(57)【要約】【課題】HLAタイピングを行うことなしに、迅速かつ安価にHLA-LLを検出する方法を提供し、以て骨髄不全の診療を向上させること。【解決手段】HLAタイプが未知の被験者から採取した血液由来のDNAを対象として、HLA-A及び／又はHLA-B遺伝子のコード配列の19番目のヌクレオチドにおける機能喪失型変異を検出する工程を含む、HLAクラスＩアレル欠失血球の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
HLAタイプが未知の被験者から採取した血液由来のDNAにおける、HLA-A及び／又はHLA-B遺伝子のコード配列の19番目のヌクレオチドにおける機能喪失型変異を検出する工程を含む、HLAクラスＩアレル欠失血球の検出方法。
【請求項２】
機能喪失型変異がナンセンス変異である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
デジタルPCR法を用いて機能喪失型変異を検出する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
被験者が骨髄不全症候群患者又はその疑いのある者である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
骨髄不全が、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群及び発作性夜間ヘモグロビン尿症からなる群より選択される疾患によって引き起こされる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
PNH型血球の検出と組み合わせて用いられる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
HLAタイプが未知の被験者におけるHLAクラスＩアレル欠失血球検出のためのキットであって、
（ａ）HLA-A及び／又はHLA-B遺伝子のコード配列の19番目のヌクレオチドを含む、該遺伝子の部分ヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーセット、
（ｂ１）上記（ａ）のプライマーセットにより増幅されるPCR産物のうち、該19番目のヌクレオチドが正常なものに特異的にハイブリダイズし得るプローブ、並びに
（ｂ２）上記（ａ）のプライマーセットにより増幅されるPCR産物のうち、該19番目のヌクレオチドが機能喪失型変異を生じさせるように変異したものに特異的にハイブリダイズし得るプローブ
を含む、キット。
【請求項８】
機能喪失型変異がナンセンス変異である、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
（ａ１）HLA-A遺伝子の部分ヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーセットが、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と実質的に同一の配列からなるフォーワードプライマーと、配列番号２〜５で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれと実質的に同一の配列からなる１以上のリバースプライマーとを含み、並びに／あるいは
（ａ２）HLA-B遺伝子の部分ヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーセットが、配列番号６〜８で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれと実質的に同一の配列からなる１以上のフォーワードプライマーと、配列番号９〜１１で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれと実質的に同一の配列からなる１以上のリバースプライマーとを含む請求項７又は８に記載のキット。
【請求項１０】
前記（ｂ１）のプローブが、配列番号１２で表されるヌクレオチド配列と実質的に同一の配列からなり、前記（ｂ２）のプローブが、配列番号１３で表されるヌクレオチド配列と実質的に同一の配列からなる、請求項８又は９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、HLAクラスＩアレル欠失血球の検出方法及びそのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄不全とは、骨髄機能の低下によってすべての血球の減少を来たす状態である。造血幹細胞の質的・量的異常によって起こる特発性の骨髄不全を総称して「骨髄不全症候群」ということがある。骨髄不全症候群は、近年、人口の高齢化に伴い患者数は増加傾向にある。骨髄不全の範疇には、再生不良性貧血（AA）、骨髄異形成症候群（MDS）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）等が含まれるが、それらは互いにオーバーラップしており、境界が不明確であるため、治療に際しては病態に即した治療を行うことが重要である。
【０００３】
再生不良性貧血は、造血幹細胞が減少することにより、貧血に伴う動悸、息切れや、白血球減少による易感染性、血小板減少による紫斑、出血傾向など種々の症状を呈する。再生不良性貧血の発症には、細胞傷害性T細胞（CTL）による造血幹細胞の直接的な傷害や、造血幹細胞を抑制するT細胞ホルモンの過剰、などの免疫学的機序による造血抑制が、多くの症例で関与していると考えられている。一方、一部の症例では、造血幹細胞自身の異常が原因となって発症するが、これらの成因を鑑別する有効な方法は確立されていない。
【０００４】
再生不良性貧血や骨髄異形成症候群の診療においては、それらの発症に免疫病態が関与しているかどうかを判断することがもっとも重要である。というのも、これらの疾患に免疫病態が関与している場合、免疫抑制療法の奏効率が高く、毒性の強い別の治療が不用意に行われることを回避できるからである。免疫病態の関与を判断する最も簡便な方法として、フローサイトメトリーを用いた発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）形質の血球の検査がある。PNH型血球は、PNHに特徴的なGPIアンカー型膜タンパクを欠失した血球である。GPIアンカー型膜タンパクを欠失した造血幹細胞は、「造血幹細胞を静止期の状態に留める炎症性サイトカイン」に対する感受性が低下するために、このサイトカインが骨髄に高濃度に存在する環境では正常幹細胞に比べて活性化されやすくなり、それらがGPIアンカー型膜タンパク欠失血球を産生する。これが、免疫病態による骨髄不全でPNH型血球が検出されやすい理由と考えられている。
しかし、PNH型血球は全ての施設で正確に検出できる訳ではなく、また、PNH型血球が陰性であっても免疫病態を否定できる訳ではない。このためPNH型血球以外の免疫病態マーカーが求められている。
【０００５】
再生不良性貧血が、CTLによる造血幹細胞の攻撃によって起こることを示す最も直接的な証拠は、末梢血中のヒト白血球型抗原（HLA）クラスＩアレル欠失血球の存在である。CTLが標的細胞を攻撃するのは、標的細胞のHLAクラスＩ分子が提示する自己抗原ペプチドを、CTLが有するT細胞レセプターが認識するためである。ウイルス感染や環境毒への曝露等をきっかけとして、「造血幹細胞が高発現している自己抗原」に対するTリンパ球の「免疫寛容」が破綻し、その結果、造血幹細胞に対するCTLが誘導されると考えられる。健常者の骨髄には、様々な遺伝子に変異を起こした造血幹細胞が存在しているが、それらは通常静止期の状態にあるため、造血に寄与することはない。しかし、造血幹細胞に対するCTLの攻撃が起こると、造血に寄与している幹細胞が減少する一方、それを補うために眠っていた幹細胞が造血に動員される。この「起こされた」幹細胞の中に、HLAの遺伝子異常により特定のHLAクラスＩアレルを欠失した造血幹細胞があれば、それらはT細胞レセプターによって認識されないため、CTLの攻撃を免れて生き残り、HLAを欠失した血球を産生する。
HLAを欠失した白血球は、該HLA分子に対する特異的な抗体を用いてフローサイトメトリ
ー（FCM）により検出することができる。
【０００６】
このHLAクラスＩアレルを欠失するメカニズムには、HLA遺伝子群が存在する第6染色体短腕のヘテロ接合体消失（6pLOH）によるHLA遺伝子ハプロタイプの喪失や、HLAクラスＩアレルの体細胞変異などが挙げられる。HLA遺伝子をコードしている第6染色体短腕（6p）の片方が細胞分裂の際に欠失すると、染色体のバランスを保つために、残存する染色体が欠失部分を補うように2倍体を形成する。その結果生じるのが6pLOHである。この現象によって、一方のHLAだけを持つようになった白血球が、再生不良性貧血全体の約13％で検出される（非特許文献１）。この6pLOHは、特定の遺伝子領域の遺伝子コピー数を定量できるSNPアレイ解析という方法で従来から調べられてきた。
6pLOHの存在を検出する別の方法として、2つの対立遺伝子量のアンバランスを、droplet digital PCR（ddPCR）によって定量する方法が挙げられる（非特許文献２）。この方法は、正常であれば各対立遺伝子をPCRで増幅すると遺伝子量は1:1であるところが、6pLOHがある患者では、片方のみしか増幅されないため、増幅された遺伝子量が1:1とならないことを利用して、6pLOHの存在を検出するというものである。
【０００７】
一方、HLAクラスＩ遺伝子の体細胞変異は、次世代シーケンサーを用いて、HLAクラスＩ遺伝子領域を詳細に調べることによって明らかとなった（非特許文献２、３）。
【０００８】
以上のように、HLAクラスＩアレル欠失血球（以下、「HLA-LL」と略記する場合がある。）の存在を明らかにすることは、骨髄不全の病態を診断し、病態に即した適切な治療を行う上で非常に重要である。しかし、既存の検出方法には以下のような問題点がある。
（１）ddPCR法やFCMでHLA-LLを検出するためには、あらかじめ高額なHLAタイピングを実施する必要があること。
（２）HLAタイピングには通常1週間以上の時間がかかるため、その後のアッセイを含めると、HLA-LLの有無が明らかになるまでに1-3か月の時間を要すること。
（３）モノクローナル抗体で検出できるHLA抗原の種類は限られており、ddPCR法による6pLOH血球の検出もすべての例に適応できる訳ではないこと。
（４）次世代シーケンサーによるHLAアレルの体細胞変異の検出は、高額の費用と時間がかかるため、実用的ではないこと。
（５）これらすべての方法は、HLA-LLの検出感度が1％以上であるため、それより割合の低いHLA-LLは検出できないこと。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Katagiri et al., Blood, 118: 6601-6609(2011)
【非特許文献２】Zaimoku et al., Blood, 129: 2908-2916(2017)
【非特許文献３】Babushok et al., Blood Adv, 1:1900-1910(2017)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明の目的は、HLAタイピングを行うことなしに、迅速、高感度、かつ安価にHLA-LLを検出する方法を提供し、以て骨髄不全の診療を飛躍的に向上させることである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく、HLA-LL陽性患者に共通する遺伝子異常がないかを検索するため、6pLOHを有する患者のHLAクラスＩ遺伝子を次世代シーケンサーを用いて詳細に解析した。その結果、解析した22例中12例において、1症例当たり1-3種類（中央値1種類）の機能喪失型変異を検出した。驚くべきことに、検出した機能喪失型変異のほ
とんどが、HLAクラスＩアレルの種類に関係なく、HLA-A又はHLA-B遺伝子のエクソン1領域における特定の箇所に集中していた。この共通変異は、再生不良性貧血患者による保有頻度が最も高いHLAクラスＩアレル（HLA-B*40:02）の解析において以前に見出されていたが（非特許文献２、３）、任意のHLAクラスＩアレル間で共通する変異であることは全く認識されていなかった。
【００１２】
本発明者らは、この共通変異を簡便かつ高感度で検出することができれば、事前にHLAタイピングを行うことなくHLA-LLの有無を迅速に評価し得ると考え、次世代PCR法であるddPCR法に着目した。HLA遺伝子は全遺伝子の中で最も多型性の高い遺伝子であるため、特定の領域のみを増幅させるプライマーとプローブを作製することは極めて困難であったが、本発明者らは、試行錯誤の結果、高感度にこの変異を検出するプライマー-プローブセットの設計に成功した。このプライマー-プローブセットを用いて、末梢血由来のDNAを鋳型としてddPCR法を実施したところ、再生不良性貧血353例中101例（約29%）で当該共通変異が検出された。また、この方法を従来のPNH型血球検査と組み合わせれば、約4/5の症例で免疫病態を検出できることが明らかになった。特筆すべきことに、PNH型血球陰性108例の中にも34例（31％）で共通変異が検出された。したがって本方法を用いれば、PNH型血球検査では病態診断が困難な症例であっても免疫病態を検出できることが明らかになった。
【００１３】
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕HLAタイプが未知の被験者から採取した血液由来のDNAにおける、HLA-A及び／又はHLA-B遺伝子のコード配列の19番目のヌクレオチドにおける機能喪失型変異を検出する工程を含む、HLAクラスＩアレル欠失血球の検出方法。
〔２〕機能喪失型変異がナンセンス変異である、〔１〕に記載の方法。
〔３〕デジタルPCR法を用いて機能喪失型変異を検出する、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕被験者が骨髄不全症候群患者又はその疑いのある者である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕骨髄不全が、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群及び発作性夜間ヘモグロビン尿症からなる群より選択される疾患によって引き起こされる、〔４〕に記載の方法。
〔６〕PNH型血球の検出と組み合わせて用いられる、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕HLAタイプが未知の被験者におけるHLAクラスＩアレル欠失血球検出のためのキットであって、
（ａ）HLA-A及び／又はHLA-B遺伝子のコード配列の19番目のヌクレオチドを含む、該遺伝子の部分ヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーセット、
（ｂ１）上記（ａ）のプライマーセットにより増幅されるPCR産物のうち、該19番目のヌクレオチドが正常なものに特異的にハイブリダイズし得るプローブ、並びに
（ｂ２）上記（ａ）のプライマーセットにより増幅されるPCR産物のうち、該19番目のヌクレオチドが機能喪失型変異を生じさせるように変異したものに特異的にハイブリダイズし得るプローブ
を含む、キット。
〔８〕機能喪失型変異がナンセンス変異である、〔７〕に記載のキット。
〔９〕（ａ１）HLA-A遺伝子の部分ヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーセットが、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と実質的に同一の配列からなるフォーワードプライマーと、配列番号２〜５で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれと実質的に同一の配列からなる１以上のリバースプライマーとを含み
、並びに／あるいは
（ａ２）HLA-B遺伝子の部分ヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーセットが、配列番号６〜８で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれと実質的に同一の配列からなる１以上のフォーワードプライマーと、配列番号９〜１１で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれと実質的に同一の配列からなる１以上のリバースプライマーとを含む
〔７〕又は〔８〕に記載のキット。
〔１０〕前記（ｂ１）のプローブが、配列番号１２で表されるヌクレオチド配列と実質的に同一の配列からなり、前記（ｂ２）のプローブが、配列番号１３で表されるヌクレオチド配列と実質的に同一の配列からなる、［８］又は［９］に記載のキット。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、HLAタイピングを行うことなしに、簡便かつ高感度にHLA-LLを検出することができるので、HLAタイピングが必要な従来法と比べて、きわめて迅速かつ安価に骨髄不全の免疫病態を診断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】HLA-LL陽性患者22例について、次世代シーケンサーを用いてHLAクラスＩ遺伝子の変異の有無を解析した結果を示す図である。左の円グラフは、22例中12例で6pLOHに加えて機能喪失型変異が見出されたことを示す。右図は、HLA-A及びHLA-B遺伝子のどの位置にどのような種類の変異が起こっているかを模式的に示す。
【図２】（Ａ）ddPCR法を用いた本発明の検出方法の結果の一例を示す図である。（Ｂ）本発明の検出方法におけるカットオフ値の決定の様子を示す。左は希釈系列を用いた検出感度の検定結果を示し、右は健常者24名における検出結果（全例が0.07％未満）を示す。
【図３】ddPCR法を用いた本発明の検出方法の実際の検査結果（実施例１）を示す図である。上がHLA-LL陽性例、下がHLA-LL陰性例を示す。
【図４】再生不良性貧血患者303例（実施例１）におけるPNH型血球の有無及び本発明の共通変異の有無の内訳を示す図である。
【図５】同一症例における実施例１（上）と実施例２（下）の検査結果の比較を示す図である。プライマーとPCR試薬の種類を変更することにより増幅効率が向上し、ddPCRの反応時間を短縮することができ、分離能も顕著に改善した。
【図６】再生不良性貧血患者353例（実施例２）におけるPNH型血球の有無及び本発明の共通変異の有無の内訳を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
［Ｉ］本発明の検出方法
本発明は、HLAタイプが未知の被験者におけるHLAクラスＩアレル欠失血球（HLA-LL）を検出する方法（以下、「本発明の検出方法」ともいう。）を提供する。
アレルとは、一対の相同染色体の同じ遺伝子座に存在する個々の遺伝子を指す。「HLAクラスＩアレル欠失血球（HLA-LL）」は、6pLOHにより1個以上のHLAクラスＩ（例、HLA-A、HLA-B、HLA-C）対立遺伝子を欠失するか、特定のHLAクラスＩアレルの機能喪失型変異によって、当該対立遺伝子にコードされるHLAクラスＩ分子を表面上に発現しない白血球を意味する。
【００１８】
本発明の検出方法は、被験者から採取した血液由来のDNAにおける、HLA-A及び／又はHLA-B遺伝子のコード配列の19番目のヌクレオチド（以下、「標的ヌクレオチド」ともいう。）における機能喪失型変異を検出する工程を含む。
【００１９】
本発明の検出方法において、測定対象となる「被験者」は、骨髄不全症候群患者又はそ
の疑いのある者である。骨髄不全とは、骨髄機能の低下によってすべての血球の減少を来たす状態であり、「骨髄不全症候群」とは、造血幹細胞の質的・量的異常によって起こる特発性の骨髄不全の総称である。骨髄不全症候群の範疇には、再生不良性貧血（AA）、骨髄異形成症候群（MDS）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、大顆粒リンパ球増多症（LGL）、赤芽球癆（PRCA）、等が含まれる。本発明の検出方法における主な被験者は、骨髄不全の発症に免疫病態が関与している可能性がある再生不良性貧血、骨髄異形成症候群もしくは発作性夜間ヘモグロビン尿症患者、又はその疑いのある者である。
【００２０】
本発明の検出方法は、HLAタイピングを行うことなしに、被験者におけるHLA-LLの有無を迅速に検出できることに最大の特徴がある。従って、本発明の検出方法における被験者は、HLAタイプが既知である必要はない。
【００２１】
本発明の検出方法に用いる被験者由来のサンプルとしては、白血球を含む末梢血から抽出したゲノムDNAが挙げられる。例えば、通常の採血により被験者から採取した血液からフェノール抽出法などによりゲノムDNAを単離することができる。その際、例えば、QIAmp
Circulating Nucleic Acid Kitなどの市販のゲノムDNA抽出キットや装置を用いてもよい。
【００２２】
本発明の検出方法において検出対象となる機能喪失型変異は、HLA-A及び／又はHLA-B遺伝子のコード配列の19番目のヌクレオチドであるシトシン（c.19C）における機能喪失型変異である。当該ヌクレオチドは、HLA-A及びHLA-B遺伝子のエクソン1内に位置し、7番目のコドン（CGA）の第１ヌクレオチドにあたる。機能喪失型変異としては、例えば、ナンセンス変異、フレームシフト変異などが挙げられる。本発明において検出するナンセンス変異は、19番目のシトシンがチミンに置換することにより終止コドン（TGA）を生じる変異（c.19C>T）である。一方、フレームシフト変異としては、19番目のヌクレオチドの位置における1もしくは2ヌクレオチドの欠失又は挿入が挙げられるが、好ましくは19番目のシトシンの欠失（c.19delC）によるフレームシフト変異である。より好ましくは、本発明の検出方法における検出対象となる機能喪失型変異は、19番目のシトシンがチミンに置換すること（c.19C>T）によるナンセンス変異である。
【００２３】
一般に遺伝子における機能喪失型変異の有無は、当分野で公知の任意の多型解析方法によって行うことができる。例えば、PCR法を用いた方法が挙げられる。PCR法を用いた方法としては、対象の核酸をPCR法により増幅し、増幅産物の変異を蛍光又は発光によって検出する方法、PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism：制限酵素断片長多型)法、PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism：単鎖高次構造多型)法(Orita,M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 2766-2770(1989)等)、PCR-SSO(specific sequence oligonucleotide：特異的配列オリゴヌクレオチド)法、PCR-SSO法とドットハイブリダイゼーション法を組み合わせたASO(allele specific oligonucleotide：アレル特異的オリゴヌクレオチド)ハイブリダイゼーション法(Saiki, Nature, 324, 163-166(1986)等)、TaqMan（登録商標、Roche Molecular Systems社）-PCR法(Livak, KJ, Genet Anal,14,143(1999),Morris, T. et al., J. Clin.Microbiol.,34,2933(1996))に代表されるリアルタイムPCR法、デジタルPCR法（例：droplet digital PCR（ddPCR）法、微細孔分配式デジタルPCR法等）などが挙げられる。
【００２４】
その他の方法として、サイクリングプローブ法、Invader（登録商標、Third Wave Technologies社）法(Lyamichev V et al., Nat Biotechnol,17,292(1999))、FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を利用した方法（Heller, Academic Press Inc, pp. 245-256(1985)、Cardullo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8790-8794(1988)、国際公開第99/28500号公報、特開2004-121232号公報など）、DNAチップ又はマイクロアレイを用いた方法(Wang DG et al., Science 280,1077(1998)等)、サザンブロットハイブリ
ダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法（Southern,E., J. Mol. Biol. 98,
503-517(1975)）などがある。
【００２５】
微量な変異DNAを検出するためには、簡便性や感度の点からPCR法を用いた方法が好ましい。また、従来のリアルタイムPCRとは異なり、増幅効率を気にしなくてよく、絶対定量が可能で、高精度・高感度で処理性能にも優れた次世代PCRであるデジタルPCR、就中ddPCRが特に好ましい。
【００２６】
PCR法を用いる場合、本発明の検出方法は、例えば、以下のようにして行うことができる。
（１）標的ヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするプローブセットとDNAサンプルとを接触させる工程
（２）標的ヌクレオチドを含む領域をPCRにより増幅する工程
（３）工程（２）で増幅したPCR産物を含む溶液の蛍光強度を測定する工程
（４）前記（３）の測定結果に基づき、標的ヌクレオチドにおける機能喪失型変異を検出する工程
【００２７】
（１）プローブセットとDNAサンプルとを接触させる工程
（ａ）プローブセット
工程（１）に用いる標的ヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするプローブセットとしては、HLA-A及び／又はHLA-B遺伝子の、標的ヌクレオチドを含む部分ヌクレオチド配列とハイブリダイズする約5〜約30塩基、好ましくは約7〜約20塩基の連続したヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドが用いられる。該プローブセットは、標的ヌクレオチド部分が正常型（シトシン）と変異型（機能喪失型変異がナンセンス変異の場合、チミン）である2種類のプローブからなる。
【００２８】
本発明の好ましい一実施態様においては、該プローブセットは、HLA-AおよびHLA-B遺伝子に対して、配列番号１２で表されるヌクレオチド配列（CCCCGAACC）と実質的に同一の配列からなるオリゴヌクレオチド（正常型）と、配列番号１３で表されるヌクレオチド配列と実質的に同一の配列からなるオリゴヌクレオチド（変異型）である。ここで配列番号１３で表されるヌクレオチド配列（CCCTGAACC）と実質的に同一の配列からなるオリゴヌクレオチドは、HLA-A及びHLA-B遺伝子の標的ヌクレオチドにおけるナンセンス変異を検出するためのプローブである。配列番号１２で表される配列は、HLA-A及びHLA-B両遺伝子のコード配列の16〜24番目のヌクレオチド配列に相当し、大半のアレルで、両遺伝子間で配列が完全に一致するので、一種類のプローブセットでHLA-A及びHLA-Bの両方を測定することができる。
【００２９】
ここで「実質的に同一の配列」とは、完全に同一な配列だけでなく、「HLA-A及び／又はHLA-B遺伝子の標的ヌクレオチドを含む部分ヌクレオチド配列にPCR反応の条件下でハイブリダイズし得ることを条件として、上記の各配列番号で表されるヌクレオチド配列において、標的ヌクレオチドに対応するヌクレオチドを除く1もしくは2ヌクレオチド、好ましくは1ヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されている配列」をも包含することを意味する。好ましくは、本発明に用いられるプローブセットは、配列番号１２で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（正常型）と、配列番号１３で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（変異型）である。
【００３０】
各プローブには標識物質を結合させることができる。該標識物質は、例えば、蛍光色素等が挙げられる。かかる蛍光色素は、種々のものが市販されており、例えば、6-FAM（フルオレセイン）、HEX、TE、Quasar 670、Quasar 570、Quasar 705、Pulsar 650、TET、HEX、VIC、JOE、CAL Fluor Orenge、CAL Fluor Gold、CAL Fluor Red、Texas Red、Cy、Cy5
などが挙げられる。正常型プローブに結合される蛍光色素と、変異型プローブに結合される蛍光色素とは、異なるものであることが好ましい。この構成をとることにより、正常な標的ヌクレオチド（c.19C）を有するHLA断片には正常型プローブが、機能喪失型変異を生じる標的ヌクレオチド（ナンセンス変異の場合、c.19C>T）を有するHLA断片には変異型プローブがそれぞれハイブリダイズすることで、各プローブの蛍光色素に由来する2種類の蛍光が検出される。
【００３１】
各プローブは、さらに蛍光物質からの蛍光を消光できるクエンチャーが結合されていることが好ましい。クエンチャーとしては、蛍光色素からの蛍光を消光できるものであれば特に制限されず、蛍光色素であっても非蛍光色素であってもよいが、検出の精度の観点から非蛍光色素が好ましい場合があり得る。具体的なクエンチャーとしては、例えば、6-カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）、6-カルボキシ-X-ローダミン（ROX）、Eclipse Dark Quencher、Iowa black FQ（IBFQ）、minor groove binder（MGB）、非蛍光クエンチャー（NFQ）などが挙げられる。
【００３２】
プローブの構成単位としては、例えば、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドが挙げられる。前記ヌクレオチド残基は、構成要素として、糖、塩基及びリン酸を含む。リボヌクレオチドは、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）及びウラシル（U）（チミン（T）に置き換えることもできる）を有し、デオキシリボヌクレオチド残基は、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン（dA）、グアニン（dG）、シトシン（dC）及びチミン（dT）（ウラシル（dU）に置き換えることもできる）を有する。
【００３３】
これらのヌクレオチドは、修飾されていても（修飾されたヌクレオチド残基を「修飾ヌクレオチド残基」と称することがある）、非修飾であってもよい（非修飾のヌクレオチド残基を「非修飾ヌクレオチド残基」と称することがある）。修飾ヌクレオチド残基を含むことによって、ヌクレアーゼ耐性が向上し、その結果安定性が向上し得る。修飾ヌクレオチド残基を有する場合、プローブ中の修飾ヌクレオチド残基の存在位置及び割合は特に限定されない。また、非修飾ヌクレオチド残基や修飾ヌクレオチド残基とは異なる分子で構成されるリンカー領域を含んでいてもよい。
【００３４】
前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記非修飾ヌクレオチド残基の構成要素のいずれが修飾されてもよい。本発明において、「修飾」には、例えば、前記構成要素の置換、付加及び／又は欠失、前記構成要素における原子及び／又は官能基の置換、付加及び／又は欠失が挙げられる。前記修飾ヌクレオチド残基としては、例えば、天然に存在するヌクレオチド残基、人工的に修飾したヌクレオチド残基等が挙げられる。前記天然由来の修飾ヌクレオチド残基としては、例えば、リンバックら（Limbach et al., 1994, Summary:the modified nucleosides of RNA, Nucleic Acids Res．22:2183〜2196）を参照できる。また、前記修飾ヌクレオチド残基としては、例えば、ヌクレオチドの代替物の残基が挙げられる。
【００３５】
前記ヌクレオチド残基の修飾は、例えば、糖−リン酸骨格（該骨格には、塩基も含まれる）（以下、糖リン酸骨格）の修飾が挙げられる。前記糖リン酸骨格において、糖がリボースの場合、例えば、リボース残基を修飾できる。前記リボース残基は、例えば、2’位炭素を修飾でき、具体的には、例えば、2’位炭素に結合する水酸基をメチル基で修飾、あるいは該水酸基を水素又はフルオロ等のハロゲンに置換できる。また、前記2’位炭素の水酸基を水素に置換することで、リボース残基をデオキシリボースに置換できる。前記リボース残基は、例えば、立体異性体に置換でき、例えば、アラビノース残基に置換してもよい。以下では、前記のように糖の2’位炭素に結合する水酸基をメチル基で修飾した核酸を2'−O−メチル修飾核酸と称することがある。また、本発明において、「核酸」に
はヌクレオチドなどの核酸モノマーが包含される。
【００３６】
前記糖リン酸骨格は、例えば、非リボース残基（非デオキシリボース残基も包含されるものとする）及び／又は非リン酸を有する非リボースリン酸骨格に置換してもよく、このような置換も糖リン酸骨格の修飾に包含される。前記非リボースリン酸骨格は、例えば、前記糖リン酸骨格の非荷電体が挙げられる。前記非リボースリン酸骨格に置換された、前記ヌクレオチドの代替物は、例えば、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン等が挙げられる。前記代替物は、この他に、例えば、人工核酸が挙げられる。具体例として、例えば、PNA（ペプチド核酸）、架橋構造型人工核酸（BNA：Bridged Nucleic Acid）などが挙げられる。BNAとしては、例えば、ロックト人工核酸（LNA：Locked Nucleic Acid）、2’-O,4’-C-エチレン架橋核酸（ENA：2’-O,4’-C-Ethylenebridged Nucleic Acid）などが挙げられるが、好ましくはLNAである。
【００３７】
前記工程（１）において、該プローブセットと、DNAサンプルとを接触させる方法は特に制限されないが、例えば、同一溶液中にプローブセットとDNAとを加えることで行うことができる。
【００３８】
また、上記溶液中には、通常PCRプライマーセット及びDNAポリメラーゼが含まれる。
【００３９】
（ｂ）PCRプライマーセット
該PCRプライマーセットは、HLA-A遺伝子、HLA-B遺伝子の標的ヌクレオチドを含む部分ヌクレオチド配列を特異的に増幅し得る、約15〜約30塩基のフォワードプライマー及びリバースプライマーからなるセットであれば特に制限はないが、HLA遺伝子は機能的遺伝子の中では最も高度な多型性を示すので、任意のHLAタイプについて標的ヌクレオチドを含む領域を増幅し得るようにするためには、多個体のHLA-A及びHLA-B遺伝子の配列情報を元に、標的ヌクレオチドを挟む領域で最も多型性の低い領域を選択し、必要に応じて、複数種のプライマーを設計することが望ましい。
【００４０】
当該プライマーセットを構成するヌクレオチドとしては、前記プローブセットと同様のものを用いることができ、また、前記プローブを構成するヌクレオチドと同様の修飾を施されたものであってもよい。
【００４１】
本発明の好ましい一実施態様においては、該プライマーセットとして、HLA-A遺伝子に対しては、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と実質的に同一の配列からなるフォーワードプライマーと、配列番号２〜５で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれと実質的に同一の配列からなる１以上のリバースプライマーとを含むプライマーセットを挙げることができる。また、HLA-B遺伝子に対しては、配列番号６〜８で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれと実質的に同一の配列からなる１以上のフォーワードプライマーと、配列番号９〜１１で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれと実質的に同一の配列からなる１以上のリバースプライマーとを含むプライマーセットを挙げることができる。
【００４２】
ここで「実質的に同一の配列」とは、完全に同一な配列だけでなく、「HLA-A及び／又はHLA-B遺伝子の各標的配列にPCR反応の条件下でハイブリダイズし得ることを条件として、上記の各配列番号で表されるヌクレオチド配列において、1もしくは2ヌクレオチド、好ましくは1ヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加された配列」をも包含することを意味する。好ましくは、本発明に用いられるプライマーセットは、HLA-A遺伝子に対しては、配列番号１及び／又は１４で表されるヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーと、配列番号２〜５で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド
配列のそれぞれからなる１以上のリバースプライマーとを含むプライマーセットである。また、HLA-B遺伝子に対しては、配列番号６〜８で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれからなる１以上のフォーワードプライマーと、配列番号９〜１１で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれからなる１以上のリバースプライマーとを含むプライマーセットである。
【００４３】
（ｃ）DNAポリメラーゼ
上記DNAポリメラーゼは、通常PCR法に用いられるDNAポリメラーゼであれば特に限定されない。
【００４４】
（２）標的ヌクレオチドを含む領域をPCRにより増幅する工程
前記工程（２）において、標的ヌクレオチドを含む領域をPCRにより増幅する方法は特に限定されないが、デジタルPCR法により増幅することが好ましい。デジタルPCRは、例えば、次の手順により行われる。デジタルPCR装置に、プローブセット、DNAサンプル、PCRプライマーセット及びDNAポリメラーゼを含む反応溶液をセットする。ここで各反応液成分の混合比率は、自体公知の範囲で適宜選択し、最適化することができる。例えば、後述の実施例に示される混合比率とすることが挙げられるが、使用するプライマーセットやプローブセット等に応じて適宜変更することができる。但し、骨髄不全症候群患者では、全血であっても十分量のDNAを得られない可能性があるので、DNAサンプル量は反応溶液あたり50〜200ng、好ましくは80〜150ngとすることが好ましい。
デジタルPCR装置により、反応溶液はチップに設けられた数千から数万という多数の反応ウェルに分配される。反応ウェルは、例えば、開口の大きさが数十μｍである微小なウェルやナノリットルサイズのドロップレットである。反応ミックスをチップに添加すると、チップ上の一部の反応ウェルにはHLA-A又はHLA-Bアレルが好ましくは１コピー程度含まれ、その他の反応ウェルには該アレルが含まれない状態となるよう、反応ミックスが反応ウェルに分配される。複数の反応ウェルに分配された反応ミックス内でPCRを実施すると、目的のHLAアレルが存在する反応ウェルでは、該アレルの一部の領域が増幅され、その際に、DNAポリメラーゼのヌクレアーゼ活性により、標的領域に結合したプローブが切断され蛍光色素が乖離し、蛍光を発する。
【００４５】
（３）PCR産物を含む溶液の蛍光強度を測定する工程
前記工程（３）における蛍光強度を測定は、例えば、自体公知の蛍光リーダーを用いて行うことができる。前記PCRをデジタルPCRで行った場合には、例えば、デジタルPCR装置のリーダーにより、蛍光が検出された反応ウェルの数を計測することで、蛍光強度が測定できる。蛍光色素が異なる複数のプローブを用いた場合には、各蛍光に由来する蛍光を検出することで、複数の蛍光強度を一度に測定することができる。
【００４６】
（４）標的ヌクレオチドにおける機能喪失型変異を検出する工程
前記工程（４）において、前記工程（３）の測定結果に基づき、HLA-A及び／又はHLA-B遺伝子の標的ヌクレオチドにおける機能喪失型変異を検出することができる。即ち、前記測定結果から、各遺伝子について、正常DNAのコピー数と変異DNAのコピー数を求め、変異DNAのコピー数を、正常DNAのコピー数と変異DNAのコピー数の和で除すことにより、変異のアレル頻度を算出することができる。
【００４７】
得られた変異のアレル頻度がカットオフ値よりも高い場合、被験者はHLA-LL陽性であると判定することができる。ここでカットオフ値は、例えば、一定数以上の健常者から採取した血液由来のDNAを鋳型として、上記と同様にしてPCR反応を実施し、変異のアレル頻度（偽陽性率）を算出して得られる中央値又は平均値よりも十分に高く（例えば、+3SD）、かつPCR反応の検出限界よりも高い数値で適宜決定することができる。カットオフ値は、測定に用いるDNA量に依存するが、後述の実施例のようにDNA量を反応溶液あたり100ngと
した場合、健常者における偽陽性率は0〜0.042%（中央値0.009％）であり、感度検定の結果と合わせてカットオフ値を0.07%と設定した。
【００４８】
本発明の検出方法によって、HLA-LL陽性と判定された場合、被験者は、免疫学的機序による造血幹細胞の傷害により骨髄不全を発症している可能性が高いと判断することができる。従って、該被験者には、免疫抑制療法、例えば抗胸腺細胞免疫グロブリン（ATG）及び／又はシクロスポリン（CsA）の投与が有効であると予測することができる。
以上の観点から、本発明はまた、本発明の検出方法を実施すること、その結果、HLA-LL陽性と判定された被験者に対して、免疫抑制療法、例えばATG及び／又はCsAの投与を行うことを含む、骨髄不全における免疫病態の診断及び治療方法を提供する。
【００４９】
本発明の検出方法をPNH型血球検査と組み合わせて用いることができる。上述のように、PNH型血球は全ての施設で正確に検出できる訳ではなく、また、PNH型血球が陰性であっても免疫病態を必ずしも否定できない。従って、特に、PNH型血球検査で陰性であった被験者に対して、本発明の検出方法を実施することが望ましい。本発明の検出方法において、HLA-LL陽性と判定された場合、PNH型血球陰性であっても、免疫学的機序による造血幹細胞の傷害により骨髄不全を発症していると考えられる。従って、これらの例では免疫抑制療法が有効であると予測することができる。PNH型血球検査は、例えば、Sugimori et al., Blood, 107: 1308-1314 (2006)、特開2012-122954号公報に記載の方法等により実施することができるが、それらに限定されない。
【００５０】
［ＩＩ］本発明のキット
本発明はまた、HLAタイプが未知の被験者におけるHLAクラスＩアレル欠失血球の検出のためのキット（以下、「本発明のキット」ともいう。）を提供する。当該キットは、上記の本発明の検出方法を実施するのに適したキットであり、下記（ａ）のプライマーセットと下記（ｂ１）及び（ｂ２）のプローブセットとを構成として含む。
（ａ）HLA-A及び／又はHLA-B遺伝子のコード配列の19番目のヌクレオチドを含む、該遺伝子の部分ヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーセット
（ｂ１）上記（ａ）のプライマーセットにより増幅されるPCR産物のうち、該19番目のヌクレオチドが正常なものに特異的にハイブリダイズし得るプローブ
（ｂ２）上記（ａ）のプライマーセットにより増幅されるPCR産物のうち、該19番目のヌクレオチドが機能喪失型変異を生じさせるように変異したものに特異的にハイブリダイズし得るプローブ
【００５１】
好ましい実施態様において、HLA-A及び／又はHLA-B遺伝子のコード配列の19番目のヌクレオチドにおける機能喪失型変異はナンセンス変異又はフレームシフト変異であり、より好ましくはナンセンス変異である。
【００５２】
前記（ａ）のプライマーセットは、任意のHLAタイプを有する被験者由来のDNAから、HLA-A及び／又はHLA-B遺伝子の該19番目のヌクレオチドを含む領域を増幅し得るものであることが望ましい。HLA遺伝子は機能的遺伝子の中では最も高度な多型性を示すので、任意のHLAタイプについて標的ヌクレオチドを含む領域を増幅し得るようにするためには、できるだけ多型性の低い領域にプライマー配列を設定することが望ましい。
【００５３】
好ましい一実施態様においては、前記（ａ）のプライマーセットとして、
（ａ１）HLA-A遺伝子の部分ヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーセットが、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と実質的に同一の配列からなるフォーワードプライマーと、配列番号２〜５で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれと実質的に同一の配列からなる１以上のリバースプライマーとを含み、並びに／あるいは
（ａ２）HLA-B遺伝子の部分ヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーセットが、配列番号６〜８で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれと実質的に同一の配列からなる１以上のフォーワードプライマーと、配列番号９〜１１で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれと実質的に同一の配列からなる１以上のリバースプライマーとを含むものが挙げられる。
ここで「実質的に同一の配列」とは前記本発明の検出方法における「（ｂ）PCRプライマーセット」の場合と同義である。
【００５４】
より好ましくは、前記（ａ）のプライマーセットは、
（ａ１）HLA-A遺伝子の部分ヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーセットが、配列番号１及び／又は１４で表されるヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーと、配列番号２〜５で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれからなる１以上のリバースプライマーとを含み、並びに／あるいは
（ａ２）HLA-B遺伝子の部分ヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーセットが、配列番号６〜８で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれからなる１以上のフォーワードプライマーと、配列番号９〜１１で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれからなる１以上のリバースプライマーとを含むものである。
【００５５】
特に好ましくは、前記（ａ）のプライマーセットは、
（ａ１）HLA-A遺伝子の部分ヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーセットが、配列番号１又は１４（好ましくは、配列番号１４）で表されるヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーと、配列番号２〜５で表されるヌクレオチド配列のそれぞれからなる4種のリバースプライマーとを含み、並びに／あるいは
（ａ２）HLA-B遺伝子の部分ヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーセットが、配列番号６〜８で表されるヌクレオチド配列のそれぞれからなる3種のフォーワードプライマーと、配列番号９〜１１で表されるヌクレオチド配列のそれぞれからなる3種のリバースプライマーとを含むものである。
（ａ１）において、配列番号１４で表されるヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーを用いると、他のPCR試薬の種類によっても異なるが、増幅効率がより向上し、分離能を改善させ得る。
【００５６】
また、HLA-A及び／又はHLA-B遺伝子のコード配列の19番目のヌクレオチドにおける機能喪失型変異がナンセンス変異の場合、好ましくは、
前記（ｂ１）のプローブは、配列番号１２で表されるヌクレオチド配列と実質的に同一の配列からなるものであり、
前記（ｂ２）のプローブは、配列番号１３で表されるヌクレオチド配列と実質的に同一の配列からなるものである。
ここで「実質的に同一の配列から」とは前記本発明の検出方法における「（ａ）プローブセット」の場合と同義である。
【００５７】
より好ましくは、該プローブセットは、
前記（ｂ１）のプローブが、配列番号１２で表されるヌクレオチド配列からなるものであり、
前記（ｂ２）のプローブが、配列番号１３で表されるヌクレオチド配列からなるものである。
【００５８】
本発明のキットは、前記（ａ）のプライマーセットと、上記（ｂ１）の正常型プローブ及び上記（ｂ２）の変異型プローブからなるプローブセットとに加えて、上記の本発明の検出方法におけるPCR反応に使用される試薬類、例えば、DNA抽出用試薬、DNAポリメラー
ゼ、dNTPs、反応緩衝液、PCRの陽性コントロールとなる標的領域を含む核酸等、さらには、容器、器具、説明書などを含むことができる。また、上記プライマーセット又はプローブセットは、各プライマー又は各プローブを共存状態で保存することにより、反応に悪影響を及ぼさない限り、それらを混合したプローブセット及び／又はプライマーセットとして、キットに含めることができる。
【００５９】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６０】
参考例１  HLAクラスＩアレル欠失血球（HLA-LL）陽性患者に共通する遺伝子異常の同定
HLAクラスＩアレル欠失血球陽性患者22例について、HLAクラスＩ遺伝子を次世代シーケンサー（機種：Miseq; illumina社）を用いて解析した。その結果、22例中12例に、1症例当たり1-3種類（中央値1種類）の機能喪失型変異が検出された。
【００６１】
【表１】
2020184992.tif 000002
【００６２】
さらに興味深いことに、検出した機能喪失型変異のほとんどがHLAクラスＩアレルに関係なく、HLA-A及びHLA-B遺伝子のエクソン1中のコード配列の19番目のヌクレオチド(c.19C)に集中していることが明らかとなった（図１）。従って、この共通変異は、HLAをタイピングすることなくHLA-LLの有無を評価するための有用なマーカーとなり得ることが示唆された。
【００６３】
実施例１  ddPCR法によるHLAクラスＩ遺伝子の共通変異を指標にしたHLA-LLの検出
そこで、この共通変異を高感度で検出するためddPCR法を用いて、再生不良性貧血患者303例と健常者24名から採取した全血より抽出したDNAサンプルについて、参考例１で同定された共通変異（ナンセンス変異（c.19C>T））のアレル頻度を測定した。
すべてのHLAクラスＩ遺伝子の多型をカバーするため、HLA-Aに対して、FW primer 1種類（配列番号１）、RV primer 4種類（配列番号２〜５）を設計した。また、HLA-Bに対しては、FW primer 3種類（配列番号６〜８）、RV primer 3種類（配列番号９〜１１）を設計した。FW及びRV primerは、それぞれ最終濃度が500 nMになるように混合した。Probeは変異配列（配列番号１３）と正常配列（配列番号１２）にそれぞれ1種類ずつ設計し、より感度を高めるために、通常のTaqman probeにLNA (Locked Nucleic Acids) を組み入れたprobeを設計した。それぞれのprobeが最終濃度250 nMとなるよう調整した。正常型プロ
ーブはHEXで、変異型プローブはFAMで標識した。クエンチャーとしてprobeの配列の3’末端側にIowa black FQ (IDT) を使用した。
【００６４】
【表２】
2020184992.tif 000003
【００６５】
表３に示す比率でそれぞれの試薬を混合し、反応液をセットアップし、該反応液QX200 Droplet Generator（Bio-Rad社）にセットしてDropletを作製した。
【００６６】
【表３】
2020184992.tif 000004
【００６７】
Droplet作製後、表４に示す条件でサーマルサイクラーを用いてPCR反応を行い、PCR終了後、QX200 Droplet reader（Bio-Rad社）で測定し、Quantasoft software（Bio-Rad社）で解析した。結果の一例を図２（Ａ）に示す。変異のアレル頻度の計算は、Mtの変異DNAのコピー数を、Wtの正常DNAのコピー数と変異DNAコピー数を足したもので割ることで計算した。
【００６８】
【表４】
2020184992.tif 000005
【００６９】
再生不良性貧血患者は、全血であっても十分量のDNAを得られない可能性があるため、本プロトコールで使用するDNA量は100 ngという少量に設定した。健常者24名の共通変異のアレル頻度の中央値は0.009 %であったことから、希釈系列によって決定した感度の結果と合わせて、カットオフ値を0.07%と設定した（図２（Ｂ））。
【００７０】
図３に実際の測定結果の例を示した。上の症例は陽性例で、共通変異のアレル頻度は1.28%と算出された。下の症例は陰性例で、アレル頻度は0.01%とカットオフ値未満のため、陰性と判定された。303例についてこのddPCR法を用いて共通変異を検出したところ、303例中99例（32.7%）が陽性であり、変異クローンサイズの中央値は0.60% (range, 0.074-23.1%)であった。
【００７１】
PNH型血球検査と、ddPCRを用いた共通ナンセンス変異検査を組み合わせることにより、図４に示すように、約4/5の症例で免疫病態を検出することができるようになった。特に重要な所見は、ddPCRを用いた本アッセイにより、これまでは病態診断が困難であった「PNH型血球陰性」の92例中30例（32.6%）に共通ナンセンス変異が検出されることである。
【００７２】
実施例２   ddPCR法によるHLAクラスＩ遺伝子の共通変異を指標にしたHLA-LLの検出（２）
実施例１で調べた303例を含む再生不良性貧血患者353例と健常者24名から採取した全血より抽出したDNAサンプルについて、一部のプライマー、試薬、及びPCR条件を変えた以外は実施例１と同様にして、共通変異（ナンセンス変異（c.19C>T））のアレル頻度を測定した。
HLA-Aに対して、FW primer 1種類（配列番号１４）、RV primer 4種類（配列番号２〜５）を設計した。また、HLA-Bに対しては、FW primer 3種類（配列番号６〜８）、RV primer 3種類（配列番号９〜１１）を設計した。FW及びRV primerは、それぞれ最終濃度が500 nMになるように混合した。Probeは変異配列（配列番号１３）と正常配列（配列番号１２）にそれぞれ1種類ずつ設計し、より感度を高めるために、通常のTaqman probeにLNA (Locked Nucleic Acids) を組み入れたprobeを設計した。それぞれのprobeが最終濃度250 nMとなるよう調整した。正常型プローブはHEXで、変異型プローブはFAMで標識した。クエンチャーとしてprobeの配列の3’末端側にIowa black FQ (IDT) を使用した。
【００７３】
【表５】
2020184992.tif 000006
【００７４】
表６に示す比率でそれぞれの試薬を混合し、反応液をセットアップし、該反応液QX200 Droplet Generator（Bio-Rad社）にセットしてDropletを作製した。
【００７５】
【表６】
2020184992.tif 000007
【００７６】
Droplet作製後、表７に示す条件でサーマルサイクラーを用いてPCR反応を行い、PCR終了後、QX200 Droplet reader（Bio-Rad社）で測定し、Quantasoft software（Bio-Rad社）で解析した。
【００７７】
【表７】
2020184992.tif 000008
【００７８】
変異のアレル頻度の計算は、実施例１と同様に、Mtの変異DNAのコピー数を、Wtの正常DNAのコピー数と変異DNAコピー数を足したもので割ることで計算した。カットオフ値も実施例１と同様に0.07%に設定した。
【００７９】
図５に、同一症例についての実施例１と実施例２の測定結果の比較を示した。上は実施例１の測定結果であり、下は実施例２の測定結果である。フォーワードプライマー及びPCR試薬を変更することにより、実施例１の場合よりも増幅効率が向上し、ddPCRの反応時間を1時間以上短縮することができ、分離能（特にWtのドット）も顕著に改善した。再生不良性貧血患者353例についてこのddPCR法を用いて共通変異を検出したところ、353例中101例（28.6%）が陽性であり、変異クローンサイズの中央値は0.42% (range, 0.071-23.1%)であった。
【００８０】
PNH型血球検査と、ddPCRを用いた共通ナンセンス変異検査とを組み合わせた結果を図６に示す。実施例１と同様に、約4/5の症例で免疫病態を検出することができ。また、「PNH型血球陰性」の108例中34例（31.5%）に共通ナンセンス変異が検出された。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明において、HLAクラスＩアレルに関係なく、HLA-LL陽性患者に共通するHLA-A及び／又はHLA-B遺伝子の特定部位の変異を見出し、該共通変異を高感度に検出し得るアッセイ系を確立した。本法によれば、HLAタイピングが不要であるため、1症例あたり2000円程度の安価で、1日以内にHLA-LLの有無を明らかにすることができる。その結果、再生不良性貧血や骨髄異形成症候群をはじめとする骨髄不全症候群において免疫病態が関与しているか否かを迅速かつ簡便に鑑別することができることから、骨髄不全症候群の診療にきわめて有用である。
【図１】
2020184992.tif 000009
【図２】
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【図３】
2020184992.tif 000011
【図４】
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【図５】
2020184992.tif 000013
【図６】
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【配列表】
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