(57)【要約】【課題】上皮細胞のエキソビボでの増殖および拡大のための方法および組成物を提供すること。【解決手段】ある特定の態様において本明細書において提供されるのは、エキソビボで分化した上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、ａ）無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で分化した上皮細胞を培養する工程；およびｂ）（ａ）の培養する工程の間に分化した上皮細胞においてＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する工程を含む方法である。ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、エキソビボで以前は静止していた上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、ａ）無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で以前は静止していた上皮細胞を培養する工程；およびｂ）（ａ）の培養する工程の間に以前は静止していた上皮細胞においてＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する工程を含む方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連特許出願）
この特許出願は、２０１５年４月３日に出願され、ＥＸ  ＶＩＶＯ  ＰＲＯＬＩＦＥＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＥＰＩＴＨＥＬＩＡＬ  ＣＥＬＬＳとの表題であり、発明者としてＣｈｅｎｇｋａｎｇ  Ｚｈａｎｇが名を連ね、そして代理人管理番号ＰＰＧ−２００１−ＰＶとして指定される米国仮特許出願第６２／１４２，８５１号の利益を主張する。この特許出願はまた、２０１５年９月１１日に出願され、ＥＸ  ＶＩＶＯ  ＰＲＯＬＩＦＥＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＥＰＩＴＨＥＬＩＡＬ  ＣＥＬＬＳとの表題であり、発明者としてＣｈｅｎｇｋａｎｇ  Ｚｈａｎｇが名を連ね、そして代理人管理番号ＰＰＧ−２００１−ＰＶ２として指定される米国仮特許出願第６２／２１７，４０６号の利益を主張する。この特許出願はまた、２０１６年２月１２日に出願され、ＥＸ  ＶＩＶＯ  ＰＲＯＬＩＦＥＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＥＰＩＴＨＥＬＩＡＬ  ＣＥＬＬＳとの表題であり、発明者としてＣｈｅｎｇｋａｎｇ  Ｚｈａｎｇが名を連ね、そして代理人管理番号ＰＰＧ−２００１−ＰＶ３として指定される米国仮特許出願第６２／２９４，８９６号の利益を主張する。本文、表および図面全体を含む上記出願の完全な内容は、全ての目的のために、参考として本明細書に援用される。
【０００２】
（分野）
本技術は、部分的には、上皮細胞のエキソビボでの増殖および拡大のための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
器官（例えば、肺、腎臓、肝臓、膵臓および皮膚）は、とりわけ、器官特異的上皮細胞の存在によって特徴付けられ得る。上皮細胞は、各々のこのような器官の１種もしくはこれより多くの特異的機能によって規定され得る。特異的機能としては、例えば、肺におけるガス交換、腎臓における濾過、肝臓における解毒および抱合、膵島細胞におけるインスリン生成、または皮膚による環境中の有害状態からの保護が挙げられ得る。このような器官の疾患または変性はしばしば、衰弱させるかまたは生命を脅かすものである。なぜなら変性または喪失した器官構造は、容易には置き換えられず、かつ１つの器官の特殊化された細胞は一般に、別の器官の機能を肩代わりすることはできないからである。
【０００４】
ある特定のタイプの上皮細胞は、インビボでは回復および／または再生するのが難しい可能性があり、身体におけるそれらの状況から一旦取り出されると、維持するのは困難であり得る。ある特定のタイプの上皮細胞（例えば、被験体から採取された器官特異的上皮細胞、多能性幹細胞に由来する系統拘束された上皮細胞、および／または分化した上皮細胞）は、インビトロで増殖および拡大させることは困難であり得、そして代表的には、培養物中での寿命は、非常に制限されている。上皮細胞をインビトロまたはエキソビボで研究するために、ある形態の遺伝子操作（例えば、ウイルス癌遺伝子または細胞癌遺伝子を挿入すること）はしばしば、細胞が数回の継代より長く生存することを可能にするために必要とされる。しかし、これら遺伝子操作は、上記細胞の遺伝的バックグラウンドおよび生理を変更し、その結果、これら細胞が通常の上皮細胞に似ていないかまたは通常の上皮細胞のように機能しない可能性がある。さらに、これら遺伝子改変された細胞は、動物への移植のための候補にならない。
【０００５】
上皮細胞（例えば、被験体から採取された細胞、幹細胞に由来する細胞）を長期間にわたって、その細胞を遺伝的に変化させることなく培養および拡大するための方法は、種々の目的（研究適用、個別化医療適用、および移植が挙げられる）のために有用である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（要旨）
ある特定の態様において本明細書において提供されるのは、エキソビボで分化した上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、ａ）無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で分化した上皮細胞を培養する工程；およびｂ）（ａ）の培養する工程の間に分化した上皮細胞においてＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する工程を含む方法である。
【０００７】
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、エキソビボで以前は静止していた上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、ａ）無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で以前は静止していた上皮細胞を培養する工程；およびｂ）（ａ）の培養する工程の間に以前は静止していた上皮細胞においてＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する工程を含む方法である。
【０００８】
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、エキソビボで系統拘束された上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、ａ）無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で系統拘束された上皮細胞を培養する工程；およびｂ）（ａ）の培養する工程の間に系統拘束された上皮細胞においてＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する工程を含む方法である。
【０００９】
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、エキソビボで上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、ａ）フィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を培養する工程；ｂ）（ａ）の培養する工程の間に上皮細胞においてＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する工程；およびｃ）（ａ）の培養する工程の間に上皮細胞においてｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）の活性を阻害する工程を含む方法である。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、分化した上皮細胞、以前は静止していた上皮細胞および／または系統拘束された上皮細胞である。
【００１０】
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、エキソビボで上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、ａ）無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を培養する工程；ｂ）（ａ）の培養する工程の間に上皮細胞においてＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する工程；およびｃ）（ａ）の培養する工程の間に上皮細胞においてミオシンＩＩの活性を阻害する工程を含む方法である。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、分化した上皮細胞、以前は静止していた上皮細胞および／または系統拘束された上皮細胞である。
【００１１】
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、エキソビボで分化した上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、ａ）フィーダー細胞なしの条件下で分化した上皮細胞を培養する工程；ｂ）分化した上皮細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化する工程；およびｃ）分化した上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程を含む方法である。
【００１２】
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、エキソビボで以前は静止していた上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、ａ）フィーダー細胞なしの条件下で以前は静止していた上皮細胞を培養する工程；ｂ）以前は静止していた上皮細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化する工程；およびｃ）以前は静止していた上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程を含む方法である。
【００１３】
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、エキソビボで系統拘束された上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、ａ）フィーダー細胞なしの条件下で系統拘束された上皮細胞を培養する工程；ｂ）系統拘束された上皮細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化する工程；およびｃ）系統拘束された上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程を含む方法である。
【００１４】
ある特定の態様において本明細書において提供されるのは、フィーダー細胞なしの条件下でエキソビボで分化した上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、無血清細胞培養培地は、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βインヒビター（例えば、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）を含む無血清細胞培養培地である。ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、フィーダー細胞なしの条件下でエキソビボで分化した上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、無血清細胞培養培地は、ＴＧＦ−βインヒビター（例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）からなる低分子インヒビターを含む無血清細胞培養培地である。
【００１５】
ある特定の態様において本明細書において提供されるのは、フィーダー細胞なしの条件下でエキソビボで以前は静止していた上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、無血清細胞培養培地は、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βインヒビター（例えば、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）を含む無血清細胞培養培地である。ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、フィーダー細胞なしの条件下でエキソビボで以前は静止していた上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、無血清細胞培養培地は、ＴＧＦ−βインヒビター（例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）からなる低分子インヒビターを含む無血清細胞培養培地である。
【００１６】
ある特定の態様において本明細書において提供されるのは、フィーダー細胞なしの条件下でエキソビボで系統拘束された上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、無血清細胞培養培地は、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βインヒビター（例えば、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）を含む無血清細胞培養培地である。ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、フィーダー細胞なしの条件下でエキソビボで系統拘束された上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、無血清細胞培養培地は、ＴＧＦ−βインヒビター（例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）からなる低分子インヒビターを含む無血清細胞培養培地である。
【００１７】
ある特定の態様において本明細書において提供されるのは、フィーダー細胞なしの条件下でエキソビボで分化した上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、無血清細胞培養培地は、１種もしくはこれより多くのテロメラーゼ逆転写酵素アクチベーターおよび１種もしくはこれより多くの細胞骨格構造調節剤を含む無血清細胞培養培地である。ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、フィーダー細胞なしの条件下でエキソビボで分化した上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、無血清細胞培養培地は、テロメラーゼ逆転写酵素アクチベーターおよび細胞骨格構造調節剤からなる低分子を含む無血清細胞培養培地である。
【００１８】
ある特定の態様において本明細書において提供されるのは、フィーダー細胞なしの条件下でエキソビボで以前は静止していた上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、無血清細胞培養培地は、１種もしくはこれより多くのテロメラーゼ逆転写酵素アクチベーターおよび１種もしくはこれより多くの細胞骨格構造調節剤を含む無血清細胞培養培地である。ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、フィーダー細胞なしの条件下でエキソビボで以前は静止していた上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、無血清細胞培養培地は、テロメラーゼ逆転写酵素アクチベーターおよび細胞骨格構造調節剤からなる低分子を含む無血清細胞培養培地である。
【００１９】
ある特定の態様において本明細書において提供されるのは、フィーダー細胞なしの条件下でエキソビボで系統拘束された上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、無血清細胞培養培地は、１種もしくはこれより多くのテロメラーゼ逆転写酵素アクチベーターおよび１種もしくはこれより多くの細胞骨格構造調節剤を含む無血清細胞培養培地である。ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、フィーダー細胞なしの条件下でエキソビボで系統拘束された上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、無血清細胞培養培地は、テロメラーゼ逆転写酵素アクチベーターおよび細胞骨格構造調節剤からなる低分子を含む無血清細胞培養培地である。
【００２０】
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下において上皮細胞を増殖させるための細胞培養培地であって、この培地は、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βインヒビター（例えば、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）および１種もしくはこれより多くのＰＡＫ１インヒビターを含む培地である。ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下において上皮細胞を増殖させるための細胞培養培地であって、この培地は、ＴＧＦ−βインヒビター（例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）およびＰＡＫ１インヒビターからなる低分子（例えば、低分子インヒビター）を含む培地である。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、分化した上皮細胞、以前は静止していた上皮細胞および／または系統拘束された上皮細胞である。
【００２１】
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下において上皮細胞を増殖させるための細胞培養培地であって、この培地は、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βインヒビター（例えば、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）および１種もしくはこれより多くのミオシンＩＩインヒビターを含む培地である。ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下において上皮細胞を増殖させるための細胞培養培地であって、この培地は、ＴＧＦ−βインヒビター（例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）およびミオシンＩＩインヒビターからなる低分子（例えば、低分子インヒビター）を含む培地である。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、分化した上皮細胞、以前は静止していた上皮細胞および／または系統拘束された上皮細胞である。
【００２２】
ある特定の態様において本明細書において提供されるのは、ａ）無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で分化した上皮細胞を培養し、増殖させる工程；およびｂ）（ａ）の培養し、増殖させる工程の間に分化した上皮細胞においてＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する工程を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた（例えば、拡大した）上皮細胞の集団である。
【００２３】
ある特定の態様において本明細書において提供されるのは、ａ）無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で以前は静止していた上皮細胞を培養し、増殖させる工程；およびｂ）（ａ）の培養し、増殖させる工程の間に以前は静止していた上皮細胞においてＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する工程を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた（例えば、拡大した）上皮細胞の集団である。
【００２４】
ある特定の態様において本明細書において提供されるのは、ａ）無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で系統拘束された上皮細胞を培養し、増殖させる工程；およびｂ）（ａ）の培養し、増殖させる工程の間に系統拘束された上皮細胞においてＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する工程を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた（例えば、拡大した）上皮細胞の集団である。
【００２５】
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、ａ）フィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を培養し、増殖させる工程；ｂ）（ａ）の培養し、増殖させる工程の間に上皮細胞においてＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する工程；およびｃ）（ａ）の培養し、増殖させる工程の間に上皮細胞においてｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）の活性を阻害する工程を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた（例えば、拡大した）上皮細胞の集団である。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、分化した上皮細胞、以前は静止していた上皮細胞および／または系統拘束された上皮細胞である。
【００２６】
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、ａ）無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を培養し、増殖させる工程；ｂ）（ａ）の培養し、増殖させる工程の間に上皮細胞においてＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する工程；およびｃ）（ａ）の培養し、増殖させる工程の間に上皮細胞においてミオシンＩＩの活性を阻害する工程を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた（例えば、拡大した）上皮細胞の集団である。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、分化した上皮細胞、以前は静止していた上皮細胞および／または系統拘束された上皮細胞である。
【００２７】
ある特定の態様において本明細書において提供されるのは、ａ）無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で分化した上皮細胞を培養し、増殖させる工程；ｂ）（ａ）の培養し、増殖させる工程の間に分化した上皮細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化する工程；およびｃ）（ａ）の培養し、増殖させる工程の間に分化した上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた（例えば、拡大した）上皮細胞の集団である。
【００２８】
ある特定の態様において本明細書において提供されるのは、ａ）無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で以前は静止していた上皮細胞を培養し、増殖させる工程；ｂ）（ａ）の培養し、増殖させる工程の間に以前は静止していた上皮細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化する工程；およびｃ）（ａ）の培養し、増殖させる工程の間に以前は静止していた上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた（例えば、拡大した）上皮細胞の集団である。
【００２９】
ある特定の態様において本明細書において提供されるのは、ａ）無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で系統拘束された上皮細胞を培養し、増殖させる工程；ｂ）（ａ）の培養し、増殖させる工程の間に系統拘束された上皮細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化する工程；およびｃ）（ａ）の培養し、増殖させる工程の間に系統拘束された上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた（例えば、拡大した）上皮細胞の集団である。
【００３０】
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、規定された無血清細胞培養培地、脂質ミックス、ＥＧＦ、ＦＧＦ、アルブミン、ＴＧＦ−βインヒビター（例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）、およびＲｈｏキナーゼインヒビター（例えば、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビター）を含む細胞培養組成物である。
【００３１】
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、規定された無血清細胞培養培地、脂質ミックス、ＥＧＦ、ＦＧＦ、アルブミン、ＴＧＦ−βインヒビター（例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）、およびＲｈｏキナーゼインヒビター（例えば、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビター）からなる細胞培養組成物である。
【００３２】
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、規定された無血清細胞培養培地、脂質ミックス、ＥＧＦ、ＦＧＦ、アルブミン、ＴＧＦ−βインヒビター（例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（例えば、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビター）、およびβアドレナリン作動性アゴニスト（例えば、βアドレナリン作動性レセプターアゴニスト）を含む細胞培養組成物である。
【００３３】
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、規定された無血清細胞培養培地、脂質ミックス、ＥＧＦ、ＦＧＦ、アルブミン、ＴＧＦ−βインヒビター（例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（例えば、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビター）、およびβアドレナリン作動性アゴニスト（例えば、βアドレナリン作動性レセプターアゴニスト）からなる細胞培養組成物である。
【００３４】
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法であって、前記方法は、分化した組織に由来する起源上皮細胞集団中の細胞数を、フィーダー細胞なしの拡大培養条件下で拡大し、それによって、拡大した上皮細胞集団を生成する工程を包含し、ここで：前記拡大培養条件は、前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび／または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達を阻害する薬剤を含み；前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養される場合に、２５回以上の集団倍加が可能であり；そして前記起源上皮細胞集団は、前記薬剤を含まないコントロール培養条件下で培養される場合に、２０回以下の集団倍加が可能である、
方法である。
【００３５】
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法であって、前記方法は、分化した組織に由来する起源上皮細胞集団中の細胞数を、無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で拡大し、それによって、拡大された上皮細胞集団を生成する工程を包含し、ここで：前記拡大培養条件は、前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび／または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達を阻害する薬剤を含み；そして前記起源上皮細胞集団は、分化した上皮細胞を含む、方法である。ある特定の実施形態において、拡大培養条件は集団における細胞骨格構造を調節する第２の薬剤を含み、コントロール培養条件はこの第２の薬剤を含まない。
【００３６】
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法であって、前記方法は、分化した組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する起源上皮細胞集団中の細胞数を、フィーダー細胞なしの拡大培養条件下で拡大し、それによって、拡大した上皮細胞集団を生成する工程を包含し、ここで：前記拡大培養条件は、前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび／または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達を阻害する薬剤を含み；前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養される場合に、２５回以上の集団倍加が可能であり；そして前記起源上皮細胞集団は、前記薬剤を含まないコントロール培養条件下で培養される場合に、２０回以下の集団倍加が可能である、方法である。
【００３７】
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法であって、前記方法は、起源上皮細胞集団中の細胞数を、無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で拡大し、それによって、拡大した上皮細胞集団を生成する工程を包含し、ここで：前記拡大培養条件は、前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび／または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達を阻害する薬剤を含み；そして前記起源上皮細胞集団は、分化した上皮細胞を含む、方法である。
【００３８】
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法であって、前記方法は、起源上皮細胞集団中の細胞数を、無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で拡大し、それによって、拡大した上皮細胞集団を生成する工程を包含し、ここで：前記拡大培養条件は、前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび／または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達を阻害する薬剤を含み；そして前記起源上皮細胞集団は、静止したおよび／または以前は静止していた上皮細胞上皮細胞を含む、方法である。
【００３９】
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法であって、前記方法は、起源上皮細胞集団中の細胞数を、無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で拡大し、それによって、拡大した上皮細胞集団を生成する工程を包含し、ここで：前記拡大培養条件は、前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび／または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達を阻害する薬剤を含み；そして前記起源上皮細胞集団は、系統拘束された上皮細胞を含む、方法である。
【００４０】
ある特定の実施形態は、以下の説明、実施例、特許請求の範囲および図面においてさらに記載される。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法であって、前記方法は、
分化した組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する起源上皮細胞集団中の細胞数を、フィーダー細胞なしの拡大培養条件下で拡大し、それによって、拡大した上皮細胞集団を生成する工程
を包含し、ここで：
前記拡大培養条件は、前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび／または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達を阻害する薬剤を含み；
前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養される場合に、２５回以上の集団倍加が可能であり；そして
前記起源上皮細胞集団は、前記薬剤を含まないコントロール培養条件下で培養される場合に、２０回以下の集団倍加が可能である、
方法。
（項目２）
上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法であって、前記方法は、
起源上皮細胞集団中の細胞数を、無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で拡大し、それによって、拡大された上皮細胞集団を生成する工程
を包含し、ここで：
前記拡大培養条件は、前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび／または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達を阻害する薬剤を含み；そして
前記起源上皮細胞集団は、分化した上皮細胞を含む、
方法。
（項目３）
上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法であって、前記方法は、
起源上皮細胞集団中の細胞数を、無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で拡大し、それによって、拡大した上皮細胞集団を生成する工程
を包含し、ここで：
前記拡大培養条件は、前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび／または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達を阻害する薬剤を含み；そして
前記起源上皮細胞集団は、静止した上皮細胞および／または以前は静止していた上皮細胞を含む、
方法。
（項目４）
上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法であって、前記方法は、
起源上皮細胞集団中の細胞数を、無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で拡大し、それによって、拡大した上皮細胞集団を生成する工程
を包含し、ここで：
前記拡大培養条件は、前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび／または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達を阻害する薬剤を含み；そして
前記起源上皮細胞集団は、系統拘束された上皮細胞を含む、
方法。
（項目５）
前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび／または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達を阻害する薬剤は、第１の薬剤であり、
前記拡大培養条件は、前記集団において細胞骨格構造を調節する第２の薬剤をさらに含み、そして
前記コントロール培養条件は、前記第１の薬剤および前記第２の薬剤を含まない、
項目１に記載の方法。
（項目６）
前記拡大培養条件は、前記集団において細胞骨格構造を調節する薬剤をさらに含む。項目２、３または４に記載の方法。
（項目７）
前記起源上皮細胞集団を単離する工程を包含する、項目１〜６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
前記起源上皮細胞集団は、分化した組織から単離される、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記起源上皮細胞集団は、胚または胚に由来する幹細胞培養物から単離される、項目７に記載の方法。
（項目１０）
前記起源上皮細胞集団は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）培養物から単離される、項目７に記載の方法。
（項目１１）
前記起源上皮細胞集団は、被験体由来のサンプルから単離される、項目７に記載の方法。
（項目１２）
前記サンプルは、組織生検材料、血液、尿、糞便、口内スワブ、および羊水のうちの１種もしくはこれより多くから選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
細胞培養物中の前記起源上皮細胞集団の細胞を、前記細胞が単離された後かつ前記起源上皮細胞集団を前記フィーダー細胞なしの拡大培養条件に接触させる前に、維持するまたは増殖させる工程を包含する、項目１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
前記起源上皮細胞集団および／または前記拡大した上皮細胞集団は、胚性幹細胞を含まない、項目１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、１種もしくはこれより多くの基底上皮細胞マーカーを発現する、項目１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ４、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ５およびＴＰ６３のうちの１種もしくはこれより多くを発現する、項目１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、１種もしくはこれより多くの上皮幹細胞マーカーを発現しない、項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、Ｌｇｒ５を発現しない、項目１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、１種もしくはこれより多くの多能性幹細胞マーカーを発現しない、項目１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、ＬＩＮ２８Ａ、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４およびＳＯＸ２のうちの１種もしくはこれより多くを発現しない、項目１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
（項目２１）
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、１種もしくはこれより多くの最終分化した上皮細胞マーカーを発現しない、項目１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、ＣＦＴＲ、ＦＯＸＪ１、ＩＶＬ、ＫＲＴ１、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ２０、ＬＯＲ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ＳＣＧＢ１Ａ１、ＳＦＴＰＢおよびＳＦＴＰＤのうちの１種もしくはこれより多くを発現しない、項目１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、１種もしくはこれより多くの胃上皮細胞マーカー、１種もしくはこれより多くの腸上皮細胞マーカー、および／または１種もしくはこれより多くの膵臓上皮細胞マーカーを発現しない、項目１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４）
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、ＣＤ３４、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＩＨＨ、ＫＩＴ、ＬＧＲ５、ＰＤＸ１、およびＰＲＯＭ１／ＣＤ１３３のうちの１種もしくはこれより多くを発現しない、項目１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、静止した上皮細胞および／または以前は静止していた上皮細胞を含む、項目１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび／またはトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達を阻害する薬剤は、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビターを含む、項目１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビターは、１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターを含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターは、１種もしくはこれより多くの低分子ＡＬＫ５インヒビターを含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターは、１種もしくはこれより多くのＡＴＰアナログを含む、項目２７または２８に記載の方法。
（項目３０）
前記１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターのうちの少なくとも１種は、式Ａ：
【化５】
2020120686.tif 000002
の構造を含み、ここで：
Ｘ、ＹおよびＺは、Ｎ、ＣおよびＯから独立して選択され；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換されたＣ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル、置換されたＣ３−Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５−Ｃ１０アリール、置換されたＣ５−Ｃ１０アリール、Ｃ５−Ｃ１０シクロアリール、置換されたＣ５−Ｃ１０シクロアリール、Ｃ５−Ｃ９複素環式、置換されたＣ５−Ｃ９複素環式、Ｃ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール、置換されたＣ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール、−リンカー−（Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（置換されたＣ３−Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ１０アリール）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ１０アリール）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ９複素環式）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ９複素環式）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール）から独立して選択され；
ｎは、０または１であり；
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換されたＣ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０アルコキシ、置換されたＣ１−Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルカノイル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、置換されたＣ１−Ｃ６アルカノイル、置換されたＣ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル、置換されたＣ３−Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５−Ｃ１０アリール、置換されたＣ５−Ｃ１０アリール、Ｃ５−Ｃ１０シクロアリール、置換されたＣ５−Ｃ１０シクロアリール、Ｃ５−Ｃ９複素環式、置換されたＣ５−Ｃ９複素環式、Ｃ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール、置換されたＣ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール、−リンカー−（Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（置換されたＣ３−Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ１０アリール）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ１０アリール）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ９複素環式）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ９複素環式）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール）から独立して選択され；そして
前記置換されたアルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニルシクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環式またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、ヒドロキシルＣ１−Ｃ１０アルキレン、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５−Ｃ９複素環式、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールである、
項目２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターは、Ａ８３−０１、ＧＷ７８８３８８、ＲｅｐＳｏｘ、およびＳＢ  ４３１５４２から選択される、項目２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
前記細胞骨格構造を調節する薬剤は、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター、ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）インヒビター、およびミオシンＩＩインヒビターのうちの１種もしくはこれより多くを含む、項目１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
前記Ｒｈｏキナーゼインヒビターは、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼ１（ＲＯＣＫ  １）インヒビターおよびＲｈｏ関連プロテインキナーゼ２（ＲＯＣＫ  ２）インヒビターから選択される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビターは、１種もしくはこれより多くの低分子Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビターを含む、項目３２または３３に記載の方法。
（項目３５）
前記１種もしくはこれより多くのＲｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビターは、Ｙ−２７６３２、ＳＲ  ３６７７、チアゾビビン、ＨＡ１１００ヒドロクロリド、ＨＡ１０７７およびＧＳＫ−４２９２８６から選択される、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）インヒビターは、ＰＡＫ１インヒビター、ＰＡＫ２インヒビター、ＰＡＫ３インヒビターおよびＰＡＫ４インヒビターから選択される、項目３２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
前記ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）インヒビターは、１種もしくはこれより多くの低分子ＰＡＫ１インヒビターを含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記１種もしくはこれより多くの低分子ＰＡＫ１インヒビターは、ＩＰＡ３を含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記ミオシンＩＩインヒビターは、１種もしくはこれより多くの非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）インヒビターを含む、項目３２〜３８のいずれか１項に記載の方法。
（項目４０）
前記１種もしくはこれより多くの非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）インヒビターは、１種もしくはこれより多くの低分子非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）インヒビターを含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記１種もしくはこれより多くの低分子非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）インヒビターは、ブレビスタチンを含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記拡大培養条件は、前記集団において細胞内環状アデノシンモノホスフェート（ｃＡＭＰ）レベルを増大させる薬剤をさらに含む、項目１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
（項目４３）
前記細胞内環状アデノシンモノホスフェート（ｃＡＭＰ）レベルを増大させる薬剤は、１種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストを含む、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記１種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストは、イソプロテレノールを含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記拡大培養条件は、無血清培養条件である、項目１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
（項目４６）
前記拡大培養条件は、規定された無血清培養条件である、項目１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
（項目４７）
前記拡大培養条件は、ゼノフリー培養条件である、項目１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
（項目４８）
前記拡大培養条件は、規定されたゼノフリー培養条件である、項目１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
（項目４９）
前記拡大培養条件は、３００μＭ未満の濃度でカルシウムを含む、項目１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
（項目５０）
前記拡大培養条件は、１００μＭ未満の濃度でカルシウムを含む、項目１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
（項目５１）
前記カルシウムは、約９０μＭの濃度で存在する、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記拡大培養条件は、１種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子を含む、項目１〜５１のいずれか１項に記載の方法。
（項目５３）
１種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子は、ＥＧＦ、ＦＧＦ、またはＥＧＦおよびＦＧＦを含む、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記拡大培養条件は、異質な成分を含む細胞外マトリクスを含まない、項目１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５５）
前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養される場合に、３０回以上の集団倍加が可能である、項目１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
（項目５６）
前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養される場合に、５０回以上の集団倍加が可能である、項目１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
（項目５７）
前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養される場合に、８０回以上の集団倍加が可能である、項目１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
（項目５８）
前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養される場合に、１００回以上の集団倍加が可能である、項目１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
（項目５９）
前記方法は、連続して増殖している上皮幹細胞および／または連続して増殖している上皮幹細胞のインビボ集団を選択する工程を含まない、項目１〜５８のいずれか１項に記載の方法。
（項目６０）
前記起源上皮細胞集団は、連続して増殖している上皮幹細胞を含まないおよび／または連続して増殖している上皮幹細胞のインビボ集団に由来する細胞を含まない、項目１〜５８のいずれか１項に記載の方法。
（項目６１）
エキソビボで拡大した上皮細胞の集団を単離する工程をさらに包含する、項目１〜６０のいずれか１項に記載の方法。
（項目６２）
エキソビボで拡大した上皮細胞の集団を細胞バンクで貯蔵する工程をさらに包含する、項目１〜６１のいずれか１項に記載の方法。
（項目６３）
項目１〜６２のいずれか１項に記載の方法によって生成される、エキソビボで拡大した上皮細胞の集団。
（項目６４）
遺伝子改変された細胞の生成のための、項目６３に記載のエキソビボで拡大した上皮細胞の集団の使用。
（項目６５）
被験体に対する１種もしくはこれより多くの候補処置を同定するための、項目６３に記載のエキソビボで拡大した上皮細胞の集団の使用。
（項目６６）
被験体において１種もしくはこれより多くの異常な上皮細胞を同定するための、項目６３に記載のエキソビボで拡大した上皮細胞の集団の使用。
（項目６７）
被験体における疾患の進行または疾患の処置をモニターするための、項目６３に記載のエキソビボで拡大した上皮細胞の集団の使用。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
図面は、本技術のある特定の実施形態を例証するのであって、限定するのではない。明瞭性および例証の容易さのために、図面は、一定の拡大縮小比で作られておらず、場合によっては、種々の局面が、特定の実施形態の理解を容易にするために、誇張または拡大して示され得る。
【００４２】
【図１】図１は、標準の培養培地（すなわち、コントロール培養条件）中での前立腺上皮細胞の増殖を示す。ＫＳＦＭ、ケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。ＰｒＥＧＭ、前立腺上皮細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ）。ＰＤ、集団倍加。
【００４３】
【図２】図２は、標準の培養培地（すなわち、コントロール培養条件）中での気管支上皮細胞の増殖を示す。ＫＳＦＭ、ケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。ＰｒＥＧＭ、前立腺上皮細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ）。ＰＤ、集団倍加。
【００４４】
【図３Ａ】図３Ａおよび図３Ｂは、上皮細胞におけるｈＴＥＲＴ発現を示す。ＨＢＥＣ、ヒト気管支上皮細胞。ｈＴＥＲＴ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子。ＫＳＦＭ、ケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。ＬＮＣａＰ、ヒト前立腺がん細胞株ＬＮＣａＰクローンＦＧＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。ＰｒＥＣ、前立腺上皮細胞。ＰｒＥＧＭ、前立腺上皮細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ）。ｎ．ｄ．、検出されない。ｐ、継代。
【図３Ｂ】図３Ａおよび図３Ｂは、上皮細胞におけるｈＴＥＲＴ発現を示す。ＨＢＥＣ、ヒト気管支上皮細胞。ｈＴＥＲＴ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子。ＫＳＦＭ、ケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。ＬＮＣａＰ、ヒト前立腺がん細胞株ＬＮＣａＰクローンＦＧＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。ＰｒＥＣ、前立腺上皮細胞。ＰｒＥＧＭ、前立腺上皮細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ）。ｎ．ｄ．、検出されない。ｐ、継代。
【００４５】
【図４】図４は、上皮細胞における上皮幹細胞マーカーＬＧＲ５発現の欠如を示す。ポリクローナルＬｇｒ５抗体（ＬｉｆｅＳｐａｎ、ＬＳ−Ａ１２３５）を、１：５０希釈において使用した。モノクローナルＴＰ６３抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−２５２６８）を、１：５０希釈において使用した。ＤＡＰＩ、ＤＮＡ蛍光染料４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール。
【００４６】
【図５Ａ】図５Ａおよび図５Ｂは、気管支上皮細胞におけるｈＴＥＲＴ発現を示す。ＨＢＥＣ、ヒト気管支上皮細胞。ｈＴＥＲＴ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子。ＫＳＦＭ、ケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。ＬＮＣａＰ、ヒト前立腺がん細胞株ＬＮＣａＰクローンＦＧＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。Ａ、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１。Ｙ、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２。ｎ．ｄ．、検出されない。ｐ、継代。
【図５Ｂ】図５Ａおよび図５Ｂは、気管支上皮細胞におけるｈＴＥＲＴ発現を示す。ＨＢＥＣ、ヒト気管支上皮細胞。ｈＴＥＲＴ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子。ＫＳＦＭ、ケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。ＬＮＣａＰ、ヒト前立腺がん細胞株ＬＮＣａＰクローンＦＧＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。Ａ、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１。Ｙ、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２。ｎ．ｄ．、検出されない。ｐ、継代。
【００４７】
【図６Ａ】図６Ａおよび図６Ｂは、前立腺上皮細胞におけるｈＴＥＲＴ発現を示す。ＰｒＥＣ、前立腺上皮細胞。ｈＴＥＲＴ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子。ＫＳＦＭ、ケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。ＰｒＥＧＭ、前立腺上皮細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ）。ＬＮＣａＰ、ヒト前立腺がん細胞株ＬＮＣａＰクローンＦＧＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。Ｊ２、３Ｔ３−Ｊ２フィーダー細胞。Ａ、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１。Ｙ、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２。ｎ．ｄ．、検出されない。ｐ、継代。
【図６Ｂ】図６Ａおよび図６Ｂは、前立腺上皮細胞におけるｈＴＥＲＴ発現を示す。ＰｒＥＣ、前立腺上皮細胞。ｈＴＥＲＴ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子。ＫＳＦＭ、ケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。ＰｒＥＧＭ、前立腺上皮細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ）。ＬＮＣａＰ、ヒト前立腺がん細胞株ＬＮＣａＰクローンＦＧＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。Ｊ２、３Ｔ３−Ｊ２フィーダー細胞。Ａ、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１。Ｙ、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２。ｎ．ｄ．、検出されない。ｐ、継代。
【００４８】
【図７】図７は、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１の存在下でのＫＳＦＭ中の標準の組織培養表面上での前立腺上皮細胞のプレーティング効率を示す。ＰｒＥＣ、前立腺上皮細胞。ＫＳＦＭ、ケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。Ａ、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１。
【００４９】
【図８】図８は、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１の存在下でのＫＳＦＭ中の標準の組織培養表面上での気管支上皮細胞のプレーティング効率を示す。ＨＢＥＣ、ヒト気管支上皮細胞。ＫＳＦＭ、ケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。Ａ、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１。
【００５０】
【図９】図９は、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１およびＲｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２の存在下でのＫＳＦＭ中の標準の組織培養表面上での前立腺上皮細胞のプレーティング効率を示す。ＰｒＥＣ、前立腺上皮細胞。ＫＳＦＭ、ケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。Ａ、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１。Ｙ、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２。
【００５１】
【図１０】図１０は、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１およびＲｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２の存在下でのＫＳＦＭ中の標準の組織培養表面上での気管支上皮細胞のプレーティング効率を示す。ＨＢＥＣ、ヒト気管支上皮細胞。ＫＳＦＭ、ケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。Ａ、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１。Ｙ、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２。
【００５２】
【図１１】図１１は、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１およびＲｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２の存在下でのＫＳＦＭ中のコラーゲンＩを被覆した組織培養表面上での前立腺上皮細胞のプレーティング効率を示す。ＰｒＥＣ、前立腺上皮細胞。ＫＳＦＭ、ケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。Ａ、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１。Ｙ、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２。
【００５３】
【図１２】図１２は、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１およびＲｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２の存在下でのＫＳＦＭ中のコラーゲンＩを被覆した組織培養表面上での気管支上皮細胞のプレーティング効率を示す。ＨＢＥＣ、ヒト気管支上皮細胞。ＫＳＦＭ、ケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。Ａ、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１。Ｙ、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２。
【００５４】
【図１３】図１３は、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２の存在下でのＫＳＦＭ中の、後期継代の前立腺上皮細胞および気管支上皮細胞の細胞老化を示す。ＰｒＥＣ、前立腺上皮細胞。ＨＢＥＣ、ヒト気管支上皮細胞。ＫＳＦＭ、ケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。Ｙ、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２。
【００５５】
【図１４】図１４は、前立腺上皮細胞の増殖を示す。ＫＳＦＭ、ケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。ＰｒＥＧＭ、前立腺上皮細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ）。Ａ、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１。Ｙ、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２。
【００５６】
【図１５】図１５は、気管支上皮細胞の増殖を示す。ＫＳＦＭ、ケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。Ａ、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１。Ｙ、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２。
【００５７】
【図１６】図１６は、種々の化合物（５μＭ、黒い棒；１μＭ、市松模様の棒；および０．２μＭ、白い棒）の存在下での前立腺上皮細胞の増殖を示す。コントロールは、化合物なしのＫＳＦＭ（ケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ））である。
【００５８】
【図１７】図１７は、種々の化合物（５μＭ、黒い棒；１μＭ、市松模様の棒；および０．２μＭ、白い棒）の存在下での前立腺上皮細胞の増殖を示す。コントロールは、化合物なしのＫＳＦＭ（ケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ））である。
【００５９】
【図１８】図１８は、ＫＳＦＭおよびＫＳＦＭ＋Ａ＋Ｙの存在下でのヒト包皮ケラチノサイトの増殖を示す。Ａ、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１。Ｙ、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２。ＫＳＦＭ、ケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。
【００６０】
【図１９】図１９は、ＫＳＦＭおよびＫＳＦＭ＋Ａ＋Ｙの存在下での前立腺上皮細胞の増殖を示す。Ａ、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１。Ｙ、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２。ＫＳＦＭ、ケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。
【００６１】
【図２０】図２０は、ＫＳＦＭおよびＫＳＦＭ＋Ａ＋Ｙの存在下での気管支上皮細胞の増殖を示す。Ａ、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１。Ｙ、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２。ＫＳＦＭ、ケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。
【００６２】
【図２１】図２１は、ＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２中で培養した種々の上皮細胞の早期継代および後期継代での核型決定結果を示す。左下パネルは、早期継代（ｐ３）でのＨＦＫ細胞の代表的中期染色体スプレッド（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｓｐｒｅａｄ）を示す。右下パネルは、後期継代（ｐ１９）でのＨＦＫ細胞の代表的中期染色体スプレッドを示す。ＨＦＫ、ヒト包皮ケラチノサイト。ＨＢＥＣ、ヒト気管支上皮細胞。ＰｒＥＣ、前立腺上皮細胞。
【００６３】
【図２２】図２２は、種々の集団倍加においてＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２中で培養した包皮ケラチノサイトにおけるテロメアの平均相対的長さを示す。テロメアの相対的長さは、定量的ＰＣＲを使用して、テロメア反復（Ｔ）  対  単一コピー遺伝子（Ｓ）の比（Ｔ／Ｓ比）として表される。ＫＳＦＭ、ケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。Ａ、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１。Ｙ、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２。
【００６４】
【図２３】図２３は、ＫＳＦＭとＡ８３−０１およびＹ−２７６３２中でのトランスジェニック核局在化赤色蛍光タンパク質（ｎＲＦＰ）を発現する上皮細胞株の増殖を示す。ＨＦＫ、ヒト包皮ケラチノサイト。ＨＢＥＣ、ヒト気管支上皮細胞。ＰｒＥＣ、前立腺上皮細胞。ｎＲＦＰ、核局在化赤色蛍光タンパク質。
【００６５】
【図２４】図２４は、ＫＳＦＭとＡ８３−０１およびＹ−２７６３２中で増殖させたトランスジェニック核局在化赤色蛍光タンパク質（ｎＲＦＰ）を発現する上皮細胞株の画像を示す。ＨＦＫ、ヒト包皮ケラチノサイト。ＨＢＥＣ、ヒト気管支上皮細胞。ＰｒＥＣ、前立腺上皮細胞。ｎＲＦＰ、核局在化赤色蛍光タンパク質。
【００６６】
【図２５】図２５は、種々の化合物および条件の存在下でのヒト包皮ケラチノサイトの増殖を示す。ＨＦＫ、ヒト包皮ケラチノサイト。Ｍ＊、改変ＭＣＤＢ−１５３培地（９０μＭ  ＣａＣｌ２を有する）＋ＥＧＦ、ａＦＧＦ、Ａ８３−０１、およびＹ−２７６３２。ＥＧＦ、上皮増殖因子。ａＦＧＦ、酸性線維芽細胞増殖因子。ＢＳＡ、脂肪酸非含有ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、Ａ８８０６）。ｒＨＡ、イネにおいて発現された組換えヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、Ａ９７３１）。脂質ミックス、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｇｉｂｃｏ、１１９０５−０３１）。ＡｌｂｕＭＡＸ、ＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標）Ｉ  Ｌｉｐｉｄ−Ｒｉｃｈ  ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ、１１０２０−０３９）。
【００６７】
【図２６】図２６は、種々の化合物および条件の存在下でのヒト気管支上皮細胞の増殖を示す。ＨＢＥＣ、ヒト管支上皮細胞。Ｍ＊、改変ＭＣＤＢ−１５３培地（９０μＭ  ＣａＣｌ２を有する）＋ＥＧＦ、ａＦＧＦ、Ａ８３−０１、およびＹ−２７６３２。ＥＧＦ、上皮増殖因子。ａＦＧＦ、酸性線維芽細胞増殖因子。ＢＳＡ、脂肪酸非含有ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、Ａ８８０６）。ｒＨＡ、イネにおいて発現された組換えヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、Ａ９７３１）。脂質ミックス、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｇｉｂｃｏ、１１９０５−０３１）。ＡｌｂｕＭＡＸ、ＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標）Ｉ  Ｌｉｐｉｄ−Ｒｉｃｈ  ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ、１１０２０−０３９）。
【００６８】
【図２７】図２７は、種々の継代においてＫＳＦＭ中で増殖させた上皮細胞と比較して、発現レベルが、種々の継代においてＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２中で増殖させた上皮細胞においてダウンレギュレートまたはアップレギュレートされる代表的遺伝子のリストを示す。ｐ２におけるＫＳＦＭ中の遺伝子発現レベルを、１に設定する。正の数は、アップレギュレーションの倍数を示し、負の数は、ダウンレギュレーションの倍数を示す。Ａ、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１。Ｙ、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２。ＫＳＦＭ、ケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。ｐ２、継代２。ｐ６、継代６。ｐ１３、継代１３。ｐ２３、継代２３。
【００６９】
【図２８】図２８は、ＫＳＦＭとＡ８３−０１およびＹ−２７６３２（左側の画像）中で、１ｍＭ  ＣａＣｌ２の添加後（右側の画像）に培養した上皮細胞の挙動の変化を示す。Ａ、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１。Ｙ、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２。ＫＳＦＭ、ケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。
【００７０】
【図２９】図２９は、ＫＳＦＭとＡ８３−０１およびＹ−２７６３２ならびに種々のカルシウム濃度中で培養した気管支上皮細胞のＴＲＡＮＳＷＥＬＬ膜を横切る電気抵抗を示す。Ａ、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１。Ｙ、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２。ＫＳＦＭ、ケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。ＲＡ、オールトランスレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ）。
【００７１】
【図３０】図３０は、イソプロテレノールの漸増濃度を補充した、ＫＳＦＭ（ケラチノサイト−ＳＦＭ）＋Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２中で培養したヒト包皮ケラチノサイト（ＨＦＫ）およびヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）の増殖を示す。
【００７２】
【図３１】図３１は、気管支球状物（ｂｒｏｎｃｈｏｓｐｈｅｒｅ）へのヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）の分化を示す。上のパネルは、低倍率（４×）で見た細胞を示し、下のパネルは、高倍率（２０×）で見た細胞を示す。目に見える内腔を有する大きな気管支球状物は、下のパネルに示される。
【００７３】
【図３２ＡＢ】図３２Ａ〜図３２Ｄは、高濃度のＣａＣｌ２の存在下で、ヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）培養物（図３２Ａ、図３２Ｂ）およびヒト包皮ケラチノサイト（ＨＦＫ）培養物（図３２Ｃ、図３２Ｄ）において形成するドーム様の構造を示す。図３２Ａおよび図３２Ｃは、ウェル全体の肉眼で見える画像である。図３２Ｂおよび図３２Ｄは、小型ドームの３Ｄ様構造を示す顕微鏡画像である。
【図３２ＣＤ】図３２Ａ〜図３２Ｄは、高濃度のＣａＣｌ２の存在下で、ヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）培養物（図３２Ａ、図３２Ｂ）およびヒト包皮ケラチノサイト（ＨＦＫ）培養物（図３２Ｃ、図３２Ｄ）において形成するドーム様の構造を示す。図３２Ａおよび図３２Ｃは、ウェル全体の肉眼で見える画像である。図３２Ｂおよび図３２Ｄは、小型ドームの３Ｄ様構造を示す顕微鏡画像である。
【００７４】
【図３３】図３３は、高濃度のＣａＣｌ２の存在下で分化誘導した後に、ヒト包皮ケラチノサイト（ＨＦＫ）間で形成する密着結合を示す。細胞間密着結合の存在は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、３３９１８８）に結合体化されたモノクローナル抗体を使用する、密着結合タンパク質ＺＯ−１の免疫蛍光染色によって明らかにされる。
【００７５】
【図３４】図３４は、ＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２中で、高濃度のＣａＣｌ２の存在下で、気相液相界面分化（ａｉｒ−ｌｉｑｕｉｄ−ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）において経時的に経膜電気抵抗（ＴＥＥＲ）が増大している、ヒト包皮ケラチノサイト（ＨＦＫ）を示す。液内相は、灰色のボックスによって示される。
【００７６】
【図３５】図３５は、ヒト包皮ケラチノサイト（ＨＦＫ）が、ＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２中の高濃度のＣａＣｌ２の存在下で、気相液相界面分化において経時的に表皮様構造を形成することを示す。角質層、顆粒層、有棘層、および基底層に似た層を有する多層構造が示される。
【００７７】
【図３６】図３６は、ＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１、Ｙ−２７６３２およびイソプロテレノール中のヒト包皮ケラチノサイト（ＨＦＫ）の単一細胞クローニングを示す。
【００７８】
【図３７】図３７は、単一細胞に由来するヒト包皮ケラチノサイト（ＨＦＫ）子孫の細胞形態の異質性を示す。
【００７９】
【図３８】図３８は、ＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１、Ｙ−２７６３２およびイソプロテレノール中で培養したヒト包皮ケラチノサイト（ＨＦＫ）およびヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）の単一細胞コロニー形成効率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
（詳細な説明）
上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法および培地組成物が、本明細書で提供される。上皮細胞（例えば、エキソビボで増殖させた上皮細胞）はしばしば、フィーダー細胞の集団と共培養されるおよび／またはフィーダー細胞由来の馴化培地中で培養される。しかし、フィーダー細胞を拠り所にすることには、上皮細胞をどこでおよびどのようにして培養するかに制限があり得、そして上皮細胞を培養するコストを顕著に増大し得る。フィーダー細胞に由来する規定されていない生物学的因子によって引き起こされる細胞培養物の変動性に起因して、フィーダー細胞の使用は問題ともなり得る。変動性は、一貫しない結果をもたらし得、これは、再現性の欠如に起因してデータ解釈を困難にする。フィーダー細胞はまた、望ましくない因子（例えば、レトロウイルス、他の病原体、および免疫原性の非ヒトシアル酸（例えば、Ｎｅｕ５Ｇｃ））を培養上皮細胞の中に導入する可能性を有する。このような培養条件は、ある特定の適用（例えば、移植のような）に望ましくない可能性がある。
【００８１】
上皮細胞は、代表的には、血清（例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ））を補充した培地中で培養される。しかし、ある特定の場合には、血清は、規定されないマイトジェンの供給源になり得、ロット間変動がしばしば観察される。さらに、血清は、マイコプラズマおよびウイルスのような感染因子で汚染されている可能性がある。従って、血清は、培養培地の規定されていないかつ変動性の成分であり得、血清の使用は、ある特定の培養細胞に関する規定された栄養およびホルモン要件をはっきりさせることを妨げ得る。
【００８２】
上皮細胞は、フィーダー細胞なしの条件下で、１種もしくはこれより多くの増殖因子および１種もしくはこれより多くの規定されていない動物器官抽出物がしばしば補充されている無血清培地で培養され得る。しかし、これらの条件下で培養された上皮細胞は、代表的には、数回の継代後に増殖を停止して、非常に制限された寿命を有し、一般には、エキソビボで大規模には拡大できない。
【００８３】
フィーダー細胞またはフィーダー細胞由来馴化培地を使用することなく、およびある特定の実施形態では、血清を使用することなく、上皮細胞をエキソビボで増殖および拡大させるための方法および培地組成物が、本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、規定された細胞培養条件下で上皮細胞をエキソビボで増殖および拡大させるための方法および培地組成物がまた、本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、本明細書で提供される方法および組成物を使用して、増殖および拡大させた上皮細胞の集団がまた、本明細書で提供される。
【００８４】
上皮細胞
上皮細胞をエキソビボで増殖および拡大させるための方法および組成物が、本明細書で提供される。上皮細胞、または上皮は、代表的には、中空の器官を裏打ちする細胞、ならびに腺および身体の外表面を構成する細胞をいう。上皮細胞は、扁平上皮細胞、円柱上皮細胞、腺腫様上皮細胞または移行上皮細胞を含み得る。上皮細胞は、器官および位置に依存して、単層で配置され得るか、または複数層で配置され得る。
【００８５】
本明細書で記載される上皮細胞は、ケラチノサイト（ＫＥ）上皮細胞または非ケラチノサイト（ＮＫＥ）上皮細胞を含み得る。ケラチノサイトは、解剖学的部位（例えば、皮膚、眼の表面、口腔粘膜、食道および子宮頸部）において見出される扁平上皮を形成する。ケラチノサイトは、平らな、高度に角化した、保護バリアを形成することによって環境および感染からの保護を助ける非生存細胞へと最終分化する。ケラチノサイト上皮細胞の例としては、皮膚ケラチノサイト、眼の上皮細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、食道上皮細胞、および子宮頸部上皮細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
ＮＫＥ細胞は、乳房、前立腺、肝臓、気道、網膜および消化管において見出されるような、身体の上皮を形成する。ＮＫＥ細胞は、代表的には、例えば、吸収および／または分泌において機能する、機能的な生きている細胞へと分化する。これら細胞は、代表的には、扁平上皮細胞に特徴的な高度に角化した構造を形成しない。
【００８７】
本明細書で記載される方法において使用するためのＮＫＥ細胞は、起源が任意のタイプまたは組織であり得る。ＮＫＥ細胞の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：前立腺細胞、乳腺細胞、肝細胞、肝臓上皮細胞、胆管上皮細胞、胆嚢細胞、膵島細胞、膵臓β細胞、膵管上皮細胞、肺上皮細胞、気道上皮細胞、鼻腔上皮細胞、腎臓細胞、膀胱細胞、尿道上皮細胞、胃上皮細胞、大腸上皮細胞、小腸上皮細胞、精巣上皮細胞、卵巣上皮細胞、卵管上皮細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、胸腺細胞、下垂体細胞、腺細胞、羊膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、汗腺上皮細胞、脂腺上皮細胞（ｓｅｂａｃｅｏｕｓ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）および毛包細胞。いくつかの実施形態において、ＮＫＥ細胞は、腸上皮細胞を含まない。
【００８８】
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、基底上皮細胞を含む。基底上皮細胞は、一般に、重層上皮および多層上皮の最深部層にある細胞である。基底上皮細胞は、多列上皮における基底板の近くに核が位置する細胞であり得る。場合によっては、基底上皮細胞は、（例えば、非対称細胞分裂または対称細胞分裂によって）分裂して、他の基底細胞および／または他の上皮細胞タイプ（例えば、重層上皮、多層上皮または多列上皮の中の他の細胞タイプ）を生じ得る。ある上皮の中の基底上皮細胞の割合は、終生の自己再生能力を有し得、他の上皮細胞タイプおよび基底細胞を生じ得、ときおり、上皮幹細胞と見做される。終生の自己再生能力を有し、上皮幹細胞と見做される基底上皮細胞の割合は、種々の組織の中で変動する。
【００８９】
上皮細胞は、被験体および／または細胞供給源から得られ得る。被験体および／または細胞供給源から得られる細胞は、起源上皮細胞集団（ｏｒｉｇｉｎａｔｉｎｇ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）といわれ得る。起源上皮細胞集団は、本明細書で記載される培養条件（例えば、拡大培養条件、フィーダー細胞なしの拡大条件）によって拡大するための上皮細胞の投入集団である。細胞供給源は、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの集団を含み得る。いくつかの実施形態において、起源上皮細胞集団は、胚または胚に由来する幹細胞培養物から単離される。いくつかの実施形態において、起源上皮細胞集団は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）培養物から単離される。起源上皮細胞集団は、種々の様式で被験体から得られ得る（例えば、生きている組織から採取される（例えば、生検、引き抜いた毛包、尿または体腔流体のような体液）か、または循環から単離される）。被験体は、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、非ヒト霊長類およびヒトのような任意の哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない任意の動物を含み得る。ある特定の実施形態において、被験体は、ヒトである。いくつかの実施形態において、被験体は、子宮環境中にある胚より長く懐胎されている動物またはヒトであり、しばしば、出生後のヒトまたは出生後の動物（例えば、新生児のヒト、新生仔の動物、成人および成体動物）である。代表的には、被験体は、胚ではない。被験体は、ときおり、若年の動物、若年のヒト、成体動物または成人である。
【００９０】
いくつかの実施形態において、起源上皮細胞集団は、被験体由来のサンプルから単離される。サンプルは、被験体またはその一部から単離または得られる任意の標本を含み得る。標本の非限定的な例としては、被験体由来の流体または組織（血液または血液製品（例えば、血清、血漿など）、臍帯血、骨髄、絨毛膜絨毛、羊水、脳脊髄液、脊髄液、洗浄液（例えば、気管支肺胞、胃、腹腔、管、耳、関節鏡）、生検サンプルまたは組織生検材料、口内スワブ、体腔穿刺（ｃｅｌｏｃｅｎｔｅｓｉｓ）サンプル、雌性の生殖路の洗浄物、尿、糞便、痰、唾液、鼻腔粘液、前立腺液、洗浄物、精液、リンパ液、胆汁、涙、汗、母乳、乳汁、硬組織（例えば、肝臓、脾臓、腎臓、肺、または卵巣）などまたはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられる。用語血液は、全血、血液製品または任意の血液画分（例えば、血清、血漿、バフィーコートまたは従来定義されたとおりの類似物）を包含する。血漿は、抗凝固薬で処理した血液の遠心分離から生じる全血の画分をいう。血清は、血液サンプルが凝固した後に残る流体の水分の多い部分をいう。いくつかの実施形態において、胎児細胞は、母体サンプル（例えば、母体血液、羊水）から単離される。
【００９１】
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、通常の健康な細胞（例えば、病的でない細胞）を含み得る。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、遺伝的に変化していない細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、病的なおよび／または遺伝的に変化したものを含み得る。病的な上皮細胞としては、疾患を引き起こす変異を有する被験体に由来する細胞（例えば、ＣＦＴＲ遺伝子に遺伝子変異を有する上皮細胞）が挙げられ得る。病的な上皮細胞は、異常な組織に由来する（例えば、新形成、過形成、悪性腫瘍または良性腫瘍に由来する）細胞を含み得る。ある特定の実施形態において、病的な上皮細胞は、腫瘍細胞でない細胞を含み得る。ある特定の実施形態において、病的な上皮細胞は、被験体の循環から単離された細胞（例えば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ））を含み得る。ある特定の実施形態において、病的な上皮細胞は、身体サンプル（例えば、尿、精液、便（糞便）など）から単離された細胞を含み得る。
【００９２】
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、初代細胞を含む。いくつかの実施形態において、起源上皮細胞集団は、初代細胞を含む。初代上皮細胞は、生きている組織（例えば、生検、引き抜いた毛包、身体のサンプル（例えば、便サンプル、尿、精液または体腔の流体のような体液など））から直接採取されるか、または循環から単離される。ある特定の場合には、初代細胞は、継代されていない。ある特定の場合には、初代細胞は、一度継代されている。初代細胞は、分化した組織から単離（例えば、種々の器官の上皮から単離）され得る。代表的には、初代細胞は、例えば、組織消化を通じて新たに単離され、プレーティングされている。初代細胞は、凍結されてもされなくてもよいし、その後に解凍されてもされなくてもよい。さらに、初代細胞が単離された組織は、処理する直前に、ある他の様式で凍結または保存されてもよいし、そうでなくてもよい。代表的には、細胞が１回より多く継代された後には、上記細胞はもはや初代細胞ではない。１回以上継代されかつ継代後に直ぐ凍結された細胞も、解凍された場合には、初代細胞と見做されない。ある特定の実施形態において、上皮細胞は、最初は初代細胞であり、本明細書で記載される方法の使用を通じて、継代後に非初代細胞になる。いくつかの実施形態において、起源上皮細胞集団の細胞は、分化した組織から上記細胞が単離された後かつ上記起源上皮細胞集団と本明細書で記載される培養条件（例えば、本明細書で記載される拡大培養条件）とを接触させる前に、細胞培養物中で維持または増殖させられる。
【００９３】
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、非初代細胞（例えば、樹立された細胞株、形質転換された細胞、以前に凍結されたコレクションから解凍された細胞などに由来する細胞）を含む。ある特定の実施形態において、上皮細胞は、二次的細胞を含む。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、樹立された細胞株に由来する細胞を全く含まない。
【００９４】
いくつかの実施形態において、培養組成物は、同じ組織または同じ組織区画に由来する上皮細胞の異質な集団を含む（例えば、上皮幹細胞、上皮前駆細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）、上皮前駆体細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）、系統拘束された上皮細胞、遷移増殖中の（ｔｒａｎｓｉｔ−ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ）上皮細胞、分化中の上皮細胞、分化した上皮細胞、および最終分化した上皮細胞のような細胞タイプおよび／または分化状態の混合物を含む）。いくつかの実施形態において、培養組成物は、同じ組織または同じ組織区画に由来する上皮細胞の同質の集団を含む（例えば、細胞タイプおよび／または分化状態の混合物を含まない）。いくつかの実施形態において、上皮細胞の同質の集団は、同じ細胞タイプであるおよび／または同じ分化状態で存在する、少なくとも約９０％の上皮細胞を含む。例えば、上皮細胞の同質の集団は、同じ細胞タイプであるおよび／または同じ分化状態で存在する、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の上皮細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、上皮細胞の同質の集団は、同じ細胞タイプであるおよび／または同じ分化状態で存在する、約１００％の上皮細胞を含む。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、基底上皮細胞の同質の集団である。いくつかの実施形態において、起源上皮細胞集団は、異質であってもよいし、同質であってもよい。いくつかの実施形態において、拡大した上皮細胞集団は、異質であってもよいし、同質であってもよい。
【００９５】
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、上皮細胞の集団に含まれるか、または上記集団にはない、細胞タイプおよび／または分化状態によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、このような細胞特徴付けは、起源上皮細胞集団に適用可能であり得る。いくつかの実施形態において、このような細胞特徴付けは、拡大した上皮細胞集団に適用可能であり得る。いくつかの実施形態において、このような細胞特徴付けは、起源上皮細胞集団および拡大した上皮細胞集団に適用可能であり得る。いくつかの実施形態において、特定の細胞タイプおよび／または分化状態を含む上皮細胞は、特定の細胞タイプおよび／または分化状態である少なくとも約５０％の上皮細胞を含む。いくつかの実施形態において、特定の細胞タイプおよび／または分化状態を含む上皮細胞は、特定の細胞タイプおよび／または分化状態である少なくとも約９０％の上皮細胞を含む。例えば、特定の細胞タイプおよび／または分化状態を含む上皮細胞は、特定のタイプおよび／または分化状態である少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の上皮細胞を含み得る。一般に、特定の細胞タイプおよび／または分化状態を含まない上皮細胞は、特定の細胞タイプおよび／または分化状態である約１０％未満の細胞を含む。例えば、特定の細胞タイプおよび／または分化状態を含まない上皮細胞は、特定の細胞タイプおよび／または分化状態である約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満の細胞を含み得る。
【００９６】
ある特定の実施形態において、培養組成物または集団は、「多数派の細胞（ｍａｊｏｒｉｔｙ  ｃｅｌｌ）」と本明細書以降でいわれる上皮細胞の特定のタイプから本質的になる。このような培養組成物は、「少数派の細胞（ｍｉｎｏｒｉｔｙ  ｃｅｌｌ）」と本明細書以降でいわれる１種もしくはこれより多くの他のタイプの上皮細胞を少量含み得る。少数派の細胞は、代表的には、多数派の細胞と同じ組織に由来するかまたはこの組織から得られ、しばしば、この多数派の細胞と同じ組織区画に由来するかまたはこの組織区画から得られる。多数派の細胞は、組成において全細胞のうちの５０％超、６０％超、７０％超、または８０％超であり得、しばしば、組成において全細胞のうちの約９０％もしくはこれより多く、ときおり、組成または集団において全細胞のうちの約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％もしくはこれより多い。
【００９７】
いくつかの実施形態において、培養組成物は、種々の細胞周期のフェーズ（例えば、Ｍ期、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、ならびに老化および静止状態を含むＧ０期）にある上皮細胞の異質な集団を含む。いくつかの実施形態において、起源上皮細胞集団は、種々の細胞周期のフェーズ（例えば、Ｍ期、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、ならびに老化および静止状態を含むＧ０期）にある上皮細胞の異質な集団を含む。いくつかの実施形態において、拡大した上皮細胞集団は、種々の細胞周期のフェーズ（例えば、Ｍ期、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、ならびに老化および静止状態を含むＧ０期）にある上皮細胞の異質な集団を含む。特定の細胞周期のフェーズにある上皮細胞は、その集団のうちの１〜１００％を構成し得る。
【００９８】
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、１種もしくはこれより多くの分化ステージにある細胞を含む。いくつかの実施形態において、このような分化ステージは、起源上皮細胞集団について記載され得る。いくつかの実施形態において、このような分化ステージは、拡大した上皮細胞集団について記載され得る。いくつかの実施形態において、このような分化ステージは、起源上皮細胞集団および拡大した上皮細胞集団について記載され得る。例えば、上皮細胞（または上皮細胞の集団）は、上皮幹細胞、上皮前駆細胞、系統限定された上皮前駆細胞、上皮前駆体細胞、系統拘束された上皮細胞、遷移増殖中の上皮細胞、増殖中の上皮細胞、分化中の上皮細胞、分化した上皮細胞、静止した上皮細胞、以前は静止していた上皮細胞、増殖していない上皮細胞、および最終分化した上皮細胞（例えば、組織および器官において見出される細胞）を含み得る。上皮細胞はまた、多能性幹細胞（胚性幹（ＥＳ）細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ））から分化したおよび／または由来した、系統拘束された上皮細胞を含み得る。
【００９９】
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、分化した上皮細胞を含む。分化した上皮細胞は、分裂し得るが、代表的には、無期限に自己再生する能力は有しない。いくつかの実施形態において、分化した上皮細胞は、複数の組織タイプへと分化する能力を獲得しない。本明細書で記載される条件において培養した分化した上皮細胞は、一般に、未分化細胞（例えば、幹細胞（胚性または成体）、前駆細胞、前駆体細胞）よりは分化しており、かつ最終分化した細胞よりは分化していない。分化した上皮細胞は、一般に、幹細胞（胚性または成体）も前駆細胞も前駆体細胞も含まない。ある特定の場合には、分化した上皮細胞は、「組織特異的」および／または「系統拘束された」上皮細胞といわれ得る。ある特定の場合には、分化した上皮細胞は、組織特異的なおよび／または系統拘束された上皮細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、分化した上皮細胞は、静止した上皮細胞を含む。いくつかの実施形態において、分化した上皮細胞は、基底上皮細胞を含む。
【０１００】
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、静止したまたは以前は静止していた細胞を含む。静止した細胞は、一般に、増殖していない細胞（すなわち、周期がまわっていない細胞、細胞周期から離れた細胞、休止細胞）であり、可逆的に増殖が停止しているとして特徴付けられ得る。ある特定の条件下では、静止した細胞は、増殖するように誘導され得る。静止した細胞は、細胞周期のＧ０期に存在するとして特徴付けられ得る。増殖するように誘導された静止した細胞は、以前は静止していた細胞といわれ得る。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、器官特異的上皮細胞を含む。器官特異的上皮細胞は、ときおり、組織特異的上皮細胞といわれる。いくつかの実施形態において、器官特異的上皮細胞は、所定の器官内でより特異的な細胞タイプへと分化し得るが、一般には、他のタイプの器官の細胞へと分化する能力を有しないかまたは獲得しない。器官特異的上皮細胞は、一般に、未分化細胞（例えば、幹細胞（胚性または成体））よりは分化しており、かつ最終分化した細胞よりは分化していない。器官特異的上皮細胞は、一般に、胚性幹細胞を含まない。器官特異的上皮細胞は、成体幹細胞（例えば、成体上皮幹細胞）を含んでいてもいなくてもよく、器官特異的上皮細胞は、前駆細胞または前駆体細胞を含んでいてもいなくてもよい。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、系統拘束された上皮細胞を含む。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、多能性幹細胞（例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ））から分化した系統拘束された上皮細胞を含み得る。系統拘束された上皮細胞は、分裂し得るが、代表的には、無期限に自己再生する能力は有しない。いくつかの実施形態において、系統拘束された上皮細胞は、所定の細胞系統（例えば、呼吸系統、消化系統または外皮系統）内の種々の細胞タイプへと分化し得るが、一般には、異なる細胞系統の細胞へと分化する能力は有しないかまたは獲得しない（例えば、外皮系統拘束された上皮細胞は、一般には、血球へは分化しない）。系統拘束された上皮細胞は、一般に、未分化の多能性幹細胞よりは分化しており、かつ最終分化した細胞よりは分化していない。系統拘束された上皮細胞は、一般に、多能性幹細胞（胚性または人工多能性）を含まない。いくつかの実施形態において、系統拘束された上皮細胞は、前駆細胞または前駆体細胞を含む。いくつかの実施形態において、系統拘束された上皮細胞は、基底上皮細胞を含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、最終分化した上皮細胞を含まない。最終分化した上皮細胞は、一般に分裂せず、特定の機能に拘束されている。最終分化した上皮細胞は一般に、細胞周期から最終的に逸脱していることによって特徴付けられ、代表的には、増殖するように誘導できない。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、最終分化した胃上皮細胞、腸上皮細胞、および／または膵臓上皮細胞を含まない。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、有糸分裂後細胞を含まない。有糸分裂後細胞は一般に、細胞分裂の能力がないか、またはもはや細胞分裂できない。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、老化した細胞を含まない。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、胚性幹細胞を含まない。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、胚性幹細胞から分化しているおよび／または由来している。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、胚性幹細胞に由来しない。一般に、胚性幹細胞は、無期限に再生するかまたは自己再生する能力を有する未分化細胞である。胚性幹細胞は、ときおり、多能性と見做され（すなわち、成体の生物の多くのまたは全ての細胞タイプへと分化し得る）、ときおり、全能性と見做される（すなわち、胎盤組織を含む全ての細胞タイプへと分化し得る）。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含まない。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化しているおよび／または由来している。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来しない。一般に、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、成体の細胞から直接生成され得る多能性幹細胞の１タイプである。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、多能性細胞を含まない。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、全能性細胞を含まない。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、成体幹細胞を含む。成体幹細胞は、代表的には、分化した細胞、器官特異的細胞または系統拘束された細胞よりは分化しておらず、かつ胚性幹細胞よりは分化している。成体幹細胞は、幹細胞、未分化幹細胞、前駆体細胞および／または前駆細胞といわれ得、成体幹細胞は胚から単離されないので、胚性幹細胞と見做されない。成体上皮幹細胞は、上皮幹細胞、未分化上皮幹細胞、上皮前駆体細胞および／または上皮前駆細胞細胞といわれ得る。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、成体幹細胞または成体幹細胞に由来する細胞を含まない。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、上皮幹細胞または上皮幹細胞に由来する細胞を含まない。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、多能性上皮幹細胞または多能性上皮幹細胞に由来する細胞を含まない。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、前駆細胞または前駆細胞に由来する細胞を含まない。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、前駆体細胞または前駆体細胞に由来する細胞を含まない。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、連続して増殖している（例えば、インビボで連続して増殖している）上皮幹細胞（例えば、腸陰窩細胞；Ｌｇｒ５＋細胞）または連続して増殖している上皮幹細胞に由来する細胞を含まない。いくつかの実施形態において、起源細胞、または起源細胞が採取された組織は、連続して増殖している上皮幹細胞（例えば、腸陰窩細胞；Ｌｇｒ５＋細胞）を含まず、本明細書中の方法は、このような細胞タイプを選択する工程を包含しなくてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、方法は、連続して増殖している上皮幹細胞を選択する工程および／または連続して増殖している上皮幹細胞のインビボ集団（すなわち、採取前に被験体の中で連続して増殖している上皮幹細胞の集団）を選択する工程を包含しない。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、オルガノイドを形成する能力を獲得しない。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、最初の単離およびプレーティングの際に、完全に未分化の細胞ではない。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、上記細胞が１種もしくはこれより多くのマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有するかおよび／またはある特定のマーカーの測定可能なレベルを有しないか、もしくはその低レベルを有するかによって特徴付けられ得る。いくつかの実施形態において、このようなマーカー特徴付けは、起源上皮細胞集団に適用可能であり得る。いくつかの実施形態において、このようなマーカー特徴付けは、拡大した上皮細胞集団に適用可能であり得る。いくつかの実施形態において、このようなマーカー特徴付けは、起源上皮細胞集団および拡大した上皮細胞集団に適用可能であり得る。
【０１０８】
ある特定の場合には、発現（例えば、ｍＲＮＡ発現）のレベルは、マーカーに関して決定される。ｍＲＮＡ発現のレベルは、ｍＲＮＡ発現を検出および測定するための任意の適した方法を使用して決定され得る。例えば、発現レベルは、Ｃｔ遺伝子値に従って定量的逆転写ＰＣＲによって決定され得る。ここでＣｔ遺伝子は、規定された（例えば、検出可能な）閾値を横切るために、定量的ＰＣＲ反応の蛍光シグナルのために必要とされるサイクル数である。一般に、マーカーの発現は、Ｃｔ遺伝子が３５より高い場合には、存在しないとみなされる。マーカーの発現レベルは、Ｃｔ遺伝子が３５より小さく３０より大きいかまたはこれに等しい場合に、低いと見做される。マーカーの発現レベルは、Ｃｔ遺伝子が２９より小さく２２より大きいかまたはこれに等しい場合に、中程度または適度と見做される。マーカーの発現レベルは、Ｃｔ遺伝子が２２より小さい場合に高いと見做される。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、特定の細胞タイプおよび／または分化状態と代表的には関連するマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、特定の細胞タイプおよび／または分化状態と代表的には関連するマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有しない。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、特定の細胞タイプおよび／または分化状態と代表的には関連しないマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、未分化幹細胞と代表的には関連しないマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、基底上皮細胞と代表的には関連する１種もしくはこれより多くのマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、分化した上皮細胞と代表的には関連する１種もしくはこれより多くのマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、気道上皮細胞および／またはケラチノサイト細胞と代表的には関連する１種もしくはこれより多くのマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有する。マーカーの中程度レベルから高レベルは、場合によっては存在し得る。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、ある特定の細胞タイプ（例えば、多能性幹細胞、最終分化した上皮細胞、老化細胞、胃上皮細胞、腸上皮細胞、膵臓上皮細胞、線維芽細胞、および／または腸杯細胞のような）と代表的には関連する１種もしくはこれより多くのマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）の測定可能なレベルを有しないかまたは低レベルを有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、細胞接着および／またはストレス応答と代表的には関連する１種もしくはこれより多くのマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）の測定可能なレベルを有しないかまたは低レベルを有する。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、器官特異的上皮細胞は、他の器官に由来する細胞タイプと代表的には関連する１種もしくはこれより多くのマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）の測定可能なレベルを有しないかまたは低レベルを有する。例えば、気道上皮細胞は、胃上皮細胞、腸上皮細胞、膵臓上皮細胞、線維芽細胞、および／または腸杯細胞と代表的には関連する１種もしくはこれより多くのマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）の測定可能なレベルを有さなくてもよいか、または低レベルを有し得る。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、基底上皮細胞と代表的には関連する１種もしくはこれより多くのマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）（例えば、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ４、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ５およびＴＰ６３のような）を有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、分化した上皮細胞と代表的には関連する１種もしくはこれより多くのマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）（例えば、ＫＲＴ４、ＫＲＴ６およびＫＲＴ８のような）を有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、気道上皮細胞と代表的には関連する１種もしくはこれより多くのマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）（例えば、ＨＥＹ２、ＮＧＦＲおよびＢＭＰ７のような）を有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、ケラチノサイト細胞と代表的には関連する１種もしくはこれより多くのマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）（例えば、ＺＦＰ４２のような）を有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、１種もしくはこれより多くのマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有する（例えば、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＩＴＥＤ２、ＣＲＥＧ１、ＩＤ１、ＭＡＰ２Ｋ６、ＩＧＦＢＰ３およびＩＧＦＢＰ５のような）。このようなマーカーの中程度のレベルから高レベルが、場合によっては存在し得る。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、上皮幹細胞と代表的には関連する１種もしくはこれより多くのマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）（例えば、ＬＧＲ５のような）の測定可能なレベルを有しないかまたは低レベルを有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、多能性幹細胞と代表的には関連する１種もしくはこれより多くのマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）（例えば、ＬＩＮ２８Ａ、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４およびＳＯＸ２のような）の測定可能なレベルを有しないかまたは低レベルを有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、最終分化した上皮細胞と代表的には関連する１種もしくはこれより多くのマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）（例えば、ＣＦＴＲ、ＦＯＸＪ１、ＩＶＬ、ＫＲＴ１、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ２０、ＬＯＲ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ＳＣＧＢ１Ａ１、ＳＦＴＰＢおよびＳＦＴＰＤのような）の測定可能なレベルを有しないかまたは低レベルを有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、細胞老化と代表的には関連する１種もしくはこれより多くのマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）（例えば、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＬＢ１、ＰＬＡＵ、ＳＥＲＰＩＮＥ１およびＳＯＤ２のような）の測定可能なレベルを有しないかまたは低レベルを有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、細胞接着と代表的には関連する１種もしくはこれより多くのマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）（例えば、接着分子ＦＮ１およびＴＨＢＳ１のような）の測定可能なレベルを有しないかまたは低レベルを有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、細胞フィラメントと代表的には関連する１種もしくはこれより多くのマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）（例えば、中間フィラメントタンパク質ビメンチン（ＶＩＭ）のような）の測定可能なレベルを有しないかまたは低レベルを有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、胃上皮細胞、腸上皮細胞、または膵臓上皮細胞と代表的には関連する１種もしくはこれより多くのマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）（例えば、ＣＤ３４、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＩＨＨ、ＫＩＴ、ＬＧＲ５、ＰＤＸ１、およびＰＲＯＭ１／ＣＤ１３３のような）の測定可能なレベルを有しないかまたは低レベルを有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、線維芽細胞と代表的には関連する１種もしくはこれより多くのマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）（例えば、ＺＥＢ１およびＺＥＢ２のような）の測定可能なレベルを有しないかまたは低レベルを有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、腸杯細胞と代表的には関連する１種もしくはこれより多くのマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）（例えば、ＫＲＴ２０のような）の測定可能なレベルを有しないかまたは低レベルを有する。
【０１１３】
細胞培養
細胞培養のための方法および組成物が本明細書で提供される。特に、拡大培養条件が本明細書で提供される。細胞培養、または培養は、代表的には、人工的なインビトロ環境における細胞の維持、または外部のエキソビボ環境（すなわち、生物の外側）における細胞の維持をいい、個々の細胞および組織の培養を包含し得る。本明細書で記載されるある特定の細胞培養システムは、エキソビボ環境および／またはインビトロ環境であり得る。いくつかの実施形態において、初代細胞が単離される。いくつかの実施形態において、初代細胞は、単一針生検を使用して単離され得る。いくつかの実施形態において、初代細胞は、組織生検を使用して単離され得る。いくつかの実施形態において、初代細胞は、引き抜いた毛髪から単離され得る。いくつかの実施形態において、初代細胞は、尿または体腔の流体のような体液から単離され得る。いくつかの実施形態において、初代細胞は、被験体の循環から単離され得る。
【０１１４】
単離後、細胞材料は洗浄され得る（例えば、生理食塩水および／またはＰＢＳ溶液で）。細胞材料は、酵素溶液（例えば、コラゲナーゼ、ディスパーゼおよび／またはトリプシンのような）で処理されて、組織マトリクスからの細胞の解離を促進し得る。例えば、ディスパーゼは、上皮をその下にある組織から解離するために使用され得る。次に、インタクトな上皮は、例えば、トリプシンまたはコラゲナーゼで処理され得る。このような消化工程はしばしば、解離した細胞および組織マトリクスを含むスラリーを生じる。このスラリーは、次いで、スラリーの残りから細胞を分離するために十分な力で遠心分離され得る。細胞ペレットは、次いで、除去され得、緩衝液および／または生理食塩水および／または細胞培養培地で洗浄され得る。この遠心分離および洗浄は、任意の回数、反復され得る。次いで、最後の洗浄後、細胞は、任意の適切な細胞培養培地で洗浄され得る。ある特定の場合には、消化および洗浄工程は、上記細胞が、単離の際にその下にある組織から十分に分離される場合にはおこなわれなくてもよい（例えば、循環からまたは針生検を使用して単離された細胞に関して）。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞のような細胞は、被験体の循環から単離され得る。ある特定の実施形態において、腫瘍細胞は、ある特定のタイプの腫瘍細胞上で特異的に発現される細胞マーカーに従って単離され得る（例えば、Ｌｕ．  Ｊ．，ら，  Ｉｎｔ’ｌ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  １２６（３）：６６９−６８３  （２０１０）およびＹｕ，  Ｍ．，ら，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １９２（３）：  ３７３−３８２  （２０１１）を参照のこと。これらは、参考として援用される）。細胞を、電子式細胞計数器（例えば、コールターカウンター）を使用して計数されてもそうでなくてもよいか、またはそれらは、血球計算板を使用して手動で計数されてもよい。
【０１１５】
細胞播種密度は、ある特定の望ましい培養条件に従って調節され得る。例えば、約１×１０３  細胞／ｃｍ２から約１〜１０×１０５  細胞／ｃｍ２までの初期播種密度が、使用され得る。いくつかの実施形態において、約１〜１０から約１〜１０×１０５  細胞／ｃｍ２までの初期播種密度が使用され得る。ある特定の場合には、１×１０６  細胞が、７５ｃｍ２  培養フラスコ中で培養され得る。細胞密度は、任意の継代で必要とされる場合には変化させられ得る。
【０１１６】
細胞は、約３７℃において通常の大気圧で、細胞インキュベーター中で培養され得る。このインキュベーター雰囲気は加湿され得、空気中約３〜１０％  二酸化炭素を含み得る。場合によっては、このインキュベーター雰囲気は、約０．１〜３０％  酸素を含み得る。温度、圧力、ならびに二酸化炭素および酸素濃度は、必要に応じて変化させられ得る。培養培地ｐＨは、約７．１〜約７．６、または約７．１〜約７．４、または約７．１〜約７．３の範囲の中にあり得る。
【０１１７】
細胞培養培地は、１〜２日ごと、または必要に応じてより高頻度もしくは低頻度で交換され得る。細胞が培養容器中でコンフルエントに近づいたとき、それらは、継代され得る。細胞継代は、細胞を分割または分配し、その細胞の一部を新しい培養容器または培養環境へと移すことである。細胞培養表面に接着している細胞は、剥離を要し得る。接着性の細胞を培養容器の表面から剥離するための方法は、周知であり、トリプシンのような酵素の使用を包含し得る。
【０１１８】
単一継代とは、細胞を一度分割または手動で分配し、少数の細胞を新しい容器または環境へと移すことをいう。継代する場合、細胞を任意の比で分割し得、その細胞が付着および増殖することを可能にする。例えば、単一継代において、上記細胞は、１：２の比、１：３の比、１：４の比、１：５の比などで分割され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、少なくとも約１回〜少なくとも約３００回継代される。例えば、細胞は、少なくとも約２回、５回、１０回、２０回、３０回、４０回、５０回、６０回、７０回、８０回、９０回、１００回、２００回または３００回、継代され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、少なくとも約１５回継代される。いくつかの実施形態において、細胞は、少なくとも約２５回継代される。
【０１１９】
細胞増殖は、一般に、１個の母細胞が２個の娘細胞へと分裂するような細胞分裂に言及する。細胞増殖は、細胞拡大といわれ得る。細胞増殖は、本明細書では一般に、細胞の実際のサイズ（例えば、直径、体積）の増大には言及しない。細胞増殖の刺激は、細胞集団（例えば、細胞集団倍加）を経時的にプロットすることによって評価され得る。より勾配が大きい増殖曲線を有する細胞集団は、一般に、より勾配が小さい曲線を有する細胞集団より増殖が早いと見做される。増殖曲線は、同じ細胞タイプの間で種々の処理に関して比較され得るか、または増殖曲線は、例えば、同じ条件で異なる細胞タイプに関して比較され得る。
【０１２０】
細胞の集団を拡大することは、集団倍加として表され得る。細胞集団倍加は、細胞数が倍加するように、培養物中の細胞が分裂する場合に起こる。場合によっては、細胞は、細胞の集団がいくつかの他の要因によって倍加したか、３倍になったか、または複数倍になったか否かを決定するために計数される。集団倍加の数は、細胞培養物が継代される回数に等しくなくてもよい。例えば、１：３比でさらなる培養のために細胞を継代し、それらを分割することは、３倍になった細胞集団に等しくなくてもよい。集団倍加（ＰＤ）の計算に使用され得る式は、方程式Ａで表される：
ｎ＝３．３２×（ｌｏｇＹ−ｌｏｇＩ）＋Ｘ                      方程式Ａ
【０１２１】
ここでｎ＝採取されるかまたは継代される場合の細胞培養の最終ＰＤ数、Ｙ＝採取時または継代時の細胞収量、Ｉ＝その細胞培養を開始するために接種物として使用される細胞数、およびＸ＝継代培養を開始するために使用される起源細胞培養のＰＤ数。
【０１２２】
細胞の集団は、ある特定の期間にわたってある特定の回数、倍加し得る。いくつかの実施形態において、細胞の集団は、ある特定の期間にわたって、少なくとも約１回〜少なくとも約５００回倍加し得るかまたは倍加する。例えば、細胞の集団は、少なくとも約２回、５回、１０回、２０回、３０回、４０回、５０回、６０回、７０回、８０回、９０回、１００回、１１０回、１２０回、１３０回、１４０回、１５０回、１６０回、１７０回、１８０回、１９０回、２００回、２５０回、３００回、３５０回、４００回、４５０回または５００回倍加し得るかまたは倍加するものであってよい。いくつかの実施形態において、細胞集団は、少なくとも２０回倍加し得るかまたは倍加する。いくつかの実施形態において、細胞集団は、少なくとも５０回倍加し得るかまたは倍加する。いくつかの実施形態において、細胞集団は、少なくとも６０回倍加し得るかまたは倍加する。いくつかの実施形態において、細胞集団は、少なくとも７０回倍加し得るかまたは倍加する。いくつかの実施形態において、細胞集団は、少なくとも８０回倍加し得るかまたは倍加する。いくつかの実施形態において、細胞集団は、少なくとも９０回倍加し得るかまたは倍加する。いくつかの実施形態において、細胞集団は、少なくとも１００回倍加し得るかまたは倍加する。いくつかの実施形態において、細胞集団は、少なくとも１２０回倍加し得るかまたは倍加する。いくつかの実施形態において、細胞集団は、少なくとも１５０回倍加し得るかまたは倍加する。いくつかの実施形態において、細胞集団は、少なくとも２００回倍加し得るかまたは倍加する。いくつかの実施形態において、細胞の集団は、約１日〜約５００日の期間にわたってある特定の回数、倍加するか、倍加し得る。例えば、細胞の集団は、約２日、５日、１０日、２０日、３０日、４０日、５０日、６０日、７０日、８０日、９０日、１００日、１１０日、１２０日、１３０日、１４０日、１５０日、１６０日、１７０日、１８０日、１９０日、２００日、２５０日、３００日、３５０日、４００日、４５０日または５００日の期間にわたってある特定の回数、倍加するか、倍加し得るものであってよい。いくつかの実施形態において、細胞の集団は、約５０日の期間にわたってある特定の回数、倍加するか、倍加し得る。いくつかの実施形態において、細胞の集団は、約１００日の期間にわたってある特定の回数、倍加するか、倍加し得る。いくつかの実施形態において、細胞の集団は、約１５０日の期間にわたってある特定の回数、倍加するか、倍加し得る。いくつかの実施形態において、細胞の集団は、約２００日の期間にわたってある特定の回数、倍加するか、倍加し得る。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、細胞の集団を拡大する工程を包含する。細胞の集団を拡大する工程は、細胞の集団を増殖させる工程ともいわれ得る。細胞の集団を拡大する工程は、細胞数の増大倍数（ｆｏｌｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ）として表され得る。集団倍加の関数として増大倍数の計算に使用され得る式は、方程式Ｂで表される：
Ｆ＝２ｎ              方程式Ｂ
【０１２４】
ここでＦ＝ｎ回の集団倍加後の細胞数における増大倍数。例えば、１回の（１）集団の倍加の後、細胞数は、２倍増大し、２回の（２）集団の倍加の後、細胞数は、４（２２＝４）倍増大し、３回の（３）集団の倍加の後、細胞数は、８（２３＝８）倍増大するなど。よって、２０回の（２０）集団の倍加の後、細胞数は、１００万倍より大きく（２２０＝１，０４８，５７６）増大し、３０回の（３０）集団の倍加の後、細胞数は、１０億倍より大きく（２３０＝１，０７３，７４１，８２４）増大し、４０回の（４０）集団の倍加の後、細胞数は、１兆倍より大きく（２４０＝１，０９９，５１１，６２７，７７６）増大するなど。いくつかの実施形態において、細胞の集団は、少なくとも約２倍〜少なくとも約１兆倍、拡大されるか、または拡大され得る。例えば、細胞の集団は、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１，０００倍、少なくとも約１０，０００倍、少なくとも約１００，０００倍、少なくとも約１００万倍、少なくとも約１０億倍、または少なくとも約１兆倍、拡大され得る。特定の倍数拡大（ｆｏｌｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）は、例えば、２日間、３日間、４日間、５日間、１０日間、２０日間、３０日間、４０日間、５０日間、１００日間もしくはこれより長くのような培養中のある特定の期間にわたって起こり得る。
【０１２５】
細胞は、連続して増殖され得るかまたは連続して培養され得る。連続増殖または連続培養とは、細胞が連続して分裂し、細胞培養容器中でコンフルエントに達するかまたは近づき、その結果、上記細胞がそれらの健康を維持するために、継代および新鮮な培地の添加を要することをいう。連続して増殖した細胞または連続して培養された細胞は、不死化細胞に類似しているか、または不死化細胞と同じである特徴を有し得る。いくつかの実施形態において、細胞は、少なくとも約５継代〜少なくとも約３００継代にわたって、増殖および分裂し続ける。例えば、細胞は、少なくとも約１０継代、少なくとも約２０継代、少なくとも約３０継代、少なくとも約４０継代、少なくとも約５０継代、少なくとも約６０継代、少なくとも約７０継代、少なくとも約８０継代、少なくとも約９０継代、少なくとも約１００継代、少なくとも約２００継代または少なくとも約３００継代にわたって、増殖および分裂し続け得る。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、初期の収集およびプレーティングの際には、上皮細胞の異質な集団であり、１回もしくはこれより多くの継代後に、上皮細胞の均質な集団になる。例えば、上皮細胞の異質な集団は、２継代後、３継代後、４継代後、５継代後、１０継代後、２０継代後、３０継代後、４０継代後、５０継代後、または１００継代後、もしくはより多くの継代後に、上皮細胞の均質な集団になり得る。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、初期の収集およびプレーティングのときに、上皮細胞の集団中に含まれるか、またはこの集団にない、細胞タイプおよび／または分化状態によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、１回もしくはこれより多くの継代後の上皮細胞の集団中に含まれるか、またはこの集団にない、細胞タイプおよび／または分化状態によって特徴付けられる。例えば、上皮細胞は、２継代後、３継代後、４継代後、５継代後、１０継代後、２０継代後、３０継代後、４０継代後、５０継代後、または１００継代後、もしくはこれより多くの継代後に、上皮細胞の集団中に含まれるか、またはこの集団にない、細胞タイプおよび／または分化状態によって特徴付けられ得る。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、起源上皮細胞集団中に含まれる細胞タイプおよび／または分化状態によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、拡大した上皮細胞集団中に含まれる細胞タイプおよび／または分化状態によって特徴付けられる。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、細胞は、拡大、連続増殖または連続培養の間の分化を受けない。例えば、細胞は、拡大、連続増殖または連続培養の間に、最終分化した細胞または他の細胞タイプへと分化しなくてもよい。いくつかの実施形態において、特定の器官または系統の細胞は、異なる器官または系統の細胞へと分化しない。例えば、気道上皮細胞は、拡大、連続増殖または連続培養の間に、線維芽細胞、腸上皮細胞、腸杯細胞、胃上皮細胞、または膵臓上皮細胞へと分化しなくてもよい。いくつかの実施形態において、細胞は、拡大、連続増殖または連続培養の間に、ある程度の分化を受ける。例えば、系統拘束された上皮細胞は、所定の系統内の細胞タイプへと分化し得るおよび／または器官特異的上皮細胞は、拡大、連続増殖または連続培養の間に、所定の器官内の他の細胞タイプへと分化し得る。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、上皮細胞のある特定の集団は、上記細胞が細胞周期を出て、分裂を停止したＧ０休止期にあり得る。このＧ０休止期は、静止状態および老化状態の両方を含む。上皮細胞のある特定の割合は、Ｇ１期にあり得る。この期において上記細胞は、サイズが増大し、ＤＮＡ合成の準備をする。上皮細胞のある特定の割合は、Ｓ期にあり得、この期においてＤＮＡ複製が起こる。上皮細胞のある特定の割合は、Ｇ２期にあり得、この期において上記細胞は増殖し続け、Ｍ（有糸分裂）期に入って分裂する準備をする。上皮細胞のある特定の割合は、Ｍ（有糸分裂）期にあり得、細胞分裂を完了する。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、細胞は、テロメア長によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、起源上皮細胞集団中の細胞は、テロメア長によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、拡大した上皮細胞集団中の細胞は、テロメア長によって特徴付けられる。代表的には、テロメア長は、細胞が分裂するときに短くなる。細胞は通常、テロメアの平均長がある特定の長さ、例えば、４ｋｂに減少したときに分裂を停止し得る。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される培地および／または培養条件において培養された細胞の平均テロメア長は、約１０ｋｂ未満の長さに減少し得、上記細胞は、分裂し続け得る。例えば、本明細書で記載される培地および／または培養条件において培養された細胞の平均テロメア長は、約９ｋｂ未満、約８ｋｂ未満、約７ｋｂ未満、約６ｋｂ未満、約５ｋｂ未満、約４ｋｂ未満、約３ｋｂ未満、約２ｋｂ未満、または約１ｋｂ未満の長さに減少し得、上記細胞は、分裂し続け得る。平均テロメア長は、ときおり、中央（ｍｅａｎ）テロメア長またはメジアンテロメア長として表される。平均テロメア長は、テロメア長を決定するための任意の適した方法を使用して決定され得、細胞タイプに従って変動し得る。いくつかの実施形態において、平均テロメア長は、単一コピー遺伝子のテロメア反復に対するテロメア反復の相対的存在量として決定される。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、細胞は、細胞の核型を変化させることなく、ある特定の継代数にわたって、拡大されるか、連続して増殖されるか、または連続して培養される。例えば、細胞の核型の変化は、染色体もしくはその一部の重複または欠失および／あるいは一方の染色体の一部の、別の染色体への転座を含み得る。核型は、ある特定の継代数の後に、細胞の集団に関してアッセイされ得る。これは、継代する前の同じ起源の細胞の集団と比較され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、少なくとも約５継代〜少なくとも約３００継代後に変化しない核型を有する。例えば、細胞は、少なくとも約１０継代、少なくとも約２０継代、少なくとも約３０継代、少なくとも約４０継代、少なくとも約５０継代、少なくとも約６０継代、少なくとも約７０継代、少なくとも約８０継代、少なくとも約９０継代、少なくとも約１００継代、少なくとも約２００継代または少なくとも約３００継代後に、変化しない核型を有し得る。ある特定の場合には、ある特定の継代数の後に変化しない核型を有する細胞は、条件付き不死化細胞（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  ｃｅｌｌ）といわれ得る。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の使用を含む。いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、細胞外マトリクスの使用を含まない。ＥＣＭは、ある特定のポリサッカリド、水、エラスチン、およびある特定の糖タンパク質（例えば、コラーゲン、エンタクチン（ニドジェン）、フィブロネクチン、およびラミニンのような）を含み得る。ＥＣＭは、ＥＣＭ生成細胞を培養し、および必要に応じてこれら細胞を、上皮細胞をプレーティングする前に除去することによって生成され得る。ＥＣＭ生成細胞の例としては、コラーゲンおよびプロテオグリカンを生成する軟骨細胞；ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、間質性プロコラーゲンおよびフィブロネクチンを生成する線維芽細胞；ならびにコラーゲン（Ｉ型、ＩＩＩ型、およびＶ型）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、およびテネイシン−Ｃを生成する結腸筋線維芽細胞が挙げられる。ＥＣＭはまた、商業的に提供され得る。市販の細胞外マトリクスの例としては、細胞外マトリクスタンパク質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞由来の基底膜調製物（例えば、マトリゲルＴＭ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））、および合成細胞外マトリクス材料（例えば、ＰｒｏＮｅｃｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ  Ｚ３７８６６６））が挙げられる。細胞外マトリクス材料の混合物は、ある特定の場合には使用され得る。細胞外マトリクスは、均質であってもよいし（本質的に単一の成分を含む）、異質であってもよい（複数の成分を含む）。異質な細胞外マトリクスは、一般に、例えば、複数の糖タンパク質および増殖因子を含む、ＥＣＭ成分の混合物を含む。異質な細胞外マトリクスの例としては、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞に由来する基底膜調製物（例えば、マトリゲルＴＭ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、異質な細胞外マトリクスの使用を含まない。細胞外マトリクスは、規定されていてもよいし（全てまたは実質的に全ての成分およびその量が既知である）、規定されていなくてもよい（全てまたは実質的に全ての成分およびその量が既知でない）。規定されていない細胞外マトリクスの例としては、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞に由来する基底膜調製物（例えば、マトリゲルＴＭ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、規定されていない細胞外マトリクスの使用を含まない。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、細胞は、被覆を含む容器の中で培養される。例えば、細胞は、１種もしくはこれより多くの付着因子を含む培養容器の表面上にプレーティングされ得る。いくつかの実施形態において、細胞は、付着因子なしの培養容器の表面上にプレーティングされる。付着因子が使用される実施形態において、培養容器は、天然の、組換えの、または合成の付着因子またはこれらのペプチドフラグメント（例えば、コラーゲン、フィブロネクチンおよび天然のもしくは合成のこれらのフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない）で予め被覆され得る。いくつかの実施形態において、培養容器は、コラーゲンで予め被覆される。いくつかの実施形態において、培養容器は、基底膜マトリクスで予め被覆される。いくつかの実施形態において、培養容器は、均質なおよび／または規定された細胞外マトリクスで予め被覆される。
【０１３４】
上記細胞は、培養プロセス全体を通じて１種もしくはこれより多くの機能的特徴を維持し得る。いくつかの実施形態において、機能的特徴は、天然の機能的特徴であり得る。天然の機能的特徴としては、一般に、所定の細胞タイプがその天然の環境の中にある間（例えば、細胞培養のために抽出される前の被験体の身体内にある細胞）に有する形質が挙げられる。天然の機能的特徴の例としては、気道上皮細胞におけるガス交換能力、肝臓上皮細胞における解毒能力、腎臓上皮細胞における濾過能力、ならびに膵島細胞におけるインスリン生成および／またはグルコース応答性が挙げられる。いくつかの実施形態において、細胞は、培養プロセス全体を通じて１種もしくはこれより多くの機能的特徴を維持しない。
【０１３５】
培養物中の細胞の特徴は、ときおり、培養物中の細胞の集団全体に関して決定される。例えば、平均テロメア長、倍加時間、増殖速度、分裂速度、遺伝子レベルまたはマーカーレベルのような特徴は、例えば、培養物中の細胞の集団に関して決定される。特徴はしばしば、その集団中の細胞の代表であり、その特徴は、培養物中の特定の細胞に関しては変動し得る。例えば、培養物中の細胞の集団が４ｋｂの平均テロメア長を示す場合、その集団中の細胞の一部は、４ｋｂのテロメア長を有し得、細胞の一部は、４ｋｂより長いテロメア長を有し得、そして細胞の一部は、４ｋｂ未満のテロメア長を有し得る。別の例において、細胞の集団が、特定の遺伝子またはマーカーの高レベルを発現すると特徴付けられる場合、その集団における全ての細胞は、特定の遺伝子またはマーカーをいくつかの実施形態では高レベルで発現し、そしてある特定の実施形態では、その集団中の細胞の一部（例えば、細胞のうちの少なくとも７５％）は、その特定の遺伝子またはマーカーを高レベルで発現し、その細胞のうちの小さい方の割合が、その特定の遺伝子を中程度のレベル、低レベル、または検出不能なレベルで発現する。別の例において、細胞の集団が、特定の遺伝子またはマーカーを発現しないか、またはその低レベルを発現すると特徴付けられる場合、その集団中の細胞は、その特定の遺伝子またはマーカーをいくつかの実施形態では検出可能なレベルで全く発現せず、そしてある特定の実施形態では、その集団中の細胞の一部（例えば、細胞のうちの１０％未満）は、その特定の遺伝子またはマーカーを検出可能なレベルで発現する。
【０１３６】
培養物中の細胞の特徴（例えば、集団倍加、マーカー発現）はときおり、コントロール培養条件において培養された細胞に関して観察されるその同じ特徴と比較される。しばしば、コントロール培養条件において培養された細胞に関して観察される特徴を比較する場合、その同じ供給源に由来する細胞の等しいかまたは実質的に等しい量が、ある特定の培養条件におよびコントロール培養条件に添加される。コントロール培養条件は、同じ基礎培地（例えば、無血清基礎培地）、および１種もしくはこれより多くの薬剤（例えば、ＴＧＦ−βインヒビター（例えば、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）、ＲＯＣＫインヒビター、ミオシンＩＩインヒビター、ＰＡＫインヒビター）のうちの１種もしくはこれより多く）を含まないさらなる成分を含み得る。いくつかの実施形態において、細胞培養条件は、本質的に、コントロール培養条件において培養された細胞に関して観察されるその同じ特徴と比較して、培養物中の細胞の１種もしくはこれより多くの特徴（例えば、集団倍加、マーカー発現）を達成するために必要なある特定の成分からなる。細胞培養条件がある特定の成分から本質的になる場合、さらなる成分または特徴が含まれ得、これら成分または特徴は、コントロール培養条件と比較した場合に、培養物中の細胞の１種もしくはこれより多くの特徴（例えば、集団倍加，マーカー発現）に対して顕著な影響を有しない。このようなさらなる成分または特徴は、本質的でない成分といわれ得、塩、ビタミン、アミノ酸、ある特定の増殖因子、脂肪酸などのような代表的な細胞培養成分を含み得る。
【０１３７】
フィーダー細胞
細胞は、フィーダー細胞ありまたはなしで培養され得る。一般に、フィーダー細胞は、ある特定の細胞培養システムのために他の細胞タイプと共培養される細胞である。フィーダー細胞は、代表的には、増殖していない細胞であり、ときおり、増殖を阻害するように処理され、しばしば、生存して代謝的に活性な状態で維持される。例えば、フィーダー細胞は、γ線照射で照射され得るおよび／またはマイトマイシンＣ（これは、細胞分裂を停止し得ると同時に、代謝的に活性な状態でフィーダー細胞を維持し得る）で処理され得る。
【０１３８】
フィーダー細胞は、任意の哺乳動物に由来し得、そのフィーダー細胞の動物供給源は、培養されている細胞と同じ動物供給源である必要はない。例えば、フィーダー細胞は、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、非ヒト霊長類およびヒトのフィーダー細胞であり得るが、これらに限定されない。フィーダー細胞のタイプとしては、脾細胞（ｓｐｌｅｅｎｏｃｙｔｅ）、マクロファージ、胸腺細胞および／または線維芽細胞が挙げられ得る。フィーダー細胞のタイプは、それらが支持する同じ細胞タイプであってもよい。フィーダー細胞のタイプは、それらが支持する同じ細胞タイプでなくてもよい。Ｊ２細胞は、ある特定の細胞培養システムのためのフィーダー細胞として使用され、樹立されたＳｗｉｓｓ  ３Ｔ３細胞株に由来するマウス線維芽細胞のサブクローンである。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、細胞は、フィーダー細胞の非存在下で培養される。いくつかの実施形態において、細胞は、フィーダー細胞によって馴化された培地中で培養されない（すなわち、馴化培地中で培養されない）。いくつかの実施形態において、細胞は、分画されたフィーダー細胞、またはフィーダー細胞の粒状および／もしくは可溶性画分の存在下で培養されない。上記の培養条件（すなわち、フィーダー細胞の非存在下で培養される；馴化培地中で培養されない；分画されたフィーダー細胞、またはフィーダー細胞の粒状物および／もしくは可溶性画分の存在下で培養されない）のうちのいずれか１つまたは全ては、フィーダー細胞なしの条件またはフィーダーなしの条件といわれ得る。本明細書で提供される拡大培養条件は、代表的には、フィーダー細胞なしの培養条件である。
【０１４０】
培地および細胞培養組成物
細胞は、代表的には、細胞培養培地の存在下で培養される。本明細書で提供される拡大培養条件は、代表的には、細胞培養培地を含む。細胞培養培地は、例えば、無血清培地；血清含有培地；血清低減培地；タンパク質非含有培地；化学的に規定された培地；タンパク質非含有の化学的に規定された培地；ペプチド非含有タンパク質非含有の化学的に規定された培地；動物性タンパク質非含有培地；ゼノフリー（ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ）培地のような培地のうちのいずれかのタイプを含み得る。細胞培養培地は、代表的には、水性ベースの培地であり、例えば、ダルベッコ改変必須培地（ＤＭＥＭ）、ノックアウト−ＤＭＥＭ（ＫＯＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地、ＤＭＥＭ／ハムＦ１２、改良型ＤＭＥＭ／ハムＦ１２、ハムＦ−１０培地、ＲＰＭＩ  １６４０、イーグル基礎培地（ＥＢＭ）、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ−ＭＥＭ）、１９９培地、ケラチノサイト−ＳＦＭ（ＫＳＦＭ；Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）、前立腺上皮増殖培地（ＰｒＥＧＭ；Ｌｏｎｚａ）、ＣＨＯ細胞培養培地、ＰＥＲ．Ｃ６培地、２９３培地、ハイブリドーマ培地などのような市販のおよび／または古典的な培地のうちのいずれか、ならびにこれらの組み合わせが挙げられ得る。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、血清含有培地である。血清としては、例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）、ヤギ血清またはヒト血清が挙げられ得る。一般に、血清は、上記培地の約１体積％〜約３０体積％の間で存在する。場合によっては、血清は、上記培地の約０．１体積％〜約３０体積％の間で存在する。いくつかの実施形態において、培地は、血清代替物を含む。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、無血清培地である。無血清培地は一般に、いかなる動物血清をも（例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ウシ胎仔血清、ヤギ血清もしくはヒト血清）含まないが、ある特定の動物由来製品（例えば、血清アルブミン（例えば、血液から精製）、増殖因子、ホルモン、キャリアタンパク質、加水分解物および／または付着因子）を含み得る。いくつかの実施形態において、無血清細胞培養培地は、ケラチノサイト−ＳＦＭ（ＫＳＦＭ；  Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）を含む。ＫＳＦＭは、インスリン、トランスフェリン、ヒドロコルチゾン、トリヨードサイロニン（Ｔ３）を含み得る。ＫＳＦＭ基礎培地の代表的製剤は、例えば、米国特許第６６９２９６１号に記載される。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、規定された無血清培地である。規定された無血清培地（ときおり、化学的に規定された無血清培地といわれる）は一般に、既知の濃度で存在する同定された成分を含み、一般に、動物器官抽出物（例えば、下垂体抽出物）または他の規定されていない動物由来製品（例えば、定量化されていない量の血清アルブミン（例えば、血液から精製）、増殖因子、ホルモン、キャリアタンパク質、加水分解物および／または付着因子）のような規定されていない成分を含まない。規定された培地は、アミノ酸、ビタミン、無機酸、無機塩、アルカリケイ酸塩、プリン、ピリミジン、ポリアミン、α−ケト酸、有機イオウ化合物、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、抗酸化物質およびエネルギー源（例えば、グルコース）のうちの１種もしくはこれより多くを含む、例えば、ＤＭＥＭ、Ｆ１２、またはＲＰＭＩ  １６４０のような基礎培地を含み得；そして組換えアルブミン、組換え増殖因子、化学的に規定された脂質、組換えインスリンおよび／または亜鉛、組換えトランスフェリンまたは鉄、セレンおよび抗酸化チオール（例えば、２−メルカプトエタノールもしくは１−チオグリセロール）のうちの１種もしくはこれより多くが補充され得る。組換えアルブミンおよび／または増殖因子は、例えば、非動物供給源（例えば、イネまたはＥ．ｃｏｌｉ）に由来し得、ある特定の場合には、合成化学物質が、規定された培地に添加される（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の機能のいくらかを再現し得るポリマーポリビニルアルコール）。いくつかの実施形態において、規定された無血清培地は、ＭＣＤＢ  １５３培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｍ７４０３）、改変ＭＣＤＢ  １５３培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、カタログ番号０１−０５９−１）、ＭＣＤＢ  １０５培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｍ６３９５）、ＭＣＤＢ  １１０培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｍ６５２０）、ＭＣＤＢ  １３１培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ
Ｍ８５３７）、ＭＣＤＢ  ２０１培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｍ６６７０）、およびこれらの改変バージョンから選択され得る。いくつかの実施形態において、規定された無血清培地は、ＭＣＤＢ  １５３培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｍ７４０３）である。いくつかの実施形態において、規定された無血清培地は、改変ＭＣＤＢ  １５３培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、カタログ番号０１−０５９−１）である。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、ゼノフリー無血清培地である。ゼノフリーは一般に、培養されている細胞が由来する動物以外の動物に由来する成分を全く有しないことを意味する。例えば、ゼノフリー培養は、ヒト細胞が培養される場合には、非ヒト動物起源の成分を全く有しない。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、規定されたゼノフリー無血清培地である。規定されたゼノフリー無血清培地は、ときおり化学的に規定されたゼノフリー無血清培地といわれ、一般に、既知の濃度で存在する同定された成分を含み、一般に、動物器官抽出物（例えば、下垂体抽出物）または他の規定されていない動物由来製品（例えば、血清アルブミン（例えば、血液から精製）、増殖因子、ホルモン、キャリアタンパク質、加水分解物、および／または付着因子）のような規定されていない成分を含まない。規定されたゼノフリー無血清培地は、動物供給源（例えば、非ヒト供給源）に由来する脂質および／または組換えタンパク質（例えば、組換えアルブミン、組換え増殖因子、組換えインスリンおよび／または組換えトランスフェリンのような）を含んでいてもよいし、そうでなくてもよい。組換えタンパク質は、例えば、植物（例えば、イネ）または細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）のような非動物供給源に由来してもよいし、ある特定の場合には、合成化学物質が、規定された培地に添加される（例えば、ポリマー（例えば、ポリビニルアルコール））。この合成化学物質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の機能のいくらかを再現し得る。いくつかの実施形態において、規定された無血清培地は、市販のゼノフリー血清代替品（例えば、ＸＦ−ＫＯＳＲＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のような）を含み得る。いくつかの実施形態において、規定された無血清培地は、市販のゼノフリー基礎培地（例えば、ｍＴｅＳＲ２ＴＭ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍＴＭ（ＳｔｅｍＧｅｎｔ）、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １０ＴＭもしくはＸ−Ｖｉｖｏ  １５ＴＭ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、またはＨＥＳｃＧＲＯＴＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のような）を含み得る。
【０１４５】
さらなる成分は、本明細書中の細胞培養培地に添加され得る。例えば、このようなさらなる成分としては、アミノ酸、ビタミン、無機塩、無機酸、アデニン、エタノールアミン、Ｄ−グルコース、ヘパリン、Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ）、ヒドロコルチゾン、インスリン、リポ酸、フェノールレッド、ホスホエタノールアミン、プトレシン、ピルビン酸ナトリウム、ピルビン酸、メタバナジン酸アンモニウム、モリブデン酸、ケイ酸塩、アルカリケイ酸塩（例えば、メタケイ酸ナトリウム）、プリン、ピリミジン、ポリアミン、α−ケト酸、有機イオウ化合物、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、抗酸化物質、チオクト酸、トリヨードサイロニン（Ｔ３）、チミジンおよびトランスフェリンを含み得る。ある特定の場合には、インスリンおよび／またはトランスフェリンは、クエン酸鉄（ＩＩＩ）または硫酸鉄（ＩＩ）キレート化合物によって置き換えられ得る。アミノ酸としては、以下が挙げられ得る：例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシンおよびＬ−バリン。ビタミンとしては、以下が挙げられ得る：例えば、ビオチン、Ｄ−ビオチン、塩化コリン、Ｄ−Ｃａ＋２−パントテン酸、Ｄ−パントテン酸、葉酸、ｉ−イノシトール、ミオイノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミンおよびビタミンＢ１２。無機塩としては、以下が挙げられ得る：例えば、カルシウム塩（例えば、ＣａＣｌ２）、ＣｕＳＯ４、ＦｅＳＯ４、ＫＣＩ、およびマグネシウム塩（例えば、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４）、マンガン塩（例えば、ＭｎＣｌ２）、酢酸ナトリウム、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、およびある特定の微量元素のイオン（セレン、ケイ素、モリブデン、バナジウム、ニッケル、スズおよび亜鉛が挙げられる）。これらの微量元素は、種々の形態で提供され得、それらとしては、塩の形態が挙げられる：例えば、Ｎａ２ＳｅＯ３、Ｎａ２ＳｉＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４、ＮＨ４ＶＯ３、ＮｉＳＯ４、ＳｎＣｌおよびＺｎＳＯ。さらなる成分としては、以下が挙げられ得る：例えば、ヘパリン、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、細胞内環状アデノシンモノホスフェート（ｃＡＭＰ）レベルを増大させる少なくとも１種の薬剤、少なくとも１種の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、酸性ＦＧＦ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（ユニプロットアクセッション番号Ｐ０４１４１）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（ユニプロットアクセッション番号Ｐ０９９１９）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（ユニプロットアクセッション番号Ｐ１４２１０）、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）（ユニプロットアクセッション番号Ｑ６１ＣＶ５）、ニューレグリン２（ＮＲＧ２）（ユニプロットアクセッション番号Ｑ３ＭＩ８６）、ニューレグリン３（ＮＲＧ３）（ユニプロットアクセッション番号Ｂ９Ｅ���Ｖ５）、ニューレグリン４（ＮＲＧ４）（ユニプロットアクセッション番号ＱＯＰ６Ｎ６）、エピレグリン（ＥＲＧ）（ユニプロットアクセッション番号０１４９４４）、ベータセルリン（ＢＣ）（ユニプロットアクセッション番号Ｑ８６ＵＦ５）、インターロイキン−１１（ＩＬ１１）（ユニプロットアクセッション番号Ｐ２０８０９）、コラーゲンおよびヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）（ユニプロットアクセッション番号Ｑ１４４８７）。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、カルシウムを含む。いくつかの実施形態において、カルシウムは、約２ｍＭの濃度で存在する。いくつかの実施形態において、カルシウムは、２ｍＭ未満の濃度で存在する。いくつかの実施形態において、カルシウムは、約１ｍＭの濃度で存在する。いくつかの実施形態において、カルシウムは、１ｍＭ未満の濃度で存在する。例えば、カルシウムは、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、９００μＭ未満、８００μＭ未満、７００μＭ未満、６００μＭ未満、５００μＭ未満、４００μＭ未満、３００μＭ未満、２００μＭ未満、１００μＭ未満、９０μＭ未満、８０μＭ未満、７０μＭ未満、６０μＭ未満、５０μＭ未満、４０μＭ未満、３０μＭ未満、２０μＭ未満または１０μＭ未満の濃度で存在し得る。いくつかの実施形態において、カルシウムは、５００μＭ未満の濃度で存在する。いくつかの実施形態において、カルシウムは、３００μＭ未満の濃度で存在する。いくつかの実施形態において、カルシウムは、１００μＭ未満の濃度で存在する。いくつかの実施形態において、カルシウムは、２０μＭ未満の濃度で存在する。いくつかの実施形態において、カルシウムは、約９０μＭの濃度で存在する。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、アルブミン（例えば、血清アルブミン）を含む。アルブミンは、脊椎動物の血液中に概して豊富にあるタンパク質である。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む。アルブミンは、精製されていてもよいし（例えば、ヒトまたはウシ血清から）、組換え生成されていてもよい（例えば、植物（例えば、イネ）、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、または酵母（例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の中でのように）。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、イネにおいて生成された組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）を含む。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、１種もしくはこれより多くの脂質を含む。脂質は一般に、油、脂肪、ろう、ステロール、脂溶性ビタミン（例えば、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、およびＫ）、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、サッカロ脂質（ｓａｃｃｈａｒｏｌｉｐｉｄ）、ポリケチド、プレノール脂質（ｐｒｅｎｏｌ  ｌｉｐｉｄ）などに言及し、脂質の混合物（例えば、化学的に規定された脂質混合物）を含み得る。いくつかの実施形態において、脂質は、アラキドン酸、コレステロール、ＤＬ−α−トコフェロールアセテート、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、プルロニックＦ−６８、ステアリン酸、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ
８０）、ＴＷＥＥＮ  ２０、タラ肝油脂肪酸（メチルエステル）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、Ｄ−α−トコフェロールアセテートから選択され得る。いくつかの実施形態において、脂質は、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸のうちの１種もしくはこれより多くを含み得る。いくつかの実施形態において、脂質ミックスは、市販の脂質ミックスであり得る（例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｇｉｂｃｏ，１１９０５−０３１）；  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｌ５１４６）；  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  １、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｌ０２８８））。いくつかの実施形態において、脂質ミックスは、市販のアルブミンが補充された脂質の混合物（例えば、ＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標）  Ｉ  Ｌｉｐｉｄ−Ｒｉｃｈ  ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ，  １１０２０−０３９））を含み得る。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、１種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子を含む。例えば、有糸分裂促進性増殖因子としては、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、および／またはケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）が挙げられ得る。いくつかの実施形態において、培地は、有糸分裂促進性増殖因子を含まない。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、１種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性補充物を含む。例えば、有糸分裂促進性補充物としては、ウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ；Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｎ−アセチルシステイン（Ｓｉｇｍａ）、ＧＥＭ２１  ＮＥＵＲＯＰＬＥＸ（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、およびＮ２  ＮＥＵＲＯＰＬＥＸ（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）が挙げられ得る。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、有糸分裂促進性補充物を含まない。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、細胞内環状アデノシンモノホスフェート（ｃＡＭＰ）レベルを増大させる１種もしくはこれより多くの薬剤を含む。例えば、細胞培養培地は、１種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性アゴニスト（例えば、１種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニスト）を含み得る。βアドレナリン作動性アゴニスト（例えば、βアドレナリン作動性レセプターアゴニスト）は一般に、βアドレナリンレセプター（例えば、β−１アドレナリン作動性レセプター、β−２アドレナリン作動性レセプター、β−３アドレナリン作動性レセプター）を活性化する交感神経作用薬のクラスである。βアドレナリンレセプターの活性化は、アデニル酸シクラーゼを活性化し、これは、環状アデノシンモノホスフェート（ｃＡＭＰ）の活性化をもたらす。βアドレナリン作動性アゴニスト（例えば、βアドレナリン作動性レセプターアゴニスト）としては、以下が挙げられ得る：例えば、エピネフリン、イソプロテレノール、ドブタミン、キサモテロール、サルブタモール（アルブテロール）、レボサルブタモール（レバルブテロール）、フェノテロール、ホルモテロール、メタプロテレノール、サルメテロール、テルブタリン、クレンブテロール、イソエタリン（ｉｓｏｅｔａｒｉｎｅ）、ピルブテロール、プロカテロール、リトドリン、アルブタミン、ベフノロール、ブロモアセチルアルプレノロールメンタン（ｂｒｏｍｏａｃｅｔｙｌａｌｐｒｅｎｏｌｏｌｍｅｎｔｈａｎｅ）、ブロキサテロール（ｂｒｏｘａｔｅｒｏｌ）、シマテロール（ｃｉｍａｔｅｒｏｌ）、シラゾリン（ｃｉｒａｚｏｌｉｎｅ）、デノパミン、ドペキサミン、エチレフリン、ヘキソプレナリン、ヒゲナミン（ｈｉｇｅｎａｍｉｎｅ）、イソクスプリン、マブテロール、メトキシフェナミン、ニリドリン、オキシフェドリン、プレナルテロール、ラクトパミン（ｒａｃｔｏｐａｍｉｎｅ）、レプロテロール、リミテロール、トレトキノール、ツロブテロール、ジルパテロール（ｚｉｌｐａｔｅｒｏｌ）およびジンテロール。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、イソプロテレノールを含む。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、約０．５μＭ〜約２０μＭの間の濃度でイソプロテレノールを含む。例えば、イソプロテレノールは、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．７μＭ、約０．８μＭ、約０．９μＭ、約１μＭ、約１．２５μＭ、約１．５μＭ、約１．７５μＭ、約２μＭ、約２．５μＭ、約３μＭ、約３．５μＭ、約４μＭ、約４．５μＭ、約５μＭ、約５．５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約１１μＭ、約１２μＭ、約１３μＭ、約１４μＭ、または約１５μＭの濃度で存在し得る。
【０１５２】
細胞内ｃＡＭＰレベルを増大させる他の薬剤としては、細胞内ｃＡＭＰレベルの直接的増大を誘導する薬剤（例えば、ジブチリルｃＡＭＰ）、細胞Ｇプロテインとの相互作用によって細胞内ｃＡＭＰレベルの増大を引き起こす薬剤（例えば、コレラ毒素およびホルスコリン）、およびｃＡＭＰホスホジエステラーゼの活性を阻害することによって細胞内ｃＡＭＰレベルの増大を引き起こす薬剤（例えば、イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）およびテオフィリン）が挙げられ得る。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、以下のうちの１種もしくはこれより多くを含まない：Ｗｎｔアゴニスト、β−カテニンアゴニスト、Ｎｏｇｇｉｎ、ＤＡＮ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、Ｇｒｅｍｌｉｎ、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ、Ｗｎｔ−３ａ、ＥＧＦ、ニコチンアミド、ＦＧＦ１０、ガストリン、ｐ３８インヒビター、ＳＢ２０２１９０、ＤＨＴ、ｎｏｔｃｈインヒビター、ガンマセクレターゼインヒビター、ＤＢＺ、ＤＡＰＴ、インターロイキン−６（ＩＬ６）、またはエフリンＡ５（ＥｆｎＡ５）。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、１種もしくはこれより多くのインヒビターを含む。インヒビターとしては、以下が挙げられ得る：例えば、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βインヒビター（例えば、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）、１種もしくはこれより多くのｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）インヒビター、１種もしくはこれより多くのミオシンＩＩインヒビター（例えば、非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）インヒビター）、および１種もしくはこれより多くのＲｈｏキナーゼインヒビター（例えば、１種もしくはこれより多くのＲｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）。インヒビターのこのようなクラスは、以下でさらに詳細に考察される。インヒビターは、低分子インヒビター（例えば、小型有機分子）、抗体、ＲＮＡｉ分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、組換えタンパク質、天然もしくは改変された基質、酵素、レセプター、ペプチド摸倣物、無機分子、ペプチド、ポリペプチド、アプタマーなどならびにこれらの構造的または機能的摸倣物の形態にあり得る。インヒビターは、競合的に、非競合的に、不競合的にまたは混合型の阻害によって、作用し得る。例えば、ある特定の実施形態において、インヒビターは、標的キナーゼ（例えば、プロテインキナーゼ）のＡＴＰ結合ポケットの競合的インヒビターであり得る。いくつかの実施形態において、インヒビターは、１種もしくはこれより多くのレセプターの活性を破壊する。いくつかの実施形態において、インヒビターは、１種もしくはこれより多くのレセプター−リガンド相互作用を破壊する。いくつかの実施形態において、インヒビターは、その標的に結合し、その活性を低減し得る。いくつかの実施形態において、インヒビターは、その標的に結合し得、その標的の活性を、コントロールと比較して約１０％もしくはこれより多く低減し得る。例えば、インヒビターは、その標的に結合し得、その標的の活性を、コントロールと比較して、約２０％もしくはこれより多く、約３０％もしくはこれより多く、約４０％もしくはこれより多く、約５０％もしくはこれより多く、約６０％もしくはこれより多く、約７０％もしくはこれより多く、約８０％もしくはこれより多く、約９０％もしくはこれより多く、約９５％もしくはこれより多く、または約９９％もしくはこれより多く低減し得る。阻害は、例えば、細胞アッセイを使用して評価され得る。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、インヒビターは、キナーゼインヒビター（例えば、プロテインキナーゼインヒビター）である。その標的の生物学的または生化学的機能を阻害するキナーゼインヒビターの有効性は、ＩＣ５０値として表され得る。ＩＣ５０は一般に、特定のインヒビターが、キナーゼを５０％阻害するためにどの程度必要とされるかを示す。いくつかの実施形態において、インヒビターは、１０００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、もしくは１０ｎＭ以下のＩＣ５０値を有する。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、インヒビターは、１種もしくはこれより多くの細胞の活性、機能または特徴に直接的にまたは間接的に影響を及ぼし得る。例えば、インヒビターは、培養された細胞において、例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路の阻害を通じて、テロメラーゼ逆転写酵素発現を誘導し得る。ある特定の実施形態において、ＴＧＦ−βインヒビター（例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）は、培養された細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素発現を活性化する。ある特定の実施形態において、ＡＬＫ５インヒビターは、培養された細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素発現を活性化する。ある特定の実施形態において、Ａ８３−０１は、培養された細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素発現を活性化する。別の例では、インヒビターは、培養された細胞内の細胞骨格構造を、例えば、Ｒｈｏキナーゼ（例えば、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼ）、ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）、および／またはミオシンＩＩ（例えば、非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ））の阻害を通じて調節し得る。細胞骨格構造の調節は、例えば、アクチンミクロフィラメント、チューブリン微小管、および中間フィラメントを含む細胞骨格構造のうちのいずれかの局面における改変、破壊もしくは変化；または分子モーター、架橋剤、キャップ形成タンパク質および核生成促進因子のような任意の関連タンパク質との相互作用を含み得る。ある特定の実施形態において、ＲＯＣＫインヒビターは、培養された細胞内の細胞骨格構造を調節する。ある特定の実施形態において、Ｙ−２７６３２は、培養された細胞内の細胞骨格構造を調節する。ある特定の実施形態において、ＰＡＫ１インヒビターは、培養された細胞内の細胞骨格構造を調節する。ある特定の実施形態において、ＩＰＡ３は、培養された細胞内の細胞骨格構造を調節する。ある特定の実施形態において、ミオシンＩＩインヒビター（例えば、非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）インヒビター）は、培養された細胞内の細胞骨格構造を調節する。ある特定の実施形態において、ブレビスタチンは、培養された細胞内の細胞骨格構造を調節する。
【０１５７】
ＴＧＦ−βインヒビター
いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、培養された上皮細胞においてトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達を阻害する工程を包含する。ＴＧＦ−βシグナル伝達は、種々の細胞タイプにおいて増殖、細胞分化、および他の機能を制御し、細胞周期制御、免疫系の調節、およびある特定の細胞タイプにおける発生において役割を果たし得る。ＴＧＦ−βシグナル伝達の阻害は、任意のＴＧＦ−βシグナル伝達経路および／またはＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、インヒビン、アクチビン、抗ミュラー管ホルモン、骨形成タンパク質、デカペンタプレジック（ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）およびＶｇ−１のようなリガンド；ＴＧＦ−βタイプＩレセプター、ＴＧＦ−βタイプＩＩレセプター、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、ＡＬＫ７およびＡＬＫ８のようなレセプター；ならびにＲ−ＳＭＡＤおよび他のＳＭＡＤタンパク質（例えば、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５）のような下流のエフェクターが挙げられる）の阻害を含み得る。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βレセプターの活性は、阻害される。いくつかの実施形態において、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βレセプター−リガンド相互作用は、阻害される。いくつかの実施形態において、ＴＧＦ−βタイプＩレセプターは、阻害される。ＴＧＦ−βタイプＩレセプターとしては、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、ＡＬＫ７およびＡＬＫ８のうちの１種もしくはこれより多くが挙げられ得る。いくつかの実施形態において、ＴＧＦ−βレセプターは、ＡＬＫ５である。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βインヒビター（例えば、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）を含む。いくつかの実施形態において、ＴＧＦ−βインヒビター（例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）は、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βレセプターに結合する。いくつかの実施形態において、ＴＧＦ−βインヒビター（例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）は、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βリガンドに結合する。いくつかの実施形態において、ＴＧＦ−βインヒビター（例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）は、１種もしくはこれより多くのＳＭＡＤタンパク質に結合する。いくつかの実施形態において、ＴＧＦ−βインヒビター（例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）は、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βレセプターおよび１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βリガンドに結合する。いくつかの実施形態において、ＴＧＦ−βインヒビター（例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）は、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βレセプターおよび１種もしくはこれより多くのＳＭＡＤタンパク質に結合する。いくつかの実施形態において、ＴＧＦ−βインヒビター（例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）は、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βレセプター−リガンド相互作用を破壊する。いくつかの実施形態において、ＴＧＦ−βインヒビター（例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）は、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βレセプター−ＳＭＡＤ相互作用を破壊する。いくつかの実施形態において、ＴＧＦ−βインヒビター（例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）は、ＴＧＦ−βレセプターのリン酸化または自己リン酸化をブロックする。いくつかの実施形態において、ＴＧＦ−βインヒビター（例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）は、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βレセプターの脱リン酸化を促進する。いくつかの実施形態において、ＴＧＦ−βインヒビター（例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）は、１種もしくはこれより多くのＳＭＡＤタンパク質のリン酸化をブロックする。いくつかの実施形態において、ＴＧＦ−βインヒビター（例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）は、１種もしくはこれより多くのＳＭＡＤタンパク質の脱リン酸化を促進する。いくつかの実施形態において、ＴＧＦ−βインヒビター（例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）は、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βレセプターのユビキチン媒介性分解を促進する。いくつかの実施形態において、ＴＧＦ−βインヒビター（例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）は、１種もしくはこれより多くのＳＭＡＤタンパク質のユビキチン媒介性分解を促進する。いくつかの実施形態において、ＴＧＦ−βインヒビター（例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）は、ＳＭＡＤの核トランスロケーション、ＳＭＡＤの核シャフリング、ＳＭＡＤとコアクチベーターとの相互作用などに影響を及ぼす。ある特定の場合には、ＴＧＦ−βシグナル伝達は、ＳＭＡＤレポーターアッセイによって測定され得る。
【０１６０】
ＴＧＦ−βインヒビター（例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）は、いくつかの実施形態において、ＡＬＫ５インヒビターであり得る。ＡＬＫ５インヒビターは、ＡＬＫ５または１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５リガンドまたはその両方に結合し得る。ＡＬＫ５インヒビターは、ＡＬＫ５または１種もしくはこれより多くの下流のＳＭＡＤタンパク質またはその両方に結合し得る。ＡＬＫ５インヒビターは、１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５−リガンド相互作用を破壊し得るか、または１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５−ＳＭＡＤ相互作用を破壊し得る。いくつかの実施形態において、ＡＬＫ５インヒビターは、ＳＭＡＤ２のリン酸化をブロックする。
【０１６１】
ＡＬＫ５インヒビターは、１種もしくはこれより多くの低分子ＡＬＫ５インヒビターを含み得る。いくつかの実施形態において、ＡＬＫ５インヒビターは、ＡＴＰアナログである。いくつかの実施形態において、ＡＬＫ５インヒビターは、式Ａ：
【化１】
2020120686.tif 000003
の構造を含み、ここで：
Ｘ、ＹおよびＺは、Ｎ、ＣおよびＯから独立して選択され；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換されたＣ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル、置換されたＣ３−Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５−Ｃ１０アリール、置換されたＣ５−Ｃ１０アリール、Ｃ５−Ｃ１０シクロアリール、置換されたＣ５−Ｃ１０シクロアリール、Ｃ５−Ｃ９複素環式、置換されたＣ５−Ｃ９複素環式、Ｃ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール、置換されたＣ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール、−リンカー−（Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（置換されたＣ３−Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ１０アリール）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ１０アリール）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ９複素環式）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ９複素環式）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール）から独立して選択され；
ｎは、０または１であり；
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換されたＣ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０アルコキシ、置換されたＣ１−Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルカノイル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、置換されたＣ１−Ｃ６アルカノイル、置換されたＣ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル、置換されたＣ３−Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５−Ｃ１０アリール、置換されたＣ５−Ｃ１０アリール、Ｃ５−Ｃ１０シクロアリール、置換されたＣ５−Ｃ１０シクロアリール、Ｃ５−Ｃ９複素環式、置換されたＣ５−Ｃ９複素環式、Ｃ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール、置換されたＣ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール、−リンカー−（Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（置換されたＣ３−Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ１０アリール）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ１０アリール）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ９複素環式）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ９複素環式）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール）から独立して選択され；そして  前記置換されたアルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニルシクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環式またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、ヒドロキシルＣ１−Ｃ１０アルキレン、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５−Ｃ９複素環式、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールである。
【０１６２】
ＡＬＫ５インヒビターとしては、以下が挙げられ得る：例えば、Ａ８３−０１（３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド）、ＧＷ７８８３８８（４−［４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２−ピリジニル］−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−ベンズアミド）、ＲｅｐＳｏｘ（２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン）、およびＳＢ  ４３１５４２（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド）。いくつかの実施形態において、ＡＬＫ５インヒビターは、Ａ８３−０１である。
【０１６３】
ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）インヒビター
いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、培養された上皮細胞においてｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）の活性を阻害する工程を包含する。ＰＡＫタンパク質、セリン／スレオニンｐ２１活性化キナーゼのファミリーは、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２、ＰＡＫ３およびＰＡＫ４を含み、そして一般に、ＧＴＰａｓｅのＲｈｏファミリーを細胞骨格再組織化および核シグナル伝達に関連させるように機能する。これらタンパク質は、Ｃｄｃ４２およびＲａｃに関する標的であり、種々の生物学的活動において機能し得る。ＰＡＫ１は、例えば、細胞運動性および形態を調節し得る。いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、培養された上皮細胞においてＰＡＫ１の活性を阻害する工程を包含する。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、１種もしくはこれより多くのＰＡＫ１インヒビターを含む。いくつかの実施形態において、ＰＡＫ１インヒビターは、ＰＡＫ１タンパク質に結合する。いくつかの実施形態において、ＰＡＫ１インヒビターは、１種もしくはこれより多くのＰＡＫ１アクチベーター（例えば、Ｃｄｃ４２、Ｒａｃ）に結合する。いくつかの実施形態において、ＰＡＫ１インヒビターは、１種もしくはこれより多くの、ＰＡＫ１の下流のエフェクターに結合する。いくつかの実施形態において、ＰＡＫ１インヒビターは、ＰＡＫ１タンパク質および１種もしくはこれより多くのＰＡＫ１アクチベーター（例えば、Ｃｄｃ４２、Ｒａｃ）に結合する。いくつかの実施形態において、ＰＡＫ１インヒビターは、１種もしくはこれより多くのＰＡＫ１−アクチベーター相互作用を破壊する。いくつかの実施形態において、ＰＡＫ１インヒビターは、１種もしくはこれより多くのＰＡＫ１−エフェクター相互作用を破壊する。いくつかの実施形態において、ＰＡＫ１インヒビターは、自己調節機構を標的化し、ＰＡＫ１の不活性コンホメーションを促進する。
【０１６５】
ＰＡＫ１インヒビターは、１種もしくはこれより多くの低分子ＰＡＫ１インヒビターを含み得る。ＰＡＫ１インヒビターとしては、以下が挙げられ得る：例えば、ＩＰＡ３（１，１’−ジチオジ−２−ナフトール）、ＡＧ−１４７８（Ｎ−（３−クロロフェニル）−６，７−ジメトキシ−４−キナゾリンアミン（ｑｕｉｎａｚｏｌｉｎａｎｉｎｅ））、ＦＲＡＸ５９７（６−［２−クロロ−４−（１，３−チアゾール−５−イル）フェニル］−８−エチル−２−［４−（４−メチルピペラジン−１−イル）アニリノ］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−オン）、ＦＲＡＸ４８６（６−（２，４−ジクロロフェニル）−８−エチル−２−［［３−フルオロ−４−（１−ピペラジニル）フェニル］アミノ］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン）、およびＰＦ−３７５８３０９（（Ｓ）−Ｎ−（２−（ジメチルアミノ）−１−フェニルエチル）−６，６−ジメチル−３−（（２−メチルチエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ）−４，６−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−５（１Ｈ）−カルボキサミド）。いくつかの実施形態において、ＰＡＫ１インヒビターは、ＩＰＡ３である。
【０１６６】
ミオシンＩＩインヒビター
いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、培養された上皮細胞においてミオシンＩＩ（例えば、非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ））の活性を阻害する工程を包含する。ミオシンＩＩ（例えば、非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ））は、ＡＴＰ依存性モータータンパク質のファミリーのメンバーであり、筋収縮および他の運動性プロセス（例えば、アクチンベースの運動性）において役割を果たす。非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）は、アクチン架橋および収縮特性を有し、その軽鎖および重鎖のリン酸化によって調節されるアクチン結合タンパク質である。収束性シグナル伝達経路の下流にあるその位置のおかげで、非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）は、細胞接着、細胞移動および組織構築の制御に関与する。より高次の真核生物において、非筋肉ミオシンＩＩは、Ｓｅｒ１９／Ｔｈｒ１８においてその調節性軽鎖（ＭＬＣ）のリン酸化によって活性化される。ＭＬＣリン酸化は、アクトミオシン収縮装置のアセンブリおよびその収縮性の両方を制御する。酵素の２つの群が、一般に、ＭＬＣリン酸化を制御する。一方の群は、ＭＬＣをリン酸化し、活性を促進するキナーゼ（ＭＬＣキナーゼ）を含む。他方は、ＭＬＣを脱リン酸化し、活性を阻害するホスファターゼである。いくつかのキナーゼは、インビトロで、ある場合にはインビボで、Ｓｅｒ１９／Ｔｈｒ１８においてＭＬＣをリン酸化し得る。これらは、例えば、ＭＬＣＫ、ＲＯＣＫ、ＰＡＫ（ｐ２１活性化キナーゼ）、シトロンキナーゼ、ＩＬＫ（インテグリン結合キナーゼ）、ＭＲＣＫ（筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ関連、ｃｄｃ４２結合キナーゼ）およびＤＡＰＫ（ＺＩＰＫを含む細胞死関連プロテインキナーゼ（ｄｅａｔｈ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ））を含む。平滑筋細胞および非筋細胞に存在する主要なミオシンホスファターゼは、３つのサブユニットを含む：１３０ｋＤａの大きなサブユニット（ミオシンホスファターゼ標的化サブユニットＭＹＰＴ１といわれる（Ｍ１３０／１３３、Ｍ１１０またはＭＢＳとも称される））、３８ｋＤａの触媒サブユニット（タイプ１プロテインホスファターゼのδアイソフォーム、ＰＰ１ｃ）および２０ｋＤａの小さいサブユニット。Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）は、ＭＹＰＴ１を阻害することによって、およびＭＬＣを直接リン酸化することによって、ミオシンＩＩを活性化し得る。ＰＡＫ１は、異型プロテインキナーゼＣ（ａＰＫＣζ）のリン酸化を通じてミオシンＩＩを活性化し得る。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、１種もしくはこれより多くのミオシンＩＩインヒビター（例えば、非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）インヒビター）を含む。いくつかの実施形態において、ミオシンＩＩインヒビターは、ミオシンＩＩタンパク質に結合する。いくつかの実施形態において、ミオシンＩＩインヒビターは、ミオシン頭部構造に結合する。いくつかの実施形態において、ミオシンＩＩインヒビターは、ミオシン−ＡＤＰ−Ｐｉ複合体に結合する。いくつかの実施形態において、ミオシンＩＩインヒビターは、ミオシンＩＩ  ＡＴＰａｓｅ活性を破壊する。いくつかの実施形態において、ミオシンＩＩインヒビターは、ミオシンＩＩへの結合に関してＡＴＰと競合する。いくつかの実施形態において、ミオシンＩＩインヒビターは、ミオシンサブフラグメント−１に結合するヌクレオチドと競合する。いくつかの実施形態において、ミオシンＩＩインヒビターは、ミオシンＩＩ−アクチン結合を破壊する。いくつかの実施形態において、ミオシンＩＩインヒビターは、ミオシン頭部とアクチンおよび／または基質との相互作用を破壊する。いくつかの実施形態において、ミオシンＩＩインヒビターは、ＡＴＰ誘導性アクトミオシン解離を破壊する。いくつかの実施形態において、ミオシンＩＩインヒビターは、ホスフェート放出プロセスに干渉する。いくつかの実施形態において、ミオシンＩＩインヒビターは、堅いアクトミオシン架橋を妨げる。
【０１６８】
ミオシンＩＩインヒビター（例えば、非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）インヒビター）は、１種もしくはこれより多くの低分子ミオシンＩＩインヒビター（例えば、低分子非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）インヒビター）を含み得る。ミオシンＩＩインヒビターとしては、以下が挙げられ得る：例えば、ブレビスタチン（（±）−１，２，３，３ａ−テトラヒドロ−３ａ−ヒドロキシ−６−メチル−１−フェニル−４Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］キノリン−４−オン）およびそのアナログ（例えば、パラ−ニトロブレビスタチン、（Ｓ）−ニトロ−ブレビスタチン、Ｓ−（−）−７−デスメチル−８−ニトロブレビスタチンなど）、ＢＴＳ（Ｎ−ベンジル−ｐ−トルエンスルホンアミド）、ならびにＢＤＭ（２，３−ブタンジオンモノオキシム）。いくつかの実施形態において、ミオシンＩＩインヒビターは、ブレビスタチンである。
【０１６９】
ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼ）インヒビター
いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、培養された上皮細胞においてＲｈｏキナーゼ（例えば、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼ）の活性を阻害する工程を包含する。いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、培養された上皮細胞においてＲｈｏキナーゼ（例えば、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼ）の活性を阻害する工程を包含しない。Ｒｈｏキナーゼ（例えば、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼ）は、タンパク質のＲｈｏ
ＧＴＰａｓｅファミリーに属し、このファミリーは、Ｒｈｏ、Ｒａｃ１およびＣｄｃ４２キナーゼを含む。Ｒｈｏのエフェクター分子は、ＲＯＣＫであり、これは、ＲｈｏのＧＴＰ結合形態に結合するセリン／スレオニンキナーゼである。ＲＯＣＫの触媒性キナーゼドメインは、セリン／スレオニンキナーゼに特徴的な保存されたモチーフを含み、Ｎ末端において見出される。ＲＯＣＫタンパク質はまた、中心のコイルドコイルドメインを有し、これは、Ｒｈｏ結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む。そのＣ末端は、プレクストリン相同（ＰＨ）ドメインと内部システインリッチドメインとを含む。上記コイルドコイルドメインは、他のαらせんタンパク質と相互作用すると考えられる。ＲＢＤ（上記コイルドコイルドメイン内に位置する）は、活性化したＲｈｏ  ＧＴＰａｓｅ（ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢ、およびＲｈｏＣを含む）と相互作用する。上記ＰＨドメインは、アラキドン酸およびスフィンゴシルホスホリルコリンのような脂質メディエーターと相互作用すると考えられ、タンパク質局在化において役割を果たし得る。上記ＰＨドメインおよびＲＢＤとキナーゼドメインとの相互作用は、自己阻害ループを生じる。さらに、上記キナーゼドメインは、ＲｈｏＥへの結合に関与し、これはＲＯＣＫ活性の負の調節因子である。
【０１７０】
ＲＯＣＫファミリーは、ＲＯＣＫ１（ＲＯＫ−βまたはｐ１６０ＲＯＣＫとしても公知）およびＲＯＣＫ２（ＲＯＫ−αとしても公知）を含む。ＲＯＣＫ１は、長さが約１３５４アミノ酸であり、ＲＯＣＫ２は、長さが約１３８８アミノ酸である。ヒトＲＯＣＫ１およびヒトＲＯＣＫ２のアミノ酸配列は、それぞれ、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ）アクセッション番号Ｑ１３４６４および０７５１１６において見出され得る。ヒトＲＯＣＫ１およびＲＯＣＫ２のヌクレオチド配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５４０６．２およびＮＭ＿００４８５０において見出され得る。種々の動物に由来するＲＯＣＫ１およびＲＯＣＫ２タンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔおよびＧｅｎＢａｎｋ両方のデータベースにおいて見出され得る。
【０１７１】
両方のＲＯＣＫアイソフォームが、組織において遍在的に発現されているが、それらは、いくつかの組織では異なる強度を示す。例えば、ＲＯＣＫ２は、脳および骨格筋ではより優勢である一方で、ＲＯＣＫ１は、肝臓、精巣および腎臓において、より豊富である。両方のアイソフォームが血管平滑筋および心臓において発現される。休止状態では、ＲＯＣＫ１およびＲＯＣＫ２の両方は、主にサイトゾルにあるが、Ｒｈｏ活性化の際には、膜へとトランスロケーションされる。Ｒｈｏ依存性ＲＯＣＫ活性化は、高度に細胞タイプ依存性であり、ＲＯＣＫ活性は、収縮性、細胞透過性、アポトーシスへの移動および増殖における変化を含む、いくつかの異なる機構によって調節される。いくつかのＲＯＣＫ基質は、同定されている（例えば、Ｈｕ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｔｈｅｒ．  Ｔａｒｇｅｔｓ  ９：７１５−７３６（２００５）；  Ｌｏｉｒａｎｄ  ｅｔ
ａｌ，  Ｃｉｒ．  Ｒｅｓ．  ９８：３２２−３３４（２００６）；およびＲｉｅｎｔｏ  ａｎｄ  Ｒｉｄｌｅｙ，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｉ．  ４：４４６−４５６（２００３）を参照のこと（これらは全て参考として援用される））。場合によっては、ＲＯＣＫは、ＧＴＰ結合したＲｈｏの結合を介して活性化された後に、ＬＩＭキナーゼおよびミオシン軽鎖（ＭＬＣ）ホスファターゼをリン酸化する。
【０１７２】
Ｒｈｏキナーゼ（例えば、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼ）の活性を阻害する工程は、その活性を低減する工程、その機能を低減する工程、またはＲＯＣＫ１もしくはＲＯＣＫ２のうちの少なくとも一方の発現を低減する工程を包含し得る。上記活性、機能または発現は、完全に抑制され得る（すなわち、活性、機能または発現が全くない）か；あるいは上記活性、機能または発現は、処理していない細胞に対して処理した細胞において低い可能性がある。いくつかの実施形態において、Ｒｈｏキナーゼ（例えば、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼ）の活性を阻害する工程は、ＲＯＣＫ１および／またはＲＯＣＫ２経路の上流のエフェクター（例えば、ＧＴＰ結合したＲｈｏ）をブロックし、その結果、ＲＯＣＫ１および／またはＲＯＣＫ２が活性化されないか、またはその活性は、処理されていない細胞と比較して低減される工程を包含する。他の上流エフェクターとしては、インテグリン、増殖因子レセプター（ＴＧＦ−βおよびＥＧＦＲが挙げられるが、これらに限定されない）、カドヘリン、Ｇプロテイン共役レセプターなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、Ｒｈｏキナーゼ（例えば、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼ）の活性を阻害する工程は、ＲＯＣＫ１および／またはＲＯＣＫ２が、いかなるシグナルをも伝達できないか、または処理されていない細胞と比較して低減したシグナルしか伝達することができないように、活性化されたＲＯＣＫ１および／またはＲＯＣＫ２の下流のエフェクター分子の活性、機能または発現をブロックする工程を包含する。下流のエフェクターとしては、ビメンチン、ＬＩＭＫ、ミオシン軽鎖キナーゼ、ＮＨＥｌ、コフィリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、Ｒｈｏキナーゼ（例えば、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼ）の活性を阻害する工程は、１種もしくはこれより多くのＲｈｏキナーゼインヒビター（例えば、１種もしくはこれより多くのＲｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）の使用を包含し得る。Ｒｈｏキナーゼインヒビター（例えば、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）は、１種もしくはこれより多くの低分子Ｒｈｏキナーゼインヒビター（例えば、１種もしくはこれより多くの低分子Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）を含み得る。分子、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（例えば、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）の例としては、以下が挙げられる：例えば、Ｙ−２７６３２（（Ｒ）−（＋）−ｔｒａｎｓ−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミドジヒドロクロリド）、ＳＲ  ３６７７（Ｎ−［２−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］−４−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）フェニル−２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシン−２−カルボキサミドジヒドロクロリド）、チアゾビビン（Ｎ−ベンジル−［２−（ピリミジン−４−イル）アミノ］チアゾール−４−カルボキサミド）、ＨＡ１１００ヒドロクロリド（１−［（１，２−ジヒドロ−１−オキソ−５−イソキノリニル）スルホニル］ヘキサヒドロ−１Ｈ−１，４−ジアゼピンヒドロクロリド）、ＨＡ１０７７（ファスジルヒドロクロリド）、およびＧＳＫ−４２９２８６（４−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−Ｎ−（６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−２−メチル−６−オキソ−１，４，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジンカルボキサミド）（これらの各々は、市販されている）。さらなる低分子Ｒｈｏキナーゼインヒビター（例えば、低分子Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）としては、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ  ０３／０５９９１３、ＷＯ  ０３／０６４３９７、ＷＯ  ０５／００３１０１、ＷＯ  ０４／１１２７１９、ＷＯ  ０３／０６２２２５およびＷＯ  ０３／０６２２２７に記載されるもの、ならびに米国特許第７，２１７，７２２号および同第７，１９９，１４７号、ならびに米国特許出願公開番号２００３／０２２０３５７、２００６／０２４１１２７、２００５／０１８２０４０および２００５／０１９７３２８に記載されるもの（これらの全ての内容は、参考として援用される）が挙げられる。
【０１７４】
その後の環境
いくつかの実施形態において、上記細胞は、ある特定の時間量の後に、上記で記載される培養条件から除去され得、その後の環境へと置かれ得る。上記で記載される成分のうちのいずれも、その後の環境に存在しなくてもよい。いくつかの実施形態において、上記の１種もしくはこれより多くのインヒビターは、その後の環境に存在しない。例えば、ＴＧＦ−βインヒビター（例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター）、ＲＯＣＫインヒビター、ＰＡＫ１インヒビターおよびミオシンＩＩインヒビター（例えば、非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）インヒビター）のうちの１種もしくはこれより多くは、その後の環境に存在しなくてもよい。
【０１７５】
その後の環境は、上記細胞の分化を促進する環境であり得る。その後の環境は、上記細胞が元々由来した器官または組織に類似または同一であるインビボ環境であり得る（例えば、自家移植物）。その後の環境は、上記細胞が元々由来した器官または組織のある特定の生化学的または生理学的特性に厳密に似たインビトロ環境またはエキソビボ環境であり得る。その後の環境は、インビトロまたはエキソビボで分化を促進することが公知の因子が上記細胞培養物に添加されるような合成の環境であり得る。例えば、カルシウムまたはさらなるカルシウムは、分化を促進するために上記細胞培養物に添加され得る。いくつかの実施形態において、カルシウムは、分化を促進するために、上記細胞培養培地のカルシウム濃度が少なくとも約１ｍＭであるように添加され得る。例えば、上記細胞培養培地中のカルシウム濃度は、少なくとも約１ｍＭ、少なくとも約１．１ｍＭ、少なくとも約１．２ｍＭ、少なくとも約１．３ｍＭ、少なくとも約１．４ｍＭ、少なくとも約１．５ｍＭ、少なくとも約１．６ｍＭ、少なくとも約１．７ｍＭ、少なくとも約１．８ｍＭ、少なくとも約１．９ｍＭまたは少なくとも約２．０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、カルシウムは、分化を促進するために、上記細胞培養培地中のカルシウム濃度が約１．５ｍＭであるように細胞培養物に添加される。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、細胞は、上記細胞が元々由来した器官または組織の細胞へと、細胞の分化を刺激するために特異的であるその後の環境に置かれる。いくつかの実施形態において、細胞は、透過性の膜の一方の側に播種され得る。いくつかの実施形態において、透過性の膜の一方の側で培養された細胞は、上記細胞が、透過性の膜の他方の側から栄養を受け取る間に空気に曝され得、そしてこのような培養は、気相液相界面といわれ得る。場合によっては、細胞は、気相液相界面分化の間に経膜電気抵抗（ＴＥＥＲ）の増大を発生させる。いくつかの実施形態において、細胞は、天然のまたは合成の三次元細胞培養表面の中またはその上へとその後の環境において播種され得る。三次元表面の非限定的な例は、マトリゲル（登録商標）被覆培養表面である。いくつかの実施形態において、上記細胞は、マトリゲル（登録商標）または他のヒドロゲルの中に埋め込まれ得る。他の三次元培養環境としては、コラーゲンゲルおよび／または任意の構成の合成生体ポリマー物質（例えば、ヒドロゲルのような）を含む表面が挙げられる。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、培養物中で密着結合を形成する。密着結合は一般に、細胞膜を一緒に結合して、流体に対して不透過または実質的に不透過なバリアを形成する部分である。密着結合の形成は、例えば、密着結合タンパク質（例えば、ＺＯ−１）の免疫蛍光染色によって可視化され得る。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、密着結合を培養物中で形成するように誘導され得る。例えば、上皮細胞は、ある特定の濃度のカルシウムに曝された場合に密着結合を形成するように誘導され得る。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、約１ｍＭもしくはこれより高いカルシウム濃度に曝された場合に密着結合を形成するように誘導され得る。例えば、上皮細胞は、約１ｍＭ、約１．１ｍＭ、約１．２ｍＭ、約１．３ｍＭ、約１．４ｍＭ、約１．５ｍＭ、約１．６ｍＭ、約１．７ｍＭ、約１．８ｍＭ、約１．９ｍＭ、約２．０ｍＭまたはこれより高いカルシウム濃度に曝された場合に密着結合を形成するように誘導され得る。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、約１．５ｍＭのカルシウム濃度に曝された場合に密着結合を形成するように誘導され得る。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、培養物中でドームまたはドーム様構造を形成する。ドームは一般に、培養物中の極性化上皮に特有の多細胞性嚢胞様構造（ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ  ｈｅｍｉｃｙｓｔ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）であり、経上皮溶質輸送を伴う分化した上皮に機能的に等しい可能性がある。ドームは、細胞がコンフルエントな間に小さな領域で散発的に存在し得、しばしば、機能的上皮単層の初期分化プロセスを特徴付け得る。ある特定の場合には、ドーム形成は、密着結合タンパク質の発現、不透過性の基層形成（ｉｍｐｅｒｍｅａｂｌｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｕｍ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、および下にある支持体に対する細胞接着の減少（例えば、細胞層と下にある支持体との間の液体蓄積の結果として）のうちの１種もしくはこれより多くを含み得る。ドーム形成は、例えば、形態として極性化した細胞に関する経上皮輸送システムの発生の間に起こり得る（例えば、Ｓｕら（２００７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８２（１３）：９８８３−９８９４を参照のこと）。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、培養物中でドームまたはドーム様構造を形成するように誘導され得る。例えば、上皮細胞は、ある特定の濃度のカルシウムに曝された場合にドームまたはドーム様構造を形成するように誘導され得る。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、約１ｍＭもしくはこれより高いカルシウム濃度に曝された場合にドームまたはドーム様構造を形成するように誘導され得る。例えば、上皮細胞は、約１ｍＭ、約１．１ｍＭ、約１．２ｍＭ、約１．３ｍＭ、約１．４ｍＭ、約１．５ｍＭ、約１．６ｍＭ、約１．７ｍＭ、約１．８ｍＭ、約１．９ｍＭ、約２．０ｍＭ、もしくはこれより高いカルシウム濃度に曝された場合にドームまたはドーム様構造を形成するように誘導され得る。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、約１．５ｍＭのカルシウム濃度に曝された場合にドームまたはドーム様構造を形成するように誘導され得る。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、上記細胞は、ＴＧＦ−βシグナル伝達が阻害されないその後の環境へと置かれる。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ＲＯＣＫが阻害されないその後の環境へと置かれる。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ＰＡＫ１が阻害されないその後の環境へと置かれる。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ミオシンＩＩ（例えば、非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ））が阻害されないその後の環境へと置かれる。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ＴＧＦ−βシグナル伝達およびＲＯＣＫが阻害されないその後の環境へと置かれる。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ＴＧＦ−βシグナル伝達およびＰＡＫ１が阻害されないその後の環境へと置かれる。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ＴＧＦ−βシグナル伝達およびミオシンＩＩ（例えば、非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ））が阻害されないその後の環境へと置かれる。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、上記細胞は、ＴＧＦ−βシグナル伝達が阻害されない細胞培養環境へと置かれた後に、１種もしくはこれより多くの天然の機能的特徴を維持または再獲得する。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ＲＯＣＫが阻害されない細胞培養環境へと置かれた後に、１種もしくはこれより多くの天然の機能的特徴を維持または再獲得する。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ＰＡＫ１が阻害されない細胞培養環境へと置かれた後に、１種もしくはこれより多くの天然の機能的特徴を維持または再獲得する。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ミオシンＩＩ（例えば、非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ））が阻害されない細胞培養環境へと置かれた後に、１種もしくはこれより多くの天然の機能的特徴を維持または再獲得する。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ＴＧＦ−βシグナル伝達およびＲＯＣＫが阻害されない細胞培養環境へと置かれた後に、１種もしくはこれより多くの天然の機能的特徴を維持または再獲得する。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ＴＧＦ−βシグナル伝達およびＰＡＫ１が阻害されない細胞培養環境へと置かれた後に、１種もしくはこれより多くの天然の機能的特徴を維持または再獲得する。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ＴＧＦ−βシグナル伝達およびミオシンＩＩ（例えば、非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ））が阻害されない細胞培養環境へと置かれた後に、１種もしくはこれより多くの天然の機能的特徴を維持または再獲得する。
【０１８１】
拡大された細胞の使用
ある特定の実施形態において、拡大した上皮細胞集団は、ある特定の生物医学的使用および実験使用（例えば、生体分子生成（例えば、タンパク質発現）、診断剤（例えば、異常な上皮細胞の同定）および／または治療剤（例えば、候補治療剤のスクリーニング；細胞療法（例えば、細胞療法のための遺伝子改変された細胞））のようなのために使用され得る。場合によっては、拡大した上皮細胞集団は、自家適用（例えば、自家移植）のために使用され得、そしてある特定の場合には、拡大した上皮細胞集団は、非自家適用（例えば、薬物スクリーニング）のために使用され得る。場合によっては、拡大した上皮細胞集団は、集められ得るおよび／または単離され得るおよび／または貯蔵され得る（例えば、細胞バンクのために）。
【０１８２】
一例では、拡大した上皮細胞集団は、タンパク質発現、ウイルス／ワクチン製造などのために使用され得る。場合によっては、拡大した上皮細胞集団は、目的のタンパク質（例えば、治療用タンパク質）を発現するために遺伝子改変され得る。場合によっては、上皮細胞または細胞の群は、遺伝子改変され得、次いで、本明細書で記載される拡大条件を使用して拡大され得る。上記細胞のこのような遺伝子改変は一般に、細胞拡大を増大することが意図された改変ではない。むしろ、上記細胞のこのような遺伝子改変は、例えば、特定のタンパク質をコードする導入遺伝子（例えば、疾患修飾導入遺伝子（ｄｉｓｅａｓｅ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ））を挿入するように設計される。導入遺伝子によって発現されるタンパク質は、失われているタンパク質もしくは欠陥タンパク質の機能的バージョンとして作用し得るか、または遺伝子または他のタンパク質のサプレッサーまたはインヒビターとして作用し得る。特定のタンパク質を発現する細胞は、次いで、細胞がインビボで上記タンパク質を生成するように、その後の環境（例えば、患者への自家移植のような）に置かれ得る。
【０１８３】
別の例では、拡大した上皮細胞集団は、異常なまたは病的な上皮細胞の存在によって特徴付けられる状態を有する被験体のための候補処置を同定するために有用であり得る。このような状態は、例えば、新形成、過形成、および悪性腫瘍もしくは良性腫瘍が挙げられ得る。場合によっては、被験体から得られる異常な上皮細胞は、異常な上皮細胞のインビトロ集団を生成するために、本明細書で記載される拡大条件のうちのいずれかに従って拡大され得る。例えば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、被験体の循環から単離され得、本明細書中の拡大条件は、さらなる分析（例えば、上記細胞の機能的、表現型的および／または遺伝的特徴付けのような）のために十分な数の細胞を得るために利用され得る。
【０１８４】
別の例では、拡大した上皮細胞集団は、被験体のための１種もしくはこれより多くの候補処置を同定するために有用であり得る。例えば、拡大した上皮細胞集団は、応答プロフィールを生成するためにアッセイされ得る。応答プロフィールは、代表的には、特定の処置が、例えば、正常なまたは異常な上皮細胞において、所望の応答を生成する可能性を示し得る、１種もしくはこれより多くのデータ点の集まりである。治療剤への応答としては、例えば、細胞死（例えば、壊死、毒性、アポトーシスなどによる）、および／または上記細胞の増殖速度の減少が挙げられ得る。治療剤への応答を評価するための方法は、以下を含む：例えば、用量応答曲線、細胞生存曲線、治療指数などを決定する工程。例えば、鼻または気管の上皮細胞は、ＣＦＴＲ遺伝子における変異を有する被験体から単離され得、本明細書中の拡大条件は、さらなる分析（例えば、治療剤（例えば、薬物および／または抗体）への応答プロフィールを生成するためのアッセイ）のために、十分な数の細胞を得るために利用され得る。
【０１８５】
別の例では、拡大した上皮細胞集団は、被験体において１種もしくはこれより多くの異常な上皮細胞を同定するために有用であり得る。例えば、少なくとも１種の候補の異常な上皮細胞は、本明細書で記載される拡大条件のうちのいずれかに従って拡大され得る。上記細胞が一旦拡大された後、例えば、組織起源プロフィールは、ありそうな起源組織を決定するために、細胞に関して（例えば、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現をアッセイする、組織学的評価、免疫組織化学的染色によって）決定され得る。上記細胞の少なくとも１つの特徴は、同じ組織起源に由来する正常な上皮細胞の同じ特徴と比較され得る。比較され得る細胞特徴としては、例えば、細胞増殖特徴、コロニー形成、プロテオームプロフィール、代謝プロフィールおよびゲノムプロフィールが挙げられる。上記候補の異常な上皮細胞および正常な上皮細胞において検出される差異は、上記候補の異常な上皮細胞が、正常な上皮細胞と比較して異常であることを示し得る。
【０１８６】
別の例では、拡大した上皮細胞集団は、被験体における疾患の進行または疾患の処置をモニターするために有用であり得る。疾患の進行をモニターする工程は一般に、異常な状態が進行しつつある（増悪しつつある）のか、退縮しつつある（改善しつつある）のか、または静的なままである（検出可能な変化なし）のかを決定するために、被験体における異常な状態を周期的にチェックすることを意味する。被験体由来の拡大した上皮細胞は、進行または退縮の種々のマーカーに関してアッセイされ得る。疾患の進行をモニターする工程はまた、１種もしくはこれより多くの処置の効力をモニターする工程を包含し得る。
【実施例】
【０１８７】
以下に示される実施例は、ある特定の実施形態を例証するのであって、本技術を限定するのではない。
【０１８８】
実施例１：材料および方法
この実施例に示される材料および方法を、別段注記される場合は除いて、実施例２〜９に記載される細胞培養および他のアッセイを行うために使用した。
【０１８９】
細胞培養および集団倍加の決定
上皮細胞（前立腺上皮細胞および気管支上皮細胞）を、実施例２〜５および図１〜１７に示されるように、培養培地を使用して組織培養容器の中に３，０００〜１０，０００個の生細胞／ｃｍ２でプレーティングし、３７℃において５％  ＣＯ２とともにインキュベートした。上記培地を２日または３日ごとに交換した。細胞が約７０〜９０％  コンフルエントになった場合に、それらを、標準的トリプシン処理法を使用して継代培養した。総細胞数を、製造業者の説明書に従って、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  ＩＩ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＡＭＱＡＸ１０００）を使用して決定した。
【０１９０】
これらのアッセイに使用した細胞および培地は、以下を含んだ：ＰｒＥＣ前立腺上皮細胞（Ｌｏｎｚａ  ＣＣ−２５５５）；正常ヒト気管支上皮細胞（Ｌｏｎｚａ  ＣＣ−２５４０）；ＬＮＣａｐクローンＦＧＣ細胞株（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄ−０７３）；ＰｒＥＢＭ基礎培地およびＰｒＥＧＭ  ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ  Ｋｉｔ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ＆  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ（Ｌｏｎｚａ  ＣＣ−３１６６）を含むＰｒＥＧＭ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ；ならびに事前に選定された（ｐｒｅｑｕａｌｉｆｉｅｄ）ヒト組換え表皮増殖因子１−５３（ＥＧＦ  １−５３、０．２ｎｇ／ｍＬで使用）およびウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ、３０μｇ／ｍＬで使用）を供給したケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  １７００５−０４２）。細胞培養材料は、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）  ＢｉｏＣｏａｔＴＭ  Ｃｅｌｌｗａｒｅ，  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｔｙｐｅ  Ｉ，  Ｔ−２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５６４８４）を含んだ。
【０１９１】
集団倍加（ＰＤ）を計算するために使用される式は、方程式Ａに表される：  
ｎ＝３．３２×（ｌｏｇＹ−ｌｏｇＩ）＋Ｘ                          方程式Ａ
ここでｎ＝所定の継代培養の最後の最終ＰＤ数、Ｙ＝採取時点での細胞収量、Ｉ＝その継代培養を始めるために接種物として使用される細胞数、およびＸ＝定量している継代培養を開始するために使用される接種物の倍加レベル。
【０１９２】
この研究において使用されるある特定の化学物質のストックを、ＤＭＳＯ中に１０ｍＭへと溶解することによって調製した。上記化学物質ストックを、実施例２〜５に記載されかつ図１〜１７に示されるように、細胞培養を開始した時点から、所望の最終濃度になるように培養培地に添加した。使用したある特定の化合物を、以下の表１に列挙する。
【表１】
2020120686.tif 000004
【０１９３】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
総ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）  Ｐｌｕｓ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１２１８３−５５５）およびＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  １２１８３０１８Ａ）を使用して、製造業者の説明書に従って調製した。１００ナノグラムの総ＲＮＡを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＲＮＡ−ｔｏ−ＣＴＴＭ  １−Ｓｔｅｐ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ４３９２９３８）を使用して、供給元によって提供されたプロトコルに従って、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）発現の決定のために使用した。使用したｈＴＥＲＴプライマーおよびＴａｑｍａｎプローブは、以下のとおりであった：正方向プライマー、５’−ＴＧＡＣＡＣＣＴＣＡＣＣＴＣＡＣＣＣＡＣ−３’（配列番号１）、逆方向プライマー、５’−ＣＡＣＴＧＴＣＴＴＣＣＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣ−３’（配列番号２）およびＴａｑｍａｎプローブ、５’−ＡＣＣＣＴＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＧ−３’（配列番号３）。
【０１９４】
実施例２：従来の細胞培養培地（すなわち、コントロール培養条件）での上皮細胞の増殖
この実施例において、前立腺上皮細胞（ＰｒＥＣ）および気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）を、従来の細胞培養培地（すなわち、コントロール培養条件）中で増殖させて、インビトロおよび／またはエキソビボでの上皮細胞増殖のある特定の特性を示した。
【０１９５】
前立腺上皮細胞（ＰｒＥＣ）を、前立腺上皮細胞を培養するために一般に使用される標準の培養培地の２タイプのうちの一方で培養した：１）前立腺上皮細胞増殖培地（ＰｒＥＢＭ基礎培地およびＰｒＥＧＭ  ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ  Ｋｉｔ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ＆  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ（Ｌｏｎｚａ  ＣＣ−３１６６）を含むＰｒＥＧＭ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ）、または２）ＫＳＦＭ（ケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  １７００５−０４２）（事前に選定されたヒト組換え表皮増殖因子１−５３（ＥＧＦ  １−５３、０．２ｎｇ／ｍＬで使用）およびウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ、３０μｇ／ｍＬで使用）を補充した）。各継代における細胞の集団倍加を計算し、総集団倍加を、培養日数に対してプロットした（図１、上パネル）。両方の培地タイプにおいて、前立腺上皮細胞は、老化に入る前にわずか１０〜２０回の集団倍加という制限された細胞複製を示した。ＫＳＦＭ中で培養された前立腺上皮細胞は、集団倍加１８（ＰＤ  １８；  図１、下パネル）において、細胞老化に特徴的な形態を示した。
【０１９６】
気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）を、ＫＳＦＭ中で培養した。各継代における上記細胞の集団倍加を計算し、総集団倍加を、培養日数に対してプロットした（図２、上パネル）。上記気管支上皮細胞は、細胞老化に入る前にわずか１１回の集団倍加の間に活発な複製を示した。ＫＳＦＭ中で培養した気管支上皮細胞は、集団倍加１１（ＰＤ  １１；  図２、下パネル）において、細胞老化の特徴的な形態を示した。
【０１９７】
ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子の発現を、種々の継代での気管支上皮細胞および前立腺上皮細胞において定量的リアルタイムＰＣＲによって試験した。染色体の末端は、テロメアといわれるＤＮＡ構造の反復セグメントから構成される。テロメアは、異常に一緒にくっつくまたは壊れる（分解する）ことから染色体を保護する。正常な上皮細胞では、テロメアは、代表的には、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）の発現の欠如に起因して、細胞が分裂するにつれて徐々に短くなる。テロメラーゼは一般に、幹細胞において活性であり、大部分のがん細胞（これは、制限なく増殖および分裂する）において異常に活性である。ｈＴＥＲＴ発現のレベルを、ＬＮＣａＰ細胞（ヒト前立腺がん細胞株（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄ−０７３））と比較した。ＬＮＣａＰ細胞を、ｈＴＥＲＴ発現の陽性コントロールとして使用した。気管支上皮細胞は、早期継代（ｐ３）または後期継代（ｐ５）のいずれにおいてもｈＴＥＲＴを発現しなかった。早期継代（ｐ２）での前立腺上皮細胞は、ｈＴＥＲＴの極めて低いレベルを発現し、これは、継代３には迅速に減少し、継代５までには検出不能になった（図３Ａおよび図３Ｂ）。これらの知見から、ＰｒＥＣおよびＨＢＥＣの両方が正常な上皮細胞であることが確認された。
【０１９８】
ある特定の細胞マーカーの発現を、培養した前立腺上皮細胞において試験した。これらの細胞は、免疫蛍光染色によって試験した場合、上皮幹細胞マーカー、Ｌｇｒ５を発現しなかった（図４、下パネル）。代わりに、全ての細胞は、ＴＰ６３発現に関して陽性に染色された（図４、中央パネル）。このＴＰ６３遺伝子、転写因子は、基底上皮細胞のマーカーであり、一般には、上皮組織の正常な機能に必要とされる。細胞核を、ＤＡＰＩ染色を使用して可視化した（図４、上パネル）。ポリクローナルＬｇｒ５抗体（抗ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５抗体、ＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＬＳ−Ａ１２３５）を、１：５０希釈で使用した。モノクローナル抗ＴＰ６３抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−２５２６８）を、１：５０希釈で使用した。
【０１９９】
従って、上記の実験は、従来の細胞培養培地（すなわち、コントロール培養条件）で培養した上皮細胞が、インビトロおよび／またはエキソビボで制限された増殖能、テロメラーゼ逆転写酵素遺伝子の極めて低いまたは検出されない発現を有し、上皮幹細胞に代表的なタンパク質マーカーを発現しない（すなわち、上皮幹細胞マーカーＬＧＲ５を発現しない）ことを示した。
【０２００】
実施例３：ＡＬＫ５インヒビターの存在下でのヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）発現
この実施例において、上皮細胞におけるｈＴＥＲＴ発現を、ＡＬＫ５インヒビター、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）、またはその両方の存在下で評価した。ｈＴＥＲＴ遺伝子の発現を、気管支上皮細胞および前立腺上皮細胞において定量的リアルタイムＰＣＲによって試験した。上記細胞を、ＡＬＫ５インヒビター、Ａ８３−０１、またはＲｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）、Ｙ−２７６３２、またはその両方のインヒビターで、ＫＳＦＭ中の種々の継代において処理した。Ａ８３−０１は、以下で記載されるように、上皮細胞におけるｈＴＥＲＴ発現を迅速に誘導しかつ持続させた。
【０２０１】
図５Ａおよび図５Ｂに示されるように、気管支上皮細胞は、ＫＳＦＭ中での早期継代（ｐ３）および後期継代（ｐ５）の両方においてｈＴＥＲＴを発現しなかった。ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１は、気管支上皮細胞において早期継代（ｐ３）でｈＴＥＲＴ発現を強く誘導し、後期継代（ｐ６）で測定可能なｈＴＥＲＴ発現を持続させた。Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２は、気管支上皮細胞において早期継代（ｐ３）でｈＴＥＲＴ発現を僅かに誘導した；しかし、それは後期継代（ｐ６）で検出不能になった。Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２の両方の存在下では、ｈＴＥＲＴ発現は、後期継代（ｐ６）で気管支上皮細胞において誘導および持続した。
【０２０２】
図６Ａおよび図６Ｂに示されるように、早期継代（ｐ２）での前立腺上皮細胞は、低レベルのｈＴＥＲＴを発現し、これは、継代３で迅速に減少し、継代５で検出不能になった。ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１は、前立腺上皮細胞において早期継代（ｐ２）でｈＴＥＲＴ発現を迅速に誘導し、後期継代（ｐ５）で測定可能なｈＴＥＲＴ発現を持続させた。Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２は、前立腺上皮細胞において早期継代（ｐ２）でｈＴＥＲＴ発現を誘導した；しかし、それは、後期継代（ｐ５）で検出不能になった。Ａ８３−１０およびＹ−２７６３２の両方の存在下で、ｈＴＥＲＴ発現は、早期継代（ｐ２）の前立腺上皮細胞において有意に誘導され、後期継代（ｐ５）においてすら高レベルで持続した。ｈＴＥＲＴ発現のこのレベルは、３Ｔ３−Ｊ２フィーダー細胞（Ｊ２）と共培養した前立腺上皮細胞におけるｈＴＥＲＴ発現のレベルと匹敵した。
【０２０３】
実施例４：上皮細胞プレーティング効率
この実施例において、上皮細胞プレーティング効率、すなわち、細胞培養表面に効率的に付着して、分裂し、コロニーへと増殖し続ける細胞の数を、種々の条件下で調べた。
【０２０４】
図７に示されるように、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１は、標準の組織培養表面（すなわち、被覆されていない）上でＫＳＦＭ中での前立腺上皮細胞プレーティング効率に干渉した。ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１の存在下では、大部分の前立腺上皮細胞は、３日後ですら、標準の組織培養表面に付着しなかった。しかし、付着した少数の細胞は、増殖し続けた。８日目まで、細胞を継代した場合に、大部分の細胞は、活発に分裂している細胞の特徴的な形態を示した。
【０２０５】
図８に示されるように、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１は、標準の組織培養表面（すなわち、被覆されていない）上で、ＫＳＦＭ中での気管支上皮細胞プレーティング効率に干渉した。ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１の存在下では、大部分の気管支上皮細胞は、３日後ですら、標準の組織培養表面に付着しなかった。しかし、付着した少数の細胞は、増殖し続けた。大部分の細胞は、７日目で活発に分裂している細胞の特徴的な形態を示した。
【０２０６】
図９に示されるように、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２は、ＫＳＦＭ中のＡ８３−０１によって引き起こされた前立腺上皮細胞の低いプレーティング効率を改善した。多くの前立腺上皮細胞は、プレーティング後２日目で、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２の両方の存在下で標準の組織培養表面に付着した。上記細胞は増殖し続け、大部分の細胞は、７日目で活発に分裂している細胞の特徴的形態を示した。
【０２０７】
図１０に示されるように、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２は、ＫＳＦＭ中のＡ８３−０１によって引き起こされた気管支上皮細胞の低いプレーティング効率を改善した。多くの気管支上皮細胞は、プレーティング後２日目でＡ８３−０１およびＹ−２７６３２の両方の存在下で標準の組織培養表面に付着した。上記細胞は増殖し続け、大部分の細胞は、７日目で活発に分裂している細胞の特徴的形態を示した。
【０２０８】
図１１に示されるように、コラーゲンＩを被覆した組織培養表面の使用は、ＫＳＦＭ中のＡ８３−０１およびＹ−２７６３２の存在下での前立腺上皮細胞のプレーティング効率を劇的に増大させた。大部分の細胞は、プレーティング後１日目で上記表面に効率的に付着し、迅速に増殖した。５日目までに、上記細胞を継代した場合に、大部分の細胞は、活発に分裂している細胞の特徴的形態を示した。
【０２０９】
図１２に示されるように、コラーゲンＩを被覆した組織培養表面の使用は、ＫＳＦＭ中のＡ８３−０１およびＹ−２７６３２の存在下での気管支上皮細胞のプレーティング効率を劇的に増大させた。大部分の細胞は、プレーティング後１日目で上記表面に効率的に付着し、迅速に増殖した。６日目までに、上記細胞を継代した場合に、大部分の細胞は、活発に分裂している細胞の特徴的形態を示した。
【０２１０】
実施例５：上皮細胞増殖に対するＡＬＫ５インヒビター、Ｒｈｏキナーゼインヒビター、および他の化合物を含む化合物の効果
この実施例において、前立腺上皮細胞および気管支上皮細胞の増殖を、ＡＬＫ５インヒビター、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）、および他の化合物を含む化合物の存在下で評価した。
【０２１１】
前立腺上皮細胞および気管支上皮細胞を、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２の存在下で、ＫＳＦＭ中で増殖させた。図１３に示されるように、前立腺上皮細胞および気管支上皮細胞の両方は、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２の連続使用にも拘わらず、後期継代において老化に入った。８日目および９日目までに、前立腺上皮細胞および気管支上皮細胞の後期継代は、平らなかつ拡張した細胞形状のような細胞老化の特徴的な形態を示した。従って、これを単独で使用した場合、Ｙ−２７６３２は、前立腺上皮細胞または気管支上皮細胞の増殖を促進しなかった。
【０２１２】
さらなるインビトロおよび／またはエキソビボ増殖条件の効果を試験するために、前立腺上皮細胞を、培地単独、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２、またはその両方（コラーゲンありまたはなし）の存在下で、ＫＳＦＭまたはＰｒＥＧＭ中で増殖させた。図１４に示されるように、前立腺上皮細胞は、ＰｒＥＧＭまたはＫＳＦＭ中での１０〜２０回の集団倍加後に老化に入った。Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２は、前立腺上皮細胞の総集団倍加を僅かに増大させたが、上記細胞は、ＰＤ２０超に達してまもなくなお老化に入った。Ａ８３−０１はまた、総集団倍加を増大させた；しかし、Ａ８３−０１は、標準の組織培養表面上でのプレーティング効率に干渉し得る（実施例４を参照のこと）ので、細胞数の増大は、遅い。Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２の両方のＫＳＦＭへの添加は、標準の組織培養容器およびコラーゲンを被覆した組織培養容器の両方の上で、遙かに早いペースで前立腺上皮細胞の総集団倍加を有意に増大させた。従って、前立腺上皮細胞の総集団倍加は、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１およびＲｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２を組み合わせて使用した場合に有意に増大した。
【０２１３】
上記の実験に類似して、気管支上皮細胞を、培地単独、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２、またはその両方（コラーゲンありまたはなし）の存在下で、ＫＳＦＭ中で増殖させた。図１５に示されるように、気管支上皮細胞は、ＫＳＦＭ中での１１回の集団倍加後に老化に入った。Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２は、気管支上皮細胞の総集団倍加を僅かに増大させたが、上記細胞は、ＰＤ１３超に達してまもなくなお老化に入った。Ａ８３−０１はまた、総集団倍加を増大させた；しかし、Ａ８３−０１は、標準の組織培養表面上でのプレーティング効率に干渉し得る（実施例４を参照のこと）ので、細胞数の増大は遅い。Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２の両方のＫＳＦＭへの添加は、標準の組織培養表面およびコラーゲンを被覆した組織培養表面の両方の上で、遙かに早いペースで気管支上皮細胞の総集団倍加を有意に増大させた。そのうちの後者は、さらに速いペースで示した。従って、気管支上皮細胞の総集団倍加は、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１およびＲｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２を組み合わせて使用した場合に有意に増大した。
【０２１４】
別の実験では、後期継代の前立腺上皮細胞を、ＫＳＦＭ＋図１６中で示されるとおりの個々の化合物の中で培養し、上記個々の化合物は、種々の濃度で試験した（すなわち、５μＭ、黒い棒；１μＭ、市松模様の棒；および０．２μＭ、白い棒）。化合物を添加しなかったコントロール実験では、５日後に細胞数の最小限の増大が存在した。Ｙ−２７６３２、ＳＲ  ３６７７、ＧＳＫ  ４２９２８６およびチアゾビビンのようなＲｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）は、総細胞数の僅かな増大をもたらす。対照的に、ＡＬＫ５インヒビター（例えば、Ａ８３−０１、ＳＢ
４３１５４２、ＧＷ  ７８８３８８およびＲｅｐＳｏｘ）は、５日後に総細胞数の顕著な増大を生じた。ＰＡＫ１インヒビターＩＰＡ−３もミオシンＩＩインヒビター（すなわち、非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）インヒビター）ブレビスタチンも、細胞増殖のいかなる増大をも生じず、ＩＰＡ−３は、試験した最高濃度（５μＭ）でほぼ全ての細胞死を引き起こした。従って、単独で使用した場合には、ＡＬＫ５インヒビターは、ＫＳＦＭ中の後期継代の前立腺上皮細胞の増殖を有意に増大させた；単独で使用した場合には、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）は、増殖を僅かに増大させた；そして単独で使用した場合には、ＰＡＫ１インヒビターまたはミオシンＩＩインヒビター（すなわち、非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）インヒビター）は、増殖を増大させなかった。
【０２１５】
さらなる実験では、後期継代の前立腺上皮細胞を、ＫＳＦＭ、またはＡ８３−０１＋図１７に示されるとおりの個々の化合物を補充したＫＳＦＭ中で培養し、上記個々の化合物を、種々の濃度で試験した（５μＭ、黒い棒；１μＭ、市松模様の棒；および０．２μＭ、白い棒）。インヒビターがＫＳＦＭに添加されなかったコントロール実験では、５日後に細胞数の最小限の増大が存在した。Ａ８３−０１は、後期継代の前立腺上皮細胞増殖を有意に増大させた一方で、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２は、細胞増殖の僅かな増大をもたらす。Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２の両方を使用した場合、それらは、前立腺上皮細胞の増殖を相乗効果的に増大させた。このような相乗効果はまた、他のＲｈｏキナーゼインヒビター（例えば、ＳＲ  ３６７７、ＧＳＫ  ４２９２８６およびチアゾビビン）についても観察された。ＰＡＫ１インヒビターＩＰＡ−３およびミオシンＩＩインヒビター（すなわち、非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）インヒビター）ブレビスタチンはまた、ＫＳＦＭ中でＡ８３−０１と一緒に使用した場合に、前立腺上皮細胞増殖を相乗効果的に増大させた。対照的に、他のＡＬＫ５インヒビター（例えば、ＧＷ  ７８８３８８、ＳＢ  ４３１５４２またはＲｅｐＳｏｘ）をＡ８３−０１と一緒に使用した場合には、前立腺上皮細胞増殖のさらなる増大はほとんど存在しなかった。従って、細胞骨格の完全性を調節するいくつかのクラスのインヒビターは、これらをＡ８３−０１と一緒に使用した場合、ＫＳＦＭ中での後期継代の前立腺細胞増殖を相乗効果的に増大させた。上記のように、これらは、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）（例えば、Ｙ−２７６３２、ＳＲ  ３６７７、ＧＳＫ  ４２９２８６およびチアゾビビン）；ＰＡＫ１インヒビターＩＰＡ−３；およびミオシンＩＩインヒビター（すなわち、非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）インヒビター）ブレビスタチンを含む。
【０２１６】
実施例６：上皮細胞増殖および他の特性に対するＡＬＫ５インヒビター、Ｒｈｏキナーゼインヒビター、および他の化合物を含む化合物の効果に関するさらなる研究
この実施例において、包皮ケラチノサイト、前立腺上皮細胞、および気管支上皮細胞の増殖を、ＡＬＫ５インヒビター、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）、および他の化合物を含む化合物の存在下で評価した。
【０２１７】
包皮ケラチノサイト（図１８）、前立腺上皮細胞（図１９）、および気管支上皮細胞（図２０）を、コラーゲンを被覆した培養容器上で、ＫＳＦＭ単独、または１μＭ  ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１および５μＭ  Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２を補充したＫＳＦＭのいずれかの中で培養した。各継代における上記細胞の集団倍加を評価し、総集団倍加を培養日数に対してプロットした（図１８、１９および２０）。ＫＳＦＭ中、上記上皮細胞は、増殖を止める前に、わずか１０〜２０回の集団倍加にわたる制限された細胞複製を示した。ＫＳＦＭとＡ８３−０１およびＹ−２７６３２においては、上記上皮細胞は、４０〜６０回のさらなる集団倍加にわたって増殖し続けた。従って、包皮ケラチノサイト、前立腺上皮細胞および気管支上皮細胞の集団倍加は、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１およびＲｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２が一緒に使用された場合に有意に増大し、これは、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２が一緒に、培養物中の種々の上皮細胞の寿命を有意に延ばすことを示す。
【０２１８】
さらなる調査では、上皮細胞増殖を、βアドレナリン作動性アゴニスト（すなわち、βアドレナリン作動性レセプターアゴニスト）の存在下で評価した。ヒト包皮ケラチノサイト（ＨＦＫ）およびヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）を、漸増濃度のイソプロテレノール（環状ｃＡＭＰレベルを増大させるβアドレナリン作用性レセプターアゴニスト）を補充した、ＫＳＦＭ＋１μＭ  Ａ８３−０１および５μＭ  Ｙ−２７６３２中で培養した。細胞数を６日後に計数して、コントロールに対する細胞増殖を計算した。図３０に示されるように、イソプロテレノールは、ＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２中での上皮細胞増殖をさらに増大させた。
【０２１９】
安定なトランスジェニック細胞株を、核局在化赤色蛍光タンパク質（ｎＲＦＰ）を発現するレンチウイルスベクターを使用して、種々の上皮細胞（すなわち、ヒト包皮ケラチノサイト（ＨＦＫ）、前立腺上皮細胞（ＰｒＥＣ）、およびヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ））について樹立した。このようなトランスジェニック細胞株（例えば、図２４に示される）は、ｎＲＦＰレポーター遺伝子を遍在的に発現し、標準的抗生物質選択を通じて選択する。ＨＦＫ／ｎＲＦＰ、ＰｒＥＣ／ｎＲＦＰおよびＨＢＥＣ／ｎＲＦＰ細胞を、図２３に示されるように、ＫＳＦＭとＡ８３−０１およびＹ−２７６３２中で長期間培養した。
【０２２０】
ＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２中で培養した種々の上皮細胞に関する核型を、早期継代および後期継代において評価した。具体的には、核型分析は、継代３（１３．５回の集団倍加）および継代１９（６２．０回の集団倍加）でのヒト包皮ケラチノサイト（ＨＦＫ）；継代４（１１．１回の集団倍加）および継代１６（４５．１回の集団倍加）でのヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）；ならびに継代３（１３．５回の集団倍加）および継代１３（４１．１回の集団倍加）での前立腺上皮細胞（ＰｒＥＣ）に対して、中期染色体スプレッドを使用して行った。核型分析の結果を、図２１に示す。上記細胞は、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２の存在下での長期間の培養後に、肉眼で見える核型の異常性がない、４６本の正常な染色体を示した。図２１、左下パネルは、早期継代（ｐ３）でのＨＦＫ細胞の代表的中期染色体スプレッドを示し、図２１、右下パネルは、後期継代（ｐ１９）でのＨＦＫ細胞の代表的中期染色体スプレッドを示す。
【０２２１】
平均テロメア長を、数回の集団倍加にわたって、ＫＳＦＭ単独またはＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２の中で培養した細胞に関して評価した。具体的には、ＫＳＦＭ単独またはＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２中で培養した包皮ケラチノサイトにおける平均テロメア長を、定量的ＰＣＲアッセイを使用して決定し、図２２においてＴ／Ｓ比（Ｔ、テロメア；Ｓ、単一コピー遺伝子）として表す。ＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２中で培養した包皮ケラチノサイトにおけるテロメアの平均長は、培養物の集団倍加が増大するにつれて着実に減少した。
【０２２２】
ある特定の遺伝子の発現を、ＫＳＦＭ単独またはＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２中で培養した上皮細胞に関して種々の継代で評価した。図２７は、発現レベルがＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２中でダウンレギュレートまたはアップレギュレートされる代表的遺伝子のリストを提供する。総ＲＮＡを、ＫＳＦＭ単独、またはＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２中で、種々の継代で培養した包皮ケラチノサイトから抽出した。遺伝子発現レベルを、ＲＴ2  ＰｒｏｆｉｌｅｒＴＭ  ＰＣＲ  Ａｒ
ｒａｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅアッセイ（Ｑｉａｇｅｎ，  ＰＡＨＳ−０５０Ｚ）を使用する定量的ＰＣＲによって分析した。ストレス応答および老化に関与するいくつかの遺伝子は、上記細胞がＫＳＦＭ中、６回目の継代で老化に入った場合に増大した発現を示した（すなわち、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＬＢ１、ＰＬＡＵ、ＳＥＲＰＩＮＥ１およびＳＯＤ２）一方で、これら遺伝子の発現は、ＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２中では抑制された。同様に、接着分子遺伝子（ＦＮ１、ＴＨＢＳ１）および中間フィラメントタンパク質（ＶＩＭ）遺伝子は、上記細胞がＫＳＦＭ中、６回目の継代で老化に入った場合に増大した発現を示した一方で、これらの遺伝子の発現は、ＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２中で抑制された。ある特定の遺伝子、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＩＴＥＤ２、ＣＲＥＧ１、ＩＤ１、ＭＡＰ２Ｋ６、ＩＧＦＢＰ３およびＩＧＦＢＰ５の発現は、ＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２中で、特に、後期継代において有意にアップレギュレートされた。従って、細胞の老化とときおり関連するいくつかの遺伝子（例えば、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＩＴＥＤ２、ＣＲＥＧ１、ＩＤ１、ＭＡＰ２Ｋ６、ＩＧＦＢＰ３およびＩＧＦＢＰ５）は、ＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２中で培養した後期継代の上皮細胞集団において増大した発現を示した。ＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２中で培養した後期継代の正常な上皮細胞において観察される正常な核型およびより短いテロメアとともに、これは、ＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２中で拡大した正常な上皮細胞が起源上皮細胞集団とは異なるが、それらが異常な細胞に形質転換されないような特徴を獲得したことを示す。
【０２２３】
細胞挙動に対する培養培地カルシウム含有量の効果を、ＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２中で培養した上皮細胞に関して評価した。ヒト気管支上皮細胞を、ＫＳＦＭ（９０μＭ  ＣａＣｌ２あり）＋Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２中で増殖させた。これらの細胞は、培養容器全体にわたって拡がり（図２８、左パネル）、いくらかの細胞は、それらが互いに直ぐ近くに存在した場合にすら、細胞間連結を形成した。高濃度（１ｍＭ）のＣａＣｌ２をＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２の中への添加は、気管支上皮細胞を密な塊へと凝集させた（図２８、右パネル）。パッチの中央にある細胞は、積み重なる傾向にあり、個々の細胞間の境界は概して認識できなかった。ある特定の場合には、異常な伸長が塊の間で形成された。
【０２２４】
さらなる調査では、細胞間結合に対する培養培地カルシウム含有量の効果を、ＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２中で培養した気管支上皮細胞に関して評価した。細胞間結合を、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）によって測定した場合に、イオンの傍細胞流に従って評価した。図２９（上パネル）に示されるように、気管支上皮細胞は、ＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２中の高濃度（１ｍＭ）のＣａＣｌ２の存在下でＴＥＥＲを増大させることによって示されるように、イオンの傍細胞流を最小限にした密な細胞間結合を確立した。対照的に、気管支上皮細胞は、ＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２中の低濃度（９０μＭ）のＣａＣｌ２の下では、密な細胞間結合を確立しなかった。気管支上皮細胞を、多孔性膜支持体（ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５４４７４）上にプレーティングし、膜が培養培地で覆われていた７日間にわたって維持した（液内相、図２９、上パネルの灰色のボックス）。８日目に、その培地を膜の先端側から除去し、その細胞を空気に曝して、さらなる分化を誘導した。さらに、図２９（下パネル）に示されるように、気管支上皮細胞は、ＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２中の高濃度（１ｍＭ）のＣａＣｌ２の存在下で経時的に経膜電気抵抗（ＴＥＥＲ）の増大を確立した。気管支上皮細胞を、多孔性膜支持体（ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５４４７４）上にプレーティングし、その膜を培養培地で上記培養の継続期間にわたって覆って２４日間維持した。経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）は、培養期間全体の間に高レベルのままであった。図２９（下パネル）における各トレースは、１つの多孔性膜を横切るＴＥＥＲの測定値を示す。
【０２２５】
実施例７：上皮細胞増殖のための規定された培地組成物の同定
ウシ下垂体抽出物を、ＫＳＦＭ中のおよび多くの無血清細胞培養培地中の有糸分裂促進性補充物として使用する。その有糸分裂促進性活性に加えて、ＢＰＥは、種々の規定されていないタンパク質、脂質およびホルモンを含む。上皮細胞が増殖し得る１種もしくはこれより多くの規定された培地組成物を同定するために、さらなる培養培地組成物を試験した。具体的には、上皮細胞を、ＡＬＫ５インヒビターおよびＲｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）を含む種々の規定された培地組成物の中で増殖させ、これら細胞集団の増殖を評価した。規定された培地組成物は、Ｍ＊（ＭＣＤＢ−１５３（改変）培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、カタログ番号０１−０５９−１、この製剤は、ワールドワイドウェブアドレス  ｂｉｏｉｎｄ．ｃｏｍ／ｐａｇｅ＿１６６８２および以下の表２Ｂにおいて見出され得る）＋表皮増殖因子（ＥＧＦ）＋酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）＋Ａ８３−０１＋Ｙ−２７６３２）；脂肪酸非含有ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；  Ｓｉｇｍａ、Ａ８８０６）；イネにおいて発現された組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ；  Ｓｉｇｍａ、Ａ９７３１）；脂質ミックス（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ；Ｇｉｂｃｏ、１１９０５−０３１）；およびＡＬＢＵＭＡＸ  Ｉ  Ｌｉｐｉｄ−Ｒｉｃｈ  ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ，  １１０２０−０３９）から選択される１種もしくはこれより多くの成分を含んだ。ＭＣＤＢ−１５３（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍ７４０３）および改変ＭＣＤＢ−１５３（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、カタログ番号０１−０５９−１）中のある特定の成分、ならびにそれらの濃度を、以下の表２Ａおよび２Ｂに示す。この脂質ミックスは、エチルアルコールおよび以下の表３に列挙される成分を含む。ＡＬＢＵＭＡＸは、ＢＳＡおよび以下の脂肪酸を各々、１ｇ  ＢＳＡあたり約０．５〜２．２ｍｇの間で含む：α−リノレン酸、リノール酸、オレイン酸、ステアリン酸、およびパルミチン酸。
【表２Ａ−１】
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【表２Ａ−２】
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【表２Ａ−３】
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【表２Ｂ−１】
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【表２Ｂ−２】
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【表２Ｂ−３】
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【表３】
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【０２２６】
ＨＦＫ細胞およびＨＢＥＣ細胞を、Ｍ＊；Ｍ＊＋ＡＬＢＵＭＡＸ（１０００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、１２５μｇ／ｍＬ、６２．５  μμｇ／ｍＬ、３１．３μｇ／ｍＬおよび１５．６μｇ／ｍＬで）；Ｍ＊＋ＢＳＡ＋脂質ミックス（１：５０希釈、１：１００希釈、１：２００希釈、１：４００希釈、１：８００希釈、１：１６００希釈、および１：３２００希釈で）；またはＭ＊＋ｒＨＡ＋脂質ミックス（１：５０希釈、１：１００希釈、１：２００希釈、１：４００希釈、１：８００希釈、１：１６００希釈、および１：３２００希釈で）の中で増殖させた。上記細胞集団の増殖を評価した。その結果をＨＦＫ細胞については図２５で、およびＨＢＥＣ細胞については図２６で、細胞数の倍数増大として示す。その結果は、アルブミンおよび脂質混合物が、ウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ）補充の必要性なしに上皮細胞増殖を支持するために使用され得ることを示す。
【０２２７】
実施例８：上皮細胞遺伝子発現プロフィール
この実施例において、遺伝子発現プロフィールを、種々の無血清培地条件で増殖させた上皮細胞について記載する。
【０２２８】
総ＲＮＡを、継代２および継代６においてＫＳＦＭ中で、または継代２、継代１３および継代２３においてＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１（１μＭ）およびＹ−２７６３２（５μＭ）中で培養したヒト包皮ケラチノサイト；および継代２および継代８においてＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１（１μＭ）およびＹ−２７６３２（５μＭ）中で培養した気道上皮細胞から抽出した。気道上皮細胞のための細胞培養培地はまた、イソプロテレノール（３μＭ）を含んだ。遺伝子発現レベルを、特注のＲＴ2  ＰｒｏｆｉｌｅｒＴＭ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙ
（Ｑｉａｇｅｎ）を使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ヒト小腸または肺組織に由来する総ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、コントロールとして含めた。アクチンＢに対する遺伝子発現レベルを、２＾（ＣｔアクチンＢ−Ｃｔ遺伝子）を使用して計算した（ここでＣｔアクチンＢまたはＣｔ遺伝子は、規定された閾値を横切るために、定量的ＰＣＲ反応の蛍光シグナルに必要とされるサイクル数である）。ＣｔアクチンＢは、概して１８あたりであった。遺伝子の発現レベルを、Ｃｔ遺伝子が３５より高い場合に検出不能（ＮＤ）と見做した。遺伝子の発現レベルを、Ｃｔ遺伝子が３５未満でありかつ３０以上である場合に低いと見做した。遺伝子の発現レベルを、Ｃｔ遺伝子が２９未満でありかつ２２以上である場合に中程度または適度と見做した。遺伝子の発現レベルを、Ｃｔ遺伝子が２２未満である場合に高いと見做した。
【０２２９】
以下の表４に示されるように、ＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２中で増殖させた上皮細胞は、代表的には、基底上皮細胞において発現される遺伝子（ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ４、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ５およびＴＰ６３）の高レベルを発現した。これら細胞はまた、ある特定の多能性幹細胞マーカー（例えば、ＬＩＮ２８Ａ、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４およびＳＯＸ２）の発現を欠いており、ＫＬＦ４の中程度のレベルを発現した。上記細胞はまた、代表的には、最終分化した上皮細胞において発現される遺伝子（ＣＦＴＲ、ＦＯＸＪ１、ＩＶＬ、ＫＲＴ１、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ２０、ＬＯＲ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ＳＣＧＢ１Ａ１、ＳＦＴＰＢおよびＳＦＴＰＤが挙げられる）を発現しなかったか、またはその非常に低いレベルを発現した。胃、腸、または膵臓の上皮細胞において高度に発現される遺伝子は、ＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２中で増殖させた細胞において全く検出されなかった（ＣＤ３４、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＩＨＨ、ＫＩＴ、ＬＧＲ５、ＰＤＸ１、およびＰＲＯＭ１／ＣＤ１３３が挙げられる）。
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【０２３０】
実施例９：培養物中の上皮細胞の特徴付け
この実施例において、ある特定の特徴を、種々のフィーダーなしかつ無血清培地条件で増殖させた上皮細胞について記載する。
【０２３１】
気管支球状物への気管支上皮細胞の分化
１μＭ  Ａ８３−０１および５μＭ  Ｙ−２７６３２を補充したＫＳＦＭ（ＫＳＦＭ＋Ａ＋Ｙ）中で培養した継代２のヒト気管支上皮細胞を、ＫＳＦＭ＋Ａ＋Ｙ条件から除去し、単一細胞としてマトリゲル（登録商標）中に埋め込み、ＣｌｏｎｅｔｉｃｓＴＭ  Ｂ−ＡＬＩＴＭ  気相液相界面培地（高カルシウム分化培地、Ｌｏｎｚａ）中で１４日間培養した。図３１は、気管支球状物へと分化した気管支上皮細胞を示す。図３１の上パネルは、低倍率（４×）で見た細胞を示し、図３１の下パネルは、高倍率（２０×）で見た細胞を示す。目に見える内腔を有する大きな気管支球状物は、図３１の下パネルに示される。
【０２３２】
高カルシウム濃度への曝露後の上皮細胞の特徴付け
ドーム様構造は、高濃度のＣａＣｌ２の存在下で、ケラチノサイトおよび気管支上皮細胞培養物中で形成した。具体的には、低ＣａＣｌ２（９０μＭ）において１μＭ  Ａ８３−０１および５μＭ  Ｙ−２７６３２を補充したＫＳＦＭ（ＫＳＦＭ＋Ａ＋Ｙ）中で培養した後期継代のヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）および後期継代のヒト包皮ケラチノサイト（ＨＦＫ）を、６ウェルプレート中でコンフルエントに達するようにした。上記細胞を、ＫＳＦＭ＋Ａ＋Ｙ条件の中に残し、ＣａＣｌ２濃度を、上皮細胞の分化を誘導するために１．５ｍＭへと上昇させた。多くのドーム様構造が７〜１０日後に形成された。これを図３２Ａ〜図３２Ｄに示す。
【０２３３】
密着結合形成が、高濃度のＣａＣｌ２に曝した後にケラチノサイト間で観察された。具体的には、１μＭ  Ａ８３−０１および５μＭ  Ｙ−２７６３２を補充したＫＳＦＭ（ＫＳＦＭ＋Ａ＋Ｙ）中で、低ＣａＣｌ２（９０μＭ）において培養した後期継代のヒト包皮ケラチノサイト（ＨＦＫ）を、コンフルエントに達するようにした。上記細胞を、ＫＳＦＭ＋Ａ＋Ｙ条件の中に残し、そのＣａＣｌ２濃度を、分化を誘導するために１．５ｍＭへと上昇させた。細胞間密着結合の存在を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８に結合体化したモノクローナル抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，  ３３９１８８）を使用して、密着結合タンパク質ＺＯ−１を免疫蛍光染色することによって明らかにした。これを図３３に示す。
【０２３４】
ケラチノサイトは、ＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２中の高濃度（１．５ｍＭ）のＣａＣｌ２の存在下で、気相液相界面分化において経時的に経膜電気抵抗（ＴＥＥＲ）の増大を確立した。具体的には、１μＭ  Ａ８３−０１および５μＭ  Ｙ−２７６３２を補充したＫＳＦＭ（ＫＳＦＭ＋Ａ＋Ｙ）中で低ＣａＣｌ２（９０μＭ）において予め培養したヒト包皮ケラチノサイト（ＨＦＫ）を、多孔性膜支持体（ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５４４７４）上にプレーティングし、１４日間維持した。上記細胞を、培養培地（ＫＳＦＭ＋Ａ＋Ｙおよび１．５ｍＭのＣａＣｌ２）によって初日の間は覆って（液内相、図３４の灰色のボックス）、残りの日数にわたって空気に曝した。図３４に示されるように、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）は、培養期間全体にわたって非常に高レベルに達した。
【０２３５】
ケラチノサイトは、ＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２中の高濃度（１．５ｍＭ）のＣａＣｌ２の存在下で、気相液相界面分化において経時的に表皮様構造を形成した。具体的には、低ＣａＣｌ２（９０μＭ）において１μＭ  Ａ８３−０１および５μＭ
Ｙ−２７６３２を補充したＫＳＦＭ（ＫＳＦＭ＋Ａ＋Ｙ）中で予め培養したヒト包皮ケラチノサイト（ＨＦＫ）を、多孔性膜支持体（ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５４４７４）上にプレーティングし、１４日間維持した。上記細胞を、培養培地（ＫＳＦＭ＋Ａ＋Ｙおよび１．５ｍＭのＣａＣｌ２）で初日の間は覆って、残りの日数にわたって空気に曝した。実験の最後に（すなわち、１４日目に）、培養物を４％  パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン中に包埋し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色（Ｈ＆Ｅ）のために切片にして、その構造を明らかにした。図３５に示されるように、上記細胞は、角質層、顆粒層、有棘層、および基底層に似た層を有する多層構造へと分化した。
【０２３６】
上皮細胞培養物のさらなる特徴付け
単一細胞クローニングおよびケラチノサイトの拡大を調べた。具体的には、後期継代での単一ヒト包皮ケラチノサイト（ＨＦＫ）（ＫＳＦＭ＋１μＭ  Ａ８３−０１、５μＭ  Ｙ−２７６３２および３μＭ  イソプロテレノール中で予め培養）を、コラーゲンＩを被覆した３８４ウェルプレートの上にプレーティングし、ＫＳＦＭ＋１μＭ  Ａ８３−０１、５μＭ  Ｙ−２７６３２および３μＭ  イソプロテレノール中で培養した。１０日間にわたって、細胞は１０００個より多くの細胞へと分裂し、図３６に示されるようにコロニーを形成した。
【０２３７】
細胞形態における異質性は、単一細胞に由来するケラチノサイト子孫について観察された。具体的には、上記で記載されかつ図３６に示される単一細胞由来コロニーを、ＫＳＦＭ＋１μＭ  Ａ８３−０１、５μＭ  Ｙ−２７６３２および３μＭ  イソプロテレノール中で、Ｔ−２５フラスコの中でさらに拡大した。細胞形態（例えば、細胞サイズ）における異質性が観察された。これを図３７に示す。有糸分裂細胞を、特徴的な丸い形態、明るいハローの位相（ｐｈａｓｅ  ｂｒｉｇｈｔ  ｈａｌｏ）、および中央の暗いバンド（凝縮した染色体を示す）によって同定した。
【０２３８】
単一細胞コロニー形成効率を、ＫＳＦＭ＋Ａ８３−０１、Ｙ−２７６３２およびイソプロテレノール中で培養したある特定の上皮細胞タイプに関して試験した。具体的には、ＫＳＦＭ＋１μＭ  Ａ８３−０１、５μＭ  Ｙ−２７６３２および３μＭ  イソプロテレノール中で予め培養した後期継代のヒト包皮ケラチノサイト（ＨＦＫ）およびヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）を、コラーゲンを被覆した３８４ウェルプレート上に１細胞／ウェルで播種し、ＫＳＦＭ＋１μＭ  Ａ８３−０１、５μＭ  Ｙ−２７６３２および３μＭ  イソプロテレノール中で１０日間増殖させた。１０日目に、各ウェル中の細胞数を決定した。２０個未満の細胞を有する、２１〜１００個の細胞を有する、１０１〜５００個の細胞を有する、または５００個より多くの細胞を有するウェル（すなわち、コロニー）の数を記録およびプロットした。その結果を図３８に示す。
【０２３９】
種々の培地条件で培養した上皮細胞の拡大
種々の組織に由来する上皮細胞を培養して、種々の培養培地中での拡大に関するそれらの能力を評価した。上記細胞を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ／Ｇｉｂｃｏ（ＨＦＫｎおよびＨＥＫａ）またはＬｏｎｚａ（ＨＭＥＣ、ＰｒＥＣ、ＨＢＥＣ、ＳＡＥＣおよびＤＨＢＥ−ＣＦ）から得た。式Ｆ＝２ｎ（ここでＦ＝ｎ回の集団倍加後の拡大の倍数）を使用して倍数拡大を計算した。その結果を以下の表５に示す。
【表５−１】
2020120686.tif 000016
【表５−２】
2020120686.tif 000017
【０２４０】
ＨＦＫｎ、新生児ヒト包皮ケラチノサイト。ＨＥＫａ、成体ヒト表皮ケラチノサイト。ＨＭＥＣ、ヒト乳腺上皮細胞（女性）。ＰｒＥＣ、ヒト前立腺上皮細胞。ＨＢＥＣ、ヒト気管支上皮細胞。ＳＡＥＣ、ヒト小気道上皮細胞。ＤＨＢＥ−ＣＦ、嚢胞性線維症患者に由来する病的ヒト気管支上皮細胞。
【０２４１】
＊は、細胞培養を、ＫＳＦＭ中より遙かに高い拡大の倍数を達成した後に自発的に一時停止し、その集団は、実験を一時停止した場合になお活発な分裂を受けていたことを注記する。
【０２４２】
ＫＳＦＭ、ケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。ＰｒＧＭ、前立腺上皮細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ）。Ａ、ＡＬＫ５インヒビターＡ８３−０１。Ｙ、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）Ｙ−２７６３２。Ｂ、ミオシンＩＩインヒビターブレビスタチン。ＩＰＡ、グループＩ  ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ１）インヒビター。ＧＳＫ、Ｒｈｏキナーゼインヒビター（すなわち、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼインヒビター）ＧＳＫ−４２９２８６。
実施例１０：  実施形態の例
【０２４３】
以下に示される例は、ある特定の実施形態を例示するのであって、本技術を限定するものではない。
【０２４４】
Ａ１．  エキソビボで分化した上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、
ａ）無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で分化した上皮細胞を培養する工程および
ｂ）（ａ）の培養する工程の間に前記分化した上皮細胞においてＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する工程、を含む方法。
Ａ１．１  エキソビボで以前は静止していた上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、
ａ）無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で以前は静止していた上皮細胞を培養する工程および
ｂ）（ａ）の培養する工程の間に前記以前は静止していた上皮細胞においてＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する工程、を含む方法。
Ａ１．２  エキソビボで系統拘束された上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、
ａ）無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で系統拘束された上皮細胞を培養する工程および
ｂ）（ａ）の培養する工程の間に前記系統拘束された上皮細胞においてＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する工程、を含む方法。
【０２４５】
Ａ２．  エキソビボで上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、
ａ）フィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を培養する工程
ｂ）（ａ）の培養する工程の間に前記上皮細胞においてＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する工程および
ｃ）（ａ）の培養する工程の間に前記上皮細胞においてｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）の活性を阻害する工程、を含む方法。
Ａ２．１  前記上皮細胞が、分化した上皮細胞を含む、実施形態Ａ２の方法。
Ａ２．２  前記上皮細胞が、以前は静止していた上皮細胞を含む、実施形態Ａ２の方法。
Ａ２．３  前記上皮細胞が、系統拘束された上皮細胞を含む、実施形態Ａ２の方法。
【０２４６】
Ａ３．  エキソビボで上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、
ａ）無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を培養する工程
ｂ）（ａ）の培養する工程の間に前記上皮細胞においてＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する工程および
ｃ）（ａ）の培養する工程の間に前記上皮細胞においてミオシンＩＩの活性を阻害する工程、を含む方法。
Ａ３．１  前記上皮細胞が、分化した上皮細胞を含む、実施形態Ａ３の方法。
Ａ３．２  前記上皮細胞が、以前は静止していた上皮細胞を含む、実施形態Ａ３の方法。
Ａ３．３  前記上皮細胞が、系統拘束された上皮細胞を含む、実施形態Ａ３の方法。
Ａ３．４  前記ミオシンＩＩが非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）である、実施形態Ａ３〜Ａ３．３のいずれか１つの方法。
【０２４７】
Ａ４．  （ａ）の培養する工程は、血清含有培地の存在下で行われる、実施形態Ａ２〜Ａ３．４のいずれか１つの方法。
Ａ４．１  （ａ）の培養する工程は、無血清培地の存在下で行われる、実施形態Ａ２〜Ａ３．４のいずれか１つの方法。
【０２４８】
Ａ５．  エキソビボで分化した上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、
ａ）フィーダー細胞なしの条件下で分化した上皮細胞を培養する工程
ｂ）前記分化した上皮細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化する工程；および
ｃ）前記分化した上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程、を含む方法。
Ａ５．１  エキソビボで以前は静止していた上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、
ａ）フィーダー細胞なしの条件下で以前は静止していた上皮細胞を培養する工程
ｂ）前記以前は静止していた上皮細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化する工程；および
ｃ）前記以前は静止していた上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程、を含む方法。
Ａ５．２  エキソビボで系統拘束された上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、
ａ）フィーダー細胞なしの条件下で系統拘束された上皮細胞を培養する工程
ｂ）前記系統拘束された上皮細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化する工程；および
ｃ）前記系統拘束された上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程、を含む方法。
Ａ５．３  ＴＧＦ−βシグナル伝達が（ｂ）において阻害される、実施形態Ａ５、Ａ５．１またはＡ５．２の方法。
Ａ５．４  （ａ）および（ｂ）が同時に行われる；または（ａ）、（ｂ）および（ｃ）が同時に行われる、実施形態Ａ１〜Ａ５．３のいずれか１つの方法。
Ａ５．５  前記上皮細胞が（ａ）の前に凍結および解凍される、実施形態Ａ１〜Ａ５．４のいずれか１つの方法。
【０２４９】
Ａ６．  １種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βレセプターの活性が（ｂ）において阻害される、実施形態Ａ１〜Ａ５．５のいずれか１つの方法。
【０２５０】
Ａ７．  １種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βレセプター−リガンド相互作用が（ｂ）において阻害される、実施形態Ａ６の方法。
【０２５１】
Ａ８．  前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βレセプターが、ＴＧＦ−βタイプＩレセプターを含む、実施形態Ａ６またはＡ７の方法。
【０２５２】
Ａ９．  前記ＴＧＦ−βタイプＩレセプターが、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、ＡＬＫ７およびＡＬＫ８から選択される、実施形態Ａ８の方法。
【０２５３】
Ａ１０．  前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βレセプターが、ＡＬＫ５を含む、実施形態Ａ８の方法。
【０２５４】
Ａ１１．  ＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する工程が、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βインヒビターおよび／または１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビターの使用を含む、実施形態Ａ１〜Ａ１０のいずれか１つの方法。
【０２５５】
Ａ１２．  前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βインヒビターおよび／または前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビターが、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βレセプターまたは１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βリガンドあるいは両方に結合する、実施形態Ａ１１の方法。
【０２５６】
Ａ１３．  前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βインヒビターおよび／または前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビターが、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βレセプター−リガンド相互作用を破壊する、実施形態Ａ１１またはＡ１２の方法。
【０２５７】
Ａ１４．  前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βインヒビターおよび／または前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビターが、組換えタンパク質を含まない、実施形態Ａ１１、Ａ１２またはＡ１３の方法。
【０２５８】
Ａ１５．  前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βインヒビターおよび／または前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビターが、Ｎｏｇｇｉｎ、ＤＡＮ、ＣｅｒｂｅｒｕｓまたはＧｒｅｍｌｉｎを含まない、実施形態Ａ１１〜Ａ１４のいずれか１つの方法。
【０２５９】
Ａ１６．  前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βインヒビターおよび／または前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビターが、１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターを含む、実施形態Ａ１１〜Ａ１５のいずれか１つの方法。
【０２６０】
Ａ１７．  前記１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターが、１種もしくはこれより多くの低分子ＡＬＫ５インヒビターを含む、実施形態Ａ１６の方法。
【０２６１】
Ａ１８．  前記１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターが、１種もしくはこれより多くのＡＴＰアナログを含む、実施形態Ａ１７の方法。
【０２６２】
Ａ１９．  前記１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターのうちの少なくとも１種は、式Ａ：
【化２】
2020120686.tif 000018
の構造を含み、ここで：
Ｘ、ＹおよびＺは、Ｎ、ＣおよびＯから独立して選択され；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換されたＣ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル、置換されたＣ３−Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５−Ｃ１０アリール、置換されたＣ５−Ｃ１０アリール、Ｃ５−Ｃ１０シクロアリール、置換されたＣ５−Ｃ１０シクロアリール、Ｃ５−Ｃ９複素環式、置換されたＣ５−Ｃ９複素環式、Ｃ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール、置換されたＣ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール、−リンカー−（Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（置換されたＣ３−Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ１０アリール）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ１０アリール）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ９複素環式）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ９複素環式）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール）から独立して選択され；
ｎは、０または１であり；
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換されたＣ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０アルコキシ、置換されたＣ１−Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルカノイル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、置換されたＣ１−Ｃ６アルカノイル、置換されたＣ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル、置換されたＣ３−Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５−Ｃ１０アリール、置換されたＣ５−Ｃ１０アリール、Ｃ５−Ｃ１０シクロアリール、置換されたＣ５−Ｃ１０シクロアリール、Ｃ５−Ｃ９複素環式、置換されたＣ５−Ｃ９複素環式、Ｃ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール、置換されたＣ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール、−リンカー−（Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（置換されたＣ３−Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ１０アリール）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ１０アリール）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ９複素環式）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ９複素環式）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール）から独立して選択され；そして
前記置換されたアルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニルシクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環式またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、ヒドロキシルＣ１−Ｃ１０アルキレン、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５−Ｃ９複素環式、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールである、
実施形態Ａ１６〜Ａ１８のいずれか１つの方法。
【０２６３】
Ａ２０．  前記１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターが、Ａ８３−０１、ＧＷ７８８３８８、ＲｅｐＳｏｘ、およびＳＢ４３１５４２から選択される、実施形態Ａ１６〜Ａ１９のいずれか１つの方法。
【０２６４】
Ａ２１．  前記１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターが、Ａ８３−０１を含む、実施形態Ａ２０の方法。
【０２６５】
Ａ２２．  前記１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターが、ＡＬＫ５または１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５リガンドあるいは両方に結合する、実施形態Ａ１６〜Ａ２１のいずれか１つの方法。
【０２６６】
Ａ２３．  前記１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターが、１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５−リガンド相互作用を破壊する、実施形態Ａ１６〜Ａ２２のいずれか１つの方法。
【０２６７】
Ａ２４．  前記方法が、前記上皮細胞のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化する工程を含む、実施形態Ａ１〜Ａ２３のいずれか１つの方法。
Ａ２４．１  前記方法が、前記上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程を含む、実施形態Ａ１〜Ａ２４のいずれか１つの方法。
Ａ２４．２  前記方法が、
ａ）前記上皮細胞のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化する工程；および
ｂ）前記上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程
を含む、実施形態Ａ１〜Ａ２４．１のいずれか１つの方法。
【０２６８】
Ａ２５．  （ａ）の培養する工程の間に前記上皮細胞においてＲｈｏキナーゼおよび／またはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼの活性を阻害する工程をさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ２４．２のいずれか１つの方法。
【０２６９】
Ａ２６．  Ｒｈｏキナーゼおよび／またはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼが、Ｒｈｏキナーゼ１（ＲＯＣＫ１）およびＲｈｏキナーゼ２（ＲＯＣＫ２）から選択される、実施形態Ａ２５の方法。
【０２７０】
Ａ２７．  Ｒｈｏキナーゼおよび／またはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼの活性を阻害する工程が、１種もしくはこれより多くのＲｈｏキナーゼインヒビターおよび／または１種もしくはこれより多くのＲｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビターの使用を含む、実施形態Ａ２５またはＡ２６の方法。
【０２７１】
Ａ２８．  前記１種もしくはこれより多くのＲｈｏキナーゼインヒビターおよび／または前記１種もしくはこれより多くのＲｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビターが、１種もしくはこれより多くの低分子Ｒｈｏキナーゼインヒビターおよび／または１種もしくはこれより多くの低分子Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビターを含む、実施形態Ａ２７の方法。
【０２７２】
Ａ２９．  前記１種もしくはこれより多くのＲｈｏキナーゼインヒビターおよび／または前記１種もしくはこれより多くのＲｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビターが、Ｙ−２７６３２、ＳＲ３６７７、チアゾビビン、ＨＡ１１００ヒドロクロリド、ＨＡ１０７７およびＧＳＫ−４２９２８６から選択される、実施形態Ａ２８の方法。
【０２７３】
Ａ３０．  前記１種もしくはこれより多くのＲｈｏキナーゼインヒビターおよび／または前記１種もしくはこれより多くのＲｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビターが、Ｙ−２７６３２を含む、実施形態Ａ２９の方法。
【０２７４】
Ａ３０．１  （ａ）の培養する工程の間に前記上皮細胞においてＲｈｏキナーゼおよび／またはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼの活性を阻害する工程を含まない、実施形態Ａ１〜Ａ２４のいずれか１つの方法。
【０２７５】
Ａ３１．  （ａ）の培養する工程の間に前記上皮細胞においてｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）の活性を阻害する工程をさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ３０．１のいずれか１つの方法。
【０２７６】
Ａ３２．  前記ＰＡＫが、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２、ＰＡＫ３およびＰＡＫ４から選択される、実施形態Ａ３１の方法。
【０２７７】
Ａ３３．  前記ＰＡＫがＰＡＫ１である、実施形態Ａ３２の方法。
【０２７８】
Ａ３４．  ＰＡＫ１の活性を阻害する工程が、１種もしくはこれより多くのＰＡＫ１インヒビターの使用を含む、実施形態Ａ３３の方法。
【０２７９】
Ａ３５．  前記１種もしくはこれより多くのＰＡＫ１インヒビターが、１種もしくはこれより多くの低分子ＰＡＫ１インヒビターを含む、実施形態Ａ３４の方法。
【０２８０】
Ａ３６．  前記１種もしくはこれより多くのＰＡＫ１インヒビターが、ＩＰＡ３を含む、実施形態Ａ３５の方法。
【０２８１】
Ａ３７．  （ａ）の培養する工程の間に前記上皮細胞においてミオシンＩＩの活性を阻害する工程をさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ３６のいずれか１つの方法。
Ａ３７．１  前記ミオシンＩＩが非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）である、実施形態Ａ３７の方法。
Ａ３７．２  ミオシンＩＩの活性を阻害する工程が、１種もしくはこれより多くのミオシンＩＩインヒビターの使用を含む、実施形態Ａ３７またはＡ３７．１の方法。
Ａ３７．３  前記１種もしくはこれより多くのミオシンＩＩインヒビターが、１種もしくはこれより多くの低分子ミオシンＩＩインヒビターを含む、実施形態Ａ３７．２の方法。
Ａ３７．４．  前記１種もしくはこれより多くのミオシンＩＩインヒビターが、ブレビスタチンを含む、実施形態Ａ３７．２またはＡ３７．３の方法。
【０２８２】
Ａ３８．  （ａ）の培養する工程の間に上皮細胞における細胞内環状アデノシンモノホスフェート（ｃＡＭＰ）レベルを増大させることをさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ３７．４のいずれか１つの方法。
【０２８３】
Ａ３９．  細胞内環状アデノシンモノホスフェート（ｃＡＭＰ）レベルを増大させる工程が、１種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性アゴニストおよび／または１種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストの使用を含む、実施形態Ａ３８の方法。
Ａ３９．１  前記１種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性アゴニストおよび／または前記１種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストがイソプロテレノールを含む、実施形態Ａ３９の方法。
【０２８４】
Ａ４０．  前記上皮細胞は、（ａ）の前に被験体から得られる、実施形態Ａ１〜Ａ３９．１のいずれか１つの方法。
Ａ４０．１  前記被験体が哺乳動物である、実施形態Ａ４０の方法。
Ａ４０．２  前記被験体がヒトである、実施形態Ａ４０の方法。
Ａ４０．３  前記上皮細胞が被験体由来の組織に由来する、実施形態Ａ４０〜Ａ４０．２のいずれか１つの方法。
Ａ４０．４  前記上皮細胞が被験体由来の分化した組織に由来する、実施形態Ａ４０．３の方法。
Ａ４０．５  前記上皮細胞が被験体由来の循環細胞に由来する、実施形態Ａ４０〜Ａ４０．２のいずれか１つの方法。
【０２８５】
Ａ４１．  前記上皮細胞が、被験体由来の初代細胞を含む、実施形態Ａ４０〜Ａ４０．５のいずれか１つの方法。
【０２８６】
Ａ４２．  前記上皮細胞が、被験体由来の初代細胞を含まない、実施形態Ａ４０〜Ａ４０．５のいずれか１つの方法。
【０２８７】
Ａ４３．  前記上皮細胞が、被験体由来の腫瘍細胞を含む、実施形態Ａ４０〜Ａ４２のいずれか１つの方法。
【０２８８】
Ａ４４．  被験体に由来する上皮細胞が、扁平上皮細胞、円柱上皮細胞、腺腫様上皮細胞および移行上皮細胞から選択される、実施形態Ａ４１〜Ａ４３のいずれか１つの方法。
Ａ４４．１  被験体に由来する上皮細胞が、扁平上皮細胞、円柱上皮細胞、腺腫様上皮細胞および移行上皮細胞のうちの１つまたは複数を含む、実施形態Ａ４１〜Ａ４３のいずれか１つの方法。
【０２８９】
Ａ４５．  被験体に由来する上皮細胞が、ケラチノサイト上皮細胞を含む、実施形態Ａ４１〜Ａ４４．１のいずれか１つの方法。
Ａ４５．１  前記ケラチノサイト上皮細胞が、皮膚ケラチノサイト、眼の上皮細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、食道上皮細胞、および子宮頸部上皮細胞から選択される、実施形態Ａ４５の方法。
【０２９０】
Ａ４６．  被験体に由来する上皮細胞が、非ケラチノサイト上皮細胞を含む、実施形態Ａ４１〜Ａ４４のいずれか１つの方法。
【０２９１】
Ａ４７．  前記非ケラチノサイト上皮細胞が、腺上皮細胞を含む、実施形態Ａ４６の方法。
【０２９２】
Ａ４８．  前記非ケラチノサイト上皮細胞が、前立腺細胞、乳腺細胞、肝細胞、肝臓上皮細胞、胆管上皮細胞、胆嚢細胞、膵島細胞、膵臓β細胞、膵管上皮細胞、肺上皮細胞、気道上皮細胞、鼻腔上皮細胞、腎臓細胞、膀胱細胞、尿道上皮細胞、胃上皮細胞、大腸上皮細胞、小腸上皮細胞、精巣上皮細胞、卵巣上皮細胞、卵管上皮細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、胸腺細胞、下垂体細胞、腺細胞、羊膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、汗腺上皮細胞、脂腺上皮細胞および毛包細胞から選択される、実施形態Ａ４６またはＡ４７の方法。
Ａ４８．１  前記上皮細胞が、基底上皮細胞を含む、実施形態Ａ１〜Ａ４７のいずれか１つの方法。
Ａ４８．２  前記上皮細胞は腸上皮細胞ではない、実施形態Ａ１〜Ａ４７のいずれか１つの方法。
【０２９３】
Ａ４９．  （ａ）の培養する工程は、無血清培地の存在下で行われる、実施形態Ａ１〜Ａ４８．２のいずれか１つの方法。
Ａ４９．１  前記無血清培地が規定された無血清培地である、実施形態Ａ４９の方法。
Ａ４９．２  前記無血清培地がゼノフリー無血清培地である、実施形態Ａ４９の方法。
Ａ４９．３  前記無血清培地が規定されたゼノフリー無血清培地である、実施形態Ａ４９の方法。
【０２９４】
Ａ５０．  前記無血清培地が、カルシウムを含む、実施形態Ａ４９〜Ａ４９．３のいずれか１つの方法。
【０２９５】
Ａ５１．  前記無血清培地が、１ｍＭ未満の濃度でカルシウムを含む、実施形態Ａ５０の方法。
【０２９６】
Ａ５２．  前記無血清培地が、５００μＭ未満の濃度でカルシウムを含む、実施形態Ａ５０の方法。
【０２９７】
Ａ５３．  前記無血清培地が、１００μＭ未満の濃度でカルシウムを含む、実施形態Ａ５０の方法。
Ａ５３．１  前記無血清培地が、約９０μＭの濃度でカルシウムを含む、実施形態Ａ５３の方法。
【０２９８】
Ａ５４．  前記無血清培地が、２０μＭ未満の濃度でカルシウムを含む、実施形態Ａ５０の方法。
Ａ５４．１  前記無血清培地が、緩衝液と、無機酸、無機塩、アルカリケイ酸塩、アミノ酸、ビタミン、プリン、ピリミジン、ポリアミン、α−ケト酸、有機イオウ化合物およびグルコースから選択される１種もしくはこれより多くの成分とを含む、実施形態Ａ４９〜Ａ５４のいずれか１つの方法。
Ａ５４．２  １種もしくはこれより多くの塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウムおよびリン酸ナトリウムから選択される、実施形態Ａ５４．１の方法。
Ａ５４．３  １種もしくはこれより多くのアミノ酸が、アルギニンおよびグルタミンから選択される、実施形態Ａ５４．１またはＡ５４．２の方法。
Ａ５４．４  前記緩衝液がＨＥＰＥＳ緩衝液である、実施形態Ａ５４．１〜Ａ５４．３のいずれか１つの方法。
Ａ５４．５  前記無血清培地が、アルブミンを含む、実施形態Ａ４９〜Ａ５４．４のいずれか１つの方法。
Ａ５４．６  前記アルブミンが、ウシ血清アルブミンおよび組換えヒト血清アルブミンから選択される、実施形態Ａ５４．５の方法。
Ａ５４．７  前記無血清培地が、１種もしくはこれより多くの脂質を含む、実施形態Ａ４９〜Ａ５４．６のいずれか１つの方法。
Ａ５４．８  前記１種もしくはこれより多くの脂質が、アラキドン酸、コレステロール、ＤＬ−α−トコフェロールアセテート、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、プルロニックＦ−６８、ステアリン酸およびポリソルベート８０から選択される、実施形態Ａ５４．７の方法。
Ａ５４．９  前記１種もしくはこれより多くの脂質が、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸から選択される、実施形態Ａ５４．８の方法。
【０２９９】
Ａ５５．  １種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子の使用を含む、実施形態Ａ１〜Ａ５４．９のいずれか１つの方法。
【０３００】
Ａ５６．  前記１種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子が、ＥＧＦを含む、実施形態Ａ５５の方法。
Ａ５６．１  前記１種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子が、ＦＧＦを含む、実施形態Ａ５５の方法。
Ａ５６．２  前記１種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子が、ＥＧＦおよびＦＧＦを含む、実施形態Ａ５５の方法。
Ａ５６．３  前記ＦＧＦが、酸性ＦＧＦを含む、実施形態Ａ５６．１またはＡ５６．２の方法。
【０３０１】
Ａ５７．  有糸分裂促進性増殖因子の使用を含まない、実施形態Ａ１〜Ａ５４．９のいずれか１つの方法。
【０３０２】
Ａ５８．  １種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性補充物の使用を含む、実施形態Ａ１〜Ａ５７のいずれか１つの方法。
【０３０３】
Ａ５９．  前記１種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性補充物が、ウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ）を含む、実施形態Ａ５８の方法。
Ａ５９．１  有糸分裂促進性補充物の使用を含まない、実施形態Ａ１〜Ａ５７のいずれか１つの方法。
【０３０４】
Ａ６０．  Ｗｎｔアゴニストまたはβ−カテニンアゴニストの使用を含まない、実施形態Ａ１〜Ａ５９．１のいずれか１つの方法。
Ａ６０．１  ｎｏｇｇｉｎ、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ、Ｗｎｔ−３ａ、ＥＧＦ、ニコチンアミド、ＦＧＦ１０、ガストリン、ｐ３８インヒビター、ＳＢ２０２１９０、ＤＨＴ、ｎｏｔｃｈインヒビター、ガンマセクレターゼインヒビター、ＤＢＺおよびＤＡＰＴから選択される成分のうちの１つまたは複数の使用を含まない、実施形態Ａ１〜Ａ６０のいずれか１つの方法。
【０３０５】
Ａ６１．  細胞外マトリクスの使用を含まない、実施形態Ａ１〜Ａ６０．１のいずれか１つの方法。
【０３０６】
Ａ６２．  （ａ）の培養する工程が被覆を含む容器の中で行われる、実施形態Ａ１〜Ａ６０．１のいずれか１つの方法。
【０３０７】
Ａ６３．  前記被覆が、コラーゲンを含む、実施形態Ａ６２の方法。
【０３０８】
Ａ６４．  前記被覆が、基底膜マトリクスを含む、実施形態Ａ６２の方法。
【０３０９】
Ａ６５．  （ａ）の培養する工程が、前記上皮細胞を拡大する工程を含む、実施形態Ａ１〜Ａ６４のいずれか１つの方法。
【０３１０】
Ａ６６．  前記上皮細胞は少なくとも約２倍拡大される、実施形態Ａ６５の方法。
【０３１１】
Ａ６７．  前記上皮細胞は少なくとも約５倍拡大される、実施形態Ａ６５の方法。
【０３１２】
Ａ６８．  前記上皮細胞は少なくとも約１０倍拡大される、実施形態Ａ６５の方法。
【０３１３】
Ａ６９．  前記上皮細胞は少なくとも約１５倍拡大される、実施形態Ａ６５の方法。
【０３１４】
Ａ７０．  前記上皮細胞は少なくとも約２０倍拡大される、実施形態Ａ６５の方法。
Ａ７０．１  前記上皮細胞は少なくとも約１００倍拡大される、実施形態Ａ６５の方法。
Ａ７０．２  前記上皮細胞は少なくとも約１，０００倍拡大される、実施形態Ａ６５の方法。
Ａ７０．３  前記上皮細胞は少なくとも約１０，０００倍拡大される、実施形態Ａ６５の方法。
Ａ７０．４  前記上皮細胞は少なくとも約１００，０００倍拡大される、実施形態Ａ６５の方法。
Ａ７０．５  前記上皮細胞は少なくとも約１００万倍拡大される、実施形態Ａ６５の方法。
Ａ７０．６  前記上皮細胞は少なくとも約１０億倍拡大される、実施形態Ａ６５の方法。
Ａ７０．７  前記上皮細胞は少なくとも約１兆倍拡大される、実施形態Ａ６５の方法。
【０３１５】
Ａ７１．  前記上皮細胞は約４日間培養される、実施形態Ａ６５〜Ａ７０．７のいずれか１つの方法。
【０３１６】
Ａ７２．  前記上皮細胞は約５日間培養される、実施形態Ａ６５〜Ａ７０．７のいずれか１つの方法。
【０３１７】
Ａ７３．  前記上皮細胞は連続して増殖している、実施形態Ａ１〜Ａ７２のいずれか１つの方法。
【０３１８】
Ａ７４．  少なくとも１５回前記上皮細胞を継代することを含む、実施形態Ａ１〜Ａ７３のいずれか１つの方法。
【０３１９】
Ａ７５．  少なくとも２５回前記上皮細胞を継代することを含む、実施形態Ａ１〜Ａ７３のいずれか１つの方法。
【０３２０】
Ａ７６．  前記上皮細胞の集団はある期間にわたって倍加する、実施形態Ａ１〜Ａ７５のいずれか１つの方法。
【０３２１】
Ａ７７．  前記上皮細胞集団は少なくとも２０回倍加する、実施形態Ａ７６の方法。
【０３２２】
Ａ７８．  前記上皮細胞集団は少なくとも５０回倍加する、実施形態Ａ７６の方法。
Ａ７８．１  前記上皮細胞集団は少なくとも８０回倍加する、実施形態Ａ７６の方法。
【０３２３】
Ａ７９．  前記上皮細胞集団は少なくとも１００回倍加する、実施形態Ａ７６の方法。
【０３２４】
Ａ８０．  前記上皮細胞集団は少なくとも１２０回倍加する、実施形態Ａ７６の方法。
【０３２５】
Ａ８１．  前記上皮細胞集団は少なくとも１５０回倍加する、実施形態Ａ７６の方法。
【０３２６】
Ａ８２．  前記上皮細胞集団は少なくとも２００回倍加する、実施形態Ａ７６の方法。
【０３２７】
Ａ８３．  前記期間は約５０日間である、実施形態Ａ７６〜Ａ８２のいずれか１つの方法。
【０３２８】
Ａ８４．  前記期間は約１００日間である、実施形態Ａ７６〜Ａ８２のいずれか１つの方法。
【０３２９】
Ａ８５．  前記期間は約１５０日間である、実施形態Ａ７６〜Ａ８２のいずれか１つの方法。
【０３３０】
Ａ８６．  前記期間は約２００日間である、実施形態Ａ７６〜Ａ８２のいずれか１つの方法。
【０３３１】
Ａ８７．  前記上皮細胞が、（ｂ）の間に１種もしくはこれより多くの天然の機能的特徴を維持する、実施形態Ａ１〜Ａ８６のいずれか１つの方法。
【０３３２】
Ａ８８．  前記上皮細胞が、（ｂ）の間に１種もしくはこれより多くの天然の機能的特徴を維持しない、実施形態Ａ１〜Ａ８６のいずれか１つの方法。
【０３３３】
Ａ８９．  前記上皮細胞が、（ｂ）の後に、ＴＧＦ−βシグナル伝達が阻害されない細胞培養環境へと置かれる、実施形態Ａ１〜Ａ８８のいずれか１つの方法。
【０３３４】
Ａ９０．  前記上皮細胞が、ＴＧＦ−βシグナル伝達が阻害されない細胞培養環境へと置かれた後に、１種もしくはこれより多くの天然の機能的特徴を維持または再獲得する、
実施形態Ａ８９の方法。
【０３３５】
Ａ９１．  前記上皮細胞が、複数の組織タイプに分化するように誘導され得る、実施形態Ａ１〜Ａ９０のいずれか１つの方法。
Ａ９１．１  前記上皮細胞が、複数の組織タイプに分化する能力を獲得しない、実施形態Ａ１〜Ａ９０のいずれか１つの方法。
【０３３６】
Ａ９２．  前記上皮細胞が、オルガノイドを形成する能力を獲得しない、実施形態Ａ１〜Ａ９１．１のいずれか１つの方法。
【０３３７】
Ａ９３．  前記上皮細胞は胚性幹細胞に由来するものではない、実施形態Ａ１〜Ａ９２のいずれか１つの方法。
Ａ９３．１  前記上皮細胞は連続して増殖している上皮幹細胞に由来するものではない、実施形態Ａ１〜Ａ９３のいずれか１つの方法。
Ａ９３．２  前記上皮細胞は、静止した上皮細胞を含む上皮組織に由来する、実施形態Ａ１〜Ａ９３．１のいずれか１つの方法。
Ａ９３．３  連続して増殖している上皮幹細胞を選択することを含まない、実施形態Ａ１〜Ａ９３．２のいずれか１つの方法。
Ａ９３．４  腸陰窩細胞を選択することを含まない、実施形態Ａ１〜Ａ９３．３のいずれか１つの方法。
Ａ９３．５  ＬＧＲ５＋細胞を選択することを含まない、実施形態Ａ１〜Ａ９３．４のいずれか１つの方法。
【０３３８】
Ａ９４．  被験体から得られた前記上皮細胞および／または培養物中の前記上皮細胞が、連続して増殖している上皮幹細胞または連続して増殖している上皮幹細胞に由来する細胞を含まない、実施形態Ａ４０〜Ａ９３．５のいずれか１つの方法。
Ａ９４．１  被験体から得られた前記上皮細胞および／または培養物中の前記上皮細胞が、多能性幹細胞または多能性幹細胞に由来する細胞を含まない、実施形態Ａ４０〜Ａ９４のいずれか１つの方法。
Ａ９４．２  被験体から得られた前記上皮細胞および／または培養物中の前記上皮細胞が、最終分化した上皮細胞を含まない、実施形態Ａ４０〜Ａ９４．１のいずれか１つの方法。
Ａ９４．３  被験体から得られた前記上皮細胞および／または培養物中の前記上皮細胞が、胃上皮細胞、腸上皮細胞、および／または膵臓上皮細胞を含まない、実施形態Ａ４０〜Ａ９４．２のいずれか１つの方法。
Ａ９４．４  被験体から得られた前記上皮細胞および／または培養物中の前記上皮細胞が、腸陰窩細胞を含まない、実施形態Ａ４０〜Ａ９４．３のいずれか１つの方法。
Ａ９４．５  被験体から得られた前記上皮細胞および／または培養物中の前記上皮細胞が、ＬＧＲ５＋細胞を含まない、実施形態Ａ４０〜Ａ９４．４のいずれか１つの方法。
【０３３９】
Ａ９５．  被験体から得られた前記上皮細胞および／または培養物中の前記上皮細胞が、上皮細胞の均質な集団である、実施形態Ａ４０〜Ａ９４．５のいずれか１つの方法。
Ａ９５．１  被験体から得られた前記上皮細胞および／または培養物中の前記上皮細胞が、基底上皮細胞の均質な集団である、実施形態Ａ４０〜Ａ９５のいずれか１つの方法。
Ａ９５．２  被験体から得られた前記上皮細胞および／または培養物中の前記上皮細胞が、上皮細胞の異質な集団である、実施形態Ａ４０〜Ａ９４．５のいずれか１つの方法。
【０３４０】
Ａ９６．  被験体から得られた前記上皮細胞および／または培養物中の前記上皮細胞が、最終分化した細胞より分化しておらず、胚性幹細胞または成体幹細胞より分化している、実施形態Ａ４０〜Ａ９５．２のいずれか１つの方法。
【０３４１】
Ａ９７．  被験体から得られた前記上皮細胞および／または培養物中の前記上皮細胞が、１種もしくはこれより多くの基底上皮細胞マーカーを発現する、実施形態Ａ４０〜Ａ９６のいずれか１つの方法。
【０３４２】
Ａ９８．  被験体から得られた前記上皮細胞および／または培養物中の前記上皮細胞が、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ４、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ５およびＴＰ６３のうちの１つまたは複数を発現する、実施形態Ａ４０〜Ａ９７のいずれか１つの方法。
【０３４３】
Ａ９９．  被験体から得られた前記上皮細胞および／または培養物中の前記上皮細胞が、１種もしくはこれより多くの上皮幹細胞マーカーを発現しない、実施形態Ａ４０〜Ａ９８のいずれか１つの方法。
【０３４４】
Ａ１００．  被験体から得られた前記上皮細胞および／または培養物中の前記上皮細胞が、Ｌｇｒ５を発現しない、実施形態Ａ４０〜Ａ９９のいずれか１つの方法。
【０３４５】
Ａ１０１．  被験体から得られた前記上皮細胞および／または培養物中の前記上皮細胞が、１種もしくはこれより多くの多能性幹細胞マーカーを発現しない、実施形態Ａ４０〜Ａ１００のいずれか１つの方法。
【０３４６】
Ａ１０２．  被験体から得られた前記上皮細胞および／または培養物中の前記上皮細胞が、ＬＩＮ２８Ａ、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４およびＳＯＸ２のうちの１つまたは複数を発現しない、実施形態Ａ４０〜Ａ１０１のいずれか１つの方法。
【０３４７】
Ａ１０３．  被験体から得られた前記上皮細胞および／または培養物中の前記上皮細胞が、１種もしくはこれより多くの最終分化した上皮細胞マーカーを発現しない、実施形態Ａ４０〜Ａ１０２のいずれか１つの方法。
【０３４８】
Ａ１０４．  被験体から得られた前記上皮細胞および／または培養物中の前記上皮細胞が、ＣＦＴＲ、ＦＯＸＪ１、ＩＶＬ、ＫＲＴ１、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ２０、ＬＯＲ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ＳＣＧＢ１Ａ１、ＳＦＴＰＢおよびＳＦＴＰＤのうちの１つまたは複数を発現しない、実施形態Ａ４０〜Ａ１０３のいずれか１つの方法。
【０３４９】
Ａ１０５．  被験体から得られた前記上皮細胞および／または培養物中の前記上皮細胞が、１種もしくはこれより多くの胃上皮細胞マーカー、１種もしくはこれより多くの腸上皮細胞マーカー、および／または１種もしくはこれより多くの膵臓上皮細胞マーカーを発現しない、実施形態Ａ４０〜Ａ１０４のいずれか１つの方法。
【０３５０】
Ａ１０６．  被験体から得られた前記上皮細胞および／または培養物中の前記上皮細胞が、ＣＤ３４、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＩＨＨ、ＫＩＴ、ＬＧＲ５、ＰＤＸ１、およびＰＲＯＭ１／ＣＤ１３３のうちの１つまたは複数を発現しない、実施形態Ａ４０〜Ａ１０５のいずれか１つの方法。
【０３５１】
Ａ１０７．  エキソビボで増殖させた上皮細胞の集団を単離する工程をさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ１０６のいずれか１つの方法。
【０３５２】
Ａ１０８．  エキソビボで拡大した上皮細胞の集団を細胞バンクで貯蔵する工程をさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ１０７のいずれか１つの方法。
【０３５３】
Ａ１０９．  実施形態Ａ１〜Ａ１０８のいずれか１つに従う方法によって生産されたエキソビボで増殖させた上皮細胞の集団。
【０３５４】
Ａ１１０．  遺伝子改変された細胞の生産のための実施形態Ａ１０９のエキソビボで増殖させた上皮細胞の集団の使用。
【０３５５】
Ａ１１１．  被験体のための１種もしくはこれより多くの候補処置を同定するための実施形態Ａ１０９のエキソビボで増殖させた上皮細胞の集団の使用。
【０３５６】
Ａ１１２．  被験体において１種もしくはこれより多くの異常な上皮細胞を同定するための実施形態Ａ１０９のエキソビボで増殖させた上皮細胞の集団の使用。
【０３５７】
Ａ１１３．  被験体における疾患の進行または疾患の処置をモニターするための実施形態Ａ１０９のエキソビボで増殖させた上皮細胞の集団の使用。
【０３５８】
Ｂ１．  エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で分化した上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βインヒビターおよび／または１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビターを含む、無血清細胞培養培地。
Ｂ１．１  エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で以前は静止していた上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βインヒビターおよび／または１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビターを含む、無血清細胞培養培地。
Ｂ１．２  エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で系統拘束された上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βインヒビターおよび／または１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビターを含む、無血清細胞培養培地。
Ｂ１．３  エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で分化した上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、ＴＧＦ−βインヒビターまたはＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビターからなる低分子インヒビターを含む、無血清細胞培養培地。
Ｂ１．４  エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で以前は静止していた上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、ＴＧＦ−βインヒビターまたはＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビターからなる低分子インヒビターを含む、無血清細胞培養培地。
Ｂ１．５  エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で系統拘束された上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、ＴＧＦ−βインヒビターまたはＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビターからなる低分子インヒビターを含む、無血清細胞培養培地。
Ｂ１．６  規定された無血清細胞培養培地である、実施形態Ｂ１〜Ｂ１．５のいずれか１つの無血清細胞培養培地。
Ｂ１．７  ゼノフリー無血清細胞培養培地である、実施形態Ｂ１〜Ｂ１．５のいずれか１つの無血清細胞培養培地。
Ｂ１．８  規定されたゼノフリー無血清細胞培養培地である、実施形態Ｂ１〜Ｂ１．５のいずれか１つの無血清細胞培養培地。
【０３５９】
Ｂ２．  エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を増殖させるための細胞培養培地であって、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βインヒビターおよび／または１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター、および１種もしくはこれより多くのＰＡＫ１インヒビターを含む、細胞培養培地。
Ｂ２．１  エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を増殖させるための細胞培養培地であって、ＴＧＦ−βインヒビターまたはＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビターおよびＰＡＫ１インヒビターからなる低分子インヒビターを含む、細胞培養培地。
【０３６０】
Ｂ３．  エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を増殖させるための細胞培養培地であって、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βインヒビターおよび／または１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター、および１種もしくはこれより多くのミオシンＩＩインヒビターを含む、細胞培養培地。
Ｂ３．１  前記ミオシンＩＩが非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）である、実施形態Ｂ３の細胞培養培地。
Ｂ３．２  エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を増殖させるための細胞培養培地であって、ＴＧＦ−βインヒビターまたはＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビターおよびミオシンＩＩインヒビターからなる低分子インヒビターを含む、細胞培養培地。
Ｂ３．３  前記ミオシンＩＩが非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）である、実施形態Ｂ３．２の細胞培養培地。
【０３６１】
Ｂ４．  前記上皮細胞が、分化した上皮細胞を含む、実施形態Ｂ２〜Ｂ３．３のいずれか１つの細胞培養培地。
【０３６２】
Ｂ４．１  前記上皮細胞が、以前は静止していた上皮細胞を含む、実施形態Ｂ２〜Ｂ３．３のいずれか１つの細胞培養培地。
【０３６３】
Ｂ４．２  前記上皮細胞が、系統拘束された上皮細胞を含む、実施形態Ｂ２〜Ｂ３．３のいずれか１つの細胞培養培地。
【０３６４】
Ｂ５．  血清含有培地である、実施形態Ｂ２〜Ｂ４のいずれか１つの細胞培養培地。
【０３６５】
Ｂ５．１  無血清培地である、実施形態Ｂ２〜Ｂ４のいずれか１つの細胞培養培地。
【０３６６】
Ｂ５．２  規定された無血清培地である、実施形態Ｂ５．１の細胞培養培地。
【０３６７】
Ｂ５．３  ゼノフリー無血清培地である、実施形態Ｂ５．１の細胞培養培地。
【０３６８】
Ｂ５．４  規定されたゼノフリー無血清培地である、実施形態Ｂ５．１の細胞培養培地。
【０３６９】
Ｂ６．  前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βインヒビターおよび／または前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビターが、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βレセプターまたは１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βリガンドあるいは両方に結合する、実施形態Ｂ１〜Ｂ５．３のいずれか１つの細胞培養培地。
【０３７０】
Ｂ７．  前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βインヒビターおよび／または前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビターが、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βレセプター−リガンド相互作用を破壊する、実施形態Ｂ１〜Ｂ６のいずれか１つの細胞培養培地。
【０３７１】
Ｂ８．  前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βインヒビターおよび／または前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビターが、組換えタンパク質を含まない、実施形態Ｂ１〜Ｂ７のいずれか１つの細胞培養培地。
【０３７２】
Ｂ９．  前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βインヒビターおよび／または前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビターが、Ｎｏｇｇｉｎ、ＤＡＮ、ＣｅｒｂｅｒｕｓまたはＧｒｅｍｌｉｎを含まない、実施形態Ｂ１〜Ｂ８のいずれか１つの細胞培養培地。
【０３７３】
Ｂ１０．  前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βインヒビターおよび／または前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビターが、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βレセプターインヒビターを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ９のいずれか１つの細胞培養培地。
【０３７４】
Ｂ１１．  前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βレセプターインヒビターが、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βタイプＩレセプターインヒビターを含む、実施形態Ｂ１０の細胞培養培地。
【０３７５】
Ｂ１２．  前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βタイプＩレセプターインヒビターが、ＡＬＫ１インヒビター、ＡＬＫ２インヒビター、ＡＬＫ３インヒビター、ＡＬＫ４インヒビター、ＡＬＫ５インヒビター、ＡＬＫ６インヒビター、ＡＬＫ７インヒビター、およびＡＬＫ８インヒビターから選択される、実施形態Ｂ１１の細胞培養培地。
【０３７６】
Ｂ１３．  前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βタイプＩレセプターインヒビターが、１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターを含む、実施形態Ｂ１２の細胞培養培地。
【０３７７】
Ｂ１４．  前記１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターが、１種もしくはこれより多くの低分子ＡＬＫ５インヒビターを含む、実施形態Ｂ１３の細胞培養培地。
【０３７８】
Ｂ１５．  前記１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターが、１種もしくはこれより多くのＡＴＰアナログを含む、実施形態Ｂ１５の細胞培養培地。
【０３７９】
Ｂ１６．  前記１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターのうちの少なくとも１種は、式Ａ：
【化３】
2020120686.tif 000019
の構造を含み、ここで：
Ｘ、ＹおよびＺは、Ｎ、ＣおよびＯから独立して選択され；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換されたＣ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル、置換されたＣ３−Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５−Ｃ１０アリール、置換されたＣ５−Ｃ１０アリール、Ｃ５−Ｃ１０シクロアリール、置換されたＣ５−Ｃ１０シクロアリール、Ｃ５−Ｃ９複素環式、置換されたＣ５−Ｃ９複素環式、Ｃ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール、置換されたＣ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール、−リンカー−（Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（置換されたＣ３−Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ１０アリール）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ１０アリール）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ９複素環式）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ９複素環式）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール）、
−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール）から独立して選択され；
ｎは、０または１であり；
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換されたＣ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０アルコキシ、置換されたＣ１−Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルカノイル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、置換されたＣ１−Ｃ６アルカノイル、置換されたＣ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル、置換されたＣ３−Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５−Ｃ１０アリール、置換されたＣ５−Ｃ１０アリール、Ｃ５−Ｃ１０シクロアリール、置換されたＣ５−Ｃ１０シクロアリール、Ｃ５−Ｃ９複素環式、置換されたＣ５−Ｃ９複素環式、Ｃ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール、置換されたＣ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール、−リンカー−（Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（置換されたＣ３−Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ１０アリール）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ１０アリール）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ９複素環式）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ９複素環式）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール）から独立して選択され；そして
前記置換されたアルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニルシクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環式またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、ヒドロキシルＣ１−Ｃ１０アルキレン、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５−Ｃ９複素環式、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールである、
実施形態Ｂ１４またはＢ１５の細胞培養培地。
【０３８０】
Ｂ１７．  前記１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターが、Ａ８３−０１、ＧＷ７８８３８８、ＲｅｐＳｏｘ、およびＳＢ４３１５４２から選択される、実施形態Ｂ１４、Ｂ１５またはＢ１６の細胞培養培地。
【０３８１】
Ｂ１８．  前記１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターが、Ａ８３−０１を含む、実施形態Ｂ１７の細胞培養培地。
【０３８２】
Ｂ１９．  前記１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターが、ＡＬＫ５または１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５リガンドあるいは両方に結合する、実施形態Ｂ１３〜Ｂ１８のいずれか１つの細胞培養培地。
【０３８３】
Ｂ２０．  前記１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターが、１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５−リガンド相互作用を破壊する、実施形態Ｂ１３〜Ｂ１９のいずれか１つの細胞培養培地。
【０３８４】
Ｂ２１．  １種もしくはこれより多くのＲｈｏキナーゼインヒビターおよび／または１種もしくはこれより多くのＲｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビターをさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ２０のいずれか１つの細胞培養培地。
【０３８５】
Ｂ２２．  前記１種もしくはこれより多くのＲｈｏキナーゼインヒビターおよび／または前記１種もしくはこれより多くのＲｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビターが、Ｒｈｏキナーゼ１（ＲＯＣＫ１）インヒビターおよびＲｈｏキナーゼ２（ＲＯＣＫ２）インヒビターから選択される、実施形態Ｂ２１の細胞培養培地。
【０３８６】
Ｂ２３．  前記１種もしくはこれより多くのＲｈｏキナーゼインヒビターおよび／または前記１種もしくはこれより多くのＲｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビターが、１種もしくはこれより多くの低分子Ｒｈｏキナーゼインヒビターおよび／または１種もしくはこれより多くの低分子Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビターを含む、実施形態Ｂ２１またはＢ２２の細胞培養培地。
【０３８７】
Ｂ２４．  前記１種もしくはこれより多くのＲｈｏキナーゼインヒビターおよび／または前記１種もしくはこれより多くのＲｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビターが、Ｙ−２７６３２、ＳＲ３６７７、チアゾビビン、ＨＡ１１００ヒドロクロリド、ＨＡ１０７７およびＧＳＫ−４２９２８６から選択される、実施形態Ｂ２３の細胞培養培地。
【０３８８】
Ｂ２５．  前記１種もしくはこれより多くのＲｈｏキナーゼインヒビターおよび／または前記１種もしくはこれより多くのＲｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビターが、Ｙ−２７６３２を含む、実施形態Ｂ１４の細胞培養培地。
Ｂ２５．１  Ｒｈｏキナーゼインヒビターおよび／またはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビターを含まない、実施形態Ｂ１〜Ｂ２０のいずれか１つの細胞培養培地。
【０３８９】
Ｂ２６．  １種もしくはこれより多くのＰＡＫ１インヒビターをさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ２５．１のいずれか１つの細胞培養培地。
【０３９０】
Ｂ２７．  前記１種もしくはこれより多くのＰＡＫ１インヒビターが、１種もしくはこれより多くの低分子ＰＡＫ１インヒビターを含む、実施形態Ｂ２６の細胞培養培地。
【０３９１】
Ｂ２８．  前記１種もしくはこれより多くのＰＡＫ１インヒビターが、ＩＰＡ３を含む、実施形態Ｂ２７の細胞培養培地。
【０３９２】
Ｂ２９．  １種もしくはこれより多くのミオシンＩＩインヒビターをさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ２８のいずれか１つの細胞培養培地。
Ｂ２９．１  前記１種もしくはこれより多くのミオシンＩＩインヒビターが、１種もしくはこれより多くの非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）インヒビターを含む、実施形態Ｂ２９の細胞培養培地。
【０３９３】
Ｂ３０．  前記１種もしくはこれより多くのミオシンＩＩインヒビターが、１種もしくはこれより多くの低分子ミオシンＩＩインヒビターを含む、実施形態Ｂ２９またはＢ２９．１の細胞培養培地。
Ｂ３０．１  前記１種もしくはこれより多くのミオシンＩＩインヒビターが、ブレビスタチンを含む、実施形態Ｂ３０の細胞培養培地。
【０３９４】
Ｂ３１．  １種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性アゴニストおよび／または１種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストをさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３０．１のいずれか１つの細胞培養培地。
Ｂ３１．１  前記１種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性アゴニストおよび／または前記１種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストが、イソプロテレノールを含む、実施形態Ｂ３１の細胞培養培地。
【０３９５】
Ｂ３２．  前記上皮細胞が被験体に由来する、実施形態Ｂ１〜Ｂ３１．１のいずれか１つの細胞培養培地。
Ｂ３２．１  前記上皮細胞が被験体由来の組織に由来する、実施形態Ｂ３２の細胞培養培地。
Ｂ３２．２  前記上皮細胞が被験体由来の分化した組織に由来する、実施形態Ｂ３２．１の細胞培養培地。
Ｂ３２．３  前記上皮細胞が、初代細胞を含む、実施形態Ｂ３２〜Ｂ３２．２のいずれか１つの細胞培養培地。
【０３９６】
Ｂ３３．  前記上皮細胞が、初代細胞を含まない、実施形態Ｂ３２〜Ｂ３２．２のいずれか１つの細胞培養培地。
【０３９７】
Ｂ３４．  前記上皮細胞が、腫瘍細胞を含む、実施形態Ｂ３２〜Ｂ３３のいずれか１つの細胞培養培地。
【０３９８】
Ｂ３５．  被験体に由来する上皮細胞が、扁平上皮細胞、円柱上皮細胞、腺腫様上皮細胞および移行上皮細胞から選択される、実施形態Ｂ３２〜Ｂ３４のいずれか１つの細胞培養培地。
Ｂ３５．１  被験体に由来する上皮細胞が、扁平上皮細胞、円柱上皮細胞、腺腫様上皮細胞および移行上皮細胞のうちの１つまたは複数を含む、実施形態Ｂ３２〜Ｂ３４のいずれか１つの細胞培養培地。
【０３９９】
Ｂ３６．  被験体に由来する上皮細胞が、ケラチノサイト上皮細胞を含む、実施形態Ｂ３２〜Ｂ３５．１のいずれか１つの細胞培養培地。
Ｂ３６．１  前記ケラチノサイト上皮細胞が、皮膚ケラチノサイト、眼の上皮細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、食道上皮細胞、および子宮頸部上皮細胞から選択される、実施形態Ｂ３６の細胞培養培地。
【０４００】
Ｂ３７．  被験体に由来する上皮細胞が、非ケラチノサイト上皮細胞を含む、実施形態Ｂ３２〜Ｂ３５のいずれか１つの細胞培養培地。
【０４０１】
Ｂ３８．  前記非ケラチノサイト上皮細胞が、腺上皮細胞を含む、実施形態Ｂ３７の細胞培養培地。
【０４０２】
Ｂ３９．  前記非ケラチノサイト上皮細胞が、前立腺細胞、乳腺細胞、肝細胞、肝臓上皮細胞、胆管上皮細胞、胆嚢細胞、膵島細胞、膵臓β細胞、膵管上皮細胞、肺上皮細胞、気道上皮細胞、鼻腔上皮細胞、腎臓細胞、膀胱細胞、尿道上皮細胞、胃上皮細胞、大腸上皮細胞、小腸上皮細胞、精巣上皮細胞、卵巣上皮細胞、卵管上皮細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、胸腺細胞、下垂体細胞、腺細胞、羊膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、汗腺上皮細胞、脂腺上皮細胞および毛包細胞から選択される、実施形態Ｂ３７またはＢ３８の細胞培養培地。
Ｂ３９．１  前記上皮細胞が、基底上皮細胞を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３９のいずれか１つの細胞培養培地。
Ｂ３９．２  前記上皮細胞は腸上皮細胞ではない、実施形態Ｂ１〜Ｂ３９のいずれか１つの細胞培養培地。
【０４０３】
Ｂ４０．  カルシウムを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３９．２のいずれか１つの細胞培養培地。
【０４０４】
Ｂ４１．  前記カルシウムが、１ｍＭ未満の濃度で存在する、実施形態Ｂ４０の細胞培養培地。
【０４０５】
Ｂ４２．  前記カルシウムが、５００μＭ未満の濃度で存在する、実施形態Ｂ４０の細胞培養培地。
【０４０６】
Ｂ４３．  前記カルシウムが、１００μＭ未満の濃度で存在する、実施形態Ｂ４０の細胞培養培地。
Ｂ４３．１  前記カルシウムが、約９０μＭの濃度で存在する、実施形態Ｂ４３の細胞培養培地。
【０４０７】
Ｂ４４．  前記カルシウムが、２０μＭ未満の濃度で存在する、実施形態Ｂ４０の細胞培養培地。
Ｂ４４．１  緩衝液と、無機酸、無機塩、アルカリケイ酸塩、アミノ酸、ビタミン、プリン、ピリミジン、ポリアミン、α−ケト酸、有機イオウ化合物およびグルコースから選択される１種もしくはこれより多くの成分とを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ４４のいずれか１つの細胞培養培地。
Ｂ４４．２  前記１種もしくはこれより多くの塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウムおよびリン酸ナトリウムから選択される、実施形態Ｂ４４．１の細胞培養培地。
Ｂ４４．３  前記１種もしくはこれより多くのアミノ酸が、アルギニンおよびグルタミンから選択される、実施形態Ｂ４４．１またはＢ４４．２の細胞培養培地。
Ｂ４４．４  前記緩衝液がＨＥＰＥＳ緩衝液である、実施形態Ｂ４４．１〜Ｂ４４．３のいずれか１つの細胞培養培地。
Ｂ４４．５  アルブミンを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ４４．４のいずれか１つの細胞培養培地。
Ｂ４４．６  前記アルブミンが、ウシ血清アルブミンおよび組換えヒト血清アルブミンから選択される、実施形態Ｂ４４．５の細胞培養培地。
Ｂ４４．７  １種もしくはこれより多くの脂質を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ４４．６のいずれか１つの細胞培養培地。
Ｂ４４．８  前記１種もしくはこれより多くの脂質が、アラキドン酸、コレステロール、ＤＬ−α−トコフェロールアセテート、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、プルロニックＦ−６８、ステアリン酸およびポリソルベート８０から選択される、実施形態Ｂ４４．７の細胞培養培地。
【０４０８】
Ｂ４４．９  前記１種もしくはこれより多くの脂質が、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸から選択される、実施形態Ｂ４４．８の細胞培養培地。
【０４０９】
Ｂ４５．  １種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ４４．９のいずれか１つの細胞培養培地。
【０４１０】
Ｂ４６．  前記１種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子が、ＥＧＦを含む、実施形態Ｂ４５の細胞培養培地。
【０４１１】
Ｂ４６．１  前記１種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子が、ＦＧＦを含む、実施形態Ｂ４５の細胞培養培地。
Ｂ４６．２  前記１種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子が、ＥＧＦおよびＦＧＦを含む、実施形態Ｂ４５の細胞培養培地。
Ｂ４６．３  前記ＦＧＦが、酸性ＦＧＦを含む、実施形態Ｂ４６．１またはＢ４６．２の細胞培養培地。
【０４１２】
Ｂ４７．  有糸分裂促進性増殖因子を含まない、実施形態Ｂ１〜Ｂ４４．９のいずれか１つの細胞培養培地。
【０４１３】
Ｂ４８．  １種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性補充物を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ４７のいずれか１つの細胞培養培地。
【０４１４】
Ｂ４９．  前記１種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性補充物が、ウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ）を含む、実施形態Ｂ４８の細胞培養培地。
【０４１５】
Ｂ４９．１  有糸分裂促進性補充物を含まない、実施形態Ｂ１〜Ｂ４７のいずれか１つの細胞培養培地。
【０４１６】
Ｂ５０．  Ｗｎｔアゴニストまたはβ−カテニンアゴニストを含まない、実施形態Ｂ１〜Ｂ４９．１のいずれか１つの細胞培養培地。
Ｂ５０．１  ｎｏｇｇｉｎ、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ、Ｗｎｔ−３ａ、ＥＧＦ、ニコチンアミド、ＦＧＦ１０、ガストリン、ｐ３８インヒビター、ＳＢ２０２１９０、ＤＨＴ、ｎｏｔｃｈインヒビター、ガンマセクレターゼインヒビター、ＤＢＺおよびＤＡＰＴのうちの１つまたは複数から選択される成分を含まない、実施形態Ｂ１〜Ｂ５０のいずれか１つの細胞培養培地。
【０４１７】
Ｂ５１．  細胞外マトリクスを含まない、実施形態Ｂ１〜Ｂ５０．１のいずれか１つの細胞培養培地。
【０４１８】
Ｃ１．  
ａ）無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で分化した上皮細胞を培養する工程、およびｂ）（ａ）の培養する工程の間に前記分化した上皮細胞においてＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する工程、を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた上皮細胞の集団。
Ｃ１．１
ａ）無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で以前は静止していた上皮細胞を培養する工程、および
ｂ）（ａ）の培養する工程の間に前記以前は静止していた上皮細胞においてＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する工程、を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた上皮細胞の集団。
Ｃ１．２  
ａ）無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で系統拘束された上皮細胞を培養する工程、および
ｂ）（ａ）の培養する工程の間に前記系統拘束された上皮細胞においてＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する工程、を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた上皮細胞の集団。
【０４１９】
Ｃ２．  
ａ）フィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を培養する工程
ｂ）（ａ）の培養する工程の間に前記上皮細胞においてＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する工程、および
ｃ）（ａ）の培養する工程の間に前記上皮細胞においてｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）の活性を阻害する工程、を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた上皮細胞の集団。
Ｃ２．１  分化した上皮細胞を含む、実施形態Ｃ２のいずれか１つの上皮細胞。
Ｃ２．２  以前は静止していた上皮細胞を含む、実施形態Ｃ２のいずれか１つの上皮細胞。
Ｃ２．３  系統拘束された上皮細胞を含む、実施形態Ｃ２のいずれか１つの上皮細胞。
【０４２０】
Ｃ３．  
ａ）無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を培養する工程
ｂ）（ａ）の培養する工程の間に前記上皮細胞においてＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する工程、および
ｃ）（ａ）の培養する工程の間に前記上皮細胞においてミオシンＩＩの活性を阻害する工程、を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた上皮細胞の集団。
Ｃ３．１  分化した上皮細胞を含む、実施形態Ｃ３の上皮細胞。
Ｃ３．２  以前は静止していた上皮細胞を含む、実施形態Ｃ３の上皮細胞。
Ｃ３．３  系統拘束された上皮細胞を含む、実施形態Ｃ３の上皮細胞。
Ｃ３．４  前記ミオシンＩＩが非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）である、実施形態Ｃ３〜Ｃ３．３のいずれか１つの上皮細胞。
【０４２１】
Ｃ４．  （ａ）の培養する工程は、血清含有培地の存在下で実施される、実施形態Ｃ２〜Ｃ３．４のいずれか１つの上皮細胞。
【０４２２】
Ｃ５．  （ａ）の培養する工程は、無血清培地の存在下で行われる、実施形態Ｃ２〜Ｃ３．４のいずれか１つの上皮細胞。
Ｃ５．１  （ａ）および（ｂ）が同時に行われる；または（ａ）、（ｂ）および（ｃ）が同時に行われる、実施形態Ｃ１〜Ｃ５のいずれか１つの上皮細胞。
Ｃ５．２  前記上皮細胞が（ａ）の前に凍結および解凍される、実施形態Ｃ１〜Ｃ５．１のいずれか１つの上皮細胞。
【０４２３】
Ｃ６．  １種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βレセプターの活性が（ｂ）において阻害される、実施形態Ｃ１〜Ｃ５．２のいずれか１つの上皮細胞。
【０４２４】
Ｃ７．  １種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βレセプター−リガンド相互作用が（ｂ）において阻害される、実施形態Ｃ６の上皮細胞。
【０４２５】
Ｃ８．  前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βレセプターが、ＴＧＦ−βタイプＩレセプターを含む、実施形態Ｃ６またはＣ７の上皮細胞。
【０４２６】
Ｃ９．  前記ＴＧＦ−βタイプＩレセプターが、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、ＡＬＫ７およびＡＬＫ８から選択される、実施形態Ｃ８の上皮細胞。
【０４２７】
Ｃ１０．  前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βレセプターが、ＡＬＫ５を含む、実施形態Ｃ８の上皮細胞。
【０４２８】
Ｃ１１．  ＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する工程が、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βインヒビターおよび／または１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビターの使用を含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ１０のいずれか１つの上皮細胞。
【０４２９】
Ｃ１２．  前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βインヒビターおよび／または前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビターが、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βレセプターまたは１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βリガンドあるいは両方に結合する、実施形態Ｃ１１の上皮細胞。
【０４３０】
Ｃ１３．  前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βインヒビターおよび／または前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビターが、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βレセプター−リガンド相互作用を破壊する、実施形態Ｃ１１またはＣ１２の上皮細胞。
【０４３１】
Ｃ１４．  前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βインヒビターおよび／または前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビターが、組換えタンパク質を含まない、実施形態Ｃ１１、Ｃ１２またはＣ１３の上皮細胞。
【０４３２】
Ｃ１５．  前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βインヒビターおよび／または前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビターが、Ｎｏｇｇｉｎ、ＤＡＮ、ＣｅｒｂｅｒｕｓまたはＧｒｅｍｌｉｎを含まない、実施形態Ｃ１１〜Ｃ１４のいずれか１つの上皮細胞。
【０４３３】
Ｃ１６．  前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βインヒビターおよび／または前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビターが、１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターを含む、実施形態Ｃ１１〜Ｃ１５のいずれか１つの上皮細胞。
【０４３４】
Ｃ１７．  前記１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターが、１種もしくはこれより多くの低分子ＡＬＫ５インヒビターを含む、実施形態Ｃ１６の上皮細胞。
【０４３５】
Ｃ１８．  前記１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターが、１種もしくはこれより多くのＡＴＰアナログを含む、実施形態Ｃ１７の上皮細胞。
【０４３６】
Ｃ１９．  前記１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターのうちの少なくとも１種は、式Ａ：
【化４】
2020120686.tif 000020
の構造を含み、ここで：
Ｘ、ＹおよびＺは、Ｎ、ＣおよびＯから独立して選択され；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換されたＣ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル、置換されたＣ３−Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５−Ｃ１０アリール、置換されたＣ５−Ｃ１０アリール、Ｃ５−Ｃ１０シクロアリール、置換されたＣ５−Ｃ１０シクロアリール、Ｃ５−Ｃ９複素環式、置換されたＣ５−Ｃ９複素環式、Ｃ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール、置換されたＣ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール、−リンカー−（Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（置換されたＣ３−Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ１０アリール）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ１０アリール）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ９複素環式）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ９複素環式）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール）から独立して選択され；
ｎは、０または１であり；
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換されたＣ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０アルコキシ、置換されたＣ１−Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルカノイル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、置換されたＣ１−Ｃ６アルカノイル、置換されたＣ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル、置換されたＣ３−Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５−Ｃ１０アリール、置換されたＣ５−Ｃ１０アリール、Ｃ５−Ｃ１０シクロアリール、置換されたＣ５−Ｃ１０シクロアリール、Ｃ５−Ｃ９複素環式、置換されたＣ５−Ｃ９複素環式、Ｃ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール、置換されたＣ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール、−リンカー−（Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（置換されたＣ３−Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ１０アリール）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ１０アリール）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ９複素環式）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ９複素環式）、−リンカー−（Ｃ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール）、−リンカー−（置換されたＣ５−Ｃ９ヘテロシクロアリール）から独立して選択され；そして
前記置換されたアルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニルシクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環式またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、ヒドロキシルＣ１−Ｃ１０アルキレン、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５−Ｃ９複素環式、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールである、
実施形態Ｃ１６〜Ｃ１８のいずれか１つの上皮細胞。
【０４３７】
Ｃ２０．  前記１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターが、Ａ８３−０１、ＧＷ７８８３８８、ＲｅｐＳｏｘ、およびＳＢ４３１５４２から選択される、実施形態Ｃ１６〜Ｃ１９のいずれか１つの上皮細胞。
【０４３８】
Ｃ２１．  前記１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターが、Ａ８３−０１を含む、実施形態Ｃ２０の上皮細胞。
【０４３９】
Ｃ２２．  前記１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターが、ＡＬＫ５または１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５リガンドあるいは両方に結合する、実施形態Ｃ１６〜Ｃ２１のいずれか１つの上皮細胞。
【０４４０】
Ｃ２３．  前記１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターが、１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５−リガンド相互作用を破壊する、実施形態Ｃ１６〜Ｃ２２のいずれか１つの上皮細胞。
【０４４１】
Ｃ２４．  前記方法が、前記上皮細胞においてテロメラーゼを活性化する工程および／または細胞骨格構造を調節する工程を含む、実施形態Ｃ１６〜Ｃ２３のいずれか１つの上皮細胞。
【０４４２】
Ｃ２５．  前記方法が、（ａ）の培養する工程の間に前記上皮細胞においてＲｈｏキナーゼおよび／またはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼの活性を阻害する工程をさらに含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ２４のいずれか１つの上皮細胞。
【０４４３】
Ｃ２６．  Ｒｈｏキナーゼおよび／またはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼが、Ｒｈｏキナーゼ１（ＲＯＣＫ１）およびＲｈｏキナーゼ２（ＲＯＣＫ２）から選択される、実施形態Ｃ２５の上皮細胞。
【０４４４】
Ｃ２７．  Ｒｈｏキナーゼおよび／またはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼの活性を阻害する工程が、１種もしくはこれより多くのＲｈｏキナーゼインヒビターおよび／または１種もしくはこれより多くのＲｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビターの使用を含む、実施形態Ｃ２５またはＣ２６の上皮細胞。
【０４４５】
Ｃ２８．  前記１種もしくはこれより多くのＲｈｏキナーゼインヒビターおよび／または前記１種もしくはこれより多くのＲｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビターが、１種もしくはこれより多くの低分子Ｒｈｏキナーゼインヒビターを含む、実施形態Ｃ２７の上皮細胞。
【０４４６】
Ｃ２９．  前記１種もしくはこれより多くのＲｈｏキナーゼインヒビターおよび／または前記１種もしくはこれより多くのＲｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビターが、Ｙ−２７６３２、ＳＲ３６７７、チアゾビビン、ＨＡ１１００ヒドロクロリド、ＨＡ１０７７およびＧＳＫ−４２９２８６から選択される、実施形態Ｃ２８の上皮細胞。
【０４４７】
Ｃ３０．  前記１種もしくはこれより多くのＲｈｏキナーゼインヒビターおよび／または前記１種もしくはこれより多くのＲｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビターが、Ｙ−２７６３２を含む、実施形態Ｃ２９の上皮細胞。
Ｃ３０．１  前記方法が、（ａ）の培養する工程の間に前記上皮細胞においてＲｈｏキナーゼおよび／またはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼの活性を阻害する工程を含まない、実施形態Ｃ１〜Ｃ２４のいずれか１つの上皮細胞。
【０４４８】
Ｃ３１．  前記方法が、（ａ）の培養する工程の間に前記上皮細胞においてｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）の活性を阻害する工程をさらに含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ３０．１のいずれか１つの上皮細胞。
【０４４９】
Ｃ３２．  前記ＰＡＫが、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２、ＰＡＫ３およびＰＡＫ４から選択される、実施形態Ｃ３１の上皮細胞。
【０４５０】
Ｃ３３．  前記ＰＡＫがＰＡＫ１である、実施形態Ｃ３２の上皮細胞。
【０４５１】
Ｃ３４．  ＰＡＫ１の活性を阻害する工程が、１種もしくはこれより多くのＰＡＫ１インヒビターの使用を含む、実施形態Ｃ３３の上皮細胞。
【０４５２】
Ｃ３５．  前記１種もしくはこれより多くのＰＡＫ１インヒビターが、１種もしくはこれより多くの低分子ＰＡＫ１インヒビターを含む、実施形態Ｃ３４の上皮細胞。
【０４５３】
Ｃ３６．  前記１種もしくはこれより多くのＰＡＫ１インヒビターが、ＩＰＡ３を含む、実施形態Ｃ３５の上皮細胞。
【０４５４】
Ｃ３７．  前記方法が、（ａ）の培養する工程の間に前記上皮細胞においてミオシンＩＩの活性を阻害する工程をさらに含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ３６のいずれか１つの上皮細胞。
Ｃ３７．１  前記ミオシンＩＩが非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）である、実施形態Ｃ３７の上皮細胞。
Ｃ３７．２  ミオシンＩＩの活性を阻害する工程が、１種もしくはこれより多くのミオシンＩＩインヒビターの使用を含む、実施形態Ｃ３７またはＣ３７．１の上皮細胞。
Ｃ３７．３  前記１種もしくはこれより多くのミオシンＩＩインヒビターが、１種もしくはこれより多くの低分子ミオシンＩＩインヒビターを含む、実施形態Ｃ３７．２の上皮細胞。
Ｃ３７．４  前記１種もしくはこれより多くのミオシンＩＩインヒビターが、ブレビスタチンを含む、実施形態Ｃ３７．２またはＣ３７．３の上皮細胞。
【０４５５】
Ｃ３８．  前記方法が、（ａ）の培養する工程の間に前記上皮細胞において細胞内環状アデノシンモノホスフェート（ｃＡＭＰ）レベルを増大させることをさらに含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ３７．４のいずれか１つの上皮細胞。
【０４５６】
Ｃ３９．  細胞内環状アデノシンモノホスフェート（ｃＡＭＰ）レベルを増大させる工程が、１種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性アゴニストおよび／または１種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストの使用を含む、実施形態Ｃ３８の上皮細胞。
Ｃ３９．１  前記１種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性アゴニストおよび／または前記１種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストがイソプロテレノールを含む、実施形態Ｃ３９の上皮細胞。
【０４５７】
Ｃ４０．  前記上皮細胞は、（ａ）の前に被験体から得られる、実施形態Ｃ１〜Ｃ４０のいずれか１つの上皮細胞。
Ｃ４０．１  前記被験体が哺乳動物である、実施形態Ｃ４０の上皮細胞。
Ｃ４０．２  前記被験体がヒトである、実施形態Ｃ４０の上皮細胞。
Ｃ４０．３  前記上皮細胞が被験体由来の組織に由来する、実施形態Ｃ４０〜Ｃ４０．２のいずれか１つの上皮細胞。
Ｃ４０．４  前記上皮細胞が被験体由来の分化した組織に由来する、実施形態Ｃ４０．３の上皮細胞。
Ｃ４０．５  前記上皮細胞が被験体由来の循環細胞に由来する、実施形態Ｃ４０〜Ｃ４０．２のいずれか１つの上皮細胞。
【０４５８】
Ｃ４１．  前記上皮細胞が、被験体由来の初代細胞を含む、実施形態Ｃ４０〜Ｃ４０．５のいずれか１つの上皮細胞。
【０４５９】
Ｃ４２．  前記上皮細胞が、被験体由来の初代細胞を含まない、実施形態Ｃ４０〜Ｃ４０．５のいずれか１つの上皮細胞。
【０４６０】
Ｃ４３．  前記上皮細胞が、被験体由来の腫瘍細胞を含む、実施形態Ｃ４０〜Ｃ４２のいずれか１つの上皮細胞。
【０４６１】
Ｃ４４．  被験体に由来する上皮細胞が、扁平上皮細胞、円柱上皮細胞、腺腫様上皮細胞および移行上皮細胞から選択される、実施形態Ｃ４１〜Ｃ４３のいずれか１つの上皮細胞。
Ｃ４４．１  被験体に由来する上皮細胞が、扁平上皮細胞、円柱上皮細胞、腺腫様上皮細胞および移行上皮細胞のうちの１つまたは複数を含む、実施形態Ｃ４１〜Ｃ４３のいずれか１つの上皮細胞。
【０４６２】
Ｃ４５．  被験体に由来する上皮細胞が、ケラチノサイト上皮細胞を含む、実施形態Ｃ４１〜Ｃ４４．１のいずれか１つの上皮細胞。
Ｃ４５．１  前記ケラチノサイト上皮細胞が、皮膚ケラチノサイト、眼の上皮細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、食道上皮細胞、および子宮頸部上皮細胞から選択される、実施形態Ｃ４５の上皮細胞。
【０４６３】
Ｃ４６．  被験体に由来する上皮細胞が、非ケラチノサイト上皮細胞を含む、実施形態Ｃ４１〜Ｃ４４のいずれか１つの上皮細胞。
【０４６４】
Ｃ４７．  前記非ケラチノサイト上皮細胞が、腺上皮細胞を含む、実施形態Ｃ４６の上皮細胞。
【０４６５】
Ｃ４８．  前記非ケラチノサイト上皮細胞が、前立腺細胞、乳腺細胞、肝細胞、肝臓上皮細胞、胆管上皮細胞、胆嚢細胞、膵島細胞、膵臓β細胞、膵管上皮細胞、肺上皮細胞、気道上皮細胞、鼻腔上皮細胞、腎臓細胞、膀胱細胞、尿道上皮細胞、胃上皮細胞、大腸上皮細胞、小腸上皮細胞、精巣上皮細胞、卵巣上皮細胞、卵管上皮細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、胸腺細胞、下垂体細胞、腺細胞、羊膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、汗腺上皮細胞、脂腺上皮細胞および毛包細胞から選択される、実施形態Ｃ４６またはＣ４７の上皮細胞。
Ｃ４８．１  前記上皮細胞が、基底上皮細胞を含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ４８のいずれか１つの上皮細胞。
Ｃ４８．２  前記上皮細胞は腸上皮細胞ではない、実施形態Ｃ１〜Ｃ４８のいずれか１つの上皮細胞。
【０４６６】
Ｃ４９．  （ａ）の培養する工程は、無血清培地の存在下で行われる、実施形態Ｃ１〜Ｃ４８．２のいずれか１つの上皮細胞。
Ｃ４９．１  前記無血清培地が規定された無血清培地である、実施形態Ｃ４９の上皮細胞。
Ｃ４９．２  前記無血清培地がゼノフリー無血清培地である、実施形態Ｃ４９の上皮細胞。
Ｃ４９．３  前記無血清培地が規定されたゼノフリー無血清培地である、実施形態Ｃ４９の上皮細胞。
【０４６７】
Ｃ５０．  前記無血清培地が、カルシウムを含む、実施形態Ｃ４９〜Ｃ４９．３のいずれか１つの上皮細胞。
【０４６８】
Ｃ５１．  前記無血清培地が、１ｍＭ未満の濃度でカルシウムを含む、実施形態Ｃ５０の上皮細胞。
【０４６９】
Ｃ５２．  前記無血清培地が、５００μＭ未満の濃度でカルシウムを含む、実施形態Ｃ５０の上皮細胞。
【０４７０】
Ｃ５３．  前記無血清培地が、１００μＭ未満の濃度でカルシウムを含む、実施形態Ｃ５０の上皮細胞。
Ｃ５３．１  前記無血清培地が、約９０μＭの濃度でカルシウムを含む、実施形態Ｃ５３の上皮細胞。
【０４７１】
Ｃ５４．  前記無血清培地が、２０μＭ未満の濃度でカルシウムを含む、実施形態Ｃ５０の上皮細胞。
Ｃ５４．１  前記無血清培地が、緩衝液と、無機酸、無機塩、アルカリケイ酸塩、アミノ酸、ビタミン、プリン、ピリミジン、ポリアミン、α−ケト酸、有機イオウ化合物およびグルコースのうちの１つまたは複数とを含む、実施形態Ｃ４９〜Ｃ５４のいずれか１つの上皮細胞。
Ｃ５４．２  前記１種もしくはこれより多くの塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウムおよびリン酸ナトリウムから選択される、実施形態Ｃ５４．１の上皮細胞。
Ｃ５４．３  前記１種もしくはこれより多くのアミノ酸が、アルギニンおよびグルタミンから選択される、実施形態Ｃ５４．１またはＣ５４．２の上皮細胞。
Ｃ５４．４  前記緩衝液がＨＥＰＥＳ緩衝液である、実施形態Ｃ５４．１〜Ｃ５４．３のいずれか１つの上皮細胞。
Ｃ５４．５  前記無血清培地が、アルブミンを含む、実施形態Ｃ４９〜Ｃ５４．４のいずれか１つの上皮細胞。
Ｃ５４．６  前記アルブミンが、ウシ血清アルブミンおよび組換えヒト血清アルブミンから選択される、実施形態Ｃ５４．５の上皮細胞。
Ｃ５４．７  前記無血清培地が、１種もしくはこれより多くの脂質を含む、実施形態Ｃ４９〜Ｃ５４．６のいずれか１つの上皮細胞。
Ｃ５４．８  前記１種もしくはこれより多くの脂質が、アラキドン酸、コレステロール、ＤＬ−α−トコフェロールアセテート、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、プルロニックＦ−６８、ステアリン酸およびポリソルベート８０から選択される、実施形態Ｃ５４．７の上皮細胞。
Ｃ５４．９  前記１種もしくはこれより多くの脂質が、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸から選択される、実施形態Ｃ５４．８の上皮細胞。
【０４７２】
Ｃ５５．  前記方法が、１種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子の使用を含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ５４のいずれか１つの上皮細胞。
【０４７３】
Ｃ５６．  前記１種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子が、ＥＧＦを含む、実施形態Ｃ５５の上皮細胞。
Ｃ５６．１  前記１種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子が、ＦＧＦを含む、実施形態Ｃ５５の上皮細胞。
Ｃ５６．２  前記１種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子が、ＥＧＦおよびＦＧＦを含む、実施形態Ｃ５５の上皮細胞。
Ｃ５６．３  前記ＦＧＦが、酸性ＦＧＦを含む、実施形態Ｃ５６．１またはＣ５６．２の上皮細胞。
【０４７４】
Ｃ５７．  前記方法が、有糸分裂促進性増殖因子の使用を含まない、実施形態Ｃ１〜Ｃ５４．９のいずれか１つの上皮細胞。
【０４７５】
Ｃ５８．  前記方法が、１種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性補充物の使用を含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ５７のいずれか１つの上皮細胞。
【０４７６】
Ｃ５９．  前記１種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性補充物が、ウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ）を含む、実施形態Ｃ５８の上皮細胞。
Ｃ５９．１  前記方法が、有糸分裂促進性補充物の使用を含まない、実施形態Ｃ１〜Ｃ５７のいずれか１つの上皮細胞。
【０４７７】
Ｃ６０．  前記方法が、Ｗｎｔアゴニストまたはβ−カテニンアゴニストの使用を含まない、実施形態Ｃ１〜Ｃ５９．１のいずれか１つの上皮細胞。
Ｃ６０．１  前記方法が、ｎｏｇｇｉｎ、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ、Ｗｎｔ−３ａ、ＥＧＦ、ニコチンアミド、ＦＧＦ１０、ガストリン、ｐ３８インヒビター、ＳＢ２０２１９０、ＤＨＴ、ｎｏｔｃｈインヒビター、ガンマセクレターゼインヒビター、ＤＢＺおよびＤＡＰＴから選択される成分のうちの１つまたは複数の使用を含まない、実施形態Ｃ１〜Ｃ６０のいずれか１つの上皮細胞。
【０４７８】
Ｃ６１．  前記方法が、細胞外マトリクスの使用を含まない、実施形態Ｃ１〜Ｃ６０．１のいずれか１つの上皮細胞。
【０４７９】
Ｃ６２．  （ａ）の培養する工程が被覆を含む容器の中で行われる、実施形態Ｃ１〜Ｃ６０．１のいずれか１つの上皮細胞。
【０４８０】
Ｃ６３．  前記被覆が、コラーゲンを含む、実施形態Ｃ６２の上皮細胞。
【０４８１】
Ｃ６４．  前記被覆が、基底膜マトリクスを含む、実施形態Ｃ６２の上皮細胞。
【０４８２】
Ｃ６５．  （ａ）の培養する工程が、前記上皮細胞を拡大する工程を含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ６４のいずれか１つの上皮細胞。
【０４８３】
Ｃ６６．  前記上皮細胞は少なくとも約２倍拡大される、実施形態Ｃ６５の上皮細胞。
【０４８４】
Ｃ６７．  前記上皮細胞は少なくとも約５倍拡大される、実施形態Ｃ６５の上皮細胞。
【０４８５】
Ｃ６８．  前記上皮細胞は少なくとも約１０倍拡大される、実施形態Ｃ６５の上皮細胞。
【０４８６】
Ｃ６９．  前記上皮細胞は少なくとも約１５倍拡大される、実施形態Ｃ６５の上皮細胞。
【０４８７】
Ｃ７０．  前記上皮細胞は少なくとも約２０倍拡大される、実施形態Ｃ６５の上皮細胞。
Ｃ７０．１  前記上皮細胞は少なくとも約１００倍拡大される、実施形態Ａ６５の上皮細胞。
Ｃ７０．２  前記上皮細胞は少なくとも約１，０００倍拡大される、実施形態Ａ６５の上皮細胞。
Ｃ７０．３  前記上皮細胞は少なくとも約１０，０００倍拡大される、実施形態Ａ６５の上皮細胞。
Ｃ７０．４  前記上皮細胞は少なくとも約１００，０００倍拡大される、実施形態Ａ６５の上皮細胞。
Ｃ７０．５  前記上皮細胞は少なくとも約１００万倍拡大される、実施形態Ａ６５の上皮細胞。
Ｃ７０．６  前記上皮細胞は少なくとも約１０億倍拡大される、実施形態Ａ６５の上皮細胞。
Ｃ７０．７  前記上皮細胞は少なくとも約１兆倍拡大される、実施形態Ａ６５の上皮細胞。
【０４８８】
Ｃ７１．  前記上皮細胞は約４日間培養される、実施形態Ｃ６５〜Ｃ７０．７のいずれか１つの上皮細胞。
【０４８９】
Ｃ７２．  前記上皮細胞は約５日間培養される、実施形態Ｃ６５〜Ｃ７０．７のいずれか１つの上皮細胞。
【０４９０】
Ｃ７３．  前記上皮細胞は連続して増殖している、実施形態Ｃ１〜Ｃ７２のいずれか１つの上皮細胞。
【０４９１】
Ｃ７４．  前記方法が、前記上皮細胞を少なくとも１５回継代する工程を含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ７３のいずれか１つの上皮細胞。
【０４９２】
Ｃ７５．  前記方法が、前記上皮細胞を少なくとも２５回継代する工程を含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ７３のいずれか１つの上皮細胞。
【０４９３】
Ｃ７６．  前記上皮細胞の集団はある期間にわたって倍加する、実施形態Ｃ１〜Ｃ７５のいずれか１つの上皮細胞。
【０４９４】
Ｃ７７．  前記上皮細胞集団は少なくとも２０回倍加する、実施形態Ｃ７６の上皮細胞。
【０４９５】
Ｃ７８．  前記上皮細胞集団は少なくとも５０回倍加する、実施形態Ｃ７６の上皮細胞。
Ｃ７８．１  前記上皮細胞集団は少なくとも８０回倍加する、実施形態Ｃ７６の上皮細胞。
【０４９６】
Ｃ７９．  前記上皮細胞集団は少なくとも１００回倍加する、実施形態Ｃ７６の上皮細胞。
【０４９７】
Ｃ８０．  前記上皮細胞集団は少なくとも１２０回倍加する、実施形態Ｃ７６の上皮細胞。
【０４９８】
Ｃ８１．  前記上皮細胞集団は少なくとも１５０回倍加する、実施形態Ｃ７６の上皮細胞。
【０４９９】
Ｃ８２．  前記上皮細胞集団は少なくとも２００回倍加する、実施形態Ｃ７６の上皮細胞。
【０５００】
Ｃ８３．  前記期間は約５０日間である、実施形態Ｃ７６〜Ｃ８２のいずれか１つの上皮細胞。
【０５０１】
Ｃ８４．  前記期間は約１００日間である、実施形態Ｃ７６〜Ｃ８２のいずれか１つの上皮細胞。
【０５０２】
Ｃ８５．  前記期間は約１５０日間である、実施形態Ｃ７６〜Ｃ８２のいずれか１つの上皮細胞。
【０５０３】
Ｃ８６．  前記期間は約２００日間である、実施形態Ｃ７６〜Ｃ８２のいずれか１つの上皮細胞。
【０５０４】
Ｃ８７．  （ｂ）の間に１種もしくはこれより多くの天然の機能的特徴を維持する、実施形態Ｃ１〜Ｃ８６のいずれか１つの上皮細胞。
【０５０５】
Ｃ８８．  （ｂ）の間に１種もしくはこれより多くの天然の機能的特徴を維持しない、実施形態Ｃ１〜Ｃ８６のいずれか１つの上皮細胞。
【０５０６】
Ｃ８９．  （ｂ）の後に、ＴＧＦ−βシグナル伝達が阻害されない細胞培養環境へと置かれる、実施形態Ｃ１〜Ｃ８８のいずれか１つの上皮細胞。
【０５０７】
Ｃ９０．  ＴＧＦ−βシグナル伝達が阻害されない細胞培養環境へと置かれた後に、１種もしくはこれより多くの天然の機能的特徴を維持または再獲得する、実施形態Ｃ８９の上皮細胞。
【０５０８】
Ｃ９１．  複数の組織タイプに分化するように誘導され得る、実施形態Ｃ１〜Ｃ９０のいずれか１つの上皮細胞。
Ｃ９１．１  複数の組織タイプに分化する能力を獲得しない、実施形態Ｃ１〜Ｃ９０のいずれか１つの上皮細胞。
【０５０９】
Ｃ９２．  オルガノイドを形成する能力を獲得しない、実施形態Ｃ１〜Ｃ９１．１のいずれか１つの上皮細胞。
【０５１０】
Ｃ９３．  胚性幹細胞に由来するものではない、実施形態Ｃ１〜Ｃ９２のいずれか１つの上皮細胞。
Ｃ９３．１  連続して増殖している上皮幹細胞に由来するものではない、実施形態Ｃ１〜Ｃ９３のいずれか１つの上皮細胞。
Ｃ９３．２  静止した上皮細胞を含む上皮組織に由来する、実施形態Ｃ１〜Ｃ９３．１のいずれか１つの上皮細胞。
Ｃ９３．３  方法が、連続して増殖している上皮幹細胞を選択することを含まない、実施形態Ｃ１〜Ｃ９３．２のいずれか１つの上皮細胞。
Ｃ９３．４  方法が、腸陰窩細胞を選択することを含まない、実施形態Ｃ１〜Ｃ９３．３のいずれか１つの上皮細胞。
Ｃ９３．５  方法が、ＬＧＲ５＋細胞を選択することを含まない、実施形態Ｃ１〜Ｃ９３．４のいずれか１つの上皮細胞。
【０５１１】
Ｃ９４．  被験体および／またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、連続して増殖している上皮幹細胞または連続して増殖している上皮幹細胞に由来する細胞を含まない、実施形態Ｃ４０〜Ｃ９３．５のいずれか１つの上皮細胞。
Ｃ９４．１  被験体および／またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、多能性幹細胞または多能性幹細胞に由来する細胞を含まない、実施形態Ｃ４０〜Ｃ９４のいずれか１つの上皮細胞。
Ｃ９４．２  被験体および／またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、最終分化した上皮細胞を含まない、実施形態Ｃ４０〜Ｃ９４．１のいずれか１つの上皮細胞。
Ｃ９４．３  被験体および／またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、胃上皮細胞、腸上皮細胞、および／または膵臓上皮細胞を含まない、実施形態Ｃ４０〜Ｃ９４．２のいずれか１つの上皮細胞。
Ｃ９４．４  被験体および／またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、腸陰窩細胞を含まない、実施形態Ｃ４０〜Ｃ９４．３のいずれか１つの上皮細胞。
Ｃ９４．５  被験体および／またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、ＬＧＲ５＋細胞を含まない、実施形態Ｃ４０〜Ｃ９４．４のいずれか１つの上皮細胞。
【０５１２】
Ｃ９５．  被験体および／またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、上皮細胞の均質な集団である、実施形態Ｃ４０〜Ｃ９４．５のいずれか１つの上皮細胞。
Ｃ９５．１  被験体および／またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、基底上皮細胞の均質な集団である、実施形態Ｃ４０〜Ｃ９５のいずれか１つの上皮細胞。
Ｃ９５．２  被験体および／またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、上皮細胞の異質な集団である、実施形態Ｃ４０〜Ｃ９４．５のいずれか１つの上皮細胞。
【０５１３】
Ｃ９６．  被験体および／またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、最終分化した細胞より分化しておらず、胚性幹細胞または成体幹細胞より分化している、実施形態Ｃ４０〜Ｃ９５．２のいずれか１つの上皮細胞。
【０５１４】
Ｃ９７．  被験体および／またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、１種もしくはこれより多くの基底上皮細胞マーカーを発現する、実施形態Ｃ４０〜Ｃ９６のいずれか１つの上皮細胞。
【０５１５】
Ｃ９８．  被験体および／またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ４、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ５およびＴＰ６３のうちの１つまたは複数を発現する、実施形態Ｃ４０〜Ｃ９７のいずれか１つの上皮細胞。
【０５１６】
Ｃ９９．  被験体および／またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、１種もしくはこれより多くの上皮幹細胞マーカーを発現しない、実施形態Ｃ４０〜Ｃ９８のいずれか１つの上皮細胞。
【０５１７】
Ｃ１００．  被験体および／またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、Ｌｇｒ５を発現しない、実施形態Ｃ４０〜Ｃ９９のいずれか１つの上皮細胞。
【０５１８】
Ｃ１０１．  被験体および／またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、１種もしくはこれより多くの多能性幹細胞マーカーを発現しない、実施形態Ｃ４０〜Ｃ１００のいずれか１つの上皮細胞。
【０５１９】
Ｃ１０２．  被験体および／またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、ＬＩＮ２８Ａ、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４およびＳＯＸ２のうちの１つまたは複数を発現しない、実施形態Ｃ４０〜Ｃ１０１のいずれか１つの上皮細胞。
【０５２０】
Ｃ１０３．  被験体および／またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、１種もしくはこれより多くの最終分化した上皮細胞マーカーを発現しない、実施形態Ｃ４０〜Ｃ１０２のいずれか１つの上皮細胞。
【０５２１】
Ｃ１０４．  被験体および／またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、ＣＦＴＲ、ＦＯＸＪ１、ＩＶＬ、ＫＲＴ１、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ２０、ＬＯＲ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ＳＣＧＢ１Ａ１、ＳＦＴＰＢおよびＳＦＴＰＤのうちの１つまたは複数を発現しない、実施形態Ｃ４０〜Ｃ１０３のいずれか１つの上皮細胞。
【０５２２】
Ｃ１０５．  被験体および／またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、１種もしくはこれより多くの胃上皮細胞マーカー、１種もしくはこれより多くの腸上皮細胞マーカー、および／または１種もしくはこれより多くの膵臓上皮細胞マーカーを発現しない、実施形態Ｃ４０〜Ｃ１０４のいずれか１つの上皮細胞。
【０５２３】
Ｃ１０６．  被験体および／またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、ＣＤ３４、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＩＨＨ、ＫＩＴ、ＬＧＲ５、ＰＤＸ１、およびＰＲＯＭ１／ＣＤ１３３のうちの１つまたは複数を発現しない、実施形態Ｃ４０〜Ｃ１０５のいずれか１つの上皮細胞。
【０５２４】
Ｃ１０７．遺伝子改変された細胞の生産のための、実施形態Ｃ１〜Ｃ１０６のいずれか１つの上皮細胞の使用。
【０５２５】
Ｃ１０８．  被験体のための１種もしくはこれより多くの候補処置を同定するための、実施形態Ｃ１〜Ｃ１０６のいずれか１つの上皮細胞の使用。
【０５２６】
Ｃ１０９．  被験体において１種もしくはこれより多くの異常な上皮細胞を同定するための、実施形態Ｃ１〜Ｃ１０６のいずれか１つの上皮細胞の使用。
【０５２７】
Ｃ１１０．  被験体における疾患の進行または疾患の処置をモニターするための、実施形態Ｃ１〜Ｃ１０６のいずれか１つの上皮細胞の使用。
【０５２８】
Ｄ１．  規定された無血清細胞培養培地、脂質ミックス、ＥＧＦ、ＦＧＦ、アルブミン、ＴＧＦ−βインヒビターまたはＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター、およびＲｈｏキナーゼインヒビターまたはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビターを含む細胞培養組成物。
【０５２９】
Ｄ２．  規定された無血清細胞培養培地、脂質ミックス、ＥＧＦ、ＦＧＦ、アルブミン、ＴＧＦ−βインヒビターまたはＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター、およびＲｈｏキナーゼインヒビターまたはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビターからなる細胞培養組成物。
【０５３０】
Ｄ３．  規定された無血清細胞培養培地、脂質ミックス、ＥＧＦ、ＦＧＦ、アルブミン、ＴＧＦ−βインヒビターまたはＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター、ＲｈｏキナーゼインヒビターまたはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビター、およびβアドレナリン作動性アゴニストまたはβアドレナリン作動性レセプターアゴニストを含む細胞培養組成物。
【０５３１】
Ｄ４．  規定された無血清細胞培養培地、脂質ミックス、ＥＧＦ、ＦＧＦ、アルブミン、ＴＧＦ−βインヒビターまたはＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター、ＲｈｏキナーゼインヒビターまたはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビター、およびβアドレナリン作動性アゴニストまたはβアドレナリン作動性レセプターアゴニストからなる細胞培養組成物。
【０５３２】
Ｄ５．  ゼノフリー無血清細胞培養培地、脂質ミックス、ＥＧＦ、ＦＧＦ、アルブミン、ＴＧＦ−βインヒビターまたはＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター、およびＲｈｏキナーゼインヒビターまたはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビターを含む細胞培養組成物。
【０５３３】
Ｄ６．  ゼノフリー無血清細胞培養培地、脂質ミックス、ＥＧＦ、ＦＧＦ、アルブミン、ＴＧＦ−βインヒビターまたはＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター、およびＲｈｏキナーゼインヒビターまたはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビターからなる細胞培養組成物。
【０５３４】
Ｄ７．  ゼノフリー無血清細胞培養培地、脂質ミックス、ＥＧＦ、ＦＧＦ、アルブミン、ＴＧＦ−βインヒビターまたはＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター、ＲｈｏキナーゼインヒビターまたはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビター、およびβアドレナリン作動性アゴニストまたはβアドレナリン作動性レセプターアゴニストを含む細胞培養組成物。
【０５３５】
Ｄ８．  ゼノフリー無血清細胞培養培地、脂質ミックス、ＥＧＦ、ＦＧＦ、アルブミン、ＴＧＦ−βインヒビターまたはＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター、ＲｈｏキナーゼインヒビターまたはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビター、およびβアドレナリン作動性アゴニストまたはβアドレナリン作動性レセプターアゴニストからなる細胞培養組成物。
【０５３６】
Ｄ９．  規定されたゼノフリー無血清細胞培養培地、脂質ミックス、ＥＧＦ、ＦＧＦ、アルブミン、ＴＧＦ−βインヒビターまたはＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター、およびＲｈｏキナーゼインヒビターまたはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビターを含む細胞培養組成物。
【０５３７】
Ｄ１０．  規定されたゼノフリー無血清細胞培養培地、脂質ミックス、ＥＧＦ、ＦＧＦ、アルブミン、ＴＧＦ−βインヒビターまたはＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター、およびＲｈｏキナーゼインヒビターまたはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビターからなる細胞培養組成物。
【０５３８】
Ｄ１１．  規定されたゼノフリー無血清細胞培養培地、脂質ミックス、ＥＧＦ、ＦＧＦ、アルブミン、ＴＧＦ−βインヒビターまたはＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター、ＲｈｏキナーゼインヒビターまたはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビター、およびβアドレナリン作動性アゴニストまたはβアドレナリン作動性レセプターアゴニストを含む細胞培養組成物。
【０５３９】
Ｄ１２．  規定されたゼノフリー無血清細胞培養培地、脂質ミックス、ＥＧＦ、ＦＧＦ、アルブミン、ＴＧＦ−βインヒビターまたはＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビター、ＲｈｏキナーゼインヒビターまたはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビター、およびβアドレナリン作動性アゴニストまたはβアドレナリン作動性レセプターアゴニストからなる細胞培養組成物。
【０５４０】
Ｅ１．  エキソビボで上皮細胞を増殖させる方法であって、
分化した組織に由来する起源上皮細胞集団中の細胞数を、フィーダー細胞なしの条件下で拡大し、それによって、拡大した上皮細胞集団を生成する工程を含み、ここで、
前記拡大培養条件は、集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するかつ／または集団においてトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達を阻害する薬剤を含み；
前記起源上皮細胞集団は、拡大培養条件下で培養した場合に２５回またはそれより多くの集団倍加をすることができ；
前記起源上皮細胞集団は、前記薬剤を含まないコントロール培養条件下で培養した場合に２０回以下の集団倍加が可能である、方法。
Ｅ１．１  エキソビボで上皮細胞を増殖させる方法であって、
分化した組織に由来する起源上皮細胞集団中の細胞数を、無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で拡大し、それによって、拡大した上皮細胞集団を生成する工程を含み、ここで、
前記拡大培養条件は、集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するかつ／または集団においてトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達を阻害する薬剤を含み；
前記起源上皮細胞集団は、静止したおよび／または以前は静止していた上皮細胞を含む、方法。
Ｅ１．２  ：
集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するかつ／または集団においてトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達を阻害する薬剤が第１の薬剤であり、前記拡大培養条件が、集団において細胞骨格構造を調節する第２の薬剤をさらに含み、
前記コントロール培養条件が、前記第１の薬剤および前記第２の薬剤を含まない、実施形態Ｅ１の方法。
Ｅ１．３  前記拡大培養条件が、集団において細胞骨格構造を調節する薬剤をさらに含む、実施形態Ｅ１．１の方法。
【０５４１】
Ｅ２．  分化した組織分化した組織に由来する起源上皮細胞集団を単離する工程を含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ１．３のいずれか１つの方法。
【０５４２】
Ｅ３．  細胞培養物中の前記起源上皮細胞集団の細胞を、前記細胞が単離された後かつ前記起源上皮細胞集団を前記フィーダー細胞なしの拡大培養条件に接触させる前に、維持するまたは増殖させる工程を包含する、実施形態Ｅ１〜Ｅ２のいずれか１つの方法。
【０５４３】
Ｅ４．  前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団が胚性幹細胞を含まない、実施形態Ｅ１〜Ｅ３のいずれか１つの方法。
【０５４４】
Ｅ５．
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、１種もしくはこれより多くの基底上皮細胞マーカーを発現する
、実施形態Ｅ１〜Ｅ４のいずれか１つの方法。
【０５４５】
Ｅ６．
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ４、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ５およびＴＰ６３のうちの１つまたは複数を発現する、実施形態Ｅ１〜Ｅ５のいずれか１つの方法。
【０５４６】
Ｅ７．
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、１種もしくはこれより多くの上皮幹細胞マーカーを発現しない、実施形態Ｅ１〜Ｅ６のいずれか１つの方法。
【０５４７】
Ｅ８．
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、Ｌｇｒ５を発現しない、実施形態Ｅ１〜Ｅ７のいずれか１つの方法。
【０５４８】
Ｅ９．
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、１種もしくはこれより多くの多能性幹細胞マーカーを発現しない、実施形態Ｅ１〜Ｅ８のいずれか１つの方法。
【０５４９】
Ｅ１０．
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、ＬＩＮ２８Ａ、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４およびＳＯＸ２のうちの１つまたは複数を発現しない、実施形態Ｅ１〜Ｅ９のいずれか１つの方法。
【０５５０】
Ｅ１１．
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団が、１種もしくはこれより多くの最終分化した上皮細胞マーカーを発現しない、実施形態Ｅ１〜Ｅ１０のいずれか１つの方法。
【０５５１】
Ｅ１２．  
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、ＣＦＴＲ、ＦＯＸＪ１、ＩＶＬ、ＫＲＴ１、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ２０、ＬＯＲ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ＳＣＧＢ１Ａ１、ＳＦＴＰＢおよびＳＦＴＰＤのうちの１つまたは複数を発現しない、実施形態Ｅ１〜Ｅ１１のいずれか１つの方法。
【０５５２】
Ｅ１３．  
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、１種もしくはこれより多くの胃上皮細胞マーカー、１種もしくはこれより多くの腸上皮細胞マーカー、および／または１種もしくはこれより多くの膵臓上皮細胞マーカーを発現しない、実施形態Ｅ１〜Ｅ１２のいずれか１つの方法。
【０５５３】
Ｅ１４．  
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、ＣＤ３４、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＩＨＨ、ＫＩＴ、ＬＧＲ５、ＰＤＸ１、およびＰＲＯＭ１／ＣＤ１３３のうちの１つまたは複数を発現しない、実施形態Ｅ１〜Ｅ１３のいずれか１つの方法。
【０５５４】
Ｅ１５．
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、静止したおよび／または以前は静止していた上皮細胞を含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ１４のいずれか１つの方法。
【０５５５】
Ｅ１６．  集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するかつ／またはトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達を阻害する薬剤が、１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビターを含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ１５のいずれか１つの方法。
【０５５６】
Ｅ１７．  前記１種もしくはこれより多くのＴＧＦ−βシグナル伝達インヒビターが、１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターを含む、実施形態Ｅ１６の方法。
【０５５７】
Ｅ１８．  前記１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターが、１種もしくはこれより多くの低分子ＡＬＫ５インヒビターを含む、実施形態Ｅ１７の方法。
【０５５８】
Ｅ１９．  前記１種もしくはこれより多くのＡＬＫ５インヒビターが、Ａ８３−０１、ＧＷ７８８３８８、ＲｅｐＳｏｘ、およびＳＢ４３１５４２から選択される、実施形態Ｅ１７の方法。
【０５５９】
Ｅ２０．  集団において細胞骨格構造を調節する薬剤が、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビター、ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）インヒビター、およびミオシンＩＩインヒビターのうちの１つまたは複数を含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ１９のいずれか１つの方法。
【０５６０】
Ｅ２１．  前記Ｒｈｏキナーゼインヒビターが、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ１（ＲＯＣＫ１）インヒビターおよびＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ２（ＲＯＣＫ２）インヒビターから選択される、実施形態Ｅ２０の方法。
【０５６１】
Ｅ２２．  前記Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビターが、１種もしくはこれより多くの低分子Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビターを含む、実施形態Ｅ２０またはＥ２１の方法。
【０５６２】
Ｅ２３．  前記１種もしくはこれより多くのＲｈｏ関連タンパク質キナーゼインヒビターが、Ｙ−２７６３２、ＳＲ３６７７、チアゾビビン、ＨＡ１１００ヒドロクロリド、ＨＡ１０７７およびＧＳＫ−４２９２８６から選択される、実施形態Ｅ２２の方法。
【０５６３】
Ｅ２４．  前記ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）インヒビターが、ＰＡＫ１インヒビター、ＰＡＫ２インヒビター、ＰＡＫ３インヒビターおよびＰＡＫ４インヒビターから選択される、実施形態Ｅ２０〜Ｅ２３のいずれか１つの方法。
【０５６４】
Ｅ２５．  前記ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）インヒビターが、１種もしくはこれより多くの低分子ＰＡＫ１インヒビターを含む、実施形態Ｅ２４の方法。
【０５６５】
Ｅ２６．  前記１種もしくはこれより多くの低分子ＰＡＫ１インヒビターが、ＩＰＡ３を含む、実施形態Ｅ２５の方法。
【０５６６】
Ｅ２７．  前記ミオシンＩＩインヒビターが、１種もしくはこれより多くの非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）インヒビターを含む、実施形態Ｅ２０〜Ｅ２６のいずれか１つの方法。
【０５６７】
Ｅ２８．  前記１種もしくはこれより多くの非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）インヒビターが、１種もしくはこれより多くの低分子非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）インヒビターを含む、実施形態Ｅ２７の方法。
【０５６８】
Ｅ２９．  前記１種もしくはこれより多くの低分子非筋肉ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）インヒビターが、ブレビスタチンを含む、実施形態Ｅ２８の方法。
【０５６９】
Ｅ３０．  前記拡大培養条件が、集団において細胞内環状アデノシンモノホスフェート（ｃＡＭＰ）レベルを増大させる薬剤をさらに含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ２９のいずれか１つの方法。
【０５７０】
Ｅ３１．  細胞内環状アデノシンモノホスフェート（ｃＡＭＰ）レベルを増大させる薬剤が、１種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストを含む、実施形態Ｅ３０の方法。
【０５７１】
Ｅ３２．  前記１種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストが、イソプロテレノールを含む、実施形態Ｅ３１の方法。
【０５７２】
Ｅ３３．  前記拡大培養条件が、無血清培養条件である、実施形態Ｅ１〜Ｅ３２のいずれか１つの方法。
【０５７３】
Ｅ３４．  前記拡大培養条件が、規定された無血清培養条件である、実施形態Ｅ１〜Ｅ３３のいずれか１つの方法。
【０５７４】
Ｅ３５．  前記拡大培養条件が、ゼノフリー培養条件である、実施形態Ｅ１〜Ｅ３４のいずれか１つの方法。
【０５７５】
Ｅ３６．  前記拡大培養条件が、規定されたゼノフリー培養条件である、実施形態Ｅ１〜Ｅ３５のいずれか１つの方法。
【０５７６】
Ｅ３７．  前記拡大培養条件が、１００μＭ未満の濃度でカルシウムを含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ３６のいずれか１つの方法。
【０５７７】
Ｅ３８．  前記カルシウムが、約９０μＭの濃度で存在する、実施形態Ｅ３７の方法。
【０５７８】
Ｅ３９．  前記拡大培養条件が、１種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子を含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ３８のいずれか１つの方法。
【０５７９】
Ｅ４０．  １種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子が、ＥＧＦ、ＦＧＦ、またはＥＧＦおよびＦＧＦを含む、実施形態Ｅ３９の方法。
【０５８０】
Ｅ４１．  前記拡大培養条件が、細胞外マトリクスを含まない、実施形態Ｅ１〜Ｅ４０のいずれか１つの方法。
【０５８１】
Ｅ４２．  前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養した場合に３０回またはそれより多くの集団倍加し得る、実施形態Ｅ１〜Ｅ４１のいずれか１つの方法。
【０５８２】
Ｅ４３．  前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養した場合に５０回またはそれより多くの集団倍加し得る、実施形態Ｅ１〜Ｅ４１のいずれか１つの方法。
【０５８３】
Ｅ４４．  前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養した場合に８０回またはそれより多くの集団倍加し得る、実施形態Ｅ１〜Ｅ４１のいずれか１つの方法。
【０５８４】
Ｅ４５．  前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養した場合に１００回またはそれより多くの集団倍加し得る、実施形態Ｅ１〜Ｅ４１のいずれか１つの方法。
【０５８５】
Ｅ４６．  前記方法が、前記起源上皮細胞集団において連続して増殖している上皮幹細胞を選択することを含まない、実施形態Ｅ１〜Ｅ４５のいずれか１つの方法。
【０５８６】
Ｅ４７．  前記起源上皮細胞集団が、連続して増殖している上皮幹細胞を含まない、実施形態Ｅ１〜Ｅ４５のいずれか１つの方法。
【０５８７】
Ｅ４８．  エキソビボで拡大した上皮細胞を単離する工程をさらに含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ４７のいずれか１つの方法。
【０５８８】
Ｅ４９．  エキソビボで拡大した上皮細胞の集団を細胞バンクで貯蔵する工程をさらに含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ４８のいずれか１つの方法。
【０５８９】
Ｅ５０．  実施形態Ｅ１〜Ｅ４９のいずれか１つに従う方法によって生産されたエキソビボで拡大した上皮細胞の集団。
【０５９０】
Ｅ５１．  遺伝子改変された細胞の生産のための実施形態Ｅ５０のエキソビボで拡大した上皮細胞の集団の使用。
【０５９１】
Ｅ５２．  被験体のための１種もしくはこれより多くの候補処置を同定するための実施形態Ｅ５０のエキソビボで拡大した上皮細胞の集団の使用。
【０５９２】
Ｅ５３．  被験体において１種もしくはこれより多くの異常な上皮細胞を同定するための実施形態Ｅ５０のエキソビボで拡大した上皮細胞の集団の使用。
【０５９３】
Ｅ５４．  被験体における疾患の進行または疾患の処置をモニターするための実施形態Ｅ５０のエキソビボで拡大した上皮細胞の集団の使用。
【０５９４】
本明細書で言及される各特許、特許出願、刊行物および文書の全体は、本明細書に参考として援用される。上記特許、特許出願、刊行物および文書の引用は、前述のうちのいずれかが、関連のある先行技術であるという承認でもなく、これらの刊行物または文書の内容または日付に関して、任意の承認を構成するものでもない。それらの引用は、関連する開示に関する検索の表示ではない。上記文書の日付または内容に関する全ての陳述は、入手可能な情報に基づき、それらの精度または正確性に関する承認ではない。
【０５９５】
改変は、本技術の基本的局面から逸脱することなく、前述に対して行われ得る。本技術は、１種もしくはこれより多くの具体的実施形態を参照して実質的に詳細に記載されてきたが、当業者は、本願において具体的に開示される実施形態に対して変更が行われ得るが、これら改変および改善は、本技術の範囲および趣旨内にあることを認識する。
【０５９６】
本明細書で適切に例証として記載される技術は、本明細書で具体的に開示されないいかなる要素の非存在下でも実施され得る。従って、例えば、本明細書での各場合において、用語「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」、および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」のうちのいずれかが、他方の２つの用語のうちのいずれかと置き換わり得る。使用されている用語および表現は、説明の用語として使用されるのであって、限定の用語として使用されているのではなく、このような用語および表現の使用は、示されかつ記載される特徴のいかなる均等物またはその一部をも排除せず、種々の改変は、特許請求される本技術の範囲内で考えられる。用語「１つの、ある（ａ）」または「１つの、ある（ａｎ）」は、その要素のうちの１つまたはその要素のうちの１つより多くのいずれかが記載されることが、文脈上明らかでなければ、その用語が修飾する要素のうちの１つまたは複数に言及し得る（例えば、「１種の試薬」は、１種もしくはこれより多くの試薬を意味し得る）。用語「約」は、本明細書で使用される場合、その基礎にあるパラメーターの１０％以内の値（すなわち、±１０％）に言及し、一連の値の始まりにおける用語「約」の使用は、それら値の各々を修飾する（すなわち、「約１、２および３」とは、約１、約２および約３をいう）。例えば、「約１００グラム」という重量は、９０グラム〜１１０グラムの間の重量を含み得る。さらに、値のリストが本明細書で記載される場合（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％または８６％）、そのリストは、その全ての中間値および小数値を含む（例えば、５４％、８５．４％）。従って、本技術は、代表的実施形態および選択肢的な特徴によって具体的に開示されてきたが、本明細書で開示される概念の改変およびバリエーションは、当業者によって求められ得るものであり、このような改変およびバリエーションは、この技術の範囲内にあると見做されることは、理解されるものとする。
【０５９７】
本技術のある特定の実施形態は、以下に続く特許請求の範囲に示される。
【図１】
2020120686.tif 000021
【図２】
2020120686.tif 000022
【図３Ａ】
2020120686.tif 000023
【図３Ｂ】
2020120686.tif 000024
【図４】
2020120686.tif 000025
【図５Ａ】
2020120686.tif 000026
【図５Ｂ】
2020120686.tif 000027
【図６Ａ】
2020120686.tif 000028
【図６Ｂ】
2020120686.tif 000029
【図７】
2020120686.tif 000030
【図８】
2020120686.tif 000031
【図９】
2020120686.tif 000032
【図１０】
2020120686.tif 000033
【図１１】
2020120686.tif 000034
【図１２】
2020120686.tif 000035
【図１３】
2020120686.tif 000036
【図１４】
2020120686.tif 000037
【図１５】
2020120686.tif 000038
【図１６】
2020120686.tif 000039
【図１７】
2020120686.tif 000040
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２ＡＢ】
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【図３２ＣＤ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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