(57)【要約】      （修正有）【課題】ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質の活性を安定に維持することができる液体製剤の提供。【解決手段】ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、プロリンとヒスチジンとの混合物、緩衝液及び等張化剤を含む液体製剤であって、該融合タンパク質がＴＮＦＲ（腫瘍壊死因子受容体）又はそれらの断片及び免疫グロブリンＦｃ領域を含む、液体製剤。【選択図】図２ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、１又は数個のアミノ酸、緩衝液及び等張化剤を含む液体製剤であって、該融合タンパク質がＴＮＦＲ（腫瘍壊死因子受容体）又はそれらの断片及び免疫グロブリンＦｃ領域を含み、かつ、該１又は数個のアミノ酸がプロリン、ヒスチジン及びグルタミン酸から成る群から選択される、液体製剤。
【請求項２】
前記融合タンパク質がエタネルセプトである、請求項１に記載の液体製剤。
【請求項３】
前記融合タンパク質が配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の液体製剤。
【請求項４】
前記融合タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列におけるアミノ酸の置換、欠失又は挿入により調製される変異融合タンパク質、あるいは、エタネルセプトの活性と類似の活性を示すペプチドアナログである、請求項１に記載の液体製剤。
【請求項５】
前記等張化剤が液体製剤に２８０から３５０ｍＯｓｍの浸透圧を維持させる、請求項１から４のいずれか一項に記載の液体製剤。
【請求項６】
前記等張化剤が塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）及びスクロースを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の液体製剤。
【請求項７】
塩化ナトリウムが１から１０００ｍＭの濃度で存在し、かつ、スクロースが総組成の０．０１から３重量％の量で存在する、請求項６に記載の液体製剤。
【請求項８】
塩化ナトリウムが１０５ｍＭから１５０ｍＭの濃度で存在し、かつ、スクロースが総組成の０．０１から１．５重量％の量で存在する、請求項７に記載の液体製剤。
【請求項９】
液体製剤中の前記融合タンパク質の濃度が、２０から５５ｍｇ／ｍＬの範囲内である、請求項１から８のいずれか一項に記載の液体製剤。
【請求項１０】
前記緩衝液がクエン酸−リン酸又はリン酸緩衝液である、請求項１から９のいずれか一項に記載の液体製剤。
【請求項１１】
前記緩衝液の濃度が、１０から３５ｍＭの範囲内である、請求項１０に記載の液体製剤。
【請求項１２】
液体製剤のｐＨが６．０から６．６の範囲内である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の液体製剤。
【請求項１３】
前記製剤が、プロリンを１０ｍＭ未満の濃度で、又は、ヒスチジンを５ｍＭ未満の濃度で含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の液体製剤。
【請求項１４】
前記製剤が、プロリンを９ｍＭ未満の濃度で、又は、ヒスチジンを０．１ｍＭ未満の濃度で含む、請求項１３に記載の液体製剤。
【請求項１５】
前記製剤がプロリン及びヒスチジンの混合物を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の液体製剤。
【請求項１６】
プロリンが１ｍＭから９ｍＭの濃度で存在し、かつ、ヒスチジンが０．１ｍＭ未満の濃度で存在する、請求項１５に記載の液体製剤。
【請求項１７】
プロリンが１ｍＭから９ｍＭの濃度で存在し、かつ、ヒスチジンが０．０１から０．０９ｍＭの濃度で存在する、請求項１６に記載の液体製剤。
【請求項１８】
プロリンが６ｍＭの濃度で存在し、かつ、ヒスチジンが０．０９ｍＭの濃度で存在する、請求項１７に記載の液体製剤。
【請求項１９】
グルタミン酸を１ｍＭから２０ｍＭの濃度でさらに含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の液体製剤。
【請求項２０】
グルタミン酸が１０から１５ｍＭの濃度で存在する、請求項１９に記載の液体製剤。
【請求項２１】
薬学的有効量でのＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、クエン酸−リン酸緩衝液、塩化ナトリウム、スクロース、ならびにプロリン及びヒスチジンを含むアミノ酸の混合物を含む液体製剤であって、該ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質がp７５  ｓＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質である、液体製剤。
【請求項２２】
液体製剤が、３０から５５ｍｇ／ｍＬのＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、及び１０から３５ｍＭのクエン酸−リン酸緩衝液、１０５から１２０ｍＭのＮａＣｌ、０．５から１．５％のスクロース、１から９ｍＭのプロリン及び０．０１から０．１ｍＭのヒスチジンを含み、かつ、６．３のｐＨを有する、請求項２１に記載の液体製剤。
【請求項２３】
液体製剤が、５０ｍｇ／ｍＬのＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、２５ｍＭのクエン酸−リン酸緩衝液、１１５ｍＭのＮａＣｌ、１％のスクロース、６ｍＭのプロリン、及び０．０９ｍＭのヒスチジンを含み、かつ、６．３のｐＨを有する、請求項２２に記載の液体製剤。
【請求項２４】
液体製剤が、３０から５５ｍｇ／ｍＬのＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、及び１０から３５ｍＭのクエン酸−リン酸緩衝液、１２０から１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１から０．５％のスクロース、１から９ｍＭのプロリン及び０．０１から０．１ｍＭのヒスチジンを含み、かつ、６．３のｐＨを有する、請求項２１に記載の液体製剤。
【請求項２５】
液体製剤が、５０ｍｇ／ｍＬのＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、２５ｍＭのクエン酸−リン酸緩衝液、１３０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のスクロース、６ｍＭのプロリン、及び０．０９ｍＭのヒスチジンを安定化剤として含み、かつ、６．３のｐＨを有する、請求項２４に記載の液体製剤。
【請求項２６】
液体製剤が、３０から５５ｍｇ／ｍＬのＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、１０から３５ｍＭのクエン酸−リン酸緩衝液、１００〜１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１から１．５％のスクロース、５から１５ｍＭのグルタミン酸塩、１から１０ｍＭのプロリン、及び１から１０ｍＭのヒスチジンを含み、かつ、６．３のｐＨを有する、グルタミン酸をさらに含む、請求項２１に記載の液体製剤。
【請求項２７】
液体製剤が、５０ｍｇ／ｍＬのＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、２５ｍＭのクエン酸−リン酸緩衝液、１００ｍＭのＮａＣｌ、１％のスクロース、１０ｍＭのグルタミン酸塩、１０ｍＭのプロリン、及び５ｍＭのヒスチジンを含み、かつ、６．３のｐＨを有する、請求項２６に記載の液体製剤。
【請求項２８】
請求項１から２７のいずれか一項のＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を含む液体製剤を調製するための方法であって、以下：
ａ）ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を調製し；そして
ｂ）ステップａ）で調製されたＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を、プロリン及びヒスチジンからなる群から選択される１又は数個のアミノ酸を含む安定化剤、緩衝液、ならびに塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）及びスクロースを含む等張化剤と混合すること、
を含む、方法。
【請求項２９】
ステップｂ）での混合が、ｉ）安定化剤、緩衝液、及び等張化剤を含む溶液を調製すること、ならびに、ｉｉ）ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質がステップａ）で調製される溶液を、ステップｉ）の溶液と交換すること、を含む、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質及び安定化剤を含む液体製剤であって、該融合タンパク質がＴＮＦＲ（腫瘍壊死因子受容体）又はそれらの断片及び免疫グロブリンＦｃ領域を含み、かつ、該安定化剤が、プロリン及びヒスチジンからなる群から選択される１又は数個のアミノ酸、緩衝液、ならびに塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）及びスクロースを含む等張化剤を含む液体製剤に関し、そして、該液体製剤の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
一般に、タンパク質薬剤の化学的及び物理的変性は、好ましくない温度、せん断応力、振動、凍結融解、ＵＶ照射、過度なｐＨ変化、有機溶媒、微生物汚染などによって容易に起こり得る。化学的変性は、タンパク質を構成するアミノ酸、及びタンパク質を含む溶媒の条件（塩、ｐＨ及び温度）によって影響を受ける、二量体の解離、酸化、脱アミド化、異性化、及び重合を含む。物理的変性は、タンパク質含有の周囲の環境、例えば溶媒、複雑なタンパク質構造、例えば電荷分布、及び熱熱安定性によって変化する、タンパク質表面上の疎水性パッチによって影響を受ける、三次構造の喪失、共有結合的／非共有結合的な凝集、及び単量体の接着を含む。
【０００３】
抗体を含むタンパク質の物理的又は化学的変性はその生理活性の喪失を引き起こす。変性は不可逆的な過程であるため、タンパク質は一度変性すると、それらの本来の特性を取り戻すことができず、それらの治療効果の減少をもたらす。単量体の凝集などの現象が免疫反応を引き起こすということも示唆されている。それゆえ、凝集することなく生理学的有効量のタンパク質を含む製剤に関して多くの研究が行われている（Ｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．  ，Ｂｉｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３３（８）：  １４１３−１４１７、２０１０）。
【０００４】
液体製剤中のタンパク質変性を防止するために利用できる多くの方法がある。いくつかのタンパク質薬剤では、安定性の問題は凍結乾燥によって対処される。しかしながら、凍結乾燥工程は凍結及び乾燥に関連するストレス、例えば氷結晶の形成、ｐＨ変化、及び高濃度の溶質を引き起こし、そして、それらのストレスはタンパク質変性を引き起こし得る。加えて、大容量の凍結乾燥機が製造中の凍結乾燥工程に必要とされるので、大規模生産中に高い製造コストが生じる。使用前に滅菌水性媒体で凍結乾燥産物を溶解させることも不便さをもたらす。
【０００５】
これらの制限を解決するための代替として、タンパク質安定性の向上のために安定化剤が液体製剤に添加される。界面活性剤、血清アルブミン、多糖類、アミノ酸、ポリマー、塩などがタンパク質薬剤に用いられる安定化剤として知られている（Ｗａｎｇ，Ｉｎｔ．  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，１８５：  １２９−１８８、１９９９；  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ，Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，９６（１）：  １−２６、２００７）。
【０００６】
薬剤の安定な製剤を調製するためには、しかしながら、適当な安定化剤は各活性成分の物理化学的特性を考慮して使用されるべきである。安定化剤が組み合わせて使用される場合、それらの間における競争及び副作用が望ましくない影響をもたらし得る。加えて、タンパク質の濃度は安定化に適した範囲内にあるべきであり、特に、高濃度のタンパク質薬剤を調製するために、多くの努力及び注意が溶液中のタンパク質を安定化するために必要とされる（Ｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  ，Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，９３（６）：  １３９０−１４０２，２００４）。
【０００７】
一方で、エタネルセプトは、細胞表面のＴＮＦ−α受容体に結合するＴＮＦ−αの競合的阻害薬としての機能し、ＴＮＦ−α介在性免疫反応を阻害する、生物学的モジュレーター（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）である。エタネルセプトは１５０ｋＤａの分子量を有する高分子であり、かつ、ジスルフィド結合により連結された２つの融合タンパク質のホモダイマーであって、それぞれの融合タンパク質はヒト免疫グロブリンＧサブクラス１のＦｃ部分に結合されたヒト可溶性ｐ７５  ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）受容体からなる（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２１（１）：  ７５−８７，１９９９；  Ｍｏｒｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．  ，Ａｎｎ．  Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１３０（６）：  ４７８−４８６，１９９９）。
【０００８】
これは、２００２年にエンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）の商品名でアムジェン（Ａｍｇｅｎ）により市販される。エタネルセプトは、関節リウマチ、乾癬、及び強直性脊椎炎を治療するために使用されるＴＮＦ−α阻害薬であり、血管炎、アルツハイマー病及びクローン病の治療のための臨床試験中である。
【０００９】
ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、例えばエタネルセプトのための製剤安定化技術は、製造、保存、及び輸送中に起こり得るタンパク質変性を最小限に抑え、かつ、従来のタンパク質薬剤の活性と同一であるように長期間それらの活性を維持するための液体製剤を開発することを目的とするが、満足な液体製剤を開発することは困難であった。それゆえ、長期間にわたってＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質（エタネルセプト）の活性を安定に維持することができ、かつ、米国特許第７，６４８，７０２号明細書に開示されるアルギニンを含む既知の製剤よりもＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質（エタネルセプト）の安定化に効果的である、新たな液体製剤を開発する緊急の必要性がある。
【発明の概要】
【００１０】
発明の開示
技術的問題
従って、本発明者らは、エタネルセプトの活性を安定に維持するができる液体製剤を調製するための方法を開発するために多くの努力をした。本発明は、単一アミノ酸又は混合アミノ酸を含む既知の安定化剤に用いられる濃度よりも低い濃度で用いられる場合であっても、プロリン及びヒスチジンからなる群から選択される１又は数個のアミノ酸を含む安定化剤が溶液中のエタネルセプトの安定化に顕著な効果を示すということを与え、それによって本発明を完成する。
【００１１】
問題の解決策
本発明の目的は、ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質及び安定化剤を含む安定な液体製剤であって、該ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質がＴＮＦＲ（腫瘍壊死因子受容体）又はそれらの断片及び免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質であり、かつ、該安定化剤がプロリン及びヒスチジンからなる群から選択される１又は数個のアミノ酸、緩衝液、ならびに、等張化剤、好ましくは塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）及びスクロースを含む等張化剤を含む、液体製剤を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、該液体製剤の調製方法を提供することである。
【００１３】
本発明の有利な効果
ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質（エタネルセプト）の長期間の保存が可能であり、かつ、特定の保存条件が必要とされないため、本発明に係る液体製剤は優れた保存安定性を与える。該製剤が単純であっても、本発明の液体製剤は優れた保存安定性を示すので、それは他の安定化され又は凍結乾燥された製剤よりも経済的であり、したがって該製剤は、ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質（エタネルセプト）による治療に効果的に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ｐ７５  ｓＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質（エタネルセプト）についてのアミノ酸配列を示す（配列番号１）。
【図２ａ】図２は、４℃（図２ａ）及び２５℃（図２ｂ）における実施例３に記載される製剤１、２、３、及び対照についての、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）グラフを示す。保存温度に従って６か月時点で、アルギニン及びヒスチジン（製剤１）、又は、プロリン及びヒスチジン（製剤２及び３）のいずれかを含むエタネルセプト製剤の４℃（２ａ）及び２５℃（２ｂ）におけるＤＳＣサーモグラム。
【図２ｂ】図２は、４℃（図２ａ）及び２５℃（図２ｂ）における実施例３に記載される製剤１、２、３、及び対照についての、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）グラフを示す。保存温度に従って６か月時点で、アルギニン及びヒスチジン（製剤１）、又は、プロリン及びヒスチジン（製剤２及び３）のいずれかを含むエタネルセプト製剤の４℃（２ａ）及び２５℃（２ｂ）におけるＤＳＣサーモグラム。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明を実施するための最良の形態
上記目的を達成するための１つの態様では、本発明は、ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質及び安定化剤を含む液体製剤を提供し、該融合タンパク質はＴＮＦＲ（腫瘍壊死因子受容体）又はそれらの断片及び免疫グロブリンＦｃ領域を含み、かつ、該安定化剤は、プロリン及びヒスチジンからなる群から選択される１又は数個のアミノ酸、緩衝液、ならびに、等張化剤、好ましくは塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）及びスクロースを含む等張化剤を含む。
【００１６】
ＴＮＦＲ又はそれらの断片及び免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質は、特に配列番号１のアミノ酸配列によって表される、エタネルセプト（組換えｐ７５  ｓＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質）であってもよい。さらに融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列におけるアミノ酸の置換、欠失又は挿入により調製される変異融合タンパク質、あるいは、エタネルセプトの活性と類似の活性を示すペプチドアナログであってもよい。本発明の液体製剤は、プロリン及びヒスチジンからなる群から選択される１又は数個のアミノ酸、あるいはそれらの薬学的に許容される塩を含み、それによってＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質（エタネルセプト）の副産物形成を低減し、長期間にわたってその活性を安定に維持する、安定化された液体製剤又は安定な液体製剤である。
【００１７】
本明細書で用いられる、用語「ＴＮＦＲ及び免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質」は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）又はそれらの断片及び免疫グロブリンＦｃ領域の融合によって調製される組換えタンパク質をいい、特に免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ１の免疫グロブリンＦｃ領域に由来してもよい。好ましくは、融合タンパク質はエタネルセプトであってもよく、そして配列番号１のアミノ酸配列によって表されてもよい。
【００１８】
本明細書で用いられる用語「エタネルセプト（組換えｐ７５  ｓＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質）」は、ジスルフィド結合より連結された２つの融合タンパク質のホモダイマーの形態であって、それぞれの融合タンパク質はヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ１）サブクラス１のＦｃ部分に結合されたヒト可溶性７５キロダルトン（ｐ７５）ＴＮＦ受容体からなるタンパク質をいう。
【００１９】
より具体的には、エタネルセプトは、３つのジスルフィド結合により連結された２つの融合タンパク質のホモダイマーの形態であり、それぞれの融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分と結合されたヒト可溶性ｐ７５  ＴＮＦ受容体の細胞外リガンド結合部分からなる。エタネルセプトのＦｃ成分は、ＩｇＧ１のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びヒンジ領域を含むが、ＣＨ１ドメインは含まない。エタネルセプトは約１５０ｋＤａの分子量を有し得る。このエタネルセプトは現在、商品名エンブレル（ＥＮＢＲＥＬ）（登録商標）として販売され（アムジェン・インク（Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃ．）、サウザンドオークス、カリフォルニア州）、ＣＡＳ番号１８５２４３−６９−０を有し得る。
【００２０】
本発明のＴＮＦＲ又はそれらの断片及び免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質、特にエタネルセプトは、細胞発現系における組換えＤＮＡ技術によって生産されてもよいが、これに限定されない。
【００２１】
本発明のエタネルセプトは、細胞表面のＴＮＦ−α受容体に結合するＴＮＦ−αの競合的阻害薬として機能し、ＴＮＦ−α介在性免疫反応を阻害する、生物学的モジュレーターであり、そして、関節リウマチ、乾癬、及び強直性脊椎炎を治療するために使用され、そして血管炎、アルツハイマー病及びクローン病の治療のための臨床試験中である。
【００２２】
本発明の液体製剤中に、本発明のＴＮＦＲ又はそれらの断片及び免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質、特にエタネルセプトは、薬学的有効量で、かつ、１から１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは２０から５５ｍｇ／ｍＬ、そしてより好ましくは３０から５５ｍｇ／ｍＬの量で含まれてもよい。
【００２３】
本明細書で用いられる用語「安定化された液体製剤」又は「安定な液体製剤」は、溶液での保存中に、治療的活性成分、すなわち本発明の融合タンパク質、特にエタネルセプトの物理的及び化学的な同一性及び完全性を保持する製剤をいう。本発明の融合タンパク質、特にエタネルセプトの安定性の分析測定は、当該技術分野において広く知られているタンパク質安定性アッセイによって行われてもよい。安定性は、所定の時間、所定の温度で測定されてもよい。迅速なアッセイのために、製剤は、より高い又は「上昇した」温度、例えば、２週間から１ヶ月又はより長く、４０℃で保存されてもよく、その経時的な安定性はこの時点で測定される。
【００２４】
本明細書で用いられる用語「安定化剤」は、製剤中の生物学的分子及び／又は一般的な医薬賦形剤と相互作用し、その安定性を向上させる、特定の化学化合物又は組成物をいう。安定化剤は一般に、タンパク質凝集を引き起こす、空気／溶液界面誘発性ストレス及び溶液／表面誘発性ストレスからタンパク質を保護する。本発明では、安定化剤は、溶液中での保存中に本発明の融合タンパク質、特にエタネルセプトの副産物の形成を減少させ、長期間にわたってその活性を維持する成分である。好ましくは、安定化剤は、プロリン及びヒスチジンからなる群から選択される１又は数個のアミノ酸を含む。
【００２５】
本発明のアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸の両方を含んでもよい。
【００２６】
本発明の安定化剤として、アミノ酸それ自体、例えばプロリン及びヒスチジンだけでなく、アナログ、溶媒和物、水和物、立体異性体、及びそれらの薬学的に許容される塩も、それらが実質的に同一の効果を示す限りは、本発明の範囲内である。
【００２７】
本明細書で用いられる用語「副産物」は、製剤中の治療的活性成分、ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質（エタネルセプト）の比率を低下させ又は減少させる望ましくない産物をいう。典型的な副産物は、脱アミノ化又は加水分解によるＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質（エタネルセプト）の変性に起因する「低分子量産物」、オリゴマー及び凝集体などの「高分子量産物」、あるいはそれらの混合物を含む。
【００２８】
本明細書で用いられる用語「高分子量産物」は、変性によってその後凝集される（例えば、脱アミノ化又は加水分解によるポリペプチドの分解によって生じる）ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質（エタネルセプト）断片、あるいはそれらの混合物を含む。典型的には、高分子量産物は、治療的単量体のＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質（エタネルセプト）よりも高い分子量を有する複合体であり、約１５０ｋＤａ超の分子量を有してもよい。
【００２９】
本明細書で用いられる用語「低分子量産物」は、例えば、脱アミノ化又は加水分解により生成される治療的ポリペプチド、すなわち、ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質（エタネルセプト）断片を含む。典型的には、低分子量産物は、治療的単量体のＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質（エタネルセプト）よりも低い分子量を有する複合体であって、約１５０ｋＤａ未満の分子量を有してもよい。
【００３０】
本発明の液体製剤は、安定化剤としてプロリン及びヒスチジンからなる群から選択される１又は数個のアミノ酸を含む。例えばグルタミン酸などの他の付加的なアミノ酸は、製剤を安定化させるために添加されてもよい。好ましくは、液体製剤は、プロリン又はヒスチジンを単独で、あるいは、プロリン及びヒスチジンの両方のアミノ酸を含む。その組み合わせにおいて、プロリン又はヒスチジンの薬学的に許容される塩がさらに含まれてもよく、あるいは、プロリン及びヒスチジン又はそれらの薬学的に許容される塩の修飾された形態が含まれてもよい。好ましくは、液体製剤はプロリン及びヒスチジンのアミノ酸の混合物を含む。
【００３１】
本発明において、安定化剤中の、プロリン濃度は、１から１０ｍＭまで、好ましくは１から９ｍＭまで、より好ましくは３から９ｍＭまで、よりいっそう好ましくは３から６ｍＭまでの範囲内であってもよく、そして、ヒスチジン濃度は、０．０１から５ｍＭまで、好ましくは０．０１から０．１ｍＭまで、より好ましくは０．０３から０．１ｍＭまで、よりいっそう好ましくは０．０３から０．０９ｍＭまで、よりいっそう好ましくは０．０６から０．０９ｍＭまでの範囲内であってもよく、又はよりいっそう好ましくは約０．０９ｍＭであってもよい。具体的に、安定化剤として含まれるプロリン及びヒスチジンのアミノ酸の混合物中では、プロリン濃度は、１から１０ｍＭまで、好ましくは１から９ｍＭまで、より好ましくは３から９ｍＭまで、よりいっそう好ましくは３から６ｍＭまでの範囲内であってもよく、そして、ヒスチジン濃度は、０．０１から５ｍＭまで、好ましくは０．０１から０．１ｍＭまで、より好ましくは０．０３から０．１ｍＭまで、よりいっそう好ましくは０．０３から０．０９ｍＭまで、よりいっそう好ましくは０．０６から０．０９ｍＭまでの範囲内であってもよく、又はよりいっそう好ましくは約０．０９ｍＭであってもよい。付加的なアミノ酸、例えばグルタミン酸の添加は、１から２０ｍＭまで、好ましくは５から１５ｍＭまで、より好ましくは１０から１５ｍＭまでの範囲内であってもよい。プロリン及びヒスチジンの混合物と組み合わされる場合、グルタミン酸の濃度は、１から２０ｍＭまで、好ましくは５から１５ｍＭまで、より好ましくは１０から１５ｍＭまでの範囲内であってもよい。
【００３２】
本発明の１つの特定の実施形態では、ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質（エタネルセプト）のための安定化された液体製剤の調製において、液体製剤は、エタネルセプトの安定化された液体製剤としてアルギニンを含む既知の液体製剤（米国特許第７，６４８，７０２号明細書）を超える利点を有する液体製剤を開発するために、アミノ酸の組み合わせ及び等張化剤の条件を変化させることによって調製され、それらの安定化効果が調べられた。
【００３３】
結果として、プロリン及びヒスチジンからなる群から選択される１又は数個のアミノ酸を含む製剤は、高温での保存中にその変性を防止することによって、溶液中のエタネルセプトを安定化させる顕著な効果を示すことが見出された（表１の製剤４及び製剤５、製剤７及び製剤８、表４の製剤２及び製剤３、表７の製剤２から製剤４及び製剤６から製剤７）。特に、プロリン及びヒスチジンのアミノ酸の混合物を含む製剤（表１の製剤５及び製剤８、表４の製剤２及び製剤３、表７の製剤２から製剤４及び製剤６から製剤７）は、対照製剤よりも優れた安定化効果を示した。
【００３４】
すなわち、単一アミノ酸又はアミノ酸の混合物を使用する既知の安定化剤の濃度（１０ｍＭ以上）よりも低い濃度（６．１ｍＭ）で使用された場合であっても、プロリン及びヒスチジンからなる群から選択される１又は数個のアミノ酸を含む安定化剤が、溶液中のエタネルセプトの安定化に顕著な効果を示すということを、本発明は最初に実証した。
【００３５】
本発明に係る液体製剤は、それがプロリン及びヒスチジンからなる群から選択される１又は数個のアミノ酸を含む安定化剤を添加することによるＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質（エタネルセプト）の安定性を向上させる機能を損なわない限り、タンパク質薬剤又は抗体医薬の液体製剤に一般に含まれる任意の材料をさらに含んでもよい。
【００３６】
本明細書で用いられる用語「緩衝液」は、製剤の等張性及び化学的安定性を向上させ、生理学的に好適なｐＨを維持する働きをする成分いう。緩衝剤は液体製剤の急激なｐＨ変化を防ぎ、ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質（エタネルセプト）の安定化のための溶液のｐＨを維持する。緩衝液の好ましい例は、クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酢酸塩、ヒスチジン、又はトリスなどの水溶液を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、緩衝剤は水性クエン酸−リン酸緩衝液である。緩衝剤は、単独又はそれらの２以上の組み合わせのいずれかで使用されてもよい。
【００３７】
本発明の液体製剤は、約５から７．５のｐＨ又は約５．８から６．８のｐＨを有してもよい。特に、該製剤は約６．０から６．６のｐＨを有する。必要であれば、ｐＨは当該技術分野で既知の手法によって調整されてもよい。緩衝液は０．１から１００ｍＭ、好ましくは１から５０ｍＭ、そしてより好ましくは１０から３５ｍＭの濃度で存在してもよい。好ましくは、本発明の水性緩衝液には注射用水が使用される。
【００３８】
本明細書で用いられる用語「等張化剤」は、製剤の等張性及びタンパク質レベルを部分的に維持し、そして、製剤中に存在する治療的活性ポリペプチドのレベル、比率、又は割合を部分的に維持する働きをする成分をいう。等張化剤は血漿と同一の浸透圧を維持し、そのため対象の血漿の浸透圧を変化させることなく、対象に静脈内注射することができる。本発明に係る１つの実施形態では、浸透圧は本発明の製剤の静脈内注射に適している。しばしば、等張化剤は増量剤（ｂｕｌｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）としても働く。このように、等張化剤はタンパク質に、凍結及びせん断などの種々のストレスを克服させ得る。
【００３９】
等張化剤は、溶液のＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質（エタネルセプト）が体内に投与される際に、体内の適切な浸透圧を維持するのに役立つ。等張化剤の例は、一般的に使用される塩化ナトリウム、塩化カリウム、ホウ酸、ホウ酸ナトリウム、マンニトール、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、マルトース、スクロース、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、グルコースなどを含んでもよいが、これらに限定されない。これらの等張化剤は、単独又はそれらの２以上の組み合わせのいずれかで使用されてもよい。本発明では、等張化剤は塩化ナトリウム及びスクロースを含む等張化剤であってもよい。本発明の等張化剤は、溶液に２５０から３５０ｍＯｓｍの浸透圧を維持させ、それは好ましくは１から１０００ｍＭの塩化ナトリウム及び／又は０．０１から３％のスクロース、より好ましくは５０から２５０ｍＭの塩化ナトリウム及び／又は０．０１から１．５％のスクロース、そしてよりいっそう好ましくは１０５から１５０ｍＭの塩化ナトリウム及び／又は０．０１から１．５％のスクロースを含んでもよい。本発明の製剤に塩化ナトリウム及びスクロースが使用される場合、塩化ナトリウム濃度は１から１０００ｍＭまで、好ましくは５０から２５０ｍＭまで、より好ましくは１００から１５０ｍＭまで、よりいっそう好ましくは１０５から１５０ｍＭまで、さらによりいっそう好ましくは１１５から１４０ｍＭまで、よりいっそう好ましくは１１５から１３０ｍＭまでとすることができ、そして、製剤中のスクロースの量は総製剤の０．０１から３重量％まで、好ましくは０．０１から１．５重量％まで、より好ましくは０．１から１．０重量％までとすることができ、よりいっそう好ましくは製剤中のスクロースの量は０．１重量％、０．５重量％、及び１．０重量％から選択される。
【００４０】
本発明の１つの特定の実施形態では、本発明の液体製剤における等張化剤として塩化ナトリウム及びスクロースが使用され、そして、１１５ｍＭの塩化ナトリウム及び１．０％のスクロースを含む製剤（表１の製剤１から製剤５）又は１１５ｍＭの塩化ナトリウム及び０．５％のスクロースを含む製剤（表７の製剤１から製剤４）ならびに１４０ｍＭの塩化ナトリウム及び０．１％のスクロースを含む製剤（表１の製剤６から製剤８）又は１３０ｍＭの塩化ナトリウム及び０．１％のスクロースを含む製剤（表７の製剤５から製剤７）が調製され、そして、それらの安定化効果が対照製剤（１００ｍＭの塩化ナトリウム、１．０％のスクロース）の安定化効果と比較された。
【００４１】
結果として、既知のエタネルセプト製剤と比較して、スクロース及び塩化ナトリウムの濃度を変化させることにより調製された等張化剤を使用する本発明の製剤は、等張化剤中の塩化ナトリウム濃度の上昇及びスクロース濃度の低下によって、エタネルセプトの安定性の向上を示すことが見出された。
【００４２】
本発明に係る液体製剤は薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよく、該賦形剤の例は糖及びポリオール、界面活性剤、ポリマーなどを含んでもよい。糖及びポリオールの例は、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトース、ガラクトース、マンニトール、ソルビトール、グリセロールなどを含んでもよく、界面活性剤の例は、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポロキサマーなどを含んでもよく、そしてポリマーの例は、デキストラン、ポリエチレングリコール、カルボキシルメチルセルロース、ヒアルロン酸、シクロデキストリンなどを含んでもよい。
【００４３】
本発明に係る液体製剤は保存剤をさらに含んでもよい。保存剤とは、抗菌剤として医薬製剤に添加される化学物質をいう。保存剤の例は、塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム、クロロヘキシジン、フェノール、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ο−クレゾール、ρ−クレゾール、クロロクレゾール、硝酸フェニル水銀、チメロサール、安息香酸などを含んでもよいが、これらに限定されない。これら保存剤は、単独又はそれらの２以上の組み合わせのいずれかで使用されてもよい。
【００４４】
本発明の液体製剤は、薬学的有効量でのＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質及び安定化剤を含む安定な液体製剤であって、該ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質（「エタネルセプト」）が配列番号１のアミノ酸配列によって表され、かつ、該安定化剤がクエン酸−リン酸緩衝液、塩化ナトリウム、スクロース、ならびにプロリン及びヒスチジンのアミノ酸の混合物を含む液体製剤であってもよい。特に、本発明の液体製剤は、ｐＨ６．３で、３０から５５ｍｇ／ｍＬのＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、及び１０から３５ｍＭのクエン酸−リン酸緩衝液、１０５から１２５ｍＭのＮａＣｌ、０．５から１．５％のスクロース、１から９ｍＭのプロリン及び０．０１から０．１ｍＭのヒスチジンを含む液体製剤；又は、ｐＨ６．３で、３０から５５ｍｇ／ｍＬのＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、及び１０から３５ｍＭのクエン酸−リン酸緩衝液、１２０から１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１から０．５％のスクロース、１から９ｍＭのプロリン及び０．０１から０．１ｍＭのヒスチジンを含む液体製剤であってもよい。
【００４５】
本発明の特定の実施形態では、以下の液体製剤が提供される。
−ｐＨ６．３で、５０ｍｇ／ｍＬのＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、２５ｍＭのクエン酸−リン酸緩衝液、１１５ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のスクロース、６ｍＭのプロリン及び０．０９ｍＭのヒスチジンを含む液体製剤（表７の製剤３）。
−ｐＨ６．３で、５０ｍｇ／ｍＬのＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、２５ｍＭのクエン酸−リン酸緩衝液、１３０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のスクロース、６ｍＭのプロリン及び０．０９ｍＭのヒスチジンを含む液体製剤（表７の製剤７）。
−ｐＨ６．３で、５０ｍｇ／ｍＬのＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、２５ｍＭのクエン酸−リン酸緩衝液、１００ｍＭのＮａＣｌ、１．０％のスクロース、１０ｍＭのプロリン、５ｍＭのヒスチジン、及び１０ｍＭのグルタミン酸を含む液体製剤（表１の製剤１０）。
【００４６】
本発明の製剤は、エタネルセプトが治療的に有効である疾患の治療に使用できる。エタネルセプトはＴＮＦ−α介在性免疫反応を阻害する生物学的モジュレーターであり、本発明の製剤は、関節リウマチ、乾癬、強直性脊椎炎、血管炎、アルツハイマー病、又はクローン病を治療するために使用することができるが、これらに限定されない。
【００４７】
本発明に係る製剤は、経口又は非経口経路すなわち、皮下、筋肉内、腹腔内、胸骨内、経皮、及び静脈内注射によって体内に投与されてもよいが、これらに限定されない。
【００４８】
別の態様では、本発明は液体製剤の調製方法を提供する。
【００４９】
本発明の液体製剤は、エタネルセプトを調製するステップ；そして、上記ステップで調製されるエタネルセプトを、プロリン及びヒスチジンからなる群から選択される１又は数個のアミノ酸、緩衝液、ならびに等張化剤、好ましくは塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）及びスクロースを含む等張化剤、を含む安定化剤と混合するステップを含む方法によって調製されてもよい。上述の調製方法における混合ステップは、エタネルセプトが調製される溶液を、安定化剤を含む溶液で交換することを含むことができる。
【００５０】
さらに別の態様では、本発明はＴＮＦα活性が有害である疾患の予防又は治療のための液体製剤を含む医薬組成物を提供する。
【００５１】
該液体製剤は、上述と同じである。
【００５２】
本明細書で用いられる用語「ＴＮＦα活性が有害である疾患」は、疾患に罹患している対象にＴＮＦαの存在が示されており、あるいは、疾患の病態生理に関与している、又は、疾患の悪化の一因となる因子であるかのいずれかの疑いがある、病気及びその他の疾患を含む。本発明では、ＴＮＦα活性が有害である疾患の例は、炎症性疾患、例えば敗血症、自己免疫疾患、特に、関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎、変形性関節症、痛風性関節炎、アレルギー、多発性硬化症、自己免疫性糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、ならびにネフローゼ症候群、感染症、同種移植片拒絶及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、悪性腫瘍、肺障害、腸障害、心臓障害などを含んでもよいが、これらに限定されない。
【００５３】
ＴＮＦα活性が有害である疾患は、対象に本発明の組成物を投与することによって予防し又は治療することができる。
【００５４】
本明細書で用いられる用語「治療」は、ＴＮＦα活性が有害である疾患の症状の改善をもたらす任意の行為、又は、本発明の組成物の投与によるＴＮＦα活性が有害である疾患の有益な変化をいい、そして、用語「予防」は、本組成物の投与によるＴＮＦα活性が有害である疾患の発症の抑制又は遅延をもたらす任意の行為をいう。予防又は治療は、ＴＮＦα活性が有害である疾患を有する任意の哺乳動物、例えば、ヒト及び霊長類、並びに家畜、例えばウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコなどに、限定されることなく、そして好ましくはヒトに適用することができる。
【００５５】
本明細書で用いられる用語「投与」とは、ある好適な方法によって患者に所定の量の物質を導入することをいう。組成物の投与経路は、それが所望の組織に達することができる限り一般的な経路のいずれであってもよい。投与経路は、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経口、局所、鼻腔内、肺内、又は直腸経路であってもよいが、これらに限定されない。しかしながら、ペプチドは経口投与に際して消化されるので、経口投与のための組成物の活性成分は好ましくは、胃での分解から保護するためにコーティングされ又は処方されるべきである。好ましくは、それは注射用製剤により投与されてもよい。加えて組成物は、標的細胞への活性成分の伝達を助ける任意の装置を用いて投与されてもよい。
【００５６】
さらに、本発明の医薬組成物は、種々の関連因子、例えば治療すべき疾患、投与の経路、患者の年齢、性別及び体重、ならびに疾患の重症度と共に、活性成分の種類に応じて決定される。
【００５７】
さらに、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含んでもよい。本明細書で用いられる用語「薬学的に許容される担体」とは、生物に著しい刺激を引き起こさず、かつ、投与される化合物の生物学的活性及び特性を抑止しない、担体又は希釈剤をいう。経口投与のために、結合剤、潤滑剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、着色剤、香料などが使用されてもよい。注射用投与のために、緩衝剤、保存剤、鎮痛剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などが組み合わせて使用されてもよい。局所投与のために、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などが使用されてもよい。本発明の医薬組成物は、それを上述の薬学的に許容される担体と混合することによって種々の製剤に調製されてもよい。例えば、経口投与のために、医薬組成物は、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハーなどの形態で調製されてもよい。注射用組成物は、単位投与量アンプル又は多投与量形態（ｍｕｌｔｉ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍ）で処方されてもよい。それは、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放製剤などとして調製することもできる。
【００５８】
本発明の液体製剤は治療的有効量のＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質（エタネルセプト）を含む。例えば、エタネルセプト（エンブレル）の治療的有効量は一般に、１週間あたり２５から１００ｍｇである。
【００５９】
さらに別の態様では、本発明は、ＴＮＦα活性が有害である疾患を有する対象に液体製剤を含む組成物を投与するステップを含む、ＴＮＦα活性が有害である疾患を予防し又は治療するための方法を提供する。
【００６０】
本発明の液体製剤を含む組成物は、長期間にわたってＴＮＦＲ−ｆｃ融合タンパク質（エタネルセプト）の高い濃度を安定に維持することができるので、長期間の保存が可能であり、かつ、特定の保存条件が必要とされない。それゆえ、それはＴＮＦα活性が有害である疾患を予防し又は治療するために広く使用できる。
【００６１】
本発明の第１の実施形態は、ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、１又は数個のアミノ酸、緩衝液、及び等張化剤を含む液体製剤であって、該融合タンパク質がＴＮＦＲ（腫瘍壊死因子受容体）又はそれらの断片及び免疫グロブリンＦｃ領域を含み、かつ、該１又は数個のアミノ酸がプロリン及びヒスチジンならびにグルタミン酸からなる群から選択される、液体製剤である。
【００６２】
第２の実施形態は、該融合タンパク質がエタネルセプトである、第１の実施形態に記載の液体製剤である。
【００６３】
第３の実施形態は、該融合タンパク質が配列番号１のアミノ酸配列を有する、第１の実施形態に記載の液体製剤である。
【００６４】
第４の実施形態は、該融合タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列におけるアミノ酸の置換、欠失又は挿入により調製される変異融合タンパク質、あるいは、エタネルセプトの活性と類似の活性を示すペプチドアナログである、第１の実施形態に記載の液体製剤である。
【００６５】
第５の実施形態は、該等張化剤が液体製剤に２８０から３５０ｍＯｓｍの浸透圧を維持させる、第１から第４の実施形態のいずれか１つに記載の液体製剤である。
【００６６】
第６の実施形態は、該等張化剤が塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）及びスクロースを含む、第１から第５の実施形態のいずれか１つに記載の液体製剤である。
【００６７】
第７の実施形態は、塩化ナトリウムが１から１０００ｍＭの濃度で存在し、かつ、スクロースが総組成の０．０１から３重量％の量で存在する、第６の実施形態に記載の液体製剤である。
【００６８】
第８の実施形態は、塩化ナトリウムが１０５ｍＭから１５０ｍＭの濃度で存在し、かつ、スクロースが総組成の０．０１から１．５重量％の量で存在する、第７の実施形態に記載の液体製剤である。
【００６９】
第９の実施形態は、液体製剤中の融合タンパク質の濃度が２０から５５ｍｇ／ｍＬの範囲内である、第１から第８の実施形態のいずれか１つに記載の液体製剤である。
【００７０】
第１０の実施形態は、該緩衝液がクエン酸−リン酸又はリン酸緩衝液である、第１から第９の実施形態のいずれか１つに記載の液体製剤である。
【００７１】
第１１の実施形態は、該緩衝液の濃度が１０から３５ｍＭの範囲内である、第１０の実施形態に記載の液体製剤である。
【００７２】
第１２の実施形態は、液体製剤のｐＨが６．０から６．６の範囲内である、第１から第１１の実施形態のいずれか１つに記載の液体製剤である。
【００７３】
第１３の実施形態は、該製剤が、プロリンを１０ｍＭ未満の濃度で、又は、ヒスチジンを５ｍＭ未満の濃度で含む、第１から第１２の実施形態のいずれか１つに記載の液体製剤である。
【００７４】
第１４の実施形態は、該製剤が、プロリンを９ｍＭ未満の濃度で、又は、ヒスチジンを０．１ｍＭ未満の濃度で含む、第１３の実施形態に記載の液体製剤である。
【００７５】
第１５の実施形態は、該製剤がプロリン及びヒスチジンの混合物を含む、第１から第１４の実施形態のいずれか１つに記載の液体製剤である。
【００７６】
第１６の実施形態は、プロリンが１ｍＭから９ｍＭの濃度で存在し、かつ、ヒスチジンが０．１ｍＭ未満の濃度で存在する、第１５の実施形態に記載の液体製剤である。
【００７７】
第１７の実施形態は、プロリンが１ｍＭから９ｍＭの濃度で存在し、かつ、ヒスチジンが０．０１から０．０９ｍＭの濃度で存在する、第１６の実施形態に記載の液体製剤である。
【００７８】
第１８の実施形態は、プロリンが６ｍＭの濃度で存在し、かつ、ヒスチジンが０．０９ｍＭの濃度で存在する、第１７の実施形態に記載の液体製剤である。
【００７９】
第１９の実施形態は、グルタミン酸を１ｍＭから２０ｍＭの濃度でさらに含む、第１から第１３の実施形態のいずれか１つに記載の液体製剤である。
【００８０】
第２０の実施形態は、グルタミン酸が１０から１５ｍＭの濃度で存在する、第１９の実施形態に記載の液体製剤である。
【００８１】
第２１の実施形態は、薬学的有効量でのＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、クエン酸−リン酸緩衝液、塩化ナトリウム、スクロース、ならびにプロリン及びヒスチジンを含むアミノ酸の混合物を含む液体製剤であって、該ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質がｐ７５  ｓＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質である、液体製剤である。
【００８２】
第２２の実施形態は、液体製剤が、３０から５５ｍｇ／ｍＬのＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、及び１０から３５ｍＭのクエン酸−リン酸緩衝液、１０５から１２０ｍＭのＮａＣｌ、０．５から１．５％のスクロース、１から９ｍＭのプロリン及び０．０１から０．１ｍＭのヒスチジンを含み、かつ、６．３のｐＨを有する、第２１の実施形態に記載の液体製剤である。
【００８３】
第２３の実施形態は、液体製剤が、５０ｍｇ／ｍＬのＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、２５ｍＭのクエン酸−リン酸緩衝液、１１５ｍＭのＮａＣｌ、１％のスクロース、６ｍＭのプロリン、及び０．０９ｍＭのヒスチジンを含み、かつ、６．３のｐＨを有する、第２２の実施形態に記載の液体製剤である。
【００８４】
第２４の実施形態は、液体製剤が、３０から５５ｍｇ／ｍＬのＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、及び１０から３５ｍＭのクエン酸−リン酸緩衝液、１２０から１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１から０．５％のスクロース、１から９ｍＭのプロリン及び０．０１から０．１ｍＭのヒスチジンを含み、かつ、６．３のｐＨを有する、第２１の実施形態に記載の液体製剤である。
【００８５】
第２５の実施形態は、液体製剤が５０ｍｇ／ｍＬのＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、２５ｍＭのクエン酸−リン酸緩衝液、１３０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のスクロース、６ｍＭのプロリン、及び０．０９ｍＭのヒスチジンを安定化剤としてを含み、かつ、６．３のｐＨを有する、第２４の実施形態に記載の液体製剤である。
【００８６】
第２６の実施形態は、液体製剤が３０から５５ｍｇ／ｍＬのＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、１０から３５ｍＭのクエン酸−リン酸緩衝液、１００〜１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１から１．５％のスクロース、５から１５ｍＭのグルタミン酸塩、１から１０ｍＭのプロリン、及び１から１０ｍＭのヒスチジンを含み、かつ、６．３のｐＨを有する、さらにグルタミン酸を含む、第２１の実施形態に記載の液体製剤である。
【００８７】
第２７の実施形態は、液体製剤が５０ｍｇ／ｍＬのＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、２５ｍＭのクエン酸−リン酸緩衝液、１００ｍＭのＮａＣｌ、１％のスクロース、１０ｍＭのグルタミン酸塩、１０ｍＭのプロリン、及び５ｍＭのヒスチジンを含み、かつ、６．３のｐＨを有する、第２６の実施形態に記載の液体製剤である。
【００８８】
第２８の実施形態は、請求項１から１６のいずれか一項のＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を含む液体製剤を調製するための方法であって、以下：
ａ）ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を調製し；そして
ｂ）ステップａ）で調製されたＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を、プロリン及びヒスチジンからなる群から選択される１又は数個のアミノ酸を含む安定化剤、緩衝液、ならびに塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）及びスクロースを含む等張化剤と混合すること、
を含む、方法である。
【００８９】
第２９の実施形態は、ステップｂ）での混合が、ｉ）安定化剤、緩衝液、及び等張化剤を含む溶液を調製すること、ならびに、ｉｉ）ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質がステップａ）で調製される溶液を、ステップｉ）の溶液と交換すること、を含む、第２８の実施形態に記載の方法である。
【実施例】
【００９０】
発明の形態
以下、実施例を参照して本発明をより詳細に説明することとする。しかしながら、これらの実施例は例示の目的のためのみであり、本発明はこれらの実施例によって限定されることを意図しない。
【００９１】
実施例１：エタネルセプト液体製剤の調製
ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、エタネルセプト（組換えｐ７５  ｓＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質）の液体製剤を安定化するために、アミノ酸又はアミノ酸の混合物を安定化剤として使用し、又は、等張化剤を調節して安定化効果を調べた。すなわち、安定化剤としてプロリン、又はプロリン及びヒスチジンの混合物を使用することによって、あるいは、等張化剤としてＮａＣｌ及びスクロースの濃度を調節することによって、液体製剤を調製した。
【００９２】
本発明の液体製剤、詳細には、製剤１から製剤１０を、アルギニン、グルタミン酸、プロリン及びヒスチジンからなる群から選択される１又は数個のアミノ酸を、２５ｍＭのクエン酸−リン酸水性緩衝液へと添加すること、そしてその後、等張化剤としてスクロース及び塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を添加することにより調製した。その後、各製剤のｐＨを６．３に調整し、そしてＴＮＦＲ−ｆｃ融合タンパク質（エタネルセプト）の濃度が５０ｍｇ／ｍＬとなるように製剤を透析に供し、それによって製剤１から製剤１０を調製した。さらに、対照液体製剤を、２５ｍＭのアルギニン、等張化剤として１００ｍＭの塩化ナトリウム及び１．０％のスクロースを２５ｍＭのリン酸緩衝液中に加え、また５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプトを加え、そしてその後ｐＨを６．３に調整して、調製した。従って、エタネルセプト濃度が５０ｍｇ／ｍＬである対照製剤を調製した。
【００９３】
調製された液体製剤の組成は以下のとおりである。
【００９４】
【表１】
2020063261.tif 000003
【００９５】
実施例２：エタネルセプト液体製剤の安定性試験
実施例１で調製された液体製剤の安定性を調べるために、各製剤を、１、２、４及び８週間、２５℃及び４０℃の条件下で保存し、そしてその後エタネルセプトの残量を、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）及び疎水性相互作用高速液体クロマトグラフィー（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）によって測定した。
【００９６】
測定結果を以下の表２及び３に示す。
【００９７】
【表２】
2020063261.tif 000004
【００９８】
【表３】
2020063261.tif 000005
【００９９】
２５℃及び４０℃でのＳＥ−ＨＰＬＣ及びＨＩＣ−ＨＰＬＣの分析結果を示す表２及び３で確認されるように、プロリン及びヒスチジンのアミノ酸の混合物を使用する製剤（製剤５、製剤８）は、従来のエタネルセプト製剤の組成物に安定化剤としてアルギニンを単独で使用することにより調製された対照製剤と比較して、エタネルセプト溶液の安定性を向上させる効果を示した。
【０１００】
これらの結果は、安定化剤としてプロリン及びヒスチジンのアミノ酸の混合物を含むエタネルセプト液体製剤が、エタネルセプトの変性を防止して、長期間にわたってその活性を維持し、そして、プロリン及びヒスチジンのアミノ酸の混合物が安定化剤としてエタネルセプト溶液の安定性向上に効果的であるということを実証した。
【０１０１】
さらに、従来のエタネルセプト製剤の組成物における等張化剤のスクロース及び塩化ナトリウムの組成を変化させることにより調製された本発明の製剤間で、エタネルセプトの安定性を調べた。より高濃度の塩化ナトリウム及びより低濃度のスクロースを有する本製剤は、対照製剤と比較して、エタネルセプト溶液の安定性を向上させる効果を示した。
【０１０２】
また、安定化剤としてプロリン及びヒスチジンのアミノ酸の混合物を使用する液体製剤（製剤５及び製剤８）は、アミノ酸の安定化剤を含まない液体製剤（製剤１及び製剤６）と比較して、エタネルセプト溶液の安定性を向上させる効果を示した。
【０１０３】
その結果として、これらの実験結果は、１）等張化剤中のＮａＣｌ濃度を上昇させること及びスクロース濃度を低下させること、ならびに２）エタネルセプト液体製剤中の安定化剤としてプロリン及びヒスチジンのアミノ酸の混合物を使用することによって、エタネルセプト溶液の安定性が向上され得るということを示した。すなわち、１）又は２）の条件を通じて、エタネルセプトの副産物の形成を効果的に防止することができ、そして、従来のエタネルセプト液体製剤と比較して長期間にわたってエタネルセプトの薬学的有効性を安定に維持するように、その安定性を向上させることができる。
【０１０４】
実施例３：長期間の保存中のアミノ酸の混合物の組成物を有するエタネルセプト液体製剤の安定性試験
実施例１及び２の実験によってその安定性向上が確認された、プロリン及びヒスチジンならびにそれらの混合物から選択される１又は数個のアミノ酸を含むエタネルセプト液体製剤を、６ヶ月間、長期間の保存条件下で、安定性試験に供した。
【０１０５】
詳細には、０．０９ｍＭのヒスチジン及び３ｍＭのプロリン、又は０．０９ｍＭのヒスチジン及び３ｍＭのアルギニンの混合物を含むアミノ酸の混合物を、２５ｍＭのクエン酸−リン酸緩衝液に添加し、そして、１．０％又は０．１％のスクロース及び１１５ｍＭ又は１３０ｍＭの塩化ナトリウムも等張化剤としてそこに添加した。その後、各製剤のｐＨを６．３に調整し、そしてＴＮＦＲ−ｆｃ融合タンパク質（エタネルセプト）の濃度が５０ｍｇ／ｍＬとなるように製剤を透析に供し、それによって製剤１から製剤３を調製した。さらに、対照液体製剤を、２５ｍＭのアルギニン、等張化剤として１００ｍＭの塩化ナトリウム及び１．０％のスクロースを、エタネルセプトも含む２５ｍＭのリン酸緩衝液中に加え、そしてその後ｐＨを６．３に調整して、調製した。従って、エタネルセプト濃度が５０ｍｇ／ｍＬである対照製剤を調製した。
【０１０６】
調製された液体製剤の組成は以下の表４に同じである。
【０１０７】
【表４】
2020063261.tif 000006
【０１０８】
表４のとおり調製された液体製剤の安定性を調べるために、各製剤を１、３及び６ヶ月間、４℃、２５℃及び４０℃の条件下（３ヶ月間、４０℃の条件下）で保存し、そしてその後エタネルセプトの残量を、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）及び疎水性相互作用高速液体クロマトグラフィー（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）によって測定した。
【０１０９】
測定結果を以下の表５及び６に示す。
【０１１０】
【表５】
2020063261.tif 000007
【０１１１】
【表６】
2020063261.tif 000008
【０１１２】
また、表４に記載の製剤におけるエタネルセプトの熱安定性を決定し、エタネルセプトのタンパク質がアンフォールドする温度を決定するために、エタネルセプトのサーモグラムを示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により測定した。図２は、４℃（図２Ａ）及び２５℃（図２Ｂ）での６ヶ月の時点における各製剤のＤＳＣサーモグラムを示す。
【０１１３】
ＣＨ２（Ｔｍ２）、ＣＨ３（Ｔｍ３）のドメインを含むエタネルセプトのＦｃ成分に由来する２つのドメイン、及び細胞外リガンド結合タンパク質、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ；Ｔｍ１）の存在を示す、Ｔｍ１、Ｔｍ２、及びＴｍ３の転移温度を有する３つの熱変性状態は明らかであった（Ｎ．  Ａ．Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  ，Ｉｎｔ．  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，４６０（１−２）、１０８−１１８、２０１４）。
【０１１４】
図２に示されるように、２５℃（図２Ｂ）でのアルギニン及びヒスチジンの混合物を使用する製剤１は、対照製剤ならびにプロリン及びヒスチジンの混合物を使用するその他の製剤と比較して、４℃（図２Ａ）で及び２５℃（図２Ｂ）での保存の間に、Ｔｍ１とＴｍ２のピーク間の谷が消失したことを示した。この結果は、製剤１におけるエタネルセプトの、Ｆｃ成分のＣＨ２ドメイン及び細胞外リガンド結合ドメイン（ＴＮＦＲ）の低下した安定性を示した。
【０１１５】
さらに、２５℃及び４０℃でのＳＥ−ＨＰＬＣ及びＨＩＣ−ＨＰＬＣの分析結果を示す表５及び６で確認されるように、プロリン及びヒスチジンのアミノ酸の混合物を使用する製剤（製剤２及び３）は、従来のエタネルセプト製剤の組成物に安定化剤としてアルギニンを単独で使用することにより調製された対照製剤と比較して、エタネルセプト溶液の安定性を向上させる効果を示した。
【０１１６】
これらの結果は、安定化剤としてプロリン及びヒスチジンのアミノ酸の混合物を含むエタネルセプト液体製剤は、エタネルセプトの変性を防止し、長期間にわたってその活性を維持するということを実証した。
【０１１７】
実施例４：混合アミノ酸の組成比によるエタネルセプト液体製剤の安定性試験
アミノ酸の混合物の組成比によって、実施例１から３において従来のエタネルセプト製剤（アルギニンを単独で含む単一製剤）と比較して、それらの製剤が向上された安定性を有すると確認された、プロリン及びヒスチジンの混合物を含むエタネルセプト液体製剤の安定性を調べるために、アミノ酸の混合物の組成比による安定化効果を調べた。すなわち、種々の濃度で安定化剤としてプロリン及びヒスチジンを混合することにより、そして、等張化剤としてスクロース及び塩化ナトリウムの濃度を調節することにより、液体製剤を調製した。
【０１１８】
詳細には、２５ｍＭのクエン酸−リン酸緩衝液に、安定化剤として０．０９ｍＭのヒスチジン及び３ｍＭから９ｍＭのプロリンのアミノ酸の混合物を添加し、そして、０．５％又は０．１％のスクロース及び１１５ｍＭ又は１３０ｍＭの塩化ナトリウムを等張化剤として添加した。その後、各製剤のｐＨを６．３に調整し、そしてＴＮＦＲ−ｆｃ融合タンパク質（エタネルセプト）の濃度が５０ｍｇ／ｍＬとなるように製剤を透析に供し、それによって製剤１から製剤５を調製した。さらに、対照液体製剤を、２５ｍＭのアルギニン、等張化剤として１００ｍＭの塩化ナトリウム及び１．０％のスクロースを、５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプトを含む２５ｍＭのリン酸緩衝液中に加え、そしてその後ｐＨを６．３に調整して、調製した。従って、エタネルセプト濃度が５０ｍｇ／ｍＬである対照製剤を調製した。
【０１１９】
調製された液体製剤の組成は以下の表７に同じである。
【０１２０】
【表７】
2020063261.tif 000009
【０１２１】
表７のとおり調製された液体製剤の安定性を調べるために、各製剤を２、４及び８週間、２５℃及び４０℃の条件下で保存し、そしてその後エタネルセプトの残量を、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）及び疎水性相互作用高速液体クロマトグラフィー（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）によって測定した。
【０１２２】
測定結果を以下の表８及び９に示す。
【０１２３】
【表８】
2020063261.tif 000010
【０１２４】
【表９】
2020063261.tif 000011
【０１２５】
２５℃及び４０℃でのＳＥ−ＨＰＬＣ及びＨＩＣ−ＨＰＬＣの分析結果を示す表８及び９で確認されるように、プロリン及びヒスチジンのアミノ酸の混合物を使用する製剤は、従来のエタネルセプト製剤の組成物に安定化剤としてアルギニンを単独で使用することにより調製された対照製剤と比較して、エタネルセプト溶液の安定性を向上させる効果を示した。
【０１２６】
安定化剤として使用される混合アミノ酸の濃度比率による安定性を向上させる効果を調べたところ、６ｍＭのプロリン及び０．０９ｍＭのヒスチジンを混合することにより調製された製剤（製剤３）は、１１５ｍＭの塩化ナトリウム及び０．５％のスクロースを使用し、プロリン濃度を３ｍＭから９ｍＭまで変化させることによって調製された、プロリン及びヒスチジンの混合アミノ酸を含む製剤（製剤２から製剤４）の中で最も向上された安定性を示した。
【０１２７】
これらの結果は、プロリン及びヒスチジンの上記組成比で示された、安定化剤として６ｍＭのプロリン及び０．０９ｍＭのヒスチジンの混合アミノ酸を含むエタネルセプト液体製剤が、エタネルセプトの変性を防止し、長期間にわたってその活性を維持するということを実証した。
【０１２８】
まとめると、本発明は、安定化剤としてプロリン及びヒスチジンの混合アミノ酸を含むエタネルセプト液体製剤が、変性を防止して長期間にわたってその活性を維持し、そして、高濃度の塩化ナトリウム及び低濃度のスクロースからなる等張化剤を使用することによって、エタネルセプト溶液の安定性を向上させることができるということを実証した。
【０１２９】
上述の説明に基づいて、本発明はそれらの技術的思想又は本質的特徴を変更することなく、異なる特定の形態で実施されてもよいということが当業者により理解されるであろう。それゆえ、上記実施形態はすべての態様において制限的ではなく例示的であるということが理解されるべきである。本発明の範囲はそれらに先行する説明よりもむしろ添付の特許請求の範囲によって定義され、それゆえ、特許請求の範囲の境界及び範囲、又はそれら境界及び範囲の等価物に入る、すべての変更及び修正はそれによって特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図１】
2020063261.tif 000012
【図２ａ】
2020063261.tif 000013
【図２ｂ】
2020063261.tif 000014
【配列表】
2020063261000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月26日(2019.12.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、プロリンとヒスチジンとの混合物、緩衝液及び等張化剤を含む液体製剤であって、該融合タンパク質がＴＮＦＲ（腫瘍壊死因子受容体）又はそれらの断片及び免疫グロブリンＦｃ領域を含む、液体製剤。
【外国語明細書】
2020063261000001.pdf