(57)【要約】【課題】より均一なサイズを有する細胞凝集体を形成可能な細胞培養方法を得る。【解決手段】細胞培養方法は、ウェルの底部４に円錐状の形状を有する複数の微細穴５が形成された細胞培養基材を準備する工程と、複数の細胞と複数のハイドロゲル粒子とを複数の微細穴５内に播種する工程と、複数の微細穴５の各々の内側で複数の細胞を培養することにより凝集体を形成する工程と、を含み、複数の微細穴５の各々は、１００μｍ以上８６００μｍ以下の直径Ｄ１を有して開口しており、微細穴５の内周面５Ｓの開口側の角度θが６０°以上１２０°以下である。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウェルの底部に円錐状の形状を有する複数の微細穴が形成された細胞培養基材を準備する工程と、
複数の細胞と複数のハイドロゲル粒子とを複数の前記微細穴内に播種する工程と、
複数の前記微細穴の各々の内側で複数の前記細胞を培養することにより凝集体を形成する工程と、を含み、
複数の前記微細穴の各々は、１００μｍ以上８６００μｍ以下の直径を有して開口しており、前記微細穴の内周面の開口側の角度が６０°以上１２０°以下である、細胞培養方法。
【請求項２】
前記播種する工程では、複数の前記細胞と複数の前記ハイドロゲル粒子とが懸濁された状態で前記ウェル内に供給される、
請求項１に記載の細胞培養方法。
【請求項３】
複数の前記ハイドロゲル粒子の各々の直径は、５０ｎｍ以上１０００μｍ以下である、
請求項１または２に記載の細胞培養方法。
【請求項４】
前記播種する工程では、複数の前記細胞の個数に対して０．１以上０．２以下の個数比となるように複数の前記ハイドロゲル粒子が播種される、
請求項１から３のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
【請求項５】
複数の前記ハイドロゲル粒子の各々はゼラチンから形成されている、
請求項１から４のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子含有細胞凝集体の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内の細胞周囲環境や形態を模倣することによって、より生体内に近い環境で細胞を培養する三次元の細胞培養方法が開発されている。下記の特許文献１〜４に開示されているように、三次元の細胞培養に用いられる基材としては、マルチウェルプレートの底面に半球状や円錐状の凹形状を有する１つのウェルを構成し、１つのウェルにつき１個の細胞凝集体を得るものが知られている。また、１つのウェルの底部に凹形状を有する複数の微細穴を形成し、効率的に多くの細胞凝集体を得るものも知られている。
【０００３】
上記のような基材を用いて細胞凝集体を培養する場合、細胞が増殖するにつれてそのサイズが大きくなるため、細胞凝集体の内部へ酸素や栄養が供給されにくくなったり、細胞凝集体の内部から老廃物が排出されにくくなったりする。これに対して下記の特許文献５に開示されているように、ハイドロゲル粒子（以下、単に「粒子」という場合がある。）とともに細胞を培養することにより、粒子を含んだ細胞集合体（細胞凝集体）を得るという手法が開発されている。
【０００４】
粒子の存在により、細胞凝集体の内部へ栄養および酸素が供給されやすくなるとともに、細胞凝集体の内部から老廃物も排出されやすくなる。細胞−細胞間の相互作用が体内の状態に近い様式で行われ、その結果、細胞の長期培養を実現することが可能となる。長期培養によって細胞の分化や機能発現がより高められるため、このような培養技術は各種の研究等への展開が期待される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−２４９５４７号公報
【特許文献２】特再公表ＷＯ２０１４／１９６２０４号
【特許文献３】特許第２７１６６４６号公報
【特許文献４】特許第５５７８７７９号公報
【特許文献５】特再公表ＷＯ２０１１／０５９１１２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
細胞機能の評価や創薬研究などにおいて、細胞凝集体のサイズが不均一であると評価等の結果にばらつきが生じる可能性が高まるため、より高精度の結果を得るためには細胞凝集体のサイズにできるだけ高い均一性が求められる。上記特許文献１〜４は種々の三次元培養技術を開示しているが、粒子を含んだ細胞凝集体の形成技術にまでは言及していない。
【０００７】
本発明は、上述のような実情に鑑みて創作されたものであって、より均一なサイズを有する粒子を含んだ細胞凝集体を形成可能な、細胞培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に基づく細胞培養方法は、ウェルの底部に円錐状の形状を有する複数の微細穴が形成された細胞培養基材を準備する工程と、複数の細胞と複数のハイドロゲル粒子とを複数の微細穴内に播種する工程と、複数の微細穴の各々の内側で複数の細胞を培養することにより凝集体を形成する工程と、を含み、複数の前記微細穴の各々は、１００μｍ以上８６００μｍ以下の直径を有して開口しており、前記微細穴の内周面の開口側の角度が６０°以上１２０°以下である。
【発明の効果】
【０００９】
上記の細胞培養方法によれば、より均一なサイズを有する粒子を含んだ細胞凝集体を形成可能な、細胞培養方法を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、細胞培養方法に使用される細胞培養基材１を部分的に示す平面図である。
【図２】図１中のＩＩ−ＩＩ線に沿った矢視断面図であり、細胞培養基材１に備えられた１つの微細穴５を拡大して示している。
【図３】（Ａ）は、実施例１等で用いた細胞培養基材１Ａの断面形状を示す図であり、（Ｂ）は、細胞培養基材１Ａ〜１Ｄの各種寸法を示す表である。
【図４】（Ａ）は、実施例１の比較実験で用いたＵ底プレート１Ｙの断面形状を示す図であり、（Ｂ）は、実施例１の比較実験で用いたＶ底プレート１Ｚの断面形状を示す図であり、（Ｃ）は、Ｕ底プレート１Ｙ、Ｖ底プレート１Ｚの各種寸法を示す表である。
【図５】（Ａ）は、実施例１に関し、細胞培養基材１Ａ（開口角θ＝６０°）を用いてｈＭＳＣを３時間培養して得られた細胞凝集体を表す写真であり、（Ｂ）はこの細胞凝集体をピペッティング後にＦ底プレートに移動させた状態を表す写真である。
【図６】（Ａ）は、実施例１に関し、細胞培養基材１Ａ（開口角θ＝６０°）を用いてＭＣＦ−７を２１時間培養して得られた細胞凝集体を表す写真であり、（Ｂ）はこの細胞凝集体をピペッティング後にＦ底プレートに移動させた状態を表す写真である。
【図７】（Ａ）は、実施例１に関し、Ｕ底プレート１Ｙを用いてｈＭＳＣを５時間培養して得られた細胞凝集体を表す写真であり、（Ｂ）はこの細胞凝集体をピペッティング後にＦ底プレートに移動させた状態を表す写真である。
【図８】（Ａ）は、Ｕ底プレート１Ｙを用いてＭＣＦ−７を３３時間培養して得られた細胞凝集体を表す写真であり、（Ｂ）はこの細胞凝集体をピペッティング後にＦ底プレートに移動させた状態を表す写真である。
【図９】実施例１に関して、所定の観察を細胞培養基材１Ａ〜１Ｃ、Ｕ底プレート１Ｙ及びＶ底プレート１Ｚについて行なった結果をまとめたものである。
【図１０】実施例２に関し、比較実験で用いた、微細穴を複数有する市販の培養プレート１Ｘの微細孔の断面形状を示す図である。
【図１１】（Ａ）は、実施例２に関し、細胞培養基材１Ａで培養した細胞凝集体の写真であり、（Ｂ）はこの凝集体のサイズと頻度との関係をヒストグラム形式で表わしたグラフである。
【図１２】（Ａ）は、実施例２に関し、細胞培養基材１Ｂで培養した細胞凝集体の写真であり、（Ｂ）はこの凝集体のサイズと頻度との関係をヒストグラム形式で表わしたグラフである。
【図１３】（Ａ）は、実施例２に関し、細胞培養基材１Ｄで培養した細胞凝集体の写真であり、（Ｂ）はこの凝集体のサイズと頻度との関係をヒストグラム形式で表わしたグラフである。
【図１４】（Ａ）は、実施例２に関し、培養プレート１Ｘで培養した細胞凝集体の写真であり、（Ｂ）はこの凝集体のサイズと頻度との関係をヒストグラム形式で表わしたグラフである。
【図１５】図１１〜図１４に示す結果を、細胞培養基材１Ａ，１Ｂ，１Ｄ及び培養プレート１Ｘについてまとめたものである。
【図１６】（Ａ）は、実施例３に関し、細胞培養基材１Ｂで培養した細胞凝集体の写真であり、（Ｂ）はこの凝集体のサイズと頻度との関係をヒストグラム形式で表わしたグラフである。
【図１７】（Ａ）は、実施例３に関し、細胞培養基材１Ｄで培養した細胞凝集体の写真であり、（Ｂ）はこの凝集体のサイズと頻度との関係をヒストグラム形式で表わしたグラフである。
【図１８】（Ａ）は、実施例３に関し、培養プレート１Ｘで培養した細胞凝集体の写真であり、（Ｂ）はこの凝集体のサイズと頻度との関係をヒストグラム形式で表わしたグラフである。
【図１９】図１６〜図１８に示す結果を、細胞培養基材１Ｂ，１Ｄ及び培養プレート１Ｘについてまとめたものである。
【図２０】実施例４（細胞数１００個）に関して、細胞培養基材１Ｂ（開口角θ＝７５°）の場合に得られた凝集体のサイズと頻度との関係をヒストグラム形式で表わしたグラフである。
【図２１】実施例４（細胞数１００個）に関して、細胞培養基材１Ｄ（開口角θ＝１２０°）の場合に得られた凝集体のサイズと頻度との関係をヒストグラム形式で表わしたグラフである。
【図２２】実施例４（細胞数１００個）に関して、培養プレート１Ｘ（開口角θ＝１５０°）の場合に得られた凝集体のサイズと頻度との関係をヒストグラム形式で表わしたグラフである。
【図２３】実施例４（細胞数５００個）に関して、細胞培養基材１Ｂ（開口角θ＝７５°）の場合に得られた凝集体のサイズと頻度との関係をヒストグラム形式で表わしたグラフである。
【図２４】実施例４（細胞数５００個）に関して、細胞培養基材１Ｄ（開口角θ＝１２０°）の場合に得られた凝集体のサイズと頻度との関係をヒストグラム形式で表わしたグラフである。
【図２５】実施例４（細胞数５００個）に関して、培養プレート１Ｘ（開口角θ＝１５０°）の場合に得られた凝集体のサイズと頻度との関係をヒストグラム形式で表わしたグラフである。
【図２６】図２０〜図２２に示す観察結果を細胞培養基材１Ｂ，１Ｄ及び培養プレート１Ｘについてまとめたものである。
【図２７】図２３〜図２５に示す観察結果を細胞培養基材１Ｂ，１Ｄ及び培養プレート１Ｘについてまとめたものである。
【図２８】実施例５に関し、細胞の個数に対するゼラチン粒子の個数の割合の違いが細胞凝集体の直径の均一性（％）に及ぼす影響を示したグラフである。
【図２９】実施例５に関し、細胞数：粒子数＝３：１で培養した細胞凝集体の状態を表す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明を実施するための形態について、以下、図面を参照しながら説明する。以下の説明において同一の部品および相当部品には同一の参照番号を付し、重複する説明は繰り返さない場合がある。
【００１２】
［実施の形態］
図１は、細胞培養方法に使用される細胞培養基材１を部分的に示す平面図である。図２は、図１中のＩＩ−ＩＩ線に沿った矢視断面図であり、細胞培養基材１に備えられた１つの微細穴５を拡大して示している。細胞培養基材１は例えばポリマー製である。細胞培養基材１の上面２には１つまたは複数のウェル３が形成されており、ウェル３の底部４に複数の微細穴５が形成されている。
【００１３】
実施の形態の細胞培養方法は、ウェル３の底部４に略円錐状の形状を有する複数の微細穴５が形成された細胞培養基材１を準備する工程と、複数の細胞と複数のハイドロゲル粒子とを複数の微細穴５内に播種する工程と、複数の微細穴５の各々で複数の細胞を培養することにより凝集体を形成する工程とを含む。
【００１４】
培地としては、一般的な細胞培養用培地を利用することができ、例えばＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製のα−ＭＥＭまたはＤＭＥＭである。細胞種としては、一般的な培養細胞を利用することができ、例えばｈＭＳＣ（ヒト間葉系幹細胞）であったり、ＭＣＦ−７（乳腺上皮がん細胞）であったりする。継代数は例えばＭＣＦ−７で１８継代等、任意の継代数のものを利用可能である。
【００１５】
細胞凝集体サイズは、一般的には直径で５０μｍ〜３０００μｍである。細胞凝集体サイズは直径で５０００μｍ又はそれ以上であってもよい。細胞数としては、必要な細胞凝集体サイズに応じて決定できる。例えば、１つの微細穴５あたり１００〜１０００個である。
【００１６】
ハイドロゲル粒子としては、典型的にはゼラチン粒子を用いることが可能である。ハイドロゲル粒子の架橋度およびサイズに関係なく、ハイドロゲル内には水を大量に含んでいるため、水溶性の栄養物、酵素、老廃物などが容易に拡散移動する。本発明に利用できる粒子は、上記のハイドロゲルの性質をもつものであれば、いずれの材料からなる粒子でも利用することができる。例えば、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリレート、ポリビニルアルコールなどの水溶性合成高分子、多糖、タンパク質などを化学架橋したハイドロゲルからなる粒子である。
【００１７】
ハイドロゲル粒子の粒子サイズ（粒子の直径）は、例えば５０ｎｍ〜３０００μｍであり、より具体的には例えば５０ｎｍ以上１０００μｍ以下程度である。ゼラチン濃度１〜２０ｗ／ｗ％という設定や、架橋剤濃度０．０１〜１ｗ／ｗ％という設定も可能である。
【００１８】
粒子／細胞（細胞１個に対する粒子数）は、好ましくは０．１〜０．２である。粒子／細胞（細胞１個に対する粒子数）は、細胞や粒子の種類やサイズ、培養時間によっては、０．１〜３０という値も採りえる。粒径サイズ（粒子の直径）が２０μｍ〜３１μｍである場合には、粒子／細胞（細胞１個に対する粒子数）は０．１とすることが可能である。
【００１９】
複数の微細穴５の各々は１００μｍ以上８６００μｍ以下の直径Ｄ１（図２）、あるいは１００μｍ以上１０００μｍ以下の直径Ｄ１（図２）を有して開口部６が開口している。直径Ｄ１は例えば５００μｍである。微細穴５の内周面５Ｓの開口部６側の角度（開口角θ）が６０°以上１２０°以下であり、微細穴５の底部の直径Ｄ２は０μｍ以上５００μｍ以下であり且つＤ２＜Ｄ１を具備する。直径Ｄ２は、大きすぎると１つの細胞凝集体が形成されるのにより長時間を要する可能性が生じるため、好適には５０μｍ以下、あるいは１０μｍ以下であるとよい。隣り合う微細穴５，５の間に形成される底部４（平坦部）の長さは０μｍ以上５０μｍ以下であることが好ましい。
【００２０】
開口部６の直径Ｄ１とは、ウェル３の底部４において、微細穴５が形成している円の直径である。開口部６側の開口角θとは、微細穴５の軸線を通る断面を見た場合に（図２参照）、微細穴５の軸線に対して一方側（図２の場合左側）に位置する内周面５Ｓと、微細穴５の軸線に対して他方側（図２の場合右側）に位置する内周面５Ｓとの間に形成される角度のことである。以下、直径Ｄ１および開口角θなどの数値範囲の技術的意義について詳述する。
【実施例１】
【００２１】
細胞凝集体を用いて長期間で細胞機能などを評価するに際し、少しでも迅速な評価を実現するためには、より短時間で細胞凝集体を形成できることが望ましい。しかし、粒子を含んだ細胞凝集体は粒子を含んでいる分、細胞のみの細胞凝集体に比べて長時間の形成時間が必要となる可能性がある。また、がん細胞や上皮系細胞のように細胞同士の接着性の低い細胞種においては細胞凝集体を形成しにくいことも考えられる。
【００２２】
そこで、本発明者らは細胞凝集体を形成しやすい細胞を培養する場合と細胞凝集体を形成しにくい細胞を培養する場合とに、微細穴５の形状がどのような影響を及ぼし得るかについて検証した。
【００２３】
＜細胞培養基材＞
細胞培養基材１として、図２に示すような断面略Ｖ字形状の微細穴５を複数有するアクリル製の細胞培養基材１Ａ〜１Ｃを用いた。具体的には、細胞培養基材１は、直径約６ｍｍの円柱状の穴の底面に１２１個の微細穴５を有するウェル３（図１）を１２個有する容器である。微細穴５は、例えば、ダイヤモンド工具で切削加工によって作製したり、又は、複数の微細穴５を転写した電鋳型を用いてインプリント成型により作製したりする等適宜の方法で形成することができる。
【００２４】
細胞培養基材１Ａ〜１Ｃの各部位のサイズは、図３（Ａ）及び図３（Ｂ）に示すように、微細穴５の開口部６の直径Ｄ１は５００μｍであり、隣り合う微細穴５，５のＶ字形状の中心同士の距離Ｌ２は５３０μｍであり、隣り合う微細穴５，５間の底部４（平坦部）の長さＬ１は３０μｍである。細胞培養基材１Ａ〜１Ｃの微細穴５の開口角θは、それぞれ６０°，７５°，９０°である。微細穴５を作製後に測定したところ、微細穴５の底部の直径Ｄ２は、０〜０．０１μｍであった。細胞培養基材１Ａ〜１Ｃの微細穴５の軸方向深さＨはそれぞれ４３３μｍ、３２６μｍ、２５０μｍであった。
【００２５】
細胞培養基材１は、使用する前に、２０分間紫外線を照射して滅菌し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で数回洗浄した。その後、１ウェル３に、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）のＰＢＳ溶液１ｗｔ％  ２００μｍを滴下し、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、３７℃のインキュベータ内に１５分以上静置し、その後、ＰＢＳで２回洗浄して、細胞非接着コーティングを行った。
【００２６】
＜ハイドロゲル粒子＞
本実施例では、ゼラチン粒子を用いた。ゼラチン粒子は、例えば、特許文献５に記載の公知の方法によって作製することができる。本実施例で用いたゼラチン粒子の粒子径は３２〜５３μｍであった。
【００２７】
＜細胞＞
細胞凝集体を形成しやすい細胞としてｈＭＳＣ（ヒト間葉系幹細胞、１２継代）を用い、細胞凝集体を形成しにくい細胞としてＭＣＦ−７（乳腺上皮がん細胞、１８継代）を用いた。
【００２８】
＜細胞培養＞
まず、各細胞に適切な培地（例えば、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製のα−ＭＥＭ又はＤＭＥＭ）に細胞とセラチン粒子を加え穏やかに混ぜて懸濁液を作製した。この懸濁液は、培地２００μｌ当たり、１０００個の細胞と１００個のゼラチン粒子が微細穴数分含まれるように調整した。この懸濁液２００μｌを、細胞非接着コーティングされた細胞培養基材１に播種し、３７℃５％ＣＯ２濃度のインキュベータ内で３時間〜３３時間培養した。その他の詳細な手順は、本発明者の一人が著者の一人である論文“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｇｅｌａｔｉｎ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ”（Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ  ７（２０１１）２７９７−２８０３）に記載の手順に従った。
【００２９】
＜評価方法＞
細胞培養後、細胞培養基材１の細胞及び培地を穏やかにピペッティングした後、市販のＦ底プレートに移し、顕微鏡で細胞凝集体の状態（形成の有無）を観察した。
【００３０】
＜比較実験＞
比較のために、市販の９６ウェルのＵ底プレート１Ｙ、Ｖ底プレート１Ｚを用いて、ｈＭＳＣ、ＭＣＦ−７を上記と同様に培養した。Ｕ底プレート１Ｙ、Ｖ底プレート１Ｚの形状は、それぞれ図４（Ａ）、図４（Ｂ）に示すとおりであり、各部のサイズは、図４（Ｃ）に示すとおりである。具体的には、Ｕ底プレート１Ｙ、Ｖ底プレート１Ｚにおいて、ウェルの開口部の直径Ｄ１１は６．９ｍｍであり、ウェルの軸方向深さＨ１１は１０．７ｍｍである。Ｖ底プレート１Ｚウェルの底部には略Ｖ字状（円錐状）の凹部が形成されており、この凹部の外径Ｄ３１は６．４ｍｍである。
【００３１】
これらのＵ底プレート１Ｙ、Ｖ底プレート１Ｚの１つのウェルに、１０００個の細胞と１００個のゼラチン粒子が含まれた培地の懸濁液２００μｌを播種した。その他の細胞培養の手順は、細胞培養基材１を用いた場合と同じである。
【００３２】
＜結果＞
図５（Ａ）は、細胞培養基材１Ａ（開口角θ＝６０°）を用いてｈＭＳＣを３時間培養して得られた細胞凝集体９を表す写真であり、図５（Ｂ）はこの細胞凝集体９をピペッティング後にＦ底プレートに移動させた状態を表す写真である。各図中の点線で示すように、細胞培養基材１Ａを用いてｈＭＳＣから形成された細胞凝集体９は、ピペッティング後も細胞凝集体としての形状を保持できていることがわかる。
【００３３】
図６（Ａ）は、細胞培養基材１Ａ（開口角θ＝６０°）を用いてＭＣＦ−７を２１時間培養して得られた細胞凝集体９を表す写真であり、図６（Ｂ）はこの細胞凝集体９をピペッティング後にＦ底プレートに移動させた状態を表す写真である。各図中の点線で示すように、細胞培養基材１Ａを用いてＭＣＦ−７から形成された細胞凝集体９は、ピペッティング後も細胞凝集体としての形状を保持できていることがわかる。
【００３４】
図７（Ａ）は、Ｕ底プレート１Ｙを用いてｈＭＳＣを５時間培養して得られた細胞凝集体９を表す写真であり、図７（Ｂ）はこの細胞凝集体９をピペッティング後にＦ底プレートに移動させた状態を表す写真である。各図中の点線で示すように、Ｕ底プレート１Ｙを用いてｈＭＳＣから形成された細胞凝集体９は、ピペッティング後に細胞凝集体としての形状を十分には保持できていない（細胞凝集体が細かく分解されている）ことがわかる。
【００３５】
図８（Ａ）は、Ｕ底プレート１Ｙを用いてＭＣＦ−７を３３時間培養して得られた細胞凝集体９を表す写真であり、図８（Ｂ）はこの細胞凝集体９をピペッティング後にＦ底プレートに移動させた状態を表す写真である。各図中の点線で示すように、Ｕ底プレート１Ｙを用いてＭＣＦ−７から形成された細胞凝集体９は、ピペッティング後に細胞凝集体としての形状を十分には保持できていない（細胞凝集体が細かく分解されている）ことがわかる。
【００３６】
図９は、以上のような観察を細胞培養基材１Ａ〜１Ｃ、Ｕ底プレート１Ｙ及びＶ底プレート１Ｚについて行なった結果をまとめたものである。細胞培養基材１Ａ〜１Ｃを用いた場合には、ｈＭＳＣに対しても、ＭＣＦ−７に対しても、良好な細胞凝集体９を形成することが可能であり、Ｕ底プレート１Ｙ及びＶ底プレート１Ｚの場合に比べて短時間で細胞凝集体９を形成することが可能であった。
【００３７】
Ｕ底プレート１Ｙ、Ｖ底プレート１Ｚの場合には、ｈＭＳＣから細胞凝集体９を形成することは可能であったが細胞培養基材１Ａ〜１Ｃの場合に比べて長い培養時間が必要であり、ＭＣＦ−７に対しては３３時間の培養を行なっても良好な細胞凝集体９を形成することができなかった。したがって細胞培養基材１Ａ〜１Ｃによれば、より短時間で細胞凝集体９を形成可能であり、細胞凝集体が形成されにくい細胞種に対しても細胞凝集体９を形成可能であると言える。
【実施例２】
【００３８】
本発明者らは、細胞凝集体のサイズの均一性に、微細穴５の形状がどのような影響を及ぼし得るかについて検証した。本実施例では、細胞培養基材１として、図３（Ａ）及び図３（Ｂ）に示す細胞培養基材１Ａ（開口角θ＝６０°）、細胞培養基材１Ｂ（開口角θ＝７５°）に加えて、細胞培養基材１Ｄ（開口角θ＝１２０°）を用いた。
【００３９】
細胞は、ＭＣＦ−７を用いた。用いたゼラチン粒子の粒子径は、２０〜３２μｍであった。本実施例では、培地２００μｌ当たり４００個の細胞と４０個のゼラチン粒子が微細穴数分含まれるように懸濁液を調整した。その他は実施例１と同様にして細胞培養を行った。細胞培養した時間は４８時間であった。
【００４０】
＜評価方法＞
細胞培養後、細胞培養基材１のウェル３内の細胞をピペッティングした後、市販のＦ底プレートに移し、細胞凝集体を蛍光顕微鏡（キーエンス社ＢＺ−Ｘ７１０）で観察し、蛍光顕微鏡付属の粒子径計測ソフトを用いて細胞凝集体のサイズを測定した。具体的には、細胞凝集体を蛍光染色し、写真（画像）を撮り、得られた画像を二値化して解析し、細胞凝集体の面積を求め、この細胞凝集体の面積から相対直径を算出した。直径の均一性（％）を、｛（直径平均±２０μｍ範囲内の細胞凝集体の個数／細胞凝集体の全個数）×１００｝の式により数値化した。
【００４１】
＜比較実験＞
比較のために、図１０に示す断面形状を有する微細穴を複数有する市販の培養プレート１Ｘを用いて、ＭＣＦ−７を上記と同様に培養した。この培養プレート１Ｘの微細穴の開口部の直径は４００μｍ〜５００μｍであり、深さは１００〜２００μｍであり、開口角は約１５０°であった。
【００４２】
＜結果＞
図１１（Ａ）は、細胞培養基材１Ａで培養した細胞凝集体の写真である。図１１（Ｂ）に示すように、細胞培養基材１Ａ（開口角θ＝６０°）の場合には、形成された細胞凝集体の全個数が１２１であり、細胞凝集体の直径平均は１８９μｍであり、標準偏差（Ｓ．Ｄ．）は２２μｍであった。上記｛式｝に基づくと、直径の均一性は、８７／１２１×１００＝約７２（％）となった。
【００４３】
図１２（Ａ）は、細胞培養基材１Ｂで培養した細胞凝集体の写真である。図１２（Ｂ）に示すように、細胞培養基材１Ｂ（開口角θ＝７５°）の場合には、形成された細胞凝集体の全個数が１０２であり、細胞凝集体の直径平均は２０１μｍであり、標準偏差は１８μｍであった。上記｛式｝に基づくと、直径の均一性は、８１／１０２×１００＝約７９（％）となった。
【００４４】
図１３（Ａ）は、細胞培養基材１Ｄで培養した細胞凝集体の写真である。図１３（Ｂ）に示すように、細胞培養基材１Ｄ（開口角θ＝１２０°）の場合には、形成された細胞凝集体の全個数が９２であり、細胞凝集体の直径平均は２１２μｍであり、標準偏差は２０μｍであった。上記｛式｝に基づくと、直径の均一性は、７１／９２×１００＝約７７（％）となった。
【００４５】
図１４（Ａ）は、培養プレート１Ｘで培養した細胞凝集体の写真である。図１４（Ｂ）に示すように、培養プレート１Ｘ（開口角θ＝１５０°）の場合には、形成された細胞凝集体の全個数が１０２であり、細胞凝集体の直径平均は１８９μｍであり、標準偏差は３０μｍであった。上記｛式｝に基づくと、直径の均一性は、５２／１０２×１００＝約５１（％）であった。
【００４６】
図１５は、以上の結果を細胞培養基材１Ａ，１Ｂ，１Ｄおよび培養プレート１Ｘについてまとめたものである。細胞培養基材１Ａ，１Ｂ，１Ｄを用いた場合には、いずれも７０％以上のサイズ均一性が得られた。これに対して培養プレート１Ｘ（開口角θ＝１５０°）を用いた場合には、約５１％のサイズ均一性が得られた。すなわち、細胞培養基材１Ａ，１Ｂ，１Ｄを用いた場合には、培養プレート１Ｘを用いる場合に比べて高いサイズ均一性が得られると言える。このことから、微細穴５の内周面の開口側の角度が６０°以上１２０°以下であるとよいことがわかる。
【実施例３】
【００４７】
本発明者らは、細胞培養基材１でハイドロゲル粒子を加えずに細胞培養することによって、ハイドロゲル粒子を用いて細胞凝集体を形成する場合と、ハイドロゲル粒子を用いないで細胞凝集体を形成する場合とに、細胞凝集体のサイズの均一性にどのような差が生じるかについて検証した。
【００４８】
本実施例では、細胞培養基材１として、図３（Ａ）及び図３（Ｂ）に示す細胞培養基材１Ｂ（開口角θ＝７５°）と細胞培養基材１Ｄ（開口角θ＝１２０°）とを用いた。細胞は、ＭＣＦ−７を用い、細胞培養基材１に２００μｌの培地を入れ、（４００×微細穴数）個の細胞を播種した。ゼラチン粒子は加えなかった。その他の培養手順は実施例２と同様に行った。評価も実施例２と同様に行った。
【００４９】
＜比較実験＞
比較のために、図１０に示す断面形状を有する微細穴を複数有する培養プレート１Ｘを用いて、ＭＣＦ−７を上記と同様に培養した。
【００５０】
＜結果＞
図１６（Ａ）は、細胞培養基材１Ｂで培養した細胞凝集体の写真である。図１６（Ｂ）に示すように、細胞培養基材１Ｂ（開口角θ＝７５°）の場合には、形成された細胞凝集体の全個数が１００であり、細胞凝集体の直径平均は１５９μｍであり、標準偏差の値は１８μｍであった。上記｛式｝に基づくと（実施例２参照）、直径の均一性は、７９／１００×１００＝約７９（％）となった。
【００５１】
図１７（Ａ）は、細胞培養基材１Ｄで培養した細胞凝集体の写真である。図１７（Ｂ）に示すように、細胞培養基材１Ｄ（開口角θ＝１２０°）の場合には、形成された細胞凝集体の全個数が１１９であり、細胞凝集体の直径平均は１５９μｍであり、標準偏差の値は１９μｍであった。上記｛式｝に基づくと、直径の均一性は、９６／１１９×１００＝約８１（％）となった。
【００５２】
図１８（Ａ）は、培養プレート１Ｘで培養した細胞凝集体の写真である。図１８（Ｂ）に示すように、培養プレート１Ｘ（開口角θ＝１５０°）の場合には、形成された細胞凝集体の全個数が１１７であり、細胞凝集体の直径平均は１５３μｍであり、標準偏差の値は２１μｍであった。上記｛式｝に基づくと、直径の均一性は、８５／１１７×１００＝約７３（％）となった。
【００５３】
図１９は、以上の結果を細胞培養基材１Ｂ，１Ｄ及び培養プレート１Ｘについてまとめたものである。ハイドロゲル粒子としてのゼラチン粒子を用いないで細胞凝集体を形成した場合には、細胞培養基材１Ｂ，１Ｄ及び培養プレート１Ｘのいずれにおいても７３％以上の高いサイズ均一性が得られた。つまり、ゼラチン粒子を用いない場合には開口角θが１５０°であっても高いサイズ均一性が得られることがわかる。一方、実施例２の結果より、ハイドロゲル粒子を用いて細胞を培養する場合には、開口角θが１５０°の場合はサイズ均一性が低下していることから、微細穴５の内周面５Ｓの開口部６側の角度（開口角θ）を６０°以上１２０°以下の値に設定することに技術的な意義があることがわかる。
【実施例４】
【００５４】
本発明者らは、細胞培養基材１に播種する細胞の個数とハイドロゲル粒子の個数とが、サイズ均一性にどのような差を発生させるかについて検証した。
【００５５】
本実施例では、細胞培養基材１として、図３（Ａ）及び図３（Ｂ）に示す細胞培養基材１Ｂ（開口角θ＝７５°）及び細胞培養基材１Ｄ（開口角θ＝１２０°）を用いた。
【００５６】
細胞は、ＭＣＦ−７を用いた。用いたゼラチン粒子の粒子径は、２０〜３１μｍであった。本実施例では、ＭＣＦ−７に適切な培地２００μｌに、１００個の細胞と１０個のゼラチン粒子、又は５００個の細胞と５０個のゼラチン粒子が、それぞれ微細穴数分含まれるように懸濁液を調整した。その他は実施例１と同様にして細胞培養を行った。評価は実施例２と同様に行った。
【００５７】
＜比較実験＞
比較のために、実施例２と同様に、図１０に示す断面形状を有する微細穴を複数有する市販の培養プレート１Ｘを用いて、ＭＣＦ−７を上記と同様に培養した。
【００５８】
＜結果＞
図２０に示すように、細胞培養基材１Ｂ（開口角θ＝７５°）の場合には、１つの微細穴５あたり１００個の細胞と１０個のゼラチン粒子とから形成された細胞凝集体の全個数が１０５であった。細胞凝集体の直径平均は１２４μｍであり、標準偏差の値は１７μｍである。上記｛式｝に基づくと、直径の均一性は約８１（％）となった。
【００５９】
図２１に示すように、細胞培養基材１Ｄ（開口角θ＝１２０°）の場合には、１つの微細穴５あたり１００個の細胞と１０個のゼラチン粒子とから形成された細胞凝集体の全個数が９５であった。細胞凝集体の直径平均は１３８μｍであり、標準偏差の値は１６μｍである。上記｛式｝に基づくと、直径の均一性は約８５（％）となった。
【００６０】
図２２に示すように、培養プレート１Ｘ（開口角θ＝１５０°）の場合には、１つの微細穴５あたり１００個の細胞と１０個のゼラチン粒子とから形成された細胞凝集体の全個数が１０７であった。細胞凝集体の直径平均は１０２μｍであり、標準偏差の値は２２μｍである。上記｛式｝に基づくと、直径の均一性は約６７（％）となった。
【００６１】
図２３に示すように、細胞培養基材１Ｂ（開口角θ＝７５°）の場合には、１つの微細穴５あたり５００個の細胞と５０個のゼラチン粒子とから形成された細胞凝集体の全個数が９１であった。細胞凝集体の直径平均は１９３μｍであり、標準偏差の値は２３μｍである。上記｛式｝に基づくと、直径の均一性は約６７（％）となった。
【００６２】
図２４に示すように、細胞培養基材１Ｄ（開口角θ＝１２０°）の場合には、１つの微細穴５あたり５００個の細胞と５０個のゼラチン粒子とから形成された細胞凝集体の全個数が８９であった。細胞凝集体の直径平均は２２０μｍであり、標準偏差の値は２５μｍである。上記｛式｝に基づくと、直径の均一性は約６６（％）となった。
【００６３】
図２５に示すように、培養プレート１Ｘ（開口角θ＝１５０°）の場合には、１つの微細穴５あたり５００個の細胞と５０個のゼラチン粒子とから形成された細胞凝集体の全個数が１１８であった。細胞凝集体の直径平均は１７２μｍであり、標準偏差の値は３５μｍである。上記｛式｝に基づくと、直径の均一性は約６６（％）となった。
【００６４】
図２６は、図２０〜図２２に示す結果を細胞培養基材１Ｂ，１Ｄ及び培養プレート１Ｘについてまとめたものである。図２７は、図２３〜図２５に示す結果を細胞培養基材１Ｂ，１Ｄ及び培養プレート１Ｘについてまとめたものである。１つの微細穴５あたり１００個の細胞と１０個のゼラチン粒子とから細胞凝集体を形成する場合には、開口角θが１２０°以下であることにより、細胞凝集体９のサイズに高い均一性が得られることがわかる。これは、上記の実施例２の場合（１つの微細穴５あたり４００個の細胞と４０個のゼラチン粒子とから細胞凝集体を形成する場合）と同様な結果が得られたことがわかる。
【００６５】
一方、１つの微細穴５あたり５００個の細胞と５０個のゼラチン粒子とから細胞凝集体を形成する場合には、細胞培養基材１Ｂ，１Ｄ及び培養プレート１Ｘによって形成される細胞凝集体９のサイズに均一性の差はほとんど見られなかった。これは、微細穴５の容積に対して細胞数およびゼラチン粒子の数が多いため、微細穴５内の細胞やゼラチン粒子が、この微細穴５に隣接する別の微細穴５内の細胞やゼラチン粒子と接着したためであると推察される。所望する細胞凝集体９のサイズや種類に応じてこのような接着を抑制するためには、隣り合う微細穴５，５の間に形成される底部４（平坦部）の長さＬ１、微細穴５の形状、微細穴５の底面の形状、微細穴５の軸方向深さＨなどを最適化するとよい。
【実施例５】
【００６６】
本発明者らは、細胞の個数に対するハイドロゲル粒子の個数比が、サイズ均一性にどのような差を発生させるかについて検証した。上述の実施例１〜４においては、細胞数の１／１０の数のハイドロゲル粒子を含む懸濁液を用いた。
【００６７】
本実施例では、細胞培養基材１として、細胞培養基材１Ｄ（開口角θ＝１２０°）を用いた。
【００６８】
細胞は、ＭＣＦ−７を用いた。用いたゼラチン粒子の粒子径は、２０〜３１μｍであった。本実施例では、培地２００μｌに、２５０個の細胞と５０個のゼラチン粒子、又は２５０個の細胞と８１個のゼラチン粒子が、それぞれ微細穴数分含まれるように懸濁液を調整した。その他は実施例１と同様にして細胞培養を行った。評価は実施例２と同様に行った。
【００６９】
＜比較実験＞
比較のために、実施例２と同様に、図１０に示す断面形状を有する微細穴を複数有する市販の培養プレート１Ｘを用いて、ＭＣＦ−７を上記と同様に培養した。
【００７０】
＜結果＞
図２８に示すように、｛（直径平均±１０μｍ範囲内の細胞凝集体の個数／細胞凝集体の全個数）×１００｝の式により求めた細胞凝集体の直径の均一性（％）を示す。細胞の個数に対してゼラチン粒子の個数の占める割合が低い方（細胞数：粒子数＝５：１の方）が、高い場合（細胞数：粒子数＝３：１の場合）に比べてサイズに高い均一性が得られていることがわかる。
【００７１】
図２９は、細胞数：粒子数＝３：１で培養した細胞凝集体の状態を表す写真である。図２９中の点線で示すように、細胞凝集体から離れたところにゼラチン粒子が多数存在していることがわかる。以上のことから、細胞培養基材１を用いる場合、細胞と一緒に播種するハイドロゲル粒子の数は、細胞数の１／１０以上１／５以下が好ましいことがわかる。
【００７２】
以上、実施の形態について説明したが、上記の開示内容はすべての点で例示であって制限的なものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【符号の説明】
【００７３】
１，１Ａ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｄ  細胞培養基材、１Ｘ  培養プレート、１Ｙ  Ｕ底プレート、１Ｚ  Ｖ底プレート、２  上面、３  ウェル、４  底部、５  微細穴、５Ｓ  内周面、６  開口部、９  細胞凝集体。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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