を形成し得るが、他の系統の細胞を形成しない可能性があることを意味する。例えば、多分化能性血液幹細胞は、多くの異なる型の血球（赤、白、血小板など）を形成できるが、ニューロンを形成することはできない。
【００５１】
用語「胚性幹細胞」または「ＥＳ細胞」または「ＥＳＣ」は、本明細書で相互交換可能に使用され、胚性胚盤胞の内部細胞塊の多能性幹細胞を指す（参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８４３，７８０号、米国特許第６，２００，８０６号を参照のこと）。かかる細胞は、体細胞核移植から誘導された胚盤胞の内部細胞塊から同様に取得され得る（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９４５，５７７号、米国特許第５，９９４，６１９号、米国特許第６，２３５，９７０号を参照のこと）。胚性幹細胞の識別的特徴は、胚性幹細胞表現型を規定する。したがって、細胞は、その細胞が他の細胞から識別され得るように、胚性幹細胞の独自の特徴のうち１つまたは複数をそれが有する場合、胚性幹細胞の表現型を有する。例示的な識別的な胚性幹細胞の特徴には、遺伝子発現プロファイル、増殖能力、分化能力、核型、特定の培養条件に対する応答性などが含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ＥＳ細胞は、胚を破壊することなく、例えば、ヒト胚を破壊することなく、取得され得る。
【００５２】
用語「成体幹細胞」または「ＡＳＣ」は、胎児、若年および成体組織を含む非胚性組織由来の任意の多分化能性幹細胞を指すために使用される。幹細胞は、血液、骨髄、脳、嗅上皮、皮膚、膵臓、骨格筋および心筋肉を含む広範な種々の成体組織から単離されている。これらの幹細胞の各々は、遺伝子発現、因子応答性、および培養物中での形態学に基づいて特徴付けられ得る。例示的な成体幹細胞には、神経幹細胞、神経堤幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞および膵幹細胞が含まれる。上に示したように、幹細胞は、事実上全ての組織中に存在することが見出されている。したがって、本発明は、幹細胞集団が、事実上任意の動物組織から単離され得ることを認識する。
【００５３】
用語「ヒト多能性幹細胞」（ｈＰＳＣと略す）とは、本明細書で使用する場合、幹細胞および多能性について上で議論したような、種々の異なる細胞型へと分化する能力を有するヒト細胞を指す。ヒト多能性ヒト幹細胞には、例えば、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）およびヒト胚性幹細胞、例えば、ＥＳ細胞株が含まれる。
【００５４】
用語「ヒト心前駆体細胞」とは、本明細書で使用する場合、心系統に傾倒し、３つ全ての心系統細胞（心筋肉細胞、内皮細胞および平滑筋細胞）へと分化する能力を有する、ヒト前駆体細胞を指す。
【００５５】
用語「ヒト心筋原性前駆体細胞」とは、本明細書で使用する場合、心系統に傾倒し、心筋肉細胞へと優勢に分化する（即ち、前駆体細胞由来の分化した細胞の５０％超、好ましくは、分化した細胞の６０％、７０％、８０％または９０％超が、心筋肉細胞である）、ヒト前駆体細胞を指す。
【００５６】
用語「心室前駆体細胞」とは、本明細書で使用する場合、心系統に傾倒し、心室筋細胞へと優勢に分化する（即ち、前駆体細胞由来の分化した細胞の５０％超、好ましくは、分化した細胞の６０％、７０％、８０％または９０％超が、心室筋細胞である）、前駆体細胞を指す。この型の細胞は、本明細書で、ヒト心室前駆体即ちＨＶＰ細胞とも呼ばれる。
【００５７】
用語「心筋細胞」とは、心臓の筋肉細胞（例えば、心筋肉細胞）を指す。心筋細胞は、一般に、その細胞表面上および／または細胞質中に、１つまたは複数の心特異的マーカーを発現する。適切な心筋細胞特異的マーカーには、心筋トロポニンＩ、心筋トロポニン−Ｃ、トロポミオシン、カベオリン−３、ＧＡＴＡ−４、ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖−２ａ、ミオシン軽鎖−２ｖ、リアノジン受容体および心房性ナトリウム利尿因子が含まれるがこれらに限定されない。
【００５８】
別の細胞由来の（ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ）細胞に関して使用される用語「〜由来の（ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ）」とは、ある細胞が、異なる細胞型の細胞に始まった（例えば、かかる細胞から変化したまたはかかる細胞によって産生された）ことを意味する。用語「〜由来の」とは、前駆体細胞から分化した細胞もまた指す。
【００５９】
用語「Ｉｓｌ１＋心前駆体細胞」とは、本明細書で使用する場合、心系統に傾倒し、Ｉｓｌｅｔ１を発現するヒト前駆体細胞を指す。
【００６０】
用語「Ｉｓｌ１＋Ｊａｇｇｅｄ１＋心前駆体細胞」とは、本明細書で使用する場合、心系統に傾倒し、Ｉｓｌｅｔ１およびＪａｇｇｅｄ１の両方を発現するヒト前駆体細胞を指す。
【００６１】
用語「Ｉｓｌ１＋Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４＋心前駆体細胞」とは、本明細書で使用する場合、心系統に傾倒し、Ｉｓｌｅｔ１およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４の両方を発現するヒト前駆体細胞を指す。
【００６２】
用語「Ｉｓｌ１＋Ｊａｇｇｅｄ１＋Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４＋心前駆体細胞」とは、本明細書で使用する場合、心系統に傾倒し、Ｉｓｌｅｔ１、Ｊａｇｇｅｄ１およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４を発現するヒト前駆体細胞を指す。
【００６３】
細胞培養物中または細胞集団中の細胞に関して、用語「〜を実質的に含まない」とは、その細胞培養物または細胞集団が含まない特定化された細胞型が、その細胞培養物または細胞集団中に存在する細胞の総数の約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満または約１％未満の量で存在することを意味する。
【００６４】
細胞個体発生に関して、形容詞「分化した」または「分化する」とは、相対的な用語である。「分化した細胞」は、それが比較されている細胞よりも、発生経路のさらに下に進行した細胞である。したがって、幹細胞は、系統限定された先駆体細胞（例えば、中胚葉幹細胞）へと分化し得、これは次に、経路のさらに下の他の型の先駆体細胞（例えば、心筋細胞先駆体）へと分化し得、次いで、特定の組織型において特徴的な役割を果たし、さらに増殖する能力を保持していてもいなくてもよい、末期分化した細胞へと分化し得る。
【００６５】
用語「分化」とは、本発明の文脈では、より特殊化し、さらなる分化が不可能な最終分化した細胞になることにより近い細胞と関連することが公知のマーカーを発現する細胞の形成を意味する。あまり傾倒していない細胞から特定の細胞型に次第に傾倒した細胞へと、最終的には最終分化した細胞へと細胞が進行する経路は、進行性の分化または進行性の傾倒と呼ばれる。より特殊化している（例えば、進行性の分化の通路に沿って進行し始めている）がまだ最終分化していない細胞は、部分的に分化したといわれる。分化は、細胞が、特殊化した表現型をとる、例えば、他の細胞型とは別個の１つまたは複数の特徴または機能を獲得する、発生プロセスである。一部の場合には、分化した表現型とは、一部の発生経路中の成熟終点における細胞表現型（いわゆる最終分化した細胞）を指す。全てではないが多くの組織では、分化のプロセスは、細胞周期からの退出とカップリングされる。これらの場合には、最終分化した細胞は、増殖する能力を喪失するか、または増殖する能力を大きく制限する。しかし、本発明者らは、本明細書の文脈において、用語「分化」または「分化した」とは、それらの発生における以前の点においてよりも、それらの運命または機能においてより特殊化した細胞を指し、これには、最終分化した細胞、および最終分化してはいないが、それらの発生における以前の点においてよりもより特殊化した細胞の両方が含まれることに注目する。傾倒していない細胞（例えば、幹細胞）から、特定の分化した細胞型への増加する程度の傾倒を有する細胞への、最後には最終分化した細胞への、細胞の発生は、進行性の分化または進行性の傾倒として公知である。前駆体細胞と比較して「分化した」細胞は、その前駆体細胞と比較して１つまたは複数の表現型上の差異を有する。表現型上の差異には、形態学的差異、ならびに発現されたマーカーの存在または非存在だけでなく、マーカーの量における差異およびマーカーのセットの共発現パターンにおける差異もまた含む、遺伝子発現および生物学的活性における差異が含まれるがこれらに限定されない。
【００６６】
用語「分化」とは、本明細書で使用する場合、原始的な段階から、より成熟した（即ち、あまり原始的でない）細胞に向かう、細胞の細胞発生を指す。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「増殖する」および「増殖」とは、細胞分裂による、集団中の細胞の数における増加（成長）を指す。細胞増殖は、一般に、成長因子および他のマイトジェンを含む、環境に応答した複数のシグナル伝達経路の協調された活性化から生じると理解される。細胞増殖は、細胞増殖を遮断するまたはそれに負に影響を与える細胞内または細胞外のシグナルおよび機構の作用からの解放によっても、促進され得る。
【００６８】
用語「更新」または「自己更新」または「増殖」は、本明細書で相互交換可能に使用され、細胞のそれ自身のより多くのコピー（例えば、重複）を作製する細胞のプロセスを指す。一部の実施形態では、細胞は、長期間、および／または数カ月もしくは数年間にわたって、同じ未分化細胞（例えば、前駆体細胞型）へと分裂することによって、それら自身の更新が可能である。一部の場合には、増殖とは、単一の細胞の、２つの同一の娘細胞への反復分裂による、細胞の拡大増殖を指す。
【００６９】
用語「系統」とは、本明細書で使用する場合、共通の祖先を有する細胞または共通の発生運命を有する細胞、例えば、心室心筋細胞へと発生する発生運命を有する細胞を記載するための用語を指す。
【００７０】
用語「クローン性集団」とは、本明細書で使用する場合、単一の細胞の増生由来の細胞の集団を指す。即ち、クローン性集団内の細胞は、このクローン性集団を播種するために使用した単一の細胞の全ての後代である。
【００７１】
用語「培地」は、本明細書で言及する場合、組織もしくは細胞集団を維持するための培地、または細胞生存度を維持し増殖を支持する栄養素を含む、細胞集団を培養するための培地（例えば、「培養培地」）である。細胞培養培地は、適切な組合せで以下のいずれかを含み得る：塩、緩衝液、アミノ酸、グルコースまたは他の糖、抗生物質、血清または血清代替品、および他の構成要素、例えば、ペプチド成長因子など。特定の細胞型のために通常使用される細胞培養培地は、当業者に公知である。
【００７２】
用語「表現型」とは、実際の遺伝子型に関わらず、特定のセットの環境条件および因子の下で細胞または生物を規定する、合計の生物学的特徴のうち１つまたはいくつかを指す。
【００７３】
「マーカー」は、本明細書で使用する場合、細胞の特徴および／または表現型を記載する。マーカーは、目的の特徴を含む細胞の選択のために使用され得る。マーカーは、特定の細胞によって変動する。マーカーは、細胞型に特定の形態学的、機能的または生化学的（酵素的）特徴であれ、その細胞型によって発現された分子であれ、特徴的である。好ましくは、かかるマーカーは、タンパク質であり、より好ましくは、抗体または当該分野で利用可能な他の結合分子に対するエピトープを有する。しかし、マーカーは、タンパク質（ペプチドおよびポリペプチド）、脂質、多糖、核酸およびステロイドが含まれるがこれらに限定されない、細胞中に見出される任意の分子からなり得る。形態学的特徴または形質の例には、形状、サイズ、および核対細胞質比が含まれるがこれらに限定されない。機能的特徴または形質の例には、特定の基材に接着する能力、特定の色素を取り込むまたは除外する能力、特定の条件下で遊走する能力、および特定の系統に沿って分化する能力が含まれるがこれらに限定されない。マーカーは、当業者に利用可能な任意の方法によって検出され得る。
【００７４】
用語「単離された細胞」とは、本明細書で使用する場合、それが元々見出された生物から取り出された細胞、またはかかる細胞の子孫を指す。任意選択で、この細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば、他の細胞の存在下で培養されたものである。任意選択で、この細胞は、第２の生物中に後に導入され、またはこの細胞が単離された生物（またはこの細胞がその流れをくむ細胞）中に再導入される。
【００７５】
用語「単離された集団」とは、細胞の単離された集団に関して本明細書で使用する場合、細胞の混合されたまたは不均一集団から取り出され分離された細胞の集団を指す。一部の実施形態では、単離された集団は、それらの細胞がそこから単離または富化された不均一集団と比較して、細胞の実質的に純粋な集団である。
【００７６】
用語「実質的に純粋な」とは、特定の細胞集団に関して、総細胞集団を構成する細胞に関して、少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％純粋な、細胞の集団を指す。
【００７７】
用語「対象」および「個体」は、本明細書で相互交換可能に使用され、本明細書に開示された心室前駆体細胞が、例えば、本明細書に記載される方法および組成物により、一部の実施形態では防止的処置を包含する処置のため、または疾患モデルのためにインプラントされ得る動物、例えば、ヒトを指す。特定の動物、例えば、ヒト対象に対して特異的な疾患状態の処置のために、用語「対象」とは、その特定の動物を指す。用語「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳動物」は、本明細書で相互交換可能に使用され、これには、哺乳動物、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタおよび非ヒト霊長類が含まれる。用語「対象」は、哺乳動物、爬虫類、両生類および魚類が含まれるがこれらに限定されない、任意の脊椎動物もまた包含する。しかし、有利には、この対象は、哺乳動物、例えば、ヒト、または他の哺乳動物、例えば、家畜化された哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマなどであり、または産生哺乳動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタなどもまた、用語、対象に包含される。
【００７８】
本明細書で使用する場合、用語「レシピエント」とは、移植された臓器、組織または細胞を受ける対象を指す。
【００７９】
用語「三次元マトリックス」または「足場」または「マトリックス（複数）」とは、本明細書で使用する場合、生体適合性のマトリックス、足場などを含む組成物を、広い意味で指す。この三次元マトリックスは、２５℃で液体、ゲル、半固体または固体であり得る。この三次元マトリックスは、生分解性または非生分解性であり得る。一部の実施形態では、この三次元マトリックスは、生体適合性、または生体吸収性もしくは生物学的に交換可能（ｂｉｏｒｅｐｌａｃａｂｌｅ）である。例示的な三次元マトリックスには、コラーゲン、フィブリン、キトサン、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）、ポリエチレングリコール、化学的に架橋可能なまたは光架橋性のデキストランを含むデキストラン、加工された組織マトリックス、例えば粘膜下組織などを含む、ポリマーおよびヒドロゲルが含まれる。ある特定の実施形態では、この三次元マトリックスは、同種構成要素、自家構成要素、または同種構成要素および自家構成要素の両方を含む。ある特定の実施形態では、この三次元マトリックスは、合成または半合成材料を含む。ある特定の実施形態では、この三次元マトリックスは、フレームワークまたは支持体、例えば、フィブリン由来足場を含む。
【００８０】
本明細書で使用する場合、用語「投与する」、「導入する」および「移植する」は、相互交換可能に使用され、所望の部位における細胞の少なくとも部分的な局在化を生じる方法またはルートによる、本明細書に記載される分化した心筋原性前駆体細胞および／または心筋細胞の、対象中への配置を指す。これらの細胞は、対象中の所望の位置への送達を生じる任意の適切なルートによって投与され得、この場所で、細胞の少なくとも一部分は生存したままである。対象への投与後の細胞の生存度の期間は、数時間ほどの短い時間、例えば２４時間から、数日間まで、数年間ほどの長い時間までであり得る。
【００８１】
用語「統計的に有意」または「有意に」とは、統計学的有意性を指し、一般に、マーカーの正常濃度の２標準偏差（２ＳＤ）下またはそれよりも下を意味する。この用語は、差異が存在するという統計的証拠を指す。これは、帰無仮説が実際に真であるときに、この帰無仮説を棄却する決定を行う確率として定義される。この決定は、ｐ値を使用してしばしば行われる。用語「実質的に」または「優勢に」とは、本明細書で使用する場合、少なくとも約６０％、または好ましくは少なくとも約７０％または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％または少なくとも約９９％もしくはそれ超、または７０％と１００％との間の任意の整数の割合を意味する。
【００８２】
用語「疾患」または「障害」は、本明細書で相互交換可能に使用され、機能の遂行を妨害するもしくは妨げる、および／または罹患したヒトもしくはヒトと接触したものに対する症状、例えば、不快感、機能障害、苦悩もしくはさらには死亡を引き起こす、身体の状態または臓器の一部の状態における任意の変更を指す。疾患または障害は、ジステンパー、病的状態にあること、病的状態、病弊、障害、不調、病気、愁訴、不快または情動にも関し得る。
【００８３】
本明細書で使用する場合、語句「心血管状態、疾患または障害」は、不十分な、望ましくないまたは異常な心機能を特徴とする全ての障害、例えば、虚血性心臓疾患、高血圧性心臓疾患および肺高血圧性心臓疾患、弁膜疾患、先天性心臓疾患ならびに対象、特にヒト対象においてうっ血性心不全をもたらす任意の状態を含む意図である。不十分なまたは異常な心機能は、疾患、傷害および／または加齢の結果であり得る。背景として、心筋傷害に対する応答は、一部の細胞は死亡するが、他の細胞は、まだ死亡してはいないが機能障害性である冬眠の状態に入る、十分に規定された通路に従う。これの後には、炎症細胞の浸潤、瘢痕の一部としてのコラーゲンの沈着が続き、これらは全て、新たな血管の内殖およびある程度の継続された細胞死と並行して生じる。本明細書で使用する場合、用語「虚血」とは、血液の流入の低減に起因する、任意の局在性の組織虚血を指す。用語「心筋虚血」とは、冠状動脈硬化症および／または心筋への不適切な酸素供給によって引き起こされる循環障害を指す。例えば、急性心筋梗塞は、心筋組織に対する不可逆的な虚血侵襲を示す。この侵襲は、冠状循環における閉塞性（例えば、血栓性または塞栓性）事象を生じ、心筋の代謝的需要が心筋組織への酸素の供給を超える環境を生み出す。
【００８４】
本明細書で使用する場合、用語「処置する」または「処置」は、本明細書で相互交換可能に使用され、心血管状態、疾患または障害、即ち、不十分なまたは望ましくない心機能を特徴とする任意の障害の少なくとも１つの有害効果または症状を低減または減少または軽減または停止させることを指す。心障害の有害効果または症状は、当該分野で周知であり、これには、呼吸困難、胸部疼痛、動悸、めまい、失神、浮腫、チアノーゼ、蒼白、疲労および死亡が含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、用語「処置」とは、本明細書で使用する場合、対象における心血管状態の症状の発症を予防するための防止的処置または予防的処置を指す。
【００８５】
処置は、一般に、１つまたは複数の症状または臨床的マーカーが、その用語が本明細書に定義されるように低減される場合、「有効」である。あるいは、処置は、疾患の進行が低減または停止される場合、「有効」である。即ち、「処置」は、疾患の症状の改善または疾患のマーカーの減少だけではなく、処置の非存在下で予測される症状の進行または悪化の休止または緩徐化もまた含む。有益なまたは所望の臨床的結果には、検出可能であれ検出不能であれ、１つまたは複数の症状の軽減、疾患の程度の減退、疾患の安定化された（即ち、悪化していない）状態、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の回復または緩和、および寛解（部分的であれ全体的であれ）が含まれるがこれらに限定されない。「処置」とは、処置を受けていない場合の予測された生存と比較して、延長している生存もまた意味する。処置を必要とする者には、心状態を有するとすでに診断された者、ならびに遺伝子感受性または他の因子、例えば、体重、食餌および健康状態に起因して心状態を発症する可能性が高い者が含まれる。一部の実施形態では、用語、処置する、は、疾患または障害の発病を予防するために本明細書に開示される医薬組成物を投与することを含む、予防的手段および／または防止的処置もまた包含する。
【００８６】
症状における治療的に有意な低減は、対照または非処置対象と比較して、測定されたパラメーターにおける、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％またはそれ超である。測定されたまたは測定可能なパラメーターには、疾患の臨床的に検出可能なマーカー、例えば、上昇したまたは抑圧されたレベルの生物学的マーカー、ならびに疾患または障害についての症状またはマーカーの臨床的に受容された尺度と関連するパラメーターが含まれる。本明細書に開示される組成物および製剤の合計一日使用は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決断されることが理解される。必要とされる正確な量は、処置されている疾患の型などの因子に依存して変動する。
【００８７】
対象における心血管状態または疾患の処置に関して、用語「治療有効量」とは、安全かつ、発症または心血管疾患もしくは障害を予防または遅延させるのに十分な量を指す。したがって、この量は、心血管疾患もしくは障害を治癒するまたは心血管疾患もしくは障害を寛解に向かわせる、心血管疾患の進行の過程を緩徐化させる、心血管疾患または障害の症状を緩徐化または阻害する、心血管疾患または障害の二次性症状の樹立を緩徐化または阻害する、あるいは心血管疾患または障害の二次性症状の発症を阻害することができる。心血管疾患または障害の処置のための有効量は、処置される心血管疾患の型、症状の重症度、処置されている対象、対象の年齢および全身状態、投与の様式などに依存する。したがって、正確な「有効量」を特定することは不可能である。しかし、任意の所与の症例について、適切な「有効量」は、慣用的にすぎない実験を使用して、当業者によって決定され得る。処置の効力は、当業者によって判断され得る、例えば、効力は、本明細書で議論される心血管疾患または障害の動物モデル、例えば、急性心筋梗塞または虚血−再灌流傷害を有するげっ歯類の処置、ならびに本明細書に開示される心血管疾患または障害の少なくとも１つの症状の減少、例えば、増加した心臓駆出率、心不全の減少した比率、減少した梗塞サイズ、減少した関連する罹患率（肺浮腫、腎不全、不整脈）改善された運動耐容能または他の生活の質の尺度をもたらす組成物または製剤の任意の処置または投与において判定され得、減少した死亡率は有効な処置を示す。組成物が心血管疾患または障害の処置のために使用される実施形態では、組成物の効力は、心血管疾患の実験動物モデル、例えば、虚血−再灌流傷害の動物モデル（Ｈｅａｄｒｉｃｋ  Ｊ  Ｐ、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８５巻；Ｈ１７９７頁；２００３年）および急性心筋梗塞の動物モデル（Ｙａｎｇ  Ｚ、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８２巻：Ｈ９４９頁：２００２年；Ｇｕｏ  Ｙ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ３３巻；８２５〜８３０頁、２００１年）を使用して判断され得る。実験動物モデルを使用する場合、処置の効力は、心血管疾患または障害の症状における低減、例えば、呼吸困難、胸部疼痛、動悸、めまい、失神、浮腫、チアノーゼ、蒼白、疲労および高血圧の１つまたは複数の症状における低減が、未処置の動物と比較して、処置された動物においてより早く生じる場合に、明らかとなる。「より早く」とは、例えば、腫瘍のサイズにおける減少が、少なくとも５％より早く、より好ましくは、例えば、１日より早く、２日より早く、３日より早くまたはそれ超早く生じることを意味する。
【００８８】
本明細書で使用する場合、用語「処置する」は、心血管疾患または障害の処置に言及して使用する場合、心血管疾患または障害の症状および／または生化学的マーカーの低減を指すために使用され、例えば、心血管疾患の少なくとも１つの生化学的マーカーにおける、少なくとも約１０％の低減は、有効な処置とみなされる。心血管疾患のかかる生化学的マーカーの例には、例えば、血液中のクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の低減、ならびに／または心電図（ＥＣＧまたはＥＫＧ）もしくは心エコー図（心臓超音波）、ドップラー超音波および核医学画像化によって測定される、当業者によって決定される心血管疾患の症状における減少ならびに／もしくは血流および心機能における改善が含まれる。心血管疾患の症状における少なくとも約１０％の減少もまた、本明細書に開示される方法によって有効な処置とみなされる。代替的な一例として、少なくとも約１０％の、心血管疾患の症状における低減、例えば、以下；呼吸困難、胸部疼痛、動悸、めまい、失神、浮腫、チアノーゼなどのうち少なくとも１つの低減、もしくはかかる系の休止、または心血管疾患の１つのかかる症状のサイズにおける少なくとも約１０％の低減もまた、本明細書に開示される方法によって、有効な処置とみなされる。一部の実施形態では、治療剤は、管理可能な程度まで症状を単に低減させるのではなく、心血管疾患または障害を実際に排除することが好ましいが、必要なわけではない。
【００８９】
本明細書に開示される方法による処置に適した対象は、本明細書に開示される方法を使用する処置に適した当業者によって一般に公知の、心筋梗塞（一般に心臓発作と呼ばれる）を診断するための任意の方法によって同定され得、かかる診断方法には、例えば、以下が含まれるがこれらに限定されない；（ｉ）クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）および心筋梗塞の間に放出される他の酵素のレベルを検出するための血液試験；（ｉｉ）紙上またはコンピューターモニター上のいずれかの、心活動のグラフ記録である心電図（ＥＣＧまたはＥＫＧ）。ＥＣＧは、疾患および／または損傷を検出する際に有益であり得る；（ｉｉｉ）先天性心臓疾患を調査するため、ならびに心臓壁、弁および血管の機能的異常性を含む心臓壁の異常性を判定するために使用される心エコー図（心臓超音波）；（ｉｖ）ドップラー超音波は、心臓弁を横断する血流を測定するために使用され得る；（ｖ）核医学画像化（当該分野で放射性核種スキャニングとも呼ばれる）は、臓器の解剖学および機能の可視化を可能にし、冠状動脈疾患、心筋梗塞、弁疾患、心臓移植片拒絶を検出するため、バイパス手術の有効性をチェックするため、または血管形成術もしくは冠状バイパスグラフトのために患者を選択するために使用され得る。
【００９０】
用語「冠状動脈疾患」および「急性冠症候群」は、本明細書で相互交換可能に使用される場合、心筋梗塞を指し、心血管状態、疾患または障害を指し、これには、不十分な、望ましくないまたは異常な心機能を特徴とする全ての障害、例えば、虚血性心臓疾患、高血圧性心臓疾患および肺高血圧性心臓疾患、弁膜疾患、先天性心臓疾患ならびに対象、特にヒト対象においてうっ血性心不全をもたらす任意の状態が含まれる。不十分なまたは異常な心機能は、疾患、傷害および／または加齢の結果であり得る。背景として、心筋傷害に対する応答は、一部の細胞は死亡するが、他の細胞は、まだ死亡してはいないが機能障害性である冬眠の状態に入る、十分に規定された通路に従う。これの後には、炎症細胞の浸潤、瘢痕の一部としてのコラーゲンの沈着が続き、これらは全て、新たな血管の内殖およびある程度の継続された細胞死と並行して生じる。
【００９１】
本明細書で使用する場合、用語「虚血」とは、血液の流入の低減に起因する、任意の局在性の組織虚血を指す。用語「心筋虚血」とは、冠状動脈硬化症および／または心筋への不適切な酸素供給によって引き起こされる循環障害を指す。例えば、急性心筋梗塞は、心筋組織に対する不可逆的な虚血侵襲を示す。この侵襲は、冠状循環における閉塞性（例えば、血栓性または塞栓性）事象を生じ、心筋の代謝的需要が心筋組織への酸素の供給を超える環境を生み出す。
【００９２】
本明細書で相互交換可能に使用される用語「組成物」または「医薬組成物」とは、当該分野で従来的であり、哺乳動物、好ましくはヒトまたはヒト細胞への投与に適した薬学的に許容される担体などの賦形剤を通常は含む、組成物または製剤を指す。一部の実施形態では、医薬組成物は、例えば、標的組織への直接的注射またはカテーテルを介した注射による、標的組織または臓器への直接送達のために具体的に製剤化され得る。他の実施形態では、組成物は、経口、眼内、非経口、静脈内、動脈内、皮下、鼻腔内、舌下、脊髄内、脳室内などが含まれるがこれらに限定されない、いくつかのルートのうち１つまたは複数を介した投与のために具体的に製剤化され得る。さらに、局所（例えば、口腔粘膜、呼吸粘膜）および／または経口投与のための組成物は、本明細書に記載される当該分野で公知のように、溶液、懸濁物、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤、含嗽液または粉末を形成し得る。これらの組成物は、安定剤および防腐剤もまた含み得る。担体、安定剤およびアジュバントの例については、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（２００５年）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ｗｉｔｈ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ、第２１版。
【００９３】
本明細書で使用する場合、用語「投与する」、「導入する」および「移植する」は、相互交換可能に使用され、所望の部位または組織位置における医薬組成物の少なくとも部分的な局在化を生じる方法またはルートによる、本明細書に記載される心筋原性前駆体細胞を含む医薬組成物または分化した心筋細胞（例えば、心室心筋細胞）の集団を含む組成物の、対象中への配置を指す。一部の実施形態では、この医薬組成物は、対象において有効な処置を生じる任意の適切なルートによって投与され得る、即ち、投与は、細胞の少なくとも一部分が所望の標的組織または標的細胞位置に位置する、対象中の所望の位置または組織への送達を生じる。
【００９４】
語句「非経口投与」および「非経口投与される」とは、本明細書で使用する場合、通常は注射による、経腸および外用投与以外の投与の様式を意味し、これには、静脈内、筋内、動脈内、くも膜下腔内、心室内、嚢内、眼窩内、心臓内、真皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内および胸骨内の注射および注入が含まれるがこれらに限定されない。語句「全身投与」、「全身投与される」、「末梢投与」および「末梢投与される」とは、本明細書で使用する場合、それが、動物の系に進入し、したがって、代謝および他の同様のプロセスに供されるように、心組織中に直接投与する以外の、心血管幹細胞および／もしくはそれらの後代ならびに／または化合物および／もしくは他の材料の投与、例えば、皮下または静脈内投与を意味する。
【００９５】
語句「薬学的に許容される」は、健全な医学的判断の範囲内の、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症なしの、ヒトおよび動物の組織と接触させた使用に適切な、合理的なベネフィット／リスク比に見合う、化合物、材料、組成物および／または投薬形態を指すために、本明細書で使用される。
【００９６】
語句「薬学的に許容される担体」とは、本明細書で使用する場合、対象の薬剤を、１つの臓器または身体の部分から別の臓器または身体の部分へと運搬または輸送することに関与する、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクル、例えば、液体もしくは固体フィラー、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料を意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性であるという意味で、「許容される」必要がある。
【００９７】
用語「薬物」または「化合物」または「試験化合物」とは、本明細書で使用する場合、疾患または状態を処置または予防または制御するために対象に投与される、化学的実体もしくは生物学的産物、または化学的実体もしくは生物学的産物の組合せを指す。化学的実体または生物学的産物は、好ましくは低分子量化合物であるが必ずしも低分子量化合物ではなく、より大きい化合物、例えば、タンパク質、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡｚｙｍｅ、糖タンパク質、ｓｉＲＮＡ、リポタンパク質、アプタマー、ならびにそれらの改変および組合せが含まれるがこれらに限定されない、核酸、アミノ酸または炭水化物のオリゴマーでもあり得る。
【００９８】
用語「移植」とは、本明細書で使用する場合、宿主（即ち、移植レシピエントまたは移植対象）中への、新たな細胞（例えば、再プログラムされた細胞）、組織（例えば、再プログラムされた細胞から産生された分化した細胞）または臓器の導入を指す。
【００９９】
用語「Ｊａｇｇｅｄ１と反応性の薬剤」とは、本明細書で使用する場合、Ｊａｇｇｅｄ１と結合するまたはＪａｇｇｅｄ１と他の方法で相互作用する薬剤を指す。好ましくは、この薬剤は、それが、他の非Ｊａｇｇｅｄ１タンパク質と結合しないまたは他の非Ｊａｇｇｅｄ１タンパク質と相互作用しないように、Ｊａｇｇｅｄ１と「特異的に」結合するまたはＪａｇｇｅｄ１と他の方法で「特異的に」相互作用する。
【０１００】
用語「Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤」とは、本明細書で使用する場合、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４と結合するまたはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と他の方法で相互作用する薬剤を指す。好ましくは、この薬剤は、それが、他の非Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４タンパク質と結合しないまたは他の非Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４タンパク質と相互作用しないように、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４と「特異的に」結合するまたはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と他の方法で「特異的に」相互作用する。
【０１０１】
用語「Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤」とは、本明細書で使用する場合、Ｉｓｌｅｔ１と結合するまたはＩｓｌｅｔ１と他の方法で相互作用する薬剤を指す。好ましくは、この薬剤は、それが、他の非Ｉｓｌｅｔ１タンパク質と結合しないまたは他の非Ｉｓｌｅｔ１タンパク質と相互作用しないように、Ｉｓｌｅｔ１と「特異的に」結合するまたはＩｓｌｅｔ１と他の方法で「特異的に」相互作用する。
【０１０２】
用語「抗体」は、本明細書で使用する場合、抗体全体および任意の抗原結合性断片（即ち、「抗原結合性部分」）またはその単鎖を含む。「抗体」とは、好ましい一実施形態では、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合性部分を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書でＶＨと略す）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書でＶＬと略す）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬから構成される。抗体の用語「抗原結合性部分」（または単純に「抗体部分」）とは、本明細書で使用する場合、抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つまたは複数の断片を指す。
【０１０３】
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書で使用する場合、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す抗体を指す。
【０１０４】
用語「ヒトモノクローナル抗体」とは、本明細書で使用する場合、単一の結合特異性を示し、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および任意選択の定常領域を有する、抗体を指す。
【０１０５】
用語「ヒト化モノクローナル抗体」とは、本明細書で使用する場合、単一の結合特異性を示し、ヒトフレームワークおよび定常領域中にグラフトされた非ヒト抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）由来の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、２および３を有する、抗体を指す。
【０１０６】
用語「キメラモノクローナル抗体」とは、本明細書で使用する場合、単一の結合特異性を示し、別の種由来の定常領域に連結された１つの種由来の重鎖および軽鎖可変領域を有する、抗体を指す。
【０１０７】
用語「融合タンパク質」とは、本明細書で使用する場合、２つの異なるタンパク質またはその部分が一緒に動作可能に連結される組換えＤＮＡテクノロジーを使用して典型的には作製される、複合タンパク質を指す。非限定的な一例は、非免疫グロブリンタンパク質が免疫グロブリンＦｃ領域に動作可能に連結されたＦｃ融合タンパク質である。
【０１０８】
本発明の種々の態様は、以下のサブセクションにおいてさらに詳細に記載されている。
【０１０９】
ヒト心室前駆体細胞を単離する方法
一態様では、本発明は、ヒト心室前駆体細胞を単離する方法に関する。実施例に記載されるように、Ｊａｇｇｅｄ１およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４は、本明細書でヒト心室前駆体細胞の細胞表面マーカーとして同定されており、したがって、このマーカーは、これらの前駆体細胞の単離を容易にするために使用され得る。したがって、一実施形態では、本発明は、ヒト心室前駆体細胞を単離するための方法であって、
心前駆体細胞を含むヒト細胞の培養物を、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の１つまたは複数の薬剤と接触させるステップ；および
【０１１０】
Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４反応性陽性細胞を非反応性細胞から分離することによって、ヒト心室前駆体細胞を単離するステップを含む、方法を提供する。
【０１１１】
あるいは、接触させるステップの後、この方法は、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４反応性陽性細胞を非反応性細胞から単離することによって、ヒト心室前駆体細胞を単離するステップを含み得る。
【０１１２】
これもまた実施形態に記載されるように、Ｉｓｌｅｔ１は、心室前駆体細胞によってＪａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と共発現されるマーカーであり、したがって、両方のマーカーが、これらの前駆体細胞の単離を容易にするために使用され得る。したがって、上記方法の別の実施形態では、ヒト細胞の培養物を、Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤とも接触させ；Ｊａｇｇｅｄ１反応性／Ｉｓｌｅｔ１反応性陽性細胞、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４反応性／Ｉｓｌｅｔ１反応性陽性細胞またはＪａｇｇｅｄ１反応性／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４反応性／Ｉｓｌｅｔ１反応性陽性細胞を、非反応性細胞から分離することによって、ヒト心室前駆体細胞を単離する。ヒト細胞の培養物を、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤ならびにＩｓｌｅｔ１と反応性の薬剤と、同時に接触させてもよい。あるいは、ヒト細胞の培養物を、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤と接触させる前に、Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤と接触させてもよい。あるいは、ヒト細胞の培養物を、Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤と接触させる前に、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤と接触させてもよい。
【０１１３】
さらに別の実施形態では、ヒト細胞の培養物を、Ｊａｇｇｅｄ１と反応性の薬剤およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤と接触させてもよく、Ｊａｇｇｅｄ１＋／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４＋である細胞を分離してもよい。さらに別の実施形態では、ヒト細胞の培養物を、Ｊａｇｇｅｄ１と反応性の薬剤、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤およびＩｓｌｅｔ１と反応性の薬剤と接触させてもよい、Ｊａｇｇｅｄ１＋／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４＋／Ｉｓｌｅｔ１＋である細胞を分離してもよい。
【０１１４】
別の実施形態では、本発明は、ヒト心室前駆体細胞を単離するための方法であって、
心前駆体細胞を生成する条件下でヒト多能性幹細胞を培養して、細胞の培養物を取得するステップ；
細胞の培養物を、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の１つまたは複数の薬剤と接触させるステップ；および
Ｊａｇｇｅｄ１反応性陽性細胞および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４反応性陽性細胞を非反応性細胞から分離することによって、ヒト心室前駆体細胞を単離するステップ
を含む、方法を提供する。
【０１１５】
あるいは、培養するステップおよび接触させるステップの後に、この方法は、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４反応性陽性細胞を非反応性細胞から単離することによって、ヒト心室前駆体細胞を単離するステップを含み得る。
【０１１６】
上記方法の一実施形態では、ヒト細胞の培養物を、Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤とも接触させ；Ｊａｇｇｅｄ１反応性／Ｉｓｌｅｔ１反応性、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４反応性／Ｉｓｌｅｔ１反応性陽性細胞またはＪａｇｇｅｄ１反応性／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４反応性／Ｉｓｌｅｔ１反応性陽性細胞を、非反応性細胞から分離することによって、ヒト心室前駆体細胞を単離する。ヒト細胞の培養物を、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤ならびにＩｓｌｅｔ１と反応性の薬剤と、同時に接触させてもよい。あるいは、ヒト細胞の培養物を、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤と接触させる前に、Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤と接触させてもよい。あるいは、ヒト細胞の培養物を、Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤と接触させる前に、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤とさせてもよい。
【０１１７】
さらに別の実施形態では、ヒト細胞の培養物を、Ｊａｇｇｅｄ１と反応性の薬剤およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤と接触させてもよく、Ｊａｇｇｅｄ１＋／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４＋である細胞を分離してもよい。さらに別の実施形態では、ヒト細胞の培養物を、Ｊａｇｇｅｄ１と反応性の薬剤、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤およびＩｓｌｅｔ１と反応性の薬剤と接触させてもよく、Ｊａｇｇｅｄ１＋／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４＋／Ｉｓｌｅｔ１＋である細胞を分離してもよい。
【０１１８】
好ましい実施形態では、Ｊａｇｇｅｄ１と反応性の薬剤は、抗Ｊａｇｇｅｄ１抗体、例えば、モノクローナル抗体である。非限定的な例には、Ｊａｇｇｅｄ１に対する結合特異性を有する、マウス、ウサギ、ヒト、ヒト化またはキメラモノクローナル抗体が含まれる。抗Ｊａｇｇｅｄ１モノクローナル抗体は、当該分野で市販されている（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。さらに、抗Ｊａｇｇｅｄ１抗体は、抗原としてＪａｇｇｅｄ１を使用して、当該分野で十分に確立された標準的な技術を使用して調製され得る。
【０１１９】
別の実施形態では、Ｊａｇｇｅｄ１と反応性の薬剤は、Ｊａｇｇｅｄ１リガンド、例えば、可溶性Ｊａｇｇｅｄ１リガンドまたは可溶性Ｊａｇｇｅｄ１リガンド融合タンパク質である。Ｊａｇｇｅｄ１リガンドの非限定的な例には、Ｎｏｔｃｈ−１およびＮｏｔｃｈ−２が含まれる。好ましくは、このＪａｇｇｅｄ１リガンドはＮｏｔｃｈ−１である。可溶性Ｊａｇｇｅｄ１リガンド、例えば、Ｎｏｔｃｈ−１の可溶性形態は、例えば、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの欠失によって、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して調製され得る。可溶性リガンドは、これもまた標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、可溶性リガンド融合タンパク質へと変形され得る。融合パートナーが融合タンパク質の分離を容易にする結合性部分を含み得る融合タンパク質が、調製され得る。
【０１２０】
同様に、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤は、例えば、抗Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４抗体（例えば、モノクローナル抗体）またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４リガンド、例えば、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４リガンド融合タンパク質であり得る。非限定的な例には、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４に対する結合特異性を有する、マウス、ウサギ、ヒト、ヒト化またはキメラモノクローナル抗体が含まれる。抗Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４モノクローナル抗体は、当該分野で市販されている（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。さらに、抗Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４抗体は、抗原としてＦｒｉｚｚｌｅｄ４を使用して、当該分野で十分に確立された標準的な技術を使用して調製され得る。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４リガンドの非限定的な例には、ネスチンタンパク質およびＷｎｔ受容体が含まれる。
【０１２１】
同様に、Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤は、例えば、抗Ｉｓｌｅｔ１抗体（例えば、モノクローナル抗体）またはＩｓｌｅｔ１リガンド、例えば、Ｉｓｌｅｔ１リガンド融合タンパク質であり得る。
【０１２２】
Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４反応性陽性細胞を非反応性細胞から分離するために、当該分野で公知の種々の異なる細胞分離技術のうち１つが使用され得る。好ましくは、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４反応性陽性細胞は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって非反応性細胞から分離される。ＦＡＣＳテクノロジー、および細胞を分離するためにそれを実施するための装置は、当該分野で十分確立されている。ＦＡＣＳが細胞分離に使用される場合、好ましくは、使用されるＪａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤は、蛍光標識された抗Ｊａｇｇｅｄ１および／または抗Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４モノクローナル抗体である。あるいは、細胞分離は、例えば、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によって達成され得る。ＭＡＣＳが細胞分離に使用される場合、好ましくは、使用されるＪａｇｇｅｄ１またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤は、抗Ｊａｇｇｅｄ１または抗Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４モノクローナル抗体でコーティングされた磁性ナノ粒子である。あるいは、ＩｓｏＲａｆｔアレイおよびＤＥＰＡｒｒａｙテクノロジーが含まれるがこれらに限定されない、当該分野で公知の他の単一細胞選別方法論が、本発明の心室前駆体細胞を単離する方法に適用され得る。
【０１２３】
Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤との接触の前ならびにＪａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４反応性細胞の分離の前に、ヒト多能性幹細胞は、心前駆体細胞の生成をもたらす条件下で培養され得る。心前駆体細胞を生成するための培養条件は、当該分野で記載されており（例えば、Ｌｉａｎ，  Ｘ．ら（２０１２年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０９巻：Ｅ１８４８〜１８５７頁；米国特許出願公開第２０１３０１８９７８５号を参照のこと）、実施例１および図１ならびに実施例１０にも詳細に記載されている。典型的には、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達が、ｈＰＳＣにおいて最初に活性化され、その後インキュベーション期間が続き、その後Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害が続く。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性化は、Ｇｓｋ３阻害剤、好ましくはＣＨＩＲ９８０１４（ＣＡＳ  ５５６８１３−３９−９）とのインキュベーションによって達成される。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害は、Ｐｏｒｃｎ阻害剤、好ましくはＷｎｔ−Ｃ５９（ＣＡＳ  １２４３２４３−８９−１）とのインキュベーションによって達成される。本発明の方法における使用に適切なｈＰＳＣには、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、例えば、１９−１１−１、１９−９−７または６−９−９細胞（Ｙｕ，  Ｊ．ら（２００９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４巻：７９７〜８０１頁）、およびヒト胚性幹細胞株、例えば、ＥＳ０３細胞（ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）またはＨ９細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎ，  Ｊ．Ａ．ら（１９９８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２巻：１１４５〜１１４７頁）が含まれる。心筋原性前駆体を生成するために適切な培養培地には、実施例１および／または実施例１０に各々さらに記載される、Ｅ８培地、ｍＴｅＳＲ１培地およびＲＰＭＩ／インスリン非含有Ｂ２７が含まれる。
【０１２４】
好ましくは、これらのヒト心筋原性前駆体細胞は、心室前駆体細胞である。心筋原性前駆体細胞を心室系統に偏向させる培養条件が、本明細書で決定されている。これらの心室心筋原性前駆体細胞は、ＲＰＭＩ／Ｂ２７培地中で培養され得、心室筋細胞へとさらに分化し得る。それらがｉｎ  ｖｉｔｒｏで心室細胞（例えば、下記に記載するＭＬＣ２ｖマーカーを発現する）へと分化するような、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで心室前駆体細胞を培養するのに好ましい培地は、心前駆体培養（ＣＰＣ）培地（２０％ノックアウト血清代替物、２．５ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸおよび１００μｇ／ｍｌ  ビタミンＣを補充したアドバンストＤＭＥＭ／Ｆ１２）である。
【０１２５】
分化した心細胞の公知のマーカーは、心前駆体細胞の分化によって生成される細胞の型を同定するために使用され得る。例えば、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）は、心筋細胞分化のマーカーとして使用され得る。ＣＤ１４４（ＶＥ−カドヘリン）は、内皮細胞のマーカーとして使用され得る。平滑筋アクチン（ＳＭＡ）は、平滑筋細胞のマーカーとして使用され得る。ＭＬＣ２ｖは、心室筋細胞のマーカーとして使用され得る。未熟心室筋細胞および房筋肉細胞の両方の上で発現されるＭＬＣ２ａは、これらの細胞型についてのマーカーとして使用され得る。さらに、房筋肉細胞において特異的に発現されるサルコリピン（ｓａｒｃｏｌｉｐｉｎ）は、房筋肉細胞についてのマーカーとして使用され得る。心室において優性に発現され、房においてより低い程度まで発現されるホスホランバンもまた、マーカーとして使用され得る。房心筋細胞において発現される、Ｈｅｙ１とも呼ばれるＨａｉｒｙ関連転写因子１（ＨＲＴ１）は、房心筋細胞についてのマーカーとして使用され得る。心室心筋細胞において発現されるＨＲＴ２（Ｈｅｙ２）は、心室心筋細胞についてのマーカーとして使用され得る。さらに、ＩＲＸ４は、発生の全ての段階の間に心室に限定された発現パターンを有し、したがって、心室系統マーカーとして使用され得る。まとめると、心室において発現され、したがって、適切な心室マーカーである遺伝子は、ＭＬＣ２ｖ、ＩＲＸ４およびＨＲＴ２であるが、房において発現され、したがって、適切な房マーカーである遺伝子は、ＭＬＣ２ａ、ＨＲＴ１、サルコリピンおよびＡＮＦ（心房性ナトリウム利尿因子）である。心室分化の好ましいマーカーは、ＭＬＣ２ｖである。
【０１２６】
ヒト心室前駆体細胞のクローン性集団
別の態様では、本発明は、ヒト心室前駆体細胞のクローン性集団、ならびにかかる前駆体の単離されたクローン性集団を取得するための方法を提供する。本発明は、十億またはそれ超の細胞のクローン性集団が達成され得るような、心室前駆体細胞の拡大増殖および繁殖を可能にする。Ｊａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋心室前駆体細胞をかかる多数までクローン的に拡大増殖させる能力は、心機能を増強するためのｉｎ  ｖｉｖｏでのこれらの細胞の首尾よい使用にとって必要な特色であるが、それは、かかる使用が、十億またはそれ超の規模の細胞を必要とするからである。
【０１２７】
したがって、別の態様では、本発明は、ヒト心室前駆体細胞のクローン性集団を取得するための方法であって、
単一のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞を単離するステップ；および
細胞が少なくとも１×１０９細胞まで拡大増殖されるような条件下で、単一のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞を培養することによって、ヒト心室前駆体細胞のクローン性集団を取得するステップ
を含む、方法を提供する。
【０１２８】
好ましい実施形態では、この単一のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞は、初期培養の時点においてＩｓｌｅｔ１陽性、Ｎｋｘ２．５陰性およびｆｌｋ１陰性である。実施例にさらに記載されるように、かかる単一の細胞は、心筋原性前駆体の生成を促進する条件下における培養のおよそ６日目に取得され得る。ヒト心室前駆体のクローン性集団は、細胞が心室マーカーＭＬＣ２ｖを発現するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでさらに培養および分化され得る。
【０１２９】
好ましくは、この単一のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞は、蛍光活性化細胞選別によって単離される。あるいは、この細胞は、ＭＡＣＳによって、または当該分野で公知のおよび／もしくは本明細書に記載される他の細胞選別方法によって、単離され得る。
【０１３０】
好ましくは、この単一のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞は、Ｊａｇｇｅｄ１および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の１つまたは複数の薬剤、例えば、本明細書で以前に記載した抗Ｊａｇｇｅｄ１抗体もしくはＪａｇｇｅｄ１と反応性の他の薬剤、または本明細書で以前に記載した抗Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４抗体もしくはＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の他の薬剤を使用して、単離される。
【０１３１】
他の実施形態では、ヒト心室前駆体細胞のクローン性集団は、Ｊａｇｇｅｄ１＋およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋である。かかる二重陽性細胞は、Ｊａｇｇｅｄ１と反応性の薬剤およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４と反応性の薬剤の両方を使用する前に、本明細書に記載されるように単離され得、クローン的に拡大増殖され得る。
【０１３２】
好ましい実施形態では、この単一のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞は、本明細書で以前に記載したように、心前駆体培養（ＣＰＣ）培地中で培養される。
【０１３３】
好ましい実施形態では、この単一のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞は、細胞が心室分化に偏向するような条件下で培養される。好ましい培養条件には、ＣＰＣ培地中での培養が含まれる。
【０１３４】
種々の実施形態では、この単一のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞は、少なくとも１×１０９細胞、少なくとも２×１０９細胞、少なくとも３×１０９細胞、少なくとも４×１０９細胞、少なくとも５×１０９細胞、少なくとも６×１０９細胞、少なくとも７×１０９細胞、少なくとも８×１０９細胞、少なくとも９×１０９細胞または少なくとも１０×１０９細胞まで、拡大増殖され得る。
【０１３５】
したがって、本発明は、ヒト心室前駆体細胞のクローン性集団を取得するための本発明の方法によって取得可能なまたは取得される、少なくとも１×１０９のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞のクローン性集団もまた提供する。種々の実施形態では、Ｊａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞のクローン性集団は、少なくとも１×１０９細胞、少なくとも２×１０９細胞、少なくとも３×１０９細胞、少なくとも４×１０９細胞、少なくとも５×１０９細胞、少なくとも６×１０９細胞、少なくとも７×１０９細胞、少なくとも８×１０９細胞、少なくとも９×１０９細胞または少なくとも１０×１０９細胞を含む。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの心室系統への前駆体細胞の分化は、心室系統に偏向させるための、本明細書に記載される条件下における培養によって達成され得る。さらに、心室前駆体細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの移植は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの心室分化をもたらす。
【０１３６】
本発明は、心室前駆体細胞のクローン性集団を含む医薬組成物もまた提供する。これらの医薬組成物は、典型的には無菌であり、医薬品投与に適切な、緩衝液、培地、賦形剤などを含み得る。一実施形態では、クローン性集団を含む医薬組成物は、三次元（３Ｄ）マトリックス上に製剤化される。３Ｄマトリックス上に製剤化された組成物は、心筋修復のためにｉｎ  ｖｉｖｏで移植され得る心筋細胞パッチの形成のために特に好ましい。さらに、これらの組成物は、Ｄｏｍｉａｎ，  Ｉ．  Ｊ．ら（２００９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６巻：４２６〜４２９頁に記載されるように、筋肉薄層（ＭＴＦ）などの、細胞の二次元（２Ｄ）シートへと製剤化され得る。細胞組織のかかる２Ｄシートは、心筋修復のためにｉｎ  ｖｉｖｏで移植され得る心筋細胞パッチの形成においても使用され得る。
【０１３７】
ヒト心室前駆体（ＨＶＰ）の生成
上述の方法による単離の前に、および任意選択で、上述の方法によってクローン性集団を取得する前に、ヒト心室前駆体（ＨＶＰ）の非クローン性集団が、ＨＶＰを生成するための適切な培養条件下におけるヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の培養によって取得され得る。培養条件および適切な出発細胞の例示的なセットは、実施例１および実施例１０に詳細に記載されており、本明細書でヒト心室前駆体生成（ＨＶＰＧ）プロトコールとも呼ばれる。適切なｈＰＳＣ出発細胞には、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）およびヒト胚性幹細胞、例えば、ＥＳ細胞株が含まれる。このプロトコールのために、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達が、ｈＰＳＣにおいて最初に活性化され、その後インキュベーション期間が続き、その後Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害が続く。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性化は、Ｇｓｋ３阻害剤、好ましくはＣＨＩＲ９８０１４（ＣＡＳ  ５５６８１３−３９−９；例えば、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍから市販されている）とのインキュベーションによって達成される。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害は、Ｐｏｒｃｎ阻害剤、好ましくはＷｎｔ−Ｃ５９（ＣＡＳ  １２４３２４３−８９−１；例えば、ＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍまたはＴｏｃｒｉｓから市販されている）とのインキュベーションによって達成される。Ｇｓｋ３阻害剤は、心中胚葉分化を促進するために使用されるが、Ｐｏｒｃｎ阻害剤は、中胚葉細胞からの心室前駆体分化を増強するために使用される。
【０１３８】
したがって、別の態様では、本発明は、ヒト心室前駆体（ＨＶＰ）を生成する方法であって、Ｇｓｋ３阻害剤、好ましくはＣＨＩＲ９８０１４を含む培地中で、少なくとも２４時間、より好ましくは２日間または３日間にわたってヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を培養するステップ、その後、ＨＶＰが生成されるように、Ｐｏｒｃｎ阻害剤、好ましくはＷｎｔ−Ｃ５９を含む（かつＧｓｋ３阻害剤を欠く）培地中で、少なくとも４８時間にわたってｈＰＳＣを培養するステップ、を含む、方法を提供する。実験により、ＣＨＩＲ−９８０１４による２４時間の処理の後、ｈＰＳＣのうち９９％超が、中胚葉マーカーブラキュリを発現し、ＣＨＩＲ−９８０１４による処理の３日後、分化した細胞のうち９５％超が、心中胚葉を示すＭｅｓｐ１を発現したことが示された。さらに、Ｗｎｔ−Ｃ５９による４８時間の処理は、中胚葉細胞からの心室前駆体分化を増強した。
【０１３９】
したがって、Ｇｓｋ３阻害剤およびＰｏｒｃｎ阻害剤の使用のタイミングに関して、典型的には培養の０日目に、ｈＰＳＣは、Ｇｓｋ３阻害剤と共に培養され、培養の３日目に、Ｇｓｋ３阻害剤を除去するために培地が交換され、次いで、細胞は、培養の５日目の間Ｐｏｒｃｎ阻害剤を含む培地を用いて培養される。ＨＶＰ生成は、培養における５日目と７日目との間（５日目および７日目を含む）で最適であり、培養の６日目にピークに達する。培養条件、ならびにＧｓｋ３阻害剤およびＰｏｒｃｎ阻害剤の使用のタイミングに関する、他の非限定的な例示的な詳細は、実施例１および１０に詳細に記載されている。
【０１４０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ組織操作
ヒト心室前駆体（ＨＶＰ）をヌードマウスにおいて腎臓被膜下に移植した実施例６および７に記載されるｉｎ  ｖｉｖｏ移植研究は、腎臓被膜の表面上に、成熟した機能的なヒト心室筋の大きい壁へとＨＶＰが自発的にアセンブルする能力を立証している。血管新生は、マウス脈管構造を心室の室筋壁に呼び込むことによってパラクリン経路を介して生じるが、マトリックスは、前駆体自身から細胞自律的経路を介して生成される。ＨＶＰを正常マウス心臓中に移植した実施例８に記載されるｉｎ  ｖｉｖｏ心筋内移植研究は、ＨＶＰが心外膜表面へと自発的に遊走し、その場所でそれらが拡大増殖し、引き続いて分化し、心外膜の表面上でヒト心室筋の壁へと成熟化することを立証している。合わせると、これらの研究は、ヒト心室形成が、精製されたＨＶＰを介してｉｎ  ｖｉｖｏで完全に細胞自律的経路を介して生じ得、それによって、臓器ごとのｉｎ  ｖｉｖｏ組織操作におけるそれらの使用が可能になることを示している。
【０１４１】
ヒト心室の心筋は、再生のための限定的な能力を有し、そのほとんどは、１０歳後には失われる（Ｂｅｒｇｍａｎｎ，  Ｏ．ら（２０１５年）Ｃｅｌｌ  １６１巻：１５６６〜１５７５頁）。このように、心傷害の間の心筋の修復、再生および組織操作アプローチを生み出すための新たな戦略は、再生生物学および医学において活発な調査の対象となってきた（Ｓａｈａｒａ，  Ｍ．ら（２０１５年）ＥＭＢＯ  Ｊ．  ３４巻：７１０〜７３８頁；Ｓｅｇｅｒｓ，  Ｖ．Ｆ．Ｍ．およびＬｅｅ，  Ｒ．Ｔ．（２００８年）Ｎａｔｕｒｅ  ４５１巻：９３７〜９４２頁）。任意の固形臓器の組織操作の間の協調された血管新生およびマトリックス形成を達成する必要を考慮して、インタクトな３Ｄ固形臓器のｉｎ  ｖｉｖｏでの形成は、脈管細胞および／または導管、ならびに収縮力の整列および生成を可能にする生体材料および／または脱細胞化マトリックスの添加を最終的に必要とするという仮説が存在した（Ｆｏｒｂｅｓ，  Ｓ．Ｊ．およびＲｏｓｅｎｔｈａｌ，  Ｎ．（２０１４年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  ２０巻：８５７〜８６９頁；Ｈａｒｒｉｓｏｎ，  Ｒ．Ｈ．ら（２０１４年）Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．  Ｐａｒｔ  Ｂ  Ｒｅｖ．  ２０巻：１〜１６頁）。機能的な固形臓器の形成を達成するためにこれらの種々の構成要素を添加することの複雑性は、これを臨床的実施に落とし込むための試みを複雑にしている（Ｗｅｂｂｅｒ，  Ｍ．Ｊ．ら（２０１４年）Ａｎｎ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．  ４３巻：６４１〜６５６頁）。ｈＰＳＣは、今日まで大きな有望さを有しているが、任意の哺乳動物系において、心臓の表面上に、純粋な、血管新生した、完全に機能的な成熟３Ｄヒト心室筋臓器をｉｎ  ｖｉｖｏで構築することは可能ではなかった（Ｖｕｎｊａｋ−Ｎｏｖａｋｏｖｉｃ，  Ｇ．ら（２０１１年）Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．  １３巻：２４５〜２６７頁）。
【０１４２】
ヒトＥＳまたはｉＰＳ細胞株のいずれかの再生可能な供給源から数十億の精製されたＨＶＰを生成する能力は、進行型心不全の背景における機能的な心室筋肉の生成のための新たなアプローチを提示する。前駆体は、心筋内注射によって送達され得、次いで、心外膜表面へと自己遊走し、その場所で、それらは拡大増殖および分化して、前駆体マーカーを喪失する。数週間の過程のうちに、細胞は細胞周期から退出し、Ｔ管の形成、カテコールアミン応答性、自動能の喪失、整列された筋節構造を有する成体桿状コンフォメーション、およびｈＰＳＣ分化した心筋細胞由来の他の心筋パッチと同等な力を生む能力を含む、成熟心室心筋のいくつかの独立したマーカーを示す成体桿状細胞を形成するように進行する（Ｔｕｌｌｏｃｈ，  Ｎ．Ｌ．ら（２０１１年）Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．  １０９巻：４７〜５９頁）。この細胞自律的経路の拡張可能性は、ヒト心室自由壁と対応するレベルに近づく、厚さが１．５ｃｍを超える合わせた厚さを有するヒト心室筋の異所的生成を可能にしている（Ｂａｓａｖａｒａｊａｉａｈ，  Ｓ．ら（２００７年）Ｂｒ．  Ｊ．  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｍｅｄ．  ４１巻：７８４〜７８８頁）。
【０１４３】
より後期の段階における成体心臓前駆体の大部分の部位、心外膜ニッチに遊走する能力は、ＨＶＰの独自の特色であり、心室形成中の心室の緻密層（ｃｏｍｐａｃｔ  ｚｏｎｅ）の拡大増殖の間のこれらの細胞の正常ニッチを模倣する。以前の研究により、急性虚血性傷害の発生および脈管透過性における破綻は、傷害された心筋中への比較的少数のＥＳ細胞由来心筋細胞のグラフティングのための必要条件であり（ｖａｎ  Ｌａａｋｅ，  Ｌ．Ｗ．ら（２００７年）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  １巻：９〜２４頁；Ｌａｆｌａｍｍｅ，  Ｍ．Ａ．ら（２００７年）Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２５巻：１０１５〜１０２４頁）、その場合にも、生存率が低い（＜５％）（Ｌａｆｌａｍｍｅ，  Ｍ．Ａ．およびＭｕｒｒｙ，  Ｃ．Ｅ．（２０１１年）Ｎａｔｕｒｅ  ４７３巻：３２６〜３３５頁；Ｌａｆｌａｍｍｅ，  Ｍ．Ａ．ら（２００５年）Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １６７巻：６６３〜６７１頁）ことが示されている。急性虚血性傷害の非存在下で心外膜表面上で大規模な心室パッチを形成する心筋内ＨＶＰの能力は、さらなる生体材料、細胞、または外因性遺伝子および／もしくはＲＮＡの移入の必要なしの、拡張型心筋症に対する新たな治療戦略を提供する。
【０１４４】
より後期段階の前駆体は、心背景または非心背景のいずれかにおいて三次元心室組織の形成のための能力を示さないので、ｉｎ  ｖｉｖｏ正常心臓の心外膜表面上に３Ｄ心室筋肉壁を形成する能力は、ＩＳＬ１／ＦＺＤ４／ＪＡＧ１心室前駆体の独自の特色であり、このことは、傾倒した心室系統を生成すること、ならびに心室形成の特定の段階で特定の心室前駆体を精製することの重要性を強調している。
【０１４５】
したがって、本発明は、本明細書に記載されるＨＶＰを使用して、ヒト心室組織をｉｎ  ｖｉｖｏで生成するための方法を提供する。一実施形態では、この方法は、Ｊａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋前駆体を、非ヒト動物の臓器中に移植するステップ、およびヒト心室組織が生成されるように、これらの前駆体をｉｎ  ｖｉｖｏで成長させるステップを含む。好ましくは、この非ヒト動物は、ヒト前駆体細胞に対する免疫応答を開始できないように、免疫不全である。一実施形態では、この非ヒト動物は、マウス、例えば、免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪマウスまたは免疫不全ＳＣＩＤ−ベージュマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｆｒａｎｃｅから市販されている）である。一実施形態では、この臓器は、腎臓である（例えば、これらの細胞は、腎臓被膜下に移植される）。別の実施形態では、この臓器は心臓である。種々の実施形態では、少なくとも１×１０６細胞、少なくとも２×１０６細胞、少なくとも３×１０６細胞、少なくとも４×１０６細胞、少なくとも５×１０６細胞、少なくとも１×１０７細胞、少なくとも５×１０７細胞、少なくとも１×１０８細胞、少なくとも１×１０９細胞が移植される。
【０１４６】
移植のためのＨＶＰを取得するために、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、本明細書に記載される、ＨＶＰの生成をもたらす条件（本明細書でＨＶＰＧプロトコールと呼ばれる）下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養され得る。ｉｎ−ｖｉｔｒｏ培養後にＨＶＰを移植するタイミングに関して、最適な心室組織生成のために、これらの細胞は、ＨＶＰＧプロトコールの０日目として定義される培養の開始の数日後に決定される、移植の時点においてＨＶＰによって発現される細胞マーカーに基づいて規定され得る段階において移植すべきである。一実施形態では、これらの細胞は、中胚葉マーカーＭＥＳＰ１のピーク発現として規定され得る心中胚葉形成のピーク後に移植される。典型的には、ＭＥＳＰ１発現は、培養の２日目から４日目の間（２日目および４日目を含む）であり、３日目にピークに達する。一実施形態では、これらの細胞は、Ｉｓｌｅｔ−１発現のピークに対応する時点で移植される。典型的には、Ｉｓｌｅｔ１は、培養の４日目から８日目の間（４日目および８日目を含む）に発現され、培養の６日目にピークに達する。一実施形態では、これらの細胞は、ＮＫＸ２．５発現のピーク前に移植される。典型的には、ＮＫＸ２．５発現は、培養の６日目に始まり、培養の１０日目にピークに達し、次いで、その後維持される。一実施形態では、これらの細胞は、下流遺伝子ＭＥＦ−２およびＴＢＸ−１発現のピーク前に移植される。典型的には、これらの下流遺伝子は、培養の５日目から１５日目の間（５日目および１５日目を含む）に発現され、培養の８日目にピークに達する。一実施形態では、これらの細胞は、分化した収縮タンパク質遺伝子の発現前に移植される。典型的には、収縮タンパク質遺伝子（ＴＮＮＴ２およびＭＹＨ６を含む）の発現は、培養の１０日目以降に始まる。ある特定の実施形態では、これらの細胞は、上述のマーカーパターンのうち２、３または４つが存在するときに、移植される。別の実施形態では、これらの細胞は、上述のマーカーパターンのうち５つ全てが存在するときに、移植される。一実施形態では、これらの細胞は、培養の４日目から８日目の間（４日目および８日目を含む）に移植される。より好ましい実施形態では、これらの細胞は、培養の５日目から７日目の間（５日目および７日目を含む）に移植される。最も好ましい実施形態では、これらの細胞は、培養の６日目に移植される。
【０１４７】
移植された細胞は、所望のサイズ、量または厚さの心室組織の生成を可能にするために、適切な期間にわたって非ヒト動物中で成長させられ得る。種々の実施形態では、これらの細胞は、１週間、２週間、１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間または６カ月間にわたって成長させられる。この方法は、細胞の成長および心室組織への分化後に、この非ヒト動物から心室組織を回収するステップをさらに含み得る。
【０１４８】
心機能を増強する方法
本発明の心室前駆体細胞は、細胞を心臓中に直接移植することによって心機能を増強するためにｉｎ  ｖｉｖｏで使用され得る。Ｊａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋前駆体は、３つ全ての型の心系統細胞（心筋細胞、内皮細胞および平滑筋細胞）へと分化する能力を有することが、本明細書で示されている（実施例３を参照のこと）。さらに、心室系統に偏向させる条件下で培養される場合、Ｊａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋前駆体は、天然の心室環境中にｉｎ  ｖｉｖｏで移植される場合に、優勢に心室の筋肉表現型をとることが本明細書で示されており、このことは、これらの前駆体細胞が心室環境を「認識」し、ｉｎ  ｖｉｖｏで適切に応答および分化することを実証している。心室環境への損傷は、心疾患および障害における損なわれた心機能の大きな原因であるので、本発明の心室前駆体細胞を使用して心室筋細胞を回復させる能力は、当該分野における顕著な進歩を示す。
【０１４９】
したがって、別の態様では、本発明は、対象において心機能を増強する方法であって、本発明のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋心室前駆体細胞のクローン性集団を含む医薬組成物を、対象に投与するステップを含む、方法を提供する。好ましくは、このクローン性集団は、対象の心臓中に直接投与される。より好ましくは、このクローン性集団は、対象の心臓の心室領域中に直接投与される。一実施形態では、対象に投与される医薬組成物は、三次元マトリックス上に製剤化されたクローン性集団を含む。
【０１５０】
対象において心機能を増強するための本発明の方法は、心臓への損傷、または低減もしくは損なわれた心機能が関与する、種々の臨床的状況において使用され得る。かかる臨床的状況の非限定的な例には、心筋梗塞に罹患している対象および先天性心臓障害を有する対象が含まれる。
【０１５１】
したがって、別の態様では、本発明は、対象において心血管状態、疾患または障害を処置する方法であって、本発明のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋心室前駆体細胞のクローン性集団を含む医薬組成物を、対象に投与するステップを含む、方法を提供する。治療有効量の心室前駆体細胞が、心血管状態、疾患または障害の処置のために投与され得る。好ましい心血管状態、疾患または障害の例には、冠状動脈疾患および急性冠症候群が含まれる。
【０１５２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの心室前駆体細胞の使用の方法
本発明の心室前駆体細胞は、心成熟化および分化の種々の態様の研究、特に、心成熟化および分化のプロセスに関与する細胞シグナル伝達経路および生物学的メディエーターを同定する際に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用され得る。
【０１５３】
さらに、本発明のＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋心室前駆体細胞は、心系統に傾倒しており、さらに、心室分化に偏向されているので、これらの前駆体細胞は、試験化合物の心毒性を評価するためにも有用である。全ての潜在的な新たな薬物および治療薬が、ヒトでの使用について安全であるとみなされる前に、心細胞に対するそれらの毒性について評価されなければならない。したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系において心毒性を判定する能力は、非常に有利である。したがって、別の態様では、本発明は、試験化合物の心毒性についてスクリーニングする方法であって、
Ｊａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞を提供するステップ；
細胞を試験化合物と接触させるステップ；および
細胞に対する試験化合物の毒性を測定するステップ
を含み、これらの細胞に対する試験化合物の毒性は、試験化合物の心毒性を示す、方法を提供する。
【０１５４】
好ましい実施形態では、Ｊａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞は、本明細書に記載される方法に従って細胞を単離することによって提供される。特に好ましい実施形態では、これらの細胞は、抗Ｊａｇｇｅｄ１および／または抗Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４抗体を使用して、心前駆体細胞を含む細胞培養物からＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋細胞を分離することによって単離される。好ましくは、これらの細胞は、本明細書に記載されるように、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳを使用して単離される。さらに別の実施形態では、このＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞は、試験化合物と接触させる前に、ＭＬＣ２ｖ＋心室細胞へとさらに培養および分化される。
【０１５５】
細胞に対する試験化合物の毒性は、細胞生存度または他の生理学的機能を判定するための種々の異なる方法のうち１つまたは複数によって測定され得る。好ましくは、細胞生存度に対する試験化合物の影響は、標準的な細胞生存度アッセイを使用して測定され、ここで、試験化合物の存在下で低減された細胞生存度は、試験化合物の心毒性を示す。さらに、またはあるいは、細胞成長が測定され得る。さらに、またはあるいは、生理学的機能の他の指標、例えば、細胞接着、細胞シグナル伝達、表面マーカー発現、遺伝子発現などが、測定され得る。同様に、生理学的機能のこれらの指標のいずれかに対する試験化合物の負の影響は、試験化合物の心毒性を示す。
【０１５６】
本発明は、ヒト心室前駆体細胞分化をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
Ｊａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞を提供するステップ；
試験化合物の存在下または非存在下で細胞を培養するステップ；
試験化合物の存在下または非存在下での細胞の分化を測定するステップ；および
試験化合物の非存在下での分化と比較して、ヒト心室前駆体細胞分化をモジュレートする試験化合物を選択することによって、ヒト心室前駆体細胞分化をモジュレートする化合物を同定するステップ
を含む、方法をさらに提供する。
【０１５７】
一実施形態では、この試験化合物は、ヒト心室前駆体細胞分化を刺激する。別の実施形態では、この試験化合物は、ヒト心室前駆体細胞分化を阻害する。細胞の分化は、例えば、本明細書に記載されるように、培養された細胞上に出現する分化マーカーの発現の経時的な測定によって測定され得る。好ましい実施形態では、Ｊａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞は、本明細書に記載される方法に従って細胞を単離することによって提供される。特に好ましい実施形態では、これらの細胞は、抗Ｊａｇｇｅｄ１および／または抗Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４抗体を使用して、心前駆体細胞を含む細胞培養物からＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋細胞を分離することによって単離される。好ましくは、これらの細胞は、本明細書に記載されるように、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳを使用して単離される。
【０１５８】
本発明は、ヒト心室心筋細胞機能をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
Ｊａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞を提供するステップ；
ヒト心室心筋細胞を生成する条件下で、試験化合物の存在下または非存在下で細胞を培養するステップ；
試験化合物の存在下または非存在下でのヒト心室心筋細胞の機能を測定するステップ；および
試験化合物の非存在下での機能と比較して、ヒト心室心筋細胞機能をモジュレートする試験化合物を選択することによって、ヒト心室心筋機能をモジュレートする化合物を同定するステップ
を含む、方法をさらに提供する。
【０１５９】
一実施形態では、この試験化合物は、ヒト心室心筋細胞機能を刺激する。別の実施形態では、この試験化合物は、ヒト心室心筋細胞機能を阻害する。細胞の機能は、例えば、Ｔ管の形成、成体−桿状心室心筋細胞の獲得、および電気刺激に応答して力を生む能力が含まれるがこれらに限定されない、心室細胞機能の任意の適切な指標の測定によって測定され得る。心室細胞機能のかかる指標を測定するのに適切なアッセイは、当該分野で公知である。好ましい実施形態では、Ｊａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体細胞は、本明細書に記載される方法に従って細胞を単離することによって提供される。特に好ましい実施形態では、これらの細胞は、抗Ｊａｇｇｅｄ１および／または抗Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４抗体を使用して、心前駆体細胞を含む細胞培養物からＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋細胞を分離することによって単離される。好ましくは、これらの細胞は、本明細書に記載されるように、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳを使用して単離される。
【０１６０】
ヒト心室前駆体細胞を使用したｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデル
心疾患のヒトｉＰＳおよびＥＳ細胞ベースのモデルの開発は、心血管薬物の開発および発見における新たな展望を開いている。しかし、今日まで、これらの系は、培養細胞系における２Ｄ構造に基づいているという制限を有してきた。さらに、細胞の胎児特性および未熟特性が、成体心臓に対するそれらの有用性および忠実度を制限している。ヒト心疾患、特に心不全は、治療標的として公知の部位である、環境性、ホルモン性および他の重要な臓器、例えば腎臓によって影響される、複雑な多因子性の多臓器疾患である。異所的に、またはインタクトな正常マウス心臓の表面上のいずれかに成熟した機能的なヒト心室臓器を構築する能力は、通常は成熟ヒト心室筋腔に対してアッセイされ得るだけの研究を可能にするための、新たなｉｎ  ｖｉｖｏモデル系、例えば、心室不整脈、収縮力の発生、線維症、および再生のための潜在力を開拓する。したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組織培養系を離れて、ｉｎ  ｖｉｖｏで心不全の背景において直接的にヒト心疾患を研究するための選択肢が、本明細書で明らかに可能である。
【０１６１】
したがって、ヒト心室前駆体細胞は、例えば、試験化合物の心毒性をｉｎ  ｖｉｖｏで決定するため、またはヒト心組織の分化もしくは機能をモジュレートする化合物をｉｎ  ｖｉｖｏで同定するための、ヒト心組織機能のｉｎ  ｖｉｖｏ判定および化合物のｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングを可能にする動物モデルを創出するためにも使用され得る。したがって、本発明は、本明細書に記載されるＨＶＰを使用してヒト心室組織に対する試験化合物の影響をｉｎ  ｖｉｖｏで試験するための方法を提供する。一実施形態では、この方法は、
Ｊａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体を、非ヒト動物の臓器中に移植するステップ；
ヒト心室組織が生成されるように、これらの前駆体をｉｎ  ｖｉｖｏで成長させるステップ；
試験化合物を非ヒト動物に投与するステップ；および
非ヒト動物におけるヒト心室組織に対する試験化合物の影響を評価するステップ
を含む。
【０１６２】
別の実施形態では、この方法は、
試験化合物を非ヒト動物に投与するステップであって、この非ヒト動物は、この非ヒト動物の臓器中に移植されたＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体を含む、ステップ；および
非ヒト動物におけるＪａｇｇｅｄ１＋および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体に対する試験化合物の影響を評価するステップ
を含む。
【０１６３】
一実施形態では、試験化合物の心毒性は、例えば、非ヒト動物における、ヒト心室組織またはＪａｇｇｅｄ１＋および／もしくはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト心室前駆体の生存度に対する（試験化合物の非存在下での組織または前駆体の生存度と比較した）試験化合物の影響を測定することによって評価される。細胞生存度は、当該分野で公知の標準的な方法によって判定され得る。
【０１６４】
別の実施形態では、試験化合物が心分化をモジュレートする能力は、例えば、非ヒト動物における、ヒト心室組織またはＪａｇｇｅｄ１＋および／もしくはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋前駆体の分化に対する（試験化合物の非存在下での組織または前駆体の分化と比較した）試験化合物の影響を測定することによって評価され得る。細胞の分化は、例えば、細胞上に出現する分化マーカーの発現の経時的な測定によって測定され得る。
【０１６５】
別の実施形態では、試験化合物が心機能をモジュレートする能力は、例えば、非ヒト動物における、ヒト心室組織またはＪａｇｇｅｄ１＋および／もしくはＦｒｉｚｚｌｅｄ４＋ヒト前駆体の機能に対する（試験化合物の非存在下での組織または前駆体の機能と比較した）試験化合物の影響を測定することによって評価され得る。組織または前駆体の機能は、例えば、Ｔ管の形成、成体−桿状心室心筋細胞の獲得、および電気刺激に応答して力を生む能力が含まれるがこれらに限定されない、心室細胞機能の任意の適切な指標の測定によって測定され得る。心室細胞機能のかかる指標を測定するのに適切なアッセイは、当該分野で公知である。
【０１６６】
好ましくは、この非ヒト動物は、ヒト前駆体細胞に対する免疫応答を開始できないように、免疫不全である。一実施形態では、この非ヒト動物は、マウス、例えば、免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪマウスまたは免疫不全ＳＣＩＤ−ベージュマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｆｒａｎｃｅから市販されている）である。一実施形態では、この臓器は、腎臓である（例えば、これらの細胞は、腎臓被膜下に移植される）。別の実施形態では、この臓器は心臓である。種々の実施形態では、少なくとも１×１０６細胞、少なくとも２×１０６細胞、少なくとも３×１０６細胞、少なくとも４×１０６細胞、少なくとも５×１０６細胞、少なくとも１×１０７細胞、少なくとも５×１０７細胞、少なくとも１×１０８細胞、少なくとも１×１０９細胞が移植される。
【０１６７】
動物モデルを創出するために、移植のためのＨＶＰが、ＨＶＰの生成をもたらす条件下でｈＰＳＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することによって、上記のように取得され得る。ｉｎ−ｖｉｔｒｏ培養後にＨＶＰを移植するタイミングに関して、最適な心室組織生成のために、これらの細胞は、ＨＶＰＧプロトコールの０日目として定義される培養の開始の数日後に決定される、移植の時点においてＨＶＰによって発現される細胞マーカーに基づいて規定され得る段階において移植すべきである。一実施形態では、これらの細胞は、中胚葉マーカーＭＥＳＰ１のピーク発現として規定され得る心中胚葉形成のピーク後に移植される。典型的には、ＭＥＳＰ１発現は、培養の２日目から４日目の間（２日目および４日目を含む）であり、３日目にピークに達する。一実施形態では、これらの細胞は、Ｉｓｌｅｔ−１発現のピークに対応する時点で移植される。典型的には、Ｉｓｌｅｔ１は、培養の４日目から８日目の間（４日目および８日目を含む）に発現され、培養の６日目にピークに達する。一実施形態では、これらの細胞は、ＮＫＸ２．５発現のピーク前に移植される。典型的には、ＮＫＸ２．５発現は、培養の６日目に始まり、培養の１０日目にピークに達し、次いで、その後維持される。一実施形態では、これらの細胞は、下流遺伝子ＭＥＦ−２およびＴＢＸ−１発現のピーク前に移植される。典型的には、これらの下流遺伝子は、培養の５日目から１５日目の間（５日目および１５日目を含む）に発現され、培養の８日目にピークに達する。一実施形態では、これらの細胞は、分化した収縮タンパク質遺伝子の発現前に移植される。典型的には、収縮タンパク質遺伝子（ＴＮＮＴ２およびＭＹＨ６を含む）の発現は、培養の１０日目以降に始まる。ある特定の実施形態では、これらの細胞は、上述のマーカーパターンのうち２、３または４つが存在するときに、移植される。別の実施形態では、これらの細胞は、上述のマーカーパターンのうち５つ全てが存在するときに、移植される。一実施形態では、これらの細胞は、培養の４日目から８日目の間（４日目および８日目を含む）に移植される。より好ましい実施形態では、これらの細胞は、培養の５日目から７日目の間（５日目および７日目を含む）に移植される。最も好ましい実施形態では、これらの細胞は、培養の６日目に移植される。
【０１６８】
移植された細胞は、所望のサイズ、量または厚さの心室組織の生成を可能にするために、試験化合物の投与の前に、適切な期間にわたって非ヒト動物中で成長させられ得る。種々の実施形態では、これらの細胞は、１週間、２週間、１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間または６カ月間にわたって成長させられる。
【０１６９】
本発明は、さらなる限定として解釈すべきではない以下の実施例によってさらに説明される。図面、ならびに本出願を通じて引用される全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照によって明示的に本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１７０】
（実施例１）
ヒト多能性幹細胞におけるＷｎｔシグナル伝達のモジュレーションによるヒトＩｓｌ１＋心筋原性前駆体細胞の生成
【０１７１】
古典的Ｗｎｔシグナル伝達の一時的モジュレーションは、多数のｈＰＳＣ株から、高い収量および純度で機能的心筋細胞を生成するのに十分であることが示されている（Ｌｉａｎ，  Ｘ．ら（２０１２年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ１０９巻：Ｅ１８４８〜１８５７頁；Ｌｉａｎ，  Ｘ．ら（２０１３年）Ｎａｔ．  Ｐｒｏｔｏｃ．８巻：１６２〜１７５頁）。このアプローチでは、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は、ｈＰＳＣにおいて最初に活性化され、その後インキュベーション期間が続き、その後Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害が続く。元々公開されたプロトコールでは、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性化は、Ｇｓｋ３阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ−３α、ＩＣ５０＝１０ｎＭ；ＧＳＫ−３、β  ＩＣ５０＝６．７ｎＭ）とのインキュベーションによって達成され、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害は、Ｐｏｒｃｎ阻害剤ＩＷＰ２（ＩＣ５０＝２７ｎＭ）とのインキュベーションによって達成されていた。本発明者らは、心分化のためにＧｓｋ３阻害剤およびＷｎｔ産生阻害剤を使用したので、このプロトコールをＧｉＷｉプロトコールと称した。元のプロトコールの効率を改善し、元のプロトコールにおいて使用した小分子の潜在的副作用を低減させるために、より高い阻害ポテンシーを有する小分子の別のセットを使用する第２世代プロトコールを開発した。この第２世代ＧｉＷｉプロトコールでは、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性化を、Ｇｓｋ３阻害剤ＣＨＩＲ９８０１４（ＣＡＳ  ５５６８１３−３９−９；例えば、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍから市販されている）（ＧＳＫ−３α、ＩＣ５０＝０．６５ｎＭ；ＧＳＫ−３、β  ＩＣ５０＝０．５８ｎＭ）とのインキュベーションによって達成し、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害を、Ｐｏｒｃｎ阻害剤Ｗｎｔ−Ｃ５９（ＣＡＳ  １２４３２４３−８９−１；例えば、ＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍまたはＴｏｃｒｉｓから市販されている）（ＩＣ５０＝７４ｐＭ）とのインキュベーションによって達成した。Ｇｓｋ３阻害剤ＣＨＩＲ９８０１４を使用して、心中胚葉分化を促進し、Ｐｏｒｃｎ阻害剤Ｗｎｔ−Ｃ５９を使用して、中胚葉細胞からの心室前駆体分化を増強した。
【０１７２】
これらの小分子の使用を介した心筋細胞分化のために、ｈＰＳＣを、Ｅ８培地（Ｃｈｅｎ，  Ｇ．ら（２０１１年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、８巻：４２４〜４２９頁に記載される；市販される；ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはｍＴｅＳＲ１培地（市販される；ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）コーティングされたプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で維持した。適切なｈＰＳＣには、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、例えば、１９−１１−１、１９−９−７または６−９−９細胞（Ｙｕ，  Ｊ．ら（２００９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２４巻：７９７〜８０１頁）およびヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、例えば、ＥＳ０３（ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）およびＨ９細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎ，  Ｊ．Ａ．ら（１９９８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２巻：１１４５〜１１４７頁）が含まれる。
【０１７３】
ｍＴｅＳＲ１培地中でＭａｔｒｉｇｅｌコーティングされた表面上で維持したｈＰＳＣを、３７℃で５分間Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて単一の細胞へと解離させ、次いで、５μＭのＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を補充したｍＴｅＳＲ１培地中１００，０００〜２００，０００細胞／ｃｍ２で、Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングされた細胞培養ディッシュ上に２４時間播種した（−２日目）。
【０１７４】
次いで、細胞を、毎日交換して、ｍＴｅＳＲ１中で培養した。次いで、０日目に、細胞を、ＲＰＭＩ／Ｂ２７−ｉｎｓ（１０ｍｌ  Ｂ２７補充物を含みインスリンを含まない５００ｍｌ  ＲＰＭＩ）中で、１μＭのＧｓｋ３阻害剤ＣＨＩＲ９８０１４（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）で２４時間（０日目〜１日目）処理した。次いで、培地を、３日目に、２μＭのＰｏｒｃｎ阻害剤Ｗｎｔ−Ｃ５９（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を含む対応する培地に交換し、これを次いで、５日目に培地交換の間に除去した。細胞を、７日目から開始してＲＰＭＩ／Ｂ２７（ストック溶液：５００ｍｌ  ＲＭＰＩ培地＋１０ｍｌ  Ｂ２７補充物）中で維持し、３日毎に培地を交換した。心筋原性前駆体細胞を生成するためのこの例示的な培養プロトコールは、図１中に模式的に示される。
【０１７５】
フローサイトメトリーおよび免疫染色を実施して、特定の系統マーカーの発現を検査した。ＣＨＩＲ−９８０１４による２４時間の処理後、ｈＰＳＣの９９％超が、中胚葉マーカーブラキュリを発現した。ＣＨＩＲ−９８０１４による処理の３日後、分化した細胞の９５％超が、心中胚葉を示すＭｅｓｐ１を発現した。この培養プロトコールは、ｃＴｎＴフローサイトメトリーおよび電気生理学分析によって決定したように、細胞を心中胚葉系統へと同調的に分化させただけでなく、１４日間の分化後に９０％超の心室筋細胞を再現性よく生成した。
【０１７６】
ｈＰＳＣの心分化を経時的にさらに判定するために、ウエスタンブロット分析を、０〜７日目および１１日目に実施して、Ｉｓｌ１およびＮｋｘ２．５（心筋原性前駆体マーカー）およびｃＴｎＩ（心筋細胞マーカー）の発現を検査した。細胞を、Ｈａｌｔ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｐｉｅｒｃｅ）の存在下で、Ｍ−ＰＥＲ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）中で溶解させた。タンパク質を、変性条件下で１０％  Ｔｒｉｓ−グリシン  ＳＤＳ／ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって分離し、ニトロセルロースメンブレンに移した。ＴＢＳＴ中５％の粉乳でブロッキングした後、メンブレンを、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。次いで、このメンブレンを洗浄し、抗マウス／ウサギペルオキシダーゼコンジュゲート化二次抗体と共に室温で１時間インキュベートし、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ化学発光（Ｐｉｅｒｃｅ）によって発色させた。結果を図２に示す。ｈＰＳＣの心分化の間、Ｉｓｌ１発現は、４日目に始まり、６日目にその最大発現まで増加したが、ＮＫｘ２．５は、６日目になってやっと発現され始め、１０日目の後にその最大発現に達した。心筋細胞（ｃＴｎＩ＋細胞）は、分化の１１日目まで誘導されなかった。
【０１７７】
さらに、６日目の細胞の免疫染色を、Ｉｓｌ１発現について実施した。細胞を、４％ホルムアルデヒドを用いて室温で１５分間固定し、次いで、ＰＢＳ＋０．４％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および５％脱脂粉乳（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中の一次抗体（抗Ｉｓｌ１）および二次抗体で染色した。核を、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にＧｏｌｄ  Ａｎｔｉ−ｆａｄｅ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いて染色した。ＱＩｍａｇｉｎｇ（登録商標）Ｒｅｔｉｇａ  ４０００Ｒカメラを用いた落射蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭ  ＩＲＢ）を、画像分析に使用した。結果は、かなりの数のＩｓｌ１＋細胞を示した。
【０１７８】
Ｉｓｌ１発現についての６日目の細胞のフローサイトメトリー分析もまた実施した。細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅを１０分間用いて単一の細胞へと解離させ、次いで、１％パラホルムアルデヒドで室温で２０分間固定し、ＰＢＳ  ０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．５％  ＢＳＡ中の一次抗体および二次抗体で染色した。データを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で収集し、ＦｌｏＪｏを使用して分析した。図３に示される結果は、この段階において細胞の９５％超がＩｓｌ１を発現したことを示した。
【０１７９】
まとめると、この実施例は、６日以内の効率的に数十億のＩｓｌ１＋ヒトＨＰＶの大規模産生を可能にする、ヒト心室前駆体生成のためのプロトコール（ＨＶＰＧプロトコール）を提供する。
【０１８０】
（実施例２）
心前駆体細胞の細胞表面マーカーとしてのＪａｇｇｅｄ１の同定
心分化プロセスの間に生じる転写変化をゲノム規模レベルでプロファイリングするために、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ−ｓｅｑ）を、分化後の異なる時点において実施して、心発生転写景観を構築した。本発明者らは、０日目〜７日目の試料、ならびに１９日目および３５日目の試料に対して、ＲＮＡ−ｓｅｑ実験を実施した（１つの時点につき２つの独立した生物学的複製）。２バッチのＲＮＡ−ｓｅｑ（１００ｂｐおよび５０ｂｐのリード長さ）を、ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｈｉｓｅｑ  ２０００プラットホームを使用して実施した。合計で、２０の試料を検査した。ＢｏｗｔｉｅおよびＴｏｐｈａｔを使用して、本発明者らのリードを参照ヒトゲノム（ｈｇ１９）へとマッピングし、本発明者らは、ＲＰＫＭ法（リード／転写物１キロベース／１００万リード）を使用して、各遺伝子発現（Ｒｅｆｓｅｑに従う遺伝子のアノテーション）を計算した。心筋細胞へのｈＰＳＣの分化には、５つの主要な細胞型が関与する：多能性幹細胞（０日目）、中胚葉前駆体（１日目〜２日目）、心中胚葉細胞（３日目〜４日目）、心臓原基前駆体（５日目、６日目および７日目）、および心筋細胞（１０日目の後）。
【０１８１】
ＨＶＰＧプロトコールを使用したｈＰＳＣからの心分化の分子ｍＲＮＡ分析により、分化の間の多能性マーカーＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧおよびＳＯＸ２の下方調節を伴う、遺伝子発現におけるダイナミックな変化が明らかとなった。原条様遺伝子ＴおよびＭＩＸＬ１の誘導が、ＣＨＩＲ−９８０１４添加後の最初の２４時間以内に生じ、その後、２日目および３日目に、心中胚葉マーカーＭＥＳＰ１の上方調節が続いた。心筋肉マーカーＴＮＮＴ２、ＴＮＮＣ１、ＭＹＬ２、ＭＹＬ７、ＭＹＨ６、ＭＹＨ７およびＩＲＸ４の発現が、分化のより後期の段階（１０日目の後）に検出された。
【０１８２】
この分析によって、中胚葉細胞、心前駆体および心筋細胞を含む各分化段階において富化された遺伝子が同定された。１日目の分化した細胞と関連する中胚葉細胞は、ブラキュリを発現する。本発明者らは、ＦＺＤ１０、ＣＤ４８、ＣＤ１Ｄ、ＣＤ８Ｂ、ＩＬ１５ＲＡ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＳＦ１３、ＩＣＯＳＬＧ、ＳＥＭＡ７Ａ、ＳＬＣ３Ａ２、ＳＤＣ１、ＨＬＡ−Ａを含む、中胚葉細胞についての潜在的表面マーカーを同定した。類似の分析によって、本発明者らは、ＣＸＣＲ４、ＡＮＰＥＰ、ＩＴＧＡ５、ＴＮＦＲＳＦ９、ＦＺＤ２、ＣＤ１Ｄ、ＣＤ１７７、ＡＣＶＲＬ１、ＩＣＡＭ１、Ｌ１ＣＡＭ、ＮＧＦＲ、ＡＢＣＧ２、ＦＺＤ７、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂを含む、心中胚葉ｍｅｓｐ１陽性細胞についての表面マーカーもまた同定した。
【０１８３】
ウエスタンブロット分析と一致して、ＩＳＬ１  ｍＲＮＡは、早くも４日目に発現され、そのタンパク質発現がそのピークに達する１日前の５日目にピークに達した。分化の５日目（心前駆体段階、５日目にｉｓｌ１  ｍＲＮＡ発現最大、６日目にｉｓｌ１タンパク質発現最大）、５日目の富化された遺伝子を、抗ＣＤ抗体アレイ（３５０の公知のＣＤ抗体のパネル）と比較し、いくつかの潜在力細胞表面タンパク質マーカーを同定した。本発明者らは、ＦＺＤ４、ＪＡＧ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＬＩＦＲ（ＣＤ１１８）、ＴＮＦＳＦ９、ＦＧＦＲ３を含む、この段階で発現された多くの細胞表面タンパク質を同定した。
【０１８４】
細胞表面タンパク質Ｊａｇｇｅｄ１（ＪＡＧ１）およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４（ＦＺＤ４）を、さらなる分析のために選択した。Ｊａｇｇｅｄ１発現を、以下ならびに実施例３および４に記載されるようにさらに研究した。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４発現を、実施例５に記載されるようにさらに研究した。
【０１８５】
最初に、Ｉｓｌ１およびＪａｇ１の発現を、二重染色フローサイトメトリー技術を使用してプロファイリングした。フローサイトメトリー分析を、二重染色のために抗Ｉｓｌ１抗体および抗Ｊａｇ１抗体を使用して、本質的に実施例１に記載されるように実施した。結果を図４に示す。Ｊａｇｇｅｄ１発現は、分化の６日目に、Ｉｓｌｅｔ１の発現を追跡することが見出され、Ｉｓｌｅｔ１陽性細胞の全ては、Ｊａｇｇｅｄ１もまた発現し、逆もまた然りであった。これら２つのマーカーの共発現パターンにより、Ｊａｇｇｅｄ１抗体を使用して、９９．８％の純度のＩｓｌｅｔ１＋Ｊａｇｇｅｄ１＋細胞へと、９４．１％のＩｓｌｅｔ１＋細胞の分化した集団を富化した。
【０１８６】
Ｉｓｌｅｔ１は、ＨＶＰにおけるＩＳＬ１およびＮＫＸ２．５発現の二重免疫染色を使用して、Ｎｋｘ２．５遺伝子よりも早期の発生遺伝子であることもまた確認された。精製されたＨＶＰは、ＩＳＬ１遺伝子を均一に発現するが、この段階では、これらの細胞のうちほんのわずかだけが、Ｎｋｘ２．５を発現し始めた。
【０１８７】
さらに、抗Ｉｓｌ１および抗Ｊａｇ１の両方による免疫染色を、４週目ヒト胎児心臓組織、新生児心臓組織および８歳心臓組織に対して、本質的に実施例１に記載されるように実施した。これらの結果により、ｉｎ  ｖｉｖｏ胎児心臓において、Ｉｓｌｅｔ１陽性細胞の全てがＪａｇｇｅｄ１もまた発現したことが明らかになった。しかし、新生児心臓および８歳心臓は、Ｉｓｌｅｔ１もＪａｇｇｅｄ１も発現しなかった。４週目ヒト胎児心臓の心室において、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）染色により、可視的な筋節構造が明らかになった。さらに、４週目胎児心臓中の心室細胞の５０％超が、Ｉｓｌｅｔ１およびＪａｇｇｅｄ１の両方を発現し、これは、ヒト新生児心臓の心室筋細胞におけるＩｓｌｅｔ１およびＪａｇｇｅｄ１の両方の発現の喪失を伴って、その後の成熟化の間に顕著に減少した。
【０１８８】
上記実験は、Ｊａｇｇｅｄ１がＩｓｌｅｔ１陽性心筋原性前駆体細胞についての細胞表面マーカーであることを実証している。
【０１８９】
（実施例３）
Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋心前駆体細胞のクローン性分化
Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋細胞のクローン性分化潜在力を特徴付けるために、心筋原性前駆体細胞を、実施例１に記載される培養プロトコールによって生成し、１つの単一のＩｓｌ１＋Ｊａｇ１＋細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングされた４８ウェルプレートの１つのウェル中に播種した。細胞を、Ｊａｇ１の抗体を用いて精製し、次いで、１つの単一の細胞を、１つのウェル中に播種した。次いで、単一の細胞を、心前駆体培養（ＣＰＣ）培地（２．５ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ、１００μｇ／ｍｌ  ビタミンＣ、２０％ノックアウト血清代替物を補充したアドバンストＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で３週間培養した。
【０１９０】
次いで、３週目の分化細胞集団の免疫染色を、３つの抗体：心筋細胞について心筋トロポニンＩ（ｃＴｎ１）、内皮細胞についてＣＤ１４４（ＶＥ−カドヘリン）、および平滑筋細胞について平滑筋アクチン（ＳＭＡ）を用いて実施した。これらの結果は、単一の細胞から培養されたＩｓｌ１＋Ｊａｇ１＋細胞が、ｃＴｎＩ陽性およびＳＭＡ陽性細胞を生じさせたが、ＶＥ−カドヘリン陽性内皮細胞は生じさせなかったことを示しており、このことは、これらの生成されたＩｓｌｅｔ１＋細胞が、内皮系統への限定的な分化潜在力を有する心筋前駆体であることを示している。ヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ  １９−９−１１株）からＨＶＰＧプロトコールによって分化された精製されたＩｓｌｅｔ１＋Ｊａｇｇｅｄ１＋細胞もまた、類似のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化潜在力を示し、ｃＴｎＩ＋ＳＭＡ＋細胞へと優勢に分化するが、ＶＥ−カドヘリン＋細胞へは分化しない。数週間の過程のうちに、細胞は、心室特異的マーカーＭＬＣ２ｖを発現し、このことは、初期のＩＳＬ１＋サブセットが心室細胞になることがすでに決まっていたことを示している。ＨＶＰＧプロトコールを使用して生成されたＩｓｌｅｔ１＋細胞の限定的な脈管分化潜在力に起因して、これらの生成されたＩｓｌｅｔ１＋細胞は、心血管細胞の３つ全ての系統を生じさせ得る、以前に報告されたＫＤＲ＋集団（Ｙａｎｇ，  Ｌ．ら（２００８年）Ｎａｔｕｒｅ  ４５３巻：５２４〜５２８頁）または多分化能性ＩＳＬ１＋細胞（Ｂｕ，  Ｌ．ら（２００９年）Ｎａｔｕｒｅ  ４６０巻：１１３〜１１７頁；Ｍｏｒｅｔｔｉ，  Ａ．ら（２００６年）Ｃｅｌｌ  １２７巻：１１５１〜１１６５頁）とは別個の前駆体集団を示し得る。
【０１９１】
これらの結果は、Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋心筋原性前駆体細胞が、心筋細胞優位で、心系統細胞の３つ全ての型を含む顕著に拡大増殖された細胞集団（１×１０９細胞またはそれ超）へと、単一の細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで首尾よく培養され得ることを実証した。さらに、これらの細胞は、延長された期間にわたって、少なくとも２〜３週間にわたって、さらには数カ月間（例えば、６カ月間またはそれ超）にわたって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養され得る。心筋原性前駆体細胞は、増殖しない心筋細胞へと徐々に分化するので、およそ２〜３週間の培養期間が好ましい。
【０１９２】
（実施例４）
Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋心前駆体細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ発生潜在力
ＥＳ０３ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）株（ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから取得した）は、心特異的ｃＴｎＴプロモーターによって駆動される緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する。ＥＳ０３細胞を使用して、実施例１に記載される培養プロトコールを使用して、Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋心筋原性前駆体細胞を生成した。これらのＩｓｌ１＋Ｊａｇ１＋心筋原性前駆体細胞を、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）ベージュマウスの心臓中に移植して、ｉｎ  ｖｉｖｏでのそれらの発生潜在力を立証した。
【０１９３】
簡潔に述べると、Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋細胞を、開胸手順においてＮＯＤ／ＳＣＩＤ−ガンママウスの左心室壁中に直接注射した（レシピエント１匹当たり１，０００，０００細胞）。心臓を、手術の２〜３週間後に回収し、１％  ＰＦＡ中で固定し、１０μｍで切片化した（ｎ＝１２）。移植されたマウスの心臓の組織学的分析により、落射蛍光および抗ＧＦＰ抗体による染色によって検出されたＧＦＰ＋ドナー細胞の存在が明らかになり、このことは、Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋心筋原性前駆体細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏで移植された場合に心筋細胞へと分化することが可能であったことを実証している。
【０１９４】
Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋心筋原性前駆体細胞を、同様に移植された正常マウスと比較して、ＳＣＩＤベージュマウス（「傷害されたマウス」）の梗塞した心臓中にも、直接移植した。２週間後に分析した場合、Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋心筋原性前駆体細胞が移植された傷害されたマウスは、同様に移植した正常マウスよりも大きいグラフトサイズを有し、このことは、Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋心筋原性前駆体細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの心筋細胞再生能力を実証している。
【０１９５】
（実施例５）
心前駆体細胞の細胞表面マーカーとしてのＦｒｉｚｚｌｅｄ４の同定
実施例２に記載されるように、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４（ＦＺＤ４）は、ＲＮＡ−ｓｅｑ分析によって心前駆体細胞において発現されることが同定された。したがって、心前駆体細胞の細胞表面マーカーとしてＦＺＤ４を確認するために、ＦＺＤ４発現を、ウエスタンブロット分析を介して心分化の間に判定した。図５に示される結果は、ＦＺＤ４が、多能性幹細胞および最初の３日間の分化した細胞においては発現されなかったことを実証した。しかし、ＦＺＤ４は、４日目に発現され始め、発現の５日目にその発現を最大化する。
【０１９６】
単一の細胞のレベルでＦＺＤ４およびＩｓｌ１の共発現パターンを定量化するために、ＦＡＣＳ分析を実施した。図６に示されるように、分化の５日目に、細胞の８３％超が、ｉｓｌ１およびＦＺＤ４の両方を発現し、このことは、ＦＺＤ４が、ＧｉＷｉプロトコールを使用した心前駆体分化の間のｉｓｌ１陽性細胞についての細胞表面マーカーであることを実証している。
【０１９７】
ＪＡＧ１およびＦＺＤ４の両方がヒト心室前駆体細胞上でＩＳＬ１と共に実際に共発現されたことを確認するために、ｈＰＳＣ由来の６日目の分化した細胞の三重免疫蛍光分析を、Ｉｓｌｅｔ１、Ｊａｇｇｅｄ１およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４に対する抗体を用いて実施した。この三重染色実験により、Ｉｓｌ１＋細胞がＪａｇｇｅｄ１およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４の両方を発現したことが実証された。
【０１９８】
（実施例６）
ヒト心室前駆体（ＨＰＶ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏで３Ｄ心室心筋臓器を生成する
心室の心筋腔の構築は、ヒト臓器形成の間の最も重要かつ早期のステップのうちの１つであり、遊走、増殖、血管新生、アセンブリおよびマトリックス整列を含む、一連の協調されたステップを必要とする。ＨＶＰがｉｎ  ｖｉｖｏで心室形成を駆動する能力を試験するために、本発明者らは、免疫不全マウスの腎臓被膜下に、精製されたＨＶＰまたは未精製のＨＶＰ（９２．０±１．９％  ＩＳＬ１＋）を移植した。移植の２カ月後に、未精製のＨＶＰを移植した動物は、腫瘍を形成し、１００％の腫瘍形成効率（１００％、４／４）を生じたが、精製されたＨＶＰを移植した動物は、いずれの腫瘍も形成しなかった（０％、０／１０）。
【０１９９】
精製されたＨＶＰが生着した腎臓を、組織学的分析のためにさらにアッセイした。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色により、マウス腎臓の表面上に、長さが０．５ｃｍを超え、厚さが１ｍｍ超の、心室特異的マーカーＭＬＣ２ｖを均一に発現した臓器が明らかになった（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，  Ｔ．Ｘ．ら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０巻：５１５７〜５１６１頁）。得られたヒト筋肉臓器は、完全に血管新生し、赤血球が血管中で検出できた。ｃＴｎＴ、ＭＬＣ２ｖおよびＭＬＣ２ａ免疫染色の分析により、移植されたＨＶＰが心筋肉細胞（ｃＴｎＴ＋細胞）へと分化しただけではなく、さらに成熟して、ＭＬＣ２ａ発現について陰性のＭＬＣ２ｖ＋心室筋細胞になることが、さらに明らかになった。得られた心室筋肉臓器は、その血管新生がＨＶＰ由来のパラクリン合図を介して生じたという見解と一致して、マウス由来脈管細胞によって完全に血管新生する。
【０２００】
構造化された血管が、ＶＥ−カドヘリンおよび平滑筋アクチン発現に対する抗体の免疫染色分析によって明らかになった。さらに、ラミニンγ−１鎖を標的化するヒト特異的モノクローナルラミニン抗体を使用して、ＨＶＰは、それらの細胞外マトリックスとして、それら自身のヒトラミニンを分泌した（マウス腎臓領域は、ヒトラミニン免疫染色について陰性である）。さらに、本発明者らは、モノクローナルヒトフィブロネクチン抗体を使用して、ヒトフィブロネクチン発現が血管の近傍のエリアに限定されることを見出した。
【０２０１】
後期段階の心細胞が心室形成を駆動する能力を判定するために、ＮＫＸ２．５＋細胞（分化後１０日目）を、免疫不全ＮＳＧマウスの腎臓被膜下に移植した。移植の３週間後に、ＮＫＸ２．５＋細胞を移植した動物は、いずれの可視的なヒト筋肉グラフトも形成せず、このことは、ＨＶＰが、Ｉｓｌｅｔ−１発現のピーク後にｉｎ  ｖｉｖｏ心室形成のためのそれらの能力を喪失することを示している。
【０２０２】
合わせると、これらの研究は、ＨＶＰが、それら自身の心ラミニン由来マトリックス、ならびに新生心室臓器への脈管構造を安定化するように機能するフィブロネクチンを、合成および放出できることを示している。
【０２０３】
（実施例７）
ＨＶＰは、細胞自律的経路を介してｉｎ  ｖｉｖｏで、成熟した機能性の心室筋臓器を創出する
ヒト心生物学および疾患の研究のためのｈＰＳＣの有用性についての重要な制限の１つは、成熟度の欠如および胎児アイソフォームの発現の持続である。ＨＶＰ由来の臓器が機能的な成熟した心室筋肉になることができるかどうかを決定するために、長期移植研究を実施し、その後、Ｔ管の形成（Ｂｒｅｔｔｅ，  Ｆ．およびＯｒｃｈａｒｄ，  Ｃ．（２００３年）Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．  ９２巻：１１８２〜１１９２頁；Ｍａｒｋｓ，  Ａ．Ｒ．（２０１３年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １２３巻：４６〜５２頁）、操作された心室組織の他の研究と同等な力を生む能力、自動能の喪失、および成体−桿状心室心筋細胞の獲得を含む、成体心室心筋の十分に受容された特色のパネルの詳細な分析を行った。
【０２０４】
精製されたＨＶＰの移植の５カ月後に、腫瘍は、本発明者らの動物の全てにおいて形成されなかった。動物を屠殺し、生着した腎臓を、さらなる分析のために取り出した。５カ月目のヒトグラフトは、半径０．４ｃｍ（直径０．８ｃｍ）を有する半球構造であった。５カ月目のヒトグラフトについての体積は、腎臓１つにつきほぼ０．１３ｃｍ３であり、この体積は、ｉｎ  ｖｉｖｏヒト成体心臓と同等の厚さを達成するヒト心室筋肉を生成することの実現可能性を示唆している。桿状成熟ヒト心室筋細胞が、ヒト筋肉臓器において観察された。さらに、本発明者らの成熟ヒト筋肉臓器から採取した筋条片は、電気刺激に応答して力（０．３６±０．０４ｍＮ）を生み出し、β−アドレナリンアゴニストイソプレナリンによる処理後にそれらの力発生を増加させた（０．５１±０．０２ｍＮ、対照と比較してｐ＜０．０５）。合わせると、これらの研究は、ＨＶＰが、細胞自律的経路を介して、即ち、他の細胞、遺伝子、マトリックスタンパク質または生体材料の添加なしに、完全に機能的な成熟ヒト心室筋肉臓器をｉｎ  ｖｉｖｏで生成することが可能であることを示している。
【０２０５】
（実施例８）
ＨＶＰは、心外膜ニッチに向かって遊走し、正常マウス心臓の表面上でヒト心室筋肉パッチをｉｎ  ｖｉｖｏで自発的に形成する
心外膜は、緻密層拡大増殖の間に心室腔の成長を駆動し、ならびに心筋傷害後に拡大増殖でき、公知の脈管細胞運命スイッチ、例えばＶＥＧＦに応答して脈管形成を駆動できる成体心外膜前駆体のホームとして機能する、心臓前駆体のための公知のニッチである（Ｇｉｏｒｄａｎｏ，  Ｆ．Ｊ．ら（２００１年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９８巻：５７８０〜５７８５頁；Ｍａｓｔｅｒｓ，  Ｍ．およびＲｉｌｅｙ，  Ｐ．Ｒ．（２０１４年）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  １３巻：６８３〜６９２頁；Ｚａｎｇｉ，  Ｌ．ら（２０１３年）Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３１巻：８９８〜９０７頁）。ＨＶＰが正常心臓の心外膜表面へと自発的に遊走し得るかどうかを決定するために、精製された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）標識ＨＶＰを、免疫不全マウスの心臓中に心筋内注射した。移植の１週間後または１カ月後、動物を屠殺し、生着した心臓を組織学のために取り出した。移植の１週間後、ＧＦＰ＋細胞の大部分は、心筋中で保持された。しかし、ほぼ全てのＧＦＰ＋細胞が、移植の１カ月後に心外膜に遊走した。さらに、ＧＦＰ＋細胞は、移植の１週間後にＩＳＬ１＋かつＫｉ６７＋であった。
【０２０６】
Ｉｓｌｅｔ１＋細胞の分化潜在力を追跡するために、ｃＴｎＴプロモーター駆動性の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現性ｈＥＳＣ株（Ｈ９−ｃＴｎＴ−ＧＦＰ）から生成された精製されたＩＳＬ１＋ＪＡＧ１＋細胞を、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）ベージュマウスの心臓中に移植して、ｉｎ  ｖｉｖｏでのそれらの発生潜在力を立証した。ＳＣＩＤベージュマウスの心臓の心室中へ直接のＩｓｌ１＋Ｊａｇ１＋細胞の移植の１カ月後、ヘマトキシリンおよびエオシン染色により、マウス心臓の心外膜中に存在するヒト筋条片グラフトが明らかになった。さらに、免疫組織学的分析により、落射蛍光および抗ＧＦＰ抗体による染色によって検出されるＧＦＰ＋ドナー細胞の存在が明らかになった。より重要なことに、ＭＬＣ２ｖおよびＭＬＣ２ａの抗体を用いて分析した場合、グラフトされたヒト筋条片は、ＭＬＣ２ｖについて陽性（細胞＋の１００％）であり、房マーカーＭＬＣ２ａについて陰性であり、このことは、移植されたＩＳＬ１＋細胞が、心筋肉細胞へとさらに分化しただけでなく、心室筋細胞にもなったことを示している。
【０２０７】
合わせると、これらの研究は、ＨＶＰが心外膜ニッチへと遊走でき、その場所で拡大増殖し、引き続いて、再び外因性の細胞、遺伝子、マトリックスまたは生体材料の添加なしに、均質な心室筋肉パッチへと分化することを示している。
【０２０８】
（実施例９）
さらなる実験材料および方法
この実施例では、実施例１〜８において使用した実験材料および方法に関するさらなる詳細が提供される。
【０２０９】
ｈＰＳＣの維持
ｈＥＳＣ（ＥＳ０３、Ｈ９）およびヒトｉＰＳＣ（１９−９−１１）を、以前に公開された方法（Ｌｉａｎ，  Ｘ．ら（２０１３年）Ｎａｔ．  Ｐｒｏｃ．  ８巻：１６２〜１７５頁；Ｌｉａｎ，  Ｘ．ら（２０１３年）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ３１巻：４４７〜４５７頁）に従って、ｍＴｅＳＲ１培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）コーティングしたプレート上で維持した。
【０２１０】
ヒト心室前駆体生成（ＨＶＰＧ）プロトコール
ｍＴｅＳＲ１中でＭａｔｒｉｇｅｌコーティングされた表面上で維持したｈＰＳＣを、３７℃で１０分間Ａｃｃｕｔａｓｅを用いて単一の細胞へと解離させ、次いで、５μＭのＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を補充したｍＴｅＳＲ１中１００，０００〜２００，０００細胞／ｃｍ２で、Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングされた細胞培養ディッシュ上に２４時間播種した（−２日目）。−１日目に、細胞をｍＴｅＳＲ１中で培養した。０日目に、細胞を、インスリン非含有Ｂ２７を補充したＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ／Ｂ２７−ｉｎｓ）中１μＭのＣＨＩＲ−９８０１４（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）で２４時間（０日目〜１日目）処理し、次いで、これを、１日目に培地交換の間に除去した。３日目に、培地の半分を、２μＭのＷｎｔ−Ｃ５９（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を含むＲＰＭＩ／Ｂ２７−ｉｎｓ培地に交換し、次いで、これを、５日目に培地交換の間に除去した。６日目に、細胞を、単一の細胞へと解離させ、抗ＪＡＧ１抗体または抗ＦＺＤ４抗体を用いて精製した。
【０２１１】
ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリー構築
ＲＮＡを単離し（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）、定量化し（Ｑｕｂｉｔ  ＲＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、品質制御した（ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ  ２１００、Ａｇｉｌｅｎｔ）。各試料由来のＲＮＡ（８００ｎｇ）を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ  ｍＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  ｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）のためのインプットとして使用し、配列決定ライブラリーを、製造者のプロトコールに従って創出した。簡潔に述べると、ポリ−Ａ含有ｍＲＮＡ分子を、ポリ−Ｔオリゴが結合した磁性ビーズを使用して精製した。精製後、ｍＲＮＡを断片化し、ランダムプライマーおよび逆転写酵素を使用して第１鎖相補的ＤＮＡへとコピーした。次いで、第２鎖ｃＤＮＡ合成を、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＲＮａｓｅ  Ｈを使用して実施した。ｃＤＮＡをアダプターにライゲーションさせ、ＰＣＲで富化して、最終ｃＤＮＡライブラリーを創出した。このライブラリーをプールし、製造者の指示に従ってＨｉＳｅｑ  ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）機器で配列決定した。
【０２１２】
ＲＮＡ−ｓｅｑデータ処理
ＲＮＡ−ｓｅｑのリードをトリミングし、Ｔｏｐｈａｔ  ２を使用してｈｇ１９参照にマッピングした。平均して、およそ２，３００万リードが１試料当たり生成され、これらのリードのうち７６％が、独自にマッピングされた。各遺伝子についての発現レベルを、ｐｙｔｈｏｎ  ｓｃｒｉｐｔ  ｒｐｋｍｆｏｒｇｅｎｅｓを使用して定量化し、ＲｅｆＳｅｑを使用してアノテーションした。少なくとも１０リードを有する少なくとも１つの試料がない遺伝子を、分析から除去した。Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓおよびｈｅａｔｍａｐｓを、それぞれ、ＲおよびＧｅｎｅ−Ｅを使用して構築した。
【０２１３】
移植
２００万の精製されたＨＶＰのアリコートを、ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中に収集した。細胞をスピンダウンし、上清を廃棄した。細胞の各チューブを、以前に記載されたプロトコール（Ｓｈｕｌｔｚ，  Ｌ．Ｄ．ら（２００５年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７４巻：６４７７〜６４８９頁）に従って、それぞれ免疫不全マウス、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪまたはＳＣＩＤ−ベージュ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｆｒａｎｃｅ）の腎臓被膜下に移植したか、またはそれらの心臓中に心筋内注射した。生着した腎臓または心臓を、組織学的分析および生理学的分析のために、種々の時間間隔で回収した。
【０２１４】
フローサイトメトリー
細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅを１０分間用いて単一の細胞へと解離させ、次いで、１％パラホルムアルデヒドで室温で２０分間固定し、ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．５％  ＢＳＡ中の一次抗体および二次抗体で染色した。データを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で収集し、ＦｌｏｗＪｏを使用して分析した。
【０２１５】
免疫染色
細胞を、４％パラホルムアルデヒドで室温で１５分間固定し、次いで、ＰＢＳ＋０．４％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および５％脱脂粉乳（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中の一次抗体および二次抗体で染色した。核を、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にＧｏｌｄ  Ａｎｔｉ−ｆａｄｅ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いて染色した。落射蛍光顕微鏡および共焦点顕微鏡（ＺＥＩＳＳ、ＬＳＭ  ７００）を、画像分析に使用した。
【０２１６】
ウエスタンブロット分析
細胞を、Ｈａｌｔ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｐｉｅｒｃｅ）の存在下で、Ｍ−ＰＥＲ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）中に溶解させた。タンパク質を、変性条件下で１０％  Ｔｒｉｓ−グリシン  ＳＤＳ／ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって分離し、ニトロセルロースメンブレンに移した。ＴＢＳＴ中５％の粉乳でブロッキングした後、メンブレンを、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。次いで、このメンブレンを洗浄し、抗マウス／ウサギペルオキシダーゼコンジュゲート化二次抗体と共に室温で１時間インキュベートし、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ化学発光（Ｐｉｅｒｃｅ）によって発色させた。
【０２１７】
電気生理学（パッチクランピング）
拍動する心室筋細胞クラスターを、顕微解剖し、記録前にガラスカバースリップ上に再プレートした。活動電位活性を、１２０ｍＭ  Ｋ  Ｄ−グルコネート、２５ｍＭ  ＫＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＡＴＰ、２ｍＭ  ＮａＧＴＰ、４ｍＭ  Ｎａ２−ホスホ−クレアチン、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（２５℃でＨＣｌによってｐＨ７．４に調整した）からなる細胞内溶液を満たしたホウケイ酸ガラスピペット（４〜５Ｍオームの抵抗）を使用して判定した。カバースリップディッシュ上に播種した培養した心筋細胞を、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭグルコース、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（２５℃でＮａＯＨによってｐＨ７．４に調整した）を含む細胞外溶液（タイロード溶液）中に浸した。自発的活動電位を、１ｋＨｚでローパスフィルタをかけたＭｕｌｔｉｃｌａｍｐ  ７００Ｂ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）ソフトウェアを使用して実施したパッチクランプ技術（全細胞、電流固定構成）を使用して３７℃で記録し、デジタル化し、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １３２２ＡおよびＣｌａｍｐｅｘ  ９．６ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して保存した。
【０２１８】
統計学
データは、平均±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として示される。統計的有意性を、２つの群間のスチューデントｔ検定（両側）によって決定した。ｐ＜０．０５を統計的に有意とみなした。
【０２１９】
（実施例１０）
ゼノフリー（Ｘｅｎｏ−Ｆｒｅｅ）ヒト心室前駆体分化プロトコール
この実施例では、規定されたゼノフリー培養培地、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８を利用する、ヒト心室前駆体の分化のための代替的分化プロトコールが提供される。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の成長および拡大増殖のために開発したものであり、Ｃｈｅｎ，  Ｇ．ら（２０１１年）Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８巻：４２４〜４２９頁（この中では「Ｅ８」培地と呼ばれる）中にさらに記載されている。
【０２２０】
Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地中でビトロネクチン（またはラミニン５２１）コーティングされた表面上で維持したｈＰＳＣを、３７℃で１０分間Ｖｅｒｓｅｎｅ溶液を用いて単一の細胞へと解離させ、次いで、５μＭのＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を補充したＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地中１００，０００〜２００，０００細胞／ｃｍ２で、ビトロネクチン（またはラミニン５２１）コーティングされた細胞培養ディッシュ上に２４時間播種した（−２日目）。−１日目に、細胞をＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地中で培養した。０日目に、細胞を、ＲＰＭＩ中０．５μＭのＣＨＩＲ−９８０１４で２４時間（０日目〜１日目）処理し、次いで、これを、１日目に培地交換の間に除去した。３日目に、培地の半分を、０．５μＭのＷｎｔ−Ｃ５９を含むＲＰＭＩ培地に交換し、次いで、これを、５日目に培地交換の間に除去した。６日目に、細胞（ヒト心室前駆体）を、単一の細胞へと解離させ、抗ＪＡＧ１抗体または抗ＦＺＤ４抗体を用いて精製した。
【０２２１】
等価物
当業者は、本明細書に記載される発明の具体的実施形態の多くの等価物を認識し、または慣用的実験にすぎないものを使用して、それらを確認することができる。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2020120677.tif 000007
【図７】
2020120677.tif 000008
【図８】
2020120677.tif 000009
【外国語明細書】
2020120677000001.pdf