(57)【要約】【課題】植物組織の培養細胞内で産生される代謝中間体を基質として、その代謝フローをスイッチングさせることで得られる、新規ヒドロキシ安息香酸誘導体の生合成方法の提供を目的とする。【解決手段】タケ植物由来の培養細胞が産生する二次代謝産物の代謝中間体を基質とし、導入した外来の二次代謝生合成遺伝子により得られることを特徴とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タケ植物由来の培養細胞が産生する二次代謝産物の代謝中間体を基質とし、導入した外来の二次代謝生合成遺伝子により得られることを特徴とするヒドロキシ安息香酸誘導体の生合成方法。
【請求項２】
前記外来の二次代謝生合成遺伝子は、シュードモナス  プチダ由来の４−ヒドロキシシンナモイル−ＣｏＡヒドラターゼ／リアーゼをコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１記載のヒドロキシ安息香酸誘導体の生合成方法。
【請求項３】
前記タケ植物由来の培養細胞が産生する二次代謝産物は、ヒドロキシ桂皮酸誘導体であることを特徴とする請求項１又は２記載のヒドロキシ安息香酸誘導体の生合成方法。
【請求項４】
前記ヒドロキシ安息香酸誘導体は、グルコースエステル体又はグルコースエーテル体であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のヒドロキシ安息香酸誘導体の生合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物培養細胞を用いたヒドロキシ安息香酸誘導体の生合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
４−ヒドロキシ安息香酸（パラベン）は、抗菌剤に広く使用されている。
また、そのグルコースエステル体等がアンチエージング剤としての検討もされている。
これまでの、この種のヒドロキシ安息香酸誘導体は化学合成に頼っており、環境への負荷が大きく、また消費エネルギーが大きいことも問題となっている。
【０００３】
本発明者らは、これまでに植物組織からカルスの誘導及びその培養細胞に成果を得ており（特許文献１）、また植物培養細胞内での活発な代謝経路を利用した「合理的代謝フロースィッチング」を提案している（特許文献２）。
本発明は、これまでの成果をヒドロキシ安息香酸誘導体の生合成に応用すべく研究した結果、得られた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１４−５４２３０号公報
【特許文献２】特開２０１４−１５８４５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、植物組織の培養細胞内で産生される代謝中間体を基質として、その代謝フローをスイッチングさせることで得られる、新規ヒドロキシ安息香酸誘導体の生合成方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に係るヒドロキシ安息香酸誘導体の生合成方法は、タケ植物由来の培養細胞が産生する二次代謝産物の代謝中間体を基質とし、導入した外来の二次代謝生合成遺伝子により得られることを特徴とする。
【０００７】
タケ植物に由来する組織は、フェニルプロパノイド代謝が活発であることが、本発明者らの研究にて明らかになっている（特許文献２）。
本発明は、このフェニルプロパノイド代謝系にて産生される中間体を基質とする外来の二次代謝生合成酵素を導入することで、新たな代謝経路にスィッチングした点に特徴がある。
【０００８】
ここで、外来の二次代謝生合成遺伝子は、シュードモナス  プチダ由来の４−ヒドロキシシンナモイル−ＣｏＡヒドラターゼ／リアーゼをコードする遺伝子であるのが好ましい。
シュードモナス  プチダ（Pseudomonas putida）は、グラム陰性桿菌に属する土壌微生物であり、例えばＫＴ２４４０株由来の４−ヒドロキシシンナモイル−ＣｏＡヒドラターゼ／リアーゼ（ＰｐＨＣＨＬ：4-hydroxycinnamoyl - CoA hydratase / lyase）は、４−ヒドロキシ桂皮酸に係る代謝経路に関する酵素である。
よって、タケ植物由来の培養細胞が産生する二次代謝産物は、ヒドロキシ桂皮酸誘導体であるのが好ましい。
【０００９】
本発明に用いる培養細胞は、タケ植物の組織片を培地で培養した培養細胞であり、固体培地による増殖や、液体培地による懸濁培養が例として挙げられる。
【００１０】
タケ植物としては、マダケ属マダケ（Phyllostachys bambusoides Seib. Et Zucc），ハチク（Phyllostachys nigra Munro var. Henonis.），モウソウチク（Phyllostachys pubescens Mazel ex Houz.）等が例として挙げられる。
【００１１】
本発明にて生合成できるヒドロキシ安息香酸誘導体は、タケ植物由来の培養細胞が産生する二次代謝中間体を基質として、外部から導入された遺伝子により、形質転換された培養細胞内で生合成された二次代謝物及び、それに基づく誘導体が含まれる。
具体例としては、グルコースエステル体，グルコースエーテル体も含まれ、具体的な化合物の例として、以下のものが挙げられる。
【化１】
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4-Hydroxybenzoic acid glucose ester（４ＨＢＡＧＥ）
【化２】
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4-Hydroxybenzoic acid glucoside（４ＨＢＡＧ）
【化３】
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Vanillic acid glucose ester（ＶＡＧＥ）
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る生合成方法によれば、タケ植物由来の培養細胞に有する活発な代謝経路中の代謝中間産生物を基質とする外来の二次代謝生合成遺伝子による代謝フローのスイッチングにて生合成されるので、従来の化学合成に比較して省エネルギーであり、環境負荷も小さく抑えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】形質転換に用いたベクターを示す。
【図２】形質転換体ゲノムへの遺伝子の導入確認結果を示す。
【図３】形質転換株カルス抽出液のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図４】形質転換カルスに含まれる生成物の蓄積量を示す。
【図５】形質転換懸濁細胞の増殖曲線を示す。
【図６】形質転換懸濁細胞における代謝物蓄積量の継時変化を示す。
【図７】培地量１００ｍｌあたりの化合物蓄積量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明に係る生合成例を以下、具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。
【００１５】
本実施例は、タケ植物としてハチクの組織を用いた培養細胞の形質転換を行った。
なお、培養細胞は、特許文献１に記載の方法にて得られた培養細胞を用いた。
形質転換に用いたベクターの構成例を図１に示す。
具体的には、ｐＲＩ２０１−ＯＮ（タカラバイオ）の選抜マーカー遺伝子をNeomycin phosphotransferaseからHygromycin phosphotransferase（ＨＰＴ）へと置換したベクターｐＲＩ２０１−ＯＮ−Ｈｍのマルチクローニングサイトに、Pseudomonas putida KT2440由来の4-hydroxycinnamoyl-CoA hydratase/lyase （ＰｐＨＣＨＬ）を導入したベクターｐＲＩ２０１−ＯＮ−Ｈｍ／ＰｐＨＣＨＬを作製した。
【００１６】
次に上記ベクターを用い、特許文献２に開示する金粒子をキャリアーとしたパーティクルボンバードメント法によって、ハチク培養細胞の形質転換を行った。
形質転換後の培養細胞は、ＫＨ２ＰＯ４濃度を６８０ｍｇ／ｍＬに改変したＭＳ（Murashige and Skoog）培地にスクロースを３％、Picloramを１０μＭ添加した培地（ＭＳ  Ｐ６８０Ｐｉｃ培地）にゲランガム０．３％を加えた固体培地にて培養し（２５℃、暗条件）、細胞の増殖状態に応じて２０〜３０日後にハイグロマイシンＢ（１００ｍｇ／Ｌ）を含むＭＳ  Ｐ６８０Ｐｉｃ／０．３％ゲランガム固体培地に移植した。
安定した増殖性を示した株のゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによりＰｐＨＣＨＬ遺伝子およびＨＰＴ遺伝子の導入を確認した。
その結果、図２に示すようにＨＰＴとＰｐＨＣＨＬの両方が導入された株（＃２０と＃２８）とＨＰＴのみが導入された株（＃２３と＃２６）を得た。
ゲノムＤＮＡが正しく抽出されていることを確かめるためハチクのActin1（ＡＣＴ１）遺伝子を増幅するプライマーでＰＣＲを行ったところ、野生株を含む全ての株で遺伝子の増幅がみられた。
その結果を図２に示す。
【００１７】
得られた形質転換カルス＃２０（ＰｐＨＣＨＬとＨＰＴ双方導入）および＃２３（ＨＰＴのみ導入）と野生株カルスをＭＳ  Ｐ６８０Ｐｉｃ培地／０．３％ゲランガム固体培地で４週間培養し、細胞内に蓄積する代謝物を調べた。
カルス１００ｍｇあたり１ｍＬの８０％メタノール／２％酢酸を加え、超音波抽出後、遠心した上清をＨＰＬＣ分析に供した。
その結果、ＰｐＨＣＨＬ導入株＃２０で4-hydroxybenzoic acid glucose ester（４ＨＢＡＧＥ）、4-hydroxybenzoic acid glucoside（４ＨＢＡＧ）、およびvanillic acid glucose ester（ＶＡＧＥ）が蓄積していた。
その一方で、野生株やＰｐＨＣＨＬ非導入株＃２３ではそれら化合物の蓄積は確認できなかった。
これら化合物の同定は化学合成した標準物質と比較することによって行った。
なお、ＨＰＬＣクロマトグラムの条件を下記に示す。
ＨＰＬＣ条件
カラム：MIGHTYSIL RP-18 GP Aqua 250 × 4.6 mm (5 μm)
移動相：７％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：２８０ｎｍ
【００１８】
ハチク培養細胞の活発な増殖が促されるＭＳ  Ｐ６８０Ｐｉｃ／０．３％ゲランガム固体培地での培養（ＰＲ条件）に加えて、細胞の木化が促進されるＭＳ培地の無機塩類濃度のみを１／２に改変した培地（１／２ＭＳ培地：ＬＧ１条件）で４週間カルスを培養し、細胞内に蓄積する４ＨＢＡＧＥ、ＶＡＧＥ、および４ＨＢＡＧの定量分析を行った。
その結果を図４のグラフに示す。
ＰｐＨＣＨＬ導入株である＃２０と＃２８でこれら化合物の蓄積がみられ、＃２８よりも＃２０で蓄積量が高いことがわかった。また、ＰＲ条件よりもＬＧ１条件で培養したカルスでこれら化合物の蓄積量は高く、ＬＧ１条件で培養した形質転換カルス＃２０における４ＨＢＡＧＥ、ＶＡＧＥ、４ＨＢＡＧの細胞１ｇあたりの蓄積量は、それぞれ５．４μｍｏｌ、０．８７μｍｏｌ、０．６１μｍｏｌであった。
【００１９】
得られた形質転換株を増殖条件であるＰＲ条件、もしくは木化誘導条件であるＬＧ１条件とＬＧ２条件（１／２ＭＳ＋１０μＭ  6-benzyladenine）において懸濁培養した際の細胞内における代謝物蓄積量の継時変化を調べた。
３００ｍＬ容三角フラスコに、ＰＲ条件で２週間前培養した野生株もしくは形質転換株の懸濁細胞を沈降細胞量（sedimented cell volume: ＳＣＶ）が５％になるように移植し、各培地１００ｍＬをそれぞれ加え培養を開始した（２５℃、暗条件、１００ｒｐｍ）。
０日目から３０日目まで４日おきに１フラスコ分の細胞を回収し、ＳＣＶを測定すると共に、細胞抽出物中の主要代謝産物をＨＰＬＣを用いて分析した。
ＳＣＶに基づく増殖曲線を図５に示す。
木化条件であるＬＧ１とＬＧ２条件下で培養すると、野生株やＰｐＨＣＨＬの導入されていない＃２３と比較して、ＰｐＨＣＨＬが導入された＃２０および＃２８は細胞の増殖が抑制されていた。
【００２０】
前述の手法で懸濁培養した細胞を吸引ろ過によりサンプリングした。
カルスの分析の際と同様の手法で、得られた細胞抽出液をＨＰＬＣ分析に供した。
カルスを分析した結果と同様に、ＰｐＨＣＨＬ導入株である＃２０および＃２８において４ＨＢＡＧ、４ＨＢＡＧＥ、ＶＡＧＥの蓄積が観察された。
ＰＲ条件で培養した細胞と比較して、ＬＧ１およびＬＧ２条件で培養した細胞で４ＨＢＡＧＥとＶＡＧＥがより高蓄積することも明らかとなった（図６）。
４ＨＢＡＧＥの蓄積量が特に多く、ＬＧ２条件で培養した＃２０においては５日目以降、７０μｍｏｌ／ｇＦＷ以上蓄積していた。
＃２０株をＬＧ２条件で２０日間培養した細胞のフラスコ（培地量１００ｍＬ）あたりの蓄積量は、４ＨＢＡＧＥが１７２ｍｇ、ＶＡＧＥが１６ｍｇ、４ＨＢＡＧが３．６ｍｇであった（図７）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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