(57)【要約】      （修正有）【課題】真皮に存在するメラニンによるシミを改善する方法を提供する。【解決手段】マクロファージ群と、メラノソームを貪食した線維芽細胞を含む線維芽細胞群を隔離して同一培養系内で培養する工程、被験物質を培地に添加する工程、メラノソームを貪食した線維芽細胞を含む線維芽細胞に対するマクロファージの移動速度及び／又は数を指標とし、コントロールと比較してマクロファージの移動速度が速い被験物質及び／又はマクロファージの数が多い被験物質を有効物質と判定する工程を含むマクロファージの誘引活性化剤のスクリーニング方法を含む。【選択図】図３
2020063219.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有色米ヌカ抽出物を含むマクロファージ誘引活性化剤
【請求項２】
有色米ヌカ抽出物を含むメラニン分解剤
【請求項３】
有色米ヌカ抽出物を含むシミ改善剤
【請求項４】
（１）  マクロファージ群と、メラノソームを貪食した線維芽細胞を含む線維芽細胞群を隔離して同一培養系内で培養する工程
（２）  被験物質を培地に添加する工程
（３）  メラノソームを貪食した線維芽細胞を含む線維芽細胞に対するマクロファージの
移動速度及び／又は数を指標とし、
コントロールと比較してマクロファージの移動速度が速い被験物質及び／又は
マクロファージの数が多い被験物質を有効物質と判定する工程
を含むマクロファージの誘引活性化剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、真皮シミ改善剤に関し、更に詳しくは、マクロファージを所望の部位に誘引し、所望の部位でマクロファージによるメラノソームの貪食を促進することによって、真皮シミを予防・改善する発明に関する。
【０００２】
私たちの肌は常に外的環境から様々なストレスを受けている。特に紫外線による皮膚への傷害は、シミ、そばかす、日焼けの大きな原因になっている。
紫外線照射などにより、基底層で産生されたメラニンは、表皮細胞に移行して角層に到達し、垢となって排出される。しかしながら、シミ部位の皮膚臨床所見では真皮においてもメラニンが検出されており、ターンオーバーが活発ではない真皮にメラニンが長期間留まり、改善しにくいシミの原因となっていた。
【０００３】
従来の美白剤は、メラニン産生に影響を及ぼす酵素であるチロシナーゼを阻害する物質や、表皮のターンオーバーを活性化する物質を有効成分として配合したものが主流であった。しかしながら、これらの美白剤は表皮のメラニンに作用するものであり、真皮のメラニンに対して作用を及ぼすものはなかった。
【０００４】
一方、マクロファージは貪食能が高い細胞と定義され、体に生じた廃棄物の処理が主な役割であり、古くなった細胞や死滅した細胞の処理を行っていることが知られている。この性質を利用して、真皮に存在するメラニンを除去することを目的としたマクロファージ活性化剤の提案がされている（特許文献１）。一方で、真皮の細胞である線維芽細胞はメラニンを集める性質があることが分かってきた（特許文献２）。先行特許は、真皮に単体で存在するメラニン（メラノソームを含む。以下同じ。）の貪食を促進するものであるため、特定の線維芽細胞に貪食されたメラニンを効率的に除去することは困難であった。
【０００５】
マクロファージは走化性因子、例えばＭＣＰ−１（ＣＣＬ２）の濃度勾配に従って移動して、死滅した細胞や菌、メラニンなどの異物を貪食することが知られている（非特許文献１、２）。しかし、化粧料に直接ＭＣＰ−１を配合しても、皮膚表層から深層への拡散による濃度勾配が形成されるのみで、標的部位であるメラニンを貪食した特定の線維芽細胞に対して、マクロファージを選択的に誘引することはできない。
【０００６】
有色米由来の抽出物には、各種の効果が見出されている。例えば、親水性の溶媒で抽出された有色米の抽出物にメラニン生成抑制作用があることが知られている（特許文献３）。また、米ヌカ米胚芽等から得られたスフィンゴ糖脂質によりマクロファージの貪食能を促進する効果が報告されている（特許文献４）。  
しかしながら、メラニンを効率的に除去するためには、マクロファージの貪食能を促進するだけでなく、マクロファージが所望する部位、即ち線維芽細胞がメラニンを集めている部位にまで素早くマクロファージを誘引させる必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−２８１２０５号
【特許文献２】特開２０１８−７２０９８号
【特許文献３】特開平１０−２８７５２５号
【特許文献４】特開２０１０−２７０１０４号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Essential Contribution of Monocyte Chemoattractant Protein-1/C-C Chemokine Ligand-2 to Resolution and Repair Processes in Acute Bacterial Pneumonia. Hideaki Amano, Kounosuke Morimoto. J Immunol 2004; 172: 398-409
【非特許文献２】Monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1), -2, and -3 are chemotactic for human T lymphocytes. Carr MW1, Roth SJ, Luther E, Rose SS, Springer TA, Proc Natl Acad Sci USA. 1994; 91 (9): 3652-6
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、このような問題を解決するためになされたものであり、真皮に存在するメラニンによるシミ（以下、「真皮シミ」という場合がある。）の改善することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
有色米ヌカの抽出物を用いることにより、上記問題を解決した。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、真皮に存在するメラニンを蓄積した線維芽細胞に、マクロファージを誘引させ、メラニンを貪食させることにより、真皮に存在するメラニンによるシミを改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】メラノソームを貪食した線維芽細胞およびマクロファージの共培養経過写真。ｈは時間を示す。以下の図面において同じ。
【図２】図１における写真（０ｈ、１３２ｈ）の二値化画像
【図３】マクロファージ誘引作用の比較
【図４】紫玄米ヌカ抽出物を添加した場合の、メラノソームを貪食した線維芽細胞およびマクロファージの共培養経過写真。
【図５】ＰＢＳ（−）を添加した場合の、メラノソームを貪食した線維芽細胞およびマクロファージの共培養経過写真。
【００１３】
本発明の有色米ヌカ抽出物は、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）イネ属（Ｏｒｙｚａ）イネ（学名：Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）のヌカから抽出することができる。ここで、有色米とは玄米中の種皮、糊粉層またはでんぷん層の一部または全部に色素を含有する品種の米であり、これらの米の色調により、黒米、赤米等が挙げられる。黒米は、中国原産の古代米の一種で、紫黒米、紫米とも呼ばれる。その玄米の表面は黒色で、果皮・種皮および胚芽の部分に紫黒色系色素（アントシアニン系）を含む。赤米は、野生稲の大部分が赤米であることから、赤米は米のルーツとされる。玄米の色が赤褐色で果皮、種皮の部分に赤色系色素（タンニン系）を含む。ヌカ層を有する状態の紫玄米は紫黒色を呈し、褐色を呈する一般的な白米の玄米とは外観によって容易に識別が可能である。また、紫玄米を搗精する際に生じるヌカも、一般的な白米のヌカとは外観によって容易に識別が可能である。
【００１４】
本発明の有色米ヌカ抽出物の調製も特に限定されるものではない。例えば、水、種々適当な有機溶媒、及びこれらの混合溶媒のいずれかに投入し、低温下及び／又は加温下で抽出された物が使用できる。
【００１５】
有色米ヌカ抽出物の各剤の組成物全体に対する配合量は、有効量であれば特に限定されないが、乾燥質量に換算して０．００１〜１０質量％が好ましく、より好ましくは０．００１〜１．０質量％である。
【００１６】
抽出溶媒としては、特に限定はされないが例えば、水；メチルアルコール、エチルアルコール等の低級１価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール等の液状多価アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン；酢酸エチルなどのアルキルエステル；ベンゼン、ヘキサン等の炭化水素；ジエチルエーテル等のエーテル類；ジクロルメタン、クロロホルム等のハロゲン化アルカン等の１種または２種以上を用いることができる。就中、水、エチルアルコール、1,3-ブチレングリコールの１種または２種以上の混合溶媒が特に好適である。
【００１７】
以上のような条件で得られる有色米ヌカ抽出物は、抽出された溶液のまま用いても良いが、さらに必要により濾過等の処理をして、濃縮、粉末化したものを適宜使い分けて用いることができる。また、市販品を用いることができ、丸善製薬社製の紫玄米ヌカエキスＢＧ等を用いることができる。
【００１８】
本発明におけるマクロファージ誘引剤とは有効成分がマクロファージに直接的に作用して、マクロファージを誘引するものをさし、マクロファージ誘引活性剤とは有効成分が細胞等に作用して、マクロファージを間接的に誘引するものをさす。
【００１９】
以下、本発明における有色米ヌカ抽出物の調製、効果試験等の実施例を示すが、ここに記載された実施例に限定されないのは言うまでもない。
【００２０】
＜試料の調製＞
有色米ヌカ抽出物は、丸善製薬社製の紫玄米ヌカエキスＢＧ、米ヌカ抽出物は、丸善製薬社製のコメヌカ抽出液ＢＧ、アントシアニンは、和光純薬製の塩化デルフィニジンを用いた。
【００２１】
＜メラノソームの調製＞
ヒト由来メラノーマ細胞ＨＭ３ＫＯを５％ＣＯ２下、３７℃のインキュベーター内で、１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｇｉｂｃｏ）を用いて培養した。
１００％コンフルエント近くになりメラニン産生が進んだ細胞を、トリプシンを用いて７．０×１０６ｃｅｌｌｓ/ ｔｕｂｅになるようにエッペンドルフチューブに回収、遠心（１０００ｇ、４℃、３分）によって細胞ペレットを作成した。その後ペレットをＰＢＳ（−）にて洗浄した。
【００２２】
細胞ペレットに対し、１ｍＬのｃｏｌｄ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（１％  ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｘｙ  ｐｏｌｙ  （ｅｔｈｙｌｅｎｅｏｘｙ）ｅｔｈａｎｏｌ（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０）、０．０１％  ＳＤＳ含有０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液ｐＨ７．５）を添加した。これを１０分ごとに攪拌しながら、２０分室温にて静置した。この分散溶液を遠心分離し（１０００ｇ、４℃、３分）、不要物を沈殿させ、メラノソームを含む上清を回収した。回収した上清を再度、遠心分離し（１０００ｇ、４℃、３分）、上清を回収した。この上清を遠心分離し（２００００ｇ、４℃、３分）、得られた沈殿をメラノソームリッチ画分とした。上清を吸引除去し、メラノソームのペレットをＰＢＳにて２度洗浄した。（２００００ｇ、４℃、３分）これにＰＢＳを添加し、５０回以上ピペッティングすることによってメラノソームを分散させた。このメラノソーム懸濁液をメラノソームとした。
【００２３】
＜アントシアニン量の調製＞
紫玄米に含まれるアントシアニンの量は収穫年度や品種によって異なるが、各紫玄米１ｇあたりのアントシアニン量が、朝紫は１−６ｍｇ、おくのむらさきは０−０．５ｍｇであった。
これらの数値より、紫玄米に含まれる平均のアントシアニン量を算出し、０．０３ｍｇ／ｍLのアントシアニンを１０００ｐｐｍ紫玄米ヌカ抽出物の比較例として用いた。
【００２４】
−マクロファージの貪食能確認試験−  
線維芽細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬおよび単球細胞を１．０×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬになるように５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｇｉｂｃｏ）にそれぞれ懸濁し、各細胞を７０μＬずつｃｕｌｔｕｒｅ-Ｉｎｓｅｒｔ ｉｎ  μ-Ｄｉｓｈ ３５ ｍｍ, ｈｉｇｈ, ｉｂｉＴｒｅａｔ（ｉｂｉｄｉ）のウェルに播種した。５％のＣＯ２下、３７℃のインキュベーター内で２４時間培養した。培養後線維芽細胞のウェルにはメラノソーム１０μＬを添加し、単球細胞のウェルには、単球細胞をマクロファージに分化させるために、３．２ｍＭ  ＰＭＡをそれぞれ添加した。５％のＣＯ２下、３７℃のインキュベーター内で７２時間培養した。各ウェル内をＰＢＳ（―）で洗浄した後に、インサートを除去して共培養を開始し、マクロファージの貪食能について確認を行った。
【００２５】
＜分析条件＞
画像解析ソフト（ＷｉｎＲＯＯＦ：三谷商事株式会社）を用いて、メラノソームによって黒く見える部分とそれ以外を二値化し、メラノソームの存在する面積を算出した。
【００２６】
図１は、共培養開始直後（０時間）、共培養開始から１３２時間後まで２４時間ごとに撮影した写真である（ＢＺ−Ｘ７００、ＫＥＹＥＮＣＥ、明視野１０倍レンズ）。共培養開始直後には左側にマクロファージ、右側にメラノソームを貪食した線維芽細胞が位置していたが、共培養開始２４時間後あたりからマクロファージが線維芽細胞の方に誘引され始めた。その後、マクロファージがメラノソームを貪食し始め、共培養開始１３２時間後では、画面上のメラノソームの量が減少していることが目視で明らかである。メラノソーム部分の面積を計測したところ、メラノソーム添加直後を１とすると、１３２時間後は０．３０２にまで減少した（図２）。これにより、マクロファージは線維芽細胞に取り込まれたメラノソームも貪食できることを確認した。
【００２７】
ＣｙｔｏＳｅｌｅｃｔ  ９６−ｗｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ、５μｍ、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｆｏｒｍａｔ（ＣＢＡ−１０５、セルバイオラボ）の下層のウェルに５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地および１０００ｐｐｍのスクリーニングサンプルを加えた。なお、ポジティブコントロールとしてＭＣＰ−１  １００ｎｇ／ｍＬ、ネガティブコントロールとしてＰＢＳ（―）を添加した。
上層のメンブレンチャンバーを下層のウェルにセットし、一晩ＦＢＳを除いたＲＰＭＩ１６４０培地で培養を行った単球細胞懸濁液（５．０×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬ）を１００μＬ添加した。フタをして５％のＣＯ２下、３７℃のインキュベーター内で４時間インキュベートした。１５０μＬの  Ｃｅｌｌ  ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを９６−ｗｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ  Ｔｒａｙに添加し、その上に単球細胞懸濁液を除いたメンブレンチャンバーをのせて５％のＣＯ２下、３７℃のインキュベーター内で３０分間インキュベートした。新しい９６ウェルプレートに下層に誘引された単球細胞懸濁液７５μＬおよびＤｅｔａｃｈｍｅｎｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ７５μＬを合わせた。そこに４ｘＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ／Ｃｙｑｕａｎｔ  ＧＲ  Ｄｙｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（７５：１）を作製し、先ほどの誘引されたマクロファージを合わせた１５０μＬの懸濁液の中に５０μＬずつ添加した。この溶液１５０μＬを新しい９６ウェルプレートに移し、蛍光プレートリーダー（ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００Ｐｒｏ、ＴＥＣＡＮ）で４８０ｎｍ／５２０ｎｍで測定を行った。コントロールよりも誘引作用が高ければ、誘引作用があると言えるが、ポジティブコントロールであるＭＣＰ−１よりも高い誘引性作用があれば、著しく高い誘引作用があると言える。
【００２８】
図３に示したマクロファージ誘引試験結果より、米ヌカ抽出物およびアントシアニンには誘引作用がなく、紫玄米ヌカ抽出物には著しく高い誘引作用が認められた。
【００２９】
以上の結果より、有色米である紫玄米のヌカ抽出物にマクロファージ誘引作用があることが見出されたが、有色米ではない通常の米ヌカ抽出物には誘引作用がないことが分かった。また、アントシアニンには誘引作用が見られなかった。このことから、本誘引効果は、アントシアニン以外の成分によるものであることが分かった。
そこで、次に有色米ヌカ抽出物によって、メラノソームを取り込んでいる線維芽細胞部分にマクロファージを誘引できるかを確認した。
【００３０】
線維芽細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬおよび単球細胞を１．０×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬになるように５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｇｉｂｃｏ）に懸濁し、それぞれの細胞を７０μＬずつｃｕｌｔｕｒｅ-Ｉｎｓｅｒｔ ｉｎ  μ-Ｄｉｓｈ ３５ ｍｍ, ｈｉｇｈ, ｉｂｉＴｒｅａｔ（ｉｂｉｄｉ）のウェルに播種した。５％のＣＯ２下、３７℃のインキュベーター内で２４時間培養した。培養後線維芽細胞のウェルにはメラノソーム１０μＬを添加し、単球細胞のウェルには、単球細胞をマクロファージに分化させるために、３．２ｍＭ  ＰＭＡをそれぞれ添加した。５％のＣＯ２下、３７℃のインキュベーター内で７２時間培養した。各ウェル内をＰＢＳ（―）で洗浄した後にインサートを除去して共培養を開始した。なお、７２時間培養後に共培養を開始したのは、メラノソームを添加した線維芽細胞が特定の線維芽細胞にメラノソームを移送終了するのが概ね７２時間後であることからである。共培養開始直後に紫玄米ヌカ抽出物１０００ｐｐｍおよびコントロールとして同量のＰＢＳ（−）を培地に添加後試料添加による濃度勾配ができないよう培地を十分攪拌した。培養直後からタイムラプス動画撮影を行った。コントロールの結果と比較して、誘引されたマクロファージの数が多い、あるいは早さが早ければ、誘引活性化作用があると判断できる。
【００３１】
図４（紫玄米ヌカ抽出物を添加）および図５（コントロールとしてＰＢＳ（−）を添加）は、共培養開始直後（０時間）、共培養開始から７２時間後まで２４時間ごとに撮影した写真である（ＢＺ−Ｘ７００、ＫＥＹＥＮＣＥ、明視野１０倍レンズ）。共培養開始直後には左側にマクロファージ、右側にメラノソームを貪食した線維芽細胞が位置していたが、紫玄米ヌカ抽出物を添加した方では、共培養開始２４時間後あたりからマクロファージが線維芽細胞の方に誘引され始めた。一方、コントロールであるＰＢＳ（−）を添加した方では、共培養開始２４時間後にはまだマクロファージは線維芽細胞の方に誘引されていない。また、共培養開始７２時間後を比較すると、明らかに有色米である紫玄米ヌカ抽出物を添加した方が、マクロファージが多く誘引されている。
この結果より、有色米ヌカ抽出物にはマクロファージ誘引活性化作用があることが確認され、また、線維芽細胞の方に誘引されるマクロファージの様子をリアルタイムで確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明によれば、シミ部位等の所望部位にマクロファージを誘引させることができ、マクロファージにより真皮に落ち込んだメラニン（メラノソーム含む）を貪食させることによって、できたシミを改善することができる。また、本発明のシミ改善剤を用いれば、メラニンが真皮に落ち込んだ後停滞する前にメラニンを貪食させれば、シミ予防も期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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