(57)【要約】【課題】樹状細胞の成熟を抑制することが可能な新規な樹状細胞の成熟抑制剤、その成熟抑制剤を用いた樹状細胞の成熟抑制方法、その成熟抑制剤を有効成分として含有する医薬組成物、樹状細胞の成熟抑制剤のスクリーニング方法、及び樹状細胞が仲介する疾患の治療成分のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】本発明に係る樹状細胞の成熟抑制剤は、ＴＡＲＭ１タンパク質とコラーゲンタンパク質との結合を阻害することにより、樹状細胞の成熟を抑制する。樹状細胞の成熟抑制剤としては、例えば、ＴＡＲＭ１タンパク質のコラーゲン結合ドメインに結合することにより、ＴＡＲＭ１タンパク質とコラーゲンタンパク質との結合を阻害する分子；コラーゲンタンパク質に結合することにより、ＴＡＲＭ１タンパク質とコラーゲンタンパク質との結合を阻害する分子；等が挙げられる。【選択図】図５Ａ
2020063198.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＡＲＭ１タンパク質とコラーゲンタンパク質との結合を阻害することにより、樹状細胞の成熟を抑制する樹状細胞の成熟抑制剤。
【請求項２】
ＴＡＲＭ１タンパク質のコラーゲン結合ドメイン又はコラーゲンタンパク質に結合する請求項１に記載の樹状細胞の成熟抑制剤。
【請求項３】
ＴＡＲＭ１タンパク質のコラーゲン結合ドメイン若しくはコラーゲンタンパク質に結合する抗体又はその機能的断片である請求項２に記載の樹状細胞の成熟抑制剤。
【請求項４】
ＴＡＲＭ１タンパク質若しくはコラーゲンタンパク質又はそれらの機能的等価物である請求項２に記載の樹状細胞の成熟抑制剤。
【請求項５】
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリペプチド、又は該ポリペプチドとＩｇＧのＦｃ領域との融合タンパク質である請求項４に記載の樹状細胞の成熟抑制剤。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、Ｎ末端から２７番目〜１２０番目又は１２４番目〜２１９番目のアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド。
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、Ｎ末端から２７番目〜１２０番目又は１２４番目〜２１８番目のアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド。
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、コラーゲンタンパク質への結合能を有するポリペプチド。
（ｄ）前記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、コラーゲンタンパク質への結合能を有するポリペプチド。
【請求項６】
コラーゲンポリペプチド、コラーゲン様ドメインを含むポリペプチド、又はコラーゲンポリペプチド若しくはコラーゲン様ドメインを含むポリペプチドとＩｇＧのＦｃ領域との融合タンパク質である請求項４に記載の樹状細胞の成熟抑制剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の樹状細胞の成熟抑制剤を未成熟樹状細胞に接触させることを含む樹状細胞の成熟抑制方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の樹状細胞の成熟抑制剤を有効成分として含有し、樹状細胞が仲介する疾患の治療に用いられる医薬組成物。
【請求項９】
関節リウマチの治療に用いられる請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
被験物質の存在下及び非存在下において、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリペプチドとコラーゲンタンパク質との結合活性を測定する工程と、
前記被験物質の存在下における前記結合活性が前記被験物質の非存在下における前記結合活性よりも低い場合に、該被験物質を樹状細胞の成熟抑制剤の候補として選択する工程と、
を含むスクリーニング方法。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から２７番目〜１２０番目又は１２４番目〜２１９番目のアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド。
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から２７番目〜１２０番目又は１２４番目〜２１８番目のアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド。
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列のうち、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、コラーゲンタンパク質への結合能を有するポリペプチド。
（ｄ）前記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、コラーゲンタンパク質への結合能を有するポリペプチド。
【請求項１１】
被験物質の存在下及び非存在下において、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリペプチドとコラーゲンタンパク質との結合活性を測定する工程と、
前記被験物質の存在下における前記結合活性が前記被験物質の非存在下における前記結合活性よりも低い場合に、該被験物質を樹状細胞が仲介する疾患の治療成分の候補として選択する工程と、
を含むスクリーニング方法。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から２７番目〜１２０番目又は１２４番目〜２１９番目のアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド。
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から２７番目〜１２０番目又は１２４番目〜２１８番目のアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド。
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列のうち、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、コラーゲンタンパク質への結合能を有するポリペプチド。
（ｄ）前記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、コラーゲンタンパク質への結合能を有するポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、樹状細胞の成熟抑制剤及び成熟抑制方法、医薬組成物、並びに樹状細胞の成熟抑制剤又は樹状細胞が仲介する疾患の治療成分のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞やマクロファージ等の抗原提示細胞は、様々な共刺激受容体を発現している。共刺激受容体は、ＭＨＣクラスＩ分子及びＭＨＣクラスＩＩ分子とＴ細胞受容体との相互作用と協同的にＴ細胞に活性化シグナルを伝達し、獲得免疫応答を活性化する。また、共刺激受容体は、Ｔ細胞の不応答を誘導する抑制シグナルも伝達する。この正及び負のシグナルは、受容体とリガンドとの相互作用によって精緻にコントロールされている。このため、抗原提示細胞の受容体−リガンド軸によって適切なシグナルが伝達されることは、Ｔ細胞を介した免疫応答の制御にとって極めて重要である。例えば、関節リウマチ等の自己免疫疾患には、共刺激シグナルの低下が密接に関係している。
【０００３】
白血球免疫グロブリン様受容体（ＬＩＬＲ）ファミリーには、数多くの免疫グロブリン様受容体が含まれる。一部の免疫グロブリン様受容体は、樹状細胞やマクロファージ等の骨髄系細胞に発現しており、免疫細胞への共刺激を仲介している。過去の幾つかの報告では、ＬＩＬＲファミリーの遺伝子が自己免疫疾患に密接に関与していることが示唆されている。
【０００４】
最近になり、ＬＩＬＲファミリーの白血球受容体複合体の領域にコードされる免疫グロブリン様受容体として、ＴＡＲＭ１（T cell-interacting, activating receptor on myeloid cells-1）が同定された（非特許文献１参照）。ＴＡＲＭ１は、２つの細胞外免疫グロブリン様ドメイン、膜貫通ドメイン、及び典型的なシグナルモチーフを持たない短い細胞質ドメインから構成され、ＩＴＡＭ（Immunoreceptor tyrosine-based activation motif）を有するアダプター分子であるＦｃＲγ鎖と特異的に会合する。アミノ酸配列解析の結果、ＴＡＲＭ１は、ヒト単球由来樹状細胞やマウス破骨細胞の共刺激を仲介するＯＳＣＡＲ（Osteoclast-associated receptor）との相同性が高いことが判明している。ＴＡＲＭ１は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンドの存在下、抗ＴＡＲＭ１モノクローナル抗体で架橋することにより、マクロファージ及び好中球からのＴＮＦ−α及びＩＬ−６の産生を促進する。また、ＴＡＲＭ１遺伝子の発現は、ＬＰＳ（lipopolysaccharide）等の炎症刺激により亢進する。
【０００５】
特許文献１には、樹状細胞にＴＡＲＭ（ＴＡＲＭ１等）が発現していること、炎症刺激によりＴＡＲＭの発現が亢進すること、ＴＡＲＭを介して樹状細胞とＴ細胞とが接着すること、抗ＴＡＲＭ抗体により樹状細胞とＴ細胞との接着が抑制されること、抗ＴＡＲＭ抗体がコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）に対する治療効果を有すること等が記載されている。しかし、ＴＡＲＭ１と樹状細胞の成熟との関係については従来知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００７／０３７４３０号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】V. Radjabova et al., J. Immunol., 195, 3149-3159, 2015
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、樹状細胞の成熟を抑制することが可能な新規な樹状細胞の成熟抑制剤、その成熟抑制剤を用いた樹状細胞の成熟抑制方法、その成熟抑制剤を有効成分として含有する医薬組成物、樹状細胞の成熟抑制剤のスクリーニング方法、及び樹状細胞が仲介する疾患の治療成分のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するための具体的な手段には、以下の実施態様が含まれる。
＜１＞  ＴＡＲＭ１タンパク質とコラーゲンタンパク質との結合を阻害することにより、樹状細胞の成熟を抑制する樹状細胞の成熟抑制剤。
【００１０】
＜２＞  ＴＡＲＭ１タンパク質のコラーゲン結合ドメイン又はコラーゲンタンパク質に結合する＜１＞に記載の樹状細胞の成熟抑制剤。
【００１１】
＜３＞  ＴＡＲＭ１タンパク質のコラーゲン結合ドメイン若しくはコラーゲンタンパク質に結合する抗体又はその機能的断片である＜２＞に記載の樹状細胞の成熟抑制剤。
【００１２】
＜４＞  ＴＡＲＭ１タンパク質若しくはコラーゲンタンパク質又はそれらの機能的等価物である＜２＞に記載の樹状細胞の成熟抑制剤。
【００１３】
＜５＞  下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリペプチド、又は該ポリペプチドとＩｇＧのＦｃ領域との融合タンパク質である＜４＞に記載の樹状細胞の成熟抑制剤。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、Ｎ末端から２７番目〜１２０番目又は１２４番目〜２１９番目のアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド。
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、Ｎ末端から２７番目〜１２０番目又は１２４番目〜２１８番目のアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド。
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、コラーゲンタンパク質への結合能を有するポリペプチド。
（ｄ）前記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、コラーゲンタンパク質への結合能を有するポリペプチド。
【００１４】
＜６＞  コラーゲンポリペプチド、コラーゲン様ドメインを含むポリペプチド、又はコラーゲンポリペプチド若しくはコラーゲン様ドメインを含むポリペプチドとＩｇＧのＦｃ領域との融合タンパク質である＜４＞に記載の樹状細胞の成熟抑制剤。
【００１５】
＜７＞  ＜１＞〜＜６＞のいずれか１項に記載の樹状細胞の成熟抑制剤を未成熟樹状細胞に接触させることを含む樹状細胞の成熟抑制方法。
【００１６】
＜８＞  ＜１＞〜＜６＞のいずれか１項に記載の樹状細胞の成熟抑制剤を有効成分として含有し、樹状細胞が仲介する疾患の治療に用いられる医薬組成物。
【００１７】
＜９＞  関節リウマチの治療に用いられる＜８＞に記載の医薬組成物。
【００１８】
＜１０＞  被験物質の存在下及び非存在下において、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリペプチドとコラーゲンタンパク質との結合活性を測定する工程と、
前記被験物質の存在下における前記結合活性が前記被験物質の非存在下における前記結合活性よりも低い場合に、該被験物質を樹状細胞の成熟抑制剤の候補として選択する工程と、
を含むスクリーニング方法。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から２７番目〜１２０番目又は１２４番目〜２１９番目のアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド。
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から２７番目〜１２０番目又は１２４番目〜２１８番目のアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド。
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列のうち、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、コラーゲンタンパク質への結合能を有するポリペプチド。
（ｄ）前記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、コラーゲンタンパク質への結合能を有するポリペプチド。
【００１９】
＜１１＞  被験物質の存在下及び非存在下において、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリペプチドとコラーゲンタンパク質との結合活性を測定する工程と、
前記被験物質の存在下における前記結合活性が前記被験物質の非存在下における前記結合活性よりも低い場合に、該被験物質を樹状細胞が仲介する疾患の治療成分の候補として選択する工程と、
を含むスクリーニング方法。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から２７番目〜１２０番目又は１２４番目〜２１９番目のアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド。
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から２７番目〜１２０番目又は１２４番目〜２１８番目のアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド。
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列のうち、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、コラーゲンタンパク質への結合能を有するポリペプチド。
（ｄ）前記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、コラーゲンタンパク質への結合能を有するポリペプチド。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、樹状細胞の成熟を抑制することが可能な新規な樹状細胞の成熟抑制剤、その成熟抑制剤を用いた樹状細胞の成熟抑制方法、その成熟抑制剤を有効成分として含有する医薬組成物、樹状細胞の成熟抑制剤のスクリーニング方法、及び樹状細胞が仲介する疾患の治療成分のスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】Ｉｌ１ｒｎ−／−マウスの関節におけるＴａｒｍ１遺伝子の発現を定量的ＰＣＲにより分析した結果を示す図である（＊ｐ＜０．０５（スチューデントの両側ｔ検定））。
【図１Ｂ】ＨＴＬＶ−Ｉ Ｔｇマウスの関節におけるＴａｒｍ１遺伝子の発現を定量的ＰＣＲにより分析した結果を示す図である（＊ｐ＜０．０５（スチューデントの両側ｔ検定））。
【図１Ｃ】Ｉｌ１ｒｎ−／−マウスの関節におけるＴａｒｍ１遺伝子及び炎症性サイトカイン遺伝子の発現を定量的ＰＣＲにより分析した結果を示す図である。
【図１Ｄ】ＨＴＬＶ−Ｉ Ｔｇマウスの関節におけるＴａｒｍ１遺伝子及び炎症性サイトカイン遺伝子の発現を定量的ＰＣＲにより分析した結果を示す図である。
【図１Ｅ】ＩＩ型コラーゲンとＣＦＡとを混合したエマルションをＴａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス及びＷＴマウスに免疫したときの関節炎の発症率を示す図である（＊ｐ＜０．０５（χ２検定）。
【図１Ｆ】ＩＩ型コラーゲンとＣＦＡとを混合したエマルションをＴａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス及びＷＴマウスに免疫したときの関節炎の重症度を示す図である（＊ｐ＜０．０５（マン・ホイットニーのＵ検定））。
【図１Ｇ】免疫後５０日目のＴａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス及びＷＴマウスにおける関節の状態を示す図である。
【図１Ｈ】免疫後５０日目のＴａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス及びＷＴマウスにおける関節炎部分の組織をサフラニンＯで染色した結果を示す図である。
【図１Ｉ】免疫後５０日目のＴａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス及びＷＴマウスにおける関節炎部分の組織をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）で染色した結果を示す図である。
【図１Ｊ】免疫後５０日目のＴａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス及びＷＴマウスにおける滑膜炎、パンヌス形成、及び骨破壊を含む組織病理学スコアを示す図である（＊ｐ＜０．０５（マン・ホイットニーのＵ検定））。
【図１Ｋ】免疫後４２日目のＴａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス及びＷＴマウスについて、免疫細胞（ＣＤ１１ｃ＋、Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ＋ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ４４＋ＣＤ４＋、ＣＤ１９＋）のポピュレーションをフローサイトメトリーにより解析した結果を示す図である（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１（スチューデントの両側ｔ検定））。
【図１Ｌ】Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス及びＷＴマウスについて、ＩＩ型コラーゲンに特異的なＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３の抗体価をＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す図である（＊＊ｐ＜０．０１（スチューデントの両側ｔ検定））。
【図２Ａ】ＣＩＡ誘導後１０日目のＴａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス及びＷＴマウスから採取した所属リンパ節（ｄＬＮ）の細胞をＩＩ型コラーゲンにより再刺激した後、［３Ｈ］チミジン取り込みを測定した結果を示す図である（＊ｐ＜０．０５（スチューデントの両側ｔ検定））。
【図２Ｂ】所属リンパ節の細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで６６時間、種々の濃度のＩＩ型コラーゲンにより再刺激した後の培養上清に含まれるＴＮＦの量をＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す図である（＊ｐ＜０．０５（スチューデントの両側ｔ検定））。
【図２Ｃ】所属リンパ節の細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで６６時間、種々の濃度のＩＩ型コラーゲンにより再刺激した後の培養上清に含まれるＩＮＦ−γの量をＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す図である（＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１（スチューデントの両側ｔ検定））。
【図２Ｄ】所属リンパ節の細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで６６時間、種々の濃度のＩＩ型コラーゲンにより再刺激した後の培養上清に含まれるＩＬ−１７の量をＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す図である（＊＊＊ｐ＜０．００１（スチューデントの両側ｔ検定））。
【図２Ｅ】ＣＩＡ誘導後１０日目のＴａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス及びＷＴマウスについて、所属リンパ節におけるＩ−Ａ／Ｉ−Ｅ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞のポピュレーションをフローサイトメトリーにより解析した結果を示す図である（＊＊ｐ＜０．０１（スチューデントの両側ｔ検定））。
【図２Ｆ】ＣＩＡ誘導後１０日目のＴａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス及びＷＴマウスについて、所属リンパ節のＣＤ１１ｃ＋細胞におけるＩ−Ａ／Ｉ−Ｅの発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す図である（＊＊＊ｐ＜０．００１（スチューデントの両側ｔ検定））。
【図２Ｇ】ＣＩＡ誘導後１０日目のＴａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス及びＷＴマウスの所属リンパ節から樹状細胞及びＴ細胞を単離し、ＩＩ型コラーゲンの存在下で共培養したときのＴ細胞の増殖を［３Ｈ］チミジン取り込みにより確認した結果を示す図である（＊ｐ＜０．０５（スチューデントの両側ｔ検定））。
【図３Ａ】ＧＭ−ＣＳＦ誘導性樹状細胞（ＧＭ−ＤＣｓ）、Ｍ−ＣＳＦ誘導性骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭｓ）、破骨細胞（ＯＣｓ）、Ｔ細胞（Ｔｈｙ１．２＋細胞）、及びＢ細胞（Ｂ２２０＋細胞）におけるＴａｒｍ１遺伝子の発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより分析した結果を示す図である。
【図３Ｂ】Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／＋マウス及びＷＴマウスについて、通常型樹状細胞（ｃＤＣｓ；ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋及びＣＤ２４＋ＣＤ１１ｃ＋）及び形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣｓ；Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｃ＋）におけるＴａｒｍ１遺伝子の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す図である。
【図３Ｃ】ＣＩＡ誘導後７日目のＴａｒｍ１ｅｇｆｐ／＋マウス及びＷＴマウスについて、炎症性樹状細胞（ｉＤＣｓ；Ｌｙ６Ｃ＋Ｌｙ６Ｇ−ＭＨＣ ＩＩｈｉＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋）におけるＴａｒｍ１遺伝子の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す図である。
【図３Ｄ】ＧＭ−ＤＣｓにおけるＴａｒｍ１遺伝子の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す図である。
【図３Ｅ】Ｆｌｔ３Ｌ誘導性樹状細胞（ＦＬ−ＤＣｓ）におけるＴａｒｍ１遺伝子の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す図である。
【図３Ｆ】ＧＭ−ＤＣｓを炎症性サイトカイン（ＴＮＦ、ＩＬ−１β）で処理した後、Ｔａｒｍ１遺伝子の発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより分析した結果を示す図である。
【図３Ｇ】ＧＭ−ＤＣｓを病原体関連分子パターン（ＬＰＳ、ＣｐＧ、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））で処理した後、Ｔａｒｍ１遺伝子の発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより分析した結果を示す図である。
【図３Ｈ】Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス由来及びＷＴマウス由来のＧＭ−ＤＣｓについて、ＧＭ−ＣＳＦ処理から所定日数経過後に、ＣＤ１１ｃ＋細胞の割合をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す図である。
【図３Ｉ】Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス由来及びＷＴマウス由来のＧＭ−ＤＣｓについて、ＧＭ−ＣＳＦ処理から所定日数経過後に、Ｉ−Ａ／Ｉ−ＥｈｉＣＤ１１ｃ＋細胞の割合をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す図である（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１（スチューデントの両側ｔ検定））。
【図３Ｊ】Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス由来及びＷＴマウス由来のＧＭ−ＤＣｓについて、ＧＭ−ＣＳＦ処理から所定日数経過後に、樹状細胞活性化マーカー（Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ、ＣＤ８６、ＣＤ８０）の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す図である（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１（スチューデントの両側ｔ検定））。
【図３Ｋ】Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス由来及びＷＴマウス由来のＧＭ−ＤＣｓについてＤＮＡマイクロアレイにより遺伝子発現を解析したときの、発現量の差異が２倍超である遺伝子のヒートマップを示す図である。
【図３Ｌ】ＯＴ−ＩＩ Ｔｇマウス由来のＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋ Ｔ細胞を、所定濃度のＯＶＡの存在下、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス由来及びＷＴマウス由来のＧＭ−ＤＣｓと共培養し、培養３日目にＣＦＳＥ強度をフローサイトメトリーにより測定した結果を示す図である（＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１（スチューデントの両側ｔ検定））。
【図４Ａ】Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス由来及びＷＴマウス由来のＧＭ−ＤＣｓとＴａｒｍ１−Ｆｃとの結合をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す図である。
【図４Ｂ】トリプシン処理又は未処理のＧＭ−ＤＣｓとＴａｒｍ１−Ｆｃとの結合をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す図である。
【図４Ｃ】プレートに固定化されたＩ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、又はＢＳＡに対するＴａｒｍ１−Ｆｃの結合性を固相結合アッセイにより確認した結果を示す図である。
【図４Ｄ】ＥＤＴＡの存在下又は非存在下で、プレートに固定化されたＩＩ型コラーゲンに対するＴａｒｍ１−Ｆｃの結合性を固相結合アッセイにより確認した結果を示す図である。
【図４Ｅ】ＧＭ−ＤＣｓの細胞表面におけるＩ型コラーゲン及びＩＩ型コラーゲンの発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す図である。
【図４Ｆ】コラーゲン処理又は未処理のＧＭ−ＤＣｓについて、Ｔａｒｍ１−Ｆｃとの結合をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す図である。
【図４Ｇ】ＧＭ−ＤＣｓの全細胞溶解液（ＷＣＬ）についてＴａｒｍ１−Ｆｃ又はＩｇＧ Ｆｃを用いて免疫沈降を行い、沈殿物について抗ＩＩ型コラーゲン抗体を用いてイムノブロッティングを行った結果を示す図である。
【図４Ｈ】Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス由来及びＷＴマウス由来のＧＭ−ＤＣｓをＩＩ型コラーゲンで刺激し、樹状細胞活性化マーカー（ＣＤ８６、Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ）の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す図である（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１（スチューデントの両側ｔ検定））。
【図４Ｉ】Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス由来及びＷＴマウス由来のＧＭ−ＤＣｓをＩＩ型コラーゲンで刺激し、培養上清中のサイトカイン（ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０）の濃度をサイトメトリックビーズを用いたフローサイトメトリーにより解析した結果を示す図である（＊＊ｐ＜０．０１（スチューデントの両側ｔ検定））。
【図５Ａ】ＣＩＡを誘導したＤＢＡ／１Ｊマウスの左足首関節及び右足首関節の関節腔にＴａｒｍ１−Ｆｃ及びＩｇＧ Ｆｃを投与したときの関節炎の重症度を示す図である（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１（マン・ホイットニーのＵ検定））。
【図５Ｂ】ＣＩＡを誘導したＤＢＡ／１Ｊマウスの左足首関節及び右足首関節の関節腔にＴａｒｍ１−Ｆｃ及びＩｇＧ Ｆｃを投与したときの足の状態を示す図である。
【図５Ｃ】Ｔａｒｍ１−Ｆｃ及びＩｇＧ Ｆｃを投与したＤＢＡ／１Ｊマウスの足首関節の組織をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）で染色した染色像を示す図である。
【図５Ｄ】Ｔａｒｍ１−Ｆｃ及びＩｇＧ Ｆｃを投与したＤＢＡ／１Ｊマウスにおける滑膜炎、パンヌス形成、及び骨破壊を含む組織病理学スコアを示す図である（＊ｐ＜０．０５（マン・ホイットニーのＵ検定））。
【図５Ｅ】Ｔａｒｍ１−Ｆｃ及びＩｇＧ Ｆｃを投与したＤＢＡ／１Ｊマウスの関節におけるサイトカイン（ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７ａ）遺伝子の発現を定量的ＰＣＲにより分析した結果を示す図である（＊ｐ＜０．０５（スチューデントの両側ｔ検定））。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
＜樹状細胞の成熟抑制剤＞
本実施形態に係る樹状細胞の成熟抑制剤は、ＴＡＲＭ１タンパク質とコラーゲンタンパク質との結合を阻害することにより、樹状細胞の成熟を抑制するものである。
【００２３】
ＴＡＲＭ１タンパク質は、樹状細胞の細胞膜に発現しているタンパク質であり、炎症刺激により発現が増強することが知られている。ＴＡＲＭ１タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列情報及びＴＡＲＭ１タンパク質のアミノ酸配列情報は、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋデータベースから入手可能である。一例として、ヒトＴＡＲＭ１の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号１、２に示し、マウスＴＡＲＭ１の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号３、４に示す。
【００２４】
本発明者らは、樹状細胞の細胞膜に発現しているＴＡＲＭ１タンパク質が、同じく樹状細胞の細胞膜に発現しているＩＩ型コラーゲンタンパク質に結合すること（すなわち、ＩＩ型コラーゲンタンパク質がＴＡＲＭ１タンパク質のリガンドであること）、ＩＩ型コラーゲンタンパク質が樹状細胞の成熟をＴＡＲＭ１依存的に制御していること、ＴＡＲＭ１タンパク質の細胞外ドメインとＩｇＧのＦｃ領域との融合タンパク質（ＴＡＲＭ１−Ｆｃ）を用いてＴＡＲＭ１タンパク質とＩＩ型コラーゲンタンパク質との結合を阻害することにより、樹状細胞の成熟が抑制されること等を見出した。
【００２５】
また、本発明者らは、ＴＡＲＭ１タンパク質がＩ型コラーゲンタンパク質に結合すること（すなわち、Ｉ型コラーゲンタンパク質がＴＡＲＭ１タンパク質のリガンドであること）も見出した。樹状細胞は、Ｉ型コラーゲンタンパク質に結合すると成熟が促進することが知られている（U. Brand et al., Eur. J. Immunol., 28, 1673-1680, 1998）。したがって、ＴＡＲＭ１タンパク質とＩ型コラーゲンタンパク質との結合を阻害することにより、樹状細胞の成熟を抑制することができる。
【００２６】
本実施形態に係る樹状細胞の成熟抑制剤によれば、樹状細胞の成熟を抑制することにより、樹状細胞が仲介する免疫反応を抑制することが可能である。したがって、本実施形態に係る樹状細胞の成熟抑制剤は、例えば、樹状細胞が仲介する疾患の治療成分として使用することができる。実際、本発明者らは、コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデルにおいて、ＴＡＲＭ１−Ｆｃが治療効果を有することを確認している。なお、コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデルは、自己免疫疾患の１つである関節リウマチのモデルである。
【００２７】
本実施形態に係る樹状細胞の成熟抑制剤は、ＴＡＲＭ１タンパク質とコラーゲンタンパク質との結合を阻害する作用を有するものであれば特に制限されない。樹状細胞の成熟抑制剤としては、例えば、ＴＡＲＭ１タンパク質のコラーゲン結合ドメインに結合することにより、ＴＡＲＭ１タンパク質とコラーゲンタンパク質との結合を阻害する分子；コラーゲンタンパク質に結合することにより、ＴＡＲＭ１タンパク質とコラーゲンタンパク質との結合を阻害する分子；等が挙げられる。
【００２８】
本実施形態に係る樹状細胞の成熟抑制剤は、ＴＡＲＭ１タンパク質のコラーゲン結合ドメイン若しくはコラーゲンタンパク質に結合する抗体又はその機能的断片であってもよい。
【００２９】
ＴＡＲＭ１タンパク質のコラーゲン結合ドメインに結合する抗体としては、ＴＡＲＭ１タンパク質のコラーゲン結合ドメインの一部又は全部をエピトープとして認識するものが挙げられる。後述するように、ＴＡＲＭ１タンパク質の２つの免疫グロブリン様ドメインはコラーゲンタンパク質への結合能を有するため、ＴＡＲＭ１タンパク質に結合する抗体としては、例えば、少なくとも一方の免疫グロブリン様ドメインの一部又は全部をエピトープとして認識するものを用いることができる。
【００３０】
コラーゲンタンパク質に結合する抗体としては、Ｉ型コラーゲンタンパク質又はＩＩ型コラーゲンタンパク質の少なくとも一部をエピトープとして認識するものが挙げられる。
【００３１】
抗体のアイソタイプは特に制限されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等のいずれであってもよい。また、抗体は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれであってもよい。モノクローナル抗体としては、非ヒト動物への免疫により得られるモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体等が挙げられる。
【００３２】
抗体の機能的断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。
【００３３】
また、本実施形態に係る樹状細胞の成熟抑制剤は、抗体以外に、低分子化合物、ポリペプチド、タンパク質、多糖類、核酸等であってもよい。
【００３４】
上述したとおり、ＴＡＲＭ１タンパク質はコラーゲンタンパク質に結合するため、ＴＡＲＭ１タンパク質又はその機能的等価体を樹状細胞の成熟抑制剤として使用することもできる。ＴＡＲＭ１タンパク質の機能的等価体としては、例えば、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリペプチド、又は該ポリペプチドとＩｇＧのＦｃ領域との融合タンパク質が挙げられる。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から２７番目〜１２０番目又は１２４番目〜２１９番目のアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド。
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から２７番目〜１２０番目又は１２４番目〜２１８番目のアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド。
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列のうち、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、コラーゲンタンパク質への結合能を有するポリペプチド。
（ｄ）上記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、コラーゲンタンパク質への結合能を有するポリペプチド。
【００３５】
上記（ａ）のポリペプチドは、配列番号２に示すヒトＴＡＲＭ１タンパク質のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から２７番目〜１２０番目又は１２４番目〜２１９番目のアミノ酸残基を少なくとも含むものである。Ｎ末端から２７番目〜１２０番目の領域、及びＮ末端から１２４番目〜２１９番目の領域は、ヒトＴＡＲＭ１タンパク質の２つの免疫グロブリン様ドメインに対応する。ヒトＴＡＲＭ１タンパク質の少なくとも１つの免疫グロブリン様ドメインを含む上記（ａ）のポリペプチドは、コラーゲンタンパク質への結合能を有する。
【００３６】
なお、ＴＡＲＭ１タンパク質と相同性の高いＯＳＣＡＲタンパク質もまた２つの免疫グロブリン様ドメインを有しており、各免疫グロブリン様ドメインがコラーゲンタンパク質への結合能を有することが知られている（A. D. Barrow et al., J. Clin. Invest., 121, 3505-3516, 2011; L. Zhou et al., Blood, 127, 529-537, 2016; J. Haywood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 113, 1038-1043, 2016）。
【００３７】
上記（ｂ）のポリペプチドは、配列番号４に示すマウスＴＡＲＭ１タンパク質のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から２７番目〜１２０番目又は１２４番目〜２１８番目のアミノ酸残基を少なくとも含むものである。Ｎ末端から２７番目〜１２０番目の領域、及びＮ末端から１２４番目〜２１８番目の領域は、マウスＴＡＲＭ１タンパク質の２つの免疫グロブリン様ドメインに対応する。マウスＴＡＲＭ１タンパク質の少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含む上記（ｂ）のポリペプチドは、コラーゲンタンパク質への結合能を有する。
【００３８】
上記（ｃ）のポリペプチドは、上記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列のうち、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、コラーゲンタンパク質への結合能を有するものである。置換、欠失、又は付加されるアミノ酸残基の数は、コラーゲンタンパク質への結合能が維持される限り特に制限されない。置換、欠失、又は付加されるアミノ酸残基の数は、例えば、１〜３０個であってもよく、１〜２５個であってもよく、１〜２０個であってもよく、１〜１５個であってもよい。
【００３９】
任意のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する場合、通常、置換前後でアミノ酸側鎖の性質が保存されていることが好ましい。アミノ酸側鎖の性質によってアミノ酸を分類する場合、例えば、親水性アミノ酸（Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ）；疎水性アミノ酸（Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｍ、Ｃ、Ｐ）；酸性アミノ酸（Ｄ、Ｅ）；塩基性アミノ酸（Ｋ、Ｒ、Ｈ）；脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ）；芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｆ、Ｙ、Ｗ）；硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｍ、Ｃ）；等に分類することができる（括弧内のアルファベットはアミノ酸の一文字表記を示す）。
【００４０】
上記（ｄ）のポリペプチドは、上記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、コラーゲンタンパク質への結合能を有するものである。上記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列との配列同一性は、９２％以上であってもよく、９５％以上であってもよく、９８％以上であってもよく、９９％以上であってもよい。
【００４１】
なお、「配列同一性」とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントした場合の配列間の一致性を意味し、例えば、ＢＬＡＳＴプログラム（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/cgi）を使用して算出することができる。
【００４２】
また、上述したとおり、コラーゲンタンパク質はＴＡＲＭ１タンパク質に結合するため、コラーゲンタンパク質又はその機能的等価体を樹状細胞の成熟抑制剤として使用することもできる。コラーゲンタンパク質の機能的等価体としては、例えば、コラーゲンポリペプチド、コラーゲン様ドメインを含むポリペプチド、又はコラーゲンポリペプチド若しくはコラーゲン様ドメインを含むポリペプチドとＩｇＧのＦｃ領域との融合タンパク質が挙げられる。
【００４３】
＜樹状細胞の成熟抑制方法＞
本実施形態に係る樹状細胞の成熟抑制剤は、上述した本実施形態に係る樹状細胞の成熟抑制剤を未成熟樹状細胞に接触させることを含む。樹状細胞の成熟抑制剤については上述したとおりであるため、詳細な説明を省略する。
【００４４】
樹状細胞の成熟抑制剤を未成熟樹状細胞に接触させる方法は特に制限されず、例えば、樹状細胞の成熟抑制剤を含有する培地で未成熟樹状細胞を培養する方法が挙げられる。
【００４５】
なお、樹状細胞が未成熟樹状細胞であるか成熟樹状細胞であるかは、例えば、樹状細胞の成熟化マーカーであるＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ等の発現をフローサイトメトリーにより解析することによって判定することができる。
【００４６】
＜医薬組成物＞
本実施形態に係る医薬組成物は、上述した本実施形態に係る樹状細胞の成熟抑制剤を有効成分として含有する。樹状細胞の成熟抑制剤については上述したとおりであるため、詳細な説明を省略する。
【００４７】
本実施形態に係る医薬組成物は、樹状細胞の成熟を抑制することができるため、樹状細胞が仲介する疾患の治療に好適に用いることができる。すなわち、樹状細胞が仲介する疾患の患者に本実施形態に係る医薬組成物を投与することにより、当該疾患を治療することができる。樹状細胞が仲介する疾患としては、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患等を挙げることができる。自己免疫疾患としては、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、結合組織病、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、多発性硬化症、グッドパスチャー症候群、バセドウ病、Ｉ型糖尿病等が挙げられる。アレルギー性疾患としては、気道過敏症（喘息）、アトピー性皮膚炎等が挙げられる。炎症性疾患としては、潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬、乾癬性関節炎、腎炎等が挙げられる。
【００４８】
なお、「治療」には、疾患の症状を消失又は軽減させることのほか、症状の進行の度合いを抑制することも含まれる。
【００４９】
本実施形態に係る医薬組成物は、樹状細胞の成熟抑制剤以外の成分を含有していてもよい。例えば、医薬組成物は、製剤素材として慣用の有機又は無機の担体を含有していてもよい。この担体は、固形製剤においては、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等として、液状製剤においては、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤等として配合される。また、自己免疫疾患治療剤は、防腐剤、抗酸化剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を含有していてもよい。
【００５０】
医薬組成物の剤形は特に制限されない。医薬組成物の剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、フィルム剤等の経口剤；注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤、ペレット、経鼻剤、経肺剤（吸入剤）、点眼剤等の非経口剤；などが挙げられる。
【００５１】
医薬組成物の投与量は、投与対象（年齢、性別、体重等）、投与経路、対象疾患、症状などに応じて適宜決定される。通常、成人（体重６０ｋｇ）あたり、１〜５０００ｍｇ／日、好ましくは５〜２０００ｍｇ／日、より好ましくは５０〜２０００ｍｇ／日を、１回又は数回に分けて投与することができる。ただし、実際の投与量は、臨床医師の判断により大幅に変動することもあり、上記の投与量から逸脱することもある。
【００５２】
＜スクリーニング方法＞
本実施形態に係るスクリーニング方法の第１の態様は、被験物質の存在下及び非存在下において、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリペプチドとコラーゲンタンパク質との結合活性を測定する工程と、被験物質の存在下における結合活性が被験物質の非存在下における結合活性よりも低い場合に、該被験物質を樹状細胞の成熟抑制剤の候補として選択する工程と、を含む。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から２７番目〜１２０番目又は１２４番目〜２１９番目のアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド。
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から２７番目〜１２０番目又は１２４番目〜２１８番目のアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド。
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列のうち、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、コラーゲンタンパク質への結合能を有するポリペプチド。
（ｄ）上記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、コラーゲンタンパク質への結合能を有するポリペプチド。
【００５３】
また、本実施形態に係るスクリーニング方法の第２の態様は、被験物質の存在下及び非存在下において、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリペプチドとコラーゲンタンパク質との結合活性を測定する工程と、被験物質の存在下における結合活性が被験物質の非存在下における結合活性よりも低い場合に、該被験物質を樹状細胞が仲介する疾患の治療成分の候補として選択する工程と、を含む。
【００５４】
上記（ａ）〜（ｄ）のポリペプチドについては上述したとおりであるため、詳細な説明を省略する。
【００５５】
上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリペプチドとコラーゲンタンパク質との結合活性は、公知の方法に従って測定することができる。例えば、コラーゲンタンパク質を固相化したプレートに上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリペプチドを添加し、所定時間経過後、結合していないポリペプチドを洗浄等により取り除き、結合したポリペプチドの量を測定することにより、結合活性を測定することができる。上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリペプチドを添加する場合、該ポリペプチドは、酵素、放射性同位体、蛍光色素等の標識物質を用いて適宜標識することができる。
【００５６】
そして、被験物質の存在下における結合活性が被験物質の非存在下における結合活性よりも低い場合に、該被験物質を樹状細胞の成熟抑制剤の候補、又は樹状細胞が仲介する疾患の治療成分の候補として選択する。一例としては、被験物質の存在下における結合活性が被験物質の非存在下における結合活性に対して５０％以下である場合に、該被験物質を樹状細胞の成熟抑制剤の候補、又は樹状細胞が仲介する疾患の治療成分の候補として選択することができる。
【００５７】
なお、被験物質としては、低分子化合物、タンパク質、ポリペプチド、多糖類、核酸等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。被験物質は、新規な物質であっても公知の物質であってもよい。
【実施例】
【００５８】
以下に実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって制限されるものではない。
【００５９】
＜材料及び方法＞
（マウス）
ＣＤ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＢＡＬＢｃ／Ａマウス、及びＤＢＡ／１Ｊマウスは、日本エスエルシー（株）又は日本クレア（株）から購入した。Ｔａｒｍ１ヘテロ欠損マウス（Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／＋マウス）及びＴａｒｍ１ホモ欠損マウス（Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス）は、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスのＴａｒｍ１遺伝子のエクソン１をｅＧＦＰ遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子と相同組換えすることにより作製した。Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウスは予想されるメンデル比で産まれ、明確な異常を示さなかった。ＯＴ−ＩＩ ＴＣＲトランスジェニックマウス（ＯＴ−ＩＩ Ｔｇマウス）は、東京理科大学生命医科学研究所のＨ．Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ氏より供与を受けた。
【００６０】
全てのマウスは、東京理科大学生命医科学研究所のクリーンルーム内でＳＰＦ条件下にて飼育した。実験には、週齢（６〜１２週齢）及び性別を揃えたマウスを使用した。動物実験は学内委員会の承認を受けており、動物実験の倫理ガイドライン及び遺伝子操作実験の安全性ガイドラインに従って実施した。
【００６１】
（コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ））
ＣＩＡは既報に従って、以下のように誘導した（D. D. Brand et al., Nature protocols, 2, 1269-1275, 2007; J. J. Inglis et al., Nature protocols, 3, 612-618, 2008）。不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ；ThermoFisher Scientific）に結核菌（M. tuberculosis）（Ｈ３７Ｒａ；Difco）の加熱死菌を加えることにより、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；１ｍｇ／ｍＬ）を調製した。４ｍｇ／ｍＬ ＩＩ型コラーゲン（SIGMA-ALDRICH）とＣＦＡとを１：１（体積比）で混合することにより、エマルションを調製した。そして、マウス（８〜１０週齢）の尾の付け根付近の３箇所に計２００μＬのエマルションを皮内投与した。初回免疫から１４日経過後、同量のエマルションをブースター投与した。各足の腫脹は以下のようにスコア化して評価した。０：変化なし、１：腫脹又は発赤が指関節に認められた、２：軽度の腫脹が足首関節に認められた、３：重度の腫脹が足全体に認められた。四足分のスコアを合計したため、スコアの最大値は１２である。
【００６２】
自己免疫性関節炎に対するＴａｒｍ１−Ｆｃの治療効果を確認する際には、ＣＩＡ（軽度のスコア）を誘導したＤＢＡ／１Ｊマウスの左又は右足首関節の関節腔に、Ｔａｒｍ１−Ｆｃ（足首関節あたり１μｇ）又はＩｇＧ Ｆｃ（足首関節あたり１μｇ）を投与した。０日目に、２ｍｇ／ｍＬ ＩＩ型コラーゲン及び１．６５ｍｇ／ｍＬ ＣＦＡとからなるエマルション１００μＬを雌のＤＢＡ１／Ｊマウス（６〜８週齢）に投与して免疫した（M. A. Murayama et al., Nature communications, 6, 8483, 2015）。さらに２１日目に、同量のエマルションをブースター投与した。関節炎の進行は以下のようにスコア化して評価した。０：変化無し、１：紅斑及び軽度の腫脹が足根関節に認められた、２：紅斑及び軽度の腫脹が足根関節から足指に広がっていた、３：紅斑及び中等度の腫脹が中足骨関節から広がっていた、４：紅斑及び重度の腫脹が足首、足、足指に広がっていたか、又は足に強直があった。四足分のスコアを合計したため、スコアの最大値は１６である。
【００６３】
（組織病理学）
マウスを麻酔下で安楽死させて足を切断し、１０％ 中性ホルマリンで固定化した後、１０％ ＥＤＴＡで脱灰した。パラフィン包埋切片の作製及び免疫組織染色は、東京大学医科学研究所に委託して実施した。簡単には以下のとおりである。連続組織切片（５μｍ）をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）及びサフラニンＯで染色し、以下のようにスコア化して評価した（J. J. Inglis et al., Nature protocols, 3, 612-618, 2008）。０：炎症サインが認められなかった、１：滑膜表層の過形成を伴い、軟骨破壊を伴わない軽度の炎症が認められた、２：滑膜下内層においてグレード１の変化及び肉芽腫性病変が認められた、３：グレード２の変化、並びにパンヌス形成及び軟骨／骨破壊が認められた。足首関節の関節炎インデックスは、距骨、並びに脛骨及び踵骨を含む骨のグレードから推定した。
【００６４】
（抗体価）
ニワトリＩＩ型コラーゲンに特異的なＩｇＧの抗体価はＥＬＩＳＡにより測定した。血清は免疫から４２日後に回収した。ニワトリＩＩ型コラーゲン（２０μｇ／ｍＬ）を９６ウェルプレートにコートし、段階的に希釈した血清を添加して室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、アルカリホスファターゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Zymed）を添加して室温で１時間インキュベートした。次いで、基質となるホスファターゼであるＳＩＧＭＡ１０４（SIGMA-ALDRICH）を添加し、マクロプレートリーダー（ＭＴＰ−３００；Hitachi）を用いて波長４１５ｎｍの吸光度を測定した。
【００６５】
（フローサイトメトリー）
フローサイトメトリーは、既報に従って実施した（R. Yabe et al., FEBS Journal, 277, pp.4010-4026, 2010）。簡単には以下のとおりである。細胞を２．４Ｇ２抗体によりブロッキングした後、蛍光標識抗体により４℃で３０分間処理することにより、細胞を染色した。その後、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ又はＦＡＣＳＶｅｒｓｅ；Becton Dickinson）を用いて細胞を分析し、ＦｌｏｗＪｏ（Tree Star）を用いてデータを解析した。死細胞は、７ＡＡＤ（SIGMA-ALDRICH）及びＰＩ（SIGMA-ALDRICH）を用いて染色した。
【００６６】
樹状細胞サブセットの染色に際しては、２００Ｕ／ｍＬ ＶＩＩＩ型コラゲナーゼ（SIGMA-ALDRICH）を用いてリンパ節を酵素分解した。
【００６７】
セルソーティングに際しては、単細胞懸濁液をビオチン化抗体とともにインキュベートした後、抗ビオチンビーズ（Miltenyi Biotec）とともにインキュベートした。そして、磁気セルソーティングシステム（ａｕｔｏＭＡＣＳ；Miltenyi Biotec）を用いて、ネガティブセレクションモードにて、ラベルされた細胞を単離した。陰性細胞は蛍光標識抗体にて染色し、ＣＤ１１ｃ＋細胞及びＣＤ４＋ＣＤ３＋細胞はフローサイトメーター（ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ（Becton Dickinson）又はＭｏＦｌｏ ＸＤＰ（Beckman Coulter））を用いて高度に精製した。
【００６８】
Ｔａｒｍ１リガンドのスクリーニングに際しては、細胞を２．４Ｇ２抗体によりブロッキングした後、Ｔａｒｍ１−Ｆｃとともに氷上で１時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体（ＨＰ６０１７；BioLegend）とともにさらにインキュベートした。
【００６９】
サイトメトリー解析に使用した抗体を下記表１に示す。
【００７０】
【表１】
2020063198.tif 000003
【００７１】
（増殖応答アッセイ）
初回免疫後１０日目に安楽死させたマウスから鼡径部のリンパ節を採取した。所属リンパ節から単細胞懸濁液を調製し、所定濃度の熱変性ニワトリＩＩ型コラーゲンの存在下、９６ウェルプレートで培養した（２×１０５個／ウェル）。６６時間インキュベートした後、細胞を［３Ｈ］チミジン（０．２５μＣｉ／ｍＬ；PerkinElmer）で６時間処理することによりラベルした。細胞をMicro 96 cell harvester（Skatron）により回収し、［３Ｈ］放射活性をMicro Beta Systems（Pharmacia Biotech）により測定した。培養上清は刺激から６６時間後に回収した。
【００７２】
（サイトカイン産生の測定）
サイトカイン産生は、Mouse TNF ELISA MAX（BioLegend）、Duo set IFN-γ（R&D systems）、Duo set IL-17（R&D systems）、Cytometric Bead Array (CBA) mouse TNF Flex Set（BD Biosciences）、CBA mouse IL-6 Flex Set（BD Biosciences）、及びCBA mouse IL-10 Flex Set（BD Biosciences）を用いて測定した。
【００７３】
（逆転写及び定量ＰＣＲ）
組織及び細胞からＲＮＡを抽出し、それぞれSepasol-RNA I Super（Nacalai Tesque）及びGenElute mammalian total RNA miniprep kit（SIGMA-ALDRICH）を用いて精製した。得られたＲＮＡは、high capacity cDNA reverse transcription kit（Applied Biosystems）を用いて逆転写した。定量ＰＣＲ分析に際しては、下記表２に示すプライマーセットとともに、SYBR Premix Ex Taq I kit（TaKaRa）又はSYBR Premix Ex Taq II kit（TaKaRa）を使用した。
【００７４】
【表２】
2020063198.tif 000004
【００７５】
（骨髄由来樹状細胞の調製）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脛骨及び大腿骨から骨髄を取り出し、溶血バッファー（１４０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ，１７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．２）により赤血球を破壊することにより、骨髄細胞を回収した。
【００７６】
ＧＭ−ＣＳＦ誘導性樹状細胞（ＧＭ−ＤＣｓ）の調製に際しては、１０％ ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、０．１％ ２−メルカプトエタノール、及び組換えマウスＧＭ−ＣＳＦ（２〜２０ｎｇ／ｍＬ；Peprotech）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中、骨髄細胞を２×１０５個／ｍＬの細胞密度で培養した。培養３日目に、同量の培地をウェルにさらに添加した。培養６日目及び８日目に、接着性の弱い細胞を回収し、ＧＭ−ＣＳＦ（１〜１０ｎｇ／ｍＬ）を含有する新しい培地で培養した。そして、非接着性の細胞をＧＭ−ＤＣｓとして使用した。
【００７７】
Ｆｌｔ３Ｌ誘導性樹状細胞（ＦＬ−ＤＣｓ）の調製に際しては、１０％ ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、０．１％ ２−メルカプトエタノール、及び組換えマウスＦｌｔ３Ｌ（１００ｎｇ／ｍＬ；Peprotech）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中、骨髄細胞を２×１０６個／ｍＬの細胞密度で培養した。そして、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳでピペッティングすることにより接着性細胞を回収し、ＦＬ−ＤＣｓとして使用した。
【００７８】
Ｍ−ＣＳＦ誘導性骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）の調製に際しては、１０％ ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、０．１％ ２−メルカプトエタノール、及び組換えヒトＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ；R&D systems）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中、骨髄細胞を２×１０６個／ｍＬの細胞密度で培養した。培養３日目に、半量の培地をウェルにさらに添加した。そして、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳで剥離することにより接着性細胞を回収し、ＢＭＭとして使用した。
【００７９】
（ＧＭ−ＤＣｓへの刺激）
大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４のＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ；SIGMA-ALDRICH）、ＣｐＧ（１μＭ；Eurofins Genomics）、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（１００μｇ／ｍＬ；InvivoGen）、ＴＮＦ（１０ｎｇ／ｍＬ；Peprotech）、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ；Peprotech）、又はＩＩ型コラーゲン（１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、又は１００μｇ／ｍＬ；SIGMA-ALDRICH）の存在下、ＧＭ−ＤＣｓを３７℃で所定時間培養した。
【００８０】
（ＤＮＡマイクロアレイ）
ＤＮＡマイクロアレイ分析は化学物質評価研究機構に委託して実施した。簡単には以下のとおりである。2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies）を用いてＲＮＡの分解度及び品質を確認した。ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを得た後、Low Input Quick Amp Labeling Kit（Agilent）を用いて、転写物であるＣｙ３ラベル化ｃＲＮＡを得た。得られたサンプルは、オーブン内でSurePrint G3 Mouse GE Microarray（Ver.2.0）にハイブリダイズさせ、DNA Microarray Scanner（Agilent Technologies）を用いてマイクロアレイをスキャンした。
【００８１】
Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウスのＧＭ−ＤＣｓにおいて発現が１／２以下に下方制御されている遺伝子について、PANTHER Overrepresentation Testにより遺伝子オントロジー解析を行い、ボンフェローニ補正によって修正した。
【００８２】
（ＧＭ−ＤＣｓ及びＴ細胞の共培養）
ＯＴ−ＩＩ Ｔｇマウスの脾臓及びリンパ節から単離した細胞を２．４Ｇ２抗体でブロッキングした後、ビオチン化抗ＣＤ１１ｃ抗体（BioLegend）、ビオチン化抗ＣＤ１１ｂ抗体（BioLegend）、又はビオチン化抗Ｂ２２０抗体（BioLegend）で処理し、抗ビオチンビーズ（Miltenyi Biotec）で処理した。ラベル化された細胞は、磁気セルソーティングシステム（ａｕｔｏＭＡＣＳ；Miltenyi Biotec）を用いて取り除いた。陰性画分をさらに抗ＣＤ４ビーズ（Miltenyi Biotec）で処理し、磁気セルソーティングシステムを用いてラベル化された細胞（ＣＤ４＋ Ｔ細胞）を回収した。ＣＤ４＋ Ｔ細胞を５μＭ ＣＦＳＥ（Invitrogen）とともに３７℃で５分間インキュベートした。そして、ＯＶＡ（１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、又は１００μｇ／ｍＬ）の存在下、ＣＦＳＥラベル化ＣＤ４＋ Ｔ細胞（２×１０５個／ウェル）をＧＭ−ＤＣｓ（２×１０４個／ウェル）とともに３７℃で３日間共培養した。細胞増殖はフローサイトメトリーにより解析した。
【００８３】
（Ｆｃ融合タンパク質）
ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質は既報に従って合成した（R. Yabe et al., FEBS Journal, 277, 4010-4026, 2010）。Lipofectamine LTX（Invitrogen）を用いてプラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトから２４時間後、２％ 低ＩｇＧ ＦＢＳ（Invitrogen）を含有するＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（Invitrogen）へと培地を交換した。そして、Protein A Sepharose担体を用いたアフィニティクロマトグラフィーにより、培地中に分泌された融合タンパク質を精製した。
【００８４】
（トリプシン消化及びコラゲナーゼ消化）
トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．０５％又は０．０２％；SIGMA-ALDRICH）又は２００Ｕ／ｍＬ コラゲナーゼ（Wako chemicals）を用いて、細胞を３７℃で３０分間処理した。
【００８５】
（固相結合アッセイ）
Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルプレート（ThermoFisher SCIENTIFIC）にＩ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、又はＢＳＡ（０〜１０μｇ／ｍＬ）をコートし、洗浄バッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０及び２ｍＭ ＣａＣｌ２を含有するＴＢＳ）により洗浄した後、ブロッキングバッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０及び５％ ＢＳＡを含有するＴＢＳ）によりブロッキングを行った。ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質（５μｇ／ｍＬ）を含有する結合バッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍＭ ＣａＣｌ２、及び０．５％ ＢＳＡを含有するＴＢＳ）は、室温で２時間インキュベートした。ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｆｃγフラグメント特異的；５０００倍希釈；Jackson ImmunoResearch）は、室温で１時間インキュベートした。そして、各ウェルに発色試薬としてSureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate（SeraCare）を添加した後、１Ｎ ＨＣｌにより反応を停止させた。発色は、ｉＭａｒｋマクロプレートリーダー（BIO-RAD）を用いて波長４５０ｎｍにてモニターした。
【００８６】
（Ｔａｒｍ１−Ｆｃによる免疫沈降及びウェスタンブロッティング）
１％ ＮＰ−４０及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（哺乳動物細胞／組織抽出物用）（Nacalai tesque）を含有するＴＢＳにより細胞を溶解した。細胞溶解液をプレクリアした後、Ｔａｒｍ１−Ｆｃ又はＩｇＧ Ｆｃを固定化したProtein A Sepharose担体とともに４℃で一晩インキュベートした。次いで、洗浄を行った後、スラリーをＳＤＳサンプルバッファーとともに９５℃で５分間加熱した。加熱後のサンプルを遠心分離し、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ＰＶＤＦ膜にエレクトロブロッティングを行った。次いで、ＰＶＤＦ膜を４％ ＢｌｏｃｋＡｃｅ（DS Pharma Biomedical Co.）でブロッキングした後、ビオチン化抗ＩＩ型コラーゲン抗体（Ａ２−１０、Ｆ１０−２１、Ｄ８−６、Ｄ１−２Ｇ；Chondrex）とともにインキュベートし、さらにＨＲＰ標識ストレプトアビジン（BioLegend）とともにインキュベートした。その後、ＰＶＤＦ膜をECL Prime Western Blotting Detection System（GE Healthcare）とともにインキュベートし、デジタルイメージャー（ＬＡＳ４０００システム；Fuji Film Life Science）を用いて化学発光を検出した。
【００８７】
（統計処理）
統計処理には、スチューデントの両側ｔ検定、χ２検定、及びマン・ホイットニーのＵ検定を使用し、Ｐ値が０．０５未満である場合を統計学的に有意であると判定した（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。データは平均値±ＳＤで示した。
【００８８】
＜試験例１＞
従来、遺伝子発現解析により、白血球免疫グロブリン様受容体（ＬＩＬＲ）ファミリーの免疫グロブリン様遺伝子が関節炎の進行に関与していることが示唆されている（N. Fujikado et al., Arthritis research & therapy, 8, R100, 2006）。そこで、まず、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト遺伝子（Ｉｌ１ｒｎ）欠損マウス（Ｉｌ１ｒｎ−／−マウス）及びヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）トランスジェニックマウス（ＨＴＬＶ−Ｉ Ｔｇマウス）（R. Horai et al., The Journal of experimental medicine, 191, 313-320, 2000; Y. Iwakura et al., Science, 253, 1026-1028, 1991）の関節におけるＴａｒｍ１遺伝子の発現について確認した。Ｉｌ１ｒｎ−／−マウス及びＨＴＬＶ−Ｉ Ｔｇマウスはいずれも、関節リウマチに類似した関節炎を自然発症する。
【００８９】
Ｉｌ１ｒｎ−／−マウス及びＨＴＬＶ−Ｉ Ｔｇマウスについて、関節におけるＴａｒｍ１遺伝子の発現を定量的ＰＣＲにより分析した結果を図１Ａ及び図１Ｂに示す（Ｉｌ１ｒｎ−／−マウス；ｎ＝３、ＨＴＬＶ−Ｉ Ｔｇマウス；ｎ＝４）。コントロールとして、ＷＴマウスにおけるＴａｒｍ１遺伝子の発現も併せて分析した（ｎ＝４）。図１Ａ及び図１Ｂに示すとおり、関節炎を発症しているＩｌ１ｒｎ−／−マウス及びＨＴＬＶ−Ｉ Ｔｇマウスにおいては、ＷＴマウスと比較して、Ｔａｒｍ１遺伝子の発現が有意に亢進していた。
【００９０】
次いで、Ｔａｒｍ１遺伝子の発現及び炎症性サイトカイン（ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１β）遺伝子の発現の相関性について検討した。Ｉｌ１ｒｎ−／−マウス及びＨＴＬＶ−Ｉ Ｔｇマウスについて、関節におけるＴａｒｍ１遺伝子及び炎症性サイトカイン遺伝子の発現を定量的ＰＣＲにより分析した結果を図１Ｃ及び図１Ｄに示す（Ｉｌ１ｒｎ−／−マウス；ｎ＝３、ＨＴＬＶ−Ｉ Ｔｇマウス；ｎ＝３）。コントロールとして、ＷＴマウスにおけるＴａｒｍ１遺伝子及び炎症性サイトカイン遺伝子の発現も併せて分析した（ｎ＝３）。図１Ｃ及び図１Ｄに示すとおり、Ｔａｒｍ１遺伝子の発現は、炎症性サイトカイン遺伝子の発現とよく相関していた。
【００９１】
次いで、Ｔａｒｍ１ホモ欠損マウス（Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス）のコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）への感受性について検討した。
【００９２】
ＩＩ型コラーゲンと完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）とを混合したエマルションをＴａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス及びＷＴマウスに免疫したときの関節炎の発症率及び重症度を図１Ｅ及び図１Ｆに示す（Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス；ｎ＝２２、ＷＴマウス；ｎ＝１９）。図１Ｅ及び図１Ｆは、２回の独立した実験を組み合わせたものである。図１Ｆでは、スコアの合計値をマウスの総数で除算した。また、免疫後５０日目のＴａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス及びＷＴマウスにおける関節の状態（代表例）を図１Ｇに示す。図１Ｅ〜図１Ｇに示すとおり、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウスにおいては、ＷＴマウスと比較して、関節炎の発症率及び重症度が顕著に低下していた。
【００９３】
免疫後５０日目のＴａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス及びＷＴマウスにおける関節炎部分の組織像（代表例）を図１Ｈ及び図１Ｉに示す。図１Ｈは、後足の切片（５μｍ）をサフラニンＯで染色したものであり、図１Ｉは、後足の切片（５μｍ）をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）で染色したものである。また、滑膜炎、パンヌス形成、及び骨破壊を含む組織病理学スコアを図１Ｊに示す（Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス；ｎ＝７、ＷＴマウス；ｎ＝８）。図１Ｈ〜図１Ｊに示すとおり、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウスにおいては、ＷＴマウスと比較して、滑膜炎、パンヌス形成、及び骨破壊が顕著に減少していた。
【００９４】
次いで、免疫後４２日目のＴａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス及びＷＴマウスについて、免疫細胞（ＣＤ１１ｃ＋、Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ＋ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ４４＋ＣＤ４＋、ＣＤ１９＋）のポピュレーションをフローサイトメトリーにより解析した。Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス及びＷＴマウスの鼡径部のリンパ節における免疫細胞のポピュレーションを図１Ｋに示す（Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス；ｎ＝１４、ＷＴマウス；ｎ＝１１）。図１Ｋに示すとおり、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウスにおいては、ＷＴマウスと比較して、鼡径部のリンパ節における免疫細胞のポピュレーションが有意に減少していた。この結果は、炎症及び骨破壊が抑制されていることと整合している。
【００９５】
次いで、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス及びＷＴマウスについて、ＩＩ型コラーゲンに特異的な血清ＩｇＧの抗体値をＥＬＩＳＡにより測定した。ＩＩ型コラーゲンに特異的なＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３の抗体価を図１Ｌに示す（Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス；ｎ＝１４、ＷＴマウス；ｎ＝１１）。図１Ｌに示すとおり、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウスにおいては、ＷＴマウスと比較して、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３の抗体価が有意に低下していた。
【００９６】
以上の結果から、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウスは、ＷＴマウスと比較して、ＣＩＡに抵抗性を示すことが示唆された。
【００９７】
＜試験例２＞
まず、ＣＩＡ誘導後１０日目のＴａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス及びＷＴマウスについて、所属リンパ節（ｄＬＮ）の増殖応答能を確認した。ＣＩＡ誘導後１０日目に、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス及びＷＴマウスからリンパ節を採取し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで６６時間、種々の濃度のＩＩ型コラーゲンにより再刺激した後、酸不溶性分画への［３Ｈ］チミジン取り込みを測定した。結果を図２Ａに示す。図２Ａに示すとおり、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウスのｄＬＮ細胞においては、ＷＴマウスのｄＬＮ細胞と比較して、ＩＩ型コラーゲンに対する増殖応答能が低下していた。
【００９８】
次いで、ｄＬＮ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで６６時間、種々の濃度のＩＩ型コラーゲンにより再刺激した後の培養上清に含まれる前炎症性サイトカインの量をＥＬＩＳＡにより測定した。培養上清に含まれる前炎症性サイトカイン（ＴＮＦ、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−１７）の量を図２Ｂ〜図２Ｄに示す。図２Ｂ〜図２Ｄに示すとおり、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウスのｄＬＮ細胞の培養上清に含まれる前炎症性サイトカインの量は、ＷＴマウスのｄＬＮ細胞の培養上清に含まれる前炎症性サイトカインの量と比較して有意に少なかった。
【００９９】
次いで、ＣＩＡ誘導後１０日目のＴａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス及びＷＴマウスについて、所属リンパ節（ｄＬＮ）における樹状細胞の活性化を確認した。所属リンパ節（ｄＬＮ）におけるＩ−Ａ／Ｉ−Ｅ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞のポピュレーションをフローサイトメトリーにより解析した結果を図２Ｅに示す（Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス；ｎ＝６、ＷＴマウス；ｎ＝６）。図２Ｅに示すとおり、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウスにおいては、ＷＴマウスと比較して、Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞のポピュレーションが有意に減少していた。
【０１００】
次いで、ＣＩＡ誘導後１０日目のＴａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス及びＷＴマウスについて、所属リンパ節（ｄＬＮ）のＣＤ１１ｃ＋細胞におけるＩ−Ａ／Ｉ−Ｅの発現を確認した。所属リンパ節（ｄＬＮ）のＣＤ１１ｃ＋細胞におけるＩ−Ａ／Ｉ−Ｅの発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を図２Ｆに示す（Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス；ｎ＝６、ＷＴマウス；ｎ＝６）。図２Ｆに示すとおり、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウスのＣＤ１１ｃ＋細胞においては、ＷＴマウスのＣＤ１１ｃ＋細胞と比較して、Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅの発現が有意に減少していた。
【０１０１】
次いで、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス及びＷＴマウスから単離した樹状細胞及びＴ細胞を共培養したときの、ＩＩ型コラーゲンに対する樹状細胞のプライミング能を確認した。ＣＩＡ誘導後１０日目に、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス及びＷＴマウスの所属リンパ節（ｄＬＮ）から樹状細胞及びＴ細胞を単離し、ＩＩ型コラーゲンの存在下で共培養した。Ｔ細胞の増殖を［３Ｈ］チミジン取り込みにより確認した結果を図２Ｇに示す。図２Ｇに示すとおり、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス及びＷＴマウスから単離したＴ細胞は、ＷＴマウスから単離した樹状細胞と共培養することにより有意に増殖した。しかし、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス及びＷＴマウスから単離したＴ細胞とＴａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウスから単離した樹状細胞とを共培養してもＴ細胞の増殖は認められなかった。
【０１０２】
以上の結果から、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウスにおいては、樹状細胞の機能低下によりＴ細胞のプライミングが減弱していることが示唆された。
【０１０３】
＜試験例３＞
免疫系におけるＴａｒｍ１の機能について検討した。まず、ＧＭ−ＣＳＦ誘導性樹状細胞（ＧＭ−ＤＣｓ）、Ｍ−ＣＳＦ誘導性骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭｓ）、破骨細胞（ＯＣｓ）、Ｔ細胞（Ｔｈｙ１．２＋細胞）、及びＢ細胞（Ｂ２２０＋細胞）におけるＴａｒｍ１遺伝子の発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより分析した。各細胞におけるＴａｒｍ１遺伝子の発現量を図３Ａに示す。図３Ａに示すとおり、Ｔａｒｍ１遺伝子は、ＧＭ−ＤＣｓにおいて顕著に発現していたが、ＢＭＭｓにおいては殆ど発現していなかった。
【０１０４】
次いで、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／＋マウスを用いて、樹状細胞サブセットにおけるＴａｒｍ１遺伝子の発現を確認した。Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／＋マウス及びＷＴマウスから樹状細胞を単離し、ｅＧＦＰ遺伝子の発現をフローサイトメトリーにより解析することで、Ｔａｒｍ１遺伝子の発現を確認した。通常型樹状細胞（ｃＤＣｓ；ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋及びＣＤ２４＋ＣＤ１１ｃ＋）及び形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣｓ；Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｃ＋）におけるＴａｒｍ１遺伝子の発現を確認した結果を図３Ｂに示す。図３Ｂに示すとおり、生理的条件では、ＣＤ１１ｂ＋ ｃＤＣにおいて選択的にＴａｒｍ１遺伝子が発現していたが、ＣＤ２４＋ ｃＤＣ及びｐＤＣではＴａｒｍ１遺伝子の発現が認められなかった。
【０１０５】
次いで、ＩＩ型コラーゲンと完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）とを混合したエマルションをＴａｒｍ１ｅｇｆｐ／＋マウス及びＷＴマウスに投与することによりＣＩＡを誘導し、ＣＩＡの誘導後７日目に樹状細胞を単離し、ｅＧＦＰ遺伝子の発現をフローサイトメトリーにより解析することで、Ｔａｒｍ１遺伝子の発現を確認した。炎症性樹状細胞（ｉＤＣｓ；Ｌｙ６Ｃ＋Ｌｙ６Ｇ−ＭＨＣ ＩＩｈｉＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋）におけるＴａｒｍ１遺伝子の発現を図３Ｃに示す。図３Ｃに示すとおり、所属リンパ節（ｄＬＮ）のｉＤＣｓにおいてＴａｒｍ１遺伝子が強く発現していた。
【０１０６】
次いで、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／＋マウス及びＷＴマウスの骨髄細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導した樹状細胞について、Ｔａｒｍ１遺伝子の発現を検討した。ＧＭ−ＤＣｓにおけるＴａｒｍ１遺伝子の発現を確認した結果を図３Ｄに示し、Ｆｌｔ３Ｌ誘導性樹状細胞（ＦＬ−ＤＣｓ）におけるＴａｒｍ１遺伝子の発現を確認した結果を図３Ｅに示す。図３Ｄに示すとおり、Ｔａｒｍ１遺伝子は、ＣＤ１１ｂ＋ ＧＭ−ＤＣにおいて明確に発現しており、炎症性のサブセット（Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ＋）においてはより強く発現していた。一方、図３Ｅに示すとおり、ＣＤ１１ｂ＋ ＦＬ−ＤＣにおいてはＴａｒｍ１遺伝子が発現していたものの、ＣＤ２４＋ ＦＬ−ＤＣ及びＢ２２０＋ ＦＬ−ＤＣにおいてはＴａｒｍ１遺伝子の発現が認められなかった。
【０１０７】
次いで、ＧＭ−ＤＣｓを刺激することによりＴａｒｍ１遺伝子の発現が誘導されるか否かを確認した。ＧＭ−ＤＣｓを炎症性サイトカイン（ＴＮＦ、ＩＬ−１β）及び病原体関連分子パターン（ＬＰＳ、ＣｐＧ、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））で処理した後、Ｔａｒｍ１遺伝子の発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより分析した。Ｔａｒｍ１遺伝子の発現量を図３Ｆ及び図３Ｇに示す。図３Ｆ及び図３Ｇにおける発現量は、２つのウェルの平均値を示したものである。図３Ｆ及び図３Ｇに示すとおり、炎症性サイトカイン及び病原体関連分子パターンのいずれで刺激した場合にも、ＧＭ−ＤＣｓにおけるＴａｒｍ１遺伝子の発現が誘導された。
【０１０８】
次いで、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス由来及びＷＴマウス由来のＧＭ−ＤＣｓについて、ＧＭ−ＣＳＦ処理から所定日数経過後に、ＣＤ１１ｃ＋細胞及びＩ−Ａ／Ｉ−ＥｈｉＣＤ１１ｃ＋細胞の割合をフローサイトメトリーにより解析した。ＣＤ１１ｃ＋細胞の割合を図３Ｈに示し、Ｉ−Ａ／Ｉ−ＥｈｉＣＤ１１ｃ＋細胞の割合を図３Ｉに示す（ｎ＝３）。図３Ｈに示すとおり、ＣＤ１１ｃ＋細胞の割合は、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス由来のＧＭ−ＤＣｓとＷＴマウス由来のＧＭ−ＤＣｓとで殆ど変わらない。しかし、図３Ｉに示すとおり、Ｉ−Ａ／Ｉ−ＥｈｉＣＤ１１ｃ＋細胞の割合は、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス由来のＧＭ−ＤＣｓの方がＷＴマウス由来のＧＭ−ＤＣｓよりも有意に低かった。
【０１０９】
次いで、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス由来及びＷＴマウス由来のＧＭ−ＤＣｓについて、ＧＭ−ＣＳＦ処理から所定日数経過後に、樹状細胞活性化マーカー（Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ、ＣＤ８６、ＣＤ８０）の発現をフローサイトメトリーにより解析した。結果を図３Ｊに示す（ｎ＝３）。図３Ｊに示すとおり、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス由来のＧＭ−ＤＣｓにおいては、ＷＴマウス由来のＧＭ−ＤＣｓと比較して、樹状細胞活性化マーカーの発現が有意に減少していた。
【０１１０】
次いで、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス由来及びＷＴマウス由来のＧＭ−ＤＣｓについて、ＤＮＡマイクロアレイにより遺伝子発現を解析した。発現量の差異が２倍超である遺伝子のヒートマップを図３Ｋに示す。遺伝子オントロジー解析の結果、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス由来のＧＭ−ＤＣｓにおいては、炎症反応及び白血球遊走の正の制御に関連する免疫機能が低下していることが明らかになった。
【０１１１】
次いで、Ｔａｒｍ１遺伝子の欠損がＧＭ−ＤＣｓの抗原提示能に与える影響について検討した。ＯＴ−ＩＩ Ｔｇマウス由来のＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋ Ｔ細胞を、所定濃度のＯＶＡの存在下、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス由来及びＷＴマウス由来のＧＭ−ＤＣｓと共培養した。そして、培養３日目にＣＦＳＥ強度をフローサイトメトリーにより測定した。結果を図３Ｌに示す（ｎ＝３）。図３Ｌに示すとおり、ＯＴ−ＩＩ Ｔｇマウス由来のＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋ Ｔ細胞をＴａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス由来のＧＭ−ＤＣｓと共培養した場合には、ＷＴマウス由来のＧＭ−ＤＣｓと共培養した場合と比較して、Ｔ細胞の増殖が抑えられていた。
【０１１２】
以上の結果から、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウスにおいては、ＧＭ−ＤＣｓの成熟が抑制されていることが示唆された。
【０１１３】
＜試験例４＞
試験例１〜試験例３の結果から、Ｔａｒｍ１が自己認識を通じてＧＭ−ＤＣｓの成熟を制御している可能性が考えられる。そこで、Ｔａｒｍ１の細胞外ドメインをＩｇＧのＦｃ領域と融合したＴａｒｍ１−Ｆｃを用いて、ＧＭ−ＤＣｓ上におけるＴａｒｍ１のリガンドをフローサイトメトリーにより解析した。ネガティブコントロールとしては、Ｔａｒｍ１−Ｆｃの代わりにＩｇＧ Ｆｃを用いた。Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス由来及びＷＴマウス由来のＧＭ−ＤＣｓとＴａｒｍ１−Ｆｃとの結合をフローサイトメトリーにより解析した結果を図４Ａに示す。図４Ａに示すとおり、Ｔａｒｍ１−Ｆｃは、ＷＴマウス由来のＧＭ−ＤＣｓの７ＡＡＤ−生細胞の一部と結合した。抗ＣＤ１１ｃ抗体及び抗Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ抗体により共染色してさらに解析したところ、Ｔａｒｍ１−Ｆｃは、ＣＤ１１ｃ＋細胞に特異的に結合した。また、Ｔａｒｍ１−Ｆｃは、ＣＤ１１ｃ＋細胞のうちＩ−Ａ／Ｉ−Ｅｈｉ群及びＩ−Ａ／Ｉ−Ｅｉｎｔ群のいずれにも結合した。
【０１１４】
免疫グロブリン様メンバーは自己に対してシスに作用することが知られている（A. D.Barrow and J. Trowsdale, Immunological reviews, 224, 98-123, 2008; J. Trowsdale et al., Immunological reviews, 267, 117-136, 2015）。そこで、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス由来のＧＭ−ＤＣｓについても同様にＴａｒｍ１−Ｆｃとの結合をフローサイトメトリーにより解析したところ、Ｔａｒｍ１−Ｆｃは、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス由来のＣＤ１１ｃ＋細胞にも結合することが確認された（図４Ａ）。
【０１１５】
次いで、トリプシン処理又は未処理のＧＭ−ＤＣｓとＴａｒｍ１−Ｆｃとの結合をフローサイトメトリーにより解析した。ネガティブコントロールとしては、Ｔａｒｍ１−Ｆｃの代わりにＩｇＧ Ｆｃを用いた。結果を図４Ｂに示す。図４Ｂに示すとおり、ＧＭ−ＤＣｓをトリプシン処理した場合には、Ｔａｒｍ１−Ｆｃが結合しなかった。
【０１１６】
従来、コラーゲンがＯＳＣＡＲの機能的リガンドであることが報告されている（A. D. Barrow et al., J. Immunol., 194, 3317-3326, 2015; A. D. Barrow et al., J. Clin. Invest., 121, 3505-3516, 2011; J. Haywood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 113, 1038-1043, 2016; L. Zhou et al., Blood, 127, 529-537, 2016）。また、コラーゲンとＯＳＣＡＲとの相互作用が樹状細胞の活性化及び成熟に関与していることも報告されている（H. S, Schultz et al., J. Immunol., 194, 3169-3179, 2015）。さらに、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）や糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）等の他の免疫グロブリン様白血球受容体複合体によってコラーゲン様分子が認識されることも報告されている（R. J. Lebbink et al., The Journal of experimental medicine, 203, 1419-1425, 2006; R. J. Lebbink et al., Biology, 28, 202-210, 2009; Y. Miura et al., The Journal of biological chemistry, 277, 46197-46204, 2002）。そこで以下では、コラーゲン様分子がＴａｒｍ１の内因性リガンドである可能性について検討した。
【０１１７】
まず、プレートに固定化されたＩ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、又はＢＳＡに対するＴａｒｍ１−Ｆｃの結合性を固相結合アッセイにより確認した。ネガティブコントロールとしては、Ｔａｒｍ１−Ｆｃの代わりにＩｇＧ Ｆｃを用いた。結果を図４Ｃに示す。図４Ｃに示すとおり、Ｔａｒｍ１−Ｆｃは、Ｉ型コラーゲン及びＩＩ型コラーゲンに濃度依存的に結合したが、ＢＳＡには結合しなかった。
【０１１８】
また、ＥＤＴＡの存在下又は非存在下で、プレートに固定化されたＩＩ型コラーゲンに対するＴａｒｍ１−Ｆｃの結合性を固相結合アッセイにより確認した結果を図４Ｄに示す（ｎ＝３）。ネガティブコントロールとしては、Ｔａｒｍ１−Ｆｃの代わりにＩｇＧ Ｆｃを用いた。図４Ｄに示すとおり、Ｔａｒｍ１−Ｆｃは、ＥＤＴＡの存在下においてもＩＩ型コラーゲンに結合した。
【０１１９】
次いで、ＧＭ−ＤＣｓ上のコラーゲン様分子をフローサイトメトリーにより解析した。ＧＭ−ＤＣｓの細胞表面におけるＩ型コラーゲン及びＩＩ型コラーゲンの発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を図４Ｅに示す。図４Ｅに示すとおり、ＧＭ−ＤＣｓ上にはＩＩ型コラーゲンが発現していたものの、Ｉ型コラーゲンは発現していなかった。
【０１２０】
次いで、コラーゲン処理又は未処理のＧＭ−ＤＣｓについて、Ｔａｒｍ１−Ｆｃとの結合をフローサイトメトリーにより解析した。ネガティブコントロールとしては、Ｔａｒｍ１−Ｆｃの代わりにＩｇＧ Ｆｃを用いた。結果を図４Ｆに示す。図４Ｆに示すとおり、ＧＭ−ＤＣｓをコラーゲン処理した場合には、Ｔａｒｍ１−Ｆｃが結合しなかった。
【０１２１】
次いで、ＧＭ−ＤＣｓの全細胞溶解液（ＷＣＬ）を用いて、免疫沈降及びイムノブロッティング（ウェスタンブロッティング）を行った。ＧＭ−ＤＣｓの全細胞溶解液についてＴａｒｍ１−Ｆｃ又はＩｇＧ Ｆｃを用いて免疫沈降を行い、沈殿物について抗ＩＩ型コラーゲン抗体を用いてイムノブロッティングを行った。また、全細胞溶解液について抗ＩＩ型コラーゲン抗体及び抗β−アクチン抗体を用いてイムノブロッティングを行った。結果を図４Ｇに示す。図４Ｇに示すとおり、Ｔａｒｍ１−Ｆｃは、ＧＭ−ＤＣｓ溶解液中のＩＩ型コラーゲンと結合した。
【０１２２】
次いで、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス由来及びＷＴマウス由来のＧＭ−ＤＣｓをＩＩ型コラーゲンで刺激し、樹状細胞活性化マーカー（ＣＤ８６、Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ）の発現をフローサイトメトリーにより解析した。結果を図４Ｈに示す（ｎ＝３）。図４Ｈに示すとおり、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス由来のＧＭ−ＤＣｓにおいては、ＷＴマウス由来のＧＭ−ＤＣｓと比較して、樹状細胞活性化マーカーの発現が有意に減少していた。
【０１２３】
また、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス由来及びＷＴマウス由来のＧＭ−ＤＣｓをＩＩ型コラーゲンで刺激し、培養上清中のサイトカイン（ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０）の濃度をサイトメトリックビーズを用いたフローサイトメトリーにより解析した結果を図４Ｉに示す（ｎ＝３）。図４Ｉに示すとおり、Ｔａｒｍ１ｅｇｆｐ／ｅｇｆｐマウス由来のＧＭ−ＤＣｓにおいては、ＷＴマウス由来のＧＭ−ＤＣｓと比較して、培養上清中のＴＮＦ及びＩＬ−６の量が有意に減少していた。
【０１２４】
以上の結果から、ＩＩ型コラーゲンがＧＭ−ＤＣｓ上におけるＴａｒｍ１のリガンドであり、ＧＭ−ＤＣｓの成熟をＴａｒｍ１依存的に制御していることが示唆された。
【０１２５】
＜試験例５＞
自己免疫性関節炎に対するＴａｒｍ１−Ｆｃの生理活性を確認するため、ＣＩＡを誘導したＤＢＡ／１Ｊマウスの左足首関節及び右足首関節の関節腔にＴａｒｍ１−Ｆｃ及びＩｇＧ Ｆｃを投与した。関節炎の重症度を図５Ａに示す（ｎ＝１２）。図５Ａは、２回の独立した実験を組み合わせたものである。また、Ｔａｒｍ１−Ｆｃ及びＩｇＧ Ｆｃを投与したＤＢＡ／１Ｊマウスにおける関節の状態（代表例）を図５Ｂに示す。図５Ａ及び図５Ｂに示すとおり、Ｔａｒｍ１−Ｆｃを投与した場合には、関節炎の重症度が顕著に低下していた。
【０１２６】
Ｔａｒｍ１−Ｆｃ及びＩｇＧ Ｆｃを投与したＤＢＡ／１Ｊマウスの足首関節の組織をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）で染色した染色像（代表例）を図５Ｃに示す。また、滑膜炎、パンヌス形成、及び骨破壊を含む組織病理学スコアを図５Ｄに示す（ｎ＝６）。図５Ｃ及び図５Ｄに示すとおり、Ｔａｒｍ１−Ｆｃを投与した場合には、滑膜炎、パンヌス形成、及び骨破壊が顕著に減少していた。
【０１２７】
次いで、Ｔａｒｍ１−Ｆｃ及びＩｇＧ Ｆｃを投与したＤＢＡ／１Ｊマウスの関節におけるサイトカイン（ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７ａ）遺伝子の発現を定量的ＰＣＲにより分析した。結果を図５Ｅに示す。図５Ｅに示すとおり、Ｔａｒｍ１−Ｆｃを投与した場合には、ＩＬ−１０遺伝子の発現が有意に亢進していた。
【０１２８】
以上の結果から、Ｔａｒｍ１−Ｆｃの投与によって自己免疫性関節炎の進行が抑えられることが示唆された。
【図１Ａ】
2020063198.tif 000005
【図１Ｂ】
2020063198.tif 000006
【図１Ｃ】
2020063198.tif 000007
【図１Ｄ】
2020063198.tif 000008
【図１Ｅ】
2020063198.tif 000009
【図１Ｆ】
2020063198.tif 000010
【図１Ｇ】
2020063198.tif 000011
【図１Ｈ】
2020063198.tif 000012
【図１Ｉ】
2020063198.tif 000013
【図１Ｊ】
2020063198.tif 000014
【図１Ｋ】
2020063198.tif 000015
【図１Ｌ】
2020063198.tif 000016
【図２Ａ】
2020063198.tif 000017
【図２Ｂ】
2020063198.tif 000018
【図２Ｃ】
2020063198.tif 000019
【図２Ｄ】
2020063198.tif 000020
【図２Ｅ】
2020063198.tif 000021
【図２Ｆ】
2020063198.tif 000022
【図２Ｇ】
2020063198.tif 000023
【図３Ａ】
2020063198.tif 000024
【図３Ｂ】
2020063198.tif 000025
【図３Ｃ】
2020063198.tif 000026
【図３Ｄ】
2020063198.tif 000027
【図３Ｅ】
2020063198.tif 000028
【図３Ｆ】
2020063198.tif 000029
【図３Ｇ】
2020063198.tif 000030
【図３Ｈ】
2020063198.tif 000031
【図３Ｉ】
2020063198.tif 000032
【図３Ｊ】
2020063198.tif 000033
【図３Ｋ】
2020063198.tif 000034
【図３Ｌ】
2020063198.tif 000035
【図４Ａ】
2020063198.tif 000036
【図４Ｂ】
2020063198.tif 000037
【図４Ｃ】
2020063198.tif 000038
【図４Ｄ】
2020063198.tif 000039
【図４Ｅ】
2020063198.tif 000040
【図４Ｆ】
2020063198.tif 000041
【図４Ｇ】
2020063198.tif 000042
【図４Ｈ】
2020063198.tif 000043
【図４Ｉ】
2020063198.tif 000044
【図５Ａ】
2020063198.tif 000045
【図５Ｂ】
2020063198.tif 000046
【図５Ｃ】
2020063198.tif 000047
【図５Ｄ】
2020063198.tif 000048
【図５Ｅ】
2020063198.tif 000049
【配列表】
2020063198000001.app