(57)【要約】【課題】少なくとも、第１のフラボノイド類から第２のフラボノイド類を製造する方法の提供。【解決手段】下記工程（ａ）を含む、第２のフラボノイド類の製造方法。工程（ａ）：第１のフラボノイド類を含有する溶液において、第１のフラボノイド類から第２のフラボノイド類を生成する能力を有する微生物に、第１のフラボノイド類から第２のフラボノイド類を生成させる工程【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（ａ）を含む、下記一般式（２）で表される第２のフラボノイド類の製造方法。
工程（ａ）：下記一般式（１）で表される第１のフラボノイド類を含有する溶液において、第１のフラボノイド類から下記一般式（２）で表される第２のフラボノイド類を生成する能力を有する微生物に、第１のフラボノイド類から第２のフラボノイド類を生成させる工程
【化１】
2020141666.tif 000011
（式中、Ｒ１乃至Ｒ１０は、それぞれ、水酸基又は水素原子を表し、且つ、Ｒ１乃至Ｒ１０のうち１つ以上は水酸基である。）
【化２】
2020141666.tif 000012
（式中、Ｒ１乃至Ｒ１０は、それぞれ、前記一般式（１）で表される第１のフラボノイド類のＲ１乃至Ｒ１０と同一である。）
【請求項２】
前記微生物が腸内細菌又は酵母である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記微生物が、ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する微生物である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する微生物が、ラクトバチルス・ビフェルメンタンス（Lactobacillus bifermentans）に属する微生物である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記ラクトバチルス・ビフェルメンタンス（Lactobacillus bifermentans）に属する微生物が、ラクトバチルス・ビフェルメンタンス（Lactobacillus bifermentans）ＪＣＭ  １０９４株である、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記第１のフラボノイド類と前記第２のフラボノイド類の組み合わせが、それぞれ、ケルセチンとジヒドロケルセチン、フィセチンとフスチン、ゴシッペチンとジヒドロゴシッペチン、アピゲニンとナリンゲニン、ルテオリンとエリオジクチオール、クリシンとピノセンブリン、ケンフェロールとジヒドロケンフェロール、又はミリセチンとジヒドロミリセチンである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記第１のフラボノイド類と前記第２のフラボノイド類の組み合わせが、それぞれ、ケンフェロールとジヒドロケンフェロール、又はケルセチンとジヒドロケルセチンである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記第１のフラボノイド類と前記第２のフラボノイド類の組み合わせが、それぞれ、ケルセチンとジヒドロケルセチンである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記ケルセチンが植物由来である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記植物がタマネギ又はエンジュである、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記ケルセチンが、ケルセチン配糖体の加水分解により得られるケルセチンである、請求項６〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記ケルセチン配糖体が植物由来である、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記第１のフラボノイド類を含有する溶液がシクロデキストリンを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記シクロデキストリンが、前記第１のフラボノイド類を含有する溶液に対してモル比の総量で０．１当量以上５．０当量以下である、請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記シクロデキストリンが、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、又はヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである、請求項１３又は１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
気相が水素を含む環境下で行われる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１７】
前記気相における前記水素の割合が０．５％以上２０％以下である、請求項１６に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、フラボノイド類の製造方法に関する。詳細には、第１のフラボノイド類から第２のフラボノイド類を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フラボノイド類であるジヒドロケルセチンはポリフェノールの一種であり、強力な抗酸化物質として知られており、医薬品、化粧品、飲食品の素材としての利用が期待されている。ジヒドロケルセチンの製造方法としてはウチワサボテン（特許文献１）やカラマツ（特許文献２、特許文献３）などの植物からの抽出法が報告されている。また、植物からアスチルビン類を抽出し、それを加水分解することでジヒドロケルセチン（タキシフォリン）を取得する方法（特許文献４）も報告されている。しかし、植物からの抽出法は水溶性有機溶媒を大量に使用し、製造工程も複雑である。
【０００３】
また、遺伝子組換え微生物を用いてロイコシアニジンからジヒドロケルセチンを生産する方法（特許文献５）が報告されているが、該方法は遺伝子組換え微生物を使用するため、製造には国の安全性審査の手続が必要となる。また、非組換え微生物の発酵による生産方法としては、ユーバクテリウム・ラムラス（非特許文献１）やアスペルギルス・フミガーツス（特許文献６）を用いた方法が報告されているが、ユーバクテリウム・ラムラスはケルセチンを基質に用いて中間代謝物としてジヒドロケルセチンを生産するものの、ジヒドロケルセチンの蓄積はなく低分子まで反応が進行する。アスペルギルス・フミガーツスはバイオセーフティレベル２であり、医薬品、化粧品、飲食品の素材としての製造方法としては適さない。
すなわち、安全性を満たし、フラボノイド類やその類縁体を生成する微生物は報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４４１８６７５号明細書
【特許文献２】特表２０１４−５０３４８９号公報
【特許文献３】特表２０１５−５０９９７９号公報
【特許文献４】特許第４３３４８３４号明細書
【特許文献５】特表２００８−５０５６５７号公報
【特許文献６】中国特許出願公開第１０７８９３０３３号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】APPL. ENVIRON. MICROBIOL., 67, 12, 5558-5567 (2001)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本開示の課題は、少なくとも、第１のフラボノイド類から第２のフラボノイド類を製造する方法の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
〔１〕下記工程（ａ）を含む、下記一般式（２）で表される第２のフラボノイド類の製造方法。
工程（ａ）：下記一般式（１）で表される第１のフラボノイド類を含有する溶液において、第１のフラボノイド類から下記一般式（２）で表される第２のフラボノイド類を生成
する能力を有する微生物に、第１のフラボノイド類から第２のフラボノイド類を生成させる工程
【化１】
2020141666.tif 000002
（式中、Ｒ１乃至Ｒ１０は、それぞれ、水酸基又は水素原子を表し、且つ、Ｒ１乃至Ｒ１０のうち１つ以上は水酸基である。）
【化２】
2020141666.tif 000003
（式中、Ｒ１乃至Ｒ１０は、それぞれ、前記一般式（１）で表される第１のフラボノイド類のＲ１乃至Ｒ１０と同一である。）
〔２〕前記微生物が腸内細菌又は酵母である、〔１〕に記載の製造方法。
〔３〕前記微生物が、ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する微生物である、〔１〕又は〔２〕に記載の製造方法。
〔４〕前記ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する微生物が、ラクトバチルス・ビフェルメンタンス（Lactobacillus bifermentans）に属する微生物である、〔３〕に記載の製造方法。
〔５〕前記ラクトバチルス・ビフェルメンタンス（Lactobacillus bifermentans）に属する微生物が、ラクトバチルス・ビフェルメンタンス（Lactobacillus bifermentans）ＪＣＭ  １０９４株である、〔４〕に記載の製造方法。
〔６〕前記第１のフラボノイド類と前記第２のフラボノイド類の組み合わせが、それぞれ、ケルセチンとジヒドロケルセチン、フィセチンとフスチン、ゴシッペチンとジヒドロゴシッペチン、アピゲニンとナリンゲニン、ルテオリンとエリオジクチオール、クリシンとピノセンブリン、ケンフェロールとジヒドロケンフェロール、又はミリセチンとジヒドロミリセチンである、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の製造方法。
〔７〕前記第１のフラボノイド類と前記第２のフラボノイド類の組み合わせが、それぞれ、ケンフェロールとジヒドロケンフェロール、又はケルセチンとジヒドロケルセチンである、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の製造方法。
〔８〕前記第１のフラボノイド類と前記第２のフラボノイド類の組み合わせが、それぞれ、ケルセチンとジヒドロケルセチンである、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の製造方法。
〔９〕前記ケルセチンが植物由来である、〔６〕〜〔８〕のいずれかに記載の製造方法。〔１０〕前記植物がタマネギ又はエンジュである、〔９〕に記載の製造方法。
〔１１〕前記ケルセチンが、ケルセチン配糖体の加水分解により得られるケルセチンである、〔６〕〜〔８〕のいずれかに記載の製造方法。
〔１２〕前記ケルセチン配糖体が植物由来である、〔１１〕に記載の製造方法。
〔１３〕前記第１のフラボノイド類を含有する溶液がシクロデキストリンを含む、〔１〕
〜〔１２〕のいずれかに記載の製造方法。
〔１４〕前記シクロデキストリンが、前記第１のフラボノイド類を含有する溶液に対してモル比の総量で０．１当量以上５．０当量以下である、〔１３〕に記載の製造方法。
〔１５〕前記シクロデキストリンが、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、又はヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである、〔１３〕又は〔１４〕に記載の製造方法。
〔１６〕気相が水素を含む環境下で行われる、〔１〕〜〔１５〕のいずれかに記載の製造方法。
〔１７〕前記気相における前記水素の割合が０．５％以上２０％以下である、〔１６〕に記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本開示は、少なくとも、第１のフラボノイド類から第２のフラボノイド類を製造する方法を提供するという効果を奏し得る。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
各態様における各構成及びそれらの組み合わせ等は、一例であって、本発明の主旨から逸脱しない範囲内で、適宜、構成の付加、省略、置換、及びその他の変更が可能である。本開示は、態様によって限定されることはなく、クレームの範囲によってのみ限定される。また、本明細書に開示された各々の態様は、本明細書に開示された他のいかなる特徴とも組み合わせることができる。
【００１０】
本明細書において、ＪＣＭとの文言から始まる菌株の受託番号は、Japan Collection of Microorganisms（国立研究開発法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室、郵便番号：305-0074、住所：茨城県つくば市高野台3-1-1）に保存されている微生物に付与された番号であり、同機関から入手することができる。
【００１１】
本開示の一態様は、下記工程（ａ）を含む、下記一般式（２）で表される第２のフラボノイド類の製造方法である。
工程（ａ）：下記一般式（１）で表される第１のフラボノイド類を含有する溶液において、第１のフラボノイド類から下記一般式（２）で表される第２のフラボノイド類を生成する能力を有する微生物に、第１のフラボノイド類から第２のフラボノイド類を生成させる工程
【００１２】
工程（ａ）は、下記一般式（１）で表される第１のフラボノイド類を含有する溶液において、第１のフラボノイド類から下記一般式（２）で表される第２のフラボノイド類を生成する能力を有する微生物に、第１のフラボノイド類から第２のフラボノイド類を生成させる工程である。
【化３】
2020141666.tif 000004
（式中、Ｒ１乃至Ｒ１０は、それぞれ、水酸基又は水素原子を表し、且つ、Ｒ１乃至Ｒ１０のうち１つ以上は水酸基である。）
【化４】
2020141666.tif 000005
（式中、Ｒ１乃至Ｒ１０は、それぞれ、前記一般式（１）で表される第１のフラボノイド類のＲ１乃至Ｒ１０と同一である。）
【００１３】
第１のフラボノイド類の具体例としては、フラボノール（前記一般式（１）におけるＲ１０が水酸基である。）又はフラボン（前記一般式（１）におけるＲ１０が水素原子である。）が挙げられる。
第２のフラボノイド類は、前記第１のフラボノイド類の２位の二重結合が還元されていること以外は前記第１のフラボノイド類と同一のものである。第１のフラボノイド類がフラボノールの場合は、第２のフラボノイド類の具体例としてフラバノノールが挙げられ、第１のフラボノイド類がフラボンの場合は、第２のフラボノイド類としてフラバノンが挙げられる。
【００１４】
第１のフラボノイド類は、好ましくは、ケルセチン（フラボノール）、フィセチン（フラボノール）、ゴシッペチン（フラボノール）、アピゲニン（フラボン）、ルテオリン（フラボン）、クリシン（フラボン）、ケンフェロール（フラボノール）、ミリセチン（フラボノール）である。
このとき、第２のフラボノイド類は、それぞれ、ジヒドロケルセチン（フラバノノール）、フスチン（フラバノノール）、ジヒドロゴシッペチン（フラバノノール）、ナリンゲニン（フラバノン）、エリオジクチオール（フラバノン）、ピノセンブリン（フラバノン）、ジヒドロケンフェロール（フラバノノール）、ジヒドロミリセチン（フラバノノール）である。
【００１５】
第１のフラボノイド類は、より好ましくは、ケンフェロール、ケルセチンであり、このとき、第２のフラボノイド類は、それぞれ、ジヒドロケンフェロール、ジヒドロケルセチンである。
第１のフラボノイド類は、さらに好ましくはケルセチンであり、このとき、第２のフラボノイド類はジヒドロケルセチンである。
【００１６】
（第１のフラボノイド類から第２のフラボノイド類を生成する能力を有する微生物）
本態様における、第１のフラボノイド類から第２のフラボノイド類を生成する能力を有する微生物は特に制限されないが、例えば、腸内細菌や酵母が挙げられる。
【００１７】
腸内細菌の具体例としては、ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する微生物が挙げられる。より具体的には、ラクトバチルス・ビフェルメンタンス（Lactobacillus bifermentans）に属する微生物が挙げられ、さらに具体的には、ラクトバチルス・ビフェルメンタンス（Lactobacillus bifermentans）ＪＣＭ  １０９４株が挙げられる。
酵母の具体例としては、食品製造に用いられ安全性が認められている酵母が好ましく、例えば、パン酵母、ビール酵母、清酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵母、アルコール酵母、味噌酵母、醤油酵母、トルラ酵母が挙げられる。より具体的には、例えば、サッカロマイセス（Saccharomyces）属に属する酵母、カンジダ（Candida）属に属する酵母、トルロプシス（Torulopsis）属に属する酵母、ミコトルラ（Mycotorula）属に属する酵母、トルラス
ポラ（Torulaspora）属に属する酵母、ロードトルラ（Rhodotorula）属に属する酵母、ザイゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属に属する酵母、スキゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属に属する酵母、ピキア（Pichia）属に属する酵母、ヤロウィア（Yarrowia）属に属する酵母、ハンセヌラ（Hansenula）属に属する酵母、クルイウェロマイセス（Kluyeromyces）属に属する酵母、デバリオマイセス（Debaryomyces）属に属する酵母、ゲオトリクム（Geotrichum）属に属する酵母、ウィッケルハミア（Wickerhamia）属に属する酵母、フェロマイセス（Fellomyces）属に属する酵母、スポロボロマイセス（Sporobolomyces）属に属する酵母が挙げられる。
が挙げられる。
本態様における微生物は、腸内細菌と酵母の一方を用いてもよいし、両方を用いてもよい。また、いずれにおいても、属、種、株に制限はなく、１種でも２種以上を用いてもよい。
【００１８】
また、前記寄託菌株は、それと同一の菌株に制限されず、前記寄託菌株と実質的に同等の菌株であってもよい。実質的に同等の菌株とは、その16S rRNA遺伝子の塩基配列が、前記寄託菌株の16S rRNA遺伝子の塩基配列と９７．５％以上、好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％の相同性を有する微生物である。さらに、第１のフラボノイド類から第２のフラボノイド類を生成する能力を有する微生物は、本態様の効果が損なわれない限り、前記寄託菌株又はそれと実質的に同等の菌株から、変異処理、遺伝子組換え、自然変異株の選択等によって育種された菌株であってもよい。
【００１９】
（第１のフラボノイド類から第２のフラボノイド類を生成する能力を有する微生物の静止菌体）
本態様における、第１のフラボノイド類から第２のフラボノイド類を生成する能力を有する微生物は、その静止菌体を含む。尚、本明細書において微生物が酵母である場合には、下記静止菌体と同義の状態にある細胞を指すものとする。
静止菌体とは、培養した微生物から遠心分離等の操作により培地成分を取り除き、水や生理食塩水等の塩溶液、あるいは緩衝液で洗浄し、洗浄液と同一の液に懸濁した菌体であって、増殖しない状態の菌体を指し、本態様においては、少なくとも、第１のフラボノイド類から第２のフラボノイド類を生成できる代謝系を有している菌体をいう。緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス‐塩酸緩衝液、クエン酸‐リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、MOPS緩衝液、酢酸緩衝液、グリシン緩衝液等が好ましい。緩衝液のｐＨや濃度は、常法に従い適宜調製したものを使用できる。
【００２０】
（第１のフラボノイド類を含有する溶液）
本態様における第１のフラボノイド類を含有する溶液とは、該溶液において、第１のフラボノイド類から第２のフラボノイド類を生成する能力を有する微生物に、第１のフラボノイド類から第２のフラボノイド類を生成させることができるものであれば特に制限されない。好ましくは培地であり、より好ましくは後述する「培地、及び培養による第２のフラボノイド類の生成」欄に記載した培地である。また、第１のフラボノイド類から第２のフラボノイド類を生成する能力を有する微生物が静止菌体である場合には、前述した水や塩溶液、緩衝液が好ましい。
尚、本明細書に記載されている「培地」とは、いずれも、最少培地を含む、微生物が増殖できる溶液をいい、微生物が増殖できない溶液、例えば、前述した水や塩溶液、緩衝液などを含まないものとする。
【００２１】
該溶液へ第１のフラボノイド類を添加する場合には、第２のフラボノイド類の生成前に添加しても、その途中で添加してもよく、また、一括添加、逐次添加、連続添加でもよい。
溶液中の第１のフラボノイド類の含有量は、総量で、通常０．０１ｇ／Ｌ以上、好まし
くは０．１ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１ｇ／Ｌ以上である。一方、通常１００ｇ／Ｌ以下、好ましくは２０ｇ／Ｌ以下、より好ましくは１０ｇ／Ｌ以下である。
【００２２】
（培地、及び培養による第２のフラボノイド類の生成）
工程（ａ）では、前記溶液が培地であることが好ましい。該培地は特に限定されないが、例えば、Difco社製のMRS培地、Oxoid社製のANAEROBE BASAL BROTH （ABB培地）、Oxoid社製のWilkins-Chalgren Anaerobe Broth (CM0643)、日水製薬株式会社製のGAM培地、変法GAM培地、ブレインハートインヒュージョン培地等を使用することができる。
【００２３】
また、培地に水溶性の有機物を炭素源として加えることができる。水溶性の有機物としては、グルコース、アラビノース、ソルビトール、フラクトース、マンノース、スクロース、トレハロース、キシロースなどの糖類；グリセロールなどのアルコール類；吉草酸、酪酸、プロピオン酸、酢酸、ギ酸、フマル酸などの有機酸類などを挙げることが出来る。
【００２４】
培地に加える炭素源としての有機物の濃度は、効率的に発育させるために適宜調節することができる。一般的には、０．１〜１０ｗｔ／ｖｏｌ％の範囲から添加量を選択することができる。
【００２５】
上記の炭素源に加えて、培地に窒素源が加えることができる。窒素源としては通常の発酵に用いうる各種の窒素化合物を用いることができる。
好ましい無機窒素源として、アンモニウム塩、硝酸塩などを、より好ましくは、硫安、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、リン酸水素アンモニウム、硝酸カリウム及び硝酸ソーダなどを挙げることが出来る。
また、有機窒素源としては、アミノ酸類、酵母エキス、ペプトン類（例えばポリペプトンＮ、大豆ペプトンなど）、肉エキス（例えばエールリッヒカツオエキス、ラブ−レムコ末、ブイヨンなど）、魚介類エキス、肝臓エキス、消化血清末、魚油などを挙げることが出来る。
【００２６】
さらに、炭素源や窒素源に加えて、例えば、ビタミンなどの補因子や各種の塩類等の無機化合物を培地に加えることによって、増殖や活性を増強できる場合もある。たとえば無機化合物、ビタミン類、脂肪酸など、動植物由来の微生物増殖補助因子として以下のものを挙げることができる。
【００２７】
無機化合物                      ビタミン類
リン酸二水素カリウム            ビオチン
硫酸マグネシウム                葉酸
硫酸マンガン                    ピリドキシン
塩化ナトリウム                  チアミン
塩化コバルト                    リボフラビン
塩化カルシウム                  ニコチン酸
硫酸亜鉛                        パントテン酸
硫酸銅                          ビタミンＢ１２
明ばん                          チオオクト酸
モリブデン酸ソーダ              ｐ−アミノ安息香酸
塩化カリウム                    ビタミンＫ
ホウ酸等
塩化ニッケル
タングステン酸ナトリウム
セレン酸ナトリウム
硫酸第一鉄アンモニウム
酢酸ナトリウム三水和物
硫酸マグネシウム七水和物
硫酸マンガン四水和物
【００２８】
また、培地中に、システイン、シスチン、硫化ナトリウム、亜硫酸塩、アスコルビン酸、グルタチオン、チオグリコール酸、ルチンなどの還元剤や、カタラーゼ、スーパーオキシドムターゼなどの活性酸素種を分解する酵素を添加することにより生育が良好になる可能性がある。
【００２９】
培養中の気相、水相としては、空気もしくは酸素を含まないことが好ましく、例えば、窒素及び／又は水素を任意の比率で含むことや、窒素及び／又は二酸化炭素を任意の比率で含むことが挙げられ、水素を含む気相や水相であることが好ましい。気相における水素の割合は、第２のフラボノイド類の生成が促進されることから、通常０．５％以上、好ましくは１．０％以上、より好ましくは２．０％以上であり、一方、通常１００％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下である。
培養中の気相や水相をこのような環境にする方法は特に制限されないが、例えば、培養前に前記ガスで気相を置換する方法、これに加えて、培養中も培養器の底部から供給する及び／又は培養器の気相部に供給する方法、培養前に前記ガスで水相をバブリングするなどの方法をとることが出来る。前記水素は、水素ガスをそのまま用いてもよい。また、培地にギ酸及び／又はその塩などの水素の原料を添加し、微生物の作用により培養中に水素を生成してもよい。
【００３０】
通気量としては、好ましくは０．００５〜２ｖｖｍであり、０．０５〜０．５ｖｖｍがより好ましい。また、混合ガスはナノバブルとして供給することもできる。
培養温度は、好ましくは２０℃〜４５℃、より好ましくは２５℃〜４０℃、さらに好ましくは３０℃〜３７℃である。
培養器の加圧条件は、微生物が生育できる条件であれば特に限定されるものではないが、好ましくは０．００１〜１ＭＰａ、より好ましくは０．０１〜０．５ＭＰａである。
培養時間としては、好ましくは８〜３４０時間、より好ましくは１２〜１７０時間、さらに好ましくは１６〜１２０時間である。
【００３１】
また、培養液に界面活性剤、吸着剤、包摂化合物などを添加することにより、第２のフラボノイド類の生成を促進できる場合がある。
界面活性剤としては、例えば、Tween 80等が挙げられ、０．００１ｇ／Ｌ以上１０ｇ／Ｌ以下程度添加することが出来る。
吸着剤としては、例えば、セルロース及びその誘導体；デキストリン；三菱化学株式会社製の疎水吸着剤であるダイアイオンHPシリーズやセパビーズシリーズ；オルガノ株式会社製のアンバーライトXADシリーズなどを挙げることができる。
【００３２】
包摂化合物としては、例えば、シクロデキストリンが挙げられる。シクロデキストリンは、数分子のＤ−グルコースがα（１→４）グリコシド結合によって結合し、環状構造をとった環状オリゴ糖の一種である。例えば、グルコースが５個以上結合したものが知られており、グルコースが６個結合したα−シクロデキストリン（シクロヘキサアミロース）、７個結合したβ−シクロデキストリン（シクロヘプタアミロース）、８個結合したγ−シクロデキストリン（シクロオクタアミロース）が知られている。また、シクロデキストリンの誘導体として、ヒドロキシプロピル化、アセチル化、トリアセチル化、メチル化、トリメチル化などの化学修飾がされたシクロデキストリンが知られている。具体的には、メチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンが挙げられる。更に、クラスターデキストリン（高度分岐環状デキストリン）も知られている。
本発明において用いるシクロデキストリンは、１種でも２種以上でもよい。２種以上のシクロデキストリンを共存させることにより、第２のフラボノイド類の生成を更に促進できる場合がある。
シクロデキストリンの由来は特に制限されず、天然品でも合成品でもよい。抽出方法や精製方法についても特に制限はなく公知の方法に従えばよい。また、市販のものを用いてもよく、例えば、シクロケム社製や塩水港精糖社製のシクロデキストリンなどを用いてよい。
添加量としては、第１のフラボノイド類に対し、モル比の総量で、通常０．１当量以上、好ましくは０．５当量以上、より好ましくは１．０当量以上、さらに好ましくは１．１当量以上であり、一方、通常５．０当量以下、好ましくは２．５当量以下、より好ましくは２．０当量以下、さらに好ましくは１．５当量以下、よりさらに好ましくは１．３当量以下である。
【００３３】
（静止菌体による第２のフラボノイド類の生成）
第１のフラボノイド類から第２のフラボノイド類を生成する能力を有する微生物が静止菌体である場合の溶液は、前記培地の代わりに、前述した「第１のフラボノイド類から第２のフラボノイド類を生成する能力を有する微生物の静止菌体」欄に記載した水や塩溶液、緩衝液が好ましい。
その他の条件については、前記「培地、及び培養による第２のフラボノイド類の生成」欄の記載が援用される。
【００３４】
（第１のフラボノイド類）
本態様における第１のフラボノイド類は、どのような方法により調製されたものでもよいが、植物由来であることが好ましい。
前記植物は、本態様における第１のフラボノイド類を含有するものであれば制限されないが、タマネギ、エンジュ、林檎、ほうれん草、松葉、ケール、パセリ、緑茶等が好ましく、より好ましくは、タマネギ、エンジュである。
また、廃棄物を有効利用するという観点から、前記植物の外皮やエキスが好ましく、タマネギの外皮や、タマネギのエキス、エンジュのエキス等がより好ましい。
【００３５】
前記植物から第１のフラボノイド類を抽出する場合、抽出溶媒としては、例えば、水、熱水、アルコール（好適にはエタノール）、アセトン、 エーテル、酢酸エチル、ジメチルスルフォキシド等の有機溶媒、またはこれらの水溶液が使用できる。抽出溶媒を用いて前記植物から第１のフラボノイド類を抽出した後、そのまま又は粗精製し、抽出溶媒を、例えば減圧により除去することが好ましい。この際、抽出溶媒を残さずに除去することが好ましい。
【００３６】
また、第１のフラボノイド類は、第１のフラボノイド類の配糖体を加水分解して得たものであってもよい。第１のフラボノイド類の配糖体は、どのような方法により調製されたものでもよいが、植物由来であることが好ましい。
このとき、前記植物は、本態様における第１のフラボノイド類の配糖体を含有するものであれば制限されないが、タマネギ、エンジュ、林檎、ほうれん草、松葉、ケール、パセリ、緑茶等が好ましく、より好ましくは、タマネギ、エンジュである。
また、廃棄物を有効利用するという観点から、前記植物の外皮やエキスが好ましく、タマネギの外皮や、タマネギのエキス、エンジュのエキス等がより好ましい。
【００３７】
（その他の工程）
本態様は、例えば、得られた第２のフラボノイド類を定量する工程を含んでもよい。その方法は常法に従うことができる。たとえば、培養液の一部を採取して適宜希釈し、よく撹拌した後、ポリテロラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜などの膜を使用して濾過し、不
溶物を除去したものを高速液体クロマトグラフィーで定量することなどが挙げられる。
また、本態様は、得られた第２のフラボノイド類を回収する工程を含んでもよい。当該回収工程は、精製工程や濃縮工程等を含む。精製工程における精製処理としては、熱などによる微生物の殺菌；精密濾過（ＭＦ）、限外濾過（ＵＦ）などによる除菌；固形物、高分子物質の除去；有機溶媒やイオン性液体などによる抽出；疎水性吸着剤、イオン交換樹脂、活性炭カラム等を用いた吸着、脱色といった処理を行うことができる。また、濃縮工程における濃縮処理としては、エバポレーター、逆浸透膜等による濃縮が挙げられる。
さらに、得られた第２のフラボノイド類を含む溶液は、凍結乾燥、噴霧乾燥などにより粉末化することができる。粉末化において、ラクトース、デキストリン、コーンスターチ等の賦形剤を添加することもできる。
【実施例】
【００３８】
以下に実施例を記載するが、いずれの実施例も、限定的な意味として解釈される実施例ではない。
【００３９】
〔実施例１〕
第１のフラボノイド類であるケルセチン（Cayman Chemical社製）を０．３３ｍＭとなるように添加したＭＲＳ培地（Difco Laboratories社製）１０ｍＬを加熱滅菌し、気相をＮ２：ＣＯ２：Ｈ２（８０％／１０％／１０％）ガスで置換したものを基本培地とした。このケルセチンを含むＭＲＳ培地に、ラクトバチルス・ビフェルメンタンス（Lactobacillus bifermentans）ＪＣＭ  １０９４株を植菌し、３０℃で嫌気的に培養した。培養終了後、培養液０．１ｍＬに対して０．９ｍＬのジメチルスルフォキシド（０．１％ギ酸）で希釈し、ＨＰＬＣにより、第２のフラボノイド類であるジヒドロケルセチンの定量分析を行った。
【００４０】
ＨＰＬＣは以下に記載の条件で行った。Toronto Research Chemicals社製のジヒドロケルセチンを標品として用い、ジメチルスルフォキシドに溶解して用いた。
ＨＰＬＣ条件：
カラム：Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８（２５０×４．６ｍｍ）（Imtakt社製）
溶離液：Ａ液（水／ギ酸＝９９／１）、Ｂ液（アセトニトリル／ギ酸＝９９／１）、およびＢ液２０％〜６０％のグラジェント
流速：０．７ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：２９０ｎｍ、３６０ｎｍ
【００４１】
その結果、９６時間の培養により、表１に示すとおり、添加したケルセチンの８６．１％がジヒドロケルセチンに変換された。
【００４２】
【表１】
2020141666.tif 000006
【００４３】
〔実施例２〕
第１のフラボノイド類として、ケルセチンの代わりに、ケルセチンを含むタマネギエキス、エンジュエキスを用いてケルセチン濃度が０．３３ｍＭとなるように培地に添加した以外は実施例１と同様に培養した。
その結果、９６時間の培養により、表２に示すとおり、いずれにおいても、第２のフラボノイド類であるジヒドロケルセチンが生産された。
【００４４】
【表２】
2020141666.tif 000007
【００４５】
〔実施例３〕
第１のフラボノイド類として、ケルセチンの代わりに、ケルセチンを含むタマネギ外皮をケルセチン濃度が０．３３ｍＭとなるように培養液に添加した以外は実施例１と同様に培養した。尚、ケルセチン濃度は、事前に乾燥タマネギ外皮を水に入れ、オートクレーブ抽出（１２１℃、１５分）し、乾燥タマネギ外皮中のケルセチン含量を測定し、それに基づいて０．３３ｍＭとなるように調整した。
その結果、９６時間の培養により、表３に示すとおり、第２のフラボノイド類であるジヒドロケルセチンが生産された。
【００４６】
【表３】
2020141666.tif 000008
【００４７】
〔実施例４〕
第１のフラボノイド類として、ケルセチンの代わりに、ケンフェロール濃度が０．３３ｍＭとなるように培地に添加した以外は実施例１と同様に培養した。尚、HPLC条件は、実施例１の条件と同一である。また、標品として、ケンフェロール（Cayman Chemical社製）、ジヒドロケンフェロール（Chemodex社製）を用いた。
その結果、１４４時間の培養により、表４に示すとおり、第２のフラボノイド類であるジヒドロケンフェロールが生産された。
【００４８】
【表４】
2020141666.tif 000009
【００４９】
〔実施例５〕
表５に記載するように各種シクロデキストリンを、培養液中に添加したケルセチンのモル濃度に対して１．２当量となるように培地に添加した以外は実施例１と同様に９６時間の培養を行った。尚、HPLC条件は、実施例１の条件と同一である。
結果を表５に示す。シクロデキストリンを添加しない場合のジヒドロケルセチンの蓄積濃度を１００％とした。各種シクロデキストリンを添加した場合は、ジヒドロケルセチン生産性は１０５〜１３１％に向上した。
【００５０】
【表５】
2020141666.tif 000010