(57)【要約】【課題】重症熱性血小板減少症候群(SFTS)ウイルスを高感度且つ迅速に検出できる方法を提供することを目的とする。【解決手段】SFTSウイルスに特異的な塩基配列と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、LAMP法によりSFTSウイルスに特異的な塩基配列を増幅することを含む、SFTSウイルスの検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)〜(d)のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含む、重症熱性血小板減少症候群（SFTS）ウイルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセット。
(a) 5'-CCTCCTCAGGAAGCATCTG-3'(配列番号１)
(b) 5'-TCCTCTTTGTTCTTGTAGTACCC-3'(配列番号２)
(c) 5'-CATTCTACCCTCCCCTCTCTATGCATGGTGCGAATTG-3'(配列番号３)
(d) 5'-GGGAGGAACATTTCATGCGCAGCTGTTGACCATATTCTC-3'(配列番号４)
【請求項２】
以下の(e)及び/又は(f)のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、請求項１記載のプライマーセット。
(e) 5'-GATTAGGCTGAATGGCTGAC-3'(配列番号５)
(f) 5'-CTCAGGCCGGTCCAC-3'(配列番号６)
【請求項３】
以下の(g)〜(j)のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含む、SFTSウイルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセット。
(g) 5'-AGGGAAGTCTCATGGATGG-3'(配列番号７)
(h) 5'-ATCCACCACCCCATTG-3'(配列番号８)
(i) 5'-GGAGGCTGGATGTAAAGTGCGGGCGAACTTACATAAAGACAG-3'(配列番号９)
(j) 5'-CTCTTGTGTTCAGAGCTTTTACAAGCTTTCCCCCATGTATCC-3'(配列番号１０)
【請求項４】
以下の(k)及び/又は(l)のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、請求項３記載のプライマーセット。
(k) 5'-CCCTGCATCATTCCTGTC-3'(配列番号１１)
(l) 5'-CTTATTTCGTCTCAAAGCTTAAGG-3'(配列番号１２)
【請求項５】
以下の(m)〜(p)のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含む、SFTSウイルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセット。
(m) 5'-GATGGAGATGGGACTAGCAAC-3'(配列番号１３)
(n) 5'-CTTGATCTTGAAYCCACTCAG-3'(配列番号１４)
(o) 5'-CTYCGGATSGATTCAATGACTGGCTTGAGGAGATCAGG-3'(配列番号１５)
(p) 5'-GTGAYGACCTTGGGATCACCTAACCATGCAATGACCTC-3'(配列番号１６)
【請求項６】
以下の(q)及び/又は(r)のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、請求項５記載のプライマーセット。
(q) 5'-CATAAAGCCTGGCATCACTAC-3'(配列番号１７)
(r) 5'-YAACAGGGTRGCATCTGC-3'(配列番号１８)
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載のプライマーセットを含む、SFTSウイルス検出又はSFTSウイルス感染症診断用キット。
【請求項８】
蛍光標識プローブをさらに含む、請求項７記載のキット。
【請求項９】
請求項１又は２記載のプライマーセットを含み、蛍光標識プローブが以下の(aa)及び/又は（bb）のオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブである、請求項８記載のキット。
(aa) 5'-GGATTAGGCTGAATGGCTGAGAAGC-3'(配列番号１９)
(bb) 5'-GGATTAGGCTGAATGGCTGAGAAIC-3'(配列番号２０)
【請求項１０】
請求項３又は４記載のプライマーセットを含み、蛍光標識プローブが以下の(cc)のオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブである、請求項８記載のキット。
(cc) 5'-CAATATGCCCTGCATCATTCCTGTC-3'(配列番号２１)
【請求項１１】
請求項５又は６記載のプライマーセットを含み、蛍光標識プローブが以下の(dd)〜(gg)のいずれか1つのオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブである、請求項８記載のキット。
(dd) 5'-CATAAAGCCTGGCATCACTACTGAGCC-3'(配列番号２２)
(ee) 5'-TAACAGGGTGGCATCTGCATATAGAGGTC-3'(配列番号２３)
(ff) 5'-GGATCCAATAACAGGGTGGCATCTGC-3'(配列番号２４)
(gg) 5'-GGATCCAATAACAGGGTGGCATCTIC-3'(配列番号２５)
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項記載のプライマーセット又は請求項７〜１１のいずれか１項記載のキットを用いて、SFTSウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行う工程を含む、SFTSウイルスの検出方法。
【請求項１３】
SFTSウイルスの標的核酸領域の増幅反応がLAMP法による請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか１項記載のプライマーセット又は請求項７〜１１のいずれか１項記載のキットを用いて、SFTSウイルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、SFTSウイルス感染の有無を検査する工程を含む、SFTSウイルス感染症の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、重症熱性血小板減少症候群(severe fever with thrombocytopenia syndrome：SFTS；以下、「SFTS」と称する)ウイルスの検出方法に関し、さらに詳しくは遺伝子の、高感度且つ迅速な検出法を利用したSFTSウイルス感染症の診断方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
国立感染症研究所(日本)が公表する情報によれば、SFTSは、2011年に中国の研究者等によって発表されたブニヤウイルス科フレボウイルス属に分類される新しいウイルスによるダニ媒介性感染症である。
【０００３】
SFTSウイルスに感染すると、6日〜2週間の潜伏期を経て、発熱、消化器症状(食欲低下、嘔気、嘔吐、下痢、腹痛)を生じ、その他には頭痛、筋肉痛、意識障害や失語等の神経症状、リンパ節腫脹、皮下出血や下血等の出血症状等を起こす。
【０００４】
また、SFTSウイルスに感染すると、白血球減少、血小板減少、AST・ALT・LDHの血清逸脱酵素の上昇が多くの症例で認められ、血清フェリチンの上昇や骨髄での血球貪食像も認められることがある。さらに、致死率は6.3〜30％と報告されている。
【０００５】
SFTSウイルスの感染経路は主にマダニ(フタトゲチマダニ等)を介したものであるが、血液等の患者体液との接触によりヒトからヒトへの感染も報告されている。
【０００６】
従来において、SFTSの治療は対症的な方法しかなく、有効な薬剤やワクチンが存在しない。従って、SFTSに対するワクチンや効率的なSFTSウイルスの検出方法の開発が望まれている。
【０００７】
一方、特許文献１〜４は、SFTSウイルスを検出する方法を開示する。特許文献４は、LAMP法によりSFTSウイルスを構成するS、M、およびLの各セグメントを増幅して検出しているが、各セグメントを単独で増幅した場合には感度や特異性が十分ではなく、３つのセグメントをすべて増幅する方法が好ましいと記載されている。LAMP法は他の核酸増幅法と比較して感度や特異性が優れた方法であるが、特許文献４はLAMP法の特徴を十分に生かしているとは言えず、感度や特異性がより向上したSFTSウイルスの検出方法が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】中国特許第102070704号明細書
【特許文献２】中国特許出願公開第105296674号明細書
【特許文献３】中国特許出願公開第106191307号明細書
【特許文献４】中国特許第102618669号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上述の実情に鑑み、SFTSウイルスを高感度且つ迅速に検出できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、SFTSウイルスに特異的な塩基配列と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、LAMP(Loop-mediated Isothermal Amplification)法によりSFTSウイルスに特異的な塩基配列を増幅することで、SFTSウイルスを高感度且つ迅速に検出できることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下を包含する。
（１）以下の(a)〜(d)のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含む、SFTSウイルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセット。
(a) 5'-CCTCCTCAGGAAGCATCTG-3'(配列番号１)
(b) 5'-TCCTCTTTGTTCTTGTAGTACCC-3'(配列番号２)
(c) 5'-CATTCTACCCTCCCCTCTCTATGCATGGTGCGAATTG-3'(配列番号３)
(d) 5'-GGGAGGAACATTTCATGCGCAGCTGTTGACCATATTCTC-3'(配列番号４)
（２）以下の(e)及び/又は(f)のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、（１）記載のプライマーセット。
(e) 5'-GATTAGGCTGAATGGCTGAC-3'(配列番号５)
(f) 5'-CTCAGGCCGGTCCAC-3'(配列番号６)
（３）以下の(g)〜(j)のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含む、SFTSウイルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセット。
(g) 5'-AGGGAAGTCTCATGGATGG-3'(配列番号７)
(h) 5'-ATCCACCACCCCATTG-3'(配列番号８)
(i) 5'-GGAGGCTGGATGTAAAGTGCGGGCGAACTTACATAAAGACAG-3'(配列番号９)
(j) 5'-CTCTTGTGTTCAGAGCTTTTACAAGCTTTCCCCCATGTATCC-3'(配列番号１０)
（４）以下の(k)及び/又は(l)のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、（３）記載のプライマーセット。
(k) 5'-CCCTGCATCATTCCTGTC-3'(配列番号１１)
(l) 5'-CTTATTTCGTCTCAAAGCTTAAGG-3'(配列番号１２)
（５）以下の(m)〜(p)のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含む、SFTSウイルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセット。
(m) 5'-GATGGAGATGGGACTAGCAAC-3'(配列番号１３)
(n) 5'-CTTGATCTTGAAYCCACTCAG-3'(配列番号１４)
(o) 5'-CTYCGGATSGATTCAATGACTGGCTTGAGGAGATCAGG-3'(配列番号１５)
(p) 5'-GTGAYGACCTTGGGATCACCTAACCATGCAATGACCTC-3'(配列番号１６)
（６）以下の(q)及び/又は(r)のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、（５）記載のプライマーセット。
(q) 5'-CATAAAGCCTGGCATCACTAC-3'(配列番号１７)
(r) 5'-YAACAGGGTRGCATCTGC-3'(配列番号１８)
（７）（１）〜（６）のいずれか１記載のプライマーセットを含む、SFTSウイルス検出又はSFTSウイルス感染症診断用キット。
（８）蛍光標識プローブをさらに含む、（７）記載のキット。
（９）（１）又は（２）記載のプライマーセットを含み、蛍光標識プローブが以下の(aa)及び/又は（bb）のオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブである、（８）記載のキット。
(aa) 5'-GGATTAGGCTGAATGGCTGAGAAGC-3'(配列番号１９)
(bb) 5'-GGATTAGGCTGAATGGCTGAGAAIC-3'(配列番号２０)
（１０）（３）又は（４）記載のプライマーセットを含み、蛍光標識プローブが以下の(cc)のオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブである、（８）記載のキット。
(cc) 5'-CAATATGCCCTGCATCATTCCTGTC-3'(配列番号２１)
（１１）（５）又は（６）記載のプライマーセットを含み、蛍光標識プローブが以下の(dd)〜(gg)のいずれか1つのオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブである、（８）記載のキット。
(dd) 5'-CATAAAGCCTGGCATCACTACTGAGCC-3'(配列番号２２)
(ee) 5'-TAACAGGGTGGCATCTGCATATAGAGGTC-3'(配列番号２３)
(ff) 5'-GGATCCAATAACAGGGTGGCATCTGC-3'(配列番号２４)
(gg) 5'-GGATCCAATAACAGGGTGGCATCTIC-3'(配列番号２５)
（１２）（１）〜（６）のいずれか１記載のプライマーセット又は（７）〜（１１）のいずれか１記載のキットを用いて、SFTSウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行う工程を含む、SFTSウイルスの検出方法。
（１３）SFTSウイルスの標的核酸領域の増幅反応がLAMP法による、（１２）記載の方法。
（１４）（１）〜（６）のいずれか１記載のプライマーセット又は（７）〜（１１）のいずれか１記載のキットを用いて、SFTSウイルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、SFTSウイルス感染の有無を検査する工程を含む、SFTSウイルス感染症の検査方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、SFTSウイルスに特異的な塩基配列と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、LAMP法によりSFTSウイルスに特異的な塩基配列を増幅することで、SFTSウイルスを高感度且つ迅速に検出することができる。特に本発明では、他のプライマーセットを組み合わせることなく、Lセグメントの配列を増幅するプライマーセットのみで、高感度で特異性も良好なSFTSウイルス検出を実現した。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】SFTSウイルスのゲノムLセグメントにおける本発明に係るプライマーの設計位置を示す図である。
【図２】リアルタイム蛍光(インターカレーター系)測定によるSFTS virus検出用Primerを用いたLAMP反応の増幅曲線の結果を示す。
【図３】リアルタイム蛍光(probe系)測定によるSFTS virus検出用Primerを用いたLAMP反応の増幅曲線の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
本発明に係るプライマーセットは、SFTSウイルスに特異的な塩基配列と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを含む、LAMP法によりSFTSウイルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセットである。
【００１６】
本発明に係るプライマーセットによれば、被験体由来のサンプル中のSFTSウイルスを高感度且つ迅速に検出することができる。
【００１７】
本発明において使用されるサンプルとしては、SFTSウイルス感染が疑われるヒト又は他の動物の生体由来のサンプル、例えば喀痰、気管支肺胞洗浄液、鼻汁、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、うがい液、唾液、血液、血清、血漿、髄液、尿、精液および羊水等の体液、糞便、組織等が挙げられる。また、感染実験等に用いられた細胞やその培養液、あるいは生体由来の検体や培養細胞等から分離したウイルスを含む検体等もサンプルとなりうる。これらのサンプルは分離、抽出、濃縮、精製等の前処理を行っても良い。
【００１８】
本発明における核酸増幅は、納富らが開発した、PCR法で不可欠とされる温度制御が不要な核酸増幅法：LAMP法と呼ばれるループ媒介等温増幅法(国際公開第00/28082号パンフレット)で達成することができる。当該方法は、鋳型となるヌクレオチドに自身の3'末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とすると共に、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法である。また、LAMP法では、プライマーの3'末端が常にサンプルに由来する領域に対してアニールするために、塩基配列の相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能するため、その結果として、高感度に且つ特異性の高い核酸増幅反応を可能としている。
【００１９】
LAMP反応で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸の塩基配列の計6領域、すなわち3'末端側からF3c、F2c、F1cという領域と、5'末端側からB3、B2、B1という領域の塩基配列を認識する少なくとも4種類のプライマーであって、各々インナープライマーF(FIP)及びB(BIP)とアウタープライマーF(F3)及びB(B3)と呼ぶ。また、F1c、F2c、F3cの相補配列をそれぞれF1、F2、F3、またB1、B2、B3の相補鎖をB1c、B2c、B3cと呼ぶ。インナープライマーとは、標的塩基配列上の「ある特定のヌクレオチド配列領域」を認識し、且つ合成起点を与える塩基配列を3'末端に有し、同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を5'末端に有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「F2より選ばれた塩基配列」及び「F1cより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーF(FIP)、そして「B2より選ばれた塩基配列」と「B1cより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーB(BIP)と呼ぶ。一方、アウタープライマーとは、標的塩基配列上の『「ある特定のヌクレオチド配列領域」の3'末端側に存在するある特定のヌクレオチド配列領域』を認識し、且つ合成起点を与える塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「F3より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーF(F3)、「B3より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーB(B3)と呼ぶ。ここで、各プライマーにおけるFとは、標的塩基配列のセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示であり、一方、Bとは、標的塩基配列のアンチセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示である。ここで、プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドの長さは、10塩基以上、好ましくは15塩基以上で、化学合成あるいは天然のどちらでも良く、各プライマーは単一のオリゴヌクレオチドであってもよく、複数のオリゴヌクレオチドの混合物であってもよい。
【００２０】
LAMP法においては、インナープライマーとアウタープライマーに加え、さらにこれとは別のプライマー、すなわちループプライマー(Loop Primer)を用いることができる。ループプライマーLF及び/又はLBは、増幅産物におけるダンベル構造の5'末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的な塩基配列を持つプライマーである。このプライマーを用いると、核酸合成の起点が増加し、反応時間の短縮と検出感度の上昇が可能となる(国際公開第02/24902号パンフレット)。ループプライマーの塩基配列は上述の増幅産物のダンベル構造の5'末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的であれば、標的遺伝子の塩基配列又はその相補鎖から選ばれても良く、他の塩基配列でも良い。また、ループプライマーは1種類でも2種類でも良い。
【００２１】
SFTSウイルスはマイナス鎖一本鎖RNAウイルスである。LAMP法は鋳型がRNAの場合には、鋳型がDNAの場合の反応液に逆転写酵素を添加することで、同様に核酸増幅反応を進めることができる(RT-LAMP法)。
【００２２】
SFTSウイルスに特異的な塩基配列を迅速に増幅できるLAMP法のプライマーの塩基配列とその組み合わせを鋭意研究した結果、SFTSウイルスのゲノムLセグメントを標的配列として、以下の第１及び第２のプライマーセットを選定した。
第１のプライマーセット(実施例における「PM2119のPrimer set」に相当)：
(a) F3：5'-CCTCCTCAGGAAGCATCTG-3'(配列番号１)；
(b) B3：5'-TCCTCTTTGTTCTTGTAGTACCC-3'(配列番号２)；
(c) FIP：5'-CATTCTACCCTCCCCTCTCTATGCATGGTGCGAATTG-3'(配列番号３)；
(d) BIP：5'-GGGAGGAACATTTCATGCGCAGCTGTTGACCATATTCTC-3'(配列番号４)；
(e) LF：5'-GATTAGGCTGAATGGCTGAC-3'(配列番号５)；
(f) LB：5'-CTCAGGCCGGTCCAC-3'(配列番号６)。
第２のプライマーセット(実施例における「PM3191のPrimer set」に相当)：
(g) F3：5'-AGGGAAGTCTCATGGATGG-3'(配列番号７)；
(h) B3：5'-ATCCACCACCCCATTG-3'(配列番号８)；
(i) FIP：5'-GGAGGCTGGATGTAAAGTGCGGGCGAACTTACATAAAGACAG-3'(配列番号９)；
(j) BIP：5'-CTCTTGTGTTCAGAGCTTTTACAAGCTTTCCCCCATGTATCC-3'(配列番号１０)；
(k) LF：5'-CCCTGCATCATTCCTGTC-3'(配列番号１１)；
(l) LB：5'-CTTATTTCGTCTCAAAGCTTAAGG-3'(配列番号１２)。
【００２３】
また、図１に示すように、SFTSウイルスのゲノムLセグメントを標的配列として、以下の第３のプライマーセットを選定した。なお、図１において、「003A Ehime L」、「SPL179」、「SPL193」、「SPL230」及び「SPL238」は、各SFTSウイルス株のゲノムLセグメントである。
【００２４】
また、図１において、「Primer 1」は「PM5228のPrimer set 1」であり、「Primer 2」は「PM5228のPrimer set 2」である。
第３のプライマーセット：
(m) F3：5'-GATGGAGATGGGACTAGCAAC-3'(配列番号１３)；
(n) B3：5'-CTTGATCTTGAAYCCACTCAG-3'(配列番号１４)；
(o) FIP：5'-CTYCGGATSGATTCAATGACTGGCTTGAGGAGATCAGG-3'(配列番号１５)；
(p) BIP：5'-GTGAYGACCTTGGGATCACCTAACCATGCAATGACCTC-3'(配列番号１６)；
(q) LF：5'-CATAAAGCCTGGCATCACTAC-3'(配列番号１７)；
(r) LB：5'-YAACAGGGTRGCATCTGC-3'(配列番号１８)。
【００２５】
(n)のB3：オリゴヌクレオチドプライマーとして、例えば以下の(n')及び(n'')のオリゴヌクレオチドプライマーのうち1つ又は両方を使用してもよい：
(n') B3：5'-CTTGATCTTGAACCCACTCAG-3'(配列番号２６)；
(n'') B3：5'-CTTGATCTTGAATCCACTCAG-3'(配列番号２７)。
【００２６】
また、(o)のFIP：オリゴヌクレオチドプライマーとして、例えば以下の(o')及び(o'')のオリゴヌクレオチドプライマーのうち1つ又は両方を使用してもよい：
(o') FIP：5'-CTTCGGATGGATTCAATGACTGGCTTGAGGAGATCAGG-3'(配列番号２８)；
(o'') FIP：5'-CTCCGGATCGATTCAATGACTGGCTTGAGGAGATCAGG-3'(配列番号２９)。
【００２７】
さらに、(p)のBIP：オリゴヌクレオチドプライマーとして、例えば以下の(p')及び(p'')のオリゴヌクレオチドプライマーのうち1つ又は両方を使用してもよい：
(p') BIP：5'-GTGACGACCTTGGGATCACCTAACCATGCAATGACCTC-3'(配列番号３０)；
(p'') BIP：5'-GTGATGACCTTGGGATCACCTAACCATGCAATGACCTC-3'(配列番号３１)。
【００２８】
また、(r)のLB：オリゴヌクレオチドプライマーとして、例えば以下の(r')及び(r'')のオリゴヌクレオチドプライマーのうち1つ又は両方を使用してもよい：
(r') LB：5'-TAACAGGGTGGCATCTGC-3'(配列番号３２)；
(r'') LB：5'-CAACAGGGTAGCATCTGC-3'(配列番号３３)。
【００２９】
好ましくは、第３のプライマーセットとしては、
上述の(m)、(n')、(o')及び(p')のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含むか又はから成るプライマーセット；
上述の(m)、(n'')、(o'')及び(p'')のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含むか又はから成るプライマーセット；又は、
上述の(m)、(n')、(n'')、(o')、(o'')、(p')及び(p'')のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含むか又はから成るプライマーセット、
が挙げられる。
【００３０】
さらに好ましくは、第３のプライマーセットとしては、
上述の(m)、(n')、(o')、(p')、(q)及び(r')のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含むか又はから成るプライマーセット(実施例における「PM5228のPrimer set 1」に相当)；
上述の(m)、(n'')、(o'')、(p'')、(q)及び(r'')のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含むか又はから成るプライマーセット(「PM5228のPrimer set 2」に相当)；又は
上述の(m)、(n')、(n'')、(o')、(o'')、(p')、(p'')、(q)、(r')及び(r'')のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含むか又はから成るプライマーセット(「PM5228のPrimer set 1及び2の組合せ」に相当)、
が挙げられる。
【００３１】
核酸合成で使用する酵素は、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、例えばBst DNAポリメラーゼ(ラージフラグメント)、Bca(exo-)DNAポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、Csa DNAポリメラーゼ等が挙げられ、好ましくはBst DNAポリメラーゼ(ラージフラグメント)が挙げられる。
【００３２】
RT-LAMP法に用いる逆転写酵素としては、RNAを鋳型としてDNAを合成する活性を有する酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、例えばAMV、Cloned AMV、MMLV、Recombinant HIVの逆転写酵素、SuperscriptII/III/IV、ReverTraAce、Thermoscript、Ominiscript、Sensiscript等が挙げられ、好ましくは、AMV又はCloned AMV逆転写酵素が挙げられる。またBca DNAポリメラーゼのように、逆転写酵素活性とDNAポリメラーゼ活性の両活性を有する酵素を用いると、RT-LAMP反応を1つの酵素で行うことができる。
【００３３】
核酸合成で使用する酵素や逆転写酵素は、ウイルスや細菌等から精製されたものでも良く、遺伝子組み換え技術によって作製されたものでも良い。またこれらの酵素はフラグメント化やアミノ酸の置換等の改変をされたものでも良い。
【００３４】
LAMP反応後の核酸増幅産物の検出には公知の技術が適用できる。例えば、増幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドや蛍光性インターカレーター法(特開2001-242169号公報)を用いたり、あるいは反応終了後の反応液をそのままアガロースゲル電気泳動にかけたりしても容易に検出できる。アガロースゲル電気泳動では、LAMP増幅産物は、塩基長の異なる多数のバンドがラダー(はしご)状に検出される。また、LAMP法では核酸の合成により基質が大量に消費され、副産物であるピロリン酸が、共存するマグネシウムと反応してピロリン酸マグネシウムとなり、反応液が肉眼でも確認できる程に白濁する。従って、この白濁を、反応終了後あるいは反応中の濁度上昇を経時的に光学的に観察できる測定機器、例えば400nmの吸光度変化を通常の分光光度計を用いて確認することで、核酸増幅反応を検出することも可能である(国際公開第01/83817号パンフレット)。
【００３５】
LAMP反応の核酸増幅産物の検出の一態様としては、蛍光標識プローブを用いる方法が挙げられる。例えば、蛍光消光プローブ(Quenching Probe：QProbe(登録商標))と称される3'末端または5'末端に蛍光標識されたプローブは、標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素がその発光を減少させることで、増幅産物を検出又は定量することができる(特開2001-286300号公報)。また末端部分において、ハイブリダイゼーションの塩基対がG（グアニン）とC（シトシン）のペアを形成するように設計されることを特徴としている。ここで使用される蛍光標識としては、例えば、BODIPY-FL、カルボキシローダミン6G（CR6G）、カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）、Pacific Blue、フルオレセイン-4-イソチオシアネート（FITC）等が挙げられる。
【００３６】
本発明においては、上記3組のプライマーセットに合わせて、以下のQProbeを使用することができる。なお、各QProbeは、3'末端にBODIPY-FLで標識されている。
第１のプライマーセットに対するQProbe(実施例におけるPM2119に対するQPに相当)：
以下の(aa)又は(bb)のオリゴヌクレオチドを有するQProbe：
(aa) 5'-GGATTAGGCTGAATGGCTGAGAAGC-3'(配列番号１９)；
(bb) 5'-GGATTAGGCTGAATGGCTGAGAAIC-3'(配列番号２０)。
第２のプライマーセットに対するQProbe(実施例におけるPM3191に対するQPに相当)：
以下の(cc)のオリゴヌクレオチドを有するQProbe：
(cc) 5'-CAATATGCCCTGCATCATTCCTGTC-3'(配列番号２１)。
第３のプライマーセットに対するQProbe(実施例におけるPM5228に対するQPに相当)：
以下の(dd)〜(gg)のいずれか1つのオリゴヌクレオチドを有するQProbe：
(dd) 5'-CATAAAGCCTGGCATCACTACTGAGCC-3'(配列番号２２)；
(ee) 5'-TAACAGGGTGGCATCTGCATATAGAGGTC-3'(配列番号２３)；
(ff) 5'-GGATCCAATAACAGGGTGGCATCTGC-3'(配列番号２４)；
(gg) 5'-GGATCCAATAACAGGGTGGCATCTIC-3'(配列番号２５)。
【００３７】
本発明に係るプライマーセットを用いて核酸増幅の検出を行う際に必要な各種の試薬類は、予めパッケージングしてSFTSウイルス検出又はSFTSウイルス感染症診断用にキット化することができる。具体的には、本発明に係るプライマーセット、蛍光標識プローブ、核酸合成の基質となる4種類のdNTP、核酸合成を行うDNAポリメラーゼ、逆転写活性を持つ酵素、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液や塩類、酵素や鋳型を安定化する保護剤、さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類がキットとして提供される。
【００３８】
以上に説明した本発明に係るプライマーセット又はキットを用いて、SFTSウイルスの標的核酸領域の増幅反応(好ましくはLAMP法)を行い、SFTSウイルスを検出又は定量することができる。換言すれば、当該検出又は定量により、SFTSウイルス感染の有無を検査し、SFTSウイルス感染症を検査又は評価することができる。本発明に係るプライマーセットを用いたLAMPの反応液には、例えば、反応液25μl当たり、本発明に係るプライマーセットに含まれる各プライマー2.5〜80pmol(好ましくは5〜40pmol)、検体用核酸0.02fg〜4μg(好ましくは8fg〜0.0004μg)、鎖置換型DNA合成酵素4〜64U(好ましくは8〜32U)、逆転写酵素0.1〜10U(好ましくは0.5〜4U)、最終濃度0.8〜2.4mM(好ましくは1.2〜1.8mM)のdNTPが含まれる。また、QProbeを使用する場合には、例えば、LAMPの反応液25μl当たり0.5〜20pmol(好ましくは1〜5pmol)のQProbeを含む。さらに、LAMPの増幅反応条件としては、例えば、温度60℃〜65℃(好ましくは63℃)で10〜60分(好ましくは15〜30分)が挙げられる。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４０】
以下の実施例において使用するプライマーセット及びQProbe(QP)を以下の表１に示す。
【００４１】
【表１】
2020065488.tif 000002
【００４２】
〔実施例１〕 SFTS virus検出用Primerの反応性確認
SFTS virus検出用Primerを用いてLAMP反応を行った。
【００４３】
１．試料及び試薬の調製
１）試料
SFTSウイルス HB29株のRNAを、10mM Tris buffer(WAKO製) pH8.0に溶解し、1テスト当たり100、1,000、10,000コピーとなるよう試料溶液を調製した。また同Tris bufferを0コピーの試料溶液とした。
【００４４】
２）LAMP法に用いる試薬組成及び濃度
LAMP法で使用するSFTSウイルス検出用プライマーとして、
プライマーセット（1）：PM2119
プライマーセット（2）：PM3191
プライマーセット（3）：PM5228(Primer set 1)
を使用した。
【００４５】
最終反応溶液25μL中の各試薬濃度が下記になるよう調製した。
反応溶液組成(濁度検出系)：
・20mM Tricine pH8.6
・30mM KCl
・8mM MgSO4
・1.4mM dNTPs
・0.5％Tween20
・1.6mM DTT
・1.6μM FIP及びBIP
・0.2μM F3及びB3
・0.8μM LF及びLB
・AMV Reverse Transcriptase 1.0U(20U/μl、Roche)
・Bst DNApolymerase 16U(New England Biolabs)
・RNase Inhibitor(40U/μl) 1μL
・RNA Template 5μL
【００４６】
反応溶液組成(インターカレーター系)：
上記検出系の反応溶液組成に、更に以下の試薬を添加して調製した。
・PPase 20mU(New England Biolabs)
・YO-PRO-1 160nM(Thermo Fisher Scientific)
【００４７】
反応溶液組成(probe系)：
上記検出系の反応溶液組成に、更に以下の試薬を添加して調製した。
・PPase 20mU(New England Biolabs)
・QProbe 0.04μM(日鉄住金環境株式会社)
【００４８】
表１に示す各QProbe(QP)を、各LAMPプライマーセット(1)-(3)と組み合わせて使用した。
【００４９】
２．LAMP法による反応
LAMP反応は、LAMP用試薬にRNA溶液5μLを加え、最終反応溶液25μLとし、0.2mLの専用チューブ内でリアルタイム定量PCRシステムMx3005P(Agilent Technologies)を用い、63℃で30分LAMP反応を行った。
【００５０】
３．リアルタイム蛍光(インターカレーター系)測定による検出感度の比較結果
プライマーセット(1)-(3)を用いたLAMP法のリアルタイム蛍光測定の反応時間の結果を表２に示す。各コピー数について、2重測定を実施した。表の上から、10000c/t(コピー/テスト)、1000コピー/テスト、100コピー/テスト、鋳型なし(0コピー/テスト)を示す。また、増幅曲線の結果を図２に示す。
【００５１】
【表２】
2020065488.tif 000003
【００５２】
＜結果・考察＞
プライマーセット(1)-(3)は、100コピー以上が測定開始後20分までに蛍光の増加を確認し、0コピーは測定時間中の増加が確認されなかった。
【００５３】
４．リアルタイム蛍光(probe系)測定による検出感度の比較結果
プライマーセット(1)-(3)を用いたLAMP法のリアルタイム蛍光測定の反応時間の結果を表３に示す。各コピー数について、2重測定を実施した。表の上から、10000c/t(コピー/テスト)、1000コピー/テスト、100コピー/テスト、鋳型なし(0コピー/テスト)を示す。また、増幅曲線の結果を図３に示す。
【００５４】
【表３】
2020065488.tif 000004
【００５５】
＜結果・考察＞
プライマーセット(1)-(3)は、100コピー以上が測定開始後30分までに蛍光の増加を確認し、0コピーは測定時間中の増加が確認されなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明によれば、SFTSウイルスを高感度且つ迅速に検出することができ、SFTSウイルス感染症を効率的に診断することができる。
【図１】
2020065488.tif 000005
【図２】
2020065488.tif 000006
【図３】
2020065488.tif 000007
【配列表】
2020065488000001.app