(57)【要約】【課題】非電荷薬物であっても、その苦味の強さをより高い精度で評価できる方法及び装置を提供すること。【解決手段】微生物の苦味評価方法を実行するための苦味評価装置１００を、ヒトの苦味受容体を発現している培養細胞を収容した収容部１１と、当該収容部１１に、試験物質を溶解または分散させた溶媒を添加する試料添加部１２と、当該試験物質を接触させた当該培養細胞内の苦味受容体の活性を測定する測定部１３と、測定部１３で取得された苦味受容体の活性情報に基づいて当該試験物質の苦味の強さを評価する制御部２１と、を備えて構成する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験物質を溶解または分散させた溶媒を、ヒトの苦味受容体を発現している培養細胞に接触させる工程と、
当該培養細胞内の苦味受容体の活性を測定する工程と、
当該苦味受容体の活性に基づいて当該試験物質の苦味の強さを評価する工程と、
を有することを特徴とする苦味評価方法。
【請求項２】
前記培養細胞が、ヒト十二指腸上皮付着細胞に由来するものである、請求項１に記載の苦味評価方法。
【請求項３】
前記培養細胞が、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R44、TAS2R46、TAS2R49、TAS2R50及びTAS2R60から選ばれる１種以上の苦味受容体を発現している培養細胞である、請求項１又は２に記載の苦味評価方法。
【請求項４】
前記試験物質が、水に難溶性であり、かつ、非電荷の物質である、請求項１〜３のいずれかに記載の苦味評価方法。
【請求項５】
前記苦味受容体の活性が、前記培養細胞内のカルシウム濃度である、請求項１〜４のいずれかに記載の苦味評価方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の苦味評価方法を実行するための装置であって、
ヒトの苦味受容体を発現している培養細胞を収容した収容部と、
当該収容部に、試験物質を溶解または分散させた溶媒を添加する試料添加部と、
当該試験物質を接触させた当該培養細胞内の苦味受容体の活性を測定する測定部と、
当該苦味受容体の活性に基づいて当該試験物質の苦味の強さを評価する制御部と、
を備えたことを特徴とする苦味評価装置。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、苦味評価方法及び苦味評価装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
小児の薬物治療において、薬の苦味が服薬困難・拒否を起こす大きな問題となっている。しかしながら、小児の味覚の特性についての知見は乏しく、その現状は不明な点が多い。その理由の一つとして、薬剤の味の測定が難しいことが挙げられる。
【０００３】
特定の味覚に対して選択的に応答する人工脂質膜を被検物質溶液に浸し、被検物質との相互作用によって生じる膜電位変化を測定することにより、被検物質の苦味強度を数値化できる人工脂質膜センサーが知られている（例えば、非特許文献１、特許文献１参照）。あるいは人工脂質膜の代わりに電気化学を利用した官能膜を用いたセンサーも知られているが、同様に電気化学センサーと参照電極間の電位差を信号として検出する（例えば、非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Kobayashi Y et al., “Advanced Taste Sensors Based on Artificial Lipids with Global Selectivity to Basic Taste Qualities and High Correlation to Sensory Scores”, Sensors (www.mdpi.com/journal/sensors), Volume 10, Issue 4, p.3411-344, April 2010
【非特許文献２】吉田浩一、「小児製剤開発における電子味覚・嗅覚システムの有用性」、薬剤学, 75 (1), 48-53 (2015)
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第4480839号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
近年、新薬の多くが電荷を持たない物質であるところ、上記の先行技術では、脂質膜に結合しない非電荷薬物の測定が原理的に不可能であるという問題があった。
【０００７】
また、官能検査による評価は、パネラーの個人差や体調等でバラつきがあり、再現性の高い検査が行えない。さらに、パネラーの健康のために検査できる量も限られてしまい、効率的な検査が行えないという問題があった。
【０００８】
本発明は、上記の事情に鑑みて為されたもので、非電荷薬物であっても、その苦味の強さをより高い精度で評価できる方法及び装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の目的を達成するため鋭意研究を重ねた結果、ヒトの苦味受容体を発現している培養細胞を苦味センサーとして用いることで、非電荷薬物についても苦味の強さをより高い精度で評価できることを知見した。つまり、本発明者らは、モデル薬物として非電荷薬物であるプレドニゾロンを用いて、これを溶媒に溶解させ、ヒトの苦味受容体を発現している培養細胞に添加し接触させた後に、当該細胞内の苦味受容体の活性を示すカルシウム濃度を指標として、薬物の苦味の強さを評価できることを知見し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本願に係る苦味評価方法は、試験物質を溶解または分散させた溶媒を、ヒトの苦味受容体を発現している培養細胞に接触させる工程と、当該培養細胞内の苦味受容体の活性を測定する工程と、当該苦味受容体の活性に基づいて当該試験物質の苦味の強さを評価する工程と、を有することを特徴とする。
【００１１】
また、本願に係る苦味評価装置は、ヒトの苦味受容体を発現している培養細胞を収容した収容部と、当該収容部に、試験物質を溶解または分散させた溶媒を添加する試料添加部と、当該試験物質を添加して所定時間接触させた当該細胞内の苦味受容体の活性を測定する測定部と、当該苦味受容体の活性に基づいて当該試験物質の苦味の強さを評価する制御部と、を備えたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、臨床現場において苦味による服薬拒否の声が多く、また従来技術による苦味測定が困難な非電荷薬物であっても、その苦味の強さをより高い精度で評価できる方法及び装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の実施形態に係る苦味評価方法を実行する苦味評価装置の全体構成を示す概略図である。
【図２Ａ】実施例１におけるコントロール（薬物無添加）の蛍光顕微鏡像図である。
【図２Ｂ】実施例１における1mMキニーネ添加区の蛍光顕微鏡像図である。
【図２Ｃ】実施例１における1mMプレドニゾロン添加区の蛍光顕微鏡像図である。
【図２Ｄ】実施例１における1mMヒドロコルチゾン添加区の蛍光顕微鏡像図である。
【図３Ａ】実験例１におけるRU486を前処置していないＨｕｔｕ  ８０細胞に1mMプレドニゾロンを添加したときの蛍光顕微鏡像図である。
【図３Ｂ】実験例１における10μM RU486を前処置したＨｕｔｕ  ８０細胞に1mMプレドニゾロンを添加したときの蛍光顕微鏡像図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本願の一実施形態である苦味評価方法は、試験物質を分散させた溶媒を、ヒトの苦味受容体を発現している培養細胞に接触させる工程と、当該培養細胞内の苦味受容体の活性を測定する工程と、当該苦味受容体の活性に基づいて当該試験物質の苦味の強さを評価する工程と、を有することを特徴とするものである。
【００１５】
苦味受容体（ＴＡＳ２Ｒ）は、おもに舌の味蕾に発現するＧ蛋白質共役型受容体である。苦味受容体は多様性を持つことが特徴で、ヒトでは２６種類のＴＡＳ２Ｒ遺伝子が存在し、多種類かつ異なるリガンドを受容することができることが知られている。ここで、培養細胞は、多様なヒトの苦味受容体のうち、TAS2R4、TAS2R5、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R44、TAS2R46、TAS2R49、TAS2R50及びTAS2R60から選ばれる１種以上を発現している培養細胞であることが好ましい。個々の苦味受容体がどの苦味物質に対応しているか十分に解明されてないのが現状であるが、実際のヒトの味覚に近い評価を実施するためには、多くの苦味を網羅できるよう少なくとも5種以上の苦味受容体を発現している培養細胞を用いることが好ましく、基質特異性の広いTAS2R4、TAS2R14、TAS2R38、TAS2R39及びTAS2R46を発現しているものがより好ましい。さらには、よりヒトの味覚に近い評価を行うにはヒト由来培養細胞であることが好ましい。
【００１６】
このような培養細胞は、ＡＴＣＣなどの細胞バンクに保管されている既知の培養細胞（例えば、ヒト十二指腸上皮付着細胞ＨｕＴｕ  ８０（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−４０（登録商標））またはその突然変異株を用いることができる。また、常法により所望のＴＡＳ２Ｒ遺伝子を組み込んで、苦味受容体を安定に発現する形質転換細胞を作製することも可能である。具体的には、ＴＡＳ２Ｒをコードするポリヌクレオチドの塩基配列情報を公知のデータベース（DDBJ／GenBank／EMBL等）から取得し、目的の遺伝子領域を増幅するためのプライマーを設計し、ヒトのゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ等を鋳型にしてＰＣＲ等を行うことで、ＴＡＳ２Ｒをコードするポリヌクレオチドを取得することができる。なお、上記の苦味受容体をコードするポリヌクレオチドの塩基配列情報については、以下に例示することができる。例えば、TAS2R4：配列表の配列番号１、TAS2R5：配列番号２、TAS2R13：配列番号３、TAS2R14：配列番号４、TAS2R16：配列番号５、TAS2R38：配列番号６、TAS2R39：配列番号７、TAS2R40：配列番号８、TAS2R44：配列番号９、TAS2R46：配列番号１０、TAS2R49：配列番号１１、TAS2R50：配列番号１２、TAS2R60：配列番号１３、であるがこれらに限定されない。上記の苦味受容体は、公知のデータベースから取得された、または上記で例示した塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる苦味受容体のみに限定されず、当該ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する苦味受容体であれば特に限定されない。ここで、実質的に同一のアミノ酸配列とは、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。「１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されることを意味する。このような変異タンパク質は、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するタンパク質に限定されるものではなく、天然に存在するタンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００１７】
次いで、宿主細胞の種類に応じて選択されるプラスミド等の適当な発現ベクターに、当該ポリヌクレオチドと、当該ポリヌクレオチドを発現させることができる適当なプロモーター配列と、を常法により組み込むことで、当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを作製することができる。さらに、当該発現ベクターを用いて常法により宿主細胞を形質転換することで、所望の苦味受容体を安定に発現する形質転換細胞を作製することができる。なお、培養細胞の維持または増殖は、細胞の種類に応じて公知の方法で適切に保管または培養を行うことにより可能である。
【００１８】
本実施形態の方法では、まず、当該培養細胞と、水または適当な培地と、を図１に示す収容部１１に収容する。ここで、培地としては、培養細胞の生存に悪影響を及ぼさないものであれば特に制限されない。なお、後述する細胞内カルシウム濃度を測定する工程において、カルシウムイメージング法を用いる場合は、培養細胞は事前にカルシウムイオン感受性色素（蛍光指示薬）を添加し、色素を細胞内に取り込ませたものを用いる。
【００１９】
本発明者らがHuTu-80にプレドニゾロンを含む様々な苦味物質の作用を検討したところ、物質によって程度の差はあれ、応答能を有することが明らかとなった。その中では、苦味の代表薬物であるキニーネに最も強い応答を示し、ついでプレドニゾロンとヒドロコルチゾンに対して中程度の応答を示した。したがって、本実施形態において評価対象である試験物質は、苦味の強さを評価することを所望する物質であれば、特に制限されない。試験物質は、天然に存在する物質であっても、化学的または生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよく、また新規化合物であっても、組成物もしくは混合物であってもよい。例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、あるいは微生物、動植物等由来の天然成分等が挙げられる。
【００２０】
従来技術においては、原理的に試験物質を水中に溶解する必要があり、脂質膜に結合または吸着しない非電荷物質の苦味を測定することは不可能であった。一方、本願の苦味評価方法及び苦味評価装置は、水に難溶性の物質や、非電荷物質についても評価対象とすることができるが、試験物質を培養細胞に添加するにあたり、適当な溶媒を用いて当該試験物質を溶媒中に溶解または分散させる必要がある。したがって本実施形態では、次に、試験物質と溶媒とを図１に示す試料添加部１２に投入し、撹拌することで試験物質を溶媒中に分散または溶解させる。この溶媒は、試験物質の極性や、培養細胞への影響の有無などを考慮して適宜選択する。特に、試験物質が水に難溶性であり、かつ、非電荷の物質である場合は、溶媒としてジメチルスルホキシドを用いて分散させることが好ましい。
【００２１】
そして、試験物質と溶媒との混合物を、収容部１１に収容した培養細胞に添加し、接触させる。培養細胞に対する試験物質の添加濃度としては、試験物質を苦味受容体に確実に結合させる観点から、培養液中における試験物質の濃度として50μＭ〜1ｍＭとなるように添加することが好ましい。苦味物質を培養細胞に添加し、苦味物質が苦味受容体に結合すると、苦味受容体が活性化し、そのシグナルが直ちに伝わって細胞内のカルシウム濃度が上昇する。したがって、試験物質を添加してから、苦味受容体の活性を測定するまでの時間、すなわち試験物質を培養細胞に接触させる時間は、短時間でよく、例えば数10秒間〜６０分間とすることができる。
【００２２】
さらに、培養細胞の苦味受容体の活性、つまりは培養細胞内のカルシウム濃度を、図１に示す測定部１３を用いて測定する。培養細胞内のカルシウム濃度を測定する方法は特に限定されず、市販の試薬やキットを用いて行うことができる。例えば、カルシウムイオンと結合することで蛍光を発する色素（例えばＦｌｕｏ  ４−ＡＭ、（株）同仁化学研究所製）を使用して、細胞を着色することで、カルシウム濃度の上昇を可視化できるカルシウムイメージング法を用いてもよい。本技術によれば、カルシウム濃度が高いほど蛍光強度も強くなるので、蛍光強度を測定することで定量的なカルシウム濃度の測定が可能である。
【００２３】
最後に、測定した苦味受容体の活性（すなわち、培養細胞内のカルシウム濃度または蛍光強度）に基づいて当該試験物質の苦味の強さを評価する。培養細胞内のカルシウム濃度およびその指標としての蛍光強度は、試験物質の苦味の強さに比例して上昇する。したがって、培養細胞内の苦味受容体の活性（カルシウム濃度または蛍光強度）に基づいて試験物質の苦味の強さを評価することができる。苦味評価の具体的な態様として、複数の試験物質（そのうち１つは既知の苦味を呈する基準物質であってもよい。）を、異なるウェル（図１に示す収容部１１）に収容された培養細胞にそれぞれ添加し、苦味受容体の活性をそれぞれ測定する。得られた測定値を比較して、より高い活性（カルシウム濃度または蛍光強度）を示す試験物質が、より強い苦味を呈すると評価することができる。その逆に、より低い活性（カルシウム濃度または蛍光強度）を示す試験物質が、より弱い苦味を呈すると評価することができる。なお、上記の苦味評価は図１に示す制御部２１により行われる。
【００２４】
本実施形態では、ヒトの苦味受容体を発現している培養細胞を苦味センサーとして利用することにより、従来の人工脂質膜を用いた味覚センサーに比べて、より人間の味覚に近い評価を行うことが可能である。また、水に難溶性であり、かつ、非電荷の物質についても適用可能であり、しかも苦味物質を培養細胞に添加してから極めて短時間で反応することから、効率よく苦味評価を行うことができる。
【００２５】
次に、上記した本実施形態に係る苦味評価方法を実施するための苦味評価装置の実施形態について、図面を参照しながら説明する。図１は、本実施形態に係る苦味評価装置１００の全体構成を示す概略図である。
【００２６】
図１に示すように、本実施形態に係る苦味評価装置１００は、試験物質を溶解または分散させた溶媒を、人の苦味受容体を発現している培養細胞Ｃに接触させた後に、当該細胞内の苦味受容体の活性を測定することにより、当該試験物質についての特性情報（苦味受容体の活性情報）を取得する特性情報取得装置１０と、苦味評価装置１００全体の動作を制御し、特性情報取得装置１０で取得した特性情報に基づいて当該試験物質の苦味の強さを評価する情報処理装置２０と、を備えている。
【００２７】
特性情報取得装置１０は、ヒトの苦味受容体を発現している培養細胞Ｃを収容する収容部１１と、当該収容部１１に、試験物質を溶解または分散させた溶媒を添加する試料添加部１２と、当該試験物質を添加して接触させた当該培養細胞Ｃ内の苦味受容体の活性を測定する測定部１３と、を備えている。測定部１３は、カルシウム濃度指示薬などを用いて培養細胞内の苦味受容体の活性を測定する機能を有し、培養細胞Ｃに対してカルシウム濃度を検出するための所定の波長を有する励起光を照射する励起光照射部１４と、当該励起光の照射によって培養細胞Ｃから発せられたカルシウム濃度に応じた蛍光を検出し、その強度を測定する検出部１５と、を備えている。本実施形態では、苦味受容体の活性の指標であるカルシウム濃度の測定法として上述のカルシウムイメージング法を用いることができるが、これに限定されない。なお、収容部１１と試料添加部１２の組み合わせを複数備えることによって、複数の試験物質について同時に苦味評価を行うこともできる。
【００２８】
収容部１１には、培養細胞Ｃ（カルシウムイメージング法を用いる場合には、予めカルシウムイオン感受性色素を添加して培養細胞Ｃ内に取り込ませておく）と、水または適当な培地と、を収容する。試料添加部１２は、外部から投入された試験物質と溶媒とを撹拌し、溶媒中に試験物質を分散または溶解した後、当該試験物質と溶媒との混合物を収容部１１に添加する。励起光照射部１４は、所定の波長を有する励起光（カルシウムイメージング法を用いる場合には、前記したカルシウムイオン感受性色素に適した波長を有するもの）を、培養細胞Ｃ（を収容した収容部１１）に向けて照射する。検出部１５は、培養細胞Ｃから発せられた蛍光を受光し、その蛍光強度に応じた検出信号を生成して情報処理装置２０へと出力する。
【００２９】
情報処理装置２０は、制御部２１と、記憶部２２と、入力部２３と、表示部２４と、出力部２５と、等を備えて構成される。情報処理装置２０は、例えば、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）などからなる。
【００３０】
制御部２１は、ＣＰＵなどから構成される。制御部２１は、試料添加部１２の撹拌や添加の制御、励起光照射部１４の照射の制御など、特性情報取得装置１０の動作を含む、苦味評価装置１００全体の動作を制御する。また、制御部２１は、特性情報取得装置１０から入力される検出信号に基づいて、各試験物質に関する特性情報（苦味受容体の活性情報）を生成し、この特性情報と記憶部２２に記憶された他の試験物質に関する特性情報（あるいは既知の苦味を呈する基準物質に関するカルシウム濃度の基準値情報）を比較して、各試験物質の苦味の強さを評価する機能を有している。
【００３１】
記憶部２２は、例えば、ＲＯＭ、（Read Only Memory）、ＲＡＭ（Random Access Memory）、フラッシュメモリ、ハードディスクなどから構成される。記憶部２２には、苦味評価装置１００の動作に必要な各種プログラムや、各種情報が記憶される。また、記憶部２２には、苦味評価結果などを記憶してもよい。
【００３２】
入力部２３は、キーボード、マウス、タッチパネル等からなり、苦味評価の開始指示、結果の出力指示等、ユーザから入力される指示を受け付ける。表示部２４は、液晶ディスプレイ等からなり、制御部２１の制御の下、特性情報取得装置１０で取得した特性情報、制御部２１で行った苦味評価結果などが表示される。出力部２５は、レーザプリンタ等のプリンタからなる。出力部２５は、制御部２１の制御の下、苦味評価結果などの各種情報を印刷して出力する。
【００３３】
なお、情報処理装置２０としてタブレット端末やモバイル端末を用いれば、より手軽に使用できる苦味評価装置を提供することができる。また、情報処理装置２０をマイコンとし、このマイコンを特性情報取得装置１０に組み込んでもよく、よりコンパクトな苦味評価装置１００を提供することができる。また、情報処理装置２０が、クラウドサーバ上であってもよく、ユーザ側の特性情報取得装置１０で取得した蛍光強度をクラウドサーバに適宜の通信手段を介して送信し、クラウドサーバで行った苦味評価結果をユーザ側で受信する構成とすることもできる。
【実施例】
【００３４】
（実施例１）
ヒト十二指腸上皮付着細胞Ｈｕｔｕ  ８０を用い、水に難溶性かつ非電荷の薬物の代表例であるプレドニゾロンについて、カルシウムイメージング法による苦味の評価が可能であるか検討した。Ｈｕｔｕ  ８０は、ヒトの苦味受容体であるTAS2R4、TAS2R5、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R16、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R44、TAS2R46、TAS2R49、TAS2R50及びTAS2R60を発現していること、並びに、いくつかの苦味物質に対して応答することが報告されている（Rozengurt, N., S. et al. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 291: G792-G802, 2006.及びLe Neve B. et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 299: G1368-G1375, 2010.参照）。
【００３５】
・使用細胞：ヒト十二指腸上皮付着細胞Ｈｕｔｕ  ８０（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−４０（登録商標））  ＡＴＣＣより入手、培養にはウシ胎児血清（biosera、Lot：013BS802）を10 ％加えたE-MEM（和光）を使用した。
【００３６】
・カルシウム蛍光指示薬：Ｆｌｕｏ  ４−ＡＭ（株式会社同仁化学研究所製）、使用時にFluo-4-AM 50μgにDMSO 50μLを添加して溶解させた（用時調製）
【００３７】
・ＰＢＳ：NaCl（和光）8g 、KCL（和光）0.2g 、KH２PO４（和光）0.2g 、Na２HPO４ (和光)1.15g を混合し、純水を加えて全量を1Lとした。
・Recording Medium：20 mM HEPES、115 mM NaCl、5.4 mM KCL、0.8 mM MgCl２、 1.8 mM CaCl２（和光）、13.8 mMグルコース（和光）にKOH添加によりpH 7.4に調製し、0.2 μmフィルターでフィルター滅菌後、冷蔵（4℃）で保存した。
・Loading Buffer：Recording Medium 10mLにFluo-4-AM 50μg及びDMSO 50μLを添加して溶解（＝0.9mmol/L）した溶液を添加した。
【００３８】
・被検薬物：
（１）プレドニゾロン（(11β)-11,17,21-Trihydroxypregna-1,4-diene-3,20-dione（式１参照）、和光純薬（株）製  Lot ECN5909）、使用時にプレドニゾロン 36  mgにDMSO１ｍLを添加して溶解させた（用時調製）
（２）ヒドロコルチゾン（プレドニゾロン類似物質、(11β)-11,17,21-trihydroxypregn-4-ene-3,20-dione（式２参照）、和光純薬（株）製  Lot LKG5586）、使用時にヒドロコルチゾン ３６．２mgにDMSO １ｍLを添加して溶解させた（用時調製）
（３）キニーネ塩酸塩（代表的苦味薬物、ナカライテスク（株）製  Lot M9K8160）
【００３９】
【数１】
2020120624.tif 000003
【００４０】
【数２】
2020120624.tif 000004
【００４１】
被検薬物添加に対する細胞の応答は、細胞内カルシウム濃度変化を細胞内に取り込ませた蛍光指示薬の蛍光強度変化で測定するカルシウムイメージング法を用いて解析した。HuTu-80を播種した3cmシャーレの培地をアスピレーターにより取り除き、PBS 2mLで洗った。次に蛍光指示薬を含むLoading Bufferを1mLずつ各シャーレに加え、37 ℃で1時間インキュベートした。Loading Bufferを取り除いた後、Recording Medium 各1mLずつを加えた。その後、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、キニーネの各薬物を最終濃度1mmol/Lになるように培地に添加し、10分間37 ℃でインキュベートした後、蛍光顕微鏡（落射蛍光倒立顕微鏡  ECLIPSE TE300（Nikon製））で細胞内Ca２＋濃度の変化を観察した。コントロールとしては細胞内にカルシウム検出試薬を導入した無処理の細胞を用いた。
【００４２】
蛍光顕微鏡写真を図２Ａ〜図２Ｄに示す。図２Ａはコントロール（薬物無添加）、図２Ｂはキニーネ添加区、図２Ｃはプレドニゾロン添加区、図２Ｄはヒドロコルチゾン添加区、をそれぞれ示す。
【００４３】
その結果、プレドニゾロンおよびヒドロコルチゾンを添加した細胞は、コントロールに比べて蛍光の強度が増加した。両者の蛍光の強度はほぼ同等であった。一方、キニーネを添加した場合にはより強い蛍光を発した。
【００４４】
本実施形態においては、蛍光プレートリーダーを用いて細胞の蛍光強度を経時的に測定して蛍光の強度を数値化し、苦味受容体の活性の指標である細胞内カルシウム濃度の変化を定量的に検出することが可能である。その場合、蛍光強度の測定は、励起波長495nm、検出波長515nmで行うことができる。そして、苦味受容体の活性の指標であるカルシウム濃度が被検物質の苦味の強さと相関していることは既に公知であるから、上記のように苦味受容体の活性が定量的に検出可能であれば、被検物質の苦味の強さを評価することも十分に可能である。
【００４５】
以上の結果から、本願の苦味評価方法及び苦味評価装置により、水に難溶性かつ非電荷の薬物についても苦味の強さを評価できることが示された。
【００４６】
（実験例１）
実施例１で用いたＨｕｔｕ  ８０細胞はステロイド受容体も発現していることが知られている。プレドニゾロンはステロイド受容体への結合が考えられるため、ステロイド受容体拮抗薬を用いてステロイド受容体を阻害した条件で苦味応答性への影響を検討した。
【００４７】
プレドニゾロンによる蛍光指示薬の蛍光強度変化がステロイド受容体を介してのものかを検討するため、細胞に蛍光指示薬を取り込ませる前に、ステロイド受容体拮抗薬Mifepristone (RU-486) （Cayman Chemica製）を10μMになるよう培地に直接添加し、1時間インキュベートした。その後、実施例１と同様に、Loading Bufferに培地を交換し、細胞に蛍光指示薬を取り込ませた。その後、ステロイド受容体拮抗薬処理細胞と、未処理細胞それぞれについて、Loading Bufferを取り除いた後、Recording Medium 各1mLずつを加えた。最終濃度1 mMになるようにプレドニゾロンを添加し、10分間37 ℃でインキュベートした後、実施例１と同様にしてその蛍光の様子を観察した。プレドニゾロン添加後の蛍光顕微鏡写真を図３Ａ、図３Ｂに示す。図３Ａはコントロール（プレドニゾロンのみ添加）、図３ＢはRU486添加区（RU486処理後、プレドニゾロン添加）、をそれぞれ示す。
【００４８】
その結果、RU486前処理した細胞にプレドニゾロンを添加した場合においても無処理のものと同様の蛍光強度の上昇が観察され、プレドニゾロンの刺激応答に対してステロイド受容体拮抗薬の影響は認められなかった。したがって、プレドニゾロンはステロイド受容体を介してＨｕｔｕ  ８０細胞に作用しているのではなく、苦味受容体を介している（苦味受容体に結合している）ことが示唆された。
【００４９】
以上、本発明の実施例を詳述してきたが、上記各実施例は本発明の例示にしか過ぎないものであり、本発明は上記各実施例の構成にのみ限定されるものではない。本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計の変更等があっても、本発明に含まれることは勿論である。
【符号の説明】
【００５０】
１１  収容部    １３  測定部    ２１  制御部    １００  苦味評価装置
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【配列表】
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