(57)【要約】      （修正有）【課題】アクチビンＡ及び／又はＶＰＡを含む、ＮＫＴ細胞培養のための添加剤の提供。【解決手段】アクチビンＡ及び／又はＶＰＡを含む、ＮＫＴ細胞培養のための添加剤。ＮＫＴ細胞が、末梢血から分離されるか、幹細胞又は前駆細胞から分化誘導されたＮＫＴ細胞である。アクチビンＡ及び／又はＶＰＡを添加した培地で培養する工程を含む、ＮＫＴ細胞の培養方法。培地におけるアクチビンＡの濃度が、５〜１００ｎｇ／ｍｌであり、培地におけるＶＰＡの濃度が、３．９〜２５０μＭである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクチビンＡ及び／又はＶＰＡを含む、ＮＫＴ細胞培養のための添加剤。
【請求項２】
ＮＫＴ細胞が、末梢血から分離されるか、幹細胞又は前駆細胞から分化誘導されたＮＫＴ細胞である、請求項１記載の添加剤。
【請求項３】
アクチビンＡ及び／又はＶＰＡを添加した培地で培養する工程を含む、ＮＫＴ細胞の培養方法。
【請求項４】
ＮＫＴ細胞が、末梢血から分離されるか、幹細胞又は前駆細胞から分化誘導されたＮＫＴ細胞である、請求項３記載の培養方法。
【請求項５】
培地におけるアクチビンＡの濃度が、５〜１００ｎｇ／ｍｌである、請求項４記載の培養方法。
【請求項６】
培地におけるＶＰＡの濃度が、３．９〜２５０μＭである、請求項４記載の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アクチビンＡ及び／又はＶＰＡを含む、ＮＫＴ細胞培養のための添加剤、及びＮＫＴ細胞の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）細胞は、ヒト末梢血Ｔ細胞のうち０．０１〜０．１％しか存在せず、採取・培養が極めて困難な細胞である。
【０００３】
アクチビンＡをＴ細胞の培養のために添加することは知られている（非特許文献１及び２）。アクチビンＡを脂肪前駆細胞や心筋線維芽細胞といった間葉系細胞の培養のために添加することは知られている（非特許文献３及び４）。ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞から血球系前駆細胞を分化誘導するためにアクチビンＡを添加することは知られている（非特許文献５および６）。その他、ＥＳ細胞から内胚葉系へ分化誘導する際に使用することや（非特許文献７）、ＥＳ細胞を維持培養する際に使用することが知られている（非特許文献８）。
【０００４】
バルプロ酸ナトリウム（ＶＰＡ）については、一般的には、抗てんかん薬として知られる。また、最近ｉＰＳ細胞樹立効率の向上のために使用できることが報告されている（非特許文献９）。
【０００５】
よって、アクチビンＡについても、ＶＰＡについても、ＮＫＴ細胞の機能修飾のために細胞培養培地へ添加することは知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Huber et al., The Journal of Immunology, 182: 4633-4640, 2009
【非特許文献２】Locci et al., Nature Immunology, 17: 976-986, 2016
【非特許文献３】Zagarosi et al., Diabetes, 59: 2513-2521, 2010
【非特許文献４】Hu et al., European Journal of Pharmacology, 789: 319-327, 2016
【非特許文献５】Kennedy et al., Cell Reports, 2: 1722-1735, 2012
【非特許文献６】Cerdan et al., Stem Cells and development, 21: 2866-2877, 2012
【非特許文献７】Wang et al., Biotechnol Lett, 37: 1711-1717, 2015
【非特許文献８】Beattie et al., Stem Cell, 23: 489-195, 2005
【非特許文献９】Huangfu et al., Nature Biotechnology, 26: 1269-1275, 2008
【非特許文献１０】Fujii et al., Front Immunol, 4: 409, 2013
【非特許文献１１】Yamada et al., Stem cell, 34: 2852-2860, 2016
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、従来、培養が困難であると認識されていた、ＮＫＴ細胞を培養するための方法であって、好ましくは長期間、増殖させることができ、活性を維持又は増強することができる方法を探索することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは鋭意研究の末、アクチビンＡ及び／又はＶＰＡを、ＮＫＴ細胞培養のための添加剤として使用することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明の要旨は、以下である。
［１］アクチビンＡ及び／又はＶＰＡを含む、ＮＫＴ細胞培養のための添加剤。
［２］ＮＫＴ細胞が、末梢血から分離されるか、幹細胞又は前駆細胞から分化誘導されたＮＫＴ細胞である、上記［１］記載の添加剤。
［３］アクチビンＡ及び／又はＶＰＡを添加した培地で培養する工程を含む、ＮＫＴ細胞の培養方法。
［４］ＮＫＴ細胞が、末梢血から分離されるか、幹細胞又は前駆細胞から分化誘導されたＮＫＴ細胞である、上記［３］記載の培養方法。
［５］培地におけるアクチビンＡの濃度が、５〜１００ｎｇ／ｍｌである、上記［４］記載の培養方法。
［６］培地におけるＶＰＡの濃度が、３．９〜２５０μＭである、上記［４］記載の培養方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、従来には知られていなかった、アクチビンＡ及び／又はＶＰＡの新たな用途が提供される。本発明による培養添加剤は、ＮＫＴ細胞を、長期間、生存させることができ、また増殖させ、活性を維持又は増強させるという、優れた効果を有する。特に、ＶＰＡはＮＫＴ細胞のインターフェロンγ（ＩＦＮγ）産生も増強することから、本発明により培養されたＮＫＴ細胞を投与されたガン患者の生存期間を延長することが期待できる（非特許文献１０）。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ｉＰＳ細胞の樹立から、ｉＰＳ−ＮＫＴ細胞の純化培養までのスキームの一実施態様を示す。
【図２】図２は、本発明の一実施態様であるＮＫＴ細胞の培養方法により得られた、細胞数の変化の結果を示す図である。
【図３】図３は、本発明の一実施態様であるＮＫＴ細胞の培養方法により得られた、細胞数の変化とＩＦＮγの産生能の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、アクチビンＡ及び／又はＶＰＡを含む、ＮＫＴ細胞培養のための添加剤、及びＮＫＴ細胞の培養方法を提供する。
【００１３】
本発明におけるアクチビンＡとは、ＴＧＦ−βファミリーに分類されるサイトカインであって、１１６〜１１７のアミノ酸鎖が２本結合したホモダイマーをいう。
【００１４】
本発明におけるＶＰＡとは、バルプロ酸ナトリウムをいうが、遊離体及びその他の塩であってもよい。
【００１５】
本発明におけるＮＫＴ細胞とは、ナチュラルキラーＴ細胞をいい、特には末梢血から分離されるか、幹細胞又は前駆細胞から分化誘導されたＮＫＴ細胞をいう。幹細胞から分化誘導されたＮＫＴ細胞としては、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞から分化誘導されたＮＫＴ細胞が挙げられる。
【００１６】
本発明は、アクチビンＡ及び／又はＶＰＡを添加した培地で培養する工程を含む、ＮＫＴ細胞の培養方法を提供する。
【００１７】
典型的には、ｉＰＳ−ＮＫＴ細胞は、ｉＰＳ細胞から造血幹細胞へ１次誘導させたのち、ｉＰＳ−ＮＫＴ細胞へ２次誘導させ、そののちｉＰＳ−ＮＫＴ細胞を純化培養することにより、得られる。
【００１８】
アクチビンＡを培地に添加する濃度は、５ｎｇ〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ〜５０ｎｇ／ｍｌであればよい。
【００１９】
ＶＰＡを培地に添加する濃度は、３．９〜２５０μＭ、好ましくは１５．６〜２５０μＭであればよい。
【００２０】
本発明によるＮＫＴ細胞の培養方法では、アクチビンＡはｉＰＳ−ＮＫＴ細胞の純化培養の初日〜純化培養終了まで培地に継続的に存在すればよい。
【００２１】
本発明によるＮＫＴ細胞の培養方法では、アクチビンＡをｉＰＳ−ＮＫＴ細胞への２次誘導の培養初日〜純化培養終了まで継続的に培地に存在させてもよい。
【００２２】
本発明によるＮＫＴ細胞の培養方法では、ＶＰＡをｉＰＳ−ＮＫＴ細胞の純化培養の初日〜純化培養終了まで、好ましくは純化培養の７日目〜純化培養終了まで培地に存在させればよい。
【００２３】
本発明によるＮＫＴ細胞の培養方法では、ＶＰＡをｉＰＳ−ＮＫＴ細胞への２次誘導の培養初日〜純化培養終了まで培地に存在させてもよい。
【００２４】
本発明によるＮＫＴ細胞の培養方法では、アクチビンＡ又はＶＰＡを単独で添加してもよく、両者を同時に添加してもよく、アクチビンＡを先に添加したのちにＶＰＡを添加してもよく、またＶＰＡを添加したのちにアクチビンＡを添加してもよい。ＶＰＡはＩＦＮγの産生を増強することから、アクチビンＡを先に添加したのちにＶＰＡを添加することが、好ましい。
【００２５】
本発明によれば、ＶＰＡでＮＫＴ細胞を前処理又は培養することにより、ＮＫＴ細胞を活性化することを必要とする患者、例えばガン患者の体内においてＮＫＴ細胞を活性化できる。
【実施例】
【００２６】
実施例１  ｉＰＳ−ＮＫＴ細胞の樹立
ｉＰＳ−ＮＫＴ細胞は文献（非特許文献１１：Yamada et al., Stem cell, 34: 2852-2860, 2016）に記載される方法により樹立した。ｉＰＳ細胞の樹立からｉＰＳ−ＮＫＴ細胞の純化培養までのスキームを、図１に示す。
具体的には、図１に示されるように、ｉＰＳ細胞にコロニーを形成させ（−８〜−５日目）、造血幹細胞への１次誘導をし（０〜１３日目）、ｉＰＳ−ＮＫＴ細胞への２次誘導をし（１３〜３３日目）、そしてｉＰＳ−ＮＫＴ細胞の純化培養をした（３３〜４０又は５４日目）。
【００２７】
（基本培地の組成）
１２ウェルの培養プレートを用い、初期播種量２．５×１０５／１ｍｌ／ウェルで培養開始（０日目）した。培養開始から３日目および５日目に培地０．５ｍｌを追加し、７日目および１０日目に１ｍｌを追加した。１２日目からは培地１ｍｌを２日ごとに交換し、２１日目まで培養を継続した。２０％ウシ血清添加αＭＥＭにヒトＩＬ７ (最終５ｎｇ／ｍｌ) およびＩＬ１５(最終１０ｎｇ／ｍｌ) を添加したものを基本培地とした。
【００２８】
実施例２  様々な濃度のアクチビンＡを添加した培養液におけるｉＰＳ−ＮＫＴ細胞の純化培養（１〜１００ｎｇ／ｍｌ）
実施例１で調製した基本培地に対して、１〜１００ｎｇのアクチビンＡを添加し、実施例１で調製したｉＰＳ−ＮＫＴ細胞を純化培養した。
アクチビンＡは、純化培養の初日（造血幹細胞の誘導から３３日目）に加え、その後２週間（造血幹細胞の誘導から５４日目まで）培養し（３７℃・５％炭酸ガス）、細胞数の変化を経時的に記録した。結果を、図２に示す。
結果から、アクチビンＡの添加により、純化培養の初日から２週間を超えるまで、ｉＰＳ−ＮＫＴ細胞の数は増大し続けることが確認された。
また、アクチビンＡの添加量が、培養液に対して５ｎｇ／ｍｌ以上である場合に、特には１０ｎｇ〜５０ｎｇ／ｍｌである場合に、細胞増殖の効果は、格別に優れていることが確認された。
本実施例で増殖したｉＰＳ−ＮＫＴ細胞は、その標的細胞傷害活性を維持していた。
【００２９】
実施例３  様々な濃度のＶＰＡを添加した培養液におけるｉＰＳ−ＮＫＴ細胞の純化培養（３．９〜１０００μＭ）
実施例１で調整した基本培地に対して、３．９〜１０００μＭのＶＰＡを添加し、実施例１で調製したｉＰＳ−ＮＫＴ細胞を純化培養した。
ＶＰＡは、純化培養の初日（造血幹細胞の誘導から３３日目）に加え、その後１週間（造血幹細胞の誘導から４０日目まで）培養し（３７℃・５％炭酸ガス）、細胞数の変化とＩＦＮγの産生能を記録した。結果を、図３に示す。
結果から、ＶＰＡの添加により、純化培養の初日から１週間を超えるまで、ｉＰＳ−ＮＫＴ細胞の数を増大させることが確認された。また、比較的高濃度のＶＰＡの添加により、ＩＦＮγの産生能が上昇することが確認された。
ＶＰＡの添加量が、培養液に対して３．９μＭ〜２５０μＭである場合に、細胞増殖の効果は格別に優れていることが確認され、培養液に対して１５．６μＭ〜２５０μＭである場合に、ＩＦＮγの産生能が格別に優れていることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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