(57)【要約】      （修正有）【課題】組織型プラスミノゲン活性化剤（ｔＰＡ）等の従来の血栓溶解薬と比較して優れた効果を有する新規血栓溶解薬の提供。【解決手段】有効量のプラスミノゲンを含む、被験者の動脈、静脈血栓を予防及び／又は解消させるための組成物。前記組成物は組織型プラスミノゲン活性化剤（ｔＰＡ）等の他の治療薬と組み合わせて用いてもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のプラスミノゲンを含む、被験者の動脈、静脈血栓を予防及び／または解消させるための薬物組成物。
【請求項２】
前記血栓は新鮮血栓及び陳旧性血栓を含むことを特徴とする、請求項１に記載の薬物組成物。
【請求項３】
前記血栓は血液系疾患、循環系疾患、自己免疫疾患、代謝に乱れが生じる疾患または感染性疾患によってもたらされる血栓であることを特徴とする、請求項１または２に記載の薬物組成物。
【請求項４】
前記血栓は糖尿病に継発する大血管、小血管、微小血管の血栓であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の薬物組成物。
【請求項５】
前記血栓は大小血管病変によってもたらされる血栓であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の薬物組成物。
【請求項６】
有効量のプラスミノゲンを含み、前記プラスミノゲンは血栓を解消させることにより、被験者の血栓関連疾患を予防及び／または治療することを特徴とする、被験者の前記血栓関連疾患を予防及び／または治療するための薬物組成物。
【請求項７】
前記血栓関連疾患は、門静脈血栓によってもたらされる膵臓炎、肝硬変；腎静脈血栓によってもたらされる腎栓塞；頸部静脈血栓に起因する全身性敗血症、肺栓塞、脳血栓、深部静脈血栓；動脈及び静脈血栓によってもたらされる臓器梗塞であり、前記臓器梗塞は、脳梗塞、心筋梗塞、血栓性脳卒中、心房細動、不安定性狭心症、難治性狭心症、一過性の脳虚血発作、肺栓塞を含むがこれらに限られないことを特徴とする、請求項６に記載の薬物組成物。
【請求項８】
前記血栓関連疾患は糖尿病性網膜症、糖尿病性肝臓疾患、糖尿病性心臓疾患、糖尿病性腸疾患であることを特徴とする、請求項６に記載の薬物組成物。
【請求項９】
前記プラスミノゲンは血栓の形成を伴うその他の疾患の治療薬と組み合わせて投与できることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の薬物組成物。
【請求項１０】
前記プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するタンパク質であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の薬物組成物。
【請求項１１】
有効用量のプラスミノゲンを含有する容器、及び被験者の動脈、静脈血栓の予防及び／または解消における製品の投与を指導するプロトコルを含む、被験者の動脈、静脈血栓を予防及び／または解消させるための製品。
【請求項１２】
有効用量のプラスミノゲンを含有する容器、及び被験者の血栓関連疾患の予防及び／またに治療における製品の投与を指導するプロトコルを含む、被験者の血栓関連疾患を予防及び／または治療するための製品。
【請求項１３】
さらに一種類または複数種類の他の薬物を含有する容器を含むことを特徴とする、請求項１１または１２に記載の製品。
【請求項１４】
前記他の薬物は血栓の形成を伴うその他の疾患を治療する薬物であることを特徴とする、請求項１３に記載の製品。
【請求項１５】
前記プロトコルはさらに前記プラスミノゲンは前記他の薬物を投与する前、投与と同時、及び／または後に投与できることを説明するものであることを特徴とする、請求項１３または１４に記載の製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新しいプラスミノゲンを使用して血栓を予防及び／または治療する方法に係るものである。プラスミノゲンは特異的に血栓を溶解させることができるが出血などの副作用をもたらすことがない。本発明の薬物はさらに新鮮血栓及び陳旧性血栓を溶解できるが且つ半減期が長く及び血栓溶解強度が制御できるなどのメリットを有する。そのため、プラスミノゲンは体内血栓を溶解させる全く新しいストラテジーとなる可能性がある。
【背景技術】
【０００２】
＜血栓の形成及び危害＞
血栓とは人体または動物が生存期間中においてなんらかの誘因により、血液の有形成分が循環血中において異常が発生した場合の血液凝塊、または心臓内壁または血管壁上に発生する血液沈着物を言う。心筋梗塞、脳梗塞、肺血栓、深部静脈血栓及び末梢血管栓塞などを含み、人類の健康をひどく脅かす疾患であり、その発病率、障害が残る確率、致死率はいずれも大変高いものである。世界保健機関の統計によれば、世界中において毎年血栓疾患で死亡する人数は約２６００万人であり、他の死亡原因よりはるかに高く、人類の健康を脅かす最大の敵となっている（非特許文献１）。
【０００３】
プラスミンはプラスミノゲン活性化系（ＰＡ系）の重要な成分である。それは広スペクトルのプロテアーゼであり、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の幾つかの成分を加水分解することができ、これらの成分はフィブリン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン及びプロテオグリカンを含む（非特許文献２）。また、プラスミンは一部のプロマトリックスメタロプロテアーゼ（ｐｒｏ−ＭＭＰ）を活性化させて活性のあるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）にすることができる。そのためプラスミンは細胞外タンパク加水分解作用の一つの重要な上流調節因子である（非特許文献３，４）。プラスミンはプラスミノゲンが二種類の生理性のＰＡ：組織型プラスミノゲン活性化剤（ｔＰＡ）またはウロキナーゼプラスミノゲン活性化剤（ｕＰＡ）によってタンパク質加水分解することで形成されるものである。プラスミノゲンは血漿及び他の体液中において、相対的レベルが比較的高く、従来的にはＰＡ系の調節は主にＰＡの合成及び活性レベルよって実現されると考えられている。ＰＡ系成分の合成は異なる要素によって厳格な調節を受け、例えばホルモン、成長因子及びサイトカインである。また、この他に、プラスミンとＰＡの特定の生理的阻害剤が存在する。プラスミンの主な阻害剤はα２−抗プラスミン（α２−ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ）である。一部の細胞表面には直接加水分解する活性のあるｕＰＡ特異性細胞表面受容体（ｕＰＡＲ）（非特許文献５、６）を有する。
【０００４】
プラスミノゲン（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ，ｐｌｇ）は単一鎖の糖タンパクであり、分子量は約９２ｋＤａである（非特許文献７、８）。プラスミノゲンは主に肝臓で合成され、大量に細胞外液に存在している。血漿中に含まれるプラスミノゲンの含有量は約２μＭである。そのためプラスミノゲンは組織及び体液中のタンパク質加水分解活性の大きな潜在的なソースである（引用文献９、１０参照）。プラスミノゲンには二種類の分子の形が存在する：グルタミン酸−プラスミノゲン（Ｇｌｕ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）及びリジン−プラスミノゲン（Ｌｙｓ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）である。天然的に分泌され及び分解していない形のプラスミノゲンは一つのアミノ基末端（Ｎ−末端）グルタミン酸を有し、そのためグルタミン酸−プラスミノゲンと称される。しかし、プラスミンが存在する場合、グルタミン酸−プラスミノゲンはＬｙｓ７６−Ｌｙｓ７７においてリジン−プラスミノゲンに加水分解される。グルタミン酸−プラスミノゲンと比較して、リジン−プラスミノゲンはフィブリンとより高い親和力を有し、さらにより高い速度でＰＡによって活性化されることができる。この二種類の形のプラスミノゲンのＡｒｇ５６０−Ｖａｌ５６１
ペプチド結合はｕＰＡ  またはｔＰＡによって切断され、これによりジスルフィド結合によって接続された二重鎖プロテアーゼプラスミンの形成をもたらす（非特許文献１１）。プラスミノゲンのアミノ基末端部分は五つの同源トリクル環を含み、即ちいわゆるｋｒｉｎｇｌｅであり、カルボキシル基末端部分はプロテアーゼドメインを含む。一部のＫｒｉｎｇｌｅはプラスミノゲンとフィブリン及びその阻害剤α２−ＡＰの特異的相互作用を介在するリジン結合部位を含む。最も新しく発見されたのは３８ｋＤａのフィブリンプラスミノゲンフラグメントであり、ｋｒｉｎｇｌｅｌ−４を含み、血管生成の有効的な阻害剤である。このフラグメントは血管阻害剤と命名され、幾つかのプロテアーゼ加水分解プラスミノゲンから生成される。
【０００５】
プラスミンの主な基質はフィブリンであり、フィブリンの溶解は病理性血栓の形成を予防するキーポイントである（非特許文献１２）。プラスミンはさらにＥＣＭの幾つかの成分に対する基質特異性を有し、これらはラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン及びゼラチンを含み、これはプラスミンがＥＣＭ再建において重要な作用を有することを示している（非特許文献８、１３、１４）。間接的に、プラスミンはさらにいくつかのプロテアーゼ前駆体を活性プロテアーゼに変換することによりＥＣＭのその他の成分を分解させることができ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９を含む。そのため、以下のように提唱する人がいる。プラスミンは細胞外タンパク加水分解の重要な上流調節因子である（非特許文献１５）。また、プラスミンはいくつかの潜在的な形の成長因子を活性化させる能力を有する（非特許文献１６−１８）。体外において、プラスミンはさらに補体系の成分を加水分解させて走化性の補体フラグメントを放出することができる。
【０００６】
＜現在の血栓を溶解させる治療方法＞
現在の血栓を減少させる関連の薬物治療はよく見られる非手術的治療方法であって、血栓溶解療法、抗凝固療法、抗血小板薬及び血管拡張薬を含む。現在の最も有効な方法は血栓溶解療法を用いることであり、よく用いられる血栓溶解薬には三つの世代がある：第一世代はストレプトキナーゼ（ＳＫ）及びウロキナーゼ（ＵＫ）を代表とし、血栓溶解能力が高く、しかし血栓溶解特異性を有さず、全身的な血栓溶解亢進が現れやすくこれにより出血をもたらすことがある（非引用文献１９、２０）。第二世代は組織型プラスミノゲン活性化剤ｔＰＡを代表とし、その血栓溶解作用はＳＫ、ＵＫより優れ、体内における半減期が短い（非特許文献２１）。第三世代は遺伝子工学技術を用いたものであり、単一クローン技術で第一世代、第二世代の薬物に対して改造を行うものであるが、しかし基本的には試験段階にある。これらの薬物は血栓溶解平衡における活性化剤を増加させることに基づくものであり、プラスミン（Ｐｌｍ）を生成させてフィブリン溶解を促進し、これにより血栓溶解の目的を果たす（非特許文献２２）。
【０００７】
現在の承認が得られている血栓溶解薬は二種類に分けられる：絶対的大多数の血栓溶解薬が使用するのはプラスミノゲン活性化剤であり、天然及び異なる組み換え形式のｔＰＡ、ｕＰＡ及びストレプトキナーゼ（ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ）を含む。プラスミノゲン活性化剤自身は血栓を溶解させることができず、血栓付近のプラスミノゲン分子を活性化させて活性のプラスミンにさせてから血栓溶解作用を果たすことになる。最近の数年間において、活性プラスミンを直接局所血栓溶解に用いることが許されるようになり、具体的な方法はガイドチューブを血栓部位に導通して局所で活性プラスミンを放出することで直接血栓を溶解させる。
【０００８】
プラスミノゲン（ｐｌｇ）はプラスミン（Ｐｌｍ）の非活性形式であり、従来ではそれは体内において過量で安定的なものであり、生体の血栓溶解プロセスはプラスミノゲンが活性化剤の作用下において活性化されて活性のあるプラスミンとなり、活性プラスミンはさらにフィブリン血液凝塊（ｆｉｂｒｉｎ  ｃｌｏｔ）を溶解させる機能を果たすもので
ある。従来的にプラスミノゲン自身は血栓を溶解させる作用を有しないと考えられている。
【０００９】
しかし、本発明は意外にも、天然プラスミノゲンが優れた新鮮血栓及び陳旧性血栓を溶解させる機能を有することを見出し、安全性に優れ、血栓を溶解させる強度が調整しやすく、特異性が優れるなどの長所を有する。
【００１０】
本発明の血栓溶解メカニズムは従来知られている血栓溶解ストラテジーと完全に異なるものである。従来技術における血栓を溶解させる方法は、血栓溶解反応の触媒、即ちプラスミノゲン活性化剤を増やすこと、活性化剤はｔＰＡ、ｕＰＡ、ストレプトキナーゼ及びその誘導体または血栓溶解反応の生成物を含み、即ち活性プラスミンを増やすことで実現されるものである。本発明の血栓を溶解させる方法は、血栓溶解反応の基質のプラスミノゲンを調整するストラテジーで実現されるものである。
【００１１】
従来技術における血栓溶解薬に比べて、本発明のプラスミノゲン血栓溶解は少なくとも以下のメリットを有する。
【００１２】
１、優れた血栓溶解効果
末梢動脈血栓（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ，ＰＡＯ）及び深部静脈血栓（ｄｅｅｐ  ｖｅｉｎ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ＤＶＴ）の状況下で形成される長い血栓及び徐々に収縮する陳旧性血栓に対して、従来技術における血栓溶解薬の効果は比較的弱い（非特許文献２３〜２５）。しかし本発明はプラスミノゲンまたはプラスミンとＰＡの組み合わせを用いることにより、前記血栓に対して優れた血栓溶解効果を実現している。そのため、本発明は効果的にｔＰＡ，ｕＰＡの前記課題を解決できる。
【００１３】
２、半減期が長い
現在の血栓溶解物質の一つの重要な特徴は体内半減期が短すぎることである。例えば天然ｕＰＡの体内半減期は５〜１０分間であり、天然ｔＰＡの体内半減期は３〜５分間であり、天然プラスミンの体内半減期はさらに極めて短いものである。現在は遺伝子工学によってこれらの物質の半減期を伸ばそうとしているが、その効果が理想的でなく、半減期が短すぎることは依然非常に大きくこれらの物質の応用を制限している。
【００１４】
しかし、プラスミノゲンの体内半減期は５３時間に達し、これはプラスミノゲンまたはプラスミンとＰＡの組み合わせを使用することで、いずれも顕著に体内における血栓溶解の作用期を延長させる顕著な作用を有し、持続的に、穏やかに血栓を溶解させる目的を達成できる。
【００１５】
３、より穏やかで制御可能性が高い
活性プラスミンにとって、それは高活性を有するプロテアーゼであり、そのため、活性プラスミンを使用することで血栓を溶解させることは非常に速い反応プロセスであり、これにより現在の使用において必ずガイドチューブを用いて直接血栓部位に導く必要がある。
【００１６】
プラスミノゲン活性化剤の場合、それは血栓溶解反応において触媒の位置に属し、少量のプラスミノゲン活性化剤を添加することにより短時間で速やかに大量の活性プラスミンを形成し、激しい酵素反応プロセスである。
【００１７】
しかし、本発明は実験により以下を証明している。血栓溶解反応の基質プラスミノゲンを調整することにより血栓を溶解する過程をより穏やかにし、且つ、異なるプラスミノゲ
ン用量及び血栓溶解効果の研究により、プラスミノゲンの血栓溶解速度はプラスミノゲンの用量によって調整することができる。
【００１８】
４、特異性及び副作用が低い
従来技術においてプラスミノゲン活性化剤を血栓溶解薬物として使用する一つの主な副作用は出血であり、特に腸管及び脳部における出血である。正常の体内においてプラスミノゲンは広くすべての体液中に存在し、正常な状況では体内に生理性のフィブリンの沈着があり、プラスミノゲン活性化剤の増加は受傷、出血、激しい運動などの特殊な状況下において起きる場合が多い。そのため、プラスミノゲン活性化剤を一旦注射すれば、体内において非特異的に広くプラスミノゲンが活性化されてプラスミンが形成される反応が発生し、これにより元の正常なフィブリンが沈着して溶解しさらに出血が発生する。臨床上において、頭蓋骨内出血リスクは一つの主な出血リスクである。報道によって、２〜２４時間持続する投薬プロセスにおいて、頭蓋骨内出血の発生率は１％〜２％であり、現在はこのような出血リスクを回避する良い方法がない。
【００１９】
本発明において、プラスミノゲンは活性酵素ではなく、そのためプラスミノゲンを注射した後に非特異的に広くプラスミノゲンを活性化させて活性プラスミンを形成するという反応が生じることはない。この反応の発生部位はどこでプラスミノゲン活性化剤が発現されるかであり、即ち血栓が生じる部位である。本発明は実験によりプラスミノゲンは特異的に血栓部位に吸着できることを証明し、血栓溶解特異性を有し、且つ実験により出血という副作用が生じていないことが証明されている。
【００２０】
５、効果的に陳旧性血栓を溶解させる
現在の血栓溶解薬物の血栓溶解作用は血栓形成初期に集中しており、即ち「新鮮血栓」である。虚血性の脳卒中の研究が証明するように、血栓が形成してから３時間以内に組み換えｔＰＡを注射することで効果的に血栓を溶解できる。後続の研究により以下が証明されている。組み換えｔＰＡは最長で血栓が形成されてから４．５時間以内に血栓を溶解できる。４．５時間を過ぎれば、組み換えｔＰＡを注射するリスクは有効的な作用を超える可能性がある。そのため、従来の薬物において、なるべく血栓形成の早期（４．５時間未満）に組み換えｔＰＡを注射する（非特許文献２６、２７）必要がある。言い換えれば、現在、本分野において、強力な陳旧性血栓を溶解させる薬物を望まれている。
【００２１】
本発明において、プラスミノゲン（及び生理的レベルのｔＰＡ）を単独で使用し、またはプラスミノゲン及びプラスミノゲン活性化剤（ｔＰＡまたはｕＰＡ）を使用することにより、いずれも効果的に新鮮血栓（血栓形成から０．５時間）、または陳旧性血栓（血栓形成から２０時間）、場合によっては極めて古い陳旧性血栓（７２時間）の血栓を溶解させることができる。これらのデータは明確にプラスミノゲンが陳旧性血栓を溶解させることに非常に大きな優位性を有することを示している。
【００２２】
そのため、プラスミノゲンは新しいより優位性のある血栓溶解新薬となることが望まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】袁桂清,血栓性疾病已成為脅威人類健康和生命的重要疾病（和訳：血栓性疾患は人類の健康及び生命を脅かす重要な疾患となっている）（Ｊ），中華検験医学雑誌，２００４，８（２７）：４８７ｄ
【非特許文献２】Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＣＭ  ａｎｄ  Ｗｅｒｂ，Ｚ．（１９９１）．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ，Ｈａｙ  ＥＤ，ｅｄ．（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ），ｐｐ．２５５−３０２．
【非特許文献３】Ｗｅｒｂ，Ｚ．，Ｍａｉｎａｒｄｉ，Ｃ．Ｌ．，Ｖａｔｅｒ，Ｃ．Ａ．，ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，Ｅ．Ｄ．，Ｊｒ．（１９７７）．Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ａｃｔｉｖｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｔｅｎｔ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｂｙ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２９６，１０１７−１０２３．
【非特許文献４】Ｈｅ，Ｃ．Ｓ．，Ｗｉｌｈｅｌｍ，Ｓ．Ｍ．，Ｐｅｎｔｌａｎｄ，Ａ．Ｐ．，Ｍａｒｍｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｇｒａｎｔ，Ｇ．Ａ．，Ｅｉｓｅｎ，Ａ．Ｚ．，ａｎｄ  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｇ．Ｉ．（１９８９）．Ｔｉｓｓｕｅ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｃａｓｃａｄｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ８６，２６３２−２６３６．
【非特許文献５】Ｓｔｏｐｐｅｌｌｉ，Ｍ．Ｐ．，Ｃｏｒｔｉ，Ａ．，Ｓｏｆｆｉｅｎｔｉｎｉ，Ａ．，Ｃａｓｓａｎｉ，Ｇ．，Ｂｌａｓｉ，Ｆ．，ａｎｄ  Ａｓｓｏｉａｎ，Ｒ．Ｋ．（１９８５）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｔｏ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｏｎ  Ｕ９３７ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ８２，４９３９−４９４３．
【非特許文献６】Ｖａｓｓａｌｌｉ，Ｊ．Ｄ．，Ｂａｃｃｉｎｏ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｂｅｌｉｎ，Ｄ．（１９８５）．Ａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍｒ  ５５，０００ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖｅｔｏｒ，ｕｒｏｋｉｎａｓｅ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１００，８６−９２．
【非特許文献７】Ｗｉｍａｎ，Ｂ．ａｎｄ  Ｗａｌｌｅｎ，Ｐ．（１９７５）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ“ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ”ａｎｄ“ｌｙｓｉｎｅ”ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＮＨ２−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｓ  ｓｔｕｄｉｅｄ  ｂｙ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０，４８９−４９４．
【非特許文献８】Ｓａｋｓｅｌａ，Ｏ．ａｎｄ  Ｒｉｆｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．（１９８８）．Ｃｅｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ：ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４，９３−１２６
【非特許文献９】Ｒａｕｍ，Ｄ．，Ｍａｒｃｕｓ，Ｄ．，Ａｌｐｅｒ，Ｃ．Ａ．，Ｌｅｖｅｙ，Ｒ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｐ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｓｔａｒｚｌ，Ｔ．Ｅ．（１９８０）．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０８，１０３６−１０３７
【非特許文献１０】Ｗａｌｌeｎ  Ｐ（１９８０）．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ．Ｉｎ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，Ｋｌｉｎｅ  ＤＬ  ａｎｄ  Ｒｅｄｄｙ  ＫＫＮ，ｅｄｓ．
【非特許文献１１】Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，Ｌ．，Ｚａｊｄｅｌ，Ｍ．，Ｃｌａｅｙｓ，Ｈ．，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｔ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｓ．（１９７５）．Ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅ  ｉｎ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ：ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｗｉｔｈ“ｐｒｏ”ｐａｒｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ７２，２５７７−２５８１．
【非特許文献１２】Ｃｏｌｌｅｎ，Ｄ．ａｎｄ  Ｌｉｊｎｅｎ，Ｈ．Ｒ．（１９９１）．Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ．Ｂｌｏｏｄ  ７８，３１１４−３１２４．
【非特許文献１３】Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｃ．Ｍ．ａｎｄ  Ｗｅｒｂ，Ｚ．（１９８９）．Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１，９７４−９８２．
【非特許文献１４】Ｍｉｇｎａｔｔｉ，Ｐ．ａｎｄ  Ｒｉｆｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．（１９９３）．Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｉｎｖａｓｉｏｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．７３，１６１−１９５．
【非特許文献１５】Ｃｏｌｌｅｎ，Ｄ．（２００１）．Ｈａｍ−Ｗａｓｓｅｒｍａｎ  ｌｅｃｔｕｒｅ：ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｆｉｂｒｉｎ−ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ．（Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｅｄｕｃ．Ｐｒｏｇｒａｍ．）１−９．
【非特許文献１６】Ｒｉｆｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．，Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉ，Ｄ．，Ｂｉｚｉｋ，Ｊ．，Ｑｕａｒｔｏ，Ｎ．，Ｂｌｅｉ，Ｆ．，Ｄｅｎｎｉｓ，Ｐ．，Ｆｌａｕｍｅｎｈａｆｔ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｍｉｇｎａｔｔｉ，Ｐ．（１９９０）．Ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．Ｄｅｖ．３２，３１３−３１８．
【非特許文献１７】Ａｎｄｒｅａｓｅｎ，Ｐ．Ａ．，Ｋｊｏｌｌｅｒ，Ｌ．，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｄｕｆｆｙ，Ｍ．Ｊ．（１９９７）．Ｔｈｅ  ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７２，１−２２．
【非特許文献１８】Ｒｉｆｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．，Ｍａｚｚｉｅｒｉ，Ｒ．，Ｍｕｎｇｅｒ，Ｊ．Ｓ．，Ｎｏｇｕｅｒａ，Ｉ．，ａｎｄ  Ｓｕｎｇ，Ｊ．（１９９９）．Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ．ＡＰＭＩＳ  １０７，８０−８５．
【非特許文献１９】Ｈｉｌｌｉｓ  ＬＤ，ｅｔ．ａｌ．．Ｈｉｇｈ  ｄｏｓｅ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ  ｆｏｒ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ：ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  ｔｒｉａｌ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．１９８５；６：９５７-９６２．
【非特許文献２０】Ｓｍａｌｌｉｎｇ  ＲＷ．Ａ  ｆｒｅｓｈ  ｌｏｏｋ  ａｔ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ：ｆｒｏｍ  ｔｈｅｏｒｙ  ｔｏ  ｔｅｓｔ  ｔｕｂｅ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｈｅａｌｔｈ−Ｓｙｓｔ  Ｐｈａｒｍ  １９９７；５４（ｓｕｐｐｌ１）：Ｓ１７−Ｓ２２．
【非特許文献２１】Ｎｏｂｅｌ  Ｓ，ＭｃＴａｖｉｓｈ  Ｄ．Ｒｅｔｅｐｌａｓｅ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｔ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．［Ｊ］．Ｄｒｕｇ，１９９６，５２（４）：５８９−６０５．
【非特許文献２２】Ａｂｄｏｌｉ−Ｎａｓａｂ  Ｍ１，Ｊａｌａｌｉ−Ｊａｖａｒａｎ  Ｍ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ（Ｋ２Ｓ）ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐ（２０１３）４０：５７４９-５７５８
【非特許文献２３】Ｇｏｔｔｌｏｂ  Ｒ．（１９７５）Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎａｒｔｅｒｉａｌ  ａｎｄ  ｖｅｎｏｕｓ  ｔｈｒｏｍｂｉ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ａｇｅｓ．Ｉｎ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎｃｈｅｍｉｃａｌ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ．ｖｏｌ．１．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２３-３６．
【非特許文献２４】Ｓａｂｏｖｉｃ  Ｍ，Ｌｉｊｎｅｎ  ＨＲ，Ｋｅｂｅｒ  Ｄ，Ｃｏｌｌｅｎ  Ｄ．（１９８９）Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆｒｅｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｌｏｔｓ  ｗｉｔｈ  ｆｉｂｒｉｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄｎｏｎ−ｆｉｂｒｉｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ，６２，１０８３-１０８７．
【非特許文献２５】Ｐｏｔｔｅｒ  ｖａｎ  Ｌｏｏｎ  ＢＪ，Ｒｉｊｋｅｎ  ＤＣ，Ｂｒｏｍｍｅｒ  ＥＪ，ｖａｎ  ｄｅｒ  ＭａａｓＡＰ．（１９９２）Ｔｈｅ  ａｍｏｕｎｔ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ，ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔｙｐｅ  １ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｈｒｏｍｂｉ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｅｘ−ｖｉｖｏ  ｌｙｓｉｂｉｌｉｔｙ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ，６７，１０１-１０５．
【非特許文献２６】Ｈａｃｋｅ  Ｗ，Ｋａｓｔｅ  Ｍ，Ｂｌｕｈｍｋｉ  Ｅ，Ｂｒｏｚｍａｎ  Ｍ，Ｄaｖａｌｏｓ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅｐｌａｓｅ  ３ｔｏ  ４．５ｈｏｕｒｓ  ａｆｔｅｒ  ａｃｕｔｅ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｓｔｒｏｋｅ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５９：１３１７−１３２９．
【非特許文献２７】Ｌｅｅｓ  ＫＲ，Ｂｌｕｈｍｋｉ  Ｅ，ｖｏｎ  Ｋｕｍｍｅｒ  Ｒ，Ｂｒｏｔｔ  ＴＧ，Ｔｏｎｉ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｔｉｍｅ  ｔｏ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ａｌｔｅｐｌａｓｅ  ａｎｄ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ｓｔｒｏｋｅ：ａｎｕｐｄａｔｅｄ  ｐｏｏｌｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｅｃａｓｓ，Ａｔｌａｎｔｉｓ，Ｎｉｎｄｓ，ａｎｄ  Ｅｐｉｔｈｅｔ  ｔｒｉａｌｓ．Ｌａｎｃｅｔ  ３７５．
【非特許文献２８】Ｍａｒｄｅｒ  Ｖ  Ｊ，Ｎｏｖｏｋｈａｔｎｙ  Ｖ．Ｄｉｒｅｃｔ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ，ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，２０１０，８（３）：４３３−４４４．
【非特許文献２９】Ｈｕｎｔ  Ｊ  Ａ，Ｐｅｔｔｅｗａｙ  Ｊｒ  Ｓ  Ｒ，Ｓｃｕｄｅｒｉ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｌａｓｍｉｎ：ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕ−ｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｍａ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｌａｓｍｉｎ［Ｊ］．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ，２００８，１００（３）：４１３−４１９．
【非特許文献３０】Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ  Ｌ，Ｃｌａｅｙｓ  Ｈ，Ｚａｊｄｅｌ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｌｙｓｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｏｎｅ“ｍｉｎｉ”−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ（ＭＷ，３８，０００）ｂｙ  ｅｌａｓｔａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ，１９７８，３：１９１−２０９．
【非特許文献３１】Ｎａｇａｉ  Ｎ，Ｄｅｍａｒｓｉｎ  Ｅ，Ｖａｎ  Ｈｏｅｆ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｃｒｏｐｌａｓｍｉｎ：ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，２００３，１（２）：３０７−３１３．
【非特許文献３２】Ｖａｌｅｒｙ  Ｖ．Ｎｏｖｏｋｈａｔｎｙ，Ｇａｒｙ  Ｊ．Ｊｅｓｍｏｋ，Ｌｏｃａｌｌｙ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｐｌａｓｍｉｎ：ｗｈｙ  ｓｈｏｕｌｄ  ｉｔ  ｂｅ  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｔｏ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｄｉｒｅｃｔ  ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｖｏｌ．２５Ｎｏ．２Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００４
【非特許文献３３】Ｖ．Ｎｏｖｏｋｈａｔｎｙ，Ｋ．Ｔａｌｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｔ．Ｐ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ａｃｉｄ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｌａｓｍｉｎ：ｓｕｐｅｒｉｏｒｉｔｙ  ｏｖｅｒ  ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｃａｔｈｅｔｅｒ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，１：１０３４-１０４１
【非特許文献３４】Ｆ  Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃｓ，２００１，１４６（４）：６７０
【非特許文献３５】Ｒ．Ｂ．Ａｉｓｉｎａ１  ａｎｄ  Ｌ．Ｉ．Ｍｕｋｈａｍｅｔｏｖａ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ／Ｐｌａｓｍｉｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１４，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．６，ｐｐ．５９０-６０５．
【非特許文献３６】Ｋｙｌｅ  Ｌａｎｄｓｋｒｏｎｅｒ，ＭＳ，Ｎｅｉｌ  Ｏｌｓｏｎ，ＤＶＭ，ＰｈＤ，ａｎｄ  Ｇａｒｙ  Ｊｅｓｍｏｋ，ＰｈＤ，Ｃｒｏｓｓ−Ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｉｎ  ａｓ  ａ  Ｄｉｒｅｃｔ−Ａｃｔｉｎｇ  Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ  Ａｇｅｎｔ：Ｅｘ  Ｖｉｖｏ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｌａｒｇｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｊ  Ｖａｓｃ  Ｉｎｔｅｒｖ  Ｒａｄｉｏｌ  ２００５；１６：３６９-３７７．
【非特許文献３７】Ｅｄｖｉｎ  Ｌ．Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｇａｒｙ  Ｓ．Ｃｏｏｍｂｓ，ａｎｄ  Ｄａｃｉｄ  Ｒ．Ｃｏｒｅｙ，Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｙｐｅ  Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，Ｖｏｌ．２７０，Ｎｏ．１３，ｐｐ．７５５８-７５６２．
【非特許文献３８】Ｋｅｉ  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｈａｕ  Ｃ．Ｋｗａａｎ，Ｅｎｋｉ  Ｋｏｈ，ａｒｄＭａｓａｔａｋａＴａｎａｂｅ，Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−Ｔｙｐｅ  Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａｔｏｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９２Ｐａｇｅｓ  １４７３−１４８１
【非特許文献３９】Ｈｕｉ  ＹＨ，Ｈｕａｎｇ  ＮＨ，Ｅｂｂｅｒｔ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｏｆ  ｔａｉｌ−ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｃａｎｎｕｌａ−ｏｒ  ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｉｘ  ｍａｒｋｅｔｅｄ  ｄｒｕｇｓ．Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００７Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；５６（２）：２５６−６４．
【非特許文献４０】Ｊａｅ  Ｋｙｕ  Ｒｙｕ，Ｍａｒｋ  Ａ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｓａｒａ  Ｇ．Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｎｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０１５，６：８１６４．
【非特許文献４１】Ｄｉｍｉｔｒｉｏｓ  Ｄａｖａｌｏｓ  ，Ｋａｔｅｒｉｎａ  Ａｋａｓｓｏｇｌｏｕ．Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  ａｓ  ａ  ｋｅｙ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１２．  ３４（１）：４３−６２．
【非特許文献４２】Ｖａｌｖｉ  Ｄ，Ｍａｎｎｉｎｏ  ＤＭ，Ｍｕｌｌｅｒｏｖａ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ，ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ（ＣＯＰＤ）ａｎｄ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｗｏ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｃｏｈｏｒｔｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｈｒｏｎ  Ｏｂｓｔｒｕｃｔ  Ｐｕｌｍｏｎ  Ｄｉｓ  ２０１２；７：１７３-８２．
【発明の概要】
【００２４】
一方において、本発明は被験者の動脈、静脈血栓を予防及び／または解消させる方法に係り、被験者に対してプラスミノゲンを投与することを含む。本発明はさらにプラスミノゲンの被験者の動脈、静脈血栓の予防及び／または解消における用途を含む。一つの実施形態において、前記血栓は新鮮血栓及び陳旧性血栓を含む。一つの実施形態において、前記血栓は血液系疾患、循環系疾患、自己免疫疾患、代謝に乱れが生じる疾患または感染性疾患によってもたらされる血栓である。一つの実施形態において、前記血栓は糖尿病によって生じる大血管、小血管、微小血管血栓である。一つの実施形態において、前記血栓は大小血管病変によって起こる血栓である。
【００２５】
これと共に、本発明は新しい血栓関連疾患を予防及び／または治療する方法に係り、該方法は被験者体内に有効量のプラスミノゲンを投与することを含む。本発明はさらにプラスミノゲンを血栓関連疾患の予防及び／治療に用いる関連の用途に係る。本発明は被験者の病理的血栓を予防及び／解消させる方法に係り、該方法は全身または局所にプラスミノゲンを投与することにより前記血栓を溶解させる。前記血栓は新鮮血栓及び／または陳旧性血栓であり、前記血栓関連疾患は新鮮血栓及び／または陳旧性血栓によって誘発またはもたらされる疾患である。前記被験者は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
【００２６】
一つの実施形態において、前記被験者のプラスミンまたはプラスミノゲンが低下している。具体的には、前記低下は先天的、継発的、及び／または局所的なものである。
【００２７】
一つの実施形態において、本発明の血栓は静脈血栓及び／または動脈血栓である。前記血栓関連疾患は以下を含む：門静脈血栓によってもたらされる膵臓炎、肝硬変；腎静脈血栓がもたらす腎栓塞；頸部静脈血栓によってもたらされる全身性敗血症、肺栓塞、脳血栓；動脈及び静脈血栓がもたらす臓器の梗塞：脳梗塞、心筋梗塞、血栓性脳卒中、心房細動、不安定性狭心症、難治性狭心症、一過性の脳虚血発作、肺栓塞、糖尿病による大小血管栓塞等を含むが、これらに限られない。
【００２８】
一つの実施形態において、前記血栓関連疾患は糖尿病性腎臓病、糖尿病性網膜症、糖尿病性肝臓疾患、糖尿病性心臓病、糖尿病性腸疾患であり、糖尿病性神経痛等の糖尿病性神経病変を含む。
【００２９】
一つの実施形態において、前記血栓は継発的及び／または局所の血栓である；前記血栓関連疾患は継発的及び／または局所の血栓関連疾患である。
【００３０】
一つの実施形態において、プラスミノゲンと配列２、６、８、１０または１２は少なく
とも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有する。一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１−１００、１−９０、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４５、１−４０、１−３５、１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、１−２、１個のアミノ酸を追加、削除及び／または置換したもので、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、プラスミノゲンは以下から選ばれる保存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）な置換バリアントである：Ｇｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはマイクロプラスミノゲン。一つの実施形態において、プラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンであり、例えば配列２が示すプラスミノゲンのオルソログであり、例えば、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するプラスミノゲンのオルソログであり、例えばゴリラ、アカゲザル、マウス、ウシ、ウマ、イヌに由来するプラスミノゲンのオルソログである。もっとも好ましくは、本発明のプラスミノゲンのアミノ酸配列は配列２、６、８、１０または１２に示される通りである。
【００３１】
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは例えば、静脈内、筋肉内、皮下、吸入、椎管内、局所注射、関節内注射または直腸投与によって全身または局所にて投与される。一つの実施形態において、前記局所投薬は血栓領域においてプラスミノゲンを含有するドレッシング材及び／またはガイドチューブを用いることによって行われる。
【００３２】
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは適切なポリペプチド担体または安定剤と組み合わせて投与される。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは毎日０．０００１−２０００ｍｇ／ｋｇ、０．００１−８００ｍｇ／ｋｇ、０．０１−６００ｍｇ／ｋｇ、０．１−４００ｍｇ／ｋｇ、１−２００ｍｇ／ｋｇ、１−１００ｍｇ／ｋｇ、１０−１００ｍｇ／ｋｇ（体重一キロあたりで計算）または０．０００１−２０００ｍｇ／ｃｍ２、０．００１−８００ｍｇ／ｃｍ２、０．０１−６００ｍｇ／ｃｍ２、０．１−４００ｍｇ／ｃｍ２、１−２００ｍｇ／ｃｍ２、１−１００ｍｇ／ｃｍ２、１０−１００ｍｇ／ｃｍ２（体表面積平方センチメートルあたりで計算）の用量を投与し、好ましくは少なくとも一回繰り返し、好ましくは毎日投与する。局所投与の場合、前記用量はさらに状況に応じて調整することができる。
【００３３】
前記プラスミノゲンは単独で投与でき、他の薬物と組み合わせても使用でき、前記他の薬物は例えば、心血管疾患治療薬、不整脈治療薬、糖尿病治療薬等である。
【００３４】
もう一方において、本発明はプラスミノゲンの被験者の動脈、静脈血栓を予防及び／または消去する薬物、製品、薬物キット中における用途に係る。本発明はさらに製薬方法に係り、プラスミノゲンを薬学的に許容できる担体と一緒に被験者の動脈、静脈血栓を予防及び／または消去する薬物、製品、薬物キットに係る。一つの実施形態において、その前記血栓は新鮮血栓（急性血栓）及び陳旧性血栓（慢性血栓）を含む。一つの実施形態において、前記血栓は血液系疾患、循環系疾患、自己免疫疾患、代謝に乱れが生じる疾患または感染性疾患がもたらす血栓である。一つの実施形態において、前記血栓は糖尿病によって継発する大血管、小血管、微小血管の血栓である。一つの実施形態において、前記血栓は大小血管の病変がもたらす血栓である。
【００３５】
これとともに、本発明はプラスミノゲンの被験者病理性血栓を予防及び／解消させる薬
物、製品、薬物キットにおける用途に係り、及びプラスミノゲンの被験者血栓関連疾患を予防及び／または治療する薬物、製品、薬物キットにおける使用に係る。本発明はさらに薬物を製造する方法に係り、プラスミノゲンを薬学的に許容し得る担体と共に被験者の病理性血栓を予防及び／または解消させる薬物、製品、薬物キットに製造することであり、または被験者の血栓関連疾患を予防及び／または治療する薬物、製品、薬物キットに係る。前記血栓は新鮮血栓及び／または陳旧性血栓であり、前記血栓関連疾患は新鮮血栓及び／または陳旧性血栓がもたらす疾患である。前記被験者は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
【００３６】
一つの実施形態において、前記被験者のプラスミンまたはプラスミノゲンは低下している。具体的には、前記低下は先天的、継発的、及び／または局所的なものである。
【００３７】
一つの実施形態において、本発明の血栓は静脈血栓及び／または動脈血栓である。前記血栓関連疾患は以下を含む：門静脈血栓によってもたらされる膵臓炎、肝硬変；腎静脈血栓がもたらす腎栓塞；頸部静脈血栓によってもたらされる全身性敗血症、肺栓塞、脳血栓；動脈及び静脈血栓がもたらす臓器梗塞：脳梗塞、心筋梗塞、血栓性脳卒中、心房細動、不安定性狭心症、難治性狭心症、一過性の脳虚血発作、肺栓塞、糖尿病による大小血管栓塞等を含むが、これらに限られない。
【００３８】
一つの実施形態において、前記血栓関連疾患は糖尿病性腎臓疾患、糖尿病性網膜病変、糖尿病性肝臓疾患、糖尿病性心臓疾患、糖尿病性腸疾患、糖尿病性神経痛等を含む糖尿病性神経病変である。
【００３９】
一つの実施形態において、前記血栓は継発的及び／または局所の血栓である。上記血栓関連疾患は継発的及び／または局所の血栓関連疾患である。
【００４０】
一つの実施形態において、プラスミノゲンと配列２、６、８、１０または１２は少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有する。一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１−１００、１−９０、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４５、１−４０、１−３５、１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、１−２、１個のアミノ酸を追加、消去及び／または置換したもので、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、プラスミノゲンは以下から選ばれる保存的な置換バリアントである：Ｇｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはマイクロプラスミノゲン。一つの実施形態において、プラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンであり、例えば配列２が示すプラスミノゲンのオルソログであり、例えば、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するプラスミノゲンのオルソログであり、例えばゴリラ、アカゲザル、マウス、ウシ、ウマ、イヌに由来するプラスミノゲンのオルソログである。もっとも好ましくは、本発明のプラスミノゲンのアミノ酸配列は配列２、６、８、１０または１２に示される通りである。
【００４１】
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは例えば体表、静脈内、筋肉内、皮下、吸入、椎管内、局所注射、関節内注射または直腸投与によって全身または局所にて投与される。一つの実施形態において、前記局所投与は血栓領域においてプラスミノゲンを含有するドレッシング材及び／またはガイドチューブを用いることによって行われる。
【００４２】
上記プラスミノゲンは単独で投与でき、または他の薬物と組み合わせて投与することで病理性の血栓に伴って発生する他の疾患を治療することができ、上記他の薬物は例えば心血管疾患治療薬、不整脈治療薬、糖尿病治療薬等である。
【００４３】
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは適切なポリペプチド担体または安定剤と組み合わせて投与される。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは毎日０．０００１−２０００ｍｇ／ｋｇ、０．００１−８００ｍｇ／ｋｇ、０．０１−６００ｍｇ／ｋｇ、０．１−４００ｍｇ／ｋｇ、１−２００ｍｇ／ｋｇ、１−１００ｍｇ／ｋｇ、１０−１００ｍｇ／ｋｇ（体重一キロあたりで計算）または０．０００１−２０００ｍｇ／ｃｍ２、０．００１−８００ｍｇ／ｃｍ２、０．０１−６００ｍｇ／ｃｍ２、０．１−４００ｍｇ／ｃｍ２、１−２００ｍｇ／ｃｍ２、１−１００ｍｇ／ｃｍ２、１０−１００ｍｇ／ｃｍ２（体表面積平方センチメートルあたりで計算）の用量を投与し、好ましくは少なくとも一回繰り返し、好ましくは毎日投与する。局所投与の場合、前記用量はさらに状況に応じて調整することができる。
【００４４】
もう一方において、本発明は被験者の動脈、静脈血栓を予防及び／または解消させるプラスミノゲンに係り、及び被験者の動脈、静脈血栓を予防及び／または解消させる、プラスミノゲンを含有する薬物組成物に係る。一つの実施形態において、前記血栓は新鮮血栓及び陳旧性血栓を含む。一つの実施形態において、前記血栓は血液系疾患、循環系疾患、自己免疫疾患、代謝に乱れが生じる疾患または感染性疾患がもたらす血栓である。一つの実施形態において、前記血栓は糖尿病に継発する大血管、小血管、微小血管血栓である。一つの実施形態において、前記血栓は大小血管病変がもたらす血栓である。これとともに、本発明は血栓関連疾患の予防及び／または治療に用いるプラスミノゲンに係り、及び血栓関連疾患を予防及び／または治療する、プラスミノゲンを含有する薬物組成物に係る。上記血栓は新鮮血栓及び／または陳旧性血栓であり、前記血栓関連疾患は新鮮血栓及び／または陳旧性血栓がもたらす疾患である。一つの実施形態において、前記血栓は静脈血栓及び／または動脈血栓である。前記血栓関連疾患は以下を含む：門静脈血栓によってもたらされる膵臓炎、肝硬変；腎静脈血栓がもたらす腎栓塞；頸部静脈血栓によってもたらされる全身性敗血症、肺栓塞、脳血栓；動脈血栓がもたらす臓器の梗塞：脳梗塞、心筋梗塞、血栓性脳卒中、心房細動、不安定性狭心症、難治性狭心症、一過性の脳虚血発作、肺栓塞、糖尿病による大小血管栓塞等を含むが、これらに限られない。
【００４５】
一つの実施形態において、前記血栓関連疾患は糖尿病性腎臓病、糖尿病性網膜症、糖尿病性肝臓疾患、糖尿病性心臓病、糖尿病性腸疾患であり、糖尿病性神経痛等の糖尿病性神経病変を含む。
【００４６】
一つの実施形態において、前記血栓は先天的、継発的、及び／または局所的なものである。上記血栓関連疾患は先天的、継発的及び／または局所の血栓関連疾患である。
【００４７】
一つの実施形態において、プラスミノゲンと配列２、６、８、１０または１２は少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有する。一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１−１００、１−９０、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４５、１−４０、１−３５、１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、１−２、１個のアミノ酸を追加、削除及び／または置換したもので、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせ
から選ばれるものである。一つの実施形態において、プラスミノゲンは以下から選ばれる保存的な置換バリアントである：Ｇｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはマイクロプラスミノゲン。一つの実施形態において、プラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンであり、例えば配列２が示すプラスミノゲンのオルソログであり、例えば、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するプラスミノゲンのオルソログであり、例えばゴリラ、アカゲザル、マウス、ウシ、ウマ、イヌに由来するプラスミノゲンのオルソログである。もっとも好ましくは、本発明のプラスミノゲンのアミノ酸配列は配列２、６、８、１０または１２に示される通りである。
【００４８】
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは例えば、体表、静脈内、筋肉内、皮下、吸入、椎管内、局所注射、関節内注射または直腸投与によって全身または局所にて投与される。一つの実施形態において、前記局所投薬は血栓領域においてプラスミノゲンを含有するドレッシング材及び／またはガイドチューブを用いることによって行われる。
【００４９】
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは適切なポリペプチド担体または安定剤と組み合わせて投与される。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは毎日０．０００１−２０００ｍｇ／ｋｇ、０．００１−８００ｍｇ／ｋｇ、０．０１−６００ｍｇ／ｋｇ、０．１−４００ｍｇ／ｋｇ、１−２００ｍｇ／ｋｇ、１−１００ｍｇ／ｋｇ、１０−１００ｍｇ／ｋｇ（体重一キロあたりで計算）または０．０００１−２０００ｍｇ／ｃｍ２、０．００１−８００ｍｇ／ｃｍ２、０．０１−６００ｍｇ／ｃｍ２、０．１−４００ｍｇ／ｃｍ２、１−２００ｍｇ／ｃｍ２、１−１００ｍｇ／ｃｍ２、１０−１００ｍｇ／ｃｍ２（体表面積平方センチメートルあたりで計算）の用量で投与し、好ましくは少なくとも一回繰り返し、好ましくは毎日投与する。局所投与の場合、前記用量はさらに状況に応じて調整することができる。
【００５０】
もう一方において、本発明は被験者の動脈、静脈血栓を予防及び／または解消させるプラスミノゲンを含有する薬物キットに係る。一つの実施形態において、前記血栓は新鮮血栓及び陳旧性血栓を含む。一つの実施形態において、前記血栓は血液系疾患、循環系疾患、自己免疫疾患、代謝に乱れが生じる疾患または感染性疾患がもたらす血栓である。一つの実施形態において、前記血栓は糖尿病に継発する大血管、小血管、微小毛管血栓である。一つの実施形態において、前記血栓は大小血管病変がもたらす血栓である。一つの実施形態において、前記製品または薬物キットは有効用量のプラスミノゲンを含有する容器である。さらには、前記製品または薬物キットはさらに一種類または複数種類の他の薬物を含む容器を有し、そのうち前記他の薬物は血栓の形成を伴うその他の疾患の治療薬である。該薬物はさらにプロトコル（使用説明書）を含むことができ、該プロトコルは前記プラスミノゲンが前記動脈、静脈血栓、または血栓関連疾患の予防及び／治療に用いることができることを説明するものであり、さらには前記プラスミノゲンが前記他の薬物を投与する前、投与と同時、及び／または後に投与できることを説明するものである。一つの実施形態において、前記他の薬物は例えば、心血管疾患治療薬、不整脈治療薬、糖尿病治療薬等であり、病理的血栓の発生に伴う他の疾患を治療するためのものである。具体的には前記技術構成において、上記血栓は新鮮血栓及び／または陳旧性血栓であり、前記血栓関連疾患は新鮮血栓及び／または陳旧性血栓がもたらす疾患である。一つの実施形態において、前記血栓は静脈血栓及び／または動脈血栓である。前記血栓関連疾患は以下を含む：門静脈血栓によってもたらされる膵臓炎、肝硬変；腎静脈血栓がもたらす腎栓塞；頸部静脈血栓によってもたらされる全身性敗血症、肺栓塞、脳血栓；動脈及び静脈血栓がもたらす臓器の梗塞：脳梗塞、心筋梗塞、血栓性脳卒中、心房細動、不安定性狭心症、難治性狭心症、一過性脳虚血発作、肺栓塞、糖尿病による大小血管栓塞等を含むが、これらに限られない。
【００５１】
一つの実施形態において、前記血栓関連疾患は糖尿病性腎臓病、糖尿病性網膜症、糖尿
病性肝臓疾患、糖尿病性心臓病、糖尿病性腸疾患であり、糖尿病性神経痛等の糖尿病性神経病変を含む。
【００５２】
一つの実施形態において、前記血栓は先天的、継発的、及び／または局所的なものである。上記血栓関連疾患は先天的、継発的及び／または局所の血栓関連疾患である。
【００５３】
一つの実施形態において、プラスミノゲンと配列２、６、８、１０または１２は少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有する。一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１−１００、１−９０、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４５、１−４０、１−３５、１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、１−２、１個のアミノ酸を追加、削除及び／または置換したもので、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、プラスミノゲンは以下から選ばれる保存的な置換バリアントである：Ｇｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはマイクロプラスミノゲン。一つの実施形態において、プラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンであり、例えば配列２が示すプラスミノゲンのオルソログであり、例えば、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するプラスミノゲンのオルソログであり、例えばゴリラ、アカゲザル、マウス、ウシ、ウマ、イヌに由来するプラスミノゲンのオルソログである。もっとも好ましくは、本発明のプラスミノゲンのアミノ酸配列は配列２、６、８、１０または１２に示される通りである。
【００５４】
一つの実施形態において、前記被験者のプラスミンまたはプラスミノゲンは低下している。具体的には、前記低下は先天的、継発的、及び／または局所的なものである。
【００５５】
本発明は本発明の実施形態どうしの技術的特徴のすべての組み合わせを明確にカバーし、且つこれらの組み合わせ後の技術構成は本出願で明確に開示され、前記技術構成が単独且つ明確に開示されているのと一緒である。また、本発明はさらに各実施形態及び要素のすべてのサブの組み合わせをカバーし、さらに本明細書中において開示され、それぞれのサブの組み合わせが単独且つ明確に本明細書中において開示されているのと一緒である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は１２５ｎｇｔＰＡが存在する条件下において３７℃で１時間インキュベーションを行った場合の、異なる用量のプラスミノゲンの２０時間陳旧性血栓に対する血栓溶解効果を示したものである。
【図２】図２は１２５ｎｇｔＰＡが存在する条件下において３７℃で２時間インキュベーションを行った場合の、異なる用量のプラスミノゲンの２０時間陳旧性血栓に対する血栓溶解効果を示したものである。
【図３】図２は１０ｎｇｔＰＡが存在する条件下において３７℃で２時間インキュベーションを行った場合の、異なる用量のプラスミノゲンの２０時間陳旧性血栓に対する血栓溶解効果を示したものである。
【図４】図４は１２５ｎｇ  ｔＰＡが存在する条件下において３７℃で２時間インキュベーションを行った場合の、異なる用量のプラスミノゲンの７２時間陳旧性血栓に対する血栓溶解効果を示したものである。
【図５】図５は１０ｎｇ  ｔＰＡが存在する条件下において３７℃で２時間インキュベーションを行った場合の、異なる用量のプラスミノゲンの７２時間陳旧性血栓に対する血栓溶解効果を示したものである。
【図６】図６は２０時間の陳旧性血栓に１０ｎｇのｔＰＡ及び１ｍｇのｐｌｇを添加し、または単独で５μｇのｔＰＡを添加した後の時間の延長に伴う血栓溶解率の変化を示したものである。
【図７】図７は１００ｎｇ  ｔＰＡが存在する条件下において３７℃で１時間インキュベーションを行った場合の、異なる用量のプラスミノゲンの２０時間陳旧性血栓に対する血栓溶解効果を示したものである。
【図８】図８は１ｎｇ  ｔＰＡが存在する条件下において３７℃で２時間インキュベーションを行った場合の、異なる用量のプラスミノゲンの２０時間陳旧性血栓に対する血栓溶解効果を示したものである。
【図９】図９はプラスミノゲンの体内血栓に対する特異性吸着実験の結果を示したものである。
【図１０】図２は１２５ｎｇ  ｔＰＡが存在する条件下において３７℃で２時間インキュベーションを行った場合の、異なる濃度のプラスミノゲンの３０分間新鮮血栓に対する血栓溶解効果を示したものである。
【図１１】図１１は２４〜２５週齢糖尿病マウスに対してプラスミノゲンを１５日間投与した後の血清中Ｄ−二量体の濃度の測定結果である。
【図１２】図１２は２４〜２５週齢糖尿病マウスに対してＰＢＳ（Ａ）またはプラスミノゲン（Ｂ）を３１日間投与した後の心臓フィブリン免疫組織染色の結果を示したものである。
【図１３】図１３は２４〜２５週齢の糖尿病マウスに対してＰＢＳ（Ａ）またはプラスミノゲン（Ｂ）を３１日間投与した後の腎臓フィブリン免疫組織染色の結果を示したものである。
【図１４】図１４は２４〜２５週齢の糖尿病マウスに対してＰＢＳ（Ａ）またはプラスミノゲン（Ｂ）を３１日間投与した後の肝臓フィブリン免疫組織染色の結果を示したものである。
【図１５】図１５は２４〜２５週齢の糖尿病マウスに対してＰＢＳ（Ａ）またはプラスミノゲン（Ｂ）を３１日間投与した後の坐骨神経フィブリン免疫組織染色の結果を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
１．定義
「血栓」は凝血プロセスにおいて形成される産物である。凝血プロセスは生体が密閉高圧循環系の完全性を保持するための防御メカニズムである。正常な場合において、該プロセスは非活性化状態を維持すべきであり、しかし組織が損傷を受けた場合、速やかに該メカニズムを起動させて血液の外部への漏洩を減らすべきである。血管が損傷を受けた場合、トロンビンの作用下において血漿中に溶解しているフィブリノーゲン（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）は最終的に水に溶けないフィブリン（ｆｉｂｒｉｎ）多重合体となり、さらに互いに網となり、血液細胞を中に網羅し、血液凝塊を形成することで、凝血プロセスを完成させる。該プロセスにおいて、血液凝塊と傷口の大きさの比が極めて重要である。そのため血液凝塊の形成を開始させる分子（フィブリン、トロンビン）及び血液凝塊を溶解させる分子（プラスミン、プラスミノゲン活性化剤など）の間には平衡が存在する。しかし病理的なプロセスにおいて、該平衡の破壊は過剰の血液凝塊形成分子を破壊し、これにより血栓  （ｔｈｒｏｍｂｕｓ）を形成させ、該血栓は「病理性血栓」である。
【００５８】
人体において、血栓は血流のあるところであればどこでも発生する可能性があり、現在は主に二種類に分けられる：静脈血栓及び動脈血栓である。静脈血栓は静脈中において生じる血液凝塊によってもたらされる。最もよく見られる静脈血栓のタイプは以下である：深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、それは体の静脈例えば大腿静脈（ｆｅｍｏｒａｌ  ｖｅｉｎ）に影響し、これにより影響を受ける部位の痛みと腫れをもたらす；門静脈血栓、それは
肝臓門静脈に影響し、これにより膵臓炎、肝硬変、憩室炎または胆管がんをもたらす；腎静脈血栓、腎栓塞をもたらす；頸内静脈血栓、それは全身性の敗血症、肺塞栓などの複数種類の合併症を引き起こす；脳静脈血栓、患者の頭痛、視覚異常、脳卒中などの症状をもたらす。動脈血栓は体内のほとんどの臓器の梗塞をもたらす可能性があり、それが引き起こす疾患は以下を含むがこれらに限られない：脳梗塞、心筋梗塞、血栓性卒中、アテローム性動脈硬化、不安定性狭心症、難治性狭心症、一過性脳虚血発作、肺栓塞などである。
【００５９】
「血栓関連疾患」は血栓形成及び血栓栓塞という二種類の病理的プロセスによってもたらされる疾患である。本発明の血栓関連疾患はという用語は血栓形成及び血栓栓塞によって引き起こされるすべての疾患を含む。
【００６０】
血栓の形成（ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）とは一定条件下において、血液有形成分が血管内（多くは小血管）に栓を形成し、これにより血管の一部または全体が詰まり、対応部位の血液供給に障害が生じる病理的プロセスである。血栓組成成分により血小板血栓、赤血球血栓、フィブリン血栓、混合血栓等に分けられる。血管の種類に応じて動脈性血栓、静脈性血栓及び毛細血管性血栓に分けられる。
【００６１】
血栓栓塞（ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｓｍ）は血栓が形成部位から脱落し、血液の流動に伴って移動する過程においてなんらかの血管の一部または全部を詰まらせることをいい、これにより組織及び（または）臓器の虚血、酸素不足、壊死（動脈血栓）及び鬱血、むくみ（静脈血栓）を形成する病理的プロセスである。
【００６２】
静脈血栓形成は下肢の深部静脈血栓の形成が最もよく見られ、よく見られるのは深部静脈例えば膝窩静脈、大腿静脉、腸間膜静脈及び門静脈などである。多くは赤血球血栓またはフィブリン血栓などである。主な表れは以下である：（１）血栓によって形成される局所の腫れ、痛み；（２）血栓による末梢血液の還流障害：例えば末梢のむくみ、腫れと痛み、皮膚変色、腹水等である；（３）血栓脱落後に栓塞した血管によってもたらされる関連臓器の機能障害、例えば肺梗塞の症状、特徴などである。
【００６３】
動脈血栓の形成の多くは冠状動脈、脳動脈、腸系膜動脈及び手足動脈等に見られ、血栓のタイプは早期において血小板血栓が多く、それからフィブリン血栓である。臨床的表れは以下である：（１）発病の多くが突然で、局所の激しい痛み、例えば狭心症、腹痛、手足の激痛などを伴う；（２）関連供血部位の組織の虚血、酸素不足によってもたらされる臓器、組織構造及び機能異常、例えば心筋梗塞、心不全、心原性ショック、不整脈、意識障害及び片麻痺などである。（３）血栓の脱落により引き起こされる脳栓塞、腎栓塞、脾臓栓塞などの関連症状及び特徴である；（４）血液供給組織の虚血性壊死によって引き起こされる臨床的症状、例えば発熱等である。毛細血管血栓の形成はよくＤＩＣ、ＴＴＰ及び溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）等で見られる。臨床上の表れの多くの場合特異性がなく、主に皮膚粘膜の栓塞性壊死、微小循環不全及び臓器機能障害である。
【００６４】
「糖尿病」は遺伝的要素、免疫機能の乱れ、微生物感染及びその毒素、フリーラジカル毒素、精神要因などの各種病気誘発因子が生体に作用することによる、インスリン減退、インスリン抵抗などによって引き起こされる糖、タンパク質、脂肪、水及び電解質等の一連の代謝に乱れが生じる症候群であり、臨床的には高血糖を主な特徴とする。
【００６５】
「糖尿病合併症」は糖尿病プロセスにおける血糖の制御不良によって引き起こされる身体のその他の臓器または組織のダメージまたは機能障害であり、肝臓、腎臓、心臓、網膜、神経系のダメージまたは機能障害等を含む。世界保健機関の統計によれば、糖尿病合併症は１００種類以上あり、現在における合併症が最も多い疾患である。これらの糖尿病の合併症は主に患者の各臓器の大血管、小血管、微小血管が損傷を受けることによって起こ
るものである。
【００６６】
「糖尿病性大血管病変」は主に主動脈及び各臓器の動脈に発生するアテローム性動脈硬変である。その発病メカニズムは以下の面を含む：１）持続性の高血糖は血液の粘度及び凝固性を向上させ、これにより動脈の血管弾性の弱まり及び喪失をもたらす；２）脂質類代謝異常、それはコレステロール及びコレステロールエステルの細胞内における堆積を促進し、これによりアテローム性動脈硬変の発生および発展をもたらす；３）動脈壁の内皮細胞損傷、血流動力学の変化により血液が機械的に長期的に血管内皮に衝突し、内皮の損傷を引き起こし、これにより血小板、フィブリンが損傷部位において凝集して血栓を形成し、さらには炎症を引き起こす；４）凝血メカニズムに関与する糖タンパク質因子が多くなり、血小板及びフィブリンが損傷した内皮下層に附着することで溶解能力が低下することを促進し、これにより血栓を形成する。
【００６７】
「糖尿病性微小血管病変」とは糖尿病患者の生体の各臓器または組織の微小循環において異なる程度の異常がもたらす微小血管障害である。微小血管障害が形成するプロセスは概ね以下である：微小循環の機能改変、内皮損傷、基膜の厚み増大、血液粘度の上昇、赤血球の凝集、血小板の粘着及び凝集、最終的には微小血栓形成及び／または微小血管閉塞をもたらす。
【００６８】
前記の二種類の「糖尿病性血管病変」は組織または臓器の局所血管損傷、血流不順、細胞の酸素欠乏、血液凝塊の形成、血栓及び炎症をもたらし、さらには周辺の組織及び臓器の機能に影響し、これにより糖尿病合併症をもたらす。例えば、糖尿病性心臓病、糖尿病性腸疾患、糖尿病性腎臓病、糖尿病性網膜症、糖尿病性肝臓疾患、糖尿病性神経病変である。
【００６９】
「糖尿病性腎疾患」は糖尿病微小血管合併症であり、主に糖尿病性糸球体硬化症といい、これは血管損傷を主とする糸球体の病変であり、タンパク尿、高血圧、むくみ、糸球体硬化症、血管構造変化及び細管間質性疾患（ｔｕｂｕｌｏｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）を含むことを特徴とする。糖尿病性腎臓疾患の第一の臨床的証拠は通常、尿液中に存在するアルブミン尿であり、例えば微量アルブミン尿（ｍｉｃｒｏａｌｂｕｍｉｎｕｒｉａ）または大量アルブミン尿（ｍａｃｒｏａｌｂｕｍｉｎｕｒｉａ）である。
【００７０】
「糖尿病性神経病変」は「糖尿病性神経病」とも呼ばれ、糖尿病によって引き起こされる神経系損傷によってもたらされ、感覚神経損傷、運動神経損傷及び自主神経損傷を含む。そのうち感覚神経損傷が通常比較的ひどく、よく見られる症状は以下を含むがこれらに限られない：体の痛み、感覚減退、痺れ、熱さ、冷たさ、及び糖尿病神経性疼痛；糖尿病合併症によって引き起こされる自発性疼痛、痛覚減退（ｈｙｐｏａｌｇｅｓｉａ）、痛覚過敏（ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ）等を含むがこれらに限られない。
【００７１】
「糖尿病性神経疼痛」は糖尿病の神経病変の最もよく見られる形であり、通常は糖尿病による感覚神経の損傷によってもたらされる。主な疼痛は通常、温度及び触覚の喪失を伴い、疼痛の発生は足の感覚の場合が多く、同時に腕及び胴体にも発生する。一般的には末梢及び中枢神経疼痛に分けることができる。周囲神経疼痛は周囲神経の損傷によって引き起こされ、中枢神経疼痛は中枢神経系及び／または脊髄損傷によって引き起こされる。
【００７２】
「糖尿病性肝損傷」は糖尿病によって引き起こされる肝臓組織学及び機能に変化が生じる病変である。それは主に糖尿病によって引き起こされる大血管、微細血管病変によってもたらされる。糖尿病によって引き起こされる肝損傷は以下を含む：肝酵素学的異常であって、肝細胞内の二酸化炭素の蓄積、酸中毒、酸素供給の減少、酸素消耗の増加を引き起こし、肝臓アミノ基移転酵素の活性を向上させ、ビリルビンの代謝を乱し、ひどいものは
肝細胞の壊死をもたらす；脂肪肝、脂肪肝をもたらすすべての病因において、糖尿病は第３位を占め、そのうち、２１％〜７８％の糖尿病患者は脂肪肝を伴う；肝炎、肝硬変及び肝臓がん、そのうち糖尿病患者におけるウイルス性肝炎の疾患率は健常者の２〜４倍であり、原発性の肝臓がんの発生率は健常者の４倍である。
【００７３】
臨床において、糖尿病によって引き起こされる肝疾患及びその関連症状は以下を含むがこれらに限られない：肝臓酵素学異常、肝臓周辺の不快感と圧迫痛、肝腫大、脾腫大、肝脾腫大、肝炎、脂肪肝、胆管炎、肝硬変、肝壊死及び肝臓がんである。
【００７４】
「糖尿病性心血管疾患」とは糖尿病によって引き起こされる心血管系の組織学及び機能変化が生じる病変であり、最もよく見られる糖尿病合併症の一つであり、主に糖尿病によって引き起こされる大血管、小血管、微小血管病変によってもたらされる。そのうち、患者は臨床的に心電図異常、心臓の拡張、不整脈、狭心症、無痛性心筋梗塞、心不全として現れる。統計によれば、概ね７０％−８０％の糖尿病患者は最終的に心血管合併症で死亡する。
【００７５】
「糖尿病性網膜病変」は「糖尿病性網膜症」とも呼ばれ、糖尿病に引き起こされる、網膜に組織学及び機能的変化が生じる病変であり、主に糖尿病によって引き起こされる大血管、微小血管の病変がもたらすものである。糖尿病網膜症は最もよく見られる糖尿病性眼疾患であり、視力減退または失明をもたらす。統計によれば、５０％の糖尿病患者は病程の１０年前後において該病変が現れ、１５年以上では８０％に達する。糖尿病の病状がひどく、年齢が大きいほど、発病の確率が高い。
【００７６】
ＣＴまたはＭＲＩ等の技術により患者の血栓組織を検査する際、病巣部に新鮮血栓、または陳旧性血栓が見られる。初発の病巣は急性発作期では新鮮病巣であり、病巣部組織が虚血して中心部分が壊死し、一部は回復する可能性があり、周辺領域は影響を受けていない。この時の治療目的は主に「中心梗塞領域」の拡大を防ぐことである。一方で陳旧性血栓の場合は組織の虚血により中心部は完全に壊死し、治療目的は梗塞域の周辺組織機能が継続的に改善されることに尽力することである。陳旧性血栓は比較的高い再発リスクを有し、そのため陳旧性血栓の患者によって、治療と予防は同じように重要で、症状を減軽すると同時に高い再発率を低減させることができる。現在の複数種類の血栓溶解薬は急性期の新鮮血栓に対しては治療効果が優れているが、しかし陳旧性血栓に対しては治療効果が比較的良くない。
【００７７】
「プラスミン」は血液中に存在する非常に重要な酵素であり、フィブリン凝塊をフィブリン分解生成物及びＤ−二量体に加水分解できる。
【００７８】
「プラスミノゲン」はプラスミンの酵素前駆体の形であり、ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔ中の配列に基づいて、シグナルペプチドを含有する天然ヒト由来プラスミノゲンのアミノ酸配列（配列４）は計算によれば８１０個のアミノ酸からなり、分子量は約９２ｋＤであり、主に肝臓において合成され且つ血液中で循環できる糖タンパク質であり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列３に示される通りである。フルサイズのプラスミノゲンは七つのドメインを含む：Ｃ末端に位置するセリンプロテアーゼドメイン、Ｎ末端に位置するＰａｎ  Ａｐｐｌｅ（ＰＡｐ）ドメイン及び５つのＫｒｉｎｇｌｅドメイン（Ｋｒｉｎｇｌｅ１−５）を含む。ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔ中の配列を参照すれば、そのシグナルペプチドは残基Ｍｅｔ１−Ｇｌｙ１９を含み、Ｐａｐは残基Ｇｌｕ２０−Ｖａｌ９８を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ１は残基Ｃｙｓ１０３−Ｃｙｓ１８１を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ２は残基Ｇｌｕ１８４−Ｃｙｓ２６２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ３は残基Ｃｙｓ２７５−Ｃｙｓ３５２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ４は残基Ｃｙｓ３７７−Ｃｙｓ４５４を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ５は残基Ｃｙｓ４８１−Ｃｙｓ５６０を含む。ＮＣＢＩデータによれば、セリンプロテア
ーゼドメインは残基Ｖａｌ５８１−Ａｒｇ８０４を含む。
【００７９】
Ｇｌｕ−プラスミノゲンは天然のフルサイズのプラスミノゲンであり、７９１個のアミノ酸からなる（１９個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含まない）、該配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１に示される通りであり、そのアミノ酸配列は配列２に示される通りである。体内において、さらにＧｌｕ−プラスミノゲンの第７６−７７位のアミノ酸の位置で加水分解することにより形成されたＬｙｓ−プラスミノゲンが存在し、例えば配列６に示されるものであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列５が示す通りである。Δ−プラスミノゲン（δ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はフルサイズのプラスミノゲンにＫｒｉｎｇｌｅ２−Ｋｒｉｎｇｌｅ５構造の欠損が生じているフラグメントであり、Ｋｒｉｎｇｌｅ１及びセリンプロテアーゼドメインしか含有せず（非特許文献２８，２９）、δ−プラスミノゲンのアミノ酸配列（配列８）を報告している文献があり（非特許文献３０）、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は例えば配列７である。ミニプラスミノゲン（Ｍｉｎｉ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はＫｒｉｎｇｌｅ５及びセリンプロテアーゼドメインからなり、残基Ｖａｌ４４３−Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドＧｌｕ−プラスミノゲン配列を含まないＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）について文献が報告しており（非特許文献３１）、そのアミノ酸配列は配列１０に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列９が示す通りである。しかしマイクロプラスミノゲン（Ｍｉｃｒｏ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はセリンプロテアーゼドメインのみ含有し、そのアミノ酸配列は残基Ａｌａ５４３−Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ−プラスミノゲン配列のＧｌｕ残基は開始アミノ酸である）と文献が報告し（非特許文献３２）、特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａはそれが残基Ｌｙｓ５３１−Ａｓｎ７９１を含むと開示し（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ−プラスミノゲン配列のＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）、本特許の配列は特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａを参照でき、そのアミノ酸配列は配列１２に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１１に示される通りである。
【００８０】
本発明の「プラスミン」と「フィブリンプラスミン」、「繊維タンパクプラスミン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。「プラスミノゲン」と「フィブリンプラスミノゲン」、「繊維タンパクプラスミノゲン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。
【００８１】
本発明の「新鮮血栓」及び「急性血栓」は互いに置き換えて使用できる；「陳旧性血栓」と「慢性血栓」は互いに置き換えて使用できる。
【００８２】
循環プロセスにおいて、プラスミノゲンは閉鎖した非活性コンフォメーションであるが、血栓または細胞表面に結合した際、プラスミノゲン活性化剤（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ
ａｃｔｉｖａｔｏｒ，ＰＡ）の介在下において、開放性のコンフォメーションを有する活性プラスミンとなる。活性を有するプラスミンはさらにフィブリン凝塊をフィブリン分解生成物及びＤ−二量体に加水分解して、これにより血栓を溶解させる。そのうちプラスミノゲンのＰａｐドメインはプラスミノゲンを非活性閉鎖コンフォメーションにする重要な決定クラスターであり、しかしＫＲドメインは受容体及び基質上のリシン残基と結合できるものである。プラスミノゲン活性化剤としての酵素は、既に複数種類知られ、以下を含む：組織プラスミノゲン活性化剤（ｔＰＡ）、ウロキナーゼプラスミノゲン活性化剤（ｕＰＡ）、カリクレイン及び凝結因子ＸＩＩ（ハーゲマン因子）などである。
【００８３】
「プラスミノゲン活性フラグメント」とはプラスミノゲンのタンパク質において、基質中のターゲット配列と結合してタンパク質加水分解機能を発揮できる活性フラグメントである。本発明はプラスミノゲンの技術構成に係り、プラスミノゲン活性フラグメントでプラスミノゲンの代替とする技術構成を含む。本発明に記載のプラスミノゲン活性フラグメ
ントはプラスミノゲンのセリンプロテアーゼドメインを含むタンパク質であり、好ましくは、本発明に記載のプラスミノゲン活性フラグメントは配列１４、配列１４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性のアミノ酸配列を含有するタンパク質を含むものである。そのため、本発明に記載のプラスミノゲンは該プラスミノゲン活性フラグメントを含み、且つ依然該プラスミノゲン活性を有するタンパク質を含む。
【００８４】
現在、血液中のプラスミノゲン及びその活性測定方法は以下を含む：組織フィブリンプラスミノゲン活性化剤の活性に対する測定（ｔ−ＰＡＡ）、血漿組織プラスミノゲン活性化剤抗原に対する測定（ｔ−ＰＡＡｇ）、血漿組織プラスミノゲン活性に対する測定（ｐｌｇＡ）、血漿組織プラスミノゲン抗原に対する測定（ｐｌｇＡｇ）、血漿組織プラスミノゲン活性化剤の阻害物活性に対する測定、血漿組織プラスミノゲン活性化剤の阻害物抗原に対する測定、血漿プラスミン−抗プラスミン複合物に対する測定（ＰＡＰ）。最もよく見られる測定方法は発色基質法である：測定対象の血漿中にストレプトキナーゼ（ＳＫ）と発光基質を添加し、測定対象の血漿中のＰＬＧはＳＫの作用下においてＰＬＭとなり、後者は発光基質に作用し、その後に分光光度計で測定し、吸光度の増加はプラスミノゲンの活性と正比例関係となる。この他にも免疫化学法、ゲル電気泳動法、免疫比濁法、放射免疫拡散法などを用いて血液中のフィブリンプラスミノゲン活性に対して測定を行う。
【００８５】
「オルソロジー（ｏｒｔｈｏｌｏｇｙ）」とは異なる種どうしのオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）であり、タンパク質の相同物もＤＮＡの相同物も含む。それは具体的に異なる種どうしの同じ祖先の遺伝子から進化して得られるタンパク質または遺伝子を言う。本発明のプラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンを含み、さらには異なる種に由来する、プラスミノゲン活性を有するプラスミノゲン直系同源物または直系同系物である。
【００８６】
「保存的置換バリアント」とはそのうちの一つの指定されたアミノ酸残基が改変されたがタンパク質または酵素の全体のコンフォメーション及び機能を変えないものであり、これは類似の特性（例えば酸性、アルカリ性、疎水性など）のアミノ酸でペアレントタンパク質中のアミノ酸配列中のアミノ酸を置換するものを含むがこれらに限られない。類似の性質を有するアミノ酸は知られている通りである。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリシンは親水性のアルカリ性アミノ酸であり且つ互いに置き換えることができる。同じように、イソロイシンは疎水アミノ酸であり、ロイシン、メチオニンまたはバリンによって置換されることができる。そのため、機能の類似する二つのタンパク質またはアミノ酸配列の類似性は異なる可能性もある。例えば、ＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づいて７０％〜９９％の類似性（同一性）を有する。「保存的置換変異体」はさらにＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムに基づいて６０％以上のアミノ酸同一性を有するポリペプチドまたは酵素であり、７５％以上に達すればさらによく、最も好ましくは８５％以上に達し、さらには９０％以上に達するのが最も好ましく、さらに天然またはペアレントタンパク質または酵素と比較して同じまたは基本的に類似する性質または機能を有する。
【００８７】
「分離された」プラスミノゲンとは天然環境から分離及び／または回収されたプラスミノゲンタンパク質である。いくつかの実施形態において、前記プラスミノゲンは（１）９０％を超える、９５％を超える、または９８％を超える純度（重量で計算した場合）になるまで精製し、例えばＬｏｗｒｙ法によって決まるもので、例えば９９％（重量で計算した場合）を超えるまで精製する、（２）少なくともスピニングカップ配列分析装置によりＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基が得られる程度になる精製する、または（３）同質性になるまで精製する。該同質性はクマシーブリリアントブルーまたは銀染色により還元性または非還元性条件下のドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミノゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって決まるものである。分離されたプラスミノゲンはバイオエンジニアリング技術により組み換え細胞から製造することができ、さら
に少なくとも一つの精製ステップで分離されたプラスミノゲンを含む。
【００８８】
用語の「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は本明細書において互いに置き換えて使用でき、いかなる長さのアミノ酸の重合体をも指し、遺伝的にコードされた及び非遺伝的にコードされたアミノ酸、化学的または生化学的に修飾されまたは派生したアミノ酸、及び修飾されたペプチド主鎖を有するポリペプチドを含む。該用語は融合タンパク質を含み、異種性アミノ酸配列を有する融合タンパク質を含むがこれに限られず、異種性と同種性由来のリーダー配列（Ｎ端メチオニン残基を有するか有しない）を含む融合物；等々である。
【００８９】
参照ペプチド配列の「アミノ酸配列同一性パーセンテージ（％）」の定義は、必要な時にギャップを導入することで最大のパーセンテージ配列の同一性を実現した後、如何なる保存的な置換も配列同一性の一部として見なさない場合、候補配列中における参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基のパーセンテージである。パーセンテージのアミノ酸配列の同一性を測定することを目的とした比較は本分野の技術範囲における複数種類の方式によって実現でき、例えば公衆が入手できるコンピュータソフトウエア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアによって実現できる。当業者は引用配列の適切なパラメータを決めることができ、比較対象の配列のフルサイズを比較することで最大比較の要求を実現するための如何なるアルゴリズムも含む。しかし、本発明の目的のために、アミノ酸配列の同一性パーセンテージは配列比較コンピュータソフトウエアＡＬＩＧＮ−２により得られるものである。
【００９０】
ＡＬＩＧＮ−２を用いることによりアミノ酸配列を比較する場合、アミノ酸配列Ａと所定のアミノ酸配列Ｂのアミノ酸配列同一性％（または所定のアミノ酸配列Ｂのあるアミノ酸配列と同一性を有する所定のアミノ酸配列Ａの占める％）は以下のように計算される：
分数Ｘ／Ｙ×１００
【００９１】
そのうちＸは配列比較プログラムＡＬＩＧＮ−２によって該プログラムのＡ及びＢの比較において同一でマッチングすると評価したアミノ酸残基の数であり、且つそのうちＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である。以下のように理解するべきである：アミノ酸配列Ａの長さとアミノ酸配列Ｂの長さが等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列の同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは異なる。明確に説明した場合を除き、本文中において使用するすべてのアミノ酸配列同一性値％は前記の段落に記載の通りであり、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムによって得られるものである。
【００９２】
本文において使用されているように、用語の「治療」、「処理」及び「解消」は期待される薬理及び／または生理的効果が得られることを言う。前記効果は疾患またはその症状を完全または一部予防すること、及び／または疾患及び／またはその症状を一部または完全に治癒させるものとする。さらに以下を含む：（１）疾患が被験者の体内で発生することを予防し、前記被験者は疾患の要因を持っているが、該疾患を有すると診断されていない状況である；（２）疾患を抑制し、その形成を阻害する；及び（３）疾患及び／またはその症状を減軽し、即ち疾患及び／またはその症状を減退させる。
【００９３】
用語の「個体」、「被験者」及び「患者」は本明細書中において互いに置き換えて使用でき、哺乳動物を指し、ネズミ（ラット、マウス）、ヒト以外の霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含むがこれらに限られない。
【００９４】
「治療上有効量」または「有効量」とは、哺乳動物またはその他の被験者に投与して疾
患の治療に用いられる際に、疾患の前記予防及び／または治療を実現できるプラスミノゲンの量である。「治療上有効量」は使用するプラスミノゲン、治療しようとする被験者の疾患及び／または症状の重症度及び年齢、体重などに従って変化するものである。
【００９５】
２、本発明のプラスミノゲンの製造
プラスミノゲンは自然界から分離及び精製され、さらに治療の用途に用いられるものであり、さらには標準的な化学ペプチド合成技術によって合成することができる。化学的手法によりポリペプチドを合成する際、液相または固相で合成を行うことができる。固相ポリペプチド合成（ＳＰＰＳ）（配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に附着させ、順番に配列中の残りのアミノ酸を添加する）はプラスミノゲンの化学的合成に適したものである。各種形式のＳＰＰＳ、例えばＦｍｏｃ及びＢｏｃは、プラスミノゲンの合成に用いることができる。固相合成に用いられる技術は以下に記載されている：Ｂａｒａｎｙ及びＳｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；３−２８４ページ、Ｔｈｅ
Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．第二巻：Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ  Ａ．，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ｔら  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５６（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．（１９８４）；及びＧａｎｅｓａｎ  Ａ．２００６Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．６：３−１０及びＣａｍａｒｅｒｏ  ＪＡら  ２００５Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｌｅｔｔ．１２：７２３−８。簡単に言えば、その上にペプチド鎖を構築している機能性ユニットにより不溶性の多孔ビーズを処理する。カップリング／脱保護の繰り返し循環後に、附着した固相の遊離Ｎ末端アミンと単一のＮ保護を受けているアミノ酸ユニットをカップリングさせる。それから、該ユニットを脱保護し、他のアミノ酸と接続する新しいＮ末端アミンを露出させる。ペプチドを固相上に固定したままにし、それからそれを切除する。
【００９６】
標準的な組み換え方法により本発明のプラスミノゲンを生産する。例えば、プラスミノゲンをコードする核酸を発現ベクター中に挿入し、それと発現ベクター中の制御配列を操作可能に接続させる。発現制御配列はプロモーター（例えば天然に関連されているプロモーター、または異種由来のプロモーター）、シグナル配列、エンハンサー素子及び転写終了配列を含むが、これらに限られない。発現の制御はベクター中の真核プロモーター系とすることができ、前記ベクターは真核宿主細胞（例えばＣＯＳまたはＣＨＯ細胞）を形質転換またはトランスフェクションさせることができるものである。一旦ベクターを適切な宿主に導入すれば、ヌクレオチド配列の高レベル発現及びプラスミノゲンの収集及び精製の条件下において宿主を維持できる。
【００９７】
適切な発現ベクターは通常宿主体内において附加体または宿主染色体ＤＮＡの整合部分として複製される。通常、発現ベクターは選択マーカー（例えばアンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性またはネオマイシン耐性）を含み、これは外部由来に期待のＤＮＡ配列で形質転換されたそれらの細胞に対して測定を行うことに有用である。
【００９８】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）はプラスミノゲンをコードするポリヌクレオチドをクローンする原核宿主細胞の例である。その他の使用に適した微生物宿主は桿菌を含み、例えばバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びその他の腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えばサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、及び各種シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種である。これらの原核宿主において、発現ベクターを生成でき、通常は宿主細胞と許容する発現制御配列（例えば複製開始点）を含むものである。ま
た、多くの公知のプロモーターが存在し、例えば乳糖プロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、またはファージλ由来のプロモーター系である。プロモーターは通常発現を制御し、遺伝子配列を操縦する場合、さらにリボソームの結合位置配列を有し、転写及び翻訳を起動させてもよい。
【００９９】
その他の微生物、例えば酵母も発現に用いることができる。酵母（例えば出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））及びピキア（Ｐｉｃｈｉａ）が適した酵母宿主細胞の例であり、そのうちの適切な担体は必要に応じて発現制御配列（例えばプロモーター）、複製開始点、終止配列など含む。典型的なプロモーターは３−ホスホグリセリン酸キナーゼ及びその他の糖分解酵素を含む。誘導型酵母はアルコール脱水素酵素、イソ細胞色素Ｃ、及び麦芽糖とガラクトースの利用のための酵素のプロモーターによって起動される。
【０１００】
微生物以外に、哺乳動物細胞（例えば体外細胞培養物中において培養された哺乳動物細胞）も本発明のプラスミノゲンの発現に用いることができる（例えばプラスミノゲンをコードするポリヌクレオチド）。例えばＷｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ
Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）参照。適した哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞系、各種Ｃｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、及び形質転換されたＢ細胞またはハイブリドーマである。これらの細胞に用いられる発現ベクターは発現制御配列、例えば複製開始点、プロモーター、及びエンハンサー（Ｑｕｅｅｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、及び必要とされる加工情報位置、例えばリボソームの結合位置、ＲＮＡの切断位置、ポリアデノシン酸化位置、及び転写終止子配列を含むことができる。適切な発現制御配列の例はウサギ免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウィルス、サイトメガロウイルスなどの派生のプロモーターである。Ｃｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照すること。
【０１０１】
一旦合成（化学または組み換え方式）されれば、本分野の標準的な手順、例えば硫酸アンモニウム沈殿、アフィニテイカラム、カラムクロマトグラフィー、高速液相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ゲル電気泳動などにより本発明に記載のプラスミノゲンを精製することができる。該プラスミノゲンは基本的に純粋なものであり、例えば少なくとも約８０％から８５％の純度で、少なくとも約８５％〜９０％の純度で、少なくとも約９０％〜９５％の純度で、または９８％〜９９％の純度またはさらに純度が高いものであり、例えば汚染物を含まず、前記汚染物は例えば細胞砕片、プラスミノゲン以外の大分子などである。
【０１０２】
３、薬物配合剤
必要とする純度のプラスミノゲンと選択可能な薬用担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．ｅｄ．（１９８０））を混合して凍結乾燥製剤または水溶液を形成して治療用の配合剤を得る。許容可能な担体、賦形剤、安定剤は所要の用量及び濃度下において被験者に対して毒性がなく、さらに例えばリン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸などの緩衝剤を含む。抗酸化剤はアスコルビン酸和メチオニンを含む；防腐剤（例えばベンジルジメチルステアリルアンモニウムクロリド水和物；塩化ヘキサメチレンジアミン；塩化ベンザルコニウム（ｂｅｎｚａｌｋｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブタノールまたはベンジルエタノール；アルキルパラヒドロキシ安息香酸エステル、例えばメチルまたはプロピルのパラヒドロキシ安息香酸エステル；ピロカテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンチルエタノール；ｍ−クレゾール）；低分子量ポリペプチド（少なくとも１０個の残基を有するもの）；タンパク質例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリゼニールピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン
、アルギニンまたはリシンである；単糖、二糖及びその他の炭水化物はブドウ糖、マンノース、またはデキストリンを含む；キレート剤は例えばＥＤＴＡである；糖類は例えばショ糖、マンニトール、フコースまたはソルビトールである；塩形成イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば亜鉛−タンパク複合体）；及び／または非イオン界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。好ましくは凍結乾燥された抗−ＶＥＧＦ抗体配合剤であり、ＷＯ  ９７／０４８０１に記載されているとおりであり、本明細書において参考とされるものである。
【０１０３】
本発明の配合剤は治療を必要とする具体的な症状に必要な一種類以上の活性化合物を含有してもよく、好ましくは活性が相補的で互いに副作用を有しないものである。例えば、血圧降下薬、抗不整脈薬、糖尿病治療薬等である。
【０１０４】
本発明のプラスミノゲンは例えば凝集技術または界面重合によって作られるマイクロカプセル中に包まれることができ、例えば、膠質薬物輸送系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン剤、ナノ粒子及びナノカプセル）中に入れまたはエマルジョン状液中のヒドロキシメチルセルロースまたはゲルーマイクロカプセル及びポリ―（メタアクリル酸メチル）マイクロカプセル中に入れることができる。これらの技術は以下に開示されている。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）。
【０１０５】
体内に投与することに用いられる本発明のプラスミノゲンは必ず無菌である必要がある。これは凍結乾燥及び再度配合する前または後に除菌ろ過膜でろ過することで容易に実現できる。
【０１０６】
本発明のプラスミノゲンは緩衝製剤を調製できる。緩衝製剤の適切な実例は一定の形状を有し且つ糖タンパクを含む固体の疎水性重合体の半透過基質を含み、例えば膜またはマイクロカプセルである。緩衝基質の実例はポリエステル、水性ゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタアクリル酸エステル）（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））またはポリ（ビニールアルコール）、ポリラクチド（米国特許３７７３９１９，ＥＰ  ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγメチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎ，ら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７（１９８３））、分解できないエチレン−ビニルアセテート（ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｖｉｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）（Ｌａｎｇｅｒ，ら，出所は前記と同じ）、または分解可能な乳酸−ヒドロキシ酢酸共重合体、例えばＬｕｐｒｏｎ  ＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸−ヒドロキシ酢酸共重合体及びリュープロレリン（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）酢酸エステルからなる注射可能なミクロスフェア体）、及びポリＤ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。重合体、例えばエチレン−酢酸エチル及び乳酸−ヒドロキシ酢酸は、持続的に１００日間以上分子を放出することができ、しかしいくつかの水性ゲルがタンパク質を放出する時間は比較的短い。関連のメカニズムに応じてタンパク質を安定化させる合理的なストラテジーを設計できる。例えば、凝集のメカニズムが硫化ジスルフィド結合の交換によって分子間Ｓ−Ｓ結合を形成するであれば、メルカプト基残基を修飾することにより、酸性溶液中から凍結乾燥させ、湿度を制御し、適切な添加剤を用いて、及び特定の重合体基質組成物を開発することで安定化を実現できる。
【０１０７】
４．投与及び用量
異なる方式、例えば静脈内、腹膜内、皮下、頭蓋骨内、髄腔内、動脈内（例えば頸動脈）、筋肉内、鼻内、体表または皮内投与または脊髄または脳内輸送により本発明の薬物組成物の投与を実現できる。エアロゾル製剤例えば鼻噴霧製剤は活性剤を含有する精製した水性またはその他の溶液及び防腐剤と等張剤を含有する。このような製剤を鼻粘膜と許容
し得るｐＨ及び等張状態に調整する。
【０１０８】
一部の場合において、以下の方式により本発明のプラスミノゲン薬物組成物を修飾または調製することができ、これにより血液脳関門を貫通する能力を提供する。各種腸内及び胃腸外の投与ルート、内服、静脈内等を含むもので血栓及び／または血栓関連疾患を患っている個体に対してこのようなプラスミノゲン組成物を投与する。
【０１０９】
胃腸外での投与に用いられる製造物は無菌水性または非水性溶液、懸濁液及び乳剤を含む。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は水、アルコール性／水性溶液、乳剤または懸濁液を含み、食塩水及び緩衝媒介を含む。胃腸外媒介物は塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、または固定油である。静脈内媒介物は液体及び栄養補充物、電気分解補充物などを含む。されには防腐剤及びその他の添加剤、例えば抗微生物製剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなども存在してもよい。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、本発明のプラスミノゲンは血液脳関門の通過を促進する薬剤と配合されている。いくつかの場合において、本発明のプラスミノゲンは直接またはアダプターにより血液脳関門の通過を促進する担体分子、ペプチドまたはタンパク質と融合する。一部の実施形態において、本発明のプラスミノゲンは内在性血液脳関門（ＢＢＢ）受容体に結合するポリペプチドと融合する。プラスミノゲンと内在性血液脳関門受容体に結合するポリペプチドは、ＢＢＢの通過を促進する。内在性血液脳関門（ＢＢＢ）受容体に結合するポリペプチドは抗体、例えばモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントを含み、それは特異的に内在性ＢＢＢ受容体に結合する。適切な内在性ＢＢＢ受容体はインスリン受容体を含むがこれに限られず、抗体はリポソームに内包されたものである。体、鉄タンパク受容体、リポタンパク受容体、及びインスリン様成長因子受容体である。例えば米国特許公開文書Ｎｏ．２００９／０１５６４９８を参照すること。
【０１１１】
医療関係者は各種臨床的要素により用量案を決めることができる。例えば医学分野で公知のように、任意の患者の用量は複数の要素によって決められ、これらの要素は患者の体型、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与回数及び経路、全体の健康度、及び同時に投与するその他の薬物を含む。本発明が含有するプラスミノゲンの薬物組成物の用量の範囲は例えば被験者体重に対して毎日約０．０００１〜２０００ｍｇ／ｋｇであり、または約０．００１〜５００ｍｇ／ｋｇ（例えば０．０２ｍｇ／ｋｇ，０．２５ｍｇ／ｋｇ，０．５ｍｇ／ｋｇ，０．７５ｍｇ／ｋｇ，１０ｍｇ／ｋｇ，５０ｍｇ／ｋｇなど）である。例えば、用量は１ｍｇ／ｋｇ体重または５０ｍｇ／ｋｇ体重または１−５０ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができ、または少なくとも１ｍｇ／ｋｇである。この例示性の範囲より高いまたは低い用量もカバーされ、特に前記の要素を考慮した場合である。前記範囲中の中間用量も本発明の範囲内に含まれるものである。被験者は毎日、隔日、毎週または経験分析によって決められた任意のスケジュール表に従ってこのような用量を投与できる。例示的な用量の日程表は連続数日１−１０ｍｇ／ｋｇ投与することである。本発明の薬物の投与過程において血栓疾患及びその関連疾患の治療効果及び安全性はリアルタイムに評価、定期的に評価すべきである。
【０１１２】
５．治療効力及び治療安全性
治療の効力
プラスミノゲンの治療効力に対する評価は主に以下の指標をモニタリングすることによって行われる：
（１）治療一週間後の血栓溶解率。例えば、ガイドチューブから造影剤を注入し、毎日血栓溶解状況について評価し、各血管域に対してスコア付けを行い、完全に解消されてい
るものは０点、一部閉塞しているものは１点とし、完全に閉塞しているものは２点とする。血栓を溶解させる前の総スコアから血栓を溶解させた後の総スコアを引き、血栓を溶解する前の総スコアを割って、得られた割合に応じて異なる血栓溶解ランクとし、一級＜５０％、二級５０％〜９０％、三級は血栓が完全に溶解したものとする。
（２）６か月後の血管開通率。例えば、内視鏡、ＣＴ血管造影分析、カラードップラー超音波などの方法により血管開通率に対して評価を行う。治療後の血管開通率のパーセンテージが治療前と比較して統計学的に顕著に向上されているかによって、治療の有効性を判断する。
（３）６か月後の血管閉塞及び／または静脈還流率。治療後の血管閉塞及び／または静脈還流率の低下を統計することにより薬剤の血栓溶解率に対する改善を判断する。
（４）その他の評価指標；例えば、血管腔内エコー変化、血管壁の厚み比較、及び２年後の血栓後遺症発生率等である。例えば、血管壁の厚み及び腔内エコーはグレースケール超音波を用いて評価でき、回腸静脈、大腿静脈の血流及び大腿静脈弁機能膜不全に対しては患者の立ち姿勢におけるトップラー超音波を用いて評価することができる。
【０１１３】
安全性の評価
プラスミノゲン薬物を用いて血栓を治療した後の安全性に対して評価を行い、前記評価は主に治療後の有害事象の発生率を観察することを含む。一般的にはひどい出血、栓塞、卒中、死亡を重大有害事象し、次に出血及びその他の軽微な症状の合併症を副次的有害事象とする。
【０１１４】
安全性評価において、最もよく見られる有害事象は出血であり、例えば脳内出血である（または出血性ショック、網膜下出血、硬膜下出血等を含む）。本発明の前記ひどい出血は一般的に脳内出血または出血の重大さが死亡、手術、治療停止または輸血を必要とする出血事象をいい、「大出血（ｍａｊｏｒ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）事象」及び「命を脅かす出血事象」を含む。副次的な出血とはガイドチューブ周囲の出血、及び／または血栓溶解薬、抗凝固薬または抗血小板薬物の用量を変えること、または圧迫することによって止血できる出血を言う。前記「大出血」、「大出血事象」とは具体的にはヘモグロビンの含有量が少なくとも２．０ｇ／Ｌ低下するまたは少なくとも２単位の輸血を必要とするものであり、または重要部位または臓器における症状性の出血である。「大出血」よりの程度のひどい出血事象、即ち大出血のサブクラスは、「命を脅かす出血事象」と称し、致命性の出血、症状性脳内出血、ヘモグロビンが少なくとも５．０ｇ／Ｌ低下するものまたは４単位を超える血液の輸血を必要とするもの、または心筋収縮剤もしくは手術を必要とする出血を言う。
【０１１５】
また、大出血事象リスク因子を有すると評価される患者に対して、事情の重大さの程度に応じてその投与する用量に対して微調整を行いさらに投与後の有害事象に対して少なくとも３か月のフォローモニタリングを行い、好ましくは６か月以上行う。前記大出血リスクは以下を含むがこれに限られない：（１）年齢が７５歳以上、（２）以前に出血事象の病歴を有する、（３）低減されたクレアチニン除去率を有し、８０ｍＬ／分未満または５０ｍＬ／分未満である。
【０１１６】
６．製品または薬物キット
本発明の一つの実施形態は製品または薬物キットに係るものであり、血栓の治療に用いられる本発明のプラスミノゲンを含有する。前記製品は好ましくは一つの容器、ラベルまたはパンフレットを含む。適切な容器はボトル、小瓶、注射器などである。容器は各種材料例えばガラスまたはプラスチックから作られることができる。前記容器は組成物を含有し、前記組成物は本発明の疾患または症状を有効に治療し且つ無菌の入口を有する（例えば前記容器は静脈輸液用パックまたは小瓶であり、皮下注射針によって貫通される栓を含む）。前記組成物中の少なくとも一種類の活性化剤がプラスミノゲンである。前記容器上
にあるまたは添付されているラベルは前記組成物を本発明の前記血栓及び血栓関連疾患の治療に用いられるものであると説明するものである。前記製品はさらに薬用緩衝液を含有する第二容器を含み、前記薬用緩衝液は例えばリン酸塩緩衝の食塩水、リンガー溶液及びブドウ糖溶液である。さらには商業及び使用者の角度から見ると必要とされるその他の物質、即ちその他の緩衝液、希釈剤、濾過物、針及び注射器を含むことができる。また、前記製品は使用説明を有するパンフレットを含み、これは例えば前記組成物の使用者にプラスミノゲン組成物及び併発する疾患の治療に用いるその他の薬物を患者に投与することを指示するものである。
【実施例】
【０１１７】
材料と方法：
体内実験：
実験動物
Ｃ５７マウス（６−８週齢）は南方医科大学実験動物センターから購入されたものである。購入したマウスをバリア環境動物室内で飼育する。ｄｂ／ｄｂマウスは南京生物医薬研究所から購入したものである。
【０１１８】
実験設計及び投与方式
対照グループ及び実験グループのすべての動物に対して手術の方式により頸部動脈を遊離させた後に、１０％ＦｅＣｌ３を含有する濾紙で５ｍｉｎ接触させ片側頸部動脈血栓モデル構築を行い、モデル構築後１ｈ以内にプラスミノゲンを静脈注射し、対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを静脈注射する。３時間以後に対応の頸静脈血栓及び向こう側の静脈付近の筋肉を取り出す。血栓及び向こう側の静脈付近の筋肉を研磨装置で均質化（ホモジネート）を行い、遠心した後に上澄みを取り、上澄みに対してＢＣＡ法を利用してそのタンパク質総量を測定し、エライザ法を用いて均質液中のプラスミノゲン含有量を測定し、一定のタンパク質総量中のプラスミノゲン含有量を計算する。プラスミノゲン体内血栓溶解の特異性について研究する。
【０１１９】
また、２４−２５週齢ｄｂ／ｄｂマウスを対照グループ及び実験グループ動物として、それぞれ尾部静脈から溶媒ＰＢＳまたはプラスミノゲンを投与する。３１日後に眼球を摘出して血中Ｄ―二量体の測定を行い、神経、肝臓、腎臓、心臓のフィブリン免疫組織染色を行い、プラスミノゲンの体内における血栓溶解効果について研究を行う。
【０１２０】
血液中Ｄ−二量体の分析
マウスの眼球を摘出して採血を行い、血漿を得て、Ｄ−二量体キット（武漢優爾生、中国）を用いて実験操作を行い、試験が完了した後にエライザリーダー（ｅｌｉｓａ  ｒｅａｄｅｒ）（Ｂｉｏｔｅｋ米国）を用いて４５０ｎｍで数値を読み取り、データ分析を行う。
【０１２１】
免疫組織分析
神経、肝臓、腎臓、心臓を取り、１０％中性ホルマリン中にて２４時間固定を行う。固定後の心臓組織をエタノールで段階的に脱水させ及びキシレンで透明にした後にパラフィンで包埋させる。組織切片の厚みは５μｍで、切片を脱パラフィンさせて再水和した後に１回水洗いし、それからＰＡＰマーカーで組織を囲む。０．３％メタノールで希釈した過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、３回水洗いする。１０％の二次抗体と同由来の正常血清を用いて１０分間封止させ、余分な血清を吸い取る。一次抗体を室温にて３０分間インキュベーションしまたは４℃で終夜インキュベーションし、ＴＢＳで３回洗浄する。ＨＲＰでマークした二次抗体を室温にて３０分間インキュベーションし、ＴＢＳで３回洗う。ＤＡＢキット（ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で顕色させ、ヘマトキシリンで３０秒再染色して、流水で５分間安定化させ、それから
ＴＢＳで１回洗う。透明になるよう段階的に脱水してから封止を行う。用いられる抗体は以下である：マーカー抗体はＦｉｂｒｉｎ（ｏｇｅｎ）（Ａｂｃａｍ）である。切片は光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，ＢＸ４３）下にて観察する。
【０１２２】
体外血栓溶解実験の設計：
健常者の血漿を取りＥＬＩＳＡ  ９６ウェルプレート中に入れ、固定量のトロンビン（Ｓｉｇｍａ，米国）を添加して血栓を形成し、それから以下の異なる実験を行う。固定量のｔＰＡ、ｕＰＡ（ｓｉｇｍａ，米国）及び異なる量のプラスミノゲン、固定量のプラスミノゲン及び異なる量のｔＰＡ、ｕＰＡ、ストレプトキナーゼ（ｓｉｇｍａ，米国）を添加し、対照グループはＰＢＳを添加する。血栓が溶解されるまで、異なる時間のインキュベーションを行い、エライザリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ，米国）を用いてＯＤ４０５の波長を観察して吸光度の数値及び毎回の記録時間を記録する。さらにデータ分析を行う。
【実施例１】
【０１２３】
実施例１は２０時間の陳旧性血栓を１２５ｎｇ  ｔＰＡ条件下にて３７℃で１時間インキュベーションした場合の、異なる用量のプラスミノゲンの血栓溶解効果に関するものである。
【０１２４】
２匹のＳＤラットの全血を採取してＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブ内に入れ、３７℃で２０ｈインキュベーションした後に上澄みを破棄し、陳旧性血栓を形成する（非特許文献３３，３４）。ＰＢＳを添加して繰り返し５〜１０回洗浄し、ＰＢＳ溶液が澄清になるようにする。吸水紙で血栓の水分をなるべく吸い取り、それから血栓を平均的に各ＥＰチューブ中に分布させ、血栓の重量を測り、各血栓の重量が同じになるようにする。血栓をＰＢＳブランク対照グループ、１２５ｎｇ  ｔＰＡ対照グループ、２０μｇ  ｔＰＡ対照グループ、０．２ｍｇプラスミノゲングループ、１ｍｇプラスミノゲングループ及び２ｍｇプラスミノゲングループにし、各グループのチューブが３つずつである。ＰＢＳブランク対照グループに１ｍＬ  ＰＢＳを添加する；１２５ｎｇ  ｔＰＡ対照グループに１ｍＬ  ＰＢＳ及び１２５ｎｇ  ｔＰＡを添加する；２０μｇ  ｔＰＡ対照グループに１ｍＬ  ＰＢＳ及び２０μｇ  ｔＰＡを添加する；０．２ｍｇプラスミノゲングループに１ｍＬ  ＰＢＳ及び１２５ｎｇ  ｔＰＡ及び０．２ｍｇプラスミノゲンを添加する；１ｍｇプラスミノゲングループに１ｍＬ  ＰＢＳ及び１２５ｎｇ  ｔＰＡ及び１ｍｇプラスミノゲンを添加する；２ｍｇプラスミノゲングループに１ｍＬ  ＰＢＳ及び１２５ｎｇ  ｔＰＡ及び２ｍｇプラスミノゲンを添加する。すべての反応は３７℃のインキュベータにおいて行われ、１時間インキュベーションした後に上澄みを吸い取り、吸水紙でなるべく血栓の水分を吸い取り、さらに血栓の重さを測り、血栓溶解率を計算する。
【０１２５】
文献の報告によれば、正常な生理状況下におけるｔＰＡの含有量は５−１０ｎｇ／ｍＬであり（非特許文献３５）、激しい運動しまたは静脈うっ血の場合において、体内のｔＰＡの含有量は２０倍乃至１００倍に増加し、即ち１００ｎｇ／ｍＬ以上に達する（非特許文献３６）。そのため、本実験中で使用するｔＰＡの用量は１２５ｎｇ／ｍＬで、これにより体内の血栓状況下において自然に発生するｔＰＡ含有量をシミュレーションする。
【０１２６】
結果は以下を示している。体外において２０時間形成された陳旧性血栓は、１２５ｎｇのｔＰＡ条件下において、プラスミノゲンを０．２ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇを添加した場合の血栓溶解率は単独で１２５ｎｇ  ｔＰＡを添加する場合より明らかに上昇し、統計の差異は極めて顕著で、これは体内に血栓が現れた場合に自然に発生するｔＰＡレベルの状況下において、０．２ｍｇまたはより多くのプラスミノゲンを添加することにより、１時間で顕著に血栓溶解を促進できることを示している。１２５ｎｇ  ｔＰＡの条件下において、プラスミノゲン１ｍｇを添加することで体内注射用量２０μｇ  ｔＰＡの場合と同じ血栓溶解効果を得ることができる（２０μｇ  ｔＰＡは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅ
ｌｈｅｉｍ社が生産する注射用アルテプラーゼプロトコルによる、体内に血栓が生じる状況下における血栓の溶解に必要とされる用量を、ラットの必要とする注射量に変換したものである）。即ち同じような血栓溶解効率に達することができ、体内において１ｍｇプラスミノゲンが存在すれば、必要とするｔＰＡの量は元の１／１６０に減少する。また、１２５ｎｇ  ｔＰＡ条件下において、プラスミノゲン１ｍｇを添加することでプラスミノゲンの血栓溶解のピークに達し、さらに１倍多いプラスミノゲンを添加したところで血栓溶解率は下がる傾向があり、これはプラスミノゲンの添加に飽和度が存在し、飽和度は１から２ｍｇ前後であることを示している（図１）。
【実施例２】
【０１２７】
実施例２は２０時間の陳旧性血栓を１２５ｎｇ  ｔＰＡ条件下にて３７℃で２時間インキュベーションした場合の、異なる用量のプラスミノゲンの血栓溶解効果に関するものである。
【０１２８】
２匹のＳＤラットの全血を採取してＥＰチューブ内に入れ、３７℃で２０ｈインキュベーションした後に上澄みを破棄し、陳旧性血栓を形成する（非特許文献３３，３４）。ＰＢＳを添加して繰り返し５〜１０回洗浄し、ＰＢＳ溶液が澄清になるようにする。吸水紙で血栓の水分をなるべく吸い取り、それから血栓を平均的に各ＥＰチューブ中に分布させ、血栓の重量を測り、各血栓の重量が同じになるようにする。血栓をＰＢＳブランク対照グループ、１２５ｎｇ  ｔＰＡ対照グループ、２０μｇ  ｔＰＡ対照グループ、０．２ｍｇプラスミノゲングループ、１ｍｇプラスミノゲングループ及び２ｍｇプラスミノゲングループにし、各グループのチューブが３つずつである。ＰＢＳブランク対照グループに１ｍＬ  ＰＢＳを添加する；１２５ｎｇ  ｔＰＡ対照グループに１ｍＬ  ＰＢＳ及び１２５ｎｇ  ｔＰＡを添加する；２０μｇ  ｔＰＡ対照グループに１ｍＬ  ＰＢＳ及び２０μｇ
ｔＰＡを添加する；０．２ｍｇプラスミノゲングループに１ｍＬ  ＰＢＳ及び１２５ｎｇ  ｔＰＡ及び０．２ｍｇプラスミノゲンを添加する；１ｍｇプラスミノゲングループに１ｍＬ  ＰＢＳ及び１２５ｎｇ  ｔＰＡ及び１ｍｇプラスミノゲンを添加する；２ｍｇプラスミノゲングループに１ｍＬ  ＰＢＳ及び１２５ｎｇ  ｔＰＡ及び２ｍｇプラスミノゲンを添加する。すべての反応は３７℃のインキュベータ中において行われ、２時間インキュベーションした後に上澄みを吸い取り、吸水紙でなるべく血栓の水分を吸い取り、さらに血栓の重さを測り、血栓溶解率を計算する。
【０１２９】
文献の報告によれば、正常な生理状況下におけるｔＰＡの含有量は５−１０ｎｇ／ｍＬであり（非特許文献３５）、激しい運動しまたは静脈うっ血の場合において、体内のｔＰＡの含有量は２０倍乃至１００倍にまで増加し、即ち１００ｎｇ／ｍＬ以上に達する（非特許文献３６）。そのため、本実験中で使用するｔＰＡの用量は１２５ｎｇ／ｍＬで、これにより体内の血栓の状況下において自然に発生するｔＰＡ含有量をシミュレーションする。
【０１３０】
結果は以下を示している。体外において２０時間形成された陳旧性血栓は、実施例１と比較して、各グループは反応時間の延長に伴い、血栓溶解率も対応するように増加する。１２５ｎｇのｔＰＡ条件下において、プラスミノゲンを０．２ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇを添加した場合の血栓溶解率は単独で１２５ｎｇ  ｔＰＡを添加する場合より明らかに上昇し、統計の差異は極めて顕著である。これは体内に血栓が現れた場合に自然に発生するｔＰＡ用量の状況下において、０．２ｍｇまたはより多くのプラスミノゲンを添加することにより、２時間で顕著に血栓溶解を促進できることを示している。１ｍｇ、２ｍｇのプラスミノゲングループの血栓溶解効果は体内正常注射量２０μｇ  ｔＰＡ対照グループより優れている（２０μｇ  ｔＰＡは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ社が生産する注射用アルテプラーゼプロトコルによる、体内に血栓が生じる状況下における血栓の溶解に必要とされる用量を、ラットの必要とする注射量に変換したものである）。即ち同じ
ような血栓溶解効率に達することができ、体内において１ｍｇプラスミノゲンが存在すれば、必要とするｔＰＡの量は元の１／１６０未満に減少する（図２）。
【実施例３】
【０１３１】
実施例３は２０時間の陳旧性血栓の１０ｎｇ  ｔＰＡ条件下における血栓溶解率がプラスミノゲン用量の増加に応じて上昇することに関するものである。
【０１３２】
２匹のＳＤラットの全血を採取してＥＰチューブ内に入れ、３７℃で２０ｈインキュベーションした後に上澄みを破棄し、陳旧性血栓を形成する（非特許文献３３，３４）。ＰＢＳを添加して繰り返し５〜１０回洗浄し、ＰＢＳ溶液が澄清になるようにする。吸水紙で血栓の水分をなるべく吸い取り、それから血栓を平均的に各ＥＰチューブ中に分布させ、血栓の重量を測り、各血栓の重量が同じになるようにする。血栓をＰＢＳブランク対照グループ、１０ｎｇ  ｔＰＡ対照グループ、０．２ｍｇ  ｔＰＡ対照グループ、０．２ｍｇプラスミノゲングループ、１ｍｇプラスミノゲングループ及び２ｍｇプラスミノゲングループに分け、各グループのチューブが３つずつである。ＰＢＳブランク対照グループに始めに１ｍＬ  ＰＢＳを添加する；１０ｎｇ  ｔＰＡ対照グループに１ｍＬ  ＰＢＳ及び１０ｎｇ  ｔＰＡを添加する；０．２ｍｇプラスミノゲン対照グループに１ｍＬ  ＰＢＳ及び０．２ｍｇプラスミノゲンを添加する；０．２ｍｇプラスミノゲングループに１ｍＬ
ＰＢＳ及び１０ｎｇ  ｔＰＡ及び０．２ｍｇプラスミノゲンを添加する；１ｍｇプラスミノゲングループに１ｍＬ  ＰＢＳ及び１０ｎｇ  ｔＰＡ及び１ｍｇプラスミノゲンを添加する；２ｍｇプラスミノゲングループに１ｍＬ  ＰＢＳ及び１０ｎｇ  ｔＰＡ及び２ｍｇプラスミノゲンを添加する。すべての反応は３７℃のインキュベータにおいて行われ、２時間インキュベーションした後に上澄みを吸い取り、吸水紙でなるべく血栓の水分を吸い取り、さらに血栓の重さを測り、血栓溶解率を計算する。
【０１３３】
文献の報告によれば、正常な生理状況下におけるｔＰＡの含有量は５−１０ｎｇ／ｍＬであり（非特許文献３５）、そのため、本実験中で使用するｔＰＡの用量１０ｎｇ／ｍＬは、体内の正常生理状況下において自然に発生するｔＰＡ含有量をシミュレーションしたものである。
【０１３４】
結果は以下を示している。体外において２０時間形成された陳旧性血栓は、体内の正常な生理状況下において自然に発生するｔＰＡ含有量（１０ｎｇ）の条件下において、プラスミノゲンを添加した各グループの血栓溶解率はいずれも体内生理用量ｔＰＡの対照グループの血栓溶解率より高く、統計的な差異も極めて顕著である。プラスミノゲンの添加用量の増加に伴い、対応の血栓溶解率も段階的に向上する傾向を示し、これはプラスミノゲンの用量を調整することで２０時間の血栓を溶解させる速度を調整できると示している。また、０．２ｍｇプラスミノゲンの存在下において、体内の生理的レベルのｔＰＡ（１０ｎｇ）を添加したグループの血栓溶解率はｔＰＡを添加していないグループより極めて高く、０．２ｍｇのプラスミノゲンのみを添加したグループの血栓溶解効果はＰＢＳを添加した対照グループの血栓溶解効果と類似し、これは生理的レベルのｔＰＡがプラスミノゲンの血栓溶解作用を発揮させることに重要な作用を有することを示している（図３）。
【実施例４】
【０１３５】
実施例４は７２時間の陳旧性血栓の１２５ｎｇ  ｔＰＡ条件下における血栓溶解率がプラスミノゲン用量の増加に応じて上昇することに関するものである。
【０１３６】
２匹のＳＤラットの全血を採取してＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブ内に入れ、３７℃で７２ｈインキュベーションした後に上澄みを破棄し、陳旧性血栓を形成する（非特許文献３６）。ＰＢＳを添加して繰り返し５〜１０回洗浄し、ＰＢＳ溶液が澄清になるようにする。吸水紙で血栓の水分をなるべく吸い取り、それから血栓を平均的に各ＥＰチュ
ーブ中に分布させ、血栓の重量を測り、各血栓の重量が同じになるようにする。血栓をＰＢＳブランク対照グループ、１２５ｎｇ  ｔＰＡ対照グループ、０．２ｍｇプラスミノゲン対照グループ、０．２ｍｇプラスミノゲングループ、１ｍｇプラスミノゲングループ及び２ｍｇプラスミノゲングループにし、各グループのチューブが３つずつである。ＰＢＳブランク対照グループに１ｍＬ  ＰＢＳを添加する；１２５ｎｇ  ｔＰＡ対照グループに１ｍＬ  ＰＢＳ及び１２５ｎｇ  ｔＰＡを添加する；０．２ｍｇプラスミノゲン対照グループに１ｍＬ  ＰＢＳ及び０．２ｍｇプラスミノゲンを添加する；；０．２ｍｇプラスミノゲングループに１ｍＬ  ＰＢＳ及び１２５ｎｇ  ｔＰＡ及び０．２ｍｇプラスミノゲンを添加する；１ｍｇプラスミノゲングループに１ｍＬ  ＰＢＳ及び１２５ｎｇ  ｔＰＡ及び１ｍｇプラスミノゲンを添加する；２ｍｇプラスミノゲングループに１ｍＬ  ＰＢＳ及び１２５ｎｇ  ｔＰＡ及び２ｍｇプラスミノゲンを添加する。すべての反応は３７℃のインキュベータにおいて行われ、１時間インキュベーションした後に上澄みを吸い取り、吸水紙でなるべく血栓の水分を吸い取り、さらに血栓の重さを測り、血栓溶解率を計算する。
【０１３７】
文献の報告によれば、正常な生理状況下におけるｔＰＡの含有量は５−１０ｎｇ／ｍＬであり（非特許文献３５）、激しい運動しまたは静脈うっ血の場合において、体内のｔＰＡの含有量は２０倍乃至１００倍にまで増加し、即ち１００ｎｇ／ｍＬ以上に達する（非特許文献３６）。そのため、本実験中で使用するｔＰＡの用量は１２５ｎｇ／ｍＬで、これにより体内の血栓状況下において自然に発生するｔＰＡ含有量をシミュレーションする。
【０１３８】
結果は以下を示している。体外において７２時間形成された陳旧性血栓は、１２５ｎｇのｔＰＡ条件下において、プラスミノゲンを添加した場合の血栓溶解率は単独で１２５ｎｇ  ｔＰＡを添加する場合より明らかに高く、且つ差異は極めて顕著で、これは体内に血栓が現れた場合に自然に発生するｔＰＡレベル（１２５ｎｇ）下において、０．２ｍｇまたはより多くのプラスミノゲンを添加することで、２時間で顕著に７２時間陳旧性血栓の溶解を促進できることを示している。添加するプラスミノゲン用量の段階的な増加により、その血栓溶解率も段階的に増加し、これはプラスミノゲンの用量を調節することにより陳旧性血栓を溶解する速度を調整できることを示している。また、プラスミノゲン４ｍｇを添加した場合の血栓溶解率は本実験において体内正常注射用量  ２０μｇ  ｔＰＡの場合より血栓溶解効果が向上されている（２０μｇ  ｔＰＡは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ社が生産する注射用アルテプラーゼプロトコルによる、体内に血栓が生じる状況下における血栓の溶解に必要とされる用量を、ラットの必要とする注射量に変換したものである）。これは体内に血栓が発生した場合に自然に生じるｔＰＡ用量（１２５ｎｇ）の状況下において、プラスミノゲンのみを添加して陳旧性血栓を溶解させる効果は従来の血栓溶解薬の効果より優れ（図４）、プラスミノゲンがより血栓溶解効果の優れた血栓溶解物質となれることを示している。
【０１３９】
また、実施例２において、対照ＰＢＳグループと比較して、単独で１２５ｎｇのｔＰＡを添加した場合、２０時間血栓を溶解させる能力を顕著に向上させることができる。しかし、本実施例において、７２時間の陳旧性血栓に対しては、体内状況と類似し、単独で１２５ｎｇのｔＰＡを添加するグループと対照ＰＢＳグループの血栓溶解効果はほとんど同じで、これは血栓が古くなるにつれ、生理状況下において自然に発生するｔＰＡの血栓溶解能力が次第に低下することを示し、これは側面から実施例が使用するモデルはある程度体内の状況をシミュレーションできることを示している。
【実施例５】
【０１４０】
実施例５は７２時間の陳旧性血栓の１０ｎｇ  ｔＰＡ条件下における血栓溶解率がプラスミノゲン用量の増加に応じて上昇することに関するものである。
【０１４１】
２匹のＳＤラットの全血を採取してＥＰチューブ内に入れ、３７℃で７２ｈインキュベーションした後に上澄みを破棄し、陳旧性血栓を形成させる（非特許文献３６）。ＰＢＳ溶液が澄清になるまで、ＰＢＳを添加して繰り返し５〜１０回洗浄する。吸水紙で血栓の水分をなるべく吸い取り、それから血栓を平均的に各ＥＰチューブ中に分布させ、血栓の重量を測り、各血栓の重量が同じになるようにする。血栓をＰＢＳブランク対照グループ、１０ｎｇ  ｔＰＡ対照グループ、２０ｎｇ  ｔＰＡ対照グループ、０．２ｍｇ  ｔＰＡ対照グループ、０．２ｍｇプラスミノゲングループ、１ｍｇプラスミノゲングループ、２ｍｇプラスミノゲングループ及び４ｍｇプラスミノゲングループに分け、各グループのチューブが３つずつである。ＰＢＳブランク対照グループに１ｍＬ  ＰＢＳを添加する；１０ｎｇ  ｔＰＡ対照グループに１ｍＬ  ＰＢＳ及び１０ｎｇ  ｔＰＡを添加する；２０ｎｇ  ｔＰＡ対照グループに１ｍＬ  ＰＢＳ及び２０μｇ  ｔＰＡを添加する；０．２ｍｇプラスミノゲン対照グループに１ｍＬ  ＰＢＳ及び０．２ｍｇプラスミノゲンを添加する；０．２ｍｇプラスミノゲングループに１ｍＬ  ＰＢＳ及び１０ｎｇ  ｔＰＡ及び０．２ｍｇプラスミノゲンを添加する；１ｍｇプラスミノゲングループに１ｍＬ  ＰＢＳ及び１０ｎｇ  ｔＰＡ及び１ｍｇプラスミノゲンを添加する；２ｍｇプラスミノゲングループに１ｍＬ  ＰＢＳ及び１０ｎｇ  ｔＰＡ及び２ｍｇプラスミノゲンを添加する。４ｍｇプラスミノゲングループに１ｍＬ  ＰＢＳ及び１０ｎｇ  ｔＰＡ及び４ｍｇプラスミノゲンを添加する。すべての反応は３７℃のインキュベータにおいて行われ、２時間反応した後に上澄みを吸い取り、吸水紙でなるべく血栓の水分を吸い取り、さらに血栓の重さを測り、血栓溶解率を計算する。
【０１４２】
文献の報告によれば、正常な生理状況下におけるｔＰＡの含有量は５−１０ｎｇ／ｍＬであり（非特許文献３５）、そのため、本実験中で使用するｔＰＡの用量は１０ｎｇ／ｍＬで、これにより体内の正常生理状況下において自然に発生するｔＰＡ含有量をシミュレーションする。
【０１４３】
結果は以下を示している。体外において７２時間形成された陳旧性血栓は、体内の正常な生理状況下において自然に発生するｔＰＡ含有量１０ｎｇの条件下において、プラスミノゲンを添加した場合の血栓溶解率は単独で１０ｎｇ  ｔＰＡを添加した場合の血栓溶解率より高く、且つ差異が極めて顕著である。体内において血栓発生時に自然に生じるｔＰＡ用量（１０ｎｇ）の状況下において、０．２ｍｇまたはより多くのプラスミノゲンを添加して２時間で顕著に７２時間の陳旧性血栓の溶解を促進できる。プラスミノゲンの添加用量の増加に伴い、対応の血栓溶解率も段階的に向上する傾向を示し、これはプラスミノゲンの用量を調整することで陳旧性血栓を溶解する速度を調整できると示している。さらに、プラスミノゲン４ｍｇを添加した場合の血栓溶解率は体内正常ｔＰＡ注射用量の場合に血栓溶解効果が近いことを示している（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ社が生産する注射用アルテプラーゼプロトコルによる、体内に血栓が生じる状況下における血栓の溶解に必要とされる用量を、ラットの必要とする注射量に変換したものである）（図５）。これは生理的レベルのｔＰＡ用量（１０ｎｇ）の状況において、プラスミノゲンのみを添加することで陳旧性血栓を溶解させる効果は従来の血栓溶解薬の効果と同じことを示し、この意味では、プラスミノゲンが新しい陳旧性血栓溶解薬となる見込みを有する。
【実施例６】
【０１４４】
実施例６はプラスミノゲンで穏やかに２０時間陳旧性血栓を溶解することに関するものである。
【０１４５】
２匹のＳＤラットの全血を採取してＥＰチューブ中に入れ、３７℃で２０ｈインキュベーションした後に上澄みを廃棄して、陳旧性血栓を形成する（非特許文献３３、３４参照
）。ＰＢＳを添加して繰り返し５〜１０回洗浄し、ＰＢＳ溶液を添加して澄清になるようにする。給水紙でなるべく血栓の水分を吸い取り、それから血栓を平均的に各ＥＰチューブ内に分布させ、血栓の重量を測り、それぞれの血栓の重さが一致するようにする。血栓を二つのグループに分け、各グループ１２個サンプルである。第一グループはｔＰＡ対照グループで、１ｍＬ  ＰＢＳ及び５μｇ  ｔＰＡを添加する；二つ目のグループはプラスミノゲングループで、１ｍＬ  ＰＢＳ、１０ｎｇ  ｔＰＡ及び１ｍｇプラスミノゲンを添加する。予備実験により以下が証明されている：これらの二つのグループの２０時間陳旧性血栓に対する２時間以内の血栓溶解率は似ている（データは示されていない）。すべての反応は３７℃インキュベータにおいて行われ、それぞれ０．５ｈ、１ｈ、１．５ｈ、２ｈにサンプルを取り、それぞれの時間でそれぞれ３つのサンプルを取り、上澄みを吸い取り、吸水紙でなるべく血栓の水分を吸い取り、さらに血栓の重量を測り、血栓溶解率を計算する。
【０１４６】
文献の報告によれば、正常な生理状況下におけるｔＰＡの含有量は５−１０ｎｇ／ｍＬである（非特許文献３５）。そのため、本実験で使用するｔＰＡの用量は１０ｎｇ／ｍＬであり、体内の正常な生理状況下において自然に発生するｔＰＡの含有量をシミュレーションしている。
【０１４７】
実験は以下を示している。２０時間の陳旧性血栓に対して、二つのグループの血栓溶解率は時間の延長に伴って上昇し、しかし０から０．５時間及び０．５から１時間の二つの区間において、プラスミノゲングループの血栓溶解曲線の傾斜はいずれもｔＰＡグループより低い（図６）。表１は１０ｎｇ  ｔＰＡの存在条件下において、１ｍｇプラスミノゲン血栓溶解効率は単独で５ｕｇ  ｔＰＡを添加した場合の血栓溶解率の時間に伴う変化の比較である。表１が示すように、プラスミノゲングループの２時間の総血栓溶解率の７５％は約１時間以内に集中し、ｔＰＡの対照グループの２時間の総血栓溶解率の７５％は約０．５時間に集中している。これらのデータは明らかに以下を示している：ｔＰＡに対して、プラスミノゲンの血栓溶解速度はｔＰＡの血栓溶解速度よりも穏やかである（図６、表１）。
【０１４８】
表１は１０ｎｇｔＰＡ存在条件下における、１ｍｇプラスミノゲンの血栓溶解効率と単独で５ｕｇｔＰＡを添加した場合の血栓溶解効率の時間に伴う変化を示したものである。
【０１４９】
【表１】
2020090541.tif 000002
【実施例７】
【０１５０】
実施例７は１００ｎｇ  ｕＰＡ条件下における、プラスミノゲンの２０時間陳旧性血栓の溶解促進に関するものである。
【０１５１】
２匹のＳＤラットの全血を採取してＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブ内に入れ、３７℃で２０ｈインキュベーションした後に上澄みを破棄し、陳旧性血栓を形成する（非特許文献３３，３４）。ＰＢＳを添加して繰り返し５〜１０回洗浄し、ＰＢＳ溶液が澄清になるようにする。吸水紙で血栓の水分をなるべく吸い取り、それから血栓を平均的に各ＥＰチューブ中に分布させ、血栓の重量を測り、各血栓の重量が同じになるようにする。血栓をＰＢＳブランク対照グループ、１００ｎｇ  ｕＰＡ対照グループ、０．２ｍｇプラスミノゲン対照グループ、０．２ｍｇプラスミノゲングループ、１ｍｇプラスミノゲングループ及び２ｍｇプラスミノゲングループに分け、各グループのチューブが３つずつである。ＰＢＳブランク対照グループに開始時に１ｍＬ  ＰＢＳを添加する；１００ｎｇ  ｕＰＡ対照グループに１ｍＬ  ＰＢＳ及び１００ｎｇ  ｕＰＡを添加する；０．２ｍｇプラスミノゲン対照グループに対して１ｍＬＰＢＳ及び０．２ｍｇプラスミノゲンを添加する；０．２ｍｇプラスミノゲングループに対して１ｍＬ  ＰＢＳ及び１００ｎｇ  ｕＰＡ及び１ｍｇプラスミノゲンを添加する；１ｍｇプラスミノゲングループに対して１ｍＬ  ＰＢＳ及び１００ｎｇ  ｕＰＡ及び１ｍｇプラスミノゲンを添加する；２ｍｇプラスミノゲングループに対して１ｍＬ  ＰＢＳ及び１００ｎｇ  ｕＰＡ及び２ｍｇプラスミノゲンを添加する。すべての反応は３７℃インキュベータで行われ、１時間インキュベーションした後、上澄みを吸い取り、吸水紙で血栓の水分をなるべく吸い取り、さらに血栓の重量を測り、血栓溶解率を計算する。
【０１５２】
文献の報道によれば、プラスミノゲンを基質とする酵素促進反応プロセスにおけるｔＰＡのミカエリス定数は０．１８×１０−７ｍｏｌ／Ｌであり（非特許文献３７）、しかしｕＰＡのミカエリス定数は２．４３×１０−７ｍｏｌ／Ｌである（非特許文献３８）。即ち、同じ反応条件において、同じ反応時間内のｔＰＡの親和力はｕＰＡの約１０倍であり、そのため今回の実験において、実施例３が使用した１０ｎｇ  ｔＰＡ／ｍｌにより算出されたｕＰＡの用量は１００ｎｇ／ｍｌである。
【０１５３】
結果が示すように、体外において２０時間形成された陳旧性血栓に対して、プラスミノゲン活性化剤１０ｎｇ  ｔＰＡを１００ｎｇ  ｕＰＡに変更した後、プラスミノゲン０．２ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇを添加した各グループの血栓溶解率は単独で１００ｎｇ  ｕＰＡを添加した場合の血栓溶解率より明らかに上昇し、統計上の差異はいずれも極めて顕著である（＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。これは１００ｎｇのｕＰＡ用量の場合、０．２ｍｇまたはより多くのプラスミノゲンを添加することにより１時間で顕著に血栓を溶解させることができ、さらにプラスミノゲン添加用量の段階的な増加により、その血栓溶解効率も顕著的に向上する（図７）ことを示している。これは１００ｎｇ  ｕＰＡ条件下において、プラスミノゲンが陳旧性血栓の溶解を促進できることを示している。
【実施例８】
【０１５４】
実施例８は１ｎｇ  ｕＰＡ条件下における、プラスミノゲンの２０時間陳旧性血栓の溶解促進に関するものである。
【０１５５】
２匹のＳＤラットの全血を採取してからＥＰチューブ内に入れ、３７℃で２０時間インキュベーションしてから上澄みを廃棄し、陳旧性血栓を形成する（非特許文献３３，３４）。ＰＢＳを添加して繰り返し５〜１０回洗浄し、ＰＢＳ溶液が澄清になるようにする。吸水紙で血栓の水分をなるべく吸い取り、それから血栓を平均的に各ＥＰチューブ中に分布させ、血栓の重量を測り、各血栓の重量が同じになるようにする。血栓をＰＢＳブランク対照グループ、１ｎｇ  ｕＰＡ対照グループ、０．２ｍｇ  Ｐｌｇ対照グループ、０．２ｍｇプラスミノゲングループ、１ｍｇプラスミノゲングループ及び２ｍｇプラスミノゲングループに分け、各グループのチューブが３つずつである。ＰＢＳブランク対照グループに１ｍＬ  ＰＢＳを添加する；１ｎｇ  ｕＰＡ対照グループに対して１ｍＬ  ＰＢＳ及び１ｎｇ  ｕＰＡを添加する；０．２ｍｇ  Ｐｌｇ対照グループに対して１ｍＬ  ＰＢＳ
及び０．２ｍｇ  Ｐｌｇを添加する；０．２ｍｇプラスミノゲングループに対して１ｍＬ
ＰＢＳ及び１ｎｇ  ｕＰＡ及び０．２ｍｇプラスミノゲンを添加する；１ｍｇプラスミノゲングループに対して１ｍＬ  ＰＢＳ及び１ｎｇ  ｕＰＡ及び１ｍｇプラスミノゲンを添加する；２ｍｇプラスミノゲングループに対して１ｍＬ  ＰＢＳ及び１ｎｇ  ｕＰＡ及び２ｍｇプラスミノゲンを添加する。すべての反応は３７℃インキュベータで行われ、２時間インキュベーションした後、上澄みを吸い取り、吸水紙で血栓の水分をなるべく吸い取り、さらに血栓の重量を測り、血栓溶解率を計算する。
【０１５６】
文献の報道によれば、正常な生理状況下におけるｕＰＡの含有量は１ｎｇ／ｍＬである（非特許文献３５）。そのため、本実験中で使用するｕＰＡの用量は１ｎｇ／ｍＬで、体内の正常な生理状況下において自然に発生するｕＰＡの含有量をシミュレーションするものである。
【０１５７】
結果は以下を示している。体内において２０時間形成された陳旧性血栓に対して、ｕＰＡの用量を体内の正常含有量１ｎｇに低下させた場合、陳旧性血栓の血栓溶解率の血栓溶解全体が比較的遅いものである。しかし１ｍｇ及び２ｍｇのプラスミノゲングループの血栓溶解率は顕著に１ｎｇ  ｕＰＡ対照グループより高く、統計的差異を有する。これは１ｎｇ  ｕＰＡ条件下において、プラスミノゲンを添加した場合、陳旧性血栓の溶解に対して顕著な促進作用を有することを示している（図８）。
【実施例９】
【０１５８】
実施例９はマウスに対してｔＰＡ及びプラスミノゲンを静脈注射した後の再出血実験である。
【０１５９】
１１週齢のＣ５７野生型オスマウス５５匹を取り、３％ペントバルビタールで全身麻酔を行い、それぞれ尾部を３ｍｍせん断し、尾部を３７℃温水中に入れ、尾部の出血状況を観察する（非特許文献３９）。止血してからランダムに二つのグループに分け、ｔＰＡグループ５匹、プラスミノゲングループ５０匹である。ｔＰＡグループに対して目縁からｔＰＡ  ４００μｇ／０．０５ｍＬ／匹を静脈注射する；プラスミノゲングループに対して目縁から１ｍｇ／０．０５ｍＬ／匹のプラスミノゲンを静脈注射する。実験過程において、終始マウス尾部を３７℃温水中に入れ、実験の出血状況を２０分間観察し、且つ記録する。
【０１６０】
実験結果は以下を示している。４００μｇ  ｔＰＡを静脈注射することで受傷したマウスの既に凝血したマウス尾部の傷口が再出血する現象が生じ、これはｔＰＡ薬物の一つの普遍的な副作用である。しかし１ｍｇプラスミノゲンを静脈注射したマウスにはこのような副作用が見られていない（表２）。これは、プラスミノゲンはｔＰＡに対して安全性がより優れていることを示している。
【０１６１】
表２はマウスに対してｔＰＡまたはプラスミノゲンを静脈注射した後の体内出血実験の結果を示したものである。
【０１６２】
【表２】
2020090541.tif 000003
【実施例１０】
【０１６３】
実施例１０はプラスミノゲンの体内血栓に対する特異性吸着実験を示したものである。
【０１６４】
野生型オスマウス９匹を選択し、ランダムに３つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ対照グループ、０．２ｍｇプラスミノゲングループ及び１ｍｇプラスミノゲングループであり、各グループ３匹ずつである。３％ペントバルビタールを使用して全身麻酔を行い、マウス頸部静脈を分離させ、さらに１０％ＦｅＣｌ３溶液を浸している吸水紙（３ｍｍ×５ｍｍ）を頸部静脈に５分間接触させ静脈血栓を形成する。血栓形成後にすぐにプラスミノゲンまたは溶媒ＰＢＳの投与を開始する。溶媒ＰＢＳ対照グループに対して尾部静脈から１００ｕｌのＰＢＳ、１ｍｇプラスミノゲングループ及び０．２ｍｇプラスミノゲングループに対してそれぞれ尾部静脈から１ｍｇ、０．２ｍｇプラスミノゲンを投与する。３時間以後に対応の頸静脈血栓及び向こう側の静脈付近の筋肉を取り出す。血栓及び向こう側の静脈付近の筋肉を研磨装置で均質化（ホモジナイズ）を行い、遠心した後に上澄みを取り、上澄みに対してＢＣＡ法を利用してそのタンパク質総量を測定し、エライザ法を用いて均質液中のプラスミノゲン含有量を測定し、一定のタンパク質総量中のプラスミノゲン含有量を計算する。
【０１６５】
結果は以下を示している。血栓が形成された後に血栓中のプラスミノゲンの含有量はいずれも筋肉中のプラスミノゲンの含有量より明らかに高い。且つプラスミノゲンを静脈注射した後の血栓中のプラスミノゲンの含有量はさらに増加する。これらの結果は以下を示している：体内血栓の存在下において、プラスミノゲンは特異的に血栓上に結合して（図９）さらに血栓溶解作用を発揮することができ、しかし一旦ｔＰＡを血管中に注入すれば、非特異的に血管内において血栓溶解反応を触媒する。該実験結果は、プラスミノゲンはｔＰＡに比較して顕著な特異性のある血栓溶解ができるという長所を有することを示している。
【実施例１１】
【０１６６】
実施例１１は３０分間新鮮血栓にプラスミノゲンを添加した後の血栓溶解効率が顕著に上昇することに関するものである。
【０１６７】
２匹のＳＤラットの全血を採取してからＥＰチューブ内に入れ、３７℃で３０分間インキュベーションしてから、上澄みを廃棄し、新鮮血栓を形成する（非特許文献３３）。ＰＢＳを添加５〜１０回繰り返し洗浄し、ＰＢＳ溶液を添加して澄清になるようにする。吸水紙でなるべく血栓の水分を吸い取り、それから血栓を平均的に各ＥＰチューブ中に分布させ、血栓の重量を測定し、各チューブの血栓の重量を一致させる。血栓をＰＢＳブランク対照グループ、１２５ｎｇｔＰＡ対照グループ、０．２ｍｇプラスミノゲングループ、１ｍｇプラスミノゲングループ及び２ｍｇプラスミノゲングループに分け、各グループ２チューブずつである。ＰＢＳブランク対照グループに対して１ｍＬ  ＰＢＳ添加する；ｔＰＡ対照グループに対して１ｍＬ  ＰＢＳ及び１２５ｎｇ  ｔＰＡを添加する；０．２ｍｇプラスミノゲングループに対して１ｍＬ  ＰＢＳ及び１２５ｎｇ  ｔＰＡ及び０．２ｍｇプラスミノゲンを添加する；１ｍｇプラスミノゲングループに対して１ｍＬ  ＰＢＳ及び１２５ｎｇ  ｔＰＡ及び１ｍｇプラスミノゲンを添加する；２ｍｇプラスミノゲングループに対して１ｍＬ  ＰＢＳ及び１２５ｎｇ  ｔＰＡ及び２ｍｇプラスミノゲンを添加する。すべての反応は３７℃のインキュベータ中において行われ、２時間インキュベーションした後、上澄みを吸い取り、吸水紙で血栓の水分をなるべく吸い取り、さらに血栓の重量を測り、血栓溶解率を計算する。
【０１６８】
文献の報告によれば、正常な生理状況下におけるｔＰＡの含有量は５−１０ｎｇ／ｍＬであり（非特許文献３５）、激しい運動しまたは静脈うっ血の場合において、体内のｔＰ
Ａの含有量は２０倍乃至１００倍に増え、即ち１００ｎｇ／ｍＬ以上に達する（非特許文献３６）。そのため、本実験中で使用するｔＰＡの用量は１２５ｎｇ／ｍＬで、これにより体内の血栓の状況下において自然に発生するｔＰＡ含有量をシミュレーションする。
【０１６９】
この実験は以下を示している。体内において３０分間形成された新鮮血栓に対して、段階的にプラスミノゲンの用量を増加する条件下において、血栓溶解率は段階的に向上し、さらにプラスミノゲンの各グループの血栓溶解率はいずれも単独でｔＰＡを添加する対照グループの血栓溶解率より高く、統計的差異が極めて顕著である。これらの結果は以下を示している。体内において血栓が出現する際に自然に発生するｔＰＡレベルの状況下において、０．２ｍｇまたはより多いプラスミノゲンを添加することで、１時間で顕著に血栓の溶解を促進することができる（図１０）。これは、プラスミノゲンが陳旧性血栓の溶解を促進できるだけでなく、新鮮血栓の溶解も促進できることを示している。
【実施例１２】
【０１７０】
実施例１２はプラスミノゲンの糖尿病によってもたらされる微小血栓の溶解促進に関するものである。
【０１７１】
２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス１０匹を取り、ランダムで二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与グループ及びプラスミノゲン投与グループに分け、各グループ５匹である。実験開始当日を０日目として体重を測ってからグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して１日目と記録し、連続的１５日間投与する。プラスミノゲン投与グループのマウスに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日にてプラスミノゲンを尾部静脈から注射し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。１６日目に眼球を摘出して採血を行い、全血を静置した後に血液中のＤ−二量体の含有量の測定に用いる。
【０１７２】
結果は以下を示している。投与から１５日後に、プラスミノゲン投与グループの血清中のＤ−二量体の含有量が顕著に上昇している（図１１）。これはプラスミノゲンを投与した後に、糖尿病によってもたらされる微小血栓が顕著に溶解していることを示している。
【実施例１３】
【０１７３】
実施例１３はプラスミノゲンの糖尿病末期マウスの心臓組織血栓の溶解促進に関するものである。
【０１７４】
２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス１０匹を取り、ランダムで二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与グループ及びプラスミノゲン投与グループで、各グループ５匹である。実験開始当日を０日目として体重を測定してからグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与してさらに１日目と記録し、連続的３１日間投与する。プラスミノゲン投与グループのマウスに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日にてプラスミノゲンを尾部静脈から注射し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。３２日目にマウスを殺処分して心臓組織を取り１０％中性ホルマリン固定液中において２４時間固定する。固定した後の心臓組織をエタノールで段階的に脱水させて及びキシレンで透明にした後にパラフィンで包埋させる。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせてから再水和してさらに１回水洗いする。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、２回水洗いし、毎回５分間である。１０％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間封止する；時間になった後に、ヒツジ血清液を廃棄し、ＰＡＰマーカーで組織を囲む。ウサギ抗マウスフィブリン（フィブリノーゲン）抗体（Ａｂｃａｍ）４℃で終夜インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間である。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間
である。ＤＡＢ薬物キット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で顕色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流し、透明になるよう段階的に脱水してから封止させ、切片を顕微鏡下で４００倍にて観察する。
【０１７５】
フィブリノーゲンはフィブリンの前駆体であり、組織に損傷が存在する状況下における生体の損傷に対する応答反応として、フィブリノーゲンはフィブリンに加水分解される（非特許文献４０〜４２）。そのためフィブリノーゲンのレベルを損傷程度の一つの指標とすることができる。フィブリンは組織損傷後に血栓を形成する主な成分であり、そのため、フィブリンレベルを血栓の一つの指標とすることができる。
【０１７６】
結果は以下を示している。触媒ＰＢＳ投与対照グループ（図１２Ａ）と比較して、プラスミノゲン投与グループ（図１２Ｂ）のマウス心臓組織フィブリンの陽性着色が比較的薄く、これはプラスミノゲン投与グループの心臓組織沈着したフィブリンが減少し、プラスミノゲンは糖尿病によってもたらされる心臓組織の損傷を修復でき、プラスミノゲンは心臓組織血栓の溶解を促進できることを示している。
【実施例１４】
【０１７７】
実施例１４はプラスミノゲンの糖尿病末期マウスの腎臓組織血栓の溶解促進に関するものである。
【０１７８】
２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス２０匹を取り、ランダムで二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与グループ及びプラスミノゲン投与グループで、各グループ１０匹である。実験開始当日を０日目として体重を測ってからグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与してさらに１日目と記録し、連続的３１日間投与する。プラスミノゲン投与グループのマウスに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日にてプラスミノゲンを尾部静脈から注射し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。３２日目にマウスを殺処分して腎臓組織を取り１０％中性ホルマリン固定液中において２４時間固定する。固定した後の腎臓組織をエタノールで段階的に脱水させて及びキシレンで透明にした後にパラフィンで包埋させる。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせてから再水和してさらに１回水洗いする。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、２回水洗いし、毎回５分間である。１０％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間封止する；時間になった後に、ヒツジ血清液を廃棄し、ＰＡＰマーカーで組織を囲む。ウサギ抗マウスフィブリン（フィブリノーゲン）抗体（Ａｂｃａｍ）４℃で終夜インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間である。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間である。ＤＡＢ薬物キット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で顕色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流し、透明になるよう段階的に脱水してから封止させ、切片を顕微鏡下で２００倍にて観察する。
【０１７９】
フィブリノーゲンはフィブリンの前駆体であり、組織に損傷が存在する状況において、生体の損傷に対する応答反応として、フィブリノーゲンはフィブリンに加水分解される（非特許文献４０〜４２）。そのためフィブリノーゲンのレベルを損傷程度の一つの指標とすることができる。フィブリンは組織損傷後に血栓を形成する主な成分であり、そのため、フィブリンレベルを血栓の一つの指標とすることができる。
【０１８０】
結果は以下を示している。プラスミノゲン投与対照グループ（図１３Ｂ）と比較して、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ（図１３Ａ）のマウス心臓組織フィブリンの陽性着色が比較
的薄い。プラスミノゲンを注射することで糖尿病マウスの腎臓フィブリンの沈着を顕著に低減させることができ、プラスミノゲンは糖尿病マウスの腎臓損傷に対して顕著な修復作用を有し、プラスミノゲンが腎臓組織の血栓の溶解を促進できることを示している。
【実施例１５】
【０１８１】
実施例１５はプラスミノゲンの糖尿病末期マウスの肝臓組織血栓の溶解促進に関するものである。
【０１８２】
２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス１０匹を取り、ランダムで二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与グループ及びプラスミノゲン投与グループで、各グループ５匹ずつである。実験開始当日を０日目として体重を測ってからグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与してさらに１日目と記録し、連続的３１日間投与する。プラスミノゲン投与グループのマウスに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日にてプラスミノゲンを尾部静脈から注射し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。３２日目にマウスを殺処分して肝臓組織を取り１０％中性ホルマリン固定液中において２４時間固定する。固定した後の肝臓組織をエタノールで段階的に脱水させて及びキシレンで透明にした後にパラフィンで包埋させる。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせてから再水和してさらに１回水洗いする。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、２回水洗いし、毎回５分間である。１０％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間封止する；時間になった後に、ヒツジ血清液を廃棄し、ＰＡＰマーカーで組織を囲む。ウサギ抗マウスフィブリン（フィブリノーゲン）抗体（Ａｂｃａｍ）４℃で終夜インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間である。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間である。ＤＡＢ薬物キット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で顕色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流す。透明になるよう段階的に脱水してから封止させ、切片を顕微鏡下で２００倍にて観察する。
【０１８３】
フィブリノーゲンはフィブリンの前駆体であり、組織に損傷が存在する状況下において、生体の損傷に対する応答反応として、フィブリノーゲンはフィブリンに加水分解される（非特許文献４０〜４２）。そのためフィブリノーゲンのレベルを損傷程度の一つの指標とすることができる。フィブリノーゲンは組織損傷後に血栓を形成する主な成分であり、そのため、フィブリンのレベルを血栓の一つの指標とすることができる。
【０１８４】
研究は以下を示している。触媒ＰＢＳ投与対照グループ（図１４Ａ）と比較して、プラスミノゲン投与グループ（図１４Ｂ）のマウス肝臓組織フィブリンの陽性着色が比較的薄く、これはプラスミノゲンを注射することで糖尿病肝臓フィブリンの沈着を顕著に減軽できることを示し、フィブリンは糖尿病マウスの肝臓損傷に対して顕著な修復作用を有することを反映し、プラスミノゲンが肝臓組織血栓の溶解を促進できることを示している。
【実施例１６】
【０１８５】
実施例１６はプラスミノゲンの糖尿病後期マウスの神経組織血栓の溶解促進に関するものである。
【０１８６】
２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス１０匹を取り、ランダムで二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与グループ及びプラスミノゲン投与グループで、各グループ５匹である。実験開始当日を０日目として体重を測ってからグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して１日目と記録し、連続的１５日間投与する。プラスミノゲン投与グループのマウスに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日にてプラスミノゲン
を尾部静脈から注射し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。１６日目にマウスを殺処分して坐骨神経を取り１０％中性ホルマリン固定液中において２４時間固定する。固定した後の坐骨神経をエタノールで段階的に脱水させて及びキシレンで透明にした後にパラフィンで包埋させる。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせてから再水和してさらに１回水洗いする。それからＰＡＰマーカーで組織を囲む。３％ＴＢＳで希釈した過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、３回水洗いする。１０％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間封止する；余分な血清を吸い取る。ウサギ抗マウスフィブリン（フィブリノーゲン）抗体（Ａｂｃａｍ）４℃で終夜インキュベーションし、ＴＢＳで３回洗う。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＴＢＳで３回洗う。ＤＡＢ薬物キット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で顕色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流す。透明になるよう段階的に脱水してから封止させ、切片を顕微鏡下で４００倍にて観察する。
【０１８７】
フィブリノーゲンはフィブリンの前駆体であり、組織に損傷が存在する状況下において、生体の損傷に対する応答反応として、フィブリノーゲンはフィブリンに加水分解される（非特許文献４０〜４２）。そのためフィブリノーゲンのレベルを損傷程度の一つの指標とすることができる。フィブリノーゲンは組織損傷後に血栓を形成する主な成分であり、そのため、フィブリンのレベルを血栓の一つの指標とすることができる。
【０１８８】
研究により以下を見出した。触媒ＰＢＳ投与対照グループ（図１５Ａ）と比較して、プラスミノゲン投与グループ（図１５Ｂ）のマウスの坐骨神経のフィブリンのレベルが低下し、これは、プラスミノゲンはフィブリンレベルを低減させる機能を有し、損傷がある程度修復されることを示し、プラスミノゲンは神経組織周囲の血栓溶解を促進できることも示している。
【０１８９】
実験結果は以下のようにまとめることができる。
【０１９０】
本発明の実施例の実験はプラスミノゲン体外血栓溶解及び体内血栓溶解の二つの部分を含む。
【０１９１】
体外血栓溶解において体内血栓溶解条件をシミュレーションし、１０ｎｇ／ｍＬ  ｔＰＡを用いて正常な生理状況下において自然に発生するｔＰＡの量、１２５ｎｇ／ｍＬ  ｔＰＡで体内血栓状況下において体内に自然に生じるｔＰＡ量をシミュレーションすることで、プラスミノゲンの血栓溶解能力について研究する。
【０１９２】
本発明の実験研究は以下を示している。１０ｎｇ／ｍＬ  ｔＰＡまたは１２５ｎｇ／ｍＬ  ｔＰＡ条件下において、２０時間陳旧性血栓か７２時間陳旧性血栓かにかかわらず、プラスミノゲンは非常に優れた血栓溶解効果を有し、且つプラスミノゲンの用量の増大により血栓溶解効率も上昇する。
【０１９３】
プラスミノゲンは新鮮血栓に対して非常に強い溶解能力を有し、２時間インキュベーションした時の血栓溶解率は８０％以上に達する。
【０１９４】
我々はｕＰＡ存在条件下におけるプラスミノゲンの血栓溶解効果についても研究した。１ｎｇ／ｍＬ  ｕＰＡまたは１００ｎｇ／ｍＬ  ｕＰＡ条件下において、プラスミノゲンは同じように非常に優れた血栓溶解効果を有し、且つプラスミノゲンの用量の増加に伴い血栓溶解効率も増大する。
【０１９５】
体内実験において、糖尿病後期マウスに対して連続的に２ｍｇプラスミノゲンを１５日間毎日投与し、血清中のＤ−二量体の含有量は顕著に増加している。これとともに、心臓、肝臓、腎臓、神経組織のフィブリンレベルは顕著に低下し、これはプラスミノゲンが明らかにこれらの組織中の糖尿病組織損傷によっても引き起こされる血栓の溶解を明らかに促進することができ、フィブリンが分解し、実験動物にプラスミノゲンを投与することで同じように顕著な血栓溶解効果が得られることを証明している。
【０１９６】
マウス頸部静脈血栓のモデル実験が示すように、プラスミノゲンは非常に特異的に体内血栓と結合できる。
【０１９７】
また、我々の研究は以下を示している。ｔＰＡと比較した場合、プラスミノゲンの血栓に対する溶解はより穏やかで、且つマウスのｔａｉｌ−ｂｌｅｅｄｉｎｇ実験はプラスミノゲンに出血の副作用がないことを示している。
【０１９８】
以上をまとめると、プラスミノゲンは非常に優れた血栓溶解能力を有し、特に陳旧性血栓に対して優れた血栓溶解能力を有する。さらに特異性が高く、穏やかで、効き目が速く及び出血の副作用がないという特徴を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年3月18日(2020.3.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書又は図面に記載の発明。