(57)【要約】      （修正有）【課題】ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長させた感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの提供。【解決手段】生殖母細胞期からスポロゾイト期までのスポロゴニーが蚊に対して外側にある、ヒト宿主域のｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトと、これを産生する方法を対象とする。生殖母細胞期からスポロゾイト期までのスポロゴニーが蚊に対して外側にある、ヒト宿主域のｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育された感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト（ＳＰＺ）、特に、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｏｖａｌｅ、Ｐ．ｍａｌａｒｌａｅおよびＰ．ｋｎｏｗｌｅｓｉと、これを産生する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１４年５月２日に出願された米国仮出願第６１／９８７，８３４号お
よび２０１４年６月２５日に出願された米国仮出願第６２／０１６，９８１号（各々の内
容は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、一般に、寄生虫学、マラリア研究およびマラリアワクチン開発の分野に関す
る。より具体的には、本発明は、ヒト宿主域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトと、ヒ
ト宿主域の感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物の蚊体内発育期（ｍｏｓｑｕｉｔｏ  ｓ
ｔａｇｅ）、特に、スポロゾイト期までのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養と、ワクチンおよび他の
試薬の免疫原性成分としてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾ
イトの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
毎年、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（Ｐｆ）マラリアは、＞２億件の
臨床症例、６００，０００名を超える死亡を引き起こし、アフリカにおける１２Ｂドルを
超える国内総生産の損失の原因となる［１〜３］。マラリアは、旅行者および軍事要員に
対する深刻な懸念でもある。２０１０〜２０１１年の間に、英国からの旅行者におけるマ
ラリアの症例数は、３０％増加した［４］。２０１１年に、米国は、過去４０年間におけ
るどの年よりも多くのマラリア症例を有した［５、６］。過去１５０年間の高度マラリア
流行地域におけるあらゆる米国軍事行動において、米軍は、敵の砲火よりも多くのマラリ
アによる死傷者を有した［７］。高度に有効なワクチンは、国際保健市場におけるおよそ
２５億人の「リスクがある」個体に劇的な影響を有するであろう。
【０００４】
国際社会は現在、殺虫剤を浸透させた蚊帳、殺虫剤および抗マラリア薬の使用によりマ
ラリアを管理するために、毎年およそ２０億ドルを費やしている。これは、アフリカに生
まれる子供毎に年間およそ８０ドルに達し、一部の区域では、この量の５〜１０倍が費や
されている。これらのアプローチは、多くの地域で優れた効果を有している。しかし、薬
物および殺虫剤抵抗性は依然として発生しており、このような努力を維持する財政支援者
および地方自治体の能力は限られている。高度伝染地域からのマラリアの排除が、新たな
ツールを必要とすることが明らかである。２０１０年の論説に記載されている通り、高度
に有効なワクチンは、世界中でマラリアの予防、管理および排除のための理想的なツール
となるであろう：
「いずれかの感染性疾患を真に克服したことがある唯一のツール：有効で…手頃なワク
チンが、依然として必要とされている…そこで、世界的なマラリア共同体は、あまりにも
現状に甘んじていた…ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅの…ＲＴＳ，Ｓプラスアジュバン
トＡＳ０１は、中程度かつ期限付きの有効性を有する第一世代の前赤内期（ｐｒｅ−ｅｒ
ｙｔｈｒｏｃｙｔｅ−ｓｔａｇｅ）ワクチンである…我々は、次世代…ワクチンをさらに
２０年間待つ余裕がない…。」
−  匿名、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ、２０１０年４月２４日
【０００５】
また、２０１１年のｍａｌＥＲＡ発議報告に記載されている通り、理想的なワクチンは
、寄生生物が肝臓から血流へと出ることを予防し、これにより疾患および伝播を予防する
前赤内期ワクチンとなるであろう［８］。これは、「マラリア伝播を中断するワクチン」
（「ＶＩＭＴ」）と命名された。
【０００６】
Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅは、組換えタンパク質（Ｂ型肝炎表面抗原とＰｆ
スポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）の一部とを融合）と強力なアジュバント（ＡＳ０
１）を使用する、ＲＴＳ，Ｓ／ＡＳ０１と命名されたワクチン候補を開発した。５〜２７
月齢のヒトにおける近年の第３相治験［９〜１２］は、１年間のマラリアの発生率の３６
％低下と、最初の１年間にマラリアに感染した比率の５６％低下と、最初の１年間の重篤
マラリアの４７％低下を実証した。残念ながら、乳児における結果はそれほど強くなかっ
た。６〜１２週齢のヒトにおいて、ワクチンは、１年間のマラリアの発生率の１６％低下
と、最初の１年間にマラリアに感染した比率の３１％低下と、最初の１年間の重篤マラリ
アの３６％低下（処置する意図による２６％）を実証した。これらの結果は、期待外れと
呼ばれ、このワクチンを高度に有効またはＶＩＭＴとは認定しないであろう。
【０００７】
ここ１０年間、高度に有効なＶＩＭＴマラリアワクチンの開発の焦点は、一部には、ワ
クチン免疫原としてのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍの寄生生物全体、スポロゾイト（ＳＰＺ）期
の利用へとシフトした。国立アレルギー感染病研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔ
ｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）（Ｎ
ＩＡＩＤ）のワクチン研究センター（Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ
）（ＶＲＣ）で近年完了した試験において、放射線弱毒化されたＰｆ  ＳＰＺで構成され
たＳａｎａｒｉａ（登録商標）ＰｆＳＰＺワクチンを静脈内（ＩＶ）注射により投与した
ところ、最高用量を与えた６名のボランティアのうち６名（１００％）を保護した。保護
有効性（次に高い総用量で６／９名を保護）に関して用量応答があり、Ｐｆ  ＳＰＺに対
する抗体の力価および保護の間に有意な相関があった。したがってＳａｎａｒｉａ（登録
商標）ＰｆＳＰＺワクチンは、ヒトにおいて証明できるほどに強力かつ高度に保護性であ
る。これらの歴史的な結果は、２０１３年８月にＳｃｉｅｎｃｅにオンラインで、２０１
３年９月に印刷物で発表された［１３］。
【０００８】
ＳＰＺは、クロロキン等の無性赤血球期抗マラリア薬の存在下で生きた感染性Ｐｌａｓ
ｍｏｄｉｕｍ  ＳＰＺが投与される、Ｓａｎａｒｉａ（登録商標）ＰｆＳＰＺ−ＣＶａｃ
と呼ばれるワクチン接種のための感染および処置アプローチの寄生生物成分としても使用
されている［１４］。
【０００９】
最後に、生きた感染性Ｐｆ  ＳＰＺは、マラリアワクチンおよび他の治療法を検査する
ための手段として、管理されたヒトマラリア感染（ＣＨＭＩ）のために使用されている［
１５、１６］。
【００１０】
蚊から抽出された唾液腺から調製されたおよび培養で成長した、実質的に精製されたＰ
ｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，
０４３，６２５号に記載されている。
現在、上述のワクチンおよび試薬に使用される寄生生物Ｐｆ  ＳＰＺ全体は、無菌的Ａ
ｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊を飼育し、これに無菌的Ｐｆ生殖母細胞を感染させ、Ｐｆ寄生生物を
、蚊の中でｉｎ  ｖｉｖｏでスポロゴニーを経てスポロゾイト期へと進行させ、続いて蚊
から唾液腺を手作業で解剖し、無菌的スポロゾイトを単離および精製することにより得ら
れた（米国特許第７，２２９，６２７号；米国特許第８，３６７，８１０号）［１７］。
この製造アプローチは、これらの産物の全臨床治験における使用のために十分な量の生き
た無菌的精製Ｐｆ  ＳＰＺを産生することができるが、この方法論は、労働集約的であり
、昆虫飼育管理および寄生生物解剖のために相当な資源を必要とする。特に、蚊の唾液腺
からの解剖は、ヒト宿主域のＰｆ  ＳＰＺおよび他のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種ＳＰＺの産
生における技術的で時間のかかるステップである。
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物発達の蚊宿主期を図１に示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰｌ
ａｓｍｏｄｉｕｍ生活環の無性部分（脊椎動物宿主期）を樹立するための努力は成功した
が［１８］、有性（蚊宿主期）およびスポロゴニー部分でこれを達成するための相当な努
力が為されたものの、ヒト宿主域の臨床的に関連した感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロ
ゾイト、特に、Ｐｆ  ＳＰＺを産生するためのこのような努力は不成功であった。Ｐ．ｇ
ａｌｌｉｎａｃｅｕｍ（鳥類宿主域）およびＰｆオーキネートのｉｎ  ｖｉｔｒｏ変態は
、少数のオーシストおよびＳＰＺをもたらしたが、これらのスポロゾイトの感染性は実証
されなかった［１９〜２０］。Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ（齧歯類宿主域）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ
変態は、オーシストおよびＳＰＺを産生したが、ＳＰＺは、蚊由来のＳＰＺよりもはるか
に低い感染性であった［２１］。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第７，２２９，６２７号明細書
【特許文献２】米国特許第８，３６７，８１０号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｓａｃｈｓ  Ｊら、Ｎａｔｕｒｅ（２００２）４１５：６８０〜６８５
【非特許文献２】Ｍｕｒｒａｙ  ＣＪら、Ｌａｎｃｅｔ（２０１２）３７９：４１３〜４３１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
生殖母細胞期からスポロゾイト期までのスポロゴニーが蚊に対して外側にある、ヒト宿
主域のｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育された感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト（ＳＰＺ）
、特に、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（Ｐｆ）ＳＰＺが本明細書で提供
される。一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育された感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ
スポロゾイトは、いかなる付随する蚊材料もない。
【００１４】
ヒト宿主域のｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物、特に、Ｐｆ
寄生生物であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでスポロゴニー発達を起こした前記寄生生物の培養
物がさらに提供される。一部の実施形態では、培養物は、いかなる付随する蚊材料もない
。
【００１５】
ヒト宿主域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトを前記スポロゾイトのスポロゴニー発
達の間にｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する方法であって、赤血球細胞の存在下で、鞭毛放出培
養培地においてヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生殖母細胞を培養するステップと、レク
チンを使用して赤血球細胞を凝集させるステップと、接合子、配偶子、生殖母細胞および
凝集細胞を含む混合物（例えば、ペレット）を収集するステップと、収集された混合物（
例えば、ペレット）を、マトリックスを含む担体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）上でオーキネー
ト培養培地において培養するステップと、培地を交換し、オーシスト培地において培養を
続けるステップと、これにより産生されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトを回収する
ステップとを含む方法がさらに提供される。
【００１６】
蚊における等しい数のヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生殖母細胞からのオーシスト産
生と比べて、ヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍオーシストの産生を増加させるための方法
であって、鞭毛放出培養培地においてヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生殖母細胞を培養
するステップと、接合子、配偶子、生殖母細胞および凝集細胞を含む混合物（例えば、ペ
レット）を収集するステップと、収集された混合物（例えば、ペレット）を、マトリック
スを含む担体上でオーキネート培養培地において培養するステップと、培地を交換し、オ
ーシスト培地において培養を続けるステップと、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍオーシストの数を
定量化するステップとを含み、等しい数のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ生殖母細胞から蚊におい
て発達した同じ種のオーシストと比較して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで発達したより多くのオー
シストを産生する前記方法も提供される。
【００１７】
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種特異的抗原に対する被験体における免疫応答を誘導する方法で
あって、ヒト宿主域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ飼育されたスポロゾイトを被験体に投与する
ステップを含む方法も提供される。
【００１８】
ヒト宿主域のｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトを含むワ
クチン組成物も提供される。一部の実施形態では、ワクチンは、いかなる付随する蚊材料
もない。
【００１９】
本明細書に開示されている本発明は、例えば、次の新機軸を提供する：ｉ）蚊において
発達し、かつ等しい数のステージＶ生殖母細胞に由来する同じＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の
オーシストと比較して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで発達した平均３９倍多いオーシストの達成；
ｉｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育された感染性Ｐｆ  ＳＰＺの産生；およびｉｉｉ）蚊で産生
されたＰｆ  ＳＰＺと少なくとも同じほど効率的な、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生されたＰｆ  
ＳＰＺによるヒト肝臓細胞の感染性の到達。
【００２０】
本研究は、所定の数の生殖母細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生されたＰｆ  ＳＰＺの量
と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生されたＰｆ  ＳＰＺの完全に機能的な感染活性の実証とにおい
て固有であるように際立つ。例えば、本明細書において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生されたＰ
ｆ  ＳＰＺが、ヒト肝細胞細胞株ＨＣ−０４への侵入［２４、２５］および感染性を実証
するタンパク質であるメロゾイト表面タンパク質１（Ｐｆ  ＭＳＰ１）を発現するシゾン
トへの発達に成功したことが記載されており；このｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染性が、蚊で産生
されたＰｆ  ＳＰＺと少なくとも同じほど効率的であったことが実証された。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
生殖母細胞期からスポロゾイト期までのスポロゴニーが蚊に対して外側にある、ヒト宿
主域のｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育された感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト。
（項目２）
いかなる付随する蚊材料もない、項目１に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育された感染性Ｐ
ｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト。
（項目３）
蚊において飼育されたヒト宿主域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの少なくとも７
０％、８０％または９０％のヒト肝細胞感染性である、項目１または２に記載のｉｎ  ｖ
ｉｔｒｏ飼育された感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト。
（項目４）
無菌的である、項目１〜３のいずれかに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍ
ｏｄｉｕｍスポロゾイト。
（項目５）
薬学的使用に適する、項目４に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕ
ｍスポロゾイト。
（項目６）
前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの種が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである、項
目１〜５のいずれかに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾ
イト。
（項目７）
ヒト宿主域のｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物の培養物であ
って、前記寄生生物が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでスポロゴニー発達を起こした培養物。
（項目８）
前記寄生生物が、発達のスポロゾイト期に達した、項目７に記載の培養物。
（項目９）
前記スポロゾイト期寄生生物が、蚊において飼育された同じ種のヒト宿主域Ｐｌａｓｍ
ｏｄｉｕｍスポロゾイトの少なくとも７０％、８０％または９０％のヒト肝細胞感染性で
ある、項目８に記載の培養物。
（項目１０）
無菌的である、項目７〜９のいずれかに記載の培養物。
（項目１１）
前記スポロゾイト期寄生生物が、薬学的使用に適する、項目１０に記載の培養物。
（項目１２）
ヒト宿主域の前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍの種が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである、項
目７〜１１のいずれかに記載の培養物。
（項目１３）
等しい数のステージＶ生殖母細胞から蚊において発達した同じＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種
のオーシストと比較して、少なくとも１０〜２０、１０〜３０、１０〜３９または１０〜
４０倍多いオーシストが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで発達する、項目７〜１２のいずれかに記載
の培養物。
（項目１４）
ヒト宿主域の感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの培養物であって、いかなる付
随する蚊材料もない培養物。
（項目１５）
前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトが、蚊において飼育された同じ種のヒト宿主域
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの少なくとも７０％、８０％または９０％のヒト肝細
胞感染性である、項目１４に記載の培養物。
（項目１６）
前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトが、無菌的である、項目１４または１５に記載
の培養物。
（項目１７）
前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトが、薬学的使用に適する、項目１６に記載の培
養物。
（項目１８）
前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの種が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである、項
目１４〜１７のいずれかに記載の培養物。
（項目１９）
ヒト宿主域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトを前記スポロゾイトのスポロゴニー発
達の間にｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する方法であって、
ａ．赤血球細胞の存在下で、鞭毛放出培養培地においてヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕ
ｍ生殖母細胞を培養するステップと、
ｂ．レクチンにより前記赤血球細胞を凝集させるステップと、
ｃ．接合子、配偶子、生殖母細胞および凝集した赤血球細胞を含む混合物を収集するス
テップと、
ｄ．マトリックスを含む担体上で、オーキネート培養培地において前記混合物を培養す
るステップであって、オーキネート期寄生生物が、前記マトリックスに浸透するステップ
と、
ｅ．前記オーキネート培地をオーシスト培地に交換するステップと、
ｆ．これにより産生されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト期寄生生物を回収するス
テップと
を含む、方法。
（項目２０）
前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの種が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである、項
目１９に記載の方法。
（項目２１）
蚊における同じ種の等しい数のヒトＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ生殖母細胞からのオーシスト
産生と比べて、ヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍオーシストの産生を増加させるための方
法であって、
ａ．赤血球細胞の存在下で、鞭毛放出培養培地においてヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕ
ｍ生殖母細胞を培養するステップと、
ｂ．レクチンにより前記赤血球細胞を凝集させるステップと、
ｃ．接合子、配偶子、生殖母細胞および凝集した赤血球細胞を含む混合物を収集するス
テップと、
ｄ．マトリックスを含む担体上で、オーキネート培地においてステップｃの前記混合物
を培養するステップであって、前記寄生生物が、オーキネートへと分化し、前記オーキネ
ートが、前記マトリックスに進入し、オーシスト期へと分化するステップと、
ｅ．前記オーキネート培地をオーシスト培養培地と置き換えるステップと、
ｆ．ヒト宿主域のオーシスト期Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物を定量化するステップと
を含み、
ｇ．等しい数のヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生殖母細胞から、蚊において発達した
同じ種のオーシストと比較して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで発達したヒト宿主域のより多くのＰ
ｌａｓｍｏｄｉｕｍオーシストを産生する、方法。
（項目２２）
前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍオーシストの種が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである、項目
２１に記載の方法。
（項目２３）
項目１〜６のいずれかに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポ
ロゾイトを含むワクチン組成物。
（項目２４）
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ特異的抗原に対する被験体における免疫応答を誘導する方法であ
って、項目１〜６のいずれかに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ
スポロゾイトまたは項目２３に記載のワクチンを前記被験体に投与するステップを含む、
方法。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、蚊におけるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのスポロゴニー発達を図解する。
【００２２】
【図２】図２Ａ〜図２Ｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの接合子後期発達の試料画像を提示する。（Ａ）は、初期レトルト（ｒｅｔｏｒｔ）、中期レトルトおよび後期レトルト（左から右）を示し、（Ｂ）は、成熟オーキネートを示す。寄生生物は、誘導１８日後の生殖母細胞培養物から採取した。初期レトルトが先ずオーキネート培養開始後約１４時間で、オーキネートが２４時間目から観察される。培養物のギムザ染色されたスメアを示した。
【００２３】
【図３】図３Ａ〜図３Ｂは、グリコホリンＡおよびＰｆｓ２５に対する抗体を使用した、（Ａ）生殖母細胞および（Ｂ）オーキネートの免疫染色を示す。グリコホリンＡ（白矢印は赤色染色を指す）およびＰｆｓ２５（黒矢印は緑色染色を指す）に対する抗体。
【００２４】
【図４】図４は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで発達するＰｆオーシストのＩＦＡおよび明視野像を示す。抗Ｐｆｓ２５および抗ＰｆＣＳＰ  ｍＡｂを使用したＩＦＡによって検出される３日目（上パネル）および８日目（下パネル）のオーシストを示す。８日間培養物をＩＦＡのために透過処理した。８日目のオーシストにおける点状染色は、出芽Ｐｆ  ＳＰＺを示唆する。中央パネルは、培養において発達する７〜８日目のオーシストを示す。矢印は、オーシストを示す。
【００２５】
【図５】図５Ａ〜図５Ｂは、（Ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび（Ｂ）マーキュロクロム染色された蚊中腸における７日目のオーシストを示す。
【００２６】
【図６】図６Ａ〜図６Ｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生されたＰｆ  ＳＰＺを示す：（Ａ）ウェルの固定後に検出された、培養ウェルにおいて発達したＰｆ  ＳＰＺおよび（Ｂ）抽出されたＰｆ  ＳＰＺ。両者共に、蛍光標識された抗Ｐｆ  ＣＳＰ  ｍＡｂを使用したＩＦＡによって検出された。
【００２７】
【図７】図７は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ３Ｄ培養系の例を図解する。
【００２８】
【図８】図８Ａ〜図８Ｃは、遠心分離によって抽出された、トランズウェルインサート（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｉｎｓｅｒｔ）改変３Ｄマトリックス由来のオーシストの試料画像を示す：（ＡおよびＢ）定量化に使用されるセロメーター（ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ）におけるオーシストの位相差像および（Ｃ）蛍光標識された抗Ｐｆ  ＣＳＰ  ｍＡｂを使用した、懸濁液（透過処理なし）における抽出されたオーシストのＩＦＡ。
【００２９】
【図９】図９Ａ〜図９Ｂは、ＨＣ−０４細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生されたおよび蚊で産生されたＰｆ  ＳＰＺの発達を示す。（Ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生されたＰｆ  ＳＰＺ（上部パネル）または（Ｂ）蚊で産生された、無菌的、精製、凍結保存されたＰｆ  ＳＰＺ（下部パネル）感染後の、ＨＣ−０４細胞における６日肝臓期（６  ｄａｙ  ｌｉｖｅｒ  ｓｔａｇｅ）の共焦点顕微鏡像。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
定義
本明細書において、寄生生物発達に関する「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」とは、インタクトな宿
主生物（宿主生物全体とも称される）に依存せず、かつそれに対して外側を意味する。例
えば、ヒト宿主域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発達は、生きた動
物宿主、例えば、蚊に対して外側かつそれに依存しない発達ステージを経て進む寄生生物
の培養を含む。
【００３１】
本明細書において、「飼育する」または「飼育された」は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ成長
および発達の整然とした個体発生的進行の促進および支持を意味する。
【００３２】
本明細書において、「スポロゴニー」（またはスポロゴニー発達）は、生殖母細胞から
スポロゾイトへの特徴的な有性期を経た、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ発達の整然とした個体発
生的進行を意味する。
【００３３】
本明細書において、「ヒト宿主域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種」（ヒト宿主域Ｐｌａｓｍ
ｏｄｉｕｍ種、ヒト宿主域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物およびヒト宿主域Ｐｌａｓｍ
ｏｄｉｕｍ寄生生物と互換的に使用）は、次の種のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍを含む：Ｐ．ｆ
ａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｏｖａｌｅ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅおよびＰ
．ｋｎｏｗｌｅｓｉ。
【００３４】
本明細書において、「培養」は、ヒト宿主域のｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍ
ｏｄｉｕｍ寄生生物の文脈において、培地およびヒト宿主域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生
生物を含む、生きた動物宿主（例えば、蚊）に対して外側の系を意味する。ある特定の実
施形態では、培養は、担体をさらに含む。
【００３５】
「担体」は、本明細書において、成長表面を意味する。一部の実施形態では、担体は、
例えば、ポリスチレンマトリックスおよび／またはマトリゲルを含む細胞培養マトリック
スを含む［２７、２８］。
【００３６】
「培地」は、本明細書において、栄養素組成物を意味する。ある特定の実施形態では、
培地は、例えば、血液摂取後の蚊の管腔条件を模倣することにより、生殖母細胞からの配
偶子の出現を容易にする鞭毛放出培地であり、これは続いて、受精を起こして接合子とな
る。ある特定の実施形態では、培地は、接合子からオーキネートへの分化を容易にするオ
ーキネート培地である。ある特定の実施形態では、培地は、スポロゾイト期へのｉｎ  ｖ
ｉｔｒｏスポロゴニーのための栄養素を提供するオーシスト培地である。
【００３７】
「ヒトの薬学的使用に適した」は、本明細書において、例えば、ＦＤＡまたはＵＳＰ標
準に従って許容できる、ヒトにおける認可された臨床使用に十分な量、滅菌性（無菌性）
および純度を有することを指す。
【００３８】
「無菌的」は、本明細書において、細菌、真菌、病理学的ウイルスその他等、検出可能
な微生物汚染の導入または存在がないことを意味する。スポロゾイト調製の無菌的方法は
、スポロゾイトの滅菌調製をもたらす−いかなる他の種類の微生物または感染病原体も含
まない。滅菌組成物の無菌的調製は、臨床および薬学的使用に必要とされる。無菌的方法
論のモニターに使用される微生物学的アッセイは、汚染の存在または非存在を評価する。
そのようなものとして、参照により本明細書に組み込まれる、微生物限度試験、現行のＵ
ＳＰ＜６１＞および滅菌性検査、現行のＵＳＰ＜７１＞が挙げられるがこれらに限定され
ない。
【００３９】
「付随する材料」は、本明細書において、培地もしくは培地成分またはキャリアもしく
は賦形剤ではない、それ自体スポロゾイトに特異的ではない、スポロゾイトの培養物また
は調製物における材料を指す。ある特定の実施形態では、付随する材料は、例えば、生物
学的残渣を含む。一部の実施形態では、付随する材料は、スポロゾイトが産生される手段
の結果である。
【００４０】
「付随する蚊材料」は、本明細書において、蚊に由来し、これに特異的な、生物学的材
料または残渣である。
【００４１】
「防御免疫を付与する」は、本明細書において、攻撃後に、宿主における疾患の臨床的
症状発現、病理学または症状が、無処置宿主と比較して低下されるような、あるいは感染
または疾患の臨床的症状発現、病理学もしくは症状が集団内に現れる比率が、無処置集団
と比較して低下されるような、集団または宿主（すなわち、個体）に、病原体（例えば、
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に起因する疾患（例えば、マラリア）に
対し防御的な免疫応答を生じる能力を与えることを指す。
【００４２】
本明細書における「免疫応答」は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ特異的抗原の文脈において、
抗体および／または細胞性免疫応答の産生によって一般に特徴付けられるがこれらに限定
されない、レシピエントにおけるスポロゾイトの導入に対する応答を意味する。一般に、
免疫応答は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種エピトープに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞もしくはＣＤ
８＋Ｔ細胞の誘導または活性化等の細胞性応答、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ特異的抗体の産生
増加の液性応答、または細胞性および液性応答の両方となり得る。マラリアワクチンに関
して、スポロゾイトを含むワクチンによって確立される免疫応答として、寄生生物が宿主
細胞、特に、肝細胞および樹状細胞等の単核細胞に進入した後の、細胞外スポロゾイトも
しくは他のステージの寄生生物によって発現されるタンパク質に対するおよび／または前
記寄生生物の成分に対する応答が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の実施形態
では、免疫応答は、スポロゾイト特異的抗原に対する測定可能な抗体および／または細胞
性応答である。他の実施形態では、感染性生物によるその後の攻撃後に、免疫応答は、疾
患を引き起こす赤血球期への病原性寄生生物の発達を予防する。
【００４３】
「ワクチン」は、本明細書において、賦形剤、アジュバントおよび／または添加物また
は保護剤と組み合わせる可能性がある、免疫原性作用物質および薬学的に許容される希釈
剤を含む調製物である。免疫原は、感染病原体全体または感染病原体の分子サブセット（
感染病原体によって、合成によりまたは組換えにより産生）で構成されていてよい。ワク
チンが被験体に投与されると、免疫原は、免疫応答を刺激し、これは、感染病原体による
その後の攻撃後に、疾病から被験体を保護する、または該病原体によって引き起こされる
病理学、症状もしくは臨床的症状発現を軽減する。治療（処置）ワクチンは、感染後に与
えられ、疾患進行の低下または抑止が企図される。予防（予防法的）ワクチンは、初期感
染の予防または感染の比率もしくは負荷の低下が企図される。マラリア等の寄生虫病に対
するワクチンにおいて使用される因子は、死滅した（不活性）寄生生物全体、生きた寄生
生物、生きた弱毒化された寄生生物（その生活環を十分に進行することができない）また
は寄生生物に関連する精製もしくは人工的に製造された分子−例えば、組換えタンパク質
、合成ペプチド、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍタンパク質を発現するＤＮＡプラスミドおよび組
換えウイルスまたは細菌となり得る。ワクチンは、当業者であれば容易に理解できる通り
、賦形剤、希釈剤、キャリア、保存料、アジュバントもしくは他の免疫強化薬またはこれ
らの組合せ等、他の成分と共にスポロゾイトを含むことができる。
【００４４】
「弱毒化」は、本明細書において、その正常な生活環を完了する能力を失うような、む
しろ、発達の特定のステージで停止するような、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物等、生物
の遺伝子変更または突然変異を意味する。本発明のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物において、
弱毒化された突然変異体が、宿主に感染し、肝臓内の肝細胞に侵入する能力を保持するが
、肝臓期において発達を停止するように、放射線弱毒化または遺伝的に弱毒化された寄生
生物（ＧＡＰ）の１種または複数の遺伝子の機能が破壊される。
【００４５】
「肝細胞侵入」は、本明細書において、宿主の循環器系への初期導入後に、特定の標的
細胞、この場合は、培養における肝細胞［２４、２５］またはｉｎ  ｖｉｖｏの肝性細胞
のいずれかの宿主肝細胞を探し出し、これに進入する、スポロゾイト期のＰｌａｓｍｏｄ
ｉｕｍ寄生生物の能力を指す。続いて、非弱毒化寄生生物は、さらなるステージ特異的発
達を起こすであろう。
【００４６】
「代謝的に活性」は、本明細書において、生きており、維持的機能およびいくつかの生
活環過程を行うことができることを意味する。弱毒化スポロゾイトに関して、このような
ものとして、肝臓内でいくつかの発達ステージを経て分裂および進行する限定的な能力を
潜在的に有する、培養およびｉｎ  ｖｉｖｏの肝細胞に侵入することができ、そしてステ
ージ特異的タンパク質のｄｅ  ｎｏｖｏ発現ができるスポロゾイトが挙げられるがこれら
に限定されない。
【００４７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏスポロゾイト
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育された生きた感染性スポロゾイト、特に、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ
スポロゾイト−弱毒化されたスポロゾイトおよび病原性スポロゾイトの組成物が開示され
ている。ある特定の実施形態では、本願は、生殖母細胞期からスポロゾイト期までのスポ
ロゴニーが蚊に対して外側にある、ヒト宿主域のｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍ
ｏｄｉｕｍスポロゾイトの培養物を対象とする。一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ
飼育された感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、いかなる付随する蚊材料もない
。ある特定の実施形態では、生殖母細胞期からスポロゾイト期までのスポロゴニーは、蚊
に対して外側で発生した。
【００４８】
一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト
は、ヒト肝細胞に対して、蚊において飼育されたヒト宿主域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポ
ロゾイトの少なくとも７０％、８０％または９０％の感染性である。一部の実施形態では
、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、ヒト肝細胞に対し
て、蚊において飼育されたヒト宿主域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの７０〜１０
０％、８０〜１００％または９０〜１００％の間の感染性である。一部の実施形態では、
感染性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで測定される。
【００４９】
一部の実施形態では、感染性は、ＨＣ−０４（１Ｆ９）細胞（ヒト肝性細胞株）に感染
し［２４、２５］、ＰｆＭＳＰ−１を発現する後期肝臓期寄生生物へと発達する［１５］
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｐｆ  ＳＰＺの能力の決定に使用される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｐｆ  
６日間肝細胞効力アッセイを使用して測定される。斯かる方法の例として、次のものを挙
げることができる：
ａ．ＥＣＬコーティングされたＬａｂ−Ｔｅｋスライドの細胞培養および播種。８ウェ
ルＰｅｒｍａｎｏｘ  Ｌａｂ−Ｔｅｋチャンバースライドを、ＥＣＬ細胞付着マトリック
スで１〜２時間、３７±２℃でコーティングする。ＨＣ−０４（１Ｆ９）細胞を完全ＤＭ
ＥＭ／Ｆ−１２培地（ＣＭ）で希釈して、ウェル当たり０．３ｍＬにおける４×１０４の
生存可能な細胞で播種する。洗浄し、２４±４時間、３７±２ｂ℃および５±２％ＣＯ２
でインキュベートする；
ｂ．感染およびウェル当たりの添加したＳＰＺの数の計算：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生され
たＰｆスポロゾイトを２分間、１３，２００ｒｐｍ（相対遠心力１６，１００）、２２±
２℃で、固定角ローターを使用して遠心分離する。上清を廃棄し、ペレットをＣＭに再懸
濁する。Ｌａｂ  Ｔｅｋスライドの各ウェルから培地を吸引し廃棄する。５０μＬのｉｎ
ｖｉｔｒｏ  ＳＰＺ懸濁液／ウェルを３連で添加する。感染スポロゾイト懸濁液をＣＭ
において１：１０希釈し、セロメーターおよび位相差顕微鏡を使用して、スポロゾイトの
数を計数し、ウェル当たりの添加したＳＰＺの数を計算する。チャンバースライドを３７
±２℃および５±２％ＣＯ２で３時間±１０分間インキュベートする。対照ウェルをＰｆ
ＳＰＺで汚染しないように慎重に、１０００μＬピペットチップを使用して、各ウェル
からスポロゾイトを含有する過剰な培養培地を穏やかに吸引することにより、単層を０．
３ｍＬ  ＤＭＥＭ／Ｆ−１２完全培地で３回洗浄する。最終洗浄後に、各ウェルに０．３
ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ−１２完全培地を添加する；
ｃ．培養物の維持：培養培地を毎日交換して、肝臓期の成功裏の発達および培養物の維
持を確実にする。感染６日後にチャンバースライド培養物を氷冷メタノールで固定する。
４±２℃で貯蔵する；
ｄ．間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）のための染色：スライドからＰＢＳを廃棄し、続
いて各ウェルに２〜３滴のイメージｉＴ−ＦＸシグナルエンハンサーを添加し、３７±２
℃で３０±３分間インキュベートする。イメージエンハンサー溶液を廃棄し、培養物をＰ
ＢＳで３回洗浄する。１００μＬの希釈された抗ＰｆＭＳＰ−１モノクローナルマウス抗
体を３連のウェルに添加し、３７±２℃で６０〜７０分間インキュベートする。インキュ
ベーション期間の終わりに、抗体溶液を廃棄し、ＰＢＳで洗浄する。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕ
ｏｒ  ４８８抗マウスＩｇＧを、０．０２％エバンスブルー入りのＰＢＳにおいて１：２
００希釈する。１００μＬの希釈されたＡｌｅｘａ  ４８８抗マウスＩｇＧを３連のウェ
ルに添加する。スライドを３７±２℃で６０〜７０分間インキュベートする。ＤＡＰＩ入
りのＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄマウント用媒体を使用して、カバーガラスをマウントし、観
察時まで光を避けて２〜８℃で貯蔵する；および
ｅ．Ｐｆ肝臓期の評価および数え上げ：４００×倍率の落射蛍光顕微鏡を使用して、抗
体反応性を示すＰｆ肝臓期／ウェルの数を評価および記録する。全３個のウェルにおける
肝臓期寄生生物の数を計数し、平均を報告する。
【００５０】
一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト
は、無菌的である。一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉ
ｕｍスポロゾイトは、宿主生物、例えば、蚊（宿主蚊の唾液腺から解剖されたスポロゾイ
トによる場合のように）由来の付随する材料による汚染のリスクが低下している。
【００５１】
一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト
は、ヒト宿主域のものである。一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａ
ｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの種は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである。
【００５２】
一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト
は、薬学的使用に適する。一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍ
ｏｄｉｕｍスポロゾイトは、ワクチンにおいて使用される。一部の実施形態では、ｉｎ  
ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、弱毒化される。
【００５３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｆ  ＳＰＺは、培養物におけるヒト肝細胞に侵入し、そ
こで発達するその能力に関して検査される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｆＳＰＺは、
Ｐｆ生活環を完了する能力に関してｉｎ  ｖｉｖｏで検査することもできる。これは、ヒ
ト血液を輸血したヒト肝臓キメラマウスを使用することにより行うことができる。
【００５４】
培養物
ある特定の実施形態では、本願は、ヒト宿主域のｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓ
ｍｏｄｉｕｍ寄生生物の培養物を対象とし、前記寄生生物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでスポロ
ゴニー発達を起こしているか、またはそれを起こした。
【００５５】
ある特定の実施形態では、培養物は、スポロゴニー発達の等価なステージにおけるヒト
宿主域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物を含む。ある特定の実施形態では、培養物は、ヒ
ト宿主域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物の継続的なスポロゴニー発達を維持することが
できる。
【００５６】
一部の実施形態では、寄生生物は、発達のスポロゾイト期に達した。一部の実施形態で
は、ヒト宿主域のｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、蚊
において飼育された同じ種のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの少なくとも７０％、８
０％または９０％の肝細胞感染性である。一部の実施形態では、ヒト宿主域のｉｎ  ｖｉ
ｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、蚊において飼育された同じ種の
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの７０〜１００％、８０〜１００％または９０〜１０
０％の間のヒト肝細胞感染性である。一部の実施形態では、感染性は、ＨＣ−０４細胞の
培養物において測定され、一部の実施形態では、感染性は、ｉｎ  ｖｉｖｏの肝臓感染に
より測定される。
【００５７】
一部の実施形態は、ヒト宿主域のｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育された感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉ
ｕｍスポロゾイトの培養物を対象とし、前記培養物は、いかなる付随する蚊材料もなく、
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、ヒト宿主域の同
じ種の、蚊において飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの少なくとも７０％、
８０％または９０％のヒト肝細胞感染性である。一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ
飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、ヒト宿主域の同じ種の、蚊において飼
育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの７０〜１００％、８０〜１００％または９
０〜１００％の間のヒト肝細胞感染性である。
【００５８】
一部の実施形態では、培養物は、例えば、血液摂取後の蚊の管腔条件を模倣することに
より、生殖母細胞からの配偶子の出現を容易にする、第１の（鞭毛放出と称される）培地
を含む。一部の実施形態では、鞭毛放出培地は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、グルコース、
重炭酸ナトリウムおよびキサンツレン酸（ｘａｎｔｈｒｕｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）を含む。
一部の実施形態では、鞭毛放出培地は、１０〜３０％、１５〜２５％または１８〜２２％
ＦＢＳを含む。一部の実施形態では、鞭毛放出培地は、０．０５％〜０．５％、０．０７
５％〜０．５％または０．０７５％〜０．２５％グルコースを含む。一部の実施形態では
、鞭毛放出培地は、０．０５％〜０．５％、０．０７５％〜０．５％または０．０７５％
〜０．２５％重炭酸ナトリウムを含む。一部の実施形態では、鞭毛放出培地は、０．０１
％〜０．０５％、０．０１％〜０．０４％または０．０２％〜０．０４％キサンツレン酸
を含む。一部の実施形態では、鞭毛放出培地は、ＦＢＳ、０．０５％〜０．５％グルコー
ス（例えば、０．１％）、０．０５％〜０．５％重炭酸ナトリウム（例えば、０．１％）
および０．０１％〜０．０５％キサンツレン酸（例えば、０．０２２％）を含む。
【００５９】
一部の実施形態では、第１の培地が除去され、培養は、接合子からオーキネートへの分
化および３Ｄマトリックス担体へのオーキネートの侵入を容易にする、第２の（オーキネ
ートと称される）培地を含む。一部の実施形態では、オーキネート培地は、ＦＢＳ、ＲＰ
ＭＩおよびトレハロースを含む。一部の実施形態では、オーキネート培地は、１０〜３０
％、１５〜２５％または１８〜２２％ＦＢＳを含む。一部の実施形態では、オーキネート
培地は、０．１％〜０．５％、０．１５％〜０．３％または０．２％〜０．３％トレハロ
ースを含む。一部の実施形態では、オーキネート培地は、０．１％〜０．５％、０．１５
％〜０．３％または０．２％〜０．３％デキストロースを含む。一部の実施形態では、オ
ーキネート培地は、０．０１％〜０．０８％、０．０２％〜０．０６％、０．０３％〜０
．０５％重炭酸ナトリウムを含む。一部の実施形態では、オーキネート培地は、抗生物質
をさらに含む。一部の実施形態では、抗生物質は、ペニシリン、ストレプトマイシンまた
はこれらの組合せである。一部の実施形態では、オーキネート培地は、１〜５０ユニット
／ｍＬ、１〜４０ユニット／ｍＬ、５〜３０ユニット／ｍＬまたは１０〜２０ユニット／
ｍＬの抗生物質を含む。一部の実施形態では、オーキネート培地は、１〜５０μｇ／ｍＬ
、１〜４０μｇ／ｍＬ、５〜３０μｇ／ｍＬまたは１０〜２０μｇ／ｍＬの抗生物質を含
む。一部の実施形態では、オーキネート培地は、１０〜３０％ＦＢＳ（例えば、２０％）
、０．１％〜０．５％トレハロース（例えば、０．２５％）、０．１％〜０．５％デキス
トロース（例えば、０．２５％）、０．０１％〜０．０８％重炭酸ナトリウム（例えば、
０．０４％）、１〜５０ユニット／ｍＬペニシリン（例えば、１０ユニット／ｍＬ）およ
び１〜５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（例えば、１０μｇ／ｍＬ）を含有するＲＰＭ
Ｉ培地を含む。
【００６０】
一部の実施形態では、第２の培地が除去され、培養は、スポロゾイト期へのＰｌａｓｍ
ｏｄｉｕｍ寄生生物のｉｎ  ｖｉｔｒｏスポロゴニーのための栄養素を提供する、第３の
（オーシストと称される）培地を含む。一部の実施形態では、オーシスト培地は、Ｓｃｈ
ｎｅｉｄｅｒのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地［２６］、ＦＢＳ、重炭酸ナトリウム、トレハ
ロース、ヒポキサンチン、ＨＥＰＥＳ、必須アミノ酸、パラ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ
）、抗生物質（例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシン）、リポタンパク質、コレ
ステロールおよびビタミンを含む。一部の実施形態では、オーシスト培地は、１０〜３０
％、１５〜２５％または１８〜２２％ＦＢＳを含む。一部の実施形態では、オーシスト培
地は、０．０１％〜０．０８％、０．０２％〜０．０６％、０．０３％〜０．０５％重炭
酸ナトリウムを含む。一部の実施形態では、オーシスト培地は、０．１％〜０．５％、０
．１５％〜０．３％または０．２％〜０．３％トレハロースを含む。一部の実施形態では
、オーシスト培地は、１０〜１００μｇ／ｍＬ、２０〜１００μｇ／ｍＬ、２５〜７５μ
ｇ／ｍＬまたは４０〜６０μｇ／ｍＬヒポキサンチンを含む。一部の実施形態では、オー
シスト培地は、０．０５Ｍ〜０．２５Ｍ、０．０７５Ｍ〜０．２Ｍまたは０．０７５Ｍ〜
１．５Ｍ  ＨＥＰＥＳを含む。一部の実施形態では、オーシスト培地は、０．０１％〜０
．０８％、０．０２％〜０．０６％、０．０３％〜０．０５％ＰＡＢＡを含む。一部の実
施形態では、オーシスト培地は、抗生物質をさらに含む。一部の実施形態では、抗生物質
は、ペニシリン、ストレプトマイシンまたはこれらの組合せである。一部の実施形態では
、オーシスト培地は、１〜５０ユニット／ｍＬ、１〜４０ユニット／ｍＬ、５〜３０ユニ
ット／ｍＬまたは１０〜２０ユニット／ｍＬの抗生物質を含む。一部の実施形態では、オ
ーシスト培地は、１〜５０μｇ／ｍＬ、１〜４０μｇ／ｍＬ、５〜３０μｇ／ｍＬまたは
１０〜２０μｇ／ｍＬの抗生物質を含む。一部の実施形態では、オーシスト培地は、０．
０５％〜０．５％、０．０７５％〜０．５％または０．０７５％〜０．２５％リポタンパ
ク質を含む。一部の実施形態では、オーシスト培地は、０．０５％〜０．５％、０．０７
５％〜０．５％または０．０７５％〜０．２５％コレステロールを含む。一部の実施形態
では、オーシスト培地は、ＳｃｈｎｅｉｄｅｒのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地、１０〜３０
％ＦＢＳ（例えば、２０％）、０．０１％〜０．０８％重炭酸ナトリウム（例えば、０．
０４％）、０．１％〜０．５％トレハロース（例えば、０．２５％）、１０〜１００μｇ
／ｍＬヒポキサンチン（例えば、５０μｇ／ｍＬ）、０．０５Ｍ〜０．２５Ｍ  ＨＥＰＥ
Ｓ（例えば、０．１Ｍ）、必須アミノ酸（例えば、１×、ＧＩＢＣＯ）、０．０１％〜０
．０８％パラ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ、例えば、０．０４μｇ／ｍＬ）、１〜５０ユ
ニット／ｍＬペニシリン（例えば、１０ユニット／ｍＬ）および１〜５０μｇ／ｍＬスト
レプトマイシン（例えば、１０μｇ／ｍＬ）、０．０５％〜０．５％リポタンパク質（例
えば、１．５％）、０．０５％〜０．５％コレステロール（例えば、０．１％）およびビ
タミン（例えば、１×、ＧＩＢＣＯ）を含む。
【００６１】
一部の実施形態では、培養担体は、３Ｄ培養マトリックスを含む。一部の実施形態では
、３Ｄ培養マトリックスは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｓ２細胞を予
め播種される［２６］。一部の実施形態では、培養マトリックスは、マトリゲルでコーテ
ィングされたポリスチレンマトリックス（例えば、ＡＭＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｌｔｄ、ＵＫ）を含む［２７、２８］。例えば、１ｍｇ／ｍＬのマトリゲルをポリスチ
レンマトリックスの上に慎重に重層し、続いて３７℃でインキュベーションすることによ
り、ポリスチレンマトリックスをマトリゲルでコーティングすることができる。一部の実
施形態では、培養マトリックスは、ポリスチレンマトリックス、マトリゲルおよびＤｒｏ
ｓｏｐｈｉｌａ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｓ２細胞を含む。一部の実施形態では、マトリッ
クスは、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、ラミニン、コラーゲンまたはこれらの
組合せでコーティングされる。
【００６２】
一部の実施形態では、培養物は、無菌的である。一部の実施形態では、培養物に由来す
るスポロゾイトは、薬学的使用に適する。
【００６３】
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物を培養する方法
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物を培養するおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育された
生きた感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの培養物を作製する方法、ならびにｉｎ
ｖｉｔｒｏ飼育された弱毒化Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトを培養および／または
その組成物を作製する方法が開示されている。
【００６４】
ある特定の実施形態では、本願は、ヒト宿主域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物を前記
寄生生物のスポロゴニー発達の間にｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する方法であって、
ａ．赤血球細胞の存在下で、鞭毛放出培養培地においてヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕ
ｍ生殖母細胞を培養するステップと、
ｂ．レクチンを使用して赤血球細胞を凝集させるステップと、
ｃ．接合子、配偶子、生殖母細胞および凝集細胞を含む混合物を収集するステップと（
一部の実施形態では、これは、遠心分離およびペレットの収集によって達成される）、
ｄ．マトリックスを含む担体上でオーキネート培地において前記混合物を培養するステ
ップであって、前記寄生生物が、オーキネートへと分化し、前記オーキネートが、前記マ
トリックスに進入し、オーシスト期へと分化するステップと、
ｅ．前記オーキネート培地をオーシスト培養培地と置き換えるステップと、
ｆ．これにより産生されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト期寄生生物を回収するス
テップと
を含む方法を対象とする。
【００６５】
例えば、培養するための方法は、（ａ）鞭毛放出培地にステージＶ生殖母細胞を懸濁す
るステップと（１時間）（このステップにおいて、雄性配偶子および雌性配偶子が、小生
殖母細胞および大生殖母細胞から出現し、相互作用（受精）して接合子を形成する）；（
ｂ）レクチン、例えば、コムギ胚芽凝集素、コムギから精製されたレクチンを添加するこ
とにより、赤血球を凝集させるステップと（１時間）；（ｃ）培養懸濁液を遠心分離して
、接合子、赤血球残渣ならびに分化を起こさなかったあらゆる生殖母細胞および配偶子を
含有するペレットを収集するステップと；（ｄ）オーキネート培地にペレットを懸濁し、
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｓ２細胞を予め播種した３Ｄ細胞培養マト
リックス［２６］に播種するステップとを含むことができる。８ウェル培養プレートまた
は他の組織培養バイアルもしくはトランズウェル培養インサートにおけるマトリゲル［２
７、２８］を使用して、３Ｄ培養マトリックスを開発した。次に、発達したオーキネート
は、運動能力があるため（運動能力がない生殖母細胞、配偶子および接合子とは異なり）
、続く２０〜２４時間にマトリックスに侵入する；（ｅ）２０〜２４時間後、トランズウ
ェルインサートまたは８ウェル培養プレートを洗浄して、マトリックスに侵入しなかった
あらゆるオーキネートならびに残る生殖母細胞、配偶子および接合子（オーキネートに発
達しなかった）を除去し、培養培地をオーシスト培地と置き換える。マトリックス中のオ
ーキネートは、侵入１２〜２４時間後にオーシストへと変態する。（ｆ）２〜３日間に１
回オーシスト培地を交換する；（ｇ）培養開始後７、８および１１日目に、７、８および
１１日目のオーシストを決定する；（ｈ）培養開始後１５、１８および２１日目に、８ウ
ェルまたはトランズウェル培養プレートから培地を収集し、続いて研和することにより、
培地からＳＰＺを回収する。セロメーターを使用して、ＰｆＳＰＺを計数する；次に、６
日間肝細胞効力アッセイを使用して効力を決定するために、回収されたＳＰＺをＨＣ−０
４細胞に播種することができる。
【００６６】
ある特定の実施形態では、ヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生殖母細胞は、例えば、参
照により本明細書に組み込まれるＴｒａｇｅｒ  Ｗ、およびＪｅｎｓｅｎ  ＪＢ．、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ  １９３巻：６７３〜６７５頁、１９７６年に開示されている通り、赤血球細
胞（赤血球）におけるヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍの培養物に由来する。
【００６７】
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍオーシストの産生増加方法
ある特定の実施形態では、本願は、同じ種の、等しい数のヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉ
ｕｍ生殖母細胞から蚊において発達したオーシストと比較して、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍオ
ーシストの産生を増加させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
ａ．赤血球細胞の存在下で、鞭毛放出培養培地においてヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕ
ｍ生殖母細胞を培養するステップと、
ｂ．レクチンを使用して前記赤血球細胞を凝集させるステップと、
ｃ．接合子、配偶子、生殖母細胞および凝集細胞を含む混合物を収集するステップと（
一部の実施形態では、これは、遠心分離およびペレットの収集により達成される）、
ｄ．マトリックスを含む担体上でオーキネート培地において、前記混合物を培養するス
テップであって、前記寄生生物が、オーキネートに分化し、前記オーキネートが、前記マ
トリックスに進入し、オーシスト期へと分化するステップと、
ｅ．前記オーキネート培地をオーシスト培養培地と置き換えるステップと、
ｆ．オーシスト培地を、Ｓ２細胞を含有するオーシスト培地（Ｓ２細胞は、培地交換の
際の細胞損失を補充するために添加される）に４０〜８０（好ましくは、４８〜７２時間
）毎に置き換えることにより、寄生生物培養を続けるステップと、
ｇ．ヒト宿主域のオーシスト期Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物を定量化するステップと
を含み、
ｈ．等しい数のヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生殖母細胞から蚊において発達した同
じ種のオーシストと比較して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで発達したヒト宿主域のより多くのＰｌ
ａｓｍｏｄｉｕｍオーシストを産生する方法を対象とする。
【００６８】
ある特定の実施形態では、ヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生殖母細胞は、例えば、Ｔ
ｒａｇｅｒ（１９７６年）に開示されている通り、赤血球細胞（赤血球）におけるヒト宿
主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍの培養物に由来する。
【００６９】
一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるステージＶ生殖母細胞からオーキネー
トへの変態の効率は、１〜２５％、５〜２５％、５〜２１％または８〜２１％の範囲内で
ある。
【００７０】
一部の実施形態では、ステージＶ生殖母細胞から７、８または１１日目のオーシストへ
の変態の効率は、１〜１５％、２〜１４％、２〜２５％または２．４〜１２．５％の範囲
内である。
【００７１】
一部の実施形態では、等しい数のステージＶ生殖母細胞から蚊において発達したオーシ
ストと比較して、少なくとも１０〜２０、１０〜３０、１０〜３９または１０〜６０倍多
いオーシストが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで発達する。一部の実施形態では、等しい数のステー
ジＶ生殖母細胞から蚊において発達したオーシストと比較して、１０〜２０、１０〜３０
、１０〜３９または１０〜６０倍多いオーシストが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで発達する。
【００７２】
使用方法
マラリアを予防するためのワクチンにおける免疫原として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育され
たＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトおよび弱毒化されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰ
ｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト（例えば：両者共に参照により本明細書に組み込まれる
、Ｕ．Ｓ．７，２２９，６２７；ＵＳＳＮ６１／７８３，３２６を参照）を使用する方法
が開示されている。抗マラリア薬およびワクチンの有効性の評価に有用な、また、抗マラ
リア剤、特に、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ感染の無性赤血球期を標的とするクロロキン等の抗
マラリア薬と併せて、防御免疫を付与するためのワクチンレジメンにおいて有用な、ｉｎ
ｖｉｔｒｏ飼育された病原性寄生生物を使用する方法も開示されている。
【００７３】
ある特定の実施形態では、本願のヒト宿主域のｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍ
ｏｄｉｕｍスポロゾイトは、ワクチン組成物において使用される。一部の実施形態では、
ヒト宿主域のｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、弱毒化
される。一部の実施形態では、ヒト宿主域のｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄ
ｉｕｍスポロゾイトは、弱毒化されない。一部の実施形態では、ヒト宿主域のｉｎ  ｖｉ
ｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、弱毒化されず、抗マラリア剤、
例えば、クロロキンと共に使用される。一部の実施形態では、ヒト宿主域のｉｎ  ｖｉｔ
ｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、ヒト被験体における免疫応答を誘
導する。一部の実施形態では、ヒト宿主域のｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄ
ｉｕｍスポロゾイトは、相当するＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトに対する免疫応答を
生じ、一部の実施形態では、ヒト宿主域のｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉ
ｕｍスポロゾイトは、ヒト被験体に防御免疫をもたらす。
【実施例】
【００７４】
（実施例１）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで多数のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍオーキネートを再現性よく産生お
よび精製するための最適化方法
異なる齢数の、高いおよび低い生殖母細胞密度での生殖母細胞培養物からのオーキネー
ト産生を評価した。生殖母細胞誘導１４〜２２日後の（表１）、高および低密度培養物の
両方に由来するオーキネートおよび後期レトルトを再現性よく産生した（図２Ａ〜図２Ｂ
）。レトルトは、接合子からオーキネートへのその発達における、寄生生物の中間形態で
あり、オーキネートおよび後期レトルトは両者共に（図２Ａ〜図２Ｂ）、蚊においてオー
シストへと変態する。誘導１８日後の生殖母細胞培養物から寄生生物を採取した。初期レ
トルト（図２Ａ）が先ず、ほぼ１４時間で観察され、オーキネートは、オーキネート培養
開始２４時後から観察された。光学顕微鏡で検鏡した培養物のギムザ染色したスメアは、
培養物における丸い大配偶子および接合子、ならびに三日月形の生殖母細胞およびオーキ
ネートの混合物を示した。顕著な核の存在によって、接合子を大配偶子から区別した。顕
著な核の存在および周囲の赤血球膜の欠如によって、オーキネートを生殖母細胞から区別
した。２種の他のアプローチを使用して、変換および精製率の推定をもたらした。先ず、
寄生生物の異なるステージで発現される分子に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をス
クリーニングした：Ｐｆｓ４８／４５は、成熟大生殖母細胞および大配偶子において、Ｐ
ｆｓ２３０は、大配偶子および接合子において、Ｐｆｓ２５は、配偶子およびオーキネー
トにおいて、ＰｆＣｅｌＴＯＳは、オーキネートおよびＰｆＳＰＺにおいて発現された（
データ図示せず）。Ｐｆｓ２３０は、生殖母細胞および大配偶子に局在化した一方、Ｐｆ
ｓ４８／４５は、配偶子およびレトルトに局在化した。Ｐｆｓ２５は、生殖母細胞に変動
して局在化したが、レトルトおよびオーキネートに強く発現された。Ｐｆｓ２５（黒矢印
は、緑色染色を指す）および赤血球抗原、グリコホリンＡ（白矢印は、赤色染色を指す）
（図３Ａ〜図３Ｂ）に対する抗体で培養寄生生物を標識することにより、それぞれ赤血球
膜の存在または非存在に基づき、生殖母細胞をオーキネートから区別した。
【００７５】
いくつかのアプローチを採用して、非感染赤血球から離して、培養されたオーキネート
を精製および濃縮した。Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ−Ｈ勾配遠心分離を使用して、非感染赤血
球のおよそ９０％を除去することができたが、オーキネートは、生殖母細胞、配偶子およ
び接合子と同時精製された。精製および濃縮のための３ステップ手順を開発した。この手
順は成功し、＞７０％濃縮を達成した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのステージＶ生殖母細胞から
オーキネートへの変態の平均効率は、１３％であった（範囲＝８〜２１％、表１）。
【表１】
2020141691.tif 000002
【００７６】
（実施例２）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるオーキネートからのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイト
の産生
第１のステップは、オーシストを効率的に産生することであった。簡潔に説明すると、
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物からステージＶ生殖母細胞を鞭毛放出培地（ＦＢＳ、０．１％グ
ルコース、０．１％重炭酸ナトリウムおよび０．０２２％キサンツレン酸）へと移し、イ
ンキュベーション後に、接合子を改変オーキネート培地（２０％ＦＢＳ、ＲＰＭＩ培地、
０．２５％トレハロース、０．２５％デキストロース、０．０４％重炭酸ナトリウム、１
０ユニット／ｍＬペニシリンおよび１０μｇ／ｍＬストレプトマイシン）へと移し、改変
マトリゲルコーティングされた８ウェルスライド上に重層した。８ウェルスライドをコー
ティングするために、マトリゲルをＲＰＭＩ培地で希釈し、８ウェルスライドに注いだ。
このようなスライドを３７℃で２時間インキュベートし、過剰な培地を除去した。接合子
を重層する前に、マトリゲルの上にＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｓ２細
胞を播種することにより、マトリゲルコーティングされたスライドをさらに改変した。分
化したオーキネートは、マトリゲルに侵入した。インキュベーション２４時間後に、オー
キネートからオーシスト培地（ＳｃｈｎｅｉｄｅｒのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地、２０％
ＦＢＳ、０．０４％重炭酸ナトリウム、０．２５％トレハロース、５０μｇ／ｍＬヒポキ
サンチン、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、必須アミノ酸（１×、ＧＩＢＣＯ）、０．０４μｇ／
ｍＬパラ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、１０ユニット／ｍＬペニシリンおよび１０μｇ
／ｍＬストレプトマイシン、１．５％リポタンパク質、０．１％コレステロールおよびビ
タミン（１×、ＧＩＢＣＯ））への交換の際に、マトリゲルに侵入しなかった未分化接合
子およびオーキネートを洗い流した。オーキネートおよびオーシスト培地の両方において
、Ｓ２細胞を添加した（図４）。抗Ｐｆｓ２５および抗Ｐｆ  ＣＳＰ  ｍＡｂを使用した
ＩＦＡによって検出された３日目（図４、上パネル）および８日目（図４、下パネル）の
オーシストを示す。８日間培養物をＩＦＡのために透過処理した。８日目のオーシストに
おける点状染色は、出芽ＰｆＳＰＺを示唆した。中央パネル（図４）において、矢印は、
培養において発達する７〜８日目のオーシストを示す。初期実験後に、コーティングに使
用されるマトリゲルの濃度および各ウェルに播種される接合子の数等、培養条件を改変し
て、ステージＶ生殖母細胞から８日目のオーシストへの発達の変態効率を有意に増加させ
た。この改変ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養プロトコールを使用して、ステージＶ生殖母細胞から
８日目のオーシストへの２．４〜１２．５％（平均８．３％）変態が、一貫して達成され
た（表２）。これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養プロトコールの改変前の初期に記録された０
．１３％の大きな改善であった。蚊におけるステージＶ生殖母細胞からオーシストへの変
態効率は、Ｓａｎａｒｉａ（Ｌｉら、発表準備中）で行われた７４回の独立的膜供給アッ
セイにおいて０．２２％であった。この変態効率は、文献［２２、２３］において報告さ
れたものに匹敵した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの８．３％の変態効率は、蚊において観察され
るものよりも３９倍高かった（表２、３）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで（図４、図５Ａ、図８Ａ
〜図８Ｃ）および蚊において（図５Ｂ）発達するオーシストのサイズおよび構造は同様で
あった。図５Ａは、抗（ａｎｔ−）ＰｆＣＳＰ  ｍＡｂで染色されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ培
養された７日目のオーシストのＩＦＡを示し、マーキュロクロム染色された蚊中腸の７日
目のオーシストを示す（図５Ｂ）。
【００７７】
付着していないＳ２細胞を含むウェルからの培養上清を収集することにより、１５日目
および／または１８日目にｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物を回収した。形態学的に発達したＰｆ
ＳＰＺの数をセロメーターにおいて計数し、確認のために蛍光抗ＰｆＣＳＰ  ｍＡｂを使
用してアリコートを染色した（図６Ｂ、表４）。蛍光抗Ｐｆ  ＣＳＰ  ｍＡｂで染色する
ウェルの固定後に、培養ウェルにおいて発達したＰｆ  ＳＰＺを検出した（図６Ａ）。７
回の独立的実験において、１０枚の８ウェルスライドから回収あたり１８０，０００〜３
５０，０００個の間の成熟Ｐｆ  ＳＰＺを産生した。全実験において、２種の形態学的に
異なる形態のＰｆ  ＳＰＺが存在した。唾液腺Ｐｆ  ＳＰＺと同一に見えた形態学的に成
熟したＰｆ  ＳＰＺは、運動能力があり、１０〜１３μｍ長であり、抗Ｐｆ  ＣＳＰ  ｍ
Ａｂに対し高度に反応性であった（図６Ａ〜図６Ｂ、表４）。短い形態の、未成熟Ｐｆ  
ＳＰＺは、＜１０μｍ長であったが、依然として運動能力があり、抗Ｐｆ  ＣＳＰ  ｍＡ
ｂに対し高度に反応性であった。報告された全実験において、形態学的に成熟したＰｆ  
ＳＰＺのみを定量化した。同じ培養物からの１５および１８日目の両方における回収は、
１０枚のスライド当たりほぼ５００，０００ＰｆＳＰＺまで収量を増加させた。
【００７８】
その後、３Ｄトランズウェル系を検査した。このアプローチを使用した２回の独立的培
養実験において、２２８，０００および２０８，０００個の形態学的に成熟したＰｆ  Ｓ
ＰＺを１枚の６ウェルプレート培養物から回収した。最初に、オーシストのｉｎ  ｖｉｔ
ｒｏ培養に適していることが判明した２種の市販の３Ｄマトリックスを使用した。３Ｄ  
Ｌｉｆｅ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ（Ｃｅｌｌｅｎｄｅｓ  ＧｍｂＨ、ドイツ）を使用して、生
物模倣型３Ｄ環境において細胞を培養し、ＡｌｇｉＭａｔｒｉｘ（商標）３Ｄ培養系（Ｇ
ｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、３Ｄ細胞培養を容易にする動物起源不含生物足場
である。両者共に、Ｐｆスポロゴニーを支持する。３Ｄ  Ｌｉｆｅ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌは
、Ｐｆ  ＳＰＺをマトリックスから放出するためにガラクトシダーゼ消化を必要としたが
、成熟Ｐｆ  ＳＰＺは、Ａｌｇｉｍａｔｒｉｘマトリックスに捕捉された。したがって、
本発明者らは、代替としてのＡｌｖｅｔｅｘ  ３Ｄ培養技術（ＡＭＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ（Ｅｕｒｏｐｅ）Ｌｉｍｉｔｅｄ、ＵＫ）と併せて、トランズウェルインサー
トに基づく培養系を開発した。トランズウェルインサートは、プレートウェルに挿入され
ると、２区画培養を可能にした（図７）。この系において、マトリゲルでコーティングさ
れた、不活性２００μｍ厚多孔性ポリスチレン足場を、インサートの多孔性膜上に配置し
た。この３Ｄマトリックス上に播種された接合子は、オーキネートへと分化し、マトリゲ
ルコーティングされたポリスチレン足場に侵入し、オーシストへと変態した。上部区画に
は、Ｓ２細胞を播種した。このマトリックスにおいて発達したオーシストおよびＰｆＳＰ
Ｚを下部区画に放出させ、ここから収集した。予備実験において、この系は、Ｐｆスポロ
ゴニー発達を支持し（表５）、オーシスト発達および保持は、チャンバースライド培養と
極めて類似した（表２、３）。スポロゴニー発達を評価するために、マトリックスと共に
多孔性膜を除去し、遠心分離によってオーシストを収集した。ステージＶ生殖母細胞から
７および１１日目のオーシストへの変態効率（図８Ａ〜図８Ｃ）は、それぞれ１０．３％
（範囲９〜１１．５）および９．０％（範囲７．８〜１０．７）であった（表５）。１１
日目のオーシストの数は、おびただしい増加を表し、培養におけるオーシストの有意な保
持を示した。さらに、抽出されたオーシストは、１１日目の蚊中腸において発達したオー
シストと外観が同様であり、これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ形成されたオーシストは、ＰｆＣ
ＳＰを発現した（図８Ｃ）。図８Ａ〜図８Ｂは、定量化に使用されるセロメーターにおけ
るオーシストの位相差像を示し（図８Ａ＆図８Ｂ）、蛍光標識された抗Ｐｆ  ＣＳＰ  ｍ
Ａｂを使用した懸濁液（透過処理なし）における抽出されたオーシストのＩＦＡを示す（
図８Ｃ）。透過処理なしの懸濁液におけるオーシストの染色を行ったところ、ＰｆＣＳＰ
染色されたオーシストは、点状パターンではなく均一なＰｆＣＳＰ発現を有していた（図
８Ｃ）。
【００７９】
２回の独立的培養実験において、２２８，０００および２０８，０００個の形態学的に
発達したＰｆＳＰＺを、６個の改変インサートを使用した１枚の６ウェルプレート培養か
ら回収した。これは、８ウェルスライドにより達成される数と比較して、収量において最
小で３倍増加であった（表４、５）。特に、表４は、８ウェル培養の結果を示す一方、表
５は、トランズウェル培養の結果を示す。このトランズウェルインサート培養条件は、ｉ
）培地交換の際のマトリゲルの損失を低下させ、ｉｉ）単一の培養からのＰｆＳＰＺの反
復回収を可能にし、ｉｉｉ）ラミニンおよびコラーゲン等、異なる細胞外マトリックスタ
ンパク質によるマトリックスのコーティングに適しており、ｉｖ）適した液体取り扱い系
を使用したスケールアップおよび自動化に適していたため、いくつかの利点を提供した。
【００８０】
この結果は、以前の実験と比較して、オーシストから回収される成熟Ｐｆ  ＳＰＺの数
において最小で３倍増加を表す。
【表２】
2020141691.tif 000003
【表３】
2020141691.tif 000004
【００８１】
（実施例３）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトおよびＡｎｏｐｈ
ｅｌｅｓ  ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ蚊において個体発生的に発達したＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍスポロゾイトがそれぞれ、同様の効率でヒト肝細胞細胞株（ＨＣ−０４）内に侵入およ
び発達することの実証。
効力の評価に慣例的に使用される６日間肝細胞アッセイにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼
育されたＰｆ  ＳＰＺをその感染性に関して検査した。このアッセイは、典型的には、凍
結保存前後のＰｆ  ＳＰＺにより行われる。新鮮および凍結保存されたＰｆ  ＳＰＺは、
形態学的に同一の６日肝臓期寄生生物を産生するが、凍結保存による効力の５〜２５％損
失がある［５］。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｆ  ＳＰＺは、新鮮蚊由来ＰｆＳＰＺと
より類似しており、したがって、製造キャンペーンにおいて作製された新鮮ＰｆＳＰＺ由
来の読み出し情報と比較を行った。７連続産生キャンペーンにおいて、Ｐｆ  ＭＳＰ−１
を発現する２０．７〜３２．７の成熟した６日目の寄生生物は、５０，０００の蚊で産生
された新鮮Ｐｆ  ＳＰＺから発達した（表４）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育されたＰｆＳＰＺ
を、ＨＣ−０４細胞（ｉｎ  ｖｉｖｏで産生されたＰｆ  ＳＰＺの感染を支持することが
示されたヒト肝細胞細胞株）を蒔いた３ウェルに接種し［２４、２５］、６日間インキュ
ベートした（図９Ａ上パネル、表４）。図９Ａ〜図９Ｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育された
Ｐｆ  ＳＰＺ（図９Ａ上パネル）または蚊で産生された、無菌的、精製、凍結保存された
Ｐｆ  ＳＰＺ（図９Ｂ下パネル）による感染後の、ＨＣ−０４細胞における６日肝臓期の
共焦点顕微鏡像を示す。４回の独立的６日間肝細胞アッセイにおいて、５６，５９８±７
，２９４  Ｐｆ  ＳＰＺ／ウェルで播種されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生されたＰｆ  ＳＰＺ
は、２８．６±７．０  Ｐｆ  ＭＳＰ１を発現する６日目の寄生生物を産生した（表４）
。これは、このアッセイにおける新鮮、無菌的、精製されたＰｆ  ＳＰＺにより観察され
る２５．７±４．１  Ｐｆ  ＭＳＰ１発現寄生生物に匹敵し（表４）、凍結保存されたＰ
ｆ  ＳＰＺによるものよりも僅かに多かった（データ図示せず）。これらのデータは、１
８日目のｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生されたＰｆ  ＳＰＺが、１５日目のｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育
されたＰｆ  ＳＰＺよりも感染性であったことも示唆した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ
ｖｉｖｏ（蚊）産生されたＰｆ  ＳＰＺ由来のＨＣ−０４細胞において発達した６日目
の寄生生物のサイズは、同様であった（図９Ａ〜図９Ｂ）。顕微鏡写真のための陽性対照
として、蚊唾液腺由来の無菌的、精製、凍結保存されたＰｆ  ＳＰＺをＨＣ−０４細胞に
おいてインキュベートし、Ｐｆ  ＭＳＰ１発現を評価した（図９Ｂ）。これらのデータは
、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生されたＰｆ  ＳＰＺが、蚊で産生された新鮮Ｐｆ  ＳＰＺと同じ
ほどに肝細胞培養物において感染性であったことを実証した。
【表４】
2020141691.tif 000005
【表５】
2020141691.tif 000006
【００８２】
これらの結果は、蚊において産生されるオーシストよりも３９倍優れた効率で、ｉｎ  
ｖｉｔｒｏでＰｆオーシストを産生するための方法を示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ飼育された
Ｐｆ  ＳＰＺは、侵入し、蚊から新鮮に解剖されたＰｆ  ＳＰＺと少なくとも同じほど優
れた効率で、Ｐｆメロゾイト表面タンパク質１を発現する成熟した６日肝臓期シゾントへ
と発達した。
【００８３】
前述において、本発明は、適した実施形態を参照しつつ記載されているが、これらの実
施形態は、本発明の理解のみを目的としており、様々な変更または改変が可能である。
【化１】
2020141691.tif 000007
【化２】
2020141691.tif 000008
【化３】
2020141691.tif 000009
【図１】
2020141691.tif 000010
【図２】
2020141691.tif 000011
【図３】
2020141691.tif 000012
【図４】
2020141691.tif 000013
【図５】
2020141691.tif 000014
【図６】
2020141691.tif 000015
【図７】
2020141691.tif 000016
【図８】
2020141691.tif 000017
【図９】
2020141691.tif 000018
【外国語明細書】
2020141691000001.pdf