(57)【要約】【課題】悪性の膵胆道系疾患を判定する技術を提供することを目的とする。【解決手段】被験者が悪性の膵胆道系疾患を有するか否かを判定するためのデータ収集方法であって、前記被験者由来の生体試料中の、ｍｉＲ−１２４７遺伝子、ｍｉＲ−２００ａ遺伝子又はｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合を測定することを含み、前記割合が対照と比較して高いことが、前記被験者が悪性の膵胆道系疾患を有することを示す、データ収集方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者が悪性の膵胆道系疾患を有するか否かを判定するためのデータ収集方法であって、
前記被験者由来の生体試料中の、ｍｉＲ−１２４７遺伝子、ｍｉＲ−２００ａ遺伝子又はｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合を測定することを含み、
前記割合が対照と比較して高いことが、前記被験者が悪性の膵胆道系疾患を有することを示す、データ収集方法。
【請求項２】
前記生体試料が血液であり、
前記メチル化されたシトシン残基の割合の測定を、ｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基について行い、
ｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおける前記シトシン残基が、配列番号１で示されるｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターの塩基配列における第第９１番目のシトシン残基である、請求項１に記載のデータ収集方法。
【請求項３】
前記生体試料が胆汁であり、
ｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおける前記シトシン残基が、配列番号１で示されるｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターの塩基配列における第２６番目、第４９番目、第６９番目、第７８番目、第８９番目、第９１番目、第９４番目及び第１０４番目のシトシン残基からなる群より選択されるシトシン残基であり、
ｍｉＲ−２００ａ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおける前記シトシン残基が、配列番号２で示されるｍｉＲ−２００ａ遺伝子のプロモーターの塩基配列における第８０番目、第８６番目、第１５６番目、第１７５番目及び第１９７番目のシトシン残基からなる群より選択されるシトシン残基であり、
ｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおける前記シトシン残基が、配列番号３で示されるｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターの塩基配列における第７４番目、第１５６番目、第１６０番目、第１６７番目、第１７８番目及び第１８６番目のシトシン残基からなる群より選択されるシトシン残基である、請求項１に記載のデータ収集方法。
【請求項４】
前記悪性の膵胆道系疾患が膵癌又は胆道癌である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のデータ収集方法。
【請求項５】
亜硫酸水素塩、及び、ｍｉＲ−１２４７遺伝子、ｍｉＲ−２００ａ遺伝子又はｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドを増幅するプライマー、を含む、悪性の膵胆道系疾患を有するか否かの判定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性の膵胆道系疾患を有するか否かを判定するためのデータ収集方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
膵癌は、５年生存率が７％程度であり、すべての癌の中で最も予後不良の癌である。膵癌症例のうち、腫瘍径１ｃｍ以下の小膵癌で診断される割合は０．８％程度であり、腫瘍径２ｃｍ以下の膵癌で診断される割合は１０％前後である。このように、膵癌を小病変の段階で発見することは現状難しい状況にある。
【０００３】
一方、膵癌を小病変の段階で発見することができれば比較的良好な予後が期待できる。例えば、ＴＳ１ａ（腫瘍径３〜１０ｍｍ）の膵癌の５年生存率は８０．４％であり、国際対がん連合（ＵＩＣＣ）分類のＳｔａｇｅ  ０の膵癌の５年生存率は８５．８％である。
【０００４】
したがって、膵癌等の悪性の膵胆道系疾患を早期に発見する技術が求められている。例えば、非特許文献１には、ＣＤ１Ｄ遺伝子のメチル化が膵癌のマーカーとして有用であることが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kisiel J. B., et al., New DNA Methylation Markers for Pancreatic Cancer: Discovery, Tissue Validation, and Pilot Testing in Pancreatic Juice, Clin Cancer Res., 21 (19), 4473-4481, 2015.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このような背景のもと、本発明は悪性の膵胆道系疾患を判定する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の態様を含む。
［１］被験者が悪性の膵胆道系疾患を有するか否かを判定するためのデータ収集方法であって、前記被験者由来の生体試料中の、ｍｉＲ−１２４７遺伝子、ｍｉＲ−２００ａ遺伝子又はｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合を測定することを含み、前記割合が対照と比較して高いことが、前記被験者が悪性の膵胆道系疾患を有することを示す、データ収集方法。
［２］前記生体試料が血液であり、前記メチル化されたシトシン残基の割合の測定を、ｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基について行い、ｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおける前記シトシン残基が、配列番号１で示されるｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターの塩基配列における第第９１番目のシトシン残基である、［１］に記載のデータ収集方法。
［３］前記生体試料が胆汁であり、ｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおける前記シトシン残基が、配列番号１で示されるｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターの塩基配列における第２６番目、第４９番目、第６９番目、第７８番目、第８９番目、第９１番目、第９４番目及び第１０４番目のシトシン残基からなる群より選択されるシトシン残基であり、ｍｉＲ−２００ａ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおける前記シトシン残基が、配列番号２で示されるｍｉＲ−２００ａ遺伝子のプロモーターの塩基配列における第８０番目、第８６番目、第１５６番目、第１７５番目及び第１９７番目のシトシン残基からなる群より選択されるシトシン残基であり、ｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおける前記シトシン残基が、配列番号３で示されるｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターの塩基配列における第７４番目、第１５６番目、第１６０番目、第１６７番目、第１７８番目及び第１８６番目のシトシン残基からなる群より選択されるシトシン残基である、［１］に記載のデータ収集方法。
［４］前記悪性の膵胆道系疾患が膵癌又は胆道癌である、［１］〜［３］のいずれかに記載のデータ収集方法。
［５］亜硫酸水素塩、及び、ｍｉＲ−１２４７遺伝子、ｍｉＲ−２００ａ遺伝子又はｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドを増幅するプライマー、を含む、悪性の膵胆道系疾患を有するか否かの判定用キット。
【０００８】
本発明は以下の態様を含むものであるということもできる。
［Ｐ１］被験者が悪性の膵胆道系疾患を有するか否かを判定するためのデータ収集方法であって、前記被験者由来の生体試料中の、ｍｉＲ−１２４７遺伝子、ｍｉＲ−２００ａ遺伝子又はｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合を測定することを含み、前記割合が対照と比較して高いことが、前記被験者が悪性の膵胆道系疾患を有することを示す、データ収集方法。
［Ｐ２］ｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおける前記シトシン残基が、配列番号１で示されるｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターの塩基配列における第２６番目、第４９番目、第６９番目、第７８番目、第８９番目、第９１番目、第９４番目及び第１０４番目のシトシン残基からなる群より選択されるシトシン残基であり、ｍｉＲ−２００ａ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおける前記シトシン残基が、配列番号２で示されるｍｉＲ−２００ａ遺伝子のプロモーターの塩基配列における第８０番目、第８６番目、第１５６番目、第１７５番目及び第１９７番目のシトシン残基からなる群より選択されるシトシン残基であり、ｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおける前記シトシン残基が、配列番号３で示されるｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターの塩基配列における第７４番目、第１５６番目、第１６０番目、第１６７番目、第１７８番目及び第１８６番目のシトシン残基からなる群より選択されるシトシン残基である、［Ｐ１］に記載のデータ収集方法。
［Ｐ３］前記生体試料が、胆汁又は血液である、［Ｐ１］又は［Ｐ２］に記載のデータ収集方法。
［Ｐ４］前記悪性の膵胆道系疾患が膵癌又は胆道癌である、［Ｐ１］〜［Ｐ３］のいずれかに記載のデータ収集方法。
［Ｐ５］亜硫酸水素塩、及び、ｍｉＲ−１２４７遺伝子、ｍｉＲ−２００ａ遺伝子又はｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドを増幅するプライマー、を含む、悪性の膵胆道系疾患を有するか否かの判定用キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、悪性の膵胆道系疾患を判定する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】実験例１において、膵癌患者由来の試料におけるｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。
【図１Ｂ】実験例１において、胆道癌患者由来の試料におけるｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。
【図１Ｃ】実験例１において、良性膵胆道疾患患者由来の試料におけるｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。
【図２Ａ】実験例１において、膵癌患者由来の試料におけるｍｉＲ−２００ａ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。
【図２Ｂ】実験例１において、胆道癌患者由来の試料におけるｍｉＲ−２００ａ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。
【図２Ｃ】実験例１において、良性膵胆道疾患患者由来の試料におけるｍｉＲ−２００ａ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。
【図３Ａ】実験例１において、膵癌患者由来の試料におけるｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。
【図３Ｂ】実験例１において、胆道癌患者由来の試料におけるｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。
【図３Ｃ】実験例１において、良性膵胆道疾患患者由来の試料におけるｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。
【図４Ａ】実験例２において、膵癌患者由来の試料におけるｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。
【図４Ｂ】実験例２において、胆道癌患者由来の試料におけるｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。
【図４Ｃ】実験例２において、良性膵胆道疾患患者由来の試料におけるｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。
【図５】（ａ）は、実験例２において、胆道癌患者と、良性膵胆道疾患患者の血漿中のｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターの塩基配列（配列番号１）における第９１番目のシトシン残基のメチル化の割合の測定結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例２において、胆道癌患者と、良性膵胆道疾患患者の血漿中のｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターの塩基配列（配列番号１）における第９１番目のシトシン残基のメチル化の割合に基づいて作成したＲＯＣ曲線である。
【図６Ａ】実験例２において、膵癌患者由来の試料におけるｍｉＲ−２００ａ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。
【図６Ｂ】実験例２において、胆道癌患者由来の試料におけるｍｉＲ−２００ａ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。
【図６Ｃ】実験例２において、良性膵胆道疾患患者由来の試料におけるｍｉＲ−２００ａ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。
【図７Ａ】実験例２において、膵癌患者由来の試料におけるｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。
【図７Ｂ】実験例２において、胆道癌患者由来の試料におけるｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。
【図７Ｃ】実験例２において、良性膵胆道疾患患者由来の試料におけるｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［データ収集方法］
１実施形態において、本発明は、被験者が悪性の膵胆道系疾患を有するか否かを判定するためのデータ収集方法であって、前記被験者由来の生体試料中の、ｍｉＲ−１２４７遺伝子、ｍｉＲ−２００ａ遺伝子又はｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合を測定することを含み、前記割合が対照と比較して高いことが、前記被験者が悪性の膵胆道系疾患を有することを示す、データ収集方法を提供する。
【００１２】
実施例において後述するように、本実施形態の方法によれば、被験者が悪性の膵胆道系疾患を有するか否かを判定するためのデータを収集することができる。なお、データ収集方法は医師が判断する工程を含まない。本実施形態の方法は、悪性の膵胆道系疾患の検出方法、膵胆道系疾患が悪性であるか良性であるかを判定する方法等といいかえることもできる。本実施形態の方法において、悪性の膵胆道系疾患としては、膵癌、胆道癌が挙げられる。
【００１３】
本実施形態の方法において、ｍｉＲ−１２４７遺伝子、ｍｉＲ−２００ａ遺伝子又はｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合が、被験者が悪性の膵胆道系疾患を有するか否かを判定するためのデータである。
【００１４】
また、本実施形態の方法において、対照とは、悪性の膵胆道系疾患を有しないことが予め明らかである被験者由来の生体試料中の、ｍｉＲ−１２４７遺伝子、ｍｉＲ−２００ａ遺伝子又はｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合である。悪性の膵胆道系疾患を有しないことが予め明らかである被験者としては、健常者、良性の膵胆道系疾患を有すると診断された患者等が挙げられる。
【００１５】
ｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおける前記シトシン残基としては、配列番号１で示されるｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターの塩基配列における第２６番目、第４９番目、第６９番目、第７８番目、第８９番目、第９１番目、第９４番目及び第１０４番目のシトシン残基からなる群より選択される１又は複数のシトシン残基が挙げられる。
【００１６】
実施例において後述するように、発明者らは、悪性の膵胆道系疾患を有する患者由来の生体試料では、これらのシトシン残基がメチル化されている割合が、対照における割合と比較して有意に高いことを明らかにした。
【００１７】
ｍｉＲ−２００ａ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおける前記シトシン残基としては、配列番号２で示されるｍｉＲ−２００ａ遺伝子のプロモーターの塩基配列における第８０番目、第８６番目、第１５６番目、第１７５番目及び第１９７番目のシトシン残基からなる群より選択される１又は複数のシトシン残基が挙げられる。
【００１８】
実施例において後述するように、発明者らは、悪性の膵胆道系疾患を有する患者由来の生体試料では、これらのシトシン残基がメチル化されている割合が、対照における割合と比較して有意に高いことを明らかにした。
【００１９】
ｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおける前記シトシン残基としては、配列番号３で示されるｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターの塩基配列における第７４番目、第１５６番目、第１６０番目、第１６７番目、第１７８番目及び第１８６番目のシトシン残基からなる群より選択される１又は複数のシトシン残基が挙げられる。
【００２０】
実施例において後述するように、発明者らは、悪性の膵胆道系疾患を有する患者由来の生体試料では、これらのシトシン残基がメチル化されている割合が、対照における割合と比較して有意に高いことを明らかにした。
【００２１】
本実施形態の方法では、ｍｉＲ−１２４７遺伝子、ｍｉＲ−２００ａ遺伝子、ｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のうち、いずれか１種の遺伝子においてメチル化されたシトシン残基の割合を測定してもよいし、いずれか２種の遺伝子においてメチル化されたシトシン残基の割合を測定してもよいし、３種類全ての遺伝子においてメチル化されたシトシン残基の割合を測定してもよい。
【００２２】
ｍｉＲ−１２４７遺伝子、ｍｉＲ−２００ａ遺伝子又はｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のメチル化されたシトシン残基の割合を測定することにより、被験者が悪性の膵胆道系疾患を有するか否かをより高精度に判定することが可能となる。
【００２３】
本実施形態の方法において、前記生体試料としては、胆汁又は血液を用いることができる。血液としては、血漿を用いることが好ましい。より具体的には、生体試料中に存在する、セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）等を抽出し、ｍｉＲ−１２４７遺伝子、ｍｉＲ−２００ａ遺伝子、ｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のメチル化の割合を測定する。
【００２４】
ｃｆＤＮＡの多くは、血球系細胞の死滅に由来するＤＮＡであるといわれている。また、癌の発生により、癌細胞が免疫によって破壊されたり、自ら細胞死（アポトーシス）をおこしたり、血中に漏れ出した循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）が何らかの影響によって血中で破壊されたりすると、癌細胞のゲノムＤＮＡが血中に漏出することになる。このようなＤＮＡは特にｃｔＤＮＡ  （ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ）と呼ばれる場合がある。
【００２５】
ＣｐＧアイランドとは、シトシンの次にグアニンが現れる２塩基配列（ジヌクレオチド）であるＣｐＧの出現頻度が、ゲノム中の他の領域と比べて高い領域のことである。ＣｐＧの「ｐ」の文字は、シトシンとグアニンの間のホスホジエステル結合を表している。哺乳類の遺伝子の多くは、プロモーター内部又は近傍にＣｐＧアイランドを含んでいることが知られている。
【００２６】
上記の生体試料中には、ｍｉＲ−１２４７遺伝子、ｍｉＲ−２００ａ遺伝子、ｍｉＲ−２００ｂ遺伝子等をコードするゲノムＤＮＡ由来の遺伝子断片が含まれている。本実施形態の検出方法では、これらの遺伝子断片のプロモーター領域のＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のメチル化を検出する。
【００２７】
シトシン残基のメチル化の検出は、ＤＮＡ断片のバイサルファイト（亜硫酸水素塩）処理を利用する方法により好適に行うことができる。ＤＮＡ断片のバイサルファイト処理は、市販のキット等を用いて実施することができる。バイサルファイト処理により、シトシン残基は脱アミノ化されてウラシル残基に変換されるが、メチル化されたシトシン残基はそのまま残る。
【００２８】
そこで、バイサルファイト処理後のＤＮＡ断片をシーケンスすることにより、シトシン残基のメチル化を検出することができる。ここで、次世代シーケンサーを用いて全ＤＮＡ断片の塩基配列をシーケンスすることにより、メチル化されたシトシン残基の割合を測定することができる。
【００２９】
あるいは、バイサルファイト処理後のＤＮＡ断片を鋳型とし、シトシン残基又はウラシル残基を識別するプライマーを用いたＰＣＲ法によってもシトシン残基のメチル化を検出することができる。ここで、定量的ＰＣＲを行うことにより、メチル化されたシトシン残基の割合を測定することができる。
【００３０】
あるいは、バイサルファイト処理後のＤＮＡ断片を鋳型としたＰＣＲ反応を行った後、シトシン残基又はウラシル残基を識別する制限酵素処理によりＰＣＲ増幅断片が切断されるか否かを検討することによってもシトシン残基のメチル化を検出することができる。
【００３１】
［キット］
１実施形態において、本発明は、亜硫酸水素塩、及び、ｍｉＲ−１２４７遺伝子、ｍｉＲ−２００ａ遺伝子又はｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドを増幅するプライマー、を含む、悪性の膵胆道系疾患を有するか否かの判定用キットを提供する。
【００３２】
本実施形態のキットにより、ｍｉＲ−１２４７遺伝子、ｍｉＲ−２００ａ遺伝子又はｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合を測定することができる。
【００３３】
本実施形態のキットは、亜硫酸水素塩、上記の各プライマーのほかにも、ｃｆＤＮＡ又はｃｔＤＮＡの抽出用試薬を更に含んでいてもよい。
【００３４】
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、被験者由来の生体試料中の、ｍｉＲ−１２４７遺伝子、ｍｉＲ−２００ａ遺伝子又はｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合を測定することと、前記割合が対照と比較して高い場合に、前記被験者に外科的治療を行うか、抗癌薬の有効量を投与するか、又は放射線治療を行うことと、を含む、悪性の膵胆道系疾患の治療方法を提供する。
【００３５】
上述したように、発明者らは、悪性の膵胆道系疾患を有する患者由来の生体試料では、ｍｉＲ−１２４７遺伝子、ｍｉＲ−２００ａ遺伝子又はｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基がメチル化されている割合が、対照における割合と比較して有意に高いことを明らかにした。したがって、これらのシトシン残基がメチル化されている割合が、対照における割合と比較して有意に高い場合、被験者は悪性の膵胆道系疾患を有すると判断することができる。
【００３６】
本実施形態の治療方法において、対照、悪性の膵胆道系疾患、メチル化されたシトシン残基の割合の測定方法等は上述したものと同様である。
【００３７】
抗癌薬を用いる治療としては、ゲムシタビン療法、Ｓ−１療法、ゲムシタビン＋エルロチニブ療法、フォルフィリノックス療法、ゲムシタビン＋ナブパクリタキセル療法等が用いられる。
【実施例】
【００３８】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３９】
［実験例１］
（胆汁を用いた検討）
膵癌５３例、胆道癌２５例、良性膵胆道疾患２０例、計９８例の患者から、内視鏡的逆行性胆管膵管造影（ＥＲＣＰ）又は経皮経肝胆道ドレナージ（ＰＴＢＤ）により、胆汁を採取した。
【００４０】
続いて、以下の方法により、胆汁中に含まれるＤＮＡ断片を精製し、１６個のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−２６ａ１、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−３４ｂｃ、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−３４５、ｍｉＲ−６１５−５ｐ、ｍｉＲ−１２４７、ｍｉＲ−１２５４−１）のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のメチル化の割合を解析した。
【００４１】
まず、ＤＮＡ自動抽出機器（商品名、「Ｍａｘｗｅｌｌ  ＲＳＣ  ｃｃｆＤＮＡ  Ｐｌａｓｍａ  Ｋｉｔ」、プロメガ社）及び抽出キット（ＡＳ１４８０、プロメガ社）を用いて、胆汁からセルフリーＤＮＡを抽出した。
【００４２】
続いて、ＤＮＡ断片のバイサルファイト（亜硫酸水素塩）処理を行った。この段階でメチル化されていないシトシン残基はウラシル残基に変換されるが、メチル化されたシトシン残基は変換されない。
【００４３】
続いて、各ｍｉＲＮＡのプロモーターのＣｐＧアイランドを中心に数か所の標的領域でプライマーを設定し、標的領域ごとに個別にＰＣＲ増幅を行った。続いて、ライブラリー調製、テンプレート調製を行い、次世代シーケンサー（ＮＧＳ）を用いてバイサルファイトシーケンスを行った。続いて、各ｍｉＲＮＡの標的領域のシトシン残基のうちメチル化されたシトシン残基の割合をそれぞれ算出した。
【００４４】
続いて、各ｍｉＲＮＡのプロモーターに数か所ずつ設定した標的領域において、それぞれ膵癌、胆道癌、良性膵胆道疾患の３群でメチル化の割合に有意差があるかについて、ｔ検定を用いて統計学的に検討を行った。Ｐ＜０．０５を有意差ありとした。
【００４５】
（ｍｉＲ−１２４７）
ｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーター領域を増幅するプライマーとして、配列番号４及び５に塩基配列を示すプライマーを使用した。図１Ａは、膵癌患者由来の胆汁中のｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。最も左の列は患者番号を示す。図１Ａ中、「ＰＣ」は膵癌を示す。
【００４６】
図１Ｂは、胆道癌患者由来の胆汁中のｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。最も左の列は患者番号を示す。図１Ｂ中、「ＢＴＣ」は胆道癌を示す。
【００４７】
図１Ｃは、良性膵胆道疾患患者由来の胆汁中のｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。最も左の列は患者番号を示す。図１Ｃ中、「ＢＤ」は良性膵胆道疾患を示す。
【００４８】
図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ中、ＣｐＧ  Ｎｏ．１〜８は、それぞれ、配列番号１で示されるｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターの塩基配列における第２６番目、第４９番目、第６９番目、第７８番目、第８９番目、第９１番目、第９４番目及び第１０４番目のシトシン残基を示す。
【００４９】
その結果、胆汁を試料に用いた場合、膵癌患者及び胆道癌患者では、良性膵胆道疾患患者と比較して、配列番号１で示されるｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターの塩基配列における第２６番目、第６９番目、第７８番目、第８９番目及び第１０４番目のシトシン残基のメチル化の割合が有意に高いことが明らかとなった。
【００５０】
また、胆汁を試料に用いた場合、胆道癌患者では、膵癌患者及び良性膵胆道疾患患者と比較して、配列番号１で示されるｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターの塩基配列における第４９番目、第９１番目及び第９４番目のシトシン残基のメチル化の割合が有意に高いことが明らかとなった。
【００５１】
（ｍｉＲ−２００ａ）
ｍｉＲ−２００ａ遺伝子のプロモーター領域を増幅するプライマーとして、配列番号６及び７に塩基配列を示すプライマーを使用した。図２Ａは、膵癌患者由来の胆汁中のｍｉＲ−２００ａ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。最も左の列は患者番号を示す。図２Ａ中、「ＰＣ」は膵癌を示す。
【００５２】
図２Ｂは、胆道癌患者由来の胆汁中のｍｉＲ−２００ａ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。最も左の列は患者番号を示す。図２Ｂ中、「ＢＴＣ」は胆道癌を示す。
【００５３】
図２Ｃは、良性膵胆道疾患患者由来の胆汁中のｍｉＲ−２００ａ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。最も左の列は患者番号を示す。図２Ｃ中、「ＢＤ」は良性膵胆道疾患を示す。
【００５４】
図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ中、ＣｐＧ  Ｎｏ．１〜９は、それぞれ、配列番号２で示されるｍｉＲ−２００ａ遺伝子のプロモーターの塩基配列における第６７番目、第８０番目、第８６番目、第１０９番目、第１１４番目、第１５６番目、第１６６番目、第１７５番目及び第１９７番目のシトシン残基を示す。
【００５５】
その結果、胆汁を試料に用いた場合、膵癌患者及び胆道癌患者では、良性膵胆道疾患患者と比較して、配列番号２で示されるｍｉＲ−２００ａ遺伝子のプロモーターの塩基配列における第８０番目、第８６番目、第１５６番目、第１７５番目及び第１９７番目のシトシン残基のメチル化の割合が有意に高いことが明らかとなった。
【００５６】
（ｍｉＲ−２００ｂ）
ｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーター領域を増幅するプライマーとして、配列番号８及び９に塩基配列を示すプライマーを使用した。図３Ａは、膵癌患者由来の胆汁中のｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。最も左の列は患者番号を示す。図３Ａ中、「ＰＣ」は膵癌を示す。
【００５７】
図３Ｂは、胆道癌患者由来の胆汁中のｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。最も左の列は患者番号を示す。図３Ｂ中、「ＢＴＣ」は胆道癌を示す。
【００５８】
図３Ｃは、良性膵胆道疾患患者由来の胆汁中のｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。最も左の列は患者番号を示す。図３Ｃ中、「ＢＤ」は良性膵胆道疾患を示す。
【００５９】
図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ中、ＣｐＧ  Ｎｏ．１〜１２は、それぞれ、配列番号３で示されるｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターの塩基配列における第３２番目、第４４番目、第５９番目、第７４番目、第７７番目、第１０５番目、第１３４番目、第１５６番目、第１６０番目、第１６７番目、第１７８番目及び第１８６番目のシトシン残基を示す。
【００６０】
その結果、胆汁を試料に用いた場合、膵癌患者では、良性膵胆道疾患患者と比較して、配列番号３で示されるｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターの塩基配列における第７４番目、第１５６番目、第１６０番目、第１６７番目、第１７８番目及び第１８６番目のシトシン残基のメチル化の割合が有意に高いことが明らかとなった。
【００６１】
［実験例２］
（血漿を用いた検討）
膵癌２９例、胆道癌９例、良性膵胆道疾患２２例、計６０例の患者から、血漿を採取した。
【００６２】
続いて、以下の方法により、血漿中に含まれるＤＮＡ断片を精製し、ｍｉＲ−１２４７、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−２００ｂのプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のメチル化の割合を解析した。
【００６３】
まず、ＤＮＡ自動抽出機器（商品名、「Ｍａｘｗｅｌｌ  ＲＳＣ  ｃｃｆＤＮＡ  Ｐｌａｓｍａ  Ｋｉｔ」、プロメガ社）及び抽出キット（ＡＳ１４８０、プロメガ社）を用いて、血漿からセルフリーＤＮＡを抽出した。
【００６４】
続いて、ＤＮＡ断片のバイサルファイト（亜硫酸水素塩）処理を行った。この段階でメチル化されていないシトシン残基はウラシル残基に変換されるが、メチル化されたシトシン残基は変換されない。
【００６５】
続いて、各ｍｉＲＮＡのプロモーターのＣｐＧアイランドを中心に数か所の標的領域でプライマーを設定し、標的領域ごとに個別にＰＣＲ増幅を行った。続いて、ライブラリー調製、テンプレート調製を行い、次世代シーケンサー（ＮＧＳ）を用いてバイサルファイトシーケンスを行った。続いて、各ｍｉＲＮＡの標的領域のシトシン残基のうちメチル化されたシトシン残基の割合をそれぞれ算出した。
【００６６】
続いて、各ｍｉＲＮＡのプロモーターに数か所ずつ設定した標的領域において、それぞれ膵癌、胆道癌、良性膵胆道疾患の３群でメチル化の割合に有意差があるかについて、ｔ検定を用いて統計学的に検討を行った。Ｐ＜０．０５を有意差ありとした。
【００６７】
（ｍｉＲ−１２４７）
ｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーター領域を増幅するプライマーとして、配列番号４及び５に塩基配列を示すプライマーを使用した。図４Ａは、膵癌患者由来の血漿中のｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。最も左の列は患者番号を示す。図４Ａ中、「ＰＣ」は膵癌を示す。
【００６８】
図４Ｂは、胆道癌患者由来の血漿中のｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。最も左の列は患者番号を示す。図４Ｂ中、「ＢＴＣ」は胆道癌を示す。
【００６９】
図４Ｃは、良性膵胆道疾患患者由来の血漿中のｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。最も左の列は患者番号を示す。図４Ｃ中、「ＢＤ」は良性膵胆道疾患を示す。
【００７０】
図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ中、ＣｐＧ  Ｎｏ．１〜８は、それぞれ、配列番号１で示されるｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターの塩基配列における第２６番目、第４９番目、第６９番目、第７８番目、第８９番目、第９１番目、第９４番目及び第１０４番目のシトシン残基を示す。
【００７１】
その結果、血漿を試料に用いた場合、膵癌患者及び胆道癌患者では、良性膵胆道疾患患者と比較して、配列番号１で示されるｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターの塩基配列における第９１番目のシトシン残基のメチル化の割合が有意に高いことが明らかとなった（ｐ＝０．０１９）。
【００７２】
また、血漿を試料に用いた場合、胆道癌患者では、良性膵胆道疾患患者と比較して、配列番号１で示されるｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターの塩基配列における第９１番目のシトシン残基のメチル化の割合が有意に高いことが明らかとなった（ｐ＝０．００５８）。
【００７３】
図５（ａ）は、膵癌患者及び胆道癌患者と、良性膵胆道疾患患者の、血漿中の配列番号１で示されるｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターの塩基配列における第９１番目のシトシン残基のメチル化の割合の測定結果を示すグラフである。図５（ａ）中、「＊」はｐ＜０．０５で有意差が存在することを示す（ｐ＝０．０１９）。
【００７４】
また、図５（ｂ）は、膵癌患者及び胆道癌患者と、良性膵胆道疾患患者の、血漿中の配列番号１で示されるｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターの塩基配列における第９１番目のシトシン残基のメチル化の割合に基づいて作成したＲＯＣ曲線である。その結果、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は０．６９と算出された。
【００７５】
また、図５（ａ）と同様の解析を、胆道癌患者と、良性膵胆道疾患患者の、血漿中の配列番号１で示されるｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターの塩基配列における第９１番目のシトシン残基のメチル化の割合について行った。その結果、両者の間に有意差が存在することが明らかとなった（ｐ＝０．００５８）。
【００７６】
また、図５（ｂ）と同様のＲＯＣ曲線を、胆道癌患者と、良性膵胆道疾患患者の、血漿中の配列番号１で示されるｍｉＲ−１２４７遺伝子のプロモーターの塩基配列における第９１番目のシトシン残基のメチル化の割合について作成した。その結果、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は０．８４と算出された。
【００７７】
（ｍｉＲ−２００ａ）
ｍｉＲ−２００ａ遺伝子のプロモーター領域を増幅するプライマーとして、配列番号６及び７に塩基配列を示すプライマーを使用した。図６Ａは、膵癌患者由来の血漿中のｍｉＲ−２００ａ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。最も左の列は患者番号を示す。図６Ａ中、「ＰＣ」は膵癌を示す。
【００７８】
図６Ｂは、胆道癌患者由来の血漿中のｍｉＲ−２００ａ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。最も左の列は患者番号を示す。図６Ｂ中、「ＢＴＣ」は胆道癌を示す。
【００７９】
図６Ｃは、良性膵胆道疾患患者由来の血漿中のｍｉＲ−２００ａ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。最も左の列は患者番号を示す。図６Ｃ中、「ＢＤ」は良性膵胆道疾患を示す。
【００８０】
図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ中、ＣｐＧ  Ｎｏ．１〜９は、それぞれ、配列番号２で示されるｍｉＲ−２００ａ遺伝子のプロモーターの塩基配列における第６７番目、第８０番目、第８６番目、第１０９番目、第１１４番目、第１５６番目、第１６６番目、第１７５番目及び第１９７番目のシトシン残基を示す。
【００８１】
その結果、血漿を試料に用いた場合には、膵癌患者、胆道癌患者、良性膵胆道疾患患者の３群でメチル化の割合に有意差は認められなかった。
【００８２】
（ｍｉＲ−２００ｂ）
ｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーター領域を増幅するプライマーとして、配列番号８及び９に塩基配列を示すプライマーを使用した。図７Ａは、膵癌患者由来の血漿中のｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。最も左の列は患者番号を示す。図７Ａ中、「ＰＣ」は膵癌を示す。
【００８３】
図７Ｂは、胆道癌患者由来の血漿中のｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。最も左の列は患者番号を示す。図７Ｂ中、「ＢＴＣ」は胆道癌を示す。
【００８４】
図７Ｃは、良性膵胆道疾患患者由来の血漿中のｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドにおけるシトシン残基のうち、メチル化されたシトシン残基の割合の測定結果を示す表である。最も左の列は患者番号を示す。図７Ｃ中、「ＢＤ」は良性膵胆道疾患を示す。
【００８５】
図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ中、ＣｐＧ  Ｎｏ．１〜１２は、それぞれ、配列番号３で示されるｍｉＲ−２００ｂ遺伝子のプロモーターの塩基配列における第３２番目、第４４番目、第５９番目、第７４番目、第７７番目、第１０５番目、第１３４番目、第１５６番目、第１６０番目、第１６７番目、第１７８番目及び第１８６番目のシトシン残基を示す。
【００８６】
その結果、血漿を試料に用いた場合には、膵癌患者、胆道癌患者、良性膵胆道疾患患者の３群でメチル化の割合に有意差は認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明によれば、悪性の膵胆道系疾患を判定する技術を提供することができる。
【図１Ａ】
2020141664.tif 000002
【図１Ｂ】
2020141664.tif 000003
【図１Ｃ】
2020141664.tif 000004
【図２Ａ】
2020141664.tif 000005
【図２Ｂ】
2020141664.tif 000006
【図２Ｃ】
2020141664.tif 000007
【図３Ａ】
2020141664.tif 000008
【図３Ｂ】
2020141664.tif 000009
【図３Ｃ】
2020141664.tif 000010
【図４Ａ】
2020141664.tif 000011
【図４Ｂ】
2020141664.tif 000012
【図４Ｃ】
2020141664.tif 000013
【図５】
2020141664.tif 000014
【図６Ａ】
2020141664.tif 000015
【図６Ｂ】
2020141664.tif 000016
【図６Ｃ】
2020141664.tif 000017
【図７Ａ】
2020141664.tif 000018
【図７Ｂ】
2020141664.tif 000019
【図７Ｃ】
2020141664.tif 000020
【配列表】
2020141664000001.app