(57)【要約】【課題】本発明の目的は微生物により嫌気性環境下でＰＡＨｓを分解する方法を提供することである。【解決手段】前記課題は、本発明の配列番号１で表される塩基配列を含む１６ＳｒＤＮＡ、又は配列番号１で表される塩基配列と９９％以上の相同性の塩基配列を含む１６ＳｒＤＮＡを有するクロストリジウム属細菌をフェナントレンに接触させる工程を含む、フェナントレンの分解方法によって解決することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される塩基配列を含む１６ＳｒＤＮＡ、又は配列番号１で表される塩基配列と９９％以上の相同性の塩基配列を含む１６ＳｒＤＮＡを有するクロストリジウム属細菌をフェナントレンに接触させる工程を含む、フェナントレンの分解方法。
【請求項２】
配列番号１で表される塩基配列を含む１６ＳｒＤＮＡ、又は配列番号１で表される塩基配列と９９％以上の相同性の塩基配列を含む１６ＳｒＤＮＡを有するクロストリジウム属細菌をベンゼンに接触させる工程を含む、ベンゼンの分解方法。
【請求項３】
配列番号１で表される塩基配列を含む１６ＳｒＤＮＡ、又は配列番号１で表される塩基配列と９９％以上の相同性の塩基配列を含む１６ＳｒＤＮＡを有するクロストリジウム属細菌をトルエンに接触させる工程を含む、トルエンの分解方法。
【請求項４】
受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２８７０のクロストリジウム属細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フェナントレンの分解方法に関する。本発明によれば、３環性の芳香族化合物であるフェナントレンを嫌気的に分解することができる。
【背景技術】
【０００２】
多環芳香族炭化水素（Polycyclic aromatic hydrocarbon；以下、ＰＡＨｓと称することがある）とは、置換基を持たない芳香環が縮合した炭化水素の総称である。ＰＡＨｓは共通の特徴として発がん性や水生環境有害性、変異原性、光毒性を有し、主に有機物や原油の不完全燃焼により発生するため、環境中に広く存在する環境汚染物質の１つと言われている（Yan et al., 2004; IARC, 1986）。また、ＰＡＨｓは構造上安定のため環境に存在する有機物に吸着し長期間存在するため、様々な生物に暴露し続ける（Wang et al., 2012）。
【０００３】
ＰＡＨｓ好気分解菌として、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas fluoresens、Mycobacterium spp.、Haemophilus spp.、Rhodococcus spp.等が単離されている（Haritash and Kaushik, 2009）。また、ＰＡＨｓを分解する通性嫌気性菌として、Paraccus denitrificans M-1株及びPseudomonas属のJP1株が報告されている（Yang et al., 2013; Liang et al., 2014）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Yan et al., 2004; IARC, 1986
【非特許文献２】Wang et al., 2012
【非特許文献３】Haritash and Kaushik, 2009
【非特許文献４】Yang et al., 2013; Liang et al., 2014
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ＰＡＨｓを分解する偏性嫌気性菌は報告されておらず、嫌気性環境下で効率的にＰＡＨｓを分解することができなかった。
従って、本発明の目的は微生物により嫌気性環境下でＰＡＨｓを分解する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、微生物により嫌気性環境下でＰＡＨｓを分解する方法について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、新規のクロストリジウム属の細菌がＰＡＨｓであるフェナントレンを分解できることを見出した。すなわち、前記クロストリジウム属細菌を用いることにより、偏性嫌気性環境下でフェナントレンを分解する方法を見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］配列番号１で表される塩基配列を含む１６ＳｒＤＮＡ、又は配列番号１で表される塩基配列と９９％以上の相同性の塩基配列を含む１６ＳｒＤＮＡを有するクロストリジウム属細菌をフェナントレンに接触させる工程を含む、フェナントレンの分解方法、
［２］配列番号１で表される塩基配列を含む１６ＳｒＤＮＡ、又は配列番号１で表される塩基配列と９９％以上の相同性の塩基配列を含む１６ＳｒＤＮＡを有するクロストリジウム属細菌をベンゼンに接触させる工程を含む、ベンゼンの分解方法、
［３］配列番号１で表される塩基配列を含む１６ＳｒＤＮＡ、又は配列番号１で表される塩基配列と９９％以上の相同性の塩基配列を含む１６ＳｒＤＮＡを有するクロストリジウム属細菌をトルエンに接触させる工程を含む、トルエンの分解方法、及び
［４］受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２８７０のクロストリジウム属細菌、
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のフェナントレンの分解方法によれば、偏性嫌気性の環境下においてもＰＡＨｓであるフェナントレンを分解することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ＮＢＦ＋フェナントレン寒天培地において、ＹＰＨ０２株がフェナントレンを分解して、クリアゾーンを形成している写真である。
【図２】５倍希釈した変法ＧＡＭ液体培地又は５倍希釈Ｒ２Ａ液体培地で、ＹＰＨ０２株を培養した場合の増殖曲線を示したグラフである。
【図３】ベンゼン、トルエン、酢酸、乳酸、フェナントレンを基質（電子供与体）とした場合のＹＰＨ０２株の増殖を調べたグラフである。
【図４】ＹＰＨ０２株及びClostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4（HMT）株のＦＣ液体培地における生育試験のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［１］フェナントレンの分解方法
本発明のフェナントレンの分解方法は、配列番号１で表される塩基配列を含む１６ＳｒＤＮＡ、又は配列番号１で表される塩基配列と９９％以上の相同性の塩基配列を含む１６ＳｒＤＮＡを有するクロストリジウム属細菌をフェナントレンに接触させる工程を含む。
フェナントレンは、下記式（１）：
【化１】
2020120628.tif 000002
で表される３環性の芳香族炭化水素であり、トルエン、四塩化炭素、エーテル、クロロホルム、酢酸、及びベンゼンなどの比較的極性の低い有機溶媒に溶解するが、水にほとんど溶解しない。フェナントレンは、安定な化合物であり、環境に存在する有機物に吸着し、長期間存在するため、環境汚染物質であると考えられている。
【００１０】
《フェナントレン分解菌》
本発明のフェナントレンの分解方法に用いるフェナントレン分解菌は、新規のクロストリジウム属細菌である。この新規クロストリジウム属細菌は、配列番号１で表される塩基配列を有する１６ＳｒＤＮＡを含むか、又は配列番号１で表される塩基配列と９９％以上の相同性の塩基配列を有する１６ＳｒＤＮＡを含むクロストリジウム属細菌（以下、クロストリジウムＡと称することがある）である。クロストリジウムＡは、真正細菌である。偏性嫌気性で芽胞を形成するグラム陽性の桿菌である。
クロストリジウムＡは、配列番号１で表される塩基配列と９９％以上の相同性の塩基配列（配列番号１で表される塩基配列を含む）を有する１６ＳｒＤＮＡを含む細菌であり、フェナントレンを分解することができる。通常、９９％以上の相同性の１６ＳｒＤＮＡを有する細菌は、同じ種の細菌と見做される。本明細書において、相同性とは、２つのヌクレオチドの間の同一性の程度を指す。また、本発明のフェナントレンの分解方法に用いられるクロストリジウムＡは、好ましくは受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２８７０のクロストリジウムＡ（実施例に記載のＹＰＨ０２株）である。
【００１１】
前記クロストリジウムＡを培養する培地は、特に限定されるものではなく、例えば、電子供与体となる化合物を添加したＮＢＦ培地、２ｘＹＴＧ培地、変法ＧＡＭ培地、Ｒ２Ａ液体培地、電子供与体となる化合物を添加したＦＣ液体培地などが挙げられる。
クロストリジウムＡは、偏性嫌気性菌であり、非酸素存在下で培養される。酸素存在下では増殖できず、芽胞を形成して休眠する。また、クロストリジウムＡの培養温度は特に限定されないが、例えば５〜５０℃であり、好ましくは１０〜４０℃であり、より好ましくは２５〜３７℃である。
【００１２】
《接触工程》
接触工程における接触の態様は、クロストリジウムＡが接触によってフェナントレンを分解できる状態になる限りにおいて、特に限定されるものではない。例えば、フェナントレンを含む固体培地又は液体培地において、フェナントレンとクロストリジウムＡを接触させてもよい。また、フェナントレンが含まれる土壌、堆積物、廃液、排水、海水、又は河川水などにクロストリジウムＡを添加することによって、フェナントレンとクロストリジウムＡを接触させてもよい。従って、接触工程は、フェナントレンが含まれる廃液槽、排水槽、土壌槽などの閉鎖系で実施することもできるが、環境中の土壌、畑地、河川、又は湖沼などの開放系で実施することもできる。
【００１３】
接触工程における、接触物に含まれるフェナントレンの濃度は、フェナントレンが分解される限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば１０ｎＭ〜１０ｍＭであり、好ましくは１００ｎＭ〜１ｍＭであり、より好ましくは１μＭ〜１００μＭである。一方、フェナントレンが含まれる接触物へのクロストリジウムＡの添加量も、クロストリジウムＡが接触工程において増殖できると考えられるので、特に限定されない。
接触工程は偏性嫌気性環境下が好ましく、酸素濃度は３％以下であり、好ましくは１％以下であり、より好ましくは０．１％以下である。
【００１４】
前記接触工程の温度も、特に限定されるものではないが、例えば５〜５０℃であり、好ましくは１０〜４０℃であり、より好ましくは２５〜３７℃である。
【００１５】
［２］ベンゼンの分解方法
本発明のベンゼンの分解方法は、配列番号１で表される塩基配列を含む１６ＳｒＤＮＡ、又は配列番号１で表される塩基配列と９９％以上の相同性の塩基配列を含む１６ＳｒＤＮＡを有するクロストリジウム属細菌をベンゼンに接触させる工程を含む。
本発明のベンゼンの分解方法に用いるクロストリジウム属細菌として、前記フェナントレンの分解方法におけるクロストリジウムＡを用いることができる。
【００１６】
また、ベンゼンの分解方法における接触工程は、前記フェナントレンの分解方法における接触工程における「フェナントレン」を「ベンゼン」に置き換えて実施することができる。
但し、接触工程における、接触物に含まれるベンゼンの濃度は、ベンゼンが分解される限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば１０〜５０ｍＭであり、好ましくは２０〜３０ｍＭである。
【００１７】
［３］トルエンの分解方法
本発明のトルエンの分解方法は、配列番号１で表される塩基配列を含む１６ＳｒＤＮＡ、又は配列番号１で表される塩基配列と９９％以上の相同性の塩基配列を含む１６ＳｒＤＮＡを有するクロストリジウム属細菌をトルエンに接触させる工程を含む。
本発明のトルエンの分解方法に用いるクロストリジウム属細菌として、前記フェナントレンの分解方法におけるクロストリジウムＡを用いることができる。
【００１８】
また、トルエンの分解方法における接触工程は、前記フェナントレンの分解方法における接触工程における「フェナントレン」を「トルエン」に置き換えて実施することができる。
但し、接触工程における、接触物に含まれるトルエンの濃度は、トルエンが分解される限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば１０〜５０ｍＭであり、好ましくは２０〜３０ｍＭである。
【００１９】
［４］クロストリジウム属細菌
本発明のクロストリジウム属細菌は、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２８７０の細菌（以下、ＹＰＨ０２株と称することがある）であり、配列番号１で表される塩基並列を含む１６ＳｒＤＮＡを有する。ＹＰＨ０２株は、本発明のフェナントレンの分解方法、ベンゼンの分解方法、及びトルエンの分解方法におけるクロストリジウム属細菌として、好適に用いることができる。ＹＰＨ０２株は、川の水底土壌から分離されたクロストリジウム属細菌であり、偏性嫌気性環境下で、フェナントレンを分解代謝できる。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００２１】
《実施例１》
本実施例では、フェナントレン分解菌のスクリーニング及び分離を行った。本実施例では、鉄還元の嫌気性条件で、フェナントレン分解菌をスクリーニングした。
川、池、及び水田から１２サンプルの土壌を採取し、４℃の冷蔵庫で保存した。表１に記載の組成のＦｅＧｅｌ液体培地を１Ｌ作成し、粉末状のフェナントレン（Sigma-Aldrich）１７８ｍｇ（１ｍｍｏｌ）を添加した。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
採取したサンプルをＦｅＧｅｌ＋フェナントレン液体培地１０ｍＬに植菌し、３０℃、暗所の条件下で、嫌気性のフェナントレン分解菌が選択的に増殖できるように集積培養を行った。ＦｅＧｅｌ液体培地は、培地中に存在する不溶性Ｆｅ３＋が還元されると、培地が橙色から黒色へ変化する。その培地の色の変化により、嫌気性菌のスクリーニングができる。鉄還元が確認された培養液（１０ｍＬ）を新しいＦｅＧｅｌ液体培地（１００ｍＬ）に植え継ぐ作業を繰り返すことによって、集積培養を行った。植え継ぎの途中で鉄還元が確認できなくなった集積培養液はそこで培養を終了した。
１２サンプルのうち１１サンプルにおいて鉄還元が確認された。更に、７つのサンプルにおいて、２週間〜１ヶ月の間でＦｅＧｅｌ液体培地の鉄還元が確認された。ＹＩ１、ＹＩ２、ＹＩ３、ＹＩ４、ＴＩ１、ＴＩ２、及びＴＩ３の７サンプルを次の単離操作に使用した。
集積培養液をＮＢＦ液体培地（フマル酸を電子受容体とし、電子供与体を含まない液体培地）で１００倍希釈し、ＮＢＦ＋フェナントレン（終濃度１ｇ／Ｌ）寒天培地８ｍＬに植菌し、３０℃、嫌気条件で培養を行った。ＮＢＦ寒天培地の組成を表２に示す。
【００２４】
【表２】
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【００２５】
ＮＢＦ＋フェナントレン寒天培地は、添加したフェナントレンにより白濁する。寒天培地で生育したコロニーがフェナントレンを代謝している場合、そのコロニーの周辺が透明になる。この透明な部分をクリアゾーンと呼び、クリアゾーンを形成するコロニーが確認された場合、ＮＢＦ＋フェナントレン寒天培地に継代して培養する。この操作を３回以上繰り返した。クリアゾーンを形成するコロニーが単一であるかを視覚で確認するために栄養培地へ植菌した。
集積培養液ＹＩ２、ＹＩ３、及びＹＩ４においてクリアゾーンを形成するコロニーを確認した。集積培養液ＹＩ２から、クリアゾ−ンを形成する菌のコロニーが確認できた（図１）。Ｙ１２から単離された菌をＹＰＨ０２株と命名した。ＹＰＨ０２株は、２０１９年１月３０日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２８７０として寄託されている。
【００２６】
《実施例２》
本実施例では、フェナントレン分解菌の属種を決定した。
得られたＹＰＨ０２株を、５倍に希釈した変法ＧＡＭ培地又はＲ２Ａ液体培地により増殖した。５倍に希釈した変法ＧＡＭ培地の作成方法は、変法ＧＡＭ粉末８．３４ｇを６０〜７０℃に加温したＭｉｌｌｉ−Ｑ水１，０００ｍＬで溶解し、１０ｍＬ試験管または２０ｍＬセラムボトルにそれぞれ１０ｍＬ、２０ｍＬずつ分注した。分注後、混合ガス（Ｎ２：ＣＯ２＝８０：２０）で１５分間バブリングし、ブチルゴムとアルミシールで蓋をした後、１１５℃、１５分間オートクレーブした。使用前に１００ｍＭシステインを３００μＬ添加し、１２〜２４時間静置した。５倍希釈したＲ２Ａ液体培地の作成方法は、Ｒ２Ａ粉末０．６４ｇをＭｉｌｌｉ−Ｑ水１Ｌに溶解し、その後の操作は変法ＧＡＭ液体培地と同様に行った。
【００２７】
ＹＰＨ０２株を５倍希釈した変法ＧＡＭ液体培地、５倍希釈Ｒ２Ａ液体培地で培養した結果、どちらの培地でも生育が確認されたが、変法ＧＡＭ培地の方がより旺盛に生育した（図２）。ＹＰＨ０２株は培養開始から２時間、約１２時間から２５時間にかけて吸光度が上がっており、増殖が２段階に分けて行われている可能性が示唆された。
【００２８】
変法ＧＡＭ液体培地によって得られた菌体から、Genomic-Tip 100/G及びGenomic DNA Buffer SetによってゲノムＤＮＡを抽出した。得られたゲノムＤＮＡから１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲで増幅した。ＰＣＲはExTaq Hot Start Version（Takara-Bio）をDNApolymeraseとして用い、添付のプロトコールに従って行った。プライマーは、ユニバーサルプライマーの２７Ｆ（AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；配列番号２）、１４９２Ｒ（TACGGYTACCTTGTTACGACTT；配列番号３）を使用した。
得られた１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列を、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Thermo Fisher Scientific Inc.）を用いて解析した。宮崎大学フロンティア化学実験総合センターにあるApplied Biosystems 3500xLジェネティックアナライザ（Thermo Fisher Scientific Inc.）を用いてシークエンス分析を行った。シークエンス結果をフリーソフトの Bio Edit（http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/BioEdit.html）で解析し、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を決定した。また、決定した１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列をＢＬＡＳＴ検索（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）し、属種を決定した。
ＹＰＨ０２株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列を、配列番号１に示す。解析の結果、ＹＰＨ０２株はClostridium saccharoperbutylacetonicum Ｎ１−４（ＨＭＴ）株と９８．４％の相同性を示した。また、Clostridium beijerinckii ＮＣＩＭＢ８０５２株と９７．６％の相同性を示し、Clostridium butyricum ＣＧＳ５株とは９７．２％の相同性を示した。従って、ＹＰＨ０２株は、Clostridium属細菌であることが示された。
【００２９】
《実施例３》
本実施例では、得られたフェナントレン分解菌の利用できる基質を検討した。表３の組成に従い、電子受容体がクエン酸Ｆｅ３＋のＦＣ液体培地を調製した。
【表３】
2020120628.tif 000005
【００３０】
ＦＣ液体培地１０ｍＬに電子供与体のフェナントレン、ベンゼン、トルエン、乳酸、酢酸をそれぞれ終濃度が２５ｍＭ、２５ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、５０ｍＭになるように加え、ＹＰＨ０２株を含むＦＷＮＮ液体培地（電子供与体と電子受容体が含まない培地：表４に組成を示す）１００μＬを加え、培養を開始した。生育の目安としてＯＤ６００をNanoDropTM 2000/2000c Spectrophotometersにて測定した。また、ＹＰＨ０２株を含むＦＷＮＮ液体培地を１２１℃、２０分でオートクレーブした溶液をＦＣ液体培地に添加したものをコントロールとして使用した。
【００３１】
【表４】
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【００３２】
ベンゼン、トルエン、酢酸、乳酸、フェナントレンを基質として加えたＦＣ培地にＹＰＨ０２株を植菌及び培養した結果、全ての基質において吸光度（ＯＤ６００）の増加がみられ、生育が確認された（図３）。ベンゼン、乳酸、フェナントレンを基質とした培地では、培養７日から吸光度が増加し続けていたが、トルエンを基質とした培地では培養１４日目から吸光度が増加していた。酢酸を基質とした培地では培養開始から２１日目まで緩やかな吸光度の増加が確認された。
【００３３】
《実施例４》
本実施例では、ＹＰＨ０２株の１６ＳｒＲＮＡと、９８．４％の相同性を有するClostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4（HMT）株（ATCC 27021）（以下Ｎ１−４株とする）を用いて、ＹＰＨ０２株及びＮ１−４株の生育の比較を行った。Ｎ１−４株は、独立行政法人の製品評価技術基盤機構から購入し、変法ＧＡＭ液体培地にて生育させたものを用いた。
ＹＰＨ０２株とＮ１−４株それぞれＦＷＮＮ液体培地に植菌し、３日間培養を行い、その培養液を生育実験に用いた。ＦＣ液体培地２０ｍＬに終濃度２５ｍＭになるようにフェナントレンを、酸素除去剤としてＦｅＣｌ２溶液（３００ｍＭ）を４００μＬ、ＹＰＨ０２株又はＮ１−４株を含む培養液２００μＬをそれぞれ加え培養を開始した。ＹＰＨ０２株とＮ１−４株の生育は、フェロジン法を用いてＦｅ２＋濃度を測定し、Ｆｅ２＋濃度が増加するにつれて菌の生育が行われていることと判断した。
【００３４】
図４に示すように、Ｆｅ２＋濃度をフェロジン法で測定した結果、どちらの菌株も、コントロールと比較してＦｅ２＋濃度の増加が確認され、菌が生育していると考えられた。
なお、Ｎ１−４株をＮＢＦ＋フェナントレン寒天培地で培養したところ、コロニーの形成は見られたが、クリアゾーンは形成されなかった。従って、Ｎ１−４株は、フェナントレンを分解できないと考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明の分解方法によれば、環境中の３環性芳香族炭化水素であるフェナントレンを効率的に分解することが可能であり、偏性嫌気性環境下における汚染物質の除去が可能となる。
【図１】
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【図２】
2020120628.tif 000008
【図３】
2020120628.tif 000009
【図４】
2020120628.tif 000010
【配列表】
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