(57)【要約】      （修正有）【課題】２種の機能的抗体を対象に送達する方法の提供。【解決手段】アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドと、このＡＡＶカプシド中にパッケージングされた、細胞中で少なくとも２種の機能的単一特異性抗体を発現する異種核酸とを有する組み換えＡＡＶであって、５’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）と、第１の発現カセットの発現を指示する調節制御配列の制御下にある、第１の免疫グロブリン用の第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を少なくともコードする第１の発現カセットと、第２の発現カセットの発現を指示する調節制御配列の制御下にある、第２のＯＲＦ、リンカーおよび第３のＯＲＦを含む第２の発現カセットであり、前記第２のＯＲＦおよび前記第３のＯＲＦが第２の免疫グロブリン構築物用および第３の免疫グロブリン構築物用である、第２の発現カセットと、３’ＡＡＶ  ＩＴＲとを含む組み換えＡＡＶ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドと、このＡＡＶカプシド中にパッケージングされた、細胞中で少なくとも２種の機能的単一特異性抗体を発現する異種核酸とを有する組み換えＡＡＶであって、
５’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）と、
第１の発現カセットの発現を指示する調節制御配列の制御下にある、第１の免疫グロブリン用の第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を少なくともコードする第１の発現カセットと、
第２の発現カセットの発現を指示する調節制御配列の制御下にある、第２のＯＲＦ、リンカーおよび第３のＯＲＦを含む第２の発現カセットであり、前記第２のＯＲＦおよび前記第３のＯＲＦが第２の免疫グロブリン構築物用および第３の免疫グロブリン構築物用である、第２の発現カセットと、
３’ＡＡＶ  ＩＴＲと
を含む組み換えＡＡＶ。
【請求項２】
二重特異性抗体を更に発現する請求項１に記載の組み換えＡＡＶ。
【請求項３】
前記第１の発現カセットと前記第２の発現カセットとの間に位置している双方向エンハンサーを含む請求項１に記載の組み換えＡＡＶ。
【請求項４】
前記第１のＯＲＦが免疫グロブリン軽鎖をコードし、前記第２のＯＲＦが第１の免疫グロブリン重鎖をコードし、前記第３のＯＲＦが第２の重鎖をコードし、前記発現される機能的抗体構築物が、特異性が異なる２種の異なる重鎖を有し、前記重鎖が軽鎖を共有する、請求項１に記載の組み換えＡＡＶ。
【請求項５】
前記第２のＯＲＦおよび前記第３のＯＲＦの少なくとも一方が、改変されたＦｃコード配列を含む、請求項１に記載の組み換えＡＡＶ。
【請求項６】
前記第２のカセット中の前記リンカーが、ＩＲＥＳまたはＦ２Ａから選択されるリンカーを含む、請求項１に記載の組み換えＡＡＶ。
【請求項７】
前記第１の発現カセット用の前記調節制御配列および／または前記第２のカセット用の前記調節制御配列が最小プロモーターを含む、請求項１に記載の組み換えＡＡＶ。
【請求項８】
前記第１の発現カセット用の前記調節制御配列および／または前記第２の発現カセット用の前記調節制御配列が最小ポリＡまたは合成ポリＡを含む、請求項１に記載の組み換えＡＡＶ。
【請求項９】
前記第１の発現カセットが２シストロン性であり、更なるＯＲＦを含む、請求項１に記載の組み換えＡＡＶ。
【請求項１０】
前記各ＯＲＦがｓｃＦｖを含む、請求項９に記載の組み換えＡＡＶ。
【請求項１１】
ベクターが、前記第１の発現カセットと前記第２の発現カセットとの間に双方向ポリＡを含む請求項１に記載の組み換えＡＡＶ。
【請求項１２】
前記第１の発現カセットがエンハンサーおよび最小プロモーターを含む、請求項１０に記載の組み換えＡＡＶ。
【請求項１３】
前記第２の発現カセットがエンハンサーおよび最小プロモーターを含む、請求項１２に記載の組み換えＡＡＶ。
【請求項１４】
前記第１の発現カセットおよび前記第２の発現カセットが共に２種のＦａｂを発現する、請求項８に記載の組み換えＡＡＶ。
【請求項１５】
前記少なくとも２種の抗体構築物が異なる特異性を有する、請求項１に記載の組み換えＡＡＶ。
【請求項１６】
前記少なくとも２種の抗体構築物が、モノクローナル抗体、イムノアドヘシン、Ｆａｂ、二重機能的抗体およびこれらの組み合わせから独立して選択される、請求項１に記載の組み換えＡＡＶ。
【請求項１７】
第１の特異性を有する第１のモノクローナル抗体、前記第１のモノクローナル抗体とは異なる特異性を有する第２のモノクローナル抗体、および二重機能的抗体を発現する請求項１に記載の組み換えＡＡＶ。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組み換えＡＡＶと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１９】
少なくとも２種の機能的抗体を対象に送達する方法であって、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組み換えＡＡＶを前記対象に投与することを含む方法。
【請求項２０】
特異性が異なる２種の機能的抗体を含む組成物であって、前記各抗体が同じ軽鎖および異なる重鎖を有し、前記抗体の一方または両方に関して、前記軽鎖が前記重鎖の供給源に対して異種の供給源に由来する、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
電子的形態で提出された資料の参照による援用
本出願人は、本明細書と共に電子的形態で出願された配列表資料を参照により援用する。このファイルを「１４−７０３２ＰＣＴ＿Ｓｅｑ  Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と標識する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体は、がんおよびその他の疾患に有効な治療法であることが証明されている。現在の抗体治療は反復投与および長期にわたる処置レジメンを含むことが多く、これらは、一貫性のない血清レベルおよび投与当たりの有効性の持続時間の制限等の多く欠点を伴い、その結果、頻繁な再投与が必要であり高コストである。近年、診断ツールおよび治療モダリティとしての抗体の使用が増大していることが分かっている。がんの処置用に最初にＦＤＡに認可されたモノクローナル抗体Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ）は、非ホジキンリンパ腫を有する患者の処置用に１９９７年に認可され、その直後の１９９５年にＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（転移性乳がんを有する患者の処置用のヒト化モノクローナル抗体）が認可された。臨床開発の様々な段階である多くの抗体に基づく治療が有望さを示している。様々なモノクローナル抗体治療の成功から、次世代の生物製剤が抗体のカクテル（即ち混合物）を含むであろうことが示唆されている。
【０００３】
抗体技法の幅広い臨床的応用の１つの限界は、治療効果には概して大量の抗体が必要であり、生成に関連するコストが著しいことである。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＳＰ２０骨髄腫細胞およびＮＳＯ２骨髄腫細胞は、抗体等のグリコシル化ヒトタンパク質を商業的規模で生成するために最も一般に使用されている哺乳類細胞株である。哺乳類細胞株による生成から得られる収率は概して、バッチ発酵槽中での５〜７日の培養の場合に５０〜２５０ｍｇ／Ｌの範囲であり、流加発酵槽中での７〜１２日では３００〜１０００ｍｇ／Ｌの範囲である。
【０００４】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、このアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の安全性プロファイルおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの長期にわたる遺伝子発現の能力に起因して、治療用遺伝子の送達に望ましいベクターである。ｉｎ  ｖｉｖｏで一本鎖抗体および完全長抗体を発現するために、組み換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）が既に使用されている。ＡＡＶの制限されているトランス遺伝子パッケージング能力に起因して、完全長抗体を生成するために単一のＡＡＶベクターを使用して抗体の重鎖および軽鎖を発現するための厳密に調節されたシステムを得るには技術的課題がある
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
当分野では、治療で使用するために単一の組成物で２種の抗体を送達することが依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書では、細胞中で２種の機能的抗体を発現する異種核酸がパッケージングされているアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドを有する組み換えＡＡＶが提供される。一実施形態では、この組み換えＡＡＶは、免疫グロブリン軽鎖をコードするＯＲＦ、第１の免疫グロブリン重鎖をコードする第２のＯＲＦ、および第２の重鎖をコードする第３のＯＲＦを含み、発現される機能的抗体構築物は、特異性が異なる２種の異なる重鎖を有し、これらの重鎖は軽鎖を共有する。一実施形態では、特異性が異なる２種の抗体は、２種の単
一特異性抗体の特異性を有する第３の二重特異性抗体と共発現される。
【０００７】
一実施形態では、このｒＡＡＶは、５’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）と、第１の発現カセットの発現を指示する調節制御配列の制御下にある、第１の免疫グロブリン用の第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を少なくともコードする第１の発現カセットと、第２の発現カセットの発現を指示する調節制御配列の制御下にある、第２のＯＲＦ、リンカーおよび第３のＯＲＦを含む第２の発現カセットであって、第２のＯＲＦおよび第３のＯＲＦが第２の免疫グロブリン構築物および第３の免疫グロブリン構築物をコードする、第２の発現カセットと、３’ＡＡＶ  ＩＴＲとを含む。
【０００８】
少なくとも２種の機能的抗体構築物を発現する組み換えＡＡＶと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が提供される。一実施形態では、少なくとも２種の機能的抗体は異なる特異性を有する。任意選択で、二重特異性抗体も共発現される。
【０００９】
異なる特異性を有する少なくとも２種の機能的抗体を含む組成物が提供され、各抗体は同じ軽鎖および異なる重鎖を有する。一方のまたは両方の抗体に関して、軽鎖は重鎖とは異なる供給源に由来する。一実施形態では、２種の機能的単一特異性抗体および二重機能的抗体が発現されている。一実施形態では、抗体の比率は約２５：約５０：約２５（ホモ二量体性：二重特異性：ホモ二量体性）である。
【００１０】
２種の機能的抗体を対象に送達する方法であって、組み換えＡＡＶを対象に投与することを含む方法が提供される。
【００１１】
本発明の更にその他の態様および利点は、本発明の下記の詳細な説明から容易に明らかであるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】第１の重鎖および第２の重鎖ならびに軽鎖（第１の重鎖および第２の重鎖が由来する抗体の内の一方または両方に対して異種の抗体由来であることができる）を含む２種の単一特異性抗体構築物と、第３の二重特異性抗体とを発現するベクターの代表的な配置を漫画で示す図である。この配置では、双方向性であるならびに第１の発現カセットおよび第２の発現カセットを分離する共有エンハンサーが利用される。３種のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が示されている。Ｌはリンカーを意味する。ｐＡ１は第１のポリＡを意味しており、ｐＡ２は第２のポリＡを意味している。ＭＰ１は第１の最小プロモーターを意味しており、ＭＰ２は第２の最小プロモーターを意味している。各発現カセットに関して、ポリＡおよびＭＰは同じでもよいし異なっていてもよい。
【図１Ｂ】第１の重鎖および第２の重鎖ならびに軽鎖（第１の重鎖および第２の重鎖が由来する抗体の内の一方または両方に対して異種の抗体由来であることができる）を含む２種の抗体構築物と、第３の二重特異性抗体とを発現するベクターの別の代表的な配置を漫画で示す図である。この配置では共有ポリＡが利用される。Ｅ１は第１のエンハンサーを意味しており、Ｅ２は第２のエンハンサーを意味している。これらのエンハンサーは、各発現カセットに関して同じエンハンサーでもよいし異なるエンハンサーでもよい。同様に、ＭＰ１およびＭＰ２は同じでもよいし異なっていてもよい。
【図２】ＡＡＶカプシド中へのパッケージング用のプラスミドにより保持され、抗ＴＳＧ  １０１重鎖、ＦＩ６インフルエンザ重鎖およびＦＩ６軽鎖の共発現に使用される核酸分子を示す図である。この抗体鎖では、インターロイキン２（ＩＬ２）由来の異種リーダーが利用される。ヒトＣＭＶエンハンサーをＣＭＶプロモーターと共に使用した。２シストロン性発現カセットは、フリン認識部位と、ＦＩ６  ＶＬ領域およびＦＩ６  ＣＬ領域を含むＯＲＦを、ＦＩ６重鎖を含むＯＲＦから分離する２Ａリンカー配列とを含む。右側の発現カセット用のポリＡは短縮チミジンキナーゼポリＡである。左側の発現カセット用のポリＡは合成ポリＡ配列である。
【図３】本明細書に記載したように調製した組み換えＡＡＶ８からＣ０５抗体と共発現されたＦＩ６ｖ３ｋ２抗体の結合能力を示すグラフである。この結果から、ＦＩ６に特徴的な完全長ＨＡおよびＨＡ基部への予測された結合、ならびにＣ０５に特徴的なＨＡおよびＨＡ頭部のみ（基部なし）への予測された結合が実証される。
【図４Ａ−Ｂ】本明細書に記載したように調製した組み換えＡＡＶ８から１Ａ６抗体（抗ＴＳＧ  １０１）と共発現されたＦＩ６ｖ３ｋ２抗体の結合能力を示すグラフである。図４Ａは、プロテインＡへの結合により、混合物中の全モノクローナル抗体が捕捉されることを示す棒グラフである（陰性コントロールを左側の棒で表し、抗体混合物を右側の棒で表す）。図４Ｂは、ＴＳＧ１０１ペプチドへの結合により、１Ａ６重鎖を含むＭＡＢ（上側の線）のみが捕捉されることを示すグラフである。これらのデータから、ＦＩ６ｖ３ｋ２と共発現された場合、１Ａ６抗体は、重鎖が由来する抗体の結合特異性を保持したことが実証される。
【図５】１×１０11のゲノムコピー（ＧＣ）または１×１０10のＧＣの用量にて、第２の抗体と共にＡＡＶベクターから共発現されたＦＩ６を投与したマウスにおける全身発現レベルを示すグラフである。
【図６Ａ−Ｂ】１×１０11のＧＣで筋肉内注射（ＩＭ）により送達されたＡＡＶ９．ＢｉＤ．ＦＩ６ｖ３＿ＣＲ８０３３ｍＡｂの、インフルエンザ株ＰＲ８によるチャレンジに対する保護に関する評価を示すグラフである。図６Ａは、体重の変化率を示す線グラフである。円形は、合成されたＦＩ６ｖ３モノクローナル抗体およびＣＲ８０３３モノクローナル抗体（同じ異種軽鎖を有する）を発現する双方向プロモーターを有するＡＡＶ９構築物を表す。四角形は陽性コントロール（即ち、同様に１×１０11のＧＣで送達された単一の抗体型ＦＩ６を発現するＡＡＶ９）を表し、三角形は未処理動物を表す。図６Ｂはチャレンジ後の生存を示す。
【図７Ａ−Ｂ】１×１０11のＧＣで筋肉内注射（ＩＭ）により送達されたＡＡＶ９．ＢｉＤ．ＦＩ６ｖ３＿ＣＲ８０３３ｍＡｂの、インフルエンザ株Ｂ／Ｌｅｅ／４０によるチャレンジに対する保護に関する評価を示すグラフである。図７Ａは、体重の変化率を示す線グラフである。円形は、合成されたＦＩ６モノクローナル抗体およびＣＲ８０３３モノクローナル抗体（同じ異種軽鎖を有する）を発現する双方向プロモーターを有するＡＡＶ９構築物を表す。四角形は陽性コントロール（即ち、同様に１×１０11のＧＣで送達された単一の抗体型ＣＲ８０３３を発現するＡＡＶ９）を表し、三角形は未処理動物を表す。図７Ｂはチャレンジ後の生存を示す。
【図８Ａ】数日にわたるマウスの体重で表される、ＦＩ６ｖ３モノクローナル抗体およびＴＣＮモノクローナル抗体の両方を発現するＡＡＶの投与後のマウスモデルでの保護を示すチャートである。上方の線（ひし形）は２５マイクログラム（μｇ／ｍＬ）の用量を表し、下方の線は０．４μｇ／ｍＬを表す。
【図８Ｂ】数日にわたるマウスの体重で表される、ＦＩ６ｖ３モノクローナル抗体およびＩＡ６モノクローナル抗体の両方を発現するＡＡＶの投与後のマウスモデルでの保護を示すチャートである。上方の線（ひし形）は２６３．２マイクログラム（μｇ／ｍＬ）の用量を表し、下方の線は３６．５μｇ／ｍＬを表す。
【図８Ｃ】数日にわたるマウスの体重で表される、ＦＩ６ｖ３モノクローナル抗体およびＣＲ８０３３モノクローナル抗体の両方を発現するＡＡＶの投与後のマウスモデルでの保護を示すチャートである。上方の線（ひし形）は１２６．３マイクログラム（μｇ／ｍＬ）の用量を表し、下方の線は６．９μｇ／ｍＬを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書で提供されるのは、細胞中で発現される場合に特異性が異なる（即ち、異なる抗原（またはリガンド）を認識する）２種の機能的抗体を形成する２種の異なる重鎖および単一の軽鎖を共発現することにより少なくとも２種の機能的抗体を送達するベクターである。第３の機能的抗体も発現させることができ、この第３の機能的抗体は二重特異性で
あり、２種の単一特異性抗体それぞれの重鎖を有する。典型的には、第３の抗体は、２種の単一特異性抗体と比べて低レベルで発現される。少なくとも２種の抗体を利用し得る組成物を効率的に生成するためにベクターをｉｎ  ｖｉｖｏで使用することができる、または２種の異なる重鎖および単一種の軽鎖のための発現カセットを含むように抗体産生宿主細胞を操作することができる。そのため、本発明はまた、２種の単一特異性抗体の混合物であって、各抗体が異なる特異性を有するが同じ軽鎖を含む、混合物と、二重特異性である第３の抗体とを発現する宿主細胞を包含する。望ましい一実施形態では、このベクターは、このベクターが投与される対象中で３種の異なる抗体構築物を送達するように設計されている。
【００１４】
一実施形態では、このベクターは、ＡＡＶカプシド内にパッケージングされた、２種の異なる重鎖および単一の軽鎖をコードする配列を含む核酸分子を有する組み換えＡＡＶであり、この核酸分子は、共発現された場合に、２種の機能的単一特異性抗体（即ち第１の重鎖および軽鎖を有する第１の抗体ならびに第２の重鎖および軽鎖を有する第２抗体）と、二重特異性抗体を作るために各重鎖の内の一方および同じ軽鎖を有する第３の抗体とを形成する。
【００１５】
「機能的抗体」は、所望の生理学的結果をもたらすのに十分な結合親和性で、選択された標的（例えば、がん細胞上のまたは病原体（例えばウイルス、細菌もしくは寄生虫）上の抗原）に結合する抗体または免疫グロブリンであることができ、この生理学的効果は、保護的（例えば受動免疫化）または治療的であることができる。
【００１６】
本明細書で提供されるＡＡＶベクターは、最大で１０種の免疫グロブリンドメイン用の１種、２種または３種のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むことができる。本明細書で使用する場合「免疫グロブリンドメイン」は、従来の完全長抗体に関して定義されるような抗体の重鎖または軽鎖のドメインを意味する。より具体的には、完全長抗体は、４種のドメイン：１種のＮ末端可変（ＶＨ）領域ならびに３種のＣ末端定常（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）領域を含む重（Ｈ）鎖ポリペプチドと、２種のドメイン：１種のＮ末端可変（ＶＬ）領域および１種のＣ末端定常（ＣＬ）領域を含む軽（Ｌ）鎖ポリペプチドとを含む。Ｆｃ領域は２種のドメイン（ＣＨ２−ＣＨ３）を含む。Ｆａｂ領域は、各重鎖および各軽鎖に関して１種の定常ドメインおよび１種の可変ドメインを含むことができる。
【００１７】
本明細書に記載のＡＡＶベクターでは、２種の完全長重鎖ポリペプチド（それぞれ４種のドメイン）および軽鎖ポリペプチド（２種のドメイン）が発現され得る。望ましい一実施形態では、２種の重鎖ポリペプチドは異なる特異性を有する（即ち、異なる標的を対象とする）。そのため、このベクターは、抗体の混合物の発現に単独でまたは組み合わせで有用である。
【００１８】
本明細書で使用する場合、「異なる特異性」は、言及される免疫グロブリン構築物（例えば、完全長抗体、重鎖、または特定の標的に結合可能なその他の構築物）が異なる標的部位に結合することを示す。好適には、２重に発現された抗体構築物では、２種の特異性は重複せず、および／または干渉せず、任意選択で互いを増強することができる。本明細書に記載の２種の抗体（免疫グロブリン）構築物は、同じ病原体または標的部位（例えばウイルスタンパク質もしくは腫瘍）上の異なる標的部位に結合することにより、異なる特異性を付与する。そのような異なる標的抗原は、同じウイルス型の異なる株（例えば、２種の異なるインフルエンザ株）または２種の異なる抗原（例えば、抗ウイルスおよび抗がん、２種の異なる抗がん構築物等）であることができる。例えば、第１の重鎖ポリペプチドは、軽鎖と組み合わさって第１の特異性を有する抗体構築物を形成することができ、第２の重鎖ポリペプチドは、軽鎖と組み合わさって第２の特異性を有する第２の抗体構築物
を形成することができ、第１の重鎖および第２の重鎖は、軽鎖と組み合わさって二重特異性抗体を形成することができる。これらの抗体は、単一の標的上の異なる抗原部位（エピトープ）（例えば、選択されたウイルス病原体、細菌病原体、真菌病原体もしくは寄生虫病原体上の異なる抗原部位）または異なる標的を任意選択で対象とすることができる。例えば、２種の抗体由来の重鎖はインフルエンザウイルスを対象とすることができ、共発現されて２種の単一特異性抗体を形成することができ（例えば、インフルエンザウイルスＦＩ６、ＣＲ８０３３およびＣＯ５由来の重鎖を選択することができ）、選択された軽鎖と共に発現されて二重特異性抗体を形成することができる。適切なインフルエンザ抗体およびその他の抗空中病原体抗体構築物の例ならびにそれらを送達する方法が、例えば国際公開第２０１２／１４５５７２Ａ１号パンフレットに記載されている。これらの抗体はまた、慢性ウイルス感染、がんに関連するウイルス感染、もしくは様々な抗腫瘍性細胞表面タンパク質またはその他の標的等の様々な標的を対象とすることもできる（例えば抗ウイルス抗体であることもできる）。適切なウイルス標的の例として、インフルエンザ血球凝集素（ｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ）タンパク質またはその他のウイルスタンパク質、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス、ヒトヘルペスウイルス、呼吸器合抱体ウイルス等が挙げられる。そのため、本発明は、抗体の組み合わせが望ましい治療および受動的予防での使用に特に適している。
【００１９】
用語「免疫グロブリン」は本明細書において、抗体およびこの機能的断片を含むように使用される。抗体は様々な形態で存在することができ、この形態として、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）単一ドメイン抗体、細胞内抗体（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）（「細胞内抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）」）、組み換え抗体、多重特異性抗体（二重特異性）、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）2、Ｆ（ａｂ）3、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）2、一本鎖可変断片抗体（ｓｃＦｖ）、タンデム／ビス−ｓｃＦｖ、Ｆｃ、ｐＦｃ’、ｓ
ｃＦｖＦｃ（またはｓｃＦｖ−Ｆｃ）、ジスルフィドＦｖ（ｄｓＦｖ）、二重特異性抗体（ｂｃ−ｓｃＦｖ）、例えばＢｉＴｅ抗体；ラクダ科抗体、再表面化抗体（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）としても既知である）、キメラ抗体、少なくとも１種のヒト定常領域を含むキメラ抗体等が挙げられる。「抗体断片」は、標的（例えば腫瘍細胞）に結合する免疫グロブリンの可変領域の少なくとも一部を意味する。一実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧである。しかしながら、その他のタイプの免疫グロブリンを選択することができる。別の実施形態では、選択されるＩｇＧサブタイプはＩｇＧ１である。しかしながら、その他のアイソタイプを選択することもできる。更に、ＩｇＧ１アロタイプの内のいずれかを選択することができる。
【００２０】
用語「異種」は、タンパク質または核酸に関して使用される場合、このタンパク質または核酸が、天然では互いに同様に関連付けられて発見されない２種以上の配列または部分配列を含むことを示す。例として、核酸は典型的には組み換えにより生成され、新規の機能的核酸を作るように配置された無関係の遺伝子由来の２種以上の配列を有する。例えば、一実施形態では、この核酸は、別の遺伝子由来のコード配列の発現を指示するように配置された、ある遺伝子由来のプロモーターを有する。そのため、コード配列に対して、このプロモーターは異種である。用語「異種軽鎖」とは、重鎖の標的特異性とは異なる標的特異性を有する抗体由来の可変ドメインおよび／または定常ドメインを含む軽鎖のことである。
【００２１】
ベクター内にパッケージングされた核酸分子により保持された２種以上のＯＲＦは２種の発現カセットから発現され得、これらの発現カセットの内の一方または両方は２シストロン性であることができる。これらの発現カセットは２種の異なる抗体由来の重鎖を含む
ことから、２種の重鎖配列の間に配列変異を導入して相同組み換えの可能性を最小化することが望ましい。典型的には、２種の抗体の可変ドメイン（ＶＨ−Ａｂ１およびＶＨ−Ａｂ２）の間には十分な変異が存在する。しかしながら、第１の抗体（Ａｂ１）の定常領域および第２の抗体（Ａｂ２）の定常領域の間に十分なコード配列変異が確実に存在することが望ましく、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域それぞれに確実に存在することが最も好ましい。例えば、一実施形態では、第１の抗体の重鎖定常領域は、配列番号１のｎｔ１〜７０５の配列（配列番号２のアミノ酸１〜２３３をコードする）、または、いかなるアミノ酸変更を導入することなく、この配列と約９５％〜約９９％同一である配列を有することができる。一実施形態では、これらの領域の配列の変異は同義語コドンの形態で導入される（即ち、核酸配列の変異が、アミノ酸レベルで全く変更されることなく導入される）。例えば、第２の重鎖は、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３に関して少なくとも１５％、少なくとも約２５％、少なくとも約３５％相違する（即ち、約６５％〜約８５％同一である）定常領域を有することができる。
【００２２】
標的および免疫グロブリンを選択すると、選択された免疫グロブリン（例えば重鎖および／または軽鎖）のコード配列を得ることができる、および／または合成することができる。核酸（例えばＲＮＡおよびＤＮＡ）の配列決定方法は当業者に既知である。核酸の配列が分かるとアミノ酸を推定することができ、続いて、アミノ酸配列を核酸コード配列に逆翻訳するウェブベースのコンピュータプログラムおよび市販のコンピュータプログラムならびにサービスを基本とする企業が存在する。例えばＥＭＢＯＳＳによるｂａｃｋｔｒａｎｓｅｑ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｔ／；Ｇｅｎｅ  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｉｎｆｉｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｓｍｓ／ｓｍｓ＿ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ）；ＥｘＰａｓｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／）を参照されたい。一実施形態では、ＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡのコード配列は、ヒト細胞中で最適に発現するように設計されている。核酸を合成する方法は当業者に既知であり、本明細書に記載の核酸構築物の全てまたは一部に利用することができる。
【００２３】
コドン最適化コード領域を、種々の異なる方法により設計することができる。この最適化を、オンラインで利用可能である方法（例えばＧｅｎｅＡｒｔ）、公開された方法、またはコドン最適化サービスを提供する企業（例えばＤＮＡ２．０（カリフォルニア州、メンローパーク（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ））を使用して実施することができる。一例のコドン最適化アルゴリズムが、例えば米国特許出願第ＷＯ２０１５／０１２９２４号明細書に記載されており、この明細書は参照により本明細書に援用される。例えば米国特許出願公開第２０１４／００３２１８６号明細書および米国特許出願公開第２００６／０１３６１８４号明細書も参照されたい。好適には、生成物用のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長が改変されている。しかしながら、一部の実施形態では、ＯＲＦの断片のみを変更することができる。これらの方法の内の１つを使用して、任意の所与のポリペプチド配列に頻度を適用することができる、およびポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域の核酸断片を生成することができる。
【００２４】
多くのオプションが、コドンに対して実際の変更を実施するために利用可能である、または本明細書に記載したように設計されたコドン最適化コード領域を合成するために利用可能である。そのような改変または合成を、当業者に公知の標準的なおよび定常的な分子生物学的操作を使用して実施することができる。一例のアプローチでは、それぞれ８０〜９０ヌクレオチドの長さおよび所望の配列の長さに及ぶ一連の相補オリゴヌクレオチド対を、標準的な方法により合成する。これらのオリゴヌクレオチド対を、アニール時に、付着末端を含む８０〜９０の塩基対の二本鎖断片を形成するように合成し、例えば、この対内の各オリゴヌクレオチドを、この対内のその他のオリゴヌクレオチドに対して相補的である領域を超えて３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはより多くの
塩基だけ伸びるように合成する。各対のオリゴヌクレオチドの一本鎖末端は、別の対のオリゴヌクレオチドの一本鎖末端とアニールするように設計されている。オリゴヌクレオチド対をアニール可能にし、次いで、約５〜６個のこれらの二本鎖断片を、付着一本鎖末端を介して互いにアニール可能にし、次いで、互いにライゲートさせ、標準的な細菌クローニングベクター（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能なＴＯＰＯ（登録商標）ベクター）にクローニングする。次いで、この構築物を標準的な方法により配列決定する。互いにライゲートした８０〜９０塩基対断片の５〜６個の断片（即ち、約５００塩基対の断片）からなるいくつかのこれらの構築物が調製され、その結果、所望の配列全体が一連のプラスミド構築物中に示される。次いで、これらのプラスミドの挿入断片を適切な制限酵素で切断し、互いにライゲートさせて最終構築物を形成する。次いで、最終構築物を標準的な細菌クローニングベクターにクローニングし、配列決定する。追加の方法は当業者にすぐに明らかであるだろう。更に、遺伝子合成を容易に商業利用可能である。
【００２５】
任意選択で、２種の抗体重鎖間の配列多様性を増加させるためにおよび／または別の目的のために、アミノ酸置換を重鎖定常領域に導入することができる。そのようなアラインメントを作成するための方法およびコンピュータプログラムが利用可能であり、当業者に公知である。置換を、（単一文字コードで識別されるアミノ酸）−位置番号−（単一文字コードで識別されるアミン酸）（１番目のアミノ酸は置換されるアミノ酸であり、２番目のアミノ酸は、明示された位置で置換するアミノ酸である）として表すこともできる。用語「置換」および「アミノ酸の置換」および「アミノ酸置換」は本明細書で使用する場合、アミノ酸配列中のアミノ酸の別のアミノ酸（この別のアミノ酸は、置き換えられるアミノ酸とは異なる）による置き換えを意味する。アミノ酸を置き換える方法は当業者に公知であり、この方法として、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の変異が挙げられるがこれに限定されない。ＩｇＧ中でアミノ酸置換を行う方法は、例えば国際公開第２０１３／０４６７０４号パンフレットに記載されており、このパンフレットは、アミノ酸改変技法の議論に関して参照により援用される。
【００２６】
用語「アミノ酸置換」および上記に記載のこの用語の同義語は、あるアミノ酸を別の置換するアミノ酸で置き換えることによるアミノ酸配列の改変を包含するように意図されている。この置換は保存的置換であることができる。用語保存的は、２種のアミノ酸への言及では、これらのアミノ酸が、当業者により認識される共通の性質の共有することを意味するように意図されている。用語非保存的は、２種のアミノ酸への言及では、これらのアミノ酸が、当業者により認識される少なくとも１つの性質で差異を有することを意味するように意図されている。例えば、そのような性質として、疎水性の非酸性側鎖を有するアミノ酸、疎水性側鎖を有するアミノ酸（酸性または非酸性に更に区別され得る）、脂肪族の疎水性側鎖を有するアミノ酸、芳香族の疎水性側鎖を有するアミノ酸、極性の中性側鎖を有するアミノ酸、帯電した側鎖を有するアミノ酸、帯電した酸性側鎖を有するアミノ酸、ならびに帯電した塩基性側鎖を有するアミノ酸を挙げることができる。天然に存在するアミノ酸および天然には存在しないアミノ酸の両方が当分野で既知であり、実施形態での置換用アミノ酸として使用され得る。そのため、保存的アミノ酸置換として、疎水性側鎖を有する最初のアミノ酸を、疎水性側鎖を有する別のアミノ酸で変更することを挙げることができ、非保存的アミノ酸置換として、酸性の疎水性側鎖を有する最初のアミノ酸を、異なる側鎖（例えば、塩基性の疎水性側鎖または親水性側鎖）を有する別のアミノ酸で変更することを挙げることができる。当業者は、更にその他の保存的変更または非保存的変更を決定することができる。更にその他の実施形態では、所与の位置での置換は、あるアミノ酸に対してであることができ、または一群のアミノ酸の内の１つに対してであることができ、このことは、本明細書で特定される目的を達成するために当業者に明らかであるだろう。
【００２７】
選択された免疫グロブリンドメインを発現させるために、選択された哺乳類種（例えばヒト）中での免疫グロブリンポリペプチドの最適な発現のために選択されているコドンを含む核酸分子を設計することができる。更に、核酸分子は、選択された抗体の重鎖および軽鎖それぞれのための異種リーダー配列を含むことができ、この異種リーダー配列は、可変領域および定常領域で構成されている重ポリペプチドおよび軽ポリペプチの上流に融合した、野生型ＩＬ−２シグナルリーダーペプチドまたは変異型ＩＬ−２シグナルリーダーペプチドをコードする。しかしながら、ＩＬ−２シグナルペプチドの内の一方また両方を別の異種リーダー配列で置換することもできる。シグナル／リーダーペプチドは、重鎖免疫グロブリン構築物および軽鎖免疫グロブリン構築物それぞれに関して同じであることができる、または異なることができる。これらのペプチドは、免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）中で天然に見出されるシグナル配列であることができる、または異種供給源由来であることができる。そのような異種供給源は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ１２、ＩＬ１８等）、インスリン、アルブミン、β−グルクロニダーゼ、アルカリプロテアーゼまたはフィブロネクチン分泌シグナルペプチド等であることができる。
【００２８】
本明細書で使用する場合「発現カセット」は、少なくとも第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、任意選択で第２のＯＲＦを含む核酸配列を意味する。ＯＲＦは、２種、３種または４種の抗体ドメインを含むことができる。例えば、ＯＲＦは完全長重鎖を含むことができる。あるいは、ＯＲＦは１種または２種の抗体ドメインを含むことができる。例えば、ＯＲＦは、重鎖可変ドメインおよび単一の重鎖定常ドメインを含むことができる。別の例では、ＯＲＦは、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域を含むことができる。そのため、発現カセットを２シストロン性であるように設計することができる（即ち、ＯＲＦの発現を指示する調節配列を、共有される調節配列から含むように設計することができる）。この場合、２種のＯＲＦは典型的にはリンカーで分離されている。適切なリンカー、例えば内部リボザイム結合部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）（ＩＲＥＳ）および／またはフリン−２ａ自己切断ペプチドリンカー（Ｆ２ａ）［例えばＲａｄｃｌｉｆｆｅ  ａｎｄ  Ｍｉｔｒｏｐｈａｎｏｕｓ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００４），１１，１６７３−１６７４を参照されたい］が当分野で既知である。好適には、ＯＲＦは、標的細胞中で発現を指示する調節制御配列に作動可能に連結されている。そのような調節制御配列は、ポリＡ、プロモーターおよびエンハンサーを含むことができる。ＡＡＶベクターからの共発現を促進するために、エンハンサー配列および／またはポリＡ配列の内の少なくとも一方を、第１の発現カセットおよび第２の発現カセットが共有することができる。
【００２９】
一実施形態では、ｒＡＡＶは、選択されたＡＡＶカプシド内にパッケージングされた、５’ＩＴＲと、第１の発現カセットと、双方向エンハンサーと、第２の発現カセットであって、双方向エンハンサーが第１の発現カセットおよび第２の発現カセットを分離している、第２の発現カセットと、３’ＩＴＲとを含む核酸分子を有する。図１Ａは、この実施形態の例として本明細書で提供される。例えば、そのような実施形態では、第１の発現カセット用の第１のプロモーターが双方向エンハンサーの左側に位置しており、続いて、少なくとも第１のオープンリーディングフレームおよびポリＡ配列および第２のプロモーターが位置している。更に、第２の発現カセット用の第２のプロモーターが双方向エンハンサーの右側に位置しており、続いて、少なくとも第２のオープンリーディングフレームおよびポリＡが位置している。第１のプロモーターおよび第２のプロモーターならびに第１のポリＡ配列および第２のポリＡ配列は同じでもよいし異なっていてもよい。スペースを節約するために、最小プロモーターおよび／または最小ポリＡを選択することができる。典型的には、この実施形態では、各プロモーターはエンハンサー配列に（左側または右側（即ち５’または３’）のいずれかで）隣接して位置しており、ポリＡ配列はＩＴＲに隣接して位置しており、これらの間のＯＲＦが存在する。図１Ａは例証であり、ＯＲＦの順序を変更することができ、同様に、これらのＯＲＦによりコードされる免疫グロブリンド
メインを変更することができる。例えば、軽鎖の定常配列および可変配列はエンハンサーの左側に位置することができ、２種の重鎖を、エンハンサーに右側に位置するＯＲＦでコードすることができる。あるいは、重鎖の内の一方はエンハンサーの左側に位置することができ、エンハンサーの右側のＯＲＦが別の重鎖および軽鎖をコードする。あるいは、逆の配置も可能であり、エンハンサーの左側の発現カセットが２シストロン性であることができる。あるいは、コードされるドメインが何かに応じて、両方の発現カセットは１シストロン性であることができる（例えば２種のイムノアドヘシンをコードすることができる）、または両方とも２シストロン性であることができる（例えば２種の完全ＦＡＢをコードすることができる）。
【００３０】
別の実施形態では、ｒＡＡＶは、選択されたＡＡＶカプシド内にパッケージングされた、５’ＩＴＲと、第１の発現カセットと、双方向で機能するポリＡと、第２の発現カセットであって、双方向ポリＡが第１の発現カセットおよび第２の発現カセットの両方を分離しているおよびこれらに機能する、第２の発現カセットと、３’ＩＴＲとを含む核酸分子を有する。図１Ｂは、この実施形態の例として本明細書で提供される。この実施形態では、第１のエンハンサーおよび第１のプロモーター（即ちエンハンサー／プロモーターの組み合わせ）が５’ＩＴＲの右側に位置しており、続いて、ＯＲＦおよび双方向ポリＡが位置している。第２の発現カセットは双方向ポリＡにより第１の発現カセットから分離されており、逆方向で転写される。この発現カセットでは、エンハンサーおよびプロモーター（即ちプロモーター／エンハンサーの組み合わせ）が３’ＩＴＲに隣接して位置しており、ＯＲＦが双方向ポリＡに隣接している。図１Ｂは例証であり、ＯＲＦの順序を変更することができ、同様に、これらのＯＲＦによりコードされる免疫グロブリンドメインを変更することができる。例えば、軽鎖の定常配列および可変配列はポリＡの左側に位置することができ、２種の重鎖を、ポリＡに右側に位置するＯＲＦでコードすることができる。あるいは、重鎖の内の一方はポリＡの左側に位置することができ、ポリＡの右側のＯＲＦが別の重鎖および軽鎖をコードする。あるいは、逆の配置も可能であり、ポリＡの左側の発現カセットが２シストロン性であることができる。あるいは、コードされるドメインが何かに応じて、両方の発現カセットは１シストロン性であることができる（例えば２種のイムノアドヘシンをコードすることができる）、または両方とも２シストロン性であることができる。
【００３１】
任意選択で、図１Ａおよび図１Ｂに例示したならびに本明細書に記載した発現構成を使用して、その他の免疫グロブリン構築物を共発現することができる。例えば、２種のイムノアドヘシン（ＩＡ）を２種の１シストロン性発現カセットから発現させることができる。イムノアドヘシンは、Ｆｃドメイン（ＣＨ２−ＣＨ３）に融合した一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）単位（即ち、ＶＬに連結されたＶＨまたはＶＨに連結されたＶＬ）（例えばＶＨ−ＶＬ−ＣＨ２−ＣＨ３またはＶＬ−ＶＨ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む単一のオープンリーディングフレームとして発現されている抗体の形態を含む。あるいは、最大で４種のｓｃＦｖが２種の２シストロン性発現カセットから発現される可能性がある。別の代替では、ＩＡを完全長抗体と共発現させることができる。別の代替では、１種の完全ＦＡＢＳを完全長抗体と共発現させることができる、または２種の完全ＦＡＢを共発現させることができる。更に別の実施形態では、完全長抗体、ＩＡまたはＦＡＢ断片のその他の組み合わせを共発現させることができる。
【００３２】
適切な調節制御配列を選択することができ、様々な供給源から得ることができる。一実施形態では、最小プロモーターおよび／または最小ポリＡを利用してサイズを節約することができる。
【００３３】
本明細書で使用する場合、用語「最小プロモーター」は、調節エレメントが発現の制御用に付加されている、ＴＡＴＡボックスと転写開始の部位を特定するのに役立つその他の
配列とで構成されている短ＤＮＡ配列を意味する。一実施形態では、プロモーターは、コード配列または機能的ＲＮＡの発現の制御が可能である調節エレメントを有する最小プロモーターを含むヌクレオチド配列を意味する。このタイプのプロモーター配列は、近位の上流エレメントおよびより遠位の上流エレメントからなり、より遠位の上流エレメントはエンハンサーと称されることが多い。一実施形態では、最小プロモーターはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最小プロモーターである。別の実施形態では、最小プロモーターは、ｈＣＭＶ前初期プロモーター由来の最小プロモーター等のヒトＣＭＶ（ｈＣＭＶ）に由来する（米国特許出願第２０１４０１２７７４９号明細書ならびにＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，８９：５５４７−５５５１）を参照されたい。これらは参照により本明細書に援用される）。別の実施形態では、最小プロモーターはウイルス源に由来し、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターもしくは後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーターもしくはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）初期プロモーター；または真核細胞プロモーター、例えばベータアクチンプロモーター（Ｎｇ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１７：６０１−６１５，１９８９；Ｑｕｉｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：９５３９−９５４５，１９８９）、ＧＡＤＰＨプロモーター（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５０９２−５０９６，１９８８，Ｅｒｃｏｌａｎｉ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５３３５−１５３４１，１９８８）、ＴＫ−１（チミジンキナーゼ）プロモーター、ＨＳＰ（熱ショックタンパク質）プロモーター、ＵｂＢプロモーターもしくはＵｂＣプロモーター、ＰＧＫ、Ｅｆ１−アルファプロモーター、もしくはＴＡＴＡボックスを含むあらゆる真核プロモーター（米国特許出願公開第２０１４／００９４３９２号明細書）に由来する。別の実施形態では、最小プロモーターとして、米国特許出願公開第２０１４／００６５６６６号明細書に記載のＣＬＤＮ５ミニプロモーター等のミニプロモーターが挙げられる。別の実施形態では、最小プロモーターはチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターである。一実施形態では、最小プロモーターは組織特異的であり、例えば筋細胞特異的プロモーター最小ＴｎＩＳｌｏｗプロモーター、最小ＴｎＩＦａｓｔプロモーターまたは筋クレアチンキナーゼプロモーター（米国特許出願公開第２０１２／０２８２６９５号明細書）の内の１つである。これらの文献はそれぞれ参照により本明細書に援用される。
【００３４】
一実施形態では、ポリアデニル化（ポリ（Ａ））シグナルは最小ポリ（Ａ）シグナル（即ち、効率的なポリアデニル化に必要な最短配列）である。一実施形態では、最小ポリ（Ａ）は、Ｌｅｖｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１９８９  Ｊｕｌ，３（７）：１０１９−２５およびＸｉａ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２  Ｏｃｔ；２０（１０）：１００６−１０．Ｅｐｕｂ  ２００２  Ｓｅｐ  １６に記載されているもの等の合成ポリ（Ａ）である。別の実施形態では、ポリ（Ａ）はウサギベータ−グロブリンポリ（Ａ）に由来する。一実施形態では、ポリＡは双方向で作用する（Ａｎ  ｅｔ  ａｌ，２００６，ＰＮＡＳ，１０３（４９）：１８６６２−１８６６７。一実施形態では、ポリ（Ａ）はＳＶ４０初期ポリＡシグナル配列に由来する。これらの文献はそれぞれ参照により本明細書に援用される。
【００３５】
本明細書に記載したように、一実施形態では、単一のエンハンサー（即ち同じエンハンサー）がプラスミド構築物中で複数の異種遺伝子の転写を調節することができる。本発明での使用に適した様々なエンハンサーが当分野では既知であり、このエンハンサーとして、例えばＣＭＶ初期エンハンサー、Ｈｏｘｃ８エンハンサー、ｎＰＥ１およびｎＰＥ２が挙げられる。本明細書で有用な追加のエンハンサーがＡｎｄｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２０１４  Ｍａｒｃｈ，５０７（７４９３）：４５５−６１に記載されており、この文献は参照により本明細書に援用される。更にその他のエンハンサーエレメントとして、例えばアポリポタンパク質エンハンサー、ゼブラフィッシュエンハンサー、ＧＦＡＰエンハンサーエレメント、および国際公開第２０１３／１５５５２２２号パンフレ
ットに記載されているような組織特異的エンハンサー、ウッドチャック肝炎後転写後調節エレメントを挙げることができる。加えて、またはあるいは、その他の（例えば）ハイブリッドヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）−前初期（ＩＥ）−ＰＤＧＲプロモーターまたはその他のプロモーター−エンハンサーエレメントを選択することができる。発現を増強するために、その他のエレメントは（プロメガイントロンまたはキメラニワトリグロビン−ヒト免疫グロブリンイントロンのような）イントロンであることができる。本明細書で有用なその他のプロモーターおよびエンハンサーを、ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｍｏｔｅｒ．ｃｄｂ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／で見出されるＭａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｄａｔａｂａｓｅで見出すことができる。
【００３６】
本明細書に記載の構築物は、その他の発現制御配列または発現調節配列を更に含むことができ、これらの配列として、例えば適切な転写開始配列、終止配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシングシグナルおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を高める配列（即ちＫｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質安定性を高める配列；ならびに所望される場合には、コード産物の分泌を増強する配列が挙げられる。プロモーターを、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、細胞特異的プロモーター、生理的合図に応答するプロモーター、または調節可能なプロモーター［例えば、国際公開第２０１１／１２６８６８号パンフレットおよび国際公開第２０１３／０４９４９２号パンフレットを参照されたい］の中から選択することができる。
【００３７】
これらの制御配列は、免疫グロブリン構築物遺伝子配列に「作動可能に連結されている」。本明細書で使用する場合、用語「作動可能に連結されている」は、目的の遺伝子に隣接している発現制御配列および目的の遺伝子を制御するためにｉｎ  ｔｒａｎｓでまたは離れて作用する発現制御配列の両方を意味する。
【００３８】
抗体ドメインの発現の制御に適した構成的プロモーターの例として、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）またはその他の種由来のベータアクチンプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）の初期プロモーターおよび後期プロモーター、Ｕ６プロモーター、メタロチオネインプロモーター、ＥＦｌαプロモーター、ユビキチンプロモーター、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーター（Ｓｃｈａｒｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８８：４６２６−４６３０（１９９１）、アデノシンデアミナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ピルビン酸キナーゼプロモーターホスホグリセロールムターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター（Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１０００６−１００１０（１９８９）、ＵｂＢ、ＵｂＣ、モロニー白血病ウイルスおよびその他のレトロウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター、ならびに当業者に既知のその他の構成的プロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。本発明での使用に適した組織特異的プロモーターまたは細胞特異的プロモーターの例として、エンドセリン−Ｉ（ＥＴ−Ｉ）およびＦｌｔ−Ｉ（これらは内皮細胞に対して特異的である）、ＦｏｘＪ１（繊毛細胞を標的とする）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３９】
抗体ドメインの発現の制御に適した誘導性プロモーターとして、外因性因子（例えば薬剤）または生理的合図に応答するプロモーターが挙げられる。これらの応答エレメントとして、ＨＩＦ−ＩαおよびＨＩＦ−Ｉβに結合する低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）、Ｍａｙｏら（１９８２，Ｃｅｌｌ  ２９：９９−１０８）、Ｂｒｉｎｓｔｅｒら（１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）およびＳｅａｒｌｅら（１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１４８０−１４８９）により説明されているような金属イオン応答
エレメント、または（Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ｅｄ．Ｎｏｕｅｒ，Ｌ．，ＣＲＣ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，ｐｐＩ６７−２２０，１９９１で）Ｎｏｕｅｒらにより説明されているような熱ショック応答エレメントが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４０】
一実施形態では、オープンリーディングフレームの発現は、ＯＲＦ（遺伝子）の転写中に厳密な制御を提供する調節可能なプロモーターにより、例えば薬剤により、または薬剤により活性化される転写因子により、または代替実施形態では生理的合図により制御される。使用することができるリガンド依存性転写因子複合体である調節可能なプロモーターの例として、各リガンド（例えば、グルココルチコイド、エストロゲン、プロゲスチン、レチノイド、エクジソンおよびこれらの類似物および模倣物）により活性化される核内受容体スーパーファミリーのメンバー、ならびにテトラサイクリンにより活性化されるｒＴＴＡが挙げられるがこれらに限定されない。そのようなシステムの例として、ＡＲＧＥＮＴ（商標）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＡＲＩＡＤ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ）が挙げられるがこれに限定されない。そのようなプロモーターシステムの例が例えば国際公開第２０１２／１４５５７２号パンフレットに記載されており、このパンフレットは参照により本明細書に援用される。
【００４１】
更にその他のプロモーターとして、例えばヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０初期エンハンサー／プロモーター、ＪＣポリオーマウイルス（ｐｏｌｙｍｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーターまたはグリア繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）潜伏関連プロモーター（ＬＡＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ニューロン特異的プロモーター（ＮＳＥ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）プロモーター、ｈＳＹＮ、メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）プロモーター、ＣＢＡ、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、マトリックスメタロタンパク質プロモーター（ＭＰＰ）、およびニワトリベータ−アクチンプロモーターを挙げることができる。各発現カセットに関して、プロモーターは同じでもよいし異なっていてもよい。
【００４２】
ＡＡＶウイルスベクター（例えば組み換え（ｒ）ＡＡＶ）の生成で使用するために、発現カセットを任意の適切なベクター（例えばプラスミド）上に保持させることができ、このベクターをパッケージング宿主細胞に送達させる。本発明で有用なプラスミドを、原核細胞中での、哺乳類細胞中でのまたは両方中での複製およびパッケージングに適しているように操作することができる。適切なトランスフェクション技法およびパッケージング宿主細胞は当業者に既知である、および／または当業者により容易に設計され得る。
【００４３】
ベクターとしての使用に適したＡＡＶを生成する方法および単離する方法は当分野で既知である。一般に、例えばＧｒｉｅｇｅｒ  ＆  Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５，“Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ａｓ  ａ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９−１４５、Ｂｕｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，“Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．１０：７１７−７３３および下記で引用する参考文献を参照されたい。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される。トランス遺伝子のビリオン中へのパッケージングには、ＩＴＲが、発現カセットを含む核酸分子と同じ構築物中においてｉｎ  ｃｉｓで必要な唯一のＡＡＶ成分である。ｃａｐ遺伝子およびｒｅｐ遺伝子をｉｎ  ｔｒａｎｓ
で供給することができる。
【００４４】
上記に記載したように、用語「約」は数値を修飾するために使用する場合、別途指定されない限り±１０％の変動を意味する。
【００４５】
本明細書および特許請求の範囲の全体を通して使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」ならびにその他の変化形の中でも「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」等の変化形は、その他の成分、構成要素、整数、工程等を包含する。用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、その他の成分、構成要素、整数、工程等を除外する。
【００４６】
２種以上の核酸またはポリペプチド配列との関連における用語「同一」または割合「同一性」は、下記に記載のデフォルトパラメータを有するＢＬＡＳＴ配列比較アルゴリズムもしくはＢＬＡＳＴ  ２．０配列比較アルゴリズムを使用して測定した場合に、または手動によるアラインメントおよび目視検査（例えばＮＣＢＩウェブサイト等を参照されたい）により、同じである２種以上の配列もしくは部分配列を意味する、または同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチドが特定の割合である（即ち、比較ウィンドウもしくは指定領域の全体にわたり一致が最大になるように比較して整列させた場合に、特定の領域（例えば、本明細書に記載の改変ＯＲＦの内のいずれか１つ）全体にわたる約７０％の同一性を有し、好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはより高い同一性を有する）２種以上の配列もしくは部分配列を意味する。別の例の場合、Ｆａｓｔａ（ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１のプログラム）を使用してポリヌクレオチド配列を比較することができる。Ｆａｓｔａは、アラインメントと、問い合わせの配列および検索配列の間の重複が最高の領域の配列同一性の割合とを提供する。例えば、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１で提供される場合に、デフォルトパラメータ（ワードサイズ６およびスコアリングマトリックスに関するＮＯＰＡＭ係数（ＮＯＰＡＭ  ｆａｃｔｏｒ））を有するＦａｓｔａを使用して、核酸配列間の配列同一性の割合を決定することができ、参照により本明細書に援用される。一般に、当業者は必要に応じてデフォルト設定を変更することができるが、これらのプログラムはデフォルト設定で使用される。あるいは、当業者は、参照したアルゴリズムおよびプログラムにより提供される同一性またはアラインメントのレベルと少なくとも同程度の同一性またはアラインメントのレベルを提供する別のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムを利用することができる。この定義はまた、配列への賛辞も意味する、またはこの定義を配列への賛辞に適用することもできる。この定義はまた、欠失および／または付加を有する配列ならびに置換を有する配列も含む。下記に記載するように、好ましいアルゴリズムはギャップ等を考慮することができる。好ましくは、少なくとも約２５個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個のアミノ酸またはヌクレオチドの長さである領域全体にわたり同一性が存在し、２２５個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個のアミノ酸もしくはヌクレオチドの長さである領域全体にわたりまたは完全長のアミノ酸配列もしくは核酸配列の全体にわたり同一性が存在することが多い。
【００４７】
典型的には、アミノ酸配列に基づいてアラインメントが作成される場合、このアラインメントは、参照ＡＡＶ配列に対してそのように特定される挿入および欠失を含み、アミノ酸残基のナンバリングは、アラインメントに提供された参照スケールに基づく。しかしながら、任意の所与のＡＡＶ配列は、参照スケールと比べて少ないアミノ酸残基を有する場合がある。本発明では、親配列を論じる場合、用語「同じ位置」または「対応する位置」は、整列させた配列の参照スケールに対して、各配列中における同じ残基番号に位置するアミノ酸を意味する。しかしながら、アラインメントから外される場合、各タンパク質は
、異なる残基番号に位置するこれらのアミノ酸を有することができる。様々な公的にまたは商業的に利用可能な多重配列アラインメントプログラムの内のいずれかを使用してアラインメントが実施される。「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ」プログラム、「ＭＡＰ」プログラム、「ＰＩＭＡ」プログラム、「ＭＳＡ」プログラム、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」プログラム、「ＭＥＭＥ」プログラムおよび「Ｍａｔｃｈ−Ｂｏｘ」プログラム等の配列アラインメントプログラムがアミノ酸配列に利用可能である。一般に、当業者は必要に応じてデフォルト設定を変更することができるが、これらのプログラムはいずれもデフォルト設定で使用される。あるいは、当業者は、参照したアルゴリズムおよびプログラムにより提供される同一性またはアラインメントのレベルと少なくとも同程度の同一性またはアラインメントのレベルを提供する別のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムを利用することができる。例えばＪ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２−２６９０（１９９９）を参照されたい。
【００４８】
一実施形態では、本明細書に記載の発現カセットを操作して、保持している免疫グロブリン構築物配列をウイルスベクター生成用のパッケージング宿主細胞中に運ぶ遺伝子エレメント（例えばシャトルプラスミド）にする。一実施形態では、トランスフェクション、電気穿孔、リポソーム送達、膜融合技法、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染および原形質融合等の任意の適切な方法により、選択された遺伝子エレメントをＡＡＶパッケージング細胞に送達することができる。安定したＡＡＶパッケージング細胞も作ることができる。あるいは、発現カセットを使用して、ＡＡＶ以外のウイルスベクターを生成することができる、または、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗体の混合物を生成することができる。そのような構築物を作るために使用される方法は核酸操作の当業者に既知であり、この方法として、遺伝子操作、組み換え操作および合成技法が挙げられる。例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。
【００４９】
ＡＡＶベクター
組み換えＡＡＶベクター（ＡＡＶウイルス粒子）は、ＡＡＶカプシド内にパッケージングされた、５’ＡＡＶ  ＩＴＲ、本明細書に記載の発現カセットおよび３’ＡＡＶ  ＩＴＲを含む核酸分子を含むことができる。本明細書に記載したように、発現カセットは、各発現カセット内のオープンリーディングフレーム用の調節エレメントを含むことができ、核酸分子は、追加の調節エレメントを任意選択で含むことができる。
【００５０】
ＡＡＶベクターは、完全長ＡＡＶ５’逆位末端反復（ＩＴＲ）および完全長３’ＩＴＲを含むことができる。Ｄ−配列および末端分解部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）（ｔｒｓ）が欠失している５’ＩＴＲの短縮バージョン（ΔＩＴＲと命名される）が説明されている。略語「ｓｃ」は自己相補的を意味する。「自己相補的ＡＡＶ」は、組み換えＡＡＶ核酸配列により保持されるコード領域が分子内二本鎖ＤＮＡテンプレートを形成するように設計されている構築物を意味する。感染すると、２番目の鎖の細胞媒介性合成を待つことなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補的な半分が会合して、即時の複製および転写の準備ができている１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成することができる。例えばＤ  Ｍ  ＭｃＣａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ，“Ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ  ２００１），Ｖｏｌ  ８，Ｎｕｍｂｅｒ  １６，Ｐａｇｅｓ  １２４８−１２５４を参照されたい。自己相補的ＡＡＶが、例えば米国
特許第６，５９６，５３５号明細書、米国特許第７，１２５，７１７号明細書および米国特許第７，４５６，６８３号明細書に記載されており、これらの明細書はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００５１】
偽型ＡＡＶを生成すべき場合、ＩＴＲは、カプシドのＡＡＶ源とは異なる供給源から選択される。例えば、選択された細胞受容体、標的組織またはウイルス標的に対して特定の効率を有するＡＡＶカプシドと共に使用するために、ＡＡＶ２  ＩＴＲを選択することができる。一実施形態では、便宜上、および規制当局による承認を速めるために、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列またはこの欠失バージョン（ΔＩＴＲ）が使用される。しかしながら、その他のＡＡＶ源由来のＩＴＲを選択することができる。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２由来であり、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ源由来である場合、得られるベクターを偽型と命名することができる。しかしながら、ＡＡＶ  ＩＴＲのその他の供給源を利用することができる。
【００５２】
様々なＡＡＶカプシドが説明されている。ＡＡＶベクターを生成する方法が、例えば国際公開第２００３／０４２３９７号パンフレット、国際公開第２００５／０３３３２１号パンフレット、国際公開第２００６／１１０６８９号パンフレット、米国特許第７５８８７７２Ｂ２号明細書等の文献および特許文献に広く記載されている。ＡＡＶカプシドの供給源を、所望の組織を標的とするＡＡＶから選択することができる。例えば、適切なＡＡＶとして、例えばＡＡＶ９［米国特許第７，９０６，１１１号明細書、米国特許出願公開第２０１１−０２３６３５３−Ａ１号明細書］、ｒｈ１０［国際公開第２００３／０４２３９７号パンフレット］および／またはｈｕ３７［例えば米国特許第７，９０６，１１１号明細書、米国特許出願公開第２０１１−０２３６３５３−Ａ１号明細書を参照されたい］を挙げることができる。しかしながら、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、［米国特許第７７９０４４９号明細書、米国特許第７２８２１９９号明細書］等のその他のＡＡＶ。しかしながら、その他の免疫グロブリン構築物およびその他のベクターエレメントであり得る場合には、ＡＡＶカプシドおよびその他のウイルスエレメントのその他の供給源を選択することができる。
【００５３】
一本鎖ＡＡＶウイルスベクターが提供される。対象への送達に適したＡＡＶウイルスベクターを生成する方法および単離する方法は当分野で既知である。例えば、米国特許第７７９０４４９号明細書、米国特許第７２８２１９９号明細書、国際公開第２００３／０４２３９７号パンフレット、国際公開第２００５／０３３３２１号パンフレット、国際公開第２００６／１１０６８９号パンフレットおよび米国特許第７５８８７７２Ｂ２号明細書］を参照されたい。ある種のシステムでは、産生細胞株を、ＩＴＲで挟まれたトランス遺伝子をコードする構築物とｒｅｐおよびｃａｐをコードする構築物とで過渡的にトランスフェクトする。別のシステムでは、ｒｅｐおよびｃａｐを安定的に供給するパッケージング細胞株を、ＩＴＲで挟まれたトランス遺伝子をコードする構築物で過渡的にトランスフェクトする。これらのシステムそれぞれでは、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスの感染に応じてＡＡＶウイルスが産生され、夾雑ウイルスからのｒＡＡＶの分離が必要である。より近年では、ＡＡＶの回収にヘルパーウイルスの感染を必要としないシステムが開発されており、このシステムにより、必要なヘルパー機能（即ち、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡおよびＥ４またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２およびＵＬ２９およびヘルペスウイルスポリメラーゼ）もｉｎ  ｔｒａｎｓで供給される。このより新規のシステムでは、必要なヘルパー機能をコードする構築物による細胞の過渡的なトランスフェクションにより、ヘルパー機能を供給することができる、またはこの細胞を、ヘルパー機能をコードする遺伝子（この遺伝子の発現は転写レベルまたは転写後レベルで制御され得る）を安定的に含むように操作することができる。更に別のシステムでは、ＩＴＲで挟まれたトランス遺伝子およびｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子が、バキュロウイルスベースのベクターの感染により昆虫細胞中に導入される。これらの産生システムの概説に関
して、例えばＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，”Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０：９２２−９２９を概して参照されたい。この文献の内容はその全体が参照により本明細書に援用される。これらのおよびその他のＡＡＶ産生システムを作る方法および使用する方法も下記の米国特許に記載されており、これらの特許の内容はその全体が参照により本明細書に援用される：米国特許第５，１３９，９４１号明細書、米国特許第５，７４１，６８３号明細書、米国特許第６，０５７，１５２号明細書、米国特許第６，２０４，０５９号明細書、米国特許第６，２６８，２１３号明細書、米国特許第６，４９１，９０７号明細書、米国特許第６，６６０，５１４号明細書、米国特許第６，９５１，７５３号明細書、米国特許第７，０９４，６０４号明細書、米国特許第７，１７２，８９３号明細書、米国特許第７，２０１，８９８号明細書、米国特許第７，２２９，８２３号明細書および米国特許第７，４３９，０６５号明細書。
【００５４】
使用およびレジメン
ｒＡＡＶ（好ましくは、生理的に適合する担体中に懸濁されている）を、ヒト患者または非ヒト哺乳類患者に投与することができる。当業者は、導入用ウイルスが導かれる適応症を考慮して、適切な担体を容易に選択することができる。例えば、ある適切な担体として生理食塩水が挙げられ、この生理食塩水は、様々な緩衝溶液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）と共に製剤化され得る。その他の代表的な担体として、無菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、マルトースおよび水が挙げられる。担体を選択することで本発明は制限されない。任意選択で、本発明の組成物は、ｒＡＡＶおよび担体に加えて、その他の従来の医薬成分、例えば防腐剤または化学安定剤を含むことができる。
【００５５】
例えば受動免疫化のために、このｒＡＡＶを使用する方法が、例えば国際公開第２０１２／１４５５７２号パンフレットに記載されている。送達および使用のその他の方法は当業者に明らかであるだろう。例えば、本明細書に記載のレジメンは、本明細書に記載の組み合わせの内の１つまたは複数に加えて、生物学的製剤、小分子薬剤、化学療法剤、免疫エンハンサー、放射線照射、外科手術等の内の１つまたは複数との更なる組み合わせを含むことができる。本明細書に記載の生物学的製剤は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、核酸分子、ベクター（ウイルスベクターを含む）等をベースとする。
【００５６】
併用療法では、本明細書に記載の、ＡＡＶにより送達される免疫グロブリン構築物を、別の薬剤による治療の施行の前に、最中にまたは後におよびこれらの任意の組み合わせで（即ち、治療の施行の前におよび最中に、前におよび後に、最中におよび後に、または前に、最中におよび後に）投与する。例えば、放射線治療の施行の１〜３０日前に、好ましくは３〜２０日前に、より好ましくは５〜１２日前に、ＡＡＶを投与することができる。本発明の別の実施形態では、ＡＡＶ媒介性免疫グロブリン（抗体）療法と同時に、またはより好ましくはこの療法の後に、化学療法が投与される。更にその他の実施形態では、本発明の組成物を、その他の生物製剤（例えば、組み換えモノクローナル抗体剤、抗体−薬剤複合体等）と併用することができる。更に、上記で論じたような様々なＡＡＶにより送達される免疫グロブリン構築物の組み合わせを、そのようなレジメンで使用することができる。
【００５７】
あらゆる適切な方法または経路を使用して、本明細書に記載したＡＡＶ含有組成物を投与することができる、および任意選択で、その他の活性薬剤または療法を本明細書に記載のＡＡＶ媒介性抗体と共に同時投与することができる。投与経路として、例えば、全身投与、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与または筋肉内投与が挙げられる。
【００５８】
本明細書に記載の免疫グロブリン構築物用の標的を、様々な病原体（例えば、細菌、ウイルス、真菌および寄生性感染病原体等）から選択することができる。適切な標的として、がんまたはがん関連抗原等を更に挙げることができる。更にその他の標的として、関節リウマチ（ＲＡ）または多発性硬化症（ＭＳ）等の自己免疫状態を挙げることができる。
【００５９】
ウイルス標的の例として、オルトミクソウイルス科からのインフルエンザウイルスが挙げられ、このインフルエンザウイルスとして、インフルエンザＡ、インフルエンザＢおよびインフルエンザＣが挙げられる。Ａ型ウイルスは、最も病原性が強いヒト病原体である。パンデミックに関連しているインフルエンザＡの血清型として、Ｈ１Ｎ１（１９１８年にスペイン風邪を引き起こし、２００９年にブタインフルエンザを引き起こした）、Ｈ２Ｎ２（１９５７年にアジア風邪を引き起こした）、Ｈ３Ｎ２（１９６８年にホンコン風邪を引き起こした）、Ｈ５Ｎ１（２００４年に鳥インフルエンザを引き起こした）、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３およびＨ１０Ｎ７が挙げられる。
【００６０】
インフルエンザＡに対する広域中和抗体が説明されている。本明細書で使用する場合、「広域中和抗体」は、複数種の血清型からの複数種の株を中和することができる中和抗体を意味する。例えば、ＣＲ６２６１［Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／Ｃｒｕｃｅｌｌ］は、１９１８年の「スペイン風邪」（ＳＣ１９１８／Ｈ１）等の広範囲のインフルエンザウイルスと、２００４年にベトナムでニワトリからヒトへと飛び移った鳥インフルエンザのＨ５Ｎ１クラスのウイルス（Ｖｉｅｔ０４／Ｈ５）とに結合するモノクローナル抗体として説明されている。ＣＲ６２６１は、インフルエンザウイルスの表面上の主要なタンパク質である赤血球凝集素の膜近位ステム中において高度に保存された螺旋領域を認識する。この抗体は国際公開第２０１０／１３０６３６号パンフレットに記載されており、参照により本明細書に援用される。別の中和抗体Ｆ１０［ＸＯＭＡ  Ｌｔｄ］が、Ｈ１Ｎ１およびＨ５Ｎ１に対して有用であると説明されている。［Ｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｉ，ｅｔ  ａｌ．２００９，１６（３）：２６５−７３）］インフルエンザに対するその他の抗体、例えばＦａｂ２８およびＦａｂ４９を選択することができる。例えば国際公開第２０１０／１４０１１４号パンフレットおよび国際公開第２００９／１１５９７２号パンフレットを参照されたい。これらのパンフレットは参照により援用される。国際公開第２０１０／０１０４６６号パンフレット、米国特許出願公開第２０１１／０７６２６５号明細書および国際公開第２００８／１５６７６３号パンフレットに記載されているもの等の更にその他の抗体を容易に選択することができる。
【００６１】
その他の標的病原性ウイルスとして、アレナウイルス（フニン（ｆｕｎｉｎ）、マチュポおよびラッサ等）、フィロウイルス（マールブルグおよびエボラ等）、ハンタウイルス、ピコルナウイルス（ｐｉｃｏｒｎｏｖｉｒｉｄａｅ）（ライノウイルス、エコーウイルス等）、コロナウイルス、パラミクソウイルス、モルビリウイルス、呼吸器合抱体ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、トガウイルス、コクサッキーウイルス、パルボウイルスＢ１９、パラインフルエンザ、アデノウイルス、レオウイルス、ポックスウイルス科からの痘瘡（大痘瘡（天然痘））およびワクシニア（牛痘）、ならびに水痘帯状疱疹（仮性狂犬病）が挙げられる。
【００６２】
ウイルス性出血熱は、アレナウイルス科のメンバー（ラッサ熱）（この科はリンパ性脈絡髄膜炎（ＬＣＭ）にも関連する）、フィロウイルス（エボラウイルス）およびハンタウイルス（プレマラ（ｐｕｒｅｍａｌａ））により引き起こされる。ピコルナウイルス（ライノウイルスの亜科）のメンバーはヒトでの感冒と関連する。コロナウイルス科は、伝染性気管支炎ウイルス（家禽類）、ブタ伝染性ガストロエンテリティスウイルス（ブタ）、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（ブタ）、猫伝染性腹膜炎ウイルス（ネコ）、猫腸コロナウイルス（ネコ）、イヌコロナウイルス（イヌ）等の多くの非ヒトウイルスを含む。ヒ
ト呼吸器コロナウイルスは、感冒、非Ａ型肝炎、非Ｂ型肝炎または非Ｃ型肝炎および突発性急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）と推定的に関連している。パラミクソウイルス科は、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス３型、ウシパラインフルエンザウイルス３型、ルブラウイルス（ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス４型、ニューカッスル病ウイルス（ニワトリ）、牛疫、モルビリウイルス（麻疹および犬ジステンパーを含む）、ならびにニューモウイルス（呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）を含む）を含む。パルボウイルス科は、猫パルボウイルス（猫腸炎）、猫汎血球減少症ウイルス、イヌパルボウイルスおよびブタパルボウイルスを含む。アデノウイルス科は、呼吸器疾患を引き起こすウイルス（ＥＸ、Ａｄ７、ＡＲＤ、Ｏ．Ｂ．）を含む。
【００６３】
細菌性病原体に対する中和抗体構築物を本発明で使用するために選択することもできる。一実施形態では、この中和抗体構築物は細菌自体を対象とする。別の実施形態では、この中和抗体構築物は、細菌により産生された毒素を対象とする。空中細菌性病原体の例として、例えばナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（髄膜炎）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）（肺炎）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（肺炎）、シュードモナス・シュードマレイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）（肺炎）、シュードモナス・マレイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｌｅｉ）（肺炎）、アシネトバクター（肺炎）、モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、モラクセラ・ラクナータ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｌａｃｕｎａｔａ）、アルカリゲネス（Ａｌｋａｌｉｇｅｎｅｓ）、カルジオバクテリウム（Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（インフルエンザ）、ヘモフィルス・パラインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ボルデテラ・パータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）（百日咳）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（肺炎／発熱）、レジオネラ・ニューモニエ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）（レジオネラ病）、クラミジア・シタッシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）（肺炎）、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（肺炎）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（結核（ＴＢ））、マイコバクテリウム・カンサシ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ）（ＴＢ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）（肺炎）、ノカルジア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ
ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）（肺炎）、バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（肺炎）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（猩紅熱）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（肺炎）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）（ジフテリア）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（肺炎）が挙げられる。
【００６４】
炭疽の原因因子は、バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｉｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）により産生された毒素である。防御因子（ＰＡ）（毒素を形成する３種のペプチドの内の１つ）に対する中和抗体が説明されている。その他の２種のポリペプチドは、致死因子（ＬＦ）および浮腫因子（ＥＦ）からなる。抗ＰＡ中和抗体は炭疽に対する受動免疫化で効果的であると説明されている。例えば米国特許第７，４４２，３７３号明細書、Ｒ．Ｓａｗａｄａ−Ｈｉｒａｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｔｈｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２００４；２：５．（２００４年５月１２日にオンライン）を参照され
たい。更にその他の抗炭疽毒素中和抗体が説明されている、および／または生成され得る。同様に、その他の細菌および／または細菌毒素の対する中和抗体を使用して、本明細書に記載のＡＡＶにより送達される抗病原体構築物を生成することができる。
【００６５】
その他の感染性疾患は空中真菌により引き起こされる可能性があり、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、アブシジア・コリムビフェラ（Ａｂｓｉｄｉａ  ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）、リゾプス・ストロニファー（Ｒｈｉｘｐｕｓ  ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ）、ムコール・プランベウス（Ｍｕｃｏｒ  ｐｌｕｍｂｅａｕｓ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種、ミクロポリスポラ・フェニ（Ｍｉｃｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｆａｅｎｉ）、テルモアクチノミセス・ブルガリス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、アルテルナリア・アルテルネート（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔｅ）、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、ヘルミントスポリウム（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）およびスタキボトリス（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ）種により引き起こされる可能性がある。
【００６６】
加えて、受動免疫化を使用して、真菌感染（例えば水虫）、白癬またはウイルス、細菌、寄生虫、真菌および直接的接触により伝染され得るその他の病原体を防ぐことができる。加えて、ペット、ウシおよびその他の家畜ならびにその他の動物に影響を及ぼす様々な条件。例えば、イヌでは、イヌ副鼻腔アスペルギルスによる上気道の感染により、重篤な疾患が引き起こされる。ネコでは、上気道疾患または鼻部で起こるネコ呼吸器病症候群は、処置ないまま放置すると病的状態および大量死を引き起こす。ウシは、ウシ感染性鼻気管炎（一般にＩＢＲまたは赤い鼻と呼ばれており、ウシの急性伝染性ウイルス疾患である）に感染しやすい。加えて、ウシは、軽症から重症の呼吸器系疾患を引き起こし、その他の疾患に対する耐性を弱める可能性があるウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）が生じやすい。更にその他の病原体および疾患は当業者に明らかであるだろう。例えば米国特許第５，８１１，５２４号明細書（抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）中和抗体の生成が説明されている）を参照されたい。本明細書に記載の技法はその他の病原体に適用可能である。そのような抗体を、インタクトなまたは人工的なもしくは組み換えの中和抗体構築物を生成するために改変されている配列（足場）で使用することができる。そのような方法が説明されている［例えば国際公開第２０１０／１３０３６号パンフレット、国際公開第２００９／１１５９７２号パンフレット、国際公開第２０１０／１４０１１４号パンフレットを参照されたい］。
【００６７】
本明細書に記載の抗腫瘍性免疫グロブリンは、ヒト上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ）（例えばＨＥＲ２）を標的とすることができる。例えば、トラスツズマブは、ヒト上皮増殖因子受容体タンパク質の細胞外ドメインに対して細胞ベースのアッセイ（Ｋｄ＝５ｎＭ）において高親和性で選択的に結合するヒト化モノクローナル抗体である組み換えＩｇＧ１カッパである。市販の製品はＣＨＯ細胞培養で産生される。例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ０００７２を参照されたい。このデータベースでは、受託番号ＤＢ０００７２で、トラスツズマブの軽鎖１および軽鎖２ならびに重鎖１および重鎖２のアミノ酸配列、ならびにトラスツズマブのｘ線構造の研究から得られた配列が提供され、これらの配列は参照により本明細書に援用される。２１２−Ｐｂ−ＴＣＭＣ−トラスツズマブ［Ａｒｅｖａ  Ｍｅｄ、メリーランド州、Ｂｅｔｈｅｓｄａ］も参照されたい。目的の別の抗体として、例えば、ヒト上皮増殖因子受容体２型タンパク質（ＨＥＲ２）の細胞外二量体化ドメイン（サブドメインＩＩ）を標的とする組み換えヒト化モノクローナル抗体であるペルツズマブが挙げられる。ペルツズマブは、それぞれ４４８
個の残基および２１４個の残基を有する２本の重鎖および２本の軽鎖からなる。ＦＤＡは２０１２年６月８日に認可した。ペルツズマブの重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、例えば、ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ０６３６６のデータベースにて受託番号ＤＢ０６３６６で提供される（同義語として２Ｃ４、ＭＯＡＢ  ２Ｃ４、モノクローナル抗体２Ｃ４およびｒｈｕＭＡｂ−２Ｃ４が挙げられる）。ＨＥＲ２に加えて、その他のＨＥＲ標的を選択することができる。
【００６８】
例えば、ＭＭ−１２１／ＳＡＲ２５６２１２は、ＨＥＲ３受容体［Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ’ｓ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｂｉｏｌｏｇｙ］を標的とするならびに非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がんおよび卵巣がんの処置で有用であることが報告されている完全ヒトモノクローナル抗体である。ＳＡＲ２５６２１２は、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）受容体［Ｓａｎｏｆｉ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ］を標的とする、治験中の完全ヒトモノクローナル抗体である。別の抗Ｈｅｒ３／ＥＧＦＲ抗体はＲＧ７５９７［Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ］であり、頭頸部がんで有用であると説明されている。ＨＥＲ［ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ］を標的とする次世代のＦｃ最適化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である別の抗体マーゲツキジマブ（ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ）（またはＭＧＡＨ２２）も利用することができる。
【００６９】
あるいは、その他のヒト上皮細胞表面マーカーおよび／またはその他の腫瘍受容体もしくは抗原を標的とすることができる。その他の細胞表面マーカー標的の例として、例えば、５Ｔ４、ＣＡ−１２５、ＣＥＡ（例えばラベツズマブの標的である）、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０（例えばリツキシマブの標的である）、ＣＤ２２（例えばエプラツズマブまたはベルツズマブの標的である）、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５１（またはインテグリンαvβ3）、ＣＤ１３３（例えば膠芽腫細胞）、ＣＴＬＡ−４（例えば、例えば神経芽細胞腫の処置で使用されるイピリムマブ）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体２型（ＣＸＣＲ２）（脳中の様々な領域で発現される）；例えば抗ＣＸＣＲ２（細胞外）抗体＃ＡＣＲ−０１２（Ａｌｏｍｅｎｅ  Ｌａｂｓ））；ＥｐＣＡＭ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）［例えば国際公開第２０１２０２０００６Ａ２号パンフレットを参照されたい、脳がん］、葉酸受容体アルファ（例えば小児上衣脳腫瘍、頭頸部がん）、線維芽細胞増殖因子受容体１型（ＦＧＦＲ１）（抗ＦＧＦＲ１抗体によるがんの処置の議論に関して例えば国際公開第２０１２１２５１２４Ａ１号パンフレットを参照されたい）、ＦＧＦＲ２（例えば国際公開第２０１３０７６１８６Ａ号パンフレットおよび国際公開第２０１１１４３３１８Ａ２号パンフレットに記載の抗体を参照されたい）、ＦＧＦＲ３（例えば米国特許第８１８７６０１号明細書および国際公開第２０１０１１１３６７Ａ１号パンフレットに記載の抗体を参照されたい）、ＦＧＦＲ４（例えば国際公開第２０１２１３８９７５Ａ１号パンフレットに記載の抗ＦＧＦＲ４抗体を参照されたい）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（例えば、国際公開第２０１０１１９９９１Ａ３号パンフレット中の抗体を参照されたい）、インテグリンα5β1、ＩＧＦ−１受容体、ガングリオシドＧＤ２（例えば国際公開第２０１１１６０１１９Ａ２号パンフレットに記載の抗体を参照されたい）、ガングリオシドＧＤ３、膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ（ＧＰＮＭＢ）（グリオーマ等と関連する、および抗体グレムバツムマブ（ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ）（ＣＲ０１１）の標的、ムチン、ＭＵＣ１、ホスファチジルセリン（例えばバビツキシマブの標的である、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ］、前立腺癌細胞、ＰＤ−Ｌ１（例えば、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ−１１０６、ＯＮＯ−４５３８）、完全ヒトｇＧ４、例えば転移性黒色腫］、血小板由来増殖因子受容体、アルファ（ＰＤＧＦＲα）またはＣＤ１４０、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ−７２）、テネイシンＣ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）−Ａ（例えばベバシズマブの標的である）ならびにＶＥＧＦＲ２（例えばラムシルマブの標的である）が挙げられる。
【００７０】
その他の抗体およびこの標的として、例えば、モノクローナル抗体であるＡＰＮ３０１
（ｈｕ１４．１９−ＩＬ２）［ニワトリの悪性黒色腫および神経芽細胞腫、Ａｐｅｉｒｏｎ  Ｂｉｏｌｇｉｃｓ、オーストリア、Ｖｉｅｎｎａ］が挙げられる。例えば、転移性脳がん等の固形腫瘍の処置で有用であると説明されているモノクローナル抗体８Ｈ９も参照されたい。モノクローナル抗体８Ｈ９は、Ｂ７Ｈ３抗原に対して特異性を有するマウスＩｇＧ１抗体である［Ｕｎｉｔｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ］。このマウス抗体をヒト化することができる。Ｂ７−Ｈ３および／またはＢ７−Ｈ４抗原を標的とする更にその他の免疫グロブリン構築物を本発明で使用することができる。別の抗体はＳ５８（抗ＧＤ２、神経芽細胞腫）である。Ｃｏｔａｒａ（商標）［Ｐｅｒｒｅｇｒｉｎｃｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ］は、再発性神経膠芽腫の処置用と説明されているモノクローナル抗体である。その他の抗体として、例えばアバスチン、フィクラツズマブ、ｍｅｄｉ−５７５およびオララツマブを挙げることができる。更にその他の免疫グロブリン構築物またはモノクローナル抗体を、本発明で使用するために選択することができる。例えばＭｅｄｉｃｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，２０１３  Ｒｅｐｏｒｔ，ｐｐ．１−８７，ａ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ
ＰｈＲＭＡ’ｓ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ＆  Ｐｕｂｌｉｃ  Ａｆｆａｉｒｓ
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ．（２０２）８３５−３４６０を参照されたい。この文献は参照により本明細書に援用される。
【００７１】
例えば、免疫源を様々なウイルス科から選択することができる。免疫応答が望ましいであろうウイルス科の例として、ピコルナウイルス科（ライノウイルス属を含み、感冒の症例の約５０％を占める）；ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルスおよびＡ型肝炎ウイルス等のヒトエンテロウイルスを含むエンテロウイルス属；ならびに主に非ヒト動物で口蹄疫の原因であるアフトウイルス属が挙げられる。ピコルナウイルス科のウイルスでは、標的抗原としてＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４およびＶＰＧが挙げられる。別のウイルス科として、カリシウイルス科（Ｎｏｒｗａｌｋ群のウイルスを包含し、流行性胃腸炎の重要な原因因子である）が挙げられる。ヒトおよび非ヒト動物で免疫応答を誘発するための抗原の標的化での使用に望ましい更に別のウイルス科としてトガウイルス科か挙げられ、このトガウイルス科はアルファウイルス属を含み、このアルファウイルス属は、シンドビスウイルス、ロスリバーウイルスならびにベネズエラ東部および西部のウマ脳炎、ならびに風疹ウイルス等のルビウイルスを含む。フラビウイルス科は、デング熱ウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルスおよびダニ媒介脳炎ウイルスを含む。その他の標的抗原を、Ｃ型肝炎またはコロナウイルス科から生成することができ、このコロナウイルス科は、多数の非ヒトウイルス、例えば伝染性気管支炎ウイルス（家禽）、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ブタ）、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（ブタ）、猫伝染性腹膜炎ウイルス（ネコ）、猫腸コロナウイルス（ネコ）、イヌコロナウイルス（イヌ）、ならびにヒト呼吸器コロナウイルス（感冒および／または非Ａ型肝炎、非Ｂ型肝炎もしくは非Ｃ型肝炎を引き起こす可能性がある）を含む。コロナウイルス科では、標的抗原として、Ｅ１（Ｍもしくはマトリックスタンパク質とも呼ばれる）糖タンパク質、Ｅ２（Ｓもしくはスパイクタンパク質とも呼ばれる）糖タンパク質、Ｅ３（ＨＥもしくはヘマグルチン−エルテロースとも呼ばれる）糖タンパク質（全てのコロナウイルスで存在するわけではい）またはＮ（ヌクレオカプシド）が挙げられる。更にその他の抗原をラブドウイルス科に対する標的にすることができ、このラブドウイルス科は、ベジクロウイルス属（例えば水疱性口内炎ウイルス）およびリッサウイルス属（例えば狂犬病）を含む。
【００７２】
ラブドウイルス科では、適切な抗原はＧタンパク質またはＮタンパク質に由来することができる。フィロウイルス科（マールブルクおよびエボラウイルス等の出血熱ウイルスを含む）は抗原の適切な供給源であることができる。パラミクソウイルス科は、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス３型、ウシパラインフルエンザウイルス３型、ルブラウイルス（ムンプスウイルス）、パラインフルエンザウイルス２型、パ
ラインフルエンザウイルス４型、ニューカッスル病ウイルス（ニワトリ）、牛疫、モルビリウイルス（麻疹および犬ジステンパーを含む）ならびにニューモウイルス（呼吸器合胞体ウイルスを含む）を含む。インフルエンザウイルスはオルソミクソウイルス科内に分類され、抗原（例えばＨＡタンパク質、Ｎ１タンパク質）の適切な供給源である。ブニヤウイルス科は、ブニヤウイルス属（カリフォルニア脳炎、Ｌａ  Ｃｒｏｓｓｅ）、フレボウイルス（リフトバレー熱）、ハンタウイルス（プレマラはヘマハギン熱ウイルスである）、ナイロウイルス（ナイロビヒツジ病）および様々な未割り当てのブニヤウイルス（ｂｕｎｇａｖｉｒｕｓｅｓ）を含む。アレナウイルス科は、ＬＣＭおよびラッサ熱ウイルスに対する抗原の供給源を提供する。レオウイルス科は、レオウイルス属、ロタウイルス（子供では急性胃腸炎を引き起こす）、オルビウイルスおよびカルチウイルス（ｃｕｌｔｉｖｉｒｕｓ）（コロラドダニ熱、Ｌｅｂｏｍｂｏ（ヒト）、ウマ脳炎、ブルータング）を含む。
【００７３】
レトロウイルス科は、オンコリウイルス亜科（ヒトおよび獣医分野の疾患、例えばネコ白血病ウイルス、ＨＴＬＶＩおよびＨＴＬＶＩＩを包含する）、レンチウイルス（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルスおよびスプマウイルスを含む）を含む。レンチウイルスでも多くの適切な抗原が説明されており、標的として容易に選択され得る。適切なＨＩＶ抗原およびＳＩＶ抗原の例として、ｇａｇタンパク質、ｐｏｌタンパク質、Ｖｉｆタンパク質、Ｖｐｘタンパク質、ＶＰＲタンパク質、Ｅｎｖタンパク質、Ｔａｔタンパク質、Ｎｅｆタンパク質およびＲｅｖタンパク質ならびにこれらの様々な断片が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｅｎｖタンパク質の適切な断片として、このＥｎｖタンパク質のサブユニットの内のいずれか、例えばｇｐ１２０、ｇｐ１６０、ｇｐ４１、またはこれらのより小さい断片、例えば少なくとも約８個のアミノ酸の長さの断片を挙げることができる。同様に、ｔａｔタンパク質の断片を選択することができる。［米国特許第５，８９１，９９４号明細書および米国特許第６，１９３，９８１号明細書を参照されたい。］また、Ｄ．Ｈ．Ｂａｒｏｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５（５）：２４６２−２４６７（Ｍａｒｃｈ  ２００１）およびＲ．Ｒ．Ａｍａｒａ，ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：６９−７４（６  Ａｐｒｉｌ  ２００１）に記載のＨＩＶタンパク質およびＳＩＶタンパク質も参照されたい。別の例では、ＨＩＶおよび／またはＳＩＶ免疫原性タンパク質またはペプチドを使用して、融合タンパク質またはその他の免疫原性分子を形成することができる。例えば、２００１年８月２日に公開された国際公開第０１／５４７１９号パンフレットおよび１９９９年４月８日に公開された国際公開第９９／１６８８４号パンフレットに記載のＨＩＶ−１  Ｔａｔおよび／またはＮｅｆ融合タンパク質ならびに免疫付与レジメンを参照されたい。本発明は、本明細書に記載のＨＩＶおよび／またはＳＩＶ免疫原性タンパク質またはペプチドに限定されない。加えて、これらのタンパク質への様々な改変が説明されている、または当業者により容易に行われ得る。例えば、米国特許第５，９７２，５９６号明細書に記載されている改変ｇａｇタンパク質を参照されたい。
【００７４】
パポーバウイルス科は、ポリオ−マウイルス亜科（ＢＫＵウイルスおよびＪＣＵウイルス）ならびにパピローマウイルス亜科（がんまたは乳頭腫の悪性化と関連する）を含む。アデノウイルス科は、呼吸器疾患および／または腸炎を引き起こすウイルス（ＥＸ、ＡＤ７、ＡＲＤ、Ｏ．Ｂ．）を含む。パルボウイルス科、ネコパルボウイルス（ネコ腸炎）、ネコパンロイコペニアウイルス、イヌパルボウイルスおよびブタパルボウイルス。ヘルペスウイルス科は、アルファヘルペスウイルス亜科（シンプレックスウイルス属（ＨＳＶＩ、ＨＳＶＩＩ）、バリセロウイルス（仮性狂犬病、水痘帯状疱疹）を包含する）、およびベータヘルペスウイルス亜科（サイトメガロウイルス属（ＨＣＭＶ、ムロメガロウイルス）を含む）、およびガンマヘルペスウイルス亜科（リンホクリプトウイルス属、ＥＢＶ（バーキットリンパ腫）、感染性鼻気管炎、マレック病ウイルスおよびラジノウイルスを含
む）を含む。ポックスウイルス科は、コードポックスウイルス亜科（オルソポックスウイルス属（痘瘡（天然痘）およびワクシニア（牛痘））、パラポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルスを包含する）ならびにエントモポックスウイルス亜科を含む。ヘパドナウイルス科はＢ型肝炎ウイルスを含む。抗原の適切な供給源であり得るある種の未分類のウイルスはデルタ型肝炎ウイルスである。更にその他のウイルス源として、トリ感染性ファブリキウス嚢病ウイルスならびにブタ呼吸および生殖症候群ウイルスを挙げることができる。アルファウイルス科は、ウマ動脈炎ウイルスおよび様々な脳炎ウイルスを含む。
【００７５】
抗体用のその他の病原体標的として、例えば、ヒトおよび非ヒト脊椎動物に感染するまたはがん細胞もしくは腫瘍細胞に由来する細菌、真菌、寄生微生物または多細胞寄生生物を挙げることができる。細菌病原体の例として、肺炎球菌を含む病原性グラム陽性球菌；ブドウ球菌；および連鎖球菌が挙げられる。病原性グラム陰性球菌は髄膜炎菌、淋菌を含む。病原性腸グラム陰性桿菌は、腸内細菌科；シュードモナス、アシネトバクテリアおよびエイケネラ；類鼻疽；サルモネラ；赤痢菌；ヘモフィルス；モラクセラ；Ｈ．デュクレイ（Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ）（軟性下疳を引き起こす）；ブルセラ；フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（野兎病を引き起こす）；エルシニア（パスツレラ）；ストレプトバシラス・モニリフォルミスおよびスピリルム；リステリア・モノサイトゲネスを含むグラム陽性桿菌；エリジペロスリックス・ルジオパシエ；コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）（ジフテリア）；コレラ；Ｂ．アントラシス（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽）；ドノヴァン症（鼠径肉芽腫）；ならびにバルトネラ症を含む。病原性嫌気性菌により引き起こされる疾患として、破傷風、ボツリヌス中毒、その他のクロストリジウム、結核、ハンセン病およびその他のマイコバクテリアが挙げられる。病原性スピロヘータ疾患として、梅毒；トレポネーマ症；イチゴ腫、ピンタおよび地方病性梅毒；ならびにレプトスピラ症が挙げられる。より高等な病原体細菌および病原体真菌により引き起こされるその他の感染として、放線菌症；ノカルジア症；クリプトコッカス症、ブラストミセス症、ヒストプラスマ症およびコクシジオイデス症；カンジダ症、アスペルギルス症およびムコール症；スポロトリクム症；パラコクシジオイドミコーシス、ペトリエリオジオーシス（ｐｅｔｒｉｅｌｌｉｄｉｏｓｉｓ）、トルロプシス症、菌腫および黒色真菌症；ならびに皮膚糸状菌症が挙げられる。リケッチアの感染として、発疹チフス、ロッキー山紅斑熱、Ｑ熱およびリケッチア痘症が挙げられる。マイコプラズマおよびクラミジアの感染の例として、肺炎マイコプラズマ、性病性リンパ肉芽腫症、オウム病および周産期のクラミジア感染が挙げられる。病原性真核生物は病原性原生生物および蠕虫を包含し、これらにより引き起こされる感染として、アメーバ症；マラリア；リーシュマニア症；トリパノソーマ症；トキソプラズマ症；ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）；トリカンス（Ｔｒｉｃｈａｎｓ）；トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）；バベシア症；ジアルジア症；旋毛虫症；フィラリア症；住血吸虫症；線形動物；吸虫（ｔｒｅｍａｔｏｄｅ）または吸虫（ｆｌｕｋｅ）；および条虫（サナダムシ）の感染が挙げられる。
【００７６】
これらの生物および／またはこれらの生物により産生される毒素の多くが、生物攻撃で使用される可能性がある因子として疾病管理センター［（ＣＤＣ）、米国、保健福祉省］により同定されている。例えば、これらの生物学的因子の内のいずれかとして、バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽）、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）およびこの毒素（ボツリヌス中毒）、エルシニア・ペスチス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）（ペスト）、大痘瘡（天然痘）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（野兎病）、ならびにウイルス性出血熱［フィロウイルス（例えばエボラ、マールブルク］およびアレナウイルス［例えばラッサ、マチュポ］）（これらは全て、現在
はカテゴリーＡ因子として分類される）；コクシエラ・ブルネッティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ
ｂｕｒｎｅｔｔｉ）（Ｑ熱）；ブルセラ種（ブルセラ症）、バークホルデリア・マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ）（鼻疽）、バークホルデリア・シュードマレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）（類鼻疽）、リシナス・コムニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）およびこの毒素（リシン毒素）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）およびこの毒素（エプシロン毒素）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種およびこの毒素（エンテロトキシンＢ）、クラミジア・シタッシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）（オウム病）、水の安全性の脅威（例えばビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、クリプトスポリジウム・パルバム（Ｃｒｙｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ））、発疹チフス（リケッチア・プロワツェキイ（Ｒｉｃｈｅｔｔｓｉａ  ｐｏｗａｚｅｋｉｉ））、ならびにウイルス性脳炎（アルファウイルス、例えばベネズエラウマ脳炎；東部ウマ脳炎；西部ウマ脳炎（これらは全て、現在はカテゴリーＢ因子として分類される）；ならびにニパンウイルスおよびハンタウイルス（これらは現在カテゴリーＣ因子として分類される）が挙げられる。加えて、その他の生物（これらは同じように分類される、または分類が困難である）を将来、そのような目的で同定することができる、および／または使用することができる。本明細書に記載のウイルスベクターおよびその他の構築物は、これらの生物、ウイルス、これらの毒素またはその他の副生成物に由来する抗原を標的とするのに有用であり、これらのウイルスベクターおよびその他の構築物は、これらの生物学的因子による感染もしくはその他の有害反応を予防することができるおよび／もしくは処置することができることが容易に理解されるだろう。
【００７７】
下記の実施例は一例にすぎず、本明細書に記載の本発明を限定しない。
【実施例】
【００７８】
実施例１：完全長抗体の共発現カセットを含むベクターの生成
宿主標的細胞へ送達する核酸分子を含むＡＡＶウイルス粒子の生成で使用するために、一連のｃｉｓプラスミドを調製した。この核酸分子は、各末端でＡＡＶ２  ５’ＩＴＲ配列およびＡＡＶ２  ３’ＩＴＲ配列を含み、逆方向の２種の発現カセットで挟まれた共通のＣＭＶエンハンサーを含む（第１の発現カセットは第１の最小ＣＭＶプロモーターで制御され、第２の発現カセットは第２の最小ＣＭＶプロモーターで制御される）。ＡＡＶ２
ＩＴＲの間に位置する全て配列を、商業ベンダー（ＧｅｎｅＡｒｔ）に新たに合成させた。免疫グロブリン可変ドメインの全コード配列を、所望の可変ドメインの簡便なシャトルを可能にする特有の制限酵素で挟んだ。異種軽鎖配列（ｋｇｌ）を有する構築物を作成するために、生殖系列軽鎖（ＩＧＫＶ４−１*０１）をコードするコード領域を新たに合
成してＦＩ６可変軽配列の置換に使用した。
【００７９】
代表的な抗体共発現シャトルを図２に示す。このシャトルは、エンハンサーの左側に第１の発現カセットを含み、この第１の発現カセットは右から左へと、ＣＭＶ最小プロモーター、抗ＴＳＧ１０１抗体（１Ａ６）可変重（ＶＨ）ドメインに連結された異種ＩＬ２リーダー配列、ＣＨ’１ドメイン、ヒト中での発現に最適化されているＣＨ’２−３ドメインおよび合成ポリＡを含む。エンハンサーの右側には、ＣＭＶ最小プロモーター、異種ＩＬ２リーダー配列、ＦＩ６ｋ２（抗インフルエンザ抗体）軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメイン、フリン切断部位、口蹄疫ウイルス由来の２ａリンカー、ＩＬ２リーダー配列、ＦＩ６ｖ３  ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２−３、ならびにチミジンキナーゼ短ポリＡ配列が位置している。記号ＣＨは、既知の抗体アロタイプＧ１ｍ１７，１を意味する。
【００８０】
ＦＩ６定常領域の配列を配列番号１に示す。ＦＩ６アミノ酸軽鎖のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００８１】
図２のｃｉｓプラスミドを、例えば米国特許出願第１２／２２６，５５８号明細書に既に記載されているような三重トランスフェクション法で使用して、本明細書に記載のその後の試験で使用するＡＡＶ８ベクターおよびＡＡＶ９ベクターを生成した。得られたプラスミドｐＮ５０９＿ＡＣＥ  Ｆｉ６−１Ａ６  ＭＡＢ＿ｐ３１６０は７７２２ｂｐの長さであり、この配列を配列番号３に示し、この配列は、この特徴と共に参照により本明細書に援用される。ＦＩ６可変軽（ＶＬ）鎖のコード化配列［配列番号４］、ＦＩ６可変重のコード化配列［配列番号５］、ＣＨ１のコード化配列（配列番号６）、ＣＨ２−３のコード化配列［配列番号７］も示す。
【００８２】
可変ドメインの容易なシャッフルを可能にする、前方に位置する特有の制限部位を使用して、図２の１Ａ６重可変ドメインの代わりに、季節性インフルエンザ抗体（ＣＲ８０３３）もしくは汎流行性インフルエンザ抗体（Ｃ０５）のサブクローニングより、または抗Ｍ２ｅ抗体（ＴＣＮ−０３２）のサブクローニングにより、同様の抗体共発現ｃｉｓプラスミドを生成した。次に、このｃｉｓプラスミドを三重トランスフェクション（例えば、米国特許出願第１２／２２６，５８８号明細書に記載したように実施した）で使用し、その後の試験用にＡＡＶ８ベクターおよびＡＡＶ９ベクターを生成した。ｐＮ５１０＿ＡＣＥ  Ｆｉ６−Ｃ０５  ＭＡＢシャトルの配列を配列番号８に示し、可変軽鎖のアミノ酸配列を配列番号９に示し、定常軽を配列番号１０に示し、ＦＩ６可変重鎖を配列番号１１に示し、ＣＨ１を配列番号１２に示し、ＣＨ２−３を配列番号１３に示す。
【００８３】
ｐＮ５１４＿ＡＣＥ  Ｆｉ６−Ｃ０５  ＭＡＢシャトルの配列を配列番号１９に示し、定常軽のアミノ酸配列を配列番号２０に示し、ＦＩ６可変重鎖を配列番号２１に示し、ＣＨ１を配列番号２２に示し、ＣＨ２−３を配列番号２３に示す。次に、このシャトルを使用して、その後の試験に使用するＡＡＶ８ベクターおよびＡＡｖ９ベクターを生成した。
【００８４】
実施例２：Ｆ１６モノクローナル抗体（ＭＡＢ）およびＩＡ６  ＭＡＢを共発現するＡＡＶ８ベクターから発現された生成物のキャラクタリゼーション
一連のＥＬＩＳＡアッセイを実施して、発現レベルをキャラクタライズした、およびＨＥＫ  ２９３細胞中へのトランスフェクション後に実施例１に記載したように生成したｃｉｓプラスミドに由来するＩＡ６  ＭＡＢと共発現されたＦＩ６  ＭＡＢの結合を評価した。ミモトープによるｆ−Ｍｏｃ化学を使用して、ＴＳＧ１０１ペプチドを合成した。全てのインフルエンザ抗原を商業サプライヤＩｍｍｕｎｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃから調達した。プロテインＡをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、全ヒトＩｇＧ１の発現のモニタリングに使用した。組織培養上清中のヒトＩｇＧ１の検出を、抗原特異的ＥＬＩＳＡまたはプロテインＡ捕捉ＥＬＩＳＡのいずれかで測定した。高結合性ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳで希釈した２μｇ／ｍｌ  ＨＡタンパク質もしくはＨＡペプチドまたは５μｇ／ｍｌプロテインＡでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ウェルを５〜８回洗浄し、室温で１時間にわたり、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％加熱不活性化ＰＢＳ、ＰＢＳ中の０．０７％  Ｔｗｅｅｎ２０でブロックした。このプレートに、２反復で組織培養上清を様々な希釈度で添加し、１時間にわたり３７℃でインキュベートした。プレートを洗浄し、ブロックし、Ｂｉｏ−ＳＰ−共役Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅｓヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｂｉｏ−ＳＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅｓ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国、ペンシルバニア州、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ）を１：１０，０００の希釈度で添加した。１時間後、プレートを洗浄し、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｄａｖｉｄｉｎ）共役セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を１：３０，０００の希釈度で添加した。１時間後、プレートを洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加した。２Ｎ  硫酸を使用して室温で３０分後に反応を停止させ、ＢｉｏＴｅｋ  μＱｕａｎｔプレートリーダー（米国、バーモント州、Ｗｉｎ
ｏｏｓｋｉ）を使用して４５０ｎｍでプレートを読み取った。
【００８５】
予想したように、ＴＳＧ１０１ペプチド、ＨＡ（Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２／００４）またはＨＡ（インフルエンザ株Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７の頭部領域のみ）へのＦＩ６の結合は観測されない。完全長ＨＡが存在する場合にはインフルエンザの同じ株に関してＦＩ６の結合が観測され、更にインフルエンザ株ＨＡ（ｄＴＭ）（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／０１／２００９、Ｈ１Ｎ１）の場合も観測される。予想したように、ＦＩ６の結合はプロテインＡの場合も観測される。
【００８６】
公開されたレポートによれば、先行技術の方法に従って生成されたＦＩ６は、完全長ＨＡおよびＨＡ基部には結合するが頭部のみの領域には結合しない。これらのデータから、共発現されたＦＩ６モノクローナルは、その特徴的な結合プロファイルを保持することが実証される。
【００８７】
実施例３：Ｆ１６モノクローナル抗体（ＭＡＢ）および汎流行性インフルエンザＭＡＢ  Ｃ０５を共発現するＡＡＶ８ベクターから発現された生成物のキャラクタリゼーション
２種の異なるモノクローナル抗体の分別検出（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）の可能性を捕捉アッセイで評価した。実施例１に記載したように調製したｃｉｓプラスミドから共発現させてＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトしたモノクローナル抗体ＦＩ６およびＣ０５を、結合に関して評価した。ＦＩ６は完全長ＨＡおよびＨＡ基部には結合するが頭部のみの領域には結合しないことが予想される。図３に示す結合試験の結果から、共発現された抗体がそれらの特徴的な結合を保持することが実証される。より具体的には、ＦＩ６に特徴的な完全長ＨＡおよびＨＡ基部への結合が観測され、Ｃ０５に特徴的なＨＡおよびＨＡ頭部のみ（基部なし）への結合も観測される。実施例２に記載したようにＥＬＩＳＡアッセイを実施した。
【００８８】
実施例４：Ｆ１６モノクローナル抗体（ＭＡＢ）および第２の完全長ＭＡＢを共発現するＡＡＶ８ベクターから発現された生成物のキャラクタリゼーション
６〜８週齢の雄のＲＡＧ  ＫＯマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、米国、メイン州）を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ’ｓ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにて病原体フリーの条件下で飼育した。全ての動物の処置およびプロトコルはＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を受けた。マウスを二酸化炭素窒息で屠殺し、頸椎脱臼により死亡を確認した。ベクターを投与するために、腹腔内（ＩＰ）注射により、体重１ｋｇ当たり７０ｍｇのケタミンおよび体重１ｋｇ当たり７ｍｇのキシラジンの混合物でマウスを麻酔した。ベクターをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用してＩＭ注射を実施した。眼窩後出血により血清を毎週採取した。
【００８９】
組織培養上清中のヒトＩｇＧ１の検出を、プロテインＡ捕捉ＥＬＩＳＡで測定した。高結合性ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳで希釈した５μｇ／ｍｌプロテインＡでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ウェルを５〜８回洗浄し、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％加熱不活性化ＰＢＳ、ＰＢＳ中の０．０７％  Ｔｗｅｅｎ２０でブロックした。マウス血清サンプルを加熱不活性化し、２反復で様々な希釈度にてプレートに添加し、１時間にわたり３７℃でインキュベートした。プレートを洗浄し、ブロックし、Ｂｉｏ−ＳＰ−共役Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅｓヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、米国、ペンシルバニア州、Ｗｅｓｔ
Ｇｒｏｖｅ）を１：１０，０００の希釈度で添加した。１時間後、プレートを洗浄し、１：３０，０００の希釈度でのストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｄａｖｉｄｉｎ）共役セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と共にインキュベートした。１時間後、プレー
トを洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加した。２Ｎ
硫酸を使用して室温で３０分後に反応を停止させ、ＢｉｏＴｅｋ  μＱｕａｎｔプレートリーダー（米国、バーモント州、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ）を使用して４５０ｎｍでプレートを読み取った。
【００９０】
図５は、ＦＩ６をＩＡ６抗体と共発現するＡＡＶベクターを投与したマウスにおける全ヒトＩｇＧ１の全身発現レベルを示す。１×１０11のゲノムコピー（ＧＣ）または１×１０10のＧＣの用量でマウスに筋肉内注射した。７日目、１５日目、２１日目、２８日目、３４日目、４２日目、４９日目および５６日目に発現レベルを評価し、マイクログラム／ｍＬの濃度で測定した。発現の用量依存的増加を観測した。
【００９１】
実施例５：ＦＩ６モノクローナル抗体（ＭＡＢ）および３種の異なる完全長モノクローナル抗体を共発現するＡＡＶ８ベクターから発現された生成物のキャラクタリゼーション
下記の表は、完全長のＣＲ８０３３モノクローナル抗体、Ｃ０５モノクローナル抗体または１Ａ６モノクローナル抗体と共にＦＩ６を共発現するＡＡＶベクターを投与したマウスにおける発現レベルを示す。上記の実施例に記載したように、１×１０11のゲノムコピー（ＧＣ）または１×１０10のＧＣの用量でＲＡＧノックアウト（ＫＯ）マウスに筋肉内注射した。７日目、１５日目、２１日目、２８日目、３４日目、４２日目および４９日目に発現レベルを毎週評価し、マイクログラム／ｍＬの濃度で測定した。発現された抗体に関して発現の用量依存的増加を観測した。アッセイに使用した捕捉抗原は、上記の実施例に記載したプロテインＡ  ＥＬＩＳＡである。
【００９２】
【表１】
2020141697.tif 000002
【００９３】
【表２】
2020141697.tif 000003
【００９４】
【表３】
2020141697.tif 000004
【００９５】
実施例６：単一のＡＡＶ９および／またはＡＡＶ８ベクターの筋肉注射から発現された２種の完全長抗体により抗ウイルス効果が付与される
Ａ．ＡＡＶ９．ＢｉＤ．ＦＩ６＿ＣＲ８０３３ｍＡｂおよびインフルエンザＡによるチャレンジ
ＢＡＬＢ／ｃマウスにＡＡＶ９．ＢｉＤ．ＦＩ６＿ＣＲ８０３３ｍＡｂを筋肉内注射し、１×１０11のＧＣでの筋肉内注射（ＩＭ）により送達した。２週間後、マウスをマウス適合ＰＲ８（インフルエンザＡ）５ＬＤ５０で鼻腔内チャレンジした。円形は、合成されたＦＩ６モノクローナル抗体およびＣＲ８０３３モノクローナル抗体（同じ異種軽鎖を有する）を発現する双方向プロモーターを有するＡＡＶ９構築物を表す。四角形は陽性コントロール（即ち、同様に１×１０11のＧＣで送達された単一の抗体型ＦＩ６を発現するＡＡＶ９）を表し、三角形は未処理動物を表す。図６Ｂはチャレンジ後の生存を示す。１匹のマウス当たり１０１１のＧＣの用量でのＡＡＶ９．ＢｉＤ．ＦＩ６＿ＣＲ８０３３ｍＡｂの投与により、体重減少の有意な遅延による部分保護が可能になった。
【００９６】
Ｂ．ＡＡＶ９．ＢｉＤ．ＦＩ６＿ＣＲ８０３３ｍＡｂおよびインフルエンザＢによるチャレンジ
ＡＡＶ９ベクター注射の場合：ＢＡＬＢ／ｃの雌のマウスを、ＰＢＳ中の１００ｍｇ／ｋｇケタミン／１０ｍｇ／ｋｇキシラジン混合物の筋肉内注射により麻酔し、ＡＡＶ９．ＢｉＤ．ＦＩ６＿ＣＲ８０３３ｍＡｂベクターを、１匹のマウス当たり１×１０11のＧＣで筋肉内注射（ＩＭ）した。ＢｉＤベクターを、同様に１×１０11のＧＣで送達された単一の抗体型ＣＲ８０３３を発現するＡＡＶ９および陰性コントロール（未処理動物）と比較した。図７Ｂはチャンレジ後の生存を示す。インフルエンザによるチャレンジの場合、
ベクター処理の２週後に、ＡＡＶ処理したＢＡＬＢ／ｃマウスおよび未処理マウスを秤量して尾を色分けし、上記に記載したように麻酔し、後肢をプラットフォーム上で支持した状態で背側の切歯で吊し、上記に記載したように総量で５０μｌのＰＢＳ中のＢ／Ｌｅｅ／４０（インフルエンザＢ）５ＬＤ５０を鼻腔内投与した。次いで、マウスを毎日秤量し、疾患または苦痛の徴候に関してモニタリングした。苦痛の行動的徴候を示したまたは初期体重から３０％減少した動物を、ＣＯ２窒息により安楽死させた
【００９７】
図７Ａは、体重の変化率を示す線グラフである。このデータから、この用量での２種の発現された抗体により完全保護効果が付与されたことが分かる。図７Ｂはチャレンジ後の生存を示す。
【００９８】
Ｃ．ＩＭで投与されたＡＡＶ８．ＦＩ６−ＴＣＮ０３２ベクター、ＡＡＶ８．ＦＩ６−１Ａ６ベクターおよびＡＡＶ８．ＦＩ６−ＣＲ８０３３ベクターならびにマウス適合ＰＲ８インフルエンザＡによるチャレンジ。
これらのベクターを実施例１に記載したように作成した。６〜８週齢の雄のＲＡＧ  ＫＯマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、米国、メイン州）を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ’ｓ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにて病原体フリーの条件下で飼育した。全ての動物の処置およびプロトコルはＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を受けた。ベクターを投与するために、腹腔内（ＩＰ）注射により、体重１ｋｇ当たり７０ｍｇのケタミンおよび体重１ｋｇ当たり７ｍｇのキシラジンの混合物でマウスを麻酔した。ベクターをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用してＩＭ注射を実施した。眼窩後出血により血清を毎週採取した。
【００９９】
組織培養上清中のヒトＩｇＧ１の検出を、プロテインＡ捕捉ＥＬＩＳＡで測定した。高結合性ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳで希釈した５μｇ／ｍｌプロテインＡでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ウェルを５〜８回洗浄し、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％加熱不活性化ＰＢＳ、ＰＢＳ中の０．０７％  Ｔｗｅｅｎ２０でブロックした。マウス血清サンプルを加熱不活性化し、２反復で様々な希釈度にてプレートに添加し、１時間にわたり３７℃でインキュベートした。プレートを洗浄し、ブロックし、Ｂｉｏ−ＳＰ−共役Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅｓヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、米国、ペンシルバニア州、Ｗｅｓｔ
Ｇｒｏｖｅ）を１：１０，０００の希釈度で添加した。１時間後、プレートを洗浄し、１：３０，０００の希釈度でのストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｄａｖｉｄｉｎ）共役セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と共にインキュベートした。１時間後、プレートを洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加した。２Ｎ
硫酸を使用して室温で３０分後に反応を停止させ、ＢｉｏＴｅｋ  μＱｕａｎｔプレートリーダー（米国、バーモント州、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ）を使用して４５０ｎｍでプレートを読み取った。
【０１００】
図８Ｃを参照すると、全てのパネルで、ベクター投与から５６日後に発現レベルを示す。５６日目の最後の眼窩出血の数日後、マウスを秤量して尾を色分けし、上記に記載したように麻酔し、後肢をプラットフォーム上で支持した状態で背側の切歯で吊し、上記に記載したように総量で５０μｌのＰＢＳ中のマウス適合ＰＲ８（インフルエンザＡ）５ＬＤ50を鼻腔内投与した。次いで、マウスを毎日秤量し、疾患または苦痛の徴候に関してモニタリングした。苦痛の行動的徴候を示したまたは初期体重から３０％減少した動物をＣＯ2窒息により安楽死させ、頸椎脱臼により死亡を確認した。図８Ａから、わずか２５μｇ
／ｍｌの抗インフルエンザ抗体の全身発現がＰＲ８チャレンジの保護をもたらすのに十分であるが、０．４μｇ／ｍｌの発現は保護に不十分であることが分かる。
【０１０１】
Ｄ．ＡＡＶ９．ＦＩ６＿ＩＡ６  ｍＡｂｓおよびインフルエンザＡによるチャレンジ
人工的なＦＩ６および抗ＨＩＶイムノアドヘシンＩＡ６を発現するＡＡＶ９ベクターを、上記に記載したようなインフルエンザＡによるチャレンジに対する保護に関して評価した。図８Ｂから、３６．５μｇ／ｍｌの抗インフルエンザ抗体の発現は、ＰＲ８によるチャレンジに対する完全な保護をもたらすのに十分であることが分かる。図８Ｃから、６．９μｇ／ｍｌの抗インフルエンザ抗体の発現はＰＲ８によるチャレンジに対する保護に不十分であることが分かる。
【０１０２】
実施例８−２種のイムノアドヘシン共発現カセットを含むベクターの生成
図２に示すものと類似のシャトルベクターを使用して、２種のイムノアドヘシンを含むベクターを生成する。
【０１０３】
一実施形態では、ＦＩ６イムノアドヘシンおよびＣ０５イムノアドヘシンを含むベクターを作成した。ＦＩ６イムノアドヘシン発現カセットおよびＣＯ５イムノアドヘシン発現カセットを保持するプラスミドからの配列を配列番号３６に示し、翻訳されたコード化配列を、配列番号３７（ＦＩ６可変重鎖）、配列番号３８（ＦＩ６可変軽鎖）および配列番号３９（ＣＨ２−３）に示す。これらの配列およびこれらの特徴は参照により援用される。
【０１０４】
別の実施形態では、ＦＩ６イムノアドヘシンおよびＣＲ８０３３イムノアドヘシンを含むベクターを作成した。ＦＩ６イムノアドヘシンおよびＣＲ８０３３イムノアドヘシンを含むプラスミドからの配列を配列番号４０に示し、翻訳されたコード化配列を、配列番号４１（ＦＩ６  ＶＨ）および配列番号４２（ＦＩ６可変軽）に示す。これらの配列およびこれらの特徴は参照により援用される。
【０１０５】
当業者に既知の技法を使用して、上記に記載のイムノアドヘシンシャトルプラスミドからＡＡＶを生成することができる。
【０１０６】
追加の例証的なシャトルプラスミドは下記の通りである。
【０１０７】
両方の重鎖１Ａ６およびＦＩ６ｖ３の供給源とは異種であるカッパ生殖系列軽鎖を含むプラスミドｐＮ５１２＿ＡＣＥ  ＦＩ６ｖ３ｋｇｌ−１Ａ６  ＭＡＢ＿ｐ３１８４の配列を配列番号１４に示す。翻訳されたコード化配列を、配列番号１５（定常軽）、配列番号１６（ＦＩ６可変重）、配列番号１７（ＣＨ１）および配列番号１８（ＣＨ２−３）に示す。
【０１０８】
ＴＣＮ０３２の重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖免疫グロブリンを保持する中間ベクターの配列を配列番号３０に示す。このプラスミドによりコードされる、翻訳されたアミノ酸配列として、配列番号３１のＴＣＮ０３２重鎖、配列番号３２のＣＨ１配列、配列番号３３のＦＩ６  ＶＨ鎖、配列番号３４のＣＨ１配列、および配列番号３５のＣＨ２−３配列が挙げられる。
【０１０９】
ＴＣＮ０３２重鎖およびＦＩ６重鎖を保持し、特異性を有する２種の抗体を共発現するプラスミドの配列を配列番号４３に示す。ＴＣＮ０３２可変重鎖の翻訳されたアミノ酸は配列番号４４であり、ＣＨ１は配列番号４５であり、ヒンジ−ＣＨ２’−ＣＨ３’は配列番号４６であり、Ｆｉ６  ＶＨは配列番号４７であり、ＣＨ１は配列番号４８であり、ＣＨ２−３は配列番号４９であり、アンピシリン耐性遺伝子は配列番号５０である。これらの配列およびこれらの特徴は参照により本明細書に援用される。
【０１１０】
（配列表フリーテキスト）
下記の情報は、識別番号＜２２３＞でフリーテキストを含む配列のために提供される。
【０１１１】
【表４】
2020141697.tif 000005
【０１１２】
【表５】
2020141697.tif 000006
【０１１３】
【表６】
2020141697.tif 000007
【０１１４】
【表７】
2020141697.tif 000008
【０１１５】
【表８】
2020141697.tif 000009
【０１１６】
【表９】
2020141697.tif 000010
【０１１７】
【表１０】
2020141697.tif 000011
【０１１８】
【表１１】
2020141697.tif 000012
【０１１９】
【表１２】
2020141697.tif 000013
【０１２０】
【表１３】
2020141697.tif 000014
【０１２１】
【表１４】
2020141697.tif 000015
【０１２２】
【表１５】
2020141697.tif 000016
【０１２３】
【表１６】
2020141697.tif 000017
【０１２４】
【表１７】
2020141697.tif 000018
【０１２５】
【表１８】
2020141697.tif 000019
【０１２６】
【表１９】
2020141697.tif 000020
【０１２７】
【表２０】
2020141697.tif 000021
【０１２８】
【表２１】
2020141697.tif 000022
【０１２９】
【表２２】
2020141697.tif 000023
【０１３０】
本出願は配列および配列表を含み、この配列表は参照により援用される。本明細書で引用される全ての公報、特許および特許出願、ならびに２０１４年５月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／９９２，６４９号明細書（この優先権が主張されている）は、個々の公報または特許出願が、参照により援用されると具体的におよび個別に示されたかのように、これらの全体が参照により援用される。上記の発明は、理解の明確さを目的とする説明および例示により多少詳しく記載されているが、添付した特許請求の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明にある特定の変更および改変を行うことができることは、本発明の教示を考慮して当業者には容易に明らかであるだろう。
【図１Ａ−１Ｂ】
2020141697.tif 000024
【図２】
2020141697.tif 000025
【図３】
2020141697.tif 000026
【図４Ａ−４Ｂ】
2020141697.tif 000027
【図５】
2020141697.tif 000028
【図６Ａ−６Ｂ】
2020141697.tif 000029
【図７Ａ−７Ｂ】
2020141697.tif 000030
【図８Ａ−８Ｃ】
2020141697.tif 000031
【配列表】
2020141697000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年5月25日(2020.5.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドと、このＡＡＶカプシド中にパッケージングされた、細胞中で２種の機能的単一特異性抗体を発現する異種核酸とを有する組み換えＡＡＶであって、
５’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）と、
第１の発現カセットの発現を指示する調節制御配列の制御下にある、第１の免疫グロブリン用の第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を少なくともコードする第１の発現カセットと、
第２の発現カセットの発現を指示する調節制御配列の制御下にある、第２のＯＲＦ、リンカーおよび第３のＯＲＦを含む第２の発現カセットであって、前記第２のＯＲＦおよび前記第３のＯＲＦが第２の免疫グロブリン構築物用および第３の免疫グロブリン構築物用である、第２の発現カセットと、
３’ＡＡＶ  ＩＴＲと
を含み、
以上によって免疫グロブリン軽鎖、第１の免疫グロブリン重鎖および第２の免疫グロブリン重鎖がコードされる組み換えＡＡＶ。
【請求項２】
二重特異性抗体を更に発現する請求項１に記載の組み換えＡＡＶ。
【請求項３】
前記第１の発現カセットと前記第２の発現カセットとの間に位置している双方向エンハンサーを含む請求項１に記載の組み換えＡＡＶ。
【請求項４】
前記第１のＯＲＦが免疫グロブリン軽鎖をコードし、前記第２のＯＲＦが第１の免疫グロブリン重鎖をコードし、前記第３のＯＲＦが第２の重鎖をコードし、前記発現される機能的抗体構築物が、特異性が異なる２種の異なる重鎖を有し、前記重鎖が軽鎖を共有する、請求項１に記載の組み換えＡＡＶ。
【請求項５】
前記第２のＯＲＦおよび前記第３のＯＲＦの少なくとも一方が、改変されたＦｃコード配列を含む、請求項１に記載の組み換えＡＡＶ。
【請求項６】
前記第２のカセット中の前記リンカーが、ＩＲＥＳまたはＦ２Ａから選択されるリンカーを含む、請求項１に記載の組み換えＡＡＶ。
【請求項７】
前記第１の発現カセット用および／または前記第２のカセット用の前記調節制御配列が最小プロモーターを含む、請求項１に記載の組み換えＡＡＶ。
【請求項８】
前記第１の発現カセット用の前記調節制御配列および／または前記第２の発現カセット用の前記調節制御配列が最小ポリＡまたは合成ポリＡを含む、請求項１に記載の組み換えＡＡＶ。
【請求項９】
前記第１の発現カセットが２シストロン性であり、更なるＯＲＦを含む、請求項１に記載の組み換えＡＡＶ。
【請求項１０】
前記各ＯＲＦがｓｃＦｖを含む、請求項９に記載の組み換えＡＡＶ。
【請求項１１】
ベクターが、前記第１の発現カセットと前記第２の発現カセットとの間に双方向ポリＡを含む請求項１に記載の組み換えＡＡＶ。
【請求項１２】
前記第１の発現カセットがエンハンサーおよび最小プロモーターを含む、請求項１０に記載の組み換えＡＡＶ。
【請求項１３】
前記第２の発現カセットがエンハンサーおよび最小プロモーターを含む、請求項１２に記載の組み換えＡＡＶ。
【請求項１４】
前記第１の発現カセットおよび前記第２の発現カセットが共に２のＦａｂを発現する、請求項８に記載の組み換えＡＡＶ。
【請求項１５】
前記２の単一特異性抗体が異なる特異性を有する、請求項１に記載の組み換えＡＡＶ。
【請求項１６】
前記２の単一特異性抗体が、モノクローナル抗体、イムノアドヘシン、Ｆａｂ、二重機能的抗体およびこれらの組み合わせから独立して選択される、請求項１に記載の組み換えＡＡＶ。
【請求項１７】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドと、このＡＡＶカプシド中にパッケージングされた、２の機能的単一特異性抗体を発現する異種核酸とを有する組み換えＡＡＶであって、
第１の特異性を有する第１のモノクローナル抗体、前記第１のモノクローナル抗体とは異なる特異性を有する第２のモノクローナル抗体、および二重特異性抗体を発現し、
５’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）と、
第１の発現カセットの発現を指示する調節制御配列の制御下にある、第１の免疫グロブリン用の第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を少なくともコードする第１の発現カセットと、
第２の発現カセットの発現を指示する調節制御配列の制御下にある、第２のＯＲＦ、リンカーおよび第３のＯＲＦを含む第２の発現カセットであって、前記第２のＯＲＦおよび前記第３のＯＲＦが第２の免疫グロブリン構築物用および第３の免疫グロブリン構築物用である、第２の発現カセットと、
３’ＡＡＶ  ＩＴＲと
を含み
以上によって免疫グロブリン軽鎖、第１の免疫グロブリン重鎖および第２の免疫グロブリン重鎖がコードされる組み換えＡＡＶ。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組み換えＡＡＶと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１９】
２の機能的単一特異性抗体を対象に送達する方法における使用のための組成物であって、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組み換えＡＡＶを含む組成物。
【請求項２０】
前記第１のＯＲＦが免疫グロブリン軽鎖をコードし、前記第２のＯＲＦが第１の免疫グロブリン重鎖をコードし、前記第３のＯＲＦが第２の重鎖をコードし、前記発現される機能的抗体構築物が、特異性が異なる２の異なる重鎖を有し、前記重鎖が軽鎖を共有する、請求項１７に記載の組み換えＡＡＶ。
【外国語明細書】
2020141697000001.pdf