(57)【要約】【課題】ポリヒドロキシアルカン酸のオリゴマーを微生物の細胞外に分泌させるポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーの製造技術を提供する【解決手段】アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）又はバチルス・セレウスＹＢ４（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ＹＢ４）由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子をコードした微生物を炭素源存在下で培養する工程を有する、分子量が２００〜１０００であり、細胞外オリゴマーである、ポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーの製造方法により解決する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）又はバチルス・セレウスＹＢ４（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ＹＢ４）由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子をコードした微生物を炭素源存在下で培養する工程を有する、分子量が２００〜１０００であり、細胞外オリゴマーである、ポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーの製造方法。
【請求項２】
前記微生物が、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２８９９として寄託されたＥ. ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ΔａｄｈＥ ｐＧＥＭ−ｐｈａＣＡｃＡＢ株である、請求項１記載のポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーの製造方法。
【請求項３】
前記微生物が、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２９００として寄託されたＥ. ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ΔａｄｈＥ ｐＧＥＭ−ｐｈａＲＣＹＢ４ＡＢ株である、請求項１記載のポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーの製造方法。
【請求項４】
前記培地が、さらに、アルコール又はジオールを含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーの製造方法。
【請求項５】
前記アルコールが、エタノール、１−ブタノールからなる群から選択された少なくとも１種である、請求項４に記載のポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーの製造方法。
【請求項６】
前記ジオールが、ジエチレングリコール、１，３−プロパンジオール、１，２−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、ジプロピレングリコールからなる群から選択された少なくとも１種である、請求項４に記載のポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーの製造方法。
【請求項７】
前記アルコールの濃度が、０〜１５体積％である、請求項４又は５に記載のポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーの製造方法。
【請求項８】
前記ジオールの濃度が、０〜１５体積％である、請求項４又は６に記載のポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーの製造方法。
【請求項９】
前記ジエチレングリコールの濃度が、０〜１５体積％である、請求項６に記載のポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーの製造方法。
【請求項１０】
前記炭素源の濃度が、０．１〜１０質量％である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーの製造方法。
【請求項１１】
さらに、得られた培養液からポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーを回収する工程を有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーの製造方法。
【請求項１２】
３−ヒドロキシブタン酸を少なくとも含むポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーを製造するものである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）は、微生物がエネルギー貯蔵物質として細胞内で合成するポリエステルである。ポリヒドロキシアルカン酸は再生可能なバイオマスから合成されることから、いわゆる生分解性プラスチックとして、石油由来プラスチックの代替材料としての利用・普及が期待されている。
【０００３】
ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法としては、例えば、特開２０１５−２９４８４号公報に、ＩＶ型のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を有する微生物をアルコールの存在下で培養することを特徴とする、重量平均分子量が５，０００〜４０，０００であり、カルボキシ末端が修飾されたポリヒドロキシアルカン酸を製造する方法が開示されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１５−２９４８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前述した特許文献１の方法によれば、分子量が低減されたポリヒドロキシアルカン酸が得られるため、これを結晶核剤として用いれば、ポリヒドロキシアルカン酸樹脂の結晶化速度が向上することが期待される。しかし、加工性などの観点から、結晶化速度の更なる向上が求められている。これまで報告されているポリヒドロキシアルカン酸の製造方法では、その重量平均分子量が５，０００〜４０，０００のポリマーであり、微生物がエネルギー貯蔵物質として細胞内で合成するため、これを利用するには細胞を破砕しポリヒドロキシアルカン酸を分離精製する工程が必要である。
【０００６】
従って本発明の目的は、ポリヒドロキシアルカン酸のオリゴマーを微生物の細胞外に分泌させるポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーの製造技術を提供することにある。前述の細胞を破砕する工程が不用であり、且つ細胞体積の制約を受けずに物質生産できる利点を有する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、特定のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子をコードした微生物を培養することにより、分泌型のオリゴマーを培地中に生成することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）又はバチルス・セレウスＹＢ４（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ＹＢ４）由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子をコードした微生物を、炭素源存在下で培養する工程を有する、分子量が２００〜１０００であり、細胞外オリゴマーである、ポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーの製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、これまで内分泌型のポリマーであったポリヒドロキシアルカン酸を外分泌型のオリゴマーとして製造することができるようになる。ポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーは、植物の成長因子やクモの性フェロモンに含まれる生理活性物質として知られており、特にジオール末端型のポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーはポリウレタンなどの高分子材料の基幹物質としての利用が期待でき、付加価値の高い化合物である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ポリ３−ヒドロキシブタン酸-ジエチレングリコールオリゴマー（３ＨＢＯ）構造を確認した際のＮＭＲチャートである。
【図２】ポリ３−ヒドロキシブタン酸-ジエチレングリコールオリゴマー（３ＨＢＯ）の分子量分布（重合度）を確認した際のＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳチャートである。
【図３】エタノール生産株による３ＨＢＯ−ＥｔＯＨと、エタノール非生産株による３ＨＢＯの生産メカニズムを説明するための図である。
【図４】種々ジオールの添加効果について検討した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明に係る実施形態について詳細に説明する。本実施形態のポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーの製造方法は、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）又はバチルス・セレウスＹＢ４（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ＹＢ４）由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子をコードした微生物を培養する工程を有する。
【００１２】
ポリヒドロキシアルカン酸の合成には、β−ケトチオラーゼ（ＰｈａＡ）、アセトアセチルＣｏＡ還元酵素（ＰｈａＢ）、およびポリヒドロキシアルカン酸重合酵素（ＰｈａＣもしくはＰｈａＥＣもしくはＰｈａＲＣ）の三つの酵素が関与することが知られている。これらのうちＰｈａＡは、２分子のアセチルＣｏＡが縮合してアセトアセチルＣｏＡが形成される反応を触媒する酵素である。また、ＰｈａＢは、補酵素ＮＡＤＰＨの存在下でアセトアセチルＣｏＡを還元し、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを形成する反応を触媒する酵素である。また、ＰｈａＣは、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを基質としてポリ３−ヒドロキシブタン酸を合成する反応の触媒活性を有する酵素である。上述のようにＰｈａＣは、３−ヒドロキシアシルＣｏＡを基質として種々のポリヒドロキシアルカン酸を合成することができるが、その基質特異性、サブユニット構造などに基づいて、Ｉ〜ＩＶ型が知られている。
【００１３】
本実施形態において、ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子としては、Ｉ型のアエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）又はＩＶ型のバチルス・セレウスＹＢ４（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ＹＢ４）由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子を用いる。
【００１４】
本実施形態において、上記遺伝子コードした微生物としては、上記のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子を発現させたとき、ポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーを生産できる微生物であれば特に限定されないが、例えば、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）に属する微生物（例えばＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に属する微生物、ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素の基質を供給できるように改変された微生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に属する微生物などが挙げられる。これらのうち、入手のし易さ、増殖能などの観点から、大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）であることが好ましい。特に、国立遺伝学研究所より分譲されているＥ.ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ΔａｄｈＥが好ましい。なお、野生型の大腸菌を用いる場合は、細胞内で生成されるエタノールによってカルボキシ末端側にエタノールがキャッピングされたオリゴマーを生成させることができる点で好ましい。
【００１５】
本実施形態において用いられる形質転換体の具体例としては、Ｉ型のアエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子を導入して形質転換したＥ. ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ΔａｄｈＥ ｐＧＥＭ−ｐｈａＣＡｃＡＢ、ＩＶ型のバチルス・セレウスＹＢ４（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ＹＢ４）由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子を導入して形質転換したＥ. ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ΔａｄｈＥ ｐＧＥＭ−ｐｈａＲＣＹＢ４ＡＢを挙げることができる。これらの菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託され、それぞれ、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２８９９、ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２９００を付与された。
【００１６】
上記微生物は、前述したポリヒドロキシ酪酸の合成経路を考慮すれば、更に、ｐｈａＡ（β−ケトチオラーゼ遺伝子）やｐｈａＢ（アセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子）を含む微生物を用いることが好ましい。
【００１７】
本実施形態において使用される基本培地は、大腸菌などの培養に使用される一般的な培地、例えば、ＬＢ培地やＭ９培地等を使用することができる。本実施形態においては、炭素源として、グルコース、フルクトース、キシロース、マルトース、ガラクトース、セルビオース等の糖類；蟻酸、酢酸、乳酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸等の脂肪酸類；或いはこれら脂肪酸のエステルや塩等の脂肪酸誘導体、ヤシ油、パーム油、パーム核油（以下ＰＫＯＯ）等の植物油脂；二酸化炭素；グリセロールからなる群から選択された少なくとも１種を含有する。
【００１８】
炭素源の濃度は、０．１〜１０質量％であることが好ましく、１〜５質量％であることがより好ましい。
【００１９】
本実施形態においては、前記培地が、さらに、アルコール又はジオールを含有することが好ましい。アルコール又はジオールを含有することにより、これらが連鎖移動剤（重合停止剤）として機能し、微生物からのポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーの分泌が促進され、より多くのポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーを得ることができる。
【００２０】
前記アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、１−ブタノール、１−ペンタノール、１−ヘキサノール、１−ヘプタノール、１−オクタノール、１−ノナノール、１−デカノール、ベンジルアルコール、３−メルカプト−１−プロパノール、２−プロピン−１−オール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、２−プロペン−１−オール、３−アミノ−１−プロパノール、３−ブチン−１−オール等からなる群から選択された少なくとも１種であることが好ましい。
【００２１】
アルコール濃度は、０〜１５質量％であることが好ましく、１〜５質量％であることがより好ましい。
【００２２】
前記ジオールとしては、例えば、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、１，３プロパンジオール、１，２プロパンジオール、１，４ブタンジオール、ジプロピレングリコールからなる群から選択された少なくとも１種であることが好ましい。特に、高い分泌促進効果、細胞毒性の低さ、オリゴマー末端への修飾効率の高さ、高分子化する際の反応起点を含有する観点から、ジエチレングリコールであることが好ましい。また、上記の利点に加え大腸菌自身が細胞内で合成可能である観点から、１，３プロパンジオールが好ましい。
【００２３】
ジオール濃度は、０〜１５質量％であることが好ましく、１〜１０質量％であることがより好ましく、２〜５質量％であることがさらに好ましい。
【００２４】
本実施形態によれば、使用するアルコール又はジオールが、ポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーの末端のカルボン酸基に結合することで、ポリヒドロキシアルカン酸オリゴマー末端が修飾される。これにより、オリゴマー量を増加させる連鎖移動剤として機能する。
【００２５】
培養工程について説明する。先述したアエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）又はバチルス・セレウスＹＢ４（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ＹＢ４）由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子をコードした微生物は、炭素源の存在下で培養される。
【００２６】
培地中にアルコール又はジオールを添加する時期は、ポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーを生産できる限り特に限定されず、培養の初期、中期、後期のいずれの段階でもよい。但し、一旦、培地中にアルコール又はジオールを添加した後は、引き続き、当該アルコール又はジオール添加培地で培養を行なうことが好ましく、培養途中で、アルコール又はジオールを含まない培地に移し換えない方が好ましい。培養途中で、アルコール又はジオール非添加培地に培地を移し変えると、ポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーの生産が減少する恐れがあるためである。
【００２７】
培養条件は適宜設定することができるが、例えば、ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子をコードした微生物を培地中に０．１〜１０体積％の濃度で接種し、２０〜４０℃で１２〜９６時間培養することで、ポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーを培地中に分泌させることができる。
【００２８】
図３は、エタノール生産株による３ＨＢＯ−ＥｔＯＨと、エタノール非生産株による３ＨＢＯの生産メカニズムを説明するための図である。ポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーを培地中に分泌する際は、大腸菌の細胞膜に存在するトランスポーターが関与している。野生型の大腸菌を用いる場合は、細胞内で生成されるエタノールを利用することができるため、アルコールを外添することなく、カルボキシ末端側にエタノールがキャッピングされたポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーを生成させることができる。ここで、発明者らは、大腸菌の細胞膜に存在するトランスポーターが、乳酸ベースオリゴマーとでは異なることを見出している。
【００２９】
本実施形態においては、さらに、得られた培養液からポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーを回収する工程を有する。上記製造方法によって得られたポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーを回収する方法などは、公知の方法を採用することができる。
【００３０】
例えば、まず、培養終了後、培養液から遠心分離機などで上清と菌体を分離し、上清を回収する。この上清画分に、クロロホルムなどの良溶媒を加えて攪拌後、静置することで、クロロホルム層にポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーを分画する。次いで、クロロホルム層を回収し、所望とするポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーを取得する。
【００３１】
このようにして回収されたポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーの組成は、例えば、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）などの方法により分析することができる。また、上記ポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーの分子量は、例えば、飛行時間型質量分析装置（ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）などの方法により測定することができる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記実施例によって制限されず、前・後記の主旨に適合し得る範囲で変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００３３】
１．ポリヒドロキシアルカン酸オリゴマー生産候補株の作製
ポリヒドロキシアルカン酸合成のための目的遺伝子ｐｈａＣ、ｐｈａＡ、ｐｈａＢもしくはｐｈａＥ、ｐｈａＣ、ｐｈａＡ、ｐｈａＢもしくはｐｈａＲ、ｐｈａＣ、ｐｈａＡ、ｐｈａＢによって構成される発現ベクターを用いた。ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子であるｐｈａＣはラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ （Ｒｅ））、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ （Ａｃ））、デルフチア・アシドボランス（Ｄｅｌｆｔｉａ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｃｅ （Ｄａ））由来、ｐｈａＥ・ｐｈａＣはアロクロマチウム ビノスム（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ （Ａｖ））由来、ｐｈａＲ・ｐｈａＣはバチルス・エスピーＩＮＴ００５（Ｂａｃｉｌｕｓ Ｓｐ. ＩＮＴ００５ （Ｂｓ））、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ （Ｂｍ））、バチルス・セレウスＹＢ４（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ＹＢ４ （ＹＢ４））由来のいずれか、ｐｈａＡおよびｐｈａＢはラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来で構成されている。使用した発現ベクターは以下の７つである；ｐＧＥＭ―ｐｈａＣＲｅＡＢ、ｐＧＥＭ―ｐｈａＣＡｃＡＢ、ｐＧＥＭ―ｐｈａＣＤａＡＢ、ｐＧＥＭ−ｐｈａＥＣＡｖＡＢ、ｐＧＥＭ−ｐｈａＲＣＢｓＡＢ、ｐＧＥＭ−ｐｈａＲＣＢｍＡＢ、ｐＧＥＭ−ｐｈａＲＣＹＢ４ＡＢ。
【００３４】
次に定法により、上記７種類の発現ベクターをＥ.ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ΔａｄｈＥ（国立遺伝学研究所より供与）に形質転換し、所望するポリヒドロキシアルカン酸オリゴマー生産候補株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ΔａｄｈＥ ｐＧＥＭ―ｐｈａＣＲｅＡＢ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ΔａｄｈＥ ｐＧＥＭ―ｐｈａＣＡｃＡＢ（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２８９９）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ΔａｄｈＥ ｐＧＥＭ―ｐｈａＣＤａＡＢ、Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ΔａｄｈＥ  ｐＧＥＭ−ｐｈａＥＣＡｖＡＢ、Ｅ. ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ΔａｄｈＥ ｐＧＥＭ−ｐｈａＲＣＢｓＡＢ、Ｅ. ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ΔａｄｈＥ ｐＧＥＭ−ｐｈａＲＣＢｍＡＢ、Ｅ. ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ΔａｄｈＥ ｐＧＥＭ−ｐｈａＲＣＹＢ４ＡＢ（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２９００））を作製した。
【００３５】
２．ポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーの生産（その１）
上記ポリヒドロキシアルカン酸オリゴマー生産候補株によるオリゴマー生産の有無、また生産量の差異を調べるため、培養実験を行った。
【００３６】
詳細には、まず上記１より得られた生産株候補（Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ΔａｄｈＥ ｐＧＥＭ―ｐｈａＣＲｅＡＢ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ΔａｄｈＥ ｐＧＥＭ―ｐｈａＣＡｃＡＢ（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２８９９）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ΔａｄｈＥ ｐＧＥＭ―ｐｈａＣＤａＡＢ、Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ΔａｄｈＥ  ｐＧＥＭ−ｐｈａＥＣＡｖＡＢ、Ｅ. ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ΔａｄｈＥ ｐＧＥＭ−ｐｈａＲＣＢｓＡＢ、Ｅ. ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ΔａｄｈＥ ｐＧＥＭ−ｐｈａＲＣＢｍＡＢ、Ｅ. ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ΔａｄｈＥ ｐＧＥＭ−ｐｈａＲＣＹＢ４ＡＢ（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２９００））を２質量％グルコースおよび０．０１質量％アンピシリン含有ＬＢ培地中に１体積％の濃度で接種し、３０℃で４８時間培養した。
【００３７】
このようにして得られた各培養液を、６０００ｒｐｍ、１０分間（室温）の条件で遠心分離し、培養上清を回収した。また、得られた菌体ペレットを純水に懸濁した後、再度、上記と同じ条件で遠心分離し、菌体ペレットを得た。このようにして得られた菌体ペレットを凍結乾燥し、乾燥菌体を得た。得られた乾燥菌体重量（ｇ／Ｌ）を表１に示す。
【００３８】
次に、上記乾燥菌体の細胞量（ｇ／Ｌ）、細胞内ポリマー（ポリヒドロキシアルカン酸）量（ｇ／Ｌ）、培養上清中（細胞外）オリゴマー（ポリヒドロキシアルカン酸）量（ｇ／Ｌ）を測定した。細胞量、細胞内ポリマー量の測定はJ. Agus et al. / Polymer Degradation and Stability 91 (2006) 1138e1146、オリゴマー量はACS Sustainable Chem. Eng. 2017, 5, 3, 2360-2367に記載の方法に準じて行った。これらの結果を表１にまとめて示す。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
表１に示すように、ポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーは、全ての重合酵素種で生産され、またその生産量は０．０１〜１．０３ｇ／Ｌと重合酵素種により大きく異なった。
【００４１】
特に、Ａｃ由来、ＹＢ４由来の重合酵素を使用することにより、オリゴマー量の分泌が多いことが確認された。
【００４２】
３．ポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーの生産（その２）
上記２の結果、オリゴマー量が高かった重合酵素種Ａｃ、ＹＢ４、また比較対象としてＲｅを加え、連鎖移動剤（重合停止剤）を添加した培地中で培養を行ったときの、オリゴマー生産量への影響を調べた。
【００４３】
まず、上記１で得られたＥ. ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ΔａｄｈＥ ｐＧＥＭ−ｐｈａＣＲｅＡＢ（以降Ｒｅ株）、Ｅ. ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ΔａｄｈＥ ｐＧＥＭ−ｐｈａＣＡｃＡＢ（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２８９９）（以降Ａｃ株）、Ｅ. ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ΔａｄｈＥ ｐＧＥＭ−ｐｈａＲＣＹＢ４ＡＢ（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２９００）（以降ＹＢ４株）を、２質量％グルコース、０．０１質量％アンピシリン、ジエチレングリコールを０〜１５体積％（０〜１５０ｍＬ／Ｌ）含むＬＢ培地に１体積％の濃度で接種し、３０℃で４８時間培養した。
【００４４】
このようにして得られた各培養液を、前述した２と同じ方法で処理して乾燥菌体を得た後、乾燥菌体重量、細胞量、細胞内ポリマー量、細胞外オリゴマー量を、前記１と同様の方法により測定した。これらの結果を表２に示す。
【００４５】
【表２】
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【００４６】
表２に示すように、Ａｃ株およびＹＢ４株（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２８９９及び受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２９００）では、比較株であるＲｅ株と異なり、ジエチレングリコール添加量に伴い、オリゴマー量が増加する傾向が見られた。Ａｃ株（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２８９９）では、１．０３〜３．１４ ｇ／Ｌ、ＹＢ４株（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２９００）では、０．２１〜４．９８ｇ／Ｌであった。いずれもジエチレングリコールを５０ｍＬ／Ｌの濃度で添加した場合に最も高いオリゴマー量が得られた。
【００４７】
また先述の２の結果と併せて、重合酵素種と連鎖移動剤濃度の組み合わせによる相乗効果が確認された。
【００４８】
４．ポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーの生産（その３）
上記３の結果により、最もオリゴマー生産量が高かったＹＢ４株（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２９００）を用い、ジエチレングリコールと同様に連鎖移動剤（重合停止剤）として機能し得る各種アルコール、ジオールによるオリゴマー生産量への影響を調べた。
【００４９】
まず、上記１で得られたＹＢ４株（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２９００）を、２質量％グルコース、０．０１質量％アンピシリン、また以下いずれかの連鎖移動剤候補：エタノール、１−ブタノール、１，３−プロパンジオール、１，２−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、ジプロピレングリコールを１体積％（１０ｍＬ／Ｌ）もしくは５体積％（５０ｍＬ／Ｌ）で含むＬＢ培地に１体積％の濃度で接種し、３０℃で４８時間培養した。また、アルコール、ジオールを添加せずに、ＹＢ４株（Ｅ. ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ΔａｄｈＥ ｐＧＥＭ−ｐｈａＲＣＹＢ４ＡＢ）に加えて野生株（Ｅ. ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ ｐＧＥＭ−ｐｈａＲＣＹＢ４ＡＢ）を使用した場合についても検討した。
【００５０】
このようにして得られた各培養液を、前述した２、３と同じ方法で処理して乾燥菌体を得た後、乾燥菌体重量、細胞量、細胞内ポリマー量、細胞外オリゴマー量を、前記２、３と同様の方法により測定した。
【００５１】
これらの結果を表３に示す。比較対象として、添加なし（表１より引用）、ジエチレングリコール添加１体積％（１０ｍＬ／Ｌ）、５体積％（５０ｍＬ／Ｌ）の結果も併せて示す。
【００５２】
【表３】
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【００５３】
表３に示すように、全てのアルコール、ジオールの利用で、添加なしの場合と比べて、オリゴマー生産量が増加した。特にジオール（１，３−プロパンジオール、１，２−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、ジプロピレングリコール）では、１体積％（１０ｍＬ／Ｌ）と比較し５体積％（５０ｍＬ／Ｌ）でオリゴマー量が増加した。ジプロピレングリコールは、１体積％（１０ｍＬ／Ｌ）添加の効果がジエチレングルコール１体積％（１０ｍＬ／Ｌ）添加時よりも高かった。１，３−プロパンジオールは宿主大腸菌が糖から生産可能なジオールであるため、内在性連鎖移動剤としての利用も考えられる。
【００５４】
上記結果より、検討したアルコールおよびジオールは、オリゴマー量を増加させる連鎖移動剤として機能する効果が確認された。特に、ジエチレングリコール、ジプロプレングリコール、１，３−プロパンジオールの有用性が高いと考えられる。
【００５５】
５．ポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーの生産（その４）
上記１で得られたＹＢ４株（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２９００）を、４質量％グルコース、０．０１質量％アンピシリン、また以下いずれかの連鎖移動剤候補：エチレングリコール（ＥＧ）、ジエチレングリコール（ＤＥＧ）、トリエチレングリコール（ＴｒｉＥＧ）、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）、グリセロール（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、ジプロピレングリコール（ＤＰＧ）、１，２−プロパンジオール（１，２−ＰＤＯ）、１，３−プロパンジオール（１，３−ＰＤＯ）、１，３−ブタンジオール（１，３−ＢＤＯ）、１，４−ブタンジオール（１，４−ＢＤＯ）、２，３−ブタンジオール（２，３−ＢＤＯ）を５体積％（５０ｍｌ／Ｌ）で含むＬＢ培地に１体積％の濃度で接種し、３０℃で４８時間培養した。このようにして得られた各培養液について、細胞外オリゴマー量を前記２、３と同様の方法により測定した。
【００５６】
これらの結果を表４と図４に示す。検討したアルコールおよびジオールは、オリゴマー量を増加させる連鎖移動剤として機能する効果が確認された。特に、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ジプロプレングリコール、１，３−プロパンジオールの有用性が高いと考えられる。
【００５７】
【表４】
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【００５８】
６．ポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーの構造解析（その１）
前述した３のＹＢ４株（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２９００）のうち、ジエチレングリコール５体積％（５０ｍＬ／Ｌ）添加培地で培養して得られたオリゴマーについて、その繰り返し構造および末端構造を解析した。
【００５９】
オリゴマーは、溶媒抽出法により回収した。すなわち、オリゴマー含む培養液に等量のクロロホルムを加え、１時間攪拌後、静置し、クロロホルム層を回収した。回収液に等量の純水で３回洗浄し、水溶性物質を除去した。クロロホルム層を回収し、乾燥後、０．０３％（ｖ／ｖ）ＴＭＳ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｓｉｌａｎｅ）を含む重クロロホルム中に溶かし、０．４５μｍ径のＭｉｌｌｅｘ−ＨＶＰＶＤＦフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）にてろ過したものを用意した。
【００６０】
次に、上記サンプルについて１Ｈ−ＮＭＲを用いて、構造を決定した。具体的には、日本電子製ＮＭＲ機器を用い、室温にて５００ＭＨｚ、ＳＣＡＮ回数１２８回程度の条件で行った。データ解析は、ＡＣＬＩＣＥ２ ｆｏｒ ｗｉｎｄｏｗｓ ｖｅｒ．４を用いて行った。
【００６１】
これらの結果を図１に示す。図１に示すように、ポリ３−ヒドロキシブタン酸の末端に結合するジエチレングリコール由来のピークが４．２６ｐｐｍ付近にトリプレットとして観察された。また、ほかのジエチレングリコール由来のピークがそれぞれ３．６０および３．７２ｐｐｍ付近に観察された。
【００６２】
これらの結果より、上記３で得られたオリゴマーのうちジエチレングリコール５ｍＬ／Ｌ添加培地で培養して得られたオリゴマーはジエチレングリコールが末端に付加されたポリ３−ヒドロキシブタン酸であることが確認された。
【００６３】
７．ポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーの構造解析（その２）
前述した３のポリヒドロキシアルカン酸オリゴマーのうち、重合度および末端構造を解析した。
【００６４】
まず、前記６と同様にオリゴマーは溶媒抽出法により回収した。オリゴマー含む培養液に等量のクロロホルムを加え、１時間攪拌後、静置し、クロロホルム層を回収した。回収液に等量の純水で３回洗浄し、水溶性物質を除去した。クロロホルム層を回収し、乾燥後、メタノール中に溶かし、０．４５μｍ径のＭｉｌｌｅｘ−ＨＶＰＶＤＦフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）にてろ過したものを用意した。
【００６５】
次に、上記サンプルについてＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いて、重合度および末端構造を解析した。具体的には、ブルカー社製ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ機器を用い、データ収集はｍ／ｚ１００及び１０００の間のフルスキャンで、ポジティブモードで行った。サンプルをメタノールに溶解し、１８０μＬ／ｍｉｎの流速でイオン源に導入した。イオンスプレー電圧は、２５０Ｖとした。窒素ガスを使用した。データ解析は、付属ソフトウェアＣｏｍｐａｓｓを用いて行った。
【００６６】
これらの結果を図２に示す。図２に示すように、末端にジエチレングリコールが結合した２−９量体の主に３−ヒドロキシブタン酸（質量数８６の連鎖）から構成されるオリゴマー（Ｎａ付加体）が観察され、分子量は２００〜１０００であった。
【００６７】
オリゴマーのカルボキシ末端はジエチレングリコールが結合しており、水酸基末端は一部が脱水された構造が確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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