(57)【要約】【課題】  がんの免疫療法に用いるワクチンの製造方法を提供する。【解決手段】  エクソソームは常温でも一定時間以上放置すると膜構造が崩れ樹状細胞と融合させることができない。したがって、タンパク質のペプチド化を促進しつつエクソソームの膜構造を維持する条件で加熱処理する必要があり、この条件は５６℃以下且つ３０分以下である。それ以上の温度条件ではタンパク質は変性し、抗原性を保てない。そこで、がん患者のがん細胞または血液などの体液から分離したエクソソーム（Exosome）を、５６℃以下且つ３０分以下の条件で加熱処理することで、エクソソーム内のタンパク質酵素の失活を促し、タンパク質分解酵素及び脂質分解酵素を失活させる。次いでこのエクソソームをがん患者又は健常人の血液などから誘導した樹状細胞に導入するか共培養する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん患者のがん細胞または血液などの体液から分離したエクソソーム（Exosome）を、５６℃以下且つ３０分以下の条件で加熱処理することで、エクソソーム内のタンパク質酵素の失活を促し、次いでこのエクソソームをがん患者又は健常人の血液などから誘導した樹状細胞に導入するか共培養することで抗原提示細胞とすることを特徴とする免疫療法ワクチンの製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の免疫療法ワクチンの製造方法において、前記加熱処理によりタンパク質分解酵素及び脂質分解酵素を失活させることで、エクソソームの粒子としての安定性を維持することを特徴とする免疫療法ワクチンの製造方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の免疫療法ワクチンの製造方法において、前記樹状細胞をＴ細胞と共培養して傷害性Ｔ細胞とすることを特徴とする免疫療法ワクチンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はがん細胞のエクソソームと樹状細胞を用いた免疫療法に用いる樹状細胞ワクチンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫療法は、がん細胞が作出する特定のタンパク質を指標として特異抗体を提示し、がん細胞を攻撃する免疫細胞（ＣＴＬ）を作成する療法（獲得免疫）と、異物タンパク質を認識し異物排除を行う（自然免疫）の二つの療法がある。
今までの免疫療法は、患者の血液単球などから単離した樹状細胞（DC：dendritic cell）と患者から得たがん細胞（前がん細胞も含む）とを融合させ、この融合細胞を単独若しくは細胞傷害性Ｔ細胞応答や液性免疫応答を刺激するサイトカインとともに皮下注射などによって投与している。
【０００３】
この従来の免疫療法にあっては樹状細胞とがん細胞の融合効率が１０％前後と低いため、投与したワクチンの抗原提示効率が悪い。一方、エクソソームを使用しＤＣへ取り込むと、１０５ＤＣに対し、エクソソームの数は１０８〜１０９取得が可能であり、ほとんどのＤＣにエクソソームは取り込まれる。
【０００４】
また、正常な成熟樹状細胞由来のエクソソームやＮＫ細胞由来のエクソソームは、がん細胞増殖の阻害、制御性Ｔ細胞（Treg）の阻害、ＭＤＳＣの阻害、血管新生の阻害を起こし、がん組織を破壊する方向に働く。このため、成熟樹状細胞由来のエクソソームやＮＫ細胞由来のエクソソームががん治療に使用されつつある。
【０００５】
一方、がん細胞由来のエクスゾームはがん細胞を増悪化しその遺伝子を変異させる傾向がある。また、がん細胞増殖を阻止する免疫細胞の失活化をもたらす。この場合には、ワクチンを構成する樹状細胞の抗原提示機能からがん細胞が逃れてしまい、融合細胞が抗原提示細胞（ＡＰＣ）として働き、細胞障害性T細胞（ＣＴＬ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）を誘導しても、ＣＴＬの活性、ＮＫ活性がなくなり、抗がん活性を失う事になる。即ち、がん細胞は免疫療法から逃れるため、がん細胞由来のエクスソームを放出し、頻繁にその遺伝子を変異させ、かつ、免疫細胞の活性を失活させる。これに対する有効な対処方法が確立されていない。
【０００６】
樹状細胞とがん細胞の融合効率が低いという従来の問題を解消する先行技術として特許文献１が提案されている。この特許文献１には、がん細胞から放出されたエクソソーム（exosome）を樹状細胞やＴ細胞などの免疫細胞に電気穿孔処理（electroporation）によって挿入し、この電気穿孔処理した細胞（ワクチン）を患者に投与することが開示されている。
【０００７】
特許文献１によれば、がん細胞の遺伝子は常に変化し、がん細胞が遺伝子を変異させるとがん細胞が表示するタンパク質も変化し、抗原提示から逃れることになる。細胞由来エクソソームは分泌元である細胞と同等のタンパク質、機能を維持している。正常な成熟樹状細胞由来またはＮＫ細胞由来のエクソソームではなく、がん細胞から放出されたエクソソームも放出元がん細胞と同等のタンパク質、すなわち抗原を持っている。すなわち、がん細胞由来エクソソームを用いた場合には、がん細胞が遺伝子を変異させても、変異したがん細胞由来エクソソームには、変異したがん細胞と同等の抗原を持っている。
すなわち、がん細胞由来エクソソームを抗原として使用すれば、がん細胞遺伝子が変化し表示するタンパク質を変化させても、そのタンパク質はがん細胞由来のエクソソームが有するタンパク質と同等であるので、がん細胞は抗原提示から逃れることができない。
【０００８】
また、非特許文献１及び非特許文献２には、がん細胞由来のエクソソームを樹状細胞にパルス導入することで、当該樹状細胞が患者のＴ細胞に自己腫瘍細胞傷害活性を誘導したことが開示されている。
【０００９】
更に非特許文献３には、白血病細胞由来のエクソソームで刺激した樹状細胞が、白血病細胞に対する細胞傷害性Ｔリンパ球免疫反応を誘導することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表２０１３−５２３８２４号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】日本外科学会雑誌，２００５年，vol.106, 臨時増刊号，p.195,  Abstract No.SF2309-2
【非特許文献２】Biotherapy, ２００４年，vol.18, Suppl.1, p.116, Abstract No.p-27
【非特許文献３】PLOS ONE, ２００４年，vol.9, no.3, e91463, p.1-7
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
がん細胞から放出されたエクソソームを樹状細胞（DC：dendritic cell）と融合させ、この融合した細胞をワクチンとして患者に投与すれば、たとえがん細胞遺伝子が変異をおこしても、当該ワクチンは抗原提示細胞（ＡＰＣ）としての機能を失うことがない。したがって、先行技術文献に開示される方法は有効である。
【００１３】
抗原提示のメカニズムは、がん細胞に特異的なタンパク質が細胞内でペプチドまで分解され、このペプチドががん細胞表面にあるＭＨＣ分子に結合して抗原ペプチドとして提示され、細胞傷害性Ｔ細胞（CTL）はこの抗原ペプチドを認識してがん細胞を攻撃することが判明している。  
【００１４】
しかしながら、エクソソーム内のタンパク質がペプチドまで分解されるには時間がかかり免疫反応が起こりにくい。つまりがん細胞から放出されたエクソソームを樹状細胞と融合させてもワクチンとして効果を発揮するまでに時間がかかるという問題がある。
【００１５】
また、エクソソームは長期保存できないという問題がある。樹状細胞と融合させるエクソソームは膜構造を維持した粒子であることが必要である。しかしながら、常温で一定時間経過すると膜構造が崩れるため、保存することができない。
【００１６】
極低温、例えば−９６℃で凍結保存すれば長期保存は可能であるが、ワクチンを作成する際に融解しなければならず、融解を繰り返すと、このときに膜が壊れ粒子としての構造が保てなくなる場合もある。凍結保存ではなく４℃程度の低温で保存することも考えられる。しかしながら膜構造をもつウイルス（インフルエンザ、パラインフルエンザ、ヘルペスウイルス）などの粒子と同様に１ヵ月程度で失活（９９％）し、粒子が破壊され、抗原提示効率は悪化する。タンパク質を作出しなくなる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
エクソソームはがん細胞の増悪化とともに、その母細胞と同じ抗原を持ちうる。それ故、その変異に対する有効な抗原提示を持つ。
本発明に係るがんの免疫療法ワクチンの製造方法は、がん細胞（がん幹細胞を含む）の培養上清やがん患者の血液や腹水などの体液からエクソソームを分離し、この分離したエクソソームを加熱処理することで不活性化し、この不活性化したエクソソームを樹状細胞に導入して融合するようにした。
【００１８】
前記したように、エクソソームは常温でも一定時間以上放置すると膜構造が崩れ樹状細胞と融合させることができない。したがって、タンパク質のペプチド化を促進しつつエクソソームの膜構造を維持する条件で加熱処理する必要があり、この条件は５６℃以下且つ３０分以下である。それ以上の温度条件ではタンパク質は変性し、抗原性を保てない。
【００１９】
本発明に係るがんの免疫療法に用いるワクチンの製造方法は、がん細胞や患者の体液などから分離されたエクソソームを樹状細胞に導入させる手段として、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法、センダイ・ウイルス法を用いる事が可能である。
【００２０】
エレクトロポレーション法を用いた場合には、瞬時に取り込まれ、また１ｍｌの末期がん患者の血清中には１０９以上のエクソソーム粒子が存在するので、樹状細胞への取込み率は９０％以上であると考えられる。したがって、従来の樹状細胞とがん細胞とを融合させていた場合に比較し、大幅に抗原提示細胞（ＡＰＣ）が増加するものと思われる。
【００２１】
また、エクソソームはがん患者の血液のみならず、尿や腹水など体液から分離することも可能である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、抗原提示機能が高まる点が挙げられる。前記したように、がん細胞特有のタンパク質（エクソソーム内のタンパク質）はププチドに分解され、これがＭＨＣ分子と結合して細胞傷害性Ｔ細胞（CTL）に抗原ペプチドとして提示されるのであるが、一般にタンパク質は生理活性を保つためプロテアーゼやリパーゼなどのタンパク質分解酵素、脂質分解酵素の攻撃目標にならないように３次元立体構造をとっている。しかしながら、本発明の加熱処理によりタンパク質の３次元構造は壊れないが、活性基のみに変異が起こり、酵素活性を失う。しかも、がん細胞特有のタンパク質は容易にププチドに分解されてＭＨＣ分子と結合する。このため、細胞傷害性Ｔ細胞（CTL）に対する抗原提示機能が高まる。
【００２３】
副次的効果として、タンパク質分解酵素や脂質分解酵素が失活し、エクソソームの粒子として安定性が維持でき、長期保存が可能となることが挙げられる。更にエクソソームを加熱することでタンパク質（Heat Shock Protein：HSP）の発現量が増える可能性も考えられる。これらHSPは免疫を強化する機能があると考えられている。
【００２４】
前記HSPは免疫全体を活性化するとともに熱耐性のタンパク質であり、熱処理により失活するよりむしろ活性化する。このことも、熱処理したエクソソームを抗原として使用することに意味がある。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】加熱条件を５６℃且つ３０分とした場合のエクソソームの顕微鏡写真。
【図２】加熱条件を５６℃且つ３０分とした場合のエクソソームの顕微鏡写真。
【図３】加熱条件を５６℃且つ３０分とした場合のエクソソームの顕微鏡写真。
【図４】熱処理したエクソソームの熱処理後の期間と細胞傷害活性（% of Lysis）を比較した結果を示すグラフ。
【図５】エクソソームを導入した樹状細胞（ＤＣ）のタンパク質の蛍光（緑蛍光と赤蛍光）及び明視野の顕微鏡写真であり、上段は熱処理しないエクソソームを電気穿孔処理（electroporation）で導入した樹状細胞（ＤＣ）、中段は本発明の条件で熱処理したエクソソームを共培養（co-culture）で導入した樹状細胞（ＤＣ）、下段は本発明の条件で熱処理したエクソソームを電気穿孔処理（electroporation）で導入した樹状細胞（ＤＣ）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下に本発明の実施例を説明する。本発明の権利範囲はこの実施例によって制限されるものではない。
【００２７】
（Ａ）細胞培養上清よりエクソソームの抽出
工程１：Exosome-depleted FCS添加培地で２日間培養後、培養上清から抽出した。抽出には単離キットとして、miRCURY Exosome Cell/Urine/CSF Kit（タカラバイオCat.300102）を用いた。
工程２：工程１で抽出したエクソソーム粒子数を計測した。
工程３：加熱処理（５６℃、３０分）を行うことで、エクソソームを不活化した。
【００２８】
エクソソームは加熱により細胞膜が崩壊しやすい。細胞膜が崩壊すると樹状細胞と融合させることができないので、加熱条件を変えることで加熱処理の上限温度及び上限時間を決定した。決定方法は条件ごとの顕微鏡写真から、エクソソームの膜構造を観察して行った。
【００２９】
図１〜３はいずれも加熱条件として５６℃で３０分を選定している。各図において、円形状で黒っぽい部分が膜構造であり、膜構造は維持できているエクソソーム、黒っぽい部分よりも大きな円形状の白っぽい部分が膜構造が崩壊したエクソソームである。膜構造が維持できているエクソソーム内には核は見られず、エクソソームが細胞質から分泌されていることが確認できる。膜構造が崩壊したエクソソーム内には核がなくなっているものもある。
【００３０】
温度条件として５６℃未満、例えば３7℃（体温）とした場合には加熱とは言えず、酵素の活性基の変性もない通常のエクスソームである。また５６℃を超えると膜構造が崩壊したエクソソームが増加した。処理時間についても同様であった。
５６℃×３０分の場合は、顕微鏡写真からも明らかなように、ある程度膜構造が崩壊したエクソソームも交じっている。このことは逆に膜構造が崩壊していないエクソソームが存在し、エクソソーム内の酵素変性が進行していることの証左であるので、５６℃以下且つ３０分以下の条件内で、できるだけ５６℃且つ３０分に近い条件で加熱処理することが望ましい。
【００３１】
（Ｂ）活性化細胞傷害性Ｔ細胞（CTL）による腫瘍細胞の障害性
工程１：健常人より採血後、抹消血単核球より樹状細胞を誘導した。具体的には、  抹消血（５０ｍｌ）を採血する。次いで遠心分離（c.f.g. 1800xg 15min）を行い、中間層の細胞を集める。この後、ＰＢＳで２回洗浄（c.f.g. 1200r.p.m. 5min）し、細胞数を計測し、２×１０６/ｍｌになるように培地（CTS AIM V medium (Gibco, Thermo Fisher Scientific）に再浮遊する。
２４well plate に1ml/well で播き、３７℃ ５％ ＣＯ２インキュベーターで２時間培養する。次いで、浮遊細胞を除いて、樹状細胞用培地（AIM V 培地にサイトカイン(fainal 10ng/ml GM-CSF 及びIL-4, Miltenyi Biotec)と２％自己血漿を添加したもの）を 1ml/well 加え培養を開始する。
この後、fresh 樹状細胞用培地500ulをWell に添加し、また成熟用のサイトカイン(final 10ng/ml TNFα, Miltenyi Biotec)を添加する。
【００３２】
工程２：樹状細胞の抗原刺激として、以下の試験区（１）〜（３）を行った。
（１）DCと腫瘍細胞のPEG（ポリエチレングリコール）による細胞融合
（２）DCとエクソソームのエレクトロポレーション
（３）DCとエクソソームの共培養
【００３３】
工程３：上記の試験区（１）〜（３）で活性化した樹状細胞と傷害性Ｔ細胞（CTL）との共培養を行った。
【００３４】
工程４：上記共培養された細胞傷害性Ｔ細胞（CTL）と腫瘍細胞との共培養を行った。
【００３５】
ＭＴＴアッセイにより、上記細胞傷害性Ｔ細胞（CTL）の傷害性を観察した。結果を図４、図５に示す。
この図４は、Target:Effectorの比率と傷害性Ｔ細胞の傷害性（Lysis）との関係を示すものであり、本発明方法によって加熱処理したエクソソームを電気穿孔処理（electroporation）法によってＤＣ細胞に導入してこれを抗原とした細胞傷害性Ｔ細胞（CTL）は、現行のPEG（ポリエチレングリコール）による細胞融合によって得られた傷害性Ｔ細胞（CTL）、および共培養（co-culture）と同等の傷害性を示すことが分かる。
特に、Target:Effector（横軸）において、Effectorを増加させた場合は、PEG細胞融合および共培養（co-culture）に比べ、傷害性（Lysis）が高くなっている。
【００３６】
また図５から、熱処理した場合のエクソソームによるタンパク質の発現量が増えていることが分かる。
したがって、本発明方法によって得られたワクチンは免疫療法に効果的である。
【００３７】
本発明のワクチン、即ち熱処理したエクソソームをエレクトロポレーションなどによってDC（樹状細胞）に導入したものは、抗原提示細胞（APC）として機能する。この抗原提示細胞（APC）を皮下注射などによって患者の体内に投与すると、抗原提示細胞（APC）はリンパ節まで移動し、リンパ節中のＴ細胞を教育し、傷害性Ｔ細胞（CTL）に変える。
前記したように、DCに比較してエクソソームの数は極めて多いため、エクソソームを取込むDCの数も多くなる。このようなDCの数が多くなれば抗原提示細胞（APC）の数も増え、傷害性Ｔ細胞（CTL）も増えて免疫効果が高くなる。
【００３８】
尚、エクソソームを導入したDC（樹状細胞）を更にＴ細胞と共培養して傷害性Ｔ細胞（CTL）としたものをワクチンとすることも可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年11月25日(2019.11.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん患者のがん細胞または血液などの体液から分離したエクソソーム（Exosome）を、５６℃且つ３０分の条件で加熱処理することで、エクソソーム内のタンパク質分解酵素の失活を促し、次いでこのエクソソームをがん患者又は健常人の血液などから誘導した樹状細胞に導入するか共培養することで抗原提示細胞とすることを特徴とする免疫療法ワクチンの製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の免疫療法ワクチンの製造方法において、前記加熱処理によりタンパク質分解酵素及び脂質分解酵素を失活させることで、エクソソームの粒子としての安定性を維持することを特徴とする免疫療法ワクチンの製造方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の免疫療法ワクチンの製造方法において、前記樹状細胞をＴ細胞と共培養して傷害性Ｔ細胞とすることを特徴とする免疫療法ワクチンの製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
一方、がん細胞由来のエクソソームはがん細胞を増悪化しその遺伝子を変異させる傾向がある。また、がん細胞増殖を阻止する免疫細胞の失活化をもたらす。この場合には、ワクチンを構成する樹状細胞の抗原提示機能からがん細胞が逃れてしまい、融合細胞が抗原提示細胞（ＡＰＣ）として働き、細胞障害性T細胞（ＣＴＬ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）を誘導しても、ＣＴＬの活性、ＮＫ活性がなくなり、抗がん活性を失う事になる。即ち、がん細胞は免疫療法から逃れるため、がん細胞由来のエクソソームを放出し、頻繁にその遺伝子を変異させ、かつ、免疫細胞の活性を失活させる。これに対する有効な対処方法が確立されていない。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明によれば、抗原提示機能が高まる点が挙げられる。前記したように、がん細胞特有のタンパク質（エクソソーム内のタンパク質）はペプチドに分解され、これがＭＨＣ分子と結合して細胞傷害性Ｔ細胞（CTL）に抗原ペプチドとして提示されるのであるが、一般にタンパク質は生理活性を保つためプロテアーゼやリパーゼなどのタンパク質分解酵素、脂質分解酵素の攻撃目標にならないように３次元立体構造をとっている。しかしながら、本発明の加熱処理によりタンパク質の３次元構造は壊れないが、活性基のみに変異が起こり、酵素活性を失う。しかも、がん細胞特有のタンパク質は容易にペプチドに分解されてＭＨＣ分子と結合する。このため、細胞傷害性Ｔ細胞（CTL）に対する抗原提示機能が高まる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
温度条件として５６℃未満、例えば３7℃（体温）とした場合には加熱とは言えず、酵素の活性基の変性もない通常のエクソソームである。また５６℃を超えると膜構造が崩壊したエクソソームが増加した。処理時間についても同様であった。
５６℃×３０分の場合は、顕微鏡写真からも明らかなように、ある程度膜構造が崩壊したエクソソームも交じっている。このことは逆に膜構造が崩壊していないエクソソームが存在し、エクソソーム内の酵素変性が進行していることの証左であるので、５６℃以下且つ３０分以下の条件内で、できるだけ５６℃且つ３０分に近い条件で加熱処理することが望ましい。