(57)【要約】      （修正有）【課題】短縮ガイドＲＮＡ（ｔｒｕ−ｇＲＮＡ）を用いて、ＲＮＡ誘導型ゲノム編集、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を用いた編集の特異性を増大させる方法の提供。【解決手段】細胞におけるＲＮＡ誘導型ゲノム編集の特異性を増大させる方法であって、前記細胞と、選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチドに相補的な１７〜１８ヌクレオチドからなる相補性領域を含むガイドＲＮＡとを接触させることを含む、方法。【選択図】図２−６
2020120661.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞におけるＲＮＡ誘導型ゲノム編集の特異性を増大させる方法であって、前記細胞と
、選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチドに相補的な１７
〜１８ヌクレオチドからなる相補性領域を含むガイドＲＮＡとを接触させることを含む、
方法。
【請求項２】
細胞内の二本鎖ＤＮＡ分子の標的領域に切断を誘発する方法であって、
Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはＣａｓ９ニッカーゼと、
二本鎖ＤＮＡ分子の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチドに相補的な１７〜１８ヌ
クレオチドからなる相補性領域を含むガイドＲＮＡと
を前記細胞内で発現させるか、前記細胞内に導入することを含む、方法。
【請求項３】
細胞内の二本鎖ＤＮＡ分子の標的領域を修飾する方法であって、
ｄＣａｓ９−異種機能ドメイン融合タンパク質（ｄＣａｓ９−ＨＦＤ）と、
選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチドに相補的な１７
〜１８ヌクレオチドからなる相補性領域を含むガイドＲＮＡと
を前記細胞内で発現させるか、前記細胞内に導入することを含む、方法。
【請求項４】
前記ガイドＲＮＡが、
（ｉ）選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチドに相補的
な１７〜１８ヌクレオチドからなる相補性領域を含む単一ガイドＲＮＡまたは
（ｉｉ）選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチドに相補
的な１７〜１８ヌクレオチドからなる相補性領域を含むｃｒＲＮＡ、およびｔｒａｃｒＲ
ＮＡ
である、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
前記ガイドＲＮＡが、
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号２４０４）
；
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ
（配列番号２４０７）；または
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号２
４０８）；
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡ
ＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（ＸＮ）（配列番号１）、
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＡＡＡＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧ
ＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣ（ＸＮ）（配列番号２）、
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧＧＡＡＡＣＡＡＡＡ
ＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣ（ＸＮ）
（配列番号３）、
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡ
ＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣ
ＧＧＵＧＣ（ＸＮ）（配列番号４）、
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡ
ＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣ
ＧＧＵＧＣ（配列番号５）；
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡ
ＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧ
ＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号６）；または
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡ
ＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧ
ＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号７）
からなる群より選択されるリボ核酸であるか、これを含み、
Ｘ１７〜１８が、選択される標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ（Ｐ
ＡＭ）の５’側に隣接する標的配列の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチドに相補的
な相補性領域であり、ＸＮが、前記リボ核酸とＣａｓ９との結合に干渉しない任意の配列
であり、Ｎが０〜２００、例えば、０〜１００、０〜５０または０〜２０であり得る、
請求項１〜３に記載の方法。
【請求項６】
１７〜１８ヌクレオチドの標的相補性領域を有する、ガイドＲＮＡ分子。
【請求項７】
前記標的相補性領域が１７〜１８ヌクレオチドからなる、請求項６に記載のｇＲＮＡ。
【請求項８】
前記標的相補性領域が１７〜１８ヌクレオチドの標的相補性からなる、請求項６に記載
のｇＲＮＡ。
【請求項９】
以下の配列
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号２４０４）
；
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ
（配列番号２４０７）；または
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号２
４０８）；
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡ
ＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（ＸＮ）（配列番号１）、
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＡＡＡＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧ
ＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣ（ＸＮ）（配列番号２）、
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧＧＡＡＡＣＡＡＡＡ
ＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣ（ＸＮ）
（配列番号３）、
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡ
ＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣ
ＧＧＵＧＣ（ＸＮ）（配列番号４）、
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡ
ＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣ
ＧＧＵＧＣ（配列番号５）；
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡ
ＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧ
ＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号６）；または
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡ
ＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧ
ＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号７）
からなり、
Ｘ１７〜１８が、選択される標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ（Ｐ
ＡＭ）の５’側に隣接する標的配列の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチドに相補的
な配列であり、ＸＮが、前記リボ核酸とＣａｓ９との結合に干渉しない任意の配列であり
、Ｎが０〜２００、例えば、０〜１００、０〜５０または０〜２０であり得る、
請求項６に記載のｇＲＮＡ。
【請求項１０】
前記リボ核酸が、前記リボ核酸分子の３’末端に１つまたは複数のＵを含む、請求項５
に記載の方法または請求項６に記載のリボ核酸。
【請求項１１】
前記リボ核酸が、前記ＲＮＡ分子の５’末端に前記標的配列に相補的ではない１つまた
は複数の追加のヌクレオチドを含む、請求項５に記載の方法または請求項６に記載のリボ
核酸。
【請求項１２】
前記リボ核酸が、前記ＲＮＡ分子の５’末端に前記標的配列に相補的ではない１つ、２
つまたは３つの追加のヌクレオチドを含む、請求項５に記載の方法または請求項６に記載
のリボ核酸。
【請求項１３】
前記相補性領域が、選択される標的配列の相補鎖の連続する１７ヌクレオチドに相補的
である、請求項１〜５に記載の方法または請求項６〜１２に記載のリボ核酸。
【請求項１４】
前記相補性領域が、選択される標的配列の相補鎖の連続する１８ヌクレオチドに相補的
である、請求項１〜５に記載の方法または請求項６〜１２に記載のリボ核酸。
【請求項１５】
請求項６〜１４のリボ核酸をコードする、ＤＮＡ分子。
【請求項１６】
請求項１５に記載のＤＮＡ分子を含む、ベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載のベクターを発現する、宿主細胞。
【請求項１８】
前記標的領域が標的ゲノム配列内にある、請求項１〜５に記載の方法または請求項６〜
１２に記載のリボ核酸。
【請求項１９】
前記標的ゲノム配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側に隣接する
、請求項１〜５に記載の方法または請求項６〜１２に記載のリボ核酸。
前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、以下の配列
ＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵ
ＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ
（配列番号８）もしくはその活性部分；
ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡ
ＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２４０５）もしくはその活性部
分；
ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵ
ＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２４０７）もしくはそ
の活性部分；
ＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡ
ＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２４０９
）もしくはその活性部分；
ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡ
ＡＡＡＧＵＧ（配列番号２４１０）もしくはその活性部分；
ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡ（配列番号２４
１１）もしくはその活性部分；または
ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（配列番号２４１２）もしく
はその活性部分
からなる、請求項４に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｃＲＮＡが（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣ
ＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号２４０７）であり、前記ｔｒａｃｒＲＮＡがＧＧＡＡＣＣＡＵ
ＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡ
ＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号８）であ
るか；前記ｃＲＮＡが（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（
配列番号２４０４）であり、前記ｔｒａｃｒＲＮＡがＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡ
ＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧ
ＧＵＧＣ（配列番号２４０５）であるか；または前記ｃＲＮＡが（Ｘ１７〜１８またはＸ
１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号２４０８）であり、前記ｔｒ
ａｃｒＲＮＡがＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡ
ＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２４０６
）である、請求項４に記載の方法。
【請求項２１】
前記ｄＣａｓ９−異種機能ドメイン融合タンパク質（ｄＣａｓ９−ＨＦＤ）が、遺伝子
発現、ヒストンまたはＤＮＡを修飾するＨＦＤを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項２２】
前記異種機能ドメインが、転写活性化ドメイン、ＤＮＡ脱メチル化を触媒する酵素、ヒ
ストン修飾を触媒する酵素、または転写サイレンシングドメインである、請求項２１に記
載の方法。
【請求項２３】
前記転写活性化ドメインが、ＶＰ６４またはＮＦ−κＢ  ｐ６５由来のものである、請
求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ヒストン修飾を触媒する酵素が、ＬＳＤ１、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（
ＨＮＭＴ）、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ
（ＨＤＡＣ）またはヒストンデメチラーゼである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記転写サイレンシングドメインが、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）、例え
ばＨＰ１αまたはＨＰ１β由来のものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記選択される標的ゲノム配列に挿入欠失変異または配列変化を生じさせる、請求項１
〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞が真核細胞である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権の主張）
本願は、２０１３年３月１５日に出願された米国特許出願第６１／７９９，６４７号；
２０１３年６月２１日に出願された米国特許出願第６１／８３８，１７８号；２０１３年
６月２１日に出願された米国特許出願第６１／８３８，１４８号および２０１３年１２月
２６日に出願された米国特許出願第６１／９２１，００７号の利益を主張するものである
。上記出願の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（連邦支援による研究または開発）
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成番号ＤＰ１  ＧＭ１０５３７８の
下、政府の支援を受けてなされたものである。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
短縮ガイドＲＮＡ（ｔｒｕ−ｇＲＮＡ）を用いて、ＲＮＡ誘導型ゲノム編集、例えばＣ
ＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を用いた編集の特異性を増大させる方法。
【背景技術】
【０００４】
近年の研究では、クラスター化され等間隔にスペーサーが入った短い回文型の反復配列
（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系（Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔら，Ｎａｔｕ
ｒｅ  ４８２，３３１−３３８（２０１２）；Ｈｏｒｖａｔｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２
７，１６７−１７０（２０１０）；Ｔｅｒｎｓら，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ  １４，３２１−３２７（２０１１））が、細菌、酵母およびヒト細胞のほか、ショ
ウジョウバエ、ゼブラフィッシュおよびマウスなどのそのままの生物体においてｉｎ  ｖ
ｉｖｏでゲノム編集を実施するための基盤としての役割を果たし得ることが明らかにされ
ている（Ｗａｎｇら，Ｃｅｌｌ  １５３，９１０−９１８（２０１３）；Ｓｈｅｎら，Ｃ
ｅｌｌ  Ｒｅｓ（２０１３）；Ｄｉｃａｒｌｏら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ
（２０１３）；Ｊｉａｎｇら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，２３３−２３９（
２０１３）；Ｊｉｎｅｋら，Ｅｌｉｆｅ  ２，ｅ００４７１（２０１３）；Ｈｗａｎｇら
，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，２２７−２２９（２０１３）；Ｃｏｎｇら，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８１９−８２３（２０１３）；Ｍａｌｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３
３９，８２３−８２６（２０１３ｃ）；Ｃｈｏら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１
，２３０−２３２（２０１３）；Ｇｒａｔｚら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９４（４）：１０
２９−３５（２０１３））。化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９ヌ
クレアーゼ（以降、単にＣａｓ９と呼ぶ）は、人工的に設計されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮ
Ａ）の最初の２０ヌクレオチドと、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、例えば、
配列ＮＧＧまたはＮＡＧにマッチするＰＡＭに隣接する目的とする標的ゲノムＤＮＡ配列
の相補鎖との間の塩基対相補性を介して誘導され得る（Ｓｈｅｎら，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ（
２０１３）；Ｄｉｃａｒｌｏら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（２０１３）；Ｊ
ｉａｎｇら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，２３３−２３９（２０１３）；Ｊｉ
ｎｅｋら，Ｅｌｉｆｅ  ２，ｅ００４７１（２０１３）；Ｈｗａｎｇら，Ｎａｔ  Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，２２７−２２９（２０１３）；Ｃｏｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３
３９，８１９−８２３（２０１３）；Ｍａｌｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８２３−８
２６（２０１３ｃ）；Ｃｈｏら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，２３０−２３２
（２０１３）；Ｊｉｎｅｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７，８１６−８２１（２０１２））
。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Ｊｉｎｅｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７，８１６−８２１（２０１
２））、細菌（Ｊｉａｎｇら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，２３３−２３９（
２０１３））およびヒト細胞（Ｃｏｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８１９−８２３（
２０１３））で実施されたこれまでの研究では、Ｃａｓ９を介した切断が、場合によって
は、ｇＲＮＡ／標的部位接合部、特に２０ヌクレオチド（ｎｔ）ｇＲＮＡ相補性領域の３
’末端にある最後の１０〜１２ｎｔにおける単一のミスマッチによって無効になり得るこ
とが示されている。
【発明の概要】
【０００５】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓゲノム編集では、相補性領域（塩基対形成によって標的ＤＮＡと
結合する）とＣａｓ９結合領域をともに含むガイドＲＮＡを用いて、Ｃａｓ９ヌクレアー
ゼを標的ＤＮＡに誘導する（図１を参照されたい）。このヌクレアーゼは相補性領域にお
けるいくつかのミスマッチ（本明細書に示されるように、最大５つまで）を許容し、なお
も切断することが可能であるが、任意の単一のミスマッチまたはミスマッチの組合せが活
性に及ぼす影響を予測するのは困難である。まとめると、これらのヌクレアーゼは著しい
オフターゲット効果を示し得るが、その部位を予測するのが困難であり得る。本明細書に
は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いるゲノム編集、例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ９ベー
スの融合タンパク質を用いるゲノム編集の特異性を増大させる方法が記載される。具体的
には、短縮された標的相補性領域（すなわち、２０ｎｔ未満、例えば１７〜１９ｎｔまた
は１７〜１８ｎｔの標的相補性、例えば１７ｎｔ、１８ｎｔまたは１９ｎｔの標的相補性
）を含む短縮ガイドＲＮＡ（ｔｒｕ−ｇＲＮＡ）およびそれらの使用方法が提供される。
本明細書で使用される「１７〜１８」または「１７〜１９」には１７ヌクレオチド、１８
ヌクレオチドまたは１９ヌクレオチドが含まれる。
【０００６】
一態様では、本発明は、１７〜１８ヌクレオチドまたは１７〜１９ヌクレオチドの標的
相補性領域、例えば、１７〜１８ヌクレオチドまたは１７〜１９ヌクレオチドからなる標
的相補性領域、例えば、１７〜１８ヌクレオチドまたは１７〜１９ヌクレオチドの連続す
る標的相補性からなる標的相補性領域を有するガイドＲＮＡ分子（例えば、単一のガイド
ＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ）を提供する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、選択
される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチドまたは１７〜１９ヌク
レオチドに相補的な１７〜１８ヌクレオチドまたは１７〜１９ヌクレオチドからなる相補
性領域を含む。いくつかの実施形態では、標的相補性領域は、１７〜１８ヌクレオチド（
の標的相補性）からなる。いくつかの実施形態では、相補性領域は、選択される標的配列
の相補鎖の連続する１７ヌクレオチドに相補的である。いくつかの実施形態では、相補性
領域は、選択される標的配列の相補鎖の連続する１８ヌクレオチドに相補的である。
【０００７】
別の態様では、本発明は、配列：
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号２４０４）；
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（
配列番号２４０７）；または
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号２４
０８）；
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧ
ＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（ＸＮ）（配列番号１）；
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＡＡＡＡＧＣ
ＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣ（ＸＮ）（配列番
号２）；
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧＧ
ＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵ
ＵＡＵＣ（ＸＮ）（配列番号３）；
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡ
ＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧ
ＧＵＧＣ（ＸＮ）（配列番号４）、
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧ
ＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣ
ＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号５）；
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡ
ＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧ
ＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号６）；または
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡ
ＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧ
ＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号７）；
からなるリボ核酸を提供し、配列中、Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９は、選択される標
的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、例えばＮＧＧ、ＮＡＧま
たはＮＮＧＧの５’側に隣接する標的配列の相補鎖に相補的な（１７〜１８ヌクレオチド
または１７〜１９ヌクレオチドの）配列であり（例えば、図１の構造を参照されたい）、
ＸＮは、リボ核酸とＣａｓ９との結合に干渉しない任意の配列であり、（ＲＮＡ中の）Ｎ
は０〜２００、例えば、０〜１００、０〜５０または０〜２０であり得る。Ｘ１７〜１８
またはＸ１７〜１９は、ＲＮＡの残りの部分に隣接して自然に発生する配列と同一である
ことは決してない。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ  ＰｏｌＩＩＩ転写を停止させる終
止シグナルとして用いられる１つまたは複数のＴが任意選択で存在するので、ＲＮＡは分
子の３’末端に１つまたは複数のＵ、例えば、１〜８つまたはそれ以上のＵ（例えば、Ｕ
、ＵＵ、ＵＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵＵ
ＵＵ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ＲＮＡ分子の５’末端に標的配列に
相補的ではない１つまたは複数、例えば最大３つ、例えば１つ、２つまたは３つの追加の
ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的相補性領域は、１７〜１８ヌクレオ
チド（の標的相補性）からなる。いくつかの実施形態では、相補性領域は、選択される標
的配列の相補鎖の連続する１７ヌクレオチドに相補的である。いくつかの実施形態では、
相補性領域は、連続する１８に相補的である。
【０００８】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のリボ核酸をコードするＤＮＡ分子およびリ
ボ核酸またはベクターを保有または発現する宿主細胞を提供する。
【０００９】
さらなる態様では、本発明は、細胞でのＲＮＡ誘導型ゲノム編集の特異性を増大させる
方法を提供し、この方法は、細胞と、選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する１７
〜１８ヌクレオチドまたは１７〜１９ヌクレオチドに相補的な１７〜１８ヌクレオチドま
たは１７〜１９ヌクレオチドからなる相補性領域を含む本明細書に記載のガイドＲＮＡと
を接触させることを含む。
【００１０】
さらに別の態様では、本発明は、例えば細胞のゲノム配列内の二本鎖ＤＮＡ分子の標的
領域に一本鎖または二本鎖の切断を誘導する方法を提供する。この方法は、Ｃａｓ９ヌク
レアーゼまたはニッカーゼ；および選択される標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣
接モチーフ（ＰＡＭ）、例えばＮＧＧ、ＮＡＧまたはＮＮＧＧの５’側に隣接する標的配
列の相補鎖に相補的な１７ヌクレオチドまたは１８ヌクレオチドまたは１９ヌクレオチド
からなる配列を含むガイドＲＮＡ、例えば、本明細書に記載のリボ核酸を細胞内で発現さ
せるか、細胞内に導入することを含む。
【００１１】
本明細書にはこのほか、細胞内の二本鎖ＤＮＡ分子の標的領域を修飾する方法が提供さ
れる。この方法は、ｄＣａｓ９−異種機能ドメイン融合タンパク質（ｄＣａｓ９−ＨＦＤ
）；および選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチドまたは
１７〜１９ヌクレオチドに相補的な１７〜１８ヌクレオチドまたは１７〜１９ヌクレオチ
ドからなる相補性領域を含む本明細書に記載のガイドＲＮＡを細胞内で発現させるか、細
胞内に導入することを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、（ｉ）選択される標的ゲノム配列の相補鎖
の連続する１７〜１８ヌクレオチドもしくは１７〜１９ヌクレオチドに相補的な１７〜１
８ヌクレオチドもしくは１７〜１９ヌクレオチドからなる相補性領域を含む単一ガイドＲ
ＮＡまたは（ｉｉ）選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチ
ドもしくは１７〜１９ヌクレオチドに相補的な１７〜１８ヌクレオチドもしくは１７〜１
９ヌクレオチドからなる相補性領域を含むｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡである。
【００１３】
いくつかの実施形態では、標的相補性領域は１７〜１８ヌクレオチド（の標的相補性）
からなる。いくつかの実施形態では、相補性領域は、選択される標的配列の相補鎖の連続
する１７ヌクレオチドに相補的である。いくつかの実施形態では、相補性領域は、連続す
る１８に相補的である。
【００１４】
本明細書に記載のいかなる分子のＸ１７〜１８またはＸ１７〜１９も、ＲＮＡの残りの
部分に隣接して自然に発生する配列と同一であるものは決してない。いくつかの実施形態
では、ＲＮＡ  ＰｏｌＩＩＩ転写を停止させる終止シグナルとして用いられる１つまたは
複数のＴが任意選択で存在するので、ＲＮＡは分子の３’末端に１つまたは複数のＵ、例
えば、１〜８つまたはそれ以上のＵ（例えば、Ｕ、ＵＵ、ＵＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵ
、ＵＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵＵＵＵ）を含む。いくつかの実施形態では
、ＲＮＡは、標的配列に相補的ではない１つまたは複数、例えば最大３つ、例えば１つ、
２つまたは３つの追加のヌクレオチドをＲＮＡ分子の５’末端に含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡの１つまたは複数のヌクレオチド、例えば、標的相補
性領域Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９の内部または外部の１つまたは複数のヌクレオチ
ドが修飾されている、例えば、ロックされている（２’−Ｏ−４’−Ｃメチレン架橋）、
５’−メチルシチジンである、２’−Ｏ−メチル−プソイドウリジンである、あるいはリ
ボースリン酸骨格がポリアミド鎖に置き換わっている。いくつかの実施形態では、ｔｒａ
ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡの一部または全部が、例えばＸ１７〜１８またはＸ１７〜１
９標的相補性領域の内部または外部に、デオキシリボヌクレオチドを含む（例えば、全部
または一部がＤＮＡである、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである）。
【００１６】
ほかの態様では、本発明は、例えば細胞のゲノム配列内の二本鎖ＤＮＡ分子の標的領域
を修飾する方法を提供する。この方法は、ｄＣａｓ９−異種機能ドメイン融合タンパク質
（ｄＣａｓ９−ＨＦＤ）；および選択される標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接
モチーフ（ＰＡＭ）、例えばＮＧＧ、ＮＡＧまたはＮＮＧＧの５’側に隣接する標的配列
の相補鎖に相補的な１７〜１８ヌクレオチドまたは１７〜１９ヌクレオチドからなる配列
を含むガイドＲＮＡ、例えば、本明細書に記載のリボ核酸を細胞内で発現させるか、細胞
内に導入することを含む。Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９は、ＲＮＡの残りの部分に隣
接して自然に発生する配列と同一であることは決してない。いくつかの実施形態では、Ｒ
ＮＡは、標的配列に相補的ではない１つまたは複数、例えば最大３つ、例えば１つ、２つ
または３つの追加のヌクレオチドをＲＮＡ分子の５’末端に含む。
【００１７】
別の態様では、本発明は、例えば細胞のゲノム配列内の二本鎖ＤＮＡ分子の標的領域を
修飾する、例えば、このような領域内に配列特異的切断を導入する方法を提供する。この
方法は、
Ｃａｓ９ヌクレアーゼもしくはニッカーゼまたはｄＣａｓ９−異種機能ドメイン融合タン
パク質（ｄＣａｓ９−ＨＦＤ）と、
ｔｒａｃｒＲＮＡ、例えば、配列ＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡ
ＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧ
ＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号８）もしくはその活性部分；
ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡ
ＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２４０５）もしくはその活性部分
；
ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵ
ＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２４０７）もしくはその
活性部分；
ＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵ
ＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２４０９）
もしくはその活性部分；
ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡ
ＡＡＧＵＧ（配列番号２４１０）もしくはその活性部分；
ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡ（配列番号２４１
１）もしくはその活性部分；または
ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（配列番号２４１２）もしくは
その活性部分を含むか、これよりなるｔｒａｃｒＲＮＡと、
選択される標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、例えばＮＧ
Ｇ、ＮＡＧまたはＮＮＧＧの５’側に隣接する標的配列の相補鎖に相補的な１７〜１８ヌ
クレオチドまたは１７〜１９ヌクレオチドからなる配列を含む、ｃｒＲＮＡと
を細胞内で発現させるか、細胞内に導入することを含み、いくつかの実施形態では、ｃｒ
ＲＮＡは配列：
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号２４０４）；
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（
配列番号２４０７）；または
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号２４
０８）
を有する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡが（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵ
ＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号２４０７）であり、かつｔｒａｃｒＲ
ＮＡがＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧ
ＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵ
ＧＣ（配列番号８）である；ｃＲＮＡが（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵ
ＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号２４０４）であり、かつｔｒａｃｒＲＮＡがＵＡＧＣＡＡＧＵ
ＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡ
ＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２４０５）である；あるいはｃＲＮＡが（Ｘ１７〜
１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号２４０８）であ
り、かつｔｒａｃｒＲＮＡがＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵ
ＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列
番号２４０６）である。
【００１９】
Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９は、ＲＮＡの残りの部分に隣接して自然に発生する配
列と同一であることは決してない。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ  ＰｏｌＩＩＩ転写
を停止させる終止シグナルとして用いられる１つまたは複数のＴが任意選択で存在するの
で、ＲＮＡ（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ）は、分子の３’末端に１つま
たは複数のＵ、例えば、２〜８つまたはそれ以上のＵ（例えば、Ｕ、ＵＵ、ＵＵＵ、ＵＵ
ＵＵ、ＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵＵＵＵ）を含む。いくつ
かの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ）は、ＲＮＡ分
子の５’末端に標的配列に相補的ではない１つまたは複数、例えば最大３つ、例えば１つ
、２つまたは３つの追加のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡま
たはｔｒａｃｒＲＮＡの１つまたは複数のヌクレオチド、例えば、配列Ｘ１７〜１８また
はＸ１７〜１９の内部または外部の１つまたは複数のヌクレオチドが修飾されている、例
えば、ロックされている（２’−Ｏ−４’−Ｃメチレン架橋）、５’−メチルシチジンで
ある、２’−Ｏ−メチル−プソイドウリジンである、あるいはリボースリン酸骨格がポリ
アミド鎖に置き換わっている。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡまたはｃｒＲ
ＮＡの一部または全部が、例えばＸ１７〜１８またはＸ１７〜１９標的相補性領域の内部
または外部に、デオキシリボヌクレオチドを含む（例えば、全部または一部がＤＮＡであ
る、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである）。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９−異種機能ドメイン融合タンパク質（ｄＣａｓ９
−ＨＦＤ）は、遺伝子発現、ヒストンもしくはＤＮＡを修飾するＨＦＤ、例えば、転写活
性化ドメイン、転写リプレッサー（例えば、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）、
例えばＨＰ１αもしくはＨＰ１βなどのサイレンサー）、ＤＮＡのメチル化状態を修飾す
る酵素（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）もしくはＴＥＴタンパク
質、例えばＴＥＴ１）またはヒストンサブユニットを修飾する酵素（例えば、ヒストンア
セチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）もしくはヒ
ストンデメチラーゼ）を含む。好ましい実施形態では、異種機能ドメインは、転写活性化
ドメイン、例えばＶＰ６４もしくはＮＦ−κＢ  ｐ６５転写活性化ドメイン；ＤＮＡ脱メ
チル化を触媒する酵素、例えばＴＥＴタンパク質ファミリーのメンバーもしくはこのよう
なファミリーのメンバーのうちの１つの触媒ドメイン；またはヒストン修飾（例えば、Ｌ
ＳＤ１、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ＨＤＡＣもしくはＨＡＴ）もしくは転写サ
イレンシングドメイン、例えば、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）、例えばＨＰ
１αもしくはＨＰ１βの転写サイレンシングドメイン；または生物学的テザー、例えば、
ＭＳ２、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓサブタイプＹｐｅｓｔタンパク質４（Ｃｓｙ４）もしくは
ラムダＮタンパク質である。ｄＣａｓ９−ＨＦＤについては、２０１３年３月１５日に出
願された代理人整理番号００７８６−０８８２Ｐ０２の米国仮特許出願第６１／７９９，
６４７号、２０１３年６月２１日に出願された米国特許出願第６１／８３８，１４８号お
よび国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１４／２７３３５号に記載されており、上記出願はすべてその
全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法によって、選択される標的ゲノム配列
に挿入欠失変異または配列変化が生じる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、細胞は真核細胞、例えば哺乳動物細胞、例えばヒト細胞であ
る。
【００２３】
特に明記されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はいずれも、本
発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に
は本発明で使用する方法および材料が記載されるが、ほかにも、当該技術分野で公知の他
の適切な方法および材料を使用することができる。材料、方法および具体例は単に例示的
なものであって、限定することを意図するものではない。本明細書で言及される刊行物、
特許出願、特許、配列、データベースエントリをはじめとする参照物はいずれも、その全
体が参照により組み込まれる。不一致が生じた場合、定義を含めた本明細書が優先される
．
【００２４】
本発明のその他の特徴と利点は、以下の詳細な説明および図面ならびに特許請求の範囲
から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１：標的ＤＮＡ部位と結合したｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ複合体を示す模式図である。鋏はゲノムＤＮＡ標的部位のＣａｓ９ヌクレアーゼのおよその切断点を示す。ガイドＲＮＡのヌクレオチドの番号が５’から３’に向かって逆向きに進むことに留意されたい。
【図２−１】図２Ａ：ｇＲＮＡの５’相補性領域を短縮する原理を示す模式図である。灰色の太線＝標的ＤＮＡ部位、濃い灰色の細線の構造＝ｇＲＮＡであり、黒線はｇＲＮＡと標的ＤＮＡ部位との間の塩基対形成（またはその欠如）を示している。
【図２−２】図２Ｂ：ＥＧＦＰ崩壊アッセイの模式的概観である。単一の組み込まれたＥＧＦＰ−ＰＥＳＴレポーター遺伝子の標的化Ｃａｓ９仲介性二本鎖切断が、誤りがちなＮＨＥＪ仲介性修復によって修復されると、細胞にコード配列を崩壊させるフレームシフト変異およびそれに付随する蛍光の消失が起こる。
【図２−３】図２Ｃ〜図２Ｆ：ＥＧＦＰレポーター遺伝子配列の３つの異なる標的部位でアッセイした、（Ｃ）単一ミスマッチ、（Ｄ）隣接する二重ミスマッチ、（Ｅ）様々な間隔の二重ミスマッチおよび（Ｆ）数の増加する隣接するミスマッチを有する単一ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を保有するＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）の活性。反復試験の活性を、完全にマッチする単一ｇＲＮＡの活性に正規化した平均値が示されている。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。各単一ｇＲＮＡのミスマッチの位置が下の格子に灰色で強調されている。３つのＥＧＦＰ標的部位の配列は以下の通りであった：  ＥＧＦＰ部位１  ＧＧＧＣＡＣＧＧＧＣＡＧＣＴＴＧＣＣＧＧＴＧＧ（配列番号９）  ＥＧＦＰ部位２  ＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧＴＣＧＧ（配列番号１０）  ＥＧＦＰ部位３  ＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧ（配列番号１１）
【図２−４】図２Ｃ〜図２Ｆ：ＥＧＦＰレポーター遺伝子配列の３つの異なる標的部位でアッセイした、（Ｃ）単一ミスマッチ、（Ｄ）隣接する二重ミスマッチ、（Ｅ）様々な間隔の二重ミスマッチおよび（Ｆ）数の増加する隣接するミスマッチを有する単一ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を保有するＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）の活性。反復試験の活性を、完全にマッチする単一ｇＲＮＡの活性に正規化した平均値が示されている。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。各単一ｇＲＮＡのミスマッチの位置が下の格子に灰色で強調されている。３つのＥＧＦＰ標的部位の配列は以下の通りであった：  ＥＧＦＰ部位１  ＧＧＧＣＡＣＧＧＧＣＡＧＣＴＴＧＣＣＧＧＴＧＧ（配列番号９）  ＥＧＦＰ部位２  ＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧＴＣＧＧ（配列番号１０）  ＥＧＦＰ部位３  ＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧ（配列番号１１）
【図２−５】図２Ｃ〜図２Ｆ：ＥＧＦＰレポーター遺伝子配列の３つの異なる標的部位でアッセイした、（Ｃ）単一ミスマッチ、（Ｄ）隣接する二重ミスマッチ、（Ｅ）様々な間隔の二重ミスマッチおよび（Ｆ）数の増加する隣接するミスマッチを有する単一ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を保有するＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）の活性。反復試験の活性を、完全にマッチする単一ｇＲＮＡの活性に正規化した平均値が示されている。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。各単一ｇＲＮＡのミスマッチの位置が下の格子に灰色で強調されている。３つのＥＧＦＰ標的部位の配列は以下の通りであった：  ＥＧＦＰ部位１  ＧＧＧＣＡＣＧＧＧＣＡＧＣＴＴＧＣＣＧＧＴＧＧ（配列番号９）  ＥＧＦＰ部位２  ＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧＴＣＧＧ（配列番号１０）  ＥＧＦＰ部位３  ＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧ（配列番号１１）
【図２−６】図２Ｇ：ｇＲＮＡの５’末端のミスマッチの方が３’のミスマッチよりもＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの感度が高くなる。ｇＲＮＡは、ワトソン−クリックトランスバージョンを用いてミスマッチさせた「ｍ」で表される位置を除いて、ＲＮＡとＤＮＡとの間でワトソン−クリック塩基対を形成する（すなわち、ＥＧＦＰ部位＃２  Ｍ１８−１９は、位置１８および１９でｇＲＮＡをそのワトソン−クリックパートナーに変化させることによってミスマッチさせたものである）。ｇＲＮＡの５’付近の位置は一般に許容性が極めて高いが、他の残基がミスマッチである場合、この位置でのマッチがヌクレアーゼ活性には重要である。４つの位置すべてがミスマッチである場合、ヌクレアーゼ活性はもはや検出されなくなる。このことはさらに、この５’の位置でのマッチがほかにも３’の位置に生じたミスマッチを相殺し得ることを示している。これらの実験はコドン最適化型よりも低い絶対レベルのヌクレアーゼ活性を示し得る非コドン最適化型のＣａｓ９を用いて実施したものであることに留意されたい。    図２Ｈ：ヒト細胞ベースのＵ２ＯＳ  ＥＧＦＰ崩壊アッセイにおいて１５〜２５ｎｔの範囲の様々な長さの相補性領域を有するｇＲＮＡによって誘導されたＣａｓ９ヌクレアーゼ活性の効率。Ｕ６プロモーターからのｇＲＮＡ発現には５’Ｇの存在が必要であるため、標的ＤＮＡ部位に対して特定の長さの相補性（１５ｎｔ、１７ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２３ｎｔおよび２５ｎｔ）を保有するｇＲＮＡに限り評価することが可能であった。
【図３−１】図３Ａ：Ｃａｓ９およびＥＧＦＰレポーター遺伝子の４か所の標的部位に対する完全長ｇＲＮＡまたは短縮ｇＲＮＡによって仲介されるＥＧＦＰ崩壊のヒト細胞における効率。相補性領域の長さおよび対応する標的ＤＮＡ部位が示されている。Ｃｔｒｌ＝相補性領域を欠く対照ｇＲＮＡ。
【図３−２】図３Ｂ：マッチする標準的なＲＧＮ（Ｃａｓ９および標準的な完全長ｇＲＮＡ）およびｔｒｕ−ＲＧＮ（Ｃａｓ９および５’相補性領域に短縮を有するｇＲＮＡ）によって７つの異なるヒト内在遺伝子標的に導入された標的化挿入欠失変異の効率。ｇＲＮＡ相補性領域の長さおよび対応する標的ＤＮＡ部位が示されている。挿入欠失頻度はＴ７ＥＩアッセイによって測定したものである。Ｃｔｒｌ＝相補性領域を欠く対照ｇＲＮＡ。
【図３−３】図３Ｃ：ＥＭＸ１部位を標的とするｔｒｕ−ｇＲＮＡまたはマッチする完全長ｇＲＮＡを用いたＲＧＮによって誘発された挿入欠失変異のＤＮＡ配列。標的ＤＮＡ部位のｇＲＮＡ相補性領域と相互作用する部分が灰色で強調され、ＰＡＭ配列の最初の塩基が小文字で示されている。欠失が灰色で強調された破線で表され、挿入が灰色で強調されたイタリック体の文字で表されている。欠失または挿入塩基の総数および各配列が単離された回数が右側に示されている。
【図３−４】図３Ｄ：マッチする標準的なＲＧＮおよびｔｒｕ−ＲＧＮによって２つの内在ヒト遺伝子に導入された正確なＨＤＲ／ｓｓＯＤＮ仲介性変化の効率。％ＨＤＲはＢａｍＨＩ制限消化アッセイを用いて測定したものである（実施例２の実験手順を参照されたい）。対照ｇＲＮＡ＝空のＵ６プロモーターベクター。
【図３−５】図３Ｅ：Ｕ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞に様々な量の完全長ｇＲＮＡ発現プラスミド（上段）またはｔｒｕ−ｇＲＮＡ発現プラスミド（下段）を一定量のＣａｓ９発現プラスミドとともにトランスフェクトした後、ＥＧＦＰ発現が減少した細胞の百分率をアッセイした。二重反復実験の平均値が平均値の標準誤差とともに示されている。この３か所のＥＧＦＰ標的部位では、ｔｒｕ−ｇＲＮＡで得られたデータがｔｒｕ−ｇＲＮＡプラスミドの代わりに完全長ｇＲＮＡ発現プラスミドで実施した実験のデータと緊密に一致していることに留意されたい。    図３Ｆ：Ｕ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞に様々な量のＣａｓ９発現プラスミドを一定量の各標的に対する完全長ｇＲＮＡ発現プラスミド（上段）またはｔｒｕ−ｇＲＮＡ発現プラスミド（下段）（図３Ｅの実験から各ｔｒｕ−ｇＲＮＡの量を決定した）とともにトランスフェクトした。二重反復実験の平均値が平均値の標準誤差とともに示されている。この３か所のＥＧＦＰ標的部位では、ｔｒｕ−ｇＲＮＡで得られたデータがｔｒｕ−ｇＲＮＡプラスミドの代わりに完全長ｇＲＮＡ発現プラスミドで実施した実験のデータと緊密に一致していることに留意されたい。これらの漸増法の結果から、実施例１および２で実施したＥＧＦＰ崩壊アッセイに使用するプラスミドの濃度を決定した。
【図４】図４Ａ：ペアの二重ニックのためのｇＲＮＡが標的とするＶＥＧＦＡ部位１および４の位置を示す模式図である。完全長ｇＲＮＡの標的部位に下線が施されており、ＰＡＭ配列の最初の塩基が小文字で示されている。ｓｓＯＤＮドナーを用いたＨＤＲによって挿入されるＢａｍＨＩ制限部位の位置が示されている。    図４Ｂ：ｔｒｕ−ｇＲＮＡをペアニッカーゼ戦略とともに用いて挿入欠失変異を効率的に誘発することができる。ＶＥＧＦＡ部位１に対する完全長ｇＲＮＡをｔｒｕ−ｇＲＮＡに置き換えても、ＥＧＦＡ部位４に対するペアの完全長ｇＲＮＡおよびＣａｓ９−Ｄ１０Ａニッカーゼで観察される挿入欠失変異の効率は低下しない。使用した対照ｇＲＮＡは相補性領域を欠くｇＲＮＡである。    図４Ｃ：ｔｒｕ−ｇＲＮＡをペアニッカーゼ戦略とともに用いて正確なＨＤＲ／ｓｓＯＤＮ仲介性配列変化を効率的に誘発することができる。ＶＥＧＦＡ部位１に対する完全長ｇＲＮＡをｔｒｕ−ｇＲＮＡに置き換えても、ｓｓＯＤＮドナー鋳型を用いたＶＥＧＦＡ部位４に対するペアの完全長ｇＲＮＡおよびＣａｓ９−Ｄ１０Ａニッカーゼで観察される挿入欠失変異の効率は低下しない。使用した対照ｇＲＮＡは相補性領域を欠くｇＲＮＡである。
【図５−１】図５Ａ：完全長ｇＲＮＡ（上段）または各位置（Ｕ６プロモーターからの効率的な発現のためのＧのままでなければならない最も５’側の塩基を除く）に単一ミスマッチを有するｔｒｕ−ｇＲＮＡ（下段）を用いた、ＥＧＦＰの３つの部位をそれぞれ標的とするＲＧＮの活性。下の格子の灰色の四角はワトソン−クリックトランスバージョンミスマッチの位置を表す。使用した空のｇＲＮＡ対照は相補性領域を欠くｇＲＮＡである。ＲＧＮ活性はＥＧＦＰ崩壊アッセイを用いて測定したものであり、示される値は、完全にマッチするｇＲＮＡを用いたＲＧＮに対する観察されたＥＧＦＰ陰性の百分率を表す。実験は二重反復で実施したものであり、平均値が平均値の標準誤差を表すエラーバーとともに示されている。
【図５−２】図５Ｂ：完全長ｇＲＮＡ（上段）または各位置（Ｕ６プロモーターからの効率的な発現のためのＧでなければならない最も５’側の塩基を除く）に隣接した二重ミスマッチを有するｔｒｕ−ｇＲＮＡ（下段）を用いた、ＥＧＦＰの３つの部位をそれぞれ標的とするＲＧＮの活性。データは図５Ａと同じように表されている。
【図６−１】図６Ａ：ディープシーケンシングによって測定した、３か所の異なる内在ヒト遺伝子部位を標的とするＲＧＮによって誘発されたオンターゲットおよびオフターゲット挿入欠失変異の絶対頻度。完全長ｇＲＮＡ、ｔｒｕ−ｇＲＮＡまたは相補性領域を欠く対照ｇＲＮＡを有する標的化ＲＧＮを発現した細胞の３か所の標的部位について挿入欠失頻度が示されている。これらのグラフの作成に用いた挿入欠失変異の絶対数を表３Ｂにみることができる。
【図６−２】図６Ｂ：３種類のｔｒｕ−ＲＧＮのオフターゲット部位特異性の改善倍数。示される値は、示されるオフターゲット部位について（Ａ）および表３Ｂのデータを用いて計算した、ｔｒｕ−ＲＧＮのオンターゲット活性／オフターゲット活性の、標準的なＲＧＮのオンターゲット活性／オフターゲット活性に対する比を表す。アスタリスク（＊）の付いた部位については、ｔｒｕ−ＲＧＮでは挿入欠失が観察されなかったため、示される値は、これらのオフターゲット部位に対する特異性の控えめな統計的推定値を表す（結果および実験手順を参照されたい）。    図６Ｃ、上段：Ｔ７ＥＩアッセイによって特定されたＶＥＧＦＡ部位１を標的とするｔｒｕ−ＲＧＮのオンターゲット部位とオフターゲット部位の比較（ディープシーケンシングによってさらに多くの部位が特定された）。完全長ｇＲＮＡが標的部位の５’末端にある２つのヌクレオチドにミスマッチであり、これらはｔｒｕ−ｇＲＮＡ標的部位に存在しない２つのヌクレオチドであることに留意されたい。オンターゲット部位に対するオフターゲット部位のミスマッチが下線を施した太字で強調されている。ｇＲＮＡとオフターゲット部位との間のミスマッチがＸで示されている。    図６Ｃ、下段：完全長ｇＲＮＡまたは短縮ｇＲＮＡを有するＲＧＮによってオフターゲット部位に誘発された挿入欠失変異の頻度。挿入欠失変異頻度はＴ７ＥＩアッセイによって決定したものである。この図のオフターゲット部位は、本発明者らが以前の研究でＶＥＧＦＡ部位１を標的とする標準的なＲＧＮによって誘発される挿入欠失変異ついて既に検討し、部位ＯＴ１−３０と命名した部位であることに留意されたい（実施例１およびＦｕら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（９）：８２２−６（２０１３））。挿入欠失変異の頻度はＴ７ＥＩアッセイの信頼できる検出限界（２〜５％）にあると思われるので、本発明者らの以前の実験ではこの部位にオフターゲット変異が確認されなかった可能性がある。
【図７−１】図７Ａ〜図７Ｄ：ＶＥＧＦＡ部位１および３を標的とするｔｒｕ−ｇＲＮＡまたはマッチする完全長ｇＲＮＡを用いたＲＧＮによって誘発された挿入欠失変異のＤＮＡ配列。配列は図３Ｃと同じように図示されている。
【図７−２】図７Ａ〜図７Ｄ：ＶＥＧＦＡ部位１および３を標的とするｔｒｕ−ｇＲＮＡまたはマッチする完全長ｇＲＮＡを用いたＲＧＮによって誘発された挿入欠失変異のＤＮＡ配列。配列は図３Ｃと同じように図示されている。
【図７−３】図７Ａ〜図７Ｄ：ＶＥＧＦＡ部位１および３を標的とするｔｒｕ−ｇＲＮＡまたはマッチする完全長ｇＲＮＡを用いたＲＧＮによって誘発された挿入欠失変異のＤＮＡ配列。配列は図３Ｃと同じように図示されている。
【図７−４】図７Ａ〜図７Ｄ：ＶＥＧＦＡ部位１および３を標的とするｔｒｕ−ｇＲＮＡまたはマッチする完全長ｇＲＮＡを用いたＲＧＮによって誘発された挿入欠失変異のＤＮＡ配列。配列は図３Ｃと同じように図示されている。
【図７−５】図７Ｅ：ミスマッチの５’Ｇヌクレオチドを有するｔｒｕ−ｇＲＮＡによって誘発された挿入欠失変異の頻度。ＶＥＧＦＡ部位１および３ならびにＥＭＸ１部位１に対する１７ｎｔ、１８ｎｔまたは２０ｎｔの相補性領域を有するｔｒｕ−ｇＲＮＡによって誘導されるＣａｓ９によってヒトＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞に誘発された挿入欠失変異の頻度が示されている。この３種類のｇＲＮＡにはミスマッチの５’Ｇ（太字で印をつけた位置によって表される）が含まれている。バーは、完全長ｇＲＮＡ（２０ｎｔ）、ｔｒｕ−ｇＲＮＡ（１７ｎｔまたは１８ｎｔ）およびミスマッチの５’Ｇヌクレオチドを有するｔｒｕ−ｇＲＮＡ（５’末端に太字のＴがある１７ｎｔまたは１８ｎｔ）を用いた実験の結果を表す。（ミスマッチのあるＥＭＸ１部位１に対するｔｒｕ−ｇＲＮＡでは活性が検出されなかったことに留意されたい。）
【図８−１】図８Ａ〜図８Ｃ：ＲＧＮによってヒトＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞に誘発されたオフターゲット挿入欠失変異の配列。ＲＧＮによって認識される野生型ゲノムオフターゲット部位（ＰＡＭ配列を含む）が灰色で強調されており、表１および表Ｂと同じように番号が付されている。いくつかの部位については相補鎖が示されていることに留意されたい。欠失塩基は灰色の背景に破線で示されている。挿入塩基はイタリック体で表され、灰色で強調されている。
【図８−２】図８Ａ〜図８Ｃ：ＲＧＮによってヒトＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞に誘発されたオフターゲット挿入欠失変異の配列。ＲＧＮによって認識される野生型ゲノムオフターゲット部位（ＰＡＭ配列を含む）が灰色で強調されており、表１および表Ｂと同じように番号が付されている。いくつかの部位については相補鎖が示されていることに留意されたい。欠失塩基は灰色の背景に破線で示されている。挿入塩基はイタリック体で表され、灰色で強調されている。
【図８−３】図８Ａ〜図８Ｃ：ＲＧＮによってヒトＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞に誘発されたオフターゲット挿入欠失変異の配列。ＲＧＮによって認識される野生型ゲノムオフターゲット部位（ＰＡＭ配列を含む）が灰色で強調されており、表１および表Ｂと同じように番号が付されている。いくつかの部位については相補鎖が示されていることに留意されたい。欠失塩基は灰色の背景に破線で示されている。挿入塩基はイタリック体で表され、灰色で強調されている。
【図９−１】図９Ａ〜図９Ｃ：ＲＧＮによってヒトＨＥＫ２９３細胞に誘発されたオフターゲット挿入欠失変異の配列。ＲＧＮによって認識される野生型ゲノムオフターゲット部位（ＰＡＭ配列を含む）が灰色で強調されており、表１および表Ｂと同じように番号が付されている。いくつかの部位については相補鎖が示されていることに留意されたい。欠失塩基は灰色の背景に破線で示されている。挿入塩基はイタリック体で表され、灰色で強調されている。＊単一ｂｐの挿入欠失が多数生じた。
【図９−２】図９Ａ〜図９Ｃ：ＲＧＮによってヒトＨＥＫ２９３細胞に誘発されたオフターゲット挿入欠失変異の配列。ＲＧＮによって認識される野生型ゲノムオフターゲット部位（ＰＡＭ配列を含む）が灰色で強調されており、表１および表Ｂと同じように番号が付されている。いくつかの部位については相補鎖が示されていることに留意されたい。欠失塩基は灰色の背景に破線で示されている。挿入塩基はイタリック体で表され、灰色で強調されている。＊単一ｂｐの挿入欠失が多数生じた。
【図９−３】図９Ａ〜図９Ｃ：ＲＧＮによってヒトＨＥＫ２９３細胞に誘発されたオフターゲット挿入欠失変異の配列。ＲＧＮによって認識される野生型ゲノムオフターゲット部位（ＰＡＭ配列を含む）が灰色で強調されており、表１および表Ｂと同じように番号が付されている。いくつかの部位については相補鎖が示されていることに留意されたい。欠失塩基は灰色の背景に破線で示されている。挿入塩基はイタリック体で表され、灰色で強調されている。＊単一ｂｐの挿入欠失が多数生じた。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（詳細な説明）
ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）は、簡便で効率的なゲノム編集の
プラットフォームとして急速に登場した。Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉら（Ｊｉａｎｇら，Ｎａ
ｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，２３３−２３９（２０１３））は近年、細菌でのＣａ
ｓ９  ＲＧＮの特異性を体系的に研究したが、ヒト細胞でのＲＧＮ特異性については十分
に明らかにされていない。これらのヌクレアーゼを研究および治療応用に広く用いるので
あれば、ヒトをはじめとする真核細胞においてＲＧＮによるオフターゲット効果が及ぶ範
囲を理解することが極めて重要になる。本発明者らは、ヒト細胞ベースのレポーターアッ
セイを用いてＣａｓ９ベースのＲＧＮによるオフターゲット切断の特徴を明らかにした。
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）−ＤＮＡ接合部に沿った位置に応じて、様々な程度で単一およ
び二重のミスマッチが許容された。一部ミスマッチのある部位を調べることによって、ヒ
ト細胞の内在遺伝子座を標的とした６種類のＲＧＮのうちの４種類によって誘発されるオ
フターゲット変化が迅速に検出された。特定されたオフターゲット部位は最大５つのミス
マッチを保有しており、その多くが目的とするオンターゲット部位で観察された頻度と同
等（またはそれ以上）の頻度で変異していた。したがって、ＲＧＮはヒト細胞において、
不完全にマッチしたＲＮＡ−ＤＮＡに対しても高い活性を示し、この観察結果は研究およ
び治療応用での使用を複雑なものにしかねないものである。
【００２７】
本明細書に記載される結果は、任意のＲＧＮの特異性プロファイルを予測することが容
易なものでもなく単純なものでもないことを示している。ＥＧＦＰレポーターアッセイの
実験は、単一および二重のミスマッチがヒト細胞でのＲＧＮ活性に様々な影響を及ぼし得
るものであり、その影響はミスマッチの標的部位内での位置（１つまたは複数）に厳密に
依存するものではないことを示している。例えば、これまでに公開されている報告の通り
、一般にｓｇＲＮＡ／ＤＮＡ接合部の３’側半分にみられる変化の方が、５’側半分にみ
られる変化よりも影響が大きいが（Ｊｉａｎｇら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１
，２３３−２３９（２０１３）；Ｃｏｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８１９−８２３
（２０１３）；Ｊｉｎｅｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７，８１６−８２１（２０１２））
。しかしながら３’末端の単一および二重変異が十分に許容されると思われる場合もある
のに対して、５’末端の二重変異は活性を大幅に低下させ得る。さらに、任意の位置（１
つまたは複数）のミスマッチの影響の大きさは部位依存的であると思われる。可能なあら
ゆるヌクレオチド置換（本発明者らのＥＧＦＰレポーター実験で用いられるワトソン−ク
リックトランスバージョン以外にも）を試験し、大きな一連のＲＧＮに関して広範囲にわ
たるプロファイリングを実施すれば、オフターゲットの及び得る範囲についてさらに洞察
が得られると考えられる。この点に関して、近年記載されたＭａｒｒａｆｆｉｎｉらの細
菌細胞ベースの方法（Ｊｉａｎｇら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，２３３−２
３９（２０１３））または以前にＬｉｕらがＺＦＮに適用したｉｎ  ｖｉｔｒｏのコンビ
ナトリアルライブラリーベースの切断部位選択手法（Ｐａｔｔａｎａｙａｋら，Ｎａｔ  
Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８，７６５−７７０（２０１１））が、さらに大きなＲＧＮ特異性プロ
ファイルの作製に有用であると考えられる。
【００２８】
ＲＧＮ特異性を広範囲にわたって予測するには上に挙げたような困難が伴うが、オンタ
ーゲット部位と１〜５つのミスマッチの分だけ異なる一部のゲノム部位を調べることによ
って、真のＲＧＮによるオフターゲットを特定することができた。注目すべきことに、こ
れらの実験の条件下では、多くのこれらのオフターゲット部位におけるＲＧＮ誘発変異の
頻度は、目的とするオンターゲット部位で観察された頻度とほぼ同じ（またはそれ以上）
であり、Ｔ７ＥＩアッセイ（本発明者らの実験室で実施した場合、信頼できる変異頻度の
検出限界が約２〜５％である）を用いてこれらの部位を検出することが可能であった。こ
れらの変異率は極めて高いため、これまではるかに頻度の低いＺＦＮ誘発オフターゲット
変化およびＴＡＬＥＮ誘発オフターゲット変化の検出に必要とされたディープシーケンシ
ング法の使用を回避することができた（Ｐａｔｔａｎａｙａｋら，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ  ８，７６５−７７０（２０１１）；Ｐｅｒｅｚら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  
２６，８０８−８１６（２００８）；Ｇａｂｒｉｅｌら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
２９，８１６−８２３（２０１１）；Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ  ２９，７３１−７３４（２０１１））。このほか、ヒト細胞におけるＲＧＮオ
フターゲット変異誘発の解析から、ＲＧＮ特異性を予測することが困難であることが確認
され、単一および二重のミスマッチのあるオフターゲット部位がすべて変異の証拠を示す
わけではないが、ミスマッチが５つに及ぶ一部の部位でも変化がみられた。さらに、特定
された真のオフターゲット部位には、目的とする標的配列と比較して、転移または転換に
よる差への明らかな偏りは全くみられない（表Ｅ；灰色で強調した行）。
【００２９】
いくつかのＲＧＮにオフターゲット部位がみられたが、このような部位の特定は広範囲
の規模でもゲノム全域にわたる規模でもなかった。研究対象にした６種類のＲＧＮでは、
ヒトゲノム内にある総数がはるかに多い潜在的オフターゲット配列のごく一部のものだけ
（目的とする標的部位とは３〜６つのヌクレオチドが異なる部位；表Ｅと表Ｃを比較され
たい）を検討した。Ｔ７ＥＩアッセイによってこれだけ多数のオフターゲット変異の遺伝
子座を検討するのは実用的な戦略でも費用効果に優れた戦略でもないが、今後の研究でハ
イスループットシーケンシングを使用することになれば、多数のオフターゲット部位の候
補を調べることが可能になり、より高感度に真のオフターゲット変異を検出する方法が得
られるものと考えられる。例えば、そのような方法を用いれば、本発明者らがいかなるオ
フターゲット変異も明らかにできなかった２種類のＲＧＮについて、さらなるオフターゲ
ット部位を明らかにすることが可能になると考えられる。さらに、細胞内でのＲＧＮ活性
に影響を及ぼし得るＲＧＮ特異性とエピゲノミックな要因（例えば、ＤＮＡメチル化およ
びクロマチン状態）の両方の理解が進展すればほかにも、検討する必要のある潜在的部位
の数が減少し、これによりゲノム全域にわたるＲＧＮオフターゲットの評価の実用性が高
まり、価格も手頃なものになり得ると考えられる。
【００３０】
本明細書に記載されるように、ゲノムオフターゲット変異の頻度を最小限に抑えるのに
いくつかの戦略を用いることができる。例えば、ＲＧＮ標的部位の特異的選択を最適化す
ることができる。目的とする標的部位と最大５つの位置において異なるオフターゲット部
位がＲＧＮによって効率的に変異され得るとすると、ミスマッチの計数によって判定され
る最小数のオフターゲット部位を有する標的部位を選択するのが効果的であるとは思われ
ない。ヒトゲノム内の配列を標的とする任意のＲＧＮには通常、２０ｂｐのＲＮＡ：ＤＮ
Ａ相補性領域内の４つまたは５つの位置が異なる何千もの潜在的オフターゲット部位が存
在することになる（例えば、表Ｃを参照されたい）。このほか、ｇＲＮＡ相補性領域のヌ
クレオチド含有量が潜在的オフターゲット効果の範囲に影響を及ぼす可能性がある。例え
ば、ＧＣ含有量が高いとＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドが安定することが示されており（Ｓ
ｕｇｉｍｏｔｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４，１１２１１−１１２１６（１９９
５））、したがって、ｇＲＮＡ／ゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションの安定性および
ミスマッチの許容性も高まることが予想されると考えられる。この２つのパラメータ（ゲ
ノム内のミスマッチ部位の数およびＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの安定性）がゲノム全域
にわたるＲＧＮ特異性に影響を及ぼす可能性およびその機序を評価するには、ｇＲＮＡの
数を増やした実験がさらに必要となる。しかし、このような予測パラメータを定めること
ができるとしても、このようなガイドラインの実施による影響がＲＧＮの標的化の範囲を
さらに制限することになる可能性があることに留意することが重要である。
【００３１】
ＲＧＮ誘発オフターゲット効果を低減する一般的な戦略で有望なものの１つに、細胞内
で発現するｇＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼの濃度を低くすることが考えられる。Ｕ
２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞のＶＥＧＦＡ標的部位２および３にＲＧＮを用いて、この考えを検
討した。トランスフェクトするｓｇＲＮＡ発現およびＣａｓ９発現プラスミドを減らした
ところ、オンターゲット部位での変異率が低下したが、オフターゲット変異の相対的比率
はあまり変化しなかった（表２Ａおよび２Ｂ）。これと同じように、他の２種類のヒト細
胞型（ＨＥＫ２９３細胞およびＫ５６２細胞）でも、オンターゲット変異誘発の絶対的比
率がＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞より低いものの、高レベルのオフターゲット変異誘発率が観
察された。したがって、細胞内でのｇＲＮＡおよびＣａｓ９の発現レベルを低下させても
オフターゲット効果を低減する解決策にはならないと思われる。さらに、上の結果はほか
にも、ヒト細胞に観察される高率のオフターゲット変異誘発がｇＲＮＡおよび／またはＣ
ａｓ９の過剰発現に起因するものではないことを示唆している。
【００３２】
【表１】
2020120661.tif 000003
【００３３】
【表２】
2020120661.tif 000004
【００３４】
３種類の異なるヒト細胞型でＲＧＮによって大幅なオフターゲット変異誘発が引き起こ
され得るという観察結果は、このゲノム編集プラットフォームの使用に重要な意味を持つ
。研究に適用する場合、特に望ましくない変化の他配が課題となる世代時間の長い培養細
胞または生物体を用いる実験では、高頻度のオフターゲット変異の潜在的に複雑な作用を
考慮に入れる必要がある。オフターゲット効果はランダムなものではなく、標的とする部
位と関係があるため、このような作用を制御する方法の１つとして、異なるＤＮＡ配列を
標的とする複数のＲＧＮを用いて同じゲノム変化を誘発することが考えられる。しかし、
治療に適用する場合、ここに挙げた観察結果は、これらのヌクレアーゼをヒト疾患の治療
により長期間にわたって安全に使用するのであれば、ＲＧＮ特異性を慎重に定め、かつ／
または改善する必要があることを明確に示している。
【００３５】
特異性を改善する方法
本明細書に示されるように、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパ
ク質を土台とするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、目的とするオン
ターゲット活性と同等以上の著しいオフターゲット変異誘発効果を有し得る（実施例１）
。このようなオフターゲット効果は、研究の適用する際に、また特に将来治療に適用する
際に問題となり得る。したがって、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（
ＲＧＮ）の特異性を改善する方法が必要とされている。
【００３６】
実施例１に記載されるように、Ｃａｓ９  ＲＧＮはヒト細胞のオフターゲット部位に高
頻度の挿入欠失変異を誘発し得る（このほか、Ｃｒａｄｉｃｋら，２０１３；Ｆｕら，２
０１３；Ｈｓｕら，２０１３；Ｐａｔｔａｎａｙａｋら，２０１３を参照されたい）。こ
のような望ましくない変化は、目的とするオンターゲット部位と５つものミスマッチによ
って異なるゲノム配列に起こり得る（実施例１を参照されたい）。さらに、ｇＲＮＡ相補
性領域の５’末端のミスマッチは一般に、３’末端のミスマッチよりも許容されやすいが
、このような関係は絶対的なものではなく、部位依存性を示す（実施例１およびＦｕら，
２０１３；Ｈｓｕら，２０１３；Ｐａｔｔａｎａｙａｋら，２０１３を参照されたい）。
その結果、現在、ミスマッチの数および／または位置に依存するコンピュータを用いる方
法は、真のオフターゲット部位を特定するために予測に用いる価値が低下している。した
がって、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを研究および治療応用に使用するのであれば、オフタ
ーゲット変異の頻度を低下させる方法が依然として重要な優先事項である。
【００３７】
短縮ガイドＲＮＡｓ（ｔｒｕ−ｇＲＮＡｓ）により特異性が高くなる
一般的に言えば、ガイドＲＮＡには２つの系、すなわち、一緒に機能してＣａｓ９によ
る切断を誘導する別個のｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを用いる系１および２つの別個の
ガイドＲＮＡを単一の系に組み合わせるキメラｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッ
ドを用いる系２（単一ガイドＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと呼ばれる。このほか、Ｊｉｎｅｋ
ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１２；３３７：８１６−８２１を参照されたい）がある。ｔｒ
ａｃｒＲＮＡは様々な長さに短縮することが可能であり、様々な長さのものが別個の系（
系１）およびキメラｇＲＮＡ系（系２）の両方で機能することが示されている。例えば、
いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、その３’末端から少なくとも１ｎｔ、２
ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１５ｎｔ
、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔまたは４０ｎｔ短縮されていてよい。いくつ
かの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、その５’末端から少なくとも１ｎｔ、２ｎ
ｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１５ｎｔ、
２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔまたは４０ｎｔ短縮されていてよい。あるいは
、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、５’末端および３’末端の両方から、例えば、５’末端で少
なくとも１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、
１０ｎｔ、１５ｎｔまたは２０ｎｔ、３’末端で少なくとも１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４
ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１５ｎｔ、２０ｎｔ、２５
ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔまたは４０ｎｔ短縮されていてよい。例えば、Ｊｉｎｅｋら，
Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１２；３３７：８１６−８２１；Ｍａｌｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２
０１３  Ｆｅｂ  １５；３３９（６１２１）：８２３−６；Ｃｏｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ
．２０１３  Ｆｅｂ  １５；３３９（６１２１）：８１９−２３；ならびにＨｗａｎｇお
よびＦｕら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３  Ｍａｒ；３１（３）：２２７−
９；Ｊｉｎｅｋら，Ｅｌｉｆｅ  ２，ｅ００４７１（２０１３）を参照されたい。系２で
は一般に、キメラｇＲＮＡの長さが長いほどオンターゲット活性が高いことがわかってい
るが、様々な長さのｇＲＮＡの相対的特異性は現時点では明らかにされておらず、したが
って、場合によっては短いｇＲＮＡを用いる方が望ましいことがある。いくつかの実施形
態では、ｇＲＮＡは、転写開始部位を含む転写開始部位の上流約１００〜８００ｂｐ以内
、例えば、転写開始部位の上流約５００ｂｐ以内、または転写開始部位の下流約１００〜
８００ｂｐ以内、例えば、約５００ｂｐ以内にある領域に相補的である。いくつかの実施
形態では、２種類以上のｇＲＮＡをコードするベクター（例えば、プラスミド）、例えば
、標的遺伝子の同じ領域の異なる部位を対象とする２種類、３種類、４種類、５種類また
はそれ以上のｇＲＮＡをコードするプラスミドを用いる。
【００３８】
本願は、ｇＲＮＡの相補性領域を長くするのではなく短くするという、一見反直観的に
思える考えに基づいてＲＧＮ特異性を改善する戦略について記載するものである。これら
の短いｇＲＮＡは、組み込まれた単一のＥＧＦＰレポーター遺伝子および内在ヒト遺伝子
の複数の部位において完全長ｇＲＮＡと同等（または場合によってはそれを上回る）の効
率を示す様々なタイプのＣａｓ９仲介性オンターゲットゲノム編集事象を誘発し得る。さ
らに、このような短いｇＲＮＡを用いたＲＧＮは、ｇＲＮＡ−標的ＤＮＡ接合部の少数の
ミスマッチに対する感度が増大する。最も重要なのは、短縮したｇＲＮＡを用いると、ヒ
ト細胞でのゲノムオフターゲット効果の発生率が大幅に低下し、それらの部位において５
０００倍にも及ぶ特異性の改善が得られることである。したがって、この短縮したｇＲＮ
Ａを用いる戦略は、オンターゲット活性を損なわず、かつ変異を誘発する可能性のある第
二のｇＲＮＡを発現させる必要もなくオフターゲット効果を低減する極めて効率的な方法
となる。この方法は、ヒト細胞でのＲＧＮのオフターゲット効果を低減するのに単独で実
施することも、対を形成したニッカーゼを用いる方法などの他の戦略とともに実施するこ
とも可能である。
【００３９】
したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの特異性を増大させる１つの方法は、
ヌクレアーゼの特異性を誘導するために使用するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）種の長さを短
くする。５’末端にゲノムＤＮＡ標的部位の相補鎖に相補的な１７〜１８ｎｔを有するガ
イドＲＮＡ、例えば単一ｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡと対を形成する）
を用いて、追加の隣接する、例えば配列ＮＧＧのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ
）を有する特定の１７〜１８ｎｔゲノム標的までＣａｓ９ヌクレアーゼを誘導することが
できる（図１）。
【００４０】
ｇＲＮＡの相補性領域の長さを長くすれば特異性が改善されることも予想されようが、
本発明者ら（Ｈｗａｎｇら，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３  Ｊｕｌ  ９；８（７）：ｅ６
８７０８）および他の者（Ｒａｎら，Ｃｅｌｌ．２０１３  Ｓｅｐ  １２；１５４（６）
：１３８０−９）は以前、ｇＲＮＡの５’末端の標的部位相補性領域を長くすると、オン
ターゲット部位における機能の効率が実際に低下することを観察している。
【００４１】
一方、実施例１の実験では、標準的な長さの５’相補性標的化領域内に複数のミスマッ
チを有するｇＲＮＡが依然として、その標的部位のＣａｓ９仲介性切断を確実に誘発する
ことが可能であることが示された。したがって、これらの５’末端ヌクレオチドを欠く短
縮ｇＲＮＡがその完全長の対応物と同等の活性を示す可能性が考えられた（図２Ａ）。さ
らに、これらの５’ヌクレオチドは通常、ｇＲＮＡ−標的ＤＮＡ接合部の他の位置のミス
マッチを相殺すると考えられたため、短いｇＲＮＡの方がミスマッチに対する感度が高く
、したがって、誘発するオフターゲット変異のレベルが低くなると予測された（図２Ａ）
。
【００４２】
ほかにも、標的とするＤＮＡ配列の長さを短くすれば、ｇＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド
の安定性が低下してミスマッチに対する許容性が低下し、これにより標的化の特異性が増
大すると考えられる。つまり、より短いＤＮＡ標的を認識するようにｇＲＮＡ配列を短縮
すれば、単一のヌクレオチドミスマッチに対しても許容性が低く、したがって特異性が高
く、目的外のオフターゲット効果が減少したＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが実際に得られる
と考えられる。
【００４３】
このｇＲＮＡ相補性領域を短縮する戦略は、細菌もしくは古細菌由来の他のＣａｓタン
パク質およびＤＮＡの単一鎖に切れ目を入れるＣａｓ９変異体または一方もしくは両方の
ヌクレアーゼドメインに触媒能不活性化変異を有するｄＣａｓ９などのヌクレアーゼ活性
をもたないＣａｓ９変異体を含めた化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９以
外のＲＮＡ誘導型タンパク質に用いることができる可能性がある。この戦略は、単一ｇＲ
ＮＡを用いる系のほか、二重ｇＲＮＡ（例えば、天然の系にみられるｃｒＲＮＡとｔｒａ
ｃｒＲＮＡ）を用いる系に適用することができる。
【００４４】
したがって、本明細書には、通常通りにトランスコードされたｔｒａｃｒＲＮＡと融合
したｃｒＲＮＡを含む単一ガイドＲＮＡ、例えば、Ｍａｌｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１
３  Ｆｅｂ  １５；３３９（６１２１）：８２３−６に記載されている単一Ｃａｓ９ガイ
ドＲＮＡであるが、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、例えばＮＧＧ、ＮＡＧま
たはＮＮＧＧの５’側に隣接する標的配列の相補鎖の２０未満のヌクレオチド（ｎｔ）、
例えば１９ｎｔ、１８ｎｔまたは１７ｎｔ、好ましくは１７ｎｔまたは１８ｎｔに相補的
な配列を５’末端に有するガイドＲＮＡが記載される。いくつかの実施形態では、短縮Ｃ
ａｓ９ガイドＲＮＡは配列：
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号２４０４）；
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（
配列番号２４０７）；または
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号２４
０８）；
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧ
ＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（ＸＮ）（配列番号１）；
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＡＡＡＡＧＣ
ＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣ（ＸＮ）（配列番
号２）；
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧＧ
ＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵ
ＵＡＵＣ（ＸＮ）（配列番号３）；（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧ
ＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣ
ＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（ＸＮ）（配列番号４）
、
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧ
ＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣ
ＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号５）；
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡ
ＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧ
ＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号６）；または（Ｘ１７〜１
８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧ
ＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧ
ＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号７）；
からなり、配列中、Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９はそれぞれ、標的配列の連続する１
７〜１８ヌクレオチドまたは１７〜１９ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列である
。本明細書にはほかにも、既に文献（Ｊｉｎｅｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３７（６０９６
）：８１６−２１（２０１２）およびＪｉｎｅｋら，Ｅｌｉｆｅ．２：ｅ００４７１（２
０１３））に記載されている短縮Ｃａｓ９ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡが記載される
。
【００４５】
ガイドＲＮＡは、リボ核酸とＣａｓ９との結合に干渉しない任意の配列であり得るＸＮ
を含んでよく、（ＲＮＡ中の）Ｎは０〜２００、例えば、０〜１００、０〜５０または０
〜２０であり得る。
【００４６】
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、３’末端に１つまたは複数のアデニン（Ａ
）またはウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ  Ｐｏｌ
ＩＩＩ転写を停止させる終止シグナルとして用いられる１つまたは複数のＴが任意選択で
存在するの、ＲＮＡは分子の３’末端に１つまたは複数のＵ、例えば、１〜８つまたはそ
れ以上のＵ（例えば、Ｕ、ＵＵ、ＵＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵＵ、ＵＵＵ
ＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵＵＵＵ）を含む。
【００４７】
ロックト核酸（ＬＮＡ）などの修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、修飾オリゴヌクレオ
チドをより好ましい（安定な）コンホメーションにロックすることによってＲＮＡ−ＤＮ
Ａハイブリダイゼーションの特異性を増大させることが示されている。例えば、２’−Ｏ
−メチルＲＮＡは２’酸素と４’炭素の間に追加の共有結合が存在する修飾塩基であり、
これをオリゴヌクレオチド内に組み込むことによって全体の熱安定性および選択性を改善
することができる（式Ｉ）。
【化１】
2020120661.tif 000005
【００４８】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｔｒｕ−ｇＲＮＡは、１
つまたは複数の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含み得る。例えば、本明細書に記載の短
縮ガイドＲＮＡ分子は、標的配列に相補的なガイドＲＮＡの１７〜１８ｎｔまたは１７〜
１９ｎ５’領域の１つ、一部または全部が修飾されていてよく、例えば、ロックされてい
てよく（２’−Ｏ−４’−Ｃメチレン架橋）、５’−メチルシチジンであってよく、２’
−Ｏ−メチル−プソイドウリジンであってよく、あるいはリボースリン酸骨格がポリアミ
ド鎖に置き換わっていてよく（ペプチド核酸）、例えば、合成リボ核酸であってよい。
【００４９】
他の実施形態では、ｔｒｕ−ｇＲＮＡ配列の１つ、一部または全部のヌクレオチドが修
飾されていてよく、例えば、ロックされていてよく（２’−Ｏ−４’−Ｃメチレン架橋）
、５’−メチルシチジンであってよく、２’−Ｏ−メチル−プソイドウリジンであってよ
く、あるいはリボースリン酸骨格がポリアミド鎖に置き換わっていてよく（ペプチド核酸
）、例えば、合成リボ核酸であってよい。
【００５０】
細胞との関連において、Ｃａｓ９と上に挙げた合成ｇＲＮＡの複合体によりＣＲＩＳＰ
Ｒ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ系のゲノム全域にわたる特異性を改善することが可能である。
【００５１】
例示的な修飾または合成ｔｒｕ−ｇＲＮＡは以下の配列：
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（ＸＮ）（配列番号２４
０４）；
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（
ＸＮ）（配列番号２４０７）；
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（ＸＮ）（配列
番号２４０８）；
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧ
ＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（ＸＮ）（配列番号１）；
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＡＡＡＡＧＣ
ＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣ（ＸＮ）（配列番
号２）；
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧＧ
ＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵ
ＵＡＵＣ（ＸＮ）（配列番号３）；
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡ
ＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧ
ＧＵＧＣ（ＸＮ）（配列番号４）、
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧ
ＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣ
ＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号５）；
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡ
ＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧ
ＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号６）；または
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡ
ＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧ
ＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号７）；
を含むか、これよりなるものであり得、配列中、Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９はそれ
ぞれ、標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、例えばＮＧＧ、
ＮＡＧまたはＮＮＧＧの５’側に隣接する標的配列の１７〜１８ｎｔまたは１７〜１９ｎ
ｔに相補的な配列であり、さらに配列中、１つまたは複数のヌクレオチド、例えば、配列
Ｘ１７〜１８もしくはＸ１７〜１９内の１つもしくは複数のヌクレオチド、配列ＸＮ内の
１つもしくは複数のヌクレオチドまたはｔｒｕ−ｇＲＮＡの任意の配列内の１つもしくは
複数のヌクレオチドがロックされている。ＸＮは、リボ核酸とＣａｓ９との結合に干渉し
ない任意の配列であり、（ＲＮＡ中の）Ｎは０〜２００、例えば、０〜１００、０〜５０
または０〜２０であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ  ＰｏｌＩＩＩ転写を停止
させる終止シグナルとして用いられる１つまたは複数のＴが任意選択で存在するので、Ｒ
ＮＡは分子の３’末端に１つまたは複数のＵ、例えば、１〜８つまたはそれ以上のＵ（例
えば、Ｕ、ＵＵ、ＵＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵＵＵ、ＵＵ
ＵＵＵＵＵＵ）を含む。
【００５２】
本明細書に記載される実施例の一部では単一ｇＲＮＡを用いるが、ほかにもこの方法を
二重ｇＲＮＡ（例えば、天然の系にみられるｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ）とともに用
いてもよい。この場合、単一ｔｒａｃｒＲＮＡを、本発明の系を用いて発現させる複数の
異なるｃｒＲＮＡとともに使用し、例えば、以下のように：（Ｘ１７〜１８またはＸ１７
〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号２４０４）；
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（
配列番号２４０７）；または
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号２４
０８）；とｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを使用する。この場合、ｃｒＲＮＡを本明細書に記載
の方法および分子のガイドＲＮＡとして使用し、ｔｒａｃｒＲＮＡを同じまたは異なるＤ
ＮＡ分子から発現させ得る。いくつかの実施形態では、この方法は、細胞と、配列ＧＧＡ
ＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣ
ＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番
号８）またはその活性部分（活性部分とは、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９と複合体を形成す
る能力を保持している部分のことである）を含むか、これよりなるｔｒａｃｒＲＮＡとを
接触させることを含む。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、その３’末
端から少なくとも１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、
９ｎｔ、１０ｎｔ、１５ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔまたは４０ｎｔ
短縮されていてよい。別の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、その５’末端から少
なくとも１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、
１０ｎｔ、１５ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔまたは４０ｎｔ短縮され
ていてよい。あるいは、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、５’末端および３’末端の両方から、
例えば、５’末端で少なくとも１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎ
ｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１５ｎｔまたは２０ｎｔ、３’末端で少なくとも１ｎｔ
、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１５
ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔまたは４０ｎｔ短縮されていてよい。例
示的なｔｒａｃｒＲＮＡ配列は配列番号８のほかにも、以下のものを含む：
ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡ
ＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２４０５）もしくはその活性部分
；
ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵ
ＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２４０７）もしくはその
活性部分；
ＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵ
ＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２４０９）
もしくはその活性部分；
ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡ
ＡＡＧＵＧ（配列番号２４１０）もしくはその活性部分；
ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡ（配列番号２４１
１）もしくはその活性部分；またはＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣ
ＣＧ（配列番号２４１２）もしくはその活性部分。
【００５３】
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（
配列番号２４０７）をｃｒＲＮＡとして用いるいくつかの実施形態では、以下のｔｒａｃ
ｒＲＮＡを用いる：ＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡ
ＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡ
ＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号８）またはその活性部分。（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１
９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号２４０４）をｃｒＲＮＡとして用いるいくつか
の実施形態では、以下のｔｒａｃｒＲＮＡを用いる：ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡ
ＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧ
ＧＵＧＣ（配列番号２４０５）またはその活性部分。（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９
）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号２４０８）をｃｒＲＮＡとして用いるい
くつかの実施形態では、以下のｔｒａｃｒＲＮＡを用いる：ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵ
ＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣ
ＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２４０６）またはその活性部分。
【００５４】
さらに、別個のｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを用いる系では、その一方または両方が
合成であり、１つまたは複数の修飾（例えば、ロックト）ヌクレオチドまたはデオキシリ
ボヌクレオチドを含むものであり得る。
【００５５】
いくつかの実施形態では、単一ガイドＲＮＡおよび／またはｃｒＲＮＡおよび／または
ｔｒａｃｒＲＮＡは、３’末端に１つまたは複数のアデニン（Ａ）またはウラシル（Ｕ）
ヌクレオチドを含み得る。
【００５６】
既存のＣａｓ９ベースのＲＧＮは、目的とするゲノム部位への標的化を誘導するのにｇ
ＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二本鎖の形成を利用するものである。しかし、ＲＮＡ−ＤＮＡヘテ
ロ二本鎖ではそのＤＮＡ−ＤＮＡ対応物よりも無差別な範囲の構造が形成され得る。実際
、ＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖の方がミスマッチに対する感度が高く、このことは、ＤＮＡ誘導
型ヌクレアーゼがオフターゲット配列と容易には結合せず、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼに
比して特異性が高いことを示唆している。したがって、本明細書に記載の短縮ガイドＲＮ
Ａはハイブリッド、すなわち、１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド、例えば短い
ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、ｇＲＮＡの全部または一部、例えばｇＲＮＡの相補性領域
の全部または一部と置き換わったハイブリッドであり得る。このＤＮＡベースの分子は、
単一ｇＲＮＡ系の全部または一部と置き換わってもよく、あるいは二重ｃｒＲＮＡ／ｔｒ
ａｃｒＲＮＡ系のｃｒＲＮＡの全部または一部と置き換わってもよい。一般にＤＮＡ−Ｄ
ＮＡ二本鎖の方がＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖よりもミスマッチに対する許容性が低いことから
、相補性領域内にＤＮＡを組み込むこのような系の方がより高い信頼性で目的とするゲノ
ムＤＮＡ配列を標的とするはずである。このような二本鎖を作製する方法は当該技術分野
で公知であり、例えば、Ｂａｒｋｅｒら，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００５  Ａｐｒ
２２；６：５７；およびＳｕｇｉｍｏｔｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０００  
Ｓｅｐ  １９；３９（３７）：１１２７０−８１を参照されたい。
【００５７】
例示的な修飾または合成ｔｒｕ−ｇＲＮＡは、以下の配列：
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧ
ＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（ＸＮ）（配列番号１）；
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＡＡＡＡＧＣ
ＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣ（ＸＮ）（配列番
号２）；
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧＧ
ＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵ
ＵＡＵＣ（ＸＮ）（配列番号３）；（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧ
ＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣ
ＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（ＸＮ）（配列番号４）
、
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧ
ＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣ
ＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号５）；
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡ
ＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧ
ＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号６）；または
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡ
ＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧ
ＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号７）；
を含むか、これよりなるものであり得、配列中、Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９はそれ
ぞれ、標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、例えばＮＧＧ、
ＮＡＧまたはＮＮＧＧの５’側に隣接する標的配列の１７〜１８ｎｔまたは１７〜１９ｎ
ｔに相補的な配列であり、さらに配列中、１つまたは複数のヌクレオチド、例えば、配列
Ｘ１７〜１８もしくはＸ１７〜１９内の１つもしくは複数のヌクレオチド、配列ＸＮ内の
１つもしくは複数のヌクレオチドまたはｔｒｕ−ｇＲＮＡの任意の配列内の１つもしくは
複数のヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドである。ＸＮは、リボ核酸とＣａｓ９と
の結合に干渉しない任意の配列であり、（ＲＮＡ中の）Ｎは０〜２００、例えば、０〜１
００、０〜５０または０〜２０であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ  ＰｏｌＩ
ＩＩ転写を停止させる終止シグナルとして用いられる１つまたは複数のＴが任意選択で存
在するため、ＲＮＡは分子の３’末端に１つまたは複数のＵ、例えば、１〜８つまたはそ
れ以上のＵ（例えば、Ｕ、ＵＵ、ＵＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵＵ、ＵＵＵ
ＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵＵＵＵ）を含む。
【００５８】
さらに、別個のｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを用いる系では、その一方または両方が
合成であり、１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチドを含むものであり得る。
【００５９】
いくつかの実施形態では、単一ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ
は、３’末端に１つまたは複数のアデニン（Ａ）またはウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを含
む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、オフターゲット効果を最小限に抑えるため、ｇＲＮＡをゲノ
ムの残りの部分の配列と異なる少なくとも３つ以上のミスマッチである部分に標的化する
。
【００６１】
記載される方法は、細胞内で本明細書に記載の短縮Ｃａｓ９  ｇＲＮＡ（ｔｒｕ−ｇＲ
ＮＡ）（任意選択で、修飾ｔｒｕ−ｇＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドｔｒｕ−
ｇＲＮＡ）およびこの短縮Ｃａｓ９  ｇＲＮＡによって誘導され得るヌクレアーゼ、例え
ばＣａｓ９ヌクレアーゼ、例えば、Ｍａｌｉらに記載されているＣａｓ９ヌクレアーゼ、
Ｊｉｎｅｋら，２０１２に記載されているＣａｓ９ニッカーゼ；またはｄＣａｓ９−異種
機能ドメイン融合物（ｄＣａｓ９−ＨＦＤ）を発現させるか、細胞とこれらとを接触させ
ることを含み得る。
【００６２】
Ｃａｓ９
いくつかの細菌がＣａｓ９タンパク質変異体を発現する。現在、化膿性連鎖球菌（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９が最もよく用いられているが、他
のＣａｓ９タンパク質にも化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９と高レベル
の配列同一性を有し、同じガイドＲＮＡを利用するものがある。それ以外のものはさらに
多様であり、利用するｇＲＮＡが異なり、認識するＰＡＭ配列（ＲＮＡによって定められ
る配列に隣接するタンパク質によって定められる、２〜５のヌクレオチドの配列）も異な
る。Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉらは多数の細菌群のＣａｓ９タンパク質を分類し（ＲＮＡ  Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ  １０：５，１−１２；２０１３）、その付図１および付表１に多数のＣａｓ
９タンパク質を列記しており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。ほかのＣａ
ｓ９タンパク質については、Ｅｓｖｅｌｔら，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３  Ｎｏ
ｖ；１０（１１）：１１１６−２１およびＦｏｎｆａｒａら，“Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ  ｏ
ｆ  Ｃａｓ９  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｉ
ｌｉｔｙ  ｏｆ  ｄｕａｌ−ＲＮＡ  ａｎｄ  Ｃａｓ９  ａｍｏｎｇ  ｏｒｔｈｏｌｏｇ
ｏｕｓ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ．”  Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｎｏｖ  ２２．［印刷前電子出版］ｄｏｉ：１０．１
０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１０７４に記載されている。
【００６３】
本明細書に記載の方法および組成物には様々な種のＣａｓ９分子を用いることができる
。化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびサーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子が本開示の大部分の対象となるが、ほかにも、本明細書に
列記する他の種のＣａｓ９タンパク質に由来するか、これに基づくＣａｓ９分子を用いる
ことができる。換言すれば、本記載の大部分が化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）
およびサーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子を用いるもの
であるが、他の種のＣａｓ９分子をその代わりに用いることができる。このような種とし
ては、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉら，２０１３の付図に基づいて作成した以下の表に記載される
種が挙げられる。
【００６４】
【表３】
2020120661.tif 000006
2020120661.tif 000007
2020120661.tif 000008
【００６５】
本明細書に記載の構築物および方法は上に挙げたいずれかのＣａｓ９タンパク質および
その対応するガイドＲＮＡまたはこれに相当する他のガイドＲＮＡの使用を含み得る。こ
のほか、サーモフィルス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）
ＬＭＤ−９のＣａｓ９  ＣＲＩＳＰＲ１系がヒト細胞で機能することがＣｏｎｇらに示さ
れている（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８１９（２０１３））。髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎ
ｇｉｔｉｄｅｓ）Ｃａｓ９オルソログがＨｏｕら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃ
ｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１３  Ｓｅｐ  ２４；１１０（３９）：１５６４４−９およびＥｓ
ｖｅｌｔら，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３  Ｎｏｖ；１０（１１）：１１１６−２
１に記載されている。さらに、Ｊｉｎｅｋらは、サーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）およびＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９オルソログ（異な
るガイドＲＮＡを利用すると思われる髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）および
ジェジュニ菌（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のＣａｓ９オルソログではない）が、わずかに効率が
低下するものの、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）二重ｇＲＮＡによって誘導さ
れて標的プラスミドＤＮＡを切断し得ることをｉｎ  ｖｉｔｒｏで明らかにしている。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本発明の系は、細菌にコードされるか、哺乳動物細胞での発
現にコドン最適化され、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｈ９８３またはＤ９８６およびＨ８４０また
はＮ８６３の変異、例えば、Ｄ１０Ａ／Ｄ１０ＮおよびＨ８４０Ａ／Ｈ８４０Ｎ／Ｈ８４
０Ｙを含む化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質を用いてタンパ
ク質のヌクレアーゼ部分の触媒能を不活性化し；これらの位置における置換は、（Ｎｉｓ
ｈｉｍａｓｕら，Ｃｅｌｌ  １５６，９３５−９４９（２０１４）に記載されているよう
に）アラニンであってよく、また他の残基、例えばグルタミン、アスパラギン、チロシン
、セリンまたはアスパラギン酸、例えばＥ７６２Ｑ、Ｈ９８３Ｎ、Ｈ９８３Ｙ、Ｄ９８６
Ｎ、Ｎ８６３Ｄ、Ｎ８６３ＳまたはＮ８６３Ｈであってよい（図１Ｃ）。本明細書に記載
の方法および組成物に使用することができる触媒能が不活性化された化膿性連鎖球菌（Ｓ
．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９は以下の通りであり、例示的なＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａ
の変異は太字で表され、下線が施されている。
【００６７】
【表４】
2020120661.tif 000009
2020120661.tif 000010
【００６８】
いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるＣａｓ９ヌクレアーゼは、化膿性連鎖
球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の配列と少なくとも約５０％同一である、すなわ
ち、配列番号３３と少なくとも５０％同一である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチ
ド配列は配列番号３３と約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、
８５％、９０％、９５％、９９％または１００％同一である。いくつかの実施形態では、
配列番号３３との差はいずれも非保存領域内にあり、これはＣｈｙｌｉｎｓｋｉら，ＲＮ
Ａ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：５，１−１２；２０１３（例えば、その付図１および付表１
）；Ｅｓｖｅｌｔら，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３  Ｎｏｖ；１０（１１）：１１
１６−２１およびＦｏｎｆａｒａら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２０１４）４２
（４）：２５７７−２５９０．［印刷前電子出版  ２０１３  Ｎｏｖ  ２２］ｄｏｉ：１
０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１０７４に記載されている配列の配列アライメントによっ
て確認される。
【００６９】
２つの配列のパーセント同一性を決定するには、最適比較目的で配列を整列させる（最
適な整列に必要であれば第一および第二のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギ
ャップを導入し、また非相同配列を無視することができる）。比較目的で整列させる参照
配列の長さは少なくとも５０％である（いくつかの実施形態では、参照配列の長さの約５
０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％または１００
％を整列させる）。次いで、対応する位置のヌクレオチドまたは残基を比較する。第一の
配列のある位置が、第二の配列の対応する位置と同じヌクレオチドまたは残基によって占
められていれば、２つの分子はその位置において同一である。２つの配列のパーセント同
一性は、２つの配列の最適な整列のために導入する必要があるギャップの数および各ギャ
ップの長さを考慮に入れた、２つの配列に共通する同一の位置の数の関数となる。
【００７０】
配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用
いて実施することができる。本願の目的には、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプ
ログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３）のアルゴリズムを使用し、ギャップペナルテ
ィが１２、ギャップ伸長ペナルティが４、フレームシフトギャップペナルティが５のＢｌ
ｏｓｓｕｍ６２スコア行列を用いて、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性を決定す
る。
【００７１】
Ｃａｓ９−ＨＦＤ
Ｃａｓ９−ＨＦＤについては、２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６
１／７９９，６４７号、２０１３年６月２１日に出願された米国特許出願第６１／８３８
，１４８号および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１４／２７３３５号に記載されており、上記出願
はすべてその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７２】
Ｃａｓ９−ＨＦＤは、異種機能ドメイン（例えば転写活性化ドメイン、例えば、ＶＰ６
４またはＮＦ−κＢ  ｐ６５の転写活性化ドメイン）と、触媒能不活性化Ｃａｓ９タンパ
ク質（ｄＣａｓ９）のＮ末端またはＣ末端とを融合することによって作製される。本発明
の場合、上記の通り、ｄＣａｓ９は任意の種のものでよいが、好ましくは化膿性連鎖球菌
（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のｄＣａｓ９であり、いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、
例えば、上の配列番号３３に示されるように、タンパク質のヌクレアーゼ部分の触媒能が
不活性化されるようＤ１０およびＨ８４０残基の変異、例えば、Ｄ１０Ｎ／Ｄ１０Ａおよ
びＨ８４０Ａ／Ｈ８４０Ｎ／Ｈ８４０Ｙを含む。
【００７３】
転写活性化ドメインはＣａｓ９のＮ末端に融合しても、Ｃ末端に融合してもよい。さら
に、本記載では転写活性化ドメインを例にあげているが、ほかにも当該技術分野で公知の
他の異種機能ドメイン（例えば、転写リプレッサー（例えば、ＫＲＡＢ、ＥＲＤ、ＳＩＤ
など、例えば、ｅｔｓ２リプレッサー因子（ＥＲＦ）リプレッサードメイン（ＥＲＤ）の
アミノ酸４７３〜５３０、ＫＯＸ１のＫＲＡＢドメインのアミノ酸１〜９７またはＭａｄ
ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）のアミノ酸１〜３６；Ｂｅｅｒｌｉら，ＰＮＡ
Ｓ  ＵＳＡ  ９５：１４６２８−１４６３３（１９９８）を参照されたい）またはヘテロ
クロマチンタンパク質１（ＨＰ１、ｓｗｉ６としても知られる）、例えば、ＨＰ１αもし
くはＨＰ１βなどのサイレンサー；固定化ＲＮＡ結合配列、例えばＭＳ２コートタンパク
質，エンドリボヌクレアーゼＣｓｙ４またはラムダＮタンパク質が結合するＲＮＡ結合配
列などと融合した長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を動員し得るタンパク質またはペ
プチド；ＤＮＡのメチル化状態を修飾する酵素（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラー
ゼ（ＤＮＭＴ）またはＴＥＴタンパク質）；あるいはヒストンサブユニットを修飾する酵
素（例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ
（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（例えば、リジンまたはアルギニン残
基をメチル化する）またはヒストンデメチラーゼ（例えば、リジンまたはアルギニン残基
を脱メチル化する））を用いることができる。このようなドメインのいくつかの配列、例
えば、ＤＮＡ中のメチル化シトシンのヒドロキシル化を触媒するドメインの配列が当該技
術分野で公知である。例示的なタンパク質は、ＤＮＡ中の５−メチルシトシン（５−ｍＣ
）を５−ヒドロキシメチルシトシン（５−ｈｍＣ）ｎ変換する酵素である、Ｔｅｎ−Ｅｌ
ｅｖｅｎ−Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（ＴＥＴ）１〜３のファミリーを含む。
【００７４】
ヒトＴＥＴ１−３の配列は当該技術分野で公知であり、これを下の表に示す。
【００７５】
【表５】
2020120661.tif 000011
【００７６】
いくつかの実施形態では、触媒ドメインの完全長配列の全部または一部、例えば、シス
テインリッチ延長と７つの高度の保存されたエキソンによってコードされる２ＯＧＦｅＤ
Ｏドメインとを含む触媒モジュール、例えば、アミノ酸１５８０〜２０５２を含むＴｅｔ
１触媒ドメイン、アミノ酸１２９０〜１９０５を含むＴｅｔ２およびアミノ酸９６６〜１
６７８を含むＴｅｔ３を含み得る。例えば、３種類すべてのＴｅｔタンパク質の重要な触
媒残基を示す整列に関しては、Ｉｙｅｒら，Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ．２００９  Ｊｕｎ  
１；８（１１）：１６９８−７１０．Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｊｕｎ  ２７の図１を、また
完全長配列に関してはその付属資料（ｆｔｐサイトｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／
ｐｕｂ／ａｒａｖｉｎｄ／ＤＯＮＳ／ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ＿ｍａｔｅｒｉａｌ＿
ＤＯＮＳ．ｈｔｍｌで入手可能）を参照されたい（例えば、ｓｅｑ  ２ｃを参照されたい
）；いくつかの実施形態では、配列はＴｅｔ１のアミノ酸１４１８〜２１３６またはＴｅ
ｔ２／３の対応する領域を含む。
【００７７】
その他の触媒モジュールは、Ｉｙｅｒら，２００９で特定されているタンパク質に由来
するものであり得る。
【００７８】
いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは生物学的テザーであり、ＭＳ２コートタ
ンパク質、エンドリボヌクレアーゼＣｓｙ４またはラムダＮタンパク質の全部または一部
（例えば、これらのＤＮＡ結合ドメイン）を含む。これらのタンパク質を用いて、特異的
なステムループ構造を含むＲＮＡ分子をｄＣａｓ９  ｇＲＮＡ標的化配列によって特定さ
れる場所に動員することができる。例えば、ＭＳ２コートタンパク質、エンドリボヌクレ
アーゼＣｓｙ４またはラムダＮと融合したｄＣａｓ９を用いて、Ｃｓｙ４結合配列、ＭＳ
２結合配列またはラムダＮ結合配列と連結したＸＩＳＴまたはＨＯＴＡＩＲなどの長い非
コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を動員することができる（例えば、Ｋｅｒｙｅｒ−Ｂｉｂ
ｅｎｓら，Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １００：１２５−１３８（２００８）を参照されたい）
。あるいは、Ｃｓｙ４結合配列、ＭＳ２結合配列またはラムダＮタンパク質結合配列を例
えば、Ｋｅｒｙｅｒ−Ｂｉｂｅｎｓら（上記）に記載されているように、別のタンパク質
と連結してもよく、本明細書に記載の方法および組成物を用いて、このタンパク質をｄＣ
ａｓ９結合部位に標的化してもよい。いくつかの実施形態では、Ｃｓｙ４は触媒能が不活
性化されている。
【００７９】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質はｄＣａｓ９と異種機能ドメインとの間にリ
ンカーを含む。これらの融合タンパク質（または連結構造の融合タンパク質同士）に使用
し得るリンカーは、融合タンパク質の機能に干渉しない任意の配列を含み得る。好ましい
実施形態では、リンカーは短く、例えば２〜２０アミノ酸であり、通常は柔軟である（す
なわち、グリシン、アラニンおよびセリンなどの自由度の高いアミノ酸を含む）。いくつ
かの実施形態では、リンカーはＧＧＧＳ（配列番号３４）またはＧＧＧＧＳ（配列番号３
５）からなる１つまたは複数の単位、例えば、２回、３回、４回またはそれ以上反復した
ＧＧＧＳ（配列番号３４）またはＧＧＧＧＳ（配列番号３５）の単位を含む。ほかにも、
これ以外のリンカー配列を使用することができる。
【００８０】
発現系
記載されるガイドＲＮＡを使用するためには、それをコードする核酸から発現させるの
が望ましいであろう。これは様々な方法で実施することができる。例えば、ガイドＲＮＡ
をコードする核酸を中間ベクターにクローン化して原核細胞または真核細胞を形質転換し
、複製および／または発現させる。中間ベクターは通常、ガイドＲＮＡをコードする核酸
を保管または操作しガイドＲＮＡを産生するための原核生物ベクター、例えばプラスミド
もしくはシャトルベクターまたは昆虫ベクターである。このほか、ガイドＲＮＡをコード
する核酸を発現ベクターにクローン化して植物細胞、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞
もしくはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞または原生動物細胞に投与してもよい。
【００８１】
発現させるためには、ガイドＲＮＡをコードする配列を通常、転写を指令するプロモー
ターを含む発現ベクターにサブクローン化する。適切な細菌プロモーターおよび真核プロ
モーターは当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版，２００１）；
Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏ
ｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編，２０１０
）に記載されている。設計したタンパク質を発現させるための細菌発現系を例えば、大腸
菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏ
ｎｅｌｌａ）で入手することができる（Ｐａｌｖａら，１９８３，Ｇｅｎｅ  ２２：２２
９−２３５）。そのような発現系のキットが市販されている。哺乳動物細胞、酵母および
昆虫細胞用の真核発現系は当該技術分野で周知であり、同じく市販されている。
【００８２】
核酸の発現を指令するために使用するプロモーターは、具体的な用途によって決まる。
例えば、融合タンパク質の発現および精製には通常、強力な構成的プロモーターを使用す
る。これに対して、遺伝子調節のためにガイドＲＮＡをｉｎ  ｖｉｖｏで投与する場合、
ガイドＲＮＡの具体的な用途に応じて構成的プロモーターまたは誘導プロモーターのいず
れかを使用することができる。さらに、ガイドＲＮＡの投与に好ましいプロモーターは、
ＨＳＶ  ＴＫなどの弱いプロモーターまたはこれと類似する活性を有するプロモーターで
あり得る。プロモーターはほかにも、トランス活性化に応答性の要素、例えば、低酸素応
答要素、Ｇａｌ４応答要素、ｌａｃリプレッサー応答要素ならびにテトラサイクリン調節
系およびＲＵ−４８６系などの小分子制御系を含み得る（例えば、ＧｏｓｓｅｎおよびＢ
ｕｊａｒｄ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４
７；Ｏｌｉｇｉｎｏら，１９９８，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，５：４９１−４９６；Ｗａｎ
ｇら，１９９７，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，４：４３２−４４１；Ｎｅｅｒｉｎｇら，１９
９６，Ｂｌｏｏｄ，８８：１１４７−５５；ならびにＲｅｎｄａｈｌら，１９９８，Ｎａ
ｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：７５７−７６１を参照されたい）。
【００８３】
発現ベクターは通常、プロモーターに加えて、原核または真核宿主細胞で核酸を発現す
るのに必要なほかのあらゆる要素を含む転写単位または発現カセットを含む。したがって
、典型的な発現カセットは、例えばｇＲＮＡをコードする核酸配列と作動可能に連結され
たプロモーターと、例えば効率的な転写産物のポリアデニル化、転写停止、リボソーム結
合部位または翻訳停止に必要な任意のシグナルとを含む。カセットのほかの要素としては
、例えば、エンハンサーおよび異種スプライスイントロンシグナルを挙げ得る。
【００８４】
細胞内に遺伝情報を輸送するのに使用する具体的な発現ベクターは、意図するｇＲＮＡ
の用途、例えば、植物、動物、細菌、真菌、原生動物などでの発現を考慮して選択する。
標準的な細菌発現ベクターとしては、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥ
Ｔ２３ＤなどのプラスミドならびにＧＳＴおよびＬａｃＺなどの市販のタグ融合発現系が
挙げられる。
【００８５】
真核発現ベクターには真核ウイルスの調節要素を含む発現ベクター、例えば、ＳＶ４０
ベクター、パピローマウイルスベクターおよびエプスタイン・バーウイルス由来のベクタ
ーを用いることが多い。その他の例示的な真核ベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００
９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥおよ
びＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモータ
ー、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘド
リンプロモーターをはじめとする真核細胞での発現に効果を示すプロモーターの指令を受
けてタンパク質を発現させる他の任意のベクターが挙げられる。
【００８６】
ガイドＲＮＡを発現させるためのベクターは、ガイドＲＮＡの発現を駆動するＲＮＡ  
ＰｏｌＩＩＩプロモーター、例えば、Ｈ１、Ｕ６または７ＳＫプロモーターを含み得る。
これらのヒトプロモーターは、プラスミドトランスフェクション後に哺乳動物細胞にｇＲ
ＮＡを発現させる。あるいは、例えばｖｉｔｒｏ転写にＴ７プロモーターを使用してもよ
く、ＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写させてから精製することができる。短いＲＮＡ、例
えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡをはじめとする低分子ＲＮＡの発現に適したベクターを使
用することができる。
【００８７】
一部の発現系は、安定にトランスフェクトされた細胞系を選択するためのマーカー、例
えばチミジンキナーゼ、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼおよびジヒドロ葉酸
レダクターゼなどを有する。このほか、昆虫細胞にバキュロウイルスベクターを用いてポ
リヘドリンプロモーターをはじめとする強力なバキュロウイルスプロモーターの指令の下
にｇＲＮＡコード配列を置くものなど、高収率の発現系が適している。
【００８８】
発現ベクターに通常含まれる要素としてはほかにも、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で機能す
るレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコー
ドする遺伝子およびプラスミドの非必須領域にあり組換え配列の挿入を可能にする固有の
制限部位が挙げられる。
【００８９】
標準的なトランスフェクション法を用いて、大量のタンパク質を発現する細菌、哺乳動
物、酵母または昆虫の細胞系を作製し、次いで標準的な技術を用いてこのタンパク質を精
製する（例えば、Ｃｏｌｌｅｙら，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１７
６１９−２２；Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｉｎ  
Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８２（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒら
編，１９９０）を参照されたい）。真核および原核細胞の形質転換を標準的な技術により
実施する（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９７７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３２：３
４９−３５１；Ｃｌａｒｋ−ＣｕｒｔｉｓｓおよびＣｕｒｔｉｓｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉ
ｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １０１：３４７−３６２（Ｗｕら編，１９８３）を参照され
たい）。
【００９０】
宿主細胞内に外来ヌクレオチド配列を導入するあらゆる既知の方法を用い得る。このよ
うな方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラス
ト融合、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポソーム、マイクロインジ
ェクション、裸のＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベクター（エピソーム型および
組込み型の両方）およびクローン化したゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡをはじめと
する外来遺伝物質を宿主細胞内に導入する他のあらゆる周知の方法の使用が挙げられる（
例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，上記を参照されたい）。唯一必要なのは、用いる具体的な
遺伝子工学的方法で、宿主細胞内にｇＲＮＡの発現が可能な遺伝子を少なくとも１つ良好
に導入することができることである。
【００９１】
本発明は、ベクターおよびベクターを含む細胞を含む。
【実施例】
【００９２】
本発明は以下の実施例でさらに説明されるが、これらの実施例は特許請求の範囲に記載
される本発明の範囲を限定するものではない。
【００９３】
実施例１．ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの特異性の評価
ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）は、簡便で効率的なゲノム編集の
プラットフォームとして急速に登場したものである。この実施例では、ヒト細胞ベースの
レポーターアッセイを用いてＣａｓ９ベースのＲＧＮのオフターゲット切断の特徴を明ら
かにすることついて記載する。
【００９４】
材料および方法
実施例１では以下の材料および方法を用いた。
【００９５】
ガイドＲＮＡの構築
Ｃａｓ９標的化のための可変２０ｎｔ配列を保有するＤＮＡオリゴヌクレオチド（表Ａ
）をアニールさせて、４ｂｐオーバーハングを有しＢｓｍＢＩ消化プラスミドｐＭＬＭ３
６３６へのライゲーションに適合した短い二本鎖ＤＮＡフラグメントを作製した。このア
ニールしたオリゴヌクレオチドのクローン化により、Ｕ６プロモーターの発現下に２０の
可変５’ヌクレオチドを有するキメラ＋１０３一本鎖ガイドＲＮＡをコードするプラスミ
ドが得られる（Ｈｗａｎｇら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，２２７−２２９（
２０１３）；Ｍａｌｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８２３−８２６（２０１３））。こ
の研究に使用するｐＭＬＭ３６３６および発現プラスミドｐＪＤＳ２４６（コドン最適化
型のＣａｓ９をコードする）はともに非営利プラスミド配布サービスＡｄｄｇｅｎｅ（ａ
ｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ）から入手可能である。
【００９６】
【表６】
2020120661.tif 000012
2020120661.tif 000013
2020120661.tif 000014
2020120661.tif 000015
2020120661.tif 000016
2020120661.tif 000017
2020120661.tif 000018
2020120661.tif 000019
2020120661.tif 000020
2020120661.tif 000021
2020120661.tif 000022
2020120661.tif 000023
2020120661.tif 000024
2020120661.tif 000025
2020120661.tif 000026
2020120661.tif 000027
【００９７】
ＥＧＦＰ活性アッセイ
ＥＧＦＰ−ＰＥＳＴ融合遺伝子の単一コピーが組み込まれたＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞を
既に記載されている通りに培養した（Ｒｅｙｏｎら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ３０，４
６０−４６５（２０１２））。トランスフェクションでは、ＳＥ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  
４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｘキット（Ｌｏｎｚａ）を製造業者のプロトコ
ルに従って用い、示される量のｓｇＲＮＡ発現プラスミドおよびｐＪＤＳ２４６をＴｄ−
トマトコードプラスミド３０ｎｇとともに２００，０００個の細胞にヌクレオフェクトし
た。トランスフェクションの２日後、ＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメータを用いて細胞
を解析した。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９プラスミドの濃度を最適化するトランスフェクションを
三重反復で実施し、他のトランスフェクションをいずれも二重反復で実施した。
【００９８】
内在ヒトゲノム部位のＰＣＲ増幅および配列検証
Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＩＩ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）お
よびＰＣＲプライマーならびに表Ｂに列記される条件を用いてＰＣＲ反応を実施した。ほ
とんどの遺伝子座がタッチダウンＰＣＲ（［９８℃、１０秒；７２〜６２℃、−１℃／サ
イクル、１５秒；７２℃、３０秒］１０サイクル、［９８℃、１０秒；６２℃、１５秒；
７２℃、３０秒］２５サイクル）を用いて良好に増幅された。必要に応じて、６８℃また
は７２℃の一定のアニーリング温度および３％ＤＭＳＯまたは１Ｍベタインを用いて残り
の標的のＰＣＲを３５サイクル実施した。ＰＣＲ産物をＱＩＡＸＣＥＬキャピラリー電気
泳動系で分析して、その大きさおよび純度を検証した。妥当性が確認された産物をＥｘｏ
Ｓａｐ−ＩＴ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）で処理し、サンガー法（ＭＧＨ  ＤＮＡ  Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｒｅ）により配列決定して各標的部位を検証した。
【００９９】
【表７】
2020120661.tif 000028
2020120661.tif 000029
2020120661.tif 000030
2020120661.tif 000031
2020120661.tif 000032
2020120661.tif 000033
2020120661.tif 000034
2020120661.tif 000035
2020120661.tif 000036
2020120661.tif 000037
2020120661.tif 000038
2020120661.tif 000039
2020120661.tif 000040
2020120661.tif 000041
2020120661.tif 000042
2020120661.tif 000043
2020120661.tif 000044
2020120661.tif 000045
2020120661.tif 000046
2020120661.tif 000047
2020120661.tif 000048
2020120661.tif 000049
2020120661.tif 000050
2020120661.tif 000051
2020120661.tif 000052
2020120661.tif 000053
2020120661.tif 000054
2020120661.tif 000055
2020120661.tif 000056
2020120661.tif 000057
2020120661.tif 000058
2020120661.tif 000059
2020120661.tif 000060
2020120661.tif 000061
2020120661.tif 000062
【０１００】
ヒト細胞におけるＲＧＮ誘発オンターゲットおよびオフターゲット変異の頻度の決定
Ｕ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞およびＫ５６２細胞では、４Ｄ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  
Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｏｎｚａ）を製造業者の説明書に従って用い、２×１０５個の細胞にｇ
ＲＮＡ発現プラスミドまたは空のＵ６プロモータープラスミド（陰性対照）２５０ｎｇ、
Ｃａｓ９発現プラスミド７５０ｎｇおよびｔｄ−トマト発現プラスミド３０ｎｇをトラン
スフェクトした。ＨＥＫ２９３細胞では、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ試薬（Ｌ
ｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の指示に従って用い、１．６５×１０５
個の細胞にｇＲＮＡ発現プラスミドまたは空のＵ６プロモータープラスミド（陰性対照）
１２５ｎｇ、Ｃａｓ９発現プラスミド３７５ｎｇおよびｔｄ−トマト発現プラスミド３０
ｎｇをトランスフェクトした。ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（
ＱＩＡＧＥＮ）を製造業者の説明書に従って用い、トランスフェクトしたＵ２ＯＳ．ＥＧ
ＦＰ細胞、ＨＥＫ２９３細胞またはＫ５６２細胞からゲノムＤＮＡを回収した。オフター
ゲット候補部位を増幅するのに十分なゲノムＤＮＡが得られるように、３回のヌクレオフ
ェクション（Ｕ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞）、２回のヌクレオフェクション（Ｋ５６２細胞）
または２回のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸトランスフェクションで得られたＤＮ
ＡをプールしてからＴ７ＥＩを実施した。試験した各条件に対してこの操作を２回実施す
ることにより同じゲノムＤＮＡのプールを２つ作製し、各トランスフェクションを計４回
または６回分得た。次いで、これらのゲノムＤＮＡを鋳型に用いてＰＣＲを上記の通りに
実施し、Ａｍｐｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）を製造業者の説明書に従って
用い精製した。Ｔ７ＥＩアッセイを既に記載されている通りに実施した（Ｒｅｙｏｎら，
２０１２，上記）。
【０１０１】
ＮＨＥＪ仲介性挿入欠失変異のＤＮＡシークエンシング
Ｔ７ＥＩアッセイに使用した精製ＰＣＲ産物をＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯベクタ
ー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローン化し、ＭＧＨ  ＤＮＡ  Ａｕｔｏ
ｍａｔｉｏｎ  Ｃｏｒｅによりアルカリ溶解ミニプレップ法を用いてプラスミドＤＮＡを
単離した。Ｍ１３順方向プライマー（５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ−３’（
配列番号１０５９）を用いてサンガー法（ＭＧＨ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏ
ｒｅ）によりプラスミドの配列を決定した。
【０１０２】
実施例１ａ．単一ヌクレオチドミスマッチ
ヒト細胞におけるＲＧＮ特異性決定因子を明らかにすることを始めるにあたり、複数の
ｇＲＮＡ／標的ＤＮＡ接合部内の様々な位置に系統的にミスマッチを生じさせることの影
響を評価するために大規模な試験を実施した。これを実施するため、既に記載されている
標的ヌクレアーゼ活性の迅速の定量化が可能な定量的なヒト細胞ベースの高感度緑色蛍光
タンパク質（ＥＧＦＰ）崩壊アッセイ（上の「方法」およびＲｅｙｏｎら，２０１２，上
記を参照されたい）（図２Ｂ）を用いた。このアッセイでは、ヌクレアーゼ誘発二本鎖切
断（ＤＳＢ）の誤りがちな非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復によって導入されるフレーム
シフト挿入／欠失（挿入欠失）変異を不活性化することによって起こるヒトＵ２ＯＳ．Ｅ
ＧＦＰ細胞内の蛍光シグナルを評価することによって、単一の組み込まれたＥＧＦＰレポ
ーター遺伝子を標的とするヌクレアーゼの活性を定量化することができる（図２Ｂ）。こ
こに記載される研究では、ＥＧＦＰ内の異なる配列を標的とする以下のような３種類の約
１００ｎｔの単一ｇＲＮＡを用いた：
ＥＧＦＰ部位１  ＧＧＧＣＡＣＧＧＧＣＡＧＣＴＴＧＣＣＧＧＴＧＧ（配列番号９）
ＥＧＦＰ部位２  ＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧＴＣＧＧ（配列番号１０）
ＥＧＦＰ部位３  ＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧ（配列番号１１）
。
上記ｇＲＮＡはそれぞれ、Ｃａｓ９仲介性のＥＧＦＰ発現崩壊を効率的に誘導することが
できる（実施例１ｅおよび２ａならびに図３Ｅ（最上段）および３Ｆ（最上段）を参照さ
れたい）。
【０１０３】
最初の実験では、３種類のＥＧＦＰ標的化ｇＲＮＡの相補的標的化領域の２０ヌクレオ
チドのうち１９ヌクレオチドにおける単一ヌクレオチドミスマッチの影響を試験した。こ
れを実施するため、３種類の標的部位のそれぞれについて、位置１〜１９（３’から５’
の方向に１〜２０の番号を付した；図１を参照されたい）にワトソン−クリックトランス
バージョンミスマッチを保有する変異体ｇＲＮＡを作製し、これらの各種ｇＲＮＡがヒト
細胞においてＣａｓ９仲介性ＥＧＦＰ崩壊を誘導する能力を試験した（位置２０のヌクレ
オチドはＵ６プロモーター配列の一部であり、発現への影響を避けるためグアニンでなけ
ればならないことから、この位置に置換のある変異体ｇＲＮＡは作製しなかった）。
【０１０４】
ＥＧＦＰ標的部位＃２では、ｇＲＮＡの３’末端よりも５’末端のミスマッチの方が許
容性に高いことを示唆するこれまでの研究結果（Ｊｉａｎｇら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ  ３１，２３３−２３９（２０１３）；Ｃｏｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８
１９−８２３（２０１３）；Ｊｉｎｅｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７，８１６−８２１（
２０１２））の通り、ｇＲＮＡの位置１〜１０に単一ミスマッチがあると、付随するＣａ
ｓ９の活性に著しい影響がみられた（図２Ｃ、中央パネル）。しかし、ＥＧＦＰ標的部位
＃１および＃３では、ｇＲＮＡの一部を除くいずれの位置に単一ミスマッチがあっても、
それが配列の３’末端内でも、高い許容性がみられた。さらに、上記２種類の標的にはミ
スマッチに対する感度が高い具体的な位置に差がみられた（図２Ｃ、最上段と最下段のパ
ネルを比較されたい）。例えば、標的部位＃１は特に位置２のミスマッチに対して高い感
度を示したのに対して、標的部位＃３は位置１および８のミスマッチに対して最も高い感
度を示した。
【０１０５】
実施例１ｂ．複数のミスマッチ
ｇＲＮＡ／ＤＮＡ接合部の２つ以上のミスマッチによる影響を試験するため、隣接する
位置および離れた位置にワトソン−クリックトランスバージョンミスマッチを２つ有する
一連の変異体ｇＲＮＡを作製し、ＥＧＦＰ崩壊アッセイを用いて、ヒト細胞でこれらのｇ
ＲＮＡがＣａｓ９ヌクレアーゼ活性を誘導する能力を試験した。全般的に標的部位は３種
類とも、一方または両方のミスマッチがｇＲＮＡ標的化領域の３’側半分に起こる２つの
変化に対して感度が高くなることが分かった。しかし、この影響の大きさには部位による
差がみられ、標的部位＃２がこの２つのミスマッチに対して最も高い感度を示し、標的部
位＃１が全般的に最も低い感度を示した。許容され得る隣接したミスマッチの数を試験す
るため、ｇＲＮＡ標的化領域の５’末端の位置１９〜１５（単一および２つのミスマッチ
の許容性が高いと思われる位置）の範囲でミスマッチの位置の数が漸増する変異体ｇＲＮ
Ａを構築した。
【０１０６】
このようにミスマッチを漸増させたｇＲＮＡを試験したところ、３種類の標的部位でい
ずれも、３つ以上の隣接するスマッチを導入することによってＲＧＮ活性が大幅に消失す
ることが明らかになった。５’末端の位置１９から開始し、３’末端に向かってミスマッ
チを追加して漸増させていくと、３種類の異なるＥＧＦＰ標的化ｇＲＮＡの活性が突然低
下した。具体的には、位置１９および１９＋１８にミスマッチを含むｇＲＮＡが実質的に
完全な活性を示すのに対して、位置１９＋１８＋１７、１９＋１８＋１７＋１６および１
９＋１８＋１７＋１６＋１５にミスマッチのあるｇＲＮＡには陰性対照に比して実質的に
差がみられなかった（図２Ｆ）。（位置２０はｇＲＮＡの発現を駆動するＵ６プロモータ
ーの一部であるためＧでなければならないことから、本発明者らは上記変異体ｇＲＮＡの
位置２０にはミスマッチを生じさせなかったことに留意されたい。）
【０１０７】
ｇＲＮＡ相補性を短縮することにより特異性が増大したＲＧＮを得ることができる根拠
がほかにも以下の実験で得られた：４種類の異なるＥＧＦＰ標的化ｇＲＮＡ（図２Ｈ）で
は、位置１８および１９に２つのミスマッチを導入しても活性にあまり影響を及ぼさなか
った。しかし、上記ｇＲＮＡの位置１０および１１にさらに２つのミスマッチを導入する
と活性がほぼ完全に消失する。１０／１１の２つのミスマッチのみを導入しても、全般的
に活性にそれほど大きな影響を及ぼさないのは興味深い。
【０１０８】
以上をまとめると、ヒト細胞で得られたこれらの結果は、ＲＧＮの活性がｇＲＮＡ標的
化配列の３’側半分のミスマッチに対する方が高い感度を示し得ることを裏付けるもので
ある。しかし、以上のデータはほかにも、ＲＧＮ特異性が複雑で標的部位依存性であり、
単一および２つのミスマッチであれば、ＲＮＡ標的化領域の３’側半分に１つまたは複数
のミスマッチが生じても高い許容性を示すことが多いことを明確に示している。さらに、
以上のデータはほかにも、ｇＲＮＡ／ＤＮＡ接合部の５’側半分のあらゆるミスマッチが
必ずしも許容性が高いわけではないことを示唆している。
【０１０９】
さらに、以上の結果は、より短い領域の相補性（具体的には約１７ｎｔ）を有するｇＲ
ＮＡの方が活性の特性が高くなることを強く示唆している。本発明者らは、１７ｎｔの特
異性と、ＰＡＭ配列によって付与される２ｎｔの特異性とを組み合わせることによって、
ヒト細胞にみられるゲノムのような大型で複雑なゲノム内で固有なものとなるのに十分な
長さの１つである１９ｂｐ配列の仕様が得られることに注目する。
【０１１０】
実施例１ｃ．オフターゲット変異
内在ヒト遺伝子を標的とするＲＧＮのオフターゲット変異を特定することができるかど
うかを明らかにするため、ＶＥＧＦＡ遺伝子の３つの異なる部位、ＥＭＸ１遺伝子の１つ
の部位、ＲＮＦ２遺伝子の１つの部位およびＦＡＮＣＦ遺伝子の１つの部位を標的とする
６種類の単一ｇＲＮＡを用いた（表１および表Ａ）。上記６種類のｇＲＮＡは、Ｔ７エン
ドヌクレアーゼＩ（Ｔ７ＥＩ）アッセイによって検出されたように、ヒトＵ２ＯＳ．ＥＧ
ＦＰ細胞のそれぞれの内在遺伝子座におけるＣａｓ９仲介性挿入欠失を効率的に誘導する
ものであった（上の「方法」および表１）。次いで本発明者らは、この６種のＲＧＮそれ
ぞれについて、Ｕ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞におけるヌクレアーゼ誘発ＮＨＥＪ仲介性挿入欠
失変異の証拠を得るため、候補となるオフターゲット部位を数十か所（４６から６４に及
ぶ箇所数）検討した。評価した遺伝子座には、ヌクレオチドが１つまたは２つ異なる全ゲ
ノム部位のほかにも、ヌクレオチドが３〜６つ異なるゲノム部位のサブセットを含め、ｇ
ＲＮＡ標的化配列の５’側半分にこのようなミスマッチを１つまたは複数有するものを重
視した（表Ｂ）。Ｔ７ＥＩアッセイを用いて、ＶＥＧＦＡ部位１では（検討した５３か所
の候補部位うち）４か所のオフターゲット部位、ＶＥＧＦＡ部位２では（検討した４６か
所のうち）１２か所、ＶＥＧＦＡ部位３では（検討した６４か所のうち）７か所、ＥＭＸ
１部位では（検討した４６か所のうち）１か所（表１および表Ｂ）が容易に特定された。
ＲＮＦ２またはＦＡＮＣＦ遺伝子について検討したそれぞれ４３か所および５０か所の候
補部位にはオフターゲット変異は検出されなかった（表Ｂ）。実証されたオフターゲット
部位の変異率は極めて高く、目的とする標的部位に観察された変異率の５．６％から１２
５％（平均４０％）に及ぶものであった（表１）。このような真のオフターゲットには、
標的部位の３’末端にミスマッチを有し、合計５つに及ぶミスマッチを有する配列が含ま
れ、ほとんどのオフターゲット部位がタンパク質をコードする遺伝子内にみられた（表１
）。一部のオフターゲット部位のＤＮＡシーケンシングから、予測されるＲＧＮ切断部位
に挿入欠失変異が起こることを示す分子的な裏付けがさらに得られた（図８Ａ〜８Ｃ）。
【０１１１】
【表８】
2020120661.tif 000063
2020120661.tif 000064
【０１１２】
実施例１ｄ．その他の細胞型のオフターゲット変異
ＲＧＮがＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞に高頻度でオフターゲット変異を誘発し得ることが確
認されたため、本発明者らは次に、これらのヌクレアーゼが他のタイプのヒト細胞にもこ
のような影響を及ぼすかどうかを明らかにしようとした。本発明者らは以前、ＴＡＬＥＮ
１５の活性を評価するのにＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞を用いたため、本発明者らの最初の実
験にはＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞を選択したが、標的化ヌクレアーゼの活性の試験にはヒト
ＨＥＫ２９３細胞およびＫ５６２細胞の方が広く用いられている。したがって、本発明者
らはＨＥＫ２９３細胞およびＫ５６２細胞についてもＶＥＧＦＡ部位１、２および３なら
びにＥＭＸ１部位に標的化した４種類のＲＧＮを評価した。本発明者らは、この４種類の
ＲＧＮが、変異頻度はＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞に観察された頻度よりもいくぶん低いもの
の、上記のさらなる２種類のヒト細胞系でもその目的とするオンターゲット部位にＮＨＥ
Ｊ仲介性挿入欠失変異を効率的に誘発することを発見した（Ｔ７ＥＩアッセイによる評価
）（表１）。最初にＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞で特定された上記４種類のＲＧＮの２４か所
のオフターゲット部位を評価したところ、多くの部位が、ＨＥＫ２９３細胞およびＫ５６
２細胞でも同様にその対応するオンターゲット部位と同程度の頻度で変異することが明ら
かになった（表１）。予想された通り、ＨＥＫ２９３細胞のこれらのオフターゲット部位
の一部のＤＮＡシーケンシングにより、予測されたゲノム遺伝子座に変化が生じることを
示す分子的な根拠がさらに得られた（図９Ａ〜９Ｃ）。Ｕ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞で特定さ
れたオフターゲット部位のうち、ＨＥＫ２９３細胞の４か所、Ｋ５６２細胞の１１か所が
検出可能な変異を示さなかった理由は正確にはわからない。しかし、これらのオフターゲ
ット部位の多くがＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞でも比較的低い変異頻度を示したことが注目さ
れる。したがって、本発明者らの実験ではＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞に比してＨＥＫ２９３
細胞およびＫ５６２細胞の方が全般的にＲＧＮの活性が低いと思われるため、ＨＥＫ２９
３細胞およびＫ５６２細胞のこれらの部位における変異率が本発明者らのＴ７ＥＩアッセ
イの信頼できる検出限界（約２〜５％）未満になるものと推測される。以上をまとめると
、本発明者らがＨＥＫ２９３細胞およびＫ５６２細胞で得た結果は、今回ＲＧＮに観察さ
れる高頻度のオフターゲット変異が複数のヒト細胞型にみられる一般的な現象である根拠
を示すものである。
【０１１３】
実施例１ｅ．ＥＧＦＰ崩壊アッセイに使用するｇＲＮＡ発現およびＣａｓ９発現プラス
ミドの量の漸増
非相同末端結合を介したフレームシフト変異の誘発がＥＧＦＰの発現を確実に崩壊させ
得る位置であるＥＧＦＰヌクレオチド５０２の上流に位置する３つの異なる配列（上に示
したＥＧＦＰ部位１〜３）に対して単一ｇＲＮＡを作製した（Ｍａｅｄｅｒ，Ｍ．Ｌ．ら
，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ３１，２９４−３０１（２００８）；Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．ら，Ｎａｔ
Ｂｉｏｔｅｃｈ  ３０，４６０−４６５（２０１２））。
【０１１４】
３つの標的部位について、最初に様々な量のｇＲＮＡ発現プラスミド（１２．５〜２５
０ｎｇ）を、構成的に発現するＥＧＦＰ−ＰＥＳＴレポーター遺伝子の単一コピーを有す
る本発明者らのＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰレポーター細胞に、コドン最適化型のＣａｓ９ヌクレ
アーゼ発現プラスミド７５０ｎｇとともにトランスフェクトした。最高濃度のｇＲＮＡコ
ードプラスミド（２５０ｎｇ）ではＲＧＮが３種類とも効率的にＥＧＦＰ発現を崩壊させ
た（図３Ｅ（上段））。しかし、これより少ない量のｇＲＮＡ発現プラスミドをトランス
フェクトした場合、標的部位＃１および＃３に対するＲＧＮが同レベルの崩壊を示したの
に対して、標的部位＃２のＲＧＮ活性は、トランスフェクトするｇＲＮＡ発現プラスミド
の量を減らすと直ちに低下した（図３Ｅ（上段））。
【０１１５】
本発明者らのＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰレポーター細胞にトランスフェクトするＣａｓ９コー
ドプラスミドの量を漸増させ（５０ｎｇ〜７５０ｎｇ）てＥＧＦＰ崩壊をアッセイした。
図３Ｆ（上段）に示されるように、標的部位＃１では、トランスフェクトするＣａｓ９コ
ードプラスミドの量を３分の１にしても、ＥＧＦＰ崩壊活性が実質的に低下せずに許容さ
れた。しかし、標的部位＃２および＃３を標的とするＲＧＮの活性は、トランスフェクト
するＣａｓ９プラスミドの量を３分の１にすると直ちに低下した（図３Ｆ（上段））。以
上の結果を踏まえて、実施例１ａ〜１ｄに記載される実験には、ＥＧＦＰ標的部位＃１、
＃２および＃３に対してｇＲＮＡ発現プラスミド／Ｃａｓ９発現プラスミドをそれぞれ２
５ｎｇ／２５０ｎｇ、２５０ｎｇ／７５０ｎｇおよび２００ｎｇ／７５０ｎｇ用いた。
【０１１６】
一部のｇＲＮＡ／Ｃａｓ９の組合せが他の組合せよりもＥＧＦＰ発現の崩壊に高い効果
を示す理由も、これらの組合せの一部がトランスフェクションに用いるプラスミドの量に
多かれ少なかれ感受性を示す理由も理解されていない。上記３種類のｇＲＮＡゲノム内に
存在するオフターゲット部位の範囲がそれぞれの活性に影響を及ぼしている可能性がある
が、３種類のｇＲＮＡの挙動の差の原因となり得るこれらの特定の標的部位の１〜６ｂｐ
だけ異なるゲノム部位の数に差はみられなかった（表Ｃ）。
【０１１７】
【表９】
2020120661.tif 000065
【０１１８】
実施例２：ＲＧＮ切断特異性を改善させるためのｇＲＮＡ相補性の長さの短縮
最初は反直観的に思われる方法であるが、単にｇＲＮＡ−ＤＮＡ接合部の長さを短くこ
とによって、オンターゲット活性を損なわずにＲＧＮのオフターゲット効果が最小限に抑
えられるとする仮説を立てた。実際、長いｇＲＮＡの方がオンターゲット部位における機
能の効率が低い（以下の記述およびＨｗａｎｇら，２０１３ａ；Ｒａｎら，２０１３を参
照されたい）。これに対して、上の実施例１に示されるように、５’末端に複数のミスマ
ッチを有するｇＲＮＡでも依然としてその標的部位に確実な切断を誘発することが可能で
あり（図２Ａおよび２Ｃ〜２Ｆ）、完全なオンターゲット活性にはこれらのヌクレオチド
が不要である可能性が示唆された。したがって、これらの５’ヌクレオチドを欠く短縮ｇ
ＲＮＡが完全長ｇＲＮＡと同等の活性を示すのではないかとする仮説を立てた（図２Ａ）
。完全長ｇＲＮＡの５’ヌクレオチドがオンターゲット活性に不要であるならば、その存
在がｇＲＮＡ−標的ＤＮＡ接合部の他の位置におけるミスマッチも相殺するのではないか
と推測された。この推測が正しいとすれば、ｇＲＮＡのミスマッチに対する感度が高くな
ることに加えて、Ｃａｓ９仲介性オフターゲット変異のレベルが実質的に低下するのでは
ないかとする仮説を立てた（図２Ａ）。
【０１１９】
実験手順
実施例２では以下の実験手順を用いた。
【０１２０】
プラスミド構築
ｇＲＮＡ発現プラスミドはいずれも、上記（実施例１）のように相補性領域を保有する
オリゴヌクレオチド（ＩＤＴ）のペアを設計、合成、アニーリングし、プラスミドｐＭＬ
Ｍ３６３６（Ａｄｄｇｅｎｅ社から入手可能）にクローン化することによって組み立てた
。得られたｇＲＮＡ発現ベクターは、ヒトＵ６プロモーターによって発現が駆動される約
１００ｎｔのｇＲＮＡをコードする。ｇＲＮＡ発現ベクターの構築に使用した全オリゴヌ
クレオチドを表Ｄに示す。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ）を以下のプライマー：Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａセンスプライマー５’−ｔｇｇ
ａｔａａａａａｇｔａｔｔｃｔａｔｔｇｇｔｔｔａｇｃｃａｔｃｇｇｃａｃｔａａｔｔｃ
ｃｇ−３’（配列番号１０８９）；Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａアンチセンスプライマー  ５’−
ｃｇｇａａｔｔａｇｔｇｃｃｇａｔｇｇｃｔａａａｃｃａａｔａｇａａｔａｃｔｔｔｔｔ
ａｔｃｃａ−３’（配列番号１０９０）とともに用いてプラスミドｐＪＤＳ２４６を変異
させることによって、ＲｕｖＣエンドヌクレアーゼドメインに変異を有するＣａｓ９  Ｄ
１０Ａニッカーゼ発現プラスミド（ｐＪＤＳ２７１）を作製した。この研究に使用した標
的化ｇＲＮＡプラスミドおよびＣａｓ９ニッカーゼプラスミドはいずれも、非営利プラス
ミド配布サービスＡｄｄｇｅｎｅ（ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ）か
ら入手可能である。
【０１２１】
【表１０】
2020120661.tif 000066
2020120661.tif 000067
2020120661.tif 000068
2020120661.tif 000069
2020120661.tif 000070
2020120661.tif 000071
2020120661.tif 000072
2020120661.tif 000073
2020120661.tif 000074
【０１２２】
ヒト細胞ベースのＥＧＦＰ崩壊アッセイ
単一コピーの組み込まれたＥＧＦＰ−ＰＥＳＴ遺伝子レポーターを保有するＵ２ＯＳ．
ＥＧＦＰ細胞については既に記載されている（Ｒｅｙｏｎら，２０１２）。この細胞を１
０％ＦＢＳ、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニ
シリン／ストレプトマイシンおよび４００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を添加したＡｄｖａｎｃ
ｅｄ  ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で維持した。ＥＧＦＰ発現の崩
壊をアッセイするため、ＬＯＮＺＡ  ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）にＳＥ溶
液およびＤＮ１００プログラムを製造業者の説明書に従って用い、２×１０５個のＵ２Ｏ
Ｓ．ＥＧＦＰ細胞にｇＲＮＡ発現プラスミドまたは陰性対照の空のＵ６プロモータープラ
スミド、Ｃａｓ９発現プラスミド（ｐＪＤＳ２４６）（実施例１およびＦｕら，２０１３
）およびｔｄ−トマト発現プラスミド（トランスフェクション効率の対照）１０ｎｇを二
重反復でトランスフェクトした。本発明者らは、ＥＧＦＰ部位＃１、＃２、＃３および＃
４の実験にｇＲＮＡ発現プラスミド／Ｃａｓ９発現プラスミドをそれぞれ２５ｎｇ／２５
０ｎｇ、２５０ｎｇ／７５０ｎｇ、２００ｎｇ／７５０ｎｇおよび２５０ｎｇ／７５０ｎ
ｇ用いた。トランスフェクションの２日後、細胞をトリプシンで処理し、１０％（ｖｏｌ
／ｖｏｌ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁させ、ＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメータで解析した
。各試料について、トランスフェクションおよびフローサイトメトリー測定を二重反復で
実施した。
【０１２３】
ヒト細胞のトランスフェクションおよびゲノムＤＮＡの単離
内在ヒト遺伝子を標的とするＲＧＮによって誘発されるオンターゲットおよびオフター
ゲット挿入欠失変異を評価するため、以下の条件を用いてＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞または
ＨＥＫ２９３細胞にプラスミドをトランスフェクトした：Ｕ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞は上記
のＥＧＦＰ崩壊アッセイと同じ条件を用いてトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３細胞は
、３７℃のＣＯ２インキュベーター中、１０％ＦＢＳおよび２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭａｘ（
Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ（Ｌｉｆ
ｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を入れた２４ウェルプレートに１ウェル当たり１．６５
×１０５細胞の密度で播種することによってトランスフェクトした。２２〜２４時間イン
キュベートした後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ試薬を製造業者の説明書（Ｌｉ
ｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って用い、細胞にｇＲＮＡ発現プラスミドまたは
空のＵ６プロモータープラスミド（陰性対照）１２５ｎｇ、Ｃａｓ９発現プラスミド（ｐ
ＪＤＳ２４６）（実施例１およびＦｕら，２０１３）３７５ｎｇおよびｔｄ−トマト発現
プラスミド１０ｎｇをトランスフェクトした。トランスフェクションの１６時間後に培地
を交換した。両細胞型とも、トランスフェクションの２日後にＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＤＮ
ＡｄｖａｎｃｅゲノムＤＮＡ単離キット（Ｂｅｃｋｍａｎ）を製造業者の説明書に従って
用い、ゲノムＤＮＡを回収した。アッセイする各ＲＧＮ試料には、１２回の個別の４Ｄト
ランスフェクション反復を実施し、この１２回のトランスフェクションからそれぞれゲノ
ムＤＮＡを単離した後、これらの試料を合わせて、それぞれが６つのプールしたゲノムＤ
ＮＡ試料からなる「二重反復」プールを２つ作製した。次いで、以下に記載するＴ７ＥＩ
アッセイ、サンガーシーケンシングおよび／またはディープシーケンシングによって、上
記二重反復試料のオンターゲットおよびオフターゲット部位における挿入欠失変異を評価
した。
【０１２４】
ｓｓＯＤＮドナー鋳型を用いるＨＤＲによって導入される正確な変化の頻度を評価する
ため、２×１０５個のＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞にｇＲＮＡ発現プラスミドまたは空のＵ６
プロモータープラスミド（陰性対照）２５０ｎｇ、Ｃａｓ９発現プラスミド（ｐＪＤＳ２
４６）７５０ｎｇ、ｓｓＯＤＮドナー５０ｐｍｏｌ（または対照にはｓｓＯＤＮ無し）お
よびｔｄ−トマト発現プラスミド（トランスフェクション対照）１０ｎｇをトランスフェ
クトした。トランスフェクションの３日後、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＤＮＡｄｖａｎｃｅを
用いてゲノムＤＮＡを精製し、以下に記載するように目的とする遺伝子座におけるＢａｍ
ＨＩ部位の導入をアッセイした。上記トランスフェクションはいずれも二重反復で実施し
た。
【０１２５】
Ｃａｓ９ニッカーゼに関する実験では、２×１０５個のＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞に各ｇ
ＲＮＡ発現プラスミド（対形成したｇＲＮＡを用いる場合）１２５ｎｇまたはｇＲＮＡ発
現プラスミド（単一ｇＲＮＡを用いる場合）２５０ｎｇ、Ｃａｓ９−Ｄ１０Ａニッカーゼ
発現プラスミド（ｐＪＤＳ２７１）７５０ｎｇ、ｔｄ−トマトプラスミド１０ｎｇおよび
（ＨＤＲを実施する場合）ｓｓＯＤＮドナー鋳型（ＢａｍＨＩ部位をコードする）５０ｐ
ｍｏｌをトランスフェクトした。トランスフェクションはいずれも二重反復で実施した。
トランスフェクションの２日後（挿入欠失変異をアッセイする場合）またはトランスフェ
クションの３日後（ＨＤＲ／ｓｓＯＤＮ仲介性の変化をアッセイする場合）、Ａｇｅｎｃ
ｏｕｒｔ  ＤＮＡｄｖａｎｃｅゲノムＤＮＡ単離キット（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いてゲノ
ムＤＮＡを回収した。
【０１２６】
挿入欠失変異の頻度を定量化するためのＴ７ＥＩアッセイ
Ｔ７ＥＩを既に記載されている通りに実施した（実施例１およびＦｕら，２０１３）。
簡潔に述べれば、Ｐｈｕｓｉｏｎ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ）に以下のプログラムのうちの一方：（１）タッチダウンＰＣＲプログ
ラム［（９８℃、１０秒；７２〜６２℃、−１℃／サイクル、１５秒；７２℃、３０秒）
×１０サイクル、（９８℃、１０秒；６２℃、１５秒；７２℃、３０秒）×２５サイクル
］または（２）定常Ｔｍ  ＰＣＲプログラム［（９８℃、１０秒；６８℃または７２℃、
１５秒；７２℃、３０秒）×３５サイクル］を必要に応じて３％ＤＭＳＯまたは１Ｍベタ
インとともに用いて、特異的オンターゲットまたはオフターゲット部位を増幅するＰＣＲ
反応を実施した。上記の増幅に使用した全プライマーを表Ｅに列記する。得られたＰＣＲ
産物は大きさが３００〜８００ｂｐであり、これを製造業者の説明書に従ってＡｍｐｕｒ
ｅ  ＸＰビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）により精製した。精製したＰＣＲ産物２００ｎｇ
を総体積１９μの１×ＮＥＢ緩衝液２中でハイブリダイズさせ、以下の条件を用いて変性
させてヘテロ二本鎖を形成させた：９５℃、５分；９５〜８５℃、−２℃／秒；８５〜２
５℃、−０．１℃／秒；４℃で保持。ハイブリダイズしたＰＣＲ産物にＴ７エンドヌクレ
アーゼＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、１０単位／μｌ）を１μｌ加え、
３７℃で１５分間インキュベートした。０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ溶液２μｌを加えることに
よりＴ７ＥＩ反応を停止させ、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）を用い
て０．１×ＥＢ緩衝液（ＱＩＡｇｅｎ）２０μｌで溶離させることにより反応生成物を精
製した。次いで、ＱＩＡＸＣＥＬキャピラリー電気泳動系で反応生成物を分析し、既に記
載されているもの（Ｒｅｙｏｎら，２０１２）と同じ式を用いて挿入欠失変異の頻度を計
算した。
【０１２７】
【表１１】
2020120661.tif 000075
2020120661.tif 000076
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2020120661.tif 000127
2020120661.tif 000128
【０１２８】
挿入欠失変異の頻度を定量化するためのサンガーシーケンシング
Ｔ７ＥＩアッセイに使用した精製ＰＣＲ産物をＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯベクタ
ー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内に連結し、化学的コンピテントＴｏｐ１０
細菌細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡを単離し、マサチューセッツ総合病院（Ｍ
ＧＨ）ＤＮＡ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ＣｏｒｅにＭ１３順方向プライマー（５’−ＧＴ
ＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ−３’）（配列番号１０５９）を用いて配列決定した。
【０１２９】
ｓｓＯＤＮを用いるＨＤＲによって誘発される特異的変化を定量化するための制限消化
アッセイ
Ｐｈｕｓｉｏｎ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ
ｓ）を用いて特異的オンターゲット部位のＰＣＲ反応を実施した。タッチダウンＰＣＲプ
ログラム（（９８℃、１０秒；７２〜６２℃、−１℃／サイクル、１５秒；７２℃、３０
秒）×１０サイクル、（９８℃、１０秒；６２℃、１５秒；７２℃、３０秒）×２５サイ
クル）を３％ＤＭＳＯとともに用いてＶＥＧＦおよびＥＭＸ１遺伝子座を増幅した。これ
らのＰＣＲ反応に用いたプライマーを表Ｅに列記する。製造業者の説明書に従ってＡｍｐ
ｕｒｅビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）によりＰＣＲ産物を精製した。ｓｓＯＤＮドナー鋳
型によってコードされるＢａｍＨＩ制限部位の検出には、精製ＰＣＲ産物２００ｎｇを３
７℃で４５分間、ＢａｍＨＩにより消化した。Ａｍｐｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ａｇｅｎｃｏ
ｕｒｔ）を用いて２０μｌ  ０．１×ＥＢ緩衝液で溶離させることにより消化産物を精製
し、ＱＩＡＸＣＥＬキャピラリー電気泳動系を用いて分析および定量化した。
【０１３０】
ＴｒｕＳｅｑライブラリーの作製およびシーケンシングデータの解析
遺伝子座特異的プライマーをオンターゲット部位および候補となる検証済みのオフター
ゲット部位に隣接するように設計して、長さ約３００ｂｐ〜４００ｂｐのＰＣＲ産物を作
製した。上記のプールした二重反復試料のゲノムＤＮＡをＰＣＲの鋳型として用いた。全
ＰＣＲ産物を製造業者の説明書に従ってＡｍｐｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ
）により精製した。精製ＰＣＲ産物をＱＩＡＸＣＥＬキャピラリー電気泳動系で定量化し
た。プールした二重反復試料（上記）それぞれから各遺伝子座のＰＣＲ産物を増幅、精製
、定量化した後、ディープシーケンシング用に等量ずつプールした。プールしたアンプリ
コンを既に記載されている通り（Ｆｉｓｈｅｒら，２０１１）にデュアルインデックスＩ
ｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑアダプターと連結した。アダプター連結後、ライブラリー
を精製し、ＱＩＡＸＣＥＬキャピラリー電気泳動系で泳動させて大きさの変化を確認した
。アダプター連結ライブラリーをｑＰＣＲにより定量化した後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉ
Ｓｅｑ  ２５０ｂｐペアエンドリードを用いて、配列決定をダナ・ファーバー癌研究所分
子生物学コア施設によって実施した。本発明者らは、各試料について７５，０００〜１，
２７０，０００（平均約４２２，０００）のリードを解析した。既に記載されている通り
（Ｓａｎｄｅｒら，２０１３）にＴｒｕＳｅｑリードの挿入欠失変異誘発率を解析した。
特異性の比をディープシーケンシングによって決定されるオンターゲット遺伝子座に観察
された変異誘発の、特定のオフターゲット遺伝子座に観察された変異誘発との比として計
算した。ｔｒｕ−ＲＧＮの個々のオフターゲット部位に対する特異性の改善倍数を、マッ
チする完全長ｇＲＮＡを用いた同じ標的の特異性の比に対するｔｒｕ−ｇＲＮＡを用いて
観察された特異性の比として計算した。本文で言及されるように、一部のオフターゲット
部位についてはｔｒｕ−ｇＲＮＡによる挿入欠失変異は観察されなかった。これらの場合
、本発明者らは、ポアソン計算器を用いて、変異配列の実際の数の上限値が３になるよう
９５％の信頼度で計算した。本発明者らは次いで、この上限値を用いて、上記オフターゲ
ット部位の特異性の最小改善倍数を推定した。
【０１３１】
実施例２ａ．短縮ｇＲＮＡはヒト細胞に効率的にＣａｓ９仲介性ゲノム編集を誘導する
ことができる
５’末端で短縮したｇＲＮＡがその完全長対応物と同程度の効率で機能するのではない
かとする仮説を検証するため、最初に、以下の配列：５’−ＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＧ
ＣＣＡＣＣＴＡｃＧＧ−３’（配列番号２２４１）を有するＥＧＦＰレポーター遺伝子の
単一の標的部位に対して、徐々に短くなる一連のｇＲＮＡを上記の通りに構築した。この
特定のＥＧＦＰ部位を選択したのは、それぞれが５’末端にＧ（これらの実験に使用する
Ｕ６プロモーターから効率的に発現させるのに必要である）を有する１５ｎｔ、１７ｎｔ
、１９ｎｔおよび２０ｎｔの相補性のｇＲＮＡをこの部位に対して作製することが可能で
あったからである。組み込まれて構成的に発現する単一の高感度緑色蛍光タンパク質（Ｅ
ＧＦＰ）遺伝子の崩壊を評価することによってＲＧＮ誘発挿入欠失の頻度を定量化するこ
とが可能なヒト細胞ベースのレポーターアッセイ（実施例１およびＦｕら，２０１３；Ｒ
ｅｙｏｎら，２０１２）（図２Ｂ）を用いて、上記の長さを変えたｇＲＮＡが標的部位に
Ｃａｓ９誘発挿入欠失を誘導する能力を測定した。
【０１３２】
上記の通り、より長い相補性（２１ｎｔ、２３ｎｔおよび２５ｎｔ）を有するｇＲＮＡ
の方が２０ｎｔの相補配列を含む標準的な完全長ｇＲＮＡよりも低い活性を示し（図２Ｈ
）、この結果は、他の者（Ｒａｎら，Ｃｅｌｌ  ２０１３）によって近年報告された結果
と一致している。しかし、１７ｎｔまたは１９ｎｔの標的相補性を有するｇＲＮＡが完全
長ｇＲＮＡと同等かそれ以上の活性を示したのに対して、これより短いわずか１５ｎｔの
相補性を有するｇＲＮＡでは有意な活性はみられなかった（図２Ｈ）。
【０１３３】
これらの最初の知見の一般性を検証するため、完全長ｇＲＮＡおよび４つの追加のＥＧ
ＦＰレポーター遺伝子部位（ＥＧＦＰ部位＃１、＃２、＃３および＃４；図３Ａ）に対し
て１８ｎｔ、１７ｎｔおよび／または１６ｎｔの相補性を有する対応するｇＲＮＡをアッ
セイした。４種類の標的部位のいずれでも、１７ｎｔおよび／または１８ｎｔの相補性を
有するｇＲＮＡは、その対応する完全長ｇＲＮＡと同程度の効率で（またはある場合には
、これよりも効率的に）機能してＣａｓ９仲介性のＥＧＦＰ発現崩壊を誘発した（図３Ａ
）。しかし、相補性が１６ｎｔしかないｇＲＮＡでは、作製することができた２つの部位
で大幅に減少した活性または検出不可能な活性がみられた（図３Ａ）。本発明者らは、検
証した様々な部位のそれぞれについて、同じ量の完全長または短縮ｇＲＮＡ発現プラスミ
ドおよびＣａｓ９発現プラスミドをトランスフェクトした。ＥＧＦＰ部位＃１、＃２およ
び＃３についてトランスフェクトするＣａｓ９発現プラスミドおよび短縮ｇＲＮＡ発現プ
ラスミドの量を変化させた対照実験では、短縮ｇＲＮＡがその完全長対応物と同程度に機
能すること（図３Ｅ（下段）および３Ｆ（下段））、したがって、任意の標的部位で比較
をする際に同じ量のプラスミドを用いることが可能であることが示唆された。まとめると
、以上の結果は、１７ｎｔまたは１８ｎｔの相補性を有する短縮ｇＲＮＡが一般に、完全
長ｇＲＮＡと同程度の効率で機能し得る根拠を示すものであり、以後、相補性がこのよう
な長さである短縮ｇＲＮＡを「ｔｒｕ−ｇＲＮＡ」と呼び、このようなｔｒｕ−ｇＲＮＡ
を用いたＲＧＮを「ｔｒｕ−ＲＧＮ」と呼ぶ。
【０１３４】
次に、ｔｒｕ−ＲＧＮが、クロマチン化した内在遺伝子標的に効率的に挿入欠失を誘導
することができるかどうかを検証した。既に３つの内在ヒト遺伝子（ＶＥＧＦＡ、ＥＭＸ
１およびＣＬＴＡ）内で標準的な完全長ｇＲＮＡで標的化されている４つの部位：ＶＥＧ
ＦＡ部位１、ＶＥＧＦＡ部位３、ＥＭＸ１およびＣＴＬＡ（実施例１およびＦｕら，２０
１３；Ｈｓｕら，２０１３；Ｐａｔｔａｎａｙａｋら，２０１３）を含めた３つの内在ヒ
ト遺伝子内の７つの部位に対してｔｒｕ−ｇＲＮＡを構築した（図３Ｂ）。（実施例１の
ＶＥＧＦＡ部位２については、この標的配列にはＵ６プロモーターからｇＲＮＡが発現す
るのに必要な相補性領域の位置１７にも位置１８にもＧがないため、これに対するｔｒｕ
−ｇＲＮＡを検証することは不可能であった。）上記の十分に確立されたＴ７エンドヌク
レアーゼＩ（Ｔ７ＥＩ）遺伝子型決定アッセイ（Ｒｅｙｏｎら，２０１２）を用いて、上
記各種のｇＲＮＡがそれぞれの標的部位に誘発するＣａｓ９仲介性挿入欠失変異の頻度を
ヒトＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞で定量化した。７つの４つの部位のうち５つの部位ではいず
れも、ｔｒｕ−ＲＧＮが、対応する標準的なＲＧＮによって仲介される挿入欠失変異と同
程度の効率で挿入欠失変異を確実に誘発した（図３Ｂ）。ｔｒｕ−ＲＧＮがその完全長対
応物よりも低い活性を示した２つの部位については、絶対変異誘発率が依然としてほとん
どの適用に有用と思われる高い値（平均１３．３％および１６．６％）を示したことが注
目される。上記標的部位のうち３つの部位（ＶＥＧＦＡ部位１および３ならびにＥＭＸ１
）のサンガーシーケンシングでは、ｔｒｕ−ＲＧＮによって誘発される挿入欠失が予測さ
れた切断部位に由来するものであり、これらの変異は標準的なＲＧＮによって誘発される
変異と実質的に識別不可能であることが確認された（図３Ｃおよび図７Ａ〜７Ｄ）。
【０１３５】
ほかにも、効率的なＲＧＮ活性には最小でも１７ｎｔの相補性が必要であるという本発
明者らの知見の通り、ミスマッチ５’Ｇと１８ｎｔの相補性領域とを有するｔｒｕ−ｇＲ
ＮＡがＣａｓ９誘発挿入欠失を効率的に誘導することができるのに対して、ミスマッチ５
’Ｇと１７ｎｔの相補性領域とを有するｔｒｕ−ｇＲＮＡは、対応する完全長ｇＲＮＡに
比して低い活性または検出不可能な活性を示すことがわかった（図７Ｅ）。
【０１３６】
ｔｒｕ−ＲＧＮのゲノム編集能をさらに評価するため、ｔｒｕ−ＲＧＮがｓｓＯＤＮド
ナー鋳型を用いたＨＤＲを介して正確な配列変化を誘発する能力を試験した。これまでの
研究から、ヒト細胞ではＣａｓ９誘発切断が相同なｓｓＯＤＮドナーから内因遺伝子座へ
の配列の導入を刺激し得ることがわかっている（Ｃｏｎｇら，２０１３；Ｍａｌｉら，２
０１３ｃ；Ｒａｎら，２０１３；Ｙａｎｇら，２０１３）。したがって、相同なｓｓＯＤ
ＮにコードされるＢａｍＨＩ制限部位をこれらの内在遺伝子に導入する能力をＶＥＧＦＡ
部位１およびＥＭＸ１部位を標的とする対応する完全長ｇＲＮＡとｔｒｕ−ｇＲＮＡとで
比較した。ｔｒｕ−ＲＧＮは両部位において、完全長ｇＲＮＡ対応物を保有する標準的な
ＲＧＮと同程度の効率でＢａｍＨＩ部位の導入を仲介した（図３Ｄ）。まとめると、この
データは、ｔｒｕ−ＲＧＮがヒト細胞において標準的なＲＧＮと同程度の効率で両部位の
挿入欠失および正確なＨＤＲ仲介性ゲノム編集事象を誘導するよう機能し得ることを示し
ている。
【０１３７】
実施例２ｂ．ｔｒｕ−ＲＧＮはｇＲＮＡ／ＤＮＡ接合部のミスマッチに対する感度の増
大を示す
ｔｒｕ−ＲＧＮがオンターゲットゲノム編集変化を誘発するよう効率的に機能し得るこ
とが確認されたため、これらのヌクレアーゼがｇＲＮＡ／ＤＮＡ接合部のミスマッチに対
して高い感度を示すかどうかを試験した。これを評価するため、既にＥＧＦＰ部位＃１、
＃２および＃３で試験したｔｒｕ−ｇＲＮＡ（図３Ａの上方）の体系的な一連の変異体を
構築した。この変異体ｇＲＮＡは相補性領域内の各位置（Ｕ６プロモーターからの発現に
必要な５’Ｇは除く）に単一のワトソン−クリック置換を保有する（図５Ａ）。ヒト細胞
ベースのＥＧＦＰ崩壊アッセイを用いて、実施例１に記載されているものと同じ３つの部
位に対して作製したこれらの変異体ｔｒｕ−ｇＲＮＡおよび対応する類似した一連の変異
体完全長ｇＲＮＡがＣａｓ９仲介性挿入欠失を誘導する相対的能力を評価した。その結果
から、３つのＥＧＦＰ標的部位ではいずれも、ｔｒｕ−ＲＧＮの方が全般的に、対応する
完全長ｇＲＮＡを保有する標準的なＲＧＮよりも単一ミスマッチに対して高い感度を示す
ことがわかる（図５Ａの上下のパネルを比較されたい）。感度の強さは部位によって異な
り、ｔｒｕ−ｇＲＮＡが１７ｎｔの相補性を有する部位＃２および＃３に最も大きな差が
みられた。
【０１３８】
単一のヌクレオチドミスマッチに対するｔｒｕ−ＲＧＮの感度が増大したことに後押し
されて、本発明者らは次に、ｇＲＮＡ−ＤＮＡ接合部の２つの隣接する位置を体系的にミ
スマッチさせることによる影響を検討しようとした。そこで本発明者らは、それぞれが２
つの隣接するヌクレオチド位置にワトソン−クリックトランスバージョン置換を有し、Ｅ
ＧＦＰ標的部位＃１、＃２および＃３を標的とするｔｒｕ−ｇＲＮＡの変異体を作製した
（図５Ｂ）。ＥＧＦＰ崩壊アッセイによる判定では、隣接する二重ミスマッチがＲＧＮ活
性に及ぼす影響も同様に、ｔｒｕ−ｇＲＮＡの方が実施例１で作製した全３種類のＥＧＦ
Ｐ標的部位を標的とする対応する完全長ｇＲＮＡの類似した変異体よりも大幅に大きかっ
た（図５Ｂの上下のパネルを比較されたい）。このような効果は部位依存性であると思わ
れ、ＥＧＦＰ部位＃２および＃３に対する二重ミスマッチｔｒｕ−ｇＲＮＡのほぼすべて
が、相補性領域を欠く対照ｇＲＮＡよりもＥＧＦＰ崩壊活性の増大を示すことはなく、Ｅ
ＧＦＰ部位＃１に対するミスマッチｔｒｕ−ｇＲＮＡ変異体のうちの３つのみが残存活性
を示した（図５Ｂ）。さらに、二重変異は全般的に、完全長ｇＲＮＡでは５’末端の方が
大きい影響を示したが、ｔｒｕ−ｇＲＮＡではこのような影響は観察されなかった。以上
をまとめると、本発明者らのデータは、ｔｒｕ−ｇＲＮＡの方が完全長ｇＲＮＡよりもｇ
ＲＮＡ−ＤＮＡ接合部における単一および二重のワトソン−クリックトランスバージョン
ミスマッチに対して高い感度を示すことを示唆している。
【０１３９】
実施例２ｃ．内在遺伝子を標的とするｔｒｕ−ＲＧＮはヒト細胞での特異性の改善を示
す
ｔｒｕ−ＲＧＮが完全長ｇＲＮＡ対応物を保有する標準的なＲＧＮに比してヒト細胞に
おけるゲノムオフターゲット効果の低減を示すかどうかを明らかにするべく次の実験を実
施した。それまでの研究（実施例１およびＦｕら，２０１３；Ｈｓｕら，２０１３を参照
されたい）でＶＥＧＦＡ部位１、ＶＥＧＦＡ部位３およびＥＭＸ１部位１（図３Ｂの上方
に記載されている）を標的とする完全長ｇＲＮＡについて１３か所の真のオフターゲット
部位が明らかにされていたため、本発明者らはこれらの部位を標的とする対応する完全長
ｇＲＮＡおよびｔｒｕ−ｇＲＮＡを検討した。（ＶＥＧＦＡ部位２にはＵ６プロモーター
からｇＲＮＡが効率的に発現するのに必要な相補性領域の位置１７にも位置１８にもＧが
ないため、本発明者らの初期の研究６からこの標的配列に対するｔｒｕ−ｇＲＮＡを試験
することはできなかった。）特筆すべきことに、Ｔ７ＥＩアッセイによって判定したとこ
ろ、これらの真のオフターゲット部位１３か所すべてにおいて、ｔｒｕ−ＲＧＮが対応す
る標準的なＲＧＮに比してヒトＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞における変異誘発活性が大幅に低
減されていることがわかり（表３Ａ）；１３か所のオフターゲット部位のうち１１か所で
は、ｔｒｕ−ＲＧＮによる変異の頻度がＴ７ＥＩアッセイの信頼できる検出限界（２〜５
％）未満に低下した（表３Ａ）。これらの標準的なＲＧＮとｔｒｕ−ＲＧＮの対応する対
を別のヒト細胞系（ＦＴ−ＨＥＫ２９３細胞）の同じ１３か所のオフターゲット部位で試
験したところ、ほぼ同じ結果が観察された（表３Ａ）。
【０１４０】
ｔｒｕ−ＲＧＮに観察された特異性改善の程度を定量化するため、本発明者らは、低頻
度の変異をＴ７ＥＩアッセイよりも高感度で検出および定量化する方法であるハイスルー
プットシーケンシングを用いて、オフターゲット変異頻度を測定した。本発明者らは、Ｔ
７ＥＩアッセイによってｔｒｕ−ｇＲＮＡによる変異率の低下がみられた１３か所の真の
オフターゲット部位のうち１２か所のサブセットを評価し（１３か所の部位のうちの１か
所については、技術的な理由から必要な短いアンプリコンを増幅することができなかった
）、ほかにも、別のグループ７によって特定されていたほかのＥＭＸ１部位１のオフター
ゲット部位を検討した（図６Ａ）。検討した１３か所のオフターゲット部位すべてについ
て、ｔｒｕ−ＲＧＮは対応する標準的なＲＧＮに比して大幅に低下した変異誘発の絶対頻
度を示し（図６Ａおよび表３Ｂ）、その標準的なＲＧＮ対応物の約５０００倍以上もの特
異性の改善をもたらした（図６Ｂ）。２か所のオフターゲット部位（ＯＴ１−４およびＯ
Ｔ１−１１）については、ｔｒｕ−ＲＧＮによって誘発された挿入欠失変異の絶対数およ
び頻度がバックグラウンドのレベルまたはほぼバックグラウンドのレベルまで低下してい
たため、ｔｒｕ−ＲＧＮのオンターゲットとオフターゲットの比を定量化するのが困難で
あった。したがって、この場合、オンターゲットのオフターゲットに対する比は無限大で
あると計算された。この問題に対処するため、本発明者らは代わりに、これらの部位につ
いて９５％の信頼水準で推定される挿入欠失頻度の最大値を特定し、次いで、この内輪の
見積もりを用いて、標準的なＲＧＮと比較したこれらのオフターゲットに対するｔｒｕ−
ＲＧＮの推定される特異性改善の程度の最小値を計算した。これらの計算から、ｔｒｕ−
ＲＧＮがこれらの部位において約１０，０００倍以上の改善をもたらすことが示唆される
（図６Ｂ）。
【０１４１】
ｔｒｕ−ＲＧＮの特異性をさらに検証するため、本発明者らは、ｔｒｕ−ＲＧＮがヒト
ゲノムのほかの密接に関係する部位にオフターゲット変異を誘発する能力を検討した。そ
れぞれ１８ｎｔの標的部位相補性を有するＶＥＧＦＡ部位１およびＥＭＸ１に対するｔｒ
ｕ−ｇＲＮＡについて、相補性領域内の１つまたは２つの位置にミスマッチのあるヒトゲ
ノムのほかのあらゆる部位（上の表３Ａで未だ検討されていない部位）および本発明者ら
が支持する実施例１に記載されている部位の５’末端のミスマッチのうち３つの位置にミ
スマッチのあるあらゆる部位のサブセットをコンピュータで特定した。１７ｎｔの標的部
位相補性を有するＶＥＧＦＡ部位３に対するｔｒｕ−ｇＲＮＡについては、５’末端のミ
スマッチが支持される位置のうち１つの位置にミスマッチのあるあらゆる部位および２つ
の位置にミスマッチのあるあらゆる部位（同じく表３Ａで未だ検討されていない部位）の
サブセットを特定した。このコンピュータによる解析から、ＶＥＧＦＡ部位１、ＶＥＦＧ
Ａ部位３およびＥＭＸ１部位をそれぞれ標的とするｔｒｕ−ＲＧＮのさらなる潜在的オフ
ターゲット部位がそれぞれ計３０か所、３０か所および３４か所得られ、次いで、ＲＧＮ
を発現させたヒトＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞およびＨＥＫ２９３細胞にＴ７ＥＩアッセイを
用いて、これらの部位の変異を評価した。
【０１４２】
特筆すべきことに、ＶＥＧＦＡ部位１、ＶＥＦＧＡ部位３およびＥＭＸ１それぞれに対
する３種類のｔｒｕ−ＲＧＮは、ヒトＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞で検討した９４か所の潜在
的オフターゲット部位のうち９３か所に検出可能なＣａｓ９仲介性挿入欠失変異を誘発せ
ず、またヒトＨＥＫ２９３細胞の９４か所の潜在的オフターゲット部位にはいずれも検出
可能なＣａｓ９仲介性挿入欠失変異を誘発しなかった（表３Ｃ）。オフターゲット変異が
みられた１か所の部位について、ＶＥＧＦＡ部位１を標的とし完全長ｇＲＮＡを有する標
準的なＲＧＮも、この同じオフターゲット部位を変異させることができるかどうかを検討
したところ、標準的なＲＧＮはｔｒｕ−ＲＧＮよりわずかに頻度が低いものの、検出可能
な変異を誘発した（図６Ｃ）。このオフターゲット部位にはｇＲＮＡを短縮しても改善が
見られなかったという事実は、完全長ｇＲＮＡとｔｒｕ−ｇＲＮＡの２０ｎｔ配列と１８
ｎｔ配列とを比較することによって理解することが可能であり、この比較は、完全長２０
ｎｔの標的にある２つの追加の塩基がともにミスマッチであることを示している（図６Ｃ
）。まとめると、９４か所のさらなる潜在的オフターゲット部位を対象にしたこの調査結
果から、ｇＲＮＡを短縮しても新たに高頻度のオフターゲット変異を誘発することはない
と思われる。
【０１４３】
この９４部位のセットのうち最も密接にマッチする潜在的オフターゲット部位（すなわ
ち、１つまたは２つのミスマッチを有する部位）３０か所のディープシーケンシングによ
り、以前に特定された他のオフターゲット部位で観察されたもの（表３Ｂ）と同程度の検
出不可能な挿入欠失変異または極めて低い割合の挿入欠失変異（表３Ｄ）が示された。本
発明者らは、ｔｒｕ−ＲＧＮが一般に、オンターゲット部位と１つまたは２つのミスマッ
チによって異なる部位に極めて低レベルまたは検出不可能なレベルの変異を誘発すると思
われるという結論を導いた。この結論は、５つものミスマッチによって異なる部位に高頻
度のオフターゲット変異が比較的容易にみられた標準的なＲＧＮとは対照的なものである
（実施例１を参照されたい）。
【０１４４】
【表１２】
2020120661.tif 000129
【０１４５】
【表１３】
2020120661.tif 000130
【０１４６】
【表１４】
2020120661.tif 000131
2020120661.tif 000132
2020120661.tif 000133
2020120661.tif 000134
2020120661.tif 000135
2020120661.tif 000136
2020120661.tif 000137
【０１４７】
【表１５】
2020120661.tif 000138
2020120661.tif 000139
【０１４８】
実施例２ｄ．ｔｒｕ−ｇＲＮＡを二重Ｃａｓ９ニッカーゼとともに用いてヒト細胞に効
率的にゲノム編集を誘発することができる
近年記載された挿入欠失変異を誘発するための二重Ｃａｓ９ニッカーゼ法を用いてｔｒ
ｕ−ｇＲＮＡを試験した。この試験を実施するため、Ｃａｓ９−Ｄ１０Ａニッカーゼを、
ヒトＶＥＧＦＡ遺伝子の部位（ＶＥＧＦＡ部位１および本発明者らがＶＥＧＦＡ部位４と
呼ぶ追加の配列）を標的とする２種類の完全長ｇＲＮＡとともにＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞
で共発現させた（図４Ａ）。既に記載されているように（Ｒａｎら，２０１３）、このニ
ッカーゼのペアは協働して機能して、ＶＥＧＦＡ標的遺伝子座に高率で挿入欠失変異を誘
発した（図４Ｂ）。興味深いことに、ＶＥＧＦＡ部位４を標的とするｇＲＮＡとのみ共発
現させたＣａｓ９−Ｄ１０Ａニッカーゼでも、ペアの完全長ｇＲＮＡで観察された変異率
よりいくぶん低いものの、高率で挿入欠失変異が誘発された（図４Ｂ）。重要なことに、
ＶＥＧＦＡ部位１に完全長ｇＲＮＡの代わりにｔｒｕ−ｇＲＮＡを使用しても、二重ニッ
カーゼ法が挿入欠失変異を誘発する効果に影響を及ぼさなかった（図４Ｂ）。
【０１４９】
二重ニッカーゼ戦略はこのほか、ｓｓＯＤＮを用いた特異的配列変化の導入を刺激する
ためにも使用されていることから（Ｍａｌｉら，２０１３ａ；Ｒａｎら，２０１３）、ｔ
ｒｕ−ｇＲＮＡをこのタイプの変化に使用し得るかどうかについても試験した。ＶＥＧＦ
Ａ部位１および４に対するペアの完全長ｇＲＮＡはＣａｓ９−Ｄ１０Ａニッカーゼと協働
して、ｓｓＯＤＮドナーから予想されるヒトＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞のＶＥＧＦＡ遺伝子
座（図３Ｃ）への短い挿入物の効率的な導入を増強した（図３Ａ）。さらに、二重ニッキ
ングによるｓｓＯＤＮ仲介性配列変化の効率は、ＶＥＧＦＡ部位１を標的とする完全長ｇ
ＲＮＡの代わりにｔｒｕ−ｇＲＮＡを使用した場合と同程度に高い値で維持された（図３
Ｃ）。まとめると、以上の結果は、ｔｒｕ−ｇＲＮＡを二重Ｃａｓ９ニッカーゼ戦略の一
部として用いて、この方法によるゲノム編集の効率を損なわずに挿入欠失変異およびｓｓ
ＯＤＮ仲介性配列変化の両方を誘発し得ることを示している。
【０１５０】
ｔｒｕ−ｇＲＮＡを使用してもペアのニッカーゼのオンターゲットゲノム編集活性が消
失しないことが確認されたため、本発明者らは次に、ディープシーケンシングを用いて、
既に特定されている４か所の真のオフターゲット部位におけるＶＥＧＦＡ部位１  ｇＲＮ
Ａによる変異頻度を検討した。この解析から、ペアのニッカーゼをｔｒｕ−ｇＲＮＡとと
もに使用すると、上記４か所のオフターゲット部位のいずれにおいても変異率が実質的に
検出不可能なレベルまで低下することが明らかになった（表４）。一方、上記４か所のオ
フターゲット部位のうち１か所（ＯＴ１−３）では、ｔｒｕ−ＲＧＮ（表３Ｂ）、完全長
ｇＲＮＡを有するペアのニッカーゼ（表４）ともにオフターゲット変異を完全には排除す
ることはできなかった。以上の結果は、ｔｒｕ−ｇＲＮＡを使用することにより、オンタ
ーゲットゲノム編集の効率を損なわずにペアのＣａｓ９ニッカーゼのオフターゲット効果
をさらに低減し得る（逆も同様である）ことを示している。
【０１５１】
【表１６】
2020120661.tif 000140
【０１５２】
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ｉｒｅｄ  ｎｉｃｋａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，８３３−８３８．（２０１３
ａ）．
Ｍａｌｉ，Ｐ．，Ｅｓｖｅｌｔ，Ｋ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．Ｃａｓ９  
ａｓ  ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｉｏｌ
ｏｇｙ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０，９５７−９６３．（２０１３ｂ）．
Ｍａｌｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｉａ  Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８２３−８２６（２０
１３ｃ）．
Ｐａｔｔａｎａｙａｋ，Ｖ．，Ｌｉｎ，Ｓ．，Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｐ．，Ｍａ，Ｅ
．，Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ  Ｌｉｕ，Ｄ．Ｒ．Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕ
ｔ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ＤＮＡ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｒ
ｅｖｅａｌｓ  ＲＮＡ−ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｃａｓ９  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｓｐｅｃ
ｉｆｉｃｉｔｙ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，８３９−８４３．（２０１３）
．
Ｐａｔｔａｎａｙａｋ，Ｖ．，Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｃ．Ｌ．，Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．＆  Ｌ
ｉｕ，Ｄ．Ｒ．Ｒｅｖｅａｌｉｎｇ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｐｅ
ｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｂｙ  ｉ
ｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８，７６５−７７０（
２０１１）．
Ｐｅｒｅｚ，Ｅ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｒ
ｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔ
ｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌ  ２６，８０８−８１６（２００８）．
Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａ，Ｐ．，Ｋｏｃａｋ，Ｄ．Ｄ．，Ｖｏｃｋｌｅｙ，Ｃ．Ｍ．，
Ａｄｌｅｒ，Ａ．Ｆ．，Ｋａｂａｄｉ，Ａ．Ｍ．，Ｐｏｌｓｔｅｉｎ，Ｌ．Ｒ．，Ｔｈａ
ｋｏｒｅ，Ｐ．Ｉ．，Ｇｌａｓｓ，Ｋ．Ａ．，Ｏｕｓｔｅｒｏｕｔ，Ｄ．Ｇ．，Ｌｅｏｎ
ｇ，Ｋ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｇｅｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  
ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ｂａｓｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏ
ｒｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０，９７３−９７６．（２０１３）．
Ｑｉ，Ｌ．Ｓ．，Ｌａｒｓｏｎ，Ｍ．Ｈ．，Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｌ．Ａ．，Ｄｏｕｄｎａ，
Ｊ．Ａ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｓ．，Ａｒｋｉｎ，Ａ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｌｉｍ，Ｗ．
Ａ．Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ  ａｓ  ａｎ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｐｌ
ａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  
ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  １５２，１１７３−１１８３．（２０１３
）．
Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，Ｌｉｎ，Ｃ．Ｙ．，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．
Ｓ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ，Ａ．Ｅ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．Ａ．，
Ｉｎｏｕｅ，Ａ．，Ｍａｔｏｂａ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｄｏｕｂｌｅ
ｎｉｃｋｉｎｇ  ｂｙ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９  ｆｏｒ  ｅ
ｎｈａｎｃｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｃｅｌｌ  
１５４，１３８０−１３８９．（２０１３）．
Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．ＦＬＡＳＨ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ＴＡＬＥＮｓ  ｆ
ｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ  ３０，４６０−４６５（２０１２）．
Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．，Ｍａｅｄｅｒ，Ｍ．Ｌ．，Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．，Ｖｏｙｔａｓ，
Ｄ．Ｆ．，Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｄｏｂｂｓ，Ｄ．ＺｉＦｉＴ（Ｚｉｎｃ  Ｆ
ｉｎｇｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｅｒ）：ａｎ  ｕｐｄａｔｅｄ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｅ
ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｏｏｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３８，Ｗ４６
２−４６８．（２０１０）．
Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．，Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｃ．Ｌ．，Ｌｉｎｄｅｒ，Ｓ．Ｊ．，Ｐａｔ
ｔａｎａｙａｋ，Ｖ．，Ｓｈｏｒｅｓｈ，Ｎ．，Ｋｕ，Ｍ．，Ｆｏｄｅｎ，Ｊ．Ａ．，Ｒ
ｅｙｏｎ，Ｄ．，Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｂ．Ｅ．，Ｌｉｕ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ
ｓｉｌｉｃｏ  ａｂｓｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅ
ａｓｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅ
ｄ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｓｉｔｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  
Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２０１３）．
Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．，Ｚａｂａｃｋ，Ｐ．，Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．，Ｖｏｙｔａｓ，
Ｄ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｄｏｂｂｓ，Ｄ．Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｅｒ（Ｚｉ
ＦｉＴ）：ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ／ｔａｒｇｅｔ  ｓｉ
ｔｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｔｏｏｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３５，Ｗ５９９
−６０５．（２００７）．
Ｓｈｅｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ
ｍｉｃｅ  ｖｉａ  Ｃａｓ９／ＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉ
ｎｇ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ（２０１３）．
Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ
ｓ  ｔｏ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄ
ｄｕｐｌｅｘｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４，１１２１１−１１２１６（１９
９５）．
Ｔｅｒｎｓ，Ｍ．Ｐ．＆  Ｔｅｒｎｓ，Ｒ．Ｍ．ＣＲＩＳＰＲ−ｂａｓｅｄ  ａｄａｐｔ
ｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １
４，３２１−３２７（２０１１）．
Ｗａｎｇ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｅ
Ｃａｒｒｙｉｎｇ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｇｅｎｅｓ  ｂｙ
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．
Ｃｅｌｌ  １５３，９１０−９１８（２０１３）．
Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔ，Ｂ．，Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｈ．＆  Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ
．ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ
ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ａｒｃｈａｅａ．Ｎａｔｕｒｅ  ４８２，３３１−３３８
（２０１２）．
Ｙａｎｇ，Ｌ．，Ｇｕｅｌｌ，Ｍ．，Ｂｙｒｎｅ，Ｓ．，Ｙａｎｇ，Ｊ．Ｌ．，Ｄｅ  Ｌ
ｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，Ａ．，Ｍａｌｉ，Ｐ．，Ａａｃｈ，Ｊ．，Ｋｉｍ−Ｋｉｓｅｌａ
ｋ，Ｃ．，Ｂｒｉｇｇｓ，Ａ．Ｗ．，Ｒｉｏｓ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｏｐ
ｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｃａｒｌｅｓｓ  ｈｕｍａｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｇ
ｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４１，９０４９−
９０６１．
【０１５３】
その他の実施形態
ここまで本発明をその詳細な説明と関連させて記載してきたが、上記説明は例示を目的
とするものであり、添付の「特許請求の範囲」の範囲によって定められる本発明の範囲を
限定するものではないことを理解するべきである。その他の態様、利点および改変は以下
の特許請求の範囲内にある。
【図１】
2020120661.tif 000141
【図２−１】
2020120661.tif 000142
【図２−２】
2020120661.tif 000143
【図２−３】
2020120661.tif 000144
【図２−４】
2020120661.tif 000145
【図２−５】
2020120661.tif 000146
【図２−６】
2020120661.tif 000147
【図３−１】
2020120661.tif 000148
【図３−２】
2020120661.tif 000149
【図３−３】
2020120661.tif 000150
【図３−４】
2020120661.tif 000151
【図３−５】
2020120661.tif 000152
【図４】
2020120661.tif 000153
【図５−１】
2020120661.tif 000154
【図５−２】
2020120661.tif 000155
【図６−１】
2020120661.tif 000156
【図６−２】
2020120661.tif 000157
【図７−１】
2020120661.tif 000158
【図７−２】
2020120661.tif 000159
【図７−３】
2020120661.tif 000160
【図７−４】
2020120661.tif 000161
【図７−５】
2020120661.tif 000162
【図８−１】
2020120661.tif 000163
【図８−２】
2020120661.tif 000164
【図８−３】
2020120661.tif 000165
【図９−１】
2020120661.tif 000166
【図９−２】
2020120661.tif 000167
【図９−３】
2020120661.tif 000168
【配列表】
2020120661000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月22日(2020.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５３】
その他の実施形態
ここまで本発明をその詳細な説明と関連させて記載してきたが、上記説明は例示を目的とするものであり、添付の「特許請求の範囲」の範囲によって定められる本発明の範囲を限定するものではないことを理解するべきである。その他の態様、利点および改変は以下の特許請求の範囲内にある。
本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
細胞におけるＲＮＡ誘導型ゲノム編集の特異性を増大させる方法であって、前記細胞と、選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチドに相補的な１７〜１８ヌクレオチドからなる相補性領域を含むガイドＲＮＡとを接触させることを含む、方法。
［２］
細胞内の二本鎖ＤＮＡ分子の標的領域に切断を誘発する方法であって、
Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはＣａｓ９ニッカーゼと、
二本鎖ＤＮＡ分子の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチドに相補的な１７〜１８ヌクレオチドからなる相補性領域を含むガイドＲＮＡと
を前記細胞内で発現させるか、前記細胞内に導入することを含む、方法。
［３］
細胞内の二本鎖ＤＮＡ分子の標的領域を修飾する方法であって、
ｄＣａｓ９−異種機能ドメイン融合タンパク質（ｄＣａｓ９−ＨＦＤ）と、
選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチドに相補的な１７〜１８ヌクレオチドからなる相補性領域を含むガイドＲＮＡと
を前記細胞内で発現させるか、前記細胞内に導入することを含む、方法。
［４］
前記ガイドＲＮＡが、
（ｉ）選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチドに相補的な１７〜１８ヌクレオチドからなる相補性領域を含む単一ガイドＲＮＡまたは
（ｉｉ）選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチドに相補的な１７〜１８ヌクレオチドからなる相補性領域を含むｃｒＲＮＡ、およびｔｒａｃｒＲＮＡ
である、上記［１］〜［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］
前記ガイドＲＮＡが、
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号２４０４）；
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号２４０７）；または
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号２４０８）；
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（ＸＮ）（配列番号１）、
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＡＡＡＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣ（ＸＮ）（配列番号２）、
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧＧＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣ（ＸＮ）（配列番号３）、
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（ＸＮ）（配列番号４）、
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号５）；
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号６）；または
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号７）
からなる群より選択されるリボ核酸であるか、これを含み、
Ｘ１７〜１８が、選択される標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側に隣接する標的配列の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチドに相補的な相補性領域であり、ＸＮが、前記リボ核酸とＣａｓ９との結合に干渉しない任意の配列であり、Ｎが０〜２００、例えば、０〜１００、０〜５０または０〜２０であり得る、
上記［１］〜［３］のいずれか一項に記載の方法。
［６］
１７〜１８ヌクレオチドの標的相補性領域を有する、ガイドＲＮＡ分子。
［７］
前記標的相補性領域が１７〜１８ヌクレオチドからなる、上記［６］に記載のｇＲＮＡ。
［８］
前記標的相補性領域が１７〜１８ヌクレオチドの標的相補性からなる、上記［６］に記載のｇＲＮＡ。
［９］
以下の配列
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号２４０４）；
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号２４０７）；または
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号２４０８）；
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（ＸＮ）（配列番号１）、
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＡＡＡＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣ（ＸＮ）（配列番号２）、
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧＧＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣ（ＸＮ）（配列番号３）、
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（ＸＮ）（配列番号４）、
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号５）；
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号６）；または
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号７）
からなり、
Ｘ１７〜１８が、選択される標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側に隣接する標的配列の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチドに相補的な配列であり、ＸＮが、前記リボ核酸とＣａｓ９との結合に干渉しない任意の配列であり、Ｎが０〜２００、例えば、０〜１００、０〜５０または０〜２０であり得る、
上記［６］に記載のｇＲＮＡ。
［１０］
前記リボ核酸が、前記分子の３’末端に１つまたは複数のＵを含む、上記［５］に記載の方法または上記［６］に記載のリボ核酸。
［１１］
前記リボ核酸が、前記ＲＮＡ分子の５’末端に前記標的配列に相補的ではない１つまたは複数の追加のヌクレオチドを含む、上記［５］に記載の方法または上記［６］に記載のリボ核酸。
［１２］
前記リボ核酸が、前記ＲＮＡ分子の５’末端に前記標的配列に相補的ではない１つ、２つまたは３つの追加のヌクレオチドを含む、上記［５］に記載の方法または上記［６］に記載のリボ核酸。
［１３］
前記相補性領域が、選択される標的配列の相補鎖の連続する１７ヌクレオチドに相補的である、上記［１］〜［５］のいずれか一項に記載の方法または上記［６］〜［１２］のいずれか一項に記載のリボ核酸。
［１４］
前記相補性領域が、選択される標的配列の相補鎖の連続する１８ヌクレオチドに相補的である、上記［１］〜［５］のいずれか一項に記載の方法または上記［６］〜［１２］のいずれか一項に記載のリボ核酸。
［１５］
上記［６］〜［１４］のいずれか一項に記載のリボ核酸をコードする、ＤＮＡ分子。
［１６］
上記［１５］に記載のＤＮＡ分子を含む、ベクター。
［１７］
上記［１６］に記載のベクターを発現する、宿主細胞。
［１８］
前記標的領域が標的ゲノム配列内にある、上記［１］〜［５］のいずれか一項に記載の方法または上記［６］〜［１２］のいずれか一項に記載のリボ核酸。
［１９］
前記標的ゲノム配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側に隣接する、上記［１］〜［５］のいずれか一項に記載の方法または上記［６］〜［１２］のいずれか一項に記載のリボ核酸。
［２０］
前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、以下の配列
ＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号８）もしくはその活性部分；
ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２４０５）もしくはその活性部分；
ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２４０７）もしくはその活性部分；
ＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２４０９）もしくはその活性部分；
ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧ（配列番号２４１０）もしくはその活性部分；
ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡ（配列番号２４１１）もしくはその活性部分；または
ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（配列番号２４１２）もしくはその活性部分
からなる、上記［４］に記載の方法。
［２１］
前記ｃＲＮＡが（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号２４０７）であり、前記ｔｒａｃｒＲＮＡがＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号８）であるか；前記ｃＲＮＡが（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号２４０４）であり、前記ｔｒａｃｒＲＮＡがＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２４０５）であるか；または前記ｃＲＮＡが（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号２４０８）であり、前記ｔｒａｃｒＲＮＡがＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２４０６）である、上記［４］に記載の方法。
［２２］
前記ｄＣａｓ９−異種機能ドメイン融合タンパク質（ｄＣａｓ９−ＨＦＤ）が、遺伝子発現、ヒストンまたはＤＮＡを修飾するＨＦＤを含む、上記［３］に記載の方法。
［２３］
前記異種機能ドメインが、転写活性化ドメイン、ＤＮＡ脱メチル化を触媒する酵素、ヒストン修飾を触媒する酵素、または転写サイレンシングドメインである、上記［２２］に記載の方法。
［２４］
前記転写活性化ドメインが、ＶＰ６４またはＮＦ−κＢ  ｐ６５由来のものである、上記［２３］に記載の方法。
［２５］
前記ヒストン修飾を触媒する酵素が、ＬＳＤ１、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＮＭＴ）、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）またはヒストンデメチラーゼである、上記［２３］に記載の方法。
［２６］
前記転写サイレンシングドメインが、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）、例えばＨＰ１αまたはＨＰ１β由来のものである、上記［２３］に記載の方法。
［２７］
前記選択される標的ゲノム配列に挿入欠失変異または配列変化を生じさせる、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［２８］
前記細胞が真核細胞である、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［２９］
前記細胞が哺乳動物細胞である、上記［２８］に記載の方法。
【外国語明細書】
2020120661000001.pdf