(57)【要約】【課題】  ＰＣＲ（ｑＰＣＲを含む）法において、測定機器の特性に依らずにインターナルコントロールの検出を可能とし、データの堅牢性を向上させる手法を提供させること。【解決手段】  インターナルコントロール核酸と、該インターナルコントロール核酸を増幅するための１セット以上のプライマーセットと、該１セット以上のプライマーセットで増幅されるインターナルコントロール核酸由来の二本鎖のいずれか一方の鎖に対して相補的な塩基配列を含み、且つ、蛍光物質を含む標識で修飾された２種以上のインターナルコントロールプローブであってそれぞれ異なる標識で修飾されている２種以上のインターナルコントロールプローブを共存させるようにして、核酸増幅反応に用いるための試薬を調製する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターナルコントロール核酸と、
該インターナルコントロール核酸を増幅するための１セット以上のプライマーセットと、
該１セット以上のプライマーセットで増幅されるインターナルコントロール核酸由来の二本鎖のいずれか一方の鎖に対して相補的な塩基配列を含み、且つ、蛍光物質を含む標識で修飾された２種以上のインターナルコントロールプローブと、
を含み、該２種以上のインターナルコントロールプローブはそれぞれ異なる標識で修飾されている、核酸増幅反応に用いるための試薬。
【請求項２】
前記標識に含まれる蛍光物質の１つが、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、ローダミン、テトラメチルローダミン、５−カルボキシローダミン６Ｇ、フルオロセイン、カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、テトラクロロフルオレセイン、５’−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト、ＶＩＣ（登録商標）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、Ｃｙ（登録商標）色素、及びこれらの誘導体、並びにこれらの塩からなる群より選択される化合物である、請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
前記標識に含まれる蛍光物質の１つが、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、ローダミン、テトラメチルローダミン、５−カルボキシローダミン６Ｇ、及びこれらの誘導体、並びにこれらの塩からなる群より選択されるローダミン系化合物である、請求項１又は２に記載の試薬。
【請求項４】
前記２種以上のインターナルコントロールプローブが、
（１）５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、ローダミン、テトラメチルローダミン、５−カルボキシローダミン６Ｇ、及びこれらの誘導体、並びにこれらの塩からなる群より選択されるローダミン系化合物を含む標識で修飾された第１のインターナルコントロールプローブ、並びに、
（２）フルオロセイン、カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、テトラクロロフルオレセイン、５’−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト、ＶＩＣ（登録商標）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、Ｃｙ（登録商標）色素、及びこれらの誘導体、並びにこれらの塩からなる群より選択される非ローダミン系化合物を含む標識で修飾された第２のインターナルコントロールプローブ、
を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の試薬。
【請求項５】
前記２種以上のインターナルコントロールプローブがすべて、インターナルコントロール核酸由来の二本鎖のうちいずれか一方の同じ鎖に対して相補的な塩基配列を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の試薬。
【請求項６】
前記２種以上のインターナルコントロールプローブが、前記インターナルコントロール核酸由来の二本鎖において異なる位置に相当する部位に相補的な塩基配列を有する、請求項１〜５のいずれかに記載の試薬。
【請求項７】
１種以上のヌクレオチド塩基、緩衝液、逆転写酵素、及びポリメラーゼからなる群より選択される少なくとも１つを更に含有する、請求項１〜６のいずれかに記載の試薬。
【請求項８】
前記ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼである、請求項７に記載の試薬。
【請求項９】
前記ポリメラーゼが、抗体と複合体化されている、請求項７又は８に記載の試薬。
【請求項１０】
前記ポリメラーゼが、高温下で活性化する、請求項７〜９のいずれかに記載の試薬。
【請求項１１】
インターナルコントロール核酸以外の標的核酸配列を増幅するための１セット以上のプライマーセット、及び該プライマーセットで増幅された標的核酸配列のいずれか一方の鎖に相補的な塩基配列を含み、且つ、蛍光物質を含む標識で修飾された１種以上の標的プローブを更に含有する、請求項１〜１０のいずれかに記載の試薬。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の試薬を用いることを特徴とする、核酸増幅方法。
【請求項１３】
インターナルコントロール核酸と、インターナルコントロール核酸以外の標的核酸とを同時に増幅させてリアルタイムＰＣＲ反応を行う、請求項１２に記載の核酸増幅方法。
【請求項１４】
生体由来試料又は環境由来試料を用いて行う、請求項１２又は１３に記載の核酸増幅方法。
【請求項１５】
前記標的核酸が、生体由来試料又は環境由来試料に含まれる核酸である、請求項１２〜１４のいずれかに記載の核酸増幅方法。
【請求項１６】
前記２種以上のインターナルコントロールプローブを修飾する標識のいずれか１つを検出することにより核酸増幅反応の確認を行う、請求項１２〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記２種以上のインターナルコントロールプローブを修飾する標識のいずれか１つにより発生する蛍光を検出可能なチャネルを備えた機器により核酸増幅反応の確認を行う、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記機器が、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、ローダミン、テトラメチルローダミン、５−カルボキシローダミン６Ｇ、及びこれらの誘導体、並びにこれらの塩からなる群より選択されるローダミン系化合物を０．５μＭ〜１００μＭの濃度で含む場合に検出可能なチャネルを備えている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記機器が、フルオロセイン、カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、テトラクロロフルオレセイン、５’−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト、ＶＩＣ（登録商標）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、Ｃｙ（登録商標）色素、及びこれらの誘導体、並びにこれらの塩からなる群より選択される非ローダミン系化合物を含む標識による蛍光を検出可能なチャネルを備えている、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法において、反応液中で増幅反応が行われていることを検出するための試薬、及び当該試薬を用いて核酸を増幅する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅法は数コピーの標的核酸を可視化可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術であり、生命科学研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床検査といった医療分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられている。
代表的な核酸増幅法は、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。ＰＣＲは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。アニーリングと伸長を同温度で、２ステップで行う場合もある。
【０００３】
ＰＣＲでは、近年、測定感度の高さや迅速性から、増幅産物の生成過程を経時的にモニタリングすることが可能な定量的ＰＣＲ（以下「ｑＰＣＲ」と略す）の一種であるリアルタイムＰＣＲが広く実施されている。主なｑＰＣＲには、各種蛍光プローブを用いて、ＰＣＲをハイブリダイゼーションプロービングと組み合わせた手法がある。プローブを用いたｑＰＣＲとして、ＴａｑＭａｎ（登録商標）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ、Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅなどの方法が存在し、蛍光エネルギー転移などの技術を利用して、増幅核酸の量に相関して蛍光が増減するように工夫されている。
【０００４】
一般的に広く普及しているＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法は、５’末端に蛍光物質を、３’末端に消光物質（クエンチャー）を結合させたプローブを使用する方法である。このプローブは鋳型にアニールするが、励起光を照射してもクエンチャーにより蛍光は抑制されている。相補鎖が伸長される際、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によりプローブが加水分解され、蛍光物質がプローブから遊離し、クエンチャーから離れることにより蛍光を発する。この蛍光を検出することで、増幅による蛍光強度の増加をモニタリングすることができる。
【０００５】
一般的に、増幅対象となる１つの核酸（標的核酸、インターナルコントロール核酸等）の検出は、対象となる核酸をＰＣＲ増幅するための１セットのプライマーと、増幅された配列に結合する配列を蛍光色素で標識した１種類のプローブで検出する。
【０００６】
ｑＰＣＲにおいて反応および検出に使用される機器は各社から発売されており、各機器で励起光学、蛍光光学が異なる。そのため使用出来る蛍光色素は各機器で異なる。これらの機器は、一般的には２チャンネル〜５チャンネルを有し、各チャンネルの励起波長、蛍光波長に合う蛍光色素を使用する。一般的にカルボキシフルオレセインまたはそれらの類似体（例えば、ＦＡＭとして市販される）、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミンおよび／もしくは６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンまたはそれらの類似体（例えば、ＲＯＸとして市販される）等の蛍光色素は使用可能であることが多く、機器によってはこれら以外の蛍光色素を使用することが出来る場合もある。
【０００７】
例えば、ＰＣＲ（ｑＰＣＲを含む）の検出機器ではその設計の違いにより、一部の機器は蛍光色素として高濃度のＲＯＸ色素（例えば、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン色素または６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン色素）を検出する一方で、他の機器は低濃度でも前記ＲＯＸ色素を検出できる、またはＲＯＸ色素をかならずしも必要としない場合もある。例えば、ＡＢ７９００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）などは、高濃度のＲＯＸ色素を必要とする機器（これを、「高ＲＯＸ機器」と称することがある）として知られ、ＣＦＸ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）、ＤＩＣＥ（タカラバイオ社製）などは低濃度でもＲＯＸ色素を検出できる機器（これらを纏めて、「低ＲＯＸ機器」と称することがある）として知られている。典型的には、高ＲＯＸ機器での検出に必要とされるＲＯＸ濃度は、低ＲＯＸ機器での検出に必要とされるＲＯＸ濃度より約１０倍高い濃度が必要とも報告されている（特許文献１）。
【０００８】
ＰＣＲでは、サンプルに含まれる阻害要因、手技、使用する試薬の劣化、容器の蛍光特性などを原因とし、増幅が一定効率で行われない、増幅が見られない、増幅が上手く検出され難い等の問題が発生することがある。そのため、臨床検査や食品検査で行われるｑＰＣＲ試験においては、反応溶液中に注目している核酸を含むかどうか試験したいサンプルの他に、インターナルコントロールとして外来性の核酸（本明細書では、これを「インターナルコントロール核酸」ともいう）と、このインターナルコントロール核酸の塩基配列又はその相補鎖に対応するプライマー及び蛍光標識プローブとを加えて増幅反応を実施することにより、インターナルコントロールの増幅をもって反応が適切に進んでいることの確認することがある。その際、使用する機器が備えているチャネルに応じて、インターナルコントロール核酸のプローブに用いる蛍光標識を選択する必要がある。さらに５−又は６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン色素等のＲＯＸ色素で標識されたプローブを、標的核酸又はインターナルコントロール核酸の検出のためのプローブとしてｑＰＣＲに使用する場合、ＲＯＸを検出可能なチャネルを備えているかに加えて、機器ごとに検出に適切なＲＯＸ濃度が異なることも考慮する必要があった。そのため、それぞれの機種にあわせて反応液を用意しなければならず、作業が煩雑であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第５９８５５０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ｑＰＣＲ等の核酸増幅法を実施するにおいて、反応および検出に使用する機器が異なると使用出来る蛍光色素が異なり、また、５−および／または６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンが使える機器においても高ＲＯＸ機器、低ＲＯＸ機器のタイプがあることから、確実に検出することが望まれるインターナルコントロール核酸を検出するためには、それぞれの測定機種の蛍光検出チャネルの特性にあわせて反応液を用意しなければならず、作業が煩雑であった。従って、核酸増幅法の実施に使用する測定機器が備えている種々の蛍光検出チャネルに適用でき、インターナルコントロール核酸の簡便且つ確実な検出を可能にする、新たな手法の開発が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記事情に鑑みて鋭意研究を行った結果、インターナルコントロールとなる核酸と、該インターナルコントロールとなる核酸を増幅可能なプライマーセットと共に、該プライマーセットで増幅される産物を検出可能な異なる蛍光標識で修飾された２つ以上のインターナルコントロールプローブを含む反応混合物を用意し、これを使用して核酸増幅法にて検出すことにより、種々の蛍光検出チャネルの機器特性に適用でき、インターナルコントロールの簡便且つ確実な検出が可能になることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、代表的な本発明の構成を示すと以下の通りである。
［項１］  インターナルコントロール核酸と、
該インターナルコントロール核酸を増幅するための１セット以上のプライマーセットと、
該１セット以上のプライマーセットで増幅されるインターナルコントロール核酸由来の二本鎖のいずれか一方の鎖に対して相補的な塩基配列を含み、且つ、蛍光物質を含む標識で修飾された２種以上のインターナルコントロールプローブと、
を含み、該２種以上のインターナルコントロールプローブはそれぞれ異なる標識で修飾されている、核酸増幅反応に用いるための試薬。
［項２］  前記標識に含まれる蛍光物質の１つが、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、ローダミン、テトラメチルローダミン、５−カルボキシローダミン６Ｇ、フルオロセイン、カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、テトラクロロフルオレセイン、５’−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト、ＶＩＣ（登録商標）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、Ｃｙ（登録商標）色素、及びこれらの誘導体、並びにこれらの塩からなる群より選択される化合物である、項１に記載の試薬。
［項３］  前記標識に含まれる蛍光物質の１つが、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、ローダミン、テトラメチルローダミン、５−カルボキシローダミン６Ｇ、及びこれらの誘導体、並びにこれらの塩からなる群より選択されるローダミン系化合物である、項１又は２に記載の試薬。
［項４］  前記２種以上のインターナルコントロールプローブが、
（１）５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、ローダミン、テトラメチルローダミン、５−カルボキシローダミン６Ｇ、及びこれらの誘導体、並びにこれらの塩からなる群より選択されるローダミン系化合物を含む標識で修飾された第１のインターナルコントロールプローブ、並びに、
（２）フルオロセイン、カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、テトラクロロフルオレセイン、５’−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト、ＶＩＣ（登録商標）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、Ｃｙ（登録商標）色素、及びこれらの誘導体、並びにこれらの塩からなる群より選択される非ローダミン系化合物を含む標識で修飾された第２のインターナルコントロールプローブ、
を含む、項１〜３のいずれかに記載の試薬。
［項５］  前記２種以上のインターナルコントロールプローブがすべて、インターナルコントロール核酸由来の二本鎖のうちいずれか一方の同じ鎖に対して相補的な塩基配列を有する、項１〜４のいずれかに記載の試薬。
［項６］  前記２種以上のインターナルコントロールプローブが、前記インターナルコントロール核酸由来の二本鎖において異なる位置に相当する部位に相補的な塩基配列を有する、項１〜５のいずれかに記載の試薬。
［項７］  １種以上のヌクレオチド塩基、緩衝液、逆転写酵素、及びポリメラーゼからなる群より選択される少なくとも１つを更に含有する、項１〜６のいずれかに記載の試薬。
［項８］  前記ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼである、項７に記載の試薬。
［項９］  前記ポリメラーゼが、抗体と複合体化されている、項７又は８に記載の試薬。
［項１０］  前記ポリメラーゼが、高温下で活性化する、項７〜９のいずれかに記載の試薬。
［項１１］  インターナルコントロール核酸以外の標的核酸配列を増幅するための１セット以上のプライマーセット、及び該プライマーセットで増幅された標的核酸配列のいずれか一方の鎖に相補的な塩基配列を含み、且つ、蛍光物質を含む標識で修飾された１種以上の標的プローブを更に含有する、項１〜１０のいずれかに記載の試薬。
［項１２］  項１〜１１のいずれかに記載の試薬を用いることを特徴とする、核酸増幅方法。
［項１３］  インターナルコントロール核酸と、インターナルコントロール核酸以外の標的核酸とを同時に増幅させてリアルタイムＰＣＲ反応を行う、項１２に記載の核酸増幅方法。
［項１４］  生体由来試料又は環境由来試料を用いて行う、項１２又は１３に記載の核酸増幅方法。
［項１５］  前記標的核酸が、生体由来試料又は環境由来試料に含まれる核酸である、項１２〜１４のいずれかに記載の核酸増幅方法。
［項１６］
前記２種以上のインターナルコントロールプローブを修飾する標識のいずれか１つを検出することにより核酸増幅反応の確認を行う、項１２〜１５のいずれかに記載の方法。
［項１７］  前記２種以上のインターナルコントロールプローブを修飾する標識のいずれか１つにより発生する蛍光を検出可能なチャネルを備えた機器により核酸増幅反応の確認を行う、項１６に記載の方法。
［項１８］  前記機器が、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、ローダミン、テトラメチルローダミン、５−カルボキシローダミン６Ｇ、及びこれらの誘導体、並びにこれらの塩からなる群より選択されるローダミン系化合物を０．５μＭ〜１００μＭの濃度で含む場合に検出可能なチャネルを備えている、項１７に記載の方法。
［項１９］  前記機器が、フルオロセイン、カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、テトラクロロフルオレセイン、５’−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト、ＶＩＣ（登録商標）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、Ｃｙ（登録商標）色素、及びこれらの誘導体、並びにこれらの塩からなる群より選択される非ローダミン系化合物を含む標識による蛍光を検出可能なチャネルを備えている、項１７に記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によって、蛍光検出チャネルの特性が異なる機器が混在する状況においても、反応混合物を変えることなく、汎用的に対応でき、インターナルコントロールを簡便且つ確実に検出することが出来る。例えば、高ＲＯＸ機種においてＲＯＸ蛍光、低ＲＯＸ機種においてその機種で使用出来るＲＯＸ以外の蛍光を使用することで、インターナルコントロールを検出することができる。またその逆も可能であり、低ＲＯＸ機種でＲＯＸ蛍光、高ＲＯＸ機種でその機種で使用出来るＲＯＸ以外の蛍光を使用することで、インターナルコントロールを検出することが出来る。従って、本発明により、様々な蛍光検出チャネルを備えた多種類の測定機器に適用可能なｑＰＣＲ反応試薬を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、実施例１において設計したインターナルコントロール核酸、その増幅のための１セットのプライマーセット、及びその増幅産物の検出のための２つの異なる蛍光標識で修飾されたインターナルコントロールプローブ（同じ位置に結合する２つのプローブ）のセットを示す模式図である。
【図２】図２は、実施例１のｑＰＣＲにおける蛍光検出結果を示すグラフである（左図：Ｓｔｅｐ  Ｏｎｅ  Ｐｌｕｓでの検出結果、右図：Ｄｉｃｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩＩでの検出結果）。
【図３】図３は、実施例２において設計したインターナルコントロール核酸、その増幅のための１セットのプライマーセット、及びその増幅産物の検出のための２つの異なる蛍光標識で修飾されたインターナルコントロールプローブ（異なる位置に結合する２つのプローブ）のセットを示す模式図である。
【図４】図４は、実施例２のｑＰＣＲにおける蛍光検出結果を示すグラフである（左図：Ｓｔｅｐ  Ｏｎｅ  Ｐｌｕｓでの検出結果、右図：Ｄｉｃｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩＩでの検出結果）。
【図５】図５は、実施例３において設計したインターナルコントロール核酸、その増幅のための２セットのプライマーセット、及びその各々の増幅産物の検出のための２つの異なる蛍光標識で修飾されたインターナルコントロールプローブ（異なる位置に結合する２つのプローブ）のセットを示す模式図である。
【図６】図６は、実施例３のｑＰＣＲにおける蛍光検出結果を示すグラフである（左図：Ｓｔｅｐ  Ｏｎｅ  Ｐｌｕｓでの検出結果、右図：Ｄｉｃｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩＩでの検出結果）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施の形態は、いずれも本開示の好ましい一具体例を示すものである。したがって、以下の実施の形態で示される、数値、形態、材料、構成要素、構成要素の配置位置、並びに、ステップ及びステップの順序などは、一例であって本開示を限定するものではない。よって、以下の実施の形態における構成要素のうち、本開示の最上位概念を示す独立項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。
【００１６】
なお、各図は、模式図であり、必ずしも厳密に図示されたものではない。また、各図において、実質的に同一の構成に対しては同一の符号を付しており、重複する説明は省略又は簡略化する。
【００１７】
（核酸増幅反応に用いるための試薬）
一つの実施形態において、本発明は、少なくとも以下の（ａ）〜（ｃ）を含む核酸増幅反応に用いるための試薬を提供する：
（ａ）インターナルコントロール核酸（本明細書ではこれを略して、「ＩＣ核酸」ともいう）、
（ｂ）該インターナルコントロール核酸を増幅するための１セット以上のプライマーセット（本明細書ではこれを略して、「ＩＣプライマーセット」ともいう）、及び
（ｃ）該１セット以上のプライマーセットで増幅されるインターナルコントロール核酸由来の二本鎖のいずれか一方の鎖に対して相補的な塩基配列を含み、且つ、蛍光物質を含む標識で修飾された２種以上のインターナルコントロールプローブであって、それぞれ異なる標識で修飾されている、２種以上のインターナルコントロールプローブ（本明細書ではこれを略して、「ＩＣプローブ」ともいう）。
【００１８】
従来、インターナルコントロールの検出においては、通常は１つのインターナルコントロールを検出すればよいことから、その検出のために用いる標識プローブは、１つの標識で修飾された１種類のインターナルコントロールプローブを用いることが一般的であった。これに対し、本発明は、インターナルコントロール核酸及びその増幅のための１セット以上のプライマーセットと共に、異なる標識で修飾されている２種以上のインターナルコントロールプローブを組み合わせて用いることを特徴の一つとする。本発明は、上記のような構成を採用することにより、蛍光検出チャネルの特性に応じてＰＣＲ（ｑＰＣＲを含む）反応液の組成を変更する必要がなくなるので、簡便な手法でありながら異なる蛍光検出チャネル特性を有する複数の測定機種に対応可能となり、確実な検出が望まれるインターナルコントロールの検出を良好に行えるようになるというメリットを有する。
【００１９】
更に、図１〜図３を参照しながら、本発明の実施形態を説明する。本発明は、一つの実施形態として、インターナルコントロール核酸１の検出のための混合物（例えば、試薬）を提供する。該混合物は、インターナルコントロール核酸を増幅するための１セット（７ａ，７ｂ）、若しくは２セット（７ａ，７ｂ，８ａ，８ｂ）、又はそれより多いセット数のプライマーセット、それぞれに異なる蛍光物質（４，５）と必要に応じて消光物質（６ａ，６ｂ）とから構成される標識で修飾された２つ以上のプローブ（２，３）を少なくとも含むことを特徴としている。
【００２０】
本明細書において、インターナルコントロールとは、ＰＣＲ反応（特に、ｑＰＣＲ反応）が阻害物質等の影響を受けずに適切に実施され検出できていることを確認し、偽陰性の可能性を排除するために用いられる外来性コントロールのことをいう。本発明では、インターナルコントロールとして、インターナルコントロール核酸と、インターナルコントロール核酸を増幅し得る１セット以上のプライマーセットと、該プライマーセットで増幅された産物を検出可能な複数のインターナルコントロールプローブとで構成される。
【００２１】
＜（ａ）インターナルコントロール核酸＞
本発明に用いられるインターナルコントロール核酸（ＩＣ核酸）は、同じｑＰＣＲ反応液に含まれ得るインターナルコントロール核酸以外の検出を意図する核酸（即ち、標的核酸）を増幅するためのプライマーセット（本明細書ではこれを、「標的プライマーセット」ともいう）もプローブ（本明細書ではこれを、「標的プローブ」ともいう）も結合しない塩基配列から構成されるものであればよい。ここで、標的プライマーセットも標的プローブも結合しない塩基配列とは、好ましくは、標的プライマーセットを構成する標的プライマーの塩基配列、標的プローブの塩基配列又はこれらと相補的な塩基配列に対して完全同一の塩基配列を含まないことをいう。また、インターナルコントロール核酸は任意の形態であり得、例えば、環状ＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ等であり得るが、限定されない。
【００２２】
本発明において、核酸増幅反応液中に添加されるインターナルコントロール核酸の長さは、本発明の効果を奏する限り、特に限定されない。一例として、ｑＰＣＲにおけるインターナルコントロール核酸は、４０〜１０００塩基長のものを用いることができ、好ましくは６０〜２００塩基長のものを利用することができる。インターナルコントロール核酸としては、任意の核酸を用いることができ、例えば、天然の遺伝子由来の塩基配列を有する核酸を用いてもよいし、人工的に合成した塩基配列を有する核酸を用いてもよい。インターナルコントロール核酸の例として、例えば、公知のヒト由来の遺伝子配列（例えば、ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の塩基配列、ヒトβアクチン遺伝子の塩基配列等）を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００２３】
本発明において、核酸増幅反応液中に含まれるインターナルコントロール核酸の濃度は、本発明の効果を奏する限りにおいて特に限定されない。標的核酸の増幅への影響を抑えつつ、インターナルコントロール核酸の高感度な検出を可能にするという観点から、核酸増幅反応液５０μｌ当りで換算して、例えば１０〜１００００コピー程度、好ましくは５０〜８０００コピー程度、より好ましくは１００〜５０００コピー程度とすることができる。核酸増幅反応液中に添加されるインターナルコントロール核酸のコピー数は、添加するインターナルコントロール核酸の長さ等によっても変動し得るが、当業者は適宜調整して決定することができる。
【００２４】
＜（ｂ）インターナルコントロール核酸を増幅するためのプライマーセット＞
本発明に用いられるインターナルコントロール核酸を増幅するためのプライマーセット（ＩＣプライマーセット）としては、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種一対のプライマーが挙げられる。当該プライマーの長さは、２塩基またはそれ以上の任意の長さであり得る。より具体的には、例えば、ｑＰＣＲ反応に使用されるプライマーの長さは、約１０塩基以上、好ましくは約１３塩基以上、より好ましくは約１５塩基以上であり得る。ｑＰＣＲ反応に使用されるプライマーの長さの上限もまた、本発明の効果を奏し得る限り、特に限定されないが、例えば、約５０塩基以下、好ましくは約４０塩基以下、より好ましくは約３０塩基以下とすることができる。例えば、ｑＰＣＲ反応に使用するプライマーの例として、長さが約１５〜３０塩基のものとすることができる。
【００２５】
本発明において、核酸増幅反応液中に含まれるＩＣプライマー濃度としては、ｑＰＣＲ反応においてＩＣ核酸を増幅でき、本発明の効果を発揮できる限りにおいて、特に限定されない。標的核酸の増幅反応への影響を抑えつつ、インターナルコントロール核酸の高感度で正確な検出を可能にするという観点から、核酸増幅反応液５０μｌ当りで換算して、好ましくは、フォワードプライマーの濃度が約０．０１μＭ〜３μＭであり、かつリバースプライマーの濃度が約０．０１μＭ〜３μＭであると良い。本発明において２セット以上のプライマーセットを用いる場合には、フォワードプライマーとそれに対応するリバースプライマーから構成される一対のプライマーセットが、上記濃度範囲となるような濃度で用いることが好ましい。
【００２６】
＜（ｂ’）標的核酸を増幅するためのプライマーセット＞
特定の更なる実施形態において、本発明の核酸増幅反応に用いるための試薬は、インターナルコントロール核酸以外の標的核酸を増幅するためのプライマーセット（標的プライマーセット）を１つもしくは複数含むことが好ましい。このような標的核酸を増幅するためのプライマーセットもまた、標的核酸を増幅可能なように設計された一方の標的プライマーが他方の標的プライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種一対のプライマーが挙げられる。これらの標的プライマーの長さや反応液中終濃度等は、上記で説明したようなインターナルコントロール核酸を増幅するためのプライマーセットにおけるプライマーの長さと同様であり得る。さらに、インターナルコントロール以外の標的核酸を増幅するプライマーは、増幅対象となる標的核酸が亜型からなる場合には縮重プライマーを含んでもよい。
【００２７】
＜（ｃ）インターナルコントロールプローブ＞
本発明に用いられるインターナルコントロールプローブ（ＩＣプローブ）は、前記のようなＩＣプライマーセットにより増幅されたインターナルコントロール核酸断片の塩基配列又はその相補的な塩基配列に結合し得る塩基配列を有する。このようなインターナルコントロール核酸断片に結合し得る塩基配列としては、通常は、増幅されるインターナルコントロール核酸断片の塩基配列と１００％の同一性を有するものであることが好ましいが、特に限定されず、インターナルコントロール核酸と結合し得る限り、塩基配列の同一性は１００％である必要はない。例えば、塩基配列の同一性は８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上であり得る。また、Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）などの修飾ヌクレオチド等を使用してもよい。
【００２８】
特定の好ましい実施形態において、本発明に用いる２種以上のインターナルコントロールプローブは、検出対象となるインターナルコントロール核酸由来の二本鎖のうちいずれか一方の同じ鎖に対して相補的な塩基配列を有するものとすることができる。即ち、この実施形態では、２種以上のインターナルコントロールプローブは、インターナルコントロール核酸由来の二本鎖のうち全て同じセンス鎖に対して相補的な塩基配列を有するものであってもよいし、インターナルコントロール核酸由来の二本鎖のうち全て同じアンチセンス鎖に対して相補的な塩基配列を有するものであってもよい。
【００２９】
本発明に用いる２種以上のインターナルコントロールプローブは、検出対象となるインターナルコントロール核酸由来の二本鎖において、例えば、同じ位置に相当する部位に相補的な塩基配列を有するものであってもよいし（図１を参照）、一部が重複する位置に相当する部位に相補的な塩基配列を有するものであってもよいし、異なる位置に相当する部位に相補的な塩基配列を有するものであってもよい（図３を参照）。特に限定されないが、例えば、本発明に用いる２種以上のインターナルコントロールプローブは、インターナルコントロール核酸由来の二本鎖の同じ位置と完全に相補的な塩基配列を有するものとすることができ、例えば、２種以上のインターナルコントロールプローブの塩基配列が互いに１塩基又は数塩基のみ異なるものではない塩基配列から構成されるものとしてもよい。更に、後述の実施例の結果に示されるように、２種以上のインターナルコントロールプローブは、インターナルコントロール核酸由来の二本鎖において、互いに異なる位置に相当する部位に結合する塩基配列を有するものである場合の方が、互いに同じ位置に相当する部位に結合する塩基配列を有するものである場合よりも高感度にインターナルコントロールを検出できるので好ましい。互いに異なる位置に相当する部位に結合する２種以上のインターナルコントロールプローブとする場合、これらのプローブが結合する塩基配列の位置は、例えば、互いに１ｂｐ以上離れた位置とすることができ、好ましくは５ｂｐ以上離れた位置とすることができ、より好ましくは１０ｂｐ以上離れた位置とすることができる。
【００３０】
本発明に用いられるインターナルコントロールプローブの塩基配列の長さは、本発明の効果を奏する限り特に限定されず、２塩基またはそれ以上の任意の長さであり得る。より具体的には、例えば、ｑＰＣＲ反応に使用されるインターナルコントロールプローブの塩基配列の長さは、約５塩基以上、好ましくは約８塩基以上、より好ましくは約１０塩基以上であり得る。ｑＰＣＲ反応に使用されるインターナルコントロールプローブの塩基配列の長さの上限もまた、本発明の効果を奏し得る限り、特に限定されないが、例えば、約３０塩基以下、好ましくは約２５塩基以下、より好ましくは約２０塩基以下とすることができる。例えば、ｑＰＣＲ反応に使用するインターナルコントロールプローブの塩基配列の長さの一例として、約１０〜３０塩基長のものとすることができる。
【００３１】
本発明に用いるインターナルコントロールプローブは、少なくとも蛍光物質を含む標識で修飾されていることを一つの特徴とする。なかでも、インターナルコントロールプローブは、蛍光物質及び消光物質を含む標識で修飾されたものであることが好ましい。例えば、インターナルコントロールプローブの塩基配列の一方の末端を蛍光物質で修飾し、他方の末端を当該蛍光物質に対応した消光物質で修飾したものを用いることができる。蛍光物質を含む標識で修飾する核酸プローブとしては、例えば、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ（米国特許第５，２１０，０１５号公報、米国特許第５，５３８，８４８号公報、米国特許第５，４８７，９７２号公報、米国特許第５，８０４，３７５号公報）、モレキュラービーコン（米国特許第５，１１８，８０１号公報）、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ（国際公開第９７／４６７０７号パンフレット，国際公開第９７／４６７１２号パンフレット，国際公開第９７／４６７１４号パンフレット）などが当該分野で公知であり、本発明に好適に使用することができるが、これらに限定されない。
【００３２】
ｑＰＣＲ法において一般的に広く普及しているＴａｑＭａｎプローブ法においては、蛍光物質（４，５）は使用したいｑＰＣＲ機器に合わせて選択すればよく、限定されない。例えば、ローダミン若しくはその誘導体（例えば、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、５−カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ））、又はそれらの塩などのローダミン系化合物；フルオロセイン又はその誘導体（例えば、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５’−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト））、ＶＩＣ（登録商標）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）シリーズ、ローダミン又はその誘導体（例えば、５−カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）やテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ））、Ｃｙ（登録商標）色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５）、若しくはそれらの誘導体、又はそれらの塩等の非ローダミン系化合物等があげられる。本発明においては、インターナルコントロールプローブを修飾する標識の少なくとも１つは、蛍光物質として、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、５−カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ））、又はこれらの塩などのローダミン系化合物を含むものとすることができ、なかでも５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン又はこれらの塩を含むものとすることができる。これらのローダミン系化合物は、蛍光検出に必要とされる濃度調整等が通常必要とされるが、本発明によれば、必ずしもそのような煩雑な調整等を行わなくてもよいというメリットがある。さらに、必要に応じて、使用する蛍光物質にあった消光物質（６ａ，６ｂ）を使用することができる。上記のような蛍光物質に対応した消光物質としては、例えば、ＴＡＭＲＡ（テトラメチル−ローダミン）、ＤＡＢＣＹＬ（４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸）、ＢＨＱ１（ＢＨＱ：Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標））、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
本発明では、異なる標識で修飾されたインターナルコントロールプローブを２種以上用いることを特徴とする。本明細書において、異なる標識で修飾されたインターナルコントロールプローブとは、異なる蛍光物質を含む標識で修飾されたインターナルコントロールプローブのことをいう。従って、同じ消光物質（クエンチャー）を含む標識で修飾されたインターナルコントロールプローブであっても、当該標識を構成する蛍光物質が互いに異なる限り、異なる標識で修飾されたインターナルコントロールプローブに相当する。即ち、本発明では少なくとも、第１の蛍光物質を含む標識で修飾された第１のインターナルコントロールプローブ、及び、第１の蛍光物質とは異なる第２の蛍光物質を含む標識で修飾された第２のインターナルコントロールプローブを用いる。ここで、第１の蛍光物質と第２の蛍光物質の組合せは、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、例えば、第１の蛍光物質がローダミン系化合物であり、且つ、第２の蛍光物質がローダミン系化合物以外の非ローダミン系化合物（例えば、フルオレセイン系化合物、ＶＩＣ系化合物、ＢＯＤＩＰＹ系化合物、Ｃｙ系色素化合物等）である組合せなどであり得る。
【００３４】
特定の好ましい実施形態では、本発明は少なくとも、（１）５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、ローダミン、テトラメチルローダミン、５−カルボキシローダミン６Ｇ、及びこれらの誘導体、並びにこれらの塩からなる群より選択されるローダミン系化合物を含む標識で修飾された第１のインターナルコントロールプローブ、並びに、（２）フルオロセイン、カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、テトラクロロフルオレセイン、５’−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト、ＶＩＣ（登録商標）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、Ｃｙ（登録商標）色素、及びこれらの誘導体、並びにこれらの塩からなる群より選択される非ローダミン系化合物を含む標識で修飾された第２のインターナルコントロールプローブを含むことが好適である。このような第１のインターナルコントロールプローブ及び第２のインターナルコントロールプローブの組合せとすることで、より確実にインターナルコントロールの定量検出が可能となり、汎用性の高いｑＰＣＲ反応試薬とすることができる。
【００３５】
本発明において、核酸増幅反応に用いるための試薬中におけるインターナルコントロールプローブの濃度は、本発明の効果を奏する限り特に限定されず、使用する機器と蛍光によって当業者によって適宜決定され得る。例えば、インターナルコントロールプローブの増幅反応液中の終濃度は、０．０１μＭ〜２００μＭ程度とすることができる。偽陽性又は偽陰性の可能性を低減し、コストも抑えることができ、尚且つ高感度な検出も可能となるという観点から、インターナルコントロールプローブの反応液中終濃度は、好ましくは０．５〜１００μＭ程度とすることができる。
【００３６】
例えば、インターナルコントロールの検出に高ＲＯＸ機種においてＲＯＸ蛍光、低ＲＯＸ機種においてその機種で使用出来るＲＯＸ以外の蛍光を使用する場合、５−及び／又は６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン等のＲＯＸ色素を含む標識で修飾されたインターナルコントロールプローブは、低ＲＯＸ機器で測定するときよりも約１０倍以上の濃度のＲＯＸ色素の使用が必要となり、例えば約０．５μＭ〜１００μＭの濃度で使用できる。逆に、低ＲＯＸ機種でＲＯＸ蛍光、高ＲＯＸ機種でその機種で使用出来るＲＯＸ以外の蛍光を使用する場合、５−及び／又は６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン等のＲＯＸ色素を含む標識で修飾されたインターナルコントロールプローブは、例えば、約０．０１〜０．１μＭ程度の濃度で使用出来る。
【００３７】
＜（ｃ’）標的プローブ＞
特定の更なる実施形態において、本発明の核酸増幅反応に用いるための試薬は、インターナルコントロール核酸以外の標的核酸を検出するためのプローブ（標的プローブ）を１つ以上含むことが好ましい。インターナルコントロール核酸以外の標的核酸を検出するための標的プローブの塩基配列は、インターナルコントロール核酸以外の標的核酸を増幅するための標的プライマーのセット（標的プライマーセット）で増幅された核酸に結合し得る配列であればよいが、インターナルコントロール核酸を増幅するためのプライマーセットで増幅されるインターナルコントロール核酸断片の塩基配列又はその相補的な塩基配列に対して結合し得ない塩基配列を有するものがよく、インターナルコントロール核酸の全長の塩基配列又はその相補的な塩基配列に対して結合し得ない塩基配列を有するものとすることが好ましい。このような標的プローブの長さは、上記で説明したようなインターナルコントロールプローブの長さと同様であり得る。また、増幅対象となる標的核酸が亜型からなる場合には縮重プローブを含んでもよい。
【００３８】
本発明の核酸増幅反応に用いる試薬が上記のような標的プローブを含む場合、標的プローブは、通常は検出したい標的核酸と１００％の同一性を有する塩基配列を有することが好ましいが、特に限定されず、標的核酸と結合し得る限り、塩基配列の同一性は１００％である必要はない。例えば、塩基配列の同一性は８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上であり得る。また、Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）などの修飾ヌクレオチド等を使用してもよい。
【００３９】
本発明の核酸増幅反応に用いる試薬が標的プローブを含む場合、その標的プローブの濃度もまた、インターナルコントロールプローブと同様に、使用する機器と蛍光によって決定され得る。高感度な検出を可能にするという観点から、標的プローブ濃度は、増幅反応液中の終濃度が通常０．００１μＭ〜２００μＭ程度とすることができ、例えば、約０．００５μＭ〜２０μＭ程度であることが好ましく、約０．０１μＭ〜１．５μＭ程度であることがより好ましいが、特に限定されない。
【００４０】
本発明に用いられるｑＰＣＲ反応液には、インターナルコントロール核酸、インターナルコントロール核酸を増幅するためのプライマーセットとその検出のための２種以上の異なる標識で修飾されたインターナルコントロールプローブの他、ｑＰＣＲ反応に通常必要な他の任意の成分を含むことができる。例えば、本発明に用いられるｑＰＣＲ反応液は、上記のようなＩＣ核酸、ＩＣプライマーセット、及び異なる標識で修飾された２種以上のＩＣプローブに加えて、ポリメラーゼ、緩衝剤、適当な塩（例えば、マグネシウム塩又はマンガン塩）、デオキシヌクレオチド三リン酸、インターナルコントロール以外の注目している標的核酸を増幅するためのプライマーセットとその検出のための標識プローブ、さらに必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。
【００４１】
本発明で使用され得るヌクレオチド塩基は、核酸の重合に有用な任意のヌクレオチドであり得る。ヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチドであってもよいし、人工的なヌクレオチドであってよい。一般的にはヌクレオチドはデオキシヌクレオシド三リン酸であり、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、又はこれらの混合物（好ましくは等量混合物）が使用される。ｄＴＴＰの代わり及び／又はその一部としてｄＵＴＰを使用することによって、クロスコンタミネーションを抑制することが可能となり得る。本発明の核酸増幅反応液が、ヌクレオチド塩基を含む場合、各ヌクレオチド塩基がそれぞれ０．１〜０．５ｍＭ、例えば０．２ｍＭ程度となるような濃度で加えられるのがよい。
【００４２】
本発明で使用され得る緩衝剤（緩衝液）としては、特に限定されないが、トリス（Ｔｒｉｓ）、トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、ビスートリシン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ）、ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）などが挙げられる。硫酸、塩酸、酢酸、リン酸などでｐＨを６〜９、より好ましくはｐＨ７〜８に調整されたものであることが好ましい。また、添加する緩衝剤の濃度としては、一例として１０〜２００ｍＭ，より好ましくは２０〜１５０ｍＭで使用される。この際、反応に適当なイオン条件とするために、塩溶液が加えられることが好ましい。塩溶液としては、塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、及び／又は酢酸アンモニウムなどが挙げられる。また、逆転写酵素やポリメラーゼに必要とされるマグネシウム塩やマンガン塩を添加する場合、マグネシウム塩としては、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、マンガン塩としては、塩化マンガン、硫酸マンガン、酢酸マンガンなどが例示され、１〜１０ｍＭ程度加えられることが好ましい。
【００４３】
本発明で使用され得る逆転写酵素としては、ＲＮＡをＤＮＡに変換できれば特に限定されないが、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）−ＲＴ、ＡＭＶ−ＲＴ（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）、ＨＩＶ−ＲＴ、ＲＡＶ２−ＲＴ、ＥＩＡＶ−ＲＴ、カルボキシドサーマス・ハイドロゲノフォルマン（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｍ）ＤＮＡポリメラーゼ）やその変異体、ＴｔｈおよびＴｔｈ様ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｎ２＋存在下で逆転写酵素として機能する）が例示される。特に好ましい例としては、ＭＭＬＶ−ＲＴ、ＡＭＶ−ＲＴ、またはそれらのポリメラーゼ活性が失われていない変異体（例えば、９０％以上、好ましくは９５％以上のアミノ酸配列同一性を有し、且つポリメラーゼ活性が失われていない変異体等）が挙げられる。
【００４４】
本発明で使用され得るポリメラーゼは、どのようなポリメラーゼであってもよく、好ましくはＤＮＡ分子を複製することができるＤＮＡポリメラーゼである。ＰＣＲにおいて代表的なポリメラーゼは、耐熱性ポリメラーゼである。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ、Ｔｔｈ，Ｂｓｔ，ＫＯＤ，Ｐｆｕ，Ｐｗｏ、Ｔｂｒ，Ｔｆｉ，Ｔｆｌ，Ｔｍａ，Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ，Ｚ０５，ＤＥＥＰＶＥＮＴやこれらの変異体が挙げられるが、特に限定されない。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの量は、核酸反応液中の終濃度が少なくとも０．０１Ｕ／μＬ以上であることが好ましい。より好ましくは、０．１５Ｕ／μＬ以上である。
【００４５】
本発明に用いられ得るポリメラーゼは、非特異的反応抑制の効果を高めるため、高温下で活性化する性質を有するものであることが好ましい。本発明に用いられ得るポリメラーゼは、例えば、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体等の抗体と複合体化されたもの、あるいは化学修飾により熱不安定ブロック基のＤＮＡポリメラーゼへ導入したものであることが好ましい。これによりポリメラーゼ反応が始まる前はポリメラーゼの酵素活性を抑制され、ホットスタートＰＣＲへの適用ができるので好ましい。
【００４６】
本発明に使用され得る添加剤としては、例えば、当該技術分野でＰＣＲ増幅反応の効率を向上することが知られる物質を使用することができる。例えば、アミノ酸におけるアミノ基に３個のメチル基を付加した構造を有する第４級アンモニウム塩（ベタイン（例えば、トリメチルグリシン、Ｌ−カルニチン）など）、ウシ血清アルブミン、グリセロール、グリコール、多糖類およびゼラチン、サルコシンやトリメチルグリシンなどのオスモライトファミリーなどから選択されるが、限定するものではない。さらには、当該技術分野でＲＴ−ＰＣＲを促進することが知られる物質と組み合わせて使用することもできる。例えば、グリセロール、ポリオール、プロテアーゼインヒビター、シングルストランド結合タンパク質（ＳＳＢ）、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｔＲＮＡ、硫黄または酢酸含有化合物類、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチレングリコール、ホルムアミド、アセトアミド、ベタイン、エクトイン、トレハロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ），塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）、酢酸テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＡ）、ポリエチレングリコール、トリトンＸ−１００（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、トリトンＸ−１１４（ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４）、ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０），ノニデットＰ４０、Ｂｒｉｊｉ５８などが挙げられるが、これらに限定されない。さらに反応阻害を低減するように、エチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）のようなキレート剤を含んでいてもよい。
【００４７】
＜核酸増幅方法＞
更なる実施形態として、本発明は、前記のような試薬を用いた核酸増幅方法を提供する。即ち、本発明の核酸増幅方法は、少なくとも、（ａ）インターナルコントロール核酸と、（ｂ）該インターナルコントロール核酸を増幅するための１セット以上のプライマーセットと、（ｃ）該１セット以上のプライマーセットで増幅されるインターナルコントロール核酸由来の二本鎖のいずれか一方の鎖に対して相補的な塩基配列を含み、且つ、蛍光物質を含む標識で修飾された２種以上のインターナルコントロールプローブであって、それぞれ異なる標識で修飾されている、２種以上のインターナルコントロールプローブを用いることを特徴とする。
【００４８】
上記のように（ａ）〜（ｃ）成分を少なくとも用いて核酸増幅反応を行うことにより、様々な蛍光検出チャネルを備えた多種類の測定機器において、簡便且つ確実にインターナルコントロールを検出することが可能となり、標的核酸の検出において偽陰性又は偽陽性の発生を抑制することができ、またｑＰＣＲ反応の定量性における確度を高めることができる。
【００４９】
上記の本発明の核酸増幅方法において用いられる（ａ）〜（ｃ）成分、及び必要に応じて用いられる他の成分の種類又は濃度等は、上記核酸増幅反応に用いるための試薬において説明したものと同様であり得る。
【００５０】
特定の好ましい実施形態において、本発明の核酸増幅方法は、インターナルコントロール核酸（ＩＣ核酸）と、インターナルコントロール核酸以外の標的核酸とを同時に増幅させてＰＣＲ反応を行う方法である。なかでも、ＩＣ核酸と標的核酸とを同時に増幅させて定量的ＰＣＲ反応（ｑＰＣＲ反応）を行う方法であることが好ましく、とりわけ定量的なリアルタイムＰＣＲ反応を行う方法であることが好ましい。ここで、ＩＣ核酸と標的核酸とを同時に増幅させるとは、両核酸の増幅反応を同時期に並行して行うことをいう。
【００５１】
更に特定の実施形態において、本発明の核酸増幅方法では、インターナルコントロールプローブ（ＩＣプローブ）及び／又は標的プローブの検出を、特定の蛍光を定量的に検出できる蛍光検出チャネルを備えた測定機器を用いて行う。このような測定機器としては、高濃度のＲＯＸ色素を必要とする高ＲＯＸ機器や、低濃度でもＲＯＸ色素を検出出来る低ＲＯＸ機器等を適宜選択して使用することができる。一つの実施形態では、高ＲＯＸ機器として、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、ローダミン、テトラメチルローダミン、５−カルボキシローダミン６Ｇ、及びこれらの誘導体、並びにこれらの塩からなる群より選択されるローダミン系化合物を約０．５μＭ〜１００μＭの濃度で含む場合に検出可能なチャネルを備えている測定機器を用いることができる。更に別の実施形態では、フルオロセイン、カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、テトラクロロフルオレセイン、５’−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト、ＶＩＣ（登録商標）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、Ｃｙ（登録商標）色素、及びこれらの誘導体、並びにこれらの塩からなる群より選択される非ローダミン系化合物を含む標識による蛍光を検出可能なチャネルを備えている測定機器を用いることができるが、これらに限定されない。
【００５２】
本発明は、任意の核酸増幅方法において実施することができ、例えば、生体由来試料又は環境由来試料に含まれ得る核酸の増幅を行う方法において実施され得る。本発明において用いられ得る生体由来試料（生物学的試料）として、例えばヒト由来であれば糞便（排泄便、直腸便）、嘔吐物、唾液などが挙げられ、ヒト以外の動植物由来であれば食肉、植物の組織の一部などが上げられるが、限定されるものではなく、生体に由来するもの全般に用いることが可能である。環境由来試料としては、下水、河川由来の試料（例えば、濃縮試料）、調理者の手や指からの拭き取り試料、トイレ等からの拭き取り試料などが含まれるが、限定されるものではない。また、これらは直接反応液に供しても良いし、ｑＰＣＲ反応への影響を低減し、より安定した検査結果を得るために、水、生理食塩水または緩衝液に前記試料を懸濁した試料、もしくは市販のキットで核酸を精製したりしてもよいが、これらの処理方法に限定されるものではない。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例をもって、本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００５４】
実施例１．同じ位置に結合するプローブを用いた検出
以下に示される組成にインターナルコントロール核酸、プライマー液、プローブ液を変えて各機器で検出を実施した。
（１）使用機器
高ＲＯＸ機器としてＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、低ＲＯＸ機種としてＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（商標）  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩＩ（タカラバイオ）を使用した。
ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓでは、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＮＥＤ、ＲＯＸ、ＳＹＢＲ、ＴＡＭＲＡ、ＶＩＣの蛍光が選択可能であるが、ＦＡＭ、ＲＯＸ、ＶＩＣを使用した。Ｄｉｃｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩＩはＦＡＭとＲＯＸが使用可能であり、両方を使用した。
【００５５】
（２）反応混合物
反応液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−高速プローブ検出  Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔｅｐ−添付（東洋紡））
酵素液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−高速プローブ検出  Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔｅｐ−添付（東洋紡））
プライマー（インターナルコントロール）ＲＴＰｒｉｍｅｒＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｔｐｒｉｍｅｒｄｂ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）  ＩＤ：２０２１のＦｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１）とＲｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号２）をそれぞれ０．１μＭ
プライマー（ノロウイルス）  厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）記載のＣＯＧ１Ｆ（配列番号３），ＣＯＧ１Ｒ（配列番号４）をそれぞれ０．４μＭ
プローブ（インターナルコントロール）ＲＴＰｒｉｍｅｒＤＢ  ＩＤ：２０２１のｐｒｏｂｅ配列（配列番号５）で、３’ＲＯＸ修飾−５’ＢＨＱ１修飾のプローブ、３’ＶＩＣ修飾−５’ＢＨＱ１修飾のプローブをそれぞれ０．１μＭ
プローブ（ノロウイルス）厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）記載のＲＩＮＧ１−ＴＰ（ａ）（配列番号６）を０．３４μＭ
サンプル（インターナルコントロール核酸）ＨｕｍａｎＧＡＰＤＨ配列含有ＤＮＡ（配列番号７）１０００コピー
サンプル（インターナルコントロール以外の核酸）ノロウイルスＧ１の合成ＲＮＡ（配列番号８）１０００コピー
【００５６】
（３）反応
前記反応液３０μＬと酵素液５μＬを混合し、各プライマー、プローブ、サンプルを所定濃度加え、液量が５０μＬになるよう水で調製した。これを、高ＲＯＸ機器としてＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、低ＲＯＸ機種としてＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（商標）  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩＩ（タカラバイオ）を使用しリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。
【００５７】
（ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ）
４２℃  ４分（逆転写反応）、９５℃  １０秒、
９８℃  １秒−５２℃  １０秒  １０サイクル（ＰＣＲ）
９８℃  １秒−５２℃  ２０秒  ３０サイクル（ＰＣＲ）
ＰＣＲの後半３０サイクルの５２℃伸長ステップにおいて、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＲＯＸ蛍光の読み取りを行った。
（Ｄｉｃｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩＩ）
４２℃  ４分（逆転写反応）、９５℃  １０秒、
９８℃  １０秒−５２℃  ３０秒  １０サイクル（ＰＣＲ）
９８℃  １０秒−５２℃  ２５秒  ３０サイクル（ＰＣＲ）
ＰＣＲの後半３０サイクルの５２℃伸長ステップにおいて、ＦＡＭ、ＲＯＸ蛍光の読み取りを行った。
【００５８】
（４）結果
結果を図１に示す。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ、Ｄｉｃｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩＩの両方において同じ溶液を用いてノロウイルスＧ１およびｈｕｍａｎＧＨＰＤＨを検出した。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓでは、機器上はＲＯＸ蛍光も取得できるが、高ＲＯＸ機器のためＲＯＸ蛍光がほとんど確認されていない。そのため同じ遺伝子を検出するＶＩＣ蛍光色素を使用したプローブで検出した。それに対してＤｉｃｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩＩではＲＯＸ蛍光が確認されている。以上により、一つの溶液を用いて、励起光学、蛍光光学が異なる機器で検出できていることが確認できた。
【００５９】
実施例２．１つのプライマーセットと２つの異なる位置に結合するプローブを用いた検出
（１）使用機器
実施例１と同じ機器を使用した。
（２）反応混合物
反応液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−高速プローブ検出  Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔｅｐ−添付（東洋紡））
酵素液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−高速プローブ検出  Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔｅｐ−添付（東洋紡））
プライマー（インターナルコントロール）ＲＴＰｒｉｍｅｒＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｔｐｒｉｍｅｒｄｂ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）  ＩＤ：２０２１のＦｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１）とＲｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号２）をそれぞれ０．１μＭ
プライマー（ノロウイルス）  厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）記載のＣＯＧ１Ｆ（配列番号３），ＣＯＧ１Ｒ（配列番号４）をそれぞれ０．４μＭ
プローブ（インターナルコントロール）ＲＴＰｒｉｍｅｒＤＢ  ＩＤ：２０２１のｐｒｏｂｅ配列（配列番号５）で３’ＲＯＸ修飾−５’ＢＨＱ１修飾のプローブ、ＲＴＰｒｉｍｅｒＤＢ  ＩＤ：５５のｐｒｏｂｅ配列（配列番号９）で３’ＶＩＣ修飾−５’ＢＨＱ１修飾のプローブをそれぞれ０．１μＭ
プローブ（ノロウイルス）厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）記載のＲＩＮＧ１−ＴＰ（ａ）（配列番号６）を０．３４μＭ
サンプル（インターナルコントロール核酸）ＨｕｍａｎＧＡＰＤＨ配列含有ＤＮＡ（配列番号７）１０００コピー
サンプル（インターナルコントロール以外の核酸）ノロウイルスＧ１の合成ＲＮＡ（配列番号８）１０００コピー
【００６０】
（３）反応
前記反応液３０μＬと酵素液５μＬを混合し、各プライマー、プローブ、サンプルを所定濃度加え、液量が５０μＬになるよう水で調製した。これを、高ＲＯＸ機器としてＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、低ＲＯＸ機種としてＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（商標）  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩＩ（タカラバイオ）を使用しリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。
【００６１】
（ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ）
４２℃  ４分（逆転写反応）、９５℃  １０秒、
９８℃  １秒−５２℃  １０秒  １０サイクル（ＰＣＲ）
９８℃  １秒−５２℃  ２０秒  ３５サイクル（ＰＣＲ）
ＰＣＲの後半３５サイクルの５２℃伸長ステップにおいて、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＲＯＸ蛍光の読み取りを行った。
（Ｄｉｃｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩＩ）
４２℃  ４分（逆転写反応）、９５℃  １０秒、
９８℃  １０秒−５２℃  ３０秒  １０サイクル（ＰＣＲ）
９８℃  １０秒−５２℃  ２５秒  ３５サイクル（ＰＣＲ）
ＰＣＲの後半３５サイクルの５２℃伸長ステップにおいて、ＦＡＭ、ＲＯＸ蛍光の読み取りを行った。
【００６２】
（４）結果
結果を図２に示す。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ、Ｄｉｃｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩＩの両方において同じ溶液を用いてノロウイルスＧ１およびｈｕｍａｎＧＨＰＤＨを検出した。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓでは、機器上はＲＯＸ蛍光も取得できるが、高ＲＯＸ機器のためＲＯＸ蛍光がほとんど確認されていない。そのため同じ遺伝子を検出するＶＩＣ蛍光色素を使用したプローブで検出した。それに対してＤｉｃｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩＩではＲＯＸ蛍光が確認されている。以上により、一つの溶液を用いて、励起光学、蛍光光学が異なる機器で検出できている。
更に、二次効果として、１つのインターナルコントロール核酸遺伝子に結合する２つのプローブ位置が異なる本実施例の場合には、プローブ位置が同じである上記実施例１の場合と比べて蛍光強度が実施例１より高くなり、更に高感度に検出できることが明らかとなった。
【００６３】
実施例３．２つのプライマーセットと２つのプローブを用いた検出
（１）使用機器
実施例１と同じ機器を使用した。
（２）反応混合物
反応液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−高速プローブ検出  Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔｅｐ−添付（東洋紡））
酵素液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−高速プローブ検出  Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔｅｐ−添付（東洋紡））
プライマー（インターナルコントロール）ＲＴＰｒｉｍｅｒＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｔｐｒｉｍｅｒｄｂ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）  ＩＤ：２０２１のＦｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１）とＲｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号２）、ＩＤ：１４４８のＦｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１０）とＲｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１１）をそれぞれ０．１μＭ
プライマー（ノロウイルス）  厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）記載のＣＯＧ１Ｆ（配列番号３），ＣＯＧ１Ｒ（配列番号４）をそれぞれ０．４μＭ
プローブ（インターナルコントロール）ＲＴＰｒｉｍｅｒＤＢ  ＩＤ：２０２１のｐｒｏｂｅ配列（配列番号５）で３’ＶＩＣ修飾−５’ＢＨＱ１修飾のプローブ、ＲＴＰｒｉｍｅｒＤＢ  ＩＤ：１４４８のｐｒｏｂｅ配列（配列番号１２）で３’ＲＯＸ修飾−５’ＢＨＱ１修飾のプローブをそれぞれ０．１μＭ
プローブ（ノロウイルス）厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）記載のＲＩＮＧ１−ＴＰ（ａ）（配列番号６）を０．３４μＭ
サンプル（インターナルコントロール核酸）ＨｕｍａｎＧＡＰＤＨ配列含有ＤＮＡ（配列番号７）１０００コピー
サンプル（インターナルコントロール以外の核酸）ノロウイルスＧ１の合成ＲＮＡ（配列番号８）１０００コピー
【００６４】
（３）反応
前記反応液３０μＬと酵素液５μＬを混合し、各プライマー、プローブ、サンプルを所定濃度加え、液量が５０μＬになるよう水で調製した。これを、高ＲＯＸ機器としてＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、低ＲＯＸ機種としてＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（商標）  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩＩ（タカラバイオ）を使用しリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。
（ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ）
４２℃  ４分（逆転写反応）、９５℃  １０秒、
９８℃  １秒−５２℃  １０秒  １０サイクル（ＰＣＲ）
９８℃  １秒−５２℃  ２０秒  ３０サイクル（ＰＣＲ）
ＰＣＲの後半３０サイクルの５２℃伸長ステップにおいて、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＲＯＸ蛍光の読み取りを行った。
（Ｄｉｃｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩＩ）
４２℃  ４分（逆転写反応）、９５℃  １０秒、
９８℃  １０秒−５２℃  ３０秒  １０サイクル（ＰＣＲ）
９８℃  １０秒−５２℃  ２５秒  ３０サイクル（ＰＣＲ）
ＰＣＲの後半３０サイクルの５２℃伸長ステップにおいて、ＦＡＭ、ＲＯＸ蛍光の読み取りを行った。
【００６５】
（４）結果
結果を図３に示す。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ、Ｄｉｃｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩＩの両方において同じ溶液を用いてノロウイルスＧ１およびｈｕｍａｎＧＨＰＤＨを検出した。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓでは、機器上はＲＯＸ蛍光も取得できるが、高ＲＯＸ機器のためＲＯＸ蛍光がほとんど確認されていない。そのため同じ遺伝子を検出するＶＩＣ蛍光色素を使用したプローブで検出した。それに対してＤｉｃｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩＩではＲＯＸ蛍光が確認されている。以上により、一つの溶液を用いて、励起光学、蛍光光学が異なる機器で検出できており、汎用性の高いｑＰＣＲ反応試薬となることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明は、分子生物学研究、さらに臨床検査や食品衛生管理などを目的とした検査において、好適に用いられる。
【符号の説明】
【００６７】
１：インターナルコントロール核酸
２：第１のインターナルコントロールプローブ
３：第２のインターナルコントロールプローブ
４：第１の蛍光物質
５：第２の蛍光物質
６（６ａ，６ｂ）：消光物質
７（７ａ，７ｂ）：第１のインターナルコントロールプライマーセット
８（８ａ，８ｂ）：第２のインターナルコントロールプライマーセット
【図１】
2020184889.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
2020184889.tif 000005
【図５】
2020184889.tif 000006
【図６】
2020184889.tif 000007
【配列表】
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