(57)【要約】      （修正有）【課題】生物学的材料のマスキング剤として、ポリ（ピロリドン）大環系、オリゴマー及び低分子量ポリマーからなる組成物の提供。【解決手段】式（１）で表される、環状アミド、環状尿素、環状アミノアミド、又は環状アミノ尿素化合物を蛍光剤として含む組成物であって、式（Ｉ）の化合物は、２００〜３８５ｎｍでの励起後にその基本化合物の値の少なくとも１０倍、蛍光し、その発光が４００〜８５０ｎｍの可視近赤外領域にあり、ＱＨ２がそのような環状アミド等の残基を有さない組成物。2020063250.tif 000048（Ｑはピロリドン環に窒素原子を与える少なくとも１つの第一級アミンを含む化合物の残基；Ｒ２はＮＨ２等；ＷはＮ又は（ＣＨ２）ｎ；ｍは１〜４の整数；ｎは０又は１）【選択図】図１０
2020063250.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式：
【化１】
2020063250.tif 000044
[式中、
Ｑは、示されるように環に窒素を導入するために反応する第一級アミンを有する任意の実体であり；
Ｗは、Ｎ、Ｏ、Ｓ又は(ＣＨ２)ｎであり、ここでｎは０又は１であり；
Ｒ２は、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ; −Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ １−Ｃ４アルキル）; −Ｃ（Ｏ）−ＮＨＲ ５（ここで、Ｒ５は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、又はポリマー上の部分であり得るアミド基である）であり；そして
ｍは、１〜４である。]
で表される、蛍光性環状アミド、環状尿素、環状ウレタン及び環状アミノアミド又はアミド尿素化合物（但し、前記式（Ｉ）の化合物は、存在するそのような環状アミド、尿素、ウレタン又は環状アミド実体を有さないＱＨ２であるその基本化合物の値の少なくとも１０倍、蛍光する）。
【請求項２】
その発光が、４００−８５０ｎｍの可視近赤外領域にある、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
下記式：
【化２】
2020063250.tif 000045
[式中、
Ｑは、式（ＩＶ）の化合物中に窒素原子を導入するために反応する少なくとも１つの第一級アミンを有し、そしてピロリドン部分の一部になる任意の実体であり；
ｘは、１〜Ｑに存在する第一窒素の総数であり；
Ｒ２は、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ; −Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ １−Ｃ４アルキル）; −Ｃ（Ｏ）−ＮＨＲ ５（ここで、Ｒ５は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、又はポリマー上の部分であり得るアミド基である）であり；そして
但し、総ピロリドン部分は、１００ＫＤａ以下の分子量を有し、そして式（ＩＶ）の化合物は１５ｎｍ以下である。]
で表される化合物。
【請求項４】
インビボ生物学的注入及びイメージング用途のために適切である、固有蛍光（ＩＦ）、低毒性及び低補体活性化性質を示す、式（ＩＶ）のＭＷ調節されたピロリドン部分含有の式（ＩＶ）のポリマー組成物である、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
前記化合物が細胞に対して非免疫原性である、請求項１又は４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ２が、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル)又は−Ｃ（Ｏ）ＯＨである、請求項１又は３に記載の化合物。
【請求項７】
Ｗが(ＣＨ２)ｎ（ここで、ｎは１であり）;そしてｍは１である、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ｑが、アミン末端樹枝状ポリマー又はアミン末端デンドロンである、請求項１又は３に記載の化合物。
【請求項９】
Ｑが、(Ｃ１−Ｃ２０アルキル) アミン、 (Ｃ１−Ｃ２０ヒドロキシルアルキル) アミン、（Ｃ１−Ｃ２０ アルキルエーテル) アミン、Ｃ６−Ｃ１４ アリール又は (Ｃ６−Ｃ１４アリールＣ１−Ｃ４アルキル) アミンである、請求項１又は３に記載の化合物。
【請求項１０】
下記式（III）：
【化３】
2020063250.tif 000046
［式中、
Ｒは、Ｃ１−Ｃ１８アルキル、Ｃ６−Ｃ１２アリール、Ｃ６−Ｃ１２ アリーレン, (Ｃ１−Ｃ１２アルキル) Ｃ６−Ｃ１２アリーレンであり；そして
Ｘ＝Ｙは独立に、Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ２、 −ＳＨ、−ＣＯ２Ｈ、アルキン、アジド（すなわち、クリック試薬）、又は任意の適切な反応性部分／誘導体であり、それらは所望の／標的化された基質、例えばペプチド、タンパク質、抗体、酵素、ポリ核酸、薬物、ナノ粒子、微粒子、リポソーム、ミセル、デンドリマー、デンドロン、デンドリマーソーム（dendrimersomes）、医薬品、又は他の生物学的実体又はそれらのフラグメントへのピロリジン化試薬を結合するために必要とされる。］
を有する、活性化されたピロリジノン化試薬が製造される、請求項１又は３に記載の化合物。
【請求項１１】
−ＣＯ２Ｈの医薬的に許容できる塩及びエステルがまた含まれる、請求項１、４及び１０に記載の化合物。
【請求項１２】
蛍光により種々のシステム、試験、植物又は動物及びヒトにおける部分及び流体を追跡し、そして請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物を用いて蛍光により前記部分の位置をモニターするか、又は検出するための方法。
【請求項１３】
請求項４又は１０に記載の化合物を、ＰＥＧ化においてＰＥＧの代わりに使用する方法。
【請求項１４】
下記式：
【化４】
2020063250.tif 000047
[式中、
Ｑ及びＷは、請求項１の式（Ｉ）におけるように定義され；そしてｘは２又は３である]
の４〜１４の成分を有する蛍光大環状アミド。
【請求項１５】
蛍光により種々のシステム、試験、植物又は動物及びヒトにおける部分及び流体を追跡し、そして請求項１４に記載の式（II）の化合物を用いて蛍光により前記部分の位置をモニターするか、又は検出するための方法。
【請求項１６】
請求項３に記載の式（ＩＶ）の化合物の調製方法であって、請求項３に記載のＱと、任意にはメタノール中、ＩＴＡ、ＩＴＥ、又はＤＭＩの試薬とを、種々の第一級アミン部分と試薬との間の所望の化学量論比で、反応させ、ここで得られる式（ＩＶ）の化合物は、ピロリドン部分の１００ＫＤａ以下、好ましくは５０ＫＤａ以下の全分子量を有し、そして式（ＩＶ）の化合物のサイズが１５ｎｍ以下、好ましくは１０ｎｍ以下である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般的に、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を用いて得たものと同様に、生物学的材料のマスキング剤として、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）の誘導体／類似体、すなわちポリ（ピロリドン）大環系、オリゴマー及び低分子量ポリマーの使用に関する。さらに、小分子ピロリドン中間体（すなわち、モノマー前駆体）、及びそれらの誘導体から得られた新規なポリ（ピロリドン）オリゴマー/ポリマーは、従来の光化学及び蛍光パラダイムにより説明され得ない独特な固有蛍光（ＩＶ）又は非従来の蛍光（ＮＴＦ）特性を示す。それらの化合物、すなわちオリゴマー及びポリマーは、生物学的用途、細胞イメージング、遺伝子トランスフェクション、バイオセンシング、蛍光指向性外科的切除、薬物送達、法医学、鉱物／宝石の特徴付け、油田増強及び診断、偽造製品検出、流体／水流に関連するトレーサー研究、蛍光増白剤及びＬＥＤディスプレイの改良などのための薬物のマスキングに種々の用途を有する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の説明
ＰＥＧ化
ＰＥＧ化の一般的な概念は、血液循環時間、薬物溶解性及び治療のＰＫ／ＰＤを促進すると共に、治療薬物／タンパク質の毒性、免疫原性及びタンパク質分解を低める戦略として、１９７０年代、F. Davisなど（米国特許第４，１７９，３３７号（１９７９））により、最初に導入され、そして特許された。その戦略は、所望する治療薬物又は基質へのポリ（エチレングリコール）オリゴマー（すなわち、ＤＰ＝４−５０）の共有結合を包含する。ＰＥＧ化戦略は、次のものを包含する十数種の重要な薬物にわたって起動するための基礎を提供して来た：いくつか言及すると、癌治療に関しては、Ortho/Schering-Plough (2001)によるDixil／Caelyx（商標）、多発性硬化症に関しては、Biogen（２０１４）によるPlegridy（商標）、癌関連薬物に関しては、AstraZeneca（２０１４）によるMovantik（商標）、貧血に関してはAffmax Takeda Pharma, (2012)によるPeginesatide（商標）。この戦略は、いわゆる、下記に記載されるような「活性化されたＰＥＧ試薬」を用いての低分子量ＰＥＧオリゴマー（すなわち、＜５０−７０ＫＤａ）の共有結合を包含する：
【０００３】
【化１】
2020063250.tif 000003
【０００４】
ここで、Ｘ及びＹは、独立に、改変される所望のタンパク質、ポリヌクレオチド又は治療薬が有する官能基と反応性であるか、又は非反応性であり得；ｎは４−５０である。
【０００５】
ＰＯＸ化
ＰＥＧオリゴマーの化学的性質（すなわち、酸化的、酵素的安定性又は慢性的使用による免疫原性問題及びより高いＭＷ画分による）に関連する多くの欠点のために（G.T. Hermanson, Chapter 18 in Bioconjugate Techniques, Second Ed., (2008) 707-742）、代わりのポリマー型及び組成物について積極的に探究して来た。これは、ＰＥＧの代替物としてのポリ（オキサゾリン）の有用性及び潜在的利点を記載する、Zalipsky et al. (S. Zalipsky, et al., J. Pharm. Sci., (1996), 85, 133-137を参照のこと)による初期報告につながった。つい最近では、研究者は、ポリ（オキサゾリン（F. M. Veronese, et al., Bioconjugate Chem., (2011), 22, 976-986）、及びSerina Therapeutics（www.serinatherapeutics.com）によるパーキンソン病の治療のためにロチゴチン（すなわち、ドーパミンアゴニスト）のＰＯＸ化結合の使用に焦点を当てて来た。従って、それらのＰＯＸ化プロトコルは、下記のようなそれらの治療薬物／タンパク質への結合のための「活性化されたＰＯＸ試薬」の使用を包含する：
【０００６】
【化２】
2020063250.tif 000004
【０００７】
ここで、Ｘ及びＹは、独立に、改変される所望のタンパク質、ポリヌクレオチド又は治療薬が有する官能基と反応性であるか、又は非反応性であり得；ｎは４−５０である。
【０００８】
ヒトへの注射可能合成ポリマーとしてのポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）の従来の使用
従来、ヒトにおける内部注射のために使用される、最も広範囲に研究され／文書化されたポリマー組成物は、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）であった。７５年以上の間、１９３０年代、後期におけるその発見以来、このポリマーは、非常に好結果をもたらす代用血液／増量剤として使用のために有害な毒性、免疫原性又は他の負の効果を事実上伴わないで、５０万人以上のヒト患者に注入されて来た（Sultana, et al., J. Pakistan Med. Association, (1978), 28 (10), 147-153）。この合成ポリマー組成物を注射剤として使用するより広範囲で且つ現代的なヒト使用は、より高分子量のポリマー画分（すなわち＞７０ＫＤａ）が腎臓を通して適切に排泄されず、そして複数回の注射でインビボで長時間にわたって蓄積され得る。この仮説は、いくつかの十分に文書化された医薬研究により確認されているように思える（Wang et al., J. Cutan Pathol., 2006, 33, 454-457）。創造される特定の医学的状態は、ＰＶＰ蓄積疾患又はDupont-Lachapella疾患として言及される。この医学的状態は、現在入手できるポリ（ピロリドン）製品中に存在する、非排泄性の高分子量ＰＶＰ画分に起因すると広く認識されている。この医学的状態は致命的ではないが、より高分子量ＰＶＰ画分は除去するのには不可能ではないが、困難であることが判明しているので、ＰＶＰにとって負の特徴であると考えられ（Pfirrmann et al., 米国特許第6,080,397号, 2000）、そして将来の使用のために重要な科学的解決策又は代用物を必要とするであろう。
【０００９】
現在、ＰＶＰポリマーは、種々の製造業者、例えばＢＡＳＦにより多量に商業的に製造されている。ＰＶＰ製造は、Ｎ−ビニルピロリドンモノマー（Ｎ−ＶＰ）のフリーラジカル重合を包含する。Ｎ−ＶＰポリマーは、高圧下で、アセチレン、ホルムアルデヒド及びアンモニアの組み合わせを含むオリジナルReppe工程により得られる（下記スキーム１を参照のこと）。
【００１０】
スキーム１
【化３】
2020063250.tif 000005
【００１１】
（Ｎ−ＶＰ）モノマーは、フリーラジカル触媒（すなわち、過酸化物、過流酸塩）のみで、バルク、溶液又は懸濁液中で都合良く重合され、２５００−１，０００，０００Ｄａの範囲の重量平均モル質量を有する線状ＰＶＰが得られる（Haaf et al.Polymer Journal, 1985, 17(1), 143-152を参照のこと）。それらの線状ＰＶＰポリマーは一般的に、高いポリ分散化された生成物として得られ、そしてＭｗ、Ｍｎ及びＫ（ここで、Mw＝１５K２/３ 及びMn ＝ ２４K2）の関係を用いて、Kern and Cherdron (Kern et al., Houben Weyl, Methoden der Organische Chemie, Vol. 14, 4th ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1961, p.1106)により開発された「Fikentscher Ｋ値分子量関係」に従って、溶液でのそれらの粘度を測定することにより特徴づけられた。適切な数の文字Ｋを用いて、種々のＰＶＰ分子量画分についての分子量を関連付けた。例えば、Ｋ−１２は、約２０，０００Ｄａの平均分子量を有し、そしてＫ−９０は、約１Ｍ  Ｄａの分子量を有する。従って、特定されたＫ値及び平均分子量を有するＰＶＰは、ある範囲の分子サイズから成る。それらの粘度特徴化プロトコルに基づいて、明確に定義された分子量範囲のみでは、ＰＶＰのための十分に規定された制御可能な分子量は現在、存在しないことは明らかである。ナノスケールのサイズに関連するＰＶＰポリマー分子量の制御は、多くのナノ医学用途にとって重要な問題であり、ここでナノスケールサイズは、排泄モード、生体分布、毒物学及び補体活性化特性を決定することが知られている（例えば、Kannan et al., J. Intern. Med. 2014, 276, 579-617を参照のこと）。
【００１２】
ＰＶＰに見られるようなポロリドン部分（すなわち、ポビドン、ＢＡＳＦの商標）は、多種多様な医学的用途のための多目的の非毒性、生体適合性、生理学的に不活性な材料としての優れた記録及び普遍的な認識を享受する（Haaf et al., Polymer Journal, 1985, 17(1), 143-152を参照のこと）。第１に、血漿増量剤としてのＰＶＰの広範なインビボ使用が存在し（Sultana, et al., J. Pakistan Med. Association, 1978, 25, 28,(10), 147-153を参照のこと）；ここで、それは、間違いなく無数の命を救って来た。第二次世界大戦中に（すなわち、Ｉ．Ｇ．により開始され；現在、ＢＡＳＦによるピロビドン）、及びその後の年（朝鮮戦争）http:/hcvets.com/data/military/korea.htm; page 44]（スウェーデンでは、ペリストンと呼ばれる）、有害な効果の何れの重大な証拠もなしに（Ravin et al., New England J. of Med., 1952, 247, 921-929）、ＰＶＰが血液増量剤として、５０万以上のヒト受容体に注射により内部的に使用されて来たことが実証されている（Sultana, et al., J. Pakistan Med. Association, 1978, 28, (10), 30, 147-153）。放射性研究は、注射されたＰＶＰ（すなわち、ペリストン）の９５−１００％が、７２時間以内に尿を通して排泄され；その４０％が２０分以内に排泄され；そして６時間以内に、実質的にすべての循環ＰＶＰは、血漿から消失したことを示した。続く研究は、（ＰＶＰ）組成物が、他の合成（すなわち、ポリエステル／ポリアルコール）又は生物学的ポリマー（すなわち、ポリ（デキストラン）又は多糖類）に比較して、抗原特性を実質的に示さないことを示した（Maurer et al., J. Immunology, 1956, 77(2), 105-110）。
【００１３】
現在、（ＰＶＰ）は、体外受精プロトコルのために精子を固定化するためのアジュバントとして使用されている（www.coopersurgical.com）。他の例は、化粧品（例えば、ヘアスプレー）が点眼剤及び経口ピル結合剤に及び用途におけるＰＶＰの使用を包含する。ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーの表面上に提示される場合、タンパク質とポリ(ピロリドン)部分との低毒性及び最小相互作用の最近の確認が報告されている（Ciolkowski et al., Nanomedicine, NBM, 2012, 8, 815-817; 及びJanaszewska et al., Nanomedicine, NBM, 2013, 9, 461-464）。
【００１４】
このように、３−１４ＫＤの範囲でＰＶＰ分子量を合成／制御することが極めて重要である（Pfirrmann et al., U.S. Patent 6,080,397, 2000）。これは、より高いＭＷ ＰＶＰ画分のインビボ蓄積を回避し、そしてインビボ適用のための注射用製品として許容できるためには必要である。不運には、ＰＶＰポリマーを製造するためにＮ−ビニルピロリドンを増大するための全ての既知重合機構（すなわち、フリーラジカル、アニオン、カチオン型）は、実質的な量の制御されていない高分子量（すなわち、＞１４ＫＤａ）をもたらす。ＰＶＰ製品、並びに、それらの材料を、インビボ又は注射可能な製品用途のために許容できなくする重合複製品が挙げられる。より特定には、高分子量画分（すなわち、＞１４ＫＤａ）を含むＰＶＰが静脈内投与される場合、そのポリマーのインビボ蓄積が生じ、これは、「ＰＶＰ貯蔵疾患」と呼ばれるか、又はDupont-Lachapelle疾患（Wang et al., J. Cutan Pathol., 2006, 33, 454-457）としても知られている。この疾患は、皮膚病、リウマチ性関節痛、及び肺呼吸不全を包含する症状により特徴づけられる。他方では、＜１４ＫＤａの分子量及び１７以下のＫ値を有する低分子量ＰＶＰは、非アレルギー性であることが見出され、そして腎臓を通して血流からの排泄により未変化のまま、すばやく除去される。しかしながら、フリーラジカル重合及び続く限外濾過により低ＭＷのＰＶＰを独占的に製造するすべての試みは失敗した（Pfirrmann et al., 米国特許第6,080,397号, 2000;www.rloginconsulting.com/... pyrrolidone%20backbone%20polymers.pdf）。
【００１５】
蛍光の論議
基底状態（Ｓ０）での原子、分子、ポリマー又はナノ構造体の軌道電子が、何れかの形のエネルギー（すなわち、通常、光子、ｈＶｅｔ）の吸収により高い量子状態（Ｓ１）に励起され、そして次に、基底状態に戻る場合に蛍光が発生する（図１を参照のこと）。この二段階工程は次の通りに記載される：
１．励起：（Ｓｏ）＋ｈＶｅｘ→（Ｓ１）
２．蛍光（発光）：（Ｓ１）→（Ｓｏ）＋ｈｖｅｍ＋熱
【００１６】
基底状態へのこの緩和又はリターン[すなわち、（Ｓ１）→（Ｓｏ）]は、蛍光と呼ばれる、光の底エネルギー光子の放出（ｈｖｅｍ）を伴う（図１を参考のこと）。（The Molecular Probes Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 2010, 11th Ed.）。
【００１７】
（Ｓ１）状態でのフルオロフォアは、放射放出（すなわち、蛍光）、非放射イベント（すなわち、熱）、又は１０−１０〜１０−９秒の程度の時間スケールで非蛍光トリプレット励起状態（Ｔ１）への内部システム間転換（IC）（すなわち、システム間クロスオーバー（ＩＳＣ））を包含する緩和経路を介して基底状態（Ｓ０）に戻ることができる。
【００１８】
それらの（Ｔ１）種は、分子酸素に対して非常に敏感であり、そしてレドックス反応を受け、高反応性スーパーオキシドラジカル（ＲＯＳ）及び「光退色」と呼ばれる不可逆的フルオロフォア損傷を導く（Q. Zheng, et al., Chem. Soc. Rev., 2014, 43, 1044- 1056）。それらの高反応性酸素種（ＲＯＳ）は、フルオロフォア分解を引起すか、又は近くの生体分子と反応することにより光毒性を引起すことがあり、そして実際、ナノ医薬に用いられるいわゆる光力学療法の中心である。
【００１９】
励起に続く振動緩和のために、（Ｓ１）から放出される光子エネルギーは一般的に、励起光子よりも低いであろう。これは、励起波長よりも５−５０ｎｍ高い範囲である蛍光発光波長の増加をもたらす。励起波長と発光波長との間の差異は、ストークスシフト（Stokes shift）と呼ばれる（N.J. Turro et al., Modern Molecular Photochemistry of Organic Molecules, 2010 University Science Books, The Molecular Probes Handbook -A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 2010, 11th Ed.）。
【００２０】
蛍光イメージング技法は、生命科学及び臨床研究に広い用途を有する。しかしながら、それらの技法は、明るく且つ光安定性の蛍光プローブに決定的に依存している。生物学的イメージングのための現在入手できる蛍光プローブは主に、有機フルオロフォア（Terai and Nagano, Pflugers Archiv. European J. Physiology, 2013, 465, 347-359）及び量子ドット（Chen et al., Trends Analytical Chemistry, 2014, 58, 120-129）を含む。小さな有機色素は、いくつかの所望しない特性、例えば難溶性、所望の細胞区画を標的化する問題、急速な不可逆的光退色及び細胞漏出に悩まされている。無機ナノコンジュゲート、例えば量子ドットは、例外的に明るく、光安定性であり、そして狭い発光スペクトルにより特徴づけられるが、しかしそれらは重要な欠点を有する。まず第１に、それらは毒性であり、そしてインビボでのその適用を制限している。さらに、それらの細胞内送達は、いくつかの生物学的工程に従うことを困難にする問題を引き起こす（Jamieson et al., Biomaterials, 2007; 28, 4717-4732）。
【００２１】
生物学的及びナノ医薬の分野における蛍光は、細胞イメージング、バイオセンシング、蛍光指向性外科的切除（R. Tsien et al., Proc. of the National Acad. of Sci., 2010, 107, 4317-4322）、及び薬物送達（S. Lo, et al., Mol. Pharmaceutics, 2013, 10,793-812; R. Tsien et al., Proc. of the National Acad. of Sci. 2010, 107, 4311-4316）へのそれらの広い適用のために、主な研究焦点となって来た。
【００２２】
生物学／医学用途以外の蛍光の用途は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：法医学（M.Y. Berezin et al., Chem. Reviews, 2010, 110, 2641-2684）；油田の強化及び診断（M. Amanullah, 2013, SPE164162）；偽造品の検出（2014年５月２７日に発行された米国特許第8,735,852号; Y. Zhang et al., Dyes Pigm., 2008, 77, 545）；流体／水流に関するトレーサー研究（国際公開第2011/030313号, A method for detecting an analyte, Indian Inst. of Science , March 17, 2011）；蛍光増白剤；及びＬＥＤディスプレイの強化（米国特許出願第20140035960号, Apple Inc.）及び他のもの。
【００２３】
従来の標準蛍光剤は通常、次の３つの主要カテゴリーのメンバーであると記載されている：
【００２４】
カテゴリーＩは、低分子量（＜１０００ｄａ）の小分子を含む有機芳香族結合ポリマーであり、そしてそれらの結合された有機芳香族構造から誘導される。
【００２５】
カテゴリーIIは、通常、１又は２以上の３種のキー芳香族部分、例えばトリプトファン、チロシン及び／又はフェニルアラニンを含む蛍光タンパク質から成る。
【００２６】
カテゴリーIIIは、カドニウム又は鉛カルコゲナイド、例えばボーア励起子又は半径（２−５０ｎｍ）よりも小さなサイズを有しなければならない重金属硫化物又はセレニドから誘導される無機ナノ粒子から成る。それらの蛍光は、それらのサイズにより決定されるが、しかし光退色の弱点を示さない。
【００２７】
各従来のフルオロフォアカテゴリーの弱点は、次の通りである：カテゴリーＩ：光退色と呼ばれる急速なフルオロフォア分解に導く酸素の存在下での堅牢性の欠如、及び細胞損傷及び可能性ある発癌性を引起すことができる活性酸素種（ＲＯＳ）の生成に起因する光毒性；カテゴリーII：変性し、光退色と呼ばれる急速分解を導く酸素の存在下で堅牢性を欠き、免疫原性を示すタンパク質；カテゴリーIII：量子ドットは、重金属毒性、蛍光点滅、インビボ適用のための溶解性の欠如を示し、サイズはナノメートルで且つ正確なサイズ（２−５０ｎｍ）でなければならない。
【００２８】
他方では、本発明の重要成分であるピロリドン部分は、多種多様な医療用途のための多目的性で非毒性の生体適合性材料としての卓越した記録的及び国際的認識を有する。最も重要なことは、インビボ血液増量剤としてのポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）の広範な使用であった（Polyvinyl Pyrrolidone as a Plasma Expander -Studies on Its Excretion, Distribution and Metabolism, Herbert A. Ravin, Arnold M. Seligman, M.D., and Jacob Fine, M.D.）。第二次世界大戦以来、それは、有害な影響の証拠なしに、５０万人以上のヒト受容体に使用されて来た（H.A. Ravin, N. Engl. J. Med., 1952, 247, 921-929）。
【００２９】
別の特徴においては、樹枝状ポリマーが当核技術分野において公知であり、そしてDENDRIMERS, DENDRONS, AND DENDRITIC POLYMERS, Tomalia, D.A., Christensen, J.B. and Boas, U. (2012) Cambridge University Press, New York, N.Y.に広範に論じられている。樹枝状ポリマーは、第４のごく最近報告されたポリマー構造の主要クラスとして認識されている（J. Polym. Science, Part A: Polym. Chem. 2002, 40, 2719-2728）。
【００３０】
デンドリマーの３つの主要構造成分、すなわちコア、内部組成物、及びそれらの表面化学が容易に修飾され得る。現在、多数の多様なコア、ほぼ１００の異なった内部組成物及び１０００以上の異なった表面部分がデンドリマーについて報告されている[例えば、DENDRIMERS, DENDRONS,AND DENDRITIC POLYMERS, Tomalia, D.A., Christensen, J.B. and Boas, U. (2012) Cambridge University Press, New York, N.Y.]。多くの場合、デンドリマー表面の修飾は、新しい出現特性を変更し、増強し、又は得るために、例えば従来のフルオロフォア、例えばフルオロセイン、ローダミンレッド又はシアニン色素を包含する、薬物、標的化又はイメージング剤の結合のために、デンドリマー毒性を修飾し／低めるために、増強された溶解性を得るために、デンドリマータンパク質相互作用／免疫原性（すなわち、デンドリマーステルス）を低めるために、行われて来た。それらの表面化学増強デンドリマー特性の多くは、種々の生命科学及びナノ医薬用途において非常に貴重であることが示されて来た（例えば、米国特許第５，５２７，５２４号）。
【００３１】
２００１年初期、ポリ（アミノアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーが、何れか既知の従来の蛍光パラダイムにより機械的に説明され得なかった固有の蛍光特性を示すために、Tucker et al., (S. Tucker et al., Applied Spectroscopy, 2001, 55, 679-683)により報告されている。デンドリマーに観察される、この新規の非従来の蛍光（ＮＴＦ）は一般的に、２５０−４００ｎｍ間に励起放射線を必要として、続いて可視領域から近赤外領域（すなわち、４００−７５０ｎｍ）に及ぶ特徴的な発光バンドを生成するために、基底状態に緩和する。
【００３２】
この初期報告以来、ＮＴＦ現象は、広範囲の異なったデンドリマーファミリー（すなわち、内部組成物）に観察されており、これらのすべては共通して１つのものを有するように見え、すなわちそれらはそれらの内部骨格組成に多数の第三級アミン（３°−アミン）及び／又はアミドを有する。デンドリマー末端／表面官能基は（ＮＴＦ）に有意に影響を与えないようであることは注目すべきであり；しかしながら、デンドリマー生成レベル(G. Jayamurugan et al., Org. Lett., 2008, 10, 9-12)、デンドリマー凝集度(P.K. Antharjanam et al., J. Photochemistry & Photobiology A: Chem., 2009, 203, 50-55)、溶剤粘度(P.K. Antharjanam et al., J. Photochemistry & Photobiology A: Chem., 2009, 203, 50-55)、低pH's (T. Imae et al., J. Am. Chem. Soc., 2004, 126, 13204-13205; L. Pastor-Perez et al., Macromol Rapid Commun., 2007, 28,1404-1409; Y. Wang et al., J. Nanosci. Nanotechnol., 2010, 10, 4227-4233; Y. Shen et al., Chem. Eur. J., 2011, 17, 5319-5326)、エージング(D. Wang et al., J. Colloid & Interface Science, 2007, 306, 222-227)、空気又は酸化剤への暴露(A.J. Bard et al., J. Am. Chem. Soc., 2004, 126, 8358-8359; T. Imae et al., Colloids & Surfaces B: Biointerfaces, 2011, 83, 58-60)、及びさらにいくつかの他のものは、蛍光強度の増強を引起した。初期のより秩序のある、単分散性のデンドリマーの例に加えて、（ＮＴＦ）現象は続いて、以下を含むいくつかの他の主要高分子構造において観察された：（ａ）ランダムに超分岐されたポリマー構造（Y. Chen et al., Bioconjugate Chem., 2011, 22, 1162-1170）、（ｂ）直鎖状態ポリマー構造（L. Pastor-Perez et al., Macromol Rapid Commun., 2007, 28, 1404-1409）、及び（ｃ）特定の単純分岐ポリマー構造（S.-W. Kuo et al., J. of Nanomaterials, 2012, 749732, 10 Pages）。生物学的細胞又は標識をイメージングするためのそれらのユニークデンドリマー（ＮＴＦ）特性を利用する多くの試みにも関わらず、低（ＮＴＦ）蛍光発光強度は一般的に、特定の用途、例えば遺伝子トランスフェクションのための適切な発光強度を得るために、特定の酸化試薬／環境の存在下で又は低ｐＨ（すなわち、２−３）を除いて、実用的な使用を妨げている（Y. Chen et al., Bioconjugate Chem., 2011, 22, 1162-1170）。
【００３３】
デンドリマー（多くの表面官能基を有する、多目的、球状、単分散性ポリマー）の適用は、単一の有機フルオロフォア及び無機ナノ粒子の両者の限界を克服するのに助けとなる解決策であると思われる。デンドリマーのサイズは、蛍光タンパク質と同じスケール上にそれらを置き：それらは有機色素よりも大きく、そして量子ドットよりも小さい。
【００３４】
デンドリマーは、フルオロフォアの足場として使用されて来た。ＰＥＧ鏡を有するＧ２ ＰＡＭＡＭデンドリマーは、次の２つのタイプのフルオロフォアにより官能化されており：カルボキシフルオレセイン及びテトラメチル−ローダミン、そしてチャイニーズハムスター卵巣細胞において試験されている（Albertazzi et al., PloS ONE, 2011, 6, e28450. doi:l0.1371/journal.pone.0028450）。高次生成のＧ５及びＧ６ＰＡＭＡＭデンドリマーが、複数のシアニン色素により結合されている（Kim et al., Biophys. J., 2013, 104, 1566-1575）。多くの場合、デンドリマーの表面上の蛍光標識の共有結合が、インビトロ又はインビボでのその生物学的機能を評価するために必要である。しかしながら、そのような修飾は、低められたデンドリマー生体適合性のリスクを創造し、そしてその生体分布特性に影響を及ぼす。そのために、本質的に蛍光デンドリマーの探索が最も重要である。
【００３５】
明確に、底毒性で、所望する波長及び強度の蛍光を表示する生体適合性化合物を有する場合、意図される用途に商業的に適用される。
【発明の概要】
【００３６】
発明の簡単な概要
本発明は、下記式：
【００３７】
【化４】
2020063250.tif 000006
【００３８】
[式中、
Ｑは、示されるように環に窒素を導入するために反応する第一級アミンを有する任意の実体であり；
Ｗは、Ｎ、Ｏ、Ｓ又は(ＣＨ２)ｎであり、ここでｎは０又は１であり；
Ｒ２は、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ; −Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ １−Ｃ４アルキル）; −Ｃ（Ｏ）−ＮＨＲ ５（ここで、Ｒ５は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、又はポリマー上の部分であり得るアミド基である）であり；そして
ｍは、１〜４である]で表される、蛍光性環状アミド、環状尿素、環状ウレタン及び環状アミノアミド又はアミド尿素化合物を提供し、但し、前記式（Ｉ）の化合物は、存在するそのような環状アミド、尿素、ウレタン又は環状アミド実体を有さないＱＨ２であるその基本化合物の値の少なくとも１０倍、蛍光する。
【００３９】
その発光が４００−８５０ｎｍの可視近赤外領域にあり、そして細胞に対して非免疫原性である、式（Ｉ）の化合物。
【００４０】
式（Ｉ）の好ましい化合物は、Ｒ２が、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル)又は−Ｃ（Ｏ）ＯＨであり、特にここでアルキルはメチルであり；Ｗが(ＣＨ２)ｎ（ここで、ｎは１である）であり；そしてｍが１であり、特に好ましくは、Ｑがアミン末端樹枝状ポリマー又はアミン末端デンドロンであるそれらの化合物である。Ｑ中のいくつかのアミンは、(Ｃ１−Ｃ２０アルキル) アミン、 (Ｃ １−Ｃ２０ヒドロキシルアルキル) アミン、(Ｃ１−Ｃ２０ アルキルエーテル) アミン、Ｃ６−Ｃ１４アリール又は(Ｃ６−Ｃ１４アリールＣ１−Ｃ４ アルキル) アミンである。
【００４１】
式（Ｉ）の化合物は、蛍光により種々のシステム、試験、植物又はヒトにおける部分及び流体を追跡し、そしてその蛍光により前記部分の位置をモニターするか、又は検出する方法に使用される。従って、それらの化合物は、トレーサー、バイオセンサー、又はイメージング剤として作用し、光退色を妨げるか、又はＬＥＤディスピレイを増強することができる。
下記式：
【００４２】
【化５】
2020063250.tif 000007
【００４３】
[式中、Ｑ及びＷは、上記式（Ｉ）のように定義され；そしてｘは２又は３である]で表される、４〜１４の成分を有する追加の蛍光大環状アミド。
【００４４】
式（II）のそれらの化合物は、蛍光により種々のシステム、試験、植物又はヒトにおける部分及び流体を追跡し、そしてその蛍光により前記部分の位置をモニターするか、又は検出する方法に使用され得る。
【００４５】
同様に、式（II）のそれらの化合物は、トレーサー、バイオセンサー、標識剤、非生物センサー又はイメージング剤として使用され：光退色を妨げるか又はＬＥＤディスプレイを増強することができる。
【００４６】
式（Ｉ）における適切なＱ部分であるいくつかの第一級アミンは、Ｘ−Ｚ−Ｎ−であり、ここでＸは、−ＮＨ２、−ＯＨ、又は−Ｃ（Ｏ）ＯＨであり、そしてＺは、次のものである：(Ｃ１−Ｃ１８アルキル)、 (Ｃ６−Ｃ１２)アリール、 (Ｃ６−Ｃ１２) アリーレン、 又は(Ｃ６−Ｃ１２) アルキルアリーレン、 例えば (Ｃ１−Ｃ２０ アルキル)アミン; (Ｃ１−Ｃ２０ヒドロキシルアルキル)アミン; (Ｃ１−Ｃ２０アルキル) エーテルアミン; ベンジルアミン、又は下記式：
【００４７】
【化６】
2020063250.tif 000008
【００４８】
[式中、Ｒ２は−ＮＨ２、−ＯＨ又は−Ｃ（Ｏ）ＯＨであり、そしてＲ３及びＲ４は独立に、−Ｈ又はＣ１−Ｃ４アルキル又は−ＣＨ２ＯＨである]；その表面上に第一級アミンを有する、デンドリマー、デンドロン又は樹枝状ポリマー；環化される場合、蛍光ミセルをもたらす両親媒性界面活性剤を形成することができる、第一級アミンを有する脂肪／親油性実体、第一級アミン又は一般的アミン酸、例えばリシン、グリシン、トリプトファン、チロシン及び／又はフェニルアラニンの何れかを有するタンパク質。
【００４９】
式（Ｉ）実体において適切なＱ部分である第一級アミンは、（１）小有機分子、（２）４つの主要ポリマー構造型、例えば線状、架橋された、分岐及び樹枝状ポリマー型の何れかに由来する、オリゴマー及びポリマー（DENDRIMERS, DENDRONS, AND DENDRITIC POLYMERS, Tomalia, D.A., Christensen, J.B. and Boas, U. (2012) Cambridge University Press, New York, N.Y.）（両有機及び無機組成物（すなわち、シリカ、無機酸化物、金属カルコゲナイド、フラーレン、等）を含む）、又は（３）(Chapter 8, DENDRIMERS, DENDRONS, AND DENDRITIC POLYMERS, Tomalia, D.A., Christensen, J.B. and Boas, U. (2012) Cambridge University Press, New York, N.Y.)に記載されるような、定義されたソフト又はハードナノ要素（すなわち、ナノ粒子）の何れかにより提示され得る。
【００５０】
本発明はまた、下記式（III）：
【００５１】
【化７】
2020063250.tif 000009
【００５２】
［式中、
Ｒは、Ｃ１−Ｃ１８アルキル、Ｃ６−Ｃ１２アリール、Ｃ６−Ｃ１２ アリーレン, (Ｃ１−Ｃ１２アルキル) Ｃ６−Ｃ１２アリーレンであり；そして
Ｘ＝Ｙは独立に、Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ２、 −ＳＨ、−ＣＯ２Ｈ、アルキン、アジド（すなわち、クリック試薬）、又は任意の適切な反応性部分／誘導体であり、それらは所望の／標的化された基質、例えばペプチド、タンパク質、抗体、酵素、ポリ核酸、薬物、ナノ粒子、微粒子、リポソーム、ミセル、デンドリマー、デンドロン、デンドリマーソーム（dendrimersomes）、医薬品、又は他の生物学的実体又はそれらのフラグメントへのピロリジン化試薬を結合するために必要とされる］を有する、活性化されたピロリジノン化試薬が製造されるにも関する。
【００５３】
このリストに限定されないが、実証された小分子アミンの多くは、図３Ａ及びＢに示されている。言及され得る他のものは、(Ｃ１−Ｃ２０アルキル)アミン、 (Ｃ１−Ｃ２０ヒドロキシルアルキル) アミン、(Ｃ１−Ｃ２０アルキエーテル ) アミン、(Ｃ６−Ｃ１８アリール) アミン、又は(Ｃ７−Ｃ２１アリールアルキル) アミンを包含する。広範囲の化学的表面、基質、種々の巨視的表面、例えばシリカ、金属、歯科用エナメル、綿、羊毛、食品、布、ガラス及び他のものへの、それらの非従来の固有フルオロフォア（ＮＴＩＦ）構造の化学的結合、キレート化、会合、又は吸着を可能にするであろう、適切な結合及び封鎖（すなわち、キレート化）機能を、それらのＱ実体が有することが、すべての場合において所望される。
【００５４】
それらの反応のいくつかは、また本発明の一部である大環状蛍光アミドを形成することができる。前記環のサイズは、４〜１４個の成分を有し、そして表２に示されるように、式（Ｉ）のそれらの化合物について記載される有用性を依然として提供する。大環状化合物は、下記式：
【００５５】
【化８】
2020063250.tif 000010
【００５６】
[式中、Ｑ及びＷは、式（Ｉ）の通りに定義され；そしてｘは２又は３である]を有する。
【００５７】
それらの環は、下記式：
【００５８】
【化９】
2020063250.tif 000011
【００５９】
[式中、Ｒ５はＣ１−Ｃ４アルキルであり；Ｒ３及びＲ４は、上記で定義された通りである]の化合物と、ＥＤＡ、ＤＥＴＡ、ＴＥＴＡ等とを反応せしめる一般的工程から形成される。図２を参照のこと。理論に縛られることは望ましくないが、１４員の環が、下記式：
【００６０】
【化１０】
2020063250.tif 000012
【００６１】
の可能な式を有する実施例１８及び２３の、下記式：
【００６２】
【化１１】
2020063250.tif 000013
【００６３】
の式を有する実施例５、１５及び２９の工程の間、形成すると思われる。
【００６４】
ＥＤＡが２当量のジメチルイタコネーと反応させると、蛍光を発するダイマーが形成される。しかし、１当量のジメチルイタコネートがＥＤＡと反応される場合、蛍光を発するポリマーが形成される。従って、その状態に依存して、得られるフルオロフォアのサイズが制御され得る。
【００６５】
従って、種々の環にアミド基を有する大環状アミド及びポリマーが、使用のための特性、所望の蛍光強度、及び得られる青色から近赤外に至る発光波長に依存して、製造され、そして使用される。
【００６６】
式（Ｉ）のそれらの化合物は、細胞イメージング、バイオセンシング、蛍光指向性外科的切除及び薬物送達のための医学におけるトレーサーとして使用される。生物学／医学用途以外の用途は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：法医学; ミネラル/宝石の特徴付け; 油田の強化及び診断、偽造品の検出、 液体/水流に関するトレーサー研究; 光退色の防止; LEDディスプレイの強化。従って、本発明は、式（Ｉ）の化合物を用いて、部分及び流体を追跡し、そして蛍光によりそのような検出のためのシステムにおける位置をモニターする方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は、基底状態の化合物のエネルギーを上昇させた状態での励起を示し、そして蛍光発光により基底状態に戻る。
【図２】図２は、末端複素環式デンドリマーを調製するための概略的工程を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、表２に番号付けされている例の化合物の化学構造を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、表２に番号付けされている例の化合物の化学構造を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、表２に番号付けされている例の化合物の化学構造を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、表２に番号付けされている例の化合物の化学構造を示す。
【図４】図４は、表２に示される比較例の化学構造を示す。
【図５】図５は、５、１５、３０分、１、１．５、２、３、４、５、６、２４及び４８時間のインキュベーションの後、ｍＨｉｐｐｏＥ−１８（青菱形）、ＢＲＬ−３Ａ（赤い丸）及びＢ−１４（緑の三角）細胞による、１００μＭの濃度でのＧ４−ＰＡＭＡＭ−ピロリドンデンドリマーの細胞摂取のデータをグラフで示す。
【図６】図６は、１００μＭのＰＡＭＡＭ−ピロリドンデンドリマーにより２４時間、処理された、Ｂ１４、ＢＲＬ−３Ａ及びｍＨｉｐｐｏＥ−１８細胞の共焦点画像を示す。（Ａ）未洗浄で且つ非固定の細胞の固有デンドリマー蛍光。（Ｂ）デンドリマー蓄積８青色チャネル）の後、細胞をＰＢＳによりすすぎ、そして染色し、細胞核（赤色チャネル）及び原形質膜（緑色チャネル）を可視化した。イメージングの前、細胞をホルムアルデヒドにより固定した。
【図７】図７は、５、１５、３０分、１、１．５、２、３、４、５、６、２４及び４８時間のインキュベーションの後、ｍＨｉｐｐｏＥ−１８（青菱形）、ＢＲＬ−３Ａ（赤い丸）及びＢ−１４（緑の三角）細胞による、１００μＭの濃度でのＧ４−ＰＡＭＡＭ−ピロリドンデンドリマーの細胞流出のデータをグラフで示す。
【図８】図８は、ランダムＰＡＭＡＭ ＰｙｒＡｍメガマーの構造を示す。
【図９】図９は、ピロリドン部分を有するシェル試薬により被覆されたデンドリマーの構造を示す。
【図１０】図１０は、ＰＡＭＡデンドリマーと本発明のピロリドンとの間の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
発明の詳細な説明
本明細書において使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定することを意図するものではないことが理解される。本明細書において使用される場合、単数形「ａ」、「an」及び「ｔｈｅ」は、特にことわらない限り、複数の指示対象を含む。本出願で使用される用語集における以下の用語は、以下に述べるように定義され、これらの用語に関しては、単数及び複数を含む。
【００６９】
種々の見出しが、読者を助けるために存在するが、しかしその参照される主題の全ての側面の非他的な場所ではなく、そしてそのような議論の場所を限定するものとしては解釈されるべきではない。
【００７０】
また、特定の米国特許及びＰＣＴ公開出願は、参照により組込まれている。しかしながら、そのような特許のテキストは、そのようなテキストと、本明細書に記載される他の記述との間に矛盾がない限り、参照によってのみ組み込まれる。そのような矛盾が生じた場合、そのような米国特許及びＰＣＴ出願により組込まれているそのような矛盾するテキストは、特にこの特許には組み込まれていない。
【００７１】
用語集
本出願に使用されるような以下の用語は、以下に述べられるように定義され、そしてそれらの用語に関しては、単数は複数を含む。太字フォントは、この定義を満たす必要はないが、しかしこのリストにおける用語の意味を容易に見出すことができる。
AEEA は、N−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミンを意味する。
AEP は、１−（２−アミノエチル）ピペラジンを意味する。
Alkyl は、特にことわらない限り、直鎖及び分枝鎖部分を意味する。
BOCは、tert-ブトキシカルボニルを意味する。
BSAは、ウシ血清アルブミンを意味する。
4-CP-PAMAMは、４−カルボメトキシピロリドン末端PAMAMデンドリマーを意味する。
Daは、ダルトンを意味する。
DABは、１，４−ジアミノブタンを意味する。
DABCOは、１，４−ジアザビシクロ［２.２．２］オクタンを意味する。
DBAは、ジベンジルアミンを意味する。
DBIは、イタコン酸ジブチルを意味する。
DEAは、ジエタノールアミンを意味する。
樹枝状ポリマーとは、コアシェル型テクトデンドリマーを含むランダムな超分岐、樹枝状突起、デンドロン又はデンドリマーポリマーの樹枝状ポリマークラスを意味する。
DETAは、ジエチレントリアミンを意味する。
DMDTBは、ジメチルジチオブチレートを意味する。
DMEMは、ダルベッコ改変イーグル培地を意味する。
DMIは、イタコン酸ジメチルを意味する。
DNA又はRNA又は核酸は、好ましくは４〜９０００塩基対または５００〜１５０kDの合成又は天然の一本鎖又は二本鎖DNA又はRNA又はPNA（リン核酸）又はそれらの組み合わせ又はアプタマーを意味する。
Pは、重合度を意味する。
EAは、エタノールアミンを意味する。
EDAは、エチレンジアミンを意味する。
EEMは、励起 - 発光マトリクスを意味する。
equiv. は、当量を意味する。
FBSは、ウシ胎児血清を意味する。
FT-IRは、フーリエ変換赤外分光法を意味する。
FWAは、蛍光増白剤を意味する。
Gは、デンドリマー生成を意味し、これは、コアを取り囲む同心枝細胞殻の数によって示される（通常、コアから連続して数えられる）。
gは、グラムを意味する。
hは、時間を意味する。
ハロは、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨード原子、イオン又はラジカルを意味する。
HB-PEIは、ハイパーブランチ− ポリエチレンイミンを意味する。
HEDAは、（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミンを意味する。
HMDAは、ヘキサメチレンジアミンを意味する。
IAは、イタコン酸を意味する。
IFは、固有の蛍光を意味する。
IRは、赤外分光法を意味する。
ITAは、イタコン酸を意味する。
ITEは、イタコン酸エステルLを意味する。
Lは、リットルを意味する。
L-PEIは、線状ポリ（エチレンイミン）を意味する。
MeOHは、メタノールを意味する。
mgは、ミリグラムを意味する。
minは、分を意味する。
mLは、ミリリットルを意味する。
MWは、分子量を意味する。
μmは、マイクロメートルを意味する。
nmは、ナノメートルを意味する。
NTFは、非従来の蛍光を意味する。
NTIFは、非従来の固有蛍光を意味する。
N-VPは、N-ビニルピロリドンモノマーを意味する。
PAMAMは、第一級アミン末端基を有する線状及び分岐ポリマー又はデンドリマーを包含する、ポリ（アミドアミン）を意味する; Starburst（商標）(Dendritic Nanotechnologies, Inc.の商標)
PBSは、リン酸緩衝生理食塩水を意味する。
PEGは、ポリ（エチレングリコール）を意味する。
パーセント又は％は、特に断らない限り、重量を意味する。
PETIMは、ポリ（プロピルエーテルイミン）を意味する。
PIPZは、ピペラジン又はジエチレンジアミンを意味する。
PPIは、ポリ（プロピレンイミン）デンドリマーを意味する。
PVPは、ポリ（ビニルピロリドン）を意味する。
PyrAMは、ピロリドンアミンを意味する。
rpmは、1分間当たりの回転数、振とう水浴中での攪拌の頻度を意味する。
RTは周囲温度又は約20〜25℃の室温を意味する。
ステルスは、細胞に対して非免疫原性を意味する。
TETAは、トリエチレンテトラミンを意味する。
TMSは、テトラメチルシランを意味する。
Tracer は、化合物の自然なプロセス又は存在の進行または履歴を追跡するために使用される化合物、例えば細胞及び組織の組成の研究のための組織化学トレーサー；流体運動を追跡するために使用される任意の流体特性のためのフロートレーサー；色素トレーサー；又はそれが使用される環境に位置することができる任意の化合物、を意味する。
TRENは、トリス（2-アミノエチル）アミンを意味する。
TRISは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを意味する。
UV-visは、紫外線および可視分光法を意味する。
【００７２】
議論１
ピロリドン化
より高い分子量画分（すなわち、＞２０ＫＤa；下記参照のこと）を除いて、何れの既知の生理学的問題を伴わないで、ヒト（すなわち、５０万人を超えるヒト対象において７５歳以上）における注射可能な合成ポリマーとしてＰＶＰを使用する広範な肯定的経験を考慮して、それらのピロリドン組成物の本発明の使用は、ＰＥＧ化又はＰＯｘ化の何れかの代替物である。ＰＥＧ化及びＰＯＸ化の両者は、ＰＶＰよりもヒト自体の欠点を有し、そしてＰＶＰよりも、ヒトにおいて、はるかに少ないインビボ記録を有する。さらに、ＰＥＧ化及びＰＯＸ化生成物に対するＰＶＰのそれらの新しいピロリドン類似体の付加的特徴は、予想外の固有の蛍光特性である。それらの蛍光特性は、生物学的細胞をイメージングし、そしてインビボ輸送及び生体分布をモニターするためには非常に重要であることが示されている。従来の用語と一致して、ポリヌクレオチド、タンパク質、薬物及び他の実体を修飾するためのそれらの新規プロトコルは現在、ピロリドン化と呼ばれる。それらのピロリドン化試薬の一般的な構造表示は、式（III）で下記に示される通りである。
【００７３】
それらのピロリドン反復単位は、（ａ）線状、（ｂ）架橋、（ｃ）分岐、又は（ｄ）樹枝状を包含する４種の主要ポリマー構造のいずれか中に効果的に組み込まれ、ここで重合度（ＤＰ）＝（ｎ）は一般的に、４−１００であり、そしてＸ又はＹは独立に、修飾される所望のタンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド又は治療薬が有する官能基と反応性であっても又は非反応性であっても良い。
【００７４】
本発明は、腎臓により排泄されるべきであり、そして広範囲の注射可能な生物医学的用途のために適している、ＰＶＰの十分に定義され、離散性で、低分子量（すなわち、＜１００ＫＤａ、好ましくは＜５０ＫＤａ）のオリゴマー／ポリマー類似体を提出することにより、この広く認識されたジレンマを改善するような化学的解決法を記載する。このように、それらの個別の官能化された低分子量ポリ（ピロリドン）はまた、注射可能な血液代用物／増量剤として過去７５年間にわたってのそれらの広範な且つ非常に安全な医学的使用に基づいて、ＰＥＧ試薬の代用物又は代替物としての使用のための卓越し且つ実行可能な候補体にもなる。さらに、それらの新規の小分子及びピロリドン組成物の多くは、従来の光化学パラダイムに従って説明できない重要な予想外の蛍光特性を示すが、しかしながら、この新規の蛍光特性は、生物学的細胞をイメージングし、そして生物内のインビボ輸送及び分布をモニターするために非常に価値があり、且つ有用であることが文書化されていることが決定された。
【００７５】
本発明は現在、インビボ薬物送達用途のためへのピロリドン組成物の使用に関連する上述の懸念及び欠点の全てを改善する、非常に望ましい末端基「活性薬物結合官能性部位」を有する、明確に定義された、低分子量ポリ（ピロリドン）オリゴマーを生成する新規の方法及び戦略を記載する。ＰＥＧ及びＰＯｘについて使用される用語の精神及び内容においては、それらの新規プロトコル及び試薬は、ピロリドン化と呼ばれる。それらの活性化されたピロリドン化試薬の一般的な例は、以下に記載される通りである：
【００７６】
【化１２】
2020063250.tif 000014
【００７７】
［式中、Ｒは、Ｃ１−Ｃ１８アルキル、Ｃ６−Ｃ１２アリール、Ｃ６−Ｃ１２ アリーレン, (Ｃ１−Ｃ１２アルキル) Ｃ６−Ｃ１２アリーレンであり；そして
Ｘ＝Ｙは独立に、Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ２、 −ＳＨ、−ＣＯ２Ｈ、アルキン、アジド（すなわち、クリック試薬）、又は任意の適切な反応性部分／誘導体、例えばG.T. Hermanson, Chapters 1-27 (pp 3-1039) in Bioconjugate Techniques, Second Ed., (2008)により記載されるそれらであり、それらは所望の／標的化された基質、例えばペプチド、タンパク質、抗体、酵素、ポリ核酸、薬物、ナノ粒子、微粒子、リポソーム、ミセル、デンドリマー、デンドロン、デンドリマーソーム（dendrimersomes）、医薬品、又は他の生物学的実体又はそれらのフラグメントへのピロリジン化試薬を結合するために必要とされる］。
【００７８】
−ＣＯ２Ｈの医薬的に許容できる塩及びエステルもまた、式（III）の化合物として含まれる。それらの塩及びエステルは、薬物開発において当業者に良く知られており、そして多くの薬物について、ＦＤＡから承認された薬物の許容リストから入手できる。
【００７９】
本発明は、明確に定義された小分子ピロリドン中間体を含む新規ピロリドンポリマー組成物（すなわち、線状、分枝状、架橋及び樹枝状構造）を記載し、それらの合成のための戦略／プロトコルは、特にオリゴマー又は低分子量ポリマー組成物として、分子量（ＭＷ）制御を可能にするユニークで明確に定義されたピロリドンポリマー組成物の入手を可能にする。これは、図１０により理解され得る。
【００８０】
現在、そのようなオリゴマー／低ＭＷポリマーピロリドン組成物は、何れの既知の重合プロトコルによっては入手できない（Pfirrmann et al., 米国特許第6,080,397号, 2000; www.rloginconsulting.com/ ... pyrrolidone%20backbone%20polymers.pdf）。本発明を構成する、新規の制御された低ＭＷピロリドンポリマーは、従来のＰＥＧ化（すなわち、上記で論じられたようなポリ（エチレングルコール）ポリマー）に対する劇的に強化された代替案を提供する。ＰＥＧポリマーは、とりわけ、特定の負の特性（すなわち、酸化不安定性、免疫原性特性）を有する。最近では、ＰＯＸ化（すんわち、ポリ（オキサゾリン）（J. Milton Harris et al., 米国特許第8,088,884号, (Jan. 3, 2012)）プロトコルが存在する。それらのＰＥＧ化及びＰＯｘ化プロトコルは、広範囲のインビボ薬物送達及びイメージング用途下で、種々のタンパク質、酵素、薬物又はイメージング剤と、ポリ（エチレングリコール）又はポリオキサゾリンとの共有結合又は会合を包含する。ＰＥＧ化プロトコルによる生物医薬品のＰＥＧへの結合は、Ｃ型肝炎、好中球減少症及び貧血の治療のための多数の有意で、商業的に重要な高分子薬物の臨床／マーケッティングの成功を導いて来た（F. M. Veronese, A. Mro, G. Pausut, (2009) "Protein PEGylation, Basic Science and Biological Applications. PEGylated protein, drugs; basic science and clinical applications, milestones in drug therapy series" F.M. Veronese, Ed., pp 11-31, Birkhauser Verlag, Berlin）。
【００８１】
それらの初期の技法の背景及び精神においては、本発明により記載される技法に基づくこの新規ポリ（ピロリドン）は、（ピロリドン化）（すなわち、ポリ（ピロリドン））プロトコルと命名される。この線状ポリ（アミドピロリドン）（ＰＡＭＰｙｒ）生成物は、ＰＥＧ（Davis et al., Adv. Drug Delivery Reviews, 2002, 54(4),457-458）、及びＰＥＯｘ（Harris et al., 米国特許第7,943,141号, 2011）タイプのポリマーに類似する。このようにして、それらは、低毒性、低補体活性化特徴を示し、そして注射剤として使用される場合、それらの結合体についてのインビボ保持時間を増強しながら、薬物結合体とのタンパク質相互作用を低めるために使用され得る。それらの新規ポリ（ピロリドン）組成物は、驚くほど低い毒性［Ciolkowski et al., Nanomedicine, NBM, (2012), 8, 815-817; Janaszewska et al., Nanomedicine, NBM, (2013), 9, 461-464］及び低い補体活性化（すなわち、低い免疫原性特性）、並びにインビボステルス特性（N. Spyropoulos-Antonakkakis et al., Nanoscale Research Letters, (2015); 10:210）を示し、それらは、従来のＰＥＧ化プロトコルについて認識されるそれらの特性を越える。予期しないことには、それらの新規の小分子ピロリドン中間体及びそれらの得られるポリ（ピロリドン）（ＰＶＰ）組成物の多くは、生物及び動物モデルにおいて、生物学的細胞のインビボイメージング、又は生理学的運動及び生体分布を追跡するために適切な非従来の「固有蛍光」特性を示すことが見出された。
【００８２】
ごく最近、ピロリドン末端ＰＡＭＡＭデンドリマーは、それらの非常に低い毒性（Ciolkowski et al., Nanomedicine, NBM, 2012, 8, 815-817; Janaszewska et al. Nanomedicine, NBM, 2013, 9, 461-464）、無視できる補体活性化特性（N. Spyropoulos-Antonakkakis et al., Nanoscale Research Letters, (2015); 10:210）、及びヒトアテローム性頸動脈組織（すなわち、心血管プラーク）を選択的に標的化する非常に顕著な前例のない能力（N. Spyropoulos-Antonakkakis et al., Nanoscale Research Letters, (2015); 10:210）のために、すべての他のナノスケール粒子に比較して、真にユニークであることが報告されている。
【００８３】
プロセスの議論
ＰＥＧ化試薬の代わりの代替物として本質的に蛍光性の小分子ピロリドン中間体、オリゴマー及びポリマーを合成するための方法／プロセス
それらの小ピロリドン分子は、第一級アミンとイタコン酸又はその誘導体（すなわち、エステル、アミド、無水物）との反応を包含する単純な工程により容易に調製される。この一般的な第一級アミン＋イタコン酸誘導体反応スキームは、それらのピロリドン中間体のＭＷ、及び所望する低分子量ピロリドンポリマーのＭＷを制御するために使用され得、それらのすべては、インビボ用途のために適切な予想外の固有蛍光（ＩＦ）を示す。それらの戦略は、以下の流れ図（スキーム２）で例示されている。
【００８４】
【化１３】
2020063250.tif 000015
【００８５】
このスキームにおいて、ＲはＨ又はＣ１−Ｃ４アルキルであり；Ｒ′はＣ１−Ｃ１８アルキルである。
【００８６】
本発明のための複素環式／大環状（すなわち、ピロリドン）環を合成するために使用される合成戦略は、一般的に、モノ−及びポリ−第一級アミンと、イタコン酸（ＩＴＡ）、イタコン酸エステル（ＩＴＥ）、例えばＤＭＩ、又は無水イタコン酸との反応を包含する。すべての場合、種々の第一級アミンと、イタコン酸試薬との間の化学量論は非常に重要である。それらの化学学論は、広範囲の４−カルボン酸／エステルピロリドンカテゴリーを生成するよう体系的に調整することができた。それらのカテゴリーは、（１）単純な分子機構、（２）二環式／オリゴマー／大環状構造、又は（３）ポリマーピロリドン生成型を包含した。
【００８７】
単純な小分子第一級アミンとイタコン酸誘導体との間の高収率反応は、デンドリマー、並びに線状ポリマー、すなわちポリ（ビニルアミン）及びポリ（アリルアミン）を含む、第一級アミンを担持するすべてのポリマー構造に、非常に容易に拡張された。
【００８８】
スキーム２における（Ａ）により示されるＩＦ小分子ピロリドン中間体を形成する第１の反応は、少なくとも１つの第一級アミンを必要とし、結果的に、モノアミン、ジアミン、トリアミン分子はＲであり得、次に、アミンはイタコン酸（ＩＴＡ）又はイタコン酸エステル（ＩＴＥ）と反応せしめられる。任意の第一級アミン、例えば２−アミノエタノール、アミノエチルエタノールアミン（ＡＥＥＡ）、ｔｒｉｓ−ヒドロキシルメチルアミン（ＴＲＩＳ）、グルコサミン、グリシン、ドデシルアミン、又は他の所望のモノアミンが使用され得る。化学量論は、次の通りである：
[1°アミノ部分: ＩＴＡ/ＩＴＥ]
[l：l]→２−Ｒ（Ｘ）置換−4−カルボキシピロリドン
[2:l] →２−Ｒ（Ｘ）−置換-４−カルボキシアミドピロリドン
得られる生成物は、ＩＦを有し、そしてスキーム２における（Ａ）である。
【００８９】
２つの第一級アミンを有するジアミンがＩＴＡ又はＩＴＥと反応する場合、２つのピロリドン環がジアミン当たり形成することができる。それらの第一級ジアミンの例は、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、シスタミン（ＣＹＳ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）、トリエチレンテトラアミン（ＴＥＴＡ）、又は他の所望のジアミンである。化学量論は、次の通りである：
[1° ジアミン部分: ＩＴＡ/ＩＴＥ]
[ｌ：ｌ] →Ｒ（Ｘ）置換−４−カルボキシピロリドン骨格大環状、オリゴマー、ポリマー
[４： ｌ] →２−Ｒ（Ｘ）−置換−４−カルボキシアミドピロリドン
[ｌ：２] → ２−［−Ｒ（Ｘ）−］−置換−４− カルボキシアミドジ − ピロリドン
【００９０】
後者の場合、システミンに対してこの[１：２]反応を行ない、ジピロリドン中間体を形成することができ、それから、過剰のＥＤＡ及び続くＤＭＩと逐次反復を行うことができる。この反復順序決定は、下記に例示されるように、種々の生物学的基質のピロリドン化にとって非常に重要である所望する長さの主要なチオール保護線状ＰＡＭＰｙｒオリゴマーを生成する：
【００９１】
【化１４】
2020063250.tif 000016
【００９２】
他方では、ＢＯＣ保護ジアミンに対して反復ＤＭＩ＋過剰ＥＤＡ配列決定を行うことができ、この場合、反復の数は、ピロリドン化試薬の長さを決定するであろう。もちろん、従来のMerrifield様基質もまた、そのようなジアミンの類似する保護のために使用され得る。その耐性、適切な末端基修飾、樹脂からの切断及び／又はＢＯＣ基の保護解除は、G. Hermanson (G.T. Hermanson, in Bioconjugate Techniques, Second Ed.,(2008).)により広範に記載された手順に従って、すべての所望する生物学的基質又は標的への適切な結合のためのそれらのピロリドン化試薬の選択的官能化提供するであろう。
【００９３】
【化１５】
2020063250.tif 000017
【００９４】
３個の第一級アミンを有するトリアミンがＩＴＡ又はＩＴＥと反応する場合、３個のピロリドン環がトリアミンア当たり形成することができる。それらの第一級トリアミンの例は、トリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）又は他の所望するトリアミンである。化学量論は、次の通りである：
[1°トリアミン部分: ＩＴＡ/ＩＴＥ]
[1:1]→三置換-[２− Ｒ（Ｘ）, ４−カルボン酸/エステルピロリドン]
Ｎ−［（ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２）]３ (ＴＲＥＮ)＋ ３ ＤＭＩ→Ｎ−［（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（４−カルボン酸/エステル) ピロリドン）］
【００９５】
このアプローチで形成された第１のトリ−ピロリドン反応生成物は、ＭＷ／構造制御の３−アーム分枝の星形ピロリドン化試薬を合成するための反応性足場として使用され得ることが注目されるべきである。下記に示される反復工程は、９つのピロリドン環を含む、星型分枝状ポリ（ピロリドン）オリゴマー生成物を生成する。
【００９６】
【化１６】
2020063250.tif 000018
【００９７】
このＤＭＩ＋ＥＤＡ介入戦略を、アミン末端デンドリマーシリーズに拡張することにより、以下に示すように、生成レベルの関数として、その対応するデンドリマー提供ＮｃＮｂＧポリ（直鎖状）分枝を製造することができる：
【００９８】
【化１７】
2020063250.tif 000019
【００９９】
同様に、エチレンジアミン（ＥＤＡ）を、トリ−（２−アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）により単に置換することにより、類似の十分に定義されたトリ−デンドロン型デンドリマー構造を生成することができる。上記のＴＲＥＮと同様の反復順序を用いることにより、ＥＤＡは、以下に示されるように、ＴＲＥＮの中心Ｎ−コアの周りに３つのデンドロンを生成する：
【０１００】
【化１８】
2020063250.tif 000020
【０１０１】
この新規の前例のないＧ＝０；トリ−デンドロンデンドリマー構造は正確に２１−ピロリドン環を含み、そしてポリ（アミノピロリドンアミン）（ＰＡＭＰｙｒＡＭ）ファミリーの代表的メンバーと呼ばれる。
［１：２］→モノ( ＮＨ２)−Ｒ（Ｘ）−置換−ジ−（４−カルボキシアミドピロリドン) →ハイパーブランチ−Ｒ（Ｘ）−置換-ポリ−( ４−カルボキシアミドピロリドン
Ｎ−［（ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２）３+ ２ ＤＭＩ→Ｎ−［（ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２ ) [(４−カルボン酸/エステル) ピロリドン]２→ハイパーブランチ−ピロリドン
［２：１］→ジ−（ＮＨ２）−Ｒ（Ｘ）−置換−モノ−（４−カルボキシアミドジ − ピロリドン )→ハイパーブランチ− Ｒ（Ｘ）−置換−ポリ−（ ４−カルボキシアミドピロリドン)
Ｎ−［（ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２）３ + １ ＤＭＩ→Ｎ−［（ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２）２ [(４−カルボン酸/エステル) ピロリドン] →ハイパーブランチピロリドン
【０１０２】
スキーム２においては、（Ｂ）ポリマーが形成される場合、それらは、この工程により制御されるそれらのＭＷを有し、そしてインビボ生物学的注入及びイメージング用途のために適切な、ＩＦ、低毒性及び低補体活性化特性を示すピロリドンポリマー組成物である。すべてのポリマーは、それらの構造中に、すなわち表面基として、又はＩＴＡ、ＩＴＣ又はＤＭＩと、又はその構造中で、又は表面又はポリマー上で反応するアミンの構造の一部として、ピロリドン部分を含む。それらのポリマー組成物は、次の４種の異なった構造形で生成され得る：（ａ）線状ポリマー、（ｂ）架橋されたポリマー、（ｃ）分岐上ポリマー、及び（ｄ）樹枝状ポリマー。
【０１０３】
線状−ペンダントピロリドンオリゴマー／ポリマー：
１-ポリアミン [ＲＸ−（ＮＨ２）ｚ ] + ＩＴＡ又はＩＴＥ→
上記反応においては、いくつかの第一級ポリアミンは、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（アリルアミン）、ポリ（ビニルベンジルアミン）、又は１又は２以上の第一級アミンを有する他の適切なポリアミン；及びＺ＝重合度（ＤＰ）である。化学量論は次の通りである：
[1°アミン部分: ＩＴＡ/ＩＴＥ] ＝ ［１：１］
［ｌ：ｌ］→線状− [ポリ−２−（Ｒ（Ｘ））−置換−４−カルボン酸/エステルピロリドン] DP=n
【０１０４】
【化１９】
2020063250.tif 000021
【０１０５】
架橋された線状−ペンダントピロリドンポリマー：
[1°アミン部分: ＩＴＡ/ＩＴＥ] ＝ ［ＤＰ：ＤＰ−ｘ］
[ＤＰ：ＤＰ−ｘ] →架橋された[２−（Ｒ（Ｘ））−置換ポリ−４−カルボン酸/エステルピロリドン] ＤＰ−ｘ
【０１０６】
ＤＭＩ：第一級アミンの化学量論が＜１：１になるよう、ＤＭＩ：第一級アミンの比を単純に調節することにより、上記線状−ペンダントピロリドンオリゴマー／ポリマー（上記に示される）の架橋バージョンを容易に形成することができる。
【０１０７】
線状−ペンダント分岐ピロリドンポリマー
【０１０８】
【化２０】
2020063250.tif 000022
【０１０９】
樹枝状コア−樹枝状表面（ピロリドン）コポリマーデンドリマー：
上記に示されるように、[１：１]ＤＭＩ化学量論、続いて、単純な小分子第一級アミンコア、例えばトリス−（２−アミノエチル）アミン（すなわち、ＴＲＥＮ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、１，４−ジアミノブタン（ＤＡＢ）、等から出発しての過剰のＴＲＥＮを用いて、反復反応順序を実施することにより純粋なすべてのポリ（ピロリドン）ベースのデンドロンを成長させることができる。そのようなデンドリ−｛ポリ（アミドピロリドン）アミン｝−（ＮＨ２）ｚ；Ｇ＝３；コア＝Ｒ＝［ＤＡＢ］由来の（ＰＡＭＰｙｒＡＭ）デンドリマー（ここで、Ｎｃ＝４）は、正確に２８−ポロリドン環を含み、そして下記に示される通りである：
【０１１０】
【化２１】
2020063250.tif 000023
【０１１１】
他方では、任意の所望する内部デンドリマー組成物由来の第一級アミン末端デンドリマーの表面からデンドリ−ポリ（ピロリドン）型デンドロン成分を成長させ、前例のない新規な［デンドリ−１］−［デンドリ−２（ピロリドン）］型コポリマーデンドリマーを生成することができる。この戦略は、生成の関数として導入され得、そして従来の表現；Ｚ＝ＮｃＮｂＧ（ここで、Ｚ＝生成あたり導入されるピロリドン環の数）に従って予測され得るピロリドン環の総数に対する完全な数学的制御を保証する。従って、特定のピロリドン化試薬構造において所望されるピロリドン環の数に対する全体的制御は、以下の数学に従って企画され、そして構築され得る。
【０１１２】
本発明の最も重要な側面の１つは、ポリ（ピロリドン）オリゴマー、ポリマー、デンドロン及びデンドリマーの分子量を企画し、そして制御する能力である。デンドロン／デンドリマーベースのシステムのために開発された十分に文書化されている反復原理／工程を適用すると、以下に記載され、そして図１０に示されるような数学的に駆動される原理／表現に従って企画され、そして構築され得る少なくとも３つの新規ポリ（ピロリドン）組成物を合成することが可能であった。
【０１１３】
（Ｉ）．従来のデンドリ−ＰＡＭＡＭ−４−カルボメトキシピロリドン末端デンドリマー
従来のＰＡＭＡＭデンドリマー；末端第一級アミンの数＝Ｚ＝ＮｃＮｂＧ
末端ピロリドン部分の総数＝Ｐ＝Ｚ＝ＮｃＮｂＧ
（ＩＩ）．デンドリ−ＰＡＭＡＭ：線状−ポリ（アミドピロリドン）末端; （Ｌ−ＰＡＭＰｙｒ）コポリマー; (直鎖変性表面; 鎖長= n)
ピロリドン部分の総数＝ Ｐ ＝ ｎＺ ＝ ｎＮｅＮｂ Ｇ
（ＩＩＩ）．デンドリ-ＰＡＭＡＭ: 樹枝状ポリ（アミドピロリドンアミノ）; (ＰＡＭＰｙｒＡＭ)コポリマー
【０１１４】
前提条件：
基本的ＰＡＭＡＭデンドリマー末端第一級アミンの数 ＝Ｚ ＝ＮｃＮｂＧ
（ＰＡＭＰｙｒＡＭの数）G' 及びN' Ｇにより定義される表面生成(上記のような単一のピロリドンＧ '＝ ０)
表面ピロリドン部分の総数 ＝ Ｐｚ ＝ Ｚ Ｎ‘ｂＧ’ ＝ ＮｅＮｂ Ｇ Ｎ‘ｂＧ’
内部＋表面ピロリドン部分の総数＝ Ｐ = Ｚ (Ｎ‘ｂＧ’＋１−１)/( N‘ｂ-1)
内部＋表面ピロリドン部分の総数 = ＮｃＮｂ Ｇ（Ｎ‘ｂＧ’＋１-l)/( N‘ｂ-1)
(IV). [コア]: 樹枝状−ポリ（アミドピロリドンアミン）(ＰＡＭＰｙｒＡＭｓ)
【０１１５】
前提条件：
総ピロリドンデンドリマー(上記のようなＧ‘ 及びＮ‘ｂ)
表面ピロリドン部分の総数 ＝ Ｐｚ ＝ Ｎｃ Ｎ‘ｂＧ’
内部＋表面ピロリドン部分の総数＝ Ｐ ＝ Ｎｃ（Ｎ‘ｂＧ’＋１−ｌ）/（N‘ｂ-1）
1°−ポリアミン末端デンドリマー(すなわち、 ここで:デンドリマー−（ＮＨ ２）ｚ=[コア; (Ｎｃ)];[内部;（Ｎｂ）]; [末端基;（Ｚ）])
【０１１６】
ＩＴＡ、ＩＴＥ又はＤＭＩとの反応のために利用できるＺ部分として、デンドリマーの表面上に少なくとも１つの第一級アミンが存在すべきである。いくつかの可能な樹枝状構造は、ポリ（アミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、ポリ（プロピレンイミン）（ＰＰＩ）デンドリマー、ポリ（リシン）樹枝状ポリマー及び／他のもの［DENDRIMERS, DENDRONS, AND DENDRITIC POLYMERS, Tomalia, D.A., Christensen, J.B. and Boas, U. (2012) Cambridge University Press, New York, N.Y.］；及びＺ＝ＮｃＮｂＧである。化学量論は次の通りである：
[1°アミン部分:ＩＴＡ/ＩＴＥ]＝[１：１]。
［ｌ：１]→[デンドリマー]−［（２−置換−４−カルボン酸/エステル）ピロリドン)]z
ここで、Ｚ＝ＮｃＮｂＧ
【０１１７】
デンドリマーの生成は、ＤＭＩ及びメタノールと反応されるＧ＝０，１，２，３，４（例えば、ＰＡＭＡＭ）であり得、それに応じて、１〜表面上に利用できるアミンの最大数（すなわち、それぞれ、４，３，１６，３２，６４）で、所望の数のピロリドン部分が形成される。これは、次のように一般化される：
コア＝Ｎｃ＝４である場合、（Ｘ）（Ｙ）が表１に示されるようになるよう、デンドリマー生成（Ｇ）の関数としての[(1°アミン部分)x :(ＩＴＡ/ＩＴＥ)ｙ] = [Ｘ：Ｙ]
【０１１８】
【表１】
2020063250.tif 000024
【０１１９】
メガマー：
ランダム構造のデンドリマーＰｙｒＡｍメガマー：
広範囲のランダム構造のデンドリマーピロリドンアミン（ＰｙｒＡｍ）メガマーは、任意のアミン末端デンドリマー上の第一級アミン成分（Ｘ）及び（ＩＴＡ又はＩＴＥ）成分（Ｙ）の化学量論を調整することにより、容易に生成される。より特定には、上記表１に示されるようにＰＡＭＡＭデンドリマーの関数として、それらの（Ｘ）及び（Ｙ）の調節は、ランダム構造のＰＡＭＡＭ−ＰｙｒＡＭメガマーに導くことであろう。Ｙ＞Ｘである場合、メガマーは、表面上でピロリドンの優勢を提供するであろう。Ｘ＞Ｙである場合、メガマーは、第一級アミン基の優勢を提供するであろう。それらのメガマーは、図８に示される。
【０１２０】
構造的に編成されたメガマー：コア−シェルテクト（デンドリマー）：
図９（Ａ）は、編成されたメガマーとしてのコア−シェルテクト（デンドリマー）を示し；（Ｂ）は、ピロリドン部分がシェル試薬に存在する、高反応性メガマー表面を示す。
【０１２１】
本発明は、特定カテゴリーの４−１５員のアミド、ウレア、ウレタン及びアミドアミノ複素環分子について観察される新規の予想外の特性、及び幅広い医療及び商業用途のために価値があり、且つ有用である、末端樹枝状、官能化された線状又は架橋ポリマーへのそれらの使用に関する。前記分子は、強い非従来の固有蛍光を有するトレーサー（上記に定義される）として有用である。
【０１２２】
非従来の固有蛍光（ＮＴＩＦ）材料は一般的に、高い多重度の第三級アミンを含むポリマー材料であることが認識されている。それらは当初、デンドリマー構造からのみ由来すると考えられており；しかしながら、ＮＴＩＦ現象はすべての４種の主要構造カテゴリーにおいて観察されていることが現在、知られている。
【０１２３】
それらのＮＴＩＦ現象は、低分子量有機構造体、例えば従来のフルオロフォア、例えば従来のフルオロフォアに記載されるそれら（上記カテゴリーＩ）においては観察も又は報告も決してされていない。本発明は、従来の蛍光材料の属性又は特性のいずれも有さないが、３００〜８００ｎｍの間の蛍光発光をまだ示す小分子有機材料のクラスに関する。１つの非常に重要な識別特性は、それらが一般的に、非芳香族の低分子量構造（基本単位＜５００ｄａ）を含み、そして光退色に対して堅牢であると思われる低毒性の非免疫原性成分により特徴づけられることである。さらに、それらは、個々の小ＮＴＩＦ構造として独立して使用されるか、又は広範囲の有機／無機ポリマー格子又はナノ粒子中に組み込まれ得る、診断、美白剤、日焼け止め、法医学、ＬＥＤ、薬物送達、生物学的細胞標識及びイメージングにおいて有用な蛍光発光特性又は高い価値及び重要性を生むことができる。そのようなＮＴＩＦナノ粒子の例は、デンドリマー上の末端基としてのそれらの小構造フルオロフォアの使用である。それらのＮＴＩＦフルオロフォアはナノスケールからマイクロスケールまで変化する基質への電荷中和により、重合され、結合され、そして／又は付着され得る。それらは、ナノメートル（ナノメーター）からマイクロスケール（メーター）の範囲の寸法を有する基質上にそれらのフルオロフォアの高い倍数を関連づけることにより増強される価値ある発光蛍光特性を示すビルディングブロックである。それらの発光特性は、重合、結合、凝集、超分子アセンブリー、電荷中和により及び物理的に、それらのフルオロフォアの大きな倍数を関連づけることにより、増強され得る。
【０１２４】
デンドリマー又は他のポリマー足場に結合さえされていない、広範囲の種類の単純な低分子量（すなわち、＜７００ダルトン）のＮ−置換−４−カルボアルコキシ／カルボン酸官能化ピロリドン化合物（すなわち、環状アミド型複素環）が試験される場合、それらは、可視近赤外領域（すなわち、４００−８５０ｎｍ）における発光を伴う、有意な非従来の蛍光（ＮＴＦ）／固有蛍光（ＩＦ）を示す。それらの発光は、特手の電子求引／供与基の有無により影響されると思われる。例えば、そのような基は、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、アミド、ウレア、カルバメート（すなわち、ウレタン）である。それらの単純ピロリドン誘導体は、それらのＮＴＦフルオロフォアの広範囲の無機／有機粒子又は足場、例えばシリカ、炭素、金属、合成ポリマー、タンパク質、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ウィルス及び他のものへの結合を可能にする種々のコネクター官能性を有する。
【０１２５】
驚くべきことには、それらの単純ピロリドンベースのＮＴＩＦフルオロフォアの吸収／発光特性は、商業的に有意な蛍光増白剤（ＦＷＡ）のために必要とされる非常に所望の特徴と非常に密接に一致する。本質的に、ＦＷＡの目的は、ＵＶ光を吸収し、そしてそのエネルギーを、より高い波長の可視光（すなわち、青色領域）に転換する蛍光化合物を使用することである。このようにして、基質の黄色の外観が、蛍光化合物による対応する量の青紫色光の発光により補正され得る。蛍光剤の有効性は、光源における紫外線の存在に依存する。
【０１２６】
ＦＷＡは、多くの大規模商業用途、例えば次のものに使用される：織物/布/歯科用ホワイトナー、歯科用複合材、パーソナルケア、塗料、紙コーティング、インク、合成ポリマー、コーティング、天然ポリマー（すなわち羊毛/絹及び他のもの）、化粧品、微小な漏れ（すなわち、接着剤/シーラント）の検出のための蛍光トレーサー、フィルム、表面、膜又は他の基質又は薬物送達用途（すなわち、siRNA、DNA、腫瘍学、他の生物医学的役割など）のためのトレーサーとしてナノ気孔を画定するための蛍光キャリブレーター。ＦＷＡの最大の用途は、洗剤においてであり、そしてほとんどの市販の洗剤は、１又は２以上のＦＷＡを、０．０５〜０．３重量％の割合で含む。
【０１２７】
それらの現在のＮＴＩＦ−ＦＷＡは、以下の分野において強化された特性を示すことが予測され：低い細胞毒性、低い光毒性、生分解性、非免疫原性、基質に対する保持又は拒絶、消光、貯蔵安定性、そして多くの現在の従来のＵＶ吸収剤及びフルオロフォアとコスト競争力があり；多くの生命科学／医療用途における適用、例えば遺伝子トランスフェクション及び他の薬物送達役割（すなわち、生体適合性トレーサー）におけるそれらの使用のために適切な広範囲の非常に調整可能な化学成分をまだ提供する。
【０１２８】
ピロリドン化
過去７０年の間に５０万人を超えるヒト受容体においてＰＶＰのインビボ使用に関する広範且つ非常に肯定的な歴史に基づいて、ＰＥＧの代替物として、このポリマー組成物の欠点の是正に非常に活発な関心が存在している[F.M.Veronese et al., J. Bioactive Compatible Polym., (1995), 10, 103-12], 及び Macromolecular Chem. Phys, (1999), 195, 9-79]。それらの努力は、主に、連鎖移動重合プロトコルを用いることにより、高ＭＷ（すなわち、＞５０ＫＤａ）ＰＶＰ画分を回避することに向けられて来た[Torchillin et al., Biomaterials, (2001), 22 , 3035-3044]。不運なことには、得られた生成物は、非常に多分散され、そして一般的に、治療薬物への共有結合のための適切な機能性を欠いていた。最近の別の努力によれば、Pfisterなど．、[米国特許第６，０８０，３９７号（２０００）]は、市販のＰＶＰの限外濾過により高分子量画分を除去しようと試みたが、完全には成功しなかった。市販のＰＶＰのそれらの広く認識されている欠点を改善するそれらの失敗は、最近、Login et al., (www.rloginconsulting.com/ ...pyrrolidone%20backbone%20polymers.pdf) により強調表示されており、これは、主鎖にペンダントされたピロリドン環を有する生成物を生成するフリーラジカル重合法の使用に対して、ポリマー主鎖中への非常に所望するピロリドン環の導入のために、縮合重合戦略が考慮されるべきであることを示唆している。
【０１２９】
Ｎ−置換−４−カルボキシ−アルキレート／アリレートピロリドンの合成のための一般的手順
適切なアルキル又はアリールアミン（０．０５モル）を、磁気攪拌機を備え、そして１５ｍｌの無水メタノールを含む、１００ｍｌの丸底フラスコ中に計量した。１５ｍｌの無水メタノールに溶解された適切なジアルキル／ジアリールイタコネート（０．０５モル／第一級アミン部分）を、攪拌下で、１０分間にわたって滴下した。場合によっては、適度な発熱が認められた。反応を、ＲＴで１時間、攪拌し、続いて、８〜１０時間、還流した。最終生成物を、Buchiローター蒸発器による溶媒の除去により得、７５〜９８％の範囲の収率を伴って、固形物、液体又はシロップを得た。それらの構造については、実施例中の表２及び図３Ａ−３Ｂを参照のこと。それらの最終生成物を、ＦＴＩＲ、１Ｈ−、１３Ｃ−ＮＭＲにより特徴づけた。それらのＵＶ−可視／蛍光特性を、蛍光分光計（Molecular DevicesからのSpectramax）により評価し、実施例中の表２に記載のデータを得た。
【０１３０】
Ｎ−置換−４−カルボン酸ピロリドンの合成のための一般的手順
イタコン酸（Sigma-Aldrich）（０．０５モル／第一級アミン部分）を、磁気攪拌機を備えた１００ｍｌの丸底フラスコ中に計量した。攪拌下で、適切なアルキル又はアリールアミン（０．０５モル）を、１０分間にわたって滴下した。場合によっては、適度な発熱が液体溶融物への転換で認められたが、他の場合、各反応物は固体のままであり、そして密接に混合された。フラスコ及び反応混合物を、還流冷却器にかけ、そして油浴に浸漬し、そして１２５℃で２−５時間、加熱した。反応からの水凝縮物の形成は、冷却器内で気づくことができる。次に、２５ｍｌの部分の無水メタノールを添加し、そして反応混合物を１時間、還流した。Buchiローター蒸発器上での溶媒の除去により、５９〜９５％の範囲の収率で、油状物、シロップ又は固形物として、所望するピロリドンを生成する。それらの最終生成物を、Thomos-Hoover毛細菅融点装置、ＦＴＩＲ及び１Ｈ−、１３Ｃ−ＮＭＲを用いることにより特徴づけた。それらのＵＶ−可視／蛍光特性を、蛍光分光計（Molecular DevicesからのSpectramax）により評価し、表２に記載のデータを得た。
【０１３１】
官能化樹枝状ポリマー
カルボキシレート末端ＰＡＭＡＭデンドリマーが、弱いが、しかし検出できる蛍光を有する最初の報告は、２００１年に登場した（Larson and Tucker, Applied Spectroscopy, 2001,55, 679-683）。それぞれ、３８０及び４４０ｎｍの最大励起及び発光を有する広いピークが観察された。蛍光の正確な性質は十分には理解されていないにもかかわらず、著者らは、樹枝状構造を通してアミド基からｎ→π＊への遷移に起因する可能性があることを主張した。Ｇ２及びＧ４アミノ末端ＰＡＭＡＭデンドリマーからのより強い蛍光発光が、後に、非常に類似する励起及び発光波長で観察された（Wang and Imae, J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 13204- 13205）。Ｇ２及びＧ４ ＰＡＭＡＭデンドリマー両者は、有意なｐＨ−依存性蛍光特性を示した。発光は、５よりも低いｐＨの酸性条件下で検出できた。蛍光強度とデンドリマー濃度との間の線状関係が観察された。デンドリマー固有の青色蛍光を観察するのに必要とされる不適切な低ｐＨ値は、実質的に、生物学的システムにおけるその適用性を制限する。
【０１３２】
その後、たぶん第三級アミンの酸化による酸化処理（Wang et al., J Colloid Interface Science, 2007, 306, 222-227）に基づいて、劇的に増強され得ることが見出された。従って、Ｇ４  ＰＡＭＡＭデンドリマーを、過流酸アンモニウムにより処理し、その固有蛍光を増強した。そのような調製されたデンドリマーは、遺伝子送達及びバイオイメージングを同時に可能にする３種のアンチセンスオリゴヌクレオチドのキャリアとして使用された（Tsai et al., Biomacromolecules, 2011, 12, 4283-4290）。
【０１３３】
ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーの表面上に提示されるような、タンパク質とポリ（ピロリドン）部分との低毒性及び最小相互作用の最近の確認は、Klajnert et al. (Nanomedicine, NBM, 2012, 8, 815-817; Nanomedicine, NBM, 2013, 9, 461-464)により報告されている。現在、ＰＶＰは、体外受精プロトコル（www.coopersurgical.com）のために精子を固定するためのアジュバントとして使用される。
【０１３４】
本発明は、その標準表面化学（すなわち、エステル、アミノ、ヒドロキシル、カルボン酸）は、官能化されたデンドリマーについて観察される「固有蛍光」（ＩＦ）の劇的な増強を導いて来た、アミノ、アミド、イミノ、エーテル、エステル、ケト、カルボン酸又はチオエーテル官能基（但し、それらだけには限定されない）を含む種々の複素複素環式又は大環状部分に転換することにより、ＰＡＭＡＭデンドリマー（Ｇ＝０〜６）の表面を修飾する。例えば、図２（ａ）に示されるような、デンドリマーアミン末端基の４−カルボメトキシピロリドンへの転換は、アミン末端デンドリマー前駆体に比較して、１８倍以上、固有蛍光を増強した。この劇的に増強されたＩＦが生物学的細胞のイメージング／標識を可能にし；ところが、非複素環式官能化デンドリマーは、細胞イメージング／標識のために使用するのには弱過ぎる、非常に低い蛍光発光強度を示す。類似する結果が、図２（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）に記載されるように、他の複素環式及び大環状部分について観察された。
【０１３５】
より特定には、本発明は、官能化された２−ピロリドン、２−アザ−シクロヘプタノン、又は２−アゼチジノン−末端樹枝状ポリマーについて観察される、新規の非従来の蛍光（ＮＴＦ）、ステルス（すなわち、非免疫原性）及び増強された温度安定化特性に関する。ピロリドンの４−カルボキシアルコキシ、４−カルボキサミド又は４−カルボン酸誘導体の好ましい例は、前駆体第一級アミン（例えば、−ＮＨ２）−末端樹枝状ポリマーと、特定の官能化メタクリレートエステル、メタクリル酸又はメタクリルアミド試薬とを反応させ、エステル、カルボン酸又はアミド置換された２−ピロリドン部分により終結又は官能化された、又はその両者の何れかである新規の樹枝状、線状、分岐状又は架橋されたポリマーを生成することにより得られる。それらのピロリドン末端デンドリマーは、８月１９日に公開された国際公開第２００４／０６９８７８号に記載される方法により製造される。
【０１３６】
他の類似の及び適切な小〜大（４〜１５員）の複素環式部分、例えば２−アセチジノン、２−ピペリドン、２−アザ−シクロヘプタノン又は大環状アミドアミン部分は、文献に記載される種々の合成方法を用いて、樹枝状又は架橋ポリマーの表面末端で直接的に、又は線状又は分岐状ポリマーにより提示される適切な官能基を介して導入され得る。それらの複素環式官能基は、本明細書では集合的には、「イドン（idones）」と呼ばれる。
【０１３７】
本発明はさらに、エステル、酸又はアミン反応試薬と、それらの「イドン−末端／官能化」ポリマーとの反応により、それらの新規ＮＴＦ、ステルス又は増強された温度安定特性を示し、そして表す新規の「混合された官能性」の樹枝状ポリマー材料の提供を具体化する。
【０１３８】
本発明は、本明細書に記載されるように、NanoSynthons LLC /The National Dendrimer & Nanotechnology Centerでの未発表の研究に基づいて、次の前例のない結果を示している：
・「ジアミノブタン−コア」；アミン末端ＰＡＭＡＭデンドリマー（すなわち、Ｇ＝０〜６）の、４−カルボメトキシピロリドン末端ＰＡＭＡＭデンドリマー（４−ＣＰ−ＰＡＭＡＭ）（すなわち、Ｇ＝０〜６）への転換のための高収率（すなわち、９３−９８％の収率）の容易な合成工程（すなわち、１−工程）が、行われ、そしてマルチグラム量まで都合良くスケールアップされて来た。
【０１３９】
・「シスタミン−コア」；アミン末端ＰＡＭＡＭデンドリマー（すなわち、Ｇ＝０〜６）の、４−カルボメトキシピロリドン末端ＰＡＭＡＭデンドリマー（４−ＣＰ−ＰＡＭＡＭ）（すなわち、Ｇ＝０〜６）への転換のための高収率（すなわち、９０−９８％の収率）の容易な合成工程（すなわち、１−工程）が、定義され、そしてマルチグラム量まで都合良くスケールアップされて来た。
【０１４０】
・４−カルボメトキシピロリドン末端化ＰＡＭＡＭデンドリマー（すなわち、Ｇ＝４．０）は、対応するアミン末端ＰＡＭＡＭデンドリマー（すなわち、Ｇ＝４．０）に比較して、酸化剤又はより低いｐＨ調整を必要としないで、１８倍以上の高いＮＴＦ発光強度を示すことが示されている。実施例における表２を参照のこと。
【０１４１】
・４−ＣＰ−ＰＡＭＡＭデンドリマー（すなわち、Ｇ＝４．０）は、まだ定義されていないエンドサイトーシス機構により生物学的細胞に侵入することが実証されており、そして３種の異なった細胞系において細胞質ドメインの好都合なイメージングを可能にするのに十分なＮＴＦ発光強度を示した（Lodz大学）。実施例１及び図６を参照のこと。
【０１４２】
・４−ＣＰ−ＰＡＭＡＭデンドリマー（すなわち、Ｇ＝０〜４）は、非常に低い細胞毒性、及び「補体活性化」特徴を実質的に示さないことが示されている。実施例１を参照のこと。
【０１４３】
・３０以上の単純ではあるが、異なった４−カルボメトキシ／カルボン酸ピロリドン誘導体が、合成され、特徴づけられ、そして可視〜近赤外領域（すなわち、４００−７５０ｎｍ）の範囲の最大発光を有する有意なＮＴＦ発光特性を示すことが示されている。実施例における表２を参照のこと。理論に縛られることは望まないが、それらの最大発光は、適切な励起波長の選択及び適切なピロリドン構造企画の組み合わせにより容易に企画され、そして制御されると思われる。
【０１４４】
・このＮＴＦ現象は、そのような単純な低分子量ピロリドン構造又は官能化デンドリマーについては、決して報告されたことはない。  それは、これまで非毒性システムにおいては達成できなかった多くの用途に必要な発光強度を有する。
【０１４５】
・それらの単純な４−カルボメトキシ／カルボン酸ピロリドン誘導体は、ＮＴＦ及び他の細胞標識評価のための広範なデンドリマー及び他のポリマー構造への結合を可能にするのに適切な化学官能基を有する。
【０１４６】
式（Ｉ）又は式（II）の化合物を用いて、蛍光により、種々のシステム、試験、植物又は動物及びヒトにおける部分及び流体を追跡し、そして蛍光により前記部分の位置をモニタリングするか、又は検出する方法。
【０１４７】
デンドリマー表面基の修飾は、デンドリマーの毒性を低減するために一般的に適用される方法である。そのような修飾は、４−カルボメトキシピロリドン表面基を有するポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーを開発したTomaliaなど、により提案されている（国際公開第２００４／０６９８７８号、２００４年８月１９日）。このデンドリマーの生体適合性は、評価されている（Ciolkowski et al., Nanomedicine NBM, 2012, 8, 815-817; Janaszewska et al., Nanomedicine NBM, 2013, 9, 461-464）。ヒト血清アルブミンとのデンドリマーの相互作用する能力、その溶血活性、及びマウス神経芽腫細胞系ＮＺａに対する毒性効果を分析した後、カルボメトキシピロリドン表面基を有するＰＡＭＡＭデンドリマーは、アミン表面基を有する未修飾ＰＡＭＡＭデンドリマーと比較して、卓越した特性を示すという結論を導くことが可能であった（Ciolkowski et al., NBM,2012, 8, 815-817）。
【０１４８】
修飾されたデンドリマーの生体適合性に対するさらなる研究は、ナノ医療における適用の可能性が確認された。以下の３種の齧歯細胞系：チャイニーズハムスター繊維芽細胞（Ｂ１４）、胚性マウスに海馬細胞（ｍＨｉｐｏＥ−１８）及びラット肝臓由来の細胞（ＢＲＬ−３Ａ）を用いて、修飾されたデンドリマーが細胞アポトーシスを誘発せず、反応性酸素種（ＲＯＳ）生成を引起さず、そしてミトコンドリア膜電位を変えなかったことが示されている（Janaszewska et al., Nanomedicine NBM, 2013, 9, 461- 464）。一般的に、すべての３種の細胞系に関しては、デンドリマーは非毒性であった。そのような結果は、デンドリマーが細胞に侵入するか否かの疑問を生じさせる。この疑問に対処するために、同じ３種の齧歯細胞系に対する修飾されたＰＡＭＡＭ−ピロリドンデンドリマーの取り込みが行われた。デンドリマーが細胞に侵入するかどうかのモニタリングが、ピロリドン−修飾ＰＡＭＡＭデンドリマーのユニーク特性のおかげで可能であり：それらは、強い固有蛍光（λexc＝３７０ｎｍ、λmex em=４４０ｎｍ）を有する。
【０１４９】
本発明はさらに、次の実施例を考慮することにより、明確にされるが、それらは本発明の純粋な例示であることが意図される。
【実施例】
【０１５０】
実施例に使用される材料及び方法
材料
すべての化学試薬は、市販の供給元から購入された。
デンドリマーの合成のための溶媒は、Sigma−Aldrichから購入された。
すべての細胞培養試薬は、Gibco（商標）（Germany）から購入された。
インビトロ研究のためのフラスコ及び多ウェルプレートはNunc（Germany）から得られた。
共焦点顕微鏡のためのSensePlate（商標）９６−ウェルガラス底プレートは、Greiner Bio=One (USA)からであった。
ＰＢＳ及びＦＢＳは、Sigma-Aldrichから購入された。
トリパンブルーは、Molecular Probes (USA)から購入された。
NeuroDio及びRedDot1は、Biotium（USA）から購入された。
【０１５１】
チャイニーズハムスター線維芽細胞（B14；ATCC番号CCL−１４）細胞系は、ＡＴＣＣ（ＵＳＡ）から購入された。胚性マウス海馬細胞系（ｍＨｉｐｐｏＥ−１８）は、CEDARLANE Laboratories Limited (Canada)から購入された。ラット肝臓細胞系（ＢＲＬ−３Ａ）は、Banca Biologica e Cell Factory (Italy)から購入された。
【０１５２】
蛍光データは、Perkin- Elmer LS50B Luminescence分光計により取得した。一定のスリット幅（励起及び発光の両者−３ｎｍ）を使用し、そして濃度を調整し、スケール発光応答を得た。発光応答を、濃度で割り算し、１ｇ当たりの応答を与え、そして標準のフルオレセイン−Ｎａの相対的応答を、１，０００，０００に設定するために、倍率を掛けた。
Perkin Elmerからのフーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）１６００。
Anasazi 60 HMz NMR
【０１５３】
すべての生成物はまた、メタノール中、Sephadex LH−２０を用いて精製され得る。ここで使用されるカラムは、約４００ｇの無水Sephadex LH-20を有する。デンドリマーサンプルに使用される空隙容量は、３００ｍｌである。画分は、それぞれ、約１８ｍｌを、試験管（２０ｍｌの管）に採取した。それらの条件下で、Ｇ＝０は、最初、画分６又は７で出現し、そしてＧ＝５は、画分２又は３で出現する。画分を、シリカゲルＴＬＣプレートを用いてモニターする。プレート上に２本のラインを描き、各ラインを０．５ｃｍの間隔でマークし、そして各画分を、あらゆる他のマーク上にスポットする。プレートを、単にヨウ素チャンバーに配置する。生成物を含む画分を集め、そして回転蒸発器上で除く。
【０１５４】
一般的合成スキーム
ピロリドン末端ＰＡＭＡＭデンドリマーの合成を、Tomalia et al. (W02004/069878, published 19 August 2004)の方法により行った。国際公開２００４／０６９８７８号により記載される類似する事項において、すべての樹枝状ポリマー、例えばデンドロン、デンドリマー、デンドリグラフト、コア−シェルテクト（デンドリマー）、末端第一級アミンを有する超分枝ポリマーを、実施例１−２５を包含するこの方法で反応させることができる。次の表２及び実施例１においては、それらの化合物は、この方法により製造された。一般方法及び特定の例は、番号付けされている。比較例は文字にされている。実施例１は、類似する方法により、論じられた効用において試験された化合物を製造する方法を示す。
【０１５５】
実施例１：第一級アミンからのＮ−アルキル−４−カルボメトキシピロリジノンの一般的調製
カルボン酸に対して直交反応性を示す種々の官能基を含むモノ第一級アミン（すなわち、−ＮＨ２）を、対応する４−カルボン酸ピロリドンに、高収率で転換することができる。それらの生成物は、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋ装置を用いて、約１２５℃で、トルエンの存在下で種々の化学量論的量の第一級アミン及びカルボン酸を加熱することにより得られた。予測される化学量論的量の水の除去の後（約２〜３時間後）、生成物を、ＵＶ線（２６５〜３９５ｎｍ）に暴露される場合、若干のレベル／程度の蛍光を示す、吸湿性の粉末球固形物又は脆いガラス状物として得る。生成物を、ＦＴＩＲ、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及びＵＶ / 可視蛍光測定法により特徴づけた（図３Ｃ、化合物２６−３７、表２）。
【０１５６】
化学量論：［第一級アミン部分：ＩＴＡ］＝［１：１］は、式（Ｉ）の化合物を提供し、ここでＷは１であり；Ｒ２は−ＣＯ２Ｈであり；ｍは１であり；そしてＱはＸ−Ｒ−Ｎであり；そして［第一級アミン部分：ＩＴＡ／ＩＴＥ］＝［４：１］は、式（Ｉ）の化合物を提供し、ここでＷは１であり；Ｒ２は−ＣＯ２Ｈであり；ｍは１であり；そしてＱはＲ（Ｘ）Ｎであり、ここでＲはＣ２−Ｃ１８アルキレン、−（ＮＨＣＨ２ＣＨ２）ｎ、アリーレン、アルキルアリーレン、オリゴマー、大環状、融合された二環、線状ポリ（アミド）であり、ｎは０、１〜４であり；そしてＸは、−ＯＨ、−ＮＲ２、ＮＨＲ、−ＳＨ、−ＣＯ２Ｈである。それらの化合物をさらに反応せしめ、線状ポリマーにピロリドン環を含むポリマーを、又は２つのピロリドン部分を含む複素環式実体として形成することができる。より特定には、反応は次の通りに記載され得る。
【０１５７】
１５ｍｌのメタノールに溶解された０．５ｍｍｏｌの第一級アミンの溶液に、５０ｍｍｏｌのＤＭＩ（７．９ｇ）を添加した。溶液を、ＲＴで一晩、攪拌し、そして次に、溶媒を、真空下での蒸留により除去し、所望の生成物を得た。図３Ｃ上の構造、化合物番号２６−３７、及び表２中のデータを参照のこと。
【０１５８】
それらの中間体の続く反応は、ＰＥＧ及びポリ（オキサゾリン）タイプのオリゴマーに類似すると思われる、予測される線状−ポリ（アミド−ピロリドン）（ＰＡＭＰｙｒ）高分子を生成する。例えば、モノ−ＢＯＣ−ＮＲ（Ｘ）ＮＨ２開始剤単位、続くＤＭＩ及び過剰のＮＨ２Ｒ（Ｘ）ＮＨ２による線状反復成長により、数回の反復の後に下記に示される一般構造を有する高分子が得られる：
【０１５９】
【化２２】
2020063250.tif 000025
【０１６０】
しかしながら、得られる主要生成物タイプは、Ｒのスペーサー長に依存すると思われる。スペーサー長Ｒが長い場合、得られる主要生成物は、線状−ポリ（アミド−ピロリドン）（ＰＡＭＰｙｒ）高分子であると思われる。スペーサーＲが分子内環形成に適している場合、図３Ｄに示されるような融合された二環式ピロリドン生成物及び／又は大環状ピロリドン生成物（化合物４０及び４１）のいずれかを得ることができる。
【０１６１】
実施例２：第一級アミンからのＮ−アルキル−ピロリジノン−４−カルボン酸の一般的調製
５０ｍｍｏｌのＩＴＡ（６．５ｇ）に、５０ｍｍｏｌの第一級アミンを添加した。その混合物を、１２５℃で２時間、加熱した。その混合物を、メタノールと共に粉砕し、濾過により単離し、白色沈殿物を得た。
【０１６２】
実施例３：ｎ−アルキル−カルボメトキシピロリドンからのＮ−アルキル−ピロリジノン−４−（Ｎ−２−アミノエチル）カルボキサミドの一般的調製
メタノール（５０重量％）中、Ｎ−アルキル−４−カルボメトキシピロリドンの溶液を、攪拌しながら、過剰のＥＤＡ（１モルのエステル当たり２５モル）に添加した。その溶液を、ＲＴで４日間、維持した。過剰のＥＤＡを、真空下で除去し、続いて真空下でトルエンと共に共沸蒸留し、所望の生成物を得た。
【０１６３】
実施例４：Ｎ−アルキル−カルボメトキシピロリジノンからのＮ−アルキル−ピロリジノン−４−（Ｎ−２−（ビス（２−アミノエチル）アミノエチル）カルボキサミドの一般的調製
メタノール（５０重量％）中、Ｎ−アルキル−４−カルボメトキシピロリジノンの溶液を、攪拌しながら、過剰のＴＲＥＮ（１モルのエステル当たり２５モル）に添加した。その溶液を、ＲＴで４日間、維持した。過剰のＴＲＥＮを、水による希釈により除去し、そして１ｋＤａのカットオフ再生セルロース膜を用いて限外濾過し、所望する生成物を得た。
【０１６４】
注目：上記のように、第一級アミンとＤＭＩとを反応させ、４−（Ｎ−２−（ビス（２−アミノエチル）アミノエチル）カルボキサミドピロリドンを得、続いて過剰のＴＲＥＮと反応させることから成る反復順序の使用が、一連のＰＡＭＰｙｒＡＭデンドロンについての生成順序を生成する。それらのデンドロンは、カテゴリー（ＩＶ）；[コア]；樹枝状ポリ（アミド）ピロリドンアミンデンドロンにより図１０に表される。
【０１６５】
実施例５：第一級ジアミンからのポリマーＮ−アミノアルキル−ピロリジノン−４−（Ｎ−アミノアルキル）カルボキサミドの一般的調製
１５ｍｌのメタノールに溶解された、５０ｍｍｏｌの第一級ジアミン（例えば、ＥＤＡ３．０ｇ）の溶液に、５０ｍｍｏｌのＤＭＩ（７．９ｇ）を添加した。その溶液を、ＲＴで４時間、攪拌し、そして次に、溶媒を、真空下での蒸留により除去し、所望する生成物を得た。
【０１６６】
２モルのジアミンと、１モルのイタコン酸との化学量論的反応由来の２，４−ジアミノピロリドンを、１モルのアミノ酸と、イタコン酸との反応由来する２，４−ジカルボン酸ピロリドンと組合して、中間体として使用することができ、ポリ（エチレングリコール）の線状−ポリ（アミド−ピロリドン）模倣体であると思われる、その対応する線状−アミド−ピロリドン（すなわち、アミド−ピロリドンナイロン）を生成する。（図３Ｄ、化合物３８及び３９を参照のこと）。
【０１６７】
第一級アミン部分：イタコン酸／エステル＝４：１の化学量論では、その対応する二置換ピロリドン（すなわち、２−（ＮＨ２−Ｒ（Ｘ））−４−（ＣＯＮＨ−Ｒ（Ｘ）−ＮＨ２）ピロリドン）を、下記のようにして得ることができる：
ＮＨ２−Ｒ（Ｘ）ＮＨ２＋イタコン酸／エステル→２−（ＮＨ２−Ｒ（Ｘ））−４−（ＣＯＮＨ−Ｒ（Ｘ）−ＮＨ２）ピロリドン
【０１６８】
それらの２，４−二置換ピロリドン生成物の例は、図３Ｄ、化合物４２及び４３に示される。
【０１６９】
第一級アミン表面デンドリマー及びジメチルイタコネーとからのＰＡＭＡＭピロリジノン表面の調製
【０１７０】
実施例６：[コア：ＤＡＢ]；（４→２）；デンドリ−{ポリ（アミドアミン）−（Ｐｙｒ−４−ＣＯ２Ｍｅ）４}；（Ｇ＝０）；ＰＡＭＡＭデンドリマー；ＭＷ＝１０４９
５℃に冷却されたメタノール５ｍｌ中、ＤＭＩ（１．３ｇ、８．２ｍｍｏｌ、１０％過剰）の攪拌混合物に、２〜３分間にわたって、メタノール５ｍｌ中、[ＤＡＢコア]；デンドリ−｛ポリ（アミドアミン）−（ＮＨ２）４｝；（Ｇ＝Ｏ）；（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー（１．０ｇ、１．８ｍｍｏｌ、７．３ｍｍｏｌのアミノ基）の溶液を滴下した。その混合物を、ＲＴに暖め、そして２４時間、攪拌した。反応混合物を、ＴＬＣプレート上にスポットし、そしてニンヒドリン溶液により染色し、負の試験を得た。反応混合物を、Ｂｕｃｈi回転蒸発器を用いて揮発物を除去した。得られる残渣を、１０ｍｌの水に溶解し、そしてジエチルエーテル（３×５ｍｌ）により洗浄した。水性層を、揮発物から除去し、そして得られる残渣を、１０ｍｌのメタノールに再溶解した。揮発物を、Ｂｕｃｈｉ回転蒸発器を用いて、このサンプルから除去した。この工程を３度、反復し、高い真空下での最終溶媒除去の後、以下のスペクトルを有する１．８ｇ（９６％の収率）の標記化合物を得た：
【０１７１】
13CNMR (75MHz, D20) δ 23.32, 32.00, 33.72, 35.62, 36.22, 41.94, 48.64, 49.55, 52.35, 52.79, 174.55, 175.43, 176.75。
【０１７２】
実施例７：［コア：ＤＡＢ]；（４→２）；デンドリ−{ポリ（アミドアミン）−（Ｐｙｒ−４−ＣＯ２Ｍｅ）４}；（Ｇ＝１）；ＰＡＭＡＭデンドリマー；ＭＷ＝２４６６
５℃に冷却されたメタノール５ｍｌ中、ＤＭＩ（１．９ｇ、１２ｍｍｏｌ、１０％過剰）の攪拌混合物に、２〜３分間にわたって、メタノール５ｍｌ中、[ＤＡＢコア]；デンドリ−｛ポリ（アミドアミン）−（ＮＨ２）８｝；（Ｇ＝１）；（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー（２．０ｇ、１．４ｍｍｏｌ、１１ｍｍｏｌのアミノ基）の溶液を滴下した。この混合物を、ＲＴに暖め、そして２４時間、攪拌した。反応混合物を、ＴＬＣプレート上にスポットし、そしてニンヒドリン溶液により染色し、負の試験を得た。反応混合物を、回転蒸発器を用いて揮発物を除去し、そして得られる残渣を、１０ｍｌの水に溶解した。この混合物を、ジエチルエーテル（３×５ｍｌ）により洗浄した。水性層を、揮発物から除去し、そして得られる残渣を、１０ｍｌのメタノールに再溶解した。揮発物を、回転蒸発器を用いて除去した。この工程を３度、反復し、高い真空下での最終溶媒除去の後、以下のスペクトルを有する３．３ｇ（９５％の収率）の標記化合物を得た：
【０１７３】
13CNMR (75MHz,D20) δ 23.32, 32.41, 33.74, 35.66, 36.25, 36.61, 41.96, 48.79, 49.83, 51.08, 52.80, 174.69, 175.42, 176.73。
【０１７４】
実施例８：［コア：ＤＡＢ]；（４→２）；デンドリ−{ポリ（アミドアミン）−（Ｐｙｒ−４−ＣＯ２Ｍｅ）１６}；（Ｇ＝２）；ＰＡＭＡＭデンドリマー；ＭＷ＝５３００
５℃で冷却されたメタノール１０ｍｌ中、ＤＭＩ（２．５ｇ、１６ｍｍｏｌ、１０％過剰）の攪拌混合物に、２〜３分間にわたって、メタノール１５ｍｌ中、[ＤＡＢコア]；デンドリ−｛ポリ（アミドアミン）−（ＮＨ２）８｝；（Ｇ＝２）；（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー（３．０ｇ、０．９１ｍｍｏｌ、１４．６ｍｍｏｌのアミノ基）の溶液を滴下した。この混合物を、ＲＴに暖め、そして２４時間、攪拌した。反応混合物を、ＴＬＣプレート上にスポットし、そしてニンヒドリン溶液により染色し、負の試験を得た。反応混合物を、回転蒸発器を用いて揮発物を除去し、そして得られる残渣を、２０ｍｌの水に溶解した。この混合物を、ジエチルエーテル（３×５ｍｌ）により洗浄した。水性層を、揮発物から除去し、そして得られる残渣を、１０ｍｌのメタノールに再溶解した。揮発物を、回転蒸発器を用いて除去した。この工程を３度、反復し、高い真空下での最終溶媒除去の後、４．６ｇ（９５％の収率）の標記化合物を得た。
【０１７５】
第二の精製工程において、反応混合物を、メタノールにおいて１００ｍｌに希釈し、そして限外濾過し、１０００分子量カットオフの再生セルロース膜を含む正接流限外濾過装置を用いて、８つの保持量の透過物を得た。保持物を、回転蒸発器を用いて揮発物を除去し、続いて高い真空下で除去し、４．６ｇ（９５％の収率）の標記化合物を得た。
【０１７６】
標記化合物は、次のスペクトルを有する：
13CNMR(75MHz,D20)δ32.38, 33.70, 35.59, 36.20, 36.55, 41.92, 48.73, 48.81, 49.52, 51.06, 52.74, 174.38, 174.63, 175.35, 176.68。
【０１７７】
実施例９：［コア：ＤＡＢ]；（４→２）；デンドリ−{ポリ（アミドアミン）−（Ｐｙｒ−４−ＣＯ２Ｍｅ）３２}；（Ｇ＝３）；ＰＡＭＡＭデンドリマー；ＭＷ＝１０９６９
５℃で冷却されたメタノール１５ｍｌ中、ＤＭＩ（３．２ｇ、２０．３ｍｍｏｌ、１０％過剰）の攪拌混合物に、２〜３分間にわたって、メタノール１５ｍｌ中、ＰＡＭＡＭデンドリマー、ＤＡＢコア、Ｇ＝０（４．０ｇ、０．５８ｍｍｏｌ、１８．５ｍｍｏｌのアミノ基）を滴下した。この混合物を、ＲＴに暖め、そして２４時間、攪拌した。反応混合物を、ＴＬＣプレート上にスポットし、そしてニンヒドリン溶液により染色し、負の試験を得た。反応混合物を、回転蒸発器を用いて揮発物を除去し、そして得られる残渣を、３０ｍｌの水に溶解した。この混合物を、ジエチルエーテル（３×５ｍｌ）により洗浄した。水性層を、回転蒸発器を用いて、揮発物から除去し、続いて高い真空下で除去し、６．０ｇ（９４％の収率）の標記化合物を得た。
【０１７８】
第二の精製工程において、反応混合物を、メタノールにおいて１００ｍｌに希釈し、そして限外濾過し、１０００分子量カットオフの再生セルロース膜を含む正接流限外濾過装置を用いて、８つの保持量の透過物を得た。保持物を、回転蒸発器を用いて揮発物を除去し、続いて高い真空下で除去し、６．０ｇ（９４％の収率）の標記化合物を得た。
【０１７９】
標記化合物は、次のスペクトルを有する：
13CNMR (75MHz,D 20)δ32.43, 32.60, 33.71, 35.62, 36.22, 36.60, 41.95, 48.76, 48.84, 48.94, 49.54, 51.08, 52.77, 174.35, 174.63, 175.33, 176.65。
【０１８０】
実施例１０：［コア：ＤＡＢ]；（４→２）；デンドリ−{ポリ（アミドアミン）−（Ｐｙｒ−４−ＣＯ２Ｍｅ）６４}；（Ｇ＝３）；ＰＡＭＡＭデンドリマー；ＭＷ＝２２，３０７
５℃で冷却されたメタノール２０ｍｌ中、ＤＭＩ（４．７ｇ、３０ｍｍｏｌ、１０％過剰）の攪拌混合物に、２〜３分間にわたって、メタノール２５ｍｌ中、ＰＡＭＡＭデンドリマー、ＤＡＢコア、Ｇ＝０（６．０ｇ、０．２４ｍｍｏｌ、２７ｍｍｏｌのアミノ基）を滴下した。この混合物を、ＲＴに暖め、そして２４時間、攪拌した。反応混合物を、ＴＬＣプレート上にスポットし、そしてニンヒドリン溶液により染色し、負の試験を得た。反応混合物を、回転蒸発器を用いて揮発物を除去し、そして得られる残渣を、３０ｍｌの水に溶解した。この混合物を、ジエチルエーテル（３×５ｍｌ）により洗浄した。水性層を、揮発物から除去し、８．９ｇ（９５％の収率）の標記化合物を得た。
【０１８１】
第二の精製工程において、反応混合物を、メタノールにおいて１００ｍｌに希釈し、そして限外濾過し、１０００分子量カットオフの再生セルロース膜を含む正接流限外濾過装置を用いて、８つの保持量の透過物を得た。保持物を、回転蒸発器を用いて揮発物を除去し、続いて高い真空下で除去し、８．９ｇ（９５％の収率）の標記化合物を得た。
【０１８２】
標記化合物は、次のスペクトルを有する：
13CNMR(75MHz,D20)δ32.45, 32.60, 33.71, 35.62, 36.22, 36.60, 41.95, 48.76,48.84, 48.94, 49.52, 51.08, 52.77, 174.32, 174.60, 175.28, 176.61。
【０１８３】
［ＤＡＢ：コア］；デンドリ−｛ポリ（アミドアミン）−（４−アミドエチルアミンピロリドン）ｚ｝；（Ｇ＝０−５）；ＰＡＭＡＭデンドリマーの調製
【０１８４】
実施例１１：［コア：ＤＡＢ]；（４→２）；デンドリ−{ポリ（アミドアミン）−（Ｐｙｒ−４−ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）４}；（Ｇ＝０）；ＰＡＭＡＭデンドリマー
攪拌棒を含む、２５０ｍｌの丸底フラスコに、５７ｇの８０％ＥＤＡ−２０％メタノール混合物（ｗ／ｗ、エステル当たり１００当量）を添加した。この混合物を８℃に冷却し、そしてＰＡＭＡＭデンドリマー、ＤＡＢコア、Ｇ＝０ピロリジノン表面（ＭＷ＝１０４９）（２．０ｇ、１．９１ｍｍｏｌ、７．６ｍｍｏｌのエステル）のメタノールに溶液を、約１−２分間にわたって、添加した。この得られる混合物を、ＲＴに暖め、そして２日間、攪拌した。この材料の赤外線スペクトル（高真空下でアリコートを排気する）は、反応が、１７３８ｃｍ−１でエステルカルボニル基の消出から決定されるように、約９５％完結したことを示唆した。この混合物を、回転蒸発器上で揮発物を除去した。得られる残渣を、１５ｍｌのメタノールに溶解し、そして４０ｍｌのトルエンを添加し、そして混合し、均質溶液を形成した。この混合物を、回転蒸発器上で除き、混合物からＥＤＡを共沸した。この工程を、６回、反復するか、又はＴＬＣ（シリカゲル、メタノール中、１０％のＮＨ４ＯＨ）が、ヨウ素チャンバーにおける乾燥ＴＬＣプレートの進展によるＥＤＡの不在を示すまで、反復した。この混合物をメタノールに溶解し、そして濾過し、そして回転蒸発器上で、続いて高真空下で、５０℃で１時間、揮発物を除き、以下のスペクトルを有する、２．１ｇ（９５％）（ＭＷ＝１１６１）の生成物を得た：
【０１８５】
13CNMR (75MHz,D20)δ23.64, 32.32, 34.54, 36.17, 36.61, 39.55, 41.71, 41.92,48.58, 48.76, 50.28, 52.35, 174.89, 175.45,176.87。
【０１８６】
実施例１２：［コア：ＤＡＢ]；（４→２）；デンドリ−{ポリ（アミドアミン）−（Ｐｙｒ−４−ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）８}；（Ｇ＝１）；ＰＡＭＡＭデンドリマー
この生成物を、ＰＡＭＡＭデンドリマー、ＤＡＢコア、Ｇ＝１  ピロリジノンメトキシエステル（ＭＷ＝２４６６）（２ｇ、０．８１ｍｍｏｌ／エステル）、９７ｇの８０％ＥＤＡ−２０％メタノールの混合物、Ｗ／Ｗ、２００当量／エステルを用いて、ＰＡＭＡＭデンドリマー、ＤＡＢコア、Ｇ＝０  ピロリジノンアミドエチルアミンと同じ方法で調製し、以下のスペクトルを有する、２．０ｇ（９５％の収率）の標記化合物を得た：
【０１８７】
13CNMR(75MHz,D20)δ 23.71, 32.29, 32.42, 34.48, 36.14, 36.64, 39.56, 40.15, 41.25, 41.33, 41.91, 48.70, 48.74, 50.22, 50.96, 52.44, 174.52, 174.74, 175.42, 175.80。
【０１８８】
実施例１３：［コア：ＤＡＢ]；（４→２）；デンドリ−{ポリ（アミドアミン）−（Ｐｙｒ−４−ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）１６}；（Ｇ＝２）；ＰＡＭＡＭデンドリマー
【０１８９】
【化２３】
2020063250.tif 000026
【０１９０】
この生成物を、ＰＡＭＡＭデンドリマー、ＤＡＢコア、Ｇ＝２  ピロリジノンメトキシエステル（ＭＷ＝２４６６）（２ｇ、０．８１ｍｍｏｌ、０．６．５ｍｍｏｌのエステル）、９７ｇの８０％ＥＤＡ−２０％メタノールの混合物、Ｗ／Ｗ、２００当量／エステルを用いて、ＰＡＭＡＭデンドリマー、ＤＡＢコア、Ｇ＝０  ピロリジノンアミドエチルアミンと同じ方法で調製し、以下のスペクトルを有する、２．１ｇ（９７％の収率）の標記化合物を得た：
【０１９１】
13CNMR (75MHz,D20)δ 32.51, 32.51, 34.54, 36.20, 36.61, 39.65, 41.54, 41.59, 41.95, 48.82, 48.94, 50.21, 51.08, 174.46, 174.75, 175.42, 175.03。
【０１９２】
実施例１４：［コア：ＤＡＢ]；（４→２）；デンドリ−{ポリ（アミドアミン）−（Ｐｙｒ−４−ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）３２}；（Ｇ＝３）；ＰＡＭＡＭデンドリマー
【０１９３】
【化２４】
2020063250.tif 000027
【０１９４】
この生成物を、ＰＡＭＡＭデンドリマー、ＤＡＢコア、Ｇ＝３  ピロリジノンカルボメトキシエステル（ＭＷ＝１０９６９）（３ｇ、０．２７ｍｍｏｌ、８．７ｍｍｏｌのエステル）、５２２ｇの８０％ＥＤＡ−２０％メタノールの混合物、ｗ／ｗ、８００当量／エステルを用いて、ＰＡＭＡＭデンドリマー、ＤＡＢコア、Ｇ＝０  ピロリジノンアミドエチルアミンと同じ方法で調製し、以下のスペクトルを有する、３．０ｇ（９３％の収率）の標記化合物を得た：
【０１９５】
13CNMR (75MHz,D20) δ32.52, 32.55, 34.55, 36.22, 36.61, 39.66, 41.71, 41.56, 41.95, 48.83, 50.29, 51.11, 174.42, 174.72, 175.41, 175.80。
【０１９６】
実施例１５：［コア：ＤＡＢ]；（４→２）；デンドリ−{ポリ（アミドアミン）−（Ｐｙｒ−４−ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）６４}；（Ｇ＝４）；ＰＡＭＡＭデンドリマー
【０１９７】
【化２５】
2020063250.tif 000028
【０１９８】
この生成物を、ＰＡＭＡＭデンドリマー、ＤＡＢコア、Ｇ＝４  ピロリジノンメトキシエステル（ＭＷ＝２２３０７）（２ｇ、０．０９ｍｍｏｌ、５．７ｍｍｏｌのエステル）、７１４ｇの８０％ＥＤＡ−２０％メタノールの混合物、ｗ／ｗ、１６００当量／エステルを用いて、ＰＡＭＡＭデンドリマー、ＤＡＢコア、Ｇ＝０  ピロリジノンアミドエチルアミンと同じ方法で調製し、以下のスペクトルを有する、２．０ｇ（９２％の収率）の標記化合物を得た：
【０１９９】
13CNMR (75MHz,D20)δ32.52, 34.55, 36.20, 36.61, 39.70, 41.62, 41.65, 41.95、48.78, 48.83, 50.29, 51.11, 174.38, 174.69, 175.36, 175.77。
【０２００】
実施例１６：［コア：ＤＡＢ]；（４→２）；デンドリ−{ポリ（アミドアミン）−（Ｐｙｒ−４−ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）１２８}；（Ｇ＝５）；ＰＡＭＡＭデンドリマー
【０２０１】
【化２６】
2020063250.tif 000029
【０２０２】
この生成物を、ＰＡＭＡＭデンドリマー、ＤＡＢコア、Ｇ＝５ ピロリジノンメトキシエステル（ＭＷ＝４４７８２）（１．５ｇ、０．０３ｍｍｏｌ、４．２ｍｍｏｌのエステル）、１０２４ｇの８０％ＥＤＡ−２０％メタノールの混合物、ｗ／ｗ、３２００当量／エステルを用いて、ＰＡＭＡＭデンドリマー、ＤＡＢコア、Ｇ＝０ ピロリジノンアミドエチルアミンと同じ方法で調製し、以下のスペクトルを有する、１．４５ｇ（９１％の収率）の標記化合物を得た：
【０２０３】
13CNMR(75MHz,D20)δ 32.64, 34.55, 36.20, 36.61, 39.73, 41.66, 41.95, 48.76, 48.87, 50.28, 51.16, 174.32, 174.64, 175.30, 176.72。
【０２０４】
ＰＡＭＡＭデンドリマー、ＤＡＢコア、ピロリジノン−３−カルボアミドエチルアミノ−Ｎ，Ｎ′−ビス−エチルアミン表面の調製
【０２０５】
実施例１７：［コア：ＤＡＢ]；（４→２）；デンドリ−{ポリ（アミドアミン）−（Ｐｙｒ−４−ＣＯＮＨ−ＴＲＥＮ)１６}；（Ｇ＝２）；ＰＡＭＡＭデンドリマー
【０２０６】
【化２７】
2020063250.tif 000030
【０２０７】
この生成物を、ＴＲＥＮ（２２ｇ、１５１ｍｍｏｌ、５０当量／エステル）及び６ｇのメタノールの混合物に、８℃で添加された、３ｍｌのメタノールに溶解された、ＰＡＭＡＭデンドリマー、ＤＡＢコア、Ｇ＝２；ピロリジノンカルボメトキシエステル（ＭＷ＝５３００）（１ｇ、０．１９ｍｍｏｌ、３ｍｍｏｌのエステル）を含む１００ｍｌの丸底フラスコにおいて調製した。この混合物を、２５℃で４日間、攪拌した。この材料の赤外スペクトルは、１７３５ｃｍ−１でのエステルカルボニル周波数の完全な消出を示した。この混合物を、メタノールにより希釈し、３〜５％溶液を得、そして８〜１０回の保持再循環又は２４００−３０００ｍｌのために、又はＴＬＣ（メタノール中、２０％ＮＨ４ＯＨ）がＴＲＥＮの不在を示すまで、１Ｋ再生セルロース膜を含む正接流限外濾過装置を用いて精製した。揮発物を、回転蒸発器を用いて除去した。残渣をメタノールに溶解し、そして得られる混合物を、回転蒸発器上で、合計３回、揮発物を除去した。この残渣を、高真空下で４０℃で約２時間、排気し、８．７ｇ（９３％の収率）の所望する生成物（ＭＶ＝６２９５）を、白色固形物として得た。透析された混合物を、回転蒸発器上で揮発物を排気した。残渣を、メタノールに再溶解し、続いて揮発物を３度、除き、そして高真空下で４０℃で１時間、排気し、１．２（９７％の収率）の、次のスペクトルを有する標記化合物を得た。
【０２０８】
13CNMR(75MHz,D20)δ32.51, 35.54, 36.22, 36.58, 36.87, 37.71, 41.98, 48.78, 50.24, 51.11, 52.42, 55.47, 174.53, 174.73, 175.07, 175.79。
【０２０９】
ＰＡＭＡＭデンドリマーピロリドンカルボン酸ナトリウム表面の調製
【０２１０】
実施例１８：［コア：ＤＡＢ]；（４→２）；デンドリ−{ポリ（アミドアミン）−（Ｐｙｒ−４−Ｃ０２ − Ｎａ＋) １６ }；（Ｇ＝２）；ＰＡＭＡＭデンドリマー
この生成物を、４ｍｌの脱イオン水に溶解された炭酸ナトリウム一水和物（ＭＷ＝１２４）（４５０ｍｇ、３．６ｍｍｏｌ、１．３等量/エステル）に添加された、３ｍｌの脱イオン水に溶解されたＰＡＭＡＭデンドリマー、ＤＡＢコア、Ｇ＝２  ピロリジノンメトキシエステル（ＭＷ＝５３００）（１ｇ、０．１９ｍｍｏｌ、３ｍｍｏｌのエステル）を用いて、攪拌棒を含む２５ｍｌの丸底フラスコにおいて調製した。この混合物を、２５℃で３日間、攪拌した。この材料の赤外スペクトルは、１７３５ｃｍ−１でのエステルカルボニル周波数の完全な消出を示した。この混合物を、脱イオン水により希釈し、３〜５％溶液を得、そして１０００分子量カットオフを有する再生セルロース膜において透析した。２５０ｍｌの透析液を、交換の間、２〜１８時間で１０回、交換した。透析された混合物を、回転蒸発器上で揮発物を排気した。残渣を、メタノールに溶解し、続いて揮発物を３度、除去し、そして高真空下で４０℃で１時間、排気し、次のスペクトルを有する、１．９ｇ（９７％の収率）の標記化合物を得た。
【０２１１】
13CNMR(75MHz,D20)δ32.25, 35.15, 36.35, 38.53, 41.91, 48.87, 51.05, 51.20, 174.40, 174.58, 176.77, 180.98。
【０２１２】
ＰＡＭＡＭデンドリマーピロリドンアミドエタノール表面の調製
【０２１３】
実施例１９：［コア：ＤＡＢ]；（４→２）；デンドリ−{ポリ（アミドアミン）−（Ｐｙｒ−４−ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）４}；（Ｇ＝０）；ＰＡＭＡＭデンドリマー
攪拌棒を含む、２５０ｍｌの丸底フラスコに、３７ｇの８０％ＥＤＡ−２０％メタノール混合物（ｗ／ｗ、エステル当たり１００当量）を添加した。この混合物を８℃に冷却し、そしてＰＡＭＡＭデンドリマー、ＤＡＢコア、Ｇ＝０ピロリジノン表面（ＭＷ＝２４６６）（１．５ｇ、０．６１ｍｍｏｌ、４．９ｍｍｏｌのエステル）のメタノールに溶液を、約１−２分間にわたって、添加した。この得られる混合物を、ＲＴに暖め、そして２日間、攪拌した。この材料の赤外線スペクトル（高真空下でアリコートを排気する）は、反応が、１７３８ｃｍ−１でエステルカルボニル基の消出から決定されるように、約９５％完結したことを示唆した。この混合物を、高い真空及び１２０℃のポット温度で、ｂｕｌｂ−ｔｏ−ｂｕｓｂ蒸留装置を用いてＥＡを除いた。ほとんどのＥＡを蒸留し、粘性の残渣を残した。この残渣を、メタノールに溶解し、３０％ｗ／ｗ溶液を得、そしてメタノール中、Sephadex LH-20カラム上に負荷した。空隙間用量が終了した後、合計２０画分を、それぞれ２０ｍｌで回収した。画分を、ＴＬＣプレート上にスポットし、そしてヨウ素チャンバーにおいて展開することにより、モニターした。画分６−１１を集め、揮発物を除き、以下のスペクトルを有する、１．４４ｇ（９５％の収率）（ＭＷ＝２４７４）の標記化合物を得た：
【０２１４】
13CNMR (75MHz,D20)δ23.64, 32.02, 32.51, 34.55, 36.23, 36.60, 39.55, 41.57, 41.98, 48.84, 50.33, 51.06, 52.53, 59.91, 174.41, 174.80, 175.44, 175.91。
【０２１５】
実施例２０：［コア：ＤＡＢ]；（４→２）；デンドリ−{ポリ（アミドアミン）−（Ｐｙｒ−４−ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）８}；（Ｇ＝１）；ＰＡＭＡＭデンドリマー
攪拌棒を含む、２５０ｍｌの丸底フラスコに、３７ｇの８０％ＥＤＡ−２０％メタノール混合物（ｗ／ｗ、エステル当たり１００当量）を添加した。この混合物を８℃に冷却し、そしてＰＡＭＡＭデンドリマー、ＤＡＢコア、Ｇ＝１ピロリジノン表面（ＭＷ＝２４６６）（１．５ｇ、０．６１ｍｍｏｌ、４．９ｍｍｏｌのエステル）のメタノールに溶液を、約１−２分間にわたって、添加した。この得られる混合物を、ＲＴに暖め、そして２日間、攪拌した。この材料の赤外線スペクトル（高真空下でアリコートを排気する）は、反応が、１７３８ｃｍ−１でエステルカルボニル基の消出から決定されるように、約９５％完結したことを示唆した。この混合物を、高い真空及び１２０℃のポット温度で、ｂｕｌｂ−ｔｏ−ｂｕｓｂ蒸留装置を用いてＥＡを除いた。ほとんどのＥＡを蒸留し、粘性の残渣を残した。この残渣を、メタノールに溶解し、３０％ｗ／ｗ溶液を得、そしてメタノール中、Sephadex LH-20カラム上に負荷した。空隙間用量が終了した後、合計２０画分を、それぞれ２０ｍｌで回収した。画分を、ＴＬＣプレート上にスポットし、そしてヨウ素チャンバーにおいて展開することにより、モニターした。画分６−１１を集め、揮発物を除き、以下のスペクトルを有する、１．４４ｇ（９５％の収率）（ＭＷ＝２４７４）の標記化合物を得た：
【０２１６】
13CNMR(75MHz,D 20) δ 23.51, 32.19, 32.48, 34.54, 36.23, 36.58, 41.56, 41.93、48.72, 48.82, 50.32, 51.05, 59.79, 174.40, 174.44, 175.90。
【０２１７】
実施例２１：［コア：ＤＡＢ]；（４→２）；デンドリ−{ポリ（アミドアミン）−（Ｐｙｒ−４−ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）１６}；（Ｇ＝２）；ＰＡＭＡＭデンドリマー
【０２１８】
【化２８】
2020063250.tif 000031
【０２１９】
この生成物を、５ｇの８０％ＥＡ−２０％メタノールの混合物（ｗ・w）、約１０当量のアミン/エステルに添加される、８ｍｌノメタノールに溶解された、ＰＡＭＡＭデンドリマー、ＤＡＢコア、Ｇ＝２；ピロリジノンメトキシエステル（ＭＷ＝５３００）（２ｇ、０．３８ｍｍｏｌ、６．０ｍｍｏｌのエステル）を含む２５ｍｌの丸底フラスコにおいて調製した。この混合物を、２５℃で３日間、攪拌した。この材料の赤外スペクトルは、１７３５ｃｍ−１でのエステルカルボニル周波数の完全な消出を示した。この混合物を、脱イオン水により希釈し、３〜５％溶液を得、そして１０００分子量カットオフを有する再生セルロース膜により透析した。１Ｌの透析液を、交換の間、２〜１８時間で１０回、交換した。透析された混合物を、回転蒸発器上で揮発物を排気した。残渣を、メタノールに再溶解し、続いて揮発物を３度、除去し、そして４０℃で１時間、高い真空下で排気し、２．１ｇ（９７％の収率）の標記化合物を得た。
【０２２０】
実施例２２：［コア：ＤＡＢ]；（４→２）；デンドリ−{ポリ（アミドアミン）−（Ｐｙｒ−４−ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）３２}；（Ｇ＝３）；ＰＡＭＡＭデンドリマー
この生成物を、８ｍｌのメタノールに溶解された、ＰＡＭＡＭデンドリマー、ＤＡＢコア、Ｇ＝３ピロリジノンメトキシエステル（ＭＷ＝１０９６９）（２ｇ、０．１８ｍｍｏｌ、５．８ｍｍｏｌのエステル）を用いて調製し、そして５ｇの８０％ＥＡ−２０％メタノール混合物（ｗ／ｗ）、１０当量のアミン／エステルに添加した。この混合物を、２５℃で３日間、攪拌した。この材料の赤外スペクトルは、１７３５ｃｍ−１でのエステルカルボニル周波数の完全な消失を示した。この混合物を、脱イオン水により希釈し、３−６％溶液を得、そして１０００分子量カットオフを有する再生セルロース膜により透析した。１Ｌの透析液を、交換の間、２−１８時間で、１０回、交換した。透析された混合物を、回転蒸発器上で揮発物を排気した。残渣を、メタノールに再溶解し、続いて揮発物を３回、除去し、そして高真空下で、４０℃で１時間、排気し、以下のスペクトルを有する、２．１ｇ（９７％の収率）の標記化合物を得た：
【０２２１】
13CNMR(75MHz,D 20)δ32.60, 34.55, 36.23, 36.61, 41.71, 41.59, 41.95, 48.79, 48.84, 48.97, 52.32, 174.43, 174.74, 175.38, 176.85。
【０２２２】
実施例２３：［コア：ＤＡＢ]；（４→２）；デンドリ−{ポリ（アミドアミン）−（Ｐｙｒ−４−ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）６４}；（Ｇ＝４）；ＰＡＭＡＭデンドリマー
この生成物を、８ｍｌのメタノールに溶解された、ＰＡＭＡＭデンドリマー、ＤＡＢコア、Ｇ＝４ピロリジノンメトキシエステル（ＭＷ＝２２，３０７）（２ｇ、０．０９ｍｍｏｌ、５．７ｍｍｏｌのエステル）を用いて調製し、そして５ｇの８０％ＥＡ−２０％メタノール混合物（ｗ／ｗ）、１０当量のアミン／エステルに添加した。この混合物を、２５℃で３日間、攪拌した。この材料の赤外スペクトルは、１７３５ｃｍ−１でのエステルカルボニル周波数の完全な消失を示した。この混合物を、脱イオン水により希釈し、３−５％溶液を得、そして１０００分子量カットオフを有する再生セルロース膜により透析した。１Ｌの透析液を、交換の間、２−１８時間で、１０回、交換した。透析された混合物を、回転蒸発器上で揮発物を排気した。残渣を、メタノールに再溶解し、続いて揮発物を３回、除去し、そして高真空下で、４０℃で１時間、排気し、以下のスペクトルを有する、２．１ｇ（９７％の収率）の標記化合物を得た：
【０２２３】
13CNMR(75MHz,D20)δ32.52, 34.55, 36.23, 36.58, 41.61, 41.95, 48.85, 48.96, 50.30, 59.91, 174.34, 174.40, 174.71, 175.33, 175.80。
【０２２４】
実施例２４：［コア：ＤＡＢ]；（４→２）；デンドリ−{ポリ（アミドアミン）−（Ｐｙｒ−４−ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）１２８}；（Ｇ＝５）；ＰＡＭＡＭデンドリマー
この生成物を、８ｍｌのメタノールに溶解された、ＰＡＭＡＭデンドリマー、ＤＡＢコア、Ｇ＝５ピロリジノンメトキシエステル（ＭＷ＝４４９８２）（２ｇ、０．０４ｍｍｏｌ、５．７ｍｍｏｌのエステル）を用いて調製し、そして７５ｇの８０％ＥＡ−２０％メタノール混合物（ｗ／ｗ）、１０当量のアミン／エステルに添加した。この混合物を、２５℃で３日間、攪拌した。この材料の赤外スペクトルは、１７３５ｃｍ−１でのエステルカルボニル周波数の完全な消失を示した。この混合物を、脱イオン水により希釈し、３−５％溶液を得、そして１０００分子量カットオフを有する再生セルロース膜により透析した。１Ｌの透析液を、交換の間、２−１８時間で、１０回、交換した。透析された混合物を、回転蒸発器上で揮発物を排気した。残渣を、メタノールに再溶解し、続いて揮発物を３回、除去し、そして高真空下で、４０℃で１時間、排気し、２．１ｇ（９７％の収率）の標記化合物を得た。
【０２２５】
ＰＡＭＡデンドリマー、[ＤＡＢコア]、（Ｇ＝１）ピロリジノンアミドエチルピロリジノン表面の調製：ＰＡＭＡＭデンドリマーにおけるピロリジノンカルボメトキシ表面のピロリジノンアミドエチルアミン表面への転換のための構造の証明
【０２２６】
実施例２５：［コア：ＤＡＢ]；（４→２）；デンドリ−{ポリ（アミドアミン）−（Ｐｙｒ−４−ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）８}；（Ｇ＝１）；ＰＡＭＡＭデンドリマー
この生成物を、ＰＡＭＡＭデンドリマー、ＤＡＢコア、Ｇ＝１  ピロリジノンメトキシエステル（ＭＷ＝２４６６）（２ｇ、０．８１ｍｍｏｌ、６．５ｍｍｏｌのエステル）、９７ｇの８０％ＥＤＡ−２０％メタノールの混合物、ｗ／ｗ、２００当量／エステルを用いて、ＰＡＭＡＭデンドリマー、ＤＡＢコア、Ｇ＝０  ピロリジノンアミドエチルアミンと同じ方法で調製し、以下のスペクトルを有する９１％の収率での標記化合物を得た：
【０２２７】
13CNMR(75MHz,D20)δ23.71, 32.29, 32.42, 34.48, 36.14, 36.64, 39.56, 40.15, 41.25, 41.33, 41.91, 48.70, 48.74, 50.22, 50.96, 52.44, 174.52, 174.74, 175.42, 175.80。
【０２２８】
実施例２６：［コア：ＤＡＢ]；（４→２）；デンドリ−{ポリ（アミドアミン）−（Ｐｙｒ−４−ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２−Ｎ−Ｐｙｒ−４−ＣＯＭｅ）８}；（Ｇ＝１）；ＰＡＭＡＭデンドリマー
ＰＡＭＡＭデンドリマー、ＤＡＢコア、Ｇ＝１  ピロリジノンアミドエチルピロリジノン表面
【０２２９】
【化２９】
2020063250.tif 000032
【０２３０】
５℃で冷却された、メタノール５ｍｌ中、ＤＭＩ（３２ｍｇ、２ｍｍｏｌ、１０％過剰）の攪拌混合物に、５ｍｌのメタノール中、ＰＡＭＡＭデンドリマー、ＤＡＢコア、Ｇ＝１  ピロリジノンアミドエチルアミン（ＭＷ＝２６９０）（６００ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ、１．８ｍｍｏｌのアミノ基）を、２〜３分間にわたって滴下した。この混合物を、ＲＴに暖め、そして２４時間、攪拌した。反応混合物を、ＴＬＣプレート上にスポットし、そしてニンヒドリン溶液により染色し、負の試験を得た。反応混合物を、メタノール中、Sephadex ＬＨ＝２０カラムに添加し、そして３００ｍｌの空隙容量、続いて２０×２０ｍｌの画分により溶出した。画分６−１２は、ＴＬＣプレート（シリカゲル、非蛍光性）上に各画分をスポットし、そしてヨウ素チャンバーにおいて画分を展開することにより所望する生成物を含むことが見出された。それらの画分の揮発物を、回転蒸発器を用いて除去し、高真空下で最終排気の後、以下のスペクトルを有する、７７０ｍｇ（９５％の収率）の標記化合物（ＭＷ＝３６９８）を得た：
【０２３１】
13CNMR(75MHz,D20)δ32.42, 33.73, 34.40, 36.61, 36.24, 36.38, 36.50, 41.95, 48.81, 48.84, 49.51, 50.15, 51.13, 52.90, 174.69, 175.16, 175.42, 175.70。
【０２３２】
実施例２７：線状−ポリ（アミド−ピロリドン）（ＰＡＭＰｙｒ）オリゴマー
それらの線状−ポリ（アミドピロリドン）（ＰＡＭＰｙｒ）生成物は、ＰＥＧ（Davis et al., Adv. Drug Delivery Reviews, 2002, 54(4), 457-458）及びＰＥＯｘ（Harris et al.,米国特許第7,943,141号、2011年）タイプのポリマーに類似する。このように、それらは低補体活性化特徴を示し、そして注射剤として使用される場合、それらの結合体のインビボ滞留時間を増強しながら、薬物結合体とのタンパク質相互作用を低めるために使用され得る。
【０２３３】
それらのポリマーを調製する方法は、以下の通りである。
第一級アミン/第一級アルキレンジアミン ＋ n［ＤＭＩ＋ 過剰ＥＤＡ]  線上−Ｐｏｌ y[(アミド−ピロリドン)]ｎ(ＰＡＭＰｙｒ) オリゴマー
【０２３４】
ＲＮＨ２ ＋ n （ＤＭＩ ＋過剰ＥＤＡ)→Ｒ−ＮＨ(Ｌ−ＰＡＭＰｙｒ) ｎ−エステル/アミン末端
【０２３５】
２．ＢｏｃＮＨＲ（Ｘ）ＮＨ２＋ n (ＤＭＩ +過剰ＥＤＡ)→Ｂｏｃ−ＮＨ (Ｌ−ＰＡＭＰｙｒ)ｎ−エステル/アミン末端
(保護解除された) → ＮＨ２(Ｌ−ＰＡＭＰｙｒ) ｎ−エステル/アミン末端
【０２３６】
３．ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２ ＋ n (ＤＭＩ +過剰ＥＤＡ)→[−Ｓ- ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（Ｌ−ＰＡＭＰｙｒ）ｎ→２ ＨＳ ＣＨ２ＣＨ２Ｎ(Ｌ−ＰＡＭＰｙｒ)ｎ
【０２３７】
【化３０】
2020063250.tif 000033
【０２３８】
４．（Ｌ−ＰＡＭＰｙｒ）ｎ−エステル／アミン末端
【０２３９】
【化３１】
2020063250.tif 000034
【０２４０】
実施例２８：星形分岐、線状−ポリ（アミド−ピロリドン）（ＰＡＭＰｙｒ）
Ｎ［（ＣＨ２ＣＨ２）ＮＨ２］３（ＴＲＥＮ）＋ n（ＤＭＩ + 過剰ＥＤＡ) →樹枝状、ポリ（アミドピロリドン）アミン（ＰＡＭＰｙｒＡＭ）
【０２４１】
【化３２】
2020063250.tif 000035
【０２４２】
２．Ｎ［（ＣＨ２ＣＨ２）ＮＨ２］３（ＴＲＥＮ）＋n (ＤＭＩ ＋過剰ＴＲＥＮ)
【０２４３】
【化３３】
2020063250.tif 000036
【０２４４】
ＰＡＭＡＭ−(ＮＨ２)ｚ ＋ n (ＤＭＩ＋過剰ＴＲＥＮ)
【０２４５】
【化３４】
2020063250.tif 000037
【０２４６】
実施例２９：ピロリドン末端ＰＡＭＡＭデンドリマー
表面官能化された：
デンドリマー（第一級アミン末端）＋ＤＭＩ→
【０２４７】
【化３５】
2020063250.tif 000038
【０２４８】
効用の議論
それらの新規化合物は、ＭＷ制御された複素環式／大環状（すなわち、ピロリドン）タイプのポリマー組成物であり、それらは、インビボでの生物学的注射及びイメージング用途のために適切である、ＩＦ、低毒性及び低補体活性化特性を示す。それらのポリマー組成物は、次の４種の異なった構造形で調製され得る：（ａ）線状ポリマー；（ｂ）架橋ポリマー；（ｃ）分岐ポリマー；及び（ｄ）樹枝状ポリマー。この一般的な概要が、図１０に示される。
【０２４９】
下記表２は、それらの一般的手順により製造される式（Ｉ）の化合物についてのデータを提供する。それらの化合物の化学構造は、図３Ａ−Ｄに示され；比較例構造は図４に示される。さらに、それらの化合物について得られた蛍光が提供される。
【０２５０】
【表２−１】
2020063250.tif 000039
【表２−２】
2020063250.tif 000040
【表２−３】
2020063250.tif 000041
【０２５１】
それらの化合物の１つがデンドリマーに結合され、そして種々の細胞系における生物学的目的について試験される場合、結果が、下記実施例Ｉに提供される。
【０２５２】
実施例Ｉ：ＰＡＭＡＭピロリドン末端デンドリマーの合成
【０２５３】
【化３６】
2020063250.tif 000042
【０２５４】
このデンドリマーは、効用を示すために以下の方法で試験された。
インビボでの効用
細胞培養
チャイニーズハムスター線維芽細胞（Ｂ１４）及び胚性マウス海馬細胞（ｍＨｉｐｐｏＥ−１８）を、２ｍＭのグルタミン及び１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳにより補充されたＤＭＥＭ培地において増殖した。ラット肝臓由来の細胞（ＢＲＬ−３Ａ）を、２ｍＭのグルタミン及び１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳにより補充された、ＨＡＭのＦ１２変性培地において増殖した。細胞を、５．０％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下で、３７℃でＴ−２５培養フラスコにおいて培養し、そして２又は３日ごとに継代培養した。細胞を収穫し、そして８０−９０％の集密性を得た後、実験に使用した。生存細胞の数を、Countess Automated Cell Counter (Invitrogen)の使用により、トリパンブル−排除アッセイにより決定した。１００μｌの適切な培地において、１．０×１０４個の細胞／ウェルの密度で平底９６ウェルプレートにおいて、又は１．０ｍｌの適切な培地において、２．５×１０５個の細胞／ウェルの密度で平底１２ウェルプレートにおいて、細胞を播種した。播種の後、プレートを、プレートへの細胞の結合を可能にするために、５．０％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下で、３７℃で２４時間インキュベートした。
【０２５５】
接種及び流出の検出
インビトロ摂取研究を、自家蛍光Ｇ４  ＰＡＭＡＭ−ピロリドンデンドリマー（実施例Ｉにおいて調製された）を用いて実施した。手短には、デンドリマーを、１．０×１０５個の細胞／ウェルの密度で細胞を含む２４ウェルプレートに、１００μＭの濃度で添加した。摂取研究においては、細胞を、５．０％のＣＯ２を含む加湿雰囲気下で４８時間、３７℃で５分〜４８時間の範囲の特定時間、デンドリマーと共にインキュベートした。流出研究においては、細胞を２４時間、デンドリマーと共にインキュベートした。次に、デンドリマーを除き、細胞をＰＢＳにより洗浄し、そして５．０％のＣＯ２を含む加湿雰囲気下で５分〜４８時間の範囲の定義された時間、３７℃で培地においてさらにインキュベートした。適切なインキュベーション期間の後、細胞をＰＢＳにより洗浄し、５００μｌの培地に懸濁し、そしてすぐに、紫色レーザー（４０５ｎｍ）及びパシフィックブルーバンドパスフィルター（４５０／５０ｎｍ）を用いて、Becton ＬＳＲIIフローサイトメーター（BD Biosciences, USA）により分析した。
【０２５６】
共焦点顕微鏡法
共焦点顕微鏡画像を、４０５ｎｍレーザーダイオード及びInTune励起レーザーシステムを備えたZeiss LSM780顕微鏡（Carl Zeiss Micro Imaging, USA）を用いて、６３００倍率で得た。細胞を、９６ウェルガラス底プレート上で増殖し、そして５．０％ＣＯ２を含む、３７℃での加湿雰囲気下で２４時間、１００μＭのＧ４−ＰＡＭＡＭ−ピロリドンデンドリマー（実施例Ｉにおいて調製された）と共にインキュベートした。インキュベーションの後、細胞を直接的に（洗浄されていないデンドリマー蛍光）、又は続く原形質膜／核染色の後、画像化した。後者については、細胞を氷上で冷却し、そして冷ＰＢＳにより１度、洗浄し、エンドサイトーシスを阻害した。次に、細胞膜を、ＰＢＳにより２００倍に希釈されたNeuroDiOカルボシアニン色素を用いて、２分間のインキュベーションにより染色した。色素の親油性のために、それらの条件下での染色は均一ではない可能性がある。膜染色の後、細胞核を、ＰＢＳにより２００倍に希釈されたＲｅｄＤｏｔ１核色素により１０分間、染色し、そしてＲＴで１５分間、３．６％のホルムアルデヒド溶液により固定した。最終的に、固定され、そして三重染色された細胞を画像化し、青色チャネル（励起４０５ｎｍ、発光４１０−４７０ｎｍ）でのＰＡＭＡＭ−ピロリドンデンドリマー、緑色チャネル（励起４９０ｎｍ、発光５１０−５７５ｎｍ）での原型質膜、及び遠赤色チャネル（励起５９５ｎｍ、発光６００−７４０ｎｍ）での核の固有蛍光を可視化した。
【０２５７】
結果
フローサイトメトリーによりデンドリマーの細胞摂取を分析するために、細胞（Ｂ１４、ＢＲＬ−３Ａ、及びｍＨｉｐｐｏＥ−１８）を、１００μＭの濃度でのデンドリマーと共にインキュベートした。この濃度でのデンドリマーは、何れの試験された細胞に対しても非毒性であることは、これまで示されている（Janaszewska et al., Nanomedicine NBM, 2013, 9, 461-464）。インキュベーション時間は、５分から４８時間と多様であった。すべての試験された細胞系は、その最大量がｍＨｉｐｐｏＥ−８細胞に観察されたが、ＰＡＭＡＭ−ピロリドンデンドリマーを急速に蓄積した（図５）。４８時間後、デンドリマー濃度に正比例する固有蛍光強度は、Ｂ１４細胞よりもそれらの細胞では、ほとんど２倍高かった。
【０２５８】
デンドリマーとの細胞のインキュベーションに基づいて観察される蛍光強度上昇は、２つの工程、すなわち細胞内のデンドリマーの摂取、又は細胞膜の外層へのデンドリマーの結合により生じることができる。デンドリマーが実際、細胞に侵入、そして第２の可能性を排除することを確かめるために、共焦点顕微鏡を、可視化技法として使用した。再び、この方法は、デンドリマーの固有蛍光に基づかれている。デンドリマーの濃度は同じままであり、そして１００μＭに等しかった。共焦点画像は、図６に提供される。
【０２５９】
続く洗浄を伴わないで、２４時間の処理の後に実施された、３回の試験された細胞系における蓄積したＰＡＭＡＭ−ピロリドンデンドリマーの固有蛍光を示す画像は、化合物の内部局在化を確かめた（図６Ａ）。興味深いことには、デンドリマー局在化におけるいくつかの差異が試験された細胞系間で観察され得る。すべての細胞は細胞質においてデンドリマーを蓄積するように思えるが、Ｂ−１４及びＢＲＬ−３Ａ細胞においては、核局在がまた観察され、ところがｍＨｉｐｐｏＥ−１８細胞においては、蛍光がリソソーム様構造、及び細胞境界（減刑質膜）で観察され得る。
【０２６０】
デンドリマーの内在化をさらに確かめるために、すべての細胞を、ＰＢＳにより１度、洗浄し、そして染色し、原形質膜及び細胞核を可覚化した（図６Ｂ）。ＰＡＭＡＭ−ピロリドンデンドリマーの青色蛍光を検出するために、ホルムアルデヒドによる固定化の前、原形質膜を、NeuroDiOカルボシアニン色素を用いて染色し、そして核を、RedDot1核色素により染色した。予想通り、デンドリマー蛍光は、すべての試験された細胞系において内部に局在された。驚くべきことには、ＢＲＬ−３Ａ細胞のみが、デンドリマー洗浄及び細胞固定の前に観察される染色パターンを保持し、細胞質及び核局在化を確認した。Ｂ１４細胞においては、原形質膜でのデンドリマー蛍光の一部がもはや観察されないmHippoE-18細胞に類似して、蛍光は、核蓄積を欠くエンドソーム様構造においてのみ検出され得た。たぶん、ＰＡＭＡＭ−ピロリドンデンドリマーへの色素の意図しない結合のために、RedDot1染色が青色蛍光シグナルと部分的に共局在することもまた注目される。
【０２６１】
細胞におけるデンドリマー内在化に関係する別の重要な側面は、反対の工程、すなわち細胞からのそれらの流出を知ることである。Ｂ１４、ＢＲＬ−３Ａ及びmHippoE-18細胞からの研究されたデンドリマーも細胞流出が、デンドリマー固有蛍光に基づいて、フローサイトメトリーにより摂取と同様に分析された。２４時間のインキュベーション時間の後、デンドリマーが培地から除かれ、細胞を洗浄し、そしてさらに、デンドリマーを有さない培地においてインキュベートした。図７に示されるように、最初の２４時間、デンドリマーはすべての細胞から放出されるが、しかしＢ−１４細胞からは最も遅かった。２４時間後、約１５％ほどのデンドリマーがＢ−１４細胞から脱出した。最も早い漏出が、mHippoE-18細胞に観察された。Ｂ１４及びＢＲＬ−３Ａ細胞の場合、摂取されたデンドリマーの量は、実験の最初の３時間、変化しなかった。それにもかかわらず、４８時間後、mHippoE-18細胞においては、最初からの３時間、初期量の半分のみ、ＢＲＬ−３Ａ細胞においては、１／３、及びＢ−１４細胞においては１／５が観察された。
【０２６２】
ＰＡＭＡＭ−ピロリドンデンドリマーと呼ばれる４−カルボメトキシピロリドン表面基を有する改質されたＧ４  ＰＡＭＡＭデンドリマーは、独特の特性により特徴づけられる。それは、初期手順、例えば酸化を必要としないで、中性ｐＨで本質的に蛍光性である。さらに、このデンドリマーは、アミノ末端ＰＡＭＡＭデンドリマーとは対照的に、非常に生体適合性であり、且つ非毒性であることが見出された（Ciolkowski et al., Nanomedicine NBM, 2012, 8, 815-817; Janaszewska et al., Nanomedicine NBM, 2013, 9, 461-464）。それは、ＰＡＭＡＭ−ピロリドンデンドリマーが細胞内に内在化されるかどうかという疑問が提起した。共焦点顕微鏡と組合される摂取研究は、この疑問に対して肯定的な答えを提供した。本質的に蛍光性のＰＡＭＡＭ−ピロリドンデンドリマーは、３種の異なった細胞系に内在化し、そして染色することが示されている。ＢＲＬ−３Ａ細胞の場合、デンドリマーは細胞膜を横断するのみならず、また核にも到達した。要約すると、ＰＡＭＡＭ−ピロリドンデンドリマーは、以下の３種の顕著な特性を有する：（１）強い固有の蛍光、（２）低毒性、（３）細胞内在化。それらの自己蛍光は、デンドリマーが細胞内にある場合、目に見えるのに十分に強い。
【０２６３】
強い固有の青色蛍光のために、ＰＡＭＡＭ−ピロリドンデンドリマーの細胞摂取挙動は、追加の蛍光標識、化学物質によるデンドリマーの処理、又はｐＨ調整なしに、共焦点顕微鏡及びフローサイトメトリーにより、直接分析され得た。この最初の成功した生物学的実験は、遺伝子ベクターとしての広範な可能性あるＰＡＭＡＭ−ピロリドンデンドリマー用途、及び輸送とバイオイメージングの２つの機能を同様に兼ねる薬物送達プラットフォームを開放する。
【０２６４】
【化３７】
2020063250.tif 000043
【０２６５】
G.T. Hermanson, Bioconjugation Techiques, Second Ed., (2008)により教示されるような、当業者に良く知られている日常的なプロトコルを用いる場合、それらの個別的な、明確に定義されたホモ−又はヘテロ−官能化された（チャプター４，５、ｐｐ２３３−３３４を参照のこと）ピロリドン化試薬が、従来のＰＥＧ化試薬を模倣するために創造された。それらは、先に記載された種々の新規の小分子ピロリドン誘導体、ピロリドン含有ポリマー、デンドロン、デンドリマー及びポリマーから調製された。それらのピロリドン化試薬は、G.T. Hermanason, Chapter 18, 25; in Bioconjugation Techiques, Second Ed., (2008)により教示されるように、種々のタンパク質、ポリペプチド、酵素、抗体、薬物、ポリヌクレオチド、生物学的基質及びナノ粒子、等に結合され得る。興味あるいくつかの特定基質についてのそれらのプロトコルへのいくつかの言及は、以下の通りである：(a) デンドロン/デンドリマー; Chapter 7, pp 346-394; イメージング/キレート剤、Chapter 9, pp400-496; ビオチン/アビジン、Chapter 11, pp 507-543, Chapter 233, pp 900-921; 微粒子/ナノ粒子、 Chapter 14,15 , pp582-645; ハプテン担体免疫原、Chapter 19, pp745-781; 抗体、Chapter 20, pp787-821; 免疫毒素、 Chapter 21, pp827-857; リポソーム、Chapter 22, pp 858-897; 酵素、Chapter 26. pp 961-968; 核酸/オリゴヌクレオチド、Chapter 26, pp 970-1002。
【０２６６】
本発明は、デンドリマーの分岐合成に使用される特定の反復工程及び原理[DENDRIMERS, DENDRONS, AND DENDRITIC POLYM ERS, Tomalia, D.A., Christensen, J.B. and Boas, U. (2012) Cambridge University Press, New York, N.Y．]が、個別な、十分に定義されたポリ（ピロリドン）オリゴマー及びポリマーの合成に適用され得ることを実証することにより、この化学的ジレンマに対する解決策を、現在提供する。図１０は、デンドリマーの３つの主要構造成分、すなわち（ａ）コア、（ｂ）内部及び（ｃ）表面を示す。このように、デンドリマーの分岐構造は、開始剤コアで開始し、この周りで、分岐状モノマー（すなわち、枝分かれ細胞モノマー）の同心樹枝状層が十分に定義された反復反応配列に共有結合され、生成（Ｇ）として言及される樹枝状シェルの配列を生成する。この内部の樹枝状成長、及び生成の関数として提示される表面基の数は、コア多重度（Ｎｃ）、分岐細胞多重度（Ｎｂ）及び生成レベル（Ｇ）の関数として数学的に制御されることが認識されている。このように、各生成（Ｚ）で提示される表面基の数は、以下の数学的表現に従って予想され得る；Ｚ＝ＮｃＮｂＧ。例えば、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーの従来の分岐合成は、アミン又はエステルの何れかであり得る既知多重度（Ｎｃ）の開始剤コアで始まる。一般的に、アミンコア（すなわち、ジアミノブタン；（ＤＡＢ）；Ｎｃ＝４）で出発する場合、マイケル付加により、化学量論の量（すなわち、４×）のメチルアクリレート（ＭＡ）を付加し、ＰＡＭＡＭエステル末端中間体を生成できる（図１０）。これに続いて、末端エステル基の軽度で容易なアミド化を生成する過剰のエチレンジアミン（ＥＤＡ）の添加を伴い、ＰＡＭＡＭアミン末端中間体を生成する（図１０）。（ａ）マイケル付加、続く（ｂ）アミド化のこの反応順序は、デンドロン（Ｎｃ＝１）又はデンドリマー（Ｎｃ＞２）と呼ばれる、個別の十分に定義された樹枝状高分子を生成するための「反復反応順序」を構成する。
【０２６７】
先に、本発明者は、Ｎ−置換−４−カルボメトキシピロリドンを得るためにＰＡＭＡＭデンドリマー末端第一級アミン部分の容易な反応を報告しており（すなわち、（Ｉ）。図１０）[国際公開第２００４／０６９８７８号、２００４年８月１９日]、ここで正確な数のピロリドン環が、生成の関数として存在する第一級アミン（Ｚ）の数に従って形成された。ピロリドン環上の第二４−カルボメトキシエステル部分と第一級／第二級アミンとの反応は、メチルアクリレートから誘導された第一級エステル基であるとは予想されず、そして実際、それらの基ほど反応性ではなかった。本発明者は、容易な条件下で高収率でそれらの反応を行う適切な条件を、現在見出した。
【０２６８】
このように、注射可能なインビボ用途又は他の医療用途のために肝臓排泄（すなわち、＜２０ＫＤａ）を確実にするために、特定の閾値以下の特定のポリ（ピロリドン）オリゴマー／ポリマーの分子量を制御するために、本発明者は、特定のデンドリマー／デンドロンベースの「反復反応工程／原則」の使用を呼び掛けて来た。それらの努力は現在、少なくとも３種の新規で明確に定義されたポリ（ピロリドン）オリゴマー／ポリマー、及びデンドロン／デンドリマー組成物（ポリ（ピロリドン組成物カテゴリー：II、III及びIV（図１０を参照のこと）の発見を導いて来た。それらの組成物は、非常に低い毒性、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を非常に連想させるタンパク質との非相補的活性、ステレス性質を示す。従って、それらの組成物は、ピロリドン化試薬と呼ばれ、そしてＰＥＧ化よりも、卓越した費用対効果を提供することが予測される。さらに、非従来の「固有蛍光」特性が、それらのピロリドンオリゴマー／ポリマー、並びにそれらのポリマーピロリドンへのモノマー中間体として作用して来た多くの関連する小分子ピロリドン中間体と関連することが意外には発見された。
【０２６９】
本発明はその好ましい実施形態を参照して記載されて来たが、当業者は、本開示を読み、そして理解すると、以下に請求される本発明の範囲及び趣旨から逸脱しない変更及び修飾を認めることができる。従って、この説明は、例示に過ぎず、本発明を実施する一般的な方法を当業者に教示するためのものであると解釈されるべきである。
【図１】
2020063250.tif 000049
【図２】
2020063250.tif 000050
【図３Ａ】
2020063250.tif 000051
【図３Ｂ】
2020063250.tif 000052
【図３Ｃ】
2020063250.tif 000053
【図３Ｄ】
2020063250.tif 000054
【図４】
2020063250.tif 000055
【図５】
2020063250.tif 000056
【図６】
2020063250.tif 000057
【図７】
2020063250.tif 000058
【図８】
2020063250.tif 000059
【図９】
2020063250.tif 000060
【図１０】
2020063250.tif 000061
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月29日(2019.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式：
【化１】
2020063250.tif 000062
[式中、
Ｑは、ピロリドン環に窒素原子を与える少なくとも１つの第一級アミンを含む化合物の残基であり、
Ｑは、アミン末端樹枝状ポリマー；アミン末端デンドロン；（Ｃ１−Ｃ２０アルキル）アミン；（Ｃ１−Ｃ２０ヒドロキシアルキル）アミン；（Ｃ１−Ｃ２０アルキル）エーテルアミン；（Ｃ６−Ｃ１８アリール）アミン；（Ｃ６−Ｃ１４アリールＣ１−Ｃ４アルキル）アミン；Ｘ−Ｚ−Ｎ−（ここで、Ｘは、Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ又は−ＣＯ２Ｈであり、Ｚは、Ｃ１−Ｃ１８アルキル、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール（Ｃ６−Ｃ１２）アリーレン、又は（Ｃ６−Ｃ１２）アルキルアリーレンである）；ベンジルアミン、下記式：
【化２】
2020063250.tif 000063
（式中、Ｒ２は−ＮＨ２、−ＯＨ又は−Ｃ（Ｏ）ＯＨであり、そしてＲ３及びＲ４は独立に、−Ｈ又はＣ１−Ｃ４アルキル又は−ＣＨ２ＯＨである）の化合物；第一級アミンを有する脂肪／親油性物質；第一級アミンを有するタンパク質；第一級アミンのリジン、グリシン、トリプトファン、チロシン又はフェニルアラニンを有するアミノ酸；（１）図３Ａ及び図３Ｂに記載の小有機分子由来の第一級アミン；（２）線状、架橋、分岐もしくは樹枝状ポリマー型のような４つの主要ポリマー構造型のいずれかに由来する、オリゴマー及びポリマー（両有機及び無機組成物（すなわち、シリカ、無機酸化物、金属カルコゲナイド、フラーレン、等）を含む）由来する第一級アミン、又は（３）定義されたソフト又はハードナノ要素（すなわち、ナノ粒子）のいずれかに由来する第一級アミン、から成る群より選ばれ；
Ｗは、Ｎ又は(ＣＨ２)ｎであり、ここでｎは０又は１であり；
Ｒ２は、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ; −Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）; −Ｃ（Ｏ）−ＮＨＲ ５（ここで、Ｒ５は、Ｃ１−Ｃ４アルキル）、又は−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ポリマーであり；そして
ｍは、１〜４である。]
で表される、環状アミド、環状尿素、環状アミノアミド、又は環状アミノ尿素化合物を蛍光剤として含む組成物であって、
式（Ｉ）の化合物は、２００〜３８５ｎｍでの励起後にその基本化合物の値の少なくとも１０倍、蛍光し、その発光が４００〜８５０ｎｍの可視近赤外領域にあり、ＱＨ２がそのような環状アミド、環状尿素、環状アミノアミド、又は環状アミノ尿素化合物残基を有さない、組成物。
【請求項２】
Ｒ２が、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル)又は−Ｃ（Ｏ）ＯＨである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｗが(ＣＨ２)ｎ（ここで、ｎは１であり）;そしてｍは１である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
Ｑが、末端アミン基の１以上が環状アミド、環状尿素、環状アミノアミド、又は環状アミノ尿素に取り込まれた、アミン末端枝樹状ポリマー又はアミン末端デンドロンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
Ｑが、(Ｃ１−Ｃ２０アルキル) アミン、(Ｃ１−Ｃ２０ヒドロキシルアルキル) アミン、（Ｃ１−Ｃ２０ アルキルエーテル) アミン、Ｃ６−Ｃ１４ アリール又は (Ｃ６−Ｃ１４アリールＣ１−Ｃ４アルキル) アミンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
下記式（III）：
【化３】
2020063250.tif 000064
［式中、
Ｒは、Ｃ１−Ｃ１８アルキレン、Ｃ６−Ｃ１２アリーレン、又は(Ｃ１−Ｃ１２アルキル) Ｃ６−Ｃ１２アリーレンであり；
ｎは、４〜１００であり；そして
Ｘ及びＹは独立に、Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ２、 −ＳＨ、−ＣＯ２Ｈ、アルキン、又はアジドである。］
をピロリジノン化試薬として含む、請求項１又は３に記載の組成物。
【請求項７】
−ＣＯ２Ｈの医薬的に許容できる塩及びカルボ（Ｃ１−Ｃ４アルコキシ）エステルが含まれる、請求項１又は６に記載の化合物。
【請求項８】
蛍光により種々のシステム、試験、植物又は動物及びヒトにおける部分及び流体を追跡し、そして請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物を用いて蛍光により前記部分の位置をモニターするか、又は検出するための方法。
【請求項９】
請求項６に記載の化合物を、ＰＥＧ化においてＰＥＧの代わりに使用する方法。
【請求項１０】
蛍光剤を製造するための、下記式：
【化４】
2020063250.tif 000065
[式中、Ｑ、Ｗ及びＲ２は、請求項１に定義したとおりである。]
の環状アミド、環状尿素、環状アミノアミド又は環状アミノ尿素化合物の使用。
【外国語明細書】
2020063250000001.pdf