(57)【要約】      （修正有）【課題】受胎性を判定できるＤＮＡ変異を検出するＤＮＡマーカー、並びに、それを用いた検査方法及び検査キットの提供。【解決手段】ウシの染色体における特定の塩基配列により挟まれ、連続する核酸領域に含まれる、一つ又は複数の変異マーカーであって、受胎性の判定に用いるＤＮＡマーカー。【選択図】図５
2020141581.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシの染色体における配列番号１と配列番号２に示す塩基配列により挟まれる及び／又は配列番号３と配列番号４に示す塩基配列により挟まれる、連続する核酸領域に含まれる、一又は複数の変異マーカーであって受胎性の判定に用いるＤＮＡマーカー。
【請求項２】
前記一又は複数の変異マーカーが、下記（１）から（５０）のいずれかに記載の変異マーカーであることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡマーカー、
（１）配列番号７に記載の塩基配列の一部であり、１００＿１０１位の挿入部位を含み、かつ該挿入部位の塩基がＴ、
（２）配列番号８に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＧ、
（３）配列番号９に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（４）配列番号１０に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ、
（５）配列番号１１に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ、
（６）配列番号１２に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（７）配列番号１３に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＣ、
（８）配列番号１４に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（９）配列番号１５に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（１０）配列番号１６に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（１１）配列番号１７に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＣ、
（１２）配列番号１８に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の欠失部位を含む、
（１３）配列番号１９に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の欠失部位を含む、
（１４）配列番号２０に記載の塩基配列の一部であり、１００＿１０１位の挿入部位を含み、かつ該挿入部位の塩基がＣ、
（１５）配列番号２１に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（１６）配列番号２２に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（１７）配列番号２３に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（１８）配列番号２４に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ、
（１９）配列番号２５に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ、
（２０）配列番号２６に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ、
（２１）配列番号２７に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＣ、
（２２）配列番号２８に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＣ、
（２３）配列番号２９に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＧ、
（２４）配列番号３０に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（２５）配列番号３１に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ、
（２６）配列番号３２に記載の塩基配列の一部であり、１０１＿１０３位の欠失部位を含む、
（２７）配列番号３３に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（２８）配列番号３４に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（２９）配列番号３５に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（３０）配列番号３６に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ、
（３１）配列番号３７に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ、
（３２）配列番号３８に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（３３）配列番号３９に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（３４）配列番号４０に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（３５）配列番号４１に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ、
（３６）配列番号４２に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ、
（３７）配列番号４３に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（３８）配列番号４４に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（３９）配列番号４５に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の欠失部位を含む、
（４０）配列番号４６に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＧ、
（４１）配列番号４７に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（４２）配列番号４８に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（４３）配列番号４９に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の欠失部位を含む、
（４４）配列番号５０に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ、
（４５）配列番号５１に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（４６）配列番号５２に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ、
（４７）配列番号５３に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ、
（４８）配列番号５４に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ、
（４９）配列番号５５に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ、
（５０）配列番号５６に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ。
【請求項３】
前記一又は複数の変異マーカーが、ホモ接合型又はヘテロ接合型であることを特徴とする請求項１又は２に記載のＤＮＡマーカー。
【請求項４】
前記ホモ接合型であれば低受胎又は前記ヘテロ接合型であれば低受胎の保因であることを特徴とする請求項３に記載のＤＮＡマーカー。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の一又は複数のＤＮＡマーカーの部位の塩基配列を決定する塩基決定工程と、決定された塩基から受胎性を判定する受胎性判定工程を備える、受胎性の判定方法。
【請求項６】
請求項１から４のいずれかに記載の一又は複数のＤＮＡマーカーの部位の塩基配列を決定する塩基決定手段を備える、受胎性の判定キット。
【請求項７】
請求項１から４のいずれかに記載の一又は複数のＤＮＡマーカーの部位の塩基配列を決定するためのプローブ又はプライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、受胎性を判定できるＤＮＡマーカー、並びにそれを用いた検査方法及び検査キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
動物において、簡易な方法で繁殖能力を予測できることは、労力やコストの面から極めて有用である。特に、家畜では、効率的に受胎させて産子を得ることが望まれ、雄の受胎性が保証された精液を供給することが望まれる。受胎は、精子と卵子が受精し、受精卵が子宮内膜に着床して妊娠が成立することであるが、雄の受胎性とは、受胎に関して精子等の雄側に起因する能力をいう。例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ等では、優秀な雄の凍結精液を配布して人工授精することにより、乳量や肉質といった経済形質の改良がなされているため、その優秀な雄の受胎性に問題がないことが要求される。
【０００３】
一方、例えばウシの繁殖において日本国では人工授精の普及率がほぼ１００％であるが、その受胎率は、１９８９年の初回授精の受胎率が乳用種で６２．４％、肉用種で６７．５％であったところ、２０１６年では初回授精の受胎率が乳用種で４０．４％、肉用種で５２．０％と年々低下している（非特許文献１）。受胎率が低下傾向にある現状において、雄の受胎性が保証された精液を供給することは、生産効率の観点からも益々有用である。
【０００４】
このような状況で、人工授精用精液の品質検査では、精子の生存率、運動率、運動性維持率、ミトコンドリア正常率、アクロソーム正常率、形態正常率等が検討され、一定の品質が担保されている（非特許文献２）。また、受胎性に根差した精子の検査方法も報告されている（特許文献１）。しかし、これらの検査を通じて正常な精液と判定されても、実際にフィールドで人工授精を行って受胎性を確認して、初めて低受胎であることが判明する例があり、それまでの繋養に要していたコスト等がすべて無駄になる。それゆえ、成長する前の早い段階で雄の受胎性が推定できる手法が望まれる。
【０００５】
これまで受胎性を含む繁殖能力に影響を与えるゲノム領域や遺伝子に関して研究がなされてきた。例えば、ウシの繁殖能力に関連する複数のゲノム領域や遺伝子が特定され、遺伝的不良形質に関連する領域が報告されている（非特許文献３）。また、雄側の要因としても、胚性致死や受胎性に関連する複数のゲノム領域や遺伝子が特定されている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１５／１３７４６６号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】一般社団法人家畜改良事業団、平成２８年受胎調査成績（２０１８年）
【非特許文献２】Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ｈ．，Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｏｍｅｓｔ  Ａｎｉｍ．４１，Ｓｕｐｐｌ  ２，  ２−１０  （２００６年）
【非特許文献３】Ａｎｉｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｓｃｉ．  Ｓｅｐ，  １４１（１−２），  １−１９，  ２０１３
【非特許文献４】Ａｎｉｍａｌ，  Ｊｕｎ  １２（ｓ１），  ｓ１７２−ｓ１８３，  ２０１８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、受胎性を含めた繁殖能力は一般的に遺伝率が低く、集団内で共通して大きな効果を有するゲノム領域や遺伝子は特定されていない。従って、特定のゲノム領域や遺伝子を指標マーカーとして利用して、個体の繁殖能力に着目して改良を行うことは困難であった。
【０００９】
本発明は、斯かる問題点に鑑みてなされたものであり、上記問題点を解決する受胎性を判定できるＤＮＡ変異を検出するＤＮＡマーカー、それを用いた検査方法及び検査キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、複数の種雄牛個体の受胎性を検討したところ、低受胎個体が特定の家系で多く確認され、この低受胎の形質が遺伝することを想定した。そこで、受胎率の判明している黒毛和種及びホルスタイン種の種雄牛のＤＮＡを用いて、ＧＷＡＳ解析や次世代シーケンス解析等を用いたゲノム解析を行った結果、特定のＤＮＡ変異が低受胎の雄個体に共通することを突き止めた。さらに、集団内で共通して大きな効果をもたらすゲノム領域であることも判明し、このゲノム領域を受胎性に焦点を当てた指標マーカーとして利用することで、受胎性の判定を行うことができると考え、ＤＮＡマーカー、並びにそれを用いた検査方法及び検査キットの発明に至った。
【００１１】
したがって、本発明は、低受胎を判定できるＤＮＡマーカー、検査方法及び検査キットに関して、より具体的には以下に掲げる構成とした。
［１］  ウシの染色体における配列番号１と配列番号２に示す塩基配列により挟まれる及び／又は配列番号３と配列番号４に示す塩基配列により挟まれる、連続する核酸領域に含まれる、一又は複数の変異マーカーであって、受胎性の判定に用いるＤＮＡマーカー。
［２］  前記配列番号１と配列番号２に示す塩基配列に挟まれるが、配列番号５と配列番号６に示す塩基配列により挟まれる、であることを特徴とする［１］に記載のＤＮＡマーカー。
［３］  前記一又は複数の変異マーカーが、下記（１）から（５０）のいずれかに記載の変異マーカーであることを特徴とする［１］に記載のＤＮＡマーカー、
（１）配列番号７に記載の塩基配列の一部であり、１００＿１０１位の挿入部位を含み、かつ該挿入部位の塩基がＴ、
（２）配列番号８に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＧ、
（３）配列番号９に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（４）配列番号１０に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ、
（５）配列番号１１に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ、
（６）配列番号１２に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（７）配列番号１３に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＣ、
（８）配列番号１４に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（９）配列番号１５に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（１０）配列番号１６に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（１１）配列番号１７に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＣ、
（１２）配列番号１８に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の欠失部位を含む、
（１３）配列番号１９に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の欠失部位を含む、
（１４）配列番号２０に記載の塩基配列の一部であり、１００＿１０１位の挿入部位を含み、かつ該挿入部位の塩基がＣ、
（１５）配列番号２１に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（１６）配列番号２２に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（１７）配列番号２３に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（１８）配列番号２４に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ、
（１９）配列番号２５に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ、
（２０）配列番号２６に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ、
（２１）配列番号２７に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＣ、
（２２）配列番号２８に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＣ、
（２３）配列番号２９に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＧ、
（２４）配列番号３０に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（２５）配列番号３１に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ、
（２６）配列番号３２に記載の塩基配列の一部であり、１０１＿１０３位の欠失部位を含む、
（２７）配列番号３３に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（２８）配列番号３４に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（２９）配列番号３５に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（３０）配列番号３６に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ、
（３１）配列番号３７に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ、
（３２）配列番号３８に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（３３）配列番号３９に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（３４）配列番号４０に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（３５）配列番号４１に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ、
（３６）配列番号４２に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ、
（３７）配列番号４３に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（３８）配列番号４４に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（３９）配列番号４５に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の欠失部位を含む、
（４０）配列番号４６に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＧ、
（４１）配列番号４７に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（４２）配列番号４８に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（４３）配列番号４９に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の欠失部位を含む、
（４４）配列番号５０に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ、
（４５）配列番号５１に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＡ、
（４６）配列番号５２に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ、
（４７）配列番号５３に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ、
（４８）配列番号５４に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ、
（４９）配列番号５５に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ、
（５０）配列番号５６に記載の塩基配列の一部であり、１０１位の置換部位を含み、かつ該置換部位の塩基がＴ。
［４］  前記（１）から（５０）のいずれかに記載の変異マーカーが、ホモ接合型又はヘテロ接合型であることを特徴とする［３］に記載のＤＮＡマーカー。
［５］  前記ホモ接合型であれば低受胎又は前記ヘテロ接合型であれば低受胎の保因であることを特徴とする［４］に記載のＤＮＡマーカー。
［６］  前記（６）の変異マーカーであって、ＭＩＲ２４４３の上流１２塩基にあることを特徴とする［３］から［５］のいずれかに記載のＤＮＡマーカー。
［７］  前記（９）の変異マーカーであって、ＣＤＰＦ１遺伝子のアミノ酸置換部位を含み、かつ該置換部位のアミノ酸がＬｅｕであることを特徴とする［３］から［５］のいずれかに記載のＤＮＡマーカー。
［８］  前記（１０）の変異マーカーであって、ＣＤＰＦ１遺伝子のアミノ酸置換部位を含み、かつ該置換部位のアミノ酸が終止コドンであることを特徴とする［３］から［５］のいずれかに記載のＤＮＡマーカー。
［９］  前記（１７）の変異マーカーであって、ＣＥＬＳＲ１遺伝子のアミノ酸置換部位を含み、かつ該置換部位のアミノ酸がＶａｌであることを特徴とする［３］から［５］のいずれかに記載のＤＮＡマーカー。
［１０］  前記（４４）の変異マーカーであって、ＡＬＧ１２遺伝子のアミノ酸置換部位を含み、かつ該置換部位のアミノ酸がＩｌｅであることを特徴とする［３］から［５］のいずれかに記載のＤＮＡマーカー。
［１１］  前記（４５）の変異マーカーであって、ＭＬＣ１遺伝子のアミノ酸置換部位を含み、かつ該置換部位のアミノ酸がＶａｌであることを特徴とする［３］から［５］のいずれかに記載のＤＮＡマーカー。
［１２］  前記（４６）の変異マーカーであって、ＳＥＬＥＮＯＯ遺伝子のアミノ酸置換部位を含み、かつ該置換部位のアミノ酸がＴｒｐであることを特徴とする［３］から［５］のいずれかに記載のＤＮＡマーカー。
［１３］  前記（４７）の変異マーカーであって、ＨＤＡＣ１０遺伝子のアミノ酸置換部位を含み、かつ該置換部位のアミノ酸がＩｌｅであることを特徴とする［３］から［５］のいずれかに記載のＤＮＡマーカー。
［１４］  前記（４８）の変異マーカーであって、ＤＥＮＮＤ６Ｂ遺伝子のアミノ酸置換部位を含み、かつ該置換部位のアミノ酸がＩｌｅであることを特徴とする［３］から［５］のいずれかに記載のＤＮＡマーカー。
［１５］  前記（４９）の変異マーカーであって、ＤＥＮＮＤ６Ｂ遺伝子のアミノ酸置換部位を含み、かつ該置換部位のアミノ酸がＬｙｓであることを特徴とする［３］から［５］のいずれかに記載のＤＮＡマーカー。
［１６］  前記（５０）の変異マーカーであって、ＰＰＰ６Ｒ２遺伝子のアミノ酸置換部位を含み、かつ該置換部位のアミノ酸がＡｓｐであることを特徴とする［３］から［５］のいずれかに記載のＤＮＡマーカー。
［１７］  ［１］から［１６］のいずれかに記載の一又は複数のＤＮＡマーカーの部位の塩基配列を決定する塩基決定工程と、決定された塩基から受胎性を判定する受胎性判定工程を備える、受胎性の判定方法。
［１８］  前記塩基決定工程が、ＤＮＡサンガーシーケンス、次世代シーケンサ、ＳＮＰタイピング又はリアルタイムＰＣＲを用いることを特徴とする［１７］に記載の受胎性の判定方法。
［１９］  前記塩基決定工程が、前記一又は複数のＤＮＡマーカーの部位の塩基配列を決定するためのプローブ又はプライマーを用いることを特徴とする［１７］に記載の受胎性の判定方法。
［２０］  ［１］から［１６］のいずれかに記載の一又は複数のＤＮＡマーカーの部位の塩基配列を決定する塩基決定手段を備える、受胎性の判定キット。
［２１］  前記塩基決定手段が、ＤＮＡサンガーシーケンス、次世代シーケンサ、ＳＮＰタイピング又はリアルタイムＰＣＲを用いることを特徴とする［２０］に記載の受胎性の判定キット。
［２２］  前記一又は複数のＤＮＡマーカーの部位の塩基配列を決定するためのプローブ又はプライマーを用いることを特徴とする［２０］に記載の受胎性の判定キット。
［２３］  ［１］から［１６］のいずれかに記載の一又は複数のＤＮＡマーカーの部位の塩基配列を決定するためのプローブ又はプライマー。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のＤＮＡマーカーは、雄の受胎性の判定ができる変異マーカーであり、個体のゲノムＤＮＡ等を用いて、正確かつ簡易に受胎性が判定できる。低受胎が早期に判定できれば、これまで低受胎が判明するまでに要した飼養管理費や人工授精費等のコストを大幅に削減できる。また、繁殖能力を加味した経済動物の改良に資することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、１７９頭の種雄牛の初回受胎率及び５０Ｋ  ＳＮＰを用いたＧＷＡＳ解析である。
【図２】図２は、１７９頭の種雄牛の初回受胎率及び５０Ｋ  ＳＮＰデータを用いたＧＷＡＳ解析におけるＱＱ−ｐｌｏｔである。
【図３】図３は、全ゲノム解析によって特定された配列番号７〜４９で示す本発明のＤＮＡマーカーの例の遺伝子型と種雄牛の初回受胎率を示す。
【図４】図４は、エクソーム解析によって特定された配列番号１２、２０、２１、５０〜５６で示す本発明のＤＮＡマーカーの例の遺伝子型と種雄牛の初回受胎率を示す。
【図５】図５は、配列番号１２で特定した本発明のＤＮＡマーカーの例であるウシ５番染色体の位置１１６４０８６５３について、個別の種雄牛の遺伝子型と初回受胎率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明に関する受胎性を判定できるＤＮＡマーカー、並びにそれを用いた検査方法及び検査キットの実施の形態について説明する。本発明は、下記実施の形態に限るものでなく、発明の範囲を逸脱しない限りにおいてその構成を適宜変更できる。
【００１５】
実施の形態１．ＤＮＡマーカー
本発明のＤＮＡマーカーは、動物の受胎性を判定する指標となるＤＮＡ変異の変異マーカーである。ＤＮＡの塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）の４種類であるが、ＤＮＡ変異によってＤＮＡを構成する塩基配列に変化が生じる。ＤＮＡ変異の例として、１塩基が置換された一塩基多型（ＳＮＰ，Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、１個以上の塩基の挿入（Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）や欠失（Ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、さらに重複（Ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、転座（Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）、逆位（Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）、縦列反復（Ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ）といった構造多型（ＳＶ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ、ＳＶ）等が挙げられる。
【００１６】
本発明のＤＮＡマーカーは、ウシゲノムから特定された受胎性の判定に用いるＤＮＡ変異である。本明細書中で引用するすべてのウシゲノムの染色体及び位置情報は、ウシゲノムアセンブリＡＲＳ−ＵＣＤ１．２（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ａｓｓｅｍｂｌｙ／ＧＣＡ＿００２２６３７９５．２、２０１８年４月１１日）を用いた。具体的には、ウシ５番染色体の位置１１５１１６３５７〜１２００００８４４（配列番号１と配列番号２に示す塩基配列により挟まれる連続する核酸領域）及び／又はウシ１７番染色体の位置１３０５４７７８〜２２４６４０６１（配列番号３と配列番号４に示す塩基配列により挟まれる連続する核酸領域）にある一又は複数の変異マーカーである。好ましくは、ウシ５番染色体の位置１１５６６８８６９〜１１７８５４６８０（配列番号５と配列番号６に示す塩基配列により挟まれる連続する核酸領域）にある一又は複数の変異マーカーである。配列番号１〜６の染色体と位置は、表１に示す。
【００１７】
【表１】
2020141581.tif 000003
【００１８】
上記の塩基配列により挟まれる連続する核酸領域は、次世代シーケンス解析から特定され、複数の低受胎個体に共通してＤＮＡ変異が確認された領域である。この領域は、複数のＤＮＡマーカーの間にランダムでない相関があって、連鎖不平衡が保たれている連鎖不平衡ブロックである。これらの一又は複数のＤＮＡ変異によって、受胎性に関連する遺伝子調節等に影響がもたらされ、低受胎の表現型を示すと考えられる。例えば、ＤＮＡ変異がプロモーター領域やイントロン領域に生じれば遺伝子の発現量が変化し、エクソン領域に生じればアミノ酸の種類が置き換わり表現型が変化することがある。
【００１９】
本発明のＤＮＡマーカーの例として、配列表の配列番号７〜５６及び表２を示す。配列番号７〜５６は、該当の塩基配列の変異部位に加えて、上流及び下流の１００塩基を示す。表２の先頭行の「配列番号」は、配列表の配列番号と同一である。「変異」は、ウシゲノムリファレンスに対する変異の様式を示し、塩基の「置換」、「挿入」、「欠失」のいずれかを示す。「位置」は、配列番号における変異が生じた部位である。変異が置換であれば、置換された塩基の位置（１０１）を示す。変異が欠失であれば、欠失された塩基の位置（１０１又は１０１＿１０３）を示す。該当する塩基が複数ある場合は、「＿」を用いて範囲を示す。欠失及び置換は、配列表において該当する配列をｎで示している。変異が挿入であれば、挿入された前後の塩基の位置（１００＿１０１）を示す。「染色体」及び「ウシゲノムの位置・変異情報」は、ＤＮＡマーカーを特定するウシゲノム（ＡＲＳ−ＵＣＤ１．２）上の染色体番号及び該当の染色体上の位置を示す。置換は、例えば配列番号８であれば、ウシ５番染色体のｇ．１１５９４７６７６Ａ＞Ｇと表記し、ｇ．はゲノム、１１５９４７６７６はウシ５番染色体上の位置、Ｇ＞ＡのＧはリファレンスの塩基、Ａは変異の塩基で、＞はＧからＡに変化したことを示す。挿入は、例えば配列番号７であれば、ウシ５番染色体のｇ．１１５７４６３３５＿１１５７４６３３６ｉｎｓＴと表記し、ｉｎｓＴはＴが１１５７４６３３５と１１５７４６３３６の間に付加されたことを示す。欠失は、例えば配列番号１８であれば、ウシ５番染色体のｇ．１１６６７５６７７ｄｅｌＧと表記し、ｄｅｌＧは１１６６７５６７７のリファレンスの塩基Ｇが削除されたことを示す。「アノテーション」は、ウシゲノムのアノテーション情報（２０１８／０５／１２  ９：００：００、ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ａｌｌ／ＧＣＦ／００２／２６３／７９５／ＧＣＦ＿００２２６３７９５．１＿ＡＲＳ−ＵＣＤ１．２／ＧＣＦ＿００２２６３７９５．１＿ＡＲＳ−ＵＣＤ１．２＿ｇｅｎｏｍｉｃ．ｇｆｆ．ｇｚ）を用いて、ＳｎｐＥｆｆ（ｈｔｔｐ：／／ｓｎｐｅｆｆ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｄｏｗｎｌｏａｄ＿ｄｏｎａｔｅ．ｈｔｍｌ）により該当の塩基配列に変異情報を付加した。ｉｎｔｒｏｎは蛋白質のアミノ酸配列を指定しない、ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ＿ｇｅｎｅは遺伝子の下流５０００塩基以内の領域、ｕｐｓｔｒｅａｍ＿ｇｅｎｅは遺伝子の上流５０００塩基以内の領域、ｍｉｓｓｅｎｓｅは蛋白質のアミノ酸配列が変化する、ｓｔｏｐ＿ｇａｉｎｅｄは変異により終止コドンを生じる、３＿ｐｒｉｍｅ＿ＵＴＲは遺伝子の  ３’端の非翻訳領域、ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃは遺伝子間の領域を各々示す。
【００２０】
【表２】
2020141581.tif 000004
【００２１】
本発明のＤＮＡマーカーの例として、全ゲノム解析から特定された受胎率２０％以下の低受胎種雄牛８頭すべてに共通し、平均受胎率４０％以上の正常種雄牛に現れない変異マーカーとして以下が挙げられる。本明細書中で受胎率は、ある雌に雄の精液を初めて用いた場合の初回受胎率である。全ゲノム解析を行った中で、受胎率が判明している個体における初回受胎率の平均±標準偏差は、変異ホモ接合型では８．１±５．０％であり、それ以外の型では４８．９±９．６％であり、有意差が認められる（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、ｐ＜０．０１）。ウシ５番染色体では、ｇ．１１５６６８８６９Ｇ＞Ａ、ｇ．１１５６６８８７４Ｃ＞Ｇ、ｇ．１１５６７２９３８Ａ＞Ｃ、ｇ．１１５６７２９４９Ａ＞Ｇ、ｇ．１１５６７２９５０Ａ＞Ｔ、ｇ．１１５６７３３０７Ｇ＞Ａ、ｇ．１１５６７３３２７Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１５６７８０５９＿１１５６７８０６０ｄｅｌＴＴ、ｇ．１１５６７８１０２Ｇ＞Ｔ、ｇ．１１５６７８１１７Ｇ＞Ａ、ｇ．１１５７２４９４６Ｇ＞Ａ、ｇ．１１５７４６３３５＿１１５７４６３３６ｉｎｓＴ（配列番号７の位置１００＿１０１）、ｇ．１１５７５６０２９Ａ＞Ｇ、ｇ．１１５７８６９８１Ａ＞Ｇ、ｇ．１１５７９４９３４Ｔ＞Ｇ、ｇ．１１５８１０７５０Ｇ＞Ｃ、ｇ．１１５８１２５０９Ｇ＞Ａ、ｇ．１１５８１３１７６Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１５９８０４９１Ｇ＞Ｔ、ｇ．１１５９９１９３１＿１１５９９１９３２ｉｎｓＣＡＡＴＴＣＴＴＴＧＧ、ｇ．１１６３４２０８８Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１６３４２０９３Ａ＞Ｇ、ｇ．１１６３９０９９９Ｇ＞Ａ、ｇ．１１６３９１４９９Ｇ＞Ａ（配列番号９の位置１０１）、ｇ．１１６３９１８５９Ｃ＞Ｔ（配列番号１０の位置１０１）、ｇ．１１６３９９９１７Ｇ＞Ｔ（配列番号１１の位置１０１）、ｇ．１１６４０２０５２Ａ＞Ｇ、ｇ．１１６４０８６５３Ｇ＞Ａ（配列番号１２の位置１０１）、ｇ．１１６４２８３８２Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１６４４０９２６ｄｅｌＡ、ｇ．１１６４６６１３９Ａ＞Ｇ、ｇ．１１６４６６４６０＿１１６４６６４６１ｉｎｓＴ、ｇ．１１６４７０１３８Ｔ＞Ｃ（配列番号１３の位置１０１）、ｇ．１１６４７０１９４Ｃ＞Ａ、ｇ．１１６４７０２４８Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１６４７０２７７Ａ＞Ｇ、ｇ．１１６４７０２８８Ｔ＞Ｇ、ｇ．１１６４７２３７４Ｇ＞Ｔ、ｇ．１１６４７３５０９＿１１６４７３５１０ｉｎｓＴ、ｇ．１１６４７４２１０Ｇ＞Ａ、ｇ．１１６４７５０６４Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１６４７７１１９Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１６４８０３０２Ｇ＞Ｃ、ｇ．１１６４８５８８８Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１６４８７２５５Ａ＞Ｇ、ｇ．１１６４８７３５０Ｇ＞Ａ、ｇ．１１６４８９３７４Ｇ＞Ａ、ｇ．１１６４９５０３１Ｇ＞Ａ、ｇ．１１６４９５８４６Ｇ＞Ａ（配列番号１４の位置１０１）、ｇ．１１６４９７４７４Ａ＞Ｇ、ｇ．１１６５００３７６Ａ＞Ｇ、ｇ．１１６５０９１３８Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１６５０９２６０Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１６５０９５５３Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１６５１３２９５Ｇ＞Ｃ、ｇ．１１６５１４２８５Ｇ＞Ａ（配列番号１５の位置１０１）、ｇ．１１６５１４３２５Ｃ＞Ａ（配列番号１６の位置１０１）、ｇ．１１６５１８６３６Ｇ＞Ｃ（配列番号１７の位置１０１）、ｇ．１１６５２０２１３Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１６５２１１３３Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１６５３９３１３Ａ＞Ｔ、ｇ．１１６６７５６７７ｄｅｌＧ（配列番号１８の位置１０１）、ｇ．１１６７７２３４７Ａ＞Ｇ、ｇ．１１６７８９７８６Ａ＞Ｇ、ｇ．１１６７９１１３２ｄｅｌＧ（配列番号１９の位置１０１）、ｇ．１１６７９１２９８＿１１６７９１２９９ｉｎｓＣ（配列番号２０の位置１００＿１０１）、ｇ．１１６７９１３２８Ｇ＞Ａ（配列番号２１の位置１０１）、ｇ．１１６７９１６１０Ｃ＞Ａ（配列番号２２の位置１０１）、ｇ．１１６７９３１４１Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１６７９３２９５Ｇ＞Ｔ、ｇ．１１６７９３６４８Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１６７９５０１７Ｇ＞Ａ、ｇ．１１６８０１３５８ｄｅｌＧ、ｇ．１１６８０５５２９Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１６８２４２６１Ａ＞Ｃ、ｇ．１１６８３４１８３Ｇ＞Ｃ、ｇ．１１６８４５４３７Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１６８５４９０１Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１６８５８３０７Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１６８７８４４２Ｇ＞Ａ、ｇ．１１６８９８５７４Ｃ＞Ｔ（配列番号２４の位置１０１）、ｇ．１１６９０７００７Ｃ＞Ｔ（配列番号２５の位置１０１）、ｇ．１１６９２７４７２Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１６９４７８４４Ｇ＞Ａ、ｇ．１１６９８４４３２Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１６９９３００２Ａ＞Ｇ、ｇ．１１６９９６４５１Ｃ＞Ｔ（配列番号２６の位置１０１）、ｇ．１１６９９８７９２Ｇ＞Ｔ、ｇ．１１７００１２９３Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７０１１１６８Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７０１２３０１Ｔ＞Ｇ、ｇ．１１７０１３５３７Ｃ＞Ａ、ｇ．１１７０３４３７５Ｔ＞Ｃ（配列番号２７の位置１０１）、ｇ．１１７０４１７６４Ａ＞Ｃ（配列番号２８の位置１０１）、ｇ．１１７０４２２２７Ｃ＞Ａ、ｇ．１１７０４２４８９Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７０４２８８０Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７０４５８０９Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７０４６５６２Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７０４７８７１Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７０４８４７１Ｃ＞Ｇ、ｇ．１１７０５０６９４Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７０５０９６９Ｇ＞Ｃ、ｇ．１１７０５２３７１Ａ＞Ｇ（配列番号２９の位置１０１）、ｇ．１１７０５４４６０Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７０５５７１４Ｇ＞Ｔ、ｇ．１１７０５７８４０Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７０６６９８６Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７０８１５１４Ａ＞Ｇ、ｇ．１１７０８１５２３Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７０８５５４１Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７０８６８３０Ｇ＞Ｃ、ｇ．１１７０８７２３７Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７０８９４３９Ｇ＞Ａ（配列番号３０の位置１０１）、ｇ．１１７０８９４９０Ａ＞Ｔ（配列番号３１の位置１０１）、ｇ．１１７０８９５６２＿１１７０８９５６４ｄｅｌＴＡＡ（配列番号３２の位置１０１＿１０３）、ｇ．１１７１０７９３０Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７１０８０３７Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７１０８２３２Ｃ＞Ｇ、ｇ．１１７１０９９２０Ｃ＞Ａ（配列番号３３の位置１０１）、ｇ．１１７１１１８８０Ａ＞Ｇ、ｇ．１１７１１４４６６Ｇ＞Ａ（配列番号３４の位置１０１）、ｇ．１１７１１５５７３Ｇ＞Ａ（配列番号３５の位置１０１）、ｇ．１１７１１５７０９Ａ＞Ｇ、ｇ．１１７１１５７１２Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７１１５７３３Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７１１５９３５Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７１１６０４５Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７１１８０５４Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７１２１３２６Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７１２８４６９Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７１３３４８３Ｃ＞Ａ、ｇ．１１７１３３６２３Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７１３４８１１Ｃ＞Ｔ（配列番号３６の位置１０１）、ｇ．１１７１３９８８７Ａ＞Ｇ、ｇ．１１７１４０７８３Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７１４１３６０Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７１４４２８９Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７１４５３４９Ｇ＞Ｔ、ｇ．１１７１４５６２７Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７１６６３２３Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７２２８８５３Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７２７１６５０Ａ＞Ｇ、ｇ．１１７３１２５７２＿１１７３１２５７３ｉｎｓＣ、ｇ．１１７３１２８６２Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７３１４０１５Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７３２１６３３Ｃ＞Ｔ（配列番号３７の位置１０１）、ｇ．１１７３２１９３０Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７３２５９１１Ｇ＞Ａ（配列番号３８の位置１０１）、ｇ．１１７３２７４３９Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７３２７６６２Ｃ＞Ｇ、ｇ．１１７３３００１４Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７３３０４０３Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７３３０５０９Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７３３０５１２Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７３３０５１３Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７３３０５１６Ａ＞Ｇ、ｇ．１１７３３０５２２Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７３３０５２６Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７３３０８０６Ａ＞Ｃ、ｇ．１１７３３１２５２Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７３３２２６９Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７３３２６３８Ｃ＞Ｇ、ｇ．１１７３３２７０９Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７３３２９０７Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７３３３０１６Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７３３３０９３Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７３３３１８６Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７３３４８８３Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７３３４８８４Ａ＞Ｇ、ｇ．１１７３３４８９５＿１１７３３４８９６ｉｎｓＣ、ｇ．１１７３３４８９８Ａ＞Ｃ、ｇ．１１７３３６５４６Ａ＞Ｇ、ｇ．１１７３３６９１６Ａ＞Ｔ、ｇ．１１７３３６９１８Ａ＞Ｇ、ｇ．１１７３３７６５１Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７３４００２７Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７３６８８４７Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７３７４３３７Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７３７５１３４＿１１７３７５１３５ｉｎｓＡＣＴＧＡ、ｇ．１１７４３２９８１Ａ＞Ｇ、ｇ．１１７４３８８２９Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７４３８８３２Ａ＞Ｇ、ｇ．１１７４３８８３８Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７４３８８４５Ｇ＞Ｔ、ｇ．１１７４３８８６３Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７４３８８６４Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７４３８８７０Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７４３８８９２Ａ＞Ｃ、ｇ．１１７４３８８９５Ａ＞Ｃ、ｇ．１１７４３９３５０Ｇ＞Ｔ、ｇ．１１７４４４３８４Ｇ＞Ａ（配列番号３９の位置１０１）、ｇ．１１７４４４３９４Ｇ＞Ａ（配列番号４０の位置１０１）、ｇ．１１７４４４７３９Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７４４８２１１Ａ＞Ｃ、ｇ．１１７４５１１９６Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７４５１２００Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７４５２３１５Ｇ＞Ｔ（配列番号４２の位置１０１）、ｇ．１１７４５３８５２Ｃ＞Ａ、ｇ．１１７４５３９４９Ｇ＞Ｔ、ｇ．１１７４６９８７４Ｇ＞Ａ（配列番号４３の位置１０１）、ｇ．１１７４７７３７９Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７４７８５４３Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７４８１９８０Ｃ＞Ｇ、ｇ．１１７４８３１８２Ｃ＞Ｇ、ｇ．１１７４８３３００Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７４８３３０３Ｃ＞Ａ、ｇ．１１７４８３３１０Ｃ＞Ｇ、ｇ．１１７４８３６６２Ｇ＞Ｃ、ｇ．１１７４８３７８４Ａ＞Ｇ、ｇ．１１７４８３８７７Ａ＞Ｇ、ｇ．１１７４８４１２１Ｃ＞Ｇ、ｇ．１１７４８４１２２Ａ＞Ｇ、ｇ．１１７４８４１８０Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７４８４５８８Ａ＞Ｇ、ｇ．１１７４８４６１０Ａ＞Ｃ、ｇ．１１７４８４６１７Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７４８４７００Ａ＞Ｃ、ｇ．１１７４８４７４３Ｔ＞Ｇ、ｇ．１１７４８４７６８Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７４８４８７７Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７４８５５５６Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７４８６１７１Ａ＞Ｇ、ｇ．１１７４８６１８７Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７４８６１９０Ａ＞Ｔ、ｇ．１１７４８６１９３Ａ＞Ｇ、ｇ．１１７４８６２８４Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７４８６２９８＿１１７４８６２９９ｉｎｓＧ、ｇ．１１７４８６３７１Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７４８７１６５Ｇ＞Ｃ、ｇ．１１７４８７２２２Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７４８７５５０Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７４９０４０１Ｃ＞Ｇ、ｇ．１１７４９４１０７Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７４９４７１３Ｇ＞Ｔ、ｇ．１１７４９５４２０＿１１７４９５４２１ｉｎｓＴＴＡ、ｇ．１１７４９５９０７Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７４９５９１３Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７４９６０４３Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７４９７９３０Ｔ＞Ｇ、ｇ．１１７４９８９３３Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７４９９２２０Ｔ＞Ａ、ｇ．１１７４９９２５６Ｇ＞Ｃ、ｇ．１１７４９９３９４Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７４９９７８８Ａ＞Ｇ、ｇ．１１７４９９８００Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７４９９８６７Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７５００１７７Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７５００２３６Ａ＞Ｃ、ｇ．１１７５００２８１Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７５０３００９Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７５０３８３４Ｇ＞Ｔ、ｇ．１１７５０４０５５Ｃ＞Ｇ、ｇ．１１７５０５２６５Ａ＞Ｇ、ｇ．１１７５０５３１８Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７５０６１２２Ａ＞Ｇ、ｇ．１１７５１４４４７Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７５１４８３３ｄｅｌＣ、ｇ．１１７５２２３２４Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７５２６４４７Ｃ＞Ａ（配列番号４４の位置１０１）、ｇ．１１７５２８２７３Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７５３０２２５Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７５３０８５０Ａ＞Ｇ、ｇ．１１７５３３８３５Ｃ＞Ｇ、ｇ．１１７５３３８７３Ａ＞Ｔ、ｇ．１１７５３３８９０Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７５３３９２２Ｃ＞Ｇ、ｇ．１１７５３３９２３Ｃ＞Ｇ、ｇ．１１７５３３９７１Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７５３４０５０Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７５３４０７０Ｔ＞Ａ、ｇ．１１７５３４２４６Ｇ＞Ｃ、ｇ．１１７５３４３９７＿１１７５３４４０３ｄｅｌＡＡＡＡＡＡＧ、ｇ．１１７５３４４２７Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７５３４４５８Ｔ＞Ａ、ｇ．１１７５３５１８３Ａ＞Ｃ、ｇ．１１７５３５６３２Ａ＞Ｇ、ｇ．１１７５５３７４８Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７５６０９６４Ｇ＞Ｃ、
ｇ．１１７５６１２８４Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７５６１２９７Ｃ＞Ａ、ｇ．１１７５６２２７６Ａ＞Ｇ、ｇ．１１７５７０２１６ｄｅｌＴ（配列番号４５の位置１０１）、ｇ．１１７５７１５９６Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７５７１６１２Ｔ＞Ａ、ｇ．１１７５７１６１９Ｃ＞Ｇ、ｇ．１１７５７１６５８Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７５７３２１９Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７５７４６１２Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７５７４６１３Ａ＞Ｔ、ｇ．１１７５７４８６３Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７５７７００５Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７５７７３６２Ａ＞Ｇ、ｇ．１１７５７９７９３Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７５８００５２Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７５８００７４Ｃ＞Ａ、ｇ．１１７５９３９３４Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７６１５７２０Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７６１７７１４Ａ＞Ｃ、ｇ．１１７６１８５０５Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７６２０１２１Ｔ＞Ｇ、ｇ．１１７６２３１９８Ａ＞Ｇ、ｇ．１１７６３３５８５＿１１７６３３５８６ｉｎｓＡ、ｇ．１１７６３９７４０Ａ＞Ｃ、ｇ．１１７６４０７９７Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７６４９１４５Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７６６６５２４Ｇ＞Ｃ、ｇ．１１７６７８９２９Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７６７９０４７Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７６９４３０７Ｃ＞Ｇ、ｇ．１１７６９４３０８Ａ＞Ｇ、ｇ．１１７６９５０３９Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７６９５１２８Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７６９５４１５Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７６９５６１７Ａ＞Ｃ、ｇ．１１７６９５７７２＿１１７６９５７７３ｉｎｓＴＴＧＡＧＧＧＣＡＧＧ、ｇ．１１７６９５９３３Ａ＞Ｇ、ｇ．１１７６９５９５２＿１１７６９５９５３ｉｎｓＴ、ｇ．１１７６９６６４９Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７７０３０４８Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７７０４７６４Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７７１０３２１Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７７１５５８５Ｇ＞Ｔ、ｇ．１１７７４４６８５Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１７７４８０１７Ｇ＞Ａ、ｇ．１１７７８４８３８＿１１７７８４８３９ｄｅｌＡＧ、ｇ．１１７７９３９９７Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１７８５４６８０Ａ＞Ｇがある。ウシ１７番染色体では、ｇ．１３０５４７７８＿１３０５４７７９ｉｎｓＡ、ｇ．１３０６１８７０Ｇ＞Ｃ、ｇ．１３０６３１１５Ａ＞Ｃ、ｇ．１３０６５９３２Ａ＞Ｔ、ｇ．１３０６９６４９Ｃ＞Ｇ、ｇ．１３０８５６５５Ｃ＞Ｔ、ｇ．１３０８６４６２＿１３０８６４６３ｉｎｓＡ、ｇ．１３１４９７３３ｄｅｌＴ、ｇ．１３１６０５３１Ｃ＞Ｇ、ｇ．１３１６１７４７Ｃ＞Ｇ、ｇ．１３１６１７４９Ａ＞Ｇ、ｇ．１３１７０７３１＿１３１７０７３２ｉｎｓＣＡ、ｇ．１３１７６２４９Ｃ＞Ｇ、ｇ．１３１７７４３１Ｔ＞Ｃ、ｇ．１３１７８３９６Ｔ＞Ａ、ｇ．１３１８０４０１Ｇ＞Ａ、ｇ．１３１８５１３４Ｃ＞Ｇ、ｇ．１３１９６９２３Ｃ＞Ｇ、ｇ．１３２０９０７４Ｇ＞Ｔ、ｇ．１３２１０４１７Ｔ＞Ａ、ｇ．１３２１０４１９Ｃ＞Ｇ、ｇ．１３２１３７７０Ｃ＞Ａ、ｇ．１３２１４０９５Ｔ＞Ｃ、ｇ．１３２１６２３５Ａ＞Ｇ、ｇ．１３２１６２４８Ｃ＞Ｔ、ｇ．１３２１８０９６Ｇ＞Ａ、ｇ．１３２１９５７８Ｃ＞Ｔ、ｇ．１３２２４９２１Ｔ＞Ｇ、ｇ．１３２２４９２６ｄｅｌＣ、ｇ．１３２２７１３８Ｃ＞Ｇ、ｇ．１３２２９６２２Ｇ＞Ａ、ｇ．１３２３１２５８Ａ＞Ｇ、ｇ．１３２３２２７４Ｃ＞Ｔ、ｇ．１３２３２３８８Ｇ＞Ａ、ｇ．１３２３４８８５Ａ＞Ｃ、ｇ．１３２３５５７６Ｇ＞Ａ、ｇ．１３２３６４８６Ｃ＞Ｔ、ｇ．１３２３６９８９Ｔ＞Ａ、ｇ．１３２３８１４３Ｇ＞Ａ、ｇ．１３２４０６１４＿１３２４０６１５ｉｎｓＡ、ｇ．１３２４３７３３＿１３２４３７３５ｄｅｌＡＧＡ、ｇ．１３２４９４８０ｄｅｌＴ、ｇ．１３２５８１５６＿１３２５８１５７ｉｎｓＡ、ｇ．１３２５９１６５Ｃ＞Ｔ、ｇ．１３２７１８０９Ａ＞Ｇ、ｇ．１３２８０００３Ａ＞Ｔ、ｇ．１３２８２８２１Ａ＞Ｇ、ｇ．１３２８４２３９Ａ＞Ｇ、ｇ．１３３２３９７２＿１３３２３９７３ｄｅｌＡＡ、ｇ．１３３３１１８９＿１３３３１１９０ｉｎｓＡＡＧＡＧ、ｇ．１３３４９７９７Ｇ＞Ａ、ｇ．１３３４９７９９＿１３３４９８００ｄｅｌＧＣ、ｇ．１３３４９８０１Ｇ＞Ａ、ｇ．１３３４９８０３Ｇ＞Ａ、ｇ．１３６２１１６３Ａ＞Ｃ、ｇ．１４２４６２９５Ｔ＞Ｃ、ｇ．１４２４９８９２Ｇ＞Ｃ、ｇ．１４２５１０７７＿１４２５１０７８ｉｎｓＴ、ｇ．１４２５１０８２＿１４２５１０８３ｉｎｓＴＡＴＡＴ、ｇ．１４２５１０８４Ａ＞Ｔ、ｇ．１４２５２５９７ｄｅｌＡ、ｇ．１４２５２６１８＿１４２５２６１９ｉｎｓＡ、ｇ．１４２５３５６６Ｔ＞Ｃ、ｇ．１４２５３６１５Ｔ＞Ｃ、ｇ．１４２５３７３４Ｇ＞Ａ、ｇ．１４２５３７４９Ｔ＞Ｃ、ｇ．１４２５３７５４Ｃ＞Ｔ、ｇ．１４２５３７６６Ｃ＞Ｔ、ｇ．１４２５３８７９Ｇ＞Ａ、ｇ．１４２５３９５２＿１４２５３９５３ｉｎｓＡ、ｇ．１４２５４０６３Ｇ＞Ａ、ｇ．１４２５４２０９Ｔ＞Ｇ、ｇ．１４２５５００３Ｇ＞Ａ（配列番号４８の位置１０１）、ｇ．１４２５５０２９ｄｅｌＣ（配列番号４９の位置１０１）、ｇ．１４２５５３８６Ａ＞Ｇ、ｇ．１４２５５４４５ｄｅｌＣ、ｇ．１４２５６８８１＿１４２５６８８２ｉｎｓＴ、ｇ．１４２５７８３１ｄｅｌＴ、ｇ．１４２６２６００Ｔ＞Ｇ、ｇ．１４２６２８４４Ａ＞Ｔ、ｇ．１４２６３９８８＿１４２６３９９７ｄｅｌＣＡＧＴＧＴＣＴＴＧ、ｇ．１４２６４００６Ｇ＞Ａ、ｇ．１４２６８４５３Ｇ＞Ａ、ｇ．１４２７２４７５＿１４２７２４７６ｄｅｌＡＧ、ｇ．１４２７５４３６Ｔ＞Ｃ、ｇ．１５８３０２５３Ｇ＞Ａ、ｇ．１５８３０２５７Ｃ＞Ａ、ｇ．１５８５５２８１Ｔ＞Ｇ、ｇ．１７３７８８１５Ｔ＞Ａ、ｇ．１７３９３３１７Ｔ＞Ｃ、ｇ．１７９９９２８９Ｔ＞Ａ、ｇ．１９６９９７１８Ｇ＞Ｃ、ｇ．１９６９９７４５Ｔ＞Ｃ、ｇ．１９７７８２４８Ｇ＞Ｔ、ｇ．１９７８３０１７Ｇ＞Ａ、ｇ．１９７９７３９５Ａ＞Ｇ、ｇ．１９８００８１７Ｔ＞Ｇ、ｇ．１９８０４７３２＿１９８０４７３３ｉｎｓＡＡＧＡＡＴＡＴＡＧＴＴＴ、ｇ．１９８０５６３８Ｇ＞Ａ、ｇ．１９８４２７８８Ｇ＞Ｔ、ｇ．１９８４４７３５ｄｅｌＴ、ｇ．１９８４４７５３Ａ＞Ｔ、ｇ．１９８４６０９５＿１９８４６０９６ｉｎｓＴ、ｇ．１９８４６１５２Ｃ＞Ｔ、ｇ．１９８４６２６７Ｇ＞Ａ、ｇ．１９８４６３０７Ｔ＞Ｃ、ｇ．１９８４６３２８Ｃ＞Ｔ、ｇ．１９８４８２０５Ｇ＞Ｃ、ｇ．１９８４８９０２Ａ＞Ｇ、ｇ．１９８４９０８３＿１９８４９０８４ｉｎｓＧ、ｇ．１９８４９０８４Ｔ＞Ｃ、ｇ．１９８４９０９１Ｇ＞Ａ、ｇ．１９８４９０９３Ａ＞Ｇ、ｇ．１９８４９２１３Ｃ＞Ｔ、ｇ．１９８４９２１５Ｃ＞Ｔ、ｇ．１９８４９２３０Ｇ＞Ｔ、ｇ．１９８４９２３３Ｔ＞Ｃ、ｇ．１９８４９３８１＿１９８４９３８２ｉｎｓＡ、ｇ．１９８４９３８４Ｔ＞Ｃ、ｇ．１９８５１３９３＿１９８５１３９４ｉｎｓＣＡＧＧＧＡ、ｇ．２２３３１００４Ｇ＞Ａ、ｇ．２２４６４０２４＿２２４６４０２５ｉｎｓＡ、ｇ．２２４６４０６１Ｔ＞Ｇ、ｇ．２２４６４０６２Ｔ＞Ｇ、ｇ．２２４６４０６３Ｔ＞Ｇ、ｇ．２２４６４０６４Ｔ＞Ｇ、ｇ．２２４６４０６５Ｔ＞Ｇ、ｇ．２２４６４０６６Ｔ＞Ｇ、ｇ．２２４６４０６７Ｔ＞Ｇ、ｇ．２２４６４０６８Ｔ＞Ｇ、ｇ．２２４６４０６９Ｔ＞Ｇ、ｇ．２２４６４０７０Ｔ＞Ｇ、ｇ．２２４６４０７１Ｔ＞Ｇ、ｇ．２２４６４０７２Ｔ＞Ｇ、ｇ．２２４６４０７３Ｔ＞Ｇ、ｇ．２２４６４０７４Ｔ＞Ｇ、ｇ．２２４６４０７５Ｔ＞Ｇ、ｇ．２２４６４０７６Ｔ＞Ｇ、ｇ．２２４６４０７７Ｔ＞Ｇ、ｇ．２２４６４０７８Ｔ＞Ｇ、ｇ．２２４６４０７９Ｔ＞Ｇ、ｇ．２２４６４０８０Ｔ＞Ｇがある。
【００２２】
本発明のＤＮＡマーカーの例として、エクソーム解析から特定された受胎率１０％以下の低受胎種雄牛６頭中５頭以上に共通し、平均受胎率４０％以上の正常種雄牛に現れない変異マーカーとして、以下が挙げられる。受胎率に関して、すべて変異ホモ接合型に対して、ヘテロ型及び正常ホモ接合型に有意差が認められる（Ｔｕｋｅｙの方法、ｐ＜０．０１）。ウシ５番染色体のｇ．１１５６２００５４Ｇ＞Ａ、ｇ．１１５９１８０９５Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１５９２１４２５Ａ＞Ｇ、ｇ．１１５９２１４４２Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１５９２１６０５Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１６４０８６５３Ｇ＞Ａ（配列番号１２の位置１０１）、ｇ．１１６７９１２９８＿１１６７９１２９９ｉｎｓＣ（配列番号２０の位置１００＿１０１）、ｇ．１１６７９１３２８Ｇ＞Ａ（配列番号２１の位置１０１）、ｇ．１１９１５０１４７Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１９３０４６９２Ｃ＞Ｔ（配列番号５０の位置１０１）、ｇ．１１９３１３５０３Ａ＞Ｃ、ｇ．１１９３１８３４９Ａ＞Ｇ、ｇ．１１９４６３０１７Ｇ＞Ａ（配列番号５１の位置１０１）、ｇ．１１９５８２７８５Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１９５８８７５８Ｇ＞Ｔ（配列番号５２の位置１０１）、ｇ．１１９５９２４２７Ｇ＞Ａ、ｇ．１１９５９２５２４Ｇ＞Ａ、ｇ．１１９６１１６７２Ｇ＞Ｃ、ｇ．１１９６１２５８８Ｇ＞Ａ、ｇ．１１９６１５６７０ｄｅｌＧ、ｇ．１１９６１５６７５Ｇ＞Ｔ、ｇ．１１９６１６３４２Ｃ＞Ｔ（配列番号５３の位置１０１）、ｇ．１１９６１６４８３Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１９６１６５７０Ｇ＞Ａ、ｇ．１１９６２９７６２Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１９６４０２２２Ｇ＞Ａ、ｇ．１１９６４２５１７Ｇ＞Ａ、ｇ．１１９６４３５４３Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１９６６９６４８Ｃ＞Ｔ（配列番号５４の位置１０１）、ｇ．１１９６７０９６５Ｇ＞Ａ、ｇ．１１９６７１３６７Ｇ＞Ｔ（配列番号５５の位置１０１）、ｇ．１１９６７２２２６Ｃ＞Ａ、ｇ．１１９６７５７６９Ｔ＞Ｃ、ｇ．１１９７３６９５１Ｇ＞Ｔ（配列番号５６の位置１０１）、ｇ．１１９７７１１９０Ｇ＞Ｃ、ｇ．１１９７７１４１５Ｇ＞Ａ、ｇ．１１９７７４３４８Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１９７７５７８６Ｇ＞Ａ、ｇ．１１９７９３８５３Ｇ＞Ａ、ｇ．１１９８０７２３４Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１９８０９５９９Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１９８９６２３８Ｇ＞Ｃ、ｇ．１１９９０００３４Ｇ＞Ａ、ｇ．１１９９２３４３４Ｃ＞Ｔ、ｇ．１１９９７２６１４Ｔ＞Ａ、ｇ．１２００００７６５Ｃ＞Ｔ、ｇ．１２００００８４５ｄｅｌＴが挙げられる。
【００２３】
上記のＤＮＡマーカーはあくまで例示であって、上記の連鎖不平衡ブロックの範囲にあるＤＮＡ変異であって、低受胎を判定できるＤＮＡマーカーであれば適宜用いることができる。例えば、表３に示すように、低受胎の少なくとも１個体にのみ表れる遺伝子型であっても、正常個体に変異ホモ接合型が現れなければ、ＤＮＡマーカーとして利用できる。ウシゲノム全体で受胎率１０％以下の低受胎個体１頭で低受胎個体に特異的に確認されたＤＮＡ変異は４５２，１１９個あり、半数以上に特異的に変異が確認されたＤＮＡ変異は４９，４９６個あり、すべてに確認されたＤＮＡ変異は１，２３６個ある。そのうち、ウシ５番染色体の位置１１５１１６３５７〜１２００００８４４の領域には４５１個あり、ウシ１７番染色体の位置１３０５４７７８〜２２４６４０６１の領域には１６２個あった。さらに、エクソーム領域に絞ると、ウシ５番染色体の該当領域に３個確認された。これらの一又は複数のＤＮＡ変異による変異マーカーは、低受胎を判定することが可能であるため、ＤＮＡマーカーとして用いることができる。これらのＤＮＡマーカーは、全ゲノム解析やエクソーム解析といった次世代シーケンス解析から特定した低受胎個体に共通するＤＮＡ変異から絞り込まれたため、集団内への影響が大きいことが想定され、効率的に低受胎個体を判定することができるＤＮＡマーカーである。
【００２４】
【表３】
2020141581.tif 000005
【００２５】
本発明のＤＮＡマーカーは、遺伝子発現によって作られた蛋白質のアミノ酸等の変異が生じている領域であってもよい。アミノ酸置換によって蛋白質の活性に有害な影響が生じて低受胎が生じるＤＮＡマーカーであれば、より有効な変異マーカーといえる。例えば、上記の配列番号１５、１６、２３、５０〜５６は、アミノ酸の置換が起こった例である。その中で、配列番号１６は終止コドンであり、配列番号５１はＭＬＣ１の有害変異と推定され、配列番号５５はＤＥＮＮＤ６Ｂの有害変異と推定されたため、これらは蛋白質の活性が損なわれている可能性が高く、より好ましいＤＮＡマーカーとなる。
【００２６】
本発明のＤＮＡ変異が影響を与える遺伝子の例として、上記の変異マーカーの近傍に存在する遺伝子は以下が挙げられる。ウシ５番染色体の位置１１５１１６３５７〜１２００００８４４の領域に含まれる遺伝子は、ＲＴＬ６、ＰＲＲ５、ＡＲＨＧＡＰ８、ＰＨＦ２１Ｂ、ＬＯＣ１１２４４６７８２、ＴＲＮＡＷ−ＣＣＡ、ＬＯＣ１０４９７０３２７、ＬＯＣ１１２４４６８７８、ＮＵＰ５０、ＫＩＡＡ０９３０、ＭＩＲ１２４９、ＬＯＣ１０７１３２５３０、ＵＰＫ３Ａ、ＦＡＭ１１８Ａ、ＳＭＣ１Ｂ、ＲＩＢＣ２、ＬＯＣ１００８４８５３６、ＦＢＬＮ１、ＬＯＣ１１２４４６６３１、ＡＴＸＮ１０、ＷＮＴ７Ｂ、ＬＯＣ１０１９０３０６８、ＬＯＣ１０７１３２５３１、ＬＯＣ１０１９０３２００、ＭＩＲＬＥＴ７Ａ−３、ＭＩＲ２４４３、ＭＩＲＬＥＴ７Ｂ、ＬＯＣ１１２４４６７８３、ＬＯＣ１０１９０３３８３、ＰＰＡＲＡ、ＣＤＰＦ１、ＰＫＤＲＥＪ、ＬＯＣ１０４９７２６２２、ＬＯＣ１０１９０４４１３、ＴＴＣ３８、ＧＴＳＥ１、ＴＲＭＵ、ＣＥＬＳＲ１、ＧＲＡＭＤ４、ＬＯＣ１１２４４６７８５、ＬＯＣ１１２４４６７８４、ＣＥＲＫ、ＬＯＣ１０１９０８２０６、ＴＢＣ１Ｄ２２Ａ、ＬＯＣ１１２４４６７８６、ＬＯＣ１０７１３２５３２、ＭＩＲ２２８５Ｏ−５、ＭＩＲ２２８４Ｈ、ＬＯＣ１１２４４６７８７、ＬＯＣ１０１９０４７７６、ＦＡＭ１９Ａ５、ＬＯＣ１１２４４６７９１、ＬＯＣ１１２４４６７８８、ＬＯＣ１０７１３２５３５、ＬＯＣ１１２４４６７９０、ＬＯＣ１０４９７２６１２、ＬＯＣ１１２４４６７８９、ＬＯＣ１０４９７２４１７、ＬＯＣ１１２４４６６３２、ＣＣＤＣ５９、ＭＥＴＴＬ２５、ＬＯＣ５３１１７５、ＢＲＤ１、ＬＯＣ１１２４４６７９２、ＺＢＥＤ４、ＡＬＧ１２、ＣＲＥＬＤ２、ＬＯＣ１０１９０３６４７、ＰＩＭ３、ＩＬ１７ＲＥＬ、ＴＴＬＬ８、ＬＯＣ１１２４４６７９３、ＬＯＣ１１２４４６７９４、ＭＬＣ１、ＭＯＶ１０Ｌ１、ＬＯＣ１１２４４６７９７、ＬＯＣ７８７５５０、ＬＯＣ１０７１３２５３４、ＭＩＲ２８９４、ＰＡＮＸ２、ＬＯＣ１１２４４６７９６、ＬＯＣ１０１９０４３４４、ＴＲＡＢＤ、ＬＯＣ１１２４４６７９５、ＳＥＬＥＮＯＯ、ＴＵＢＧＣＰ６、ＨＤＡＣ１０、ＭＡＰＫ１２、ＭＡＰＫ１１、ＰＬＸＮＢ２、ＤＥＮＮＤ６Ｂ、ＰＰＰ６Ｒ２、ＳＢＦ１、ＡＤＭ２、ＬＯＣ１０１９０３０８７、ＭＩＯＸ、ＬＭＦ２、ＮＣＡＰＨ２、ＳＣＯ２、ＯＤＦ３Ｂ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＳＹＣＥ３、ＣＰＴ１Ｂ、ＣＨＫＢ、ＭＡＰＫ８ＩＰ２、ＡＲＳＡがある。また、ウシ１７番染色体の位置１３０５４７７８〜２２４６４０６１の領域に含まれる遺伝子は、ＨＨＩＰ、ＴＲＮＡＣ−ＧＣＡ、ＴＲＮＡＧ−ＵＣＣ、ＧＹＰＡ、ＧＹＰＢ、ＬＯＣ１００３３７１８５、ＦＲＥＭ３、ＳＭＡＲＣＡ５、ＧＡＢ１、ＬＯＣ１０１９０６５４５、ＴＲＮＡＫ−ＵＵＵ、ＬＯＣ１１２４４２０９０、ＵＳＰ３８、ＬＯＣ１０７１３１３６７、ＬＯＣ１１２４４２０９１、ＩＮＰＰ４Ｂ、ＬＯＣ１０４９７４５７８、ＩＬ１５、ＺＮＦ３３０、ＬＯＣ１１２４４１９９３、ＲＮＦ１５０、ＬＯＣ１０１９０３９７６、ＬＯＣ１１２４４２０１５、ＴＲＮＡＲ−ＣＣＵ、ＴＢＣ１Ｄ９、ＵＣＰ１、ＥＬＭＯＤ２、ＬＯＣ１１２４４２０１６、ＭＧＡＴ４Ｄ、ＬＯＣ１１２４４２０１７、ＣＬＧＮ、ＳＣＯＣ、ＬＯＣ１０７１３３２８０、ＭＡＭＬ３、ＬＯＣ１０４９７４５８４、ＬＯＣ１１２４４２０１８、ＭＧＳＴ２、ＬＯＣ１０１９０３８４０、ＳＥＴＤ７、ＴＲＮＡＥ−ＵＵＣ、ＲＡＢ３３Ｂ、ＬＯＣ１０１９０７６１９、ＬＯＣ１００８４８７０３、ＮＡＡ１５、ＮＤＵＦＣ１、ＭＧＡＲＰ、ＬＯＣ１０１９０７８３５、ＴＲＮＡＥ−ＣＵＣ、ＬＯＣ１０１９０７７５８、ＬＯＣ１０７１３３２７５、ＥＬＦ２、ＬＯＣ１０１９０７９１６、ＮＯＣＴ、ＬＯＣ１１２４４２１２６、ＬＯＣ１００２９６１１９、ＬＯＣ７８３３９０、ＳＬＣ７Ａ１１、ＬＯＣ１１２４４２１０１、ＰＣＤＨ１８、ＬＯＣ１００１３７７６４、ＬＯＣ６１８３７７、ＴＲＮＡＦ−ＡＡＡ、ＬＯＣ１１２４４２１３７がある。
【００２７】
本発明のＤＮＡマーカーによる受胎性の判定は、リファレンスの遺伝子型と同一の正常ホモ接合型であれば選抜対象とし、ヘテロ接合型であれば当該個体は低受胎ではないが交配相手によっては子が低受胎になる可能性があり注意を要し、変異ホモ接合型であれば当該個体は低受胎と判定され選抜対象としないとする。例えば、配列番号１２であれば、ＧＧ型であれば選抜し、ＡＧ型であれば選抜に注意を要する、ＡＡ型であれば選抜しないといった対応が取れる。
【００２８】
さらに、本発明のＤＮＡマーカーは、上記のように受胎性の判定に直接的に用いられるＤＮＡ変異の変異マーカーのみならず、一部の正常個体では判定に矛盾が生じるものの、低受胎個体の多くに共通するＤＮＡ変異であれば用いることができる。例えば、ＧＷＡＳ解析はゲノム全体をカバーする複数のＳＮＰを用いて行うが、これらの解析の中では低受胎個体の共通するＤＮＡ変異が複数含まれれば、低受胎個体に特徴的な連鎖不平衡ブロックを推定できる。つまり、これらの特定に用いられたＳＮＰも本発明のＤＮＡマーカーに含まれ、例えば、イルミナ株式会社が提供するＢｏｖｉｎｅＨＤやＢｏｖｉｎｅＳＮＰ５０  ｖ３、ＢｏｖｉｎｅＬＤの各ＢｅａｄＣｈｉｐに搭載されたウシ５番染色体の位置１１５１１６３５７〜１２００００８４４やウシ１７番染色体の位置１３０５４７７８〜２２４６４０６１の領域にあるＳＮＰでもよい。また、例えばヒトであればＩｎｆｉｎｉｕｍ  Ｃｏｒｅ−２４、マウスであればＧＧＰ  ＧＩＧＡ−ＭＵＧＡ、ブタであればＰｏｒｃｉｎｅＳＮＰ６０といったＳＮＰセット（いずれもイルミナ株式会社）が乗ったタイピングチップを用いてＧＷＡＳ解析を行うことができるが、それらのウシ５番染色体の位置１１５１１６３５７〜１２００００８４４やウシ１７番染色体の位置１３０５４７７８〜２２４６４０６１に相当する領域にあるＳＮＰでもよい。該当の領域に搭載された個別のＳＮＰ型を確認することにより、受胎性に問題がある個体の推定ができる。
【００２９】
本発明のＤＮＡマーカーを構成する塩基配列の数は、変異マーカーの部位を含めば適宜選択できる。例えば、変異マーカーの部位を挟むような形であってもよく、変異の箇所の上流又は下流といった片側のみの配列のみでもよい。変異マーカーを特定するための塩基の数は、増加すればするほど特異的な配列となる。理論上はＤＮＡの塩基の組合せは、ＡＴＧＣ塩基４種類の塩基総数乗通りとなり、塩基配列が５個のＤＮＡだと約千通り、１０個だと約１００万通り、１５個だと約１０億通り、２０個だと約１兆通りの組合せがある。例えば、ウシゲノムは約２７億個の塩基から構成されるため、ＤＮＡマーカーの部位を含み１５塩基程度、より好ましくは２０塩基以上、さらに好ましくは４０塩基以上の塩基数があれば、理論上は特異的な配列を検出できる。
【００３０】
また、ＤＮＡの塩基は、水素結合によって、ＡとＴが相補的に結合し、ＧとＣが相補的に結合するため、本発明のＤＮＡマーカーとして特定された配列に対して、相補的な配列でも同様にＤＮＡマーカーとすることができる。例えば、表２の配列番号１２であれば、Ｇがリファレンスの塩基でＡが変異の塩基であるから、その相補的な配列のＤＮＡマーカーであれば、Ｃがリファレンスの塩基でＴが変異の塩基となる。この場合、体細胞２倍体では、２個のアレルにおいてＣＣ型が正常ホモ接合型、ＣＴ型が変異ヘテロ接合型、ＴＴ型が変異ホモ接合型となる。このような配列番号１２と相補的な配列によるＤＮＡマーカーによれば、ＴＴ型の変異ホモ接合型が検出された場合は、低受胎という判定になる。
【００３１】
本発明のＤＮＡマーカーは、配列表から特定される塩基配列を完全に限定するものではなく、ＤＮＡ変異となる変異マーカーの部位の塩基配列を決定できれば、１００％一致する必要はない。例えば個体によっては、変異マーカーの周辺に変異が生じている場合があり、変異マーカーの部位周辺の塩基配列は一致しない場合がある。相同性は、概ね７０％以上が好ましく、さらに好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列が一致する配列であれば、本発明のＤＮＡマーカーとして利用が可能である。
【００３２】
本発明のＤＮＡマーカーは、ウシの染色体を用いて配列を特定しているが、ホモログ、パラログ、オルソログといった相同性の高い配列として特定できれば、染色体上の位置を問わない。また、対象はウシ以外の動物種であってもよい。例えば、ウシ５番染色体の位置１１５６６８８６９〜１２００００８４４の領域は、ヒトであれば２２番染色体に、マウスであれば１５番染色体に、ラットであれば７番染色体に相当する領域がある。また、ウシ１７番染色体の位置１３０５４７７８〜２２４６４０６１の領域は、ヒトであれば４番染色体に、マウスであれば８番染色体に、ラットであれば１９番染色体に相当する領域がある。この場合、本発明のＤＮＡマーカーは、ウシのゲノム配列から特定しているため、他動物種では多少変異マーカーの部位周辺の配列が異なることも想定される。
【００３３】
また、例えば、配列番号１２の１０１位を含む配列について、公開データベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ）を用いて、塩基配列の全エントリ［Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ｎｒ／ｎｔ）］に対してＭｏｒｅ  ｄｉｓｓｉｍｉｌａｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  （ｄｉｓｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ｍｅｇａｂｌａｓｔ）の条件で相同性検索を行ったところ、コブウシ（Ｂｏｓ  ｉｎｄｉｃｕｓ）のｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ＬＯＣ１０９５５９９０８、スイギュウ（Ｂｕｂａｌｕｓ  ｂｕｂａｌｉｓ）のｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｉｋｅ  （ＬＯＣ１０２４０１４２４）、ロバ（Ｅｑｕｕｓ  ａｓｉｎｕｓ）  ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ＬＯＣ１０６８４５９７７、イノシシ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）  ＣＢＸ６  ｇｅｎｅ、アメリカバイソン（Ｂｉｓｏｎ  ｂｉｓｏｎ）ＮＫ２Ｂ  ｇｅｎｅ、ヒト（Ｈｕｍａｎ）  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｃｌｏｎｅ  ＲＰ１１−４４４Ｅ１７  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ６、アルパカ（Ｖｉｃｕｇｎａ  ｐａｃｏｓ）ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ＬＯＣ１０７０３４３９４、カマイルカ（Ｌａｇｅｎｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｉｄｅｎｓ）のｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｇ  ｍｅｍｂｅｒ  ２  （ＬＯＣ１１３６２１１５６）、ラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｆｅｒｕｓ）  ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ＬＯＣ１０６７２８６６０の各配列がヒットするため、配列番号１２の配列は様々な動物種で保存されていることが確認できる。また、遺伝子として受胎性に関わる機能を有する可能性もある。
【００３４】
実施の形態２．ＤＮＡマーカーを用いた検査方法
本発明のＤＮＡマーカーを用いた検査方法は、動物の受胎性を判定するための指標となる実施の形態１に記載のＤＮＡマーカーを用いた検査方法であり、標的となるＤＮＡ等に対して、一又は複数のＤＮＡマーカーの部位の塩基配列を決定する塩基決定工程と、決定された塩基から受胎性を判定する受胎性判定工程からなる。
【００３５】
（ｉ）  塩基決定工程
塩基決定工程は、動物の検査試料から抽出されたＤＮＡ等を用いて、本発明のＤＮＡマーカーの部位の塩基配列の決定を行う工程である。
【００３６】
動物は、標的となるＤＮＡ変異を検出できれば、任意の動物を用いることができる。例えば、ヒトを含む哺乳動物、家畜動物、愛玩動物、動物園・水族館動物、実験動物、魚類等が挙げられる。家畜動物は、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等が挙げられる。愛玩動物は、イヌ、ネコ、ウサギ等が挙げられる。動物園・水族館動物は、パンダ、イルカ、ウツボ等が挙げられる。実験動物は、マウス、ハムスター、ラット、ウニ、ヒトデ等が挙げられる。受胎性を判定する動物は、より好ましくは家畜動物であり、さらに好ましくはウシであり、さらに好ましくは黒毛和種である。
【００３７】
ウシは、Ｂｏｓ属の動物であり、例えば、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ種の家畜牛、Ｂｏｓ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ種のバンテン、Ｂｏｓ  ｉｎｄｉｃｕｓ種のコブウシ、Ｂｏｓ  ｓａｕｖｅｌｉ種のコープレイ、Ｂｏｓ  ｍｕｔｕｓ種のヤクなどが含まれる。Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ種は、例えば黒毛和種、褐毛和種、無角和種、日本短角種、アバディーン・アンガス種、ショートホーン種、ヘレフォード種、シャロレー種、シンメンタール種、リムーザン種、ホルスタイン種、ジャージー種、ガンジー種、ブラウン・スイス種、エアシャー種、デンマーク赤牛、黄牛、草原紅牛、朝鮮牛、ブラーマン種、ヒンドゥー種、カンペンセン種等があげられる。また、日本の野生化牛である口之島牛、見島牛、見蘭牛等も含む。
【００３８】
本発明のＤＮＡマーカーは、雄の受胎性を判定するが、検査自体は雄のみならず、雌、両性具有、雌雄同体等も含めて適用できる。例えば、雌の染色体構成でありながら、雄の能力を有するような雄化した雌にも適用できる。また、低受胎は本発明のＤＮＡマーカーで特定された変異ホモ接合型が該当するため、将来の子が雄の場合にホモ接合型の個体が生じないようにするため、交配を予定している雌雄双方のＤＮＡ変異を調べることによって、変異ホモ接合型又はヘテロ接合型に交配を避けて、将来的に子の変異ホモ接合型の出現を防ぐための参考にすることができる。
【００３９】
検査試料は、本発明のＤＮＡマーカーの部位の塩基配列を特定できるＤＮＡ等の核酸配列が含まれていればよい。検査資料は、１個体毎だけでなく、複数個体をプールして用いることもできる。また、マルチプレックス法のように、異なる配列のインデックスを付加する等により１個体毎にＤＮＡ等の特定を行い、同時に多個体の塩基配列を決定することもできる。
【００４０】
ＤＮＡ等の核酸配列は、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸やそれらの修飾体を含むモノマーであるヌクレオチドが多数接続したポリヌクレオチドからなる。ポリヌクレオチドは、約２０塩基対程度のオリゴヌクレオチドも含む。ポリヌクレオチドは、プリン塩基又はピリミジン塩基やそれらの修飾塩基からなる塩基を含む。例えば、ゲノムＤＮＡ、相補的なＤＮＡ、ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＰＣＲによって一部領域を増幅したＤＮＡ等があげられる。なお、ＤＮＡの塩基は上記の通り、ＡＧＴＣの４種類であるが、ＲＮＡの塩基はＴがウラシル（Ｕ）に置き換わる。また、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸は、１本鎖、２本鎖、又は３本鎖以上の任意の数の鎖であってもよく、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッド型、ＤＮＡとＲＮＡのキメラ型等の形でもよい。また、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸は、本発明のＤＮＡマーカーの部位の塩基配列の決定ができればよく、インデックス配列等の付加、アミノ化、ビオチン化、リン酸化等による修飾、蛍光色素、ハプテン、アフィニティタグ等によって標識されているものも含まれる。
【００４１】
検査試料は、検査対象となる動物個体由来のＤＮＡ等を用いる。好ましくは、動物個体の細胞から抽出する。例えば毛根、皮膚、唾液、鼻汁、血液、肉、精巣や卵巣等の臓器、精液、精子、卵子、受精卵等が挙げられる。細胞は、幹細胞、精巣幹細胞、ｉＰＳ細胞、培養細胞といった形で、人工的に培養をして、継代や増殖させたものも用いることができる。検査試料は、ポリヌクレオチドが取得できればよく、冷蔵、凍結、凍結乾燥等していてもよい。
【００４２】
検査試料を取得する方法は、毛根、皮膚、唾液、鼻汁であれば直接個体から採取する方法、血液であれば採血による方法、肉や臓器であればと体から採取する方法、精巣由来の精子であれば精巣を採取し精子を吸い出す方法等、精巣上体由来の精子であれば精巣上体を採取し精子を吸い出す若しくは掻き出す方法等、射出精液由来の精子であれば雌体内への射精後に回収する方法や電気刺激や人工腟を用いて採取する方法、受精卵であれば一部の細胞を切り取る方法、幹細胞、精巣幹細胞、ｉＰＳ細胞、培養細胞であれば細胞培養を行って回収する方法等が挙げられる。取得した精子は、取得直後の精漿に浮遊した状態でも、水溶液等でさらに希釈又は洗浄されていてもよい。
【００４３】
ＤＮＡ等の抽出は、本発明のＤＮＡマーカーを検出するためのポリヌクレオチドを回収できれば、任意の方法であってもよい。例えば、フェノール、クロロホルムを用いた方法、ヨウ化ナトリウムを用いた方法が挙げられる。また、ダイレクトＰＣＲのように、ＤＮＡの抽出操作を行うことなく細胞から直接ＤＮＡ等を用いることもできる。
【００４４】
塩基配列決定は、本発明のＤＮＡマーカーの部位の塩基配列が決定できれば、適宜手法を選択することができる。ＤＮＡ配列を決定する手法は、例えば、サンガーシーケンスを用いた個別又は複数のポリヌクレオチドシーケンス、ＳＮＰタイピングチップ等を用いたマイクロアレイ法、次世代シーケンシングを用いた全ゲノム解析やエクソーム解析又は標的領域の濃縮によるターゲットリシーケンス、リアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ、ＴａｑｍａｎＰＣＲ、ＳＮａＰ  Ｓｈｏｔ、Ｉｎｖａｄｅｒ法、質量分析法等が挙げられる。
【００４５】
サンガーシーケンスは、ＤＮＡポリメラーゼを用いて末端が特定の塩基に対応するＤＮＡ断片を合成する手法で、４種類の蛍光色素で標識したジデオキシヌクレオチドを伸長反応に使用するダイターミネーター法がある。例えば、本発明のＤＮＡマーカーの部位を含む塩基配列をＰＣＲによって増幅させた検査試料のＤＮＡ等に対して、特異的に結合する一種類のプライマーからの伸長反応でランダムに取り込まれたダイターミネーターの蛍光色素の種類とＤＮＡ断片の長さをキャピラリー電気泳動装置で検出して、本発明のＤＮＡマーカーの部位の塩基配列を決定する。
【００４６】
マイクロアレイ法は、基板上に複数の鋳型ＤＮＡの部分配列を高密度に配置して固定したポリヌクレオチド断片とハイブリダイゼーションして、結合部位を蛍光や電流により検出する。例えば、ＤＮＡマイクロアレイであれば、本発明のＤＮＡマーカーを検出するＤＮＡプローブを基板に固定化し、それらに相同性のある標識化した検査試料のＤＮＡ等をハイブリダイズさせて、本発明のＤＮＡマーカーを含む塩基配列を決定する。この方法は、複数のＤＮＡマーカーを検出するのに有効である。例えば、イルミナ株式会社が提供するＩｎｆｉｎｉｕｍ  ＸＴ又はｉＳｅｌｅｃｔ  ＨＤ  ＢｅａｄＣｈｉｐを用いて本発明のＤＮＡマーカーを検出するＳＮＰタイピングチップを作製し、ＤＮＡ等が含まれる溶液をこれらのＳＮＰタイピングチップと反応させて、ＤＮＡマーカーの部位の塩基配列を決定する。例えば、ウシ５番染色体の位置１１５１１６３５７〜１２００００８４４の領域や他動物種の相当する領域に限定してＤＮＡタイピングを行うカスタムＳＮＰタイピングチップを用いて、本発明のＤＮＡマーカーの部位の塩基配列を決定し、受胎性に問題がある個体を判定する。
【００４７】
また、一部の正常個体で判定に矛盾があっても、低受胎個体の多くに共通する複数のＳＮＰ型を用いることにより、低受胎に特異的な連鎖不平衡ブロックを特定することができるため、これらのＳＮＰ型をＤＮＡマーカーとして用いることで、受胎性に問題がある個体の推定ができる。この場合、例えばゲノム領域に複数配置されたリファレンスＳＮＰ型として、ウシであればＢｏｖｉｎｅＳＮＰ５０  ｖ３  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ＢｅａｄＣｈｉｐ（イルミナ株式会社）のＳＮＰセットが乗ったタイピングチップであれば、ウシ５番染色体の位置１１５１１６３５７〜１２００００８４４やウシ１７番染色体の位置１３０５４７７８〜２２４６４０６１の領域のＳＮＰを判定に用いることができる。
【００４８】
次世代シーケンシングは、並列処理を行うことで高スループットが実現されたポリヌクレオチドシーケンスである。並列処理は、カスタムアダプター配列を利用して増幅又はライゲーションしたライブラリを基板上の鋳型ＤＮＡに固定化し、ヌクレオチド合成過程を顕微鏡等で観察して実現する。シグナルの取得やヌクレオチド合成方法は、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社が提供するパイロシーケンシング、イルミナ株式会社が提供する合成シーケンシング、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社が提供するライゲーションを用いたシーケンシングや半導体シーケンシング、ナノポアオックスフォード・ナノポアテクノロジーズが提供するナノポアを用いたシーケンシング等により、本発明のＤＮＡマーカーの部位の塩基配列を決定する。
【００４９】
全ゲノム解析は、ゲノムを解析する上で包括的な手法で、１塩基ごとにゲノム全体で捉えることができる。エクソーム解析は、ゲノムの蛋白質コーティング領域等を標的とする手法で、例えばヒトゲノムでは遺伝子コードの２％未満に相当し既知の疾患関連の変異約８５％を含むとされ、全ゲノム解析に対するコスト効率の良い手法である。ターゲットリシーケンスは、本発明のＤＮＡマーカーの部位の塩基配列を、特殊プローブやプライマーを利用し、キャプチャーして濃縮後にシーケンス解析行う。これらは複数の本発明のＤＮＡマーカーの部位の塩基配列を決定するのに有効である。
【００５０】
リアルタイムＰＣＲは、ＰＣＲによる増幅を経時的に測定することで、増幅率に基づいて鋳型ＤＮＡの定量を行う。例えば、本発明のＤＮＡマーカーを含むＤＮＡ等の領域を増幅するプライマーセットと、これらのＤＮＡマーカーに対応する２種類の遺伝子型の蛍光プローブを用いて、本発明のＤＮＡマーカーの塩基配列を決定する。蛍光強度により、変異ホモ接合型、ヘテロ接合型、正常ホモ接合型に分けて本発明のＤＮＡマーカーの部位の塩基配列を識別して検出できる。
【００５１】
ＰＣＲ−ＲＦＬＰは、制限酵素断片長多型により変異を検出するものであり、ＰＣＲでポリヌクレオチドを増幅し、制限酵素によって切断されたポリヌクレオチド断片の長さが、ゲノムＤＮＡ変異に起因して個体間で異なることを検出して、本発明のＤＮＡマーカーの部位の塩基配列を決定する。
【００５２】
（ｉｉ）  受胎性判定工程
受胎性判定工程は、塩基決定工程で決定された塩基配列から、受胎性の判定を行う工程である。
【００５３】
受胎性の判定は、本発明のＤＮＡマーカーを用いて行う。具体的なＤＮＡマーカーによる受胎性の判定は実施の形態１にも記載したが、決定された本発明のＤＮＡマーカーの部位の塩基配列によって、低受胎型、ヘテロ接合型、正常型の判定を行う。そして、リファレンスの遺伝子型と同一の正常ホモ接合型であれば選抜対象とし、ヘテロ接合型であれば当該個体は低受胎ではないが交配相手によっては子が低受胎になる可能性があり注意を要し、変異ホモ接合型であれば当該個体は低受胎と判定され選抜対象としない判定をする。
【００５４】
判定に用いるＤＮＡマーカーの数は、１個であっても複数個の組合せであってもよい。例えば１個のＤＮＡマーカーを用いる場合、配列番号１２の１０１位がＡＡ型である場合に変異ホモ接合型と判断できる。また、３個のＤＮＡマーカーを用いる場合、配列番号１２の１０１位、配列番号２０の１００＿１０１位、配列番号２１の１０１位の組合せを選択でき、それぞれＡＡ型、ＡＡ＋ＣＣ型、ＡＡ型の個体は、変異ホモ接合型と判定することができる。これらが３個すべて揃った時に変異ホモ接合型と判定すれば、結果の信頼性がより高まる。また、このうち１個の塩基配列が決定できなかったとしても、残りの２個で変異ホモ接合型と判定することは可能である。このことから、複数の本発明のＤＮＡマーカーの部位の塩基配列を決定して、受胎性の判定を行うことにより、効果的かつ信頼性の高い検査方法となる。
【００５５】
実施の形態３．ＤＮＡマーカーを用いた検査キット
本発明の検査キットは、動物の検査試料から抽出されたＤＮＡ等を用いて、本発明のＤＮＡマーカーの部位の塩基配列の決定を行うのに特異的に必要な試薬である。
【００５６】
特異的に必要な試薬は、本発明のＤＮＡマーカーの塩基配列決定に用いるための試薬であり、例えば、サンガーシーケンシングであれば、本発明のＤＮＡマーカーの部位の塩基配列を含むＤＮＡ領域をＰＣＲで増幅するために用いる特異的なＤＮＡ等のプライマーである。また、ＤＮＡマイクロアレイであれば、本発明のＤＮＡマーカーの部位の塩基配列を検出するために用いる特異的なＤＮＡ等のプローブである。また、ターゲットリシーケンスであれば、本発明のＤＮＡマーカーの部位を含む領域を濃縮するために用いる特異的なＤＮＡ等のプローブや特異的なＤＮＡ等のプライマーである。ＰＣＲ−ＲＦＬＰであれば、本発明のＤＮＡマーカーの部位の塩基配列を検出するために用いる特異的な制限酵素である。
【００５７】
プローブは、変異マーカーの部位を挟むような形であってもよく、変異の箇所の上流又は下流といった片側のみの塩基配列のみでもよい。本発明のＤＮＡマーカーの部位の塩基配列を決定するために適宜選択できる。例えば、配列番号１２の１０１位で示すＤＮＡマーカーの塩基配列を決定するプローブであれば、配列番号１２の１〜２０１位、５０〜１５１位、５０〜１００位、１０１〜２０１位を含む塩基配列が挙げられる。また、ＤＮＡマーカーの部位の塩基配列を決定できれば、１〜２０１位のさらに上流又は下流の塩基配列を含んでもよい。
【００５８】
プライマーは、変異マーカーの部位を挟むような形であってもよく、変異の箇所の上流又は下流といった片側のみの塩基配列のみの設計でもよい。本発明のＤＮＡマーカーの部位の塩基配列を決定するために適宜選択できる。例えば、配列番号１２の１０１位で示すＤＮＡマーカーの塩基配列を決定するプライマーであれば、配列番号１２の２０〜４０位、７５〜１００位、９０〜１１０位を含む塩基配列が挙げられる。また、ＤＮＡマーカーの部位の塩基配列を決定できれば、１〜２０１位のさらに上流又は下流の塩基配列を含んでもよい。好ましくは、変異マーカーの部位を含む連続する核酸領域を増幅させるため、変異マーカーの箇所の上流及び下流に設計する。例えば、配列番号１２の１０〜３０位及び１４０〜１６０位が挙げられる。
【００５９】
プローブやプライマーの塩基配列は、本発明のＤＮＡマーカーと同様に、配列表から特定される塩基配列から完全に限定するものではなく、ＤＮＡ変異となる変異マーカーの部位の塩基配列を決定できれば、１００％一致する必要はない。相同性は、概ね７０％以上が好ましく、さらに好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列が一致する配列であれば利用が可能である。また、プローブやプライマーは、本発明のＤＮＡマーカーの部位の塩基配列の決定ができればよく、インデックス配列等の付加、アミノ化、ビオチン化、リン酸化等による修飾、蛍光色素、ハプテン、アフィニティタグ等によって標識されているものも含まれる。
【００６０】
以下に実施例を挙げて、本発明のＤＮＡマーカー、並びにそれを用いた検査方法及び検査キットを具体的に説明する。本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、本発明の技術分野において通常の変更を行うことができる。
【００６１】
実施例１．ＧＷＡＳ解析を用いたゲノムＤＮＡ変異領域の特定
ウシゲノムＤＮＡは、凍結精液からヨウ化ナトリウムを用いた方法で抽出した。ＳＮＰタイピングは、ＢｏｖｉｎｅＳＮＰ５０  ｖ３  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ＢｅａｄＣｈｉｐ（イルミナ株式会社）を用いて行った。Ｃａｌｌ  ｒａｔｅが０．９以上のサンプルについて解析を行った。１７９頭の黒毛和種種雄牛の初回授精受胎率及びＳＮＰ  ５０Ｋデータを用いてＰＬＩＮＫ１．９を用いてＧＷＡＳ解析を行った。
【００６２】
図１にＧＷＡＳ解析の結果であるマンハッタンプロットを示す。ウシ５番染色体後半に有意な連鎖不平衡ブロックが存在した（ボンフェローニの方法、ｐ＜１．２×１０−６、図１点線）。有意な領域に含まれるＳＮＰとして、ウシ５番染色体の位置１１６６６１８３８〜１１９１５０１４７の間で７個特定された。これらはウシゲノム上に置かれたマーカーであって、連鎖不平衡ブロックとして周辺領域に複数特定されるＤＮＡ変異である。有意差のあったウシ５番染色体の位置１１６６６１８３８〜１１９１５０１４７付近にある単一もしくは複数のＤＮＡ変異を低受胎種雄牛の指標マーカーとして、低受胎種雄牛を判断できる。図２にＱＱプロットを示す。横軸に期待されるＰ値、縦軸に観測Ｐ値をプロットし、集団の構造化等の問題が大きくないことを確認した。
【００６３】
実施例２．次世代シーケンス解析によるゲノムＤＮＡ変異の特定
実施例１と同様に、種雄牛の凍結精液から抽出したゲノムＤＮＡを用いて、次世代シーケンサによる解析を行った。配列解析はＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２５００又はＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ５００を用いて、リード長１５０ｂｐ、ペアシーケンスを行った。エクソン領域はＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＸＴ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ａｌｌ  Ｅｘｏｎ（アジレント・テクノロジー株式会社）を用いて濃縮した。１検体あたり標的領域を全ゲノム解析で平均ｘ１５程度、エクソーム解析で平均ｘ１００程度のデプスでカバーするように行った。次世代シーケンサから得られた配列データは、ＦａｓｔＱＣを用いてクオリティチェックをおこなった。各配列データをヘレフォード種の参照ゲノム配列（ＡＲＳ−ＵＣＤ１．２）を用いて、マッピングを行った。変異検出はＧＡＴＫ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｏｌｋｉｔ）のＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒを用いて行い、ＶａｒｉａｎｔＦｉｌｔｅｒａｔｉｏｎを用いて変異のクオリティ情報を付与した。解析結果は、ＩＧＶ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｖｉｅｗｅｒ）を用いて可視化した。
【００６４】
黒毛和種及びホルスタイン種種雄牛の初回授精受胎率を用いた解析から、初回受胎率が１０％以下の顕著な低受胎種雄牛６頭に共通するＤＮＡ変異が１，２３６個検出された。このうち低受胎種雄牛で共通して矛盾がないＤＮＡ変異の例として、配列番号７〜４９で特定されたＤＮＡ変異の遺伝子型と受胎率との関係を図３に示す。すべての配列番号で、変異ホモ接合型とそれ以外のヘテロ接合型及び正常ホモ接合型の受胎率において、有意な差が確認された（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、ｐ＜０．０１）。このように配列番号７〜４９で特定される単一もしくは複数のＤＮＡ変異を低受胎種雄牛の指標マーカーとして、低受胎を判断できた。さらに、複数のＤＮＡ変異を組み合せることにより、より信頼性の高いＤＮＡマーカーとなると考えられる。この次世代シーケンサを用いた解析から、大きな連鎖不平衡ブロックの中にも、小さな連鎖不平衡ブロックを確認することができ、個々のＳＮＰを調べることで、より精度の高い検査法となり得る。
【００６５】
実施例３．エクソーム解析によるゲノムＤＮＡ変異及びアミノ酸有害変異の推定
実施例２に記載の方法に加えて、エクソーム解析で特定したＤＮＡ変異のアノテーションはｓｎｐＥｆｆを用いて行い、遺伝子名やコーディング情報、翻訳後の蛋白質に与えるインパクト等の情報を付与した。
【００６６】
解析の結果、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＸＴ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ａｌｌ  Ｅｘｏｎのベイトライブラリ上に、初回受胎率が１０％以下の顕著な低受胎種雄牛６頭すべてに共通する変異が３個存在し、ウシ５番染色体の位置１１６４０８６５３（配列番号１２）、１１６７９１２９８＿１１６７９１２９９（配列番号２０）、１１６７９１３２８（配列番号２１）であった。また、６頭中５頭に共通する変異は４４個検出され、すべてウシ５番染色体（１１５６２００５４〜１２００００８４４）の領域であった。このうち低受胎種雄牛で共通して矛盾がないＤＮＡ変異の例として、配列番号１２、２０、２１、５０〜５６で特定されたＤＮＡ変異の遺伝子型と受胎率との関係を図４に示す。すべての配列番号で、変異ホモ接合型に対して、ヘテロ接合型及び正常ホモ接合型の各受胎率間において、有意な差が確認された（ｐ＜０．０１、Ｔｕｋｅｙの方法）。連鎖不平衡ブロックを考慮すると、さらにこれらの位置範囲に含まれるＤＮＡ変異が低受胎に関連する可能性が考えられた。実施例２と同様にこれらの単一または複数の組合せにより低受胎種雄牛のＤＮＡマーカーとしての利用可能性が示された。
【００６７】
また、初回受胎率が１０％以下の顕著な低受胎種雄牛の少なくとも６頭中１頭にある変異が７４９個確認された。個々の種雄牛における低受胎の原因が別々である場合、１頭にしか確認されない変異であっても原因となる可能性があった。また、６頭中３頭以上に共通する変異は上記のウシ５番染色体のものを含めて６３個確認されたが、そのうちウシ２番染色体の位置１２９８７７７７１〜１３０９６８９４６にも１４個確認され、この領域にも何らかの低受胎に関連するＤＮＡ変異がある可能性があった。
【００６８】
配列表で特定したＤＮＡ変異からアミノ酸の非同義置換が起こった領域が１０個推定された（表４）。配列番号は配列表に記載したものを示し、染色体及び位置は、ＰｏｌｙＰｈｅｎ２を用いた解析から、配列番号１６で示したＣＤＰＦ１は終止コドンを有し、配列番号５１で示したＭＬＣ１及び配列番号５５で示したＤＥＮＮＤ６Ｂは、蛋白質活性に有害な影響が起こった可能性が示された。ＧＷＡＳ解析の結果と合わせて、ＤＮＡ変異を低受胎種雄牛の指標マーカーとして、ウシ５番染色体の位置１１５６２００５４〜１２００００８４４、好ましくは位置１１５７４６３３５〜１１９５２９６０７の範囲にあるＤＮＡ変異は、低受胎を引き起こす遺伝子発現や遺伝子産物の活性等に関連していると考えられ、これらの単一もしくは複数のＤＮＡ変異により、低受胎種雄牛を判断できると考えられた。
【００６９】
【表４】
2020141581.tif 000006
【００７０】
実施例４．ウシゲノムで特定されたＤＮＡマーカーの他動物種への適用
表５にウシ５番染色体の位置１１５１１６３５７〜１２００００８４４の核酸領域に含まれる８個の遺伝子を示し、ヒト、マウス、ラットの同一遺伝子のゲノム上の配列を確認し、該当の領域が種を超えて保存されているか確認を行った。ウシゲノムアセンブリＡＲＳ−ＵＣＤ１．２における５番染色体の位置１１６５１３９８４〜１１９７５２４６８に存在する８遺伝子は、ヒトゲノムアセンブリＧＲＣｈ３８．ｐ１２の２２番染色体の位置４６２４４０１３〜５０４４５０９０に、マウスゲノムアセンブリＧＲＣｍ３８．ｐ６の１５番染色体の位置８５８０６９７２〜８９２８７０１５に、ラットゲノムアセンブリＲｎｏｒ＿６．０の７番染色体の位置１２６６８７４０４〜１３０２６０２０９にすべて同じ順に３〜４百万程度の塩基配列中に保存されていた。このことから、本発明のＤＮＡマーカーはウシで特定されたものであるが、塩基配列の相同性は動物種を超えて高く、遺伝子が存在する領域や遺伝子の間の領域等も含めて、本発明のＤＮＡマーカーは動物種を超えて受胎性の判定指標となり得ることが示された。
【００７１】
【表５】
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【００７２】
実施例５．ＰＣＲを用いたＤＮＡサンガーシーケンスによるゲノムＤＮＡ変異の決定
各種雄牛の精子から抽出したＤＮＡを用いてＱＩＡＧＥＮ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｋｉｔを用いてＰＣＲを行った。配列番号５７及び５８のプライマーセットは配列番号１２の１０１位で示すウシ５番染色体の位置１１６４０８６５８を含む２５９塩基を増幅し、配列番号５９及び６０のプライマーセットは配列番号２０の１００＿１０１位及び配列番号２１の１０１位で示すウシ５番染色体の位置１１６７９１２９８及び１１６７９１３２８を含む４４０塩基を増幅するように設定した。ＰＣＲ産物は、ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ試薬を用いて精製し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔのプロトコルに従ってシーケンス反応を行い、ＤＮＡアナライザ３７３０を用いたキャピラリー電気泳動によりＤＮＡ配列を決定した。
【００７３】
図５にＤＮＡサンガーシーケンスで特定した配列番号１２の１０１位における種雄牛のＳＮＰ型と初回受胎率との関係を示す。リファレンスウシゲノムＡＲＳ−ＵＣＤ１．２は「Ｇ」であるが、本解析により、このＳＮＰ型がＡＡ型、ＡＧ型、ＧＧ型に分かれ、受胎率の平均±標準偏差はＡＡ型が９．６±６．１％（ｎ＝１０、２．３〜２０．６％）、ＡＧ型が５５．３±１０．４％（ｎ＝３８、３０．０〜７２．５％）、ＧＧ型が５２．２±１３．３％（ｎ＝５２、１９．５〜７７．１％）となり、有意にＡＡ型の受胎率が低かった（Ｔｕｋｅｙの方法、異なる符号はｐ＜０．０１を示す）。雌牛への授精頭数が２０頭以上の種雄牛９１９頭の平均受胎率±標準偏差は５５．８％±１１．３％であった。従って、大まかに平均値の±１σの範囲である４４．５〜６７．１％に種雄牛全体の６８％が、平均値±２σの範囲である３３．２〜７８．４％に種雄牛全体の９５％が含まれる。また、非特許文献１から、２０１６年では初回授精の受胎率が乳用種で４０．４％、肉用種で５２．０％であることも鑑みると、変異ホモ接合型であるＡＡ型であった２．３〜２０．６％の受胎率の種雄牛は、すべて例外なく顕著に低受胎の種雄牛と判定された。また、ヘテロ接合型であるＡＧ型であれば、雌との交配組合せによっては子が低受胎種雄牛となる可能性が予想され、注意が必要と判定された。また、正常ホモ接合型であるＧＧ型であれば、選抜可能と判定された。また、配列番号１２で特定されたウシ５番染色体の位置１１６４０８６５３のＳＮＰは、マイクロＲＮＡであるＭＩＲ２４４３（ウシ５番染色体の位置１１６４０８６６５〜１１６４０８７３７）の僅か１２塩基の上流に位置すると推定され、そのＭＩＲ２４４３の発現を介して受胎性に何らの影響を与える可能性があった。
【００７４】
表６に上記で示したウシ５番染色体の位置１１６４０８６５３（配列番号１２）がＡＡ型である各種雄牛について、ウシ５番染色体の位置１１６７９１２９８（配列番号２０）及び位置１１６７９１３２８（配列番号２１）の遺伝子型を示した。ここで低受胎種雄牛のＤＮＡマーカーであるウシ５番染色体の位置１１６４０８６５３がＡＡ型であれば、その他の位置１１６７９１２９８は必ずＡＡ＋ＣＣ型、位置１１６７９１３２８は必ずＡＡ型であった。すなわち、１１６４０８６５３単独のみならず、複数のＤＮＡマーカーの遺伝子型の組合せを確認すれば、より信頼性が高く低受胎種雄牛を検出できた。
【００７５】
【表６】
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【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明の受胎性を判定できるＤＮＡマーカーを用いて検査を行い、変異ホモ接合型が判明した場合は個体を事前に淘汰できるため、これまで低受胎が判明するまでに要していた飼養管理費や人工授精費等のコストを大幅削減できる。また、両親の型を調べることにより、雄が産まれた場合の将来リスクを予測でき、交配させる雌雄を選択することができる。また、雌雄双方をランダムに調べることにより、遺伝子型頻度を調べることができ、どの程度集団に広まっているか推定でき、今後の繁殖性を加味した雄個体の作出、育種改良集団の形成ができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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