(57)【要約】【課題】凍結保存された多能性幹細胞を製造する方法、及び前記方法により得られる凍結保存された多能性幹細胞を提供すること。【解決手段】以下の工程を含む、凍結保存された多能性幹細胞を製造する方法。（1）多能性幹細胞を準備する工程、（2）工程（1）で準備された多能性幹細胞を培養器材中で培養し、前記多能性幹細胞のコロニーを形成させる工程、（3）前記形成したコロニーを有する前記培養器材において、以下の特徴量（A）：（A）コロニー被覆率、並びに、以下の特徴量（B）〜（D）：（B）コロニー平均面積、（C）コロニー面積のバラつき、及び（D）コロニー平均長径、から選択される少なくとも1つを決定する工程、（4）前記決定した特徴量と、予め設定された規格値とを比較して、前記規格値を満たす培養器材を選択する工程、並びに（5）前記選択した培養器材中の細胞を凍結保存する工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、凍結保存された多能性幹細胞を製造する方法。
（1）多能性幹細胞を準備する工程、
（2）工程（1）で準備された多能性幹細胞を培養器材中で培養し、前記多能性幹細胞のコロニーを形成させる工程、
（3）前記形成したコロニーを有する前記培養器材において、以下の特徴量（A）：
（A）コロニー被覆率、並びに
以下の特徴量（B）〜（D）：
（B）コロニー平均面積、
（C）コロニー面積のバラつき、及び
（D）コロニー平均長径、
から選択される少なくとも1つを決定する工程、
（4）前記決定した特徴量と、予め設定された規格値とを比較して、前記規格値を満たす培養器材を選択する工程、並びに
（5）前記選択した培養器材中の細胞を凍結保存する工程
【請求項２】
前記凍結保存された多能性幹細胞が7週間以上培養可能な細胞である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（1）の前に、多能性幹細胞を樹立する工程を含む、請求項1〜3の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（1）の前に、凍結保存された多能性幹細胞を解凍する工程を含む、請求項1〜3の何れか一項に記載に記載の方法。
【請求項６】
前記予め設定された規格値が、以下：
（A）コロニー被覆率：7％超、
（B）コロニー平均面積：141,933μm2未満
（C）コロニー面積のバラつき：130,257未満
（D）コロニー平均長径：483μm未満
である、請求項1〜5の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項1〜6の何れか一項に記載の方法により得られた、凍結保存された多能性幹細胞。
【請求項８】
以下の特徴（A）及び（B）〜（D）から選択される少なくとも1つを有する、凍結保存された多能性幹細胞。
（A）前記細胞が形成するコロニー被覆率：7％超
（B）前記細胞が形成するコロニー平均面積：141,933μm2未満
（C）前記細胞が形成するコロニー面積のバラつき：130,257未満
（D）前記細胞が形成するコロニー平均長径：483μm未満
【請求項９】
前記凍結保存された多能性幹細胞が7週間以上培養可能な細胞である、請求項7又は8に記載の細胞。
【請求項１０】
前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項7〜9の何れか一項に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凍結保存された多能性幹細胞を製造する方法、前記方法により得られる凍結保存された多能性幹細胞、特定の特徴を有する凍結保存された多能性幹ストック細胞等に関する。
【背景技術】
【０００２】
2014年に、加齢黄斑変性に対する自己iPS細胞由来網膜色素上皮シート移植が行われ、これを皮切りにiPS細胞を用いた再生医療の実用化が進んでいる。同時に、再生医療に用いられるiPS細胞等培養細胞の効率的かつ安定した品質管理法が求められており、その方法の一つとして「画像解析技術」が注目されている。これまでは、培養細胞の品質管理には遺伝子マーカーを用いたDNAやRNA、タンパク質の定量法が主に用いられてきたが（非特許文献1）、作業効率や侵襲性などの観点から課題があった。一方、非侵襲評価としては、培養エキスパートによる目視観察が行われているが、検査者内・間でのバラつきが大きく、安定した管理法とは言い難い。従って、効率性や安定性、コストの面からもメリットがあり、かつ非侵襲的に実施可能な画像解析による細胞品質評価は、今後ますます有用になると考えられている。
【０００３】
本発明者らは、これまでに、安定した凍結された細胞を含むストック（以下、「凍結細胞ストック」ともいう）の確立法として、培養での検討及び顕微鏡画像上のスケールバーを用いた定性的評価により、細胞の対数増殖期の変曲点前（培養日数≦7日、コロニー長径≦1250μm）に凍結細胞ストックを作製することで、起眠後も安定して人工多能性幹細胞を培養可能であることを見出してきた。前記方法により、凍結細胞ストックを作製するのに最適な細胞播種数と培養日数を規定することが可能になった。
【０００４】
しかしながら、これらの指標は同じ細胞株でも継代数や細胞の状態に左右されやすく、依然として不安定な指標である。さらに、より詳しく細胞の状態を見るために、対数増殖期初期であることを、細胞を培養ディッシュから剥がして確認することもできるが、作業効率や侵襲性などの観点から課題が残る。また、目視観察でのコロニーサイズの確認は、いくつか選択したコロニーのサイズをスケールバーで計測するため、非効率的かつ作業者間でのバラつきが避けられない。また、これまでに人工多能性幹細胞の培養工程における画像評価による細胞品質管理技術が報告されているものの（非特許文献2及び3並びに特許文献1及び2）、これら解析法には機械学習が用いられているため、指標はブラックボックス化されている点等から、前記解析法を使用可能な状態にするまでに、多大な試行錯誤やそのための時間を要し、およそ現実的ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第2018/101004号
【特許文献２】国際公開第2011/010449号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】PLoS ONE. 2010 Mar 8;5(3):e9580
【非特許文献２】J Biosci Bioeng. 2017 May;123(5):642-650
【非特許文献３】Sci Rep. 2014 Nov 11;4:6996
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、凍結保存された多能性幹細胞を製造する方法、前記方法により得られる凍結保存された多能性幹細胞（以下、「本発明の凍結ストック細胞」ともいう）、特定の特徴を有する凍結保存された多能性幹細胞（以下、「本発明の特定の特徴を有する凍結ストック細胞」ともいう）等を提供することにある。
【課題を解決しようとする手段】
【０００８】
本発明者らは、凍結保存された多能性幹細胞の製造方法に求める特徴として、該凍結保存された多能性幹細胞（及び該多能性幹細胞を含む凍結細胞ストック）が「高品質」であること、即ち、起眠後の生細胞数が継代に十分なほど多く、かつ「安定性」があること、即ち、該凍結保存された多能性幹細胞を含む凍結細胞ストックの本数が一度に十分量得られることの2点を重要とした。前記特徴を満たし得る凍結保存された多能性幹細胞の製造方法を確立するために、形態情報として明確な指標探索が可能な、機械学習を用いない画像解析手法により、非侵襲的に複数の特徴量（解析パラメータ）を抽出し、その評価を行った。鋭意検討を重ねた結果、「コロニー被覆率」、「コロニー平均面積」、「コロニー面積のバラつき（標準偏差（SD））」、及び「コロニー平均長径」の4つの指標が、多能性幹細胞の状態に左右され難い指標であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は以下に関する。
［1］以下の工程を含む、凍結保存された多能性幹細胞を製造する方法。
（1）多能性幹細胞を準備する工程、
（2）工程（1）で準備された多能性幹細胞を培養器材中で培養し、前記多能性幹細胞のコロニーを形成させる工程、
（3）前記形成したコロニーを有する前記培養器材において、以下の特徴量（A）：
（A）コロニー被覆率、並びに
以下の特徴量（B）〜（D）：
（B）コロニー平均面積、
（C）コロニー面積のバラつき、及び
（D）コロニー平均長径、
から選択される少なくとも1つを決定する工程、
（4）前記決定した特徴量と、予め設定された規格値とを比較して、前記規格値を満たす培養器材を選択する工程、並びに
（5）前記選択した培養器材中の細胞を凍結保存する工程
［2］前記凍結保存された多能性幹細胞が7週間以上培養可能な細胞である、［1］に記載の方法。
［3］前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、［1］又は［2］に記載の方法。
［4］前記工程（1）の前に、多能性幹細胞を樹立する工程を含む、［1］〜［3］の何れか一つに記載の方法。
［5］前記工程（1）の前に、凍結保存された多能性幹細胞を解凍する工程を含む、［1］〜［4］の何れか一つに記載に記載の方法。
［6］前記予め設定された規格値が、以下：
（A）コロニー被覆率：7％超、
（B）コロニー平均面積：141,933μm2未満
（C）コロニー面積のバラつき：130,257未満
（D）コロニー平均長径：483μm未満
である、［1］〜［5］の何れか一つに記載の方法。
［7］［1］〜［6］の何れか一つに記載の方法により得られた、凍結保存された多能性幹細胞。
［8］以下の特徴（A）及び（B）〜（D）から選択される少なくとも１つを有する、凍結保存された多能性幹細胞。
（A）前記細胞が形成するコロニー被覆率：7％超
（B）前記細胞が形成するコロニー平均面積：141,933μm2未満
（C）前記細胞が形成するコロニー面積のバラつき：130,257未満
（D）前記細胞が形成するコロニー平均長径：483μm未満
［9］前記凍結保存された多能性幹細胞が7週間以上培養可能な細胞である、［7］又は［8］に記載の細胞。
［10］前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、［7］〜［9］の何れか一つに記載の細胞。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、凍結保存された多能性幹細胞を製造する方法、前記方法により得られる凍結保存された多能性幹細胞、特定の特徴を有する凍結保存された多能性幹細胞等を提供することができる。本発明の方法により製造される凍結保存された多能性幹細胞は、「高品質」（即ち、起眠後の生細胞数が継代に十分なほど多い）であり、そして本発明の方法により「高品質」な凍結保存された多能性幹細胞を、「安定性」（即ち、該凍結保存された多能性幹細胞を含む凍結細胞ストックの本数が一度に十分量得られる）を確保して製造することが可能となる。また、本発明により得られる凍結保存された多能性幹細胞は、長期間（7週間以上）培養することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図1は、201B7株における抽出した各特徴量の結果と培養評価結果から、それぞれ2変量の相関を求めた図である。
【図２】図2は、1210B2株における抽出した各特徴量の結果と培養評価結果から、それぞれ2変量の相関を求めた図である。
【図３】図3は、201B7株において、起眠後生細胞数が0.3×106 cells以上、細胞ストック作製本数が12本以上得られたものを合格サンプル、下回るものを逸脱サンプルと定義し、各特徴量について、ROC-AUC分析により統計学的に至適なしきい値を算出した結果を示す図である。
【図４】図4は、1210B2株において、起眠後生細胞数が0.3×106 cells以上、細胞ストック作製本数が12本以上得られたものを合格サンプル、下回るものを逸脱サンプルと定義し、各特徴量について、ROC-AUC分析により統計学的に至適なしきい値を算出した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
1．凍結保存された多能性幹細胞の製造方法
本発明は、凍結保存された多能性幹細胞を製造する方法（以下「本発明の製法」と略記する）を提供する。本発明の製法は、（1）多能性幹細胞を準備する工程、（2）工程（1）で準備された多能性幹細胞を培養器材中で培養し、前記多能性幹細胞のコロニーを形成させる工程、（3）前記形成したコロニーを有する前記培養器材において、特定の特徴量を決定する工程、（4）前記決定した特徴量と、予め設定された規格値とを比較して、前記規格値を満たす培養器材を選択する工程、及び（5）前記選択した培養器材中の細胞を凍結保存する工程を含む。本発明の製法により、「高品質」であり（即ち、起眠後の生細胞数が継代に十分なほど多い）、かつ「安定性」の高い（即ち、凍結細胞ストックの本数が一度に十分量得られる）、凍結保存された多能性幹細胞が得られる。
【００１３】
本明細書において、「多能性幹細胞（pluripotent stem cell）」とは、胚性幹細胞（ES細胞）及びこれと同様の分化多能性、即ち、生体の様々な組織（内胚葉、中胚葉、外胚葉の全て）に分化する能力を潜在的に有する細胞を指す。本発明で用いる多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（embryonic stem cell：ES細胞）、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell：iPS細胞）、胚性腫瘍細胞（EC細胞）、胚性生殖幹細胞（EG細胞）などが挙げられ、好ましくはES細胞又はiPS細胞であり、中でもiPS細胞が好ましい。上記多能性幹細胞がES細胞又はヒト胚に由来する任意の細胞である場合、その細胞は胚を破壊して作製された細胞であっても、胚を破壊することなく作製された細胞であってもよいが、好ましくは、胚を破壊することなく作製された細胞である。
【００１４】
本発明において、「ES細胞」とは、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性幹細胞を意味する。ES細胞は、マウスで1981年に発見され（M.J. Evans and M.H. Kaufman（1981）, Nature 292:154-156）、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもES細胞株が樹立された（J.A. Thomson et al.（1998）, Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al.（1995）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848; J.A. Thomson et al.（1996）, Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall（1998）, Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165）。
【００１５】
本発明において、「人工多能性幹細胞」とは、体細胞から誘導された多能性幹細胞であり、体細胞を初期化することにより、胚性幹細胞に似た多能性を人工的に持たせた細胞を意味する。例えば、線維芽細胞等の分化した細胞をOct3/4、Sox2、Klf4、Myc等の遺伝子の発現により初期化して樹立した多分化能を有するiPS細胞（induced pluripotent stem cell）等を挙げることができる。2006年、山中らによりマウス線維芽細胞から人工多能性幹細胞が樹立された（Cell, 2006, 126(4), p663-676）。2007年にはヒト線維芽細胞から、胚性幹細胞と同様に多分化能を有する人工多能性幹細胞が樹立された（Cell, 2007, 131(5),p861-872; Science, 2007, 318(5858), p1917-1920; Nat Biotechnol., 2008, 26(1), p101-106）。
【００１６】
多能性幹細胞としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類由来の細胞、及びヒト、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類由来の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくはヒト由来の細胞である。
【００１７】
前記工程（1）で準備される多能性幹細胞は、あらかじめ樹立され、ストックされた細胞でもよく、又は新たに樹立された細胞でもよい。従って、本発明の製法は、前記（1）工程の前に、さらに下記工程を含むこともできる：
（i）多能性幹細胞を樹立する工程、又は（ii）凍結保存された多能性幹細胞を解凍する工程。
【００１８】
前記工程(i)の多能性幹細胞を樹立する工程は、多能性幹細胞が人工多能性幹細胞の場合には、体細胞に特定の初期化因子を導入する工程を含む限り特に限定されない。例えば、体細胞を採取し、Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc等の初期化因子を導入して人工的に発現させた後、多能性を獲得した細胞を選択して拡大培養する工程、レトロウイルスベクター又はセンダイウイルスベクターを用いて初期化因子（Oct3/4、Sox2、Klf4、及びc-Myc）をヒト末梢血リンパ球に導入し培養する工程（Nishimura, T. et al. Cell Stem Cell 2013, 12, 114-126）等を挙げることができる。
【００１９】
本発明に用いる人工多能性幹細胞の由来となる体細胞は特に限定されない。体細胞としては、例えば、末梢血中のリンパ球、皮膚等の線維芽細胞、皮膚細胞、視覚細胞、脳細胞、有毛細胞、口腔粘膜、肺細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞、腎細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、智歯などに由来する間葉系幹細胞、組織幹細胞、組織前駆細胞、血液細胞（例、末梢血単核球細胞（T細胞及び非T細胞を含む）、臍帯血細胞等）、上皮細胞、内皮細胞（例、血管内皮細胞）、筋肉細胞等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２０】
初期化因子に含まれる遺伝子としては、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、Judson R.L. et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-229に記載の組み合わせが例示される。
【００２１】
初期化因子を体細胞に導入する方法としては、初期化因子がDNAの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体等のベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクション等の手法等、RNAの形態の場合、例えば、リポフェクション、マイクロインジェクション等の手法等、タンパク質の形態の場合、例えば、リポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、HIV由来のTAT及びポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法等を挙げることができる。ウイルスベクターを用いた方法としては、レトロウイルスベクターを用いた方法、エピソーマルベクターを用いた方法、iDファーマ社の初期化キット「CytoTune（登録商標）-iPS 2.0」に代表されるようなセンダイウイルスベクターを用いた方法、レンチウイルスベクターを用いた方法、アデノウイルスベクターを用いた方法等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができる。さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質（GFP）、β-グルクロニダーゼ（GUS）、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記発現ベクターには、体細胞への導入後、核初期化物質をコードする遺伝子若しくはプロモーターとそれに結合する核初期化物質をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にloxP配列を有してもよい。さらに、上記発現ベクターは、エピソーマルに存在するように（即ち、染色体への取り込みがされなくとも複製されるように）、EBNA-1遺伝子及びoriP配列若しくはLarge T antigen遺伝子及びSV40ori配列を含むこともできる。
【００２２】
多能性幹細胞がES細胞の場合には、前記工程(i)の多能性幹細胞を樹立する工程は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することにより行うことができる。ヒト及びサルのES細胞の樹立と維持の方法については、例えば、USP5,843,780; Thomson JA, et al.（1995）, Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 92:7844-7848；Thomson JA, et al.（1998）, Science. 282:1145-1147； Suemori H. et al.（2006）, Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932； Ueno M. et al.（2006）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559； Suemori H. et al.（2001）, Dev. Dyn., 222:273-279; Kawasaki H. et al.（2002）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585； Klimanskaya I. et al.（2006）, Nature. 444:481-485などに記載されている。或いは、ES細胞は、胚盤胞期以前の卵割期の胚の単一割球のみを用いて樹立することもできるし（Chung Y. et al. (2008), Cell Stem Cell 2: 113-117）、発生停止した胚を用いて樹立することもできる（Zhang X. et al. (2006), Stem Cells 24: 2669-2676.）。
【００２３】
前記工程(ii)の凍結保存された多能性幹細胞を解凍する工程は、公知の任意の細胞解凍手法により行うことができ、例えば、凍結保存された細胞を、ウォーターバス、インキュベーター、恒温器などを用いて、凍結温度より高い温度の固形、液状若しくはガス状の媒体（例：水、培養液）と接触させることにより達成されるが、これに限定されない。媒体の温度は、典型的には4〜50℃、好ましくは30〜40℃、より好ましくは36〜38℃である。また、解凍時間は、典型的には2分以内であり、特に20秒以内とすることで生存率の低下を大幅に抑制することができる。解凍時間は、例えば、解凍手段または浸漬媒体の温度、凍結時の培養液または凍結保存液の容量若しくは組成などを変化させて調節することができる。
【００２４】
本発明の製法は、上記工程(ii)の後に、細胞を洗浄する工程を含んでいてもよい。細胞の洗浄は、公知の任意の手法により行うことができ、例えば、細胞を細胞洗浄液（例：血清や血清成分（血清アルブミンなど）を含んでもよい培養液または生理緩衝液等）に懸濁し、遠心分離し、上清を廃棄し、沈殿した細胞を回収することにより達成されるが、これに限定されない。細胞を洗浄する工程において、かかる懸濁、遠心分離、回収のサイクルを1回または複数回（例：2、3、4、5回又はそれ以上）行ってもよい。本発明の一態様において、細胞を洗浄する工程は、凍結保存された細胞を解凍する工程の直後に行われる。本発明において用いることができる市販の細胞洗浄液の例としては、セルローション（日本全薬工業株式会社）が挙げられる。
【００２５】
前記工程（2）の（1）で準備された多能性幹細胞を培養器材中で培養し、前記多能性幹細胞のコロニーを形成させる工程において、前記培養器材は、後述する特徴量の抽出に必要な画像が撮影できる限り、特に限定されないが、多能性幹細胞の培養に一般的に用いられるシャーレ、フラスコ、プラスチックバック、テフロン（登録商標）バック、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、細胞培養フラスコ、スピナーフラスコ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等が挙げられる。これらの培養器材の材質は特に制限されないが、例えば、ガラス、ポリ塩化ビニル、エチルセルロースやアセチルセルロース等のセルロース系ポリマー、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブタジエン、ポリ（エチレン−ビニルアセテート）コポリマー、ポリ（ブタジエン−スチレン）コポリマー、ポリ（ブタジエン−アクリロニトリル）コポリマー、ポリ（エチレン−エチルアクリレート）コポリマー、ポリ（エチレン−メタアクリレート）コポリマー、ポリクロロプレン、スチロール樹脂、クロロスルフォン化ポリエチレン、エチレン酢酸ビニル、アクリル系ブロックコポリマー等のプラスチック等が挙げられる。
【００２６】
前記培養は、未分化状態を維持した状態で多能性幹細胞を生存又は増殖させることができる限り特に限定されず、例えば、種々の因子を添加した培地中で細胞を培養することを挙げることができる。また、フィーダー細胞を用いた方法でもよく、フィーダー細胞を用いない方法（フィーダーフリー培養法）でもよい。フィーダーフリー培養法としては、例えば、マトリゲル（BD）、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、ゼラチン、ラミニン（例：Laminin511 E8（(株)ニッピ））、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、又はエンタクチン、及びこれらの組み合わせ（「マトリゲル等」ともいう）を用いて、多能性幹細胞をコーティング処理された培養用ディッシュへ接着させ、動物細胞の培養に用いられる培地を基本培地として、細胞を培養する方法が挙げられる。
【００２７】
基本培地としては、例えば、StemFit（例：StemFit AK03N、StemFit AK02N）（味の素社）、PECM（Primate ES Cell Medium）、GMEM（グラスゴー最小必須培地：Glasgow Minimum Essential Medium）、IMDM（イスコフ改変ダルベッコ培地：Iscove's Modified Dulbecco's Medium）、199培地、イーグル最小必須培地（Eagle’s Minimum Essential Medium）（EMEM）、αMEM、ダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco’s modified Eagle’s Medium）（DMEM）、Ham’s F12培地、RPMI 1640培地、フィッシャー培地（Fischer’s medium）、及びこれらの混合培地などが包含される。
【００２８】
基本培地には、ROCK阻害剤（例：Y-27632、Fasudil/HA1077、SR3677、GSK269962、H-1152、Wf-536等）、血清（例：ウシ胎仔血清（FBS）、ヒト血清、ウマ血清等）若しくは血清代替物、インスリン、各種ビタミン、L-グルタミン、非必須アミノ酸等の各種アミノ酸、２-メルカプトエタノール、各種サイトカイン（インターロイキン類（IL−2、IL−7、IL−15等）、幹細胞因子（SCF (Stem cell factor)）、アクチビンなど）、各種ホルモン、各種増殖因子（白血病抑制因子（LIF）、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、TGF−β等）、各種細胞外マトリックス、各種細胞接着分子、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピューロマイシン等の抗生物質、フェノールレッド等のpH指示薬などを適宜添加することができる。血清代替物として、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、Knockout Serum Replacement（KSR）、ITS−サプリメント及びこれらの混合物などが包含される。
【００２９】
前記工程（2）の培養期間としては、1日間（例：5、6、7日間）以上行うことが好ましく、また、10日間（例：7、8、9、10日間）以下であることが好ましい。培養温度は、特に限定されないが、30〜40℃、好ましくは37℃であり、CO2含有空気の存在下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは2〜5％である。
【００３０】
前記工程（3）の、前記形成したコロニーを有する前記培養器材において、特定の特徴量を決定する工程は、以下：
（i）前記形成したコロニーを有する前記培養器材における前記コロニーの画像を取得する工程、並びに
（ii）前記取得した画像から以下の特徴量:
（A）コロニー被覆率（％）、並びに
以下の特徴量（B）〜（D）：
（B）コロニー平均面積（μm2）、
（C）コロニー面積のバラつき（標準偏差（以下、「SD」と略記する場合もある））、及び
（D）コロニー平均長径（μm）
から選択される少なくとも１つを決定する工程
を含む手法により行うことができる。
【００３１】
前記（i）前記形成したコロニーを有する前記培養器材における前記コロニーの画像を取得する工程について、取得する画像は、多能性幹細胞が形成するコロニーを非侵襲的に撮影した画像であれば特に限定されないが、例えば、光学顕微鏡（例：位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡等）を用いて撮影した画像が挙げられる。撮影した画像の保存形式は、通常画像解析に使用されるものであれば特に限定されないが、例えば、TIFF、GIF、PNG、JPEG等の形式が挙げられる。
撮影時期は、前記培養器材において形成された多能性幹細胞を凍結保存する直前（例：凍結保存を行う1日前、当日、冷凍保存を行う5時間前、4時間前、3時間前、2時間前、1時間前等）に行なう。
【００３２】
取得する画像は、多能性幹細胞が形成するコロニーが培養されているディッシュの一部の画像であってもよく、全体の画像でもよい。ディッシュの一部又は全体の画像の撮影に際しては、例えば、ディッシュの一部又は全体を、使用する顕微鏡の各視野内の画像ごとに分割して撮影し、その後、それらを1つに結合してディッシュの一部又は全体の画像としてもよい。また撮影した画像は、後述する特徴量の抽出のために、通常の細胞の画像解析において知られた各種補正（例：傷・泡等の除去、画面端に位置し、見切れた（欠けた）コロニーの除去）を行ってもよい。
前記（A）〜（D）の特徴量は、オールインワン蛍光顕微鏡（BZ-X710及びBZ-X700、KEYENCE）による位相差画像の取得（例：10 cmディッシュにおいて、X軸方向に18.842 mm（7視野）、Y軸方向に14.131 mm（7視野）、合計266.3 mm2）、並びに解析ソフト（BZ-X Analyzer）による画像解析技術により抽出し、決定することができる。
【００３３】
前記（A）コロニー被覆率（％）とは、取得した画像あたりの多能性幹細胞が形成するコロニーが占める割合（面積率）を意味する。前記面積率は、上記1つの画像として結合する前の、分割して撮影した顕微鏡の各視野（各画像）内の多能性幹細胞が形成するコロニーの面積率をそれぞれ求めた後、その平均値を面積率として採用してもよく、1つの画像として結合した上で、多能性幹細胞が形成するコロニーの面積率を求めてもよい。
【００３４】
下述の実施例で示す通り、前記コロニー被覆率は、多能性幹細胞が形成するコロニーが培養されている培養器材1枚あたりから作製可能な細胞ストックの本数と有意な正の相関がある。前記被覆率は、細胞ストックの作製に用いる培養器材1枚あたりから作製を所望する細胞ストックの本数に合わせて適宜設定することができる。培養器材1枚あたりから、所望する細胞ストックの本数を取得できないものを効率的に排除するための被覆率の値を規格値という。本明細書において、「効率的に排除する」とは、培養器材１枚あたりから所望する細胞ストックの本数を取得できないものを80％以上の割合で排除することを意味し、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、最も好ましくは100％である。
【００３５】
前記規格値は、培養器材1枚あたりから所望する細胞ストックの本数を取得できないものを効率的に排除することができる限り、細胞ストック作製本数と被覆率との2変量解析とROC-AUC分析から求めたしきい値を規格値としてもよく、前記求めたしきい値よりもさらに厳しいものを規格値としてもよい。例えば、培養器材（例：ディッシュ）の単位面積（cm2）あたり0.2本以上の細胞ストックの作製を所望する場合（即ち、細胞ストック本数が一度に十分量得られる規格）、コロニー被覆率の規格値は少なくとも7％超（例：8％以上、16％超、17％以上、31％超、32％以上）である。
【００３６】
前記（B）コロニー平均面積（μm2）とは、取得した画像中に存在する多能性幹細胞が形成する全コロニーの平均面積（μm2）を意味する。前記コロニー平均面積の逆数と起眠後生細胞数とは有意な正の相関があり、本明細書中において「起眠後生細胞数」とは、起眠後に細胞を播種し5日間培養後の生細胞数を意味する。前記コロニー平均面積は、所望する起眠後生細胞数に合わせて適宜設定することができる。所望する起眠後生細胞数を達成できない多能性幹細胞を培養する培養器材を効率的に排除するためのコロニー平均面積の値を規格値という。本明細書において、「効率的に排除する」とは、所望する起眠後生細胞数を達成できない多能性幹細胞を培養する培養器材を80％以上の割合で排除することを意味し、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、最も好ましくは100％である。
【００３７】
前記規格値は、所望する起眠後生細胞数を達成できない多能性幹細胞を培養する培養器材を効率的に排除することができる限り、起眠後生細胞数とコロニー平均面積の逆数との2変量解析とROC-AUC分析から求めたしきい値を規格値としてもよく、前記求めたしきい値よりもさらに厳しいものを規格値としてもよい。例えば、起眠後生細胞数が0.3x106細胞以上を所望する場合（即ち、起眠後の生細胞数が継代に十分なほど多い規格）、コロニー平均面積の規格値は、少なくとも141,933μm2未満（例：141,900μm2以下、115,395μm2未満、115,300μm2以下、109,218μm2未満、109,200μm2以下、66,599μm2未満、66,500μm2以下、45,259μm2超、45,300μm2以上、23,190μm2超、23,200μm2以上）である。
【００３８】
前記（C）コロニー面積のバラつきとは、取得した画像中に存在する多能性幹細胞が形成する全コロニーの面積間のバラつきを意味し、前記バラつきの指標は標準偏差（SD）である。コロニー面積のバラつき（SD：標準偏差）の逆数と起眠後生細胞数とは有意な正の相関がある。前記コロニー面積のバラつきは、所望する起眠後生細胞数に合わせて適宜設定することができる。所望する起眠後生細胞数を達成できない多能性幹細胞を培養する培養器材を効率的に排除するためのコロニー面積のバラつきの値を規格値という。本明細書において、「効率的に排除する」とは、所望する起眠後生細胞数を達成できない多能性幹細胞を培養する培養器材を80％以上の割合で排除することを意味し、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、最も好ましくは100％である。
【００３９】
前記規格値は、所望する起眠後生細胞数を達成できない多能性幹細胞を培養する培養器材を効率的に排除することができる限り、起眠後生細胞数とコロニー面積のバラつき（SD）の逆数との2変量解析とROC-AUC分析から求めたしきい値を規格値としてもよく、前記求めたしきい値よりもさらに厳しいものを規格値としてもよい。例えば、起眠後生細胞数が0.3x106細胞以上を所望する場合（即ち、起眠後の生細胞数が継代に十分なほど多い規格）、コロニー平均面積のバラつき（SD）の規格値は、少なくとも130,257未満（例：130,200以下、57,070未満、57,000以下）である。
【００４０】
前記（D）コロニー平均長径（μm）とは、取得した画像中に存在する多能性幹細胞が形成する全コロニーの長径の平均値を意味する。コロニー平均長径の逆数と起眠後生細胞数とは有意な正の相関がある。前記コロニー平均長径は、所望する起眠後生細胞数に合わせて適宜設定することができる。所望する起眠後生細胞数を達成できない多能性幹細胞を培養する培養器材を効率的に排除するためのコロニー平均長径の値を規格値という。本明細書において、「効率的に排除する」とは、所望する起眠後生細胞数を達成できない多能性幹細胞を培養する培養器材を80％以上の割合で排除することを意味し、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、最も好ましくは100％である。
【００４１】
前記規格値は、所望する起眠後生細胞数を達成できない多能性幹細胞を培養する培養器材を効率的に排除することができる限り、起眠後生細胞数とコロニー平均長径の逆数との2変量解析とROC-AUC分析から求めたしきい値を規格値としてもよく、前記求めたしきい値よりもさらに厳しいものを規格値としてもよい。例えば、起眠後生細胞数が0.3x106細胞以上を所望する場合（即ち、起眠後の生細胞数が継代に十分なほど多い規格）、コロニー平均長径の規格値は、少なくとも483μm未満（例：480μm以下、418μm未満、410μm以下、402μm未満、400μm以下、328μm未満、320μm以下、261μm超、270μm以上、186μm超、190μm以上）である。
【００４２】
上記（B）〜（D）の特徴量は、所望する起眠後の生細胞数を達成できない多能性幹細胞を培養する培養器材を効率的に排除するための指標としてそれぞれ単独で用いることもでき、組み合わせて用いることもできる。
【００４３】
前記工程（4）の、前記決定した特徴量と、予め設定された規格値とを比較して、前記規格値を満たす培養器材を選択する工程において、前記決定した特徴量及び予め設定された規格値とは、上述の特徴量及び規格値を意味する。
【００４４】
前記工程（5）の、前記選択した培養器材中のコロニーを凍結保存する工程は、公知の任意の手法により行うことができる。かかる手法としては、例えば、形成されたコロニーを、フリーザー、ディープフリーザー内に静置すること、又は該コロニーを低温の媒体（例：液体窒素等）と接触させることにより達成されるが、これに限定されない。凍結温度は、典型的には0℃以下、好ましくは−20℃以下、より好ましくは−40℃以下、さらに好ましくは−80℃以下である。また、凍結操作における冷却速度としは、典型的には4℃から冷却を始めて−80℃に達するまで1〜5時間、好ましくは2〜4時間、特に約3時間かける程度の冷却速度が挙げられる。かかる冷却速度は、所望の温度に設定した凍結手段に、コロニーを含む容器を直接、または、凍結処理容器に収容して供することにより達成することができる。凍結処理容器は、容器内の温度の下降速度を所定の速度に制御する機能を有していてもよい。かかる凍結処理容器としては、例えば、BICELL（登録商標）（日本フリーザー）などを用いることができる。また、上記冷却速度は、プログラム設定などにより冷却速度を制御することができるフリーザーまたはディープフリーザーを用いることにより達成することができる。かかるフリーザーまたはディープフリーザーとしては、既知の任意のもの、例えば、プログラムフリーザー（例えば、PDF-2000G（ストレックス）、KRYO-560-16（朝日ライフサイエンス））などを用いることができる。
【００４５】
凍結操作は、コロニーを浸漬させた培養液や生理緩衝液などを凍結保存液として用い、これに凍結保護剤を添加したり、培養液を、凍結保護剤を含む凍結保存液と置換するなどの処理を施したうえで行ってもよい。培養液を凍結保存液に置換する場合、培養液を実質的に全て除去してから凍結保存液を添加しても、培養液を一部残したまま凍結保存液を添加してもよい。凍結保存液は、市販のものを用いてもよく、例えば、STEM-CELLBANKER（登録商標）（ZENOAQ）が挙げられる。
【００４６】
本発明で用いる凍結保護剤としては、特に限定されず、例えば、ジメチルスルホキシド（DMSO）、エチレングリコール（EG）、プロピレングリコール（PG）、1，2−プロパンジオール（1,2-PD）、1，3−プロパンジオール（1,3-PD）、ブチレングリコール（BG）、イソプレングリコール（IPG）、ジプロピレングリコール（DPG）およびグリセリンなどを含む。なかでも、DMSO又は1,2-PDが好ましい。凍結保護剤は、単独で用いても、2種又は3種以上を組み合わせて用いてもよい。また、凍結保護剤は、細胞外凍結保護剤と組み合わせて用いてもよい。細胞外凍結保護剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルスターチ（HES）、デキストラン、アルブミンなどが挙げられる。
【００４７】
培養液への凍結保護剤の添加濃度、又は凍結保存液中の凍結保護剤の濃度は、典型的には、培養液又は凍結保存液全体に対して2〜20％（v/v）、好ましくは5〜15％、より好ましくは8〜13％である。上記濃度は、凍結保護剤の種類により適宜調節することができ、例えば、凍結保護剤としてDMSOを用いた場合、DMSOの濃度は、典型的には、培養液又は凍結保存液全体に対して2〜20％（v/v）、好ましくは2.5〜12.5％、より好ましくは5〜10％である。
【００４８】
2．凍結保存された多能性幹細胞
本発明はまた、本発明の製法により得られた凍結保存された多能性幹細胞を提供する。上述の通り、本発明の凍結ストック細胞等は、「高品質」であり、かつ「安定性」が高い。また、本発明の凍結ストック細胞により形成されるコロニーは、上記1．で記載された(A)コロニー被覆率、（B）コロニー平均面積、（C）コロニー面積のバラつき、及び(D）コロニー平均長径の各規格値を満たし得る。
【００４９】
本発明の凍結ストック細胞は、上記1．に記載のように解凍したのち、体細胞に分化させることができる。多能性幹細胞の分化誘導方法としては、限定されるものではなく、種々の公知の分化手法が利用できる。公知の分化手法としては、例えば、T細胞への分化手法、間葉系幹細胞への分化手法、造血幹細胞への分化手法、赤血球への分化手法、血小板への分化手法、血管内皮細胞への分化手法、心筋細胞への分化手法、骨格筋への分化手法、神経幹細胞への分化手法、大脳皮質神経細胞への分化手法、大脳辺縁系神経細胞への分化手法、ドパミン神経細胞への分化手法、肝細胞への分化手法、骨への分化手法、軟骨への分化手法、始原生殖細胞への分化手法、膵臓細胞への分化手法、網膜細胞への分化手法、角膜細胞への分化手法、腎臓細胞への分化手法、肺胞上皮細胞への分化手法、気管支上皮細胞への分化手法、腸管への分化手法等を挙げることができる。
【００５０】
3．特定の特徴を有する凍結保存された多能性幹細胞
本発明はまた、特徴（A）細胞が形成するコロニー被覆率：7％超（例：8％以上、16％超、17％以上、31％超、32％以上）、並びに特徴（B）細胞が形成するコロニー平均面積： 141,933μm2未満（例：141,900μm2以下、115,395μm2未満、115,300μm2以下、109,218μm2未満、109,200μm2以下、66,599μm2未満、66,500μm2以下、45,259μm2超、45,300μm2以上、23,190μm2超、23,200μm2以上）、（C）細胞が形成するコロニー面積のバラつき：130,257未満（例：130,200以下、57,070未満、57,000以下）、及び（D）細胞が形成するコロニー平均長径： 483μm未満（例：480μm以下、418μm未満、410μm以下、402μm未満、400μm以下、328μm未満、320μm以下、261μm超、270μm以上、186μm超、190μm以上）から選択される少なくとも1つの特徴を有する、凍結保存された多能性幹細胞を提供する。前記凍結保存された多能性幹細胞が前記特徴を有するか否かについては、前記凍結保存された多能性幹細胞を上記1．に記載した本発明の方法の工程（5）の培養器材中の細胞を凍結保存する時点の条件と同一の条件に前記凍結保存された多能性幹細胞を置く（即ち、凍結保存された多能性幹細胞を上記1．に記載されたような方法で起眠させ、コロニーを形成させ、特徴量を決定した後、培養器材中の細胞を凍結保存する時点と同じ状態まで、該凍結保存された多能性幹細胞を培養する）ことにより評価することができる。
【実施例】
【００５１】
以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
【００５２】
実施例1：特徴量の算出
iPS細胞は、アカデミアジャパン（株）またはiPSポータル（株）より購入したiPS細胞の201B7株及び1210B2株を用いた。培養には、足場材としてiMatrix-511（ニッピ社：892012）をコートした培養容器を用い、培地はStemFit(R) AK03Nを用いた。培養条件は5％ CO2/37℃で行った。細胞播種時には、最終濃度10μMのY−27632（和光純薬工業社：036−24023）を添加した培地を使用し、翌日以降の評価においては、Y−27632を添加していない培地で培養した。細胞ストックを作製する際の培養容器は10 cmディッシュを用い、シングルセルの状態で1×105〜6×105cells/枚の範囲で細胞を播種した。播種後は5〜7日間の範囲で培養し、細胞ストックを作製した。凍結保存液にはSTEM-CELLBANKER（登録商標）（ZENOAQ）を、凍結保存容器にはCoolCell（登録商標）LX（biosicion）を用い、細胞の凍結保存（2×105cells/200μL／vial）を行った。細胞ストック作製前の細胞画像からの特徴量抽出にはオールインワン蛍光顕微鏡（KEYENCE社：BZ-X710及びBZ-X700）による位相差画像の取得、並びに解析ソフト（BZ-X Analyzer）による画像解析を用いた。画像より得られる特徴量として、「被覆率」、「コロニー面積」及び「コロニー長径」を算出した。
【００５３】
実施例2：凍結保存した多能性幹細胞の品質確認
一方、細胞起眠後の培養容器は6ウェルプレートを用い、起眠直後は201B7株では65,000 cells/well、1210B2株では40,000 cells/wellで播種し5日間培養後、起眠後生細胞数をBECKMAN COULTER社の生死細胞オートアナライザー（型番：ViCELLTM XR；以下、ViCELL）を用いて自動計測した。201B7株においては、その後1週間ごとに播種数13,000 cells/wellにて継代を実施し、最大7週間培養を継続し、安定的な培養が可能である事を確認した。各継代時には、ViCELLにて生細胞数を測定し、記録した。
【００５４】
実施例3：各規格値の設定
キーエンス解析ソフトによる画像解析から抽出した特徴量の結果と培養評価結果から、それぞれ2変量の相関を確認すると、図1に示す値となった。起眠後生細胞数が0.3x106 cells以上、細胞ストック作製本数が12本以上得られたものを合格サンプル（図1中の「〇」記号）、下回るものを逸脱サンプル（図1中の「×」記号）と定義し示した。また、これよりROC-AUC分析により統計学的に至適なしきい値を算出したところ、図2に示す結果となった。当該結果より、「被覆率対細胞ストック作製本数」、「コロニー平均面積の逆数対起眠後生細胞数」、「コロニー面積のバラつき（SD：標準偏差）の逆数対起眠後生細胞数」、及び「長径の逆数対起眠後生細胞数」において有意（p値0.01以下)な相関関係があることが示唆された。
【００５５】
さらに、「被覆率対細胞ストック作製本数の判定結果」に関しては、AUC（0〜1の範囲で推移、1で最も予測能が高くなる）が201B7株では0.9423、1210B2株では0.8788といずれも高く、両細胞株において「被覆率」による「細胞ストック作製本数」の予測能が十分に高いことが明らかとなった。同様に、「コロニー平均面積」、「コロニー面積のバラつき」、「コロニー平均長径」それぞれに対する「起眠後生細胞数の判定結果」では、AUCがそれぞれ201B7株では0.9546（コロニー平均面積）、0.8939（コロニー面積のバラつき）、0.9546（コロニー平均長径）であり、1210B2株では0.8889（コロニー平均面積）、0.8095（コロニー面積のバラつき）、0.9206（コロニー平均長径）といずれも高く、両細胞株において「コロニー平均面積」、「コロニー面積のバラつき」、「コロニー平均長径」それぞれによる「起眠後生細胞数の判定結果」の予測能が十分に高いことが明らかとなった（図2）。
【００５６】
以上より、ROC−AUC解析の結果から、Youden index（「感度+特異度-1」が最大となる点）により各指標におけるカットオフ値を算出すると、201B7株では「被覆率」7％、「コロニー平均面積」115,395μm2、「コロニー面積のバラつき」57,070、「コロニー平均長径」402μmとなった（表1）。同様に1210B2株では「被覆率」16％、「コロニー平均面積」141,933μm2、「コロニー面積のバラつき」130,257、「コロニー平均長径」483μmとなった（表1）。さらに、所望する細胞以外を100％排除するための値、すなわち感度が1である時偽陽性率が最も低い時の値は、201B7株では「被覆率」7％、「コロニー平均面積」66,599μm2、「コロニー面積のバラつき」57,070、「コロニー平均長径」328μmとなった（表１）。同様に1210B2株では「被覆率」31％、「コロニー平均面積」109,218μm2、「コロニー面積のバラつき」130,257、「コロニー平均長径」418μmとなった（表1）。以上の値をしきい値とし、「被覆率」についてはこれを超える、「コロニー平均面積」、「コロニー面積のバラつき」及び「コロニー平均長径」についてはこれを下回るものを規格値とすることで、所望する細胞以外を効率的に排除することができると考えられた。
【００５７】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明の方法は、「高品質」（即ち、起眠後の生細胞数が継代に十分なほど多い）の凍結保存された多能性幹細胞を、「安定性」（即ち、凍結細胞ストックの本数が一度に十分量得られる）を確保して製造することができるため、有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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