(57)【要約】      （修正有）【課題】偽アレルギー型反応の重症度を低減させるための方法およびこれらの応答を遮断するアンタゴニストを発見するためのスクリーニング検査の提供。【解決手段】ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体Ｘ２（ＭｒｇｐｒＸ２）またはＭｒｇｐｒＢ２を発現する組換え細胞、および、前記細胞を、候補化合物と接触させるステップと、ＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２の活性化を検出するステップであって、ＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２の活性化は、前記候補化合物が偽アレルギー型反応を誘発することを決定するステップとを含む、化合物が偽アレルギー型反応を誘発するか否かを決定するための方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体Ｘ２（ＭｒｇｐｒＸ２）またはＭｒｇｐｒＢ２を発現する組換え核酸を含み、
前記組換え核酸が、１つまたは複数の突然変異を含む、ＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２を発現し、前記１つまたは複数の突然変異はシグナル伝達経路を活性化させることができないＭｒｇｐｒＸ２タンパク質またはＭｒｇｐｒＢ２タンパク質を産生し、
前記１つまたは複数の突然変異はＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）によるシグナル伝送経路の活性化を無効にする、
単離細胞。
【請求項２】
ＧＴＰ結合タンパク質アルファ１５（Ｇα１５）を発現する組換え核酸をさらに含む、請求項１のいずれか一項に記載の単離細胞。
【請求項３】
前記単離細胞が、ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞を含む、請求項１に記載の単離細胞。
【請求項４】
化合物が偽アレルギー型反応を誘発するか否かを決定するための方法であって、
請求項１に記載の単離細胞を、候補化合物と接触させるステップと、
ＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２の活性化を検出するステップであって、ＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２の活性化は、前記候補化合物が偽アレルギー型反応を誘発することを決定するステップと
を含む、方法。
【請求項５】
ＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２の活性化が、細胞内カルシウムの増大を同定することによって検出される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記候補化合物が、ロイプロリド、ゴセレリン、ヒストレリン、トリプトレリン、セトロレリクス、ガニレリクス、デガレリクス、オクトレオチド、ランレオチド、パシレオチド、セルモレリン、テサモレリン、イカチバント、酢酸グラチラマー、テリパラチド、プラムリンチド、ブレオマイシン、エクセナチド、グルカゴン、リラグルチド、エンフビルチドおよびコリスチメタートからなる群から選択される、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記候補化合物が、スクシニルコリン、ツボクラリン、アトラクリウム、ミバクリウムおよびロクロニウムからなる群から選択される、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項８】
ＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２のアンタゴニストを同定するための方法であって、
請求項１に記載の単離細胞を、偽アレルギー型反応を誘発する化合物と接触させるステップと、
請求項１に記載の単離細胞を、候補アンタゴニストと接触させるステップと、
ＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２の活性化を検出するステップであって、前記化合物の非存在下におけるＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２の活性化と比べたＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２の活性化の減少は、前記候補化合物がアンタゴニストであることを決定するステップと
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下で、２０１４年８月１日に出願された米国仮特許出願第６２／０３２，３５０号の優先権を主張するものであり、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、偽アレルギー型反応を誘発する化合物を検出するための細胞および方法、ならびに偽アレルギー型反応の重症度を低減させるための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
多くのアメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）承認薬は、偽アレルギー型反応に、それらの副作用プロフィールの一部として関連する。本明細書において記述されている発明の前に、どの薬物が偽アレルギー型反応を引き起こす可能性が高いかを決定するための細胞株および方法が必要であった。加えて、本明細書において記述されている発明の前に、偽アレルギー型反応の重症度を低減させるための方法およびこれらの応答を遮断するアンタゴニストを発見するためのスクリーニング検査が必要であった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、一部には、ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体メンバーＸ２（ＭｒｇｐｒＸ２）またはＭｒｇｐｒＢ２を発現する組換え核酸を含む単離細胞に基づく。例えば、組換え核酸は、ＭｒｇｐｒＸ２を発現する。代替として、組換え核酸は、ＭｒｇｐｒＢ２を発現する。いくつかの場合において、細胞は、ＧＴＰ結合タンパク質アルファ１５（Ｇα１５）を発現する組換え核酸をさらに含む。他の場合において、ＭｒｇｐｒＸ２を発現する組換え核酸は、１つまたは複数の突然変異を含む。例えば、１つまたは複数の突然変異は、シグナル伝達経路を活性化させることができないＭｒｇｐｒＸ２タンパク質を産生する。代替として、ＭｒｇｐｒＢ２を発現する組換え核酸は、１つまたは複数の突然変異を含む。例えば、１つまたは複数の突然変異は、シグナル伝達経路を活性化させることができないＭｒｇｐｒＢ２タンパク質を産生する。いくつかの場合において、この細胞は、ＧＴＰ結合タンパク質アルファ１５（Ｇα１５）を発現する組換え核酸をさらに含む。
【０００５】
好ましくは、単離細胞は、ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞を含む。
【０００６】
化合物を投与することによって誘発された、対象における偽アレルギー型反応の重症度を低減させるための方法であって、化合物を対象に投与すること、ＭｒｇｐｒＢ２またはＭｒｇｐｒＸ２アンタゴニストを対象に投与し、それにより、対象における偽アレルギー型反応の重症度を低減させることによる方法も提供される。
【０００７】
例えば、本明細書において記述されている方法は、偽アレルギー型反応の重症度を、少なくとも１％、例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％だけ、低減させる。
【０００８】
対象は、好ましくは、そのような治療を必要とする哺乳動物、例えば、偽アレルギー型反応またはそれに対する素因があると診断された対象である。哺乳動物は、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ならびに、家畜または食用に育てられた動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリおよびヤギである。好ましい実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。
【０００９】
阻害剤またはアンタゴニストは、それらの指定された標的または標的の天然リガンドと結合して生物活性を変調する、核酸、ペプチド、抗体または小分子を包含し得るがこれらに限定されない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一態様において、アンタゴニストは、抗体もしくはその断片、結合タンパク質、ポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを含む。本明細書において記述されているのは、抗ＭｒｇｐｒＸ２抗体である。好適な抗ＭｒｇｐｒＸ２抗体は、ＳＡＢ２９００１５４−５０ＵＧ（シグマアルドリッチ（登録商標）、ミズーリ州セントルイス）、ＰＡ５−３２９３０（サーモサイエンティフィック、マサチューセッツ州ウォルサム）、ＴＡ３１７０３８（オリジン、メリーランド州ロックビル）および０３８５８５（ユナイテッド・ステイツ・バイオロジカル、マサチューセッツ州ボストン）を包含し、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、当業者は、本明細書において記述されている方法において使用するためのさらなる抗ＭｒｇｐｒＸ２（または抗ＭｒｇｐｒＢ２）抗体を容易に同定することができるであろう。いくつかの場合において、本明細書において記述されている抗ＭｒｇｐｒＸ２（または抗ＭｒｇｐｒＢ２）抗体は、０．１μｇ／ｍｌから５００ｍｇ／ｍｌの濃度で投与される。
【００１１】
いくつかの場合において、アンタゴニストは、小分子を含む。小分子は、質量が２０００ダルトン未満の化合物である。小分子の分子質量は、好ましくは１０００ダルトン未満、より好ましくは６００ダルトン未満であり、例えば、化合物は、５００ダルトン未満、４００ダルトン未満、３００ダルトン未満、２００ダルトン未満、または１００ダルトン未満である。
【００１２】
小分子は、有機または無機である。例示的な有機小分子は、脂肪族炭化水素、アルコール、アルデヒド、ケトン、有機酸、エステル、単糖および二糖、芳香族炭化水素、アミノ酸ならびに脂質を包含するがこれらに限定されない。例示的な無機小分子は、微量ミネラル、イオン、フリーラジカルおよび代謝産物を含む。代替として、小分子は、酵素の結合ポケットを充填するための、断片、または小部分、またはより長いアミノ酸鎖からなるように、合成的に改変され得る。典型的には、小分子は、１キロダルトン未満である。
【００１３】
いくつかの場合において、アンタゴニストは、核酸分子を含む。例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、ＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２ポリペプチドの発現を阻害し、それにより、ＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２の活性を阻害する。いくつかの場合において、核酸は、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡもしくは短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡもしくはマイクロＲＮＡ、またはそれらの任意の部分を含む。故に、好適なＭｒｇｐｒＸ２アンタゴニストは、ＭｒｇｐｒＸ２  ｓｉＲＮＡおよびＭｒｇｐｒＸ２  ｓｈＲＮＡを包含し、そのそれぞれは、例えば、オリジン、メリーランド州ロックビルまたはライフテクノロジーズ、ニューヨーク州グランドアイランドから入手でき、参照により本明細書に組み込まれる。同様に、好適なＭｒｇｐｒＢ２アンタゴニストは、ＭｒｇｐｒＢ２  ｓｉＲＮＡおよびＭｒｇｐｒＢ２  ｓｈＲＮＡを包含し、そのそれぞれは、例えば、オリジン、メリーランド州ロックビルまたはライフテクノロジーズ、ニューヨーク州グランドアイランドから入手でき、参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、当業者は、ＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２を阻害する／アンタゴナイズするさらなる核酸を容易に同定することができるであろう。
【００１４】
アンタゴニストは、化合物を対象に投与するステップの前に、それと同時に、またはその後に投与される。
【００１５】
多様な投与経路が利用可能である。例えば、アンタゴニストは、局所的に、経口的に、吸入を介して、または注射を介して、投与される。
【００１６】
アンタゴニストの有効量は、０．００１ｍｇ／ｋｇから２５０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ  ０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１７５ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、２２５ｍｇ／ｋｇ、または２５０ｍｇ／ｋｇ体重である。最終的に、主治医または獣医が、適切な量および投薬レジメンを決める。
【００１７】
いくつかの場合において、アンタゴニストは、少なくとも１日に１回、少なくとも週に１回、または少なくとも月に１回、投与される。アンタゴニストは、１日、１週間、１か月、２か月、３か月、６か月、９か月、または１年の期間にわたって投与される。いくつかの場合において、アンタゴニストは、毎日、例えば２４時間毎に、投与される。または、アンタゴニストは、連続的にまたは１日に数回、例えば、１時間毎に、２時間毎に、３時間毎に、４時間毎に、５時間毎に、６時間毎に、７時間毎に、８時間毎に、９時間毎に、１０時間毎に、１１時間毎に、または１２時間毎に、投与される。
【００１８】
対象における偽アレルギー型反応を治療する方法は、ＭｒｇｐｒＢ２またはＭｒｇｐｒＸ２アンタゴニストを対象に投与し、それにより、対象における偽アレルギー型反応を治療することによって行われる。
【００１９】
化合物が偽アレルギー型反応を誘発するか否かを決定するための方法は、本明細書において記述されている単離細胞を、候補化合物と接触させること、ＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２の活性化を検出することによって行われ、ＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２の活性化は、候補化合物が偽アレルギー型反応を誘発することを決定する。
【００２０】
例えば、ＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２の活性化は、化合物の非存在下における細胞内カルシウムのレベルと比べた細胞内カルシウムの増大を同定することによって、検出される。いくつかの場合において、細胞内カルシウムのレベルは、少なくとも１％、例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％だけ、増大する。細胞内カルシウム濃度は、本明細書において記述されている方法または当業者に利用可能なものを利用して決定される。
【００２１】
例示的な候補化合物は、ロイプロリド、ゴセレリン、ヒストレリン、トリプトレリン、セトロレリクス、ガニレリクス、デガレリクス、オクトレオチド、ランレオチド、パシレオチド、セルモレリン、テサモレリン、イカチバント、酢酸グラチラマー、テリパラチド、プラムリンチド、ブレオマイシン、エクセナチド、グルカゴン、リラグルチド、エンフビルチドおよびコリスチメタートを包含する。
【００２２】
他の例示的な候補化合物は、スクシニルコリン、ツボクラリン、アトラクリウム、ミバクリウムおよびロクロニウムを包含する。
【００２３】
候補ＭｒｇｐｒＸ２アンタゴニストは、該アンタゴニストが、ＭｒｇｐｒＸ２ポリペプチドの生物活性を、相殺するもしくは阻害する、減少させる、または抑制することを確認するために、スクリーニングされる。ＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２のアンタゴニストを同定するための方法であって、本明細書において記述されている単離細胞を、偽アレルギー型反応を誘発する化合物と接触させるステップと、本明細書において記述されている単離細胞を、候補アンタゴニストと接触させるステップと、ＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２の活性化を検出するステップであって、候補アンタゴニストの非存在下におけるＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２の活性化と比べたＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２の活性化の減少は、候補化合物がアンタゴニストであることを決定するステップと、を含む、方法も提供される。
【００２４】
ＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２のアゴニストを同定するための方法であって、本明細書において記述されている単離細胞を、偽アレルギー型反応を誘発する化合物と接触させるステップと、本明細書において記述されている単離細胞を、候補アゴニストと接触させるステップと、ＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２の活性化を検出するステップであって、候補アゴニストの非存在下におけるＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２の活性化と比べたＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２の活性化の増大は、候補化合物がアゴニストであることを決定するステップと、を含む、方法も提供される。
【００２５】
定義
特に定義しない限り、本明細書において使用されているすべての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている意味を有する。下記の参考文献は、当業者に、本発明において使用されている用語の多くの一般的定義を提供する：Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；およびＨａｌｅ＆  Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書において使用される場合、下記の用語は、別段の指定がない限り、以下でそれらに付与される意味を有する。
【００２６】
本明細書において記述されている抗体およびその断片は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ｄＡｂ（ドメイン抗体）、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ、ｓｃＦｖｓを包含するがこれらに限定されない。抗体の断片は、そのそれぞれの抗体の免疫学的活性を保有する。いくつかの実施形態において、抗体の断片は、１５００以下、１２５０以下、１０００以下、９００以下、８００以下、７００以下、６００以下、５００以下、４００以下、３００以下、２００以下のアミノ酸を含有する。例えば、タンパク質またはペプチド阻害剤は、１５００以下、１２５０以下、１０００以下、９００以下、８００以下、７００以下、６００以下、５００以下、４００以下、３００以下、２００以下、１００以下、８０以下、７０以下、６０以下、５０以下、４０以下、３０以下、２５以下、２０以下、１０以下のアミノ酸を含有する。例えば、本発明の核酸阻害剤は、４００以下、３００以下、２００以下、１５０以下、１００以下、９０以下、８０以下、７０以下、６０以下、５０以下、４０以下、３５以下、３０以下、２８以下、２６以下、２４以下、２２以下、２０以下、１８以下、１６以下、１４以下、１２以下、１０以下のヌクレオチドを含有する。
【００２７】
用語「抗体」（Ａｂ）は、本明細書において使用される場合、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片を、それらが所望の生物活性を呈する限り、包含する。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書において、「抗体」と交換可能に使用される。
【００２８】
「単離された抗体」は、その自然環境の成分から分離されたおよび／または回収されたものである。その自然環境の汚染物質の成分は、抗体への診断的または治療的使用を妨げるであろう材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を包含し得る。好ましい実施形態において、抗体は、（１）ローリー法によって決定される通り、抗体の９５重量％を上回る、最も好ましくは９９重量％超まで；（２）スピニング・カップ・シークエネーターの使用によってＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を取得するのに十分な程度まで；または（３）還元または非還元条件下、クマシーブルー、または好ましくは銀染色を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質性になるまで、精製される。単離された抗体は、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないであろうことから、組換え細胞内にインサイチュで抗体を包含する。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製されることになる。
【００２９】
基本的な四鎖抗体単位は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれるさらなるポリペプチドに沿って５つの基本的なヘテロ四量体単位からなり、したがって、１０の抗原結合部位を含有し、一方、分泌されたＩｇＡ抗体は、重合して、Ｊ鎖に沿って２〜５つの基本的な４鎖単位を含む多価集合体を形成することができる。ＩｇＧの場合、４鎖単位は、概して、約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によってＨ鎖と連結しており、一方、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて、１つまたは複数のジスルフィド結合によって互いに連結している。各ＨおよびＬ鎖は、規則的間隔の鎖間ジスルフィド架橋も有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に、可変ドメイン（ＶＨ）、続いて、αおよびγ鎖のそれぞれについて３つの定常ドメイン（ＣＨ）、ならびにμおよびεアイソタイプについて４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に、可変ドメイン（ＶＬ）、続いて、その他端に定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ＶＬはＶＨと整列しており、ＣＬは重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）と整列している。特定のアミノ酸残基は、軽鎖および重鎖可変ドメインの間に界面を形成すると考えられている。ＶＨおよびＶＬの対合は、一緒に単一の抗原結合部位を形成する。異なるクラスの抗体の構造および特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｐ．Ｓｔｉｔｅｓ，Ａｂｂａ  Ｉ．Ｔｅｒｒ  ａｎｄ  Ｔｒｉｓｔｒａｍ  Ｇ．Ｐａｒｓｌｏｗ（ｅｄｓ．），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．，１９９４，ｐａｇｅ  ７１，ａｎｄ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ６を参照されたい。
【００３０】
任意の脊椎動物種由来のＬ鎖は、それらの定常ドメイン（ＣＬ）のアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに異なる種類のうちの１つに割り当てることができる。それらの重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを、異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）およびミュー（μ）と指定された重鎖をそれぞれ有する、５つのクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがある。γおよびαクラスは、ＣＨ配列および機能における比較的わずかな差異に基づいてサブクラスにさらに分割され、例えば、ヒトは、下記のサブクラスを発現する：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２。
【００３１】
用語「可変」は、Ｖドメインのある特定のセグメントが、抗体の間で配列が広く異なるという事実を指す。Ｖドメインは、抗原結合を媒介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を定義する。しかしながら、可変性は、可変ドメインの１１０アミノ酸スパンの全体にわたって均等に分布していない。代わりに、Ｖ領域は、それぞれ９〜１２アミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれる極端な可変性のより短い領域によって分離された、１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変のストレッチからなる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、βシート配置を主に採用しており、βシート構造を接続するループを形成し、いくつかの場合において、該構造の一部を形成している、３つの超可変領域によって接続される、４つのＦＲをそれぞれ含む。各鎖における超可変領域は、ＦＲによって、他の鎖由来の超可変領域とごく近接して一緒に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照）。定常ドメインは、抗体を抗原と結合することに直接的には関わっていないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与等の種々のエフェクター機能を呈する。
【００３２】
用語「超可変領域」は、本明細書において使用される場合、抗原結合を司る抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、概して、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って番号付けした場合、ＶＬ内の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）前後、ならびにＶＨ内の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）前後；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））；および／または「超可変ループ」由来の残基（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングシステムに従って番号付けした場合、ＶＬ内の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）、ならびにＶＨ内の２６〜３２（Ｈ１）、５２〜５６（Ｈ２）および９５〜１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））；および／または「超可変ループ」／ＣＤＲ由来の残基（例えば、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って番号付けした場合、ＶＬ内の残基２７〜３８（Ｌ１）、５６〜６５（Ｌ２）および１０５〜１２０（Ｌ３）、ならびにＶＨ内の２７〜３８（Ｈ１）、５６〜６５（Ｈ２）および１０５〜１２０（Ｈ３）；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：２０９−２１２（１９９９），Ｒｕｉｚ，Ｍ．ｅ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２１９−２２１（２０００））を含む。場合により、抗体は、ＡＨｏに従って番号付けした場合、下記の点：ＶＬ内の２８、３６（Ｌ１）、６３、７４〜７５（Ｌ２）および１２３（Ｌ３）、ならびにＶＨ内の２８、３６（Ｈ１）、６３、７４〜７５（Ｈ２）および１２３（Ｈ３）の１つまたは複数において、対称的挿入を有する；Ｈｏｎｎｅｇｅｒ，Ａ．ａｎｄ  Ｐｌｕｎｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７−６７０（２００１））。
【００３３】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書において使用される場合、実質的に均質な抗体の集団から取得された抗体を指す、すなわち、該集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る可能な自然発生の突然変異を除き、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一抗原部位に対するものである。さらに、異なる決定因子（エピトープ）に対する異なる抗体を包含するポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体によって汚染されずに合成され得るという点で、有利である。修飾語「モノクローナル」は、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明において有用なモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記述されたハイブリドーマ方法論によって調製されてもよいし、細菌、真核動物または植物細胞における組換えＤＮＡ方法を使用して作製されてもよい（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照）。「モノクローナル抗体」は、ファージ抗体ライブラリから、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）において記述されている技術を使用して、単離してもよい。
【００３４】
モノクローナル抗体は、重および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一または相同であるのに対し、鎖の残りは、別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一または相同である、「キメラ」抗体、ならびに、それらが所望の生物活性を呈する限り、そのような抗体の断片を包含する（米国特許第４，８１６，５６７号明細書；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）を参照）。ヒト抗体に由来する可変ドメイン抗原結合配列も提供される。したがって、本明細書における主要な関心対象であるキメラ抗体は、１つまたは複数のヒト抗原結合配列（例えば、ＣＤＲ）を有し、非ヒト抗体に由来する１つまたは複数の配列、例えば、ＦＲまたはＣ領域配列を含有する、抗体を包含する。加えて、本明細書における主要な関心対象であるキメラ抗体は、１つの抗体クラスまたはサブクラスおよび別の配列のヒト可変ドメイン抗原結合配列、例えば、別の抗体クラスまたはサブクラスに由来するＦＲまたはＣ領域配列を含むものを包含する。本明細書における関心対象であるキメラ抗体は、本明細書において記述されているもの、または非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿等）等の異なる種に由来するものに関係する、可変ドメイン抗原結合配列を含有するものも包含する。キメラ抗体は、霊長類化およびヒト化抗体も包含する。
【００３５】
さらに、キメラ抗体は、レシピエント抗体においてもドナー抗体においても見られない残基を含み得る。これらの変調は、抗体の性能をさらに精緻化するために為される。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。
【００３６】
「ヒト化抗体」は、概して、非ヒトである供給源からその中に導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有するヒト抗体であるとみなされている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、「インポート」残基と称され、これらは、典型的には、「インポート」可変ドメインから採取される。ヒト化は、伝統的に、Ｗｉｎｔｅｒおよび同僚らの方法に準拠して（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））、ヒト抗体の対応する配列をインポート超可変領域配列で代用することにより、実施される。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）、ここでは、実質的にインタクトなヒト可変ドメイン未満が、非ヒト種由来の対応する配列によって代用されている。
【００３７】
「ヒト抗体」は、ヒトによって自然に産生された抗体中に存在する配列のみを含有する抗体である。しかしながら、本明細書において使用される場合、ヒト抗体は、本明細書において記述されている変調および変異体配列を包含する、自然発生のヒト抗体においては見られない残基または変調を含み得る。これらは、典型的には、抗体の性能をさらに精緻化するまたは強化するために為される。
【００３８】
「インタクトな」抗体は、抗原結合部位およびＣＬ、ならびに少なくとも重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含むものである。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体であってよい。好ましくは、インタクトな抗体は、１つまたは複数のエフェクター機能を有する。
【００３９】
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号明細書；Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２［１９９５］を参照）；一本鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体を包含する。
【００４０】
抗体の「機能性断片またはアナログ」という語句は、完全長抗体と共通して定性的な生物活性を有する化合物である。例えば、抗ＩｇＥ抗体の機能性断片またはアナログは、高親和性受容体、ＦｃεＲＩと結合する能力を有することにより、そのような分子の能力を防止するまたは実質的に低減させるような様式で、ＩｇＥ免疫グロブリンと結合することができるものである。
【００４１】
抗体のパパイン分解は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一抗原結合断片、および残りの「Ｆｃ」断片を産生し、呼称は容易に結晶化する能力を反映している。Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）に沿ったＬ鎖全体、および１つの重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）からなる。各Ｆａｂ断片は、抗原結合に対して一価である、すなわち、単一抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理は、二価抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合Ｆａｂ断片にほぼ対応し、依然として抗原を架橋させることができる、単一の大きいＦ（ａｂ’）２断片を産出する。Ｆａｂ’断片は、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステインを包含するさらなる少数の残基を有することにより、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書において、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を担持するＦａｂ’を表す呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生されたものである。抗体断片の他の化学的カップリングも公知である。
【００４２】
「Ｆｃ」断片は、ジスルフィドによって一緒に保持された両方のＨ鎖のカルボキシ末端部を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域における配列によって決定され、該領域は、ある特定の種類の細胞において見られるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される部分でもある。
【００４３】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部位を含有する最小抗体断片である。この断片は、緊密で非共有結合的に会合した、１つの重および１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。これらの２つのドメインのフォールディングから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を付与する、６つの超可変ループ（それぞれＨおよびＬ鎖に由来する３つのループ）が発する。しかしながら、単一可変ドメイン（または、抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識し結合する能力を有する。
【００４４】
「一本鎖Ｆｖ」は、「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略記され、単一のポリペプチド鎖に接続されたＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨおよびＶＬドメインの間に、抗原結合のための所望の構造をｓＦｖに形成させることができるポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）；Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  １９９５，ｉｎｆｒａを参照されたい。
【００４５】
用語「ダイアボディ」は、ＶＨおよびＶＬドメインの間に、Ｖドメインの鎖内ではなく鎖間対合が実現されるようなショートリンカー（約５〜１０残基）を持つｓＦｖ断片（前段落を参照）を構築して、二価断片、すなわち、２つの抗原結合部位を有する断片をもたらすことによって調製される、小さい抗体断片を指す。二重特異性ダイアボディは、２つの抗体のＶＨおよびＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する２つの「クロスオーバー」ｓＦｖ断片のヘテロ二量体である。ダイアボディについては、例えば、欧州特許第４０４，０９７号明細書；国際公開第９３／１１１６１号パンフレット；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）において、より完全に記述されている。
【００４６】
本明細書において使用される場合、「内在化する」抗体は、哺乳類細胞（例えば、細胞表面ポリペプチドまたは受容体）上の抗原との結合時に、細胞によって取り込まれる（すなわち、中に入る）ものである。抗体を内在化することは、当然ながら、抗体断片、ヒトまたはキメラ抗体、および抗体コンジュゲートを包含することになる。ある特定の治療応用のために、インビボでの内在化が企図されている。内在化される抗体分子の数は、細胞、とりわけ感染細胞を、死滅させる、またはその成長を阻害するのに十分なまたは妥当なものとなる。抗体または抗体コンジュゲートの効力に応じて、いくつかの場合において、細胞への単一抗体分子の取り込みは、抗体が結合する標的細胞を死滅させるのに十分である。例えば、ある特定の毒素は、抗体にコンジュゲートされた毒素の１分子の内在化が、感染細胞を死滅させるのに十分であるような、死滅させることに高度に強力なものである。
【００４７】
本明細書において使用される場合、抗体は、検出可能なレベルで、好ましくは、約１０４Ｍ−１以上、または約１０５Ｍ−１以上、約１０６Ｍ−１以上、約１０７Ｍ−１以上、または１０８Ｍ−１以上の親和定数Ｋａで、抗原と反応するならば、「免疫特異性」、抗原「に対して特異的」またはそれと「特異的に結合している」であると言われる。抗体の、その同種抗原に対する親和性は、解離定数ＫＤとしても一般的に表現され、ある特定の実施形態において、ＨｕＭ２ｅ抗体は、１０−４Ｍ以下、約１０−５Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、１０−７Ｍ以下、または１０−８Ｍ以下のＫＤで結合するならば、Ｍ２ｅと特異的に結合する。抗体の親和性は、従来の技術、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ５１：６６０（１９４９））によって記述されているものを使用して、容易に決定することができる。
【００４８】
抗体の、その抗原、細胞または組織に対する結合特性は、概して、例えば、免疫組織化学（ＩＨＣ）および／または蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）等の免疫蛍光ベースのアッセイを包含する免疫検出法を使用して、決定および評価され得る。
【００４９】
指定された抗体の「生物学的特徴」を有する抗体は、該抗体を他の抗体から区別する、抗体の生物学的特徴の１つまたは複数を保有するものである。例えば、ある特定の実施形態において、指定された抗体の生物学的特徴を持つ抗体は、指定された抗体によって結合されているものと同じエピトープを結合させるか、かつ／または指定された抗体として一般的なエフェクター機能を有することになる。
【００５０】
用語「アンタゴニスト抗体」は、最も広い意味で使用され、それが特異的に結合する、エピトープ、ポリペプチドまたは細胞の生物活性を、部分的にまたは完全に遮断する、阻害するまたは中和する抗体を包含する。アンタゴニスト抗体を同定するための方法は、候補アンタゴニスト抗体によって特異的に結合されているポリペプチドまたは細胞を、候補アンタゴニスト抗体と接触させるステップと、ポリペプチドまたは細胞に通常は関連する１つまたは複数の生物学的活性における検出可能な変化を測定するステップと、を含み得る。
【００５１】
抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因する生物学的活性を指し、抗体アイソタイプにより変動する。抗体エフェクター機能の例は、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション；ならびにＢ細胞活性化を包含する。
【００５２】
用語「抗原結合部位」または「結合部」は、免疫グロブリン分子の、抗原結合に関与する部分を指す。抗原結合部位は、重（「Ｈ」）および軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と称される、重および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に分岐するストレッチは、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として公知の、より保存されたフランキングストレッチ間に挟まれる。故に、用語「ＦＲ」は、免疫グロブリン内の超可変領域間に自然に見られるまたはそれに隣接する、アミノ酸配列を指す。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域は、三次元空間に互いに対して配置されて、抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は、結合抗原の三次元表面と相補的であり、重および軽鎖のそれぞれの３つの超可変領域を、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と称する。
【００５３】
本明細書において使用される場合、用語「エピトープ」は、免疫グロブリン、ｓｃＦｖまたはＴ細胞受容体と特異的結合することができる、任意のタンパク質決定因子を包含する。エピトープ決定因子は、アミノ酸または糖側鎖等の分子の化学的に活性な表面分子団からなり、特異的な三次元構造の特徴、および特異的な電荷特徴を有する。例えば、抗体を、タンパク質の、ポリペプチド、線状または非線状ペプチド配列のＮ末端またはＣ末端ペプチド、ならびに、第一の抗原のアミノ酸および第二の抗原のアミノ酸を含むエピトープに対して、高めてよい。本明細書において使用される場合、用語「免疫学的結合」および「免疫学的結合特性」は、免疫グロブリン分子と免疫グロブリンが特異的である抗原との間で発生する種類の非共有結合的相互作用を指す。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）の観点から表現することができ、ここで、より小さいＫｄは、より大きい親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当技術分野において周知の方法を使用して定量化することができる。１つのそのような方法は、抗原結合部位／抗原錯体の形成および解離の速度を測定するステップを伴い、ここで、それらの速度は、錯体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方向において速度に等しく影響を与える幾何学的パラメータによって決まる。故に、「オン速度定数」（Ｋｏｎ）および「オフ速度定数」（Ｋｏｆｆ）の両方を、濃度ならびに会合および解離の実際の速度の計算によって決定することができる（Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：１８６−８７（１９９３））。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比は、親和性に関係しないすべてのパラメータの取り消しを可能にし、解離定数Ｋｄと等しい。Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５９：４３９−４７３）。本発明の抗体は、放射性リガンド結合アッセイまたは当業者に公知である同様のアッセイ等のアッセイによって測定した際に、平衡結合定数（Ｋｄ）が、１μＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下、より好ましくは１０ｎＭ以下、より好ましくは１ｎＭ以下、最も好ましくは１００ｐＭから約１ｐＭ以下である場合に、本明細書において記述されている抗原またはエピトープ（例えば、ＣＴＬＡ、ＰＤ１、ＰＤＬ１、または他の免疫抑制タンパク質および／もしくは腫瘍抗原）と特異的に結合すると言われている。
【００５４】
本発明は、完全長ポリペプチドおよび核酸の所望の生物活性をそれぞれ呈する（すなわち、ＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２をアンタゴナイズする）限り、ポリペプチドおよび核酸断片も含む。ほぼすべての長さの核酸断片が用いられる。例えば、長さ約１０，０００、約５０００、約３０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０塩基対（すべての中間の長さを包含する）の全長を持つ例証的なポリヌクレオチドセグメントが、本発明の多くの実装に包含される。同様に、ほぼすべての長さのポリペプチド断片が用いられる。例えば、長さで約１０，０００、約５，０００、約３，０００、約２，０００、約１，０００、約５，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、または約５０アミノ酸（すべての中間の長さを包含する）の全長を持つ例証的なポリペプチドセグメントが、本発明の多くの実装に包含される。
【００５５】
ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは他の作用物質は、精製および／または単離される。具体的には、本明細書において使用される場合、「単離された」または「精製された」核酸分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質には、組換え技術によって産生された場合、他の細胞物質もしくは培養培地が、または化学的に合成された場合、化学的前駆体もしくは他の化学物質が実質的にない。精製された化合物は、少なくとも６０重量％（乾燥重量）の関心対象の化合物である。好ましくは、調製物は、重量で少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９９％の、関心対象の化合物である。例えば、精製された化合物は、重量で、所望化合物の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９８％、９９％、または１００％（ｗ／ｗ）のものである。純度は、任意の適切な標準的方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析によって測定される。精製されたまたは単離されたポリヌクレオチド（リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ））には、その自然発生の状態では、側面に位置する遺伝子も配列もない。精製されたまたは単離されたポリペプチドには、その自然発生の状態では、側面に位置するアミノ酸も配列もない。「精製された」は、ヒト対象への投与に安全である、例えば、感染性または毒性作用物質を欠いている、滅菌の程度も定義する。
【００５６】
同様に、「実質的に純粋」が意味するのは、自然にそれに付随する成分から分離されたヌクレオチドまたはポリペプチドである。典型的には、ヌクレオチドおよびポリペプチドは、重量で少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％，またはさらには９９％であり、それらが自然に結合したタンパク質および自然発生の有機分子がない場合に、実質的に純粋である。
【００５７】
「単離された核酸」が意味するのは、核酸の由来源である生物の自然発生のゲノムにおいて、側面に位置する遺伝子がない、核酸である。該用語は、例えば、（ａ）自然発生のゲノムＤＮＡ分子の一部であるが、それが自然に発生する生物のゲノムにおいて、分子のその一部の側面に位置する核酸配列の両方が側面に位置していない、ＤＮＡ；（ｂ）ベクター中に、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に、得られる分子がいかなる自然発生のベクターともゲノムＤＮＡとも同一でないような様式で組み込まれた、核酸；（ｃ）合成相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって産生された断片、または制限断片等の別個の分子；ならびに（ｄ）雑種遺伝子、すなわち、融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である、組換えヌクレオチド配列を網羅する。本発明による単離された核酸分子は、合成的に産生された分子、ならびに化学的に改変されたおよび／または修飾された骨格を有する任意の核酸をさらに包含する。例えば、単離された核酸は、精製されたｃＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドである。単離された核酸分子は、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子も包含する。
【００５８】
「候補化合物」が意味するのは、それが自然発生するまたは人工的に誘導される化学物質である。候補化合物は、例えば、ペプチド、ポリペプチド、合成有機分子、自然発生の有機分子、核酸分子、ペプチド核酸分子、ならびにそれらの成分および誘導体を包含し得る。
【００５９】
用語「医薬組成物」が意味するのは、少なくとも１つの治療的または生物学的活性剤を含有し、患者への投与に好適な、任意の組成物である。これらの製剤のいずれも、当技術分野の周知かつ認められている方法によって調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，（ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，２０００を参照されたい。
【００６０】
「分泌促進物質」が意味するのは、別の物質を分泌させる物質である。
【００６１】
「Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）」が意味するのは、細胞外の分子を感知し、細胞内で、シグナル伝達経路および最終的に細胞応答を活性化させる、タンパク質受容体である。ＧＰＣＲは、細胞膜を７回通過することから、７回膜貫通型受容体と呼ばれている。
【００６２】
「アゴニスト」が意味するのは、受容体と結合し、受容体を活性化させて生物学的応答を産生する、化学物質である。アゴニストが作用を引き起こすのに対し、「アンタゴニスト」はアゴニストの作用を遮断し、逆アゴニストはアゴニストの作用とは逆の作用を引き起こす。本明細書において使用される場合、用語「アンタゴニスト」および「阻害剤」は、その標的分子の生物活性を相殺するもしくは阻害する、減少させる、または抑制する、任意の分子を指すために、交換可能に使用される。好適なＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２アンタゴニストは、可溶性受容体、ペプチド阻害剤、小分子阻害剤、リガンド融合および抗体を包含する。
【００６３】
「野生型」または「ＷＴ」が意味するのは、それが自然界において発生する場合の、種の典型的な形態の表現型である。あるいは、野生型は、非標準的な「突然変異体」対立遺伝子によって産生されるものとは対照的に、遺伝子座で標準的な「正常な」対立遺伝子の生成物として概念化されている。
【００６４】
用語「偽アレルギー」は、真のアレルギーと同様のその提示に因んで命名されたが別の原因によるものである状態を指す。これは、ヒスタミンの代謝における改変によるものであってよい。「偽アレルギー」は、抗体ＩｇＥ非依存性アレルギー様反応を意味する。換言すれば、偽アレルギーは、ＩｇＥがアレルギー様反応を誘発することを必要としない。
【００６５】
用語「投与すること」は、本明細書において使用される場合、ＭｒｇｐｒＢ２またはＭｒｇｐｒＸ２アンタゴニストを、例えば、偽アレルギー型反応の重症度の低減を必要とする対象に、伝達する、送達する、導入する、または輸送する、任意の方式を指す。そのような方式は、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮内、鼻腔内および皮下投与を包含するがこれらに限定されない。
【００６６】
「ＭｒｇｐｒＢ２またはＭｒｇｐｒＸ２アンタゴニスト」が意味するのは、ＭｒｇｐｒＢ２またはＭｒｇｐｒＸ２の能力を、遮断し、防止し、低下させ、改変して、シグナル伝達経路を活性化させることができる、任意の小分子、化学化合物、抗体、核酸分子もしくはポリペプチド、またはそれらの断片である。
【００６７】
「改変」が意味するのは、本明細書において記述されているもの等の当技術分野において公知である標準的方法によって検出した際の、ポリペプチド、例えばＭｒｇｐｒＢ２またはＭｒｇｐｒＸ２の活性における変化（増大または減少）である。本明細書において使用される場合、改変は、遺伝子またはポリペプチドの発現レベルまたは活性における１０％以上の変化、好ましくはポリペプチドの活性における２５％の変化、より好ましくは４０％の変化、最も好ましくは５０％以上の変化を包含する。
【００６８】
本明細書において使用される場合、「改変」は、遺伝子またはポリペプチドの発現レベルまたは活性における２倍以上の、例えば、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍以上の変化も包含する。
【００６９】
「寛解させる」が意味するのは、例えば、偽アレルギー型反応等の疾患の発病または進行を、減少させる、抑制する、軽減する、和らげる、停止させる、または安定させることである。
【００７０】
「増幅する」が意味するのは、分子の複製の数を増大させることである。一例において、核酸を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が使用される。
【００７１】
「結合」が意味するのは、分子に対する物理化学的親和性を有することである。結合は、本発明の方法のいずれか、例えば、細胞上に受容体が発現された薬物／化合物によって、測定される。
【００７２】
本開示において、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「を含有する」、「を有する」等は、米国特許法においてそれらに与えられている意味を有することができ、「を包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「を包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等を意味することができ、用語「から本質的になる」または「本質的になる」は、同様に、米国特許法において与えられている意味を有し、これらの用語は、オープンエンドであり、列挙されているものの基本的なまたは新規の特徴が、列挙されている以上のものの存在によって変更されない限り、列挙されている以上のものの存在を許可するが、先行技術の実施形態は除外する。
【００７３】
「検出する」は、検出されるシグナル伝達経路のＭｒｇｐｒＢ２またはＭｒｇｐｒＸ２活性化の、存在、非存在または量を、直接的にまたは間接的にのいずれかで同定することを指す。
【００７４】
「有効量」が意味するのは、未治療患者に関連して疾患の症状を寛解させるために必要とされる量である。疾患の治療的処置のために本発明を実践するために使用される活性化合物の有効量は、投与の様式、対象の年齢、体重および全体的な健康に応じて変動する。最終的に、主治医または獣医が、適切な量および投薬レジメンを決めるであろう。そのような量を、「有効」量と称する。
【００７５】
用語「治療すること」および「治療」は、本明細書において使用される場合、症状の重症度および／もしくは頻度の低減を達成する、症状および／もしくはそれらの根本原因を排除する、ならびに／または損傷の改良もしくは改善を容易にするように、有害な状態、障害または疾患を患っている臨床症状を示す個体への、作用物質または製剤の投与を指す。
【００７６】
本明細書において提供される範囲は、該範囲内の値のすべての省略表現であると理解される。例えば、１から５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からなる群からの、任意の数、数の組み合わせ、またはサブ範囲、ならびに、例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８および１．９等、前述の整数間のすべての介在する十進法の値を包含すると理解される。サブ範囲に対して、範囲のいずれかの端点から伸長する「入れ子になったサブ範囲」が具体的に企図されている。例えば、１から５０の例示的な範囲の入れ子になったサブ範囲は、一方向に、１から１０、１から２０、１から３０および１から４０、または逆方向に、５０から４０、５０から３０、５０から２０および５０から１０を含んでよい。
【００７７】
「組換え」が意味するのは、複数の供給源からの遺伝物質を一緒にして、そうでなければ生物有機体においては見られないであろう配列を作成するための、遺伝子組換え（分子クローニング等）の実験室的方法によって形成された核酸分子である。
【００７８】
「異種プロモータ」は、遺伝子または核酸配列が自然界において動作可能に結合しているプロモータとは異なるプロモータである。用語「動作可能に結合している」は、核酸発現制御配列（プロモータ、シグナル配列、または転写因子結合部位のアレイ等）と第二の核酸配列との間の機能的結合を指し、ここで、発現制御配列は、第二の配列に対応して核酸の転写および／または翻訳に影響を及ぼす。「異種ポリヌクレオチド」または「異種遺伝子」は、本明細書において使用される場合、外の供給源を起源として特定の宿主細胞へ、または、同じ供給源からであれば、その元の形態から変調されたものである。
【００７９】
「低減させる」が意味するのは、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、または１００％の負の改変である。
【００８０】
「基準」が意味するのは、標準または対照条件である。
【００８１】
具体的に記載がない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書において使用される場合、用語「１つの（ａ）、（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」は、単数形または複数形であると理解される。具体的に記載がない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書において使用される場合、用語「または」は、包含的であると理解される。
【００８２】
具体的に記載がない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書において使用される場合、用語「約」は、当技術分野における一般公差の範囲内、例えば、平均の２標準偏差内であると理解される。約は、記載されている値の、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内であると理解することができる。文脈から別段に明らかでない限り、本明細書において提供されるすべての数値は、用語「約」によって修飾されている。
【００８３】
本発明の他の特色および利点は、その好ましい実施形態の下記の記述から、および請求項から明らかであろう。別段の定義がない限り、本明細書において使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書において記述されているものと同様のまたは同等の方法および材料を、本発明の実践または試験において使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記述する。本明細書において引用されているすべての公開外国特許および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において引用されている受託番号によって示されるジーンバンクおよびＮＣＢＩ寄託は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において引用されているすべての他の公開された参考文献、文書、原稿および科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、定義を包含する本明細書が優先するものとする。加えて、材料、方法および例は、例証的なものにすぎず、限定を意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１Ａは、マウスにおける拡大した遺伝子ファミリーならびに同様の発現パターンおよびアゴニスト特異性に基づくそれらの同定されたヒトオルソログを例証する、マウスおよびヒトＭｒｇｐｒゲノム遺伝子座の図である。マウスＭｒｇｐｒ遺伝子（上部に名称を伴う縦棒として示されている）は、染色体７上でクラスタ化する。マウスＭｒｇｐｒＡ３（Ａ３）およびＭｒｇｐｒＣ１１（Ｃ１１）は、ヒトＭｒｇｐｒＸ１（Ｘ１）のオルソログであり、後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンにおいて特異的に発現され、クロロキン（ＣＱ）およびＢＡＭ８−２２（ＢＡＭ）に誘発されたかゆみを媒介するかゆみ受容体として機能する。マウスＭｒｇｐｒＢ２（Ｂ２）、ヒトＭｒｇｐｒＸ２（Ｘ２）のオルソログの発現およびアゴニスト特異性については、以下で記述する。図１Ｂは、マウス腹膜肥満細胞におけるＭｒｇｐｒＢ２転写産物（矢印）の同定された発現をスクリーニングする、ストリンジェンドな逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）からの結果を示す。Ｍｒｇｐｒ遺伝子名は、ゲル写真の上部に示されている。逆転写酵素がｃＤＮＡ合成反応から省かれた場合、バンドは見られなかった（陰性）。図１Ｃは、ＭｒｇｐｒＢ２またはＭｒｇｐｒＸ２のプラスミド駆動発現を一過性にトランスフェクトし、２０μＭ  ＰＡＭＰ（９〜２０）の浴適用（ｂａｔｈ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（上部に黒色線によって示された持続期間）に暴露したＨＥＫ２９３細胞からの、レシオメトリックＦｕｒａ−２イメージングによって測定した際の、細胞内カルシウム濃度［Ｃａ２＋］ｉの例示的なトレースを示す。各トレースは、独自の細胞からの応答である。図１Ｄは、ＢＡＣトランスジェニックマウス組織からの代表的な共焦点画像を示す一連の顕微鏡写真である。ＭｒｇｐｒＢ２オープン・リーディング・フレームにおいてｅＧＦＰ−Ｃｒｅを発現しているＢＡＣマウスを、Ｒｏｓａ２６−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターマウスと交尾させた。したがって、ｔｄＴｏｍａｔｏの発現は、ＭｒｇｐｒＢ２プロモータの制御下にあるＣｒｅの発現パターンによって決定される。ｔｄＴｏｍａｔｏ（赤色）発現を、肥満細胞のマーカーであるアビジン染色（緑色）と比較した。２つのマーカー間のほぼ１００％の重複は、ＭｒｇｐｒＢ２が肥満細胞において特異的に含有されていることを示唆している。心臓を除くすべての組織について３匹のマウスを調査し、心臓については２匹のマウスを調査した。ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性でもあったアビジン陽性肥満細胞のパーセンテージ：無毛皮膚、９７．５％；有毛皮膚、９０．１％；気管、９７．２％；心臓、８７．１％。アビジン陽性でもあったｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞のパーセンテージ：無毛皮膚、９９．２％；有毛皮膚、１００％；気管、９８．３％；心臓、９９％。各組織において計数された細胞の総数は、１００超であった心臓を除いて、３００超であった。心臓肥満細胞は、組織中の他の場所よりも密度がはるかに高いことから、体腔付近で調査し；ｔｄＴｏｍａｔｏについて陰性であったアビジン陽性細胞は、筋肉組織中にごく少数で包埋されていることが観察されたが、それらの同定は不明瞭であった。スケールバーは２０μｍ���ある。
【図２】図２Ａ（左）は、抗ＩｇＥ（５μｇ／ｍｌ）または化合物４８／８０（１０μｇ／ｍｌ）の浴適用によって誘発されたＦｌｕｏ−４イメージングによってアッセイした際の、［Ｃａ２＋］ｉの変化を示すマウス腹膜肥満細胞の代表的なヒートマップ画像を示す一連の顕微鏡写真である。図２Ａ（中）は、代表的なイメージングトレースを示す。各色の線は、個々の細胞を表す。「抗ＩｇＥ」パネルにおける黒色線は、各遺伝子型の平均トレースである。注記：［Ｃａ２＋］ｉトレースは、ＷＴおよびＭＵＴ群の間で同様である。図２Ａ（右）は、応答している細胞のパーセンテージの定量化を示す。細胞は、［Ｃａ２＋］ｉが少なくとも１０秒につき少なくとも５０％上昇したならば応答しているとして同定され、これは、リガンド誘発性応答を無作為なちらつき事象から明らかに区別するものである。これらおよびすべての他の実験についてのグループデータを、平均±標準誤差として表現する。片側不対スチューデントｔ検定を使用して、統計的比較における有意性を決定し、差異を、ｐ＜０．０５。＊＊、ｐ＜０．０１で有意とみなした（各遺伝子型についてｎ＝３；各条件について１５０を上回る細胞が計数された）。抗ＩｇＥ応答は、有意に異なっていなかった。スケールバーは１０μｍである。図２Ｂは、４８／８０（３０μｇ／ｍｌ）に３７℃で３０分間の暴露後の、ＷＴおよびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴマウス由来の気管および腹部皮膚から上清中へのヒスタミン放出を示す棒グラフである。上清中に放出されたヒスタミンの量を定量化し、ｎｇ／ｍｇ組織（湿重量）で表現した。＊＊、ｐ＜０．０１（気管についてはｎ＝５、皮膚についてはｎ＝８）。図２Ｃは、一連のグラフである。図２Ｃ（上）は、４８／８０（３０μｇ／ｍｌ）または卵子（１０μｇ／ｍｌ；すなわちＩｇＥ依存性）に応答した、ＷＴおよびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴマウスから単離された気管（事前にオボアルブミン（卵子）に感作されたもの）の収縮を示す代表的なトレースを示す。図２Ｃ（下）は、実験の終わりに添加された１０μＭのカルバミルコリンへの応答として決定された、最大総収縮の平均データを示す。４８／８０  ＷＴについてはｎ＝５、４８／８０  ＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴについては３。図２Ｄは、一連の写真および４８／８０（右、矢印、１０μｇ／ｍｌ、生理食塩水中５μｌ）または生理食塩水（左）の足底内注射の１５分後のエバンスブルー溢出の代表的な画像を示す棒チャート（左）である。図２Ｄ（右）は、足へのエバンスブルー漏出の定量化および１５分後の足の厚みの増大を示す。＊、ｐ＜０．０２（ｎ＝５／ＷＴ、ｎ＝６／ＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ）。生理食塩水注射後の差異は有意ではなかった。図２Ｅは、Ｆｌｕｏ−４イメージングを使用してアッセイした、ＭｒｇｐｒＸ２リガンドおよび塩基性分泌促進物質に対するＷＴおよびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ肥満細胞応答性の定量化を示す棒チャートである。物質の濃度（単位μＭ）：ＰＡＭＰ（９〜２０）、２０；コルチスタチン−１４（ｃｏｒｔ．）、２０；物質Ｐ（ｓｕｂ  Ｐ）、２００；カリジン、２００；マストパラン（ｍａｓｔｏ．、スズメバチ毒の成分）、２０；スズメバチマストパラン、２０。ｎ＝３／遺伝子型；１５０を上回る細胞が計数さ��た／分泌促進物質。データを、平均±標準誤差（ＳＥＭ）として提示する。両側不対スチューデントｔ検定を使用して、統計的比較における有意性を決定し、差異を、注記のない限り、ｐ＜０．０５。＊、ｐ＜０．０５．＊＊、ｐ＜０．０１で有意とみなした。
【図３】図３Ａは、ＭｒｇｐｒＢ２が肥満細胞応答性およびペプチド性治療薬の副作用を媒介することを示す棒チャートである。図３Ａは、Ｆｌｕｏ−４イメージングを使用してアッセイした、薬物適用後のＷＴおよびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ腹膜肥満細胞由来の応答している細胞のパーセンテージを示す。薬物の濃度（単位μｇ／ｍｌ）：イカチバント、５０；セトロレリクス、２０；ロイプロリド、１００；オクトレオチド、１０；セルモレリン、６０；インスリン、８０。ｎ＝３／遺伝子型；１５０を上回る細胞が計数された／物質、インスリンについて計数された１００超の細胞を除く。インスリン応答性の間の差異は、有意ではなかった。図３Ｂ（左）は、イカチバント（右、矢印、１０ｍｇ／ｍｌ、生理食塩水中５μｌ）または生理食塩水（左）の足底内注射の１５分後の、エバンスブルー溢出の代表的な画像を示す。図３Ｂ（右）は、１５分後の足へのエバンスブルー漏出の定量化を示す。＊＊、ｐ＜０．０１（各遺伝子型についてｎ＝６）。生理食塩水注射後の差異は、有意ではなかった。図３Ｃは、名前が挙げられた物質とともにインキュベーション後の、ＷＴ（赤色のひし形）およびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ（黒色の正方形）マウスからの総ヒスタミン放出を示す一連のドットプロットである。ＷＴおよびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ細胞の間には、抗ＩｇＥ抗体のいずれの用量においても有意差が見られなかった。実験を３回超繰り返した。データを、平均±ＳＥＭとして提示する。両側不対スチューデントｔ検定：＊、ｐ＜０．０５。＊＊、ｐ＜０．０１。
【図４】図４Ａは、化合物４８／８０およびより強力であると報告されている環化バリアントの一連の構造である。テトラヒドロイソキノリン（ＴＨＩＱ）モチーフは青色で強調表示されている。図４Ｂは、すべてのＮＭＢＤクラスの代表的なメンバーの一連の構造である。ＴＨＩＱモチーフは青色で強調表示されている。スクシニルコリンのみが大きい疎水性基を欠いていることに留意されたい。図４Ｃは、ＭｒｇｐｒＢ２が、小分子治療薬の肥満細胞応答性および副作用を媒介することを示す棒チャートである。図４Ｃは、Ｆｌｕｏ−４イメージングを使用してアッセイした、種々のＮＭＢＤの適用後の、ＷＴおよびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ腹膜肥満細胞由来の応答している細胞のパーセンテージを示す。薬物の濃度（単位μｇ／ｍｌ）：アトラクリウム、５０；ミバクリウム、２０；ツボクラリン、３０；ロクロニウム、５００。ｎ＝３マウス／遺伝子型；１５０を上回る細胞が計数された／物質。図４Ｄは、シプロフロキサシンの構造の描写であり、すべてのフルオロキノロンに共通のモチーフは青色で強調表示されている。キノロンモチーフの近くの窒素に留意されたい。図４Ｅは、Ｆｌｕｏ−４イメージングを使用してアッセイした、フルオロキノロン適用後の、ＷＴおよびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ腹膜肥満細胞由来の応答している細胞のパーセンテージを示す棒チャートである。薬物の濃度（単位μｇ／ｍｌ）：シプロフロキサシン、２００；レポフロキサシン、５００；モキシフロキサシン、１６０；オフロキサシン、４００。ｎ＝３マウス／遺伝子型；１５０を上回る細胞が計数された／物質。図４Ｆは、時刻０におけるシプロフロキサシン（１２５μｌの生理食塩水中１．５ｍｇ）の静脈注射後の体温の変化を示す折れ線グラフである。ｎ＝４マウス／遺伝子型。データを、平均±ＳＥＭとして提示する。両側不対スチューデントｔ検定：＊、ｐ＜０．０５。＊＊、ｐ＜０．０１。
【図５】図５Ａは、ＭｒｇｐｒＸ１オルソログが、ナイーブ条件下で肥満細胞において示差的レベルで発現されていないことを示すブロットの写真である。図５Ａは、ＭｒｇｐｒＸ１オルソログＭｒｇｐｒＡ３およびＭｒｇｐｒＣ１１の発現について、腹膜肥満細胞における低ストリンジェンシーＲＴ−ＰＣＲスクリーニングからの結果を示す。矢印は、予測されるバンドサイズを指し示す。図５Ｂは、ＭｒｇｐｒＸ１およびＭｒｇｐｒＣ１１アゴニストウシ副腎髄質由来ペプチド、断片８〜２２（ＢＡＭ８〜２２、５００ｎＭ）に応答する腹膜肥満細胞のパーセンテージを示す棒チャートである。Ｆｌｕｏ−４色素のイメージングを使用して、細胞内カルシウムの上昇を測定することにより、活性化をアッセイした。差異は有意ではなかった（ｐ＝０．３９）。グループデータを、平均±標準誤差として表現する。両側不対スチューデントｔ検定を使用して、統計的比較における有意性を決定した。図５Ｃは、ＭｒｇｐｒＸ２、ＭｒｇｐｒＢ２、およびＭｒｇｐｒＢ２と最も密接に関係している他のマウスＭｒｇｐｒ（すなわち、ＭｒｇｐｒＢ１、Ｂ１０、およびＢ１１）のプラスミド駆動発現を一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞による、ＭｒｇｐｒＸ２リガンドおよびＭｒｇｐｒＸ１リガンドクロロキン（ＣＱ）に対する応答をまとめたチャートである。陽性および陰性応答は、それぞれ「チェック」および「バツ印」として示される。トランスフェクト細胞の少なくとも半分が［Ｃａ２＋］ｉの５０％増大を示した場合、応答は陽性とみなされた。ＭｒｇｐｒＢ１、Ｂ１０、およびＢ１１をトランスフェクトした細胞は、いかなる収載されている薬物に対しても応答しなかった。
【図６】図６Ａは、ＨＥＫ２９３細胞において発現されたマウスＭｒｇｐｒＢ２およびヒトＭｒｇｐｒＸ２を活性化させる偽アレルギー反応を誘発する塩基性分泌促進物質および薬物を示す一連の折れ線グラフである。図６Ａは、ＭｒｇｐｒＢ２およびＧα１５を発現しているＨＥＫ２９３細胞から、Ｆｌｕｏ−４イメージングによって測定した際の、［Ｃａ２＋］ｉの変化を示すトレース例を示す。図６Ｂは、ＭｒｇｐｒＸ２およびＧα１５を発現しているＨＥＫ２９３細胞から、Ｆｌｕｏ−４イメージングによって測定した際の、［Ｃａ２＋］ｉの変化を示すトレース例である。物質は、シプロフロキサシンを除いて３０から９０秒の間の期間にわたって灌流させ、シプロフロキサシンは、それが溶解する低ｐＨ溶液への暴露を最小化するために、３０から６０秒の間の期間にわたって灌流させた。インスリンを陰性対照として使用した。図６Ｃは、ＭｒｇｐｒＢ２およびＭｒｇｐｒＸ２発現ＨＥＫ２９３細胞を活性化させる偽アレルギー反応に関連する塩基性分泌促進物質および薬物のＥＣ５０の表である。ＥＣ５０は、３回繰り返した用量応答研究から決定した。データを、平均±ＳＥＭとして表現する。
【図７】図７は、ＢＡＣトランスジェニックマウスの複数の系統が肥満細胞特異的ＭｒｇｐｒＢ２発現を確認することを示す一連の顕微鏡写真である。図７は、２つの他のＢＡＣトランスジェニックマウス系統からの代表的な共焦点画像を示す。ＭｒｇｐｒＢ２オープン・リーディング・フレームにおいてｅＧＦＰ−Ｃｒｅを発現しているＢＡＣマウスを、ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターマウスと交尾させ、ｔｄＴｏｍａｔｏ（赤色）発現を、肥満細胞のマーカーであるアビジン染色（緑色）と比較した。スケールバーは２０μｍである。
【図８】図８Ａ〜図８Ｂは、ＭｒｇｐｒＢ２が、粘膜肥満細胞においても末梢白血球においても発現されないことを示す。図８Ａは、粘膜肥満細胞を標識するために抗ＭＣＰＴ１（β−キマーゼ）抗体で染色されたＭｒｇｐｒＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏマウス由来の胃の切片の代表的な画像を示す。白色矢印は、陽性細胞を示す。二重標識された細胞はなかった（２９６のＭｃｐｔ１標識細胞および２７５のｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞が計数された、ｎ＝３マウス）。スケールバーは４０μｍである。図８Ｂは、ＭｒｇｐｒＢ２発現細胞（赤色；左画像）およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２核染色（青色；右画像）についてｔｄＴｏｍａｔｏで二重標識されたＭｒｇｐｒＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏマウス由来の末梢白血球のサイトスピン調製物の代表的な画像を示す。末梢白血球はＭｒｇｐｒＢ２を発現しなかった（ｎ＝３マウス；４０００超の細胞を調査した）。スケールバーは４０μｍである。
【図９】図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃおよび図９Ｄは、ＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴマウスが機能的ノックアウトであることを示す。図９Ａは、ＭｒｇｐｒＢ２遺伝子座の中または周囲のゲノム領域の例証である。長い散在要素（ＬＩＮＥ）、短い散在要素（ＳＩＮＥ）および長いタンデム反復（ＬＴＲ）を包含する反復配列は、ＭｒｇｐｒＢ２遺伝子の３’側直後に開始し、加えて、５’側の２．５ｋｂ以内に存在することに留意されたい。ＭｒｇｐｒＢ２の３’端に隣接する５００塩基をクエリーとして使用した２０１４年３月のＢＬＡＳＴＮサーチはマウスゲノムにおいて２６９，０００超のヒットを発見した。図９Ｂは、突然変異体における４塩基対欠失の位置を示すＷＴ（配列番号６２）およびＭＵＴ（配列番号６３）ゲノム配列の比較である。数は、ＭｒｇｐｒＢ２オープン・リーディング・フレームに対応している。図９Ｃは、突然変異株が確立された後に生後１８か月のマウスから試料採取されたＷＴ（配列番号６４）およびＭＵＴ（配列番号６５）  ｃＤＮＡのシークエンシング結果である。突然変異体における欠落している塩基は赤色で強調表示されている。図９Ｄは、欠失が、第一の膜貫通領域の後まもなくフレームシフト突然変異および早期終止コドン（＊）を作成することを明らかにする、ＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴオープン・リーディング・フレームのアミノ酸翻訳である（それぞれ出現順に、配列番号６６及び配列番号６７）。Ｍｕｔ−フレームシフト欠失の部位。ＴＭ１−膜貫通領域１。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｂは、肥満細胞数ならびに気管および皮膚組織のヒスタミン含有量が、野生型およびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ動物の間で異なっていなかったことを示す、一連の顕微鏡写真および棒チャートである。図１０Ａ（上）は、ＷＴおよびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴマウスにおけるアビジン染色の代表的な写真を示す。スケールバーは４０μｍである。図１０Ａ（下）は、種々の組織における肥満細胞数の定量化を示す。両側不対スチューデントｔ検定を使用して、差異は有意ではなかった（各遺伝子型についてｎ＝３マウス；有毛および無毛皮膚では各遺伝子型についてそれぞれ３０００μｍ２および１０００μｍ２を上回って計数された；１０，０００を上回る腹腔細胞が計数された）。図１０Ｂは、気管ヒスタミン含有量がそれぞれ平均５．９±０．９および５．５±１．６ｎｇ／ｍｇ（各遺伝子型についてｎ＝５）であり、皮膚ヒスタミン含有量がそれぞれ平均３０．８±３．２および３０．２±４．０ｎｇ／ｍｇ（各遺伝子型についてｎ＝８）であったことを示す。差異は有意ではなかった。グループデータを、平均±標準誤差として表現する。両側不対スチューデントｔ検定を使用して、統計的比較における有意性を決定した。
【図１１】図１１Ａ、図１１Ｂおよび図１１Ｃは、それぞれ、一連の顕微鏡写真、折れ線グラフおよび棒チャートであり、これらは、ＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴおよび野生型肥満細胞におけるＥＴＡ  ＧＰＣＲ１に誘発された同程度の活性化を介して作用するエンドセリンを示す。図１１Ａは、エンドセリン（１μＭ）の浴適用によって誘発されたＦｌｕｏ−４イメージングによってアッセイした際の、［Ｃａ２＋］ｉの変化を示すマウス腹膜肥満細胞の代表的なヒートマップ画像を示す。スケールバーは１０μｍである。図１１Ｂは、ＷＴ（赤色線）およびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ（黒色線）について［Ｃａ２＋］ｉイメージングトレースの平均を示す。［Ｃａ２＋］ｉトレースは、ＷＴおよびＭＵＴ群間で同様である。トレースを、図２Ａについて記述されている通りに平均化した。図１１Ｃは、応答している細胞のパーセンテージの定量化を示す。グループデータを、平均±標準誤差として表現する。両側不対スチューデントｔ検定を使用して、統計的比較における有意性を決定した（各遺伝子型についてｎ＝３；各遺伝子型について１８０を上回る細胞が計数された）。エンドセリン誘発性応答は、有意に異なっていなかった。
【図１２】図１２Ａおよび図１２Ｂは、ＩｇＥ媒介性炎症が、野生型およびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴマウスの間で異なっていないことを示す。図１２Ａは、抗ＩｇＥ抗体（右、矢印、１００μｇ／ｍｌ、生理食塩水中７μｌ）または生理食塩水（左）の足底内注射の１５分後のエバンスブルー溢出の代表的な画像を示す。図１２Ｂは、１５分後の足へのエバンスブルー漏出の定量化を示す（ＷＴについてはｎ＝６、ＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴについてはｎ＝７）。抗ＩｇＥ抗体（ｐ＝０．４９）および生理食塩水（ｐ＝０．２３）注射後の差異は、有意ではなかった。グループデータを、平均±標準誤差として表現する。両側不対スチューデントｔ検定を使用して、統計的比較における有意性を決定した。
【図１３】図１３Ａ、図１３Ｂ、図１３Ｃ、図１３Ｄおよび図１３Ｅは、ＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ肥満細胞が、塩基性分泌促進物質および種々の治療薬に対して不応性であることを示す。図１３Ａは、図２Ｅからの塩基性分泌促進物質によって誘発されたＷＴおよびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ腹膜肥満細胞から、Ｆｌｕｏ−４イメージングによって測定した際の、［Ｃａ２＋］ｉの変化を示すトレース例を示す。各トレースは、独自の細胞からの応答である。図１３Ｂは、イカチバント（５０μｇ／ｍｌ）の適用中のＷＴ（上）およびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ（下）培養腹膜肥満細胞からの代表的なＦｌｕｏ−４画像（左）および蛍光トレース（右）を示す。図９Ｃは、選択されたＦＤＡ承認カチオン性ペプチド作動薬によって誘発された、ＷＴおよびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ腹膜肥満細胞から、Ｆｌｕｏ−４イメージングによって測定された際の、［Ｃａ２＋］ｉの変化を示すトレース例を示す。各トレースは、独自の細胞からの応答である。図１３Ｄは、アトラクリウム（５０μｇ／ｍｌ）の適用中のＷＴ（上）およびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ（下）培養腹膜肥満細胞からの代表的なＦｌｕｏ−４画像（左）および蛍光トレース（右）を示す一連の顕微鏡写真および折れ線グラフである。図１３Ｅは、シプロフロキサシン（２００μｇ／ｍｌ）の適用中のＷＴ（上）およびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ（下）培養腹膜肥満細胞からの代表的なＦｌｕｏ−４画像（左）および蛍光トレース（右）を示す一連の顕微鏡写真および折れ線グラフである。
【図１４】図１４Ａおよび図１４Ｂは、ヒト肥満細胞が、ＭｒｇｐｒＸ２依存性様式で偽アレルギー反応に関連する塩基性分泌促進物質および薬物によって活性化されることを示す一連の棒チャートである。図１４ＡのヒトＬＡＤ２肥満細胞を、異なる濃度の、化合物４８／８０、マストパラン、イカチバント、アトラクリウムおよびシプロフロキサシンで処理した。これらの物質に応答した肥満細胞の活性化は、β−ヘキソサミニダーゼ、ＴＮＦ、ＰＧＤ２およびヒスタミンの放出を特徴とする。加えて、ビオチンコンジュゲートヒトＩｇＥ感作ＬＡＤ２細胞の０．１μｇ／ｍｌのストレプトアビジン刺激は、未処理細胞（４．１±０．３％放出）と比較して強固なβ−ヘキソサミニダーゼの放出（７１．３±１．８％放出）を引き起こした。グループデータを、平均±標準誤差として表現する。図１４Ｂは、ヒトＭｒｇｐｒＸ２のノックダウンが、ＩｇＥによってではなく、偽アレルギー反応に関連する塩基性分泌促進物質および薬物によって引き起こされた肥満細胞活性化を、有意に低減させたことを示す。ヒトＬＡＤ２肥満細胞に、ＭｒｇｐｒＸ２  ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡを最初にトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞を、化合物４８／８０（０．１μｇ／ｍｌ）、マストパラン（５μｇ／ｍｌ）、イカチバント（１０μｇ／ｍｌ）、アトラクリウム（２５μｇ／ｍｌ）およびシプロフロキサシン（７５μｇ／ｍｌ）で処理した。β−ヘキソサミニダーゼの放出を特徴とするこれらの物質に応答した肥満細胞の活性化は、対照群における放出と比較して、ＭｒｇｐｒＸ２  ｓｉＲＮＡ処理細胞において有意に低減された。ＩｇＥ媒介性肥満細胞脱顆粒は、ＭｒｇｐｒＸ２  ｓｉＲＮＡノックダウンによって影響を受けなかった。グループデータを、平均±標準誤差として表現する。両側不対スチューデントｔ検定を使用して、統計的比較における有意性を決定し、差異を、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５で有意とみなした（実験を３回繰り返した）。
【図１５】図１５は、５０未満のアミノ酸のすべてのＦＤＡ承認治療薬の表である。電荷はケムアクソンによって算出した。セトロレリクス、ガニレリクスおよびオクトレオチドについてのＩＳＲデータは、下記の参考文献からである：参照により本明細書に組み込まれる、Ｖｅｒｓｃｈｒａｅｇｅｎ，Ｃ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ９０，５５２−５５９（２００３）；Ｆｌｕｋｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  ７５，３８−４５（２００１）；およびＴｕｖｉａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ９７，２３６２−２３６９，（２０１２）。すべての他の情報は、ＦＤＡによって供給された。
【図１６】図１６は、すべてのクラスのＦＤＡ承認神経筋遮断薬（ＮＭＢＤ）および代表的なメンバーを収載するチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
本発明は、化合物が偽アレルギー型反応を誘発するか否かを決定するための細胞および方法、ならびに対象において偽アレルギー型反応の重症度を低減させるための方法に主眼を置く。本発明は、少なくとも部分的に、Ｇタンパク質共役受容体、すなわち、異物に対するアレルギー型反応と密接に関わる、肥満細胞と呼ばれる種類の免疫細胞において排他的に発現される、マウスにおけるＭｒｇｐｒＢ２およびヒトにおけるＭｒｇｐｒＸ２の発見に基づく。本発明者らは、この単一の受容体が、それらの副作用プロフィールの一部としてアレルギー型反応に関連する少なくとも１３の異なるＦＤＡ承認薬によって活性化されることを決定した。
【００８６】
本明細書において記述されている発明の前、偽アレルギー薬物反応におけるＭｒｇｐｒＸ２／ＭｒｇｐｒＢ２の役割は全く不明であった。本明細書において記述されているのは、偽アレルギー薬物反応を誘発する薬物についてスクリーニングするため、およびこれらの反応を遮断するＭｒｇｐｒＸ２のアンタゴニストについてスクリーニングするための、ＭｒｇｐｒＸ２／ＭｒｇｐｒＢ２発現細胞ベースのアッセイの使用である。アッセイ作業を行うために、本発明者らは、ＭｒｇｐｒＸ２／ＭｒｇｐｒＢ２発現細胞にＧＴＰ結合タンパク質アルファ１５（Ｇα１５）を添加して、受容体ベースのシグナルを細胞内カルシウムの増大に変換し、細胞株をハイスループット・スクリーニング・デバイスと適合性にした。偽アレルギー薬物反応におけるＭｒｇｐｒＸ２／ＭｒｇｐｒＢ２の役割は、本発明の前は不明であった。したがって、ＭｒｇｐｒＸ２／Ｇα１５細胞が報告されていないことは、驚くに当たらない。他の単離細胞株におけるＧα１５発現は報告されていたが、受容体が細胞内カルシウムの上昇を誘導しない場合にのみ利用されている。ＭｒｇｐｒＸ２は、そのような上昇を誘発し、このことは、単離細胞においてＧαｌ５を包含することが不要であると示唆するであろう。しかしながら、本発明者らは、ＭｒｇｐｒＸ２が、通常は、一部のアゴニストに応答してそのような上昇を誘発するが他のアゴニストにはせず、アッセイに必須の共発現を行わせることを見出した。
【００８７】
本発明の単離細胞は、ＧＴＰ−結合タンパク質Ｇα１５の発現とともに、ヒトＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ＭｒｇｐｒＸ２またはマウスＧＰＣＲ  ＭｒｇｐｒＢ２を発現し、これにより、カルシウムベースのスクリーニングアッセイにおける受容体活性化の簡単な可視化を可能にする。これらの細胞株は、ＦＤＡ承認薬ならびにＭｒｇｐｒＸ２アゴニストおよびアンタゴニスト活性のために開発中の薬物のスクリーニングを可能にする。これは、ＭｒｇｐｒＸ２のオフ標的活性化が、体内で、有意な有害事象をもたらし得るアレルギー型副作用を誘発することから、望ましい。
【００８８】
薬物スクリーニングのための細胞ベースのアッセイにおいてこれらの細胞を使用して、陽性結果（すなわち、例えばカルシウム放出によって測定した際の、細胞株の活性化）は、薬物が、通常は肥満細胞を活性化させ、潜在的に、患者においてアレルギー型反応を引き起こすことを示すであろう。開発中の薬物のスクリーニングは、それらの副作用プロフィールを予測するであろうし；現在使用されている薬物のスクリーニングは、これらの薬物の有害作用の原因を同定するであろうし；アンタゴニストのスクリーニングは、アレルギー型反応を誘発する薬物と同時に提供でき、故に、肥満細胞の活性化を遮断しながら、それらの意図された使用を妨げない、新たな治療薬につながるであろう。
【００８９】
以下で詳細に記述する通り、野生型マウスにおけるこれらの薬物に応答した局所および全身のアレルギー型応答は、ヒトＭｒｇｐｒＸ２のマウスオルソログであるＭｒｇｐｒＢ２を欠いているマウスにおいて消失している。この極めて予想外の所見は、アンタゴニストを広範囲の薬物と共適用してそれらのアレルギー型副作用を遮断できることから、ＭｒｇｐｒＸ２が魅力的な薬物標的であることを実証するものである。
【００９０】
本明細書において記述されているのは、この受容体を活性化させるまたはアンタゴナイズするＦＤＡ承認薬および治験化合物をスクリーニングするために使用される細胞株である。これらは、薬物がアレルギー型応答を誘発するか否かを決定するため、およびスクリーニングにおいてこれらの応答を遮断するアンタゴニストを開発するために有用となるであろう。
【００９１】
本明細書において記述されているのは、塩基性分泌促進物質が、ヒトＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ＭｒｇｐｒＸ２のオルソログである単一の受容体、ＭｒｇｐｒＢ２を介して、マウス肥満細胞をインビトロおよびインビボで活性化させることを実証する結果である。分泌促進物質誘発性ヒスタミン放出、炎症および気道収縮は、ＭｒｇｐｒＢ２ヌル突然変異マウスにおいて消失している。さらに、以下で詳細に記述する通り、アレルギー型注射部位反応に関連するほとんどのクラスのＦＤＡ承認ペプチド作動薬は、ＭｒｇｐｒＢ２およびＭｒｇｐｒＸ２も活性化させ、その注射部位の炎症は、突然変異マウスにおいては存在しない。本明細書において記述されている結果は、ＭｒｇｐｒＢ２およびＭｒｇｐｒＸ２が、全身の偽アレルギーまたはアナフィラキシー様反応に関連する多くの小分子薬物の標的であること；アナフィラキシー様応答の薬剤誘発性の症状が、ノックアウトマウスにおいて有意に低減されていることを実証するものである。他の化合物の副作用を予測するのに役立つこれらの分子のいくつかにおける一般的な化学モチーフの同定も、本明細書において記述されている。塩基性分泌促進物質による肥満細胞活性化を研究するためのマウスモデルの導入および薬剤誘発性の有害作用のサブセットを低減させるための治療標的としてのＭｒｇｐｒＸ２の同定について、以下で詳細に記述する。
【００９２】
肥満細胞
肥満細胞は、アレルギー反応における一次エフェクターであり、ヒスタミンならびに種々の炎症および免疫調節物質を分泌することにより、疾患において重要な役割を有し得る（Ｍｅｔｃａｌｆｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ７７，１０３３−１０７９；Ｇａｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５  Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６，１３５−１４２）。古典的に、肥満細胞はＩｇＥ抗体によって活性化されるが、肥満細胞の独自の特性は、炎症性ペプチドおよびアレルギー型反応に関連する薬物を包含する、塩基性分泌促進物質と総称される広範なカチオン性物質に対するそれらの抗体非依存性応答性である（Ｍｅｔｃａｌｆｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ７７，１０３３−１０７９；Ｌａｇｕｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３  Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ２３，３３１−３５１）。病理におけるこれらの物質の役割は、それらの受容体の数十年にわたる探索を促してきた。
【００９３】
肥満細胞（肥満細胞（ｍａｓｔｏｃｙｔｅ）または肥満細胞（ｌａｂｒｏｃｙｔｅ）としても公知である）は、骨髄幹細胞に由来する。これは、免疫系の一部であり、ヒスタミンおよびヘパリンが豊富な多くの顆粒を含有する。アレルギーおよびアナフィラキシーにおける役割が最も公知であるが、肥満細胞は、重要な保護的役割も果たし、血管新生を包含する創傷治癒および病原体に対する防御に密接に関与している。肥満細胞は、外観および機能の両方において、別の種類の白血球である好塩基球と非常に類似している。これらの細胞は、肥満細胞が組織常在性であり、例えば粘膜組織内にあり、一方、好塩基球は血液中に見られるという点で、異なっている。いずれの細胞も、ヒスタミンおよびヘパリン、抗凝固剤を含有する顆粒細胞である。いずれの細胞も、免疫グロブリンＥとの結合時に、ヒスタミンを放出する。
【００９４】
肥満細胞は、血管および神経の周囲のほとんどの組織内に特徴的に存在し、とりわけ、皮膚、肺の粘膜および消化管等の外界と内部環境との間の境界、ならびに、口、結膜および鼻の付近に顕著である。
【００９５】
肥満細胞は、炎症プロセスにおいて中心的な役割を果たす。活性化されると、肥満細胞は、その特徴的な顆粒および種々のホルモンメディエータを、間質中に迅速に放出する。肥満細胞は、直接的損傷（例えば、物理的または化学的（オピオイド、アルコール、およびポリミキシン等のある特定の抗生物質等］）、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）受容体の架橋結合、または補体タンパク質によって刺激されて、脱顆粒することができる。
【００９６】
肥満細胞は、抗体の最も豊富でないメンバーであるＩｇＥのＦｃ領域のための高親和性受容体（ＦｃεＲＩ）を発現する。この受容体はＩｇＥ分子の結合が本質的に不可逆的であるような高親和性のものである。結果として、肥満細胞はＩｇＥでコーティングされており、これは、形質細胞（免疫系の抗体産生細胞）によって産生される。
【００９７】
アレルギー反応において、肥満細胞は、アレルゲンが、細胞を既にコーティングしているＩｇＥと結合するまで、不活性なままである。他の膜活性化事象は、肥満細胞をその後の脱顆粒のために準備するか、またはＦｃεＲＩシグナル伝達との相乗効果で作用するかのいずれかができる。概して、アレルゲンは、タンパク質または多糖である。アレルゲンは、肥満細胞表面と結合したＩｇＥ分子の可変領域に位置している抗原結合部位と結合する。架橋ＩｇＥ分子に関連する細胞結合Ｆｃ受容体の細胞内ドメインのクラスタ形成は、その活性化につながる肥満細胞の内側での反応の複合シーケンスを引き起こす。細胞外環境に放出される分子は、予め形成されたメディエータ（顆粒から）（例えば、トリプターゼ、ヒスタミン（２〜５ｐｇ／細胞）、セロトニン、プロテオグリカン、ヘパリン（抗凝固剤として活性）等のセリンプロテアーゼ）、新たに形成された脂質メディエータ（エイコサノイド）（すなわち、トロンボキサン、プロスタグランジンＤ２、ロイコトリエンＣ４、血小板活性化因子）、およびサイトカイン（例えば、好酸球走化因子）を包含する。
【００９８】
ヒスタミンは、後毛細血管細静脈を拡張させ、内皮を活性化させ、血管透過性を増大させる。これは、局所浮腫（腫脹）、暖かさ、赤み、および放出部位に他の炎症細胞を引きつけることにつながる。ヒスタミンはまた、神経終末を脱分極する（掻痒または疼痛につながる）。ヒスタミン放出の皮膚兆候は、「発赤および膨疹」反応を包含する。蚊に刺された直後の隆起および赤みはこの反応の好例であり、これは、アレルゲンによる肥満細胞の負荷の数秒後に発生する。
【００９９】
ＭｒｇｐｒＸ２
本明細書において記述されている通り、ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体Ｘ２（ＭｒｇｐｒＸ２）は、塩基性分泌促進物質、すなわち、カチオン性両親媒性薬物ならびに塩基性頭部基および疎水性コアからなる内因性または外因性ペプチドの、肥満細胞特異的受容体である。参照により本明細書に組み込まれる、ＭｃＮｅｉｌ  Ｂ．Ｄ．，２０１５  Ｎａｔｕｒｅ，５１９：２３７−２４１を参照されたい。以下で詳細に記述する通り、ＭｒｇｐｒＸ２は、ツボクラリンおよびアトラクリウムを包含する非ステロイド性神経筋遮断薬（ＮＭＢＤ）等の環化テトラヒドロイソキノリン（ＴＨＩＱ）を含有する小分子を認識し、結合する。以下で詳細に記述する通り、これらの化合物に応答して、ＭｒｇｐｒＸ２は、ヒスタミン放出、炎症および気道収縮を特徴とする偽アレルギー反応を媒介する。本明細書において記述されている通り、ＭｒｇｐｒＸ２は、コルチスタチン−１４、プロアドレノメデュリンＮ末端ペプチドＰＡＭＰ−１２等のペプチドおよびアルカロイド、ならびに、程度は低いが、ＰＡＭＰ−２０、抗菌性タンパク質ＬＬ−３７、ＰＭＸ−５３ペプチド、ベータ−デフェンシンおよびコンプラナジンＡを包含する、若干数の他のリガンドのための受容体としても作用する。
【０１００】
例示的なヒトＭｒｇｐｒＸ２アミノ酸配列を以下に提供する（ＮＰ＿００１２９０５４４．１（ＧＩ：７４６８１６１５３）、参照により本明細書に組み込まれる（配列番号：１））：
【０１０１】
2020141708.tif 000002
【０１０２】
例示的なヒトＭｒｇｐｒＸ２核酸配列を以下に提供する（ＮＭ＿００１３０３６１５．１（ＧＩ：７４６８１６１５２）、参照により本明細書に組み込まれる（配列番号：２））：
【０１０３】
2020141708.tif 000003
【０１０４】
例示的なマウスＭｒｇｐｒＢ２アミノ酸配列を以下に提供する（ＮＰ＿７８０７４０．２（ＧＩ：２２９０９４２４４）、参照により本明細書に組み込まれる（配列番号：３））：
【０１０５】
2020141708.tif 000004
【０１０６】
例示的なマウスＭｒｇｐｒＢ２核酸配列を以下に提供する（ＮＭ＿１７５５３１．４（ＧＩ：２２９０９４２４３）、参照により本明細書に組み込まれる（配列番号：４））：
【０１０７】
2020141708.tif 000005
【０１０８】
Ｇα１５
ＧＴＰ結合タンパク質アルファ１５（Ｇα１５）は、種々の膜貫通シグナル伝達系におけるモジュレーターまたはトランスデューサーである。
【０１０９】
例示的なヒトＧα１５アミノ酸配列を以下に提供する（ＮＰ＿００２０５９．３（ＧＩ：５９７７０９７７１）、参照により本明細書に組み込まれる（配列番号：５））：
【０１１０】
2020141708.tif 000006
【０１１１】
例示的なヒトＧα１５核酸配列を以下に提供する（ＮＭ＿００２０６８．３（ＧＩ：５９７７０９７７０）、参照により本明細書に組み込まれる（配列番号：６））：
【０１１２】
2020141708.tif 000007
【０１１３】
例示的なマウスＧα１５アミノ酸配列を以下に提供する（ＮＰ＿０３４４３４．１（ＧＩ：６７５４０１０）、参照により本明細書に組み込まれる（配列番号：７））：
【０１１４】
2020141708.tif 000008
【０１１５】
例示的なマウスＧα１５アミノ酸配列を以下に提供する（ＮＭ＿０１０３０４．３（ＧＩ：３４３２８４８７）、参照により本明細書に組み込まれる（配列番号：８））：
【０１１６】
2020141708.tif 000009
【０１１７】
ＨＥＫ２９３細胞
ヒト胎児腎臓２９３細胞は、多くの場合、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ−２９３、２９３細胞、またはあまり正確ではないがＨＥＫ細胞とも称され、組織培養において成長させたヒト胎児腎臓細胞（流産したヒト胎児由来）および死産動物に元来由来する特定の細胞株である。ＨＥＫ２９３細胞は、非常に簡単に成長し、非常にトランスフェクトしやすく、細胞生物学研究において長年にわたって広く使用されてきた。該細胞は、バイオテクノロジー産業により、遺伝子療法のための治療用タンパク質およびウイルスを産生するためにも使用される。
【０１１８】
本明細書において記述されているのは、Ｇα１５およびＭｒｇｐｒＢ２またはＭｒｇｐｒＸ２のいずれかを安定発現しているＨＥＫ２９３細胞である。
【０１１９】
下記の例は、本発明のアッセイ、スクリーニングおよび治療方法をどのようにして作製し使用するかの完全な開示および記述を当業者に提供するように提案されるものであり、本発明者らが自らの発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【０１２０】
材料および方法
下記の材料および方法を使用した。
【０１２１】
動物モデル
ＷＴおよび突然変異体試料ならびに動物における等しい処理を伴うすべての実験は、条件を知らない実験者によって行った。
【０１２２】
分析
グループデータは、平均±標準誤差として表現した。両側不対スチューデントｔ検定を使用して、統計的比較における有意性を決定し、差異を、ｐ＜０．０５で有意とみなした。統計的検出力分析を使用して、試料サイズを揃えた。ほとんどの結果値は各群内の平均値前後で対称的に分布していたため、データは正規分布していることが推測された。分散は、Ｆ検定によって決定された群の間で同様である。フィブロネクチン付着の視覚的欠如によってまたは異常に高い安静時のカルシウムレベルによってのいずれかで損傷していると考えられる肥満細胞は、分析から除外した。そうでなければ、成功した手順および／または処理に供した試料も動物も分析から除外しなかった。無作為化は、動物研究に適用可能でないため、該研究には使用しなかった。
【０１２３】
ペプチドおよび薬物
化合物４８／８０、スズメバチマストパラン、ロクロニウム、ツボクラリン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシンおよびオフロキサシンは、シグマ製であった。コルチスタチンは、トクリスバイオサイエンス製であった。ＰＡＭＰ（９〜２０）は、カスタム合成し、ジェンスクリプトによって９８％以上まで精製した。ロイプロリドは、ジェンスクリプト製であった。物質Ｐ、カリジン、マストパラン、セトロレリクス、オクトレオチド、セルモレリン（成長ホルモン放出因子１−２９）、イカチバント（ＨＯＥ−１４０）は、アナスペック製であった。アトラクリウムおよびミバクリウムは、サンタクルーズバイオテクノロジー製であった。組換えヒトインスリンは、ロシュ製であった。ヤギ抗マウスＩｇＥ（Ａｂ９１６２）は、アブカム製であった。
【０１２４】
薬物調製および貯蔵
アトラクリウム、ミバクリウム、ツボクラリン、およびすべてのフルオロキノロン溶液は、最初の３つの効力が酸化および／または凍結解凍作用の影響を受けやすいことが分かり、一方、フルオロキノロンの溶解度は新しく調製した際が最良であったため、実験日に調製した。プロプラノロールも実験日に新しく調製して、効力の損失の可能性を最小化した。レボフロキサシンを除くすべてのフルオロキノロンを、ｐＨ３．５に調整したＣＩＢに溶解した。すべての他の薬物を１００Ｘ〜１０００Ｘアリコートとして調製し、−８０℃で貯蔵した後、４℃で解凍し、カルシウムイメージング緩衝液または生理食塩水中に希釈した。
【０１２５】
Ｍｒｇｐｒ  ＲＴ−ＰＣＲスクリーニング
リボ核酸（ＲＮＡ）を、４×１０４マウス腹膜肥満細胞から、キアゲンＲＮＥａｓｙマイクロカラムを用い、メーカーの提案に従って精製した。ＲＮＡをＤＮＡｓｅ  Ｉ（ニュー・イングランド・バイオラボ）で２０分間処理し、別のＲＮＥａｓｙマイクロカラム上で再精製した。８ｎｇのＲＮＡを使用し、スーパースクリプトＩＩＩキット（インビトロジェン）をメーカーの説明書に従って使用し、オリゴｄＴプライマーを使用し、推奨１０μｌの反応物を最大６０μｌに増量して、第一鎖ｃＤＮＡを生成した。陰性対照反応は、スーパースクリプトＩＩＩ逆転写酵素を水によって置きかえたことを除き、同じであった。２５μｌのＰＣＲ反応物を、１２．５μｌのＲｅｄＴａｑレディミックス（シグマ）、０．５μｌのＤＭＳＯ、０．２５μｌずつの５０μＭ遺伝子特異的なフォワードおよびリバースプライマー、１０μｌの水、ならびにｃＤＮＡまたは陰性対照合成反応からの２μｌの混合物で実行した。すべての反応で、９５℃で４分間の最初のステップ、特定温度（後述）で３０秒のアニーリング、７２℃で４０秒および９５℃で２５秒の拡張（最後の３ステップを３９回繰り返した）、ならびに７２℃で最後の４分間のステップを使用した。低ストリンジェンシーＰＣＲは、６０℃のアニーリングに設定し；そうでなければ、アニーリング温度は、ＭｒｇｐｒＡ１、ＭｒｇｐｒＡ１０、ＭｒｇｐｒＢ２およびＭｒｇｐｒＢ６については６２℃；ＭｒｇｐｒＡ２、ＭｒｇｐｒＡ３、ＭｒｇｐｒＡ４、ＭｒｇｐｒＡ６、ＭｒｇｐｒＡ１６、ＭｒｇｐｒＡ１８およびＭｒｇｐｒＢ１１については６４℃；ＭｒｇｐｒＡ９、ＭｒｇｐｒＡ１９、ＭｒｇｐｒＢ１、ＭｒｇｐｒＢ３、ＭｒｇｐｒＢ５およびＭｒｇｐｒＢ８については６５℃；ＭｒｇｐｒＡ１２およびＭｒｇｐｒＢ１０については６６℃；ＭｒｇｐｒＢ４については６３℃；ＭｒｇｐｒＡ１４については６１℃；ならびにＭｒｇｐｒＣ１１については６５．５℃であった。
【０１２６】
プライマーは次の通りであった。ＭｒｇｐｒＡ１（ａｔｃｃａｇｃａａｇａｇｇａａｔｇｇｇｇ（配列番号：９）については、ｒｅｖ  ｔｇｔｇａｃｃｔａｇｇａｇｇａａｇａａｇａａｇ（配列番号：１０））；ＭｒｇｐｒＡ２（ｃｃｔｃｃｔａｃａｃａａｇｃｃａｇｃａａ（配列番号：１１）については、ｒｅｖ  ａａｇｃａｃａａｇｔｇａａａｇａｔｇａｔｇｃｔ（配列番号：１２））；ＭｒｇｐｒＡ３（ｇｃｔａｃａｔｃｃａｇｃａａｇａｇｇａａｔｇ（配列番号：１３）については、ｒｅｖ  ｇｃａａａａａｔｔｃｃｔｔｔｇｇｇｔａｇｇｇｔ（配列番号：１４））；ＭｒｇｐｒＡ４（ｃｃｔｇｔｇｔｇｃｔｇｔｇａｔｃｔｇｇｔ（配列番号：１５）については、ｒｅｖ  ｔｃａｃｇｇｔｔａａｔｃｃａｇｇｇｃａｃ（配列番号：１６））；ＭｒｇｐｒＡ６（ｃａｔｔｔｔｃｃｔｃｃｃｃｃａａｃａｇｔ（配列番号：１７）については、ｒｅｖ  ａｔｇｃｃｔｇａａｔｇａｇｃｃｃａｃａａ（配列番号：１８））；ＭｒｇｐｒＡ９（ｃａｇｔｇａｔｃｔａｃａｔｃｃａｇｃａａａａｇｇ（配列番号：１９）については、ｒｅｖ  ｇｃｇｔｇｇａａｇｃｔａｔｇａｔｇｃｇａ（配列番号：２０））；ＭｒｇｐｒＡ１０（ｃａｇｔｇｇｔｃｃａｃｃａｔｃｔｃｃａａ（配列番号：２１）については、ｒｅｖ  ａｃａｇｇｃａａｇａｇａｇｔｃａｔｇｇｔｔ（配列番号：２２））；ＭｒｇｐｒＡ１２（ｔｃａｇｇｇａｔｃｇｇｇｔｇａａｇｃａｃ（配列番号：２３）については、ｒｅｖ  ｇａｇｃａｔｔｔｇａａｇｇｔｇｔｔｇｔｔｇｇａ（配列番号：２４））；ＭｒｇｐｒＡ１４（ｇｇｔｔｇｃｃｃｃｔｇｔｇｔｔｔｃｔｔｃ（配列番号：２５）については、ｒｅｖ  ｔａｔｔｇｃｃａｇｔｃａｇｔａａｇｃｔｇａｇ（配列番号：２６））；ＭｒｇｐｒＡ１６（ｇｃｃｃｔｃｔｇｇｔｔｃｃｃａｔｔａｃｔ（配列番号：２７）については、ｒｅｖ  ｇｔｔｔｔｔｇｇａｃｃａｃｔｇａｇｇｃａｔｔ（配列番号：２８））；ＭｒｇｐｒＡ１８（ｔｇｃｔｃｔｇｇｔｔｔｔｃｔｃｃｔｔｔｇｃ（配列番号：２９）については、ｒｅｖ  ｔｇａｇｇｃａｔｇｔｃａａｇｔｃａｇｔｃａ（配列番号：３０））；ＭｒｇｐｒＡ１９（ｃａｇｇａｃｃｃａｇａｔｃａｃｇａｃａｃ（配列番号：３１）については、ｔｃｃｔｇｇｇｃｔｔｃｃｇａｔｔｔｃａｃ（配列番号：３２））；ＭｒｇｐｒＢ１（ａｔｔａｇｃｃｔｔｃａｔｃａｇｇｃａｃｃａ（配列番号：３３）については、ｃｃａｇｃｃｃａａｃｔａａｇｇｃａａｔｇ（配列番号：３４））；ＭｒｇｐｒＢ２（ｇｔｃａｃａｇａｃｃａｇｔｔｔａａｃａｃｔｔｃｃ（配列番号：３５）については、ｃａｇｃｃａｔａｇｃｃａｇｇｔｔｇａｇａａ（配列番号：３６））；ＭｒｇｐｒＢ３（ａｃｃｔｇｇｃｔｇｔｇｇｃｔｇａｔｔｔｔ（配列番号：３７）については、ｒｅｖ  ｇｃｔｇａａｃｃｃａｃａｇａｇａａｃｃａ（配列番号：５８））；ＭｒｇｐｒＢ４（ｔｃｔｇｇｃｔｇｇｔｇｃｔｇａｔｔｔｃｔｔ（配列番号：３８）については、ｒｅｖ  ａｃｃａｃｇａｇｇｃｔｃａａｃａａｔａｇａ（配列番号：３９））；ＭｒｇｐｒＢ５（ｃｔｇｔｇｇｔｔｃｃｔｔｃｔｇｔｇｔｃｃａ（配列番号：４０）については、ｒｅｖ  ｔｔｔｃｃａｇｔｔｃｃｃｃａｇａｃｃｔｔｔ（配列番号：４１））；��ｒｇｐｒＢ６（ｔｃｔｇｔｃｔａｃａｔｃｃｔｃａａｃｃｔｇｇ（配列番号：４２））については、ｒｅｖ  ａｔｔａｔｃｔｃａｔｇａｇｇａａｇｇｃｔｃａａ（配列番号：４３））；ＭｒｇｐｒＢ８（ａｇａｇａａｔｇｃａａａｇｃａｔｇｃｇａ（配列番号：４４）については、ｒｅｖ  ｇａｇｇａａｇｔｔｔｇｃｃｃｃａｇａｃａ（配列番号：４５））；ＭｒｇｐｒＢ１０（ｃａｃｔｇｇｔｃａｃａｔｔｇｃｃａａｃｃ（配列番号：４６については、ｒｅｖ  ｇｇｇｇａｔｇｇａａｔｃａａｔｇｔｃｃａａｇａ（配列番号：４７）；ＭｒｇｐｒＢ１１（ａｃｃｔｔｃｔｔｇｃｔａｔｔｔｔｔｃｃｃｔｃｃａ（配列番号：４８）については、ｒｅｖ  ａｇｇａｔｇａｇａｃｔｇｇａｃｃｃａｃａ（配列番号：４９））；ＭｒｇｐｒＣ１１（ｃａｇｃａｃａａｇｔｃａｇｃｔｃｃｔｃａａ（配列番号：５０）については、ｒｅｖ  ａｔｇｃｃｃａｔｇａｇａａａｇｇａｃａｇａａｃｃ（配列番号：５１））。
【０１２７】
発現構築物
Ｍｒｇｐｒ遺伝子をクローン化し、標準的な技術を使用してｐｃＤＮＡ３．１哺乳類発現プラスミドに挿入した。すべてのマウス遺伝子は、それらのＮ末端にコザック配列を有しており、また、アミノ酸リンカーＤＩＩＬによって遺伝子から分離されたＣ末端ＦＬＡＧタグをコードしていた（配列番号５９）。
【０１２８】
ｃＤＮＡ構築物
第一鎖ｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲスクリーニングについて記述されている通りに調製し、Ｑ５ホットスタート・ハイ・フィデリティ・マスター・ミックス（ニュー・イングランド・バイオラボ）を使用して増幅を実施した。野生型および突然変異マウスからそれぞれ調製した少なくとも５つの異なるクローンをシークエンシングして、突然変異体における欠失の存在および野生型または突然変異体由来の任意の他の突然変異の非存在を検証した。
【０１２９】
ＨＥＫ２９３細胞におけるカルシウムイメージング
最初のスクリーニングにおいて、ＨＥＫ２９３細胞（マイコプラズマについては試験していないが急速に分裂する）に、Ｃ末端ＦＬＡＧタグを包含する遺伝子構築物を一過性にトランスフェクトし、トランスフェクションの６時間後、１００μｇ／ｍｌのポリ−Ｄ−リジンコーティングしたガラス・カバー・スリップに載置した。２４時間後、細胞に、カルシウムインジケーターＦｕｒａ−２またはＦｌｕｏ−４のＡＭエステル（モレキュラープローブ）を、０．０２％プルロニックＦ−１２７（モレキュラープローブ）とともに、３７℃で４５分間装填した。Ｆｕｒａ−２装填細胞を、３４０および３８０ｎｍ励起中にイメージングし、Ｆｌｕｏ−４装填細胞を、４８８ｎｍ励起中にイメージングした。後の実験では、受容体を安定発現している細胞株を広宿主域Ｇタンパク質Ｇα１５の一過性または安定発現とともに利用した。細胞を、カルシウムイメージング緩衝液（ＣＩＢ；ＮａＣｌ  １２５ｍＭ、ＫＣｌ  ３ｍＭ、ＣａＣｌ２  ２．５ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ０．６ｍＭ、ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ、グルコース２０ｍＭ、ＮａＨＣＯ３  １．２ｍＭ、スクロース２０ｍＭ、ＮａＯＨでｐＨ７．４にしたもの）中でイメージングした。別段の定めがない限り、薬物をチャンバに４５から６０秒間灌流させ、応答を５秒間隔でさらに６０〜９０秒間モニターした。
【０１３０】
ＥＣ５０決定
Ｇａｌｐｈａ１５およびＭｒｇｐｒＢ２またはＭｒｇｐｒＸ２のいずれかを安定発現しているＨＥＫ２９３細胞を、９６ウェルプレート中、１ウェル当たり４×１０４細胞で平板培養し、終夜インキュベートした。翌日、培地を除去し、メーカーの提案に従って、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）に２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを加えたもの、ｐＨ７．４中で希釈した、ＦＬＩＰＲカルシウム５アッセイキット（モレキュラーデバイス）からのイメージング溶液で置きかえた。細胞を３７℃で６０分間インキュベートし、室温で１５分間回復させた後、フレックスステーション３（モレキュラーデバイス）でイメージングした。ウェルを、メーカーの仕様書に従って１２０秒間イメージングし、イメージングが開始した３０秒後に、５０μｌの３倍濃度の試験物質を添加した。最大シグナルから最小シグナルを減算することにより、応答を決定した。物質を２連のウェルで試験し、シグナルを平均化し、ＥＣ５０を、その試験における物質へのピーク応答に対して正規化することにより、各試験について決定した。すべての薬物を、溶解度の問題による下記の例外を除いて、ＨＢＳＳ＋ＨＥＰＥＳ溶液に溶解した：酢酸セトロレリクスは、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する生理食塩水に溶解し、オフロキサシンを除くフルオロキノロンは、ｐＨをＨＣｌで３．５に調整したことを除いて同じ溶液に溶解し；オフロキサシンは、完全な溶解度のために１００μｇ／ｍｌの乳酸を必要とした。ペプチドは、凍結解凍サイクル後、時に効力を失ったため、ほとんどのペプチドを凍結乾燥ストックから直接調製した。
【０１３１】
腹膜肥満細胞精製およびイメージング
２〜５月齢の成体雄および雌マウスを、ＣＯ２吸入を介して屠殺した。合計１２ｍｌの氷冷肥満細胞解離培地（ＭＣＤＭ；ＨＢＳＳに３％ウシ胎仔血清および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを加えたもの、ｐＨ７．２）を使用して２つの連続腹腔洗浄液を作製し、これを合わせ、細胞を２００ｇでスピンダウンさせた。各マウスからのペレットを２ｍｌのＭＣＤＭに再懸濁し、４ｍｌの等張７０％パーコール懸濁液（２．８ｍｌのパーコール、３２０μｌの１０×ＨＢＳＳ、４０μｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、８３０μｌのＭＣＤＭ）上に積層させ、２０分間、５００ｇ、４℃でスピンダウンさせた。肥満細胞をペレットで回収した。純度は、アビジン染色によっておよび形態学によってアッセイした際に、９５％超であった。１０％ウシ胎仔血清および２５ｎｇ／ｍｌ組換えマウス幹細胞因子を加えたＤＭＥＭ（シグマ）中に、肥満細胞を５×１０５〜１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、３０μｇ／ｍｌのフィブロネクチンをコーティングしたガラス・カバー・スリップ（シグマ）に載置した。計数のため、平板培養の代わりに、懸濁肥満細胞を１／１０に希釈し、１０００ｒｐｍで５分間、４℃にて、サイトスピン（サーモサイエンティフィック）でスピンさせることにより、スライドに貼り付けた。
【０１３２】
イメージングのために、３７℃、５％ＣＯ２で２時間のインキュベーション後、肥満細胞に、Ｆｌｕｏ−４を、０．０２％プルロニックＦ−１２７とともに室温で３０分間装填し、ＣＩＢ中で３回洗浄し、直ちにイメージングに使用した。細胞は、装填２時間以内に使用した。細胞は、［Ｃａ２＋］ｉが、少なくとも５０％、少なくとも１０秒間にわたって上昇した場合に応答しているとして同定されたが、これは、無作為なちらつき事象からリガンド誘発性応答を明らかに区別するものである。平均トレースは、マウスの各細胞からの平均応答を取り、それらを平均化することによって、算出された。
【０１３３】
ＢＡＣトランスジェニックマウス生成
ＢＡＣクローンＲＰ２３−６５Ｉ２３は、小児病院オークランド研究所から購入した。このクローンは、ＭｒｇｐｒＢ２遺伝子座、約６０ｋｂの５’ゲノム配列および１００ｋｂを上回る３’ゲノム配列を含有する。細菌における組換え工学（Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）を使用して、ＭｒｇｐｒＢ２開始コドンの直後にｅＧＦＰ−ＣｒｅおよびポリＡシグナルを導入した（Ｍｅｔｃａｌｆｅ，Ｄ．Ｄ．，Ｂａｒａｍ，Ｄ．＆  Ｍｅｋｏｒｉ，Ｙ．Ａ．Ｍａｓｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ７７，１０３３−１０７９（１９９７））。ＢＡＣをＮｏｔＩ（ニュー・イングランド・バイオラボ）で線状化し、単細胞受精Ｃ５７Ｂｌ／６卵から前核に注射した。卵を偽妊娠の雌に移植した。３つのＢＡＣマウス系統が確立された。マウスは既にＣ５７Ｂｌ／６バックグラウンドであったが、少なくとも４世代にわたって交配して、Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンドのＷＴおよびｔｄＴｏｍａｔｏレポーターマウスとした後、実験に使用した。ＢＡＣマウスを、イメージング研究のためにジャクソン研究所から購入したＲＯＳＡ２６Ｔｄｔｏｍａｔｏマウスと交尾させた。図１の実験では、ｔｄＴｏｍａｔｏシグナルが、多くの場合、異種であり、ヘテロ接合マウスにおいては弱いことから、ＲＯＳＡ２６Ｔｄｔｏｍａｔｏについてホモ接合のマウスを使用した。ＢＡＣマウスについての遺伝子型判定反応は、６１℃アニーリングで実行し、プライマーは、フォワード、ｔａｔａｔｃａｔｇｇｃｃｇａｃａａｇｃａ（配列番号６０）；リバース、ｃａｇａｃｃｇｃｇｃｇｃｃｔｇａａｇａ（配列番号６１）であった。いずれのプライマーもｅＧＦＰ−Ｃｒｅリーディングフレーム内にあるが、遺伝子全体およびＭｒｇｐｒＢ２遺伝子座における正しい配置を、事前のシークエンシングによって検証した。
【０１３４】
ＭｒｇｐｒＢ２突然変異マウス生成
ＭｒｇｐｒＢ２を標的とするジンク・フィンガー・ヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡは、シグマから購入した。結合部位は、ＭｒｇｐｒＢ２オープン・リーディング・フレームの塩基１８０〜１９４および１９６〜２１６とそれぞれ対応する、ＧＴＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＣＧ（配列番号：５２）およびＴＧＣＡＣＡＣＧＡＡＴＧＣＣＴＴＣＡＣＴＧ（配列番号：５３）であった。ｍＲＮＡを、０．２５ｍｍのＥＤＴＡを加えた１ｍｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４中で２ｎｇ／ｍｌに希釈し、Ｃ５７Ｂｌ／６株における単細胞受精卵の前核に注射した。毒性の明白な兆候は観察されなかった。胚を偽妊娠の雌に移植した。結合部位の側面に位置するＤＮＡをファウンダーマウスから増幅し、Ｃｅｌ−１アッセイキット（トランスジェノミック）を使用し、メーカーの提案に従って、突然変異についてスクリーニングした。最初の２８匹のマウスのうちの３匹を同定し、小さな突然変異を担持することをＤＮＡシークエンシングによって確認し、それ以上のスクリーニングを実施しなかった。この研究において使用した４ｂｐ突然変異に加えて、１ｂｐ欠失を担持するマウスおよび２ｂｐ欠失を持つ別のマウスを同定した。
【０１３５】
野生型およびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴマウス遺伝子型判定
野生型マウスに使用したプライマーは、ＧＧＴＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＣＧＴＡＴ（配列番号：５４）およびＧＧＴＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＣＧＴＡＴ（配列番号：５５）であり、反応は、６２．８℃のアニーリング温度で実行した。
【０１３６】
ＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴマウスのためのプライマーは、ＧＴＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＣＧＣＡＣ（配列番号：５６）およびＣＴＴＣＣＧＣＣＴＧＡＡＣＣＴＴＣＧＧＴ（配列番号：５７）であり、反応は、６４．０℃アニーリング温度で実行した。
【０１３７】
組織のアビジン標識化
最高８月齢の成体雄および雌マウスに、ペントバルビタールで麻酔をかけ、２０ｍｌの０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４、４℃）で、続いて、２５ｍｌの固定液（４％ホルムアルデヒド（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、４℃）で灌流させた。心臓、気管および皮膚切片を、灌流させたマウスから切断した。組織を、固定液中、４℃で終夜ポストフィックス（ｐｏｓｔ−ｆｉｘ）した。皮膚切片が唯一の必要な組織であった場合、灌流ステップを排除して、ＣＯ２吸入によるマウスの窒息の直後に該切片を切断し、固定液に入れた。組織を２０％スクロース（ｗｔ／ｖｏｌ）中で２４時間超にわたって凍結保護し、クライオスタットで切片にした（幅２０μｍ）。スライド上の切片を、３７℃で３０分間乾燥させ、２１〜２３℃で１０分間、４％パラホルムアルデヒドで固定させた。スライドを、ブロッキング溶液（ＰＢＳ中１０％正常ヤギ血清（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、０．２％トリトンＸ−１００（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、ｐＨ７．４）中、２１〜２３℃で１または２時間プレインキュベートし、次いで、１／５００  ＦＩＴＣ−アビジン（シグマ）またはローダミン−アビジン（ベクターラボラトリーズ）とともに４５分間インキュベートした。切片を水またはＰＢＳで３回洗浄し、１滴のフルオロマウントＧ（サザンバイオテック）を添加した後、カバースリップを上部に載置した。心臓肥満細胞は、組織中の他の場所よりも密度がはるかに高いことから、体腔付近で調査し；ｔｄＴｏｍａｔｏについて陰性であったアビジン陽性細胞は、筋肉組織中にごく少数で包埋されていることが観察されたが、それらの同定は不明瞭であった。
【０１３８】
腹膜肥満細胞のアビジン標識化のために、細胞を、肥満細胞精製の項において記述されている通りに平板培養し、２１〜２３℃で１０分間、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中の１／１０００アビジンとともに、２１〜２３℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄した後、直ちにイメージングした。
【０１３９】
胃の切片の免疫細胞化学
最高８月齢の成体雄および雌マウスに、ペントバルビタールで麻酔をかけ、２０ｍｌの０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４、４℃）で、続いて、２５ｍｌの固定液（４％ホルムアルデヒド（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、４℃）で灌流させた。胃の切片を除去し、徹底的に洗浄し、４％ホルムアルデヒド中で２時間ポストフィックスし、３０％スクロース溶液中での４８時間にわたるインキュベーションによって切片化のために調製した。組織試料をクライオエンベディング培地（ｃｒｙｏｅｍｂｅｄｄｉｎｇ  ｍｅｄｉａ）に載せて凍結させ、クライトスタット（ｃｒｙｔｏｓｔａｔ）を使用して１４μｍの切片を作製し、次いで、スライドに固定した。スライドを０．２％トリトンＸ−１００ＰＢＳ溶液で洗浄し、１０％正常ヤギ血清溶液中で１時間インキュベートし、次いで、０．２％トリトン／１％正常ヤギ血清溶液中、ラットモノクローナル抗マウスＭＣＰＴ１（モノクローナル抗体ＲＦ６．１、イーバイオサイエンス）の１：２０希釈液とともに、４℃で終夜インキュベートした。スライドを０．２％トリトン溶液で洗浄し、トリトン溶液中、ヤギ抗ラットＩｇＧアレクサフルオル４８８コンジュゲート抗体の１：５００希釈液（ライフテクノロジーズ）ともに、室温で２時間インキュベートした。スライドをＰＢＳ中で洗浄した後、カバースリップをイメージングのための抗退色溶液とともに添加した。
【０１４０】
末梢白血球調製
同じ溶液で１：１に希釈した、３０単位／ｍｌのヘパリンおよび５ｍＭ  ＥＤＴＡを加えたＰＢＳを含有するシリンジを用いる心臓穿刺を介して、ＭｒｇｐｒＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏマウスから血液を収集し、室温に冷却させた後、１５ｍｌの円錐管中の６ｍｌのヒストパック−１１１９溶液上に積層させた。管を７００ｇで３０分間遠心分離し、白血球を、ＰＢＳおよびヒストパック溶液の界面で収集した。細胞をＰＢＳで洗浄し、５００ｇで１０分間、合計３回スピンダウンさせた。細胞を、サイトスピン４（サーモサイエンティフィック）中、６００ｒｐｍで３〜５分間、ポリ−リジンコーティングしたスライド上にスピンさせ、３７℃加熱ブロック上で終夜乾燥させ、ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍｌに希釈したヘキスト３３３４２とともに２分間インキュベートした後、カバースリップを抗退色溶液とともに載せた。並行して、細胞を、ヘキスト３３３４２を加えた懸濁液中でも染色し、細胞をスピンダウンさせ、ＰＢＳ／抗退色溶液中で再懸濁した細胞と直接的に混合した後、スライドに直接載置し、懸濁液にカバースリップを載せた。いずれかの方法を使用したいずれの調製物においても、ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞は見られなかった。
【０１４１】
組織ヒスタミン放出研究
最高６月齢の剃毛した雄および雌マウス（４〜８ｍｇ湿重量）の腹部の側面から単離した気管全体または皮膚のセグメントを切断し、結合組織を取り除いた。酸素化したクレブス重炭酸塩緩衝液（３７℃）中でのインキュベーション期間において６０分後、組織をビヒクルまたは化合物４８／８０のいずれかで３０分間処理した。上清溶液はヒスタミン分析のために取っておいた。次いで、組織を、３７℃水浴中、８％ペルコロリック酸（ｐｅｒｃｈｏｌｏｒｉｃ  ａｃｉｄ）に１５分間供して、総ヒスタミン含有量を取得した。ヒスタミンを、先に記述した自動蛍光技術２によってアッセイした。
【０１４２】
気管収縮
気管収縮は、先に記述した通りに行った（Ｌａｇｕｎｏｆｆ，Ｄ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｔ．Ｗ．＆  Ｒｅａｄ，Ｇ．Ａｇｅｎｔｓ  ｔｈａｔ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｆｒｏｍ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌｓ．Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ２３，３３１−３５１）。アレルゲン（オボアルブミン、ＯＶＡ）応答のために、Ａｌ（ＯＨ）３と混合した０．２ｍＬのＯＶＡ溶液（３．７５μｇ／ｍＬ）を２日間隔で３回注射することによって、マウスを能動感作した。実験は、最初の注射の２週間後に開始して、８〜１２週齢の雄および雌の動物に対して行った。気管から結合組織および気管輪（全体または横方向に半分に分割したもの）を取り除き、クレブスを充填した１０ｍＬの臓器チャンバ中の２つのタングステンあぶみ間に懸濁し、これを３７℃に加温し、９５％Ｏ２〜５％ＣＯ２で発泡させて、７．４のｐＨを維持した。一方のあぶみを歪みゲージ（モデルＦＴ０３；グラスインストゥルメンツ、マサチューセッツ州クインシー）と接続し、張力をグラスモデル７ポリグラフ（グラスインストゥルメンツ、マサチューセッツ州クインシー）で記録した。調製物を０．２ｇの静止張力まで伸ばし、新しいクレブス緩衝液により、６０分の平衡期間中、１５分間隔で洗浄した。平衡後、気管に、ＯＶＡ（１０μｇ／ｍＬ）または化合物４８／８０のいずれかで負荷をかけた。各実験の終わりに、すべての気管をカルバコール（１μＭ）で最大限に収縮させた。すべての結果は、最大収縮のパーセンテージとして表現される。
【０１４３】
後足の腫脹および溢出
最高８月齢の成体雄マウスに、５０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタール（シグマ）の腹腔内注射で麻酔をかけた。麻酔導入の１５分後、マウスに、生理食塩水中の５０μｌの１２．５ｍｇ／ｍｌエバンスブルー（シグマ）を静脈内注射した。５分後、５μｌの試験物質（または７μｌの抗ＩｇＥ）を足底内注射によって一方の足に投与し、生理食塩水を他方の足に投与した。注射直後に、足の厚みをカリパスによって測定した。１５分後（抗ＩｇＥの３０分後）、足の厚みを再度測定し、マウスを断頭術によって屠殺した。足の組織を収集し、５０℃で２４時間乾燥させ、秤量した。エバンスブルーを、ホルムアミド中、５０℃での２４時間のインキュベーションによって抽出し、分光光度計を使用してＯ．Ｄ．を６２０ｎｍで読み取った。ケトチフェンを使用する研究では、マウスに、ペントバルビタールと同時に２５μｌのケトチフェンの１０ｍｇ／ｍｌ溶液を腹腔内注射した。
【０１４４】
全身性アナフィラキシーアッセイ
ストレスを最小化するために、動物を注射の前日に処置エリアへ輸送した。最高８月齢の成体雄および雌マウス（２５から３５グラム）に、生理食塩水（２ｍｇ／ｍｌ）中の８０μｇのプロプラノロールの腹腔内注射を、ケージから取り出した直後に与え、次いで、静脈注射前の３０分間、ケージ内に戻した。静脈注射は、１回に１匹のマウスに対して実施した。各注射について、マウスを輸送箱に入れ、他のマウスがいない部屋に連れて行って、注射中の発声によるストレスを最小化した。次いで、拘束時間が長くなるほど、注射とは無関係に身体コア温度に影響を及ぼすことが観察されたため、マウスを拘束帯に入れ、拘束の４分以内に注射を実施した。尾を繰り返し拭き取ることによって尾静脈を拡張させ、組織を１００％エタノールに浸し、続いて、３０．５標準規格注射針（ＢＤバイオサイエンス）を用いる０．２５ｍｌのハミルトンシリンジフィット中のシプロフロキサシンの注射をした。注射は、基準のすべてが満たされた場合のみ成功したと決定された：針挿入後のシリンジ内に血液が見られ、すべての尾静脈が注射後に可視であり、マウスは、針抜去後に注射部位からわずかに出血した。血液の流れが停止するまで、注射部位を綿球で拭き、マウスを、その飼育ケージから別個のケージに、ケージあたり１匹のマウスを入れ、連れ出してきた部屋に戻した。少なくとも１匹の野生型および１匹の突然変異マウスを、各実験セッションに使用した。身体コア温度は直腸検温器で測定した。
【０１４５】
マウス腹膜肥満細胞ヒスタミン放出アッセイ
肥満細胞を、カルシウムイメージングアッセイと同様に精製し、５％ＣＯ２を用いる３７℃のインキュベーター内、１０％ＦＢＳおよび２５ｎｇ／ｍｌのマウス幹細胞因子を加えたＤＭＥＭ中で２時間回復させた。次いで、細胞をスピンダウンさせ、ＣＩＢに再懸濁し、計数し、２０μｇ／ｍｌのフィブロネクチンでコーティングした９６ウェルプレート（シグマ）中、７５μｌのＣＩＢ中３００細胞／ウェルで平板培養した。該細胞を、アッセイ前に、大気条件（すなわち、ＣＯ２レベルを調整しなかった）において、３７℃で４５分間、基質に付着させた。アッセイのために、細胞を除去して室温にし、７５μｌの試験物質の２倍濃縮物（シプロフロキサシンを除いてすべてＣＩＢ中、シプロフロキサシンは、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２を加えた生理食塩水中、ｐＨ３．５）を添加した。５分後、４０μｌの上清を吸引し、４０μｌのＣＩＢで希釈し、ヒスタミンレベルが決定されるまで−８０℃で凍結させた。抗ＩｇＥ処理は、抗ＩｇＥを添加した後、上清の吸引前に、細胞を３７℃で３０分間インキュベートしたことを除き、同様であった。ヒスタミン含有量は、ＨＴＲＦヒスタミンアッセイキット（シスバイオアッセイズ（Ｃｉｓｂｉｏ  Ａｓｓａｙｓ））を、メーカーの説明書に従って使用することにより、決定された。
【０１４６】
ヒト肥満細胞培養
ＬＡＤ２（アレルギー疾患の研究室２（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ２））ヒト肥満細胞を、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒト幹細胞因子（ぺプロテック）を補充した、ステムプロ−３４  ＳＦＭ培地（ライフテクノロジーズ）中で培養した。細胞懸濁液を０．１×１０６細胞／ｍｌの密度で播種し、３７℃および５％ＣＯ２で維持し、フローサイトメトリーにより、ＣＤ１１７およびＦｃεＲＩの発現について定期的に試験した。細胞培養培地は、新しい培地を用いて毎週半枯渇させた。
【０１４７】
ＬＡＤ２脱顆粒アッセイ
ＬＡＤ２細胞を、０．５μｇ／ｍｌのビオチンコンジュゲートヒトＩｇＥ（アビオテック）で２０時間感作した。細胞を洗浄し、へぺス緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、０．３８ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４．７Ｈ２Ｏ、５．６ｍＭグルコース、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２．Ｈ２Ｏ、１．３ｍＭ  ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．４％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）に、ウェル当たり０．０２５×１０６で再懸濁し、次いで、０．１μｇ／ｍｌのストレプトアビジン（ライフテクノロジーズ）または示された濃度の他のアゴニストで、３７℃／５％ＣＯ２にて３０分間刺激した。上清中におよび細胞溶解物中で放出されたβ−ヘキソサミニダーゼを、０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中、３７℃で９０分間にわたるｐ−ニトロフェニルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミド（シグマアルドリッチ）の加水分解によって定量化した。β−ヘキソサミニダーゼ放出のパーセンテージは、総含有量のパーセントとして算出した。試験したアゴニストは、化合物４８／８０、マストパラン、イカチバント、ベシル酸アトラクリウムおよびシプロフロキサシン塩酸塩であった。
【０１４８】
ＥＩＡおよびＥＬＩＳＡ
ＬＡＤ２細胞を培地で洗浄し、ウェル当たり０．２５×１０６細胞で懸濁し、示された濃度の化合物４８／８０、マストパラン、イカチバント、アトラクリウムまたはシプロフロキサシンとともに、３７℃／５％ＣＯ２で３〜２４時間インキュベートした。無細胞上清を収穫し、ＥＩＡ（ケイマンケミカル）によってＰＧＤ２放出について分析し、一方、ＴＮＦ含有量を、ＥＬＩＳＡキット（イーバイオサイエンス）を使用し、メーカーの説明書に従って定量化した。最小検出限界は、ＰＧＤ２については５５ｐｇ／ｍｌ、ＴＮＦについては５．５ｐｇ／ｍｌであった。
【０１４９】
ＬＡＤ２細胞からのヒスタミン放出の測定
ＬＡＤ２細胞を洗浄し、ウェル当たり０．１×１０６で無ＢＳＡへぺス緩衝液に懸濁し、示された濃度の化合物４８／８０、マストパラン、イカチバント、アトラクリウムまたはシプロフロキサシンとともに、３７℃／５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。１００μｇ／ｍｌのヒスタミン（シグマアルドリッチ）ストック溶液を調製し、−２０℃で貯蔵した。２倍連続希釈を使用して、４０００ｎｇ／ｍｌから７．８ｎｇ／ｍｌの作業標準を新しく調製した。Ｏ−フタルアルデヒド（ＯＰＴ；シグマアルドリッチ）を無アセトンメタノール（１０ｍｇ／ｍｌ）に溶解し、４℃の暗所に保った。ヒスタミン標準および無細胞上清（６０μＬ）を平底９６黒色ウェルマイクロプレートに移し、１２μｌの１Ｍ  ＮａＯＨおよび３μｌのＯＰＴと混合した。室温で４分後、６μｌの３Ｍ  ＨＣｌを添加して、ヒスタミン−ＯＰＴ反応を停止させた。蛍光強度は、３５５ｎｍ励起フィルタおよび４６０発光フィルタを使用して計測した。
【０１５０】
ＬＡＤ２細胞のｓｉＲＮＡトランスフェクション
ＭｒｇｐｒＸ２の発現をＭｒｇｐｒＸ２およびダーマコン製の対照ｓｉＲＮＡに対してＯＮ−ＴＡＲＧＥＴプラスＳＭＡＲＴプールｓｉＲＮＡでダウンレギュレートした。ＬＡＤ２細胞を培地で洗浄し、ウェル当たり０．５×１０６細胞で懸濁し、１００ｎｍ  ＭｒｇｐｒＸ２  ｓｉＲＮＡおよび対照ｓｉＲＮＡを、無抗生物質ステムプロ培地中、リポフェクタミン３０００（ライフテクノロジーズ）をメーカーの説明書に従って使用して、３７℃／５％ＣＯ２でトランスフェクトした。４８時間で、逆転写酵素ＰＣＲによってノックダウンを確認し、細胞を脱顆粒アッセイに使用した。
【実施例２】
【０１５１】
ＭｒｇｐｒＢ２はヒトＭｒｇｐｒＸ２のオルソログである
塩基性分泌促進物質に対する応答性は、哺乳動物間で保存されており（Ｈａｌｐｅｒｎ，Ｂ．Ｎ．＆  Ｗｏｏｄ，Ｄ．Ｒ．Ｔｈｅ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｍｅｔｈａｚｉｎｅ（ｐｈｅｎｅｒｇａｎ）ｉｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｅａｔｈ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ５，５１０−５１６（１９５０））、鳥類においても見られ（Ｔａｎｅｉｋｅ，Ｔ．，Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｈ．，Ｏｉｋａｗａ，Ｓ．＆  Ｏｈｇａ，Ａ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄ４８／８０  ｅｌｉｃｉｔｓ  ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｈｉｃｋ  ｏｅｓｏｐｈａｇｕｓ．Ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １９，６８９−６９５（１９８８））、その機序が果たす古代からの基本的役割を示している。多くの塩基性分泌促進物質は内因性ペプチドであり、多くの場合、炎症に関わっているが、高濃度でのみ、かつそれらのカノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）受容体とは無関係に結合組織肥満細胞を活性化させるため、刺激の機序が別に存在するに違いない（Ｆｅｒｒｙ，Ｘ．，Ｂｒｅｈｉｎ，Ｓ．，Ｋａｍｅｌ，Ｒ．＆  Ｌａｎｄｒｙ，Ｙ．Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｂｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｂａｓｉｃ  ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅｓ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２３，１５０７−１５１５（２００２））。ポリカチオン性化合物を結合するいくつかの候補が塩基性分泌促進物質受容体として報告されている（Ｆｅｒｒｙ，Ｘ．，Ｂｒｅｈｉｎ，Ｓ．，Ｋａｍｅｌ，Ｒ．＆  Ｌａｎｄｒｙ，Ｙ．Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｂｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｂａｓｉｃ  ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅｓ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２３，１５０７−１５１５（２００２）；Ｐｕｒｃｅｌｌ，Ｗ．Ｍ．，Ｄｏｙｌｅ，Ｋ．Ｍ．，Ｗｅｓｔｇａｔｅ，Ｃ．＆  Ａｔｔｅｒｗｉｌｌ，Ｃ．Ｋ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ｓｉｔｅ  ｏｎ  ｒａｔ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌｓ：ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ＮＭＤＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍａｃｒｏｃｏｍｐｌｅｘ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６５，４９−５３（１９９６）；Ｔａｔｅｍｏｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ｍｒｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３４９，１３２２−１３２８，（２００６）；Ｓｉｃｋ，Ｅ．，Ｎｉｅｄｅｒｈｏｆｆｅｒ，Ｎ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．，Ｌａｎｄｒｙ，Ｙ．＆  Ｇｉｅｓ，Ｊ．Ｐ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４７  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｃａｕｓｅｓ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａ���  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ：ＣＭＬＳ６６，１２７１−１２８２，（２００９）。これらの中でも、ＭｒｇｐｒＸ２は、ほとんどの化合物でスクリーニングされてきており（Ｔａｔｅｍｏｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ｍｒｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３４９，１３２２−１３２８，（２００６）；Ｒｏｂａｓ，Ｎ．，Ｍｅａｄ，Ｅ．＆  Ｆｉｄｏｃｋ，Ｍ．ＭｒｇＸ２  ｉｓ  ａ  ｈｉｇｈ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｃｏｒｔｉｓｔａｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｄｏｒｓａｌ  ｒｏｏｔ  ｇａｎｇｌｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７８，４４４００−４４４０４，（２００３）；Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｈ．，Ｇｕｐｔａ，Ｋ．，Ｇｕｏ，Ｑ．，Ｐｒｉｃｅ，Ｒ．＆  Ａｌｉ，Ｈ．Ｍａｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  Ｘ２（ＭｒｇＸ２）ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ＬＬ−３７  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌｓ：ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ，ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８６，４４７３９−４４７４９，（２０１１）；Ｋａｓｈｅｍ，Ｓ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  Ｃ３ａ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌｓ：ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  Ｍａｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ＭｒｇＸ１  ａｎｄ  ＭｒｇＸ２．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ６６８，２９９−３０４，（２０１１）；Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．ｂｅｔａ−Ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｈｕｍａｎ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  Ｍａｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  Ｘ２．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９１，３４５−３５２，（２０１３）；Ｋａｍｏｈａｒａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭｒｇＸ２  ａｓ  ａ  ｈｕｍａｎ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｐｒｏａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３３０，１１４６−１１５２，（２００５））、ｓｉＲＮＡノックダウン研究は、非カノニカル塩基性分泌促進物質による活性化において少なくとも部分的にＭｒｇｐｒＸ２が果たす役割を裏付けるものである（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｈ．，Ｇｕｐｔａ，Ｋ．，Ｇｕｏ，Ｑ．，Ｐｒｉｃｅ，Ｒ．＆  Ａｌｉ，Ｈ．Ｍａｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  Ｘ２（ＭｒｇＸ��）ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ＬＬ−３７  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌｓ：ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ，ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８６，４４７３９−４４７４９，（２０１１）；Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．ｂｅｔａ−Ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｈｕｍａｎ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  Ｍａｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  Ｘ２．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９１，３４５−３５２，（２０１３））。しかしながら、直接的なインビボ研究もノックアウトモデルも、あらゆる候補に用いられてこなかった。マウスにおけるＭｒｇｐｒＸ２の調査は、４つのヒトＭｒｇｐｒＸメンバーを含有する遺伝子クラスタがマウスにおいて劇的に拡大しており、該メンバーは２２の潜在的なコード遺伝子からなり、多くはＭｒｇｐｒＸ２と同程度の配列同一性を持つことから、複雑である（図１Ａ）。したがって、マウスＭｒｇｐｒＸ２オルソログを、発現パターンおよび薬理学によって決定しなくてはならない。マウス一次肥満細胞におけるストリンジェンドなＲＴ−ＰＣＲスクリーニングは、単一のファミリーメンバー、ＭｒｇｐｒＢ２を表すバンドを見出さず（図１Ｂ）、一方、ＭｒｇｐｒＸ１オルソログは、示差的レベルで発現されなかった（図５Ａおよび図５Ｂ）。
【０１５２】
機能的に、ＭｒｇｐｒＢ２を異種発現しているＨＥＫ２９３細胞（ＭｒｇｐｒＢ２−ＨＥＫ）は、ＭｒｇｐｒＸ２アゴニストＰＡＭＰ（９〜２０）１４（図１Ｃ）および化合物４８／８０（４８／８０）、古典的な肥満細胞活性化因子ならびにカノニカル塩基性分泌促進物質（図６Ａ、図６Ｂおよび図６Ｃ）に応答した。ＭｒｇｐｒＢ２−ＨＥＫ細胞は、塩基性分泌促進物質の物質Ｐを包含する他のＭｒｇｐｒＸ２リガンドにも応答したが、ＭｒｇｐｒＸ１リガンドクロロキン（ＣＱ）に対しては応答せず（Ｌｉｕ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｎｓｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＧＰＣＲ  Ｍｒｇｐｒｓ  ａｒｅ  ｉｔｃｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｒｕｒｉｔｕｓ．Ｃｅｌｌ  １３９，１３５３−１３６５，（２００９））；マウスにおける密接に関係しているファミリーメンバーのいずれも、あらゆる化合物に対して応答しなかった（図５Ｃ、図６Ａおよび図６Ｃ）。ＭｒｇｐｒＢ２の発現を決定するために、ｅＧＦＰ−Ｃｒｅリコンビナーゼの発現がＭｒｇｐｒＢ２プロモータの制御下にあるＭｒｇｐｒＢ２  ＢＡＣトランスジェニックマウスを生成した。Ｃｒｅ発現パターンは、際立って、ＭｒｇｐｒＢ２発現が結合組織肥満細胞に高度に特異的であることを示す（図１Ｄ、図７、図８Ａおよび図８Ｂ）。薬理学的および発現データは、一緒に、ＭｒｇｐｒＢ２がＭｒｇｐｒＸ２のマウスオルソログであることを示す。
【実施例３】
【０１５３】
ＭｒｇｐｒＢ２はマウス肥満細胞塩基性分泌促進物質受容体である
次に、ＭｒｇｐｒＢ２がマウス肥満細胞において塩基性分泌促進物質受容体であるか否かを決定した。ＭｒｇｐｒＢ２ゲノム遺伝子座は、相同的組換えを介して遺伝子標的化を可能にするには多すぎる反復配列を含有する（図９Ａ）。したがって、ジンク・フィンガー・ヌクレアーゼベースの戦略を使用して、ＭｒｇｐｒＢ２コード領域に４塩基対欠失があるマウス系統（ＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴマウス）を生成し、第一の膜貫通ドメインの後まもなくフレームシフト突然変異および早期終止をもたらした（図９Ｂ、図９Ｃおよび図９Ｄ）。突然変異は安定かつ遺伝性であった（図９Ｃ）ため、ＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴを機能的ヌルとみなした。肥満細胞数は、野生型（ＷＴ）およびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴマウスの組織において同程度であり、ＭｒｇｐｒＢ２が肥満細胞生存にも組織への標的化にも必須ではないことを示した（図１０Ａ）。抗ＩｇＥ抗体（図２Ａ）およびエンドセリン（図１１Ａ、図１１Ｂおよび図１１Ｃ）に対する腹膜肥満細胞の応答性も同程度であり、ＭｒｇｐｒＢ２突然変異がＩｇＥまたはＧＰＣＲ媒介性肥満細胞シグナル伝達を全体的に損なうわけではないことを実証した。しかしながら、４８／８０誘発性肥満細胞活性化（図２Ａ）および組織ヒスタミン放出は、突然変異肥満細胞において本質的に消失した（図２Ｂおよび図１０Ｂ）。さらに、４８／８０が引き起こした気管収縮（図２Ｃ）および後足炎症（溢出および腫脹；図２Ｄ）は、ＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴバックグラウンドではほぼ完全に存在せず、一方、抗原（図２Ｃ）および抗ＩｇＥが引き起こした応答（図１２Ａおよび図１２Ｂ）は、ＷＴマウスと同程度であった。最後に、４つのさらなる塩基性分泌促進物質、ならびにＭｒｇｐｒＸ２アゴニストＰＡＭＰ（９〜２０）およびコルチスタチン（Ｒｏｂａｓ，Ｎ．，Ｍｅａｄ，Ｅ．＆  Ｆｉｄｏｃｋ，Ｍ．ＭｒｇＸ２  ｉｓ  ａ  ｈｉｇｈ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｃｏｒｔｉｓｔａｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｄｏｒｓａｌ  ｒｏｏｔ  ｇａｎｇｌｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７８，４４４００−４４４０４，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ３０２４５６２００（２００３））は、ＷＴを強く活性化させたが、ＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ肥満細胞はさせなかった（図２Ｅ；図１３Ａ）。ＭｒｇｐｒＢ２またはＭｒｇｐｒＸ２を発現しているＨＥＫ２９３細胞（ＭｒｇｐｒＸ２−ＨＥＫ）も、これらの分泌促進物質に応答した（図６Ａおよび図６Ｂ）。まとめると、ＭｒｇｐｒＢ２はマウス肥満細胞塩基性分泌促進物質受容体であると結論づけられた。ＭｒｇｐｒＢ２を活性化させる小型の塩基性ペプチドのリストは、この研究における数よりも大きい可能性が高く、実際に、数十のそのようなペプチドが肥満細胞を活性化させることが示されている（Ｌａｇｕｎｏｆｆ，Ｄ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｔ．Ｗ．＆  Ｒｅａｄ，Ｇ．Ａｇｅｎｔｓ  ｔｈａｔ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｆｒｏｍ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌｓ．Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ２３，３３１−３５１，ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｐａ．２３．０４０１８３．００１５５５（１９８３）；Ｆｅｒｒｙ，Ｘ．，Ｂｒｅｈｉｎ，Ｓ．，Ｋａｍｅｌ，Ｒ．＆  Ｌａｎｄｒｙ，Ｙ．Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｂｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｂａｓｉｃ  ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅｓ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２３，１５０７−１５１５（２００２）；Ｍｏｕｓｌｉ，Ｍ．，Ｈｕｇｌｉ，Ｔ．Ｅ．，Ｌａｎｄｒｙ，Ｙ．＆  Ｂｒｏｎｎｅｒ，Ｃ．Ｐｅｐｔｉｄｅｒｇｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ  ａｎｄ  ｒａｔ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２７，１−１１（１９９４）；Ｐｕｎｄｉｒ，Ｐ．＆  Ｋｕｌｋａ，Ｍ．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｉｓ  ｔｈｅｒｅ  ａ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ？Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ８８，６３２−６４０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｉｃｂ．２０１０．２７（２０１０））。とりわけ、ヒトＭｒｇｐｒＸ２は、物質Ｐに対してマウスＭｒｇｐｒＢ２よりもはるかに感受性であり（図６Ｃ）、肥満細胞シグナル伝達において物質Ｐが果たす潜在的な種特異的役割を示唆している。
【０１５４】
これらのペプチドのマイクロモル濃度がＭｒｇｐｒＢ２活性化に必要とされることを考慮すると、そのようなシグナル伝達事象がどこで発生するかは不明瞭である。しかしながら、肥満細胞は、大量の小型のカチオン性ペプチドを分泌する膵臓および副腎のような臓器に存在し、放出部位の近くの濃度はこれらのレベルに到達することが考えられる。本明細書において記述されているのは、ＭｒｇｐｒＢ２に対する高親和性内因性リガンドである。内因性ＭｒｇｐｒＢ２およびＭｒｇｐｒＸ２リガンドの同定は、病態において肥満細胞が他の細胞型とどのように相互作用するかを理解することに有意に寄与する。
【実施例４】
【０１５５】
ＭｒｇｐｒＢ２はペプチド性治療薬の肥満細胞応答性および副作用を媒介する
アレルギーおよび偽アレルギー（すなわち、ＩｇＥ非依存性）反応における肥満細胞の重大な役割は、ＭｒｇｐｒＸ２がこれらの事象における因子であるか否かを実証する実験の必要性を示唆していた。多くの治療薬がカチオン性であることから、薬剤誘発性反応が取り上げられた。薬剤誘発性有害反応の最大１５％が、アレルギー性の性質であるとみられているが、多くはＩｇＥ抗体力価と十分に相関性があるわけではなく、抗体非依存性または偽アレルギー機序が関与することを示している（Ｈａｕｓｍａｎｎ，Ｏ．，Ｓｃｈｎｙｄｅｒ，Ｂ．＆  Ｐｉｃｈｌｅｒ，Ｗ．Ｊ．Ｅｔｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｄｒｕｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ａｌｌｅｒｇｙ  ９７，３２−４６，ｄｏｉ：１０．１１５９／０００３３５６１４（２０１２））。
【０１５６】
ペプチド作動薬のほとんどは、カチオン性ペプチドが肥満細胞を活性化させるために十分高いミリモル濃度で皮下にまたは筋肉内に導入されるため、最初にペプチド作動薬を分析した（図１５）。これらの薬物のＦＤＡラベルにおいて記述されているほとんどの頻繁に起こるアレルギー型応答は、疼痛または掻痒が付随し得る、注射部位反応（ＩＳＲ）、局所腫脹および／または可変サイズの発赤である。ＦＤＡ承認ペプチド作動薬の調査において、ＩＳＲに関連する圧倒的多数がカチオン性である（図１５）。これらのカチオン性薬物のすべての一般的な市販のクラスの代表的なメンバーは肥満細胞をＭｒｇｐｒＢ２依存性様式で活性化させ、一方、無害なタンパク質インスリンは効果をもたらさなかった（図３Ａ、図１３Ｂおよび図１３Ｃ）。一貫して、インスリンを除くこれらのペプチドのすべては、ＭｒｇｐｒＢ２−ＨＥＫおよびＭｒｇｐｒＸ２−ＨＥＫ細胞の両方を活性化させる（図６Ａ、図６Ｂおよび図６Ｃ）。薬物イカチバントは、ほぼすべての患者においてＩＳＲを誘発することから、さらなる研究のために選択された（Ｌｕｍｒｙ，Ｗ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ  Ｂ（２）ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｉｃａｔｉｂａｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ａｔｔａｃｋｓ  ｏｆ  ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ａｎｇｉｏｅｄｅｍａ：ｔｈｅ  ＦＡＳＴ−３  ｔｒｉａｌ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ａｌｌｅｒｇｙ，ａｓｔｈｍａ＆  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ，＆  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０７，５２９−５３７，（２０１１））。臨床濃度のイカチバントは、ＷＴマウスにおいてはヒトＩＳＲと同様の広範囲にわたる溢出および腫脹を誘発したが、ＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴマウスにおいてはしなかった（図３Ｂ）。肥満細胞安定剤ケトチフェンで前処理したマウスも、炎症を示さず（ケトチフェンなし：足の厚みの４０．７±２．１％増大；ケトチフェンあり：３．１±０．６％増大；ｎ＝４ずつ；ｐ＝２．２ｅ−６）、肥満細胞が炎症を媒介することを強く示していた。さらに、イカチバント（ならびに陽性対照４８／８０およびマストパラン）は、ＷＴ腹膜肥満細胞からのヒスタミン放出を誘発し、一方、ＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ肥満細胞の放出は実質的により少なかった（図３Ｃ）。しかしながら、ＩｇＥ媒介性ヒスタミン放出は、ＭｒｇｐｒＢ２欠失により影響を受けなかった（図３Ｃ）。これらのデータは、薬剤誘発性ＩＳＲが、ＭｒｇｐｒＸ２を標的化することによって、またはあまり強力でないＭｒｇｐｒＸ２アゴニスト特性を持つペプチドを使用することによって軽減され得ることを予測するものである。
【実施例５】
【０１５７】
ＭｒｇｐｒＢ２は小分子治療薬の肥満細胞応答性および副作用を媒介する
次に、小分子によって誘発された偽アレルギー反応をＭｒｇｐｒＢ２が媒介する可能性を探究した。静脈内に適用される薬物は、多くの場合、迅速にかつ高用量で投与され、故に、他の経路を介して投与される薬物よりも高い血中濃度および迅速な組織分布を実現する可能性が高いことから、静脈内に適用される薬物に焦点を合わせた。静脈内投与後の偽アレルギー反応の症状は、最も重度のものをアナフィラキシー様と呼び、皮膚潮紅または発疹、血圧または心拍数の変化、および気管支けいれんを包含する（Ｎｅｌ，Ｌ．＆  Ｅｒｅｎ，Ｅ．Ｐｅｒｉ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ７１，６４７−６５８，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１３６５−２１２５．２０１１．０３９１３．ｘ（２０１１））。初期研究は、４８／８０の構造に基づく。ＭｒｇｐｒＸ２アゴニストとしての４８／８０の構造機能関係は不明であったが、テトラヒドロイソキノリン（ＴＨＩＱ）モチーフを含有する環化バリアント（図４Ａ）は、肥満細胞脱顆粒剤（ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｏｒ）として、４８／８０よりも７倍強力であった（Ｒｅａｄ，Ｇ．Ｗ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８−８０．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙ−ＴＨＩＱ，ａ  ｎｅｗ，ｍｏｒｅ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎａｌｏｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６，１２９２−１２９５（１９７３））。ＴＨＩＱを含有するＦＤＡ承認薬の探索は、ツボクラリンおよびアトラクリウムを包含するニコチン性受容体アンタゴニスト非ステロイド性神経筋遮断薬（ＮＭＢＤ）のメンバーを回復させた（図４Ｂ）。ＮＭＢＤは、手術において、不要な筋肉の動きを低減させ、人工呼吸器のための気管内挿管を可能にするために日常的に使用されている。興味深いことに、ＮＭＢＤ単独で、外科的状況におけるアレルギー反応のほぼ６０％の原因となっており（Ｍｅｒｔｅｓ，Ｐ．Ｍ．，Ａｌｌａ，Ｆ．，Ｔｒｅｃｈｏｔ，Ｐ．，Ａｕｒｏｙ，Ｙ．＆  Ｊｏｕｇｌａ，Ｅ．Ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ  ｉｎ  Ｆｒａｎｃｅ：ａｎ  ８−ｙｅａｒ  ｎａｔｉｏｎａｌ  ｓｕｒｖｅｙ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２８，３６６−３７３（２０１１））、スクシニルコリンを除くすべてが、ヒトにおいてヒスタミン放出を誘発する（Ｋｏｐｐｅｒｔ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｕｓｃｌｅ  ｒｅｌａｘａｎｔｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ．Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ  ９５，６５９−６６７（２００１））。図１６に示されている通り、スクシニルコリンを除くすべてのＮＭＢＤファミリーのメンバーは、肥満細胞を、ＭｒｇｐｒＢ２依存性様式で、臨床注射濃度の０．５％という低さの濃度にて活性化させた（図４Ｃおよび図１３Ｄ）。興味深いことに、ロクロニウムはＴＨＩＱを含有しないが、４８／８０を連想させる、数オングストローム以内の荷電窒素を持つ大きい疎水性基（図４Ｂ）を有する。したがって、研究は、アッセイを高い注射濃度の静脈内薬物に���定し、陽性または極性窒素の環化および位置の変化を包含するＴＨＩＱモチーフおよび４８／８０構造の変調を使用して実施した。抗生物質のフルオロキノロンファミリーは、同様のモチーフを有するとして同定された（図４Ｄ）。ＮＭＢＤのように、これらはアレルギー型反応に関連しており（Ｋｅｌｅｓｉｄｉｓ，Ｔ．，Ｆｌｅｉｓｈｅｒ，Ｊ．＆  Ｔｓｉｏｄｒａｓ，Ｓ．Ａｎａｐｈｙｌａｃｔｏｉｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ  ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ  ｒｅｌａｔｅｄ：ａ  ｃａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｃｌｉｎ  Ｔｈｅｒ  ３２，５１５−５２６（２０１０）；Ｂｌａｎｃａ−Ｌｏｐｅｚ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ：ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ４３，５６０−５６７（２０１３））、肥満細胞を活性化させることができる（Ｍｏｒｉ，Ｋ．，Ｍａｒｕ，Ｃ．＆  Ｔａｋａｓｕｎａ，Ｋ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ−ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ−ｖｉｔｒｏ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ５２，５７７−５８４（２０００）；Ｍｏｒｉ，Ｋ．，Ｍａｒｕ，Ｃ．，Ｔａｋａｓｕｎａ，Ｋ．＆  Ｆｕｒｕｈａｍａ，Ｋ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｌｅｖｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ａ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｇｅｎｔ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３９４，５１−５５（２０００））。静脈内使用のために承認された４つのメンバーは、ＭｒｇｐｒＢ２−ＨＥＫおよびＭｒｇｐｒＸ２−ＨＥＫ細胞（図６Ａ、図６Ｂおよび図６Ｃ）ならびに肥満細胞をＭｒｇｐｒＢ２依存性様式で（図４Ｅ；図１３Ｃ）活性化した。それに対応して、アトラクリウムおよびシプロフロキサシンは、ＷＴ腹膜肥満細胞におけるヒスタミン放出を誘発し、ＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ肥満細胞においては実質的により少なかった（図３Ｃ）。シプロフロキサシンは、マウスにおいては、ほとんどの場合、血圧および末梢血管拡張の変化による可能性が高い体温の降下によって測定される、アナフィラキシーのインビボ試験に選択された（Ｄｏｙｌｅ，Ｅ．，Ｔｒｏｓｉｅｎ，Ｊ．＆  Ｍｅｔｚ，Ｍ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １０３２，１３３−１３８，ｄｏｉ：１０．１００７／９７８−１−６２７０３−４９６−８＿１０（２０１３））。げっ歯類は、他の実験生物とは対照的に、全身レベルのヒスタミン毒性に対してほぼ免疫がある（Ｈａｌｐｅｒｎ，Ｂ．Ｎ．＆  Ｗｏｏｄ，Ｄ．Ｒ．Ｔｈｅ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｍｅｔｈａｚｉｎｅ（ｐｈｅｎｅｒｇａｎ）ｉｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｅａｔｈ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ５，５１０−５１６（１９５０））が、肥満細胞活性化因子およびベータ−アドレナリン遮断薬での前処理により分泌された生成物に対して感受性になることができる（Ｂｅｒｇｍａｎ，Ｒ．Ｋ．＆  Ｍｕｎｏｚ，Ｊ．Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ２１７，１１７３−１１７４（１９６８）；Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｙ．，Ｔａｎ，Ｅ．Ｍ．＆  Ｖａｕｇｈａｎ，Ｊ．Ｈ．Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ  ｂｅｔａ  ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｂｌｏｃｋａｄｅ：ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５８，３８７−３９４（１９７６））。これらの条件下で、高用量のシプロフロキサシンは、回復するのが非常に遅い体温の急降下を誘発し、一方、ＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴマウスは、急速に回復するはるかに小さい降下を示した（図４Ｆ）。これらの結果は、ＭｒｇｐｒＢ２を介する肥満細胞活性化がフルオロキノロンおよび他の薬物のオフ標的効果であり、ヒトにおける対応するＭｒｇｐｒＸ２活性化は、これらの薬物に見られる偽アレルギー応答のほとんどの根底にあるかもしれないことを立証するものである。
【実施例６】
【０１５８】
偽アレルギーに関連する薬物はＭｒｇｐｒＸ２を介してヒト肥満細胞を活性化させる
最後に、偽アレルギーに関連する薬物が、ＭｒｇｐｒＸ２を介してヒト肥満細胞を活性化させるか否かを決定した。調査された各薬物クラスの代表的なメンバーは、ＬＡＤ２細胞からの、ヒスタミン、ＴＮＦ、ＰＧＤ２およびβ−ヘキソサミニダーゼの放出を引き起こした（図１４Ａ）。４８／８０およびマストパランを陽性対照として使用した。重要なことには、ＭｒｇｐｒＸ２  ｓｉＲＮＡ処理ＬＡＤ２細胞は、対照ｓｉＲＮＡ処理細胞における応答と比較して有意に低い、これらの物質によって引き起こされたβ−ヘキソサミニダーゼ放出を呈し、一方、ＩｇＥ媒介性放出は同程度であった（図１４Ｂ）。ＭｒｇｐｒＸ２  ｓｉＲＮＡ処理細胞において観察された残りの放出は、不完全なｍＲＮＡおよび／またはタンパク質ノックダウンによる可能性が高い。
【０１５９】
上記で詳細に記述した通り、マウスにおけるＭｒｇｐｒＢ２およびヒトにおけるＭｒｇｐｒＸ２は、肥満細胞における塩基性分泌促進物質受容体である。ＩｇＥ非依存性薬剤誘発性偽アレルギーの重大なメディエータとしての、この受容体の最初に分かったインビボでの役割についての証拠も、本明細書において記述されている。故に、薬剤誘発性偽アレルギーにおけるＭｒｇｐｒＸ２の役割についての知識は、２つの理由で拡大している。第一に、リガンド結合要件検討は、ＭｒｇｐｒＸ２を交差活性化する薬物のための、より特異的なスクリーニングを可能にする。第二に、経口投与される薬物をスクリーニングすることは、経口投与される薬物の一般的な副作用が胃腸の問題および頭痛を包含し、そのいずれも肥満細胞成分を有することから、さらなるＭｒｇｐｒＸ２リガンドを見出す。
【０１６０】
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【０１６１】
他の実施形態
本発明について、その詳細な記述と併せて記述してきたが、前述の記述は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例証することを意図するものであり、限定することを意図するものではない。他の態様、利点および修正は、下記の特許請求の範囲内である。
【０１６２】
本明細書において参照される特許および科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立するものである。本明細書において引用されているすべての米国特許および公開または未公開の米国特許出願は、参照により組み込まれる。本明細書において引用されているすべての公開外国特許および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において引用されている受託番号によって示されるジーンバンクおよびＮＣＢＩ寄託は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において引用されているすべての他の公開された参考文献、文書、原稿および科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６３】
本発明について、その好ましい実施形態を参照して特に示し記述してきたが、添付の特
許請求の範囲によって包括される本発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細に
おける種々の変更がその中で為され得ることが、当業者には理解されるであろう。
本発明の実施形態の一つを以下に示す：
〔１〕  ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体Ｘ２（ＭｒｇｐｒＸ２）またはＭｒｇｐｒＢ２を発現する組換え核酸を含む、単離細胞。
〔２〕  前記組換え核酸が、ＭｒｇｐｒＸ２を発現する、〔１〕に記載の単離細胞。
〔３〕  前記組換え核酸が、ＭｒｇｐｒＢ２を発現する、〔１〕に記載の単離細胞。
〔４〕  ＧＴＰ結合タンパク質アルファ１５（Ｇα１５）を発現する組換え核酸をさらに含む、〔１〕に記載の単離細胞。
〔５〕  ＭｒｇｐｒＸ２を発現する前記組換え核酸が、１つまたは複数の突然変異を含む、〔２〕に記載の単離細胞。
〔６〕  前記１つまたは複数の突然変異が、シグナル伝達経路を活性化させることができないＭｒｇｐｒＸ２タンパク質を産生する、〔２〕に記載の単離細胞。
〔７〕  ＭｒｇｐｒＢ２を発現する前記組換え核酸が、１つまたは複数の突然変異を含む、〔３〕に記載の単離細胞。
〔８〕  前記１つまたは複数の突然変異が、シグナル伝達経路を活性化させることができないＭｒｇｐｒＢ２タンパク質を産生する、〔３〕に記載の単離細胞。
〔９〕  ＧＴＰ結合タンパク質アルファ１５（Ｇα１５）を発現する組換え核酸をさらに含む、〔５〕に記載の単離細胞。
〔１０〕  前記単離細胞が、ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞を含む、〔１〕に記載の単離細胞。
〔１１〕  化合物を投与することによって誘発された、対象における偽アレルギー型反応の重症度を低減させるための方法であって、
前記化合物を対象に投与するステップと、
ＭｒｇｐｒＢ２またはＭｒｇｐｒＸ２アンタゴニストを前記対象に投与し、それにより、前記対象における偽アレルギー型反応の重症度を低減させるステップと
を含む、方法。
〔１２〕  前記アンタゴニストが、抗体およびその断片、結合タンパク質、ポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを含む、〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕  前記アンタゴニストが、小分子を含む、〔１１〕に記載の方法。
〔１４〕  前記アンタゴニストが、核酸分子を含む、〔１１〕に記載の方法。
〔１５〕  前記核酸分子が、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡもしくは短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、またはアンチセンスＲＮＡ、またはそれらの任意の部分を含む、〔１４〕に記載の方法。
〔１６〕  前記アンタゴニストが、前記化合物を前記対象に投与するステップの前に、それと同時に、またはその後に投与される、〔１１〕に記載の方法。
〔１７〕  前記アンタゴニストが、局所的に、経口的に、吸入を介して、または注射を介して投与される、〔１１〕に記載の方法。
〔１８〕  対象における偽アレルギー型反応を治療する方法であって、ＭｒｇｐｒＢ２またはＭｒｇｐｒＸ２アンタゴニストを前記対象に投与し、それにより、前記対象における前記偽アレルギー型反応を治療するステップを含む、方法。
〔１９〕  化合物が偽アレルギー型反応を誘発するか否かを決定するための方法であって、
〔１〕に記載の単離細胞を、候補化合物と接触させるステップと、
ＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２の活性化を検出するステップであって、ＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２の活性化は、前記候補化合物が偽アレルギー型反応を誘発することを決定するステップと
を含む、方法。
〔２０〕  ＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２の活性化が、細胞内カルシウムの増大を同定することによって検出される、〔１９〕に記載の方法。
〔２１〕  前記候補化合物が、ロイプロリド、ゴセレリン、ヒストレリン、トリプトレリン、セトロレリクス、ガニレリクス、デガレリクス、オクトレオチド、ランレオチド、パシレオチド、セルモレリン、テサモレリン、イカチバント、酢酸グラチラマー、テリパラチド、プラムリンチド、ブレオマイシン、エクセナチド、グルカゴン、リラグルチド、エンフビルチドおよびコリスチメタートからなる群から選択される、〔１９〕に記載の方法。
〔２２〕  前記候補化合物が、スクシニルコリン、ツボクラリン、アトラクリウム、ミバクリウムおよびロクロニウムからなる群から選択される、〔１９〕に記載の方法。
〔２３〕  ＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２のアンタゴニストを同定するための方法であって、
〔１〕に記載の単離細胞を、偽アレルギー型反応を誘発する化合物と接触させるステップと、
〔１〕に記載単離細胞を、候補アンタゴニストと接触させるステップと、
ＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２の活性化を検出するステップであって、前記化合物の非存在下におけるＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２の活性化と比べたＭｒｇｐｒＸ２またはＭｒｇｐｒＢ２の活性化の減少は、前記候補化合物がアンタゴニストであることを決定するステップと
を含む、方法。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2020141708.tif 000024
【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３Ａ−１】
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【図１３Ａ−２】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４Ａ−１】
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【図１４Ａ−２】
2020141708.tif 000044
【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年7月8日(2020.7.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量のｍａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体Ｂ２（ＭｒｇｐｒＢ２）アンタゴニストまたはｍａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体Ｘ２（ＭｒｇｐｒＸ２）アンタゴニストを含有し、化合物を投与することによって誘発された、対象における偽アレルギー型反応の重症度を低減させるための医薬組成物であって、
前記医薬組成物が、前記化合物を前記対象に投与する前に、それと同時に、またはその後に投与されることを特徴とし、
前記ＭｒｇｐｒＢ２が配列番号３のアミノ酸配列を含み、前記ＭｒｇｐｒＸ２が配列番号１のアミノ酸配列を含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記医薬組成物が、治療有効量のＭｒｇｐｒＢ２アンタゴニストを含有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記医薬組成物が、治療有効量のＭｒｇｐｒＸ２アンタゴニストを含有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記アンタゴニストが、抗体またはその断片、小分子または核酸分子である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記アンタゴニストが、抗体またはその断片である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記アンタゴニストが、小分子である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記アンタゴニストが、核酸分子である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記アンタゴニストが、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡもしくは短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、またはアンチセンスＲＮＡである核酸分子である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
治療有効量のｍａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体Ｂ２（ＭｒｇｐｒＢ２）アンタゴニストまたはｍａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体Ｘ２（ＭｒｇｐｒＸ２）アンタゴニストを含有する、対象における偽アレルギー型反応を治療するための医薬組成物であって、
前記ＭｒｇｐｒＢ２が配列番号３のアミノ酸配列を含み、前記ＭｒｇｐｒＸ２が配列番号１のアミノ酸配列を含む、医薬組成物。
【請求項１０】
前記医薬組成物が、治療有効量のＭｒｇｐｒＢ２アンタゴニストを含有する、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記医薬組成物が、治療有効量のＭｒｇｐｒＸ２アンタゴニストを含有する、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記アンタゴニストが、抗体又はその断片、小分子又は核酸分子である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記アンタゴニストが、抗体又はその断片である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記アンタゴニストが、小分子である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記アンタゴニストが、核酸分子である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記アンタゴニストが、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡもしくは短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、またはアンチセンスＲＮＡである核酸分子である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。