(57)【要約】      （修正有）【課題】形質転換効率の向上した、カプリアビダス属微生物の形質転換体、及び、該形質転換体を用いたコンピテントセルを提供すること。【解決手段】下記（ａ）で示した遺伝子、及び、下記（ｂ）で示した遺伝子が改変または欠損された、カプリアビダス属微生物である形質転換体。（ａ）タイプＩ制限修飾系に関わる酵素をコードする遺伝子群のうち少なくとも１つの遺伝子。（ｂ）メチルアデニン特異的な制限系をコードする遺伝子、及び、５′−ｍｅＣｐＧ配列を制限するメチルシトシン制限系をコードする遺伝子、からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）で示した遺伝子、及び、下記（ｂ）で示した遺伝子が改変または欠損された、カプリアビダス属微生物である形質転換体。
（ａ）タイプＩ制限修飾系に関わる酵素をコードする遺伝子群のうち少なくとも１つの遺伝子。
（ｂ）メチルアデニン特異的な制限系をコードする遺伝子、及び、５′−ｍｅＣｐＧ配列を制限するメチルシトシン制限系をコードする遺伝子、からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子。
【請求項２】
前記（ｂ）で示した遺伝子として、メチルアデニン特異的な制限系をコードする遺伝子であるｍｒｒ遺伝子、又は、ｍｒｒ遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列をコードする遺伝子が 改変または欠損された、請求項１に記載の形質転換体。
【請求項３】
前記（ｂ）で示した遺伝子として、５′−ｍｅＣｐＧ配列を制限するメチルシトシン制限系をコードする遺伝子であるＡ００１４遺伝子、又は、Ａ００１４遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列をコードする遺伝子が改変または欠損された、請求項１又は２に記載の形質転換体。
【請求項４】
前記（ａ）で示した遺伝子として、少なくとも、Ａ０００６遺伝子、又は、Ａ０００６遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列をコードする遺伝子が改変または欠損された、請求項１〜３のいずれか一項に記載の形質転換体。
【請求項５】
５′−ＧｐｍｅＣ配列を制限するメチルシトシン制限系をコードする遺伝子が、さらに改変または欠損された、請求項１〜４のいずれか一項に記載の形質転換体。
【請求項６】
カプリアビダス属微生物が、カプリアビダス  ネカトールである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の形質転換体。
【請求項７】
カプリアビダス属微生物が、カプリアビダス  ネカトールＨ１６である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の形質転換体からコンピテントセルを調製する工程を含む、コンピテントセルの製造方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の形質転換体からコンピテントセルを調製する工程、及び、前記コンピテントセルを凍結する工程を含む、凍結コンピテントセルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カプリアビダス属微生物の形質転換体、及び、それを用いたコンピテントセルの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カプリアビダス  ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）Ｈ１６株は、別名ラルストニア  ユートファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）Ｈ１６株とも呼ばれ、カプリアビダス属に属するグラム陰性細菌である。Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒは、ポリヒドロキシアルカン酸（Ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ；ＰＨＡ）の生産宿主として利用されている（非特許文献１参照）。その他にも、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒは遺伝子改変の容易さ、ＲｕｂｉｓＣＯによる炭酸ガス固定能力、水素利用能力などの優位性から、イソプロパノールやブタノールなど幅広い物質の生産研究を行うためのプラットフォームとして利用されている（非特許文献２参照）。
【０００３】
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒを遺伝子改変するにあたっては、シャトルベクターとして広宿主域プラスミドであるｐＢＢＲ１−ＭＣＳ２、ｐＢＨＲ１、ｐＪＲＤ２１５、又は、安定性を改良したｐＣＵＰ２を利用することができる（特許文献１参照）。一般に、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒにこれらベクターを導入する際は、エレクトロポレーション法や接合伝達法が用いられる。エレクトロポレーション法は接合伝達法に比べて作業が簡便という利点がある。しかしながら、エレクトロポレーション法によるＣ．ｎｅｃａｔｏｒの形質転換効率は、大腸菌エシェリキア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を宿主とする市販のコンピテントセル（１０８〜１０１０ＣＦＵ／μｇ  ＤＮＡ）と比べて極めて低い。
【０００４】
非特許文献３では、エレクトロポレーション法の諸条件を改良して、１０５ＣＦＵ／μｇ  ＤＮＡまでＣ．ｎｅｃａｔｏｒの形質転換効率を改善したことが報告されている。また、非特許文献４では、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の制限修飾系遺伝子群に属するＡ０００４−０００９遺伝子を欠損することで形質転換効率を改善したことが報告されている。
【０００５】
しかしながら、プラスミド導入効率としては依然大腸菌には及ばず、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒの形質転換効率のさらなる向上が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第５６５０３６８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】J. Liu, CJ. Bringham, S. Li, AJ. Sinskey, Biotechnology for Biofuel Production and Optimization, pp. 325-351, 2016
【非特許文献２】J. Chakravarty, CJ. Brigham, Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 102, pp. 5021-5031, 2018
【非特許文献３】KL Tee, J. Grinham, AM. Othusitse, M. Gonzalez-Villanueva, AO. Johnson, TS. Wong, Biotechnol. J., vol. 12, 170081, 2017
【非特許文献４】B. Xiong, Z. Li, L. Liu, D. Zhao, X. Zhang, C. Bi, Biotechnology for Biofuels, vol. 11, 172, 2018
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在、カプリアビダス属微生物の形質転換効率は低く、形質転換効率の向上が望まれている。
本発明は、上記現状に鑑み、形質転換効率の向上した、カプリアビダス属微生物の形質転換体、及び、該形質転換体を用いたコンピテントセルを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、カプリアビダス属微生物が有する特定の遺伝子を改変または欠損した形質転換体は、カプリアビダス属微生物の形質転換効率を大幅に改善できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、下記（ａ）で示した遺伝子、及び、下記（ｂ）で示した遺伝子が改変または欠損された、カプリアビダス属微生物である形質転換体に関する。
（ａ）タイプＩ制限修飾系に関わる酵素をコードする遺伝子群のうち少なくとも１つの遺伝子。
（ｂ）メチルアデニン特異的な制限系をコードする遺伝子、及び、５′−ｍｅＣｐＧ配列を制限するメチルシトシン制限系をコードする遺伝子、からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子。
【００１１】
前記（ｂ）で示した遺伝子として、メチルアデニン特異的な制限系をコードする遺伝子であるｍｒｒ遺伝子、又は、ｍｒｒ遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列をコードする遺伝子が改変または欠損されたことが好ましい。
【００１２】
前記（ｂ）で示した遺伝子として、５′−ｍｅＣｐＧ配列を制限するメチルシトシン制限系をコードする遺伝子であるＡ００１４遺伝子、又は、Ａ００１４遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列をコードする遺伝子が改変または欠損されたことが好ましい。
【００１３】
前記（ａ）で示した遺伝子として、少なくとも、Ａ０００６遺伝子、又は、Ａ０００６遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列をコードする遺伝子が改変または欠損されたことが好ましい。
【００１４】
５′−ＧｐｍｅＣ配列を制限するメチルシトシン制限系をコードする遺伝子が、さらに改変または欠損されたことが好ましい。
【００１５】
カプリアビダス属微生物が、カプリアビダス  ネカトールであることが好ましく、カプリアビダス  ネカトールＨ１６であることがより好ましい。
【００１６】
また本発明は、前記形質転換体からコンピテントセルを調製する工程を含む、コンピテントセルの製造方法にも関する。
【００１７】
さらに本発明は、前記形質転換体からコンピテントセルを調製する工程、及び、前記コンピテントセルを凍結する工程を含む、凍結コンピテントセルの製造方法にも関する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、形質転換効率の向上した、カプリアビダス属微生物の形質転換体、及び、該形質転換体を用いたコンピテントセルを提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
本発明の形質転換体は、カプリアビダス属微生物を宿主とする形質転換体であって、カプリアビダス属微生物が本来有する、制限修飾系に関わる酵素をコードする遺伝子が改変または欠損されているものである。
【００２０】
カプリアビダス属微生物としては特に限定されないが、好ましくはカプリアビダス  ネカトールであり、より好ましくはカプリアビダス  ネカトールＨ１６である。本発明の形質転換体の宿主であるカプリアビダス属微生物は、天然由来のものであってもよいし、遺伝子操作が行われたものであってもよい。
【００２１】
一般に、制限修飾系は外来ＤＮＡの切断及び／又は分解に関与するとされており、タイプＩ−ＩＶに分類される。微生物によって保持している制限修飾系は異なるが、例えばカプリアビダス  ネカトールＨ１６の染色体上には、タイプＩ制限修飾系に関連する遺伝子群として、Ａ０００４遺伝子（配列番号１）、Ａ０００５遺伝子（配列番号２）、及び、Ａ０００６遺伝子（配列番号３）の三種が存在しており、また、タイプＩＶ制限修飾系に関連する遺伝子群として、Ａ０００８遺伝子（別名：ｍｃｒＢ遺伝子、配列番号４）、Ａ０００９遺伝子（別名：ｍｃｒＣ遺伝子、配列番号５）、Ａ００１４遺伝子（別名：ｍｃｒＡ遺伝子、配列番号６）、及び、ｍｒｒ遺伝子（別名：ＰＨＧ１７０遺伝子、配列番号７）の四種が存在している。カプリアビダス  ネカトールＨ１６の染色体上には、上記の遺伝子以外にも、Ａ０００７遺伝子（配列番号８）が存在している。Ａ０００７遺伝子は、金属依存性加水分解酵素をコードする遺伝子として知られている。
【００２２】
本発明の形質転換体は、カプリアビダス属微生物において、少なくとも、下記（ａ）で示した遺伝子、及び、下記（ｂ）が改変または欠損されたものである。これら２種類の遺伝子が改変または欠損されることによって、カプリアビダス属微生物の形質転換効率を大幅に改善することができる。
（ａ）タイプＩ制限修飾系に関わる酵素をコードする遺伝子群のうち少なくとも１つの遺伝子。
（ｂ）メチルアデニン特異的な制限系をコードする遺伝子、及び、５′−ｍｅＣｐＧ配列を制限するメチルシトシン制限系をコードする遺伝子、からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子。
【００２３】
前記（ａ）におけるタイプＩ制限修飾系に関わる酵素は、Ｍ、Ｓ、及びＲという３種のサブユニットから構成される酵素であって、それぞれ、ＤＮＡメチル化、配列認識、及びＤＮＡ切断の役割を担っている。カプリアビダス  ネカトールＨ１６では、上述のとおり、タイプＩ制限修飾系に関わる酵素をコードする遺伝子群として、Ａ０００４遺伝子、Ａ０００５遺伝子、及び、Ａ０００６遺伝子の三種が存在している。本発明の形質転換体では、これら三種のうちいずれか一つの遺伝子が改変または欠損されていればよく、２つ以上の遺伝子が改変または欠損されていてもよい。なかでも、Ａ０００６遺伝子は制限酵素（ＤＮＡ切断）をコードする遺伝子であり、少なくともこれが改質または欠損されていれば、導入するＤＮＡが切断されず、形質転換効率が改善されるため、少なくともＡ０００６遺伝子が改変または欠損されていることが好ましい。また、ＤＮＡメチル化は他の制限修飾系のターゲットになる可能性があるためＤＮＡメチル化や配列認識に関わる酵素も改質または欠損されていることが形質転換効率向上の観点から好ましく、よって、Ａ０００４遺伝子、Ａ０００５遺伝子、及び、Ａ０００６遺伝子のすべてが改変または欠損されていることがより好ましい。
【００２４】
前記（ｂ）におけるメチルアデニン特異的な制限系をコードする遺伝子、及び、５′−ｍｅＣｐＧ配列を制限するメチルシトシン制限系をコードする遺伝子は、上述したタイプＩＶ制限修飾系に関連する遺伝子群に含まれるものである。メチルアデニン特異的な制限系をコードする遺伝子としては、ｍｒｒ遺伝子が挙げられる。また、５′−ｍｅＣｐＧ配列を制限するメチルシトシン制限系をコードする遺伝子としては、Ａ００１４遺伝子が挙げられる。本発明の形質転換体では、前記（ｂ）で示した遺伝子として、ｍｒｒ遺伝子のみが改変または欠損されていてもよいし、また、Ａ００１４遺伝子のみが改変または欠損されていてもよいし、また、ｍｒｒ遺伝子とＡ００１４遺伝子の双方が改変または欠損されていてもよい。
【００２５】
さらに本発明の形質転換体では、前記（ａ）で示した遺伝子、及び、前記（ｂ）で示した遺伝子以外の遺伝子も改変または欠損されていてよい。そのような他の遺伝子としては、タイプＩＶ制限修飾系に関連する遺伝子群に属する５′−ＧｐｍｅＣ配列を制限するメチルシトシン制限系をコードする遺伝子であるＡ０００８遺伝子及びＡ０００９遺伝子が挙げられる。本発明の形質転換体では、これらのうちいずれか１つ又は双方が改変または欠損されていることが好ましい。
【００２６】
特に好ましい実施形態によると、本発明の形質転換体は、カプリアビダス属微生物がカプリアビダス  ネカトールＨ１６であり、（ａ）で示した遺伝子として、Ａ０００４遺伝子、Ａ０００５遺伝子、及び、Ａ０００６遺伝子のすべてを欠損し、（ｂ）で示した遺伝子として、ｍｒｒ遺伝子及び／又はＡ００１４遺伝子を欠損し、さらに、Ａ０００８遺伝子及びＡ０００９遺伝子も欠損している。最も好ましい実施形態によると、本発明の形質転換体は、Ａ０００４遺伝子からＡ０００９遺伝子までの全ての遺伝子と、ｍｒｒ遺伝子及びＡ００１４遺伝子を欠損している。
【００２７】
上述したＡ０００４遺伝子〜Ａ０００９遺伝子、Ａ００１４遺伝子、ｍｒｒ遺伝子などの遺伝子名は、カプリアビダス  ネカトールＨ１６が有する遺伝子名を示すものである。ネカトールＨ１６以外のカプリアビダス属微生物で改変または欠損すべき遺伝子は、ネカトールＨ１６で改変または欠損すべき各遺伝子に機能上対応する遺伝子であればよい。そのような対応遺伝子は、カプリアビダス  ネカトールＨ１６が有する特定遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列と８５％以上（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上）の配列同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつ前記特定遺伝子がコードするタンパク質と同じ機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であればよい 。
【００２８】
本願において、遺伝子が改変または欠損されるとは、該遺伝子がコードするタンパク質の機能が部分的または完全に損なわれるように遺伝子操作が行われていることを意味する。具体的な手法は特に限定されず、公知の方法を適宜使用することができるが、例えば、標的遺伝子の一部分または全長を欠失させる方法、標的遺伝子のＯＲＦ中に終止コドンを挿入する方法、標的遺伝子の開始コドンを欠失させる方法、標的遺伝子の機能が損なわれるように標的遺伝子のＯＲＦ中に塩基を挿入する方法、標的遺伝子の発現量が低下するように該遺伝子のプロモーター領域に改変または欠失を加える方法等が挙げられる。
【００２９】
微生物が保有するＤＮＡ上に任意の塩基配列を部位特異的に置換又は挿入する方法、または、微生物が保有するＤＮＡ中の任意の塩基配列を欠失させる方法は当業者に広く知られており、本発明の形質転換体を製造する際に使用できる。代表的な方法としては、トランスポゾンと相同組換えの機構を利用した方法（Ｏｈｍａｎ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．１６２：ｐ．１０６８（１９８５））、相同組換えの機構によって起こる部位特異的な組み込みと第二段階の相同組換えによる脱落を原理とした方法（Ｎｏｔｉ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，ｖｏｌ．１５４，ｐ．１９７（１９８７））、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｓａｃＢ遺伝子を共存させて、第二段階の相同組換えによって遺伝子が脱落した微生物株をシュークロース添加培地耐性株として容易に単離する方法（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．６，ｐ．１１９５（１９９２）；Ｌｅｎｚ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．１７６，ｐ．４３８５（１９９４））等が挙げられる。また、微生物へのベクターの導入方法としても特に限定されないが、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、スフェロプラスト法等が挙げられる。
【００３０】
なお、遺伝子クローニングや遺伝子組み換え技術については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９又は２００１）などに記載される技術を利用することができる。
【００３１】
本発明の形質転換体は、上述した遺伝子以外の遺伝子がさらに改変または欠損されていてもよいし、また、外来の遺伝子が導入されたものであってもよい。
【００３２】
本発明の形質転換体は、エレクトロポレーション法による形質転換効率が向上したものであるため、エレクトロポレーション法により形質転換を行う際の宿主として好適に使用することができ、また、エレクトロポレーション法に使用可能なコンピテントセル（形質転換受容性細胞）を製造するために好適に使用することができる。
【００３３】
本発明の形質転換体からコンピテントセルを調製するための方法としては特に限定されず常法に従うことができるが、例えば、形質転換体を水で洗浄することで調製することができる。また、電解質が添加されていなスクロース溶液、グリセロール溶液、ソルビトール溶液などで形質転換体を洗浄することで調製することも可能である。
本発明の形質転換体から凍結コンピテントセルを調製するための方法としても特に限定されず常法に従うことができるが、例えば、形質転換体を水で洗浄した後、１０％グリセロール溶液に懸濁し、液体窒素で凍結することで調製することかできる。グリセロールは凍結時に浸透圧保護剤として作用し得る。
【実施例】
【００３４】
以下に実施例を掲げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３５】
以下で説明する遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））の記載を参照して実施することができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用することができる。なお、前記酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。
【００３６】
（製造例１）Ｈ１６  ΔＡ０００４−０００９株の作製
まず、Ａ０００４−Ａ０００９遺伝子クラスターを破壊するためのプラスミドベクターを作製した。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、Ａ０００４上流配列とＡ０００９下流配列を有するＤＮＡ断片（配列番号９）を得た。取得したＤＮＡ断片を、特開２００７−２５９０８号公報記載のｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢベクターをＳｍｉＩ消化したＤＮＡ断片と、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（タカラバイオ）にて連結し、プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ｄＡ０００４−０００９を得た。
【００３７】
次に、当該プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ｄＡ０００４−０００９を用いてＨ１６  ΔＡ０００４−０００９株を作製した。プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ｄＡ０００４−０００９を大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７０５５）に導入した。得られた形質転換体を、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株とＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ）上で混合培養して接合伝達を行った。
【００３８】
得られた培養液を、２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、りん酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、りん酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ｄＡ０００４−０００９がＣ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ）で２世代培養した後、１５％のショ糖を含むＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、プラスミドが脱落した株を取得した。得られた形質転換体から、ＰＣＲおよびＤＮＡシーケンサーによる解析により染色体上のＡ０００４遺伝子の開始コドンからＡ０００９遺伝子の終止コドンまでを欠失した菌株１株を単離した。この遺伝子破壊株をＨ１６  ΔＡ０００４−０００９株と命名した。Ｈ１６  ΔＡ０００４−０００９株は、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株を宿主とし、染色体上のＡ０００４遺伝子の開始コドンからＡ０００９遺伝子の終止コドンまでを欠失した菌株である。
【００３９】
（製造例２）Ｈ１６  ΔＡ００１４株の作製
まず、Ａ００１４遺伝子を破壊するためのプラスミドベクターを作製した。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、Ａ００１４遺伝子の上流配列と下流配列を有するＤＮＡ断片（配列番号１０）を得た。取得したＤＮＡ断片を、ｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢベクターをＳｍｉＩ消化したＤＮＡ断片と、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔにて連結し、プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ｄＡ００１４を得た。
【００４０】
このプラスミドベクターを利用し、製造例１と同様の方法でＨ１６  ΔＡ００１４株を取得した。Ｈ１６  ΔＡ００１４株は、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株を宿主とし、染色体上のＡ００１４遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した菌株である。
【００４１】
（製造例３）Ｈ１６  Δｍｒｒ株の作製
まず、ｍｒｒ遺伝子を破壊するためのプラスミドベクターを作製した。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、ｍｒｒ遺伝子の上流配列と下流配列を有するＤＮＡ断片（配列番号１１）を得た。取得したＤＮＡ断片を、ｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢベクターをＳｍｉＩ消化したＤＮＡ断片と、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔにて連結し、プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ｄｍｒｒを得た。
【００４２】
このプラスミドベクターを利用し、製造例１と同様の方法でＨ１６  Δｍｒｒ株を取得した。Ｈ１６  Δｍｒｒ株は、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株を宿主とし、染色体上のｍｒｒ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した菌株である。
【００４３】
（製造例４）Ｈ１６  ΔＡ０００４−０００９  Δｍｒｒ株の作製
製造例１で作製したＨ１６  ΔＡ０００４−０００９株を親株として、製造例３と同様の方法でｍｒｒ遺伝子を破壊し、Ｈ１６  ΔＡ０００４−０００９  Δｍｒｒ株を作製した。Ｈ１６  ΔＡ０００４−０００９  Δｍｒｒ株は、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株を宿主とし、染色体上のＡ０００４遺伝子の開始コドンからＡ０００９遺伝子の終止コドンまで、及び、ｍｒｒ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した菌株である。
【００４４】
（製造例５）Ｈ１６  ΔＡ０００４−０００９  ΔＡ００１４  Δｍｒｒ株の作製
製造例４で作製したＨ１６  ΔＡ０００４−０００９  Δｍｒｒ株を親株として、製造例２と同様の方法でＡ００１４遺伝子を破壊し、Ｈ１６  ΔＡ０００４−０００９  ΔＡ００１４  Δｍｒｒ株を作製した。Ｈ１６  ΔＡ０００４−０００９  ΔＡ００１４  Δｍｒｒ株は、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株を宿主とし、染色体上のＡ０００４遺伝子の開始コドンからＡ０００９遺伝子の終止コドンまで、Ａ００１４遺伝子の開始コドンから終止コドンまで、及び、ｍｒｒ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した菌株である。
【００４５】
（比較例１）  Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の形質転換効率の評価
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の形質転換効率の評価は、特許５６５０３６８号記載のｐＣＵＰ２ベクターを用いて、以下の通り行った。
【００４６】
まず、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株をＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ）で一晩培養した。得られた培養液２５０μＬをＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ培地５０ｍＬに接種し、３０℃で５時間培養した。得られた培養液のうち３０ｍＬを遠沈管に移し、遠心して菌体を回収した。得られた菌体を氷冷水１ｍＬに懸濁してマイクロチューブに移し、遠心して菌体を回収した。菌体を氷冷水１ｍＬで５回洗浄したのち、ＯＤ６００＝１０となるように１０％グリセロール溶液に懸濁することにより、エレクトロ・コンピテントセルを得た。菌体液１００μＬをｐＣＵＰ２水溶液１０μＬ（５０ｎｇ）と混和し、０．２ｃｍ幅キュベットに注入してエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションは、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒエレクトロポレーター（バイオ・ラッド）を使用し、電圧１．５ｋＶ、抵抗８００Ω、静電容量２５μＦでパルスした。パルス後、速やかにＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ培地を１ｍＬ添加して混和し、３０℃で３時間インキュベートした。その後、カナマイシン１００μｇ／ｍＬを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地に塗布した。３０℃で２日間静置培養し、コロニー数をカウントしてＣＦＵ／μｇ  ＤＮＡを算出した。得られた結果を表１に示した。
【００４７】
（比較例２）  Ｈ１６  ΔＡ０００４−０００９株の形質転換効率の評価
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の代わりに、製造例１で作製したＨ１６  ΔＡ０００４−０００９株を用いて、比較例１と同様の方法で形質転換効率を評価した。得られた結果は表１に示した。
【００４８】
（比較例３）  Ｈ１６  ΔＡ００１４株の形質転換効率の評価
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の代わりに、製造例２で作製したＨ１６  ΔＡ００１４株を用いて、比較例１と同様の方法で形質転換効率を評価した。得られた結果は表１に示した。
【００４９】
（比較例４）  Ｈ１６  Δｍｒｒ株の形質転換効率の評価
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の代わりに、製造例３で作製したＨ１６  Δｍｒｒ株を用いて、比較例１と同様の方法で形質転換効率を評価した。得られた結果は表１に示した。
【００５０】
（実施例１）  Ｈ１６  ΔＡ０００４−０００９  Δｍｒｒ株の形質転換効率の評価
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の代わりに、製造例４で作製したＨ１６  ΔＡ０００４−０００９  Δｍｒｒ株を用いて、比較例１と同様の方法で形質転換効率を評価した。得られた結果は表１に示した。
【００５１】
（実施例２）  Ｈ１６  ΔＡ０００４−０００９  ΔＡ００１４  Δｍｒｒ株の形質転換効率の評価
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の代わりに、製造例５で作製したＨ１６  ΔＡ０００４−０００９  ΔＡ００１４  Δｍｒｒ株を用いて、比較例１と同様の方法で形質転換効率を評価した。得られた結果は表１に示した。
【００５２】
【表１】
2020065460.tif 000002
【００５３】
＜考察＞
表１の比較例１と比較例３又は比較例４の結果を比べると、Ａ００１４遺伝子又はｍｒｒ遺伝子の単独破壊は、形質転換効率に影響しないことが分かる。また、比較例２の結果より、Ａ０００４−０００９の５遺伝子を破壊することで、非特許文献４に記載されているように、形質転換効率が飛躍的に向上することが分かる。
【００５４】
更に、実施例１及び実施例２の結果より、Ａ０００４−０００９の５遺伝子に加えて、ｍｒｒ遺伝子及び／又はＡ００１４遺伝子を破壊することで、ｍｒｒ遺伝子又はＡ００１４遺伝子の単独破壊では効果がないにも関わらず、形質転換効率が比較例２よりも更に上昇することが分かる。
【００５５】
以上の結果より、Ａ０００４−０００９遺伝子に加えて、単独破壊では効果のないｍｒｒ遺伝子及び／又はＡ００１４遺伝子を合わせて破壊することが、形質転換効率向上に有効であることが分かる。
【００５６】
（比較例５）  Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の形質転換効率の評価（凍結コンピテントセル）
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株を用いて、比較例１と同様の方法でエレクトロ・コンピテントセル１．２  ｍＬを調製した後、４００μＬをマイクロチューブに移して液体窒素で凍結し、凍結コンピテントセルを調製した。凍結コンピテントセルを氷上で融解した後、比較例１と同様の方法で形質転換効率を評価した。得られた結果は表２に示した。
【００５７】
（比較例６）  Ｈ１６  ΔＡ０００４−０００９株の形質転換効率の評価（凍結コンピテントセル）
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の代わりに、製造例１で作製したＨ１６  ΔＡ０００４−０００９株を用いて、比較例５と同様の方法で形質転換効率を評価した。得られた結果は表２に示した。
【００５８】
（実施例３）  Ｈ１６  ΔＡ０００４−０００９  Δｍｒｒ株の形質転換効率の評価（凍結コンピテントセル）
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の代わりに、製造例４で作製したＨ１６  ΔＡ０００４−０００９  Δｍｒｒ株を用いて、比較例５と同様の方法で形質転換効率を評価した。得られた結果は表２に示した。
【００５９】
（実施例４）  Ｈ１６  ΔＡ０００４−０００９  ΔＡ００１４  Δｍｒｒ株の形質転換効率の評価（凍結コンピテントセル）
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の代わりに、製造例５で作製したＨ１６  ΔＡ０００４−０００９  ΔＡ００１４  Δｍｒｒ株を用いて、比較例５と同様の方法で形質転換効率を評価した。得られた結果は表２に示した。
【００６０】
【表２】
2020065460.tif 000003
【００６１】
＜考察＞
表２では、エレクトロ・コンピテントセルの凍結・融解後の形質転換効率を示した。
【００６２】
まず比較例５の結果より、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株のエレクトロ・コンピテントセルを凍結・融解すると、形質転換能が著しく低下することが分かる。一方、比較例６の結果より、Ａ０００４−０００９破壊株では、凍結・融解後にも形質転換能が残存することが分かる。
【００６３】
更に、実施例３及び実施例４の結果より、Ａ０００４−０００９遺伝子に加えて、ｍｒｒ遺伝子及び／又はＡ００１４遺伝子を破壊することで、凍結・融解後の形質転換能が比較例６よりも上昇することが分かる。
【００６４】
以上の結果より、Ａ０００４−０００９遺伝子に加えて、ｍｒｒ遺伝子及び／又はＡ００１４遺伝子を合わせて破壊することが、形質転換能に優れた凍結エレクトロ・コンピテントセルの調製に有用であることが分かる。
【配列表】
2020065460000001.app