(57)【要約】      （修正有）【課題】神経変性または神経筋障害の治療及び診断のための組成物及び方法を提供する。【解決手段】神経変性または神経筋障害の治療、予防もしくは発症の遅延のため、治療的有効量の1種以上のアナプレロティック剤を投与する。【選択図】図１
2020063233.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態を有する動物の治療方法であって、治療的有効量の１種以上のアナプレロティック剤を前記動物に投与し、それによって、前記動物において前記神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態を治療するステップを含む、前記方法。
【請求項２】
動物において、神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態を予防し、及び／または発症を遅延させる方法であって、治療的有効量の１種以上のアナプレロティック剤を前記動物に投与するステップを含む、前記方法。
【請求項３】
前記神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態が運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＭＮＤが、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、進行性球麻痺（ＰＢＰ）、仮性球性麻痺、または脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＭＮＤがＡＬＳである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記１種以上のアナプレロティック剤が、グルタミン酸、グルタミン、ピルビン酸、及び１種以上のプロピオニルＣｏＡの前駆体からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記１種以上のプロピオニルＣｏＡの前駆体が、不均一な鎖長の脂肪酸、トリグリセリド、Ｃ５ケトン体、リン脂質、分岐鎖アミノ酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記トリグリセリドが、１種以上の式Ｉ：
【化１】
2020063233.tif 000010
の化合物であり、
式中、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立してアルキル、アルケニルまたはアルキニルから選択される、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が、独立してＣ１〜Ｃ２０アルキル、アルケニルまたはアルキニルから選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が同一であり、Ｃ５、Ｃ７及びＣ９アルキルからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
式Ｉの化合物が、トリペンタノイン、トリヘプタノイン及びトリノナノインから選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物がトリヘプタノインである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１種以上のアナプレロティック剤が、前記動物にとっての食餌由来カロリー摂取量の少なくとも約５％を含む量で、前記動物に与えられる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記１種以上のアナプレロティック剤が、前記動物にとっての食餌由来カロリー摂取量の少なくとも約２０％を含む量で、前記動物に与えられる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記１種以上のアナプレロティック剤が、前記動物にとっての食餌由来カロリー摂取量の少なくとも約３０％を含む量で、前記動物に与えられる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記１種以上のアナプレロティック剤が、前記動物にとっての食餌由来カロリー摂取量の少なくとも約３５％を含む量で、前記動物に与えられる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記動物が成体動物である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記動物がほ乳動物である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ほ乳動物がヒトである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記治療的有効量の１種以上のアナプレロティック剤を投与するステップが経口投与である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態を有する動物の予防、予防的及び／または治療的処置に使用するためのキットであって、（ｉ）治療的有効量の１種以上のアナプレロティック剤と（ｉｉ）使用説明書とを含む、キット。
【請求項２２】
前記アナプレロティック剤が、クエン酸、アルファ−ケト−グルタル酸（２−オキソグルタル酸）、グルタミン酸、グルタミン、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、ピルビン酸、及び１種以上のプロピオニルＣｏＡの前駆体からなる群から選択される、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記アナプレロティック剤がトリヘプタノインである、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
予防、予防的及び／または治療的処置を必要とする動物において、神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態の予防、予防的及び／または治療的処置に使用するための１種以上のアナプレロティック剤。
【請求項２５】
クエン酸、アルファ−ケト−グルタル酸（２−オキソグルタル酸）、グルタミン酸、グルタミン、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、ピルビン酸、及び１種以上のプロピオニルＣｏＡの前駆体からなる群から選択される、請求項２４に記載の使用するための１種以上のアナプレロティック剤。
【請求項２６】
トリヘプタノインであるか、トリヘプタノインを含む、請求項２５に記載の使用するための１種以上のアナプレロティック剤。
【請求項２７】
動物が、神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態を有するか、罹患しやすいかを決定する方法であって、（ｉ）エネルギー代謝に関連する酵素をそれぞれコードする、前記動物の１種以上の核酸の発現レベル、（ｉｉ）前記酵素の発現レベル及び／もしくは活性、ならびに／または（ｉｉｉ）エネルギー代謝に関連する１種以上の代謝産物のレベルを測定し、それによって、前記動物が、前記神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態を有するか、罹患しやすいかを決定するステップを含む、前記方法。
【請求項２８】
エネルギー代謝に関連する酵素をそれぞれコードする、１種以上の核酸の発現レベルの低下、及び／または前記酵素の発現レベル及び／もしくは活性の低下、及び／もしくはエネルギー代謝に関連する１種以上の代謝産物のレベルの低下が、前記動物が前記神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態を有するか、罹患しやすいことを示す、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
１種以上のアナプレロティック剤の投与による、神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態の治療または予防に対する動物の応答を監視する方法であって、（ｉ）エ
ネルギー代謝に関連する酵素をそれぞれコードする１種以上の遺伝子の発現レベル、（ｉｉ）前記酵素の発現レベル及び／もしくは活性、ならびに／または（ｉｉｉ）エネルギー代謝に関連する１種以上の代謝産物のレベルを測定し、それによって前記動物に対する応答を監視するステップを含む、前記方法。
【請求項３０】
エネルギー代謝に関連する酵素をそれぞれコードする１種以上の遺伝子の発現レベルの上昇、及び／または前記酵素の発現レベル及び／もしくは活性の上昇、及び／またはエネルギー代謝に関連する１種以上の代謝産物のレベルの上昇が、前記動物が前記１種以上のアナプレロティック剤の投与に対して応答していることを示す、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記エネルギー代謝の酵素が、（ａ）糖分解酵素、（ｂ）ＴＣＡサイクル酵素、及び（ｃ）アナプレロティック酵素からなる群から選択される、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記糖分解酵素が、ピルビン酸デヒドロゲナーゼアルファ１、グルコースリン酸イソメラーゼ（ＰＧＩ）、またはホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＴＣＡサイクル酵素が、オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ及びコハク酸デヒドロゲナーゼ複合体サブユニットＡからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記アナプレロティック酵素が、ピルビン酸カルボキシラーゼ、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ１、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ２、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットＡ及びＢ、ならびにメチルマロニルＣｏＡムターゼからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記代謝産物が、（ａ）糖分解代謝産物、（ｂ）ＴＣＡサイクル代謝産物、及び（ｃ）アナプレロティック代謝産物からなる群から選択される、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記動物がほ乳動物である、請求項２７〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ほ乳動物がヒトである、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示が全体として参照により本明細書に組み込まれる、２０１３年１１月１４日に出願された、米国仮特許出願第６１／９０４，３６５号の利益を主張する。
【０００２】
電子的に提出されたテキストファイルの説明
本明細書とともに電子的に提出されたテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読フォーマットコピー（ファイル名：ＵＬＰＩ＿０１８＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０１４年１１月１２日、ファイルサイズ４キロバイト）。
【０００３】
本発明は、概して神経変性及び／または神経筋障害の治療及び診断のための組成物ならびに方法に関する。より具体的には、本発明は、神経変性及び／または神経筋障害の治療、予防、及び／または発症の遅延のためのアナプレロティック剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、運動ニューロンの進行性消失とそれに付随する筋消耗を特徴とする神経変性障害である。これは、診断後２〜５年以内に、増加する麻痺及び死をもたらす（Ｗｉｊｅｓｅｋｅｒａ及びＬｅｉｇｈ，２００９）。運動ニューロンの死の原因は不明であるが、異常ミトコンドリア、ユビキチン化封入体及びニューロフィラメント凝集体が原因となると考えられている。
【０００５】
ミトコンドリアは、トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクル、ならびに細胞機能及び生存に必要な主な細胞エネルギー源である、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の大部分を産生する電子伝達系による脂肪酸のベータ−酸化及び酸化的リン酸化に関与する。したがって、運動ニューロン及び筋肉において低下したミトコンドリア機能は、エネルギー代謝の障害及びＡＴＰ産生能力の低下をもたらすであろう。
【０００６】
ヘプタン酸（Ｃ７脂肪酸）のトリグリセリドであるトリヘプタノインは、脂肪酸酸化の稀な遺伝性代謝障害を有する患者を治療するために米国で使用されている新規な代謝性治療剤である（Ｂｒｕｎｅｎｇｒａｂｅｒ及びＲｏｅ，２００６，Ｒｏｅ及びＭｏｃｈｅｌ，２００６）。トリヘプタノインは、ベータ−酸化によりプロピオニルＣｏＡに代謝されるミトコンドリア内に拡散する中鎖脂肪酸として、ヘプタン酸を身体に供給する。また、ヘプタン酸は肝臓でβ−ヒドロペンタノエート及びβ−ケトペンタノエートのＣ５ケトンに代謝され、それは、両者ともモノカルボン酸輸送体により細胞に取り込まれる。プロピオニルＣｏＡのカルボキシル化によりメチル−マロニルＣｏＡが生成し、それはスクシニルＣｏＡに代謝され、結果的にアナプレロシス、すなわちＴＣＡサイクルの不十分なＣ４（４個の炭素を含む）中間体の再補充をもたらす（図１）。アナプレロティック酵素としては、神経細胞及び筋肉でオキサロ酢酸を生成するピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｃｘ）、そして最も重要なものとして、筋肉においてピルビン酸＋グルタミン酸＜＝＞α−ケトグルタル酸＋アラニンの反応を触媒するグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ１及び２（Ｇｐｔ１及び２）、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットＡ（Ｐｃｃａ）及びＢ（Ｐｃｃｂ）、ならびにメチルマロニルＣｏＡムターゼ（Ｍｕｔ、図１）が挙げられる。
【０００７】
家族性ＡＬＳ患者の約２０％で、また特発性ＡＬＳ患者の亜集団で、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）のタンパク質変異が見出されている。通常、細胞質ゾルで見
られるが、ミトコンドリア内で変異ＳＯＤ１が蓄積し、ＡＬＳで見出される多くのミトコンドリア障害の原因となると考えられる（Ｔｕｒｎｅｒ及びＴａｌｂｏｔ，２００８，Ｖｕｃｉｃ及びＫｉｅｒｎａｎ，２００９，Ｓｈｉら，２０１０，Ｍｉｌａｎｉら，２０１１，Ｃｏｚｚｏｌｉｎｏ及びＣａｒｒｉ，２０１２）。現在、ＳＯＤ１において変異を過剰発現するマウスが、ＡＬＳの最も好ましい動物モデルの１つである。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、一部は、ＴＣＡサイクルが、神経変性障害ＡＬＳの病因において役割を果たし、アナプレロティック剤が疾患の発症及び／または進行に影響を及ぼし得るという発見に基づいている。
【０００９】
本発明の１つの形態は、大まかに言えば、神経変性及び／または神経筋障害の治療、または予防及び／または発症の遅延のために、アナプレロティック剤を利用する方法に関する。
【００１０】
第１の態様では、本発明は、神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態を有する動物の治療法を提供し、当該方法は、治療的有効量の１種以上のアナプレロティック剤を前記動物に投与し、それによって、当該動物において神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態を治療するステップを含む、方法を提供する。
【００１１】
第２の態様では、神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態を予防し、及び／または発症を遅延させる方法を提供し、当該方法は、治療的有効量の１種以上のアナプレロティック剤を当該動物に投与するステップを含む。
【００１２】
第３の態様では、本発明は、神経変性及び／または神経筋疾患、障害または状態の予防、予防的及び／または治療的処置を、それを必要とする動物において行うことにおいて使用するための、トリヘプタノインを提供する。
【００１３】
第４の態様では、本発明は、神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態を有する動物の予防、予防的及び／または治療的処置に使用するための、（ｉ）治療的有効量の１種以上のアナプレロティック剤と：（ｉｉ）使用説明書とを含むキットを提供する。
【００１４】
一実施形態では、前述の態様のいずれか１の神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態は運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）である。
【００１５】
他の実施形態では、ＭＮＤは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、進行性球性麻痺（ＰＢＰ）、仮性球性麻痺、または脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）である。
【００１６】
更に他の実施形態では、ＭＮＤは筋萎縮性側索硬化症である。
【００１７】
一実施形態では、前述の態様のアナプレロティック剤は、グルタミン酸、グルタミン、ピルビン酸、及び１種以上のプロピオニルＣｏＡの前駆体である。
【００１８】
他の実施形態では、１種以上のプロピオニルＣｏＡの前駆体は、不均一な鎖長の脂肪酸、トリグリセリド、Ｃ５ケトン体、リン脂質、分岐鎖アミノ酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１９】
他の実施形態では、１種以上のプロピオニルＣｏＡの前駆体は不均一な鎖長の脂肪酸のトリグリセリドまたはリン脂質である。
【００２０】
更に他の実施形態では、Ｃ５ケトン体は、β−ヒドロキシペンタノエート及びβケトペンタノエートから選択される。
【００２１】
一実施形態では、プロピオニルＣｏＡの前駆体はプロピオニルカルニチンである。
【００２２】
他の実施形態では、分岐鎖アミノ酸は、バリン、イソロイシン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００２３】
更に他の実施形態では、１種以上のプロピオニルＣｏＡの前駆体は、１種以上の式Ｉ：
【００２４】
【化１】
2020063233.tif 000003
の化合物であり、
式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立してアルキル、アルケニルまたはアルキニルから選択される。
【００２５】
一実施形態では、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立してＣ１〜Ｃ２０アルキル、アルケニルまたはアルキニルから選択される。
【００２６】
他の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立してＣ３〜Ｃ１５アルキル、アルケニルまたはアルキニルから選択される。
【００２７】
更に他の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立してＣ５〜Ｃ１２アルキル、アルケニルまたはアルキニルから選択される。
【００２８】
更に他の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立してＣ６〜Ｃ９アルキル、アルケニルまたはアルキニルから選択される。
【００２９】
一実施形態では、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立してメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル及びペンタデシルから選択され、全ての異性体を含む。
【００３０】
他の実施形態では、式Ｉの化合物はトリヘプタノインである。
【００３１】
他の実施形態では、式Ｉの化合物はトリノナノインである。
【００３２】
他の実施形態では、式Ｉの化合物はトリペンタノインである。
【００３３】
他の実施形態では、１種以上のアナプレロティック剤は、動物にとっての食餌由来カロリー摂取量の少なくとも約５％を含む量で、動物に与えられる。
【００３４】
一実施形態では、１種以上のアナプレロティック剤は、動物にとっての食餌由来カロリー摂取量の少なくとも約２０％を含む量で、動物に与えられる。
【００３５】
他の実施形態では、アナプレロティック剤は、動物にとっての食餌由来カロリー摂取量の少なくとも約３０％を含む量で、動物に与えられる。
【００３６】
更に他の実施形態では、１種以上のアナプレロティック剤は、動物にとっての食餌由来カロリー摂取量の少なくとも約３５％を含む量で、動物に与えられる。
【００３７】
一実施形態では、動物はほ乳動物である。
【００３８】
他の実施形態では、ほ乳動物はヒトである。
【００３９】
本発明の他の形態は、大まかに言えば、神経変性及び／または神経筋障害に関連する遺伝子発現の変更、変化または相違を検出する方法に関する。
【００４０】
第５の態様では、本発明は、動物が、神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態を有するか、罹患しやすいかを決定する方法を提供し、当該方法は、（ｉ）エネルギー代謝に関連する酵素をそれぞれコードする、１種以上の核酸の発現レベル、（ｉｉ）当該酵素の発現レベル及び／もしくは活性、ならびに／または（ｉｉｉ）エネルギー代謝に関連する１種以上の代謝産物のレベルを測定するステップを含む方法を提供する。
【００４１】
一実施形態では、エネルギー代謝に関連する酵素をそれぞれコードする、１種以上の核酸の発現レベルの低下もしくは減少、及び／または当該酵素の発現レベル及び／もしくは活性の低下もしくは減少、及び／もしくはエネルギー代謝に関連する１種以上の代謝産物のレベルの低下もしくは減少は、当該動物が神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態を有するか、罹患しやすいことを示す。
【００４２】
第６の態様では、本発明は、１種以上のアナプレロティック剤の投与による、神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態の治療または予防に対する動物の反応を監視する方法を提供し、当該方法は、（ｉ）エネルギー代謝に関連する酵素をそれぞれコードする１種以上の核酸の発現レベル、（ｉｉ）当該酵素の発現レベル及び／もしくは活性、ならびに／または（ｉｉｉ）エネルギー代謝に関連する１種以上の代謝産物のレベルを測定することを含む。
【００４３】
一実施形態では、エネルギー代謝に関連する酵素をそれぞれコードする１種以上の核酸の発現レベルの上昇、及び／または当該酵素の発現レベル及び／または活性の上昇、及び
／またはエネルギー代謝に関連する１種以上の代謝産物のレベルの上昇は、当該動物が１種以上のアナプレロティック剤の投与に対して応答していることを示す。
【００４４】
第５及び第６の態様によれば、酵素または代謝産物は、糖分解酵素または代謝産物、ＴＣＡサイクル酵素または代謝産物及びアナプレロティック酵素または代謝産物からなる群から選択される。
【００４５】
いくつかの実施形態では、糖分解酵素は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼアルファ１、グルコースリン酸イソメラーゼ（ＰＧＩ）、またはホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）である。
【００４６】
他の実施形態では、ＴＣＡサイクル酵素は、オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ及びコハク酸デヒドロゲナーゼ複合体サブユニットＡからなる群から選択される。
【００４７】
他の実施形態では、アナプレロティック酵素は、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ１、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ２、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットＡ及びＢ、ならびにメチルマロニルＣｏＡムターゼからなる群から選択される。
【００４８】
本明細書全体を通じて、特に状況により必要とされない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの単語は、述べられている完全体または完全体群の包含を意味するが、他の任意の完全体または完全体群の除外を意味するものではないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】ＣＮＳ及び筋肉における、簡略化したＴＣＡサイクル及びアナプレロシスを示す。四角形で囲まれた数字（「１」、「２」、及び「３」）は、以下のサイクルのＣ４中間体を補充し得るアナプレロティック経路を示す：１．ピルビン酸カルボキシラーゼ（主にＣＮＳにおいて）、２．プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、及び３．グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（筋肉では非常に重要）。Ｃ５ケトン、イソロイシン（Ｉｌｅ）、バリン（Ｖａｌ）、及びヘプタン酸はプロピオニルＣｏＡに代謝され、その結果、プロピオニルＣｏＡカルボキシル化経路を介してアナプレロティックであり得る。ＯＡＡ−オキサロ酢酸、２−ＯＧ−２−オキソグルタル酸。
【図２】疾患の中期段階及び末期における、ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの腓腹筋における代謝の変化を示す。パネルＡは、野生型（ＷＴ）またはｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ（ＳＯＤ）マウスにおける、乳酸またはグルコースの代謝レベルを示す。乳酸レベルは、ＳＯＤにおいては、ＷＴマウスと比べ、中期段階（１１０〜１３０日）で低下し、これは、解糖が減少したことを示す。一方、末期（１５０〜１７５日）では、ＳＯＤマウスにおいて、ＷＴマウスと比べ、グルコースが上昇し、これは、グルコース代謝が低下したことを示す。パネルＢは、中病期（１１０〜１３０日）における、野生型（ＷＴ）またはｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ（ＳＯＤ）マウスにおける、いくつかの酵素の酵素活性レベルを示す。データは、ＷＴマウスと比べ、ＳＯＤマウスの腓腹筋における最大酵素活性が低下することをデータは示す。ＰＧＩ−グルコースリン酸イソメラーゼ−２８．５％低下、ＰＦＫ−ホスホフルクトキナーゼ−５３％低下、ＯＧＤＨ−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ−２５％低下。＊ｐ＜０．０５  ｔ−検定。Ｎ＝５〜８マウス／群。
【図３Ａ−３Ｅ】トリヘプタノイン処置が、ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおいて、後肢握力の喪失を遅延させることを示す。図３Ａ及び３Ｂは、対照食（ＣＯＮ）またはトリヘプタノイン（ＴＲＩＨ）食を与えられた野生型（図３Ａ）またはｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ（図３Ｂ）マウスの後肢握力を示す。図３Ａのデータは、トリヘプタノイン（緑色の開放三角形、ｎ＝１５）、及び対照食の野生型マウス（黒色の塗りつぶされた四角形、ｎ＝１２）の間で、握力に明らかな差がないことを示す。図３Ｂのデータは、高コピー数の導入遺伝子ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスでは、対照食（青色の開放円、ｎ＝５）に対し、トリヘプタノイン（赤色の十字型；ｎ＝８）で、握力が時間とともに異なっていたことを示し、１８及び１９．５週において著しく高いグリップ強度であった（ｐ＜０．０５  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉポストホック試験）。図３Ｃは、対照食（ＣＯＮ）またはトリヘプタノイン（ＴＲＩＨ）食を与えられたｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの平均後肢握力を示す。図３Ｃのデータは、対照食を与えたｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスと比較した時に、トリヘプタノインを与えたｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウス（ｎ＝８）において、全体として高い後肢握力が経時的な曲線下面積に見られたことを示す（ｎ＝５、ｐ＜０．０５；ｔ−検定）。図３Ｄは、対照食（ＣＯＮ）またはトリヘプタノイン（ＴＲＩＨ）食を与えたｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおける、後肢握力喪失の開始（週）を示す。図３Ｄのデータは、対照食を与えたｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウス（ｎ＝５、ｐ＜０．００２；ｔ−検定）と比較した時に、トリヘプタノインを与えたｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウス（ｎ＝８）において後肢握力喪失の開始が２．８週遅れたことを示す。図３Ｅは、マウスにおける、ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ導入遺伝子コピー数に対してプロットした、後肢握力喪失の開始時のｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの歳（週）を示す。図３Ｅのデータは、導入遺伝子コピー数に対する強度喪失開始の歳との間の線形回帰が、トリヘプタノイン（Ｒ２＝０．９１）に対して対照食（Ｒ２＝０．８９）を与えた群の間で顕著に異なることを示す。特に、ｘ及びｙ切片は２つの回帰直線間で異なるが（ｐ＜０．００１）、勾配（ｐ＝０．９０）は異ならない。
【図３Ｆ】対照食（ＣＯＮ）またはトリヘプタノイン（ＴＲＩＨ）食を与えたｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスのロータロッドにおけるバランス喪失の開始を（週で）示す。図３Ｆのデータは、対照食に対してトリヘプタノイン食を与えたＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおけるバランス喪失の開始が顕著に１３日遅れた（ｐ＝０．００１６）ことを示す。
【図３Ｇ】マウスの歳に対してプロットした、対照食（ＣＯＮ）またはトリヘプタノイン（ＴＲＩＨ）食を与えた野生型（ＷＴ）またはｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ（ＳＯＤ）マウスの体重を示す。図３Ｇのデータは、経時的な体重が、対照食に対しトリヘプタノインを与えた野生型マウスと、いずれかの食餌における  ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスに対する対照食における野生型マウスとの間に顕著に異なっていたことを示す。
【図３Ｈ】対照食（ＣＯＮ）またはトリヘプタノイン（ＴＲＩＨ）食を与えたｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの体重減少の開始を示す。図３Ｈのデータは、対照食を与えたＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウス（ｎ＝５）と比較し、トリヘプタノインを与えたマウス（ｎ＝８）における体重減少の開始が、１１日遅れたことを示す  （ｐ＝０．００７６，ｔ−検定）。＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１。
【図４】対照食（ＣＯＮ）またはトリヘプタノイン（ＴＲＩＨ）食を与えた、１０週齢の野生型（ＷＴ）またはｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ（ＳＯＤ）マウスの運動ニューロン計測アッセイの結果を示す。図４のデータは、トリヘプタノインが、トリヘプタノイン（ＴＲＩＨ）を与えたｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおいて、運動ニューロンの死を軽減したことを示す。対照食（ＣＯＮ、ｎ＝３）を与えたマウスにおけるＬ２及びＬ５領域間の運動ニューロンの３７％の統計的に有意な喪失は、２１％の喪失を示すトリヘプタノインを与えたマウス（ｎ＝４）において統計的に有意ではない。一元分散分析により分析された立体的計測に、チューキーの多重比較検定が続く。
【図５】ハウスキーピング遺伝子に対する、対照食（ＣＯＮ）またはトリヘプタノイン（ＴＲＩＨ）を与えた、１０週齢の野生型及びｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの腓腹筋のＧａｐｄｈ、Ｐｄｈアルファ、Ｏｇｄｈ及びＳｄｈサブユニットＡ  ｍＲＮＡの定量的リアルタイムＰＣＲの結果を示す。Ｐｄｈａｌｐｈａ１、ＯＧＤＨ及びＳＤＨサブユニットＡの転写物のレベルは、対照食（ＣＯＮ）を与えたｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスで低下した。このＰｄｈａｌｐｈａ１及びＳＤＨａｌｐｈａ転写物レベルの低下は、トリヘプタノインを給餌することにより減少した。各遺伝子及び各時点における一元分散分析に続き、有意であればＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後テストを行った（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１）。
【図６】アナプレロシスに関与する遺伝子、特に、ピルビン酸カルボキシラーゼＰｃｘ、グルタミン酸ピルビン酸トランスフェラーゼＧｐｔ１及び２、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼのアルファ（Ｐｃｃａ）及びベータ（Ｐｃｃｂ）サブユニット、ならびにメチルマロニルムターゼ（Ｍｕｔ）の相対的発現レベルを示す。発現を、対照食（ＣＯＮ）またはトリヘプタノイン（ＴＲＩＨ）を与えた１０週齢の野生型及びｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの腓腹筋において、ハウスキーピング遺伝子と比較する。各遺伝子及び各時点における１元分散分析に続き、有意であればＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後テストを行った（＊ｐ＜０．０５）。
【図７】ＡＬＳ患者及び実験マウスにおいて見られる代謝の変化、ならびにトリヘプタノインの作用のメカニズムを示す。ＭＮＤ患者及びマウスＭＮＤモデルにおいては、解糖、クエン酸合成（ＣＳ）、オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ（ＯＧＤＨ）（Ｒｕｓｓｅｌｌら、２０１２）の活性、及び複合体Ｉの活性（Ａｌｌｅｎら、２０１４）、ならびにオキサロ酢酸（ＯＡＡ）及び２−オキソグルタル酸（２−ＯＧ）のレベル（Ｎｉｅｓｓｅｎら、２００７）が低下する（これらの酵素または代謝物の隣に点線の矢印で示す）。また、中期段階（１１０〜１３０日）における、ｈＳＯＤ１Ｇ９３ＡマウスでのＰＧＩ、ＰＦＫ及びＯＧＤＨの最大酵素活性が低下するという本発明者らの発見は、これらの酵素の隣に実線の矢印で示す。トリヘプタノインは、プロピオニルＣｏＡに、後にスクシニルＣｏＡに代謝される。これは、１）ＴＣＡサイクルの代謝産物レベル、２）アセチルＣｏＡの酸化、及びアセチルＣｏＡを供給する全ての原料、３）電子伝達系複合体Ｉ及びＩＩの電子の数、ならびに４）ＡＴＰ生産を増大させ、神経細胞及び筋肉の生存率の改善をもたらすであろう。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本発明は、少なくとも一部は、ＴＣＡサイクルが、神経変性障害ＡＬＳの病因において役割を果たし、アナプレロティック剤が疾患の発症及び／または進行に影響を及ぼし得るという発見に基づいている。
【００５１】
広い態様では、本発明は、治療的有効量の１種以上のアナプレロティック剤を動物に投与することにより、神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態を治療するだけでなく、神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態を予防し、及び／もしくは発症を遅延させる方法にも関する。
【００５２】
他の実施形態では、本発明は、神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態の予防、予防的及び／もしくは治療的処置において使用するためのトリヘプタノインを提供する。
【００５３】
本明細書で用いられる場合、「治療すること」（または「治療する」もしくは「治療」）は、発症し始めた後に神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態の兆候または症状を改善する治療介入を意味する。神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態と関連する「改善する」という用語は、治療のあらゆる観察可能な有益な効果を意味する。治療は、対象に対して有益であることが絶対的である必要はない。有益な効果は、当業者に公知のあらゆる方法または基準を用いて判定することができる。
【００５４】
本明細書で用いられる場合、「予防すること」（または「予防する」もしくは「予防的」）、及び「発症を遅延する」は、神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態の症状、様相もしくは特徴の発症の前に、それぞれ、当該症状、様相もしくは特徴の発症を予防もしくは遅延するように開始する、一連の行動（例えば、治療的有効量の、１種以上のプロピオニルＣｏＡ前駆体を投与する）を意味する。そのような予防は、対象に有益であるために絶対的なものである必要はないことが理解されるべきである。「予防的」処置は、神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態の症状を示していないか、ま
たは初期の症状のみを示す対象に対し、または神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態の症状、様相もしくは特徴のリスクを低減する目的で投与される処置である。「治療的」処置は、神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態の少なくとも１つの症状、様相もしくは特徴を示す対象に、当該症状、様相もしくは特徴を治療、改善もしくは逆転し、及び／または進行を少なくとも一部停止及び／または遅延するように、投与される処置である。
【００５５】
本発明との関連で、「神経変性疾患、障害または状態」は、動物における神経細胞または神経組織の構造、機能、シグナル伝達及び／または数の進行性低下及び／または悪化を含む、あらゆる疾患、障害及び／または状態を意味する。本明細書で用いられる場合、「神経筋疾患、障害または状態」は、動物の筋肉を神経支配及び／または連結する神経細胞または神経組織の構造、機能、シグナル伝達及び／または数の進行性低下及び／または悪化を含む、あらゆる疾患、障害及び／または状態を意味する。
【００５６】
神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態の原因は、遺伝子変異、タンパク質のミスフォールディング、及び／または凝集、自己免疫疾患、ミトコンドリア機能障害、軸索輸送の欠陥、異常なアポトーシス、及び／またはオートファジー、及び酸化ストレスの上昇、及び／または活性酸素種（ＲＯＳ）産生が含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】
限定されないが、神経変性障害としては、パーキンソン病及び関連障害、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病及び認知症の他の形態、脊髄小脳失調症、フリードライヒ失調症、テイサックス病、レビー小体病、プリオン病、（例えば、クロイツフェルトヤコブ病）、多発性硬化症（ＭＳ）、ピック病、シャイ・ドレーガー症候群、橋小脳形成不全、神経セロイドリポフスチン症、ゴーシェ病、鉄沈着を伴う神経変性、痙性失調症／対麻痺、核上性麻痺、中脳辺縁皮質認知症、視床変性、皮質−線条体−脊椎変性、皮質ベースの神経節変性、大脳小脳皮質変性、リー症候群、ポリオ後症候群、遺伝性筋萎縮症、脳炎、神経炎、水頭症、及び運動ニューロン疾患が挙げられる。
【００５８】
更に、当業者は、神経筋障害としては、パーキンソン病及び関連障害、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、フリードライヒ失調症、テイサックス病、レビー小体病、末梢神経障害、重症筋無力症、ＭＳ、リー症候群、ポリオ後症候群、遺伝性筋萎縮症、痙性失調症／対麻痺、及び運動ニューロン疾患が挙げられるが、これらに限定されないことを理解するであろう。
【００５９】
本発明との関連で、請求項に記載の方法による予防的及び／または治療的処置の対象となる神経変性及び／または神経筋疾患、障害または状態を有する動物は、既存の神経変性及び／または神経筋疾患、障害または状態を有するか、そのような疾患、障害または状態に罹患しやすいと判定されている。
【００６０】
一実施形態では、この広い態様の神経変性及び／または神経筋疾患、障害または状態は運動ニューロン疾患である。
【００６１】
概括的に言えば、運動ニューロン疾患は、通常、疾患に冒された動物の運動ニューロンが関与する神経変性及び／または神経筋障害の形態である。当業者に容易に理解されるように、運動ニューロンは、体幹、肢及び指骨の随意筋、ならびに発声、嚥下及び呼吸に影響を与える筋肉を制御する神経細胞である。したがって、ＭＮＤの臨床症状としては、筋力低下及び／または消耗、筋けいれん、嚥下困難、不明瞭な発語、筋振戦／線維束形成、認識力低下、呼吸困難、呼吸不全、疲労、及び体重減少が挙げられるが、これらに限定されない。運動ニューロン疾患としては、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルーゲーリック病
としても知られる）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、進行性球麻痺（ＰＢＰ）、仮性球性麻痺及び脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
上記を考慮すると、運動ニューロン疾患は、ＡＬＳ、ＰＬＳ、ＰＭＡ、ＰＢＰ、仮性球性麻痺またはＳＭＡであり得る。
【００６３】
一実施形態では、運動ニューロン疾患はＡＬＳである。
【００６４】
「アナプレロティック剤」は、ＴＣＡに組み込まれた際に、ＴＣＡサイクルの１種以上の枯渇したＣ４（４個の炭素を含む）中間体を補充するか、またはＴＣＡサイクルの１種以上の中間体のレベルを維持もしくは増加させ、または両者を実施する物質を意味する。
【００６５】
当業者が認識するように、ＴＣＡサイクル中間体のレベルは、ＴＣＡサイクルの正常な機能及び調節のために重要である。しかし、ほとんどのＴＣＡサイクル中間体は、細胞内の他の代謝経路に関与し、その結果、ミトコンドリアからそれらが流出することに続いて、それらのそれぞれのレベルは、ＴＣＡサイクルで減少することが見られる可能性がある。その後、このようなＴＣＡサイクル中間体のレベルの減少は、サイクルの最適な機能を阻害する可能性がある。ＴＣＡサイクルにアナプレロティック剤を入れることにより、この流出が克服され、それにより、サイクルの最適な機能のためのＴＣＡサイクルサイクル中間体の適切なレベルが維持される。
【００６６】
一実施形態では、本発明の１種以上のアナプレロティック剤は、クエン酸、アルファ−ケト−グルタル酸（２−オキソグルタル酸）、グルタミン酸、グルタミン、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、ピルビン酸、及び／または１種以上のプロピオニルＣｏＡの前駆体である。
【００６７】
これらのアナプレロティック剤の任意の適切な塩（例えば、カルシウム、ナトリウム、マグネシウムまたはカリウム塩）、プロドラッグ、類似体、誘導体、置換及び／または分岐型、前駆体及び誘導体も、本発明の範囲内であることが企図される。例えば、本発明の塩としては、グルタミン酸モノナトリウム、ピルビン酸カルシウム（及びピルビン酸カルシウム一水和物）、クレアチンピルベート、ピルビン酸マグネシウム、ピルビン酸カリウム及びピルビン酸ナトリウムを挙げることができる。
【００６８】
アナプレロティック剤の一実施形態はプロピオニルＣｏＡの前駆体である。「プロピオニルＣｏＡの前駆体」は、それから、動物体の細胞または組織内で起こる１以上の代謝反応によりプロピオニルＣｏＡが形成し得る物質を意味する。
【００６９】
これには、その範囲内に、妥当な場合、それらの塩、プロドラッグ、類似体、誘導体、置換、非置換の分岐型、及び他の不均一な鎖長の脂肪酸、及び誘導体が含まれる。
【００７０】
プロピオニルＣｏＡの前駆体の典型例は、不均一な鎖長の脂肪酸、特に７個の炭素−脂肪酸、ヘプタノエート、不均一な鎖長の脂肪酸のトリグリセリドを含むトリグリセリド、式１の化合物、１つ以上の不均一な脂肪酸を含むリン脂質、Ｃ５ケトン体（例えば、β−ケトペンタノエート（３−ケト吉草酸）、及びβヒドロキシペンタノエート（３−ヒドロキシ吉草酸）であるが、これらに限定されない）である（Ｋｉｎｍａｎ  ２００６，Ａｍ
Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２９１（４）：Ｅ８６０−６，Ｂｒｕｎｅｎｇｒａｂｅｒ及びＲｏｅ  ２００６，Ｊ  Ｉｎｈｅｒｉｔ  Ｍｅｔａｂｏｌ  Ｄｉｓ  ２９（２−３）：３２７−３１）。上記プロピオニルＣｏＡの前駆体の例としては、その化合物自体、ならびに該当する場合はそれらの塩、プロドラッグ、溶媒和
物及び誘導体が挙げられる。
【００７１】
いくつかの実施形態では、プロピオニルＣｏＡの少なくとも１種の前駆体は、不均一な鎖長の脂肪酸、トリグリセリド、リン脂質、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００７２】
少なくとも１種のプロピオニルＣｏＡの前駆体は、不均一な鎖長の脂肪酸、例えば７個の炭素の脂肪酸であってもよい。他の実施形態では、少なくとも１種のプロピオニルＣｏＡの前駆体は、トリグリセリド、例えば不均一な鎖長の脂肪酸のトリグリセリドである。更なる実施形態では、少なくとも１種のプロピオニルＣｏＡの前駆体は、１または２個の不均一な鎖長の脂肪酸を含むリン脂質である。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のプロピオニルＣｏＡの前駆体はＣ５ケトン体である。
【００７３】
プロドラッグの例としては、ヒドロキシアルカノエートのエステル、オリゴマー、例えばオリゴ（３−ヒドロキシ吉草酸）（Ｓｅｅｂａｃｈ  １９９９，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ
Ｍａｃｒｏｍｏｌ  ２５（１−３）：２１７−３６）、ならびに個体に投与されたときにプロピオニルＣｏＡを供給し得る、他の薬学的に許容される誘導体が挙げられる。溶媒和物は、前述のプロピオニルＣｏＡの前駆体と薬学的に許容される溶媒との間に形成される複合体を指す。薬学的に許容される溶媒の例としては、水、エタノール、イソプロパノール、酢酸エチル、酢酸、及びエタノールアミンが挙げられる。本明細書で用いられる場合、本発明の「誘導体」化合物は、例えば他の化学的部分との結合または複合体形成により変化する。
【００７４】
ある特定の実施形態では、プロピオニルＣｏＡの前駆体は、不均一な鎖長の脂肪酸である。本発明は、その範囲内に不均一な鎖長の脂肪酸のエステルをも含む。不均一な鎖長の脂肪酸は、奇数個の炭素数の脂肪酸をも意味する場合があることを当業者は認識するであろう。不均一な鎖長の脂肪酸は、プロピオン酸、ペンタン酸、ヘプタン酸、ノナン酸及びウンデカン酸からなる群から選択することができる。
【００７５】
置換、不飽和及び／または分岐鎖の不均一な鎖長の脂肪酸、ならびに他の修飾された不均一な鎖長の脂肪酸は、本発明の範囲を逸脱することなく使用することができる。
【００７６】
他の実施形態では、少なくとも１種のプロピオニルＣｏＡの前駆体は、式Ｉ：
【００７７】
【化２】
2020063233.tif 000004
の化合物の１以上であってもよく、
式中、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立してアルキル、アルケニルまたはアルキニルから選択される。
【００７８】
一実施形態では、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立してＣ１〜Ｃ２０アルキル、アルケニルまたはアルキニルから選択される。
【００７９】
更なる実施形態では、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立してＣ３〜Ｃ１５アルキル、アルケニルまたはアルキニルから選択される。
【００８０】
他の更なる実施形態では、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立してＣ５〜Ｃ１２アルキル、アルケニルまたはアルキニルから選択される。
【００８１】
更に他の更なる実施形態では、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立してＣ５〜Ｃ９アルキル、アルケニルまたはアルキニルから選択される。
【００８２】
ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は同一であり、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、及びＣ９アルキルからなる群から選択され、特定の実施形態では、Ｃ５、Ｃ７及びＣ９アルキルから選択され、更に他の特定の実施形態では、Ｃ７アルキルである。
【００８３】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立してメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル及びペンタデシルから選択され、全ての異性体を含む。
【００８４】
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立してヘキシル、ヘプチル、オクチル及びノニルから選択してもよく、全ての異性体が含まれる。
【００８５】
特定の実施形態では、式Ｉの化合物は奇数個の炭素のトリグリセリドである。ある特定の実施形態では、奇数個の炭素のトリグリセリドは、トリペンタノイン、トリヘプタノイン及びトリノナノインから選択される。
【００８６】
一実施形態では、式Ｉの化合物は１、２または３個のＣ７鎖を含んでいてもよいＣ７トリグリセリドである。
【００８７】
一実施形態では、式Ｉの化合物は、下記に示すトリヘプタノインである。この化合物は、１，３−ジ（ヘプタノイルオキシ）プロパン−２−イルヘプタノエート、１，２，３−プロパントリイルトリヘプタノエート、及びグリセロールトリヘプタノエートを含む、多くの他の名称によっても知られ得る。
【００８８】
【化３】
2020063233.tif 000005
【００８９】
他の実施形態では、式Ｉの化合物はトリノナノインである、この化合物は、グリセロールトリノナノエート及びグリセリルトリペラルゴネートを含む多くの他の名称によっても知られ得る。
【００９０】
「アルキル」という用語は、任意に置換されている、１〜２０個の炭素原子を有する直鎖及び分岐鎖の炭化水素基を意味する。必要に応じて、アルキル基は特定の数の炭素原子を有してもよく、例えばＣ１〜Ｃ６アルキルであり、これは直鎖状または分枝鎖状配置において１、２、３、４、５または６個の炭素原子を含む。アルキル基の非限定的例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓ−及びｔ−ブチル、ペンチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、ヘキシル、ヘプチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、２−エチルブチル、３−エチルブチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシルが挙げられる。
【００９１】
「アルキレン」という用語は、アルカンジイルとしても知られる、いずれかの末端で置換されている飽和脂肪族鎖を意味する。非限定的な例としては、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−及び−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−を挙げることができる。
【００９２】
「アルケニル」という用語は、２〜２０個の炭素原子を有し、かつ少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する、任意で置換された不飽和の直鎖状または分枝鎖状の炭化水素基を意味する。必要に応じて、アルケニル基は特定の数の炭素原子を有してもよく、例えばＣ２〜Ｃ６アルケニルであり、これは直鎖状または分枝鎖状配置において２、３、４、５または６個の炭素原子を含む。アルケニル基の非限定的な例としては、エテニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、ｓ−及びｔ−ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプタ−１，３−ジエン、ヘキサ−１，３−ジエン、ノナ−１，３，５−トリエン等が挙げられる。
【００９３】
「アルキニル」という用語は、２〜２０個の炭素原子を有し、かつ少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する、任意で置換された不飽和の直鎖状または分枝鎖状の炭化水素基を意味する。必要に応じて、アルキニル基は特定の数の炭素原子を有してもよく、例えばＣ２〜Ｃ６アルキニル基は、直鎖状または分枝鎖状配置において２、３、４、５または６個の炭素原子を含む。アルキニル基の非限定的な例としては、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル等が挙げられる。
【００９４】
他の実施形態では、本発明は、１または２種の不均一な鎖長の脂肪酸を含むリン脂質の投与を企図する。リン脂質は、ホスファチジン酸（ホスファチデート）、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルセリン及びホスホイノシチドからなる群から選択することができる。
【００９５】
当業者は、プロピオニルＣｏＡの前駆体の標準的な製造方法を認識している。当業者は、例えば、合成法に関するテキスト（その非限定的な例は、Ｓｍｉｔｈ  Ｍ．Ｂ．及びＭａｒｃｈ  Ｊ．，Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第５版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，２００１、ならびにＬａｒｏｃｋ  Ｒ．Ｃ．，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｔｄ．，１９８９）を参照することにより、本明細書に記載された化合物を得るための適切な条件を決定することができる。更に、官能基の選択的操作は、他の官能基の保護を必要とする場合がある。不必要な副反応を防止するための適切な保護基は、Ｇｒｅｅｎ及びＷｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ
Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，第３版，１９９９に提供されている。
【００９６】
本発明のいくつかの実施形態では、プロピオニルＣｏＡの前駆体は７個の炭素原子（Ｃ７）の脂肪酸源またはその誘導体である。このような７個の炭素の脂肪酸源またはその誘導体の例としては、トリヘプタノイン、ｎ−ヘプタン酸、ｎ−ヘプタノエート、ｎ−ヘプタン酸を含むか、ｎ−ヘプタン酸と、ｎ−ペンタン酸、ｎ−ノナン酸、またはその両者のような異なる脂肪酸とを含むトリグリセリドが挙げられるが、これらに限定されない。７個の炭素の脂肪酸源の誘導体の例としては、４−メチルヘキサノエート、４−メチルヘキセノエート、３−ヒドロキシ−４−メチルヘキサノエート、５−メチルヘキサノエート、５−メチルヘキセノエート及び３−ヒドロキシ−５−メチルヘキサノエートが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９７】
例えば、７個の炭素の脂肪酸源は、当該技術分野で公知の任意の手段により３つのｎ−ヘプタン酸分子及びグリセロールのエステル化により製造することができるトリグリセリドである、トリヘプタノインである。トリヘプタノインは、Ｕｌｔｒａｇｅｎｙｘ  Ｐｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌから市販されてもいるが、これらに限定されない。
【００９８】
７個の炭素の脂肪酸の他の例は、ｎ−ヘプタン酸である。ｎ−ヘプタン酸は、以下の構造を有する、飽和の直鎖状の７個の炭素の脂肪酸である。
2020063233.tif 000006
【００９９】
ヘプタン酸は、種々のフーゼル油に相当量あることがわかっており、当該技術分野における公知の任意の手段により抽出することができる。それはまた、希硫酸中、過マンガン酸カリウムを用いてヘプタアルデヒドを酸化することにより合成することができる（Ｒｕｈｏｆｆ，Ｏｒｇ  Ｓｙｎ  Ｃｏｌｌ．ｖｏＩＩＩ，３１５（１９４３））。ヘプタン酸は、またＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）を通して市販されている。
【０１００】
本発明によれば、任意の７個の炭素の脂肪酸源またはその誘導体を、本発明において提供される治療法のために使用することができる。ヘプタン酸、ヘプタノエート及びトリヘプタノインという用語は、本明細書において区別なく使用することができる。ヘプタン酸、ヘプタノエート及びトリヘプタノインは、本明細書の全体にわたって本発明において使用される例示的な７個の炭素の脂肪酸源として使用され、本発明の例示であることが意図されるが、決して本発明の範囲を限定すると解釈すべきでないことが、当業者により理解されるであろう。置換された不飽和、または分岐鎖ヘプタノエート、ならびに他の修飾された７個の炭素の脂肪酸源を、本発明の範囲を逸脱することなく使用することができる。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、Ｃ７脂肪酸源は、最小限の不純物を有する製剤において提供され、例えば、製剤は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のトリヘプタノインを含む。他のいくつかの実施形態では、Ｃ７脂肪酸源は酸価を有し、０．１ｍｇ  ＫＯＨ／ｇｒ以下の酸価、２．８ｍｇ  ＫＯＨ／ｇｒ以下のヒドロキシル価を有する。
【０１０２】
本発明によれば、プロピオニルＣｏＡの誘導体は、単独の薬剤として、または他の治療薬または治療法とともに使用することができる。いくつかの実施形態では、それらは他の治療薬と組み合わせて使用することができる。例えば、プロピオニルＣｏＡの前駆体は、カルニチン助剤、ビオチン、ビタミンＢ１２、またはそれらの組み合わせと併用して用いることができる。カルニチン助剤の例はＬ−カルニチンである。ビタミンＢ１２の例はシアノコバラミンである。
【０１０３】
「投与」または「投与する」は、選択された経路により、組成物（例えば、１種以上のアナプレロティック剤を含む組成物）を対象に導入することを意味する。
【０１０４】
「治療的有効量」という用語は、その薬剤で治療される対象において所望の効果を達成するのに十分な特定の薬剤の量を記述する。例えば、これは、神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態の１または複数の症状の発生を減少し、軽減し、予防し、及び／または遅延するのに必要な１種以上のアナプレロティック剤を含む組成物の量であり得る。いくつかの実施形態では、「治療的有効量」は、神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態の症状を減少または取り除くのに十分である。他の実施形態では、「治
療的有効量」は、所望の生物学的効果を達成するのに十分な量、例えば、神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態と関連する、正常に機能しないミトコンドリア機能を少なくとも一部において逆転させるのに効果的な量である。
【０１０５】
理想的には、アナプレロティック剤の治療的有効量は、対象において相当な細胞毒性効果を起こさずに所望の効果を誘発するのに十分な量である。神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態の１以上の症状の発症を減少し、軽減し、予防し、及び／または遅延するのに有用なアナプレロティック剤の有効量は、治療される対象、任意の関連疾患、障害及び／または状態のタイプ及び重症度、ならびに治療組成物の投与法に依存するであろう。
【０１０６】
本発明は、食餌由来カロリー摂取量の１００％未満である１種以上のアナプレロティック剤の治療量の範囲内に含まれ、約５％〜約９０％、約１５％〜約８０％、約２０％〜約６０％、約２５％〜約５０％、及びまたは約３０％〜約４０％の範囲内であってもよい。
【０１０７】
特定の実施形態では、１種以上のアナプレロティック剤は、食餌由来カロリー摂取量の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２０．５％、少なくとも約２１％、少なくとも約２１．５％、少なくとも約２２％、少なくとも約２２．５％、少なくとも約２３％、少なくとも約２３．５％、少なくとも約２４％、少なくとも約２４．５％、少なくとも約２５％、少なくとも約２５．５％、少なくとも約２６％、少なくとも約２６．５％、少なくとも約２７％、少なくとも約２７．５％、少なくとも約２８％、少なくとも約２８．５％、少なくとも約２９％、少なくとも約２９．５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３０．５％、少なくとも約３１％、少なくとも約３１．５％、少なくとも約３２％、少なくとも約３２．５％、少なくとも約３３％、少なくとも約３３．５％、少なくとも約３４％、少なくとも約３４．５％、少なくとも約３５％、少なくとも約３５．５％、少なくとも約３６％、少なくとも約３６．５％、少なくとも約３７％、少なくとも約３７．５％、少なくとも約３８％、少なくとも約３８．５％、少なくとも約３９％、少なくとも約３９．５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４０．５％、少なくとも約４１％、少なくとも約４１．５％、少なくとも約４２％、少なくとも約４２．５％、少なくとも約４３％、少なくとも約４３．５％、少なくとも約４４％、少なくとも約４４．５％、少なくとも約４５％、少なくとも約４５．５％、少なくとも約４６％、少なくとも約４６．５％、少なくとも約４７％、少なくとも約４７．５％、少なくとも約４８％、少なくとも約４８．５％、少なくとも約４９％、少なくとも約４９．５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれ以上を含む量で、動物に与えられる。
【０１０８】
一実施形態では、１種以上のアナプレロティック剤が、動物にとっての食餌由来カロリー摂取量の少なくとも約５％を含む量で動物に与えられる。
【０１０９】
更なる実施形態では、１種以上のアナプレロティック剤が、動物にとっての食餌由来カロリー摂取量の少なくとも約２０％を含む量で動物に与えられる。
【０１１０】
他の更なる実施形態では、１種以上のアナプレロティック剤が、動物にとっての食餌由来カロリー摂取量の少なくとも約３０％を含む量で動物に与えられる。
【０１１１】
更に他の実施形態では、１種以上のアナプレロティック剤が、動物にとっての食餌由来カロリー摂取量の少なくとも約３５％を含む量で動物に与えられる。
【０１１２】
「食餌由来カロリー摂取量の％」は、ＫＪｏｕｌｅの％またはＫｃａｌの％と関連し得
ることを当業者は認識するであろう。
【０１１３】
１種以上のアナプレロティック剤を患者に提供するために、任意の安全な投与経路を使用してもよい。例えば、経腸、経口、直腸、非経口、舌下、頬、十二指腸内、胃内、静脈内、関節内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、経皮等を使用することができる。治療効果を達成するのに効果的な濃度でトリヘプタノインを含む食物の摂取により投与することができる。または、カプセルとして、またはリポソーム内、溶液または懸濁液内に混入して、単独で、または他の栄養素、甘味料及び／または香味料と組み合わせて投与することができる。カプセル及び錠剤は、セラック、及び公知の他の腸溶性剤でコーティングすることができる。
【０１１４】
剤形としては、錠剤、分散剤、懸濁液、注射、溶液、シロップ、油剤、トローチ、カプセル、座剤、エアロゾル、経皮パッチ等が挙げられる。これらの剤形は、この目的のために特に設計された、注入もしくは移植制御放出デバイス、またはこの様式で更に作用するようにされた他の形態のインプラントも含んでよい。治療薬の制御放出は、例えば、アクリル樹脂を含む疎水性ポリマー、ワックス、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸及びポリグリコール酸、ならびにヒドロキシプロピルメチルセルロース等の特定のセルロース誘導体でコーティングすることにより達成することができる。更に、制御放出は、他のポリマー材料、リポソーム、及び／またはミクロスフェアを用いることにより達成することができる。
【０１１５】
経腸、腹腔、経口または非経口投与のためのアナプレロティック剤は、それぞれ、所定量の本発明の治療薬を、粉末もしくは顆粒として、または水溶液として、または水性液体、非水性液体、水中油型エマルション、もしくは油中水型液体エマルション中の懸濁液として含むカプセル、サシェ剤または錠剤等の別個の単位で存在していてもよい。ある特定の実施形態では、一種以上のアナプレロティック剤の投与は、経口によるものである。そのような１種以上のアナプレロティック剤の治療的有効量は、薬学的方法のいずれかにより調製することができるが、全ての方法は、前述の１種以上の薬剤を、１種以上の必要な成分を含む担体と会合させるようにするステップを含む。一般に、そのような組成物は、本発明の薬剤を液体担体もしくは微粉化した個体担体またはその両者と均一かつ均質に混合し、その後、必要に応じて製品を所望の体裁に成形することにより調製することができる。
【０１１６】
アナプレロティック剤は、剤形に適合した方法で、また薬剤的に有効である量で投与することができる。本発明との関連で、患者に投与される用量は、適切な期間にわたり、患者において有益な反応をもたらすのに十分であるべきである。投与すべき薬剤の量は、治療される対象に依存し、年齢、性別、体重及び一般的健康状態、医師の判断に依存するであろう要因に依存し得る。
【０１１７】
治療法は、ヒト、及び家畜（例えば、ウマ、ウシ及びヒツジ）、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ及びネコ）、実験動物（例えば、マウス、ラット及びモルモット）及び競技用動物（例えば、競走馬、グレーハウンド及びラクダ）等の非ヒトほ乳動物を含む、ほ乳動物（しかし、これらに限定されない）の予防的または治療的処置に適用可能であることも認識されるであろう。
【０１１８】
更なる態様では、本発明は、（ｉ）治療的有効量の１種以上のアナプレロティック剤と、（ｉｉ）使用説明書とを含む、神経変性及び／または神経筋疾患、障害または状態を有する動物の治療のためのキットを提供する。
【０１１９】
１種以上のアナプレロティック剤は、トリペンタノイン、トリヘプタノイン及びトリノ
ナノインから選択することができる。
【０１２０】
特定の実施形態では、１種以上のアナプレロティック剤はトリヘプタノインである。
【０１２１】
本態様の１種以上のアナプレロティック剤は、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を更に含んでいてもよい。このような薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤は、全身投与に安全に使用することのできる固形状もしくは液状賦形剤、希釈剤もしくは封入物質を含んでいてもよい。薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を記述する有用な参考文献は、参照により本明細書に組み入れられる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．Ｎ．Ｊ．ＵＳＡ，１９９１）である。
【０１２２】
本態様の、ある特定の実施形態は、神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態の１または複数の症状のための１種以上の追加の治療薬を更に含んでいてもよい。これらとしては、例えば、酸化防止剤、抗炎症剤、抗アポトーシス化合物、コリンエステラーゼ阻害剤、アセチルコリン受容体アゴニスト及び／またはアンタゴニスト、α−アドレナリン受容体アゴニスト及び／またはアンタゴニスト、モノアミンオキシダーゼ阻害剤、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤、一酸化窒素ドナー、鎮痛薬、リルゾール（Ｒｉｌｕｔｅｋ（登録商標））、筋弛緩薬及び／または抗けいれん薬が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２３】
本態様の１種以上のアナプレロティック剤は、上で説明した剤形を含んでいてもよい。更に、当業者は、本態様のある特定の実施形態が、当該キットの剤形、及び／または組成物を投薬するのに適切な器具を含んでいてもよいことを容易に認識するであろう。このような投薬器具は、例えば、１以上のシリンジ及び／または針、ブリスターパック、アプリケーター、適切に形成した容器、吸入装置、スプーン、点滴器、噴霧器、経皮パッチ、ガーゼ、及び／または包帯（これらに限定されない）を含んでいてもよい。
【０１２４】
他の更なる態様では、本発明は、動物が、神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態を有するか、罹患しやすいかを決定する方法を提供し、当該方法は、（ｉ）エネルギー代謝に関連する酵素をそれぞれコードする、１種以上の核酸の発現レベル、（ｉｉ）当該酵素の発現レベル及び／もしくは活性、ならびに／または（ｉｉｉ）エネルギー代謝に関連する１種以上の代謝産物のレベルを測定するステップを含む。
【０１２５】
更に他の更なる態様では、本発明は、１種以上のアナプレロティック剤の投与による、神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態の治療または予防に対する動物の応答を監視する方法を提供し、当該方法は、（ｉ）エネルギー代謝に関連する酵素をそれぞれコードする１種以上の遺伝子の発現レベル、（ｉｉ）当該酵素の発現レベル及び／もしくは活性、ならびに／または（ｉｉｉ）エネルギー代謝に関連する１種以上の代謝産物のレベルを測定するステップを含む。
【０１２６】
神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態は上に記載されている。
【０１２７】
「エネルギー代謝」は、細胞のエネルギー供給、したがって生体のエネルギー供給の維持に関与する全ての化学反応及び／または過程の総和を意味する。これらの反応及び／または過程は、主に酵素により触媒され、通常、エネルギーを抽出するために、グルコースのような炭水化物等の大きい分子の小さい分子への分解を伴っている。本発明については、これらの反応及び／または過程に関与する、またはそれらの結果として産生される物質を代謝産物と呼ぶ。概括的に言えば、エネルギー代謝としては、解糖、ＴＣＡサイクル、酸化的リン酸化、アナプレロシス及び嫌気性呼吸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２８】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、酵素または代謝産物は、糖分解酵素または代謝産物、ＴＣＡサイクル酵素または代謝産物、ならびにアナプレロティック酵素または代謝産物からなる群から選択することができる。
【０１２９】
糖分解酵素の非限定的例としては、ヘキソキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、フルクトース二リン酸アルドラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、及びジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼが挙げられる。
【０１３０】
特定の実施形態では、糖分解酵素は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼアルファ１、グルコースリン酸イソメラーゼ（ＰＧＩ）、またはホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）である。
【０１３１】
糖分解代謝産物の非限定的例としては、グルコース、グルコース６−リン酸、フルクトース６−リン酸、フルクトース１，６−二リン酸、グリセルアルデヒド３−リン酸、１，３−ビスホスホグリセリン酸、３−ホスホグリセリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸及び乳酸が挙げられる。
【０１３２】
ＴＣＡサイクル酵素の非限定的例としては、クエン酸シンターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ、スクシニルＣｏＡシンテターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ複合体、フマラーゼ、複合体Ｉ（別名、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、またはＮＡＤＨユビキノン酸化還元酵素）、及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼが挙げられる。
【０１３３】
ＴＣＡサイクル酵素は、オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ及びコハク酸デヒドロゲナーゼ複合体サブユニットＡからなる群から選択することができる。
【０１３４】
ＴＣＡサイクル代謝産物の非限定的例としては、アセチルＣｏＡ、クエン酸、シス−アコニット酸、イソクエン酸、オキサロコハク酸、オキソグルタル酸、スクシニルＣｏＡ、コハク酸、フマル酸（ｆｕｍｕｒａｔｅ）、リンゴ酸及びオキサロ酢酸が挙げられる。
【０１３５】
アナプレロティック酵素の非限定的例としては、ピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、アデニロコハク酸リアーゼ、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ１、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ２ならびにプロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼＡ及びＢが挙げられる。
【０１３６】
アナプレロティック酵素は、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ１、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ２、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットＡ及びＢ、ならびにメチルマロニルＣｏＡムターゼからなる群から選択することができる。
【０１３７】
アナプレロティック代謝産物の非限定的例としては、アスパラギン酸、アラニン、ＧＡＢＡ、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、アルファ−ケトグルタル酸（２−オキソ−グルタル酸）、グルタミン酸、グルタミン、プロリン、ヒスチジン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、イソロイシン、バリン、プロピオニルＣｏＡ、メチルマロニルＣｏＡ及びアデニロコハク酸が挙げられる。
【０１３８】
適切な技術分野の当業者は、乳酸、アラニン、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン及びアスパラギン酸等のＴＣＡサイクル及び／またはアナプレロシスと関連する代謝産物のレベルが低下すると、これは、ＴＣＡサイクル中間体がより少なく、及び／またはアナプレロシスがより少ないことを示すと容易に認識するであろう。
【０１３９】
当業者に十分に認識されるように、増加したまたは減少した発現レベル（例えば、核酸もしくはタンパク質発現、または代謝産物のレベル）または活性に対する本明細書における言及は、発現の相対的及び絶対的レベルを含み、包含する。例として、発現または活性の相対的レベルは、例えば、正常もしくは非罹患個体、または個体の集団から得た試料におけるように、発現または活性の基準または標準レベルと比較して決定することができる。
【０１４０】
神経変性及び／または神経筋疾患、障害または状態を有するか罹患しやすい動物における、代謝産物のレベル、酵素のタンパク質発現、遺伝子発現及び／または酵素活性のレベルの変化または変質は、当該動物から得られた生物試料由来のこれらのレベルを、神経変性及び／または神経筋疾患、障害または状態を有していないか、罹患しやすくないことがわかっている他の動物のこれらのいずれかのレベル、または一般的な集団もしくは基準集団のこれらのレベルと、比較することにより決定することができる。
【０１４１】
一実施形態では、エネルギー代謝に関連する酵素をそれぞれコードする、１種以上の核酸の発現レベルの低下もしくは減少、及び／または当該酵素の発現レベル及び／もしくは活性の低下もしくは減少、及び／もしくはエネルギー代謝に関連する１種以上の代謝産物のレベルの低下もしくは減少は、当該動物が神経変性及び／もしくは神経筋疾患、障害または状態を有するか、罹患しやすいことを示す。
【０１４２】
更に他の実施形態では、エネルギー代謝に関連する酵素をそれぞれコードする１種以上の核酸の発現レベルの上昇、及び／または当該酵素の発現レベル及び／もしくは活性の上昇、及び／またはエネルギー代謝に関連する１種以上の代謝産物のレベルの上昇は、当該動物が１種以上のアナプレロティック剤の投与に対して応答していることを示す。
【０１４３】
通常、エネルギー代謝に関連する酵素をそれぞれコードする１種以上の核酸、及び／または当該酵素、及び／またはエネルギー代謝に関連する１種以上の代謝産物は、生物試料中で検出または測定される。試料は、動物から得られる液体、細胞もしくは組織試料であってもよい。
【０１４４】
これに関連し、「核酸」は、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡを含むが、これらに限定されない一本または二本鎖ＤＮＡであってもよく、またはｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡを含むが、これらに限定されない一本または二本鎖ＲＮＡであってもよい。核酸の特定の例は、核酸配列の増幅に由来する「増幅産物」である。これらの酵素をコードする核酸の核酸増幅に適切なプライマーの非限定的例は、表１に示すそれぞれのヌクレオチド配列を含む。
【０１４５】
【表１】
2020063233.tif 000007
2020063233.tif 000008
【０１４６】
当該技術分野において周知であるように、遺伝子発現の測定法としては、ノーザンブロッティング、核酸増幅技術（例えば、ｑＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ及び競合ＰＣＲ）、高処理発現プロファイリング（例えば、マイクロアレイ）、遺伝子発現連鎖解析（ＳＡＧＥ）及びＲＮＡ−ｓｅｑが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４７】
エネルギー代謝に関連する酵素の発現レベルを測定することに適した技術は、同様によく知られている。そのような技術としては、免疫学的検定（例えば、ウェスタンブロット）、放射免疫測定、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、タンパク質マイクロアレイ技術（例えば、逆相タンパク質マイクロアレイ（ＰＲＲＡ））、組織学的方法（例えば、免疫蛍光法（ＩＦ）及び免疫組織化学的検査（ＩＨＣ））、比色分析／蛍光分析／発光アッセイ及びプロテオミクス手法、例えば質量分析（ＭＳ）及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４８】
また、エネルギー代謝に関連する代謝産物のレベルの測定に適した技術は、当該技術分野で周知である。そのような技術としては、比色分析／蛍光分析／発光酵素学的アッセイ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスまたは液体クロマトグラフィーと組み合わせた質量分析（ＭＳ）（ＧＣ−ＭＳまたはＬＣ−ＭＳ）及び組織学的方法（例えば、ＧＡＢＡについての免疫蛍光法（ＩＦ）及び免疫組織化学的検査（ＩＨＣ））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４９】
当業者は、参照により本明細書に組み入れられる、Ｅｉｓｅｎｔｈａｌ  Ｒ及びＤａｎｓｏｎ  ＭによるＥｎｚｙｍｅ  Ａｓｓａｙｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ）（第２版，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００２）に記載されているような、酵素活性を測定するための標準法を十分に知っている。
【０１５０】
本発明が容易に理解され、実用に供することができるように、以下の非限定的な例が提供される。
【実施例】
【０１５１】
実施例１：動物にモデルにおけるＡＬＳについてのトリヘプタノインの効果
材料及び方法
動物
全ての実験はクイーンズランド大学動物倫理委員会により認可されており、クイーンズランド州の動物保護法（Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｃｔ）２００１のガイドラインに従っている。使用する動物の苦しみ及び数を最小にするために全ての努力がなされた。野生型及びｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウス（Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＳＯＤ１＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊ、ストック番号００４４３５
，Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米国メーン州）を、ｈＳＯＤ１Ｇ９３ＡのオスをＣ５７Ｂ／Ｌ６野生型のメス（クイーンズランド大学）と交配することにより作製した。マウスを、１２時間明環境、１２時間暗環境に収容し、食物及び水は自由に与えた。実験は、動物の遺伝子型及び食餌介入に対し盲検法で行った（マウスがＡＬＳの表現型を発現し始めるまで）。
【０１５２】
食餌介入
離乳直後、マウスを、標準食（ＳＦ１１−０２７、Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｆｅｅｄｓ、米国ワシントン州）または３５％のカロリーがトリヘプタノイン油（Ｓａｓｏｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に由来する同等の食餌（ＳＦ１１−０２８、Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｆｅｅｄｓ）のいずれかに配置した。全ての食餌は、タンパク質、ミネラル、酸化防止剤及びビタミン含有量が、そのカロリー密度に対して同等であった（Ｔｈｏｍａｓら、２０１２）。トリヘプタノインは、食餌中のショ糖、複合炭化水素及び長鎖脂肪の一部を置換する。
【０１５３】
酵素アッセイ
サイトゾル及びミトコンドリア画分を、冷却した分離緩衝液（１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，２１５ｍＭ  Ｄ−マンニトール，７５ｍＭショ糖  ｓｕｃｒｏｓｅ，０．１％  ＢＳＡ及び２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ  ７．４）中、均質化（Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ組織粉砕器）により、腓腹筋から分離した。試料を、４℃、７００ｇで１０分間遠心分離した。上清を集め、４℃、１０，５００ｇで１０分間遠心分離し、上清を集め、ペレットを１ｍＬの分離緩衝液に再懸濁した。遠心分離ステップを繰り返し、集められた上清（サイトゾル画分）及び再懸濁した沈殿物（ミトコンドリア画分）を−８０℃に貯蔵した。
【０１５４】
全ての酵素の活性は、Ｓｕｎｒｉｓｅ  Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、スイスＭａｎｎｅｄｏｒｆ）により２５℃で連続分光学的定量法により測定した。ＮＡＤ及びＮＡＤＰの還元（それぞれ、ＯＧＤＨ及びＰＧＩ活性）、またはＮＡＤＨの酸化（ＰＦＫ活性）を、３４０ｎｍの波長における時間による吸光度の変化により測定した。全ての活性率は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）を用い、試料中のタンパク質のミリグラムに対して補正した。
【０１５５】
ＯＧＤＨアッセイ
本アッセイは、Ｌａｉ及びＣｏｏｐｅｒ，１９８６から改変した。アッセイ混合物は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）、０．２ｍＭナトリウムＣｏＡ、２ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、０．５ｍＭ  チアミンピロリン酸、０．５ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール、及び１０μＬの試料から分離したミトコンドリアを含んでいた。反応は、ＮＡＤの還元を測定するために、１０ｍＭのオキソグルタル酸を加えることにより開始した。
【０１５６】
ＰＧＩアッセイ
グルコースリン酸イソメラーゼ（ＰＧＩ）の活性を、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼを介したＮＡＤＰ還元に反応を結合させることにより測定した。アッセイ混合物は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）、０．６ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、１７．５ｍＭ塩化マグネシウム、５Ｕ／ｍＬグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ８４０４，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び５μＬの試料からのサイトゾル画分を含んでいた。反応は、１０ｍＭのフルクトース６−リン酸を加えることにより開始した。
【０１５７】
ＰＦＫアッセイ
ホスホフルクトキナーゼの活性を、ＮＡＤＨの酸化を測定するための酵素、アルドラー
ゼ、α−グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ及びトリオースホスフェートイソメラーゼに、反応からのフルクトース１，６−ビスリン酸の産生を結合させることにより測定した。アッセイ混合物は、８０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）、２ｍＭジチオスレイトール、３．６ｍＭアデノシン三リン酸、０．６ｍＭ還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、２０ｍＭ塩化マグネシウム、６Ｕ／ｍＬアルドラーゼ（Ａ８８１１，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、１Ｕ／ｍＬα−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、及び５Ｕ／ｍＬのトリオースホスフェートイソメラーゼ（Ｇ１８８１，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ならびに５μＬの試料からのサイトゾル画分を含んでいた。反応は、１５ｍＭのフルクトース６−リン酸を加えることにより開始した。
【０１５８】
行動試験及び観察
動物は、光サイクル内で、約３〜４時間の行動試験を受けた。外部刺激の変化によって引き起こされる可能性の影響を最小にするように、全ての行動試験は、最小限の刺激での環境で行った。全ての試験セッション前に動物を秤量した。マウスを観察し、あらゆる非ＡＬＳ関連死が試験から除外されることを保証するために、疾患の進行を追跡し、神経学的スコアシートに従って等級分けした。神経学的スコアは、ＡＬＳ治療開発研究所（ＡＬＳ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）で開発された基準（Ｇｉｌｌら、２００９）から改変した。倫理学的要件に従い、食料ホッパーに到達するにはあまりにも弱くなったｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスは、ケージの床に湿った食物を与えられた。マウスが仰向けにされた後、１５秒以内に自分自身を正すことができない時に、試験の終点と定義された。末期または２５週齢に達すると、トランスジェニックマウス及びそれぞれの野生型の同腹仔は、ペントバルビタールの過剰投与（１２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、Ｐｒｏｖｅｔ、オーストラリア）により安楽死させた。腓腹筋及び尾を含む組織を、次の分析のために集めた。体重の減少が開始した時点を判断するため、本発明者らは、１２〜１７週の組み合わせた平均体重の１０％以上が減少したことが観察され、それ以降の３回の全ての測定値が、もとの平均体重の９０％以下であった日と定義した。
【０１５９】
後肢握力試験
後肢握力試験を、Ｔ−バー力変換器（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ、イタリア）を用いて週に２回行った。動物は尾より保持され、その後肢が６０°の角度で下向きに引っ張られる前にＴ−バーをつかんでいることが確実にされた。両方の後肢が同時にバーを離れる場合にのみ、力変換器の読取りを行った。各トレーニングセッションで、マウスあたり１０回の試験の平均値を記録した。握力が低下した時点を比較するため、９〜１３週の組み合わせた平均握力が３０％以上低下し、それ以降の３回の測定値がもとの平均強度の７０％以下であった場合に、その時点を記録した。
【０１６０】
ロータロッド試験
ロータロッド試験を、マウスについて設計されたロータロッド（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ、イタリア）を用い、週に１回を１０回繰り返した。動物をロッド上に配置させ、その後、１分あたり２５回転で３分間回転させた。動物が落ちる時間を記録した。本発明者らは、この時間がゼロである、ロータロッド上でバランスを失う歳を定義した。
【０１６１】
定量的遺伝子型決定
全てのマウスは、ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ導入遺伝子の相対的コピー数を評価するために既に開示されている手段（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、２００４）に従い、リアルタイム定量的ＰＣＲにより、死後に遺伝子型を同定した。使用したプライマーは、従来のＰＣＲによる遺伝子型決定のためにＪａｃｋｓｏｎの研究室によって文書化されている（ｈｔｔｐ：／／ｊａｘｍｉｃｅ．ｊａｘ．ｏｒｇ）。５ｎｇのゲノムＤＮＡ及び５μＬのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州）と混合した、各反応における順方向及び逆方向プライマーの最終濃度は、ｈＳ
ＯＤについて０．４μＭであり、マウスインターロイキン２（ｍＩｌ２）について０．５μＭであった。アッセイの温度プロファイルは、最初は９５℃で、１０分間で開始、次いで、９５℃で３０秒間、６０℃で１分間、及び７２℃で３０秒間を４０サイクルであった（ＡＢＩ  ７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。最後に、９５℃で２分間加熱し、６０℃に１５秒間冷却し、最後に１５秒間で９５℃までの２％の加熱勾配により、溶解曲線を作成した。陰性対照においてＤＮＡを置換するために水を加えた。ＣＴ値は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ２．４により、生データから計算した。次いで、以下に記載した式を用いてコピー数を計算した。
コピー数＝  (2(CThSOD1Log21.82)-(CTmIL2Log22.01))2
【０１６２】
ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、定量的リアルタイムＰＣＲアッセイ
安楽死の後、すぐに腓腹筋を取り出し、液体窒素中に凍結させた。ＲＮＡを抽出するために、筋肉試料を製造業者の説明書に従って、液体窒素中で冷却した乳鉢及び乳棒を用いて微粉砕し、ＴＲＩ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州）に溶解し、抽出した。混入ＤＮＡを、ＤＮアーゼＩ処理により除去し、製造業者の説明書に従って、Ｔｅｔｒｏ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏｌｉｎｅ、英国ロンドン）を用いてｃＤＮＡを合成した。
【０１６３】
定量的リアルタイムＰＣＲにより、いくつかの代謝関連遺伝子（Ｇａｐｄｈ、Ｐｄｈａ１、Ｏｇｄｈ、Ｓｄｈａ、Ｐｃｘ、Ｇｐｔ１、Ｇｐｔ２、Ｐｃｃａ、Ｐｃｃｂ及びＭｕｔ）の発現をアッセイした。全てのプライマー対（表１）を、筋ｃＤＮＡの４倍連続希釈系列を用いて、効率について評価した。得られた各プライマーの勾配を、式、４［（−１／勾配）−１］＊１００に適用することにより効率を計算するために使用した。反応物は、希釈ｃＤＮＡ、５μＬのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘならびにそれぞれ８μＭの順方向及び逆方向プライマーからなり、最初の加熱開始後に増幅させた。サイクリング及び溶解曲線についての条件は、定量的遺伝子型決定について記載したものと同一であった。試料がＤＮＡ汚染されていないことを確認するために、逆転写酵素処理なしの試料をアッセイした。ハウスキーピング遺伝子（Ｔｂｐ、Ｂ２ｍ及びＨｍｂｓ）の幾何平均に対する目的の遺伝子（ｇｏｉ）の発現倍率（ΔＣＴ）を、各プライマー対の個々の効率（Ｅ）を考慮し、適応式を用いて計算した（Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅら、２００２）。
2020063233.tif 000009
【０１６４】
運動ニューロンの計数
３５日〜７０日齢までマウスに対照食またはトリヘプタノイン食を与え、その時点でマウスにペントバルビタール（１００  ｍｇ／ｋｇ、腹腔注射）で麻酔をかけ、０．９％食塩、次いで４％パラホルムアルデヒドでかん流した。脊髄を取り出し、更に４％のパラホルムアルデヒド中で固定し、続いてＯＣＴコンパウンド中に埋め込み、腰椎から１６μｍの連続薄片を切り出した。切片を冷却ＰＢＳで洗浄し、酢酸緩衝液（ｐＨ３．４）中の０．１％チオニンで染色した。既に記載したように（Ｂａｎｋｓら，２００１；２００３；Ｆｏｒｇａｒｔｙら，２０１３）、運動ニューロンを、立体的方法を用いて計数した。手短に言えば、脊髄の一方の側からの外側細胞柱（ＬＭＣ）中の運動ニューロンを計数し、濃く染色された細胞質、淡い核及び暗く染色された核小体を有する大型のニューロンのみを計数した（Ｃｌａｒｋｅ及びＯｐｐｅｎｈｅｉｍ、１９９５）。全ニューロン計測数を得るために、第２腰椎から第５腰椎からの１０薄片毎に計数し、薄片数で割り、ＬＭＣを含む薄片の合計数でかけた。
【０１６５】
データ解析
統計は、いくつかの群の解析について、一元または二元配置分散分析、それに続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ多重比較事後試験を用い、ＧｒａｐｈＰａｄプリズムソフトウェア（バージョン５．０３）で実施した。体重減少の発生、及び後肢握力の曲線下面積（ＡＵＣ）の比較のために、両側不対ｔ検定を使用した。勾配及び切片の比較を用いた線形回帰分析により、導入遺伝子のコピー数対後肢握力の減少及び体重減少の齢を比較した。データは、平均±標準誤差で表わす。
【０１６６】
握力とロータロッドのバランスの喪失の発症の平均標準偏差を用いた検出力解析は、ｎ＝５が、０．０５の有意水準での８０％の力でそれぞれ、２．３及び１．５週間の間の変化を観察するのに十分であったことを示した。
【０１６７】
結果
ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの筋肉における代謝の変化
最初に、本発明者らは、疾患の中期段階及び末期において、ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスでエネルギー代謝に影響があるかを確認することを試みた。具体的には、本発明者らは、腓腹筋で、中期段階（１１０〜１３０日）で乳酸のレベルが２９％低下したことを見出し、これは解糖作用が減少したことを示す（図２、パネルＡ）。これは、グルコースリン酸の最大活性が２８．５％、またホスホフルクトキナーゼの最大活性の５３％低下したが、酸化的ストレス感受性ＴＣＡサイクル酵素−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼの最大活性が２５％低下したという観察により説明することができる（＊ｐ＜０．０５  ｔ−検定、Ｎ＝５−８マウス／群、図２、パネルＢ）。対照的に、末期においては、筋肉のグルコースレベルは１．９倍上昇し、これは、解糖作用の喪失を示唆している。
【０１６８】
トリヘプタノインは、ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおいて、後肢握力及びバランスの喪失の発症を遅らせる。ｈＳＯＤ１Ｇ９３ＡマウスにおけるＡＬＳの特徴の１つは、筋肉量及び強度の進行性の喪失である。したがって、後肢握力試験を使用し、対照食またはトリヘプタノイン食のいずれかでのマウスにおける疾患の進行の経過を評価した。トリヘプタノイン食のものと比較した場合、対照食（ｎ＝１２）における野生型マウスの平均後肢握力との間には観察可能な相違はなかった（ｎ＝１５；全てのｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスは、導入遺伝子コピー数が低い）。対照食及びトリヘプタノイン食の野生型マウスの平均後肢握力は、一貫して３００〜６００ｍＮであった（図３Ａ）。
【０１６９】
実験の過程で、いくつかのｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスが、２２週齢以降に後肢握力の喪失を発生することが観察された。ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ導入遺伝子コピー数の分析により、ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの亜集団が、わずか１２〜１７コピーのＳＯＤ１導入遺伝子しか有していないことが示された。全てのマウスを評価したところ（図３Ｅ）、導入遺伝子コピー数に対する強度喪失開始の歳の間の線形回帰が、トリヘプタノイン（Ｒ２＝０．９１）と対照食（Ｒ２＝０．８９）供給群間で顕著に相違している。特に、ｘ及びｙ切片は２つの回帰直線（ｐ＜０．００１）間で異なっているが、勾配では異ならない（ｐ＝０．９０）（これは、トリヘプタノインが、後肢握力喪失の発症を効果的に遅延させることを示す）。
【０１７０】
以下の分析では、ＳＯＤ１導入遺伝子をわずか１２〜１７コピー有するマウスを、握力及び遺伝子発現の分析から除外した。導入遺伝子を１９〜２４コピー有するマウスを、高コピー導入遺伝子数を有する１つのグループとして一緒にした。両食餌群のｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの握力は、４００ｍＮを越えることは全く無かった（図３Ｂ）。後肢握力喪失の時間経過は、トリヘプタノイン食のものと比較した時、対照食（ｎ＝５）の高コピー数ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの間で顕著に異なっていた（図３Ｂ、ｎ＝８；ｐ＝０．０４
、二元分散分析）。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較試験は、トリヘプタノイン食のｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスが、対照食のｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスと比較した時に、１８及び１９．５週齢で高い後肢握力を有することを示した（図３Ｂ、ｐ＜０．０５）。トリヘプタノインの各マウスについての経時的握力の曲線下面積は、対照食に対し、３８％増加した（ｐ＝０．０２４、ｔ−検定、図３Ｃ）。対照食のｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスは、１６．５週齢で後肢握力を喪失し始めた。トリヘプタノインを与えられたｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスよりも、後肢握力の喪失の発症時間は２．８週遅れた（図３Ｄ）。ロータロッド試験では、ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの行動は大きく異なり、多くのマウスでは、どのようにロッドでバランスをとるかについて学ぶ「動機を与えられない」ようであり、満足のいく、発症前のベースラインに達しなかった。したがって、本発明者らは、マウスがロッド上にとどまることができなかった時点を評価することだけができた。トリヘプタノインは、バランスの喪失の発生を１．６週遅らせた（ｐ＝０．００１６；図３Ｆ）。
【０１７１】
トリヘプタノインを与えたｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ  マウスと与えていないものの体重減少及び生存期間体重は、ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ遺伝子導入マウスにおける疾患の他の指標である。対照食の野生型マウス（ｎ＝１２）と比較した時、トリヘプタノイン食の野生型マウス（ｎ＝１５）は、より遅い速度で体重が増加し、選別された時に軽くなっていた（ｐ＜０．０００１、図３Ｇ）。１４週齢で、トリヘプタノインを与えた野生型マウスは、対照食の野生型マウスより約３ｇ軽かった（ｐ＜０．０５）。この体重の相違は、２２週齢で約４ｇまで増加した。
【０１７２】
対照食（ｎ＝５）及びトリヘプタノイン食（ｎ＝８）の１９〜２４コピーのｈＳＯＤ１導入遺伝子を有するマウスは、対照食の野生型マウスと比較した時に、軽かった（ｐ＜０．０００１）。全時間にわたり、異なる食餌ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ遺伝子導入マウスの間に統計的な有意な差異はなかった。しかし、対照食と比較すると、トリヘプタノインを与えたｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスは、７〜１６週から体重増加の減少の傾向を示した。生後２０週後の疾患過程の間に、対照食及びトリヘプタノイン食のｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの体重は同様になった（図３Ｇ）。ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおける体重減少の発生は、トリヘプタノイン給餌より１．６週遅れた（図３Ｆ、ｐ＝０．００７、両側不対ｔ−検定）。
【０１７３】
ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの少数のみが疾患の末期に達し、したがって、本発明者らの生存分析は制限された力しか有しない。対照食（ｎ＝５）とトリヘプタノイン（ｎ＝７）のｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスを比較した時、末期に達するまでの日数に相違は見られなかった（１７２．４±３．９に対し、１７４．９±３．５、ｐ＝０．６５３）。これは、この小規模の試験では、トリヘプタノイン処置が生存期間を変化させなかったことを示す。
【０１７４】
運動ニューロンの計数
本発明者らは、疾患の発症に相当する７０日での、マウスにおけるＬ２及びＬ５間の立体的計数により運動ニューロン数を評価した。ニューロン数は、野生型マウスと顕著に異ならなかったので（ｎ＝４、図４）、対照食を与えた野生型（ＣＯＮ、ｎ＝３〜４）に対する、ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａの運動ニューロンの３７％の統計的に有意な喪失は、トリヘプタノインを与えることにより、軽減された。
【０１７５】
遺伝子発現試験
ＴＣＡサイクル代謝またはアナプレロシスが、発症の１０週目に中間のコピー数のｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの腓腹筋で障害を受け得る程度を評価するため、定量的リアルタイムＰＣＲを用い、これらの経路に関与する遺伝子の発現を比較した。２つの食餌群のｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスは類似のｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａコピー数を有し、対照食においては１２〜１７（平均１４．４コピー）であり、トリヘプタノイン給餌群では１２〜２０（平均
１５．７５）コピーを有した（ｐ＝０．５１、不対ｔ−検定）。本発明者らは、解糖に関与する酵素（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ−Ｇａｐｄｈ）、ＴＣＡサイクル（２−オキソグルタル酸及びコハク酸デヒドロゲナーゼ、図５）及び筋肉のアナプレロティック経路に関与する酵素の発現を試験することを選択した。後者は、オキサロ酢酸を産生するピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｃｘ）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ１及び２（Ｇｐｔ１及び２、図５）、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ経路の酵素（図６）、すなわち、一緒にプロピオニルＣｏＡをスクシニルＣｏＡに代謝する、プロピオニルカルボキシラーゼのアルファ及びベータサブユニット（Ｐｃｃａ及びＰｃｃｂ）、及びメチルマロニルムターゼ（Ｍｕｔ）を含む。トリヘプタノインが、観察された任意の変化を軽減することができるかどうかを調査するために、トリヘプタノインを与えられたマウスを本分析に含ませた。
【０１７６】
１０週齢の発症前のｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスでは、定量的リアルタイムＰＣＲにより、野生型マウスと比較した時に、いくつかのデヒドロゲナーゼ及びメチルマロニルムターゼの発現が低下したことが示された。すなわち、本発明者らは、ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおいて、ピルビン酸デヒドロゲナーゼのＡ１サブユニット（Ｐｄｈａ１）が２４％、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ（Ｏｇｄｈ）が３０％、コハク酸デヒドロゲナーゼのサブユニットＡ（Ｓｄｈａ）が２３％、メチルマロニルムターゼ（Ｍｕｔ）が２７．５％、ｍＲＮＡレベルについて統計学的に有意に減少することを見出した（図３、５；事後テストにおいて、全て事後検定においてｐ＜０．０５）。トリヘプタノインを与えることにより、ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスは、ピルビン酸及びコハク酸デヒドロゲナーゼの発現の変化から保護されたが、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ及びメチルマロニルムターゼからは保護されなかった。糖分解を起こすＧａｐｄｈ、ならびにアナプレロシスに関与する遺伝子、Ｇｐｔ１及び２、Ｐｃｃａ及びＰｃｃｂを含む、調査を行った他の遺伝子ではｍＲＮＡレベルの変化は見られなかった（図５及び６）。また、トリヘプタノインの供給によりいくつかのｍＲＮＡレベルの低下が防止され、これは、効果的に筋肉及びその代謝を維持することを示す。
【０１７７】
考察
トリヘプタノインの効果及び臨床的意義
本研究の発見の１つは、ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスが、解糖及びＴＣＡサイクルの活性において代謝の変化を示すことである（図７に要約）。トリヘプタノインは、グルコースに対する代替燃料を供給し、ＴＣＡサイクル、それによってグルコースを含む燃料の酸化を改善するので、これらの代謝の欠陥は、トリヘプタノインを供給することによって機構的に対処することができる。
【０１７８】
実際に、トリヘプタノインは、ＴＣＡサイクルに関与する酵素の遺伝子発現の減少を減らし、ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおいて疾患の発症及び疾患の進行を遅らせた。これは、握力の喪失及びロータロッドにおけるバランスの喪失、体重の減少、ならびに代謝遺伝子の発現の減少の回復の開始において、運動ニューロンの死の遅れとして観察された。本発明者らのデータにより、トリヘプタノインの供給が、疾患の症状の発症前に開始された、ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの状態が明らかに改善されたことが示された。一方、発症前のｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスでは、既に脚部屈筋ニューロンの喪失が見られる（Ｎｇｏら、２０１２）。
【０１７９】
中鎖トリグリセリドとしては、トリヘプタノインは、搬送システムの介入なしで拡散により全ての組織及びミトコンドリアに入ることができるヘプタン酸を、急速に血液に供給する。また、肝臓によりＣ５ケトンが急速に産生され、それらはモノカルボン酸輸送体によりほとんどの組織に入ることができる。したがって、この経路を介したアナプレロシスは、治療開始の直後に開始されると期待される。
【０１８０】
握力及びバランスの喪失に関する本発明者らの検出力解析は、本発明者らの研究が、これらの運動症状の解析に関して適当な数のマウスを使用したことを示している。このことから、本発明者のデータは、体重に関する潜在的な交絡的影響にもかかわらず、筋機能が明らかに保護されていること（疾患修飾）を示す。これらのデータは非常に有望であり、ＡＬＳ患者の安全性の第１相臨床評価を保証するものである。
【０１８１】
ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの筋肉における代謝変化
乳酸レベルは、ピルビン酸のものと強く相関しているので、筋肉中の乳酸レベルの低下は、解糖の減少であると解釈された。本発明者らは、糖分解酵素ＰＧＩ及びＰＦＫの活性の低下、ならびにＯＧＤＨの活性の低下のためにピルビン酸のレベルが低下し、これはＴＣＡサイクルが遅くなったことを示すと仮定した。更に、本発明者らの定量的リアルタイムＰＣＲデータにより、健康な野生型マウスと比較した場合、解糖、ＴＣＡサイクル及びアナプレロシスに関与するいくつかの酵素の発現が、後肢握力がまだ正常である１０週齢の時点で（図３Ｂ）、ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの腓腹筋内で顕著に減少していることが示された（図５、６）。まとめると、これらの酵素のこの特定の下方調節は、ＴＣＡサイクルが初期症状の発症前に筋肉内で減速し、組織の生存のためには十分でないＡＴＰが産生されることを示している。更に、本発明者らは、２５週において、筋肉の主要なアナプレロティック酵素である、２種のグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ｇｐｔ１及びｇｐｔ２）のｍＲＮＡレベルが低下していることを見出たが、これは、ＴＣＡサイクル中間体のレベルが低下していることを示唆している（データは示さず）。
【０１８２】
疾患の経過を遅くすることに加え、トリヘプタノインは、野生型マウスと比較し、ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａからの腓腹筋で減少している、いくつかの酵素の下方調節を防止した。この知見は、トリヘプタノインによるエネルギー代謝の正常化が特定の代謝遺伝子の発現低下を防止し得、次いでエネルギー供給及び組織の生存率を最適化するための健全な代謝を維持するのに役立つことを意味する。
【０１８３】
結論
本研究は、トリヘプタノインが、ＡＬＳの有望な新規な治療法であることを明らかにする。本発明者らのデータは、ＡＬＳ患者における、トリヘプタノインの初期臨床安全性及び認容性試験を支持している。
【０１８４】
本明細書全体を通じて、その目的は、本発明をいかなる１つの実施形態または特定の特長群にも限定することなく、本発明のいくつかの実施形態について述べることである。本発明から逸脱することなく、記述され例示されている実施形態に様々な変更と修正がなされてもよい。
【０１８５】
本明細書において言及される各特許及び特定の書類の開示、コンピュータプログラムならびにアルゴリズムは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。参照により組み込まれる文書中の定義が本明細書中で提供される定義と一致しない場合は、本明細書中で提供する定義が優先される。
【０１８６】
参考文献
Alexander GM, Erwin KL, Byers N, Deitch JS, Augelli BJ, Blankenhorn EP, Heiman-Patterson TD. Effect of transgene copy number on survival in the G93A SOD1 transgenic mouse model of ALS. Brain Res Mol Brain Res 2004; 130: 7-15.
Allen SP, Rajan S, Duffy L, Mortiboys H, Higginbottom A, Grierson AJ, Shaw PJ.
Superoxide dismutase 1 mutation in a cellular model of amyotrophic lateral sclerosis shifts energy generation from oxidative phosphorylation to glycolysis. Neurobiology of Aging 2014, 35:1499-1509.
Banks GB, Chau TN, Bartlett SE, Noakes PG. Promotion of motoneuron survival and branching in rapsyn-deficient mice. J Comp Neurol 2001, 429: 156-165.
Banks GB, Choy PT, Lavidis NA, Noakes PG. Neuromuscular synapses mediate motor
axon branching and motoneuron survival during the embryonic period of programmed cell death. Dev Biol 2003, 257: 71-84.
Brunengraber H, Roe CR. Anaplerotic molecules: Current and future. J Inherit Metab Dis 2006; 29: 327-331.
Clarke PGH, Oppenheim RW. Neuron death in vertebrate development: in vivo methods. Methods Cell Biol. 1995, 46: 277-321.
Cozzolino M, Carri MT. Mitochondrial dysfunction in ALS. Progr Neurobiol 2012; 97: 54-66.
Forgarty MJ, Smallcombe, KL, Yanagawe, Y, Obata K, Bellingham MC, Noakes PG. Genetic deficiency of GABA differentially regulates respiratory and non-respiratory motor neuron development. Plos ONE 2013, 8: e56257
Gill A, Kidd J, Vieira F, Thompson K, Perrin S. No benefit from chronic lithium dosing in a sibling-matched, gender balanced, investigator-blinded trial using a standard mouse model of familial ALS. PLoS One 2009; 4: e6489.
Lai JCK and Cooper AJL. Brain α-Ketoglutarate Dehydrogenase Complex: Kinetic Properties, Regional Distribution, and Effects of Inhibitors. J. Neurochem 1986,
47, 1376-1386.
Milani P, Gagliardi S, Cova E, Cereda C. SOD1 Transcriptional and Posttranscriptional Regulation and Its Potential Implications in ALS. Neurology Res Int 2011; 2011: 458427
Niessen HG, Debska-Vielhaber G, Sander K, Angenstein F, Ludolph AC, Hilfert L,
Willker W, Leibfritz D, Heinze HJ, Kunz WS, Vielhaber S Metabolic progression markers of neurodegeneration in the transgenic G93A-SOD1 mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. European Journal of Neuroscience 2007, 25:1669-1677.
Ngo ST, Baumann F, Ridall PG, Pettitt AN, Henderson RD, Bellingham MC, McCombe
PA. The relationship between Bayesian motor unit number estimation and histological measurements of motor neurons in wild-type and SOD1G93A mice. Clin Neurophysiol 2012; 123: 2080-2091.
Roe CR, Mochel F. Anaplerotic diet therapy in inherited metabolic disease: Therapeutic potential. J Inherit Metab Dis 2006; 29: 332-340.
Russell AP, Wada S, Vergani L, Hock MB, Lamon S, Leger B, Ushida T, Cartoni R,
Wadley GD, Hespel P, Kralli A, Soraru G, Angelini C, Akimoto T Disruption of skeletal muscle mitochondrial network genes and miRNAs in amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiology of Disease 2012, 49C:107-117.
Shi P, Wei Y, Zhang J, Gal J, Zhu H. Mitochondrial dysfunction is a converging
point of multiple pathological pathways in amyotrophic lateral sclerosis. J Alz
Dis 2010; 20 Suppl 2: S311-324.
Steyn FJ, Ngo ST, Lee JD, Leong JW, Buckley AJ, Veldhuis JD, McCombe PA, Chen C, Bellingham MC. Impairments to the GH-IGF-I Axis in hSOD1G93A Mice Give Insight into Possible Mechanisms of GH Dysregulation in Patients with Amyotrophic Lateral Sclerosis. Endocrinol 2012; 153: 3735-3746.
Thomas NK, Willis S, Sweetman L, Borges K. Triheptanoin in acute mouse seizure
models. Epilepsy Res 2012; 99: 312-317.
Turner BJ, Talbot K. Transgenics, toxicity and therapeutics in rodent models of mutant SOD1-mediated familial ALS. Progr Neurobiol 2008; 85: 94-134.
Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, Speleman F. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol 2002; 3: RESEARCH0034.
Vucic S, Kiernan MC. Pathophysiology of neurodegeneration in familial amyotrophic lateral sclerosis. Current molecular medicine 2009; 9: 255-272.
Wijesekera LC, Leigh PN. Amyotrophic lateral sclerosis. Orphanet J Rare Dis 2009; 4: 3. 
【図１】
2020063233.tif 000011
【図２】
2020063233.tif 000012
【図３Ａ】
2020063233.tif 000013
【図３Ｂ】
2020063233.tif 000014
【図３Ｃ】
2020063233.tif 000015
【図３Ｄ】
2020063233.tif 000016
【図３Ｅ】
2020063233.tif 000017
【図３Ｆ】
2020063233.tif 000018
【図３Ｇ】
2020063233.tif 000019
【図３Ｈ】
2020063233.tif 000020
【図４】
2020063233.tif 000021
【図５】
2020063233.tif 000022
【図６】
2020063233.tif 000023
【図７】
2020063233.tif 000024
【配列表】
2020063233000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月11日(2019.10.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に実質的に記載され又は図面に実質的に示された剤又は組成物。