(57)【要約】【課題】新たな細胞周期停止剤、および、当該細胞周期停止剤を用いた抗腫瘍剤を提供する。【解決手段】下記一般式１によって示される化合物、または、その塩を含有する、細胞周期をＭ期の前中期にて停止させるための細胞周期停止剤を用いる：【化１】2020063209.tif 000008（一般式１中、Ｒ１〜Ｒ１０は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５の炭化水素基、ハロゲン原子、カルボキシ基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基、シアノ基、シリル基およびアリール基から選択される（このうち、水素原子およびハロゲン原子を除く官能基は、さらなる置換を有していてもよい））。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式１によって示される化合物、または、その塩を含有する、細胞周期をＭ期の前中期にて停止させるための細胞周期停止剤：
【化１】
2020063209.tif 000006
（一般式１中、上記Ｒ１〜Ｒ１０は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５の炭化水素基、ハロゲン原子、カルボキシ基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基、シアノ基、シリル基およびアリール基から選択される（このうち、水素原子およびハロゲン原子を除く官能基は、さらなる置換を有していてもよい））。
【請求項２】
上記一般式１によって示される化合物は、下記一般式２によって示される化合物である、請求項１に記載の細胞周期停止剤。
【化２】
2020063209.tif 000007
【請求項３】
請求項１または２に記載の細胞周期停止剤を含有する、抗腫瘍剤。
【請求項４】
経口剤である、請求項３に記載の抗腫瘍剤。
【請求項５】
白血病、膵臓癌、子宮頸癌、膠芽腫、子宮癌、乳癌または腎臓癌用である、請求項３または４に記載の抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞周期停止剤および抗腫瘍剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、日本人の３人に１人は、癌によって死亡している。それ故に、癌の治療法の開発が求められている。癌の治療法としては、外科的手術、化学療法および放射線療法などが存在するが、近年、分子標的薬による癌治療が注目されている。
【０００３】
癌は、癌関連遺伝子の変異（癌遺伝子を活性化させる変異、および／または、癌抑制遺伝子を不活性化させる変異）によって発症する。分子標的薬は、変異した癌関連遺伝子産物に特異的に作用することによって、癌細胞選択的に増殖阻害または細胞死を誘導させる。
【０００４】
現在までに開発された分子標的薬としては、（ａ）メラノーマの治療に用いられ、Ｒａｆを標的とする、ＰＬＸ４０３１およびＶｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ、並びに、（ｂ）慢性骨髄性白血病の治療に用いられ、チロシンキナーゼを標的とする、Ｇｌｅｅｖｅｃなどを挙げることができる。しかしながら、これらの分子標的薬は、薬を投与している間は病気を抑えるものの、薬の投与を止めると病気が再発するという問題点を有している。
【０００５】
また、癌の治療薬として、細胞周期を停止させる物質も用いられている。例えば、細胞周期をＭ期にて停止させる癌の治療薬として、ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎ、ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ、ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ、ｄｏｃｅｔａｘｅｌ、ｐａｃｌｉｔａｘｅｌおよびｅｒｉｂｕｌｉｎ  ｍｅｓｖｌａｔｅを挙げることができる。これらの治療薬は、微小管に作用することによって薬効を発揮する。しかしながら、微小管は抹消神経の機能に大きく関与しているため、これらの治療薬は、末梢神経に副作用（手足のしびれ、または痛み）が出るという問題点を有している。
【０００６】
従来の癌の治療薬には上述した問題点が存在するため、新たな治療薬の開発が、強く求められている。
【０００７】
ところで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける試験では、細胞周期の移行を停止させ得る物質が、現在までに数多く見出されている。例えば、ＰＧＶ−１（Pentagamavunon-1）では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの試験にて、乳癌細胞であるＴ４７ＤのＧ２期からＭ期への細胞周期の移行を停止させ、当該細胞にてアポトーシスを引き起こすことが確認されている（非特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Muhammad Da'i et. al., “PENTAGAMAVUNON-1 MENGHAMBAT SIKLUS SEL T47D TERINDUKSI CASPASE INHIBITOR Z-VAD-Fmk PADA FACE G2-M”, Journal Farmasi Indnesia, Vol.5, No.4, p.180-187, Juli 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、細胞周期の移行を停止させる物質の多くは、作用機序、および／または、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける効果が不明であるため、臨床に利用できないという問題点を有している。
【００１０】
例えば、Ｍ期は、前期（prophase）、前中期（prometaphase）、中期（metaphase）、後期（anaphase）および終期（telophase）に分割することができる。Ｍ期の中期以降に作用する薬剤は、副作用が生じる危険性が高くなる場合があるとされる。それ故に、Ｍ期の中期以前の特定の期間において機能を発揮する物質を見出すことが求められている。
【００１１】
また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて細胞周期の移行を停止させる物質が、必ずしも、ｉｎ  ｖｉｖｏにて細胞周期の移行を停止させるわけではない。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの環境と、ｉｎ  ｖｉｖｏの環境とは大きく異なる。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでは物質が疾患部位に到達する前に、分解または体外へ排出される等の原因のために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて細胞周期の移行を停止させる物質が、ｉｎ  ｖｉｖｏにて細胞周期の移行を停止できないことがある。それ故に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて治療効果を発揮する物質を見出すことが求められている。
【００１２】
本発明の一態様は、新たな細胞周期停止剤、および、当該細胞周期停止剤を用いた抗腫瘍剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、細胞周期をＭ期の前中期にて停止させる物質を見出すと共に、当該物質がｉｎ  ｖｉｖｏにおいて癌の治療効果を発揮することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
［１］上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る細胞周期停止剤は、下記一般式１によって示される化合物、または、その塩を含有する、細胞周期をＭ期の前中期にて停止させるための細胞周期停止剤である：
【００１５】
【化１】
2020063209.tif 000002
【００１６】
（一般式１中、Ｒ１〜Ｒ１０は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５の炭化水素基、ハロゲン原子、カルボキシ基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基、シアノ基、シリル基およびアリール基から選択される（このうち、水素原子およびハロゲン原子を除く官能基は、さらなる置換を有していてもよい））。
［２］本発明の一態様に係る細胞周期停止剤では、上記一般式１によって示される化合物は、下記一般式２によって示される化合物であることが好ましい。
【００１７】
【化２】
2020063209.tif 000003
【００１８】
［３］上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る抗腫瘍剤は、本発明の一態様に係る細胞周期停止剤を含有する。
［４］本発明の一態様に係る抗腫瘍剤では、投与剤型は、経口剤であることが好ましい。
［５］本発明の一態様に係る抗腫瘍剤は、白血病、膵臓癌、子宮頸癌、膠芽腫、子宮癌、乳癌または腎臓癌用であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、細胞周期をＭ期の前中期にて停止させることができるという効果を奏する。このため、例えば、抗腫瘍剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例において、ＰＧＶ−１およびクルクミンの抗腫瘍活性を示すグラフである。
【図２】実施例において、ＰＧＶ−１およびクルクミンの抗腫瘍活性およびＧＩ５０を示すグラフである。
【図３】実施例において、ＰＧＶ−１の抗腫瘍活性を示すグラフである。
【図４】（Ａ）は、実施例において生存している細胞数を示すグラフであり、（Ｂ）は、実施例において死滅している細胞数を示すグラフである。
【図５】（Ａ）および（Ｂ）は、実施例において、細胞周期の各期間に属する、ＰＧＶ−１にて処置されたＫ５６２細胞の割合を示す試験データである。
【図６】（Ａ）〜（Ｃ）は、実施例において、細胞周期をＭ期の前中期にて停止している細胞を示す試験データである。
【図７】（Ａ）〜（Ｅ）は、実施例において、ｉｎ−ｖｉｖｏにおけるＰＧＶ−１の抗腫瘍活性を示す試験データである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されない。本発明は、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態及び実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態及び実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。本明細書中、数値範囲に関して「Ａ〜Ｂ」と記載した場合、当該記載は「Ａ以上Ｂ以下」を意図する。
【００２２】
〔１．細胞周期停止剤〕
本実施の形態の細胞周期停止剤は、下記一般式１によって示される化合物、または、その塩を含有する、細胞周期をＭ期の前中期にて停止させるための細胞周期停止剤である：
【００２３】
【化３】
2020063209.tif 000004
【００２４】
（一般式１中、Ｒ１〜Ｒ１０は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５の炭化水素基、ハロゲン原子、カルボキシ基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基、シアノ基、シリル基およびアリール基から選択される）。
【００２５】
本実施の形態の細胞周期停止剤は、（ｉ）細胞周期をＭ期の前中期にて停止させることができるのみならず、（ｉｉ）低濃度にて薬理効果を発揮することができる、（ｉｉｉ）様々な細胞（例えば、様々な癌細胞）に対して薬理効果を発揮することができる、（ｉｖ）投与対象（例えば、生体）への投与を停止した後も、長期にわたって薬理効果を持続させることができる、および、（ｖ）投与対象（例えば、生体）における副作用を抑えることができる、という利点がある。
【００２６】
上記炭化水素基は、鎖状のものであっても、分枝を有しているものであっても、環を有しているものであってもよい。また、上記炭化水素基は、飽和炭化水素基であっても、不飽和炭化水素基であってもよい。このような炭化水素基には、アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基およびペンチル基など）、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基などが含まれる。
【００２７】
Ｒ１〜Ｒ１０の選択肢に含まれる、水素原子およびハロゲン原子を除く官能基は、さらなる置換を有し得る。つまり、ヒドロキシ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５の炭化水素基、カルボキシ基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基、シアノ基、シリル基およびアリール基は、官能基内の一部が、他の官能基または他の原子（例えば、炭素原子、水素原子、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、リン原子、ハロゲン原子など）と置換され得る。このような、さらなる置換を有している官能基の例としては、ヘテロアルキル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリールオキシ基、ヘテロアリール基、アリールチオ基、アリールアルコキシ基、アリールアルキルチオ基、置換アミノ基、置換シリル基、シリルオキシ基、置換シリルオキシ基、アリールスルフォニルオキシ基およびアルキルスルフォニルオキシ基が挙げられる。
【００２８】
一般式１によって示される化合物、または、その塩の親水性を向上させれば、これらを対象へ投与し易くなり、薬効が得られ易くなる。当該観点から、一般式１中、Ｒ１〜Ｒ１０の少なくとも１つがヒドロキシ基であることが好ましく、一般式１中、Ｒ１〜Ｒ１０の少なくとも２つがヒドロキシ基であることがより好ましく、Ｒ３および／またはＲ８がヒドロキシ基であることが最も好ましい。
【００２９】
上述した（ｉ）〜（ｖ）の効果を更に高めるという観点からは、（ａ）Ｒ２、Ｒ４、Ｒ７およびＲ９が同じ官能基（例えば、炭素数１〜５の炭化水素基）であること、または、Ｒ３および／またはＲ８がヒドロキシ基であることが好ましく、（ｂ）Ｒ２、Ｒ４、Ｒ７およびＲ９が同じ官能基（例えば、炭素数１〜５の炭化水素基）であり、かつ、Ｒ３および／またはＲ８がヒドロキシ基であることがより好ましく、（ｃ）Ｒ２、Ｒ４、Ｒ７およびＲ９が同じ官能基（例えば、炭素数１〜５の炭化水素基）であり、Ｒ３および／またはＲ８がヒドロキシ基であり、かつ、Ｒ１、Ｒ５、Ｒ６およびＲ１０が水素原子であることが最も好ましい。
【００３０】
より具体的に、上記一般式１によって示される化合物は、下記一般式２によって示される化合物であってもよい。なお、下記一般式２によって示される化合物は、ＰＧＶ−１（Pentagamavunon-1）である。
【００３１】
【化４】
2020063209.tif 000005
【００３２】
本実施の形態の細胞周期停止剤は、下記一般式１によって示される化合物の塩を含有していてもよい。当該塩は、対象（例えば、生体、培養細胞など）に投与することが生理学的に許容され得る塩であれば、特に限定されない。このような塩の例としては、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩など）、アンモニウム塩、有機塩基塩（例えば、トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩など）、有機酸塩（例えば、酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、蟻酸塩、トルエンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩など）、無機酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩など）が挙げられる。
【００３３】
一般式１によって示される化合物、および、その塩は、公知の手法（例えば、Food Chem. 2010, 119, 1435-1442 (F. Dai and B. Zhou) “Antioxidant capacity of curcumin-directed analogues: Structure-activity relationship and influence of microenvironment”（文献Ａ）を参照）によって得ることができる。
【００３４】
本実施の形態の細胞周期停止剤に含有されている一般式１によって示される化合物、または、その塩の量は、特に限定されず、例えば、細胞周期停止剤を１００重量％とした場合に、０．００１重量％〜１００重量％であってもよく、０．０１重量％〜１００重量％であってもよく、０．１重量％〜１００重量％であってもよく、０．１重量％〜９５重量％であってもよく、０．１重量％〜９０重量％であってもよく、０．１重量％〜８０重量％であってもよく、０．１重量％〜７０重量％であってもよく、０．１重量％〜６０重量％であってもよく、０．１重量％〜５０重量％であってもよく、０．１重量％〜４０重量％であってもよく、０．１重量％〜３０重量％であってもよく、０．１重量％〜２０重量％であってもよく、０．１重量％〜１０重量％であってもよい。
【００３５】
本実施の形態の細胞周期停止剤は、一般式１によって示される化合物、または、その塩以外の成分を含有していてもよい。当該成分としては、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、防腐剤、抗酸化剤、高分子量重合体、賦形剤、担体、希釈剤、溶媒、可溶化剤、安定剤、充填剤、結合剤、界面活性剤、および、安定化剤などを挙げることができる。
【００３６】
上記緩衝剤の例としては、リン酸、リン酸塩、ホウ酸、ホウ酸塩、クエン酸、クエン酸塩、酢酸、酢酸塩、炭酸、炭酸塩、酒石酸、酒石酸塩、ε−アミノカプロン酸、および、トロメタモールなどが挙げられる。上記リン酸塩としては、リン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウムなどが挙げられる。上記ホウ酸塩としては、ホウ砂、ホウ酸ナトリウム、および、ホウ酸カリウムなどが挙げられる。上記クエン酸塩としては、クエン酸ナトリウム、クエン酸二ナトリウム、および、クエン酸三ナトリウムなどが挙げられる。上記酢酸塩としては、酢酸ナトリウム、および、酢酸カリウムなどが挙げられる。上記炭酸塩としては、炭酸ナトリウム、および、炭酸水素ナトリウムなどが挙げられる。上記酒石酸塩としては、酒石酸ナトリウム、および、酒石酸カリウムなどが挙げられる。
【００３７】
ｐＨ調整剤の例としては、塩酸、リン酸、クエン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、および、水酸化カリウムなどが挙げられる。
【００３８】
上記等張化剤の例としては、イオン性等張化剤（塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、および、塩化マグネシウムなど）、および、非イオン性等張化剤（グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール、および、マンニトールなど）が挙げられる。
【００３９】
上記防腐剤の例としては、ベンザルコニウム塩化物、ベンザルコニウム臭化物、ベンゼトニウム塩化物、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル、および、クロロブタノールなどが挙げられる。
【００４０】
上記抗酸化剤の例としては、アスコルビン酸、トコフェノール、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、エリソルビン酸ナトリウム、没食子酸プロピル、および、亜硫酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００４１】
上記高分子量重合体の例としては、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、カルボキシメチルエチルセルロース、酢酸フタル酸セルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、および、アテロコラーゲンなどが挙げられる。
【００４２】
本実施の形態の細胞周期停止剤に含有されている一般式１によって示される化合物、または、その塩以外の成分の量は、特に限定されず、例えば、細胞周期停止剤を１００重量％とした場合に、０重量％〜９９．９９９重量％であってもよく、０重量％〜９９．９９重量％であってもよく、０重量％〜９９．９重量％であってもよく、５重量％〜９９．９重量％であってもよく、１０重量％〜９９．９重量％であってもよく、２０重量％〜９９．９重量％であってもよく、３０重量％〜９９．９重量％であってもよく、４０重量％〜９９．９重量％であってもよく、５０重量％〜９９．９重量％であってもよく、６０重量％〜９９．９重量％であってもよく、７０重量％〜９９．９重量％であってもよく、８０重量％〜９９．９重量％であってもよく、９０重量％〜９９．９重量％であってもよい。
【００４３】
〔２．抗腫瘍剤〕
本実施の形態の抗腫瘍剤は、上述した細胞周期停止剤を含有するものである。このため、本実施の形態の抗腫瘍剤は、上述した細胞周期停止剤と同様の（ｉ）〜（ｖ）の利点がある。なお、細胞周期停止剤の具体的な構成については既に説明したので、以下では、その説明を省略する。
【００４４】
本明細書において「腫瘍」とは、良性腫瘍、良性悪性境界病変および悪性腫瘍を包含する概念である。また、癌腫および肉腫のいずれもが、「腫瘍」の範囲に含まれる。腫瘍の具体例としては、脳腫瘍（例えば、膠芽腫など）、神経芽腫、網膜芽細胞腫、咽頭癌、食道癌、胃癌、大腸癌（例えば、結腸癌、直腸癌など）、肝臓癌、腎臓癌、胆嚢癌、胆管癌、膵臓癌、肺癌、胸腺癌、中皮腫、乳癌、子宮癌（例えば、子宮頸癌、子宮体癌など）、卵巣癌、膣癌、外陰癌、前立腺癌、精巣腫瘍、膀胱癌、皮膚癌（例えば、基底細胞癌、有棘細胞癌、悪性黒色腫など）、甲状腺癌、悪性リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫など）、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病など）、骨肉種、ユーイング肉腫、軟部肉腫、横紋筋肉腫などが挙げられる。上記に列挙した以外にも、「腫瘍」には、国際疾病分類第１０版（ＩＣＤ−１０、２００３年改訂）においてＣ００〜Ｄ４８に分類される疾病が含まれる。本実施の形態の抗腫瘍剤は、上述した腫瘍の治療に用いられ得る。本実施の形態の抗腫瘍剤は、上述した腫瘍の中でも、白血病、膵臓癌、子宮頸癌、膠芽腫、子宮癌、乳癌または腎臓癌に対して用いられることが好ましい。
【００４５】
本実施の形態の抗腫瘍剤の投与方法は、特に限定されず、例えば、経口投与、非経口投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与、鼻腔内投与、硬膜外投与、経口投与、舌下投与、鼻腔内投与、脳内投与、膣内投与、経皮投与、直腸内投与、吸入および局所投与を挙げることができる。本実施の形態の抗腫瘍剤の剤型は、特に限定されず、例えば、経口剤および注射剤を挙げることができる。後述する実施例にて示すように、本実施の形態の抗腫瘍剤は、特別な器具および技術を必要としない経口投与によって、高い薬理効果を発揮し得る。それ故に、患者の負担を軽減するという観点から、本実施の形態の抗腫瘍剤の投与方法は経口投与であることが好ましく、本実施の形態の抗腫瘍剤の剤型は経口剤であることが好ましい。
【００４６】
本実施の形態の抗腫瘍剤の投与間隔は、特に限定されず、例えば、１日間に１回、２日間に１回、３日間に１回、４日間に１回、５日間に１回、６日間に１回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、１箇月間に１回、２箇月間に１回、３箇月間に１回、４箇月間に１回、５箇月間に１回、６箇月間に１回、１年に１回、数年に１回であり得る。後述する実施例にて示すように、本実施の形態の抗腫瘍剤は、一度投与すれば腫瘍の再発を抑えることができ、少ない投与回数にて腫瘍を治療することができる。それ故に、患者の負担を軽減するという観点から、本実施の形態の抗腫瘍剤の投与間隔は、１箇月間に１回、２箇月間に１回、３箇月間に１回、４箇月間に１回、５箇月間に１回、６箇月間に１回、１年に１回、または、数年に１回であることが好ましい。
【００４７】
本実施の形態の抗腫瘍剤に含有されている細胞周期停止剤の量は、特に限定されず、例えば、抗腫瘍剤を１００重量％とした場合に、０．００１重量％〜１００重量％であってもよく、０．０１重量％〜１００重量％であってもよく、０．１重量％〜１００重量％であってもよく、０．１重量％〜９５重量％であってもよく、０．１重量％〜９０重量％であってもよく、０．１重量％〜８０重量％であってもよく、０．１重量％〜７０重量％であってもよく、０．１重量％〜６０重量％であってもよく、０．１重量％〜５０重量％であってもよく、０．１重量％〜４０重量％であってもよく、０．１重量％〜３０重量％であってもよく、０．１重量％〜２０重量％であってもよく、０．１重量％〜１０重量％であってもよい。
【００４８】
本実施の形態の抗腫瘍剤は、細胞周期停止剤以外の成分を含有していてもよい。当該成分としては、〔１．細胞周期停止剤〕の欄にて説明した「一般式１によって示される化合物、または、その塩以外の成分」を挙げることができる。当該成分の量は、特に限定されず、例えば、抗腫瘍剤を１００重量％とした場合に、０重量％〜９９．９９９重量％であってもよく、０重量％〜９９．９９重量％であってもよく、０重量％〜９９．９重量％であってもよく、５重量％〜９９．９重量％であってもよく、１０重量％〜９９．９重量％であってもよく、２０重量％〜９９．９重量％であってもよく、３０重量％〜９９．９重量％であってもよく、４０重量％〜９９．９重量％であってもよく、５０重量％〜９９．９重量％であってもよく、６０重量％〜９９．９重量％であってもよく、７０重量％〜９９．９重量％であってもよく、８０重量％〜９９．９重量％であってもよく、９０重量％〜９９．９重量％であってもよい。
【００４９】
本実施の形態の抗腫瘍剤、または、上述した細胞周期停止剤を対象へ投与する場合、一服の抗腫瘍剤または細胞周期停止剤に含有されている一般式１によって示される化合物、または、その塩の量の下限値は、０．００１ｍｇ、０．００２ｍｇ、０．００５ｍｇ、０．００７ｍｇ、０．０１ｍｇ、０．０２ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．０７ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．５ｍｇ、０．７ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、５ｍｇ、７ｍｇまたは１０ｍｇであり得、上限値は、１ｍｇ、２ｍｇ、５ｍｇ、７ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、５０ｍｇ、７０ｍｇ、１００ｍｇ、１ｇ、２ｇ、５ｇ、７ｇまたは１０ｇであり得る。
【００５０】
本実施の形態の抗腫瘍剤、または、上述した細胞周期停止剤が投与される対象は、特に限定されず、例えば、ヒトおよび非ヒト動物を挙げることができる。非ヒト動物としては、偶蹄類（例えば、ウシ、イノシシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、奇蹄類（ウマなど）、齧歯類（マウス、ラット、ハムスター、リスなど）、ウサギ目（ウサギなど）、食肉類（イヌ、ネコ、フェレットなど）を挙げることができる。本実施の形態の抗腫瘍剤、または、上述した細胞周期停止剤が投与される対象は、ヒトまたは非ヒト動物から採取された、細胞または組織であってもよい。
【００５１】
〔３．その他〕
本発明の一実施形態は、以下のように構成することも可能である。
＜１＞一般式１によって示される化合物、または、その塩を含有する細胞周期停止剤を対象へ投与する工程を有する、細胞周期をＭ期の前中期にて停止させる方法。
＜２＞上記一般式１中のＲ１〜Ｒ１０は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５の炭化水素基、ハロゲン原子、カルボキシ基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基、シアノ基、シリル基およびアリール基から選択される（このうち、水素原子およびハロゲン原子を除く官能基は、さらなる置換を有していてもよい）、＜１＞に記載の方法。
＜３＞上記一般式１によって示される化合物は、一般式２によって示される化合物である、＜１＞または＜２＞に記載の方法。
＜４＞一般式１によって示される化合物、または、その塩を含む細胞周期停止剤を含有する抗腫瘍剤を対象へ投与する工程を有する、腫瘍の治療方法。
＜５＞上記工程では、抗腫瘍剤を対象へ経口投与する、＜４＞に記載の方法。
＜６＞上記腫瘍は、白血病、膵臓癌、子宮頸癌、膠芽腫、子宮癌、乳癌または腎臓癌である、＜４＞または＜５＞に記載の方法。
【００５２】
本発明の一実施形態は、以下のように構成することも可能である。
＜７＞細胞周期をＭ期の前中期にて停止させるための細胞周期停止剤の製造のための、一般式１によって示される化合物、または、その塩の使用。
＜８＞上記一般式１中のＲ１〜Ｒ１０は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５の炭化水素基、ハロゲン原子、カルボキシ基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基、シアノ基、シリル基およびアリール基から選択される（このうち、水素原子およびハロゲン原子を除く官能基は、さらなる置換を有していてもよい）、＜７＞に記載の使用。
＜９＞上記一般式１によって示される化合物は、一般式２によって示される化合物である、＜７＞または＜８＞に記載の使用。
＜１０＞抗腫瘍剤の製造のための、一般式１によって示される化合物、または、その塩の使用。
＜１１＞上記抗腫瘍剤は、投与剤型が経口剤である、＜１０＞に記載の使用。
＜１２＞上記抗腫瘍剤は、白血病、膵臓癌、子宮頸癌、膠芽腫、子宮癌、乳癌または腎臓癌に用いられるものである、＜１０＞または＜１１＞に記載の使用。
【００５３】
また、本発明の細胞周期停止剤および抗腫瘍剤は、食品（例えば、健康食品、サプリメント、菓子など）として製造されてもよい。
【実施例】
【００５４】
〔ＰＧＶ−１の合成〕
文献Ａに記載の方法に準拠して、Cyclopentanoneと3,5-Dimethoxy-4-hydroxybenzaldehydeとを結合させることによって、ＰＧＶ−１を合成した。
【００５５】
〔試験１〕
ＰＧＶ−１の、抗腫瘍活性を検討した。具体的な手法は、既報［Larasati YA, Kato J et al. (2018) "Curcumin targets multiple enzymes involved in the ROS metabolic pathway to suppress tumor cell growth," Scientific Reports, Vol.8, Article number 2039.（文献Ｂ）］に記載の実験方法に準拠した。概要は以下の通りである。
１．慢性骨髄性白血病細胞株であるＫ５６２細胞を、実験に用いた。上記細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン：２ｍＭ、ペニシリン：１００Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン：１００μｇ／ｍＬおよびＦＢＳ：１０％を添加した培地で維持されていたものである。
２．Ｋ５６２細胞を、３×１０５の細胞密度で３５ｍｍディッシュに播種した。
３．Ｋ５６２細胞を、ＰＧＶ−１（濃度：０．０５μＭ、０．１μＭ、０．２μＭ、０．４μＭ、０．８μＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭ）またはクルクミン（濃度：５０μＭ）で処置した。すなわち、ＰＧＶ−１またはクルクミンを培地に加えて、４日間培養した。ネガティブコントロールでは、ＰＧＶ−１およびクルクミンを培地に加えること無く、４日間培養した。
４．１日ごとに、トリパンブルー染色によって生存している細胞数を計測した。
【００５６】
（結果）
図１に試験１の結果を示す。同図から判るように、０．８μＭ以上の濃度のＰＧＶ−１は、クルクミン（図中の「Ｃｕｒ」に対応）と同等またはそれ以上にＫ５６２細胞の増殖を抑制していた。つまり、０．８μＭ以上のＰＧＶ−１は、顕著な抗腫瘍活性を示した。また、クルクミンと比較して、ＰＧＶ−１は、低濃度にて顕著な抗腫瘍活性を示した。
【００５７】
〔試験２〕
〔試験１〕と同様の方法を用い、様々な濃度のＰＧＶ−１またはクルクミンにてＫ５６２細胞を処置し、４日後に生存している細胞数を計測した。当該データに基づいて、ＧＩ５０の値を算出した。
【００５８】
（結果）
図２に試験の結果を示す。ＰＧＶ−１のＧＩ５０の値は０．４６３μＭであり、クルクミンのＧＩ５０の値は３０μＭであった。このことは、ＰＧＶ−１抗腫瘍活性は、クルクミンの抗腫瘍活性の略６５倍（＝３０／０．４６３）高いことを示している。
【００５９】
〔試験３〕
〔試験１〕と同様の方法を用い、様々な濃度のＰＧＶ−１にて、様々な細胞を処置し、４日後に生存している細胞数を計測した。使用した細胞は、膠芽腫細胞株（Ｕ−８７）、乳癌細胞株（ＭＣＦ−７）子宮頸癌細胞株（ＨｅＬａ）、ヒト胎児腎臓由来細胞株（２９３Ｔ）、子宮癌細胞株（ＡＮ３  ＣＡ）および膵臓癌細胞株（ＭＩＡ  ＰａＣａ−２、ＰＡＮＣ−１）であった。
【００６０】
（結果）
図３から判るように、ＰＧＶ−１は、様々な細胞に対して、抗腫瘍活性を示した。この結果から、本発明の一実施形態に係る抗腫瘍剤が、広範な腫瘍に対して適用できることが示唆される。
【００６１】
〔試験４〕
ＰＧＶ−１の抗腫瘍活性が、ＰＧＶ−１を除去した後、どの程度持続するのかを検討した。具体的な手法は、文献Ｂに記載の実験方法に準拠した。概要は以下の通りである。
１．試験１の手順１〜３に従って、ＰＧＶ−１（濃度：０．８μＭおよび１μＭ）またはクルクミン（５０μＭ）を含有する培地中でＫ５６２細胞を培養した。ネガティブコントロールでは、ＤＭＳＯを含有する培地、または、ＰＧＶ−１およびクルクミンを加えない培地中でＫ５６２細胞を培養した。
２．培養開始から２日後に、Ｋ５６２細胞をＰＢＳにて洗浄して、ＰＧＶ−１、クルクミンおよびＤＭＳＯを除去し、その後、ＰＧＶ−１、クルクミンおよびＤＭＳＯが添加されていない新鮮な培地中で、当該Ｋ５６２細胞の培養を続けた。
３．実験中１日ごとに、トリパンブルー染色によって死滅している細胞を染色し、当該染色結果に基づいて、生存している細胞数、および死滅している細胞数を計測した。
【００６２】
（結果）
図４（Ａ）は、生存している細胞数を示すグラフであり、図４（Ｂ）は、死滅している細胞数を示すグラフである。図４（Ａ）から判るように、ＰＧＶ−１を培地から除去した後も、ＰＧＶ−１の抗腫瘍活性が継続した。この事実は、ＰＧＶ−１が、腫瘍の再発を防止し得ることを示唆している。また、図４（Ｂ）から判るように、ＰＧＶ−１は、細胞死を誘導した。
【００６３】
〔試験５〕
ＰＧＶ−１について、細胞周期停止能を検討した。具体的な手法は、文献Ｂに記載の実験方法に準拠した。概要は以下の通りである。
１．試験１の手順１〜３に従って、ＰＧＶ−１（濃度：０．８μＭ）またはクルクミン（５０μＭ）を含有する培地中でＫ５６２細胞を培養した。ネガティブコントロールでは、ＰＧＶ−１およびクルクミンを加えない培地中でＫ５６２細胞を培養した。
２．培養開始から０時間後、２４時間後、４８時間後および７２時間後において、それぞれの培地から細胞を回収し、細胞周期の中の各期間に属する細胞の割合を測定した。測定には、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Becton Dickinson製）を使用した。
【００６４】
（結果）
図５（Ａ）および図５（Ｂ）に、試験５の結果を示す。同図から判るように、ＰＧＶ−１にて処置されたＫ５６２細胞は、２４時間後に、細胞周期の中のＧ２／Ｍの期間に属する細胞の割合が高くなった。また、ＰＧＶ−１にて処置されたＫ５６２細胞は、４８時間および７２時間後に、細胞周期の中のｓｕｂＧ１の期間に属する細胞の割合が高くなった。これらの試験結果は、ＰＧＶ−１がＫ５６２細胞の細胞周期をＧ２／Ｍの期間にて停止させ、当該細胞周期が停止したＫ５６２細胞が時間の経過とともに細胞死を生じていることを示唆している。
【００６５】
〔試験６〕
ＰＧＶ−１にて処置されたＫ５６２細胞が、細胞周期の何れの期間にて停止するか、更に詳細に検討した。具体的な手法は、文献Ｂに記載の実験方法に準拠した。概要は以下の通りである。
１．試験１の手順１〜３に従って、ＰＧＶ−１（濃度：０．８μＭ）またはクルクミン（５０μＭ）を含有する培地中でＫ５６２細胞を培養した。ネガティブコントロールでは、ＰＧＶ−１およびクルクミンを加えない培地中でＫ５６２細胞を培養した。
２．培養開始から２４時間後において、それぞれの培地から細胞を回収した。回収した細胞を顕微鏡観察すると共に、当該細胞の細胞核を染色して顕微鏡観察した。また、顕微鏡観察された細胞の形態に基づいて、顕微鏡観察された全細胞に対する、Ｍ期にある細胞の割合を、「Ｍｉｔｏｔｉｃ  ｉｎｄｅｘ」として算出し、顕微鏡観察されたＭ期にある全細胞に対する、前中期（prometaphase）にある全細胞の割合を、「Ｐｒｏｍｅｔａｐｈａｓｅ  ｃｅｌｌｓ」として算出した。
【００６６】
（結果）
図６（Ａ）〜図６（Ｃ）に試験結果を示す。図６（Ａ）から判るように、ＰＧＶ−１で処理した場合は、クルクミンで処理した場合よりも、核膜が消失している細胞が多く観察された。このことは、ＰＧＶ−１で処理した場合は、クルクミンで処理した場合よりも、Ｍ期にある細胞が多くなっていることを示している。また、図６（Ｂ）から判るように、ＰＧＶ−１で処理した場合は、クルクミンで処理した場合よりも、略４．５倍、Ｍ期にある細胞が多くなっていた。さらに、図６（Ｃ）から判るように、Ｍ期の前中期（Prometaphase）に限定すると、ＰＧＶ−１とクルクミンとの差がより顕著に表れた。これらの結果から、ＰＧＶ−１は、細胞周期をＭ期の前中期にて特異的に停止させることが明らかになった。
【００６７】
〔試験７〕
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＰＧＶ−１の抗腫瘍活性および副作用について検討した。具体的な手法は、以下の通りである。
【００６８】
動物実験の方法については、文献Ｂに記載の方法に準拠して実施した。概要については以下の通りである（図７（Ａ）を参照）。
１．ヌードマウスに、Ｋ５６２細胞（２．５×１０６ｃｅｌｌｓ）を皮下注射した。
２．皮下注射を行った日を０日目とし、０日目から２０日目まで２日おきに、ＰＢＳ（２０ｇ）、ＰＢＳに溶かした０．４ｍｇのＰＧＶ−１（０．４ｍｇ／２０ｇ）、ＰＢＳに溶かした０．４ｍｇのクルクミン（０．４ｍｇ／２０ｇ）を経口投与した。
３．２０日目時点での目視による腫瘍のサイズ、ヌードマウスから切除された腫瘍の重量、２日ごとの体重の変化、２日ごとの腫瘍の体積を測定した。
【００６９】
（結果）
図７（Ｂ）〜図７（Ｅ）に試験結果を示す。図７（Ｂ）から判るように、ＰＧＶ−１を投与した場合、ＰＢＳまたはクルクミンを投与した場合よりも、ヌードマウスの体表上に目視で確認できる腫瘍のサイズが著しく小さかった。図７（Ｃ）から判るように、ＰＧＶ−１を投与した場合、ＰＢＳまたはクルクミンを投与した場合よりも、ヌードマウスから切除された腫瘍の重量が著しく小さかった。図７（Ｄ）から判るように、ＰＧＶ−１を投与した場合、ヌードマウスの体重に変化が無かった。図７（Ｅ）から判るように、ＰＧＶ−１を投与した場合、ＰＢＳまたはクルクミンを投与した場合よりも、ヌードマウスから切除された腫瘍の体積が著しく小さかった。
【００７０】
これらの試験結果は、ＰＧＶ−１が、経口投与によっても薬理効果を発揮し得ること、クルクミンよりも著しく抗腫瘍効果が高いこと、および、副作用が極めて小さいことを示している。特に、図７（Ｄ）に示すように、ヌードマウスの体重に変化が無かったことは、ＰＧＶ−１の副作用が極めて小さいことを示している。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明は、細胞周期停止剤および抗腫瘍剤に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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