(57)【要約】      （修正有）【課題】薬物の薬理活性を低下させることなく、効率よく腫瘍組織に薬物を送達することができる薬物送達技術の提供。【解決手段】式（１）で表わされるジオール構造を有する薬物の前記ジオール構造と式（２）で表わされるアセタール結合を形成し得る基が結合した、生体適合性ポリマーからなる、薬物送達用担体。2020063191.tif 000036［ｍ及びｎは夫々独立に０又は１；＊は結合手］2020063191.tif 000037［ｍ及びｎは夫々独立に０又は１；＊は結合手］【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表わされるジオール構造を有する薬物の前記ジオール構造と下記式（２）で表わされるアセタール結合を形成し得る基が結合した、生体適合性ポリマーからなる、薬物送達用担体。
【化１】
2020063191.tif 000029
［式（１）中、ｍ及びｎはそれぞれ０又は１の整数を表し、＊は結合手を表す。］
【化２】
2020063191.tif 000030
［式（２）中、ｍ及びｎはそれぞれ前記式（１）におけるｍ及びｎと同じ値を表し、＊は結合手を表す。］
【請求項２】
前記アセタール結合を形成し得る基が下記式（３）で表わされる基である、請求項１に記載の薬物送達用担体。
【化３】
2020063191.tif 000031
［式（３）中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に炭素数１〜３のアルキル基を表し、＊は結合手を表す。Ｒ１及びＲ２は連結して環を形成していてもよい。］
【請求項３】
前記生体適合性ポリマーが生体分解性である、請求項１又は２に記載の薬物送達用担体。
【請求項４】
重量平均分子量が２，０００〜２００，０００である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬物送達用担体。
【請求項５】
前記生体適合性ポリマー１モルあたり、前記アセタール結合を形成し得る基が５〜５００モル結合した、請求項１〜４のいずれか一項に記載の薬物送達用担体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の薬物送達用担体と、下記式（１）で表わされるジオール構造を有する薬物とが、下記式（２）で表わされるアセタール結合で結合した、薬物送達システム。
【化４】
2020063191.tif 000032
［式（１）中、ｍ及びｎはそれぞれ０又は１の整数を表し、＊は結合手を表す。］
【化５】
2020063191.tif 000033
［式（２）中、ｍ及びｎはそれぞれ前記式（１）におけるｍ及びｎと同じ値を表し、＊は結合手を表す。］
【請求項７】
酸性環境下で前記アセタール結合が切断されるとともに前記薬物の前記式（１）で表わされるジオール構造が再生され、前記薬物送達システムから前記薬物が放出される、請求項６に記載の薬物送達システム。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の薬物送達用担体と、下記式（４）で表わされるジオール構造を有する薬物とが、下記式（５）で表わされるアセタール結合で結合した、薬物送達システム。
【化６】
2020063191.tif 000034
［式（４）中、ｍ及びｎはそれぞれ０又は１の整数を表し、＊は結合手を表す。］
【化７】
2020063191.tif 000035
［式（５）中、ｍ及びｎはそれぞれ前記式（４）におけるｍ及びｎと同じ値を表し、＊は結合手を表す。］
【請求項９】
酸性環境下で前記アセタール結合が切断されるとともに前記薬物の前記式（４）で表わされるジオール構造が再生され、前記薬物送達システムから前記薬物が放出される、請求項８に記載の薬物送達システム。
【請求項１０】
ジオール構造を有する前記薬物が代謝拮抗剤である、請求項６〜９のいずれか一項に記載の薬物送達システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物送達用担体及び薬物送達システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、ゲムシタビン、ドキシフルリジン等の代謝拮抗剤は、主に制癌剤として利用されている。特に、ゲムシタビンは膵臓癌の第一選択薬として取り扱われている。しかしながら、これらの薬物は分子量が５００以下と小さいこと等から、患者に投与した場合に腎臓や肝臓からの排泄により血液中から速やかに消失してしまい、患部である腫瘍組織への集積効率が低い傾向にある。
【０００３】
従来、薬物の体内動態を制御する手法として、例えば、高分子ミセルやリポソームへの薬物の内包、高分子化合物への薬物の結合等の手法が検討されてきた（例えば、非特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Knop K., et al., Poly(ethylene glycol) in drug delivery: pros and cons as well as potential alterations., Angew. Chem. Int. Ed., 49, 6288-6208, 2010.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、高分子ミセルやリポソームへの薬物の内包は、内包効率が高い疎水性の薬物にしか適用できない場合が多く、例えばゲムシタビン等の親水性の高い薬物への適用は困難な場合がある。
【０００６】
また、高分子ミセルやリポソームへの薬物の内包により、腎臓からの薬物の排泄を低減することができるものの、薬物を内包した高分子ミセルやリポソームが、肝臓等の正常組織に集積することが問題となる場合がある。
【０００７】
一方、高分子化合物への薬物の結合においては、高分子化合物への薬物の結合を容易にするために薬物自体の構造を改変することや、患部で効率的に薬物を放出するための化学結合が検討されている。しかしながら、薬物自体の構造改変等により、薬物の薬理活性が低下してしまう等の問題が生じる場合がある。
【０００８】
そこで、本発明は、上述した高分子化合物への薬物の結合技術の問題点を克服し、薬物の薬理活性を低下させることなく、効率よく腫瘍組織に薬物を送達することができる薬物送達技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下の態様を含む。
［１］下記式（１）で表わされるジオール構造を有する薬物の前記ジオール構造と下記式（２）で表わされるアセタール結合を形成し得る基が結合した、生体適合性ポリマーからなる、薬物送達用担体。
【化１】
2020063191.tif 000002
［式（１）中、ｍ及びｎはそれぞれ０又は１の整数を表し、＊は結合手を表す。］
【化２】
2020063191.tif 000003
［式（２）中、ｍ及びｎはそれぞれ前記式（１）におけるｍ及びｎと同じ値を表し、＊は結合手を表す。］
［２］前記アセタール結合を形成し得る基が下記式（３）で表わされる基である、［１］に記載の薬物送達用担体。
【化３】
2020063191.tif 000004
［式（３）中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に炭素数１〜３のアルキル基を表し、＊は結合手を表す。Ｒ１及びＲ２は連結して環を形成していてもよい。］
［３］前記生体適合性ポリマーが生体分解性である、［１］又は［２］に記載の薬物送達用担体。
［４］重量平均分子量が２，０００〜２００，０００である、［１］〜［３］のいずれかに記載の薬物送達用担体。
［５］前記生体適合性ポリマー１モルあたり、前記アセタール結合を形成し得る基が５〜５００モル結合した、［１］〜［４］のいずれかに記載の薬物送達用担体。
［６］［１］〜［５］のいずれかに記載の薬物送達用担体と、下記式（１）で表わされるジオール構造を有する薬物とが、下記式（２）で表わされるアセタール結合で結合した、薬物送達システム。
【化４】
2020063191.tif 000005
［式（１）中、ｍ及びｎはそれぞれ０又は１の整数を表し、＊は結合手を表す。］
【化５】
2020063191.tif 000006
［式（２）中、ｍ及びｎはそれぞれ前記式（１）におけるｍ及びｎと同じ値を表し、＊は結合手を表す。］
［７］酸性環境下で前記アセタール結合が切断されるとともに前記薬物の前記式（１）で表わされるジオール構造が再生され、前記薬物送達システムから前記薬物が放出される、［６］に記載の薬物送達システム。
［８］［１］〜［５］のいずれかに記載の薬物送達用担体と、下記式（４）で表わされるジオール構造を有する薬物とが、下記式（５）で表わされるアセタール結合で結合した、薬物送達システム。
【化６】
2020063191.tif 000007
［式（４）中、ｍ及びｎはそれぞれ０又は１の整数を表し、＊は結合手を表す。］
【化７】
2020063191.tif 000008
［式（５）中、ｍ及びｎはそれぞれ前記式（４）におけるｍ及びｎと同じ値を表し、＊は結合手を表す。］
［９］酸性環境下で前記アセタール結合が切断されるとともに前記薬物の前記式（４）で表わされるジオール構造が再生され、前記薬物送達システムから前記薬物が放出される、［８］に記載の薬物送達システム。
［１０］ジオール構造を有する前記薬物が代謝拮抗剤である、［６］〜［９］のいずれかに記載の薬物送達システム。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、薬物の薬理活性を低下させることなく、効率よく腫瘍組織に薬物を送達することができる薬物送達技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実験例４の結果を示すグラフである。
【図２】（ａ）及び（ｂ）は、実験例５の結果を示すグラフである。
【図３】（ａ）及び（ｂ）は、実験例６の結果を示すグラフである。
【図４】（ａ）及び（ｂ）は、実験例６の結果を示すグラフである。
【図５】実験例７の結果を示すグラフである。
【図６】実験例８において、各群のマウスの体重の経時変化を示すグラフである。
【図７】実験例８において、各群のマウスの総摂食量の測定結果を示すグラフである。
【図８】（ａ）〜（ｃ）は、実験例８において、各群のマウスの小腸の標本をヘマトキシリン／エオジン（ＨＥ）染色した結果を示す代表的な顕微鏡写真である。
【図９】実験例８において、各群のマウスの小腸における絨毛長を測定した結果を示すグラフである。
【図１０】実験例８において、各群のマウスの脾臓の質量の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［薬物送達用担体］
１実施形態において、本発明は、下記式（１）で表わされるジオール構造を有する薬物の前記ジオール構造と下記式（２）で表わされるアセタール結合を形成し得る基が結合した、生体適合性ポリマーからなる、薬物送達用担体を提供する。
【００１３】
【化８】
2020063191.tif 000009
［式（１）中、ｍ及びｎはそれぞれ０又は１の整数を表し、＊は結合手を表す。］
【００１４】
【化９】
2020063191.tif 000010
［式（２）中、ｍ及びｎはそれぞれ前記式（１）におけるｍ及びｎと同じ値を表し、＊は結合手を表す。］
【００１５】
本実施形態の薬物送達用担体は、下記式（６）で表わされるジオール構造を有する薬物の前記ジオール構造ともアセタール結合を形成することができ、その場合、下記式（７）で表わされるアセタール結合が形成される。
【００１６】
【化１０】
2020063191.tif 000011
［式（６）中、ｍ及びｎはそれぞれ０又は１の整数を表し、＊は結合手を表す。］
【００１７】
【化１１】
2020063191.tif 000012
［式（７）中、ｍ及びｎはそれぞれ前記式（６）におけるｍ及びｎと同じ値を表し、＊は結合手を表す。］
【００１８】
発明者らは、代謝拮抗剤を含む薬物の多くが糖骨格を有すること、及び糖骨格の多くがジオール構造を有することに着目し、このジオール構造を利用してアセタール結合により薬物送達用担体に薬物を結合することに着想し本発明を完成させた。
【００１９】
実施例において後述するように、本実施形態の薬物送達用担体に結合した薬物は、分子量増大に伴って血中滞留性及び腫瘍集積性が向上する。
【００２０】
更に、患部である腫瘍組織内の細胞に取り込まれた後は、ｐＨ約４．０〜６．０の酸性オルガネラ環境でアセタール構造が切断され、薬物が細胞内で放出される。この時、薬物の本来のジオール構造が再生されるため、薬物は本来の薬理活性を発揮することができる。
【００２１】
ところで、低分子の薬物は、その薬物に特異的なトランスポーター等を介して細胞へ取り込まれることがあることが知られている。このため、そのような低分子の薬物は、その薬物に特異的なトランスポーターの発現量が高い正常な臓器に集積することが懸念される。例えば、ゲムシタビンは、胃腸に発現量が高いヌクレオシドトランスポーターに取り込まれやすい傾向がある。このため、例えば、ゲムシタビンは、消化器官に対する毒性を示す場合があり、食欲減衰や、これに起因する体重減少を引き起こす場合がある。なお、本明細書において、低分子の薬物とは分子量が約１０００以下である薬物を意味する。
【００２２】
これに対し、本実施形態の薬物送達用担体に結合させた薬物は、酸性条件等の細胞内環境に依存して薬物送達用担体から放出される。このため、トランスポーターの発現量が高い正常組織への薬物の集積を誘導することなく、腫瘍組織への薬物の集積のみを向上させることができる。この結果、本実施形態の薬物送達用担体によれば、高い薬効と低い副作用を達成することができる。
【００２３】
本実施形態の薬物送達用担体において、薬物のジオール構造とアセタール結合を形成し得る基としては、下記式（３）で表わされる基が挙げられる。
【００２４】
【化１２】
2020063191.tif 000013
［式（３）中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に炭素数１〜３のアルキル基を表し、＊は結合手を表す。Ｒ１及びＲ２は連結して環を形成していてもよい。］
【００２５】
上記式（３）で表される基としては、より具体的には、下記式（８）〜（１０）で表される基が挙げられる。
【００２６】
【化１３】
2020063191.tif 000014
［式（８）中、ｚ及びｗはそれぞれ１〜３の整数を表し、＊は結合手を表す。］
【００２７】
【化１４】
2020063191.tif 000015
［式（９）中、＊は結合手を表す。］
【００２８】
【化１５】
2020063191.tif 000016
［式（１０）中、＊は結合手を表す。］
【００２９】
上記式（１）又は上記式（６）で表わされるジオール構造を有する薬物としては、上記式（３）で表される基とアセタール結合を形成することができる薬物であれば特に限定されず、例えば、ゲムシタビン、ドキシフルリジン、シタラビン、フルダラビン、ペントスタチン等の代謝拮抗剤；ガンシクロビル、イドクスウリジン、トリフルリジン、リバビリン、エンテカビル等の抗ウイルス薬等が挙げられる。なお、上記の抗ウイルス薬は、腫瘍組織に送達した場合には制癌効果を奏するものである。
【００３０】
本実施形態の薬物送達用担体において、生体適合性ポリマーとは、生体に投与した場合に、強い炎症反応等の悪影響を及ぼしにくいポリマーを意味する。
【００３１】
生体適合性ポリマーとしては、本発明の効果が得られる限り特に制限されず、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアミノ酸、ポリアクリルアミド、ポリエーテル、ポリエステル、ポリウレタン、多糖類、これらのコポリマー等が挙げられる。生体適合性ポリマーは、一部にその合成過程で導入された任意の基を有していてもよい。このような基としては、例えば重合開始剤の一部等が挙げられる。
【００３２】
本実施形態の薬物送達用担体において、生体適合性ポリマーは生体分解性であることが好ましい。
【００３３】
生体分解性とは、生体内で吸収又は分解され得る性質を意味する。生体分解性である生体適合性ポリマーとしては、本発明の効果が得られる限り特に制限されず、例えば、ポリアミノ酸、ポリエステル、ポリヌクレオチド、多糖類等が挙げられる。
【００３４】
本明細書において、生体適合性ポリマーが生体分解性であるとは、生体適合性ポリマーの少なくとも一部が生体分解性であることを意味する。したがって、本実施形態の薬物送達用担体に用いることができる生体分解性の生体適合性ポリマーとしては、ポリアミノ酸、ポリエステル、ポリヌクレオチド、多糖類と、ＰＥＧ、ポリアクリルアミド、ポリエーテル、ポリエステル、ポリウレタン、多糖類等とのブロックコポリマー等も好適に用いることができる。
【００３５】
従来のポリマーは生体に投与した場合に生体内に蓄積することが問題となる場合があった。これに対し、生体分解性であるポリマーを用いることにより、生体内への蓄積を抑制することができ、副作用を低減させることができる。
【００３６】
本実施形態の薬物送達用担体は、重量平均分子量が２，０００〜２００，０００であることが好ましく、例えば５，０００〜１００，０００であってもよく、例えば１０，０００〜５０，０００であってもよい。
【００３７】
薬物送達用担体の重量平均分子量が上記の範囲であることにより、薬物を結合させて薬物送達システムを製造した場合に、薬物の血中滞留性、腫瘍組織への集積性を適度に向上させ、また、肝臓等の正常組織への集積を惹起しないことができる。この結果、薬物を効率よく腫瘍組織に送達することが可能になる。
【００３８】
ここで、薬物送達用担体の重量平均分子量としては、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）解析により測定した値を用いることができる。具体的には、薬物送達用担体を溶媒に溶解又は分散させた後、細孔（ポア）が数多く存在する充てん剤を用いたカラム内に移動相溶液と共に通液し、カラム内で分子量の大小によって分離させ、それを示差屈折率計や紫外可視分光光度計、粘度計、光散乱検出器等を検出器として用いて検出する。ＳＥＣ専用装置が広く市販されており、標準ポリエチレングリコール換算によって測定することが一般的である。本明細書における重量平均分子量は、この標準ポリエチレングリコール換算によって測定されたものである。
【００３９】
本実施形態の薬物送達用担体は、上述した前記生体適合性ポリマー１モルあたり、上述したアセタール結合を形成し得る基が５〜５００モル結合していることが好ましく、例えば１２〜２５０モルであってもよく、例えば２５〜１２５モルであってもよい。
【００４０】
アセタール結合を形成し得る基の含有量が上記の範囲であることにより、薬物を適切な量結合させることができ、本発明の効果が得られやすくなる。
【００４１】
［薬物送達システム］
１実施形態において、本発明は、上述した薬物送達用担体と、下記式（１）で表わされるジオール構造を有する薬物とが、下記式（２）で表わされるアセタール結合で結合した、薬物送達システムを提供する。
【００４２】
【化１６】
2020063191.tif 000017
［式（１）中、ｍ及びｎはそれぞれ０又は１の整数を表し、＊は結合手を表す。］
【００４３】
【化１７】
2020063191.tif 000018
［式（２）中、ｍ及びｎはそれぞれ前記式（１）におけるｍ及びｎと同じ値を表し、＊は結合手を表す。］
【００４４】
本実施形態の薬物送達システムは、上述した薬物送達用担体と、下記式（４）で表わされるジオール構造を有する薬物とが、下記式（５）で表わされるアセタール結合で結合した、薬物送達システムであってもよい。
【００４５】
【化１８】
2020063191.tif 000019
［式（４）中、ｍ及びｎはそれぞれ０又は１の整数を表し、＊は結合手を表す。］
【００４６】
【化１９】
2020063191.tif 000020
［式（５）中、ｍ及びｎはそれぞれ前記式（４）におけるｍ及びｎと同じ値を表し、＊は結合手を表す。］
【００４７】
実施例において後述するように、本実施形態の薬物送達システムは、血液中ｐＨに相当するｐＨ７．４においては、薬物を安定に保持しており、細胞内酸性オルガネラ環境に相当するｐＨ約４．０〜６．０においては、効率的に薬物を放出することができる。
【００４８】
また、薬物の血中滞留性、腫瘍組織への集積性を適度に向上させ、また、肝臓等の正常組織への集積を惹起しないことができる。また、薬物を単体で投与する場合と比較して、薬物の投与量を低減させることができ、更に薬物を担体で投与する場合よりも高い薬理活性を発揮することができる。また、薬物の毒性を低減することができる。
【００４９】
本実施形態の薬物送達システムにおいて、上記式（１）又は上記式（６）で表わされるジオール構造を有する薬物としては、上記式（３）で表される基とアセタール結合を形成することができる薬物であれば特に限定されず、上述したものと同様の薬物が挙げられる。
【００５０】
上記のジオール構造を有する薬物は代謝拮抗剤であってもよい。代謝拮抗剤には糖骨格を有する薬物が多く、ジオール構造を有している場合が多い。このため、本実施形態の薬物送達システムに適用しやすい。
【００５１】
本実施形態の薬物送達システムは、酸性環境下で前記アセタール結合が切断されるとともに前記薬物の上記式（１）又は上記式（４）で表わされるジオール構造が再生され、前記薬物送達システムから前記薬物が放出されるものであることが好ましい。
【００５２】
酸性環境下とは、細胞内酸性オルガネラ環境を意味し、ｐＨ約４．０〜６．０の環境である。上述したように、本実施形態の薬物送達システムは、細胞内に取り込まれ、酸性環境下におかれると、薬物を放出する。この時、薬物の本来のジオール構造が再生されるため、薬物は本来の薬理活性を発揮することができる。
【００５３】
従来、高分子化合物への薬物の結合を容易にするために薬物自体の構造を改変することが試みられてきたが、薬物自体の構造を改変することによる薬物の薬理活性の低下が問題となる場合があった。これに対し、本実施形態の薬物送達システムはこのような問題を克服することができる。
【実施例】
【００５４】
次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【００５５】
［実験例１］
（薬物送達用担体の合成）
下記スキーム（Ｉ）にしたがって、薬物送達用担体を合成した。
【００５６】
【化２０】
2020063191.tif 000021
【００５７】
《ＰＥＧ−ポリアミノ酸のジブロックコポリマーの合成》
まず、ＰＥＧ−ポリアミノ酸のジブロックコポリマーである、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐｏｌｙ（β−ｂｅｎｚｙｌ  Ｌ−ａｓｐａｒｔａｔｅ）（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ）を合成した。具体的には、まず、７２０ｍｇのＢＬＡ−Ｎ−ｃａｒｂｏｘｙ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ（ＢＬＡ−ＮＣＡ）を１０ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。続いて、得られた溶液に、４０ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解した６００ｍｇのＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ２を重合開始剤として加え、３５℃で２日間攪拌した。以上の操作は全てアルゴン雰囲気下で行った。
【００５８】
続いて、反応溶液を過剰量（３０倍容量程度）のジエチルエーテルに滴下し、沈殿物を吸引ろ過後、減圧乾燥することにより、生成物であるＰＥＧ−ＰＢＬＡを白色固体として得た（１．０２ｇ、８３．８％）。
【００５９】
得られた白色固体は１Ｈ  ＮＭＲ及びゲルろ過クロマトグラフィーにより解析し、生成物の化学構造及び分子量分布を確認した。ＰＥＧスタンダードの検量線を用いてゲルろ過クロマトグラフィーにより解析したところ、Ｍｗ（重量平均分子量）／Ｍｎ（数平均分子量）は１．１５であった。また、１Ｈ  ＮＭＲ測定により算出したＰＢＬＡの重合度は約４４であった。
【００６０】
《薬物送達用担体の合成》
続いて、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡの側鎖のベンジル基へのアミノリシス反応を利用して、下記式（１１）に示す薬物送達用担体である、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｌ）を合成した。具体的には、まず、５００ｍｇのＰＥＧ−ＰＢＬＡを８ｍＬのＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）中に溶解させ、別容器にＰＥＧ−ＰＢＬＡのベンジル基に対して５０倍モル量のＡｍｉｎｏａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｌを移し取った。続いて、Ａｍｉｎｏａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｌ溶液をＰＥＧ−ＰＢＬＡ溶液に滴下し、室温で一晩反応させた。以上の操作は全てアルゴン雰囲気下で行った。
【００６１】
続いて、反応溶液を過剰量（３０倍容量程度）のジエチルエーテルに滴下し、沈殿物を吸引ろ過後、減圧乾燥することにより、生成物であるＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｌ）を白色固体として得た（４５７ｍｇ、９２．３％）。
【００６２】
【化２１】
2020063191.tif 000022
［式（１１）中、ｐ及びｑはそれぞれ独立に１０〜１０００の整数である。］
【００６３】
１Ｈ  ＮＭＲ解析により、合成したＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｌ）の構造を確認した結果、ｐは約２２７に対し、ｑは約４４であることが確認された。
【００６４】
［実験例２］
（薬物送達システムの合成１）
下記スキーム（ＩＩ）にしたがって、実験例１で合成した薬物送達用担体に、アセタール結合によりジオール構造を有する薬物を結合させ、薬物送達システムを合成した。薬物としては、下記式（１２）に化学式を示すゲムシタビンを使用した。
【００６５】
【化２２】
2020063191.tif 000023
【００６６】
【化２３】
2020063191.tif 000024
【００６７】
まず、実験例１で合成した薬物送達用担体である、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｌ）が有するｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｌ基とゲムシタビンが有するジオール基とのトランスアセタール化反応により、下記式（１３）に示す薬物送達システムである、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｌ−ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）を得た。
【００６８】
具体的には、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｌ）２００ｍｇと、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｌ）のｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｌ基に対して１０倍モル量のゲムシタビン塩酸塩と、反応触媒としてＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｌ）のｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｌ基に対して１倍モル量のパラトルエンスルホン酸一水和物とを、１０ｍＬのＮＭＰに溶解し、５０℃で一晩反応させた。
【００６９】
この結果、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｌ）が有するｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｌ基とゲムシタビンが有するジオール基とのトランスアセタール化反応により、下記式（１３）に示す薬物送達システムである、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｌ−ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）が生成された。以上の操作は全てアルゴン雰囲気下で行った。
【００７０】
続いて、反応溶液を過剰量の炭酸水素ナトリウム水溶液に滴下し、系内のパラトルエンスルホン酸一水和物を中和した。続いて、限外ろ過により、水溶液中の未反応のゲムシタビン塩酸塩を除去し、凍結乾燥することにより、生成物であるＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｌ−ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）を白黄色固体として得た（１８７ｍｇ、８７．４％）。生成物に対するゲムシタビンの導入量は、１Ｈ  ＮＭＲ測定により確認し、約１０質量％と算出された。
【００７１】
【化２４】
2020063191.tif 000025
［式（１３）中、ｐ及びｑはそれぞれ独立に１０〜１０００の整数であり、ｘは１〜５００の整数である。］
【００７２】
［実験例３］
（薬物送達システムの合成２）
実験例１で合成した薬物送達用担体に、アセタール結合によりジオール構造を有する薬物を結合させ、薬物送達システムを合成した。薬物としては、下記式（１４）に化学式を示すドキシフルリジンを使用した。
【００７３】
【化２５】
2020063191.tif 000026
【００７４】
具体的には、実験例１で合成した薬物送達用担体である、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｌ）が有するｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｌ基と、ドキシフルリジンが有するジオール基とのトランスアセタール化反応により、下記式（１５）に示す薬物送達システムである、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｌ−ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）を得た。
【００７５】
まず、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｌ）２０ｍｇと、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｌ）のｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｌ基に対して１０倍モル量のドキシフルリジンと、反応触媒としてＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｌ）のｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｌ基に対して１倍モル量のパラトルエンスルホン酸一水和物とを、４ｍＬのＮＭＰに溶解し、５０℃で一晩反応させた。以上の操作は全てアルゴン雰囲気下で行った。
【００７６】
続いて、反応溶液を過剰量の炭酸水素ナトリウム水溶液に滴下し、系内のパラトルエンスルホン酸一水和物を中和した。続いて、限外ろ過により水溶液中の未反応のドキシフルリジンを除去し、凍結乾燥することにより、生成物であるＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｌ−ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）を白色固体として得た（２０．５ｍｇ、９８．４％）。生成物に対するドキシフルリジンの導入量は、１Ｈ  ＮＭＲ測定により確認し、約４質量％と算出された。
【００７７】
【化２６】
2020063191.tif 000027
［式（１５）中、ｐ及びｑはそれぞれ独立に１０〜１０００の整数であり、ｙは１〜５００の整数である。］
【００７８】
［実験例４］
（薬物放出試験）
実験例２で合成した薬物送達システムを用いて薬物放出試験を行った。具体的には、血液中ｐＨに相当するｐＨ７．４、細胞内酸性オルガネラ環境に相当するｐＨ５．５及びｐＨ４．２に調整した緩衝液中に、実験例２で合成した薬物送達システムを添加して３７℃でインキュベートした。続いて、経時的にサンプリングを行い、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により放出されたゲムシタビンを定量した。
【００７９】
図１は、ゲムシタビンの放出量を測定した結果を示すグラフである。その結果、血液中ｐＨに相当するｐＨ７．４においては、実験例２で合成した薬物送達システムは安定であることが明らかとなった。一方、細胞内酸性オルガネラ環境に相当するｐＨ５．５及びｐＨ４．２では、実験例２で合成した薬物送達システムから、効率的にゲムシタビンが放出されることが明らかとなった。
【００８０】
［実験例５］
（薬理評価）
４週齢のヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ）を１週間飼育した。続いて、ヌードマウスの側腹部に、ヒト膵臓癌細胞株であるＢｘＰＣ３を皮下移植し、担癌モデルマウスを作製した。
【００８１】
癌細胞を移植後のヌードマウスを、腫瘍体積が約１００ｍｍ３に成長するまで３〜４週間飼育した。続いて、実験例２で合成した薬物送達システム及びゲムシタビンの投与実験を開始した。薬物の投与は、実験開始時（０日目）、３日目、６日目及び９日目の４回、尾静脈投与により行った。実験例２で合成した薬物送達システムの投与量は、ゲムシタビン換算で２０ｍｇ／ｋｇとした。また、ゲムシタビンの投与量は治療に用いられる量である８０ｍｇ／ｋｇとした。また、対照として薬物を投与しない未治療群を用意した。
【００８２】
各群のマウスの腫瘍成長率及び体重変化率を経時的に測定した。図２（ａ）は、腫瘍成長率の測定結果を示すグラフである。図２（ａ）中、「＊」は相関係数（ｐ値）０．０５未満で有意差があることを表し、「＊＊」はｐ値０．００５未満で有意差があることを表し、「＊＊＊」はｐ値０．００１未満で有意差があることを表し、「＊＊＊＊」はｐ値０．０００１未満で有意差があることを表す。また、図２（ｂ）は、体重変化率の測定結果を示すグラフである。図２（ａ）及び（ｂ）中、矢印は、薬物を投与した時間を示す。
【００８３】
その結果、実験例２で合成した薬物送達システム及びゲムシタビンを投与したマウスでは、対照群のマウスと比較して、腫瘍成長率が有意に低下したことが明らかとなった。
【００８４】
また、実験例２で合成した薬物送達システムを投与したマウスは、ゲムシタビンを投与したマウスと比較して、ゲムシタビンの投与量が１／４であるにもかかわらず、腫瘍成長率が有意に低下したことが明らかとなった。
【００８５】
この結果は、実験例２で合成した薬物送達システムを投与すると、薬効が有意に高いことを示す。
【００８６】
［実験例６］
（体内動態評価）
クロラミンＴ法により、ゲムシタビン、及び実験例２で合成した薬物送達システムであるＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｌ−ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）のゲムシタビン内のピリミジン骨格に１２５Ｉ（ラジオアイソトープ）を導入して標識した。
【００８７】
具体的には、まず、ゲムシタビン塩酸塩及び薬物送達システムを、それぞれ１ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬとなるように、１０ｍＭリン酸緩衝液に溶解した。続いて、５μＬのＩｏｄｉｎｅ−１２５（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）、１００μＬのクロラミンＴ水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を１００μＬのゲムシタビン水溶液又は１００μＬの薬物送達システム水溶液に加えて、室温で静置して反応させた。ゲムシタビンの反応時間は３０分間とし、薬物送達システムの反応時間は１時間とした。
【００８８】
続いて、１００μＬの二亜硫酸ナトリウム水溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を各反応溶液に加えることで反応を終結させた。続いて、１２５Ｉ標識ゲムシタビンは陰イオン交換カラムにより、１２５Ｉ標識薬物送達システムはＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）により精製した。
【００８９】
一方で、実験例５と同様にして、ヒト膵臓癌細胞株であるＢｘＰＣ３を移植した担癌モデルマウスを作製した。続いて、癌細胞を移植後のヌードマウスを、腫瘍体積が約１００ｍｍ３に成長するまで３〜４週間飼育した。
【００９０】
続いて、担癌モデルマウスに、１２５Ｉ標識されたゲムシタビン及び薬物送達システムをそれぞれ尾静脈注射により投与した。１２５Ｉ標識されたゲムシタビンの投与量は、治療に用いられる量である８０ｍｇ／ｋｇとした。また、１２５Ｉ標識された薬物送達システムの投与量は、ゲムシタビン換算で２０ｍｇ／ｋｇとした。
【００９１】
続いて、薬物の投与から３０分後、２時間後及び２４時間後に各マウスを絶命処置した。続いて、血液及び各臓器（心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、胃、腸管、腫瘍）を採取した。続いて、採取した血液の放射活性をガンマカウンターで定量し、ゲムシタビンの血中滞留性を評価した。また、採取した各臓器の放射活性をガンマカウンターで定量し、ゲムシタビンの各臓器への集積量を評価した。
【００９２】
図３（ａ）は、ゲムシタビンの血中残存量の測定結果を示すグラフである。その結果、ゲムシタビンの投与では、投与後２時間で９５％が血液中から消失し、５％しか残存していなかったのに対し、実験例２で合成した薬物送達システムの投与では、約４倍の２０％のゲムシタビンが血液中に残存していたことが明らかとなった。
【００９３】
また、図３（ｂ）は、ゲムシタビンの腫瘍組織集積量の測定結果を示すグラフである。その結果、投与後２時間で、実験例２で合成した薬物送達システムの投与により、ゲムシタビンの投与に比べて約３倍のゲムシタビンが腫瘍組織に集積したことが明らかとなった。一方、実験例２で合成した薬物送達システムの投与では、肝臓等へのゲムシタビンの目立った集積は確認されなかった。
【００９４】
また、図４（ａ）は、ゲムシタビンを単体で投与した場合のゲムシタビンの各臓器への集積量を測定した結果を示すグラフである。また、図４（ｂ）は、薬物送達システムの形態で投与したゲムシタビンの各臓器への集積量を測定した結果を示すグラフである。
【００９５】
その結果、ゲムシタビンを単体で投与した場合には、胃や腸管への目立った集積が観察された。これに対し、薬物送達システムを投与した場合には、ゲムシタビンの胃や腸管への集積は抑制されており、高分子ミセルやリポソームを投与した場合にしばしば観察される、肝臓や脾臓への目立った集積も観察されなかった。
【００９６】
以上の結果から、実験例２で合成した薬物送達システムの投与では、ゲムシタビンの投与量が１／４であるにもかかわらず、ゲムシタビンの投与と比較して、血中滞留性が有意に高く、腫瘍組織集積量も有意に高く、正常臓器への目立った集積を誘起することもないことが明らかとなった。
【００９７】
この結果は、実験例２で合成した薬物送達システムを投与すると、薬効が有意に高いことを更に支持するものである。
【００９８】
［実験例７］
（毒性試験１）
４週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを１週間飼育後、ゲムシタビン及び実験例２で合成した薬物送達システムを投与し、毒性を評価した。ゲムシタビンの投与量は８０ｍｇ／ｋｇとした。また、実験例２で合成した薬物送達システムの投与量は、ゲムシタビン換算で２０ｍｇ／ｋｇとした。各薬物の投与は実験開始後１日１回毎日尾静脈投与により行い、マウスの体重の変化を観察した。体重の減少は毒性の指標の一つである。
【００９９】
図５は、各群のマウスの体重変化率を測定した結果を示すグラフである。図５中、矢印は、薬物を投与した時間を示す。その結果、ゲムシタビン投与群では、全てのマウス（３匹）の体重が減少し、実験開始から３日目に全て絶命した。これに対し、実験例２で合成した薬物送達システムの投与群では、体重減少は確認されず、絶命したマウスも確認されなかった。
【０１００】
この結果は、実験例２で合成した薬物送達システムが、既存薬であるゲムシタビンと比較して、大幅な低毒性を達成していることを示す。
【０１０１】
［実験例８］
（毒性試験２）
４週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを１週間飼育後、ゲムシタビン及び実験例２で合成した薬物送達システムを投与し、毒性を評価した。
【０１０２】
具体的には、まず、ゲムシタビン又は薬物送達システムを生理食塩水に溶解した水溶液を調製した。続いて、各水溶液を、それぞれＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝３）に尾静脈注射により１日１回ずつ３日間投与した。ゲムシタビン水溶液の濃度は２ｍｇ／ｍＬとした。また、薬物送達システムの水溶液の濃度は２０ｍｇ／ｍＬとした。各群の薬物の投与量は１回あたり２００μＬとした。この結果、１回あたりの投与量は、ゲムシタビン投与群及び薬物送達システム投与群のいずれにおいてもゲムシタビン換算で２０ｍｇ／ｋｇ体重となった。また、生理食塩水を投与したマウスを対照群とした。
【０１０３】
実験開始後、薬物の投与ごとに電子天秤で体重を測定した。また、マウスの総摂食量を測定した。続いて、実験開始日を０日目として３日目に、小腸及び脾臓を採取した。採取した小腸はパラフィン包埋法により標本とし、ヘマトキシリン／エオジン（ＨＥ）染色後に顕微鏡観察した。また、脾臓の質量を測定した。
【０１０４】
図６は、各群のマウスの体重の経時変化を示すグラフである。統計学的有意差はｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ（Ｔｕｋｅｙ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｔｅｓｔ）により算出した。その結果、対照群及び薬物送達システム投与群のマウスでは体重減少が観察されなかった。これに対し、ゲムシタビン投与群のマウスでは有意な体重減少が観察された。
【０１０５】
図７は、各群のマウスの総摂食量の測定結果を示すグラフである。統計学的有意差はｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ（Ｔｕｋｅｙ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｔｅｓｔ）により算出した。その結果、ゲムシタビン投与群のマウスは、他の群のマウスと比較して、総摂食量が有意に減少したことが明らかとなった。
【０１０６】
図８（ａ）〜（ｃ）は、各群のマウスの小腸の標本をヘマトキシリン／エオジン（ＨＥ）染色した結果を示す代表的な顕微鏡写真である。図８（ａ）は対照群のマウスの小腸の組織像であり、図８（ｂ）は薬物送達システム投与群のマウスの小腸の組織像であり、図８（ｃ）はゲムシタビン投与群のマウスの小腸の組織像である。図８（ａ）〜（ｃ）において、スケールバーは１００μｍを示す。また、四角で囲んだ部分は絨毛底部の腸陰窩を示す。その結果、ゲムシタビン投与群のマウスの小腸では、絨毛底部の腸陰窩の構造異変及び脱落が認められた。腸陰窩は、様々な酵素の分泌に寄与している腸腺として知られている。
【０１０７】
また、図８（ａ）〜（ｃ）の顕微鏡写真に基づいて、各群のマウスの小腸における絨毛長を測定した。図９は、各群のマウスの小腸における絨毛長を測定した結果を示すグラフである。統計学的有意差はｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ（Ｔｕｋｅｙ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｔｅｓｔ）により算出した。その結果、ゲムシタビン投与群のマウスの小腸では、他の群のマウスと比較して、絨毛長が有意に減少したことが明らかとなった。
【０１０８】
以上の結果から、ゲムシタビン投与群のマウスは、小腸に傷害を受けていることが明らかとなった。ゲムシタビン投与群では、摂食量が減少したことに加えて、消化器官（特に小腸）での摂食物の消化・吸収不全が生じたことが、体重減少の主な原因であると考えられた。
【０１０９】
図１０は、各群のマウスの脾臓の質量の測定結果を示すグラフである。統計学的有意差はｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ（Ｔｕｋｅｙ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｔｅｓｔ）により算出した。
【０１１０】
その結果、ゲムシタビン投与群のマウスは、他の群のマウスと比較して、脾臓の質量が有意に減少したことが明らかとなった。脾臓の質量は、免疫毒性評価の指標の１つである。したがって、この結果は、ゲムシタビン投与群のマウスにおいて免疫毒性が認められることを示す。
【０１１１】
以上の結果は、実験例２で合成した薬物送達システムが、既存薬であるゲムシタビンと比較して、大幅な低毒性を達成していることを更に支持するものである。薬物送達システムにより、特に、消化器毒性とそれに関連した体重減少の低減を達成していることが明らかとなった。
【０１１２】
［実験例９］
（毒性試験３）
ゲムシタビン及び実験例２で合成した薬物送達システムをマウスに投与し、血液学的パラメーターに対する影響を評価した。
【０１１３】
まず、ゲムシタビン又は薬物送達システムを生理食塩水に溶解した水溶液を調製した。続いて、各水溶液を、それぞれＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝３）に尾静脈注射により１日１回ずつ３日間投与した。ゲムシタビン水溶液の濃度は２ｍｇ／ｍＬとした。また、薬物送達システムの水溶液の濃度は２０ｍｇ／ｍＬとした。各群の薬物の投与量は１回あたり２００μＬとした。この結果、１回あたりの投与量は、ゲムシタビン投与群及び薬物送達システム投与群のいずれにおいてもゲムシタビン換算で２０ｍｇ／ｋｇ体重となった。また、生理食塩水を投与したマウスを対照群とした。
【０１１４】
実験開始日を０日目として３日目に、血液を採取した。血液は、自動血球分析装置（自動化法）及び染色鏡検法により血液学的パラメーターを測定・算出した。下記表１に、血液学的パラメーターの測定結果を示す。統計学的有意差は、生理食塩水投与群を対照群としたＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ  ｔｅｓｔにより算出した（ｎ＝３）。表１中、「＊」は、相関係数（ｐ値）０．０５未満で有意差があることを表す。
【０１１５】
【表１】
2020063191.tif 000028
【０１１６】
その結果、ゲムシタビン投与群において、対照群と比較して、白血球数及び白血球分画の好中球数の有意な減少が確認された。一方、薬物送達システム投与群においては血液学的パラメーターの異常は確認されなかった。この結果は、実験例２で合成した薬物送達システムが、既存薬であるゲムシタビンの投与により発現する血液毒性の低減を達成していることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明によれば、薬物の薬理活性を低下させることなく、効率よく腫瘍組織に薬物を送達することができる薬物送達技術を提供することができる。
【図１】
2020063191.tif 000038
【図２】
2020063191.tif 000039
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020063191.tif 000044
【図８】
2020063191.tif 000045
【図９】
2020063191.tif 000046
【図１０】
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