(57)【要約】      （修正有）【課題】自己免疫性水疱症の診断方法の提供。【解決手段】ラミニンベータ４を含むポリペプチド、このポリペプチドを含む担体、ラミニンベータ４に対する抗体、好ましくは自己抗体、疾患の診断のためのポリペプチド、担体または自己抗体の使用および試料中のラミニンベータ４に対する自己抗体を検出するステップを含む方法。【選択図】図２
2020090477.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
好ましくは組換え体および／または単離された形態の、ラミニンベータ４またはそのバリアントを含むポリペプチド。
【請求項２】
固定されている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
ラミニンガンマ１、ラミニン３３２、ＢＰ１８０、ＢＰ２３０、デスモグレイン１、デスモグレイン３、エンボプラキン、グリアジンおよびＶＩＩ型コラーゲンまたはそれらのバリアントおよび剥離皮膚を含む群からの少なくとも１つの抗原、好ましくは全ての抗原をさらに含む、請求項２に記載の担体。
【請求項４】
ガラススライド、好ましくは顕微鏡用スライド、さらにより好ましくはラミニンベータ４またはそのバリアントを過剰発現する真核細胞を有するスライド、バイオチップ、マイクロタイタープレート、ラテラルフローデバイス、試験片、膜、好ましくはブロット、より好ましくはラインブロット、クロマトグラフィーカラム材料およびビーズ、好ましくは磁気もしくは蛍光ビーズを含む群から選択される、請求項３に記載の担体。
【請求項５】
ヒト血液と前記ポリペプチドとの接触を可能にし、次いで患者の体内への前記血液の再循環を可能にする、好ましくはアフェレシス器具である、請求項１および２のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む治療上有用な担体。
【請求項６】
好ましくは単離された形態の、ラミニンベータ４に対する抗体、好ましくは自己抗体。
【請求項７】
疾患の診断のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド、担体または自己抗体の使用。
【請求項８】
診断上または治療上有用な担体を生成する方法であって、前記担体を請求項１に記載のポリペプチドでコーティングするステップを含む方法。
【請求項９】
自己抗体を精製するための方法であって、
ａ）前記自己抗体を含む液体に請求項１に記載のポリペプチドを、前記自己抗体および前記ポリペプチドを含む複合体の形成を可能にする条件下で接触させるステップ、
ｂ）ステップａ）の複合体を単離するステップ、ならびに
ｃ）任意選択的に、ステップａ）の複合体を検出するステップ、またはステップｂ）で単離した複合体を解離させるステップ、その後、前記ポリペプチドから前記自己抗体を分離する、
を含む方法。
【請求項１０】
試料中のラミニンベータ４に対する自己抗体を検出するステップを含む方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドまたはそのバリアントを、好ましくは薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１および２のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項３および４のいずれか１項に記載の担体を含むキットであって、洗浄溶液、キャリブレーター溶液、ラミニンベータ４に対する抗体、および好ましくは二次抗体などのラミニンベータ４に対する自己抗体の検出のための剤を含む群からの１つの試薬または複数の試薬を含有するキット。
【請求項１３】
キットまたは診断上もしくは治療上有用な担体の生成のための、請求項１に記載のポリペプチド、請求項３および４のいずれか１項に記載の担体またはラミニンベータ４に対する抗体、好ましくは自己抗体の使用。
【請求項１４】
ラミニンベータ４に対する自己抗体が、免疫拡散法、免疫電気泳動法、光散乱法、凝集法、放射能標識、酵素的標識、より好ましくはＥＬＩＳＡ、化学発光標識、より好ましくは電気化学発光標識および免疫蛍光標識、好ましくは間接的免疫蛍光による免疫測定法を含む群から選択されるものなどの標識による免疫測定法を含む群から選択される方法を使用して検出される、請求項７〜１０、１２および１３のいずれか１項に記載の方法、使用またはキット。
【請求項１５】
診断装置もしくは治療装置の、またはラミニンベータ４に対する抗体に結合する診断もしくは治療試薬の能力、好ましくは潜在能力を決定するための、請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項６に記載の抗体の使用。
【請求項１６】
前記自己抗体が、患者の組織試料中で検出される、または、ラミニンベータ４もしくはそのバリアントを含む担体、好ましくは請求項３もしくは４に記載の担体によって検出される、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラミニンベータ４を含むポリペプチド、前記ポリペプチドを含む担体、ラミニンベータ４に対する抗体、好ましくは自己抗体、疾患の診断のためのポリペプチド、担体または自己抗体の使用および試料中のラミニンベータ４に対する自己抗体を検出するステップを含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫疾患とは、免疫系が体に内在する正常な構造に向けられる疾患を意味するものと理解されている。多くの自己免疫疾患では、生体は、生体に内在するタンパク質に結合し、それにより障害の原因となり得る検出可能な自己抗体を産生する。その他の場合では、自己抗体の存在は、疾患発生の偶発的な原因にはならないようである。
【０００３】
自己免疫性水疱症は、皮膚における標的構造を攻撃する自己抗体によって判別される。免疫機構が皮膚の上部の剥離を惹起し、これが水疱の形成を招く。
【０００４】
標的抗原および分離形成の位置に基づいて、４つの主要な群、天疱瘡および類天疱瘡疾患、後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）および疱疹状皮膚炎の間が区別される。水疱形成は、天疱瘡疾患の場合は上皮内であり、その他の水疱性自己免疫性皮膚疾患の場合は上皮下である。
【０００５】
尋常性天疱瘡（ＰＶ）は、最も一般的な天疱瘡疾患であり、その次は落葉状天疱瘡であるが、腫瘍随伴性天疱瘡などの天疱瘡疾患のその他の形態が生じることは非常に稀である。尋常性天疱瘡（ＰＶ）は、比較的速やかに破裂し、表皮中の関連する細胞の溶解によって後に皮膚の発赤、びらんおよび痂皮が残る水疱によって判別される。感染は通常、患部に生じる。多くの場合、および疾患の開始時に、口腔粘膜または性器粘膜が重度の痛みを伴う水疱に冒される。この疾患は同定および治療が遅れると、疾患は重症になり、場合によっては致死的な経過をたどることも予測され得る。ＰＶは、新規症例が１００万人当たり約１人から２人と稀に発症する。
【０００６】
表皮下に水疱を形成する自己免疫疾患の場合、自己抗体は真皮表皮接合帯（ＤＥＪ）の領域中の構造タンパク質に向けられる。前記タンパク質は、下層にある真皮上の基底角化細胞の接着に非常に重要である。この群の疾患の場合、水疱性類天疱瘡、抗ｐ２００類天疱瘡、妊婦性類天疱瘡、粘膜性類天疱瘡、直鎖状ＩｇＡ皮膚疾患、紅色苔癬（ｌｉｃｈｅｎ  ｒｕｂｅｒ）類天疱瘡、後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）および疱疹状皮膚炎の間が区別される。
【０００７】
水疱性類天疱瘡（ＢＰ）は最も一般的な表皮下に水疱形成する自己免疫疾患である。表皮の剥離によって形成され、予備的徴候として重度のかゆみが伴うことがある、健康な、または発赤した皮膚上の隆起した水疱が特徴である。水疱は通常、体幹ならびに大腿および腕に生じる。患者の２０パーセントにおいて、粘膜も関与する。水疱が破裂すると、傷は通常瘢痕化することなく治癒する。ＢＰは比較的一般的な自己免疫疾患で、新規症例は１００万人当たり約１５人から２０人である。
【０００８】
水疱性類天疱瘡に続いて、粘膜類天疱瘡（ＭＭＰ、そのバリアントは抗ラミニン３３２ＭＭＰである）は２番目に一般的な水疱性自己免疫性皮膚疾患である。臨床的に、ＭＭＰは不均一な症候群で、定義の通り、粘膜が主に影響を受ける。口腔および目の粘膜が最も一般的に影響を受ける。水疱形成した病変は時々、瘢痕化して治癒する。結膜が影響を受けると、失明を招くことがある。
【０００９】
抗ｐ２００類天疱瘡の臨床像は変わりやすく、ＢＰに類似のタイプが最も一般的に生じる。この疾患はＢＰよりは稀であるが、これは、これらの患者の多くが、免疫蛍光パターンが類似しているためにＥＢＡまたは抗ラミニン３３２粘膜類天疱瘡として誤診されるという事実による可能性もあり得る。
【００１０】
後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）は、ＶＩＩ型コラーゲンに対する自己抗体が特徴の非常に稀な表皮下水疱性自己免疫疾患である。臨床的に、機械性水疱性形態と炎症性バリアント（ＢＰまたは粘膜類天疱瘡に類似している）の間を区別することができる。
【００１１】
疾患を臨床的または組織学的に判別することは困難である。しかし、先行技術では、多くの症例において診断を可能にする一連の血清学的検査が記載されたことがある。ＰＶの場合、タンパク質デスモグレイン１および／または３に対する自己抗体が生じる。ＢＰの場合、ほとんど全ての症例においてタンパク質ＢＰ１８０および／またはＢＰ２３０に対する自己抗体、さらに場合によってはラミニン３３２に対する自己抗体も検出することが可能である。
【００１２】
抗ｐ２００類天疱瘡は、約２００ｋＤａの見かけ上の分子量を有する真皮表皮接合帯のタンパク質に対する自己抗体が特徴である。前記タンパク質は、２００９年に、ラミニンガンマ１として記載された（Ｄａｉｎｉｃｈｉ，Ｔ．，Ｋｕｒｏｎｏ，Ｓ．，Ｏｈｙａｍａ，Ｂ．，Ｉｓｈｉｉ，Ｎ．，Ｓａｎｚｅｎ，Ｎ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｍ．，Ｓｈｉｍｏｎｏ，Ｃ．，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｙ．，Ｋｏｇａ，Ｈ．，Ｋａｒａｓｈｉｍａ，Ｔ．，Ｙａｓｕｍｏｔｏ，Ｓ．，Ｚｉｌｌｉｋｅｎｓ，Ｄ．，Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．（２００９）、Ａｎｔｉ−ｌａｍｉｎｉｎ  ｇａｍｍａ−１  ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ．１０６（８）：２８００−５）。さらに、エピトープ拡大の一部として、ＶＩＩ型コラーゲン、ＢＰ１８０に対する抗体またはラミニン３３２に対する抗体を発見することも可能である。
【００１３】
これに関連して使用されるのは特にＥＬＩＳＡおよび間接的免疫蛍光法であるが、その他の免疫生化学的方法も原理上使用することができる。例えば、ＢＰ１８０、ＮＣ１６Ａ−４Ｘ、ＢＰ２３０−ＣＦ、デスモグレイン１、デスモグレイン３、エンボプラキンおよびＶＩＩ型コラーゲンを包含するＥＵＲＯＩＭＭＵＮ  Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ  Ｌａｂｏｒｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ  ＡＧ（ＥＡ１４９０−１２０８−１Ｇ）の皮膚科学的プロファイルが適切である。
【００１４】
先行技術では、診断手法、特に霊長類の食道組織切片の間接的免疫蛍光法または基質として組換え自己抗原を用いたＥＬＩＳＡが開示されている（ｖａｎ  Ｂｅｅｋ，Ｎ．，Ｚｉｌｉｋｅｎｓ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｅ．（２０１８）：Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｂｕｌｌｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｊ．Ｄｔｓｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｇｅｓ．１６（９），ｐａｇｅｓ  １０７７−１０９１を参照のこと）。診断に関して、抗ラミニン３３２粘膜性類天疱瘡の検出のための特に信頼のおける測定法は、免疫蛍光法および組換えラミニン３３２を使用して実施することができる（Ｇｏｌｅｔｚ，Ｓ．，Ｐｒｏｂｓｔ，Ｃ．，Ｋｏｍｏｒｏｗｓｋｉ，Ｌ．，Ｓｃｈｌｕｍｂｅｒｇｅｒ，Ｗ．，Ｆｅｃｈｎｅｒ，Ｋ．，ｖａｎ  Ｂｅｅｋ，Ｎ．，Ｈｏｌｔｓｃｈｅ，Ｍ．Ｍ．，Ｒｅｃｋｅ，Ａ．，Ｙａｎｃｅｙ，Ｋ．Ｂ．，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．，Ａｎｔｏｎｉｃｅｌｌｉ，Ｆ．，Ｄｉ  Ｚｅｎｚｏ，Ｇ．，Ｚｉｌｌｉｋｅｎｓ，Ｄ．，Ｓｔｏｃｋｅｒ  Ｗ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｅ．（２０１８）：Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｌａｍｉｎｉｎ  ３３２  ｍｕｃｏｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ，Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，ＤＯＩ  １０−１１１１／ｂｊｄ．１７２０２）。先行技術では、ラミニンベータ４に対する自己抗体については記載されていない。
【００１５】
しかし、明らかになったのは、ラミニンガンマ１を介した検出は、全患者において陽性ではないことである。組換え型ラミニンガンマ１によるウエスタンブロットおよびラミニンガンマ１のＣ末端ドメインによるＥＬＩＳＡではそれぞれ、試験した抗ｐ２００類天疱瘡患者の９０％および６９％を検出することが可能であった（Ｄａｉｎｉｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．，Ｒｅｃｋｅ，Ａ．，Ｖａｆｉａ，Ｋ．，Ｌｕｄｗｉｇ，Ｒ．Ｊ．，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｚｉｌｌｉｋｅｎｓ，Ｄ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｅ．（２０１１）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  抗ｐ−２００  ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ．Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１６４（１）：７６−８２）。
【００１６】
抗ｐ２００類天疱瘡の臨床経過は変わりやすい。後天性表皮水疱症および水疱性類天疱瘡とは対照的に、本明細書で問題にするのは、良好な治療応答を有する比較的良性の疾患である。したがって、これらの疾患を鑑別することは臨床的に非常に重要である。
【００１７】
米国特許第６，６８２，９１１号は、ラミニン１２ならびに単離したラミニン１２およびそのサブユニットの調製について開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】米国特許第６，６８２，９１１号
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｄａｉｎｉｃｈｉ，Ｔ．，Ｋｕｒｏｎｏ，Ｓ．，Ｏｈｙａｍａ，Ｂ．，Ｉｓｈｉｉ，Ｎ．，Ｓａｎｚｅｎ，Ｎ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｍ．，Ｓｈｉｍｏｎｏ，Ｃ．，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｙ．，Ｋｏｇａ，Ｈ．，Ｋａｒａｓｈｉｍａ，Ｔ．，Ｙａｓｕｍｏｔｏ，Ｓ．，Ｚｉｌｌｉｋｅｎｓ，Ｄ．，Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．（２００９）、Ａｎｔｉ−ｌａｍｉｎｉｎ  ｇａｍｍａ−１  ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ．１０６（８）：２８００−５
【非特許文献２】ｖａｎ  Ｂｅｅｋ，Ｎ．，Ｚｉｌｉｋｅｎｓ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｅ．（２０１８）：Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｂｕｌｌｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｊ．Ｄｔｓｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｇｅｓ．１６（９），ｐａｇｅｓ  １０７７−１０９１
【非特許文献３】Ｇｏｌｅｔｚ，Ｓ．，Ｐｒｏｂｓｔ，Ｃ．，Ｋｏｍｏｒｏｗｓｋｉ，Ｌ．，Ｓｃｈｌｕｍｂｅｒｇｅｒ，Ｗ．，Ｆｅｃｈｎｅｒ，Ｋ．，ｖａｎ  Ｂｅｅｋ，Ｎ．，Ｈｏｌｔｓｃｈｅ，Ｍ．Ｍ．，Ｒｅｃｋｅ，Ａ．，Ｙａｎｃｅｙ，Ｋ．Ｂ．，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．，Ａｎｔｏｎｉｃｅｌｌｉ，Ｆ．，Ｄｉ  Ｚｅｎｚｏ，Ｇ．，Ｚｉｌｌｉｋｅｎｓ，Ｄ．，Ｓｔｏｃｋｅｒ  Ｗ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｅ．（２０１８）：Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｌａｍｉｎｉｎ  ３３２  ｍｕｃｏｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ，Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，ＤＯＩ  １０−１１１１／ｂｊｄ．１７２０２
【発明の概要】
【００２０】
この背景に対して、診断の信頼性、特に感受性が高い、抗ｐ２００類天疱瘡の検出手法が必要とされている。同時に、皮膚の様々な水疱形成自己免疫疾患の鑑別能を改善するというさらなる目的がある。
【００２１】
第１の態様では、本発明の基礎となる目的は、好ましくは組換え体および／または単離された形態の、ラミニンベータ４またはそのバリアントを含むポリペプチドによって実現される。
【００２２】
好ましい実施形態では、ポリペプチドは固定されている。
【００２３】
第２の態様では、目的は、本発明によるポリペプチドを含み、ラミニンガンマ１、ＢＰ１８０、ＢＰ２３０、デスモグレイン１、デスモグレイン３、エンボプラキン、脱アミド化グリアジン、ラミニン３３２およびＶＩＩ型コラーゲンまたはそれらのバリアントを含む群からの少なくとも１つの抗原、好ましくは全ての抗原をさらに含む担体によって実現される。
【００２４】
好ましい実施形態では、担体はガラススライド、好ましくは顕微鏡用スライド、バイオチップ、マイクロタイタープレート、ラテラルフローデバイス、試験片、膜、好ましくはブロット、より好ましくはラインブロット、クロマトグラフィーカラム材料およびビーズ、好ましくは磁気もしくは蛍光ビーズを含む群から選択される。
【００２５】
第３の態様では、目的は、本発明によるポリペプチドを含む治療上有用な担体であって、ヒト血液とポリペプチドとの接触、次いで患者の体内への血液の再循環を可能にし、好ましくはアフェレシス器具である担体によって実現される。
【００２６】
第４の態様では、目的は、好ましくは単離された形態の、ラミニンベータ４に対する抗体、好ましくは自己抗体によって実現される。
【００２７】
第５の態様では、目的は、疾患を診断するための本発明によるポリペプチド、担体または自己抗体の使用によって実現される。
【００２８】
第６の態様では、目的は、診断上または治療上有用な担体を生成する方法であって、担体を本発明によるポリペプチドでコーティングするステップを含む方法によって実現される。
【００２９】
第７の態様では、目的は、自己抗体を精製するための方法であって、ａ）自己抗体を含む液体と、本発明によるポリペプチドとを、自己抗体およびポリペプチドを含む複合体の形成を可能にする条件下で接触させるステップと、ｂ）ステップａ）の複合体を単離するステップと、ｃ）任意選択でステップａ）の複合体を検出するステップ、またはステップｂ）で単離した複合体を解離させるステップと、その後ポリペプチドから自己抗体を分離するステップを含む方法によって実現される。
【００３０】
第８の態様では、目的は、試料中のラミニンベータ４に対する自己抗体を検出するステップを含む方法によって実現される。
【００３１】
第９の態様では、目的は、本発明によるポリペプチドまたはそのバリアントを、好ましくは薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物によって実現される。
【００３２】
第１０の態様では、目的は、本発明によるポリペプチドまたは本発明による担体を含むキットであって、洗浄溶液、キャリブレーター溶液、ラミニンベータ４に対する抗体、およびラミニンベータ４に対する自己抗体の検出のための剤、好ましくは二次抗体を含む群から１つの試薬または複数の試薬、好ましくは全ての試薬を含有するキットによって実現される。
【００３３】
第１１の態様では、目的は、キットまたは診断上もしくは治療上有用な担体の生成のための、本発明によるポリペプチド、本発明による担体、またはラミニンベータ４に対する抗体、好ましくは自己抗体の使用によって実現される。
【００３４】
好ましい実施形態では、ラミニンベータ４に対する自己抗体は、免疫拡散法、免疫電気泳動法、光散乱法、凝集法、放射能標識、酵素的標識、より好ましくはＥＬＩＳＡ、化学発光標識、より好ましくは電気化学発光標識および免疫蛍光標識、好ましくは間接的免疫蛍光による免疫測定法を含む群からのものなどの標識による免疫測定法を含む群から選択される方法を使用して検出される。
【００３５】
第１２の態様では、目的は、診断装置もしくは治療装置の、またはラミニンベータ４に対する抗体に結合する診断試薬もしくは治療試薬の能力、好ましくは潜在能力を決定するための、本発明によるポリペプチドまたは本発明による抗体の使用によって実現される。
【００３６】
本発明は、ラミニンベータ４に対する自己抗体が存在し、抗ｐ２００類天疱瘡に罹患している患者においてその自己抗体を特異的に検出することができるという本発明者等による驚くべき発見に基づいている。
【００３７】
本発明者等はさらに、前記自己抗体の検出は、抗ｐ２００類天疱瘡の血清学的診断測定法の感度を増加させることを発見した。この自己抗体は、今まで唯一重要であると考えられていたラミニンガンマ１に対する自己抗体を検出することができない何人かの患者において検出することができる。
【００３８】
ラミニンは、アルファ、ベータおよびガンマ鎖からなる三量体の基底膜タンパク質である。ラミンベータ４はベータ鎖である。ラミニンは、例えば、細胞接着、遊走、分化、神経発達などの多くの生理学的機能および遺伝子発現の調節に関与する。
【００３９】
Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）は、胃および腸のがん組織におけるラミニンベータ４の発現低下を観察した。がん組織において、ラミニンベータ４の発現低下に関与する可能性がある体細胞ラミニンベータ４変異が同定された（Ｃｈｏｉ，Ｍ．Ｒ．，Ａｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｙｏｏ，Ｎ．Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｓ．Ｈ．Ｌａｍｉｎｉｎ  ｇｅｎｅ  ＬＡＭＢ４  ｉｓ  ｓｏｍａｔｉｃａｌｌｙ  ｍｕｔａｔｅｄ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｌｌｙ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ａｎｄ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒｓ．ＡＰＭＩＳ  １２３：６５−７１，２０１５）。さらに、ラミニンベータ４のレベル低下はまた、憩室炎において役割を担うことがある（Ｃｏｂｌｅ  ＪＬ，Ｓｈｅｌｄｏｎ  ＫＥ，Ｙｕｅ  Ｆ，Ｓａｌａｍｅｈ  ＴＪ，Ｈａｒｒｉｓ  ＬＲ  ＩＩＩ，Ｄｅｉｌｉｎｇ  Ｓ，Ｒｕｇｇｉｅｒｏ  ＦＭ，Ｅｓｈｅｌｍａｎ  ＭＡ，Ｙｏｃｈｕｍ  ＧＳ，Ｋｏｌｔｕｎ  ＷＡ，Ｇｅｒｈａｒｄ  ＧＳ，Ｂｒｏａｃｈ  ＪＲ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒａｒｅ  ＬＡＭＢ４  ｖａｒｉａｎｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｆａｍｉｌｉａｌ  ｄｉｖｅｒｔｉｃｕｌｉｔｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｅｘｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．２０１７；２６（１６）：３２１２−３２２０）。
【００４０】
本発明は、好ましくは、ヒト、サル、ウシ、ヒツジまたはブタ、特に好ましくは、ヒトの哺乳類ラミニンベータ４を含むポリペプチドを提供する。
【００４１】
好ましい実施形態では、ラミニンベータ４は、データベースコード（ＢＣ１４０８０４）によってコードされるポリペプチド、好ましくは配列番号２７のポリペプチド、またはそのバリアントである。本出願では、引用したデータベースコードは全てＵｎｉｐｒｏｔデータベースまたはその他のデータベース、より正確には前記出願またはその最先の優先出願の出願日におけるそれらのバージョンを表す。さらに好ましい実施形態では、さらなる抗原は、それぞれ小括弧内に指し示した配列、ラミニンガンマ１（ＬＡＭＣ１Ｐ１１０４７）；ＬＡＭＡ３（Ｑ１６７８７）、ＬＡＭＢ３（Ｑ１３７５１）およびＬＡＭＣ２（Ｑ１３７５３）から選択されたラミニン３３２、ＢＰ１８０（Ｑ９ＵＭＤ９）、ＢＰ２３０（欧州特許第３２６０８６４号の配列番号８、本明細書では配列番号２８とした）を含む群；デスモグレイン１（Ｑ０２４１３）、デスモグレイン３（Ｐ３２９２６）、エンボプラキン（Ｑ９２８１７）、好ましくはＬＧＱＱＱＰＦＰＰＱＱＰＹＰＱＰＱＰＦＰＳＱＱＰＹ（配列番号２９）、ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＳ（配列番号３０）およびＱＱＬＰＱＰＥＱＰＱＱＳＦＰＥＱＥＲＰＦ（配列番号３１）を含む群から選択されたグリアジンならびにＶＩＩ型コラーゲン（Ｑ０２３８８）またはそれらのバリアントを有する。
【００４２】
しかし、本出願で明示的または非明示的に記載された正確な配列を有するポリペプチドまたは核酸、より正確にはラミニンベータ４の野生型配列を含むポリペプチドまたはそれをコードする核酸を使用することによってだけではなく、このようなポリペプチドまたは核酸のバリアントを使用することによって、本発明による教示を実施することが可能である。
【００４３】
好ましい実施形態では、本明細書で使用した用語「バリアント」は、少なくとも１つの断片または１つの完全長配列、より正確には、一端または両端において完全長配列に対して少なくとも１つまたは複数のアミノ酸が切断されている１つまたは複数のアミノ酸配列または核酸配列を意味することができる。このような断片は、元の配列またはそのバリアントの少なくとも６、７、８、１０、１２、１５、２０、２５、５０、７５、１００、３００、４００、６００、８００、１０００または１２００個の連続したアミノ酸を含有するペプチドを含むか、またはコードする。バリアントの全長は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、８００、１０００、１２００、１５００、１８００個またはより多くのアミノ酸であってもよい。特に好ましい断片は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４ならびにそれらのバリアントを含む群から選択される。
【００４４】
さらに好ましい実施形態では、用語「バリアント」は、少なくとも１つの断片だけではなく、生物学的活性、例えば、抗原が（自己）抗体に結合する能力またはポリペプチドの折り畳み構造もしくは構造に必須のもの以外のアミノ酸の欠失または置換、および／または１もしくは複数のこのような必須アミノ酸の保存的置換および／またはポリペプチドの生物学的活性が維持されるようなアミノ酸の付加を伴った、明示的に言及されているアミノ酸配列またはその断片に少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその断片も意味する。先行技術には、２つの所与の核酸またはアミノ酸配列を整列させるため、および同一である程度を計算するために使用することができる様々な方法が含まれ、例えば、Ａｒｔｈｕｒ  Ｌｅｓｋ（２００８），Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００８，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎを参照のこと。好ましい実施形態では、ＣｌｕｓｔａｌＷソフトウェアを基本の設定を用いて使用する（Ｌａｒｋｉｎ，Ｍ．Ａ．，Ｂｌａｃｋｓｈｉｅｌｄｓ，Ｇ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｎ．Ｐ．，Ｃｈｅｎｎａ，Ｒ．，ＭｃＧｅｔｔｉｇａｎ，Ｐ．Ａ．，ＭｃＷｉｌｌｉａｍ，Ｈ．，Ｖａｌｅｎｔｉｎ，Ｆ．，Ｗａｌｌａｃｅ，Ｉ．Ｍ．，Ｗｉｌｍ，Ａ．，Ｌｏｐｅｚ，Ｒ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．（２００７）．Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ  ａｎｄ  Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２３，２９４７−２９４８）。
【００４５】
好ましい実施形態では、バリアントは、任意選択で変性している直鎖状の、折り畳まれていないポリペプチドである。
【００４６】
好ましい実施形態では、ポリペプチドおよびそのバリアントは、さらに化学的修飾、例えば、同位体標識またはグリコシル化、リン酸化、アセチル化、脱カルボキシル化、シトルリン化、メチル化、ヒドロキシル化などの共有結合修飾を含有することができる。当業者は、ポリペプチドを修飾する方法に精通している。バリアントの生物学的活性を無効にしないように、任意の修飾を考案する。
【００４７】
さらに、バリアントはまた、その他のポリペプチド、ペプチドもしくはアミノ酸またはそれらのバリアントとのＮ末端および／またはＣ末端融合によって作製することができ、例えば、野生型配列の活性部分と整列させたとき、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する活性部分またはドメインを含むことができ、本明細書で使用した用語「活性部分」は、完全長アミノ酸配列よりも短いか、または、核酸配列の場合、完全長アミノ酸配列よりも少なくコードし、および／または天然配列のバリアントであるが、少なくともいくらかの生物学的活性を含有するアミノ酸配列を意味する。融合する配列は、自己抗体がラミニンベータ４またはそのバリアントに結合するのを妨害しないように、特に、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４の配列に含まれるエピトープならびにそれらのバリアントに結合するのを妨害しないように構築される。例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端に直接または柔軟性のあるリンカーを介して融合したＧＳＴ、Ｈｉｓ、ＭＢＰおよびＦＬＡＧを含む群からのタグは、例えば、適切である。
【００４８】
好ましい実施形態では、用語「バリアント」は、ストリンジェントな条件下で参照核酸または野生型核酸とハイブリダイズする相補鎖の核酸を包含する。ハイブリダイゼーション反応の厳密さは、当業者によって容易に決定することができ、全般的に、プローブ長、洗浄温度および塩濃度に依存する経験的な計算である。全般的に、プローブが長ければ長いほど特異的アニーリングのために高温を必要とし、一方、プローブが短ければ短いほど高い温度を必要としない。ハイブリダイゼーションは全般的に、変性したＤＮＡが、その融点を下回る環境において、もう一度相補鎖にハイブリダイズする能力に依存する。ハイブリダイゼーションが可能なプローブと配列との間に必要な相同性の程度が高ければ高いほど、使用することができる相対温度は高くなる。結果として、相対温度が高ければ高いほど、反応条件はより厳密になる傾向があり、一方、温度が低ければ低いほど反応条件の程度は低くなる。厳密さおよびハイブリダイゼーション反応に関するさらなる詳細および説明は、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと。さらに、当業者は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ（１９９３）のマニュアルに見いだされる指示（Ｔｈｅ  ＤＩＧ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｕｓｅｒｓ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＤＮＡ配列がハイブリダイゼーションによってどのように同定され得るかの疑問に関しては、Ｌｉｅｂｌ，Ｗ．，Ｅｈｒｍａｎｎ，Ｍ．，Ｌｕｄｗｉｇ，Ｗ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ，Ｋ．Ｈ．（１９９１）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ４１：２５５−２６０に従うことができる。好ましい実施形態では、ストリンジェントな条件は、全ハイブリダイゼーションに適用され、すなわち、ハイブリダイゼーションは、プローブが標的配列に対して７０％またはそれ以上同一のとき生じる。標的配列に関して同一性の程度が低いプローブはハイブリダイズすることはできるが、このようなハイブリッドは不安定で、ストリンジェントな条件下での洗浄ステップにおいて、例えば、塩濃度を２×ＳＳＣまたは任意選択でその後０．５×ＳＳＣに低下させ、温度は、選択性が増すにつれて、約５０℃〜６８℃、約５２℃〜６８℃、約５４℃〜６８℃、約５６℃〜６８℃、約５８℃〜６８℃、約６０℃〜６８℃、約６２℃〜６８℃、約６４℃〜６８℃、約６６℃〜６８℃にすることによって除去される。特に好ましい実施形態では、温度は約６４℃〜６８℃または、好ましくは６６℃〜６８℃である。塩濃度は０．２×ＳＳＣまたは０．１×ＳＳＣにも調整することができる。参照配列または野生型配列に関して少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性程度を有する核酸配列を単離することができる。好ましい実施形態では、本明細書で使用した用語「核酸配列のバリアント」は���遺伝子コードの縮重に従って参照核酸配列と同じ核酸配列およびそのバリアントをコードする任意の核酸配列を意味する。
【００４９】
ポリペプチドのバリアントは生物学的活性を示す。好ましい実施形態では、これは、上記のような自己抗体に関連した自己免疫疾患、好ましくは抗ｐ２００類天疱瘡に罹患した患者において見いだされるような、ラミニンベータ４に対する自己抗体に結合する能力である。前記バリアントが患者試料の自己抗体に結合するかどうかを検出することによって、好ましくは実施例で記載した組換えタンパク質を使用したウエスタンブロッティングおよび／または間接的免疫蛍光法、好ましくは間接的免疫蛍光法によって、例えば、ラミニンベータ４のバリアントがこのような生物学的活性を有するかどうかを明らかにすることは可能である。さらに、本発明者等は、ラミニンベータ４に対する自己抗体と反応性のある配列、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４を同定した。このような自己抗体が結合することができるラミニンベータ４のバリアントは、このように、これらの配列の少なくとも１つを含むラミニンベータ４配列のエピトープを作製することによって容易に作製することができ、任意選択で、アミノ酸残基の保存的置換によってさらにバリアントを作製することが可能である。
【００５０】
本発明によるポリペプチドは、内在型のポリペプチドを含む液体試料、組織または細胞、より好ましくはポリペプチドを過剰発現している細胞、そのような細胞の粗溶解物または濃縮溶解物から、任意選択で実質的に純粋な精製および／または単離されたポリペプチドまでの任意の形態および任意の精製段階で提供することができる。好ましい実施形態では、ポリペプチドは天然のポリペプチドであり、本明細書で使用した用語「天然のポリペプチド」は、折り畳まれたポリペプチド、より好ましくは組織または細胞から、より好ましくは哺乳類細胞または組織から、任意選択的に、非組換え型組織または細胞から精製された折り畳まれたポリペプチドを表す。さらに好ましい実施形態では、ポリペプチドは組換えタンパク質であり、本明細書で使用した用語「組換え体」は、遺伝子技術を使用した生成方法の任意の段階で、例えば、細胞もしくは組織における過剰発現のためにポリペプチドをコードする核酸を強力なプロモーターに融合することによって、またはポリペプチド配列自体を修飾することによって生成されたポリペプチドを意味する。当業者は、遺伝子技術によって核酸およびそれによってコードされたポリペプチドを修飾する方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ.  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＣＳＨまたはＢｒｏｗｎ  Ｔ．Ａ．（１９８６），Ｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−ａｎ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌに記載されている）、ならびにまた、天然もしくは組換えタンパク質を生成して精製するための方法（例えば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって出版されたハンドブック“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，“Ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”（２００９／２０１０）およびＢｕｒｇｅｓｓ，Ｒ．Ｒ．，Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．（２００９），Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に精通している。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後のクーマシーブルー染色および肉眼による判定によって評価して、関連試料中の全ポリペプチドの少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％がポリペプチドからなるとき、純粋である。本発明によるポリペプチドを組織の形態で提供する場合、組織は哺乳類組織、例えば、ヒト、霊長類、ロバ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ブタまたはウシの組織、好ましくは皮膚組織であることが好ましい。ポリペプチドを組換え細胞の形態で提供する場合、組換え細胞は酵母細胞などの真核細胞、より好ましくは植物、哺乳類、カエルまたは昆虫などの多細胞真核生物の細胞、最も好ましくは哺乳類、例えば、ラット、ヒト、霊長類、ロバ、マウス、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ブタまたはウシの多細胞真核細胞が好ましい。
【００５１】
本発明による教示を実施するためのポリペプチドは、ラミニンベータ４に結合する自己抗体によって認識される少なくとも１個のエピトープを含むか、または前記自己抗体に特異的に結合するような性質であることが好ましい。エピトープは、好ましくは、このような自己抗体のみによって認識され、ラミニンガンマ１、ＢＰ１８０、ＢＰ２３０、デスモグレイン１、デスモグレイン３、エンボプラキン、グリアジン、ラミニン３３２またはＶＩＩ型コラーゲンに対する自己抗体などのその他の抗体によっては認識されないエピトープである。このような実施形態では、このようなエピトープは、ラミニンベータ４からの連続したアミノ酸の６、７、８、９、１０、１１、１２、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上、好ましくは少なくとも９個のセグメントを含むが、１６個以下である。当業者は、例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｄ．Ｃ．，Ｆｉｔｚｍａｕｒｉｃｅ，Ｃ．Ｊ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｌ．Ｅ．，Ｚｅｎｇ，Ｗ．（１９９９），Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｏｔａｌｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｓ，Ｖａｃｃｉｎｅ，ｖｏｌｕｍｅ  １８，ｉｓｓｕｅｓ３−４，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９９，ｐａｇｅｓ  ３５５−３６１；およびＢｌａｃｋ，Ｍ．，Ｔｒｅｎｔ，Ａ．，Ｔｉｒｒｅｌｌ，Ｍ．ａｎｄ  Ｏｌｉｖｅ，Ｃ．（２０１０），Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔｓ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，２０１０  Ｆｅｂｒｕａｒｙ；９（２）：１５７−１７３）に記載されたような、十分な免疫原性を有するペプチドを考案するための指針に精通している。
【００５２】
ラミニンベータ４またはそのバリアントを包含する本発明によるポリペプチドは、本発明を実施するために任意の立体構造で提供することができる。例えば、ポリペプチドは、実質的には折り畳まれていないか、または部分的もしくは完全に折り畳まれたポリペプチドであってもよい。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、本発明による自己抗体に結合するために必要なエピトープが、それ自体または全体として、天然の環境において天然のタンパク質によって想定される折り畳み構造を想定するという意味で折り畳まれている。当分野の当業者は、ポリペプチドが折り畳まれるかどうか、および折り畳まれるならば、想定される構造を決定するために使用することができる方法、例えば、限定タンパク質分解法、ＮＭＲ分光法、ＣＤ分光法またはＸ線結晶学（例えば、Ｂａｎａｓｚａｋ  Ｌ．Ｊ．（２００８），Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃｓ  Ｐｒｅｓｓ，またはＴｅｎｇ  Ｑ．（２０１３），Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒを参照のこと）に精通しており、ＣＤ分光法の使用が優先される。
【００５３】
本発明によるポリペプチドは、Ｃ末端および／またはＮ末端にラミニンベータ４以外のアミノ酸および／またはアミノ酸配列、特に、本明細書で使用した好ましい実施形態では、いくつかの生物学的または物理的機能を有し、例えば、本発明によるポリペプチドの精製、固定、沈殿もしくは同定のために認識され得るさらなる配列モチーフまたはポリペプチドを含むＣ末端またはＮ末端タグ、好ましくはＣ末端タグを含む融合タンパク質であってもよい。より好ましい実施形態では、タグは、リガンドに特異的に結合することができる配列またはドメインであり、例えば、Ｈｉｓタグ、チオレドキシン、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む群からの蛍光タグを含む群から選択されるタグである。
【００５４】
本発明によるポリペプチドは固定されたポリペプチドであってもよい。好ましい実施形態では、本明細書で使用した用語「固定した」は、水性溶液中で不溶性である固体担体に、より好ましくは、共有結合、静電気的相互作用、カプセル封入もしくは封入を介して、例えば、ゲル中での球状ポリペプチドの変性によって、または疎水性相互作用を介して、最も好ましくは１つまたは複数の共有結合を介して結合した分子を意味する。様々な適切な担体、例えば、紙、ポリスチレン、金属、シリコーンまたはガラス表面、マイクロ流体チャネル、膜、磁気ビーズなどのビーズ、クロマトグラフィーカラム媒体、バイオチップ、ポリアクリルアミドゲルなどは、文献、例えば、Ｋｉｍ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｅｒｒ，Ａ．Ｅ．（２０１３），Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ａｓｓａｙｓ，Ｂｉｏｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  ７（４），０４１５０１に記載されている。このように、不溶性担体と一緒に固定された分子は、単純な方法で、例えば、濾過、遠心分離または傾瀉によって水性溶液から容易に分離することができる。固定された分子は、可逆的または不可逆的に固定されていてもよい。例えば、固定は、分子が担体と高濃度の塩の添加によって遮蔽され得るイオン相互作用を介して相互作用するとき、または分子がチオール含有試薬の添加によって切断され得るジスルフィド架橋などの切断可能な共有結合を介して結合しているときは、可逆的である。対照的に、固定は、分子が水性溶液中で切断することができない共有結合、例えば、通常、アフィニティーカラムにリジン側鎖を結合させるために使用されるようなエポキシド基およびアミノ基の反応によって形成される結合を介して担体に結合しているときは、不可逆的である。タンパク質は、例えば、抗体または分子に親和性を有するいくつかのその他の単位の固定、次いで分子−抗体複合体を固定する効果を備えた複合体の形成によって、間接的に固定することができる。分子を固定する様々な選択肢は、文献、例えば、Ｋｉｍ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｅｒｒ，Ａ．Ｅ．（２０１３），Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ａｓｓａｙｓ，Ｂｉｏｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  ７（４），０４１５０１に記載されている。さらに、固定反応のための様々な試薬およびキットは、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから市販されている。
【００５５】
本発明による自己抗体の検出による診断のために使用した試料は、免疫グロブリンとも称される抗体を含むことが必要である。典型的に、体液の試料は、患者の代表的に選択された免疫グロブリン全体を含む。しかし、提供後、試料には、患者の免疫グロブリン全体またはある種類の免疫グロブリンクラスの分画、遠心分離、濃縮または単離を包含することができ、様々なクラスの免疫グロブリンの相対的分布に影響を及ぼすことができるさらなる処理ステップを行ってもよい。
【００５６】
本出願で記載した試薬、装置、方法および使用は、疾患の診断のために使用することができる。好ましい実施形態では、疾患は自己免疫疾患、さらにより好ましくは皮膚および／または目の自己免疫疾患である。このような疾患は、水疱、発赤および出血を含む症状の重複スペクトラム、およびまた、患部の感染などの二次疾患によって判別される。したがって、さらに可能性なことは、皮膚、目の感染またはアレルギーの診断、診断による鑑別または間接的診断である。自己免疫疾患は、特に好ましくは、抗ｐ２００類天疱瘡、抗ラミニン３３２粘膜類天疱瘡、後天性表皮水疱症、ＢＰおよびＰＶを含む群からの１つである。
【００５７】
好ましい実施形態では、本明細書で使用した用語「診断」は、疾患がどのように進行しているか、もしくは将来どのように進行するかを明らかにするために、または、ある種の治療、例えば、免疫抑制剤の投与に対する患者の応答を評価するために、患者が過去、診断時もしくは将来においてある種の疾患もしくは障害に罹患するかどうか、および／または、好ましくは類似の症状を有する平均的な比較対象者よりも罹患の可能性が高いかどうかを推定するために使用される情報を得ることを目的とした任意の手法を意味する。言い換えると、用語「診断」は、診断を行うことだけではなく、疾患または障害の経過の予後診断および／またはモニタリングも包含する。
【００５８】
多くの場合、検出のみで、言い換えると、検出可能な濃度の抗体が試料中に存在するかどうかを決定することのみで、診断には十分である。自己抗体が検出され得る場合、これは医師による診断に重要で、患者が疾患に罹患している可能性が高いことを指し示す情報である。好ましくは、前記情報または前記情報を含有するシグナルは、患者または前記患者を治療する医師に書面で、電話または電子的手段によって、例えば、インターネットを介して、例えば、ｅ−メールとして伝達することができる。この情報によって、特に好ましい実施形態では、医師は診断に有用な結論を導き、任意選択的に、患者の治療においてその結論を考慮することができる。好ましい実施形態では、自己抗体は、免疫沈降法、間接的免疫蛍光法、ＥＬＩＳＡまたはブロットを含む群から選択される１つまたは複数の方法、好ましくはブロットを使用して検出することができる場合、検出可能と見なされる。実験の詳細は、本出願の実験の部分で記載された通りであるか、または本出願の最先の優先日において利用可能な教科書もしくは実用手順書に記載された通りである。好ましい実施形態では、血清中における抗体の相対的濃度は、平均的一般人に見いだされる濃度と比較して決定される。自己抗体が試料中において存在するか、または検出可能であるかどうかを確立することは多くの場合において十分であるが、診断のために有用な情報を得るための方法は、濃度が、正常な健常人において見いだされる濃度よりも少なくとも０．１倍、好ましくは０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、２５、５０、１００、２００、５００、１０００、１００００または１０００００倍高いかどうかの決定を含むことができる。好ましい実施形態では、自己抗体の相対的濃度は、半定量的免疫沈降法、半定量的間接的免疫蛍光法、ＥＬＩＳＡまたはラインブロットを含む群から選択される１つまたは複数の方法、好ましくはＥＬＩＳＡを使用して決定する。
【００５９】
本発明は、本発明によるポリペプチドに結合する抗体、好ましくは自己抗体を含む複合体を提供する。疾患の診断のための方法の一部として、このような複合体を使用する、または検出することは可能である。患者の抗体を含む液体試料は、ラミニンベータ４に対する自己抗体を検出する方法を実施するために使用することができる。このような液体試料は、選択された代表的なヒトの抗体を含む任意の体液、好ましくはヒトの免疫グロブリンクラスＩｇＧの抗体を含む試料を包含することができる。例えば、試料は、脳脊髄液、血液または血清、リンパ液、間質液であってもよく、好ましくは血清または脳脊髄液であり、より好ましくは血清である。
【００６０】
抗体を含む液体試料に本発明によるポリペプチドを接触させるステップは、試料、すなわち、抗体を含む試料の存在下、ポリペプチドと、本発明によるポリペプチドに結合する抗体、好ましくは自己抗体とを含む複合体の形成に適合した条件下で、固定された状態の当該ポリペプチドをインキュベートすることによって実施することができる。続いて、本発明によるポリペプチドに対して結合する抗体を枯渇させた液体試料を除去し、次いで１つまたは複数の洗浄ステップを行うことができる。最後に、１種または複数の抗体および１種または複数のポリペプチドを含む複合体を検出することができる。好ましい実施形態では、用語「複合体の形成に適合した条件」は、抗原と抗体の特異的相互作用を形成してポリペプチドおよび抗体を含む複合体の構築を可能にする条件を意味する。好ましい実施形態では、このような条件は、ＰＢＳ緩衝液で１：１００に希釈した試料中における２５℃で３０分間のポリペプチドのインキュベーションを含むことができる。好ましい実施形態では、本明細書で使用した用語「自己抗体」は、動物、好ましくは哺乳類の内在性分子に特異的に結合する抗体を意味し、この動物は、自己抗体自体を産生し、好ましくはこのような内在性分子に結合する任意の抗体の平均と比較して、好ましくは健常人と比較して、自己抗体の濃度が上昇している。最も好ましい実施形態では、自己抗体はラミニンベータ４に対する自己抗体である。
【００６１】
本発明による方法は、好ましくはインビトロにおける方法である。
【００６２】
好ましい実施形態では、本発明による予後、診断、方法またはアッセイキットのための複合体の検出は、免疫拡散測定法、免疫電気泳動測定法、光散乱免疫測定法、凝集測定法、放射標識免疫測定法、酵素免疫測定法、好ましくはＥＬＩＳＡ、化学発光免疫測定法および免疫蛍光測定法、好ましくは間接的免疫蛍光測定法を含む群からのものなどの標識を有する免疫測定法を含む群から選択される方法の使用を含む。当業者は、このような方法に精通しており、それらは先行技術、例えば、Ｚａｎｅ，Ｈ．Ｄ．（２００１），Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ、特に１４章に記載されている。
【００６３】
あるいは、組織試料、すなわち、好ましくは本発明によるポリペプチドを含む組織を含む試料、特に剥離皮膚を、液体試料の代わりに使用することができ、それらを先行技術に記載された通りに調製することができる（Ｚｉｌｌｉｋｅｎｓ，Ｄ．，Ｋａｗａｈａｒａ，Ｙ．，Ｉｓｈｉｋｏ，Ａ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｈ．，Ｍａｙｅｒ，Ｊ．，Ｒａｎｋ，Ｃ．Ｖ．，Ｌｉｕ，Ｚ．，Ｇｉｕｄｉｃｅ，Ｇ．Ｊ．，Ｔｒａｎ，Ｈ．Ｈ．，Ｍａｒｉｎｋｏｖｉｃｈ，Ｍ．Ｐ．，Ｂｒｏｃｋｅｒ，Ｅ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｕｂｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｂｌｉｓｔｅｒｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ａ  ２００−ｋＤａ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｚｏｎｅ．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１９９６．１０６（６）：ｐｐ．１３３３−８）。組織試料は、好ましくはポリペプチドを関連生物（好ましくは人体）における平均的組織と比較して高い程度まで発現している、内在性ラミニンベータ４を含む組織に由来することが好ましい。このような試料は、その後担体、例えば、顕微鏡分析用のスライドに固定された組織切片の形態で存在することができ、次に、本発明による抗体、好ましくは本発明によるポリペプチドに結合する自己抗体を接触させることができる。抗体は、好ましくは本発明によるポリペプチドに結合する内在性自己抗体の判別を可能にするために標識され、これにより、第１抗体と競合する、その後接触した試料の自己抗体と新たに形成した複合体を検出し、任意選択的に定量することが可能である。新たに形成した複合体の数が健常人の試料で見いだされた数よりも多い場合、調査試料が得られた人は疾患に罹患しているものと考えられる。
【００６４】
本発明による抗体およびポリペプチドを含む複合体の有無を示すデータはいずれも参照データと比較することができる。例えば、複合体の検出は、分析試料が得られた患者が、疾患に罹患したか、疾患に罹患しているか、または将来疾患に罹患しやすいことを指し示す。患者が既に診断されており、診断上関連のある情報を得るために再度この方法を実施する場合、両段階で得られた複合体の量は、疾患の進行および／または治療の成功を明らかにするために関連付けることができる。例えば、複合体の量が増加したことが判明したら、これは疾患が進行しており、将来疾患が発現しやすいこと、および／または試みた治療が不成功であったことを示唆しており、逆も同様である。複合体の最初の検出は、試料を入手した患者が将来疾患を発症する危険性が高いか、または増大していることを指し示す。
【００６５】
好ましい実施形態では、本発明による診断方法を実施するためにマイクロタイタープレート、膜、ドットブロットもしくはラインブロットなどのブロットを使用する。当業者は実験の設定に精通しており、前記設定は先行技術に記載されている（Ｒａｏｕｌｔ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｄａｓｃｈ，Ｇ．Ａ．（１９８９），Ｔｈｅ  ｌｉｎｅ  ｂｌｏｔ：ａｎ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｅｒｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２５（１−２），５７−６５；国際公開第２０１３０４１５４０号パンフレット）。
【００６６】
さらに好ましい実施形態では、本発明による教示の通りの予後、診断、方法またはキットのために想定されるのは、間接的免疫蛍光法の使用である。当業者は、このような技術および適切な試料の調製に精通しており、これらは先行技術に記載されている（米国特許第４６４７５４３号；Ｖｏｉｇｔ，Ｊ．，Ｋｒａｕｓｅ，Ｃ．，Ｒｏｈｗａｄｅｒ，Ｅ．，Ｓａｓｃｈｅｎｂｒｅｃｋｅｒ，Ｓ．，Ｈａｈｎ，Ｍ．，Ｄａｎｃｋｗａｒｄｔ，Ｍ．，Ｆｅｉｒｅｒ，Ｃ．，Ｅｎｓ，Ｋ．，Ｆｅｃｈｎｅｒ，Ｋ．，Ｂａｒｔｈ，Ｅ．，Ｍａｒｔｉｎｅｔｚ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｓｔｏｃｋｅｒ，Ｗ．（２０１２），Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｉｎｄｉｒｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｎｕｃｌｅａｒ  Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｎ  ＨＥｐ−２  Ｃｅｌｌｓ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２０１２，ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１２／６５１０５；Ｂｏｎｉｌｌａ，Ｅ．，Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｌ．，Ａｌｌａｍ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｉｓ  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｔｏ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｂｅａｄｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１２４，ｎｏ．１，ｐｐ．１８−２１，２００７）。適切な試薬、装置およびソフトウェアパッケージは、例えば、ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ、Ｌｕｂｅｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙから市販されている。
【００６７】
本発明による教示の通りに、疾患の診断のために使用される本発明のポリペプチドに結合する抗体、好ましくは自己抗体が提供される。当分野の当業者は、抗体の精製法、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｍａｌｌｉａ，Ａ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．Ｋ．（１９９２），Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓに記載された方法に精通している。簡単に説明すると、アフィニティークロマトグラフィーによって適切な原料から目的の自己抗体を精製するために、目的の自己抗体に特異的に結合する抗原、本発明によるポリペプチドである抗原を固定して使用する。自己抗体の出現と関係がある神経障害または疾患に罹患してる患者の抗体を含む液体試料を原料として使用することができる。
【００６８】
本発明によれば、提供されるのは、本発明によるポリペプチドに特異的に結合することができる抗体、例えば、自己抗体である。好ましい実施形態では、本明細書で使用した用語「抗体」は、任意の免疫グロブリンをベースにした結合単位、好ましくは免疫グロブリンの少なくとも１つの重鎖および１つの軽鎖を含む単位を意味し、限定しなければ、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体ならびに抗体のバリアント、特に、対応する抗原に結合することができる、より好ましくはそれらに特異的に結合することができる結合単位を有する断片も包含する。好ましい実施形態では、本明細書で使用した用語「特異的に結合する」は、表面プラズモン共鳴によって、Ｂｉａｃｏｒｅ機器を使用して、ＰＢＳ緩衝液中で、ｐＨ７で、２５℃で測定すると、結合が１×１０−５Ｍ、より好ましくは１×１０−７Ｍ、より好ましくは１×１０−８Ｍ、より好ましくは１×１０−９Ｍ、より好ましくは１×１０−１０Ｍ、より好ましくは１×１０−１１Ｍ、より好ましくは１×１０−１２Ｍである解離定数によって特徴付けられる結合反応よりも強いことを意味する。抗体は好ましくは組換え体であるか、および／または単離されている。本発明によって検出されたか、または提供された抗体は、好ましくは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４の配列を含む群からの１つまたは複数の配列を含む、配列番号２７の配列由来のエピトープに特異的に結合する。自己抗体は、好ましくはＩｇＧ抗体である。
【００６９】
抗体は、不均一な自己抗体調製物の一部であってもよく、または均一な自己抗体であってもよく、不均一な調製物は、抗原に結合することができる任意の自己抗体の調製のために、例えば、固定した抗原を使用するアフィニティークロマトグラフィーによってヒトドナーの血清から調製することによって得ることができ、そのため、多数の様々な種類の自己抗体を含む。抗体はグリコシル化または非グリコシル化されていてもよい。当分野の当業者は、抗体およびそれらのバリアントの同定、生成および精製のために使用することができる方法、例えば、欧州特許第２４２３２２６Ａ２号およびそれにある参考文献に記載された方法に精通している。抗体はそれ自体で、または診断薬と組み合わせて、例えば、本発明によるポリペプチドとの複合体中で、使用することができる。
【００７０】
本発明は、本発明によるポリペプチドに結合する抗体、好ましくは自己抗体を単離するための方法であって、ａ）複合体を形成させるために、抗体を含む試料に本発明によるポリペプチドを接触させるステップ、ｂ）ａ）で形成した複合体を単離するステップ、ｃ）ｂ）で単離した複合体を解離させるステップ、およびｄ）本発明によるポリペプチドから抗体を分離するステップを含む方法を提供する。抗ｐ２００類天疱瘡に罹患している患者の試料を自己抗体の原料として使用することができる。適切な方法は、先行技術において、例えば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって出版されたハンドブック“Ａｆｆｉｎｉｔａｔｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｆｉｅ”［Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ］、“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”ａｎｄ  “Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”（２００９／２０１０），およびＰｈｉｌｉｐｓ，Ｔｅｒｒｙ，Ｍ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９２，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃにおいて記載されている。
【００７１】
本発明は、本発明によるポリペプチドを含む医薬組成物であって、対象、好ましくは哺乳類対象、より好ましくはヒトへの投与に適していることが好ましい組成物を提供する。このような医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含むことができる。医薬組成物は、例えば、経口的に、非経口的に、吸入噴霧により、局所的に、点眼により、直腸に、経鼻、頬側に、経膣、または留置した貯蔵体から投与することができ、本明細書で使用した用語「非経口的」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、クモ膜下腔内、病巣内および頭蓋内注射もしくは注入技術を包含する。医薬組成物は、適切な剤形、例えば、カプセル、錠剤ならびに好ましくは滅菌形態の水性懸濁剤および液剤で提供することができる。これは治療方法であって、本発明によるポリペプチドの有効量を対象に投与することを含む方法で使用することができる。
【００７２】
本発明の保護の範囲内で、提供されるのは、本発明による（自己）抗体および／または本発明によるポリペプチドの検出のための試薬を含む、好ましくはこれらでコーティングされた医学的または診断装置である。好ましくは、このような医学的または診断装置は、本発明によるポリペプチドを、簡単な方法で、水性溶液、より好ましくは液体のヒト試料と接触させる形態で含む。特に、本発明によるポリペプチドは、好ましくは、ガラスプレートまたはガラススライド、顕微鏡スライド、バイオチップ、マイクロタイタープレート、ビーズ、例えば、磁気ビーズ、アフェレシス装置、クロマトグラフィーカラム、膜などを含む群から選択された担体の表面に固定することができる。医学的装置の例には、ラインブロット、マイクロタイタープレート、顕微鏡用ガラススライド、ビーズ、好ましくは磁気ビーズおよびバイオチップが包含される。本発明によるポリペプチドに加えて、診断装置は、さらなるポリペプチド、例えば、目的のポリペプチドに対する抗体を含有する、もしくは含有しない試料などの陽性もしくは陰性対照、または、特に１つもしくは複数の同一もしくは類似の症状を伴うその他の疾患に関して、診断価値のある自己抗体に結合するその他の公知の抗原を含むことができる。
【００７３】
本発明の保護の範囲内で、また提供されるのは、好ましくはラミニンベータ４もしくはそのバリアントを含む、好ましくはそれらでコーティングされた治療装置であり、その性質は、血液組成への変化を最小限に抑え、特に必須成分の除去が可能な限り少なく、ラミニンベータ４に対する自己抗体を患者の血液から除去することができるようになっている。これは、アフェレシス装置、好ましくは血漿交換療法のためであってもよい。適切な試薬および方法は、本明細書に全体を参考として組み込んだ欧州特許１７００１７５９．４号および国際公開第２００７／０８５２４０号パンフレットに記載されている。先行技術では、水疱性類天疱瘡の治療のためには特異的な免疫吸収法が有望であることが既に記載されている（Ｍｅｒｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｒｅｓ  ２０１５：“Ｉｍｍｕｎｏａｄｓｏｒｂｅｒ  ｆｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｐｈｅｒｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｕｌｌｏｕｓ  ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ”）。好ましくは、装置は、入ってくる血液と出て行く血液が滅菌された成分とのみ接触するようになっているという意味で滅菌されている。
【００７４】
本発明による教示の通りに、好ましくは疾患の診断のためキットが提供される。このようなキットは、このキットをどのように使用するかについて詳細に記載した指示書および本発明によるポリペプチドを対象、好ましくはヒト対象の体液試料と接触させるための手段としての本発明による担体も含むことができる。さらに、キットは陽性対照、例えば、本発明によるペプチドに結合することが知られている自己抗体もしくは組換え抗体のバッチ、または自己抗体を含む患者の希釈試料を含むことができる。キットは、陰性対照、例えば、ウシ血清アルブミンなどの本発明によるポリペプチドに検出可能な親和性を有しないタンパク質または健康な個体の試料を含有することができる。このようなキットは、キャリブレーターとも呼ばれる、較正曲線を作成するための１つまたは複数の抗体の標準溶液を含むことができ、抗体は、組換え体および／またはモノクローナル抗体、または患者の試料の希釈抗体であることが可能であり、好ましくは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４を含む群のエピトープに対するものである。キットはさらに、ラミニンベータ４に対する自己抗体を認識する、好ましくは検出可能な標識を有する二次抗体、好ましくはＩｇＧ抗体を認識する二次抗体を含むことができる。
【００７５】
好ましい実施形態では、キットは、好ましくは、本発明によるポリペプチドおよび本発明によるポリペプチドに結合する抗体を含む複合体の検出によって、本発明によるポリペプチドに結合する自己抗体を検出するための手段を含む。このような手段は、好ましくは複合体に結合して、複合体を修飾するか、または複合体を検出可能にする標識を有する薬剤である。例えば、このような手段は、一次自己抗体が結合するか、または一次抗体の定常領域に結合する結合部位とは異なる結合部位でポリペプチドに結合する標識抗体であってもよい。あるいは、薬剤は自己抗体の定常領域に結合するラミニンベータ４に対する二次抗体、好ましくは、ＩｇＧクラスの哺乳類抗体に特異的な二次抗体であってもよい。このような複合体の検出のための多数の方法および手段は、先行技術、例えば、Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ｔｅｒｒｙ，Ｍ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９２，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．に記載されている。
【００７６】
ラミニンベータ４またはそのバリアントを含むポリペプチドは、ポリペプチドをコードする核酸を含むおよび／または発現する細胞の形態で生成または提供することができる。本発明によるポリペプチドまたはそのバリアントをコードする配列を含む核酸を使用する場合、このような核酸は未修飾核酸であってもよい。好ましい実施形態では、核酸は、それ自体天然では生じず、天然の核酸と比較して、合成元を示す少なくとも１つの修飾を含む、例えば、同位体または化学的修飾を含有する、例えば、メチル化、配列修飾、標識などを含有する核酸である。好ましい実施形態では、核酸は組換え核酸、またはより好ましい実施形態では、核酸の発現、好ましくは過剰発現を可能にするプロモーターに機能的に連結されたベクターの一部である。当業者は、市販の、例えば、Ｏｒｉｇｅｎｅ製の多数の適切なベクターに精通している。例えば、Ｃ末端にＧＦＰを有する融合構築物をコードするベクターを使用することができる。ベクターは、細菌の複製開始点および真核生物、好ましくは哺乳類細胞での発現のためのプロモーター、例えば、ＳＶ４０プロモーターまたはトリベータアクチンプロモーターを含むことができる。細胞は、真核細胞または原核細胞、好ましくは、例えば、酵母細胞などの真核細胞であってもよく、より好ましくは哺乳類細胞であり、さらにより好ましくはＨＥＫ２９３細胞などのヒト細胞である。哺乳類細胞の例には、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯまたはＣＯＳ−７細胞が包含される。本発明によるポリペプチドをコードする核酸を含む細胞は、組換え細胞または単離された細胞であってもよく、用語「単離された」は、細胞が、細胞の環境が野生型の細胞もしくはその環境と比較して、異なる分化または種の細胞の含有が少ないか、または実際にはその他のこのような細胞を全く含有しないように濃縮されていることを意味する。細胞またはベクターは、ポリペプチドの発現のために使用することができ、その後、自己免疫疾患の診断のための組成物またはキットの生成のために使用される。細胞は、生きた細胞またはもはや代謝活性のない固定された細胞であってもよい。細胞の固定は、Ｐｒｏｂｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｂｓｔ，Ｃ．Ｓａｓｃｈｅｎｂｒｅｃｋｅｒ，Ｓ．，Ｓｔｏｅｃｋｅｒ，Ｗ．，ａｎｄ  Ｋｏｍｏｒｏｗｓｋｉ，Ｌ．（２０１４）Ａｎｔｉ−ｎｅｕｒｏｎａｌ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ３，３０３−３２０）に記載されたように、アセトンまたはホルマリンによる処置によって可能である。
【００７７】
本発明による教示は、診断だけでなく、疾患の予防または治療のため、より正確には、ａ）対象の血液中における本発明によるポリペプチドに結合する自己抗体の濃度を低減させるステップ、および／またはｂ）好ましくは、リツキシマブ、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、シクロスファミド、ミコフェノール酸モフェチル、静脈内免疫グロブリン、ＦＫ５０６、シクロスポリン、メトトレキセート、プロピオン酸クロベタゾール、ダプソン、テトラサイクリン、ニコチンアミド、コルシチンおよびアザチオプリンを含む群の１つまたは複数の免疫抑制医薬物質を投与するステップを含む、疾患を予防または治療するための方法のために使用することができる。
【００７８】
好ましい実施形態では、本発明は、自己免疫疾患の診断のためのキットの生成のための、ラミニンベータ４に対する抗体またはラミニンベータ４もしくはそのバリアントをコードする配列を含む核酸または前記配列を含むベクターまたはベクターもしくは前記核酸を含む細胞を検出するための手段または試薬の使用を提供する。
【００７９】
好ましい実施形態では、本発明による任意の方法または任意の使用は、診断以外の目的を意図していてもよく、特に、患者の診断以外のいくつかの使用のためのラミニンベータ４に対する自己抗体の存在の決定を意図していてもよい。例えば、この方法または使用は、患者の血液から自己抗体を除去するために構成された医学的装置の効率をインビトロにおける試験によって決定することを意図していてもよく、この試験は患者の血液ではない液体で実施される。好ましい実施形態では、好ましくは、哺乳類、好ましくはヒトにおける疾患の検出のために、自己抗体プロファイルを作成する意図で本発明による任意の方法および任意の使用を使用することができる。好ましい実施形態では、皮膚疾患に罹患している患者の試料中における疾患関連マーカーの検出のために、方法または使用を使用することができる。
【００８０】
好ましい実施形態では、本発明による方法は、診断測定システムを検定するため、またはこのような測定システムもしくは患者の血液から自己抗体を除去するための治療システムの信頼性および／または十分な能力を確認するための方法である。診断測定システムの場合、自己抗体は診断する患者の試料中においては検出されないが、公知の組成物を有する、特に、自己抗体に結合する、規定された、公知の濃度の抗体もしくは公知の濃度の組換え抗体を有する、人工的溶液においては検出される。診断システムは、試料中における自己抗体の検出を可能にする任意のシステム、例えば、本発明による医学的な診断装置であってもよい。
【００８１】
治療システム、例えば、アフェレシスのための器具の場合、この方法は、このようなシステムを開発するため、ならびにその信頼性および／または効率および／または潜在力を試験するために使用することができる。例えば、これはアフェレシス操作後に、またはその前にこのシステムに接触させる本発明によるポリペプチドに結合する公知の濃度の抗体を含む溶液のために可能であり、本発明による方法はこのシステムが溶液から抗体を除去することができることを確認するために使用することができる。
【００８２】
好ましい実施形態では、本発明は、１つまたは複数のラミニンベータ４に対する自己抗体、患者が自己免疫疾患に罹患している可能性の増加を指し示す自己抗体または自己抗体（複数）を検出するための、患者の試料の分析のための器具であって、
ａ．試料が担体と接触したとき、試料中の少なくとも１つの自己抗体を捕捉するための手段を含む担体、
ｂ．担体と接触したとき、捕捉された抗体と結合することができる検出手段、好ましくは、担体上に捕捉された抗体に結合することができる標識された二次抗体である検出手段、
ｃ．任意選択的に、好ましくは洗浄によって、担体から試料を除去および検出手段を除去するための手段、
ｄ．検出可能な手段の存在の検出のため、および結果を電子シグナルに変換するための検出器、ならびに、
ｅ．任意選択的に、検出器からの電子シグナルを受け取り、かつ、シグナルの強度をバックグラウンドシグナルの強度または健常人の試料を使用して得られた入力参照値と比較することによってシグナルの強度が自己免疫疾患の可能性の増加を指し示すかどうか決定するための手段を含む器具を提供する。
【００８３】
本出願は、一連の新規核酸またはポリペプチドの配列を含む。
【００８４】
配列番号１：プライマーセンスＬＡＭＢ４：
【化１】
2020090477.tif 000003
【００８５】
配列番号２：プライマーアンチセンスＬＡＭＢ４：
【化２】
2020090477.tif 000004
【００８６】
配列番号３：プライマーアンチセンスＬＡＭＢ４−Ｓｔｏｐ：
【化３】
2020090477.tif 000005
【００８７】
配列番号４＿ｐＴｒｉＥｘ−１（標準ベクター）
【化４−１】
2020090477.tif 000006
【化４−２】
2020090477.tif 000007
【化４−３】
2020090477.tif 000008
【００８８】
配列番号５＿ｐＴｒｉＥｘ−１−ＬＡＭＢ４（ＩＦ１）［ヒト］−Ｈｉｓタグのないヒトラミニンベータ４をコードする
【化５−１】
2020090477.tif 000009
【化５−２】
2020090477.tif 000010
【化５−３】
2020090477.tif 000011
【化５−４】
2020090477.tif 000012
【化５−５】
2020090477.tif 000013
【化５−６】
2020090477.tif 000014
【００８９】
配列番号６＿ｐＴｒｉＥｘ−１−ＬＡＭＢ４（ＩＦ１）［ヒト］（ｄＨｉｓ）−Ｈｉｓタグを有するヒトラミニンベータ４をコードする
【化６−１】
2020090477.tif 000015
【化６−２】
2020090477.tif 000016
【化６−３】
2020090477.tif 000017
【化６−４】
2020090477.tif 000018
【化６−５】
2020090477.tif 000019
【化６−６】
2020090477.tif 000020
【００９０】
配列番号７：＞ＬＡＭＢ４−Ｈｉｓ−Ｈｉｓタグを有するヒトラミニンベータ４
【化７】
2020090477.tif 000021
【００９１】
配列番号８：自己抗体エピトープ１
【化８】
2020090477.tif 000022
【００９２】
配列番号９：自己抗体エピトープ２
【化９】
2020090477.tif 000023
【００９３】
配列番号１０：自己抗体エピトープ３
【化１０】
2020090477.tif 000024
【００９４】
配列番号１１：自己抗体エピトープ４
【化１１】
2020090477.tif 000025
【００９５】
配列番号１２：自己抗体エピトープ５
【化１２】
2020090477.tif 000026
【００９６】
配列番号１３：自己抗体エピトープ６
【化１３】
2020090477.tif 000027
【００９７】
配列番号１４：自己抗体エピトープ７
【化１４】
2020090477.tif 000028
【００９８】
配列番号１５：サブフラグメント１
【化１５】
2020090477.tif 000029
【００９９】
配列番号１６：サブフラグメント２
【化１６】
2020090477.tif 000030
【０１００】
配列番号１７：サブフラグメント３
【化１７】
2020090477.tif 000031
【０１０１】
配列番号１８：サブフラグメント４
【化１８】
2020090477.tif 000032
【０１０２】
配列番号１９：サブフラグメント５
【化１９】
2020090477.tif 000033
【０１０３】
配列番号２０：サブフラグメント６
【化２０】
2020090477.tif 000034
【０１０４】
配列番号２１：４つのトリプトファンおよびＣ末端Ｈｉｓタグを有するサブフラグメント１（ＡＭＢ４−ＴＦ１−４Ｗ−Ｈｉｓ）
【化２１】
2020090477.tif 000035
【０１０５】
配列番号２２：４つのトリプトファンおよびＣ末端Ｈｉｓタグを有するサブフラグメント２（ＬＡＭＢ４−ＴＦ２−４Ｗ−Ｈｉｓ）
【化２２】
2020090477.tif 000036
【０１０６】
配列番号２３：４つのトリプトファンおよびＣ末端Ｈｉｓタグを有するサブフラグメント３（ＬＡＭＢ４−ＴＦ３−４Ｗ−Ｈｉｓ）
【化２３】
2020090477.tif 000037
【０１０７】
配列番号２４：４つのトリプトファンおよびＣ末端Ｈｉｓタグを有するサブフラグメント４（ＬＡＭＢ４−ＴＦ４−４Ｗ−Ｈｉｓ）
【化２４】
2020090477.tif 000038
【０１０８】
配列番号２５：４つのトリプトファンおよびＣ末端Ｈｉｓタグを有するサブフラグメント５（ＬＡＭＢ４−ＴＦ５−４Ｗ−Ｈｉｓ）
【化２５】
2020090477.tif 000039
【０１０９】
配列番号２６：４つのトリプトファンおよびＣ末端Ｈｉｓタグを有するサブフラグメント６（ＬＡＭＢ４−ＴＦ６−４Ｗ−Ｈｉｓ）
【化２６】
2020090477.tif 000040
【０１１０】
配列番号２７：ラミニンベータ４
【化２７】
2020090477.tif 000041
【０１１１】
配列番号２８：欧州特許第３２６０８６４号の配列番号８
【化２８】
2020090477.tif 000042
【０１１２】
配列番号２９：グリアジンペプチド
【化２９】
2020090477.tif 000043
【０１１３】
配列番号３０：グリアジンペプチド
【化３０】
2020090477.tif 000044
【０１１４】
配列番号３１：グリアジンペプチド
【化３１】
2020090477.tif 000045
【０１１５】
本発明は、図面を参照にして例示的実施形態に基づいて以下に説明する。記載した実施形態は、あらゆる点において例示に過ぎず、限定として理解されるものではなく、引用した特徴の様々な組合せは本発明の範囲内に包含される。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】抗ｐ２００類天疱瘡の患者のＬＡＭＣ１反応性を有しないＩｇＧまたは血清、およびヒト真皮の抽出物の免疫沈降を示した図である。Ａ：ウエスタンブロット分析：一次抗体としての抗ｐ２００類天疱瘡血清（１：５０希釈）とインキュベートすることによって免疫沈降したタンパク質の検出。列１：ＬＡＭＣ１−ｃｔｅｒｍ反応性を有しない抗ｐ２００ＩｇＧ（精製済み）；列２：ＬＡＭＣ１−ｃｔｅｒｍ反応性を有しない抗ｐ２００類天疱瘡血清；列３：正常ヒトＩｇＧ（精製済み）；列４：正常ヒト血清；列５：ＧａｍｍａｂｉｎｄＧセファロースのみ。Ｂ：Ａと同じ試料を含有するゲルのシルバーブルー（クーマシー）染色。バンド１、２および３を切り出し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。ラミニンベータ４は可能性のある自己抗原として同定された（バンド１および２）。
【図２】皮膚におけるラミニンベータ４の検出を示した図である。Ａ、Ｂ：間接的免疫蛍光顕微鏡：市販のポリクローナル抗体（Ｃｌｏｕｄ−Ｃｌｏｎｅ；ＰＡＣ０７９Ｈｕ０１）を使用した、食塩剥離ヒト皮膚における人工剥離物の真皮側のラミニンベータ４の染色。Ｂ：陰性対照。Ｃ：ウエスタンブロット分析によるヒト真皮の尿素抽出物におけるラミニンベータ４抗体の試験。切片１および２：抗２００類天疱瘡血清；切片３：ラミニンガンマ１抗体；切片４：ラミニンベータ４抗体；切片５および６：正常ヒト血清。Ｄ：ラミニンベータ４抗体およびヒト真皮の抽出物の免疫沈降に続くウエスタンブロット分析（ラミニンガンマ１反応性を有しない抗ｐ２００類天疱瘡患者のＩｇＧのプールで染色）。列１および２：抗ラミニンベータ４抗体（それぞれ、５μｇおよび１０μｇ）；列３：抗ＮＣ１６Ａ  ＩｇＧ（対照ＩｇＧ、１０μｇ）；列４：正常ウサギＩｇＧ（１０μｇ）；列５：Ｇａｍｍａｂｉｎｄ  Ｇセファロースのみ。
【図３】ラミニンベータ４発現ＨＥＫ２９３細胞および抗ｐ２００類天疱瘡血清（ｎ＝２９）による代表的なウエスタンブロット分析を示した図である。ＨＥＫ２９３細胞は、ＬＡＭＢ４−ｐＴｒｉＥｘ１（ｊｅｔＰＲＩＭＥ；Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）で形質導入し、４８時間後にＲＩＰＡ緩衝液で溶解した。タンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、タンパク質をニトロセルロース膜に移し、膜をブロックし、ラミニンベータ４抗体（Ｃｌｏｕｄ−Ｃｌｏｎｅから市販されているポリクローナル抗体；１：２０００）、抗ｐ２００類天疱瘡血清（１：５０）および健康な血液ドナーの正常ヒト血清（ＮＨＳ、１：５０）で一晩インキュベートした。抗ヒトＩｇＧ４  ＨＲＰ複合体（１：２０００）を二次抗体として使用した。ブロットはＤＡＢで１分間発色させた。本明細書で示した抗ｐ２００類天疱瘡血清は全てラミニンベータ４と反応したが、対照は反応を示さなかった。
【図４】予備吸着試験の結果を示した図である。抗ｐ２００類天疱瘡血清は、ＨＥＫ２９３−ラミニンベータ４抽出物で（一晩）予備吸着し、次にそれらの反応性をウエスタンブロットで試験した。Ａ：左：３種類の抗ｐ２００類天疱瘡血清はＨＥＫ２９３−ラミニンベータ４抽出物で一晩予備吸着したところ、ラミニンベータ４によるその後のウエスタンブロットで、予備吸着しなかった血清（１、３、５）と比較してもはやシグナルを示さなかった（切片２、４、６）；切片７：正常ヒト血清；切片８：予備吸着した正常ヒト血清。右:同じ試料はまた、皮膚抽出物のニトロセルロース切片でインキュベートし、同じ結果を示した。皮膚抽出物によるウエスタンブロットでは、予備吸着したにもかかわらず、血清番号２のみが反応した。Ｂ：組換えｈＬＡＭＣ１−ｃｔｅｒｍによるウエスタンブロットでは、血清番号２はまた、ラミニンガンマ１と反応することを示すことができた。Ｃ：血清番号２のｈＬＡＭＣ１−ｃｔｅｒｍおよびラミニンベータ４を発現する細胞抽出物による再度の予備吸着。自己抗体反応性を両抽出物で無効にすることができた。切片１：抗ｐ２００類天疱瘡血清（番号２）；切片２：予備吸着した抗ｐ２００類天疱瘡血清（番号２）；切片３：正常ヒト血清；切片４：予備吸着した正常ヒト血清。
【図５】正確なエピトープマッピングからの例示的一次データを示した図である。認められるのは、４人の患者血清および血液ドナーの試料（それぞれ１：１０希釈）およびＩｇＧ二次抗体をインキュベーションした後、マイクロアレイから得られたシグナルである。
【実施例】
【０１１７】
［実施例１］
＜診断上関連する自己抗原としてのラミニンベータ４の同定＞
＜真皮抽出物の調製＞
抗ｐ２００類天疱瘡のさらなる自己抗原は、まずヒト真皮の抽出物および精製した患者抗体の免疫沈降を実施することによって同定した。
【０１１８】
このために、真皮抽出物をまず調製した（Ｚｉｌｌｉｋｅｎｓ，Ｄ．，Ｋａｗａｈａｒａ，Ｙ．，Ｉｓｈｉｋｏ，Ａ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｈ．，Ｍａｙｅｒ，Ｊ．，Ｒａｎｋ，Ｃ．Ｖ．，Ｌｉｕ，Ｚ．，Ｇｉｕｄｉｃｅ，Ｇ．Ｊ．，Ｔｒａｎ，Ｈ．Ｈ．，Ｍａｒｉｎｋｏｖｉｃｈ，Ｍ．Ｐ．，Ｂｒｏｃｋｅｒ，Ｅ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｕｂｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｂｌｉｓｔｅｒｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ａ  ２００−ｋＤａ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｚｏｎｅ．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１９９６．１０６（６）：ｐｐ．１３３３−８）。ヒト皮膚片を１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｅｔ  ＩＩＩ、Ｍｅｒｃｋ）を含有するＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中で４℃で４８時間インキュベートした。４８時間後、真皮および表皮を互いに分離することができた。タンパク質は、まず真皮に４Ｍ尿素緩衝液（４Ｍ尿素、１２．５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ）を１０分間重層し、その後緩衝液を除去し、次いで９Ｍ尿素緩衝液（９Ｍ尿素、１２．５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、１００ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍＭのＰＭＳＦ）で１時間のインキュベーションを実施することによって、真皮から抽出した。得られた抽出物をＲＩＰＡ緩衝液（放射線免疫沈降測定緩衝液：０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコレートＮａ、プロテアーゼ阻害剤（ＥＤＴＡを含まないＳＩＧＭＡＦＡＳＴ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤１錠、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））中で、脱塩カラム（Ｚｅｂａ（商標）Ｓｐｉｎ脱塩カラム、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して再緩衝し、使用するまで−２０℃で保存した。
【０１１９】
＜ＩｇＧ抗体のアフィニティー精製＞
抗ｐ２００類天疱瘡ＩｇＧは、プロテインＧセファロース（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を使用して製造元の指示に従って精製した。その後、ｈＬＡＭＣ１−ｃｔｅｒｍ（ヒトラミニンガンマ１のＣ末端、アミノ酸１３６３−１６０９）特異的自己抗体は、親和性精製手法（Ｖａｆｉａ  Ｋ，Ｇｒｏｔｈ  Ｓ，Ｂｅｃｋｍａｎｎ  Ｔ，Ｈｉｒｏｓｅ  Ｍ，Ｄｗｏｒｓｃｈａｋ  Ｊ，Ｒｅｃｋｅ  Ａ，Ｌｕｄｗｉｇ  Ｒ  Ｊ，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  Ｔ，Ｚｉｌｌｉｋｅｎｓ  Ｄ，ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｅ，Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ａｎｔｉ−ｐ２００  ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１２．７（７）：ｐ．ｅ４１７６９）を使用して単離した。患者抗体の特異的精製のために、ｈＬＡＭＣ１−ｃｔｅｒｍ−ｐＱＥ４０をまず大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２  ＤＥ３（Ｎｏｖａｇｅｎ−Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）に形質転換し、タンパク質を発現させて（ＩＭＡＣによって）精製した。最後に、組換えｈＬＡＭＣ１−ｃｔｅｒｍタンパク質を製造元の指示に従ってＡｆｆｉｇｅｌ１５（ＢＩＯ  ＲＡＤ）に共有結合させた（Ｇｒｏｔｈ  Ｓ，Ｒｅｃｋｅ  Ａ，Ｖａｆｉａ  Ｋ，Ｌｕｄｗｉｇ  Ｒ  Ｊ，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  Ｔ，Ｚｉｌｌｉｋｅｎｓ  Ｄ，ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｅ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ａｎｔｉ−ｐ２００  ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ．Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，２０１１．１６４（１）：ｐｐ．７６−８２）。この特異的アフィニティークロマトグラフィーを用いて、抗ｐ２００類天疱瘡患者血清のＩｇＧ調製物からｈＬＡＭＣ１−ｃｔｅｒｍ特異的自己抗体を除去することができた。
【０１２０】
＜免疫沈降＞
免疫沈降で使用されたのは、タンパク質源としての再緩衝化された真皮抽出物およびｈＬＡＭＣ１−ｃｔｅｒｍ反応性を有しない精製患者ＩｇＧ、ｈＬＡＭＣ１−ｃｔｅｒｍ抗体を有しない抗ｐ２００類天疱瘡血清、および健康な血液ドナーからの対応する対照であった。
【０１２１】
最初に、プロテインＧセファロース（ＧａｍｍａＢｉｎｄ  Ｇセファロース、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＲＩＰＡ緩衝液で洗浄し、健康な血液ドナーの血清で予備吸着させた。１時間予備吸着して遠心分離した後、セファロースを以下それぞれ、
１．ｈＬＡＭＣ１−ｃｔｅｒｍ反応性を有しない患者ＩｇＧ（プール）３０μｇ
２．患者血清２０μｌ
３．ＮＨＩｇＧ（健康な血液ドナーの正常なヒトＩｇＧ）３０ｍｇ
４．ＮＨＳ（健康な血液ドナーの正常なヒト血清）２０μｌ
５．ＲＩＰＡ緩衝液のみ
において、ＲＩＰＡ緩衝液中で、回転させながら室温で１時間インキュベートし、その後ＲＩＰＡ緩衝液で洗浄した。その後、再緩衝化した真皮抽出物２００μｌを各反応試験管にピペットで入れ、次いで反応調製物を回転装置で４℃で一晩インキュベートした。ＲＩＰＡ緩衝液による洗浄ステップに続いてスクロース緩衝液（１Ｍスクロース、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＨＮａＰＯ４）による洗浄ステップを行った。最後に、ＲＩＰＡ緩衝液による洗浄をもう一度実施した。試料をそれぞれＬａｅｍｍｌｉ緩衝液２０μｌと共に９５℃で５分間加熱し、遠心分離し、試料を７．５％ＰＲＯＴＥＡＮ  ＴＧＸタンパク質ゲル（ＢＩＯＲＡＤ）に添加した。
【０１２２】
ゲルの半分をクーマシー（シルバーブルー）染色し、もう半分は、タンパク質をニトロセルロース膜に転写した後で、抗ｐ２００類天疱瘡血清（１：５０希釈、４℃で一晩インキュベーション）によるウエスタンブロットで分析した。使用した緩衝液は、遊離の結合部位を飽和させるための５％粉乳を含有するＴＢＳ−Ｔおよびインキュベーション緩衝液としての５％粉乳および１％ＢＳＡを含有するＴＢＳＴであった。使用した二次抗体は、抗ヒトＩｇＧ４ＨＲＰ抗体（１：２０００、クローンＨＰ６０２５、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）であった。ブロットはＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）で発色させた。約２００ｋＤに特有のシグナルを観察することができた（図１）。クーマシー染色ゲルの対応するバンドにＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析（Ｗｉｓｔａｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）を行い、ラミニンベータ４（ＬＡＭＢ４）としてバンドを同定することができた。
【０１２３】
［実施例２］
＜ラミニンベータ４の局在の確認＞
皮膚におけるラミニンベータ４の局在は、最初に間接的免疫蛍光法において市販の抗ラミニンベータ４抗体（ポリクローナル、Ｃｌｏｕｄ−Ｃｌｏｎｅ；ＰＡＣ０７９Ｈｕ０１）を使用することによって確認した。陰性対照とは対照的に、抗ラミニンベータ４抗体は、抗ｐ２００類天疱瘡血清血清と同じように（示さず）、ヒト食塩剥離皮膚における人工的水疱の基部に結合する。さらに、抗ラミニンベータ４抗体はまた、真皮抽出物を用いたウエスタンブロットで試験した（手法は前記参照）。ヒト真皮抽出物によるウエスタンブロットは、抗ｐ２００類天疱瘡を診断するための現在の標準的診断法である。図２に示したように、抗ラミニンベータ４抗体（切片４）は、抗ｐ２００類天疱瘡血清（切片１および２）のシグナルと同じレベルに位置するタンパク質ハンドと反応する。市販のモノクローナルラミニンガンマ１抗体（クローンＢ−４、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）のシグナルは、わずかに上方に移動している。
【０１２４】
さらに、市販の抗ラミニンベータ４抗体を免疫沈降法のために使用した。本明細書でも、使用したラミニンベータ４材料はまた真皮抽出物であった。抗ラミニンベータ４抗体５μｇおよび１０μｇを免疫沈降法のために使用した（手法については上記参照）。使用した対照は、抗ＮＣ１６ＡウサギＩｇＧ（１０μｇ）、正常ウサギＩｇＧ（１０μｇ）およびＧａｍｍａＢｉｎｄ  Ｇセファロースのみであった。その後のウエスタンブロット分析において、ラミニンベータ４は、ラミニンガンマ１反応性を有しない抗ｐ２００類天疱瘡ＩｇＧのプールを使用して検出した。図２では、抗ｐ２００類天疱瘡患者はラミニンベータ４に対する自己抗体を有することを明らかに確認することができる。
【０１２５】
［実施例３］
＜クローニング＞
ラミニンベータ４（ＬＡＭＢ４）は、Ｃ末端にポリヒスチジンタグが融合したバリアントとして、および確実なバリアントとして、組換えによって生成した。ヒトラミニンベータ４のアイソフォーム１をコードするｃＤＮＡクローンＩＲＣＢｐ５００５Ｆ２２１２Ｑは、Ｓｏｕｒｃｅ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）から購入して、ＰＣＲ用の鋳型として使用した。
【０１２６】
ラミニンベータ４のコーディング配列の増幅のためには、センスプライマーＬＡＭＢ４（配列番号１）およびアンチセンスプライマーＬＡＭＢ４（配列番号２）を、ラミニンベータ４をコードする配列の末端に翻訳停止コドンを有しない断片のために使用した。コーディング配列の末端に翻訳終止コドンを有するラミニンベータ４のｃＤＮＡの増幅は、センスプライマーＬＡＭＢ４（配列番号１）およびアンチセンスプライマーＬＡＭＢ４−Ｓｔｏｐ（配列番号３）を用いて実施した。
【０１２７】
両端に、両ＰＣＲ生成物は、制限酵素ＢｓａＩの制限部位を含有した。ＢｓａＩ消化後、ラミニンベータ４単位複製配列をＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ線状化プラスミドベクターｐＴｒｉＥｘ−１（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ、配列番号４）と連結し、配列番号５および配列番号６の通りの構築物を生成した。ライゲーション調製物を大腸菌ＮＥＢ５−アルファ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＧｍｂＨ）に形質転換し、形質転換体はアンピシリン１００μｇ／ｍｌによって選択した。単離したプラスミドは、制限分析およびＤＮＡ配列決定によって正確さを確認し、ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションのために使用した。
【０１２８】
［実施例４］
＜ＨＥＫ細胞のトランスフェクションおよびウエスタンブロット分析＞
ラミニンベータ４が実際に抗ｐ２００類天疱瘡の標的抗原であることを確認するために、ＨＥＫ２９３細胞をＬＡＭＢ４−ｐＴｒｉＥｘ１（Ｈｉｓタグを有する、配列番号７）または空のベクターをｊｅｔＰＲＩＭＥ（ポリプラストランスフェクション）によりトランスフェクトし、発現を４８時間後にウエスタンブロットにおいて市販の抗ラミニンベータ４抗体（上記参照）によって確認した。全体として、４９個の抗ｐ２００類天疱瘡血清（１：５０希釈）および２０個の健康な血液ドナーの血清（ＮＨＳ、正常ヒト血清、１：５０希釈）のラミニンベータ４との反応性を、ラミニンベータ４−ＨＥＫ２９３抽出物（ＲＩＰＡ緩衝液）を用いたウエスタンブロットで試験した。このために、完了したニトロセルロース膜を切片に切断した。市販の抗ラミニンベータ４抗体（１：２０００希釈）を陽性対照として使用した。切片を一次抗体で４℃で一晩インキュベートした。本明細書ではまた、前述したように、抗ヒトＩｇＧ４ＨＲＰ抗体およびマウス抗ウサギＨＲＰ抗体を二次抗体として使用した。ブロットはＤＡＢで１分間発色させた。全体として、４９個の抗ｐ２００類天疱瘡血清のうち４７個がラミニンベータ４と反応したが、一方陰性対照は反応を示さなかった。
【０１２９】
［実施例５］
＜予備吸着試験＞
ラミニンベータ４の正確な同定は、予備吸着試験によって確認した。このために、３つの抗ｐ２００類天疱瘡血清（ラミニンガンマ１反応性を有しない）をラミニンベータ４−ＨＥＫ２９３抽出物で４℃で一晩予備吸着し、その後残存する反応性を真皮抽出物およびラミニンベータ４−ＨＥＫ２９３抽出物を用いたウエスタンブロットで試験した（図４）。ウエスタンブロット分析は、前述のように実施した。予備吸着していない血清（図４、切片１、３および５）と比較して、予備吸着した血清はラミニンベータ４−ＨＥＫ２９３抽出物とはもはや反応性を示さず、３つの予備吸着した血清のうち２つはまた、真皮抽出物中の２００ｋＤａの大きさのタンパク質ともはや反応しなかった。したがって、反応を中和することができた。血清番号２のみがまだ約２００ｋＤａに弱い反応を示した。この抗ｐ２００類天疱瘡血清は、実際にはラミニンガンマ１と反応性を示さないはずだが、それでもｈＬＡＭＣ１−ｃｔｅｒｍウエスタンブロットを使用して再度試験を実施した。血清番号２が実際にラミニンガンマ１自己抗体を有することがわかり、それによって真皮抽出物中における反応を説明することができた。
【０１３０】
血清番号２をｈＬＡＭＣ１−ｃｔｅｒｍおよびラミニンベータ４−ＨＥＫ２９３抽出物で予備吸着することによって、両抽出物との自己抗体反応性を無効にすることができた。本研究で使用した陰性対照は、健康な血液ドナーの血清（ＮＨＳ）であった。
【０１３１】
［実施例６］
＜おおまかなエピトープマッピング＞
おおまかなエピトープを同定するために、ラミニンベータ４の６つのサブフラグメント（配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０）をクローニングし、標準的な方法を使用してＣ末端Ｈｉｓタグを有するｐＥＴ２４ｄベクターで発現させた（配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６）。構築物がもともと４つのトリプトファン残基を有しなかった場合、濃度測定用に４つのトリプトファンを有するようにいくつかの各構築物に人工的に融合させた。
【０１３２】
構築物は、実施例１に記載したようにウエスタンブロット分析された。
【０１３３】
結果を表１に一緒にした。基本的に、明らかになったのは、サブフラグメント（ＳＦ）５およびＳＦ６に対してかなりの活性があることであった。それに反して、血液ドナー（ＢＤ）の血清は、ほとんど反応性を示さなかった。
【０１３４】
【表１】
2020090477.tif 000046
【０１３５】
［実施例７］
＜正確なエピトープマッピング＞
ラミニンベータ４に対する自己抗体を含む４つの患者血清をエピトープマッピングのために使用した。血液ドナーの血清を、非特異的反応を同定することを可能にするためにさらにインキュベートした。Ｃ末端部分に位置付けられる１４個のアミノ酸が重複した直鎖状１５マーペプチド、より正確にはサブフラグメント５（配列番号１９）および６（配列番号２０）を使用した。ペプチドは、インキュベーション緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および１０％Ｒｏｃｋｌａｎｄブロッキング緩衝液ＭＢ−０７０を含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４）で１：１００に希釈した試料と接触させ、１：５００、１：１００および１：１０の希釈でインキュベーション緩衝液中で１４０ｒｐｍで震盪しながら４℃で１６時間インキュベートし、次いで二次（マウス抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）ＤｙＬｉｇｈｔ６８０（０．５μｇ／ｍｌ））および対照（マウスモノクローナル抗ＨＡ（１２ＣＡ５）ＤｙＬｉｇｈｔ６８０（０．２μｇ／ｍｌ））抗体で４５分間染色した。読み取りは、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して実施した。スポット強度の定量およびペプチド予測は、ＰｅｐＳｌｉｄｅ分析装置を使用して実施した。一次データの例は図５に認めることができる。
【０１３６】
結果：決定されたことは、ペプチドとの特異的な抗体反応は低度から中程度であり、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４の配列を有するエピトープを同定することができたことを意味する。
【図１】
2020090477.tif 000047
【図２】
2020090477.tif 000048
【図３】
2020090477.tif 000049
【図４】
2020090477.tif 000050
【図５】
2020090477.tif 000051
【配列表】
2020090477000001.app
【外国語明細書】
2020090477000001.pdf