(57)【要約】      （修正有）【課題】黒穂病に対する抵抗性を示すサトウキビ属植物系統を高精度に選抜する方法の提供。【解決手段】サトウキビの染色体における特定の塩基配列を有する核酸領域からなる、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカー。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サトウキビの染色体における配列番号１に示す塩基配列及び配列番号６に示す塩基配列により挟まれる領域；配列番号１３５に示す塩基配列及び配列番号１４３に示す塩基配列により挟まれる領域；又は配列番号１４４若しくは１４５に示す塩基配列及び配列番号１５１に示す塩基配列により挟まれる領域から選ばれる連続する核酸領域からなる、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカー。
【請求項２】
上記核酸領域は、配列番号１〜６、１３５〜１４３及び１４４〜１５１からなる群から選ばれるいずれか１の塩基配列又は当該塩基配列の一部を含むことを特徴とする請求項１記載のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカー。
【請求項３】
上記核酸領域は、サトウキビの染色体における配列番号１若しくは２に示す塩基配列又は当該塩基配列の一部であることを特徴とする請求項１記載のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカー。
【請求項４】
上記核酸領域は、サトウキビの染色体における配列番号１３８〜１４０からなる群から選ばれる１つの塩基配列又は当該塩基配列の一部であることを特徴とする請求項１記載のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカー。
【請求項５】
上記核酸領域は、サトウキビの染色体における配列番号１４９若しくは１５１からなる群から選ばれる１つの塩基配列又は当該塩基配列の一部であることを特徴とする請求項１記載のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカー。
【請求項６】
上記核酸領域は、サトウキビの染色体における配列番号２９８、３０３、３０７、３１１及び３１６からなる群から選ばれる１つの塩基配列又は当該塩基配列の一部であることを特徴とする請求項１記載のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカー。
【請求項７】
少なくとも一方の親がサトウキビ植物である後代植物の染色体及び/又は当該親の染色体を抽出する工程と、上記で得られた染色体における上記請求項１〜６いずれか１項に記載のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーの存在・非存在を測定する工程とを含む、黒穂病抵抗性が向上したサトウキビ系統の製造方法。
【請求項８】
上記測定する工程では、上記サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーに対応するプローブを備えるDNAチップを使用することを特徴とする請求項７記載のサトウキビ系統の製造方法。
【請求項９】
上記後代植物は種子又は幼苗であり、当該種子又は幼苗から染色体を抽出することを特徴とする請求項７記載のサトウキビ系統の製造方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、黒穂病に対する抵抗性を示すサトウキビ属植物系統を選抜することができる黒穂病抵抗性関連マーカー及びその利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サトウキビは、砂糖の原料、酒類原料など、食用に栽培されている他、バイオ燃料原料としての利用を含む様々な産業分野で利用されている。このような状況下、所望の特性(例えば、糖含有量、生長力の増強、新芽形成能、耐病性及び虫害抵抗性、耐寒性、葉長の増大、葉面積の増大、茎長の増大など)を有するサトウキビ植物の新品種を開発するニーズがある。
【０００３】
一般に、植物品種・系統の識別として、特性データを比較する「特性比較」、同一条件で栽培し比較する「比較栽培」、DNAを解析する「DNA分析」の3つの方法がある。特性比較および比較栽培による系統識別は、栽培条件の違いによる精度低下や多大な工数が必要とされる長期間の圃場調査など多くの問題を抱える。特に、サトウキビは、イネやトウモロコシなど、他のイネ科作物と比べ植物体が極めて大きく、圃場調査による系統識別の実施が困難である。
【０００４】
また、特定の病害に対する抵抗性品種を識別するには、サトウキビを長期間栽培した後、病害原因微生物を接種する試験を行い、その後、病班等を観察することで抵抗性データを収集する。しかし、当該試験を行うには、外部環境に対する病害原因微生物の伝搬を確実に防止しなければならず、大規模専用温室や専用圃場、外部との隔離施設など設備が必要となる。さらに、サトウキビの新品種作出には、先ず、交配により数万種類の交配種子を作製し、そこから実生選抜、さらに優良な系統を段階的に選抜し、最終的に所望な特性を有する２〜３系統の新品種候補を得ることができる。このように、サトウキビの新品種作出には、非常に多くの系統を栽培・評価する必要があり、上述したような温室や圃場を準備して多大な手間をかける必要がある。
【０００５】
したがって、病害抵抗性を示すサトウキビ系統を、ゲノムに存在するマーカーを用いて識別する方法の開発が求められている。特に、サトウキビにおける新品種作出に際して、種々の特性について優れたマーカーが使用できれば、上述したようなサトウキビに特有の諸問題を回避でき、非常に有効なツールとなりうる。しかしながら、サトウキビ植物は、高次倍数性で染色体数が多いため（約100〜130）、マーカー技術開発が遅れている。サトウキビでは、USDAにおいてSSRマーカーを用いた遺伝子型決定に関する報告があるものの(非特許文献１)、マーカー数及び各マーカーからの多型数が少ないことに起因して精度が低く、適用範囲がアメリカ・オーストラリア品種に限られるため、日本国内および台湾・インドなどの主要品種および有用な遺伝資源の系統識別に利用できない。
【０００６】
また、非特許文献２は、マーカー数を増やし、各々のマーカーの特性関係を比較し、検証することでサトウキビにおける遺伝子地図を作成する可能性を示唆している。しかしながら、非特許文献２には、十分な数のマーカーが開示されておらず、目的とする特性に連鎖したマーカーも見つかっていない。
【０００７】
一方、病害抵抗性に関連するマーカーとしては、特許文献１に示すように、テンサイにおける黒根病抵抗性関連マーカーが知られている。また、特許文献２に示すように、トウモロコシにおいて、目的とする形質に連鎖したマーカーを利用して品種を選抜する技術が開示されている。
【０００８】
一方、サトウキビの黒穂病は、原因微生物の感染力が強く、一旦発病すると圃場全体に感染が拡大する。黒穂病に罹病したサトウキビは、製糖用原料として利用できないだけではなく枯死する。このため、黒穂病の発生は、次年度以降における大幅な減収を引き起こす。黒穂病の被害は、ブラジル、アメリカ、オーストラリア、中国、インドネシアなど28ヶ国以上で報告がある。黒穂病の防除方法には、植付時の殺菌処理があるが、初期生育時に効果が限定される。しがって、黒穂病の抵抗性を付与したサトウキビ品種の育成が求められている。
【０００９】
そして、特許文献３には、サトウキビにおける多数のマーカーを準備し、交雑後代系統における量的形質とマーカーとの連鎖解析によって見いだされた、黒穂病抵抗性に連鎖するマーカーが開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Maydica 48(2003),319-329 “Molecular genotyping of sugarcane clones with microsatellite DNA markers”
【非特許文献２】Nathalie Piperidis et al., Molecular Breeding, 2008, Vol 21, 233-247
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】WO 2007/125958
【特許文献２】特表2010-516236号公報
【特許文献３】WO 2012/147635
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、特許文献３に黒穂病抵抗性に連鎖するマーカーが開示されるものの、黒穂病抵抗性に対する関連性がより高い更に優れた黒穂病抵抗性マーカーが求められていた。そこで、本発明は、このような実情に鑑み、黒穂病抵抗性に対する関連性がより高い更に優れた黒穂病抵抗性マーカーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、特定のサトウキビ品種を用いて多数のマーカーを準備し、交雑後代系統における量的形質とマーカーとの連鎖解析によって、黒穂病抵抗性といった量的形質に強く連鎖するマーカーを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１４】
本発明は以下を包含する。
（１）サトウキビの染色体における配列番号１に示す塩基配列及び配列番号６に示す塩基配列により挟まれる領域；配列番号１３５に示す塩基配列及び配列番号１４３に示す塩基配列により挟まれる領域；又は配列番号１４４若しくは１４５に示す塩基配列及び配列番号１５１に示す塩基配列により挟まれる領域から選ばれる連続する核酸領域からなる、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカー。
（２）上記核酸領域は、配列番号１〜６、１３５〜１４３及び１４４〜１５１からなる群から選ばれるいずれか１の塩基配列又は当該塩基配列の一部を含むことを特徴とする（１）記載のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカー。
（３）上記核酸領域は、サトウキビの染色体における配列番号１若しくは２に示す塩基配列又は当該塩基配列の一部であることを特徴とする（１）記載のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカー。
（４）上記核酸領域は、サトウキビの染色体における配列番号１３８〜１４０からなる群から選ばれる１つの塩基配列又は当該塩基配列の一部であることを特徴とする（１）記載のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカー。
（５）上記核酸領域は、サトウキビの染色体における配列番号１４９若しくは１５１からなる群から選ばれる１つの塩基配列又は当該塩基配列の一部であることを特徴とする（１）記載のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカー。
（６）上記核酸領域は、サトウキビの染色体における配列番号２９８、３０３、３０７、３１１及び３１６からなる群から選ばれる１つの塩基配列又は当該塩基配列の一部であることを特徴とする（１）記載のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカー。
（７）少なくとも一方の親がサトウキビ植物である後代植物の染色体及び/又は当該親の染色体を抽出する工程と、上記で得られた染色体における上記（１）〜（６）いずれかに記載のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーの存在・非存在を測定する工程とを含む、黒穂病抵抗性が向上したサトウキビ系統の製造方法。
（８）上記測定する工程では、上記サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーに対応するプローブを備えるDNAチップを使用することを特徴とする（７）記載のサトウキビ系統の製造方法。
（９）上記後代植物は種子又は幼苗であり、当該種子又は幼苗から染色体を抽出することを特徴とする（７）記載のサトウキビ系統の製造方法。 
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、サトウキビにおける量的形質の中でも黒穂病抵抗性に連鎖する新規なサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを提供することができる。本発明に係るサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを利用することによって、サトウキビの交配系統における黒穂病抵抗性を検定することができる。これにより、黒穂病抵抗性が向上した特性を有するサトウキビ系統を非常に低コストに識別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】（Ａ）：「KY08−6023」と「JW90」とを交配して得られた後代について黒穂病罹病率を計算した結果、（Ｂ）：「KY08−6039」と「JW90」とを交配して得られた後代について黒穂病罹病率を計算した結果、（Ｃ）：「KY08−6041」と「JW90」とを交配して得られた後代について黒穂病罹病率を計算した結果を示す特性図である。
【図２】実施例１における黒穂病抵抗性に関するQTL解析の結果を示す特性図である。
【図３】各系統におけるAMP0121265のリード数を示す特性図である。
【図４】各系統におけるAMP0120752のリード数を示す特性図である。
【図５】各系統におけるAMP0035185のリード数を示す特性図である。
【図６】各系統におけるAMP0114852のリード数を示す特性図である。
【図７】各系統におけるAMP0089904のリード数を示す特性図である。
【図８】各系統におけるAMP0100370のリード数を示す特性図である。
【図９】実施例２における黒穂病抵抗性に関するQTL解析の結果を示す特性図である。
【図１０】各系統におけるAMP0014532のリード数を示す特性図である。
【図１１】各系統におけるAMP0043152のリード数を示す特性図である。
【図１２】各系統におけるAMP0069135のリード数を示す特性図である。
【図１３】各系統におけるAMP0032477のリード数を示す特性図である。
【図１４】各系統におけるAMP0018405のリード数を示す特性図である。
【図１５】各系統におけるAMP0002312のリード数を示す特性図である。
【図１６】各系統におけるAMP0007121のリード数を示す特性図である。
【図１７】各系統におけるAMP0090108のリード数を示す特性図である。
【図１８】各系統におけるAMP0015886のリード数を示す特性図である。
【図１９】「KY09−6092」及び「KY08−129」を交配した後代系統について黒穂病罹病率を計算した結果を示す特性図である。
【図２０】実施例３における黒穂病抵抗性に関するQTL解析の結果を示す特性図である。
【図２１】各系統におけるAMP0063683のリード数を示す特性図である。
【図２２】各系統におけるAMP0082090のリード数を示す特性図である。
【図２３】各系統におけるAMP0013802のリード数を示す特性図である。
【図２４】各系統におけるAMP0083204のリード数を示す特性図である。
【図２５】各系統におけるAMP0043774のリード数を示す特性図である。
【図２６】各系統におけるAMP0094596のリード数を示す特性図である。
【図２７】各系統におけるAMP0091501のリード数を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明に係るサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカー及びその利用方法、特にサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを用いたサトウキビ系統の製造方法について説明する。
【００１８】
＜サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカー＞
本発明に係るサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとは、サトウキビの染色体上に存在する特定の領域であり、サトウキビの黒穂病抵抗性といった形質の原因遺伝子（群）に連鎖して、サトウキビ黒穂病抵抗性という形質を判別できる機能を有する。すなわち、既知のサトウキビ系統を用いて得られた後代系統において、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーの存在・非存在を確認することで黒穂病抵抗性の向上という形質を有する系統であると判断することができる。なお、本発明において、黒穂病とは、Ustilago属の微生物が感染することに起因して病班が形成される病気を意味している。Ustilago属の微生物としては、一例としてUstilago scitamineaを挙げることができる。
【００１９】
また、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとは、黒穂病抵抗性が向上する形質の原因遺伝子（群）に連鎖するマーカーの意味である。例えば、特定のサトウキビ品種において、当該マーカーが存在していれば黒穂病抵抗性が向上した品種と判断できる。
【００２０】
ここで、サトウキビとは、イネ科サトウキビ属に属する植物を意味する。また、サトウキビとは、所謂、高貴種（学名：Saccharum officinarum）と野生種（学名：Saccharum spontaneum）、バルベリ種（Saccharum barberi）、シネンセ種（Saccharum sinense）、オフィシナルム種の祖先種であるロバスタム種（Saccharum robustum）のいずれも含むことを意味する。既知のサトウキビ品種・系統としては、特に限定されず、日本国内にて使用可能なあらゆる品種・系統、日本国外において使用されている品種・系統等を含む意味である。例えば、サトウキビ日本国内育成品種としては、特に限定されないが、Ni1、NiN2、NiF3、NiF4、NiF5、Ni6、NiN7、NiF8、Ni9、NiTn10、Ni11、Ni12、Ni14、Ni15、Ni16、Ni17、NiTn19、NiTn20、Ni22及びNi23等を挙げることができる。また、サトウキビ日本国内主要品種としては、特に限定されないが、NiF8、Ni9、NiTn10及びNi15等を挙げることができる。さらに、サトウキビ日本国内導入主要品種としては、特に限定されないが、F177、Nco310及びF172等を挙げることができる。さらに、サトウキビ品種・系統としては、特に病害抵抗性に優れた野生種、中でも黒穂病抵抗性に優れた野生種を挙げることができる。黒穂病抵抗性に優れた野生種としては、特に限定されないが、例えば、JW90、西表１５及び西表８等を挙げることができる。
【００２１】
また、後代系統は、母本及び父本の両方がサトウキビ品種・系統である同種交配による系統であっても良いし、いずれか一方がサトウキビ品種・系統であり他方が近縁のErianthus arundinaceusであるような交雑系統であっても良い。また、後代系統は、いわゆる戻し交配によって得られたものでも良い。特に、母本及び父本の両方又は一方が黒穂病抵抗性に優れた野生種、例えばJW90、西表１５又は西表８であることが好ましい。
【００２２】
＜サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーの例１＞
サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーは、サトウキビの染色体から独自に取得した31191個のマーカー（そのうち4503個がJW90由来）を基に作成した、JW90を由来とする86の連鎖群からなる遺伝子連鎖地図とサトウキビ黒穂病抵抗性データとを用いたQTL（Quantitative Trait Loci）解析によって新たに同定されたものである。なお、サトウキビ黒穂病抵抗性は、多数の遺伝子が関与していると考えられ、連続分布をとる量的形質である。すなわち、サトウキビ黒穂病抵抗性は、連続分布をとる黒穂病への罹患率に基づいて評価される。QTL解析には、遺伝解析ソフトQTL Cartographer（Wang S., C. J. Basten, and Z.-B. Zeng (2010). Windows QTL Cartographer 2.5. Department of Statistics, North Carolina State University, Raleigh, NC）を使用し、Composite interval mapping（CIM）法を適用している。
【００２３】
具体的に、上述したQTL解析により、ロッドスコア（LOD score）が所定の閾値（例えば2.5）以上となる上記遺伝子連鎖地図に含まれる領域、約8.4cM（センチモルガン）の領域を特定した。ここで、「モルガン（Ｍ）」は、染色体上の遺伝子間の距離を相対的に示した単位であり、交叉価をパーセントにした値である。サトウキビの染色体において、1cMは、約2000kbpに相当する。なお、このピーク位置又はその近傍には、黒穂病抵抗性を向上させる形質の原因遺伝子（群）が存在することが示唆される。
【００２４】
上記8.4cMの領域は、上記マーカーのうち表１に示す６種類のマーカーがこの順で含まれる領域であり、黒穂病抵抗性が向上する形質に連鎖する領域である。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
なお、表１において、連鎖群とは、QTL解析において特定された複数の連鎖群についてそれぞれ付された番号である。表１において近傍マーカーの欄に記載したマーカー名は、本発明で独自に取得したマーカーに付された名称である。
【００２７】
また、8.4cMの領域に含まれるピークは、配列番号１に示す塩基配列からなるマーカー（AMP0121265）に近接して存在している。
【００２８】
表１に示したマーカーが含まれる8.4cM領域から選ばれる連続した核酸領域を、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして使用することができる。ここで、核酸領域とは、サトウキビの染色体に存在する他の領域との同一性が９５％以下、好ましくは９０％以下、より好ましくは８０％以下、最も好ましくは７０％以下となるような塩基配列からなる領域を意味する。サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとなる核酸領域と他の領域との同一性が上記範囲であれば、定法に従って、当該核酸領域を特異的に検出することができる。ここで、同一性の値は、例えばＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出することができる。
【００２９】
サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとなる核酸領域の塩基長は、少なくとも８塩基長以上、好ましくは１５塩基長以上、より好ましくは２０塩基長以上、最も好ましくは３０塩基長とすることができる。サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとなる核酸領域の塩基長が上記範囲であれば、定法に従って、当該核酸領域を特異的に検出することができる。
【００３０】
サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとしては、上述した8.4cMの領域から選ばれる如何なる連続した核酸領域でもよい。なお、この8.4cMの領域の塩基配列については、配列番号１〜６の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いたインバースPCR等の隣接配列取得法によって特定することができる。
【００３１】
特に、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとしては、上述した8.4cMの領域のうち、配列番号１に示す塩基配列又は配列番号２に示す塩基配列と近接した領域から選ばれることが好ましい。上記ピークが配列番号１に示す塩基配列と近接して存在するためである。
【００３２】
また、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーは、上記６種類のマーカーそのもの又はその一部とすることができる。すなわち、これら６種類のマーカーのうち１種類以上のマーカーをサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして使用することができる。また、これら６種類のマーカーの部分領域をサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして使用することができる。
【００３３】
＜サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーの例２＞
サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーは、サトウキビの染色体から独自に取得した64757個のマーカー（そのうち1166個が西表１５を祖先に有する後代由来）を基に作成した、58の連鎖群からなる西表１５を祖先に有する後代を由来とする遺伝子連鎖地図とサトウキビ黒穂病抵抗性データとを用いたQTL（Quantitative Trait Loci）解析によって新たに同定されたものである。なお、サトウキビ黒穂病抵抗性は、多数の遺伝子が関与していると考えられ、連続分布をとる量的形質である。すなわち、サトウキビ黒穂病抵抗性は、連続分布をとる黒穂病への罹患率に基づいて評価される。QTL解析には、遺伝解析ソフトQTL Cartographer（Wang S., C. J. Basten, and Z.-B. Zeng (2010). Windows QTL Cartographer 2.5. Department of Statistics, North Carolina State University, Raleigh, NC）を使用し、Composite interval mapping（CIM）法を適用している。
【００３４】
具体的に、上述したQTL解析により、ロッドスコア（LOD score）が所定の閾値（例えば2.5）以上となる上記遺伝子連鎖地図に含まれる領域、約26.6cM（センチモルガン）の領域を特定した。ここで、「モルガン（Ｍ）」は、染色体上の遺伝子間の距離を相対的に示した単位であり、交叉価をパーセントにした値である。サトウキビの染色体において、1cMは、約2000kbpに相当する。なお、このピーク位置又はその近傍には、黒穂病抵抗性を向上させる形質の原因遺伝子（群）が存在することが示唆される。
【００３５】
上記26.6cMの領域は、上記マーカーのうち表２に示す９種類のマーカーがこの順で含まれる領域であり、黒穂病抵抗性が向上する形質に連鎖する領域である。
【００３６】
【表２】
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【００３７】
なお、表２において、連鎖群とは、QTL解析において特定された複数の連鎖群についてそれぞれ付された番号である。表２において近傍マーカーの欄に記載したマーカー名は、本発明で独自に取得したマーカーに付された名称である。
【００３８】
また、26.6cMの領域に含まれるピークは、配列番号１３８に示す塩基配列からなるマーカー（AMP0032477）及び配列番号１４０に示す塩基配列からなるマーカー（AMP002312）の間に位置し、特に配列番号１３９に示す塩基配列からなるマーカー（AMP0018405）に近接して存在している。
【００３９】
表２に示したマーカーが含まれる26.6cM領域から選ばれる連続した核酸領域を、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして使用することができる。ここで、核酸領域とは、サトウキビの染色体に存在する他の領域との同一性が９５％以下、好ましくは９０％以下、より好ましくは８０％以下、最も好ましくは７０％以下となるような塩基配列からなる領域を意味する。サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとなる核酸領域と他の領域との同一性が上記範囲であれば、定法に従って、当該核酸領域を特異的に検出することができる。ここで、同一性の値は、例えばＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出することができる。
【００４０】
サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとなる核酸領域の塩基長は、少なくとも８塩基長以上、好ましくは１５塩基長以上、より好ましくは２０塩基長以上、最も好ましくは３０塩基長とすることができる。サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとなる核酸領域の塩基長が上記範囲であれば、定法に従って、当該核酸領域を特異的に検出することができる。
【００４１】
サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとしては、上述した26.6cMの領域から選ばれる如何なる連続した核酸領域でもよい。なお、この26.6cMの領域の塩基配列については、配列番号１３５〜１４３の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いたインバースPCR等の隣接配列取得法によって特定することができる。
【００４２】
特に、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとしては、上述した26.6cMの領域のうち、配列番号１３８に示す塩基配列及び配列番号１４０に示す塩基配列に挟み込まれる領域から選ばれることが好ましい。さらに、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとしては、上述した26.6cMの領域のうち、配列番号１３９に示す塩基配列及び当該塩基配列に近接する塩基配列からなる領域から選ばれることが好ましい。上記ピークが配列番号１３８に示す塩基配列及び配列番号１４０に示す塩基配列に挟み込まれる領域であって、配列番号１３９に示す塩基配列と近接して存在するためである。
【００４３】
また、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーは、上記９種類のマーカーそのもの又はその一部とすることができる。すなわち、これら９種類のマーカーのうち１種類以上のマーカーをサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして使用することができる。また、これら９種類のマーカーの部分領域をサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして使用することができる。
【００４４】
＜サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーの例３＞
サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーは、サトウキビの染色体から独自に取得した57444個のマーカー（そのうち2936個が西表８を祖先に有する後代「KY09-6092」由来）を基に作成した、117の連鎖群からなる西表８を祖先に有する後代「KY09-6092」を由来とする遺伝子連鎖地図とサトウキビ黒穂病抵抗性データとを用いたQTL（Quantitative Trait Loci）解析によって新たに同定されたものである。
【００４５】
なお、サトウキビ黒穂病抵抗性は、多数の遺伝子が関与していると考えられ、連続分布をとる量的形質である。すなわち、サトウキビ黒穂病抵抗性は、連続分布をとる黒穂病への罹患率に基づいて評価される。QTL解析には、遺伝解析ソフトQTL Cartographer（Wang S., C. J. Basten, and Z.-B. Zeng (2010). Windows QTL Cartographer 2.5. Department of Statistics, North Carolina State University, Raleigh, NC）を使用し、Composite interval mapping（CIM）法を適用している。
【００４６】
具体的に、上述したQTL解析により、ロッドスコア（LOD score）が所定の閾値（例えば2.5）以上となる上記遺伝子連鎖地図に含まれる領域、約12.27cM領域（センチモルガン）の領域を特定した。ここで、「モルガン（Ｍ）」は、染色体上の遺伝子間の距離を相対的に示した単位であり、交叉価をパーセントにした値である。サトウキビの染色体において、1cMは、約2000kbpに相当する。なお、このピーク位置又はその近傍には、黒穂病抵抗性を向上させる形質の原因遺伝子（群）が存在することが示唆される。
【００４７】
上記12.27cMの領域は、上記マーカーのうち表３に示す７種類のマーカーがこの順で含まれる領域であり、黒穂病抵抗性が向上する形質に連鎖する領域である。
【００４８】
【表３】
2020065540.tif 000005
【００４９】
なお、表３において、連鎖群とは、QTL解析において特定された複数の連鎖群についてそれぞれ付された番号である。表３において近傍マーカーの欄に記載したマーカー名は、本発明で独自に取得したマーカーに付された名称である。表３に示したマーカーのうちAMP0063683は、配列番号１４４に示す塩基配列と配列番号１４５に示す塩基配列とを両端に含む核酸領域である。AMP0063683以外のマーカーは、それぞれ単一の塩基配列を含む核酸領域である。
【００５０】
また、12.27cMの領域に含まれるピークは、配列番号１５１に示す塩基配列からなるマーカー（AMP0091501）に近接して存在している。
【００５１】
表３に示したマーカーが含まれる12.27cM領域から選ばれる連続した核酸領域を、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして使用することができる。ここで、核酸領域とは、サトウキビの染色体に存在する他の領域との同一性が９５％以下、好ましくは９０％以下、より好ましくは８０％以下、最も好ましくは７０％以下となるような塩基配列からなる領域を意味する。サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとなる核酸領域と他の領域との同一性が上記範囲であれば、定法に従って、当該核酸領域を特異的に検出することができる。ここで、同一性の値は、例えばＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出することができる。
【００５２】
サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとなる核酸領域の塩基長は、少なくとも８塩基長以上、好ましくは１５塩基長以上、より好ましくは２０塩基長以上、最も好ましくは３０塩基長とすることができる。サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとなる核酸領域の塩基長が上記範囲であれば、定法に従って、当該核酸領域を特異的に検出することができる。
【００５３】
サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとしては、上述した12.27cMの領域から選ばれる如何なる連続した核酸領域でもよい。なお、この12.27cMの領域の塩基配列については、配列番号１４４〜１５１の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いたインバースPCR等の隣接配列取得法によって特定することができる。
【００５４】
特に、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとしては、上述した12.27cMの領域のうち、配列番号１５０に示す塩基配列及び配列番号１５１に示す塩基配列に挟み込まれる領域から選ばれることが好ましい。上記ピークが配列番号１５１に示す塩基配列と近接して存在するためである。
【００５５】
また、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーは、上記７種類のマーカーそのもの又はその一部とすることができる。すなわち、これら７種類のマーカーのうち１種類以上のマーカーをサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして使用することができる。また、これら７種類のマーカーの部分領域をサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして使用することができる。
【００５６】
ところで、表３に示したマーカーが含まれる12.27cM領域は、表１に示したマーカーが含まれる8.4cM領域と一部共通した部分領域を有している。詳細には、12.27cM領域に含まれるピーク近傍が、8.4cM領域に含まれるピーク近傍と塩基配列において共通している。具体的に、表１に示したJW90由来のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーのうち0cMに位置するAMP0121265を含む近傍領域と、表３に示した西表８由来のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーのうち83.76cMに位置するAMP0091501を含む近傍領域が共通した塩基配列を有している。したがって、この塩基配列が共通した領域は、サトウキビ黒穂病抵抗性を高める因子（例えば原因遺伝子）が存在する可能性が高い。よって、当該領域をサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして使用することがより好ましい。
【００５７】
＜サトウキビにおけるマーカーの同定＞
本発明では、上述したように、サトウキビの染色体から独自に取得した31191個のマーカー（そのうち4503個がJW90由来）、サトウキビの染色体から独自に取得した64757個のマーカー（そのうち1166個が西表１５を祖先に有する後代「KY08-6023, KY08-6039, KY08-6041」由来）及びサトウキビの染色体から独自に取得した57444個のマーカー（そのうち2936個が西表８を祖先に有する後代「KY09-6092」由来）からサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを特定した。ここでは、これら31191個のマーカー（そのうち4503個がJW90由来）、64757個のマーカー（そのうち1166個が西表１５を祖先に有する後代「KY08-6023, KY08-6039, KY08-6041」由来）及び57444個のマーカー（そのうち2936個が西表８を祖先に有する後代「KY09-6092」由来）について説明する。これらマーカーを同定する際には、国際公開WO 2018/003220に記載されたDNAライブラリーの作製方法に準じて作製した。
【００５８】
すなわち、任意の塩基配列を有するプライマー（以下、ランダムプライマー）を高濃度となるように調整した反応液で核酸増幅反応を行い、増幅した核酸断片をDNAライブラリーとするものである。ここで、高濃度とは、通常の核酸増幅反応におけるプライマー濃度と比較して高濃度であることを意味する。すなわち、本発明に係るDNAライブラリー作製方法は、通常の核酸増幅反応におけるプライマー濃度と比較して高濃度のランダムプライマーを使用することに特徴を有している。ここで、反応液に含まれる鋳型としては、DNAライブラリーを作製する対象の生物から調製したゲノムDNAを使用することができる。
【００５９】
ランダムプライマーとしては、その配列には何ら限定されず、例えば９〜３０塩基長のヌクレオチドを使用することができる。特に、ランダムプライマーとは、任意の配列を有する、９〜３０塩基長のヌクレオチドであって、ヌクレオチドの種類（配列の種類）は特に限定されず、１種類以上のヌクレオチド、好ましくは１〜１００００種類のヌクレオチド、より好ましくは１〜１０００種類のヌクレオチド、より好ましくは１〜１００種類のヌクレオチド、最も好ましくは１〜９６種類のヌクレオチドを意味する。ランダムプライマーとして上述の範囲のヌクレオチド（ヌクレオチド群）を使用することによって、より高い再現性で増幅核酸断片を得ることができる。なお、ランダムプライマーとして、複数のヌクレオチドを含む場合、全てのヌクレオチドが同じ塩基長（９〜３０塩基長）である必要はなく、異なる塩基長の複数のヌクレオチドを含んでいても良い。
【００６０】
通常、核酸増幅反応を用いて特定のアンプリコンを得るためには、当該アンプリコンに応じてプライマーの塩基配列を設計する。例えば、ゲノムDNA等の鋳型DNAにおけるアンプリコンに対応する位置を挟み込むように一対のプライマーを設計する。この場合、プライマーは、鋳型に含まれる特定の領域にハイブリダイズするように設計されるため「特異的プライマー」と呼称することができる。
【００６１】
これに対して、ランダムプライマーは、特定のアンプリコンを得る目的で設計されるプライマーとは異なり、鋳型DNAにおける特定の領域にハイブリダイズするように設計されるのではなく、ランダムなアンプリコンを得るために設計される。ランダムプライマーは、その塩基配列が如何なる配列であってもよく、鋳型DNAに含まれる相補的な領域に偶発的にハイブリダイズすることでランダムなアンプリコン増幅に関与できる。
【００６２】
すなわち、ランダムプライマーとは、上述のように、ランダムなアンプリコン増幅に関与する任意配列を有するヌクレオチドということができる。ここで任意配列とは、何ら限定されないが、例えば、アデニン、グアニン、シトシン及びチミンの群から無作為に選択された塩基配列として設計しても良いし、特定の塩基配列として設計しても良い。特定の塩基配列としては、例えば、制限酵素認識配列を含む塩基配列や、次世代シーケンサーに使用するアダプタ配列を有する塩基配列を挙げることができる。
【００６３】
ランダムプライマーとして複数種類のヌクレオチドを設計する場合、アデニン、グアニン、シトシン及びチミンの群から無作為に選択して所定の長さの塩基配列を複数設計する方法が適用できる。また、ランダムプライマーとして複数種類のヌクレオチドを設計する場合、特定の塩基配列からなる共通部分と、任意の塩基配列からなる非共通部分とからなる塩基配列を複数設計する方法も適用できる。ここで、非共通部分は、アデニン、グアニン、シトシン及びチミンの群から無作為に選択された塩基配列としても良いし、アデニン、グアニン、シトシン及びチミンからなる４種類の塩基の全ての組み合わせ、又はこれら全ての組み合わせから選ばれる一部の組み合わせとすることができる。共通部分は、特に限定されず如何なる塩基配列でもよいが、例えば、制限酵素認識配列を含む塩基配列や、次世代シーケンサーに使用するアダプタ配列を有する塩基配列、特定の遺伝子ファミリーに共通する塩基配列とすることができる。
【００６４】
複数のランダムプライマーとして、４種類の塩基から無作為に選択して所定の長さの塩基配列を複数設計する場合、全体の３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、更に好ましくは９０％以上が、７０％以下の同一性、好ましくは６０％以下の同一性、より好ましくは５０％以下の同一性、最も好ましくは４０％以下の同一性となるように設計することが好ましい。複数のランダムプライマーとして、４種類の塩基から無作為に選択して所定の長さの塩基配列を複数設計する場合であって、上述の範囲のヌクレオチドについて上記範囲の同一性となるように設計することで、対象生物種のゲノムDNA全体に亘って増幅断片を得ることができる。すなわち、増幅断片の均一性を高めることができる。
【００６５】
複数のランダムプライマーとして、特定の塩基配列からなる共通部分と、任意の塩基配列からなる非共通部分とからなる塩基配列を複数設計する場合、例えば、３’末端側の数塩基を非共通部分とし、残りの５’末端側を共通部分とするように設計することができる。３’末端側のｎ個の塩基を非共通部分とすれば、４ｎ種類のランダムプライマーを設計することができる。ここで、ｎ個としては、１〜５個とすることができ、好ましくは２〜４個、より好ましくは２〜３個である。
【００６６】
例えば、共通部分と非共通部分とからなるランダムプライマーとしては、５’末端側を次世代シーケンサーに使用するアダプタ配列（共通部分）とし、３’末端側を２塩基（非共通部分）とした、合計１６種類のランダムプライマーを設計することができる。なお、３’末端側を３塩基（非共通部分）とすれば、合計６４種類のランダムプライマーを設計することができる。ランダムプライマーの種類が多くなるほど、対象生物種のゲノムDNA全体に亘って増幅断片をより網羅的に得ることができる。したがって、共通部分と非共通部分とからなるランダムプライマーを設計する場合、３’末端側の塩基は３塩基とすることが好ましい。
【００６７】
ただし、例えば、共通部分と３塩基の非共通部分とからなる６４種類の塩基配列を設計した後、これら６４種類の塩基配列から選ばれる６３種類以下のランダムプライマーを使用してもよい。言い換えると、６４種類のランダムプライマーの全てを使用した場合と比較して、６３種類以下のランダムプライマーを使用した場合のほうが核酸増幅反応や、次世代シーケンサーを用いた解析において優れた結果を示す場合がある。
【００６８】
ランダムプライマーの濃度は、ランダムプライマーの塩基長に応じて適宜設定することが好ましい。ここで、ランダムプライマーの塩基長は、異なる塩基長の複数種類のヌクレオチドをランダムプライマーとして使用する場合には、その平均値（単純平均でもよいし、ヌクレオチド量を加味した加重平均でもよい）とすることができる。
【００６９】
具体的には、９〜３０塩基長のランダムプライマーを用い、当該ランダムプライマー濃度を４〜２００μＭとする条件、好ましくは４〜１００μＭとする条件で核酸増幅反応を行う。この条件であれば、核酸増幅反応により、高い再現性を達成しながら多数の増幅断片、特に１００〜５００塩基長の多数の増幅断片を得ることができる。
【００７０】
より具体的には、ランダムプライマーの濃度は、ランダムプライマーが９〜１０塩基長である場合、４０〜６０μＭとすることが好ましい。ランダムプライマーの濃度は、ランダムプライマーが１０〜１４塩基長である場合、ランダムプライマーの塩基長をｙとし、ランダムプライマーの濃度をｘとしたときに、ｙ＞３Ｅ＋０８ｘ−６．９７４且つ１００μＭ以下を満たすことが好ましい。ランダムプライマーの濃度は、ランダムプライマーが１４〜１８塩基長の場合、４〜１００μＭとすることが好ましい。ランダムプライマーの濃度は、ランダムプライマーが１８〜２８塩基長の場合、４μＭ以上であり、且つｙ＜８Ｅ＋０８ｘ−５．５３３を満たすことが好ましい。ランダムプライマーの濃度は、ランダムプライマーが２８〜２９塩基長の場合、６〜１０μＭとすることが好ましい。ランダムプライマーの濃度を、ランダムプライマーの塩基長に応じて上記のように設定することで、高い再現性を達成しながら多数の増幅断片をより確実に得ることができる。
【００７１】
なお、上述したｙ＞３Ｅ＋０８ｘ−６．９７４及びｙ＜８Ｅ＋０８ｘ−５．５３３の不等式は、国際公開WO 2018/003220で説明するように、ランダムプライマーの長さと濃度との関係を詳細に調べた結果、１００〜５００塩基長の多数のDNA断片を再現性良く増幅できる範囲として算出されたものである。
【００７２】
また、核酸増幅反応において鋳型となるゲノムDNAは、特に限定されないが、反応液の量を５０μｌとしたときに、０．１〜１０００ｎｇとすることが好ましく、１〜５００ｎｇとすることがより好ましく、５〜２００ｎｇとすることが更に好ましく、１０〜１００ｎｇとすることが最も好ましい。鋳型となるゲノムDNAの量をこの範囲とすることで、ランダムプライマーからの増幅反応が阻害されることなく、高い再現性を達成しながら多数の増幅断片を得ることができる。
【００７３】
以上の方法に従って、黒穂病抵抗性に優れたサトウキビからDNAライブラリーを作製し、また黒穂病感受性を示すサトウキビからDNAライブラリーを作製することができる。これらDNAライブラリーの塩基配列を次世代シーケンサーにより解析し、ライブラリーを構成する断片のリード数を比較することで、黒穂病抵抗性に優れたサトウキビから作製したDNAライブラリーに特有の断片を選択することができる。
【００７４】
より具体的に、本発明者らは、既知のサトウキビ品種「NiF8」にサトウキビ野生種「西表１５」を交配して得られた後代系統（3系統）に、サトウキビ野生種「JW90」を交配して得られた各後代系統（33系統、35系統及び35系統）について、上述したDNAライブラリーを作製する。そして、当該DNAライブラリーを次世代シーケンサーに供して得られたリード数データから遺伝子型データを取得し、この遺伝子型データを元にして、遺伝地図作成ソフトウェアAntMap（Iwata H, Ninomiya S (2006) AntMap: constructing genetic linkage maps using an ant colony optimization algorithm. Breed Sci 56: 371-377）を使用し、遺伝距離計算式Kosambiにより染色体におけるマーカーの位置情報を算出した。さらに、取得したマーカーの位置情報をもとに、Mapmaker/EXP ver.3.0（A Whitehead Institute for Biomedical Research Technical Report, Third Edition, January, 1993）により遺伝地図データシートを作成した。その結果、上述した配列番号１〜６に示した６種類のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを含む31191個のマーカーを同定している。また、DNAライブラリーを次世代シーケンサーに供してリード数データを取得する工程を２回繰り返すことで、より多くのリード数データを取得し、得られたリード数データから遺伝子型データを取得した。そして、同様にして、上述した配列番号１３５〜１４３に示した９種類のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを含む64757個のマーカーを同定している。
【００７５】
さらに、本発明者らは、既知のサトウキビ品種「NiF8」にサトウキビ野生種「西表８」を交配して得られた後代系統と、サトウキビ品種「NiTn18」と「NiTn24」を交配して得られた後代系統とから作製した154系統の後代系統について、上述したDNAライブラリーを作製している。そして、当該DNAライブラリーを次世代シーケンサーに供して得られたリード数データから遺伝子型データを取得し、この遺伝子型データを元にして、遺伝地図作成ソフトウェアAntMap（Iwata H, Ninomiya S (2006) AntMap: constructing genetic linkage maps using an ant colony optimization algorithm. Breed Sci 56: 371-377）を使用し、遺伝距離計算式Kosambiにより染色体におけるマーカーの位置情報を算出した。さらに、取得したマーカーの位置情報をもとに、Mapmaker/EXP ver.3.0（A Whitehead Institute for Biomedical Research Technical Report, Third Edition, January, 1993）により遺伝地図データシートを作成した。その結果、上述した配列番号１４４（及び１４５）〜１５１に示した７種類のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを含む57444個のマーカーを同定している。
【００７６】
また、配列番号１５１に示した塩基配列を有するサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを含む近傍領域と、配列番号１に示した塩基配列を有するサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを含む近傍領域とは、それぞれ独立して同定されたにも拘わらず、同一の塩基配列を有する複数のマーカーを含んでいる。
【００７７】
＜サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーの利用＞
サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを利用することで、後代系統等の黒穂病抵抗性の表現型が未知のサトウキビ系統について黒穂病抵抗性の向上という表現型を示す系統であるか判断することができる。サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして、上述した8.4cM領域に含まれる１つの核酸領域を利用しても良いし、上述した8.4cM領域に含まれる複数の核酸領域を利用しても良い。また、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして、上述した26.6cM領域に含まれる１つの核酸領域を利用しても良いし、上述した26.6cM領域に含まれる複数の核酸領域を利用しても良い。さらに、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして、上述した12.27cM領域に含まれる１つの核酸領域を利用しても良いし、上述した12.27cM領域に含まれる複数の核酸領域を利用しても良い。さらにまた、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして、上述した8.4cM領域に含まれる１つ又は複数の核酸領域、上述した26.6cM領域に含まれる１つ又は複数の核酸領域及び上述した12.27cM領域に含まれる１つ又は複数の核酸領域から選ばれる核酸領域を利用しても良い。ここで、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを利用するとは、当該マーカーを特異的に増幅するプライマー対を用いた核酸増幅反応を利用する形態、当該マーカーに対応するプローブを有するDNAマイクロアレイを利用する形態を含む意味である。
【００７８】
サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを特異的に増幅するプライマー対は、上述した8.4cM領域の塩基配列、上述した26.6cM領域の塩基配列及び上述した12.27cM領域の塩基配列に基づいて適宜、設計することができる。例えば、プライマー対は、上述した8.4cM領域、上述した26.6cM領域の塩基配列及び上述した12.27cM領域の塩基配列に含まれる、例えば1kbp以下の長さ、又は800bp以下の長さ、又は500bp以下の長さ、又は350bp以下の長さの領域を増幅するように設計することができる。或いは、プライマー対としては、配列番号１〜６、１３５〜１４３及び１４４（１４５）〜１５１のいずれかに示した塩基配列からなる核酸領域の全部又は一部を増幅するように設計することができる。当該核酸領域の一部としては、配列番号１〜６、１３５〜１４３及び１４４（１４５）〜１５１のいずれかに示した塩基配列に含まれる連続する１０塩基とすることができ、連続する２０塩基とすることができ、連続する４０塩基とすることができ、連続する８０塩基とすることができ、連続する１００塩基とすることができ、連続する１４０塩基とすることができる。
【００７９】
サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーに対応するプローブとは、上述のように定義されたサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーに対して、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを意味する。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、上述のように定義されたサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーの塩基配列又はその相補鎖の少なくとも連続する１０塩基、１５塩基、２０塩基、２５塩基、３０塩基、３５塩基、４０塩基、４５塩基、５０塩基又はそれ以上の塩基長の部分領域若しくは全領域として設計することができる。なお、このプローブは、担体に固定して使用することもできる。すなわち、ガラスやシリコーン等の平面基板を担体とするマイクロアレイや、マイクロビーズを担体とするビーズアレイ、或いは中空繊維の内壁にプローブを固定する３次元マイクロアレイ等の如何なるタイプのマイクロアレイであってもよい。
【００８０】
以上のように作製されたDNAマイクロアレイを使用することで、後代系統等に代表される黒穂病抵抗性の表現型が未知のサトウキビ系統について、黒穂病抵抗性の向上という表現型を示す系統であるか判断することができる。なお、上述したDNAマイクロアレイを使用する方法以外であっても、従来公知の手法を用いて上述したサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを検出して、黒穂病抵抗性の表現型が未知のサトウキビ系統について黒穂病抵抗性の向上という形質を有する系統であるか判断してもよい。
【００８１】
詳細には、先ず、供試サトウキビからゲノムDNAを抽出する。この供試サトウキビとは、後代系統等の黒穂病抵抗性の表現型が未知のサトウキビ系統及び/又は後代系統を作製する際に使用した親のサトウキビ系統のことであり、黒穂病抵抗性が向上する形質を有するか判定する対象となるサトウキビ系統である。なお、サトウキビ以外の植物、例えば、ソルガムやエリアンサスといったイネ科植物を供試植物とし、これら供試植物における黒穂病抵抗性を評価しても良い。
【００８２】
次に、抽出したゲノムDNAを鋳型として上述したプライマー対を用いた核酸増幅反応によりサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを増幅する。このとき、プライマーの一方に蛍光色素等の標識を付加することで、増幅したゲノムDNA断片に標識を付加することができる。標識としては、従来公知の如何なる物質を使用しても良い。標識としては、例えば蛍光分子、色素分子、放射性分子等を使用することができる。
【００８３】
次に、標識を有するゲノムDNA断片を所定の条件下でDNAマイクロアレイに接触させ、DNAマイクロアレイに固定されたプローブと標識を有するゲノムDNA断片とをハイブリダイズさせる。このとき、ハイブリダイズさせる際には高いストリンジェンシー条件とすることが好ましい。このような高いストリンジェンシー条件とすることによって、供試サトウキビにサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーが存在しているか否かを、より高精度に判定することができる。なお、ストリンジェンシー条件は、反応温度及び塩濃度で調節することができる。すなわち、より高温とすることでより高いストリンジェンシー条件となり、またより低い塩濃度でより高いストリンジェンシー条件となる。例えば、50〜75塩基長のプローブを使用する場合、ハイブリダイゼーション条件としては、40〜44℃、0.21SDS、6×SSCの条件とすることでより高いストリンジェンシー条件とすることができる。
【００８４】
また、プローブと標識を有するゲノムDNA断片とのハイブリダイズは、標識に基づいて検出することができる。すなわち、上述した標識を有するゲノムDNA断片とプローブのハイブリダイズ反応の後、未反応のゲノムDNA断片等を洗浄し、その後、プローブに対して特異的にハイブリダイズしたゲノムDNA断片の標識を観察する。例えば、標識が蛍光物質である場合にはその蛍光波長を検出し、標識が色素分子であればその色素波長を検出する。より具体的には、通常のDNAマイクロアレイ解析に使用している、蛍光検出装置やイメージアナライザー等の装置を使用することができる。
【００８５】
なお、上述のようにDNAマイクロアレイを使用する方法以外にも、供試サトウキビから抽出したゲノムDNAにおけるサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを検出することができる。例えば、供試サトウキビから抽出したゲノムDNAを鋳型として、次世代シーケンサーを用いてサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーのリード数を測定することでサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーが存在しているか否かを高精度に判定することができる。
【００８６】
以上のように、上述したDNAマイクロアレイや次世代シーケンサーを使用することにより、供試サトウキビが上述したサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを有するか否か判断することができる。ここで、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーは、黒穂病抵抗性が向上する形質に連鎖するマーカーである。したがって、供試サトウキビにおいて、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーが存在していれば、黒穂病抵抗性が向上した品種と判断できる。
【００８７】
特に、上述した方法では、供試サトウキビを実際の黒穂病抵抗性試験を実施可能な程度まで成長させる必要はなく、例えば後代系統の種子や当該種子を発芽させた幼苗を使用することができる。したがって、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを利用することによって、供試サトウキビを生育させるための圃場やその他、生育のためのコストを大幅に削減することができる。また、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを利用することによって、実際に黒穂病の原因微生物（Ustilago scitaminea）を感染させる必要がなく、大規模専用温室や専用圃場、外部との隔離施設など設備等にかかるコストを削減できる。
【００８８】
特に、サトウキビの新品種作出に際して、先ず、交配により数万種類の交配種を作製した後、実生選抜に先立って若しくは実生選抜に代えて、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを利用した判断を行うことが好ましい。これにより、実際の圃場において、優良な系統を栽培する数を大幅に削減することができ、サトウキビの新品種作出に係る手間やコストを大幅に抑制することができる。
【００８９】
或いは、サトウキビの新品種作出に際して、先ず、交配に使用する親品種におけるサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーの存在の有無を判定し、黒穂病抵抗性に優れた親品種を選抜することもできる。黒穂病抵抗性に優れた親品種を優先的に使用して後代系統を作出することで、黒穂病抵抗性に優れた後代系統が高頻度に出現すると期待できる。これにより、優良な系統を栽培する数を大幅に削減することができ、サトウキビの新品種作出に係る手間やコストを大幅に抑制することができる。
【実施例】
【００９０】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００９１】
〔実施例１〕
(1)材料
サトウキビ品種「NiF8」、サトウキビ野生種「西表１５」、「NiF8」に「西表１５」を交配した後代3系統「KY08−6023」、「KY08−6039」、「KY08−6041」、これら後代3系統にサトウキビ野生種「JW90」をそれぞれ交配した後代各33、35、35系統についてDNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN社）によりゲノムDNAを抽出、精製した。
【００９２】
(2)DNAライブラリーの作製
本実施例においてDNAライブラリーは、国際公開WO 2018/003220に記載されたDNAライブラリーの作製方法に準じて作製した。すなわち、上記(1)で取得したゲノムDNA15.0ngに最終濃度0.2mM dNTP mixture、0.625 unit Prime STAR DNA Polymerase（タカラバイオ社）に60μMランダムプライマーをそれぞれ加え、最終反応量25μlでPCRを行った。反応は98℃で2分後、98℃で10秒、50℃で15秒及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行い、最終的に4℃で保存した。
なお、本例で使用したランダムプライマーを表４にまとめた。
【００９３】
【表４】
2020065540.tif 000006
【００９４】
(3)次世代シーケンサー用のDNAライブラリーの作製
上記(2)の反応後の溶液1.5μlに最終濃度0.2 mM dNTP mixture、1.25 unit PrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ社）にプライマーセットをそれぞれ加え、最終反応量50μlでPCRを行った。反応条件は95℃で2分後、98℃で配列番号15秒、55℃で15秒及び72℃で20秒を1サイクルとして25サイクル行い、最終的に4℃で保存した。なお、本例では、「KY08-6023」、「KY08-6039」、「KY08-6041」に「JW90」を交配させた103系統用（各33、35、35系統）と、これら親及び祖父母系統（「NiF8」、「西表１５」、「KY08-6023」、「KY08-6039」、「KY08-6041」、「JW90」の6系統用（各2反復）について、合計115の組合せに関して表５に示したフォワードプライマー（配列番号１９〜１３３）と、リバースプライマー（5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCGCGCAGATCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’（配列番号１３４））のセットを利用した。
【００９５】
【表５】
2020065540.tif 000007
2020065540.tif 000008
2020065540.tif 000009
【００９６】
(4)精製及び電気泳動
上記(3)の反応後の溶液を1本のチューブに等量混合し、その内、50μlをMinElute PCR Purification Kit（QIAGEN社）により精製後、Agilent 2100 バイオアナライザー（Agilent Technology社）で電気泳動し、蛍光ユニット（Fluorescence Unit：FU）を得た。
【００９７】
(5)次世代シーケンサー解析
上記(3)で得られたDNAライブラリーをHiseq4000シーケンスシステム（イルミナ株式会社）により、リード長100塩基のペアエンド条件のもとで解析した。
【００９８】
(6)リードデータの解析
上記(5)で得られたリードデータから、解析ソフトウェアGRAS-Di（トヨタ自動車株式会社）を用いて解析し、31191個のマーカーの遺伝子型データを得た。
【００９９】
(7)遺伝地図の作成
上記(6)で得られたJW90由来の遺伝子型データをもとに、遺伝地図作成ソフトAntMap (Iwata H, Ninomiya S (2006) AntMap: constructing genetic linkage maps using an ant colony optimization algorithm. Breed Sci 56: 371-377)を用い、遺伝距離計算式Kosambiにより86の連鎖群からなる遺伝地図データを取得した。86の連鎖群にはJW90型に属する4503個のマーカーの遺伝子型データが含まれる。
【０１００】
(8)黒穂病検定試験データの取得
サトウキビ品種「NiF8」にサトウキビ野生種「西表１５」を交配した後代3系統「KY08−6023」、「KY08−6039」、「KY08−6041」、これら後代3系統にサトウキビ野生種「JW90」をそれぞれ交配した後代各33、35、35系統の茎を収穫し、2〜3日間、室温・高湿度条件下で催芽処理した後、黒穂病胞子の有傷接種を行った。有傷接種は、苗芽子両側に傷を付け（計6か所、深さ約4.0mm）、毛筆により胞子浮遊液（107〜108個・胞子/ml）を塗布した。有傷接種した苗は、2〜3日間、室温・高湿度条件下で培養し、育苗箱へ植付けた（40芽/箱、2箱/系統）。苗の植付け後、高湿度条件下、温室で栽培した。黒穂病罹病程度の調査は、罹病の兆候である鞭状物が頂部より露出した株数を計測し罹病株数とした。罹病株数の調査後、罹病株の植物体は、地際部より刈取り除去した。黒穂病の罹病率は、発芽株数（黒穂病以外の枯死株を除く）に対する罹病株数の割合（黒穂病罹病率）として算出した。「KY08−6023」と「JW90」とを交配して得られた後代について黒穂病罹病率を計算した結果を図１（Ａ）に示し、「KY08−6039」と「JW90」とを交配して得られた後代について黒穂病罹病率を計算した結果を図１（Ｂ）に示し、「KY08−6041」と「JW90」とを交配して得られた後代について黒穂病罹病率を計算した結果を図１（Ｃ）に示した。
【０１０１】
(9)量的形質（Quantitative Trait Loci）の解析
上記(7)で得られたJW90由来の遺伝地図データ及び(8)で得られた黒穂病検定試験データをもとに、遺伝解析ソフトQTL Cartographer (http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/cartographer.html)を使い、Composite interval mapping (CIM)法により、QTL解析を行った。LODの閾値は2.5を用いた。その結果、サトウキビ野生種「JW90」の第42連鎖群のマーカーAMP0121265からAMP0100370を含む約8.4cM領域にサトウキビ黒穂病に関連するQTLの存在を確認した（表６及び図２）。なお、効果の数字が負である場合、当該QTLは黒穂病抵抗性が向上する形質に連鎖することを意味する。
【０１０２】
【表６】
2020065540.tif 000010
【０１０３】
表６及び図２に示すように、本実施例で見いだした第42連鎖群のマーカーAMP0121265からAMP0100370の範囲は、国際公開 WO2012/147635に記載されたQTLに比して、LOD値が著しく高く、また効果が著しく向上することを確認できた。
【０１０４】
(10)黒穂病抵抗性選抜マーカーの選定
上記(9)で確認したサトウキビ黒穂病抵抗性QTL領域に含まれるマーカー（AMP0121265、AMP0120752、AMP0035185、AMP0114852、AMP0089904、AMP0100370）を選抜マーカーとして選定した(表７)。
【０１０５】
【表７】
2020065540.tif 000011
【０１０６】
各マーカーの遺伝子型、すなわち供試系統が上述した選抜マーカーを有するか否かは、それぞれのリード数の閾値を10とし、リード数が10以上である場合に“有”とし、リード数が10未満である場合に“無”として判別した(図３〜８、表８)。
【０１０７】
【表８】
2020065540.tif 000012
【０１０８】
表８及び図３〜８に示したように、黒穂病罹病率の低い供試系統は、黒穂病罹病率の高い供試系統と比較してこれらマーカー数が有意に高いことがわかる。これらの結果より、AMP0121265、AMP0120752、AMP0035185、AMP0114852、AMP0089904及びAMP0100370を含む約8.4cM領域から選ばれる連続する核酸領域を、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして利用できることが明らかとなった。
【０１０９】
〔実施例２〕
実施例１では、31191個のマーカーの遺伝子型データの内、JW90型に属する4503個の遺伝子型データに基づいてサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを同定した。本実施例では、西表１５型に属する遺伝子型データを収集し、同様にしてサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを同定した。
【０１１０】
本実施例では、西表１５型に属する遺伝子型データ数を増やすため、実施例１で作製したDNAライブラリーに対して、(5)次世代シーケンサー解析を２回繰り返した。このようにして得られたリードデータから、解析ソフトウェアGRAS-Di（トヨタ自動車株式会社）を用いて解析し、64757個のマーカーの遺伝子型データを得た。
【０１１１】
そして、西表１５型を祖先に有する後代「KY08-6023, KY08-6039, KY08-6041」由来の遺伝子型データをもとに、実施例１と同様にして、遺伝地図作成ソフトAntMap (Iwata H, Ninomiya S (2006) AntMap: constructing genetic linkage maps using an ant colony optimization algorithm. Breed Sci 56: 371-377)を用い、遺伝距離計算式Kosambiにより58の連鎖群からなる遺伝地図データを取得した。58の連鎖群には西表１５を祖先に有する後代「KY08-6023, KY08-6039, KY08-6041」型に属する4503個のマーカーの遺伝子型データが含まれる。
【０１１２】
このようにして得られた遺伝地図データ及び実施例１で得られた黒穂病検定試験データをもとに、遺伝解析ソフトQTL Cartographer (http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/cartographer.html)を使い、Composite interval mapping (CIM)法により、QTL解析を行った。LODの閾値は2.5を用いた。その結果、サトウキビ野生種「西表１５」の第15連鎖群のマーカーAMP0014532からAMP0015886の区間内にサトウキビ黒穂病に関連するQTLの存在を確認した（表９、図９）。なお、効果の数字が負である場合、当該QTLは黒穂病抵抗性が向上する形質に連鎖することを意味する。
【０１１３】
【表９】
2020065540.tif 000013
【０１１４】
表９及び図９に示すように、本実施例２で見いだした第15連鎖群のマーカーAMP0014532からAMP0015886の区間の範囲は、国際公開 WO2012/147635に記載されたQTLに比して、LOD値が著しく高く、また効果が著しく向上することを確認できた。本実施例では、このようにして確認したサトウキビ黒穂病抵抗性QTL領域に含まれるマーカー（AMP0014532、AMP0043152、AMP0069135、AMP0032477、AMP0018405、AMP0002312、AMP0007121、AMP0090108、AMP0015886）を選抜マーカーとして選定した(表１０)。
【０１１５】
【表１０】
2020065540.tif 000014
2020065540.tif 000015
【０１１６】
各マーカーの遺伝子型、すなわち供試系統が上述した選抜マーカーを有するか否かは、それぞれのリード数の閾値を10とし、それ以上を“有”、それ未満を“無”として判別した(図１０〜１８、表１１)。
【０１１７】
【表１１】
2020065540.tif 000016
【０１１８】
表１１及び図１０〜１８に示したように、黒穂病罹病率の低い供試系統は、黒穂病罹病率の高い供試系統と比較してこれらマーカー数が有意に高いことがわかる。これらの結果より、AMP0014532、AMP0043152、AMP0069135、AMP0032477、AMP0018405、AMP0002312、AMP0007121、AMP0090108、AMP0015886を含む約26.6cM領域から選ばれる連続する核酸領域を、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして利用できることが明らかとなった。
【０１１９】
〔実施例３〕
本実施例では、サトウキビ品種「NiF8」とサトウキビ野生種「西表８」を交配した後代「KY09−6092」、サトウキビ品種「NiTn18」とサトウキビ品種「NiN24」を交配した後代「KY08−129」、「KY09−6092」及び「KY08−129」を交配した後代154系統を使用した以外は実施例１と同様にして、サトウキビ野生種「西表８」由来のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを同定した。
本実施例では、次世代シーケンサー用のDNAライブラリーを作製するに際して表５に示したフォワードプライマーに代えて、表１２に示したフォワードプライマーを用いた以外は実施例１と同様な方法で得られたリードデータから、解析ソフトウェアGRAS-Di（トヨタ自動車株式会社）を用いて解析し、57444個のマーカーの遺伝子型データを得た。
【０１２０】
【表１２】
2020065540.tif 000017
2020065540.tif 000018
2020065540.tif 000019
【０１２１】
その内、KY09−6092に属する2936個の遺伝子型とKY08−129に属する1877個の遺伝子型とを得た。そして、「KY09-6092」由来の117の連鎖群からなる遺伝地図データと、「KY08-129」由来の123の連鎖群からなる遺伝地図データを取得した。また、「KY09−6092」及び「KY08−129」を交配した後代154系統について、実施例１と同様な条件で黒穂病検定試験データを取得し、黒穂病罹病率を計算した結果を図１９に示した。そして、これら遺伝地図データと黒穂病検定試験データをもとに、遺伝解析ソフトQTL Cartographer (http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/cartographer.html)を使い、Composite interval mapping (CIM)法により、QTL解析を行った。LODの閾値は2.5を用いた。
【０１２２】
その結果、「KY09-6092」の第8連鎖群のマーカーAMP0063683からAMP0091501を含む約12.27cM領域にサトウキビ黒穂病に関連するQTLの存在を確認した（表１３及び図２０）。なお、効果の数字が負である場合、当該QTLは黒穂病抵抗性が向上する形質に連鎖することを意味する。
【０１２３】
【表１３】
2020065540.tif 000020
【０１２４】
表１３及び図２０に示すように、本実施例で見いだした第8連鎖群のマーカーAMP0063683からAMP0091501の範囲は、国際公開 WO2012/147635に記載されたQTLに比して、LOD値が著しく高く、また効果が著しく向上することを確認できた。本実施例で確認したサトウキビ黒穂病抵抗性QTL領域に含まれるマーカー（AMP0063683、AMP0082090、AMP0013802、AMP0083204、AMP0043774、AMP0094596及びAMP0091501）を選抜マーカーとして選定した(表１４)。
【０１２５】
【表１４】
2020065540.tif 000021
【０１２６】
なお、表１４に示したマーカーのうちAMP0063683は、PCR産物の大きさが200bp以上のサイズのため、次世代シーケンサーで塩基配列が決定されたリード１（配列番号１４４）とリード２（配列番号１４５）を両端に含む核酸領域として定義される。
各マーカーの遺伝子型、すなわち供試系統が上述した選抜マーカーを有するか否かは、それぞれのリード数の閾値を10とし、リード数が10以上である場合に“有”とし、リード数が10未満である場合に“無”として判別した(図２１〜２７、表１５)。
【０１２７】
【表１５】
2020065540.tif 000022
【０１２８】
表１５及び図２１〜２７に示したように、黒穂病罹病率の低い供試系統は、黒穂病罹病率の高い供試系統と比較してこれらマーカー数が有意に高いことがわかる。これらの結果より、AMP0063683、AMP0082090、AMP0013802、AMP0083204、AMP0043774、AMP0094596及びAMP0091501を含む約12.27cM領域から選ばれる連続する核酸領域を、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして利用できることが明らかとなった。
【０１２９】
〔実施例４〕
本実施例では、実施例１で同定されたJW90由来のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを含む約8.4cM領域と、実施例３で同定された西表８由来のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを含む約12.27cM領域について塩基配列を比較した。その結果、実施例１で同定されたJW90由来のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーのうち0cMに位置するAMP0121265を含む近傍領域と、実施例３で同定された西表８由来のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーのうち83.76cMに位置するAMP0091501を含む近傍領域に同一の塩基配列を有するマーカーが複数含まれることが明らかとなった。
【０１３０】
実施例１で同定されたJW90由来のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーのうち0cMに位置するAMP0121265を含む近傍領域に含まれるマーカーを表１６にまとめた。実施例３で同定された西表８由来のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーのうち83.76cMに位置するAMP0091501を含む近傍領域に含まれるマーカーを表１７にまとめた。なお、表１６及び１７において、各マーカーに関する塩基配列情報の欄には、次世代シーケンサー解析により読み取れた一対のリードデータからコンティグ配列を導き出せる場合には、そのコンティグ配列の塩基配列を記載し、コンティグ配列を導き出せない場合には一対のリード配列（リード配列１及びリード配列２）を記載している。すなわち、表１６及び１７に示す各マーカーは、コンティグ配列の塩基配列で定義できるか、又はリード配列１の塩基配列及びリード配列２の塩基配列で定義できる。
【０１３１】
表１６に列挙したマーカーのうち、表１７に列挙したAMP0179276を含む近傍領域に含まれるマーカーと同一の塩基配列を有するものについて、「西表８由来のDNAマーカーの有無（）：西表8マーカーID」の欄に○及び同一の塩基配列を有する西表８由来マーカーのIDを記載した。同様に、表１７に列挙したマーカーのうち、表１６に列挙したAMP0121265を含む近傍領域に含まれるマーカーと同一の塩基配列を有するものについて、「JW90由来のDNAマーカーの有無（）：JW90マーカーID」の欄に○及び同一の塩基配列を有するJW90由来マーカーのIDを記載した。
【０１３２】
【表１６】
2020065540.tif 000023
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【０１３３】
【表１７】
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2020065540.tif 000031
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【０１３４】
表１６に示したように、JW90由来のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーのうち0cMに位置するAMP0121265を含む近傍領域に３６個のマーカーが含まれ、表１７に示したように、西表８由来のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーのうち83.76cMに位置するAMP0091501を含む近傍領域に１８個のマーカーが含まれていた。これらのうち、５個のマーカーが同一の塩基配列を有していることが判明した。この結果から、表１６に示した３６個のマーカーを含む領域と、表１７に示した１８個のマーカーを含む領域は、サトウキビ黒穂病に対する抵抗性に強く関連するQTLとして理解することができる。特に、本実施例で特定したサトウキビ黒穂病抵抗性のQTLは、JW90及び西表８の両者が有するため、特に限定されることなく広く様々なサトウキビ品種に存在するものと考えられる。
【０１３５】
特に、本実施例から、表１６に示した３６個のマーカー及び表１７に示した１８個のマーカーは、特に優れたサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして利用できることが示された。
【０１３６】
さらに、表１６に示した３６個のマーカー及び表１７に示した１８個のマーカーのうち、同一の塩基配列を有することが明らかとなった５個のマーカー（AMP0016471（配列番号２９８）＝AMP0020554（配列番号２４８）、AMP0036426（配列番号３０３）＝AMP0045000（配列番号２７０）、AMP0046626（配列番号３０７）＝AMP0057239（配列番号２７１）、AMP0052709（配列番号３１１）＝AMP0062853（配列番号２７３）、AMP0091501（配列番号３１６）＝AMP0111891（配列番号２９２））は、最も優れたサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして利用できることが示された。
【図１】
2020065540.tif 000033
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2020065540.tif 000037
【図６】
2020065540.tif 000038
【図７】
2020065540.tif 000039
【図８】
2020065540.tif 000040
【図９】
2020065540.tif 000041
【図１０】
2020065540.tif 000042
【図１１】
2020065540.tif 000043
【図１２】
2020065540.tif 000044
【図１３】
2020065540.tif 000045
【図１４】
2020065540.tif 000046
【図１５】
2020065540.tif 000047
【図１６】
2020065540.tif 000048
【図１７】
2020065540.tif 000049
【図１８】
2020065540.tif 000050
【図１９】
2020065540.tif 000051
【図２０】
2020065540.tif 000052
【図２１】
2020065540.tif 000053
【図２２】
2020065540.tif 000054
【図２３】
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【図２４】
2020065540.tif 000056
【図２５】
2020065540.tif 000057
【図２６】
2020065540.tif 000058
【図２７】
2020065540.tif 000059
【配列表】
2020065540000001.app