(57)【要約】      （修正有）【課題】癌の研究、診断及び治療のために有用な、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対する抗体の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するＦＡＰ特異抗体、前記抗体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞、前記宿主細胞を培養して前記抗体を製造する方法、及び、疾患の治療または診断における前記抗体の使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合する抗体であって、エフェクター機能を増加させるように糖鎖を操作されている抗体。
【請求項２】
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合する抗体であって、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、及び配列番号１７７の群から選択される少なくとも一の重鎖又は軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）、又はそれらの組み合わせを含む抗体。
【請求項３】
前記抗体が、
（ａ）配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、及び配列番号３３の群から選択される重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、及び配列番号１３３の群から選択される重鎖ＣＤＲ２；及び
（ｃ）配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、及び配列番号１４１の群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含む請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、
（ａ）配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、及び配列番号１４９の群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、及び配列番号１６１の群から選択される軽鎖ＣＤＲ２；及び
（ｃ）配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、及び配列番号１７７の群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含む請求項１から３の何れか一項に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が、配列番号３、配列番号５、配列番号１３、配列番号１５、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、及び配列番号１７５の群から選択されるＣＤＲでは無い、少なくとも一の重鎖又は軽鎖ＣＤＲを含む、請求項１から４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が、配列番号１９７、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０７、配列番号２１１、配列番号２１５、配列番号２１９、配列番号２２３、配列番号２２７、配列番号２３１、配列番号２３５、配列番号２３９、配列番号２４３、配列番号２４７、配列番号２５１、配列番号２５５、配列番号２５９、配列番号２６３、配列番号２６７、配列番号２７１、配列番号２７５、配列番号２７９、配列番号２８３、配列番号２８７、配列番号２９１、配列番号２９５、配列番号２９９、配列番号３０３、配列番号３０７、及び配列番号３１１の群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１から５の何れか一項に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体が、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９９、配列番号２０５、配列番号２０９、配列番号２１３、配列番号２１７、配列番号２２１、配列番号２２５、配列番号２２９、配列番号２３３、配列番号２３７、配列番号２４１、配列番号２４５、配列番号２４９、配列番号２５３、配列番号２５７、配列番号２６１、配列番号２６５、配列番号２６９、配列番号２７３、配列番号２７７、配列番号２８１、配列番号２８５、配列番号２８９、配列番号２９３、配列番号２９７、配列番号３０１、配列番号３０５、及び配列番号３０９の群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１から６の何れか一項に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体が、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号２０７、配列番号２０９、配列番号２１１、配列番号２１３、配列番号２１５、配列番号２１７、配列番号２１９、配列番号２２１、配列番号２２３、配列番号２２５、配列番号２２７、配列番号２２９、配列番号２３１、配列番号２３３、配列番号２３５、配列番号２３７、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、及び配列番号２５５の群から選択されるアミノ酸配列を含まない少なくとも一の重鎖又は軽鎖可変領域を含む、請求項１から７の何れか一項に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体が、免疫グロブリンのＦｃ領域又はＦｃ領域に等価な領域を含む、請求項１から８の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
前記Ｆｃ領域がＩｇＧのＦｃ領域である、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体が完全長ＩｇＧクラスの抗体である、請求項１から１０の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体がヒト定常領域を含む、請求項１から１１の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
前記抗体がヒト抗体である、請求項１から１２に記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体が糖鎖操作Ｆｃ領域を含む、請求項１から１３の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
前記抗体が、糖鎖を操作されていない抗体と比較して、前記Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の割合が増加している、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
前記Ｆｃ領域中のＮ−結合型オリゴ糖の少なくとも約２０％から約１００％が非フコシル化型である、請求項１４又は１５に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体が、糖鎖非操作型抗体と比較して、前記Ｆｃ領域における二分岐型のオリゴ糖の割合が増加している、請求項１４から１６の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１８】
前記Ｆｃ領域中のＮ−結合型オリゴ糖の少なくとも約２０％から約１００％が二分岐型である、請求項１４から１７の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１９】
前記Ｆｃ領域中のＮ−結合型オリゴ糖の少なくとも約２０％から約５０％が二分岐型で、非フコシル化型である、請求項１４から１８の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２０】
前記抗体が、増加したエフェクター機能及び／又は増加したＦｃ受容体結合親和性を有する、請求項１から１９の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２１】
前記増加したエフェクター機能は増加したＡＤＣＣである、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２２】
前記抗体が親和性成熟型である、請求項１から２１の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２３】
前記抗体が、ＦＡＰに対して、約１μＭ未満のＫＤ値で結合する、請求項１から２２の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２４】
前記抗体がヒト組織中のＦＡＰに結合する、請求項１から２３の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２５】
前記抗体が、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６に対して実質的な交差反応性を示さない、請求項１から２４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２６】
前記抗体が、細胞の表面上に発現したＦＡＰに対して結合の際にＦＡＰの内部移行を誘導しない、請求項１から２５の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２７】
請求項１から２６の何れか一項に記載の抗体の一部を形成するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項２７のポリヌクレオチドによりコードされる単離されたポリペプチド。
【請求項２９】
配列番号１９７、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０７、配列番号２１１、配列番号２１５、配列番号２１９、配列番号２２３、配列番号２２７、配列番号２３１、配列番号２３５、配列番号２３９、配列番号２４３、配列番号２４７、配列番号２５１、配列番号２５５、配列番号２５９、配列番号２６３、配列番号２６７、配列番号２７１、配列番号２７５、配列番号２７９、配列番号２８３、配列番号２８７、配列番号２９１、配列番号２９５、配列番号２９９、配列番号３０３、配列番号３０７、及び配列番号３１１の群から選択される配列を含むポリペプチドをコードする第一の単離されたポリヌクレオチド、及び配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９９、配列番号２０５、配列番号２０９、配列番号２１３、配列番号２１７、配列番号２２１、配列番号２２５、配列番号２２９、配列番号２３３、配列番号２３７、配列番号２４１、配列番号２４５、配列番号２４９、配列番号２５３、配列番号２５７、配列番号２６１、配列番号２６５、配列番号２６９、配列番号２７３、配列番号２７７、配列番号２８１、配列番号２８５、配列番号２８９、配列番号２９３、配列番号２９７、配列番号３０１、配列番号３０５、及び配列番号３０９の群から選択される配列を含むポリペプチドをコードする第二の単離されたポリヌクレオチドを含む組成物。
【請求項３０】
請求項２７に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３１】
請求項２７に記載のポリヌクレオチド、請求項２９に記載の組成物、又は請求項３０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３２】
前記宿主細胞が、ＧｎＴＩＩＩ活性を有する一以上のポリペプチドの増加したレベルを発現するように操作されている、請求項３１に記載の宿主細胞。
【請求項３３】
ＧｎＴＩＩＩ活性を有する前記ポリペプチドが、ＧｎＴＩＩＩの触媒ドメイン及びＭａｎＩＩのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドである、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３４】
前記宿主細胞が、ＭａｎＩＩ活性を有する一以上のポリペプチドの増加したレベルを発現するように更に操作されている、請求項３２又は３３に記載の宿主細胞。
【請求項３５】
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合する抗体を産生する方法であって、
ａ）抗体の発現を許容する条件下で培地中で請求項３１に記載の宿主細胞を培養し、及び
ｂ）抗体を回収すること
を含む方法。
【請求項３６】
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合する抗体を産生する方法であって、
ａ）抗体の発現及びＧｎＴＩＩＩ活性を有する前記ポリペプチドによる前記抗体のＦｃ領域に存在するオリゴ糖の修飾を許容する条件下で培地中で請求項３２から３４の何れか一項に記載の宿主細胞を培養し、
ｂ）抗体を回収すること
を含む方法。
【請求項３７】
ＦＡＰに特異的に結合する抗体であって、請求項３５又は３６に記載の方法により産生される抗体。
【請求項３８】
請求項１から２６の何れか一項に記載の抗体と細胞傷害性薬物を含む抗体コンジュゲート。
【請求項３９】
請求項１から２６の何れか一項に記載の抗体と薬学的に許容される担体を含有する薬学的製剤。
【請求項４０】
追加の治療薬を更に含む請求項３９に記載の薬学的製剤。
【請求項４１】
医薬としての使用のための、請求項１から２６の何れか一項に記載の抗体。
【請求項４２】
ＦＡＰの発現により特徴付けられる疾患の治療のための、請求項１から２６の何れか一項に記載の抗体。
【請求項４３】
前記疾患が癌である、請求項４２に記載の抗体。
【請求項４４】
腫瘍細胞又は腫瘍の間質細胞の細胞溶解の誘導における使用のための、請求項１から２６の何れか一項に記載の抗体。
【請求項４５】
医薬の製造における、請求項１から２６の何れか一項に記載の抗体の使用。
【請求項４６】
ＦＡＰの発現により特徴付けられる疾患の治療のための医薬の製造のための、請求項１から２６の何れか一項に記載の抗体の使用。
【請求項４７】
前記疾患が癌である、請求項４６に記載の抗体。
【請求項４８】
腫瘍細胞又は腫瘍の間質細胞の溶解を誘導するための医薬の製造のための、請求項１から２６の何れか一項に記載の抗体の使用。
【請求項４９】
ＦＡＰ発現により特徴付けられる疾患を有する個体を治療する方法であって、請求項１から２６の何れか一項に記載の抗体、又は請求項３９又は４０に記載の薬学的製剤の有効量を個体に投与することを含む方法。
【請求項５０】
個体へ追加の治療薬を投与することを更に含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記疾患が癌である、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項５２】
腫瘍細胞、又は腫瘍の間質細胞の細胞溶解を誘導する方法であって、請求項１から２６の何れか一項に記載の抗体と前記腫瘍細胞又は間質細胞を接触させることを含む方法。
【請求項５３】
前記細胞溶解が抗体の抗体依存性細胞傷害により誘導される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
個体における疾患を診断する方法であって、診断薬の有効量を個体に投与することを含み、前記診断薬が、請求項１から２６の何れか一項に記載される抗体と、前記診断薬とＦＡＰとの複合体の検出を可能とする標識を含む方法。
【請求項５５】
本明細書に記載される発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的な抗体に関する。加えて、本発明は、そのような抗体をコードするポリヌクレオチド、及びそのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明は、抗体を製造するための方法及び疾患の治療においてそれらを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）及び抗−ＦＡＰ抗体
ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ５１６６８）は、セプラーゼとしても知られ、１７０ｋＤａの膜内在性セリンペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．Ｂ２８）である。密接に関連する細胞表面酵素であるペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＣＤ２６としても知られる；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ２７４８７）、及び他のペプチダーゼと一緒に、ＦＡＰは、ジペプチジルペプチダーゼＩＶファミリーに属する(Yu et al., FEBS J 277, 1126-1144 (2010))。それは大規模なＣ末端細胞外ドメインを持つ２つのＮ−グリコシル化サブユニットを含むホモ二量体であり、その中に酵素の触媒ドメインが配置されている(Scanlan et al., Proc Natl Acad Sci USA 91, 5657-5661 (1994)）。ＦＡＰは、そのグリコシル化形態では、ポストプロリルジペプチジルペプチダーゼ活性とゼラチナーゼ活動の両方を持っている(Sun et al., Protein Expr Purif 24, 274-281 (2002))。
【０００３】
ヒトＦＡＰはもともとモノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ｆ１９を使用して培養線維芽細胞で同定された（国際公開第９３／０５８０４号に記載，ＡＴＣＣ番号ＨＢ ８２６９）。タンパク質のホモログはマウスを含め、幾つかの種において見いだされた(Niedermeyer et al., Int J Cancer 71, 383-389 (1997), Niedermeyer et al., Eur J Biochem 254, 650-654 (1998); ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号 ＡＡＨ１９１９０）。ＦＡＰはユニークな組織分布を有する：その発現は、肺癌、結腸・直腸癌、膀胱癌、卵巣癌及び乳癌を含み、一般的に正常な成体組織に存在しない、全ての原発性及び転移性上皮性腫瘍の９０％以上の反応性間質性線維芽細胞上において高度に上方制御されることが見いだされた(Rettig et al., Proc Natl Acad Sci USA 85, 3110-3114 (1988); Garin-Chesa et al., Proc Natl Acad Sci USA 87, 7235-7239 (1990))。続く報告では、ＦＡＰは、間質性線維芽細胞だけでなく、上皮起源の悪性細胞の幾つかの型の中においても発現されていないこと、及びＦＡＰの発現は悪性の表現型と直接相関することが示された(Jin et al., Anticancer Res 23, 3195-3198 (2003))。
【０００４】
多くの一般的な癌におけるその発現及び正常組織におけるその制限された発現のため、ＦＡＰは、癌の様々なイメージング、診断及び治療のための有望な抗原性標的と考えられてきた。従って、複数のモノクローナル抗体が、研究、診断、及び治療目的のために、ＦＡＰに対して提起されている。
【０００５】
シブロツズマブ（Ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）／ＢＩＢＨ１、ヒトＦＡＰに特異的に結合するＦ１９抗体のヒト化バージョン（国際公開第９９／５７１５１号に記載）、及びＦ１９エピトープ特異性を有するＦＡＰ抗原に対する更なるヒト化又は完全ヒト抗体(Mersmann et al., Int J Cancer 92, 240-248 (2001); Schmidt et al., Eur J Biochem 268, 1730-1738 (2001);国際公開第０１／６８７０８号に記載））が開発された。ＯＳ４抗体はＦ１９抗体の他のヒト化（ＣＤＲ移植）バージョンであるが(Wueest et al., J Biotech 92, 159-168 (2001)、一方でｓｃＦｖ３３及びｓｃＦｖ３６は、Ｆ１９とは異なる結合特異性を有し、ヒト及びマウスのＦＡＰタンパク質に対して交差反応性である(Brocks et al., Mol Med 7, 461-469 (2001))。より最近、他のマウス抗ＦＡＰ抗体、並びにそれらのキメラ及びヒト化バージョンが開発された（国際公開第２００７／０７７１７３号, Ostermann et al., Clin Cancer Res 14, 4584-4592 (2008))。
【０００６】
腫瘍間質内のプロテアーゼは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分のタンパク質分解を介して、血管新生及び／又は腫瘍細胞遊走等のプロセスを容易にする。さらに、腫瘍間質は、腫瘍への栄養素と酸素の供給において、並びに腫瘍の浸潤や転移において重要な役割を果たしている。これらの本質的な機能は、それを診断だけでなく潜在的な治療の標的としている。
【０００７】
抗ＦＡＰ抗体を用いるインビボにおける腫瘍間質標的指向化の概念の実現可能性についての証拠は、１３１ヨード標識化Ｆ１９抗体を用いた第Ｉ相臨床研究で得られ、それは腫瘍における抗体の特異的な濃縮及び転移の検出を実証した(Welt et al., J Clin Oncol 12, 1193-1203 (1994)。同様に、シブロツズマブ（sibrotuzumab）の第Ｉ相研究は、１３１Ｉ−標識化抗体の特異的腫瘍蓄積を実証した (Scott et al., Clin Cancer Res 9, 1639-1647 (2003))。しかしながら、転移性結腸直腸癌の患者における非抱合型シブロツズマブの初期第II相試験では、腫瘍進行を抑制するの抗体の有効性の欠如のため中止された(Hofheinz et al., Onkologie 26, 44-48 (2003))。また、最近開発された抗ＦＡＰ抗体は、インビボでの非抱合形態において抗腫瘍作用を示さなかった（国際公開第２００７／０７７１７３号）。
【０００８】
従って、癌の治療のためにＦＡＰを標的とし、改善された効力を有する抗体を含む、強化された治療的アプローチの必要性が依然として存在する。
【０００９】
抗体のグリコシル化
オリゴ糖成分が、物理的安定性、プロテアーゼの攻撃に対する耐性、免疫系との相互作用、薬物動態、及び特定の生物学的活性を含む、治療的糖タンパク質の有効性に関連する特性に有意に影響を与えることができる。そうした特性は、オリゴ糖の有無だけでなく、その特定の構造に依存し得る。オリゴ糖構造と糖タンパク質の機能との間において幾つかの一般化を行うことができる。例えば、特定のオリゴ糖構造は、特定の糖鎖結合タンパク質との相互作用を介して血流からの糖タンパク質の迅速なクリアランスを媒介し、一方他は、抗体に結合されて。望ましくない免疫反応を引き起こす(Jenkins et al., Nature Biotechnol 14, 975-81 (1996))。
【００１０】
ＩｇＧ１型抗体は、癌の免疫療法の中で最も一般的に使用される抗体であり、各ＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７で保存されたＮ−結合型糖鎖付加部位を持つ糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に付着した２つの複雑な二分岐型のオリゴ糖は、ＣＨ２ドメインの間に埋葬され、ポリペプチド骨格との広範な接触を形成し、そしてそれらの存在は、例えば抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などのエフェクター機能を媒介するために抗体にとって必須である(Lifely et al., Glycobiology 5, 813-822 (1995); Jefferis et al., Immunol Rev 163, 59-76 (1998); Wright and Morrison, Trends Biotechnol 15, 26-32 (1997))。タンパク質工学研究では、ＦｃγＲはＩｇＧのＣＨ２ドメインの下側のヒンジ領域と相互作用することが示されている。Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69 (1996).しかしながら、ＦｃγＲ結合はまた、ＣＨ２領域におけるオリゴ糖の存在が必要とする。Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69 (1996); Wright and Morrison, Trends Biotech. 15:26-31 (1997)は、オリゴ糖とポリペプチドの両方が相互作用部位に直接寄与するか、又はオリゴ糖が活性なＣＨ２ポリペプチドのコンフォメーションを維持するために必要であるかの何れかを示唆している。従って、オリゴ糖構造の修飾は、ＩｇＧ１とＦｃγＲとの間の相互作用の親和性を高めるため、及びＩｇＧ１のＡＤＣＣ活性を増加させるための手段として調査することができる。
【００１１】
モノクローナル抗体の効力の大きな増加を得るための方法は、Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999) 及び米国特許第６６０２６８４号（国際公開第９９／５４３４２号）に記載されるように, それらのオリゴ糖成分を操作することによって、その天然の細胞媒介性エフェクター機能を強化することであり、その内容は、その全体が本明細書中で参考として援用される。Umanaらは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）において、二分岐型のオリゴ糖の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼである、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）の過剰発現は、それらの細胞中に産生される抗体のインビトロでのＡＤＣＣ活性を有意に増大させることを示した。生産細胞株におけるＧｎＴＩＩＩの過剰発現は、一般的に非フコシル化型でハイブリッド型である二分岐型のオリゴ糖に富んだ抗体をもたらす。ＧｎＴＩＩＩに加えて、マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）が産生細胞株において過剰発現されている場合は、複合型の二分岐型の非フコシル化オリゴ糖に富んだ抗体が得られる(Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006))。抗体の両方の型が、未修飾のグリカンを有する抗体に比べて、亢進したＡＤＣＣを強く示したが、Ｎグリカンの大半が複合型である抗体のみが、有意な補体依存性細胞傷害を誘導することができる(Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006)。Ａｓｎ２９７の糖の組成における変化又はその消失はまた、抗体のＦｃドメインの、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）及び補体Ｃ１ｑタンパク質への結合にも影響を及ぼし、このことはＡＤＣＣ及びＣＤＣのそれぞれにとって重要である(Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999); Davies et al., Biotechnol Bioeng 74, 288-294 (2001); Mimura et al., J Biol Chem 276, 45539-45547 (2001); Radaev et al., J Biol Chem 276, 16478-16483 (2001); Shields et al., J Biol Chem 276, 6591-6604 (2001); Shields et al., J Biol Chem 277, 26733-26740 (2002); Simmons et al., J Immunol Methods 263, 133-147 (2002))。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、高親和性及び／又は亢進したエフェクター機能を有する線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合する抗体を提供する。
【００１３】
一態様において、本発明は、配列番号３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３，４５，４７，４９，５１，５３，５５，５７，５９，６１，６３，６５，６７，６９，７１，７３，７５，７７，７９，８１，８３，８５，８７，８９，９１，９３，９５，９７，９９，１０１，１０３，１０５，１０７，１０９，１１１，１１３，１１５，１１７，１１９，１２１，１２３，１２５，１２７，１２９，１３１，１３３，１３５，１３７，１３９，１４１，１４３，１４５，１４７，１４９，１５１，１５３，１５５，１５７，１５９，１６１，１６３，１６５，１６７，１６９，１７１，１７３，１７５及び１７７．に記載される相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一（すなわち、１、２、３、４、５又は６）を含む、ＦＡＰを特異的に結合する抗体を対象とする。一実施態様において、抗体は、配列番号３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３，４５，４７，４９，５１，５３，５５，５７，５９，６１，６３，６５，６７，６９，７１，７３，７５，７７，７９，８１，８３，８５，８７，８９，９１，９３，９５，９７，９９，１０１，１０３，１０５，１０７，１０９，１１１，１１３，１１５，１１７，１１９，１２１，１２３，１２５，１２７，１２９，１３１，１３３，１３５，１３７，１３９，１４１，１４３，１４５，１４７，１４９，１５１，１５３，１５５，１５７，１５９，１６１，１６３，１６５，１６７，１６９，１７１，１７３，１７５及び１７７に記載される３つの重鎖ＣＤＲ（すなわちＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）及び／又は３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわちＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）を含む。より具体的な実施態様において、抗体は、配列番号１９３，１９５，１９７，１９９，２０１，２０３，２０５，２０７，２０９，２１１，２１３，２１５，２１７，２１９，２２１，２２３，２２５，２２７，２２９，２３１，２３３，２３５，２３７，２３９，２４１，２４３，２４５，２４７，２４９，２５１，２５３，２５５，２５７，２５９，２６１，２６３，２６５，２６７，２６９，２７１，２７３，２７５，２７７，２７９，２８１，２８３，２８５，２８７，２８９，２９１，２９３，２９５，２９７，２９９，３０１，３０３，３０５，３０７，３０９及び３１１に記載される重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列から選択される、抗体の重鎖可変領域及び／又は抗体の軽鎖可変領域、特に、重鎖及び軽鎖の可変領域の両方を含む。一実施態様において、抗体は、Ｆｃ領域、特にＩｇＧのＦｃ領域を含む。更なる実施態様において、抗体は、全長抗体、特にＩｇＧクラスの抗体である。その他の実施態様において、抗体はヒト抗体定常領域を含む。一実施態様では、抗体はヒトである。一実施態様において、抗体は、Ｆｃ領域に修飾されたオリゴ糖を有するように糖鎖を操作されている。一実施態様において、抗体は、糖鎖を操作されていない抗体と比較して、Ｆｃ領域に非フコシル化オリゴ糖及び／又は二分岐型のオリゴ糖の割合が増加している。更なる実施態様において、抗体は、エフェクター機能が増加しているか及び／又はＦｃ受容体結合親和性が増加している。特定の実施態様において、エフェクター機能の増加とは抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の増加である。その他の実施態様において、抗体は、約１μＭ未満、好ましくは１００ｎＭ未満、最も好ましくは約１ｎＭ未満又は実に０．１ｎＭ未満のＫＤ値でＦＡＰに結合する。一実施態様において、抗体は親和性成熟である。一実施態様において、抗体は、ヒト組織においてＦＡＰに結合する。一実施態様において、抗体は、ＦＡＰの内部移行を誘導しない。
【００１４】
その他の態様において、本発明はまた、抗体に関連するポリペプチド、ポリヌクレオチド、宿主細胞、及び発現ベクターを対象とする。更なる態様において、本発明は、抗体を作製する方法に関する。更なる態様において、本発明は、抗体を用いる方法、特にＦＡＰの発現によって特徴付けられる癌などの疾患の治療を対象とする。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、親和性成熟抗ＦＡＰ Ｆａｂ断片の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく動力学解析を示す。処理された動力学データセットは、クローン１９Ｇ１のヒト（ｈｕ）ＦＡＰへの結合（Ａ）及びマウス（ｍｕ）ＦＡＢへの結合（Ｂ）、クローン２０Ｇ８のｈｕ ＦＡＰへの結合（Ｃ）、ｍｕ ＦＡＰへの結合（Ｄ）、ならびにクローン４Ｂ９のｈｕ ＦＡＰへの結合（Ｅ）及びｍｕ ＦＡＰへの結合（Ｆ）を示す。滑らかな線は、１：１相互作用モデルに対するデータのグローバルフィットを表す。
【図２】図２は、親和性成熟抗ＦＡＰ Ｆａｂ断片のＳＰＲに基づく動力学解析を示す。処理された動力学データセットは、クローン５Ｂ８のｈｕ ＦＡＰへの結合（Ａ）及びｍｕ ＦＡＢへの結合（Ｂ）、クローン５Ｆ１のｈｕ ＦＡＰへの結合（Ｃ）、ｍｕ ＦＡＰへの結合（Ｄ）、ならびにクローン１４Ｂ３のｈｕ ＦＡＰへの結合（Ｅ）及びｍｕ ＦＡＰへの結合（Ｆ）を示す。滑らかな線は、１：１相互作用モデルに対するデータのグローバルフィットを表す。
【図３】図３は、親和性成熟抗ＦＡＰ Ｆａｂ断片のＳＰＲに基づく動力学解析を示す。処理された動力学データセットは、クローン１６Ｆ１のｈｕ ＦＡＰへの結合（Ａ）及びｍｕ ＦＡＢへの結合（Ｂ）、クローン１６Ｆ８のｈｕ ＦＡＰへの結合（Ｃ）、ｍｕ ＦＡＰへの結合（Ｄ）、ならびにクローンＯ３Ｃ９のｈｕ ＦＡＰへの結合（Ｅ）及びｍｕ ＦＡＰへの結合（Ｆ）を示す。滑らかな線は、１：１相互作用モデルに対するデータのグローバルフィットを表す。
【図４】図４は、親和性成熟抗ＦＡＰ Ｆａｂ断片のＳＰＲに基づく動力学解析を示す。処理された動力学データセットは、クローンＯ２Ｄ７のｈｕ ＦＡＰへの結合（Ａ）とｍｕ ＦＡＢへの結合（Ｂ）、クローン２８Ｈ１のｈｕ ＦＡＰへの結合（Ｃ）、ｍｕ ＦＡＰへの結合（Ｄ）、ｃｙｎｏ ＦＡＰへの結合（Ｅ）、ならびにクローン２２Ａ３のｈｕ ＦＡＰへの結合（Ｆ）、ｍｕ ＦＡＰへの結合（Ｇ）及びカニクリザル（ｃｙｎｏ）ＦＡＰへの結合（Ｈ）。滑らかな線は、１：１相互作用モデルに対するデータのグローバルフィットを表す。
【図５】図５は、親和性成熟抗ＦＡＰ Ｆａｂ断片のＳＰＲに基づく動力学解析を示す。処理された動力学データセットは、クローン２９Ｂ１１のｈｕ ＦＡＰへの結合（Ａ）、ｍｕ ＦＡＢへの結合（Ｂ）、ｃｙｎｏ ＦＡＰへの結合（Ｃ）、ならびにクローン２３Ｃ１０のｈｕ ＦＡＰへの結合（Ｄ）、ｍｕ ＦＡＰへの結合（Ｅ）及びｃｙｎｏ ＦＡＰへの結合（Ｆ）を示す。滑らかな線は、１：１相互作用モデルに対するデータのグローバルフィットを表す。
【図６】図６は、３Ｆ２ （Ａ），４Ｇ８ （Ｂ） 及び３Ｄ９ （Ｃ） 抗ＦＡＰ抗体の、Ｆａｂ断片としての、ヒト、マウス及びカニクリザルＦＡＰに対する結合のＳＰＲに基づく動力学解析を示す。処理された動力学データセットが示され、滑らかな線は、１：１相互作用モデルに対するデータのグローバルフィットを表す。
【図７】図７は、３Ｆ２ （Ａ），４Ｇ８ （Ｂ） 及び３Ｄ９ （Ｃ） 抗ＦＡＰ抗体の、ヒトＩｇＧとしての、ヒト、マウス及びカニクリザルＦＡＰに対する結合のＳＰＲに基づく動力学解析を示す。処理された動力学データセットが示され、滑らかな線は、１：１相互作用モデルに対するデータのグローバルフィットを表す。
【図８】図８は、（Ａ）２Ｆ３マウスＩｇＧ２ａ抗体を用い、ＦＡＰについて免疫組織化学的に染色された非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、（Ｂ）２Ｆ３マウスＩｇＧ２ａ抗体を用い、ＦＡＰについて免疫組織化学的に染色された結腸腺癌、（Ｃ）３Ｄ９マウスＩｇＧ２ａ抗体を用い、ＦＡＰについて免疫組織化学的に染色された結腸腺癌、及び（Ｄ）４Ｇ８マウスＩｇＧ２ａ抗体を用い、ＦＡＰについて免疫組織化学的に染色された結腸腺癌のヒトサンプルの代表写真を示す。ＦＡＰは全サンプル中の腫瘍間質において全抗体により検出されるが（左パネル）、一方アイソタイプコントロール抗体について染色は観察されない（右パネル）。
【図９】図９は、ＦＡＣＳにより決定された、ヒト（Ａ）又はマウス（Ｂ）のＦＡＰで安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞に発現されたＦＡＰに対するヒトＩｇＧ１ 抗ＦＡＰ抗体の結合を示す。
【図１０】図１０は、ＦＡＣＳにより決定される、ヒトＩｇＧ１抗ＦＡＰ抗体の、安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞上に発現されたＨＥＲ２又はＤＰＰＩＶ（ＣＤ２６）に対する結合を示す。抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブと抗ＣＤ２６抗体を陽性コントロールとして使用した。二次抗体、コントロールＩｇＧ又は全く抗体無し（細胞のみ）を陰性コントロールとして用いた。
【図１１】図１１は、ＦＡＣＳにより決定される、ヒトＩｇＧ１抗ＦＡＰ抗体の、ヒト線維芽細胞上の（細胞株ＧＭ０５３８９）ＦＡＰに対する結合を示す。二次抗体、又は全く抗体無しを陰性コントロールとして用いた。
【図１２】図１２は、ＦＡＣＳにより決定される、ヒトＩｇＧ１抗ＦＡＰ抗体の、ヒト線維芽細胞上の（細胞株ＧＭ０５３８９）異なるヒト腫瘍細胞株、又はヒトＦＡＰにより安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞に対する結合を示す。
【図１３】図１３（Ａ）及び（Ｂ）は、ＦＡＣＳにより決定される、抗−ＦＡＰヒトＩｇＧ１抗体３Ｆ２又は４Ｇ８とともにインキュベーション後の異なる時点でのＧＭ０５３８９肺線維芽細胞の表面上のＦＡＰの発現レベルを示す。ＦＡＰの内部移行を示すＦＡＰの発現レベルの有意な減少は観察されなかった。二次抗体のみを陰性コントロールとして示す。
【図１４】図１４は、（Ａ）４℃で４５分間の抗ＦＡＰ４Ｇ８ ＩｇＧの結合後、（Ｂ）３７℃で２０分間の抗ＦＡＰ４Ｇ８ ＩｇＧの結合後、（Ｃ）３７℃で１時間の抗ＦＡＰ４Ｇ８ ＩｇＧの結合後、又は（Ｄ）３７℃で６時間の抗ＦＡＰ４Ｇ８ ＩｇＧの結合後に得られたＧＭ０５３８９肺線維芽細胞上の細胞膜染色を示す代表的な免疫蛍光を示す。抗ＣＤ２０抗体ＧＡ１０１は、アイソタイプコントロールとして使用され、バックグラウンド染色を示す。ＥＥＡ１は初期エンドソームをラベルする。抗ＦＡＰ４Ｇ８抗体結合後最長６時間までの、ＦＡＰ表面細胞膜染色の持続性を注意のこと。
【図１５】図１５は、野生型２８Ｈ１ ヒトＩｇＧの精製及び分析を示す。Ａ）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー精製工程。Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー精製工程。Ｃ）分析的ＳＤＳ ＰＡＧＥ。Ｄ）分析的サイズ排除クロマトグラフィー。実験手順は実施例１に記載される。
【図１６】図１６は、糖鎖操作２８Ｈ１ ヒトＩｇＧの精製及び分析を示す。Ａ）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー精製工程。Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー精製工程。Ｃ）分析的ＳＤＳ ＰＡＧＥ。Ｄ）分析的サイズ排除クロマトグラフィー。実験手順は実施例１に記載される。
【図１７】図１７は、野生型２９Ｂ１１ ヒトＩｇＧの精製及び分析を示す。Ａ）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー精製工程。Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー精製工程。Ｃ）分析的ＳＤＳ ＰＡＧＥ。Ｄ）分析的サイズ排除クロマトグラフィー。実験手順は実施例１に記載される。
【図１８】図１８は、糖鎖操作２９Ｂ１１ ヒトＩｇＧの精製及び分析を示す。Ａ）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー精製工程。Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー精製工程。Ｃ）分析的ＳＤＳ ＰＡＧＥ。Ｄ）分析的サイズ排除クロマトグラフィー。実験手順は実施例１に記載される。
【図１９】図１９は、野生型３Ｆ２ ヒトＩｇＧの精製及び分析を示す。Ａ）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー精製工程。Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー精製工程。Ｃ）分析的ＳＤＳ ＰＡＧＥ。Ｄ）分析的サイズ排除クロマトグラフィー。実験手順は実施例１に記載される。
【図２０】図２０は、糖鎖操作３Ｆ２ ヒトＩｇＧの精製及び分析を示す。Ａ）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー精製工程。Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー精製工程。Ｃ）分析的ＳＤＳ ＰＡＧＥ。Ｄ）分析的サイズ排除クロマトグラフィー。実験手順は実施例１に記載される。
【図２１】図２１は、野生型４Ｆ８ ヒトＩｇＧの精製及び分析を示す。Ａ）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー精製工程。Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー精製工程。Ｃ）分析的ＳＤＳ ＰＡＧＥ。Ｄ）分析的サイズ排除クロマトグラフィー。実験手順は実施例１に記載される。
【図２２】図２２は、糖鎖操作４Ｆ８ ヒトＩｇＧの精製及び分析を示す。Ａ）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー精製工程。Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー精製工程。Ｃ）分析的ＳＤＳ ＰＡＧＥ。Ｄ）分析的サイズ排除クロマトグラフィー。実験手順は実施例１に記載される。
【図２３】図２３は、親４Ｇ８抗ＦＡＰ抗体の結合に比較して、親和性成熟抗ＦＡＰ抗体２８Ｈ１のＨＥ２９３細胞上のヒトＦＡＰに対する結合を示す。
【図２４】図２４は、標的細胞としてＨＥＫ２９３−ｈＦＡＰ及びエフェクター細胞としてＰＢＭＮＣ（Ｆ／Ｆ ＦｃγＲＩＩＩａ遺伝子型）を用いた、抗ＦＡＰ ＩｇＧ抗体２８Ｈ１（親和性成熟）及び４Ｇ８，３Ｆ８（親）の野生型（ｗｔ）および糖鎖操作（ｇｅ）バージョンにより媒介されるＡＤＣＣを試験するためのＬＤＨ放出アッセイの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の実施態様の詳細な記述
Ｉ．定義
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク”に由来する”アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含み得る。幾つかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、Ｖはヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に、配列が同一である。
【００１７】
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般的に、解離の比率である解離定数（ＫＤ）および会合速度定数（ぞれぞれｋｏｆｆとｋｏｎ）で表すことができる。従って、同等の親和性は、速度定数の比が同じままである限り、別の速度定数を含み得る。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例示であって典型的な実施態様は、以下で説明される。
【００１８】
「親和性成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、その一又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）（例えばＣＤＲ）において一又は複数の改変（例えばアミノ酸変異）を持つものである。典型的には、親和性成熟抗体は、親抗体と同じエピトープに結合する。
【００１９】
用語「抗ＦＡＰ抗体」及び「線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する抗体」は、抗体が、ＦＡＰを標的とし、診断薬剤及び／又は治療的薬剤として有用であるように、十分な親和性でＦＡＰに結合することができる抗体を指す。一実施態様において、抗ＦＡＰ抗体の無関係な、非ＦＡＰタンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって測定される場合、抗体のＦＡＰへの結合の約１０％未満である。一実施態様において、本発明の抗ＦＡＰ抗体のＤＰＰＩＶ、ＦＡＰに密接に関連するタンパク質（ＣＤ２６としても知られ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ２７４８７）に対する結合の程度は、ＦＡＣＳにより測定される場合、ＦＡＰに対する抗体の結合の約１５％未満、約１０％又は約５％未満である。ある実施態様において、ＦＡＰへ結合する抗体は、解離定数（ＫＤ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ，、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）．ある実施態様において、抗ＦＡＰ抗体は、異なる種由来のＦＡＰ間で保存されているＦＡＰのエピトープに結合する。
【００２０】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。また、Ｆｃ領域を有する抗体断片、および免疫グロブリンのＦｃ領域に等価な領域を含む融合タンパク質も含まれる。
【００２１】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原を結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、ダイアボディ及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００２２】
参照抗体として「同一のエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて５０％以上、参照抗体のその抗原への結合をブロックする抗体、逆に競合アッセイにおいて５０％以上、その抗体のその抗原への結合をブロックするその参照抗体を指す。典型的な競合アッセイが、本明細書において提供される。
【００２３】
「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全体に相補的であり特異的に結合する領域を含む抗原結合分子の一部を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、エピトープと呼ばれる抗原の特定の部分にのみ結合することができる。抗原結合ドメインは、例えば、一以上の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）により与えられうる。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００２４】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種から由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる起源又は種から由来する抗体を指す。キメラ抗体については、例えば、非抗原結合成分は、チンパンジー及びヒトなどの霊長類を含む種の様々な種に由来し得る。ヒト化抗体は、キメラ抗体の特に好ましい形態である。
【００２５】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラスがあり：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、及びこれらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２に、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００２６】
本明細書で用いられる「細胞傷害性薬物」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞死又は破壊を生ずる物質を指す。細胞傷害性薬物は、限定されないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１, Ｉ１３１, Ｉ１２５, Ｙ９０, Ｒｅ１８６, Ｒｅ１８８, Ｓｍ１５３, Ｂｉ２１２, Ｐ３２, Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）：化学療法剤又は薬物（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤）、増殖阻害剤、酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素など、抗生物質、小分子毒素などの毒素、又は細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又はその変異体を含む）、及び以下に開示される様々な抗腫瘍剤又は抗癌剤を包含する。
【００２７】
「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）；貪食；サイトカイン分泌；抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞の活性化を含む。
【００２８】
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。
【００２９】
用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。その用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸長する。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しているか、又は存在していない場合がある。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【００３０】
「免疫グロブリンのＦｃ領域に等価である領域」は、免疫グロブリンのＦｃ領域の天然に存在する対立遺伝子改変体、ならびに置換、付加、または欠失を生じるが、免疫グロブリンがエフェクター機能を媒介する能力（抗体依存的な細胞傷害性）を実質的に減少しない変化を有する改変体を含むことが意図される。例えば、一以上のアミノ酸が、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端から、生物学的機能の実質的な損失を伴うことなく、欠失され得る。このような改変体は、活性に対して最小限の効果を有するように、当分野において公知である一般的規則に従って選択され得る（例えば、 Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-10 (1990)を参照のこと）。
【００３１】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）（又はＣＤＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメイン、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４で構成される。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００３２】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び 「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるFc領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【００３３】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本明細書において含まれる。一実施態様において、宿主細胞は、修飾されたオリゴ糖による抗体の産生を可能にするように操作されている。ある実施態様において、宿主細胞は、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有する一以上のポリペプチドの増加したレベルを発現するように操作されている。宿主細胞は、培養細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯの骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞などの哺乳類培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、わずかな例を挙げると、しかしまた、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織の中に含まれる細胞も含む。
【００３４】
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリー又は他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【００３５】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的には、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般的には、配列のサブグループは、 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3にあるサブグループである。一実施態様において、ＶＬについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループカッパＩである。一実施態様において、ＶＨについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループＩＩＩである。
【００３６】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来アミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。所定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、全てまたは実質的にＦＲの全てが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。
【００３７】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性であり、及び／又は抗原認識に関与している。ＶＨのＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域（ＨＶＲ）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分への参照において本明細書で互換的に使用される。この特定の領域は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) and by Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)に記述されており、そこで本定義は、相互に対して比較するときにアミノ酸残基の重複又はサブセットを含む。にも関わらず、抗体又はその変異体のＣＤＲを参照するために、何れかの定義の適用は、本明細書において定義され使用される用語の範囲内であることを意図されている。上記の引用文献の各々によって定義されるように、ＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基が、比較として以下の表１に記載されている。特定のＣＤＲを包含する正確な残基番号は、ＣＤＲの配列や大きさによって異なる。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮して、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを日常的に決定することができる。
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【００３８】
Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体に適用可能である可変領域配列の番号付けシステムを定義した。当業者は、配列それ自体を超えた任意の実験データに頼ることなく、任意の可変領域配列に対してこのＫａｂａｔの番号付けシステムを一義的に割り当てることができる。本明細書で用いる場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」とは、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)で明記されている番号付けシステムを指す。特記されない限り、抗体可変領域内の特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの参照は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従う。
【００３９】
ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」を含む。ＳＤＲは、略称（abbreviated-）ＣＤＲ、又はａ−ＣＤＲと呼ばれる、ＣＤＲの領域内に含まれている。一般的には、所与のＣＤＲ中の残基のほんの５分の１から３分の１が抗原結合に関与している。特定のＣＤＲにおける特異性決定残基は、例えば、三次元モデリングからの原子間接触の計算及びPadlan et al., FASEB J. 9(1):133-139 (1995)に記載される方法に従って、所定の残基位置における配列変動性の決定によって同定することができる。典型的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２に生じる(Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照）。
【００４０】
「抗体コンジュゲート」は、細胞傷害剤に結合する抗体である。
【００４１】
「個体」又は「被検体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。所定の実施態様において、個体又は被検体はヒトである。
【００４２】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）法により決定されるように、９５％以上または９９％の純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばFlatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
【００４３】
「単離された」ポリヌクレオチドは、その自然環境の成分から分離されたポリヌクレオチド分子を指す。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、しかし、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
【００４４】
「抗ＦＡＰ抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする一以上のポリヌクレオチド分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内のそのようなポリヌクレオチド分子、及び宿主細胞の一以上の位置に存在するそのようなポリヌクレオチド分子を含む。
【００４５】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる変異を含み、又はモノクローナル抗体製剤の製造時に発生し、一般的に少量で存在している変異体などの、可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び/又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を一般的に含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作成され、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【００４６】
「ネイキッド抗体」とは、異種の部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は薬学的製剤中に存在してもよい。
【００４７】
「天然型抗体」は、天然に生じる様々な構造をとる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から成る約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、続いて重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）がある。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインがある。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。
【００４８】
「交差反応性が実質的に無い」とは、分子（例えば抗体）が、分子の実際の標的抗原とは異なる抗原（例えば、標的抗原に密接に関連した抗原）を、特にその標的抗原と比較した場合に、認識しないか又は特異的に結合しないことを意味する。例えば、抗体が実際の標的抗原とは異なる抗原に対して約１０％未満から約５％未満が結合する場合があり、又は約１０％、９％、８％７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、又は０．１％未満、好ましくは約２％、１％又は０．５％未満、最も好ましくは約０．２％又は０．１％未満の、実際の標的抗原とは異なる抗原からなる群から選択される量において、実際の標的抗原とは異なる前記抗原に結合しうる。
【００４９】
用語「パッケージ挿入物」は、効能、用法、用量、投与、併用療法、禁忌についての情報、及び／又はそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の商用パッケージに慣習的に含まれている説明書を指すために使用される。
【００５０】
用語 「親」抗体は、変異体の調製のための出発点又は基礎として使用される抗体を指す。
【００５１】
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって生成される。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２もまた、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して所定の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一と一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値が、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したように、得られる。
【００５２】
同様に、本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも例えば９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドにより、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列のそれぞれ１００ヌクレオチドにつき最大で５つの点変異を含みうることを除けば、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意図している。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のヌクレオチドの５％までが欠失されたり、又は別のヌクレオチド置換され得、または参照配列中の全ヌクレオチドの最大５％までの多数のヌクレオチドが参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変化は参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端位置又はそれらの位置の間のどこでも起こり得、参照配列中の残基中に個別に散在するか又は参照配列内における一以上の隣接グループ中に散在している。実際問題として、任意の特定のポリヌクレオチド又はポリペプチドが、本発明のヌクレオチド配列又はポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、従来法により、上記のものような既知のコンピュータプログラムを用いて決定することができる。
【００５３】
用語「薬学的製剤」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。
【００５４】
「薬学的に許容される担体」は、被検体に非毒性であり、有効成分以外の製剤処方中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。
【００５５】
特に断らない限り、本明細書で使用する用語「線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）」は、霊長類（例えばヒト；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ５１６６８を参照）及びげっ歯類（例えば、マウス；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＨ１９１９０を参照）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型ＦＡＰを指す。その用語は、「完全長」、未処理のＦＡＰ並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＦＡＰを含む。その用語はまた、天然に存在するＦＡＰの変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。好ましくは、本発明の抗ＦＡＰ抗体は、ＦＡＰの細胞外ドメインに結合する。典型的なヒトＦＡＰ外部ドメイン、マウスＦＡＰ外部ドメイン及びカニクイザルＦＡＰ外部ドメインのアミノ酸配列は（Ｃ末端にポリリジン及び６×Ｈｉｓタグを伴い）、配列番号３１７、配列番号３１９及び配列番号３２１にそれぞれ示される。
【００５６】
本明細書で用いられるように、「治療」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」または 「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など文法上の変形）は、治療されている個体の疾患の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理の過程においてのいずれかで実行できる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
【００５７】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨおよびＶＬ）は、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む各ドメインを持ち、一般的に似たような構造を有する。(例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91頁 (2007)を参照)。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なＶＬ又はＶＨドメインのそれぞれのライブラリーをスクリーニングするために、抗原に特異的に結合する抗体由来のＶＨ又はＶＬドメインを用いて単離することができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照。
【００５８】
本明細書で使用される、用語「ベクター」は、それがリンクされている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なようにリンクされている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。
【００５９】
本明細書において使用される場合、「ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチド」とは、Ｎ結合型オリゴ糖のトリマンノシルコアのβ結合型マンノシドへのβ１−４結合でのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基の付加を触媒できるポリペプチドを指す。これは、用量依存性を伴うか又は伴わない特定の生物学的アッセイで測定した場合に、生化学と分子生物学の国際連合命名委員会（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）に従って、β−１，４−マンノシル−糖タンパク質の４−β−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．１４４）としても知られているβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩの活性に、必ずしも同一ではないが、類似した酵素活性を示す融合ポリペプチドを含む。用量依存性が存在する場合、それは、ＧｎＴＩＩＩのものと同一である必要はなく、むしろＧｎＴＩＩＩに比べた場合、特定の活性における用量依存性に対して実質的に類似している（すなわち、候補のポリペプチドは、ＧｎＴＩＩＩに比べて、より大きい活性を示すか又は最高で約２５倍以下の活性、好ましくは最高で約１０倍以下の活性、及びより最も好ましくは最高で約３倍以下の活性を示し得る）。
【００６０】
本明細書において用いられる場合、用語「ゴルジ局在化ドメイン」は、ゴルジ複合体内の位置にポリペプチドを固定するためのに関与するゴルジ常在性ポリペプチドのアミノ酸配列を指す。一般的に、局在化ドメインは酵素のアミノ末端「尾部」を含む。
【００６１】
本明細書で使用される場合、用語、「操作する」、「操作された」、「操作すること」、とりわけ、接頭辞の「ｇｌｙｃｏ−」が付いた用語、ならびに「グリコシル化操作」は、天然に存在するポリペプチド又は組換えポリペプチド又はその断片のグリコシル化パターンの任意の操作を含むと見なされる。グリコシル化操作には、細胞中で発現される糖タンパク質のグリコシル化の変化を達成するためのオリゴ糖合成経路の遺伝子操作を含む、細胞のグリコシル化機構の代謝的操作を含む。さらに、グリコシル化操作は、グリコシル化における変異及び細胞環境の影響を含む。一実施態様において、グリコシル化操作は、糖転移酵素活性の変化である。特定の実施態様では、操作が変更されたグルコサミニル転移酵素活性及び／又はフコース転移酵素活性をもたらす。
【００６２】
本明細書で使用される場合、用語、「Ｆｃ媒介性細胞傷害性」は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、及びヒトＦｃ領域を含む可溶性Ｆｃ融合タンパク質により媒介される細胞障害を含む。それは「ヒト免疫エフェクター細胞」による「標的化細胞」の溶解につながる免疫機構である。
【００６３】
本明細書で使用される場合、用語、「ヒト免疫エフェクター細胞」は、それらの表面上にＦｃレセプターを表示し、それらが抗体又はＦｃ融合タンパク質のＦｃ領域にそれを通して結合し、及びエフェクター機能を実行する白血球の集団である。このような集団には、末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）及び／又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれ得るがこれらに限定されない。
【００６４】
本明細書で使用される場合、用語、「標的化細胞」は、Ｆｃ領域を含む抗原結合分子（例えば、Ｆｃ領域を含む抗体又はその断片）又はＦｃ融合タンパク質によって特異的に結合される細胞である。抗原結合分子又はＦｃ融合タンパク質は、Ｆｃ領域に対してＮ末端であるタンパク質部分を通して標的細胞に結合する。
【００６５】
本明細書で使用される場合、用語、「Ｆｃ媒介性細胞傷害性の増加」は、標的細胞を取り囲む培地中で、上に定義されたＦｃ媒介性細胞傷害性のメカニズムによって、所定の時間内に、所定の抗体もしくＦｃ融合タンパク質の濃度で溶解される「標的化細胞」の数の増加、及び／又はＦｃ媒介性細胞傷害性のメカニズムによって、所定の時間内に、所定の数の「標的化細胞」の溶解を達成するために必要とされる、標的細胞を取り囲む培地中の抗体もしくはＦｃ融合タンパク質の濃度の減少のいずれかとして定義される。Ｆｃ媒介性細胞傷害性の増加は、同じ標準的な産生、精製、製剤、及び保存の方法（当業者に公知である）を使用して、同じ抗原結合分子、又は同じ型の宿主細胞によって生産されるＦｃ融合タンパク質により媒介される細胞障害性に比例するが、これは、本明細書に記載される方法によって、改変されたグリコシル化型を有するように（例えば、グリコシルトランスフェラーゼＧｎＴＩＩＩ又は他のグリコシルトランスフェラーゼを発現するように）操作された宿主細胞によって産生されなかった。
【００６６】
「抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有する抗体」によって、その用語が本明細書で定義される通り、当業者に公知である任意の適切な方法によって決定される、ＡＤＣＣの増加を有する抗体が意味される。１つの受容されるインビトロＡＤＣＣアッセイは以下の通りである。
１）このアッセイは、抗体の抗原結合領域によって認識される標的抗原を発現することが知られている標的細胞を使用する；
２）このアッセイは、エフェクター細胞として、ランダムに選択された健常ドナーの血液から単離されたヒト末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）を使用する；
３）このアッセイは以下のプロトコールに従って使用される。
ｉ）ＰＢＭＣを、標準的な密度遠心分離手順を使用して単離し、ＲＰＭＩ細胞培養培地中、５×１０６細胞／ｍｌで懸濁する；
ｉｉ）標的細胞を、標準的な培養方法によって増殖させ、９０％よりも高い生存度を有する指数増殖期から収集し、ＲＰＭＩ細胞培養培地中で洗浄し、１００マイクロキュリーの５１Ｃｒで標識し、細胞培養培地で２回洗浄し、そして１０５細胞／ｍｌの密度で細胞培養培地中に再懸濁する；
ｉｉｉ）１００マイクロリットルの上記の最終的な標的細胞懸濁物を、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに移す；
ｉｖ）抗体を、細胞培養培地中で４０００ｎｇ／ｍｌから０．０４ｎｇ／ｍｌまで段階希釈し、得られる抗体溶液の５０マイクロリットルを９６ウェルマイクロタイタープレート中の標的細胞に加えて、上記の全体の濃度範囲を網羅する種々な抗体濃度を３通りで試験する；
ｖ）最大放出（ＭＲ）コントロールのために、標識された標的細胞を含む、プレート中の３つのさらなるウェルは、抗体溶液（上記の要点ｉｖ）の代わりに、５０マイクロリットルの２％（Ｖ／Ｖ）非イオン性界面活性剤（Ｎｏｎｉｄｅｔ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）の水溶液を受容する；
ｖｉ）自発性放出（ＳＲ）コントロールのために、標識された標的細胞を含む、プレート中の３つのさらなるウェルに、抗体溶液（上記の要点ｉｖ）の代わりに、５０マイクロリットルのＲＰＭＩ細胞培養培地を受容する；
ｖｉｉ）次いで、９６ウェルマイクロタイタープレートを、５０×ｇで１分間遠心分離し、そして１時間４℃でインキュベートする；
ｖｉｉｉ）５０マイクロリットルのＰＢＭＣ懸濁液（上記の要点ｉ）を各ウェルに加えて２５：１のエフェクター：標的細胞比を生じ、そしてプレートをインキュベーター中、５％ ＣＯ２大気、３７℃下に４時間配置する；
ｉｘ）各ウェルからの無細胞上清を収集し、実験的に放出された放射能（ＥＲ）をガンマカウンターを使用して定量する；
ｘ）特異的溶解のパーセンテージを、計算式（ＥＲ−ＭＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）×１００に従って各抗体について計算し、ここで、ＥＲは抗体濃度について定量された平均放射能（上記の要点ｉｘを参照のこと）であり、ＭＲはＭＲコントロール（上記の要点ｖを参照のこと）についての定量された平均放射能（上記の要点ｉｘを参照のこと）であり、そしてＳＲはＳＲコントロール（上記の要点ｖｉを参照のこと）についての定量された平均放射能（上記の要点ｉｘを参照のこと）である；
４）「ＡＤＣＣの増加」は、上記の試験された抗体濃度範囲内で観察される特異的溶解の最大パーセンテージの増加、及び／又は上記の試験された抗体濃度範囲内で観察される特異的溶解の最大パーセンテージの半分を達成するために必要とされる抗体の濃度の減少のいずれかとして定義される。ＡＤＣＣの増加は、上記のアッセイを用いて測定される、当業者に公知である同じ標準的な産生、精製、製剤、及び保存の方法を使用して、同じ型の宿主細胞によって産生される、同じ型の抗体によって媒介されるＡＤＣＣに比例するが、これは、ＧｎＴＩＩＩを過剰発現するように操作された宿主細胞によって産生されなかった。
【００６７】
ＩＩ．組成物及び方法
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）は腫瘍の大部分に発現するが、健康な成人の組織には本質的に存在せず、従って、この抗原を標的とする抗体は大きな治療的可能性を有する。本発明は、ＦＡＰに結合する抗体、特に高い親和性と強いエフェクター機能を持つ抗体を提供する。本発明の抗体は、例えば、癌など、ＦＡＰの発現によって特徴付けられる疾患の診断又は治療のために有用である。
【００６８】
Ａ．典型的な抗ＦＡＰ抗体
本発明は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合する抗体を提供する。特に、本発明は、ＦＡＰに特異的に結合する抗体を提供し、ここで前記抗体はエフェクター機能を増加させるように糖鎖を操作されている。
【００６９】
一実施態様において、本発明の抗ＦＡＰ抗体は、配列番号３，配列番号５，配列番号７，配列番号９，配列番号１１，配列番号１３，配列番号１５，配列番号１７，配列番号１９，配列番号２１，配列番号２３，配列番号２５，配列番号２７，配列番号２９，配列番号３１，配列番号３３，配列番号３５，配列番号３７，配列番号３９，配列番号４１，配列番号４３，配列番号４５，配列番号４７，配列番号４９，配列番号５１，配列番号５３，配列番号５５，配列番号５７，配列番号５９，配列番号６１，配列番号６３，配列番号６５，配列番号６７，配列番号６９，配列番号７１，配列番号７３，配列番号７５，配列番号７７，配列番号７９，配列番号８１，配列番号８３，配列番号８５，配列番号８７，配列番号８９，配列番号９１，配列番号９３，配列番号９５，配列番号９７，配列番号９９，配列番号１０１，配列番号１０３，配列番号１０５，配列番号１０７，配列番号１０９，配列番号１１１，配列番号１１３，配列番号１１５，配列番号１１７，配列番号１１９，配列番号１２１，配列番号１２３，配列番号１２５，配列番号１２７，配列番号１２９，配列番号１３１，配列番号１３３，配列番号１３５，配列番号１３７，配列番号１３９，配列番号１４１，配列番号１４３，配列番号１４５，配列番号１４７，配列番号１４９，配列番号１５１，配列番号１５３，配列番号１５５，配列番号１５７，配列番号１５９，配列番号１６１，配列番号１６３，配列番号１６５，配列番号１６７，配列番号１６９，配列番号１７１，配列番号１７３，配列番号１７５，及び配列番号１７７の群から選択される少なくとも一の（例えば、１、２、３、４、５、又は６の）重鎖又は軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）、又は前記ＣＤＲに対する少なくとも特異性決定残基（ＳＤＲ）を含むそれらの変異体又は切断型を含む。
【００７０】
一実施態様において、前記少なくとも一のＣＤＲは重鎖ＣＤＲであり、特に、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１の群から選択される重鎖ＣＤＲ３である。別の実施態様において、抗体は少なくとも一の重鎖ＣＤＲ及び少なくとも一の軽鎖ＣＤＲを含み、特に配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１の群から選ばれる重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５及び配列番号１７７の群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【００７１】
一実施態様において、本発明の抗体は、（ａ）配列番号３，配列番号５，配列番号７，配列番号９，配列番号１１，配列番号１３，配列番号１５，配列番号１７，配列番号１９，配列番号２１，配列番号２３，配列番号２５，配列番号２７，配列番号２９，配列番号３１，及び配列番号３３の群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号３５，配列番号３７，配列番号３９，配列番号４１，配列番号４３，配列番号４５，配列番号４７，配列番号４９，配列番号５１，配列番号５３，配列番号５５，配列番号５７，配列番号５９，配列番号６１，配列番号６３，配列番号６５，配列番号６７，配列番号６９，配列番号７１，配列番号７３，配列番号７５，配列番号７７，配列番号７９，配列番号８１，配列番号８３，配列番号８５，配列番号８７，配列番号８９，配列番号９１，配列番号９３，配列番号９５，配列番号９７，配列番号９９，配列番号１０１，配列番号１０３，配列番号１０５，配列番号１０７，配列番号１０９，配列番号１１１，配列番号１１３，配列番号１１５，配列番号１１７，配列番号１１９，配列番号１２１，配列番号１２３，配列番号１２５，配列番号１２７，配列番号１２９，配列番号１３１，及び配列番号１３３の群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２；及び（ｃ）配列番号１３５，配列番号１３７，配列番号１３９，及び配列番号１４１の群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３から選択される少なくとも一、少なくとも二、又は三つ全ての重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）を含む。更なる実施態様において、本抗体は、（ａ）配列番号３，配列番号５，配列番号７，配列番号９，配列番号１１，配列番号１３，配列番号１５，配列番号１７，配列番号１９，配列番号２１，配列番号２３，配列番号２５，配列番号２７，配列番号２９，配列番号３１，及び配列番号３３の群から選択される重鎖ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号３５，配列番号３７，配列番号３９，配列番号４１，配列番号４３，配列番号４５，配列番号４７，配列番号４９，配列番号５１，配列番号５３，配列番号５５，配列番号５７，配列番号５９，配列番号６１，配列番号６３，配列番号６５，配列番号６７，配列番号６９，配列番号７１，配列番号７３，配列番号７５，配列番号７７，配列番号７９，配列番号８１，配列番号８３，配列番号８５，配列番号８７，配列番号８９，配列番号９１，配列番号９３，配列番号９５，配列番号９７，配列番号９９，配列番号１０１，配列番号１０３，配列番号１０５，配列番号１０７，配列番号１０９，配列番号１１１，配列番号１１３，配列番号１１５，配列番号１１７，配列番号１１９，配列番号１２１，配列番号１２３，配列番号１２５，配列番号１２７，配列番号１２９，配列番号１３１，及び配列番号１３３の群から選択される重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１３５，配列番号１３７，配列番号１３９，及び配列番号１４１の群から選択される重鎖ＣＤＲ３、又は前記ＣＤＲに対する少なくともＳＤＲを含むそれらの変異体又は切断型を含む。
【００７２】
一実施態様において、本発明の抗体は、（ａ）配列番号１４３，配列番号１４５，配列番号１４７，及び配列番号１４９の群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１；（ｂ）配列番号１５１，配列番号１５３，配列番号１５５，配列番号１５７，配列番号１５９，及び配列番号１６１の群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２；及び（ｃ）  配列番号１６３，配列番号１６５，配列番号１６７，配列番号１６９，配列番号１７１，配列番号１７３，配列番号１７５，及び配列番号１７７の群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３から選択される少なくとも一、少なくとも二、又は三つ全ての軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）を含む。更なる実施態様において、本抗体は、（ａ）配列番号１４３，配列番号１４５，配列番号１４７，及び配列番号１４９の群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号１５１，配列番号１５３，配列番号１５５，配列番号１５７，配列番号１５９，及び配列番号１６１の群から選択される軽鎖ＣＤＲ２；及び（ｃ）配列番号１６３，配列番号１６５，配列番号１６７，配列番号１６９，配列番号１７１，配列番号１７３，配列番号１７５，及び配列番号１７７の群から選択される軽鎖ＣＤＲ３、又は前記ＣＤＲに対する少なくともＳＤＲを含むそれらの変異体又は切断型を含む軽鎖可変領域を含む。
【００７３】
より特定の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号３，配列番号５，配列番号７，配列番号９，配列番号１１，配列番号１３，配列番号１５，配列番号１７，配列番号１９，配列番号２１，配列番号２３，配列番号２５，配列番号２７，配列番号２９，配列番号３１，及び配列番号３３の群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号３５，配列番号３７，配列番号３９，配列番号４１，配列番号４３，配列番号４５，配列番号４７，配列番号４９，配列番号５１，配列番号５３，配列番号５５，配列番号５７，配列番号５９，配列番号６１，配列番号６３，配列番号６５，配列番号６７，配列番号６９，配列番号７１，配列番号７３，配列番号７５，配列番号７７，配列番号７９，配列番号８１，配列番号８３，配列番号８５，配列番号８７，配列番号８９，配列番号９１，配列番号９３，配列番号９５，配列番号９７，配列番号９９，配列番号１０１，配列番号１０３，配列番号１０５，配列番号１０７，配列番号１０９，配列番号１１１，配列番号１１３，配列番号１１５，配列番号１１７，配列番号１１９，配列番号１２１，配列番号１２３，配列番号１２５，配列番号１２７，配列番号１２９，配列番号１３１，及び配列番号１３３の群から選択される重鎖２；及び配列番号１３５，配列番号１３７，配列番号１３９，及び配列番号１４１の群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４３，配列番号１４５，配列番号１４７，及び配列番号１４９の群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１５１，配列番号１５３，配列番号１５５，配列番号１５７，配列番号１５９，及び配列番号１６１の群から選択される軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６３，配列番号１６５，配列番号１６７，配列番号１６９，配列番号１７１，配列番号１７３，配列番号１７５，及び配列番号１７７の群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、又は前記ＣＤＲに対する少なくともＳＤＲを含むそれらの変異体又は切断型を含む。
【００７４】
他の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号３，配列番号５，配列番号７，配列番号９，配列番号１１，配列番号１３，配列番号１５，配列番号１７，配列番号１９，配列番号２１，配列番号２３，配列番号２５，配列番号２７，配列番号２９，配列番号３１，及び配列番号３３の群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号３５，配列番号３７，配列番号３９，配列番号４１，配列番号４３，配列番号４５，配列番号４７，配列番号４９，配列番号５１，配列番号５３，配列番号５５，配列番号５７，配列番号５９，配列番号６１，配列番号６３，配列番号６５，配列番号６７，配列番号６９，配列番号７１，配列番号７３，配列番号７５，配列番号７７，配列番号７９，配列番号８１，配列番号８３，配列番号８５，配列番号８７，配列番号８９，配列番号９１，配列番号９３，配列番号９５，配列番号９７，配列番号９９，配列番号１０１，配列番号１０３，配列番号１０５，配列番号１０７，配列番号１０９，配列番号１１１，配列番号１１３，配列番号１１５，配列番号１１７，配列番号１１９，配列番号１２１，配列番号１２３，配列番号１２５，配列番号１２７，配列番号１２９，配列番号１３１，及び配列番号１３３の群から選択される重鎖２；及び配列番号１３５，配列番号１３７，配列番号１３９，及び配列番号１４１の群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４３，配列番号１４５，配列番号１４７，及び配列番号１４９の群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１５１，配列番号１５３，配列番号１５５，配列番号１５７，配列番号１５９，及び配列番号１６１の群から選択される軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６３，配列番号１６５，配列番号１６７，配列番号１６９，配列番号１７１，配列番号１７３，配列番号１７５，及び配列番号１７７の群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、ここで、前記ＣＤＲの少なくとも一は、配列番号７，配列番号９，配列番号１１，配列番号１７，配列番号１９，配列番号２１，配列番号２９，配列番号３１，配列番号３３，配列番号４３，配列番号４５，配列番号４７，配列番号４９，配列番号５１，配列番号５３，配列番号５５，配列番号５７，配列番号５９，配列番号６１，配列番号６３，配列番号６５，配列番号６７，配列番号７７，配列番号７９，配列番号８１，配列番号８３，配列番号８５，配列番号８７，配列番号８９，配列番号９１，配列番号９３，配列番号９５，配列番号９７，配列番号９９，配列番号１０９，配列番号１１１，配列番号１１３，配列番号１１５，配列番号１１７，配列番号１１９，配列番号１２１，配列番号１２３，配列番号１２５，配列番号１２７，配列番号１２９，配列番号１３１，配列番号１３３及び配列番号１７７の群から選択される。
【００７５】
他の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号３，配列番号５，配列番号７，配列番号９，配列番号１１，配列番号１３，配列番号１５，配列番号１７，配列番号１９，配列番号２１，配列番号２３，配列番号２５，配列番号２７，配列番号２９，配列番号３１，及び配列番号３３の群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号３５，配列番号３７，配列番号３９，配列番号４１，配列番号４３，配列番号４５，配列番号４７，配列番号４９，配列番号５１，配列番号５３，配列番号５５，配列番号５７，配列番号５９，配列番号６１，配列番号６３，配列番号６５，配列番号６７，配列番号６９，配列番号７１，配列番号７３，配列番号７５，配列番号７７，配列番号７９，配列番号８１，配列番号８３，配列番号８５，配列番号８７，配列番号８９，配列番号９１，配列番号９３，配列番号９５，配列番号９７，配列番号９９，配列番号１０１，配列番号１０３，配列番号１０５，配列番号１０７，配列番号１０９，配列番号１１１，配列番号１１３，配列番号１１５，配列番号１１７，配列番号１１９，配列番号１２１，配列番号１２３，配列番号１２５，配列番号１２７，配列番号１２９，配列番号１３１，及び配列番号１３３の群から選択される重鎖２；及び配列番号１３５，配列番号１３７，配列番号１３９，及び配列番号１４１の群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４３，配列番号１４５，配列番号１４７，及び配列番号１４９の群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１５１，配列番号１５３，配列番号１５５，配列番号１５７，配列番号１５９，及び配列番号１６１の群から選択される軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６３，配列番号１６５，配列番号１６７，配列番号１６９，配列番号１７１，配列番号１７３，配列番号１７５，及び配列番号１７７の群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、ここで、前記ＣＤＲの少なくとも一は、配列番号３，配列番号５，配列番号１３，配列番号１５，配列番号２３，配列番号２５，配列番号２７，配列番号３５，配列番号３７，配列番号３９，配列番号４１，配列番号６９，配列番号７１，配列番号７３，配列番号７５，配列番号１０１，配列番号１０３，配列番号１０５，配列番号１０７，配列番号１３５，配列番号１３７，配列番号１３９，配列番号１４１，配列番号１４３，配列番号１４５，配列番号１４７，配列番号１４９，配列番号１５１，配列番号１５３，配列番号１５５，配列番号１５７，配列番号１５９，配列番号１６１，配列番号１６３，配列番号１６５，配列番号１６７，配列番号１６９，配列番号１７１，配列番号１７３，及び配列番号１７５の群から選択されるＣＤＲでは無い。
【００７６】
他の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号３，配列番号５，配列番号１３，配列番号１５，配列番号２３，配列番号２５，及び配列番号２７の群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号３５，配列番号３７，配列番号３９，配列番号４１，配列番号６９，配列番号７１，配列番号７３，配列番号７５，配列番号１０１，配列番号１０３，配列番号１０５，及び配列番号１０７の群から選択される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１３５，配列番号１３７，配列番号１３９，及び配列番号１４１の群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４３，配列番号１４５，配列番号１４７，及び配列番号１４９の群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１５１，配列番号１５３，配列番号１５５，配列番号１５７，配列番号１５９，及び配列番号１６１の群から選択される軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１６３，配列番号１６５，配列番号１６７，配列番号１６９，配列番号１７１，配列番号１７３，及び配列番号１７５の群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変又は前記ＣＤＲに対する少なくともＳＤＲを含むそれらの変異体又は切断型を含む。
【００７７】
特定の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号３、配列番号１３、及び配列番号２３の群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号３５，配列番号６９，及び配列番号１０１の群から選択される重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１３５の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５１の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。別の特定の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号３、配列番号１３、及び配列番号２３の群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号３７，配列番号７１，及び配列番号１０３の群から選択される重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１３７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６５の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。さらに別の特定の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号３、配列番号１３、及び配列番号２３の群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号３５，配列番号６９，及び配列番号１０１の群から選択される重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１３７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。別の特定の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号３、配列番号１３、及び配列番号２３の群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号３９，配列番号７３，及び配列番号１０５の群から選択される重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１３５の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。別の特定の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号３、配列番号１３、及び配列番号２３の群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号３５，配列番号６９，及び配列番号１０１の群から選択される重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１３７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５７の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。他の特定の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号３，配列番号７，配列番号１３，配列番号１７，配列番号２３，及び配列番号２９の群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号４３，配列番号４５，配列番号４７，配列番号４９，配列番号５１，配列番号５３，配列番号５５，配列番号５７，配列番号５９，配列番号６３，配列番号６５，配列番号７７，配列番号７９，配列番号８１，配列番号８３，配列番号８５，配列番号８７，配列番号８９，配列番号９１，配列番号９３，配列番号９７，配列番号１０９，配列番号１１１，配列番号１１３，配列番号１１５，配列番号１１７，配列番号１１９，配列番号１２１，配列番号１２３，配列番号１２５，配列番号１２９，及び配列番号１３１の群から選択される重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１３５の重鎖ＣＤＲ３、ならびに配列番号１４３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５１の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６３の軽鎖ＣＤＲ３を含む。更に特定の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号９，配列番号１１，配列番号１９，配列番号２１，配列番号３１，及び配列番号３３の群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号６１，配列番号６７，配列番号９５，配列番号９９，配列番号１２７，及び配列番号１３３の群から選択される重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１３７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。更に特定の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号３、配列番号１３、及び配列番号２３の群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号３５，配列番号６９，及び配列番号１０１の群から選択される重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１３５の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５１の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。更に特定の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号３、配列番号１３、及び配列番号２３の群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号４３，配列番号７７，及び配列番号１０９の群から選択される重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１３５の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５１の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。更に特定の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号３、配列番号１３、及び配列番号２３の群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号４５，配列番号７９，及び配列番号１１１の群から選択される重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１３５の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５１の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。更に特定の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号３、配列番号１３、及び配列番号２３の群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号６５，配列番号８９，及び配列番号１３１の群から選択される重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１３５の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５１の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。更に特定の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号３、配列番号１３、及び配列番号２３の群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号４７，配列番号８１，及び配列番号１１３の群から選択される重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１３５の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５１の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。更に特定の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号９、配列番号１９、及び配列番号３１の群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号６１，配列番号９５，及び配列番号１２７の群から選択される重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１３７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。
【００７８】
一実施態様において、本発明の抗体は、配列番号１９７，配列番号２０１，配列番号２０３，配列番号２０７，配列番号２１１，配列番号２１５，配列番号２１９，配列番号２２３，配列番号２２７，配列番号２３１，配列番号２３５，配列番号２３９，配列番号２４３，配列番号２４７，配列番号２５１，配列番号２５５，配列番号２５９，配列番号２６３，配列番号２６７，配列番号２７１，配列番号２７５，配列番号２７９，配列番号２８３，配列番号２８７，配列番号２９１，配列番号２９５，配列番号２９９，配列番号３０３，配列番号３０７，及び配列番号３１１の群から選択される配列に対して、少なくともおよそ９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。一実施態様において、抗体は、配列番号１９７，配列番号２０１，配列番号２０３，配列番号２０７，配列番号２１１，配列番号２１５，配列番号２１９，配列番号２２３，配列番号２２７，配列番号２３１，配列番号２３５，配列番号２３９，配列番号２４３，配列番号２４７，配列番号２５１，配列番号２５５，配列番号２５９，配列番号２６３，配列番号２６７，配列番号２７１，配列番号２７５，配列番号２７９，配列番号２８３，配列番号２８７，配列番号２９１，配列番号２９５，配列番号２９９，配列番号３０３，配列番号３０７，及び配列番号３１１の群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００７９】
ある実施態様において、少なくとも９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＦＡＰ抗体は、ＦＡＰへ結合する能力を保持する。ある実施態様において、計１から１０のアミノ酸が、配列番号１９７，２０１，２０３，２０７，２１１，２１５，２１９，２２３，２２７，２３１，２３５，２３９，２４３，２４７，２５１，２５５，２５９，２６３，２６７，２７１，２７５，２７９，２８３，２８７，２９１，２９５，２９９，３０３，３０７又は３１１において置換、挿入、及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ又はＣＤＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、本発明による抗ＦＡＰ抗体は、配列番号１９７，２０１，２０３，２０７，２１１，２１５，２１９，２２３，２２７，２３１，２３５，２３９，２４３，２４７，２５１，２５５，２５９，２６３，２６７，２７１，２７５，２７９，２８３，２８７，２９１，２９５，２９９，３０３，３０７又は３１１のＶＨ配列を、その配列の翻訳後修飾を含み、含む。特定の実施態様において、ＶＨは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３について、配列番号３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３，４５，４７，４９，５１，５３，５５，５７，５９，６１，６３，６５，６７，６９，７１，７３，７５，７７，７９，８１，８３，８５，８７，８９，９１，９３，９５，９７，９９，１０１，１０３，１０５，１０７，１０９，１１１，１１３，１１５，１１７，１１９，１２１，１２３，１２５，１２７，１２９，１３１，１３３，１３５，１３７，１３９及び１４１に明記される配列から選択される１つ、２つ、又は３つの重鎖ＣＤＲを含む。
【００８０】
別の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号１９３，配列番号１９５，配列番号１９９，配列番号２０５，配列番号２０９，配列番号２１３，配列番号２１７，配列番号２２１，配列番号２２５，配列番号２２９，配列番号２３３，配列番号２３７，配列番号２４１，配列番号２４５，配列番号２４９，配列番号２５３，配列番号２５７，配列番号２６１，配列番号２６５，配列番号２６９，配列番号２７３，配列番号２７７，配列番号２８１，配列番号２８５，配列番号２８９，配列番号２９３，配列番号２９７，配列番号３０１，配列番号３０５，及び配列番号３０９の群から選択される配列に対して、少なくともおよそ９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。さらに別の実施態様において、抗体は、配列番号１９３，配列番号１９５，配列番号１９９，配列番号２０５，配列番号２０９，配列番号２１３，配列番号２１７，配列番号２２１，配列番号２２５，配列番号２２９，配列番号２３３，配列番号２３７，配列番号２４１，配列番号２４５，配列番号２４９，配列番号２５３，配列番号２５７，配列番号２６１，配列番号２６５，配列番号２６９，配列番号２７３，配列番号２７７，配列番号２８１，配列番号２８５，配列番号２８９，配列番号２９３，配列番号２９７，配列番号３０１，配列番号３０５，及び配列番号３０９の群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００８１】
ある実施態様において、少なくとも９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＦＡＰ抗体は、ＦＡＰへ結合する能力を保持する。ある実施態様において、計１から１０のアミノ酸が、配列番号１９３，１９５，１９９，２０５，２０９，２１３，２１７，２２１，２２５，２２９，２３３，２３７，２４１，２４５，２４９，２５３，２５７，２６１，２６５，２６９，２７３，２７７，２８１，２８５，２８９，２９３，２９７，３０１，３０５又は３０９において置換、挿入、及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ又はＣＤＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、本発明の抗ＦＡＰ抗体は、配列番号１９３，１９５，１９９，２０５，２０９，２１３，２１７，２２１，２２５，２２９，２３３，２３７，２４１，２４５，２４９，２５３，２５７，２６１，２６５，２６９，２７３，２７７，２８１，２８５，２８９，２９３，２９７，３０１，３０５又は３０９のＶＬ配列を、その配列の翻訳後修飾を含み、含む。特定の実施態様において、ＶＬは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３について、配列番号１４３，１４５，１４７，１４９，１５１，１５３，１５５，１５７，１５９，１６１，１６３，１６５，１６７，１６９，１７１，１７３，１７５及び１７７に記載の配列から選択される、１つ、２つ、又は３つの軽鎖ＣＤＲを含む。
【００８２】
その他の態様において、抗ＦＡＰ抗体が提供され、その抗体は、上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＨ、及び上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＬを含む。一実施態様において、本抗体は、配列番号１９７，配列番号２０１，配列番号２０３，配列番号２０７，配列番号２１１，配列番号２１５，配列番号２１９，配列番号２２３，配列番号２２７，配列番号２３１，配列番号２３５，配列番号２３９，配列番号２４３，配列番号２４７，配列番号２５１，配列番号２５５，配列番号２５９，配列番号２６３，配列番号２６７，配列番号２７１，配列番号２７５，配列番号２７９，配列番号２８３，配列番号２８７，配列番号２９１，配列番号２９５，配列番号２９９，配列番号３０３，配列番号３０７，及び配列番号３１１の群から選択される配列に対して、少なくともおよそ９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１９３，配列番号１９５，配列番号１９９，配列番号２０５，配列番号２０９，配列番号２１３，配列番号２１７，配列番号２２１，配列番号２２５，配列番号２２９，配列番号２３３，配列番号２３７，配列番号２４１，配列番号２４５，配列番号２４９，配列番号２５３，配列番号２５７，配列番号２６１，配列番号２６５，配列番号２６９，配列番号２７３，配列番号２７７，配列番号２８１，配列番号２８５，配列番号２８９，配列番号２９３，配列番号２９７，配列番号３０１，配列番号３０５，及び配列番号３０９の群から選択される配列に対して、少なくともおよそ９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一実施態様において、本抗体は、配列番号１９７，２０１，２０３，２０７，２１１，２１５，２１９，２２３，２２７，２３１，２３５，２３９，２４３，２４７，２５１，２５５，２５９，２６３，２６７，２７１，２７５，２７９，２８３，２８７，２９１，２９５，２９９，３０３，３０７又は３１１及び配列番号１９３，１９５，１９９，２０５，２０９，２１３，２１７，２２１，２２５，２２９，２３３，２３７，２４１，２４５，２４９，２５３，２５７，２６１，２６５，２６９，２７３，２７７，２８１，２８５，２８９，２９３，２９７，３０１，３０５又は３０９においてそれぞれＶＨ配列及びＶＬ配列を、それらの配列の翻訳後修飾を含み、含む。
【００８３】
一実施態様において、本抗体は、配列番号１９７，配列番号２０１，配列番号２０３，配列番号２０７，配列番号２１１，配列番号２１５，配列番号２１９，配列番号２２３，配列番号２２７，配列番号２３１，配列番号２３５，配列番号２３９，配列番号２４３，配列番号２４７，配列番号２５１，配列番号２５５，配列番号２５９，配列番号２６３，配列番号２６７，配列番号２７１，配列番号２７５，配列番号２７９，配列番号２８３，配列番号２８７，配列番号２９１，配列番号２９５，配列番号２９９，配列番号３０３，配列番号３０７，及び配列番号３１１の群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１９３，配列番号１９５，配列番号１９９，配列番号２０５，配列番号２０９，配列番号２１３，配列番号２１７，配列番号２２１，配列番号２２５，配列番号２２９，配列番号２３３，配列番号２３７，配列番号２４１，配列番号２４５，配列番号２４９，配列番号２５３，配列番号２５７，配列番号２６１，配列番号２６５，配列番号２６９，配列番号２７３，配列番号２７７，配列番号２８１，配列番号２８５，配列番号２８９，配列番号２９３，配列番号２９７，配列番号３０１，配列番号３０５，及び配列番号３０９の群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここで前記可変領域の少なくとも一は、配列番号１９３，配列番号１９５，配列番号１９７，配列番号１９９，配列番号２０１，配列番号２０３，配列番号２０５，配列番号２０７，配列番号２０９，配列番号２１１，配列番号２１３，配列番号２１５，配列番号２１７，配列番号２１９，配列番号２２１，配列番号２２３，配列番号２２５，配列番号２２７，配列番号２２９，配列番号２３１，配列番号２３３，配列番号２３５，配列番号２３７，配列番号２３９，配列番号２４１，配列番号２４３，配列番号２４５，配列番号２４７，配列番号２４９，配列番号２５１，配列番号２５３，及び配列番号２５５の群から選択されるアミノ酸配列を含まない。
【００８４】
一実施態様において、本抗体は、配列番号１９７，配列番号２０１，配列番号２０３，配列番号２０７，配列番号２１１，配列番号２１５，配列番号２１９，配列番号２２３，配列番号２２７，配列番号２３１，配列番号２３５，配列番号２３９，配列番号２４３，配列番号２４７，配列番号２５１，配列番号２５５，配列番号２５９，配列番号２６３，配列番号２６７，配列番号２７１，配列番号２７５，配列番号２７９，配列番号２８３，配列番号２８７，配列番号２９１，配列番号２９５，配列番号２９９，配列番号３０３，配列番号３０７，及び配列番号３１１の群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１９３，配列番号１９５，配列番号１９９，配列番号２０５，配列番号２０９，配列番号２１３，配列番号２１７，配列番号２２１，配列番号２２５，配列番号２２９，配列番号２３３，配列番号２３７，配列番号２４１，配列番号２４５，配列番号２４９，配列番号２５３，配列番号２５７，配列番号２６１，配列番号２６５，配列番号２６９，配列番号２７３，配列番号２７７，配列番号２８１，配列番号２８５，配列番号２８９，配列番号２９３，配列番号２９７，配列番号３０１，配列番号３０５，及び配列番号３０９の群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここで、前記可変領域の少なくとも一は配列番号２５９，配列番号２６３，配列番号２６７，配列番号２７１，配列番号２７５，配列番号２７９，配列番号２８３，配列番号２８７，配列番号２９１，配列番号２９３，配列番号２９９，配列番号３０３，配列番号３０７，及び配列番号３１１の群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００８５】
一実施態様において、本抗体は、配列番号１９７，配列番号２０１，配列番号２０３，配列番号２０７，配列番号２１１，配列番号２１５，配列番号２１９，配列番号２２３，配列番号２２７，配列番号２３１，配列番号２３５，配列番号２３９，配列番号２４３，配列番号２４７，配列番号２５１，及び配列番号２５５の群から選択される配列に対して、少なくともおよそ９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１９３，配列番号１９５，配列番号１９９，配列番号２０５，配列番号２０９，配列番号２１３，配列番号２１７，配列番号２２１，配列番号２２５，配列番号２２９，配列番号２３３，配列番号２３７，配列番号２４１，配列番号２４５，配列番号２４９，及び配列番号２５３の群から選択される配列に対して、少なくともおよそ９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００８６】
特定の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１９３又は配列番号１９５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。その他の特定の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号２０１又は配列番号２０３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１９９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。更に別の特定の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号２０７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２０５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の特定の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号２１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２０９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。更に別の特定の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号２１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号２５９，配列番号２６３，配列番号２６７，配列番号２７１，配列番号２７５，配列番号２７９，配列番号２８３，配列番号２８７，配列番号２９１，配列番号２９９，配列番号３０３，配列番号３０７，及び配列番号３１１の群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は配列番号２９３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施態様において、本発明の抗体は、ａ）配列番号２５９，配列番号２６３，配列番号２６７，配列番号２７１，配列番号２７５，配列番号２７９，配列番号２８３，配列番号２８７，配列番号２９１，配列番号３０３，及び配列番号３０７から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１９５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又はｂ）配列番号２９９又は配列番号３１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２０５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又はｃ）配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２９３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号２５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１９５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の特定の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号２６３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１９５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号３０７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３０５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の特定の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号２６７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。更に別の特定の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号２９９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２０５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施態様では、上記実施態様のいずれかに記載の抗体はさらに、免疫グロブリンのＦｃ領域又は免疫グロブリンのＦｃ領域に相当する領域を含む。
【００８７】
一実施態様において、本発明の抗体は、Ｆｃ領域、特にＩｇＧのＦｃ領域、最も具体的にはＩｇＧ１のＦｃ領域を含む。
【００８８】
特定の実施態様において、本発明の抗体は、全長抗体、特にＩｇＧクラスの抗体、最も具体的にはＩｇＧ１アイソタイプ抗体である。その他の実施態様において、本発明の抗体は、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、及びＦ（ａｂ '）２断片の群から選択される抗体断片である。更なる実施態様において、本発明の抗体は、Ｆｃ領域を有する抗体断片、又は免疫グロブリンのＦｃ領域に等価な領域を含む融合タンパク質である。一実施態様において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。
【００８９】
一実施態様において、本発明の抗体は、キメラ、より具体的にはヒト化である。特定の実施態様において、本発明の抗体は、ヒトである。その他の実施態様において、本発明の抗体は、ヒト定常領域を含む。一実施態様において、本発明の抗体は、ヒトＦｃ領域、特にヒトＩｇＧのＦｃ領域、最も具体的にはヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を含む。
【００９０】
一実施態様において、本発明の抗体は、重鎖定常領域を含み、ここで前記重鎖定常領域は、Ｆｃ領域を含むヒトＩｇＧ定常領域、特にヒトＩｇＧ１定常領域を含む。特定の実施態様において、抗体は、配列番号３１３のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。別の特定の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号３１５のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。更に別の特定の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号３１３のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域、及び配列番号３１５のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。
【００９１】
特定の実施態様において、本発明は、ＦＡＰに特異的に結合する抗体を提供し、ここで前記抗体は、ａ）配列番号１９７，配列番号２０１，配列番号２０３，配列番号２０７，配列番号２１１，配列番号２１５，配列番号２１９，配列番号２２３，配列番号２２７，配列番号２３１，配列番号２３５，配列番号２３９，配列番号２４３，配列番号２４７，配列番号２５１，配列番号２５５，配列番号２５９，配列番号２６３，配列番号２６７，配列番号２７１，配列番号２７５，配列番号２７９，配列番号２８３，配列番号２８７，配列番号２９１，配列番号２９５，配列番号２９９，配列番号３０３，配列番号３０７，及び配列番号３１１の群から選択される配列に対して、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は、配列番号１９３，配列番号１９５，配列番号１９９，配列番号２０５，配列番号２０９，配列番号２１３，配列番号２１７，配列番号２２１，配列番号２２５，配列番号２２９，配列番号２３３，配列番号２３７，配列番号２４１，配列番号２４５，配列番号２４９，配列番号２５３，配列番号２５７，配列番号２６１，配列番号２６５，配列番号２６９，配列番号２７３，配列番号２７７，配列番号２８１，配列番号２８５，配列番号２８９，配列番号２９３，配列番号２９７，配列番号３０１，配列番号３０５，及び配列番号３０９の群から選択される配列に対して、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又はそれらの組み合わせ、及びｂ）免疫グロブリンのＦｃ領域又はＦｃ領域に等価な領域を含む。
【００９２】
一実施態様において、本発明の抗体は、Ｆｃ領域を含み、ここで前記Ｆｃ領域は糖鎖を操作されたＦｃ領域である。更なる実施態様において、本発明の抗体は、Ｆｃ領域に修飾されたオリゴ糖を有するように糖鎖を操作されている。特定の実施態様において、抗体は、糖鎖を操作されていない抗体と比較して、Ｆｃ領域に二分岐型のオリゴ糖の割合が増加している。より特定の実施態様において、抗体のＦｃ領域のＮ−結合型オリゴ糖の少なくとも約１０％，約１５％，約２０％，約２５％，約３０％，約３５％，約４０％，約４５％，約５０％，約５５％，約６０％，約６５％，約７０％，約７５％，約８０％，約８５％，約９０％，約９５％，又は約１００％，好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７０％が二分岐型になっている。二分岐型のオリゴ糖は、ハイブリッド又は複合体型のものであり得る。
【００９３】
別の特定の実施態様において、本発明の抗体は、糖鎖を操作されていない抗体と比較して、Ｆｃ領域に非フコシル化オリゴ糖の割合が増加している。より特定の実施態様において、抗体のＦｃ領域のＮ−結合型オリゴ糖の少なくとも約２０％，約２５％，約３０％，約３５％，約４０％，約４５％，約５０％，約５５％，約６０％，約６５％，約７０％，約７５％，約８０％，約８５％，約９０％，約９５％，又は約１００％，好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７０％が非フコシル化型である。非フコシル化オリゴ糖は、ハイブリッド又は複合体型のものであり得る。
【００９４】
特定の実施態様において、本発明の抗体は、糖鎖を操作されていない抗体と比較して、Ｆｃ領域に二分岐型の非フコシル化オリゴ糖の割合が増加している。具体的には、抗体は、Ｎ−結合型オリゴ糖の少なくとも約１０％，約１５％，約２０％，約２５％，約３０％，約３５％，約４０％，約４５％，約５０％，約５５％，約６０％，約６５％，約７０％，約７５％，約８０％，約８５％，約９０％，約９５％，又は約１００％，好ましくは少なくとも約１５％、より好ましくは少なくとも約２５％、少なくとも約３５％、又は少なくとも約５０％が二分岐型であり、非フコシル化型である。二分岐型の非フコシル化オリゴ糖は、ハイブリッド又は複合体型のものであり得る。
【００９５】
一実施態様において、本発明の抗体は、エフェクター機能が増加しているか及び／又はＦｃ受容体結合親和性が増加している。エフェクター機能の増加及び／又はＦｃ受容体結合の増加は、例えば、抗体の糖鎖操作及び／又は親和性成熟を生じることができる。一実施態様において、エフェクター機能の増加及び／又はＦｃ受容体結合の増加は、抗体のＦｃ領域の糖鎖操作の結果である。その他の実施態様において、エフェクター機能の増加及び／又はＦｃ受容体結合の増加は、親和性の増加及び糖鎖操作の組み合わせによる結果である。エフェクター機能の増加は、限定されないが、以下の一つ又は複数を含み得る：Ｆｃ媒介性細胞傷害性の増加（抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の増加を含む）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の増加、サイトカイン分泌の増加、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性の抗原取り込みの増加、ＮＫ細胞への結合の増加、マクロファージへの結合の増加、単球への結合の増加、多形核細胞への結合の増加、直接的シグナル伝達誘導性アポトーシスの増加、標的結合抗体の架橋の増加、樹状細胞成熟の増加、又はＴ細胞プライミングの増加。特定の実施態様において、エフェクター機能の増加とはＡＤＣＣの増加である。Ｆｃ受容体結合の増加は、好ましくは、活性化Ｆｃ受容体、最も好ましくはＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加である。
【００９６】
一実施態様において、本発明の抗体は、治療的有効量で個体に投与した場合、臨床的に有意なレベルの毒性を生じることはない。
【００９７】
一実施態様において、本発明の抗体は親和性が成熟されている。更なる実施態様において、本発明の抗体は、線維芽細胞活性化タンパク質に、解離定数（ＫＤ）値が約１μＭから約０．００１ｎＭ未満で、具体的にはＫＤ値が約１００ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、又は約０．１ｎＭ未満で結合する。一実施態様において、本発明の抗体は、ヒト、マウス、及びカニクイザルのＦＡＰに結合する。一実施態様において、本発明の抗体は、ヒト及びカニクイザルのＦＡＰに結合する。より特定の実施態様において、本発明の抗体は、ヒト及びカニクイザルのＦＡＰに対して、ＫＤ値が約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、より具体的には約１０ｎＭ未満、又は約１ｎＭ未満、最も具体的には０．１ｎＭ未満で結合する。ＫＤ値は、Ｆａｂ又はＩｇＧ、特にＩｇＧなどの抗体を使用して、表面プラズモン共鳴により決定される。
【００９８】
一実施態様において、本発明の抗ＦＡＰ抗体は、ヒト組織のＦＡＰに結合する。一実施態様において、本発明の抗ＦＡＰ抗体は、ヒト及びマウスのＦＡＰに対して交差反応性である。別の実施態様において、本発明の抗体は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶファミリーの他のメンバーに対して、特にＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６に対して、実質的な交差反応性を持たない。一実施態様において、本発明の抗ＦＡＰ抗体は、細胞の表面上に発現されたＦＡＰに対する前記抗体の結合の際に、ＦＡＰの内部移行を誘導しない。
【００９９】
特定の実施態様において、本発明は、ＦＡＰに特異的に結合する抗体を提供し、ここで前記抗体は、配列番号１９７，配列番号２０１，配列番号２０３，配列番号２０７，配列番号２１１，配列番号２１５，配列番号２１９，配列番号２２３，配列番号２２７，配列番号２３１，配列番号２３５，配列番号２３９，配列番号２４３，配列番号２４７，配列番号２５１，配列番号２５５，配列番号２５９，配列番号２６３，配列番号２６７，配列番号２７１，配列番号２７５，配列番号２７９，配列番号２８３，配列番号２８７，配列番号２９１，配列番号２９５，配列番号２９９，配列番号３０３，配列番号３０７，及び配列番号３１１の群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、配列番号１９３，配列番号１９５，配列番号１９９，配列番号２０５，配列番号２０９，配列番号２１３，配列番号２１７，配列番号２２１，配列番号２２５，配列番号２２９，配列番号２３３，配列番号２３７，配列番号２４１，配列番号２４５，配列番号２４９，配列番号２５３，配列番号２５７，配列番号２６１，配列番号２６５，配列番号２６９，配列番号２７３，配列番号２７７，配列番号２８１，配列番号２８５，配列番号２８９，配列番号２９３，配列番号２９７，配列番号３０１，配列番号３０５，及び配列番号３０９の群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及びヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含み、ここで、任意で前記抗体は増加したエフェクター機能及び／又はＦｃ受容体結合親和性を有するように糖鎖操作されている。別の特定の実施態様において、本発明は、ＦＡＰに特異的に結合する抗体を提供し、ここで前記抗体は、配列番号１９７，配列番号２０１，配列番号２０３，配列番号２０７，配列番号２１１，配列番号２１５，配列番号２１９，配列番号２２３，配列番号２２７，配列番号２３１，配列番号２３５，配列番号２３９，配列番号２４３，配列番号２４７，配列番号２５１，配列番号２５５，配列番号２５９，配列番号２６３，配列番号２６７，配列番号２７１，配列番号２７５，配列番号２７９，配列番号２８３，配列番号２８７，配列番号２９１，配列番号２９５，配列番号２９９，配列番号３０３，配列番号３０７，及び配列番号３１１の群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、配列番号１９３，配列番号１９５，配列番号１９９，配列番号２０５，配列番号２０９，配列番号２１３，配列番号２１７，配列番号２２１，配列番号２２５，配列番号２２９，配列番号２３３，配列番号２３７，配列番号２４１，配列番号２４５，配列番号２４９，配列番号２５３，配列番号２５７，配列番号２６１，配列番号２６５，配列番号２６９，配列番号２７３，配列番号２７７，配列番号２８１，配列番号２８５，配列番号２８９，配列番号２９３，配列番号２９７，配列番号３０１，配列番号３０５，及び配列番号３０９の群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及びヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含み、ここで、前記抗体は、前記Ｆｃ領域において、非フコシル化オリゴ糖の増加した割合を有し、及び／又は二分岐型のオリゴ糖の増加した割合を有する。
【０１００】
一態様において、本発明は、ＦＡＰに特異的に結合する抗体を提供し、ここで前記抗体は、配列番号３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１３５，配列番号１３７，配列番号１３９及び配列番号１４１の群から選択される重鎖ＣＤＲ３、配列番号１４５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６５，配列番号１６７，配列番号１６９，配列番号１７１，配列番号１７３及び配列番号１７５の群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含む親抗体に由来し、ここで前記抗体は、親抗体の少なくとも一の重鎖又は軽鎖ＣＤＲにおいて、少なくとも一のアミノ酸置換又は欠失を含む。例えば、抗体は、親抗体の一又は複数の超可変領域又はＣＤＲ（１、２、３、４、５、又は６の超可変領域又はＣＤＲ）において、少なくとも一、例えば約１から約１０（すなわち約１、２、３、４、５、６、７、８又は１０）、及び具体的には約２から約５の置換を含み得る。ある実施態様において、上記に提供されるような親抗体の任意の一以上のアミノ酸は、以下のＣＤＲの位置で置換され又は欠失している：
−  重鎖ＣＤＲ１（配列番号３）：位置２、及び３
−  重鎖ＣＤＲ２（配列番号３５）：位置１，３，４，５，６，７，８及び９
−  軽鎖ＣＤＲ１（配列番号１４５）：位置７、８、及び９
−  軽鎖ＣＤＲ２（配列番号１５３）：位置１、２、３、４及び５
−  軽鎖ＣＤＲ３（配列番号１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、又は１７５）：位置４，５，６及び７
【０１０１】
ある実施態様において、本明細書中に提供されるように、置換は保存的置換である。ある実施態様において、以下の置換又は欠失の任意の一又は複数が組合わせで作成される：
−  重鎖ＣＤＲ１（配列番号３）：Ｙ２Ｆ，Ｈ又はＳ，Ａ３Ｔ
−  重鎖ＣＤＲ２（配列番号３５）：Ａ１Ｇ，Ｓ３Ｇ，Ｉ，Ｗ又はＬ，Ｇ４Ｖ，Ｓ，Ａ 又はＴ，Ｓ５Ｇ又はＮ，Ｇ６Ｔ又はＡ，Ｇ７Ｒ，Ｓ，Ａ，Ｅ又はＮ，Ｓ８Ｙ，Ｌ，Ｒ，Ｉ，Ｎ，Ｑ，Ｉ又は欠失、Ｔ９ 欠失
−  軽鎖ＣＤＲ１（配列番号１４５）：Ｓ７Ｔ，Ｓ８Ｒ又はＳ９Ｎ
−  軽鎖ＣＤＲ２（配列番号１４３）：Ｙ１Ｎ，Ｉ又はＱ，Ｇ２Ｖ，Ａ３Ｇ，Ｓ４Ｔ又はＹ，Ｓ５Ｒ，Ｔ又はＩ
−  軽鎖ＣＤＲ３（配列番号１６５，１６７，１６９，１７１，１７３，又は１７５）：Ｇ４Ａ，Ｑ，Ｎ，Ｌ 又はＨ５Ｉ，Ｌ，Ｖ，Ｑ，Ｎ又は Ｉ６Ｍ，Ｉ７Ｌ
【０１０２】
更に、抗体は、親抗体と比較して、重鎖又は軽鎖の何れかの一以上のフレームワーク領域に一以上の付加、欠失及び／又は置換を含み得る。一実施態様において、少なくとも一つのＣＤＲにおける前記少なくとも一のアミノ酸置換は、その親抗体に比較して抗体の親和性の増加に寄与する。その他の実施態様において、前記抗体は（本発明の抗体と親抗体を、同じ形態、例えばＦａｂ形態において比較したときに）ＦＡＰに対して少なくとも約２倍から約１０倍親抗体よりも大きい親和性を有する。更に、親抗体由来の抗体は、本発明の抗体に関して、前の段落で説明される機能の何れかを単独又は組み合わせて組み込むことができる。
【０１０３】
本発明はまた、ＦＡＰに特異的に結合する抗体をコードするポリヌクレオチドを提供する。一態様において、本発明は、上文に記述されるような本発明に係る抗ＦＡＰの抗体の一部を構成するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを対象とする。一実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、上文に記述されるような本発明に係る抗ＦＡＰ抗体の一部を形成する抗体重鎖及び／又は抗体軽鎖をコードしている。
【０１０４】
一実施態様において、本発明は、配列番号３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３，４５，４７，４９，５１，５３，５５，５７，５９，６１，６３，６５，６７，６９，７１，７３，７５，７７，７９，８１，８３，８５，８７，８９，９１，９３，９５，９７，９９，１０１，１０３，１０５，１０７，１０９，１１１，１１３，１１５，１１７，１１９，１２１，１２３，１２５，１２７，１２９，１３１，１３３，１３５，１３７，１３９，１４１，１４３，１４５，１４７，１４９，１５１，１５３，１５５，１５７，１５９，１６１，１６３，１６５，１６７，１６９，１７１，１７３，１７５及び１７７．に記載される重鎖及び軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）の一以上（すなわち、１、２、３、４、５又は６）をコードする配列、又は前記ＣＤＲに対する少なくとも特異性決定残基（ＳＤＲ）を含むその変異体又は切断型をコードする配列を含むポリヌクレオチドを対象とする。別の実施態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３，４５，４７，４９，５１，５３，５５，５７，５９，６１，６３，６５，６７，６９，７１，７３，７５，７７，７９，８１，８３，８５，８７，８９，９１，９３，９５，９７，９９，１０１，１０３，１０５，１０７，１０９，１１１，１１３，１１５，１１７，１１９，１２１，１２３，１２５，１２７，１２９，１３１，１３３，１３５，１３７，１３９，１４１，１４３，１４５，１４７，１４９，１５１，１５３，１５５，１５７，１５９，１６１，１６３，１６５，１６７，１６９，１７１，１７３，１７５及び１７７から選択される３つの軽鎖ＣＤＲ（例えば、ＬＣＤＲ１，ＬＣＤＲ２，及びＬＣＤＲ３）又は３つの重鎖ＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１，ＨＣＤＲ２，及びＨＣＤＲ３）をコードする配列、又は前記３つの相補性決定領域の各々に対する少なくともＳＤＲを含むそれらの変異体又は切断型をコードする配列を含む。さらに別の実施態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３，４５，４７，４９，５１，５３，５５，５７，５９，６１，６３，６５，６７，６９，７１，７３，７５，７７，７９，８１，８３，８５，８７，８９，９１，９３，９５，９７，９９，１０１，１０３，１０５，１０７，１０９，１１１，１１３，１１５，１１７，１１９，１２１，１２３，１２５，１２７，１２９，１３１，１３３，１３５，１３７，１３９，１４１，１４３，１４５，１４７，１４９，１５１，１５３，１５５，１５７，１５９，１６１，１６３，１６５，１６７，１６９，１７１，１７３，１７５及び１７７から選択される３つの軽鎖ＣＤＲ（例えば、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）及び３つの重鎖ＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）をコードする配列を含む。特定の実施態様において、一以上のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドは、配列番号４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８，５０，５２，５４，５６，５８，６０，６２，６４，６６，６８，７０，７２，７４，７６，７８，８０，８２，８４，８６，８８，９０，９２，９４，９６，９８，１００，１０２，１０４，１０６，１０８，１１０，１１２，１１４，１１６，１１８，１２０，１２２，１２４，１２６，１２８，１３０，１３２，１３４，１３６，１３８，１４０，１４２，１４４，１４６，１４８，１５０，１５２，１５４，１５６，１５８，１６０，１６２，１６４，１６６，１６８，１７０，１７２，１７４，１７６，１７８，１７９，１８０，１８１，１８２，１８３，１８４，１８５，１８６，１８７，１８８，１８９，１９０，１９１及び１９２に示されるＣＤＲヌクレオチド配列の一以上に対して、少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列を含む。
【０１０５】
更なる実施態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１９７，配列番号２０１，配列番号２０３，配列番号２０７，配列番号２１１，配列番号２１５，配列番号２１９，配列番号２２３，配列番号２２７，配列番号２３１，配列番号２３５，配列番号２３９，配列番号２４３，配列番号２４７，配列番号２５１，配列番号２５５，配列番号２５９，配列番号２６３，配列番号２６７，配列番号２７１，配列番号２７５，配列番号２７９，配列番号２８３，配列番号２８７，配列番号２９１，配列番号２９５，配列番号２９９，配列番号３０３，配列番号３０７，及び配列番号３１１の群から選択される重鎖可変領域をコードする配列、及び／又は、配列番号１９３，配列番号１９５，配列番号１９９，配列番号２０５，配列番号２０９，配列番号２１３，配列番号２１７，配列番号２２１，配列番号２２５，配列番号２２９，配列番号２３３，配列番号２３７，配列番号２４１，配列番号２４５，配列番号２４９，配列番号２５３，配列番号２５７，配列番号２６１，配列番号２６５，配列番号２６９，配列番号２７３，配列番号２７７，配列番号２８１，配列番号２８５，配列番号２８９，配列番号２９３，配列番号２９７，配列番号３０１，配列番号３０５，及び配列番号３０９の群から選択される軽鎖可変領域をコードする配列を含む。特定の実施態様において、重鎖及び／又は軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１９４，１９６，１９８，２００，２０２，２０４，２０６，２０８，２１０，２１２，２１４，２１６，２１８，２２０，２２２，２２４，２２６，２２８，２３０，２３２，２３４，２３６，２３８，２４０，２４２，２４４，２４６，２４８，２５０，２５２，２５４，２５６，２５８，２６０，２６２，２６４，２６６，２６８，２７０，２７２，２７４，２７６，２７８，２８０，２８２，２８４，２８６，２８８，２９０，２９２，２９４，２９６，２９８，３００，３０２，３０４，３０６，３０８，３１０及び３１２に示される可変領域ヌクレオチド配列の群から選択される配列、又はそれらの組み合わせを含む。
【０１０６】
特定の実施態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１９７，配列番号２０１，配列番号２０３，配列番号２０７，配列番号２１１，配列番号２１５，配列番号２１９，配列番号２２３，配列番号２２７，配列番号２３１，配列番号２３５，配列番号２３９，配列番号２４３，配列番号２４７，配列番号２５１，配列番号２５５，配列番号２５９，配列番号２６３，配列番号２６７，配列番号２７１，配列番号２７５，配列番号２７９，配列番号２８３，配列番号２８７，配列番号２９１，配列番号２９５，配列番号２９９，配列番号３０３，配列番号３０７，及び配列番号３１１の群から選択される重鎖可変領域をコードする配列、及び重鎖定常領域、特にヒト重鎖定常領域をコードする配列を含む。特定の実施態様において、重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域、特にＦｃ領域を含むヒトＩｇＧ重鎖定常領域である。特定の実施態様において、前記重鎖定常領域は、配列番号３１３の配列を含む。別の特定の実施態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１９３，配列番号１９５，配列番号１９９，配列番号２０５，配列番号２０９，配列番号２１３，配列番号２１７，配列番号２２１，配列番号２２５，配列番号２２９，配列番号２３３，配列番号２３７，配列番号２４１，配列番号２４５，配列番号２４９，配列番号２５３，配列番号２５７，配列番号２６１，配列番号２６５，配列番号２６９，配列番号２７３，配列番号２７７，配列番号２８１，配列番号２８５，配列番号２８９，配列番号２９３，配列番号２９７，配列番号３０１，配列番号３０５，及び配列番号３０９の群から選択される軽鎖可変領域をコードする配列、及び軽鎖定常領域、特にヒト軽鎖定常領域をコードする配列を含む。特定の実施態様において、前記軽鎖定常領域は、配列番号３１５の配列を含む。
【０１０７】
一実施態様において、本発明は、配列番号１９７，配列番号２０１，配列番号２０３，配列番号２０７，配列番号２１１，配列番号２１５，配列番号２１９，配列番号２２３，配列番号２２７，配列番号２３１，配列番号２３５，配列番号２３９，配列番号２４３，配列番号２４７，配列番号２５１，配列番号２５５，配列番号２５９，配列番号２６３，配列番号２６７，配列番号２７１，配列番号２７５，配列番号２７９，配列番号２８３，配列番号２８７，配列番号２９１，配列番号２９５，配列番号２９９，配列番号３０３，配列番号３０７，及び配列番号３１１からなる群から選択される配列に対して、少なくともおよそ９０％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする第一の単離されたポリヌクレオチド、及び配列番号１９３，配列番号１９５，配列番号１９９，配列番号２０５，配列番号２０９，配列番号２１３，配列番号２１７，配列番号２２１，配列番号２２５，配列番号２２９，配列番号２３３，配列番号２３７，配列番号２４１，配列番号２４５，配列番号２４９，配列番号２５３，配列番号２５７，配列番号２６１，配列番号２６５，配列番号２６９，配列番号２７３，配列番号２７７，配列番号２８１，配列番号２８５，配列番号２８９，配列番号２９３，配列番号２９７，配列番号３０１，配列番号３０５，及び配列番号３０９からなる群から選択される配列に対して、少なくともおよそ９０％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする第二の単離されたポリヌクレオチドを含む組成物を対象とする。
【０１０８】
一実施態様において、本発明は、配列番号１９８，配列番号２０２，配列番号２０４，配列番号２０８，配列番号２１２，配列番号２１６，配列番号２２０，配列番号２２４，配列番号２２８，配列番号２３２，配列番号２３６，配列番号２４０，配列番号２４４，配列番号２４８，配列番号２５２，配列番号２５６，配列番号２６０，配列番号２６４，配列番号２６８，配列番号２７２，配列番号２７６，配列番号２８０，配列番号２８４，配列番号２８８，配列番号２９２，配列番号２９６，配列番号３００，配列番号３０４，配列番号３０８，及び配列番号３１２からなる群から選択される配列に対して、少なくともおよそ９０％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％、又は１００％同一である配列を含む第一の単離されたポリヌクレオチド、及び配列番号１９４，配列番号１９６，配列番号２００，配列番号２０６，配列番号２１０，配列番号２１４，配列番号２１８，配列番号２２２，配列番号２２６，配列番号２３０，配列番号２３４，配列番号２３８，配列番号２４２，配列番号２４６，配列番号２５０，配列番号２５４，配列番号２５８，配列番号２６２，配列番号２６６，配列番号２７０，配列番号２７４，配列番号２７８，配列番号２８２，配列番号２８６，配列番号２９０，配列番号２９４，配列番号２９８，配列番号３０２，配列番号３０６，及び配列番号３１０からなる群から選択される配列に対して、少なくともおよそ９０％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％、又は１００％同一である配列を含む第二の単離されたポリヌクレオチドを含む組成物を対象とする。
【０１０９】
更なる態様において、本発明はまた、以上に記載されるような本発明に係るポリヌクレオチドの何れかによってコードされる単離されたポリペプチドを対象とする。
【０１１０】
更なる態様にて、以下のセクション１−６で説明されるように、上記実施態様のいずれかに記載の抗ＦＡＰ抗体は、単独または組み合わせで、任意の特徴を組み込むことができる：
【０１１１】
１．抗体親和性
ある実施態様において、本明細書において与えられる抗体は、解離定数（ＫＤ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）．好ましくは、本明細書で与えられる抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定される場合、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、特にヒトＦＡＰに、ＫＤ値が１ｎＭ未満で結合する。
一実施態様によれば、ＫＤは表面プラズモン共鳴を用いて測定される。そのようなアッセイは、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−Ｔ１００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、２５℃で、抗原固定化のため、ＣＭ５チップで実施することができる。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ．）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化した。抗Ｈｉｓ抗体（Ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ，Ｑｉａｇｅｎ）を１０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５、で４０μｇ／ｍｌに希釈し、結合したタンパク質の応答単位（ＲＵ）がおよそ９０００になるように１０μｌ／分の流速で注入した。抗Ｈｉｓ抗体の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。続いて、Ｈｉｓタグ付き抗原を１０ｎＭで１０μｌ／分で２０秒間注入し（Ｆａｂ断片による測定のため）、又は２０ｎＭで２５秒間注入し（ＩｇＧ抗体による測定のため）、固定化抗Ｈｉｓタグ付き抗体によりそのＨｉｓタグを介して捕捉する。適切なＦＡＰ抗原構築物のタンパク質配列及びＤＮＡ配列が配列番号３１７から３２２に示される。動力学測定のために、抗体の段階希釈（Ｆａｂ断片について、６．２５ｎＭから２００ｎＭの範囲で２倍希釈、又はＩｇＧについて、３．２ｐＭから１０ｎＭの範囲で５倍の希釈）を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、２５℃、ｐＨ７．４に、約９０μｌ／分の流速で注入する。次のパラメータが適用される：会合時間１８０秒、解離が３００秒（Ｆａｂについて）又は９００秒（ＩｇＧについて）、各サイクルの間に６０秒間、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ２で再生。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（ｓｉｍｐｌｅ ｏｎｅ−ｔｏ−ｏｎｅ Ｌａｎｇｍｕｉｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ）（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数(ＫＤ)をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。例えば、 Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照。
【０１１２】
２．抗体断片
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Ｆａｂ，Ｆａｂ’，Ｆａｂ’−ＳＨ，Ｆ（ａｂ’）２，Ｆｖ，及びｓｃＦｖ断片、及び下記の他の断片を含む。特定の抗体断片の総説については、 Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)、又はCarter, Nat. Rev. Immunol. 6:343-357 (2006)を参照。
【０１１３】
単鎖Ｆｖ又はｓｃＦｖ断片は、単一のポリペプチド鎖としてＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。一般的に、ＶＨドメイン及びVLドメインがリンカー配列により結合される。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Plueckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照;また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ '）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
【０１１４】
ダイアボディは２価または二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号； Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照。トリアボディ及びテトラボディもまた Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。
【０１１５】
ミニボディは、二量体化領域として、免疫グロブリンの定常領域、典型的には免疫グロブリンのＣＨ３領域、好ましくはＩｇＧ、より好ましくはＩｇＧ１を含む、二価の、ホモ二量体ｓｃＦｖ誘導体である。一般的に、定常領域は、ヒンジ領域及び／又はリンカー領域を介してｓｃＦｖに接続されている。ミニボディタンパク質の例は、Hu et al., Cancer Res. 56: 3055-61 (1996)に見いだすことができる。
【０１１６】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。ある実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である (Domantis, Inc., Waltham, MA; 例えば、米国特許第６２４８５１６ Ｂ１号を参照）。
【０１１７】
抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体の分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。
【０１１８】
３．キメラ及びヒト化抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４８１６５６７号、及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
【０１１９】
ある実施態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するために、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持したまま、ヒト化されている。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはその一部）が、非ヒト抗体から由来し、ＦＲ（またはその一部）がヒト抗体配列に由来する、一以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部をも含む。幾つかの実施態様において、ヒト化抗体の幾つかのFR残基は、抗体特異性又は親和性を回復もしくは改善するめに、非ヒト抗体（例えば、HVR残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換されている。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、限定されなが、（ａ）キメラ抗体を産生するためにヒト定常領域上に全非ヒト可変ドメインを移植する、（ｂ）非ヒト（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲのみを、重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体の機能を維持するために重要であるもの）の保持を伴うか又は伴わない、ヒト（例えば、レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域の上に移植する、（ｃ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ−ＣＤＲ；抗体−抗原相互作用に重要な残基）のみを移植ヒトフレームワーク領域及び定常領域上に移植する、又は（ｄ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってヒト様部分（section）で「覆い隠す」。ヒト化抗体およびそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に、Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 米国特許第５８２１３３７号，第７５２７７９１号，第６９８２３２１号，および第７０８７４０９号; Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 31(3):169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)(ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記述); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (「リサーフェシング」を記述); Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) （「ＦＲシャッフリング」を記述);及びOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 及びKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) （ＦＲシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。
【０１２０】
ヒト化に用いられ得るヒトフレームワーク領域は、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)）；軽鎖または重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域(例えば、Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992);及びPresta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)を参照); ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域 (例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照); 及びＦＲライブラリスクリーニング由来のフレームワーク領域 (例えば、Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及び Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)を参照)を含む。
【０１２１】
４．ヒト抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。
【０１２２】
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つ又はインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、 Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)を参照。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術を記載している、米国特許第６０７５１８１号及び６１５０５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５７７０４２９号；Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７０４１８７０号及び、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号）を参照。このような動物で生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、更に改変される可能性がある。
【０１２３】
ヒト抗体は、ハイブリドーマベース法によって作成することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒトヘテロ細胞株が記載されている。(例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987);及びBoerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)を参照)ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体はまた、Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)に記載されている。更なる方法は、例えば、米国特許第７１８９８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）及びNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (ヒト-ヒトハイブリドーマを記載している)に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）もまた、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 及びVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載される。
【０１２４】
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。このような可変ドメイン配列は、次に所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術が、以下に説明される。
【０１２５】
５．ライブラリー由来の抗体
本発明の抗体は、所望の活性または活性（複数）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてのライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)に総説され、更に、例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 及びLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。
【０１２６】
特定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングされ、ファージライブラリーにランダムに再結合され、その後、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、またはＦａｂ断片のいずれかとして提示する。免疫された起源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性なしで免疫原に高親和性抗体を提供する。代わりに、Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)に記載されるように、ナイーブなレパートリーが、任意の免疫感作無しで、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対して、抗体の単一起源を提供するために、（例えば、ヒトから）クローン化することができる。最後に、ナイーブなライブラリはまた、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)に記載されるように、非常に可変なＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再構成を達成するために、幹細胞由来の未転位Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することにより合成することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記述する特許公報は、例えば、米国特許第５７５０３７３号、及び米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号及び第２００９／０００２３６０号を含む。
【０１２７】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書でヒト抗体またはヒト抗体の断片とみなされる。
【０１２８】
６．多重特異性抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様において、結合特異性の一つはＦＡＰに対してであり、他は、任意の他の抗原に対してである。ある実施態様において、二重特異性抗体は、ＦＡＰの２つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体はまたＦＡＰを発現する細胞に対して細胞傷害性薬物を局在化させるために用いることができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
【０１２９】
多重特異性抗体を作製するための技術は、限定されないが、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の組換え共発現(Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照)及び“ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ”エンジニアリング（例えば、米国特許第５７３１１６８号を参照）を含む。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ−ヘテロ２量体分子を作成するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号）、２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４６７６９８０号、及びBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照)；２重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること(例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)を参照)；二重特異性抗体フラグメントを作製するため、「ダイアボディ」技術を使用すること(例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照)；単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること(例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照)、及び、例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作成することができる。
【０１３０】
「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能性抗原結合部位を持つ改変抗体もまた本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６Ａ１号を参照）。
【０１３１】
本明細書中の抗体又は断片はまた、ＦＡＰ並びにその他の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む、「２重作用（Ｄｕａｌ Ａｃｔｉｎｇ）ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」を含む（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号参照）。
【０１３２】
７．抗体変異体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、またはペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終コンストラクトに到達させるために作成され得る。
【０１３３】
ａ）置換、挿入、および欠失変異体
ある実施態様において、一つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異の対象となる部位は、ＨＶＲとＦＲを含む。
【０１３４】
アミノ酸置換は、同様の構造的及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸で一つのアミノ酸を置換すること、例えば、保存的アミノ酸置換をもたらすことが可能である。「保存的」アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び/又は、両親媒性の性質の類似性に基づいて行うことができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンを含み;極性中性アミノ酸は、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンを含み;正に帯電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン、及びヒスチジンを含み；負に帯電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。保存的置換は、表２の「好ましい置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表２の「典型的な置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされた。
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アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン，Ｍｅｔ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ，Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ，Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｐｈｅ．
【０１３５】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。例えば、アミノ酸置換はまた、異なる構造及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸で一つのアミノ酸を置換すること、例えば、一群（例えば、極性）由来のアミノ酸を異なる群（例えば、塩基性）由来の別のアミノ酸で置換することをもたらすことができる。許容される変異は、組換えＤＮＡ技術を用いて、ポリペプチド分子中にアミノ酸の挿入、欠失、又は置換を体系的に作成し、得られた組換え変異体を活性についてアッセイすることによって実験的に決定され得る。
【０１３６】
置換変異体の一つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体など）の一以上の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的には、更なる研究のために選択され得られた変異体は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性を減少）を有し、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。典型的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるファージディスプレイベースの親和性成熟技術を用いて、簡便に生成され得る。簡潔に言えば、一つ以上のＨＶＲ残基が変異し、変異体抗体は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【０１３７】
変更（例えば、置換）は、例えば抗体の親和性を向上させるために、ＨＶＲで行うことができる。このような変更は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされた残基で(例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照)、及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）で行うことができ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリから構築し選択し直すことによる親和性成熟が、例えばHoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様において、多様性が、種々の方法（例えば、変異性ＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発）のいずれかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、ライブラリーは、所望の親和性を持つ抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するするもう一つの方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４から６残基）がランダム化されたＨＶＲ指向のアプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発、またはモデリングを用いて、特異的に同定され得る。ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的にされる。
【０１３８】
所定の実施態様において、置換、挿入、または欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限りにおいて、一以上のＨＶＲ内で発生する可能性がある。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変（例えば本明細書で与えられる保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。このような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側であってもよい。上記に与えられた変異体ＶＨ又はＶＬ配列の所定の実施態様において、各ＨＶＲは不変であるか、又はわずか１個、２個または３個のアミノ酸置換が含まれているかの何れかである。
【０１３９】
突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085により説明されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基またはグループ（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判断するために、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）に置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。代わりに、又は更に、抗体と抗原との接触点を同定するために、抗原抗体複合体の結晶構造を分析することは有益であり得る。そのような接触残基及び隣接残基が、置換の候補として標的とされるか又は排除され得る。変異体はそれらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
【０１４０】
アミノ酸配列挿入は、一残基から百以上の残基を含有するポリペプチド長にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニン残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素に対する抗体のＮ末端またはＣ末端への融合（例えばＡＤＥＰＴの場合）、または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。
【０１４１】
ｂ）グリコシル化変異体
幾つかの実施態様において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の改変は一定の改善された特性を有する抗体変異型を作成するために行われ得る。
【０１４２】
一つの態様において、本発明は、抗体依存性細胞傷害を含む、増加したエフェクター機能を有する抗ＦＡＰ抗体のグリコフォームを提供する。抗体のグリコシル化工学は以前に記載されている。例えば、米国特許第６６０２６８４号を参照し、参照によりその全体が援用される。グリコシル化に関与する遺伝子の活性を変化させた宿主細胞からの抗ＦＡＰ抗体の生産の方法もまた本明細書に詳細が記述される（下の「組換えの方法及び組成物」と題された節を参照）。
【０１４３】
ＩｇＧ分子は、そのＦｃ領域内の２つのＮ−結合型オリゴ糖、各重鎖上に１つ、を運ぶ。任意の糖タンパク質として、抗体は、同じポリペプチド骨格を共有するが、グリコシル化部位に付着された異なる糖鎖を持つグリコフォームの集団として生成される。血清ＩｇＧのＦｃ領域に通常見られるオリゴ糖は、低レベルの末端シアル酸及び二分岐したＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、及び様々な程度の端末のガラクトシル化とコアフコシル化（フコースが二分岐糖鎖構造の「基部」においてＧｌｃＮＡｃ残基に付着している）を持つ複雑な二分岐型である。幾つかの研究では、ＦｃγＲ結合のために必要な最小限の炭水化物構造はオリゴ糖コア内にあることを示唆している。Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69 (1996).
【０１４４】
抗体の産生のために産業界及びアカデミアで使用されるマウス又はハムスター由来の細胞株は、要求されるオリゴ糖決定因子をＦｃ部位に対して通常付着させる。これらの細胞株で発現されるＩｇＧは、しかしながら、血清中のＩｇＧの低い量で見いだされる分岐したＧｌｃＮＡｃを欠いている。Lifely et al., Glycobiology 318:813-22 (1995).N-結合型グリコシル化経路では、分岐したＧｌｃＮＡｃがＧｎＴＩＩＩによって付加される。Schachter, Biochem.Cell Biol.64:163-81 (1986).
【０１４５】
Ｕｍａｎａらは、クローン化されたＧｎＴＩＩＩ酵素遺伝子の異なるレベルを外部制御される様式で発現するように以前に操作された、単一の抗体産生ＣＨＯ細胞株を使用した (Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999))。このアプローチでは、グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＧｎＴＩＩＩ）の発現及び修飾された抗体のＡＤＣＣ活性間の厳密な相関関係を初めて確立した。従って、本発明は、抗体産生宿主細胞内での糖転移酵素遺伝子の発現レベルを変化させたことによる、グリコシル化を変化させたＦｃ領域又はＦｃ領域に等価な領域を含む、抗ＦＡＰ抗体を熟慮する。特定の実施態様において、遺伝子発現レベルの変化はＧｎＴＩＩＩ活性の増加である。ＧｎＴＩＩＩ活性の増加は、抗体のＦｃ領域において、二分岐型のオリゴ糖の割合の増加、並びにフコシル化オリゴ糖の割合の減少をもたらす。この抗体又はその断片は、Ｆｃ受容体結合親和性を増加させ、かつエフェクター機能を増加させている。
【０１４６】
抗体が、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分岐型のオリゴ糖とともに与えられる。このような抗体変異体はフコシル化を減少させ、及び／又はＡＤＣＣ機能を改善している可能性がある。そのような抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔｔら）；米国特許第６６０２６８４号（Ｕｍａｎａら）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａら）に記載されている。
【０１４７】
一実施態様において、本発明の抗ＦＡＰ抗体は、本発明の方法によるそのオリゴ糖の修飾の結果として、Ｆｃ領域に二分岐型のオリゴ糖の割合が増加している。一実施態様において、本発明の抗ＦＡＰ抗体のＦｃ領域における二分岐型のＮ−結合型オリゴ糖の割合は、全オリゴ糖のうち少なくとも約１００％から約１０％、具体的には少なくとも約５０％、より具体的には少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０−９５％である。二分岐型のオリゴ糖は、ハイブリッド又は複合体型のものであり得る。
【０１４８】
別の実施態様において、本発明の抗ＦＡＰ抗体は、本発明の方法によるそのオリゴ糖の修飾の結果として、Ｆｃ領域に非フコシル化オリゴ糖の割合が増加している。一実施態様において、非フコシル化オリゴ糖の割合は、少なくとも約２０％から約１００％、具体的には少なくとも約５０％、少なくとも約６０％から少なくとも約７０％、及びより具体的には少なくとも約７５％である。非フコシル化オリゴ糖は、ハイブリッド又は複合体型のものであり得る。
【０１４９】
フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定されるＡｓｎ２９７に付着しているすべての糖構造の合計（例えば、コンプレックス、ハイブリッド及び高マンノース構造）に対して、Ａｓｎ２９７の糖鎖中のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）でおよそ２９７の位置に位置するアスパラギン残基を指し、しかし、Ａｓｎ２９７もまた位置２９７の上流または下流のおよそ±３アミノ酸に、すなわち抗体の軽微な配列変異に起因して、位置２９４と３００の間に配置され得る。フコースの相対量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより、Ｎ−グリコシダーゼＦ処理した試料（例えば、複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造）に同定された全ての糖構造に関連したフコース含有構造の割合である。このようなフコシル化変異体はＡＤＣＣ機能を改善させた可能性がある。
【０１５０】
本発明の抗ＦＡＰ抗体を用いて使用することができる糖鎖工学の方法論は、米国特許第６６０２６８４号、米国特許出願公開第２００４／０２４１８１７ Ａ１号、米国特許出願公開第２００３／０１７５８８４ Ａ１号、米国仮特許出願第６０／４４１、３０７号及び国際公開第２００４／０６５５４０号により詳細に説明されており、それらの各々の内容全体は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明の抗ＦＡＰ抗体は、あるいは、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（ジェネンテック）、又は欧州特許第１１７６１９５ Ａ１号、国際公開第０３／０８４５７０号、国際公開第０３／０８５１１９号及び米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、米国特許出願公開第２００４／０９３６２１号、米国特許出願公開第２００４／１１０２８２号，米国特許出願公開第２００４／１１０７０４号，米国特許出願公開第２００４／１３２１４０号, Niwa et al., J Immunol Methods 306, 151/160 (2006), 米国特許第６，９４６，２９２号（Ｋｙｏｗａ）に開示された技術に従って、Ｆｃ領域にフコース残基を減少させるように糖鎖を操作することができる。本発明の糖鎖操作抗ＦＡＰ抗体はまた、米国特許出願公開第６０／３４４，１６９号及び国際公開第０３／０５６９１４号（ＧｌｙｃｏＦｉ，Ｉｎｃ．）又は国際公開第２００４／０５７００２号及び国際公開第 ２００４／０２４９２７号（Ｇｒｅｅｎｏｖａｔｉｏｎ）に教授されるものなど、修飾された糖タンパク質を産生する発現系において生産することができる。
【０１５１】
「フコース非修飾」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連する出版物の更なる例は次のとおりである：国際公開第２０００／６１７３９号；国際公開第２００１／２９２４６号；米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号；米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号；国際公開第２００５／０３５５８６号；国際公開第２００５／０３５７７８号；国際公開第２００５／０５３７４２号；国際公開第２００２／０３１１４０号; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)。非フコシル化抗体を産生する能力を有する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞(Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); 米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８ Ａ１号，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；及び国際公開第２００４／０５６３１２ Ａ１号，Ａｄａｍｓら、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えばアルファ−１、６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）を含む。
【０１５２】
特定の実施態様において、本発明の抗ＦＡＰ抗体は、Fc領域において、二分岐型の非フコシル化オリゴ糖の割合が増加している。二分岐型の非フコシル化オリゴ糖は、ハイブリッド又は複合体の何れかであり得る。具体的には、本発明の方法は、抗原結合分子のＦｃ領域のオリゴ糖の少なくとも約１０％から約１００％、具体的には少なくとも約１５％、より具体的には少なくとも約２０％から約２５％、及びより具体的には少なくとも約３０％から約３５％が二分岐型となり、非フコシル化型抗ＦＡＰ抗体を産生するために使用することができる。本発明の抗ＦＡＰ抗体は、抗体のＦｃ領域のオリゴ糖の少なくとも約１０％から約１００％、具体的には少なくとも約１５％、より具体的には少なくとも約２０％から約２５％、及びより具体的には少なくとも約３０％から約３５％が二分岐型となり、ハイブリッドで、非フコシル化型抗ＦＡＰ抗体を産生するために使用することができる。
【０１５３】
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、その抗体がグリコシル化される程度を増加または減少するように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、一以上のグリコシル化部位が作成または削除されるようにアミノ酸配列を変えることによって簡便に達成することができる。
【０１５４】
Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。このような抗体変異体はＣＤＣ機能を改善させた可能性がある。このような抗体変異体は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌら）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）；及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【０１５５】
ＡＤＣＣ又は本発明の抗ＦＡＰ抗体の他のエフェクター機能の増加はまた、ＦＡＰに対する抗原結合分子の親和性の増加により、例えば、親和性成熟又は親和性を改善する別の方法により(Tang et al., J. Immunol. 2007, 179:2815-2823を参照)、又は下記のようにＦｃ領域におけるアミノ酸修飾により、達成することができる。これらのアプローチの組み合わせもまた、本発明に包含される。
【０１５６】
ｃ）Ｆｃ領域変異体
ある実施態様において、１つまたは複数のアミノ酸改変を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入することができ、それによってＦｃ領域変異体を生成する。Ｆｃ領域の変異体は、１つまたは複数のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域の配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでもよい。
【０１５７】
ある実施態様において、本発明は、インビボにおける抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（例えば補体およびＡＤＣＣなど）が不要または有害である用途のための望ましい候補とならしめる、全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体を意図している。インビトロ及び／又はインビボでの細胞毒性アッセイを、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠くが（それゆえ、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認するために行うことができる。ＡＤＣＣを媒介する初代細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)の４６４ページの表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５５００３６２号（例えば、Hellstrom, I. et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)を参照) 及びHellstrom, I et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 第５８２１３３７号 (Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照)に説明される。あるいは、非放射性の方法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、又は更に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998)に開示されるように、インビボで、例えば動物モデルにおいて評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイはまた、抗体が体Ｃ１ｑを結合することができないこと、したがって、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために行うことができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003);及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照)。FcRn結合、及びインビボでのクリアランス／半減期の測定ではまた、当該分野で公知の方法を用いて行うことができる(例えば、Petkova, S.B. et al., Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照)。
【０１５８】
エフェクター機能が減少した抗体は、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、３２９の一つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２以上での置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。
【０１５９】
ＦｃＲへの改善又は減少させた結合を持つ特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照）。
【０１６０】
ある実施態様において、抗体変異体はＡＤＣＣを改善する１つまたは複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４における置換（ＥＵの残基番号付け）を含む。
【０１６１】
幾つかの実施態様において、例えば、米国特許第６１９４５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)に説明されるように、変更された（すなわち改善されたか又は減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる、Ｆｃ領域における変更がなされる。
【０１６２】
増加した半減期を持ち、胎仔への母性ＩｇＧの移送を担う、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体 (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 及びKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１号（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一つまたは複数の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域の残基の１以上の置換を有するものが含まれる：２３８，２５６，２６５，２７２，２８６，３０３，３０５，３０７，３１１，３１２，３１７，３４０，３５６，３６０，３６２，３７６，３７８，３８０，３８２，４１３，４２４又は４３４、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換（米国特許第７３７１８２６号）。
【０１６３】
Ｆｃ領域の変異体に関する更なる例については、米国特許出願第６０／４３９４９８号；米国特許出願第６０／４５６０４１号；米国特許出願第６０／５１４５４９号；又は国際公開第２００４／０６３３５１号（アミノ酸改変により増加した結合親和性を有する変異体Ｆｃ領域）；又は米国特許出願第１０／６７２２８０号又は国際公開第２００４／０９９２４９号（アミノ酸改変に起因するＦｃγＲに対する結合の変化を伴うＦｃ変異体）, Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); 米国特許第５６４８２６０号；米国特許第５６２４８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号もまた参照。
【０１６４】
ｄ）システイン改変抗体変異体
ある実施態様において、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン改変抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂｓ」を作成することが望まれ得る。特定の実施態様において、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で起きる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中でさらに記載されるように、抗体コンジュゲートを作成するために、例えば薬物部分またはリンカー−薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。ある実施態様において、一以上の以下の残基がシステインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。
【０１６５】
ｅ）抗体誘導体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手されている追加の非タンパク質部分を含むように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキソラン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体又はランダム共重合体の何れか）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造上の利点を有し得る。ポリマーは何れかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は変動してよく、そして、一以上の重合体が結合する場合は、それらは同じか又は異なる分子であることができる。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が特定の条件下で治療に使用されるのか等を考慮しながら決定することができる。
【０１６６】
その他の実施態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱されてもよい抗体と非タンパク質部分とのコンジュゲートが、提供される。一実施態様において、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである(Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)。放射線は、任意の波長であって良いが、限定されないものの、通常の細胞に害を与えないが、抗体−非タンパク質部分の近位細胞が死滅される温度に非タンパク質部分を加熱する波長が含まれる。
【０１６７】
Ｂ．組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号で説明したように、組換えの方法および組成物を用いて製造することができる。一実施態様において、本明細書に記載される抗ＦＡＰ抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。このようなポリヌクレオチドは、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。更なる実施態様において、そのようなポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクター（例えば、クローニングベクター又は発現ベクター）が提供される。更なる実施態様において、そのようなポリヌクレオチド又はそのようなベクターを含む宿主細胞が提供される。一実施態様において、宿主細胞は以下を含む（例えば、以下で形質転換される）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むベクター（例えばポリシストロンベクター）、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む第一ベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む第ニベクター。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、特に哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様において、抗ＦＡＰ抗体を作る方法が提供され、その方法は、上記のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することを含み、および必要に応じて、宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。
【０１６８】
抗ＦＡＰ抗体の組換え生産のために、例えば上述したように、抗体をコードする１つ以上のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために１つ以上のベクターに挿入される。当業者によく知られている方法は、適切な転写／翻訳制御シグナルとともに、抗ＦＡＰ抗体のコード配列を含む発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法は、インビトロでの組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボでの組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989) and Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)に記載される技術を参照。
【０１６９】
一実施態様において、抗ＦＡＰ抗体をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドは、構成的プロモーター又は、代わりに、調節された発現システムの制御下において発現させることができる。適切な調節発現系は、限定されないが、テトラサイクリン調節発現系、エクジソン誘導発現系、ｌａｃ−ｓｗｉｔｃｈ発現系、グルココルチコイド誘導性発現系、温度誘導性プロモーター系、及びメタロチオネイン金属誘導発現システムを含む。本発明の抗体をコードする複数の異なるポリヌクレオチドが宿主細胞系内に含まれている場合、それらの幾つかは、構成的プロモーターの制御下で発現させることができ、一方で他は調節されるプロモーターの制御下で発現される。
【０１７０】
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は、細菌で産生することができる。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、第５７８９１９９号及び第５８４０５２３号を参照。（また、大腸菌における抗体の発現を説明している、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254も参照。）発現の後、抗体は可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され得、更に精製することができる。
【０１７１】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含む抗体をコードするベクターのための、適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路が、「ヒト化」されており、部分的または完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の生成をもたらす。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)、及びLi et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)を参照。このような発現系はまた、米国特許第６０／３４４１６９号及び国際公開第０３／０５６９１４号（非ヒト真核生物宿主細胞中でヒト様糖タンパク質を産生するための方法）に教示されている。
【０１７２】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。
【０１７３】
植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載)を参照。
【０１７４】
脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株 (Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３又は２９３Ｔ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）、例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載されるＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及びＹ０、ＮＳ０およびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の評価については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。
【０１７５】
安定的な発現は、一般に一過性発現に対して好ましく、その理由は、それがより再現可能な結果を典型的に達成し、及び大規模生産により適しているためである；しかし一過性発現が特定の状況において良好であるかどうかを判断することは当業者の技術範囲内である。
【０１７６】
本発明は、宿主細胞によって産生される本発明の抗ＦＡＰ抗体のグリコシル化プロファイルを修飾するための方法を対象としており、前記宿主細胞中で、抗ＦＡＰ抗体をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、又はグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、又はそうしたポリヌクレオチドを含むベクターを発現させることを含む。一般に、上述した細胞株を含む培養細胞株の任意のタイプが、変更されたグリコシル化パターンを有する抗ＦＡＰ抗体の産生のための細胞株を生成するために使用できる。好ましい細胞株は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞、及び他の哺乳動物細胞が挙げられる。グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）、α−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＩＩ）を含む。一実施態様において、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドの組み合わせは、宿主細胞中で発現される（例えば、ＧｎＴＩＩＩ及びＭａｎ ＩＩ）。同様に、この方法はまた、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子が破壊されたか又はそうでなければ非活性化された宿主細胞内（例えば、α１，６フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の活性がノックアウトされた宿主細胞）で抗ＦＡＰ抗体をコードする１つ以上のポリヌクレオチドの発現を網羅する。特定の実施態様において、本発明の抗ＦＡＰ抗体は、前記抗体のグリコシル化パターンを修飾するためにＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを更に発現する宿主細胞で生産することができる。特定の実施態様において、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、ゴルジ常駐性ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドである。その他の特定の実施態様において、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する宿主細胞における本発明の抗ＦＡＰ抗体の発現は、増加したＦｃ受容体結合親和性及び／又は増加したエフェクター機能を有する抗ＦＡＰ抗体をもたらす。従って、一実施態様において、本発明は、（ａ）ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする配列を含む１つ以上の単離されたポリヌクレオチド；及び（ｂ）本発明の抗ＦＡＰ抗体をコードする１つ以上の単離されたポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を対象とする。特定の実施態様において、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、異種性ゴルジ常駐性ポリペプチドのゴルジ局在化ドメイン及びＧｎＴＩＩＩの触媒ドメインを含む融合ポリペプチドである。特に、前記ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩＩのゴルジ局在化ドメインである。このような融合ポリペプチドを生成し、増加したエフェクター機能を有する抗体を産��するためにそれらを使用するための方法は、国際公開第２００４／０６５５４０号，米国仮特許出願第６０／４９５，１４２号及び米国特許出願公開第２００４／０２４１８１７号に開示され、その内容全体が参照により本明細書に援用される。その他の実施態様において、宿主細胞は、マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）活性を有するポリペプチドをコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチドを更に含む。抗ＦＡＰ抗体をコードするポリヌクレオチドなど、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、構成的プロモーター又は、代わりに、調節された発現システムの制御下において発現させることができる。このようなシステムは、当技術分野でよく知られており、上述したシステムが含まれている。
【０１７７】
抗ＦＡＰ抗体のコード配列及び／又はグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドのコード配列を含有し、生物学的に活性な遺伝子産物を発現する宿主細胞は、例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション；「マーカー」遺伝子機能の有無；宿主細胞内でのそれぞれのｍＲＮＡ転写物の発現により測定されるように転写のレベルを評価すること；；又はイムノアッセイによって、又はその生物学的活性−当技術分野でよく知られている方法によって測定されるような遺伝子産物の検出により同定され得る。ＧｎＴＩＩＩ又はＭａｎ ＩＩ活性は、例えば、ＧｎＴＩＩＩ又はＭａｎＩＩの生合成産物に結合するレクチンを用いることによって検出することができる。そのようなレクチンの例は二分岐するＧｌｃＮＡｃを含むオリゴ糖に優先的に結合するＥ４−ＰＨＡレクチンである。ＧｎＴＩＩＩ又はＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドの生合成産物（すなわち、特定のオリゴ糖構造）はまた、前記ポリペプチドを発現する細胞により生産される糖タンパク質から遊離されたオリゴ糖の質量分析によって検出することができる。あるいは、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペ王チドをコードするポリヌクレオチドにより操作された細胞により産生される抗体によって媒介されるＦｃ受容体結合の増加又はエフェクター機能の増加を測定する機能的アッセイを使用することができる。
【０１７８】
本発明はまた、修飾されたオリゴ糖を有する抗ＦＡＰ抗体を産生するための方法を対象とし、（ａ）グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを、本発明に係る抗ＦＡＰ抗体の産生を可能にする条件下で発現させるように操作された宿主細胞を培養し、ここで、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、前記宿主細胞により産生される前記抗ＦＡＰ抗体のＦｃ領域においてオリゴ糖を修飾するために十分な量で発現され；及び（ｂ）前記抗ＦＡＰ抗体を単離することを含む。一実施態様において、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドはＧｎＴＩＩＩである。その他の実施態様において、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する２つのポリペプチドがある。特定の実施態様において、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する２つのポリペプチドはＧｎＴＩＩＩ及びＭａｎＩＩである。その他の実施態様において、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、ＧｎＴＩＩＩの触媒ドメインを含む融合ポリペプチドである。より特定の実施態様において、融合ポリペプチドはさらに、ゴルジ常駐性ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む。特に、ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩＩ又はＧｎＴＩの局在化ドメインであり、最も具体的にはマンノシダーゼＩＩの局在化ドメインである。あるいは、ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩの局在化ドメイン、ＧｎＴＩＩの局在化ドメイン、及びα１，６コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインからなる群から選択される。
【０１７９】
特定の実施態様において、宿主細胞又は上述された方法によって生産された修飾された抗ＦＡＰ抗体は、ＩｇＧ定常領域又はＦｃ領域を含むその断片を有する。その他の特定の実施態様において、抗ＦＡＰ抗体は、ヒト化又はヒト抗体又はＦｃ領域を含むそれらの断片である。
【０１８０】
宿主細胞又は上記の方法により産生されたグリコシル化が変化した抗ＦＡＰ抗体は、典型的には、宿主細胞の修飾の結果（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現により）、Ｆｃ受容体結合親和性の増加及び／又はエフェクター機能の増加を示す。好ましくは、Ｆｃ受容体結合の増加は、活性化Ｆｃγ受容体、最も好ましくはＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加である。エフェクター機能の増加は、好ましくは以下の一つ又は複数における増加である：Ｆｃ媒介性細胞傷害性の増加、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の増加、サイトカイン分泌の増加、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性の抗原取り込みの増加、Ｆｃ媒介性細胞傷害の増加、ＮＫ細胞への結合の増加、マクロファージへの結合の増加、多形核細胞（ＰＭＮＣ）への結合の増加、単球への結合の増加、標的結合抗体の架橋の増加、直接的シグナル伝達誘導性アポトーシスの増加、樹状細胞成熟の増加、又はＴ細胞プライミングの増加。
【０１８１】
Ｃ．アッセイ
本明細書で提供される抗ＦＡＰ抗体は、同定され、当技術分野で公知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、または特徴づけることができる。
【０１８２】
１．結合アッセイとその他のアッセイ
一態様において、本発明の抗体は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法など公知の方法により、その抗原結合活性について試験される。
【０１８３】
その他の態様において、競合アッセイを、ＦＡＰに結合するための他の特異的抗ＦＡＰ抗体と競合する抗体を同定するために用いることができる。ある実施態様において、このような競合する抗体は、前記の他の特異的抗ＦＡＰ抗体により結合される同一のエピトープ（例えば、直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な典型的な方法が、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。
【０１８４】
典型的な競合アッセイにおいて、固定化ＦＡＰは、ＦＡＰに結合する第一の標識された抗体（実施例に記載される３Ｆ２抗体など）、及びＦＡＰへ結合について第一の抗体と競合する能力について試験されている第二の未標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。コントロールとして、固定化ＦＡＰが、第二の未標識の抗体でなく、第一の標識された抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第一の抗体のＦＡＰへの結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰の未結合の抗体が除去され、固定化されたＦＡＰに結合した標識の量が測定される。もし、固定化ＦＡＰに結合した標識の量が、コントロールサンプルと比較して試験サンプル中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体が、ＦＡＰへの結合に対して、第一の抗体と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。
【０１８５】
２．活性のアッセイ
一態様において、アッセイは、生物学的活性を有するそれらの抗ＦＡＰ抗体を同定するために与えられる。生物学的活性は、例えば、標的細胞の溶解、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、又はアポトーシスの誘導の溶解を含み得る。インビボ及び／又はインビトロでこのような生物学的活性を有する抗体もまた提供される。
【０１８６】
ある実施態様において、本発明の抗体は、そのような生物学的活性について試験される。ＡＤＣＣを試験するための例示的なアッセイは以上に（「定義」；「ＡＤＣＣが増加した抗体」を参照）及び実施例１１に記載されている。細胞溶解（例えばＬＤＨ放出の測定による）又はアポトーシス（例えば、ＴＵＮＥＬアッセイを使用して）を検出するためのアッセイは、当該分野で周知である。ＡＤＣＣ又はＣＤＣを測定するためのアッセイは国際公開第２００４／０６５５４０号（そのなかの実施例１を参照）に記載されており、その全内容が参照により本明細書に援用される。
【０１８７】
Ｄ．抗体コンジュゲート
本発明はまた、化学療法剤又は薬物、成長抑制剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位元素など、１つ以上の細胞傷害性薬物にコンジュゲートした本明細書中の抗ＦＡＰ抗体を含むコンジュゲートを提供する。
【０１８８】
一実施態様において、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）において、抗体は、限定されないが、メイタンシノイド（米国特許第５２０８０２０号、第５４１６０６４号及び欧州特許ＥＰ０ ４２５２３５ Ｂ１を参照）；モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５６３５４８３号及び５７８０５８８号及び７４９８２９８号を参照）などのアウリスタチン；ドラスタチン、カリケアマイシン又はその誘導体（米国特許第５７１２３７４号、５７１４５８６号、５７３９１１６号、５７６７２８５号、５７７０７０１号、５７７０７１０号、５７７３００１号、及び５８７７２９６号を参照;Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993);及びLode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); ダウノマイシン又はドキソルビシンなどのアントラサイクリン (Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002);及び米国特許第6,630,579号を参照); メトトレキサート、ビンデシン、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセルなどのタキサン、トリコテセン、及びCC1065を含む一つ以上の薬物とコンジュゲートしている。
【０１８９】
その他の実施態様において、抗体コンジュゲートは、酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートした、本明細書に記載の抗体を含み、限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（PAPI、PAPII、及びPAP-S）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria oficinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。
【０１９０】
その他の実施態様では、抗体コンジュゲートは、放射性コンジュゲートを形成するために放射性原子にコンジュゲートした本明細書に記載されるような抗体を含む。様々な放射性同位体が放射性コンジュゲートの生産のために入手可能である。例としては、Ａｔ２１１，Ｉ１３１，Ｉ１２５，Ｙ９０，Ｒｅ１８６，Ｒｅ１８８，Ｓｍ１５３，Ｂｉ２１２，Ｐ３２，Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体を含む。検出のために放射性コンジュゲートを使用するとき、それはシンチグラフィー試験のための放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像化ｍｒｉとしても知られている）のためのスピン標識、例えば再び、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含んでよい。
【０１９１】
抗体と細胞傷害性薬物のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルズベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えばビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）など、を使って作成され得る。Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)に記載されるように、例えば、リシンイムノトキシンを調製することができる。カーボン−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのためのキレート剤の例である国際公開第９４／１１０２６号を参照。リンカーは、細胞中に細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光解離性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992);米国特許第５２０８０２０号）が使用され得る。
【０１９２】
本明細書で抗体コンジュゲートは、限定されないが、市販の（例えばＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａからの）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＰＢ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、ＳＶＳＢ（スクシンイミジル（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むクロスリンカー試薬を用いて調製されるコンジュゲートを限定されないが明示的に熟考している。
【０１９３】
Ｅ．診断及び検出のための方法および組成物
ある実施態様において、本明細書で提供される抗ＦＡＰ抗体の何れかは、生物学的サンプル中のＦＡＰの存在を検出するのに有用である。本明細書で使用する「検出」という用語は、定量的または定性的検出を包含する。ある実施態様において、生物学的サンプルは細胞又は組織、例えば、脳、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、小腸、胃、又は子宮からの細胞又は組織などを、これらの器官の腫瘍の細胞又組織も含み、含む。
【０１９４】
一実施態様において、診断又は検出の方法に使用される抗ＦＡＰ抗体が提供される。更なる態様において、生物学的サンプル中のＦＡＰの存在を検出する方法が提供される。ある実施態様において、本方法は、抗ＦＡＰ抗体のＦＡＰへの結合を許容する条件下で、本明細書に記載のように抗ＦＡＰ抗体と生物学的サンプル、任意でコントロールサンプルと接触させること、及び複合体が抗ＦＡＰ抗体とＦＡＰとの間に形成されているかどうかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロ又はインビボでの方法であり得る。一実施態様において、例えばＦＡＰが患者の選択のためのバイオマーカーであるなど、抗ＦＡＰ抗体が抗ＦＡＰ抗体による治療に好適な被検体を選択するために使用される。
【０１９５】
本発明の抗体を用いて診断することができる例示的な疾患は、癌及び特定の炎症性症状などＦＡＰの発現に関連する疾患を含む。
【０１９６】
一態様において、被検体における疾患を診断する方法が提供され、前記方法は、診断薬の有効量を前記被検体に投与することを含み、ここで、前記診断薬は、本明細書に記載される抗ＦＡＰ抗体、前記診断薬とＦＡＰの複合体の検出を可能とする標識、典型的には造影剤を含む。
【０１９７】
ある実施態様において、標識された抗ＦＡＰ抗体が提供される。標識は、限定されるものではないが、（例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識など）直接検出される標識又は部分、並びに、例えば、酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンドのような部分が含まれる。典型的な標識の例には、ラジオアイソトープ３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えばホタルルシェフェラーゼ及び細菌ルシェフェラーゼ(米国特許第４７３７４５６号)、ルシェフェリン、２,３-ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)、アルカリフォスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、色素前駆体、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定な遊離ラジカルなどを酸化する過酸化水素を利用する酵素とカップリングさせたもの、などが含まれる。
【０１９８】
Ｆ．薬学的製剤
本明細書に記載の抗ＦＡＰ抗体の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有するその抗体と任意の薬学的に許容される担体(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.: Williams and Wilkins PA, USA (1980))とを、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（PEG）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における典型的な薬学的に許容される担体は、介在性薬物分散剤、例えば、水溶性の中性アクティブヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。所定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、ｒＨｕＰＨ２０を含み、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８に開示されている。一態
様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つまたは複数の追加のグルコサミノグリカンと組み合わされる。
【０１９９】
典型的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性の抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０２００】
本明細書の製剤はまた、治療を受けている特定の徴候のために必要な一以上の活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものが含まれる場合がある。例えば、治療すべき疾患が癌である場合、１つ又は複数の抗癌剤、例えば、化学療法剤は、腫瘍細胞の増殖の阻害剤、又は腫瘍細胞のアポトーシスの活性化剤などを更に提供するのが望まれ得る。このような活性成分は、意図した目的のために有効な量で組み合わされ適切に存在する。
【０２０１】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合法によって、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート(methylmethacylate)）マイクロカプセル）、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロ・エマルジョンなどの調製されたマイクロカプセルに封入されてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示される。
【０２０２】
徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスが成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形をしている。
【０２０３】
インビボ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、達成することができる。
【０２０４】
本明細書中に記載の分子は多様な投与形態であってよく、限定されないが、液体溶液又は懸濁液、錠剤、丸剤、散剤、坐剤、ポリマーマイクロカプセル又はマイクロベシクル、リポソーム、及び注射可能溶液又は注入可能溶液が含まれる。好ましい形態は、投与及び治療用途の様式に依存するが、典型的には、注射可能溶液又は注入可能溶液となる。
【０２０５】
Ｇ．治療的方法及び組成物
本明細書中に提供される抗ＦＡＰ抗体又は抗ＦＡＰ抗体を含む薬学的製剤のいずれも、治療方法で使用することができる。
【０２０６】
本明細書で提供される抗ＦＡＰ抗体は、同じ細胞型の正常組織に比べて、ＦＡＰの発現によって、とりわけＦＡＰの異常な発現（例えば過剰発現又は細胞内の異なるパターンでの発現）によって特徴付けられる疾患を治療するために使用することができる。ＦＡＰは、同じ細胞型の非腫瘍組織に比べて多くのヒト腫瘍で異常に発現（例えば過剰発現）される。従って、本明細書で提供される抗ＦＡＰ抗体は、腫瘍形成の防止、腫瘍の根絶及び腫瘍の増殖又は転移の抑制に特に有用である。本明細書で提供される抗ＦＡＰ抗体は、ＦＡＰを発現する任意の腫瘍を治療するために使用することができる。本明細書において与えられる抗ＦＡＰ抗体によって治療することができる特定の悪性腫瘍は、例えば、肺癌、結腸癌、胃癌、乳癌、頭頸部癌、皮膚癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、骨格筋の癌を含む。
【０２０７】
本明細書に開示される抗ＦＡＰ抗体は、腫瘍の増殖を阻害するか又は腫瘍細胞を死滅ために使用することができる。例えば、抗ＦＡＰ抗体は癌細胞（腫瘍細胞又は腫瘍間質の細胞）の膜又は細胞表面上にあるＦＡＰに結合し、癌細胞の、例えばＡＤＣＣまたは他のエフェクター介在性死滅を引き出すことができる。
【０２０８】
抗ＦＡＰ抗体は、あるいは特に物理的に別の化合物の結合を妨害することにより、ＦＡＰ機能をブロックするために使用することができる。例えば、抗原結合分子は、ＦＡＰの酵素活性（例えば、セリンペプチダーゼ、ゼラチナーゼ、コラゲナーゼ活性）、ＦＡＰ媒介性ＥＣＭ分解、及び／又はＦＡＰ媒介性細胞浸潤又は細胞遊走をブロックするために使用することができる。
【０２０９】
一態様では、医薬として使用するための抗ＦＡＰ抗体が提供される。更なる態様において、ＦＡＰの発現によって特徴付けられる疾患の治療に使用される抗ＦＡＰ抗体が提供される。ある実施態様において、治療の方法に使用される抗ＦＡＰ抗体が提供される。ある実施態様において、本発明は、個体に抗ＦＡＰ抗体の有効量を投与することを含む、ＦＡＰの発現により特徴付けられる疾患を有する個体を治療する方法に使用のための抗ＦＡＰ抗体を提供する。一つのそのような実施態様において、本方法は、例えば後述するように、少なくとも1つの追加の治療薬の有効量を個体に投与することを更に含む。更なる実施態様において、本発明は、細胞の溶解を誘導するのに使用される抗ＦＡＰ抗体を提供する。ある実施態様において、本発明は、細胞の溶解を誘導する抗ＦＡＰ抗体の有効量を個体に投与することを含む、個体の細胞の溶解を誘導する方法で使用される抗ＦＡＰ抗体を提供する。 上記実施態様のいずれかに記載の「個体」は、好ましくはヒトである。上記実施態様の何れかに記載の「ＦＡＰの発現によって特徴付けられる疾患」は、好ましくは癌、最も好ましくは、肺癌、結腸癌、胃癌、乳癌、頭頸部癌、皮膚癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、骨格筋の癌から選択される癌である。上記実施態様の何れかに記載の「細胞」は、好ましくは腫瘍に存在する細胞、例えば、腫瘍細胞又は腫瘍間質の細胞、最も好ましくは腫瘍細胞の細胞である。上記実施態様の何れかに記載の「ＦＡＰ発現」は、異常な発現、例えば、同じ細胞型の正常組織と比較して、過剰発現又は細胞における異なるパターンでの発現である。
【０２１０】
更なる態様にて、本発明は、医薬の製造又は調製における抗ＦＡＰ抗体の使用を提供する。一実施態様において、本医薬は、ＦＡＰの発現によって特徴付けられる疾患の治療のためのものである。更なる実施態様において、本医薬は、ＦＡＰの発現によって特徴付けられる疾患を有する個体に、医薬の有効量を投与することを含む、ＦＡＰの発現によって特徴付けられる疾患を治療する方法で使用するためのものである。一つのそのような実施態様において、本方法は、例えば後述するように、少なくとも1つの追加の治療薬の有効量を個体に投与することを更に含む。更なる実施態様において、本医薬は、細胞の溶解を誘導するためである。更なる実施態様にて、本医薬は、細胞の溶解を誘導するために本医薬の有効量を個体に投与することを含む、個体における細胞の溶解を誘導する方法で使用するためである。上記実施態様のいずれかに記載の「個体」は、好ましくはヒトである。上記実施態様の何れかに記載の「ＦＡＰの発現によって特徴付けられる疾患」は、好ましくは癌、最も好ましくは、肺癌、結腸癌、胃癌、乳癌、頭頸部癌、皮膚癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、骨格筋の癌から選択される癌である。上記実施態様の何れかに記載の「細胞」は、好ましくは腫瘍に存在する細胞、例えば、腫瘍細胞又は腫瘍間質の細胞、最も好ましくは腫瘍細胞の細胞である。上記実施態様の何れかに記載の「ＦＡＰ発現」は、異常な発現、例えば、同じ細胞型の正常組織と比較して、過剰発現又は細胞における異なるパターンでの発現である。
【０２１１】
更なる態様にて、本発明は、ＦＡＰの発現により特徴付けられた疾患を治療するための方法を提供する。一実施態様において、本方法は、ＦＡＰの発現により特徴付けられた疾患などを有する個体に、抗ＦＡＰ抗体の有効量を投与することを含む。一つのそのような実施態様において、この方法は、後述するように、少なくとも1つの追加の治療薬の有効量を個体に投与することを更に含む。更なる実施態様において、本発明は、個体における細胞の溶解を誘導する方法を提供する。一実施態様において、本方法は、細胞の溶解を誘導するために抗ＦＡＰ抗体の有効量を個体に投与することを含む。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。上記実施態様の何れかに記載の「ＦＡＰの発現によって特徴付けられる疾患」は、好ましくは癌、最も好ましくは、肺癌、結腸癌、胃癌、乳癌、頭頸部癌、皮膚癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、骨格筋の癌から選択される癌である。上記実施態様の何れかに記載の「細胞」は、好ましくは腫瘍に存在する細胞、例えば、腫瘍細胞又は腫瘍間質の細胞、最も好ましくは腫瘍細胞の細胞である。上記実施態様の何れかに記載の「ＦＡＰ発現」は、異常な発現、例えば、同じ細胞型の正常組織と比較して、過剰発現又は細胞における異なるパターンでの発現である。 
更なる態様において、本発明は、例えば、上記の治療法の何れかに使用される、本明細書で提供される抗ＦＡＰ抗体の何れかを含む薬学的製剤を提供する。一実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗ＦＡＰ抗体の何れかと、及び一以上の薬学的に許容される担体を含む。その他の実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗ＦＡＰ抗体のいずれかと、少なくとも１つの更なる治療薬を、例えば後述するように含む。
【０２１２】
本発明の抗体は、治療において、単独で、または他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の抗体は少なくとも１つの更なる治療薬と同時投与され得る。ある実施態様において、追加の治療薬は、抗癌剤、例えば、化学療法剤、腫瘍細胞増殖の阻害剤、又は腫瘍細胞のアポトーシスの活性化剤である。
【０２１３】
上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療薬が、同一または別々の製剤に含まれている）、及び、本発明の抗体の投与が、追加の治療薬及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又はその後に起きうる分離投与を包含する。本発明の抗体はまた放射線治療と併用して用いることができる。
【０２１４】
本発明の抗体（および任意の追加の治療薬）は、任意の適切な手段によって投与することができ、経口、肺内、および鼻腔内、及び局所治療が所望される場合、病巣内投与が含まれる。非経口投与には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。静脈内投与が典型的には好ましい。しかしながら、腹腔内経路が、例えば結腸直腸腫瘍の治療において特に有用であると期待されている。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存し、任意の適切な経路、例えば、静脈内または皮下注射などの注射により行うことができる。限定されないが、様々な時間点にわたる、単一または複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書で考えられている。
【０２１５】
本発明の抗体は良好な医療行為に合致した方法で処方され、投与され、投薬される。この観点において考慮すべき要因は、治療すべき特定の障害、治療すべき特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者が知る他の要因を包含する。抗体は、必要ではないが任意で、問題となる障害の予防又は治療のために、現在使用中の一又は複数の薬剤ともに処方される。そのような他の薬剤の有効量は製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類及び上記した他の要因に依存する。これらは一般的には本明細書に記載されるのと同じ用量及び投与経路において、又は、本明細書に記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路により使用される。
【０２１６】
疾患の予防又は治療のためには、本発明の抗体の適切な用量（単独で使用されるか、又は、一以上の更なる治療的薬剤との組み合わされる場合）は治療すべき疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体を予防又は治療目的のいずれにおいて投与するか、以前の治療、患者の臨床的履歴及び抗体に対する応答性、及び担当医の判断に依存する。抗体は、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、抗体約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ）が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な一日当たり用量は上記した要因に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日間以上に渡る反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続するであろう。１つの例示される抗体用量は約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの１つ以上の用量（又はこれらの何れかの組み合わせ）を患者に投与してよい。このような用量は断続的に、例えば毎週又は３週毎（例えば患者が約２から約２０、例えば抗体の約６投与量を受けるように）投与してよい。初期の高負荷用量の後、１つ以上の低用量を投与してよい。しかしながら、他の用量用法も使用してよい。この治療法の進行は従来の手法及び試験により容易にモニタリングされる。
【０２１７】
上記の製剤または治療方法のいずれかが、抗ＦＡＰ抗体の代わりか又は抗ＦＡＰ抗体に加えて、本発明の抗体コンジュゲートを用いて行うことができることが理解される。
【０２１８】
Ｈ．製造品
本発明の他の実施態様において、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器とラベルまたは容器上にあるまたは容器に付属するパッケージ挿入物を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグ等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な物質から形成されうる。容器は、疾患の治療、予防、及び／又は診断に有効である、それ自体か、又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明の抗体である。ラベルまたはパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）組成物が本発明の抗体を包含する組成物を含む第一の容器；および（ｂ）組成物が更なる細胞障害性又はその他の治療的薬剤を包含する組成物を含む第２の容器を含み得る。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療することに用いることができることを示すパッケージ挿入物をさらに含んでいてもよい。別法として、または加えて、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を含む第二（または第三）の容器をさらに含んでもよい。これは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業的およびユーザーの立場から望まれる他の物質のさらに含んでもよい。
【０２１９】
上記の製造品のいずれかは、抗ＦＡＰ抗体の代わりか又はそれに加えて、本発明の抗体コンジュゲートを含み得ることが理解される。
【実施例】
【０２２０】
ＩＩＩ．実施例
以下は本発明の方法および組成物の例である。上記提供される一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
実施例１：
組換えＤＮＡ技術
Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に既述されるように、標準的な方法がＤＮＡを操作するために使用された。分子生物学的試薬を、製造元の指示に従って使用した。ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定により決定した。幾つかのケースでは、所望の遺伝子セグメントは、自動化された遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物から、Ｇｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により調製された。特異な制限酵素切断部位に隣接する遺伝子セグメントがｐＧＡ１８（ａｍｐＲ）プラスミドにクローニングされた。プラスミドＤＮＡを形質転換した細菌から精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニング遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中にサブクローニングできるように適切な制限部位を伴って設計された。
【０２２１】
ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖の塩基配列に関する一般情報については次に与えられる：Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版,ＮＩＨ出版番号９１−３２４２。発現のために、全ての構築物は、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を含んでいた。配列番号３２３から３３１は、典型的なリーダーペプチドを提供し、ポリヌクレオチド配列は、それらをコードする。
【０２２２】
（糖鎖操作）抗体の作製
完全な抗体重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列は、各レシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入された定常重鎖又は定常軽鎖の何れかとともに、フレーム内の可変領域をサブクローニングすることにより得られている。抗体の発現はＭＰＳＶプロモーターによって駆動され、ベクターは、ＣＤＳの３’末端の合成ポリＡシグナル配列を運ぶ。加えて、各ベクターは、ＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含む。
【０２２３】
抗体は、リン酸カルシウム形質移入を使用して、哺乳動物抗体の発現ベクターをＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に同時導入することによって産生させた。指数関数的に増殖しているＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞は、リン酸カルシウム法により形質移入される。あるいは、懸濁液中で増殖しているＨＥＫ２９３細胞は、ポリエチレンイミンで形質移入される。未修飾の非糖鎖操作抗体の生産に対しては、細胞を１：１の比の抗体重鎖及び軽鎖発現ベクターだけで形質移入した。
【０２２４】
糖鎖操作抗体の生産に対しては、細胞に、２つの追加のプラスミド、融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現のために一つ（ＧｎＴ−ＩＩＩ発現ベクター）、及びマンノシダーゼＩＩ発現のために一つ（ゴルジマンノシダーゼＩＩ発現ベクター）をそれぞれ４：４：１：１の比で同時導入した。細胞を、１０％のＦＣＳを補填したＤＭＥＭ培養培地を使用してＴフラスコ中で付着単層培養として増殖させ、それらが５０及び８０％集密になったときに形質移入した。Ｔ１５０フラスコの形質移入では、ＦＣＳ（最終１０％Ｖ／Ｖで）を補填した２５ｍｌのＤＭＥＭ培養培地に形質移入の２４時間前に１５００万細胞を播種し、細胞を５％ＣＯ２大気のインキュベーターに３７℃で一晩配した。形質移入される各Ｔ１５０フラスコに対して、ＤＮＡ、ＣａＣｌ２及び水の溶液を、軽鎖及び重鎖発現ベクター間に等しく分配された９４μｇの全プラスミドベクターＤＮＡ、４６９μｌの最終容量までの水及び４６９μｌの１ＭのＣａＣｌ２溶液を混合することによって調製した。この溶液に、９３８μｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４溶液（ｐＨ７．０５）を加え、直ぐに１０秒間混合し、室温で２０秒間静置した。懸濁液を、２％のＦＣＳを補填した１０ｍｌのＤＭＥＭで希釈し、既存の培地の代わりにＴ１５０に加えた。ついで、更なる１３ｍｌの形質移入培地を加えた。細胞を約１７から２０時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、ついで培地を２５ｍｌのＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳに置換した。条件培養培地を２１０×ｇでの１５分の遠心分離によって形質移入から７日後に収集し、溶液を滅菌濾過（０．２２μｍフィルター）し、０．０１％ｗ／ｖの最終濃度のアジ化ナトリウムを加え、４℃に維持した。
【０２２５】
分泌された野生型又は糖鎖操作されたアフコシル化抗体（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）は、プロテインＡ（ＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔＡ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）アフィニティークロマトグラフィーを使用するアフィニティークロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製された。簡潔には、カラムは２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化し、細胞上清がロードされ、その後、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ７．５による一回目の洗浄、及び１３．３ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．４５による二回目の洗浄が続いた。抗体は、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシンｐＨ３で溶出した。続くＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上のサイズ排除クロマトグラフィー工程において、バッファーは、２５ｍＭリン酸カリウム、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭのグリシン溶液、ｐＨ６．７、又は１４０ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．０に交換し、純粋なモノマーＩｇＧ１抗体を採取した。必要であれば、追加の陽イオン交換クロマトグラフィー工程が、２つの標準的な精製工程の間に含まれる。
【０２２６】
精製されたタンパク質サンプルのタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定することによって決定する。抗体の純度及び分子量は、還元剤（５ｍＭの１，４−ジチオトレイトール）の存在下及び非存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びクマシー（インビトロジェンからのＳｉｍｐｌｅＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ）による染色により分析される。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を、製造業者の取扱説明書に従って使用した（４−２０％のトリスグリシン・ゲル）。抗体サンプルの凝集体量を、２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ，０．０２％のＮａＮ３、ｐＨ７．３の泳動バッファー中、２５℃にてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬ分析用サイズ排除カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して分析した。還元した抗体軽鎖及び重鎖のアミノ酸骨格の完全性を、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）での酵素的処理によるＮ−グリカンの除去後のＮａｎｏＥｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｑ−ＴＯＦ質量分析によって確認した。
【０２２７】
野生型及び糖鎖操作２８Ｈ１，２９Ｂ１１，３Ｆ２及び４Ｇ８ヒトＩｇＧ抗体の精製及び分析の結果を、図１５から図２２に示す。収率は以下の表に与えられる：
2020141674.tif 000004
【０２２８】
抗体のＦｃ領域に結合したオリゴ糖は、後述するように、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳによって分析される。オリゴ糖はＰＮＧａｓｅＦ消化により抗体から酵素的に放出される。放出オリゴ糖を含む得られた消化溶液は、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ分析のために直接調製されるか、又はＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ分析のためのサンプル調製に先立ち、ＥｎｄｏＨグリコシダーゼで更に消化する。
【０２２９】
（糖鎖操作）抗体の糖鎖構造の分析
フコース及び非フコース（ａ−フコース）含有オリゴ糖構造の相対比の測定のために、精製した抗体材料の放出されたグリカンをＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ−質量分析法によって分析する。タンパク質骨格からオリゴ糖を放出するために、抗体サンプル（約５０μｇ）を２ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．０中で５ｍＵのＮ−グリコシダーゼＦ（ＱＡｂｉｏ；ＰＮＧａｓｅＦ：Ｅ−ＰＮＧ０１）と一緒に３７℃にて一晩インキュベートするグリカンの脱アミノ化のために、酢酸が最終濃度１５０ｍＭまで添加され、３７℃で１時間インキュベートされる。ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析法による分析のために、２μＬのサンプルがを２μＬのＤＨＢマトリックス溶液（４ｍｇ／ｍｌで５０％エタノール／５ｍＭのＮａＣｌに溶解された２，５−ジヒドロキシ安息香酸［Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ ＃２０１３４６］）とともにＭＡＬＤＩターゲット上で混合され、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析計Ａｕｔｏｆｌｅｘ ＩＩ測定器［Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ］で分析される。日常的に、５０から３００ショットが記録され、単一の実験にまとめられる。得られたスペクトルを、フレックス分析ソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）によって評価し、そして質量を検出したピークのそれぞれについて決定する。それに続いて、計算した質量を、それぞれの構造物（例えばそれぞれフコースを含む及び含まない複合体、ハイブリッド、及びオリゴ又は高マンノース）について理論的に予想した質量を比較することによって、ピークをフコース又はａ−フコース（非フコース）含有グリコール構造物に割り当てる。
【０２３０】
ハイブリッド構造の比率を決定するために、抗体サンプルはＮ−グリコシダーゼＦとＥｎｄｏ−グリコシダーゼＨ ［ＱＡｂｉｏ；ＥｎｄｏＨ：Ｅ−ＥＨ０２］とで同時に消化される。Ｎ−グリコシダーゼＦはタンパク質骨格から全てのＮ−結合型糖鎖構造（複合体、ハイブリッド、及びオリゴ及び高マンノース構造）を放出し、ＥｎｄｏグリコシダーゼＨは、グリカンの還元末端で、２つのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基の間の全てのハイブリッドグリカンをさらに開裂する。この消化物は、その後、Ｎ−グリコシダーゼＦ消化サンプルについて上記と同様にＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析法によって処理され、分析される。Ｎ−グリコシダーゼＦ消化物からのパターンをＮ−グリコシダーゼＦ／Ｅｎｄｏ Ｈの組み合わせによる消化物と比較することにより、特定の糖鎖構造のシグナルの減少の程度が、ハイブリッド構造の相対含量を推定するために使用される。各糖鎖構造の相対的な量は、個々の構造のピーク高さと検出された全オリゴ糖のピーク高さの和との比から算出される。フコースの量は、Ｎ−グリコシダーゼＦ処理した試料（例えば、複合体、ハイブリッド、及びオリゴ及び高マンノース構造のそれぞれ）に同定された全ての糖構造に関連したフコース含有構造の割合である。非フコシル化型の量は、Ｎ−グリコシダーゼＦ処理した試料（例えば、複合体、ハイブリッド、及びオリゴ及び高マンノース構造のそれぞれ）に同定された全ての糖に関連したフコース欠失構造の割合である。
【０２３１】
別の野生型および糖鎖操作抗ＦＡＰ抗体の非フコシル化の程度は、次の表で与えられる：
2020141674.tif 000005
実施例２：
一般的なＦａｂライブラリの構築
Ｆａｂ形態の一般的な抗体ライブラリを、以下のＶ−ドメイン組合せを用いてヒト生殖細胞系遺伝子に基づいて構築した。ＤＰ４７−３ライブラリのためにＶＨ３＿２３重鎖とＶｋ３＿２０κ軽鎖、ＤＰ８８−３ライブラリのためにＶＨ１＿６９重鎖とＶｋ１＿１７κ軽鎖。配列番号１、２を参照。
【０２３２】
両ライブラリは、軽鎖（Ｌ３）のＣＤＲ３および重鎖（Ｈ３）のＣＤＲ３においてランダム化し、スプライシング バイ オーバーラッピング エクステンション（ＳＯＥ）ＰＣＲによって１ライブラリにつき３つのフラグメントから集めた。フラグメント１は、ランダム化したＬ３を含む抗体遺伝子の５’末端を含み、フラグメント２は、Ｌ３からＨ３に拡がる中央の定常フラグメントであるのに対し、フラグメント３はランダム化したＨ３と抗体遺伝子の３’部位を含む。
【０２３３】
以下のプライマーの組合せを用いて、ＤＰ４７−３ライブラリのためのライブラリフラグメントを生成した。フラグメント１（ＬＭＢ３−ＬｉｂＬ１ｂ＿ｎｅｗ）、フラグメント２（ＭＳ６３−ＭＳ６４）、フラグメント３（Ｌｉｂ２Ｈ−ｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）。表３を参照。以下のプライマーの組合せを用いて、ＤＰ８８−３ライブラリのためのライブラリフラグメントを生成した。フラグメント１（ＬＭＢ３−ＲＪＨ＿ＬＩＢ３）、フラグメント２（ＲＪＨ３１−ＲＪＨ３２）及びフラグメント３（ＬＩＢ８８＿２−ｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）。表４を参照。
2020141674.tif 000006
2020141674.tif 000007
【０２３４】
ライブラリフラグメント生成のためのＰＣＲプロトコールは以下の通りとした。９４℃で５分の初期変性と、９４℃で１分、５８℃で１分および７２℃で１分を２５サイクルと、７２℃で１０分間の最終伸長。アセンブリＰＣＲのために、等モル比率の３フラグメントを鋳型として用いた。アセンブリＰＣＲプロトコールは以下の通りとした。９４℃で３分の初期変性と、９４℃で３０秒、５８℃で１分および７２℃で２分を５サイクル。この段階で、フラグメント１−３の外側の配列に相補的プライマーを加え、７２℃で１０分間の最終伸長の前に、さらに２０サイクル行った。
【０２３５】
十分な量の完全長ランダム化Ｆａｂコンストラクトをアセンブリした後、Ｆａｂコンストラクトを、同じように処理したアクセプタファジミドベクターと共に、ＤＰ４７−３ライブラリのためにＮｃｏＩ／ＮｏｔＩにて、そして、ＤＰ８８−３ライブラリのためにＮｃｏＩ／ＮｈｅＩにて消化した。ＤＰ４７−３ライブラリのために、２２．８μｇのＦａｂライブラリを１６．２μｇのファジミドベクターにてライゲートした。ＤＰ８８−３ライブラリのために、３０．６μｇのＦａｂライブラリを３０．６μｇのファジミドベクターにてライゲートした。
【０２３６】
精製したライゲーションは、それぞれＤＰ４７−３ライブラリに６８の形質転換体、ＤＰ８８−３ライブラリに６４の形質転換体を用いて、ＤＰ４７−３に４．２の１０１０、ＤＰ８８−３に３．３×１０９のサイズの最終ライブラリを得た。Ｆａｂライブラリを表出するファジミド粒子をレスキューし、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製して選別に用いた。
【０２３７】
実施例３：
抗ＦＡＰクローンの選別（一次選別）
ポリ−リジン及び６×ｈｉｓ−タグの上流にクローニングしたヒト又はマウス線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）の外部ドメインに対して選別を行った。配列番号：３１７および３１９を参照。選別の前に、選別のラウンドに応じて、１０μｇ／ｍｌ又は５μｇ／ｍｌの濃度の抗原をイムノチューブにコートした。選別は、以下のプロトコールに従って行った。（ｉ）およそ１０１２ファジミド粒子のライブラリＤＰ４７−３の、固定したヒト又はマウスＦＡＰへの２時間の結合、（ｉｉ）５ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０にて５回及び５ｍｌのＰＢＳにて５回によるイムノチューブの洗浄、（ｉｉｉ）１ｍｌの１００ｍＭ ＴＥＡ（トリエチルアミン）を１０分間添加することによるファージ粒子の溶出と、５００μｌの１Ｍ トリス／ＨＣｌ ｐＨ７．４の添加による中和、及び（ｖ）対数期大腸菌ＴＧ１細胞の再感染、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３による感染、およびその後の選別ラウンドに用いるためのファジミド粒子のその後のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿。
【０２３８】
選別は、ヒトＦＡＰの抗原濃度を低下させることを用いて３回又は４回にわたって、及び幾つかのケースでは最終選別ラウンドで５μｇ／ｍｌのマウスＦＡＰを用いて実施された。特異的な結合体を、バックグラウンドの５倍の高さのシグナルと定義し、ＥＬＩＳＡによって識別した。ＮＵＮＣマキシソーププレートを１０μｇ／ｍｌのヒト又はマウスＦＡＰにてコートし、その後Ｆａｂ含有細菌上清物の添加、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を用いたそれらのＦｌａｇ−タグによる特異的結合Ｆａｂの検出を行った。
【０２３９】
ＥＬＩＳＡポジティブクローンを、９６ウェルフォーマット中で１ｍＬの培養物として細菌を用いて発現させ、上清物をＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ１００を用いた動力学的スクリーニング実験に用いた。ＫＤは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる表面プラズモン共鳴法により、ＧＭ５チップ上でアミン結合により固定された抗ヒトＦ（ａｂ’）２断片特異的捕捉抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ＃１０９−００５−００６）により２５℃で測定し、続いて、細菌上清、又は精製されたＦａｂ調製物に由来するＦａｂを捕獲した。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化した。抗ヒトＦ（ａｂ’）２断片特異的抗体を１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０、で５０μｇ／ｍｌで希釈し、結合した捕捉抗体の応答単位（ＲＵ）がおよそ最大で１０．０００になるように１０μｌ／分の流速で注入した。捕捉抗体の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的測定のために、細菌の上清に由来するＦａｂ又は精製されたＦａｂが、流速１０μｌ／分で３００秒間注入され、捕捉ベースライン安定化のために３００秒間解離した。捕捉レベルは１００〜５００ＲＵの範囲であった。続く工程にて、ヒト又はマウスＦＡＰ分析物が、ＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０，ｐＨ７．４）で希釈される単一濃度として又は濃度系列として（１００ｎＭから２５０ｐＭの範囲のクローンの親和性に依存して）、２５℃で５０μｌ／分の流速で注入された。会合時間は１２０又は１８０秒で、解離時間は３００から６００秒であった。センサーチップの表面は、グリシンｐＨ１．５の９０μｌ／分で３０秒間の注入、続いてＮａＯＨを同じ流速で２０秒間の注入により再生された。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（ｓｉｍｐｌｅ ｏｎｅ−ｔｏ−ｏｎｅ Ｌａｎｇｍｕｉｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ）（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００エバリュエーションソフトウェア又はスクラバーソフトウェア（ＢｉｏＬｏｇｉｃ））を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出された。
【０２４０】
実施例４：
抗ＦＡＰ親和性成熟ライブラリの構築
３つの親和性成熟ライブラリを、一次抗ＦＡＰ選別から予め選択した抗体に基づいて構築した。より正確に言うと、それらは、（ｉ）抗ヒトＦＡＰクローン２Ｄ９（ライブラリａ．ｍ．ＦＡＰ２Ｄ９）（配列番号：２２９および２３１を参照）、（ｉｉ）抗マウスＦＡＰクローン４Ｂ８（ライブラリａ．ｍ．ＦＡＰ４Ｂ８）（配列番号：２３３および２３５を参照）、および（iii）交差反応性クローン７Ａ１、１３Ｂ２、１３Ｃ２、１３Ｅ８、１４Ｃ１０および１７Ａ１１（ライブラリａ．ｍ．ＦＡＰプール）（７Ａ１の可変領域配列に対応する配列番号：２３７および２３９；１３Ｃ２の可変領域配列に対応する配列番号：２４１および２４３；１３Ｅ８の可変領域配列に対応する配列番号：２４５および２４７；１４Ｃ１０の可変領域配列に対応する配列番号：２４９および２５１；そして、１７Ａ１１の可変領域配列に対応する配列番号：２５３および２５５）に基づいている。
【０２４１】
これら各ライブラリは、軽鎖（Ｌ１／Ｌ２）のＣＤＲ１およびＣＤＲ２又は重鎖（Ｈ１／Ｈ２）のＣＤＲ１およびＣＤＲ２の何れかをランダム化している２つのサブライブラリからなる。これらサブライブラリは形質転換でプールした。これら各サブライブラリは、増幅およびアセンブリの４つの連続した工程により構築した。
【０２４２】
Ｌ１／Ｌ２ライブラリでは、増幅およびアセンブリプロトコールには、（i）フラグメント１（ＬＭＢ３−ＤＰＫ２２＿ＣＤＲ１＿ｒａｎｄ＿ｂａ＿ｏｐｔ）およびフラグメント２（ＤＰＫ２２＿ＣＤＲ１＿ｆｏ−ＤＰＫ２２＿Ｃｋ＿ＢｓｉＷＩ＿ｂａ）の増幅；（ii） 外側のプライマーＬＭＢ３とＤＰＫ２２＿Ｃｋ＿ＢｓｉＷＩ＿ｂａを用いてフラグメント１及び２をアセンブリし、フラグメント３のための鋳型の作製；（iii）フラグメント３（ＬＭＢ３−ＤＰＫ２２＿ＣＤＲ２＿ｒａｎｄ＿ｂａ）およびフラグメント４（ＤＰＫ２２＿ＣＤＲ２＿ｆｏ−ＤＰＫ２２＿Ｃｋ＿ＢｓｉＷＩ＿ｂａ）の増幅；及び、（iv）上記と同じ外側のプライマーを用いたフラグメント３および４の最終アセンブリが含まれる。プライマー配列については表５を参照のこと。
2020141674.tif 000008
【０２４３】
Ｈ１／Ｈ２ライブラリでは、増幅およびアセンブリプロトコールには、（ｉ）フラグメント１（ＲＪＨ５３−ＤＰ４７＿ＣＤＲ１＿ｒａｎｄ＿ｂａ＿ｏｐｔ）とフラグメント２（ＤＰ４７＿ＣＤＲ１＿ｆｏ−ＭＳ５２）の増幅；（ｉｉ）外側のプライマーＲＪＨ５３とＭＳ５２を用いてフラグメント１及び２をアセンブリし、フラグメント３のための鋳型の作製；（ｉｉｉ）フラグメント３（ＲＪＨ５３−ＤＰ４７＿ＣＤＲ２＿ｒａｎｄ＿ｂａ）およびフラグメント４（ＤＰ４７＿ＣＤＲ２＿ｆｏ−ＭＳ５２）の増幅；及び、（ｉｖ）上記と同じ外側のプライマーを用いたフラグメント３および４の最終アセンブリが含まれる。プライマー配列については表6を参照のこと。
2020141674.tif 000009
【０２４４】
最終アセンブリ生成物は、クローン２Ｄ９、４Ｂ８又はクローン７Ａ１、１３Ｂ２、１３Ｃ２、１３Ｅ８、１４Ｃ１０および１７Ａ１１の等モル混合物のプラスミド調製に基づく同様に処理したアクセプタベクターと共に、ａ.ｍ.ＦＡＰ２Ｄ９およびａ.ｍ.ＦＡＰ４Ｂ８のＬ１／Ｌ２サブライブラリではＮｃｏＩ／ＢｓｉＷＩにて、ａ.ｍ.ＦＡＰ２Ｄ９及びａ.ｍ.ＦＡＰ４Ｂ８のＨ１／Ｈ２サブライブラリではＭｕｎＩおよびＮｈｅＩにて、並びに、ａ.ｍ.ＦＡＰｐｏｏｌのＬ１／Ｌ２ライブラリではＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩにて、そしてａ.ｍ.ＦＡＰプールのＨ１／Ｈ２ライブラリではＢｓｐＥＩ／ＰｓｔＩにてそれぞれ消化した。以下の量の消化したランダム化(部分的)Ｖ−ドメインおよび消化したアクセプタベクター(一又は複数)を、それぞれのライブラリのためにライゲートした。(μｇのＶ-ドメイン／μｇのベクター)：ａ.ｍ.ＦＡＰ２Ｄ９ Ｌ１／Ｌ２サブライブラリ(５．７／２１．５)、ａ.ｍ.ＦＡＰ２Ｄ９ Ｈ１／Ｈ２サブライブラリ(４．１／１５．５)、ａ.ｍ.ＦＡＰ４Ｂ８ Ｌ１／Ｌ２サブライブラリ(６．５／２４．５)、ａ.ｍ.ＦＡＰ４Ｂ８ Ｈ１／Ｈ２サブライブラリ(５．７／２１．５)、ａ.ｍ.ＦＡＰプールＬ１／Ｌ２サブライブラリ(４．４／２０)、ａ.ｍ.ＦＡＰプールＨ１／Ｈ２サブライブラリ(３．４／１５．５)。 
Ｌ１／Ｌ２およびＨ１／Ｈ２サブライブラリの精製したライゲートをプールし、３つ各々の親和性成熟ライブラリのために６０の形質転換体に用い、ａ.ｍ.ＦＡＰ２Ｄ９には６．２×１０９、ａ.ｍ.ＦＡＰ４Ｂ８には９．９×１０９およびａ.ｍ.ＦＡＰプールには２．２×１０９のサイズの最終ライブラリを得た。
【０２４５】
これらＦａｂライブラリを表出するファジミド粒子をレスキューし、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製にて精製し、二次選別に用いた。
【０２４６】
追加の抗ＦＡＰ親和性成熟ライブラリ(クローン３Ｆ２、３Ｄ９、４Ｇ８、４Ｂ３および２Ｃ６に基づく)の構築
抗ＦＡＰ抗体の第一親和性成熟キャンペーンから予め選択した交差反応性の抗体、すなわち、クローン３Ｆ２、３Ｄ９、４Ｇ８、４Ｂ３及び２Ｃ６を基礎として、さらに４つの親和性成熟ライブラリを構築した(３Ｆ２の可変領域配列に対応する配列番号：１９５および１９７；３Ｄ９の可変領域配列に対応する配列番号：１９９および２０１；４Ｂ３の可変領域配列に対応する配列番号：２０９および２１１；２Ｃ６の可変領域配列に対応する配列番号：２１７および２１９)。より正確に言うと、４つのライブラリは、１)抗ＦＡＰクローン３Ｆ２、４Ｇ８および４Ｂ３(可変重鎖のＣＤＲ１および２においてランダム化したＶＨライブラリ、すなわちＨ１／Ｈ２ライブラリ)、２)抗ＦＡＰクローン３Ｄ９および２Ｃ６(可変軽鎖のＣＤＲ１および２においてランダム化したＶＬライブラリ、すなわちＬ１／Ｌ２ライブラリ)、３)抗ＦＡＰクローン３Ｆ２(軽鎖のＣＤＲ３にソフトランダム化を持つＬ３ライブラリ、すなわちＬ３ライブラリ)および４)抗ＦＡＰクローン３Ｆ２(重鎖のＣＤＲ３にソフトランダム化を持つＨ３ライブラリ、すなわちＨ３ライブラリ)に基づく。それぞれＬ１／Ｌ２およびＨ１／Ｈ２ライブラリには、抗ＦＡＰ抗体の第一親和性成熟キャンペーンで概説したのと全く同じように、最初の２つのライブラリを構築した。これに対して、クローン３Ｆ２に基づくＬ３およびＨ３親和性成熟ライブラリには、２つの新規なプライマーを用いて、親のクローンのＬ３
<
2020141674.tif 000010
下線を付した塩基は６０％が所定の塩基で４０％が混合物Ｎ(４つのヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧおよびＴの混合物)である)、及びＨ３
2020141674.tif 000011
下線を付した塩基は６０％が所定の塩基で４０％が混合物Ｎであり、イタリック体の塩基は６０％が所定の塩基で４０％がＧ、並びにイタリック体の下線を付した塩基は６０％が所定の塩基で４０％が混合物Ｋ(２つのヌクレオチドＧおよびＴの混合物)である)にソフトランダム化を導入した。ライブラリサイズは以下のようになった。Ｈ１／Ｈ２ライブラリ(１．１３×１０１０)、Ｌ１／Ｌ２ライブラリ(５．６×１０９)、Ｌ３ライブラリ(２．３×１０１０)およびＨ３ライブラリ(２．６４×１０１０)。
【０２４７】
実施例５：
親和性成熟した抗ＦＡＰクローンの選別
ポリ-リジン及び６×ｈｉｓ-タグの５'にクローニングしたヒト又はマウス線維芽細胞活性化タンパク質(ＦＡＰ)の外部ドメインに対して選別を行った。配列番号：３１７および３１９を参照。選別の前に、ライブラリと選別のラウンドに応じて、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ又は０．２μｇ／ｍｌの濃度の抗原をイムノチューブにコートした。選別は、以下のプロトコールに従って行った。(ｉ) およそ１０１２ファジミド粒子のライブラリａ.ｍ.ＦＡＰ２Ｄ９、ａ.ｍ.ＦＡＰ４Ｂ８又はａ.ｍ.ＦＡＰプールの、固定したヒト又はマウスＦＡＰへの２時間の結合、(ii) （ライブラリと選別ラウンドに応じて）５ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０にて１０−２０回及び５ｍｌのＰＢＳにて１０−２０回によるイムノチューブの洗浄、(iii) １ｍｌの１００ｍＭ ＴＥＡ(トリエチルアミン)を１０分間添加することによるファージ粒子の溶出と、５００μｌの１Ｍ トリス／ＨＣｌ ｐＨ７．４の添加による中和、及び(v) 対数期大腸菌ＴＧ１細胞の再感染、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３による感染、およびその後の選別ラウンドに用いるためのファジミド粒子のその後のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿。
【０２４８】
選別は２ラウンド以上行い、３つのライブラリ各々について個々に条件を調整した。具体的には、選別パラメータは、ａ.ｍ.ＦＡＰ２Ｄ９(ラウンド１では５μｇ／ｍＬのヒトＦＡＰと合計２０回の洗浄、ラウンド２では１μｇ／ｍＬのヒトＦＡＰと合計３０回の洗浄)、ａ.ｍ.ＦＡＰ４Ｂ８(ラウンド１では１μｇ／ｍＬのマウスＦＡＰと合計３０回の洗浄、ラウンド２では０．２μｇ／ｍＬのヒトＦＡＰと合計４０回の洗浄)、およびａ.ｍ.ＦＡＰプール(ラウンド１では５μｇ／ｍＬのヒトＦＡＰと合計３０回の洗浄、ラウンド２では５μｇ／ｍＬのマウスＦＡＰと合計３０回の洗浄)とした。特異的な結合体を、バックグラウンドの５倍の高さのシグナルと定義し、ＥＬＩＳＡによって識別した。ＮＵＮＣマキシソーププレートを１μｇ／ｍｌ又は０．２μｇ／ｍｌのヒト又はマウスＦＡＰにてコートし、その後Ｆａｂ含有細菌上清物の添加、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を用いたそれらのＦｌａｇ-タグによる特異的結合Ｆａｂの検出を行った。
【０２４９】
上記の通り、ＥＬＩＳＡポジティブクローンを、９６ウェルフォーマット中で１ｍｌの培養物として細菌を用いて発現させ、上清物をＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ１００を用いた動力学的スクリーニング実験に用いた（実施例３を参照）。
【０２５０】
親和性成熟した抗ＦＡＰクローンの更なる選別
６×リジンおよび６×ｈｉｓタグの上流にクローニングしたヒト及びマウス線維芽細胞活性化タンパク質(ＦＡＰ)の外部ドメインに対して選別を行った(配列番号：３１７および３１９を参照)。選別の前に、ライブラリと選別のラウンドに応じて、1μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ又は０．０２μｇ／ｍｌの濃度の抗原をイムノチューブにコートした。抗ＦＡＰ抗体の第一親和性成熟キャンペーンについて記述したように、選別およびＥＬＩＳＡベースのスクリーニングを行った。二次スクリーニングはＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６バイオセンサ（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して行い、動力学的速度定数および親和性を同じ計測器上で親和性精製したＦａｂ調製物を分析して決定した。ＫＤは、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６バイオセンサ装置（Ｂｉｏｒａｄ）を用いる表面プラズモン共鳴法 により、ＧＬＭチップ上に固定された抗ヒトＦ（ａｂ’）２断片特異的捕捉抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ＃１０９−００５−００６）により２５℃で測定し、続いて、細菌上清、又は精製されたＦａｂ調製物に由来するＦａｂを捕獲 した。簡潔には、ＧＬＭバイオセンサーチップ（（Ｂｉｏｒａｄ）は、新たに調製したＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の混合物で５分間活性化した。抗ヒトＦ（ａｂ’）２断片特異的捕捉抗体が、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０で２４μｇ／ｍｌに希釈され、最大約１０．０００応答単位（ＲＵ）の結合捕捉抗体を獲得するため５分間注入した。捕捉抗体の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを５分間注入した。動力学測定のために、細菌上清からのＦａｂが流速３０μｌ／分で１００秒間注入された。捕捉量は２５０ＲＵの範囲にあった。続く工程において、２５℃で５０μｌ／分の流速で、ＰＢＳ／０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０で希釈された、ヒトマウスまたはカニクイザルのＦＡＰ分析物の段階希釈が注入された（２段階希釈、最高濃度２５ｎＭ）。会合時間は２４０秒で、解離時間は６００から１８００秒であった。センサーチップは０．８５％のＨ３ＰＯ４を３０秒間１００μｌ／分での注入、続く５０ｍＭのＮａＯＨを同じ流速で３０秒間注入により再生された。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（ｓｉｍｐｌｅ ｏｎｅ−ｔｏ−ｏｎｅ Ｌａｎｇｍｕｉｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ）（ＰｒｏｔｅＯｎマネージャーソフトウェアバージョン２．１）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出される。
【０２５１】
以下の親和性成熟クローンが識別された。１９Ｇ１（配列番号２５７および２５９を参照），２０Ｇ８（配列番号２８１および２６３を参照），４Ｂ９（配列番号２６５および２６７を参照），５Ｂ８（配列番号２６９および２７１を参照），５Ｆ１（配列番号２７３および２７５を参照），１４Ｂ３（配列番号２７７および２７９を参照），１６Ｆ１（配列番号２８１および２８３を参照），１６Ｆ８（配列番号２８５および２８７を参照），Ｏ３Ｃ９（配列番号２８９および２９１を参照），２２Ａ３（配列番号３０１および３０３を参照）および２９Ｂ１１（配列番号３０５および３０７を参照）（全てのこれらのクローンはＨ１／Ｈ２ライブラリから選択されており、親クローンの３Ｆ２かた由来する），Ｏ２Ｄ７（配列番号２９３および２９５を参照）（親クローンの３Ｆ２に基づくＬ３ライブラリから選択される）および２８Ｈ１（配列番号２９７および２９９）および２３Ｃ１０（配列番号３０９および３１１を参照）（これら二つのクローンはＨ１／Ｈ２ライブラリから選択されており、親クローン４Ｇ８から由来する）。
【０２５２】
図１から５は、固定化したＦＡＰに結合する選択した親和性成熟Ｆａｂの表面プラズモン共鳴を示し、表７は生成された各々の親和性を示す。選択されたＦａｂはｐＭからｎＭの高親和性範囲におよび、選択されたクローンについて測定される場合、ヒト（ｈｕ）及びマウス（ｍｕ）ＦＡＰ、ならびにカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＦＡＰに対して交差反応性である。親和性成熟抗ＦＡＰ Ｆａｂは、特異性解析のために、ＩｇＧ抗体及びＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ形態に変換された。結合の特異性は、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞に発現し、ＦＡＰの近接ホモログとしてのＤＰＰＩＶへの結合の欠如によって示された（実施例９を参照）。
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【０２５３】
実施例６：
ＦＡＰに結合するＦａｂのＩｇＧ変換
親３Ｆ２、４Ｇ８および３Ｄ９ Ｆａｂおよび親和性成熟３Ｆ２および４Ｇ８ Ｆａｂ誘導体が、ヒトＩｇＧ１形態、マウスＩｇＧ２ａ形態およびヒトＩｇＧ１形態に変換された。
【０２５４】
完全抗体の重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列が、異なるレシピエント哺乳動物発現ベクター中に予め挿入された各々の定常重鎖及び定常軽鎖とともにフレーム中に可変領域をサブクローニングすることにより得られ、あるいはレシピエントベクターに相同な短い配列伸展を融合することにより組換えられた。組換えは、インビトロジェンからの「Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム」に従って行われた。
【０２５５】
全てのベクターにおいて、抗体の発現はＭＰＳＶプロモーターによって駆動され、全てのベクターは、ＣＤＳの３’末端の合成ポリＡシグナル配列を運ぶ。加えて、各ベクターは、ＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含む。
【０２５６】
実施例７：
抗ＦＡＰ ＩｇＧ抗体のビアコア分析
抗ＦＡＰ Ｆａｂ断片の３Ｆ２、４Ｇ８及び３Ｄ９、ならびにヒトＩｇＧ１変換抗ＦＡＰ抗体の親和性が続いて決定され、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた２５℃での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析により、ヒト、マウス及びカニクイザルのＦＡＰについて確認された。この目的のために、ヒト、マウスまたはカニクイザルＦＡＰの細胞外ドメイン（配列番号３１７から３２２）が固定された抗Ｈｉｓ抗体（Ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ Ｑｉａｇｅｎ ３４６６０）により捕捉され、その抗体を分析物として用いた。固定化のために、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化した。Ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ抗体を１０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５、で４０μｇ／ｍｌに希釈し、結合したタンパク質の応答単位（ＲＵ）がおよそ９０００になるように１０μｌ／分の流速で注入した。リガンドの注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。
【０２５７】
動力学測定のために、ヒト又はカニクリザルＦＡＰ細胞外ドメインが、（Ｆａｂ断片について）１０ｎＭで２０秒間、又は（ＩｇＧについて）２０ｎＭで２５秒間、１０μｌ／分で注入され、固定化ペンタＨｉｓ抗体によりそのＨｉｓタグを介して捕捉された。抗体の段階希釈（Ｆａｂ断片について、６．２５ｎＭから２００ｎＭの範囲で２倍希釈、又はＩｇＧについて、３．２ｐＭから１０ｎＭの範囲で５倍の希釈）を、ＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）に、２５℃で約９０μｌ／分の流速で注入する。次のパラメータが適用された：会合時間１８０秒、解離が３００秒（Ｆａｂについて）又は９００秒（ＩｇＧについて）、各サイクルの間に６０秒間、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ２で再生。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（ｓｉｍｐｌｅ ｏｎｅ−ｔｏ−ｏｎｅ Ｌａｎｇｍｕｉｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ）（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）エバリュエーションソフトウェアバージョン１．１．１）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出した（モデルパラメータは、ローカルＲｍａｘおよびＲＩ＝０であった）。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出された。
【０２５８】
結合のＫＤ値が、表８に示されている。図６Ａ−ＣはＦａｂ断片について対応するＳＰＲベースの動力学解析を示し、図７Ａ−ＣはＩｇＧ抗体について示す。
2020141674.tif 000013
【０２５９】
実施例８：
抗ＦＡＰ抗体３Ｆ２、４Ｇ８および３Ｄ９のヒト腫瘍組織切片上への結合
我々は、抗ＦＡＰ抗体クローン３Ｆ２、４Ｇ８と３Ｄ９をマウスＩｇＧ２ａとして使用し、新鮮な凍結ヒト腫瘍組織（乳癌、結腸腺癌およびＮＳＣＬＣ組織）におけるＦＡＰの発現を検出して比較する実験を行った。
【０２６０】
Ｒｏｃｈｅ ＴＲＳ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｔｕｍｏｒｂａｎｋ．からの、各々２つのスポットを持つ３０の異なる腫瘍を含む、一つの新鮮な凍結組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）（ＡＳＴ２７４）を用いた。ＴＭＡは、乳房の１０の浸潤性乳管癌、１０の結腸直腸腺癌および１０の非小細胞肺癌を含むＴＭＡは、Ａｓｔｅｒａｎｄ Ｌｔｄ，Ｒｏｙｓｔｏｎ，ＵＫから入手した。
【０２６１】
免疫組織化学（ＩＨＣ）染色のために、以下の抗体が用いられた：モノクローナルマウス抗ヒトＦＡＰクローン３Ｆ２（１５．８ｎｇ／ｍｌ、ベンタナ抗体希釈液（Ｖｅｎｔａｎａ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ）で希釈）、モノクローナルマウス抗ヒトＦＡＰクローン４Ｇ８（１０００ｎｇ／ｍｌ、ベンタナ抗体希釈液（Ｖｅｎｔａｎａ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ）で希釈）、及びモノクローナルマウス抗ヒトＦＡＰクローン３Ｄ９（１０００ｎｇ／ｍｌ、ベンタナ抗体希釈液（Ｖｅｎｔａｎａ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ）で希釈）ポリクローナルマウスＩｇＧ２ａ、濃度１００μｇ／ｍｌ（プロバイダー：ＤＡＫＯ，Ｘ０９４３，ロット＃０００５８０６６）がアイソタイプコントロールとして用いられた。
【０２６２】
染色は、（染色用のＤＡＢとユニバーサルＨＲＰマルチマーを含む）検出用のＨＲＰシステムを伴うベンタナウルトラビュー検出キット（Ｖｅｎｔａｎａ Ｕｌｔｒａ−Ｖｉｅｗ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）を用いて、ベンタナベンチマークＸＴ機器（Ｖｅｎｔａｎａ Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ ＸＴ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）上で、標準的なプロトコルに従って実施された。対比染色はヘマトキシリンＩＩ（ベンタナ、マイヤーのヘマトキシリン）とブルーイング（Ｂｌｕｅｉｎｇ）試薬（ベンタナ）で８分間行われた。
ＴＭＡは半定量的に分析され、腫瘍組織におけるＦＡＰ発現（染色強度）の総量並びにＦＡＰの発現の局在が解析された。
【０２６３】
３つ全ての抗ＦＡＰ抗体により、評価することが可能な３つの腫瘍組織サンプル（乳癌、結腸直腸癌および肺癌）の全てが、腫瘍の間質成分において中程度から強の染色のＦＡＰシグナル強度を示した。各腫瘍と抗体に対して１０サンプルのうち少なくとも７が評価可能であった。残りのサンプルは評価することができなかったが、その理由は組織コアが、フォールディングした人工物を持っていたか、正常組織のみを含有していたか、又は欠失していたためである。
【０２６４】
期待されたように、ＦＡＰシグナルは、腫瘍の間質成分に常に局在化していた。クローン３Ｆ２およびクローン３Ｄ９と４Ｇ８の間のシグナル強度にわずかな違いがあった。若干強いシグナルがクローン３Ｄ９と４Ｇ８で見られたが、しかしながら違いは軽微であった。
【０２６５】
図８Ａ−Ｄは、抗ＦＡＰマウスＩｇＧ２ａ ３Ｆ２、３Ｄ９はまたは４Ｇ８、またはアイソタイプコントロール抗体を用いた、ＦＡＰについて免疫組織化学的染色されたヒト腫瘍組織サンプルの代表的な顕微鏡写真を示す。
【０２６６】
実施例９：
細胞上での抗ＦＡＰ抗体のＦＡＰに対する結合
ヒトＩｇＧ１抗体の３Ｆ２，４Ｂ３及び４Ｇ８の、安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞に発現したヒトおよびマウスのＦＡＰに対する結合を、ＦＡＣＳにより測定した。簡潔には、丸底９６ウェルプレートにおいて、ウェルあたり１５０．０００細胞を、抗ＦＡＰ抗体の３Ｆ２、４Ｂ３及び４Ｇ８の指示された濃度でインキュベートし、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ／０．１％のＢＳＡで１回洗浄した。結合した抗体を、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ （Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を使用して３０分間４℃でインキュベーション後、ＦＩＴＣ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ ＃１０９−０９６−０９７，希釈標準溶液：ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで１：２０に希釈，新たに調製）を用いて検出した。結果を図９に示す。ヒト及びマウスＦＡＰについて最大半量結合でのＥＣ５０値が決定され、表９に与えられる。
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【０２６７】
ＦＡＰ抗体の特異性
ファージディスプレイ由来抗体の結合特異性を評価するために、ＤＰＰＩＶ（健常者組織で発現されるＦＡＰの近接ホモログ）又はＨＥＲ２を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞対する結合が、抗ＦＡＰヒトＩｇＧ１抗体の３Ｆ２、４Ｂ３及び４Ｇ８について測定された。簡潔には、丸底９６ウェルプレートにおいて、ウェルあたり２００．０００細胞（ＨＥＫ２９３−ＤＰＰＩＶ又はコントロールとしてＨＥＫ２９３−ＨＥＲ２）を、３０μｇ／ｍｌの抗ＦＡＰ抗体の３Ｆ２、４Ｂ３又は４Ｇ８でインキュベートし、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ／０．１％のＢＳＡで１回洗浄した。トラスツズマブ（抗ＨＥＲ２抗体）またはフィコエリトリン（ＰＥ）結合マウス抗ヒト抗ＣＤ２６／ＤＰＰＩＶ抗体（ＣＤ２６＝ＤＰＰＩＶ、マウスＩｇＧ１、ｋ、ＢＤバイオサイエンス、＃５５５４３７、クローンＭ−Ａ２６１）を陽性コントロールとして使用した。結合した抗体を、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を使用して３０分間４℃でインキュベーション後、ＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ ＃１０９−１１６−１７０，希釈標準溶液：ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで１：２０に希釈，新たに調製）を用いて検出した。この実験の結果を図１０に示す。抗ＦＡＰ抗体のいずれもＤＰＰＩＶまたはＨＥＲ２に対する有意な結合を示さなかったが、陰性コントロール（二次抗体単独、アイソタイプコントロール抗体、または全く抗体無し）の範囲のシグナルを示した。
【０２６８】
ヒト線維芽細胞での抗ＦＡＰ抗体のＦＡＰに対する結合
ヒト線維芽細胞株ＧＭ０５３８９（ヒト胎児肺に由来；一般医科学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ）に発現されたヒトＦＡＰに対するヒトＩｇＧ１抗体の結合をＦＡＣＳによって測定した。簡潔には、丸底９６ウェルプレートにおいて、ウェルあたり２００．０００細胞を、３０μｇ／ｍｌの抗ＦＡＰ抗体の３Ｆ２又は４Ｇ８とともにインキュベートし、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ／０．１％のＢＳＡで１回洗浄した。結合した抗体を、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を使用して３０分間４℃でインキュベーション後、ＦＩＴＣ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ ＃１０９−０９６−０９８，希釈標準溶液：ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで１：２０に希釈，新たに調製）を用いて検出した。この実験の結果を図１１に示す。両方の抗−ＦＡＰ抗体が、ヒト線維芽細胞上に発現したＦＡＰに強く結合する。
【０２６９】
ヒト腫瘍細胞での抗ＦＡＰ抗体のＦＡＰに対する結合
ＦＡＣＳによって、ヒト線維芽細胞株ＧＭ０５３８９上と安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞上に発現されたヒトＦＡＰに対するヒトＩｇＧ１抗体の結合を、ヒト癌細胞株のＡＣＨＮ，Ｃｏｌｏ２０５，ＭＤＡ−ＭＢ２３１，ＭＤＡ−ＭＢ４３５及びＫＰＬ４におけるＦＡＰ発現に対して比較した。
【０２７０】
簡潔には、丸底９６ウェルプレートにおいて、ウェルあたり２００．０００細胞を、１０μｇ／ｍｌの抗ＦＡＰ抗体の３Ｆ２又は４Ｇ８とともにインキュベートし、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ／０．１％のＢＳＡで１回洗浄した。結合した抗体を、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を使用して３０分間４℃でインキュベーション後、ＦＩＴＣ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ ＃１０９−０９６−０９７，希釈標準溶液：ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで１：２０に希釈，新たに調製）を用いて検出した。この実験の結果を図１２に示す。抗体の３Ｆ２及び４Ｇ８は、線維芽細胞及び安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞上に強く過剰発現されるＦＡＰに特異的に結合するが、ＡＣＨＮ，Ｃｏｌｏ２０５，ＭＤＡ−ＭＢ２３１，ＭＤＡ−ＭＢ４３５及びＫＰＬ４のヒト腫瘍細胞上にはほんの弱い結合しか検出されないことを示す。
【０２７１】
実施例１０：
ＦＡＣＳによる抗ＦＡＰ抗体の結合の際のＦＡＰ内部移行の分析
当該分野で既知の幾つかのＦＡＰ抗体について、それらは結合の際にＦＡＰの内部移行を誘導することが記述されている（例えば、Baum et al., J Drug Target 15, 399-406 (2007); Bauer et al., Journal of Clinical Oncology, 2010 ＡＳＣＯ年会予稿集（ポストミーティング版），２８巻（５月２０日補足），アブストラクト番号１３０６２（２０１０）； Ostermann et al., Clin Cancer Res 14, 4584-4592 (2008)に記載）。
【０２７２】
従って、我々は我々の抗体の内部移行特性を分析した。簡単に言えば、ＥＭＥＭ培地＋ＦＣＡで培養されたＧＭ０５３８９細胞（ヒト肺線維芽細胞）が分離され、洗浄され、カウントされ、生存能力についてチェックされ、１２ウェルプレートに０．２ｍｉｏ細胞／ウェルの密度で播種した。翌日、ＦＡＰ抗体４Ｇ８及び３Ｆ２（図１３Ａ）又は４Ｇ８のみ（図１３Ｂ）が冷却培地に１０μｇ／ｍｌまで希釈され、細胞は氷上で冷却され、その希釈抗体（０．５ｍｌ／ウェル）又は培地のみが指示されるように添加された。その後、細胞を穏やかに撹拌しながら、低温室で３０分間インキュベートし、０．５ｍｌの温かい培地を添加し、３７℃で指定された時間、細胞を更にインキュベートした。異なる時点に到達したとき、細胞は氷へと移され、冷却ＰＢＳで１回洗浄し、０．４ｍｌの２次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６３３結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ ＃Ａ−２１０９１，２ｍｇ／ｍｌ，使用１：５００）とともに３０分間４℃でインキュベートした。細胞は次いでＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで２回洗浄され、９６ウェルプレートに移し、４℃で４分間、４００×ｇで遠心分離し、細胞ペレットをボルテックスで再懸濁した。細胞は、１００μｌの２パーセントＰＦＡを用いて固定した。ＦＡＣＳ測定のため、細胞を２００μｌ／サンプルＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中に再懸濁し、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩのプレートプロトコルで測定した（Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）。これらの実験の結果が図１３Ａ及びＢに示され、４Ｇ８と３Ｆ２抗ＦＡＰ抗体が線維芽細胞でＦＡＰの内部移行を誘発しないことを示している。
【０２７３】
免疫蛍光法による抗ＦＡＰ抗体の結合の際のＦＡＰ内部移行の分析
ＧＭ０５３８９細胞（ヒト肺線維芽細胞）が、ガラスカバースリップ上、ＥＭＥＭ培地＋１５％ＦＣＳ中で増殖された。処置の前に、細胞はＰＢＳで３回洗浄され、ＥＭＥＭ培地＋０．１％ＢＳＡ中で２時間飢餓状態にした。抗ＦＡＰ抗体（４Ｇ８ ＩｇＧ抗体）または抗ＣＤ２０抗体（ＧＡ１０１、アイソタイプコントロールとして使用）が冷却ＥＭＥＭ培地中で最終濃度１０μｇ／ｍｌまで希釈した。飢餓状態後に、細胞を氷上で冷却し、冷却ＰＢＳで２回すすぎ、希釈抗体（０．５ｍｌ／ウェル）と共に、表面結合可能なように持続性攪拌下、４℃で４５分間インキュベートした。次いで細胞は冷却ＰＢＳで２回洗浄し、冷却ＰＦＡ（（Ｔ０，パラホルムアルデヒド ＰＢＳ中に４％ ｐＨ７．４））で固定するか、又はＥＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中で、３７℃で、２０分間、１時間、３時間、および６時間さらにインキュベートした。各時点で、細胞を冷却ＰＢＳで２回洗浄し、氷上で２０分間ＰＦＡ固定した。固定した後、細胞を冷却ＰＢＳで４回洗浄し、０．０３％トリトンで透過し、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋１０％ＦＣＳ）中、室温で４５分間、抗ＥＥＡ１（初期エンドソームマーカー）抗体と共にインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、蛍光標識二次抗体（ロバ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４結合抗体、およびヤギ抗ヒトＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８結合抗体）と共に４５分間室温でインキュベートした。細胞を最終的に洗浄し、Ｉｍｍｕｎｏ Ｍｏｕｎｔ封入剤を使用してガラス製の支持スライド上にマウントした。
【０２７４】
図１４−Ｄは、（Ａ）４℃で４５分間の抗ＦＡＰ４Ｇ８ ＩｇＧの結合後、（Ｂ）３７℃で２０分間の抗ＦＡＰ４Ｇ８ ＩｇＧの結合後、（Ｃ）３７℃で１時間の抗ＦＡＰ４Ｇ８ ＩｇＧの結合後、又は（Ｄ）３７℃で６時間の抗ＦＡＰ４Ｇ８ ＩｇＧの結合後に得られたＧＭ０５３８９肺線維芽細胞上のＦＡＰ細胞膜染色を示す代表的な免疫蛍光を示す。抗ＣＤ２０抗体ＧＡ１０１は、アイソタイプコントロールとして使用され、バックグラウンド染色を示す。ＥＥＡ１は初期エンドソームをラベルする。抗ＦＡＰ４Ｇ８抗体結合後最長６時間までの、ＦＡＰ表面細胞膜染色の持続性を注意のこと。
【０２７５】
実施例１１：
親和性成熟抗ＦＡＰ ＩｇＧ抗体のビアコア分析
３Ｆ２及び４Ｇ８に由来する親和性成熟抗−ＦＡＰ Ｆａｂ断片を、ウサギＩｇＧ抗体に変換した。親和性成熟３Ｆ２及び４Ｇ８ベースのウサギＩｇＧ１変換性抗ＦＡＰ抗体のＦＡＰに対する親和性が、続いて決定され、２５℃でのＳＰＲ解析により（Ｂｉａｃｏｒｅ）、ヒト、マウス、及びカニクリザルのＦＡＰにおいて確認された。この目的のために、ヒト、マウスまたはカニクイザルＦＡＰの細胞外ドメイン（配列番号３１７から３２２）が固定された抗Ｈｉｓ抗体（Ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ Ｑｉａｇｅｎ ３４６６０）により捕捉され、その抗体を分析物として用いる。ＩｇＧは１０ｎＭから３．２ｎＭまで１：５に希釈される。次のパラメータが適用される：会合時間１８０秒、解離９００秒、流れは９０μｌ／分。１０ｍＭのグリシンｐＨ２により６０秒間で再生。ＫＤ値を得るために、曲線を１：１モデルによりフィットさせた（Ｒｍａｘ ローカル，ＲＩ＝０）。
【０２７６】
実施例１２：
細胞上での親和性成熟抗ＦＡＰ抗体のＦＡＰに対する結合
４Ｇ８親抗体に由来し、Ａｌｅｘａ−６４７で標識された親和性成熟ヒトＩｇＧ１抗体２８Ｈ１の、安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞上で発現されたヒトＦＡＰに対する結合がＦＡＣＳにより測定された。簡潔には、ウェルあたり２０００００細胞が、丸底９６ウェルプレート中で、親の４Ｇ８抗体及び親和性成熟２８Ｈ１抗ＦＡＰ抗体の指定された濃度の２μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌとともにインキュベートし、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ／０．１％ ＢＳＡで１回洗浄した。結合抗体を、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を用い、４℃で３０分間のインキュベーションの後に検出した。データは、両方の抗体が、ヒトＦＡＰでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞に強く結合することを示している（図２３）。
【０２７７】
実施例１３：
ヒト線維芽細胞での親和性成熟抗ＦＡＰ抗体のＦＡＰに対する結合
ヒト線維芽細胞株ＧＭ０５３８９（ヒト胎児肺に由来；一般医科学研究所（National Institute of General Medical Sciences)、Camden, NJ）に発現されたヒトＦＡＰに対する、３Ｆ２に由来する親和性成熟ヒトＩｇＧ１抗体の結合をＦＡＣＳによって測定する。簡潔には、丸底９６ウェルプレートにおいて、ウェルあたり２００．０００細胞を、３０μｇ／ｍｌの親和性成熟３Ｆ２抗ＦＡＰ抗体とともにインキュベートし、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ／０．１％のＢＳＡで１回洗浄した。結合した抗体を、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を使用して３０分間４℃でインキュベーション後、ＦＩＴＣ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ ＃１０９−０９６−０９８，希釈標準溶液：ＰＢＳ／０．１％ ＢＳＡで１：２０に希釈，新たに調製）を用いて検出する。ヒト及びマウスＦＡＰについて最大半量結合でのＥＣ５０値が決定されている。
【０２７８】
実施例１４：
糖鎖操作抗ＦＡＰ ＩｇＧ１抗体によって媒介される抗体依存性細胞媒介性細胞傷害
４Ｇ８又は３Ｆ２由来ＦＡＰに対するヒトＩｇＧ１抗体は、実施例１に記載されるように、ＧｎＴＩＩＩとＭａｎＩＩをコードするプラスミドによる同時導入によって糖鎖操作された。続いて、糖鎖操作親４Ｇ８および３Ｆ２および親和性成熟２８Ｈ１ヒトＩｇＧ１抗体を、それらの非糖鎖操作野生型バージョンに比較して優れた抗体媒介性細胞傷害を媒介するそれらの能力について、ＡＤＣＣアッセイで比較した。
簡潔には、ヒトＦＡＰで安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を標的細胞として収集し、洗浄し、培地中に再懸濁し、３０分間３７℃で新たに調製したカルセインＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し、３回洗浄し、カウントされ、３００．０００細胞／ｍｌに希釈した。この懸濁液を丸底９６ウェルプレート（３０．０００細胞／ウェル）に移し、それぞれの抗体希釈液を添加し、試験された抗体の細胞に対する結合を容易にするために、エフェクター細胞と接触させる前に、１０分間インキュベートした。ＰＢＭＣについてエフェクターとターゲットの比率は１〜２５であった。共インキュベーションは４時間実施された。読み出し情報として、攻撃された細胞の分解後の上澄み液中への乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出が使用される。共培養上清からのＬＤＨはＬＤＨ検出キット（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して収集され分析された。ＬＤＨ酵素による基質変換は、ＥＬＩＳＡ吸光リーダー（ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウェア、リファレンス波長：４９０ｎｍ対６５０ｎｍ）を用いて測定された。図２４に示すように、試験されたすべての抗ＦＡＰ抗体は、ＨＥＫ２９３−ｈＦＡＰ細胞上でＡＤＣＣを誘導することができた。糖鎖操作（ｇｅ）バージョンは、対応する野生型（ｗｔ）非糖鎖操作バージョンよりも常に良好に機能した。
【０２７９】
前述の発明は、理解を明確にする目的のために例示および実施例によってある程度詳細に説明してきたが、説明や例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。すべての特許および本明細書に引用される科学文献の開示は、参照によりその全体が援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年5月8日(2020.5.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合する抗体であって、
（ｉ）配列番号２６７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は配列番号２９９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２９７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
（ｉｉ）ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域
を含む、抗体。
【請求項２】
前記抗体が完全長ＩｇＧ１クラスの抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体がヒト定常領域を含む、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が多重特異性抗体である、請求項１から３の何れか一項に記載の抗体。
【請求項５】
請求項１から４の何れか一項に記載の抗体をコードする、１又は複数の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項７】
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合する抗体を産生する方法であって、
ａ）抗体の発現を許容する条件下で培地中で請求項６に記載の宿主細胞を培養すること、及び
ｂ）抗体を回収すること
を含む方法。
【請求項８】
請求項１から４の何れか一項に記載の抗体と薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤。
【請求項９】
請求項１から４の何れか一項に記載の抗体を含む医薬。
【請求項１０】
請求項１から４の何れか一項に記載の抗体を含む、ＦＡＰの発現により特徴付けられる疾患の治療のための医薬。
【請求項１１】
前記疾患が癌である、請求項１０に記載の医薬。
【請求項１２】
医薬の製造における、請求項１から４の何れか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１３】
ＦＡＰの発現により特徴付けられる疾患の治療のための医薬の製造のための、請求項１から４の何れか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１４】
前記疾患が癌である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
個体における疾患を診断する方法における使用のための、請求項１から４の何れか一項に記載の抗体であって、
前記方法が診断薬の有効量を個体に投与することを含み、前記診断薬が請求項１から４の何れか一項に記載される抗体と、前記診断薬とＦＡＰの複合体の検出を可能にする標識を含む、抗体。
【請求項１６】
請求項１から４の何れか一項に記載の抗体、及び前記診断薬とＦＡＰの複合体の検出を可能にする標識を含む、診断薬。
【外国語明細書】
2020141674000001.pdf