(57)【要約】【課題】より短期間で非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんを誘導することができる、非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんのモデル動物の製造方法を提供すること。【解決手段】（1）メラノコルチン4型受容体遺伝子の機能及び／又は発現が欠損又は低下した哺乳類動物に変異原性物質を投与する工程（工程1）、及び（2）前記動物に高脂肪食を摂取させる工程（工程2）を含む、非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんのモデル動物の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（1）メラノコルチン4型受容体遺伝子の機能及び／又は発現が欠損又は低下した哺乳類動物に変異原性物質を投与する工程（工程1）、及び
（2）前記動物に高脂肪食を摂取させる工程（工程2）
を含む、非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんのモデル動物の製造方法。
【請求項２】
前記変異原性物質がニトロソアミンである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記哺乳類動物がハツカネズミ属動物である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記工程1に供される前記哺乳類動物が性成熟完了前である、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
前記工程1に供される前記哺乳類動物が離乳前である、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
前記工程2の摂取期間が6〜20週間である、請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
前記高脂肪食の脂肪エネルギー比率が20％以上である、請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
前記工程1における前記変異原性物質の投与量が0.1〜100mg/kgである、請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
前記工程1の投与回数が1〜3である、請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
前記工程2が前記工程1の後に行われる、請求項１〜９のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１１】
製造対象が非アルコール性脂肪肝炎由来肝臓がんのモデル動物である、請求項１〜１０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の製造方法で得られた、非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんのモデル動物。
【請求項１３】
ハツカネズミ属動物であり、且つ30週齢以下である、請求項１２に記載のモデル動物。
【請求項１４】
（1）メラノコルチン4型受容体遺伝子の機能及び／又は発現が欠損又は低下した哺乳類動物に変異原性物質を投与する工程（工程1）、
（2）前記動物に高脂肪食を摂取させる工程（工程2）、及び
（3A）前記哺乳類動物に被検物質を投与する工程（工程3A）
を含む、非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんの予防又は治療薬の候補物質のスクリーニング方法。
【請求項１５】
（3B）請求項１２又は１３に記載のモデル動物に被検物質を投与する工程（工程3B）
を含む、非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんの予防又は治療薬の候補物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんのモデル動物の製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ライフスタイルの欧米化により、日本においてもメタボリックシンドロームに合併する非アルコール性脂肪肝炎（NASH）が増加しており、近い将来、肝臓がんの主因がウイルス性肝炎からNASHに取って代わることに疑いの余地は無い。
【０００３】
NASH由来肝臓がんの病態解析や予防又は治療薬開発には、モデル動物が必須である。非特許文献１には、遺伝性肥満を呈するメラノコルチン4型受容体（MC4R）欠損マウスに高脂肪食負荷を与えることにより、肥満やインスリン抵抗性を背景とした脂肪肝、NASH、及び肝臓がんを、高確率で誘導できることが報告されている。しかし、このモデルでは、NASHの発症に約4ヶ月、肝臓がんの発症に約1年も要してしまうことが問題であった。一方、特許文献１には、MC4R欠損マウスに高脂肪食負荷及び四塩化炭素を与えることにより、より短期間で脂肪肝からNASHを誘導できることが報告されている。しかし、このモデルでは、肝臓がんを誘導することができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開第2015−006022号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】American Journal of Pathology, 179: 2454-2463, 2011.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、より短期間で非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんを誘導することができる、非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんのモデル動物の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究を進めた結果、（1）メラノコルチン4型受容体遺伝子の機能及び／又は発現が欠損又は低下した哺乳類動物に変異原性物質を投与する工程（工程1）、及び（2）前記動物に高脂肪食を摂取させる工程（工程2）を含む、非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんのモデル動物の製造方法、であれば上記課題を解決できることを見出した。この知見に基づいてさらに研究を進めることにより、本発明が完成した。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
【０００８】
項１．  （1）メラノコルチン4型受容体遺伝子の機能及び／又は発現が欠損又は低下した哺乳類動物に変異原性物質を投与する工程（工程1）、及び（2）前記動物に高脂肪食を摂取させる工程（工程2）を含む、非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんのモデル動物の製造方法。
【０００９】
項２．  前記変異原性物質がニトロソアミンである、項１に記載の製造方法。
【００１０】
項３．  前記哺乳類動物がハツカネズミ属動物である、項１又は２に記載の製造方法。
【００１１】
項４．  前記工程1に供される前記哺乳類動物が性成熟完了前である、項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【００１２】
項５．  前記工程1に供される前記哺乳類動物が離乳前である、項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【００１３】
項６．  前記工程2の摂取期間が6〜20週間である、項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【００１４】
項７．  前記高脂肪食の脂肪エネルギー比率が20％以上である、項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【００１５】
項８．  前記工程1における前記変異原性物質の投与量が0.1〜100mg/kgである、項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
【００１６】
項９．  前記工程1の投与回数が1〜3である、項１〜８のいずれかに記載の製造方法。
【００１７】
項１０．  前記工程2が前記工程1の後に行われる、項１〜９のいずれかに記載の製造方法。
【００１８】
項１１．  製造対象が非アルコール性脂肪肝炎由来肝臓がんのモデル動物である、項１〜１０のいずれかに記載の製造方法。
【００１９】
項１２．  項１〜１１のいずれかに記載の製造方法で得られた、非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんのモデル動物。
【００２０】
項１３．  ハツカネズミ属動物であり、且つ30週齢以下である、項１２に記載のモデル動物。
【００２１】
項１４．  （1）メラノコルチン4型受容体遺伝子の機能及び／又は発現が欠損又は低下した哺乳類動物に変異原性物質を投与する工程（工程1）、（2）前記動物に高脂肪食を摂取させる工程（工程2）、及び（3A）前記哺乳類動物に被検物質を投与する工程（工程3A）を含む、非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんの予防又は治療薬の候補物質のスクリーニング方法。
【００２２】
項１５．  （3B）項１２又は１３に記載のモデル動物に被検物質を投与する工程（工程3B）を含む、非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんの予防又は治療薬の候補物質のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、より短期間で非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんを誘導することができる、非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんのモデル動物の製造方法を提供することができる。該モデル動物の製造方法及び得られたモデル動物は、非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がん、特に非アルコール性脂肪肝炎由来肝臓がんの病態解析や予防又は治療薬開発に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】一個体当たりの癌の個数の測定結果（実施例1）を示す。
【図２】一個体当たりの結節の個数の測定結果（実施例2）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
1．定義
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００２６】
アミノ酸配列の「同一性」とは、2以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対するアミノ酸配列の一致の程度をいう。従って、ある2つのアミノ酸配列の一致性が高いほど、それらの配列の同一性又は類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST（KarlinS，Altschul SF．“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes”Proc Natl Acad Sci USA．87:2264−2268（1990）、KarlinS，Altschul SF．“Applications and statistics for multiple high−scoring segments in molecular sequences．”Proc Natl Acad Sci USA．90:5873−7（1993））を用いて決定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、National Center of Biotechnology Information（NCBI）のウェエブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。また、塩基配列の『同一性』も上記に準じて定義される。
【００２７】
本明細書中において、「保存的置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
【００２８】
2．モデル動物の製造方法
本発明は、その一態様において、（1）メラノコルチン4型受容体遺伝子の機能及び／又は発現が欠損又は低下した哺乳類動物に変異原性物質を投与する工程（工程1）、及び（2）前記動物に高脂肪食を摂取させる工程（工程2）を含む、非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんのモデル動物の製造方法（本明細書において、「本発明の製造方法」と示すこともある。）、に関する。以下に、これについて説明する。
【００２９】
哺乳類動物としては、特に制限されず、例えばサル、マウス（ハツカネズミ属動物）、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカ等が挙げられる。
これらの中でも、実験動物として使用し得る動物が好ましく、ハツカネズミ属動物がより好ましく、Mus musculusがさらに好ましい。また、哺乳類動物は、系統種であってもよく、雑種であってもよい。また、系統種としては、マウスの場合であれば、例えばC57BL／6、C3H、ICR、BALB／cが挙げられるが、好ましくはC57BL／6である。
【００３０】
メラノコルチン4型受容体遺伝子は、視床下部や脳幹部にて高発現し、エネルギー代謝調節等に関与するタンパク質（MC4R）をコードする遺伝子を意味する。哺乳類動物各種において、MC4R遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列は公知である、或いは公知のMC4R遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列に基づいて（例えば、これらとの同一性解析等により）容易に決定することができる。一例として、マウスのMC4R遺伝子としては、NCBI RefSeqアクセッション番号：NP＿058673で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI  RefSeqアクセッション番号：NM＿016977で特定されるヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列からなるタンパク質）が挙げられる。
【００３１】
本発明が対象とするMC4R遺伝子には、自然界において生じ得る変異体も含まれる。本発明が対象とするMC4R遺伝子は、コードするタンパク質の受容体としての性質（リガンド結合能、下流遺伝子発現調節能等）が著しく損なわれない限りにおいて、置換、欠失、付加、挿入等の塩基変異を有していてもよい。変異としては、該mRNAから翻訳されるタンパク質においてアミノ酸置換が生じない変異やアミノ酸の保存的置換が生じる変異が好ましい。
【００３２】
本発明が対象とするMC4R遺伝子は、例えば、それによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列が、同種動物の野生型MC4R遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列と、例えば95％以上、好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上の同一性を有する、遺伝子である。また、本発明が対象とするMC4R遺伝子は、例えば、それによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列が、同種動物の野生型MC4R遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列と同一であるか又は該アミノ酸配列に対して1もしくは複数個（例えば2〜10、好ましくは2〜5、より好ましくは2〜3個、さらに好ましくは2個）が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列である、遺伝子である。
【００３３】
本発明が対象とする哺乳類動物においては、上記した本発明が対象とするMC4R遺伝子の機能及び／又は発現が欠損又は低下している。すなわち、本発明が対象とする哺乳類動物においては、上記した本発明が対象とするMC4R遺伝子の機能及び／又は発現が欠損又は低下するように、該MC4R遺伝子に変異が導入されている。ここで、MC4R遺伝子の「機能」は、MC4Rタンパク質の受容体としての性質（リガンド結合能、下流遺伝子発現調節能等）を示す。また、MC4R遺伝子の「発現」は、MC4R mRNAの発現、及びMC4Rタンパク質の発現の両方を包含するが、好ましくはMC4Rタンパク質の発現である。「欠損」とは、本発明が対象とする哺乳類動物から得られたサンプルについて、MC4R遺伝子の活性及び／又は発現量が検出限界以下であることを示す。また、「低下」とは、本発明が対象とする哺乳類動物から得られたサンプルについて、MC4R遺伝子の活性及び／又は発現量が、変異導入前のMC4R遺伝子（本発明が対象とするMC4R遺伝子）の活性及び／又は発現量よりも低い（例えば1／2、1／5、1／10、1／20、1／50、1／100、1／200、1／500、1／1000、1／2000、1／5000、1／10000以下である）ことを示す。なお、MC4R遺伝子の活性及び／又は発現量は、公知の方法に従って測定することが可能である。
【００３４】
MC4R遺伝子に導入される変異としては、MC4R遺伝子の機能及び／又は発現が欠損又は低下する変異である限り特に制限されるものではない。当該変異としては、例えば遺伝子欠損、タンパク質コード領域における変異、スプライシング調節領域における変異、発現制御領域（例えば、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー等）における変異等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは遺伝子欠損が挙げられる。また、本発明が対象とする哺乳類動物においては、当該変異を、対の染色体の両方において有することが好ましい。
【００３５】
MC4R遺伝子への変異導入は、例えばMC4R遺伝子の少なくとも一部を含むターゲティングベクターが相同組み換えによって導入されたES細胞等を用いる遺伝子ノックアウト、MC4R遺伝子に対するshRNA、アンチセンス、リボザイム等を用いる遺伝子ノックダウン、受容体拮抗剤（アンタゴニスト）投与、放射線照射、化学変異原投与、トランスポゾン導入等によって達成され得る。遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックダウン、遺伝子変異導入に用いられる、ターゲッティングベクターの構築、shRNA、アンチセンス、リボザイム等の設計及び合成、マウスのES細胞、未受精卵、受精卵、始原生殖細胞等へのDNAの導入方法、受容体拮抗剤投与、放射線照射、化学変異原投与、トランスポゾン導入等は、当業者であれば従来公知の方法を適用して行うことができる。
【００３６】
本発明の製造方法で用いられる「MC4R遺伝子の機能及び／又は発現が欠損又は低下した哺乳類動物」としては、前述の通りMC4R遺伝子ノックアウト動物（MCR遺伝子欠損マウス）、MC4R遺伝子ノックダウン動物、MC4R遺伝子変異導入動物等が挙げられるが、好ましくはMC4R遺伝子ノックアウト動物である。
【００３７】
変異原性物質は、本発明が対象とする哺乳類動物のDNA分子に異常を引き起こす物質である限り、特に制限されない。変異原性物質としては、例えばニトロソ化合物、塩基類似化合物、アルキル化剤、多環芳香族炭化水素、DNAインターカレーター、DNA架橋剤等が挙げられる。これらの中でも、本発明の効果の観点から、取り分けニトロソ化合物が好ましい。
【００３８】
ニトロソ化合物としては、例えばニトロソアミン、ニトロソグアニジン等があげられ、好ましくはニトロソアミンが挙げられる。ニトロソアミンとしては、好ましくはN−ニトロソジエチルアミン、N−ニトロソジメチルアミン、N−ニトロソメチルエチルアミン、N−ニトロソジブチルアミン等のN−ニトロソジアルキルアミン（アルキル＝C1-6、C1-4、C1-2アルキル）が挙げられ、これらの中でもより好ましくは好ましくはN−ニトロソジエチルアミンが挙げられる。ニトロソアミンとしては、上記以外にも、例えばN−ニトロソピペリジン、N−ニトロソピロリジン、N−ニトロソモルホリン、N−ニトロソプロリン、N−ニトロソサルコシン、N−ニトロソノルニコチン、4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン、4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノール、N,N'-ジニトロソペンタメチレンテトラミン等が挙げられる。
【００３９】
変異原性物質は、1種単独であっても、2種以上の組合せであってもよい。
【００４０】
変異原性物質の投与の態様は、特に制限されない。投与方法としては、例えば腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与、経口投与等が挙げられ、好ましくは腹腔内投与が挙げられる。
【００４１】
変異原性物質の投与量は、変異原性物質の種類、後述の高脂肪食摂取期間、製造対象とするモデル動物の種類等に応じて異なり得るが、例えば0.1〜200mg/kgである。該投与量は、本発明の効果、安全性等の観点から、好ましくは0.1〜100mg/kg、より好ましくは0.1〜50mg/kg、さらに好ましくは0.3〜30mg/kg、よりさらに好ましくは0.5〜30mg/kgである。一方で、該投与量は、好ましくは0.1〜20mg/kg、0.1〜10mg/kg、0.1〜5mg/kg、0.3〜3mg/kgである。上記投与量は、ニトロソ化合物を投与する場合に、特に好適である。
【００４２】
変異原性物質の投与タイミングは、特に制限されるものではない。ただ、本発明の効果の観点から、工程1に供される哺乳類動物は、好ましくは性成熟完了前、より好ましくは離乳前である。性成熟完了時期及び離乳時期は哺乳類動物の種類に応じて異なるものであるものの、各哺乳類動物におけるこれらの時期は、公知の情報に基づいて容易に決定することができる。一例として、マウスの場合であれば、離乳時期は3〜4週齢であり、性成熟完了時期は7〜8週齢である。マウスの場合の変異原性物質の投与タイミングは、好ましくは0〜7週齢、より好ましくは0〜5週齢、さらに好ましくは0〜4週齢、よりさらに好ましくは1〜3週齢、特に好ましくは1.5〜2.5週齢である。
【００４３】
変異原性物質の投与回数は、特に制限されるものではない。ただ、本発明の製造方法は少ない投与回数でモデル動物を作製することが可能である。この観点から、投与回数は、好ましくは1〜5回、より好ましくは1〜3回、さらに好ましくは1〜2回、特に好ましくは1回である。
【００４４】
高脂肪食は、特に制限されず、高脂肪食として公知のもの、或いはそれと同等のものを各種使用することができる。高脂肪食の脂肪エネルギー比率は、好ましくは20％以上、より好ましくは30％以上、さらに好ましくは35％以上、よりさらに好ましくは37％以上である。該比率の上限は、例えば80％、70％、60％、50％、45％である。また、高脂肪食のエネルギー量として、400kcal／100g以上（例えば、500kcal／100g以上）であることが好ましい。また、高脂肪食に含まれる脂肪としては、特に制限されることなく、動物性脂肪、植物性脂肪を問わず、例えば、乳脂肪、牛脂、豚脂、コーン油、大豆油、菜種油が挙げられるが、高脂肪食には、動物性脂肪（乳脂肪、牛脂、豚脂等）が含まれていることが好ましい。さらに、高脂肪食の脂肪以外の成分は、通常の食餌成分であればよく、タンパク質、炭水化物、ミネラル等を含んでいてもよく、より具体的には、スクロース、コレステロール等を含んでいてもよい。スクロースエネルギー比率は、好ましくは20〜50％、より好ましくは30〜40％である。
【００４５】
高脂肪食は、1種単独であっても、2種以上の組合せであってもよい。
【００４６】
高脂肪食を摂取させる方法としては、特に制限されず、哺乳類動物の種類に応じて、適切な方法を採用することができる。例えば、マウスの場合であれば、通常、水と共に不断に自由摂食させることで行われる。
【００４７】
工程2（高脂肪食の摂取開始）は、特に制限されるものではないが、工程1の後に行われることが好ましい。該摂取開始のタイミングは、離乳後である限り特に制限されない。マウスの場合の該摂取開始タイミングは、好ましくは4〜15週齢、より好ましくは5〜12週齢、さらに好ましくは5〜9週齢、よりさらに好ましくは5〜7週齢である。
【００４８】
工程2の摂取期間は、非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんを誘導できる限り特に制限されない。該摂取期間は、例えば6〜20週間、好ましくは7〜16週間、より好ましくは8〜12週間である。本発明の製造方法によれば、高脂肪食の摂取期間が比較的短期間であっても、より効率的に非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんを誘導することが可能である。
【００４９】
斯かる本発明の製造方法によって、非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんのモデル動物（本明細書において、「本発明のモデル動物」と示すこともある。）を製造することができる。本発明のモデル動物は、好ましくは肝臓がんのモデル動物、非アルコール性脂肪肝炎及び肝臓がんのモデル動物である。
【００５０】
非アルコール性脂肪肝炎とは、肝細胞における脂肪蓄積、肝細胞風船様変性（バルーニング変性）、アポトーシスの増加、肝臓の中心静脈領域への炎症性細胞の浸潤、脂肪変性した肝細胞をマクロファージが取り囲み貪食・処理する現象（hCLS）、肝臓における過剰な細胞外基質の沈着を伴う肝臓の疾患を意味する。また、かかる組織学的な変化のみならず、アラニンアミノ基転移酵素（ALT）、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（AST）、遊離脂肪酸及び中性脂肪のうちの少なくとも1のマーカーの血清中の濃度が高い状態にあることも、本発明のNASHに含まれ得る。
【００５１】
肝臓がんとしては、肝細胞がん、肝内胆管がん等が挙げられ、好ましくは肝細胞がんが挙げられる。肝臓がんは、好ましくは非アルコール性脂肪肝炎由来の肝臓がん、すなわち上記した非アルコール性脂肪肝炎症状の進行後に至る肝臓がんである。
【００５２】
本発明の製造方法は、より短期間で非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんを誘導することができる。この観点から、本発明の製造方法で得られたモデル動物（特に、肝臓がんのモデル動物、非アルコール性脂肪肝炎及び肝臓がんのモデル動物）は、生後日数が比較的少ない。本発明の製造方法で得られたモデル動物がマウスの場合、該モデル動物は、好ましくは30週齢以下、より好ましくは25週齢以下、さらに好ましくは20週齢以下である。
【００５３】
3．モデル動物の用途
本発明の製造方法及び本発明の製造方法により得られたモデル動物は、非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がん、特に非アルコール性脂肪肝炎由来肝臓がんの病態解析や予防又は治療薬開発、具体的には例えば非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんの予防又は治療薬の候補物質のスクリーニング方法に利用することができる。
【００５４】
本発明は、その一態様において、以下の2つのスクリーニング方法に関する。
【００５５】
＜スクリーニング方法1＞
（1）メラノコルチン4型受容体遺伝子の機能及び／又は発現が欠損又は低下した哺乳類動物に変異原性物質を投与する工程（工程1）、
（2）前記動物に高脂肪食を摂取させる工程（工程2）、及び
（3A）前記哺乳類動物に被検物質を投与する工程（工程3A）
を含む、非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんの予防又は治療薬の候補物質のスクリーニング方法。
【００５６】
＜スクリーニング方法2＞
（3B）本発明のモデル動物に被検物質を投与する工程（工程3B）
を含む、非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんの予防又は治療薬の候補物質のスクリーニング方法。
【００５７】
スクリーニング方法1は、被検物質の投与が、非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんが誘導される前、或いは誘導された後に行われる方法である。この観点から、スクリーニング方法1は、非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんの予防又は治療薬の開発に有用であり得る。
【００５８】
スクリーニング方法2は、被検物質の投与が、非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんが誘導された後に行われる方法である。この観点から、スクリーニング方法2は、非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんの治療薬の開発に有用であり得る。
【００５９】
工程3Aの投与タイミング又は投与開始タイミングは、特に制限されず、工程1と工程2の前、工程1と工程2の間、工程1と工程2の後等、いずれのタイミングであってもよい。
【００６０】
被検物質の種類は予防又は治療薬の候補になり得る限り特に限定されない。例えば、タンパク質、抗体、ペプチド、非ペプチド性化合物（ヌクレオチド、アミン、糖質、脂質等）、有機低分子化合物、無機低分子化合物、細菌放出物質、醗酵生産物、細胞抽出液又は細胞培養上清、植物抽出液、動物組織抽出液等が挙げられる。被検物質は、1種単独であっても、2種以上の組合せであってもよい。
【００６１】
スクリーニング方法1及び2は、さらに、
（4）被検物質が投与された前記動物の、非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんの表現型を評価する工程（工程4）、及び
（5）前記評価の結果に基づいて、前記被検物質を非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんの予防又は治療薬の候補物質として選別する工程（工程5）
を含むことが好ましい。
【００６２】
非アルコール性脂肪肝炎の表現型の評価としては、例えば、被検物質が投与された動物（好ましくは、被検物質の投与から一定期間、例えば1〜30日経過後の動物）から採取した肝臓を対象とし、肝細胞における脂肪蓄積、肝細胞風船様変性（バルーニング変性）、アポトーシス細胞の増加、炎症性細胞の浸潤、脂肪変性した肝細胞をマクロファージが取り囲み貪食・処理する現象（hCLS）、過剰な細胞外基質の沈着の程度を、組織学的に観察することにより行うことができる。また、ALT、AST、遊離脂肪酸及び中性脂肪のうちの少なくとも1のマーカーの体液（例えば血液、血清）の濃度を測定することによっても行うことができる。評価する表現型は、1種単独であっても、2種以上の組合せであってもよい。
【００６３】
肝臓がんの表現型の評価としては、例えば、被検物質が投与された動物（好ましくは、被検物質の投与から一定期間、例えば1〜30日経過後の動物）から採取した肝臓を対象とし、癌形成の有無、程度等を、観察することにより行うことができる。また、AFP、PIVKA-II、AFP-L3等のマーカーの体液（例えば血液、血清）の濃度を測定することによっても行うことができる。評価する表現型は、1種単独であっても、2種以上の組合せであってもよい。
【００６４】
そして、この評価結果に基づいて、例えば非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんの程度を、必要に応じて、被験物質を投与しないさ場合のそれと比較し、低くなっている場合には、被検物質を非アルコール性脂肪肝炎及び／又は肝臓がんの予防又は治療薬の候補物質として選別することができる。
【００６５】
選別された被検物質を予防又は治療薬候補物質として、さらなる解析を進めることにより、有用な予防又は治療薬を選別することができる。
【実施例】
【００６６】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００６７】
マウスの準備
メラノコルチン4型受容体を欠損させたマウス（以下、「MC4R欠損マウス」とも称する。遺伝的バックグランド：C57BL/6J）は、テキサス大学メディカルセンター  Joel  K．Elmquistより提供したものを使用した（Balthasar N．ら、Cell、2005年11月4日発行、123巻、3号、493〜505ページ 参照）。また、対照群として、C57BL/6J野生型マウスを、日本クレア株式会社より購入して用意した。
【００６８】
これらのマウスは、特に断りがない限り、温度、湿度及び照明時間（12時間明暗サイクル）が制御された環境下で維持した。また、離乳（生後4週）後は、水及び標準食（日本クレア株式会社製、げっ歯類飼育繁殖用飼料：CE-2、343.1kcal/100g、脂肪をエネルギー比率にて12.6％含む、）を不断に自由摂取させ、維持した。
【００６９】
実施例1．モデルマウスの製造1
生後14日齢の雄性MC4R欠損マウスに体重（kg）あたり1 または25 mgのDEN（N-Nitrosodiethylamine；N0258，SIGMA）を腹腔内投与した。対照にはPBS（Phosphate buffered saline）を使用した。6週齢より高脂肪食（Research  Diets社製、高脂肪飼料：D12079B、468kcal／100g、脂肪をエネルギー比率にて41％含む、スクロースを34．0％含む、コレステロールを0．2％含む）を10週間又は14週間給餌し、自由摂食・自由飲水とした。10週間負荷群及び14週間負荷群それぞれについて、肝臓を採取し、癌形成個体数、並びに一個体当たりの結節及び癌の個数を測定した。
【００７０】
結果を表１及び図１〜２に示す。
【００７１】
【表１】
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【００７２】
表１に示されるように、DEN投与群において高い割合で癌形成が認められた。また、図１〜２に示されるように、形成される結節及び癌の個数は、DEN投与量に比例することが分かった。また、10週間負荷群において形成された癌のほとんどは3mm程度の大きさであった。さらに、図１〜２には示していないが、14週間負荷群は、全ての個体において、計測不可能なレベルの癌形成が認められた（最も少ない個体で、2-5mmの癌が44個、他の個体は3mm以上の癌が60個以上）。
【００７３】
また、非アルコール性脂肪肝炎（NASH）に特徴的な病変の有無についても調べたところ、当該病変を有することを確認した。このことは、非特許文献１における報告、すなわちMC4R欠損マウスに、高脂肪食を負荷させることにより、脂肪肝からヒトNASHに特徴的な肝組織像を示すNASHモデルマウスが確立できたという報告とも矛盾しない。
【００７４】
以上より、MC4R欠損マウスに対して、DEN投与と高脂肪食負荷を組み合わせることにより、短期間でNASH及び肝臓がんを誘導できることが分かった。
【００７５】
実施例2．モデルマウスの製造2
DEN投与（10, 20, 40mg/kg）のタイミングを生後5週齢とし、高脂肪高蔗糖食負荷の開始タイミングをDEN投与の4週間後として、且つ該負荷の期間を16週間とする以外は、実施例1と同様にして行った。その結果、どのdoseでも癌形成が認められた。ただ、癌形成の程度（癌形成個体数の割合、癌形成個数、癌の大きさ等）は、実施例1の方が顕著に高かった。
【図１】
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【図２】
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