(57)【要約】      （修正有）【課題】固形腫瘍抗原を標的抗原とする新規ＣＡＲ、及び固形腫瘍に対して有効なＣＡＲ−Ｔ細胞の提供。【解決手段】標的抗原結合領域と、膜貫通領域と、Ｔ細胞活性化シグナル伝達領域とを含み、前記標的抗原がガングリオシドＧＭ２である、キメラ抗原受容体。前記キメラ抗原受容体を発現する細胞。前記キメラ抗原受容体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。前記塩基配列を含むベクター。前記ポリヌクレオチド又はベクターを細胞に導入することを含む、キメラ抗原受容体を発現する細胞の製造方法。前記細胞を含む医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的抗原結合領域と、膜貫通領域と、Ｔ細胞活性化シグナル伝達領域とを含み、前記標的抗原がガングリオシドＧＭ２である、キメラ抗原受容体。
【請求項２】
前記標的抗原結合領域が、抗ガングリオシドＧＭ２抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３】
前記抗ガングリオシドＧＭ２抗体が、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される抗体である、請求項２に記載のキメラ抗原受容体：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含み、かつガングリオシドＧＭ２に対する結合能を有する抗体；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号４に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域と、を含み、かつガングリオシドＧＭ２に対する結合能を有する抗体；並びに
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号４に記載のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域と、を含み、かつガングリオシドＧＭ２に対する結合能を有する抗体。
【請求項４】
前記重鎖可変領域が配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項５】
前記抗ガングリオシドＧＭ２抗体が、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である、請求項２〜４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項６】
前記ｓｃＦｖが、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるポリペプチドである、請求項５に記載のキメラ抗原受容体：
（ａ）配列番号１０、１２、１４及び１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号１０、１２、１４及び１６からなる群より選択されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつガングリオシドＧＭ２に対する結合能を有するポリペプチド；並びに
（ｃ）配列番号１０、１２、１４及び１６からなる群より選択されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなり、かつガングリオシドＧＭ２に対する結合能を有するポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を発現する細胞。
【請求項８】
ＩＬ−７及びＣＣＬ１９の少なくとも一方をさらに発現する、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
ＩＬ−７及びＣＣＬ１９の両方を発現する、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
前記細胞が免疫細胞である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１２】
ＩＬ−７をコードする塩基配列及びＣＣＬ１９をコードする塩基配列の少なくとも一方をさらに含む、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
ＩＬ−７をコードする塩基配列及びＣＣＬ１９をコードする塩基配列の両方を含む、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードする塩基配列を含むベクター。
【請求項１５】
ＩＬ−７をコードする塩基配列及びＣＣＬ１９をコードする塩基配列の少なくとも一方をさらに含む、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
ＩＬ−７をコードする塩基配列及びＣＣＬ１９をコードする塩基配列の両方を含む、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド又はベクターを細胞に導入することを含む、キメラ抗原受容体を発現する細胞の製造方法。
【請求項１８】
ＩＬ−７をコードする塩基配列及びＣＣＬ１９をコードする塩基配列の少なくとも一方を含むポリヌクレオチド又はベクターを、さらに細胞に導入することを含む、請求項１７に記載のキメラ抗原受容体を発現する細胞の製造方法。
【請求項１９】
ＩＬ−７をコードする塩基配列及びＣＣＬ１９をコードする塩基配列の両方を含むポリヌクレオチド又はベクターを、細胞に導入することを含む、請求項１８に記載のキメラ抗原受容体を発現する細胞の製造方法。
【請求項２０】
請求項７〜１０のいずれか一項に記載の細胞を含む医薬組成物。
【請求項２１】
腫瘍を治療または予防するための医薬組成物である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キメラ抗原受容体、キメラ抗原受容体を発現する細胞、及びキメラ抗原受容体をコードする塩基配列を含むベクター等に関する。
本願は、２０１７年３月２７日に、日本に出願された特願２０１７−０６１４６１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
キメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：以下、「ＣＡＲ」ともいう。）は、がん細胞の細胞表面抗原を認識する一本鎖抗体と、Ｔ細胞の活性化を誘導するシグナル伝達領域を融合させた人工的なキメラタンパク質である。例えば、腫瘍反応性を有さない通常の末梢血Ｔ細胞（末梢血Ｔリンパ球）にＣＡＲをコードする遺伝子を導入することにより、ＣＡＲを発現可能なＣＡＲ発現Ｔ細胞（以下、「ＣＡＲ−Ｔ細胞」ともいう。）を大量に作製することが可能となる。かかるＣＡＲ−Ｔ細胞は腫瘍反応性を有し、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）との相互作用に依存することなくがん細胞の傷害を導くことが可能となる。
【０００３】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の投与によるがん免疫療法、より具体的には、患者からＴ細胞を採取し、かかるＴ細胞にＣＡＲをコードする遺伝子を導入して増幅し、再度患者に移入する療法は、現在世界中で臨床試験が進行しており、白血病やリンパ腫などの造血器悪性腫瘍などにおいて有効性を示す結果が得られている。
【０００４】
しかしながら、ＣＡＲ−Ｔ細胞によるがん免疫療法において有効な結果が得られているのは、造血器悪性腫瘍に対してのみであり、固形腫瘍に対しては有効性を示す結果が得られていないのが現状である。固形腫瘍に対して有効なＣＡＲを開発するためには、標的抗原の選択が重要であり、固形腫瘍に対して適用可能な標的抗原の探索が求められている。
【０００５】
一方、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法が固形腫瘍に対して効果を得られていない要因として、ＣＡＲ−Ｔ細胞の生体内での生存率が低い、腫瘍局所への集積が低い、腫瘍細胞が分泌する免疫抑制因子等による活性阻害等が考えられている。このような問題を解決する方法として、ＣＡＲをコードする核酸とともに、Ｔ細胞の免疫機能促進因子をコードする核酸を、Ｔ細胞に導入する方法が報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１６／０５６２２８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１では、ヒト固形腫瘍に発現する抗原を標的としたＣＡＲ−Ｔ細胞の効果は確認されていないため、そのような抗原に対して有効性を示すＣＡＲ−Ｔ細胞が求められている。
【０００８】
そこで、本発明は、固形腫瘍抗原を標的抗原とする新規ＣＡＲ、及び固形腫瘍に対して有効なＣＡＲ−Ｔ細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は以下の態様を含む。
（１）標的抗原結合領域と、膜貫通領域と、Ｔ細胞活性化シグナル伝達領域とを含み、前記標的抗原がガングリオシドＧＭ２である、キメラ抗原受容体。
（２）前記標的抗原結合領域が、抗ガングリオシドＧＭ２抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む、（１）に記載のキメラ抗原受容体。
（３）前記抗ガングリオシドＧＭ２抗体が、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される抗体である、（２）に記載のキメラ抗原受容体：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含み、かつガングリオシドＧＭ２に対する結合能を有する抗体；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号４に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域と、を含み、かつガングリオシドＧＭ２に対する結合能を有する抗体；並びに
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号４に記載のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域と、を含み、かつガングリオシドＧＭ２に対する結合能を有する抗体。
（４）前記重鎖可変領域が配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む、（３）に記載のキメラ抗原受容体。
（５）前記抗ガングリオシドＧＭ２抗体が、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である、（２）〜（４）のいずれか１つに記載のキメラ抗原受容体。
（６）前記ｓｃＦｖが、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるポリペプチドである、（５）に記載のキメラ抗原受容体：
（ａ）配列番号１０、１２、１４及び１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号１０、１２、１４及び１６からなる群より選択されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつガングリオシドＧＭ２に対する結合能を有するポリペプチド；並びに
（ｃ）配列番号１０、１２、１４及び１６からなる群より選択されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなり、かつガングリオシドＧＭ２に対する結合能を有するポリペプチド。
（７）前記膜貫通領域がＣＤ８の膜貫通領域である、（１）〜（６）のいずれか１つに記載のキメラ抗原受容体。
（８）前記ＣＤ８の膜貫通領域が、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるポリペプチドを含む、（７）に記載のキメラ抗原受容体：
（ａ）配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号２０に記載のアミノ酸配列と、７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通能を有するポリペプチド；並びに
（ｃ）配列番号２０に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通能を有するポリペプチド。
（９）Ｔ細胞活性化シグナル伝達領域が、ＣＤ３ζのＴ細胞活性化シグナル伝達領域である、（１）〜（８）のいずれか１つに記載のキメラ抗原受容体。
（１０）前記ＣＤ３ζのＴ細胞活性化シグナル伝達領域が、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるポリペプチドを含む、（９）に記載のキメラ抗原受容体：
（ａ）配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号２８に記載のアミノ酸配列と、７０％以上の配列同一性（相同性）を有するアミノ酸配列からなり、かつＴ細胞活性化シグナル伝達能を有するポリペプチド；並びに
（ｃ）配列番号２８に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなり、かつＴ細胞活性化シグナル伝達領域能を有するポリペプチド。
（１１）前記Ｔ細胞活性化シグナル伝達領域が、さらに、ＣＤ２８のＴ細胞活性化シグナル伝達領域及び４−１ＢＢのＴ細胞活性化シグナル伝達領域の少なくとも一方を含む、（９）又は（１０）に記載のキメラ抗原受容体。
（１２）前記ＣＤ２８のＴ細胞活性化シグナル伝達領域が、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるポリペプチドを含む、（１１）に記載のキメラ抗原受容体：
（ａ）配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号２４に記載のアミノ酸配列と、７０％以上の配列同一性（相同性）を有するアミノ酸配列からなり、かつＴ細胞活性化シグナル伝達能を有するポリペプチド；並びに
（ｃ）配列番号２４に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなり、かつＴ細胞活性化シグナル伝達領域能を有するポリペプチド。
（１３）前記４−１ＢＢのＴ細胞活性化シグナル伝達領域が、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるポリペプチドを含む、（１１）に記載のキメラ抗原受容体：
（ａ）配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号２６に記載のアミノ酸配列と、７０％以上の配列同一性（相同性）を有するアミノ酸配列からなり、かつＴ細胞活性化シグナル伝達能を有するポリペプチド；並びに
（ｃ）配列番号２６に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなり、かつＴ細胞活性化シグナル伝達領域能を有するポリペプチド。
（１４）前記Ｔ細胞活性化シグナル伝達領域が、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、及びＣＤ３ζのＴ細胞活性化シグナル伝達領域を含み、Ｎ末端側からＣＤ２８、４−１ＢＢ、及びＣＤ３ζの順に配置されている、（１１）〜（１３）のいずれか１つに記載のキメラ抗原受容体。
（１５）（１）〜（１４）のいずれか１つに記載のキメラ抗原受容体を発現する細胞。
（１６）ＩＬ−７及びＣＣＬ１９の少なくとも一方をさらに発現する、（１５）に記載の細胞。
（１７）ＩＬ−７及びＣＣＬ１９の両方を発現する、（１６）に記載の細胞。
（１８）前記ＩＬ−７が、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるポリペプチドを含む、（１６）又は（１７）に記載の細胞：
（ａ）配列番号５９に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号５９に記載のアミノ酸配列と、７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｔ細胞の免疫機能促進機能を有するポリペプチド；並びに
（ｃ）配列番号５９に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなり、Ｔ細胞の免疫機能促進機能を有するポリペプチド。
（１９）前記ＣＣＬ１９が、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるポリペプチドを含む、（１６）〜（１８）のいずれか１つに記載の細胞：
（ａ）配列番号６１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号６１に記載のアミノ酸配列と、７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｔ細胞の免疫機能促進機能を有するポリペプチド；並びに
（ｃ）配列番号６１に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなり、Ｔ細胞の免疫機能促進機能を有するポリペプチド。
（２０）前記細胞が免疫細胞である、（１５）〜（１９）のいずれか１つに記載の細胞。
（２１）前記免疫細胞がＴ細胞である、（２０）に記載の細胞。
（２２）（１）〜（１４）のいずれか１つに記載のキメラ抗原受容体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（２３）ＩＬ−７をコードする塩基配列及びＣＣＬ１９をコードする塩基配列の少なくとも一方をさらに含む、（２２）に記載のポリヌクレオチド。
（２４）ＩＬ−７をコードする塩基配列及びＣＣＬ１９をコードする塩基配列の両方を含む、（２３）に記載のポリヌクレオチド。
（２５）（１）〜（１４）のいずれか１つに記載のキメラ抗原受容体をコードする塩基配列を含むベクター。
（２６）ＩＬ−７をコードする塩基配列及びＣＣＬ１９をコードする塩基配列の少なくとも一方をさらに含む、（２５）に記載のベクター。
（２７）ＩＬ−７をコードする塩基配列及びＣＣＬ１９をコードする塩基配列の両方を含む、（２６）に記載のベクター。
（２８）（１）〜（１４）のいずれか１つに記載のキメラ抗原受容体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド又はベクターを細胞に導入することを含む、キメラ抗原受容体を発現する細胞の製造方法。
（２９）ＩＬ−７をコードする塩基配列及びＣＣＬ１９をコードする塩基配列の少なくとも一方を含むポリヌクレオチド又はベクターを、さらに細胞に導入することを含む、（２８）に記載のキメラ抗原受容体を発現する細胞の製造方法。
（３０）ＩＬ−７をコードする塩基配列及びＣＣＬ１９をコードする塩基配列の両方を含むポリヌクレオチド又はベクターを、細胞に導入することを含む、（２９）に記載のキメラ抗原受容体を発現する細胞の製造方法。
（３１）（１５）〜（２０）のいずれか１つに記載の細胞を含む医薬組成物。
（３２）腫瘍を治療または予防するための医薬組成物である、（３１）に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、固形腫瘍抗原を標的抗原とする新規ＣＡＲ、及び固形腫瘍に対して有効なＣＡＲ−Ｔ細胞が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】抗ＧＭ２  ＣＡＲコンストラクトを示す模式図である。
【図１Ｂ】ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現−抗ＧＭ２ＣＡＲベクター、及び前記ベクターが導入された抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を示す模式図である。
【図２】抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞におけるＣＡＲの発現レベルをフローサイトメトリーで確認した結果を示す図である。左図は非遺伝子導入Ｔ細胞、右図は抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞での結果である。
【図３】抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現Ｔ細胞の培養上清中のＩＬ−７及びＣＣＬ１９の濃度を、ＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す図である。図中、「ＧＭ２  ＣＡＲ」は抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を表し、「ｎｏｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」は非遺伝子導入Ｔ細胞を表す（以降の図において同様）。
【図４】抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を用いた腫瘍細胞傷害性試験及び共培養試験の試験スケジュールを示す図である。
【図５Ａ】４種類の抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を用いたクロム放出試験の結果を示す図である。図５Ａは悪性中皮腫細胞株（Ｙ−ｍｅｓｏ８Ａ、ＭＳＴＯ２１１Ｈ）をターゲット細胞とした試験の結果である。図中、「ＶＬ１５ＶＨ」、「ＶＬ２５ＶＨ」、「ＶＨ１５ＶＬ」及び「ＶＨ２５ＶＬ」は、それぞれ、当該配列を抗ＧＭ２  ＣＡＲのｓｃＦｖ配列として含む抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞での結果を示す（以降の図において同様）。
【図５Ｂ】４種類の抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を用いたクロム放出試験の結果を示す図である。図５Ｂは骨髄腫細胞株（ＫＭＳ−１１、ＫＭＳ−２８ＰＥ）をターゲット細胞とした試験の結果である。
【図６Ａ】抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞とコントロールＣＡＲ−Ｔ細胞のクロム放出試験の結果の比較を示す図である。図６Ａは悪性中皮腫細胞株（Ｙ−ｍｅｓｏ８Ａ）をターゲット細胞とした試験の結果である。図中、「ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−Ｔ」は、陰性コントロールとして用いた抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−Ｔ細胞を表す（以降の図において同様）。
【図６Ｂ】抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞とコントロールＣＡＲ−Ｔ細胞のクロム放出試験の結果の比較を示す図である。図６Ｂは骨髄腫細胞株（ＫＭＳ１１）をターゲット細胞とした試験の結果である。、
【図６Ｃ】抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞とコントロールＣＡＲ−Ｔ細胞のクロム放出試験の結果の比較を示す図である。図６Ｃは大腸がん細胞株（ＳＷ４８０）をターゲット細胞とした試験の結果である。
【図７】ＧＭ２陽性の悪性中皮腫細胞株（Ｙ−ｍｅｓｏ８Ａ）と抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞又はコントロール細胞の共培養試験の結果を示す図である。図中、「ｔｕｍｏｒ  ｏｎｌｙ」は、腫瘍細胞のみを培養したものである（以降の図において同様）。
【図８】ＧＭ２陽性の悪性中皮腫細胞株（ＭＳＴＯ２２１Ｈ）と抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞又はコントロール細胞の共培養試験の結果を示す図である。
【図９】ＧＭ２陰性の大腸がん細胞株（ＳＷ４８０）と抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞又はコントロール細胞の共培養試験の結果を示す図である。
【図１０】各腫瘍細胞株と抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞又はコントロール細胞との共培養試験の培養上清中のＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡで測定した結果を示す図である。
【図１１Ａ】Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを発現するＭＳＴＯ２１１Ｈを胸腔内投与された免疫不全マウスに、抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞又は非遺伝子導入Ｔ細胞を投与したときの腫瘍増殖推移を示す図である。
【図１１Ｂ】Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを発現するＭＳＴＯ２１１Ｈを腹腔内投与された免疫不全マウスに、抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞又は非遺伝子導入Ｔ細胞を投与したときの腫瘍増殖推移を示す図である。
【図１２】Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを発現するＭＳＴＯ２１１Ｈを胸腔内投与された免疫不全マウスに、抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞または非遺伝子導入Ｔ細胞を投与したときの腫瘍増殖推移を解析した結果を示す図である。
【図１３】Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを発現するＭＳＴＯ２１１Ｈを胸腔内投与された免疫不全マウスに、抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞、抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現Ｔ細胞または非遺伝子導入Ｔ細胞を投与したときの腫瘍増殖推移を解析した結果を示す図である。図中、「×」はマウスが死亡したことを示す。
【図１４】Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを発現するＭＳＴＯ２１１Ｈを胸腔内投与された免疫不全マウスに、抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞、抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現Ｔ細胞または非遺伝子導入Ｔ細胞を投与したときの腫瘍増殖推移への効果を解析した結果を示す図である。
【図１５】Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを発現するＭＳＴＯ２１１Ｈを胸腔内投与された免疫不全マウスに、抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞、抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現Ｔ細胞または非遺伝子導入Ｔ細胞を投与したときのマウス生存率への効果を解析した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明により提供されるポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び細胞は、単離された状態であり得る。すなわち、本明細書において記載するポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び細胞は、単離されたポリペプチド、単離されたポリヌクレオチド、単離されたベクター、及び単離された細胞であり得る。
【００１３】
［キメラ抗原受容体（抗ＧＭ２  ＣＡＲ）］
１実施形態において、本発明は、標的抗原結合領域と、膜貫通領域と、Ｔ細胞活性化シグナル伝達領域とを含み、前記標的抗原がガングリオシドＧＭ２である、キメラ抗原受容体を提供する。
【００１４】
本明細書において、「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」とは、標的抗原結合領域と、膜貫通領域と、Ｔ細胞活性化シグナル伝達領域とを含む、キメラタンパク質を意味する。なお、キメラタンパク質とは、２種以上の異種タンパク質由来の配列を含むタンパク質を意味する。ＣＡＲは、上記３つの領域のみを含むものに限定されず、他の領域を含むものも包含する。
【００１５】
＜標的抗原結合領域＞
本実施形態のＣＡＲは、標的抗原がガングリオシドＧＭ２（以下、単に「ＧＭ２」ともいう。）である、標的抗原結合領域を含む。
【００１６】
「標的抗原結合領域」とは、ＣＡＲがＴ細胞で発現したときに、細胞外において標的抗原に結合する細胞外領域を意味する。ＣＡＲ−Ｔ細胞において発現したＣＡＲは、細胞膜に移行し、細胞外に位置する標的抗原結合領域と、細胞内に位置するＴ細胞活性化シグナル伝達領域とが、細胞膜を貫通する膜貫通領域を介して、連結されている状態となる。ＣＡＲ−Ｔ細胞が、標的抗原を膜抗原として有する細胞に接すると、標的抗原結合領域が当該標的抗原に結合し、これによりＴ細胞活性化シグナル伝達領域から、Ｔ細胞内にＴ細胞活性化シグナルが伝達されて、Ｔ細胞が活性化される。
【００１７】
本実施形態のＣＡＲにおいて、標的抗原結合領域が結合する標的抗原はＧＭ２である。
ＧＭ２は、シアル酸を有する糖脂質であるガングリオシドの一種である。ガングリオシドは、動物の細胞膜を構成しており、親水性側鎖である糖鎖と、疎水性側鎖であるスフィンゴシン及び脂肪酸から構成される分子である。ガングリオシドは、シアル酸の結合型、結合数、並びに非還元末端に結合するＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）及びガラクトース（Ｇａｌ）の結合の有無により分類される。ＧＭ２は、ＧａｌＮＡｃβ１−４（ＳＡα２−３）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１  Ｃｅｒａｍｉｄｅの糖鎖構造を有するガングリオシドの１つである。
【００１８】
ガングリオシドの種類と発現量は、細胞種、臓器種、動物種等によって異なっており、細胞ががん化する過程においてガングリオシドの発現が量的及び質的に変化することが知られている（Cancer Res 45:2405-14(1985)）。ＧＭ２は、正常細胞ではほとんど発現が認められないが、肺がん、神経芽腫、神経膠腫、メラノーマ、悪性中皮腫、骨髄腫などの腫瘍で発現することが報告されている（Cancer Res 45:2405-14(1985); Cancer Res 50:7444-9(1990); Cancer Sci vol.102 no.12:2157-2163; Cancer Sci vol.106 no.1:102-107(2015)）。
【００１９】
標的抗原結合領域は、ＧＭ２に特異的に結合可能なものであれば特に限定されないが、ＧＭ２に特異的に結合可能なモノクローナル抗体（以下、「抗ＧＭ２抗体」ともいう。）の抗原結合領域を含むことが好ましい。抗体の「抗原結合領域」とは、抗体において抗原との結合に関与する領域を指し、具体的には、相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）を含む領域を指す。抗体の抗原結合領域は、当該抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含む。好ましい態様において、抗体の抗原結合領域は、当該抗体の６つのＣＤＲをすべて含む。なお、ＣＤＲは、ＣＤＲの定義として知られる任意の定義で決定することができ、例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、ｃｏｔａｃｔ等による定義を用いることができる。好ましくは、Ｋａｂａｔの定義によるＣＤＲを挙げることができる。
【００２０】
標的抗原結合領域に使用可能な抗ＧＭ２抗体は、特に限定されず、公知のものであってもよく、新たに作製したものであってもよい。抗ＧＭ２抗体を新たに作製する場合、抗ＧＭ２抗体の作製は、公知の方法で行えばよい。例えば、動物をＧＭ２で免疫してハイブリドーマを得る方法、ファージディスプレイ法等を用いることができる。
【００２１】
抗ＧＭ２抗体が由来する生物は、特に限定されないが、ヒト抗体であることが好ましい。ヒト抗ＧＭ２抗体の例としては、配列番号２に記載のアミノ酸配列を重鎖可変（ＶＨ）領域として有し、配列番号４に記載のアミノ酸配列を軽鎖可変（ＶＬ）領域として有する抗体等を挙げることができる。配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＶＨ領域のＫａｂａｔの定義によるＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号６３〜６５に示す。また、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＶＬ領域のＫａｂａｔの定義によるＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号６６〜６８に示す。
【００２２】
好ましい態様において、標的抗原結合領域は、抗ＧＭ２抗体のＶＨ領域とＶＬ領域とを含むものであることができる。例えば、抗ＧＭ２抗体のＶＨ領域とＶＬ領域とを含む一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含むポリペプチドは、標的抗原結合領域の好適な例である。ｓｃＦｖは、抗体のＶＨ領域とＶＬ領域とをペプチドリンカーで連結したポリペプチドであり、ＣＡＲの標的抗原結合領域として、一般的に用いられている。
【００２３】
ｓｃＦｖを用いる場合、ＶＨ領域とＶＬ領域とを連結するペプチドリンカーは、特に限定されず、ｓｃＦｖに一般的に用いられているものを使用すればよい。ペプチドリンカーの例としては、例えば、リンカー１５（配列番号６）、リンカー２５（配列番号８）等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００２４】
ｓｃＦｖに用いるＶＨ領域とＶＬ領域は、抗ＧＭ２抗体のＶＨ領域とＶＬ領域を用いればよい。抗ＧＭ２抗体の好適な例は、上記したとおりである。また、ｓｃＦｖに用いるＶＨ領域とＶＬ領域は、ＧＭ２に対する結合能を維持する限り、一部の配列を改変したものであってもよい。例えば、ｓｃＦｖとしては、以下のようなものを好適に用いることができる。
（１ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＶＨ領域のＣＤＲ１〜３を含むＶＨ領域と、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＶＬ領域のＣＤＲ１〜３を含むＶＬ領域と、を含み、ＧＭ２に対する結合能を有するｓｃＦｖ。
（１ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＶＨ領域と、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＶＬ領域と、を含み、ＧＭ２に対する結合能を有するｓｃＦｖ。
（１ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなるＶＨ領域と、配列番号４に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなるＶＬ領域と、を含み、ＧＭ２に対する結合能を有するｓｃＦｖ。
（１ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性（相同性）を有するアミノ酸配列からなるＶＨ領域と、配列番号４に記載のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性（相同性）を有するアミノ酸配列からなるＶＬ領域と、を含み、ＧＭ２に対する結合能を有するｓｃＦｖ。
【００２５】
上記（１ａ）において、ＣＤＲ以外の配列（フレームワーク配列）は、既知のヒト抗体のフレームワーク配列を用いることが好ましい。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知の配列データベースに登録されているヒト抗体のアミノ酸配列のフレームワーク配列、ヒト抗体の各サブグループに由来する共通配列(Human Most Homologous Consensus Sequence；Kabat, E. A.らのSequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）から選択されたアミノ酸配列等から選択することができる。
【００２６】
上記（１ｃ）において、「複数個」は、例えば、２〜３０個であることができ、２〜２０個であることが好ましく、２〜１０個であることがより好ましく、２〜５個であることがさらに好ましい。また、「変異」は、欠失、置換、付加、及び挿入のいずれであってもよく、これらの組合せであってもよい。また、変異の位置は、ＣＤＲ１〜３以外の領域（すなわち、フレームワーク領域）であることが好ましい。
【００２７】
上記（１ｄ）において、配列同一性は、７０％以上である限り、特に限定されないが、８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがさらにより好ましく、６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であることが特に好ましい。なお、アミノ酸配列同士の配列同一性（相同性）は、２つのアミノ酸配列を、対応するアミノ酸が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くアミノ酸配列全体に対する一致したアミノ酸の割合として求められる。アミノ酸配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。例えば、アミノ酸配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＰにより得られたアライメントを元にした計算によって得ることができる。
【００２８】
ｓｃＦｖの具体例としては、例えば、配列番号１０、１２、１４及び１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；配列番号１０、１２、１４及び１６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１０、１２、１４及び１６からなる群より選択されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなり、かつＧＭ２に対する結合能を有するポリペプチド；配列番号１０、１２、１４及び１６からなる群より選択されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性（相同性）を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＭ２に対する結合能を有するポリペプチド等を挙げることができる。なお、「複数個」及び「変異」については、上述と同様である。また、「配列同一性」についても、上述と同様である。
【００２９】
＜膜貫通領域＞
「膜貫通領域」とは、ＣＡＲがＴ細胞で発現したときに、細胞膜を貫通して存在し、細胞外領域と細胞内領域とを連結する領域を意味する。膜貫通領域は、細胞膜を貫通する機能を有するポリペプチドであれば特に限定されない。膜貫通領域は、天然タンパク質に由来するものであってもよく、人為的に設計したものであってもよい。天然タンパク質に由来する膜貫通領域は、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質から取得することができる。好ましい態様において、膜貫通領域は、標的抗原結合領域に対する標的抗原の結合に対応して、Ｔ細胞活性化シグナル伝達領域に活性化シグナルを伝達することができる。
【００３０】
膜貫通領域としては、例えば、Ｔ細胞受容体のα鎖及びβ鎖、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、ＧＩＴＲ等の膜貫通領域を挙げることができる。好ましい例としては、ＣＤ８の膜貫通領域を挙げることができる。これらのタンパク質が由来する生物は、特に限定されないが、ヒトであることが好ましい。これらのタンパク質のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知の配列データベースから入手可能である。例えば、ヒトＣＤ８のアミノ酸配列の例としては、ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＭ＿００１７６８．６として登録されたもの等を挙げることができ、膜貫通領域のアミノ酸配列としては、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を挙げることができる。
【００３１】
また、膜貫通領域は、上記のような天然タンパク質由来の膜貫通領域の変異体であってもよい。天然タンパク質由来の膜貫通領域の変異体の例としては、例えば、以下のようなものを挙げることができる。
（２ａ）天然タンパク質由来の膜貫通領域のアミノ酸配列（例、配列番号２０）と、７０％以上の配列同一性（相同性）を有するアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通能を有するポリペプチド。
（２ｂ）天然タンパク質由来の膜貫通領域のアミノ酸配列（例、配列番号２０）において、１又は複数個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通能を有するポリペプチド。
【００３２】
上記（２ａ）において、配列同一性は、７０％以上である限り、特に限定されないが、８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることが特に好ましい。
【００３３】
上記（２ｂ）において、「複数個」は、例えば、２〜１０個であることができ、２〜５個であることが好ましく、２〜４個であることがより好ましく、２又は３個であることがさらに好ましい。また、「変異」は、欠失、置換、付加、及び挿入のいずれであってもよく、これらの組合せであってもよい。
【００３４】
＜Ｔ細胞活性化シグナル伝達領域＞
「Ｔ細胞活性化シグナル伝達領域」とは、ＣＡＲがＴ細胞で発現したときに、細胞内に位置し、Ｔ細胞内にＴ細胞活性化シグナルを伝達する領域を意味する。Ｔ細胞においては、Ｔ細胞受容体（Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＣＲ）にＭＨＣ・ペプチド複合体が結合すると、ＴＣＲ・ＣＤ３複合体を介して細胞内にＴ細胞活性化シグナルが伝達され、様々なリン酸化シグナルが惹起される（一次シグナル伝達）。また、Ｔ細胞の細胞表面上に発現する共刺激分子は、抗原提示細胞の細胞表面上に発現する各共刺激分子に特異的なリガンドとの結合により、細胞内に共刺激シグナルを伝達し、Ｔ細胞の活性化を補助することが知られている（二次シグナル伝達）。
本明細書において、「Ｔ細胞活性化シグナル伝達」とは、前記一次シグナル伝達及び二次シグナル伝達の両方を包含する。また、「Ｔ細胞活性化シグナル伝達領域」とは、前記一次シグナル伝達及び二次シグナル伝達に関与するタンパク質の、当該シグナル伝達に関与する細胞内領域を意味する。
【００３５】
Ｔ細胞活性化シグナル伝達領域は、Ｔ細胞活性化シグナル伝達に関与するタンパク質のＴ細胞活性化シグナル伝達領域であれば、特に限定されない。例えば、一次シグナル伝達には、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ：ＩＴＡＭ）が関与することが知られている。そのため、Ｔ細胞活性化シグナル伝達領域の例としては、ＩＴＡＭを有するタンパク質のＴ細胞活性化シグナル伝達領域を挙げることができる。ＩＴＡＭを有するタンパク質の例としては、例えば、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄ等を挙げることができる。これらのタンパク質のＩＴＡＭを含むＴ細胞活性化シグナル伝達領域は、ＣＡＲに用いるＴ細胞活性化シグナル伝達領域の好ましい例である。より好ましい例としては、ＣＤ３ζ等のＴ細胞活性化シグナル伝達領域を挙げることができる。
【００３６】
また、二次シグナル伝達には、上記のとおり共刺激分子が関与する。そのため、Ｔ細胞活性化シグナル伝達領域の例としては、共刺激分子のシグナル伝達領域も挙げることができる。共刺激分子の例としては、例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＯＸＯ４０（ＣＤ１３４）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ，ＣＤ１５４、ＨＶＥＭ、ＧＩＴＲ、Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  γｃｈａｉｎ等を挙げることができる。これらのタンパク質のＴ細胞活性化シグナル伝達領域もまた、ＣＡＲに用いるＴ細胞活性化シグナル伝達領域の好ましい例である。より好ましい例としては、ＣＤ２８、４−１ＢＢ等のＴ細胞活性化シグナル伝達領域を挙げることができる。
【００３７】
上記のタンパク質が由来する生物は、特に限定されないが、ヒトであることが好ましい。なお、これらのタンパク質のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知の配列データベースから入手可能である。例えば、ヒトＣＤ３ζのアミノ酸配列の例としては、ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＭ＿０００７３４．３として登録されたもの等を挙げることができ、Ｔ細胞活性化シグナル伝達領域のアミノ酸配列としては、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を挙げることができる。また、ヒトＣＤ２８のアミノ酸配列の例としては、ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＭ＿００６１３９．２として登録されたもの等を挙げることができ、Ｔ細胞活性化シグナル伝達領域のアミノ酸配列としては、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を挙げることができる。また、ヒト４−１ＢＢのアミノ酸配列の例としては、ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＭ＿００１５６１．５として登録されたもの等を挙げることができ、Ｔ細胞活性化シグナル伝達領域のアミノ酸配列としては、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を挙げることができる。
【００３８】
また、Ｔ細胞活性化シグナル伝達領域は、上記のような天然タンパク質由来のＴ細胞活性化シグナル伝達領域の変異体であってもよい。天然タンパク質由来の活性化シグナル伝達領域の変異体の例としては、例えば、以下のようなものを挙げることができる。
（３ａ）天然タンパク質由来のＴ細胞活性化シグナル伝達領域のアミノ酸配列（例、配列番号２４、２６、２８）と、７０％以上の配列同一性（相同性）を有するアミノ酸配列からなり、かつＴ細胞活性化シグナル伝達能を有するポリペプチド。
（３ｂ）天然タンパク質由来のＴ細胞活性化シグナル伝達領域のアミノ酸配列（例、配列番号２４、２６、２８）において、１又は複数個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなり、かつＴ細胞活性化シグナル伝達能を有するポリペプチド。
【００３９】
上記（３ａ）において、配列同一性は、７０％以上である限り、特に限定されないが、８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることが特に好ましい。
【００４０】
上記（３ｂ）において、「複数個」は、例えば、一次シグナル伝達に関与するタンパク質のものを用いる場合には、２〜３０個であることができ、２〜２０個であることが好ましく、２〜１０個であることがより好ましく、２〜５個であることがさらに好ましい。また、例えば、共刺激分子のものを用いる場合には、「複数個」は、２〜１５個であることができ、２〜１０個であることが好ましく、２〜５個であることがより好ましく、２又は３個であることがさらに好ましい。また、「変異」は、欠失、置換、付加、及び挿入のいずれであってもよく、これらの組合せであってもよい。
【００４１】
本実施形態のＣＡＲが含むＴ細胞活性化シグナル伝達領域の数は、１つに限定されず、複数のＴ細胞活性化シグナル伝達領域を含むこともできる。この場合、複数のＴ細胞活性化シグナル伝達領域は、同じものであってもよいし、異なるものであってもよい。好ましい態様では、ＣＡＲは、Ｔ細胞活性化シグナル伝達領域を２個以上含む。この場合、ＣＡＲが含むＴ細胞活性化シグナル伝達領域は、一次シグナル伝達に関与するＴ細胞活性化シグナル伝達領域と、二次シグナル伝達に関与するＴ細胞活性化シグナル伝達領域との組み合わせであることが好ましい。具体例としては、ＣＤ３ζとＣＤ２８のＴ細胞活性化シグナル伝達領域の組合せ、ＣＤ３ζと４−１ＢＢのＴ細胞活性化シグナル伝達領域の組合せ、ＣＤ３ζとＣＤ２８と４−１ＢＢのＴ細胞活性化シグナル伝達領域の組合せ等を挙げることができる。
【００４２】
なお、一次シグナル伝達に関与するＴ細胞活性化シグナル伝達領域と、二次シグナル伝達に関与するＴ細胞活性化シグナル伝達領域とを組み合わせる場合、一次シグナル伝達に関与するＴ細胞活性化シグナル伝達領域をＣ末端側に配置することが好ましい。上記の具体例では、ＣＤ３ζのＴ細胞活性化シグナル伝達領域を、ＣＤ２８や４−１ＢＢのＴ細胞活性化シグナル伝達領域よりもＣ末端側に配置することが好ましい。ＣＤ２８と４−１ＢＢをともに用いる場合、いずれの配置順でもよいが、Ｎ末端側からＣＤ２８、４−１ＢＢの順に配置する例が挙げられる。
【００４３】
Ｔ細胞活性化シグナル伝達領域を１つだけ用いる場合には、一次シグナル伝達に関与するＴ細胞活性化シグナル伝達領域を用いることが好ましく、ＣＤ３ζのＴ細胞活性化シグナル伝達領域を用いることがより好ましい。
【００４４】
＜その他の領域＞
本実施形態のＣＡＲは、上記の領域に加えて、他の領域を含むこともできる。他の領域の例としては、細胞外ヒンジ領域、細胞質領域、スペーサー領域、シグナルペプチド等を挙げることができる。
【００４５】
（細胞外ヒンジ領域）
「細胞外ヒンジ領域」とは、細胞外の標的抗原結合領域と膜貫通領域とを連結する領域を意味する。好ましい態様において、本実施形態のＣＡＲは、細胞外ヒンジ領域を含む。
細胞外ヒンジ領域は、標的抗原結合領域と膜貫通領域とを連結できるものであれば特に限定されない。天然タンパク質に由来するものであってもよく、人為的に設計されたものであってもよい。細胞外ヒンジ領域は、例えば、１〜１００個程度のアミノ酸、好ましくは１０〜７０個程度のアミノ酸で構成することができる。細胞外ヒンジ領域は、標的抗原結合領域のＧＭ２結合能を妨げず、かつＴ細胞活性化シグナル伝達領域によるシグナル伝達を妨げないものであることが好ましい。
【００４６】
細胞外ヒンジ領域としては、例えば、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４等の細胞外ヒンジ領域を挙げることができる。また、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ４等）のヒンジ領域を使用してもよい。好ましい例としては、ＣＤ８の細胞外ヒンジ領域を挙げることができる。
【００４７】
上記のタンパク質が由来する生物は、特に限定されないが、ヒトであることが好ましい。なお、これらのタンパク質のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知の配列データベースから入手可能である。ヒトＣＤ８のアミノ酸配列の例としては上記のものを挙げることができ、細胞外ヒンジ領域のアミノ酸配列としては、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を挙げることができる。
【００４８】
また、細胞外ヒンジ領域は、上記のような天然タンパク質由来の細胞外ヒンジ領域の変異体であってもよい。天然タンパク質由来の細胞外ヒンジ領域の変異体の例としては、例えば、以下のようなものを挙げることができる。
（４ａ）天然タンパク質由来の細胞外ヒンジ領域のアミノ酸配列（例、配列番号１８）と、７０％以上の配列同一性（相同性）を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（４ｂ）天然タンパク質由来の細胞外ヒンジ領域のアミノ酸配列（例、配列番号１８）において、１又は複数個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００４９】
上記（４ａ）において、配列同一性は、７０％以上である限り、特に限定されないが、８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることが特に好ましい。
【００５０】
上記（４ｂ）において、「複数個」は、例えば、２〜２０個であることができ、２〜１５個であることが好ましく、２〜１０個であることがより好ましく、２〜５個であることがさらに好ましい。また、「変異」は、欠失、置換、付加、及び挿入のいずれであってもよく、これらの組合せであってもよい。
【００５１】
（細胞質領域）
「細胞質領域」とは、膜貫通タンパク質において、膜貫通領域の細胞質側末端に隣接する領域であり、３〜５０個程度のアミノ酸からなる領域である。好ましい態様において、本実施形態のＣＡＲは、細胞質領域を含む。細胞質領域は、膜貫通タンパク質の膜貫通領域の細胞質側に隣接する領域であれば特に限定されない。細胞質領域を介して、膜貫通領域とＴ細胞活性化シグナル伝達領域とを連結することにより、膜貫通領域の構造を安定させることができる。細胞質領域は、天然タンパク質に由来するものであってもよく、人為的に設計されたものであってもよい。細胞質領域は、例えば、３〜５０個程度のアミノ酸、好ましくは４〜２０個程度のアミノ酸、より好ましくは５〜１０個程度のアミノ酸で構成することができる。細胞質領域は、膜貫通領域と同じタンパク質に由来するものであることが好ましい。膜貫通領域と同じタンパク質に由来する細胞質領域を用いることにより、膜貫通領域の構造をより安定に保つことができる。
【００５２】
細胞質領域としては、例えば、上記膜貫通領域で挙げたタンパク質の細胞質領域を挙げることができる。好ましい例としては、ＣＤ８の細胞質領域を挙げることができる。これらのタンパク質が由来する生物は、特に限定されないが、ヒトであることが好ましい。細胞質領域のアミノ酸配列としては、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を挙げることができる。
【００５３】
また、細胞質領域は、上記のような天然タンパク質由来の細胞質領域の変異体であってもよい。天然タンパク質由来の細胞質領域の変異体の例としては、例えば、以下のようなものを挙げることができる。
（５ａ）天然タンパク質由来の細胞質領域のアミノ酸配列（例、配列番号２２）と、７０％以上の配列同一性（相同性）を有するアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通領域安定能を有するポリペプチド。
（５ｂ）天然タンパク質由来の細胞質領域のアミノ酸配列（例、配列番号２２）において、１又は複数個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通領域安定能を有するポリペプチド。
【００５４】
上記（５ａ）において、配列同一性は、７０％以上である限り、特に限定されないが、８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることが特に好ましい。
【００５５】
上記（５ｂ）において、「複数個」は、例えば、２〜５個であることができ、２〜４個であることが好ましく、２又は３個であることがよりに好ましい。また、「変異」は、欠失、置換、付加、及び挿入のいずれであってもよく、これらの組合せであってもよい。
【００５６】
（スペーサー領域）
「スペーサー領域」とは、タンパク質の２つの機能領域（ドメイン）を連結する短いペプチドである。一態様において、本実施形態のＣＡＲは、上記の標的抗原結合領域、膜貫通領域、Ｔ細胞活性化シグナル伝達領域等の各領域が、スペーサー領域を介して連結されていてもよい。スペーサー領域は、特に限定されず、キメラタンパク質の作製に一般的に用いられるものを使用すればよい。スペーサー領域の長さとしては、１〜１００アミノ酸、好ましくは１０〜５０アミノ酸を挙げることができる。スペーサー領域の例としては、グリシン−セリン連続配列等を挙げることができる。
【００５７】
（シグナルペプチド）
「シグナルペプチド」は、膜タンパク質や分泌タンパク質の局在化を指示するペプチドである。一態様において、本実施形態のＣＡＲは、シグナルペプチドを含み得る。シグナルペプチドは、一般的に、膜タンパク質のＮ末端に存在する５〜６０個程度のアミノ酸からなるペプチドであり、局在化の完了した成熟タンパク質では除去されている。
【００５８】
本実施形態のＣＡＲに用いるシグナルペプチドは、細胞膜への局在化を指示するシグナルペプチドであることが好ましく、膜タンパク質のシグナルペプチドであることが好ましい。シグナルペプチドの例としては、Ｔ細胞受容体のα鎖及びβ鎖、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、ＧＩＴＲ、イムノグロブリン重鎖、イムノグロブリン軽鎖等のシグナルペプチドを挙げることができる。シグナルペプチドのアミノ酸配列の具体例としては、配列番号５７に記載のアミノ酸配列を挙げることができる。
【００５９】
本実施形態のＣＡＲにおいて、上記の各領域は、Ｎ末端から、標的抗原結合領域、膜貫通領域、Ｔ細胞活性化シグナル伝達領域の順に配置することができる。これらの各領域は、互いに直接連結されていてもよく、他の領域やスペーサー配列等を介して連結されていてもよい。
【００６０】
本実施形態のＣＡＲが細胞外ヒンジ領域を含む場合、細胞外ヒンジ領域は、標的抗原結合領域と膜貫通領域との間に配置される。また、本実施形態のＣＡＲが細胞質領域を含む場合、細胞質領域は、膜貫通領域とＴ細胞活性化シグナル伝達領域との間に配置される。
また、本実施形態のＣＡＲがシグナルペプチドを含む場合、シグナルペプチドは、ＣＡＲのＮ末端に配置される。
【００６１】
本実施形態のＣＡＲの具体例としては、抗ＧＭ２抗体のｓｃＦｖを含む標的抗原結合領域、ＣＤ８の膜貫通領域（又はその変異体）、ＣＤ２８のＴ細胞活性化シグナル伝達領域（又はその変異体）、４−１ＢＢのＴ細胞活性化シグナル伝達領域（又はその変異体）、及びＣＤ３ζのＴ細胞活性化シグナル伝達領域（又はその変異体）を含むＣＡＲを挙げることができる。より好ましい例としては、抗ＧＭ２抗体のｓｃＦｖを含む標的抗原結合領域、ＣＤ８の細胞外ヒンジ領域（又はその変異体）、ＣＤ８の膜貫通領域（又はその変異体）、ＣＤ８の細胞質領域（又はその変異体）、ＣＤ２８のＴ細胞活性化シグナル伝達領域（又はその変異体）、４−１ＢＢのＴ細胞活性化シグナル伝達領域（又はその変異体）、及びＣＤ３ζのＴ細胞活性化シグナル伝達領域（又はその変異体）を含むＣＡＲを挙げることができる。
【００６２】
そのようなＣＡＲとしては、例えば、配列番号４０、４２、４４、及び４６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＡＲを挙げることができる。なお、配列番号４０、４２、４４、及び４６に記載のアミノ酸配列において、１〜１９位の配列はシグナルペプチドに該当する。したがって、上記の例における成熟したＣＡＲは、それぞれ、配列番号４０に記載のアミノ酸配列の２０〜８７４位のアミノ酸配列、配列番号４２に記載のアミノ酸配列の２０〜８８４位のアミノ酸配列、配列番号４４に記載のアミノ酸配列の２０〜８７４位のアミノ酸配列、配列番号４６に記載のアミノ酸配列の２０〜８８４位のアミノ酸配列を含む。
好ましい態様において、本実施形態のＣＡＲは、配列番号４０、４２、４４、及び４６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる。また、成熟したＣＡＲは、配列番号４０に記載のアミノ酸配列の２０〜８７４位のアミノ酸配列、配列番号４２に記載のアミノ酸配列の２０〜８８４位のアミノ酸配列、配列番号４４に記載のアミノ酸配列の２０〜８７４位のアミノ酸配列、及び配列番号４６に記載のアミノ酸配列の２０〜８８４位のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる。
【００６３】
［抗ＧＭ２  ＣＡＲを発現する細胞（抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現細胞）］
１実施形態において、本発明は、上記実施形態のＣＡＲを発現する細胞を提供する。
【００６４】
本実施形態の細胞は、上記実施形態のＣＡＲ（以下、「抗ＧＭ２  ＣＡＲ」ともいう。）を発現し、細胞表面上に当該ＣＡＲを有している。ＧＭ２発現細胞において、ＧＭ２は細胞表層に多く存在している。本実施形態の細胞がＧＭ２発現細胞に接すると、抗ＧＭ２  ＣＡＲの標的抗原結合領域により、ＧＭ２発現細胞表層のＧＭ２に結合する。これにより、本実施形態の細胞が活性化されて、細胞傷害性顆粒の放出やサイトカイン産生が起こる。これら細胞傷害性顆粒やサイトカインにより、ＧＭ２発現細胞が破壊される。
【００６５】
本実施形態の細胞は、哺乳動物細胞であることが好ましく、例えば、ヒト細胞、又はマウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ブタ、サル等の非ヒト哺乳動物細胞であってよいが、ヒト細胞であることがより好ましい。細胞の種類は、特に限定されず、血液、骨髄液、脾臓、胸腺、リンパ節等から採取された細胞；原発性腫瘍、転移性腫瘍、がん性腹水などのがん組織に浸潤する免疫細胞等を挙げることができる。好ましい例としては、免疫細胞を挙げることができ、末梢血から分離された末梢血単核球等を好適に用いることができる。末梢血単核球に含まれる細胞の中でも、エフェクター細胞が好ましく、特に好ましい細胞としては、Ｔ細胞及びその前駆細胞を挙げることができる。Ｔ細胞の種類は、特に限定されず、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーT細胞、ナイーブT細胞、腫瘍浸潤Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞等のいずれのＴ細胞であってもよい。これらの中でも、ＣＤ８陽性Ｔ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞であることがより好ましい。
【００６６】
本実施形態の細胞は、抗ＧＭ２  ＣＡＲに加えて、インターロイキン（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ：ＩＬ）−７及びケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１９（Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ）Ｌｉｇａｎｄ  １９：ＣＣＬ１９）の少なくとも一方をさらに発現していることが好ましい。好ましい態様において、本実施形態の細胞は、（ｉ）抗ＧＭ２  ＣＡＲと、（ｉｉ）ＩＬ−７及びＣＣＬ１９の少なくとも一方と、を発現する細胞である。より好ましくは、本実施形態の細胞は、抗ＧＭ２  ＣＡＲと、ＩＬ−７と、ＣＣＬ１９と、を発現する細胞である。
【００６７】
ＩＬ−７は、Ｔ細胞の生存に必須のサイトカインであり、骨髄、胸腺、リンパ器官・組織のストローマ細胞などの非造血細胞によって産生されるが、Ｔ細胞での産生はほとんど認められない。
【００６８】
一方、ＣＣＬ１９は、主に、リンパ節の樹状細胞やマクロファージから産生され、その受容体であるＣＣケモカイン受容体７（Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ）Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ７：ＣＣＲ７）を介してＴ細胞やＢ細胞、成熟した樹状細胞の遊走を惹起する機能を有する。
【００６９】
ＩＬ−７及びＣＣＬ１９が由来する生物は、特に限定されないが、ヒトであることが好ましい。なお、これらのタンパク質のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知の配列データベースから入手可能である。例えば、ヒトＩＬ−７のアミノ酸配列の例としては、ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＭ＿０００８８０．３（配列番号５９）として登録されたもの等を挙げることができる。また、ヒトＣＣＬ１９のアミノ酸配列の例としては、ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＭ＿００６２７４．２（配列番号６１）として登録されたもの等を挙げることができる。なお、ＩＬ−７及びＣＣＬ１９は、シグナルペプチドを有し、成熟タンパク質では、シグナルペプチドは除去されている。例えば、配列番号５９に記載のヒトＩＬ−７のアミノ酸配列において、１〜２５位の配列はシグナルペプチドに該当する。また、例えば、配列番号６１に記載のヒトＣＣＬ１９のアミノ酸配列において、１〜２１位の配列はシグナルペプチドに該当する。
【００７０】
また、ＩＬ−７及びＣＣＬ１９は、上記のような天然タンパク質の変異体であってもよい。ＩＬ−７の変異体の例としては、例えば、以下のようなものを挙げることができる。
（６ａ）天然ＩＬ−７のアミノ酸配列（例、配列番号５９）と、７０％以上の配列同一性（相同性）を有するアミノ酸配列からなり、Ｔ細胞の免疫機能促進機能を有するポリペプチド。
（６ｂ）天然ＩＬ−７のアミノ酸配列（例、配列番号５９）において、１又は複数個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなり、Ｔ細胞の免疫機能促進機能を有するポリペプチド。
【００７１】
また、ＣＣＬ１９の変異体の例としては、例えば、以下のようなものを挙げることができる。
（７ａ）天然ＣＣＬ１９のアミノ酸配列（例、配列番号６１）と、７０％以上の配列同一性（相同性）を有するアミノ酸配列からなり、Ｔ細胞の免疫機能促進機能を有するポリペプチド。
（７ｂ）天然ＣＣＬ１９のアミノ酸配列（例、配列番号６１）において、１又は複数個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなり、Ｔ細胞の免疫機能促進機能を有するポリペプチド。
【００７２】
なお、「Ｔ細胞の免疫機能促進機能」とは、Ｔ細胞の生存、増殖、細胞傷害活性、遊走活性、腫瘍組織への浸潤活性等を維持・促進する機能を意味する。
上記（６ａ）及び（７ａ）において、配列同一性は、７０％以上である限り、特に限定されないが、８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることが特に好ましい。
また、上記（６ｂ）及び（７ｂ）において、「複数個」は、例えば、２〜３０個であることができ、２〜２０個であることが好ましく、２〜１０個であることがより好ましく、２〜５個であることがさらに好ましい。また、「変異」は、欠失、置換、付加、及び挿入のいずれであってもよく、これらの組合せであってもよい。
【００７３】
また、ＩＬ−７及びＣＣＬ１９の変異体は、これらのタンパク質のシグナルペプチドを、他のシグナルペプチドに変更したものであってもよく、シグナルペプチドを除去したものであってもよい。好ましくは、ＩＬ−７及びＣＣＬ１９の変異体は、分泌タンパク質のシグナルペプチドを有し、細胞外に分泌される。
【００７４】
本実施形態の細胞が単離されたＴ細胞である場合、抗ＧＭ２  ＣＡＲとともに、ＩＬ−７及びＣＣＬ１９の少なくとも一方を発現することにより、Ｔ細胞の免疫機能が促進され、ＧＭ２発現細胞に対する細胞傷害活性、腫瘍組織への浸潤、腫瘍微細環境での生存能力に優れたＴ細胞となり得る。
【００７５】
また、本実施形態の細胞は、抗ＧＭ２  ＣＡＲに加えて、自殺遺伝子を発現するものであってもよい。本実施形態の細胞が、自殺遺伝子を発現していることにより、必要に応じて、本実施形態の細胞にアポトーシスを誘導することが可能になる。自殺遺伝子は、特に限定されず、公知のものを用いることができる。例えば、自殺遺伝子としては、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子、誘導性カスパーゼ９（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃａｓｐａｓｅ  ９）遺伝子等を挙げることができる。ＨＳＶ−ＴＫを発現する細胞は、ガンシクロビルを共存させることにより細胞死を誘導することができる。また、誘導性カスパーゼ９を発現する細胞は、ＡＰ１９０３などの二量体誘導化合物（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ：ＣＩＤ）を共存させることにより細胞死を誘導することができる。自殺遺伝子のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知の配列データベースから入手可能である。また、市販の自殺遺伝子を含むベクター等の配列を利用することもできる。
【００７６】
本実施形態の細胞は、抗ＧＭ２  ＣＡＲを含む細胞（好ましくはＴ細胞）であるともいえる。本実施形態の細胞の好ましい例は、抗ＧＭ２  ＣＡＲと、ＩＬ−７及びＣＣＬ１９の少なくとも一方とを含む細胞（好ましくはＴ細胞）であるともいえる。本実施形態の細胞のより好ましい例は、抗ＧＭ２  ＣＡＲ、ＩＬ−７、及びＣＣＬ１９を含む細胞（好ましくはＴ細胞）であるともいえる。本実施形態の細胞のさらに好ましい例は、抗ＧＭ２  ＣＡＲ、ＩＬ−７、ＣＣＬ１９、及び自殺遺伝子を含む細胞（好ましくはＴ細胞）であるともいえる。
【００７７】
本実施形態の細胞は、後述する、抗ＧＭ２  ＣＡＲをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド又はベクターを、細胞に導入することにより得ることができる。
【００７８】
［抗ＧＭ２  ＣＡＲをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド］
１実施形態において、本発明は、抗ＧＭ２  ＣＡＲをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００７９】
本実施形態のポリヌクレオチドは、抗ＧＭ２  ＣＡＲをコードする塩基配列を含むものであれば、特に限定されない。抗ＧＭ２  ＣＡＲは、上記［キメラ抗原受容体（抗ＧＭ２  ＣＡＲ）］の項で記載したとおりである。本実施形態のポリヌクレオチドは、上記［キメラ抗原受容体（抗ＧＭ２  ＣＡＲ）］の項で例示した抗ＧＭ２  ＣＡＲのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであることが好ましい。
【００８０】
例えば、標的抗原結合領域をコードする塩基配列としては、抗ＧＭ２抗体のｓｃＦｖをコードする塩基配列を挙げることができる。より具体的には、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列と、配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列と、を含むものを例示することができる。配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、配列番号１、４９、５１、又は５３に記載の塩基配列を例示することができる。また、配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、配列番号３、５０、５２、又は５４に記載の塩基配列を例示することができる。
これらの塩基配列は、リンカーをコードする塩基配列で連結されていることが好ましい。リンカーについては、上記「キメラ抗原受容体」の項で記載したとおりである。例えば、上記で例示したリンカー１５をコードする塩基配列としては、配列番号５又は５５に記載の塩基配列を例示することができる。また、リンカー２５をコードする塩基配列としては、配列番号７又は５６に記載の塩基配列を例示することができる。
抗ＧＭ２抗体のｓｃＦｖをコードする塩基配列の具体例としては、配列番号９、１１、１３、又は１５に記載の塩基配列等を挙げることができる。
標的抗原結合領域をコードする塩基配列としては、導入する細胞の生物種に応じて、コドン最適化がされていることが好ましく、ヒト細胞に導入する場合には、ヒトコドンに最適化されていることが好ましい。
【００８１】
また、膜貫通領域及びＴ細胞活性化シグナル伝達領域をコードする塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知の配列データベースから入手可能である。また、ＧＭ２  ＣＡＲが、細胞外ヒンジ領域等の他の領域を含む場合、当該他の領域をコードする塩基配列もまた、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知の配列データベースから入手可能である。
例えば、膜貫通領域としてヒトＣＤ８の膜貫通領域を用いる場合、ヒトＣＤ８をコードする塩基配列としては、ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＭ＿００１７６８．６ として登録されたもの等を挙げることができ、膜貫通領域をコードする塩基配列としては、配列番号１９に記載の塩基配列を例示することができる。
また、例えば、Ｔ細胞活性化シグナル伝達領域としてヒトＣＤ３ζ、ヒトＣＤ２８、ヒト４−１ＢＢのＴ細胞活性化シグナル伝達領域を用いる場合、ヒトＣＤ３ζ、ヒトＣＤ２８、及びヒト４−１ＢＢをコードする塩基配列としては、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＭ＿０００７３４．３、ＮＭ＿００６１３９．２、及びＮＭ＿００１５６１．５として登録されたもの等を挙げることができ、ヒトＣＤ３ζ、ヒトＣＤ２８、及びヒト４−１ＢＢのＴ細胞活性化シグナル伝達領域をコードする塩基配列としては、それぞれ、配列番号２７、２３、及び２５に記載の塩基配列を例示することができる。
また、例えば、細胞外ヒンジ領域としてヒトＣＤ８の細胞外ヒンジ領域を用いる場合、細胞外ヒンジ領域をコードする塩基配列としては、配列番号１７に記載の塩基配列を例示することができる。
また、例えば、細胞質領域としてヒトＣＤ８の細胞質領域を用いる場合、細胞質領域をコードする塩基配列としては、配列番号２１に記載の塩基配列を例示することができる。
【００８２】
上記各領域をコードする塩基配列は、公知のものに限定されず、上記各領域をコードする塩基配列であれば、いかなる配列であってもよい。遺伝子コードの縮重により、１つのアミノ酸に対応するコドンは複数存在する。したがって、同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列は多数存在する。上記各領域をコードする塩基配列は、それらの領域をコードする限り、遺伝子コードの縮重によって生じる複数の塩基配列のいずれであってもよい。
上記各領域をコードする塩基配列としては、導入する細胞の生物種に応じて、コドン最適化がされていることが好ましく、ヒト細胞に導入する場合には、ヒトコドンに最適化されていることが好ましい。
また、上記各領域をコードする塩基配列は、天然タンパク質由来の各領域の変異体をコードするものであってもよい。各領域の変異体については、上記［キメラ抗原受容体（抗ＧＭ２  ＣＡＲ）］の項で記載したとおりである。
【００８３】
抗ＧＭ２  ＣＡＲの各領域をコードする塩基配列は、５’側から順に、標的抗原結合領域、膜貫通領域、Ｔ細胞活性化シグナル伝達領域の順に、配置されていることが好ましい。シグナルペプチド、細胞外ヒンジ領域等を用いる場合には、シグナルペプチドを標的抗原結合領域の５’側に配置し、細胞外ヒンジ領域を標的抗原結合領域と膜貫通領域との間に配置することが好ましい。これらの領域をコードする塩基配列は、直接連結されていてもよく、スペーサー領域をコードする塩基配列を介して連結されていてもよい。スペーサー領域については、上記［キメラ抗原受容体（抗ＧＭ２  ＣＡＲ）］の項で記載したとおりである。
【００８４】
抗ＧＭ２  ＣＡＲをコードする塩基配列の具体例としては、配列番号３９、４１、４３、及び４５からなる群より選択される塩基配列等を挙げることができる。
【００８５】
本実施形態のポリヌクレオチドは、抗ＧＭ２  ＣＡＲの各領域をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを、直接又はスペーサー配列を介して連結することにより、得ることができる。抗ＧＭ２  ＣＡＲの各領域をコードするポリヌクレオチドは、各領域の塩基配列に基づき、公知の方法で化学合成することにより取得してもよい。また、Ｔ細胞等から抽出したＤＮＡや、Ｔ細胞等から抽出したＲＮＡを逆転写して得たｃＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ法や等温増幅法等により、各領域をコードするポリヌクレオチドを増幅して取得してもよい。このようにして得た各領域をコードするポリヌクレオチドは、翻訳後の各領域の機能が失われない範囲内で、置換、欠失、付加、挿入等の改変を行ってもよい。
【００８６】
本実施形態のポリヌクレオチドは、抗ＧＭ２  ＣＡＲをコードする塩基配列に加えて、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、ターミネーター等の制御配列や、他のタンパク質をコードする塩基配列等を含んでいてもよい。
【００８７】
他のタンパク質としては、例えば、ＩＬ−７及びＣＣＬ１９を挙げることができる。これらのタンパク質をコードする塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知の配列データベースから入手可能である。例えば、ヒトＩＬ−７を用いる場合、ヒトＩＬ−７をコードする塩基配列としては、ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＭ＿００２１９０．２（配列番号５８）として登録されたもの等を挙げることができる。また、ヒトＣＣＬ１９を用いる場合、ヒトＣＣＬ１９をコードする塩基配列の例としては、ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＭ＿００６２７４．２（配列番号６０）として登録されたもの等を挙げることができる。
また、これらのタンパク質をコードする塩基配列は、公知のものに限定されず、これらのタンパク質をコードする塩基配列であれば、いかなる配列であってもよく、遺伝子コードの縮重によって生じる複数の塩基配列のいずれであってもよい。これらのタンパク質をコードする塩基配列としては、導入する細胞の生物種に応じて、コドン最適化がされていることが好ましく、ヒト細胞に導入する場合には、ヒトコドンに最適化されていることが好ましい。
また、これらのタンパク質をコードする塩基配列は、天然ＩＬ−７及び天然ＣＣＬ１９の変異体をコードするものであってもよい。これらの変異体については、上記［抗ＧＭ２  ＣＡＲを発現する細胞（抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現細胞）］の項で記載したとおりである。
【００８８】
また、他のタンパク質としては、自殺遺伝子を挙げることもできる。自殺遺伝子については、上記［抗ＧＭ２  ＣＡＲを発現する細胞（抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現細胞）］の項で記載したとおりである。自殺遺伝子をコードする塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知の配列データベースから入手可能である。また、市販の自殺遺伝子を含むベクター等の配列を利用することもできる。
【００８９】
本実施形態のポリヌクレオチドが、他のタンパク質をコードする塩基配列を含む場合、抗ＧＭ２  ＣＡＲをコードする塩基配列と、当該他のタンパク質をコードする塩基配列との間には、２Ａペプチドなどの自己切断型ペプチドをコードする塩基配列や、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）配列等を介在させてもよい。また、他のタンパク質が２つ以上である場合、当該他のタンパク質の間にも、自己切断型ペプチドやＩＲＥＳ等を介在させてもよい。これらの配列を介在させることにより、１つのプロモーターから、複数のタンパク質を独立して発現させることができる。
【００９０】
２Ａペプチドとしては、例えば、ピコルナウイルス、ロタウイルス、昆虫ウイルス、アフトウイルス、トリパノソーマウイルス等の２Ａペプチドを例示することができる。具体例として、ピコナウイルスの２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）のアミノ酸配列を配列番号６２に示す。２Ａペプチドをコードする塩基配列は、導入する細胞の生物種に応じて、コドン最適化がされていることが好ましく、ヒト細胞に導入する場合には、ヒトコドンに最適化されていることが好ましい。
【００９１】
また、本実施形態のポリヌクレオチドは、抗ＧＭ２  ＣＡＲをコードする塩基配列及び他のタンパク質をコードする塩基配列のタンパク質コード配列毎に、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、ターミネーター等の制御配列を有するものであってもよい。また、一部のタンパク質コード配列が独立して制御配列を有し、その他のタンパク質コード配列が２ＡペプチドやＩＲＥＳ等を介して連結され共通の制御配列を有するものであってもよい。
【００９２】
［抗ＧＭ２  ＣＡＲをコードする塩基配列を含むベクター］
１実施形態において、本発明は、抗ＧＭ２  ＣＡＲをコードする塩基配列を含むベクターを提供する。
【００９３】
上記実施形態のポリヌクレオチドは、ベクターの形態であってもよい。ベクターの種類は特に限定されず、一般的に使用される発現ベクター等を使用することができる。ベクターは、直鎖状でも環状でもよく、プラスミドなどの非ウイルスベクターでも、ウイルスベクターでも、トランスポゾンによるベクターでもよい。ベクターとしては、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、エピソーマルベクター、人工染色体ベクター等を挙げることができる。
【００９４】
ウイルスベクターとしては、例えば、センダイウイルスベクター、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）ベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、シルビスウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、オルソミクソウイルスベクター等を挙げることができる。
【００９５】
プラスミドベクターとしては、例えば、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ等の、動物細胞発現用プラスミドベクターが挙げられる。
【００９６】
エピソーマルベクターは、染色体外で自律複製可能なベクターである。エピソーマルベクターとしては、例えば、ＥＢＶ、ＳＶ４０等に由来する自律複製に必要な配列をベクター要素として含むベクターが挙げられる。自律複製に必要なベクター要素としては、具体的には、複製開始点と、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。例えば、ＥＢＶでは複製開始点ｏｒｉＰとＥＢＮＡ−１遺伝子、ＳＶ４０では複製開始点ｏｒｉとＳＶ４０ＬＴ遺伝子が挙げられる。
【００９７】
人工染色体ベクターとしては、例えば、ＹＡＣ（Ｙｅａｓｔ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター、ＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター、ＰＡＣ（Ｐ１−ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター等が挙げられる。
【００９８】
本実施形態のベクターの好適な例としては、ウイルスベクターを挙げることができ、より好適な例としてはレトロウイルスベクターを挙げることができる。レトロウイルスベクターとしては、ｐＭＳＧＶ１ベクター（Tamada k et al., Clin Cancer Res 18:6436-6445(2012)）やｐＭＳＣＶベクター（タカラバイオ社製）を例示することができる。レトロウイルスベクターを用いることにより、ベクター中の遺伝子がホスト細胞のゲノムに組み込まれ、ホスト細胞中で長期間安定して発現させることが可能となる。
【００９９】
本実施形態のベクターは、上記［抗ＧＭ２  ＣＡＲをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド］の項で記載した塩基配列の他に、複製開始点、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする塩基配列、薬剤耐性遺伝子、レポーター遺伝子などのマーカー遺伝子をコードする塩基配列等を含んでいてもよい。
【０１００】
抗ＧＭ２  ＣＡＲをコードする塩基配列は、適切なプロモーターの制御下で発現されるように、ベクター内に配置されることが好ましい。また、他のタンパク質をコードする塩基配列を含む場合は、それらの塩基配列も、適切なプロモーターの制御下で発現されるように、ベクター内に配置されることが好ましい。プロモーターとしては、例えば、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲ、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＨＳＶ−ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーター、ＥＦ１αプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター等が挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。一例としては、ＣＡＧプロモーター（サイトメガロウイルスエンハンサーとニワトリβ−アクチンプロモーターとβ−グロビン遺伝子のポリＡシグナル部位を含む）等を挙げることができる。また、上記［抗ＧＭ２  ＣＡＲをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド］で記載したように、各タンパク質コード配列間に、自己切断型ペプチドをコードする塩基配列やＩＲＥＳを配置し、共通のプロモーターの制御下で転写されるようにしてもよい。
【０１０１】
好ましい態様において、本実施形態のベクターは、抗ＧＭ２  ＣＡＲをコードする塩基配列に加えて、ＩＬ−７をコードする塩基配列及びＣＣＬ１９をコードする塩基配列の少なくとも一方をさらに含む。より好ましい態様において、本実施形態のベクターは、抗ＧＭ２  ＣＡＲをコードする塩基配列に加えて、ＩＬ−７をコードする塩基配列及びＣＣＬ１９をコードする塩基配列をさらに含む。
好ましくは、本実施形態のベクターは、適切なプロモーターに機能的に連結された抗ＧＭ２  ＣＡＲをコードする塩基配列を含む。より好ましくは、本実施形態のベクターは、抗ＧＭ２  ＣＡＲをコードする塩基配列、ＩＬ−７をコードする塩基配列、及びＣＣＬ１９をコードする塩基配列が、自己切断型ペプチドをコードする塩基配列又はＩＲＥＳを介して連結された塩基配列を含み、当該塩基配列は、適切なプロモーターに機能的に連結されている。なお、「プロモーターに機能的に連結された」とは、プロモーターの制御下で発現されるように、プロモーターの下流に連結されていることを意味する。前記の例において、抗ＧＭ２  ＣＡＲをコードする塩基配列、ＩＬ−７をコードする塩基配列、及びＣＣＬ１９をコードする塩基配列の配置順は、特に限定されず、任意の配置順とすることができる。
【０１０２】
［抗ＧＭ２  ＣＡＲを発現する細胞の製造方法］
１実施形態において、本発明は、抗ＧＭ２  ＣＡＲをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド又はベクターを、細胞に導入することを含む、抗ＧＭ２  ＣＡＲを発現する細胞の製造方法を提供する。
【０１０３】
上記実施形態の抗ＧＭ２  ＣＡＲを発現する細胞（以下、「抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現細胞」ともいう。）は、上記実施形態の抗ＧＭ２  ＣＡＲをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド又はベクターを、細胞に導入することにより得ることができる。細胞内に導入されたポリヌクレオチド又はベクターは、抗ＧＭ２  ＣＡＲを発現可能な状態で、細胞内で維持される。「発現可能な状態」とは、抗ＧＭ２  ＣＡＲをコードする塩基配列が転写・翻訳され得る状態にあることを意味する。
【０１０４】
ポリヌクレオチド又はベクターを細胞に導入する方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、ウイルス感染法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、カルシウムリン酸法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポーレーション法、トランスポゾンを用いる方法、パーティクルガン法等を挙げることができる。
【０１０５】
また、ベクターがレトロウイルスベクターである場合、ベクターが有しているＬＴＲ配列及びパッケージングシグナル配列に基づいて適切なパッケージング細胞を選択し、これを使用してレトロウイルス粒子を調製してもよい。パッケージング細胞としては、例えば、ＰＧ１３、ＰＡ３１７、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２、Ｐｓｉ−Ｃｒｉｐ等を例示することができる。また、トランスフェクション効率の高い２９３細胞や２９３Ｔ細胞をパッケージング細胞として用いることもできる。各種レトロウイルスベクター及び当該ベクターのパッケージングに使用可能なパッケージング細胞は、広く市販されているため、これらの市販品を用いてもよい。例えば、ＧＰ２−２９３細胞（タカラバイオ社製）、Ｐｌａｔ−ＧＰ細胞（コスモ・バイオ社製）、ＰＧ１３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８６）、ＰＡ３１７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０７８）などを用いることができ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ｐａｃｋａｇｉｎ  Ｋｉｔ  Ｅｃｏ（タカラバイオ社製）などの市販のキットを用いてもよい。
【０１０６】
抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現細胞に、ＩＬ−７、ＣＣＬ１９、自殺遺伝子などの他の外来タンパク質を発現させる場合、これらの他のタンパク質をコードする塩基配列を、抗ＧＭ２  ＣＡＲをコードする塩基配列を含むベクターに含ませるようにしてもよく、別のベクターに含ませるようにしてもよい。他のタンパク質をコードする塩基配列を別のベクターに含ませる場合、抗ＧＭ２  ＣＡＲをコードする塩基配列を含むベクターと、同時に又は別々に、当該ベクターを細胞に導入することができる。
【０１０７】
また、抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現細胞は、抗ＧＭ２  ＣＡＲをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを、公知の遺伝子編集技術等を用いて、適切なプロポーターの制御下で発現可能なように、細胞のゲノムに組み込むことによって製造してもよい。遺伝子編集技術としては、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ）、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ）−Ｃａｓシステム、ＰＰＲ（ｐｅｎｔａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｐｅａｔ)等のエンドヌクレアーゼを用いる技術が挙げられる。抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現細胞に他の外来タンパク質を発現させる場合も同様に、遺伝子編集技術等を用いて、他の外来タンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを、適切なプロポーターの制御下で発現可能なように、細胞のゲノムに組み込んでもよい。例えば、適切なプロモーターに機能的に連結された抗ＧＭ２  ＣＡＲ（又は他のタンパク質）をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを、細胞ゲノムの非コード領域等に組み込む方法；抗ＧＭ２  ＣＡＲ（又は他のタンパク質）をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを、細胞ゲノムの内在性プロモーターの下流に組み込む方法等が挙げられる。内在性プロモーターとしては、例えば、ＴＣＲα、ＴＣＲβのプロモーター等が挙げられる。
【０１０８】
抗ＧＭ２  ＣＡＲをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド又はベクターを細胞に導入した後、当該細胞における抗ＧＭ２  ＣＡＲの発現は、フローサイトメトリー、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、蛍光免疫染色等の公知の方法により確認することができる。また、ＩＬ−７及びＣＣＬ１９等の他の外来タンパク質の発現も、同様に、公知の方法により確認することができる。
【０１０９】
［抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現細胞を含む医薬組成物］
１実施形態において、本発明は、抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現細胞を含む、医薬組成物を提供する。
【０１１０】
抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現細胞は、ＧＭ２発現細胞に対して、特異的な細胞傷害活性を示す。そのため、抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現細胞は、ＧＭ２発現細胞が関与する疾患を治療又は予防するために使用することができる。ＧＭ２は、肺がん、神経芽腫、神経膠腫、メラノーマ、悪性中皮腫、骨髄腫などを含む幅広い腫瘍細胞に発現していることから、抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現細胞を含む医薬組成物は、腫瘍を治療又は予防するための医薬組成物として利用することができる。腫瘍は、骨組織、軟骨組織、脂肪組織、筋組織、血管組織及び造血組織のいずれで生じたものであってもよい。腫瘍としては、例えば、神経膠腫、メラノーマ、悪性中皮腫、肺がん、膵がん、頭頸部がん、肝がん、子宮がん、膀胱がん、胆道がん、食道がん、精巣腫瘍、甲状腺がん、脳腫瘍、前立腺がん、大腸がん、腎がん、卵巣がん、乳がん、腺がん、扁平上皮がん、腺扁平上皮がん、未分化がん、大細胞がん、小細胞がん、皮膚がん、膣がん、頸部がん、脾臓がん、気管がん、気管支がん、小腸がん、胃がん、胆嚢がん、精巣がんなどのがん；骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、軟部組織肉腫などの肉腫；神経芽腫、肝芽腫、髄芽腫、腎芽腫、膵芽腫、胸膜肺芽腫、網膜芽腫などの芽腫；胚細胞腫瘍；リンパ腫、白血病、骨髄腫などの血液がん等を挙げることができるが、これらに限定されない。特に、本実施形態の医薬組成物は、ＧＭ２を発現する腫瘍を治療又は予防するための医薬組成物として好適である。ＧＭ２を発現する腫瘍としては、例えば、肺がん、神経芽腫、神経膠腫、メラノーマ、悪性中皮腫、骨髄腫等を挙げることができるが、これらに限定されない。腫瘍がＧＭ２を発現しているか否かは、例えば、抗ＧＭ２抗体等を用いた公知の方法により確認することができる。公知の方法としては、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、免疫染色、蛍光免疫染色等を例示することができる。抗ＧＭ２  ＣＡＲに加えて、ＩＬ−７及びＣＣＬ１９のいずれか又は両方を発現する細胞（好ましくはＴ細胞）は、ＧＭ２を発現する腫瘍であれば、固形腫瘍に対しても強い細胞傷害活性を発揮することができる。そのため、抗ＧＭ２  ＣＡＲ、並びにＩＬ−７及びＣＣＬ１９のいずれか又は両方を発現する細胞（好ましくはＴ細胞）を含む本実施形態の医薬組成物は、ＧＭ２を発現する固形腫瘍に対して、特に好適に用いることができる。したがって、抗ＧＭ２  ＣＡＲ、並びにＩＬ−７及びＣＣＬ１９のいずれか又は両方を発現する細胞（好ましくはＴ細胞）を含む固形腫瘍を治療又は予防するための医薬組成物は、本実施形態の医薬組成物の好適な例である。「固形腫瘍」とは、造血系組織から発生する血液がん以外の腫瘍を意味し、上皮細胞がんおよび非上皮細胞がんを包含する。
【０１１１】
本実施形態の医薬組成物は、抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現細胞に加えて、薬学的に許容される担体等の他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば、薬学的に許容される担体のほか、サイトカイン等のＴ細胞活性化因子、免疫賦活剤、免疫チェックポイント阻害剤、他のＣＡＲを発現する細胞、抗炎症剤等を挙げることができるが、これらに限定されない。薬学的に許容される担体としては、細胞培養培地、生理食塩水、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液等を挙げることができる。
【０１１２】
本実施形態の医薬組成物は、公知の方法により投与することができるが、好ましくは、注射又は輸注により、患者に投与することができる。投与経路としては、静脈内投与が好ましいが、これに限定されず、腫瘍内への注入等により投与してもよい。
【０１１３】
本実施形態の医薬組成物は、抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現細胞を治療的有効量含むことができる。「治療的有効量」とは、疾患の治療又は予防のために有効な薬剤の量を意味する。治療的有効量は、投与対象の疾患の状態、年齢、性別、及び体重等によって変動し得る。本実施形態の医薬組成物において、上記の抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現細胞の治療的有効量は、例えば、抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現細胞が腫瘍の増殖を抑制し得る量であり得る。
【０１１４】
本実施形態の医薬組成物の投与量及び投与間隔は、投与対象の年齢、性別及び体重等、疾患の種類、進行度及び症状等、並びに投与方法等により、適宜選択することができる。投与量としては、治療的有効量を投与することができ、例えば、１回の投与において、投与細胞の個数として、１×１０４〜１×１０１０個、好ましくは１×１０５〜１×１０９個、より好ましくは５×１０６〜５×１０８個を挙げることができる。
【０１１５】
本実施形態の医薬組成物の投与間隔としては、例えば、１週毎、１０〜３０日毎、１月毎、３〜６月毎、１年毎等とすることができる。また、抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現細胞は、投与対象の体内で自律的に増殖できるため、１回きりの投与とすることもできる。また、投与後に体内の抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現細胞の数をモニタリングし、その結果に応じて投与時期を決定するようにしてもよい。
【０１１６】
また、本実施形態の医薬組成物は、他の抗がん剤と併用して用いることができる。他の抗がん剤としては、シクロホスファミドなどのアルキル化薬、ペントスタチンなどの代謝拮抗薬、リツキシマブなどの分子標的薬、イマチニブなどのキナーゼ阻害剤、ボルテゾミブなどのプロテアソーム阻害剤、シクロスポリンなどのカルシニューリン阻害薬、イダルビジンなどの抗がん性抗生物質、イリノテカンなどの植物アルカロイド、シスプラチンなどのプラチナ製剤、タモキシフェンなどのホルモン療法薬、ニボルマブ、ペンブロリズマブなどの免疫制御薬等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１１７】
また、他の態様において、本発明は、１）腫瘍を治療又は予防するための医薬組成物の製造における、抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現細胞の使用、２）抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現細胞を対象（例、ＧＭ２を発現する腫瘍に罹患している患者、腫瘍の外科的切除を行った患者など）に投与することを含む、ＧＭ２を発現する腫瘍を治療又は予防する方法、３）腫瘍の治療又は予防に使用するための抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現細胞、４）腫瘍を治療又は予防するための抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現細胞の使用、を提供する。
さらに、別の態様において、本発明は、上記実施形態のベクターを含む、抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現細胞を作製するためのキットを提供する。当該キットは、上記実施形態のベクターを含んでいれば特に制限されず、抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現細胞を作製するための説明書や、ベクターを細胞に導入するために用いる試薬等を含んでいてもよい。
【実施例】
【０１１８】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１１９】
［実施例１］ＩＬ−７及びＣＣＬ１９を発現する抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現Ｔ細胞の作製（Ｔ細胞の免疫機能促進因子の選択）
Ｔ細胞の機能を制御できる分子は少なくとも生体内に数百種類存在する。本発明者らは、ＣＡＲ−Ｔ細胞における抗腫瘍効果を高めるための免疫機能促進因子として、膨大な組み合わせの中からＩＬ−７とＣＣＬ１９とを選択した。
【０１２０】
なお、前記ＩＬ−７はＴ細胞の生存に必須のサイトカインであり、骨髄、胸腺及びリンパ器官・組織等に存在するストローマ細胞などの非造血細胞によって産生される。一方、Ｔ細胞には、ＩＬ−７の産生能力はほとんど認められない。
【０１２１】
また、前記ＣＣＬ１９は主にリンパ節中の樹状細胞やマクロファージから産生され、その受容体であるＣＣＲ７を介してＴ細胞やＢ細胞、成熟した樹状細胞の遊走を惹起する機能を有する。
【０１２２】
（抗ＧＭ２  ＣＡＲのｓｃＦｖ配列）
抗ＧＭ２  ｓｃＦｖの配列を、既知のＧＭ２抗体の配列に基づいて、設計した。ＶＬおよびＶＨの順序やリンカーの種類を比較するため、ＶＬ−リンカー１５−ＶＨ（配列番号９：ＶＬ１５ＶＨ）、ＶＬ−リンカー２５−ＶＨ（配列番号１１：ＶＬ２５ＶＨ）、ＶＨ−リンカー１５−ＶＬ（配列番号１３：ＶＨ１５ＶＬ）、及びＶＨ−リンカー２５−ＶＬ（配列番号１５：ＶＨ２５ＶＬ）の各ＤＮＡ断片を合成した。なお、以降の実施例では、特に記載のある場合を除き、抗ＧＭ２  ｓｃＦｖ配列としてＶＬ１５ＶＨを使用した。
【０１２３】
（ＩＬ−７及びＣＣＬ１９を発現する抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現ベクターの作製）
最初に、ヒトＩＬ−７（ストップコドン無し）と、それに続くＦ２ＡとヒトＣＣＬ１９をコードするＩＬ−７−Ｆ２Ａ−ＣＣＬ１９  ＤＮＡ断片（配列番号３３：ＩＬ−７−Ｆ２Ａ−ＣＣＬ１９）を化学合成した。次にｐＭＳＧＶ１レトロウイルス発現ベクター（Tamada k et al., Clin Cancer Res 18:6436-6445(2012)）にマウス抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖ、マウスＣＤ８膜貫通領域、マウスＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ細胞内シグナルモチーフ、およびマウスＩＬ−７−Ｆ２Ａ−マウスＣＣＬ１９からなるコンストラクトを挿入した既存のマウス抗ＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９ベクターを用い、ベクター内のマウスＩＬ−７−Ｆ２Ａ−ＣＣＬ１９の領域を、合成したヒトＩＬ−７−Ｆ２Ａ−ＣＣＬ１９  ＤＮＡ断片（配列番号３３）で、制限酵素（ＮｓｉＩ及びＳａｌＩ）処理及びライゲーションにより置き換えた。さらに、ヒト抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖ、ヒトＣＤ８膜貫通領域、及びヒトＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ細胞内シグナルモチーフからなるヒト抗ＣＤ２０  ＣＡＲ  ＤＮＡ断片（配列番号３７：抗ＣＤ２０  ＣＡＲ）を化学合成し、ベクター内のマウス抗ＣＤ２０  ＣＡＲ領域をこのＤＮＡ断片で制限酵素（ＮｃｏＩ及びＥｃｏＩ）処理及びライゲーションにより置き換えた。最後にヒト抗ＧＭ２  ｓｃＦｖをコードするＤＮＡ断片（配列番号９、１１、１３、１５）を化学合成し、ベクター内の抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖをこのＤＮＡ断片で制限酵素（ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ）処理及びライゲーションにより置き換えた。なお、抗ＧＭ２  ＣＡＲ  ＤＮＡ断片のコンストラクトを図１Ａに、得られたベクターの配置図を図１Ｂに示す。
【０１２４】
（ＩＬ−７／ＣＣＬ１９およびＨＳＶ−ｔｋを発現する抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現ベクターの作製）
ＣＡＲ−Ｔ細胞療法では、標的抗原に対する強力な免疫応答によりサイトカイン放出症候群などの全身性の副作用が起こることがある。この問題に対応するため自殺遺伝子としてヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ遺伝子ＨＳＶ−ｔｋを導入したＣＡＲコンストラクトを作製した。このコンストラクトを遺伝子導入しＣＡＲ−Ｔ細胞にＨＳＶ−ｔｋを発現させるとサイトメガロウイルス治療薬であるガンシクロビルの添加によりＣＡＲ−Ｔ細胞はアポトーシスを誘導され死滅することから、ガンシクロビル投与により体内のＣＡＲ−Ｔ細胞の制御が可能となる。
まずＩＬ−７−Ｆ２Ａ−ＣＣＬ１９−Ｆ２Ａ−ＨＳＶ−ｔｋ  ＤＮＡ断片（配列番号３５：ＩＬ−７−Ｆ２Ａ−ＣＣＬ１９−ＨＳＶ−ｔｋ）を化学合成した。次にＩＬ−７及びＣＣＬ１９を発現する抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現ベクター（配列番号３９）内のＩＬ−７−Ｆ２Ａ−ＣＣＬ１９の領域を、合成したＩＬ−７−Ｆ２Ａ−ＣＣＬ１９−ＨＳＶ−ｔｋ  ＤＮＡ断片（配列番号３５）で、制限酵素（ＮｓｉＩ及びＳａｌＩ）処理及びライゲーションにより置き換え、ＩＬ−７／ＣＣＬ１９およびＨＳＶ−ｔｋを発現する抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現ベクター（配列番号４７）を作製した。
【０１２５】
（ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現−抗ＧＭ２  ＣＡＲベクターを導入したレトロウイルスの作製）
Ｔ細胞への遺伝子導入のためレトロウイルスを作製した。リポフェクタミン３０００（ライフテクノロジー社製）を用い、上述のＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現−抗ＧＭ２  ＣＡＲベクターとｐ−Ａｍｐｈｏプラスミド（タカラバイオ社製）をＧＰ２−２９３パッケージング細胞株（タカラバイオ社製）にトランスフェクションすることで、ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現−抗ＧＭ２  ＣＡＲベクターを導入したレトロウイルスを作製した。トランスフェクションから４８時間後に前記レトロウイルスを含有する上清を回収した。
【０１２６】
前記ＧＰ２−２９３細胞の培養液としては、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを加えたＤＭＥＭを用いた。また、後述の実施例で用いるＴ細胞の培養液としては、２.０％ヒトＡＢ型血清（Sigma社製）、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ（和光純薬社製）、２.５μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ（ブリストル・マイヤーズスクイブ社製）を含むＧＴ−Ｔ５５１を用いた。
【０１２７】
（Ｔ細胞の形質導入）
健常人ドナーの血液から末梢血単核球を採取し、Ｔ細胞の活性化のため抗ＣＤ３モノクローナル抗体（５μｇ／ｍｌ）およびレトロネクチン（登録商標：タカラバイオ社製、２５μｇ／ｍｌ）を固層化したプレート上で、２×１０6個のＩＬ−２（２００ＩＵ／ｍｌ：Peprotech社製）と共に、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで３日間培養した。培養開始後２日目に、上述で作製したＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現−抗ＧＭ２  ＣＡＲベクターを導入したレトロウイルスを含有する上清を、あらかじめ２５μｇ／ｍｌのレトロネクチン（タカラバイオ社製）でコートした表面未処理２４ウェルプレートに１ウェルあたり５００μｌずつ添加し、２０００ｇ、２時間の遠心によりレトロウイルスプレロードプレートを作製した。プレートは計２枚作製し、遠心終了後、１．５％ＢＳＡ／ＰＢＳにて洗浄し、使用するまで４℃で保存した。培養３日目に、活性化させた細胞を上記プレートから回収し、細胞懸濁液（１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）として調整した。この細胞懸濁液を１ウェルあたり１ｍｌずつレトロウイルスプレロードプレートに添加し、ＩＬ−２（最終濃度２００ＩＵ／ｍｌ）の存在下で３７℃、５％ＣＯ２インキュベータにて２４時間培養し、１回目のレトロウイルス感染を行なった。翌日（培養４日目）、各ウェルの細胞溶液を、保存していた２枚目のウイルスプレロードプレートに移し、５００ｇで１分間遠心後、３７℃で４時間培養し、２回目の感染を行なった。３７℃で４時間培養後、各ウェルの細胞混濁液１ｍｌを新しい１２ウェル細胞培養プレートに移し、ＩＬ−２（２００ＩＵ／ｍｌ）を含有する新しい培養液（ＧＴ−Ｔ５５１）で４倍に希釈して、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータにて培養した。末梢血単核球の培養開始日から数えて７日目まで培養し、ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現−抗ＧＭ２  ＣＡＲベクターを導入したＴ細胞（抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞）を得た（図１Ｂ）。また同時に、ＣＡＲ陰性細胞コントロールとして、同一の健常人ドナーから得た末梢血単核球を同様の手法で活性化するがレトロウイルス感染をしていない非遺伝子導入細胞を作製した。
【０１２８】
［実施例２］フローサイトメトリーによるＣＡＲ発現測定（フローサイトメトリー解析）
ＧＭ２を抗原として認識するＣＡＲの発現レベル解析を、２色フローサイトメトリー解析によって行った。作製した抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を、ビオチン化ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ（GenScript社製）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識ストレプトアビジン（Affymetrix社製）、およびＡＰＣ標識抗ＣＤ８モノクローナル抗体（Affymetrix社製）と反応させて、染色を行った。フローサイトメトリーはＥＣ８００（ソニー社製）を用い、データ解析はＦｌｏｗＪｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Tree Star社製）を用いた。
【０１２９】
結果を図２に示す。左図はＣＡＲ遺伝子導入なしの細胞、右図は抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の結果である。また、図中の数値はそれぞれのポピュレーションのパーセンテージを表す。図２に示すように、抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞において、約６８％のＣＡＲの発現が確認された。
【０１３０】
［実施例３］ＩＬ−７、ＣＣＬ１９の産生
（抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞における培養上清中のＩＬ−７、ＣＣＬ１９濃度の測定）
上述の培養７日目の抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞又は非遺伝子導入細胞の培養上清を回収し、抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞によるＩＬ−７及びＣＣＬ１９の産生について市販のＥＬＩＳＡキット（それぞれPeprotech社製とR&D systems社製）を用いて検討した。
【０１３１】
〔結果〕
結果を図３に示す。図３に示すように、抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の培養上清中（ＧＭ２  ＣＡＲ）において、ＩＬ−７については３００ｐｇ／ｍｌ以上、ＣＣＬ１９については２０００ｐｇ／ｍｌ以上検出された。この結果から、抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞はＩＬ−７及びＣＣＬ１９を発現し、かつ発現したＩＬ−７及びＣＣＬ１９が細胞外に分泌されることが確認された。一方、コントロールの非遺伝子導入Ｔ細胞の培養上清中（ｎｏｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）においては、ＩＬ−７及びＣＣＬ１９のいずれも検出限界以下（Ｎｏｔ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ）であった。
【０１３２】
［実施例４］各腫瘍細胞のＧＭ２発現
（フローサイトメトリー解析）
悪性中皮腫の細胞株Ｙ−ｍｅｓｏ８Ａ、ＭＳＴＯ２１１Ｈ、骨髄腫の細胞株ＫＭＳ−１１、大腸がんの細胞株ＳＷ４８０を、Ａｌｅｘａ４８８で標識した抗ＧＭ２抗体とコントロールの抗ＤＮＰ抗体で染色し、フローサイトメトリー解析により各腫瘍細胞におけるＧＭ２の発現を測定した。Ａｌｅｘａ４８８標識抗ＧＭ２抗体及びＡｌｅｘａ４８８標識抗ＤＮＰ抗体は、いずれも１０μｇ／サンプルで染色を行った。
【０１３３】
大腸がん細胞株ＳＷ４８０ではＧＭ２の発現を認めなかったものの、悪性中皮腫細胞株Ｙ−ｍｅｓｏ８Ａ、ＭＳＴＯ２１１Ｈと骨髄腫細胞株ＫＭＳ−１１、ＫＭＳ−２８ＰＥにおいてＧＭ２の発現が確認された。
【０１３４】
［実施例５］細胞傷害性試験
（抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞による５１Ｃｒ放出試験  １）
図４は、抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞作製、細胞傷害性試験、共培養試験の試験スケジュールを示したものである。図４に示すように、８日目にＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を回収し、標準的な４時間５１Ｃｒ放出アッセイを用いて腫瘍細胞に対するＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の細胞傷害活性を評価した。
ヒトＧＭ２を発現する各種腫瘍細胞をターゲット細胞として用いた。前記腫瘍細胞株を、１００μＣｉ  Ｎａ２５１ＣｒＯ４存在下、３７℃で１時間培養した後に、３回洗浄し、９６ウェルＶ底プレート（Nunc社製）に１ウェルあたり５×１０３個を添加した。その後、エフェクターＴ細胞として、抗ＧＭ２  ＣＡＲのｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬ、ならびにリンカーの組み合わせを変えた４種類の抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞、又は非遺伝子導入Ｔ細胞を添加し、ターゲット細胞と３７℃で４時間共培養を行った。なお、エフェクター／ターゲット比（Ｅ／Ｔ  ｒａｔｉｏ）は、２．５、５、１０、２０、４０の範囲で調整した。ターゲット細胞の最大放出と自然放出は、ターゲット細胞を１０％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（シグマアルドリッチ社製）含有培養液又は培養液のみで培養することによって測定した。上清の５１Ｃｒ放出はＴｏｐＣｏｕｎｔシンチレーションカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）で測定した。細胞傷害活性の割合は、式：細胞傷害活性（％）＝［（試験放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）］×１００で算出した。
【０１３５】
〔結果〕
結果を図５Ａ及びＢに示す。図５Ａは悪性中皮腫細胞株（Ｙ−ｍｅｓｏ８Ａ、ＭＳＴＯ２１１Ｈ）をターゲット細胞とした結果であり、図５Ｂは骨髄腫細胞株（ＫＭＳ−１１、ＫＭＳ−２８ＰＥ）をターゲット細胞とした結果である。図中、「ＶＬ１５ＶＨ」、「ＶＬ２５ＶＨ」、「ＶＨ１５ＶＬ」および「ＶＨ２５ＶＬ」は、それぞれ、当該配列を抗ＧＭ２  ＣＡＲのｓｃＦｖ配列として含む抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を表す。図５Ａ及びＢに示すように、抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞は、ＶＨ、ＶＬおよびリンカーのいずれの組み合わせによっても、腫瘍細胞株に対する細胞傷害性を示した。一方、コントロールの非遺伝子導入Ｔ細胞（ｎｏｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）は、腫瘍細胞株に対する細胞傷害活性をほとんど示さなかった。なお、図５Ａ及びＢのグラフの横軸はエフェクター（Ｔ細胞）とターゲット（腫瘍細胞）の比をＥ／Ｔ  ｒａｔｉｏで表し、縦軸は細胞傷害活性（％）を示す。
【０１３６】
（抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞による５１Ｃｒ放出試験  ２）
抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞による細胞傷害活性のＧＭ２特異性を検討するため、抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞、ＣＡＲ−Ｔ細胞のコントロールとしてのＦＩＴＣを認識する抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、および非遺伝子導入Ｔ細胞を用いて、各細胞のＧＭ２陽性腫瘍細胞株およびＧＭ２陰性腫瘍細胞株に対する細胞傷害活性を比較検討した。なお、抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞には、ｓｃＦｖ配列としてＶＬ１５ＶＨを含むものを用いた。
【０１３７】
〔結果〕
結果を図６Ａ〜Ｃに示す。図６Ａは悪性中皮腫細胞株（Ｙ−ＭＥＳＯ８Ａ）、図６Ｂは骨髄腫細胞株（ＫＭＳ１１）、図６Ｃは大腸がん細胞株（ＳＷ４８０）をターゲット細胞とした結果である。図６Ａ〜Ｃに示すように、抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−Ｔ）はいずれのターゲット細胞に対しても有意な細胞傷害活性は認めず非遺伝子導入Ｔ細胞（ｎｏｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）とほぼ同程度であった。一方、抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞（ＧＭ２  ＣＡＲ−Ｔ）は、ＧＭ２を発現する細胞（Ｙ−ＭＥＳＯ８Ａ、ＫＭＳ１１）に対しては細胞傷害性を示したものの、ＧＭ２を発現しない細胞（ＳＷ４８０）に対しては細胞傷害性を示さなかった。これより抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞はＧＭ２特異的に細胞傷害活性を誘導することが確認された。なお、図６Ａ〜Ｃのグラフの横軸はエフェクター（Ｔ細胞）とターゲット（腫瘍細胞）の比をＥ／Ｔ  ｒａｔｉｏで表し、縦軸は細胞傷害活性（％）を示す。
【０１３８】
（共培養試験）
図４に示すように、７日目に抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を回収し、ＧＭ２陽性陰性腫瘍細胞株又はＧＭ２陰性腫瘍細胞株と共に２４ウェル細胞培養プレート上にてエフェクター：腫瘍細胞比を１：１〜１：３になるよう調整したうえで、３７℃インキュベータにて共培養を行った。共培養開始から２〜３日後に細胞傷害活性を顕微鏡観察するとともに、培養上清中に産生されたＩＦＮ−γを市販のＩＦＮ−γＥＬＩＳＡキット（BioLegend社製）を用いて測定した。抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞のコントロールとして、抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞および非遺伝子導入Ｔ細胞を用いた。
【０１３９】
〔結果〕
結果を図７〜９に示す。図７、８は悪性中皮腫細胞株（Ｙ−ｍｅｓｏ８Ａ、ＭＳＴＯ２２１Ｈ）、図９は大腸がん細胞株（ＳＷ４８０）をターゲット細胞とした結果である。図７〜９に示すように、コントロールの抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞（ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−Ｔ）または非遺伝子導入Ｔ細胞（ｎｏｎ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）とターゲット腫瘍細胞との共培養においては、どのターゲット腫瘍細胞も腫瘍のみのウェル（ｔｕｍｏｒ  ｏｎｌｙ）と同程度に増殖していることが観察された。
【０１４０】
一方、抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞（ＧＭ２  ＣＡＲ−Ｔ）においては、ターゲット腫瘍細胞の種類により腫瘍の増殖に差が認められた。ＧＭ２陰性ターゲット細胞（ＳＷ４８０：図９）との共培養では、ターゲット腫瘍細胞は、腫瘍のみのウェル同様に増殖していた。一方、ＧＭ２陽性腫瘍細胞（Ｙ−ｍｅｓｏ８Ａ：図７、ＭＳＴＯ２２１Ｈ：図８）との共培養では、腫瘍細胞のみのウェルおよびコントロール細胞との共培養のウェルと比較し、明らかに腫瘍細胞の数が減少していることが観察された。
【０１４１】
これら結果から、５１Ｃｒ放出アッセイと同様、抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞は抗原特異的に腫瘍細胞を傷害していることが確認できた。また、図１０に示すように、共培養後の上清を用いたＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡにおいても、抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞とＧＭ２陽性ターゲット細胞（ＭＳＴＯ２２１Ｈ、Ｙ−ｍｅｓｏ８Ａ）の共培養の上清においてのみＩＦＮ−γの産生が確認された。
【０１４２】
［実施例６］腫瘍モデルでの治療効果
（Ｘ線照射マウスへの抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の投与）
免疫不全マウスであるＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇＫＯ（ＮＳＧ）マウスに２ＧｙのＸ線照射後、１×１０４個のルシフェラーゼ発現ＭＳＴＯ２１１Ｈを腹腔または胸腔に接種した。この腹腔内腫瘍モデル群（ｎ＝２）または胸腔内腫瘍モデル群（ｎ＝３）に対し、１日後に２．５×１０７個の抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞（ＣＡＲ発現が確認された細胞としては１×１０７個）またはコントロールとして同数の非遺伝子導入Ｔ細胞を静脈内に投与した。細胞投与日をｄａｙ０とし、ＩＶＩＳイメージングシステム（パーキンエルマー社製）を用いて腫瘍容量（＝ルシフェラーゼ活性による発光強度）を経時的に評価した。
【０１４３】
〔結果〕
マウスの腫瘍容量の推移の結果を図１１Ａ及びＢに示す。図１１Ａは胸腔内腫瘍モデルにおける結果であり、図１１Ｂは腹腔内腫瘍モデルにおける結果である。図１１Ａに示すように、胸腔内腫瘍モデルにおいては、非遺伝子導入Ｔ細胞を投与した群（ｎｏｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）で腫瘍の増殖が確認できたが、抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞投与群（ＧＭ２  ＣＡＲ−Ｔ）では明らかな腫瘍の増殖を認めなかった。また、図１１Ｂに示すように、腹腔内腫瘍接種モデルにおいては、抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞投与群（ＧＭ２  ＣＡＲ−Ｔ）ではｄａｙ３までは腫瘍の増殖を認めたもののそれ以降は徐々に腫瘍が縮小した。これらの結果から、胸腔内腫瘍モデルおよび腹腔内腫瘍モデルのいずれにおいても、抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞は優れた抗腫瘍活性を示すことが明らかとなった。
【０１４４】
（Ｘ線非照射マウスへの抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の投与）
次にＮＳＧマウスにＸ線照射の前処置なしで胸腔内に腫瘍を接種したモデルで抗腫瘍効果を検討した。１×１０４個のルシフェラーゼ発現ＭＳＴＯ２１１Ｈを胸腔に接種し、翌日、１．６×１０７個の抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞（ＣＡＲ発現細胞としては１×１０７個）またはコントロールとして同数の非遺伝子導入Ｔ細胞を静脈内に投与した（抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞投与群ｎ＝６、非遺伝子導入Ｔ細胞投与群ｎ＝５）。細胞投与日をｄａｙ０とし、前述と同様にＩＶＩＳイメージングシステムを用いて腫瘍増殖を経時的に評価した。
【０１４５】
〔結果〕
マウスの腫瘍容量の推移の結果を図１２に示す。図１２に示すように、非遺伝子導入Ｔ細胞投与群（ｎｏｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）では腫瘍が徐々に増殖していった。一方、抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞投与群（ＧＭ２  ＣＡＲ−Ｔ）では、ｄａｙ９までは腫瘍は増殖傾向を示したものの、それ以降は１匹を除いて腫瘍は増殖せず消退した。前述のＸ線照射の前処置ありのモデル同様、抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞は優れた抗腫瘍効果を誘導することが確認された。
【０１４６】
［実施例７］腫瘍モデルでの治療効果
（抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現Ｔ細胞の作製）
ＩＬ−７−Ｆ２Ａ−ＣＣＬ１９  ＤＮＡ断片を含まないこと以外は、ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現−抗ＧＭ２  ＣＡＲベクターと同様の構成を備えた抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現ベクターを作製した。実施例１と同様の方法で、この抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現ベクターをＴ細胞に形質導入し、抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を得た。
【０１４７】
（マウスへの抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞又は抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現Ｔ細胞の投与）
免疫不全マウスであるＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇＫＯ（ＮＳＧ）マウスに、１×１０４個のルシフェラーゼ発現ＭＳＴＯ２１１Ｈを胸腔に接種した。この胸腔内腫瘍モデル群に対し、１日後に２．２×１０６個の抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞（ＣＡＲ発現が確認された細胞としては１×１０６個）、同数の抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現Ｔ細胞（ＣＡＲ発現が確認された細胞としては１×１０６個）、またはコントロールとして同数の非遺伝子導入Ｔ細胞を静脈内に投与した（各群ｎ＝５）。細胞投与日をｄａｙ１とし、ＩＶＩＳイメージングシステム（パーキンエルマー社製）を用いて腫瘍容量（＝ルシフェラーゼ活性による発光強度）を経時的に評価した。
【０１４８】
〔結果〕
マウスの腫瘍容量の推移の結果を図１３に示す。図１３中、「×」はマウスが死亡したことを示す。図１３に示すように、胸腔内腫瘍モデルにおいては、非遺伝子導入Ｔ細胞を投与した群（ｎｏｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）では、経時的に腫瘍の増殖が確認でき、ｄａｙ５７時点で生存しているマウスはいなかった。抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を投与した群（ＧＭ２  ＣＡＲ−Ｔ（−）ＩＬ−７／ＣＣＬ１９）でも経時的に腫瘍が増殖したが、非遺伝子導入Ｔ細胞投与群と比較すると、腫瘍増殖の抑制がみられた。一方、抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞投与群（ＧＭ２  ＣＡＲ−Ｔ（＋）ＩＬ−７／ＣＣＬ１９）では、他群と比較して腫瘍の増殖が抑制され、ｄａｙ７０以降もマウスは生存していた。
【０１４９】
図１４は、図１３における発光強度の推移をグラフ化したものである。図１４のグラフの横軸はマウス胸腔内に腫瘍細胞を接種してからの経過日数、縦軸は腫瘍細胞からの発光強度（×１０６  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｓｅｃ）を示す。非遺伝子導入Ｔ細胞投与群（ｎｏｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）および抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現Ｔ細胞投与群（ＧＭ２  ＣＡＲ−Ｔ（−）ＩＬ−７／ＣＣＬ１９）では、ｄａｙ５７時点で生存マウスがいなくなっため、それ以降のプロットはない。図１４では、非遺伝子導入Ｔ細胞投与群（ｎｏｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）と比較して、抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現Ｔ細胞投与群（ＧＭ２  ＣＡＲ−Ｔ（−）ＩＬ−７／ＣＣＬ１９）における腫瘍の増殖がわずかに抑制されていることが確認できる。一方、抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞投与群（ＧＭ２  ＣＡＲ−Ｔ（＋）ＩＬ−７／ＣＣＬ１９）では、腫瘍の増殖がほぼ一定の範囲内に抑制されていた。
【０１５０】
また、図１５は、マウスの生存率の推移を示すグラフである。図１５のグラフの横軸はマウス胸腔内に腫瘍細胞を接種してからの経過日数、縦軸はマウスの生存率（％）を示す。図１５に示すように、抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現Ｔ細胞投与群（ＧＭ２  ＣＡＲ−Ｔ（−）ＩＬ−７／ＣＣＬ１９）では、非遺伝子導入Ｔ細胞投与群（ｎｏｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）と比較して、生存期間のわずかな延長傾向が確認された。一方、抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞投与群（ＧＭ２  ＣＡＲ−Ｔ（＋）ＩＬ−７／ＣＣＬ１９）では、非遺伝子導入Ｔ細胞投与群および抗ＧＭ２  ＣＡＲ発現Ｔ細胞投与群と比較して、生存率の改善（生存期間の延長効果）が確認された。
以上の結果から、抗ＧＭ２  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞は優れた抗腫瘍活性を有することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１５１】
本発明によれば、固形腫瘍抗原を標的抗原とする新規ＣＡＲ、及び固形腫瘍に対して有効なＣＡＲ−Ｔ細胞が提供される。本発明のＣＡＲ−Ｔ細胞は、肺がん、神経芽腫、神経膠腫、メラノーマ、悪性中皮腫、骨髄腫等のＧＭ２を発現する固形腫瘍の治療または予防に適用することができる。
【０１５２】
本出願は、日本で出願された特願２０１７−６１４６１（出願日２０１７年３月２７日）を基礎としておりその内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2020120660.tif 000003
【図２】
2020120660.tif 000004
【図３】
2020120660.tif 000005
【図４】
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【図５Ａ】
2020120660.tif 000007
【図５Ｂ】
2020120660.tif 000008
【図６Ａ】
2020120660.tif 000009
【図６Ｂ】
2020120660.tif 000010
【図６Ｃ】
2020120660.tif 000011
【図７】
2020120660.tif 000012
【図８】
2020120660.tif 000013
【図９】
2020120660.tif 000014
【図１０】
2020120660.tif 000015
【図１１Ａ】
2020120660.tif 000016
【図１１Ｂ】
2020120660.tif 000017
【図１２】
2020120660.tif 000018
【図１３】
2020120660.tif 000019
【図１４】
2020120660.tif 000020
【図１５】
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【配列表】
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