(57)【要約】【課題】マグロ類の遺伝的性を高精度で効率よく判別できるマグロ類の性判別方法の提供。【解決手段】マグロ類の性別特異的なＤＮＡ多型を検出することができる性判別用プローブと、前記性判別用プローブが検出するＤＮＡ多型が位置する塩基を含むＤＮＡ断片を増幅することができる雌雄共通プライマーセットを用いてＨｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｌｔｉｎｇ（ＨＲＭ）解析を行うことを特徴とする、マグロ類の性判別方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される塩基配列の５０１番目の塩基、５６１及び５６２番目の塩基、５６４番目の塩基、５９５番目の塩基、６４４番目の塩基、７６９番目の塩基、７７０番目の塩基、７８９番目の塩基、１１９８番目の塩基、１２００番目の塩基、１２１３番目の塩基、１２７５番目の塩基、１２８０番目の塩基、１３３８番目の塩基、１３４４番目の塩基、１４１６〜１４２３番目の塩基、１４７２番目の塩基、１４９３番目の塩基、１８６６番目の塩基、１８６７番目の塩基、１８９９番目の塩基、１９１３番目の塩基、２５８３番目の塩基、２５８８番目の塩基、２５８９番目の塩基、２６１１番目の塩基、２６２２番目の塩基、２６３４番目の塩基、２６４３番目の塩基、２６８７番目の塩基、２６９３番目の塩基、２７５２番目の塩基、２７５３番目の塩基、２７５６番目の塩基、２８０１番目の塩基、２８１７番目の塩基、２８５５番目の塩基、２８７４番目の塩基、２９０１番目の塩基、３０５７番目の塩基、３０９３番目の塩基、３１３９番目の塩基、３１４６番目の塩基、３１４８番目の塩基、３１９６番目の塩基、３１９９番目の塩基、３２４９番目の塩基、３２５１番目の塩基、３３６８番目の塩基、３４０４番目の塩基、３４０７番目の塩基、３４２６番目の塩基、３４３３番目の塩基、３４４２番目の塩基、３４７０番目の塩基、３４７９番目の塩基、３５４５番目の塩基、３５４６番目の塩基、３７３５番目の塩基、３７５６番目の塩基、３７６９番目の塩基、３７８８番目の塩基、６２５６番目の塩基、６３１２番目の塩基、６４５５番目の塩基、６５８５番目の塩基、６７８１番目の塩基、６８７９番目の塩基、６９３０番目の塩基、６９３３番目の塩基、６９４０番目の塩基、６９４１番目の塩基、６９８７番目の塩基並びに７０１４番目の塩基の位置に存在するＤＮＡ多型からなる群から選択される１以上のＤＮＡ多型を検出することができる性判別用プローブと、前記性判別用プローブが検出するＤＮＡ多型が位置する塩基を含むＤＮＡ断片を増幅することができる雌雄共通プライマーセットを用いてＨｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｌｔｉｎｇ（ＨＲＭ）解析を行うことを特徴とする、マグロ類の性判別方法。
【請求項２】
前記性判別用プローブが検出するＤＮＡ多型が、前記配列番号１で表される塩基配列の３１３９番目の塩基、３１４６番目の塩基及び３１４８番目の塩基の位置に存在するＤＮＡ多型であることを特徴とする、請求項１記載のマグロ類の性判別方法。
【請求項３】
前記性判別用プローブが検出するＤＮＡ多型が、前記配列番号１で表される塩基配列の１４１６〜１４２３番目の塩基の位置に存在するＤＮＡ多型であることを特徴とする、請求項１記載のマグロ類の性判別方法。
【請求項４】
前記性判別用プローブが、配列番号２〜７のいずれか１つで表される塩基配列からなるプローブであり、前記雌雄共通プライマーセットが、配列番号８で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号９で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットであることを特徴とする、請求項１又は２記載のマグロ類の性判別方法。
【請求項５】
前記性判別用プローブが、配列番号１０又は１１で表される塩基配列からなるプローブであり、前記雌雄共通プライマーセットが、配列番号１２で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号１３で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットであることを特徴とする、請求項１又は３記載のマグロ類の性判別方法。
【請求項６】
性判別用プローブと雌雄共通プライマーセットを含むマグロ類の性判別用キットであって、前記性判別用プローブが、配列番号２〜７のいずれか１つで表される塩基配列からなるプローブであり、前記雌雄共通プライマーセットが、配列番号８で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号９で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットである、マグロ類の性判別用キット。
【請求項７】
性判別用プローブと雌雄共通プライマーセットを含むマグロ類の性判別用キットであって、前記性判別用プローブが、配列番号１０又は１１で表される塩基配列からなるプローブであり、前記雌雄共通プライマーセットが、配列番号１２で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号１３で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットである、マグロ類の性判別用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｌｔｉｎｇ（ＨＲＭ）解析によるマグロ類の遺伝的性判別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、世界的にマグロ類の需要が増加しているため、マグロ類の資源管理や持続的利用に関して国際的に関心が高まっている。資源管理施策の立案には、漁獲物や資源調査サンプルから取得された各種の生物情報を必要とし、体長、年齢、種等のデータとともに、性別データは重要な情報の１つである。
【０００３】
現在、マグロ類の性判別は、生殖腺の目視あるいは組織学的切片観察という古典的な手法により行われている。しかし、これらの手法には、１）生殖腺が発達していない稚仔魚及び若齢個体、並びに市場流通する内臓処理済み個体の性判別には利用できない、２）検査に労力と時間がかかる、３）個体を生かした状態で性判別することが困難である、という欠点がある。そのため、例えば、クロマグロ（Ｔｈｕｎｎｕｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）資源調査サンプルの大部分で性別データが欠損したままとなり、クロマグロ生活史における時間的・空間的な移動・分布と性別との関連性は全く分かっていない。また、近年のマグロ類養殖では、天然ヨコワから人工種苗への転換が進められているが、飼育個体を生かした状態で性判別することが困難であるため、養成中の親魚群が産卵に適した性比で構成されているかどうかを調べることも出来ない。このような理由から、マグロ類の簡便で高精度な性判別方法の開発が望まれている。
【０００４】
これまでに、継代Ｆ３世代のクロマグロの雄特異的な６塩基のＤＮＡ欠失領域を用いてクロマグロの性判別を行う方法が報告されている（非特許文献１）。しかしながら、当該領域を利用したクロマグロの性判別は、特定の経代Ｆ３世代における成功率は９４％と高いものの、天然魚では成功率が３９％と低く、天然魚を含むクロマグロの性判別方法として利用できる十分な精度を有していない。一般に、少数の親から作出された経代群や家系においては、天然集団に殆ど見つからないような低頻度のＤＮＡ多型が偶然広まってしまうことがある。当該領域は、経代飼育の過程において、ごく一部の雄個体が持つＹ染色体上の塩基配列がその子孫である経代群に広まったものであると考えられる。
【０００５】
本発明者らは、これまでに、天然クロマグロ３１個体の全ゲノムリシーケンス解析により塩基配列を網羅的に探索した結果、クロマグロゲノム中に、性別特異的なＤＮＡ多型を複数見出した。また、当該ＤＮＡ多型の存在する領域は、非特許文献１で用いる領域とは異なる領域であることを見出した。さらに、当該ＤＮＡ多型を含む領域をＰＣＲにより増幅し、増幅産物を電気泳動することで、クロマグロ個体の性判別が可能であることを見出した（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Agawa Y. et al. Identification of male sex-linked DNA sequence of the cultured Pacific Bluefin tuna Thunnus orientalis. Fisheries science. 2015, 81(1), 113-121.
【非特許文献２】平成３０年度日本水産学会春季大会講演要旨集  ６２３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記ＰＣＲ法による性判別は、ＰＣＲ後に増幅産物を電気泳動し、次いで性別特異的なバンドの有無やサイズを確認する必要があるため、解析に時間を要する上、多検体を処理するには非効率的であった。
よって、本発明の課題は、性判別の精度が高く、かつ、多検体を効率的に処理できるマグロ類の遺伝的性判別方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで、本発明者は、上記課題を解決するために種々検討した結果、クロマグロゲノム配列のスキャフォルド６４番中の性別特異的なＤＮＡ多型について、前記ＤＮＡ多型を検出することができる性判別用プローブと、前記性判別用プローブが検出するＤＮＡ多型が位置する塩基を含むＤＮＡ断片を増幅することができる雌雄共通プライマーセットを用いてＨｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｌｔｉｎｇ（ＨＲＭ）解析を行うことで、マグロ類の遺伝的性を高精度で効率よく判別できることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔７〕を提供するものである。
〔１〕配列番号１で表される塩基配列の５０１番目の塩基、５６１及び５６２番目の塩基、５６４番目の塩基、５９５番目の塩基、６４４番目の塩基、７６９番目の塩基、７７０番目の塩基、７８９番目の塩基、１１９８番目の塩基、１２００番目の塩基、１２１３番目の塩基、１２７５番目の塩基、１２８０番目の塩基、１３３８番目の塩基、１３４４番目の塩基、１４１６〜１４２３番目の塩基、１４７２番目の塩基、１４９３番目の塩基、１８６６番目の塩基、１８６７番目の塩基、１８９９番目の塩基、１９１３番目の塩基、２５８３番目の塩基、２５８８番目の塩基、２５８９番目の塩基、２６１１番目の塩基、２６２２番目の塩基、２６３４番目の塩基、２６４３番目の塩基、２６８７番目の塩基、２６９３番目の塩基、２７５２番目の塩基、２７５３番目の塩基、２７５６番目の塩基、２８０１番目の塩基、２８１７番目の塩基、２８５５番目の塩基、２８７４番目の塩基、２９０１番目の塩基、３０５７番目の塩基、３０９３番目の塩基、３１３９番目の塩基、３１４６番目の塩基、３１４８番目の塩基、３１９６番目の塩基、３１９９番目の塩基、３２４９番目の塩基、３２５１番目の塩基、３３６８番目の塩基、３４０４番目の塩基、３４０７番目の塩基、３４２６番目の塩基、３４３３番目の塩基、３４４２番目の塩基、３４７０番目の塩基、３４７９番目の塩基、３５４５番目の塩基、３５４６番目の塩基、３７３５番目の塩基、３７５６番目の塩基、３７６９番目の塩基、３７８８番目の塩基、６２５６番目の塩基、６３１２番目の塩基、６４５５番目の塩基、６５８５番目の塩基、６７８１番目の塩基、６８７９番目の塩基、６９３０番目の塩基、６９３３番目の塩基、６９４０番目の塩基、６９４１番目の塩基、６９８７番目の塩基並びに７０１４番目の塩基の位置に存在するＤＮＡ多型からなる群から選択される１以上のＤＮＡ多型を検出することができる性判別用プローブと、前記性判別用プローブが検出するＤＮＡ多型が位置する塩基を含むＤＮＡ断片を増幅することができる雌雄共通プライマーセットを用いてＨｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｌｔｉｎｇ（ＨＲＭ）解析を行うことを特徴とする、マグロ類の性判別方法。
〔２〕前記性判別用プローブが検出するＤＮＡ多型が、前記配列番号１で表される塩基配列の３１３９番目の塩基、３１４６番目の塩基及び３１４８番目の塩基の位置に存在するＤＮＡ多型であることを特徴とする、〔１〕記載のマグロ類の性判別方法。
〔３〕前記性判別用プローブが検出するＤＮＡ多型が、前記配列番号１で表される塩基配列の１４１６〜１４２３番目の塩基の位置に存在するＤＮＡ多型であることを特徴とする、〔１〕記載のマグロ類の性判別方法。
〔４〕前記性判別用プローブが、配列番号２〜７のいずれか１つで表される塩基配列からなるプローブであり、前記雌雄共通プライマーセットが、配列番号８で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号９で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットであることを特徴とする、〔１〕又は〔２〕記載のマグロ類の性判別方法。
〔５〕前記性判別用プローブが、配列番号１０又は１１で表される塩基配列からなるプローブであり、前記雌雄共通プライマーセットが、配列番号１２で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号１３で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットであることを特徴とする、〔１〕又は〔３〕記載のマグロ類の性判別方法。
〔６〕性判別用プローブと雌雄共通プライマーセットを含むマグロ類の性判別用キットであって、前記性判別用プローブが、配列番号２〜７のいずれか１つで表される塩基配列からなるプローブであり、前記雌雄共通プライマーセットが、配列番号８で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号９で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットである、マグロ類の性判別用キット。
〔７〕性判別用プローブと雌雄共通プライマーセットを含むマグロ類の性判別用キットであって、前記性判別用プローブが、配列番号１０又は１１で表される塩基配列からなるプローブであり、前記雌雄共通プライマーセットが、配列番号１２で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号１３で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットである、マグロ類の性判別用キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ＨＲＭ解析によるマグロ類の遺伝的性判別方法、当該方法に利用するプローブ、プライマー及びキットが提供される。本発明の方法は、電気泳動の必要がないため、ＰＣＲと増幅産物の電気泳動を要する従来技術と比較して、性判別の精度を損なうことなく、短時間で効率的に多検体を処理できる。また、本発明の方法は、ＰＣＲと融解曲線の作成を含む一連の操作をリアルタイムＰＣＲ装置のみで連続的に行えるため、作業工程の簡略化や工程間のコンタミネーション（汚染）の回避が可能である。かかる方法により、漁獲物もしくは資源調査サンプルから、又は個体を生かしたまま採取したサンプルから、性別データを高精度、効率的に取得できるようになり、マグロ類の生態の解明や人工種苗生産のための親魚養成の計画的な実施に資することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】雄特異的プローブを用いたＨＲＭ解析による性判別方法の判断基準の模式図である。
【図２】天然クロマグロ３１個体の領域１の塩基配列（配列番号１の３０５９〜３２８８番目の塩基からなる配列に相当する塩基配列）のアライメント結果を示す図である。ＲＥＦは、参照配列（配列番号１の３０５９〜３２８８番目の塩基からなる配列）を示す。ホモ接合型の個体はコンセンサス配列を、ヘテロ接合型の個体（一部の雌と全ての雄）は対立遺伝子１が参照配列と完全一致かほぼ同一であるため、対立遺伝子２の塩基配列のみを示す。塩基配列中のドットは、参照配列と同一の塩基を示す。塩基配列中の矢印は、雄に特異的又は極めて特異性が高い一塩基多型を示す。アライメント上部の横線は、雄特異的プローブであるｔｕｎａ＿ＨＲＭｕｐ＿２８プローブ（配列番号２）を示し、横矢印は、雌雄共通プライマーであるｔｕｎａ＿ＨＲＭ４＿Ｆプライマー（配列番号８）及びｔｕｎａ＿ＨＲＭ４＿Ｒプライマー（配列番号９）を示す。
【図３】天然クロマグロ３１個体の領域２の塩基配列（配列番号１の１３０９〜１４５８番目の塩基からなる配列に相当する塩基配列）のアライメント結果を示す図である。ＲＥＦは、参照配列（配列番号１の１３０９〜１４５８番目の塩基からなる配列）を示す。ホモ接合型の個体はコンセンサス配列を、ヘテロ接合型の個体（一部の雌と全ての雄）は対立遺伝子１が参照配列と完全一致するため、対立遺伝子２の塩基配列のみを示す。塩基配列中のドットは、参照配列と同一の塩基を、ハイフンは欠失を示す。塩基配列中の矢印及び四角は、雄に特異的又は極めて特異性が高い一塩基多型及び欠失領域を示す。アライメント上部の横線は、雄特異的プローブであるｔｕｎａ＿ＨＲＭｕｐ＿Ｐ３Ｍ＿２４プローブ（配列番号１１）を示し、横矢印は、雌雄共通プライマーであるＦ３＿ＤＥＬ＿Ｆ２プライマー（配列番号１２）及びＹ３＿ＤＥＬ＿Ｒ１プライマー（配列番号１３）を示す。
【図４】太平洋クロマグロ雌雄計２９個体（Ａ）、雄１１個体（Ｂ）、雌１８個体（Ｃ）について、ＨＲＭ解析（配列番号２のプローブを使用）の結果得られた融解曲線を示す図である。
【図５】太平洋クロマグロ雌雄計８個体（Ａ）、雄４個体（Ｂ）、雌４個体（Ｃ）について、ＨＲＭ解析（配列番号３のプローブを使用）の結果得られた融解曲線を示す図である。
【図６】太平洋クロマグロ雌雄計８個体（Ａ）、雄４個体（Ｂ）、雌４個体（Ｃ）について、ＨＲＭ解析（配列番号４のプローブを使用）の結果得られた融解曲線を示す図である。
【図７】太平洋クロマグロ雌雄計８個体（Ａ）、雄４個体（Ｂ）、雌４個体（Ｃ）について、ＨＲＭ解析（配列番号５のプローブを使用）の結果得られた融解曲線を示す図である。
【図８】太平洋クロマグロ雌雄計８個体（Ａ）、雄４個体（Ｂ）、雌４個体（Ｃ）について、ＨＲＭ解析（配列番号６のプローブを使用）の結果得られた融解曲線を示す図である。
【図９】太平洋クロマグロ雌雄計８個体（Ａ）、雄４個体（Ｂ）、雌４個体（Ｃ）について、ＨＲＭ解析（配列番号７のプローブを使用）の結果得られた融解曲線を示す図である。
【図１０】太平洋クロマグロ雌雄計８個体（Ａ）、雄４個体（Ｂ）、雌４個体（Ｃ）について、ＨＲＭ解析（配列番号１０のプローブを使用）の結果得られた融解曲線を示す図である。
【図１１】太平洋クロマグロ雌雄計８個体（Ａ）、雄４個体（Ｂ）、雌４個体（Ｃ）について、ＨＲＭ解析（配列番号１１のプローブを使用）の結果得られた融解曲線を示す図である。
【図１２】大西洋クロマグロ雌雄計１２個体（Ａ）、雄６個体（Ｂ）、雌６個体（Ｃ）について、ＨＲＭ解析（配列番号２のプローブを使用）の結果得られた融解曲線を示す図である。
【図１３】大西洋クロマグロ雌雄計１２個体（Ａ）、雄６個体（Ｂ）、雌６個体（Ｃ）について、ＨＲＭ解析（配列番号４のプローブを使用）の結果得られた融解曲線を示す図である
【図１４】大西洋クロマグロ雌雄計１２個体（Ａ）、雄６個体（Ｂ）、雌６個体（Ｃ）について、ＨＲＭ解析（配列番号１１のプローブを使用）の結果得られた融解曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書における塩基配列（ヌクレオチド配列）、核酸などの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ規定（IUPAC-IUB communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138:9-37, 1984）、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作製のためのガイドライン」（特許庁編）などの、当該分野で慣用される記号で記載されている。本明細書において「デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）」は、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖という各１本鎖ＤＮＡを包含する。
【００１３】
また、本明細書において、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、核酸と同義であって、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方を含むものとする。当該ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また当該ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ及び合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。また、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は２本鎖であっても１本鎖であってもよく、ある配列を有する「ヌクレオチド」（又は「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」）といった場合、特に言及しない限り、これに相補的な配列を有する「ヌクレオチド」（又は「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」）も包括的に意味するものとする。
【００１４】
本明細書において「ＤＮＡ多型」とは、個体間でゲノムＤＮＡ塩基配列上の特定部位の塩基配列が異なり、その頻度が集団の１％以上であるものを指し、具体的には、マグロ類雌雄間でゲノムＤＮＡ塩基配列上の特定部位の塩基配列が異なるものを指す。当該多型としては置換、欠失、重複、挿入、逆位等が挙げられる。特に、１個の塩基が他の塩基に置換されたことによる多型を一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）という。以下、ＤＮＡ多型の遺伝子型を対立遺伝子１／対立遺伝子２のように表すことがある。例えば、Ａ／Ａのように両対立遺伝子が同じ場合、遺伝子型はホモ接合型であり、Ａ／Ｔのように両対立遺伝子が異なる場合、遺伝子型はヘテロ接合型である。本明細書において「ＤＮＡ多型」は、対立遺伝子１、対立遺伝子２及びそれらの相補鎖のいずれをも含むものである。
【００１５】
本明細書において「マグロ類」としては、太平洋クロマグロ（Ｔｈｕｎｎｕｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、大西洋クロマグロ（Ｔｈｕｎｎｕｓ  ｔｈｙｎｎｕｓ）、ミナミマグロ（Ｔｈｕｎｎｕｓ  ｍａｃｃｏｙｉｉ）、メバチ（Ｔｈｕｎｎｕｓ  ｏｂｅｓｕｓ）、キハダ（Ｔｈｕｎｎｕｓ  ａｌｂａｃａｒｅｓ）、ビンナガ（Ｔｈｕｎｎｕｓ  ａｌａｌｕｎｇａ）、コシナガ（Ｔｈｕｎｎｕｓ  ｔｏｎｇｇｏｌ）、タイセイヨウマグロ（Ｔｈｕｎｎｕｓ  ａｔｌａｎｔｉｃｕｓ）等が挙げられる。このうち、太平洋クロマグロ、大西洋クロマグロが好ましく、太平洋クロマグロがより好ましい。以下、太平洋クロマグロを単にクロマグロと記載することがある。
【００１６】
本明細書において「クロマグロ」は、Ｔｈｕｎｎｕｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓを指す。クロマグロの染色体数は１組２４本であり、ゲノムサイズは約８億塩基対である。このうち、クロマグロゲノム配列のスキャフォルド６４番に含まれる約７．５ｋｂのゲノムＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。「スキャフォルド」とは、ゲノム解析により得られた多数の断片的な配列を用いてゲノム配列を構築した結果まとめられた配列のことを指す。なお、配列番号１の塩基配列は雌の塩基配列である。配列番号１の４２２番目から３５９５番目、３７３５番目から３７８８番目、６２４０番目から６６４２番目、及び６６９８番目から７１９７番目は、それぞれ、組換えが強く抑制された連鎖不平衡ブロックを形成している。本明細書において、配列番号１で表される塩基配列中、３０５９〜３２８８番目の塩基からなる配列を領域１、１３０９〜１４５８番目の塩基からなる配列を領域２と称する。
【００１７】
本発明は、クロマグロのゲノムＤＮＡの配列番号１で表される塩基配列における特定のＤＮＡ多型がマグロ類の遺伝的性と強く相関しており、当該ＤＮＡ多型を性判別の指標としてＨｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｌｔｉｎｇ（ＨＲＭ）解析により検出することによりマグロ類の遺伝的性を高精度で効率よく判別できることを見出し、完成されたものである。ここで、「遺伝的性」とは、遺伝によって決まる性別のことをいい、以下、単に「性」あるいは「性別」ともいう。
【００１８】
本発明において、マグロ類の性判別の指標として、すなわち性判別マーカーとして用いられるＤＮＡ多型には、以下の表１に示す（１）〜（７４）のＤＮＡ多型が含まれる。各ＤＮＡ多型は全て、雌の遺伝子型がホモ接合型であり、雄の遺伝子型がヘテロ接合型である。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
性判別マーカーとして用いられるＤＮＡ多型の性判別成功率は、９３％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは１００％である。ここで、性判別成功率とは、後記実施例で示す性判別成功率を指す。具体的には、表１の（１）〜（７４）のＤＮＡ多型のうち、（１）、（４）〜（１３）、（１５）、（１６）、（２３）〜（３１）、（３５）〜（４３）、（４５）〜（４７）、（４９）、（５４）〜（５７）、（５９）〜（６３）、（６５）〜（６７）及び（７１）〜（７４）のＤＮＡ多型からなる群より選択される１以上のＤＮＡ多型を性判別マーカーとして用いることが、性判別の精度の観点から好ましい。また、性判別の実施のしやすさの観点からは、（１６）及び（４２）〜（４４）のＤＮＡ多型が好ましい。なお、表１の（１）〜（７４）のＤＮＡ多型のうち、（１）〜（５８）のＤＮＡ多型、（５９）〜（６２）のＤＮＡ多型、（６３）〜（６６）のＤＮＡ多型及び（６７）〜（７４）のＤＮＡ多型は、それぞれ、連鎖不平衡ブロックに含まれている。本発明においては、上記のＤＮＡ多型のうち、１つのＤＮＡ多型のみを性判別の指標として用いてもよいし、２以上のＤＮＡ多型を組み合わせて性判別の指標として用いてもよい。２以上のＤＮＡ多型を組み合わせて指標として用いることで、性判別の精度はより高まるため好ましい。
【００２１】
本発明のマグロ類の性判別方法は、上記のＤＮＡ多型からなる群から選択される１以上のＤＮＡ多型を検出することができる性判別用プローブと、前記性判別用プローブが検出するＤＮＡ多型が位置する塩基を含むＤＮＡ断片を増幅することができる雌雄共通プライマーセットを用いてＨｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｌｔｉｎｇ（ＨＲＭ）解析を行うことを特徴とする。
【００２２】
ここで、ＨＲＭ解析とは、ＤＮＡ多型の同定等に使用される手法で、二本鎖ＤＮＡ特異的結合蛍光色素を含む反応液でＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を一本鎖化した後アニールさせ、温度を徐々に上昇させてＰＣＲ産物が一本鎖に解離する際の蛍光強度変化に基づいて融解曲線を作成し、当該融解曲線のパターンを解析することで、わずか１塩基ペアの違いまで識別する手法である。特に、ＰＣＲ増幅用のプライマーセットに加え、ＤＮＡ多型部位に特異的にハイブリダイズするプローブを用いれば、プライマーセットのみを用いる場合と比べて１塩基ペアの違いをより感度高く検出できる。
【００２３】
本発明において、「ＤＮＡ多型の検出」とは、鋳型ＤＮＡから雌雄共通プライマーセットにより増幅されるＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物）と性判別用プローブとの間の雌雄の配列の違いに起因するミスマッチの有無を、融解曲線のパターンに基づいて判定し、ＤＮＡ多型の遺伝子型を検出することをさす。
【００２４】
よって、本発明のマグロ類の性判別方法においては、より具体的には、上記のＤＮＡ多型からなる群から選択される１以上のＤＮＡ多型を検出することができる性判別用プローブと、前記性判別用プローブが検出するＤＮＡ多型が位置する塩基を含むＤＮＡ断片を増幅することができる雌雄共通プライマーセットとを用い、マグロ類被験体より抽出したＤＮＡを鋳型として、二本鎖ＤＮＡ特異的結合蛍光色素の存在下でＰＣＲと融解曲線の作成を含むＨＲＭ解析を行い、得られた融解曲線のパターンに基づき、前記マグロ類被験体の性を判別すればよい。
【００２５】
本発明の方法で用いるマグロ類の性判別用プローブは、鋳型ＤＮＡ上の目的のＤＮＡ多型を含むＤＮＡ領域と特異的にハイブリダイズできるように、配列番号１で表される塩基配列及び表１のＤＮＡ多型部位の各対立遺伝子の情報に基づき適宜設計すればよい。マグロ類の性染色体は、雄がＸＹ型（ヘテロ）、雌がＸＸ型（ホモ）であり、性判別用プローブとしては、雄に特有のＤＮＡ多型を検出できる雄検出用プローブが好ましい。雄検出用プローブは、目的のＤＮＡ多型の雄特異的塩基又は塩基配列を含むＤＮＡ領域と特異的にハイブリダイズできればよい。かかるプローブとしては、配列番号１で表される塩基配列の部分配列であって、目的のＤＮＡ多型部位の雄特異的塩基又は塩基配列を含むオリゴヌクレオチド又はその相補鎖が例示される。プローブの目的のＤＮＡ多型部位の塩基又は塩基配列とハイブリダイズする塩基又は塩基配列以外の領域については、特異的なハイブリダイズを維持できる限りにおいて、鋳型ＤＮＡ配列と１〜数個、好ましくは１〜３個のミスマッチを有していてもよいが、検出感度の観点から、ミスマッチがないことが好ましい。プローブの塩基長は、通常約１５〜５０塩基であり、好ましくは約１８〜４０塩基であり、より好ましくは約２０〜３６塩基である。プローブは、目的に応じて蛍光色素等の標識を有していてもよいが、コストの面から非標識（ｕｎｌａｂｅｌｅｄ）プローブを用いるのが好ましい。当該非標識プローブは、３’末端にＰＣＲ反応におけるプローブからの伸長を妨げる修飾を有する必要がある。かかる修飾としては、特に限定されないが、ｉｄＴ修飾、リン酸化、ＳｐａｃｅｒＣ３修飾、Ａｍｉｎｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６修飾、ｈｅｘａｎｅｄｉｏｌ修飾等が挙げられる。
【００２６】
本発明の方法で用いる雌雄共通プライマーセットは、フォワードプライマーとリバースプライマーからなり、性判別用プローブが検出する目的のＤＮＡ多型が位置する塩基を含むＤＮＡ断片を増幅することができ、かつ、可能な限りプライマー配列内に表１のＤＮＡ多型部位を含まないように、配列番号１で表される塩基配列及び表１のＤＮＡ多型部位の情報に基づき適宜設計すればよい。具体的には、性判別用プローブが検出する目的のＤＮＡ多型が位置する塩基より上流の領域、好ましくは雌雄共通配列領域にフォワードプライマーを設計し、下流の領域、好ましくは雌雄共通配列領域にリバースプライマーを設計すればよい。各プライマーは、目的のＤＮＡ断片を増幅できる限りにおいて、鋳型ＤＮＡ配列と１〜数個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のミスマッチを有していてもよい。各プライマーの塩基長は、通常１５〜５０塩基であり、好ましくは１５〜３５塩基である。雌雄共通プライマーセットで増幅されるＤＮＡ領域は、解析精度の観点から、好ましくは３００ｂｐ以下、より好ましくは２００ｂｐ以下、さらに好ましくは１５０ｂｐ以下であり、また、好ましくは５０ｂｐ以上である。
フォワードプライマーとリバースプライマーは、通常のＰＣＲと同様にそれぞれ同量を用いてもよいし、一方のプライマーを過剰量用いて、性判別用プローブがハイブリダイズし得るＤＮＡ断片がより多く合成されるように非対称ＰＣＲを行ってもよい。非対称ＰＣＲは、より効率よく性判別を行うことが可能であるため好ましい。
鋳型ＤＮＡに対し本発明の性判別用プローブがハイブリダイズする領域と、本発明の各プライマーがハイブリダイズする領域は、一部重複してもよいし、重複しなくてもよい。
【００２７】
ＰＣＲ反応に用いる鋳型としては、マグロ類被験体より抽出したゲノムＤＮＡが好適に用いられる。当該ゲノムＤＮＡを得るには、まず、マグロ類被検体よりＤＮＡを含有する試料を採取する。マグロ類被検体は、天然魚であってもよいし、養殖魚であってもよい。マグロ類被検体より採取されるＤＮＡ含有試料としては、特に制限されないが、例えば、各種細胞、組織、これらに由来する培養細胞などを例示できる。また、ヒレ、筋肉、内臓、体表粘液等を例示することができる。次に、必要に応じて当該試料に含まれるゲノムＤＮＡを抽出する。ＤＮＡ含有試料からのゲノムＤＮＡの抽出は、公知の方法を用いて行うことができる。ゲノムＤＮＡの抽出法としては、例えば、フェノール法、ＣＴＡＢ法、アルカリＳＤＳ法等が挙げられる。ゲノムＤＮＡは、粗抽出物をそのまま使用してもよいし、必要に応じて、公知の方法により精製してもよい。ゲノムＤＮＡ抽出のための試薬やキットは市販されており、これを用いてもよい。
【００２８】
ＰＣＲ反応は、目的のＤＮＡ多型を検出することができる性判別用プローブと、前記性判別用プローブが検出する目的のＤＮＡ多型が位置する塩基を含むＤＮＡ断片を増幅することができる雌雄共通プライマーセットとを用い、マグロ類被験体より抽出したＤＮＡを鋳型として、二本鎖ＤＮＡ特異的結合蛍光色素の存在下で実施すればよい。かかる蛍光色素としては、特に限定されないが、解析精度の観点から、ＰＣＲ産物に飽和した状態で結合する飽和型蛍光色素が好ましい。該飽和型蛍光色素としては、ＭｅｌｔＤｏｃｔｏｒ（登録商標）  ＨＲＭ  Ｄｙｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）、ＲｅｓｏＬｉｇｈｔＤｙｅ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）、ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｉｎｃ．製）等の市販品を用いることができる。
ＰＣＲ反応の条件としては、特に限定されず、増幅サイズ、プライマーの塩基長、ＧＣ含有率、Ｔｍ値などを考慮して適宜設定すればよい。
【００２９】
ＰＣＲ反応終了後、得られたＰＣＲ産物を熱変性して一本鎖化し、その後冷却してＰＣＲ産物同士あるいはＰＣＲ産物とプローブとをアニールさせる。次いで、温度を徐々に上げていき、ＰＣＲ産物同士あるいはＰＣＲ産物とプローブが一本鎖に解離する際の蛍光強度変化に基づいて融解曲線を作成する。融解曲線の作成にあたっては、一般的なＭｅｌｔ  ｃｕｒｖｅ  ｐｌｏｔやＤｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｐｌｏｔを用いることができる。
なお、ＰＣＲ反応及び融解曲線の作成の一連の操作は、通常、リアルタイムＰＣＲ装置を用いて行えばよい。様々なリアルタイムＰＣＲ装置が市販されており、例えば、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標）３リアルタイムＰＣＲシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）、７５００  ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ(登録商標）  ４８０システム（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）等が例示される。
【００３０】
目的のＤＮＡ多型における雌雄の配列の違いに起因して、得られる融解曲線のパターンは雌雄で異なる。よって、融解曲線のパターンから、検査対象のマグロ類被験体が雄であるか雌であるかを判別できる。例えば、性判別用プローブとして雄特異的プローブを用いると、被験体が雄である場合に比べ、被験体が雌である場合には、ＰＣＲ産物とプローブの間にＤＮＡ多型部位のミスマッチが存在するため、温度上昇時のＰＣＲ産物とプローブの解離が早くなる。その結果、温度を横軸とし、蛍光強度（微分値）を縦軸とした融解曲線の５５〜７０℃付近のパターンに雌雄で違いが生じる。かかる融解曲線のパターンの違いとして、具体的には、雄の融解曲線と雌の融解曲線を重ねあわせたときに雄のパターンが雌のパターンよりも高蛍光強度側に位置するという違いが挙げられる。よって、例えば、融解曲線において５５〜７０℃付近にピークが認められれば被験体の遺伝的性は雄であると判別でき、５５〜７０℃付近にピークが認められなければ被験体の遺伝的性は雌であると判別できる。あるいは、融解曲線において５５〜７０℃付近のパターンがゆるやかな山なりの形状（ゆるやかなピーク）であれば被験体の遺伝的性は雄であると判別でき、５５〜７０℃付近のパターンがほぼ直線であれば被験体の遺伝的性は雌であると判別できる。あるいは、融解曲線において５５〜７０℃付近のパターンがほぼなだらかな右肩下がりの形状であれば被験体の遺伝的性は雄であると判別でき、５５〜７０℃付近のパターンが下方に凹んだ形状であれば被験体の遺伝的性は雌であると判別できる。図１に、雄特異的プローブを用いる場合の性判別方法の判断基準の模式図を示す。
【００３１】
本発明の性判別方法によれば、電気泳動の必要がないため、ＰＣＲと増幅産物の電気泳動を要する従来技術と比較して、性判別の精度を損なうことなく、短時間で効率的に多検体を処理できる。また、本発明の方法によれば、ＰＣＲと融解曲線の作成を含む一連の操作をリアルタイムＰＣＲ装置のみで連続的に行えるため、作業工程の簡略化や工程間のコンタミネーション（汚染）の回避が可能である。
【００３２】
本発明の性判別方法は、試料中のＤＮＡ多型の検出のための試薬キットを利用することによって、より簡便に実施することができる。本発明はかかるマグロ類の性判別用キットをも提供する。前記性判別用キットは、性判別用プローブと雌雄共通プライマーセットを含む。
【００３３】
本発明のマグロ類の性判別用キットの一実施形態としては、例えば、配列番号２〜７のいずれか１つで表される塩基配列からなる性判別用プローブと、配列番号８で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号９で表される塩基配列からなるプライマーとからなる雌雄共通プライマーセットとを含むキットが挙げられる。
本発明のマグロ類の性判別用キットの別の一実施形態としては、例えば、配列番号１０又は１１で表される塩基配列からなる性判別用プローブと、配列番号１２で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号１３で表される塩基配列からなるプライマーとからなる雌雄共通プライマーセットとを含むキットが挙げられる。
【００３４】
プローブ及びプライマーは、それぞれ、通常のホスホルアミダイト法、リン酸トリエステル法などの化学合成法によって合成してもよいし、また市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置などを使用して合成してもよい。
【００３５】
本発明のキットは、任意成分として、ＨＲＭ解析に必須の試薬（例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、蛍光色素等）を含んでいてもよい。更にキットには、測定の実施の便益のために適当な反応希釈液、緩衝液等が含まれていてもよい。
【実施例】
【００３６】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００３７】
参考例１  クロマグロの性別特異的な塩基配列の同定
天然太平洋クロマグロ成魚の雌１６個体及び雄１５個体（生殖腺による性判別済み）の全ゲノムリシーケンスデータと新たに作成したクロマグロドラフトゲノム配列を用いて変異解析を実施し、性別特異的な複数のＤＮＡ多型を見出した。当該ＤＮＡ多型が存在するスキャフォルド６４番の約７．５ｋｂのゲノム領域の配列を配列番号１に示す。また、配列番号１で表される塩基配列中の各ＤＮＡ多型の位置、雌の遺伝子型、雄の遺伝子型、性判別成功率を表２に示す。各ＤＮＡ多型の遺伝子型は、雌においてはホモ接合型であり、雄においてはヘテロ接合型である。性判別成功率は、データの取得できた個体数における、雌又は雄特異的遺伝子型を有する個体数の割合である。各ＤＮＡ多型は、その性判別成功率が９３．５％以上と高く、性判別マーカーとして有用である。
さらに、スキャフォルド６４番のゲノム配列をＨａｐｌｏｖｉｅｗ（ｖ４．２）を用い、ＬＤ−ｂａｓｅｄ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍで解析したところ、配列番号１の４２２番目から３５９５番目、３７３５番目から３７８８番目、６２４０番目から６６４２番目及び６６９８番目から７１９７番目の領域が、それぞれ、連鎖不平衡ブロックであることが明らかとなった。
【００３８】
【表２】
2020184917.tif 000003
【００３９】
配列番号１で表される塩基配列中の２領域、具体的には配列番号１で表される塩基配列の３０５９〜３２８８番目の塩基（２３０塩基）からなる領域１と、配列番号１で表される塩基配列の１３０９〜１４５８番目の塩基（１５０塩基）からなる領域２について、リシーケンス解析に用いた雌１６個体、雄１５個体、計３１個体の塩基配列をアライメントした結果を、それぞれ図２及び３に示す。アライメント中の矢印又は四角で示される各ＤＮＡ多型は、雄に特異的又は極めて特異性の高い変異であることが明らかとなった。
【００４０】
実施例１  プローブを用いたＨＲＭ解析１：領域１
クロマグロゲノムのスキャフォルド６４番上の性特異的ＤＮＡ多型を対象に、雌雄共通プライマーであるｔｕｎａ＿ＨＲＭ４＿Ｆ（配列番号８）及びｔｕｎａ＿ＨＲＭ４＿Ｒ（配列番号９）と、配列番号１で表される塩基配列の３１３９、３１４６及び３１４８番目（領域１の８１、８８及び９０番目に相当）の塩基に位置する３箇所の雄特異的ＤＮＡ多型を含む雄特異的未標識プローブであるｔｕｎａ＿ＨＲＭｕｐ＿２８（配列番号２）を用い（図２）、ＨＲＭ解析による性判別試験を行った。プライマーとプローブの配列を表３に示す。なお、ｔｕｎａ＿ＨＲＭｕｐ＿２８プローブは、ＰＣＲで伸長しないように、３’末端にｉｄＴ修飾を有する。
本試験は、雌雄の配列の違いによりＰＣＲ産物とプローブの融解曲線が異なることを利用して性判別を行うものであり、ＨＲＭ解析の結果出力される融解曲線において、６５℃付近に特異的なピークが認められた場合に被験体の遺伝的性は雄であると判定でき、認められなかった場合に被験体の遺伝的性は雌であると判定できる。
【００４１】
【表３】
2020184917.tif 000004
【００４２】
具体的な試験方法は、以下の通りである。天然太平洋クロマグロの雄７７個体及び雌７０個体（計１４７個体、生殖腺による性判別済み）の各個体より、ハサミ等を用いて筋肉を採取し、ＴＮＥＳ・Ｕｒｅａ  ６Ｍ溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＳＤＳ、６Ｍ  Ｕｒｅａ）中でプロテアーゼ処理を行い、自動ＤＮＡ抽出装置（Ｍａｘｗｅｌｌ  ＲＳＣシステム、Ｍａｘｗｅｌｌ  ＲＳＣ  Ｂｌｏｏｄ  ＤＮＡ  ｋｉｔ、プロメガ株式会社製）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。このゲノムＤＮＡ（２５ｎｇ）を鋳型とし、表４の反応系、表５の条件に従って、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標）３リアルタイムＰＣＲシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）によりＰＣＲ反応及び融解曲線の作成を含むＨＲＭ解析を行った。融解曲線の作成では、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標）３リアルタイムＰＣＲシステムに標準装備されているＭｅｌｔ  ｃｕｒｖｅ  ｐｌｏｔを使用した。
【００４３】
【表４】
2020184917.tif 000005
【００４４】
【表５】
2020184917.tif 000006
【００４５】
ＨＲＭ解析の結果出力された融解曲線のうち、雄１１個体、雌１８個体の融解曲線を図４に示す。雄個体では６５℃付近にピークが認められた一方、雌個体では６５℃付近にピークは認められず、これら個体の遺伝的性を判別できた。図４に示さなかった個体についても、同様の融解曲線が得られており、最終的に全１４７個体の遺伝的性を正確に判別できた。
マグロ類のＨＲＭ解析による性判別方法は、上述のように高い性判別精度を有し、従来技術のＰＣＲ法による性判別方法で必要だった個々のサンプルの電気泳動とその後の特異的バンドの確認が不要となることから、簡便な操作及び短時間で多検体のマグロ類の遺伝的性を判別できる。
【００４６】
実施例２  プローブを用いたＨＲＭ解析２：領域１
被験体として実施例１の天然クロマグロのうち雄４個体及び雌４個体を用い、プローブを、配列番号１で表される塩基配列の３１３９、３１４６及び３１４８番目（領域１の８１、８８及び９０番目に相当）の塩基に位置する３箇所の雄特異的ＤＮＡ多型を含む雄特異的未標識プローブであるｔｕｎａ＿ＨＲＭｕｐ＿２４（配列番号３）、ｔｕｎａ＿ＨＲＭｕｐ＿３２（配列番号４）、ｔｕｎａ＿ＨＲＭｕｐ＿３６（配列番号５）、ｔｕｎａ＿ＨＲＭｕｐ＿２８＿２（配列番号６）又はｔｕｎａ＿ＨＲＭｕｐ＿２８＿３（配列番号７）にかえた以外は、実施例１と同様にしてＨＲＭ解析による性判別を行った。試験は２連で行った。プローブは、それぞれ、実施例１のプローブの長さを４ヌクレオチド短くしたもの、４ヌクレオチド長くしたもの、８ヌクレオチド長くしたもの、プローブ位置を５’側に６ヌクレオチド分ずらしたもの、プローブ位置を３’側に４ヌクレオチド分ずらしたものである。プライマーとプローブの配列を表６に示す。各プローブは、３’末端にｉｄＴ修飾を有する。
【００４７】
【表６】
2020184917.tif 000007
【００４８】
ＨＲＭ解析の結果出力された融解曲線を図５〜９に示す。図５は配列番号３のプローブを、図６は配列番号４のプローブを、図７は配列番号５のプローブを、図８は配列番号６のプローブを、図９は配列番号７のプローブを用いた結果を示す。いずれのプローブを用いた場合であっても、雄個体では６０〜７０℃付近にピークが認められた一方、雌個体では６０〜７０℃付近にピークは認められず、全個体の遺伝的性を正確に判別できた。
【００４９】
実施例３  プローブを用いたＨＲＭ解析：領域２
クロマグロゲノムのスキャフォルド６４番上の性特異的変異を対象に、雌雄共通プライマーであるＹ３＿ＤＥＬ＿Ｆ２（配列番号１２）及びＹ３＿ＤＥＬ＿Ｒ１（配列番号１３）と、配列番号１で表される塩基配列の１４１７〜１４２３番目（領域２の１０９〜１１５番目に相当）の塩基の欠失部位を含む雄特異的未標識プローブであるｔｕｎａ＿ＨＲＭｕｐ＿Ｐ３Ｍ＿２０（配列番号１０）又はｔｕｎａ＿ＨＲＭｕｐ＿Ｐ３Ｍ＿２４（配列番号１１）を用い（図３）、ＨＲＭ解析による性判別試験を行った。プライマーとプローブの配列を表７に示す。各プローブは、３’末端にｉｄＴ修飾を有する。
【００５０】
【表７】
2020184917.tif 000008
【００５１】
具体的には、被験体として実施例１の天然クロマグロ個体のうち雄４個体及び雌４個体を用い、上記のプライマーとプローブを用いた以外は、実施例１と同様にしてＨＲＭ解析による性判別を行った。試験は２連で行った。
【００５２】
配列番号１０のプローブを用いたＨＲＭ解析の結果出力された融解曲線を図１０に示す。雄個体では５５〜６０℃付近にゆるやかなピークが認められた一方、雌個体では５５〜６０℃付近にそのようなピークは認められず、全個体の遺伝的性を正確に判別できた。また、配列番号１１のプローブを用いたＨＲＭ解析の結果出力された融解曲線を図１１に示す。雄個体では６０〜６５℃付近のパターンがほぼなだらかな右肩下がりの形状である一方、雌個体では６０〜６５℃付近のパターンが下方に凹んだ形状であり、全個体の遺伝的性を正確に判別できた。
実施例１〜３の結果より、マグロ類のＨＲＭ解析による性判別方法は、表２に記載の一塩基多型だけにとどまらず、欠失多型にも適用できることが明らかとなった。
【００５３】
実施例４  プローブを用いたＨＲＭ解析４：領域１及び２
被験体として大西洋クロマグロ雄６個体及び雌６個体（計１２個体、生殖腺による性判別済み）を用い、プローブとして配列番号２又は４のプローブを用いた以外は、実施例１と同様にしてＨＲＭ解析による性判別を行った。また、同個体を用い、プローブとして配列番号１１のプローブを用いた以外は、実施例３と同様にしてＨＲＭ解析による性判別を行った。各試験は２連で行った。
【００５４】
ＨＲＭ解析の結果出力された融解曲線を図１２〜１４に示す。図１２は配列番号２のプローブを、図１３は配列番号４のプローブを用いた結果を示す。それぞれにおいて、雄個体では６５〜７０℃付近にピークが認められた一方、雌個体では１個体を除き６５〜７０℃付近にピークは認められず、これら個体の遺伝的性を正確に判別できた。また、図１４は配列番号１１のプローブを用いた結果を示す。雄個体では６０〜６５℃付近のパターンがほぼなだらかな右肩下がりの形状あるいはゆるやかなピークである一方、雌個体では１個体を除き６０〜６５℃付近のパターンが下方に凹んだ形状であり、これら個体の遺伝的性を正確に判別できた。
従来より実施されている生殖腺目視により雌と判別された一方、本実施例の各試験で雄の融解曲線のパターンを示し、雄と判別された個体は、同一個体である。生殖腺による性判別では、個体採取時に生殖腺等を取り出し投棄する一瞬に生殖腺をみて判別する際の記録ミスの可能性があること、当該個体について複数のプローブとプライマーの組み合わせでＰＣＲ増幅と融解曲線の作成が確認できており、かつ全てで雄であるという同じ結果が得られていることから、当該個体については、生殖腺により判別した元々の性別データが誤っていたものと考えられる。
【００５５】
比較例１  ＰＣＲ及び電気泳動による性判別：領域１
実施例１の天然太平洋クロマグロの雄７７個体及び雌７０個体（計１４７個体、生殖腺による性判別済み）の各個体より抽出したゲノムＤＮＡ（最終濃度０．５ｎｇ／μｌ）を鋳型とし、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ  ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）と、領域１に設計した雄特異的プライマーＹ２＿Ｆ１（配列番号１４）及びＹ２＿Ｒ２（配列番号１５）（最終濃度各０．４μＭ）を用いて、Ｐｒｏｆｌｅｘ  ＰＣＲ  システム（アプライドバイオシステムズ製）によりＰＣＲ反応（９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃１５秒の反応を３５サイクル）を行い、得られたＰＣＲ増幅産物を３％アガロースゲルにアプライし、１００Ｖで２０分間、電気泳動を行った。
Ｙ２＿Ｆ１プライマーの３’末端並びに３’末端から３及び１０塩基目は一塩基多型の雄特異的対立遺伝子の塩基を有し、Ｙ２＿Ｒ２プライマーの５’末端から７塩基目は雌雄共通の低頻度多型（Ａ／Ｔ）に対応する塩基Ｗを、３’末端から２及び４塩基目は一塩基多型の雄特異的対立遺伝子の塩基を有する。
電気泳動の結果、１４３ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められた場合に被験体の遺伝的性は雄であると判定でき、ＤＮＡ断片の増幅が認められなかった場合に被験体の遺伝的性は雌であると判定することができる。
なお、陰性対照として、塩基配列を確認済の雌個体を用い、陽性対照として、塩基配列を確認済の雄個体を用いた。また、ノンテンプレートコントロール（ＮＴＣ）として、ＤＮＡなしでＰＣＲを行った。さらに、人為的ミスでＰＣＲに失敗し、雄個体から特異的ＤＮＡ断片が増幅されずに、雌と誤判定されてしまう偽陰性を防止するため、内部陽性対照としてミトコンドリアＤＮＡのＮＤ４遺伝子（２６８ｂｐ）について、ＮＤ４＿Ｆプライマー（配列番号１８）及びＮＤ４＿Ｒプライマー（配列番号１９）（最終濃度各０．０５μＭ）を用いた以外は、（１）と同様にしてＰＣＲ反応及び電気泳動を行った。
各プライマーの配列を表８に示す。
【００５６】
【表８】
2020184917.tif 000009
【００５７】
電気泳動の結果、１４７個体のうち１３９個体で、雄では特異的な１４３ｂｐのＤＮＡ断片が認められ、雌では当該ＤＮＡ断片が認められなかった。よって、これら個体の遺伝的性を正確に判別できた。一方、６個体でＰＣＲ増幅に失敗し、２個体で雌を雄と誤判別したため、計８個体で性判別ができなかった。なお、陽性対照では１４３ｂｐのＤＮＡ断片が認められ、陰性対照及びＮＴＣでは当該ＤＮＡ断片が認められなかった。また、内部陽性対照であるＮＤ４遺伝子由来の２６８ｂｐのＤＮＡ断片は、全ての個体で確認された。
本比較例の方法では、ゲル電気泳動が必要なため、ＰＣＲ反応とあわせて、１回の試験あたり実働１時間程度かかる。  
【００５８】
比較例２  ＰＣＲ及び電気泳動による性判別：領域２
領域２に設計した表８に示す雄特異的プライマーＹ３＿Ｆ１（配列番号１６）及びＹ３＿Ｒ１（配列番号１７）を用いた以外は、比較例１と同様にしてＰＣＲ反応及び電気泳動を行った。
Ｙ３＿Ｆ１プライマーの３’末端及び３’末端から７塩基目は一塩基多型の雄特異的対立遺伝子の塩基を有し、Ｙ３＿Ｒ１プライマーは欠失領域の上流及び下流の配列を有する。
電気泳動の結果、１１３ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められた場合に被験体の遺伝的性は雄であると判定でき、ＤＮＡ断片の増幅が認められなかった場合に被験体の遺伝的性は雌であると判定することができる。
【００５９】
電気泳動の結果、１４７個体のうち１３９個体で、雄では特異的な１１３ｂｐのＤＮＡ断片が認められ、雌では当該ＤＮＡ断片が認められなかった。よって、これら個体の遺伝的性を正確に判別できた。一方、６個体でＰＣＲ増幅に失敗し、２個体で雌を雄と誤判別したため、計８個体で性判別ができなかった。なお、陽性対照では１１３ｂｐのＤＮＡ断片が認められ、陰性対照及びＮＴＣでは当該ＤＮＡ断片が認められなかった。また、内部陽性対照であるＮＤ４遺伝子由来の２６８ｂｐのＤＮＡ断片は、全ての個体で確認された。
本比較例の方法では、ゲル電気泳動が必要なため、ＰＣＲ反応とあわせて、１回の試験あたり実働１時間程度かかる。
【００６０】
比較例３  ＰＣＲ及び電気泳動による性判別：領域２
領域２に設計した表７に示す雌雄共通プライマーＹ３＿ＤＥＬ＿Ｆ２（配列番号１２）及びＹ３＿ＤＥＬ＿Ｒ１（配列番号１３）を用いた以外は、比較例１と同様にしてＰＣＲ反応を行った。その後、得られたＰＣＲ増幅産物をマイクロチップ電気泳動装置（ＭｕｌｔｉＮＡ  ＤＮＡ／ＲＮＡ分析用マイクロチップ電気泳動装置、ＤＮＡ−５００キット、島津製作所製）を用いて電気泳動した。マイクロチップ電気泳動は、通常のアガロースゲル電気泳動よりも分解能が高い。
Ｙ３＿ＤＥＬ＿Ｆ２プライマー及びＹ３＿ＤＥＬ＿Ｒ１プライマーで増幅されるＤＮＡ領域には、雄特異的な連続７塩基の欠失が存在するため、１４９ｂｐの雌雄共通ＤＮＡ断片と７塩基短い１４２ｂｐの雄特異的欠失型ＤＮＡ断片が認められた場合に被験体の遺伝的性は雄であると判定でき、１４９ｂｐの雌雄共通ＤＮＡ断片のみが認められた場合に被験体の遺伝的性は雌であると判定することができる。
【００６１】
電気泳動の結果、全１４７個体で、雄では１４９ｂｐ及び１４２ｂｐのＤＮＡ断片が認められ、雌では１４９ｂｐのＤＮＡ断片のみが認められた。よって、全個体の遺伝的性を正確に判別できた。なお、陽性対照では１４９ｂｐ及び１４２ｂｐのＤＮＡ断片が認められ、陰性対照では１４９ｂｐのＤＮＡ断片のみが認められ、ＮＴＣではこれらＤＮＡ断片が認められなかった。
本比較例の方法では、高解像度ゲル電気泳動が必要なため、ＰＣＲ反応とあわせて、１回の試験あたり実働１．５時間程度かかる。
【００６２】
実施例１と比較例１〜３の結果を表９にまとめる。
【００６３】
【表９】
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【００６４】
本発明のＨＲＭ解析による性判別方法は、電気泳動の必要がなく、多検体の並行処理に適しており、かつマグロ類の性を正確に判別できた（実施例１）。一方、従来のＰＣＲ及び電気泳動による性判別方法は、性判別精度が若干低い（比較例１及び２）、あるいは性判別精度は高いものの判別に時間を要した（比較例３）。よって、本発明のＨＲＭ解析による性判別方法は、従来の性判別方法と比較して、性判別の精度を損なうことなく、短時間で効率的に多検体を処理できるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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