(57)【要約】      （修正有）【課題】サルモネラ感染症の減少、予防、及び／又は治療を補助する抗体又はそのフラグメントの提供。【解決手段】特定の配列からなるアミノ酸配列、又はその変異体を含む単離された抗体又は抗体フラグメント。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜配列番号１８のいずれか１つのアミノ酸配列、又はその変異体を含む単離された抗体又は抗体フラグメント。
【請求項２】
サルモネラに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体又は抗体フラグメント。
【請求項３】
前記サルモネラの鞭毛に特異的に結合する、請求項２に記載の抗体又は抗体フラグメント。
【請求項４】
（ｉ）ＧＲＸ１ＦＳＸ２ＫＰ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１と、
（ｉｉ）ＡＳＸ３ＴＧＶＳＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）ＡＧＴＸ４ＲＴＬＷＧＳＫＷＲＤＸ５Ｘ６ＥＹＥＹ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、
（ここで、Ｘ１はＴ又はＳであり、Ｘ２はＶ又はＫであり、Ｘ３はＦ又はＹであり、Ｘ４はＴ又はＬであり、Ｘ５はＶ又はＲであり、Ｘ６はＬ又はＲである）を含む、サルモネラに結合する単離された抗体又は抗体フラグメント。
【請求項５】
（ｉ）ＧＬＤＦＳＳＹＡ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、
（ｉｉ）ＩＳＲＦＧＧＲＬ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）ＡＡＤＲＲＳＧＬＧＴＳＫＥＹＤＹ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、
を含む、サルモネラに結合する単離された抗体又は抗体フラグメント。
【請求項６】
（ｉ）ＧＩＩＦＳＩＮＡ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、
（ｉｉ）ＩＳＡＹＤＨＴ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）ＮＶＤＥＩＲＫＦ（配列番号４５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、
を含む、サルモネラに結合する単離された抗体又は抗体フラグメント。
【請求項７】
（ｉ）ＧＲＳＦＳＬＹＧ（配列番号４６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、
（ｉｉ）ＩＳＧＳＧＬＡＴＳ（配列番号４７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）ＡＱＲＷＴＳＧＴＩＡＲＡＴＧＥＹＧＹ（配列番号４８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、
を含む、サルモネラに結合する単離された抗体又は抗体フラグメント。
【請求項８】
（ｉ）ＧＳＩＦＳＧＤＡ（配列番号４９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、
（ｉｉ）ＩＧＫＥＧＤＴ（配列番号５０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）ＡＴＦＥＥＲＰＱＰＳＹＶＹ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、
を含む、サルモネラに結合する単離された抗体又は抗体フラグメント。
【請求項９】
ペプシン、トリプシン、及びキモトリプシンからなる群から選択される１以上の消化酵素に対する寛容について改変された、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
【請求項１０】
検出可能な標識を更に含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸分
子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントを含む、バクテリオファージ。
【請求項１４】
請求項１１に記載の核酸分子を含む、バクテリオファージ。
【請求項１５】
動物又は動物環境においてサルモネラの存在を減少させる方法であって、該動物に請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントを投与することを含む、方法。
【請求項１６】
前記動物に抗生物質、バクテリオシン、又はサルモネラに対して有効な他の植物若しくは動物に由来する化合物を投与することを更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記動物に、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントとともに、任意にプロバイオティクス系に同時発現又は同時含有される、競合細菌を投与することを更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体又は抗体フラグメントが前記動物に経口投与される、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記動物がニワトリである、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ニワトリが産卵用の雌鶏又はブロイラー鶏である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記動物環境が養鶏場である、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
動物環境へのサルモネラの導入を減少又は予防する方法であって、新入動物を該動物環境に導入する前に、該新入動物に請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントを投与することを含む、方法。
【請求項２３】
サルモネラに感染した被験体を治療する方法であって、該被験体に請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントを投与することを含む、方法。
【請求項２４】
前記被験体にサルモネラに対して有効な抗生物質を投与することを更に含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記被験体が、ニワトリ、ウシ、又はヒツジからなる群から選択される家畜動物である、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記被験体がヒトである、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントと、
薬学的に許容可能な賦形剤と、
を含む、サルモネラ感染症を治療するのに使用される製剤。
【請求項２８】
サルモネラ感染症の治療を必要とする被験体においてサルモネラ感染症を治療するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントの使用。
【請求項２９】
試料中のサルモネラを検出する方法であって、
該試料と、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントとを接触させることと、
結合した抗体又は抗体フラグメントの存在を検出することと、
を含む、方法。
【請求項３０】
前記試料が体液又は糞便物質を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料が食品又は食品からの表面スワブを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントと、
サルモネラの検出における使用に関する指示書と、
を備える、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項３３】
サルモネラ感染症の治療を必要とする被験体においてサルモネラ感染症を治療するための医薬品を作製するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、概して、抗体、そのフラグメント、その誘導体、並びにかかる抗体の使用及び用途に関する。記載される抗体及びフラグメントは、特異的にサルモネラに対するものとすることができる。
【背景技術】
【０００２】
サルモネラ症は、ヒトにおいて最も一般に報告される動物原性伝染病のうちの１つである。アメリカ単独で、サルモネラ症によって毎年概算１３０万人の食中毒、及び５００人を超える死者が出ている（非特許文献１）。サルモネラ血清型エンテリティディス（enteritidis）及びチフィムリウム（typhimurium）は、ヒト感染でしばしば検出される（非特許文献２）。サルモネラは、自然界において広く分布し、一般に野生の又は家畜の媒介動物によって運ばれる。家禽はサルモネラの主要かつ世界中に広がる保菌体（reservoir）
であることが知られている。サルモネラは、疾患を引き起こすことなく、腸の微生物集団の一時的なメンバーとして家禽の消化管に生息する。サルモネラのコロニー形成は、通常家禽の体重増加又は生産力（performance）に影響しないため、無症状感染は、食物連鎖
によるヒトへの動物原性感染症の伝播の可能性を増加させる場合がある（非特許文献３、非特許文献４）。ヒヨコは、垂直感染（卵を介して成体からヒヨコへ）又は水平感染（環境、害虫又は飼料から）の可能性がある（非特許文献５、非特許文献６）。
【０００３】
サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）は、ヒトにおいて胃腸炎を引き起こ
す２つの主なサルモネラ種のうちの１つである。Ｓ．エンテリカは、６つの亜種へ細分され、ほとんど全てのヒト感染症は亜種Ｉ（エンテリカ）によって引き起こされる。Ｓ．エンテリカの２６００を超える血清型が同定されているが（非特許文献７）、ヒト及び家畜における大半のサルモネラ感染症の原因となっているのは、これらの血清型のごく少数である（非特許文献８）。
【０００４】
ブロイラー鶏及び卵に対する大きな成長市場、並びにサルモネラの抗生物質耐性株の出現は、公衆衛生の懸念、ヨーロッパ及び北アメリカにおける政府規制政策の変化、並びに家禽におけるサルモネラレベルを管理するための法律を制定する更なる要求をもたらした（非特許文献３）。
【０００５】
ブロイラー鶏における予防接種戦略は、通常鳥の寿命が短いことから、現在まで最適とは言えない結果を示している。現在、２種類のサルモネラワクチン、すなわち弱毒生ワクチン及び不活化ワクチンを商業的に入手することができる。これらのワクチンは、飼育者及び産卵するニワトリの群れ（layer flocks）の両方に投与されることが多いが、有効性は標的とされる血清型、宿主種、及び根絶ではなく減少が目的であるかに依存する（非特許文献９）。これらのワクチンは、特に若い鳥では、粘膜表面の初期のコロニー形成を排除しない（非特許文献１０）。有効な管理は、農場のバイオセキュリティーの改善、農業での最良の慣行（best practices）の使用、並びに予防接種及び競合的排除製品及び飼料添加剤の使用を含む、多くの要因に依存する。予防衛生の対策は、典型的には農場の敷地での有効なバイオセキュリティー及び鶏舎の衛生プロトコルを確立することを含む。他のより多くの標的化戦略が開発されている。例えば、サルモネラ特異的溶菌ファージの組み合わせは、食品包装における用途についてヨーロッパで最近承認された。他のものは、サルモネラを管理するための家禽飼料中のバクテリオシン及び／又はテイルスパイクファージタンパク質の包含を提案し、試験した（非特許文献１１、非特許文献１２）が、今日までこれらの製品のいずれも商品化されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Messens et al., 2013
【非特許文献２】Ravel et al., 2010
【非特許文献３】Hugas et al., 2014
【非特許文献４】Mazengia et al., 2014
【非特許文献５】Cox et al., 2014
【非特許文献６】Rodriguez et al., 2006
【非特許文献７】Popoff and Le Minor, 1997
【非特許文献８】Porwollik et al., 2004
【非特許文献９】Doyle and Erickson, 2006
【非特許文献１０】Dougan et al., 1988
【非特許文献１１】Chakchouk-Mtibaa et al., 2014
【非特許文献１２】Waseh et al., 2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
サルモネラ感染症の減少、予防、及び／又は治療を補助する抗体又はそのフラグメントを提供することは有利となるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、サルモネラに結合するラクダ科シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）の開発に関するものである。ＶＨＨは、従来の抗体と比較して大量に、また非常に低コストで細菌又は酵母において容易に発現可能な、最も小さい抗原結合フラグメントである。
【０００９】
したがって、本明細書には、配列番号１〜配列番号１８のいずれか１つのアミノ酸配列、又はその変異体を含む単離された抗体又は抗体フラグメントが開示される。一実施の形態では、上記単離された抗体又は抗体フラグメントは、サルモネラの外側、任意にサルモネラの鞭毛に直接結合する。
【００１０】
本開示の好ましい実施の形態では、サルモネラ結合抗体又は抗体フラグメントは、ＧＲＸ１ＦＳＸ２ＫＰのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、ＡＳＸ３ＴＧＶＳＴのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、ＡＧＴＸ４ＲＴＬＷＧＳＫＷＲＤＸ５Ｘ６ＥＹＥＹのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と（式中、Ｘ１はＴ又はＳであり、Ｘ２はＶ又はＫであり、Ｘ３はＦ又はＹであり、Ｘ４はＴ又はＬであり、Ｘ５はＶ又はＲであり、Ｘ６はＬ又はＲである）を含む。
【００１１】
別の好ましい実施の形態では、サルモネラ結合抗体又は抗体フラグメントは、ＧＬＤＦＳＳＹＡのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、ＩＳＲＦＧＧＲＬのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、ＡＡＤＲＲＳＧＬＧＴＳＫＥＹＤＹのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む。
【００１２】
別の好ましい実施の形態では、サルモネラ結合抗体又は抗体フラグメントは、ＧＩＩＦＳＩＮＡのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、ＩＳＡＹＤＨＴのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、ＮＶＤＥＩＲＫＦのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む。
【００１３】
別の好ましい実施の形態では、サルモネラ結合抗体又は抗体フラグメントは、ＧＲＳＦＳＬＹＧのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、ＩＳＧＳＧＬＡＴＳのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、ＡＱＲＷＴＳＧＴＩＡＲＡＴＧＥＹＧＹのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む。
【００１４】
別の好ましい実施の形態では、サルモネラ結合抗体又は抗体フラグメントは、ＧＳＩＦＳＧＤＡのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、ＩＧＫＥＧＤＴのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、ＡＴＦＥＥＲＰＱＰＳＹＶＹのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む。
【００１５】
本開示の好ましい実施の形態では、本明細書に開示される単離された抗体又は抗体フラグメントは、ペプシン、トリプシン、及びキモトリプシンからなる群から選択される１以上の消化酵素に対する寛容（tolerance）について改変されている。更なる好ましい実施
の形態では、本明細書に開示される抗体又は抗体フラグメントは、検出可能な標識を含む。
【００１６】
本開示は、本明細書に開示される単離された抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸分子、該核酸分子を含む宿主細胞、及び該核酸又はポリペプチドを含むバクテリオファージを更に提供する。
【００１７】
本開示の別の好ましい態様は、動物に本明細書に開示される単離された抗体又は抗体フラグメントを投与することを含む、動物又は動物環境においてサルモネラの存在を減少させる方法である。好ましい一実施の形態では、本方法は、上記動物に抗生物質、バクテリオシン、又はサルモネラに対して有効な他の植物若しくは動物に由来する化合物を投与することを更に含む。別の好ましい実施の形態では、本方法は、上記動物に、本明細書に開示される抗体又は抗体フラグメントとともに、任意にプロバイオティクス系に同時発現又は同時含有される、競合細菌（competing microbe）を投与することを更に含む。上記抗
体又は抗体フラグメントを経口投与してもよく、上記動物はニワトリ、任意に産卵用の雌鶏又はブロイラー鶏であってもよく、上記動物環境は養鶏場であってもよい。
【００１８】
また、新入動物を動物環境に導入する前に、該新入動物に本明細書に開示される抗体又は抗体フラグメントを投与することを含む、動物環境へのサルモネラの導入を減少又は予防する方法が開示される。
【００１９】
また、被験体に本明細書に開示される単離された抗体又は抗体フラグメントを投与することを含む、サルモネラに感染した被験体を治療する方法が開示される。好ましい実施の形態では、感染した被験体を治療する方法は、被験体にサルモネラに対して有効な抗生物質を投与することを更に含む。上記被験体は、ニワトリ、ウシ、又はヒツジからなる群から選択される家畜動物であってもよく、又はヒトであってもよい。
【００２０】
また、本明細書に開示される単離された抗体又は抗体フラグメントと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、サルモネラ感染症を治療するのに使用される製剤が開示される。
【００２１】
さらに、サルモネラ感染症の治療を必要とする被験体においてサルモネラ感染症を治療するための、本明細書に開示される単離された抗体又は抗体フラグメントの使用が開示される。
【００２２】
さらに、試料中のサルモネラを検出する方法であって、該試料と、本明細書に開示される単離された抗体又は抗体フラグメントとを接触させることと、結合した抗体又は抗体フラグメントの存在を検出することとを含む、方法が開示される。好ましい一実施の形態では、上記試料が体液又は糞便物質を含む。別の好ましい実施の形態では、上記試料が食品又は食品からの表面スワブを含む。
【００２３】
本開示の別の態様は、本明細書に開示される単離された抗体又は抗体フラグメントと、サルモネラの検出における使用に関する指示書とを備える、上記検出方法を実施するためのキットである。
【００２４】
別の態様は、サルモネラ感染症を治療するための医薬品を作製するための、本明細書に開示される抗体又は抗体フラグメントの使用を提供する。
【００２５】
更なる態様及び利点は、添付の図面とともに以下の説明より明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本開示の抗サルモネラ抗体及び抗体フラグメントの例示的なアミノ酸配列、並びに該抗体及び抗体フラグメントをコードする核酸配列を示す図である。
【図２】抗サルモネラ抗体及び抗体フラグメント間のアミノ酸配列類似性を示す樹状図である。
【図３】Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ（商標）Ｇ２５０で染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の精製された抗サルモネラＶＨＨドメインを示す図である。
【図４】サルモネラのフラジェリン、又はサルモネラ・エンテリカ株であるＳ．ハイデルベルグ９１８、Ｓ．ハイデルベルグ４６４３、Ｓ．ハダル５６４３若しくはＳ．ハダル５６５９の細胞全体への１８個の異なる抗サルモネラＶＨＨドメインに関する結合アッセイ（Ａ４５０で測定した結合）の結果を示す棒グラフである。
【図５】４個の異なる抗サルモネラＶＨＨドメインの存在下でのＳ．エンテリカ株ＳＧ４９０４に対する運動性アッセイの結果を示す棒グラフである（ｙ軸は細菌コロニーの増殖の直径を示す）。
【図６】４個の異なる抗サルモネラＶＨＨドメインの存在下でのＳ．エンテリカ株ＳＧ４９０４に対する細胞増殖アッセイの結果を示す棒グラフである（ＯＤ６００を測定することによって特定される細菌増殖速度）。
【図７】ＨｅＬａ細胞サルモネラ内部移行アッセイにおけるＳ．エンテリカ血清型ハダル５６４３に対する３個のＶＨＨの活性を示す棒グラフである。
【図８】サルモネラゲノムコピー数によって測定される（単一コピーのハウスキーピング遺伝子ｔｔｒの増幅に基づく）、培養したニワトリ回腸又は空腸のサルモネラ内部移行アッセイにおけるＳ．エンテリカ血清型ハダル５６４３に対する異なる濃度の３個のＶＨＨの活性を示す棒グラフである。
【図９】Ｓ．エンテリカ血清型ハダル５６４３でチャレンジした非ＳＰＦのブロイラーのヒヨコにＶＨＨ０Ａ０７を投与することの効果を示す散布図である（回腸及び空腸の切片に対するＣＦＵ数を示す）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本開示は、好ましくはサルモネラ細胞の外部に結合する能力を有する抗体及び抗体フラグメントの生成、単離及び特性評価に基づく。該抗体及び抗体フラグメントの特徴及び使用は、ここに、より詳しく記載される。本明細書に提示される例示的な実施形態は、本発明の範囲に含まれ、限定を意図しないことが十分に理解される。本発明の好ましい実施形態に関連する図面が参照される。
【００２８】
定義
本明細書で使用される「抗体」の用語は、抗原に結合する能力を有する全長免疫グロブリンを指す。本明細書で使用される「抗体フラグメント」の用語は、抗原に結合する能力を保持する免疫グロブリン分子の全長部分未満のもの、例えばＶＨＨドメインを指す。
【００２９】
本明細書で使用される「ＶＨＨ」又は「ＶＨＨドメイン」の用語は、ラマ、アルパカ又はラクダ等のラクダ科動物において生成される重鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体を指す。当該技術分野で時々使用されるＶＨＨに対する他の用語として、限定されないが、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、単一可変ドメイン抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン
、重鎖可変ドメイン抗体、及びナノボディ（商標）が挙げられる。
【００３０】
本明細書でポリペプチド、抗体、抗体フラグメント又は核酸と関連して使用される「単離された、単離した」又は「精製された、精製した」の用語は、実質的に又は本質的に天然の会合分子を含まないポリペプチド、抗体、抗体フラグメント又は核酸を意味し、例えば、実質的に又は本質的に異なる特異性を有する抗体を含まない単離された抗体を意味する。
【００３１】
本明細書で使用される「多量体（の）」又は「多価（の）」の用語は、ポリペプチド上に、典型的には抗体若しくは抗体フラグメントの複数のコピーに由来する、又は類似するが異なる複数のかかる抗体若しくは抗体フラグメントに由来する、複数の抗原結合部位を有することを指す。
【００３２】
本明細書で使用される「核酸」の用語は、二本鎖又は一本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ分子又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを指す。生細胞で見られるように、これらの分子はニックを有してもよく（nicked）、無傷であってもよい。二本鎖又は一本鎖の核酸分子は、直線状であってもよく、環状であってもよい。二重螺旋は平滑末端でもよく、又は例えば、制限酵素によって生成された突出末端を有する一本鎖テイルを有してもよい。
【００３３】
本明細書で使用される「変異体」の用語は、被験体アミノ酸又はヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性又は配列相同性を有するアミノ酸又はヌクレオチドの配列を指す。
【００３４】
抗体及び抗体フラグメント
本開示の一態様によれば、本明細書には、配列番号１〜配列番号１８のいずれか１つのアミノ酸配列、又はその変異体を含む単離された抗体又は抗体フラグメントが提供される。好ましい実施形態では、該抗体又は抗体フラグメントはサルモネラに結合する。更なる好ましい実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントはサルモネラの鞭毛に結合する。前述の抗体又は抗体フラグメントは、これらの下記実施例に記載されるように、熱で不活性化されたサルモネラ細胞で免疫化したアルパカにおいて生成される抗体のコレクションに由来することが好ましい。配列番号１〜配列番号１８の各々は、上記コレクションに由来する単離されたＶＨＨドメインのアミノ酸配列に対応し、また上記配列は、図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ及び図１Ｆに示される。
【００３５】
ＶＨＨドメインは３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３が点在するフレームワーク領域で構成される。ＣＤＲ配列は、抗体（又は抗体フラグメント）と抗原との間の結合特異性に不可欠であることが知られている。したがって、本開示の好ましい実施形態では、本明細書に開示される抗体又は抗体フラグメントは、ＧＬＤＦＳＳＹＡ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、ＩＳＲＦＧＧＲＬ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、ＡＡＤＲＲＳＧＬＧＴＳＫＥＹＤＹ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む。別の好ましい実施形態では、ＣＤＲ１はＧＩＩＦＳＩＮＡ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２はＩＳＡＹＤＨＴ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３はＮＶＤＥＩＲＫＦ（配列番号４５）のアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、ＣＤＲ１はＧＲＳＦＳＬＹＧ（配列番号４６）のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２はＩＳＧＳＧＬＡＴＳ（配列番号４７）のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３はＡＱＲＷＴＳＧＴＩＡＲＡＴＧＥＹＧＹ（配列番号４８）のアミノ酸配列を含む。更なる好ましい実施形態では、ＣＤＲ１はＧＳＩＦＳＧＤＡ（配列番号４９）のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２はＩＧＫＥＧＤＴ（配列番号５０）のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３はＡＴＦＥＥＲＰＱＰＳＹＶＹ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含む。
【００３６】
下記実施例に記載され、表２に説明されるように、上記の指定されたＣＤＲ配列のうちの幾つかに基づいてコンセンサス配列を定義することができる。本開示の好ましい実施形態では、サルモネラに結合し、ＧＲＸ１ＦＳＸ２ＫＰ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、ＡＳＸ３ＴＧＶＳＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、ＡＧＴＸ４ＲＴＬＷＧＳＫＷＲＤＸ５Ｘ６ＥＹＥＹ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と（式中、Ｘ１はＴ又はＳであり、Ｘ２はＶ又はＫであり、Ｘ３はＦ又はＹであり、Ｘ４はＴ又はＬであり、Ｘ５はＶ又はＲであり、Ｘ６はＬ又はＲである）を含む、単離された抗体又は抗体フラグメントが本明細書において提供される。任意に、ＣＤＲ１はＧＲＴＦＳＶＫＰ（配列番号５２）のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２はＡＳＦＴＧＶＳＴ（配列番号５３）のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３はＡＧＴＴＲＴＬＷＧＳＫＷＲＤＶＬＥＹＥＹ（配列番号５４）のアミノ酸配列を含む。任意に、ＣＤＲ１はＧＲＳＦＳＶＫＰ（配列番号５５）のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２はＡＳＦＴＧＶＳＴ（配列番号５３）のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３はＡＧＴＬＲＴＬＷＧＳＫＷＲＤＲＲＥＹＥＹ（配列番号５６）のアミノ酸配列を含む。任意に、ＣＤＲ１はＧＲＴＦＳＫＫＰ（配列番号５７）のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２はＡＳＹＴＧＶＳＴ（配列番号５８）のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３はＡＧＴＴＲＴＬＷＧＳＫＷＲＤＶＬＥＹＥＹ（配列番号５４）のアミノ酸配列を含む。
【００３７】
本明細書に記載される抗体フラグメントのいずれかを、単離形態で利用してもよく、それらは、抗体、例えば組換え抗体、キメラ抗体、小分子複合抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体等の抗体内の一部のより長い分子を形成するものであってもよい。
【００３８】
さらに、抗体フラグメントとして、限定されないが、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ、ペプチドリンカーで接続されたＶＬ及びＶＨからなる分子）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、又は単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）が挙げられ得る。ｓｄＡｂはラクダ科起源であってもよいことから、ラクダ科のフレームワーク領域に基づいてもよく、代替的には、ＣＤＲを他の抗体ドメインのフレームワーク領域、例えば、限定されないがＶＮＡＲ、ヒトＶＨ又はヒトＶＬのフレームワーク領域の上にグラフトしてもよい。
【００３９】
本発明は、本明細書に開示される抗体又は抗体フラグメントの改変を含み、また、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の同一性又は配列相同性が観察される限り、またかかる改変が機能的な変異体を生じる限り、保存的置換、付加又は欠失を含む、アミノ酸変異を含んでもよい。好ましい実施形態では、パーセント同一性は、９０％以上で設定されることから、各ＶＨＨドメインの同一性は、例えば、指定される配列の９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％と個別に決定され得ることが理解される。
【００４０】
本発明の抗体又は抗体フラグメントを多量体の形態で産生することが好ましいことは十分に理解される。例えば、二量体又は五量体を形成することができる。多量体を形成するために使用されるＶＨＨ等の複数の抗体フラグメントは、互いに同一であってもよく、異なってもよい。５価の多量体ＶＨＨドメイン、すなわちペンタボディ（pentabody）は、
１価のＶＨＨドメインと比較して、抗原に対してより高い結合親和性を有する場合がある。５個のＶＨＨドメインは互いに同一である必要がないので、異なる配列のＶＨＨドメインを含んでもよい。
【００４１】
本明細書に記載される抗体又は抗体フラグメントは、１以上の消化酵素に対する寛容又は耐性について改変され得ることが好ましい。ポリペプチドに破壊的な作用を有し得る典型的な消化酵素として、ペプシン、トリプシン及びキモトリプシンが挙げられる。したがって、上記ペプチドは腸管内において周囲のサルモネラと結合するようなより長い曝露時
間を有することから、これらの酵素に対する耐性は有利なものとなる。単一ドメイン抗体は、概して、従来の抗体よりもプロテアーゼに著しく耐性である。さらに、ＶＨＨは、耐熱性及びプロテアーゼ耐性を含む生物物理学的特徴の最適化のためのポリペプチドエンジニアリングに適用可能であることが知られている（Hussack et al., 2014）。ＣＤＲ領域の内部及び外部の両方のポリペプチド部分のスキャフォルドエンジニアリングは当該技術分野で知られており、標的親和性の増加、プロテアーゼ耐性、また同様に耐熱性及び低ｐＨ耐性を与えることができる。例えば、結合のエントロピーを支援するため、伸長した柔軟なＣＤＲ３ループが、ＣＤＲ１とＣＤＲ３と、又はＣＤＲ２の５５位とＣＤＲ３と、又は５０位のＦＲ２とＣＤＲ３とを接続するループ間ジスルフィド結合で束縛されていてもよい（Muyldermans, 2013、Conrath et al, 2003）。上に言及されたいずれかのジスルフィド結合形成に関与するＣＤＲ３のシステインは、伸長されたＣＤＲ３ループの任意の位置に生じる得るか、又はその位置に入れることができる（Conrath et al, 2003）。５４
位及び７８位にシステインを導入して更なるジスルフィド結合を形成することにより、ＶＨＨの安定性が増加され得る。このジスルフィド結合は、ペプシン又はキモトリプシンによる分解に対してＶＨＨを非常に耐性とすることが知られている（Hagihara et al, 2007、Saerens et al, 2008、Hussack et al, 2014）。
【００４２】
本明細書に記載される抗体又は抗体フラグメントは、必要に応じて、許容可能な標識及び任意にリンカーで標識され得ることが好ましい。上記標識は、サルモネラへの結合の存在を観察することができるように、検出可能とされ得るか、又はそれ自体が検出可能であってもよい。抗体又は抗体フラグメントは、放射性同位元素、ガドリニウム又は酸化鉄等の常磁性標識、フルオロフォア、近赤外線（ＮＩＲ）蛍光色素若しくは色素、エコー源性マイクロバブル（echogenic microbubble）、アフィニティー標識（例えばビオチン、ア
ビジン等）、酵素、又は画像診断法によって検出され得る任意の他の好適な作用物質に連結されてもよい。
【００４３】
本明細書に記載される抗体又は抗体フラグメントは、当該技術分野で知られている方法のいずれかで産生されてもよい。例えば、抗体又は抗体フラグメントを、コードする発現ベクターを含む細胞で発現させてもよい。かかる発現系は、当該技術分野でよく知られており、多くの変異形態が使用され得る。細胞に基づく発現系の例は、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis
）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）の一種、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、及びＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、又はＨｅＬａ細胞等の哺乳動物由来の細
胞株であってもよい。発現された抗体又は抗体フラグメントは、溶解した細胞溶液から単離されてもよく、又は該ポリペプチドは培地中へと分泌され、そこから直接単離されてもよい。また、抗体又は抗体フラグメントを人工合成してもよい。人工タンパク質合成の例として、固相ペプチド合成、液相ペプチド合成、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質合成としても知られる無細胞タンパク質合成が挙げられる。
【００４４】
核酸、細胞及びバクテリオファージ
上に記載されるアミノ酸配列をコードする核酸分子が本明細書に包含される。一実施形態では、核酸分子は、配列番号１９〜配列番号３６のいずれか１つの核酸配列を含む。これらの配列は、図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ及び図１Ｆに説明される。遺伝暗号の縮重を考慮すると、当業者に容易に理解されるように、多くの変異体核酸配列がそのアミノ酸配列をコードする作用を有する。本発明の核酸分子は、二本鎖又は一本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ分子又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであってもよい。生細胞で見られるように、これらの分子はニックを有してもよく、無傷であってもよい。二本鎖又一本鎖の核酸分子は直線状であってもよく、環状であってもよい。二重螺旋は平滑末端でもよく、又
は例えば、制限酵素によって生成された突出末端を有する一本鎖テイルを有してもよい。
【００４５】
また、本明細書に記載される抗体又は抗体フラグメントのいずれか１つをコードする核酸分子を含む宿主細胞は、当業者に容易に認識される。宿主細胞は、細菌、例えばＥ．コリの所望の株、ピキア・パストリスの所望の株等の酵母細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞若しくはＨｅＬａ細胞等の哺乳動物由来の細胞株、又は本発明の核酸分子を運搬するのに適した任意の他の宿主細胞であってもよい。
【００４６】
本明細書に記載される抗体若しくは抗体フラグメント、及び／又は該抗体若しくは抗体フラグメントをコードするヌクレオチド分子を含むバクテリオファージもまた本発明に包含される。
【００４７】
方法、使用、製剤及びキット
本明細書に記載される抗体又は抗体フラグメントは、特異的にサルモネラに結合することができ、該抗体又は抗体フラグメントは、被験体におけるサルモネラの減少、サルモネラの阻害、及び／又はサルモネラの検出を含む多くの目的に有用な可能性があることが十分に理解される。
【００４８】
したがって、本明細書には、本明細書に開示される抗体又は抗体フラグメントを動物に投与することを含む、動物又は動物環境におけるサルモネラの存在を減少させる方法が提供される。
【００４９】
個々の動物において、サルモネラの存在を減少させることは、動物の表面の、又は動物の胃腸管内の汚染を減少させることを含んでもよい。万一動物が全身感染した場合、サルモネラの存在を減少させるために本明細書に記載される方法が使用され得る。
【００５０】
動物の環境は、ケージ若しくは施設の壁若しくは床、動物施設内の給餌装置若しくは飲水装置、動物施設で見られる床敷材、又は単純に動物収容施設内の動物に対して外部に存在する糞便物質等の動物の身近な環境に関連し得ることが好ましい。
【００５１】
本明細書に記載される抗体又は抗体フラグメントの動物への投与は、好ましくは、抗体若しくは抗体フラグメントが投与される動物若しくはかかる動物の子孫において、又は動物が生活する群、ケージ若しくは小屋においてサルモネラの存在を減少又は阻害する目的であってもよい。動物の胃腸管内のサルモネラの減少は、動物環境内の汚染を減少させる一つの方法であり、汚染の発生率がより低い、より安全な食糧供給連鎖をもたらす。
【００５２】
また、サルモネラに対して有効な別の物質の同時投与は、動物環境においてサルモネラを減少させるのに可能な戦略である。例えば、助剤（co-formulation）として同時に、又は抗体若しくは抗体フラグメントの送達時近くのいずれかの時点で動物に対して抗生物質を投与することは相加的効果を有する可能性があり、又は相乗的効果を有する場合がある。サルモネラ汚染の可能性を減少させ得る結果は、抗生物質の使用の減少も伴い得る（すなわち、相乗的効能を有する抗生物質の部分的な使用）。また、相加的又は相乗的な効果のため、上記抗体又は抗体フラグメントとともに、動物に対し、サルモネラに対して有効なバクテリオシンを与えることができる。バクテリオシンに加えて又はその代わりとして、サルモネラに対する効果を有する小分子、ペプチド、又はタンパク質等の任意の他の植物由来又は動物由来の化合物を、本明細書に記載される抗体又は抗体フラグメントとともに使用してもよい。また、競合細菌は、相加的又は相乗的な効果を達成可能とするため、抗体又は抗体フラグメントと同時に動物に与えてもよい。競合細菌は、プロバイオティクス系の一部として、本明細書に記載される抗体又は抗体フラグメントとともに使用されてもよい。かかるプロバイオティクス系において、抗体又は抗体フラグメントは、競合細菌
と同時投与されてもよく、順次送達されてもよい。本明細書に記載されるポリペプチドのプロバイオティクス系に抗体又は抗体フラグメントが発現していてもよい。
【００５３】
本明細書に記載される抗体又は抗体フラグメントは、被験体に経口投与されてもよい。経口送達は、ポリペプチドが水又は食糧を供給するうちに動物に送達されることを可能とし、注射よりも動物に対してそれほど重大なものでなく、よりストレスが少ない。また、経口服用による投薬計画（regime）の非常に正確な送達が望ましい場合には、胃管強制投与も許容可能な経口経路である。また、吸入；鼻腔内；ゲルに基づくすなわちスプレーによる；胚内、局所的すなわち静脈内、皮下、筋肉内、眼窩内、眼内、皮内等の注射による、ゲルに基づく、スプレー又は直腸の送達経路等の他の投与経路を考慮することができる。抗体又は抗体フラグメントは、直接投与してもよく、又はファージ若しくは宿主微生物内に投与してもよい。
【００５４】
上に記載されるように、本明細書に記載される抗体又は抗体フラグメントに対する改変は、経口送達の効能を高めるためになされてもよい。例えば、スキャフォルドエンジニアリングは、耐熱性及び低ｐＨ耐性と同様に、プロテアーゼ耐性を与えるため、ＣＤＲ領域内又はＣＤＲ領域外の抗体又は抗体フラグメントの部分に対して行うことができる。しかしながら、さらに、抗体又は抗体フラグメントを送達する形態も、消化酵素、熱又は低ｐＨの作用に対する防護効果を提供する、薬学的に許容可能なコーティング剤又は賦形剤によって変更することができる。この方法では、抗体又は抗体フラグメントの配列自体は改変される必要はなく、むしろ経口送達に対して作製された製剤自体が、抗体又は抗体フラグメントが送達される被験体の種に対してより最適となる場合がある。また、抗体又は抗体フラグメントは、送達又は安定性を改善する環状ペプチド、高分子又はポリエチレングリコール等の小分子に複合化されてもよい。
【００５５】
剤形は、動物に抗体又は抗体フラグメントを送達するのに許容可能な任意の種類であってもよい。望ましい場合、被覆形態及び徐放性形態を使用してもよい。液体、粉体、結晶、ゲル、半固形又は錠剤の形態を使用してもよい。
【００５６】
抗体又は抗体フラグメントが送達され得る動物は、ブロイラー鶏又は産卵用の雌鶏等の鳥であることが好ましい場合がある。サルモネラが動物の消化管又は周辺環境に存在する場合、ブタ、ウシ、ヒツジ等の他の種類の家畜動物も、上記ペプチドから利益を得ることがある。好ましい動物環境は、養鶏場等の小屋又は農場であってもよい。
【００５７】
実質上サルモネラを含まない動物環境の汚染を回避するため、新たに汚染された動物の又は「新入」動物の小屋等の環境への導入を予防することを目的とする方法が提供される。かかる方法では、小屋又は農場等の動物環境に新入動物を導入する前に新入動物に抗体又は抗体フラグメントを投与する。このようにして、既に治療を受けている可能性のある他の動物と居を構える前に、動物の汚染可能性を排除することができる。
【００５８】
また、抗体又は抗体フラグメントは、噴霧、又はサルモネラ汚染のレベルを低下させる他の方法により、植物又は植物系材料に施してもよい。かかる植物又は植物系材料の例として、限定されないが、サラダ及び香辛料が挙げられる。
【００５９】
また、本明細書に開示される抗体又は抗体フラグメントを被験体に投与することを含む、サルモネラに感染した被験体を治療する方法が開示される。好ましい実施形態では、該方法は、サルモネラに対して有効な抗生物質を被験体に投与することを更に含む。該被験体は、ニワトリ、ウシ、若しくはヒツジからなる群から選択される家畜動物であってもよく、該被験体はヒトであってもよい。
【００６０】
また、本明細書に開示される抗体又は抗体フラグメントと、賦形剤とを含むサルモネラ感染症を治療するのに使用される製剤を開示する。
【００６１】
また、サルモネラ感染症の治療を必要とする被験体におけるサルモネラ感染症を治療するための、本明細書に開示される抗体又は抗体フラグメントの使用を開示する。
【００６２】
また、試料と、本明細書に開示される抗体又は抗体フラグメントとを接触させることと、結合した抗体又は抗体フラグメントの存在を検出することとを含む、試料中のサルモネラを検出する方法を開示する。好ましい一実施形態では、上記試料は体液又は糞便物質を含む。別の好ましい実施形態では、上記試料は、食品又は食品からの表面スワブを含む。
【００６３】
検出目的のため、被験体からの試料は、体液又は糞便物質を含んでもよい。被験体は、ヒトであってもよく、非ヒト動物であってもよい。微生物叢の試料は、被験体の胃腸（ＧＩ）管又は消化管から収集することができる。試料収集の方法は当業者に知られている。例えば、微生物叢試料は、便、腸の粘膜生検、消化管洗浄、又はそれらの組み合わせから得ることができる。粘膜を滅菌食塩水又は滅菌水等の生理溶液で洗い流して、粘膜の上皮細胞を覆う強力な接着性粘液層、及び粘液層内に埋め込まれた微生物群を除去することにより内視鏡検査中に収集を行うことができる。その後、吸引物を消化管の特定の位置で内視鏡によって直接収集し、試料を氷上に置く。
【００６４】
また、消化管の微生物叢の収集を便に対して行うことができる。便からの細菌の収集は、当該技術分野で知られている。排泄物の微生物叢を収集及び分析する場合、新鮮な便を収集し、直ちに処理して、処理した材料を約−８０℃で保存することができる。
【００６５】
検出目的のため、被験体はニワトリ、任意にブロイラー鶏であってもよい。かかる被験体に由来する試料は、腸液、死骸、羽、皮膚、胸／脚の肉の洗ったもの（meat rinses）
、また同様に家禽の糞若しくは体液、又は直腸溶出物を含んでもよい。試料は、動物の飼料及び水と同様に、鳥小屋の床材等の環境、ブーツ、洗浄液／冷気タンク、又は家禽処理設備で使用される任意の他の機器から採取され得る。
【００６６】
一旦試料が収集されると、上記試料中の結合した抗体又は抗体フラグメントの存在は、当該技術分野で知られている多くの結合アッセイ又は結合した基質の検出手法のいずれか１つを実行することによって検出され得る。抗体又は抗体フラグメントの結合は、タグ付きの抗体又は抗体フラグメントの使用により直接又は間接的に測定することができ、それらの例は上に記載される。検出の工程は、当該技術分野で知られている任意の好適な方法、例えば、限定されないが、光学撮像、免疫組織化学的検査若しくは分子画像診断、ＥＬＩＳＡ、又は他の好適な方法によって遂行され得る。
【００６７】
また、本明細書に開示される抗体又は抗体フラグメントと、サルモネラの検出における使用に関する指示書とを備える、検出方法を実施するためのキットを開示する。
【００６８】
ここでは、本開示の例示的な実施形態が記載される。これらの実施形態は、サルモネラに特異的なラクダ科単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）の作製及び使用を含み、限定を意図するものではない。
【実施例】
【００６９】
実施例１
サルモネラの種々の株によるアルパカの免疫化
サルモネラを標的とするＶＨＨドメインを単離するため、３頭のアルパカを異なる株のサルモネラ・エンテリカで免疫化した。
【００７０】
３頭の雄性アルパカ（ビクーニャ・パコス（Vicugna pacos））を、サルモネラ・エン
テリカ血清型で皮下に免疫化した。合計５回の注射を行った。熱不活性化され（６５℃で３０分間）、アジュバント（水酸化アルミニウム、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（商標）２％）と混合された、４つのサルモネラ・エンテリカ株（各々から１×１０９ｃｆｕ）の混合物を各動物に注射した。注射群は以下で構成されるものとした：
１−Ｓ．ティフィムリウム（Typhimurium）（ＳＧＳＶ１４１２及びＳＧＳＣ４９０４
）、Ｓ．エンテリティディス（ＳＧＳＣ４９０１、ＳＧＳＣ３８２０）、
２−Ｓ．ニューポート（Newport）（ＳＧＳＣ４９１０）、Ｓ．ジャヴィアナ（Javiana）（ＳＧＳＣ４９１７）、Ｓ．ゼンフテンベルク（Senftenberg）（ＳＧＳＣ２５１６）
、Ｓ．ハイデルベルグ（Heidelberg）（ＳＧＳＣ４９６６）、及び、
３−Ｓ．ハダル（Hadar）（ＳＧＳＣ４９０６）、Ｓ．ケンタッキー（Kentucky）（Ｓ
ＧＳＣ４９１４）、Ｓ．インファンティス（Infantis）（ＳＧＳＣ４９０５）、Ｓ．セントポール（SaintPaul）（ＳＧＳＣ４９２０）。
【００７１】
注射用抗原を作製するため、サルモネラをＬＢ寒天プレート上で培養した。細菌を完全に殺傷するため、およそ１×１０９個の細胞を６５℃にて３０分間に亘り熱処理した。各注射のため、全容量０．４ｍｌ中４つの異なる株の均等な混合物とともに、合計４×１０９個の殺傷した細胞を使用した。内容物を等容量のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（商標）（Sigma（商標））と混合した。注射を１日目、１５日目、２２日目、２９日目、及び３６日目
に行った。プレート上に固定化されたＳ．ティフィムリウムに由来する商業的に入手可能な精製フラジェリン、又は全細菌細胞に対する特異的結合についてアルパカ血清を分析した。簡潔には、マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレート）（ニューヨーク州ロチェスターのNalge Nunc International（商標））をＰＢＳ中５μｇ／ｍｌのフラジェリン抗原により、４℃にて一晩被覆した。ウェルを濯ぎ、２００μｌの５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、又は１％カゼインでブロックした。血清の種々の希釈液を添加し、１．５時間に亘って室温でインキュベートした。ウェルをＰＢＳＴ（０．０５％体積／体積のＴｗｅｅｎ−２０（商標））で洗浄し、ヤギ抗ラマＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＰＢＳ中１：１０００）（テキサス州モンゴメリーのBethyl Laboratories（商標））とともに
インキュベートした後、ウサギ抗ヤギＨＲＰ（ＰＢＳ中１：５０００）（テキサス州モンゴメリーのBethyl Laboratories（商標））とともにインキュベートした。１００μｌ／
ウェルのＴＭＢペルオキシダーゼ基質を添加することによりシグナルを検出した（米国メリーランド州ゲイザースバーグのKirkegaard and Perry Laboratories（商標））。１０
０の１Ｍリン酸を添加して反応を停止し、Bio-Rad（商標）のＥＬＩＳＡプレートリーダ
ーを使用してＡ４５０を測定した。
【００７２】
実施例２
ファージディスプレイライブラリーの構築
過免疫化したアルパカのＶＨＨライブラリーを実施例１で免疫化した動物のリンパ球から単離したＲＮＡに基づいて構築した。
【００７３】
標準的なプロトコル（Arbabi Ghahroudi et al., 2009）を使用してファージディスプ
レイライブラリーを構築した。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）チューブ（ノルウェー国オスローのAxis-Shield（商標））を使用して血液からリンパ球を収集した。ＲＮＡｚｏｌ
（商標）キット（カナダ国オンタリオ州バーリントンのBioshop（商標））を使用して、
免疫化後３６日目に収集したおよそ１×１０７個のリンパ球からトータルＲＮＡを単離した。製造業者の推奨に従って鋳型として６μｇのトータルＲＮＡを使用するＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ（商標）ｃＤＮＡ合成キット（カナダ国オンタリオ州バーリントンのInvitrogen（商標））によるオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて第１鎖ｃＤＮＡを合成した。可変ドメインのＤＮＡ及び定常ドメインの一部のＤＮＡ
を、オリゴヌクレオチドＭＪ１−３（センス）、並びに２つのＣＨ２ドメインのアンチセンスプライマーであるＣＨ２及びＣＨ２ｂ３（プライマー配列については、Arbabi Ghahroudi et al., 2009、Baral et al. 2013を参照されたい）を使用して増幅し、重鎖フラグメント（長さ５５０ｂｐ〜６５０ｂｐ）をＥ．Ｚ．Ｎ．Ａ．（商標）Ｃｙｃｌｅ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ精製キット（米国ジョージア州ノークロスのOmega Bio-tek（商標））を使用
して精製した。重鎖抗体の可変領域（ＩｇＧ２及びＩｇＧ３）を、ＭＪ７プライマー及びＬＰ６−ＭＪ８プライマーを使用する２回目のＰＣＲ反応で再増幅した（プライマー配列についてはBaral et al. 2013を参照されたい）。増幅したＰＣＲ産物を、Ｃｙｃｌｅ  
Ｐｕｒｅ  Ｋｉｔ（商標）（Omega Bio-tek（商標））で精製し、ＳｆｉＩ（カナダ国オ
ンタリオ州トロントのThermoscientific（商標））で消化し、同じキットを使用して再精製した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ系及びそのプロトコル（米国ウィスコンシン州マディソンのPromega（商標））を使用して、１２マイクログラムの消化したＶＨＨフラグメントを
４０μｇ（それぞれ、モル比１：３）のＳｆｉ消化ｐＡＤＬ−２３ｃファージミドベクター（米国カリフォルニア州サンディエゴのAntibody Design Labs（商標））とライゲーションし、先に記載されるように（Arbabi Ghahroudi et al., 2009）、商用のエレクトロ
コンピテントＴＧ１  Ｅ．コリ細胞（米国ウィスコンシン州ミドルトンのLucigen（商標
）Corporation）に形質転換し、７．８×１０８個のライブラリーサイズの形質転換体を
得た。５０個のコロニーに由来するＶＨＨフラグメントをライブラリーの複雑性を分析するためＰＣＲ増幅し、配列決定したところ、全てのクローンは、予想されたサイズの挿入物を有し、該クローンがコードするＶＨＨフラグメントの配列によって決定されるＣＤＲ領域において互いに異なっていた。ライブラリーを２×ＹＴ／炭化水素−グルコース（１％重量／体積）培地中において３７℃、２５０ｒｐｍで３時間〜４時間増殖させた。先に記載されるように（Arbabi Ghahroudi et al., 2009）、細菌細胞をペレット化し、同じ
培地中に再懸濁して−８０℃でグリセロールストックとして保存した。
【００７４】
実施例３
サルモネラに結合するＶＨＨを選択するためのファージディスプレイライブラリーのスクリーニング
熱不活性化したサルモネラ菌全体、又は精製サルモネラフラジェリンタンパク質（ｆｌｉＣ遺伝子によってコードされる鞭毛の主要構成要素）のいずれかを標的として使用する逐次戦略によって、ライブラリースクリーニング（パニング）を行った。サルモネラ全体に対するパニングのため、４つの異なる株に由来する細菌細胞を均等に混合し、ＰＢＳ溶液を使用してＯＤを１に調整した。該細菌混合物を、６５℃で３０分間不活性化し、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｂ（商標）プレート上に被覆させた。フラジェリンタンパク質（Sigma（商標）、カタログ番号ＳＲＰ８０２９から購入したサルモネラ・ティフィムリウム
由来のフラジェリン）に対してパニングを行うため、フラジェリン溶液（５μｇ／ｍｌ、ＰＢＳ溶液に溶解）を９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレート上に被覆させた。各パニングについて、ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液（ＰＢＳ溶液に溶解した０．５％ＢＳＡ）も、予備スクリーニング対照と同じ９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレートに被覆した。その後、被覆したプレートを４℃で一晩インキュベートした。次の日、被覆したウェルをＰＢＳで１回濯ぎ、３７℃で２時間に亘ってＢＳＡ−ＰＢＳ溶液でブロックした。およそ２×１０１２個のファージ粒子がＢＳＡ−ＰＢＳウェルに最初に添加されるように、サルモネラファージライブラリーをＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を使用して希釈し、３７℃で１時間維持した後、サルモネラの細胞全体又はフラジェリンのウェルへ上清を移した。ファージ粒子をサルモネラ細胞全体又はフラジェリンのウェルで３７℃にて２時間インキュベートした後、０．１％体積／体積Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳＴで５回洗浄した。結合したファージを０．１Ｍトリエチルアミンで溶出し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．４）で中和して、１０ｍｌの２ＹＴ培地中、指数関数的に成長するＴＧ１細胞とともにインキュベートした。３７℃で３０分間のインキュベーションの後、細胞を更に３０分間に亘って１０１１個のＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（ニューイングランドのBiolabs（商標））
で重複感染させた。２つの抗生物質、アンピシリン（１００μｇ／Ｌ）及びカナマイシン（２５μｇ／Ｌ）をＴＧ１培養培地に添加した。３７℃で１６時間インキュベーションを継続した後、ファージ感染ＴＧ１細胞を選択した。パニングの３日目には、培養液上清中の増幅されたファージ粒子を、先に記載されるように（Arbabi-Ghahroudi et al., 2009
）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で沈澱させた。簡潔には、１０ｍｌのファージ感染ＴＧ１培養物を４℃、４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離にかけ、上清を０．２２μｍフィルタで濾過し、１時間に亘って氷上で１／５容量のＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％ＰＥＧ、２．５Ｍ  ＮａＣｌ）と混合した。ファージを４℃、４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離によってペレット化した。最後に、富化ファージプールを２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、次巡のパニングに対して準備した。２巡目、３巡目、及び４巡目のパニングではＰＢＳＴによる洗浄を７回、１０回及び１２回にそれぞれ増やしたこと以外は同じ条件に従って、パニングを更に３巡継続した。４巡目のパニングの後、９６個の無作為に選択したコロニーを増殖し、ファージＥＬＩＳＡスクリーニングにかけた。
【００７５】
実施例４
単量体ＶＨＨの発現及び精製
実施例３で同定されたフラジェリン又はサルモネラ細胞全体に対するＶＨＨを、ＢｂｓＩ１−ＶＨＨフォワードプライマー（５’−ＴＡＴＧＡＡＧＡＣＡＣＣＡＧＧＣＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＴＣＴ−３’）（配列番号５９）及びＢａｍＨＩ−ＶＨＨリバースプライマー（５’−ＴＴＧＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＧ−３’）（配列番号６０）によりｐＡＤＬ２３ファージミドベクターからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲフラグメントをＢｂｓＩ及びＢａｍＨＩの制限酵素で消化し、同様に消化したｐＳＪＦ２発現ベクターにライゲーションした（Arbabi-Ghahroudi et al., 2009
）。ライゲーションに際して、全てのプラスミドをエレクトロコンピテントＥ．コリ（ＴＧ１株）に形質転換し、カルベニシリンを含むＬＢ寒天プレート上で選択した。挿入物に対するコロニーＰＣＲによってコロニーをスクリーニングし、ＤＮＡを配列決定した。配列を整列させ、各々１以上のクローンによって示され、各々同じアミノ酸配列を示す、１８個の異なるグループ分け又はクラスに分類した（表１）。単一クローンを各クラスから無作為に選択した。１８個の選択されたＶＨＨの核酸配列及びアミノ酸配列を図１に示す。各ポリペプチド配列内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３に下線を引いた。表２に示されるように、ＣＤＲ領域における配列類似性に基づいて１８個のＶＨＨ配列を５つの異なるグループに入れることができる。
【００７６】
ＶＨＨはいずれも、ＩＭＧＴ命番方式（Lefranc, et al. 2003）による４２位（Ｆ／Ｙ）、４９位（Ｅ／Ｑ／Ａ）、５０位（Ｒ）及び５２位（Ｆ／Ｖ／Ｇ／Ｌ）（Muyldermans,
et al. 1994）にラクダ科ＶＨＨに見られる標準的なアミノ酸残基を有する。加えて、これらのＶＨＨ中のＣＤＲ３ドメインは、一般にヒトＶＨタンパク質中のＣＤＲ３ドメインより大きい。例えば、グループ１  ＶＨＨのＣＤＲ３ドメインは、２０残基のサイズである（表２）。
【００７７】
１８個のＶＨＨの全ポリペプチド配列を使用する分析は、これらのＶＨＨを２つのより大きなグループ分けに分類することができることを明らかにする（図２）。第１のグループ分けは、１Ｅ０５、１Ｅ０３、１Ｈ０７、４Ｄ０１、０Ｄ１２、１Ａ０７、１Ｂ０８、０Ａ０７、０Ｈ１２及び０Ａ０８を含み、第２のグループ分けは、４Ｅ０８、４Ｆ１２、１Ｅ０８、３Ｂ０４、２Ａ０９、１Ｇ０６、０Ａ０９及び４Ｃ１０を含む。
【００７８】
ＶＨＨ抗体は、標準的なペリプラズム発現法（Arbabi-Ghahroudi et al., 2009）を使
用して発現された。Ｅ．コリ発現法を使用して発現が達成されなかったため、ＶＨＨ抗体１Ｅ０３はＰ．パストリスで発現させた。タンパク質発現の誘導の後、細胞培養物を６０００ｒｐｍ×３０分間（４℃）で採取し、上清をデカントし、細胞ペレットからペリプラ
ズム内容物を抽出した。簡潔には、単量体ＶＨＨのペレットを２０ｍｌの氷冷ＴＥＳ（０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２０％（重量／体積）スクロース、０．５ｍＭ
ＥＤＴＡ）に再懸濁し、３０分間氷上でインキュベートした。次に、３０ｍｌの氷冷１／８  ＴＥＳ（ｄＨ２Ｏに希釈）を添加して、氷上で更に３０分間インキュベートし、スラリーを９０００ｒｐｍで３０分間（４℃）遠心分離にかけた。ＶＨＨを含む得られた上清をＰＢＳに対して一晩透析し、製造業者の指示に従って、５００ｍＭイミダゾールを含むホスフェート系溶離バッファーを用いてBioRad（商標）製のＰｒｏｆｉｎｉｔｙ（商標）ＩＭＡＣ樹脂を使用して精製した。
【００７９】
精製されたタンパク質画分をプールし、ＰＢＳに対して透析した。溶出した画分を、ＰＢＳへと透析する前にＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングによって分析した。図３は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（商標）Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｇ２５０で染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のＶＨＨポリペプチドの例を示す。矢印は、ポリペプチドの位置を指す。ポリペプチドのサイズは約２４ｋＤである。予想サイズは、約１５ｋＤである。不一致は、ＶＨＨに連結した３つのタグ（ｃ−ｍｙｃ、ＡｖｉＴａｇ（商標）及びＨｉｓ６）に起因するものである。
【００８０】
Pace et al., 1995に従ってＥｘＰＡＳｙ  ＰｒｏｔＰａｒａｍ（商標）Ｔｏｏｌ（expasy.org/tools/protparam.html）で計算した理論分子量及び吸光係数を使用する、２８０ｎｍでの吸光度測定によってＶＨＨ濃度を決定した。精製した単量体ＶＨＨの収率は、細菌培養物１Ｌに対して１ｍｇ〜２０ｍｇの範囲であった。
【００８１】
実施例５
ＶＨＨ結合アッセイ
マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレート）（ニューヨーク州ロチェスターのNalge Nunc international（商標））を、２．５μｇ／ｍｌのフラジェリン（Sigma-Aldrich（商標）ＳＲＰ８０２９）、及び１４の異なる熱不活性化した（６５℃
で３０分間）サルモネラ・エンテリカ血清型全細胞を用いて４℃にて一晩被覆した。フラジェリン及び４つのＳ．エンテリカ株の結合を実施例１に記載する。ウェルをＰＢＳ  ｐＨ７．４で濯ぎ、１時間に亘って２００μｌのＢＳＡ−ＰＢＳ溶液でブロックした。実施例１に記載されるように２０個の異なるＶＨＨ含有ファージを作製し、フラジェリン又は１４の異なるサルモネラ株に対するそれらの結合能を試験するためにそれらを使用した。２ＹＴ培地上清（１００μＬ）中のファージをブロックした被覆マイクロタイタープレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴ溶液で洗浄し、ＨＲＰ複合化抗Ｍ１３モノクローナル抗体（ＰＢＳＴ中１：５０００）（Sigma-Aldrich（商標
）ＧＥ２７−９４２１−０１）とともに室温で３０分間インキュベートした。ウェルを再度洗浄し、５０μｌ／ウェルのＴＭＢペルオキシダーゼ基質（米国、メリーランド州ゲイザースバーグのKirkegaard and Perry Laboratories（商標））を使用してシグナルを検
出した。反応を、５０μｌ／ウェルの１Ｍ塩酸を添加することにより停止し、Ａ４５０をＣｙｔａｔｉｏｎ（商標）５（Biotek（商標））マルチモードリーダを使用して測定した。図４に示されるように、多くのＶＨＨは、１以上のサルモネラフラジェリン、及び／又はサルモネラ血清型全細胞に対して結合することが特定された。例えば、ロバストな結合は、試験した全ての不活性化されたＳ．ハダル株及びＳ．ハイデルベルグ株に対するＶＨＨ１Ｅ０５について観察された。このアッセイは、ＶＨＨの標的結合の定性的又は半定量的な評価のみを提供する。さらに、上記アッセイが被覆されたプレート上での抗原の提示によって、また特定のＶＨＨを示すファージの増殖速度の変動によって制限されることから、このアッセイに従って結合することが示されなかったＶＨＨについて結合を無視することはできない。
【００８２】
実施例６
サルモネラ運動性アッセイ
先に記載されるように（Kalmokoff et al., 2006）運動性アッセイを行った。２μｇ／μｌの最終濃度のＶＨＨを、０．３５％寒天を含むミューラー−ヒントン（商標）液体培地にサルモネラ株４９０４（１×１０７）とともに蒔き、１８時間に亘って微好気性条件（５％Ｏ２、１０％ＣＯ２、及び８５％Ｎ２）下、３７℃でインキュベートした。細菌の運動性し、プレート上で成長する細菌によって作られた円の直径を測定することにより決定した。結果を図５に示す。ＶＨＨ  １Ｅ０８が細菌の運動性を著しく阻害したことがわかった。
【００８３】
実施例７
細胞増殖アッセイ
およそ１×１０７個のサルモネラ（株名：４９０４）細胞を、９６ウェルプレート中、０．２μｇ／μｌのＶＨＨを含む１００μｌのミューラー−ヒントン（商標）液体培地でインキュベートし、１８時間に亘って微好気性条件（５％Ｏ２、１０％ＣＯ２、及び８５％Ｎ２）下、３７℃でインキュベートした。６００ｎｍの波長での光学密度を測定することによって細菌増殖速度を特定した（図６）。運動性アッセイの結果と同様、ＶＨＨ  １Ｅ０８は、サルモネラ細胞の増殖を著しく阻害したことがわかった。
【００８４】
実施例８
ＨｅＬａ細胞におけるサルモネラ内部移行アッセイ
目的：上皮細胞のサルモネラコロニー形成を妨げる抗サルモネラＶＨＨドメインの同定。消化管にコロニーを形成するために、サルモネラは、表面に付着し、そこで細胞内複製を経る、宿主上皮細胞に入り込まなければならない。理論によって限定されることを望むものではないが、このプロセスを妨げるＶＨＨは、細菌の付着を予防し、及び／又は付着を許すが宿主細胞への侵入を阻むと予想される。
【００８５】
アッセイの概要：種々のＶＨＨの不在下又は存在下でＧＦＰ発現サルモネラを用いて、ＨｅＬａ上皮細胞にチャレンジを行った（challenged：に抗原を投与した）。サルモネラを細胞に付着させて細胞に入り込ませた後、結合していない細菌を除去する。付着したが内部移行しなかったサルモネラを、上皮細胞に浸透しない抗生物質であるゲンタマイシンによって排除する。その後、サルモネラの細胞内の増殖を、経時的なＧＦＰ蛍光の増加を定量する蛍光プレートリーダーの使用により追跡する。
【００８６】
方法：ＨｅＬａ細胞を、５００μｌ／ウェルのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを含む２４ウェルプレート中で増殖させ、５％ＣＯ２の存在下で３７℃にて２４時間インキュベートした（８０％〜１００％コンフルエンス）。ＧＦＰで形質転換させたサルモネラ・エンテリカ血清型ハダル５６４３を同じ日（終夜培養による）におよそ０．５のＯＤまで増殖させた。培養物を遠心分離にかけ（５分間、５０００ｒｐｍ）、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭに再懸濁し、細菌を穏やかに混合しながら、３７℃にて３０分間、種々の濃度のＶＨＨとともに予備インキュベートした。感染に先立って、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。サルモネラ及びＶＨＨをＨｅＬａ細胞に添加した（ＭＯＩ：ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ５００μｌ／ウェル中１００）。プレートを５％ＣＯ２中、３７℃で１時間インキュベートした。感染の１時間後（ＧＥＮＴＡ前試料−図７）、非接着性細菌を除去するため細胞をＰＢＳで３回洗浄した。ＨｅＬａ細胞を透過処理して溶解するため、１ｍｌの１％サポニンを添加した。上記プレートを５％ＣＯ２中、３７℃で１５分間インキュベートした。細菌を上下に勢いよくピペット操作することにより（１ウェル当たりおよそ１０回）再懸濁した。段階希釈液をＬＢ寒天プレートに蒔いた。生存可能な細胞内の細菌を定量するため、上記プレートを３７℃で一晩インキュベートした。１０％ＦＢＳ＋ゲンタマイシン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭを残りのプレートに添加した。感染の１時間後（ＧＥＮＴＡ後試料−図７）、非接着性細菌を除去するため細胞をＰＢＳで３回洗浄した。ＨｅＬａ細
胞を透過処理して溶解するため、１ｍｌの１％サポニンを添加した。プレートを５％ＣＯ２中、３７℃で１５分間インキュベートした。細菌を上下に勢いよくピペット操作することにより（１ウェル当たりおよそ１０回）再懸濁した。段階希釈液をＬＢ寒天プレートに蒔いた。生存可能な細胞内の細菌を定量するため、上記プレートを３７℃で一晩インキュベートした。１０％ＦＢＳ＋ゲンタマイシン（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭを残りのプレートに添加し、５％ＣＯ２中、３７℃で２４時間インキュベートした。全てのアッセイを二重に行った。
【００８７】
結果：コロニー数及びＧＦＰ発現の蛍光定量化の両方に基づき、ＶＨＨ  ０Ａ０７は、細胞内Ｓ．エンテリカ株ハダル５６４３の増殖の最も高い阻害を示した（図７）。
【００８８】
実施例９
ニワトリ回腸及び空腸培養物におけるサルモネラ内部移行アッセイ
目的：ニワトリ成体の腸のサルモネラコロニー形成を妨げる抗サルモネラＶＨＨの同定。ヒヨコ消化管にコロニー形成するために、サルモネラは表面に付着し、そこで細胞内複製を経る、宿主の上皮細胞に入り込まなくてはならない。理論に限定されることを望むものではないが、このプロセスを妨げるＶＨＨが、細菌の付着を予防し、及び／又は付着を許すが宿主細胞への侵入を阻むと予想される。
【００８９】
方法：１０羽（２×５）の３０日齢の非ＳＰＦニワトリから空腸及び回腸を採取した。空腸及び回腸を洗浄し、０．５ｃｍ×０．８ｃｍ片に切断した。ＶＨＨ  ０Ａ０７、０Ａ０８、１Ｅ０３、１Ｈ０７、及び０Ｈ１２をＳ．エンテリカ血清型ハダル５６４３に対して３０分間、予備結合させた。該混合物を腸切片に塗布し、３時間に亘って細菌を感染させた。ゲンタマイシンによる処理によって細胞外細菌を除去した。感染させた切片からゲノムＤＮＡを抽出し、確立されたロバストな５’ヌクレアーゼ（ＴａｑＭａｎ（商標））リアルタイムＰＣＲアッセイを使用して先に記載されるように（Malorny et al., 2004）サルモネラを検出した。
【００９０】
結果：回腸切片のＳ．エンテリカ血清型ハダル５６４３感染について、５０μｇ／ｍＬの０Ａ０７、１Ｅ０３  ＶＨＨ処理によりゲノムコピー数の７．５ｌｏｇの減少が達成された（図８）。また、ゲノムコピー数の６ｌｏｇの減少が、空腸切片の感染に対して１Ｅ０３  ＶＨＨ処理で達成された。ゲノムコピー数の４ｌｏｇの減少は、空腸切片の感染に対して１Ｈ０７  ＶＨＨで観察された。完全な抑制が５０μｇ／ｍＬまで達成されなかったため、ＭＩＣは特定されなかった。結果は、生物学的反復を表わす。
【００９１】
実施例１０
ＶＨＨによるブロイラー鶏の治療
本実施例に提示される研究の課題は、経口胃管強制投与によるサルモネラ・エンテリカのチャレンジ（challenge：抗原投与）モデルにおけるＶＨＨ  ０Ａ０７の効能を試験す
ることであった。
【００９２】
方法：動物試験及びデータ収集は、Colorado Quality Research, Inc.（コロラド州ウェ
リントン）によって行われた。市販のブロイラー鶏（品種Ｃｏｂｂ  ５００）は、Simmons Foods（商標）（アリゾナ州シロアムスプリングズ）によって供給されるものとした。
ヒヨコを約１日齢で受取り、薬物の含まれない（non-medicated）業界で平均的な食餌を
与えた。鳥を環境が管理された施設内のコンクリート床の囲いに収容した。全ての鳥を、床敷として清潔な松の削りクズを含む清潔な囲いに入れた。照明は白熱光により、また商業上の照明プログラムを使用した。水及び飼料は、研究の全体に亘って自由に供給された。総合的な群の条件、照明、水、飼料及び換気について少なくとも毎日２回、試験施設、囲い及び鳥を観察した。受取の際、及び収容（placement）に先立って、全ての鳥に独自
に番号を付与した個体識別タグを用いて、首の後ろにタグ付けをした。全ての鳥の臨床観察を、毎日１回行った。これらの観察は、体重及び飼料摂取の測定を含むものとした。
【００９３】
研究のため、６０羽の１日齢のヒヨコを２つの治療群、すなわち各群３０羽の鳥で構成される、Ａ群又はＢ群の１つに無作為に割り付けた。Ａ群は対照群であり、この群に含まれる鳥には形質転換されていない不活性化Ｅ．コリ細胞が施された。対照的に、Ｂ群の鳥には、ＶＨＨ  ０Ａ０７を発現する不活性化Ｅ．コリが施された。
【００９４】
到着に際して、ヒヨコをタグ付けし、無作為化し、計量し、６つの囲い（２ブロックの３つの囲い；１つの囲い当たり１０羽の鳥）に入れた。翌朝、経口胃管強制投与によって鳥にチャレンジを行った。具体的には、鳥に１．０×１０８ＣＦＵ／鳥の濃度で０．５ｍｌのＳ．エンテリカを用いて胃管強制投与を行った。その後、チャレンジ胃管強制投与の１時間後、２４時間後、及び４８時間後に、経口胃管強制投与によって治療を３回施した。Ａ群の鳥に不活性化Ｅ．コリを用いて胃管強制投与を行い、Ｂ群にはＶＨＨ  ０Ａ０７を発現する不活性化Ｅ．コリを用いて行った（鳥１羽当たり１投与量当たり１０００μｌのｄＨ２Ｏ中１．５ｍｇ）。７０時間で鳥を計量し、安楽死させた。
【００９５】
微生物学的アッセイのため安楽死させた鳥から直ちに組織試料を収集した。空腸及び回腸の材料を、１羽の鳥当たり１つの試料へと合成した。微生物学的アッセイのため、収集した試料を保冷剤上に置いてMicrobial Research Inc.（コロラド州フォートコリンズ）
に送った。
【００９６】
結果：ＶＨＨ  ０Ａ０７の投与は、ヒヨコの空腸及び回腸中のサルモネラ・エンテリカ血清型ハダル５６４３のレベルを、０．７ｌｏｇ１０（ｐ＝０．０２９）分著しく減少させた（図９）。対照群Ａ（ＶＨＨ  ０Ａ０７を発現しない）中のサルモネラによる負荷の幾何平均及び中央値は、それぞれ２．２×１０４及び３．１×１０４であった。Ｂ群（ＶＨＨ  ０Ａ０７を発現する）中のサルモネラによる負荷の幾何平均及び中央値は、それぞれ５．２×１０３及び１．２×１０４であった。
【００９７】
表
【００９８】
【表１】
2020120667.tif 000003
【００９９】
【表２】
2020120667.tif 000004
【０１００】
特許請求の範囲は、実施例に提示される好ましい実施形態によって限定されるべきではないが、全体として上記発明の詳細な説明と一致するより広い解釈が与えられるものとする。
【０１０１】
【表３】
2020120667.tif 000005
2020120667.tif 000006
【図１Ａ】
2020120667.tif 000007
【図１Ｂ】
2020120667.tif 000008
【図１Ｃ】
2020120667.tif 000009
【図１Ｄ】
2020120667.tif 000010
【図１Ｅ】
2020120667.tif 000011
【図１Ｆ】
2020120667.tif 000012
【図２】
2020120667.tif 000013
【図３】
2020120667.tif 000014
【図４】
2020120667.tif 000015
【図５】
2020120667.tif 000016
【図６】
2020120667.tif 000017
【図７】
2020120667.tif 000018
【図８】
2020120667.tif 000019
【図９】
2020120667.tif 000020
【配列表】
2020120667000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月28日(2020.4.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＧＲＸ１ＦＳＸ２ＫＰ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１と、
（ｉｉ）ＡＳＸ３ＴＧＶＳＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）ＡＧＴＸ４ＲＴＬＷＧＳＫＷＲＤＸ５Ｘ６ＥＹＥＹ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、
（ここで、Ｘ１はＴ又はＳであり、Ｘ２はＶ又はＫであり、Ｘ３はＦ又はＹであり、Ｘ４はＴ又はＬであり、Ｘ５はＶ又はＲであり、Ｘ６はＬ又はＲである）を含む、サルモネラに結合する単離された抗体又は抗体フラグメント。
【請求項２】
ペプシン、トリプシン、及びキモトリプシンからなる群から選択される１以上の消化酵素に対する寛容について改変された、請求項１に記載の抗体又は抗体フラグメント。
【請求項３】
検出可能な標識を更に含む、請求項１又は２に記載の抗体又は抗体フラグメント。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸分子。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントを含む、バクテリオファージ。
【請求項７】
請求項４に記載の核酸分子を含む、バクテリオファージ。
【請求項８】
動物又は動物環境においてサルモネラの存在を減少させる方法であって、該動物に請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントを投与することを含み、該動物は非ヒトである、方法。
【請求項９】
前記動物に抗生物質、バクテリオシン、又はサルモネラに対して有効な他の植物若しくは動物に由来する化合物を投与することを更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記動物に、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントとともに、任意にプロバイオティクス系に同時発現又は同時含有される、競合細菌を投与することを更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体又は抗体フラグメントが前記動物に経口投与される、請求項８〜１０いずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記動物がニワトリである、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ニワトリが産卵用の雌鶏又はブロイラー鶏である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記動物環境が養鶏場である、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
動物環境へのサルモネラの導入を減少又は予防する方法であって、新入動物を該動物環境に導入する前に、該新入動物に請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントを投与することを含む、方法。
【請求項１６】
サルモネラに感染した非ヒト被験体を治療する方法であって、該被験体に請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントを投与することを含む、方法。
【請求項１７】
前記被験体にサルモネラに対して有効な抗生物質を投与することを更に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記被験体が、ニワトリ、ウシ、又はヒツジからなる群から選択される家畜動物である、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントと、
薬学的に許容可能な賦形剤と、
を含む、サルモネラ感染症を治療するのに使用される製剤。
【請求項２０】
サルモネラ感染症の治療を必要とする被験体においてサルモネラ感染症を治療するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントの使用。
【請求項２１】
試料中のサルモネラを検出する方法であって、
該試料と、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントとを接触させることと、
結合した抗体又は抗体フラグメントの存在を検出することと、
を含む、方法。
【請求項２２】
前記試料が体液又は糞便物質を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記試料が食品又は食品からの表面スワブを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントと、
サルモネラの検出における使用に関する指示書と、
を備える、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項２５】
サルモネラ感染症の治療を必要とする被験体においてサルモネラ感染症を治療するための医薬品を作製するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントの使用。
【外国語明細書】
2020120667000001.pdf
2020120667000002.pdf
2020120667000003.pdf
2020120667000004.pdf