(57)【要約】【課題】ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼＦｃコンジュゲートを提供すること。【解決手段】本発明は、ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼとＦｃ領域とのコンジュゲートポリペプチド（ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲート）、例えばＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチド、これらを含む組成物、ならびに種々の状態を処置または診断するために、かかるコンジュゲートおよび組成物を使用する方法を提供する。本発明のＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、対応する未改変ＨＲＳポリペプチドと比較して改善された制御放出特性、安定性、半減期ならびに他の薬物動態学的および生物学的特性を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
図面に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法１１９（ｅ）の下、２０１３年３月１５日に出願された米国仮出願第６１／７８９，０１１号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
配列表に関する陳述
本出願に付随する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、ＡＴＹＲ＿１１６＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。このテキストファイルは、約３９９ＫＢであり、２０１４年３月１４日に作成し、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【０００３】
本発明は、一般に、１つまたは複数のヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＨＲＳ）ポリペプチド（複数可）および免疫グロブリンＦｃ領域（複数可）の融合ポリペプチドなどのコンジュゲート、これらを含む組成物、ならびに種々の状態を処置または診断するために、かかるポリペプチドおよび組成物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
Ｐｈｙｓｉｏｃｒｉｎｅは一般に、高等生物のアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＡＡＲＳ）遺伝子ファミリーにおいて見出される小さい天然に存在するタンパク質ドメインであり、タンパク質合成におけるアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの十分確立された役割には必要とされない。Ｐｈｙｓｉｏｃｒｉｎｅパラダイムが発見されるまで、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ、約２０種の酵素のファミリーは、全ての生細胞におけるその遍在性の発現、およびタンパク質合成のプロセスにおけるその重要な役割についてのみ知られていた。しかし、より最近の科学的知見は、現在、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼが、タンパク質合成を超えるさらなる役割を有しており、実際、多細胞生物において、組織生理学および疾患における重要な恒常性の役割を果たすように進化したことを示唆している。
【０００５】
ＡＡＲＳの非正準機能の存在の証拠には、単純な単細胞生物からより複雑な生命体への進化の間に、ＡＡＲＳが、タンパク質合成を促進する能力を喪失することなしに、付属されたドメインの付加を介して構造的により複雑になるように進化したことを確立する、十分に規定された配列比較が含まれる。
【０００６】
この仮説と一致して、ＡＡＲＳに関する拡張された機能の豊富かつ多様なセットが、高等真核生物、特にヒトのｔＲＮＡシンテターゼにおいて見出されてきた。個々のドメインの直接的分析、ならびに疾患に因果的に関連付けられているがアミノアシル化にもタンパク質合成活性にも影響を与えないｔＲＮＡシンテターゼの遺伝子における変異の発見の両方に基づくこのデータは、これらの新たに付属されたドメインまたはＰｈｙｓｉｏｃｒｉｎｅが、ＡＡＲＳの新たに獲得された非正準機能の中核をなすことを示唆している。
【０００７】
さらに、特異的ｔＲＮＡシンテターゼ、例えばヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＨＲＳ）が、生細胞から放出または分泌され得、免疫調節特性、走化性特性および血管新生特性を有する、重要な局所的に作用するシグナルを提供し得るという認識が増加している。特異的ｔＲＮＡシンテターゼの分泌および細胞外放出を示す研究、ならびに新たに付属されたドメイン（Ｐｈｙｓｉｏｃｒｉｎｅ）を含むｔＲＮＡシンテターゼの断片の付加が細胞外シグナル伝達経路の範囲において活性であるが、これらのドメインを欠く他の断片の付加はそうではないことの直接的実証を介して、細胞外シグナル伝達分子としてのＡＡＲＳの役割の直接的確認が得られている。これらのＰｈｙｓｉｏｃｒｉｎｅ、例えばＨＲＳは、ヒト疾患を処置するための治療タンパク質クラスの新たな第１位を開発する、以前には未開発の新たな機会を提示する。
【０００８】
治療設定または診断設定におけるこれらおよび他の活性を最良に利用するために、改善された薬物動態学的特性を有するＨＲＳポリペプチドが、当該分野において必要とされている。これらの改善された治療形態のＨＲＳポリペプチドは、種々の疾患および障害の処置のためのより有効な治療レジメンの開発を可能にし、未改変タンパク質よりも顕著に頻度の低い投与を必要とする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の実施形態は、それに共有結合した１つまたは複数の免疫グロブリンＦｃ領域を有するヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＨＲＳ）ポリペプチドコンジュゲート、かかる分子を含む医薬組成物、製造の方法、およびそれらの治療的使用のための方法に、一般に関する。他の利点の中で、本発明のＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、対応する非改変ＨＲＳポリペプチドと比較して、改善された薬物動態学的特性および／または改善された治療的に適切な生物学的活性を所有し得る。
【００１０】
従って、ある特定の実施形態は、配列番号１〜１０６、１７０〜１８１もしくは１８５〜１９１のいずれかに対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列または表Ｄ１、Ｄ３〜Ｄ６もしくはＤ８のいずれかの配列を含むＨＲＳポリペプチド、およびこのＨＲＳポリペプチドのＣ末端、Ｎ末端または両方に融合した少なくとも１つのＦｃ領域を含むＨＲＳ融合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドは、配列番号１〜１０６、１７０〜１８１もしくは１８５〜１９１のいずれかに対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列または表Ｄ１、Ｄ３〜Ｄ６もしくはＤ８のいずれかの配列を含むか、これらからなるか、または本質的にこれらからなる。特定の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドは、配列番号１〜１０６、１７０〜１８１もしくは１８５〜１９１のいずれか１つのアミノ酸配列または表Ｄ１、Ｄ３〜Ｄ６もしくはＤ８のいずれかの配列を含むか、これらからなるか、または本質的にこれらからなる。
【００１１】
特定の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基２〜４０、２〜４５、２〜５０、２〜５５、２〜６０、２〜６６もしくは１〜５０６、または配列番号１の残基２〜４０、２〜４５、２〜５０、２〜５５、２〜６０、２〜６６もしくは１〜５０６に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドは、最大約４０〜８０アミノ酸長であり、配列番号１の残基２〜４５を含む。具体的な実施形態では、このＨＲＳポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基２〜４０、２〜４５、２〜５０、２〜５５、２〜６０、２〜６６または１〜５０６からなるか、または本質的にこれらからなる。
【００１２】
一部の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドの少なくとも１つの内因性システイン残基は、別のアミノ酸で置換されているまたは欠失している。ある特定の実施形態では、この少なくとも１つの内因性システイン残基は、Ｃｙｓ１７４、Ｃｙｓ１９１、Ｃｙｓ２２４、Ｃｙｓ２３５、Ｃｙｓ５０７およびＣｙｓ５０９から選択される。特定の実施形態では、この少なくとも１つの内因性システイン残基は、Ｃｙｓ２２４、Ｃｙｓ２３５、Ｃｙｓ５０７およびＣｙｓ５０９から選択される。具体的な実施形態では、この内因性システイン残基は、Ｃｙｓ５０７およびＣｙｓ５０９である。一部の実施形態では、全ての内因性の表面曝露されたシステイン残基が、別のアミノ酸で置換されているまたは欠失している。
【００１３】
ある特定の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドは、タンデムに反復している。特定の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドは、ＷＨＥＰドメインを含む。具体的な実施形態では、このＨＲＳポリペプチドは、機能的アミノアシル化ドメインを欠く。一部の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドは、本質的にＷＨＥＰドメインからなる。具体的な態様では、ＨＲＳポリペプチドのＷＨＥＰドメインまたはそのバリアントもしくは断片は、表Ｄ５中のコンセンサス配列を有する。
【００１４】
一部の実施形態では、Ｆｃ領域およびＨＲＳポリペプチドは、ペプチドリンカーによって分離されている。ある特定の実施形態では、このペプチドリンカーは、約１〜２００アミノ酸長、１〜１５０アミノ酸長、１〜１００アミノ酸長、１〜９０アミノ酸長、１〜８０アミノ酸長、１〜７０アミノ酸長、１〜６０アミノ酸長、１〜５０アミノ酸長、１〜４０アミノ酸長、１〜３０アミノ酸長、１〜２０アミノ酸長、１〜１０アミノ酸長または１〜５アミノ酸長である。特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０または１００アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、このペプチドリンカーは、Ｇｌｙ残基および／またはＳｅｒ残基からなる。一部の実施形態では、このペプチドリンカーは、生理学的に安定なリンカーである。他の実施形態では、このペプチドリンカーは、放出可能なリンカー、任意選択で酵素的に切断可能なリンカーである。具体的な実施形態では、このペプチドリンカーは、配列番号２００〜２６０のいずれか１つの配列、または本明細書に記載される他のペプチドリンカーを含む。
【００１５】
一部の実施形態では、このＦｃ領域は、ＨＲＳポリペプチドのＣ末端に融合している。ある特定の実施形態では、このＦｃ領域は、ＨＲＳポリペプチドのＮ末端に融合している。
【００１６】
ある特定の実施形態では、このＦｃ領域は、哺乳動物ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４および／またはＩｇＭ由来のヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３および／またはＣＨ４ドメインのうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、このＦｃ領域は、ＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。一部の実施形態では、このＦｃ領域は、ＩｇＧ２のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。一部の実施形態では、このＦｃ領域は、ＩｇＧ３のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。特定の実施形態では、このＨＲＳ融合ポリペプチドは、免疫グロブリンのＣＨ１、ＣＬ、ＶＬおよびＶＨ領域を含まない。
【００１７】
具体的な実施形態では、このＦｃ領域は、配列番号１２８〜１６３もしくは３３９〜３４２のうちのいずれか１つ、またはそれらのバリアント、または断片、または組合せを含む。ある特定の実施形態では、このヒンジドメインは、配列番号３４１を含む改変されたＩｇＧ１ヒンジドメインである。
【００１８】
特定の実施形態では、このＦｃ領域は、ＭＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３３９）またはＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３４０）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。
【００１９】
ある特定の実施形態では、このＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）（配列番号３３７）、またはＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃ（配列番号３３８）、またはＦｃ−ＨＲＳ（２−４０）（配列番号３８１）、またはＨＲＳ（１−４０）−Ｆｃ（配列番号３８６）、またはＦｃ−ＨＲＳ（２−４５）（配列番号３８２）、またはＨＲＳ（１−４５）−Ｆｃ（配列番号３８７）、またはＦｃ−ＨＲＳ（２−５０）（配列番号３８３）、またはＨＲＳ（１−５０）−Ｆｃ（配列番号３８８）、またはＦｃ−ＨＲＳ（２−５５）（配列番号３８４）、またはＨＲＳ（１−５５）−Ｆｃ（配列番号３８９）、またはＦｃ−ＨＲＳ（２−６６）（配列番号３８５）、またはＨＲＳ（１−６６）−Ｆｃ（配列番号３９０）、またはＦｃ−ＨＲＳ（２−６０）ＨＲＳ（２−６０）（配列番号３９６）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。
【００２０】
ある特定の場合には、このＨＲＳ融合ポリペプチドは、対応するＨＲＳポリペプチドと比較して変更された薬物動態を有する。前記変更された薬物動態の例には、増加した血清半減期、増加したバイオアベイラビリティ、増加した曝露および／または減少したクリアランスが含まれる。ある特定の場合には、この曝露は、少なくとも１００倍増加する。一部の場合には、このＨＲＳ融合ポリペプチドは、マウスにおいて少なくとも３０時間の半減期を有する。ある特定の場合には、このバイオアベイラビリティは、少なくとも約３０％増加した皮下バイオアベイラビリティである。一部の場合には、このＨＲＳ融合ポリペプチドは、対応するＨＲＳポリペプチドと比較して変更された免疫エフェクター活性を有する。かかる免疫エフェクター活性の例には、補体活性化、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）のうちの１つまたは複数が含まれる。
【００２１】
ある特定の実施形態では、このＦｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と比較して、バリアントＦｃ領域を含む。一部の実施形態では、このバリアントＦｃ領域は、配列番号１２８〜１６３もしくは３４１のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一である配列、または前記配列の組合せを含む。ある特定の実施形態では、このバリアントＦｃ領域は、異なる種、異なるＩｇクラスまたは異なるＩｇサブクラス由来の１つまたは複数のＦｃ領域のハイブリッドを含む。特定の実施形態では、このバリアントＦｃ領域は、異なる種、異なるＩｇクラスおよび／または異なるＩｇサブクラス由来のＦｃ領域の１つまたは複数のヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３および／またはＣＨ４ドメインのハイブリッドを含む。
【００２２】
ある特定の実施形態では、このバリアントＦｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ領域と比較して改変されたグリコフォームである。特定の実施形態では、このバリアントＦｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ領域と比較して変更された薬物動態を有する。かかる変更された薬物動態の例には、血清半減期、バイオアベイラビリティおよび／またはクリアランスが含まれる。一部の実施形態では、このバリアントＦｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ領域と比較して変更されたエフェクター活性を有する。かかるエフェクター活性の例には、補体活性化、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）のうちの１つまたは複数が含まれる。
【００２３】
ある特定の実施形態では、このバリアントＦｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ領域と比較して、１つまたは複数のＦｃγ受容体に対する変更された結合を有する。例示的なＦｃγ受容体は、本明細書に記載され、当該分野で公知である。
【００２４】
ある特定の実施形態では、このバリアントＦｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ領域と比較して、１つまたは複数のＦｃＲｎ受容体に対する変更された結合を有する。例示的なＦｃＲｎ受容体は、本明細書に記載され、当該分野で公知である。
【００２５】
一部の実施形態では、このバリアントＦｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ領域と比較して変更された（例えば、増加した）溶解度を有し、このＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、対応する未改変ＨＲＳポリペプチドと比較して変更された溶解度を有する。
【００２６】
具体的な実施形態では、このＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、生理学的溶液中で、または他の生理学的条件下、例えばｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で、実質的にダイマー形態である。具体的な実施形態では、このＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、ＵＶ円偏光二色性分析を介して決定されるとおり、対応する未改変ＨＲＳポリペプチドまたは異なって改変されたＨＲＳポリペプチドと実質的に同じ二次構造を有する。
【００２７】
一部の実施形態では、このＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、哺乳動物に投与した場合に、対応する未改変ＨＲＳポリペプチドよりも少なくとも５倍大きい血漿または血清薬物動態学的ＡＵＣプロファイルを有する。
【００２８】
ある特定の実施形態では、このＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、抗炎症活性のアッセイにおいて、対応する未改変ＨＲＳポリペプチドまたは異なって改変されたＨＲＳポリペプチドと実質的に同じ活性を有する。
【００２９】
ある特定の実施形態では、このＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、抗炎症活性のアッセイにおいて、対応する未改変ＨＲＳポリペプチドまたは異なって改変されたＨＲＳポリペプチドの活性の２倍超の活性を有する。
【００３０】
ある特定の実施形態では、このＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で室温で７日間にわたる類似の条件下で比較した場合、対応する未改変ＨＲＳポリペプチドまたは異なって改変されたＨＲＳポリペプチドよりも少なくとも３０％高い安定性を有する。
【００３１】
ＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドの具体的な例は、配列番号１０７〜１１０もしくは３３７〜３３８もしくは３４９〜３５０もしくは３８１〜３９０もしくは３９６のうちの少なくとも１つ、または配列番号１０７〜１１０もしくは３３７〜３３８もしくは３４９〜３５０もしくは３８１〜３９０もしくは３９６に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％同一のアミノ酸配列を含み得る。配列番号１０７および３３８は、配列番号１の残基１〜６０への例示的なＣ末端Ｆｃ融合ポリペプチドのアミノ酸配列であり（ＨＲＳ（１−６０）＿Ｆｃ）；配列番号１０８および３３７は、配列番号１の残基１〜６０への例示的なＮ末端Ｆｃ融合ポリペプチドのアミノ酸配列であり（Ｆｃ＿ＨＲＳ（１−６０））；配列番号１０９は、配列番号１の残基１〜５０６への例示的なＣ末端Ｆｃ融合ポリペプチドのアミノ酸配列であり（ＨＲＳ（１−５０６）＿Ｆｃ）；配列番号１１０は、配列番号１の残基１〜５０６への例示的なＮ末端Ｆｃ融合ポリペプチドのアミノ酸配列である（Ｆｃ＿ＨＲＳ（１−５０６））。
【００３２】
一部の実施形態では、このＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、例えば、細胞ベースのアッセイにおいて、または被験体への投与の際に、抗炎症活性を有する。
【００３３】
本明細書に記載されるＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよび薬学的に許容されるまたは医薬品グレードの担体または賦形剤を含む組成物、例えば、医薬組成物または治療用組成物もまた含まれる。一部の組成物では、このポリペプチドは、少なくとも約９５％純粋であり、約５％未満が凝集している。一部の実施形態では、この組成物は、経口、皮下、鼻腔内、肺または非経口投与を介した送達のために製剤化されている。ある特定の実施形態では、この組成物は、リポソーム、ミセル、エマルションおよび細胞からなる群から選択される送達ビヒクルを含む。
【００３４】
一部の実施形態では、この組成物は、ａ）炎症性疾患もしくは自己免疫性疾患を処置する際、ｂ）自己免疫性疾患もしくは炎症性疾患と任意選択で関連する筋肉もしくは肺の炎症を低減させる際、ｃ）ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＨＲＳ）自己抗原に対する寛容を誘導する際、ｄ）ＨＲＳ自己抗原に対する自己免疫性応答に関与するＴ細胞のセットもしくはサブセットを排除する際、ｅ）被験体、任意選択で筋肉、肺および／もしくは皮膚組織における組織炎症を低減させる際、ｆ）筋ジストロフィーを処置する際、ｇ）横紋筋融解、筋消耗、悪液質、筋肉炎症もしくは筋肉傷害を処置する際、および／またはｈ）自己抗体と関連する疾患を処置する際の使用のためである。
【００３５】
３日間またはそれ超の投薬間隔を使用した場合、約３００ｐＭと約１，０００ｎＭとの間の、被験体の血漿におけるヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＨＲＳ）−Ｆｃ融合ポリペプチドの平均定常状態濃度を維持する投薬レジメンであって、本明細書に記載される治療用組成物またはＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドをこの被験体に投与するステップを含む、投薬レジメンもまた含まれる。
【００３６】
一部の実施形態は、それを必要とする被験体において、最小有効治療レベルを上回るヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＨＲＳ）−Ｆｃ融合ポリペプチドレベルを維持する方法であって、本明細書に記載される治療用組成物またはＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドをこの被験体に投与するステップを含む、方法を含む。
【００３７】
それを必要とする被験体において、炎症性または自己免疫性の疾患または状態を処置する方法であって、本明細書に記載される治療用組成物またはＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドをこの被験体に投与するステップを含む、方法もまた含まれる。
【００３８】
一部の実施形態は、それを必要とする被験体において、自己免疫性疾患または炎症性疾患と関連する筋肉または肺の炎症を低減させる方法であって、本明細書に記載される治療用組成物またはＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドをこの被験体に投与するステップを含む、方法を含む。
【００３９】
ある特定の実施形態は、それを必要とする被験体において、ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＨＲＳ）自己抗原に対する寛容を誘導する方法であって、本明細書に記載される治療用組成物またはＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドをこの被験体に投与するステップを含む、方法を含む。
【００４０】
一部の実施形態は、それを必要とする被験体において、ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＨＲＳ）自己抗原に対する自己免疫性応答に関与するＴ細胞のセットもしくはサブセットを排除する方法であって、本明細書に記載される治療用組成物またはＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドをこの被験体に投与するステップを含む、方法を含む。
【００４１】
それを必要とする被験体において、組織炎症を低減させる方法であって、本明細書に記載される治療用組成物またはＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドをこの被験体に投与するステップを含む、方法もまた含まれる。ある特定の実施形態では、この組織は、筋肉、腸、脳、肺および皮膚から選択される。
【００４２】
一部の実施形態は、それを必要とする被験体において、筋ジストロフィーを処置する方法であって、本明細書に記載される治療用組成物またはＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドをこの被験体に投与するステップを含む、方法を含む。特定の実施形態では、この筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー、肢帯筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、眼咽頭筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィーおよび先天性筋ジストロフィーから選択される。
【００４３】
ある特定の実施形態は、それを必要とする被験体において、横紋筋融解、筋消耗、悪液質、筋肉炎症または筋肉傷害を処置する方法であって、本明細書に記載される治療用組成物またはＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドをこの被験体に投与するステップを含む、方法を含む。
【００４４】
一部の実施形態は、自己抗体と関連する疾患を処置する方法であって、本明細書に記載される組成物またはＡＡＲＳ／ＨＲＳポリペプチドを、それを必要とする被験体に投与するステップを含む、方法を含む。一部の実施形態では、この疾患は、炎症性ミオパチー、多発性筋炎、皮膚筋炎および関連障害を含む炎症性ミオパチー、多発性筋炎−強皮症重複、封入体筋炎（ＩＢＭ）、抗シンテターゼ症候群、間質性肺疾患、関節炎、ならびにレイノー現象（Ｒｅｙｎａｕｄ’ｓ  ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）からなる群から選択される。一部の実施形態では、この組成物は、疾患症状の出現前に、被験体に投与される。一部の実施形態では、この自己抗体は、ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼに対して特異的である。一部の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドは、疾患特異的自己抗体によって認識される、ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼの少なくとも１つのエピトープを含む。一部の実施形態では、このエピトープは、被験体由来の血清中の抗体によって認識される免疫優性エピトープである。一部の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドは、ネイティブのヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼへの自己抗体の結合を遮断する。一部の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドは、自己反応性Ｔ細胞のクローン性のクローン除去を引き起こす。一部の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドは、自己免疫性応答に関与するＴ細胞の機能的不活性化を引き起こす。一部の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドの投与は、低減した筋肉または肺の炎症を生じる。一部の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドは、自己抗原に対する寛容を誘導する。
【００４５】
ある特定の実施形態では、この組成物は、経口、鼻腔内、肺、筋内または非経口投与を介した送達のために製剤化されている。
【００４６】
かかるポリヌクレオチドを含むベクターを含む、本明細書に記載されるＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートまたは融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド、ならびに前記ポリヌクレオチドおよび／またはベクターを含む宿主細胞もまた、含まれる。
【００４７】
一部の実施形態は、本明細書に記載されるＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドを製造する方法であって、ａ）宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２宿主細胞）を培養してＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドを発現させるステップであって、この宿主細胞は、調節エレメントに作動可能に連結した、本明細書に記載されるＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ステップ；およびｂ）この宿主細胞からＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドを単離するステップを含む、方法を含む。具体的な実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株は、Ｗ３１１０およびＵＴ５６００から選択される。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
（ａ）配列番号１〜１０６、１７０〜１８１もしくは１８５〜１９１のいずれかに対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列または表Ｄ１、Ｄ３〜Ｄ６もしくはＤ８のいずれかの配列を含むヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＨＲＳ）ポリペプチド、および（ｂ）前記ＨＲＳポリペプチドのＣ末端、Ｎ末端または両方に融合した少なくとも１つのＦｃ領域を含むＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目２）
前記ＨＲＳポリペプチドが、配列番号１〜１０６、１７０〜１８１もしくは１８５〜１９１のいずれかに対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列または表Ｄ１、Ｄ３〜Ｄ６もしくはＤ８のいずれかの配列を含む、項目１に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目３）
前記ＨＲＳポリペプチドが、配列番号１〜１０６、１７０〜１８１もしくは１８５〜１９１のいずれか１つのアミノ酸配列または表Ｄ１、Ｄ３〜Ｄ６もしくはＤ８のいずれかの配列を含む、項目１に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目４）
前記ＨＲＳポリペプチドが、配列番号１の残基２〜４０、２〜４５、２〜５０、２〜５５、２〜６０、２〜６６または１〜５０６に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目５）
前記ＨＲＳポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸残基２〜４０、２〜４５、２〜５０、２〜５５、２〜６０、２〜６６または１〜５０６を含む、項目４に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目６）
前記ＨＲＳポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸残基２〜４０、２〜４５、２〜５０、２〜５５、２〜６０、２〜６６または１〜５０６から本質的になる、項目５に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目７）
前記ＨＲＳポリペプチドが、配列番号１の残基２〜４０、２〜４５、２〜５０、２〜５５、２〜６０、２〜６６または１〜５０６からなる、項目６に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目８）
前記ＨＲＳポリペプチドが、最大約４０〜８０アミノ酸長であり、配列番号１の残基２〜４５を含む、項目１に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目９）
少なくとも１つの内因性システイン残基が、別のアミノ酸で置換されているまたは欠失している、項目１〜８のいずれかに記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目１０）
前記少なくとも１つの内因性システイン残基が、Ｃｙｓ１７４、Ｃｙｓ１９１、Ｃｙｓ２２４、Ｃｙｓ２３５、Ｃｙｓ５０７およびＣｙｓ５０９から選択される、項目９に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目１１）
前記少なくとも１つの内因性システイン残基が、Ｃｙｓ２２４、Ｃｙｓ２３５、Ｃｙｓ５０７およびＣｙｓ５０９から選択される、項目９に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目１２）
全ての内因性の表面曝露されたシステイン残基が、別のアミノ酸で置換されているまたは欠失している、項目１〜８のいずれかに記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目１３）
前記ＨＲＳポリペプチドが、タンデムに反復している、項目１〜１２のいずれかに記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目１４）
前記ＨＲＳポリペプチドが、表Ｄ５中の配列から選択される、項目１〜１３のいずれかに記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目１５）
前記ＨＲＳポリペプチドがＷＨＥＰドメインを含む、項目１〜１４のいずれか一項に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目１６）
前記Ｆｃ領域および前記ＨＲＳポリペプチドが、ペプチドリンカーによって分離されている、項目１〜１５のいずれか一項に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目１７）
前記ペプチドリンカーが、約１〜２０アミノ酸長、１〜１０アミノ酸長または１〜５アミノ酸長である、項目１６に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目１８）
前記ペプチドリンカーが、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸長である、項目１６に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目１９）
前記ペプチドリンカーが、Ｇｌｙ残基および／またはＳｅｒ残基からなる、項目１６〜１８のいずれか一項に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目２０）
前記ペプチドリンカーが、生理学的に安定なリンカーである、項目１６〜１８のいずれか一項に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目２１）
前記ペプチドリンカーが、放出可能なリンカー、任意選択で酵素的に切断可能なリンカーである、項目１６〜１８のいずれか一項に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目２２）
前記ペプチドリンカーが、配列番号２００〜２６０のいずれか１つの配列を含む、項目１６〜２１のいずれか一項に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目２３）
前記Ｆｃ領域が、前記ＨＲＳポリペプチドのＣ末端に融合している、項目１〜２２のいずれか一項に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目２４）
前記Ｆｃ領域が、前記ＨＲＳポリペプチドのＮ末端に融合している、項目１〜２２のいずれか一項に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目２５）
前記Ｆｃ領域が、哺乳動物ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４および／またはＩｇＭ由来のヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３および／またはＣＨ４ドメインのうちの１つまたは複数を含む、項目１〜２４のいずれか一項に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目２６）
前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む、項目１〜２４のいずれか一項に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目２７）
前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ２のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む、項目１〜２４のいずれか一項に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目２８）
前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ３のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む、項目１〜２４のいずれか一項に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目２９）
前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ２のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む、項目１〜
２４のいずれか一項に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目３０）
免疫グロブリンのＣＨ１、ＣＬ、ＶＬおよびＶＨ領域を含まない、項目１〜２９のいずれか一項に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目３１）
前記Ｆｃ領域が、配列番号１２８〜１６３もしくは３３９〜３４２のうちのいずれか１つ、またはそれらのバリアント、または断片、または組合せを含む、前記項目のいずれかに記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目３２）
前記ヒンジ領域が配列番号３４１を含む、前記項目のいずれかに記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目３３）
前記Ｆｃ領域が、ＭＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３３９）またはＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３４０）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、前記項目のいずれかに記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目３４）
前記ＨＲＳ融合ポリペプチドが、Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）（配列番号３３７）またはＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃ（配列番号３３８）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１〜３２のいずれかに記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目３５）
前記ＨＲＳ融合ポリペプチドが、Ｆｃ−ＨＲＳ（２−４０）（配列番号３８１）またはＨＲＳ（１−４０）−Ｆｃ（配列番号３８６）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１〜３２のいずれかに記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目３６）
前記ＨＲＳ融合ポリペプチドが、Ｆｃ−ＨＲＳ（２−４５）（配列番号３８２）またはＨＲＳ（１−４５）−Ｆｃ（配列番号３８７）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１〜３２のいずれかに記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目３７）
前記ＨＲＳ融合ポリペプチドが、Ｆｃ−ＨＲＳ（２−５０）（配列番号３８３）またはＨＲＳ（１−５０）−Ｆｃ（配列番号３８８）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１〜３２のいずれかに記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目３８）
前記ＨＲＳ融合ポリペプチドが、Ｆｃ−ＨＲＳ（２−５５）（配列番号３８４）またはＨＲＳ（１−５５）−Ｆｃ（配列番号３８９）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１〜３２のいずれかに記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目３９）
前記ＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドが、Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６６）（配列番号３８５）またはＨＲＳ（１−６６）−Ｆｃ（配列番号３９０）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１〜３２のいずれかに記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目４０）
前記ＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドが、Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）ＨＲＳ（２−６０）（配列番号３９６）に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１〜３２のいずれかに記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目４１）
対応する未改変ＨＲＳポリペプチドと比較して変更された薬物動態を有する、前記項目のいずれかに記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目４２）
前記変更された薬物動態が、増加した血清半減期、増加したバイオアベイラビリティ、曝露および／または減少したクリアランスである、項目４１に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目４３）
前記曝露が、少なくとも１００倍増加する、項目４２に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目４４）
前記ＨＲＳ融合ポリペプチドが、マウスにおいて少なくとも３０時間の半減期を有する、項目４２に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目４５）
前記バイオアベイラビリティが、少なくとも約３０％増加した皮下バイオアベイラビリティである、項目４２に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目４６）
対応するＨＲＳポリペプチドと比較して変更された免疫エフェクター活性を有する、前記項目のいずれかに記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目４７）
前記免疫エフェクター活性が、補体活性化、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）のうちの１つまたは複数である、項目３６に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目４８）
前記Ｆｃ領域が、野生型Ｆｃ領域と比較して、バリアントＦｃ領域を含む、前記項目のいずれかに記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目４９）
前記バリアントＦｃ領域が、配列番号１２８〜１６３もしくは３４１のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一である配列、または前記配列の組合せを含む、項目４８に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目５０）
前記バリアントＦｃ領域が、異なる種、異なるＩｇクラスまたは異なるＩｇサブクラス由来の１つまたは複数のＦｃ領域のハイブリッドを含む、項目４８または４９に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目５１）
前記バリアントＦｃ領域が、異なる種、異なるＩｇクラスおよび／または異なるＩｇサブクラス由来のＦｃ領域の１つまたは複数のヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３および／またはＣＨ４ドメインのハイブリッドを含む、項目４８〜５０のいずれか一項に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目５２）
前記バリアントＦｃ領域が、対応する野生型Ｆｃ領域と比較して改変されたグリコフォームである、項目４８〜５１のいずれか一項に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目５３）
前記バリアントＦｃ領域が、対応する野生型Ｆｃ領域と比較して変更された薬物動態を有する、項目４８〜５２のいずれか一項に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目５４）
前記変更された薬物動態が、血清半減期、バイオアベイラビリティおよび／またはクリアランスを含む、項目５３に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目５５）
前記バリアントＦｃ領域が、対応する野生型Ｆｃ領域と比較して変更されたエフェクター活性を有する、項目４８〜５４のいずれか一項に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目５６）
前記エフェクター活性が、補体活性化、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）のうちの１つまたは複数である、項目５５に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目５７）
前記バリアントＦｃ領域が、対応する野生型Ｆｃ領域と比較して、１つまたは複数のＦｃγ受容体に対する変更された結合を有する、項目４８〜５６のいずれか一項に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目５８）
前記バリアントＦｃ領域が、対応する野生型Ｆｃ領域と比較して、１つまたは複数のＦｃＲｎ受容体に対する変更された結合を有する、項目４８〜５６のいずれか一項に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目５９）
前記バリアントＦｃ領域が、対応する野生型Ｆｃ領域と比較して変更された溶解度を有する、項目４８〜５８のいずれか一項に記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目６０）
生理学的溶液中で実質的にダイマー形態である、前記項目のいずれかに記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目６１）
ＵＶ円偏光二色性分析を介して決定されるとおり、対応する未改変ＨＲＳポリペプチドと実質的に同じ二次構造を有する、前記項目のいずれかに記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目６２）
哺乳動物に投与した場合に、対応する未改変ＨＲＳポリペプチドよりも少なくとも５倍大きい血漿または血清薬物動態学的ＡＵＣプロファイルを有する、前記項目のいずれかに記載のＨＲＳ融合ポリペプチド。
（項目６３）
配列番号１０７〜１１０または３３７〜３３８または３４９〜３５０または３８１〜３９０または３９６のいずれか１つまたは複数に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＨＲＳ）−Ｆｃ融合ポリペプチド。
（項目６４）
抗炎症活性を有する、前記項目のいずれかに記載のヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＨＲＳ）−Ｆｃ融合ポリペプチド。
（項目６５）
ＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよび薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、治療用組成物。
（項目６６）
前記ポリペプチドが、少なくとも約９５％純粋であり、約５％未満が凝集している、項目６５に記載の治療用組成物。
（項目６７）
経口、皮下、鼻腔内、肺または非経口投与を介した送達のために製剤化されている、前記項目のいずれかに記載の治療用組成物。
（項目６８）
リポソーム、ミセル、エマルションおよび細胞からなる群から選択される送達ビヒクルを含む、前記項目のいずれかに記載の治療用組成物。
（項目６９）
ａ）炎症性疾患もしくは自己免疫性疾患を処置する際、ｂ）自己免疫性疾患もしくは炎症性疾患と任意選択で関連する筋肉もしくは肺の炎症を低減させる際、ｃ）ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＨＲＳ）自己抗原に対する寛容を誘導する際、ｄ）ＨＲＳ自己抗原に対する自己免疫性応答に関与するＴ細胞のセットもしくはサブセットを排除する際、ｅ）被験体、任意選択で筋肉、肺および／もしくは皮膚組織における組織炎症を低減させる際、ｆ）筋ジストロフィーを処置する際、ｇ）横紋筋融解、筋消耗、悪液質、筋肉炎症もしくは筋肉傷害を処置する際、および／またはｈ）自己抗体と関連する疾患を処置する際の使用のための、前記項目のいずれかに記載の治療用組成物。
（項目７０）
３日間またはそれ超の投薬間隔を使用した場合、約３００ｐＭと約１，０００ｎＭとの間の、被験体の血漿におけるヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＨＲＳ）−Ｆｃ融合ポリペプチドの平均定常状態濃度を維持する投薬レジメンであって、前記項目のいずれかに記載の治療用組成物またはＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドを前記被験体に投与するステップを含む、投薬レジメン。
（項目７１）
最小有効治療レベルを上回るヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＨＲＳ）−Ｆｃ融合ポリペプチドレベルの維持を必要とする被験体において、最小有効治療レベルを上回るヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＨＲＳ）−Ｆｃ融合ポリペプチドレベルを維持するための方法であって、前記項目のいずれかに記載の治療用組成物またはＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドを前記被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目７２）
炎症性または自己免疫性の疾患または状態の処置を必要とする被験体において、炎症性または自己免疫性の疾患または状態を処置するための方法であって、前記項目のいずれかに記載の治療用組成物またはＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドを前記被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目７３）
自己免疫性疾患または炎症性疾患と関連する筋肉または肺の炎症の低減を必要とする被験体において、自己免疫性疾患または炎症性疾患と関連する筋肉または肺の炎症を低減させる方法であって、前記項目のいずれかに記載の治療用組成物またはＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドを前記被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目７４）
ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＨＲＳ）自己抗原に対する寛容の誘導を必要とする被験体において、ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＨＲＳ）自己抗原に対する寛容を誘導する方法であって、前記項目のいずれかに記載の治療用組成物またはＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドを前記被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目７５）
ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＨＲＳ）自己抗原に対する自己免疫性応答に関与するＴ細胞のセットもしくはサブセットの排除を必要とする被験体において、ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＨＲＳ）自己抗原に対する自己免疫性応答に関与するＴ細胞のセットもしくはサブセットを排除するための方法であって、前記項目のいずれかに記載の治療用組成物またはＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドを前記被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目７６）
組織炎症の低減を必要とする被験体において、組織炎症を低減させる方法であって、前記項目のいずれかに記載の治療用組成物またはＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドを前記被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目７７）
前記組織が、筋肉、腸、脳、肺および皮膚から選択される、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
筋ジストロフィーの処置を必要とする被験体において、筋ジストロフィーを処置する方法であって、前記項目のいずれかに記載の治療用組成物またはＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドを前記被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目７９）
前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー、肢帯筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、眼咽頭筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィーおよび先天性筋ジストロフィーから選択される、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
横紋筋融解、筋消耗、悪液質、筋肉炎症または筋肉傷害の処置を必要とする被験体において、横紋筋融解、筋消耗、悪液質、筋肉炎症または筋肉傷害を処置する方法であって、前記項目のいずれかに記載の治療用組成物またはＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドを前記被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目８１）
前記組成物が、経口、鼻腔内、肺、筋内または非経口投与を介した送達のために製剤化されている、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目８２）
前記項目のいずれかに記載のＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
（項目８３）
項目８２に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
（項目８４）
項目８３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目８５）
前記項目のいずれかに記載のヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＨＲＳ）−Ｆｃ融合ポリペプチドを製造するための方法であって、ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２宿主細胞を培養してＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドを発現させるステップであって、前記宿主細胞は、調節エレメントに作動可能に連結した項目７７に記載のポリヌクレオチドを含む、ステップ；およびｂ）前記宿主細胞から前記ＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドを単離するステップを含む、方法。
（項目８６）
前記Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株が、Ｗ３１１０およびＵＴ５６００から選択される、項目８５に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、例示的な免疫グロブリンの構造的構成を示す図であり、抗体のクラスおよびサブクラスの概要を提供する。
【図２】図２は、ヒトＩｇＡ１（配列番号１５６）、ＩｇＡ２（配列番号１５７）、ＩｇＭ（配列番号１５８）、ＩｇＧ１（配列番号１５９）、ＩｇＧ２（配列番号１６０）、ＩｇＧ３（配列番号１６１）、ＩｇＧ４（配列番号１６２）およびＩｇＥ（配列番号１６３）由来のＦｃ領域のアラインメントを示す図である。Ｆｃαの二次構造が、配列の上に示される。キャレット（＾）およびアスタリスク（＊）は、結合表面のそれぞれ０〜４％および５〜１２％に寄与する残基を示す。
【図３】図３は、還元条件下および非還元条件下での、全長ＨＲＳおよびＨＲＳ（１−５０６）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。この結果は、ＨＲＳ（１−５０６）が、全長タンパク質と比較して、ジスルフィド媒介性の鎖間結合形成の形成を劇的に低減させることを示している。試料（１０μｇ）を、ＭＯＰＳ−ＳＤＳランニング緩衝液を使用して、４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上にロードした。
【図４】図４は、大腸炎のＴＮＢＳ誘導性のマウスモデルにおける例示的なＨＲＳ由来ポリペプチドの抗炎症特性を示す図である。研究を、１２匹のマウス／群で、雄性ＢＤＦ−１マウスに対して実施した。ＴＮＢＳおよびブデソニドは、５ｍｇ／ｋｇで水に添加した。ＨＲＳ（１−６０）（Ｒｅｓｏｋｉｎｅ、（ＨｉｓＲＳＮ４））を、１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇの濃度で、ＴＮＢＳ処置の３日前に開始する静脈内注射によって、毎日投与した。この図は、約８０時間にわたる、処置マウスおよび未処置マウスのパーセント（％）生存を示す。
【図５】図５Ａは、スタチンミオパチーモデルにおけるＨＲＳ（１−５０６）の治療有用性を評価するために使用した投薬レジメンを示す図である。処置投薬群は、ビヒクル（ｎ＝１１）、０．３ｍｐｋ  ＨＲＳ（１−５０６）（ｎ＝８）、１．０ｍｐｋ  ＨＲＳ（１−５０６）（ｎ＝８）、３．０ｍｐｋ  ＨＲＳ（１−５０６）（ｎ＝８）を含んだ。図５Ｂは、スタチン＋／−０．３ｍｇ／Ｋｇ、１．０ｍｇ／Ｋｇおよび３．０ｍｇ／ＫｇのＨＲＳ（１−５０６）での１５日間の処置後のトロポニンＣ測定の結果を示す図である。この図は、スタチン誘導性トロポニンＣ誘導を低減することにおけるＨＲＳ（１−５０６）の正の効果を示す。
【図６】図６Ａは、スタチン＋／−０．３ｍｇ／Ｋｇ、１．０ｍｇ／Ｋｇおよび３．０ｍｇ／ＫｇのＨＲＳ（１−５０６）での１２日間の処置後のＣＫ測定の結果を示す図である。図６Ｂは、１５日間の処置後の同じデータを示す。この図は、スタチン誘導性ＣＫレベルを低減することにおけるＨＲＳ（１−５０６）の正の効果を示す。
【図７】図７は、ビヒクル対照と比較した、スタチンでの１５日間の処置後の循環ＨＡＲＳのレベルを示す図である。この図は、スタチン（ｓｔａｉｎ）が細胞外ＨＡＲＳの放出を誘導することを示す。
【図８】図８は、スタチン＋／−０．３ｍｇ／Ｋｇ、１．０ｍｇ／Ｋｇおよび３．０ｍｇ／ＫｇのＨＲＳ（１−５０６）での１５日間の処置後の１０×拡大率での大腿屈筋切片の代表的Ｈ＆Ｅ画像を示す図である。
【図９】図９は、スタチン処置ラット大腿屈筋の遺伝子発現プロファイリングの結果を示す図である。このデータは、筋肉のマーカー、ならびに免疫細胞機能、炎症、代謝状況、組織回復、筋肉成長および萎縮症を追跡するために選択した１３７個の遺伝子の発現における変化を示す。遺伝子発現値を、参照遺伝子に対して標準化し、ビヒクル処置群に対する変化倍率として示した。
【図１０】図１０Ａは、スタチン処置ラット大腿屈筋の遺伝子発現プロファイリングの結果を示す図である。このデータは、ビヒクル処置動物と比較した、スタチン処置動物の遺伝子発現における相対的変化を比較するための、１３７個の遺伝子（図７と同様）の発現における変化を示す。図１０Ｂは、スタチン単独で処置した動物と比較した、ＨＲＳ（１−５０６）でも処置したスタチン処置動物の遺伝子発現における相対的変化を示す図である。
【図１１】図１１は、スタチン＋／−０．３ｍｇ／Ｋｇ、１．０ｍｇ／Ｋｇおよび３．０ｍｇ／ＫｇのＨＲＳ（１−５０６）での１５日間の処置後の、１０個の糖尿病／メタボリックシンドローム関連遺伝子のスタチン処置ラット大腿屈筋の遺伝子発現プロファイリングの結果を示す図である。
【図１２】図１２は、スタチン＋／−０．３ｍｇ／Ｋｇ、１．０ｍｇ／Ｋｇおよび３．０ｍｇ／ＫｇのＨＲＳ（１−５０６）での１５日間の処置後の、２６個の免疫細胞マーカー遺伝子のスタチン処置ラット大腿屈筋の遺伝子発現プロファイリングの結果を示す図である。
【図１３−１】図１３Ａ〜Ｄは、スタチン＋／−０．３ｍｇ／Ｋｇ、１．０ｍｇ／Ｋｇおよび３．０ｍｇ／ＫｇのＨＲＳ（１−５０６）での１５日間の処置後の、スタチン処置ラット大腿屈筋におけるＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ８ａおよびＣＤ８ｂ遺伝子の遺伝子発現プロファイリングの結果を示す図である。
【図１３−２】図１３Ａ〜Ｄは、スタチン＋／−０．３ｍｇ／Ｋｇ、１．０ｍｇ／Ｋｇおよび３．０ｍｇ／ＫｇのＨＲＳ（１−５０６）での１５日間の処置後の、スタチン処置ラット大腿屈筋におけるＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ８ａおよびＣＤ８ｂ遺伝子の遺伝子発現プロファイリングの結果を示す図である。
【図１４−１】図１４Ａ〜Ｃは、スタチン＋／−０．３ｍｇ／Ｋｇ、１．０ｍｇ／Ｋｇおよび３．０ｍｇ／ＫｇのＨＲＳ（１−５０６）での１５日間の処置後の、スタチン処置ラット大腿屈筋におけるＣＤ１８、ＣＣＲ５およびＣＤ４５Ｒ遺伝子の遺伝子発現プロファイリングの結果を示す図である。
【図１４−２】図１４Ａ〜Ｃは、スタチン＋／−０．３ｍｇ／Ｋｇ、１．０ｍｇ／Ｋｇおよび３．０ｍｇ／ＫｇのＨＲＳ（１−５０６）での１５日間の処置後の、スタチン処置ラット大腿屈筋におけるＣＤ１８、ＣＣＲ５およびＣＤ４５Ｒ遺伝子の遺伝子発現プロファイリングの結果を示す図である。
【図１５】図１５は、スタチン＋／−０．３ｍｇ／Ｋｇ、１．０ｍｇ／Ｋｇおよび３．０ｍｇ／ＫｇのＨＲＳ（１−５０６）での１５日間の処置後の、スタチン処置ラット大腿屈筋における１７個の炎症マーカー遺伝子の遺伝子発現プロファイリングの結果を示す図である。
【図１６−１】図１６Ａ〜Ｄは、スタチン＋／−０．３ｍｇ／Ｋｇ、１．０ｍｇ／Ｋｇおよび３．０ｍｇ／ＫｇのＨＲＳ（１−５０６）での１５日間の処置後の、スタチン処置ラット大腿屈筋における炎症性サイトカインＩＬ−６、ＭＣＰ１、ＩＬ−１０およびインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）の遺伝子発現プロファイリングの結果を示す図である。
【図１６−２】図１６Ａ〜Ｄは、スタチン＋／−０．３ｍｇ／Ｋｇ、１．０ｍｇ／Ｋｇおよび３．０ｍｇ／ＫｇのＨＲＳ（１−５０６）での１５日間の処置後の、スタチン処置ラット大腿屈筋における炎症性サイトカインＩＬ−６、ＭＣＰ１、ＩＬ−１０およびインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）の遺伝子発現プロファイリングの結果を示す図である。
【図１７】図１７は、スタチン＋／−０．３ｍｇ／Ｋｇ、１．０ｍｇ／Ｋｇおよび３．０ｍｇ／ＫｇのＨＲＳ（１−５０６）での１５日間の処置後の、１４個の接着、発生および線維症関連遺伝子のスタチン処置ラット大腿屈筋の遺伝子発現プロファイリングの結果を示す図である。
【図１８】図１８は、スタチン＋／−０．３ｍｇ／Ｋｇ、１．０ｍｇ／Ｋｇおよび３．０ｍｇ／ＫｇのＨＲＳ（１−５０６）での１５日間の処置後の、１４個の筋消耗／萎縮症関連遺伝子のスタチン処置ラット大腿屈筋の遺伝子発現プロファイリングの結果を示す図である。
【図１９−１】図１９Ａは、スタチン＋／−０．３ｍｇ／Ｋｇ、１．０ｍｇ／Ｋｇおよび３．０ｍｇ／ＫｇのＨＲＳ（１−５０６）での１５日間の処置後の、１４個の筋消耗／萎縮症関連遺伝子のスタチン処置ラット大腿屈筋の遺伝子発現プロファイリングの結果を示す図である。図１９Ｂは、ＭＭＰ−３における特異的変化を示す図であり、図１９Ｃは、同じ条件下でのＭＭＰ−９遺伝子発現における特異的変化を示す図である。
【図１９−２】図１９Ａは、スタチン＋／−０．３ｍｇ／Ｋｇ、１．０ｍｇ／Ｋｇおよび３．０ｍｇ／ＫｇのＨＲＳ（１−５０６）での１５日間の処置後の、１４個の筋消耗／萎縮症関連遺伝子のスタチン処置ラット大腿屈筋の遺伝子発現プロファイリングの結果を示す図である。図１９Ｂは、ＭＭＰ−３における特異的変化を示す図であり、図１９Ｃは、同じ条件下でのＭＭＰ−９遺伝子発現における特異的変化を示す図である。
【図２０】図２０は、スタチン＋／−０．３ｍｇ／Ｋｇ、１．０ｍｇ／Ｋｇおよび３．０ｍｇ／ＫｇのＨＲＳ（１−５０６）での１５日間の処置後の、２９個の筋形成関連遺伝子のスタチン処置ラット大腿屈筋の遺伝子発現プロファイリングの結果を示す図である。
【図２１】図２１は、精製されたＦｃ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。レーン１：Ｓｅｅ  Ｂｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２タンパク質ラダー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。レーン２および６：Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）ロット番号４７２。レーン３および７：ＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃロット番号４７３。レーン４および８：Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）ロット番号４８０。レーン５および９：ＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃロット番号４８２。レーン２〜５は非還元条件下で泳動し、レーン６〜９は還元条件下で泳動した。
【図２２】図２２は、プロテインＡ、カチオン交換およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー後の、代表的な精製されたＦｃ−ＨＲＳ（２−６０）融合物の分析的サイズ排除ＨＰＬＣ分析を示す図である（二連注入のオーバーレイ）。純度は、９９．２％が主要ピークおよび０．８％が高分子量（ＨＭＷ）種である。
【図２３−１】図２３Ａは、マウスへの静脈内注射または皮下注射のいずれかの後の、ＨＲＳ（１−６０）の時間対濃度を示す図である。図２３Ｂは、マウスへの静脈内注射後の、Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）およびＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃの時間対濃度を示す図である。図２３Ｃは、マウスへの皮下注射後の、Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）およびＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃの時間対濃度を示す図である。
【図２３−２】図２３Ａは、マウスへの静脈内注射または皮下注射のいずれかの後の、ＨＲＳ（１−６０）の時間対濃度を示す図である。図２３Ｂは、マウスへの静脈内注射後の、Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）およびＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃの時間対濃度を示す図である。図２３Ｃは、マウスへの皮下注射後の、Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）およびＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃの時間対濃度を示す図である。
【図２４】図２４Ａは、異なるＨＲＳ−Ｆｃ融合タンパク質で処置したマウスにおける終了時の疾患活動性指標（ＤＡＩ）スコアを示す図である。バーは、各処置群についての平均ＤＡＩ（±ＳＥＭ）を示す。ＤＡＩは、体重減少のスコアと一緒に、出血および下痢に関する情報を取り込む。図２４Ｂは、化合物で処置したマウスにおける終了時の結腸の重量：長さ比を示す図である。バーは、各処置群についての平均比（±ＳＥＭ）を示す。
【図２５】図２５は、ＴＮＢＳ研究における転写変化の概要を示す図である。ナイーブ動物（群１）に対する標準化の後の、ＴＮＢＳ処置動物（群２）、ＴＮＢＳおよびブデソニドで処置した動物（群３）、ＴＮＢＳおよび試験物品Ａで処置した動物（ＨＲＳ（１−６０）；群４）、ならびにＴＮＢＳおよび試験物品Ｂで処置した動物（Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）；群５および６）における相対的転写変化が示される。散布図中の各ドットは、測定した遺伝子を示す。群２では、７つの遺伝子が、１０倍よりも大きく上方調節された（ＩＬ６、ＩＬ１ｂ、ＭＣＰ−１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ９、ＣＤ１１ｂおよびＩＬ１０）。
【図２６−１】図２６Ａ〜２６Ｈは、ＴＮＢＳによって上方調節される免疫および炎症関連遺伝子を示す図である。ナイーブ動物（群１）に対する標準化の後の、ＴＮＢＳ処置動物（群２）、ＴＮＢＳおよびブデソニドで処置した動物（群３）、ＴＮＢＳおよび試験物品Ａで処置した動物（ＨＲＳ（１−６０）；群４）、ならびにＴＮＢＳおよび試験物品Ｂで処置した動物（Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）；群５および６）における個々の遺伝子の相対的転写変化が示される。散布図中の各ドットは、群内の各動物における目的の遺伝子の豊富さを示す。＊＝ｐ値＜０．０５および＊＊＝ｐ値＜０．０１で、スチューデントｔ検定を使用して有意性を計算した。
【図２６−２】図２６Ａ〜２６Ｈは、ＴＮＢＳによって上方調節される免疫および炎症関連遺伝子を示す図である。ナイーブ動物（群１）に対する標準化の後の、ＴＮＢＳ処置動物（群２）、ＴＮＢＳおよびブデソニドで処置した動物（群３）、ＴＮＢＳおよび試験物品Ａで処置した動物（ＨＲＳ（１−６０）；群４）、ならびにＴＮＢＳおよび試験物品Ｂで処置した動物（Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）；群５および６）における個々の遺伝子の相対的転写変化が示される。散布図中の各ドットは、群内の各動物における目的の遺伝子の豊富さを示す。＊＝ｐ値＜０．０５および＊＊＝ｐ値＜０．０１で、スチューデントｔ検定を使用して有意性を計算した。
【図２６−３】図２６Ａ〜２６Ｈは、ＴＮＢＳによって上方調節される免疫および炎症関連遺伝子を示す図である。ナイーブ動物（群１）に対する標準化の後の、ＴＮＢＳ処置動物（群２）、ＴＮＢＳおよびブデソニドで処置した動物（群３）、ＴＮＢＳおよび試験物品Ａで処置した動物（ＨＲＳ（１−６０）；群４）、ならびにＴＮＢＳおよび試験物品Ｂで処置した動物（Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）；群５および６）における個々の遺伝子の相対的転写変化が示される。散布図中の各ドットは、群内の各動物における目的の遺伝子の豊富さを示す。＊＝ｐ値＜０．０５および＊＊＝ｐ値＜０．０１で、スチューデントｔ検定を使用して有意性を計算した。
【図２７】図２７Ａ〜２７Ｄは、ナイーブマウスまたは実験的大腸炎を誘導するためにＴＮＢＳで結腸内処置したマウス、ＴＮＢＳ±０．５ｍｇ／ｋｇ  Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）で処置したマウスの脾臓における異なるＴ細胞集団の相対的百分率を示す図である。（２７Ａ）ＣＤ３、（２７Ｂ）ＣＤ８、（２７Ｃ）ＣＤ４、ならびに（２７Ｄ）ＣＤ２５およびＦｏｘＰ３について染色された生リンパ球の百分率が示される。Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋細胞に対してさらにゲートをかけた。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本発明の実施は、逆を具体的に示さない限り、当業者の技術範囲内の分子生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用し、これらの多くは、例示目的のために以下に記載される。かかる技術は、文献中で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版、２０００年）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．  Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．  Ｇａｉｔ編、１９８４年）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐ．  Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ編、２００４年）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５年）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：  Ｍｏｄｅｒｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｂｕｚｄｉｎ  およびＬｕｋｙａｎｏｖ編、２００９年）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６年）；  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．Ｉ．  （２００５年）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ、ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第５版、Ｈｏｂｏｋｅｎ  ＮＪ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（第３版、２０１０年）；Ｆａｒｒｅｌｌ，  Ｒ．、ＲＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ（第３版、２００５年）．  Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＡＣＳ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、１９９７年；Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，  Ｆ．およびＪ．Ｍ．  Ｈａｒｒｉｓ編、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、５４巻（４号）４５３〜６０９頁（２００２年）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，  Ｓ．ら「Ｕｓｅ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌｓ）  ｆｏｒ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓを参照のこと。
【００５０】
本明細書で引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、その全体が本明細書で参照により組み込まれる。
【００５１】
定義
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または等価な任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料が記載される。本発明の目的のために、以下の用語を以下に定義する。
【００５２】
冠詞「１つの（「ａ」および「ａｎ」）は、その冠詞の文法的客体のうちの１つまたは１つよりも多く（即ち、少なくとも１つ）を指すために、本明細書で使用される。例として、「１つの（「ａｎ」）エレメント」は、１つのエレメントまたは１つよりも多いエレメントを意味する。
【００５３】
「約」とは、参照の量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量または長さに対して、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％ほどもが変動する、量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量または長さを意味する。
【００５４】
本明細書で使用する場合、用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸の両方ならびにアミノ酸アナログおよび模倣物を意味する意図である。天然に存在するアミノ酸には、タンパク質生合成の間に利用される２０種の（Ｌ）−アミノ酸、ならびに例えば４−ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシン、デスモシン、イソデスモシン、ホモシステイン、シトルリンおよびオルニチンなどの他のアミノ酸が含まれる。天然に存在しないアミノ酸には、例えば、当業者に公知の（Ｄ）−アミノ酸、ノルロイシン、ノルバリン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、エチオニンなどが含まれる。アミノ酸アナログには、天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸の改変形態が含まれる。かかる改変には、例えば、アミノ酸上の化学基および部分の置換もしくは置き換え、またはアミノ酸の誘導体化が含まれ得る。アミノ酸模倣物には、例えば、参照アミノ酸の電荷および荷電空間特徴などの機能的に類似の特性を示す有機構造が含まれる。例えば、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）を模倣する有機構造は、天然に存在するＡｒｇアミノ酸の側鎖のｅ−アミノ基と類似の分子空間中に位置付けられ、同じ程度の移動性を有する、正の電荷部分を有する。模倣物は、アミノ酸のまたはアミノ酸官能基の最適な空間および電荷相互作用を維持するような、拘束された構造もまた含む。当業者は、機能的に等価なアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物を構成する構造がなんであるかを知っている、または決定することができる。
【００５５】
本明細書で使用する場合、疾患または有害反応を発生させる「危険性がある」被験体は、検出可能な疾患または疾患の症状を有していてもいなくてもよく、本明細書に記載される処置方法の前に検出可能な疾患または疾患の症状を示していてもいなくてもよい。「危険性がある」とは、被験体が、本明細書に記載され当該分野で公知のように、疾患の発生と相関する測定可能なパラメーターである、１つまたは複数の危険因子を有することを示す。これらの危険因子のうちの１つまたは複数を有する被験体は、これらの危険因子（複数可）のうちの１つまたは複数を有さない被験体よりも、疾患または有害反応を発生させるより高い可能性を有する。
【００５６】
「自己免疫性疾患」は、本明細書で使用する場合、個体自身の組織から生じる、および個体自身の組織に対する、疾患または障害である。自己免疫性疾患または自己免疫性障害の例には、以下が含まれるがこれらに限定されない：炎症性応答、例えば、乾癬および皮膚炎（例えば、アトピー性皮膚炎）を含む炎症性皮膚疾患；全身性強皮症および硬化症；炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）と関連する応答；呼吸窮迫症候群（成人呼吸窮迫症候群；ＡＲＤＳを含む）；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ぶどう膜炎；大腸炎；糸球体腎炎；アレルギー性状態、例えば、湿疹および喘息、ならびにＴ細胞の浸潤および慢性炎症性応答が関与する他の状態；アテローム動脈硬化症；白血球接着欠損症；関節リウマチ；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；糖尿病（例えば、Ｉ型糖尿病またはインスリン依存性糖尿病）；多発性硬化症；レイノー症候群（Ｒｅｙｎａｕｄ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；自己免疫性甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シェーグレン症候群（Ｓｊｏｒｇｅｎ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；若年発症糖尿病；ならびに結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、炎症性ミオパチー、間質性肺疾患、肉芽腫症および血管炎において典型的に見出されるサイトカインおよびＴリンパ球によって媒介される急性および遅延型過敏症と関連する免疫応答；悪性貧血（アジソン病）；白血球血管外漏出が関与する疾患；中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害；多臓器傷害症候群；溶血性貧血（クリオグロブリン血症（ｃｒｙｏｇｌｏｂｉｎｅｍｉａ）またはクームス陽性貧血が含まれるがこれらに限定されない）；重症筋無力症；抗原−抗体複合体媒介性疾患；抗糸球体基底膜抗体病；抗リン脂質抗体症候群；アレルギー性神経炎；グレーブス病；ランバート・イートン筋無力症症候群；水疱性類天疱瘡；天疱瘡；自己免疫性多腺性内分泌障害；ライター病；スティフ・マン症候群；ベーチェット病；巨細胞動脈炎；免疫複合体性腎炎；ＩｇＡ腎症；ＩｇＭ多発ニューロパチー；免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）または自己免疫性血小板減少症など。
【００５７】
本明細書を通じて、文脈が特に要求しない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、述べられたステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群を含めるが、任意の他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群を排除しないことを意味することが理解される。「からなる」とは、語句「からなる」に先行するいずれのものをも含みかつそれらに限定されることを意味する。従って、語句「からなる」は、列挙された要素が必要とされるかまたは必須であり、他の要素が存在しなくてもよいことを示す。「本質的に〜からなる」とは、この語句の前に列挙された任意の要素を含み、列挙された要素について本開示において特定された活性または作用を妨害することもそれらに寄与することもない他の要素に限定されることを意味する。従って、語句「本質的に〜からなる」とは、列挙された要素が必要とされるかまたは必須であるが、他の要素は任意選択であり、列挙された要素の活性または作用に実質的に影響を与えるか否かに依存して存在してもしなくてもよいことを示す。
【００５８】
用語「クローン除去」とは、自己反応性Ｔ細胞の除去（例えば、喪失または死）を指す。クローン除去は、胸腺において、もしくは末梢において、または両方において、中心的に達成され得る。
【００５９】
用語「コンジュゲート」は、免疫グロブリンＦｃ領域への、生物学的に活性な分子（例えば、ＨＲＳポリペプチド）などの分子の共有結合の結果として形成される実体を指す意図である。コンジュゲートポリペプチドの一例は、「融合タンパク質」または「融合ポリペプチド」、即ち、別々のポリペプチドを元々コードする２つまたはそれ超のコード配列の接続によって創出されたポリペプチドである；接続されたコード配列の転写は、別々のポリペプチドの各々に由来する機能的特性を典型的には有する、単一の融合ポリペプチドを生じる。
【００６０】
記述「エンドトキシンを含まない」または「エンドトキシンを実質的に含まない」とは、多くても微量（例えば、被験体に対して臨床的に有害な生理学的影響を有さない量）のエンドトキシン、好ましくは検出不能な量のエンドトキシンを含む、組成物、溶媒および／または容器を一般に指す。エンドトキシンは、特定の細菌、典型的にはグラム陰性細菌と関連する毒素であるが、エンドトキシンは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓなどのグラム陽性細菌においても見いだされ得る。最も流行のエンドトキシンは、種々のグラム陰性細菌の外膜において見出されるリポポリサッカリド（ＬＰＳ）またはリポオリゴサッカリド（ＬＯＳ）であり、これらの細菌が疾患を引き起こす能力において中心的な病原性特徴を示す。ヒトにおける少量のエンドトキシンは、他の有害な生理学的影響の中でも、発熱、血圧の低下、ならびに炎症および凝固の活性化を生じ得る。
【００６１】
従って、医薬品生成では、薬物製品および／または薬物コンテナから、エンドトキシンのほとんどまたは全ての痕跡を除去することが望ましい場合が多いが、これは、少量でさえも、ヒトにおいて有害な影響を引き起こし得るからである。３００℃を超える温度が、ほとんどのエンドトキシンを分解するために典型的には必要とされるので、発熱物質除去（ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ）オーブンが、この目的のために使用され得る。例えば、シリンジまたはバイアルなどの主要な包装材料に基づいて、２５０℃のガラス温度と３０分間の保持時間との組合せが、エンドトキシンレベルにおける３ｌｏｇの低減を達成するために十分である場合が多い。本明細書に記載され当該分野で公知の、例えばクロマトグラフィーおよび濾過方法を含む、エンドトキシンを除去する他の方法が企図される。本発明の組成物中にエンドトキシンが存在する危険性を低減させる、そうでないならば排除するために、哺乳動物細胞などの真核生物細胞においてＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートを生成し、かかる細胞からＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートを単離する方法もまた、含まれる。無血清細胞においてＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートを生成し、かかる細胞からＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートを単離する方法が好ましい。
【００６２】
エンドトキシンは、当該分野で公知の慣用的な技術を使用して検出され得る。例えば、カブトガニ由来の血液を利用するリムルスアメボサイト溶解物アッセイは、エンドトキシンの存在を検出するための非常に高感度のアッセイである。この試験では、非常に低いレベルのＬＰＳが、この反応を増幅する強力な酵素カスケードに起因して、リムルス溶解物の検出可能な凝固を引き起こし得る。エンドトキシンは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によっても定量され得る。エンドトキシンを実質的に含まないように、エンドトキシンレベルは、約０．００１ＥＵ／ｍｌ未満、０．００５ＥＵ／ｍｌ未満、０．０１ＥＵ／ｍｌ未満、０．０２ＥＵ／ｍｌ未満、０．０３ＥＵ／ｍｌ未満、０．０４ＥＵ／ｍｌ未満、０．０５ＥＵ／ｍｌ未満、０．０６ＥＵ／ｍｌ未満、０．０８ＥＵ／ｍｌ未満、０．０９ＥＵ／ｍｌ未満、０．１ＥＵ／ｍｌ未満、０．５ＥＵ／ｍｌ未満、１．０ＥＵ／ｍｌ未満、１．５ＥＵ／ｍｌ未満、２ＥＵ／ｍｌ未満、２．５ＥＵ／ｍｌ未満、３ＥＵ／ｍｌ未満、４ＥＵ／ｍｌ未満、５ＥＵ／ｍｌ未満、６ＥＵ／ｍｌ未満、７ＥＵ／ｍｌ未満、８ＥＵ／ｍｌ未満、９ＥＵ／ｍｌ未満または１０ＥＵ／ｍｌ未満であり得る。典型的には、１ｎｇのリポポリサッカリド（ＬＰＳ）は、約１〜１０ＥＵに対応する。
【００６３】
本明細書で使用する場合、用語「機能」および「機能的」などは、生物学的機能、酵素的機能または治療的機能を指す。
【００６４】
「相同性」とは、同一であるまたは保存的置換を構成するアミノ酸の百分率数を指す。相同性は、参照により本明細書に組み込まれるＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒａｕｘら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．  １２巻、３８７〜３９５頁、１９８４年）などの配列比較プログラムを使用して決定され得る。この方法で、本明細書に引用される配列に対して類似または実質的に異なる長さの配列が、ＧＡＰによって使用される比較アルゴリズムによって例えば決定されるギャップなどの、アラインメント中へのギャップの挿入によって、比較され得る。
【００６５】
「生理学的に安定な」リンカーとは、水中で、または生理学的条件（例えば、例えば１つまたは複数のプロテアーゼの存在下での、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養条件）下で実質的に安定なリンカー、即ち、延長された期間にわたって任意の感知できる程度まで、生理学的条件下での分解反応（例えば、酵素的に分解可能な反応）を受けないリンカーを指す。一般に、生理学的に安定なリンカーは、生理学的条件下で１日当たり約０．５％未満、約１％未満、約２％未満、約３％未満、約４％未満または約５％未満の分解の割合を示すリンカーである。
【００６６】
「単離された」とは、そのネイティブ状況において通常付随する構成要素を、実質的にまたは本質的に含まない材料を意味する。例えば、「単離されたペプチド」または「単離されたポリペプチド」などは、本明細書で使用する場合、その天然の細胞環境からの、および細胞の他の構成要素との関連からの、ペプチドまたはポリペプチド分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの単離および／または精製を含む；即ち、単離された分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏの物質と顕著には関連しない。
【００６７】
用語「半数効果濃度」または「ＥＣ５０」とは、いくらかの特定された曝露時間の後に、ベースラインと最大との間の中間の応答を誘導する、本明細書に記載されるＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートの濃度を指す；従って、段階的用量反応曲線のＥＣ５０は、その最大効果の５０％が観察される化合物の濃度を示す。ある特定の実施形態では、本明細書に提供された薬剤のＥＣ５０は、上述のように、「非正準」活性に関して示される。ＥＣ５０は、ｉｎ  ｖｉｖｏで最大効果の５０％を得るために必要とされる血漿濃度もまた示す。同様に、「ＥＣ９０」とは、その最大効果の９０％が観察される薬剤または組成物の濃度を指す。「ＥＣ９０」は、「ＥＣ５０」およびＨｉｌｌ勾配から計算でき、または当該分野における慣用的な知識を使用して、データから直接決定され得る。一部の実施形態では、ＨＲＳ−ＦｃコンジュゲートのＥＣ５０は、約０．０１ｎＭ未満、０．０５ｎＭ未満、０．１ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、０．３ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．６ｎＭ未満、０．７ｎＭ未満、０．８ｎＭ未満、０．９ｎＭ未満、１ｎＭ未満、２ｎＭ未満、３ｎＭ未満、４ｎＭ未満、５ｎＭ未満、６ｎＭ未満、７ｎＭ未満、８ｎＭ未満、９ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１１ｎＭ未満、１２ｎＭ未満、１３ｎＭ未満、１４ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、１６ｎＭ未満、１７ｎＭ未満、１８ｎＭ未満、１９ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、６０ｎＭ未満、７０ｎＭ未満、８０ｎＭ未満、９０ｎＭ未満または１００ｎＭ未満である。好ましくは、生物療法組成物は、約１ｎＭまたはそれ未満のＥＣ５０値を有する。
【００６８】
ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートの「半減期」は、生物の血清もしくは組織中への投与の時点におけるかかる活性と比較して、または任意の他の規定された時点と比較して、その薬理学的活性、生理学的活性または他の活性の半分をこのコンジュゲートが喪失するのにかかる時間を指し得る。「半減期」は、生物の血清もしくは組織中への投与の時点におけるかかる量もしくは濃度と比較して、または任意の他の規定された時点と比較して、生物の血清または組織中に投与される出発量の半分、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートの量または濃度が低減するのにかかる時間もまた指し得る。半減期は、血清および／または任意の１つもしくは複数の選択された組織において測定され得る。
【００６９】
用語「連結」、「リンカー」、「リンカー部分」または「Ｌ」は、別のＨＲＳポリペプチドからおよび／または１つもしくは複数のＦｃ領域からＨＲＳポリペプチドを分離するために使用され得るリンカーを指すために本明細書で使用される。このリンカーは、生理学的に安定であり得るか、または放出可能なリンカー、例えば酵素的に分解可能なリンカー（例えば、タンパク質分解的に切断可能なリンカー）を含み得る。ある特定の態様では、このリンカーは、例えばＨＲＳ−Ｆｃ融合タンパク質の一部としての、ペプチドリンカーであり得る。一部の態様では、このリンカーは、非ペプチドリンカーであり得る。
【００７０】
用語「モジュレートすること」および「変更すること」には、典型的には、対照と比較して統計的に有意なまたは生理学的に顕著な量または程度で、「増加させること」、「増強すること」または「刺激すること」ならびに「減少させること」または「低減させること」を含む。「増加した」、「刺激された」または「増強された」量は、典型的には「統計的に有意な」量であり、組成物なし（例えば、本発明のＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートのいずれかの非存在下）または対照の組成物、試料もしくは試験被験体によって生成される量の１．１倍、１．２倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍またはそれ超（例えば、５００倍、１０００倍）（それらの間および１を上回る全ての整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７．１．８などを含む）である増加を含み得る。「減少した」または「低減した」量は、典型的には「統計的に有意な」量であり、組成物なし（薬剤または化合物の非存在下）または対照組成物によって生成される量における、これらの間の全ての整数を含め、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の減少を含み得る。１つの非限定的な例として、正準活性と非正準活性とを比較する際の対照は、対応する（配列で）未改変または異なって改変されたＨＲＳポリペプチドと比較して、目的のＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートを含み得る。比較および「統計的に有意な」量の他の例は、本明細書に記載される。
【００７１】
「非正準」活性とは、本明細書で使用する場合、一般に、ｉ）インタクトなネイティブ全長親タンパク質によっては任意の顕著な程度まで所有されない、本発明のＨＲＳポリペプチドによって所有される新たな非アミノアシル化活性、またはｉｉ）インタクトなネイティブ全長親タンパク質によって所有されていた活性いずれかを指し、ここで、例えば、インタクトなネイティブ全長親タンパク質によって所有される他の活性からその活性を単離することによって、ＨＲＳポリペプチドは、インタクトなネイティブ全長親タンパク質と比較して、非正準活性に関して顕著により高い（例えば、少なくとも２０％高い）比活性を示すか、もしくは新たな文脈において活性を示すかのいずれかである。ＨＲＳポリペプチドの場合、非正準活性の非限定的な例には、細胞増殖のモジュレーション、細胞遊走のモジュレーション、細胞分化（例えば、造血、神経発生、筋形成、骨形成および脂肪生成）のモジュレーション、遺伝子転写のモジュレーション、アポトーシスまたは他の形態の細胞死のモジュレーション、細胞シグナル伝達のモジュレーション、細胞取り込みまたは分泌のモジュレーション、血管新生のモジュレーション、細胞結合のモジュレーション、細胞代謝のモジュレーション、サイトカインの産生または活性のモジュレーション、サイトカイン受容体活性のモジュレーション、炎症、免疫原性のモジュレーションなどを含む、細胞外シグナル伝達が含まれる。
【００７２】
ある特定の実施形態では、組成物中の任意の所与の薬剤（例えば、融合タンパク質などのＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲート）の「純度」は、具体的に規定され得る。例えば、特定の組成物は、例えば、決して限定ではなく、化合物を分離、同定および定量するために生化学および分析化学において頻繁に使用されるカラムクロマトグラフィーの周知の一形態、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定されるように、それらの間の全ての小数を含めて、少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％純粋である薬剤を含み得る。
【００７３】
特定の理論に束縛されることは望まないが、「酵素的に分解可能なリンカー」とは、１つまたは複数の酵素、例えば、ペプチダーゼまたはプロテアーゼによる分解に供されるリンカー、例えばアミノ酸配列を意味する。
【００７４】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーならびにそのバリアントおよび合成アナログを指すために、本明細書で交換可能に使用される。従って、これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、合成の天然に存在しないアミノ酸、例えば、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的アナログである、アミノ酸ポリマーに、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーに、適用される。
【００７５】
「放出可能なリンカー」には、生理学的に切断可能なリンカーおよび酵素的に分解可能なリンカーが含まれるがこれらに限定されない。従って、「放出可能なリンカー」は、生理学的条件下での、自発的加水分解またはいくつかの他の機構（例えば、酵素触媒、酸触媒、塩基触媒など）による切断のいずれかを受け得るリンカーである。例えば、「放出可能なリンカー」には、駆動力としてプロトン（例えば、イオン化可能な水素原子、Ｈα）の塩基引き抜きを有する脱離反応が関与し得る。本明細書の目的のために、「放出可能なリンカー」は、「分解可能なリンカー」と同義である。特定の実施形態では、放出可能なリンカーは、約３０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間もしくは約９６時間またはそれ超の、ｐＨ７．４、２５℃、例えば、生理学的ｐＨ、ヒト体温（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ）における半減期を有する。
【００７６】
「統計的に有意な」とは、その結果が偶然起こる可能性が低いことを意味する。統計的有意性は、当該分野で公知の任意の方法によって決定され得る。有意性の一般に使用される尺度には、帰無仮説が真であるとした場合に、観察された事象が発生する頻度または確率であるｐ値が含まれる。得られたｐ値が有意性レベルよりも小さい場合、この帰無仮説は棄却される。単純な例では、この有意性レベルは、０．０５またはそれ未満のｐ値において規定される。
【００７７】
用語「溶解度」とは、液体溶媒中で溶解し、均質溶液を形成する、本明細書で提供されるＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドの特性を指す。溶解度は典型的に、単位体積の溶媒当たりの溶質の質量（溶媒１ｋｇ当たりの溶質のｇ数、ｇ／ｄＬ（１００ｍＬ）、ｍｇ／ｍｌなど）、容積モル濃度、重量モル濃度、モル分率または濃度の他の類似の記述のいずれかによって、濃度として表される。溶媒の量当たり溶解し得る溶質の最大平衡量は、温度、圧力、ｐＨ、および溶媒の性質を含む特定の条件下での、その溶媒におけるその溶質の溶解度である。ある特定の実施形態では、溶解度は、生理学的ｐＨまたは他のｐＨ、例えば、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０もしくはｐＨ７．４で測定される。ある特定の実施形態では、溶解度は、水または生理学的緩衝液、例えばＰＢＳもしくはＮａＣｌ（ＮａＰありまたはなし）中で測定される。具体的な実施形態では、溶解度は、比較的低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．０）および比較的高い塩（例えば、５００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ  ＮａＰ）において測定される。ある特定の実施形態では、溶解度は、生体液（溶媒）、例えば血液または血清中で測定される。ある特定の実施形態では、温度は、約室温（例えば、約２０、２１、２２、２３、２４、２５℃）または約体温（３７℃）であり得る。ある特定の実施形態では、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドは、室温または３７℃で、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５または３０ｍｇ／ｍｌの溶解度を有する。
【００７８】
「被験体」には、本明細書で使用する場合、本発明のＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドを用いて処置もしくは診断され得る症状を示しているか、またはかかる症状を示す危険性がある任意の動物が含まれる。適切な被験体（患者）には、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギまたはモルモット）、家畜および飼育動物またはペット（例えば、ネコまたはイヌ）が含まれる。非ヒト霊長類および好ましくはヒト患者が含まれる。
【００７９】
「実質的に」または「本質的に」とは、ほぼ全体的にまたは完全に、例えば、ある所与の量のうちの９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ超を意味する。
【００８０】
「処置」または「処置すること」には、本明細書で使用する場合、疾患または状態の症状または病理に対する任意の望ましい効果を含み、処置されている疾患または状態の１つまたは複数の測定可能なマーカーにおける最小の変化または改善さえも含み得る。「処置」または「処置すること」は、疾患もしくは状態またはそれらの関連する症状の完全な根絶または治癒を必ずしも示さない。この処置を受けている被験体は、それを必要とする任意の被験体である。臨床的改善の例示的なマーカーは、当業者に明らかである。
【００８１】
ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ由来ポリペプチド
本発明の実施形態は、野生型ＨＲＳ配列、天然に存在する配列、天然に存在しない配列ならびに／またはそれらのバリアントおよび断片を含むＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートを含む、ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチド（「ＨＲＳまたはＨｉｓＲＳポリペプチド」）−Ｆｃコンジュゲートに関する。ＨＲＳ由来ポリペプチドの具体的な例には、変更されたシステイン含量を有するものが含まれる。ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼは、３つの高度に保存された配列モチーフを有する、クラスＩＩのｔＲＮＡシンテターゼファミリーに属する。クラスＩおよびＩＩのｔＲＮＡシンテターゼは、２ステップ反応においてその同族ｔＲＮＡへのアミノ酸の特異的結合を担うと広く認識されている：アミノ酸（ＡＡ）は、ＡＴＰによって最初に活性化されてＡＡ−ＡＭＰを形成し、次いで、ｔＲＮＡのアクセプター末端に転移される。全長ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼは、典型的に、サイトゾルホモダイマーまたは選択的スプライシングされたミトコンドリア形態のいずれかとして存在する。
【００８２】
より最近、真核生物のヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼのいくつかの生物学的断片もしくは選択的スプライシングされたアイソフォーム（ＰｈｙｓｉｏｃｒｉｎｅまたはＨＲＳポリペプチド）、または一部の文脈ではインタクトなシンテターゼが、特定の細胞シグナル伝達経路をモジュレートし、または抗炎症特性を有することが確立されている。タンパク質合成におけるｔＲＮＡシンテターゼの古典的役割とは異なるこれらの活性は、本明細書で「非正準活性」と集合的に称される。これらのＰｈｙｓｉｏｃｒｉｎｅは、選択的スプライシングまたはタンパク質分解のいずれかによって天然に生成され得、種々の恒常性機構を調節するために、細胞自律的様式（即ち、宿主細胞内）または非細胞自律的様式（即ち、宿主細胞の外側）で作用し得る。例えば、本発明に提供されるように、ＨＲＳポリペプチド、例えばヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼのＮ末端断片（例えば、ＨＲＳ  １−４８、ＨＲＳ  １−６０）は、とりわけ、活動性炎症の部位と関連する炎症性細胞（例えば、単球、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞）の遊走、活性化または分化をｉｎ  ｖｉｖｏで遮断することによって、抗炎症性シグナルを働かせることが可能である。さらに、全長ＨＲＳポリペプチド配列と比較して特定の変異または欠失（例えば、ＨＲＳ  １−５０６、ＨＲＳ  １−６０）は、増加した活性および／または改善された薬理学的特性を付与する。特定の例示的なＨＲＳポリペプチドの配列は、表Ｄ１中に提供される。
【００８３】
【表１−１】
2020141673.tif 000002
【００８４】
【表１−２】
2020141673.tif 000003
【００８５】
【表１−３】
2020141673.tif 000004
【００８６】
いくつかの天然に存在するヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ一塩基多型（ＳＮＰ）およびヒト遺伝子の天然に存在するバリアントは、配列決定されており、少なくとも部分的に機能的に相互交換可能であることが当該分野で公知である。ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼのいくつかのかかるバリアント（即ち、代表的なヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼＳＮＰ）が、表Ｄ２中に示される。
【００８７】
【表２−１】
2020141673.tif 000005
【００８８】
【表２−２】
2020141673.tif 000006
【００８９】
【表２−３】
2020141673.tif 000007
【００９０】
さらに、ヒト遺伝子のホモログおよびオルソログが、表Ｄ３中に列挙されるように、他の種において存在し、従って、表Ｄ１、Ｄ４〜Ｄ６またはＤ８中に列挙したヒトＨＲＳポリペプチド配列のいずれかの代わりに、天然に存在するアミノ酸、またはＳＮＰ中に存在するヌクレオチドバリアント、または他の天然に存在するホモログを選択することは、慣
用的な事項である。
【００９１】
【表３−１】
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【００９２】
【表３−２】
2020141673.tif 000009
【００９３】
従って、本発明の方法、治療用組成物およびキットのいずれかにおいて、用語「ＨＲＳポリペプチド」「ＨＲＳタンパク質」または「ＨＲＳタンパク質断片」には、抗炎症活性などの非正準活性を所有するおよび／またはヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼに対する自己抗体と関連する疾患を有する被験体由来の自己抗体もしくは自己反応性Ｔ細胞と特異的に交差反応する少なくとも１つのエピトープを保持する、ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼの全ての天然に存在する形態および合成形態が含まれる。かかるＨＲＳポリペプチドには、全長ヒトタンパク質、ならびに表Ｄ１、Ｄ３〜Ｄ６またはＤ８に列挙した全長タンパク質から誘導されたＨＲＳペプチドが含まれる。一部の実施形態では、用語ＨＲＳポリペプチドとは、約４５または５０〜約２５０アミノ酸長の、ヒトヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（表Ｄ１中の配列番号１）から誘導されたポリペプチド配列を指す。本明細書に記載されるＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートのいずれかにおいて、ＨＲＳポリペプチドのＮ末端アミノ酸（例えば、Ｎ末端Ｍｅｔ）が、融合タンパク質またはコンジュゲートを創出する場合に、表Ｄ１、Ｄ３〜Ｄ６またはＤ８中に列挙した配列のいずれかから欠失し得ることが理解される。
【００９４】
一部の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドは、約２０〜５０９、２０〜５０８、２０〜５０７、５０〜５０６、２０〜５０５、５０〜５０４、２０〜５０３、２０〜５０２、２０〜５０１、２０〜５００、２０〜４００、２０〜３００、２０〜２５０、２０〜２００または２０〜１００アミノ酸長の間である。例えば、具体的な実施形態では、このポリペプチドは、約２０〜２５、２０〜３５、２０〜４０、２０〜４５、２０〜５５、２０〜６０、２０〜６５、２０〜７０、２０〜７５、２０〜８０、２０〜８５、２０〜９０、２０〜９５もしくは２０〜１００アミノ酸長の間、または約３０〜３５、３０〜４０、３０〜４５、３０〜５５、３０〜６０、３０〜６５、３０〜７０、３０〜７５、３０〜８０、３０〜８５、３０〜９０、３０〜９５もしくは３０〜１００アミノ酸長の間、または約４０〜４５、４０〜５５、４０〜６０、４０〜６５、４０〜７０、４０〜７５、４０〜８０、４０〜８５、４０〜９０、４０〜９５、もしくは４０〜１００アミノ酸長の間、または約４５〜５０、４５〜５５、５０〜５５、５０〜６０、５０〜６５、５０〜７０、５０〜７５、５０〜８０、５０〜８５、５０〜９０、５０〜９５、もしくは５０〜１００アミノ酸長の間、または約６０〜６５、６０〜７０、６０〜７５、６０〜８０、６０〜８５、６０〜９０、６０〜９５、もしくは６０〜１００アミノ酸長の間、または約７０〜７５、７０〜８０、７０〜８５、７０〜９０、７０〜９５、もしくは７０〜１００アミノ酸長の間、または約８０〜８５、８０〜９０、８０〜９５、もしくは８０〜１００アミノ酸長の間である。ある特定の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドは、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、または５０９アミノ酸長である。
【００９５】
一部の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドは、最大約１〜５×１０−７Ｍまたはそれ超の濃度まで、競合的ＥＬＩＳＡにおいて、野生型ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼに対する疾患関連自己抗体の結合（例えば、Ｊｏ−１抗体）について顕著には競合しない。従って、一部の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドは、競合的ＥＬＩＳＡにおいて測定した場合、野生型ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（配列番号１）よりも、疾患関連自己抗体に対する低い親和性を有する。一部の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドは、野生型ヒト（配列番号１）に対する疾患関連自己抗体の親和性よりも、少なくとも約１０倍少ない、または少なくとも約２０倍少ない、または少なくとも約５０倍少ない、または少なくとも約１００倍少ない、疾患関連自己抗体（例えば、Ｊｏ−１抗体）に対する見かけの親和性を有する。
【００９６】
従って、ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（例えば、表Ｄ１、Ｄ３〜Ｄ６またはＤ８中に列挙したタンパク質のいずれか）の全てのかかるホモログ、オルソログ、および天然に存在するまたは合成のアイソフォームは、ヒスチジルｔＲＮＡシンテターゼに対する自己抗体と関連する疾患を有する被験体由来の自己抗体もしくは自己反応性Ｔ細胞と特異的に交差反応する少なくとも１つのエピトープを保持し、または非正準活性を所有する限り、本発明の方法、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲート、キットおよび組成物のいずれか中に含まれる。これらのＨＲＳポリペプチドは、そのネイティブ形態で、即ち、異なる種において天然に出現する場合にヒトヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼの機能的に等価なバリアントとみなされ得る異なるバリアントとして存在し得、あるいはこれらは、例えば短縮（例えば、Ｎ末端もしくはＣ末端または両方からの）または他のアミノ酸の欠失、付加、挿入、置換もしくは翻訳後修飾によって、そのアミノ酸配列が異なり得る、その機能的に等価な天然の誘導体であり得る。例えば、ＨＲＳポリペプチドまたはＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートのピログルタミル、イソ−アスパルチル、タンパク質分解、リン酸化、グリコシル化、酸化、異性化および脱アミノ化バリアントを含む、任意のＨＲＳポリペプチドの翻訳後修飾および分解産物を含む天然に存在する化学的誘導体もまた、本発明の方法および組成物のいずれか中に具体的に含まれる。ＨＲＳポリペプチドおよびＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートはまた、本明細書に記載されるように、天然に存在するアミノ酸および／または天然に存在しないアミノ酸から構成され得る。
【００９７】
上述のように、本発明の実施形態は、ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼの全てのホモログ、オルソログおよび天然に存在するアイソフォーム（例えば、表もしくは配列表中に列挙されるタンパク質、またはかかる表もしくは配列表中から誘導可能なタンパク質、またはかかる表もしくは配列表中に列挙されるそれらの対応する核酸のいずれか）ならびにこれらのＨＲＳ参照ポリペプチドの「バリアント」を含む。記述ポリペプチド「バリアント」とは、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失および／または置換によって参照ＨＲＳポリペプチドから識別され、参照ＨＲＳポリペプチドの１つまたは複数の非正準活性を典型的に保持（例えば、模倣）またはモジュレートする（例えば、アンタゴナイズする）、ポリペプチドを指す。バリアントには、改善された安定性または他の医薬的特性を有するように、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失および／または置換によって改変されたポリペプチドもまた含まれる。
【００９８】
ある特定の実施形態では、ポリペプチドバリアントは、本明細書に記載され当該分野で公知のように、保存的または非保存的であり得る１つまたは複数の置換によって、参照ポリペプチドから識別される。ある特定の実施形態では、このポリペプチドバリアントは、保存的置換を含み、これに関して、いくつかのアミノ酸が、ポリペプチドの活性の性質を変化させることなく、広く類似した特性を有する他のアミノ酸に変化され得ることは、当該分野で十分理解される。一部の実施形態では、このバリアントは、Ｌｅｕ７、Ｇｌｎ１４、Ｇｌｙ１５、Ｖａｌ１８、Ａｒｇ１９、Ｌｅｕ２１、Ｌｙｓ２２、Ｌｙｓ２５、Ａｌａ２６、Ｖａｌ３５、Ｌｅｕ３８、Ｌｅｕ３９、Ｌｅｕ４１およびＬｙｓ４２（配列番号１の番号付けに基づく）のうちの１つまたは複数を含む、１つまたは複数の保存された残基を含む。
【００９９】
本発明の方法および組成物のいずれかにおいて有用なＨＲＳポリペプチドバリアントの具体的な例には、ｉ）検出可能な非正準活性を保持するおよび／またはヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼに対する自己抗体と関連する疾患を有する被験体由来の自己抗体もしくは自己反応性Ｔ細胞と特異的に交差反応する少なくとも１つのエピトープを保持する、ならびにｉｉ）１つまたは複数のさらなるアミノ酸の挿入、置換、欠失および／または短縮を有する、全長ＨＲＳポリペプチド、またはその短縮もしくはスプライスバリアント（例えば、表もしくは配列表中に列挙されるタンパク質またはかかる表もしくは配列表から誘導可能なタンパク質のいずれか）が含まれる。ある特定の実施形態では、バリアントポリペプチドは、本明細書に記載されるように、ＨＲＳ参照ポリペプチドの対応する配列（例えば、表もしくは配列表中に列挙されるタンパク質またはかかる表もしくは配列表から誘導可能なタンパク質のいずれか）に対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％またはそれ超の配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含み、その参照ポリペプチドの非正準活性を実質的に保持する。１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０またはそれ超のアミノ酸の付加、欠失または置換によって参照ＨＲＳ配列とは異なるが、参照ＨＲＳポリペプチドの特性を保持する配列もまた含まれる。ある特定の実施形態では、このアミノ酸の付加または欠失は、ＨＲＳ参照ポリペプチドのＣ末端および／またはＮ末端において生じる。ある特定の実施形態では、このアミノ酸付加は、ＨＲＳ参照ポリペプチドのＣ末端および／またはＮ末端に対して近位である１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０またはそれ超の野生型残基（即ち、対応する全長ＨＲＳポリペプチド由来）を含む。
【０１００】
一部の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドは、配列番号１〜１０６、１７０〜１８１または１８５〜１９１のうちの１つまたは複数中に示されるＨＲＳポリペプチド配列のアミノ酸を含むか、かかるアミノ酸からなるか、またはかかるアミノ酸から本質的になる、約４５〜２５０アミノ酸または約５０〜２５０アミノ酸の、全長ヒスチジルｔＲＮＡシンテターゼのポリペプチド断片を含む。一部の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１４１、１〜４０８、１〜１１３または１〜６０を含むか、またはかかる残基からなるか、またはかかる残基から本質的になる。一部の態様では、このＨＲＳポリペプチドは、配列番号１の残基１〜６０＋１７５〜５０９、１〜６０＋２１１〜５０９または１〜６０＋１０１〜５０９を含むか、またはかかる残基からなるか、またはかかる残基から本質的になる、スプライスバリアントである。特定の態様では、このＨＲＳポリペプチドは、配列番号１の残基１〜４８または１〜５０６を含むか、またはかかる残基からなるか、またはかかる残基から本質的になる。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、本発明のＨＲＳポリペプチドは、抗炎症活性をｉｎ  ｖｉｖｏでモジュレートすることが可能であるか、または抗体もしくは自己反応性Ｔ細胞遮断活性を有することが可能な全長ＨＲＳポリペプチドの最小活性断片を含むか、またはかかる断片からなるか、またはかかる断片から本質的になる。一態様では、かかる最小活性断片は、ＷＨＥＰドメイン（即ち、配列番号１の約アミノ酸１〜４３）を含むか、またはかかるドメインからなるか、またはかかるドメインから本質的になる。一部の態様では、この最小活性断片は、アミノアシル化ドメイン（即ち、配列番号１の約アミノ酸５４〜３９８）を含むか、またはかかるドメインからなるか、またはかかるドメインから本質的になる。一部の態様では、この最小活性断片は、アンチコドン結合ドメイン（即ち、配列番号１の約アミノ酸４０６〜５０１）を含むか、またはかかるドメインからなるか、またはかかるドメインから本質的になる。他の例示的な活性断片は、以下の表Ｄ４中に示される。
【０１０２】
【表４−１】
2020141673.tif 000010
【０１０３】
【表４−２】
2020141673.tif 000011
【０１０４】
【表４−３】
2020141673.tif 000012
【０１０５】
一部のＨＲＳポリペプチドについて、ＨＲＳポリペプチドの約２０〜４０、２０〜４５、２０〜５０、２０〜５５、もしくは２０〜６０、２０〜６５、もしくは２０〜６７の連続もしくは非連続アミノ酸または少なくとも約２０〜４０、２０〜４５、２０〜５０、２０〜５５、もしくは２０〜６０、２０〜６５、もしくは２０〜６７の連続もしくは非連続アミノ酸は、配列番号１のアミノ酸１〜６７由来である。特定の実施形態では、ＨＲＳポリペプチドの約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６または６７の連続または非連続アミノ酸は、配列番号１のアミノ酸１〜６７由来である。このＨＲＳポリペプチドは、ＷＨＥＰドメイン、アミノアシル化ドメイン、アンチコドン結合ドメインまたはそれらの任意の組合せのうちの１つまたは複数を含み得る。特定の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドは、機能的アミノアシル化ドメインを欠く。一部の実施形態では、このポリペプチドは、ヒトＨＲＳ由来のＷＨＥＰドメインから本質的になる。いずれか１つの理論に束縛されることは望まないが、特定のＨＲＳポリペプチド中のＷＨＥＰドメインの独自の配向またはコンフォメーションは、これらのタンパク質において観察される増強された非正準活性および／または抗体遮断活性に寄与し得る。
【０１０６】
従って、ある特定の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドは、ヒトＨＲＳのＷＨＥＰドメイン配列を含むか、またはかかるドメイン配列からなるか、またはかかるドメイン配列から本質的になる。一部の実施形態では、このヒトＨＲＳのＷＨＥＰドメイン配列は、特定の保存された残基によって規定される。例えば、一部の態様では、このＨＲＳポリペプチドは、以下の表Ｄ５中のヒトＨＲＳのＷＨＥＰドメインコンセンサス配列を含むか、またはかかる配列からなるか、またはかかる配列から本質的になる。
【０１０７】
ある特定の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドは、最小ドメインを異種タンパク質（例えば、Ｆｃドメイン）またはスプライスバリアントに接続する可撓性リンカーの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または全２９アミノ酸を含み得る。
【０１０８】
記述「配列同一性」または例えば、「〜に対して５０％同一の配列」を含むとは、本明細書で使用する場合、比較のウインドウにわたってヌクレオチド毎を基礎にしてまたはアミノ酸毎を基礎にして、それらの配列が同一である程度を指す。従って、「配列同一性の百分率」は、比較のウインドウにわたって２つの最適にアラインされた配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が両方の配列において存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を得、比較のウインドウ中の位置の総数（即ち、ウインドウサイズ）によってこの一致した位置の数を除算し、その結果に１００を乗じて配列同一性の百分率を得ることによって、計算され得る。
【０１０９】
２つまたはそれ超のポリペプチド間の配列の関係性を記述するために使用される用語には、「参照配列」、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の百分率」および「実質的同一性」が含まれる。「参照配列」は、長さにおいてヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含めて、少なくとも１２であるが、頻繁には１５〜１８およびしばしば少なくとも２５のモノマー単位である。２つのポリペプチドの各々が、（１）２つのポリペプチド間で類似している配列（即ち、完全ポリペプチド配列の一部分のみ）、および（２）２つのポリペプチド間で多様である配列を含み得るので、２つ（またはそれ超の）ポリペプチド間の配列比較は典型的に、配列類似性の局所的領域を同定および比較するために、「比較ウインドウ」にわたって２つのポリペプチドの配列を比較することによって実施される。「比較ウインドウ」とは、２つの配列を最適にアラインした後に、配列が、同じ数の連続位置の参照配列と比較される、少なくとも６連続する位置、通常は約５０〜約１００、より通常は約１００〜約１５０の概念的セグメントを指す。比較ウインドウは、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して、約２０％またはそれ未満の付加または欠失（即ち、ギャップ）を含み得る。比較ウインドウをアラインするための配列の最適なアラインメントは、アルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）のコンピューター化実行によって、または検査および選択された種々の方法のいずれかによって生成された最良のアラインメント（即ち、比較ウインドウにわたって最も高い百分率の相同性を生じる）によって、実施され得る。例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５巻：３３８９頁によって開示されるような、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラムに対しても参照がなされ得る。配列分析の詳細な議論は、Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ、１９９４年〜１９９８年、第１５章のユニット１９．３において見出すことができる。
【０１１０】
配列間の配列類似性または配列同一性（これらの用語は、本明細書で相互交換可能に使用される）の計算は、以下のように実施され得る。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、これらの配列は、最適な比較目的のためにアラインされ得る（例えば、ギャップが、最適なアラインメントのために第１および第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方中に導入され得、非相同配列が、比較目的のために無視され得る）。ある特定の実施形態では、比較目的のためにアラインされる参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有される場合、これらの分子は、その位置において同一である。
【０１１１】
２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、それらの配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
【０１１２】
２つの配列間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。好ましい一実施形態では、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれかを使用し、１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ重みおよび１、２、３、４、５または６の長さ重みを使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム中に組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８巻：４４４〜４５３頁）のアルゴリズムを使用して決定される。さらに別の好ましい一実施形態では、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクスならびに４０、５０、６０、７０または８０のギャップ重みおよび１、２、３、４、５または６の長さ重みを使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを使用して決定される。特に好ましいセットのパラメーター（および特記しない限り使用すべき１つ）は、１２のギャップペナルティ、４のギャップ伸長ペナルティおよび５のフレームシフトギャップペナルティを用いる、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリクスである。２つのアミノ酸配列間またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）中に組み込まれたＥ．  ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．  Ｍｉｌｌｅｒ（１９８９年、Ｃａｂｉｏｓ、４巻：１１〜１７頁）のアルゴリズムを使用しても、決定され得る。
【０１１３】
本明細書に記載される核酸配列およびタンパク質配列は、例えば他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するために、公的データベースに対する検索を実施するための「クエリー配列」として使用され得る。かかる検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ、２１５巻：４０３〜１０頁）のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施され得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施され得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施され得る。比較目的のためにギャップ付きアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５巻：３３８９〜３４０２頁、１９９７年）に記載されるように利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、代表的プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターが使用され得る。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、バリアントポリペプチドは、残基の少なくとも１％であるが２０％未満、１５％未満、１０％未満または５％未満が、対応するＨＲＳ参照配列とは異なる。この比較がアラインメントを必要とする場合、これらの配列は、最大の類似性になるようにアラインすべきである。欠失もしくは挿入から「ループ」アウトされた配列、またはミスマッチは、差異とみなされる。これらの差異は、適切には、非必須残基における差異もしくは変化または保存的置換である。ある特定の実施形態では、バリアントＨＲＳポリペプチドの分子量は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％またはそれ超、ＨＲＳ参照ポリペプチドの分子量とは異なる。
【０１１５】
ＨＲＳ参照ポリペプチドの生物学的に活性な「断片」、即ち、ＨＲＳタンパク質断片の生物学的に活性な断片もまた含まれる。代表的な生物学的に活性な断片は一般に、相互作用、例えば、分子内相互作用または分子間相互作用に関与する。分子間相互作用は、特異的結合相互作用または酵素的相互作用であり得る。分子間相互作用は、ＨＲＳポリペプチドと細胞性結合パートナー、例えば、ＨＲＳポリペプチドの非正準活性に関与する細胞性受容体または他の宿主分子との間の相互作用であり得る。
【０１１６】
ＨＲＳ参照ポリペプチドの生物学的に活性な断片は、それらの間の全ての整数（例えば、１０１、１０２、１０３）および範囲（例えば、５０〜１００、５０〜１５０、５０〜２００）を含め、本明細書に記載されるＨＲＳ参照ポリペプチドのいずれか１つに示されるアミノ酸配列の、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３８０、４００、４５０、５００、５０５またはそれ超の連続または非連続アミノ酸である、ポリペプチド断片であり得る。ある特定の実施形態では、生物学的に活性な断片は、非正準活性関連の配列、ドメインまたはモチーフを含む。ある特定の実施形態では、任意のＨＲＳ参照ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端領域は、その短縮型ＨＲＳポリペプチドが参照ポリペプチドの非正準活性を保持する限り、それらの間の全ての整数および範囲（例えば、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５）を含め、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００もしくはそれ超のアミノ酸、または約１０〜５０、２０〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４５０、４５０〜５００もしくはそれ超のアミノ酸だけ短縮され得る。特定の例示的な短縮型ＨＲＳポリペプチドおよびヒトＨＲＳのＷＨＥＰドメインのコンセンサス配列は、以下の表Ｄ５中に示される。
【０１１７】
【表５−１】
2020141673.tif 000013
【０１１８】
【表５−２】
2020141673.tif 000014
【０１１９】
【表５−３】
2020141673.tif 000015
【０１２０】
本発明のＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートのいずれかにおいて、ＨＲＳポリペプチドのＮ末端アミノ酸（例えば、Ｎ末端Ｍｅｔ）が、本明細書に記載される例示的な短縮型ＨＲＳポリペプチドまたは他のＨＲＳ配列のいずれかからさらに欠失し得ることが理解される。
【０１２１】
典型的に、生物学的に活性な断片は、それが誘導される生物学的に活性なＨＲＳ参照ポリペプチドの活性（即ち、非正準活性）の約１％、１０％、２５％または５０％以上を有する。かかる非正準活性を測定するための例示的な方法は、実施例に記載される。
【０１２２】
一部の実施形態では、ＨＲＳタンパク質、バリアントおよびそれらの生物学的に活性な断片は、少なくとも約０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、１００または１５０ｎＭの親和性で、１つまたは複数の細胞性結合パートナーと結合する。一部の実施形態では、選択された細胞性結合パートナー、特に非正準活性に関与する結合パートナーに対する、ＨＲＳタンパク質断片の結合親和性は、少なくとも約１．５×、２×、２．５×、３×、３．５×、４×、４．５×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１５×、２０×、２５×、３０×、４０×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、１００×、２００×、３００×、４００×、５００×、６００×、７００×、８００×、９００×、１０００×またはそれ超（それらの間の全ての整数を含む）、対応する全長ＨＲＳポリペプチドまたは特定の選択的スプライシングされたＨＲＳポリペプチドバリアントのものよりも強力であり得る。
【０１２３】
上述のように、ＨＲＳポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、短縮および挿入を含む種々の方法で変更され得る。かかる操作のための方法は、当該分野で一般に公知である。例えば、ＨＲＳ参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡ中の変異によって調製され得る。変異誘発およびヌクレオチド配列変更のための方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ８２巻：４８８〜４９２頁）、Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５４巻：３６７〜３８２号）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ，  Ｊ．  Ｄ．ら（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ」、第４版、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ、Ｍｅｎｌｏ
Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ．、１９８７年）およびこれらの中で引用される参考文献を参照のこと。目的のタンパク質の生物学的活性に影響を与えないアミノ酸置換を充当するためのガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９７８年）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｆｏｕｎｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．）のモデルにおいて見出され得る。
【０１２４】
生物学的に活性な短縮型および／またはバリアントＨＲＳポリペプチドは、参照ＨＲＳアミノ酸残基と比較して、その配列に沿った種々の位置において保存的アミノ酸置換を含み得、かかるさらなる置換は、変更されたシステイン含量を有するＨＲＳポリペプチドの活性または安定性をさらに増強し得る。「保存的アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基でアミノ酸残基が置き換えられる置換である。以下のように一般に下位分類され得る、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当該分野において規定されている：
酸性：この残基は、生理学的ｐＨにおけるＨイオンの喪失に起因して負の電荷を有し、この残基は、ペプチドが生理学的ｐＨにおいて水性媒体中に存在する場合に、この残基が含まれるペプチドのコンフォメーションにおける表面位置を求めるように、水性溶液によって引きつけられる。酸性側鎖を有するアミノ酸には、グルタミン酸およびアスパラギン酸が含まれる。
【０１２５】
塩基性：この残基は、生理学的ｐＨにおけるまたはその１もしくは２のｐＨ単位内でのＨイオンとの会合に起因して正の電荷を有し（例えば、ヒスチジン）、この残基は、ペプチドが生理学的ｐＨにおいて水性媒体中に存在する場合に、この残基が含まれるペプチドのコンフォメーションにおける表面位置を求めるように、水性溶液によって引きつけられる。塩基性側鎖を有するアミノ酸には、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが含まれる。
【０１２６】
荷電：これらの残基は、生理学的ｐＨにおいて荷電し、従って、これには酸性側鎖または塩基性側鎖を有するアミノ酸（即ち、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リシンおよびヒスチジン）が含まれる。
【０１２７】
疎水性：これらの残基は、生理学的ｐＨにおいて荷電せず、この残基は、ペプチドが水性媒体中に存在する場合に、この残基が含まれるペプチドのコンフォメーションにおける内部位置を求めるように、水性溶液によって反発される。疎水性側鎖を有するアミノ酸には、チロシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニンおよびトリプトファンが含まれる。
【０１２８】
中性／極性：これらの残基は、生理学的ｐＨにおいて荷電しないが、この残基は、水性溶液によって十分には反発されず、その結果、この残基は、ペプチドが水性媒体中に存在する場合に、この残基が含まれるペプチドのコンフォメーションにおける内部位置を求める。中性／極性側鎖を有するアミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、システイン、ヒスチジン、セリンおよびスレオニンが含まれる。
【０１２９】
この説明はまた、特定のアミノ酸を「小さい」として特徴付けているが、これは、それらの側鎖が、極性基を欠いていても、疎水性を付与するのに十分には大きくないからである。プロリンを除いて、「小さい」アミノ酸は、少なくとも１つの極性基が側鎖上に存在する場合、４つまたはそれ未満の炭素を有するアミノ酸であり、存在しない場合には、３つまたはそれ未満の炭素を有するアミノ酸である。小さい側鎖を有するアミノ酸には、グリシン、セリン、アラニンおよびスレオニンが含まれる。遺伝子にコードされる二次アミノ酸プロリンは、ペプチド鎖の二次コンフォメーションに対するその公知の効果に起因して、特別の場合である。プロリンの構造は、その側鎖が、α−アミノ基の窒素ならびにα−炭素に結合しているという点で、他の全ての天然に存在するアミノ酸とは異なる。いくつかのアミノ酸類似性マトリクスが、当該分野で公知である（例えば、Ｄａｙｈｏｆｆら、１９７８年、Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ
ｐｒｏｔｅｉｎｓによって例えば開示される、ＰＡＭ１２０マトリクスおよびＰＡＭ２５０マトリクスを参照のこと）。しかし、Ｍ．  Ｏ．  Ｄａｙｈｏｆｆ（編）、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、５巻、３４５〜３５８頁、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣにおける；およびＧｏｎｎｅｔら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６巻：１４４３０〜１４４５頁、１９９２年）による距離の関係性を決定するためのマトリクスは、プロリンを、グリシン、セリン、アラニンおよびスレオニンと同じ群中に含めている。従って、本発明の目的のために、プロリンは、「小さい」アミノ酸として分類される。
【０１３０】
極性または非極性としての分類のために必要とされる引きつけまたは反発の程度は任意であり、従って、本発明によって具体的に企図されるアミノ酸は、一方または他方として分類されている。具体的に命名されていないほとんどのアミノ酸は、既知の挙動を基礎として分類され得る。
【０１３１】
アミノ酸残基は、環式または非環式、および芳香族または非芳香族、残基の側鎖置換基に関して自明の分類、および小型または大型として、さらに下位分類され得る。残基は、さらなる極性置換基が存在することを条件として、カルボキシル炭素を含めて、合計４つまたはそれ未満の炭素原子を含む場合に小さいとみなされる；そうでない場合には３つまたはそれ未満を含む場合に小さいとみなされる。小さい残基は、当然、常に非芳香族である。その構造的特性に依存して、アミノ酸残基は、２つまたはそれ超のクラスに入り得る。天然に存在するタンパク質アミノ酸について、このスキームに従う下位分類は、表Ａ中に提示される。
【０１３２】
【表５−４】
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【０１３３】
保存的アミノ酸置換は、側鎖に基づく群分けもまた含む。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リシン、アルギニンおよびヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。例えば、イソロイシンもしくはバリンによるロイシンの置き換え、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置き換え、セリンによるスレオニンの置き換え、または構造的に関連するアミノ酸によるあるアミノ酸の類似の置き換えが、得られたバリアントポリペプチドの特性に対して大きな影響を有さないであろうと予測することは合理的である。アミノ酸変化が機能的な短縮型および／またはバリアントＨＲＳポリペプチドを生じるかどうかは、本明細書に記載されるように、その非正準活性をアッセイすることによって、容易に決定され得る。保存的置換は、例示的な置換の見出しの下に、表Ｂ中に示される。本発明の範囲内に入るアミノ酸置換は、一般に、（ａ）置換の領域におけるペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、（ｃ）側鎖の嵩高さ、または（ｄ）生物学的機能を維持することに対するその影響が顕著には異ならない置換を選択することによって達成される。置換が導入された後、これらのバリアントは、生物学的活性についてスクリーニングされる。
【０１３４】
【表５−５】
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【０１３５】
あるいは、保存的置換を行うための類似のアミノ酸は、側鎖の正体に基づいて３つのカテゴリーに群分けされ得る。Ｚｕｂａｙ，  Ｇ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、Ｗｍ．Ｃ．  Ｂｒｏｗｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９３年）に記載されるように、第１の群は、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リシン、ヒスチジンを含み、その全てが荷電側鎖を有する；第２の群は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、グルタミン、アスパラギンを含み；第３の群は、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンを含む。
【０１３６】
ヒトＨＲＳのＷＨＥＰドメインのＮＭＲ構造は、決定されている（Ｎａｍｅｋｉら、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  １Ｘ５９＿Ａを参照のこと）。さらに、全長ヒトＨＲＳおよびＨＲＳの内部触媒ドメイン欠失変異体（ＨＲＳΔＣＤ）の結晶構造もまた、決定されている（Ｘｕら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．  ２０巻：１４７０〜７頁、２０１２年；および米国特許出願第６１／６７４，６３９号を参照のこと）。ＨＲＳの一次アミノ酸配列と併せて、このタンパク質のこれらの詳細な物理的記述は、タンパク質内の特定のアミノ酸によって果たされる役割に関する正確な洞察を提供する。従って、当業者は、他の構造的特徴のうちで、構造的に保存されたドメイン、連結領域、二次構造、例えばアルファ−ヘリックス、表面または溶媒曝露されたアミノ酸、曝露されていないまたは内部領域、触媒部位およびリガンド相互作用表面を同定するために、この情報を使用できる。かかる当業者は、次いで、例えば、これらおよび他の構造的特徴内のまたはそれらに隣接したアミノ酸残基の特徴を保存または変更することによって、例えば、野生型残基と比較して、選択されたアミノ酸側鎖（複数可）の極性、ハイドロパシー指標、電荷、サイズおよび／または位置付け（即ち、内向き、外向き）を保存または変更することによって、目的の非正準活性を保持または改善するＨＲＳバリアントを容易に操作するために、その情報または他の情報を使用できる（例えば、Ｚａｉｗａｒａら、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ５１巻：６７〜１０２頁、２０１２年；ＰｅｒｏｎａおよびＨａｄｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ５１巻：８７０５〜２９頁、２０１２年；Ｍｏｒｉｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌ．  ２９巻：１５９〜６６頁、２０１１年；Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ４０巻：８１〜９８頁、２０１１年；および米国特許出願第６１／６７４，６３９号を参照のこと）。
【０１３７】
従って、短縮型および／またはバリアントＨＲＳポリペプチド中の予測された非必須アミノ酸残基は、典型的に、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換えられる。あるいは、変異が、例えば飽和変異誘発によって、ＨＲＳコード配列の全てまたは一部に沿ってランダムに導入され得、得られた変異体は、その活性を保持する変異体を同定するために、親ポリペプチドの活性についてスクリーニングされ得る。コード配列の変異誘発後に、コードされたペプチドは組換え発現され得、ペプチドの活性が決定され得る。「非必須」アミノ酸残基は、その非正準活性のうちの１つまたは複数を無効にすることも実質的に変更することもなしに、実施形態ポリペプチドの参照配列から変更され得る残基である。適切には、この変更は、これらの活性のうちの１つを実質的に無効にしない、例えば、この活性は、参照ＨＲＳ配列の少なくとも２０％、４０％、６０％、７０％または８０％、１００％、５００％、１０００％またはそれ超である。「必須」アミノ酸残基は、ＨＲＳポリペプチドの参照配列から変更された場合に、参照活性の２０％未満が存在するように、親分子の活性の無効化を生じる残基である。例えば、かかる必須アミノ酸残基には、種々の供給源由来のＨＲＳポリペプチドの活性な結合部位（複数可）またはモチーフ（複数可）において保存された配列を含む、異なる種にわたってＨＲＳポリペプチドにおいて保存された残基が含まれる。
【０１３８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞からのサイトカイン放出の慣用的な測定ベースの、および動物研究を含む、抗炎症活性を決定するためのアッセイは、当該分野で十分確立されており（例えば、Ｗｉｔｔｍａｎｎら、Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．（６５巻）：ｅ４２０３頁．ｄｏｉ：１０．３７９１／４２０３、２０１２年；Ｆｅｌｄｍａｎら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．  ４７巻：５８５〜９５頁、２０１２年；Ｃｌｕｔｔｅｒｂｕｃｋら、Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．  ７４巻：７０４〜１５頁、２０１１年、ＧｉｄｄｉｎｇｓおよびＭａｉｔｒａ、Ｊ
Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ．  １５巻：１２０４〜１０頁、２０１０年；Ｗｉｊｎｈｏｖｅｎら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ．  ２５巻：１７７〜８５頁、２００８年；ならびにＦｒｏｗら、Ｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ．  ２４巻：２７６〜９８頁、２００４年を参照のこと）、抗炎症活性をプロファイリングおよび最適化するために、容易に使用され得る。例示的なｉｎ  ｖｉｖｏ実験系もまた、添付の実施例中に記載されている。
【０１３９】
一部の実施形態では、ＨＲＳポリペプチドは、１つまたは複数のシステイン置換を有し得、ここで、１つまたは複数の天然に存在する（非システイン）残基が、（例えば、安定性を変更するために、Ｆｃ断片のチオールベースのコンジュゲート化を促進するために、ＰＥＧまたは他の分子のチオールベースの結合を促進するために）システインで置換されている。一部の実施形態では、システイン置換は、ＨＲＳポリペプチド（例えば、配列番号１〜１０６、１７０〜１８１または１８５〜１９１）のＮ末端および／もしくはＣ末端、またはＨＲＳポリペプチドの他の表面曝露された領域の近傍である。特定の実施形態は、配列番号１〜１０６、１７０〜１８１または１８５〜１９１のいずれか１つのＮ末端および／またはＣ末端に対して０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５アミノ酸以内の残基のうちの１つまたは複数がシステイン残基で置換される場合を含む。一部の実施形態では、システイン残基は、Ｎ末端またはＣ末端融合タンパク質の創出を介して、ＨＲＳポリペプチドに付加され得る。かかる融合タンパク質は、任意の長さのものであり得るが、典型的には約１〜５、または約５〜１０、約１０〜２０、または約２０〜３０アミノ酸長である。一部の実施形態では、Ｃ末端への融合が好ましい。
【０１４０】
ＨＲＳポリペプチドＨＲＳ（１−６０）に基づく、かかるシステイン改変タンパク質の具体的な例示的な実施形態は、表Ｄ６中に示される。このアプローチは、表Ｄ５のＨＲＳポリペプチドおよび本明細書に記載される他のＨＲＳポリペプチドに、直接適用可能である。
【０１４１】
【表６】
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【０１４２】
一部の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドには、内因性または天然に存在するシステイン残基が代替的アミノ酸に変異しているまたは欠失している変異体が含まれ得る。一部の実施形態では、ＨＲＳポリペプチド中へのシステイン残基（複数可）の挿入または置換は、他の表面曝露された反応性システイン残基の排除と組み合わされ得る。従って、一部の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドは、例えば天然に存在するシステイン残基を除去するために、Ｃｙｓ８３、Ｃｙｓ１７４、Ｃｙｓ１９１、Ｃｙｓ１９６、Ｃｙｓ２２４、Ｃｙｓ２３５、Ｃｙｓ３７９、Ｃｙｓ４５５、Ｃｙｓ５０７および／またはＣｙｓ５０９（配列番号１によって規定される）において、１つまたは複数の置換および／または欠失を含み得る。
【０１４３】
具体的な実施形態には、Ｃｙｓ８３、Ｃｙｓ１７４、Ｃｙｓ１９１、Ｃｙｓ１９６、Ｃｙｓ２２４、Ｃｙｓ２３５、Ｃｙｓ３７９、Ｃｙｓ４５５のうちいずれか１つもしくは複数の変異もしくは欠失、または例えばＣ末端３アミノ酸の欠失（Δ５０７−５０９）によるＣｙｓ５０７およびＣｙｓ５０９の欠失を有する、配列番号１〜１０６、１７０〜１８１もしくは１８５〜１９１のいずれか１つ、またはそれらのバリアントもしくは断片が含まれる。これらの位置における例示的な変異には、例えば、システインからセリン、アラニン、ロイシン、バリンまたはグリシンへの変異が含まれる。ある特定の実施形態では、特異的システイン置換のためのアミノ酸残基は、他の種および生物由来のＨＲＳオルソログにおいて見出される天然に存在する置換から選択され得る。この型の例示的な置換は、表Ｄ７中に示される。
【０１４４】
【表７】
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【０１４５】
一部の実施形態では、変異誘発のために選択される天然に存在するシステインは、その表面曝露に基づいて選択される。従って、一態様では、置換のために選択されるシステイン残基は、Ｃｙｓ２２４、Ｃｙｓ２３５、Ｃｙｓ５０７およびＣｙｓ５０９から選択される。一部の実施形態では、配列番号１の最後の３つの（Ｃ末端）残基は、残基５０７〜５０９を欠失するように欠失している。一部の実施形態では、これらのシステインは、分子内システイン対、例えばＣｙｓ１７４およびＣｙｓ１９１を排除するように、変異または欠失のために選択される。
【０１４６】
表面曝露されたシステイン残基を低減させるための所望のシステイン変異／置換（太字下線で示される）の具体的なさらなる例には、表Ｄ８中に以下に列挙されるものが含まれる。
【０１４７】
【表８−１】
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【０１４８】
【表８−２】
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【０１４９】
【表８−３】
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【０１５０】
【表８−４】
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【０１５１】
【表８−５】
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【０１５２】
一部の実施形態では、かかるシステイン置換変異体は、規定された表面曝露された位置において新たな表面曝露されたシステイン残基を操作して入れ込む、挿入するまたは他の方法で導入するために改変され、ここで、導入された残基は、ＨＲＳポリペプチドの非正準活性を実質的に妨害しない。具体的な例には、例えば、上記低減したシステインのＨＲＳポリペプチドのいずれかのＮ末端またはＣ末端における、さらなるシステイン残基の挿入（または再挿入戻し）が含まれる。一部の実施形態では、かかるＮ末端またはＣ末端の表面曝露されたシステインの挿入は、ＨＲＳポリペプチドの低減したシステインバリアントへの、全長ヒトＨＲＳの最後の１つ、最後の２つまたは最後の３つの天然に存在するＣ末端アミノ酸の再挿入、例えば、配列ＣＩＣ（Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ｃｙｓ）の全てまたは一部の再挿入を含む。例示的な低減したシステイン変異体には、例えば、配列番号１〜１０６、１７０〜１８１もしくは１８５〜１９１または表Ｄ１、Ｄ３〜Ｄ６もしくはＤ８のＨＲＳポリペプチドのいずれかにおける、残基Ｃｙｓ１７４、Ｃｙｓ１９１、Ｃｙｓ２２４およびＣｙｓ２３５における変異（またはそれらの欠失）の任意の組合せ、ならびに／またはＣｙｓ５０７およびＣｙｓ５０９の欠失もしくは置換（全長ヒトＨＲＳ（配列番号１）の番号付けに基づく）が含まれる。
【０１５３】
Ｆｃ領域またはＰＥＧまたは他の異種分子などの異種分子への部位特異的なコンジュゲート化または結合のいくつかの型について、ＨＲＳポリペプチドは、１つまたは複数のグルタミン置換を有し得、ここで、１つまたは複数の天然に存在する（非グルタミン）残基は、例えば、グルタミンのアミド基への分子（複数可）のトランスグルタミナーゼ触媒性の結合を促進するために、グルタミンで置換される。一部の実施形態では、グルタミン置換は、ＨＲＳポリペプチド（例えば、配列番号１〜１０６、１７０〜１８１もしくは１８５〜１９１、または表Ｄ１、Ｄ３〜Ｄ６もしくはＤ８のＨＲＳポリペプチド）のＮ末端および／またはＣ末端の近傍に導入される。特定の実施形態は、配列番号１〜１０６、１７０〜１８１または１８５〜１９１のいずれか１つのＮ末端および／またはＣ末端に対して０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５アミノ酸以内の残基のうちの１つまたは複数が、グルタミン残基で置換される場合を含む。これらおよび関連のＨＲＳポリペプチドはまた、任意の天然に存在するグルタミン残基を除去し、所望の場合、それによって部位特異的なコンジュゲート化または結合の程度を調節するために、置換（例えば、保存的置換）を含み得る。
【０１５４】
Ｆｃ領域またはＰＥＧまたは他の異種分子などの異種分子への部位特異的なコンジュゲート化または結合の特定の型について、ＨＲＳポリペプチドは、１つまたは複数のリシン置換を有し得、ここで、１つまたは複数の天然に存在する（非リシン）残基は、例えば、リシンのアミノ基への分子（複数可）のアシル化またはアルキル化に基づく結合を促進するために、リシンで置換される。これらの方法はまた、典型的には、Ｎ末端残基への分子（複数可）の結合を生じる。一部の実施形態では、リシン置換は、ＨＲＳポリペプチド（例えば、配列番号１〜１０６、１７０〜１８１もしくは１８５〜１９１、または表Ｄ１、Ｄ３〜Ｄ６もしくはＤ８のＨＲＳポリペプチド）のＮ末端および／またはＣ末端の近傍である。特定の実施形態は、配列番号１〜１０６、１７０〜１８１もしくは１８５〜１９１（または表Ｄ１、Ｄ３〜Ｄ６もしくはＤ８のＨＲＳポリペプチド）のいずれか１つのＮ末端および／もしくはＣ末端に対して０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５アミノ酸以内の残基のうちの１つもしくは複数が、リシン残基で置換される場合を含む。これらおよび関連のＨＲＳポリペプチドはまた、任意の天然に存在するリシン残基を除去し、所望の場合、それによって部位特異的なコンジュゲート化または結合の程度を調節するために、置換（例えば、保存的置換）を含み得る。
【０１５５】
ＨＲＳポリペプチドへの部位特異的なコンジュゲート化は、ＨＲＳポリペプチドの１つまたは複数の溶媒アクセス可能な表面アミノ酸を置換することによっても、実施され得る。例えば、適切な溶媒アクセス可能なアミノ酸は、例示的なＨＲＳポリペプチドの公開された結晶構造を使用し、ＳＰＩＤＤＥＲサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｓｐｐｉｄｅｒ．ｃｃｈｍｃ．ｏｒｇ／）を使用して予測された溶媒アクセス可能性に基づいて決定され得る（Ｘｕら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．  ２０巻：１４７０〜７頁、２０１２年；および米国特許出願第６１／６７４，６３９号を参照のこと）。この分析に基づいて、表面上のいくつかのアミノ酸は、コンジュゲート化または結合に適切な官能基を導入するための変異部位として潜在的に使用され得る。結晶構造に基づくアミノ酸の表面アクセス可能性スコアが計算され得、ここで、より高いスコアは、より良いアクセス可能性を示す。特定の実施形態では、より高いスコア（例えば、＞４０）が好ましい。従って、一部の実施形態では、４０よりも大きい表面アクセス可能性スコアを有するアミノ酸位置が、システイン、リシン、グルタミンまたは他の天然に存在しないアミノ酸を導入するために使用され得る。
【０１５６】
特定の実施形態では、溶媒アクセス可能な表面アミノ酸は、アラニン、グリシンおよびセリンからなる群から選択され、システイン、グルタミンもしくはリシンが含まれるがこれらに限定されない天然に存在するアミノ酸、または部位特異的なコンジュゲート化もしくは結合のために最適化された天然に存在しないアミノ酸で置換され得る。
【０１５７】
種々の実施形態では、本発明は、Ｆｃ領域またはＰＥＧまたは他の異種分子などの異種分子に結合した官能基と共有結合を形成する官能基を含む天然に存在しないアミノ酸を置換することによる、ＨＲＳポリペプチド中の任意のアミノ酸位置における部位特異的なコンジュゲート化または結合を企図する。非天然アミノ酸は、例えば、配列番号１〜１０６、１７０〜１８１もしくは１８５〜１９１（または表Ｄ１、Ｄ３〜Ｄ６もしくはＤ８のＨＲＳポリペプチド）のいずれか１つのＮ末端および／もしくはＣ末端に対して０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５アミノ酸以内の残基のうちの１つもしくは複数において；配列番号１〜１０６、１７０〜１８１もしくは１８５〜１９１（または表Ｄ１、Ｄ３〜Ｄ６もしくはＤ８のＨＲＳポリペプチド）のいずれか１つのＮ末端および／もしくはＣ末端において；あるいは本明細書に記載される溶媒アクセス可能な表面アミノ酸残基において、挿入または置換され得る。
【０１５８】
特定の実施形態では、天然に存在しないアミノ酸には、任意のアミノ酸、改変アミノ酸、またはセレノシステイン以外のアミノ酸アナログ、および以下の２０種の遺伝子にコードされるアルファ−アミノ酸：アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンが含まれるがこれらに限定されない。アルファ−アミノ酸の一般構造は、以下の式によって例示される：
【０１５９】
【化１】
2020141673.tif 000025
【０１６０】
非天然アミノ酸は、典型的には、上述の式を有する任意の構造であり、式中、Ｒ基は、２０種の天然アミノ酸において使用される置換基以外の任意の置換基である。２０種の天然アミノ酸の構造については、例えば、生化学の教科書、例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｂｙ  Ｌ．  Ｓｔｒｙｅｒ、第３版、１９８８年、Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。本明細書に開示される非天然アミノ酸は、上記２０種のアルファ−アミノ酸以外の天然に存在する化合物であり得ることに留意されたい。本明細書に開示される非天然アミノ酸は、典型的には、側鎖のみが天然アミノ酸と異なるので、これらの非天然アミノ酸は、天然に存在するタンパク質において形成されるのと同じ様式で、例えば天然または非天然の他のアミノ酸とアミド結合を形成する。しかし、これらの非天然アミノ酸は、天然アミノ酸からそれらを識別する側鎖基を有する。例えば、上述の式中のＲは、任意選択で、アルキル−、アリール−、アリールハライド、ビニルハライド、アルキルハライド、アセチル、ケトン、アジリジン、ニトリル、ニトロ、ハライド、アシル−、ケト−、アジド−、ヒドロキシル−、ヒドラジン、シアノ−、ハロ−、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオエーテル、エポキシド、スルホン、ボロン酸、ボロン酸エステル、ボラン、フェニルボロン酸、チオール、セレノ−、スルホニル−、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環式−、ピリジル、ナフチル、ベンゾフェノン、シクロオクチンなどの束縛された環、チオエステル、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミノ、カルボン酸、アルファ−ケトカルボン酸、アルファもしくはベータ不飽和酸およびアミド、グリオキシルアミド、またはオルガノシラン基など、あるいはそれらの任意の組合せを含む。
【０１６１】
非天然アミノ酸の具体的な例には、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、β−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−セリン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧａｌＮＡｃ−α−スレオニン、α−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−スレオニン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、以下に列挙されるもの、または本発明の他の場所に列挙されるものなどが含まれるがこれらに限定されない。
【０１６２】
従って、所望の分子（例えば、Ｆｃ領域、ＰＥＧ）の任意の好ましい官能基と共有結合を形成する官能基を含む天然に存在しないアミノ酸を選択することができる。非天然アミノ酸は、一旦選択されると、供給業者から購入され得るか、または化学的に合成され得るかのいずれかである。任意の数の非天然アミノ酸が、標的分子中に取り込まれ得、これは、結合される所望の分子の数に従って変動し得る。これらの分子は、非天然アミノ酸の全てまたは一部のみに結合され得る。さらに、同じまたは異なる非天然アミノ酸が、所望の成果に依存して、ＨＲＳポリペプチド中に取り込まれ得る。ある特定の実施形態では、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ超の非天然アミノ酸が、ＨＲＳポリペプチド中に取り込まれ、そのうちいずれかまたは全てが、所望の官能基を含む分子にコンジュゲート化され得る。
【０１６３】
ある特定の態様では、非天然アミノ酸の使用は、ＨＲＳポリペプチドの選択された非正準活性を改変する（例えば、増加させる）ために、またはタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ半減期を変更するために、利用され得る。非天然アミノ酸は、本明細書の別の箇所に記載するように、ＨＲＳタンパク質の（選択的）化学的改変（例えば、ペグ化）を促進するためにも使用され得る。例えば、特定の非天然アミノ酸は、所与のタンパク質へのＦｃ領域またはＰＥＧなどのポリマーの選択的結合を可能にし、それによって、その薬物動態学的特性を改善する。
【０１６４】
アミノ酸アナログおよび模倣物の具体的な例は、例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるＲｏｂｅｒｔｓおよびＶｅｌｌａｃｃｉｏ、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ、編者ＧｒｏｓｓおよびＭｅｉｎｈｏｆｅｒ、５巻、３４１頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９８３年）中に記載されるのが見出され得る。他の例には、過アルキル化アミノ酸、特に過メチル化アミノ酸が含まれる。例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるＣｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、編者ＷｉｌｓｏｎおよびＣｚａｒｎｉｋ、第１１章、２３５頁、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ
＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９７年）を参照のこと。なお他の例には、そのアミド部分（および従って、得られたペプチドのアミド骨格）が、例えば、糖環、ステロイド、ベンゾジアゼピンまたはカルボサイクル（ｃａｒｂｏ  ｃｙｃｌｅ）によって置き換えられたアミノ酸が含まれる。例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるＢｕｒｇｅｒ’ｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、編者Ｍａｎｆｒｅｄ  Ｅ．  Ｗｏｌｆｆ、第１５章、６１９〜６２０頁、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９５年）を参照のこと。ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物およびタンパク質を合成する方法は、当該分野で周知である（例えば、その各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４２０，１０９号；Ｍ．  Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ、  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第１版および改訂第２版）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９８４年および１９９３年）、第７章を参照；ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、（第２版）、Ｐｉｅｒｃｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．（１９８４年）を参照のこと）。従って、本発明のＨＲＳポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸ならびにアミノ酸アナログおよび模倣物から構成され得る。
【０１６５】
ポリヌクレオチド
ある特定の実施形態は、ＨＲＳポリペプチドまたはＨＲＳ−Ｆｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。単独で、またはＨＲＳコード配列と組み合わせて、本明細書に記載されるＦｃ領域のうちの任意の１つまたは複数をコードするポリヌクレオチドもまた含まれる。他の使用のうちで、これらの実施形態は、所望のＨＲＳ、Ｆｃ領域、またはＨＲＳ−Ｆｃポリペプチドもしくはそのバリアントを組換え生成するために、あるいは選択された細胞または被験体においてＨＲＳ、Ｆｃ領域またはＨＲＳ−Ｆｃポリペプチドを発現させるために利用され得る。遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書に記載されるＨＲＳポリペプチドＨＲＳ−Ｆｃ融合タンパク質をコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが、当業者に理解される。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意のネイティブ遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有し得る。それにもかかわらず、コドン使用頻度における差異に起因して変動するポリヌクレオチド、例えば、ヒト、酵母または細菌のコドン選択について最適化されたポリヌクレオチドが、本発明によって具体的に企図される。
【０１６６】
当業者に認識されるように、ポリヌクレオチドは、一本鎖（コード鎖またはアンチセンス鎖）または二本鎖であり得、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成）分子またはＲＮＡ分子であり得る。さらなるコード配列または非コード配列は、必ずではないが、本発明のポリヌクレオチド内に存在し得、ポリヌクレオチドは、必ずではないが、他の分子および／または支持体材料に連結され得る。
【０１６７】
ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列（即ち、ＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドまたはその一部分をコードする内因性配列）を含み得るか、またはバリアント、もしくはかかる配列の生物学的機能的等価物を含み得る。ポリヌクレオチドバリアントは、以下にさらに記載するように、１つまたは複数の置換、付加、欠失および／または挿入を含み得、その結果、好ましくは、コードされたポリペプチドの活性は、未改変ポリペプチドと比較して実質的に減退されない。
【０１６８】
さらなる実施形態では、本発明は、ＨＲＳポリペプチドまたはＨＲＳ−Ｆｃ融合タンパク質に対して同一または相補的な配列の種々の長さの連続ストレッチを含む単離されたポリヌクレオチドを提供し、ここで、この単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載される短縮型ＨＲＳポリペプチドをコードする。
【０１６９】
従って、複数のポリヌクレオチドが、ＨＲＳポリペプチド、Ｆｃ領域および本発明の融合タンパク質をコードし得る。さらに、このポリヌクレオチド配列は、種々の理由のために操作され得る。例には、種々の生物におけるポリヌクレオチドの発現を増強するための好ましいコドンの取り込みが含まれるがこれに限定されない（一般に、Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．  ２８巻：２９２頁、２０００年を参照のこと）。さらに、サイレント変異が、制限部位を導入もしくは排除するため、ＣｐＧジヌクレオチドモチーフの密度を減少させるため（例えば、Ｋａｍｅｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３４９巻：１２６９〜１２７７頁、２００６年を参照のこと）、または一本鎖配列がステム−ループ構造を形成する能力を低減させるために（例えば、Ｚｕｋｅｒ  Ｍ．、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ３１巻：３４０６〜３４１５頁、２００３年を参照のこと）、取り込まれ得る。さらに、哺乳動物発現は、開始コドンにおいてＫｏｚａｋコンセンサス配列（即ち、（ａ／ｇ）ｃｃ（ａ／ｇ）ｃｃＡＴＧｇ）（配列番号１９９）を含むことによって、さらに最適化され得る。この目的のために有用なＫｏｚａｋコンセンサス配列は、当該分野で公知である（Ｍａｎｔｙｈら、ＰＮＡＳ  ９２巻：２６６２〜２６６６頁、１９９５年；Ｍａｎｔｙｈら、Ｐｒｏｔ．
Ｅｘｐ．  ＆  Ｐｕｒｉｆ．  ６巻：１２４頁、１９９５年）。例示的な野生型およびコドン最適化バージョンの種々のＨＲＳポリペプチドが、以下の表Ｄ９中に提供される。
【０１７０】
【表９−１】
2020141673.tif 000026
【０１７１】
【表９−２】
2020141673.tif 000027
【０１７２】
【表９−３】
2020141673.tif 000028
【０１７３】
【表９−４】
2020141673.tif 000029
【０１７４】
【表９−５】
2020141673.tif 000030
【０１７５】
【表９−６】
2020141673.tif 000031
【０１７６】
さらなるコード配列または非コード配列は、必ずではないが、本発明のポリヌクレオチド内に存在し得、ポリヌクレオチドは、必ずではないが、他の分子および／または支持体材料に連結され得る。従って、本発明のポリヌクレオチドは、コード配列自体の長さにかかわらず、他のＤＮＡまたはＲＮＡ配列、例えばプロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、マルチクローニング部位、他のコードセグメントなどと組み合わされ得、その結果、それらの全体的な長さは、かなり変動し得る。
【０１７７】
従って、ほとんど任意の長さのポリヌクレオチド断片が使用され得、その合計長さは、好ましくは、意図した組換えＤＮＡプロトコールにおける調製および使用の容易さによって限定されることが企図される。ＨＲＳ参照ポリヌクレオチド（例えば、塩基番号Ｘ〜Ｙ、ここで、Ｘは約１〜３０００またはそれ超であり、Ｙは約１０〜３０００またはそれ超である）またはその相補体の任意の一部分または断片（例えば、約６ヌクレオチド長超、７ヌクレオチド長超、８ヌクレオチド長超、９ヌクレオチド長超または１０ヌクレオチド長超）を含む、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４１、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２４０、２６０、２７０、２８０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００またはそれ超（その間の全ての整数を含む）塩基長のポリヌクレオチドが含まれる。
【０１７８】
本発明の実施形態は、ＨＲＳ参照ポリヌクレオチド配列の「バリアント」もまた含む。ポリヌクレオチド「バリアント」は、参照ポリヌクレオチドと比較して、１つまたは複数の置換、付加、欠失および／または挿入を含み得る。一般に、ＨＲＳ参照ポリヌクレオチド配列のバリアントは、デフォルトパラメーターを使用して本明細書の別の箇所に記載される配列アラインメントプログラムによって決定されるように、特定のヌクレオチド配列（例えば、配列番号１１１〜１２７、１８２〜１８４、１９２〜１９８など；実施例も参照のこと）に対して少なくとも約３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、一般には少なくとも約７５％、８０％、８５％、望ましくは約９０％〜９５％またはそれ超、より適切には約９８％またはそれ超の配列同一性を有し得る。ある特定の実施形態では、バリアントは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４１、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００（その間の全ての整数を含む）塩基またはそれ超が、参照配列とは異なり得る。ある特定の実施形態では、例えば、ポリヌクレオチドバリアントが非正準活性を有するＨＲＳポリペプチドをコードする場合、コードされたＨＲＳポリペプチドの所望の活性は、未改変ポリペプチドと比較して実質的に減退されない。コードされたポリペプチドの活性に対する影響は、本明細書に記載するように一般に評価され得る。一部の実施形態では、これらのバリアントは、例えば、異なる実施形態においてモノマー、ダイマーまたはマルチマーとして主に存在するＨＲＳポリペプチドを提供するために、ＨＲＳポリペプチドの凝集状態を変更し得る。
【０１７９】
ある特定の実施形態は、以下に記載するストリンジェンシー条件下で、参照ＨＲＳポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号１１１〜１２７、１８２〜１８４、１９２〜１９８など；実施例も参照のこと）またはそれらの相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用する場合、用語「低いストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、高いストリンジェンシーまたは非常に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を記述する。ハイブリダイゼーション反応を実施するためのガイダンスは、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９８年、上記）、セクション６．３．１〜６．３．６中に見出され得る。水性および非水性の方法が、その参考文献中に記載され、いずれも使用され得る。
【０１８０】
低いストリンジェンシー条件に対する本明細書の言及は、４２℃でのハイブリダイゼーションのために少なくとも約１％ｖ／ｖから少なくとも約１５％ｖ／ｖホルムアミドまで、および少なくとも約１Ｍから少なくとも約２Ｍ塩まで、ならびに４２℃での洗浄のために少なくとも約１Ｍから少なくとも約２Ｍ塩までを含み、それらを包含する。低いストリンジェンシー条件は、６５℃でのハイブリダイゼーションのために１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、および室温での洗浄のために（ｉ）２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ；または（ｉｉ）０．５％ＢＳＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、４０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％ＳＤＳもまた含み得る。低いストリンジェンシー条件の一実施形態は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーションと、その後の少なくとも５０℃（洗浄の温度は、低いストリンジェンシー条件に関して５５℃まで増加し得る）での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での２回の洗浄とを含む。
【０１８１】
中程度のストリンジェンシー条件は、４２℃でのハイブリダイゼーションのために少なくとも約１６％ｖ／ｖから少なくとも約３０％ｖ／ｖホルムアミドまで、および少なくとも約０．５Ｍから少なくとも約０．９Ｍ塩まで、ならびに５５℃での洗浄のために少なくとも約０．１Ｍから少なくとも約０．２Ｍ塩までを含み、それらを包含する。中程度のストリンジェンシー条件は、６５℃でのハイブリダイゼーションのために１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、および６０〜６５℃での洗浄のために（ｉ）２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ；または（ｉｉ）０．５％ＢＳＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、４０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％ＳＤＳもまた含み得る。中程度のストリンジェンシー条件の一実施形態は、約４５℃での６×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーションと、その後の６０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回または複数の洗浄とを含む。高いストリンジェンシー条件は、４２℃でのハイブリダイゼーションのために少なくとも約３１％ｖ／ｖから少なくとも約５０％ｖ／ｖホルムアミドまで、および約０．０１Ｍから約０．１５Ｍ塩まで、および５５℃での洗浄のために約０．０１Ｍから約０．０２Ｍ塩までを含み、それらを包含する。
【０１８２】
高いストリンジェンシー条件は、６５℃でのハイブリダイゼーションのために１％ＢＳＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、および６５℃を超える温度での洗浄のために（ｉ）０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ；または（ｉｉ）０．５％ＢＳＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、４０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、１％ＳＤＳもまた含み得る。高いストリンジェンシー条件の一実施形態は、約４５℃での６×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーションと、その後の６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回または複数の洗浄とを含む。非常に高いストリンジェンシー条件の一実施形態は、６５℃での０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーションと、その後の６５℃での０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中での１回または複数の洗浄とを含む。
【０１８３】
他のストリンジェンシー条件は、当該分野で周知であり、当業者は、種々の因子がハイブリダイゼーションの特異性を最適化するために操作され得ることを認識している。最終洗浄のストリンジェンシーの最適化は、高い程度のハイブリダイゼーションを確実にするように機能し得る。詳細な例については、Ａｕｓｕｂｅｌら、上記、２．１０．１〜２．１０．１６頁およびＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年、上記）、セクション１．１０１〜１．１０４を参照のこと。ストリンジェントな洗浄は、典型的には、約４２℃〜６８℃の温度で実施されるが、当業者は、他の温度が、ストリンジェントな条件に適切であり得ることを理解する。最大ハイブリダイゼーション速度は、典型的には、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの形成のためのＴｍを下回って、約２０℃〜２５℃で生じる。Ｔｍは、融解温度または２つの相補的ポリヌクレオチド配列が解離する温度であることが、当該分野で周知である。Ｔｍを推定するための方法は、当該分野で周知である（Ａｕｓｕｂｅｌら、上記、２．１０．８頁を参照のこと）。
【０１８４】
一般に、完全に一致したＤＮＡの二重鎖のＴｍは、式：Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−（６００／長さ）によって近似値として予測され得、式中、Ｍは、好ましくは０．０１モル濃度〜０．４モル濃度の範囲の、Ｎａ＋の濃度であり；％Ｇ＋Ｃは、３０％と７５％との間のＧ＋Ｃ範囲内の、塩基の総数の百分率としてのグアノシン塩基およびシトシン塩基の合計であり；％ホルムアミドは、体積パーセントのホルムアミド濃度であり；長さは、ＤＮＡ二重鎖中の塩基対の数である。二重鎖ＤＮＡのＴｍは、ランダムにミスマッチした塩基対の数における１％の増加毎に、およそ１℃減少する。洗浄は一般に、高いストリンジェンシーについてはＴｍ−１５℃で、または中程度のストリンジェンシーについてはＴｍ−３０℃で実施される。
【０１８５】
ハイブリダイゼーション手順の一例では、固定化されたＤＮＡを含むメンブレン（例えば、ニトロセルロースメンブレンまたはナイロンメンブレン）を、標識されたプローブを含むハイブリダイゼーション緩衝液（５０％脱イオン化ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドンおよび０．１％ウシ血清アルブミン）、０．１％ＳＤＳおよび２００ｍｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ）中で、４２℃で一晩ハイブリダイズさせる。次いで、このメンブレンは、２回の連続的な中程度のストリンジェンシーの洗浄（即ち、４５℃で１５分間にわたって２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、その後５０℃で１５分間にわたって２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）と、その後の２回の連続的なより高いストリンジェンシーの洗浄（即ち、５５℃で１２分間にわたって０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、その後６５〜６８℃で１２分間にわたって０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ溶液）とに供される。
【０１８６】
ＨＲＳポリペプチドおよびＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートの生成
ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドは、当該分野に公知の任意の適切な手順によって、例えば、標準的な固相ペプチド合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ８５巻：２１４９〜２１５４頁（１９６３年））を使用し、または遺伝的に改変された宿主を使用した組換え技術によって、調製され得る。タンパク質合成は、手動技術を使用して、または自動化によって実施され得る。自動化合成は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して達成され得る。あるいは、種々の断片が、所望の分子を生成するために、別々に化学的に合成され得、化学的方法を使用して組み合わされ得る。
【０１８７】
ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、周知の技術によって、適切な宿主細胞において問題のＨＲＳポリペプチドまたはＨＲＳ−ＦｃコンジュゲートをコードするＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を発現させることによっても生成され得る。ＨＲＳ−ＦｃコンジュゲートまたはＨＲＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、確立された標準的な方法、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２巻：１８５９〜１８６９頁、１９８１年によって記載されるホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｉｔｅ）法；またはＭａｔｔｈｅｓら、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３巻：８０１〜８０５頁、１９８４年によって記載される方法によって、合成により調製され得る。ホスホラミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドは、合成ＤＮＡ構築物を形成するために、例えば自動ＤＮＡ合成器中で合成され、精製され、二重鎖化され、ライゲーションされる。あるいは、ＤＮＡまたはＲＮＡ構築物は、制限酵素媒介性のクローニングおよびＰＣＲベースの遺伝子増幅を含む標準的な組換え分子生物学的技術を使用して構築され得る。一部の実施形態では、直接的なｍＲＮＡ媒介性の発現のために、このポリヌクレオチドは、効率的な送達および細胞中への取り込みを可能にするために、ナノ粒子またはリポソーム中に封入され得、任意選択で、安定性および翻訳を増強するために、改変されたキャップまたはテイル構造を含む。
【０１８８】
これらのポリヌクレオチド配列はまた、混合ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡおよび合成起源のものであり得る。例えば、リーダーペプチドをコードするゲノムまたはｃＤＮＡ配列は、ＨＲＳポリペプチドまたはＨＲＳ−ＦｃコンジュゲートをコードするゲノムまたはｃＤＮＡ配列に接続され得、その後、このＤＮＡまたはＲＮＡ配列は、周知の手順に従う相同組換えのために所望のアミノ酸配列をコードする合成オリゴヌクレオチドを挿入することによって、または好ましくは適切なオリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲによって所望の配列を生成することによって、１つの部位において改変され得る。一部の実施形態では、シグナル配列は、コード配列の前に含まれ得る。この配列は、細胞表面へとポリペプチドを指向させるようにまたはポリペプチドを培地中に分泌するように宿主細胞と連絡する、コード配列に対してＮ末端のシグナルペプチドをコードする。典型的には、このシグナルペプチドは、タンパク質が細胞を離れる前に宿主細胞によって切り取られる。シグナルペプチドは、原核生物および真核生物中の種々のタンパク質において見出され得る。
【０１８９】
種々の発現ベクター／宿主系が公知であり、ポリヌクレオチド配列を含むためおよび発現させるために利用され得る。これらには、微生物、例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミドもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）もしくは細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系；またはウイルス性、プラスミド、エピソーム性もしくは組込み発現ベクターで形質転換された哺乳動物細胞およびより具体的にはヒト細胞系を含む動物細胞系が含まれるがこれらに限定されない。
【０１９０】
発現ベクター中に存在する「制御エレメント」または「調節配列」は、転写および翻訳を実施するために宿主の細胞性タンパク質と相互作用する、ベクターの非翻訳領域−−エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域−−である。かかるエレメントは、その強度および特異性が変動し得る。利用されるベクター系および宿主に依存して、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む、任意の数の適切な転写および翻訳エレメントが使用され得る。例えば、細菌系においてクローニングする場合、誘導性プロモーター、例えばＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）のハイブリッドｌａｃＺプロモーターなどが、使用され得る。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子由来または哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが、一般に好ましい。ポリペプチドをコードする配列の複数のコピーを含む細胞株を生成することが必要な場合、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターが、適切な選択可能なマーカーとともに有利に使用され得る。
【０１９１】
ある特定の実施形態は、Ｅ．ｃｏｌｉベースの発現系を使用し得る（例えば、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ５巻：１３５〜１４６号、２００８年を参照のこと）。これらおよび関連の実施形態は、適切な発現ベクターを生成するために、ライゲーション非依存的クローニング（ＬＩＣ）に部分的にまたは全体的に依存し得る。具体的な実施形態では、タンパク質発現は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐＥＴベクターシリーズ）、または例えばＴＡＣプロモーターを含む代替的プロモーターを有する改変されたｐＥＴベクターによって、制御され得る。これらおよび関連の実施形態は、Ｔ７媒介性の発現を支持し、改善された標的タンパク質安定性のためにｌｏｎおよびｏｍｐＴプロテアーゼにおいて欠損しているＢＬ２１のλＤＥ３溶原菌、発現宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）を利用し得る。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて稀にしか使用されないｔＲＮＡをコードするプラスミドを保有する発現宿主株、例えばＲＯＳＥＴＴＡ（商標）（ＤＥ３）株およびＲｏｓｅｔｔａ  ２（ＤＥ３）株もまた含まれる。一部の実施形態では、発酵の間に低減したレベルの翻訳後修飾を生じ得る、他のＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株、例えばＷ３１１０（Ｆ−ラムダ−ＩＮ（ｒｒｎＤ−ｒｒｎＥ）１  ｒｐｈ−１）、およびＵＴ５６００（Ｆ、ａｒａＣ１４、ｌｅｕＢ６（Ａｍ）、ｓｅｃＡ２０６（ａｚｉＲ）、ｌａｃＹ１、ｐｒｏＣ１４、ｔｓｘ６７、Δ（ｏｍｐＴｆｅｐＣ）２６６、ｅｎｔＡ４０３、ｇｌｎＸ４４（ＡＳ）、λ−、ｔｒｐＥ３８、ｒｆｂＣ１、ｒｐｓＬ１０９（ｓｔｒＲ）、ｘｙｌＡ５、ｍｔｌ−１、ｔｈｉＥ１）を含む、他のＥ．ｃｏｌｉ株が利用され得る。細胞溶解および試料の取り扱いは、商標ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）ヌクレアーゼおよびＢＵＧＢＵＳＴＥＲ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔの下で販売される試薬を使用しても、改善され得る。細胞培養のために、自己誘導性培地は、ハイスループット発現系を含む多くの発現系の効率を改善し得る。この型の培地（例えば、ＯＶＥＲＮＩＧＨＴ  ＥＸＰＲＥＳＳ（商標）Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）は、ＩＰＴＧなどの人工の誘導剤の添加なしに、代謝シフトを介してタンパク質発現を段階的に惹起する。
【０１９２】
特定の実施形態は、ヘキサヒスチジンタグ（例えば、商標ＨＩＳ・ＴＡＧ（登録商標）融合物の下で販売されるもの）を使用し、その後固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）精製または関連の技術を使用する。しかし、ある特定の態様では、臨床グレードのタンパク質は、アフィニティタグの使用を伴ってまたは伴わずに、Ｅ．ｃｏｌｉ封入体から単離され得る（例えば、Ｓｈｉｍｐら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．  ５０巻：５８〜６７頁、２００６年を参照のこと）。さらなる一例として、ある特定の実施形態は、寒冷ショック誘導性のＥ．ｃｏｌｉ高収量産生系を使用し得るが、これは、低温でのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおけるタンパク質の過剰発現が、その溶解度および安定性を改善するからである（例えば、Ｑｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  ２２巻：８７７〜８８２頁、２００４年を参照のこと）。
【０１９３】
高密度細菌発酵系もまた含まれる。例えば、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａの高い細胞密度でのカルチベーションは、１５０ｇ／Ｌを超える細胞密度でのタンパク質産生、および１０ｇ／Ｌを超える力価における組換えタンパク質の発現を可能にする。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター、例えばアルファ因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨを含むいくつかのベクターが、使用され得る。総説については、Ａｕｓｕｂｅｌら（上記）およびＧｒａｎｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５３巻：５１６〜５４４頁、１９８７年を参照のこと。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｎｄｏｒｉｓ発現系（例えば、Ｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  ２４巻、２１０〜２１５頁、２００６年；およびＨａｍｉｌｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０１巻：１２４４頁、２００３年を参照のこと）もまた含まれる。ある特定の実施形態は、とりわけ、ヒト化Ｎ−グリコシル化経路を有する酵母を含む、タンパク質を選択的にグリコシル化するように操作された酵母系を含む（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ３１３巻：１４４１〜１４４３頁、２００６年；Ｗｉｌｄｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３巻：１１９〜２８頁、２００５年；およびＧｅｒｎｇｒｏｓｓら、Ｎａｔｕｒｅ−Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  ２２巻：１４０９〜１４１４頁、２００４年；米国特許第７，６２９，１６３号；米国特許第７，３２６，６８１号；および米国特許第７，０２９，８７２号を参照のこと）。単に例として、組換え酵母培養物は、とりわけ、Ｆｅｒｎｂａｃｈ  Ｆｌａｓｋまたは１５Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌおよび２００Ｌの発酵槽中で増殖され得る。
【０１９４】
植物発現ベクターが使用される場合、ポリペプチドをコードする配列の発現は、いくつかのプロモーターのいずれかによって駆動され得る。例えば、ウイルスプロモーター、例えばＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターは、単独で、またはＴＭＶ由来のオメガリーダー配列と組み合わせて、使用され得る（Ｔａｋａｍａｔｓｕ、ＥＭＢＯ  Ｊ．  ６巻：３０７〜３１１頁、１９８７年）。あるいは、植物プロモーター、例えば、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットまたはヒートショックプロモーターが使用され得る（Ｃｏｒｕｚｚｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  ３巻：１６７１〜１６８０頁、１９８４年；Ｂｒｏｇｌｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２２４巻：８３８〜８４３頁、１９８４年；およびＷｉｎｔｅｒら、Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．  １７巻：８５〜１０５頁、１９９１年）。これらの構築物は、直接的ＤＮＡ形質転換または病原体媒介性トランスフェクションによって、植物細胞中に導入され得る。かかる技術は、いくつかの一般に入手可能な総説中に記載されている（例えば、Ｈｏｂｂｓ  ｉｎ  ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ、Ｙｅａｒｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９１〜１９６頁、１９９２年を参照のこと）。
【０１９５】
昆虫系もまた、目的のポリペプチドを発現させるために使用され得る。例えば、１つのかかる系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルスウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ細胞において外来遺伝子を発現させるためのベクターとして使用される。ポリペプチドをコードする配列は、ポリヘドリン遺伝子などの、ウイルスの非必須領域中にクローニングされ得、ポリヘドリンプロモーターの制御化に置かれ得る。ポリペプチドコード配列の首尾よい挿入は、ポリヘドリン遺伝子を不活性化し、コートタンパク質を欠く組換えウイルスを生成する。次いで、これらの組換えウイルスは、例えば、目的のポリペプチドが発現され得るＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ細胞に感染するために使用され得る（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．  ９１巻：３２２４〜３２２７頁、１９９４年）。ＳＦ９、ＳＦ２１およびＴ．ｎｉ細胞を利用する発現系を含むバキュロウイルス発現系もまた含まれる（例えば、ＭｕｒｐｈｙおよびＰｉｗｎｉｃａ−Ｗｏｒｍｓ、Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．
第５章：ユニット５．４、２００１年を参照のこと）。昆虫系は、哺乳動物系と類似した翻訳後修飾を提供し得る。
【０１９６】
哺乳動物宿主細胞では、いくつかの発現系が当該分野で周知であり、市販されている。例示的な哺乳動物ベクター系には、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＣＥＰ４、ｐＲＥＰ４およびｐＲＥＰ７、ＣｒｕｃｅｌｌのＰｅｒＣ６系、ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＬＰ１などのレンチウイルスベースの系などが含まれる。例えば、アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、目的のポリペプチドをコードする配列は、後期プロモーターおよび三者間（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体へとライゲーションされ得る。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域中の挿入は、感染宿主細胞においてポリペプチドを発現させることが可能な生存ウイルスを得るために使用され得る（ＬｏｇａｎおよびＳｈｅｎｋ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．  ８１巻：３６５５〜３６５９頁、１９８４年）。さらに、転写エンハンサー、例えばラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーが、哺乳動物宿主細胞において発現を増加させるために使用され得る。
【０１９７】
有用な哺乳動物宿主細胞株の例には、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚性腎臓株（２９３または懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．  Ｇｅｎ
Ｖｉｒｏｌ．  ３６巻：５９頁、１９７７年）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  ２３巻：２４３〜２５１頁、１９８０年）；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌腫細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；ｂｕｆｆａｌｏラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲ１細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ３８３巻：４４〜６８頁、１９８２年）；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；ならびにヒトヘパトーマ株（Ｈｅｐ  Ｇ２）が含まれる。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．  ７７巻：４２１６頁、１９８０年）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；ならびに骨髄腫細胞株、例えばＮＳＯおよびＳｐ２／０が含まれる。抗体産生に適切な特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えば、ＹａｚａｋｉおよびＷｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２４８巻（Ｂ．  Ｋ．Ｃ  Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．、２００３年）、２５５〜２６８頁を参照のこと。特定の好ましい哺乳動物細胞発現系には、ＣＨＯおよびＨＥＫ２９３細胞ベースの発現系が含まれる。哺乳動物発現系は、当該分野で公知のもののうちで、例えば、Ｔ−フラスコ、ローラーボトルもしくは細胞工場中に付着した細胞株を、または例えば、１Ｌおよび５Ｌスピナー、５Ｌ、１４Ｌ、４０Ｌ、１００Ｌおよび２００Ｌ撹拌タンクバイオリアクタ、もしくは２０／５０Ｌおよび１００／２００Ｌ  ＷＡＶＥバイオリアクタ中での懸濁培養を、利用し得る。
【０１９８】
無細胞タンパク質発現の方法もまた含まれる。これらおよび関連の実施形態は、典型的に、精製されたＲＮＡポリメラーゼ、リボソーム、ｔＲＮＡおよびリボヌクレオチドを利用する。かかる試薬は、例えば、細胞からまたは細胞ベースの発現系からの抽出によって生成され得る。
【０１９９】
さらに、宿主細胞株は、挿入された配列の発現をモジュレートする能力または発現されたタンパク質を所望の様式でプロセシングする能力について、選択され得る。ポリペプチドのかかる改変には、翻訳後修飾、例えばアセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化、または天然に存在しないアミノ酸の挿入が含まれるがこれらに限定されない（米国特許第７，９３９，４９６号；米国特許第７，８１６，３２０号；米国特許第７，９４７，４７３号；米国特許第７，８８３，８６６号；米国特許第７，８３８，２６５号；米国特許第７，８２９，３１０号；米国特許第７，８２０，７６６号；米国特許第７，８２０，７６６号；米国特許第７，７７３７，２２６号、米国特許第７，７３６，８７２号；米国特許第７，６３８，２９９号；米国特許第７，６３２，９２４号；および米国特許第７，２３０，０６８号を一般に参照のこと）。一部の実施形態では、かかる天然に存在しないアミノ酸は、位置Ｃｙｓ１３０において挿入され得る。タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングは、正確な挿入、折り畳みおよび／または機能を促進するためにも使用され得る。細菌細胞に加えて、かかる翻訳後活性のための特定の細胞機械および特徴的機構を有するまたはさらには欠く異なる宿主細胞、例えば酵母、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３およびＷ１３８が、外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にするために、選択され得る。
【０２００】
組換え細胞によって産生されるＨＲＳポリペプチドまたはＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、当該分野で公知の種々の技術に従って、精製および特徴付けされ得る。タンパク質精製を実施し、タンパク質の純度を分析するための例示的な系には、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ｆａｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＦＰＬＣ）（例えば、ＡＫＴＡおよびＢｉｏ−Ｒａｄ  ＦＰＬＣ系）、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（例えば、ＢｅｃｋｍａｎおよびＷａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣ）が含まれる。精製のための例示的な化学には、当該分野で公知の他のもののうちで、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｑ、Ｓ）、サイズ排除クロマトグラフィー、塩勾配、アフィニティ精製（例えば、Ｎｉ、Ｃｏ、ＦＬＡＧ、マルトース、グルタチオン、プロテインＡ／Ｇ）、ゲル濾過、逆相、セラミックＨＹＰＥＲＤ（登録商標）イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）が含まれる。いくつかの例示的な方法は、実施例のセクションにも開示されている。
【０２０１】
ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲート
上述のように、本発明の実施形態は、１つまたは複数のＨＲＳポリペプチドと共有結合した少なくとも１つのＦｃ領域を含むＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートに関する。ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートの例には、融合タンパク質および種々の形態の化学的に架橋されたタンパク質が含まれる。任意の数の種由来の野生型配列、ならびにそれらのバリアント、断片、ハイブリッドおよび化学的に改変された形態を含む、広範な種々のＦｃ領域配列が、本発明のＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートにおいて使用され得る。これらのＨＲＳ−Ｆｃポリペプチドは、本明細書に記載され当該分野で公知のように、ペプチドリンカーおよび化学的リンカーを含む、Ｆｃ領域（複数可）をＨＲＳポリペプチド（複数可）から典型的には分離する１つまたは複数のリンカーもまた、（任意選択で）含み得る。これらのＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートのいずれかにおいて、ＨＲＳポリペプチドのネイティブのＮ末端もしくはＣ末端アミノ酸、またはＦｃドメイン中のネイティブのＮ末端もしくはＣ末端アミノ酸が、例えば、発現およびもしくはクローニングを促進するため、または２つのタンパク質間のリンカー配列として機能するために、欠失し得るおよび／または非ネイティブアミノ酸（複数可）で置き換えられ得ることが理解される。
【０２０２】
ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドは、非コンジュゲート化または未改変ＨＲＳポリペプチド、例えば、それに結合されたＦｃ領域（複数可）を有さない同じまたは類似の配列の対応するＨＲＳポリペプチドと比較して、種々の利点を提供し得る。単なる例示として、１つまたは複数のＦｃ領域の共有結合は、同じまたは類似の配列を有する未改変ＨＲＳポリペプチドと比較して、例えば、Ｆｃ領域関連エフェクター機能（例えば、古典的補体カスケードの活性化、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を介した免疫エフェクター細胞との相互作用、免疫グロブリンの区画化）、細胞取り込み、細胞内輸送、組織分布および／またはバイオアベイラビリティを提供することによって、ＨＲＳポリペプチドの溶解度、半減期（例えば、血清中、選択された組織中、保存条件下での試験管中、例えば、室温でまたは冷蔵下で）、ダイマー化またはマルチマー化特性、生物学的活性（単数または複数）を変更（例えば、増加、減少）させ得る。ある特定の態様では、Ｆｃ領域は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）に関するエフェクター機能を付与でき、これらは、腫瘍細胞および感染細胞などの特定の標的細胞を一掃するにあたり、役割を果たすと考えられている。
【０２０３】
ある特定の実施形態は、ＨＲＳ−Ｆｃ融合タンパク質を使用する。「融合タンパク質」は、融合タンパク質を作製する方法と同様、本明細書の他の場所に定義され、当該分野で周知である（例えば、Ｆｃ融合タンパク質に関する一般的な開示および方法については、米国特許第５，１１６，９６４号；米国特許第５，４２８，１３０号；米国特許第５，４５５，１６５号；米国特許第５，５１４，５８２号；米国特許第６，４０６，６９７号；米国特許第６，２９１，２１２号；および米国特許第６，３００，０９９号を参照のこと）。ＨＲＳ−Ｆｃ融合タンパク質では、Ｆｃ領域は、ＨＲＳポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端または両方に融合され得る。一部の実施形態では、１つまたは複数のＦｃ領域は、例えば、第１のＨＲＳ配列（例えば、ドメイン）と第２のＨＲＳ配列（例えば、ドメイン）との間にＦｃ領域を配置することによって、ＨＲＳ配列に対して内部に融合され得、ここで、第１のＨＲＳ配列は、Ｆｃ領域のＮ末端に融合され、第２のＨＲＳ配列は、Ｆｃ領域のＣ末端に融合される。具体的な実施形態では、この第１および第２のＨＲＳ配列は、同一である。他の実施形態では、この第１および第２のＨＲＳ配列は、異なる（例えば、これらは、ＨＲＳポリペプチドの異なる機能的ドメインを含む）。特定のＨＲＳ−Ｆｃ融合タンパク質は、さらなる異種タンパク質配列、即ち、非Ｆｃ領域および非ＨＲＳポリペプチド配列もまた含み得る。
【０２０４】
用語「ＨＲＳ−Ｆｃ」は、ＨＲＳポリペプチドへのＦｃ領域のＮ末端結合またはＣ末端結合を示し得るが、必ずしも示すわけではない。例えば、ある特定の例では、用語「Ｆｃ−ＨＲＳ」は、ＨＲＳポリペプチドのＮ末端へのＦｃ領域の融合を示し、用語「ＨＲＳ−Ｆｃ」は、ＨＲＳポリペプチドのＣ末端へのＦｃ領域の融合を示す。しかし、いずれの用語も、Ｆｃ領域およびＨＲＳポリペプチドの任意の融合タンパク質またはコンジュゲートをより一般に指すために使用され得る。
【０２０５】
一部の実施形態では、このＨＲＳ−Ｆｃ融合タンパク質は、任意選択でリンカーペプチドによって分離された、単一のＦｃドメインにカップリングされたＨＲＳポリペプチドのタンデム反復コピーを含み得る。例示的なタンデム反復ＨＲＳ−Ｆｃ融合タンパク質は、表Ｄ１０中に提供される。特定のタンデム反復ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートの調製および配列は、実施例に例示される。
【０２０６】
【表１０】
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【０２０７】
ある特定の実施形態は、例えば、１つまたは複数のＦｃ領域がＨＲＳポリペプチド（複数可）に化学的にコンジュゲート化または架橋されたＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートに関する。これらおよび関連の態様では、このＦｃ領域は、Ｎ末端領域（例えば、最初の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００などのアミノ酸内）、内部領域（Ｎ末端領域とＣ末端領域との間）、および／またはＣ末端領域（例えば、最後の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００などのアミノ酸内）において、ＨＲＳポリペプチドにコンジュゲート化され得る。ポリペプチドは、当該分野の種々の慣用的な技術に従って、他のポリペプチドにコンジュゲート化または架橋され得る。例えば、特定の技術は、Ｄ、Ｅ、およびＣ末端カルボキシル基を介して共有結合するカルボキシル−反応性カルボジイミドクロスリンカーＥＤＣ（またはＥＤＡＣ）を使用する。他の技術は、ＫおよびＮ末端アミノ基を介して共有結合する活性化ＥＤＣを使用する。なお他の技術は、システイン残基のチオール基を介して共有結合するｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）またはスルホ−ＭＢＳを使用する（チオールコンジュゲート化に使用され得るシステイン操作されたＩｇ領域については、米国特許出願第２００７／００９２９４０号もまた参照のこと）。かかる架橋されたタンパク質は、切断可能なまたは他の方法で放出可能なリンカー（例えば、酵素的に切断可能なリンカー、加水分解可能なリンカー）、および切断不能なリンカー（即ち、生理学的に安定なリンカー）を含むリンカーもまた含み得る。ある特定の実施形態は、例えば、米国特許出願第２００６／０２６９５５３号に記載されるように、Ｆｃ領域（複数可）とＨＲＳポリペプチド（複数可）との間のクロスリンカーとして、非ペプチドポリマー（例えば、ＰＥＧポリマー；ＨＲＳ−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃコンジュゲート）を使用し得る。Ｆｃ領域コンジュゲート化部位の例示的な記載については、米国特許出願第２００７／０２６９３６９号もまた参照のこと。
【０２０８】
ある特定の実施形態では、以下により詳細に議論されるように、野生型Ｆｃ領域（複数可）と比較して変更された特性または生物学的活性を有するものを含む、バリアントまたは他の方法で改変されたＦｃ領域が使用され得る。改変されたＦｃ領域の例には、例えば、野生型配と比較して１つもしくは複数のアミノ酸の置換、挿入、欠失もしくは短縮によって変異した配列を有するもの、異なる免疫グロブリンクラス／サブクラス由来のドメインから構成されるハイブリッドＦｃポリペプチド、変更されたグリコシル化／シアル酸付加パターンを有するＦｃポリペプチド、ならびに例えばビオチン化（例えば、米国特許出願第２０１０／０２０９４２４号を参照のこと）、リン酸化、硫酸化などによって改変もしくは誘導体化されたＦｃポリペプチド、または上述の任意の組合せが含まれる。かかる改変は、対応する野生型Ｆｃ配列と比較して、本明細書に記載される他の特性の中で、１つもしくは複数の特定のＦｃＲ（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、ＦｃＲｎ）に対するＦｃ領域の結合特性、その薬物動態学的特性（例えば、安定性または半減期、バイオアベイラビリティ、組織分布、分布容積、濃度、排出速度定数、排出速度、曲線下面積（ＡＵＣ）、クリアランス、Ｃｍａｘ、ｔｍａｘ、Ｃｍｉｎ、変動）、その免疫原性、その補体結合（ｆｉｘａｔｉｏｎ）もしくは活性化、および／またはＦｃ領域のＣＤＣ／ＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ関連活性を変更（例えば、増加、減少）させるために使用され得る。
【０２０９】
本明細書に提供されるＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートの「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の重鎖から通常誘導される。典型的なＩｇ分子は、２つの重鎖および２つの軽鎖から構成される。これらの重鎖は、少なくとも３つの機能的領域：Ｆｄ領域、Ｆｃ領域（断片結晶化可能な領域）およびヒンジ領域へと分割され得（図１を参照のこと）、後者は、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤ免疫グロブリンにおいてのみ見出される。Ｆｄ領域は、重鎖の可変（ＶＨ）ドメインおよび定常（ＣＨ１）ドメインを含み、軽鎖の可変（ＶＬ）ドメインおよび定常（ＣＬ）ドメインと一緒になって、抗原結合性断片またはＦａｂ領域を形成する。
【０２１０】
ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤ免疫グロブリンのＦｃ領域は、それぞれＣＨ２およびＣＨ３領域と称される重鎖定常ドメイン２および３を含む；ＩｇＥおよびＩｇＭ免疫グロブリンのＦｃ領域は、それぞれＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４領域と称される、重鎖定常ドメイン２、３および４を含む。このＦｃ領域は、例えば、エフェクター細胞の同族Ｆｃ受容体への補体結合および結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）を含む免疫グロブリンのエフェクター機能を主に担う。
【０２１１】
ヒンジ領域（ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤにおいて見出される）は、Ｆａｂ部分がＦｃ領域に対して空間的に自由に動くように、可撓性スペーサーとして作用する。定常領域とは対照的に、ヒンジ領域は、免疫グロブリンクラスおよびサブクラスの中で、配列および長さの両方において変動して、構造的に多様である。ヒンジ領域は、炭水化物結合のためのいくつかの構造的に別個の型の部位を含む、１つまたは複数のグリコシル化部位（複数可）もまた含み得る。例えば、ＩｇＡ１は、ヒンジ領域の１７アミノ酸のセグメント内に５つのグリコシル化部位を含み、腸プロテアーゼに対するヒンジ領域ポリペプチドの顕著な抵抗性を付与する。ＣＨ２ドメインのヒンジ近位領域中の残基は、免疫グロブリンとそのそれぞれのＦｃ受容体（複数可）との間の相互作用の特異性にも影響し得る（例えば、Ｓｈｉｎら、Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １０巻：１７７〜１８６頁、１９９３年を参照のこと）。
【０２１２】
従って、用語「Ｆｃ領域」または「Ｆｃ断片」または「Ｆｃ」とは、本明細書で使用する場合、それらの断片およびバリアントならびに組合せを含めた、１つまたは複数の選択された免疫グロブリン（複数可）由来のＣＨ２領域、ＣＨ３領域および／またはＣＨ４領域のうちの１つまたは複数を含むタンパク質を指す。「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリンの重鎖定常領域の１つまたは複数のヒンジ領域（複数可）もまた含み得る。ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンのＣＨ１、ＣＬ、ＶＬおよび／またはＶＨ領域のうちの１つまたは複数を含まない。
【０２１３】
このＦｃ領域は、それらのサブクラスおよび組合せを含む、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭが含まれるがこれらに限定されない任意の１つまたは複数の免疫グロブリンクラスのＣＨ２領域、ＣＨ３領域、ＣＨ４領域および／またはヒンジ領域（複数可）から誘導され得る。一部の実施形態では、このＦｃ領域は、サブクラスＩｇＡ１および／またはＩｇＡ２を含むＩｇＡ免疫グロブリンから誘導される。ある特定の実施形態では、このＦｃ領域は、ＩｇＤ免疫グロブリンから誘導される。特定の実施形態では、このＦｃ領域は、ＩｇＥ免疫グロブリンから誘導される。一部の実施形態では、このＦｃ領域は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３および／またはＩｇＧ４を含むＩｇＧ免疫グロブリンから誘導される。ある特定の実施形態では、このＦｃ領域は、ＩｇＭ免疫グロブリンから誘導される。図２は、ヒトＩｇＡ１（配列番号１５６）、ＩｇＡ２（配列番号１５７）、ＩｇＭ（配列番号１５８）、ＩｇＧ１（配列番号１５９）、ＩｇＧ２（配列番号１６０）、ＩｇＧ３（配列番号１６１）、ＩｇＧ４（配列番号１６２）およびＩｇＥ（配列番号１６３）由来のＦｃ領域のアラインメントを示す。
【０２１４】
特定のＦｃ領域は、１つまたは複数のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に対する特異的結合を実証する。Ｆｃ受容体のクラスの例には、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）、Ｆｃα受容体（ＦｃαＲ）、Ｆｃε受容体（ＦｃεＲ）および新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）が含まれる。例えば、特定のＦｃ領域は、ＦｃαＲ、ＦｃεＲおよび／またはＦｃＲｎと比較して、１つまたは複数のＦｃγＲに対する増加した結合（またはそれに対する親和性）を有する。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、１つまたは複数のＦｃγＲ、ＦｃεＲおよび／またはＦｃＲｎと比較して、ＦｃαＲに対する増加した結合を有する。他の実施形態では、Ｆｃ領域は、１つまたは複数のＦｃγＲ、ＦｃαＲおよび／またはＦｃＲｎと比較して、ＦｃεＲ（例えば、ＦｃαＲＩ）に対する増加した結合を有する。特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、１つまたは複数のＦｃγＲ、ＦｃαＲおよび／またはＦｃεＲと比較して、ＦｃＲｎに対する増加した結合を有する。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の選択されたＦｃＲ（複数可）へのＦｃ領域の結合（または親和性）は、典型的には約１．５×、２×、２．５×、３×、３．５×、４×、４．５×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１５×、２０×、２５×、３０×、４０×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、１００×、２００×、３００×、４００×、５００×、６００×、７００×、８００×、９００×、１０００×またはそれ超（その間の全ての整数を含む）、１つまたは複数の異なるＦｃＲ（複数可）に対するその結合（またはそれに対する親和性）と比較して増加する。
【０２１５】
ＦｃγＲの例には、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂが含まれる。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は、マクロファージおよび樹状細胞上で発現され、食作用、呼吸性バースト、サイトカイン刺激および樹状細胞エンドサイトーシス輸送において役割を果たす。ＦｃγＲＩの発現は、ＧＭ−ＣＳＦおよびγ−インターフェロン（γ−ＩＦＮ）の両方によって上方調節され、インターロイキン−４（ＩＬ−４）によって下方調節される。ＦｃγＲＩＩａは、多形核白血球（ＰＭＮ）、マクロファージ、樹状細胞および肥満細胞上で発現される。ＦｃγＲＩＩａは、食作用、呼吸性バーストおよびサイトカイン刺激において役割を果たす。ＦｃγＲＩＩａの発現は、ＧＭ−ＣＳＦおよびγ−ＩＦＮによって上方調節され、ＩＬ−４によって減少される。ＦｃγＩＩｂは、Ｂ細胞、ＰＭＮ、マクロファージおよび肥満細胞上で発現される。ＦｃγＩＩｂは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）媒介性の応答を阻害し、従って、阻害受容体である。ＦｃγＲＩＩｃの発現は、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）およびＩＬ−４によって上方調節され、γ−ＩＦＮによって減少される。ＦｃγＲＩＩｃは、ＮＫ細胞上で発現される。ＦｃγＲＩＩＩａは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、肥満細胞および血小板上で発現される。この受容体は、食作用、呼吸性バースト、サイトカイン刺激、血小板凝集および脱顆粒、ならびにＮＫ媒介性ＡＤＣＣに関与する。ＦｃγＲＩＩＩの発現は、Ｃ５ａ、ＴＧＦ−βおよびγ−ＩＦＮによって上方調節され、ＩＬ−４によって下方調節される。ＦｃγＲＩＩＩｂは、ＰＭＮ上で発現されるＧＰＩ結合型受容体である。
【０２１６】
特定のＦｃ領域は、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａおよび／またはＦｃγＲＩＩＩｂと比較して、ＦｃγＲＩに対する増加した結合を有する。一部の実施形態は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａおよび／またはＦｃγＲＩＩＩｂと比較して、ＦｃγＲＩＩａに対する増加した結合を有する。特定のＦｃ領域は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａおよび／またはＦｃγＲＩＩＩｂと比較して、ＦｃγＲＩＩｂに対する増加した結合を有する。特定のＦｃ領域は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａおよび／またはＦｃγＲＩＩＩｂと比較して、ＦｃγＲＩＩｃに対する増加した結合を有する。一部のＦｃ領域は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃおよび／またはＦｃγＲＩＩＩｂと比較して、ＦｃγＲＩＩＩａに対する増加した結合を有する。特定のＦｃ領域は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃおよび／またはＦｃγＲＩＩＩａと比較して、ＦｃγＲＩＩＩｂに対する増加した結合を有する。
【０２１７】
ＦｃαＲにはＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。ＦｃαＲＩは、好中球、好酸球、単球、特定のマクロファージ（例えば、クッパー細胞）および特定の樹状細胞の表面上で見出される。ＦｃαＲＩは、２つの細胞外Ｉｇ様ドメインから構成され、免疫グロブリンスーパーファミリーおよび多重鎖免疫認識受容体（ＭＩＲＲ）ファミリーの両方のメンバーであり、２つのＦｃＲγシグナル伝達鎖と会合することによってシグナル伝達する。
【０２１８】
ＦｃεＲには、ＦｃεＲＩおよびＦｃεＲＩＩが含まれる。高親和性受容体ＦｃεＲＩは、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、上皮ランゲルハンス細胞、好酸球、肥満細胞および好塩基球上で発現され、アレルギー性応答の制御において主要な役割を果たす。ＦｃεＲＩは、抗原提示細胞上でも発現され、炎症促進性サイトカインの産生を調節する。低親和性受容体ＦｃεＲＩＩ（ＣＤ２３）は、膜結合型または可溶性受容体として機能し得るＣ型レクチンである。ＦｃεＲＩＩは、Ｂ細胞の増殖および分化を調節し、好酸球、単球および好塩基球のＩｇＥ結合を遮断する。特定のＦｃ領域は、ＦｃεＲＩＩと比較して、ＦｃεＲＩに対する増加した結合を有する。他のＦｃ領域は、ＦｃεＲＩと比較して、ＦｃεＲＩＩに対する増加した結合を有する。
【０２１９】
以下の表Ｆ１は、特定のＦｃＲの特徴をまとめる。
【０２２０】
【表１１】
2020141673.tif 000033
【０２２１】
Ｆｃ領域は、ウシ、ヤギ、ブタ、イヌ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモット、非ヒト霊長類およびヒトなどの哺乳動物などの脊椎動物を含む、任意の動物の免疫グロブリン分子から誘導され得る。例示的な野生型ヒトＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＭ免疫グロブリン由来のＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４およびヒンジ領域のアミノ酸配列は、以下に示される（配列番号１２８〜１５４）。
【０２２２】
配列番号１２８は、ヒトＩｇＡ１ヒンジ領域のアミノ酸配列（ＶＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳ）である。
【０２２３】
配列番号１２９は、ヒトＩｇＡ１  ＣＨ２領域のアミノ酸配列（ＣＣＨＰＲＬＳＬＨＲＰＡＬＥＤＬＬＬＧＳＥＡＮＬＴＣＴＬＴＧＬＲＤＡＳＧＶＴＦＴＷＴＰＳＳＧＫＳＡＶＱＧＰＰＥＲＤＬＣＧＣＹＳＶＳＳＶＬＰＧＣＡＥＰＷＮＨＧＫＴＦＴＣＴＡＡＹＰＥＳＫＴＰＬＴＡＴＬＳＫＳ）である。
【０２２４】
配列番号１３０は、ヒトＩｇＡ１  ＣＨ３領域のアミノ酸配列（ＧＮＴＦＲＰＥＶＨＬＬＰＰＰＳＥＥＬＡＬＮＥＬＶＴＬＴＣＬＡＲＧＦＳＰＫＤＶＬＶＲＷＬＱＧＳＱＥＬＰＲＥＫＹＬＴＷＡＳＲＱＥＰＳＱＧＴＴＴＦＡＶＴＳＩＬＲＶＡＡＥＤＷＫＫＧＤＴＦＳＣＭＶＧＨＥＡＬＰＬＡＦＴＱＫＴＩＤＲＬＡＧＫＰＴＨＶＮＶＳＶＶＭＡＥＶＤＧＴＣＹ）である。
【０２２５】
配列番号１３１は、ヒトＩｇＡ２ヒンジ領域のアミノ酸配列（ＶＰＰＰＰＰ）である。
【０２２６】
配列番号１３２は、ヒトＩｇＡ２  ＣＨ２領域のアミノ酸配列（ＣＣＨＰＲＬＳＬＨＲＰＡＬＥＤＬＬＬＧＳＥＡＮＬＴＣＴＬＴＧＬＲＤＡＳＧＡＴＦＴＷＴＰＳＳＧＫＳＡＶＱＧＰＰＥＲＤＬＣＧＣＹＳＶＳＳＶＬＰＧＣＡＱＰＷＮＨＧＥＴＦＴＣＴＡＡＨＰＥＬＫＴＰＬＴＡＮＩＴＫＳ）である。
【０２２７】
配列番号１３３は、ヒトＩｇＡ２  ＣＨ３領域のアミノ酸配列（ＧＮＴＦＲＰＥＶＨＬＬＰＰＰＳＥＥＬＡＬＮＥＬＶＴＬＴＣＬＡＲＧＦＳＰＫＤＶＬＶＲＷＬＱＧＳＱＥＬＰＲＥＫＹＬＴＷＡＳＲＱＥＰＳＱＧＴＴＴＦＡＶＴＳＩＬＲＶＡＡＥＤＷＫＫＧＤＴＦＳＣＭＶＧＨＥＡＬＰＬＡＦＴＱＫＴＩＤＲＬＡＧＫＰＴＨＶＮＶＳＶＶＭＡＥＶＤＧＴＣＹ）である。
【０２２８】
配列番号１３４は、ヒトＩｇＤヒンジ領域のアミノ酸配列（ＥＳＰＫＡＱＡＳＳＶＰＴＡＱＰＱＡＥＧＳＬＡＫＡＴＴＡＰＡＴＴＲＮＴＧＲＧＧＥＥＫＫＫＥＫＥＫＥＥＱＥＥＲＥＴＫＴＰ）である。
【０２２９】
配列番号１３５は、ヒトＩｇＤ  ＣＨ２領域のアミノ酸配列（ＥＣＰＳＨＴＱＰＬＧＶＹＬＬＴＰＡＶＱＤＬＷＬＲＤＫＡＴＦＴＣＦＶＶＧＳＤＬＫＤＡＨＬＴＷＥＶＡＧＫＶＰＴＧＧＶＥＥＧＬＬＥＲＨＳＮＧＳＱＳＱＨＳＲＬＴＬＰＲＳＬＷＮＡＧＴＳＶＴＣＴＬＮＨＰＳＬＰＰＱＲＬＭＡＬＲＥＰ）である。
【０２３０】
配列番号１３６は、ヒトＩｇＤ  ＣＨ３領域のアミノ酸配列（ＡＡＱＡＰＶＫＬＳＬＮＬＬＡＳＳＤＰＰＥＡＡＳＷＬＬＣＥＶＳＧＦＳＰＰＮＩＬＬＭＷＬＥＤＱＲＥＶＮＴＳＧＦＡＰＡＲＰＰＰＱＰＲＳＴＴＦＷＡＷＳＶＬＲＶＰＡＰＰＳＰＱＰＡＴＹＴＣＶＶＳＨＥＤＳＲＴＬＬＮＡＳＲＳＬＥＶＳＹＶＴＤＨＧＰＭＫ）である。
【０２３１】
配列番号１３７は、ヒトＩｇＥ  ＣＨ２領域のアミノ酸配列（ＶＣＳＲＤＦＴＰＰＴＶＫＩＬＱＳＳＣＤＧＧＧＨＦＰＰＴＩＱＬＬＣＬＶＳＧＹＴＰＧＴＩＮＩＴＷＬＥＤＧＱＶＭＤＶＤＬＳＴＡＳＴＴＱＥＧＥＬＡＳＴＱＳＥＬＴＬＳＱＫＨＷＬＳＤＲＴＹＴＣＱＶＴＹＱＧＨＴＦＥＤＳＴＫＫＣＡ）である。
【０２３２】
配列番号１３８は、ヒトＩｇＥ  ＣＨ３領域のアミノ酸配列（ＤＳＮＰＲＧＶＳＡＹＬＳＲＰＳＰＦＤＬＦＩＲＫＳＰＴＩＴＣＬＶＶＤＬＡＰＳＫＧＴＶＮＬＴＷＳＲＡＳＧＫＰＶＮＨＳＴＲＫＥＥＫＱＲＮＧＴＬＴＶＴＳＴＬＰＶＧＴＲＤＷＩＥＧＥＴＹＱＣＲＶＴＨＰＨＬＰＲＡＬＭＲＳＴＴＫＴＳ）である。
【０２３３】
配列番号１３９は、ヒトＩｇＥ  ＣＨ４領域のアミノ酸配列（ＧＰＲＡＡＰＥＶＹＡＦＡＴＰＥＷＰＧＳＲＤＫＲＴＬＡＣＬＩＱＮＦＭＰＥＤＩＳＶＱＷＬＨＮＥＶＱＬＰＤＡＲＨＳＴＴＱＰＲＫＴＫＧＳＧＦＦＶＦＳＲＬＥＶＴＲＡＥＷＥＱＫＤＥＦＩＣＲＡＶＨＥＡＡＳＰＳＱＴＶＱＲＡＶＳＶＮＰＧＫ）である。
【０２３４】
配列番号１４０は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸配列（ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ）である。
【０２３５】
配列番号３４１は、改変されたヒトＩｇＧ１ヒンジ領域由来の配列のアミノ酸配列（ＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ）である。
【０２３６】
配列番号１４１は、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２領域のアミノ酸配列（ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ）である。
【０２３７】
配列番号１４２は、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３領域のアミノ酸配列（ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）である。
【０２３８】
配列番号３４２は、ヒトＩｇＧ１重鎖配列のアミノ酸配列（ＭＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）である。このヒトＩｇＧ１重鎖配列中のＭｅｔ残基は、例えば、ＨＲＳポリペプチドへのＮ末端融合の際に欠失し得ることが理解される（配列番号３４０を参照のこと）。
【０２３９】
配列番号１４３は、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域のアミノ酸配列（ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ）である。
【０２４０】
配列番号１４４は、ヒトＩｇＧ２  ＣＨ２領域のアミノ酸配列（ＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫ）である。
【０２４１】
配列番号１４５は、ヒトＩｇＧ２  ＣＨ３領域のアミノ酸配列（ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）である。
【０２４２】
配列番号１４６は、ヒトＩｇＧ３ヒンジ領域のアミノ酸配列（ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ）である。
【０２４３】
配列番号１４７は、ヒトＩｇＧ３  ＣＨ２領域のアミノ酸配列（ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＫＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫ）である。
【０２４４】
配列番号１４８は、ヒトＩｇＧ３  ＣＨ３領域のアミノ酸配列（ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）である。
【０２４５】
配列番号１４９は、ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域のアミノ酸配列（ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ）である。
【０２４６】
配列番号１５０は、ヒトＩｇＧ４  ＣＨ２領域のアミノ酸配列（ＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫ）である。
【０２４７】
配列番号１５１は、ヒトＩｇＧ４  ＣＨ３領域のアミノ酸配列（ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ）である。
【０２４８】
配列番号１５２は、ヒトＩｇＭ  ＣＨ２領域のアミノ酸配列（ＶＩＡＥＬＰＰＫＶＳＶＦＶＰＰＲＤＧＦＦＧＮＰＲＫＳＫＬＩＣＱＡＴＧＦＳＰＲＱＩＱＶＳＷＬＲＥＧＫＱＶＧＳＧＶＴＴＤＱＶＱＡＥＡＫＥＳＧＰＴＴＹＫＶＴＳＴＬＴＩＫＥＳＤＷＬＧＱＳＭＦＴＣＲＶＤＨＲＧＬＴＦＱＱＮＡＳＳＭＣＶＰ）である。
【０２４９】
配列番号１５３は、ヒトＩｇＭ  ＣＨ３領域のアミノ酸配列（ＤＱＤＴＡＩＲＶＦＡＩＰＰＳＦＡＳＩＦＬＴＫＳＴＫＬＴＣＬＶＴＤＬＴＴＹＤＳＶＴＩＳＷＴＲＱＮＧＥＡＶＫＴＨＴＮＩＳＥＳＨＰＮＡＴＦＳＡＶＧＥＡＳＩＣＥＤＤＷＮＳＧＥＲＦＴＣＴＶＴＨＴＤＬＰＳＰＬＫＱＴＩＳＲＰＫ）である。
【０２５０】
配列番号１５４は、ヒトＩｇＭ  ＣＨ４領域のアミノ酸配列（ＧＶＡＬＨＲＰＤＶＹＬＬＰＰＡＲＥＱＬＮＬＲＥＳＡＴＩＴＣＬＶＴＧＦＳＰＡＤＶＦＶＱＷＭＱＲＧＱＰＬＳＰＥＫＹＶＴＳＡＰＭＰＥＰＱＡＰＧＲＹＦＡＨＳＩＬＴＶＳＥＥＥＷＮＴＧＥＴＹＴＣＶＶＡＨＥＡＬＰＮＲＶＴＥＲＴＶＤＫＳＴＧＫＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ）である。
【０２５１】
従って、本発明のＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、それらのバリアント、断片、ホモログ、オルソログ、パラログおよび組合せを含む、配列番号１２８〜１６３または３３９〜３４２のヒトＦｃ領域アミノ酸配列のうちの１つまたは複数を含み得るか、これらからなり得るか、または本質的にこれらからなり得る。特定の例示的な実施形態は、サイズが約２０〜５０、２０〜１００、２０〜１５０、２０〜２００、２０〜２５０、２０〜３００、２０〜４００、５０〜１００、５０〜１５０、５０〜２００、５０〜２５０、５０〜３００、５０〜４００、１００〜１５０、１００〜２００、１００〜２５０、１００〜３００、１００〜３５０、１００〜４００、２００〜２５０、２００〜３００、２００〜３５０または２００〜４００アミノ酸長の範囲であるＦｃ領域を含み、任意選択で、配列番号１２８〜１５４または３４１〜３４２のうちの任意の１つまたは複数を含むか、これらからなるか、または本質的にこれらからなる。ある特定の実施形態は、最大約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、３００、３５０、４００またはそれ超のアミノ酸のＦｃ領域を含み、任意選択で、配列番号１２８〜１５４または３３９〜３４２のうちの任意の１つまたは複数を含むか、これらからなるか、または本質的にこれらからなる。
【０２５２】
特定のＦｃ領域は、それらの組合せ（例えば、配列番号１２８および１２９および１３０、配列番号１２８および１２９；配列番号１２８および１３０；配列番号１２９および１３０）、ならびにそれらのバリアントおよび断片を含め、Ｎ末端からＣ末端へと読む任意の順序で、配列番号１２８〜１３０または１５６に示されるヒトＩｇＡ１配列を含むか、これらからなるか、または本質的にこれらからなる。特定のＦｃ領域は、配列番号１２８に示されるヒトＩｇＡ１配列を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる。特定のＦｃ領域は、配列番号１２９に示されるヒトＩｇＡ１配列を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる。特定のＦｃ領域は、配列番号１３０に示されるヒトＩｇＡ１配列を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる。
【０２５３】
一部のＦｃ領域は、それらの組合せ（例えば、配列番号１３１および１３２および１３３、配列番号１３１および１３２；配列番号１３１および１３３；配列番号１３２および１３３）、ならびにそれらのバリアントおよび断片を含む、Ｎ末端からＣ末端へと読む任意の順序で、配列番号１３１〜１３３または１５７に示されるヒトＩｇＡ２配列を含むか、これらからなるか、または本質的にこれらからなる。特定のＦｃ領域は、配列番号１３１に示されるヒトＩｇＡ２配列を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる。特定のＦｃ領域は、配列番号１３２に示されるヒトＩｇＡ２配列を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる。特定のＦｃ領域は、配列番号１３３に示されるヒトＩｇＡ２配列を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる。
【０２５４】
特定のＦｃ領域は、それらの組合せ（例えば、配列番号１３４および１３５および１３６、配列番号１３４および１３５；配列番号１３４および１３６；配列番号１３５および１３６）、ならびにこれらの配列のバリアントおよび断片ならびに組合せを含む、Ｎ末端からＣ末端へと読む任意の順序で、配列番号１３４〜１３６に示されるヒトＩｇＤ配列を含むか、これらからなるか、または本質的にこれらからなる。特定のＦｃ領域は、配列番号１３４に示されるヒトＩｇＤ配列を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる。特定のＦｃ領域は、配列番号１３５に示されるヒトＩｇＤ配列を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる。特定のＦｃ領域は、配列番号１３６に示されるヒトＩｇＤ配列を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる。
【０２５５】
特定のＦｃ領域は、それらの組合せ（例えば、配列番号１３７および１３８および１３９、配列番号１３７および１３８；配列番号１３７および１３９；配列番号１３８および１３９）、ならびにこれらの配列のバリアントおよび断片ならびに組合せを含む、Ｎ末端からＣ末端へと読む任意の順序で、配列番号１３７〜１３９または１６３に示されるヒトＩｇＥ配列を含むか、これらからなるか、または本質的にこれらからなる。特定のＦｃ領域は、配列番号１３７に示されるヒトＩｇＥ配列を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる。特定のＦｃ領域は、配列番号１３８に示されるヒトＩｇＥ配列を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる。特定のＦｃ領域は、配列番号１３９に示されるヒトＩｇＥ配列を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる。
【０２５６】
特定のＦｃ領域は、それらの組合せ（例えば、配列番号１４０および１４１および１４２、配列番号１４０および１４１；配列番号１４０および１４２；配列番号１４１および１４２）、ならびにこれらの配列のバリアントおよび断片ならびに組合せを含む、Ｎ末端からＣ末端へと読む任意の順序で、配列番号１４０〜１４２または１５９または３３９〜３４２に示されるヒトＩｇＧ１配列を含むか、これらからなるか、または本質的にこれらからなる。特定のＦｃ領域は、配列番号１４０に示されるヒトＩｇＧ１配列を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる。特定のＦｃ領域は、配列番号１４１に示されるヒトＩｇＧ１配列を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる。特定のＦｃ領域は、配列番号１４２に示されるヒトＩｇＧ１配列を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる。特定のＦｃ領域は、配列番号３３９に示されるヒトＩｇＧ１配列を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる。特定のＦｃ領域は、配列番号３４０に示されるヒトＩｇＧ１配列を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる。特定のＦｃ領域は、配列番号３４１に示されるヒトＩｇＧ１配列を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる。特定のＦｃ領域は、配列番号３４２に示されるヒトＩｇＧ１配列を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる。
【０２５７】
特定のＦｃ領域は、それらの組合せ（例えば、配列番号１４３および１４４および１４５、配列番号１４３および１４４；配列番号１４３および１４５；配列番号１４４および１４５）、ならびにこれらの配列のバリアントおよび断片ならびに組合せを含む、Ｎ末端からＣ末端へと読む任意の順序で、配列番号１４３〜１４５または１６０に示されるヒトＩｇＧ２配列を含むか、これらからなるか、または本質的にこれらからなる。特定のＦｃ領域は、配列番号１４３に示されるヒトＩｇＧ２配列を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる。特定のＦｃ領域は、配列番号１４４に示されるヒトＩｇＧ２配列を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる。特定のＦｃ領域は、配列番号１４５に示されるヒトＩｇＧ２配列を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる。
【０２５８】
特定のＦｃ領域は、それらの組合せ（例えば、配列番号１４６および１４７および１４８、配列番号１４６および１４７；配列番号１４６および１４８；配列番号１４７および１４８）、ならびにこれらの配列のバリアントおよび断片ならびに組合せを含む、Ｎ末端からＣ末端へと読む任意の順序で、配列番号１４６〜１４８または１６１に示されるヒトＩｇＧ３配列を含むか、これらからなるか、または本質的にこれらからなる。特定のＦｃ領域は、配列番号１４６に示されるヒトＩｇＧ３配列を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる。特定のＦｃ領域は、配列番号１４７に示されるヒトＩｇＧ３配列を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる。特定のＦｃ領域は、配列番号１４８に示されるヒトＩｇＧ３配列を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる。
【０２５９】
特定のＦｃ領域は、それらの組合せ（例えば、配列番号１４９および１５０および１５１、配列番号１４９および１５０；配列番号１４９および１５１；配列番号１５０および１５１）、ならびにこれらの配列のバリアントおよび断片ならびに組合せを含む、Ｎ末端からＣ末端へと読む任意の順序で、配列番号１４９〜１５１または１６２に示されるヒトＩｇＧ４配列を含むか、これらからなるか、または本質的にこれらからなる。特定のＦｃ領域は、配列番号１４９に示されるヒトＩｇＧ４配列を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる。特定のＦｃ領域は、配列番号１５０に示されるヒトＩｇＧ４配列を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる。特定のＦｃ領域は、配列番号１５１に示されるヒトＩｇＧ４配列を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる。
【０２６０】
特定のＦｃ領域は、それらの組合せ（例えば、配列番号１５２および１５３および１５４、配列番号１５２および１５３；配列番号１５２および１５４；配列番号１５３および１５４）、ならびにこれらの配列のバリアントおよび断片ならびに組合せを含む、Ｎ末端からＣ末端へと読む任意の順序で、配列番号１５２〜１５４または１５８に示されるヒトＩｇＭ配列を含むか、これらからなるか、または本質的にこれらからなる。特定のＦｃ領域は、配列番号１５２に示されるヒトＩｇＭ配列を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる。特定のＦｃ領域は、配列番号１５３に示されるヒトＩｇＭ配列を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる。特定のＦｃ領域は、配列番号１５４に示されるヒトＩｇＭ配列を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる。
【０２６１】
上述のように、ある特定の実施形態は、本明細書に記載され当該分野で公知のＦｃ領域（例えば、配列番号１２８〜１６３のヒトＩｇ配列）の、バリアント、断片、ハイブリッドおよび／または他の方法で改変された形態を使用する。
【０２６２】
配列番号１２８〜１６３に示される参照配列のうちの任意の１つまたは複数などの参照配列と比較して、１つまたは複数のアミノ酸の置換、挿入、欠失および／または短縮を有するバリアントが含まれる。ある特定の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、配列番号１２８〜１６３のうちの任意の１つまたは複数に対して、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％またはそれ超の配列同一性または類似性または相同性を有するアミノ酸配列を含む。１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０またはそれ超のアミノ酸の付加、欠失、挿入または置換により、配列番号１２８〜１６３のうちの１つまたは複数とは異なるＦｃ領域もまた含まれる。ある特定の実施形態では、これらのアミノ酸の付加または欠失は、Ｆｃ参照配列のＣ末端および／またはＮ末端において存在する。
【０２６３】
特定の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、配列番号１２８〜１６３のうちの任意の１つまたは複数と最適にアラインされて、それらの間の全ての整数および範囲を含む、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００またはそれ超のＢＬＡＳＴビットスコアまたは配列類似性スコアを生成し得るアミノ酸配列を含み、ここでＢＬＡＳＴアラインメントは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス、１１のギャップ存在ペナルティおよび１のギャップ伸長ペナルティを使用した。
【０２６４】
ハイブリッドＦｃ領域、例えば、異なる種、異なるＩｇクラスおよび／または異なるＩｇサブクラスの免疫グロブリン由来のＦｃドメイン（例えば、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４）の組合せを含むＦｃ領域もまた含まれる。一般的な例には、ＣＨ２／ＣＨ３ドメインの以下の組合せ：ＩｇＡ１／ＩｇＡ１、ＩｇＡ１／ＩｇＡ２、ＩｇＡ１／ＩｇＤ、ＩｇＡ１／ＩｇＥ、ＩｇＡ１／ＩｇＧ１、ＩｇＡ１／ＩｇＧ２、ＩｇＡ１／ＩｇＧ３、ＩｇＡ１／ＩｇＧ４、ＩｇＡ１／ＩｇＭ、ＩｇＡ２／ＩｇＡ１、ＩｇＡ２／ＩｇＡ２、ＩｇＡ２／ＩｇＤ、ＩｇＡ２／ＩｇＥ、ＩｇＡ２／ＩｇＧ１、ＩｇＡ２／ＩｇＧ２、ＩｇＡ２／ＩｇＧ３、ＩｇＡ２／ＩｇＧ４、ＩｇＡ２／ＩｇＭ、ＩｇＤ／ＩｇＡ１、ＩｇＤ／ＩｇＡ２、ＩｇＤ／ＩｇＤ、ＩｇＤ／ＩｇＥ、ＩｇＤ／ＩｇＧ１、ＩｇＤ／ＩｇＧ２、ＩｇＤ／ＩｇＧ３、ＩｇＤ／ＩｇＧ４、ＩｇＤ／ＩｇＭ、ＩｇＥ／ＩｇＡ１、ＩｇＥ／ＩｇＡ２、ＩｇＥ／ＩｇＤ、ＩｇＥ／ＩｇＥ、ＩｇＥ／ＩｇＧ１、ＩｇＥ／ＩｇＧ２、ＩｇＥ／ＩｇＧ３、ＩｇＥ／ＩｇＧ４、ＩｇＥ／ＩｇＭ、ＩｇＧ１／ＩｇＡ１、ＩｇＧ１／ＩｇＡ２、ＩｇＧ１／ＩｇＤ、ＩｇＧ１／ＩｇＥ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ１、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４、ＩｇＧ１／ＩｇＭ、ＩｇＧ２／ＩｇＡ１、ＩｇＧ２／ＩｇＡ２、ＩｇＧ２／ＩｇＤ、ＩｇＧ２／ＩｇＥ、ＩｇＧ２／ＩｇＧ１、ＩｇＧ２／ＩｇＧ２、ＩｇＧ２／ＩｇＧ３、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４、ＩｇＧ２／ＩｇＭ、ＩｇＧ３／ＩｇＡ１、ＩｇＧ３／ＩｇＡ２、ＩｇＧ３／ＩｇＤ、ＩｇＧ３／ＩｇＥ、ＩｇＧ３／ＩｇＧ１、ＩｇＧ３／ＩｇＧ２、ＩｇＧ３／ＩｇＧ３、ＩｇＧ３／ＩｇＧ４、ＩｇＧ３／ＩｇＭ、ＩｇＧ４／ＩｇＡ１、ＩｇＧ４／ＩｇＡ２、ＩｇＧ４／ＩｇＤ、ＩｇＧ４／ＩｇＥ、ＩｇＧ４／ＩｇＧ１、ＩｇＧ４／ＩｇＧ２、ＩｇＧ４／ＩｇＧ３、ＩｇＧ４／ＩｇＧ４、ＩｇＧ４／ＩｇＭ、ＩｇＭ／ＩｇＡ１、ＩｇＭ／ＩｇＡ２、ＩｇＭ／ＩｇＤ、ＩｇＭ／ＩｇＥ、ＩｇＭ／ＩｇＧ１、ＩｇＭ／ＩｇＧ２、ＩｇＭ／ＩｇＧ３、ＩｇＭ／ＩｇＧ４、ＩｇＭ／ＩｇＭ（またはそれらの断片もしくはバリアント）を含むか、これらからなるか、または本質的にこれらからなり、任意選択で、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のうちの１つもしくは複数由来のヒンジ、ならびに／またはＩｇＥおよび／もしくはＩｇＭ由来のＣＨ４ドメインを含む、ハイブリッドＦｃ領域が含まれる。具体的な実施形態では、このヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインは、ヒトＩｇ由来である。
【０２６５】
さらなる例には、ＣＨ２／ＣＨ４ドメインの以下の組合せ：ＩｇＡ１／ＩｇＥ、ＩｇＡ２／ＩｇＥ、ＩｇＤ／ＩｇＥ、ＩｇＥ／ＩｇＥ、ＩｇＧ１／ＩｇＥ、ＩｇＧ２／ＩｇＥ、ＩｇＧ３／ＩｇＥ、ＩｇＧ４／ＩｇＥ、ＩｇＭ／ＩｇＥ、ＩｇＡ１／ＩｇＭ、ＩｇＡ２／ＩｇＭ、ＩｇＤ／ＩｇＭ、ＩｇＥ／ＩｇＭ、ＩｇＧ１／ＩｇＭ、ＩｇＧ２／ＩｇＭ、ＩｇＧ３／ＩｇＭ、ＩｇＧ４／ＩｇＭ、ＩｇＭ／ＩｇＭ（またはそれらの断片もしくはバリアント）を含むか、これらからなるか、または本質的にこれらからなり、任意選択で、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のうちの１つもしくは複数由来のヒンジおよび／またはＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４もしくはＩｇＭのうちの１つもしくは複数由来のＣＨ３ドメインを含む、ハイブリッドＦｃ領域が含まれる。具体的な実施形態では、このヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインは、ヒトＩｇ由来である。
【０２６６】
特定の例には、ＣＨ３／ＣＨ４ドメインの以下の組合せ：ＩｇＡ１／ＩｇＥ、ＩｇＡ２／ＩｇＥ、ＩｇＤ／ＩｇＥ、ＩｇＥ／ＩｇＥ、ＩｇＧ１／ＩｇＥ、ＩｇＧ２／ＩｇＥ、ＩｇＧ３／ＩｇＥ、ＩｇＧ４／ＩｇＥ、ＩｇＭ／ＩｇＥ、ＩｇＡ１／ＩｇＭ、ＩｇＡ２／ＩｇＭ、ＩｇＤ／ＩｇＭ、ＩｇＥ／ＩｇＭ、ＩｇＧ１／ＩｇＭ、ＩｇＧ２／ＩｇＭ、ＩｇＧ３／ＩｇＭ、ＩｇＧ４／ＩｇＭ、ＩｇＭ／ＩｇＭ（またはそれらの断片もしくはバリアント）を含むか、これらからなるか、または本質的にこれらからなり、任意選択で、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のうちの１つもしくは複数由来のヒンジおよび／またはＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４もしくはＩｇＭのうちの１つもしくは複数由来のＣＨ２ドメインを含む、ハイブリッドＦｃ領域が含まれる。具体的な実施形態では、このヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインは、ヒトＩｇ由来である。
【０２６７】
特定の例には、ヒンジ／ＣＨ２ドメインの以下の組合せ：ＩｇＡ１／ＩｇＡ１、ＩｇＡ１／ＩｇＡ２、ＩｇＡ１／ＩｇＤ、ＩｇＡ１／ＩｇＥ、ＩｇＡ１／ＩｇＧ１、ＩｇＡ１／ＩｇＧ２、ＩｇＡ１／ＩｇＧ３、ＩｇＡ１／ＩｇＧ４、ＩｇＡ１／ＩｇＭ、ＩｇＡ２／ＩｇＡ１、ＩｇＡ２／ＩｇＡ２、ＩｇＡ２／ＩｇＤ、ＩｇＡ２／ＩｇＥ、ＩｇＡ２／ＩｇＧ１、ＩｇＡ２／ＩｇＧ２、ＩｇＡ２／ＩｇＧ３、ＩｇＡ２／ＩｇＧ４、ＩｇＡ２／ＩｇＭ、ＩｇＤ／ＩｇＡ１、ＩｇＤ／ＩｇＡ２、ＩｇＤ／ＩｇＤ、ＩｇＤ／ＩｇＥ、ＩｇＤ／ＩｇＧ１、ＩｇＤ／ＩｇＧ２、ＩｇＤ／ＩｇＧ３、ＩｇＤ／ＩｇＧ４、ＩｇＤ／ＩｇＭ、ＩｇＧ１／ＩｇＡ１、ＩｇＧ１／ＩｇＡ２、ＩｇＧ１／ＩｇＤ、ＩｇＧ１／ＩｇＥ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ１、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４、ＩｇＧ１／ＩｇＭ、ＩｇＧ２／ＩｇＡ１、ＩｇＧ２／ＩｇＡ２、ＩｇＧ２／ＩｇＤ、ＩｇＧ２／ＩｇＥ、ＩｇＧ２／ＩｇＧ１、ＩｇＧ２／ＩｇＧ２、ＩｇＧ２／ＩｇＧ３、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４、ＩｇＧ２／ＩｇＭ、ＩｇＧ３／ＩｇＡ１、ＩｇＧ３／ＩｇＡ２、ＩｇＧ３／ＩｇＤ、ＩｇＧ３／ＩｇＥ、ＩｇＧ３／ＩｇＧ１、ＩｇＧ３／ＩｇＧ２、ＩｇＧ３／ＩｇＧ３、ＩｇＧ３／ＩｇＧ４、ＩｇＧ３／ＩｇＭ、ＩｇＧ４／ＩｇＡ１、ＩｇＧ４／ＩｇＡ２、ＩｇＧ４／ＩｇＤ、ＩｇＧ４／ＩｇＥ、ＩｇＧ４／ＩｇＧ１、ＩｇＧ４／ＩｇＧ２、ＩｇＧ４／ＩｇＧ３、ＩｇＧ４／ＩｇＧ４、ＩｇＧ４／ＩｇＭ（またはそれらの断片もしくはバリアント）を含むか、これらからなるか、または本質的にこれらからなり、任意選択で、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４もしくはＩｇＭのうちの１つもしくは複数由来のＣＨ３ドメインならびに／またはＩｇＥおよび／もしくはＩｇＭ由来のＣＨ４ドメインを含む、ハイブリッドＦｃ領域が含まれる。具体的な実施形態では、このヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインは、ヒトＩｇ由来である。
【０２６８】
特定の例には、ヒンジ／ＣＨ３ドメインの以下の組合せ：ＩｇＡ１／ＩｇＡ１、ＩｇＡ１／ＩｇＡ２、ＩｇＡ１／ＩｇＤ、ＩｇＡ１／ＩｇＥ、ＩｇＡ１／ＩｇＧ１、ＩｇＡ１／ＩｇＧ２、ＩｇＡ１／ＩｇＧ３、ＩｇＡ１／ＩｇＧ４、ＩｇＡ１／ＩｇＭ、ＩｇＡ２／ＩｇＡ１、ＩｇＡ２／ＩｇＡ２、ＩｇＡ２／ＩｇＤ、ＩｇＡ２／ＩｇＥ、ＩｇＡ２／ＩｇＧ１、ＩｇＡ２／ＩｇＧ２、ＩｇＡ２／ＩｇＧ３、ＩｇＡ２／ＩｇＧ４、ＩｇＡ２／ＩｇＭ、ＩｇＤ／ＩｇＡ１、ＩｇＤ／ＩｇＡ２、ＩｇＤ／ＩｇＤ、ＩｇＤ／ＩｇＥ、ＩｇＤ／ＩｇＧ１、ＩｇＤ／ＩｇＧ２、ＩｇＤ／ＩｇＧ３、ＩｇＤ／ＩｇＧ４、ＩｇＤ／ＩｇＭ、ＩｇＧ１／ＩｇＡ１、ＩｇＧ１／ＩｇＡ２、ＩｇＧ１／ＩｇＤ、ＩｇＧ１／ＩｇＥ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ１、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４、ＩｇＧ１／ＩｇＭ、ＩｇＧ２／ＩｇＡ１、ＩｇＧ２／ＩｇＡ２、ＩｇＧ２／ＩｇＤ、ＩｇＧ２／ＩｇＥ、ＩｇＧ２／ＩｇＧ１、ＩｇＧ２／ＩｇＧ２、ＩｇＧ２／ＩｇＧ３、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４、ＩｇＧ２／ＩｇＭ、ＩｇＧ３／ＩｇＡ１、ＩｇＧ３／ＩｇＡ２、ＩｇＧ３／ＩｇＤ、ＩｇＧ３／ＩｇＥ、ＩｇＧ３／ＩｇＧ１、ＩｇＧ３／ＩｇＧ２、ＩｇＧ３／ＩｇＧ３、ＩｇＧ３／ＩｇＧ４、ＩｇＧ３／ＩｇＭ、ＩｇＧ４／ＩｇＡ１、ＩｇＧ４／ＩｇＡ２、ＩｇＧ４／ＩｇＤ、ＩｇＧ４／ＩｇＥ、ＩｇＧ４／ＩｇＧ１、ＩｇＧ４／ＩｇＧ２、ＩｇＧ４／ＩｇＧ３、ＩｇＧ４／ＩｇＧ４、ＩｇＧ４／ＩｇＭ（またはそれらの断片もしくはバリアント）を含むか、これらからなるか、または本質的にこれらからなり、任意選択で、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４もしくはＩｇＭのうちの１つもしくは複数由来のＣＨ２ドメインならびに／またはＩｇＥおよび／もしくはＩｇＭ由来のＣＨ４ドメインを含む、ハイブリッドＦｃ領域が含まれる。具体的な実施形態では、このヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインは、ヒトＩｇ由来である。
【０２６９】
一部の例では、ヒンジ／ＣＨ４ドメインの以下の組合せ：ＩｇＡ１／ＩｇＥ、ＩｇＡ１／ＩｇＭ、ＩｇＡ２／ＩｇＥ、ＩｇＡ２／ＩｇＭ、ＩｇＤ／ＩｇＥ、ＩｇＤ／ＩｇＭ、ＩｇＧ１／ＩｇＥ、ＩｇＧ１／ＩｇＭ、ＩｇＧ２／ＩｇＥ、ＩｇＧ２／ＩｇＭ、ＩｇＧ３／ＩｇＥ、ＩｇＧ３／ＩｇＭ、ＩｇＧ４／ＩｇＥ、ＩｇＧ４／ＩｇＭ（またはそれらの断片もしくはバリアント）を含むか、これらからなるか、または本質的にこれらからなり、任意選択で、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４もしくはＩｇＭのうちの１つもしくは複数由来のＣＨ２ドメインおよび／またはＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４もしくはＩｇＭのうちの１つもしくは複数由来のＣＨ３ドメインを含む、ハイブリッドＦｃ領域が含まれる。
【０２７０】
ＩｇＧサブクラスの組合せまたはヒトＩｇＤおよびＩｇＧの組合せから誘導される、ハイブリッドＦｃ領域の具体的な例は、例えばＷＯ  ２００８／１４７１４３において見出され得る。
【０２７１】
誘導体化または他の方法で改変されたＦｃ領域もまた含まれる。ある特定の態様では、このＦｃ領域は、例えば、野生型または天然に存在するＦｃ領域と比較して、リン酸化、硫酸化、アクリル化、グリコシル化、メチル化、ファルネシル化、アセチル化、アミド化などによって改変され得る。ある特定の実施形態では、このＦｃ領域は、野生型もしくはネイティブのグリコシル化パターンを含み得るか、あるいは、ネイティブ形態と比較して増加したグリコシル化、ネイティブ形態と比較して減少したグリコシル化を含み得るか、または完全に脱グリコシル化され得る。改変されたＦｃグリコフォームの一例として、Ｆｃ領域の減少したグリコシル化は、第１の補体構成要素Ｃ１のＣ１ｑ領域への結合、ＡＤＣＣ関連活性における減少および／またはＣＤＣ関連活性における減少を低減させる。従って、ある特定の実施形態は、脱グリコシル化されたまたは非グリコシル化されたＦｃ領域を使用する。例示的な非グリコシル化されたＦｃ領域の生成については、例えば、ＷＯ
２００５／０４７３３７を参照のこと。Ｆｃ領域グリコフォームの別の例は、Ｋａｂａｔらの番号付け系に従って、Ｑ２９５位をシステイン残基で置換することによって（例えば、米国特許出願第２０１０／００８０７９４号を参照のこと）生成され得る。ある特定の実施形態は、Ｆｃ領域中の糖タンパク質の約８０〜１００％がフルクトースを欠く成熟コア炭水化物構造を含む、Ｆｃ領域を含み得る（例えば、米国特許出願第２０１０／０２５５０１３号を参照のこと）。一部の実施形態は、例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩａもしくはＦｃγＲＩＩＩａに対する親和性を増加させるためおよび／またはＦｃγＲＩＩａ発現細胞による食作用を改善するために、フコシル化のレベルを低減させるために置換または欠失によって最適化されたＦｃ領域を含み得る（米国特許出願第２０１０／０２４９３８２号および米国特許出願第２００７／０１４８１７０号を参照のこと）。
【０２７２】
改変されたＦｃグリコフォームの別の例として、Ｆｃ領域は、オリゴマンノース型Ｎ−グリカンを含み得、任意選択で、以下のうちの１つまたは複数を有する：複合型Ｎ−グリカンを含む対応するＦｃ領域またはＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートと比較して、増加したＡＤＣＣ活性、ＦｃγＲＩＩＩＡ（および特定の他のＦｃＲ）に対する増加した結合親和性、ＨＲＳポリペプチドの標的に対する類似のもしくは増加した結合特異性、ＨＲＳポリペプチドの標的に対する類似のもしくはより高い結合親和性、および／またはマンノース受容体に対する類似のもしくはより低い結合親和性（例えば、米国特許出願第２００７／００９２５２１号および米国特許第７，７００，３２１号を参照のこと）。別の例として、ＦｃγＲに対するＦｃ領域の増強された親和性は、操作されたまたはバリアント細胞株における抗体の発現によって生成される操作されたグリコフォームを使用して達成されている（例えば、Ｕｍａｎａら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １７巻：１７６〜１８０頁、１９９９年；Ｄａｖｉｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．  ７４巻：２８８〜２９４頁、２００１年；Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７７巻：２６７３３〜２６７４０頁、２００２年；Ｓｈｉｎｋａｗａら、２００３年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７８巻：３４６６〜３４７３頁、２００３年；および米国特許出願第２００７／０１１１２８１号を参照のこと）。特定のＦｃ領域グリコフォームは、糖鎖の還元末端においてＮ−アセチルグルコサミンの６位に結合したフコースの１位を有さない、Ｎ−グリコシド結合型複合糖鎖の増加した割合を含む（例えば、米国特許出願第２０１０／００９２９９７号を参照のこと）。特定の実施形態は、α−２，６結合によってそれぞれの末端シアル酸部分に接続された少なくとも１つのガラクトース部分によってグリコシル化されたＩｇＧのＦｃ領域を含み得、任意選択で、このＦｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ領域と比較して、より高い抗炎症活性を有する（米国特許出願第２００８／０２０６２４６号を参照のこと）。これらおよび関連の変更されたグリコシル化アプローチの特定のものは、本明細書に記載するように、Ｆｃ領域がＦｃγＲＩＩＩなどのＦｃＲに選択的に結合する能力、ＡＤＣＣを媒介する能力、およびＦｃ領域の他の特性を変更する能力の、実質的な増強を生じている。
【０２７３】
特定のバリアント、断片、ハイブリッドまたは他の方法で改変されたＦｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ配列（例えば、同じ種、同じＩｇクラス、同じＩｇサブクラス）と比較して、１つまたは複数のＦｃＲに対する変更された結合を有し得る。例えば、かかるＦｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ配列と比較して、Ｆｃγ受容体、Ｆｃα受容体、Ｆｃε受容体および／または新生児Ｆｃ受容体のうちの１つまたは複数に対する増加した結合を有し得る。他の実施形態では、バリアント、断片、ハイブリッドまたは改変されたＦｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ配列と比較して、Ｆｃγ受容体、Ｆｃα受容体、Ｆｃε受容体および／または新生児Ｆｃ受容体のうちの１つまたは複数に対する減少した結合を有し得る。特異的ＦｃＲは、本明細書の他の場所に記載される。
【０２７４】
変更された（例えば、増加した、減少した）ＦｃＲ結合を有するＦｃバリアントの具体的な例は、例えば、米国特許第５，６２４，８２１号および米国特許第７，４２５，６１９号；米国特許出願第２００９／００１７０２３号、米国特許出願第２００９／００１０９２１号および米国特許出願第２０１０／０２０３０４６号；ならびにＷＯ  ２０００／４２０７２およびＷＯ  ２００４／０１６７５０中に見出され得る。特定の例には、活性化受容体ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合を増加させることおよび阻害受容体ＦｃγＲＩＩｂに対する結合を低減させることが示されている、２９８位、３３３位および／または３３４位における１つまたは複数の置換、例えば、Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａおよび／またはＫ３３４Ａ（ＫａｂａｔらのＥＵ指標の番号付けに基づく）を有するヒトＦｃ領域が含まれる。これらの変異は、ＦｃＲに対する結合におけるさらなる改善を有する二重変異および三重変異バリアントを得るために、組み合わされ得る。ある特定の実施形態は、ＦｃγＲＩＩＩａに対する増加した結合、ＦｃγＲＩＩｂに対する減少した結合、および増加したＡＤＣＣを有する、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ三重変異体を含む（例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７６巻：６５９１〜６６０４頁、２００１年；およびＰｒｅｓｔａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ．  ３０巻：４８７〜４９０頁、２００２年を参照のこと）。Ｕｍａｎａら、上記；および米国特許第７，６６２，９２５号に開示されるような、ＦｃＲに対する増加した結合を有する操作されたＦｃグリコフォームもまた参照のこと。一部の実施形態は、ＫａｂａｔらのＥＵ指標に基づいて、４３４Ｓ、２５２Ｙ／４２８Ｌ、２５２Ｙ／４３４Ｓおよび４２８Ｌ／４３４Ｓ（米国特許出願第２００９／０１６３６９９号および米国特許出願第２００６０１７３１７０号を参照のこと）から選択される１つまたは複数の置換を含むＦｃ領域を含む。
【０２７５】
特定のバリアント、断片、ハイブリッドまたは改変されたＦｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ配列と比較して変更されたエフェクター機能を有する。例えば、かかるＦｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ配列と比較して、増加した補体結合もしくは活性化、増加したＣｌｑ結合親和性、増加したＣＤＣ関連活性、増加したＡＤＣＣ関連活性および／または増加したＡＤＣＰ関連活性を有し得る。他の実施形態では、かかるＦｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ配列と比較して、減少した補体結合もしくは活性化、減少したＣｌｑ結合親和性、減少したＣＤＣ関連活性、減少したＡＤＣＣ関連活性および／または減少したＡＤＣＰ関連活性を有し得る。単なる例示的な一例として、Ｆｃ領域は、Ｃ１ｑ結合部位などの補体結合部位における欠失もしくは置換および／またはＡＤＣＣ部位における欠失もしくは置換を含み得る。かかる欠失／置換の例は、例えば、米国特許第７，０３０，２２６号中に記載される。多くのＦｃエフェクター機能、例えばＡＤＣＣは、当該分野における慣用的な技術に従ってアッセイされ得る（例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎら、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ７巻：１〜２６頁、１９７８年を参照のこと）。かかるアッセイのために有用なエフェクター細胞には、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージおよび他の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）が含まれるがこれらに限定されない。あるいは、またはさらに、特定のＦｃエフェクター機能は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら  ＰＮＡＳ．  ９５巻：６５２〜６５６頁、１９９８年に記載される動物モデルを使用することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏで評価され得る。
【０２７６】
特定のバリアントハイブリッドまたは改変されたＦｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ配列と比較して変更された安定性または半減期を有し得る。ある特定の実施形態では、かかるＦｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ配列と比較して増加した半減期を有し得る。他の実施形態では、バリアントハイブリッドまたは改変されたＦｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ配列と比較して減少した半減期を有し得る。半減期は、放射標識、ＥＬＩＳＡまたは他の方法などの、当該分野における慣用的な技術に従って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、生理学的条件下）またはｉｎ  ｖｉｖｏで測定され得る。安定性または半減期のｉｎ  ｖｉｖｏ測定は、血液、血清、血漿、尿もしくは脳脊髄液を含む１つもしくは複数の体液、または所与の組織、例えば肝臓、腎臓、筋肉、中枢神経系組織、骨などにおいて、測定され得る。一例として、ＦｃＲｎに結合するその能力を変更するＦｃ領域への改変は、その半減期をｉｎ  ｖｉｖｏで変更し得る。ｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態学的特性（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ平均排出半減期）を測定するためのアッセイ、およびＦｃＲｎに対するその結合を変更するＦｃ改変の非限定的な例は、例えば、米国特許第７，２１７，７９７号および米国特許第７，７３２，５７０号；ならびに米国特許出願第２０１０／０１４３２５４号および米国特許出願第２０１０／０１４３２５４号に記載されている。
【０２７７】
安定性または半減期を変更するための改変のさらなる非限定的な例には、Ｋａｂａｔらの番号付け系に従って、ＣＨ２ドメイン中の２５１〜２５６、２８５〜２９０および３０８〜３１４、ならびにＣＨ３ドメイン中の３８５〜３８９および４２８〜４３６から選択されるアミノ酸残基のうちの１つまたは複数における、置換／欠失が含まれる。米国特許出願第２００３／０１９０３１１号を参照のこと。具体的な例には、任意のそれらの組合せを含め、２５１位におけるロイシンによる置換、２５２位におけるチロシン、トリプトファンもしくはフェニルアラニンによる置換、２５４位におけるスレオニンもしくはセリンによる置換、２５５位におけるアルギニンによる置換、２５６位におけるグルタミン、アルギニン、セリン、スレオニンもしくはグルタミン酸による置換、３０８位におけるスレオニンによる置換、３０９位におけるプロリンによる置換、３１１位におけるセリンによる置換、３１２位におけるアスパラギン酸による置換、３１４位におけるロイシンによる置換、３８５位におけるアルギニン、アスパラギン酸もしくはセリンによる置換、３８６位におけるスレオニンもしくはプロリンによる置換、３８７位におけるアルギニンもしくはプロリンによる置換、３８９位におけるプロリン、アスパラギンもしくはセリンによる置換、４２８位におけるメチオニンもしくはスレオニンによる置換、４３４位におけるチロシンもしくはフェニルアラニンによる置換、４３３位におけるヒスチジン、アルギニン、リシンもしくはセリンによる置換、および／または４３６位におけるヒスチジン、チロシン、アルギニンもしくはスレオニンによる置換、が含まれる。かかる改変は、任意選択で、対応する野生型Ｆｃ領域と比較して、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の親和性を増加させ、それによって半減期を増加させる。
【０２７８】
特定のバリアントハイブリッドまたは改変されたＦｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ配列と比較して変更された溶解度を有し得る。ある特定の実施形態では、かかるＦｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ配列と比較して増加した溶解度を有し得る。他の実施形態では、バリアントハイブリッドまたは改変されたＦｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ配列と比較して、減少した溶解度を有し得る。溶解度は、当該分野における慣用的な技術に従って、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、生理学的条件下）で測定され得る。例示的な溶解度測定は、本明細書の他の場所に記載される。
【０２７９】
バリアントのさらなる例には、重鎖の２５０位、３１４位もしくは４２８位のうちの１つもしくは複数またはそれらの任意の組合せ、例えば、２５０位および４２８位、もしくは２５０位および３１４位、もしくは３１４位および４２８位、もしくは２５０位、３１４位および４２８位において、保存的もしくは非保存的置換（本明細書の他の場所に記載される）を有するＩｇＧのＦｃ領域が含まれる（例えば、米国特許出願第２０１１／０１８３４１２号を参照のこと）。具体的な実施形態では、２５０位における残基は、グルタミン酸もしくはグルタミンで置換され、および／または４２８位における残基は、ロイシンもしくはフェニルアラニンで置換される。ＩｇＧのＦｃバリアントの別の例示的な例として、２１４〜２３８位、２９７〜２９９位、３１８〜３２２位および／または３２７〜３３１位におけるアミノ酸残基のうちの任意の１つまたは複数が、改変（例えば、保存的または非保存的置換、欠失）のための適切な標的として使用され得る。特定の実施形態では、このＩｇＧのＦｃバリアントのＣＨ２ドメインは、Ｆｃ領域のエフェクター機能を減弱させるために、２２８位、２３４位、２３５位および／または３３１位においてアミノ酸置換を含む（例えば、Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ変異およびＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を有するヒトＩｇＧ４）（米国特許第７，０３０，２２６号を参照のこと）。ここで、重鎖中の残基の番号付けは、ＥＵ指標の番号付けである（Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１年）を参照のこと）。これらおよび関連の実施形態のうち特定のものは、任意選択でＡＤＣＣ関連活性またはＣＤＣ関連活性などのエフェクター機能の低減を伴わずに、ＦｃＲｎ結合および／または血清半減を変更（例えば、増加、減少）させている。
【０２８０】
さらなる例には、野生型Ｆｃ領域の２７９位、３４１位、３４３位もしくは３７３位またはそれらの任意の組合せにおいて、１つまたは複数のアミノ酸置換を含むバリアントＦｃ領域が含まれる（例えば、米国特許出願第２００７／０２２４１８８号を参照のこと）。ヒトＩｇＧについてこれらの位置における野生型アミノ酸残基は、バリン（２７９）、グリシン（３４１）、プロリン（３４３）およびチロシン（３７３）である。置換（複数可）は、保存的もしくは非保存的であり得、または本明細書に記載される、天然に存在しないアミノ酸もしくは模倣物を含み得る。単独でまたはこれらの置換と組み合わせて、ある特定の実施形態は、以下から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ超のアミノ酸置換を含むバリアントＦｃ領域もまた使用し得る：２３５Ｇ、２３５Ｒ、２３６Ｆ、２３６Ｒ、２３６Ｙ、２３７Ｋ、２３７Ｎ、２３７Ｒ、２３８Ｅ、２３８Ｇ、２３８Ｈ、２３８Ｉ、２３８Ｌ、２３８Ｖ、２３８Ｗ、２３８Ｙ、２４４Ｌ、２４５Ｒ、２４７Ａ、２４７Ｄ、２４７Ｅ、２４７Ｆ、２４７Ｍ、２４７Ｎ、２４７Ｑ、２４７Ｒ、２４７Ｓ、２４７Ｔ、２４７Ｗ、２４７Ｙ、２４８Ｆ、２４８Ｐ、２４８Ｑ、２４８Ｗ、２４９Ｌ、２４９Ｍ、２４９Ｎ、２４９Ｐ、２４９Ｙ、２５１Ｈ、２５１Ｉ、２５１Ｗ、２５４Ｄ、２５４Ｅ、２５４Ｆ、２５４Ｇ、２５４Ｈ、２５４Ｉ、２５４Ｋ、２５４Ｌ、２５４Ｍ、２５４Ｎ、２５４Ｐ、２５４Ｑ、２５４Ｒ、２５４Ｖ、２５４Ｗ、２５４Ｙ、２５５Ｋ、２５５Ｎ、２５６Ｈ、２５６Ｉ、２５６Ｋ、２５６Ｌ、２５６Ｖ、２５６Ｗ、２５６Ｙ、２５７Ａ、２５７Ｉ、２５７Ｍ、２５７Ｎ、２５７Ｓ、２５８Ｄ、２６０Ｓ、２６２Ｌ、２６４Ｓ、２６５Ｋ、２６５Ｓ、２６７Ｈ、２６７Ｉ、２６７Ｋ、２６８Ｋ、２６９Ｎ、２６９Ｑ、２７１Ｔ、２７２Ｈ、２７２Ｋ、２７２Ｌ、２７２Ｒ、２７９Ａ、２７９Ｄ、２７９Ｆ、２７９Ｇ、２７９Ｈ、２７９Ｉ、２７９Ｋ、２７９Ｌ、２７９Ｍ、２７９Ｎ、２７９Ｑ、２７９Ｒ、２７９Ｓ、２７９Ｔ、２７９Ｗ、２７９Ｙ、２８０Ｔ、２８３Ｆ、２８３Ｇ、２８３Ｈ、２８３Ｉ、２８３Ｋ、２８３Ｌ、２８３Ｍ、２８３Ｐ、２８３Ｒ、２８３Ｔ、２８３Ｗ、２８３Ｙ、２８５Ｎ、２８６Ｆ、２８８Ｎ、２８８Ｐ、２９２Ｅ、２９２Ｆ、２９２Ｇ、２９２Ｉ、２９２Ｌ、２９３Ｓ、２９３Ｖ、３０１Ｗ、３０４Ｅ、３０７Ｅ、３０７Ｍ、３１２Ｐ、３１５Ｆ、３１５Ｋ、３１５Ｌ、３１５Ｐ、３１５Ｒ、３１６Ｆ、３１６Ｋ、３１７Ｐ、３１７Ｔ、３１８Ｎ、３１８Ｐ、３１８Ｔ、３３２Ｆ、３３２Ｇ、３３２Ｌ、３３２Ｍ、３３２Ｓ、３３２Ｖ、３３２Ｗ、３３９Ｄ、３３９Ｅ、３３９Ｆ、３３９Ｇ、３３９Ｈ、３３９Ｉ、３３９Ｋ、３３９Ｌ、３３９Ｍ、３３９Ｎ、３３９Ｑ、３３９Ｒ、３３９Ｓ、３３９Ｗ、３３９Ｙ、３４１Ｄ、３４１Ｅ、３４１Ｆ、３４１Ｈ、３４１Ｉ、３４１Ｋ、３４１Ｌ、３４１Ｍ、３４１Ｎ、３４１Ｐ、３４１Ｑ、３４１Ｒ、３４１Ｓ、３４１Ｔ、３４１Ｖ、３４１Ｗ、３４１Ｙ、３４３Ａ、３４３Ｄ、３４３Ｅ、３４３Ｆ、３４３Ｇ、３４３Ｈ、３４３Ｉ、３４３Ｋ、３４３Ｌ、３４３Ｍ、３４３Ｎ、３４３Ｑ、３４３Ｒ、３４３Ｓ、３４３Ｔ、３４３Ｖ、３４３Ｗ、３４３Ｙ、３７３Ｄ、３７３Ｅ、３７３Ｆ、３７３Ｇ、３７３Ｈ、３７３Ｉ、３７３Ｋ、３７３Ｌ、３７３Ｍ、３７３Ｎ、３７３Ｑ、３７３Ｒ、３７３Ｓ、３７３Ｔ、３７３Ｖ、３７３Ｗ、３７５Ｒ、３７６Ｅ、３７６Ｆ、３７６Ｇ、３７６Ｈ、３７６Ｉ、３７６Ｌ、３７６Ｍ、３７６Ｎ、３７６Ｐ、３７６Ｑ、３７６Ｒ、３７６Ｓ、３７６Ｔ、３７６Ｖ、３７６Ｗ、３７６Ｙ、３７７Ｇ、３７７Ｋ、３７７Ｐ、３７８Ｎ、３７９Ｎ、３７９Ｑ、３７９Ｓ、３７９Ｔ、３８０Ｄ、３８０Ｎ、３８０Ｓ、３８０Ｔ、３８２Ｄ、３８２Ｆ、３８２Ｈ、３８２Ｉ、３８２Ｋ、３８２Ｌ、３８２Ｍ、３８２Ｎ、３８２Ｐ、３８２Ｑ、３８２Ｒ、３８２Ｓ、３８２Ｔ、３８２Ｖ、３８２Ｗ、３８２Ｙ、３８５Ｅ、３８５Ｐ、３８６Ｋ、４２３Ｎ、４２４Ｈ、４２４Ｍ、４２４Ｖ、４２６Ｄ、４２６Ｌ、４２７Ｎ、４２９Ａ、４２９Ｆ、４２９Ｍ、４３０Ａ、４３０Ｄ、４３０Ｆ、４３０Ｇ、４３０Ｈ、４３０Ｉ、４３０Ｋ、４３０Ｌ、４３０Ｍ、４３０Ｎ、４３０Ｐ、４３０Ｑ、４３０Ｒ、４３０Ｓ、４３０Ｔ、４３０Ｖ、４３０Ｗ、４３０Ｙ、４３１Ｈ、４３１Ｋ、４３１Ｐ、４３２Ｒ、４３２Ｓ、４３８Ｇ、４３８Ｋ、４３８Ｌ、４３８Ｔ、４３８Ｗ、４３９Ｅ、４３９Ｈ、４３９Ｑ、４４０Ｄ、４４０Ｅ、４４０Ｆ、４４０Ｇ、４４０Ｈ、４４０Ｉ、４４０Ｋ、４４０Ｌ、４４０Ｍ、４４０Ｑ、４４０Ｔ、４４０Ｖまたは４４２Ｋ。上記のように、重鎖中の残基の番号付けは、ＥＵ指標の番号付けである（Ｋａｂａｔら、上記を参照のこと）。かかるバリアントＦｃ領域は、典型的には、バリアントＦｃ領域が作動可能に結合されるＨＲＳポリペプチドに、変更されたエフェクター機能または変更された血清半減期を付与する。好ましくは、この変更されたエフェクター機能は、かかるアミノ酸置換（複数可）を欠く対応するＦｃ領域と比較した、ＡＤＣＣにおける増加、ＡＤＣＣにおける減少、ＣＤＣにおける増加、ＣＤＣにおける減少、Ｃｌｑ結合親和性における増加、Ｃｌｑ結合親和性における減少、ＦｃＲ（好ましくはＦｃＲｎ）結合親和性における増加またはＦｃＲ（好ましくはＦｃＲｎ）結合親和性における減少である。
【０２８１】
さらなる例には、２２１位、２２２位、２２４位、２２７位、２２８位、２３０位、２３１位、２２３位、２３３位、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２３８位、２３９位、２４０位、２４１位、２４３位、２４４位、２４５位、２４６位、２４７位、２４９位、２５０位、２５８位、２６２位、２６３位、２６４位、２６５位、２６６位、２６７位、２６８位、２６９位、２７０位、２７１位、２７２位、２７３位、２７４位、２７５位、２７６位、２７８位、２８０位、２８１位、２８３位、２８５位、２８６位、２８８位、２９０位、２９１位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、２９９位、３００位、３０２位、３１３位、３１７位、３１８位、３２０位、３２２位、３２３位、３２４位、３２５位、３２６位、３２７位、３２８位、３２９位、３３０位、３３１位、３３２位、３３３位、３３４位、３３５位、３３６位および／または４２８位のうちの１つまたは複数においてアミノ酸置換を含むバリアントＦｃ領域が含まれる（例えば、米国特許第７、６６２、９２５号を参照のこと）。具体的な実施形態では、このバリアントＦｃ領域は、Ｐ２３０Ａ、Ｅ２３３Ｄ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｙ、Ｌ２３５Ｉ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｑ、Ｓ２３９Ｔ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２４０Ｍ、Ｆ２４３Ｌ、Ｖ２６４Ｉ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｙ、Ｖ２６６Ｉ、Ｅ２７２Ｙ、Ｋ２７４Ｔ、Ｋ２７４Ｅ、Ｋ２７４Ｒ、Ｋ２７４Ｌ、Ｋ２７４Ｙ、Ｆ２７５Ｗ、Ｎ２７６Ｌ、Ｙ２７８Ｔ、Ｖ３０２Ｉ、Ｅ３１８Ｒ、Ｓ３２４Ｄ、Ｓ３２４Ｉ、Ｓ３２４Ｖ、Ｎ３２５Ｔ、Ｋ３２６Ｉ、Ｋ３２６Ｔ、Ｌ３２８Ｍ、Ｌ３２８Ｉ、Ｌ３２８Ｑ、Ｌ３２８Ｄ、Ｌ３２８Ｖ、Ｌ３２８Ｔ、Ａ３３０Ｙ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｉ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｎ、Ｉ３３２Ｑ、Ｔ３３５Ｄ、Ｔ３３５Ｒ、およびＴ３３５Ｙからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。他の具体的な実施形態では、このバリアントＦｃ領域は、Ｖ２６４Ｉ、Ｆ２４３Ｌ／Ｖ２６４Ｉ、Ｌ３２８Ｍ、Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｍ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ、Ａ３３０Ｙ、Ｉ３３２Ｄ、Ｌ３２８Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２６６Ｉ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｄ、Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｙ、Ｌ２３５Ｉ、Ｓ２３９Ｔ、Ｖ２４０Ｍ、Ｖ２６４Ｙ、Ａ３３０Ｉ、Ｎ３２５Ｔ、Ｌ３２８Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｖ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｑ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｉ、Ｐ２３０Ａ、Ｐ２３０Ａ／Ｅ２３３Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｅ２７２Ｙ、Ｋ２７４Ｔ、Ｋ２７４Ｅ、Ｋ２７４Ｒ、Ｋ２７４Ｌ、Ｋ２７４Ｙ、Ｆ２７５Ｗ、Ｎ２７６Ｌ、Ｙ２７８Ｔ、Ｖ３０２Ｉ、Ｅ３１８Ｒ、Ｓ３２４Ｄ、Ｓ３２４Ｉ、Ｓ３２４Ｖ、Ｋ３２６Ｉ、Ｋ３２６Ｔ、Ｔ３３５Ｄ、Ｔ３３５Ｒ、Ｔ３３５Ｙ、Ｖ２４０Ｉ／Ｖ２６６Ｉ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ／Ｌ２３４Ｉ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ／Ｌ２３５Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ／Ｖ２４０Ｉ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ／Ｖ２６４Ｔ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ／Ｋ３２６Ｅ、およびＳ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ／Ｋ３２６Ｔからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。より具体的な実施形態では、このバリアントＦｃ領域は、Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４１Ｙ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｔ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｙ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｈ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｅ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｎ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｖ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｉ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、およびＮ２９７Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅからなる群から選択される一連の置換を含む。具体的な実施形態では、このバリアントＦｃ領域は、３３２位においてアミノ酸置換を含む（ＥＵ指標、Ｋａｂａｔら、上記の番号付けを使用する）。置換の例には、３３２Ａ、３３２Ｄ、３３２Ｅ、３３２Ｆ、３３２Ｇ、３３２Ｈ、３３２Ｋ、３３２Ｌ、３３２Ｍ、３３２Ｎ、３３２Ｐ、３３２Ｑ、３３２Ｒ、３３２Ｓ、３３２Ｔ、３３２Ｖ、３３２Ｗおよび３３２Ｙが含まれる。Ｆｃ領域中の残基の番号付けは、ＫａｂａｔらのＥＵ指標の番号付けである。本明細書に記載される他の特性のうちで、かかるバリアントＦｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ領域と比較して、ＦｃγＲに対する増加した親和性、増加した安定性および／または増加した溶解度を有し得る。
【０２８２】
さらなる例には、以下のアミノ酸置換：２２４Ｎ／Ｙ、２２５Ａ、２２８Ｌ、２３０Ｓ、２３９Ｐ、２４０Ａ、２４１Ｌ、２４３Ｓ／Ｌ／Ｇ／Ｈ／Ｉ、２４４Ｌ、２４６Ｅ、２４７Ｌ／Ａ、２５２Ｔ、２５４Ｔ／Ｐ、２５８Ｋ、２６１Ｙ、２６５Ｖ、２６６Ａ、２６７Ｇ／Ｎ、２６８Ｎ、２６９Ｋ／Ｇ、２７３Ａ、２７６Ｄ、２７８Ｈ、２７９Ｍ、２８０Ｎ、２８３Ｇ、２８５Ｒ、２８８Ｒ、２８９Ａ、２９０Ｅ、２９１Ｌ、２９２Ｑ、２９７Ｄ、２９９Ａ、３００Ｈ、３０１Ｃ、３０４Ｇ、３０５Ａ、３０６Ｉ／Ｆ、３１１Ｒ、３１２Ｎ、３１５Ｄ／Ｋ／Ｓ、３２０Ｒ、３２２Ｅ、３２３Ａ、３２４Ｔ、３２５Ｓ、３２６Ｅ／Ｒ、３３２Ｔ、３３３Ｄ／Ｇ、３３５Ｉ、３３８Ｒ、３３９Ｔ、３４０Ｑ、３４１Ｅ、３４２Ｒ、３４４Ｑ、３４７Ｒ、３５１Ｓ、３５２Ａ、３５４Ａ、３５５Ｗ、３５６Ｇ、３５８Ｔ、３６１Ｄ／Ｙ、３６２Ｌ、３６４Ｃ、３６５Ｑ／Ｐ、３７０Ｒ、３７２Ｌ、３７７Ｖ、３７８Ｔ、３８３Ｎ、３８９Ｓ、３９０Ｄ、３９１Ｃ、３９３Ａ、３９４Ａ、３９９Ｇ、４０４Ｓ、４０８Ｇ、４０９Ｒ、４１１Ｉ、４１２Ａ、４１４Ｍ、４２１Ｓ、４２２Ｉ、４２６Ｆ／Ｐ、４２８Ｔ、４３０Ｋ、４３１Ｓ、４３２Ｐ、４３３Ｐ、４３８Ｌ、４３９Ｅ／Ｒ、４４０Ｇ、４４１Ｆ、４４２Ｔ、４４５Ｒ、４４６Ａ、４４７Ｅのうちの１つまたは複数を含むバリアントＦｃ領域が含まれ、ここで、任意選択で、このバリアントは、親Ｆｃポリペプチドと比較して、Ｆｃリガンドの変更された認識および／または変更されたエフェクター機能を有し、残基の番号付けは、ＫａｂａｔらのＥＵ指標の番号付けである。これらおよび関連の実施形態の具体的な例には、以下の置換のセット：（１）Ｎ２７６Ｄ、Ｒ２９２Ｑ、Ｖ３０５Ａ、Ｉ３７７Ｖ、Ｔ３９４Ａ、Ｖ４１２ＡおよびＫ４３９Ｅ；（２）Ｐ２４４Ｌ、Ｋ２４６Ｅ、Ｄ３９９ＧおよびＫ４０９Ｒ；（３）Ｓ３０４Ｇ、Ｋ３２０Ｒ、Ｓ３２４Ｔ、Ｋ３２６ＥおよびＭ３５８Ｔ；（４）Ｆ２４３Ｓ、Ｐ２４７Ｌ、Ｄ２６５Ｖ、Ｖ２６６Ａ、Ｓ３８３ＮおよびＴ４１１Ｉ；（５）Ｈ２２４Ｎ、Ｆ２４３Ｌ、Ｔ３９３ＡおよびＨ４３３Ｐ；（６）Ｖ２４０Ａ、Ｓ２６７Ｇ、Ｇ３４１ＥおよびＥ３５６Ｇ；（７）Ｍ２５２Ｔ、Ｐ２９１Ｌ、Ｐ３５２Ａ、Ｒ３５５Ｗ、Ｎ３９０Ｄ、Ｓ４０８Ｇ、Ｓ４２６ＦおよびＡ４３１Ｓ；（８）Ｐ２２８Ｌ、Ｔ２８９Ａ、Ｌ３６５Ｑ、Ｎ３８９Ｓおよび５４４０Ｇ；（９）Ｆ２４１Ｌ、Ｖ２７３Ａ、Ｋ３４０ＱおよびＬ４４１Ｆ；（１０）Ｆ２４１Ｌ、Ｔ２９９Ａ、Ｉ３３２ＴおよびＭ４２８Ｔ；（１１）Ｅ２６９Ｋ、Ｙ３００Ｈ、Ｑ３４２Ｒ、Ｖ４２２ＩおよびＧ４４６Ａ；（１２）Ｔ２２５Ａ、Ｒ３０１ｃ、Ｓ３０４Ｇ、Ｄ３１２Ｎ、Ｎ３１５Ｄ、Ｌ３５１ＳおよびＮ４２１Ｓ；（１３）Ｓ２５４Ｔ、Ｌ３０６Ｉ、Ｋ３２６ＲおよびＱ３６２Ｌ；（１４）Ｈ２２４Ｙ、Ｐ２３０Ｓ、Ｖ３２３Ａ、Ｅ３３３Ｄ、Ｋ３３８ＲおよびＳ３６４Ｃ；（１５）Ｔ３３５Ｉ、Ｋ４１４ＭおよびＰ４４５Ｒ；（１６）Ｔ３３５ＩおよびＫ４１４Ｍ；（１７）Ｐ２４７Ａ、Ｅ２５８Ｋ、Ｄ２８０Ｎ、Ｋ２８８Ｒ、Ｎ２９７Ｄ、Ｔ２９９Ａ、Ｋ３２２Ｅ、Ｑ３４２Ｒ、Ｓ３５４ＡおよびＬ３６５Ｐ；（１８）Ｈ２６８Ｎ、Ｖ２７９Ｍ、Ａ３３９Ｔ、Ｎ３６１ＤおよびＳ４２６Ｐ；（１９）Ｃ２６１Ｙ、Ｋ２９０Ｅ、Ｌ３０６Ｆ、Ｑ３１１Ｒ、Ｅ３３３ＧおよびＱ４３８Ｌ；（２０）Ｅ２８３Ｇ、Ｎ３１５Ｋ、Ｅ３３３Ｇ、Ｒ３４４Ｑ、Ｌ３６５ＰおよびＳ４４２Ｔ；（２１）Ｑ３４７Ｒ、Ｎ３６１ＹおよびＫ４３９Ｒ；（２２）Ｓ２３９Ｐ、Ｓ２５４Ｐ、Ｓ２６７Ｎ、Ｈ２８５Ｒ、Ｎ３１５Ｓ、Ｆ３７２Ｌ、Ａ３７８Ｔ、Ｎ３９０Ｄ、Ｙ３９１Ｃ、Ｆ４０４Ｓ、Ｅ４３０Ｋ、Ｌ４３２ＰおよびＫ４４７Ｅ；および（２３）Ｅ２６９Ｇ、Ｙ２７８Ｈ、Ｎ３２５ＳおよびＫ３７０Ｒを含むかまたはこれらからなるバリアントＦｃ領域が含まれ、ここで、残基の番号付けは、ＫａｂａｔらのＥＵ指標の番号付けである（例えば、米国特許出願第２０１０／０１８４９５９号を参照のこと）。
【０２８３】
Ｆｃバリアントの別の具体的な例は、配列番号１５５の配列を含み、式中、１位におけるＸａａは、Ａｌａであるかもしくは存在せず；１６位におけるＸａａは、ＰｒｏもしくはＧｌｕであり；１７位におけるＸａａは、Ｐｈｅ、ＶａｌもしくはＡｌａであり；１８位におけるＸａａは、Ｌｅｕ、ＧｌｕもしくはＡｌａであり；８０位におけるＸａａは、ＡｓｎもしくはＡｌａであり；および／または２３０位におけるＸａａは、Ｌｙｓであるかもしくは存在しない（例えば、米国特許出願第２００７／０２５３９６６号を参照のこと）。これらのＦｃ領域の特定のものおよび関連のＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、増加した半減期、低減したエフェクター活性を有し、および／または野生型Ｆｃ配列よりも免疫原性が顕著に低い。
【０２８４】
バリアントＦｃ領域は、例えば、米国特許出願第２００３／０１１８５９２号に記載されるように、１つまたは複数の変異したヒンジ領域もまた有し得る。例えば、ヒンジ領域中の１つまたは複数のシステインは、欠失し得るまたは異なるアミノ酸で置換され得る。変異したヒンジ領域は、システイン残基を含まないか、または対応する野生型ヒンジ領域よりも１つ、２つまたは３つ少ないシステイン残基を含み得る。一部の実施形態では、この型の変異したヒンジ領域を有するＦｃ領域は、野生型Ｉｇヒンジ領域と比較して、低減したダイマー化する能力を示す。
【０２８５】
上述のように、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲート、例えばＨＲＳ−Ｆｃ融合タンパク質は、典型的に、対応するＨＲＳポリペプチドと比較して、変更された（例えば、改善された、増加した、減少した）薬物動態学的特性を有する。薬物動態学的特性の例には、安定性もしくは半減期、バイオアベイラビリティ（吸収される薬物の分率）、組織分布、分布容積（静脈内注射された直後に薬物が分布し、血漿と周辺組織との間で平衡に達する、見かけの容積）、濃度（血漿中の薬物の初期または定常状態濃度）、排出速度定数（薬物が身体から除去される速度）、排出速度（排出のバランスをとるために必要とされる注入の速度）、曲線下面積（ＡＵＣまたは曝露；単一の用量後の、または定常状態における、濃度−時間曲線の積分）、クリアランス（単位時間当たりの薬物が一掃される血漿の体積）、Ｃｍａｘ（経口投与後の薬物のピーク血漿濃度）、ｔｍａｘ（Ｃｍａｘに達するまでの時間）、Ｃｍｉｎ（次の用量が投与される前に薬物が到達する最も低い濃度）、および変動（定常状態における１回の投薬間隔内のピークトラフ変動）が含まれる。一部の態様では、これらの改善された特性は、二次構造を顕著に変更することおよび／またはＨＲＳポリペプチドの非正準生物学的活性を低減させることなしに、達成される。実際、一部のＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、増加した非正準生物学的活性を有する。
【０２８６】
従って、一部の実施形態では、このＨＲＳ−ＦｃコンジュゲートまたはＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、同じまたは匹敵する条件下で哺乳動物に投与した場合、対応する未改変または異なって改変されたＨＲＳポリペプチドよりも、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、５０、１００、２００、３００、４００または５００倍大きい、血漿または血清薬物動態学的ＡＵＣプロファイルを有する。ある特定の実施形態では、このＨＲＳ−ＦｃコンジュゲートまたはＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、室温における類似の条件下、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日間または１、２、３、４週間などにわたりｐＨ７．４のＰＢＳ中と比較した場合、対応する未改変または異なって改変されたＨＲＳポリペプチドよりも、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％または５００％大きい安定性（例えば、半減期によって測定される）を有する。
【０２８７】
特定の実施形態では、ＨＲＳ−ＦｃコンジュゲートまたはＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、約３０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２０時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４０時間、約４８時間、約５０時間、約６０時間、約７０時間、約７２時間、約８０時間、約８４時間、約９０時間、約９６時間、約１２０時間もしくは約１４４時間またはそれ超の、あるいは少なくとも約３０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２０時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４０時間、約４８時間、約５０時間、約６０時間、約７０時間、約７２時間、約８０時間、約８４時間、約９０時間、約９６時間、約１２０時間もしくは約１４４時間またはそれ超の、ｐＨ７．４、２５℃、例えば、生理学的ｐＨ、ヒト体温（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ、血清中、所与の組織中、ラット、マウス、サルまたはヒトなどの所与の種中）における生物学的半減期、あるいは任意の介在する半減期を有する。
【０２８８】
ある特定の実施形態では、このＨＲＳ−ＦｃコンジュゲートまたはＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、対応する未改変ＨＲＳポリペプチドと比較して、皮下（ＳＣ）投与後により大きいバイオアベイラビリティを有する。ある特定の実施形態では、このＨＲＳ−ＦｃコンジュゲートまたはＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、対応する未改変ＨＲＳポリペプチドと比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％もしくは少なくとも約１００％またはそれ超のバイオアベイラビリティを有する。
【０２８９】
ある特定の実施形態では、このＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、ＵＶ円偏光二色性分析を介して決定されるとおり、対応する未改変または異なって改変されたＨＲＳポリペプチドと実質的に同じ二次構造を有する。ある特定の実施形態では、このＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、抗炎症活性のアッセイにおいて、対応する未改変または異なって改変されたＨＲＳポリペプチドと実質的に同じ活性を有する。他の実施形態では、このＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、抗炎症活性のアッセイにおいて、対応する未改変または異なって改変されたＨＲＳポリペプチドの活性の、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０倍超の活性を有する。
【０２９０】
ペプチドリンカー
ある特定の実施形態では、ペプチドリンカー配列は、各ポリペプチドがその所望の二次構造および三次構造へと折り畳まるのを確実にするのに十分な距離、ＨＲＳポリペプチド（複数可）とＦｃ領域（複数可）とを分離するために使用され得る。かかるペプチドリンカー配列は、当該分野で周知の標準的な技術を使用して、融合タンパク質中に組み込まれ得る。
【０２９１】
特定のペプチドリンカー配列は、以下の例示的な因子に基づいて選択され得る：（１）可撓性の伸展されたコンフォメーションをとる能力；（２）第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用できる二次構造をとることができないこと；（３）生理学的安定性；ならびに（４）ポリペプチドの機能的エピトープと反応し得る疎水性残基または荷電残基の欠如、または他の特徴。例えば、ＧｅｏｒｇｅおよびＨｅｒｉｎｇａ、Ｊ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  １５巻：８７１〜８７９頁、２００２年を参照のこと。
【０２９２】
リンカー配列は、一般に、１〜約２００アミノ酸長であり得る。特定のリンカーは、約１〜２００アミノ酸、１〜１５０アミノ酸、１〜１００アミノ酸、１〜９０アミノ酸、１〜８０アミノ酸、１〜７０アミノ酸、１〜６０アミノ酸、１〜５０アミノ酸、１〜４０アミノ酸、１〜３０アミノ酸、１〜２０アミノ酸、１〜１０アミノ酸、１〜５アミノ酸、１〜４アミノ酸、１〜３アミノ酸または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００もしくはそれ超のアミノ酸の、全体的アミノ酸長を有し得る。
【０２９３】
ペプチドリンカーは、本明細書の他の場所に記載され当該分野で公知の、任意の１つまたは複数の天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸（複数可）、アミノ酸アナログおよび／またはアミノ酸模倣物を使用し得る。リンカーとして有用に使用され得る特定のアミノ酸配列には、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ  ４０巻：３９〜４６頁、１９８５年；Ｍｕｒｐｈｙら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．  ８３巻：８２５８〜８２６２頁、１９８６年；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されるものが含まれる。特定のペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ残基、Ｓｅｒ残基および／またはＡｓｎ残基を含む。他の近中性のアミノ酸、例えばＴｈｒおよびＡｌａもまた、所望の場合、ペプチドリンカー配列中で使用され得る。
【０２９４】
特定の例示的なリンカーには、以下のような、Ｇｌｙ、Ｓｅｒおよび／またはＡｓｎ含有リンカー：［Ｇ］ｘ、［Ｓ］ｘ、［Ｎ］ｘ、［ＧＳ］ｘ、［ＧＧＳ］ｘ、［ＧＳＳ］ｘ、［ＧＳＧＳ］ｘ（配列番号２００）、［ＧＧＳＧ］ｘ（配列番号２０１）、［ＧＧＧＳ］ｘ（配列番号２０２）、［ＧＧＧＧＳ］ｘ（配列番号２０３）、［ＧＮ］ｘ、［ＧＧＮ］ｘ、［ＧＮＮ］ｘ、［ＧＮＧＮ］ｘ（配列番号２０４）、［ＧＧＮＧ］ｘ（配列番号２０５）、［ＧＧＧＮ］ｘ（配列番号２０６）、［ＧＧＧＧＮ］ｘ（配列番号２０７）リンカーが含まれ、式中、ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０またはそれ超である。これらおよび関連のアミノ酸の他の組合せは、当業者に明らかである。
【０２９５】
リンカーペプチドのさらなる例には、以下のアミノ酸配列が含まれるがこれらに限定されない：Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（配列番号２０８）；Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（配列番号２０９）；Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（配列番号２１０）；Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−（配列番号２１１）；およびＡｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（配列番号２１２）。
【０２９６】
リンカーペプチドのさらなる非限定的な例には、ＤＧＧＧＳ（配列番号２１３）；ＴＧＥＫＰ（配列番号２１４）（例えば、Ｌｉｕら、ＰＮＡＳ．  ９４巻：５５２５〜５５３０頁、１９９７年を参照のこと）；ＧＧＲＲ（配列番号２１５）（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚら
１９９５年）；（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２０３）（Ｋｉｍら、ＰＮＡＳ．  ９３巻：１１５６〜１１６０頁、１９９６年）；ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号２１６）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、ＰＮＡＳ．８７巻：１０６６〜１０７０頁、１９９０年）；ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号２１７）（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４２巻：４２３〜４２６頁、１９８８年）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号２１８）；ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号２１９）；ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号２２０）；ＬＲＱＫｄ（ＧＧＧＳ）２ＥＲＰ（配列番号２２１）が含まれる。具体的な実施形態では、このリンカー配列は、３つのグリシン残基を含む、Ｇｌｙ３リンカー配列を含む。特定の実施形態では、可撓性のリンカーは、ＤＮＡ結合部位およびペプチド自体の両方をモデル化することが可能なコンピュータープログラムを使用して（ＤｅｓｊａｒｌａｉｓおよびＢｅｒｇ、ＰＮＡＳ．９０巻：２２５６〜２２６０頁、１９９３年；およびＰＮＡＳ．９１巻：１１０９９〜１１１０３頁、１９９４年）、またはファージディスプレイ法によって、合理的に設計され得る。
【０２９７】
このペプチドリンカーは、生理学的に安定であり得るか、または放出可能なリンカー、例えば生理学的に分解可能なリンカーまたは酵素的に切断可能なリンカー（例えば、タンパク質分解的に切断可能なリンカー）を含み得る。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の放出可能なリンカーは、コンジュゲートのより短い半減期およびより迅速なクリアランスを生じ得る。これらおよび関連の実施形態は、例えば、血流中でのＨＲＳポリペプチドの溶解度および血液循環寿命を増強するために使用され得、一方でまた、リンカー分解に引き続いて、血流中にＦｃ領域（複数可）を実質的に含まないＨＲＳポリペプチドを送達する。これらの態様は、ＨＲＳポリペプチドが、Ｆｃ領域へと永久的にコンジュゲート化された場合に、低減した活性を実証する場合に、特に有用である。本明細書に提供されるリンカーを使用することによって、かかるＨＲＳポリペプチドは、コンジュゲート化形態にあるとき、その治療活性を維持し得る。別の例として、大きい、比較的不活性なＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドが投与され得、これは次いで、Ｆｃ領域の一部分を所有するまたはＦｃ領域を全体的に欠く生理活性ＨＲＳポリペプチドを生成するために、ｉｎ  ｖｉｖｏで（分解可能なリンカーを介して）分解される。これらおよび他の方法において、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドの特性は、ＨＲＳポリペプチドの生理活性および循環半減期のバランスを経時的にとるために、より効率的に個別化され得る。
【０２９８】
特定の実施形態では、このリンカーペプチドは、自己触媒的または自己切断性ペプチド切断部位を含む。特定の一実施形態では、自己切断性ペプチドは、ポティウイルスおよびカルジオウイルス２Ａペプチド、ＦＭＤＶ（口蹄疫ウイルス）、ウマ鼻炎Ａウイルス、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルスならびにブタテッショウウイルスから得られるポリペプチド配列が含まれる。ある特定の実施形態では、この自己切断性ポリペプチド部位は、２Ａまたは２Ａ様の部位、配列またはドメインを含む（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．８２巻：１０２７〜１０４１頁、２００１年を参照のこと）。例示的な２Ａ部位には、以下の配列が含まれる：ＬＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２２２）；ＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２２３）；ＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２２４）；ＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２２５）；ＱＬＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２２６）；ＡＰＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２２７）；ＶＴＥＬＬＹＲＭＫＲＡＥＴＹＣＰＲＰＬＬＡＩＨＰＴＥＡＲＨＫＱＫＩＶＡＰＶＫＱＴ（配列番号２２８）；ＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２２９）；ＬＬＡＩＨＰＴＥＡＲＨＫＱＫＩＶＡＰＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２３０）；およびＥＡＲＨＫＱＫＩＶＡＰＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２３１）。一実施形態では、この自己触媒的ペプチド切断部位は、例えば、１８アミノ酸の配列であるアフトウイルス口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）ポリタンパク質の２Ａ領域などの、翻訳２Ａシグナル配列を含む。使用され得る２Ａ様配列のさらなる例には、例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．８２巻：１０２７〜１０４１頁、２００１年に記載されるような、昆虫ウイルスポリタンパク質、Ｃ型ロタウイルスのＮＳ３４タンパク質、およびＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｓｐｐ．中の反復配列が含まれる。
【０２９９】
適切なプロテアーゼ切断部位および自己切断性ペプチドは、当業者に公知である（例えば、Ｒｙａｎら、Ｊ．  Ｇｅｎｅｒ．  Ｖｉｒｏｌ．７８巻：６９９〜７２２頁、１９９７年；およびＳｃｙｍｃｚａｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．５巻：５８９〜５９４頁、２００４年を参照のこと）。例示的なプロテアーゼ切断部位には、ポティウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えば、タバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ）、ポティウイルスＨＣプロテアーゼ、ポティウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビオウイルス（ｂｙｏｖｉｒｕｓ）ＮＩａプロテアーゼ、ビオウイルスＲＮＡ−２コード化プロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（ライスツングロスフェリカルウイルス（ｒｉｃｅ  ｔｕｎｇｒｏ  ｓｐｈｅｒｉｃａｌ  ｖｉｒｕｓ））３Ｃ様プロテアーゼ、ＰＹＶＦ（パースニップ黄斑ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、第Ｘａ因子およびエンテロキナーゼの切断部位が含まれるがこれらに限定されない。その高い切断ストリンジェンシーに起因して、一部の実施形態では、ＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）（配列番号２３２）、例えば、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号２３３）およびＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号２３４）などのＴＥＶ（タバコエッチ病ウイルス）プロテアーゼ切断部位が含まれ、式中、Ｘは、任意のアミノ酸を示す（ＴＥＶによる切断は、ＱとＧとの間またはＱとＳとの間で起きる）。
【０３００】
本発明の特定の実施形態における使用のために適切な酵素的に分解可能なリンカーの更なる例には、セリンプロテアーゼ、例えばトロンビン、キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、カリクレインまたはスブチリシン（ｓｕｂｓｔｉｌｉｓｉｎ）によって切断されるアミノ酸配列が含まれるがこれに限定されない。トロンビン切断可能なアミノ酸配列の例示的な例には、−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−（配列番号２３５）、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−、−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−（配列番号２３６）、−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−（配列番号２３７）、−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−（配列番号２３８）、−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−、−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−および−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−が含まれるがこれらに限定されない。エラスターゼ切断可能なアミノ酸配列の例示的な例には、−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−、−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−（配列番号２３９）、−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−（配列番号２４０）、−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−（配列番号２４１）、−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−（配列番号２４２）および−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−（配列番号２４３）が含まれるがこれらに限定されない。
【０３０１】
酵素的に分解可能なリンカーには、マトリックスメタロプロテイナーゼ、例えばコラゲナーゼ、ストロメライシンおよびゼラチナーゼによって切断され得るアミノ酸配列もまた含まれる。マトリックスメタロプロテイナーゼ切断可能なアミノ酸配列の例示的な例には、−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｚ−（配列番号２４４）、−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｚ−（配列番号２４５）、−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｚ−（配列番号２４６）および−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｚ−（配列番号２４７）が含まれるがこれらに限定されず、式中、ＹおよびＺはアミノ酸である。コラゲナーゼ切断可能なアミノ酸配列の例示的な例には、−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｚ−（配列番号２４８）、−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｚ−（配列番号２４９）、−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−（配列番号２５０）、−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−（配列番号２５１）、−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−（配列番号２５２）、−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−（配列番号２５３）、および−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−（配列番号２５４）が含まれるがこれらに限定されず、式中、Ｚはアミノ酸である。ストロメライシン切断可能なアミノ酸配列の１つの例示的な例は、−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−（配列番号２５５）である；ゼラチナーゼ切断可能なアミノ酸配列の一例は、−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−（配列番号２５６）である。
【０３０２】
本発明の特定の実施形態における使用に適切な酵素的に分解可能なリンカーには、アンギオテンシン変換酵素によって切断され得るアミノ酸配列、例えば、−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−、−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−（配列番号２５７）および−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−（配列番号２５８）などもまた含まれる。
【０３０３】
本発明の特定の実施形態における使用に適切な酵素的に分解可能なリンカーには、カテプシンＢによって分解され得るアミノ酸配列、例えば、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−（配列番号２５９）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−（配列番号２６０）およびＰｈｅ−Ｌｙｓなどもまた含まれる。
【０３０４】
特定の実施形態では、放出可能なリンカーは、ｐＨ７．４、２５℃、例えば、生理学的ｐＨ、ヒト体温（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ、血清中、所与の組織中）において、約３０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間もしくは約９６時間またはそれ超の半減期、あるいは任意の介在する半減期を有する。当業者は、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドの半減期が、特定の放出可能なリンカーを使用することによって精密に個別化され得ることを理解する。
【０３０５】
しかし、ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーのうちの任意の１つまたは複数は、任意選択である。例えば、第１および第２のポリペプチドが、機能的ドメインを分離し、立体障害を防止するために使用され得る非必須のＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸領域を有する場合には、リンカー配列は、必要とされない可能性がある。
【０３０６】
使用のための方法
本発明の実施形態は、Ｆｃ領域−ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＨＲＳ−Ｆｃ）コンジュゲートポリペプチド、ならびにそれらの断片およびバリアントが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、有用な種々の方法で炎症性応答をモジュレートする改善された方法を提供するという発見に関連する。従って、本発明の組成物は、かかる炎症性および／または自己免疫性の疾患、状態および障害を、直接的にまたは間接的にのいずれかで媒介する細胞をモジュレートすることによって、炎症性応答、慢性炎症、急性炎症および免疫性疾患を含む広範な炎症促進性、炎症性および／または自己免疫性の適応症を処置するための免疫調節剤として有用であり得る。免疫調節剤としての本発明の組成物の有用性は、例えば、遊走アッセイ（例えば、白血球またはリンパ球を使用する）、サイトカイン産生アッセイ、または細胞生存度もしくは細胞分化アッセイ（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球またはＮＫ細胞を使用する）を含む、いくつかの当該分野で公知の利用可能な技術のいずれかを使用して、モニタリングされ得る。
【０３０７】
「炎症」とは、一般に、有害刺激、例えば病原体、損傷細胞（例えば、創傷）および刺激物に対する組織の生物学的応答を指す。用語「炎症性応答」とは、例示のみとして、本明細書に記載され当該分野で公知の他のもののうちで、免疫細胞の活性化もしくは遊走、遊走、自己免疫および自己免疫性疾患、サイトカイン産生、キニン放出、線維素溶解および凝固を含む血管拡張を含む、炎症が達成および調節される特定の機構を指す。理想的には、炎症は、傷害性刺激を除去し、罹患組織（単数または複数）のための治癒プロセスを開始することの両方のための、身体による防御の試みである。炎症の非存在下では、創傷および感染は決して治癒せず、組織の進行性の破壊が生存を脅かすという情況を生み出す。他方で、過剰なまたは慢性の炎症は、本明細書に記載され当該分野で公知の他のもののうちで、枯草熱、アテローム動脈硬化症および関節リウマチなどの種々の疾患と関連し得る。
【０３０８】
慢性炎症の臨床的徴候は、疾病の持続時間、炎症性病変、原因および罹患した解剖学的領域に依存する（例えば、Ｋｕｍａｒら、Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｂａｓｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ−第８版、２００９年  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｌｏｎｄｏｎ；Ｍｉｌｌｅｒ，  ＬＭ、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｌｅｃｔｕｒｅ  Ｎｏｔｅｓ、Ａｔｌａｎｔｉｃ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｔｏｗｎ、ＰＥＩ、Ｃａｎａｄａを参照のこと）。慢性炎症は、本明細書に記載され当該分野で公知の他のもののうちで、例えば、アレルギー、アルツハイマー病、貧血、大動脈弁狭窄症、関節炎、例えば関節リウマチおよび変形性関節症、がん、うっ血性心不全、線維筋痛症、線維症、心臓発作、腎臓不全、ループス、膵炎、脳卒中、手術合併症、炎症性肺疾患、クローン病（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を含む炎症性腸疾患、アテローム動脈硬化症、神経学的障害、糖尿病、代謝障害、肥満ならびに乾癬を含む、種々の病理学的状態または疾患と関連する。多くの他の慢性疾患は、炎症性構成要素もまた含み得、従って、例えば、筋ジストロフィーおよび横紋筋融解を含め、本発明のＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートで処置され得る。従って、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、慢性炎症を処置もしくは管理するため、個々の慢性炎症性応答のうちの１つもしくは複数のいずれかをモジュレートするため、または慢性炎症と関連する任意の１つもしくは複数の疾患もしくは状態を処置するために、使用され得る。
【０３０９】
特定の具体的な炎症性応答には、サイトカインの産生および活性、または関連経路が含まれる。例えば、特定の例示的な実施形態は、例えば、この転写因子の下流の活性を増加させることによって、核因子−ｋＢ（ＮＦ−ｋＢ）を介した細胞シグナル伝達をモジュレートすることに関する。ある特定の場合には、ＮＦ−ｋＢ活性における増加は、サイトカインのシグナル伝達または活性、例えば炎症促進性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−アルファまたはベータ）、および抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０）における増加をもたらし得る。
【０３１０】
例えば受容された臨床的基準に従って改善を決定することによって、治療有効用量が処置の過程において投与されたかどうかを決定するなど、鑑別診断を行う目的のためおよびまた処置をモニタリングするためを含む、炎症性状態および他の状態の徴候および症状を評価するための基準は、当業者に明らかであり、例えば、Ｂｅｒｋｏｗら編、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ、第１６版、Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｒａｈｗａｙ、Ｎ．Ｊ．、１９９２年；Ｇｏｏｄｍａｎら編、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１０版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｅｌｍｓｆｏｒｄ、Ｎ．Ｙ．、（２００１年）；Ａｖｅｒｙ’ｓ  Ｄｒｕｇ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第３版、ＡＤＩＳ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｔｄ．、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ．（１９８７年）；Ｅｂａｄｉ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ｌｉｔｔｌｅ、Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｂｏｓｔｏｎ、（１９８５年）；Ｏｓｏｌｃｉら編、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９９０年）；Ｋａｔｚｕｎｇ、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ（１９９２年）の教示によって例示される。
【０３１１】
本明細書に記載されるＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートのいずれかの使用を介した、自然免疫応答または適応免疫応答などの免疫応答をモジュレートする方法もまた含まれる。本明細書で使用する場合、用語「免疫応答」は、免疫系の１つまたは複数の細胞によって媒介される、抗原、ワクチン組成物または免疫調節性分子に対する測定可能なまたは観察可能な反応を含む。免疫応答は典型的に、免疫系細胞に対する抗原または免疫調節性分子の結合で始まる。抗原または免疫調節性分子に対する反応は、自然免疫応答、体液性免疫応答、細胞媒介性免疫応答を媒介することに関与する抗原または免疫調節性分子および細胞に最初に結合する細胞を含む、多くの細胞型によって媒介され得る。
【０３１２】
免疫性疾患を処置する方法もまた含まれる。本発明に従って処置され得る例示的な免疫系の疾患、障害または状態には、原発性免疫不全、免疫性媒介性血小板減少症、川崎症候群、骨髄移植（例えば、成人または小児における最近の骨髄移植）、慢性Ｂ細胞リンパ性白血病、ＨＩＶ感染（例えば、成人または小児科ＨＩＶ感染）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、輸血後紫斑病などが含まれるがこれらに限定されない。
【０３１３】
さらに、本明細書に記載されるＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートのいずれかで処置され得るさらなる疾患、障害および状態には、ギラン・バレー症候群、貧血（例えば、パルボウイルスＢ１９と関連する貧血、感染（例えば、反復感染）の危険性が高い、安定な多発性骨髄腫を有する患者、自己免疫性溶血性貧血（例えば、温式自己免疫性溶血性貧血）、血小板減少症（例えば、新生児血小板減少症）および免疫性媒介性好中球減少症）、移植（例えば、ＣＭＶ陽性臓器のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）陰性レシピエント）、低ガンマグロブリン血症（例えば、感染または罹患率の危険因子を有する低ガンマグロブリン血症新生児）、てんかん（例えば、難治性てんかん）、全身性血管炎症候群、重症筋無力症（例えば、重症筋無力症における代償不全）、皮膚筋炎ならびに多発性筋炎が含まれる。
【０３１４】
本明細書に記載されるＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートのいずれかで処置され得るさらなる自己免疫性疾患、障害および状態には、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性新生児血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性血球減少症、溶血性貧血、抗リン脂質抗体症候群、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発軟骨炎、リウマチ性心疾患、糸球体腎炎（例えば、ＩｇＡ腎症）、多発性硬化症、神経炎、ぶどう膜炎眼炎、多腺性内分泌障害（ｐｏｌｙｅｎｄｏｃｈｎｏｐａｔｈｙ）、紫斑病（例えば、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病（Ｈｅｎｌｏｃｈ−Ｓｃｏｅｎｌｅｉｎ  ｐｕｒｐｕｒａ））、ライター病、スティフ・マン症候群、自己免疫性肺炎症、ギラン・バレー症候群、インスリン依存性糖尿病および自己免疫性炎症性眼疾患が含まれるがこれらに限定されない。
【０３１５】
本明細書に記載されるＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートのいずれかで処置され得るさらなる自己免疫性疾患、障害または状態には、自己免疫性甲状腺炎；橋本甲状腺炎ならびに例えば細胞媒介性および体液性の甲状腺細胞傷害性を特徴とする甲状腺炎を含む、甲状腺機能低下症；ＳＬＥ（例えば、循環するおよび局所的に生成された免疫複合体を特徴とする場合が多い）；グッドパスチャー症候群（例えば、抗基底膜抗体を特徴とする場合が多い）；天疱瘡（例えば、上皮棘融解抗体を特徴とする場合が多い）；例えば、グレーブス病（例えば、甲状腺刺激ホルモン受容体に対する抗体を特徴とする場合が多い；例えば、アセチルコリン受容体抗体を特徴とする場合が多い重症筋無力症）などの受容体自己免疫；インスリン抵抗性（例えば、インスリン受容体抗体を特徴とする場合が多い）；自己免疫性溶血性貧血（例えば、抗体感作赤血球の食作用を特徴とする場合が多い）；ならびに自己免疫性血小板減少性紫斑病（例えば、抗体感作血小板の食作用を特徴とする場合が多い）が含まれるがこれらに限定されない。
【０３１６】
本明細書に記載されるＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートのいずれかで処置され得るさらなる自己免疫性疾患、障害または状態には、関節リウマチ（例えば、関節における免疫複合体を特徴とする場合が多い）；抗コラーゲン抗体を伴う強皮症（例えば、核小体および他の核抗体を特徴とする場合が多い）；混合性結合組織病（例えば、抽出可能な核抗原、例えばリボヌクレオタンパク質に対する抗体を特徴とする場合が多い）；多発性筋炎／皮膚筋炎（例えば、非ヒストン抗核抗体を特徴とする場合が多い）；悪性貧血（例えば、抗壁細胞、抗ミクロソームおよび抗内因子抗体を特徴とする場合が多い）；特発性アジソン病（例えば、体液性および細胞媒介性の副腎細胞傷害性を特徴とする場合が多い）；不妊症（例えば、抗精子（ａｎｔｉｓｐｅｎｎａｔｏｚｏａｌ）抗体を特徴とする場合が多い）；糸球体腎炎（例えば、糸球体基底膜抗体または免疫複合体を特徴とする場合が多い）；原発性糸球体腎炎による、ＩｇＡ腎症による；水疱性類天疱瘡（例えば、基底膜におけるＩｇＧおよび補体を特徴とする場合が多い）；シェーグレン症候群（例えば、多組織抗体および／または特異的非ヒストン抗核抗体（ＳＳ−Ｂ）を特徴とする場合が多い）；糖尿病（例えば、細胞媒介性および体液性島細胞抗体を特徴とする場合が多い）；および喘息または嚢胞性線維症を伴うアドレナリン作動性薬抵抗性を含む、アドレナリン作動性薬抵抗性（例えば、ベータ−アドレナリン作動性受容体抗体を特徴とする場合が多い）が含まれるがこれらに限定されない。
【０３１７】
本明細書に記載されるＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートのいずれかで処置され得るなおさらなる自己免疫性疾患、障害または状態には、慢性活動性肝炎（例えば、平滑筋抗体を特徴とする場合が多い）；原発性胆汁性肝硬変（例えば、抗ミトコンドリア抗体を特徴とする場合が多い）；他の内分泌腺不全（例えば、一部の場合には特異的組織抗体を特徴とする）；白斑（例えば、抗メラニン細胞抗体を特徴とする場合が多い）；血管炎（例えば、血管壁中の免疫グロブリンおよび補体ならびに／または低い血清補体を特徴とする場合が多い）；心筋梗塞後状態（例えば、抗心筋抗体を特徴とする場合が多い）；開心術症候群（例えば、抗心筋抗体を特徴とする場合が多い）；蕁麻疹（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体を特徴とする場合が多い）；アトピー性皮膚炎（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体を特徴とする場合が多い）；喘息（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体を特徴とする場合が多い）；炎症性ミオパチー；ならびに他の炎症性、肉芽腫性、変性および萎縮性障害が含まれるがこれらに限定されない。
【０３１８】
本明細書に記載されるＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートのいずれかで処置され得るさらなる疾患および障害には、Ｔｈ１７もしくは他のＴｈ細胞サブタイプの不均衡から生じるまたはかかる不均衡と関連するものが含まれる。例には、乾癬、乾癬性関節炎、アトピー性皮膚炎（湿疹）、バロー同心円硬化症、シルダーびまん性硬化症、マールブルグ型ＭＳ、ＩＢＤ、クローン、潰瘍性大腸炎、コラーゲン性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置性大腸炎（ｄｉｖｅｒｓｉｏｎ  ｃｏｌｉｔｉｓ）、ベーチェット病、不確定大腸炎、喘息、自己免疫性心筋炎、子宮内膜症、成人発症スチル障害（ＡＯＳＤ）、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、フォークト・小柳・原田（ＶＫＨ）、歯周疾患、臓器移植の失敗、移植片対宿主疾患およびデビック病（視神経脊髄炎）が含まれる。
【０３１９】
一部の態様では、本発明は、自己免疫性疾患と関連する筋肉または肺の炎症を低減させる方法であって、本明細書に記載されるＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートのいずれかを含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップを含む、方法を含む。例示的な筋肉の炎症性疾患および障害には、筋ジストロフィー、運動誘導性筋肉炎症、筋肉傷害または手術と関連する炎症、横紋筋融解、ならびに本明細書に記載される関連の疾患および障害が含まれる。
【０３２０】
自己抗体と関連する疾患を処置する方法であって、本明細書に記載されるＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートのいずれかを含む治療用組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップを含み、このＨＲＳポリペプチドは、自己抗体によって特異的に認識される少なくとも１つのエピトープを含む、方法を含む。
【０３２１】
ある特定の実施形態は、ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＨｉｓＲＳ）抗原に対する寛容を誘導する方法であって、本明細書に記載されるＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートのいずれかを含む組成物を被験体に投与するステップを含み、このＨＲＳポリペプチドは、自己抗体によって特異的に認識される少なくとも１つのエピトープを含み、この組成物の投与は、自己抗原に対する寛容化を引き起こす、方法を含む。
【０３２２】
ヒスチジルｔＲＮＡシンテターゼ（ＨｉｓＲＳ）自己抗原に対する自己免疫性応答に関与するＴ細胞のセットもしくはサブセットを排除する方法であって、本明細書に記載されるＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートのいずれかを含む組成物を被験体に投与するステップを含み、このＨＲＳポリペプチドは、自己抗体または自己反応性Ｔ細胞によって特異的に認識される少なくとも１つのエピトープを含み、この組成物の投与は、自己反応性Ｔ細胞のクローン除去を引き起こす、方法もまた含まれる。
【０３２３】
別の実施形態では、本発明は、ヒスチジルｔＲＮＡシンテターゼ（ＨＲＳ）自己抗原に対する自己免疫性応答に関与するＴ細胞においてアネルギーを誘導する方法であって、本明細書に記載されるＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートのいずれかを含む組成物を被験体に投与するステップを含み、このＨＲＳポリペプチドは、自己抗体またはＴ細胞によって特異的に認識される少なくとも１つのエピトープを含み、この組成物の投与は、自己免疫性応答に関与するＴ細胞の機能的不活性化を引き起こす、方法を含む。
【０３２４】
別の実施形態では、本発明は、ヒスチジルｔＲＮＡシンテターゼの不十分と関連する疾患を処置するための補充療法であって、本明細書に記載されるＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートのいずれかを含む治療用組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップを含み、このＨＲＳポリペプチドは、ヒスチジルｔＲＮＡシンテターゼの不十分を機能的に補償する、補充療法を含む。
【０３２５】
この補充療法の一態様では、このヒスチジルｔＲＮＡシンテターゼの不十分は、抗Ｊｏ−１抗体の存在によって引き起こされる。この補充療法の一態様では、このヒスチジルｔＲＮＡシンテターゼの不十分は、内因性ヒスチジルｔＲＮＡシンテターゼの活性、発現または細胞分布をモジュレートする、内因性ヒスチジルｔＲＮＡシンテターゼにおける変異によって引き起こされる。一態様では、このヒスチジルｔＲＮＡシンテターゼの不十分は、ペロー症候群（Ｐｅｒｒａｕｌｔ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）またはアッシャー症候群と関連する。
【０３２６】
これらの方法のいずれかでは、用語「寛容」とは、哺乳動物、特にヒトにおける特異的抗原に対する免疫応答の、持続性の低減または非存在を指す。寛容は、全般性の免疫抑制とは別個であり、ここで、免疫応答の全て、または免疫応答の免疫細胞の特定のクラスの全て、例えば、Ｂ細胞媒介性免疫応答が、減少または排除される。寛容の発生は、処置性のＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートの単一用量または逐次的用量での投与後の宿主被験体の血清における、ＨＲＳポリペプチドに対する抗体の濃度における非存在または減少によって、慣用的にモニタリングされ得る。寛容の発生は、典型的には、患者における自己免疫性疾患の症状を減少させるのに十分であり、例えば、患者は、コルチコステロイドなどの一般的免疫抑制剤の非存在下または低減した量の存在下で正常な活性を維持するように、十分に改善され得る。
【０３２７】
これらの方法および組成物のいずれかでは、寛容は、典型的には持続性であり、これは、寛容が、約１カ月間、約２カ月間、約３カ月間、約４カ月間、約５カ月間もしくは約６カ月間またはそれ超の持続時間を有することを意味する。寛容は、選択的なＢ細胞アネルギーもしくはＴ細胞アネルギーまたは両方を生じ得る。
【０３２８】
これらの方法、処置および治療用組成物のいずれかでは、用語「ヒスチジルｔＲＮＡシンテターゼに対して特異的な自己抗体と関連する疾患」とは、他の自己抗体もまた検出されるかどうか、または疾患の進行もしくは原因において役割を果たすと考えられるかどうかにかかわらず、ヒスチジルｔＲＮＡシンテターゼに対する抗体が検出されるかまたは検出可能である、任意の疾患または障害を指す。患者試料中の抗体を検出するための方法は、例えば、ＲＩＡによって、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降によって、組織もしくは細胞（トランスフェクトした細胞を含む）の染色によって、抗原マイクロアレイ、質量分析、特異的中和アッセイ、または所望の抗原特異性を同定するための当該分野で公知のいくつかの他の方法のうちの１つを含む、任意の標準的な手順によって実施され得る。一部の態様では、抗体特異性は、ヒスチジルｔＲＮＡシンテターゼの異なるスプライスバリアントおよび短縮型またはタンパク質分解形態に選択的に結合する抗体の能力を決定することによって、さらに特徴付けられ得る。ヒスチジルｔＲＮＡシンテターゼに対する比較的周知のヒト自己抗体には、例えば、Ｊｏ−１に対する抗体が含まれる。
【０３２９】
特許請求された方法および組成物のいずれかの一部の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドまたはＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼに対する疾患関連自己抗体と特異的に交差反応する、ヒスチジルｔＲＮＡシンテターゼ由来のエピトープを含む。特許請求された方法および組成物のいずれかの一部の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドまたはＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼに対する疾患関連自己反応性Ｔ細胞と特異的に交差反応する、ヒスチジルｔＲＮＡシンテターゼ由来のエピトープを含む。特許請求された方法および組成物のいずれかの一部の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドまたはＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、いずれかの別のｔＲＮＡシンテターゼに対する疾患関連自己抗体または非ｔＲＮＡシンテターゼ自己抗体と特異的に交差反応するエピトープを含む。
【０３３０】
特許請求された方法のいずれかの一部の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドまたはＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼに対する自己抗体と関連する疾患を有する患者の血清由来の抗体の大部分によって特異的に認識される免疫優性エピトープを含む。特許請求された方法のいずれかの一部の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドまたはＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼに対する自己抗体と関連する疾患を有する患者の血清由来の自己反応性Ｔ細胞の大部分によって特異的に認識される免疫優性エピトープを含む。
【０３３１】
一部の実施形態では、このエピトープは、ＨＲＳポリペプチドのＷＨＥＰドメイン（配列番号１のおよそアミノ酸１〜４３）；アミノアシル化ドメイン（配列番号１のおよそアミノ酸５４〜３９８）；もしくはアンチコドン結合ドメイン（配列番号１のおよそアミノ酸４０６〜５０１）またはそれらの任意の組合せ内に含まれる。
【０３３２】
一部の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドは、ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼに対する疾患関連自己抗体と特異的に交差反応するエピトープを含まない。一部の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドは、最大で約１×１０−７Ｍの濃度まで、競合的ＥＬＩＳＡにおいて、ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼに対する疾患関連自己抗体の結合について顕著には競合しない。一部の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドは、最大で約５×１０−７Ｍの濃度まで、競合的ＥＬＩＳＡにおいて、ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼに対する疾患関連自己抗体の結合について顕著には競合しない。一部の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドは、最大で約１×１０−６Ｍの濃度まで、競合的ＥＬＩＳＡにおいて、ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼに対する疾患関連自己抗体の結合について顕著には競合しない。
【０３３３】
従って、一部の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドは、競合的ＥＬＩＳＡで測定されるとおり、野生型ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（配列番号１）よりも、疾患関連自己抗体に対する低い親和性を有する。一部の実施形態では、このＨＲＳポリペプチドは、野生型ヒト（配列番号１）に対する疾患関連自己抗体の親和性よりも、少なくとも約１０倍少ない、または少なくとも約２０倍少ない、または少なくとも約５０倍少ない、または少なくとも約１００倍少ない、疾患関連自己抗体に対する見かけの親和性を有する。一態様では、ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼに対する自己抗体は、Ｊｏ−１抗原に対する抗体である。
【０３３４】
ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼに対して特異的な自己抗体と関連する疾患（ならびにヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼの不十分と関連する疾患）の例には、特発性炎症性ミオパチー、多発性筋炎、スタチン誘導性ミオパチー、皮膚筋炎、間質性肺疾患（および他の肺線維性状態）および関連障害、例えば多発性筋炎−強皮症重複および封入体筋炎（ＩＢＭ）ならびに例えば、間質性肺疾患、関節炎、食道蠕動低下、心血管疾患および他の血管所見、例えばレイノー現象を含む、抗シンテターゼ症候群において見出される状態などの状態を含む、自己免疫性疾患、炎症性疾患および炎症性ミオパチーが含まれるがこれらに限定されない；ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼの不十分と関連する疾患の他の例には、アッシャー症候群およびペロー症候群を含む、活性なヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼの不十分を生じる遺伝子障害が含まれる。
【０３３５】
多発性筋炎は、身体の両方の側の骨格筋（動くことに関与する）に罹患する。多発性筋炎は、１８歳未満の人においては稀にしか見られない；ほとんどの症例は、３１歳と６０歳との間の人においてである。上に列挙した症状に加えて、進行性の筋脱力は、嚥下、発話、座位からの立ち上がり、階段上り、物の持ち上げまたは腕上げの困難をもたらす。多発性筋炎を有する人は、関節炎、息切れおよび心不整脈もまた経験し得る。多発性筋炎は、ＨｉｓＲＳを含むシンテターゼに対する抗体と関連する場合が多く、損傷筋肉細胞中への免疫細胞浸潤を生じる。従って、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、免疫細胞の活性化および浸潤を低減させ、多発性筋炎を処置するために、使用され得る。
【０３３６】
皮膚筋炎は、進行性の筋脱力に先行するまたは進行性の筋脱力に付随する皮膚発疹を特徴とする。この発疹は、パッチ状に見え、紫色および赤色の変色を有し、瞼上で、ならびに指関節、肘関節、膝関節およびつま先を含む関節を伸ばすまたはまっすぐにするために使用される筋肉上で、特徴的に発生する。赤色の発疹は、顔、首、肩、胸郭上部、背中および他の位置上でも発生し得、罹患領域において腫脹が存在し得る。発疹は時折、明白な筋肉の関与なしに生じる。皮膚筋炎を有する成人は、体重減少または低グレードの発熱を経験し得、炎症を起こした肺を有し得、光に対して敏感であり得る。成人皮膚筋炎は、多発性筋炎とは異なり、乳房、肺、雌性生殖器または腸の腫瘍を伴い得る。皮膚筋炎を有する小児および成人は、皮膚の下または筋肉中の固い隆起として現れるカルシウム沈着（石灰沈着症と呼ばれる）を発生させ得る。石灰沈着症は、疾患発症の１〜３年後に生じる場合が最も多いが、何年も経過してから生じる場合もある。これらの沈着は、成人において始まる皮膚筋炎においてよりも、小児期皮膚筋炎においてより頻繁に見られる。皮膚筋炎は、コラーゲン−血管疾患または自己免疫性疾患と関連し得る。
【０３３７】
多発性筋炎および皮膚筋炎の一部の場合には、遠位筋肉（体幹部から離れている、例えば、前腕中ならびに足首および手首の周囲の筋肉）が、疾患が進行するにつれて罹患し得る。多発性筋炎および皮膚筋炎は、損傷筋肉細胞中への免疫細胞浸潤を生じるコラーゲン−血管疾患または自己免疫性疾患と関連し得る。従って、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、免疫細胞の活性化および浸潤を低減させ、皮膚筋炎を処置するために、使用され得る。
【０３３８】
封入体筋炎（ＩＢＭ）は、進行性の筋脱力および筋消耗を特徴とする。筋脱力の発症は、一般に漸進的であり（数カ月間または数年間にわたる）、近位筋肉および遠位筋肉の両方に罹患する。筋脱力は、身体の一方の側のみに罹患し得る。空砲と呼ばれる小さい穴が、罹患した筋線維の細胞において時折見られる。転倒および躓きは、通常、ＩＢＭの最初の目立った症状である。一部の個体について、この障害は、物をつまむこと、ボタンかけおよび物を握ることの困難を引き起こす、手首および手指における脱力で始まる。手首および手指筋肉の脱力ならびに前腕筋肉および脚の大腿四頭筋の萎縮症（筋肉容積の菲薄化または喪失）が存在し得る。嚥下困難は、ＩＢＭ症例のおよそ半分において生じる。この疾患の症状は、通常、５０歳後に始まるが、この疾患はより早期に生じ得る。多発性筋炎および皮膚筋炎とは異なり、ＩＢＭは、女性においてよりも男性においてより頻繁に生じる。他の筋ジストロフィーと同様、ＩＢＭもまた、損傷筋肉細胞中への進行性の免疫細胞浸潤を生じる。従って、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、免疫細胞の活性化および浸潤を低減させ、ＩＢＭを処置するために、使用され得る。
【０３３９】
若年性筋炎は、成人皮膚筋炎および多発性筋炎に対していくらかの類似性を有する。若年性筋炎は、２歳〜１５歳の小児に典型的に罹患し、その症状は、近位筋肉の脱力および炎症、浮腫（腫脹を引き起こす、身体組織内の流体の異常な収集）、筋肉疼痛、疲労、皮膚発疹、腹部疼痛、発熱ならびに拘縮（関節が自由に動くことを妨げる、筋肉腱における炎症によって引き起こされる、関節周囲の筋肉または腱の慢性短縮）を含む。若年性筋炎を有する小児は、嚥下困難および呼吸困難もまた有し得、心臓が罹患し得る。若年性皮膚筋炎を有する小児のうちのおよそ２０〜３０パーセントは、石灰沈着症を発生させる。罹患した小児は、その血液中に正常レベルよりも高い筋肉酵素クレアチンキナーゼを示さない可能性があるが、正常レベルよりも高い他の筋肉酵素を有する。若年性筋炎は、損傷筋肉細胞中への進行性の免疫細胞浸潤もまた生じる。従って、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、免疫細胞の活性化および浸潤を低減させ、若年性筋炎を処置するために、使用され得る。
【０３４０】
スタチン誘導性ミオパチーは、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼ（ＨＭＧＣＲ）の阻害を介して作用するスタチンの長期使用と関連する。一般に十分には耐容されるが、これらの薬物療法は、筋毒性の誘導剤として記載されてきた。より最近、スタチンミオパチーが薬物休止後であっても持続する患者の報告が存在しており、これは、自己免疫性の原因を有すると仮説が立てられている。スタチンの利益は、冠動脈心疾患および冠状動脈アテローム性硬化症の進行の危険性を低減させることにおいて、議論の余地がない。それにもかかわらず、関連する合併症は、生命を危うくし得る。米国における３８００万人よりも多くが、現在スタチンを摂取していると推定され、これらのうち最大７％（＞２６０万）が筋肉症状を発生させると予測され、これらのうち最大０．５％（＞１９０，０００）が、生命を危うくするミオパチーを発生させるように潜在的に進行する。
【０３４１】
全てのスタチンは、筋肉の問題を引き起こし得、その危険性は、その親油性、コレステロール低下能力および投薬量における増加と共に増加する。セリバスタチンは、特に、より高い危険性を有すると暗示されており、米国の市場から引き上げられている。残りのスタチンのうち、アトルバスタチンおよびシンバスタチンは、より高い筋毒性率を有する。他の非スタチン脂質低下剤、例えばナイアシンおよびフィブレートもまた、特にスタチンと組み合わせた場合、筋肉の問題の危険性を有する。どの患者がスタチン誘導性の筋肉の問題を有するかを予測することは不可能であるが、以前の筋肉の問題は、危険因子であり得、スタチン処置を開始する場合に考慮すべきである。ミオパチーの家族歴は、患者が遺伝的ミオパチーのキャリアであり得るかどうかに関連するが、それは、これがスタチン処置の追加されたストレスによってマスクされない可能性があるからである。他の危険因子には、８０歳を超える年齢、低体重、雌性の性別、甲状腺機能低下症、特定の遺伝的欠損およびアジア系の家系、ならびにカルシウムチャネルブロッカー、マクロライド系抗生物質、オメプラゾール、アミオダロン、アゾール系抗真菌剤、ヒスタミンＨ２受容体アンタゴニスト、ネファゾドン、シクロスポリン、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、ワルファリンおよびグレープフルーツジュースを含む特定の薬物療法の随伴する使用が含まれ得る。
【０３４２】
スタチンによって引き起こされる最も一般的な筋肉症状は、筋肉疼痛または筋肉痛であり、スタチン使用者の約７％において生じる。筋肉痛は、軽度から重度までのどこかであり得、筋肉の活動によって悪化する場合が多い。例えば、高コレステロール血症および最近の心筋梗塞を有する患者において、その症状が耐容可能であり、強いスタチン処置のための適応症である場合、継続されたスタチン処置が適切であり得る。
【０３４３】
ベースラインクレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベルは、スタチン処置を指導する機関によって、スタチン処置の開始前に一律に推奨されるわけではないが、ＣＫレベルは、筋肉症状が後に発生するかどうかの非常に有用な情報を提供し得る。筋脱力もまた生じ得、これは、質の面で疲労性である場合が多く、疼痛および上昇したＣＫと組み合わされる。ほとんどのミオパチーと同様に、脱力は、近位において最も顕著である。横紋筋融解の稀なエピソードもまた、スタチン治療で生じている；これらは、はるかに低頻度であるが、おそらくは致死的であり得る。スタチンミオパチーに最も典型的な、筋肉組織学で見られ得る変化は、チトクロムオキシダーゼ陰性線維、増加した脂質含量および赤色ぼろ線維である。自己免疫性壊死性ミオパチーは、スタチンミオパチーの稀な形態である。これらの患者では、スタチン薬物の中断は、数カ月間の薬物の中断の後でさえも、回復につながることがない。患者は、優勢に近位の、しばしば無痛性の脱力を有する。
【０３４４】
診断は、個体の診療歴、身体検査および筋肉強度の試験の結果、ならびに上昇したレベルの種々の筋肉酵素および自己抗体を示す血液試料に基づく。診断ツールには、収縮の間および安静時に筋肉を制御する電気的活動を記録するための筋電図検査、筋肉炎症を探すための超音波、ならびに異常な筋肉を明らかにし、筋肉疾患を評価するための核磁気共鳴画像化が含まれる。筋肉生検は、慢性炎症の徴候、筋線維の死、血管変形、またはＩＢＭの診断に特異的な変化について、顕微鏡によって試験され得る。従って、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、免疫細胞の活性化および損傷筋肉中への浸潤を低減させ、スタチン誘導性ミオパチーおよび横紋筋融解を処置するために、使用され得る。
【０３４５】
間質性肺疾患（ＩＬＤ）は、肺の瘢痕（即ち、「線維症」）および／または炎症を特徴とする１３０よりも多い障害を含む、肺疾患の広いカテゴリーである。ＩＬＤは、呼吸器科医によって診察された症例の１５パーセントを占める。間質性肺疾患（ＩＬＤ）は、他の疾患から環境因子までの範囲の種々の供給源から発生し得る。ＩＬＤの公知の原因のいくつかには、以下が含まれる：例えば、強皮症／進行性の全身性硬化症、ループス（全身性エリテマトーデス）、関節リウマチおよび多発性筋炎／皮膚筋炎を含む、結合組織疾患または自己免疫性疾患；ならびに例えば、粉塵および特定のガス、毒物、化学療法ならびに放射線療法への曝露を含む、職業性曝露および環境曝露。
【０３４６】
ＩＬＤでは、肺中の組織は、炎症および／または瘢痕化する。肺の間質は、酸素と二酸化炭素との交換が起こる小血管および肺胞（空気嚢）の中ならびにそれらの周囲の領域を含む。間質の炎症および瘢痕は、この組織を破壊し、肺が空気から酸素を抽出する能力における減少をもたらす。従って、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、免疫細胞の活性化および損傷肺中への浸潤を低減させ、ＩＬＤを処置するために、使用され得る。
【０３４７】
ＩＬＤの進行は、疾患によって異なり、人によって異なる。間質性肺疾患は、肺における酸素および二酸化炭素の移行を破壊するので、その症状は典型的に、呼吸に関する問題として顕在化する。ＩＬＤの２つの最も一般的な症状は、運動による息切れおよび非湿性咳である。
【０３４８】
アッシャー症候群は、聴覚および視覚の両方に罹患する最も一般的な状態である。アッシャー症候群の主要な症状は、難聴および網膜色素変性症（ＲＰ）である。ＲＰは、網膜の進行性の変性を介して、夜盲症および末梢視覚（側視（ｓｉｄｅ  ｖｉｓｉｏｎ））の喪失を引き起こす。ＲＰが進行するにつれて、視野は、中心視野のみが残るまでに狭まる。アッシャー症候群を有する多くの人は、重度の平衡問題もまた有する。全ての難聴小児のおよそ３〜６パーセントおよび聴覚障害を有する小児の別の３〜６パーセントが、アッシャー症候群を有する。米国などの先進国では、１００，０００人の出生当たり約４人の赤ん坊が、アッシャー症候群を有する。アッシャー症候群は、常染色体劣性形質として遺伝する。ヒスチジルｔ−ＲＮＡシンテターゼを含むいくつかの遺伝子座が、アッシャー症候群と関連付けられてきた（Ｐｕｆｆｅｎｂｅｒｇｅｒら、（２０１２年）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７巻（１号）ｅ２８９３６頁  ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２８９３６）。
【０３４９】
アッシャー症候群には、３つの臨床的な型が存在する：１型、２型および３型。米国では、１型および２型が、最も一般的な型である。合わせると、これらは、アッシャー症候群を有する小児の全ての症例のうちのおよそ９０〜９５パーセントを占める。
【０３５０】
１型アッシャー症候群を有する小児は、誕生時から深刻に難聴であり、重度の平衡問題を有する。１型アッシャー症候群と関連する平衡問題に起因して、この障害を有する小児は、サポートなしに座るのに手間取り、典型的には、年齢１８カ月になる前に独立して歩くことはない。これらの小児は通常、大抵は１０歳に達する時までに、初期小児期において視覚の問題を発生させ始める。視覚の問題は、夜間の視覚困難で始まる場合が最も多いが、その人が完全に盲目になるまで、迅速に進行する傾向がある。
【０３５１】
２型アッシャー症候群を有する小児は、中程度から重度の難聴および正常な平衡を伴って誕生する。難聴の重症度は変動するが、これらの小児のほとんどは、補聴器から利益を受け得、口頭でコミュニケートできる。２型アッシャー症候群における視覚の問題は、１型における視覚の問題よりも緩徐に進行する傾向があり、ＲＰの発症は、１０代まで明らかでない場合が多い。
【０３５２】
３型アッシャー症候群を有する小児は、誕生時に正常な聴覚を有する。この障害を有するほとんどの小児は、正常からほぼ正常な平衡を有するが、一部は後に平衡問題を発生させ得る。聴覚および視力は時間と共に悪化するが、それらが減退する速度は、同じ家族内であっても、人によって変動し得る。３型アッシャー症候群を有する人は、１０代までに難聴を発生させ得、彼らは、通常、中期成人期から後期成人期までに、補聴器を必要とする。夜盲症は通常、思春期の間のあるときに始まる。盲点が、１０代後期から初期成人期までに現れ、中期成人期までに、その人は通常、法律的に盲目になる。
【０３５３】
ペロー症候群（ＰＳ）は、感音性聴覚障害を有する雌性における卵巣発育異常、ならびに一部の被験体においては、進行性の小脳性運動失調症および知的障害を含む神経学的異常の関連を特徴とする。ペロー症候群の正確な有病率は未知であり、特に、性腺機能低下症が特徴ではなく、症状が検出されないままである雄性において、おそらくは過小診断される。診断時の平均年齢は、感音性難聴を有する雌性における思春期遅発症の提示後の、２２歳である。聴覚欠損が、報告された症例の１つを除いて注目された（診断時の平均年齢８歳）。難聴は、常に感音性であり両側性であるが、同じ家族由来の罹患患者においてさえも、重症度は変動する（軽度から重度まで）。卵巣発育異常は、全ての雌性の症例において報告されているが、生殖腺欠損は雄性においては検出されない。無月経症は一般に原発性であるが、二次的無月経症もまた報告されている。遅延した成長（３パーセンタイルを下回る身長）が、報告された症例の半分において報告された。神経学的異常の正確な頻度は未知であるが、神経学的異常を欠く９人の雌性および２人の雄性（１６〜３７歳）が報告されている。神経学的徴候は進行性であり、一般に、高齢期になってから現れるが、歩行の遅延または初期の頻繁な転倒が、若いＰＳ患者において注目されている。一般的な神経学的徴候は、運動失調、統合運動障害、限定的な外眼運動および多発ニューロパチーである。脊柱側弯症を有する一部の症例もまた報告されている。ＰＳの伝播は、常染色体劣性であり、ミトコンドリアヒスチジルｔＲＮＡシンテターゼにおける変異は、ペロー症候群と関連する卵巣発育異常および感音性難聴を引き起こすことが、最近同定されている（Ｐｉｅｒｃｅら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．１０８巻（１６号）６５４３〜６５４８頁、２０１１年）。
【０３５４】
筋ジストロフィーとは、強度および筋肉容積が漸進的に減退する遺伝性障害の一群を指す。全ての筋ジストロフィーは、１つまたは複数の筋肉特異的遺伝子における原発性の遺伝的欠損によって駆動される筋脱力を特徴とする。さらに、筋ジストロフィーは、典型的には、筋肉炎症を駆動し、筋肉組織の変性を最終的に増強する、可変性の炎症性構成要素を有する。従って、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、免疫細胞の活性化および損傷筋肉中への浸潤を低減させ、筋ジストロフィーを処置するために、使用され得る。少なくとも９つの型の筋ジストロフィーが、一般に認識されている。一部の態様では、この筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー、肢帯筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、眼咽頭筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィーおよび先天性筋ジストロフィーから選択される。
【０３５５】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）：ＤＭＤは、若い少年に罹患し、進行性の筋脱力を引き起こし、通常は脚において始まる。これは、最も重度の形態の筋ジストロフィーである。ＤＭＤは、３，５００人の雄性の出生のうちの約１人において生じ、米国において、およそ８，０００人の少年および若い男性に罹患している。より軽度の形態が、非常に少数の雌性キャリアにおいて生じる。
【０３５６】
ＤＭＤは、機能的タンパク質の産生を防止するジストロフィン関連糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）内で機能する筋細胞膜下タンパク質ジストロフィンをコードする遺伝子中の変異によって引き起こされる。ジストロフィンの量は、疾患の重症度と相関する（即ち、存在するジストロフィンが少ないほど、表現型はより重度になる）。このＤＧＣ複合体は、細胞内細胞骨格を細胞外マトリックスに接続する。ＤＧＣは、サルコメアのＺ線において濃縮し、筋線維に及ぶ力の伝達を付与する。この連結の破壊は、筋細胞膜破裂を最終的にもたらす膜不安定性を生じる。細胞外カルシウムの流入は、筋肉収縮などの分子プロセスを変更し、タンパク質分解活性を活性化する。罹患した筋線維は、壊死性またはアポトーシス性になり、分裂促進的化学誘引物質を放出し、これが炎症性プロセスを開始させる。変性および再生のサイクルは、不可逆的な筋消耗、ならびに線維性組織および脂肪性組織による置き換えを最終的にもたらす。
【０３５７】
デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する少年は、通常、未就学児のときに症状を示し始める。脚が最初に罹患し、歩行を困難にし、平衡問題を引き起こす。ほとんどの患者は、予測よりも３〜６カ月後に歩行し、走行困難を有する。拘縮（恒久的な筋肉の緊張）は通常、腓腹筋肉において最も重度に、５歳または６歳までに始まる。頻繁な転倒および骨折がこの年齢で始まるのが一般的である。階段上りおよび助けなしの立ち上がりは、９歳または１０歳までに不可能になり得、ほとんどの少年は、１２歳までに可動性のために車椅子を使用する。この年齢辺りの体幹筋肉の衰弱は、脊柱側弯症（左右の脊椎湾曲）および脊柱後弯症（前から後ろへの湾曲）をもたらす場合が多い。
【０３５８】
ＤＭＤの最も重篤な脱力のうちの１つは、呼吸および咳嗽の主な機能を実施する腹部の上部にある筋肉のシート、横隔膜の脱力である。横隔膜の脱力は、低減したエネルギーおよびスタミナ、ならびに効率的に咳嗽できないことに起因する増加した肺感染をもたらす。ＤＭＤを有する若い男性は、２０代およびそれ超まで生存できるが、ただし、彼らは、機械的人工呼吸の補助および良好な呼吸器衛生を有する。
【０３５９】
一部の実施形態では、ＤＭＤを有する被験体は、例えば、筋肉生検によって測定される、以下のうちの１つまたは複数を特徴とする：下肢筋肉の障害を反映する陽性のガワーズ徴候（Ｇｏｗｅｒ’ｓ  ｓｉｇｎ）；血液中の高レベルのクレアチンキナーゼ（ＣＰＫ−ＭＭ）；Ｘｐ２１遺伝子における遺伝的エラー；またはジストロフィンの非存在の低減したレベル。
【０３６０】
ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、単独で、または他の治療、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、Ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎなどのエクソンスキッピング治療）、コルチコステロイド、ベータ２−アゴニスト、理学療法、呼吸支援、幹細胞治療および遺伝子置換療法と組み合わせてのいずれかで、ＤＭＤの処置において使用され得る。一部の実施形態では、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートの投与は、６分間歩行試験における統計的に有意な改善をもたらす。
【０３６１】
ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）：ＢＭＤは、年上の少年および若い男性に罹患し、ＤＭＤよりも軽度の過程に従う。ＢＭＤは、３０，０００人の雄性の出生のうち約１人において生じる。ベッカー型筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの重症度の低いバリアントであり、短縮型ではあるが部分的に機能的な形態のジストロフィンの産生によって引き起こされる。
【０３６２】
ＢＭＤの症状は、通常、後期小児期から初期成人期にかけて現れる。症状の進行は、ＤＭＤの進行と並行であり得るが、これらの症状は、通常はより軽度であり、その過程はより可変性である。脊柱側弯症が生じ得るが、通常はより軽度であり、より緩徐に進行する。心筋疾患（心筋症）は、ＢＭＤにおいてより一般的に生じる。問題は、不規則な心拍（不整脈）およびうっ血性心不全を含み得る。症状は、疲労、息切れ、胸部疼痛およびめまいを含み得る。呼吸器脱力もまた生じ、機械的人工呼吸の必要性をもたらし得る。ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、単独で、または他の治療と組み合わせてのいずれかで、ＢＭＤの処置において使用され得る。
【０３６３】
エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）：ＥＤＭＤは、若い少年に罹患し、腓腹における拘縮および脱力、肩および上腕における脱力、ならびに電気インパルスが心臓を伝わって心臓を拍動させる経路における問題（心臓伝導欠損）を引き起こす。遺伝のパターンによって識別可能な、エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィーの３つのサブタイプが存在する：Ｘ連鎖、常染色体優性および常染色体劣性。Ｘ連鎖形態が最も一般的である。各型は、有病率および症状が異なる。この疾患は、ＬＭＮＡ遺伝子における変異によって、またはより一般的にはＥＭＤ遺伝子における変異によって、引き起こされる。両方の遺伝子が、核膜のタンパク質構成要素をコードする。
【０３６４】
ＥＤＭＤは通常、筋脱力に先行する拘縮をしばしば伴って、初期小児期に始まる。脱力は、腓腹筋肉と共に、元々は肩および上腕に罹患し、下垂足をもたらす。ＥＤＭＤを有するほとんどの男性は、中年になるまで生き延びるが、心調律における欠損（心ブロック）は、ペースメーカーで処置しない場合には、致死的であり得る。ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、単独で、または他の治療と組み合わせてのいずれかで、ＥＤＭＤの処置において使用され得る。
【０３６５】
肢帯筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）：ＬＧＭＤは、後期小児期から初期成人期にかけて始まり、男性および女性の両方に罹患して、臀部および肩の周囲の筋肉における脱力を引き起こす。これは、筋ジストロフィーの中で最も可変性であり、いくつかの異なる型の疾患が現在認識されている。ＬＧＭＤが疑われる多くの人は、おそらくは過去に誤診されており、従って、この疾患の有病率を推定するのは困難である。米国における罹患した人の数は、数千人であり得る。
【０３６６】
種々の型のＬＧＭＤを引き起こす少なくとも半ダースの遺伝子が存在するが、ＬＧＭＤの２つの主要な臨床形態が通常は認識される。重度小児期形態は、外見がＤＭＤと類似しているが、常染色体劣性形質として遺伝する。
【０３６７】
肢帯筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）は、ジスフェリン遺伝子中の機能喪失型変異によって引き起こされる。ジスフェリンは、骨格筋および心筋において主に発現されるが、単球、マクロファージおよび他の組織においても発現され、ここで、ジスフェリンは細胞質小胞および細胞膜に局在化する。ジスフェリンは、膜融合および膜輸送、ならびに修復プロセスに関与するようである。ＬＧＭＤ２Ｂは、進行性の対称的筋脱力、および顕著に悪性の免疫性／炎症性病理を特徴とする、遅発性（１０代／若い成人）の筋肉疾患である。筋肉生検は、典型的には、筋線維の変性／再生と一緒に、マクロファージ／マクロファージ活性化マーカー（ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＣＤ８６）、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞から主になる、顕著な炎症性細胞浸潤を示す。従って、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、免疫細胞の活性化および損傷筋肉中への浸潤を低減させ、肢帯筋ジストロフィーを処置するために、使用され得る。
【０３６８】
成人発症型ＬＧＭＤの症状は、通常、人の１０代または２０代において現れ、体幹に最も近い筋肉の進行性の脱力および消耗を特徴とする。拘縮が生じ得、歩行する能力は、通常、発症の約２０年後に喪失する。ＬＧＭＤを有する一部の人は、人工呼吸器の使用を必要とする呼吸器脱力を発生させる。寿命はいくらか短縮され得る（常染色体優性形態は、通常、高齢期に発生し、比較的緩徐に進行する）。
【０３６９】
顔面肩甲上腕筋ジストロフィー（ＦＳＨ）：ＦＳＨは、ランドゥジー・デジュリン病（Ｌａｎｄｏｕｚｙ−Ｄｅｊｅｒｉｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）としても公知であり、後期小児期から初期成人期にかけて始まり、男性および女性の両方に罹患し、顔、肩および上腕の筋肉における脱力を引き起こす。臀部および脚もまた罹患し得る。ＦＳＨは、２０，０００人に約１人において生じ、米国においておよそ１３，０００人の人に罹患している。
【０３７０】
ＦＳＨは、同じ家族のメンバーの中であっても、その重症度および発症の年齢が異なる。症状は、１０代または２０代初期において最も一般には始まるが、乳児または小児期の発症があり得る。症状は、より初期の発症を有する人において、より重度である傾向がある。この疾患は、この疾患によって最もひどく罹患される身体の領域：顔面（ｆａｃｉｏ−）、肩（ｓｃａｐｕｌｏ−）および上腕（ｈｕｍｅｒａｌ）の筋肉にちなんで命名されている。臀部および脚が、同様に罹患され得る。ＦＳＨを有する小児は、部分的または完全な難聴を発生させる場合が多い。
【０３７１】
２つの欠損がＦＳＨＤに必要とされ、第１は、Ｄ４Ｚ４リピートの欠失であり、第２は、ＤＵＸ４遺伝子の「毒性機能獲得型」である。注目される最初の症状は、肩より上に物を持ち上げることの困難である場合が多い。脱力は、他方の側よりも一方の側においてより大きい可能性がある。肩脱力はまた、肩甲骨を後方に突出させ、これは、スカプラリオ翼（ｓｃａｐｕｌａｒ  ｗｉｎｇｉｎｇ）と呼ばれる。ＦＳＨＤは、特定の筋肉群における炎症性浸潤と関連し、従って、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、免疫細胞の活性化および損傷筋肉中への浸潤を低減させ、ＦＳＨＤを処置するために使用され得る。
【０３７２】
筋緊張性ジストロフィー：筋緊張性ジストロフィーは、スタイナート病（Ｓｔｅｉｎｅｒｔ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）としても公知であり、男性および女性の両方に罹患し、顔、足および手において最初に見られる全般性の脱力を引き起こす。これには、罹患した筋肉を弛緩させることができないこと（筋強直）が伴う。症状は、誕生時から成人期を通じて始まり得る。筋強直性筋ジストロフィー１型（ＤＭ１）は、筋ジストロフィーの最も一般的な形態であり、米国において３０，０００人よりも多い人に罹患している。これは、ＤＭＰＫ（筋緊張性ジストロフィータンパク質キナーゼ）遺伝子のＤＮＡ配列中の短い（ＣＴＧ）リピートの増加から生じる。筋強直性筋ジストロフィー２型（ＤＭ２）は、かなり稀であり、ＺＮＦ９（ジンクフィンガータンパク質９）遺伝子中のＣＣＴＧリピートの増加の結果である。
【０３７３】
筋緊張性ジストロフィーの症状には、顔面脱力およびポカーンと開いた口（ｓｌａｃｋ
ｊａｗ）、眼瞼下垂（下垂症）、ならびに前腕および腓腹における筋消耗が含まれる。このジストロフィーを有する人は、特に物体が冷たい場合、握りを弛緩させることに困難を有する。筋緊張性ジストロフィーは、心筋に罹患し、不整脈および心ブロック、ならびに消化器系の筋肉を引き起こし、運動障害および便秘症をもたらす。他の身体系が同様に罹患する：筋緊張性ジストロフィーは、白内障、網膜変性、低ＩＱ、前頭部脱毛、皮膚障害、精巣萎縮症、睡眠時無呼吸およびインスリン抵抗性を引き起こし得る。睡眠に対する増加した必要性または熱望は、減少した意欲と同様、一般的である。重度能力障害は、発症の２０年以内にこの型のジストロフィーを有するほとんどの人に罹患するが、ほとんどが、高齢期においても車椅子を必要としない。従って、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、例えば、他の組織の中で、骨格筋（例えば、大腿四頭筋）および／または心臓組織を含む筋肉組織と関連する炎症を低減させることによって、筋緊張性ジストロフィーを処置するために使用され得る。
【０３７４】
眼咽頭筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）：ＯＰＭＤは、両方の性別の成人に罹患し、眼の筋肉および咽頭における脱力を生じる。これは、Ｑｕｅｂｅｃのフランス系カナダ人の家族の間、および米国南西部のスペイン系アメリカ人の家族において最も一般的である。
【０３７５】
ＯＰＭＤは通常、人の３０代または４０代において始まり、眼および咽頭を制御する筋肉における脱力を伴う。症状には、眼瞼下垂、嚥下困難（嚥下障害）、ならびに顔、首および時折は上肢の他の筋肉への脱力の進行、が含まれる。嚥下困難は、気道中への食品または唾液の誤嚥または導入を引き起こし得る。肺炎が後に続き得る。従って、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、例えば、筋肉組織と関連する炎症を低減させることによって、ＯＰＭＤを処置するために使用され得る。
【０３７６】
遠位型筋ジストロフィー（ＤＤ）：ＤＤは、中年またはそれ以降で始まり、足および手の筋肉における脱力を引き起こす。これは、スウェーデンにおいて最も一般的であり、世界の他の場所では稀である。ＤＤは通常、２０代または３０代に始まり、手、前腕および下腿における脱力を伴う。タイピングまたはボタン留めなどの細かい動きの困難が、最初の症状であり得る。症状は緩徐に進行し、この疾患は通常、寿命には影響しない。従って、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、筋肉組織炎症と関連する炎症を低減させることによって、ＤＤを処置するために使用され得る。
【０３７７】
先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）：ＣＭＤは、誕生時から存在し、全般性の脱力を生じ、通常は緩徐に進行する。福山型ＣＭＤと呼ばれるサブタイプは、精神遅滞にも関与する。両方とも稀である；福山型ＣＭＤは、日本においてより一般的である。
【０３７８】
ＣＭＤは、誕生時からの重度の筋脱力を特徴とし、乳児は、「筋緊張低下（ｆｌｏｐｐｉｎｅｓｓ）」および非常に少ない随意運動を示す。それにもかかわらず、ＣＭＤを有する小児は、ある種の補助器具ありまたはなしのいずれかで、歩行を習得し得、若い成人期またはそれ超まで生存する。対照的に、福山型ＣＭＤを有する小児は、歩行がほとんどできず、重度の精神遅滞を有する。この型のＣＭＤを有するほとんどの小児は、小児期に死亡する。従って、他の筋ジストロフィーと同様、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、例えば、筋肉組織炎症と関連する炎症を低減させることによって、ＣＭＤを処置するために使用され得る。
【０３７９】
悪液質：悪液質（または消耗症候群）は、典型的に、減量を積極的に試みていない人における体重減少、筋肉萎縮症、疲労、脱力および顕著な食欲低下を特徴とする。悪液質の公式の定義は、栄養的に逆転できない体重減少である。罹患した患者がより多くのカロリーを消費する場合であっても、除脂肪体重が喪失され、原発性病理の存在を示す。
【０３８０】
悪液質は、他の疾患のうちで、がん、ＡＩＤＳ、慢性閉塞性肺疾患、多発性硬化症、うっ血性心不全、結核、家族性アミロイド多発ニューロパチー、水銀中毒（肢端疼痛症）およびホルモン欠損症を有する患者によって経験される。
【０３８１】
悪液質は、がん、代謝性アシドーシス（即ち、減少したタンパク質合成および増加したタンパク質異化反応）、特定の感染性疾患（例えば、結核、ＡＩＤＳ）、慢性膵炎、自己免疫性障害、またはアンフェタミンに対する耽溺を含む、種々の基礎障害の徴候でもあり得る。悪液質は、肉体的に、食欲低下、無力症および貧血が原因で起こる不動の状態まで患者を衰弱させ、標準的な処置に対する応答は、通常は乏しい。
【０３８２】
全てのがん患者の約５０％が、悪液質に罹患している。上部胃腸および膵臓のがんを有する患者は、悪液質性症状を発生させる頻度が最も高い。罹患率および死亡率を増加させ、化学療法の副作用を悪化させ、生活の質を低減させることに加えて、悪液質は、患者の２２％〜４０％の範囲の大きい割合のがん患者の死亡の直接の原因とみなされている。がん悪液質の症状には、進行性の体重減少ならびに脂肪性組織および骨格筋の宿主の予備の枯渇が含まれる。伝統的な処置アプローチには、食欲刺激剤、５−ＨＴ３アンタゴニスト、栄養素補給およびＣＯＸ−２阻害剤の使用が含まれる。
【０３８３】
悪液質の病理発生はあまり理解されていないが、炎症促進性サイトカイン、例えばＴＮＦ−α、神経内分泌ホルモン、ＩＧＦ−１、および腫瘍特異的因子、例えばタンパク質分解誘導因子を含む、複数の生物学的経路が関与すると予測されている。
【０３８４】
従って、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、悪液質およびその関連の、基礎にあるまたは二次的な障害または合併症のいずれかを処置するために使用され得る。ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、単独で、またはの中でとりわけ、他の治療、例えば、高タンパク質、ロイシンおよび魚油の組合せによる食品栄養補給、抗酸化薬、プロゲストーゲン（酢酸メゲストロール、酢酸メドロキシプロゲステロン）、ならびに抗シクロオキシゲナーゼ−２薬物、食欲刺激剤、および５−ＨＴ３アンタゴニストと組み合わせて、使用され得る。
【０３８５】
横紋筋融解：横紋筋融解は、骨格筋組織中の筋線維の分解である。分解産物は、血流中に放出され、これらの産物のうちの特定の一部、例えばミオグロビンは、腎臓にとって有害であり、腎臓不全をもたらし得る。
【０３８６】
症状には、筋肉疼痛、嘔吐、錯乱、昏睡、または異常な心拍および心調律が含まれ、それらの重症度は、通常、筋肉損傷の程度および腎臓不全が発生するかどうかに依存する。腎臓への損傷は、通常は初回の筋肉損傷の約１２〜２４時間後に、減少したまたは非存在の尿生成を引き起こし得る。損傷筋肉の腫脹は、同じ筋膜コンパートメントにおいて、コンパートメント症候群、または神経および血管などの周辺組織の圧迫を引き起こし得、血液喪失および罹患身体部分への損傷（例えば、機能喪失型）をもたらし得る。この合併症の症状には、罹患した四肢における疼痛または低減した感覚が含まれる。他の合併症には、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、制御できない出血をもたらし得る、血液凝固における重度の破壊が含まれる。
【０３８７】
初回の筋肉損傷は、例えば、肉体的要因（例えば、挫滅傷、激しい運動）、変更された血液供給（例えば、動脈血栓症、塞栓症）、変更された代謝（例えば、高血糖性高浸透圧性状態、高ナトリウム血症および低ナトリウム血症、低カリウム血症、低カルシウム血症、低リン血症、ケトアシドーシス、甲状腺機能低下症）、変更された体温（高体温、低体温）、薬物療法および毒素（例えば、スタチン、抗精神病薬物療法、神経筋遮断剤、利尿薬、重金属、ヘムロック、昆虫またはヘビ毒）、薬物乱用（例えば、アルコール、アンフェタミン、コカイン、ヘロイン、ケタミン、ＬＤＳ、ＭＤＭＡ）、感染（例えば、コクサッキーウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、エプスタイン・バーウイルス、原発性ＨＩＶ感染、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、ヘルペスウイルス、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、サルモネラ）および自己免疫性筋肉損傷（例えば、多発性筋炎、皮膚筋炎）によって引き起こされ得る。また、特定の遺伝性状態は、解糖および糖原分解欠損（例えば、マッカードル病、ホスホフルクトキナーゼ欠損症、糖原病ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸおよびＸＩ）、脂質代謝欠損（例えば、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩおよびＩＩ欠損症、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼのサブタイプの欠損症（例えば、ＬＣＡＤ、ＳＣＡＤ、ＭＣＡＤ、ＶＬＣＡＤ、３−ヒドロキシアシル−補酵素Ａデヒドロゲナーゼ欠損症）、チオラーゼ欠損症）、ミトコンドリアミオパチー（例えば、コハク酸デヒドロゲナーゼ、チトクロムｃオキシダーゼおよび補酵素Ｑ１０の欠損症）、ならびにその他、例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損症、ミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症および筋ジストロフィーを含め、横紋筋融解の危険性を増加させる。
【０３８８】
横紋筋融解は、通常、血液試験および尿検査で診断され、異常に上昇したまたは漸増するクレアチニンおよび尿素レベル、尿量の低下、または尿のえび茶色の変色によって示され得る。一次処置には、静脈内輸液、透析および血液濾過が含まれる。
【０３８９】
従って、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、横紋筋融解およびその関連の、二次的なまたは基礎にある障害または合併症のいずれかを処置するために使用され得る。ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、単独で、またはショックを処置し、腎臓機能を保存することを意図されているものを含む他の治療と組み合わせて、使用され得る。例示的な治療には、静脈内輸液、通常は等張生理食塩水（体積当たり０．９重量％の塩化ナトリウム溶液）ならびに腎代替療法（ＲＲＴ）、例えば血液透析、連続的血液濾過および腹膜透析の投与が含まれる。
【０３９０】
より一般には、本明細書に記載されるＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、例えば、他の機構の中でも、免疫細胞の活性化、分化、遊走もしくは選択された組織中への浸潤を低減させ、抗炎症性サイトカインの産生を増加させ、または炎症促進性サイトカインの産生もしくは活性を低減させることによって、炎症性応答を低減させ得る。さらに、抗ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ抗体または自己反応性Ｔ細胞の結合、作用または産生を遮断することによる本発明の特定の方法は、抗ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ抗体、他の自己抗体ならびにヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼの不十分の他の原因と関連する、広範な自己免疫性および炎症性の疾患および障害を処置するための有用性を有する。
【０３９１】
医薬的製剤、投与およびキット
本発明の実施形態は、単独で、または１つもしくは複数の治療の他のモダリティと組み合わせてのいずれかで、細胞、被験体または動物への投与のために薬学的に許容される溶液または生理学的に許容される溶液中に製剤化されたＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドを含む組成物を含む。所望の場合、本発明の組成物は、他のタンパク質もしくはポリペプチドまたは種々の薬学的に活性な薬剤などの他の薬物と組み合わせて同様に投与され得ることもまた理解される。これもまた組成物中に含まれ得る他の構成要素には事実上制限は存在しないが、ただし、このさらなる薬剤は、達成することが所望される修飾効果または他の効果には、有害に影響を与えない。
【０３９２】
医薬品製造のために、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲート治療用組成物は、典型的には、エンドトキシンを実質的に含まない。エンドトキシンは、特定の細菌、典型的にはグラム陰性細菌と関連する毒素であるが、エンドトキシンは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓなどのグラム陽性細菌においても見出され得る。最も流行のエンドトキシンは、種々のグラム陰性細菌の外膜において見出されるリポポリサッカリド（ＬＰＳ）またはリポオリゴサッカリド（ＬＯＳ）であり、これらの細菌が疾患を引き起こす能力において中心的な病原性特徴を示す。ヒトにおける少量のエンドトキシンは、他の有害な生理学的影響の中でも、発熱、血圧の低下、ならびに炎症および凝固の活性化を生じ得る。
【０３９３】
エンドトキシンは、当該分野で公知の慣用的な技術を使用して検出され得る。例えば、カブトガニ由来の血液を利用するリムルスアメボサイト溶解物アッセイは、エンドトキシンの存在を検出するための非常に高感度のアッセイである。この試験では、非常に低いレベルのＬＰＳが、この反応を増幅する強力な酵素カスケードに起因して、リムルス溶解物の検出可能な凝固を引き起こし得る。エンドトキシンは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によっても定量され得る。
【０３９４】
エンドトキシンを実質的に含まないためには、エンドトキシンレベルは、タンパク質１ｍｇ当たり、約０．００１ＥＵ未満、０．００５ＥＵ未満、０．０１ＥＵ未満、０．０２ＥＵ未満、０．０３ＥＵ未満、０．０４ＥＵ未満、０．０５ＥＵ未満、０．０６ＥＵ未満、０．０８ＥＵ未満、０．０９ＥＵ未満、０．１ＥＵ未満、０．５ＥＵ未満、１．０ＥＵ未満、１．５ＥＵ未満、２ＥＵ未満、２．５ＥＵ未満、３ＥＵ未満、４ＥＵ未満、５ＥＵ未満、６ＥＵ未満、７ＥＵ未満、８ＥＵ未満、９ＥＵ未満または１０ＥＵ未満であり得る。典型的には、１ｎｇのリポポリサッカリド（ＬＰＳ）は、約１〜１０ＥＵに対応する。
【０３９５】
ある特定の実施形態では、本明細書で留意されるように、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲート組成物は、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲート１ｍｇ当たり約１０ＥＵ未満、またはＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲート１ｍｇ当たり約５ＥＵ未満、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲート１ｍｇ当たり約３ＥＵ未満、またはＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲート１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満またはＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲート１ｍｇ当たり約０．１ＥＵ未満、またはＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲート１ｍｇ当たり約０．０１ＥＵ未満のエンドトキシン含量を有する。ある特定の実施形態では、上述のように、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲート医薬組成物は、ｗｔ／ｗｔタンパク質ベースで、約９５％エンドトキシンを含まない、好ましくは約９９％エンドトキシンを含まない、より好ましくは約９９．９９％エンドトキシンを含まない。
【０３９６】
治療用量のＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドを含む医薬組成物は、ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼの全てのホモログ、オルソログおよび天然に存在するアイソフォームを含む。
【０３９７】
一部の実施形態では、かかる医薬組成物は、約１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲内で医薬組成物のいずれか中に存在し得るヒスチジン緩衝液を含み得る。一部の実施形態では、このヒスチジン緩衝液は、これらの濃度の間の全ての整数および範囲を含む、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭまたは約１００ｍＭの濃度で存在し得る。
【０３９８】
一態様では、かかる組成物は、実質的に単分散であるＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドを含み得、このことは、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲート組成物が、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、動的光散乱または分析的超遠心分離によって評価した場合、１つの見かけの分子量形態で主に（即ち、少なくとも約９０％またはそれ超）存在することを意味する。
【０３９９】
別の一態様では、かかる組成物は、少なくとも約９０％の純度（タンパク質に基づく）、または一部の態様では、少なくとも約９５％の純度、または一部の実施形態では、少なくとも９８％の純度を有する。純度は、当該分野で公知の任意の慣用的な分析方法を介して決定され得る。
【０４００】
別の一態様では、かかる組成物は、存在するタンパク質の総量と比較して、約１０％未満の高分子量凝集体含量を有し、または一部の実施形態では、かかる組成物は、約５％未満の高分子量凝集体含量を有し、または一部の態様では、かかる組成物は、約３％未満の高分子量凝集体含量を有し、または一部の実施形態では、約１％未満の高分子量凝集体含量を有する。高分子量凝集体含量は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、動的光散乱または分析的超遠心分離によるものを含む、種々の分析技術を介して決定され得る。
【０４０１】
医薬組成物は、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドの薬学的に許容される塩を含み得る。適切な塩に関する概説については、ＳｔａｈｌおよびＷｅｒｍｕｔによるＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｕｓｅ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、２００２年）を参照のこと。適切な塩基性塩は、非毒性塩を形成する塩基から形成される。代表的な例には、アルミニウム、アルギニン、ベンザチン、カルシウム、コリン、ジエチルアミン、ジオラミン（ｄｉｏｌａｍｉｎｅ）、グリシン、リシン、マグネシウム、メグルミン、オラミン（ｏｌａｍｉｎｅ）、カリウム、ナトリウム、トロメタミンおよび亜鉛の塩が含まれる。酸および塩基の半塩（ｈｅｍｉｓａｌｔ）、例えば、ヘミリン酸（ｈｅｍｉｓｕｌｐｈａｔｅ）塩およびヘミカルシウム（ｈｅｍｉｃａｌｃｉｕｍ）塩もまた、形成され得る。非経口投与に適切な本発明で使用される組成物は、塩化ナトリウム、グリセリン、グルコース、マンニトール、ソルビトールなどを一般に使用して、好ましくはレシピエントの血液と等張にされた、薬学的に活性な成分の無菌水性溶液および／または懸濁物を含み得る。薬学的に許容される酸付加塩を形成するために適切な有機酸には、例として、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、シュウ酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、パルミチン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、アルキルスルホン酸（例えば、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタン−ジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸）、アリールスルホン酸（例えば、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸）、４−メチルビシクロ（２．２．２）−オクト−２−エン−１−カルボン酸、グルコヘプトン酸、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、三級ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸などが含まれるがこれらに限定されない。
【０４０２】
特定の実施形態では、この担体は、水を含み得る。一部の実施形態では、この担体は、例えば、生理学的ｐＨにおいて生理学的濃度のナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムおよびクロライドを含む水などの、生理食塩水の水性溶液であり得る。一部の実施形態では、この担体は水であり得、この製剤は、ＮａＣｌをさらに含み得る。一部の実施形態では、この製剤は、等張であり得る。一部の実施形態では、この製剤は、低張であり得る。他の実施形態では、この製剤は、高張であり得る。一部の実施形態では、この製剤は、等浸透圧であり得る。一部の実施形態では、この製剤は、ポリマー（例えば、ゲル形成性ポリマー、ポリマー性粘度増強剤）を実質的に含まない。一部の実施形態では、この製剤は、粘度増加剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、ポリアニオン性ポリマー）を実質的に含まない。一部の実施形態では、この製剤は、ゲル形成性ポリマーを実質的に含まない。一部の実施形態では、製剤の粘度は、同じ濃度のＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲート（またはその薬学的に許容される塩）を含む生理食塩水溶液の粘度とおよそ同じである。
【０４０３】
本発明の医薬組成物では、薬学的に許容される賦形剤および担体溶液の製剤は、例えば、経口、非経口、静脈内、鼻腔内および筋内の投与および製剤を含む、種々の処置レジメンにおける本明細書に記載される特定の組成物を使用するのに適切な投薬および処置レジメンの開発と同様、当業者に周知である。
【０４０４】
ある特定の実施形態では、このＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドは、静脈内投与などの、特定の様式の投与にとって望ましい溶解度を有する。望ましい溶解度の例には、少なくとも約１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｍｇ／ｍｌおよび少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌが含まれる。
【０４０５】
ある特定の適用では、本明細書に開示される医薬組成物は、経口投与を介して被験体に送達され得る。このように、これらの組成物は、不活性希釈剤もしくは食用担体を用いて製剤化され得、または硬シェルもしくは軟シェルゼラチンカプセル中に封入され得、または錠剤へと圧縮され得、またはダイエット食品と共に直接取り込まれ得る。
【０４０６】
ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートの送達に適切な医薬組成物およびその調製のための方法は、当業者に容易に明らかである。かかる組成物およびその調製のための方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５年）中に見出され得る。
【０４０７】
治療用量のＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートの投与は、例えば、経口、鼻腔内、硝子体内、結膜下、テノン嚢下（ｓｕｂ−ｔｅｎｏｎ）、眼球後、脈絡膜上静脈内、動脈内、腹腔内、くも膜下腔内、脳室内、尿道内、胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）、頭蓋内、筋内、滑膜内（ｉｎｔｒａｓｙｎｏｖｉａｌ）、眼内、外用および皮下を含む非経口投与を含む、医療分野で公知の任意の適切な方法により得る。非経口投与に適切なデバイスには、針（極微針を含む）注射器、針なし注射器および注入技術が含まれる。
【０４０８】
非経口製剤は、典型的には、塩、炭水化物および緩衝剤（好ましくは、３から９までのｐＨまで）などの賦形剤を含み得る水性溶液であるが、一部の適用については、非経口製剤は、無菌非水性溶液として、または無菌の発熱物質を含まない水などの適切なビヒクルと併せて使用される乾燥形態として、より適切に製剤化され得る。例えば凍結乾燥による、無菌条件下での非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的な医薬品技術を使用して、容易に達成され得る。
【０４０９】
非経口投与のための製剤は、即時および／または持続性の放出になるように製剤化され得る。持続性の放出の組成物には、遅延された、改変された、パルス状の、制御された、標的化されたおよびプログラムされた放出が含まれる。従って、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、懸濁物として、またはＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートの持続性の放出を提供する移植されたデポーとしての投与のために固体、半固体もしくはチキソトロピック液体として、製剤化され得る。かかる製剤の例には、以下が含まれるがこれらに限定されない：薬物積載ポリ（ＤＬ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＧＬＡ）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）もしくはポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）の層状小胞もしくは微小粒子、ヒドロゲル（Ｈｏｆｆｍａｎ  ＡＳ：  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．９４４巻：６２〜７３頁（２００１年））、Ｆｌａｍｅｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．によって開発されたＭｅｄｕｓａ系などのポリ−アミノ酸ナノ粒子系、Ａｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．によって開発されたＡｔｒｉｇｅｌなどの非水性ゲル系、ならびにＤｕｒｅｃｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって開発されたＳＡＢＥＲ（Ｓｕｃｒｏｓｅ  Ａｃｅｔａｔｅ  Ｉｓｏｂｕｔｙｒａｔｅ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ）、ならびにＳｋｙｅＰｈａｒｍａによって開発されたＤｅｐｏＦｏａｍなどの脂質ベースの系を含む、薬物被覆ステントならびに半固体および懸濁物。
【０４１０】
遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。分散物は、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中で、ならびに油中でも調製され得る。貯蔵および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための防腐剤を含む。
【０４１１】
注射可能な使用に適切な医薬品形態には、無菌の水性溶液または分散物、および無菌の注射可能な溶液または分散物の即座の調製のための無菌粉末が含まれる（その全体が参照により組み込まれる、米国特許第５，４６６，４６８号）。全ての場合において、この形態は、無菌でなければならず、容易な注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで流体でなければならない。これは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して防腐されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物および／または植物油を含む、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆の使用によって、分散物の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって促進され得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物における使用によって、もたらされ得る。
【０４１２】
水性溶液中での非経口投与のために、例えば、この溶液は、必要に応じて適切に緩衝化され、液体希釈剤は、十分な生理食塩水またはグルコースで最初に等張にされるべきである。これらの特定の水性溶液は、静脈内、筋内、皮下および腹腔内投与に特に適切である。これに関して、使用され得る無菌水性媒体は、本開示の教示の下に、当業者に公知である。例えば、１つの投薬量は、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液中に溶解され得、１０００ｍｌの皮下注入（ｈｙｐｏｄｅｒｍｏｃｌｙｓｉｓ）流体に添加され得るか、または注入の提案された部位において注射され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照のこと）。投薬量におけるいくつかのバリエーションが、処置されている被験体の状態に依存して必然的に生じる。投与を担う人は、任意の事象において、個々の被験体にとって適切な用量を決定する。さらに、ヒト投与のために、調製物は、ＦＤＡ
Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ標準によって要求される無菌性、発熱性、ならびに一般的安全性および純度標準を満たすべきである。
【０４１３】
無菌注射可能な溶液は、必要に応じて、上に列挙した種々の他の成分と共に、適切な溶媒中で必要な量で活性化合物を取り込み、その後濾過無菌化することによって調製され得る。一般に、分散物は、基礎的分散媒および上に列挙したものからの必要な他の成分を含む無菌ビヒクル中に、種々の無菌化活性成分を取り込むことによって、調製される。無菌注射可能な溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、その予め無菌濾過した溶液から、活性成分＋任意のさらなる所望の成分の粉末を得る、真空乾燥技術およびフリーズドライ技術である。
【０４１４】
本明細書に開示される組成物は、中性または塩形態で製剤化され得る。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）が含まれ、これらは、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸で形成される。遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基からも誘導され得る。製剤化の際に、溶液は、投薬量製剤と適合性の様式で、治療有効量などの量で、投与される。これらの製剤は、注射可能な溶液、薬物放出カプセルなどの種々の投薬形態で、容易に投与される。
【０４１５】
本明細書で使用する場合、「担体」には、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、被覆、希釈剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁物、コロイドなどが含まれる。薬学的に活性な物質へのかかる媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性成分と不適合性である場合を除き、治療用組成物におけるその使用が企図される。補充的な活性成分もまた、組成物中に取り込まれ得る。
【０４１６】
語句「薬学的に許容される」とは、ヒトに投与した場合に、アレルギー性反応または類似の望ましくない反応を生じない、分子実体および組成物を指す。活性成分としてタンパク質を含む水性組成物の調製は、当該分野で十分理解されている。典型的には、かかる組成物は、液体溶液または懸濁物のいずれかとして、注射剤として調製される；注射前の、液体中の液体または液体中の懸濁物に適切な固体形態もまた、調製され得る。この調製物はまた、乳化され得る。
【０４１７】
本発明での使用のためのＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドはまた、単独で、あるいは１つもしくは複数の抗ヒスタミン薬、１つもしくは複数の抗生物質、１つもしくは複数の抗真菌剤、１つもしくは複数のベータブロッカー、１つもしくは複数の抗炎症剤、１つもしくは複数の抗新生物剤、１つもしくは複数の免疫抑制剤、１つもしくは複数の抗ウイルス剤、１つもしくは複数の抗酸化剤、または他の活性薬剤と組み合わせてのいずれかで、皮膚、粘膜、または眼の表面に、外用的に、経皮（皮内）的に（（ｉｎｔｒａ）ｄｅｒｍａｌｌｙ）または経皮的に（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｌｙ）投与され得る。外用および眼投与のための製剤は、即時および／または改変された放出になるように製剤化され得る。改変された放出の組成物には、遅延された、持続性の、パルス状の、制御された、標的化されたおよびプログラムされた放出が含まれる。
【０４１８】
この目的のための典型的な製剤には、ゲル、ヒドロゲル、ローション、溶液、点眼薬、クリーム、軟膏、散布剤、包帯材、発泡体、フィルム、皮膚パッチ、ウエハ、インプラント、スポンジ、線維、絆創膏およびマイクロエマルションが含まれる。リポソームもまた使用され得る。典型的な担体には、アルコール、水、鉱油、液体ワセリン、白色ワセリン、グリセリン、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールが含まれる。浸透エンハンサーが取り込まれ得る−例えば、ＦｉｎｎｉｎおよびＭｏｒｇａｎ：  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．８８巻（１０号）：９５５〜９５８頁（１９９９年）を参照のこと。外用投与の他の手段には、エレクトロポレーション、イオントフォレーシス、フォノフォレーシス、ソノフォレーシス、および極微針または針なし注射（例えば、商標ＰＯＷＤＥＲＪＥＣＴ（商標）、ＢＩＯＪＥＣＴ（商標）の下で販売されるシステム）による送達が含まれる。
【０４１９】
抗ヒスタミン薬の例には、ロラタジン（ｌｏｒａｄａｔｉｎｅ）、ヒドロキシジン、ジフェンヒドラミン、クロルフェニラミン、ブロムフェニラミン、シプロヘプタジン、テルフェナジン、クレマスチン、トリプロリジン、カルビノキサミン、ジフェニルピラリン、フェニンダミン、アザタジン、トリペレナミン、デクスクロルフェニラミン、デクスブロムフェニラミン、メトジラジン、およびトリメプラジン（ｔｒｉｍｐｒａｚｉｎｅ）ドキシラミン、フェニラミン、ピリラミン、クロルシクリジン（ｃｈｉｏｒｃｙｃｌｉｚｉｎｅ）、トンジルアミン、ならびにそれらの誘導体が含まれるがこれらに限定されない。
【０４２０】
抗生物質の例には、アミノグリコシド系（例えば、アミカシン、アプラマイシン、アルベカシン、バンベルマイシン類、ブチロシン、ジベカシン、ジヒドロストレプトマイシン、フォーチミシン（複数可）、ゲンタマイシン、イセパマイシン、カナマイシン、ミクロノマイシン、ネオマイシン、ウンデシレン酸ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、トロスペクトマイシン）、アムフェニコール（ａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）系（例えば、アジダムフェニコール、クロラムフェニコール、フロルフェニコール、チアンフェニコール）、アンサマイシン系（例えば、リファミド、リファンピン、リファマイシンｓｖ、リファペンチン、リファキシミン）、ラクタム系（例えば、カルバセフェム系（例えば、ロラカルベフ）、カルバペネム系（例えば、ビアペネム、イミペネム、メロペネム、パニペネム）、セファロスポリン系（例えば、セファクロル、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン、セファゾリン、セフカペンピボキシル、セフクリジン（ｃｅｆｃｌｉｄｉｎ）、セフジニル、セフジトレン、セフェピム、セフェタメト、セフィキシム、セフメノキシム、セフォジジム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォラニド、セフォタキシム、セフォチアム、セフォゾプラン、セフピミゾール、セフピラミド、セフピロム、セフポドキシムプロキセチル、セフプロジル、セフロキサジン、セフスロジン、セフタジジム、セフテラム、セフテゾール、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフロキシム、セフゾナム、セファセトリルナトリウム、セファレキシン、セファログリシン、セファロリジン、セファロスポリン、セファロチン、セファピリンナトリウム、セフラジン、ピブセファレキシン（ｐｉｖｃｅｆａｌｅｘｉｎ））、セファマイシン系（例えば、セフブペラゾン、セフメタゾール、セフミノクス、セフォテタン、セフォキシチン）、モノバクタム系（例えば、アズトレオナム、カルモナム、チゲモナム（ｔｉｇｅｍｏｎａｍ））、オキサセフェム系、フロモキセフ、モキサラクタム）、ペニシリン系（例えば、アムジノシリン、アムジノシリンピボキシル、アモキシシリン、アンピシリン、アパルシリン、アスポキシシリン、アジドシリン、アズロシリン、バカンピシリン、ベンジルペニシリン酸、ベンジルペニシリンナトリウム、カルベニシリン、カリンダシリン、クロメトシリン、クロキサシリン、シクラシリン、ジクロキサシリン、エピシリン、フェンベニシリン（ｆｅｎｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、フロキサシリン、ヘタシリン、レナンピシリン、メタンピシリン、メチシリンナトリウム、メズロシリン、ナフシリンナトリウム、オキサシリン、ペナメシリン、ペネタメートヒドリオジド（ｐｅｎｅｔｈａｍａｔｅ  ｈｙｄｒｉｏｄｉｄｅ）、ペニシリンｇベネタミン（ｂｅｎｅｔｈａｍｉｎｅ）、ペニシリンｇベンザチン、ペニシリンｇベンズヒドリルアミン、ペニシリンｇカルシウム、ペニシリンｇヒドラバミン（ｈｙｄｒａｂａｍｉｎｅ）、ペニシリンｇカリウム、ペニシリンｇプロカイン、ペニシリンｎ、ペニシリンｏ、ペニシリンｖ、ペニシリンｖベ���ザチン、ペニシリンｖヒドラバミン、ペニメピサイクリン、フェネチシリンカリウム、ピペラシリン、ピバンピシリン、プロピシリン、キナシリン（ｑｕｉｎａｃｉｌｌｉｎ）、スルベニシリン、スルタミシリン、タランピシリン、テモシリン、チカルシリン）、その他（例えば、リチペネム（ｒｉｔｉｐｅｎｅｍ））、リンコサミド系（例えば、クリンダマイシン、リンコマイシン）、マクロライド系（例えば、アジスロマイシン、カルボマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、エリスロマイシンアシストレート（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ  ａｃｉｓｔｒａｔｅ）、エリスロマイシンエストレート、グルコヘプトン酸エリスロマイシン、ラクトビオン酸エリスロマイシン、プロピオン酸エリスロマイシン、ステアリン酸エリスロマイシン、ジョサマイシン、ロイコマイシン系、ミデカマイシン系、ミオカマイシン、オレアンドマイシン、プリマイシン（ｐｒｉｍｙｃｉｎ）、ロキタマイシン、ロサラマイシン（ｒｏｓａｒａｍｉｃｉｎ）、ロキシスロマイシン、スピラマイシン、トロレアンドマイシン）、ポリペプチド類（例えば、アンフォマイシン（ａｍｐｈｏｍｙｃｉｎ）、バシトラシン、カプレオマイシン、コリスチン、エンジュラシジン（ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ）、エンビオマイシン、フサファンギン、グラミシジンｓ、グラミシジン（複数可）、ミカマイシン、ポリミキシン、プリスチナマイシン、リストセチン、テイコプラニン、チオストレプトン、ツベラクチノマイシン、チロシジン、チロスリシン、バンコマイシン、バイオマイシン、ヴァージニアマイシン、亜鉛バシトラシン）、テトラサイクリン系（例えば、アピサイクリン（ａｐｉｃｙｃｌｉｎｅ）、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、グアメサイクリン（ｇｕａｍｅｃｙｃｌｉｎｅ）、リメサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、ペニメピサイクリン、ピパサイクリン（ｐｉｐａｃｙｃｌｉｎｅ）、ロリテトラサイクリン、サンサイクリン、テトラサイクリン）、およびその他（例えば、シクロセリン、ムピロシン、ツベリン）、２．４−ジアミノピリミジン類（例えば、ブロジモプリム、テトロキソプリム（ｔｅｔｒｏｘｏｐｒｉｍ）、トリメトプリム）、ニトロフラン系（例えば、フラルタドン、塩化フラゾリウム（ｆｕｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ニフラデン（ｎｉｆｕｒａｄｅｎｅ）、ニフラテル、ニフルフォリン（ｎｉｆｕｒｆｏｌｉｎｅ）、ニフルピリノール（ｎｉｆｕｒｐｉｒｉｎｏｌ）、ニフルプラジン（ｎｉｆｕｒｐｒａｚｉｎｅ）、ニフルトイノール、ニトロフラントイン）、キノロン系およびアナログ（例えば、シノキサシン、シプロフロキサシン、クリナフロキサシン、ジフロキサシン、エノキサシン、フレロキサシン、フルメキン、グレパフロキサシン、ロメフロキサシン、ミロキサシン、ナジフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オキソリニン酸、パズフロキサシン、ペフロキサシン、ピペミド酸、ピロミド酸、ロソクサシン、ルフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、トスフロキサシン、トロバフロキサシン）、スルホンアミド系（例えば、アセチルスルファメトキシピラジン（ｓｕｌｆａｍｅｔｈｏｘｙｐｙｒａｚｉｎｅ）、ベンジルスルファミド、クロラミン−ｂ、クロラミン−ｔ、ジクロラミンｔ、ｎ２−ホルミルスルフイソミジン、マフェニド、４’−（メチルスルファモイル）スルファニラニリド（４’−（ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｍｏｙｌ）ｓｕｌｆａｎｉｌａｎｉｌｉｄｅ）、ノプリルスルファミド（ｎｏｐｒｙｌｓｕｌｆａｍｉｄｅ）、フタリルスルファセタミド、フタリルスルファチアゾール、サラゾスルファジミジン（ｓａｌａｚｏｓｕｌｆａｄｉｍｉｄｉｎｅ）、サクシニルスルファチアゾール、スルファベンズアミド、スルファセタミド、スルファクロルピリダジン、スルファクリソイジン（ｓｕｌｆａｃｈｒｙｓｏｉｄｉｎｅ）、スルファシチン（ｓｕｌｆａｃｙｔｉｎｅ）、スルファジアジン、スルファジクラミド、スルファジメトキシン、スルファドキシン、スルファエチドール（ｓｕｌｆａｅｔｈｉｄｏｌｅ）、スルファグアニジン、スルファグアノール（ｓｕｌｆａｇｕａｎｏｌ）、スルファレン、スルファロクス酸（ｓｕｌｆａｌｏｘｉｃ  ａｃｉｄ）、スルファメラジン、スルファメータ、スルファメタジン、スルファメチゾール、スルファメトミジン、スルファメトキサゾール、スルファメトキシピリダジン、スルファメトロール（ｓｕｌｆａｍｅｔｒｏｌｅ）、スルファミドクリソイジン（ｓｕｌｆａｍｉｄｏｃｈｒｙｓｏｉｄｉｎｅ）、スルファモキソール、スルファニルアミド、４−スルファニルアミドサリチル酸（４−ｓｕｌｆａｎｉｌａｍｉｄｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ｎ４−スルファニリルスルファニルアミド、スルファニリル尿素、ｎ−スルファニリル−３，４−キシラミド（ｎ−ｓｕｌｆａｎｉｌｙｌ−３，４−ｘｙｌａｍｉｄｅ）、スルファニトラン、スルファペリン（ｓｕｌｆａｐｅｒｉｎｅ）、スルファフェナゾール、スルファプロキシリン（ｓｕｌｆａｐｒｏｘｙｌｉｎｅ）、スルファピラジン、スルファピリジン、スルファソミゾール（ｓｕｌｆａｓｏｍｉｚｏｌｅ）、スルファシマジン（ｓｕｌｆａｓｙｍａｚｉｎｅ）、スルファチアゾール、スルファチオウレア、スルファトラミド、スルフイソミジン、スルフイソキサゾール）スルホン系（例えば、アセダプソン、アセジアスルホン（ａｃｅｄｉａｓｕｌｆｏｎｅ）、アセトスルホン（ａｃｅｔｏｓｕｌｆｏｎｅ）ナトリウム、ダプソン、ジアチモスルホン（ｄｉａｔｈｙｍｏｓｕｌｆｏｎｅ）、グルコスルホンナトリウム、ソラスルホン（ｓｏｌａｓｕｌｆｏｎｅ）、サクシスルホン（ｓｕｃｃｉｓｕｌｆｏｎｅ）、スルファニル酸、ｐ−スルファニリルベンジルアミン、スルホキソンナトリウム、チアゾールスルホン（ｔｈｉａｚｏｌｓｕｌｆｏｎｅ））、およびその他（例えば、クロホクトール、ヘキセジン、メテナミン、メテナミンアンヒドロメチレン−シトレート（ｍｅｔｈｅｎａｍｉｎｅ  ａｎｈｙｄｒｏｍｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｃｉｔｒａｔｅ）、馬尿酸メテナミン、マンデル酸メテナミン、スルホサリチル酸メテナミン、ニトロキソリン、タウロリジン、キシボルノール）が含まれるがこれらに限定されない。
【０４２１】
抗真菌剤の例には、ポリエン系（例えば、アンホテリシンｂ、カンジシジン、デルモスタチン、フィリピン、フンギクロミン（ｆｕｎｇｉｃｈｒｏｍｉｎ）、ハチマイシン、ハマイシン、ルセンソマイシン、メパルトリシン、ナタマイシン、ニスタチン、ペチロシン、ペリマイシン（ｐｅｒｉｍｙｃｉｎ））、その他（例えば、アザセリン、グリセオフルビン、オリゴマイシン類、ウンデシレン酸ネオマイシン、ピロールニトリン、シッカニン、ツベルシジン、ビリジン（ｖｉｒｉｄｉｎ））、アリルアミン系（例えば、ブテナフィン、ナフチフィン、テルビナフィン）、イミダゾール系（例えば、ビホナゾール、ブトコナゾール、クロルダントイン（ｃｈｌｏｒｄａｎｔｏｉｎ）、クロルミダゾール、クロコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、エニルコナゾール、フェンチコナゾール、フルトリマゾール、イソコナゾール、ケトコナゾール、ラノコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、硝酸オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール）、チオカルバメート系（例えば、トルシクラート、トリンデート（ｔｏｌｉｎｄａｔｅ）、トルナフテート）、トリアゾール系（例えば、フルコナゾール、イトラコナゾール、サペルコナゾール（ｓａｐｅｒｃｏｎａｚｏｌｅ）、テルコナゾール）その他（例えば、アクリソルシン（ａｃｒｉｓｏｒｃｉｎ）、アモロルフィン、ビフェナミン、ブロモサリチルクロラニリド（ｂｒｏｍｏｓａｌｉｃｙｌｃｈｌｏｒａｎｉｌｉｄｅ）、ブクロサミド（ｂｕｃｌｏｓａｍｉｄｅ）、プロピオン酸カルシウム、クロルフェネシン、シクロピロクス、クロキシキン（ｃｌｏｘｙｑｕｉｎ）、コパラフィネート（ｃｏｐａｒａｆｆｉｎａｔｅ）、ジアムタゾール二塩酸塩（ｄｉａｍｔｈａｚｏｌｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、エキサラミド、フルシトシン、ハレタゾール（ｈａｌｅｔｈａｚｏｌｅ）、ヘキセチジン、ロフルカルバン（ｌｏｆｌｕｃａｒｂａｎ）、ニフラテル、ヨウ化カリウム、プロピオン酸、ピリチオン、サリチルアニリド、プロピオン酸ナトリウム、スルベンチン、テノニトロゾール、トリアセチン、ウジョチオン（ｕｊｏｔｈｉｏｎ）、ウンデシレン酸、プロピオン酸亜鉛）が含まれるがこれらに限定されない。
【０４２２】
ベータブロッカーの例には、アセブトロール、アテノロール、ラベタロール、メトプロロール、プロプラノロール、チモロール、およびそれらの誘導体が含まれるがこれらに限定されない。
【０４２３】
抗新生物剤の例には、抗生物質およびアナログ（例えば、アクラシノマイシン類、アクチノマイシンｆ１、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン類、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルビシン、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、メノガリル、マイトマイシン類、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン類（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎｅｓ）、ペプロマイシン、ピラルビシン、プリカマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ジノスタチン、ゾルビシン）、代謝拮抗薬（例えば、葉酸アナログ（例えば、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、エダトレキセート、メトトレキセート、ピリトレキシム、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、Ｔｏｍｕｄｅｘ（登録商標）、トリメトレキセート）、プリンアナログ（例えば、クラドリビン、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニン）、ピリミジンアナログ（例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ドキシフルリジン、エミテフル（ｅｍｉｔｅｆｕｒ）、エノシタビン、フロクスウリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、テガフール（ｔａｇａｆｕｒ））が含まれるがこれらに限定されない。
【０４２４】
抗炎症剤の例には、ステロイド性抗炎症剤および非ステロイド性抗炎症剤が含まれるがこれらに限定されない。例示的なステロイド性抗炎症剤には、アセトキシプレグネノロン、アルクロメタゾン、アルゲストン、アムシノニド、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、クロロプレドニゾン、クロベタゾール、クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチコステロン、コルチゾン、コルチバゾール、デフラザコート、デソニド、デスオキシメタゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドナート、エノキソロン、フルアザコート（ｆｌｕａｚａｃｏｒｔ）、フルクロロニド（ｆｌｕｃｌｏｒｏｎｉｄｅ）、フルメタゾン、フルニソリド、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオコルチンブチル、フルオコルトロン、フルオロメトロン、酢酸フルペロロン、酢酸フルプレドニデン、フルプレドニゾロン、フルランドレノリド、プロピオン酸フルチカゾン、ホルモコータル、ハルシノニド、プロピオン酸ハロベタゾール、ハロメタゾン、酢酸ハロプレドン、ヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、エタボン酸ロテプレドノール、マジプレドン、メドリゾン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、フロ酸モメタゾン、パラメタゾン、プレドニカルベート、プレドニゾロン、２５−ジエチルアミノ酢酸プレドニゾロン、リン酸プレドニゾロンナトリウム、プレドニゾン、プレドニバル（ｐｒｅｄｎｉｖａｌ）、プレドニリデン、リメキソロン、チキソコルトール、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンベネトニド（ｔｒｉａｍｃｉｎｏｌｏｎｅ  ｂｅｎｅｔｏｎｉｄｅ）およびトリアムシノロンヘキサセトニドが含まれる。
【０４２５】
例示的な非ステロイド性抗炎症剤には、アミノアリールカルボン酸誘導体（例えば、エンフェナム酸（ｅｎｆｅｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、エトフェナメート、フルフェナム酸、イソニキシン（ｉｓｏｎｉｘｉｎ）、メクロフェナム酸、メフェナム酸、ニフルミン酸、タルニフルメート、テロフェナメート（ｔｅｒｏｆｅｎａｍａｔｅ）、トルフェナム酸）、アリール酢酸誘導体（例えば、アセクロフェナク、アセメタシン、アルクロフェナク、アンフェナク、アムトルメチングアシル（ａｍｔｏｌｍｅｔｉｎ  ｇｕａｃｉｌ）、ブロムフェナク、ブフェキサマク、シンメタシン（ｃｉｎｍｅｔａｃｉｎ）、クロピラク、ジクロフェナクナトリウム、エトドラク、フェルビナク、フェンクロズ酸（ｆｅｎｃｌｏｚｉｃ  ａｃｉｄ）、フェンチアザク、グルカメタシン（ｇｌｕｃａｍｅｔａｃｉｎ）、イブフェナク、インドメタシン、イソフェゾラク（ｉｓｏｆｅｚｏｌａｃ）、イソキセパク（ｉｓｏｘｅｐａｃ）、ロナゾラク、メチアジン酸、モフェゾラク、オキサメタシン（ｏｘａｍｅｔａｃｉｎｅ）、ピラゾラク（ｐｉｒａｚｏｌａｃ）、プログルメタシン、スリンダク、チアラミド、トルメチン、トロペシン（ｔｒｏｐｅｓｉｎ）、ゾメピラック）、アリール酪酸誘導体（例えば、ブマジゾン、ブチブフェン（ｂｕｔｉｂｕｆｅｎ）、フェンブフェン、キセンブシン（ｘｅｎｂｕｃｉｎ））、アリールカルボン酸類（例えば、クリダナク、ケトロラク、チノリジン）、アリールプロピオン酸誘導体（例えば、アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ベルモプロフェン（ｂｅｒｍｏｐｒｏｆｅｎ）、ブクロクス酸（ｂｕｃｌｏｘｉｃ  ａｃｉｄ）、カプロフェン、フェノプロフェン、フルノキサプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、イブプロキサム、インドプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピケトプロレン（ｐｉｋｅｔｏｐｒｏｌｅｎ）、ピルプロフェン、プラノプロフェン、プロチジン酸、スプロフェン、チアプロフェン酸、キシモプロフェン（ｘｉｍｏｐｒｏｆｅｎ）、ザルトプロフェン）、ピラゾール系（例えば、ジフェナミゾール（ｄｉｆｅｎａｍｉｚｏｌｅ）、エピリゾール）、ピラゾロン系（例えば、アパゾン、ベンズピペリロン（ｂｅｎｚｐｉｐｅｒｙｌｏｎ）、フェプラゾン、モフェブタゾン、モラゾン（ｍｏｒａｚｏｎｅ）、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピペブゾン（ｐｉｐｅｂｕｚｏｎｅ）、プロピフェナゾン、ラミフェナゾン（ｒａｍｉｆｅｎａｚｏｎｅ）、スキシブゾン、チアゾリノブタゾン（ｔｈｉａｚｏｌｉｎｏｂｕｔａｚｏｎｅ））、サリチル酸誘導体（例えば、アセトアミノサロール（ａｃｅｔａｍｉｎｏｓａｌｏｌ）、アスピリン、ベノリレート（ｂｅｎｏｒｙｌａｔｅ）、ブロモサリゲニン（ｂｒｏｍｏｓａｌｉｇｅｎｉｎ）、アセチルサリチル酸カルシウム、ジフルニサル、エテルサレート（ｅｔｅｒｓａｌａｔｅ）、フェンドサール（ｆｅｎｄｏｓａｌ）、ゲンチジン酸、サリチル酸グリコール、サリチル酸イミダゾール、アセチルサリチル酸リシン、メサラミン、サリチル酸モルホリン、サリチル酸１−ナフチル、オルサラジン、パルサルミド（ｐａｒｓａｌｍｉｄｅ）、アセチルサリチル酸フェニル���サリチル酸フェニル、サラセタミド（ｓａｌａｃｅｔａｍｉｄｅ）、サリチルアミドｏ−酢酸、サリチル硫酸、サルサラート、スルファサラジン）、チアジンカルボキサミド系（例えば、アンピロキシカム、ドロキシカム、イソキシカム（ｉｓｏｘｉｃａｍ）、ロルノキシカム、ピロキシカム、テノキシカム）、ε−アセトアミドカプロン酸（ε−ａｃｅｔａｍｉｄｏｃａｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ｓ−アデノシルメチオニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン（ａｍｉｘｅｔｒｉｎｅ）、ベンダザック、ベンジダミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾール、エモルファゾン、フェプラジノール（ｆｅｐｒａｄｉｎｏｌ）、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オキサセプロール、パラニリン（ｐａｒａｎｙｌｉｎｅ）、ペリソキサール、プロカゾン、スーパーオキシドジスムターゼ、テニダップおよびジロートン含まれる。
【０４２６】
抗ウイルス剤の例には、インターフェロンガンマ、ジドブジン、塩酸アマンタジン、リバビリン、アシクロビル、バラシクロビル（ｖａｌｃｉｃｌｏｖｉｒ）、ジデオキシシチジン、ホスホノギ酸、ガンシクロビル、およびそれらの誘導体が含まれる。
【０４２７】
抗酸化剤の例には、アスコルベート、アルファ−トコフェロール、マンニトール、還元型グルタチオン、種々のカロテノイド、システイン、尿酸、タウリン、チロシン、スーパーオキシドジスムターゼ、ルテイン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン（ｃｒｙｏｔｐｘａｎｔｈｉｎ）、アスタキサンチン（ａｓｔａｚａｎｔｈｉｎ）、リコペン、Ｎ−アセチル−システイン、カルノシン、ガンマ−グルタミルシステイン、ケルセチン（ｑｕｅｒｃｉｔｉｎ）、ラクトフェリン、ジヒドロリポ酸、シトレート、Ｇｉｎｋｇｏ  Ｂｉｌｏｂａ抽出物、茶カテキン、ビルベリー抽出物、ビタミンＥ類またはビタミンＥのエステル、パルミチン酸レチニル、およびそれらの誘導体が含まれる。他の治療剤には、スクアラミン、炭酸脱水酵素阻害剤、アルファ−２アドレナリン作動性受容体アゴニスト、抗寄生虫薬、抗真菌薬、およびそれらの誘導体が含まれる。
【０４２８】
投与される各構成要素の正確な用量は、もちろん、処方された特定の構成要素、処置されている被験体、疾患の重症度、例えば炎症性反応の重症度、投与の様式、および処方医師の判断に依存して異なる。従って、患者毎の可変性に起因して、上に与えられる投薬量はガイドラインであり、医師は、医師が適切とみなす処置を達成するために、化合物の用量を調整し得る。
【０４２９】
当業者に理解されるように、担体がゲル形成性ポリマーを含むＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲート製剤について、特定の製剤では、特に生理食塩水溶液中に塩（複数可）を含めることは、塩を含めることが、特定のｉｎ  ｓｉｔｕゲル形成性ポリマー（例えば、ジェランゲル）と同様に、外用投与の前に溶液をゲルにし得る場合、または塩を含めることが、ゲル形成性ポリマーのゲル化特性を阻害し得る場合、禁忌である。当業者は、製剤の所望の特性および当該分野で公知のゲル形成性ポリマーの特徴に基づいて、適切な組合せを選択することができる。
【０４３０】
適切な水性生理食塩水溶液は、当業者に理解され、例えば、約ｐＨ４．５〜約ｐＨ８．０のｐＨの溶液を含み得る。水性溶液（水が担体中に含まれる場合）のさらなるバリエーションでは、製剤のｐＨは、約６と約８．０との間；約６と約７．５との間；約６と約７．０との間；約６．２と約８との間；約６．２と約７．５との間；約７と約８との間；約６．２と約７．２との間；約５．０と約８．０との間；約５と約７．５との間；約５．５と約８．０との間；約６．１と約７．７との間；約６．２と約７．６との間；約７．３と約７．４との間；約６．０；約７．１；約６．２；約７．３；約６．４；約６．５；約６．６；約６．７；約６．８；約６．９；約７．０；約７．１；約７．２；約７．３；約７．４；約７．５；約７．６；または約８．０のいずれかである。一部のバリエーションでは、このＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲート製剤は、約６．０〜約７．０のｐＨを有する。一部のバリエーションでは、この製剤は、約７．４のｐＨを有する。特定のバリエーションでは、この製剤は、約６．２〜約７．５のｐＨを有する。
【０４３１】
ある特定の実施形態では、塩（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は、例えば約０％〜約０．９％（ｗ／ｖ）である。例えば、塩の濃度は、約０．０１〜約０．９％、約０．０２％〜約０．９％、約０．０３％〜約０．９％、約０．０５％〜約０．９％、約０．０７％〜約０．９％、約０．０９％〜約０．９％、約０．１％〜約０．９％、約０．２％〜約０．９％、約０．３％〜約０．９％、約０．４％〜約０．９％、約０．５％〜約０．９％、約０．６％〜約０．９％、約０．７％〜約０．９％、約０．８％〜約０．９％、約０．９％、約０％、約０．０５％、約０．０１％、約０．０９％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％または約０．８％であり得る。ある特定の実施形態では、この水性生理食塩水溶液は、等張（例えば、約０．９％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）のＮａＣｌ濃度）である。ある特定の実施形態では、この水性溶液は、約０．５％、約０．７％、約０．８％、約０．８５または約０．７５％のＮａＣｌ濃度を含む。当業者に明らかなように、他の構成要素の濃度に依存して、例えば、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートがその塩として存在する場合、投与に適切な製剤を達成するために必要とされるＮａＣｌまたは他の塩の濃度は、変動し得る。
【０４３２】
一部の実施形態では、製剤が粘度増加剤を実質的に含まない場合、この製剤は、例えば、ポリアニオン性ポリマー、水溶性セルロース誘導体（例えば、ヒプロメロース（ＨＰＭＣ、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロースとしても公知）、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）など）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、可溶性デンプンなどであるがこれらに限定されない粘度増加剤を実質的に含んでいなくてもよい。一部のバリエーションでは、この製剤は、ヒドロゲルも他の保持剤（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２５５１４４号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるものなど）も取り込まず、ここで、例えば、ヒドロゲルには、ホモポリマー；コポリマー（例えば、ヒドロキシメチルメタクリレート、エチレングリコール、ジメチルメタクリレートおよびメタクリル酸のテトラポリマー）、炭酸トリメチレンおよびポリグリコール酸のコポリマー、ポリグラクチン９１０、グリコネート（ｇｌｙｃｏｎａｔｅ）、ポリ−ｐ−ジオキサノン、ポリグリコール酸、ポリグリコール酸フェルト、ポリ−４−ヒドロキシブチレート、ポリ（Ｌ−ラクチド）およびポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）の組合せ、グリコールメタクリレート、ポリ−ＤＬ−ラクチドまたはＰｒｉｍａｃｒｙｌ）；酸化再生セルロース、ポリプロピレンおよびポリジオキサノンの複合材料またはポリプロピレンおよびポリグレカプロン（ｐｏｌｉｇｅｌｃａｐｒｏｎｅ）の複合材料などを取り込むヒドロゲルが含まれ得る。一部のバリエーションでは、この製剤は、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレングリコール４００ヒマシ油エマルション、カルボキシメチルセルロースナトリウム、プロピレングリコール、グアーヒドロキシプロピル、カルボキシメチルセルロースナトリウム、白色ワセリン、鉱油、デキストラン７０、グリセリン、ヒプロメロース、アマニ油、魚油、オメガ３およびオメガ６脂肪酸、ルテインまたはプリムローズ油のうちの１つまたは複数を含まない。一部のバリエーションでは、この製剤は、米国特許第４，８８８，３５４号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）中に記載される担体のうちの１つまたは複数、例えば、オレイン酸、エタノール、イソプロパノール、モノオレイン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｄｉｏｏｌｅａｔｅ）、ラウリン酸メチル、プロピレングリコール、プロパノールまたはジメチルスルホキシドのうちの１つまたは複数などを含まない。一部のバリエーションでは、これらの製剤は、ジオレイン酸グリセロールおよびイソプロパノールを実質的に含まない。
【０４３３】
特定の実施形態では、このゲル形成性ポリマーは、例えば、ポリサッカライドであり得る。ある特定の実施形態では、このポリサッカライドは、ジェランガムである。ジェランガムとは、細菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｌｏｄｅａによって作り出されるヘテロポリサッカライドを指すが、名称「ジェランガム」は、この分野においてより一般的に使用される。ジェランガム、特に製剤ＧＥＬＲＩＴＥ（登録商標）は、特にチモロールの製剤におけるその使用において、米国特許第４，８６１，７６０号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）中に詳細に記載される。ＧＥＬＲＩＴＥ（登録商標）、低アセチル清澄化グレードのジェランガムは、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ（Ｒａｈｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）から市販され、ジェランガムは、の中でとりわけ、ＣＰＫｅｌｃｏ（Ａｔｌａｎｔａ、Ｇａ．）から市販され得る。ジェランガムなどのポリサッカライドの調製は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，３２６，０５３号および米国特許第４，３２６，０５２号に記載されている。
【０４３４】
ある特定の実施形態では、このゲル形成性ポリマーは、約０．０３％〜約２％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。一部の実施形態では、このゲル形成性ポリマーは、約０．０３％〜約１．７５％；約０．０３％〜約１．５％、約０．０３％〜約１．２５％、約０．０３％〜約１％、約０．０３％〜約０．９％、約０．０３％〜約０．８％、約０．０３％〜約０．７％、約０．０３％〜約０．６％、約０．０３％〜約０．５％、約０．０５％〜約２％、約０．０５％〜約１．７５％、約０．０５％〜約１．５％、約０．０５％〜約１．２５％、約０．０５％〜約１％、約０．０５％〜約０．９％、約０．０５％〜約０．８％、約０．０５％〜約０．７％、約０．０５％〜約０．６％、約０．０５％〜約０．５％、約０．１％〜約２％、約０．１％〜約１．７５％、約０．１％〜約１．５％、約０．１％〜約１．２５％、約０．１％〜約１％、約０．１％〜約０．９％、約０．１％〜約０．８％、約０．１％〜約０．７％、約０．１％〜約０．６％、約０．１％〜約０．５％、約０．２％〜約２％、約０．２％〜約１．７５％、約０．２％〜約１．５％、約０．２％〜約１．２５％、約０．２％〜約１％、約０．２％〜約０．９％、約０．２％〜約０．８％、約０．２％〜約０．７％、約０．２％〜約０．６％、約０．２％〜約０．５％または約０．５％〜約１．５％の濃度で存在する。一部の実施形態では、ゲル形成性ポリマーの濃度は、約０．１％、約０．２％、約０．４％、約０．６％、約０．８％、約１％である。
【０４３５】
特定の実施形態では、このゲル形成性ポリマーは、約０．０５％〜約２％（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約２％（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約１％（ｗ／ｖ）、約０．０５％〜約１％（ｗ／ｖ）または約０．１％〜約０．６％（ｗ／ｖ）の濃度のジェランガムである。一部の実施形態では、ジェランガムの濃度は、約０．１％、約０．２％、約０．４％、約０．６％、約０．８％、約１％である。
【０４３６】
製剤の一部の実施形態では、この製剤は、１つもしくは複数の防腐剤、１つもしくは複数の界面活性剤または１つもしくは複数の医薬品薬剤などのさらなる構成要素を含み得る。特定の実施形態では、この製剤は、１つもしくは複数の防腐剤、１つもしくは複数の界面活性剤、１つもしくは複数の等張化剤、１つもしくは複数の緩衝剤、１つもしくは複数のキレート剤、１つもしくは複数の粘度増加剤、１つもしくは複数の塩または１つもしくは複数の医薬品薬剤などのさらなる構成要素を含み得る。これらの実施形態のある特定のものでは、この製剤は、（ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲート（またはその薬学的に許容される塩）および担体に加えて）：１つまたは複数の防腐剤、１つまたは複数の緩衝剤（例えば、１つ、２つ、３つなど）、１つまたは複数のキレート剤および１つまたは複数の塩を含み得る。一部の実施形態では、この製剤は、（ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲート（またはその薬学的に許容される塩）および担体に加えて）：１つまたは複数の防腐剤、１つまたは複数の等張化剤、１つまたは複数の緩衝剤、１つまたは複数のキレート剤および１つまたは複数の粘度増加剤を含み得る。
【０４３７】
一部の実施形態では、この製剤の粘度は、同じ濃度のＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲート（またはその薬学的に許容される塩）を含む生理食塩水溶液とおよそ同じ粘度である。一部の実施形態では、この製剤は、ゲル形成性ポリマーを実質的に含まない。ある特定の実施形態では、担体が水である場合、この製剤は、１つまたは複数のキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、１つまたは複数の防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、メチルパラベン、フェニルエチルアルコール、プロピルパラベン、チメロサール、硝酸フェニル水銀、ホウ酸フェニル水銀、酢酸フェニル水銀、または上述の２つもしくはそれ超の組合せ）、塩（例えば、ＮａＣｌ）および１つまたは複数の緩衝剤（例えば、１つまたは複数のリン酸塩緩衝液（例えば、二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、それらの組合せなど）、クエン酸塩緩衝液、マレイン酸塩緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、および上述の２つもしくはそれ超の組合せ）をさらに含み得る。
【０４３８】
特定の実施形態では、このキレート剤は、ＥＤＴＡ二ナトリウムであり、この防腐剤は、塩化ベンザルコニウムであり、この塩は、ＮａＣｌであり、この緩衝剤は、二塩基性リン酸ナトリウムおよび一塩基性リン酸ナトリウムである。これらの実施形態の特定のものでは、この製剤は、ポリマーを実質的に含まない。一部の実施形態では、この製剤は、実質的に、粘度増加剤（複数可）（例えば、カルボキシメチルセルロース、ポリアニオン性ポリマーなど）を実質的に含まない。一部の実施形態では、この製剤の粘度は、同じ濃度のＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲート（またはその薬学的に許容される塩）を含む生理食塩水溶液とおよそ同じ粘度である。これらの実施形態の一部では、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲート（またはその薬学的に許容される塩）の濃度は、約０．０２％〜約３％、約０．０２％〜約２％、約０．０２％〜約１％（ｗ／ｖ）である。ある特定の実施形態では、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲート（またはその薬学的に許容される塩）の濃度は、約０．０１％、約０．０２％、約０．０３％、約０．０５％、約０．０７％、約０．１％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．８％または約１％（ｗ／ｖ）である。
【０４３９】
ある特定の実施形態では、担体が水を含む場合、粘度増加剤もまた、製剤中に含まれ得る。当業者は、適切である粘度増加剤（例えば、水溶性セルロース誘導体（例えば、ヒプロメロース（ＨＰＭＣ、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロースとしても公知）、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなど）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸および可溶性デンプン）をよく承知している。粘度増加剤が使用される場合、これらは、投与の前または後に製剤がゲルを形成するような高い十分な濃度では含まれない（例えば、このとき、粘度増加剤の濃度は、ゲル形成を誘導するのに十分ではない）ことが、意図される。
【０４４０】
粘度増加剤の正確な濃度は、製剤中の他の構成要素の選択および濃度ならびに選択された特定の粘度増加剤（複数可）に依存し、一般に、粘度増加剤は、得られた溶液の粘度が約１０００センチポアズ未満であるような濃度で存在し得る。ある特定の実施形態では、この製剤の粘度は、約９００センチポアズ未満、約８００センチポアズ未満、約７００センチポアズ未満、約６００センチポアズ未満、約５００センチポアズ未満、約４００センチポアズ未満、約３００センチポアズ未満、約２００センチポアズ未満、約１５０センチポアズ未満、約１００センチポアズ未満、約５０センチポアズ未満である。一部の実施形態では、この製剤の粘度は、約２００、約１５０、約１００、約５０センチポアズである。特定の実施形態では、この粘度は、約２００センチポアズ未満である。他の場合には、約１２０センチポアズ未満または約１００センチポアズ未満である。一部の実施形態では、この粘度は、約１００センチポアズである。他の場合には、約５０センチポアズである。なお他の実施形態では、この粘度は、約２００センチポアズである。粘度を測定するための方法は、当業者に周知である。例えば、米国薬局方２９（第９１１章）Ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ、２７８５頁（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される。当業者に周知のように、一般に「ゲル」とみなされる製剤は、１０００センチポアズよりも顕著に大きい、例えば、約２０００センチポアズよりも大きい、約５０００センチポアズよりも大きい粘度を有する。
【０４４１】
塩の使用が上記のように禁忌である場合を含む（しかしそれらに限定されない）一部の実施形態では、この製剤は、１つまたは複数の等張化剤をさらに含み得る。本明細書で使用する場合、用語「等張化剤」およびその同語源語は、製剤の浸透圧を調整するが塩ではない（例えば、ＮａＣｌではない）薬剤を指し、これは、本明細書に提供される教示を考慮して当業者に理解されるように、特定のゲル形成性ポリマーまたは粘度増加剤の存在に起因して一部の製剤にとっては禁忌である。これらの薬剤は、等張または近等張（例えば、幾分高〜等張または低〜等張；例えば、等張の約±２０％、約±１５％、約±１０％、約±５％以内）である製剤を調製するために使用され得る。等張化剤（複数可）は、塩の使用が禁忌ではない製剤中でも使用され得る。
【０４４２】
本明細書に記載される製剤の浸透圧を調整するために使用され得る等張化剤は、当業者に公知であり、本明細書に提供される教示に基づいて選択され得る。例えば、等張化剤には、ポリオール（例えば、糖アルコール（例えば、マンニトールなど）、トリヒドロキシアルコール（例えば、グリセリンなど）、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなど）、または２つもしくはそれ超のポリオールの組合せが含まれる。同様に、等張化剤（複数可）の濃度は、製剤中の他の構成要素の正体および濃度に依存し、本明細書に提供される教示を考慮して、当業者によって容易に決定され得る。
【０４４３】
ある特定の実施形態では、この等張化剤は、グリセリンまたはマンニトールである。一部の実施形態では、この等張化剤はグリセリンである。他の実施形態では、これはマンニトールである。なお他の場合には、マンニトールとグリセリンとの組合せが使用され得る。等張化剤の例示的な濃度には、例えば、約０．００１〜約３％が含まれる。一部の実施形態では、等張化剤（例えば、マンニトールまたはグリセリン）の濃度は、例えば、約０．００１％〜約２．７％、約０．００１％〜約２．５％、約０．００１％〜約２％、約０．００１％〜約１．５％、約０．００１％〜約１％、約０．０１％〜約３％、約０．０１％〜約２．７％、約０．０１％〜約２．５％、約０．０１％〜約２％、約０．０１％〜約１．５％、約０．０１％〜約１％、約０．１％〜約３％、約０．１％〜約２．７％、約０．１％〜約２．５％、約０．１％〜約２％、約０．１％〜約１．５％、約０．１％〜約１％、約０．００１％、約１％〜約３％、約１％〜約２．５％、約１％〜約２％、約１％〜約１．８％、約１％〜約１．５％、または約０．００１％、約０．０１％、約０．０５％、約０．０８％、約０．１％、約０．２％、約０．５％、約０．８％、約１％、約１．５％、約１．８％、約２％、約２．２％、約２．５％、約２．８％もしくは約３％（ｗ／ｖ）である。ある特定の実施形態では、この等張化剤はマンニトールである。これらの実施形態の一部では、この担体は、ゲル形成性薬剤（例えば、ジェランガム）を含む。
【０４４４】
一部の実施形態では、この等張化剤は、マンニトールである。これらの実施形態の特定のものでは、この担体には、粘度増加剤（例えば、水溶性セルロース誘導体（例えば、ヒプロメロース）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸または可溶性デンプン）が含まれる。
【０４４５】
一部の実施形態では、この製剤は、防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、メチルパラベン、フェニルエチルアルコール、プロピルパラベン、チメロサール、硝酸フェニル水銀、ホウ酸フェニル水銀または酢酸フェニル水銀、過酸化物）、または上述の防腐剤の２つもしくはそれ超の組合せを、さらに含み得る。ある特定の実施形態では、この防腐剤は、塩化ベンザルコニウムである。
【０４４６】
当業者に理解されるように、防腐剤は、約０．００１％〜約０．７％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し得る。特定の実施形態では、この防腐剤（複数可）は、約０．００１％〜約０．５％（ｗ／ｖ）；約０．００１％〜約０．０５％（ｗ／ｖ）、約０．００１％〜約０．０２％（ｗ／ｖ）、約０．００１％〜約０．０１５％（ｗ／ｖ）、約０．００１％〜約０．００５％（ｗ／ｖ）、約０．０１％〜約０．０２％、約０．００２％〜約０．０１％、約０．０１５％〜約０．０５％、約＜０．５％未満、約０．００５％〜約０．０１％、約０．００１％〜約０．１５％、約０．００２％〜約０．００４％、約０．００１％〜約０．００２％の濃度で存在し得る。一部の実施形態では、この防腐剤の濃度は、例えば、約０．００１％、約０．００５％、約０．０１％、約０．０２％、約０．０３％、約０．０５％、約０．１％、約０．２％、約０．５％または約０．７％（ｗ／ｖ）であり得る。種々の一般に使用される防腐剤について典型的な濃度（ｗ／ｖ）は、以下の表Ｃに列挙される。
【０４４７】
【表１２】
2020141673.tif 000034
【０４４８】
ある特定の実施形態では、この製剤は、１つの界面活性剤、または２もしくはそれ超の界面活性剤をさらに含み得る。特定の実施形態では、この製剤は、界面活性剤を実質的に含まない。本明細書で使用する場合、用語「実質的に含まない」は、当業者に公知の慣用的な検出方法およびプロトコールを使用して検出不能な、特定の構成要素のレベルを指す意図である。例えば、ＨＰＬＣ（キラルＨＰＬＣ、キラルＨＰＬＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳなどを含む）、薄層クロマトグラフィー、質量分析、旋光分析測定、ガスクロマトグラフィー質量分析など。
【０４４９】
特定の実施形態では、この製剤は、キレート剤（例えば、クエン酸ＥＤＴＡ二ナトリウム（ＥＤＴＡ）（例えば、ＥＤＴＡ二ナトリウム（二水和物）など）など）をさらに含み得る。一部の実施形態では、キレート剤の組合せが存在し得る。当業者に理解されるように、キレート剤は、製剤構成要素の分解を妨げるために使用され得、それによって、製剤の有効期間を増加させ得る。当業者に理解されるように、ＥＤＴＡは、ジェランガム製剤の投与前にゲル形成を引き起こし得るので、ジェランガム製剤と組み合わせたＥＤＴＡの使用は、禁忌であり得る。
【０４５０】
キレート剤についての典型的な濃度は、約０．００５％〜０．１％（ｗ／ｖ）である。例えば、約０．００５％〜約０．０９％、約０．００５％〜約０．０８％、約０．００５％〜約０７％、約０．００５％〜約０．０６％、約０．００５％〜約０．０５％、約０．００５〜約０．０４％、約０．００５％〜約０．０３％、約０．０１％〜約０．１％、約０．０１％〜約０．０９％、約０．０１％〜約０．０８％、約０．０１％〜約０．０７％、約０．０１％〜約０．０６％、約０．０１％〜約０．０５％、約０．０１％〜約０．０４％など。ある特定の実施形態では、キレート剤（複数可）の濃度は、約０．００５％、約０．０１％、約０．０２％、約０．０３％、約０．０５％、約０．０６％、約０．０７％、約０．０８％、約０．０９％または約０．１％である。
【０４５１】
特定の実施形態では、このキレート剤は、ＥＤＴＡ二ナトリウムである。ある特定の実施形態では、このキレート剤は、ＥＤＴＡ二ナトリウム（二水和物）である。これらの実施形態の一部では、このＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物は、約０．０１％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。
【０４５２】
一部の実施形態では、この製剤は、１つまたは複数の緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液（複数可）（例えば、リン酸ナトリウム緩衝液（例えば、二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウムなど）、クエン酸塩緩衝液、マレイン酸塩緩衝液、ホウ酸塩緩衝液など）を、さらに含み得る。当業者に理解されるように、１つまたは複数の緩衝剤（複数可）は、使用に適切なｐＨ（例えば、約４．５〜約８のｐＨ）を達成するために、所与の製剤の他の構成要素と組み合わせて選択すべきである。
【０４５３】
ある特定の実施形態では、この緩衝剤は、１つのリン酸塩緩衝液または２つもしくはそれ超のリン酸塩緩衝液の組合せである。ある特定の実施形態では、この緩衝剤は、二塩基性リン酸ナトリウムおよび一塩基性リン酸ナトリウムである。
【０４５４】
緩衝剤（複数可）、例えば、リン酸塩緩衝剤（複数可）について典型的な濃度は、約０．００５モル濃度〜０．１モル濃度であり得る。一部の実施形態では、この緩衝剤（複数可）は、約０．０１〜約０．１、約０．０１〜約０．０８、約０．０１〜約０．０５、約０．０１〜約０．０４、約０．０２〜約０．１、約０．０２〜約０．０８、約０．０２〜約０．０６、約０．０２〜約０．０５、約０．０２〜約０．０４モル濃度などの濃度であり得る。特定の実施形態では、２つの緩衝剤が存在する。例示的な緩衝剤には、二塩基性リン酸ナトリウム（例えば、二塩基性リン酸ナトリウム．７Ｈ２Ｏ）と一塩基性リン酸ナトリウム（例えば、一塩基性リン酸ナトリウム無水物）との組合せが含まれる。一部の実施形態では、緩衝剤（複数可）の濃度は、約０．００５モル濃度、約０．０１モル濃度、約０．０２モル濃度、約０．０３モル濃度、約０．０４モル濃度、約０．０５モル濃度、約０．０６モル濃度、約０．０７モル濃度または約０．１モル濃度である。
【０４５５】
本発明のさらなる一態様は、医薬の製造における、本明細書に記載される製剤の使用を含む。特に、本明細書に記載される状態の処置および／または予防における使用のための医薬の製造。さらに、本明細書中で様々に記載される製剤は、特記しない限り、本明細書に記載される方法に従う、状態の処置および／または予防における使用のための医薬の製造における使用のためにも意図される。
【０４５６】
製剤化の方法は、当該分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、第１９版（１９９５年）中に開示されている。本明細書に提供される組成物および薬剤は、任意の治療的に有効な投薬レジメンにおいて、本発明の方法に従って投与され得る。投薬量および頻度は、有害な影響なしに薬剤の有効なレベルを創出するために選択される。本発明の化合物の有効量は、投与の経路、処置されている温血動物の型、および考慮されている特定の温血動物の肉体的特徴に依存する。この量を決定するためのこれらの因子およびそれらの関係性は、医学分野の当業者に周知である。この量および投与の方法は、最適な効力を達成するために個別化され得るが、体重、食餌、同時発生的薬物療法および医薬分野の当業者が認識する他の因子などの因子に依存する。
【０４５７】
ある特定の実施形態では、これらの医薬組成物は、鼻腔内スプレー、吸入および／または他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達され得る。鼻エアロゾルスプレーを介して遺伝子、ポリヌクレオチドおよびペプチド組成物を肺に直接送達するための方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号および米国特許第５，８０４，２１２号（各々、その全体が参照として本明細書に具体的に組み込まれる）中に記載されている。同様に、鼻腔内微小粒子樹脂（Ｔａｋｅｎａｇａら、１９９８年）およびリゾホスファチジル−グリセロール化合物（その全体が参照として本明細書に具体的に組み込まれる米国特許第５，７２５，８７１号）を使用した薬物の送達もまた、医薬品の分野において周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｅｙｌｅｎｅ）支持マトリックスの形態での経粘膜薬物送達は、米国特許第５，７８０，０４５号（その全体が参照として本明細書に具体的に組み込まれる）に記載されている。
【０４５８】
ある特定の実施形態では、この送達は、適切な宿主細胞中への本発明の組成物の導入のための、リポソーム、ナノカプセル、微小粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などの使用によって生じ得る。特に、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、ナノ粒子などのいずれかの中に封入されて、送達のために製剤化され得る。製剤化およびかかる送達ビヒクルの使用は、公知の従来の技術を使用して実施され得る。
【０４５９】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される薬剤は、生体適合性および生分解性の基材、例えばポリマーおよびマトリックスを含む、薬学的に許容される固体基材に結合され得る。かかる固体基材の例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、分解不能なエチレン酢酸ビニール、分解可能な乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）およびＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸リュープロリドから構成される注射可能なミクロスフェア）、ポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸、コラーゲン、金属、ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミネート、バイオセラミック材料および精製されたタンパク質が含まれるがこれらに限定されない。
【０４６０】
特定の一実施形態では、この固体基材は、Ａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＱＬＴ，Ｉｎｃ．、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｂ．Ｃ．）を含む。このＡｔｒｉｇｅｌ（登録商標）薬物送達系は、生体適合性の担体中に溶解された生分解性のポリマーからなる。医薬品は、製造の時点でこの液体送達系中にブレンドされ得、または製品に依存して、使用の時点で医師によって後に添加され得る。液体製品が、小ゲージ針を介して皮下空間中に注射されるか、またはアクセス可能な組織部位中にカニューレを介して配置される場合、組織液中の水は、ポリマーを沈降させ、固体インプラント中の薬物を捕捉させる。次いで、インプラント内に封入された薬物は、ポリマーマトリックスが時と共に生分解する場合に、制御された様式で放出される。
【０４６１】
特定の実施形態では、投与されるＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲート組成物の量は、一般に、約０．１〜約１００ｍｇ／ｋｇの投薬量の範囲であり、典型的には、経口、皮下または静脈内で投与される場合、約０．１〜１０または２０ｍｇ／ｋｇの範囲である。特定の実施形態では、投薬量は、約１ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇまたは約１０ｍｇ／ｋｇである。ある特定の実施形態では、組成物は、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇまたは０．５〜５ｍｇ／ｋｇの単一投薬量で投与される。一部の実施形態では、組成物は、０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．５〜２０ｍｇ／ｋｇまたは５〜２０ｍｇ／ｋｇの投薬量で投与される。
【０４６２】
ヒトについて、使用される１日投薬量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇおよび約５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ／２４時間の範囲であり得る。
【０４６３】
より長い半減期を有するＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートについて、使用されるヒト投薬量は、例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ／週〜０．５ｍｇ／ｋｇ／週、約１ｍｇ／ｋｇ／週〜５ｍｇ／ｋｇ／週、約５ｍｇ／ｋｇ／週〜１０ｍｇ／ｋｇ／週、約１０ｍｇ／ｋｇ／週〜２０ｍｇ／ｋｇ／週、約２０ｍｇ／ｋｇ／週〜３０ｍｇ／ｋｇ／週、約３０ｍｇ／ｋｇ／週〜５０ｍｇ／ｋｇ／週または約５０ｍｇ／ｋｇ／週〜１００ｍｇ／ｋｇ／週の範囲であり得る。
【０４６４】
なおより長い半減期を有するＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、ヒトにおいて、約０．１ｍｇ／ｋｇ／月〜０．５ｍｇ／ｋｇ／月、約１ｍｇ／ｋｇ／月〜５ｍｇ／ｋｇ／月、約５ｍｇ／ｋｇ／月〜１０ｍｇ／ｋｇ／月、約１０ｍｇ／ｋｇ／月〜２０ｍｇ／ｋｇ／月、約２０ｍｇ／ｋｇ／月〜３０ｍｇ／ｋｇ／月、約３０ｍｇ／ｋｇ／月〜５０ｍｇ／ｋｇ／月または約５０ｍｇ／ｋｇ／月〜１００ｍｇ／ｋｇ／月で投薬され得る。
【０４６５】
種々の実施形態では、この投薬量は、約５０〜２５００ｍｇ／日、１００〜２５００ｍｇ／日、３００〜１８００ｍｇ／日もしくは５００〜１８００ｍｇ／日、または５００〜２５００ｍｇ／週、１０００〜２５００ｍｇ／週、３００〜１８００ｍｇ／週もしくは５００〜１８００ｍｇ／週、または５００〜２５００ｍｇ／月、１０００〜２５００ｍｇ／月、３００〜１８００ｍｇ／月もしくは５００〜１８００ｍｇ／月である。一部の実施形態では、この投薬量は、約１００〜６００ｍｇ／日の間、１００〜６００ｍｇ／週の間または１００〜６００ｍｇ／月の間である。一部の実施形態では、この投薬量は、約３００ｍｇ／日と１２００ｍｇ／日との間、３００ｍｇ／週と１２００ｍｇ／週との間、または３００ｍｇ／月と１２００ｍｇ／月との間である。特定の実施形態では、この組成物または薬剤は、１週間当たりまたは１カ月当たり１つまたは複数の用量で（即ち、組み合わせた用量が所望の１週間または１カ月間の投薬量を達成する）、１００ｍｇ／週、２．４ｍｇ／週、３００ｍｇ／週、６００ｍｇ／週、１０００ｍｇ／週、１２００ｍｇ／週または１８００ｍｇ／週の投薬量で投与される。一部の実施形態では、投薬量は、１日２回１００ｍｇ、１日２回１５０ｍｇ、１日２回２４０ｍｇ、１日２回３００ｍｇ、１日２回５００ｍｇまたは１日２回６００ｍｇである。種々の実施形態では、この組成物または薬剤は、単一の投薬または反復投薬で投与される。初回投薬量および引き続く投薬量は、同じでも異なってもよい。
【０４６６】
一部の実施形態では、総１日用量は、約０．００１ｍｇ、約０．００５ｍｇ、約０．０１ｍｇ、約０．０５ｍｇ、約０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ、約２０ｍｇ、約３０ｍｇ、約４０ｍｇ、約５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７０ｍｇ、約８０ｍｇ、約９０ｍｇまたは約１００ｍｇ／２４時間であり得る。
【０４６７】
一部の実施形態では、総１週間用量は、約０．００１ｍｇ、約０．００５ｍｇ、約０．０１ｍｇ、約０．０５ｍｇ、約０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ、約２０ｍｇ、約３０ｍｇ、約４０ｍｇ、約５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７０ｍｇ、約８０ｍｇ、約９０ｍｇまたは約１００ｍｇ／週であり得る。
【０４６８】
一部の実施形態では、総１カ月用量は、約０．００１ｍｇ、約０．００５ｍｇ、約０．０１ｍｇ、約０．０５ｍｇ、約０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ、約２０ｍｇ、約３０ｍｇ、約４０ｍｇ、約５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７０ｍｇ、約８０ｍｇ、約９０ｍｇまたは約１００ｍｇ／月であり得る。
【０４６９】
数日間またはそれ超にわたる反復投与のために、その状態に依存して、処置は、疾患症状の所望の抑制が生じるまで、持続される。これらおよび他の治療（例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏ治療）の進行は、従来の方法およびアッセイによって容易にモニタリングされ得、医師または他の当業者に公知の基準に基づき得る。
【０４７０】
持続性の送達デバイスおよび組成物について、かかる送達系中に含まれるＨＲＳの総用量は、持続性の放出系の放出プロファイルに依存して、対応してより大きいことが、さらに理解される。従って、５日間の期間にわたってＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートを送達するために意図された持続性の放出組成物またはデバイスは、典型的に、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートの１日用量の少なくとも約５〜１０倍を含む；３６５日間の期間にわたってＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートを送達するために意図された持続性の放出組成物またはデバイスは、典型的に、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートの１日用量の少なくとも約４００〜８００倍を含む（持続性の放出系を使用して投与される場合の、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートの安定性およびバイオアベイラビリティに依存する）。
【０４７１】
ある特定の実施形態では、組成物または薬剤は、例えば、約１０分間〜９０分間の期間にわたる注入などによって、静脈内投与される。他の関連の実施形態では、組成物または薬剤は、例えば、ある期間にわたって約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／時間の間の投薬量で、連続的注入によって投与される。この期間は変動し得るが、ある特定の実施形態では、この期間は、約１０分間〜約２４時間の間または約１０分間〜約３日間の間であり得る。
【０４７２】
特定の実施形態では、有効量または治療有効量は、約３００ｐＭ超、約１ｎＭ超、約１０ｎＭ超、約１００ｎＭ超または約１０００ｎＭ超の、被験体の血漿中のＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートの濃度を維持するのに十分な量である。
【０４７３】
ある特定の実施形態では、静脈内または皮下投薬量は、約１，０００ｎＭ〜約５，０００ｎＭの間または約２００ｎＭ〜約１，０００ｎＭの間または約２０ｎＭ〜約２００ｎＭの間の血漿濃度（Ｃｍａｘ）を達成するのに十分な量である。
【０４７４】
特定の実施形態では、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、約３００ｐＭと約１ｎＭとの間の平均トラフ値濃度および／または約３００ｐＭと約１ｎＭとの間の定常状態濃度を有する、哺乳動物中での血漿濃度を達成するのに十分な量および頻度で投与される。一部の実施形態では、哺乳動物の血漿中のＨＲＳ−ＦｃコンジュゲートのＣｍｉｎは、約１ｎＭ超および／または約１ｎＭと約１０ｎＭとの間の定常状態濃度で維持される。ある特定の実施形態では、哺乳動物の血漿中のＨＲＳ−ＦｃコンジュゲートのＣｍｉｎは、約１０ｎＭ超および／または約１０ｎＭと約１００ｎＭとの間の定常状態濃度で維持される。ある特定の実施形態では、哺乳動物の血漿中のＨＲＳ−ＦｃコンジュゲートのＣｍｉｎは、約１００ｎＭ超および／または約１００ｎＭと約１０００ｎＭとの間の定常状態濃度で維持される。
【０４７５】
本発明の特定の実施形態では、ＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートの有効量またはＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートの血漿濃度は、例えば、少なくとも１５分間、少なくとも３０分間、少なくとも４５分間、少なくとも６０分間、少なくとも９０分間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも１カ月間、少なくとも２カ月間、少なくとも３カ月間、少なくとも４カ月間、または少なくとも６カ月間にわたり、単一の投与で達成または維持される。
【０４７６】
特定の実施形態では、この有効投薬量は、本明細書に記載される組成物または薬剤の血漿レベルまたは平均トラフ値濃度を達成する。これらは、慣用的手順を使用して容易に決定され得る。
【０４７７】
本発明の実施形態は、他の態様では、本明細書に記載される、本発明のＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲート、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、多ユニット複合体、それらの組成物などのうちの１つまたは複数で満たされた１つまたは複数のコンテナを含むキットを提供する。これらのキットは、かかる組成物を使用する方法についての書面による指示を含み得る（例えば、細胞シグナル伝達、血管新生、がん、炎症性状態、診断などをモジュレートするため）。
【０４７８】
本明細書中のキットは、処置されている適応症のためにまたは所望の診断適用のために適切なまたは望まれる、１つまたは複数のさらなる治療剤または他の構成要素もまた含み得る。さらなる治療剤は、所望に応じて、第２のコンテナ中に含まれ得る。さらなる治療剤の例には、抗新生物剤、抗炎症剤、抗細菌剤、抗ウイルス剤、血管新生剤などが含まれるがこれらに限定されない。
【０４７９】
本明細書中のキットは、送達の意図した様式（例えば、ステント、移植可能なデポーなど）を促進するために必要なまたは望まれる１つまたは複数のシリンジまたは他の構成要素もまた含み得る。
【０４８０】
ここで、本発明のある特定の実施形態は、以下の実施例によって説明される。しかし、本発明は、多くの異なる形態で具体化され得、本明細書に示される実施形態に限定されると解釈すべきではない；むしろ、これらの実施形態は、本開示が徹底的かつ完全になり、当業者に本発明の範囲を完全に伝えるように、提供されている。
【実施例】
【０４８１】
（実施例１）
Ｈｉｓタグ化Ｒｅｓｏｋｉｎｅ（アミノ酸１〜６０を含むＨＲＳ）の生成
コドン最適化および遺伝子合成。
Ｒｅｓｏｋｉｎｅ（ＨＲＳ（１−６０））をコードするＤＮＡを、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）が開発したアルゴリズムを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ発現のためにコドン最適化した。
コドン最適化ＤＮＡ配列は以下の通りである：
ＡＴＧＧＣＡＧＡＡＣＧＴＧＣＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＧＡＡＴＴＧＧＴＴＡＡＡＣＴＧＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＴＴＣＧＴＧＧＴＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣＴＡＧＣＧＣＧＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＴＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧＣＧＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＣＧＧＡＣＧＡＧＡＧＣＡＡＡＣＡＡＡＡＧＴＴＣＧＴＣＣＴＧＡＡＡＡＣＣＣＣＧＡＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣ（配列番号２６１）  。
【０４８２】
翻訳されたタンパク質配列は以下の通りである：
ＭＡＥＲＡＡＬＥＥＬＶＫＬＱＧＥＲＶＲＧＬＫＱＱＫＡＳＡＥＬＩＥＥＥＶＡＫＬＬＫＬＫＡＱＬＧＰＤＥＳＫＱＫＦＶＬＫＴＰＫＨＨＨＨＨＨ（配列番号２６２）  。
【０４８３】
さらに、操作されたバージョンのこの構築物を、Ｎ末端（さらなるＮ末端のＭｅｔ残基およびＣｙｓ残基を含む）、Ｃ末端（６１位におけるさらなるＣ末端システインを含む）の近傍に、およびこの分子の２つのアルファヘリックスセクションを接続するリンカードメイン（変異Ａｌａ２６→Ｃｙｓを含む）中に挿入されたシステイン残基によって調製した。これらの構築物についてのコドン最適化ＤＮＡ配列および対応するアミノ酸配列を、以下に列挙する
Ｈ−Ｎ４：１−Ｈ（コドン−ＨＲＳ（１−６０）−Ｍ１ＭＣ−６×Ｈｉｓ）：
ＡＴＧＴＧＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＡＡＧＡＧＴＴＡＧＴＴＡＡＧＴＴＧＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＴＣＣＧＴＧＧＴＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣＴＡＧＣＧＣＧＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＴＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧＣＧＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＣＧＧＡＣＧＡＧＡＧＣＡＡＡＣＡＡＡＡＧＴＴＣＧＴＣＣＴＧＡＡＡＡＣＣＣＣＧＡＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣ（配列番号２６３）  。
【０４８４】
翻訳されたタンパク質配列は以下の通りである：
ＭＣＡＥＲＡＡＬＥＥＬＶＫＬＱＧＥＲＶＲＧＬＫＱＱＫＡＳＡＥＬＩＥＥＥＶＡＫＬＬＫＬＫＡＱＬＧＰＤＥＳＫＱＫＦＶＬＫＴＰＫＨＨＨＨＨＨ（配列番号２６４）
Ｈ−Ｎ４：２−Ｈ（コドン−ＨＲＳ（１−６０）−Ａ２６Ｃ−６×Ｈｉｓ）：
ＡＴＧＧＣＡＧＡＡＣＧＴＧＣＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＧＡＡＴＴＧＧＴＴＡＡＡＣＴＧＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＴＴＣＧＴＧＧＴＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＧＣＧＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＴＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧＣＧＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＣＧＧＡＣＧＡＧＡＧＣＡＡＡＣＡＡＡＡＧＴＴＣＧＴＣＣＴＧＡＡＡＡＣＣＣＣＧＡＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣ（配列番号２６５）  。
【０４８５】
翻訳されたタンパク質配列は以下の通りである：
ＭＡＥＲＡＡＬＥＥＬＶＫＬＱＧＥＲＶＲＧＬＫＱＱＫＣＳＡＥＬＩＥＥＥＶＡＫＬＬＫＬＫＡＱＬＧＰＤＥＳＫＱＫＦＶＬＫＴＰＫＨＨＨＨＨＨ（配列番号２６６）
Ｈ−Ｎ４：３−Ｈ（コドン−ＨＲＳ（１−６０）−Ｃ６１−６×Ｈｉｓ）：
ＡＴＧＧＣＡＧＡＡＣＧＴＧＣＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＧＡＡＴＴＧＧＴＴＡＡＡＣＴＧＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＴＴＣＧＴＧＧＴＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣＴＡＧＣＧＣＧＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＴＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧＣＧＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＣＧＧＡＣＧＡＧＡＧＣＡＡＡＣＡＡＡＡＧＴＴＣＧＴＣＣＴＧＡＡＡＡＣＣＣＣＧＡＡＡＴＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣ（配列番号２６７）  。
【０４８６】
翻訳されたタンパク質配列は、以下の通りである：
ＭＡＥＲＡＡＬＥＥＬＶＫＬＱＧＥＲＶＲＧＬＫＱＱＫＡＳＡＥＬＩＥＥＥＶＡＫＬＬＫＬＫＡＱＬＧＰＤＥＳＫＱＫＦＶＬＫＴＰＫＣＨＨＨＨＨＨ（配列番号２６８）  。
【０４８７】
対応する遺伝子を、Ｃ末端６×Ｈｉｓタグと共に合成し（ＤＮＡ２．０）、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４１１発現ベクター中にサブクローニングし、ここでは、Ｔ７プロモーターを、転写を駆動するために使用し、カナマイシン抵抗性を、抗生物質選択のために使用した。
【０４８８】
発現株。
ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログ番号６９４５０）を、記載されるように、適切なコドン最適化発現構築物で形質転換した。簡潔に述べると、このプラスミド（１μＬ）を、５０μＬのコンピテント細胞中に添加した。反応物を混合し、氷上で３０分間インキュベートした。この反応は、４２℃で３０秒間ヒートショックし、その後氷上で２分間寒冷ショックした。次いで、ＳＯＣ培地（５００μＬ）を添加し、チューブを、３７℃、２５０ｒｐｍで１時間インキュベートした。最後に、１アリコートの培養物（５０μＬ）を、カナマイシンプレート（Ｔｅｋｎｏｖａ  Ｓ９６４１）上に広げ、３７℃で一晩インキュベートした。単一コロニーを選別し、発現のスケールアップに使用した。
【０４８９】
培地。
Ｍ９ＹＥ培地を、２００ｍＬの無菌Ｍ９最小塩５×（ＢＤ２４８５１０）、無菌精製水中７７８ｍＬの３０ｇ／Ｌ酵母抽出物（ＢＤ２１２７５０）、２０ｍＬの無菌化２０％グルコース（Ｓｉｇｍａ  Ｇ７０２１）および２ｍＬ無菌１．０Ｍ  ＭｇＳＯ４（Ｓｉｇｍａ
Ｍ７５０６）を混合することによって調製した。供給溶液は、５％酵母抽出物、５０％グルコース、微量元素および２ｇ／Ｌ硫酸マグネシウムを含む。硫酸カナマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １５１６０）を、Ｍ９ＹＥおよび供給溶液の両方中１００μｇ／ｍＬの最終濃度になるように添加した。
【０４９０】
流加発酵。
ＭＦＣＳ／ＤＡソフトウェアを備えた４Ｌ発酵槽（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｂｉｏｓｔａｔ
Ｂ  ｐｌｕｓ）を、流加発酵に使用した。かき混ぜを、１０００ｒｐｍに設定した。ｐＨ値を、３０％水酸化アンモニウム（Ｓｉｇｍａ  ２２１２２８）および３０％リン酸（Ｓｉｇｍａ  Ｐ５８１１）の添加によって自動的に７．０に制御した。空気を、オイルフリーダイヤフラム空気圧縮機（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ）によって４Ｌ／分の流速で提供した。空気を、０．２μｍ  Ｍｉｄｉｓａｒｔ  ２０００フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  １７８０５）を通過させた。純粋酸素（Ｗｅｓｔ  Ａｉｒ）を供給して、溶解酸素レベルを７０％に自動的に制御した。温度を、Ｎｅｓｌａｂ  ＲＴＥ７サーキュレーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて３０℃に制御した。発泡を、ａｎｔｉｆｏａｍ  ２０４（Ｓｉｇｍａ  Ａ８３１１）の添加によって制御した。発酵槽中のＭ９ＹＥ培地の初期体積は、３Ｌであった。発酵槽に、３０℃および２５０ｒｐｍで一晩増殖させた種培養物１５０ｍＬを接種した。容器中のグルコースが枯渇した場合、濃縮供給溶液を、０．９ｍＬ／分に設定した蠕動ポンプによって容器中に導入した。６００ｎｍにおける細胞の光学密度が約３０に達した時に、培養物を、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＢＰ１７５５）で誘導した。培養を一晩（約１８時間の流加相）行い、６，０００×ｇで１時間の遠心分離によって回収した。細胞ペレットを、精製まで−２０℃で貯蔵した。Ｒｅｓｏｋｉｎｅの発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で確認した。
【０４９１】
タンパク質の精製。ＲｅｓｏｋｉｎｅおよびそのＣｙｓバリアントを、細胞溶解および清澄化；固定化金属アフィニティクロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィーを介してＥ．ｃｏｌｉ細胞ペーストから精製した。ＲｅｓｏｋｉｎｅまたはＣｙｓバリアントを含む１０ｇの重量の凍結細胞を解凍し、５ｍＭベータ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｍ７１５４−２５ＭＬ）および１つのプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０５  ０５６  ４８９  ００１）と一緒に、４：１のｍｌ／ｇペースト比で、１×ＮｉＮＴＡ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ  ２５ｍＭイミダゾール  ｐＨ８）中に再懸濁した。全ての細胞を再懸濁した後、細胞を、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ  Ｍ−１１０Ｙにおいて氷上で溶解させ、氷上で１５０００ｐｓｉで２回通過させて、可溶性ＲｅｓｏｋｉｎｅまたはＣｙｓバリアントを放出させた。ＮｉＮＴＡ緩衝液を、２回の通過後に追加して、残りの溶解物をＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒを通して流した（溶解後に１００〜１２０ｍｌの最終体積）。溶解物を、１５０００×ｇで４℃で３０分間遠心分離した。上清を、Ａｃｒｏｐａｋ  ２００（Ｐａｌｌカタログ番号１２０９４）で０．４５／０．２ｕｍ濾過した。濾過した上清は、清澄化された溶解物である。
【０４９２】
固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）精製。１０ｇの細胞ペースト由来の清澄化された溶解物を、３ｍｌ  ＮｉＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ番号３０２１０）を含む、ＮｉＮＴＡ緩衝液で予め平衡化した重力流カラム上にロードした。樹脂を、５０カラム体積（ＣＶ）の、１×ＮｉＮＴＡ緩衝液中０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４で洗浄してエンドトキシンを除去し、次いで、３０ＣＶの１×ＮｉＮＴＡ緩衝液で洗浄し、その後、５ＣＶのＮｉＮＴＡ溶出緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍイミダゾール  ｐＨ８で４℃で溶出した。
【０４９３】
カチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー精製。ＣＥＸロードを、ＣＥＸ  Ａ緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、２ｍＭ  ＤＴＴ）中でＮｉＮＴＡ溶離液を１／２０×希釈することによって調製し、次いで、ＣＥＸ  Ａで平衡化したＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム上にロードした。タンパク質を、２０ＣＶにわたって０〜１００％Ｂの直線勾配で溶出し、２１４ｎｍにおいて吸光度をモニタリングしたが、ここで、Ａ＝１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、２ｍＭ  ＤＴＴであり、Ｂ＝１０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ塩化ナトリウム、２ｍＭ  ＤＴＴ  ｐＨ７．０である。２１４ｎｍにおける吸光度によって、溶出勾配中の主要ピークに対応する画分をプールした。ＣＥＸプールを、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  ３ｋＤ  ＭＷＣＯ超遠心分離デバイスを使用して、１×ＰＢＳ  ｐＨ７．４（Ｇｉｂｃｏ番号１００１０）へと緩衝液交換した。
【０４９４】
（実施例２）
Ｈｉｓタグ化全長ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＨＲＳ）の生成
コドン最適化および遺伝子合成。全長ＨｉｓＲＳ遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉ発現のためにコドン最適化し、ｐＥＴ２１ａベクター中にサブクローニングし、このとき、Ｔ７プロモーターを使用して転写を駆動した。さらに、５−アミノ酸リンカーおよび６×Ｈｉｓタグを、Ｃ末端に結合させた。
【０４９５】
ＤＮＡ配列は以下の通りである：
ＡＴＧＧＣＧＧＡＡＣＧＴＧＣＣＧＣＡＣＴＧＧＡＡＧＡＡＴＴＧＧＴＴＡＡＡＴＴＡＣＡＧＧＧＡＧＡＡＣＧＣＧＴＡＣＧＴＧＧＴＣＴＴＡＡＡＣＡＡＣＡＡＡＡＡＧＣＣＴＣＴＧＣＧＧＡＡＴＴＧＡＴＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＴＴＧＣＣＡＡＡＴＴＡＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＧＣＴＣＡＡＣＴＴＧＧＡＣＣＣＧＡＴＧＡＡＡＧＴＡＡＡＣＡＡＡＡＡＴＴＴＧＴＧＴＴＧＡＡＡＡＣＧＣＣＣＡＡＡＧＧＡＡＣＣＣＧＴＧＡＴＴＡＴＡＧＴＣＣＡＣＧＴＣＡＡＡＴＧＧＣＣＧＴＴＣＧＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＴＴＣＧＡＣＧＴＴＡＴＴＡＴＴＣＧＣＴＧＴＴＴＴＡＡＡＣＧＴＣＡＣＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＴＡＡＴＣＧＡＴＡＣＣＣＣＣＧＴＡＴＴＴＧＡＡＴＴＧＡＡＡＧＡＧＡＣＴＣＴＧＡＴＧＧＧＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＧＡＡＧＡＴＴＣＴＡＡＡＣＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＴＴＴＧＡＡＡＧＡＣＣＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＡＣＴＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＣＧＣＴＡＣＧＡＣＴＴＡＡＣＴＧＴＧＣＣＴＴＴＴＧＣＣＣＧＴＴＡＣＴＴＡＧＣＣＡＴＧＡＡＴＡＡａＴＴａＡＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＡＣＧＴＴＡＣＣＡＴＡＴＴＧＣＡＡＡＡＧＴＡＴＡＴＣＧＣＣＧＣＧＡＣＡＡＣＣＣＴＧＣＡＡＴＧＡＣＴＣＧＴＧＧＡＣＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＡＴＣＡＧＴＧＴＧＡＴＴＴＴＧＡＴＡＴＴＧＣＣＧＧＡＡＡＴＴＴＣＧＡＣＣＣＧＡＴＧＡＴＣＣＣＧＧＡＴＧＣＣＧＡＧＴＧＴＴＴＧＡＡＡＡＴＴＡＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＣＴＧＡＧＴＴＣＧＴＴＧＣＡＧＡＴＣＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＡＡＡＧＴＴＡＡＴＧＡＣＣＧＣＣＧＴＡＴＴＣＴＧＧＡＴＧＧＴＡＴＧＴＴＴＧＣＴＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＴＴＴＣＴＧＡＴＴＣＣＡＡＡＴＴＣＣＧＴＡＣＡＡＴＣＴＧＣＴＣＡＡＧＣＧＴＧＧＡＣＡＡＡＴＴＧＧＡＴＡＡＡＧＴＧＴＣＴＴＧＧＧＡＡＧＡＡＧＴＡＡＡＡＡＡＴＧＡＡＡＴＧＧＴＧＧＧＡＧＡＡＡＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣＴＣＣＡＧＡＡＧＴＡＧＣＡＧＡＣＣＧＴＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴＡＴＧＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＴＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＣＣＴＴＡＧＴＣＧＡＡＣＡＧＴＴＡＴＴＡＣＡＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＣＴＧＡＧＣＣＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡＧＣＡＣＴＴＧＡＡＧＧＡＣＴＧＧＧＡＧＡＴＣＴＧＡＡＡＴＴＡＣＴＣＴＴＴＧＡＡＴＡＴＣＴＧＡＣＣＴＴＡＴＴＴＧＧＧＡＴＴＧＡＴＧＡＴＡＡＡＡＴＴＡＧＣＴＴＴＧＡＴＣＴＧＡＧＣＴＴＧＧＣＣＣＧＣＧＧＴＣＴＴＧＡＴＴＡＴＴＡＴＡＣＣＧＧＣＧＴＧＡＴＴＴＡＣＧＡＡＧＣＴＧＴＴＣＴＣＴＴＧＣＡＡＡＣＣＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＡＧＡＧＣＣＴＴＴＧＧＧＡＧＴＣＧＧＣＡＧＴＧＴＧＧＣＡＧＣＣＧＧＴＧＧＴＣＧＴＴＡＴＧＡＴＧＧＴＴＴＧＧＴＡＧＧＡＡＴＧＴＴＴＧＡＣＣＣＴＡＡＡＧＧＣＣＧＴＡＡＡＧＴＡＣＣＡＴＧＴＧＴＧＧＧＧＣＴＴＴＣＴＡＴＣＧＧＴＧＴＣＧＡＡＣＧＴＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＴＴＧＴＴＧＡＡＣＡＡＣＧＴＣＴＴＧＡＡＧＣＴＴＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧＡＴＣＣＧＴＡＣＣＡＣＧＧＡＡａｃＣＣＡＡＧＴＣＴＴＡＧＴＴＧＣａＡＧＴＧＣＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＣＴＧＴＴＡＧＡＡＧＡＡＣＧＣＣＴＧＡＡＡＣＴＣＧＴＡＴＣＡＧＡＡＣＴＴＴＧＧＧＡＣＧＣＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＣＣＧＡＡＣＴＧＣＴＧＴＡＴＡＡＡＡＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＡＡＣＣＡＡＣＴＣＣＡＧＴＡＴＴＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＧＧＡＴＣＣＣＡＣＴＣＧＴＡＧＣＴＡＴＴＡＴＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＡＡＴＴＡＡＡＡＧＡＴＧＧＣＧＴＧＡＴＴＡＡＡＣＴＧＣＧＴＴＣＡＧＴＡＡＣＡＡＧＣＣＧＴＧＡＡＧＡＧＧＴＡＧＡＴＧＴＡＣＧＴＣＧＣＧＡＡＧＡＣＴＴＡＧＴＧＧＡＡＧＡＡＡＴＴＡＡＡＣＧＣＣＧＣＡＣＣＧＧＴＣＡＡＣＣＧＴＴＡＴＧＴＡＴＴＴＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡ（配列番号２６９）  。
【０４９６】
翻訳されたタンパク質の配列は以下の通りである：
ＭＡＥＲＡＡＬＥＥＬＶＫＬＱＧＥＲＶＲＧＬＫＱＱＫＡＳＡＥＬＩＥＥＥＶＡＫＬＬＫＬＫＡＱＬＧＰＤＥＳＫＱＫＦＶＬＫＴＰＫＧＴＲＤＹＳＰＲＱＭＡＶＲＥＫＶＦＤＶＩＩＲＣＦＫＲＨＧＡＥＶＩＤＴＰＶＦＥＬＫＥＴＬＭＧＫＹＧＥＤＳＫＬＩＹＤＬＫＤＱＧＧＥＬＬＳＬＲＹＤＬＴＶＰＦＡＲＹＬＡＭＮＫＬＴＮＩＫＲＹＨＩＡＫＶＹＲＲＤＮＰＡＭＴＲＧＲＹＲＥＦＹＱＣＤＦＤＩＡＧＮＦＤＰＭＩＰＤＡＥＣＬＫＩＭＣＥＩＬＳＳＬＱＩＧＤＦＬＶＫＶＮＤＲＲＩＬＤＧＭＦＡＩＣＧＶＳＤＳＫＦＲＴＩＣＳＳＶＤＫＬＤＫＶＳＷＥＥＶＫＮＥＭＶＧＥＫＧＬＡＰＥＶＡＤＲＩＧＤＹＶＱＱＨＧＧＶＳＬＶＥＱＬＬＱＤＰＫＬＳＱＮＫＱＡＬＥＧＬＧＤＬＫＬＬＦＥＹＬＴＬＦＧＩＤＤＫＩＳＦＤＬＳＬＡＲＧＬＤＹＹＴＧＶＩＹＥＡＶＬＬＱＴＰＡＱＡＧＥＥＰＬＧＶＧＳＶＡＡＧＧＲＹＤＧＬＶＧＭＦＤＰＫＧＲＫＶＰＣＶＧＬＳＩＧＶＥＲＩＦＳＩＶＥＱＲＬＥＡＬＥＥＫＩＲＴＴＥＴＱＶＬＶＡＳＡＱＫＫＬＬＥＥＲＬＫＬＶＳＥＬＷＤＡＧＩＫＡＥＬＬＹＫＫＮＰＫＬＬＮＱＬＱＹＣＥＥＡＧＩＰＬＶＡＩＩＧＥＱＥＬＫＤＧＶＩＫＬＲＳＶＴＳＲＥＥＶＤＶＲＲＥＤＬＶＥＥＩＫＲＲＴＧＱＰＬＣＩＣＡＡＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号２７０）  。
【０４９７】
発現株。ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログ番号６９４５０）を、コドン最適化発現構築物で形質転換した。簡潔に述べると、このプラスミド（１μＬ）を、５０μＬのコンピテント細胞中に添加した。反応物を混合し、氷上で３０分間インキュベートした。この反応は、４２℃で３０秒間ヒートショックし、その後氷上で２分間寒冷ショックした。次いで、ＳＯＣ培地（５００μＬ）を添加し、チューブを、３７℃、２５０ｒｐｍで１時間インキュベートした。最後に、１アリコートの培養物（５０μＬ）を、アンピシリンプレート（Ｔｅｋｎｏｖａ  Ｓ９６４１）上に広げ、３７℃で一晩インキュベートした。単一コロニーを選別し、発現のスケールアップに使用した。
【０４９８】
培地。Ｍ９ＹＥ培地を、２００ｍＬの無菌Ｍ９最小塩５×（ＢＤ２４８５１０）、無菌精製水中７７８ｍＬの３０ｇ／Ｌ酵母抽出物（ＢＤ２１２７５０）、２０ｍＬの無菌化２０％グルコース（Ｓｉｇｍａ  Ｇ７０２１）および２ｍＬ無菌１．０Ｍ  ＭｇＳＯ４（Ｓｉｇｍａ  Ｍ７５０６）を混合することによって調製した。供給溶液は、５％酵母抽出物、５０％グルコース、微量元素および２ｇ／Ｌ硫酸マグネシウムを含む。アンピシリンを、Ｍ９ＹＥおよび供給溶液の両方中１００μｇ／ｍＬの最終濃度になるように添加した。
【０４９９】
流加発酵。ＭＦＣＳ／ＤＡソフトウェアを備えた４Ｌ発酵槽（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｂｉｏｓｔａｔ  Ｂ  ｐｌｕｓ）を、流加発酵に使用した。かき混ぜを、１０００ｒｐｍに設定した。ｐＨ値を、３０％水酸化アンモニウム（Ｓｉｇｍａ  ２２１２２８）および３０％リン酸（Ｓｉｇｍａ  Ｐ５８１１）の添加によって自動的に７．０に制御した。空気を、オイルフリーダイヤフラム空気圧縮機（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ）によって４Ｌ／分の流速で提供した。空気を、０．２μｍ  Ｍｉｄｉｓａｒｔ  ２０００フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  １７８０５）を通過させた。純粋酸素（Ｗｅｓｔ  Ａｉｒ）を供給して、溶解酸素レベルを７０％に自動的に制御した。温度を、Ｎｅｓｌａｂ  ＲＴＥ７サーキュレーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて３０℃に制御した。発泡を、ａｎｔｉｆｏａｍ  ２０４（Ｓｉｇｍａ  Ａ８３１１）の添加によって制御した。発酵槽中のＭ９ＹＥ培地の初期体積は、３Ｌであった。発酵槽に、３０℃および２５０ｒｐｍで一晩増殖させた種培養物１５０ｍＬを接種した。容器中のグルコースが枯渇した場合、濃縮供給溶液を、０．９ｍＬ／分に設定した蠕動ポンプによって容器中に導入した。６００ｎｍにおける細胞の光学密度が約３０に達した時に、培養物を、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＢＰ１７５５）で誘導した。培養を一晩（約１８時間の流加期）行い、６，０００×ｇで１時間の遠心分離によって回収した。細胞ペレットを、精製まで−２０℃で貯蔵した。ＨｉｓＲＳの発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で確認した。
【０５００】
ＨｉｓＲＳの精製
凍結細胞ペースト（４０ｇ）を、１６０ｍＬ（即ち、４ｍＬ／ｇ細胞ペースト）の溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、１４ｍＭ
β−ＭＥ、ｐＨ８．０、４℃）中に再懸濁した。完全ＥＤＴＡ−ＦＲＥＥプロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｒｏｃｈｅ）を、１錠剤／５０ｍＬの比率で懸濁物に添加した。この懸濁物を、氷で冷却しながら、１５，０００ｐｓｉでｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を２回通過させた。この溶解物を、３５，０００×ｇで４５分間４℃で遠心分離した。上清を、０．２２μｍ  Ａｃｒｏｐａｋ  ２００カプセルフィルター（Ｐａｌｌ）を通して濾過した。
【０５０１】
この清澄化された溶解物を、Ｎｉ−ＮＴＡ結合緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、５ｍＭ  β−ＭＥ、ｐＨ８．０、４℃）で予め平衡化したＮｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）に結合させた。このカラムを、５００カラム体積のＮｉ−ＮＴＡ結合緩衝液＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４で洗浄し、その後５０カラム体積のＮｉ−ＮＴＡ結合緩衝液で洗浄した。結合したタンパク質、ＨｉｓＲＳを、５カラム体積のＮｉ−ＮＴＡ溶出緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、５ｍＭ  β−ＭＥ、ｐＨ８．０、４℃）で溶出させた。
【０５０２】
このＮｉ−ＮＴＡ溶出物を、アニオン交換カラムによってさらに精製した。具体的には、このＮｉ−ＮＴＡ溶出物を、Ｑ結合緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．４）に対して透析し、Ｑ結合緩衝液で予め緩衝化した５ｍＬ
Ｑ−セファロースカラム上にロードした。所望の生成物を、１０カラム体積にわたって、Ｑ結合緩衝液中の０〜１Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配でカラムから溶出した。精製されたＨｉｓＲＳを濃縮し、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製品番号１００１０）＋１ｍＭ  ＤＴＴへと緩衝液交換し、０．２２μｍ無菌フィルターを通して濾過した。
【０５０３】
（実施例３）
全長ＨＡＲＳ中のシステイン残基の活性部位力価決定
全長ＨＡＲＳ中の表面曝露されたシステイン残基の位置および正体を決定するために、精製された組換えタンパク質を、ネイティブ条件下および変性条件下でヨードアセトアミドと共にインキュベートして、任意の表面曝露されたシステイン残基をアルキル化した。次いで、試料を、限定的タンパク質分解とその後のＬＣ質量分析によって分析して、改変されたシステイン残基の位置および正体を決定した。
【０５０４】
アルキル化研究を実施するために、最初に、全長ポリヒスチジンタグ化ＨＡＲＳ（ＰＢＳ、１０％グリセロール、２ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．４中６．６５ｍｇ／ｍｌ）（実施例２）を、室温で４５分間の１０ｍＭ  ＤＴＴとのインキュベーションによって、完全に還元した。ヨードアセトアミドとのインキュベーションは、暗中で３０分間、３０ｍＭ（「低」）または１００ｍＭ（「高」）のいずれかのヨードアセトアミド濃度で実施し、ＨＡＲＳのネイティブ試料および変性試料に対して実施して、反応が成功したことを確認した。変性ＨＡＲＳを、５０℃で４５分間の４Ｍグアニジンとのタンパク質のプレインキュベーションによって調製した。ヨードアセトアミドとのインキュベーション後、試料を、少なくとも３回の緩衝液交換で、１０ＫＤａ分子量カットオフ透析膜を使用して４℃でＰＢＳ  ｐＨ７．４中で透析し、次いで、以下に記載されるように質量分析に使用した。
【０５０５】
簡潔に述べると、試料を、０．１％ギ酸中に１ｍ／ｍｌの最終濃度になるようにタンパク質を希釈することによって調製し、タンパク質の５μｇ試料を注入し、逆相ＨＰＬＣとその後のＡｇｉｌｅｎｔ  ＴＯＦ質量分析器を使用する質量分析とによって分析した。最初に、試料を、１８分間にわたる（２〜６０％の移動相Ｂ）の直線勾配（移動相Ａ：０．１％ギ酸；移動相Ｂ：アセトニトリル中０．１％のギ酸）を使用して、Ｃ３  ＨＰＬＣカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＺＯＲＢＡＸ  ３００ＳＢ−Ｃ３、５μｍ、２．１×１５０ｍｍカラム）上で分離した。試料の質量分析は、プロファイルモードであった。データを取得し、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって分析した。測定された分子量を、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ  Ｂｉｏｃｏｎｆｉｒｍ  Ａｇｉｌｅｎｔ）によって計算した。
【０５０６】
これらの結果（データ示さず）は、ネイティブ条件下で、３つまたは４つのみのシステイン残基が容易に改変されるが、比較として、このタンパク質がそのネイティブコンフォメーションを破壊するために最初に変性される場合には１０個全てのシステインが容易に変性されたことを実証した。
【０５０７】
改変されたシステイン残基の正体を同定するために、ヨードアセトアミドとのインキュベーションの前および後の試料を、３７℃で３０分間にわたる４ＭグアニジンＨＣｌ中での変性に供し、その後、室温で２０時間にわたり１０：１比（ｗ／ｗ）を使用する、ＬｙｓＣによるタンパク質分解切断に供した。タンパク質消化物を、Ｄｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣおよびＴｈｅｒｍｏ  ＬＴＱ  ＸＬ質量分析器を使用してＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析した。最初に、試料を、移動相Ｂの勾配（移動相Ａ：０．１％ギ酸；移動相Ｂ：アセトニトリル中０．１％のギ酸）を使用して、Ｃ１８  ＨＰＬＣカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＺＯＲＢＡＸ  ３００ＳＢ−Ｃ１８、５μｍ、２．１×１５０ｍｍ）上で分離した。この勾配は、１０分間の１〜３％Ｂで始まり、次いで、７６分間の４０％Ｂにする。分離されたタンパク質消化物を、プロファイルモードのフルＭＳまたはフルＭＳスキャンのいずれかによって分析し、上位３つの同定されたイオンに対するタンデムＭＳ／ＭＳスキャンによって分析した。データを取得し、Ｘｃａｌｉｂｕｒ（Ｔｈｅｒｍｏ）によって分析した。ペプチド配列決定は、各ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルに基づいたが、ここで、ｂイオンピークおよびｙイオンピークは、その理論上のイオンと一致する。ペプチドの同定および改変部位のマッピングは、分子量に基づき、ＭＳ／ＭＳスペクトルを使用したペプチド配列決定によって確認され、表Ｅ１中に列挙される。
【０５０８】
【表１３】
2020141673.tif 000035
【０５０９】
これらの結果は、Ｃｙｓ２３５、Ｃｙｓ５０７およびＣｙｓ５０９が、ヨードアセトアミド処理によって容易に改変され、従って、化学的改変を容易に受け入れる表面曝露された残基である可能性が高いことを明らかにした（データ示さず）。
【０５１０】
（実施例４）
変更されたシステイン含量を有する改変されたＨＲＳポリペプチドの創出
全長ＨＲＳ中の１０個の天然に存在するシステイン残基のいずれが代替的な天然に存在するアミノ酸残基へと変異し得るかまたは欠失し得るかを決定するために、プライマーを、各システイン残基を選択的に変異させるように設計した。これを達成するために、以下に基づくプライマーが使用され得る（表Ｅ２を参照のこと）。
【０５１１】
【表１４】
2020141673.tif 000036
【０５１２】
活性部位力価決定データを確認するために、全長ＨＲＳの結晶構造を、プログラムＧｅｔａｒｅａ１．１を使用して分析して、１０個のシステイン残基の相対的位置を評価した。これらの結果（データ示さず）は、Ｃ２３５、Ｃ５０７およびＣ５０９に加えて、配列番号１のＣ１７４位、Ｃ１９１位およびＣ２２４位におけるシステインが、少なくとも部分的に表面に曝露され、標準的な試薬によって改変され得る可能性が高いことを示唆している。さらに、ＨＲＳの結晶構造の分析は、Ｃ１７４およびＣ１９１は、内部ジスルフィド結合を形成することが可能であるが、Ｃ５０７およびＣ５０９は、ＨＲＳダイマー内の鎖間ジスルフィド結合を形成することが可能であり、両方とも、有益に排除され得る微小不均一性に潜在的に寄与することを示唆している。
【０５１３】
鎖間ジスルフィド結合形成に寄与することにおける２つのＣ末端システイン残基の重要性を直接評価するために、全長のＨｉｓ−タグ化バージョンおよびＨＲＳのＣ末端欠失バージョン（ＨＲＳ（１−５０６））を、還元の前および後にＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析によって比較した。図３に示される結果は、全長ＨＲＳが、非共有結合およびＳＳ−結合ダイマーの約５０：５０混合物であるが、ＨＲＳ（１−５０６）はＳＳ−結合ダイマーを劇的に低減させることを実証している。以下に記載するような競合的ＥＬＩＳＡによる２つのタンパク質の比較は、両方のタンパク質が、Ｊｏ−１抗体結合に関して匹敵するＩＣ５０値を有することを明らかにした（データ示さず）。ＨＲＳ（１−５０６）と関連する劇的に低減した鎖間ジスルフィド結合形成は、このバリアントが、改善された次世代生成物形態の開発のための適切な出発点であることを示唆している。
【０５１４】
全長ＨＲＳ中の残りの４つの部分的に曝露されたシステイン残基のいずれが代替的な天然に存在するアミノ酸残基へと変異し得るかを決定するために、Ｃ１７４残基、Ｃ１９１残基、Ｃ２２４残基およびＣ２３５残基を選択的に変異させるようにプライマーを設計した。これを達成するために、表Ｅ３中に列挙される以下のプライマーを使用した：
【０５１５】
【表１５】
2020141673.tif 000037
【０５１６】
変異を、製造業者の指示に従って、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ、カタログ番号２１０５１８）を使用した変異誘発によって導入した。変異誘発後、試料を、３７℃でＤｐｎ  Ｉ酵素で処理し、慣用的手順を使用してＸＬ１０  ｇｏｌｄコンピテント細胞中に形質転換した。複数のコロニーを、３７℃で一晩ｔｅｒｒｉｆｉｃブロス中で増殖させ、得られたプラスミドを、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号２７１０６）を用いて精製する。これらのプラスミドを配列決定して、各クローンのアミノ酸置換の正体を確認する。代表的なクローンを、ＮｏｖａＢｌｕｅコンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎカタログ番号７０１８１）中に形質転換し、３７℃で一晩２５０ｍｌのＭ９ＹＥ培地中で増殖させた。ｍａｘｉｐｒｅｐを、ＨｉＳｐｅｅｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号１２６６３）を使用して実施して、さらなる分析のための変異体のプラスミドストックを創出した。濃度および純度を、Ａ２６０、Ａ２８０およびＡ２３０を測定することによって決定した。精製されたプラスミドを、標準的なプロトコールに従って、Ｅ．ｃｏｌｉまたは哺乳動物細胞中へのトランスフェクション前に−２０℃で貯蔵した。
【０５１７】
各残基の変異の影響を評価するために、代表的なクローンを、Ｅ．ｃｏｌｉまたは哺乳動物細胞中に形質転換し、以下に記載されるＪｏ−１抗体結合を決定するためのＥＬＩＳＡアッセイにおける、その生成収量、エンドトキシン含量、安定性および相対的活性。
【０５１８】
タンパク質生成。ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログ番号６９４５０）またはＷ３１１０細胞（ＡＴＴＣ）を、上記のように低減したシステインの構築物をコードするコドン最適化発現構築物で形質転換した。組換えタンパク質を生成するために使用した発現系、発酵培地、発酵条件および精製ステップは、生成規模および使用される細胞ペーストの量について調整した後、以下の実施例４に記載されるものと本質的に同じであった。以下の表Ｅ４は、生成されたタンパク質についての精製収量およびのエンドトキシンレベルを示す。
【０５１９】
【表１６】
2020141673.tif 000038
【０５２０】
これらの結果は、低減型バリアントの全てが、比較的良好に発現され、低いエンドトキシンレベルで首尾よく精製されたことを示す。特に、Ｃｙｓ１９１およびＣｙｓ２３５の変異に基づく低減したシステインバリアントは、好ましい発現レベルを示した；しかし、全てのクローンは、合理的なレベルの発現、および低いエンドトキシンレベルを示した。
【０５２１】
精製されたタンパク質の電荷不均一性に対するシステイン変異の影響を評価するために、各クローンの試料を、等電点電気泳動によって分析した。試料（１０μｇ）を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｎｏｖｅｘ  ｐＨ  ３−１０  ＩＥＦゲル１．０ｍｍ（カタログ番号Ｐ／Ｎ  ＥＣ６６４５ＢＯＸ）、Ｎｏｖｅｘ  ＩＥＦマーカー３−１０（カタログ番号Ｐ／Ｎ  ３９１２０１）、Ｎｏｖｅｘ  ｐＨ  ３−１０ＩＥＦ緩衝液キット（カタログ番号Ｐ／Ｎ  ＬＣ５３１７）を使用して等電点電気泳動ゲル（ｐＨ３〜１０）上にロードし、１００Ｖで１時間、２００Ｖで１時間、および５００Ｖで３０分間、１×カソード緩衝液（上部チャンバ）および１×アノード緩衝液（下部チャンバ）で泳動した。ゲルを、３．５％スルホサリチル酸を含む１２％ＴＣＡで３０分間固定し、Ｅｘｐｅｄｅｏｎ  ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ（カタログ番号Ｐ／Ｎ  ＩＳＢ１Ｌ）で染色した。データ（結果示さず）は、１７４位におけるシステインの変異が、このシステイン残基がシステイン１９１との分子内ジスルフィド結合形成を受ける可能性と一致して、等電点不均一性を顕著に低減させたことを示している。
【０５２２】
得られたタンパク質の熱安定性、凝集傾向、構造およびｔＲＮＡシンテターゼ活性に対するシステイン改変の影響を評価するために、これらのタンパク質を、示差走査蛍光定量、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）、競合的ＥＬＩＳＡおよび活性部位力価決定によって評価した。結果を以下の表Ｅ５に示す。
【０５２３】
示差走査蛍光定量を、熱変性の間の親油性色素の蛍光強度の関数として蛍光をモニタリングすることによって、タンパク質試料に対して実施した。研究を、１００μＬの最終体積のＰＢＳ  ｐＨ７．０（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸塩）中に０．５ｍｇ／ｍＬになるように試料を希釈し、超高純度蒸留水（Ｇｉｂｃｏ、Ｐ／Ｎ  １０９７７）中にストック溶液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐ／Ｎ  ４４６１１４６）を２０倍希釈することによって調製した熱シフト色素溶液と混合した後に、これらの試料に対して実施した。５μＬの希釈色素を、１００μＬの試料に添加した。この混合物を、各ウェル２０μＬで３８４ウェル透明光学反応プレート（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｐ／Ｎ  ４３０９８４９）中にプレーティングし、１試料当たり４ウェル複製する。このプレートを、ＶｉｉＡ  ７  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐ／Ｎ  ４４５３５５２）によって読み取った。熱変性プロトコールは、２５℃の温度が達成されるまで、１．６℃／秒の変化速度で開始し、達成の時点で、機器を２分間この温度に維持し、その後０．５℃／秒の速度で温度を９９℃までさらに増加させ、この時点で、この温度をさらに２分間維持した。
【０５２４】
サイズ排除ＨＰＬＣ分析を、ＴＳＫｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  ＳＷ３０００、４．６ｍｍ  ＩＤ×３０ｃｍ、４μｍ粒子サイズ、２５０Åカラム（Ｔｏｓｏｈ、１８６７５）を使用し、２００ｍＭリン酸Ｎａ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０の移動相を使用し、０．３ｍｌ／分の流速で、真空脱気装置、バイナリ／クオータナリポンプ、サーモスタット付オートサンプラー、サーモスタット付カラムコンパートメント、ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）およびＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎクロマトグラフィーソフトウェアを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＨＰＬＣシステムを用いて、精製されたタンパク質試料に対して完了した。各タンパク質の未希釈試料（４０μｇ）を、短時間の遠心分離後に注入した。系適合性試料（ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐ／Ｎ：２３２０９）および内部対照（野生型ＨＲＳ）を使用して、試料をひとくくりにして、試験の妥当性を確実にした。
【０５２５】
競合的ＥＬＩＳＡを、全長ｈｉｓタグ化ＨＡＲＳの、ＰＢＳで２μｇ／ｍＬの濃度に調整した５０μＬ溶液で被覆した９６ウェルプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ４ＨＢＸ）において実施した。プレートを密封し、４℃で一晩インキュベートした。使用前に、プレートを、ＰＢＳＴで５回洗浄し、引き続いて、室温で１時間にわたってＰＢＳ中１％のＢＳＡ  １００μｌでブロッキングした。ＥＬＩＳＡプレートをブロッキングしながら、低減したシステイン競合分子（１×１０−６Ｍ〜１×１０−１３Ｍの濃度範囲にわたる）を、別々のインキュベーションプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３３５７  ９６ウェル）中で、４℃で１時間にわたって、１％ＢＳＡ  ＰＢＳ中１：１０，０００希釈のα−Ｊｏ−１抗体（ＧｅｎＷａｙ  ＧＷＢ−ＦＢ７Ａ３ＤまたはＩｍｍｕｎｏｖｉｓｉｏｎ  ＨＪＯ−０１００）と共にインキュベートした。ブロッキングが終了した後に、これらのＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳＴで３回洗浄し、抗体および競合物を含む溶液５０μＬを、このＥＬＩＳＡプレートに添加し、試料を、室温で１．５時間インキュベートした。最初の結合インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した。次に、５０μＬの検出抗体（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２：ＨＲＰ  ０５００−００９９）を、１：５，０００希釈で添加し、室温で１時間インキュベートした。二次的結合インキュベーション後、プレートを、ＰＢＳＴで５回洗浄し、５０μＬのＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ  ＴＭＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ＰＩ−３４０２１）を添加した。反応を８分間進行させ、この時点で、５０μＬの２Ｍ硫酸停止溶液を添加した。比色分析定量を、４５０ｎＭでＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーを使用して実施した。
【０５２６】
各ＨＡＲＳ５０６システインバリアント中の触媒活性部位の数を決定するために、活性部位力価決定アッセイ（Ｆｅｒｓｈｔら、（１９７５年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ中に記載される）を使用した。簡潔に述べると、アッセイを、標準緩衝液（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、２０ｍＭ  ＫＣｌ）中の５μＭ  ＨＡＲＳ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０μＭ  ＡＴＰ、２０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、２ｕｇ／ｍＬ無機ピロホスファターゼ、１．６５μＭ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いて、室温で実施した。反応を、低プロファイルＰＣＲプレートにおいて酵素で開始させ、３０秒、１分、２分、４分、６分および１０分において、時点を、ＨＣｌＯ４／木炭スラリー（１：４  ７％ＨＣｌＯ４：１０％木炭スラリー）を含む９６ウェルＰＶＤＦ  ｍｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎフィルタープレートＭｉｌｌｉｐｏｒｅ中でクエンチした。ピペッティングすることによって出し入れして混合した後、試料を、Ｓｕｐｅｒｍｉｘシンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）を含む収集プレート中にスピンし、Ｍｉｃｒｏｂｅｔａｅプレートリーダー中で計数した。
【０５２７】
【表１７】
2020141673.tif 000039
【０５２８】
これらの研究からの結果により、活性部位力価決定、ＥＬＩＳＡ結合および熱変性のためのＴｍ決定によって測定した場合、システイン変異体の全てが活性であり、活性、安定性またはコンフォメーションにおける喪失がほとんどまたは全くないことが確認される。ｔＲＮＡシンテターゼ活性の活性部位力価決定により、低減したシステイン変異体の全てが活性であり、従って、本発明の組成物、方法およびキットのいずれかにおける使用に適切であることが明らかである。一般に、Ｃｙｓ１９１置換は、全体的なより低い熱安定性を示したが、Ｃｙｓ１７４変異体は、等電点電気泳動で決定した場合、顕著により低い不均一性を示した。
【０５２９】
（実施例５）
Ｃ末端短縮を有する改変された（Ｔａｇなし）ＨＲＳポリペプチド（ＨｉｓＲＳＮ８）または（ＨＲＳ（１−５０６）の創出
最後の３つのアミノ酸および野生型ＨｉｓＲＳとＨｉｓタグとの間のリンカーを欠失させるために、プライマーを、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ、カタログ番号２１０５１９）との使用のために設計した。これを達成するために、表Ｅ６中に列挙された以下のプライマーを使用する。
【０５３０】
【表１８】
2020141673.tif 000040
【０５３１】
欠失を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔの製造者の指示に従って作成した。変異誘発後、この試料を、３７℃でＤｐｎ  Ｉ酵素で処理し、慣用的手順を使用してＸＬ１０  ｇｏｌｄコンピテント細胞中に形質転換した。複数のコロニーを、３７℃で一晩ｌｕｒｉａ−ｂｅｒｔａｎｉブロス中で増殖させ、得られたプラスミドを、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号２７１０６）を用いて精製した。これらのプラスミドを配列決定して、各クローンのアミノ酸置換の正体を確認した。Ｈｉｓタグを欠失させるために、プライマーを、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ、カタログ番号２１０５１９）との使用のために設計した。これを達成するために、表Ｅ７中に列挙された以下のプライマーを使用した。
【０５３２】
【表１９】
2020141673.tif 000041
【０５３３】
欠失を、上記のように、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔの製造者の指示に従って作成した。
【０５３４】
タンパク質産生。ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログ番号６９４５０）またはＷ３１１０細胞（ＡＴＴＣ）を、実施例２に記載したように、ＨｉｓＲＳＮ８（ＨＲＳ（１−５０６））をコードするコドン最適化発現構築物で形質転換した。組換えタンパク質を生成するために使用した発現系、発酵培地および発酵条件は、実施例２に記載されたものと本質的に同じであった。
【０５３５】
タグなしＨｉｓＲＳＮ８（ＨｉｓＲＳ（１−５０６））の精製。凍結細胞ペースト（４００ｇ）を、４体積（１６００ｍＬ）の溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  Ｌ−システイン、ｐＨ７．４）中に再懸濁した。完全ＥＤＴＡ−ＦＲＥＥプロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０５  ０５６  ４８９  ００１）を、１錠剤／５０ｍＬの比率で懸濁物に添加した。この懸濁物を、氷で冷却しながら、１８，０００ｐｓｉでｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を２回通過させた。この溶解物を、１５，０００×ｇで４５分間４℃で遠心分離した。上清を、２〜３個のＡｃｒｏＰａｋ  １５００カプセル（０．８／０．２μｍ、Ｐａｌｌ、ＰＮ１２６７５）を通して濾過した。
【０５３６】
この清澄化された溶解物を、Ｑ緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で予め平衡化した３８２ｍｌのＱ  ＨＰカラム（５×１９．５ｃｍ）上にロードした。この生成物を、１０カラム体積（ＣＶ）にわたって０〜３０％Ｑ緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）の直線勾配で溶出させた。画分を、１／２  ＣＶ／画分において収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。プールはゲル分析に基づいた。
【０５３７】
３．５Ｍ硫酸アンモニウム溶液を、上記Ｑ  ＨＰプールに、１．２Ｍの最終濃度になるように添加した。この混合物を、ＡｃｒｏＰａｋ  ２００（０．２ｕｍ）を通して濾過し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１．２Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０で予め平衡化した４８１ｍｌのフェニルＨＰカラム（５×２４．５ｃｍ）上にロードした。この生成物を、１０ＣＶにわたって、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ｐＨ７．０中１．２〜０Ｍの硫酸アンモニウムの直線勾配で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づいて、生成物を含む画分（１／２  ＣＶ／画分）をプールした。
【０５３８】
上記からのフェニルプールを、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  Ｍｉｎｉカセットホルダー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号ＸＸ４２ＰＭＩＮＩ）、Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ  Ｉ／Ｐポンプおよび２×０．１ｍ２カセット（３０ｋＤ  ＭＷＣＯ、Ｎｏｖａｓｅｐカタログ番号ＰＰ０３０Ｍ０１Ｌ）からなるＴＦＦ系を介して、０．５Ｌに濃縮した。次いで、この濃縮溶液を、６ダイアボリューム（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）（３Ｌ）のＣＨＴ緩衝液Ａ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で緩衝液交換した。残余分を、次のステップに進む前に、０．２μｍ  Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＰ−５０フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ部品番号ＳＬＧＰ  ０５０１０）を通して濾過した。
【０５３９】
上記溶液を、ＣＨＴ緩衝液Ａで予め平衡化した３８０ｍｌのセラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラム（５×１９．４ｃｍ）上にロードした。このカラムを、緩衝液Ａで洗浄し、その後６％緩衝液Ｂ（５００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で洗浄した。生成物を、１０ＣＶにわたって６〜５６％緩衝液Ｂの直線勾配で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づいて、生成物を含む画分（１／２  ＣＶ／画分）をプールした。
【０５４０】
同じＴＦＦ系を使用して、このＣＨＴプールを、約０．２Ｌに濃縮し、６ダイアボリュームの現在の製剤緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で緩衝液交換し、約１０ｍｇ／ｍｌの標的濃度まで濃縮した。生成物溶液を、０．２μｍ  Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＰ−５０フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ部品番号ＳＬＧＰ  ０５０１０）を通して濾過し、−８０℃の冷凍庫中で貯蔵した。
【０５４１】
（実施例６）
抗炎症剤としてのＨＲＳ（１−６０）（Ｒｅｓｏｋｉｎｅ）の評価
ＨＲＳ由来ポリペプチドの潜在的な抗炎症特性を評価するために、ＨＲＳのアミノ酸１〜６０を含む、Ｎ末端の天然に存在するスプライスバリアント（「Ｒｅｓｏｋｉｎｅ」）を、大腸炎のＴＮＢＳ誘導性モデルにおいて試験した。研究を、１２マウス／群で雄性ＢＤＦ−１マウスにおいて実施した；ブデソニドを、５ｍｇ／ｋｇで経口で追加した。
【０５４２】
この研究では、Ｒｅｓｏｋｉｎｅを、１ｍｇ／Ｋｇまたは５ｍｇ／Ｋｇの濃度で、ＴＮＢＳ処置の３日前に開始して、静脈内注射によって毎日投与した。図４に示されるデータは、いずれの濃度でのＲｅｓｏｋｉｎｅによる処置も、生存における顕著な増加を生じたことを実証している。従って、Ｒｅｓｏｋｉｎｅは、強力な抗炎症効果を有するようであり、これは、ＨＲＳポリペプチドが炎症性プロセスの局所的制御に関与するという仮説と一致している。
【０５４３】
（実施例７）
スタチン誘導性の筋炎および横紋筋融解の処置についてのＨＲＳポリペプチドの評価
スタチンは、コレステロール合成における律速段階であるメバロネートの合成を阻害するＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼ阻害剤である。スタチン治療は、患者においてコレステロールレベルを低下させることにおいて利益を提供している。しかし、スタチン治療の副作用および合併症には、筋脱力、筋炎および横紋筋融解が含まれる。筋肉ミオパチーは、市場にあるいくつかのスタチンによる合併症であり、患者は、これらの症状のいずれかを示す場合、そのスタチン治療から除外される場合が多い。多くの他のミオパチー、筋ジストロフィーおよび筋肉の炎症性障害と同様に、スタチン誘導性ミオパチーにおける疾患進行は、初回の化学的、遺伝的または肉体的傷害の結果として生じるようであり、損傷筋肉細胞中への免疫細胞浸潤の結果としてますます炎症を起こしていく。
【０５４４】
従って、スタチン誘導性ミオパチーは、他のミオパチーおよび筋ジストロフィーに直接適用可能である、薬物誘導性筋炎を研究するために広く適用可能なモデル系を示し、それらの全てが、全て、損傷筋肉組織の免疫細胞浸潤を促進することによって疾患進行を媒介する一般的な炎症性構成要素を共有する。
【０５４５】
この研究の目的は、変更された循環酵素レベルによって示される、スタチン誘導性の筋肉筋炎の影響を逆転させることにおけるＨＲＳ（１−５０６）の効力、ならびにＨＲＳ（１−５０６）による処置に応答した筋肉機能および炎症マーカーの遺伝子発現における変化を評価することであった。
【０５４６】
これを達成するために、ラットに、１ｍｇ／ｋｇセリバスタチンを毎日投薬し、次いで、セリバスタチンによる１日おきの（ｑｏｄ）投薬に切り替えた。この投薬レジメンの目的は、動物において持続性の疾患を維持することであったが、ラットの生存が大きく影響されるような重度の疾患を有することではなかった。次いで、ＨＲＳ（１−５０６）の用量範囲の効力を、筋炎の循環マーカーにおける測定可能な変化をスタチン投薬が既に開始した後に、ラットにおいて評価した。
【０５４７】
プロトコールおよび方法。この研究では、１０週齢の雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、経口経管栄養を介して１日目に開始して、０．５％メチルセルロース中の１ｍｇ／ｋｇセリバスタチン（（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＳＭＬ０００５）で処置した。７日間の毎日の投与の後に、ラットを、９日目、１１日目および１３日目の、１日おきの投薬戦略（ｑｏｄ）に切り替えた。ＨＲＳ（１−５０６）およびビヒクル投与を、静脈内注射によって６日目に開始し、ラットに、１４日目まで毎日投薬した（図５Ａ中に模式的に示される）。全てのラットを、１５日目に、最終試験物品投薬の２４時間後および最後のスタチン投与の４８時間後に屠殺した。ＨＲＳ（１−５０６）を、２０ｍＭ  ＮａＰＯ４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０中３種の用量（０．３、１．０および３．０ｍｇ／ｋｇ）で、毎日投与した。
【０５４８】
この研究の主目的に取り組むために、以下の研究測定およびエンドポイントを実施した：ラットの生存、体重、１２日目および１５日目における循環血清ＣＫレベル、１５日目の大腿屈筋試料に対するＨ＆Ｅ染色、トロポニン−Ｉ  ＥＬＩＳＡ、１５日目の血液に対するＣＢＣ、大腿屈筋試料に対するｑＰＣＲ、および血清内因性ＨＡＲＳレベル。
【０５４９】
ｑＰＣＲ法。マウス大腿屈筋を、動物から切り出し、分析まで−８０℃で貯蔵した。組織を、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙ  Ｆｉｂｒｏｕｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（カタログ番号７５７４２）を使用して、１０個の大腿屈筋の群において調製した。ＲＮＡをＱｉａｇｅｎカラムから溶出させた時点で、ＲＮＡ完全性を試験するためにＡｇｉｌｅｎｔのＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００に、ＲＮＡの濃度および純度を決定するためにＮａｎｏＤｒｏｐに、ＲＮＡをかけた。次いで、ＲＮＡを−８０℃で貯蔵した。
【０５５０】
ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写（ＲＴ）を、以下のプログラムを用いて、ＥｐｐｅｎｄｏｒｆのＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ＰＣＲ機械において、９６ウェルＰＣＲプレート形式で実施した：３７℃で６０分間、９５℃で５分間。９６ウェルプレートの端のウェルは使用せず、５０ｍｃＬの水を満たして、内側のウェルの蒸発を防止した。２０ｍｃＬのＲＮＡおよび３０ｍｃＬの逆転写マスターミックス（ＡｍｂｉｏｎのＴａｑＭａｎ  ＰｒｅＡｍｐ  Ｃｅｌｌ  ｔｏ  ＣＴ  Ｋｉｔ、カタログ番号４３８７２９９）を、１回の試料ＲＴ当たり使用した。ＲＴが完了した時点で、次のステップは、試料ｃＤＮＡ中の目的の遺伝子を予め増幅することであった。目的の遺伝子のプライマー（Ｆｌｕｉｄｉｇｍによって設計されたＤＥＬＴＡｇｅｎｅプライマー）を合わせて、２００ｎＭの最終濃度にした。これらのプライマーを使用して、目的の遺伝子を、各試料において予め増幅した。予めの増幅を、以下のプログラムを用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＶｉｉＡ７  ＰＣＲ機械を使用して、３８４ウェル形式で、１０ｍｃＬの反応（２．５ｍｃＬ  ｃＤＮＡ、７．５ｍｃＬ  Ｐｒｅ−Ａｍｐマスターミックス）において実施した：９５℃で１０分間、９５℃で１５秒間の１４サイクルおよび６０℃で４分間。予めの増幅ステップの後、エキソヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓカタログ番号Ｍ０２９３Ｌ）を添加して、取り込まれていないプライマーを各試料から除去した。このエキソヌクレアーゼ反応もまた、以下のプログラムを用いて、ＶｉｉＡ７  ＰＣＲ機械において完了させた：３７℃で３０分間、８０℃で１５分間。エキソヌクレアーゼ後、ＲＴ試料を、さらに１：５希釈した（７ｍｃＬエキソヌクレアーゼ試料＋１８ｍｃＬ低ＥＤＴＡ緩衝液）。
【０５５１】
ＦｌｕｉｄｉｇｍのＢｉｏｍａｒｋシステム上でｑＰＣＲを実行するために使用したチップは、９６．９６  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ａｒｒａｙ  ＩＦＣ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎであった。最初に、このチップを、試料およびアッセイをロードする前に、製造業者の推奨に従ってＩＦＣコントローラーＨＸを用いてプライムした。チップ上にロードするアッセイを調製するために、目的の各遺伝子についての３．６ｍｃＬの２０ｍｃＭフォワードプライマーおよびリバースプライマーに対して、４．４ｍｃＬのアッセイマスターミックス（Ｆｌｕｉｄｉｇｍの２×Ａｓｓａｙ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔカタログ番号８５００７３６および低ＥＤＴＡ  ＴＥ）を、９６ウェルプレートにおいて調製した。試料を調製するために、４．５ｍｃＬの試料マスターミックス（Ａｍｂｉｏｎの２×ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、Ｆｌｕｉｄｉｇｍの２０×ＤＮＡ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｙｅ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｌｏａｄｉｎｇ
Ｒｅａｇｅｎｔカタログ番号１００−０３８８、およびＢｉｏｔｉｕｍの２０×ＥｖａＧｒｅｅｎカタログ番号３１０００）を、９６ウェルプレート中の、３ｍｃＬの希釈された予め増幅された／エキソヌクレアーゼ試料に添加した。チップがプライムされた時点で、上で調製した５ｍｃＬの試料またはアッセイを、そのチップ上にロードした。次いで、このチップを、チップ中に試料をロードするために、ＩＦＣコントローラー中に戻した。次いで、チップのロードが終了した後に、ｑＰＣＲが、プライマー特異性を決定するための融解曲線と共に、９６．９６  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ａｒｒａｙ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎのためのプリセットプログラムを使用して、Ｂｉｏｍａｒｋ上で実行できた。相対的遺伝子発現を、デルタデルタＣｔ法によって決定した。
【０５５２】
細胞外ＨＡＲＳの定量。９６ウェルベースのＥＬＩＳＡを、サンドイッチ形式で、２つのマウス抗ＨＡＲＳモノクローナル抗体Ｍ０３（Ｓｉｇｍａ番号ＳＡＢ１４０３９０５およびＡｂｎｏｖａ番号Ｈ００００３０３５−Ｍ０３）およびＭ０１（Ａｂｇｅｎｔ番号ＡＴ２３１７ａ）を使用して、社内で開発して、ラット血清中のＨＡＲＳを検出した。アッセイを、７５ｎｇ／ｍｌから０．１ｎｇ／ｍｌの範囲で作成した７ポイント検量線を使用し、ＨＲＳ（１−５０６）のストック溶液；（２０ｍＭ  ＮａＰＯ４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０中７．５ｍｇ／ｍｌ、希釈剤として１×ＰＢＳＴ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を使用）を使用して、９６ウェルＣｏｓｔａｒプレート（Ｃｏｓｔａｒ９６ウェルプレート番号３３６９）において実行した。Ｍ０１マウスモノクローナル、クローン１Ｃ８（Ａｂｇｅｎｔ番号ＡＴ２３１７ａ）を、社内でビオチン化し、検出抗体として使用し、Ｍ０３マウスモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ番号ＳＡＢ１４０３９０５、ロット番号１１２３８、０．５ｍｇ／ｍＬおよびＡｂｎｏｖａ番号Ｈ００００３０３５−Ｍ０３、ロット番号１１２３８、０．５ｍｇ／ｍＬ）を、捕捉抗体として使用した。カゼイン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号３７５２８）をブロッキング剤として使用し、１×ＰＢＳＴ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を洗浄緩衝液として使用した。抗体結合を、ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ番号３４０２１）を使用し、停止溶液として２Ｍ硫酸を用いて、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号４３４３２３、ロット番号８１６７５５Ａ）を使用して定量した。
【０５５３】
ＥＬＩＳＡアッセイを、１×ＰＢＳ中０．６〜２μｇ／ｍｌのＭ０３抗体でプレートを一晩被覆し、次いで、これを、１時間にわたるカゼインとのインキュベーションによってブロッキングし、ＰＢＳＴで３回洗浄することによって実行した。次いで、プレートを、標準および試料と共に１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで、ＰＢＳＴ中に希釈した５００ｎｇ／ｍｌビオチン化−Ｍ０１と共に１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、２００ｎｇ／ｍｌストレプトアビジン−ＨＲＰと共に１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで、ＴＭＢ基質を４分間添加した。反応を、停止溶液で停止させ、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
【０５５４】
結果を、バックグラウンドの減算なしの平均生吸光度値に基づく検量線に基づいて定量した。Ｐｒｉｓｍを、検量線フィッティングのために使用した。モデル：Ｌｏｇ（アゴニスト）対応答フィット［４パラメーターロジスティック回帰］パーセント回復を、各個々の濃度点（平均していない）について、以下：
（測定−実際）×１００％／（実際）
によって計算した。
【０５５５】
他の読み出し。ラットを毎日体重測定した。血清試料を、１日目、８日目、１２日目（尾部静脈を介して）および１５日目（末端）に採取して、循環酵素分析（Ｉｄｅｘｘ）に使用し、血清骨格筋トロポニン−Ｉ測定を、市販のＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。尿検査を、その日の投薬の前に、３日目、５日目、８日目、１０日目、１２日目および１５日目に実施した。ＣＢＣ分析を、ラットを安楽死させる前に、１５日目に単離した血液に対して実行した。１５日目に、ラットを安楽死させ、大腿屈筋および肺（炎症を起こしていない）の一部分を、切片のパラフィン包埋およびＨ＆Ｅ染色のために、１０％ＮＢＦ中に配置した（Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。大腿屈筋および肺の別の一部分を、ＲＮＡ抽出およびプロファイリングに使用するために、−８０℃に配置した。肝臓、腎臓および心臓もまた、１５日目に単離し、長期組織貯蔵のために、パラフィン包埋（ＴＳＲＩ組織学）のために亜鉛−ホルマリン中に配置した。
【０５５６】
結果。この研究において１００％の生存があり、全てのラットが、１５日目の計画された屠殺まで生存した。スタチン投薬したラットは、スタチンを投薬しなかった対照ラットよりも低い平均体重を有した。１５日目に、スタチン＋ビヒクル群は、全ての群のうちで最も低い平均ラット体重を有したが、スタチン＋３ｍｇ／ｋｇ  ＨＲＳ（１−５０６）投薬群は、全てのスタチン処置動物のうちで最も高い体重平均を有した（データ示さず）。ＣＢＣ分析により、異なる動物処置群間の変化の、全体的に類似のパターンが示された（データ示さず）。
【０５５７】
１２日目および１５日目の未処置の対照を超える、血清ＣＫにおける小さい増加が、スタチン処置ラットにおいて観察された。１２日目に、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇのＨＲＳ（１−５０６）を投薬したラットは、スタチン＋ビヒクル処置動物と比較して、より小さく、より詰まったＣＫ平均を有し（図６Ａ〜Ｂ）、これは、スタチン誘導性筋炎に対するＨＲＳ（１−５０６）処置の正の影響と一致し、筋肉機能に対するＨＲＳ（１−５０６）の正の効果とも一致しており、筋肉トロポニンＣレベルもまた、ＨＲＳ（１−５０６）処置動物において低減した（図５Ｂ）。さらに、内因性血清ＨＲＳレベルは、スタチンを受けていないラットと比較して、スタチン処置ラットにおいて上昇しており（図７）、これは、ＨＲＳの放出が、筋肉炎症の内因性調節因子として役割を果たし得ることを示唆している。大腿屈筋に対するＨ＆Ｅ染色は、ビヒクル投薬ラットおよび０．３ｍｇ／ｋｇ  ＨＲＳ（１−５０６）投薬ラットと比較して、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇのＨＲＳ（１−５０６）が投薬されたスタチン処置ラットにおいて、低減した筋肉変性／壊死および炎症スコアを実証した（図８）。
【０５５８】
スタチン誘導性ミオパチーに対するＨＲＳの効果についての基本メカニズムをさらに調査するために、処置動物由来の大腿屈筋における遺伝子発現の変化を、研究の完了後に試験した。ＲＮＡプロファイリングを、上記のように１５日目にラットから単離した大腿屈筋に対して実施した。これらの研究からの結果は、スタチン処置に応答して５倍超上昇した１３全ての遺伝子が、ＨＲＳ（１−５０６）による処置によって低減したことを実証した（表Ｅ８；および図９〜１０を参照のこと）。
【０５５９】
【表２０】
2020141673.tif 000042
【０５６０】
スタチン処置ラット大腿屈筋の転写プロファイリングは、１０個の糖尿病／メタボリックシンドローム関連遺伝子（図１１）およびいくつかのハウスキーピング遺伝子（データ示さず）が、ＨＲＳ処置によって顕著には影響を受けなかったことを明らかにした。対照的に、２６の免疫細胞マーカー遺伝子の、スタチン処置ラット大腿屈筋の転写プロファイリングは、ＩＴＧＡＬ（ＣＤ１１ａ）、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ１８、ＣＣＲ５、ＰＴＰＰＣおよび（ＣＤ４５Ｒ）発現の用量依存的阻害を含む、多数の遺伝子における顕著な変化を明らかにした（図１２〜１４を参照のこと）。さらに、ＨＲＳ（１−５０６）は、ＩＬ６、ＭＣＰ１、ＩＬ１０およびＩＦＮガンマを含むいくつかの炎症マーカー遺伝子の発現を低減させるのに有効であった（図１５〜１６を参照のこと）。転写変化は、１４の接着、発生および線維症関連遺伝子（図１７〜１８を参照のこと）、筋肉収縮性遺伝子Ｎｅｂ（データ示さず）、ならびに筋消耗、萎縮症および筋形成と関連する遺伝子（図１９〜２０を参照のこと）においても、観察された。
【０５６１】
結論。減少したＣＫ、血清トロポニン−Ｉならびに筋肉細胞変性／壊死および筋肉炎症が、全て、ビヒクルまたは低用量０．３ｍｇ／ｋｇ  ＨＲＳ（１−５０６）のいずれかを受けている動物とは対照的に、１．０ｍｇ／ｋｇまたは３．０ｍｇ／ｋｇのいずれかのより高い用量のＨＲＳ（１−５０６）を受けている動物において観察された。ＲＮＡプロファイリングデータは、より高い用量のＨＲＳ（１−５０６）を投薬したスタチン処置ラットの大腿屈筋における、低減したＣＤ８ａ、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１およびＭＭＰ−９発現を実証することによって、これらの結果を支持した。これらの遺伝子の上方調節は、損傷筋肉組織中への増加した免疫細胞浸潤物に起因する可能性が最も高い。発現された遺伝子の正体に基づいて、浸潤する免疫細胞は、以下の細胞型、Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞およびマクロファージ／単球のうちの１つまたは複数で構成される可能性が高い。これらの細胞型の全てが筋肉炎症と関連付けられており、この免疫細胞流入の劇的な阻害を媒介する、ＨＲＳ（１−５０６）を含むＨＲＳポリペプチドの能力は、ＨＲＳ（１−５０６）などのＨＲＳポリペプチドが、広範な炎症性および自己免疫性の疾患および障害において強力な免疫調節剤として作用することが可能な強力な免疫調節因子であることを示唆している。
【０５６２】
（実施例８）
ＨＲＳ−Ｆｃポリペプチドの調製
Ｎ末端およびＣ末端Ｆｃ−ヒスチジルｔＲＮＡシンテターゼ（ＨＲＳ−Ｆｃ）融合タンパク質を、以下のように調製し、精製し、分析した。
【０５６３】
プラスミド構築。ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインを、以下のプライマーを使用して、連続的ＰＣＲ反応によって、ＨＲＳポリペプチドＨＲＳ（１−６０）のＣ末端またはＮ末端中に挿入する前に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、得られた増幅されたＤＮＡ断片を、ｐＥＴ２８発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ  ６９８６４）中に位置付けられたＨＲＳ（１−６０）のＣ末端またはＮ末端中に挿入した。Ｎ末端Ｆｃ融合タンパク質の創出は、ＨＲＳ（１−６０）中のＮ末端メチオニンの欠失／ＦｃドメインのＣ末端アミノ酸による置き換え、ならびに必要に応じてその逆を生じることが理解される。
【０５６４】
以下のプライマーを使用して、Ｎ末端融合したＨＲＳ（１−６０）Ｆｃ融合タンパク質（Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０））を創出した（表Ｅ９）：
【０５６５】
【表２１】
2020141673.tif 000043
【０５６６】
以下のプライマーを使用して、Ｃ末端融合したＨＲＳ（１−６０）Ｆｃ融合タンパク質（ＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃ）を創出した（表Ｅ１０）。
【０５６７】
【表２２】
2020141673.tif 000044
【０５６８】
これらのＰＣＲ反応を、推奨される熱サイクリングパラメーターを使用して実施し、ＰＣＲ増幅断片を、ゲル電気泳動によって検証した。配列を、ＥＭＢＯＳＳ  Ｐａｉｒｗｉｓｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓを使用して、理論的配列とのアラインメントを実施することによって確認した。Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）およびＨＲＳ（１−６０）−ＦｃのクローニングされたＤＮＡおよびタンパク質配列を以下に示す。
【０５６９】
Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）（Ｎ末端Ｆｃ融合物）のＤＮＡ配列：
ＡＴＧＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＧＣＡＧＡＧＣＧＴＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣＧＡＧＧＣＣＴＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＴＴＧＴＧＣＴＣＡＡＡＡＣＣＣＣＣＡＡＧ  ＴＧＡ（配列番号３３５）  。
【０５７０】
ＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃ（Ｃ末端Ｆｃ融合物）のＤＮＡ配列：
ＡＴＧＧＣＡＧＡＧＣＧＴＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣＧＡＧＧＣＣＴＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＴＴＧＴＧＣＴＣＡＡＡＡＣＣＣＣＣＡＡＧＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＣＴＧ  ＴＣＴ  ＣＣＧ  ＧＧＴＡＡＡＴＧＡ（配列番号３３６）  。
【０５７１】
Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）（Ｎ末端Ｆｃ融合物）のタンパク質配列
ＭＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＡＥＲＡＡＬＥＥＬＶＫＬＱＧＥＲＶＲＧＬＫＱＱＫＡＳＡＥＬＩＥＥＥＶＡＫＬＬＫＬＫＡＱＬＧＰＤＥＳＫＱＫＦＶＬＫＴＰＫ（配列番号３３７）  。
【０５７２】
ＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃ（Ｃ末端Ｆｃ融合物）のタンパク質配列
ＭＡＥＲＡＡＬＥＥＬＶＫＬＱＧＥＲＶＲＧＬＫＱＱＫＡＳＡＥＬＩＥＥＥＶＡＫＬＬＫＬＫＡＱＬＧＰＤＥＳＫＱＫＦＶＬＫＴＰＫＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
（配列番号３３８）  。
【０５７３】
さらなるＮ末端およびＣ末端Ｆｃ−ヒスチジルｔＲＮＡシンテターゼ（ＨＲＳ−Ｆｃ）のＤＮＡ構築物を、以下のように調製した。
【０５７４】
プラスミド構築。Ｎ末端Ｆｃを有するＨＲＳ（２−６０）またはＣ末端Ｆｃを有するＨＲＳ（１−６０）（実施例８）を、Ｔ７の代わりにＴＡＣプロモーターを含む改変ｐＥＴ２４ｂベクター（ＥＭＤ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）（「ｐＥＴ２４ｂ＿ＴＡＣ」）中にサブクローニングした。Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）およびＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃを、５’ＮｄｅＩ部位および３’ＸｈｏＩ部位を含む以下のプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、得られた増幅されたＤＮＡを、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位を使用してｐＥＴ２４ｂ＿ＴＡＣ中にサブクローニングした。
【０５７５】
以下のプライマーを使用して、Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）（Ｎ末端Ｆｃ融合物）を増幅した（表Ｅ１１）：
【０５７６】
【表２３】
2020141673.tif 000045
【０５７７】
以下のプライマーを使用して、ＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃ（Ｃ末端Ｆｃ融合物）を増幅した（表Ｅ１２）。
【０５７８】
【表２４】
2020141673.tif 000046
【０５７９】
これらのＰＣＲ反応を、推奨される熱サイクリングパラメーターを使用して実施し、ＰＣＲ増幅断片を、ゲル電気泳動によって検証した。配列を、ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  ＳｅｑＭａｎ  Ｐｒｏを使用して、理論的配列とのアラインメントを実施することによって確認した。Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）およびＨＲＳ（１−６０）−ＦｃのクローニングされたＤＮＡおよびタンパク質配列を以下に示す。
【０５８０】
Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）（Ｎ末端Ｆｃ融合物）のＤＮＡ配列：
ＡＴＧＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＧＣＡＧＡＧＣＧＴＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣＧＡＧＧＣＣＴＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＴＴＧＴＧＣＴＣＡＡＡＡＣＣＣＣＣＡＡＧ  ｔｇａ（配列番号３４７）  。
【０５８１】
ＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃ（Ｃ末端Ｆｃ融合物）のＤＮＡ配列：
ＡＴＧＧＣＡＧＡＧＣＧＴＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣＧＡＧＧＣＣＴＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＴＴＧＴＧＣＴＣＡＡＡＡＣＣＣＣＣＡＡＧＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡ  ｔｇａ（配列番号３４８）  。
【０５８２】
Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）（Ｎ末端Ｆｃ融合物）のタンパク質配列：
ＭＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＡＥＲＡＡＬＥＥＬＶＫＬＱＧＥＲＶＲＧＬＫＱＱＫＡＳＡＥＬＩＥＥＥＶＡＫＬＬＫＬＫＡＱＬＧＰＤＥＳＫＱＫＦＶＬＫＴＰＫ。（配列番号３４９）  。
【０５８３】
ＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃ（Ｃ末端Ｆｃ融合物）のタンパク質配列：
ＭＡＥＲＡＡＬＥＥＬＶＫＬＱＧＥＲＶＲＧＬＫＱＱＫＡＳＡＥＬＩＥＥＥＶＡＫＬＬＫＬＫＡＱＬＧＰＤＥＳＫＱＫＦＶＬＫＴＰＫＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３５０）  。
【０５８４】
さらなるＮ末端およびＣ末端Ｆｃ−ヒスチジルｔＲＮＡシンテターゼ（ＨＲＳ−Ｆｃ）のＤＮＡ構築物を、以下のように調製した。
【０５８５】
プラスミド構築。Ｎ末端Ｆｃを有するＨＲＳ（２−４０）、（２−４５）、（２−５０）、（２−５５）、（２−６６）またはＣ末端Ｆｃを有するＨＲＳ（１−４０）、（１−４５）、（１−５０）、（１−５５）、（１−６６）を、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して生成した。以下に列挙したプライマーと組み合わせて、Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）およびＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃを含む以前に生成したｐＥＴ２４ｂ＿ＴＡＣ構築物をＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ反応において使用して、ＨＲＳ−Ｆｃ構築物を生成した。
【０５８６】
以下のプライマーを使用して、Ｆｃ−ＨＲＳ（２−４０）、（２−４５）、（２−５０）、（２−５５）、（２−６６）ポリペプチド（Ｎ末端Ｆｃ融合物）を増幅した（表Ｅ１３）：
【０５８７】
【表２５】
2020141673.tif 000047
【０５８８】
以下のプライマーを使用して、ＨＲＳ（１−４０）、（１−４５）、（１−５０）、（１−５５）、（１−６６）−Ｆｃ（Ｃ末端Ｆｃ融合物）を増幅した：（表Ｅ１４）。
【０５８９】
【表２６】
2020141673.tif 000048
【０５９０】
これらのＰＣＲ反応を、製造者の推奨する熱サイクリングパラメーターを使用して実施した。配列を、ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  ＳｅｑＭａｎ  Ｐｒｏを使用して、理論的配列とのアラインメントを実施することによって確認した。ＨＲＳ−Ｆｃ構築物のクローニングされたＤＮＡおよびタンパク質配列を以下に示す。
【０５９１】
Ｆｃ−ＨＲＳ（２−４０）（Ｎ末端Ｆｃ融合物）のＤＮＡ配列：
ＡＴＧＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＧＣＡＧＡＧＣＧＴＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣＧＡＧＧＣＣＴＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＡＡＴＧＡ（配列番号３７１）  。
【０５９２】
Ｆｃ−ＨＲＳ（２−４５）（Ｎ末端Ｆｃ融合物）のＤＮＡ配列：
ＡＴＧＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＧＣＡＧＡＧＣＧＴＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣＧＡＧＧＣＣＴＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＧＴＧＡ（配列番号３７２）  。
【０５９３】
Ｆｃ−ＨＲＳ（２−５０）（Ｎ末端Ｆｃ融合物）のＤＮＡ配列：
ＡＴＧＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＧＣＡＧＡＧＣＧＴＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣＧＡＧＧＣＣＴＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡＡＧＣＴＧＡ（配列番号３７３）  。
【０５９４】
Ｆｃ−ＨＲＳ（２−５５）（Ｎ末端Ｆｃ融合物）のＤＮＡ配列：
ＡＴＧＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＧＣＡＧＡＧＣＧＴＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣＧＡＧＧＣＣＴＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＴＴＧＴＧＴＧＡ（配列番号３７４）  。
【０５９５】
Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６６）（Ｎ末端Ｆｃ融合物）のＤＮＡ配列：
ＡＴＧＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＧＣＡＧＡＧＣＧＴＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣＧＡＧＧＣＣＴＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＴＴＧＴＧＣＴＣＡＡＡＡＣＣＣＣＣＡＡＧＧＧＡＡＣＣＣＧＴＧＡＴＴＡＴＡＧＴＴＧＡ（配列番号３７５）  。
【０５９６】
ＨＲＳ（１−４０）−Ｆｃ（Ｃ末端Ｆｃ融合物）のＤＮＡ配列：
ＡＴＧＧＣＡＧＡＧＣＧＴＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣＧＡＧＧＣＣＴＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＡＡＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＴＧＡ（配列番号３７６）  。
【０５９７】
ＨＲＳ（１−４５）−Ｆｃ（Ｃ末端Ｆｃ融合物）のＤＮＡ配列：
ＡＴＧＧＣＡＧＡＧＣＧＴＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣＧＡＧＧＣＣＴＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＧＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＴＧＡ（配列番号３７７）  。
【０５９８】
ＨＲＳ（１−５０）−Ｆｃ（Ｃ末端Ｆｃ融合物）のＤＮＡ配列：
ＡＴＧＧＣＡＧＡＧＣＧＴＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣＧＡＧＧＣＣＴＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡＡＧＣＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＴＧＡ（配列番号３７８）  。
【０５９９】
ＨＲＳ（１−５５）−Ｆｃ（Ｃ末端Ｆｃ融合物）のＤＮＡ配列：
ＡＴＧＧＣＡＧＡＧＣＧＴＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣＧＡＧＧＣＣＴＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＴＴＧＴＧＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＴＧＡ（配列番号３７９）  。
【０６００】
ＨＲＳ（１−６６）−Ｆｃ（Ｃ末端Ｆｃ融合物）のＤＮＡ配列：
ＡＴＧＧＣＡＧＡＧＣＧＴＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣＧＡＧＧＣＣＴＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＴＴＧＴＧＣＴＣＡＡＡＡＣＣＣＣＣＡＡＧＧＧＡＡＣＣＣＧＴＧＡＴＴＡＴＡＧＴＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＴＧＡ（配列番号３８０）  。
【０６０１】
Ｆｃ−ＨＲＳ（２−４０）（Ｎ末端Ｆｃ融合物）のタンパク質配列：
ＭＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＡＥＲＡＡＬＥＥＬＶＫＬＱＧＥＲＶＲＧＬＫＱＱＫＡＳＡＥＬＩＥＥＥＶＡＫＬＬＫ（配列番号３８１）  。
【０６０２】
Ｆｃ−ＨＲＳ（２−４５）（Ｎ末端Ｆｃ融合物）のタンパク質配列：
ＭＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＡＥＲＡＡＬＥＥＬＶＫＬＱＧＥＲＶＲＧＬＫＱＱＫＡＳＡＥＬＩＥＥＥＶＡＫＬＬＫＬＫＡＱＬ（配列番号３８２）  。
【０６０３】
Ｆｃ−ＨＲＳ（２−５０）（Ｎ末端Ｆｃ融合物）のタンパク質配列：
ＭＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＡＥＲＡＡＬＥＥＬＶＫＬＱＧＥＲＶＲＧＬＫＱＱＫＡＳＡＥＬＩＥＥＥＶＡＫＬＬＫＬＫＡＱＬＧＰＤＥＳ（配列番号３８３）  。
【０６０４】
Ｆｃ−ＨＲＳ（２−５５）（Ｎ末端Ｆｃ融合物）のタンパク質配列：
ＭＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＡＥＲＡＡＬＥＥＬＶＫＬＱＧＥＲＶＲＧＬＫＱＱＫＡＳＡＥＬＩＥＥＥＶＡＫＬＬＫＬＫＡＱＬＧＰＤＥＳＫＱＫＦＶ（配列番号３８４）  。
【０６０５】
Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６６）（Ｎ末端Ｆｃ融合物）のタンパク質配列：
ＭＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＡＥＲＡＡＬＥＥＬＶＫＬＱＧＥＲＶＲＧＬＫＱＱＫＡＳＡＥＬＩＥＥＥＶＡＫＬＬＫＬＫＡＱＬＧＰＤＥＳＫＱＫＦＶＬＫＴＰＫＧＴＲＤＹＳ（配列番号３８５）  。
【０６０６】
ＨＲＳ（１−４０）−Ｆｃ（Ｃ末端Ｆｃ融合物）のタンパク質配列：
ＭＡＥＲＡＡＬＥＥＬＶＫＬＱＧＥＲＶＲＧＬＫＱＱＫＡＳＡＥＬＩＥＥＥＶＡＫＬＬＫＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３８６）  。
【０６０７】
ＨＲＳ（１−４５）−Ｆｃ（Ｃ末端Ｆｃ融合物）のタンパク質配列：
ＭＡＥＲＡＡＬＥＥＬＶＫＬＱＧＥＲＶＲＧＬＫＱＱＫＡＳＡＥＬＩＥＥＥＶＡＫＬＬＫＬＫＡＱＬＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３８７）  。
【０６０８】
ＨＲＳ（１−５０）−Ｆｃ（Ｃ末端Ｆｃ融合物）のタンパク質配列：
ＭＡＥＲＡＡＬＥＥＬＶＫＬＱＧＥＲＶＲＧＬＫＱＱＫＡＳＡＥＬＩＥＥＥＶＡＫＬＬＫＬＫＡＱＬＧＰＤＥＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３８８）  。
【０６０９】
ＨＲＳ（１−５５）−Ｆｃ（Ｃ末端Ｆｃ融合物）のタンパク質配列：
ＭＡＥＲＡＡＬＥＥＬＶＫＬＱＧＥＲＶＲＧＬＫＱＱＫＡＳＡＥＬＩＥＥＥＶＡＫＬＬＫＬＫＡＱＬＧＰＤＥＳＫＱＫＦＶＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３８９）  。
【０６１０】
ＨＲＳ（１−６６）−Ｆｃ（Ｃ末端Ｆｃ融合物）のタンパク質配列：
ＭＡＥＲＡＡＬＥＥＬＶＫＬＱＧＥＲＶＲＧＬＫＱＱＫＡＳＡＥＬＩＥＥＥＶＡＫＬＬＫＬＫＡＱＬＧＰＤＥＳＫＱＫＦＶＬＫＴＰＫＧＴＲＤＹＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３９０）  。
【０６１１】
Ｎ末端Ｆｃ−ヒスチジルｔＲＮＡシンテターゼ（ＨＲＳ−Ｆｃ）タンデム融合ＤＮＡ構築物を、以下のように調製した。
【０６１２】
プラスミド構築。Ｎ末端Ｆｃを有するＨＲＳ（２−６０）＿ＨＲＳ（２−６０）を、ｐＥＴ２４ｂ＿ＴＡＣ＿Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）構築物を使用して生成した。ＨＲＳ（２−６０）遺伝子を、５’および３’のＸｈｏＩ部位を含む、以下に列挙したプライマーでＰＣＲ増幅した。これらのＰＣＲ反応を、推奨される熱サイクリングパラメーターを使用して実施した。ｐＥＴ２４ｂ＿ＴＡＣ＿Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）構築物を、ＸｈｏＩで消化し、脱リン酸化し、ゲル精製した。ＰＣＲ生成された断片もまた、ＸｈｏＩで消化し、ゲル精製した。ゲル精製されたＨＲＳ（２−６０）を、ｐＥＴ２４ｂ＿ＴＡＣ＿Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）のＸｈｏＩ部位中にサブクローニングした。最終構築物を生成するために、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ変異誘発を使用し、以下に列挙したプライマーを使用して、タンデムＨＲＳ（２−６０）断片間の終止コドンおよびＸｈｏＩ部位を除去した。配列を、ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  ＳｅｑＭａｎ  Ｐｒｏを使用して、理論的配列とのアラインメントを実施することによって確認した。
【０６１３】
以下のプライマーを使用して、Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）を増幅した（表Ｅ１５）：
【０６１４】
【表２７】
2020141673.tif 000049
【０６１５】
Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）ＨＲＳ（２−６０）（Ｎ末端Ｆｃ融合物）のＤＮＡ配列：
ＡＴＧＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＧＣＡＧＡＧＣＧＴＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣＧＡＧＧＣＣＴＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＴＴＧＴＧＣＴＣＡＡＡＡＣＣＣＣＣＡＡＧＧＣＡＧＡＧＣＧＴＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣＧＡＧＧＣＣＴＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＴＴＧＴＧＣＴＣＡＡＡＡＣＣＣＣＣＡＡＧＴＧＡ（配列番号３９５）  。
【０６１６】
Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）ＨＲＳ（２−６０）（Ｎ末端Ｆｃ融合物）のタンパク質配列：
ＭＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＡＥＲＡＡＬＥＥＬＶＫＬＱＧＥＲＶＲＧＬＫＱＱＫＡＳＡＥＬＩＥＥＥＶＡＫＬＬＫＬＫＡＱＬＧＰＤＥＳＫＱＫＦＶＬＫＴＰＫＡＥＲＡＡＬＥＥＬＶＫＬＱＧＥＲＶＲＧＬＫＱＱＫＡＳＡＥＬＩＥＥＥＶＡＫＬＬＫＬＫＡＱＬＧＰＤＥＳＫＱＫＦＶＬＫＴＰＫ（配列番号３９６）  。
【０６１７】
ＨＲＳ（１−６０）−ＦｃおよびＦｃ−ＨＲＳ（２−６０）融合タンパク質の調製および精製。Ｅ．ｃｏｌｉ株。上記ｐＥＴ発現構築物で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（登録商標）（ＤＥ３）ＲＩＰＬコンピテント細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ  ２３０２８０）を、Ｆｃ融合タンパク質の初回生成のために使用した。
【０６１８】
培地。Ｍ９ＹＥ培地を、無菌５×Ｍ９最小塩（ＢＤ  ２４８５１０）、無菌精製水中の酵母抽出物溶液（ＢＤ  ２１２７５０）、無菌化２０％グルコース（Ｓｉｇｍａ  Ｇ７０２１）および無菌１．０Ｍ  ＭｇＳＯ４（Ｓｉｇｍａ  Ｍ７５０６）を混合することによって調製した。供給溶液に関して、酵母抽出物溶液（５％）、グルコース溶液（５０％）および１０ｍｌの濃縮微量元素溶液（Ｆｅ３＋、Ｍｎ２＋、ホウ酸、Ｍｏ６＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋およびＥＤＴＡを含む）を、１０ｍｌ硫酸マグネシウム溶液と同様、別々にオートクレーブした。これらの構成要素を、流加期の直前に混合した。硫酸カナマイシンを、培養培地中１００μｇ／ｍｌの最終濃度になるように添加した。
【０６１９】
流加発酵。Ｉｒｉｓソフトウェアを備えた０．５Ｌ  Ｍｕｌｔｉｆｏｒｓ発酵槽（ＨＴ−Ｉｎｆｏｒｓ）を、流加発酵プロセスに使用した。かき混ぜを、１０００ｒｐｍに設定した。ｐＨ値を、３０％水酸化アンモニウム（Ｓｉｇｍａ  ２２１２２８）および３０％リン酸（Ｓｉｇｍａ  Ｐ５８１１）の添加によって自動的に７．０に制御した。空気を、オイルフリーダイヤフラム空気圧縮機（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ）によって０．５Ｌ／分の流速で提供し、０．２μｍフィルターを通過させた。溶解酸素レベルを、純粋酸素（Ｗｅｓｔ  Ａｉｒ）を提供することによって７０％に制御した。温度を、Ｎｅｓｌａｂ  ＲＴＥ７サーキュレーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて３０℃に制御した。発泡を、ａｎｔｉｆｏａｍ  ２０４（Ｓｉｇｍａ  Ａ８３１１）の添加によって制御した。
【０６２０】
発酵槽中のＭ９ＹＥ培地の初期体積は、０．３Ｌであった。発酵槽に、３０℃および２５０ｒｐｍで一晩増殖させた種培養物１５ｍＬを接種した。容器中の炭素供給源が枯渇した場合、濃縮供給溶液を、０．１２ｍＬ／分に設定した蠕動ポンプによって容器中に導入した。６００ｎｍにおける細胞の光学密度が対数期に達した時に、培養物を、０．５ｍＭ
ＩＰＴＧ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＢＰ１７５５）で誘導した。培養物を一晩増殖させたところ（約１７時間の誘導）、最終ＯＤ６００は約１２０に達した。細胞を、８，０００ｇで３０分間の遠心分離によって回収した。上清をデカントし、ペレットを精製まで−２０℃で貯蔵した。
【０６２１】
さらなるＨＲＳ−Ｆｃ融合タンパク質を、Ｔ７の代わりにＴＡＣプロモーターを含む改変ｐＥＴ２４ｂベクター（ＥＭＤ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）（「ｐＥＴ２４ｂ＿ＴＡＣ」）を使用して調製し、ＵＴ５６００コンピテント細胞中に形質転換した。ＵＴ５６００コンピテント細胞を、Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＳＣ、Ｙａｌｅ）から得た細菌ストックから調製した。ＵＴ５６００は、Ｅ．ｃｏｌｉのＫ１２誘導体株であり、以下の遺伝子型として表される：Ｆ、ａｒａＣ１４、ｌｅｕＢ６（Ａｍ）、ｓｅｃＡ２０６（ａｚｉＲ）、ｌａｃＹ１、ｐｒｏＣ１４、ｔｓｘ−６７、Δ（ｏｍｐＴ−ｆｅｐＣ）２６６、ｅｎｔＡ４０３、ｇｌｎＸ４４（ＡＳ）、λ−、ｔｒｐＥ３８、ｒｆｂＣ１、ｒｐｓＬ１０９（ｓｔｒＲ）、ｘｙｌＡ５、ｍｔｌ−１、ｔｈｉＥ１。
【０６２２】
これらの構築物を含む発現ベクターを、標準的な手順を使用してＵＴ５６００細胞中に形質転換し、グリセロールストックを調製した。
【０６２３】
発酵培地。ＵＴ５６００＿Ｍ９＿ＹＥ培地を、バッチ培地について、以下：１６グラム／Ｌ酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ  ２１２７５０）、８ｇ／Ｌグリセロール（Ｓｉｇｍａ  Ｇ２０２５）、１１．２８ｇ／Ｌ  Ｍ９塩（Ｄｉｆｃｏ  ２４８５１０）および１００μｌ／Ｌ  Ａｎｔｉｆｏａｍ  ２０４（Ｓｉｇｍａ  ＡＧ６４２６）を脱イオン化水中に混合することによって調製し、オートクレーブで無菌化した。オートクレーブ後に、０．６４ｍｌ／Ｌ微量金属溶液、２．３ｍｌ／Ｌ  １００×硫酸マグネシウムおよび４５．８３ｇ／Ｌ  Ｌ−ロイシンを添加した。フィード培地を、２５０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２２５ｇ／Ｌグリセロールおよび１００μｌ／Ｌ  Ａｎｔｉｆｏａｍ  ２０４を脱イオン化水中に混合することによって調製し、オートクレーブで無菌化した。無菌化後、１０ｍｌ／Ｌ微量金属溶液、２．３ｍｌ／Ｌ  １００×硫酸マグネシウム、４５．８３ｍｌ／Ｌ  Ｌ−ロイシンを添加した。
【０６２４】
流加発酵。ＭＦＣＳ／ＤＡソフトウェアを備えた０．５Ｌ発酵槽（Ｉｎｆｏｒｓ）を、流加発酵に使用した。かき混ぜを、５００〜１２００ｒｐｍのカスケードに設定した。ｐＨ値を、３０％水酸化アンモニウム（Ｓｉｇｍａ  ２２１２２８）および３０％リン酸（Ｓｉｇｍａ  Ｐ５８１１）の添加によって自動的に７．０±０．１に制御した。空気を、オイルフリーダイヤフラム空気圧縮機（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ）によって０．５Ｌ／分の流速で提供した。空気を、０．２μｍ  Ｍｉｄｉｓａｒｔ  ２０００フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  １７８０５）を通過させた。純粋酸素（Ｗｅｓｔ  Ａｉｒ）を供給して、溶解酸素レベルを３０％に自動的に制御した。温度を、Ｎｅｓｌａｂ  ＲＴＥ７サーキュレーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて３０℃に制御した。発泡を、必要に応じて、ａｎｔｉｆｏａｍ  ２０４（Ｓｉｇｍａ  Ａ８３１１）の添加によって制御した。発酵槽中のＵＴ５６００＿Ｍ９＿ＹＥ培地の初期体積は、０．２４Ｌであった。発酵槽に、３７℃および２５０ｒｐｍで６時間増殖させた種培養物約１０ＯＤ単位（およそ１〜２ｍｌの、ＯＤ５〜１０の種）を接種した。容器中のバッチグリセロールが枯渇した場合（約４時間）、濃縮供給溶液を、対数供給プログラム上に設置した蠕動ポンプによって容器中に導入した。６００ｎｍにおける細胞の光学密度が約１５０に達した時に、培養物を、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＢＰ１７５５）で誘導した。培養物を誘導後４時間インキュベートし、１０，０００×ｇで３０分間の遠心分離によって回収した。およその最終細胞ペレット収量は、１リットルの湿細胞重量（ＷＣＷ）当たり１５０〜２００グラムであった。細胞ペレットを、精製まで−８０℃で貯蔵した。標的タンパク質の発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびヤギ抗ヒトＩｇＧ、ＨＲＰコンジュゲート化抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  ｐ／ｎ  ３１４１３）に対するウエスタンブロットによって確認した。
【０６２５】
ＦＣ融合タンパク質の精製。凍結細胞ペレットを、４体積（即ち、４ｍＬ／ｇ細胞ペレット）の溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１４ｍＭ  β−ＭＥ、ｐＨ７．５）中に再懸濁した。完全ＥＤＴＡ−ＦＲＥＥプロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｒｏｃｈｅ）を、１錠剤／５０ｍＬの比率で懸濁物に添加した。この懸濁物を、氷で冷却しながら、１４，０００ｐｓｉでｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を２回通過させた。この溶解物を、≧１０，０００×ｇで４５分間４℃で遠心分離した。上清を、０．４５＋０．２２μｍ  Ｓａｒｔｏｂｒａｎカプセルフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通して濾過した。
【０６２６】
この清澄化された溶解物を、１ｍｌ樹脂／１０ｇ細胞ペーストの比率で、結合緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で予め平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合させた。このカラムを、５００カラム体積の結合緩衝液＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４で洗浄し、その後１００カラム体積の結合緩衝液で洗浄した。結合したタンパク質、融合タンパク質を、１．２５カラム体積の中和緩衝液（１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）を含む収集チューブ中に、３．７５カラム体積の溶出緩衝液（０．１Ｍグリシン、０．５Ｍアルギニン、ｐＨ３．０）で溶出させた。
【０６２７】
任意選択で、高分子量種のさらなる除去のために、材料を、Ａｍｉｃｏｎ  ３０ｋＤａ超遠心分離濃縮デバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）において濃縮し、ＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ  １６／６００サイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。この材料を、１．１カラム体積の１×ＰＢＳ  ｐＨ７．４（Ｇｉｂｃｏ番号１００１０）中で溶出させ、２８０ｎｍでのプロセスクロマトグラム吸光度に基づいて主要ピークに対応する画分をプールした。
【０６２８】
サイズ排除クロマトグラフィーを実施しなかった場合、精製されたＦｃ融合タンパク質を、ＰＢＳ、ｐＨ７．４を含む緩衝液へと緩衝液交換した。透析したタンパク質を、さらなるエンドトキシン除去のためにＱメンブレンフィルター（ＳａｒｔｏｒｉｕｓのＳａｒｔｏｂｉｎｄ−ＱまたはＰａｌｌのＭｕｓｔａｎｇ−Ｑ）またはＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を通過させ、０．２２μｍ無菌フィルターを通して濾過した。
【０６２９】
ＦＣ融合タンパク質のための拡大縮小可能な精製プロセス
ＭａｂＳｅｌｅｃｔとその後のサイズ排除クロマトグラフィーとを使用する精製プロセスを使用し、最小精製の開発で有効なロバストプロセスを使用して、複数のＦｃ融合タンパク質を精製した。しかし、プロテインＡ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ）およびサイズ排除クロマトグラフィーステップの間の洗剤洗浄の使用は、精製をスケールアップする能力を制限する。スケールアップのための精製プロセスもまた、溶解物綿状沈殿、プロテインＡクロマトグラフィー、カチオン交換（ＣＥＸ）およびセラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）クロマトグラフィーを使用して、Ｆｃ融合タンパク質のために開発した。
【０６３０】
再懸濁および溶解を、溶解緩衝液からプロテアーゼ阻害剤錠剤およびβ−ＭＥを省いて、上記のように実施した。溶解後、溶解物を、０．０４％（ｖ／ｖ）までのポリエチレンイミン、分子量１３００（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の添加によって綿状沈殿させ、４℃で３０分間インキュベートした。遠心分離および清澄化を、上記のように実施した。プロテインＡクロマトグラフィーを、４ｇの細胞ペースト当たり１ｍｌの樹脂のロード比で充填済みクロマトグラフィーカラム中のＭａｂＳｅｌｅｃｔ樹脂を使用して、清澄化された溶解物に対して実施し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５中５カラム体積の洗浄ステップを行い、その後、３カラム体積の０．１Ｍグリシン  ｐＨ３．０中で溶出させ、０．３カラム体積の１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０中で中和した。プロテインＡの後、ＣＥＸロードを、ＣＥＸ平衡化緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０）中の５×希釈のプロテインＡ後溶離液によって調製し、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム上にロードし、５カラム体積の平衡化緩衝液で洗浄し、１０カラム体積にわたって０〜３００ｍＭのＮａＣｌの直線塩化ナトリウム勾配で溶出させた。ＣＥＸ画分を、溶出ピーク画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づいてプールした。セラミックヒドロキシアパタイトを、ＣＨＴ平衡化緩衝液（５ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１μＭ塩化カルシウム、ｐＨ６．５）中で平衡化したＣＨＴ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  ４０μｍカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上にロードすることによってＣＥＸプールに対して実施し、５カラムの平衡化緩衝液で洗浄し、１０カラム体積にわたって１５０ｍＭ〜１．５Ｍの塩化ナトリウムの直線塩化ナトリウム勾配で溶出させ、最大２０カラム体積まで１．５Ｍ  ＮａＣｌを維持して、溶出を完了させた。ＣＨＴ後、タンパク質を、Ａｍｉｃｏｎ  ３０ｋＤａ遠心分離濃縮デバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して１×ＰＢＳ  ｐＨ７．４へと緩衝液交換した。
【０６３１】
融合タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）または２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度によって決定した。融合タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって決定した。エンドトキシンレベルは、ＥｎｄｏＳａｆｅ  ＰＴＳ  ＬＡＬアッセイ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）によって決定したとき、４ＥＵ／ｍｇを下回った。
【０６３２】
ＨＲＳ−Ｆｃ融合タンパク質の分析。精製されたＨＲＳ−Ｆｃ融合タンパク質を、図２１に示したように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。１０μｇタンパク質ロードの試料を、ＮｕＰＡＧＥ  ４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で、ＭＯＰＳ−ＳＤＳ緩衝液中で１５０Ｖで６０分間泳動し、Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｂｌｕｅで染色した。還元された試料は、２５ｍＭ  ＤＴＴを有し、ロードする前に１×ＬＤＳ緩衝液中で９５℃で１０分間加熱した。
【０６３３】
精製されたＨＲＳ−Ｆｃ融合タンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）法によっても分析した。試料を、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＨＰＬＣシステム上でＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  ＳＷ３０００カラム（ＴＯＳＯＨ、４．６ｍｍ  ＩＤ×３０ｃｍ、４μｍ）にロードした。３０分の均一濃度泳動を、ｐＨ７の０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．２Ｍリン酸Ｎａおよび５％  ２−プロパノールを含む移動相を用いて０．３ｍｌ／分で実施した。ＵＶ検出を、２８０ｎｍで実施した。クロマトグラムは図２２中に示される。
【０６３４】
タンパク質のおよそ８３％は、プロテインＡ後およびサイズ排除クロマトグラフィー精製前に、所望のダイマー形態で存在し、残りの量は高分子量種として存在する。サイズ排除クロマトグラフィー後、ダイマーの割合は、９５〜９９％に増加する。プロテインＡ、カチオン交換およびヒドロキシアパタイト精製プロセスを使用すると、ダイマーの割合は９９％よりも大きい。ダイマータンパク質のほとんどが、Ｆｃヒンジ領域中に鎖間ジスルフィド結合を含むが、一部の非共有結合ダイマーもまた存在する。
【０６３５】
ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳを使用して得られたインタクトな質量スペクトルデータの分析は、非還元条件下でのＦＣ融合タンパク質の分子サイズが、およそ６４，５２０ダルトンの予測分子量と一致することを実証している（データ示さず）。遠ＵＶ領域および近ＵＶ領域におけるＦｃ融合タンパク質のＣＤスペクトルは、この融合タンパク質の構造が、予測されたドメイン構造と一致することを明らかにしている。さらに、ＨＲＳ−Ｆｃ融合タンパク質から得られたデコンボリューション示差走査熱量測定データは、このＦｃ融合タンパク質が、予測された構造と一致して、Ｆｃ構成要素のＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメインに特徴的な２つの主要な熱転移で折り畳まっていることを実証している（データ示さず）。
【０６３６】
未改変ＨＲＳタンパク質と比較したＨＲＳ−Ｆｃ融合タンパク質構築物の薬物動態学的特徴を評価するために、タンパク質を、８ｍｇ／ｋｇの用量の単一の静脈内または皮下ボーラスを介して正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与した。血液を、１つの生成物形態当たり９匹の動物にわたって分布する試料採取時間で、連続的に試料採取した。各時点について、３匹の独立したマウスから血清を引き出した。試験物品濃度を、ＥＬＩＳＡによって測定し、薬物動態学的パラメーターを、Ｐｈｏｅｎｉｘソフトウェア上での非コンパートメント分析を使用して導出した。
【０６３７】
図２３Ａ、２３Ｂおよび２３Ｃ中に示される結果は、Ｆｃ融合タンパク質の創出が、顕著に増強された半減期、曝露および皮下バイオアベイラビリティを生じたことを実証している。
【０６３８】
【表２８】
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【０６３９】
表Ｅ１６中に示される薬物動態学的分析は、ＨＲＳ−Ｆｃ融合構築物が、未改変タンパク質と比較して、顕著に改善された全身性曝露、クリアランスおよび半減期を示すことを実証している。Ｆｃ融合タンパク質の創出は、未改変タンパク質と比較して、このタンパク質の皮下バイオアベイラビリティもまた改善した。特に、投与の経路に依存して、Ｆｃ−ＨＲＳ（１−６０）は、未改変タンパク質と比較して曝露を２００〜３００倍増加させ、さらに皮下バイオアベイラビリティおよび半減期は、両方とも顕著に増強された。
【０６４０】
（実施例９）
ＴＮＢＳ誘導性大腸炎におけるＦｃ融合タンパク質の試験
大腸は、フラスコ様構造、陰窩中に陥入した上皮粘膜によって裏打ちされている。小腸とは異なり、この領域中には絨毛は存在せず、陰窩の上部は、フラットテーブル（ｆｌａｔ  ｔａｂｌｅ）領域上に開口している。陰窩の細胞は、陰窩基部に位置する幹細胞によって生成され、その娘細胞は、迅速に分裂し、優勢な結腸細胞およびムチン産生杯細胞へと分化する（より少数の内分泌細胞およびＭ細胞もまた生成される）。陰窩のサイズおよび陰窩１つ当たりの杯細胞の数は、おそらくは糞便の通過を補助し、水が糞便から吸収される際の十分な粘膜細胞および幹細胞を提供するために、盲腸から直腸へと大腸に沿って増加する。
【０６４１】
正常では、腸陰窩における細胞生成の速度は、細胞喪失の速度と正確に一致する−非常に敏感な恒常性機構が動作する。粘膜関門の破壊は、身体中への細菌の侵入を可能にし、疾患の関与を生じる。逆に、過形成は、ポリープを生じ得、最終的に腫瘍を生じ得る。腸関門の破壊は、非細胞型特異的（しばしば増殖特異的）細胞傷害剤−典型的には抗がん治療−への曝露によって引き起こされ得る。しかし、上皮細胞ターンオーバーの乱れもまた、炎症性疾患の一般的特徴である。
【０６４２】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の現在のげっ歯類モデルには、例えば、Ｔ細胞集団の操作によって自己免疫性疾患を誘発すること、大腸における粒状材料の蓄積によって腸の粘膜裏打ちを刺激すること（例えば、ＤＳＳ、デキストラン硫酸ナトリウムによる）、または上皮の化学的破壊（例えば、トリニトロベンゼンスルホン酸、ＴＮＢＳによる）によって生成されたモデルが含まれる。
【０６４３】
これらのモデルのいずれかにおいて、疾患重症度は、基礎的生物学に関するより有意義な洞察を提供するために、観察された病理学的グレードの種々の主観的評価、ならびに損傷のより客観的かつ定量的な測定によって評価され得る。粘膜／粘膜下層における変化をマッピングし、損傷のより定量的な測定、および従って治療的効力を得るために、コンピューター補助された長さ／面積測定を使用することによって、分析を広げることが可能である。これらのモデルの各々は、異なる良い点および悪い点があるものの、このＴＮＢＳ大腸炎モデルは、ヒトにおける炎症性腸疾患の種々の態様の確立されたモデルであり、ヒト治療効力を検証および最適化するために首尾よく使用されてきた。
【０６４４】
ＴＮＢＳマウスモデル。大腸炎のこのモデルでは、結腸刺激は、エタノール中のＴＮＢＳの結腸内投与によって誘導される。これは、とりわけＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２をコードする遺伝子の発現を特徴とするＴＨ１型サイトカインプロファイルを有する急性大腸炎を誘発する（Ｆｉｃｈｔｎｅｒ−Ｆｅｉｇｌら  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．２００５年．１１５巻：３０５７〜３０７１頁）。この大腸炎は、重度であり得、ＴＮＢＳが導入される結腸の領域に限局化される。この炎症性応答は、限局化された腫脹、炎症性細胞浸潤および上皮喪失を生じる。
【０６４５】
この研究では、未改変ＨＲＳポリペプチド、（ＨＲＳ（１−６０）の効力を、Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）およびＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃと比較して、マウスにおけるＴＮＢＳ誘導性の急性大腸炎を寛解させることにおけるその効力を評価した。試験品目の静脈内投与または皮下投与のいずれかを使用する３つの異なる投薬レジメンを評価した。ブデソニド（経口）を、この研究のための参照品目として使用した。
【０６４６】
動物およびケージング：合計１００匹のＢＤＦ−１（Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉなし、マウスノロウイルスなし）雄性マウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＫ）を、この研究において使用した。動物は、供給時に８〜１０週齢であり、１０〜１２週齢で使用した。全てのマウスを、ＳＰＦ（特定病原体除去）バリアユニット中の個々に換気するケージ（ＩＶＣ）中に保持した。これらの動物を、番号を付けたケージおよび耳のパンチによって同定した。
【０６４７】
食餌および動物福祉：これらの動物に、Ｂ＆ＫのＲａｔ  ａｎｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｘｐａｎｄｅｄ食を給餌した。水を、ＨＹＤＲＯＰＡＣ（商標）水パウチ（濾過ＲＯ水；Ｈｙｄｒｏｐａｃ／ｌａｂの製品、Ｄｅｌａｗａｒｅ、ＵＳＡ）で供給した。餌および水の両方は、自由裁量で入手可能であった。２１±２℃の一定温度および５５±１０％の平均相対湿度であった。昼−夜サイクルは一定であり、各々１２時間の明期および暗期であった（０７：００時／１９：００時に切り替え）。動物の健康を、毎日モニタリングし、ケージを一定の間隔で掃除した。全ての手順は、ＵＫ  Ａｎｉｍａｌ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ  １９８６年に従って認証された。
【０６４８】
群、投薬量、投与および製剤：合計１００匹のマウスを、１０個の研究群に無作為化した（表Ｅ１７）。任意の１つのケージ中の全てのマウスは、同じ処置を受け、同定目的のために耳パンチした。毎日の体重測定を使用して、適用可能な群に投与した試験品目またはビヒクルの体積を計算した。
【０６４９】
【表２９】
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【０６５０】
ＴＮＢＳおよび試験品目の調製および投与。ＴＮＢＳ：ＴＮＢＳ（Ｓｉｇｍａ；ロット番号ＳＬＢＤ６８１１Ｖ）を、生理食塩水／５０％エタノール中の１５ｍｇ／ｍｌ溶液として調製した。２００μｌ（３ｍｇのＴＮＢＳ）の単一用量を、研究０日目の１１：００時に、肛門縁の近位４ｃｍに配置したプラスチックカテーテルを使用して、結腸中に注入した。動物を、化合物の漏出を最小化するために、結腸中へのＴＮＢＳの導入後１分間にわたって逆位で維持した。
【０６５１】
ＨＲＳ（１−６０）：この試験品目を、使用まで−８０℃で貯蔵した１７．１ｍｇ／ｍｌの凍結ストック溶液の４つのバイアル（各々において０．０３３ｍｌ体積）として受け取った。試験品目投与の各日に、単一のアリコートを取り、湿った氷上で解凍した。解凍後、バイアルの内容物を、１０回ピペッティングして出し入れすることによって混合した。引き続いて、この試験品目を、冷ビヒクル（無菌、×１  ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で希釈して、０．２ｍｇ／ｍｌの溶液を得た；この溶液を、１０回ピペッティングして出し入れすることによって混合した。この溶液を、１ｍｇ／ｋｇの用量を得るために、５ｍｌ／ｋｇで静脈内注射によって毎日投与した（研究０日目から研究３日目まで）。
【０６５２】
Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）：この試験品目を、使用まで−８０℃で貯蔵した４．７ｍｇ／ｍｌの凍結ストック溶液の４つのバイアル（２．５１ｍｌの１つのバイアルおよび２．０１ｍｌの３つのバイアル）として受け取った。試験品目投与の各日に、単一のアリコートを取り、湿った氷上で解凍した。解凍後、バイアルの内容物を、１０回ピペッティングして出し入れすることによって混合した。引き続いて、この試験品目を、冷ビヒクル（無菌、×１  ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で希釈して、３ｍｇ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌの溶液を得た；これらの溶液を、１０回ピペッティングして出し入れすることによって混合した。Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）を、以下の３つの異なるレジメンに従って投与した：ｉ）１ｍｇ／ｍｌ溶液を、５ｍｇ／ｋｇの用量を得るために、５ｍｌ／ｋｇで静脈内注射によって毎日投与した（研究０日目から研究３日目まで）；ｉｉ）１ｍｇ／ｍｌ溶液を、５ｍｇ／ｋｇの用量を得るために、５ｍｌ／ｋｇで静脈内注射によって、研究０日目に１回だけ、毎日投与した；ｉｉｉ）３ｍｇ／ｍｌ溶液を、１５ｍｇ／ｋｇの用量を得るために、５ｍｌ／ｋｇで皮下注射によって、毎日投与した（研究０日目から研究３日目まで）。
【０６５３】
ＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃ：この試験品目を、使用まで−８０℃で貯蔵した４．９９ｍｇ／ｍｌの凍結ストック溶液の４つのバイアル（２．３７ｍｌの１つのバイアルおよび１．８９ｍｌの３つのバイアル）として受け取った。試験品目投与の各日に、単一のアリコートを取り、湿った氷上で解凍した。解凍後、バイアルの内容物を、１０回ピペッティングして出し入れすることによって混合した。引き続いて、この試験品目を、冷ビヒクル（無菌、×１  ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で希釈して、３ｍｇ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌの溶液を得た；これらの溶液を、１０回ピペッティングして出し入れすることによって混合した。ＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃを、以下の３つの異なるレジメンに従って投与した：ｉ）１ｍｇ／ｍｌ溶液を、５ｍｇ／ｋｇの用量を得るために、５ｍｌ／ｋｇで静脈内注射によって毎日投与した（研究０日目から研究３日目まで）；ｉｉ）１ｍｇ／ｍｌ溶液を、５ｍｇ／ｋｇの用量を得るために、５ｍｌ／ｋｇで静脈内注射によって、研究０日目に１回だけ、毎日投与した；ｉｉｉ）３ｍｇ／ｍｌ溶液を、１５ｍｇ／ｋｇの用量を得るために、５ｍｌ／ｋｇで皮下注射によって、毎日投与した（研究０日目から研究３日目まで）。
【０６５４】
ブデソニド：ブデソニドを、Ｔｏｃｒｉｓから取得し（Ｔｏｃｒｉｓ  １１０１、ロット番号１Ａ／１２８９０２）、使用まで周囲温度で暗中で貯蔵した。投与の各日に、ブデソニドを、落花生油（Ｓｉｇｍａ）中の１ｍｇ／ｍｌ溶液として製剤化した。ブデソニドを、５ｍｇ／ｋｇの用量を得るために、５ｍｌ／ｋｇで経口経管栄養によって毎日投与した（研究０日目から研究３日目まで）。
【０６５５】
臨床試験および鎮痛。１５％よりも多い体重減少を示している任意の動物を、体調不良とみなし、処置が差し控えられ得る。体重減少が２０％よりも大きかった場合、任意の動物を間引いた。動物の福祉を、毎日モニタリングした。−１日目から研究の最後まで、１日１回、全てのマウスを計量し、表Ｅ１８中の基準に従って、大便の硬さについて、ならびに大便中および肛門周辺の顕性血液の存在について評価した。
【０６５６】
【表３０】
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【０６５７】
鎮痛の使用：鎮痛は、スポンサーの指示で、この研究では使用しなかったが、これは、鎮痛が試験品目の作用を妨害した可能性があるからである。
【０６５８】
組織学的試験のための組織の回収および準備：屠殺の際に、マウスを、２Ｌ／分のＯ２および２Ｌ／分のＮ２Ｏと共に、４％イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）で麻酔した。完全に麻酔した時点で、血液を、直接的心穿刺によって引き出し、頸椎脱臼によって死亡を確認した。
【０６５９】
全血および血漿試料の調製。血液を、１．５ｍｌ微量遠心管中に、全てのマウスからの心穿刺によって収集した。血液試料を、氷上に即座に配置し、６０分間凝血させた。次いで、試料を、３０００ｇで７分間、４℃で遠心分離した。遠心分離の直後、血清を、無菌ピペットによって、予めラベルを付けたバイアル中に移し、ドライアイス上で即座に凍結させた。
【０６６０】
腸試料の調製。大腸を取り出し、ＰＢＳで流し、その長さおよび湿重量を記録し、その後、近位、中央および遠位領域へと切り分け、Ｃａｒｎｏｙ溶液中で固定した。さらに、結腸の小さい試料を、液体窒素中で即座に凍結させた。固定した組織を、Ｌｅｉｃａ  ＴＰ１０２０組織プロセッサーおよびＥＧ１１４０Ｈワークステーションを使用して、一連のアルコールおよびキシレンを通して脱水し、パラフィン中に包埋した。切片（厚さ５μｍ）を、Ｌｅｉｃａ  ＲＭ２１２５ＲＴＦミクロトームを使用して切り、３７℃で一晩、顕微鏡スライド上で風乾した。引き続いて、スライドを、キシレン中で脱脂し、段階的なアルコールによってＰＢＳまで再水和した。次いで、全ての切片を、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、マウントした。
【０６６１】
組織学的分析：組織学的切片を、盲検様式で評価した。切片を、顕微鏡により観察し、表Ｅ１９中に概要を示した基準に従って、０と５との間の範囲の主観的重症度スコアを割り当てた。中央および遠位大腸からの最大１２の横断面を評価した。
【０６６２】
【表３１】
2020141673.tif 000053
【０６６３】
統計的分析：言及する場合、群データの統計的比較を、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して、事後試験と組み合わせてＡＮＯＶＡを使用して実施した。
【０６６４】
ｑＰＣＲ分析：マウス結腸を、動物から切り出し、分析まで−８０℃で貯蔵した。ＲＮＡを、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（カタログ番号７４１０６）を使用して、結腸から調製した。ＲＮＡをＱｉａｇｅｎカラムから溶出させた時点で、ＲＮＡ完全性を試験するためにＡｇｉｌｅｎｔのＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００に、ＲＮＡの濃度および純度を決定するためにＮａｎｏＤｒｏｐに、ＲＮＡをかけた。次いで、ＲＮＡを−８０℃で貯蔵した。
【０６６５】
ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写（ＲＴ）を、以下のプログラムを用いて、ＥｐｐｅｎｄｏｒｆのＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ＰＣＲ機械において、９６ウェルＰＣＲプレート形式で実施した：３７℃で６０分間、９５℃で５分間。９６ウェルプレートの端のウェルは使用せず、５０ｍｃＬの水を満たして、内側のウェルの蒸発を防止した。２５ｍｃＬの逆転写マスターミックス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ番号４３８７４０６）中１００ｎｇのＲＮＡを、１回の試料ＲＴ当たり使用した。ＲＴが完了した時点で、次のステップは、試料ｃＤＮＡ中の目的の遺伝子を予め増幅することであった。目的の遺伝子のプライマー（Ｆｌｕｉｄｉｇｍによって設計されたＤＥＬＴＡｇｅｎｅプライマー）を合わせて、２００ｎＭの最終濃度にした。これらのプライマーを使用して、目的の遺伝子を、各試料において予め増幅した。予めの増幅を、以下のプログラムを用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＶｉｉＡ７  ＰＣＲ機械を使用して、３８４ウェル形式で、１０ｍｃＬの反応（２．５ｍｃＬ  ｃＤＮＡ、７．５ｍｃＬ  Ｐｒｅ−Ａｍｐマスターミックス）において実施した：９５℃で１０分間、９５℃で１５秒間の１４サイクルおよび６０℃で４分間。予めの増幅ステップの後、エキソヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ
ＢｉｏＬａｂｓカタログ番号Ｍ０２９３Ｌ）を添加して、取り込まれていないプライマーを各試料から除去した。このエキソヌクレアーゼ反応もまた、以下のプログラムを用いて、ＶｉｉＡ７  ＰＣＲ機械において完了させた：３７℃で３０分間、８０℃で１５分間。エキソヌクレアーゼ後、ＲＴ試料を、さらに１：５希釈した（７ｍｃＬエキソヌクレアーゼ試料＋１８ｍｃＬ低ＥＤＴＡ緩衝液）。
【０６６６】
ＦｌｕｉｄｉｇｍのＢｉｏｍａｒｋシステム上でｑＰＣＲを実行するために使用したチップは、９６．９６  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ａｒｒａｙ  ＩＦＣ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎであった。最初に、このチップを、試料およびアッセイをロードする前に、製造業者の推奨に従ってＩＦＣコントローラーＨＸを用いてプライムした。チップ上にロードするアッセイを調製するために、目的の各遺伝子についての３．６ｍｃＬの２０ｍｃＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマーに対して、４．４ｍｃＬのアッセイマスターミックス（Ｆｌｕｉｄｉｇｍの２×Ａｓｓａｙ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔカタログ番号８５００７３６および低ＥＤＴＡ  ＴＥ）を、９６ウェルプレートにおいて調製した。試料を調製するために、４．５ｍｃＬ試料マスターミックス（Ａｍｂｉｏｎの２×ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、Ｆｌｕｉｄｉｇｍの２０×ＤＮＡ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｙｅ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｌｏａｄｉｎｇ
Ｒｅａｇｅｎｔカタログ番号１００−０３８８、およびＢｉｏｔｉｕｍの２０×ＥｖａＧｒｅｅｎカタログ番号３１０００）を、９６ウェルプレート中の、３ｍｃＬの希釈された予め増幅された／エキソヌクレアーゼ試料に添加した。チップがプライムされた時点で、上で調製した５ｍｃＬの試料またはアッセイを、そのチップ上にロードした。次いで、このチップを、チップ中に試料をロードするために、ＩＦＣコントローラー中に戻した。次いで、チップのロードが終了した後に、ｑＰＣＲが、プライマー特異性を決定するための融解曲線と共に、９６．９６  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ａｒｒａｙ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎのためのプリセットプログラムを使用して、Ｂｉｏｍａｒｋ上で実行できた。相対的遺伝子発現を、複数のハウスキーピング遺伝子を使用して、デルタデルタＣｔ法によって決定した。
【０６６７】
結果：
存命中パラメーター−全てのＴＮＢＳレシピエント群は、大腸炎剤の投与後の最初の２４時間にわたって、出発体重の８〜１０％の間の、平均体重における急性の減少を実証した；引き続いて、平均体重におけるより緩徐な減少が存在し、全ての群が、研究の最後までに、出発体重の８０〜９０％の間までの、平均体重における顕著な減退を示した（ｐ≦０．０１５８）。ビヒクルのみで処置したマウスの体重は、研究４日目までに、出発体重の９９．６±１．７％（平均±標準偏差）の最終平均体重で、研究の期間にわたって最小限の変化を示した。ＴＮＢＳ／ビヒクル群は、７９．８±１．８％において最低の平均最終体重を有した。一部の群（即ち、ＴＮＢＳ／Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）−皮下群およびＴＮＢＳ／ブデソニド群）についての最終平均体重は、これらの群における初期罹患率のより高い発生率に起因して、人為的に高かった。最下位の初期罹患率を実証した群のうち、ＴＮＢＳ／Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）−１日１回−静脈内群は、８５．６±７．１％の最高の平均最終体重を有したが、これは、ＴＮＢＳ／ビヒクル群から有意には異ならなかった（ｐ＞０．０５）（データ示さず）。
【０６６８】
ＴＮＢＳレシピエントマウスの大部分は、この研究の間にある段階において下痢を実証したが、粘膜出血の観察は、あまり一般的でなかった。一部の試験品目処置に応答して、下痢の発生率において低減があった。ＴＮＢＳ／ビヒクル群は、４日目の研究の最後までに、３１の累積（標準化）下痢スコアを有した；ＴＮＢＳ／Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）−１日１回−静脈内およびＴＮＢＳ／ＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃ−１日１回−静脈内群は、２６の最低スコアを有した（データ示さず）。
【０６６９】
マウスの臨床状態は、疾患活動性指標（ＤＡＩ）スコアを得るために、出血および下痢に関する情報を体重減少についてのスコアと一緒に組み合わせることによって、最良に得ることができる。これは、マウスを安楽死させる日に最も正確に決定され得るが、これは、大便の硬さの観察データがないことが、直腸中の大便の観察で補足され得るからである。４日目に生存しているマウスについて、ＴＮＢＳ／Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）−皮下群を除いて、未処置対照群と比較して（ｐ≦０．００６２で）、全てのＴＮＢＳレシピエント群について平均ＤＡＩスコアにおける有意な増加が存在したが、この皮下群では、３匹のマウスのみが、計画されたエンドポイントにおいて研究に残留していた。ＴＮＢＳ／ビヒクル群中の４日目の生存マウスについての平均ＤＡＩは、７．１３±０．６４であった；比較して、ＴＮＢＳ／ブデソニド群およびＴＮＢＳ／ＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃ−１回−静脈内群は、それぞれ４．３３±１．９７および４．２０±３．０３において、有意により低い平均ＤＡＩを有した（ｐ≦０．０３０４）。少なくとも１日目の０７：００時まで生存している全てのマウスを含むことは、ＤＡＩの計算において、類似の結果を与えたが、ＴＮＢＳ／ブデソニド群およびＴＮＢＳ／ＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃ−１回−静脈内群において観察された効果は、もはや有意ではなかった（ｐ＞０．０５）（図２４Ａを参照のこと）。
【０６７０】
死後観察−ビヒクルのみマウスについて、平均大腸重量および長さは、それぞれ２００．４±２１．７ｍｇおよび１０８．３±７．８ｍｍであった；平均大腸重量：長さ比は、１．８５±０．１２（ｍｇ／ｍｍ）であった。全てのＴＮＢＳ処置群は、未処置の対照マウスと比較して、大腸重量における有意な増加を実証し（ｐ≦０．０２１５）、ＴＮＢＳ／ビヒクル群は３６８．４±７０．１ｍｇの平均大腸重量を有した。ＴＮＢＳ／ブデソニド群は、２９８．０±６２．０ｍｇにおいて、全てのＴＮＢＳレシピエント群のうちで最低の平均大腸重量を有した。ＴＮＢＳ投与は、全てのＴＮＢＳレシピエント群における大腸長さにおける有意な低減とも関連し（ｐ≦０．０２８５）、ＴＮＢＳ／ビヒクル群は、７５．６±９．３ｍｍの平均大腸長さを有した；比較して、ＴＮＢＳ／ＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃ−１日１回−静脈内群は、９４．９±１１．８ｍｍの平均大腸長さで、大腸の短縮の有意な寛解を実証した（ｐ＝０．００１９）。大腸の重量および長さにおける変化は、全てのＴＮＢＳレシピエント群について大腸重量：長さ比における有意な増加を生じた（ｐ≦０．０１１６）。ＴＮＢＳ／ビヒクル群は、４．９２±０．９９（ｍｇ／ｍｍ）において、全ての群のうちで最高の平均大腸重量：長さ比を有した。ＴＮＢＳ／ブデソニド群、ＴＮＢＳ／Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）−皮下群、ＴＮＢＳ／ＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃ−１日１回−静脈内群およびＴＮＢＳ／ＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃ−１回−静脈内群は、全て、ＴＮＢＳ／ビヒクル対照群と比較して、大腸重量：長さ比における有意な低減を実証したが、ＴＮＢＳ／ＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃ−１日１回−静脈内群についての平均比は、この研究において早期に安楽死させたマウスの数によって歪められた。ＴＮＢＳ／ブデソニド群およびＴＮＢＳ／ＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃ−１日１回−静脈内群についての平均大腸重量：長さ比は、それぞれ、３．５７±１．０１および３．５６±０．８０であった（ｐ＝０．０１４３およびｐ＝０．０４５６）（図２４Ｂを参照のこと）。
【０６７１】
組織病理学−ＴＮＢＳ誘導性の大腸炎と関連する組織病理学的変化を、Ｅｐｉｓｔｅｍの標準的な組織学的スコアリング手順に従って評価した。全てのＴＮＢＳレシピエント群は、組織病理学スコアにおける有意な増加を実証した（ｐ≦０．００３６）。Ｔ細胞／ビヒクル群は、２．３２±０．６５の平均組織病理学スコアを有し、ＴＮＢＳ／ＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃ−皮下群は、２．４１±０．６８において、最高の平均組織病理学スコアを有した。他の処置群は、ＴＮＢＳ／ビヒクル群よりも低い平均組織病理学スコアを有し、ＴＮＢＳ／ブデソニド群およびＴＮＢＳ／Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）−１日１回−静脈内群は、それぞれ１．６６±１．０８および１．６８±１．０３の最低スコアを有したが、これらの低減は、統計的に有意ではなかった。領域ごとに、これらの処置の効果は、大腸の遠位３分の１においてより明白であったが、なおも統計的に有意なものではなかった。
【０６７２】
罹患率−１群のみ、ＴＮＢＳ／ＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃ−１日１回−静脈内が、全ての（適格）マウスの生存を実証した（マウス７５は、ＴＮＢＳ投与の間の大腸穿孔に起因して排除し、マウス７８は、疾患誘導の欠如に起因して排除した）。他の群における生存は、８０％（ＴＮＢＳ／Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）−１日１回−静脈内群）から３３．３％（ＴＮＢＳ／Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）−皮下群）の範囲であった）；ＴＮＢＳ／ブデソニド群における生存は６０％であった。マウスを、不良な状態（正常な挙動を示すことをやめたこと／示せないこと）を提示した場合に、安楽死させた；６時間毎のチェックにもかかわらず、２匹のマウス（４０および５０）は、研究３日目の１９：００時に死亡して見出された（データ示さず）。
【０６７３】
ｑＰＣＲ結果。ＴＮＢＳ誘導性大腸炎に対するＨＲＳ（１−６０）およびＦｃ−ＨＲＳ（２−６０）の効果の基本メカニズムをさらに調査するために、動物由来の結腸における遺伝子発現の変化を、研究の完了後に試験した。ＲＮＡプロファイリングを、上記のような日にマウスから単離した結腸に対して実施した。これらの研究からの結果は、ＴＮＢＳ処置に応答して１０倍超上昇した７つの遺伝子が、Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）による処置によって顕著に低減したことを実証した（表Ｅ２０；および図２５を参照のこと）。
【０６７４】
【表３２】
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【０６７５】
ＴＮＢＳ処置マウス結腸の転写プロファイリングは、いくつかのハウスキーピング遺伝子を含む多くの遺伝子（データ示さず）が、Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）処置によって顕著には影響を受けなかったことを明らかにした。対照的に、ＴＮＢＳ処置マウス結腸の転写プロファイリングは、ＴＮＢＳ調節された免疫性および炎症性関連遺伝子の、Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）による顕著な低減を明らかにした。この結果は、ＨＲＳ（１−６０）もまた、ＭＣＰ１、ＭＭＰ３、ＣＤ１１ｂおよびＩＬ１０のＴＮＢＳ誘導されたレベルを顕著に低減させるという知見によって補強された（図２６Ａ〜２６Ｈを参照のこと）。
【０６７６】
結論：ＢＤＦ−１マウスへのＴＮＢＳの結腸内投与は、急性体重減少を特徴とする大腸炎の発生を生じ、下痢および粘膜出血の発生率における中程度の増加を生じた。死後試験は、腸内の狭窄および付随する大便蓄積を伴って、大腸重量：長さ比および大腸における潰瘍性病変における顕著な変化を実証した。ブデソニドによる処置は、存命中および死後の両方の疾患パラメーターにおける改善と関連し、全てのＴＮＢＳレシピエント群のうちで最低の平均組織病理学スコアを有したが、この疾患パラメーターにおける低減は、有意性を達成しなかった。Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）−１日１回−静脈内による処置は、組織病理学スコアを低減させることにおいてブデソニドと類似の効果を有し、優れた生存と関連した。ＴＮＢＳ／ＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃ−１日１回−静脈内群は、最高レベルの生存および大腸重量：長さ比における顕著な改善を示したが、組織病理学スコアを低減させることにおいて、ブデソニドまたはＦｃ−ＨＲＳ（２−６０）のいずれよりも有効性が低かった。組織病理学スコアに関して、これらの試験品目のうち３つ全てが、大腸の遠位３分の１に対してその最大の効果を有するようであった。疾患パラメーターにおける改善が、ＴＮＢＳ／Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）−皮下群およびＴＮＢＳ／ＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃ−１回−静脈内群について観察された（例えば、体重および大腸重量：長さ比）。さらに、ＴＮＢＳ処置マウス結腸の転写プロファイリングは、Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）による、ＴＮＢＳ調節された免疫性および炎症性関連遺伝子の顕著な低減を明らかにした。この結果は、ＨＲＳ（１−６０）もまた、ＭＣＰ１、ＭＭＰ３、ＣＤ１１ｂおよびＩＬ１０のＴＮＢＳ誘導されたレベルを顕著に低減させるという知見によって補強され、ＨＲＳ−Ｆｃ融合タンパク質が、この系において免疫調節遺伝子発現において活性であったことを実証している。
【０６７７】
全体として、このデータは、Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）およびＨＲＳ（１−６０）−Ｆｃが、腸炎症および他の炎症性状態の処置において、顕著な潜在性を有することを示唆している。
【０６７８】
（実施例１０）
Ｔ細胞集団に対するＨＲＳ−Ｆｃ融合タンパク質の影響
Ｔ細胞集団に対するＨＲＳ−Ｆｃコンジュゲートの潜在的な影響をｉｎ  ｖｉｖｏで評価するために、Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）を、上記と類似した、大腸炎のＴＮＢＳ誘導性モデルにおいて試験した。研究を、雄性ＢＤＦ−１マウスにおいて実施した。簡潔に述べると、雄性ＢＤＦ−１マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、実験前に最低１週間にわたって順応させ、ＴＮＢＳ投与の１６時間前および投薬の１３時間前に開始して絶食させた。Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）を、ＴＮＢＳ処置を開始するのと同じ時点で、単一用量、０．５ｍｇ／Ｋｇ、静脈内で投与した。１群当たり３匹の動物由来の脾細胞を、免疫性集団について分析した。分析のための動物を選択するために、最も重度の疾患スコアを有したマウスおよび最も重症度が低い疾患スコアを有したマウスを排除した（臨床的観察、大便の硬さおよび体重に基づく）。残りの動物から、各処置群由来の３匹の動物を、そのそれぞれの群の平均を示すことに基づいて選別した。
【０６７９】
手順。脾臓を、ＢＤＦ−１マウスから回収し、１０ｍｌ冷細胞染色緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２０２０１、ロット番号Ｂ１６６４７８）中に氷上で直接配置した。脾臓を、組織培養皿中の２つの急速冷凍したオートクレーブしたスライド間で機械的に解離させた。細胞懸濁物を、７０μｍフィルターを通して濾過し、細胞を、３００ｇで５分間、４℃での遠心分離によってペレット化した。細胞を、１０ｍｌ細胞染色緩衝液中で１回洗浄し、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ  Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ  Ａｕｔｏ  ２０００  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｕｎｔｅｒを使用して計数した。脾細胞を、細胞染色緩衝液中５×１０５細胞／ｍｌで再構成し、フローサイトメトリーのために抗体で即座に染色した。
【０６８０】
合計１×１０６細胞を、製造業者の指示に従ってＯｎｅ  Ｓｔｅｐ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ
Ｍｏｕｓｅ  Ｔｒｅｇ  Ｆｌｏｗ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号１３６８０、ロット番号Ｂ１７７８５２、Ｂ１７７８５３、Ｂ１７４３０９、Ｂ１７６３６５）を使用して、調節性Ｔマーカー（ＣＤ４、ＣＤ２５およびＦＯＸＰ３）について染色した。
【０６８１】
免疫細胞の表現型決定のために、合計１×１０６細胞を、ＣＤ３εに対する蛍光標識抗体（カタログ番号１００３３４、ロット番号１６２９５６）、ＣＤ４に対する蛍光標識抗体（カタログ番号１００５２９、ロット番号Ｂ１５２９０７）およびＣＤ８に対する蛍光標識抗体（カタログ番号１００７１４、ロット番号Ｂ１６５２２６）（抗体は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した）で染色した。細胞を、細胞染色緩衝液中に製造業者の推奨する濃度で希釈した抗体で染色し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を、細胞染色緩衝液で徹底的に洗浄し、安定化固定緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号３３８０３６、ロット番号２２９１６１４）を使用して固定した。
【０６８２】
フローサイトメトリーを、ＶＡ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｅ設備（ＶＡ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）において実施した。試料を、３レーザーＢＤ  Ｃａｎｔｏ機器（４８８  Ａｒｇｏｎ、６３３  ＨｅＮｅ、４０５  Ｖｉｏｌｅｔ）で分析した。生ＦＡＣＳファイルを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用して分析した。
【０６８３】
結果。細胞外染色された脾細胞を、生リンパ球集団およびＣＤ３＋細胞に対してゲートをかけて、合計Ｔ細胞百分率を決定した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の集団百分率を生成するために、細胞を、生リンパ球ゲートから、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ二重陽性細胞へとゲートをかけた。調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を、生リンパ球ゲートに対して、次いでＣＤ４＋細胞に対してゲートをかけた。Ｔｒｅｇ細胞を、ＣＤ２５およびＦｏｘＰ３の発現に基づいて決定した。これらのデータのうちで（図２７Ａ〜２７Ｄを参照のこと）、各ドットは１匹の動物を示し、線は平均を示す。
【０６８４】
ＴＮＢＳ処置マウスでは、ナイーブ動物と比較して、ＣＤ３＋Ｔ細胞における増加があった（図２７Ａ）。対照的に、３匹のＦｃ−ＨＲＳ（２−６０）処置マウスのうち２匹は、ＴＮＢＳ処置動物と比較して、ＣＤ３＋Ｔ細胞における低減を示した。どのＣＤ３＋集団がこの変化の主原因であるのかを決定するために、ＣＤ８＋、ＣＤ４＋およびＴｒｅｇ細胞集団をさらに調査した。図２７Ｂおよび図２７Ｃは、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋細胞が、ＴＮＢＳ処置動物において上昇し、Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）による処置が両方の場合においてレベルを低減させたことを示している。さらに、Ｔｒｅｇ細胞は、ナイーブ動物と比較して、ＴＮＢＳ処置動物において枯渇したが、ＴＮＢＳ処置動物と比較して、Ｆｃ−ＨＲＳ（２−６０）処置群においては上昇した（図２７Ｄ）。さらに、１匹のＦｃ−ＨＲＳ（２−６０）で処置したマウスは、ナイーブ動物と類似のＴｒｅｇレベルを示した。合わせると、これらの結果は、ＴＮＢＳが、脾臓中のＴ細胞集団を、増加したＣＤ８＋Ｔ細胞および減少したＴｒｅｇ細胞を介してより炎症性の表現型に変更させること、ならびにＦｃ−ＨＲＳ（２−６０）による処置が、恒常的レベルに向けてこれらの集団を回復させることを示唆している。
【０６８５】
これらおよび他の変化が、上に詳述した説明の教示の下に、実施形態に対してなされ得る。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用された用語は、これらの特許請求の範囲を本明細書および特許請求の範囲中に開示された具体的な実施形態に限定すると解釈すべきではないが、かかる特許請求の範囲が権利付与される等価物の全範囲に沿った、全ての可能な実施形態を含むと解釈すべきである。従って、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２６−３】
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【図２７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年5月7日(2020.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
息切れ、非湿性咳、またはその両方を伴う肺の炎症の低減における使用のため、または、被験体において間質性肺疾患（ＩＬＤ）を処置するための治療用組成物であって、ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＨＲＳ）−Ｆｃ領域融合ポリペプチドを含み、該融合ポリペプチドは、配列番号３３７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、該ＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、抗炎症活性を有し、かつ、配列番号６に従うアミノ酸配列を有する非改変ＨＲＳポリペプチドと比較して変更された薬物動態を有し、該変更された薬物動態は、増加した血清半減期、増加したバイオアベイラビリティ、増加した曝露および／または減少したクリアランスであり、該ＨＲＳ−Ｆｃ領域融合ポリペプチドは、少なくとも約９５％の純度で約５％未満が凝集しており、そして、該組成物は、実質的にエンドトキシンを含まない、組成物。
【請求項２】
前記ＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドが、免疫細胞の活性化と損傷肺中への浸潤を低下させる、請求項１に記載の使用のための治療用組成物。
【請求項３】
前記ＨＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドが、抗炎症性サイトカインの産生を増加させるか、炎症促進性サイトカインの産生もしくは活性を低減させるか、または、その両方である、請求項１に記載の使用のための治療用組成物。
【請求項４】
前記ＨＲＳ融合ポリペプチドが、配列番号３３７と少なくとも９７％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための治療用組成物。
【請求項５】
前記ＨＲＳ融合ポリペプチドが、配列番号３３７と少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の使用のための治療用組成物。
【請求項６】
前記Ｆｃ領域と前記ＨＲＳポリペプチドとがペプチドリンカーによって分離されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のための治療用組成物。
【請求項７】
前記ペプチドリンカーが約１〜１０アミノ酸長または１〜５アミノ酸長である、請求項６に記載の使用のための治療用組成物。
【請求項８】
前記ＨＲＳ融合ポリペプチドが、生理学的溶液中で実質的にダイマー形態である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のための治療用組成物。
【請求項９】
前記ＨＲＳ−Ｆｃ領域融合ポリペプチドが、ＵＶ円偏光二色性分析を介して決定されるとおり、対応する非改変ＨＲＳポリペプチドと実質的に同じ二次構造を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための治療用組成物。
【請求項１０】
前記ＨＲＳ−Ｆｃ領域融合ポリペプチドが、哺乳動物に投与した場合に、対応する非改変ＨＲＳポリペプチドよりも少なくとも５倍大きい血漿または血清薬物動態学的ＡＵＣプロファイルを有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のための治療用組成物。
【請求項１１】
前記ＨＲＳ−Ｆｃ領域融合ポリペプチドが、対応する非改変ＨＲＳポリペプチドと比較して増加した抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の治療用組成物。
【請求項１２】
前記Ｆｃ領域が、増加した抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する改変されたＦｃグリコフォームである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用のための治療用組成物。
【請求項１３】
前記ＨＲＳ−Ｆｃ領域融合ポリペプチドがＥ．ｃｏｌｉにおいて生成されたものである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用のための治療用組成物。
【請求項１４】
前記ＨＲＳ−Ｆｃ領域融合ポリペプチドが哺乳動物細胞において生成されたものである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用のための治療用組成物。
【請求項１５】
前記組成物が、経口、皮下、鼻腔内、肺または非経口投与を介した送達のために製剤化される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用のための治療用組成物。
【請求項１６】
前記組成物が、静脈内の投与を介した送達のために製剤化される、請求項１５に記載の使用のための治療用組成物。
【請求項１７】
前記組成物が、リポソーム、ミセル、エマルションおよび細胞からなる群より選択される送達ビヒクルを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の使用のための治療用組成物。