(57)【要約】【課題】第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドを含む、凍結乾燥前製剤、再構成された製剤、凍結乾燥粉末、及び凍結乾燥粉末組成物を提供する。【解決手段】本発明はまた、ＦＩＸポリペプチドを含む凍結乾燥粉末を作製するための凍結乾燥法を提供する。本発明は、（ａ）ＦＩＸ凝固活性を有する第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチド、（ｂ）緩衝薬、（ｃ）安定剤、（ｄ）充填剤、及び（ｅ）界面活性剤、を含む凍結乾燥前製剤に関し、製剤は、約５ｍＬ未満の充填容量を有し、（ａ）〜（ｅ）のそれぞれは、（１）凍結乾燥される際の、ＦＩＸポリペプチドの安定性の改善、を可能にするのに十分なバイアル毎の量（ｍｇ／バイアル）である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は一般に、止血障害の治療分野に関する。
【０００２】
血友病Ｂ（クリスマス病としても知られる）は、世界中で最も一般的な遺伝性出血障害の１つである。それは、インビボ及びインビトロ血液凝固活性の減少をもたらし、影響を受ける個人の生涯わたる、広範な医療監視を必要とする。介入がない場合は、影響を受ける個人は、関節における突発性出血を患うことになり、これが重度の疼痛及び消耗性の不動状態をもたらし、筋肉中への出血は、それらの組織内での血液の蓄積をもたらし、咽喉及び頚部における突発性出血は、直ちに処置されない場合、窒息を引き起こす可能性があり、腎出血、及び外科手術、軽度の不慮の外傷、または抜歯後の重度の出血もよく見られる。
【０００３】
通常のインビボの血液凝固は最低でも、セリンプロテアーゼ第ＩＩ因子（プロトロンビン）、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、及び第ＸＩ因子（水溶性血漿タンパク質）を必要とし、補因子として、膜貫通タンパク質組織因子及び血漿タンパク質第Ｖ因子及び第ＶＩＩＩ因子、フィブリノゲン、トランスグルタミナーゼ第ＸＩＩＩ因子、リン脂質（活性化血小板を含む）、及びカルシウムを含む。カリクレイン、高分子量キニノゲン、及びＸＩＩ因子を含む追加のタンパク質は、一部のインビトロ凝固テストに必要とされ、病的状態下のインビボで役割を果たすことができる。
【０００４】
血友病では、特定の血液凝固因子である血漿の不足により、血液凝固が妨げられる。血友病Ｂは、第ＩＸ因子タンパク質の合成の減少、または活性が低減した不完全分子のいずれかより生じる可能性がある、第ＩＸ因子の欠乏により引き起こされる。血友病の治療は、不足している凝固因子を、第ＩＸ因子が非常に豊富な外来の因子濃縮物と交換することにより行われる。しかし、血液からこのような濃縮物を生成することは、以下に記載されるように、技術的困難を伴う。
【０００５】
血漿からの第ＩＸ因子（血漿由来の第ＩＸ因子；ｐｄＦＩＸ）の精製により、活性第ＩＸ因子がほぼ排他的に生じる。しかし、第ＩＸ因子は血漿内に低濃度でしか存在しないので、第ＩＸ因子を血漿からこのように精製することは、非常に困難である（５μｇ／ｍＬ。Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７：  ４５１  ４５９  （１９７５））。さらに、血液からの精製は、ＨＩＶ及びＨＣＶなどの感染因子の除去または不活化を必要とする。加えて、ｐｄＦＩＸは半減期が短く、それ故、頻繁な投薬を必要とする。組み換え第ＩＸ因子（ｒＦＩＸ）はまた、利用可能であるが、半減期が同じく短いという欠点があり、ｐｄＦＩＸと同様に頻繁な投薬を必要とする（例えば、予防のために、１週間に２〜３回）。ｒＦＩＸはまた、増分回収率（Ｋ値）がｐｄＦＩＸと比較して低いので、ｐｄＦＩＸよりも高い用量のｒＦＩＸの使用が必要となる。
【０００６】
死亡率の低減、関節損傷の予防、及び生活の質の改善は、血漿由来及び組み換え第ＩＸ因子の開発による重要な成果である。出血からの保護が延長されると、血友病Ｂの対象の治療における別の重要な進歩が表されることになる。しかし、現在まで、保護の延長を可能にする製品が開発されていない。それ故、現在の治療法よりも無難で有効である、第ＩＸ因子欠乏症に起因する血友病の治療方法の改善が、依然として必要である。
【０００７】
特に、薬物製品の強度がより高く、貯蔵寿命がより長く、凍結乾燥プロセス時間が低減し、再構成時間がより短い、凍結乾燥ＦＩＸ製剤の改善が依然として必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７：  ４５１  ４５９  （１９７５）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、（ａ）ＦＩＸ凝固活性を有する第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチド、（ｂ）緩衝薬、（ｃ）安定剤、（ｄ）充填剤、及び（ｅ）界面活性剤、を含む凍結乾燥前製剤に関し、製剤は、約５ｍＬ未満、約４ｍＬ未満、または約３ｍＬ未満の充填容積を有し、（ａ）〜（ｅ）のそれぞれは、標準凍結乾燥前製剤と比較して、（１）凍結乾燥時のＦＩＸポリペプチドの安定性の改善、（２）凍結乾燥時の再構成時間の低減、（３）製剤を含む、栓への飛散の低減、（４）凍結乾燥サイクル時間の低減、（５）室温での凍結乾燥前製剤から調製される凍結乾燥体の貯蔵寿命の増加、または（６）それらの任意の組み合わせ、を可能にするのに十分なバイアル毎の量（ｍｇ／バイアル）であり、標準製剤は、凍結乾燥前製剤と同じバイアル毎の量の（ａ）〜（ｅ）を含んで、少なくとも５ｍＬの充填容量を有する。特定の実施形態では、製剤の充填容量は、約２．６５ｍＬである。
【００１０】
一部の実施形態では、凍結乾燥前製剤は、少なくとも１００ＩＵ／バイアルのＦＩＸポリペプチドを含む。一部の実施形態では、凍結乾燥前製剤は、約２００ＩＵ／バイアル〜約１０，０００ＩＵ／バイアルのＦＩＸポリペプチドを含む。
【００１１】
一部の実施形態では、ＦＩＸポリペプチドは、野生型ＦＩＸを含む。一部の実施形態では、ＦＩＸポリペプチドは、野生型ＦＩＸと結合される異種部分をさらに含む。一実施形態では、異種部分は、ＦＩＸの半減期を延長する部分である。別の実施形態では、異種部分は、ポリペプチドまたは非ポリペプチド部分を含む。一実施形態では、ＦＩＸの半減期を延長する部分は、ＦｃＲｎ結合パートナーまたはＦｃ領域を含む。一実施形態では、ＦＩＸポリペプチドは、配列番号２と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％同一である。
【００１２】
一部の実施形態では、充填容量は、約４ｍＬ、約３．５ｍＬ、約３．０ｍＬ、約２．９ｍＬ、約２．８ｍＬ、約２．７ｍＬ、約２．６５ｍＬ、約２．６ｍＬ、約２．５ｍＬ、約２．４ｍＬ、約２．３ｍＬ、約２．２ｍＬ、約２．１ｍＬ、または約２．０ｍＬである。
【００１３】
一部の実施形態では、低減した再構成時間は、１．５分未満、１分未満、５０秒未満、４０秒未満、３０秒未満、２０秒未満、または１０秒未満である。
【００１４】
一部の実施形態では、緩衝薬は、Ｌ−ヒスチジンである。一実施形態では、緩衝薬は、約３ｍｇ／ｍＬと約１５ｍｇ／ｍＬとの間の濃度（ｍｇ／ｍＬ）である。別の実施形態では、緩衝薬は、バイアル毎に約８ｍｇと約３９ｍｇとの間の濃度である。
【００１５】
一部の実施形態では、安定剤は、スクロースである。一実施形態では、安定剤は、１０ｍｇ／ｍＬと約５０ｍＬとの間の濃度（ｍｇ／ｍＬ）である。別の実施形態では、安定剤は、バイアル毎に約２７ｍｇと約１３２ｍｇとの間の濃度である。
【００１６】
一部の実施形態では、充填剤は、マンニトールである。一実施形態では、充填剤は、２０ｍｇ／ｍＬと約１００ｍｇ／ｍＬとの間の濃度（ｍｇ／ｍＬ）である。別の実施形態では、充填剤は、バイアル毎に約５３ｍｇとバイアル毎に約２６５ｍｇとの間の濃度である。
【００１７】
一部の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０である。一実施形態では、界面活性剤は、０．０１ｍｇ／ｍＬと約５ｍｇ／ｍＬとの間の濃度（ｍｇ／ｍＬ）である。別の実施形態では、界面活性剤は、バイアル毎に約０．０３ｍｇと約１３ｍｇとの間の濃度である。
【００１８】
一態様では、本発明は、（ａ）約８０〜約２，７５０ＩＵ／ｍＬのｒＦＩＸＦｃ、（ｂ）約７．７６ｍｇ／ｍＬのＬ−ヒスチジン、（ｃ）約４７．６ｍｇ／ｍＬのマンニトール、（ｄ）約２３．８ｍｇ／ｍＬのスクロース、及び（ｅ）約０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０、を含む凍結乾燥前製剤に関する。
【００１９】
本発明はさらに、ＦＩＸポリペプチド、緩衝薬、安定剤、充填剤、界面活性剤、またはそれらの任意の組み合わせ、を含む凍結乾燥粉末に関する。
【００２０】
一部の実施形態では、凍結乾燥粉末の残留水分濃度は、１％以下である。
【００２１】
一実施形態では、凍結乾燥粉末は、（ａ）バイアル毎に約２ｍｇとバイアル毎に約１５０ｍｇとの間の量のＦＩＸポリペプチド、（ｂ）バイアル毎に１０ｍｇとバイアル毎に約３０ｍｇとの間の量の緩衝薬、（ｃ）バイアル毎に７０ｍｇ（ｍｇ  ｖｉａｌ）とバイアル毎に約２００ｍｇとの間の量の充填剤、（ｄ）バイアル毎に３０ｍｇとバイアル毎に１００ｍｇとの間の量の安定剤、及び（ｅ）バイアル毎に０．０５ｍｇとバイアル毎に約５ｍｇとの間の量の界面活性剤、を含む。
【００２２】
別の実施形態では、凍結乾燥粉末は、（ａ）バイアル毎に約２．２ｍｇとバイアル毎に約１２５ｍｇとの間の量の凍結乾燥ＦＩＸポリペプチド、（ｂ）バイアル毎に約１２．５ｍｇとバイアル毎に２５ｍｇとの間の量の緩衝薬、（ｃ）バイアル毎に約３２．５ｍｇとバイアル毎に８０ｍｇとの間の量の安定剤、（ｄ）バイアル毎に約７５ｍｇとバイアル毎に１５０ｍｇとの間の量の充填剤、及び（ｅ）約０．１ｍｇ／ｍＬと約２ｍｇ／ｍＬとの間の量の界面活性剤、を含む。
【００２３】
別の実施形態では、凍結乾燥粉末は、（ａ）約２．２〜約１２５ｍｇ／バイアルのＦＩＸポリペプチド、（ｂ）約２０．６ｍｇ／バイアルのＬ−ヒスチジン、（ｃ）約１２６．１ｍｇ／バイアルのマンニトール、（ｄ）約６３．１ｍｇ／バイアルのスクロース、及び、（ｅ）約０．５３ｍｇ／バイアルのポリソルベート２０、を含む。
【００２４】
本発明はまた、再構成緩衝液により再構成された、本明細書に記載される凍結乾燥粉末を含む再構成された製剤に関する。
【００２５】
一実施形態では、再構成された製剤は、（ａ）約０．９ｍｇ／ｍＬと約５０ｍｇ／ｍＬとの間の濃度のＦＩＸポリペプチド、（ｂ）１．５ｍｇ／ｍＬと約７．５ｍｇ／ｍＬとの間の濃度の緩衝薬、（ｃ）１０ｍｇ／ｍＬと約５０ｍｇ／ｍＬとの間の濃度の充填剤、（ｄ）バイアル毎に５ｍｇ／ｍＬと２５ｍｇ／ｍＬとの間の濃度の安定剤、及び（ｅ）０．００５ｍｇ／ｍＬと約２．５ｍｇ／ｍＬとの間の濃度の界面活性剤、を含む。
【００２６】
別の実施形態では、再構成された製剤は、（ａ）約０．９ｍｇ／ｍＬと約５０ｍｇ／ｍＬとの間の濃度のＦＩＸポリペプチド、（ｂ）約３．８８ｍｇ／ｍＬの濃度の緩衝薬、（ｃ）約２３．８ｍｇ／ｍＬの濃度の充填剤、（ｄ）約１１．９ｍｇ／ｍＬの濃度の安定剤、（ｅ）約０．１ｍｇ／ｍＬの濃度の界面活性剤、及び（ｆ）再構成緩衝液、を含む。
【００２７】
別の実施形態では、再構成された製剤は、（ａ）約８０ＩＵ／ｍＬと約２，７５０ＩＵ／ｍＬとの間の濃度のＦＩＸポリペプチド、（ｂ）約２５ｍＭの濃度の緩衝薬、（ｃ）約１３１ｍＭの濃度の充填剤、（ｄ）約３５ｍＭの濃度の安定剤、（ｅ）０．０１％（ｗ／ｖ）の濃度の界面活性剤、及び（ｆ）再構成緩衝液、を含む。
【００２８】
本発明はさらに、本明細書に記載される再構成された製剤を患者に投与することを含む、ＦＩＸポリペプチドを必要とする血友病Ｂ患者に、ＦＩＸポリペプチドを投与する方法、または血友病Ｂの予防、治療、改善、または管理を必要とする患者において、血友病Ｂを予防、治療、改善、または管理する方法に関する。
【００２９】
本発明はまた、本明細書に記載される凍結乾燥前製剤を凍結乾燥させることを含む、ＦＩＸポリペプチドを含む凍結乾燥粉末の作製方法に関する。
【００３０】
一態様では、本発明は、（ａ）ＦＩＸポリペプチド及び水性溶媒を含む凍結乾燥前製剤を凍結させることを含む「凍結工程」、（ｂ）凍結された凍結乾燥前製剤から水性溶媒を除去するのに有効な量だけ、凍結された凍結乾燥前製剤の圧力を低減させることを含む「真空工程」、及び（ｃ）崩壊温度を超えて、凍結された凍結乾燥前製剤の温度を増加させて、それにより凍結乾燥粉末を作製することを含む単一の「乾燥工程」、を含むＦＩＸポリペプチドを凍結乾燥させる方法に関する。一部の実施形態では、凍結乾燥前製剤は、工程（ａ）前に、無菌濾過され、バイアルに無菌充填される。
【００３１】
別の態様では、本発明は、（ａ）温度を、約−５５℃の凍結温度まで約２時間低下させ、約２時間凍結温度を保持することにより、ＦＩＸポリペプチドを含む凍結乾燥前製剤を凍結させることを含む「凍結工程」、（ａ′）工程（ａ）の凍結された凍結乾燥前製剤の温度を、約−６℃のアニーリング温度まで約１．５時間上昇させ、約３時間アニーリング温度を保持し、温度を、約−５５℃まで約１．５時間低下させることを含む「アニーリング工程」、（ｂ）工程（ａ′）の凍結された凍結乾燥前製剤を、常圧で２時間約−５５℃に保持し、圧力を、約０．３３ｍｂａｒまで約２時間低下させることを含む「真空工程」、及び（ｃ）圧力を約０．３３ｍｂａｒに保持しながら、工程（ｂ）の凍結された凍結乾燥前製剤の温度を、約４０℃まで３時間上昇させ、圧力を約０．３３ｍｂａｒに保持しながら、凍結された凍結乾燥前製剤の温度を、約２５時間約４０℃に保持し、それにより凍結乾燥粉末を作製することを含む単一の「乾燥工程」、を含む、ＦＩＸポリペプチドを含む凍結乾燥粉末の作製方法に関する。
【００３２】
さらなる態様では、凍結乾燥粉末は、（１）凍結乾燥時のＦＩＸポリペプチドの安定性の改善、（２）凍結乾燥時の再構成時間の低減、（３）製剤を含む、栓への飛散の低減、（４）凍結乾燥サイクル時間の低減、（５）室温での凍結乾燥前製剤から調製される凍結乾燥体の貯蔵寿命の増加、または（６）それらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上の特徴を有する。
【００３３】
一態様では、本開示は、本明細書で記載される方法に従って、凍結乾燥前製剤を凍結乾燥させることを含む、ＦＩＸペプチドを含む凍結乾燥粉末を安定化させる方法を提供し、複数の乾燥工程を含む凍結乾燥法を使用することにより調製される凍結乾燥粉末に関して、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で測定される場合に、凍結乾燥粉末が安定化する。
【００３４】
別の態様では、本開示は、本明細書で記載される方法に従って、凍結乾燥前製剤を凍結乾燥させることを含む、ＦＩＸポリペプチドを含む凍結乾燥粉末の貯蔵寿命を増加させる方法を提供し、複数の乾燥工程を含む凍結乾燥法を使用することにより調製される凍結乾燥粉末の貯蔵寿命に関して、ＳＥＣ及び／またはＦＩＸ凝固活性アッセイで測定した場合に、凍結乾燥粉末の貯蔵寿命が増加する。
【００３５】
本開示はまた、本明細書で記載される方法に従って、凍結乾燥前製剤を凍結乾燥させることを含む、ＦＩＸポリペプチドを含む凍結乾燥粉末の再構成時間を減少させる方法を提供し、複数の乾燥工程を含む凍結乾燥法を使用することにより調製される凍結乾燥粉末の再構成時間に関して、凍結乾燥粉末の再構成時間が減少する。
【００３６】
本開示は、本明細書で記載される方法に従って、凍結乾燥前製剤を凍結乾燥させることを含む、ＦＩＸポリペプチドを含む凍結乾燥粉末を作製する凍結乾燥プロセス時間を低減させる方法をさらに提供し、複数の乾燥工程を含む凍結乾燥法を使用して凍結乾燥粉末を作製する凍結乾燥プロセス時間に関して、凍結乾燥前製剤の凍結乾燥プロセス時間が低減する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
凍結乾燥前製剤であって、
（ａ）ＦＩＸ凝固活性を有する第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチド、
（ｂ）緩衝薬、
（ｃ）安定剤、
（ｄ）充填剤、及び
（ｅ）界面活性剤、
含み、
前記製剤が、約５ｍＬ未満、約４ｍＬ未満、または約３ｍＬ未満の充填容量を有し、（ａ）〜（ｅ）のそれぞれが、標準凍結乾燥前製剤と比較して、
（１）凍結乾燥時の前記ＦＩＸポリペプチドの安定性の改善、
（２）凍結乾燥時の再構成時間の低減、
（３）前記製剤を含む、栓への飛散の低減、
（４）凍結乾燥サイクル時間の低減、
（５）室温での前記凍結乾燥前製剤から調製される凍結乾燥体の貯蔵寿命の増加、または
（６）それらの任意の組み合わせ、
を可能にするのに十分なバイアル毎の量（ｍｇ／バイアル）であり、
前記標準製剤が、前記凍結乾燥前製剤と同じバイアル毎の量の（ａ）〜（ｅ）を含んで、５ｍＬの充填容量を有する、前記凍結乾燥前製剤。
（項目２）
前記充填容量が、約４ｍＬ、約３．５ｍＬ、約３．０ｍＬ、約２．９ｍＬ、約２．８ｍＬ、約２．７ｍＬ、約２．６５ｍＬ、約２．６ｍＬ、約２．５ｍＬ、約２．４ｍＬ、約２．３ｍＬ、約２．２ｍＬ、約２．１ｍＬ、または約２．０ｍＬである、項目１に記載の凍結乾燥前製剤。
（項目３）
前記充填容量が約２．６５ｍＬである、項目１または２に記載の凍結乾燥前製剤。
（項目４）
前記低減した再構成時間が、未満１．５分、未満１分、未満５０秒、未満４０秒、未満３０秒、未満２０秒、または未満１０秒である、項目１〜３のいずれか１項に記載の凍結乾燥前製剤。
（項目５）
前記低減した再構成時間が、３０秒未満である、項目１〜４のいずれか１項に記載の凍結乾燥前製剤。
（項目６）
前記低減した凍結乾燥サイクル時間が、約４日以下、約３日以下、約２日以下、または約１日以下である、項目１〜５のいずれか１項に記載の凍結乾燥前製剤。
（項目７）
前記緩衝薬が、Ｌ−ヒスチジンである、項目１〜６のいずれか１項に記載の凍結乾燥前製剤。
（項目８）
前記安定剤が、スクロースである、項目１〜７のいずれか１項に記載の凍結乾燥前製剤。
（項目９）
前記充填剤が、マンニトールである、項目１〜８のいずれか１項に記載の凍結乾燥前製剤。
（項目１０）
前記界面活性剤が、ポリソルベート２０である、項目１〜９のいずれか１項に記載の凍結乾燥前製剤。
（項目１１）
前記製剤が、少なくとも１００ＩＵ／バイアルの前記ＦＩＸポリペプチドを含む、項目１〜１０のいずれか１項に記載の凍結乾燥前製剤。
（項目１２）
前記製剤が、約２００ＩＵ／バイアル〜約１０，０００ＩＵ／バイアルの前記ＦＩＸポリペプチドを含む、項目１〜１１のいずれか１項に記載の凍結乾燥前製剤。
（項目１３）
前記ＦＩＸポリペプチドが、約２２０ＩＵ／バイアル、約２５０ＩＵ／バイアル、約３００ＩＵ／バイアル、約４００ＩＵ／バイアル、約５００ＩＵ／バイアル、約６００ＩＵ／バイアル、約７００ＩＵ／バイアル、約８００ＩＵ／バイアル、約９００ＩＵ／バイアル、約１，０００ＩＵ／バイアル、約１，１００ＩＵ／バイアル、約１，２００ＩＵ／バイアル、約１，３００ＩＵ／バイアル、約１，４００ＩＵ／バイアル、約１，５００ＩＵ／バイアル、約２，０００ＩＵ／バイアル、約２，５００ＩＵ／バイアル、約３，０００ＩＵ／バイアル、約４，０００ＩＵ／バイアル、約５，０００ＩＵ／バイアル、約５，５００ＩＵ／バイアル、約６，０００ＩＵ／バイアル、約６，５００ＩＵ／バイアル、約７，０００ＩＵ／バイアル、約７，５００ＩＵ／バイアル、約８，０００ＩＵ／バイアル、約８，５００ＩＵ／バイアル、約９，０００ＩＵ／バイアル、約９，５００ＩＵ／バイアル、または約１０，０００ＩＵ／バイアルを含む、項目１〜１２のいずれか１項に記載の凍結乾燥前製剤。
（項目１４）
前記緩衝薬が、約３ｍｇ／ｍＬと約１５ｍｇ／ｍＬとの間の濃度（ｍｇ／ｍＬ）である、項目１〜１３のいずれか１項に記載の凍結乾燥前製剤。
（項目１５）
前記緩衝薬が、約３．８８ｍｇ／ｍＬと約９．７ｍｇ／ｍＬとの間の濃度（ｍｇ／ｍＬ）である、項目１〜１４のいずれか１項に記載の凍結乾燥前製剤。
（項目１６）
前記緩衝薬が、約７．７６ｍｇ／ｍＬの濃度（ｍｇ／ｍＬ）である、項目１〜１５のいずれか１項に記載の凍結乾燥前製剤。
（項目１７）
前記安定剤が、１０ｍｇ／ｍＬと約５０ｍｇ／ｍＬとの間の濃度（ｍｇ／ｍＬ）である、項目１〜１６のいずれか１項に記載の凍結乾燥前製剤。
（項目１８）
前記安定剤が、約１７．８５ｍｇ／ｍＬと約２９．９５ｍｇ／ｍＬとの間の濃度（ｍｇ／ｍＬ）である、項目１〜１７のいずれか１項に記載の凍結乾燥前製剤。
（項目１９）
前記安定剤が、約２３．８ｍｇ／ｍＬの濃度（ｍｇ／ｍＬ）である、項目１〜１８のいずれか１項に記載の凍結乾燥前製剤。
（項目２０）
前記充填剤が、２０ｍｇ／ｍＬと約１００ｍｇ／ｍＬとの間の濃度（ｍｇ／ｍＬ）である、項目１〜１９のいずれか１項に記載の凍結乾燥前製剤。
（項目２１）
前記充填剤が、３５．７ｍｇ／ｍＬと５９．５ｍｇ／ｍＬとの間の濃度（ｍｇ／ｍＬ）である、項目１〜２０のいずれか１項に記載の凍結乾燥前製剤。
（項目２２）
前記充填剤が、４７．６ｍｇ／ｍＬの濃度（ｍｇ／ｍＬ）である、項目１〜２１のいずれか１項に記載の凍結乾燥前製剤。
（項目２３）
前記界面活性剤が、０．０１ｍｇ／ｍＬと約５ｍｇ／ｍＬとの間の濃度（ｍｇ／ｍＬ）である、項目１〜２２のいずれか１項に記載の凍結乾燥前製剤。
（項目２４）
前記界面活性剤が、０．２ｍｇ／ｍＬの濃度（ｍｇ／ｍＬ）である、項目２３に記載の凍結乾燥前製剤。
（項目２５）
前記ＦＩＸポリペプチドが、約８０ＩＵ／ｍＬと約２，７５０ＩＵ／ｍＬとの間の濃度（ＩＵ／ｍＬ）を有する、項目１〜２４のいずれか１項に記載の凍結乾燥前製剤。
（項目２６）
凍結乾燥前製剤であって、
（ａ）約８０〜約２，７５０ＩＵ／ｍＬのｒＦＩＸＦｃ、
（ｂ）約７．７６ｍｇ／ｍＬのＬ−ヒスチジン、
（ｃ）約４７．６ｍｇ／ｍＬのマンニトール、
（ｄ）約２３．８ｍｇ／ｍＬのスクロース、及び
（ｅ）約０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０、
含む前記凍結乾燥前製剤。
（項目２７）
前記製剤が、約３ｍＬ、約２．９ｍＬ、約２．８ｍＬ、約２．７ｍＬ、約２．６５ｍＬ、約２．６ｍＬ、約２．５ｍＬ、約２．４ｍＬ、約２．３ｍＬ、約２．２ｍＬ、約２．１ｍＬ、または約２．０ｍＬのバイアル毎の充填容量を有する、項目２６に記載の凍結乾燥前製剤。
（項目２８）
前記製剤が、約２．６５ｍＬのバイアル毎の充填容量を有する、項目２７に記載の凍結乾燥前製剤。
（項目２９）
項目１〜２８のいずれか１項に記載の凍結乾燥前製剤から凍結乾燥される、凍結乾燥粉末。
（項目３０）
１％未満の残留水分濃度を有する、項目２９に記載の凍結乾燥粉末。
（項目３１）
緩衝薬、安定剤、充填剤、界面活性剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む、項目２９または３０に記載の凍結乾燥粉末。
（項目３２）
前記緩衝薬が、Ｌ−ヒスチジンである、項目３１に記載の凍結乾燥粉末。
（項目３３）
前記安定剤が、スクロースである、項目３１に記載の凍結乾燥粉末
（項目３４）
前記界面活性剤が、ポリソルベート２０である、項目３１に記載の凍結乾燥粉末。
（項目３５）
前記緩衝薬が、バイアル毎に約８ｍｇと約３９ｍｇとの間の濃度である、項目３１〜３４のいずれか１項に記載の凍結乾燥粉末。
（項目３６）
前記緩衝薬が、バイアル毎に約２０．６ｍｇの濃度である、項目３５に記載の凍結乾燥粉末。
（項目３７）
前記安定剤が、バイアル毎に約２７ｍｇと約１３２ｍｇとの間の濃度である、項目３１〜３６のいずれか１項に記載の凍結乾燥粉末。
（項目３８）
前記安定剤が、バイアル毎に約６３．１ｍｇの濃度である、項目３７に記載の凍結乾燥粉末。
（項目３９）
前記充填剤が、バイアル毎に約５３ｍｇとバイアル毎に約２６５ｍｇとの間の濃度である、項目３１〜３８のいずれか１項に記載の凍結乾燥粉末。
（項目４０）
前記充填剤が、バイアル毎に約１２６．１ｍｇの濃度である、項目３９に記載の凍結乾燥粉末。
（項目４１）
前記界面活性剤が、バイアル毎に約０．０３ｍｇと約１３ｍｇとの間の濃度である、項目３１〜４０のいずれか１項に記載の凍結乾燥粉末。
（項目４２）
前記界面活性剤が、バイアル毎に約０．５３ｍｇの濃度である、項目４１に記載の凍結乾燥粉末。
（項目４３）
凍結乾燥粉末であって、
（ａ）バイアル毎に約２ｍｇとバイアル毎に約１５０ｍｇとの間の量のＦＩＸポリペプチド、
（ｂ）バイアル毎に１０ｍｇとバイアル毎に約３０ｍｇとの間の量の緩衝薬、
（ｃ）バイアル毎に７０ｍｇ（ｍｇ  ｖｉａｌ）とバイアル毎に約２００ｍｇとの間の量の充填剤、
（ｄ）バイアル毎に３０ｍｇとバイアル毎に１００ｍｇとの間の量の安定剤、及び
（ｅ）バイアル毎に０．０５ｍｇとバイアル毎に約５ｍｇとの間の量の界面活性剤、
を含む前記凍結乾燥粉末。
（項目４４）
（ａ）バイアル毎に約２．２ｍｇとバイアル毎に約１２５ｍｇとの間の量の前記凍結乾燥ＦＩＸポリペプチド、
（ｂ）バイアル毎に約１２．５ｍｇとバイアル毎に２５ｍｇとの間の量の前記緩衝薬、
（ｃ）バイアル毎に約３２．５ｍｇとバイアル毎に８０ｍｇとの間の量の前記安定剤、
（ｄ）バイアル毎に約７５ｍｇとバイアル毎に１５０ｍｇとの間の量の前記充填剤、及び
（ｅ）約０．１ｍｇ／ｍＬと約２ｍｇ／ｍＬとの間の量の前記界面活性剤、
含む、項目４３に記載の凍結乾燥粉末。
（項目４５）
（ａ）約２．２〜約１２５ｍｇ／バイアルの前記ＦＩＸポリペプチド、
（ｂ）約２０．６ｍｇ／バイアルのＬ−ヒスチジン、
（ｃ）約１２６．１ｍｇ／バイアルのマンニトール、
（ｄ）約６３．１ｍｇ／バイアルのスクロース、及び
（ｅ）約０．５３ｍｇ／バイアルのポリソルベート−２０、
含む、項目４４に記載の凍結乾燥粉末。
（項目４６）
再構成緩衝液で再構成された、項目２９〜４５のいずれか１項に記載の凍結乾燥粉末（ｌｙｏｐｈｉｌａｔｅ  ｐｏｗｅｒ）を含む再構成された製剤。
（項目４７）
血友病Ｂを治療するために使用される、項目４６に記載の再構成された製剤。
（項目４８）
非経口投与に適する、項目４６または４７に記載の再構成製剤。
（項目４９）
前記非経口投与が静脈内または皮下投与である、項目４８に記載の再構成された製剤。（項目５０）
（ａ）約０．９ｍｇ／ｍＬと約５０ｍｇ／ｍＬとの間の濃度の前記ＦＩＸポリペプチド、
（ｂ）１．５ｍｇ／ｍＬと約７．５ｍｇ／ｍＬとの間の濃度の前記緩衝薬、
（ｃ）１０ｍｇ／ｍＬと約５０ｍｇ／ｍＬとの間の濃度の前記充填剤、
（ｄ）バイアル毎に５ｍｇ／ｍＬと２５ｍｇ／ｍＬとの間の濃度の前記安定剤、及び
（ｅ）０．００５ｍｇ／ｍＬと約２．５ｍｇ／ｍＬとの間の濃度の前記界面活性剤、
含む、項目４７〜４９のいずれか１項に記載の再構成された製剤。
（項目５１）
（ａ）約０．９ｍｇ／ｍＬと約５０ｍｇ／ｍＬとの間の濃度の前記ＦＩＸポリペプチド、
（ｂ）約３．８８ｍｇ／ｍＬの濃度の前記緩衝薬、
（ｃ）約２３．８ｍｇ／ｍＬの濃度の前記充填剤、
（ｄ）約１１．９ｍｇ／ｍＬの濃度の前記安定剤、
（ｅ）約０．１ｍｇ／ｍＬの濃度の前記界面活性剤、及び
（ｆ）前記再構成緩衝液、
含む、項目５０に記載の再構成された製剤。
（項目５２）
（ａ）約８０ＩＵ／ｍＬと約２，７５０ＩＵ／ｍＬとの間の濃度の前記ＦＩＸポリペプチド、
（ｂ）約２５ｍＭの濃度の前記緩衝薬、
（ｃ）約１３１ｍＭの濃度の前記充填剤、
（ｄ）約３５ｍＭの濃度の前記安定剤、
（ｅ）０．０１％（ｗ／ｖ）の濃度の前記界面活性剤、及び
（ｆ）前記再構成緩衝液、
含む、項目４９に記載の再構成された製剤。
（項目５３）
項目１〜２８のいずれか１項に記載の凍結乾燥前製剤、項目２９〜４５のいずれか１項に記載の凍結乾燥粉末（ｌｙｏｐｈｉｌａｔｅ  ｐｏｗｅｒ）、または、項目４６〜５２のいずれか１項に記載の再構成された製剤を含むバイアル。
（項目５４）
前記ＦＩＸポリペプチドが、野生型ＦＩＸを含む、項目１〜２８のいずれか１項に記載の凍結乾燥前製剤、項目２９〜４５のいずれか１項に記載の凍結乾燥粉末（ｌｙｏｐｈｉｌａｔｅ  ｐｏｗｅｒ）、項目４６〜５２のいずれか１項に記載の再構成された製剤、または項目５３に記載のバイアル（ｔｈｅ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ４６  ｔｏ  ５２，  ｏｒ  ｔｈｅ  ｖｉａｌ  ｏｆ  ５３）。
（項目５５）
前記ＦＩＸポリペプチドが、野生型ＦＩＸに結合された異種部分をさらに含む、項目１〜２８のいずれか１項に記載の凍結乾燥前製剤、項目２９〜４５のいずれか１項に記載の凍結乾燥粉末（ｌｙｏｐｈｉｌａｔｅ  ｐｏｗｅｒ）、項目４６〜５２のいずれか１項に記載の再構成された製剤、または項目５３に記載のバイアル（ｔｈｅ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ４６  ｔｏ  ５２，  ｏｒ  ｔｈｅ  ｖｉａｌ  ｏｆ  ５３）。
（項目５６）
前記異種部分が、ＦＩＸの半減期を延長する部分である、項目１〜２８のいずれか１項に記載の凍結乾燥前製剤、項目２９〜４５のいずれか１項に記載の凍結乾燥粉末（ｌｙｏｐｈｉｌａｔｅ  ｐｏｗｅｒ）、項目４６〜５２のいずれか１項に記載の再構成された製剤、または項目５３に記載のバイアル（ｔｈｅ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ４６  ｔｏ  ５２，  ｏｒ  ｔｈｅ  ｖｉａｌ  ｏｆ  ５３）。（項目５７）
前記異種部分が、ポリペプチド若しくは非ポリペプチド部分を含む、項目１〜２８のいずれか１項に記載の凍結乾燥前製剤、項目２９〜４５のいずれか１項に記載の凍結乾燥粉末（ｌｙｏｐｈｉｌａｔｅ  ｐｏｗｅｒ）、項目４６〜５２のいずれか１項に記載の再構成された製剤、または項目５３に記載のバイアル（ｔｈｅ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ
ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ４６  ｔｏ  ５２，  ｏｒ  ｔｈｅ  ｖｉａｌ  ｏｆ
５３）。
（項目５８）
ＦＩＸの半減期を延長する前記部分が、ＦｃＲｎ結合パートナー若しくはＦｃ領域を含む、項目１〜２８のいずれか１項に記載の凍結乾燥前製剤、項目２９〜４５のいずれか１項に記載の凍結乾燥粉末（ｌｙｏｐｈｉｌａｔｅ  ｐｏｗｅｒ）、項目４６〜５２のいずれか１項に記載の再構成された製剤、または項目５３に記載のバイアル（ｔｈｅ
ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ４６  ｔｏ  ５２，  ｏｒ  ｔｈｅ  ｖｉａｌ  ｏｆ  ５３）。
（項目５９）
前記ＦＩＸポリペプチドが、配列番号２と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、若しくは１００％同一である、項目１〜２８のいずれか１項に記載の凍結乾燥前製剤、項目２９〜４５のいずれか１項に記載の凍結乾燥粉末（ｌｙｏｐｈｉｌａｔｅ  ｐｏｗｅｒ）、項目４６〜５２のいずれか１項に記載の再構成された製剤、または項目５３に記載のバイアル（ｔｈｅ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ４６  ｔｏ  ５２，  ｏｒ  ｔｈｅ  ｖｉａｌ
ｏｆ  ５３）。
（項目６０）
項目２９〜４５のいずれか１項に記載の凍結乾燥粉末（ｌｙｏｐｈｉｌａｔｅ  ｐｏｗｅｒ）を含む第１の容器、及び前記第１の容器の前記凍結乾燥製剤と組み合わされた場合に、作製するのに十分な量の再構成緩衝液を含む第２の容器を含むキット。
（項目６１）
血友病Ｂを治療するために使用される、項目６０に記載のキット。
（項目６２）
前記再構成緩衝液がＮａＣｌを含む、項目６０または６１に記載のキット。
（項目６３）
ＦＩＸポリペプチドを必要とする血友病Ｂ患者に、ＦＩＸポリペプチドを投与する方法であって、項目４６〜５２のいずれか１項に記載の（ａｎｙ  ｏｎｅ  ｏｆ  ４６  ｔｏ
５２）再構成された製剤を患者に投与することを含み、前記投与が、患者の出血エピソードの頻発若しくは重症化を防止するか、または低減させる、前記方法。
（項目６４）
項目４６〜５２のいずれか１項に記載の再構成された製剤を投与することにより、血友病Ｂの予防、治療、改善、または管理を必要とする患者において、血友病Ｂを予防、治療、改善、または管理する方法。
（項目６５）
項目１〜２８のいずれか１項に記載の凍結乾燥前製剤を凍結乾燥させることを含む、ＦＩＸポリペプチドを含む凍結乾燥粉末を作製する方法。
（項目６６）
（ａ）前記ＦＩＸポリペプチド及び水性溶媒を含む凍結乾燥前製剤を凍結させることを含む「凍結工程」、
（ｂ）前記凍結された凍結乾燥前製剤から前記水性溶媒を除去するのに有効な量だけ、前記凍結された凍結乾燥前製剤の圧力を低減させることを含む「真空工程」、ならびに
（ｃ）前記崩壊温度を超えて、前記凍結された凍結乾燥前製剤の温度を増加させて、それにより凍結乾燥粉末を作製することを含む単一の「乾燥工程」、
を含む、ＦＩＸポリペプチドを凍結乾燥させる方法。
（項目６７）
前記崩壊温度が約−１．５℃である、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記凍結乾燥前製剤が、前記凍結工程中に、約−６５〜約−４０℃の凍結温度で凍結される、項目６６または６７に記載の方法。
（項目６９）
前記凍結乾燥前製剤が、前記凍結工程中に、約−５５℃の凍結温度で凍結される、項目６６〜６８のいずれか１項に記載の方法。
（項目７０）
前記凍結温度が、前記凍結工程中に、約５℃から約−５５℃に低下する、項目６６〜６９のいずれか１項に記載の方法。
（項目７１）
前記凍結温度が、前記凍結工程中に、約３０分から約５時間まで保持される、項目６６〜７０のいずれか１項に記載の方法。
（項目７２）
前記凍結温度が、前記凍結工程中に、約２時間保持される、項目６６〜７１のいずれか１項に記載の方法。
（項目７３）
工程（ａ）の前記凍結された凍結乾燥前製剤が、前記「真空工程」（ｂ）の前に、「アニーリング工程」（ａ′）にさらにかけられる、項目６６〜７２のいずれか１項に記載の方法。
（項目７４）
工程（ａ）の前記凍結された凍結乾燥前製剤の温度が、前記アニーリング工程中に、約−１５℃〜−約２℃のアニーリング温度に上昇する、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
工程（ａ）の前記凍結された凍結乾燥前製剤の前記温度が、前記アニーリング工程中に、約−６℃のアニーリング温度まで上昇する、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記アニーリング温度が、前記アニーリング工程中に、約３０分間〜約５時間保持される、項目７３〜７５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７７）
前記アニーリング温度が、前記アニーリング工程中に、約３時間保持される、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
前記凍結された凍結乾燥前製剤の前記温度が、前記アニーリング工程中に、前記アニーリング温度から約−６５℃から約−４０℃の温度まで低下する、項目７３〜７７のいずれか１項に記載の方法。
（項目７９）
前記凍結された凍結乾燥前製剤の前記温度が、前記アニーリング工程中に、前記アニーリング温度から−５５℃の温度まで低下する、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記「真空工程」が、前記凍結された凍結乾燥前製剤を、約０．０５と約１ｍｂａｒとの間の真空にかけることを含む、項目６６〜７９のいずれか１項に記載の方法。
（項目８１）
前記「真空工程」の前記真空が、約０．３３ｍｂａｒである、項目８０に記載の方法。（項目８２）
前記真空が、約２時間、前記「真空工程」において保持される、項目６６〜８１のいずれか１項に記載の方法。
（項目８３）
前記「乾燥工程」が、前記凍結された凍結乾燥前製剤の前記温度を、約−５５℃から約４０℃の乾燥温度に上昇させることを含む、項目６６〜８２のいずれか１項に記載の方法。
（項目８４）
前記乾燥工程が、前記乾燥温度を約１０時間〜約４０時間保持することをさらに含む、項目６６〜８３のいずれか１項に記載の方法。
（項目８５）
前記乾燥温度が、約２５時間保持される、項目８４に記載の方法。
（項目８６）
前記乾燥工程が、約０．０５ｍｂａｒ〜約１ｍｂａｒの圧力で実施される、項目６６〜８５のいずれか１項に記載の方法。
（項目８７）
前記圧力が、前記乾燥工程中に、約０．３３ｍｂａｒで保持される、項目８６に記載の方法。
（項目８８）
ＦＩＸポリペプチドを含む凍結乾燥粉末を作製する方法であって、
（ａ）前記温度を、約−５５℃の凍結温度まで約２時間低下させ、約２時間凍結温度を保持することにより、ＦＩＸポリペプチドを含む凍結乾燥前製剤を凍結させることを含む「凍結工程」、
（ａ′）工程（ａ）の前記凍結された凍結乾燥前の製剤の前記温度を、約−６℃のアニーリング温度まで約１．５時間上昇させ、約３時間前記アニーリング温度を保持し、前記温度を、約−５５℃まで約１．５時間低下させることを含む「アニーリング工程」、
（ｂ）工程（ａ′）の前記凍結された凍結乾燥前製剤を、常圧で２時間約−５５℃に保持し、前記圧力を、約０．３３ｍｂａｒまで約２時間低下させることを含む「真空工程」、及び
（ｃ）前記圧力を約０．３３ｍｂａｒに保持しながら、工程（ｂ）の前記凍結された凍結乾燥前製剤の前記温度を、約４０℃まで３時間上昇させ、前記圧力を約０．３３ｍｂａｒに保持しながら、前記凍結された凍結乾燥前製剤の前記温度を、約２５時間約４０℃に保持し、それにより凍結乾燥粉末を作製することを含む単一の「乾燥工程」、
を含む前記方法。
（項目８９）
前記凍結乾燥前製剤が、項目１〜２８のいずれか１項に記載の製剤である、項目６６〜８８のいずれか１項に記載の方法。
（項目９０）
前記凍結乾燥粉末が、
（１）凍結乾燥時の前記ＦＩＸポリペプチドの安定性の改善、
（２）凍結乾燥時の再構成時間の低減、
（３）前記製剤を含む、栓への飛散の低減、
（４）凍結乾燥サイクル時間の低減、
（５）室温での前記凍結乾燥前製剤から調製される凍結乾燥体の貯蔵寿命の増加、または
（６）それらの任意の組み合わせ、
からなる群から選択される１つ以上の特徴を有する、項目６５〜８９のいずれか１項に記載の方法。
（項目９１）
前記凍結乾燥前製剤が、５ｍＬ未満の充填容量である、項目６５〜９０のいずれか１項に記載の方法。
（項目９２）
前記凍結乾燥前製剤の前記充填容量が、約４ｍＬ、約３．５ｍＬ、約３．０ｍＬ、約２．９ｍＬ、約２．８ｍＬ、約２．７ｍＬ、約２．６５ｍＬ、約２．６ｍＬ、約２．５ｍＬ、約２．４ｍＬ、約２．３ｍＬ、約２．２ｍＬ、約２．１ｍＬ、または約２．０ｍＬである、項目９１に記載の方法。
（項目９３）
前記凍結乾燥前製剤の前記充填容量が、約２．６５ｍＬである、項目９１または９２に記載の方法。
（項目９４）
前記低減した再構成時間が、１．５分未満、１分未満、５０秒未満、４０秒未満、３０秒未満、２０秒未満、または１０秒未満である、項目９０〜９３のいずれか１項に記載の方法。
（項目９５）
前記低減した再構成時間が、３０秒未満である、項目９０〜９４のいずれか１項に記載の方法。
（項目９６）
前記低減した凍結乾燥サイクル時間が、約４日以下、約３日以下、約２日以下、または約１日以下である、項目９０〜９５のいずれか１項に記載の方法。
（項目９７）
前記凍結乾燥前製剤が、工程（ａ）前に、無菌濾過され、バイアルに無菌充填される、項目６６〜９６のいずれか１項に記載の方法。
（項目９８）
前記凍結乾燥粉末が、約４５時間以下で、前記凍結乾燥前製剤から作製される、項目６５〜９７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９９）
前記凍結乾燥粉末中の残留水分が０．７％未満である、項目６５〜９８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１００）
前記凍結乾燥粉末中の前記残留水分が、約０．５％である、項目６５〜９９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０１）
ＦＩＸポリペプチドを含む凍結乾燥粉末を安定化させる方法であって、項目６５〜１００のいずれか１項に記載の方法に従って、凍結乾燥前製剤を凍結乾燥させることを含み、複数の乾燥工程を含む凍結乾燥法を使用することにより調製される凍結乾燥粉末に関して、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で測定される場合に、凍結乾燥粉末が安定化する、前記方法。
（項目１０２）
ＦＩＸポリペプチドを含む凍結乾燥粉末の貯蔵寿命を増加させる方法であって、項目６５〜１００のいずれか１項に記載の方法に従って、凍結乾燥前製剤を凍結乾燥させることを含み、複数の乾燥工程を含む凍結乾燥法を使用することにより調製される凍結乾燥粉末の貯蔵寿命に関して、ＳＥＣ及び／またはＦＩＸ凝固活性アッセイで測定した場合に、凍結乾燥粉末の貯蔵寿命が増加する、前記方法。
（項目１０３）
ＦＩＸポリペプチドを含む凍結乾燥粉末の前記再構成時間を減少させる方法であって、項目６５〜１００のいずれか１項に記載の方法に従って、凍結乾燥前製剤を凍結乾燥させることを含み、複数の乾燥工程を含む凍結乾燥法を使用することにより調製される凍結乾燥粉末の再構成時間に関して、凍結乾燥粉末の再構成時間が減少する、前記方法。
（項目１０４）
ＦＩＸポリペプチドを含む凍結乾燥粉末を作製する凍結乾燥プロセス時間を低減させる方法であって、項目６５〜１００のいずれか１項に記載の方法に従って、凍結乾燥前製剤を凍結乾燥させることを含み、複数の乾燥工程を含む凍結乾燥法を使用して凍結乾燥粉末を作製する凍結乾燥プロセスに関して、凍結乾燥前製剤の凍結乾燥プロセス時間が低減する、前記方法。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】各凍結乾燥サイクルのためのバイアルのローディングパターンを示す。数字１、２、及び３は、熱電対の位置を示す。
【図２】凍結乾燥パラメータ−温度、真空、及び時間の関数として、残留水分のＤＯＥ分析からの予測プロファイラを示す。
【図３】凍結乾燥パラメータ−温度及び真空の関数として、昇華中の製品温度のＤＯＥ分析からの予測プロファイラを示す。
【図４】凍結乾燥パラメータ−温度及び真空状態の関数として、昇華中のバイアルマスフローのＤＯＥ分析からの予測プロファイラを示す。
【図５】提案されたｒＦＩＸＦｃ−２Ｇ凍結乾燥サイクルと類似する実施例２のＤＯＥの実行８からの凍結乾燥データ（４０℃の棚温度、２５０ｍＴｏｒｒ（０．３３ｍＢａｒ）のチャンバ真空、及び２５時間の乾燥時間）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本開示は、とりわけ、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドを含む、凍結乾燥前製剤、再構成された製剤、及び凍結乾燥粉末組成物を提供する。本開示はまた、ＦＩＸポリペプチドを含む凍結乾燥粉末を作製するための凍結乾燥法を提供する。また、ＦＩＸポリペプチドを含む凍結乾燥粉末を安定化させるための方法、ＦＩＸポリペプチドを含む凍結乾燥粉末の貯蔵寿命を増加させる方法、ＦＩＸポリペプチドを含む凍結乾燥粉末の再構成時間を減少させる方法、及びＦＩＸポリペプチドを含む凍結乾燥前製剤の凍結乾燥プロセス時間を低減させる方法が、提供される。加えて、本開示は、ＦＩＸポリペプチドを含む再構成された製剤を投与することにより、血友病Ｂの予防、治療、改善、または管理を必要とする患者において、血友病Ｂを予防、治療、改善、または管理する方法を提供する。
【００３９】
定義
本開示中で、用語「ａ」または「ａｎ」ものは、そのものの１つ以上を示し、例えば、「ポリヌクレオチド」は、１つ以上のポリヌクレオチドを表すことが理解される。そのようなものであるから、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書で同じ意味で使用できる。
【００４０】
さらに、「及び／または」は、本明細中で使用される場合、他方の有無にかかわらず、２つの特定の特徴または構成要素のそれぞれの具体的な開示と解釈されるべきである。したがって、本明細書で「Ａ及び／またはＢ」などの語句で使用される用語「及び／または」は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」などの語句で使用される用語「及び／または」は、次の態様：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）、のそれぞれを包括することが意図される。
【００４１】
態様が、文言「を含む」で本明細書に記載される場合、別途「からなる」及び／または「本質的にからなる」の用語で記載される類似の態様も提供されることが理解される。
【００４２】
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本開示が関連する当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有する。例えば、ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ
Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｕｏ，  Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，  第２版，  ２００２，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  第３版，  １９９９，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  改訂，  ２０００，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓは、本開示で使用される多くの用語の一般辞書を当業者に提供する。
【００４３】
単位、接頭語、及び記号は、Ｓｙｓｔｅ｀ｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  Ｕｎｉｔｅｓ（ＳＩ）に容認される形式で表される。数値範囲は、範囲を定義する数を含む。別途表記のない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向に、左から右へ記載される。本明細書で提供される見出しは、全体として本明細書を参照することにより得ることができる本開示の様々な態様を限定するものではない。従って、直後に定義される用語は、全体として本明細書を参照することにより、より完全に定義される。
【００４４】
用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、本明細書で、ほぼ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）、おおよそ（ｒｏｕｇｈｌｙ）、およそ（ａｒｏｕｎｄ）、または領域で（ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ）を意味するために使用され、値は、測定システムの限界の程度によって決まることになる。用語「約」は、数値範囲と共に使用される場合、設定された数値の上及び下の境界を延長することにより、その範囲を変更する。一般に、用語「約」は、数値を、例えば、上または下の（より高いまたはより低い）１０パーセントまたは２０パーセントの変動で、記載された値の上及び下の数値を変更できる。別途記載のない限り、「約」の意味は、製剤または組成物のための特定値に対する許容誤差範囲内であるとみなされるべきである。
【００４５】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、同じ意味で使用され、共有結合されるアミノ酸残基からなるポリマー化合物を指す。
【００４６】
用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、同じ意味で使用され、共有結合されるヌクレオチド残基からなるポリマー化合物を指す。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖、または二重鎖、ベクター、プラスミド、ファージ、またはウイルスとすることができる。
【００４７】
本明細書で使用される用語「投与する」は、例えば、ＦＩＸポリペプチドを含む医薬組成物を対象に、処方するか、または与えることを意味する。投与経路の例としては、例えば、中心静脈アクセスによる、静脈内、例えば静脈内注射及び静脈内注入が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる投与経路は、皮下、筋肉内、経口、経鼻、及び肺内投与を含む。ＦＩＸポリペプチドを含む医薬組成物は、本明細書に記載されるような、１つ以上の賦形剤を含むことができる。本明細書で提供される、方法、組成物、及び医薬キットの利点は、投薬計画遵守の改善、破綻出血の低減、関節の出血からの保護の増加、関節損傷の防止、疾病率の低減、死亡率の低減、出血からの保護の延長、血栓事象の減少、及び生活の質の改善を含む。投与することは、非経口投与を含む。一部の実施形態では、非経口投与は、静脈内または皮下投与である
【００４８】
本明細書で使用される用語「治療」または「治療すること」は、血友病Ｂを含むが、これらに限定されない、出血性疾患または障害の１つ以上の症状の改善または低減を意味する。一実施形態では、出血性疾患または障害「の治療」または、それ「治療すること」は、出血性疾患または障害の１つ以上の症状を予防することを含む。ＦＩＸ欠乏症（例えば、低基準値のＦＩＸ活性）により引き起こされる出血性疾患または障害では、用語「治療」または「治療すること」は、ＦＩＸ補充療法を意味する可能性がある。ＦＩＸＦｃポリペプチドを対象に投与することにより、対象は、約１ＩＵ／ｄｌの、または１ＩＵ／ｄｌを超えるＦＩＸ活性の血漿トラフ濃度を達成及び／または維持できる。他の実施形態では、「治療」または「治療すること」は、出血性疾患または障害の１つ以上の症状、例えば、突発性または制御不能の出血エピソード、の頻度が低減することを意味する。しかし、「治療」は、治癒である必要がない。
【００４９】
本明細書で使用される「患者」は、制御不能な出血エピソードの少なくとも１つが発生すると知られており、制御不能な出血エピソードと関連する疾患または障害、例えば、出血性疾患または障害、例えば、血友病Ｂ、と診断されており、制御不能な出血エピソード、例えば、血友病、またはそれらの任意の組み合わせ、の影響を受けやすい個体を含む。患者はまた、特定の活動、例えば、手術、スポーツ活動、または任意の激しい活動、の前に、１つ以上の制御不能な出血エピソードの恐れがある個体を含むことができる。患者は、１％未満、０．５％未満、２％未満、２．５％未満、３％未満、または４％未満の基準値のＦＩＸ活性を有することができる。患者はまた、小児を含む。小児患者は、出生〜２０歳、好ましくは出生〜１８歳、出生〜１６歳、出生〜１５歳、出生〜１２歳、出生〜１１歳、出生〜６歳、出生〜５歳、出生〜２歳、及び２〜１１歳である。
【００５０】
本明細書で使用される「基準値」は、用量を投与する前の対象において、測定された最も低い血漿第ＩＸ因子濃度である。第ＩＸ因子血漿濃度は、投薬前の２時点、スクリーニング検診時及び投与直前に測定できる。あるいは、（ａ）前処理したＦＩＸ活性が＜１％であり、検出可能なＦＩＸ抗原を有さず、ナンセンス遺伝子型を有する対象の基準値を０％と定義することができ、（ｂ）前処理した＜１％のＦＩＸ活性を有し、検出可能なＦＩＸ抗原を有する対象の基準値を０．５％に設定することができ、（ｃ）前処理したＦＩＸ活性が１〜２％の間にある対象の基準値は、Ｃｍｉｎ（ＰＫ研究を通じて最低の活性）であり、（ｄ）前処理したＦＩＸ活性が≧２％である対象の基準値を、２％に設定できる。投与前基準値を超える活性は、前の治療からの残留薬物と考えることができ、基準値まで低下し、ｒＦＩＸＦＢＰ投与に続くＰＫデータから差し引くことができる。
【００５１】
本明細書で使用される「トラフ」は、本発明のキメラポリペプチドまたは別の第ＩＸ因子分子の容量を投与した後に、及び、もしあれば次の容量が投与される前に、到達する最も低い血漿第ＩＸ因子活性レベルである。トラフは、本明細書では「閾値」と同じ意味で使用される。基準値の第ＩＸ因子濃度は、トラフ濃度を計算するために、測定された第ＩＸ因子濃度から差し引かれる。
【００５２】
本明細書で使用される場合、用語「半減期」は、インビボの特定のポリペプチドの生物学的半減期を指す。半減期は、患者に投与される半量が、動物の血行及び／または他の組織から消失するのに必要とされる所要時間により表すことができる。
【００５３】
用語「長時間作用型」及び「長期持続性」は、本明細書で同じ意味で使用される。一実施形態では、用語「長時間作用性」または「長期持続性」は、ｒＦＩＸＦＢＰポリペプチドを投与した結果としてのＦＩＸ活性が、野生型ＦＩＸ（例えば、ＢＥＮＥＦＩＸ（登録商標）または血漿由来のＦＩＸ（「ｐｄＦＩＸ」））のＦＩＸ活性よりも長いことを示す。「より長い」ＦＩＸ活性は、当該技術分野で任意の既知の方法、例えば、ａＰＴＴアッセイ、発色アッセイ、ＲＯＴＥＭ、ＴＧＡなどで、測定できる。一実施形態では、「より長い」ＦＩＸ活性は、Ｔ１／２ベータ（活性）により示すことができる。別の実施形態では、「より長い」ＦＩＸ活性は、血漿に存在するＦＩＸ抗原の濃度、例えば、Ｔ１／２ベータ（抗原）により推測できる。
【００５４】
本明細書で使用される用語「凍結乾燥体」、「凍結乾燥粉末」、「凍結乾燥製品」、または「製品固形物」は、フリーズドライ法により製造される製剤を表す。溶媒（例えば、水）は、真空下で昇華の後に凍結させること及び高温での残留水の脱離により除去される。医薬分野では、凍結乾燥体は、粉末または物理的に（ｐｈｙｓｉｃａｌ）安定な固形物として存在する。凍結乾燥体は、再構成溶媒を添加した後の高速溶解を特徴とする。
【００５５】
本明細書で使用される用語「凍結乾燥前製剤」または「凍結乾燥原料」は、溶媒（例えば、水）がフリーズドライ法により除去される前の液体製剤を表す。凍結乾燥前製剤の「充填容量」は、凍結乾燥前の液体製剤の合計容量である。
【００５６】
本明細書で使用される「Ｔ１／２β」若しくは「Ｔ１／２ベータ」または「ベータＨＬ」は、排出相に関連する半減期であり、ｔ１／２β＝（Ｉｎ２）／排泄速度定数は、終末相に関連する半減期である。Ｔ１／２ベータは、血漿中のＦＩＸ活性またはＦＩＸ抗原濃度で測定できる。活性に基づくＴ１／２ベータは、Ｔ１／２ベータ（活性）として示され、ＦＩＸ抗原濃度に基づくＴ１／２ベータは、Ｔ１／２ベータ（抗原）として示すことができる。Ｔ１／２ベータ（活性）及びＴ１／２ベータ（抗原）の両方は、範囲または幾何平均として示すことができる。
【００５７】
本明細書で使用される用語「再構成された製剤」または「再構成後組成物」は、凍結乾燥され、希釈剤の添加により再溶解される製剤を表す。希釈剤は、注射用蒸留水（ＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、塩化ナトリウム溶液（例えば、０．９％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌ）、グルコース溶液（例えば、５％のグルコース）、界面活性剤含有溶液（例えば、０．０１％のポリソルベート２０またはポリソルベート８０）、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）、及びそれらの組み合わせを限定なしに含有できる。
【００５８】
一般の凍結乾燥プロセス
凍結乾燥またはフリーズドライは、生物材料及び医薬材料の保存のために、医薬業界で広く使用されるプロセスである。凍結乾燥サイクルとしても知られている凍結乾燥プロセスは従来、３つの異なる段階：凍結、１次乾燥、及び２次乾燥、に分けられる。本明細書で使用される「凍結乾燥すること」は、凍結工程及び乾燥工程の両方を含む、凍結乾燥のプロセス全体を指す。
【００５９】
凍結乾燥では、材料中に存在する水は、凍結工程中に氷に転換され、次に、１次乾燥工程中に低圧条件下で直接昇華させることにより材料から除去される。しかし、凍結中に、すべての水が氷に変換されるわけではない。一部の水が、例えば、製剤構成成分及び／または活性成分を含有する固体のマトリックスに閉じ込められている。マトリックス内に過剰に結合された水は、２次乾燥工程中に、所望の濃度の残留水分まで低減させることができる。全ての凍結乾燥工程である、凍結、１次乾燥、及び２次乾燥、が最終製品の特性を決定している。１次乾燥は通常、凍結乾燥プロセス中の最も長い工程であり、それ故、プロセスのこの部分の最適化は、著しい経済効果を有する。
【００６０】
本発明の特定の態様では、凍結乾燥プロセスは、１次乾燥工程をのみを含む。
【００６１】
本発明の特定の態様では、凍結乾燥プロセスはまた、凍結工程と１次乾燥工程との間に、独立した「真空工程」を含む。
【００６２】
本発明の他の態様では、凍結乾燥プロセスは、凍結工程と１次乾燥工程との間に、「アニーリング工程」をさらに含む。
【００６３】
本明細書で使用される用語「アニーリング工程」は、製剤の乾燥工程前の、凍結乾燥を受けているポリペプチド製剤の凍結乾燥プロセスの工程を指し、この工程では、製剤の温度は、より低い温度からより高い温度に上昇し、次に、一定期間後に再び冷却される。
【００６４】
サイクル及び製剤の最適化は従来、１次乾燥中の製品温度が崩壊温度を決して超えないことを保証するために実施されている。本明細書で使用される用語「崩壊温度」は、製品固形物がその元の構造を失い始める、フリーズドライ中の製品温度を指す。崩壊温度を超えると、製品は、製品の外観に影響をもたらし得る、ゆっくりとした散発的な発泡、膨張、起泡、空洞化、開口（ｆｅｎｅｓｔｒａｔｉｏｎ）、総崩壊、収縮、及び数珠状化（ｂｅａｄｉｎｇ）を呈する可能性がある。その結果、崩壊により、製品安定性が不十分さ、乾燥時間の長さ、乾燥の不均一さ、及び質感の消失がもたらされることがある。例えば、米国特許第ＵＳ２０１０／００４１８７０号を参照のこと。
【００６５】
本発明による凍結乾燥製品は、製品の品質分析、再構成時間、再構成の品質、高い分子量、水分、ガラス転移温度（Ｔｇ）、及び生物学的または生化学的活性に基づいて評価できる。通常は、製品の品質分析は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、陽イオン交換ＨＰＬＣ（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）、Ｘ線回折（ＸＲＤ）、変調示差走査熱量計（ｍＤＳＣ）、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）、蛍光、紫外線吸収、比濁法、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びそれらの組み合わせ、を含むが、これらに限定されない方法を使用した、製品の分解速度分析を含む。一部の実施形態では、本発明による凍結乾燥製品は、固形物の外観を評価する工程を含む。さらに、凍結乾燥製品は、通常は再構成後の製品の生物学的または生化学的活性に基づいて評価されても良い。
【００６６】
凍結乾燥第ＩＸ因子製剤
本開示は、ＦＩＸポリペプチドを含む、凍結乾燥前の、凍結乾燥された、及び再構成後の製剤または医薬組成物を提供する。
【００６７】
本発明の特定の態様では、本明細書で開示される製剤は、ＦＩＸポリペプチド、緩衝薬、安定剤、充填剤、及び界面活性剤、またはそれらの任意の組み合わせ、を含む。製剤はまた、医薬製剤に有用な、他の任意の剤を含有できる。
【００６８】
第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチド
製剤に有用なＦＩＸポリペプチドまたはＦＩＸタンパク質は、別途明記のない限り、凝固での通常の役割における機能的なＦＩＸタンパク質である。従って、ＦＩＸポリペプチドは、機能的である変異型ポリペプチド、及びこのような機能的な変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、ＦＩＸポリペプチドは、ヒト、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、及びマウスのＦＩＸポリペプチドである。ＦＩＸの完全長ポリペプチド及びポリヌクレオチド配列は、多くの機能的変異体、例えば、フラグメント、突然変異体、及び改変バージョン、であるので、既知である。ＦＩＸポリペプチドは、完全長ＦＩＸ、完全長ＦＩＸマイナスＮ末端のＭｅｔ、完全長ＦＩＸマイナスシグナル配列、成熟ＦＩＸ（マイナスシグナル配列及びプロペプチド）、及びＮ末端に追加的なＭｅｔを有する成熟ＦＩＸ、を含む。ＦＩＸは、組み換え手段（「組み換え第ＩＸ因子」または「ｒＦＩＸ」）で作製でき、すなわち、それは、天然のまたは血漿由来ではない。
【００６９】
非常に多くの機能的なＦＩＸ変異体が知られている。全体として本明細書に参照により組み込まれる国際公開第ＷＯ０２／０４０５４４Ａ３号は、４頁９〜３０行及び１５頁６〜３１行に、ヘパリンによる阻害に対する耐性の増加を示す突然変異体について開示する。全体として本明細書に参照により組み込まれる国際公開第ＷＯ０３／０２０７６４Ａ２号は、（１４〜２４頁の）表２及び表３、ならびに１２頁１〜２７行に、Ｔ細胞免疫原性が低減したＦＩＸ突然変異体について開示する。全体として本明細書に参照により組み込まれる国際公開第ＷＯ２００７／１４９４０６Ａ２号は、４頁１行〜１９頁１１行に、タンパク質安定性の増加、インビボ及びインビトロ半減期の増加、及びプロテアーゼに対する耐性の増加を示す機能的な突然変異体ＦＩＸ分子について開示する。ＷＯ２００７／１４９４０６Ａ２はまた、１９頁１２〜２０頁９行に、キメラ及び他の変異型ＦＩＸについて開示する。全体として本明細書に参照により組み込まれる国際公開第ＷＯ０８／１１８５０７Ａ２号は、５頁１４行〜６頁５行に、凝固活性の増加を示すＦＩＸ突然変異体について開示する。全体として本明細書に参照により組み込まれる国際公開第ＷＯ０９／０５１７１７Ａ２号は、９頁１１行〜２０頁２行に、半減期及び／または回収率の増加をもたらす、Ｎ結合型及び／またはＯ結合型グリコシル化部位の数が増加するＦＩＸ突然変異体について開示する。全体として本明細書に参照により組み込まれる国際公開第ＷＯ０９／１３７２５４Ａ２号はまた、２頁［００６］パラグラフ〜５頁［０１１］パラグラフ、及び１６頁［０４４］パラグラフから２４頁［０５７］パラグラフに、グリコシル化部位の数が増加した第ＩＸ因子突然変異体について開示する。全体として本明細書に参照により組み込まれる国際公開第ＷＯ０９／１３０１９８Ａ２号は、４頁２６行〜１２頁６行に、グリコシル化部位の数が増加した機能的な突然変異体ＦＩＸ分子について開示する。全体として本明細書に参照により組み込まれる国際公開第ＷＯ０９／１４００１５Ａ２号は、１１頁［００４３］パラグラフ〜１３頁［００５３］パラグラフに、ポリマー（例えば、ＰＥＧ）コンジュゲートのために使用できるＣｙｓ残基の数が増加した（ｔｈａｔ  ａｎ
ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ｃｙｓ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ）機能的なＦＩＸ突然変異体について開示する。２０１１年７月１１日に出願され、２０１２年１月１２日にＷＯ２０１２／００６６２４として公開された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４３５６９号に記載されているＦＩＸポリペプチドはまた、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【００７０】
特定の実施形態では、ＦＩＸポリペプチドは、野生型ＦＩＸを含む。一部の実施形態では、ＦＩＸポリペプチドは、野生型ＦＩＸと結合される異種部分をさらに含む。特定の実施形態では、異種部分は、ＦＩＸの半減期を延長する部分である。特定の実施形態では、異種部分は、ポリペプチドまたは非ポリペプチド部分を含む。
【００７１】
他の実施形態では、ＦＩＸポリペプチドは、長時間作用型ＦＩＸポリペプチドである。長時間作用型ＦＩＸポリペプチドは、ＦＩＸ部分及び非ＦＩＸ部分、例えば、ＦＩＸポリペプチドのインビボまたはインビトロ半減期を延長できる異種部分を含むことができる。例示的な非ＦＩＸ部分としては、例えば、Ｆｃ、アルブミン、ＰＡＳ配列、トランスフェリン、ＣＴＰ（４つのＯ−グリカンを有するヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の２８アミノ酸Ｃ末端ペプチド（ＣＴＰ））、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合ポリペプチド、アルブミン結合小分子、またはそれらの任意の組み合わせ、が挙げられる。本発明の例示的な長時間作用型ＦＩＸポリペプチドとしては、例えば、第ＩＸ因子Ｆｃポリペプチド、第ＩＸ因子アルブミンポリペプチド、第ＩＸ因子ＰＡＳポリペプチド、第ＩＸ因子トランスフェリンポリペプチド、第ＩＸ因子ＣＴＰポリペプチド、第ＩＸ因子ＰＥＧポリペプチド、第ＩＸ因子ＨＥＳポリペプチド、第ＩＸ因子アルブミン結合ポリペプチド（Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  −ａｌｂｕｍｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）、または第ＩＸ因子アルブミン結合小分子ポリペプチド、が挙げられる。
【００７２】
一実施形態では、ＦＩＸポリペプチドは、ｒＦＩＸＦｃ、ヒト凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）からなる組み換え融合タンパク質、及びヒト抗体（ＩｇＧ１アイソタイプ）のＦｃドメインである。例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれる、２０１１に７月１１日に出願され、ＷＯ２０１２／００６６２４として公開されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４３５６９号を参照のこと。ｒＦＩＸＦｃポリペプチドは、Ｆｃのヒンジ領域内の２つのジスルフィド結合を介して、ＦＩＸＦｃ一本鎖（ＦＩＸＦｃ−ｓｃ）及びＦｃ一本鎖（Ｆｃ−ｓｃ）が互いに結合されるヘテロ二量体タンパク質である。ｒＦＩＸＦｃは、最終タンパク質生成物であるｒＦＩＸＦｃを形成するためにトランスフェクションされた細胞株内で組み立てる２つのタンパク質サブユニット、ＦＩＸＦｃ−ｓｃ（６４２アミノ酸、配列番号２）及びＦｃ−ｓｃ（２２７アミノ酸、配列番号４）を必要とする。ＦＩＸＦｃ−ｓｃ及びＦｃ−ｓｃをコードするポリヌクレオチド配列はそれぞれ、配列番号１及び配列番号３として提示される。
【００７３】
特定の実施形態では、ｒＦＩＸＦｃの第ＩＸ因子部分は、血漿由来の第ＩＸ因子のＴｈｒ１４８対立形質と同一である１次アミノ酸配列を有し、内因性の第ＩＸ因子に類似する構造的及び機能的特徴を有する。ｒＦＩＸＦｃのＦｃドメインは、ＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域を含有する。ｒＦＩＸＦｃの集合した二量体の成熟形態は、ほぼ９８キロダルトンの分子量を有する８６９個のアミノ酸を含有する。いくつかの実施形態では、ｒＦＩＸＦｃポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜６４２と、少なくとも９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【００７４】
一実施形態では、ＦＩＸに結合された第２の部分は、ＦｃＲｎ結合パートナーである。別の実施形態では、ＦＩＸと結合されたＦｃＲｎ結合パートナーは、Ｆｃフラグメントである。ＦｃＲｎ結合パートナーは、ＦｃＲｎ受容体により特異的に結合でき、結果として起こる、ＦｃＲｎ結合パートナーのＦｃＲｎ受容体による能動輸送を伴う、任意の分子である。従って、用語Ｆｃは、機能的であるＩｇＧ  Ｆｃの任意の変異体を含む。ＦｃＲｎ受容体に結合するＩｇＧのＦｃ部分の領域は、Ｘ線結晶学に基づいて記載されている（全体として参照により本明細書に組み込まれるＢｕｒｍｅｉｓｔｅｒら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３７９  （１９９４））。ＦｃのＦｃＲｎとの主な接触域は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとの接合部の近くにある。Ｆｃ−ＦｃＲｎ接触は全て、単一のＩｇ重鎖内にある。ＦｃＲｎ結合パートナーとしては、例えば、ＩｇＧ全体、ＩｇＧのＦｃフラグメント、及びＦｃＲｎの完全結合領域を含むＩｇＧの他のフラグメントが挙げられる。主な接触部位は、ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２４８、２５０〜２５７、２７２、２８５、２８８、２９０〜２９１、３０８〜３１１、及び３１４、ならびにＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５〜３８７、４２８、及び４３３〜４３６を含む。免疫グロブリン若しくは免疫グロブリンフラグメント、または領域のアミノ酸番号付けに対してなされる言及は全て、全体として参照により本明細書に組み込まれるＫａｂａｔら  １９９１，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｕ．  Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ；ＭＤに基づく。（ＦｃＲｎ受容体は、ヒトを含むいくつかの哺乳類種から単離されている。ヒトＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎ、及びマウスＦｃＲｎの配列が知られている（全体として参照により本明細書に組み込まれるＳｔｏｒｙら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８０：  ２３７７  （１９９４））。Ｆｃは、免疫グロブリンのヒンジ領域の有無にかかわらず、免疫グロブリンのＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むことができる。例示的なＦｃ変異体は、全体として参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００４／１０１７４０及びＷＯ２００６／０７４１９９で提供される。
【００７５】
Ｆｃ（またはキメラポリペプチドのＦｃ部分）は、１つ以上の突然変異、及び突然変異の組み合わせを含有する可能性がある。
【００７６】
Ｆｃ（またはキメラポリペプチドのＦｃ部分）は、全体として参照により本明細書に組み込まれるＯｇａｎｅｓｙａｎら，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４６：１７５０  （２００９）に開示されるような、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、及びそれらの組み合わせ；全体として参照により本明細書に組み込まれるＶａｃｃａｒｏら，  Ｎａｔ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３：１２８３  （２００５）に開示されるような、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｆ、及びそれらの組み合わせ；全体として参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００９／０２６４６２７Ａ１の１〜２頁［００１２］パラグラフならびに実施例９及び１０に開示される突然変異体；ならびに全体として参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００９０１６３６９９Ａ１の２頁［００１４］〜［００２１］パラグラフに開示される突然変異体、などの、半減期の増加を与える突然変異を含有する可能性がある。
【００７７】
Ｆｃ（またはキメラポリペプチドのＦｃ部分）はまた、例えば、次の突然変異を含むことができ、ＩｇＧのＦｃ領域は、ＦｃＲｎで結合されることになる、改変ＩｇＧ若しくはＦｃフラグメントまたはそれらの部分を生じるために、よく知られた手順、例えば、部位特異的変異導入法及び同類のもの、に従って改変できる。このような改変としては、例えば、ＦｃＲｎの接触部位から離れた改変、及びＦｃＲｎへの結合を維持またはさらに増強する接触部位内の改変が挙げられる。例えば、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（Ｆｃｙ１）における次の単一のアミノ酸残基は、ＦｃＲｎ：Ｐ２３８Ａ、Ｓ２３９Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｋ２４８Ａ、Ｄ２４９Ａ、Ｍ２５２Ａ、Ｔ２５６Ａ、Ｅ２５８Ａ、Ｔ２６０Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ａ、Ｈ２６８Ａ、Ｅ２６９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｅ２７２Ａ、Ｌ２７４Ａ、Ｎ２７６Ａ、Ｙ２７８Ａ、Ｄ２８０Ａ、Ｖ２８２Ａ、Ｅ２８３Ａ、Ｈ２８５Ａ、Ｎ２８６Ａ、Ｔ２８９Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ａ、Ｅ２９３Ａ、Ｅ２９４Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｙ２９６Ｆ、Ｎ２９７Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｆ、Ｒ３０１Ａ、Ｖ３０３Ａ、Ｖ３０５Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｌ３０９Ａ、Ｑ３１１Ａ、Ｄ３１２Ａ、Ｎ３１５Ａ、Ｋ３１７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｓ３２４Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ａ３３０Ｑ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ａ、Ｐ３３１Ｓ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｔ３３５Ａ、Ｓ３３７Ａ、Ｋ３３８Ａ、Ｋ３４０Ａ、Ｑ３４２Ａ、Ｒ３４４Ａ、Ｅ３４５Ａ、Ｑ３４７Ａ、Ｒ３５５Ａ、Ｅ３５６Ａ、Ｍ３５８Ａ、Ｔ３５９Ａ、Ｋ３６０Ａ、Ｎ３６１Ａ、Ｑ３６２Ａ、Ｙ３７３Ａ、Ｓ３７５Ａ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｑ、Ｅ３８０Ａ、Ｅ３８２Ａ、Ｓ３８３Ａ、Ｎ３８４Ａ、Ｑ３８６Ａ、Ｅ３８８Ａ、Ｎ３８９Ａ、Ｎ３９０Ａ、Ｙ３９１Ｆ、Ｋ３９２Ａ、Ｌ３９８Ａ、Ｓ４００Ａ、Ｄ４０１Ａ、Ｄ４１３Ａ、Ｋ４１４Ａ、Ｒ４１６Ａ、Ｑ４１８Ａ、Ｑ４１９Ａ、Ｎ４２１Ａ、Ｖ４２２Ａ、Ｓ４２４Ａ、Ｅ４３０Ａ、Ｎ４３４Ａ、Ｔ４３７Ａ、Ｑ４３８Ａ、Ｋ４３９Ａ、Ｓ４４０Ａ、Ｓ４４４Ａ、及びＫ４４７Ａ、とのＦｃ結合親和性の重大な損失なしに置換でき、式中、例えば、Ｐ２３８Ａは、位置番号２３８で、アラニンにより置換された野生型プロリンを表す。アラニンに加えて、他のアミノ酸は、上記で特定された位置で、野生型アミノ酸と置換できる。突然変異は、Ｆｃに単独で導入して、天然のＦｃと異なる１００を超えるＦｃＲｎ結合パートナーを生じさせることができる。さらに、これらの個々の突然変異の２つ、３つ、またはそれ以上の組み合わせは、一緒に導入して、数百以上のＦｃＲｎ結合パートナーを生じさせることができる。これらの突然変異の一部は、ＦｃＲｎ結合パートナーに新しい機能性を付与できる。例えば、一実施形態は、Ｎ２９７Ａを組み込み、高度に保存されたＮ−グリコシル化部位を除去する。この変異の影響は、免疫原性を低減させ、それによりＦｃＲｎ結合パートナーの循環半減期を向上させること、ならびＦｃＲｎに対する親和性を損なうことなく、ＦｃＲｎ結合パートナーをＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、及びＦｃγＲＩＩＩＡ（ＦｃｙＲＩ，  ＦｃｙＲＩＩＡ，  ＦｃｙＲＩＩＢ，  ａｎｄ  ＦｃｙＲＩＩＩＡ）に結合できないようにすることである（全体として参照により本明細書に組み込まれるＲｏｕｔｌｅｄｇｅ  ら．  １９９５，  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６０：８４７；全体として参照により本明細書に組み込まれるＦｒｉｅｎｄら  １９９９，  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６８：１６３２；全体として参照により本明細書に組み込まれるＳｈｉｅｌｄｓら  １９９５，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：６５９１）。さらに、少なくとも３つのヒトＦｃγ受容体は、下側のヒンジ領域、一般にアミノ酸２３４〜２３７内のＩｇＧの結合部位を認識するようにみえる。それ故、新しい機能及び潜在的な免疫原性の減少の別の例は、例えば、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸２３３〜２３６「ＥＬＬＧ」の、ＩｇＧ２からの対応する配列「ＰＶＡ」との交換により、この領域の突然変異から生じる可能性がある。種々のエフェクター機能を媒介するＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩ（ＦｃｙＲＩ，  ＦｃｙＲＩＩ，  ａｎｄ  ＦｃｙＲＩＩＩ）は、このような突然変異が導入されている場合に、ＩｇＧ１に結合しないことが示されている（全体として参照により本明細書に組み込まれるＷａｒｄ及びＧｈｅｔｉｅ，  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２：７７  （１９９５）；及び全体として参照により本明細書に組み込まれるＡｒｍｏｕｒら，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２９：２６１３  （１９９９））。上記突然変異から生じる新しい機能性のさらなる例として、ＦｃＲｎに対する親和性は、場合によっては野生型のものを超えて増加させることができる。この親和性の増加により、「オン」速度の増加、「オフ」速度の減少、又はその両方を反映できる。ＦｃＲｎに対する親和性の増加をもたらすと考えられる変異は、例えば、Ｔ２５６Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、及びＮ４３４Ａを含む（全体として参照により本明細書に組み込まれるＳｈｉｅｌｄｓら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：６５９１  （２００１））。
【００７８】
Ｆｃ（またはキメラポリペプチドのＦｃ部分）は、表１４に示されるＦｃアミノ酸配列（例えば、配列番号４のアミノ酸２１〜２４７）と少なくとも約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％同一であることができる。Ｆｃ（またはキメラポリペプチドのＦｃ部分）は、表１４に示されるＦｃアミノ酸配列（例えば、配列番号４のアミノ酸２１〜２４７）と同一とすることができる。
【００７９】
上述のように、例示的な長時間作用型ポリペプチドとしては、１つ以上のアルブミンポリペプチド、アルブミン結合ポリペプチド、またはアルブミン結合小分子と結合されたＦＩＸも挙げられる。一実施形態において、アルブミンは、ヒトアルブミンである。アルブミンまたはアルブミン結合タンパク質は、ＦＩＸのＮ末端若しくはＦＩＸのＣ末端のいずれかに結合するか、またはＦＩＸの２つのアミノ酸の間に挿入できる。本発明で使用できるアルブミン、例えば、そのフラグメント、の例は、例えば、米国特許第７，５９２，０１０号；米国特許第６，６８６，１７９号；及びＳｃｈｕｌｔｅ，  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓ．  １２４  Ｓｕｐｐｌ．  ２：Ｓ６−Ｓ８  （２００９）（これらのそれぞれは、全体として参照により本明細書に組み込まれる）により知られている（ａｒｅ  ｋｎｏｗｎ．）。
【００８０】
アルブミン結合ポリペプチドは、細菌アルブミン結合ドメイン、アルブミン結合ペプチド、またはアルブミンに結合できるアルブミン結合抗体フラグメントを含むこと（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）ができるが、これらに限定されない。Ｋｒａｕｌｉｓら，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３７８：１９０−１９４  （１９９６）及びＬｉｎｈｕｌｔら，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  １１：２０６−２１３  （２００２）によって開示される連鎖球菌のタンパク質Ｇのドメイン３は、細菌アルブミン結合ドメインの例である。アルブミン結合ペプチドの例としては、コア配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号５）を有する一連のペプチドが挙げられる。例えば、Ｄｅｎｎｉｓら．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２００２，  ２７７：  ３５０３５−３５０４３  （２００２）を参照のこと。アルブミン結合抗体フラグメントの例は、参照により本明細書に組み込まれるＭｕｌｌｅｒ及びＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ９：３１９−３２６  （２００７）；Ｒｏｏｖｅｒｓｅｔら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ５６：３０３−３１７  （２００７）、及びＨｏｌｔら，  Ｐｒｏｔ．  Ｅｎｇ．  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｃｉ．，  ２１：２８３−２８８  （２００８）で開示される。
【００８１】
特定の態様では、本発明の組み換えＦＩＸポリペプチドは、非ポリペプチド小分子、変異体、またはアルブミンに結合できるそれらの誘導体に対する少なくとも１つの結合部位を含む。このようなアルブミン結合部分の例は、Ｔｒｕｓｓｅｌｅｔら，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ２０：２２８６−２２９２  （２００９）により開示される２−（３−マレイミドプロパンアミド）−６−（４−（４−ヨードフェニル）ブタンアミド）ヘキサノエート（「Ａｌｂｕ」タグ）である。
【００８２】
上述のように、例示的な長時間作用型ポリペプチドとしては、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットの少なくとも１つのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、またはそれらのフラグメント、変異体、若しくは誘導体に結合されたＦＩＸも挙げられる。ＣＴＰは、ＦＩＸのＮ末端またはＦＩＸのＣ末端のいずれかに（ＦＩＸ  ｅｉｔｈｅｒ  ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄ  ｏｆ  ＦＩＸ  ｏｒ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄ  ｏｆ  ＦＩＸ）結合できる。組み換えタンパク質に結合または挿入された１つ以上のＣＴＰペプチドは、そのタンパク質のインビボでの半減期を増加させることが知られている。例えば、本明細書に参照として組み込まれる米国特許第５，７１２，１２２号を参照のこと。例示的なＣＴＰペプチドとしては、ＤＰＲＦＱＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬ（配列番号６）またはＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号７）が挙げられる。例えば、参照により組み込まれる米国特許出願公開第ＵＳ２００９／００８７４１１Ａ１号を参照のこと。
【００８３】
上述のように、例示的な長時間作用型ポリペプチドとしては、少なくとも１つのＰＡＳ配列、またはそれらのフラグメント、変異体、若しくは誘導体に結合されたＦＩＸも挙げられる。ＰＡＳ配列は、ＦＩＸのＮ末端またはＦＩＸのＣ末端のいずれかに結合できる。本明細書で使用されるＰＡＳペプチドまたはＰＡＳ配列は、主にアラニン及びセリン残基を含むアミノ酸配列、または主にアラニン、セリン、及びプロリン残基を含むアミノ酸配列を意味し、アミノ酸配列は、生理的条件下でランダムコイルコンンフォメーションを形成する。従って、ＰＡＳ配列は、キメラタンパク質において異種部分の一部として使用できる、アラニン、セリン、及びプロリン、を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる、ビルディングブロック、アミノ酸ポリマー、または配列カセットである。アミノ酸ポリマーはまた、アラニン、セリン、及びプロリン以外の残基がＰＡＳ配列において微量成分として付加される場合、ランダムコイルコンンフォメーションを形成できる。「微量成分」とは、アラニン、セリン、及びプロリン以外のアミノ酸が、ＰＡＳ配列において、ある程度、例えば、アミノ酸の多くとも約１２％、すなわち、ＰＡＳ配列の１００個のアミノ酸のうちの約１２個、多くとも約１０％、多くとも約９％、多くとも約８％、約６％、約５％、約４％、約３％、すなわち、約２％、または約１％まで付加できることを意味する。アラニン、セリン、及びプロリンとは異なるアミノ酸は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌからなる群から選択できる。生理的条件下で、ＰＡＳペプチドは、ランダムコイルコンンフォメーションを形成して、それにより本発明の組み換えタンパク質にインビボ及び／またはインビトロ安定性の増加をもたらすことができ、かつ凝血促進活性を有する。
【００８４】
ＰＡＳペプチドの非限定例としては、ＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡ（配列番号８）、ＡＡＰＡＳＰＡＰＡＡＰＳＡＰＡＰＡＡＰＳ（配列番号９）、ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳＳ（配列番号１０）、ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳ（配列番号１１）、ＳＳＰＳＡＰＳＰＳＳＰＡＳＰＳＰＳＳＰＡ（配列番号１２）、ＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡ（配列番号１３）、ＡＳＡＡＡＰＡＡＡＳＡＡＡＳＡＰＳＡＡＡ（配列番号１４）、または任意の変異体、誘導体、フラグメント、若しくはそれらの組み合わせ、が挙げられる。ＰＡＳ配列のさらなる例は、例えば、米国特許公開第２０１０／０２９２１３０Ａ１号、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２００８／１５５１３４Ａ１号、及び欧州発行特許ＥＰ２１７３８９０により知られている。
【００８５】
上述のように、例示的な長時間作用型ポリペプチドとしては、少なくとも１つのトランスフェリンペプチド、またはそれらのフラグメント、変異体、若しくは誘導体に結合されたＦＩＸも挙げられる。少なくとも１つのトランスフェリンペプチドは、ＦＩＸのＮ末端若しくはＦＩＸのＣ末端のいずれかに結合するか、またはＦＩＸの２つのアミノ酸の間に挿入できる。任意のトランスフェリンは、本発明の組み換えＦＩＸタンパク質に結合または挿入できる。一例として、野生型ヒトＴｆ（Ｔｆ）は、遺伝子重複に由来するようにみえる、２つの主要なドメイン、Ｎ（約３３０個のアミノ酸）及びＣ（約３４０個のアミノ酸）を有する、ほぼ７５ＫＤａ（グリコシル化を考慮せず）の６７９個のアミノ酸のタンパク質である。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ００１０６３、ＸＭ００２７９３、Ｍ１２５３０、ＸＭ０３９８４５、ＸＭ０３９８４７、及びＳ９５９３６（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）（これらの全ては、本明細書に参照により組み込まれる）を参照のこと。
【００８６】
トランスフェリンは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）介在性エンドサイトーシスを通じて鉄を輸送する。鉄がエンドソーム区画に放出され、Ｔｆ−ＴｆＲ複合体が細胞表面上に再循環された後、Ｔｆは、次の鉄輸送周期のために細胞外空間に再び放出される。Ｔｆは、１４〜１７日間を超える長い半減期を有する（Ｌｉら，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｓｃｉ．  ２３：２０６−２０９  （２００２））。トランスフェリン融合タンパク質は、半減期の延長、癌療法のための標的送達、経口送達、及びプロインスリンの持続的活性化について研究されている（Ｂｒａｎｄｓｍａら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ａｄｖ．，  ２９：  ２３０−２３８  （２０１１）；Ｂａｉ  ら，  Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０２：７２９２−７２９６  （２００５）；Ｋｉｍら，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．，  ３３４：６８２−６９２  （２０１０）；Ｗａｎｇら，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １５５：３８６−３９２  （２０１１））。
【００８７】
上述のように、例示的な長時間作用型ポリペプチドとしては、少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に結合されるＦＩＸも挙げられる。
【００８８】
ＰＥＧ化されたＦＩＸは、ＦＩＸと少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子との間に形成されたコンジュゲートを指すことができる。ＰＥＧは、幅広い種々の分子量及び平均分子量の範囲で市販されている。ＰＥＧの平均分子量の範囲の代表例としては、約２００、約３００、約４００、約６００、約１０００、約１３００〜１６００、約１４５０、約２０００、約３０００、約３０００〜３７５０、約３３５０、約３０００〜７０００、約３５００〜４５００、約５０００〜７０００、約７０００〜９０００、約８０００、約１００００、約８５００〜１１５００、約１６０００〜２４０００、約３５０００、約４００００、約６００００、及び約８００００ダルトンが挙げられるが、これらに限定されない。これらの平均分子量は、単に例示として提供されるものであり、決して限定となることを意図するものではない。
【００８９】
本発明の組み換え長時間作用型ＦＩＸタンパク質は、モノまたはポリ（例えば、２〜４個の）ＰＥＧ部分を含むようにＰＥＧ化できる。ＰＥＧ化は、当該技術分野で既知のＰＥＧ化反応のいずれによっても実施できる。ＰＥＧ化タンパク質生成物を調製するための方法は一般に、（ｉ）本発明のペプチドが１つ以上のＰＥＧ基に結合する条件下で、ポリペプチドをポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体等）と反応させること、及び（ｉｉ）反応生成物（複数可）を得ること、を含むことになる。一般に、反応のための最適な反応条件は、既知のパラメータ及び所望の結果に基づいて個別的に決定されることになる。
【００９０】
当業者らに利用可能ないくつかのＰＥＧ結合方法、例えば、Ｍａｌｉｋ  Ｆら，  Ｅｘｐ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ２０：１０２８−３５  （１９９２）；Ｆｒａｎｃｉｓ，  Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３（２）：４−１０  （１９９２）；欧州特許公開第ＥＰ０４０１３８４号、同第ＥＰ０１５４３１６号、及び同第ＥＰ０４０１３８４号；ならびに国際特許出願公開第ＷＯ９２／１６２２１号、及び同第ＷＯ９５／３４３２６号がある。非限定例として、ＦＩＸ変異体は、ＦＩＸの１つ以上の挿入部位にシステイン置換基を含有することができ、システインは、ＰＥＧポリマーにさらにコンジュゲートできる。Ｍｅｉら，  Ｂｌｏｏｄ  １１６：２７０−２７９  （２０１０）、及び米国特許第７，６３２，９２１号を参照のこと。
【００９１】
上述のように、例示的な長時間作用型ポリペプチドとしては、少なくとも１つのヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）ポリマーに結合されるＦＩＸも挙げられる。ＨＥＳは、天然のアミロペクチンの誘導体であり、体内のα−アミラーゼにより分解される。ＨＥＳは、有利な生物学的特性を示し、医療機関で、血液量補充剤として、及び血液希釈療法において使用される。例えば、Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒら，  Ｋｒａｎｋｅｎｈａｕｓｐｈａｒｍａｚｉｅ  ８：２７１−２７８  （１９８７）；及びＷｅｉｄｌｅｒら，  Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ／Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．  ４１：  ４９４−４９８  （１９９１）を参照のこと。
【００９２】
ＨＥＳは、分子量分布及び置換度を主に特徴とする。ＨＥＳは、１〜３００ｋＤ、２〜２００ｋＤ、３〜１００ｋＤ、または４〜７０ｋＤの平均分子量（重量平均）を有する。ヒドロキシエチルデンプンは、０．１〜３、０．１〜２、０．１〜０．９、または０．１〜０．８の置換度、及びヒドロキシエチル基に関して、２〜２０個の範囲のＣ２置換とＣ６置換との比を、さらに示すことができる。約１３０ｋＤの平均分子量を有するＨＥＳは、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ製ＶＯＬＵＶＥＮ（登録商標）である。ＶＯＬＵＶＥＮ（登録商標）は、例えば、循環血液量減少の治療法及び予防法に対する治療適応症に使用される、体積補充のための人工コロイドである。当業者らが利用可能ないくつかのＨＥＳ結合方法、例えば、上記の同じＰＥＧ結合方法がある。
【００９３】
第ＩＸ因子凝固活性は、国際単位（複数可）（ＩＵ）として表される。１ＩＵの第ＩＸ因子活性は、１ミリリットル正常ヒト血漿中の第ＩＸ因子の量にほぼ相当する。１段階凝固アッセイ（活性化部分トロンボプラスチン時間；ａＰＴＴ）、トロンビン生成時間（ＴＧＡ）、及び回転式トロンボエラストメトリ（ＲＯＴＥＭ（登録商標））を含む、いくつかのアッセイが、第ＩＸ因子活性を測定するために利用可能である。
【００９４】
緩衝薬
本発明に有用な緩衝薬は、別の酸または塩基の添加後に、選択される値の近くの溶液の酸性度（ｐＨ）を維持するために使用される弱酸または塩基とすることができる。好適な緩衝薬は、製剤のｐＨ制御を維持することにより、医薬製剤の安定性を最大化させることができる。好適な緩衝薬はまた、生理学的適合性を確保するか、または溶解性を最適化できる。レオロジー、粘度、及び他の特性はまた、製剤のｐＨに依存する可能性がある。一般的な緩衝薬としては、ヒスチジン、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、及びリン酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、緩衝薬は、等張剤と共に、Ｌ−ヒスチジンまたはＬ−ヒスチジンのＬ−ヒスチジン塩酸塩との混合物を含み、当該技術分野で既知の酸または塩基と共に潜在的にｐＨ調整する。特定の実施形態では、緩衝薬は、Ｌ−ヒスチジンである。特定の実施形態では、製剤のｐＨは、約６と約８との間、または約６．５と約７．５との間に維持される。
【００９５】
安定剤
安定剤は、その製品を安定化させるために医薬製品に添加される。このような薬剤は、いくつかの異なる手段で、タンパク質を安定化させることができる。一般的な安定剤としては、グリシン、アラニン、リシン、アルギニン、若しくはスレオニンなどのアミノ酸；グルコース、スクロース、トレハロース、ラフィノース、若しくはマルトースなどの炭化水素；任意の種類及び分子量のグリセロール、マンニトール、ソルビトール、シクロデキストリン、若しくはデストランスなどのポリオール；またはＰＥＧが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の一態様では、安定剤は、凍結乾燥製剤中のＦＩＸポリペプチドの安定性を最大化させるために選択される。特定の実施形態では、安定剤は、スクロースである。
【００９６】
充填剤
充填剤は、製品に体積と質量を追加するために医薬品に添加することができ、それにより、医薬品の正確な計量及び取り扱いが容易になる。一般的な充填剤としては、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、炭酸カルシウム、またはステアリン酸マグネシウムが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、充填剤は、マンニトールである。
【００９７】
界面活性剤
界面活性剤は、親液性及び疎液性基を有する両親媒性物質である。界面活性剤は、アニオン性、カチオン性、双性イオン性、または非イオン性とすることができる。非イオン性界面活性剤の例としては、アルキルエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アミンエトキシレート、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、セチルアルコール若しくはオレイルアルコールなどの脂肪族アルコール、コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、ポリソルベート、または、ドデシルジメチルアミンオキシドが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。
【００９８】
凍結乾燥前製剤
一態様では、本開示は、
（ａ）ＦＩＸ凝固活性を有する第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチド、
（ｂ）緩衝薬、
（ｃ）安定剤、
（ｄ）充填剤、及び
（ｅ）界面活性剤、
を含む凍結乾燥前製剤を提供し、
製剤が、約５ｍＬ未満、約４ｍＬ未満、または約３ｍＬ未満の充填容量を有し、（ａ）〜（ｅ）のそれぞれが、標準凍結乾燥前製剤と比較して、
（１）凍結乾燥時のＦＩＸポリペプチドの安定性の改善、
（２）凍結乾燥時の再構成時間の低減、
（３）製剤を含む、栓への飛散の低減、
（４）凍結乾燥サイクル時間の低減、
（５）室温での凍結乾燥前製剤から調製される凍結乾燥体の貯蔵寿命の増加、または
（６）それらの任意の組み合わせ、
を可能にするのに十分なバイアル毎の量（ｍｇ／バイアル）であり、
標準製剤が、凍結乾燥前製剤と同じバイアル毎の量の（ａ）〜（ｅ）を含んで、少なくとも５ｍＬの充填容量を有する。一部の実施形態では、標準製剤は、５．３ｍＬの充填容量または５ｍＬの充填容量を有する。
【００９９】
他の実施形態では、凍結乾燥前製剤は、（１）凍結乾燥時のＦＩＸポリペプチドの安定性の改善、（２）凍結乾燥時の再構成時間の低減、（３）製剤を含む、栓への飛散の低減、（４）凍結乾燥サイクル時間の低減、及び、（５）室温での凍結乾燥前製剤から調製される凍結乾燥体の貯蔵寿命の増加、から選択される少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、または少なくとも５つの特性を可能にする。特定の実施形態では、凍結乾燥前製剤は、（１）凍結乾燥時のＦＩＸポリペプチドの安定性の改善を可能にする。特定の実施形態では、凍結乾燥前製剤は、（２）凍結乾燥時の再構成時間の低減を可能にする。特定の実施形態では、凍結乾燥前製剤は、（３）製剤を含む、栓への飛散の低減を可能にする。特定の実施形態では、凍結乾燥前製剤は、（４）凍結乾燥サイクル時間の低減を可能にする。特定の実施形態では、凍結乾燥前製剤は、（５）室温での凍結乾燥前製剤から調製される凍結乾燥体の貯蔵寿命の増加を可能にする。特定の実施形態では、凍結乾燥前製剤は、（６）本明細書に記載される特性の任意の組み合わせを可能にする。
【０１００】
特定の実施形態では、凍結乾燥前製剤は、少なくとも約１００ＩＵ／バイアルのＦＩＸポリペプチドを含む。特定の実施形態では、凍結乾燥前製剤は、少なくとも約２００ＩＵ／バイアル〜約１０，０００ＩＵ／バイアル、約２００ＩＵ／バイアル〜約６，０００ＩＵ／バイアル、または約５００ＩＵ／バイアル〜約５，０００ＩＵ／バイアルのＦＩＸポリペプチドを含む。特定の実施形態では、凍結乾燥前製剤は、約２２０ＩＵ／バイアル、約２５０ＩＵ／バイアル、約３００ＩＵ／バイアル、約４００ＩＵ／バイアル、約５００ＩＵ／バイアル、約６００ＩＵ／バイアル、約７００ＩＵ／バイアル、約８００ＩＵ／バイアル、約９００ＩＵ／バイアル、約１，０００ＩＵ／バイアル、約１，１００ＩＵ／バイアル、約１，２００ＩＵ／バイアル、約１，３００ＩＵ／バイアル、約１，４００ＩＵ／バイアル、約１，５００ＩＵ／バイアル、約２，０００ＩＵ／バイアル、約２，５００ＩＵ／バイアル、約３，０００ＩＵ／バイアル、約４，０００ＩＵ／バイアル、約５，０００ＩＵ／バイアル、約５，５００ＩＵ／バイアル、約６，０００ＩＵ／バイアル、約６，５００ＩＵ／バイアル、約７，０００ＩＵ／バイアル、約７，５００ＩＵ／バイアル、約８，０００ＩＵ／バイアル、約８，５００ＩＵ／バイアル、約９，０００ＩＵ／バイアル、約９，５００ＩＵ／バイアル、または約１０，０００ＩＵ／バイアルのＦＩＸポリペプチドを含む。
【０１０１】
一部の実施形態では、より高濃度の凍結乾燥前製剤は、充填容量を低減させることにより達成される。特定の実施形態では、凍結乾燥前製剤は、約４．０ｍＬ、約３．５ｍＬ、約３．０ｍＬ、約２．９ｍＬ、約２．８ｍＬ、約２．７ｍＬ、約２．６５ｍＬ、約２．６ｍＬ、約２．５ｍＬ、約２．４ｍＬ、約２．３ｍＬ、約２．２ｍＬ、約２．１ｍＬ、または約２．０ｍＬの充填容量を有する。一部の実施形態では、凍結乾燥前製剤の充填容量は、約２．６５ｍＬである。一部の実施形態では、凍結乾燥前製剤の充填容量は、約５ｍＬ未満である。
【０１０２】
一部の実施形態では、ＦＩＸポリペプチドは、追加の精製工程、例えば、第２の限界濾過工程によりさらに濃縮できる。
【０１０３】
特定の実施形態では、低減した再構成時間は、１．５分未満、１分未満、５０秒未満、４０秒未満、３０秒未満、２０秒未満、または１０秒未満である。特定の実施形態では、低減した再構成時間は、３０秒未満である。
【０１０４】
特定の実施形態では、凍結乾燥前製剤の低減した凍結乾燥サイクル時間は、約４日以下、約３日以下、約２日以下、または約１日以下である。
【０１０５】
特定の実施形態では、凍結乾燥前製剤中の緩衝薬の濃度は、約３ｍｇ／ｍＬと約１５ｍｇ／ｍＬとの間、４ｍｇ／ｍＬと１２ｍｇ／ｍＬとの間（ｂｅｔｗｅｅｎ  ４ｍｇ／ｍＬ
ａｎｄ  ｂｅｔｗｅｅｎ  １２  ｍｇ／ｍＬ）、約５ｍｇ／ｍＬと約１０ｍｇ／ｍＬとの間、または約５．８２ｍｇ／ｍＬと約９．７ｍｇ／ｍＬとの間にある。一実施形態では、緩衝薬は、約３．８８ｍｇ／ｍＬと約９．７ｍｇ／ｍＬとの間の濃度である。一実施形態では、緩衝薬は、約７．７６ｍｇ／ｍＬの濃度である。一部の実施形態では、凍結乾燥前製剤は、約７．７６ｍｇ／ｍＬの濃度のＬ−ヒスチジンを含有する。
【０１０６】
特定の実施形態では、凍結乾燥前製剤中の安定剤の濃度は、１０ｍｇ／ｍＬと約５０ｍｇ／ｍＬとの間、約１３ｍｇ／ｍＬと約４０ｍｇ／ｍＬとの間、約１５ｍｇ／ｍＬと約３５ｍｇ／ｍＬとの間、または約１７．８５ｍｇ／ｍＬと約２９．９５ｍｇ／ｍＬとの間にある。一実施形態では、緩衝薬は、約２３．８ｍｇ／ｍＬの濃度である。一部の実施形態では、凍結乾燥前製剤は２３．８ｍｇ／ｍＬの濃度のスクロースを含有する。
【０１０７】
特定の実施形態では、凍結乾燥前製剤中の充填剤の濃度は、約２０ｍｇ／ｍＬと約１００ｍｇ／ｍＬとの間、約３０ｍｇ／ｍＬと約７０ｍｇ／ｍＬとの間、約３０ｍｇ／ｍＬと約６０ｍｇ／ｍＬとの間、または約３５．７ｍｇ／ｍＬと約５９．５ｍｇ／ｍＬとの間にある。一実施形態では、充填剤は、約４７．６ｍｇ／ｍＬの濃度である。一部の実施形態では、凍結乾燥前製剤は、約４７．６ｍｇ／ｍＬの濃度のマンニトールを含有する。
【０１０８】
特定の実施形態では、凍結乾燥前製剤中の界面活性剤の濃度は、約０．０１ｍｇ／ｍＬと約５ｍｇ／ｍＬとの間、約０．１ｍｇ／ｍＬと約４ｍｇ／ｍＬとの間、約０．１ｍｇ／ｍＬと約３ｍｇ／ｍＬとの間、約０．０１ｍｇ／ｍＬと約２ｍｇ／ｍＬとの間、または約０．０５ｍｇ／ｍＬと約１ｍｇ／ｍＬとの間である。一実施形態では、界面活性剤は、約０．２ｍｇ／ｍＬの濃度である。一部の実施形態では、凍結乾燥前製剤は、約０．２ｍｇ／ｍＬの濃度のポリソルベート２０またはポリソルベート８０を含有する。
【０１０９】
特定の実施形態では、凍結乾燥前製剤中のＦＩＸポリペプチドの濃度は、約８０ＩＵ／ｍＬと約２，７５０ＩＵ／ｍＬとの間にある。一部の実施形態では、凍結乾燥前製剤中のＦＩＸポリペプチドの濃度は、少なくとも約１００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約２００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約３００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約４００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約５００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約６００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約７００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約８００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約９００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約１０００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約１５００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約２０００ＩＵ／ｍＬ、または少なくとも約２５００ＩＵ／ｍＬである。
【０１１０】
一態様では、本開示は、
（ａ）約８０〜約２，７５０ＩＵ／ｍＬのｒＦＩＸＦｃ、
（ｂ）約７．７６ｍｇ／ｍＬのＬ−ヒスチジン、
（ｃ）約４７．６ｍｇ／ｍＬのマンニトール、
（ｄ）約２３．８ｍｇ／ｍＬのスクロース、及び
（ｅ）約０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０、
含む凍結乾燥前製剤をさらに提供する。
【０１１１】
特定の実施形態では、このような凍結乾燥前製剤の充填容量は、約３ｍＬ、約２．９ｍＬ、約２．８ｍＬ、約２．７ｍＬ、約２．６５ｍＬ、約２．６ｍＬ、約２．５ｍＬ、約２．４ｍＬ、約２．３ｍＬ、約２．２ｍＬ、約２．１ｍＬ、または約２．０ｍＬである。一実施形態では、このような凍結乾燥前製剤の充填容量は、約２．６５ｍＬである。
【０１１２】
加えて、本開示は、凍結乾燥前製剤のいずれかから凍結乾燥する凍結乾燥粉末を提供する。一部の実施形態では、凍結乾燥前製剤は、本明細書に記載される任意の製剤である。
【０１１３】
凍結乾燥粉末（ｌｙｏｐｈｉｌａｔｅ  ｐｏｗｅｒ）
本開示はまた、ＦＩＸポリペプチド、緩衝薬、安定剤、充填剤、界面活性剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む凍結乾燥粉末を提供する。
【０１１４】
特定の実施形態では、凍結乾燥粉末は、バイアル毎に約８ｍｇと約３９ｍｇとの間、バイアル毎に約９ｍｇと約３５ｍｇとの間、バイアル毎に約１０ｍｇと約３０ｍｇとの間、バイアル毎に約１２ｍｇと約２５ｍｇとの間、バイアル毎に約１５ｍｇと約２３ｍｇとの間の緩衝薬（例えば、Ｌ−ヒスチジン）を含む。一実施形態では、凍結乾燥粉末は、バイアル毎に約２５ｍｇ、バイアル毎に約２４ｍｇ、バイアル毎に約２３ｍｇ、バイアル毎に約２２ｍｇ、バイアル毎に約２１ｍｇ、バイアル毎に約２０ｍｇ、バイアル毎に約１９ｍｇ、バイアル毎に約１８ｍｇ、バイアル毎に約１７ｍｇ、バイアル毎に約１６ｍｇ、バイアル毎に約１５ｍｇの緩衝薬を含む。別の実施形態では、凍結乾燥粉末は、バイアル毎に約２０．６ｍｇの緩衝薬を含む。一部の実施形態では、緩衝薬は、Ｌ−ヒスチジンである。
【０１１５】
特定の実施形態では、凍結乾燥粉末は、バイアル毎に約２７ｍｇと約１３２ｍｇとの間、バイアル毎に約３０ｍｇと約１２０ｍｇとの間、バイアル毎に約４０ｍｇと約１１０ｍｇとの間、バイアル毎に約５０ｍｇと約１００ｍｇとの間、バイアル毎に約６０ｍｇと約９０ｍｇとの間の安定剤を含む。一実施形態では、凍結乾燥粉末は、バイアル毎に約６８ｍｇ、バイアル毎に約６７ｍｇ、バイアル毎に約６６ｍｇ、バイアル毎に約６５ｍｇ、バイアル毎に約６４ｍｇ、バイアル毎に約６３ｍｇ、バイアル毎に約６２ｍｇ、バイアル毎に約６１ｍｇ、バイアル毎に約６０ｍｇ、バイアル毎に約５９ｍｇの安定剤を含む。別の実施形態では、凍結乾燥粉末（ｌｙｏｐｈｉｌａｔｅ  ｐｏｗｅｒ）は、バイアル毎に約６３．１ｍｇの安定剤を含む。一部の実施形態では、安定剤は、スクロースである。
【０１１６】
特定の実施形態では、凍結乾燥粉末は、バイアル毎に約５０ｍｇと約２６５ｍｇとの間、バイアル毎に約５３ｍｇと約２６５ｍｇとの間、バイアル毎に約５０ｍｇと約２５０ｍｇとの間、バイアル毎に約５３ｍｇと約２６５ｍｇとの間、バイアル毎に約８０ｍｇと約２００ｍｇとの間、バイアル毎に約１００ｍｇと約１５０ｍｇとの間、またはバイアル毎に約１１０ｍｇと約１４０ｍｇとの間の充填剤を含む。一実施形態では、凍結乾燥粉末は、バイアル毎に約１３１ｍｇ、バイアル毎に約１３０ｍｇ、バイアル毎に約１２９ｍｇ、バイアル毎に約１２８ｍｇ、バイアル毎に約１２７ｍｇ、バイアル毎に約１２６ｍｇ、バイアル毎に約１２５ｍｇ、バイアル毎に約１２４ｍｇ、バイアル毎に約１２３ｍｇ、またはバイアル毎に約１２２ｍｇの充填剤を含む。別の実施形態では、凍結乾燥粉末は、バイアル毎に約１２６．１ｍｇの充填剤を含む。一部の実施形態では、充填剤は、マンニトールである。
【０１１７】
特定の実施形態では、凍結乾燥粉末は、バイアル毎に約０．０３ｍｇと約１３ｍｇとの間、バイアル毎に約０．０５ｍｇと約１０ｍｇとの間、バイアル毎に約０．０７ｍｇと約８ｍｇとの間、バイアル毎に約０．１ｍｇと約２ｍｇとの間の界面活性剤を含む。一実施形態では、凍結乾燥粉末は、バイアル毎に約１ｍｇ、バイアル毎に約０．９ｍｇ、バイアル毎に約０．８ｍｇ、バイアル毎に約０．７ｍｇ、バイアル毎に約０．６ｍｇ、バイアル毎に約０．５ｍｇ、バイアル毎に約０．４ｍｇ、バイアル毎に約０．３ｍｇ、バイアル毎に約０．２ｍｇ、またはバイアル毎に約０．１ｍｇの界面活性剤を含む。別の実施形態では、凍結乾燥粉末（ｌｙｏｐｈｉｌａｔｅ  ｐｏｗｅｒ）は、バイアル毎に約０．５ｍｇの界面活性剤を含む。一実施形態では、凍結乾燥粉末は、バイアル毎に約０．５３ｍｇの界面活性剤を含む。一部の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。
【０１１８】
特定の実施形態では、凍結乾燥粉末は、
（ａ）バイアル毎に約２ｍｇとバイアル毎に約１５０ｍｇとの間の量のＦＩＸポリペプチド、
（ｂ）バイアル毎に約１０ｍｇとバイアル毎に約３０ｍｇとの間の量の緩衝薬、
（ｃ）バイアル毎に約７０ｍｇ（ｍｇ  ｖｉａｌ）とバイアル毎に約２００ｍｇとの間の量の充填剤、
（ｄ）バイアル毎に約３０ｍｇとバイアル毎に１００ｍｇとの間の量の安定剤、及び
（ｅ）バイアル毎に約０．０５ｍｇとバイアル毎に約５ｍｇとの間の量の界面活性剤、
含む。
【０１１９】
一部の実施形態では、凍結乾燥粉末は、
（ａ）バイアル毎に約２．２ｍｇとバイアル毎に約１２５ｍｇとの間の量のＦＩＸポリペプチド、
（ｂ）バイアル毎に約８ｍｇとバイアル毎に約３９ｍｇとの間の量の緩衝薬、
（ｃ）バイアル毎に約５３ｍｇ（ｍｇ  ｖｉａｌ）とバイアル毎に約２６５ｍｇとの間の量の充填剤、
（ｄ）バイアル毎に約２７ｍｇとバイアル毎に１３２ｍｇとの間の量の安定剤、及び
（ｅ）バイアル毎に約０．０３ｍｇとバイアル毎に約１３ｍｇとの間の量の界面活性剤、
含む。
【０１２０】
特定の実施形態では、凍結乾燥粉末は、
（ａ）バイアル毎に約２．２ｍｇとバイアル毎に約１２５ｍｇとの間の量の凍結乾燥ＦＩＸポリペプチド、
（ｂ）バイアル毎に約１２．５ｍｇとバイアル毎に２５ｍｇとの間の量の緩衝薬、
（ｃ）バイアル毎に約３２．５ｍｇとバイアル毎に８０ｍｇとの間の量の安定剤、
（ｄ）バイアル毎に約７５ｍｇとバイアル毎に１５０ｍｇとの間の量の充填剤、及び
（ｅ）約０．１ｍｇ／ｍＬと約２ｍｇ／ｍＬとの間の量の界面活性剤、
含む。
【０１２１】
一実施形態では、凍結乾燥粉末は、
（ａ）約２．２〜約１２５ｍｇ／バイアルのＦＩＸポリペプチド、
（ｂ）約２０．６ｍｇ／バイアルのＬ−ヒスチジン、
（ｃ）約１２６．１ｍｇ／バイアルのマンニトール、
（ｄ）約６３．１ｍｇ／バイアルのスクロース、及び
（ｅ）約０．５３ｍｇ／バイアルのポリソルベート２０、
含む。
【０１２２】
再構成された製剤
さらに、本開示は、上再構成緩衝液により再構成された上記の凍結乾燥粉末のいずれかを含む再構成された製剤を提供する。
【０１２３】
特定の実施形態では、再構成緩衝液は、ＮａＣｌ溶液である。一部の実施形態では、再構成緩衝液は、５ｍＬである。
【０１２４】
特定の実施形態では、再構成された製剤は、
（ａ）約０．９ｍｇ／ｍＬと約５０ｍｇ／ｍＬとの間の濃度のＦＩＸポリペプチド、
（ｂ）２ｍｇ／ｍＬと約５ｍｇ／ｍＬとの間の濃度の緩衝薬、
（ｃ）２０ｍｇ／ｍＬと約３０ｍｇ／ｍＬとの間の濃度の充填剤、
（ｄ）バイアル毎に８ｍｇ／ｍＬと１５ｍｇ／ｍＬとの間の濃度の安定剤、及び
（ｅ）０．０５ｍｇ／ｍＬと約０．４ｍｇ／ｍＬとの間の濃度の界面活性剤、
含む。
【０１２５】
特定の実施形態では、再構成された製剤は、
（ａ）約０．９ｍｇ／ｍＬと約５０ｍｇ／ｍＬとの間の濃度のＦＩＸポリペプチド、
（ｂ）約３．８８ｍｇ／ｍＬの濃度の緩衝薬、
（ｃ）約２３．８ｍｇ／ｍＬの濃度の充填剤、
（ｄ）約１１．９ｍｇ／ｍＬの濃度の安定剤、
（ｅ）約０．１ｍｇ／ｍＬの濃度の界面活性剤、及び
（ｆ）約３．２５ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌを含む再構成緩衝液、
含む。
【０１２６】
特定の実施形態では、再構成された製剤は、
（ａ）約８０ＩＵ／ｍＬと約２，７５０ＩＵ／ｍＬとの間の濃度のＦＩＸポリペプチド、
（ｂ）約２５ｍＭの濃度の緩衝薬、
（ｃ）約１３１ｍＭの濃度の充填剤、
（ｄ）約３５ｍＭの濃度の安定剤、
（ｅ）０．０１％（ｗ／ｖ）の濃度の界面活性剤、及び
（ｆ）再構成緩衝液、
含む。
【０１２７】
製剤組成物の実施例は、表２〜４でさらに提供される。
【０１２８】
一態様では、本開示は、本明細書に記載される、凍結乾燥前製剤、凍結乾燥粉末、または再構成された製剤を含むバイアルをさらに提供する。
【０１２９】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される凍結乾燥粉末を含む第１の容器、及び第１の容器の凍結乾燥粉末と組み合わされた場合に、再構成された製剤を作製するのに十分な容積の再構成緩衝液を含む第２の容器を含むキットを提供する。特定の実施形態では、キットの再構成緩衝液の容積は、約５ｍＬである。一部の実施形態では、容積は、約５．３ｍＬである。特定の実施形態では、キットの再構成緩衝液は、ＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、キットは、血友病Ｂを治療するために使用される。
【０１３０】
さらに別の態様では、本開示は、本明細書に記載される再構成された製剤を患者に投与することを含む、ＦＩＸポリペプチドを必要とする血友病Ｂ患者に、ＦＩＸポリペプチドを投与する方法を提供し、投与は、患者の出血エピソードの頻発または重症化を防止するか、または低減させる。
【０１３１】
本開示は、本明細書に記載される再構成された製剤を投与することにより、血友病Ｂの予防、治療、改善、または管理を必要とする患者において、血友病Ｂを予防、治療、改善、または管理する方法をさらに提供する。
【０１３２】
ＦＩＸポリペプチドを含む凍結乾燥粉末の作製方法
本開示は、ＦＩＸポリペプチドを含む凍結乾燥粉末の作製方法を提供する。一態様では、本開示は、本明細書に記載される凍結乾燥前製剤を凍結乾燥させることを含む凍結乾燥法を提供する。別の態様では、本開示は、単一の乾燥工程を含む凍結乾燥法を提供する。
【０１３３】
一態様では、本開示は、
（ａ）ＦＩＸポリペプチド及び水性溶媒を含む凍結乾燥前製剤を凍結させることを含む「凍結工程」、
（ｂ）凍結された凍結乾燥前製剤から水性溶媒を除去するのに有効な量だけ、凍結された凍結乾燥前製剤の圧力を低減させることを含む「真空工程」、ならびに
（ｃ）崩壊温度を超えて、凍結された凍結乾燥前製剤の温度を増加させて、それにより凍結乾燥粉末を作製することを含む単一の「乾燥工程」、
を含む、ＦＩＸポリペプチドを凍結乾燥させる方法を提供する。別の態様では、凍結乾燥プロセス時間は、標準方法、例えば、２つ以上の乾燥工程を有する凍結乾燥プロセスと比較して低減する。
【０１３４】
他の態様では、本発明の方法により作製される凍結乾燥粉末（ｌｙｏｐｈｉｌａｔｅ  ｐｏｗｅｒ）は、次の：（１）ＦＩＸポリペプチドの安定性が改善されること、（２）再構成時間が低減すること、（３）製剤を含む、栓への飛散の低減、または（４）室温での凍結乾燥粉末の貯蔵寿命が増加すること、のうち１つ以上の特徴を有する。
【０１３５】
特定の実施形態では、崩壊温度は、−１．５℃である。
【０１３６】
特定の実施形態では、凍結乾燥前製剤は、凍結工程中に、約−６５〜約−４０℃、約−６５〜約−４５℃、約−６５〜約−５５℃、約−６０〜約−４０℃、約−６０〜約−５０℃、または約−６０〜約−５５℃の凍結温度で凍結される。特定の実施形態では、凍結乾燥前製剤は、凍結工程中に、約−５５℃の凍結温度で凍結される。特定の実施形態では、凍結温度は、凍結工程中に、約５℃から約−５５℃まで低下する。
【０１３７】
特定の実施形態では、凍結温度は、凍結工程中に、約３０分〜約５時間、約１時間〜約５時間、約１．５時間〜約５時間、約１．５時間〜約４時間、約１．５時間〜約３時間、または約１．５時間〜約２．５時間保持する。特定の実施形態では、凍結温度は、凍結工程中に、約２時間保持される。
【０１３８】
特定の実施形態では、工程（ａ）の凍結された凍結乾燥前製剤は、「真空工程」（ｂ）の前に、「アニーリング工程」（ａ′）にさらにかける。特定の実施形態では、工程（ａ）の凍結された凍結乾燥前製剤の温度は、アニーリング工程中に、約−１５℃〜約−２℃のアニーリング温度まで上昇する。特定の実施形態では、工程（ａ）の凍結された凍結乾燥前製剤の温度は、アニーリング工程中に、約−６℃のアニーリング温度まで上昇する。
【０１３９】
特定の実施形態では、アニーリング温度は、アニーリング工程中に、約２時間〜約４時間保持される。特定の実施形態では、アニーリング温度は、アニーリング工程中に、約３０分〜約５時間、約１時間〜約５時間、約２時間〜約５時間、約２時間〜約４時間、または約２．５時間〜約３．５時間保持される。特定の実施形態では、アニーリング温度は、アニーリング工程中に、約３時間保持される。
【０１４０】
特定の実施形態では、凍結された凍結乾燥前製剤の温度は、アニーリング工程中に、アニーリング温度から約−６５℃〜約−４０℃の温度まで低下する。特定の実施形態では、凍結された凍結乾燥前製剤の温度は、アニーリング工程中に、アニーリング温度から−５５℃の温度まで低下する。
【０１４１】
特定の実施形態では、「真空工程」は、凍結された凍結乾燥前製剤を、約０．０５と約１ｍｂａｒとの間、約０．０５と約０．５０ｍｂａｒとの間、約０．１０と約０．５０ｍｂａｒとの間、約０．１５と約０．５０ｍｂａｒとの間、約０．２０と約０．５０ｍｂａｒとの間、または約０．２５と約０．５０ｍｂａｒとの間の真空にかけることを含む。特定の実施形態では、「真空工程」の真空は、約０．３３ｍｂａｒである。
【０１４２】
特定の実施形態では、真空は、約５時間、約４時間、約３時間、約２時間、または約１時間、「真空工程」に保持される。一部の実施形態では、真空は、約２時間、「真空工程」に保持される。
【０１４３】
特定の実施形態では、「乾燥工程」は、凍結された凍結乾燥前製剤の温度を、約−５５℃から約４０℃の乾燥温度まで上昇させることを含む。特定の実施形態では、乾燥温度は、少なくとも約３０℃、少なくとも約３２℃、少なくとも約３４℃、少なくとも約３５℃、少なくとも約３６℃、少なくとも約３８℃、少なくとも約３９℃、少なくとも約４０℃である。他の実施形態では、乾燥温度は、約３５℃、約４０℃、約３２℃、または約４５℃である。
【０１４４】
特定の実施形態では、乾燥工程は、約１０時間〜約４０時間、約１０時間〜約３０時間、または約２０時間〜約３０時間の乾燥温度を保持することをさらに含む。特定の実施形態では、乾燥温度は、約２５時間保持される。
【０１４５】
特定の実施形態では、乾燥工程は、約０．０５ｍｂａｒ〜約１ｍｂａｒ、約０．０５と約０．５０ｍｂａｒとの間、約０．１０と約０．５０ｍｂａｒとの間、約０．１５と約０．５０ｍｂａｒとの間、約０．２０と約０．５０ｍｂａｒとの間、または約０．２０ｍｂａｒ〜約０．４５ｍｂａｒの圧力で実施される。特定の実施形態では、圧力は、乾燥工程中に、約０．３３ｍｂａｒに保持される。ｍｂａｒの単位は、Ｔｏｒｒまたは他の任意の単位に変換できる。例えば、１ｍｂａｒは、０．７５００６３７５５４１９２１Ｔｏｒｒに変換できる。
【０１４６】
一態様では、本開示は、
（ａ）温度を、約−５５℃の凍結温度まで約２時間低下させ、約２時間凍結温度を保持することにより、ＦＩＸポリペプチドを含む凍結乾燥前製剤を凍結させることを含む「凍結工程」、
（ａ′）工程（ａ）の凍結された凍結乾燥前製剤の温度を、約−６℃のアニーリング温度まで約１．５時間上昇させ、約３時間アニーリング温度を保持し、温度を、約−５５℃まで約１．５時間低下させることを含む「アニーリング工程」、
（ｂ）工程（ａ′）の凍結された凍結乾燥前製剤を、常圧で２時間約−５５℃に保持し、圧力を、約０．３３ｍｂａｒまで約２時間低下させることを含む「真空工程」、及び
（ｃ）圧力を約０．３３ｍｂａｒに保持しながら、工程（ｂ）の凍結された凍結乾燥前製剤の温度を、約４０℃まで３時間上昇させ、圧力を約０．３３ｍｂａｒに保持しながら、凍結された凍結乾燥前製剤の温度を、約２５時間約４０℃に保持し、
それにより凍結乾燥粉末を作製することを含む単一の「乾燥工程」、を含む、ＦＩＸポリペプチドを含む凍結乾燥粉末を作製する方法を提供する。一部の実施形態では、凍結乾燥法は、より少ないサイクル時間を要する。
【０１４７】
特定の実施形態では、本明細書で記載される方法により作製された凍結乾燥粉末は、次の特徴：
（１）ＦＩＸポリペプチドの安定性が改善されること、
（２）再構成時間が低減すること、
（３）製剤を含む、栓への飛散の低減、
（４）室温での凍結乾燥粉末の貯蔵寿命が増加すること、または
（５）それらの任意の組み合わせ、
有する。
【０１４８】
一部の実施形態では、凍結乾燥サイクル期間は、約４．５日未満、約４日、約３．５日、約３日、約２．５日、または約２日とすることができる。他の実施形態では、凍結乾燥サイクル期間は、約３日以下である。特定の実施形態では、凍結乾燥法に使用される凍結乾燥前製剤の充填容量は、約５ｍＬ未満である。特定の実施形態では、充填容量は、約４ｍＬ、約３．５ｍＬ、約３．０ｍＬ、約２．９ｍＬ、約２．８ｍＬ、約２．７ｍＬ、約２．６５ｍＬ、約２．６ｍＬ、約２．５ｍＬ、約２．４ｍＬ、約２．３ｍＬ、約２．２ｍＬ、約２．１ｍＬ、または約２．０ｍＬである。一実施形態では、充填容量は、約２．６５ｍＬである。
【０１４９】
特定の実施形態では、凍結乾燥法により作製された凍結乾燥粉末の低減した再構成時間は、約１．５分未満、約１分未満、約５０秒未満、約４０秒未満、約３０秒未満、約２０秒未満、または約１０秒未満である。特定の実施形態では、凍結乾燥法により作製された凍結乾燥粉末の低減した再構成時間は、約３０秒未満である。
【０１５０】
特定の実施形態では、凍結乾燥法で使用される凍結乾燥前製剤の低減した凍結乾燥サイクル時間は、約４日以下、約３日以下、約２日以下、または約１日以下である。
【０１５１】
一部の実施形態では、凍結乾燥粉末は、約９０時間以下、約８０時間以下、約７０時間以下、約６０時間以下、約５０時間以下、約４５時間以下、約４０時間以下、または約３０時間以下で、凍結乾燥前製剤から作製される。特定の実施形態では、凍結乾燥粉末は、約４５時間以下で、凍結乾燥前製剤から作製される。
【０１５２】
特定の実施形態では、凍結乾燥粉末の残留水分は、約１．０％未満、約０．７％、約０．６％、約０．５％、約０．４％、または約０．３％である。一部の実施形態では、凍結乾燥粉末の残留水分は、約０．５％未満である。
【０１５３】
一態様では、本開示は、本明細書で記載される方法に従って、凍結乾燥前製剤を凍結乾燥させることを含む、ＦＩＸペプチドを含む凍結乾燥粉末を安定化させる方法を提供し、複数の乾燥工程を含む凍結乾燥法を使用することにより調製される凍結乾燥粉末に関して、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で測定される場合に、凍結乾燥粉末が安定化する。
【０１５４】
別の態様では、本開示は、本明細書で記載される方法に従って、凍結乾燥前製剤を凍結乾燥させることを含む、ＦＩＸポリペプチドを含む凍結乾燥粉末の貯蔵寿命を増加させる方法を提供し、複数の乾燥工程を含む凍結乾燥法を使用することにより調製される凍結乾燥粉末の貯蔵寿命に関して、ＳＥＣ及び／またはＦＩＸ凝固活性アッセイで測定した場合に、凍結乾燥粉末の貯蔵寿命が増加する。
【０１５５】
本開示はまた、本明細書で記載される方法に従って、凍結乾燥前製剤を凍結乾燥させることを含む、ＦＩＸポリペプチドを含む凍結乾燥粉末の再構成時間を減少させる方法を提供し、複数の乾燥工程を含む凍結乾燥法を使用することにより調製される凍結乾燥粉末の再構成時間に関して、凍結乾燥粉末の再構成時間が減少する。
【０１５６】
本開示は、本明細書で記載される方法に従って、凍結乾燥前製剤を凍結乾燥させることを含む、ＦＩＸポリペプチドを含む凍結乾燥粉末を作製する凍結乾燥プロセス時間を低減させる方法をさらに提供し、複数の乾燥工程を含む凍結乾燥法を使用して凍結乾燥粉末を作製する凍結乾燥プロセス時間に関して、凍結乾燥前製剤の凍結乾燥プロセス時間が低減する。
【０１５７】
これまで本発明を詳細に記載しているが、それは、次の実施例を参照することにより、より明確に理解されるであろう。これらの実施例は、例示のみを目的として本明細書に含まれ、本発明の限定とすることを意図するものではない。本明細書で言及される全ての特許及び刊行物は、参照により明示的に組み込まれる。
【実施例】
【０１５８】
実施例１：第ＩＸ因子−Ｆｃ薬物物質及び薬物製品組成物
ｒＦＩＸＦｃの説明
ｒＦＩＸＦｃは、ヒト免疫グロブリンＧ１（ｌｇＧ１）のＦｃドメインに共有結合されたヒト凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）からなる、長時間作用型の完全組み換え融合タンパク質である。ｒＦＩＸＦｃの第ＩＸ因子部分は、血漿由来の第ＩＸ因子のＴｈｒ１４８対立形質と同一である１次アミノ酸配列を有し、内因性の第ＩＸ因子に類似する構造的及び機能的特徴を有する。ｒＦＩＸＦｃのＦｃドメインは、ＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域を含有する。ｒＦＩＸＦｃは、ほぼ９８キロダルトンの分子量を有する８６９個のアミノ酸を含有する。
【０１５９】
ｒＦＩＸＦｃは、組み換えＤＮＡ技術により、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞株で産生され、次に精製される。
【０１６０】
ｒＦＩＸＦｃを含む本発明のｒＦＩＸＦｃ薬物製品製剤は、高濃度の薬物製品、例えば、４０００＋ＩＵ／バイアルの薬物製品、の強度の進歩を可能にすることができる。これは、以下の比較表１に示されるような薬物物質においてより高濃度のｒＦＩＸＦｃタンパク質を必要とする。本発明のｒＦＩＸＦｃ薬物製品製剤は、室温安定性の増加を可能にするために、２５０及び５００ＩＵ／バイアルの薬物製品の強度の貯蔵寿命を増加させることができる。開発データは、２５０及び５００ＩＵ／バイアルの薬物製品の強度は、標準薬物製品よりも、加速条件下で著しく安定であることを示唆する。
【０１６１】
本発明のｒＦＩＸＦｃ薬物製品製剤はまた、凍結乾燥時に、再構成時間を減少させることができる。標準薬物製品の再構成時間は、１〜２分の間で変動する。開発データは、ＬＣＭ薬物製品により、再構成時間が３０秒未満に低減することを示唆する。
【０１６２】
本発明のｒＦＩＸＦｃ薬物製品製剤はまた、凍結乾燥プロセス時間の低減を可能にできる。現在では、凍結乾燥サイクルは〜４．５日である。バイアル充填容量が小さいと、凍結乾燥サイクルは、より経済的な製造のために、〜３日以下におそらく低減できる。
【０１６３】
薬物物質（ＤＳ）
本発明のｒＦＩＸＦｃ製剤のための薬物物質は、標準薬物物質と同じ製剤賦形剤を使用することになる。より高い濃度は、薬物物質製造中の第２の限界濾過工程を使用して達成されることになる。表１を参照のこと。
【０１６４】
【表１】
2020063313.tif 000002
【０１６５】
薬物製品（ＤＰ）
上記の目的を達成するために、凍結乾燥前に、バイアルの充填容量を低減させるとともに、標準薬物製品の全ての構成成分（タンパク質及び賦形剤）の濃度を２倍にした薬物製品を計画した。これにより、上述の薬物製品性能パラメータを改善しながら、患者への全ての構成成分の用量が一定のままであることが確実になる。
【０１６６】
以下の表２〜４は、凍結乾燥原料の組成、乾燥凍結後のバイアル中の固体製品の含有量、及び再構成後の組成について詳述する。ｒＦＩＸＦｃタンパク質濃度の広い変動に注意することが重要である。第ＩＸ因子の各バッチが、ＩＵ／ｍｇで表すその活性において、わずかに異なるという事実により、原料は、測定された活性を使用して配合される。これにより、幅広いタンパク質濃度がもたらされ、薬物製品の異なる強度に追加されたこの変動により、以下に記載される範囲が与えられる。
【０１６７】
【表２】
2020063313.tif 000003
【０１６８】
【表３】
2020063313.tif 000004
【０１６９】
【表４】
2020063313.tif 000005
【０１７０】
実施例２：第２世代ｒＦＩＸＦｃ薬物製品のための凍結乾燥サイクルパラメータの開発
要旨
本研究の目標は、本発明のｒＦＩＸＦｃ薬物製品のための凍結乾燥サイクルの乾燥段階プロセスパラメータに関する範囲を評価することであった。
【０１７１】
本報告は、凍結乾燥プロセスパラメータ（乾燥棚温度、チャンバ真空レベル、及び乾燥時間）、ならびに乾燥中の製品温度への影響、結果として生じる残留水分、及び薬物製品の乾燥速度を評価する、統計的な実験計画法（ＤＯＥ）研究をまとめたものである。
【０１７２】
第２世代ｒＦＩＸＦｃ薬物製品の予備凍結乾燥サイクル計画実験は、製剤のほぼ−１．５℃の高い崩壊温度に起因して、別個の１次及び２次乾燥工程が必要でなかったことを実証した。プラシーボの凍結乾燥プロセス中の、残留水分濃度及び製品温度における、棚温度、真空レベル、及び乾燥時間の影響を評価するために、１２実験の実験計画法（ＤＯＥ）研究を開発した。データの分析は、１％未満の残留水分濃度を達成するために、乾燥段階中に、３０℃の最小棚温度が必要とされることを示す。分析はまた、２５時間より長い乾燥時間により、バイアル中の残留水分がさらに減少せず、チャンバ真空レベルが残留水分に小さい影響しか及ぼさないことを実証した。乾燥中の製品温度は、棚温度及びチャンバ真空レベルに著しく影響を受けるが、研究の乾燥条件が最も積極的（１０００ｍＴｏｒｒのチャンバ真空で４０℃棚温度）であると、崩壊温度よりも１０℃下回る製品温度がもたらされた。バイアルマスフローは主に、棚温度の関数であり、真空制御を維持するために、市販の凍結乾燥装置は、０．７ｇ／時間／バイアルの水分流速を処理できるようにする必要があるであろう。４０℃の棚温度、２５０ｍＴｏｒｒ（０．３３ｍｂａｒ）のチャンバ真空、及び２５時間の乾燥時間を使用して、＜０．５％の残留水分を有する製品を得るための凍結乾燥サイクルを提案した。
【０１７３】
導入
第２世代第ＩＸ因子Ｆｃ（ｒＦＩＸＦｃ−２Ｇ）薬物製品組成物を、加速貯蔵中のタンパク質の安定性の改善、再構成時間の改善、及び栓への飛散を低減させるための充填容量の低減が可能になるように計画した。再構成された製品が第１世代の組成物と同じになるように、充填容量を５．３ｍＬから２．６５ｍＬに低減し、製剤中のタンパク質及び賦形剤の濃度を２倍にすることにより、これを達成した。充填容量を低減させる別の利益は、乾燥凍結プロセス中の、除去する必要のある水の量の減少であった。
【０１７４】
新しい薬物製品計画は、薬物製品プロセスの再検証を必要とするので、凍結乾燥サイクルを再開発した。プラシーボ製剤の崩壊温度を、ほぼ−１．５℃として測定した。この温度は、使用されることになる凍結乾燥サイクルが、標準ｒＦＩＸＦｃ凍結乾燥プロセスために計画されたものよりも、短縮されることを可能にするであろう。製品は、４０℃を超える棚温度でさえ崩壊を経なかったので、別個の１次乾燥工程が必要とされないことが、最初の実験を通して決定された。標準薬物製品からの凍結プロファイルを使用して、真空が適用された後の１次乾燥温度への直接工程と組み合わされたサイクルを計画した。マンニトールが、固形物に結晶構造を提供して、活性バイアルと同じ外観になるので、プラシーボは、活性なｒＦＩＸＦｃ−２Ｇに対する良好な代用物である。非晶質糖はまた、タンパク質よりも乾燥させることが困難であり、それ故、結果として生じた残留水分がわずかに高く、プロセスに最悪の値を提供する。また、バイアルからタンパク質を除去すると、水蒸気に対する耐性が低減し、バイアルマスフローレートに対する最悪の場合の推定値が与えられる。
【０１７５】
凍結乾燥プロセスパラメータ（乾燥棚温度、チャンバ真空レベル、及び乾燥時間）、ならびに薬物製品の乾燥プロセス中の製品温度、結果として生じる残留水分、及び乾燥速度に及ぼす影響を評価するために、統計的な実験計画法（ＤＯＥ）研究を実施した。
【０１７６】
材料及び方法
本研究の目標は、第２世代ｒＦＩＸＦｃ薬物製品のための凍結乾燥サイクルの乾燥段階プロセスパラメータに関する範囲を評価することであった。ＪＭＰ９のＤＯＥ研究を計画するために使用される乾燥段階パラメータ及び範囲は、表５に示される。個々の実行パラメータの設定値を示す、結果として生じる１２実験のＤＯＥ計画は、表６に示される。
【０１７７】
【表５】
2020063313.tif 000006
【０１７８】
【表６】
2020063313.tif 000007
【０１７９】
研究の各凍結乾燥サイクルの場合、８０個の１０ｍＬのショットバイアル（Ｐ／Ｎ：６８０００３２０）を、残留水分の評価のために、最悪の場合の充填容量を与える、表７に示されるように２．７５ｍＬの第２世代ｒＦＩＸＦｃプラシーボで充填した。図１に示されるような各実験に対し、３つの熱電対を有する単一の棚に、充填されたバイアルを配置した。
【０１８０】
【表７】
2020063313.tif 000008
【０１８１】
使用された凍結乾燥サイクルは、表８に示されるサイクルの変形形態であった。凍結乾燥装置の棚の乾燥温度、乾燥工程時間、及び乾燥真空レベルを、表６に示される実験計画法の表に基づいて変動させた。ＳＰ  ＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓのＬｙｏｓｔａｒ  ＩＩを、各凍結乾燥サイクルに対し使用し、バイアルを中段の棚に配置した。
【０１８２】
【表８】
2020063313.tif 000009
【０１８３】
各凍結乾燥サイクルの後に、５つのバイアルを、隅及び中央の位置から選択し、手順ＴＤＭＰ−７４を使用して残留水分に関し測定し、棚全体で平均した。熱電対を使用して、Ｌｙｏｓｔａｒ  ＩＩのソフトウェアの流体圧力計での温度測定により、乾燥中の製品温度及びバイアルマスフローレートを測定した。第２世代ｒＦＩＸＦｃ凍結乾燥プロセスにおける乾燥パラメータの影響を評価するために、ＪＭＰ９ソフトウェアを使用して、これらのアウトプットを分析した。重要な変数を決定するために、ＪＭＰ段階的分析を実施し、次に、プロセスアウトプット（乾燥中の、残留水分、製品温度、及びマスフロー）がインプット変数にいかに対応するかを示す標準的な最小二乗効果スクリーニングアルゴリズムを使用して、これらの変数を分析した。
【０１８４】
結果及び考察（ＤＩＳＣＵＴＩＯＮ）
１２凍結乾燥実験の結果は、表９に示される。
【０１８５】
【表９】
2020063313.tif 000010
【０１８６】
１．残留水分における凍結乾燥サイクルパラメータの分析
２次乾燥中に、タンパク質よりも糖から残留水分を除去することが一般に困難であるので、薬物製品に対する最悪の場合の代用物として、ｒＦＩＸＦｃ−２Ｇプラシーボを使用した。ＤＯＥ分析の結果を示す、結果として生じる予測プロファイラは、図２に示される。いくつかの所見：棚温度が、薬物製品の残留水分に最も重要な影響があることが、明らかである。このことは、強固に結合した水を除去する２次乾燥が拡散及び吸着制御されたプロセスであるという事実に基づいて予想される。モデルは、３０℃よりも高い棚温度が１％より低い残留水分濃度を達成するのに必要とされることが、モデルにより高い信頼度で予測される。真空レベルは、結果として生じる残留水分に小さいが測定可能な影響を有するようにみえる。乾燥時間は、さらなる乾燥時間を追加しても、残留水分濃度が減少し続けない、２５時間で始まる収穫逓減点を示すようにみえる。このタイプの挙動は、棚温度により決定される平衡境界への動力学的アプローチに合致し、残留水分は、さらなる乾燥が不可能な漸近線に近づく。この残留水分ＤＯＥ分析に基づいて、乾燥棚温度は３０℃以上であるべきであり、乾燥時間は、２５時間以下に固定されるべきである。
【０１８７】
２．昇華中の製品温度の凍結乾燥サイクルパラメータの分析
ｒＦＩＸＦｃ−２Ｇ薬物製品プラシーボのフリーズドライ崩壊温度は、ほぼ−１．５℃として測定されている。実際に、これは、バルク水が凍結乾燥中にバイアルから除去される場合、製品温度がこの崩壊温度以下に維持される限り、薬物製品が、明解な固形物構造を維持することになることを意味する。棚温度及びチャンバ真空レベルの両方が、図３に示されるように、製品温度に著しい影響を及ぼしたことが、ＤＯＥ分析により判定された。チャンバ真空は、昇華中に、より高い製品温度がより高い圧力に変換する、最大の効果を有する。１０００ｍＴｏｒｒ（１．３３ｍＢａｒ）でさえ、最も高い測定された製品温度は、−１５．２℃であり、製品崩壊温度のほぼ１３℃下回った。棚温度はまた、製品温度に適度な効果を及ぼしたが、結果は真空効果よりも顕著でない。４０℃の棚温度及び１０００ｍＴｏｒｒのチャンバ真空レベルでさえ崩壊のリスクがほとんどなく、任意の実用的な凍結乾燥サイクル計画空間から崩壊の可能性が実質的に排除されることが、この分析により示される。
【０１８８】
３．昇華中のバイアルマスフローレートにおける凍結乾燥サイクルパラメータの分析
バイアルマスフローレート（ｄｍ／ｄｔ）は、昇華プロセス中に水がバイアルから除去されている速度の尺度である。高速乾燥は、凍結乾燥サイクルに必要とされる時間を低減するために望ましいが、水分があまりにも多いと、製造規模の凍結乾燥機の凝縮器に負担をかけ、製品チャンバの真空制御の低下がもたらされる可能性がある。プラシーボは、最悪の場合のバイアルマスフロー条件を表す。製剤中に存在するタンパク質がないので、固形物中の固形分のパーセンテージが最小化され、これにより、フリーズドライされた固形物からのマスフローに対する抵抗の低下がもたらされる。棚温度は、図４に示されるように、バイアルマスフローに著しい影響を及ぼし、温度を増加させると、より速い昇華が引き起こされる。チャンバ真空レベルは、ＤＯＥ分析モデルに含まれたが、ｐ値は０．１３６であり、これは９５％の信頼度で重要ではない。研究で最も高い測定されたｄｍ／ｄｔは、０．７ｇ／時間／バイアルであった。
【０１８９】
４．プラシーボＤＯＥ研究に基づく、提案された第２世代ｒＦＩＸＦｃ凍結乾燥サイクル
単一の乾燥工程を使用して、製品を崩壊温度以下に維持しながら、凍結乾燥サイクルに＜０．５％の残留水分目標を達成させるように計画することが可能であることが、プラシーボＤＯＥ研究からのデータにより示唆される。提案された凍結乾燥サイクルは、表１０に示され、提案されたｒＦＩＸＦｃ−２Ｇ凍結乾燥サイクルと類似の条件下のＤＯＥの実行８からのデータは、図５に示される。０．５％の残留水分目標は、第１世代ｒＦＩＸＦｃ薬物製品の強度シリーズの平均値であるので、これを選択した。この水分濃度は、製品が加速安定性中に水分を吸収する場合に、製品品質属性が影響を受けないように、緩衝装置を提供する。
【０１９０】
標準ｒＦＩＸＦｃ薬物製品凍結乾燥サイクルのために開発される場合、凍結乾燥サイクルの凍結及びアニーリング部分を使用し、別々の１次及び２次乾燥工程を、２５時間４０℃の棚温度及び２５０ｍＴｏｒｒの真空の単一の乾燥工程で置き換えている。
【０１９１】
【表１０】
2020063313.tif 000011
【０１９２】
結言
プラシーボの、残留水分、製品温度、及びバイアルマスフローレートにおける第２世代ｒＦＩＸＦｃ薬物製品凍結乾燥プロセスパラメータを評価する１２実験のＤＯＥ研究を完成させた。データの分析は、１％以下の残留水分濃度を達成するために、乾燥段階中に、３０℃の最小棚温度が必要とされることを示す。また、乾燥時間が２５時間より長くても、バイアル中の残留水分が著しく減少せず、真空レベルは、残留水分に小さい影響しか及ぼさないことが、分析により実証された。乾燥中の製品温度は、棚温度及びチャンバ真空レベルにより著しく影響を受ける。研究の条件が最も積極的（４０℃の棚温度、１０００ｍＴｏｒｒのチャンバ真空）であると、崩壊温度よりも１０℃より大きく下回る製品温度がもたらされた。
【０１９３】
４０℃の棚温度、２５０ｍＴｏｒｒ（０．３３ｍｂａｒ）のチャンバ真空、及び２５時間の乾燥時間を使用して、＜０．５％の残留水分を有する製品を得るための凍結乾燥サイクルを提案した。
【０１９４】
特定の実施形態の上述の説明は、本発明の一般的な概念から逸脱することなく、過度な実験を行うことなしに、他の者が当業者の技能の範囲内の知識を適用することによって、種々の用途のためにこのような特定の実施形態を容易に変更する、及び／または適応させることができる、本発明の一般的な性質を十分に明らかにするであろう。それ故、このような適応及び変更は、本明細書に提示される教示及びガイダンスに基づいて、開示される実施形態の均等物の意味及び範囲内にあることが意図される。本明細書の語法または用語は、限定ではなく、説明のためのものであることを理解すべきであり、その結果、本明細書の用語または語法は、当業者が教示及びガイダンスに照らして解釈すべきである。
【０１９５】
本発明の広がり及び範囲は、上記実施形態のいずれによっても限定されるべきでなく、次の特許請求の範囲及びそれらの均等物にのみ従って定義されるべきである。本発明の他の実施形態は、本明細書の考察及び本明細書で開示される本発明の実施から、当業者にとって明らかであろう。
【０１９６】
本明細書に記載される、全ての文献、記事、刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が、参照により組み込まれることが具体的及び個別的に示されるように、同程度に本明細書に参照により組み込まれる。
【０１９７】
本出願は、全体として参照により本明細書に組み込まれる、２０１４年３月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／９６９，８０１号に対する優先権を主張する。
（配列表）
【０１９８】
【表１１−１】
2020063313.tif 000012
【表１１−２】
2020063313.tif 000013
【表１１−３】
2020063313.tif 000014
【表１１−４】
2020063313.tif 000015
【表１１−５】
2020063313.tif 000016
【表１１−６】
2020063313.tif 000017
【０１９９】
【表１２】
2020063313.tif 000018
【０２００】
【表１３】
2020063313.tif 000019
【０２０１】
【表１４】
2020063313.tif 000020
【図１】
2020063313.tif 000021
【図２】
2020063313.tif 000022
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
2020063313000001.app
【外国語明細書】
2020063313000001.pdf