(57)【要約】      （修正有）【課題】糖尿病性神経疼痛、神経過敏の予防及び／又は治療方法の提供。【解決手段】被験者に有効量のプラスミノゲンを投与することを含む、糖尿病性神経損傷を修復するための方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者に有効量のプラスミノゲンを投与することを含む、糖尿病性神経損傷を修復するための方法。
【請求項２】
前記糖尿病性神経損傷は神経組織損傷及び神経の炎症を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被験者に有効量のプラスミノゲンを投与することを含む、糖尿病性神経損傷の関連疾患を治療及び／または予防するための方法。
【請求項４】
前記糖尿病性神経損傷の関連疾患は体の痛み、感覚減退、痺れ、熱さ、冷たさ、及び糖尿病性神経疼痛を含み、当該糖尿病性神経疼痛は糖尿病合併症によって引き起こされる自発性疼痛、痛覚減退、痛覚過敏を含むがこれに限られないことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するものであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含み、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するタンパク質であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ（ｄｅｌｔａ）−プラスミノゲンまたはその任意の組み合わせから選択されるものであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記プラスミノゲンは例えば、体表、静脈内、筋肉内、皮下、吸入、椎管内、局所注射、関節内注射または直腸投与によって全身または局所にて投与されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記プラスミノゲンは他の薬物または療法と組み合わせて施用できることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記他の薬物または療法は神経栄養薬、鎮痛系薬、糖尿病治療薬、抗感染薬、血圧降下薬、高脂血症治療薬、物理療法を含み、前記物理療法は例えば電磁療法、赤外線療法であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
糖尿病性神経損傷を修復、治療及び／または予防するための製品であって、有効用量のプラスミノゲンを含有する容器、及び被験者の糖尿病性神経損傷を修復、治療及び／または予防することにおける製品の投与を指導するプロトコルを含むことを特徴とする、前記製品。
【請求項１２】
さらに一種類または複数種類の他の薬物の容器を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の製品。
【請求項１３】
前記他の薬物は神経栄養薬、鎮痛系薬、糖尿病治療薬、抗感染薬、血圧降下薬、高脂血
症治療薬であることを特徴とする、請求項１２に記載の製品。
【請求項１４】
前記プロトコルはさらに前記プラスミノゲンは前記他の薬物の投与の前、投与と同時、及び／または後に投与できることを説明するものであることを特徴とする、請求項１２または１３に記載の製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は神経組織損傷の修復、糖尿病性神経損傷の関連疾患の予防及び／または治療におけるプラスミノゲンまたはプラスミンの作用に係る。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ）とは体内におけるインスリンの相対的または絶対的不足またはターゲット細胞のインスリンに対する感受性低下、またはインスリン自身に構造上の欠陥が存在することによってもたらされる炭水化物、脂肪、タンパク質代謝の乱れに関連する慢性疾患である（非特許文献１）。米国において毎年糖尿病の治療に費やされる費用は１７６０億米ドル（１７６ｂｉｌｌｉｏｎ）であり、糖尿病によって間接的にもたらされる損失は６９０（６９ｂｉｌｌｉｏｎ）億ドルに達する（非特許文献２）。糖尿病による神経病変は糖尿病の高血糖を特徴とする生体代謝障害によって起きる神経系の疾患であり、これと同時に糖尿病において最もよく見られる慢性合併症の一つである（非特許文献３）。そのうち６０−７５％の糖尿病患者は最終的に糖尿病神経病変にまで進行する（非特許文献４）。糖尿病神経病変は非侵襲性の下肢切断の最も主な要因である。糖尿病神経病変とは主に糖尿病中枢神経病変及び末梢神経病変（Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ，ＤＮＰ）を含み、特に後者が多い。糖尿病中枢神経病変とは、糖尿病の背景下において、大脳、小脳、脳幹ニューロン及び神経繊維及び脊髄のニューロンが損傷することによって起きる病変である。糖尿病末梢神経病変とはその他の原因を排除している場合、糖尿病患者に現れる末梢神経の機能障害に関連する症状及び／または特徴であり、主に末梢感覚神経の損傷または感染によってもたらされる。
【０００３】
痛みは糖尿病性神経病変の主な症状の一つであり、主に糖尿病性神経損傷によってもたらされる。前記のように、糖尿病神経疼痛は対応するように糖尿病中枢神経性疼痛及び糖尿病末梢神経性疼痛に分けられ、後者がより多く見られ、且つひどく患者のクオリティ・オブ・ライフに影響し、特に睡眠を害し及び生活を楽しむ程度を損い、長期慢性疼痛症状は患者の精神及び情緒などの面に影響し、これとともにその生活及び社交能力を低下させる。
【０００４】
糖尿病性神経病変に対して、異なるステージにおける痛みが発生する具体的な発病メカニズムはいまだに完全に明らかにされていない。現在、臨床上において糖尿病の神経疼痛の治療に用いられている薬物は以下の幾つかの種類を含む：（１）抗てんかん薬、例えばガバペンチン、プレガバリンなど；（２）アヘン系鎮痛薬、例えばトラマドール、モルヒネ類、オキシコドンなど；（３）局所麻酔薬、例えばリドカイン；（４）抗うつ剤、例えばアミトリプチリン、パロキセチン、ベンラファキシンなど；（５）非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えばナプロキセン、ナブメトンなど。しかし従来の薬物には依然多くの欠陥が存在し、例えば、ガバペンチン等の抗てんかん薬の副作用及び有害反応の確率が比較的高く且つコストが高く、アヘン類及び非ステロイド性抗炎症薬の末梢及び中枢神経疼痛に対する効力は限られまたは不足し、パロキセチン及びベンラファキシンなどの抗うつ薬では容易に中枢セロトニン症候群が生じやすく、そのため投薬禁忌が多い。そのため、近年糖尿病神経疼痛を緩和する薬物の開発においてある程度の進歩が得られているが、依然として有効的に糖尿病による神経損傷を修復し、糖尿病性神経損傷及びその関連疾患を予防する薬物を必要とする。
【０００５】
プラスミンはプラスミノゲン活性化系（ＰＡ系）の重要な成分である。それは広スペクトルのプロテアーゼであり、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の幾つかの成分を加水分解す
ることができ、これらの成分はフィブリン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン及びプロテオグリカンを含む（非特許文献５）。また、プラスミンは一部のプロマトリックスメタロプロテアーゼ（ｐｒｏ−ＭＭＰ）を活性化させて活性のあるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）にすることができる。そのためプラスミンは細胞外タンパク加水分解作用の一つの重要な上流調節因子である（非特許文献６，７）。プラスミンはプラスミノゲンが二種類の生理性のＰＡ：組織型プラスミノゲン活性化剤（ｔＰＡ）またはウロキナーゼプラスミノゲン活性化剤（ｕＰＡ）をタンパク質加水分解することで形成されるものである。プラスミノゲンは血漿及び他の体液中において、相対的レベルが比較的高く、従来的にはＰＡ系の調節は主にＰＡの合成及び活性レベルよって実現されると考えられている。ＰＡ系成分の合成は異なる要素によって厳格な調節を受け、例えばホルモン、成長因子及びサイトカインである。また、この他に、プラスミンとＰＡの特定の生理的阻害剤を含む。プラスミンの主な阻害剤はα２−抗プラスミン（α２−ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ）である。一部の細胞表面には直接加水分解する活性のあるｕＰＡ特異性細胞表面受容体（ｕＰＡＲ）（非特許文献８、９）を有する。
【０００６】
プラスミノゲン（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ，ｐｌｇ）は単一鎖の糖タンパクであり、７９１個のアミノ酸からなり、分子量は約９２ｋＤａである（非特許文献１０、１１）。プラスミノゲンは主に肝臓で合成され、大量に細胞外液に存在している。血漿中に含まれるプラスミノゲンの含有量は約２μＭである。そのためプラスミノゲンは組織及び体液中のタンパク質加水分解活性の大きな潜在的なソースである（引用文献１２、１３参照）。プラスミノゲンには二種類の分子の形が存在する：グルタミン酸−プラスミノゲン（Ｇｌｕ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）及びリジン−プラスミノゲン（Ｌｙｓ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）である。天然的に分泌され及び分解していない形のプラスミノゲンは一つのアミノ基末端（Ｎ−末端）グルタミン酸を有し、そのためグルタミン酸−プラスミノゲンと称される。しかし、プラスミンが存在する場合、グルタミン酸−プラスミノゲンはＬｙｓ７６−Ｌｙｓ７７においてリジン−プラスミノゲンに加水分解される。グルタミン酸−プラスミノゲンと比較して、リジン−プラスミノゲンはフィブリンとより高い親和力を有し、さらにより高い速度でＰＡによって活性化されることができる。この二種類の形のプラスミノゲンのＡｒｇ５６０−Ｖａｌ５６１ペプチド結合はｕＰＡ  またはｔＰＡによって切断され、これによりジスルフィド結合によって接続された二重鎖プロテアーゼプラスミンの形成をもたらす（非特許文献１４）。プラスミノゲンのアミノ基末端部分は五つの同源トリクル環を含み、即ちいわゆるｋｒｉｎｇｌｅであり、カルボキシル基末端部分はプロテアーゼドメインを含む。一部のＫｒｉｎｇｌｅはプラスミノゲンとフィブリン及びその阻害剤α２−ＡＰの特異的相互作用を介在するリジン結合部位を含む。最も新しく発見されたのは３８ｋＤａのフィブリンプラスミノゲンフラグメントであり、ｋｒｉｎｇｌｅｌ−４を含み、血管生成の有効的な阻害剤である。このフラグメントは血管阻害剤と命名され、幾つかのプロテアーゼによってプラスミノゲンを加水分解することで生成される。
【０００７】
プラスミンの主な基質はフィブリンであり、フィブリンの溶解は病理性血栓の形成を予防するキーポイントである（非特許文献１５）。プラスミンはさらにＥＣＭの幾つかの成分に対する基質特異性を有し、これらはラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン及びゼラチンを含み、これはプラスミンがＥＣＭ再建において重要な作用を有することを示している（非特許文献１２、１６、１７）。間接的に、プラスミンはさらにいくつかのプロテアーゼ前駆体を活性プロテアーゼに変換することによりＥＣＭのその他の成分を分解し、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９を含む。そのため、以下のように提唱する人がいる。プラスミンは細胞外タンパク加水分解の重要な上流調節因子である（非特許文献１８）。また、プラスミンはいくつかの潜在的な形の成長因子を活性化させる能力を有する（非特許文献１９−２１）。体外において、プラスミンはさらに補体系の成分を加水分解させて走化性の補体フラグメントを放出することができる。
【０００８】
ｄｂ／ｄｂマウスは最も広く応用される糖尿病実験動物モデルの一つであり、それは糖尿病神経痛の発症プロセスにおいて、発病メカニズムなどの面において高度に人の糖尿病神経痛の発病の状況と似ている。そのため、ｄｂ／ｄｂマウスを用いて関連の研究を行い、その結果は代表性を有する。ｄｂ／ｄｂマウスは４−６週時に糖尿病マウスとなり、８−１２週時に痛覚過敏となり、１２週以後では痛覚減退が見られる（非特許文献２２〜２６）。
【０００９】
研究により、本発明は意外にも以下について見出した。プラスミノゲンは顕著な神経修復作用及び糖尿病性神経損傷及びその関連疾患を治療する作用を有し、且つ安全性に優れている。そのため、プラスミノゲンは新しい糖尿病の神経組織損傷の修復、及びその関連疾患を治療及び／または予防するストラテジーとなる可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｍｄ．Ｓｈａｈｉｄｕｌ  Ｉｓｌａｍ，２０１３．Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  Ｓｉｎｃｅ  １９６０ｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．
【非特許文献２】Ｅｉｚｉｒｉｋ  ＤＬ，Ｍｉａｎｉ  Ｍ，Ｃａｒｄｏｚｏ  ＡＫ．２０１３．Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｄａｎｇｅｒ：Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ５６：２３４-２４１．
【非特許文献３】Ｓａｉｄ  Ｇ．Ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ．Ｎａｔ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２００７；３：３３１−４０．
【非特許文献４】Ｖｉｎｃｅｎｔ  ＡＭ，Ｃａｌｌａｇｈａｎ  ＢＣ，Ｓｍｉｔｈ  ＡＬ，Ｆｅｌｄｍａｎ  ＥＬ．２０１１．Ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｌ  ７：５７３-５８３．
【非特許文献５】Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＣＭ  ａｎｄ  Ｗｅｒｂ，Ｚ．（１９９１）．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ，Ｈａｙ  ＥＤ，ｅｄ．（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ），ｐｐ．２５５−３０２．
【非特許文献６】Ｗｅｒｂ，Ｚ．，Ｍａｉｎａｒｄｉ，Ｃ．Ｌ．，Ｖａｔｅｒ，Ｃ．Ａ．，ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，Ｅ．Ｄ．，Ｊｒ．（１９７７）．Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ａｃｔｉｖｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｔｅｎｔ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｂｙ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２９６，１０１７−１０２３．
【非特許文献７】Ｈｅ，Ｃ．Ｓ．，Ｗｉｌｈｅｌｍ，Ｓ．Ｍ．，Ｐｅｎｔｌａｎｄ，Ａ．Ｐ．，Ｍａｒｍｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｇｒａｎｔ，Ｇ．Ａ．，Ｅｉｓｅｎ，Ａ．Ｚ．，ａｎｄ  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｇ．Ｉ．（１９８９）．Ｔｉｓｓｕｅ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｃａｓｃａｄｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ８６，２６３２−２６３６．
【非特許文献８】Ｓｔｏｐｐｅｌｌｉ，Ｍ．Ｐ．，Ｃｏｒｔｉ，Ａ．，Ｓｏｆｆｉｅｎｔｉｎｉ，Ａ．，Ｃａｓｓａｎｉ，Ｇ．，Ｂｌａｓｉ，Ｆ．，ａｎｄ  Ａｓｓｏｉａｎ，Ｒ．Ｋ．（１９８５）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｔｏ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｏｎ  Ｕ９３７  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ８２，４９３９−４９４３．
【非特許文献９】Ｖａｓｓａｌｌｉ，Ｊ．Ｄ．，Ｂａｃｃｉｎｏ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｂｅｌｉｎ，Ｄ．（１９８５）．Ａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍｒ  ５５，０００  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｕｒｏｋｉｎａｓｅ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１００，８６−９２．
【非特許文献１０】Ｗｉｍａｎ，  Ｂ．ａｎｄ  Ｗａｌｌｅｎ，Ｐ．（１９７５）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ“ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ”ａｎｄ“ｌｙｓｉｎｅ”ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＮＨ２−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｓ  ｓｔｕｄｉｅｄ  ｂｙ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０，４８９−４９４．
【非特許文献１１】Ｓａｋｓｅｌａ，Ｏ．ａｎｄ  Ｒｉｆｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．（１９８８）．Ｃｅｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ：ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４，９３−１２６．
【非特許文献１２】Ｒａｕｍ，Ｄ．，Ｍａｒｃｕｓ，Ｄ．，Ａｌｐｅｒ，Ｃ．Ａ．，Ｌｅｖｅｙ，Ｒ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｐ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｓｔａｒｚｌ，Ｔ．Ｅ．（１９８０）．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０８，１０３６−１０３７
【非特許文献１３】Ｗａｌｌeｎ  Ｐ（１９８０）．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ．Ｉｎ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，Ｋｌｉｎｅ  ＤＬ  ａｎｄ  Ｒｅｄｄｙ  ＫＫＮ，ｅｄｓ．（Ｆｌｏｒｉｄａ：ＣＲＣ
【非特許文献１４】Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，Ｌ．，Ｚａｊｄｅｌ，Ｍ．，Ｃｌａｅｙｓ，Ｈ．，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｔ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｓ．（１９７５）．Ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅ  ｉｎ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ：ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｗｉｔｈ“ｐｒｏ”ｐａｒｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ７２，２５７７−２５８１．
【非特許文献１５】Ｃｏｌｌｅｎ，Ｄ．ａｎｄ  Ｌｉｊｎｅｎ，Ｈ．Ｒ．（１９９１）．Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ．Ｂｌｏｏｄ  ７８，３１１４−３１２４．
【非特許文献１６】Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｃ．Ｍ．ａｎｄ  Ｗｅｒｂ，Ｚ．（１９８９）．Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１，９７４−９８２．
【非特許文献１７】Ｍｉｇｎａｔｔｉ，Ｐ．ａｎｄ  Ｒｉｆｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．（１９９３）．Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｉｎｖａｓｉｏｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．７３，１６１−１９５．
【非特許文献１８】Ｃｏｌｌｅｎ，Ｄ．（２００１）．Ｈａｍ−Ｗａｓｓｅｒｍａｎ  ｌｅｃｔｕｒｅ：ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｆｉｂｒｉｎ−ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ．（Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｅｄｕｃ．Ｐｒｏｇｒａｍ．）１−９．
【非特許文献１９】Ｒｉｆｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．，Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉ，Ｄ．，Ｂｉｚｉｋ，Ｊ．，Ｑｕａｒｔｏ，Ｎ．，Ｂｌｅｉ，Ｆ．，Ｄｅｎｎｉｓ，Ｐ．，Ｆｌａｕｍｅｎｈａｆｔ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｍｉｇｎａｔｔｉ，Ｐ．（１９９０）．Ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．Ｄｅｖ．３２，３１３−３１８．
【非特許文献２０】Ａｎｄｒｅａｓｅｎ，Ｐ．Ａ．，Ｋｊｏｌｌｅｒ，Ｌ．，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｄｕｆｆｙ，Ｍ．Ｊ．（１９９７）．Ｔｈｅ  ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７２，１−２２．
【非特許文献２１】Ｒｉｆｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．，Ｍａｚｚｉｅｒｉ，Ｒ．，Ｍｕｎｇｅｒ，Ｊ．Ｓ．，Ｎｏｇｕｅｒａ，Ｉ．，ａｎｄ  Ｓｕｎｇ，Ｊ．（１９９９）．Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ．ＡＰＭＩＳ  １０７，８０−８５．
【非特許文献２２】Ｃｈｅｎｇ  ＨＴ，Ｄａｕｃｈ  ＪＲ，Ｈａｙｅｓ  ＪＭ，Ｈｏｎｇ  Ｙ，Ｆｅｌｄｍａｎ  ＥＬ．２００９．Ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ａｌｌｏｄｙｎｉａ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ６８：１２２９-１２４３．
【非特許文献２３】Ｉｉ  Ｍ，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｈ，Ｋｕｓａｎｏ  ＫＦ，Ｑｉｎ  Ｇ，Ｙｏｏｎ  ＹＳ，Ｗｅｃｋｅｒ  Ａ，Ａｓａｈａｒａ  Ｔ，Ｌｏｓｏｒｄｏ  ＤＷ．２００５．Ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｓｔａｔｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓａ  ｎｅｒｖｏｒｕｍ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１２：９３-１０２．
【非特許文献２４】Ｋａｎ  Ｍ，Ｇｕｏ  Ｇ，Ｓｉｎｇｈ  Ｂ，Ｓｉｎｇｈ  Ｖ，Ｚｏｃｈｏｄｎｅ  ＤＷ．２０１２．Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  １，ｉｎｓｕｌｉｎ，ｓｅｎｓｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎｓ，  ａｎｄ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ７１：４９４-５１０．
【非特許文献２５】Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＫＡ，Ｈａｙｅｓ  ＪＭ，Ｗｉｇｇｉｎ  ＴＤ，Ｂａｃｋｕｓ  Ｃ，Ｓｕ  Ｏｈ  Ｓ，Ｌｅｎｔｚ  ＳＩ，Ｂｒｏｓｉｕｓ  Ｆ  ３ｒｄ，Ｆｅｌｄｍａｎ  ＥＬ．２００７．Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ  ２８：２７６-２８５．
【非特許文献２６】Ｗａｎｇ  Ｌ，Ｃｈｏｐｐ  Ｍ，Ｓｚａｌａｄ  Ａ，Ｌｉｕ  Ｚ，Ｂｏｌｚ  Ｍ，Ａｌｖａｒｅｚ  ＦＭ，Ｌｕ  Ｍ，Ｚｈａｎｇ  Ｌ，Ｃｕｉ  Ｙ，Ｚｈａｎｇ  ＲＬ，Ｚｈａｎｇ  ＺＧ．２０１１．Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ−５  ｉｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｍｉｃｅ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １９３：３９９-４１０．
【非特許文献２７】Ｍａｒｄｅｒ  Ｖ  Ｊ，Ｎｏｖｏｋｈａｔｎｙ  Ｖ．Ｄｉｒｅｃｔ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ，  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，２０１０，８（３）：４３３−４４４．
【非特許文献２８】Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ  Ｌ，Ｃｌａｅｙｓ  Ｈ，Ｚａｊｄｅｌ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｌｙｓｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｏｎｅ“ｍｉｎｉ”−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ（ＭＷ，３８，０００）ｂｙ  ｅｌａｓｔａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ，１９７８，３：１９１−２０９．
【非特許文献２９】Ｎａｇａｉ  Ｎ，Ｄｅｍａｒｓｉｎ  Ｅ，Ｖａｎ  Ｈｏｅｆ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｃｒｏｐｌａｓｍｉｎ：ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，２００３，１（２）：３０７−３１３．
【非特許文献３０】Ｈｕｎｔ  Ｊ  Ａ，Ｐｅｔｔｅｗａｙ  Ｊｒ  Ｓ  Ｒ，Ｓｃｕｄｅｒｉ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｌａｓｍｉｎ：  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕ−ｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｍａ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｌａｓｍｉｎ［Ｊ］．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ，２００８，１００（３）：４１３−４１９．
【非特許文献３１】Ｙｏｏｎ  Ｃｈｏｉ  ａ，Ｙｏｕｎｇ  Ｗｏｏｋ  Ｙｏｏｎ  ａ，Ｈｅｕｎｇ  Ｓｉｋ  Ｎａ，Ｓｕｎ  Ｈｏ  Ｋｉｍ  ，Ｊｉｎ  ＭＯ  Ｃｈｕｎｇ．Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｓｉｇｎｓ  ｏｆ  ｏｎｇｏｉｎｇ  ｐａｉｎ  ａｎｄ  ｃｏｌｄ  ａｌｌｏｄｙｎｉａ  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ  ｐａｉｎ，Ｐａｉｎ，５９（１９９４）３６９−３７６．
【非特許文献３２】Ｓ．Ｒ．Ｃｈａｐｌａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔａｃｔｉｌｅ  ａｌｌｏｄｙｎｉａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｐａｗ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５３（１９９４）５５−６３．
【非特許文献３３】Ｊａｅ  Ｋｙｕ  Ｒｙｕ，Ｍａｒｋ  Ａ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，  Ｓａｒａ  Ｇ．Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｎｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ．ＮＡＴＵＲＥ  ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ，２０１５，６：８１６４．
【非特許文献３４】Ｄｉｍｉｔｒｉｏｓ  Ｄａｖａｌｏｓ，Ｋａｔｅｒｉｎａ  Ａｋａｓｓｏｇｌｏｕ．Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  ａｓ  ａ  ｋｅｙ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１２．３４（１）：４３−６２．
【非特許文献３５】Ｖａｌｖｉ  Ｄ，Ｍａｎｎｉｎｏ  ＤＭ，Ｍｕｌｌｅｒｏｖａ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ，ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ（ＣＯＰＤ）ａｎｄ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｗｏ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｃｏｈｏｒｔｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｈｒｏｎ  Ｏｂｓｔｒｕｃｔ  Ｐｕｌｍｏｎ  Ｄｉｓ  ２０１２；７：１７３-８２．
【非特許文献３６】Ｍｏｕｎｇｊａｒｏｅｎ  Ｊ，Ｎｉｍｍａｎｎｉｔ  Ｕ，Ｃａｌｌｅｒｙ  ＰＳ，Ｗａｎｇ  Ｌ，Ａｚａｄ  Ｎ，Ｌｉｐｉｐｕｎ  Ｖ，Ｃｈａｎｖｏｒａｃｈｏｔｅ  Ｐ，Ｒｏｊａｎａｓａｋｕｌ  Ｙ（２００６）．Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｃａｓｐａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｂｃｌ−２  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ３１９，１０６２-１０６９．
【非特許文献３７】Ｗａｎｇ  Ｌ，Ｃｈａｎｖｏｒａｃｈｏｔｅ  Ｐ，Ｔｏｌｅｄｏ  Ｄ，Ｓｔｅｈｌｉｋ  Ｃ，Ｍｅｒｃｅｒ  ＲＲ，Ｃａｓｔｒａｎｏｖａ  Ｖ，Ｒｏｊａｎａｓａｋｕｌ  Ｙ（２００８）．Ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｉｓ  ａ  ｋｅｙ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｏｆ  Ｂｃｌ−２  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７３，１１９-１２７．
【非特許文献３８】Ｒ．Ｌａｎｇｈｏｒｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｌ．Ｗｉｌｌｅｓｅｎ．Ｃａｒｄｉａｃ  Ｔｒｏｐｏｎｉｎｓ  ｉｎ  Ｄｏｇｓ  ａｎｄ  Ｃａｔｓ．Ｊ  Ｖｅｔ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  ２０１６；３０：３６-５０．
【非特許文献３９】Ｚｗａｒｔ  Ｂ，Ｃｉｕｒａｎａ  Ｃ，Ｒｅｎｓｉｎｋ  Ｉ，Ｍａｎｏｅ  Ｒ，Ｈａｃｋ  ＣＥ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｏｃｃｕｒｓ  ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ  ｖｉａ  ＩｇＭ  ａｎｄ  ｉｓ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ  ｌａｔｅ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ）ｃｅｌｌｓ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３７：９５-１０２．
【非特許文献４０】Ｚｈａｎｇ  Ｍ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，Ａｌｉｃｏｔ  ＥＭ，Ｖｏｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ  Ｔ，Ｋｅｓｓｌｅｒ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｅｃｔｉｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｂｙ  ｎａｔｕｒａｌ  ＩｇＭ  ｉｎ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７７：４７２７-４７３４．
【非特許文献４１】Ｋｉｍ  ＳＪ，Ｇｅｒｓｈｏｖ  Ｄ，Ｍａ  Ｘ，Ｂｒｏｔ  Ｎ，Ｅｌｋｏｎ  ＫＢ（２００２）Ｉ−ＰＬＡ２  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  Ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｙ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｍ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９６：６５５-６６５．
【非特許文献４２】Ｋａｒｍｅｎ  Ａ，Ｗｒｏｂｌｅｗｓｋｉ  Ｆ，Ｌａｄｕｅ  ＪＳ（Ｊａｎ  １９５５）．Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｌｏｏｄ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．３４（１）：１２６-３１
【非特許文献４３】Ｗａｎｇ  ＣＳ，Ｃｈａｎｇ  ＴＴ，Ｙａｏ  ＷＪ，Ｗａｎｇ  ＳＴ，Ｃｈｏｕ  Ｐ（Ａｐｒ  ２０１２）．Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ａｌａｎｉｎｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｒａｎｇｅ  ｏｎ  ｉｎｃｉｄｅｎｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｏｒｍｏｓａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ＝Ｔａｉｗａｎ  Ｙｉ  Ｚｈｉ．１１１（４）：２０１-８．
【非特許文献４４】Ｒｏｙ  Ｓ，Ｓａｔｏ  Ｔ，Ｐａｒｙａｎｉ  Ｇ，Ｋａｏ  Ｒ：Ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｒｅｔｉｎａｓ  ｏｆ  ｇａｌａｃｔｏｓｅ−ｆｅｄ  ｒａｔｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２００３，５２：１２２９-１２３４．
【非特許文献４５】Ｃｈｅｎｇ  ＨＴ，Ｄａｕｃｈ  ＪＲ，Ｈａｙｅｓ  ＪＭ，Ｈｏｎｇ  Ｙ，Ｆｅｌｄｍａｎ  ＥＬ．２００９．Ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ａｌｌｏｄｙｎｉａ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ６８：１２２９-１２４３．
【非特許文献４６】Ｉｉ  Ｍ，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｈ，Ｋｕｓａｎｏ  ＫＦ，Ｑｉｎ  Ｇ，Ｙｏｏｎ  ＹＳ，Ｗｅｃｋｅｒ  Ａ，Ａｓａｈａｒａ  Ｔ，Ｌｏｓｏｒｄｏ  ＤＷ．２００５．Ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｍｅｄｉａｔｅｓｓｔａｔｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓａ  ｎｅｒｖｏｒｕｍ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１２：９３-１０２．
【発明の概要】
【００１１】
一方において、本発明は糖尿病性神経損傷を予防及び／または修復する方法に係り、被
験者に有効量のプラスミノゲンまたはプラスミンを投与することを含む。一方において本発明はプラスミノゲンまたはプラスミンを糖尿病性の神経損傷を予防及び／または修復する用途に用いることに係り、被験者に対して有効量のプラスミノゲンまたはプラスミンを投与することを含む。
【００１２】
一つの実施形態において、前記糖尿病性神経損傷は神経組織損傷、神経の炎症を含む。本発明はさらに糖尿病性神経損傷の関連疾患を治療及び／または予防する方法に係り、被験者に治療有効量のプラスミノゲンまたはプラスミンを投与することを含む。一つの実施形態において、前記糖尿病性神経損傷の関連症状は体の痛み、感覚減退、痺れ、熱さ、冷たさ、及び糖尿病性神経性疼痛を含み、糖尿病合併症によって引き起こされる自発性疼痛、痛覚減退（ｈｙｐｏａｌｇｅｓｉａ）、痛覚過敏（ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ）などを含むがこれらに限られない。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、さらに依然としてプラスミノゲン活性を有するものである。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選択されるものである。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは例えば、体表、静脈内、筋肉内、皮下、吸入、椎管内、局所注射、関節内注射または直腸投与によって全身または局所にて投与される。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは他の薬物または療法と組み合わせて投与できる。一つの実施形態において、前記他の薬物または療法は神経栄養薬、鎮痛系薬、糖尿病治療薬、抗感染薬、血圧降下薬、高脂血症治療薬、物理療法を含み、前記物理療法は例えば電磁療法、赤外線療法である。
【００１３】
一つの実施形態において、前記被験者は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
【００１４】
一つの実施形態において、前記被験者のプラスミンまたはプラスミノゲンは低下している。具体的には、前記低下は先天的、継発的、及び／または局所的なものである。
【００１５】
一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するものである。一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１−１００、１−９０、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４５、１−４０、１−３５、１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、１−２、１個のアミノ酸を追加、削除及び／または置換したもので、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、プラスミノゲンは以下から選ばれる保存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）な置換バリアントである：Ｇｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはマイクロプラスミノゲン。一つの実施形態において、プラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンであり、例えば配列２が示すプラスミノゲンのオルソログであり、例えば、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するプラスミノゲンのオルソログであり、例えばゴリラ、アカゲザル、マウス、ウシ、ウマ、イヌに由来するプラスミノゲンのオルソログである。もっとも好ましくは、本発明のプラスミノゲンのアミノ酸配列は配列２、６、８、
１０または１２に示される通りである。
【００１６】
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは適切なポリペプチド担体または安定剤と組み合わせて投与される。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは毎日０．０００１−２０００ｍｇ／ｋｇ、０．００１−８００ｍｇ／ｋｇ、０．０１−６００ｍｇ／ｋｇ、０．１−４００ｍｇ／ｋｇ、１−２００ｍｇ／ｋｇ、１−１００ｍｇ／ｋｇ、１０−１００ｍｇ／ｋｇ（体重一キロあたりで計算）または０．０００１−２０００ｍｇ／ｃｍ２、０．００１−８００ｍｇ／ｃｍ２、０．０１−６００ｍｇ／ｃｍ２、０．１−４００ｍｇ／ｃｍ２、１−２００ｍｇ／ｃｍ２、１−１００ｍｇ／ｃｍ２、１０−１００ｍｇ／ｃｍ２（体表面積平方センチメートルあたりで計算）の用量で投与され、好ましくは少なくとも一回繰り返し、好ましくは毎日投与される。局所投与の場合、前記用量はさらに状況に応じて調整することができる。
【００１７】
もう一方で、本発明はプラスミノゲンまたはプラスミンの糖尿病性神経損傷を予防及び／治療する薬物の製造における用途に係る。一方において、本発明は製薬方法に係り、プラスミノゲンまたはプラスミン及び薬学上の許容し得る担体を共に糖尿病性神経損傷を予防及び／治療する薬物に製造することを含む。
【００１８】
一つの実施形態において、前記糖尿病性神経損傷は神経組織損傷、神経の炎症を含む。本発明はさらにプラスミノゲンまたはプラスミンの、糖尿病性神経損傷及びその関連疾患を治療及び／または予防する薬物の製造における用途に係る。一つの実施形態において、前記糖尿病性神経損傷の関連疾患は体の痛み、感覚減退、痺れ、熱さ、冷たさ、及び糖尿病神経性疼痛を含み、糖尿病合併症によって引き起こされる自発性疼痛、痛覚減退、痛覚過敏を含むがこれらに限られない。一つの実施形態において、前記フィブリンプラスミンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然プラスミン活性を有する。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選択されるものである。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは例えば、体表、静脈内、筋肉内、皮下、吸入、椎管内、局所注射、関節内注射または直腸投与によって全身または局所にて投与される。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは他の薬物または療法と組み合わせて投与される。一つの実施形態において、前記他の薬物または療法は神経栄養薬、鎮痛系薬、糖尿病治療薬、抗感染薬、血圧降下薬、高脂血症治療薬、物理療法を含み、前記物理療法は例えば電磁療法、赤外線療法である。
【００１９】
一つの実施形態において、前記被験者は哺乳動物で、好ましくはヒトである。
【００２０】
一つの実施形態において、前記被験者のフィブリンプロテアーゼまたはプラスミノゲンは低下している。具体的に、前記低下は先天的、継発的及び／または局所的である。
【００２１】
一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有する。一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１−１００、１−９０、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４５、１−４０、１−３５、１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、１−２、１個のアミノ酸を追加、削除及び／または置換したもので、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメ
ントを含有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、プラスミノゲンは以下から選ばれる保存的な置換バリアントである：Ｇｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはマイクロプラスミノゲン。一つの実施形態において、プラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンであり、例えば配列２が示すプラスミノゲンのオルソログであり、例えば、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するプラスミノゲンのオルソログであり、例えばゴリラ、アカゲザル、マウス、ウシ、ウマ、イヌに由来するプラスミノゲンのオルソログである。もっとも好ましくは、本発明のプラスミノゲンのアミノ酸配列は配列２、６、８、１０または１２に示される通りである。
【００２２】
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは適切なポリペプチド担体または安定剤と組み合わせて投与される。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは毎日０．０００１−２０００ｍｇ／ｋｇ、０．００１−８００ｍｇ／ｋｇ、０．０１−６００ｍｇ／ｋｇ、０．１−４００ｍｇ／ｋｇ、１−２００ｍｇ／ｋｇ、１−１００ｍｇ／ｋｇ、１０−１００ｍｇ／ｋｇ（体重一キロあたりで計算）または０．０００１−２０００ｍｇ／ｃｍ２、０．００１−８００ｍｇ／ｃｍ２、０．０１−６００ｍｇ／ｃｍ２、０．１−４００ｍｇ／ｃｍ２、１−２００ｍｇ／ｃｍ２、１−１００ｍｇ／ｃｍ２、１０−１００ｍｇ／ｃｍ２（体表面積平方センチメートルあたりで計算）の用量を投与され、好ましくは少なくとも一回繰り返し、好ましくは毎日投与される。局所投与の場合、前記用量はさらに状況に応じて調整することができる。
【００２３】
もう一方において、本発明は糖尿病性神経損傷を予防及び／または修復するためのプラスミノゲン、及び被験者の糖尿病性神経損傷を予防及び／または修復するための、プラスミノゲンまたはプラスミンを含有する薬物組成物に係る。一つの実施形態において、前記糖尿病性神経損傷は神経組織損傷、神経の炎症を含む。本発明はさらに被験者の糖尿病性神経損傷関連疾患を予防及び／または治療するためのプラスミノゲンに係り、及び糖尿病性神経損傷関連疾患の治療及び／または予防に用いられる、プラスミノゲンを含有する薬物組成物に係る。一つの実施形態において、前記糖尿病性神経損傷の関連疾患は体の痛み、感覚減退、痺れ、熱さ、冷たさ、及び糖尿病性神経疼痛を含み、糖尿病合併症によって引き起こされる自発性疼痛、痛覚減退、痛覚過敏を含むがこれに限られない。一つの実施形態において、前記フィブリンプラスミンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、さらに依然としてプラスミン活性を有するものである。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを有し、さらに依然としてプラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選択されるものである。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは例えば、体表、静脈内、筋肉内、皮下、吸入、椎管内、局所注射、関節内注射または直腸投与によって全身または局所にて投与される。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは他の薬物または療法と組み合わせて投与される。一つの実施形態において、前記他の薬物または療法は神経栄養薬、鎮痛系薬、糖尿病治療薬、抗感染薬、血圧降下薬、高脂血症治療薬、物理療法を含み、前記物理療法は例えば電磁療法、赤外線療法である。
【００２４】
一つの実施形態において、前記被験者は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
【００２５】
一つの実施形態において、前記被験者のプラスミンまたはプラスミノゲンは低下してい
る。具体的には、前記低下は先天的、継発的、及び／または局所的なものである。
【００２６】
一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有する。一つお実施形態において、プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１−１００、１−９０、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４５、１−４０、１−３５、１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、１−２、１個のアミノ酸を追加、削除及び／または置換したもので、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、プラスミノゲンは以下から選ばれる保存的な置換バリアントである：Ｇｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはマイクロプラスミノゲンである。一つの実施形態において、プラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンであり、例えば配列２が示すプラスミノゲンのオルソログであり、例えば、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するプラスミノゲンのオルソログであり、例えばゴリラ、アカゲザル、マウス、ウシ、ウマ、イヌに由来するプラスミノゲンのオルソログである。最も好ましくは、本発明のプラスミノゲンのアミノ酸配列は配列２、６、８、１０または１２に示される通りである。
【００２７】
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは適切なポリペプチド担体または安定剤と組み合わせて投与される。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは毎日０．０００１−２０００ｍｇ／ｋｇ、０．００１−８００ｍｇ／ｋｇ、０．０１−６００ｍｇ／ｋｇ、０．１−４００ｍｇ／ｋｇ、１−２００ｍｇ／ｋｇ、１−１００ｍｇ／ｋｇ、１０−１００ｍｇ／ｋｇ（体重一キロあたりで計算）または０．０００１−２０００ｍｇ／ｃｍ２、０．００１−８００ｍｇ／ｃｍ２、０．０１−６００ｍｇ／ｃｍ２、０．１−４００ｍｇ／ｃｍ２、１−２００ｍｇ／ｃｍ２、１−１００ｍｇ／ｃｍ２、１０−１００ｍｇ／ｃｍ２（体表面積平方センチメートルあたりで計算）の用量を投与し、好ましくは少なくとも一回繰り返し、好ましくは毎日投与する。局所投与の場合、前記用量はさらに状況に応じて調整することができる。
【００２８】
もう一方において、本発明は被験者の糖尿病性神経損傷の予防及び／または修復に用いる、プラスミノゲンまたはプラスミンを含有する薬物組成物の製品または薬物キットに係る。一つの実施形態において、前記糖尿病性神経損傷は神経組織損傷、神経の炎症を含む。本発明はさらに被験者の糖尿病性神経損傷の関連疾患の治療及び／または予防に用いられる、プラスミノゲンまたはプラスミンを含有する薬物組成物の製品または薬物キットに係る。一つの実施形態において、前記糖尿病性神経損傷の関連疾患は体の痛み、感覚減退、痺れ、熱さ、冷たさ、及び糖尿病神経性疼痛を含み、糖尿病合併症によって引き起こされる自発性疼痛、痛覚減退、痛覚過敏を含むがこれらに限られない。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するものである。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは例えば、体表、静脈内、筋肉内、皮下、吸入、椎管内、局所注射、関節内注射または直腸投与によって全身または局所にて投与される。一つ
の実施形態において、前記プラスミノゲンは一種類または複数種類の他の薬物または療法と組み合わせて投与することができる。一つの実施形態において、前記その他の薬物または療法は神経栄養薬、鎮痛系薬、糖尿病治療薬、抗感染薬、血圧降下薬、高脂血症治療薬、物理療法を含み、前記物理療法は例えば電磁療法、赤外線療法である。
【００２９】
一つの実施形態において、前記被験者は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
【００３０】
一つの実施形態において、前記被験者のプラスミンまたはプラスミノゲンは低下している。具体的には、前記低下は先天的、継発的、及び／または局所的なものである。
【００３１】
一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有する。一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１−１００、１−９０、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４５、１−４０、１−３５、１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、１−２、１個のアミノ酸を追加、削除及び／または置換したもので、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、プラスミノゲンは以下から選ばれる保存的な置換バリアントである：Ｇｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはマイクロプラスミノゲン。一つの実施形態において、プラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンであり、例えば配列２が示すプラスミノゲンのオルソログであり、例えば、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するプラスミノゲンのオルソログであり、例えばゴリラ、アカゲザル、マウス、ウシ、ウマ、イヌに由来するプラスミノゲンのオルソログである。最も好ましくは、本発明のプラスミノゲンのアミノ酸配列は配列２、６、８、１０または１２に示される通りである。
【００３２】
一つの実施形態において、前記製品または薬物キットは有効用量のプラスミノゲンを含有する容器を含む。好ましくは、該製品または薬物キットはさらに一種類または複数種類の他の薬物を含有する容器を含む。該製品または薬物キットはさらに使用プロトコルを含むことができ、これは前記プラスミノゲンを糖尿病によって引き起こされる神経損傷及びその関連症状の予防及び／または治療に用いることができることを説明するものであり、さらには以下のように説明することができる。即ち、前記プラスミノゲンは前記他の薬物を投与する前、投与と同時、及び／または後に投与できる。
【００３３】
一方において、本発明はプラスミノゲンまたはプラスミンの、被験者の糖尿病性血管病変によってもたらされる生体組織及び内臓臓器の損傷（ダメージ）を予防及び／または治療するための薬物、製品、薬物キットの製造における用途に係るものである。一つの実施形態において、前記組織及び内臓臓器の損傷（ダメージ）は大脳、心臓、肝臓、肺臓、腎臓、神経、網膜、皮膚、胃腸管の損傷（ダメージ）を含む。一方において、本発明はプラスミノゲンまたはプラスミンの被験者の糖尿病合併症を予防及び／または治療するための薬物、製品、薬物キットにおける用途に係る。一つの実施形態において、前記糖尿病合併症は糖尿病によって引き起こされる糖尿病性大脳病変、糖尿病性心臓病変、糖尿病性肝臓病変、糖尿病性腎臓病変、糖尿病性肺臓病変、糖尿病性神経病変、糖尿病網膜症、糖尿病性皮膚病変である。
【００３４】
一方において、本発明は製薬方法に係り、プラスミノゲンまたはプラスミンと薬学的に
許容し得る担体から、被験者の糖尿病性血管病変によってもたらされる生体組織及び内臓臓器の損傷（ダメージ）を予防及び／または治療するための薬物、製品、薬物キットに製造することを含む。一つの実施形態において、前記組織及び内臓臓器の損傷（ダメージ）は大脳、心臓、肝臓、肺臓、腎臓、神経、網膜、皮膚、胃腸管の損傷（ダメージ）を含む。一方において、本発明は製薬方法に係り、プラスミノゲンまたはプラスミンの薬学的に許容し得る担体を、被験者の糖尿病合併症を予防及び／または治療するための薬物、製品、薬物キットに製造することを含む。一つの実施形態において、前記糖尿病合併症は糖尿病によって引き起こされる糖尿病性大脳病変、糖尿病性心臓病変、糖尿病性肝臓病変、糖尿病性腎臓病変、糖尿病性肺臓病変、糖尿病性神経病変、糖尿病網膜症、糖尿病性皮膚病変である。
【００３５】
一方において、本発明は被験者の糖尿病性血管病変によってもたらされる生体組織及び内臓臓器の損傷（ダメージ）を予防及び／または治療するためのプラスミノゲンまたはプラスミン、プラスミノゲンまたはプラスミンを含有する組成物、製品、薬物キットに係るものである。一つの実施形態において、前記組織及び内臓臓器の損傷（ダメージ）は大脳、心臓、肝臓、腎臓、肺臓、神経、網膜、胃腸管、皮膚の損傷（ダメージ）を含む。一方において、本発明は被験者の糖尿病合併症を予防及び／または治療するプラスミノゲン、プラスミノゲンを含有する薬物組成物、製品または薬物キットに係る。一つの実施形態において、前記糖尿病合併症は糖尿病によって引き起こされる糖尿病性大脳病変、糖尿病性心臓病変、糖尿病性肝臓病変、糖尿病性肺臓病変、糖尿病性腎臓病変、糖尿病性神経病変、糖尿病性血管病変、糖尿病網膜症、糖尿病性皮膚病変である。
【００３６】
一方において、本発明は被験者の糖尿病性血管病変によってもたらさる生体組織及び内臓臓器損傷（ダメージ）を予防及び／または治療する方法に係り、被験者にプラスミノゲンまたはプラスミン、プラスミノゲンまたはプラスミンを含有する薬物組成物、製品、薬物キットを投与することを含む。本発明はさらにプラスミノゲンまたはプラスミン、プラスミノゲンまたはプラスミンを含有する薬物組成物、製品、薬物キットの被験者の糖尿病性血管病変によってもたらされる生体組織及び内臓臓器損傷（ダメージ）を予防及び／または治療する用途に係るものである。一つの実施形態において、前記組織及び内臓臓器の損傷（ダメージ）は大脳、心臓、肝臓、肺臓、腎臓、神経、網膜、胃腸管、皮膚に対する損傷（ダメージ）を含む。一方において、本発明は被験者の糖尿病合併症を予防及び／または治療する方法に係り、被験者にプラスミノゲンまたはプラスミン、プラスミノゲンまたはプラスミンを含有する薬物組成物、製品または薬物キットを投与することを含む。本発明はさらにプラスミノゲンまたはプラスミン、プラスミノゲンまたはプラスミンを含有する薬物組成物、製品または薬物キットの、被験者の糖尿病合併症を予防及び／治療することにおける用途を含む。一つの実施形態において、前記糖尿病合併症は糖尿病によって引き起こされた糖尿病性大脳病変、糖尿病性心臓病変、糖尿病性肝臓病変、糖尿病性肺臓病変、糖尿病性腎臓病変、糖尿病性神経病変、糖尿病性血管病変、糖尿病性網膜病変、糖尿病性皮膚病変である。
【００３７】
一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有する。一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１−１００、１−９０、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４５、１−４０、１−３５、１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、１−２、１個のアミノ酸を追加、削除及び／または置換したもので、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミ
ノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、プラスミノゲンは以下から選ばれる保存的な置換バリアントである：Ｇｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはマイクロプラスミノゲンである。一つの実施形態において、プラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンであり、例えば配列２が示すプラスミノゲンのオルソログであり、例えば、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するプラスミノゲンのオルソログであり、例えばゴリラ、アカゲザル、マウス、ウシ、ウマ、イヌに由来するプラスミノゲンのオルソログである。最も好ましくは、本発明のプラスミノゲンのアミノ酸配列は配列２、６、８、１０または１２に示される通りである。
【００３８】
一つの実施形態において、前記被験者のプラスミンまたはプラスミノゲンは低下している。具体的には、前記低下は先天的、継発的、及び／または局所的なものである。
【００３９】
本発明は本発明の実施形態どうしの技術的特徴のすべての組み合わせを明確にカバーし、且つこれらの組み合わせ後の技術構成は本出願で明確に開示され、前記技術構成が単独且つ明確に開示されているのと一緒である。また、本発明はさらに各実施形態及び要素のすべてのサブの組み合わせをカバーし、さらに本明細書中において開示され、それぞれのサブの組み合わせが単独且つ明確に本明細書中において開示されているのと一緒である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は１４−１５週齢の糖尿病マウスに対してプラスミノゲンを投与した後の体重の変化を示したものである。
【図２】図２は１４−１５週齢の糖尿病マウスに対してプラスミノゲンを投与した後の機械的接触によって誘発される疼痛に対する応答能力の変化を示したものである。
【図３】図３は１４−１５週齢の糖尿病マウスに対してプラスミノゲンを投与した後の０、３、６、１２日目の冷刺激に対する感知能力の測定結果を示したものである。
【図４】図４は１４−１５週齢の糖尿病マウスに対してプラスミノゲンを投与した後の０、３、６、１２日目の機械的接触によって誘発される疼痛に対する応答能力を示したものである。
【図５】図５は２４−２５週齢の糖尿病マウスに対してプラスミノゲンを投与した後の体重の変化を示したものである。
【図６】図６は２４−２５週齢の糖尿病マウスに対してプラスミノゲンを投与した後の０、４、７、１１、１６日目の機械的接触によって誘発される疼痛に対する応答能力の測定結果を示したものである。
【図７】図７は２４−２５週齢の糖尿病マウスに対してプラスミノゲンを投与した後の０、４、７、１１、１６日目の冷刺激に対する感知能力の測定結果を示したものである。
【図８】図８は２４−２５週齢の糖尿病マウスに対してプラスミノゲンを投与した後の０、４、７、１１、１６日目の機械性の疼痛に対する応答能力を示したものである。
【図９】図９は２４−２５週齢の糖尿病マウスに対してプラスミノゲンを連続的に１５日間投与した後の坐骨神経のＨＥ染色の観察結果を示したものである。
【図１０】図１０は２４−２５週齢の糖尿病マウスに対してプラスミノゲンを連続的に１５日間投与した後の坐骨神経フィブリンの免疫染色の観察結果を示したものである。
【図１１】図１１は２４−２５週齢の糖尿病マウスに対してプラスミノゲンを連続的に３１日間投与した後の肝臓フィブリンの免疫染色の観察結果を示したものである。
【図１２】図１２は２４−２５週齢の糖尿病マウスに対してプラスミノゲンを連続的に３１日間投与した後の肝臓Ｆ４／８０免疫染色の観察結果を示したものである。
【図１３】図１３は２４−２５週齢の糖尿病マウスに対してプラスミノゲンを連続的に３１日間投与した後の腎臓フィブリンの免疫染色の観察結果を示したものである。
【図１４】図１４は２４−２５週齢の糖尿病マウスに対してプラスミノゲンを連続的に３１日間投与した後の腎臓Ｂｃｌ−２免疫染色の観察結果を示したものである。
【図１５】図１５は２４−２５週齢の糖尿病マウスに対してプラスミノゲンを連続的に３１日間投与した後の網膜ＰＡＳ染色の観察結果を示したものである。
【図１６】図１６は２４−２５週齢の糖尿病マウスに対してプラスミノゲンを連続的に１５日間投与した後の血清中Ｄ−二量体の含有量の測定結果を示したものである。
【図１７】図１７は２４−２５週齢の糖尿病マウスに対してプラスミノゲンを連続的に３１日間投与した後の血清心筋トロポニンＩの濃度の測定結果を示したものである。
【図１８】図１８は２４−２５週齢の糖尿病マウスに対してプラスミノゲンを連続的に３１日間投与した後の腎臓ＩｇＭ免疫染色の観察結果を示したものである。
【図１９】図１９は２４−２５週齢の糖尿病マウスに対してプラスミノゲンを連続的に３１日間投与した後の血清グルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素（ＡＬＴ）の測定結果を示したものである。
【図２０】図２０は８週齢の糖尿病マウスに対してプラスミノゲンを連続的に９日間投与した後の機械的接触によって誘発される疼痛に対する応答能力を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
１、定義
「糖尿病」は遺伝的要素、免疫機能の乱れ、微生物感染及びその毒素、フリーラジカル毒素、精神要因などの各種病気誘発因子が生体に作用することによる、インスリン減退、インスリン抵抗などによって引き起こされる糖、タンパク質、脂肪、水及び電解質等の一連の代謝に乱れが生じる症候群であり、臨床的には高血糖を主な特徴とする。
【００４２】
「糖尿病合併症」は糖尿病プロセスにおける血糖の制御不良によって引き起こされる身体のその他の臓器または組織のダメージまたは機能障害であり、肝臓、腎臓、心臓、網膜、神経系のダメージまたは機能障害等を含む。世界保健機関（ＷＨＯ）の統計によれば、糖尿病合併症は１００種類以上あり、現在における合併症が最も多い疾患である。
【００４３】
「糖尿病性微小血管病変」とは糖尿病患者の生体の各臓器または組織の微小循環において異なる程度の異常がもたらす微小血管障害である。微小血管障害が形成するプロセスは概ね以下である：微小循環の機能性改変、内皮損傷、基膜の厚み増大、血液粘度の上昇、赤血球の凝集、血小板の粘着及び凝集、最終的には微小血栓形成及び／または微小血管閉塞をもたらす。
【００４４】
前記「糖尿病性微小血管病変」は組織または臓器の局所血管損傷、血流不順、細胞の酸素欠乏、血液凝塊の形成、血栓及び炎症をもたらし、さらには周辺の組織及び臓器の機能に影響し、これにより「糖尿病合併症」をもたらす。このため、本発明の請求項の技術構成における「糖尿病性微小血管病変」及び「糖尿病合併症」という用語に言及した場合、いずれも糖尿病によって引き起こされる血栓形成をカバーするものである。
【００４５】
「糖尿病性脳神経病変」は「糖尿病性神経症」とも呼ばれ、糖尿病高血糖を特徴とする生体の代謝障害により引き起こされる神経系の疾患であり、糖尿病によって引き起こされる神経損傷によってもたらされるものである。
【００４６】
「糖尿病性神経損傷」は感覚神経の障害、運動神経の障害及び自主的神経の障害を含む。そのうち感覚神経の障害は通常は比較的ひどく、よく見られる症状は疼痛であり、焼けるような痛み、電極で刺すような痛み、針で刺すような痛み及び様々な異なる患者体験等を含む。
【００４７】
「糖尿病性神経損傷関連疾患」は糖尿病高血糖を特徴とする生体代謝障害によって引き起こされる神経系の一連の疾患であり、糖尿病によって引き起こされる神経系損傷によっ
てもたらされ、以下を含むがこれらに限られない：体の痛み、感覚減退、痺れ、熱さ、冷たさ、及び糖尿病神経性疼痛、糖尿病合併症によって引き起こされる自発性疼痛、痛覚減退（ｈｙｐｏａｌｇｅｓｉａ）、痛覚過敏（ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ）等を含むがこれらに限られない。
【００４８】
「糖尿病性神経疼痛」は糖尿病の神経病変の最もよく見られる形であり、通常は糖尿病感覚神経のダメージによってもたらされる。主な疼痛は通常、温度及び触覚の喪失を伴い、疼痛の発生は足の感覚の場合が多く、同時に腕及び胴体にも発生する。一般的には末梢及び中枢神経疼痛に分けることができる。周囲神経疼痛は周囲神経の損傷によって引き起こされ、中枢神経疼痛は中枢神経系及び／または脊髄損傷によって引き起こされる。
【００４９】
「プラスミン」は血液中に存在する非常に重要な酵素であり、フィブリン凝塊をフィブリン分解生成物及びＤ−二量体に加水分解する。
【００５０】
「プラスミノゲン」はプラスミンの酵素前駆体の形であり、ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔ中の配列に基づいて、シグナルペプチドの天然ヒト由来プラスミノゲンのアミノ酸配列（配列４）は計算によれば８１０個のアミノ酸からなり、分子量は約９０ｋＤであり、主に肝臓において合成され且つ血液中で循環できる糖タンパク質であり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列３に示される通りである。フルサイズのプラスミノゲンは七つのドメインを含む：Ｃ末端に位置するセリンプロテアーゼドメイン、Ｎ末端に位置するＰａｎ  Ａｐｐｌｅ（ＰＡｐ）ドメイン及び５つのＫｒｉｎｇｌｅドメイン（Ｋｒｉｎｇｌｅ１−５）を含む。ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔ中の配列を参照すれば、そのシグナルペプチドは残基Ｍｅｔ１−Ｇｌｙ１９を含み、Ｐａｐは残基Ｇｌｕ２０−Ｖａｌ９８を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ１は残基Ｃｙｓ１０３−Ｃｙｓ１８１を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ２は残基Ｇｌｕ１８４−Ｃｙｓ２６２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ３は残基Ｃｙｓ２７５−Ｃｙｓ３５２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ４は残基Ｃｙｓ３７７−Ｃｙｓ４５４を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ５は残基Ｃｙｓ４８１−Ｃｙｓ５６０を含む。ＮＣＢＩデータによれば、セリンプロテアーゼドメインは残基Ｖａｌ５８１−Ａｒｇ８０４を含む。
【００５１】
Ｇｌｕ−プラスミノゲンは天然のフルサイズのプラスミノゲンであり、７９１個のアミノ酸からなる（１９個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含まない）、該配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１に示される通りであり、そのアミノ酸配列は配列２に示される通りである。体内において、さらにＧｌｕ−プラスミノゲンの第７６−７７位のアミノ酸の位置で加水分解することにより形成されたＬｙｓ−プラスミノゲンが存在し、例えば配列６に示されるものであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列５が示す通りである。Δ−プラスミノゲン（δ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はフルサイズのプラスミノゲンにＫｒｉｎｇｌｅ２−Ｋｒｉｎｇｌｅ５構造の欠損が生じているフラグメントであり、Ｋｒｉｎｇｌｅ１及びセリンプロテアーゼドメインしか含有せず（非特許文献２７、３０参照）、δ−プラスミノゲンのアミノ酸配列（配列８）を報告している文献があり（非特許文献３０）、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は例えば配列７である。ミニプラスミノゲン（Ｍｉｎｉ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はＫｒｉｎｇｌｅ５及びセリンプロテアーゼドメインからなり、残基Ｖａｌ４４３−Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドＧｌｕ−プラスミノゲン配列を含まないＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）について文献が報告しており（非特許文献２８参照）、そのアミノ酸配列は配列１０に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列９が示す通りである。しかしマイクロプラスミノゲン（Ｍｉｃｒｏ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はセリンプロテアーゼドメインのみ含有し、そのアミノ酸配列は残基Ａｌａ５４３−Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ−プラスミノゲン配列のＧｌｕ残基は開始アミノ酸である）と文献が報告し（非特許文献２９）、特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａはそれが残基Ｌｙｓ５３１−Ａｓｎ７９１を含むと開示し（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ−プラスミノゲン
配列のＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）、本特許の配列は特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａを参照でき、そのアミノ酸配列は配列１２に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１１に示される通りである。
【００５２】
本発明の「プラスミン」と「フィブリンプラスミン」、「繊維タンパクプラスミン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。「プラスミノゲン」と「フィブリンプラスミノゲン」、「繊維タンパクプラスミノゲン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。
【００５３】
循環過程において、プラスミノゲンは閉鎖した非活性コンフォメーションであるが、血栓または細胞表面に結合した際、プラスミノゲン活性化剤（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ，ＰＡ）の介在下において、開放性のコンフォメーションを有する活性プラスミンとなる。活性を有するプラスミンはさらにフィブリン凝塊をフィブリン質加水分解生成物及びＤ−二量体に加水分解して、これにより血栓を溶解させる。そのうちプラスミノゲンのＰａｐドメインはプラスミノゲンを非活性閉鎖コンフォメーションにする重要な決定クラスターであり、しかしＫＲドメインは受容体及び基質上のリジン残基と結合できるものである。プラスミノゲン活性化剤としての酵素は、既に複数種類知られ、以下を含む：組織プラスミノゲン活性化剤（ｔＰＡ）、ウロキナーゼプラスミノゲン活性化剤（ｕＰＡ）、カリクレイン及び凝結因子ＸＩＩ（ハーゲマン因子）などである。
【００５４】
「プラスミノゲン活性フラグメント」とはプラスミノゲンのタンパク質において、基質中のターゲット配列と結合してタンパク質加水分解機能を発揮できる活性フラグメントである。本発明はプラスミノゲンの技術構成に係り、プラスミノゲン活性フラグメントでプラスミノゲンの替わりとする技術構成を含む。本発明に記載のプラスミノゲン活性フラグメントはプラスミノゲンのセリンプロテアーゼドメインを含むタンパク質であり、好ましくは、本発明に記載のプラスミノゲン活性フラグメントは配列１４、配列１４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性のアミノ酸配列を含有するタンパク質を含むものである。そのため、本発明に記載のプラスミノゲンは該プラスミノゲン活性フラグメントを含み、且つ依然該プラスミノゲン活性を有するタンパク質を含む。
【００５５】
現在、血液中のプラスミノゲン及びその活性測定方法は以下を含む：組織フィブリンプラスミノゲン活性化剤の活性に対する測定（ｔ−ＰＡＡ）、血漿組織プラスミノゲン活性化剤抗原に対する測定（ｔ−ＰＡＡｇ）、血漿組織プラスミノゲン活性に対する測定（ｐｌｇＡ）、血漿組織プラスミノゲン抗原に対する測定（ｐｌｇＡｇ）、血漿組織プラスミノゲン活性化剤の阻害物活性に対する測定、血漿組織プラスミノゲン活性化剤の阻害物抗原に対する測定、血漿プラスミン−抗プラスミン複合物に対する測定（ＰＡＰ）。最もよく見られる測定方法は発色基質法である：測定対象の血漿中にストレプトキナーゼ（ＳＫ）と発光基質を添加し、測定対象の血漿中のプラスミノゲンはＳＫの作用下においてＰＬＭとなり、後者は発光基質に作用し、それから分光光度計で測定し、吸光度の増加はプラスミノゲンの活性と正比例関係となる。この他にも免疫化学法、ゲル電気泳動法、免疫比濁法、放射免疫拡散法などを用いて血液中のフィブリンプラスミノゲン活性に対して測定を行うことができる。
【００５６】
「オルソロジー（ｏｒｔｈｏｌｏｇｙ）」とは異なる種どうしのオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）であり、タンパク質の相同物もＤＮＡの相同物も含む。それは具体的に異なる種どうしの同じ祖先の遺伝子から進化して得られるタンパク質または遺伝子を言う。本発明のプラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンを含み、さらには異なる種に由来する、プラスミノゲン活性を有するプラスミノゲン直系同源物または直系同系物である。
【００５７】
「保存的置換バリアント」とはそのうちの一つの指定されたアミノ酸残基が改変されたがタンパク質または酵素の全体のコンフォメーション及び機能を変えないものであり、これは類似の特性（例えば酸性、アルカリ性、疎水性など）のアミノ酸でペアレントタンパク質中のアミノ酸配列中のアミノ酸を置換するものを含むがこれらに限られない。類似の性質を有するアミノ酸は知られている通りである。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリジンは親水性のアルカリ性アミノ酸であり且つ互いに置き換えることができる。同じように、イソロイシンは疎水アミノ酸であり、ロイシン、メチオニンまたはバリンによって置換されることができる。そのため、機能の類似する二つのタンパク質またはアミノ酸配列の類似性は異なる可能性もある。例えば、ＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づいて７０％〜９９％の類似性（同一性）を有する。「保存的置換バリアント」はさらにＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムに基づいて６０％以上のアミノ酸同一性を有するポリペプチドまたは酵素であり、７５％以上に達すればさらによく、最も好ましくは８５％以上に達し、さらには９０％以上に達するのが最も好ましく、さらに天然またはペアレントタンパク質または酵素と比較して同じまたは基本的に類似する性質または機能を有する。
【００５８】
「分離された」プラスミノゲンとは天然環境から分離及び／または回収されたプラスミノゲンタンパク質である。いくつかの実施形態において、前記プラスミノゲンは（１）９０％を超える、９５％を超える、または９８％を超える純度（重量で計算した場合）になるまで精製し、例えばＬｏｗｒｙ法によって決まるもので、例えば９９％（重量で計算した場合）を超えるまで精製する、（２）少なくともスピニングカップ配列分析装置によりＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基が得られる程度になる精製する、または（３）同質性になるまで精製する。該同質性はクマシーブリリアントブルーまたは銀染色により還元性または非還元性条件下のドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミノゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって決まるものである。分離されたプラスミノゲンはバイオエンジニアリング技術により組み換え細胞から製造することができ、さらに少なくとも一つの精製ステップで分離されたプラスミノゲンを含む。
【００５９】
用語の「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は本明細書において互いに置き換えて使用でき、いかなる長さのアミノ酸の重合体をも指し、遺伝的にコードされた及び非遺伝的にコードされたアミノ酸、化学的または生化学的に修飾されまたは派生したアミノ酸、及び修飾されたペプチド主鎖を有するポリペプチドを含む。該用語は融合タンパク質を含み、異種性アミノ酸配列を有する融合タンパク質を含むがこれに限られず、異種性と同種性由来のリーダー配列（Ｎ端メチオニン残基を有するか有しない）を含む融合物；などである。
【００６０】
参照ペプチド配列の「アミノ酸配列同一性パーセンテージ（％）」の定義は、必要な時にギャップを導入することで最大のパーセンテージ配列の同一性を実現した後、如何なる保存的な置換も配列同一性の一部として見なさない場合、候補配列中における参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基のパーセンテージである。パーセンテージのアミノ酸配列の同一性を測定することを目的とした比較は本分野の技術範囲における複数種類の方式によって実現でき、例えば公衆が入手できるコンピュータソフトウエア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアによって実現できる。当業者は引用配列の適切なパラメータを決めることができ、比較対象の配列のフルサイズを比較することで最大比較の要求を実現するための如何なるアルゴリズムも含む。しかし、本発明の目的のために、アミノ酸配列の同一性パーセンテージは配列比較コンピュータソフトウエアＡＬＩＧＮ−２により得られるものである。
【００６１】
ＡＬＩＧＮ−２を用いることによりアミノ酸配列を比較する場合、アミノ酸配列Ａと所定のアミノ酸配列Ｂのアミノ酸配列同一性％（または所定のアミノ酸配列Ｂのあるアミノ
酸配列と同一性を有する所定のアミノ酸配列Ａの占める％）は以下のように計算される：
分数Ｘ／Ｙ×１００
【００６２】
そのうちＸは配列比較プログラムＡＬＩＧＮ−２において該プログラムのＡ及びＢの比較において同一でマッチングすると評価したアミノ酸残基の数であり、且つそのうちＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である。以下のように理解するべきである：アミノ酸配列Ａの長さとアミノ酸配列Ｂの長さが等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列の同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは異なる。明確に説明した場合を除き、本文中において使用するすべてのアミノ酸配列同一性値％は前記の段落に記載の通りであり、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムによって得られるものである。
【００６３】
本文において使用されているように、用語の「治療」及び「処理」は期待される薬理及び／または生理的効果が得られることを言う。前記効果は疾患またはその症状を完全または一部予防すること、及び／または疾患及び／またはその症状を一部または完全に治癒するものとすることができる。且つ以下を含む：（ａ）疾病が被験者の体内で発生することを予防し、前記被験者は疾患の要因を持っているが、該疾患を有すると診断されていない状況である；（ｂ）疾患を抑制し、その形成を阻害する；及び（ｃ）疾患及び／またはその症状を減軽し、即ち疾患及び／またはその症状を解消させる。
【００６４】
用語の「個体」、「被験者」及び「患者」は本明細書中において互いに置き換えて使用でき、哺乳動物を指し、ネズミ（ラット、マウス）、ヒト以外の霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含むがこれらに限られない。
【００６５】
「治療上有効量」または「有効量」とは、哺乳動物またはその他の被験者に投与して、疾患の治療に用いられる際に疾患の前記予防及び／または治療を実現できるプラスミノゲンの量である。「治療上有効量」は使用するプラスミノゲン、治療しようとする被験者の疾患及び／または症状の重症度及び年齢、体重などに従って変化するものである。
【００６６】
２．本発明のプラスミノゲンの製造
プラスミノゲンは自然界から分離及び精製され、さらに治療の用途に用いられるものであり、さらには標準的な化学ペプチド合成技術によって合成することができる。化学的手法によりポリペプチドを合成する際、液相または固相で合成を行うことができる。固相ポリペプチド合成（ＳＰＰＳ）（配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に附着させ、順番に配列中の残りのアミノ酸を添加する）はプラスミノゲンの化学的合成に適したものである。各種形式のＳＰＰＳ、例えばＦｍｏｃ及びＢｏｃは、プラスミノゲンの合成に用いることができる。固相合成に用いられる技術は以下に記載されている：Ｂａｒａｎｙ及びＳｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；３−２８４ページ、Ｔｈｅ
Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．第二巻：Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ  Ａ．，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ｔら  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５６（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．（１９８４）；及びＧａｎｅｓａｎ  Ａ．２００６Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．６：３−１０及びＣａｍａｒｅｒｏ  ＪＡら  ２００５Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｌｅｔｔ．１２：７２３−８。簡単に言えば、その上にペプチド鎖が構築された機能性ユニットにより不溶性の多孔ビーズを処理する。カップリング／脱保護の繰り返し循環後に、附着した固相の遊離Ｎ末端アミンと単一のＮ保護を受けているアミノ酸ユニットをカップリングさせる。それから、該ユニットを脱保護させ、他のアミノ酸と連結する新しいＮ末端アミンを露出させる。ペプチドを固相上に固定したままにし、それ
からそれを切除する。
【００６７】
標準的な組み換え方法により本発明のプラスミノゲンを生産することができる。例えば、プラスミノゲンをコードする核酸を発現ベクター中に挿入し、それと発現ベクター中の制御配列を操作可能に接続させる。発現制御配列はプロモーター（例えば天然に関連されているプロモーター、または異種由来のプロモーター）、シグナル配列、エンハンサー素子及び転写終了配列を含むが、これらに限られない。発現の制御はベクター中の真核プロモーター系とすることができ、前記ベクターは真核宿主細胞（例えばＣＯＳまたはＣＨＯ細胞）を形質転換またはトランスフェクションさせることができる。一旦ベクターを適切な宿主に導入すれば、ヌクレオチド配列の高レベル発現及びプラスミノゲンの収集及び精製の条件下において宿主を維持できる。
【００６８】
適切な発現ベクターは通常宿主体内において附加体または宿主染色体ＤＮＡの整合部分として複製される。通常、発現ベクターは選択マーカー（例えばアンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性またはネオマイシン耐性）を含み、外部由来に期待のＤＮＡ配列によって形質転換されたそれらの細胞に対して測定を行うことに有用である。
【００６９】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）はターゲット抗体をコードするポリヌクレオチドのクローンに用いられる原核宿主細胞の例である。その他の使用に適した微生物宿主は桿菌を含み、例えばバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びその他の腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えばサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、及び各種シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種である。これらの原核宿主において、発現ベクターを生成でき、通常は宿主細胞と許容する発現制御配列（例えば複製開始点）を含むものである。また、多くの公知のプロモーターが存在し、例えば乳糖プロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、またはファージλ由来のプロモーター系である。プロモーターは通常発現を制御し、遺伝子配列を操縦する場合、さらにリボソームの結合位置配列を有し、転写及び翻訳を起動させてもよい。
【００７０】
その他の微生物、例えば酵母も発現に用いることができる。酵母（例えば出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））及びピキア（Ｐｉｃｈｉａ）が適した酵母宿主細胞の例であり、そのうちの適切な担体は必要に応じて発現制御配列（例えばプロモーター）、複製開始点、終止配列など含む。典型的なプロモーターは３−ホスホグリセリン酸キナーゼ及びその他の糖分解酵素を含む。誘導型酵母はエタノール脱水素酵素、イソ細胞色素Ｃ、及び麦芽糖とガラクトースの利用のための酵素のプロモーターによって起動される。
【００７１】
微生物以外に、哺乳動物細胞（例えば体外細胞培養物中において培養された哺乳動物細胞）も本発明のプラスミノゲンの発現に用いることができる（例えばターゲット抗−Ｔａｕ抗体をコードするポリヌクレオチド）。例えばＷｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）参照。適した哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞系、各種Ｃｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、及び形質転換されたＢ細胞またはハイブリドーマである。これらの細胞に用いられる発現ベクターは発現制御配列、例えば複製開始点、プロモーター、及びエンハンサー（Ｑｕｅｅｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、及び必要とされる加工情報位置、例えばリボソームの結合位置、ＲＮＡの切断位置、ポリアデノシン酸化位置、及び転写終止子配列を含むことができる。適切な発現制御配列の例はウサギ免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウィルス、サイトメガロウイルスなどの派生のプロモーターである。Ｃｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照すること。
【００７２】
一旦合成（化学または組み換え方式）されれば、本分野の標準的な手順、例えば硫酸アンモニウム沈殿、アフィニテイカラム、カラムクロマトグラフィー、高速液相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ゲル電気泳動などにより本発明に記載のプラスミノゲンを精製することができる。該プラスミノゲンは基本的に純粋なものであり、例えば少なくとも約８０％から８５％の純度で、少なくとも約８５％〜９０％の純度で、少なくとも約９０％〜９５％の純度で、または９８％〜９９％の純度またはさらに純度が高いものであり、例えば汚染物を含まず、前記汚染物は例えば細胞砕片、ターゲット抗体以外の大分子などである。
【００７３】
３．薬物配合剤
必要とする純度のプラスミノゲンと選択可能な薬用担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．ｅｄ．（１９８０））を混合して凍結乾燥製剤または水溶液を形成して治療用配合剤を得る。許容可能な担体、賦形剤、安定剤は所要の用量及び濃度下において被験者に対して毒性がなく、さらに例えばリン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸などの緩衝剤を含む。抗酸化剤はアスコルビン酸和メチオニンを含む；防腐剤（例えばベンジルジメチルステアリルアンモニウムクロリド水和物；塩化ヘキサメチレンジアミン；塩化ベンザルコニウム（ｂｅｎｚａｌｋｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブタノールまたはベンジルエタノール；アルキルパラヒドロキシ安息香酸エステル、例えばメチルまたはプロピルのパラヒドロキシ安息香酸エステル；ピロカテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンチルエタノール；ｍ−クレゾール）；低分子量ポリペプチド（少なくとも１０個の残基を有するもの）；タンパク質例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリゼニールピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンである；単糖、二糖及びその他の炭水化物はブドウ糖、マンノース、またはデキストリンを含む；キレート剤は例えばＥＤＴＡである；糖類は例えばショ糖、マンニトール、フコースまたはソルビトールである；塩形成イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば亜鉛−タンパク複合体）；及び／または非イオン界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。好ましくは凍結乾燥された抗−ＶＥＧＦ抗体配合剤であり、ＷＯ  ９７／０４８０１に記載されているとおりであり、本明細書において参考とされるものである。
【００７４】
本発明の配合剤は治療を必要とする具体的な症状の必要とする一種類以上の活性化合物を含有してもよく、好ましくは活性が相補的で互いに副作用を有しないものである。例えば、血圧降下薬、抗不整脈薬、糖尿病治療薬等である。
【００７５】
本発明のプラスミノゲンは例えば凝集技術または界面重合によって作られるマイクロカプセル中に被包されることができ、例えば、膠質薬物輸送系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン剤、ナノ粒子及びナノカプセル）中に入れまたはエマルジョン状液中のヒドロキシメチルセルロースまたはゲルーマイクロカプセル及びポリ―（メタアクリル酸メチル）マイクロカプセル中に入れることができる。これらの技術は以下に開示されている。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）。
【００７６】
体内に投与することに用いられる本発明のプラスミノゲンは必ず無菌である必要がある。これは凍結乾燥及び再度配合する前または後に除菌ろ過膜でろ過することで容易に実現できる。
【００７７】
本発明のプラスミノゲンは緩衝製剤を調製できる。緩衝製剤の適切な実例は一定の形状を有し且つ糖タンパクを含む固体の疎水性重合体の半透過基質を含み、例えば膜またはマイクロカプセルである。緩衝基質の実例はポリエステル、水性ゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタアクリル酸エステル）（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））またはポリ（ビニールエタノール）、ポリラクチド（米国特許３７７３９１９，ＥＰ  ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγメチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎ，ら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７（１９８３）），分解できないエチレン−ビニルアセテート（ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｖｉｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）（Ｌａｎｇｅｒ，ら，出所は前記と同じ）、または分解可能な乳酸−ヒドロキシ酢酸共重合体、例えばＬｕｐｒｏｎ  ＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸−ヒドロキシ酢酸共重合体及びリュープロレリン（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）酢酸エステルからなる注射可能なミクロスフェア体）、及びポリＤ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。重合体、例えばエチレン−酢酸エチル及び乳酸−ヒドロキシ酢酸は、持続的に１００日間以上分子を放出することができ、しかしいくつかの水性ゲルがタンパク質を放出する時間は比較的短い。関連のメカニズムに応じてタンパク質を安定化させる合理的なストラテジーにより設計できる。例えば、凝集のメカニズムが硫化ジスルフィド結合の交換によって分子間Ｓ−Ｓ結合を形成するであれば、メルカプト基残基を修飾することにより、酸性溶液中から凍結乾燥させ、湿度を制御し、適切な添加剤を用いて、及び特定の重合体基質組成物を開発することで安定化を実現する。
【００７８】
４．投与及び使用量
異なる方式、例えば静脈内、腹膜内、皮下、頭蓋骨内、髄腔内、動脈内（例えば頸動脈）、筋肉内、鼻内、体表または皮内投与または脊髄または脳内輸送により本発明の薬物組成物の投与を実現できる。エアロゾル製剤例えば鼻噴霧製剤は活性剤を含有する精製した水性またはその他の溶液及び防腐剤と等張剤を含有する。このような製剤を鼻粘膜と許容し得るｐＨ及び等張状態に調整する。
【００７９】
一部の場合において、以下の方式により本発明のプラスミノゲン薬物組成物を修飾または調製することができ、これにより血液脳関門を貫通する能力を提供する。各種腸内及び胃腸外の投与ルート、内服、静脈内等を含むもので血栓及び／または血栓関連疾患を患っている個体に対してこのようなプラスミノゲン組成物を投与する。
【００８０】
胃腸外での投与に用いられる製造物は無菌水性または非水性溶液、懸濁液及び乳剤を含む。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は水、アルコール性／水性溶液、乳剤または懸濁液を含み、食塩水及び緩衝媒介を含む。胃腸外媒介物は塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、または固定油である。静脈内媒介物は液体及び栄養補充物、電気分解補充物などを含む。されには防腐剤及びその他の添加剤、例えば抗微生物製剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなども存在してもよい。
【００８１】
いくつかの実施形態において、本発明のプラスミノゲンは血液脳関門の通過を促進する薬剤と配合されている。いくつかの場合において、本発明のプラスミノゲンは直接またはアダプターにより血液脳関門の通過を促進する担体分子、ペプチドまたはタンパク質と融合する。一部の実施形態において、本発明のプラスミノゲンは内在性血液脳関門（ＢＢＢ）受容体に結合するポリペプチドと融合する。プラスミノゲンと内在性血液脳関門受容体に結合するポリペプチドは、ＢＢＢの通過を促進する。内在性血液脳関門（ＢＢＢ）受容体に結合するポリペプチドは抗体、例えばモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントを含み、それは特異的に内在性ＢＢＢ受容体に結合する。適切な内在性ＢＢＢ受
容体はインスリン受容体を含むがこれに限られず、抗体はリポソームに内包されたものである。例えば米国特許公開文書Ｎｏ．２００９／０１５６４９８を参照すること。
【００８２】
医療関係者は各種臨床的要素により用量案を決めることができる。例えば医学分野で公知のように、任意の患者の用量は複数の要素によって決められ、これらの要素は患者の体型、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与回数及び経路、全体の健康度、及び同時に投与するその他の薬物を含む。本発明が含有するプラスミノゲンの薬物組成物の用量の範囲は例えば被験者体重に対して毎日約０．０００１〜２０００ｍｇ／ｋｇであり、または約０．００１〜５００ｍｇ／ｋｇ（例えば０．０２ｍｇ／ｋｇ，０．２５ｍｇ／ｋｇ，０．５ｍｇ／ｋｇ，０．７５ｍｇ／ｋｇ，１０ｍｇ／ｋｇ，５０ｍｇ／ｋｇなど）である。例えば、用量は１ｍｇ／ｋｇ体重または５０ｍｇ／ｋｇ体重または１−５０ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができ、または少なくとも１ｍｇ／ｋｇである。この例示性の範囲より高いまたは低い用量もカバーされ、特に前記の要素を考慮した場合である。前記範囲中の中間用量も本発明の範囲内に含まれるものである。被験者は毎日、隔日、毎週または経験分析によって決められた任意のスケジュール表に従ってこのような用量を投与できる。例示的な用量の日程表は連続数日１−１０ｍｇ／ｋｇ投与することである。本発明の薬物の投与過程において血栓及び血栓関連疾患の治療効果及び安全性はリアルタイムに評価、定期的に評価すべきである。
【００８３】
５．治療効力及び治療安全性
本発明の一つの実施形態はプラスミノゲンを用いて被験者を治療した後、治療効力及び治療安全性に対して判断を行うことに係る。
【００８４】
治療効力評価：治療開始週間（ベースライン週）からあらかじめ設定された治療ステージまでの間に被験者に対して日常の平均疼痛評価を行い、前記評価は例えば１１点ＶＡＳ量表による疼痛スコア付け、ＬＡＮＳＳ量表、神経病理性疼痛量表（ＮＰＳ）またはＬｉｋｅｒｔ量表（０−１０点に応じてレベル評価を行う）などによって行われる。例えばＶＡＳ量表であり、０は痛みがない、１１は痛みが耐えられないことを示している。そのうち、
０点：痛みがない；
３点以下：軽微な痛みがあるが、我慢できる；
４−６点：被験者が痛みを感じて且つ睡眠に影響しているが、まだ我慢できる；
７−１０点：被験者には強い痛みがあり、痛みが我慢しづらく、食欲と睡眠に影響を及ぼす。
【００８５】
より精細なＶＡＳ量表でスコア付けを行うこともでき、例えば１００−ミリスケールにより疼痛を評価する。
【００８６】
疼痛指数を主な評価指標とし、これとともに二次的な評価指標を設置し、例えば関節活動度、機能状況、クオリティ・オブ・ライフなどである。
【００８７】
安全性評価：また、本発明はプラスミノゲン及びそのバリアントを使用して被験者に対して治療を行うプロセス中、及び治療後における、前記治療案の安全性に対する判断に係り、有害事象のモニタリング、臨床実験室評価、心電図（ＥＣＧ）、バイタルサイン測定、及び物理及び神経検査等を含むがこれらに限られず、さらに被験者の薬物の血清半減期、治療半減期、半数中毒量（ＴＤ５０）、半数致死量（ＬＤ５０）に対して統計を行う。有害事象は薬物を投与する患者または臨床試験被験者における如何なる不利な医学事象として定義され、前記事象は該治療と因果関係を有する必要がない。そのうち有害事象は頭
痛、めまい、上気道感染、悪心等を含むがこれらに限られない。
【００８８】
６．製品または薬物キット
本発明の一つの実施形態は製品または薬物キットに係るものであり、本発明のプラスミノゲン／プラスミンを含有する。前記製品は好ましくは一つの容器、ラベルまたはパンフレットを含む。適切な容器はボトル、小瓶、注射器などである。容器は各種材料例えばガラスまたはプラスチックから作られることができる。前記容器は組成物を含有し、前記組成物は本発明の疾患または症状を有効に治療し且つ無菌の入口を有する（例えば前記容器は静脈輸液用パックまたは小瓶であり、皮下注射針によって貫通される栓を含む）。前記組成物中の少なくとも一種類の活性化剤がプラスミノゲン／プラスミンである。前記容器上にあるまたは添付されているラベルは前記組成物を本発明の前記糖尿病神経損傷の治療に用いられると説明するものである。前記製品はさらに薬用緩衝液を含有する第二容器を含み、前記薬用緩衝液は例えばリン酸塩緩衝の食塩水、リンガー溶液及びブドウ糖溶液である。さらには商業及び使用者の角度から見ると必要とされるその他の物質、即ちその他の緩衝液、希釈剤、濾過物、針及び注射器を含むことができる。また、前記製品は使用説明を有するパンフレットを含み、これは例えば前記組成物の使用者にプラスミノゲン組成物及び疾患の治療に伴うその他の薬物を患者に投与することを指示するものである。
【実施例１】
【００８９】
実施例１はプラスミノゲンの実験動物体重に対する影響に関するものである。
【００９０】
１４−１５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス１０匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループ各５匹ずつである。実験開始当日を０日目として体重計測してグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与し始め、且つ１日目と記録する。プラスミノゲン投与グループマウスに対して１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。０、３、６、１２日目にそれぞれ体重を測定する。結果は以下を示している。プラスミノゲン投与グループと溶媒ＰＢＳ投与対照グループは０、３、６、１２日目において体重に顕著な差異がない（図１）。これは、プラスミノゲンは動物体重に対して影響が大きくないことを示している。
【実施例２】
【００９１】
実施例２はプラスミノゲンの糖尿病マウスの疼痛感知能力に対する修復促進に関するものである。
【００９２】
１４−１５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス１０匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ対照グループ及びプラスミノゲン投与グループで、各グループ５匹ずつである。
【００９３】
実験開始当日を０日目として体重計測してグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与し始め、且つ１日目と記録する。プラスミノゲン投与グループマウスに対して１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。プラスミノゲン投与後の０、３、６、１２日目にＶｏｎ−Ｆｒｅｙファイバー（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ，ＵＳＡ）を用いて動物の機械性損傷に関する感受度を測定する。２．０ｇの力を開始力として、まずその左足を測定する。５回の刺激中に４回の足を引っ込める反応があれば陽性で、該動物の機械的損傷に対する閾値と記録する。２．０ｇの力の刺激反応が陰性であれば、１ランク大きい力でその右足を刺激し、このように左右足を交互に刺激し、陽性反応が見られるまで行う（非特許文献３１）。Ｖｏｎ−Ｆｒｅｙファイバー実験の統計結果が
示すように、投薬３日後及び投薬１１日後にいずれもその５０％疼痛に対する閾値は顕著に溶媒ＰＢＳ投与対照グループより低く（図２）、これはプラスミノゲンの糖尿病マウスの機械的接触によって誘発される疼痛（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ａｌｌｏｄｙｎｉａ）に対する応答能力の修復を示している。
【実施例３】
【００９４】
実施例３はプラスミノゲンの糖尿病マウスの冷刺激に対する神経感知の回復に関するものである。
【００９５】
１４−１５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス１０匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループで、各グループ５匹ずつである。実験開始当日を０日目として体重計測してグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与し始め、且つ１日目と記録する。プラスミノゲン投与グループマウスに対して１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。投薬後の０、３、６、１２日目に針注射器で一滴のアセトン液滴を押し出してさらに糖尿病マウスの足裏に接触させ、それが足裏全体を覆うようにする。左足から始め、３分間間隔で交互にその左右足を刺激し、全部で１０回刺激し、その足を引っ込める反応の回数を統計する。反応パーセンテージ＝足を引っ込めた回数／刺激回数×１００のパーセンテージである。
【００９６】
実験結果は以下を示している。０及び３日目に、プラスミノゲン投与グループ及び溶媒ＰＢＳ投与対照グループはアセトン刺激に対して顕著な差異がなく、６日目から顕著な差異が観察され、１２日目に極めて顕著な差異が観察されている（図３）。これは投薬から６日後に冷たさに対する感覚が顕著に敏感になり、１２日目に顕著な差異が現れていることを示している。これは、プラスミノゲンは極めて顕著に糖尿病マウスの冷刺激に対する神経感知損傷を修復していることを示している。
【実施例４】
【００９７】
実施例４はプラスミノゲンの糖尿病マウスの機械的な疼痛に対する感知の修復の促進に関するものである。
【００９８】
１４−１５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス１０匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループで、各グループ５匹ずつである。実験開始当日を０日目として体重計測してグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与し始め、且つ１日目と記録する。プラスミノゲン投与グループマウスに対して１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。プラスミノゲンを投与した後の０、３、６、１２日目に２７番標準規格注射針（２７ｇａｕｇｅ−ｎｅｅｄｌｅ）でマウスの足裏に軽く接触するが真皮層を穿刺しない力加減でｄｂ／ｄｂマウスの足裏を刺激し、左足から始め、３分間間隔で交互にその左右足を刺激し、全部で１０回刺激し、その足を引っ込める反応の回数をカウントする。反応パーセンテージ＝足を引っ込めた回数／刺激回数×１００のパーセンテージである。プラスミノゲン投与グループと溶媒ＰＢＳ投与対照グループの針穿刺反応に対する差異は極めて顕著で、Ｐ値は０．０００１より小さい（図４）。これは、プラスミノゲンは極めて顕著に糖尿病によってもたらされた神経の機械性疼痛に対する感知の損傷を回復させたことを示している。
【実施例５】
【００９９】
実施例５はプラスミノゲンの糖尿病マウス後期の神経損傷マウスに対する体重の影響を示したものである。
【０１００】
２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス１０匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループで、各グループ５匹ずつである。実験開始当日を０日目として体重計測してグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与し始め、且つ１日目と記録し、連続的に１５日間投薬する。プラスミノゲン投与グループマウスに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。０、４、７、１１、１６日目にそれぞれ体重を測定する。結果は以下を示している。プラスミノゲン投与グループと溶媒ＰＢＳ投与対照グループは０、４、７、１１、１６日目において体重に顕著な差異がない（図５）。これは、プラスミノゲンは動物体重に対して影響が大きくないことを示している。
【実施例６】
【０１０１】
実施例６はプラスミノゲンの糖尿病後期神経損傷マウスの機械的な誘発による疼痛に対する感知能力の修復促進に関するものである。
【０１０２】
２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス１０匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ対照グループ及びプラスミノゲン投与グループで、各グループ５匹ずつである。実験開始当日を０日目として体重計測してグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与し始め、且つ１日目と記録する。連続的に１５日間投薬する。プラスミノゲン投与グループマウスに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。プラスミノゲン投与後の０、４、７、１１、１６日目にＶｏｎ−Ｆｒｅｙファイバー（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ，ＵＳＡ）を用いて動物の機械性損傷に関する感受度を測定する。２．０ｇの力を開始力として、まずその左足を測定する。５回の刺激中に２回の足を引っ込める反応があれば陽性で、陽性であれば、１ランク小さい力でその右足に対して刺激を行う；陰性であれば、１ランク大きい力でその右足を刺激し、このように左右足を交互に刺激し、刺激の間隔は５分間であり、全部で６回刺激し、それからＳ．Ｒ．Ｃｈａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）（非特許文献３２）で紹介した方法によりその５０％足の引っ込めが生じる閾値を計算する。
【０１０３】
研究により、溶媒ＰＢＳ投与対照グループと比較して、プラスミノゲン投与グループの糖尿病マウスの機械的誘発疼痛に対する反応の均一性が増加し、且つ１６日目測定した際に溶媒ＰＢＳ投与対照グループと比較して極めて顕著な差異が見られている（図６）。これはプラスミノゲンが神経損傷末期の糖尿病マウスの機械的な誘発による疼痛（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ａｌｌｏｄｙｎｉａ）に対する応答能力を修復していることを示している。
【実施例７】
【０１０４】
実施例７はプラスミノゲンの糖尿病後期神経損傷マウスの冷刺激に対する感知の回復に関するものである。
【０１０５】
２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス１０匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループで、各グループ５匹ずつである。実験開始当日を０日目として体重計測してグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与し始め、且つ１日目と記録する。連続的に１５日間投薬する。プラスミノゲン投与グループマウスに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。投薬後の０、４、７、１１、１６日目に針注射器で一滴のアセトン液滴を押し出してさらに糖尿病マウスの足裏に接触させ、それが足裏全体を覆うように
する。左足から始め、３分間間隔で交互にその左右足を刺激し、全部で１０回刺激し、その足を引っ込める反応の回数をカウントする。反応パーセンテージ＝足を引っ込めた回数／刺激回数×１００のパーセンテージである。
実験結果は以下を示している。０及び４日目に、プラスミノゲン投与グループ及び溶媒ＰＢＳ投与対照グループはアセトン刺激に対して顕著な差異がなく、７日目から顕著な差異が観察され、１６日目に極めて顕著な差異が観察され、Ｐ値＜０．０００１である（図７）。これは投薬から１５日後に、糖尿病マウスは冷刺激に対する反応がほとんど完全に回復していることを回復し、これは、プラスミノゲンは極めて顕著に糖尿病末期マウスの冷刺激に対する刺激損傷を修復していることを示している。
【実施例８】
【０１０６】
実施例８はプラスミノゲンの糖尿病後期神経損傷マウスの機械性の疼痛に対する感知の修復の促進に関するものである。
【０１０７】
２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス１０匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループであり、各グループ５匹ずつである。実験開始当日を０日目として体重計測してグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与し始め、且つ１日目と記録する。連続的に１５日間投与する。プラスミノゲン投与グループマウスに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。プラスミノゲンを投与した後の０、４、７、１１、１６日目に２７番標準規格注射針（２７ｇａｕｇｅ−ｎｅｅｄｌｅ）でマウスの足裏に軽く接触するが真皮層を穿刺しない力加減でｄｂ／ｄｂマウスの足裏を刺激し、左足から始め、３分間間隔で交互にその左右足を刺激し、全部で１０回刺激し、その足を引っ込める反応の回数をカウントする。反応パーセンテージ＝足を引っ込めた回数／刺激回数×１００のパーセンテージである。
【０１０８】
実験結果は以下を示している。プラスミノゲンを投与した７日目またはより早く糖尿病後期神経損傷マウスの針刺激痛の感知に対する異なる程度の回復が見られ、１１日及び１６日目にプラスミノゲン投与グループ及び溶媒ＰＢＳ投与対照グループマウスは針刺激反応に対して極めて顕著な差異、及び顕著な差異が見られている（図８）。これはプラスミノゲンが顕著に糖尿病後期マウスの機械性の疼痛に対する感知を顕著に修復したことを示している。
【実施例９】
【０１０９】
実施例９はプラスミノゲンの糖尿病後期神経損傷マウスの神経組織損傷に対する保護作用に関するものである。
【０１１０】
２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス１０匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループであり、各グループ５匹ずつである。実験開始当日を０日目として体重計測してグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与し始め、且つ１日目と記録する。連続的に１５日間投薬する。プラスミノゲン投与グループマウスに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。１６日目にマウスを殺処分して坐骨神経を取り１０％中性ホルマリン固定液中において２４時間固定する。固定後の坐骨神経をエタノールで段階的に脱水させ及びキシレンで透明にした後にパラフィンで包埋させる。組織切片の厚みは５μｍで、切片を脱パラフィンさせて再水和した後にヘマトキシリン及びエオジンで染色させ（ＨＥ染色）、１％塩酸エタノールで分化させ、アンモニア水で安定化させ、さらにエタノールで段階的に脱水させて封入する。切片を顕微鏡下において４００倍下にて観察する
。
【０１１１】
実験結果は以下を示している。溶媒ＰＢＳ投与対照グループの坐骨神経繊維の隙間が広くなり、比較的大きい数量のミエリン鞘軸索の腫れが見られ（↑）、少量の軸索の崩壊が見られている（▲）（図９Ａ）。しかしプラスミノゲン投与グループは神経繊維の配列が緊密で、少量のミエリン鞘軸索の腫れ、崩壊が見られるのみである（図９Ｂ）。これは、プラスミノゲンが糖尿病後期マウスの神経組織損傷に対して一定の修復作用を有することを示している。
【実施例１０】
【０１１２】
実施例１０はプラスミノゲンが糖尿病後期の神経損傷マウスの神経組織フィブリンレベルを減少させることに関するものである。
【０１１３】
２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス１０匹を準備し、ランダムで二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミン投与グループであり、各グループ５匹ずつである。実験開始当日を０日目として体重測定してからグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して１日目と記録する。連続的に１５日間投与する。プラスミノゲン投与グループに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じてプラスミノゲンを尾部から静脈注射を行い、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。１６日目にマウスを殺処分してから坐骨神経を取り、１０％中性ホルマリン固定液にて２４時間固定する。固定後の坐骨神経をエタノールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透明にした後にパラフィンで包埋させる。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに再水和して１回水洗いして、ＰＡＰマーカーで組織を囲む。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、３回水洗いする。１０％の正常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間封止する；余分の血清を吸い取る。ウサギ抗マウスフィブリン（フィブリノーゲン）抗体（Ａｂｃａｍ）室温で１時間インキュベーションしまたは４℃で終夜インキュベーションし、ＴＢＳで３回洗う。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＴＢＳで３回洗う。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ
ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で顕色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒再染色して、流水で５分間洗い流す。透明になるよう段階的に脱水してから封止を行い、顕微鏡下で４００倍下にて切片を観察する。
【０１１４】
フィブリノーゲンはフィブリンの前駆体であり、組織に損傷が存在する状況下において、有機体の損傷に対する刺激応答反応として、フィブリノーゲンは加水分解してフィブリンとなる（非特許文献３３〜３５）。そのためフィブリノーゲンレベルを損傷の程度の一つの指標とすることができる。
【０１１５】
研究により以下が示されている。溶媒ＰＢＳ投与対照グループ（図１０Ａ）と比較して、プラスミノゲン投与グループ（図１０Ｂ）のマウス坐骨神経のフィブリンのレベルが低下し、これはプラスミノゲンが神経組織の損傷をある程度修復していることを示している。
【実施例１１】
【０１１６】
実施例１１はプラスミノゲンが糖尿病末期肝臓組織フィブリンレベルを低減させることに関するものである。
【０１１７】
２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス１０匹を準備し、ランダムで二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミン投与グループであり、各グループ５匹ずつである。実験開始当日を０日目として体重測定してからグループ分けを行い、実験２
日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して１日目と記録する。連続的に３１日間投与する。プラスミノゲン投与グループに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じてプラスミノゲンを尾部から静脈注射を行い、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。３２日目にマウスを殺処分してから肝臓を取り、１０％中性ホルマリン固定液にて２４時間固定する。固定後の腎臓組織をエタノールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透明にした後にパラフィンで包埋させる。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに再水和して１回水洗いする。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、２回水洗いし、毎回５分間である。１０％の正常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間封止する；時間になった後に、ヒツジ血清液を廃棄し、ＰＡＰマーカーで組織を囲む。ウサギ抗マウスフィブリン（フィブリノーゲン）抗体（Ａｂｃａｍ）４℃で終夜インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間である。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間である。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で顕色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒再染色して、流水で５分間洗い流す。透明になるよう段階的に脱水してから封止を行い、顕微鏡下で２００倍下にて切片を観察する。
【０１１８】
フィブリノーゲンはフィブリンの前駆体であり、組織に損傷が存在する状況下において、有機体の損傷に対する刺激応答反応として、フィブリノーゲンは加水分解してフィブリンとなる（非特許文献３３〜３５）。そのためフィブリノーゲンレベルを損傷の程度の一つの指標とすることができる。
【０１１９】
研究により以下が示されている。溶媒ＰＢＳ投与対照グループ（図１１Ａ）と比較して、プラスミノゲン投与グループ（図１１Ｂ）のマウス肝臓組織のフィブリンの陽性着色が浅く、これはプラスミノゲンを注射することで顕著に糖尿病マウス肝臓フィブリンの沈着を低減させ、プラスミノゲンは糖尿病マウスの肝臓損傷に対して顕著な修復効果を有することが示されている。
【実施例１２】
【０１２０】
実施例１２はプラスミノゲンの糖尿病末期マウス肝臓組織の炎症修復に関するものである。
【０１２１】
２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス１０匹準備し、ランダムで二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミン投与グループであり、各グループ５匹である。実験開始当日を０日目として体重測定してからグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して１日目と記録する。連続的に３１日間投与する。プラスミノゲン投与グループのマウスに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じてプラスミノゲンを尾部から静脈注射を行い、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。プラスミノゲンを３１日間投与した後にマウスを殺処分してから肝臓組織を取り、１０％中性ホルマリン固定液中にて２４時間固定する。固定後の肝臓組織をエタノールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透明にした後にパラフィンで包埋させる。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに再水和して１回水洗いする。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、２回水洗いし、毎回５分間である。１０％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間封止する；時間になった後に、血清を遠心により廃棄し、ＰＡＰマーカーで組織を囲む。Ｆ４／８０のウサギポリグローナル抗体（Ａｂｃａｍ）４℃で終夜インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間である。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗う。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）
で顕色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒再染色して、流水で５分間洗い流す。透明になるよう段階的に脱水してから封止させ、切片を顕微鏡下で４００倍にて観察する。
【０１２２】
Ｆ４／８０はマクロファージマーカーである。マクロファージは炎症段階の主なマクロファージ細胞であり、炎症反応の程度及びステージを表している。プラスミノゲン投与グループ（図１２Ｂ）と溶媒ＰＢＳ投与対照グループ（図１２Ａ）を比較した場合、プラスミノゲン投与グループのネズミのＦ４／８０陽性レベルは明らかに低下し、これはプラスミノゲンを投与した後の肝臓組織の炎症の程度が減軽されていることを示している。図１２ＣはＦ４／８０免疫組織陽性発現数の定量分析の結果であり、プラスミノゲン投与グループのＦ４／８０の発現量が顕著に減少され、且つ統計学的差異を有し、プラスミノゲンは糖尿病マウスの肝臓炎症の修復を顕著に促進できることを示している。
【実施例１３】
【０１２３】
実施例１３はプラスミノゲンの糖尿病末期マウス腎臓フィブリン加水分解の促進に関するものである。
【０１２４】
２４−２５週齢ｄｂ／ｄｂオスマウスを２０匹準備し、ランダムで二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミン投与グループであり、各グループ１０匹である。実験開始当日を０日目として体重測定してからグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して１日目と記録する。連続的に３１日間投与する。プラスミノゲン投与グループに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じてプラスミノゲンを尾部から静脈注射を行い、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。３２日目にマウスを殺処分してから腎臓を取り、１０％中性ホルマリン固定液にて２４時間固定する。固定後の腎臓組織をエタノールで段階的に脱水させ及びキシレンで透明化処理した後にパラフィンで包埋処理を行う。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに再水和して１回水洗いする。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、２回水洗いし、毎回５分間である。１０％の正常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間封止する；時間になった後に、ヒツジ血清液を廃棄し、ＰＡＰマーカーで組織を囲む。ウサギ抗マウスフィブリン（フィブリノーゲン）抗体（Ａｂｃａｍ）４℃で終夜インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間である。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間である。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で顕色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒再染色して、流水で５分間流す。透明になるよう段階的に脱水してから封止させ、顕微鏡下で２００倍にて切片を観察する。
【０１２５】
フィブリノーゲンはフィブリンの前駆体であり、組織に損傷が存在する状況下において、有機体の損傷に対する刺激応答反応として、フィブリノーゲンは加水分解してフィブリンとなって損傷部位に沈着する（非特許文献３３〜３５）。そのためフィブリノーゲンレベルを損傷の程度の一つの指標とすることができる。
【０１２６】
結果により、プラスミノゲン投与グループ（図１３Ｂ）は溶媒ＰＢＳ投与対照グループ（図１３Ａ）と比較した場合、フィブリノゲンの陽性着色が浅い。これはプラスミノゲンを注射することで顕著に糖尿病マウスの腎臓フィブリン沈着を低下させることができ、プラスミノゲンは糖尿病マウスの腎臓ダメージに対して顕著な修復作用を有することが示されている。
【実施例１４】
【０１２７】
実施例１４はプラスミノゲンの糖尿病末期マウスの腎臓アポトーシス阻害タンパクＢｃ
ｌ−２の発現促進に関するものである。
【０１２８】
２４−２５週齢ｄｂ／ｄｂオスマウスを２０匹準備し、ランダムで二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミン投与グループであり、各グループ１０匹ずつである。実験開始当日を０日目として体重測定してからグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して１日目と記録する。連続的に３１日間投与する。プラスミノゲン投与グループに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じてプラスミノゲンを尾部静脈から注射を行い、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。３２日目にマウスを殺処分し、腎臓を取り１０％中性ホルマリン固定液中において２４時間固定させる。固定後の腎臓組織をエタノールで段階的に脱水させ及びキシレンで透明化処理した後にパラフィンで包埋処理を行う。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに再水和して１回水洗いする。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、２回水洗いし、毎回５分間である。１０％の正常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間封止する；時間になった後に、ヒツジ血清液を廃棄し、ＰＡＰマーカーで組織を囲む。ウサギ抗マウスＢｃｌ−２抗体（Ａｂｃａｍ）４℃で終夜インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間である。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間である。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で顕色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒再染色して、流水で５分間流す。透明になるよう段階的に脱水させてから封止を行い、顕微鏡下で２００倍下にて切片を観察する。
【０１２９】
Ｂｃｌ−２は細胞アポトーシス阻害タンパクであり、アポトーシス刺激因子の作用下において発現が減少するように制御される（非特許文献３６、３７）。結果は以下を示している。プラスミノゲン投与グループ（図１４Ｂ）の腎細管上皮細胞の陽性発現着色は明らかに溶媒ＰＢＳ投与対照グループ（図１４Ａ）より深く、且つ前者の着色範囲がより広い。定量分析結果は観察結果と一致し、且つ顕著な差異を有する（図１４Ｃに示す通り）。これは、プラスミノゲンは糖尿病マウス腎臓アポトーシス阻害分子Ｂｃｌ−２的の発現を促進させ、これにより糖尿病マウス腎臓組織細胞のアポトーシスを阻害することを示している。
【実施例１５】
【０１３０】
実施例１５はプラスミノゲンの糖尿病末期マウスの網膜損傷に対する改善に関するものである。
【０１３１】
２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス２０匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループとプラスミノゲン投与グループで、各グループ１０匹ずつである。実験開始当日を０日目として体重計測してグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して且つ１日目と記録し、３１日間連続的に投与する。プラスミノゲン投与グループのマウスに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒ＰＢＳ投与グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。３２日目にマウスを殺処分して左側眼球を取り、パラホルムアルデヒド固定液において２４時間固定を行う。固定後の眼球から網膜を剥離した後、１ｍＬ  ３％パンクレアチン（Ｓｏｌａｒｂｉｏ）のＥＰチューブ中に入れ、振動テーブルにおいて３７℃で２〜３ｈ振動消化させる。網膜に軟化、脱落の現象が現れてからていねいに網膜を蒸留水の入ったＥＰチューブ中に移し、振動テーブルにおいて３７℃で２〜３ｈ振動させ、網膜上の余分な組織を脱落させる。優しく網膜を処理し、血管層のみが残るようにしてからスライド上にサンプルを広げて載せ、自然乾燥させる。網膜をＳｃｈｉｆｆ氏液で染色させ（ＰＡＳ染色）、１％塩酸エタノールで分化させ、アンモニア水で安定化させ、さらにエタノールで段階的に脱水させてキシレンで透明にしてから封入を行い、顕微鏡下で４
００倍下にて観察を行う。
【０１３２】
実験結果から分かるように、プラスミノゲン投与グループ（図１５Ｂ）と比較して、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ（図１５Ａ）のｄｂ／ｄｂマウス網膜毛細血管の管径の太さが不均一で、血管の管壁が厚くなり深く染色させ、血管内皮細胞（Δ）が増殖し、周細胞（↓）が明らかに減少している。これに対してプラスミノゲン投与グループは病理的改変に明らかに減軽されている；定量分析により、プラスミノゲン投与グループは溶媒ＰＢＳ投与対照グループと比較した場合、無細胞血管の長さ（図１５Ｃ）が顕著に低下し、且つ統計学的分析結果から顕著な差異があると示されている。これはプラスミノゲンが糖尿病後期のマウス網膜損傷の修復を顕著に促進できることを示している。
【実施例１６】
【０１３３】
実施例１６はプラスミノゲンの糖尿病によってもたらされる網膜微小血栓の溶解の促進に関するものである。
【０１３４】
２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス１０匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループとプラスミノゲン投与グループで、各グループ５匹ずつである。実験開始当日を０日目として体重計測してグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して且つ１日目と記録し、１５日間連続的に投与する。プラスミノゲン投与グループのマウスに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒ＰＢＳ投与グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。１６日目に眼球を摘出して採血し、全血を静置した後に血清を用いて血液中のＤ−二量体の含有量（Ｄ−ｄｉｍｅｒ）を測定する。
【０１３５】
結果は以下を示している。投薬１５日後に、血清中のＤ−二量体の含有量が顕著に上昇し（図１６）、これはプラスミノゲンを投与した後に、糖尿病によってもたらされる微小血栓が顕著に溶解していることを示している。
【実施例１７】
【０１３６】
実施例１７はプラスミノゲンの糖尿病末期心筋損傷の修復促進に関するものである。
【０１３７】
２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス２８匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ１２匹で、プラスミノゲン投与グループ１６匹である。実験開始当日を０日目として体重計測してグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与し始め、且つ１日目と記録する。連続的に３１日間投与する。プラスミノゲン投与グループマウスに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し，溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。３２日目に眼球を摘出して採血を行い、３５００ｒ／ｍｉｎにて１５−２０分間遠心を行い、さらに上澄み液を取って心筋トロポニンＩの濃度測定を行う。
【０１３８】
心筋トロポニンＩ（ｃａｒｄｉａｃ  ｔｒｏｐｏｎｉｎ，ＣＴＮＩ）は心筋損傷の重要なマーカーであり、その血清濃度は心筋損傷の程度を反映できる（非特許文献３８）。結果は以下を示している。プラスミノゲン投与グループの心筋トロポニンＩの濃度は明らかに溶媒ＰＢＳ対照グループより低く、且つ極めて顕著な統計学差異を有する（図１７）。これはプラスミノゲンが糖尿病後期のマウスの心筋損傷の修復を顕著に促進できることを示している。
【実施例１８】
【０１３９】
実施例１８はプラスミノゲンの糖尿病末期マウスの腎臓損傷を低減させることに関するものである。
【０１４０】
２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス８匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループで、毎組各４匹である。実験開始当日を０日目として体重計測してグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与し始め、且つ１日目と記録する。連続的に３１日間投与する。プラスミノゲン投与グループマウスに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。３２日目に生理的指標を測定してから、マウスを殺処分して肝臓組織を取り１０％中性ホルマリン固定液中において２４時間固定させる。固定した後の肝臓組織をエタノールで段階的に脱水させ及びキシレンで透明にした後にパラフィンで包埋させる。組織切片の厚みは５μｍで、切片を脱パラフィンさせて再水和した後にさらに１回水洗いする。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、２回水洗いし、毎回５分間である。ヤギ抗マウスＩｇＭ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）室温で１時間インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間である。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で顕色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒再染色して、流水で５分間洗い流す。透明になるよう段階的に脱水させてから封止させ、顕微鏡下で４００倍下にて切片を観察する。
【０１４１】
ＩｇＭ抗体はアポトーシス及び壊死した細胞を除去する過程において重要な役割を果たしている（非特許文献３９〜４１）。そのため、それは組織器官の損傷状況を反映することができる。
【０１４２】
結果は以下を示している。プラスミノゲン投与グループ（図１８Ｂ）のマウス腎糸球体ＩｇＭの陽性着色は溶媒ＰＢＳ投与対照グループより浅く（図１８Ａ）、且つ範囲も対照グループより小さく、統計分析の結果と観察結果は一致している（図１８Ｃ）。これはプラスミノゲンを注射した後の腎糸球体の損傷が明らかに改善され、プラスミノゲンは糖尿病マウスの生体損傷に対して顕著な修復機能を有することを反映している。
【実施例１９】
【０１４３】
実施例１９はプラスミノゲンの糖尿病マウス肝臓損傷の修復促進に関するものである。
【０１４４】
２５−２８週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス９匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ３匹、プラスミノゲン投与グループ６匹である。実験開始当日を０日目として体重計測してグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与し始め、且つ１日目と記録する。連続的に３１日間投与する。プラスミノゲン投与グループマウスに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し，溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。プラスミノゲンを３１日間投与した後に眼球を摘出して全血を採取し、血清が析出してから４℃、３５００ｒ／ｍｉｎにて１０分間遠心させ、上澄み液を取って測定を行う。本実験はグルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素測定薬物キット（南京建成生物工程研究所、品番Ｃ００９−２）を使用して、ライトマン−フランケル法（Ｒｅｉｔｍａｎ−Ｆｒａｎｋｅｌ）を用いて血清中のグルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素（ＡＬＴ）の含有量を測定する。
【０１４５】
グルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素は肝臓の健康状態を示す重要な指標であり（非特許文献４２、４３）、グルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素の正常参考値の範囲は９〜５０Ｕ／Ｌである。測定結果は以下を示している。溶媒ＰＢＳ投与対照グループの血清中のＡＬＴの含有量は明らかに正常な生理的数値より高く、プラスミノゲン投与グループは既に体内の正常レベルに戻り、且つプラスミノゲン投与グループは溶媒ＰＢＳ投与対照グループより顕著に低く、且つ統計学的差異を有する（図１９）。これは糖尿病末期
モデルマウスにおいて、プラスミノゲンを注射することでより効果的に肝損傷を修復できることを示している。
【実施例２０】
【０１４６】
実施例２０はプラスミノゲンの糖尿病マウスの痛覚感知能力の修復促進に関するものである。
【０１４７】
８週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス８匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループで、４匹ずつである。実験開始当日を０日目として体重計測してグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与し始め、且つ１日目と記録する。連続的に８日間投与する。プラスミノゲン投与グループマウスに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し，溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。プラスミノゲン投与後の０、３、６、９日目にＶｏｎ−Ｆｒｅｙファイバー（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ，ＵＳＡ）を用いて動物の機械性損傷に関する感受度を測定する。２．０ｇの力を開始力として、まずその左足を測定する。５回の刺激中に２回の足を引っ込める反応があれば陽性で、陽性であれば、１ランク小さい力でその右足に対して刺激を行う；陰性であれば、１ランク大きい力でその右足を刺激し、このように左右足を交互に刺激し、刺激の間隔は５分間であり、全部で６回刺激し、それからＳ．Ｒ．Ｃｈａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）（非特許文献３２）で紹介した方法によりその５０％足の引っ込めが生じる閾値を計算する。
【０１４８】
ｄｂ／ｄｂマウスは４週前後で糖尿病マウスとなり、８−１２週で痛覚過敏が生じ、１２週以後に痛覚脱感作となる（非引用文献４５、４６）。そのため、８週齢の痛覚過敏期にあるｄｂ／ｄｂマウスを選択して実験を行う。
【０１４９】
結果は以下を示している。溶媒ＰＢＳ投与対照グループと比較して、プラスミノゲン投与グループのマウスの痛覚閾値が顕著に上昇している（図２０）。これは、プラスミノゲンは糖尿病早期神経損傷による痛覚過敏（過剰感知）を顕著に減軽できることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年3月18日(2020.3.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書又は図面に記載の発明。