(57)【要約】      （修正有）【課題】新規発現カセット、該発現カセットを用いたタンパク質の製造方法、および薬剤耐性化抑制剤のスクリーニング方法の提供。【解決手段】式（１）：Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘ［式中、Ｘ及びＹは塩基数が１以上の異なる塩基配列を示す。］、又は式（２）：Ｘ−Ｙ−Ｘ［式中、Ｘ及びＹは前記に同じ。］で示される塩基配列を含む真核細胞用発現カセット、該発現カセットを用いた発現誘導システムによるタンパク質の製造方法、および被検物質との接触または非接触における、式（１）で示される塩基配列中のＸ−Ｙで示される塩基配列の欠失率、又は式（２）で示される塩基配列の５’側へのＸ−Ｙ塩基配列の挿入率を測定することによる、薬剤耐性化抑制剤の候補物質スクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）：Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘ  （１）［式中、Ｘ及びＹは塩基数が１以上の異なる塩基配列を示す。］、又は式（２）：Ｘ−Ｙ−Ｘ  （２）［式中、Ｘ及びＹは前記に同じ。］で示される塩基配列を含む真核細胞用発現カセット。
【請求項２】
前記式（１）中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋１又は３ｎ＋２（ただし、ｎは整数）であり、前記式（２）中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋１又は３ｐ＋２（ただし、ｐは整数）である、請求項１に記載の真核細胞用発現カセット。
【請求項３】
前記式（１）又は前記式（２）で示される塩基配列の５’側に開始コドン及び／又はプロモーターが配置されている、請求項１又は２に記載の真核細胞用発現カセット。
【請求項４】
５’側から順に、プロモーター、開始コドン、前記式（１）又は前記式（２）で示される塩基配列が配置されている、請求項１〜３のいずれかに記載の真核細胞用発現カセット。
【請求項５】
前記式（１）又は前記式（２）で示される塩基配列を含むプロモーターを含む、請求項１に記載の真核細胞用発現カセット。
【請求項６】
前記プロモーターが刺激応答性プロモーターである、請求項３〜５のいずれかに記載の真核細胞用発現カセット。
【請求項７】
前記式（１）又は前記式（２）で示される塩基配列の３’側にＯＲＦが配置されている、請求項１〜６のいずれかに記載の真核細胞用発現カセット。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の真核細胞用発現カセットを含む、真核細胞用発現ベクター。
【請求項９】
５’側から順に、式（１）：Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘ  （１）［式中、Ｘ及びＹは塩基数が１以上の異なる塩基配列を示す。］、又は式（２）：Ｘ−Ｙ−Ｘ  （２）［式中、Ｘ及びＹは前記に同じ。］で示される塩基配列、ＯＲＦが配置されている真核細胞用発現カセットを含む真核細胞を培養する工程を含むタンパク質発現方法。
【請求項１０】
前記真核細胞用発現カセットが５’側から順にプロモーター、開始コドン、式（１）又は式（２）で示される塩基配列、ＯＲＦが配置されている真核細胞用発現カセットであって、
式（１）で示される塩基配列が配置されている場合は、
前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋１（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（１）で示される塩基配列中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋１（ただし、ｎは整数）であるか、或いは
前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋２（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（１）で示される塩基配列中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋２（ただし、ｎは整数）であり、
式（２）で示される塩基配列が配置されている場合は、
前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋１（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（２）で示される塩基配列中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋２（ただし、ｐは整数）であるか、或いは
前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋２（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（２）で示される塩基配列中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋１（ただし、ｐは整数）である、
請求項９に記載のタンパク質発現方法。
【請求項１１】
前記真核細胞用発現カセットが、５’側から順に、式（１）又は式（２）で示される塩基配列を含むプロモーター、ＯＲＦが配置されている真核細胞用発現カセットであって、該プロモーターが、前記式（１）で示される塩基配列中のＸ−Ｙで示される塩基配列が欠失することにより、又は前記式（２）で示される塩基配列の５’側に隣接してＸ−Ｙで示される塩基配列が挿入されることにより、転写活性が変化するプロモーターである、
請求項９に記載のタンパク質発現方法。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれかに記載の方法で発現させたタンパク質を回収する工程を含む、タンパク質の製造方法。
【請求項１３】
（工程ａ）５’側から順に、式（１）：Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘ  （１）［式中、Ｘ及びＹは塩基数が１以上の異なる塩基配列を示す。］、又は式（２）：Ｘ−Ｙ−Ｘ  （２）［式中、Ｘ及びＹは前記に同じ。］で示される塩基配列、ＯＲＦが配置されている真核細胞用発現カセットを含む真核細胞と、被検物質とを接触させる工程、
（工程ｂ）被検物質と接触させた真核細胞（被検真核細胞）、及び被検物質を接触させない真核細胞（対照真核細胞）における、前記式（１）で示される塩基配列中のＸ−Ｙで示される塩基配列の欠失率、又は前記式（２）で示される塩基配列の５’側に隣接してＸ−Ｙで示される塩基配列が挿入される率（挿入率）を測定する工程、及び
（工程ｃ）被検真核細胞における欠失率又は挿入率が、対照真核細胞における欠失率又は挿入率よりも低い場合に、前記被検物質を薬剤耐性化抑制剤候補物質として選択する工程、
を含む薬剤耐性化抑制剤の候補物質のスクリーニング方法。
【請求項１４】
前記真核細胞用発現カセットが、５’側から順にプロモーター、開始コドン、式（１）又は式（２）で示される塩基配列、ＯＲＦが配置されている真核細胞用発現カセットであって、前記式（１）中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋１又は３ｎ＋２（ただし、ｎは整数）であり、前記式（２）中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋１又は３ｐ＋２（ただし、ｐは整数）である、請求項１３に記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
前記真核細胞用発現カセットが、５’側から順に、式（１）又は式（２）で示される塩基配列を含むプロモーター、ＯＲＦが配置されている真核細胞用発現カセットである、請求項１３に記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
対象塩基配列を入力データとして取り込む取り込みステップと、
前記塩基配列中に、式（１）：Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘ （１）［式中、Ｘ及びＹは塩基数が１以上の異なる塩基配列を示す。］、又は式（２）：Ｘ−Ｙ−Ｘ （２）［式中、Ｘ及びＹは前記に同じ。］で示される塩基配列を検索する検索ステップと、を有する塩基配列の検索方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の前記取り込みステップ及び前記検索ステップをコンピュータに実行させるための検索プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規発現誘導システムを可能にする真核細胞用発現カセット、並びにこれを利用したタンパク質の発現方法、及び薬剤耐性化抑制剤の候補物質のスクリーニング方法に関する。さらには、本発明は、この新規発現誘導システムを可能にする配列の検索方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、多様な分野において組換えタンパク質の発現技術が利用されている。例えば、医薬分野においては、インスリン等のタンパク質製剤を、大腸菌や酵母に導入した遺伝子から発現させることによって生産している。また、抗体作製、タンパク質の機能解析、タンパク質の立体構造解析等に用いられるタンパク質の調製にも、組換えタンパク質の発現技術が利用されている。
【０００３】
ただ、目的タンパク質を例えば大腸菌等の細胞内で発現させる場合、該タンパク質の機能により細胞の増殖が阻害され、結果として効率的に目的タンパク質を得られないことがある。したがって、通常、ある程度細胞が増殖した段階で目的タンパク質の発現が誘導されるようなシステムを利用する（非特許文献1）。
【０００４】
例えば、細胞の対数増殖期にIPTGを添加することにより、IPTG応答性のプロモーター（lacプロモーター等）を活性化させ、タンパク質の発現を誘導するというシステムが知られている。また、別の例としては、2種類の炭素源を含む培地で培養することによって、細胞の増殖に伴う利用炭素源の切替えによってタンパク質の発現が誘導されるというシステムが知られている。
【０００５】
上記各種発現誘導システムそれぞれは、その原理が異なるが故に、発現の誘導時期、誘導される細胞の割合、発現誘導が細胞の増殖に与える影響等が異なる。例えば、IPTGによる発現誘導システムは、IPTG添加により培養中の細胞全てにおいて一斉にタンパク質の発現が誘導されるので、誘導が比較的急激に起こる。また、利用炭素源の切り替えによる発現誘導システムは、利用炭素源の切り替えが起こった細胞から順次タンパク質の発現が誘導されるので、誘導が比較的緩やかに起こる。このような各発現誘導システムの特徴は、目的タンパク質の最終的な収率や、変性しない状態で回収できるか等に影響を与えると考えられる。
【０００６】
一方、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）は、自然環境中に存在する常在菌であり、日和見感染症の原因菌である。消毒剤や抗生物質等の薬剤に対する抵抗性が元来高いことが知られており、このため、緑膿菌に対して抗菌効果を発揮する薬剤の種類は、他の細菌に比べて少ない。具体的には、ペニシリンやセフェム系などのβラクタム系抗菌薬は、緑膿菌に対しては抗菌効果を発揮しないことが知られている。
【０００７】
緑膿菌は、薬剤への曝露により容易に高度に耐性化することが知られている。例えば、野生株には抗菌効果を発揮するニューキノロン系抗菌薬、クロラムフェニコール、イミペネム等に対して耐性を示す変異株の存在、さらにはこれらの3種の抗菌薬全てに対して耐性を示す多剤耐性株（NfxC型変異株）の出現が問題となっている。このような薬剤の開発とそれに対する耐性菌の出現といういわゆる“イタチごっこ”の問題は、元来有効な薬剤が少ない緑膿菌においては極めて深刻な問題である。
【０００８】
NfxC型変異株は、欧米人の2500人に1人が有する遺伝病である嚢胞性線維症（CF:Cystic Fibrosis）の患者からしばしば分離される耐性菌の1つである。NfxC型変異株は、RND型薬剤排出ポンプ（MexEF-OprN）を発現しており、その結果薬剤耐性能を獲得することが知られている。該変異株においては、mexT遺伝子のORFが8 bp欠失してフレームシフトしており、その結果発現する活性型MexTタンパク質（転写因子）が、RND型薬剤排出ポンプの発現を活性化している（非特許文献2）。
【０００９】
しかしながら、該8 bpの欠失がランダムに起こる欠失によるものなのか否かについては全く知られていなかった。さらに、何らかの配列が関与しているとしても、該8 bpの欠失にどのような配列が寄与しているのか、該欠失が他の生物でも起こる現象なのか、さらには該欠失に寄与する配列を有してさえいれば欠失が起こるのか等の、薬剤耐性化機構の詳細については全く知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】東端啓貴、「大腸菌を宿主とした異種タンパク質高発現のイロハ」、生物工学 第91巻2号 第96〜100頁
【非特許文献２】FEMS Microbiology Letters, Vol.192, Issue.1, 2000, pp107-112
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、新規発現誘導システムを提供することを目的とする。さらには、該システムを利用したタンパク質の発現方法を提供することも目的とする。
【００１２】
また、本発明は、薬剤の開発とそれに対する耐性菌の出現といういわゆる“イタチごっこ”の問題を解消するために、薬剤耐性化抑制剤候補物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。さらには、該スクリーニングをより簡便且つ効率的に行う方法を提供することをも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者等は、細菌の薬剤耐性化機構について解析していたところ、驚くべきことに、細菌等の原核生物においては、X-Y-Xという配列とX-Y-Xという配列がXにおいて重なり合った配列（X-Y-X-Y-X；以下、このような配列を「重なり合ったダイレクトリピート」と示すこともある）中の重なっていない配列（X-Y）が欠失するという法則が存在することを見出した。また、X-Y-Xという配列の5’側に隣接してX-Yで示される塩基配列が挿入され、重なり合ったダイレクトリピートが創出されるという法則が存在することをも見出した。さらに、これらの法則が、真核細胞においても保存されていることも見出した。
【００１４】
さらに、重なり合ったダイレクトリピート又はX-Y-Xという配列を含む発現カセットを用いることにより、例えば上記欠失又は挿入により引き起こされるフレームシフトを利用して、又は上記欠失又は挿入により引き起こされるプロモーターの転写活性の変化、又は上記欠失又は挿入により引き起こされるアミノ酸の欠失又は挿入を利用して、目的タンパク質の発現誘導が可能であることを見出した。
【００１５】
さらに、上記欠失又は挿入は薬剤耐性化の原因であったことから、上記欠失又は挿入を阻害することを指標として、薬剤耐性化抑制剤の候補物質をスクリーニングできることが明らかとなった。
【００１６】
上記知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
【００１７】
項１．
式（１）：Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘ  （１）［式中、Ｘ及びＹは塩基数が１以上の異なる塩基配列を示す。］、又は式（２）：Ｘ−Ｙ−Ｘ  （２）［式中、Ｘ及びＹは前記に同じ。］で示される塩基配列を含む真核細胞用発現カセット。
【００１８】
項２．
前記式（１）中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋１又は３ｎ＋２（ただし、ｎは整数）であり、前記式（２）中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋１又は３ｐ＋２（ただし、ｐは整数）である、項１に記載の真核細胞用発現カセット。
【００１９】
項３．
前記式（１）又は前記式（２）で示される塩基配列の５’側に開始コドンが配置されている、項１又は２に記載の真核細胞用発現カセット。
【００２０】
項４．
前記式（１）又は前記式（２）で示される塩基配列の５’側にプロモーターが配置されている、項１〜３のいずれかに記載の真核細胞用発現カセット。
【００２１】
項５．
５’側から順に、プロモーター、開始コドン、前記式（１）又は前記式（２）で示される塩基配列が配置されている、項１〜４のいずれかに記載の真核細胞用発現カセット。
【００２２】
項６．
前記式（１）又は前記式（２）で示される塩基配列を含むプロモーターを含む、項１に記載の真核細胞用発現カセット。
【００２３】
項７．
前記プロモーターが刺激応答性プロモーターである、項４〜６のいずれかに記載の真核細胞用発現カセット。
【００２４】
項８．
前記式（１）又は前記式（２）で示される塩基配列の３’側にＯＲＦが配置されている、項１〜７のいずれかに記載の真核細胞用発現カセット。
【００２５】
項９．
項１〜８のいずれかに記載の真核細胞用発現カセットを含む、真核細胞用発現ベクター。
【００２６】
項１０．
５’側から順に、式（１）：Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘ  （１）［式中、Ｘ及びＹは塩基数が１以上の異なる塩基配列を示す。］、又は式（２）：Ｘ−Ｙ−Ｘ  （２）［式中、Ｘ及びＹは前記に同じ。］で示される塩基配列、ＯＲＦが配置されている真核細胞用発現カセットを含む真核細胞を培養する工程を含むタンパク質発現方法。
【００２７】
項１１．
前記真核細胞用発現カセットが５’側から順にプロモーター、開始コドン、式（１）又は式（２）で示される塩基配列、ＯＲＦが配置されている真核細胞用発現カセットであって、
式（１）で示される塩基配列が配置されている場合は、
前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋１（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（１）で示される塩基配列中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋１（ただし、ｎは整数）であるか、或いは
前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋２（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（１）で示される塩基配列中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋２（ただし、ｎは整数）であり、
式（２）で示される塩基配列が配置されている場合は、
前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋１（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（２）で示される塩基配列中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋２（ただし、ｐは整数）であるか、或いは
前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋２（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（２）で示される塩基配列中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋１（ただし、ｐは整数）である、
項１０に記載のタンパク質発現方法。
【００２８】
項１２．
前記真核細胞用発現カセットが、５’側から順に、式（１）又は式（２）で示される塩基配列を含むプロモーター、ＯＲＦが配置されている真核細胞用発現カセットであって、該プロモーターが、前記式（１）で示される塩基配列中のＸ−Ｙで示される塩基配列が欠失することにより、又は前記式（２）で示される塩基配列の５’側に隣接してＸ−Ｙで示される塩基配列が挿入されることにより、転写活性が変化するプロモーターである、
項１０に記載のタンパク質発現方法。
【００２９】
項１３．
項１０〜１２のいずれかに記載の方法で発現させたタンパク質を回収する工程を含む、タンパク質の製造方法。
【００３０】
項１４．
（工程ａ）５’側から順に、式（１）：Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘ  （１）［式中、Ｘ及びＹは塩基数が１以上の異なる塩基配列を示す。］、又は式（２）：Ｘ−Ｙ−Ｘ  （２）［式中、Ｘ及びＹは前記に同じ。］で示される塩基配列、ＯＲＦが配置されている真核細胞用発現カセットを含む真核細胞と、被検物質とを接触させる工程、
（工程ｂ）被検物質と接触させた真核細胞（被検真核細胞）、及び被検物質を接触させない真核細胞（対照真核細胞）における、前記式（１）で示される塩基配列中のＸ−Ｙで示される塩基配列の欠失率、又は前記式（２）で示される塩基配列の５’側に隣接してＸ−Ｙで示される塩基配列が挿入される率（挿入率）を測定する工程、及び
（工程ｃ）被検真核細胞における欠失率又は挿入率が、対照真核細胞における欠失率又は挿入率よりも低い場合に、前記被検物質を薬剤耐性化抑制剤候補物質として選択する工程、
を含む薬剤耐性化抑制剤の候補物質のスクリーニング方法。
【００３１】
項１５．
前記真核細胞用発現カセットが、５’側から順にプロモーター、開始コドン、式（１）又は式（２）で示される塩基配列、ＯＲＦが配置されている真核細胞用発現カセットであって、前記式（１）中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋１又は３ｎ＋２（ただし、ｎは整数）であり、前記式（２）中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋１又は３ｐ＋２（ただし、ｐは整数）である、項１４に記載のスクリーニング方法。
【００３２】
項１６．
前記真核細胞用発現カセットが、５’側から順に、式（１）又は式（２）で示される塩基配列を含むプロモーター、ＯＲＦが配置されている真核細胞用発現カセットである、項１４に記載のスクリーニング方法。
【００３３】
項１７．
前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ（但し、ｍは３以上の整数）である、項１５に記載のスクリーニング方法。
【００３４】
項１８．
前記真核細胞用発現カセットにおいて、式（１）で示される塩基配列が配置されており、前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋１（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（１）で示される塩基配列中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋１である、項１５に記載のスクリーニング方法。
【００３５】
項１９．
前記真核細胞用発現カセットにおいて、式（１）で示される塩基配列が配置されており、前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋２（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（１）で示される塩基配列中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋２である、項１５に記載のスクリーニング方法。
【００３６】
項２０．
前記真核細胞用発現カセットにおいて、式（２）で示される塩基配列が配置されており、前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋１（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（２）で示される塩基配列中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋２である、項１５に記載のスクリーニング方法。
【００３７】
項２１．
前記真核細胞用発現カセットにおいて、式（２）で示される塩基配列が配置されており、前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋２（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（２）で示される塩基配列中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋１である、項１５に記載のスクリーニング方法。
【００３８】
項２２．
前記プロモーターが、式（１）で示される塩基配列中のＸ−Ｙで示される塩基配列が欠失することにより、又は前記式（２）で示される塩基配列の５’側に隣接してＸ−Ｙで示される塩基配列が挿入されることにより、転写活性が変化するプロモーターである、項１６に記載のスクリーニング方法。
【００３９】
項２３．
前記ＯＲＦがレポータータンパク質をコードするＯＲＦである、項１７〜２２のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【００４０】
項２４．
前記工程ｂにおける欠失率又は挿入率の測定が、レポーターシグナルを発する真核細胞の割合を測定することにより行われる、項２３に記載のスクリーニング方法。
【００４１】
項２５．
前記ＯＲＦが薬剤耐性タンパク質をコードするＯＲＦである、項１７〜２２のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【００４２】
項２６．
前記工程ｂにおける欠失率又は挿入率の測定が、薬剤耐性を示す真核細胞の割合を測定することにより行われる、項２５に記載のスクリーニング方法。
【００４３】
項２７．
対象塩基配列を入力データとして取り込む取り込みステップと、
前記塩基配列中に、式（１）：Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘ （１）［式中、Ｘ及びＹは塩基数が１以上の異なる塩基配列を示す。］、又は式（２）：Ｘ−Ｙ−Ｘ （２）［式中、Ｘ及びＹは前記に同じ。］で示される塩基配列を検索する検索ステップと、を有する塩基配列の検索方法。
【００４４】
項２８．
項２７に記載の前記取り込みステップ及び前記検索ステップをコンピュータに実行させるための検索プログラム。
【発明の効果】
【００４５】
本発明によれば、新規発現誘導システムを可能にする発現カセット、及びこれを利用したタンパク質の発現方法を提供することができる。この発現誘導システムは、重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない配列の欠失現象、又はX-Y-Xという配列の5’側に隣接してX-Yで示される塩基配列が挿入される現象が起こった細胞から順次目的タンパク質の発現が起こるという従来にない原理に基づいたシステムである。したがって、本発明の発現カセットを用いることにより、従来の発現誘導システムでは効率的に発現させることができなかったタンパク質を、より効率的に発現させることが可能となる。また、上記欠失又は挿入は、本発明の発現カセットを含む細胞を培養することにより自然と起こるものであるため、余分な操作を要さずに簡便且つ効率的に発現誘導を行うことが可能である。
【００４６】
また、本発明によれば、重なり合ったダイレクトリピート又はX-Y-Xという配列を有する発現カセットを含む細胞において、重なっていない配列の欠失率又はX-Yで示される塩基配列の挿入率を指標として、薬剤耐性化抑制剤の候補物質をスクリーニングすることができる。さらに、発現カセットからのタンパク質の発現量や活性が該欠失又は該挿入により変化するように発現カセットを設計することによって、薬剤耐性化抑制剤をより簡便且つ効率的にスクリーニングすることができる。また、上記欠失は原核細胞及び真核細胞一般で起こるため、取り扱いの容易さ等の観点から好適な細胞を用いてスクリーニングを行うことができる。
【００４７】
本発明のスクリーニング方法により選別された薬剤耐性化候補物質は、薬剤耐性株の出現を抑えることができるため、薬剤の開発とそれに対する耐性菌の出現といういわゆる“イタチごっこ”の問題を解消することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】mexT遺伝子中の重なり合ったダイレクトリピート（X-Y-X-Y-X）を示す。
【図２】pMMB67EH中のtacプロモーター配列（上部）と、該tacプロモーターのスペーサー領域（16 bp）をより長い配列（24 bp）に置換したpSdmexTCM-24bp中の改変プロモーター配列（下部）を示す。
【図３】実施例2のアッセイプラスミドの構築スキームを示す。
【図４】転写効率が欠失効率に与える影響の解析結果を示す（実施例5）。
【図５】重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない配列の欠失による、蛍光タンパク質の発現を示す（実施例6）。
【図６】重なり合ったダイレクトリピートの創出現象を示す（実施例7）。
【図７】重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない配列の欠失による、蛍光タンパク質の発現を示す（実施例8）。
【図８】本発明の塩基配列の検索方法を実行するための検索装置の一例を示す。
【図９】本発明の塩基配列の検索方法の概略手順を示す。
【図１０】Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘで示される配列の検索手順の一例を示す。
【図１１】Ｘ−Ｙ−Ｘで示される配列の検索手順の一例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本発明において、「発現カセット」とは、細胞に導入して該細胞内で目的ｍＲＮＡを発現させる目的に用いられるＤＮＡ領域、又は該ＤＮＡ領域を含むＤＮＡを細胞内に導入することによって形成される、ｍＲＮＡ発現可能なＤＮＡ領域を意味する。以下、便宜上、前者を「細胞外発現カセット（或いは「単離された発現カセット」）」、後者を「細胞内発現カセット」と示す。
【００５０】
本発明において、「細胞」には、細菌等の原核細胞や、真核細胞が包含される。
【００５１】
本発明において、「発現カセット」には、「原核細胞（細菌等）用発現カセット」や、「真核細胞用発現カセット」が包含される。
【００５２】
本発明において、「発現ベクター」には、「原核細胞（細菌等）用発現ベクター」や、「真核細胞用発現ベクター」が包含される。
【００５３】
細胞外発現カセットは、上記目的に用いられる限りにおいて、プロモーター、ＯＲＦ等のエレメントを含んでいなくとも良い。該エレメントを含んでいない場合は、該エレメントを挿入してから細胞に導入することが好ましい。この観点から、細胞外発現カセットは、プロモーターやＯＲＦ等の上記エレメントが容易に挿入可能なように、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を有することが好ましい。細胞外発現カセットとしては、例えば各種市販されている発現ベクターにおける、プロモーター、タンパク質タグをコードする領域、及びＯＲＦ挿入用のＭＣＳで構成されるＤＮＡ領域が挙げられる。このＤＮＡ領域にはＯＲＦが含まれないが、細胞に導入する前に、ＭＣＳにＯＲＦを挿入して用いられる。このように、細胞外発現カセットには、そのままではタンパク質を発現させることができなくとも、最終的に細胞に導入して目的タンパク質をコードするｍＲＮＡを発現させる目的で用いられるものであれば包含される。
【００５４】
細胞内発現カセットは、上記定義に当てはまる限りにおいて特に限定されない。例えば、ｍＲＮＡを発現させることができる状態の細胞外発現カセットを細胞に導入した場合、細胞外発現カセットがそのまま細胞内発現カセットを意味する。別の例としては、プロモーターを含まない細胞外発現カセットを細胞に導入し、該細胞外発現カセットが細胞のゲノムＤＮＡ中のプロモーター下流に組み込まれて存在する場合、該プロモーター及び細胞外発現カセットを併せたＤＮＡ領域が細胞内発現カセットを意味する。
【００５５】
（１）発現カセット（細胞外発現カセット）
本発明は、式（１）：Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘ  （１）［式中、Ｘ及びＹは塩基数が１以上の異なる塩基配列を示す。］、又は式（２）：Ｘ−Ｙ−Ｘ  （２）［式中、Ｘ及びＹは前記に同じ。］で示される塩基配列を含む発現カセットに関する。なお、この発現カセットは、細胞に導入して該細胞内で目的ｍＲＮＡを発現させる目的に用いられるＤＮＡ（細胞外発現カセット）である。以下、この発現カセットを「本発明の細胞外発現カセット」と示すこともある。後述するように、本発明の細胞外発現カセットを用いることにより、例えば上記欠失又は挿入により引き起こされるフレームシフトを利用して、又は上記欠失又は挿入により引き起こされるプロモーターの転写活性の変化を利用して目的タンパク質の発現誘導が可能となる。
【００５６】
本発明の発現カセットは、式（１）で示される塩基配列を含む塩基配列として、Ｘ−Ｙが３以上繰り返された塩基配列（いわゆるタンデムリピート）を含まないことが好ましい。換言すれば、本発明の発現カセットにおいて、式（１）で示される塩基配列は、Ｘ−Ｙが３以上繰り返された塩基配列内の配列として存在しないことが好ましい。
【００５７】
また、本発明の発現カセットは、式（２）で示される塩基配列を含む塩基配列として、Ｘ−Ｙが２以上繰り返された塩基配列（いわゆるタンデムリピート）を含まないことが好ましい。換言すれば、本発明の発現カセットにおいて、式（２）で示される塩基配列は、Ｘ−Ｙが２以上繰り返された塩基配列内の配列として存在しないことが好ましい。
【００５８】
さらに、本発明の発現カセットは、Ｘ−Ｙで示される塩基配列が、Ｚ（塩基数１以上の任意の塩基配列）が２回以上繰り返した配列ではないことが好ましい。
【００５９】
式（１）及び式（２）中、Ｘ及びＹは塩基数が１以上の任意の塩基配列であって、互いに異なる塩基配列である。Ｘの塩基数は、例えば２〜１５、好ましくは２〜１２、より好ましくは２〜１０、より好ましくは３〜９、より好ましくは４〜８、さらに好ましくは５〜７、特に好ましくは６であることができる。Ｙの塩基数は、例えば２〜１５、好ましくは２〜１２、より好ましくは２〜１０、より好ましくは２〜５、より好ましくは２〜４、さらに好ましくは２〜３、特に好ましくは２であることができる。Ｘの塩基数とＹの塩基数の組み合わせ（好ましくは式（１）におけるＸの塩基数とＹの塩基数の組み合わせ）は、好ましくはＸの塩基数が３〜９であり且つＹの塩基数が２〜５である組み合わせ、より好ましくはＸの塩基数が４〜８であり且つＹの塩基数が２〜４である組み合わせ、さらに好ましくはＸの塩基数が５〜７であり且つＹの塩基数が２〜３である組み合わせ、特に好ましくはＸの塩基数が６であり且つＹの塩基数が２である組み合わせであることができる。
【００６０】
式（１）で示される塩基配列として、具体的には、配列番号１、１２、１３、１４、及び１５が挙げられる。式（２）で示される塩基配列として、具体的には、配列番号２２及び２３が挙げられる。
【００６１】
本発明の細胞外発現カセットは、細胞に導入して該細胞内で目的ｍＲＮＡを発現させる目的に用いられる限りにおいて、式（１）又は式（２）で示される塩基配列以外の他のエレメントを含んでいても良い。他のエレメントとしては、プロモーター、開始コドン、ＯＲＦ、ＭＣＳ、オペレーター領域、ＳＤ配列等が挙げられる。
【００６２】
プロモーターとしては、原核細胞又は真核細胞内において転写開始に必要な配列である限り特に限定されず、公知のプロモーターを採用することができる。例えば、原核細胞用のプロモーターとしては、lacプロモーター、tacプロモーター、tetプロモーター、araプロモーター等の刺激応答性プロモーター等が挙げられる。真核細胞用のプロモーターとしては、CMVプロモーター、EF1プロモーター、SV40プロモーター、MSCVプロモーター、hTERTプロモーター、βアクチンプロモーター、CAGプロモーター等が挙げられる。重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない塩基配列の欠失効率は、転写活性の高さに比例するため、より転写活性の高いプロモーターを用いることにより、効率的に上記欠失を起こすことが可能となる。また、刺激応答性プロモーターを用いれば、該プロモーターを応答させる物質を添加することによって、上記欠失を誘導することができる。このように上記欠失を誘導することにより、タンパク質の発現効率を調節することが可能である。
【００６３】
ＯＲＦは、発現させる目的タンパク質をコードするＯＲＦである限り、より詳細にはＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠が目的タンパク質をコードする限り特に限定されない。なお、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンは、開始コドンに限定されない。該コドンが開始コドンでない場合は、発現カセット中の転写開始点の３’側であって且つＯＲＦの５’側に開始コドンが配置されていればよい。
【００６４】
ＯＲＦにコードされるタンパク質は、特に限定されず、所望のタンパク質を採用することができる。例えば、酵素タンパク質、構造タンパク質、輸送タンパク質、貯蔵タンパク質、収縮タンパク質、防御タンパク質、調節タンパク質等、これらタンパク質の改変タンパク質が挙げられる。改変タンパク質の例としては、一部の領域を欠失させた欠失タンパク質や、アミノ酸が一部置換されたタンパク質等が挙げられる。
【００６５】
ＭＣＳは、複数（例えば２以上、好ましくは２〜５０、より好ましくは４〜２０）の制限酵素サイトが集積して存在する配列である限り特に限定されず、例えば公知の発現ベクターに使用されているＭＣＳが挙げられる。
【００６６】
本発明の細胞外発現カセットの好ましい一態様（態様１）としては、例えば式（１）におけるＸ−Ｙで示される塩基配列の欠失、又は式（２）の５’側におけるＸ−Ｙで示される塩基配列の挿入によりフレームシフトが起こる発現カセットが挙げられる。より具体的には、例えば、式（１）中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋１又は３ｎ＋２（ただし、ｎは整数、例えば１〜６の整数）であり、又は式（２）中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋１又は３ｐ＋２（ただし、ｐは整数）であり、且つ式（１）で示される塩基配列の５’側に開始コドンが配置されている発現カセットが挙げられる。態様１において、目的タンパク質をコードする（ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠が目的タンパク質をコードする）ＯＲＦは、式（１）で示される塩基配列の３’側に挿入（或いは配置）される。態様１においては、好ましくは、式（１）で示される塩基配列の５’側にプロモーターが挿入（或いは配置）され、より好ましくは５’側から順に、プロモーター、開始コドン、式（１）で示される塩基配列が配置されている。
【００６７】
態様１においては、重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない部分が欠失するという法則に基づいて欠失する塩基配列（Ｘ−Ｙで示される塩基配列）、及び式（２）の５’側に挿入される塩基配列（Ｘ−Ｙで示される塩基配列）の塩基数が３の倍数ではないので、開始コドンの３’側の該配列が欠失する、又は開始コドンの３’側に該配列が挿入されると開始コドンから始まる読み枠が途中でずれる（フレームシフトする）。これを利用して、態様１においては、例えば下記設計１〜２のように発現カセットを設計することにより、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質の発現を、Ｘ−Ｙで示される塩基配列の欠失又は挿入によって誘導することができる。
【００６８】
設計１は、式（１）で示される塩基配列が配置されている場合は、開始コドンとＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋１（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ式（１）で示される塩基配列中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋１であるという設計であり、式（２）で示される塩基配列が配置されている場合は、前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋１（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（２）で示される塩基配列中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋２（ただし、ｐは整数）であるという設計である。なお、ｍは、ＯＲＦが翻訳される限り特に限定されない。ｍは、例えば３〜１００の整数、好ましくは３〜５０の整数、より好ましくは３〜２５の整数、さらに好ましくは３〜１５の整数であることができる。開始コドンとＯＲＦの間の塩基数が３ｍ＋１であるので、Ｘ−Ｙで示される配列が欠失しない状態、又はＸ−Ｙで示される配列が挿入されない状態ではＯＲＦのフレームシフトが起こる。したがって、この状態のＯＲＦの読み枠は、ＯＲＦの５’末端から３番目の塩基から３塩基で構成されるコドンを含む読み枠である。一方、開始コドンとＯＲＦの間に配置されているＸ−Ｙ（塩基数は３ｎ＋１）で示される配列が欠失した状態、又はＸ−Ｙ（塩基数は３ｐ＋２）で示される配列が挿入された状態ではＯＲＦのフレームシフトが解消される。したがって、この状態のＯＲＦの読み枠は、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠である。このように、設計１においては、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質が、Ｘ−Ｙで示される塩基配列の欠失又は挿入によって発現するようになる。なお、本発明の細胞外発現カセットがＯＲＦを含まない場合は、ＯＲＦを挿入した時に上記設計になるように、ＭＣＳ等のＯＲＦ挿入予定位置を設計することが好ましい。
【００６９】
設計２は、式（１）で示される塩基配列が配置されている場合は、開始コドンとＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋２（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ式（１）で示される塩基配列中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋２であるという設計であり、式（２）で示される塩基配列が配置されている場合は、前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋２（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（２）で示される塩基配列中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋１（ただし、ｐは整数）であるという設計である。開始コドンとＯＲＦの間の塩基数が３ｍ＋２であるので、Ｘ−Ｙで示される配列が欠失しない状態、又はＸ−Ｙで示される配列が挿入されない状態ではＯＲＦのフレームシフトが起こる。したがって、この状態のＯＲＦの読み枠は、ＯＲＦの５’末端から２番目の塩基から３塩基で構成されるコドンを含む読み枠である。一方、開始コドンとＯＲＦの間に配置されているＸ−Ｙ（塩基数は３ｎ＋２）で示される配列が欠失した状態、又はＸ−Ｙ（塩基数は３ｐ＋１）で示される配列が挿入された状態ではＯＲＦのフレームシフトが解消される。したがって、この状態のＯＲＦの読み枠は、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠である。このように、設計２においては、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質が、Ｘ−Ｙで示される塩基配列の欠失又は挿入によって発現するようになる。なお、本発明の細胞外発現カセットがＯＲＦを含まない場合は、ＯＲＦを挿入した時に上記設計になるように、ＭＣＳ等のＯＲＦ挿入予定位置を設計することが好ましい。
【００７０】
本発明の細胞外発現カセットの別の好ましい一態様（態様２）としては、例えば、式（１）又は式（２）で示される塩基配列を含むプロモーターを含む発現カセットが挙げられる。この発現カセットにおいては、プロモーター内に欠失する塩基配列（Ｘ−Ｙで示される塩基配列）が存在する、或いはプロモーター内にＸ−Ｙで示される塩基配列の挿入を引き起こす配列（式（２））が存在するので、この配列の欠失又は挿入によりプロモーター構造が変化して、転写活性が変化する。例えば、Ｘ−Ｙで示される塩基配列の欠失（及びそれによる塩基配列の変化）によって、転写活性に重要なプロモーターエレメント（−３５ボックス、−１０ボックス、その他の転写活性化エレメント）の塩基配列が現れるように設計されたプロモーターであれば、Ｘ−Ｙで示される塩基配列が欠失することによって転写活性を高めることができる。別の例としては、−３５ボックス及び−１０ボックスは、約１６〜１９ｂｐ程度のスペーサー配列を介して連結されることによって、転写を効率的に進めることが知られているので、これを利用して設計することが例示される。具体的には、−３５ボックスと−１０ボックスとが、転写が起こらない程度に長く（例えば２０ｂｐ以上、好ましくは２４ｂｐ以上）且つ式（１）で示される塩基配列を含むスペーサー配列を介して連結されていて、Ｘ−Ｙで示される塩基配列の欠失により該スペーサー配列の長さが１６〜１９ｂｐ程度になるように設計されたプロモーターであれば、Ｘ−Ｙで示される塩基配列が欠失することによって転写活性を高めることができる。このような転写活性の変化を利用して、Ｘ−Ｙで示される塩基配列の欠失によって、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質を発現させることができる。なお、本発明の細胞外発現カセットがＯＲＦを含まない場合は、ＯＲＦを挿入した時に上記設計になるように、ＭＣＳ等のＯＲＦ挿入予定位置を設計することが好ましい。
【００７１】
本発明の細胞外発現カセットは、公知の分子生物学的手法に従って容易に得ることができる。例えば、ＰＣＲ、制限酵素切断、ＤＮＡ連結技術等を利用して作製することができる。
【００７２】
本発明の細胞外発現カセットは、必要に応じてプロモーター、開始コドン、目的タンパク質をコードするＯＲＦ等が挿入され、さらに発現ベクター内に組み込まれ、目的タンパク質を発現させるための細胞に導入して使用される。このようにして用いることにより、例えばＸ−Ｙで示される塩基配列の欠失又は挿入により引き起こされるフレームシフトを利用して、又はＸ−Ｙで示される塩基配列の欠失又は挿入により引き起こされるプロモーターの転写活性の変化を利用して目的タンパク質の発現誘導が可能となる。
【００７３】
（２）タンパク質発現方法
本発明は、５’側から順に、式（１）：Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘ  （１）［式中、Ｘ及びＹは塩基数が１以上の異なる塩基配列を示す。］、又は式（２）：Ｘ−Ｙ−Ｘ  （２）［式中、Ｘ及びＹは前記に同じ。］で示される塩基配列、ＯＲＦが配置されている発現カセットを含む細胞を培養する工程を含むタンパク質発現方法に関する。なお、該方法の発現カセットは、細胞に含まれる細胞内発現カセットを意味する。以下、該方法の発現カセットを「本発明の細胞内発現カセット」を示すこともある。
【００７４】
「発現カセットを含む細胞」は、本発明の細胞内発現カセットをゲノム上又はゲノム外（例えばプラスミド上）に有する細胞であれば特に限定されない。
【００７５】
「発現カセットを含む細胞」は、本発明の細胞外発現カセットを、必要に応じてプロモーター、開始コドン、目的タンパク質をコードするＯＲＦ等を挿入し、さらに発現ベクター内に組み込み、目的タンパク質を発現させるための細胞に導入することによって得ることができる。
【００７６】
重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない配列の欠失という法則は、細菌等の原核細胞及び真核細胞において保存されているため、細胞の由来生物は特に限定されない。
【００７７】
原核細胞の由来生物としては、例えばグラム陰性菌（緑膿菌、大腸菌、セラチア菌、スフィンゴモナス菌、ブルセラ菌、淋菌、バークホルデリア、赤痢菌、サルモネラ菌、アシネトバクター、コレラ菌、肺炎桿菌、レジオネラ菌、ピロリ菌、カンピロバクター等）、グラム陽性菌（結核菌、マイコプラズマ菌、黄色ブドウ球菌、放線菌、枯草菌、炭疽菌等）等、種類を問わず広く例示することができる。これらの中でも、好ましくはグラム陰性菌等が挙げられ、より好ましくは緑膿菌、大腸菌、セラチア菌、スフィンゴモナス菌等が挙げられ、さらに好ましくは緑膿菌、大腸菌等が挙げられ、よりさらに好ましくは大腸菌が挙げられる。
【００７８】
真核細胞の由来生物としては、哺乳類動物（例えばヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ等）、昆虫等の動物や、植物等、種類を問わず広く例示することができる。これらの中でも、好ましくは哺乳類動物、昆虫等の動物が挙げられ、より好ましくは哺乳類動物が挙げられる。
【００７９】
発現カセットを含む細胞は、公知の分子生物学的手法に従って容易に得ることができる。例えば、ＰＣＲ、制限酵素切断、ＤＮＡ連結技術等を利用して作成した細胞外発現カセットを、公知の方法に従って細胞に導入することにより得ることができる。
【００８０】
培養は、本発明の細胞内発現カセット中でＸ−Ｙで示される塩基配列の欠失又は挿入が起こる限りにおいて、その条件は特に限定されない。例えば、細胞の由来生物の種類に応じた公知の方法に従って行うことができる。一例として、大腸菌であれば、ＬＢ液体培地中、約３０〜４０℃で振盪培養する方法が挙げられる。培養時間も、上記欠失が起こる限りにおいて特に限定されない。培養時間としては、例えば６〜３６時間、好ましくは１０〜２４時間程度であればよい。
【００８１】
斯かる培養により、Ｘ−Ｙで示される塩基配列の欠失又は挿入が起こり、それによりＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質の発現を誘導することができる。細胞内発現カセットとして、例えば、上記「（１）発現カセット（細胞外発現カセット）」で説明した態様１（例えば設計１〜２など）や態様２の発現カセットを用いることにより、効率的に上記タンパク質の発現を誘導することができる。
【００８２】
さらに、上記方法によって発現させた目的タンパク質（ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質）を回収することにより、該タンパク質を製造することができる。
【００８３】
回収は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、目的タンパク質を発現している細胞を集め、適当な溶解液で溶解することにより目的タンパク質を含む溶液を得ることができる。その後、各種クロマトグラフィー等の精製を経て、より高純度の目的タンパク質を得ることができる。
【００８４】
上記タンパク質発現方法によれば、重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない配列の欠失が起こった細胞、又はX-Y-Xという配列の5’側に隣接してX-Yで示される塩基配列が挿入された細胞から順次目的タンパク質の発現が起こるという従来にない発現誘導システムによりタンパク質を発現させることができる。したがって、該方法により、従来の発現誘導システムでは効率的に発現させることができなかったタンパク質を、より効率的に発現させることが可能となる。
【００８５】
（３）薬剤耐性化抑制剤の候補物質のスクリーニング方法
本発明は、工程ａ、工程ｂ、及び工程ｃを含む薬剤耐性化抑制剤の候補物質のスクリーニング方法に関する。
【００８６】
工程ａ
工程ａは、５’側から順に、式（１）：Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘ  （１）［式中、Ｘ及びＹは塩基数が１以上の異なる塩基配列を示す。］、又は式（２）：Ｘ−Ｙ−Ｘ  （２）［式中、Ｘ及びＹは前記に同じ。］で示される塩基配列、ＯＲＦが配置されている発現カセットを含む細胞と、被検物質とを接触させる工程である。
【００８７】
工程ａの発現カセットは、細胞に含まれる細胞内発現カセットである。
【００８８】
工程ａの発現カセットには、５’側から順に、式（１）又は式（２）で示される塩基配列、ＯＲＦが配置されている。両者は、直接連結されていても良いし、任意の塩基配列を介して連結されていてもよい。
【００８９】
ＯＲＦは、タンパク質をコードするＯＲＦである限り、より詳細にはＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠がタンパク質をコードする限り特に限定されない。なお、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンは、開始コドンに限定されない。該コドンが開始コドンでない場合は、発現カセット中の転写開始点の３’側であって且つＯＲＦの５’側に開始コドンが配置されていればよい。
【００９０】
ＯＲＦにコードされるタンパク質は、特に限定されず、例えば、蛍光タンパク質、酵素タンパク質、構造タンパク質、輸送タンパク質、貯蔵タンパク質、収縮タンパク質、防御タンパク質、調節タンパク質等、これらタンパク質の改変タンパク質が挙げられる。改変タンパク質の例としては、そのタンパク質の機能に影響を与えないＮ末端側の領域を欠失させた欠失タンパク質や、そのアミノ酸が一部置換されることにより機能が向上（改変）されたタンパク質等が挙げられる。ＯＲＦにコードされるタンパク質としては、後述の工程ｂにおける欠失率の測定をより簡便且つ効率的にできるという観点から、好ましくはレポータータンパク質、及び薬剤耐性タンパク質が挙げられる。
【００９１】
レポータータンパク質は、特定の基質と反応して発光（発色）するタンパク質、或いは励起光によって蛍光を発するタンパク質である限り特に限定されない。具体的には、例えば、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、βグルクロニダーゼ等が挙げられる。これらの中でも、後述の工程ｂにおける欠失率の測定をより簡便且つ効率的にできるという観点から、好ましくは蛍光タンパク質が挙げられる。
【００９２】
薬剤耐性タンパク質は、それを発現する細胞に抗菌薬などの薬剤に対する耐性を付与できる限り特に限定されない。具体的には、例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子にコードされるタンパク質（クロラムフェニコール耐性タンパク質）、テトラサイクリン耐性遺伝子にコードされるタンパク質（テトラサイクリン耐性タンパク質）、ネオマイシン耐性遺伝子にコードされるタンパク質（ネオマイシン耐性タンパク質）、エリスロマイシン耐性遺伝子にコードされるタンパク質（エリスロマイシン耐性タンパク質）、スペクチノマイシン耐性遺伝子にコードされるタンパク質（スペクチノマイシン耐性タンパク質）、カナマイシン耐性遺伝子にコードされるタンパク質（カナマイシン耐性タンパク質）、ハイグロマイシン耐性遺伝子にコードされるタンパク質（ハイグロマイシン耐性タンパク質）、ピューロマイシン耐性遺伝子にコードされるタンパク質（ピューロマイシン耐性タンパク質）等が挙げられる。
【００９３】
工程ａの発現カセットは、発現カセットからｍＲＮＡを発現させるために必要に応じて、式（１）又は式（２）で示される塩基配列及びＯＲＦ以外の他のエレメントを含んでいてもよい。他のエレメントとしては、例えばプロモーター、開始コドン、ＭＣＳ、オペレーター領域、ＳＤ配列等が挙げられる。これらの中でも、プロモーターを含んでいることが好ましい。プロモーターとしては、原核細胞又は真核細胞内において転写開始に必要な配列である限り特に限定されず、公知のプロモーターを採用することができる。例えば、原核細胞用のプロモーターとしては、tacプロモーター、tetプロモーター、araプロモーター等が挙げられる。真核細胞用のプロモーターとしては、CMVプロモーター、EF1プロモーター、SV40プロモーター、MSCVプロモーター、hTERTプロモーター、βアクチンプロモーター、CAGプロモーター等が挙げられる。また、ＯＲＦに開始コドンが含まれない場合は、他のエレメントとして、ＯＲＦの５’側に開始コドンを含むことが好ましい。
【００９４】
工程ａの発現カセットの好ましい一態様としては、例えばＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質の発現量或いは活性（蛍光活性等）が、式（１）におけるＸ−Ｙで示される塩基配列の欠失、又は式（２）の５’側におけるＸ−Ｙで示される塩基配列の挿入により変化する発現カセットが挙げられる。このような発現カセットを用いることにより、Ｘ−Ｙで示される塩基配列の欠失率又は挿入率を、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質の発現量或いは活性（蛍光活性等）を指標にして評価することができる。特に、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質が、蛍光タンパク質や薬剤耐性タンパク質である場合には、蛍光量や薬剤耐性株の出現率を測定することによって、より簡便にＸ−Ｙで示される塩基配列の欠失率又は挿入率を測定することができる。このような発現カセットの態様としては、例えば、Ｘ−Ｙで示される塩基配列が欠失又は挿入されることにより、ＯＲＦのフレームシフトが起こり、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質が発現するようになる（或いは発現しないようになる）態様（態様３）が挙げられる。別の例としては、Ｘ−Ｙで示される塩基配列が欠失又は挿入されることにより、発現カセットからの転写量が変化する態様（態様４）が挙げられる。また別の例としては、Ｘ−Ｙで示される塩基配列が欠失又は挿入されることにより、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質の活性が変化する態様（態様５）が挙げられる。以下、態様３〜５について詳述する。
【００９５】
工程ａの発現カセットの態様３は、５’側から順にプロモーター、開始コドン、式（１）又は式（２）で示される塩基配列、ＯＲＦが配置されている発現カセットであって、式（１）中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋１又は３ｎ＋２（ただし、ｎは整数、例えば１〜６の整数）である、又は式（２）中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋１又は３ｐ＋２（ただし、ｐは整数）である発現カセットである。この発現カセットにおいては、重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない部分が欠失するという法則に基づいて欠失する塩基配列（Ｘ−Ｙで示される塩基配列）、及び式（２）の５’側に挿入される塩基配列（Ｘ−Ｙで示される塩基配列）の塩基数が３の倍数ではないので、この配列の欠失又は挿入により、ＯＲＦの読み枠がずれる（すなわちフレームシフトが起こる）。このため、該配列の欠失又は挿入の有無で、発現カセットから発現するタンパク質が変化する。これを利用して、態様３においては、例えば下記設計３〜５のように発現カセットを設計することにより、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質を、Ｘ−Ｙで示される塩基配列の欠失又は挿入によって発現させる（或いは発現させないようにする）ことができる。
【００９６】
設計３は、開始コドンとＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ（但し、ｍは３以上の整数である）であるという設計である。なお、ｍは、ＯＲＦが翻訳される限り特に限定されない。ｍは、例えば３〜１００の整数、好ましくは３〜５０の整数、より好ましくは３〜２５の整数、さらに好ましくは３〜１５の整数であることができる。開始コドンとＯＲＦの間の塩基数が３ｍであるので、Ｘ−Ｙで示される配列が欠失しない状態、又はＸ−Ｙで示される配列が挿入されない状態ではＯＲＦのフレームシフトは起こらない。したがって、この状態のＯＲＦの読み枠は、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠である。一方、開始コドンとＯＲＦの間に配置されているＸ−Ｙ（塩基数は３ｎ＋１又は３ｎ＋２）で示される配列が欠失した状態、又はＸ−Ｙ（塩基数は３ｐ＋１又は３ｐ＋２）が挿入された状態ではＯＲＦのフレームシフトが起こる。したがって、この状態のＯＲＦの読み枠は、ＯＲＦの５’末端から２又は３番目の塩基から３塩基で構成されるコドンを含む読み枠である。このように、設計３においては、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質が、Ｘ−Ｙで示される塩基配列の欠失又は挿入によって発現しなくなる。
【００９７】
設計４は、式（１）で示される塩基配列が配置されている場合は、開始コドンとＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋１（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ式（１）で示される塩基配列中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋１であるという設計であり、式（２）で示される塩基配列が配置されている場合は、前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋１（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（２）で示される塩基配列中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋２（ただし、ｐは整数）であるという設計である。開始コドンとＯＲＦの間の塩基数が３ｍ＋１であるので、Ｘ−Ｙで示される配列が欠失しない状態、又はＸ−Ｙで示される配列が挿入されない状態ではＯＲＦのフレームシフトが起こる。したがって、この状態のＯＲＦの読み枠は、ＯＲＦの５’末端から３番目の塩基から３塩基で構成されるコドンを含む読み枠である。一方、開始コドンとＯＲＦの間に配置されているＸ−Ｙ（塩基数は３ｎ＋１）で示される配列が欠失した状態、又はＸ−Ｙ（塩基数は３ｐ＋２）で示される配列が挿入された状態ではＯＲＦのフレームシフトが解消する。したがって、この状態のＯＲＦの読み枠は、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠である。このように、設計４においては、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質が、Ｘ−Ｙで示される塩基配列の欠失又は挿入によって発現するようになる。
【００９８】
設計５は、式（１）で示される塩基配列が配置されている場合は、開始コドンとＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋２（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ式（１）で示される塩基配列中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋２であるという設計であり、式（２）で示される塩基配列が配置されている場合は、前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋２（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（２）で示される塩基配列中のＸ−Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋１（ただし、ｐは整数）であるという設計である。開始コドンとＯＲＦの間の塩基数が３ｍ＋２であるので、Ｘ−Ｙで示される配列が欠失しない状態、又はＸ−Ｙで示される配列が挿入されない状態ではＯＲＦのフレームシフトが起こる。したがって、この状態のＯＲＦの読み枠は、ＯＲＦの５’末端から２番目の塩基から３塩基で構成されるコドンを含む読み枠である。一方、開始コドンとＯＲＦの間に配置されているＸ−Ｙ（塩基数は３ｎ＋２）で示される配列が欠失した状態、又はＸ−Ｙ（塩基数は３ｐ＋１）で示される配列が挿入された状態ではＯＲＦのフレームシフトが解消する。したがって、この状態のＯＲＦの読み枠は、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠である。このように、設計５においては、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質が、Ｘ−Ｙで示される塩基配列の欠失又は挿入によって発現するようになる。
【００９９】
工程ａの発現カセットの態様４は、５’側から順に、式（１）又は式（２）で示される塩基配列を含むプロモーター、ＯＲＦが配置されている発現カセットが挙げられる。この発現カセットにおいては、プロモーター内に欠失する塩基配列（Ｘ−Ｙで示される塩基配列）が存在する、或いはプロモーター内にＸ−Ｙで示される塩基配列の挿入を引き起こす配列（式（２））が存在するので、この配列の欠失又は挿入によりプロモーター構造が変化して、転写活性が変化する。例えば、Ｘ−Ｙで示される塩基配列が転写活性に重要なプロモーターエレメント（−３５ボックス、−１０ボックス、その他の転写活性化エレメント）の全部又は一部を構成するように設計されたプロモーターであれば、Ｘ−Ｙで示される塩基配列が欠失することによって転写活性を低下させることができる。別の例としては、−３５ボックス及び−１０ボックスは、約１６〜１９ｂｐ程度のスペーサー配列を介して連結されることによって、転写を効率的に進めることが知られているので、これを利用して設計することが例示される。具体的には、−３５ボックスと−１０ボックスとが、転写が起こらない程度に長く（例えば２０ｂｐ以上、好ましくは２４ｂｐ以上）且つ式（１）で示される塩基配列を含むスペーサー配列を介して連結されていて、Ｘ−Ｙで示される塩基配列の欠失により該スペーサー配列の長さが１６〜１９ｂｐ程度になるように設計されたプロモーターであれば、Ｘ−Ｙで示される塩基配列が欠失することによって転写活性を高めることができる。このような転写活性の変化を利用して、Ｘ−Ｙで示される塩基配列の欠失によって、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質を発現させる（或いは発現させないようにする）ことができる。
【０１００】
工程ａの発現カセットの態様５は、５’側から順に、プロモーター、式（１）又は式（２）で示される塩基配列を含むＯＲＦが配置されている発現カセットが挙げられる。この発現カセットにおいては、ＯＲＦ内に欠失する塩基配列（Ｘ−Ｙで示される塩基配列）が存在する、或いはＯＲＦ内にＸ−Ｙで示される塩基配列の挿入を引き起こす配列（式（２））が存在するので、この配列の欠失又は挿入によりＯＲＦにコードされるタンパク質の活性が変化する。この活性の変化は、フレームシフトが無くとも起こる場合がある。例えば、EGFP等の蛍光タンパク質中の特定部位にアミノ酸が挿入されることにより、蛍光活性が消失することが知られている。
【０１０１】
工程ａの「発現カセットを含む細胞」は、上記発現カセットをゲノム上又はゲノム外（例えばプラスミド上）に有する細胞であれば特に限定されない。
【０１０２】
重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない配列の欠失という法則は、細菌等の原核細胞及び真核細胞において保存されているため、細胞の由来生物は特に限定されない。
【０１０３】
原核細胞の由来生物としては、例えばグラム陰性菌（緑膿菌、大腸菌、セラチア菌、スフィンゴモナス菌、ブルセラ菌、淋菌、バークホルデリア、赤痢菌、サルモネラ菌、アシネトバクター、コレラ菌、肺炎桿菌、レジオネラ菌、ピロリ菌、カンピロバクター等）、グラム陽性菌（結核菌、マイコプラズマ菌、黄色ブドウ球菌、放線菌、枯草菌、炭疽菌等）等、種類を問わず広く例示することができる。これらの中でも、好ましくはグラム陰性菌等が挙げられ、より好ましくは緑膿菌、大腸菌、セラチア菌、スフィンゴモナス菌等が挙げられ、さらに好ましくは緑膿菌、大腸菌等が挙げられる。
【０１０４】
真核細胞の由来生物としては、哺乳類動物（例えばヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ等）、昆虫等の動物や、植物等、種類を問わず広く例示することができる。これらの中でも、好ましくは哺乳類動物、昆虫等の動物が挙げられ、より好ましくは哺乳類動物が挙げられる。
【０１０５】
発現カセットを含む細胞は、公知の分子生物学的手法に従って容易に得ることができる。例えば、ＰＣＲ、制限酵素切断、ＤＮＡ連結技術等を利用して作成した細胞外発現カセットを、公知の方法に従って細胞に導入することにより得ることができる。
【０１０６】
被検物質は、特に制限されない。例えば、低分子化合物、高分子化合物（ペプチド、タンパク質、糖鎖等の生体高分子化合物を含む）等の化合物であり得る。また、精製された化合物に限らず、多種の化合物を混合した組成物や、動植物の抽出液も使用することができる。
【０１０７】
発現カセットを含む細胞と被検物質とを接触させる方法は、両者が接触する限り、いかなる方法でもよい。典型的には、発現カセットを含む細胞を含む溶液（培養液等）と被検物質とを混合する方法が挙げられる。
【０１０８】
斯かる接触後、発現カセットを含む細胞をさらに培養することが好ましい。発現カセットを含む細胞を培養することにより、該発現カセット中のＸ−Ｙで示される塩基配列の欠失率が高まる。したがって、被検物質による欠失率の低下が検出し易くなる。培養は、細胞の由来生物の種類に応じた公知の方法に従って行うことができる。例えば、大腸菌であれば、ＬＢ液体培地中、約３０〜４０℃で振盪培養する方法が挙げられる。培養時間は、特に限定されないが、例えば６〜３６時間、好ましくは１０〜２４時間程度であればよい。
【０１０９】
工程ｂ
工程ｂは、被検物質と接触させた細胞（被検細胞）、及び被検物質を接触させない細胞（対照細胞）における、前記式（１）で示される塩基配列中のＸ−Ｙで示される塩基配列の欠失率、又は前記式（２）で示される塩基配列の５’側に隣接してＸ−Ｙで示される塩基配列が挿入される率（挿入率）を測定する工程である。
【０１１０】
被検細胞は、上記工程ａにおいて被検物質と接触させた前記発現カセットを含む細胞である。対照細胞は、被検物質を接触させていない前記発現カセットを含む細胞である。対照細胞は、被検物質と接触させていない以外は、被検細胞と同様の処理を施されたものが好ましい。
【０１１１】
Ｘ−Ｙで示される塩基配列の欠失率又は挿入率の測定方法は、被検物質の接触による欠失率又は挿入率の変化を評価できる方法である限り特に限定されない。例えば次の方法が挙げられる。まず、被検細胞の集団及び対照細胞の集団それぞれ（Ｘ−Ｙで示される塩基配列が欠失している又は挿入されている細胞、及び該配列が欠失していない又は挿入されていない細胞が混在する）から発現カセットを含むＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡを適当な制限酵素で消化する。次に、この消化断片を電気泳動によりゲル上に展開する。最後に、ゲル上の、Ｘ−Ｙで示される塩基配列の欠失又は挿入により表れるバンド（Ｘ−Ｙで示される塩基配列の塩基数の分だけ短くなった又は長くなった消化断片のバンド）の濃さを測定することにより、細胞の集団内においてＸ−Ｙで示される塩基配列が欠失又は挿入されている細胞の割合、すなわち欠失率又は挿入率を測定することができる。
【０１１２】
好ましい一態様としては、工程ａの発現カセットとして、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質の発現量が、Ｘ−Ｙで示される塩基配列の欠失又は挿入により変化する発現カセット（態様３〜５等）を用いることにより、該発現量を指標にしてより簡便に欠失率又は挿入率を測定することができる。例えば次の方法が挙げられる。まず、被検細胞の集団及び対照細胞の集団それぞれから、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質を含む画分を抽出する。次に、この画分を電気泳動でゲル上に展開後、該タンパク質を特異的に検出できる抗体でウェスタンブロットを行う。最後に、ウェスタンブロットで検出されたバンドの濃さを測定することにより、細胞の集団内においてＸ−Ｙで示される塩基配列が欠失又は挿入されている細胞の割合、すなわち欠失率又は挿入率を測定することができる。
【０１１３】
上記好ましい態様において、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質が、蛍光タンパク質や薬剤耐性タンパク質である場合には、蛍光量や薬剤耐性株の出現率を測定することによって、より簡便にＸ−Ｙで示される塩基配列の欠失率又は挿入率を測定することができる。例えば薬剤耐性タンパク質を採用する場合は次のように測定することができる。まず、被検細胞の集団及び対照細胞の集団のそれぞれを、薬剤を含む固形培地（寒天培地等）にプレーティングする。次に、該培地上に出現するコロニー（薬剤耐性株）数を測定することにより、細胞の集団内においてＸ−Ｙで示される塩基配列が欠失又は挿入されている細胞の割合、すなわち欠失率又は挿入率を測定することができる。
【０１１４】
上記欠失率又は挿入率の測定方法に用いる手法（ＤＮＡ抽出、制限酵素消化、電気泳動、タンパク質抽出、ウェスタンブロット、薬剤耐性株の取得及びその数の測定等）は公知の方法に従って行うことができる。
【０１１５】
工程ｃ
工程ｃは、被検細胞における欠失率又は挿入率が、対照細胞における欠失率又は挿入率よりも低い場合に、前記被検物質を薬剤耐性化抑制剤候補物質として選択する工程である。
【０１１６】
「低い」か否かの判断は、一定の基準、例えば統計学的基準に基づき判断すればよい。具体的には、複数回測定してｐ値を求め、ｐ値が一定値以下、例えば０．０５以下である場合に有意に相違すると判断する方法等が挙げられる。判断の結果、有意に相違している場合は、その被検物質を選択する。
【０１１７】
工程ｃで選択された被検物質は、薬剤耐性化の原因である「重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない配列（Ｘ−Ｙで示される塩基配列）の欠失」という現象、又はＸ−Ｙ−Ｘという配列の５’側に隣接してＸ−Ｙで示される塩基配列が挿入され、重なり合ったダイレクトリピートが創出されるという法則を阻害することを指標として選択される物質であるので、薬剤耐性化抑制剤候補物質として、特に緑膿菌の薬剤耐性化抑制剤候補物質として有用である。得られた薬剤耐性化抑制剤候補物質は、さらに薬剤耐性化抑制剤のスクリーニングに供してもよい。
【０１１８】
（４）式（１）又は式（２）で示される塩基配列の検索方法
本発明は、対象塩基配列を入力データとして取り込む取り込みステップと、前記塩基配列中に、式（１）：Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘ （１）［式中、Ｘ及びＹは塩基数が１以上の異なる塩基配列を示す。］、又は式（２）：Ｘ−Ｙ−Ｘ （２）［式中、Ｘ及びＹは前記に同じ。］で示される塩基配列（以下、「本発明の塩基配列」と示すこともある。）を検索する検索ステップと、を有する塩基配列の検索方法（以下、「本発明の塩基配列の検索方法」と示すこともある。）に関する。
【０１１９】
検索装置
図８は、本発明の塩基配列の検索方法を実行するための検索装置１の一例を示すブロック図である。検索装置１は、汎用のパーソナルコンピュータによって構成することができ、ＣＰＵ２、ＲＡＭ３、ハードディスク４及びインターフェース５〜７等を備えている。ＣＰＵ２は、検索装置１の各種演算動作を実行及び制御する。ＲＡＭ３は、ＣＰＵ２による演算処理に必要なデータを一時的に格納する。ハードディスク４は、ＣＰＵ２が検索動作を行うための検索プログラム８等の各種アプリケーションプログラム、及び、演算処理によって生成された各種データを格納する。
【０１２０】
検索装置１には、それぞれインターフェース５，６を介してキーボード９及びディスプレイ１０が接続されている。また、検索装置１は、インターフェース７を介してインターネット１１等の通信回線に接続されている。
【０１２１】
検索方法の概略
図９は、本発明の塩基配列の検索方法の概略手順を示すフローチャートである。まず、検索装置１は、ユーザの操作により、図８に示す検索プログラム８を起動する（Ｓ１）。検索プログラム８は、インターネット１１を介して、あるいは、ＣＤ−ＲＯＭ等のコンピュータ読み取り可能な記録媒体を介して検索装置１にインストールすることができる。
【０１２２】
続いて、検索装置１は、ユーザの操作により、対象遺伝子の塩基配列を入力データとして取り込む（Ｓ２、取り込みステップ）。この入力データは、例えば、インターネット１１を介して公共の配列データベース１２からダウンロードすることにより、検索装置１に供給することができる。あるいは、ＵＳＢメモリ、ＳＤメモリーカード等のコンピュータ読み取り可能な記録媒体を介して、入力データを検索装置１に供給することができる。検索装置１に取りこまれた入力データは、ＲＡＭ３に読み出される。
【０１２３】
続いて、検索装置１は、本発明の塩基配列の検索を実行する（Ｓ３、検索ステップ）。具体的には、検索装置１は、入力データの塩基配列中に、式（１）：Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘ （１）［式中、Ｘ及びＹは塩基数が１以上の異なる塩基配列を示す。］、又は式（２）：Ｘ−Ｙ−Ｘ （２）［式中、Ｘ及びＹは前記に同じ。］で示される塩基配列を検索する。
【０１２４】
検索が終了すると、検索装置１は、検索結果を出力する（Ｓ４）。具体的には、検索結果として、入力データの塩基配列中の本発明の塩基配列の有無、本発明の塩基配列が存在する場合のＸ及びＹの各配列、並びに、Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−ＸまたはＸ−Ｙ−Ｘで示される配列の全配列中の位置等を、ディスプレイ１０に表示する。なお、検索結果を紙媒体に印刷して出力してもよい。
【０１２５】
Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘの検索手順例
続いて、本発明の塩基配列の検索（Ｓ３）の具体例について説明する。図１０は、Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘで示される配列の検索手順の一例を示すフローチャートである。
【０１２６】
まず、検索装置１は、検索対象となる配列を構成するＸおよびＹの塩基数を決定する（Ｓ３−１）。本フローチャートにおいて、Ｘの塩基数をａ、Ｙの塩基数をｂと設定する。塩基数の決定は、ユーザの操作により行うことができるが、検索装置１が、ａおよびｂの所定の組み合わせ（例えば、ａ＝２〜１５，ｂ＝２〜１５の組み合わせ）から自動的に決定してもよい。なお、本発明において、ａ及びｂの値は、上記組み合わせに限定されない。
【０１２７】
続いて、検索装置１は、入力データの塩基配列中の検索範囲を決定する（Ｓ３−２）。初期設定における検索範囲は、全配列中の５’側の最上流から第１〜３ａ＋２ｂ番目の範囲であることができる。
【０１２８】
続いて、検索装置１は、決定された検索範囲の５‘側から第１〜ａ番目の配列をＸ、第ａ＋１〜ａ＋ｂ番目の配列をＹと仮定する（Ｓ３−３）。
【０１２９】
続いて、検索装置１は、Ｘ−Ｙで示される配列（すなわち、第１〜ａ＋ｂ番目の配列）がＺ（Ｚは塩基数が１以上の任意の塩基配列）の２回以上の繰り返しであるかを確認する（Ｓ３−４）。Ｘ−Ｙで示される配列がＺの繰り返しである場合（Ｓ３−４においてＹＥＳ）、後述するＳ３−１０に移行する。
【０１３０】
Ｘ−Ｙで示される配列がＺの繰り返しでない場合（Ｓ３−４においてＮＯ）、検索装置１は、検索範囲の第ａ＋ｂ＋１〜２ａ＋ｂ番目の配列（すなわち、Ｘ−Ｙに続くａ個の配列）がＸに一致するかを確認する（Ｓ３−５）。当該配列がＸに一致しない場合（Ｓ３−５においてＮＯ）、後述するＳ３−１０に移行する。
【０１３１】
当該配列がＸに一致する場合（Ｓ３−５においてＹＥＳ）、検索装置１は、第２ａ＋ｂ＋１〜２ａ＋２ｂ番目の配列（すなわち、Ｘ−Ｙ−Ｘに続くｂ個の配列）がＹに一致するかを確認する（Ｓ３−６）。当該配列がＹに一致しない場合（Ｓ３−６においてＮＯ）、後述するＳ３−１０に移行する。
【０１３２】
当該配列がＹに一致する場合（Ｓ３−６においてＹＥＳ）、検索装置１は、第２ａ＋２ｂ＋１〜３ａ＋２ｂ番目の配列（すなわち、Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｙに続くａ個の配列）がＸに一致するかを確認する（Ｓ３−７）。当該配列がＸに一致しない場合（Ｓ３−７においてＮＯ）、後述するＳ３−１０に移行する。
【０１３３】
当該配列がＸに一致する場合（Ｓ３−７においてＹＥＳ）、検索装置１は、Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘの直前または直後の配列（すなわち、Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘの直前のｂ個の配列、またはＸ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘに続くｂ個の配列）がＹに一致するかを確認する（Ｓ３−８）。当該配列の少なくともいずれかがＹに一致する場合（Ｓ３−８においてＹＥＳ）、後述するＳ３−１０に移行する。
【０１３４】
当該配列がいずれもＹに一致しない場合（Ｓ３−８においてＮＯ）、検索範囲の配列がＸ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘで示される配列に一致し、かつ、当該配列及びその前後を含む配列が任意の塩基配列の単純な繰り返しでないこととなる。検索装置１は、このときのＸ、Ｙの各配列、及びＸ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘの全配列中の位置を図８に示すＲＡＭ３に記録する（Ｓ３−９）。
【０１３５】
続いて、検索装置１は、入力データの全配列の検索が完了したかを確認する（Ｓ３−１０）。全配列の検索が完了していない場合（Ｓ３−１０においてＮＯ）、検索範囲を３’側に１シフトさせる（Ｓ３−１１）。その後、シフトされた検索範囲について、Ｓ３−３〜Ｓ３−１０のステップを実行する。
【０１３６】
一方、全配列の検索が完了した場合（Ｓ３−１０においてＹＥＳ）、検索ステップを終了する。塩基配列中にＸ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘで示される配列が見付かった場合は、ＲＡＭ３に記録されたＸ、Ｙの各配列、及びＸ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘの全配列中の位置を出力する（図９に示すＳ４）。また、塩基配列中にＸ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘで示される配列が見付からなかった場合は、その旨をディスプレイ１０等に表示してもよい。
【０１３７】
その後、ＸおよびＹの塩基数の組み合わせを変更して、本発明の塩基配列の検索を再度行ってもよい。
【０１３８】
Ｘ−Ｙ−Ｘの検索手順例
図１１は、Ｘ−Ｙ−Ｘで示される配列の検索手順の一例を示すフローチャートである。
【０１３９】
まず、検索装置１は、検索対象となる配列を構成するＸおよびＹの塩基数を決定する（Ｓ３−１２）。本フローチャートにおいて、Ｘの塩基数をａ、Ｙの塩基数をｂと設定する。塩基数の決定は、図１０におけるフローチャートと同様である。
【０１４０】
続いて、検索装置１は、入力データの塩基配列中の検索範囲を決定する（Ｓ３−１３）。初期設定における検索範囲は、全配列中の５’側の最上流から第１〜２ａ＋ｂ番目の範囲であることができる。
【０１４１】
続いて、検索装置１は、決定された検索範囲の５‘側から第１〜ａ番目の配列をＸ、第ａ＋１〜ａ＋ｂ番目の配列をＹと仮定する（Ｓ３−１４）。
【０１４２】
続いて、検索装置１は、Ｘ−Ｙで示される配列（すなわち、第１〜ａ＋ｂ番目の配列）がＺ（Ｚは塩基数が１以上の任意の配列）の２回以上の繰り返しであるかを確認する（Ｓ３−１５）。Ｘ−Ｙで示される配列がＺの繰り返しである場合（Ｓ３−１５においてＹＥＳ）、後述するＳ３−１９に移行する。
【０１４３】
Ｘ−Ｙで示される配列がＺの繰り返しでない場合（Ｓ３−１５においてＮＯ）、検索装置１は、検索範囲の第ａ＋ｂ＋１〜２ａ＋ｂ番目の配列（すなわち、Ｘ−Ｙに続くａ個の配列）がＸに一致するかを確認する（Ｓ３−１６）。当該配列がＸに一致しない場合（Ｓ３−１６においてＮＯ）、後述するＳ３−１９に移行する。
【０１４４】
当該配列がＸに一致する場合（Ｓ３−１６においてＹＥＳ）、検索装置１は、Ｘ−Ｙ−Ｘの直前または直後の配列（すなわち、Ｘ−Ｙ−Ｘの直前のｂ個の配列、またはＸ−Ｙ−Ｘに続くｂ個の配列）がＹに一致するかを確認する（Ｓ３−１７）。当該配列の少なくともいずれかがＹに一致する場合（Ｓ３−１７においてＹＥＳ）、後述するＳ３−１９に移行する。
【０１４５】
当該配列がいずれもＹに一致しない場合（Ｓ３−１７においてＮＯ）、検索範囲の配列がＸ−Ｙ−Ｘで示される配列に一致し、かつ、当該配列及びその前後を含む配列が任意の塩基配列の単純な繰り返しでないこととなる。検索装置１は、このときのＸ、Ｙの各配列、及びＸ−Ｙ−Ｘの全配列中の位置を図８に示すＲＡＭ３に記録する（Ｓ３−１８）。
【０１４６】
続いて、検索装置１は、入力データの全配列の検索が完了したかを確認する（Ｓ３−１９）。全配列の検索が完了していない場合（Ｓ３−１９においてＮＯ）、検索範囲を３’側に１シフトさせる（Ｓ３〜２０）。その後、シフトされた検索範囲について、Ｓ３−１４〜Ｓ３−１９のステップを実行する。
【０１４７】
一方、全配列の検索が完了した場合（Ｓ３−１９においてＹＥＳ）、検索ステップを終了する。塩基配列中にＸ−Ｙ−Ｘで示される配列が見付かった場合は、ＲＡＭ３に記録されたＸ、Ｙの各
配列、及びＸ−Ｙ−Ｘの全配列中の位置を出力する（図９に示すＳ４）。また、塩基配列中にＸ−Ｙ−Ｘで示される配列が見付からなかった場合は、その旨をディスプレイ１０等に表示してもよい。
【０１４８】
その後、ＸおよびＹの塩基数の組み合わせを変更して、本発明の塩基配列の検索を再度行ってもよい。
【０１４９】
その他
なお、上述の本発明の塩基配列の検索手順はあくまで例示であり、塩基配列の入力データからＸ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−ＸまたはＸ−Ｙ−Ｘで示される配列を検索可能なものであれば、本発明は特に限定されない。
【０１５０】
また、上記では、汎用のパーソナルコンピュータが検索プログラム８を実行することにより、本発明の塩基配列の検索方法をソフトウェア的に実施していたが、例えば、集積回路上に形成された論理回路によって、本発明の塩基配列の検索方法をハードウェア的に実施してもよい。
【実施例】
【０１５１】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。なお、下記に示す発現ベクターの調製は、公知の遺伝子工学的手法に従って行った。
【０１５２】
実施例1．薬剤耐性化機構の解析
薬剤耐性菌であるNfxC型変異株は、RND型薬剤排出ポンプ（MexEF-OprN）を発現しており、その結果薬剤耐性能を獲得することが知られている。該変異株においては、mexT遺伝子のORFが8 bp欠失してフレームシフトしており、その結果発現する活性型MexTタンパク質（転写因子）が、RND型薬剤排出ポンプの発現を活性化している（非特許文献2）。しかしながら、該8 bpの欠失が必ず起こるものなのか、或いは6 bpや7 bpの欠失も起こりうるのかについては全く知られていなかった。そこで、該欠失のメカニズムを調べた。
【０１５３】
1-1．重なり合ったダイレクトリピートの発見
野生株mexT遺伝子配列中の、NfxC型変異株において欠失が起こる配列の周辺を解析したところ、図1に示すような、X-Y-Xという配列と、X-Y-Xという配列が、Xにおいて重なり合った配列（配列番号1、重なり合ったダイレクトリピート）が見出された。そして、NfxC型変異株においては、この重なり合ったダイレクトリピート中の重なっていない配列(X-Y)が欠失していることが見出された（図1）。
【０１５４】
これらの発見から、重なり合ったダイレクトリピートがあれば、その重なっていない配列が欠失するという法則の存在が推測された。
【０１５５】
1-2．重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない配列が欠失することの実証試験
上記推測の実証試験を行った。概要としては、重なっていない部分の欠失により初めてプロモーターが機能し、その結果薬剤耐性遺伝子が発現する大腸菌を作製し、該大腸菌の薬剤耐性を測定することによって欠失の有無を調べた。具体的には次のように行った。
【０１５６】
まず、pMMB67EHベクターを、該ベクターのMCSにクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入され、且つ該遺伝子のプロモーター領域にPsi Iサイトが導入されるように、改変した（改変後のプラスミド名は「pSCm」）。次に、pSCmベクターをPsi Iサイトで切断し、In-fusion HD Cloning Kit（Clontech）を用いて該切断サイトに合成核酸を挿入することによって、クロラムフェニコール耐性遺伝子上流のtacプロモーターの-35ボックスと-10ボックスの間のスペーサー領域が、mexT遺伝子の重なり合ったダイレクトリピート22 bpに2 bp（CT）付加した24 bpの配列（配列1：表1）となるように改変した（図2、改変後のプラスミド名は「pSdmexTCM-24bp」）。また、これとは別に、該スペーサー領域が、配列1において重なり合ったダイレクトリピート中の重なっていない配列（CGGCCAGC）が欠失した配列（配列2（16 bp）：表1）、配列2において5’末端に1 bp（G）付加された配列（配列3（17 bp）：表1）、又は配列2において5’末端に2 bp（GA）付加された配列（配列4（18 bp）：表1）となるように改変したプラスミドも、pSdmexTCM-24bpと同様の方法で作製した（表1）。
【０１５７】
【表１】
2020141675.tif 000002
【０１５８】
pSdmexTCM-24bpは、-35ボックスと-10ボックスの間の配列が長すぎるため、転写が起こらず、結果として該プロモーター下流のクロラムフェニコール耐性遺伝子が発現しないことが予想される一方、pSdmexTCM-16bp, 17bp, 18bpは、-35ボックスと-10ボックスの間の配列の長さが正常範囲であるため、クロラムフェニコール耐性遺伝子が発現することが予想される。このことを確かめるために、これら4種類のプラスミドを大腸菌DH5αに定法に従って導入し、次いで、これらの大腸菌に対するクロラムフェニコールの最小発育阻止濃度（MIC）を定法に従って測定した。結果を表2に示す。表2に示されるように、予想通り、pSdmexTCM-24bpを導入した大腸菌はクロラムフェニコールに対する耐性が極めて低い一方、pSdmexTCM-16bp, 17bp, 18bpを導入した大腸菌は耐性を獲得していた。
【０１５９】
【表２】
2020141675.tif 000003
【０１６０】
次に、pSdmexTCM-24bpを導入した大腸菌を液体培地（1％ Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, pH 7.0, 0.5 mM IPTG）5 mLに植菌し、37℃で16時間培養した。該培養液を1/100に希釈し、該希釈液100 μLを、10 cmディッシュ上のクロラムフェニコール含有寒天培地（10 μg/mL クロラムフェニコール, 1.5% agar, 1％ Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, pH 7.0, 0.5 mM IPTG）及びコントロール寒天培地（クロラムフェニコール含有寒天培地からクロラムフェニコールを除いた組成、又はクロラムフェニコールに替えて50 μg/mL CARを含有する組成を有する）にプレーティングし、37℃で22時間培養した。培養後、クロラムフェニコール含有寒天培地及びコントロール寒天培地それぞれで出現したコロニー数から、クロラムフェニコール耐性株の出現頻度を算出した。さらに、ランダムに100個のコロニーをピックアップし、コロニーから定法に従って抽出したDNAのシークエンシングをFASMAC社に依頼し、-35ボックスと-10ボックスの間の配列を決定した。
【０１６１】
その結果、1.28×10-3％の頻度でクロラムフェニコール耐性株が出現した。また、-35ボックスと-10ボックスの間の配列は100個のコロニー全てにおいて配列2、すなわち元の配列（配列1）において重なり合ったダイレクトリピート中の重なっていない配列（CGGCCAGC）が欠失した配列であった。以上より、重なり合ったダイレクトリピートがあれば、その重なっていない配列が欠失するという法則の存在が示された。また、表2のpSdmexTCM-24bpが導入されたDH5α（液体培養を経ていない）は、クロラムフェニコールに対する耐性を示さないことから、上記欠失は、pSdmexTCM-24bpを導入した大腸菌を液体培養している際に自然に生じたものであることが示唆された。
【０１６２】
実施例2．重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない配列が欠失するという法則の、細菌一般における保存性
上記実施例1で示された法則が細菌一般で起こるものかどうかを調べた。具体的には次のように行った。
【０１６３】
まず、図3に示すスキームに従ってアッセイプラスミドを構築した。5’側から、GAATTC（EcoR Iサイト）、19 bpの配列（CCTGGAAACGAGGAACGCC）、及び緑膿菌野生株のゲノムDNA由来のmexT遺伝子の開始コドンから該遺伝子のsal Iサイトまでの配列（配列番号6、重なり合ったダイレクトリピートを含む）が連結した配列（断片1）と、5’側から、GTCGAC（Sal Iサイト）、クロラムフェニコール耐性遺伝子のORFの開始コドンの次のコドンから終始コドンの一つ前のコドンまでの配列、6×His tagをコードする配列、TAA（終始コドン）、及びAAGCTT（Hind IIIサイト）が連結した配列（断片2）とを、pMMB67EHベクターのMCSのEcoR IサイトとHind IIIサイト、及び断片1の3’末端のSal Iサイトと断片2の5’末端のSal Iサイトを利用して、該ベクターのMCS中に連結した状態で導入した（大腸菌又はセラチア菌アッセイ用ベクター）。断片1の開始コドンと断片2のクロラムフェニコール耐性遺伝子のORFとの間の塩基数は635 bp（3m＋2）であるため、クロラムフェニコール耐性遺伝子のORFは正常な読み枠で翻訳されないが、断片1中の重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない配列（8 bp（3n＋2））が欠失することによりフレームシフトが起これば、クロラムフェニコール耐性遺伝子のORFが正常な読み枠で翻訳されることになる。さらに、上記で得られた大腸菌又はセラチア菌アッセイ用ベクターをEcoR I及びHind IIIで処理して、断片1及び断片2の連結配列を切り出し、該連結配列をpVLT33のMCSに導入した（スフィンゴモナス菌用アッセイベクター）。
【０１６４】
次に、大腸菌又はセラチア菌アッセイ用ベクターを大腸菌に定法に従って導入した。該細菌を液体培地（1％ Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, pH 7.0, 1 mM IPTG）5 mLに植菌し、37℃で16時間培養した。該培養液を1/1000に希釈し、該希釈液100 μLを10 cmディッシュ上のクロラムフェニコール含有寒天培地（5 μg/mL クロラムフェニコール, 1.5% agar, 1％ Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, pH 7.0, 1 mM IPTG）及びコントロール寒天培地（クロラムフェニコール含有寒天培地からクロラムフェニコールを除いた組成、又はクロラムフェニコールに替えて50 μg/mL CARを含有する組成を有する）にプレーティングし、37℃で22時間培養した。
【０１６５】
上記と同様の方法で、セラチア菌（Serratia marcescens）及びスフィンゴモナス菌（Sphingomonas paucimobilis）についても実験を行った。
【０１６６】
各細菌において上記実施例1で示された法則が保存されていれば、該細菌の培養中に8 bpの欠失が起こり、クロラムフェニコール耐性株が出現するはずである。
【０１６７】
培養の結果、大腸菌、セラチア菌、スフィンゴモナス菌全てについて、コロニー（クロラムフェニコール耐性株）が出現した。さらに、各コロニーから定法に従って抽出したDNAのシークエンシングを行った結果、各コロニーにおいて、重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない配列（8 bp）が確かに欠失していることを確認した。以上より、上記実施例1で示された法則は細菌一般で保存されていることが示された。
【０１６８】
実施例3．各種生物における重なり合ったダイレクトリピートの探索
各種生物のゲノム中の、重なり合ったダイレクトリピート（Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘで示される配列）を、検索プログラムを用いて検索した。検索条件は、Ｘが6塩基以上、Ｙが2塩基以上、Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘが200塩基以下とした。なお、この検索プログラムにおいては、検索対象であるＸ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘから、Ｘ−Ｙが３以上繰り返された配列内に存在するＸ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘ、及びＸ−ＹがＺ（１以上の任意の塩基配列）の２回以上の繰り返し配列である場合のＸ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘを除外した。検索結果を表3に示す。
【０１６９】
【表３】
2020141675.tif 000004
【０１７０】
表3に示されるように、グラム陰性菌及びグラム陽性菌等の細菌のみならず、真核生物においても重なり合ったダイレクトリピートが存在することが明らかとなった。
【０１７１】
実施例4．各種生物由来の重なり合ったダイレクトリピートの解析
実施例3で見出された重なり合ったダイレクトリピートからも、重なっていない配列の欠失が起こるか調べた。具体的には次のように行った。
【０１７２】
まずアッセイプラスミドを構築した。実施例2で得られた「大腸菌又はセラチア菌アッセイ用ベクター」を基に、5’側から、GAATTC（EcoR Iサイト）、19 bpの配列（CCTGGAAACGAGGAACGCC）、開始コドン、CTGCAG（PstIサイト）、GCGGCCGC（Not Iサイト）、GTCGAC（Sal Iサイト）、クロラムフェニコール耐性遺伝子のORFの開始コドンの次のコドンから終始コドンの一つ前のコドンまでの配列、6×His tagをコードする配列、TAA（終始コドン）、及びAAGCTT（Hind IIIサイト）が連結した配列を得た。この配列を、制限酵素サイトを利用して、pMMB67EHベクターのMCSのEcoR IサイトとHind IIIサイトの間に挿入した。得られたベクター（pLCM）をPst I及びSal Iで切断し、そこへ、5’側から、CTGCAG（Pst Iサイト）、下記表4の配列5〜9のいずれか、及びGTCGAC（Sal Iサイト）が連結された配列をPst I及びSal Iで切断して得られた断片を挿入して、アッセイプラスミドを得た。配列5〜9の塩基数はいずれも「3の倍数＋2」であるため、該発現カセットのクロラムフェニコール耐性遺伝子のORFは正常な読み枠で翻訳されないが、配列5〜9中の重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない配列（8 bp）が欠失することによりフレームシフトが起これば、クロラムフェニコール耐性遺伝子のORFが正常な読み枠で翻訳されることになる。
【０１７３】
次に、アッセイプラスミドを定法に従って大腸菌に導入した。該大腸菌を、実施例1と同様にクロラムフェニコール含有寒天培地にプレーティングして、培養した。培養後、出現したコロニー（クロラムフェニコール耐性株のコロニー）数から、クロラムフェニコール耐性株の出現頻度を算出した。さらに、ランダムに10個のコロニーをピックアップし、コロニーから定法に従って抽出したDNAをシークエンシングし、欠失した配列を同定した。
【０１７４】
【表４】
2020141675.tif 000005
【０１７５】
【表５】
2020141675.tif 000006
【０１７６】
耐性株の出現頻度は表5に示すとおりである。また、シークエンシングの結果、全てのコロニーで、重なり合ったダイレクトリピート中の重なっていない配列（表4の「配列」の下線で示される配列）が欠失していることが確認できた。以上より、各種生物由来の重なり合ったダイレクトリピートについても、mexT遺伝子由来の該リピートと同様に、重なっていない配列の欠失が起こることが示された。
【０１７７】
実施例5．転写活性が欠失効率に与える影響の解析
転写活性が欠失効率に与える影響を解析した。具体的には次のように行った。
【０１７８】
緑膿菌野生株のゲノムDNAから、制限酵素サイトを付加したプライマーセット（mexT1-Bam（配列番号16）、及びmexT2-Hin（配列番号17））を用いたPCRにより、mexT遺伝子（重なり合ったダイレクトリピートを含む）を含むDNA断片を増幅した。該断片のプライマー由来の制限酵素サイトを切断し、得られた断片をpMMB67EHのtacプロモーターの下流にライゲーションし、アッセイプラスミドを得た。アッセイプラスミドを、緑膿菌（PAO1S-Lac）に導入した。
【０１７９】
該緑膿菌のアッセイプラスミドのmexT遺伝子内には重なり合ったダイレクトリピートが存在するため、該遺伝子からは、正常な読み枠で翻訳される活性型MexTタンパク質が発現しない。ただ、該ダイレクトリピート中の重なっていない配列（8 bp）が欠失することによりフレームシフトが起これば、正常な読み枠で翻訳される活性型MexTタンパク質が発現し、これによりRND型薬剤排出ポンプが発現する（すなわち薬剤耐性が獲得される）。一方、mexT遺伝子の上流のtacプロモーターはIPTGによって正に調節されるため、IPTG添加の有無により転写活性を調節することができる。したがって、IPTG無添加の場合（転写活性低い）とIPTG添加の場合（転写活性高い）とで、薬剤耐性株の出現率を比較することにより、転写活性が欠失効率に与える影響を調べることができる。
【０１８０】
アッセイプラスミドを導入した緑膿菌を2 mM IPTGを含む液体培地（1％ Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, pH 7.0）、又はIPTGを含まない液体培地5 mLに植菌し、37℃で14時間培養した。該培養液を1/10に希釈し、該希釈液100 μLを10 cmディッシュ上のクロラムフェニコール含有寒天培地（500 μg/mL クロラムフェニコール, 1.5% agar, 1％ Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, pH 7.0, 0 or 2 mM IPTG）及びコントロール寒天培地（クロラムフェニコール含有寒天培地からクロラムフェニコールを除いた組成、又はクロラムフェニコールに替えて150 μg/mL CARを含有する組成を有する）にプレーティングし、37℃で24時間培養した。得られたコロニー数から、薬剤耐性株（NfxC変異株）の出現率を求めた。一方で、液体培養液100 μLからRNAを抽出し、mexT遺伝子の転写量をリアルタイムPCR法によって測定した。
【０１８１】
結果を図4に示す。図4に示されるように、IPTG添加によって転写量（転写活性）が高まると、欠失効率も高まることが明らかとなった。
【０１８２】
実施例6．重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない配列の欠失による、蛍光タンパク質の発現
まず、EGFP発現ベクターにおいて、EGFPのORF内に重なり合ったダイレクトリピート創り出し、このORFを緑膿菌アッセイ用ベクターに挿入して、アッセイプラスミドを得た。具体的には次のように行った。
【０１８３】
inverse PCRでpEGFP-C3（クロンテック社製）のMCS（配列番号18）を除去し、MCSを除去した位置に、Not Iサイトを含む9 bpの配列（agcggccgc）を挿入した。EGFP ORF内の14 bpの配列（配列番号19）の上流に隣接して5’側からtgaccacccからなる配列を挿入して、該14 bpの配列を合わせて重なり合ったダイレクトリピート（配列番号20）を創り出した。このように改変したEGFP ORFを、pMMB67EHにEcoR I−Hind IIIサイトにクローニングした。この際、EGFP ORFの開始コドンの上流に隣接して、pET21(a)のribosome binding site＋8 bp（T7 tagの上流域）の配列（配列番号21）を挿入した。得られたアッセイプラスミドを緑膿菌に導入した。
【０１８４】
上記アッセイプラスミドのEGFPのORF内には9 bpの配列（tgaccaccc）が挿入されており、これにより該ORFから発現するEGFPは活性中心の立体構造が崩れてしまっているので、蛍光を示さない。ただ、上記9 bpの配列の挿入により創り出された重なり合ったダイレクトリピート（配列番号20）中の重なっていない配列（9 bp）が欠失すれば、正常なEGFPタンパク質が発現する。
【０１８５】
アッセイプラスミドを導入した緑膿菌を液体培地（1％ Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, 2mM IPTG, pH 7.0）5 mLに植菌し、37℃で14時間培養した。該培養液を1/100000に希釈し、該希釈液100 μLを10 cmディッシュ上の寒天培地（1.5% agar, 1％ Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, 2mM IPTG, pH 7.0）にプレーティングし、37℃で24時間培養した。培養後、ディッシュを青色LEDトランスイルミネーター（オプトコード社製、LEDB-SBOXH）で観察した（励起波長：470 nm、付属のオレンジフィルターを使用）。
【０１８６】
結果を図5に示す。図5に示されるように、重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない配列の欠失による、蛍光タンパク質の発現（図5の下方に光る1つのコロニー）が観察できた。また、シークエンシングの結果、重なり合ったダイレクトリピート中の重なっていない配列（tgaccaccc）が欠失していることが確認できた。
【０１８７】
実施例7．重なり合ったダイレクトリピートの創出現象の発見
緑膿菌の臨床分離株の一部では、mexT遺伝子において、重なり合ったダイレクトリピート中の重なっていない配列が欠失し、活性型MexTタンパク質を発現しているにも関わらず、NfxC型のフェノタイプを示さない株が存在する。このような株では、活性型MexTタンパク質をMexSタンパク質が抑制することにより、野生型のフェノタイプを示すことが明らかになっている。
【０１８８】
そこで、上記のような臨床分離株から、さらなる変異によりNfxC型変異株が出現するかどうか調べた。具体的には次のように行った。
【０１８９】
上記臨床分離株（8380株：Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol.39, No.3, p645-649, 1995.）を液体培地（1％ Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, pH 7.0）5 mLに植菌し、37℃で15時間培養した。該培養液100 μLを10 cmディッシュ上の寒天培地（1.5% agar, 1％ Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, 800 μg/mL クロラムフェニコール, pH 7.0）にプレーティングし、37℃で20時間培養した。NfxC型変異株はクロラムフェニコールに対して高度に耐性を示すので、この培養により得られたコロニーは、上記臨床分離株から出現したNfxC型変異株であると考えられる。
【０１９０】
その結果、2.1×10-5%の割合でNfxC型変異株が出現することが明らかとなった。また、シークエンシングの結果、全てNfxC型変異株でmexS遺伝子に変異が認められた。このことから、MexSが変異し、機能型のMexTを抑制できなくなった為にMexEF-OprN薬剤排出ポンプが発現し、NfxC型のフェノタイプを示していることが明らかとなった。
【０１９１】
また面白いことに、出現したNfxC型変異株の中には、mexS遺伝子内部の特定の配列（配列番号22及び23）の上流に隣接して塩基配列（配列番号24及び25）が挿入されており、これにより重なり合ったダイレクトリピート配列（配列番号26及び27）が創られることにより、MexSが機能を失っていることが明らかとなった（図6）。
【０１９２】
実施例８．重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない配列が欠失するという法則の、真核細胞における保存性
上記実施例１等で示された法則が真核細胞においても起こるものかどうかを調べた。具体的には次のように行った。
【０１９３】
実施例６で作成したアッセイプラスミドから、改変型EGFP ORF（重なり合ったダイレクトリピート（配列番号20）を含む）を切り出し、この下流にpoly Aシグナル配列を付加して得られた断片を、ヒト細胞用ベクターであるpCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-RFPのCMVプロモーター下に挿入した。得られたベクターを鋳型として、PCRにより、改変型EGFP ORFを含む領域（5’からgag, RRE, env, cPPT, CMVプロモーター, 改変型EGFP ORF, EF1 プロモーター, ピューロマイシン耐性遺伝子 ORF, WPREからなる領域）を増幅し、線状DNAを得た。なお、PCRのプライマーとしては、Eu-TF1プライマー（配列番号28）及びEu-TF2プライマー（配列番号29）を用いた。該DNAを、ヒト胎児腎細胞であるHEK293T細胞に導入した。この細胞を3 μg/mlのピューロマイシンを含む液体培地（DMEM培地に10% FBS, 1U Penicillin-streptomycinを添加）にて培養（37℃、5% CO2）し、導入した線状DNAがゲノムに挿入された細胞株を分離した。線状DNAがゲノムに挿入されていること、挿入された改変型EGFP ORFが転写されていることは、PCRとreal time PCRにより確認した。
【０１９４】
得られた細胞株を100 mm ディッシュで培養した後、5×105細胞を150 mmディッシュに播種し、5〜7日間、約90％コンフルエントになるまで、培養した。培養後、ディッシュを蛍光実体顕微鏡（Microscopy Leica M205FA）にて観察した（励起波長：488 nm、フィルター：GFP（Leica））。
【０１９５】
観察結果を図7に示す。図7に示されるように、重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない配列の欠失による、蛍光タンパク質の発現（図7B）が観察できた。また、シークエンシングの結果、重なり合ったダイレクトリピート中の重なっていない配列（tgaccaccc）が欠失していることが確認できた。このことより、重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない配列が欠失するという法則は、細菌等の原核細胞のみならず、真核細胞においても保存されていることが示された。
【符号の説明】
【０１９６】
１    検索装置
２    ＣＰＵ
３    ＲＡＭ
４    ハードディスク
５〜７  インターフェース
８    検索プログラム
９    キーボード
１０    ディスプレイ
１１    インターネット
１２    配列データベース
【図１】
2020141675.tif 000007
【図２】
2020141675.tif 000008
【図３】
2020141675.tif 000009
【図４】
2020141675.tif 000010
【図５】
2020141675.tif 000011
【図６】
2020141675.tif 000012
【図７】
2020141675.tif 000013
【図８】
2020141675.tif 000014
【図９】
2020141675.tif 000015
【図１０】
2020141675.tif 000016
【図１１】
2020141675.tif 000017
【配列表】
2020141675000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年5月14日(2020.5.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象塩基配列を入力データとして取り込む取り込みステップと、
前記塩基配列中に、式（１）：Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘ （１）［式中、Ｘ及びＹは異なる塩基配列を示し、Ｘの塩基数は５〜６であり、Ｙの塩基数は２〜４である。］、又は式（２）：Ｘ−Ｙ−Ｘ （２）［式中、Ｘ及びＹは塩基数が２〜１５の異なる塩基配列を示す。］で示される塩基配列を検索する検索ステップと、を有する塩基配列の検索方法。
【請求項２】
請求項１に記載の前記取り込みステップ及び前記検索ステップをコンピュータに実行させるための検索プログラム。