(57)【要約】      （修正有）【課題】少なくとも２以上のエピトープに高い親和性で結合することができる機能的多価抗体、特に、１より多くの修飾性(modifying)リガンドを有する受容体を提供する。【解決手段】ＬＲＰ６標的受容体の２つの異なる結合部位に対する少なくとも２つの受容体結合ドメインを含む二重特異性抗体およびその抗体断片であって、第１の受容体結合ドメインはβ−プロペラ１ドメインに結合し、第２の受容体結合ドメインは同じＬＲＰ６標的受容体上のβ−プロペラ３ドメインに結合し、ＬＲＰ６標的受容体のβ−プロペラ１ドメインおよびβ−プロペラ３ドメインへの第１および第２の受容体結合ドメインの結合がＷｎｔ−１およびＷｎｔ−３またはＷｎｔ−３ａシグナル伝達経路を阻害し、かつ、前記二重特異性抗体およびその抗体断片がＷｎｔシグナルの有意な増強を示さない、二重特異性抗体およびその抗体断片。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＲＰ６標的受容体の２つの異なる結合部位に対する少なくとも２つの受容体結合ドメインを有する単離された多価抗体であって、第１の受容体結合ドメインは、標的受容体上の第１の結合部位に結合し、第２の受容体結合ドメインは、同じＬＲＰ６標的受容体上の第２の結合部位に結合し、該第１および第２の受容体結合ドメインは、ＬＲＰ６標的受容体の第１および第２の結合部位への第１および第２の受容体結合ドメインの結合が古典的Ｗｎｔシグナル変換経路を阻害するように、互いに連結されており、該抗体または抗原結合断片は、Ｗｎｔシグナルの有意な増強を示さない、多価抗体。
【請求項２】
約ナノモル親和性の標的受容体に対する親和性を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
約１ピコモル親和性の標的受容体に対する親和性を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
第１および第２の受容体結合ドメインが、ＩｇＧ抗体、ｓｃＦｖ断片、一本鎖ダイアボディ、抗体模擬物および抗体可変ドメインからなる群から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
多価抗体、二価抗体、二重特異性抗体、および二パラトープ(biparatopic)抗体からなる群から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
第１の受容体結合ドメインがＩｇＧ抗体であり、第２の受容体結合ドメインがｓｃＦｖ断片であり、該ＩｇＧ抗体およびｓｃＦｖ断片は、ＩｇＧ抗体およびｓｃＦｖ断片がそれぞれＬＲＰ６の第１および第２のエピトープに結合することができる空間分布にて、リンカーにより互いに連結されている、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
リンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３からなる群から選択されるＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーである、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
ＬＲＰ６標的受容体の第１のエピトープがβ−プロペラ１ドメインである、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
ＬＲＰ６標的受容体の第２のエピトープがβ−プロペラ３ドメインである、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
ＬＰＲ６  β−プロペラ１ドメインに結合し、配列番号：１、配列番号：２１および配列番号：４７からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号：２、配列番号：２２および配列番号：４８からなる群から選択されるＣＤＲ２；および配列番号：３、配列番号：２３および配列番号：４９からなる群から選択されるＣＤＲ３；ならびに配列番号：４、配列番号：２４および配列番号：５０からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号：５、配列番号：２５および配列番号：５１からなる群から選択されるＣＤＲ２；および配列番号：６、配列番号：２６および配列番号：５２からなる群から選択されるＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
ＬＰＲ６  β−プロペラ３ドメインに結合し、配列番号：６９、配列番号：９３および配列番号：１１５からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号：７０、配列番号：９４および配列番号：１１６からなる群から選択されるＣＤＲ２；および配列番号：７１、配列番号：９５および配列番号：１１７からなる群から選択されるＣＤＲ３；ならびに配列番号：７２、配列番号：９６および配列番号：１１８からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号：７３、配列番号：９７および配列番号：１１９からなる群から選択されるＣＤＲ２；および配列番号：７４、配列番号：９８および配列番号：１２０からなる群から選択されるＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１２】
ＩｇＧ重鎖抗体が、配列番号：１８、６６および１０１からなる群から選択され、軽鎖が配列番号：１７、８６および８５からなる群から選択される、請求項６に記載の抗体。
【請求項１３】
ｓｃＦｖが、配列番号：１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２および１６４からなる群から選択される、請求項６に記載の抗体。
【請求項１４】
ｓｃＦｖ断片が、未変異ｓｃＦｖ断片と比較してｓｃＦｖの安定性を改善する少なくとも１つのアミノ酸変異を含み、該アミノ酸変異は図２９−３２から選択される、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
Ｗｎｔ１シグナル経路およびＷｎｔ３シグナル変換経路からなる群から選択される古典的Ｗｎｔシグナル変換経路を阻害する機能活性を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１６】
細胞集団を枯渇させる、細胞集団の増殖を阻害するか、または減少させる、細胞集団からの炎症性メディエーターの分泌を阻害するか、または減少させる、細胞集団からの細胞質顆粒の分泌を阻害するか、または減少させる機能活性を有し、該細胞集団は腫瘍細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＷｎｔ依存性細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項１７】
ＬＲＰ６標的受容体上のβ−プロペラ１ドメインに結合するＩｇＧ抗体およびＬＲＰ６標的上のβ−プロペラ３ドメインに結合するｓｃＦｖを含む単離された二パラトープ抗体であって、該ＩｇＧ抗体およびｓｃＦｖは、β−プロペラ１ドメインおよびβ−プロペラ３ドメインへのＩｇＧ抗体およびｓｃＦｖのそれぞれの結合が、古典的Ｗｎｔシグナル変換経路を阻害するように、リンカーにより連結されており、該二パラトープ抗体は、Ｗｎｔシグナルの有意な増強を示さない、抗体。
【請求項１８】
約ナノモル親和性の標的受容体に対する親和性を有する、請求項１７に記載の抗体。
【請求項１９】
約１ピコモル親和性の標的受容体に対する親和性を有する、請求項１７に記載の抗体。
【請求項２０】
リンカーが、ＬＲＰ６のβ−プロペラ１ドメインおよびＬＲＰ６のβ−プロペラ３ドメインへのＩｇＧ抗体およびｓｃＦｖ断片のそれぞれの結合を可能にする空間分布を含む、請求項１７に記載の抗体。
【請求項２１】
ｓｃＦｖが、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカーにより、ＩｇＧ抗体のＦｃ結合部位に連結されており、該Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３からなる群から選択される、請求項１７に記載の抗体。
【請求項２２】
ＩｇＧ抗体のＦｃ結合部位がＣＨ３ドメインである、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
ｓｃＦｖが、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカーにより、ＩｇＧ抗体の軽鎖に連結されており、該Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３からなる群から選択される、請求項１７に記載の抗体。
【請求項２４】
ｓｃＦｖが、未変異ｓｃＦｖ断片と比較してｓｃＦｖの安定性を改善する少なくとも１つのアミノ酸変異を含み、該アミノ酸変異は図２９−３２から選択される、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２５】
配列番号：１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号：３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号：４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号：６の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含むＬＲＰ６のβ−プロペラ１ドメインに結合する抗体、ならびに、配列番号：６９の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：７０の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号：７１の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号：７２の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：７３の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号：７４の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含むＬＲＰ６のβ−プロペラ３ドメインに結合するｓｃＦｖを含む、請求項１７に記載の抗体。
【請求項２６】
配列番号：１６６の位置４５４のＬｙｓ欠失をさらに含む、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２７】
配列番号：１６６の位置６７７でＰｒｏからＡｌａへの変異をさらに含む、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２８】
配列番号：１６６の位置６７６−６７７でＡｓｐＰｒｏからＴｈｒＡｌａへの変異をさらに含む、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２９】
配列番号：１６６、１７１、１７３、１７５、１９５、２０１および２０７からなる群から選択される重鎖配列と配列番号：１７０、１９３、１９９および２０５からなる群から選択される軽鎖配列を共に含む、請求項１７に記載の抗体。
【請求項３０】
配列番号：１６６／１７０、１７１／１７０、１７３／１７０、１７５／１７０、２０１／１９９、２０７／２０５および１９５／１９３からなる群から選択される重鎖および軽鎖配列の組合せを含む、請求項１７に記載の抗体。
【請求項３１】
配列番号：１６６／１７０を有する重鎖および軽鎖配列を含む、請求項１７に記載の抗体。
【請求項３２】
配列番号；１７７の重鎖配列および配列番号：１８１を含む軽鎖配列を含む、請求項２３に記載の抗体。
【請求項３３】
Ｗｎｔ１シグナル経路およびＷｎｔ３シグナル変換経路からなる群から選択される古典的Ｗｎｔシグナル変換経路を阻害する機能活性を有する、請求項１７に記載の抗体。
【請求項３４】
細胞集団を枯渇させる、細胞集団の増殖を阻害するか、または減少させる、細胞集団からの炎症性メディエーターの分泌を阻害するか、または減少させる、細胞集団からの細胞質顆粒の分泌を阻害するか、または減少させる機能活性を有し、該細胞集団は、腫瘍細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＷｎｔ依存性細胞からなる群から選択される、請求項１７に記載の抗体。
【請求項３５】
ＬＲＰ６標的受容体上のβ−プロペラ３ドメインに結合するＩｇＧ抗体およびＬＲＰ６標的上のβ−プロペラ１ドメインに結合するｓｃＦｖを含む単離された二パラトープ抗体であって、該ＩｇＧ抗体およびｓｃＦｖは、β−プロペラ３ドメインおよびβ−プロペラ１ドメインへのＩｇＧ抗体およびｓｃＦｖのそれぞれの結合が、古典的Ｗｎｔシグナル変換経路を阻害するように、リンカーにより連結されており、該二パラトープ抗体は、Ｗｎｔシグナルの有意な増強を示さない、抗体。
【請求項３６】
約ナノモル親和性の標的受容体に対する親和性を有する、請求項３５に記載の抗体。
【請求項３７】
約１ピコモル親和性の標的受容体に対する親和性を有する、請求項３５に記載の抗体。
【請求項３８】
リンカーが、ＬＲＰ６のβ−プロペラ３ドメインおよびＬＲＰ６のβ−プロペラ１ドメインへのＩｇＧ抗体およびｓｃＦｖのそれぞれの結合を可能にする空間分布を含む、請求項３５に記載の抗体。
【請求項３９】
ｓｃＦｖが、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカーにより、ＩｇＧ抗体のＦｃ結合部位に連結されており、該Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３からなる群から選択される、請求項３５に記載の抗体。
【請求項４０】
ＩｇＧ抗体のＦｃ結合部位がＣＨ３ドメインである、請求項３９に記載の抗体。
【請求項４１】
ｓｃＦｖが、未変異ｓｃＦｖ断片と比較してｓｃＦｖの安定性を改善する少なくとも１つのアミノ酸変異を含み、該アミノ酸変異は図２９−３２から選択される、請求項３５に記載の抗体。
【請求項４２】
配列番号：６９の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：７０の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号：７１の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号：７２の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：７３の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号：７４の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含むＬＲＰ６のβ−プロペラ３ドメインに結合する抗体、ならびに、配列番号：１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号：３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号：４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号：６の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含むＬＲＰ６のβ−プロペラ１ドメインに結合するｓｃＦｖを含む、請求項３５に記載の抗体。
【請求項４３】
ｓｃＦｖ  ＶＨおよびＶＬが、３つのアミノ酸を含むリンカーで連結されている、請求項４２に記載の抗体。
【請求項４４】
ｓｃＦｖ  ＶＨおよびＶＬが、４つのアミノ酸を含むリンカーで連結されている、請求項４２に記載の抗体。
【請求項４５】
配列番号：１８７および１８９からなる群から選択される重鎖配列；ならびに配列番号：１８５を含む軽鎖配列を含む、請求項４２に記載の抗体。
【請求項４６】
Ｗｎｔ１シグナル経路およびＷｎｔ３シグナル変換経路からなる群から選択される古典的Ｗｎｔシグナル変換経路を阻害する機能活性を有する、請求項３５に記載の抗体。
【請求項４７】
細胞集団を枯渇させる、細胞集団の増殖を阻害するか、または減少させる、細胞集団からの炎症性メディエーターの分泌を阻害するか、または減少させる、細胞集団からの細胞質顆粒の分泌を阻害するか、または減少させる機能活性を有し、該細胞集団は、腫瘍細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＷｎｔ依存性細胞からなる群から選択される、請求項３５に記載の抗体。
【請求項４８】
請求項１、１７および３５に記載の多価抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項４９】
配列番号：１６６、１７１、１７３、１７５、１９５、２０１および２０７からなる群から選択される重鎖配列；ならびに配列番号：１７０、１９３、１９９および２０５からなる群から選択される軽鎖配列を含む多価抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項５０】
配列番号：１６６、１７１、１７３、１７５、１９５、２０１および２０７と少なくとも９８％配列同一性；ならびに配列番号：１７０、１９３、１９９および２０５からなる群から選択される軽鎖配列を有する多価抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項５１】
配列番号：１６６および配列番号：１７０を含む多価抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項５２】
配列番号：１６６および配列番号：１７０と少なくとも９８％配列同一性を含む多価抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項５３】
配列番号：１７７からなる群から選択される配列；ならびに配列番号：１８１の軽鎖配列を含む多価抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項５４】
配列番号：１７７と少なくとも９８％配列同一性；ならびに配列番号：１８１の軽鎖配列を含む多価抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項５５】
配列番号：１８７および１８９からなる群から選択される配列；ならびに配列番号：１８５の軽鎖配列を含む多価抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項５６】
配列番号：１８７または１８９と少なくとも９８％配列同一性；ならびに配列番号：１８５の軽鎖配列を含む多価抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項５７】
請求項４８−５６に記載の核酸を含むベクター。
【請求項５８】
標的受容体の２つの異なる結合部位に対する少なくとも２つの受容体結合ドメインを有する請求項１−４７から選択される多価抗体、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項５９】
（ａ）ＬＲＰ６標的受容体の第１の結合部位に結合する第１の受容体結合ドメインを提供すること；（ｂ）ＬＲＰ６標的受容体の第２の結合部位に結合する第２の受容体結合ドメインを提供すること；および（ｃ）第１の受容体結合ドメインを第２の受容体結合ドメインに連結すること、を含む請求項１、１７または３５に記載の多価抗体を得る方法。
【請求項６０】
第１または第２の受容体結合ドメインが、ＩｇＧ抗体、ｓｃＦｖ断片、一本鎖ダイアボディ、抗体模擬物および抗体可変ドメインからなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
第１および第２の受容体結合ドメインが、第１および第２の受容体結合ドメインがＬＲＰ６の第１および第２のエピトープにそれぞれ結合することができる空間分布にて、リンカーにより互いに連結されている、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
リンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３からなる群から選択されるＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
アミノ酸変異が、未変異第１または第２の受容体結合ドメインと比較して、第１または第２の受容体結合ドメインの安定性を改善するように、第１または第２の受容体結合ドメインに少なくとも１つのアミノ酸変異を導入することをさらに含む方法であって、該アミノ酸変異は図２９−３２から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
ＬＲＰ６を発現する癌を有する対象を選択すること、および標的受容体の２つの異なる結合部位に対する少なくとも２つの受容体結合ドメインを有する請求項１−４７のいずれかに記載の多価抗体を含む有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法。
【請求項６５】
対象がヒトである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
ＬＲＰ６を発現する癌を有する対象を選択すること、および標的受容体の２つの異なる結合部位に対する少なくとも２つの受容体結合ドメインを有する請求項１−４７のいずれかに記載の多価抗体を含む有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法であって、該癌は、乳癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、扁平上皮癌および黒色腫からなる群から選択される、方法。
【請求項６７】
癌が乳癌である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
ＬＲＰ６に対する多価抗体を使用して、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路が介在する疾患を処置する方法。
【請求項６９】
任意の癌の標準治療と組み合わせて、ＬＲＰ６を発現する癌を有する対象を選択すること、および配列番号：１６６／１７０、１７１／１７０、１７３／１７０、１７５／１７０、２０１／１９９、２０７／２０５および１９５／１９３からなる群から選択される重鎖および軽鎖配列を有する多価抗体を含む有効量の組成物を、該対象に投与することを含む癌を処置する方法。
【請求項７０】
乳癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、扁平上皮癌および黒色腫からなる群から選択される癌の処置のための医薬の製造における、前記請求項のいずれかに記載の多価抗体の使用。
【請求項７１】
古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：１４のＶＨ；配列番号：１３のＶＬ；配列番号：８２のＶＨ；配列番号：８１のＶＬを有する多価抗体。
【請求項７２】
薬物としての使用のための、配列番号：１４のＶＨ；配列番号：１３のＶＬ；配列番号：８２のＶＨ；配列番号：８１のＶＬを有する多価抗体。
【請求項７３】
古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：１６６および配列番号：１７０を有する多価抗体
【請求項７４】
薬物としての使用のための配列番号：１６６および配列番号：１７０を有する多価抗体。
【請求項７５】
医薬としての使用のための、請求項１−４７のいずれかに記載の多価抗体。
【請求項７６】
ＬＲＰ６を発現する癌の処置のための医薬としての使用のための、請求項１−４７のいずれかに記載の多価抗体。
【請求項７７】
ＬＲＰ６を発現する癌の処置のための医薬としての使用のための多価抗体であって、該癌が、乳癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、扁平上皮癌および黒色腫からなる群から選択される、請求項１−４７のいずれかに記載の多価抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、2010年5月6日出願の米国仮出願第61/331,993号に基づく優先権を主張するものであり、参照によって該仮出願の内容全体が本明細書に取り込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、LRP6上の２つの異なる結合部位に対する少なくとも２つの受容体結合ドメインを含む多価抗体に関する。本発明は、より具体的には、LRP6アンタゴニストである多価抗体に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
Wnt/β-カテニン経路は、β-カテニンのタンパク質安定性の調節を通して、発生中における多様な生物学的プロセスおよび組織恒常性を制御する(Clevers et al., (2006) Cell 127:469-480; および Logan et al., (2004) Annu. Rev Cell Dev. Biol 20:781-810)。Wnt シグナル伝達の非存在下においては、細胞質のβ-カテニンは、大腸腺腫症(adenomatous polyposis coli)(APC)、アキシンおよびグリコーゲン合成酵素キナーゼ3(GSK3)を含む複数のタンパク質を含有するβ-カテニン破壊複合体と結合する。かかる複合体中において、β-カテニンは GSK3 によって構成的にリン酸化され、プロテアソーム経路によって分解される。Wnt シグナルは、２つの別個の受容体、セルペンチン受容体の Frizzled および一回膜貫通タンパク質である LRP5 または LRP6 を介して、原形質膜を横切って伝達される。Wnt タンパク質は、Frizzled-LRP5/6 シグナル伝達複合体の集合を促進し、GSK3 およびカゼインキナーゼIによるLRP5/6 の細胞質 PPPSPxS モチーフのリン酸化を誘導する。リン酸化された LRP5/6 はアキシンと結合し、β-カテニン分解複合体を不活化する。安定化されたβ-カテニンは核に入り、TCF ファミリーの転写因子と結合して、転写をオンにする。
【０００４】
LRP5/6 の大きな細胞外ドメインは、それぞれの後にEGF様ドメインが続く４つの YWTD型β-プロペラ領域、および LDLR ドメインを含む。各々のプロペラ領域は、６枚羽根の(six-bladed)β-プロペラ構造を形成する６つの YWTD モチーフを含む。生化学的研究により、Wnt タンパク質は Frizzled および LRP6 の両方と物理的に相互作用し、Frizzled-LRP6 シグナル伝達複合体の形成を誘導することが示唆されている(Semenov et al., (2001) Curr. Biol 11, 951-961; および Tamai, et al. (2000) Nature 407, 530-535)。Wnt タンパク質の他に、LRP5/6 の大きな細胞外ドメインは、Wnt アンタゴニスト、DKK1 およびスクレロスチン(SOST)、ならびに Wnt アゴニストであるR-スポンジン(R-Spondin)を含む複数の分泌型 Wnt モジュレーターと結合する。
【０００５】
経路の構成要素、例えば APC および β-カテニンにおける突然変異は、ヒトの癌に関連している。近年の研究により、Wnt タンパク質の過剰発現および/または Wnt アンタゴニスト、例えば DKK1、WISP および sFRP のサイレンシングが、癌の発生および進行を促進することが示唆されている(Akiri et al., (2009) Oncogene 28:2163-2172; Bafico et al., (2004) Cancer Cell 6:497-506; Suzuki et al., (2004) Nat Genet. 36:417-422; Taniguchi et al., (2005) Oncogene. 24:7946-7952; Veeck et al., (2006) Oncogene. 25:3479-3488; Zeng et al., (2007) Hum. Pathol. 38:120-133)。さらに、Wnt シグナル伝達は、癌幹細胞の維持と関係付けられている(Jamieson et al., (2004) Cancer Cell 6:531-533 and Zhao et al., (2007) Cancer Cell 12:528-541)。
【０００６】
抗体治療は、一定の癌を処置するための手段として用いられている。結合価または個々の抗体分子が結合し得る抗原決定基の数を増大させる試みは、二特異性抗体の開発につながった(例えば、Jimenez et al., Molecular Cancer Therapeutics 2005:4427-434, Lu et al., J. of Immun. Methods 1999:230, 159-171 ならびに米国特許公開第20070014794号および第20050100543号を参照されたい)。二特異性抗体は、同一のまたは別個の抗原上の２つの異なるエピトープに結合する、免疫グロブリン(Ig)に基づく分子である。該抗体は、例えば、腫瘍細胞抗原とエフェクター細胞、例えば活性化T細胞に特異的、または２つの機能的標的もしくはエピトープに特異的であり得る。
【０００７】
治療法としての二特異性抗体の開発における主要な障害は、臨床試験を行うのに十分な量および質で抗体を生産することの困難性である。特に、２つの別個のハイブリドーマを融合させて２つのセットの重鎖および軽鎖を発現する細胞を作出する雑種(hybrid)ハイブリドーマ、および化学的複合化 (Carter et al., (1995) J. Hematotherapy 4:463-70) を含む伝統的な方法では不十分である。例えば、雑種ハイブリドーマにおける２つの異なるセットの IgG 軽鎖および重鎖の共発現は、最大で 10 の軽鎖および重鎖のペアを生産し得、機能的な二特異性ヘテロダイマーを形成するのはこれらのペアのうちわずか１つである (Suresh et al. (1986) Methods Enzymol. 121:210-28)。さらに、雑種ハイブリドーマにより生産される非機能性種、例えばホモダイマーおよび非同族 Ig 軽鎖および重鎖の誤対合(mispaired)ヘテロダイマーからの抗体の精製は、煩雑かつ非効率である。
【０００８】
２つの IgG またはそれらの断片の化学的架橋も非効率的であり、抗体活性の喪失につながり得る (Zhu et al. (1994) Cancer Lett. 86:127-34)。化学的複合化により生じる多量体凝集体は、低い収率をもたらす (Cao et al. (1998) Bioconj. Chem. 9:635-44)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、少なくとも２以上のエピトープに高い親和性で結合することができる機能的多価抗体が求められている。特に、１より多くの修飾性(modifying)リガンドを有する受容体、例えば古典的(canonical) Wnt シグナル伝達の共受容体である LRP6 を修飾する機能的多価抗体が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の概要
本発明は、LRP6 受容体上の複数の結合部位に結合する新規な多価抗体を提供する。特に、本発明は、古典的 Wnt シグナル伝達経路を阻害する LRP6 多価抗体を提供する。
【００１１】
本発明は、該多価抗体(例えば、単一のLRP6 二パラトープ(biparatopic)抗体)がプロペラ 1 (例えば Wnt1) およびプロペラ 3 (例えば Wnt 3)リガンドの両方を阻害する能力を有するという発見に基づく。さらに、予期せぬことに、該多価抗体(例えば、単一の LRP6 二パラトープ抗体)は、Wnt シグナルの有意な増強(亢進)を示さない。該多価抗体は、別個の LRP6 β-プロペラドメインに結合する。プロペラ 1 抗体は、β-プロペラ 1 ドメインに結合し、プロペラ 1 依存性の Wnt、例えば Wnt1、Wnt2、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt9、Wnt10A およびWnt10B を遮断する。プロペラ 3 抗体は、β-プロペラ 3 ドメインに結合し、プロペラ 3 依存性の Wnt、例えばWnt3a および Wnt3 を遮断する。LRP6 抗体は、プロペラ 1 およびプロペラ 3 リガンドを２つの別々のクラスへ区別し、LRP6 標的受容体の別個の結合部位に結合する。LRP6 抗体の断片(例えば、Fab)の全長 IgG 抗体への変換は、別のタンパク質、例えば Wnt 1 または Wnt 3 リガンドの存在下において Wnt シグナルを増強(亢進)させる抗体をもたらす。多価抗体は、増強を伴わずに、プロペラ 1 (例えば、Wnt1) およびプロペラ 3 (例えば、Wnt 3)リガンドの両方を阻害する。Wnt リガンドに加えて、LRP6 プロペラ 1 抗体は、他のプロペラ 1 結合性リガンド(例えばスクレロスチン、Dkk1)との相互作用を阻害すると期待される。同様に、プロペラ 3 抗体は、他のプロペラ 3 結合性リガンド(例えば Dkk1)との相互作用を阻害すると期待される。さらに、プロペラ 1 および 3 結合性の抗体は、他のWnt シグナル伝達モジュレーター、例えば R-スポンジンの活性に影響を及ぼすものと期待し得る。
【００１２】
多価抗体は、伝統的な抗体を超える利点、例えば、標的のレパートリーの拡大、新規な結合特性を有すること、増大した効力、およびシグナル増強が無いこと等の利点を提供する。単一の LRP6 多価抗体は、同一の細胞上における単一の LRP6 標的受容体上の複数のβ-プロペラドメインに結合し、Wnt シグナル伝達を阻害することができる。一つの態様において、該多価抗体は、プロペラ 1、プロペラ 2、プロペラ 3 およびプロペラ 4 からなる群より選択されるβ-プロペラドメインのいずれかの組合せに結合する。一つの態様において、該多価抗体は、LRP6 のプロペラ 1 およびプロペラ3 ドメインに結合する。したがって、単一の LRP6 多価抗体は、複数のβ-プロペラドメインに結合し、各々のドメインに媒介される Wnt シグナル伝達を阻害することによって、増大した作用強度を有する。例えば、単一のLRP6 多価抗体は、プロペラ 1 およびプロペラ 3 ドメインにそれぞれ結合し、プロペラ 1 およびプロペラ 3 の両方に媒介される Wnt シグナル伝達を阻害する。増大した作用強度は、LRP6 多価抗体の増大したアビディティーまたはより良好な結合によるものであろう。
【００１３】
したがって、一つの側面において、本発明は、標的受容体の２つの異なる結合部位に対する少なくとも２つの受容体結合ドメインを有する単離された多価抗体であって、第一の受容体結合ドメインが該標的受容体上の第一の結合部位に結合し、第二の受容体結合ドメインが同じ標的受容体上の第二の結合部位に結合し、該第一および第二の受容体結合ドメインと該標的受容体の該第一および第二の結合部位との結合が古典的 Wnt シグナル伝達経路を阻害するよう、該第一および第二の受容体結合ドメインが連結しており; かつ、該抗体または抗原結合性断片が Wnt シグナルの有意な増強を示さない、多価抗体に関する。
【００１４】
該多価抗体は、標的受容体に対して、およそナノモルの親和性またはおよそ 1 ピコモルの親和性を有する。該多価抗体は、多価抗体、二価抗体、二特異性抗体、または二パラトープ抗体である。一つの態様において、第一および第二の受容体結合ドメインは、IgG 抗体、scFv 断片、単鎖ダイアボディ(single chain diabody)、抗体模倣物(antibody mimetic)、または抗体可変ドメインである。第一および第二の受容体結合ドメインは、該第一および第二の受容体結合ドメインがそれぞれ第一および第二の結合部位に結合することを許容する空間分布を有するリンカーによって連結している。一つの態様において、該リンカーは、Gly-Ser リンカーである。一つの態様において、多価抗体は、古典的 Wnt シグナル伝達経路、例えば Wnt1 シグナル経路および/またはWnt3 シグナル伝達経路を阻害する機能的活性を有する。一つの態様において、多価抗体は、細胞集団を枯渇させる機能的活性、細胞集団の増殖を阻害または減少させる機能的活性、細胞集団からの炎症メディエーターの分泌を阻害または減少させる機能的活性、細胞集団からの細胞質顆粒の分泌を阻害または減少させる機能的活性を有し、ここで、該細胞集団は、腫瘍細胞、T 細胞、B 細胞および Wnt 依存性細胞からなる群より選択される。
【００１５】
別の側面において、本発明は、LRP6 標的受容体の２つの異なる結合部位に対する少なくとも２つの受容体結合ドメインを有する単離された多価抗体であって、第一の受容体結合ドメインが該標的受容体上の第一の結合部位に結合し、かつ、第二の受容体結合ドメインが同じ LRP6 標的受容体上の第二の結合部位に結合する、多価抗体に関する。該第一および第二の受容体結合ドメインは、該第一および第二の受容体結合ドメインと該 LRP6 標的受容体の第一および第二の結合部位との結合が古典的 Wnt シグナル伝達経路を阻害するよう連結しており、また、該抗体または抗原結合性断片は、Wnt シグナルの有意な増強を示さないものである。
【００１６】
一つの態様において、該抗体は、標的受容体に対しておよそナノモルの親和性を有する。別の態様において、該抗体は、標的受容体に対しておよそ 1 ピコモルの親和性を有する。
【００１７】
一つの態様において、第一の受容体結合ドメインは IgG 抗体であり、第二の受容体結合ドメインは scFv 断片であり、ここで、該 IgG 抗体と scFv 断片は、該 IgG 抗体および scFv 断片がそれぞれ LRP6 の第一および第二のエピトープに結合することを許容する空間分布を有するリンカーによって連結している。一つの態様において、該リンカーは、(Gly4Ser)4 および (Gly4Ser)3からなる群より選択される Gly-Ser リンカーである。
【００１８】
一つの態様において、LRP6 標的受容体の第一のエピトープはβ-プロペラ 1 ドメインであり、LRP6 標的受容体の第二のエピトープはβ-プロペラ 3 ドメインである。一つの態様において、抗体または抗原結合性断片は、LPR6 β-プロペラ 1 ドメインに結合するものであり、かつ、配列番号1、配列番号21および配列番号47からなる群より選択される重鎖CDR1; 配列番号2、配列番号22および配列番号48からなる群より選択される重鎖CDR2; および配列番号3、配列番号23および配列番号49からなる群より選択される重鎖CDR3; ならびに、配列番号4、配列番号24および配列番号50からなる群より選択される軽鎖CDR1; 配列番号5、配列番号25および配列番号51からなる群より選択される軽鎖CDR2; および配列番号6、配列番号26および配列番号52からなる群より選択される軽鎖CDR3を含むものである。
【００１９】
一つの態様において、抗体または抗原結合性断片は、LPR6 β-プロペラ 3 ドメインに結合するものであり、かつ、配列番号69、配列番号93および配列番号115からなる群より選択される重鎖CDR1; 配列番号70、配列番号94および配列番号116からなる群より選択される重鎖CDR2; および配列番号71、配列番号95および配列番号117からなる群より選択される重鎖CDR3; ならびに、配列番号72、配列番号96および配列番号118からなる群より選択される軽鎖CDR1; 配列番号73、配列番号97および配列番号119からなる群より選択される軽鎖CDR2; および配列番号74、配列番号98および配列番号120からなる群より選択される軽鎖CDR3を含むものである。一つの態様において、IgG 重鎖抗体は配列番号18、66 および 101 からなる群より選択され、軽鎖は配列番号17、86 および 85 からなる群より選択される。一つの態様において、scFv は、配列番号142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162 および 164 からなる群より選択される。一つの態様において、scFv 断片は、変異していない scFv 断片と比較して該 scFv の安定性を改善する少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含み、該アミノ酸突然変異は図29-32から選択されるものである。一つの態様において、多価抗体は、Wnt1 シグナル経路および Wnt3 シグナル伝達経路からなる群より選択される古典的 Wnt シグナル伝達経路を阻害する機能的活性を有する。別の態様において、多価抗体は、細胞集団を枯渇させる機能的活性、細胞集団の増殖を阻害または減少させる機能的活性、細胞集団からの炎症メディエーターの分泌を阻害または減少させる機能的活性、細胞集団からの細胞質顆粒の分泌を阻害または減少させる機能的活性を有し、ここで、該細胞集団は、腫瘍細胞、T 細胞、B 細胞および Wnt 依存性細胞からなる群より選択される。
【００２０】
別の側面において、本発明は、LRP6 標的受容体上のβ-プロペラ 1 ドメインに結合する IgG 抗体および該 LRP6 標的上のβ-プロペラ 3 ドメインに結合する scFv を含む単離された二パラトープ抗体であって、それぞれ該 IgG 抗体および該 scFv とβ-プロペラ 1 ドメインおよびβ-プロペラ 3 ドメインとの結合が古典的 Wnt シグナル伝達経路を阻害するよう該 IgG 抗体と該 scFv がリンカーによって連結しており、かつ、該二パラトープ抗体が Wnt シグナルの有意な増強を示さないものである、二パラトープ抗体に関する。
【００２１】
一つの態様において、抗体は、標的受容体に対しておよそナノモルの親和性を有する。別の態様において、抗体は、標的受容体に対しておよそ 1 ピコモルの親和性を有する。
【００２２】
一つの態様において、リンカーは、IgG 抗体および scFv 断片がそれぞれ LRP6 のβ-プロペラ 1 ドメインおよび LRP6 のβ-プロペラ 3 ドメインに結合することを許容する空間分布を含む。一つの態様において、scFv は、Ser-Gly リンカーによって IgG 抗体の Fc 結合部位に連結しており、ここで、該 Ser-Gly リンカーは (Gly4Ser)4および (Gly4Ser)3 からなる群より選択されるものである。別の態様において、IgG 抗体の Fc 結合部位は CH3 ドメインである。別の態様において、scFv は Ser-Gly リンカーによって IgG 抗体の軽鎖に連結しており、ここで、該Ser-Gly リンカーは (Gly4Ser)4 および (Gly4Ser)3 からなる群より選択されるものである。一つの態様において、scFv は、変異していない scFv 断片と比較して該 scFv の安定性を改善する少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含み、該アミノ酸突然変異は図29-32から選択されるものである。
【００２３】
一つの態様において、抗体は、配列番号1の重鎖可変領域CDR1; 配列番号2の重鎖可変領域CDR2; 配列番号3の重鎖可変領域CDR3; 配列番号4の軽鎖可変領域CDR1; 配列番号5の軽鎖可変領域CDR2; および配列番号6の軽鎖可変領域CDR3を含み、ここで、該抗体は LRP6 のβ-プロペラ 1 ドメインに結合するものであり; かつ、配列番号69のscFv重鎖可変領域CDR1; 配列番号70のscFv重鎖可変領域CDR2; 配列番号71のscFv重鎖可変領域CDR3; 配列番号72のscFv軽鎖可変領域CDR1; 配列番号73のscFv軽鎖可変領域CDR2; および配列番号74のscFv軽鎖可変領域CDR3を含み、ここで、該 scFv はLRP6 のβ-プロペラ 3 ドメインに結合するものである。一つの態様において、抗体は、配列番号166の位置454における Lys の欠失をさらに含む。一つの態様において、抗体は、配列番号166の位置677における Pro から Ala への突然変異をさらに含む。
【００２４】
一つの態様において、抗体は、配列番号166、171、173、175、195、201 および 207 からなる群より選択される重鎖配列を、配列番号170、193、199 および 205 からなる群より選択される軽鎖配列と組み合わせて含むものである。一つの態様において、抗体は、配列番号166/170、171/170、173/170、175/170、201/199、207/205 および 195/193 からなる群より選択される重鎖および軽鎖配列の組合せを含む。一つの態様において、抗体は、配列番号166/170を有する重鎖および軽鎖配列を含む。一つの態様において、抗体は、配列番号177/181を有する重鎖および軽鎖配列を含む。
【００２５】
一つの態様において、抗体は、Wnt1 シグナル経路および Wnt3 シグナル伝達経路からなる群より選択される古典的 Wnt シグナル伝達経路を阻害する機能的活性を有する。別の態様において、抗体は、細胞集団を枯渇させる機能的活性、細胞集団の増殖を阻害または減少させる機能的活性、細胞集団からの炎症メディエーターの分泌を阻害または減少させる機能的活性、細胞集団からの細胞質顆粒の分泌を阻害または減少させる機能的活性を有し、ここで、該細胞集団は、腫瘍細胞、T 細胞、B 細胞および Wnt 依存性細胞からなる群より選択される。
【００２６】
別の側面において、本発明は、LRP6 標的受容体上のβ-プロペラ 3 ドメインに結合する IgG 抗体および該 LRP6 標的上のβ-プロペラ 1 ドメインに結合する scFv を含む単離された二パラトープ抗体であって、それぞれ該 IgG 抗体および該 scFv とβ-プロペラ 3 ドメインおよびβ-プロペラ 1 ドメインとの結合が古典的 Wnt シグナル伝達経路を阻害するよう、該 IgG 抗体と該 scFv がリンカーによって連結しており、かつ、該二パラトープ抗体が Wnt シグナルの有意な増強を示さない、二パラトープ抗体に関する。
【００２７】
一つの態様において、該抗体は、標的受容体に対しておよそナノモルの親和性を有する。別の態様において、該抗体は、標的受容体に対しておよそ 1 ピコモルの親和性を有する。
【００２８】
一つの態様において、リンカーは、IgG 抗体および scFv がそれぞれ LRP6 のβ-プロペラ 3 ドメインおよび LRP6 のβ-プロペラ 1 ドメインに結合することを許容する空間分布を含む。一つの態様において、scFv は Ser-Gly リンカーによって IgG 抗体の Fc 結合部位に連結しており、ここで、該 Ser-Gly リンカーは (Gly4Ser)4および (Gly4Ser)3 からなる群より選択されるものである。一つの態様において、IgG 抗体の Fc 結合部位は CH3 ドメインである。一つの態様において、scFv は、変異していない scFv 断片と比較して該 scFv の安定性を改善する少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含み、該アミノ酸突然変異は図29-32から選択されるものである。
【００２９】
一つの態様において、抗体は、配列番号69の重鎖可変領域CDR1; 配列番号70の重鎖可変領域CDR2; 配列番号71の重鎖可変領域CDR3; 配列番号72の軽鎖可変領域CDR1; 配列番号73の軽鎖可変領域CDR2; および配列番号74の軽鎖可変領域CDR3を含み、ここで、該抗体は LRP6 のβ-プロペラ 3 ドメインに結合するものであり; かつ、配列番号1の重鎖可変領域CDR1; 配列番号2の重鎖可変領域CDR2; 配列番号3の重鎖可変領域CDR3; 配列番号4の軽鎖可変領域CDR1; 配列番号5の軽鎖可変領域CDR2; および配列番号6の軽鎖可変領域CDR3を有する scFv を含み、ここで、該 scFv は LRP6 のβ-プロペラ 1 ドメインに結合するものである。一つの態様において、scFv の VH および VL は、3 つのアミノ酸を含むリンカーによって連結している。別の態様において、scFv の VH および VL は、4 つのアミノ酸を含むリンカーによって連結している。一つの態様において、抗体は、配列番号187および189からなる群より選択される重鎖配列; および配列番号185を含む軽鎖配列を含む。一つの態様において、抗体は、Wnt1 シグナル経路および Wnt3 シグナル伝達経路からなる群より選択される古典的 Wnt シグナル伝達経路を阻害する機能的活性を有する。別の態様において、抗体は、細胞集団を枯渇させる機能的活性、細胞集団の増殖を阻害または減少させる機能的活性、細胞集団からの炎症メディエーターの分泌を阻害または減少させる機能的活性、細胞集団からの細胞質顆粒の分泌を阻害または減少させる機能的活性を有し、ここで、該細胞集団は、腫瘍細胞、T 細胞、B 細胞および Wnt 依存性細胞からなる群より選択される。
【００３０】
別の側面において、本発明は、多価抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
【００３１】
一つの側面において、本発明は、配列番号166、171、173、175、195、201 および 207 からなる群より選択される重鎖配列;および配列番号170、193、199 および 205 からなる群より選択される軽鎖配列を含む多価抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
【００３２】
別の側面において、本発明は、配列番号166、171、173、175、193、199、201 および 207 からなる群より選択される重鎖配列;および配列番号170、195 および 205 からなる群より選択される軽鎖配列を含む多価抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、少なくとも、該抗体または抗原結合性断片が配列番号166、171、173、175、195、201 および 207;ならびに配列番号170、193、199 および 205 からなる群より選択される軽鎖配列に対し 98% の配列同一性を有するものである、核酸に関する。
【００３３】
別の側面において、本発明は、配列番号166および配列番号170を含む多価抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
【００３４】
別の側面において、本発明は、配列番号166および配列番号170に対する少なくとも 98% の配列同一性を含む多価抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
【００３５】
別の側面において、本発明は、配列番号177からなる群より選択される配列;ならびに配列番号181の軽鎖配列を含む多価抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
【００３６】
別の側面において、本発明は、配列番号177;および配列番号181の軽鎖配列に対する少なくとも 98% の配列同一性を含む多価抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
【００３７】
別の側面において、本発明は、配列番号187および189からなる群より選択される配列;および配列番号185の軽鎖配列を含む多価抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
【００３８】
別の側面において、本発明は、配列番号187および189;ならびに配列番号185の軽鎖配列に対する少なくとも 98% の配列同一性を含む多価抗体をコードするヌクレオチド配列に関する。別の側面において、本発明は、本発明の核酸を含むベクターに関する。
【００３９】
別の側面において、本発明は、標的受容体の２つの異なる結合部位に対する少なくとも２つの受容体結合ドメインを有する多価抗体および医薬上許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【００４０】
別の側面において、本発明は、a) LRP6 標的受容体の第一の結合部位に結合する第一の受容体結合ドメインを提供すること; (b) LRP6 標的受容体の第二の結合部位に結合する第二の受容体結合ドメインを提供すること; および (c) 該第一の受容体結合ドメインと該第二の受容体結合ドメインを連結させることにより、本発明の多価抗体を得る方法に関する。一つの態様において、第一または第二の受容体結合ドメインは、IgG 抗体、scFv 断片、単鎖ダイアボディ、抗体模倣物および抗体可変ドメインからなる群より選択される。一つの態様において、第一および第二の受容体結合ドメインは、該第一および第二の受容体結合ドメインがそれぞれ LRP6 の第一および第二のエピトープに結合することを許容する空間分布を有するリンカーによって連結している。一つの態様において、リンカーは、(Gly4Ser)4 および (Gly4Ser)3からなる群より選択される Gly-Ser リンカーである。一つの態様において、該方法は、アミノ酸突然変異が第一または第二の受容体結合ドメインの安定性を変異していない第一または第二の受容体結合ドメインと比較して改善するよう、少なくとも１つのアミノ酸突然変異を第一または第二の受容体結合ドメインに導入することをさらに含む。
【００４１】
一つの側面において、本発明は、LRP6 を発現する癌を有する対象(例えばヒト)を選択すること、および標的受容体の２つの異なる結合部位に対する少なくとも２つの受容体結合ドメインを有する多価抗体を含む有効量の組成物を必要としている対象に投与することを含む、癌を処置する方法に関する。
【００４２】
一つの側面において、本発明は、LRP6 を発現する癌を有する対象を選択すること、および標的受容体の２つの異なる結合部位に対する少なくとも２つの受容体結合ドメインを有する多価抗体を含む有効量の組成物を必要としている対象に投与することを含む、癌を処置する方法であって、該癌が乳癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、有棘細胞癌およびメラノーマからなる群より選択される方法に関する。一つの態様において、癌は乳癌である。
【００４３】
別の側面において、本発明は、LRP6 に対する二パラトープ抗体を用いて古典的 Wnt シグナル伝達経路によって媒介される疾患を処置する方法に関する。
【００４４】
別の側面において、本発明は、LRP6 を発現する癌を有する対象を選択すること、および、いずれかの標準的な癌治療と組み合わせて、配列番号166/170、171/170、173/170、175/170、201/199、207/205 および 195/193 からなる群より選択される重鎖および軽鎖配列を有する抗体を含む有効量の組成物を該対象に投与することを含む、癌を処置する方法
に関する。
【００４５】
別の側面において、本発明は、乳癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、有棘細胞癌およびメラノーマからなる群より選択される癌の処置のための医薬の製造における多価抗体の使用に関する。
【００４６】
別の側面において、本発明は、古典的 Wnt シグナル伝達経路によって媒介される癌の処置における使用のための、配列番号14のVH; 配列番号13のVL; 配列番号82のVH; 配列番号81のVLを有する多価抗体に関する。
【００４７】
別の側面において、本発明は、薬剤としての使用のための、配列番号14のVH; 配列番号13のVL; 配列番号82のVH; 配列番号81のVLを有する多価抗体に関する。
【００４８】
別の側面において、本発明は、古典的 Wnt シグナル伝達経路によって媒介される癌の処置における使用のための、配列番号166および配列番号170を有する多価抗体に関する。
【００４９】
別の側面において、本発明は、薬剤としての使用のための、配列番号166および配列番号170を有する多価抗体に関する。
【００５０】
別の側面において、本発明は、医薬としての使用のための多価抗体に関する。別の側面において、本発明は、LRP6 を発現する癌の処置のための医薬としての使用のための多価抗体に関する。別の側面において、本発明は、LRP6 を発現する癌の処置のための医薬としての使用のための多価抗体であって、該癌が乳癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、有棘細胞癌およびメラノーマからなる群より選択される多価抗体に関する。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１Ａ】図 1 は、PA1 細胞、U266 細胞および Daudi 細胞上の選択された Fab の FACS EC50 測定および対応する mRNA 発現データ(A)ならびにshRNA による LRP6 のノックダウンおよび対応するmRNA 発現データ(B)を示すグラフである。
【図１Ｂ】図 1 は、PA1 細胞、U266 細胞および Daudi 細胞上の選択された Fab の FACS EC50 測定および対応する mRNA 発現データ(A)ならびにshRNA による LRP6 のノックダウンおよび対応するmRNA 発現データ(B)を示すグラフである。
【図２Ａ】図 2A-L は、Wnt1 または Wnt3A リガンドを発現する HEK293T/17 STF 細胞(遺伝子レポーターアッセイ)における抗 LRP6 Fab 断片の活性を示すグラフである。データは、抗 LRP6 Fab が Wnt1 または Wnt3 シグナル伝達を選択的に遮断することを示す。
【図２Ｂ】図 2A-L は、Wnt1 または Wnt3A リガンドを発現する HEK293T/17 STF 細胞(遺伝子レポーターアッセイ)における抗 LRP6 Fab 断片の活性を示すグラフである。データは、抗 LRP6 Fab が Wnt1 または Wnt3 シグナル伝達を選択的に遮断することを示す。
【図３】図 3 は、ヒト、マウスおよびカニクイザル(cymologous monkey)についての、抗 LRP6 β-プロペラ 1 およびβ-プロペラ 3 抗体の交差反応性の値を示す。
【図４】図 4 は、HEK293T/17 STF 細胞(遺伝子レポーターアッセイ)における様々な WNT リガンドの一過性発現および抗 LRP6 抗体を用いた処置を示すグラフであり、LRP6 の特定のβ-プロペラ領域に対する抗体結合/遮断に基づく特定の WNT の活性阻害を示すものである。
【図５】図 5 は、Fab の IgG への変換が、遮断されていない Wnt リガンドからのシグナルの増強をもたらすことを示す棒グラフである。
【図６】図 6 は、細胞系におけるLRP6 の選択的標的阻害を示すウエスタンブロットである。
【図７】図 7 は、げっ歯類における、β-プロペラ 1 領域に結合する LRP6 抗体の 5mg/kg での単回静脈内(i.v.)投与を示すグラフである。
【図８Ａ−１】図 8A は、MMTV-Wnt1 腫瘍を有するマウスへの MOR08168 (5 mg/kg) の単回投与の 8 時間後において、調整された(adjusted) <0.01 の P値で t=0 対照に対して>2倍上方制御された MMTV-Wnt1 腫瘍内の遺伝子を示す表である。
【図８Ａ−２】図 8A は、MMTV-Wnt1 腫瘍を有するマウスへの MOR08168 (5 mg/kg) の単回投与の 8 時間後において、調整された(adjusted) <0.01 の P値で t=0 対照に対して>2倍上方制御された MMTV-Wnt1 腫瘍内の遺伝子を示す表である。
【図８Ｂ−１】図 8B は、MMTV-Wnt1 腫瘍を有するマウスへの MOR08168 (5 mg/kg) の単回投与の 8 時間後において、調整された <0.01 の P値で t=0 対照に対して>2倍下方制御された遺伝子を示す表である。
【図８Ｂ−２】図 8B は、MMTV-Wnt1 腫瘍を有するマウスへの MOR08168 (5 mg/kg) の単回投与の 8 時間後において、調整された <0.01 の P値で t=0 対照に対して>2倍下方制御された遺伝子を示す表である。
【図８Ｂ−３】図 8B は、MMTV-Wnt1 腫瘍を有するマウスへの MOR08168 (5 mg/kg) の単回投与の 8 時間後において、調整された <0.01 の P値で t=0 対照に対して>2倍下方制御された遺伝子を示す表である。
【図９Ａ】図 9A は、MMTV-Wnt1 モデルにおいて、プロペラ 1 mAb がインビボの腫瘍退縮を引き起こすが、プロペラ 3 mAb は引き起こさないことを示すグラフである。
【図９Ｂ】図 9B は、異なる投与量のプロペラ 1 mAb の MMTV-Wnt1 腫瘍モデルの増殖に対する効果を示すグラフである。
【図１０】図 10 は、プロペラ3 mAb が MMTV-Wnt3 モデルにおける腫瘍増殖の阻害を引き起こすが、プロペラ 1 mAb は引き起こさないことを示すグラフである。
【図１１】図 11 は、インビボで、プロペラ 3 mAb が PA-1 細胞においてWnt3A に誘導される Super Top Flash 活性の阻害を引き起こすが、プロペラ 1 mAb は引き起こさないことを示すグラフである。
【図１２Ａ】図 12 は、HDx MS による、MOR06475 によって溶媒保護されたLRP6 PD3-4 の領域(A)、および、特定の残基の突然変異が scFv MOR06475 の結合の喪失をもたらすこと(B)を示す図である。
【図１２Ｂ】図 12 は、HDx MS による、MOR06475 によって溶媒保護されたLRP6 PD3-4 の領域(A)、および、特定の残基の突然変異が scFv MOR06475 の結合の喪失をもたらすこと(B)を示す図である。
【図１３】図 13 は、LRP6 のβ-プロペラ領域を示す模式図である。
【図１４】図 14 は、全てのscFv 分子が大腸菌からの発現および精製に成功したことを示すSDS-PAGE ゲルの写真である。
【図１５】図 15 A-D は、多価抗体の模式的な例である。(15A) 全長 IgG の C 末端に結合した scFv、(15B) Fc の N 末端に結合した scFv、(15C) Fc の C 末端に結合した scFv、(15D) Fc の N 末端および C 末端に結合した scFv。
【図１６】図 16 は、非還元(レーン1)および還元(レーン2)条件における精製された二パラトープ抗 LRP6 IgG scFv を示すSDS-PAGE ゲルの写真である。
【図１７】図 17 は、二パラトープ抗体の STF アッセイにおける活性およびそれぞれの構成部分を別々に示す。
【図１８】図 18 は、scFv 分子におけるリンカー長比較の STF アッセイにおける活性を示す。
【図１９】図 19 は、二パラトープ抗体の結合活性を示す表である。
【図２０】図 20 は、PA-1/Wnt3a L-細胞共培養モデルにおける、二パラトープ抗体および(Prop1 抗体ではなく)Prop3 抗体の活性を示す。
【図２１】図 21 は、げっ歯類における、Prop1 LRP6 抗体および Prop1/3 二パラトープ抗体の 5mg/kg での単回静脈内投与の比較を示すグラフである。
【図２２】図 22 は、プロペラ1 抗体および二パラトープ性プロペラ 1/3 抗体の両方がMMTV-Wnt1 モデルにおいてインビボで腫瘍退縮を引き起こすことを示すグラフである。
【図２３】図 23 は、MMTV-Wnt1 モデルにおける Prop1/3 結合性二パラトープ抗体の用量反応関係を示すグラフである。
【図２４Ａ】図 24 は、マウスのMMTV-Wnt1 乳房腫瘍の分化がアンタゴニスト性 LRP6 抗体によって誘導されることを示す。A-B) MMTV-Wnt1 腫瘍の断片をヌードマウスの皮下に移植した。腫瘍を有するマウスを、PBS(対照)または 5mg/kg MOR08168IgG1LALA 6475 scfv のいずれかの単回投与により処置した。A) Oil Red O staining for lipid のそれぞれの画像。B) Oil Red O staining の定量。グラフは、平均±SEMの値を示す。72 時間群において n=4、24 時間群において n=3、5 日群において n=2、PBS(対照)については n=1。
【図２４Ｂ】図 24 は、マウスのMMTV-Wnt1 乳房腫瘍の分化がアンタゴニスト性 LRP6 抗体によって誘導されることを示す。A-B) MMTV-Wnt1 腫瘍の断片をヌードマウスの皮下に移植した。腫瘍を有するマウスを、PBS(対照)または 5mg/kg MOR08168IgG1LALA 6475 scfv のいずれかの単回投与により処置した。A) Oil Red O staining for lipid のそれぞれの画像。B) Oil Red O staining の定量。グラフは、平均±SEMの値を示す。72 時間群において n=4、24 時間群において n=3、5 日群において n=2、PBS(対照)については n=1。
【図２５】図 25 は、E-カドヘリン陰性 MDA-MB231異種移植モデルにおける Prop1/3 結合性二パラトープ抗体の活性を示すグラフである。
【図２６Ａ】図 26 は、組換えLRP6 PD1/2 および PD3/4 に対するMOR08168、MOR06475 およびMOR08168IgG1LALA 6475 scfv の親和性および結合動態を示す。A) Biacore 解析によって決定された親和性およびon/offレートの要約表。B) 抗LRP6 分子の、対応する LRP6 受容体ドメインであるPD1/2 および PD3/4 に対する代表的な結合曲線。C) LRP6 PD1/2 および PD3/4 の、MOR08168IgG1LALA 6475 scfv との逐次的結合。
【図２６Ｂ−１】図 26 は、組換え LRP6 PD1/2 および PD3/4 に対する MOR08168、MOR06475 および MOR08168IgG1LALA 6475 scfv の親和性および結合動態を示す。A) Biacore 解析によって決定された親和性およびon/offレートの要約表。B) 抗 LRP6 分子の、対応するLRP6 受容体ドメインである PD1/2 および PD3/4 に対する代表的な結合曲線。C) LRP6 PD1/2 およびPD3/4 の、MOR08168IgG1LALA 6475 scfv との逐次的結合。
【図２６Ｂ−２】図 26 は、組換え LRP6 PD1/2 および PD3/4 に対する MOR08168、MOR06475 および MOR08168IgG1LALA 6475 scfv の親和性および結合動態を示す。A) Biacore 解析によって決定された親和性およびon/offレートの要約表。B) 抗 LRP6 分子の、対応するLRP6 受容体ドメインである PD1/2 および PD3/4 に対する代表的な結合曲線。C) LRP6 PD1/2 およびPD3/4 の、MOR08168IgG1LALA 6475 scfv との逐次的結合。
【図２６Ｃ】図 26 は、組換えLRP6 PD1/2 および PD3/4 に対するMOR08168、MOR06475 およびMOR08168IgG1LALA 6475 scfv の親和性および結合動態を示す。A) Biacore 解析によって決定された親和性およびon/offレートの要約表。B) 抗LRP6 分子の、対応する LRP6 受容体ドメインであるPD1/2 および PD3/4 に対する代表的な結合曲線。C) LRP6 PD1/2 および PD3/4 の、MOR08168IgG1LALA 6475 scfv との逐次的結合。
【図２７】図 27 は、IgG に基づく二パラトープ抗体の模式図を示す。
【図２８】図 28 は、大腸菌における抗 LRP6 scFv の発現の最適化を示す SDS-PAGE ゲルの写真である。
【図２９】図 29 は、MOR06475 scFv における単一の突然変異の、Tm に対する影響を示す表である。
【図３０】図 30 は、MOR08168 scfv における単一の突然変異の、Tm に対する影響を示す表である。
【図３１】図 31 は、細菌および哺乳類の両方の系において発現された物質における、MOR08168 scFv の二重突然変異の Tm に対する影響を示す表である。
【図３２】図 32 は、ELISA、Proteon 親和性および STF レポーター遺伝子アッセイにおける、野生型ならびに MOR06475 および MOR08168 scFv の単一/二重の突然変異を有するバージョンの結合および機能的活性を要約する表である。
【図３３】図 33 は、設計された突然変異の選択された例の図示である。全ての図において、タンパク質骨格はリボンの図形で表され、選択された側鎖は枝(stick)として表される。(a): scFv6475 の相同性モデルにおいて、VH:I37 は２つの芳香族残基 VL:F98 および VH:W103 と近接している。(b) scFv6475 の VH:I37F 突然変異体においては、VH:F37 および VH:W103 が垂直 pi-pi スタッキング相互作用を形成し得、VH:F37 および VL:F98 が別の垂直 pi-pi スタッキング相互作用を形成し得る。(c) scFv8168 の相同性モデルにおいて、疎水性残基 VH:V33 が極性残基 VH:N100a と近接している。(d) scFv8168 の VH:V33N 突然変異体においては、VH:N33 の側鎖が VH:N100a と水素結合を形成し得ることが相同性モデリングによって示唆される。該２つの残基間の水素結合は、ボンド(bond)によって図示されている。(e): scFv8168 の相同性モデルにおいて、帯電した残基 VH:K43 は疎水性残基 VH:V85 と塩橋を形成しなかった。(f): VH:K43 および VH:E85 の２つの帯電した側鎖は、scFv8168 における VH:V85E 突然変異によって、塩橋を形成し得る。２つの帯電基間の距離は 2.61Åである。
【図３４】図 34 は、二パラトープ抗体の熱安定性の測定を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
本発明の詳細な説明
定義
本発明がより容易に理解されるよう、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義は、詳細な説明全体を通して示される。
【００５３】
本明細書において用いる“免疫応答”の語句は、例えばリンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、および上記細胞または肝臓によって産生される可溶性高分子(抗体、サイトカインおよび補体を含む)の、侵入性病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌細胞、または自己免疫もしくは病的炎症の場合には正常なヒト細胞もしくは組織を、選択的に傷害し、破壊し、または人体から除去する作用をいう。
【００５４】
本明細書において用いる“シグナル伝達経路”または“シグナル伝達活性”の語句は、一般的にタンパク質-タンパク質相互作用、例えば受容体への成長因子の結合によって開始され、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達をもたらす生化学的因果関係をいう。LRP6 に関して、該伝達は、シグナル伝達を引き起こす一連の反応における１以上のタンパク質上の１以上のチロシン、セリンまたはスレオニン残基の特異的リン酸化を含む。最後から２番目のプロセスは通常、核の事象を含み、遺伝子発現の変化をもたらす。
【００５５】
本明細書において用いる“Wnt シグナル伝達経路”の語句は、分泌型タンパク質リガンドの Wnt ファミリーのメンバーが LRP および Frizzled(FZD)の受容体複合体に結合し、それによりβ-カテニンが核内に移動し、LEF/TCF 転写因子と相互作用し、標的遺伝子の発現を活性化することができる、古典的 Wnt 経路をいう。Wnt シグナル伝達経路は、Wnt レポーター遺伝子アッセイまたは本明細書に記載される Wnt に指揮されるシグナル伝達の他の基準(例えば LRP6 のリン酸化、β-カテニンの安定化および核移行、細胞の増殖/生存)を用いて測定することができる。
【００５６】
“Wnt 1 シグナル伝達経路”の語句は、Wnt1 リガンドおよびWnt1 結合リガンドのクラス、例えば Wnt2、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt9a、Wnt10a または Wnt10b と相互作用する LRP6 によって活性化される古典的 Wnt 経路をいう。
【００５７】
“Wnt 3 シグナル伝達経路”の語句は、Wnt3 または Wnt3a リガンドと相互作用する LRP6 によって活性化される古典的 Wnt 経路をいう。
【００５８】
“LRP6”の用語は、受入番号NP002327において定義されるヒト LRP6 をいう。
【００５９】
本明細書において用いる“抗体”の用語は、(例えば結合、立体障害、安定化/不安定化、空間分布によって) LRP6 エピトープと相互作用し、シグナル伝達を阻害する抗体全体(whole antiboy)をいう。天然の“抗体”は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重(H)鎖および２つの軽(L)鎖を含む糖タンパク質である。各々の重鎖は、重鎖可変領域(本明細書において VH と略す)および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、CH1、CH2 および CH3 で構成される。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書において VL と略す)および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、CL で構成される。VH および VL領域は、より保存されたフレームワーク領域(FR)と称される領域と共に散在する、相補性決定領域(CDR)と称される超可変性の領域にさらに細分することができる。各々の VH および VL は、アミノ末端からカルボキシ末端へ以下の順番で並んだ３つの CDR および４つの FR で構成される: FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞(例えばエフェクター細胞)および古典的補体系の第一成分(Clq)を含む宿主の組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。“抗体”の用語は、例えば、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化(camelised)抗体、キメラ抗体、Fab 断片、F(ab')断片、および抗イディオタイプ(抗-Id)抗体(例えば本発明の抗体に対する抗-Id抗体を含む)、ならびに上記のいずれかのエピトープ結合性断片を含む。抗体は、いかなるアイソタイプ(例えば IgG、IgE、IgM、IgD、IgA および IgY)、クラス(例えば IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1 および IgA2)またはサブクラスのものであってもよい。
【００６０】
軽鎖および重鎖は共に、構造上および機能上の相同性の領域に分けられる。“定常”および“可変”の用語は、機能的に用いられる。この点に関し、軽鎖(VL)および重鎖(VH)部分の両方の可変ドメインが抗原認識および特異性を決定することが理解される。逆に、軽鎖(CL)および重鎖(CH1、CH2 または CH3)の定常ドメインは、重要な生物学的特性、例えば分泌、経胎盤移動性、Fc 受容体結合、補体結合等を与える。慣例により、定常領域ドメインの番号付けは、それが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠く離れるにつれて大きくなる。N-末端は可変領域であり、C-末端は定常領域である; CH3 および CL ドメインは、それぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を実際に含む。特に、“抗体”の用語は、図12A-Dに示される IgG-scFv 形式を具体的に含む。
【００６１】
“受容体結合ドメイン”または“RBD”の用語は、(例えば結合、立体障害、安定化/不安定化、空間分布によって)標的受容体上の結合部位と特異的に相互作用する、結合分子(例えば抗体)の部分をいう。RBD はまた、(例えば結合、立体障害、安定化/不安定化、空間分布によって) LRP6 エピトープと特異的に相互作用し、シグナル伝達を阻害する能力を保持している、抗体の１以上の断片をもいう。抗体断片の例としては、これらに限定されないが、scFv、Fab 断片、VL、VH、CL および CH1 ドメインからなる一価の断片; F(ab)2 断片、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結した２つの Fab 断片を含む二価の断片; VH および CH1 ドメインからなる Fd 断片; 抗体の単一のアームの VL および VH ドメインからなる Fv 断片; VH ドメインからなるdAb 断片 (Ward et al.、(1989) Nature 341:544-546); および単離された相補性決定領域(CDR)が挙げられる。
【００６２】
さらに、Fv 断片の２つのドメインである VL および VH は別々の遺伝子によってコードされているが、それらは、組換え方法を用いて、VL および VH 領域が対になって一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖(単鎖Fv(scFv)として知られる; 例えば Bird et al., (1988) Science 242:423-426; および Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883 を参照)として作成されることを可能にする合成リンカーによって連結することができる。かかる単鎖抗体も、“抗体断片”の用語の中に包含されることを意図されている。これらの抗体断片は当業者に公知の常套の方法を用いて得られ、該断片はインタクトな抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。
【００６３】
抗体断片は、“単一ドメイン抗体”、“マキシボディ(maxibody)”、“ミニボディ(minibody)”、“ダイアボディ(diabody)”、“トリアボディ(triabody)”、“テトラボディ(tetrabody)”、“v-NAR”および“ビス-scFv”(例えば、Hollinger and Hudson、(2005) Nature Biotechnology 23: 1126-1136 を参照)の中に組み込むこともできる。抗体断片は、ポリペプチド、例えばフィブロネクチンIII型(Fn3)に基づく足場(フィブロネクチンポリペプチドモノボディ(monobody)を記載する米国特許第6,703,199号を参照)の中に移植することができる。
【００６４】
抗体断片は、相補的軽鎖ポリペプチドと共に抗原結合領域のペアを形成するタンデムな Fv セグメントのペア(VH-CH1-VH-CH1)を含む単鎖分子の中に組み込むことができる(Zapata et al.、(1995) Protein Eng. 8:1057-1062; および米国特許第5,641,870号)。
【００６５】
RBD は、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ユニボディ(unibody)、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、v-NAR およびビス-scFv (例えば Hollinger and Hudson、(2005) Nature Biotechnology 23: 1126-1136 を参照)、二特異性単鎖ダイアボディ、すなわち２つの別個のエピトープに結合するよう設計された単鎖ダイアボディ、をも包含する。RBD は、エピトープに特異的に結合する抗体様分子または抗体模倣物をも含み、これらに限定されないが、ミニボディ、マキシボディ、Fn3 に基づくタンパク質足場、アンキリンリピート(Ankrin repeat)(DARpinとしても知られる)、VASP ポリペプチド、トリ膵臓ポリペプチド(aPP)、テトラネクチン、アフィリリン(Affililin)、ノッチン(Knottin)、SH3 ドメイン、PDZ ドメイン、テンダミスタット(Tendamistat)、ネオカルチノスタチン(Neocarzinostatin)、プロテインAドメイン、リポカリン、トランスフェリンおよびクニッツ(Kunitz)ドメインが挙げられ、これらは本発明の範囲内である。
【００６６】
“多価抗体”の用語は、１より大きい価数を有する単一の結合分子をいい、ここで“価数”とは、１分子の抗体構造につき存在する抗原結合部分の数として説明される。そのため、該単一の結合分子は、標的受容体上の１より多くの結合部位に結合することができる。多価抗体の例としては、これらに限定されないが、二価抗体、三価抗体、四価抗体、五価抗体等、ならびに二特異性抗体および二パラトープ抗体が挙げられる。例えば、LRP6 受容体に関して、多価抗体(例えば LRP6 二パラトープ抗体)は、LRP6 のそれぞれβ-プロペラ 1 ドメイン結合部位に対する結合部分およびβ-プロペラ 3 ドメイン結合部位に対する結合部分を有する。
【００６７】
“多価抗体”の用語は、２つの別々の標的受容体に対する１より多くの抗原結合部分を有する単一の結合分子をもいう。例えば、LRP6 標的受容体および LRP6 ではない第二の標的受容体(例えば ErbB、cmet、IGFR1、Smoothened、Notch 受容体)の両方に結合する抗体。一つの態様において、多価抗体は、４つの受容体結合ドメインを有する四価抗体である。四価の分子は、二特異性であってその標的受容体上の各結合部位に対して二価であるものであってもよい。
【００６８】
多価抗体は、例えば、(例えば細胞表面受容体に結合し、活性化または抑制シグナルの伝達または阻害をもたらすことによって)細胞活性化を調節するか、(例えば細胞シグナルに誘導される経路によって)細胞死をもたらすか、または(例えば細胞殺傷を媒介もしくは促進することによって、または生体が利用可能な物質の量を調節することによって)対象における疾患または障害を調節する生物学的作用を媒介する。
【００６９】
本明細書において用いる“単離された抗体”の語句は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体をいう(例えば、LRP6 に特異的に結合する単離された抗体は、LRP6 以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まないものである)。しかし、LRP6 に特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原、例えば他の種の LRP6 分子に対する交差反応性を有するものであってもよい。さらに、単離された抗体は、他の細胞性物質および/または化学物質を実質的に含まないものであってもよい。
【００７０】
本明細書において用いる“一価抗体”の用語は、標的受容体、例えば LRP6 上の、単一のエピトープに結合する抗体をいう。
【００７１】
本明細書において用いる“二価抗体”の用語は、少なくとも２つの同一の標的受容体上の２つのエピトープに結合する抗体(例えば、２つの LRP6 受容体のβ-プロペラ 1 ドメインに結合する抗体、あるいは、２つの LRP6 受容体のβ-プロペラ 3 ドメインに結合する抗体)をいう。二価抗体は、標的受容体を互いに架橋することもできる。“二価抗体”は、少なくとも２つの同一の標的受容体上の２つの異なるエピトープに結合する抗体をもいう。
【００７２】
本明細書において用いる“二パラトープ抗体”の用語は、同じ標的受容体上の２つの異なるエピトープに結合する抗体、例えば、単一の LRP6 受容体上のβ-プロペラ 1 ドメインおよびβ-プロペラ 3 ドメインに結合する抗体をいう。該用語は、少なくとも２つの LRP6 受容体のβ-プロペラ 1 およびβ-プロペラ 3 ドメインの両方に結合する抗体、例えば四価の二パラトープ抗体をも含む。
【００７３】
本明細書において用いる“二特異性抗体”の用語は、少なくとも２つの異なる標的受容体(例えば LRP6 受容体と LRP6 受容体ではない受容体)上の２以上の異なるエピトープに結合する抗体をいう。
【００７４】
本明細書において用いる“モノクローナル抗体”または“モノクローナル抗体組成物”の語句は、実質的に同一のアミノ酸配列を有するか又は同じ遺伝源(genetic source)に由来する、抗体、抗体断片、二特異性抗体等を含むポリペプチドをいう。かかる用語は、単一の分子構成の抗体分子の調製物をも含む。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。
【００７５】
本明細書において用いる“ヒト抗体”の語句は、フレームワークおよび CDR 領域の両方がヒト起源の配列に由来するものである可変領域を有する抗体を含む。さらに、該抗体が定常領域を含む場合、該定常領域もかかるヒト配列、例えばヒト生殖系列配列に由来するものであるか、またはヒト生殖系列配列の突然変異したバージョンであるか、あるいは、該抗体は、例えば Knappik、et al. (2000. J Mol Biol 296、57-86)に記載されるヒトフレームワーク配列の解析から得られるコンセンサスフレームワーク配列を含むものである。免疫グロブリン可変ドメイン、例えば CDR の構造および位置は、周知の番号付け体系、例えば、Kabat 番号付け体系、Chothia 番号付け体系、または Kabat および Chothia の組み合わせを用いて定義することができる(例えば Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat et al.; Al Lazikani et al., (1997) J. Mol. Bio. 273:927 948; Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NIH Publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services; Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., (1989) Nature 342:877-883; およびAl-Lazikani et al., (1997) J. Mol. Biol. 273:927-948 を参照されたい)。
【００７６】
本発明のヒト抗体は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基(例えば、インビトロのランダムなもしくは部位特異的突然変異誘発によって又はインビボの体細胞突然変異によって導入される突然変異、または安定性もしくは製造を促進するための保存的置換)を含んでもよい。しかし、本明細書において用いる“ヒト抗体”の用語は、別の哺乳類の種、例えばマウスの生殖系列に由来する CDR 配列がヒトのフレームワーク配列上に移植された抗体を含むことを意図していない。
【００７７】
本明細書において用いる“組換えヒト抗体”の語句は、組換えの手段によって調製、発現、作成または単離される全てのヒト抗体、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックまたは染色体導入である動物(例えばマウス)または該動物から調製されたハイブリドーマから単離される抗体、ヒト抗体を発現するよう形質転換された宿主細胞、例えばトランスフェクトーマ(transfectoma)から単離される抗体、組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体、および、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の全てまたは一部を他の DNA 配列へスプライスすることを含む他のいずれかの手段によって調製、発現、作成または単離される抗体を含む。かかる組換えヒト抗体は、フレームワークおよび CDR 領域がヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来するものである可変領域を有する。しかし、特定の態様においては、かかる組換えヒト抗体は、インビトロの突然変異誘発(または、ヒト Ig 配列に関してトランスジェニックである動物を用いる場合には、インビボの体細胞突然変異誘発)に供することができ、それにより、該組換え抗体の VH および VL 領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列の VH および VL 配列に由来し且つ関連するが、インビボのヒト抗体生殖系列レパートリー内には天然には存在しない可能性がある配列となり得る。
【００７８】
本明細書において用いる“リンカー”の用語は、scFv と IgG を連結するために用いられる、グリシンおよびセリン残基からなるペプチドリンカーをいう。例示的な Gly/Ser リンカーは、アミノ酸配列(Gly-Gly-Ser)2、即ち (Gly2 Ser)n (n は 1 以上の正の整数である)を含む。例えば、n=1、n=2、n=3。n=4、n=5 および n=6、n=7、n=8、n=9 および n=10。一つの態様において、リンカーとしては、これらに限定されないが、(Gly4 Ser)4  または (Gly4Ser)3 が挙げられる。別の態様において、リンカーは、より良い可溶性のために Glu および Lys 残基が Gly-Ser リンカー内に散在したものである。別の態様において、リンカーは、複数の (Gly2Ser)、(GlySer) または (Gly3Ser) の繰り返しを含む。別の態様において、リンカーは、(Gly3Ser)+(Gly4Ser)+(GlySer) の組み合わせおよび重複を含む。別の態様において、Ser は Ala で置換することができ、例えば、(Gly4Ala) または (Gly3Ala) である。別の態様において、リンカーは Gly、Ser および Pro のいずれかの組み合わせを含む。別のさらなる態様において、リンカーは、モチーフ(GluAlaAlaAlaLys)n を含むものであり、ここで n は 1 以上の正の整数である。
【００７９】
本明細書において用いる“Fc 領域”の用語は、抗体の CH3、CH2、および定常ドメインのヒンジ領域の少なくとも一部を含むポリペプチドをいう。所望により、Fc 領域は、いくつかの抗体クラスに存在する CH4 ドメインを含んでもよい。Fc 領域は、抗体の定常ドメインのヒンジ領域全体を含むものであってもよい。一つの態様において、本発明は、抗体の Fc 領域および CH1 領域を含む。一つの態様において、本発明は、抗体の Fc 領域 CH3 領域を含む。別の態様において、本発明は、抗体の定常ドメインの Fc 領域、CH1 領域および Cカッパ/ラムダ領域を含む。一つの態様において、本発明の結合分子は、定常領域、例えば重鎖定常領域を含む。一つの態様において、かかる定常領域は、野生型の定常領域と比較して改変される。即ち、本明細書に記載される本発明のポリペプチドは、３つの重鎖定常ドメイン(CH1、CH2 または CH3)および/または軽鎖定常領域ドメイン(CL)の１以上に対する変更または改変を含み得る。例示的な改変としては、１以上のドメインにおける１以上のアミノ酸の付加、欠失または置換が挙げられる。かかる変更は、エフェクター機能、半減期等を最適化するために含めることができる。
【００８０】
本明細書において用いる“結合部位”の用語は、抗体または抗原結合性断片が選択的に結合する標的受容体上の領域を含む。例えば、LRP6 上の結合部位は、β-プロペラ 1 結合ドメイン、β-プロペラ 2 結合ドメイン、β-プロペラ 3 結合ドメイン、およびβ-プロペラ 4 結合ドメインを含む。
【００８１】
本明細書において用いる“エピトープ”の用語は、高い親和性で免疫グロブリンと結合することができるいずれかの決定基(determinant)をいう。エピトープは、ある抗原を特異的に標的とする抗体が結合する該抗原の領域であり、抗原がタンパク質である場合、抗体と直接接触する特定のアミノ酸を含む。もっとも多くの場合、エピトープはタンパク質上に存在するが、いくつかの場合においては、他の種類の分子上、例えば核酸上に存在し得る。エピトープ決定基は、化学的に活性な分子の表面基、例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニル基を含み得、特定の３次元構造特徴、および/または特定の電荷特性を有しうる。
【００８２】
一般的に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質および/または高分子の複雑な混合物中において、標的抗原上のエピトープと結合する。
【００８３】
所与のポリペプチドのエピトープを含む領域は、当該技術分野において周知のエピトープマッピング手法のいずれかを用いて同定することができる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology、Vol.66 (Glenn E.Morris、Ed.、1996) Humana Press、Totowa、New Jersey を参照されたい。例えば、直線状エピトープは、例えばタンパク質分子の部分に相当する多数のペプチドを固体支持体上で同時に合成し、該ペプチドが支持体に付着している間に該ペプチドを抗体と反応させることによって、決定し得る。かかる手法は当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許第4,708,871号; Geysen et al.、(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002; Geysen et al.、(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182; Geysen et al.、(1986) Mol. Immunol. 23:709-715 に記載されている。同様に、立体構造的エピトープは、例えば x 線結晶学および二次元核磁気共鳴によってアミノ酸の空間的高次構造を決定することにより、容易に同定される。例えば、前掲の Epitope Mapping Protocols を参照されたい。タンパク質の抗原性領域も、標準的な抗原性および疎水性プロット、例えば Oxford Molecular Group から入手可能な Omiga version 1.0 ソフトウェアプログラムを使用して計算されるプロットを用いて同定することができる。このコンピュータプログラムは、抗原性プロファイルの決定のために Hopp/Woods 法、Hopp et al.、(1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828 を採用し; 疎水性プロットのために Kyte-Doolittle 法、Kyte et al.、(1982) J.MoI. Biol. 157:105-132 を採用している。
【００８４】
２つの実体間の“特異的結合”の用語は、少なくとも 102M-1、少なくとも 5x102M-1、少なくとも 103M-1、少なくとも 5x103M-1、少なくとも 104M-1、少なくとも 5x104M-1、少なくとも 105M-1、少なくとも 5x105M-1、少なくとも 106M-1、少なくとも 5x106M-1、少なくとも 107M-1、少なくとも 5x107M-1、少なくとも 108M-1、少なくとも 5x108M-1、少なくとも 109M-1、少なくとも 5x109M-1、少なくとも 1010M-1、少なくとも 5x1010M-1、少なくとも 1011M-1、少なくとも 5x1011M-1、少なくとも 1012M-1、少なくとも 5x1012M-1、少なくとも 1013M-1、少なくとも 5x1013M-1、少なくとも 1014M-1、少なくとも 5x1014M-1、少なくとも 1015M-1、または少なくとも 5x1015M-1 の平衡定数(KA)(kon/koff)での結合を意味する。
【００８５】
LRP6 多価抗体(例えば二パラトープ抗体)と“特異的に(または選択的に)結合する”との語句は、タンパク質および他の生物学的物質(biologics)の異種性集団中における同族の抗原(例えばヒト LRP6)の存在を決定する結合反応をいう。平衡定数(KA)に加えて、本発明の LRP6 多価抗体は、通常、約 5x10-2M未満、10-2M未満、5x10-3M未満、10-3M未満、5x10-4M未満、10-4M未満、5x10-5M未満、10-5M未満、5x10-6M未満、10-6M未満、5x10-7M未満、10-7M未満、5x10-8M未満、10-8M未満、5x10-9M未満、10-9M未満、5x10-10M未満、10-10M未満、5x10-11M未満、10-11M未満、5x10-12M未満、10-12M未満、5x10-13M未満、10-13M未満、5x10-14M未満、10-14M未満、5x10-15M未満、もしくは 10-15M未満またはそれより小さい解離速度定数(KD)(koff/kon)をも有し、非特異的抗原(例えば HSA)に対するその結合親和性よりも少なくとも２倍大きい親和性で LRP6 と結合する。一つの態様において、LRP6 多価抗体は、本明細書に記載される方法または当業者に公知の方法(例えば BIAcore アッセイ、ELISA、FACS、SET) (Biacore International AB、Uppsala、Sweden)を用いて評価される 3000 pM未満、2500 pM未満、2000 pM未満、1500 pM未満、1000 pM未満、750 pM未満、500 pM未満、250 pM未満、200 pM未満、150 pM未満、100 pM未満、75 pM未満、10 pM未満、1 pM未満の解離定数(Kd)を有する。
【００８６】
本明細書において用いる“Kassoc”または“Ka”の用語は、特定の抗体-抗原相互作用の会合速度をいい、他方、本明細書において用いる“Kdis”または“Kd”の用語は、特定の抗体-抗原相互作用の解離速度をいう。本明細書において用いる“KD”の用語は、Ka に対する Kd の比(即ちKd/Ka)から得られ、モル濃度(M)として表される解離定数をいう。抗体についての KD 値は、当該分野において十分に確立された方法を用いて決定することができる。抗体の KD を決定する方法は、表面プラズモン共鳴法を用いること、またはバイオセンサー系、例えば Biacore(登録商標) システムを用いることである。
【００８７】
本明細書において用いる“親和性”の用語は、単一の抗原性部位における抗体と抗原の間の相互作用の強さをいう。各々の抗原性部位内において、抗体“アーム”の可変領域は、多数の部位において弱い非共有結合的力を介して抗原と相互作用する; 相互作用が大きければ大きいほど、親和性は強くなる。
【００８８】
本明細書において用いる“アビディティー”の用語は、抗体-抗原複合体の全体的安定性または強度の有益な尺度をいう。それは３つの主な要因: 抗体エピトープ親和性; 抗原および抗体両方の価数; および相互作用する部分の構造的配置によって制御される。究極的に、これらの要因は、抗体の特異性、即ち、特定の抗体が正確な(precise)抗原エピトープに結合している可能性を規定する。
【００８９】
本明細書において用いる“Wnt 1”の用語は、Wnt1、Wnt2、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt9a、Wnt10a、またはWnt10b をいう。
【００９０】
本明細書において用いる“Wnt 3a”の用語は、Wnt3a および Wnt3 をいう。
【００９１】
本明細書において用いる“増強する”の用語は、Wnt リガンドの存在下における抗体の断片の全長 IgG LRP6 抗体への変換により Wnt シグナルが活性化され、亢進する過程をいう。
【００９２】
“有意な増強が無い”または“増強を回避する”の用語は、同じエピトープに結合する対照抗体またはそれらの断片と比較して活性化も亢進もされていない Wnt シグナルをいう。有意な増強が無いことは、対照抗体またはそれらの断片よりも、少なくとも 10%、少なくとも 20%、少なくとも30%、少なくとも 40%、少なくとも 50%、少なくとも 60%、少なくとも 70%、少なくとも80%、少なくとも 90%、少なくとも 100% 低いものであり得る。
【００９３】
本明細書において用いる“クラスター”の用語は、LRP6 受容体と共に集合し又は集団となり、Wnt シグナル伝達を増強するあらゆるタンパク質をいう。かかるタンパク質の例としては、これらに限定されないが、Wnt1 リガンド、Wnt3a リガンドおよび Wnt3 リガンドが挙げられる。これらのタンパク質は、多量体化、例えば２つの内在性LRP6 受容体の二量体化を引き起こし得る。かかる二量体化は、LRP6 の増大した相互作用に起因する増大したアビディティーをもたらし得、Wnt リガンドの存在下において Wnt シグナルを増強し得る。
【００９４】
“保存的に改変された変異体”の語句は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関し、保存的に改変された変異体とは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいうか、あるいは核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列をいう。遺伝暗号の縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が所与のタンパク質をコードする。例えば、コドン GCA、GCC、GCG および GCU はすべてアミノ酸アラニンをコードする。したがって、あるコドンによってアラニンが特定されるあらゆる位置において、該コドンは、コードされるポリペプチドを変化させることなく、記載した対応するコドンのいずれかに変更することができ、かかる核酸変異は“サイレント変異”であり、保存的に改変された変異の一種である。本明細書における、ポリペプチドをコードするすべての核酸配列は、該核酸のあらゆる可能なサイレント変異をも表す。当業者は、核酸中の各々のコドン(通常メチオニンの唯一のコドンである AUG、および通常トリプトファンの唯一のコドンである TGG を除く)を改変して機能的に同一の分子を生み出し得ることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各々のサイレント変異が、記載された各々の配列中に潜在している。
【００９５】
ポリペプチド配列に関し、“保存的に改変された変異体”は、アミノ酸の、化学的に類似するアミノ酸による置換をもたらす、ポリペプチド配列に対する個々の置換、欠失または付加を含む。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は当該技術分野において周知である。かかる保存的に改変された変異体は、本発明の多型変異体、種間ホモログおよび対立遺伝子に対して追加的なものであり、これらを除外しない。以下の８つのグループは、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む: 1) アラニン(A)、グリシン(G);  2) アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);  3) アスパラギン(N)、グルタミン(Q);  4) アルギニン(R)、リジン(K);  5) イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);  6) フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);  7) セリン(S)、スレオニン(T); および 8) システイン(C)、メチオニン(M) (例えば Creighton、Proteins (1984)を参照)。いくつかの態様において、“保存的配列改変”の用語は、あるアミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意な影響を与えず、また有意に変化もさせないアミノ酸改変をいうために用いられる。
【００９６】
“交差遮断する(cross-block)”、“交差遮断される”および“交差遮断”の用語は、標準的な競合結合アッセイにおいて他の抗体または結合物質と LRP6 との結合に干渉する多価抗体の能力を意味するために本明細書において互換的に用いられる。
【００９７】
多価抗体が別の抗体または結合分子と LRP6 との結合に干渉することができる能力または程度、およびそれを本発明による交差遮断と言えるか否かは、標準的な競合結合アッセイを用いて決定することができる。１つの適切なアッセイとしては、表面プラズモン共鳴の技術を用いて相互作用の程度を測定することができる Biacore テクノロジー(例えばBIAcore 3000 装置 (Biacore、Uppsala、Sweden)を用いることによる)の使用が挙げられる。交差遮断を測定するための別のアッセイは、ELISAに基づくアプローチを用いるものである。
【００９８】
本明細書において用いる“最適化された”の用語は、産生細胞または生物、一般的には真核細胞、例えばピキア(Pichia)の細胞、トリコデルマ(Trichoderma)の細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)またはヒト細胞において好適なコドンを用いたアミノ酸配列をコードするよう変更されたヌクレオチド配列をいう。最適化されたヌクレオチド配列は、“親”配列としても知られる出発ヌクレオチド配列によって元々コードされていたアミノ酸配列を完全に又は可能な限り多く保持するよう、操作される。
【００９９】
様々な種の LRP6 に対する多価抗体の結合能力を評価するための標準的なアッセイは、当該技術分野において公知であり、例えば ELISA、ウエスタンブロットおよび RIA が挙げられる。適切なアッセイは、実施例において詳細に記載されている。多価抗体の結合動態(例えば結合親和性)も、当該技術分野において公知の標準的なアッセイ、例えば Biacore(商標) 解析によって評価することができる。LRP6 の機能的特性に対する多価抗体の効果を評価するためのアッセイ(例えば、受容体結合アッセイ、Wnt 経路の調節、または IgG 産生)は、実施例においてさらに詳細に記載されている。
【０１００】
したがって、当該技術分野において公知の方法および本願明細書に記載される方法によって決定される、これら LRP6 の機能的特性(例えば、生化学的、免疫化学的、細胞性、生理学的または他の生物学的活性等)の１以上を“阻害する”多価抗体は、該多価抗体の非存在下(例えば、または無関係の特異性を有する対照抗体が存在する場合)において見られる活性と比較した、特定の活性の統計的に有意な減少に関連すると理解される。LRP6 の活性を阻害する多価抗体は、かかる統計的に有意な減少を、測定されるパラメータの少なくとも 10%、少なくとも 50%、80% または 90% もたらし、特定の態様においては、本発明の抗体は、LRP6 の機能的活性の 95% より多く、98% より多く、または 99% より多くを阻害し得る。
【０１０１】
２以上の核酸またはポリペプチド配列に関し、“パーセント同一”または“パーセント同一性”の語句は、同一である２以上の配列または部分配列(subsequence)をいう。以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、または手動アラインメントおよび目視検査によって測定される比較ウィンドウまたは指定した領域にわたる最大の対応(maximum correspondence)に対して比較および整列された場合に、２つの配列が同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定されたパーセンテージ(即ち、特定された領域にわたる 60% の同一性、所望により 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% または 99%、あるいは、特定されていない場合には、配列全体にわたる)を有していれば、２つの配列は“実質的に同一”である。所望により、同一性は、長さが少なくとも約 50 ヌクレオチド(または 10 アミノ酸)である領域にわたって、またはより好ましくは長さが 100 から 500 または 1000 またはそれ以上のヌクレオチド(または 20、50、200 またはそれ以上のアミノ酸)である領域にわたって存在する。
【０１０２】
配列比較に関し、通常は１つの配列が参照配列としての役割を果たし、試験配列は該参照配列と比較される。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要であれば部分配列の座標を指定し、そして配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを用いてもよく、あるいは代替のパラメータを指定してもよい。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を算出する。
【０１０３】
本明細書において用いる“比較ウィンドウ”は、２つの配列（ある配列と参照配列）が最適に整列された後、ある配列を同じ数の連続する位置の参照配列と比較し得る、20 から 600、通常約 50 から約 200、より通常には約 100 から約150 からなる群より選択される連続する位置の数のいずれかのセグメントへの言及を含む。比較のための配列のアラインメントの方法は、当該技術分野において周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Smith および Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c の局所的相同性アルゴリズムによって、Needleman および Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443 の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson および Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行(Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group、575 Science Dr.、Madison、WI における GAP、BESTFIT、FASTA、および TFASTA)によって、または、手動アラインメントおよび目視検査(例えば Brent et al.、(2003) Current Protocols in Molecular Biology を参照)によって、行うことができる。
【０１０４】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの２つの例は、それぞれ Altschul et al.、(1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; および Altschul et al.、(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 に記載されている、BLAST および BLAST 2.0 アルゴリズムである。BLAST 解析を行うためソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information)を通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列した場合に一致するかまたはいくつかの正の値の閾値スコア T を満たすクエリー配列中の長さ W の短いワードを同定することにより、最初に高スコア配列ペア(HSP)を同定することを含む。T は、隣接ワードスコア閾値(neighborhood word score threshold)(前掲のAltschul et al.)と称される。これらの初期隣接ワードヒットは、それらを含むより長い HSP を見出す検索を開始するための種としての役割を果たす。ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増大させ得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータ M (一致する残基のペアに対する報酬スコア; 常に > 0) および N (ミスマッチ残基に対するペナルティスコア; 常に < 0) を用いて算出される。アミノ酸配列については、累積スコアを算出するためにスコアリングマトリックスが用いられる。各方向におけるワードヒットの伸長は、以下の場合に停止される: 累積アラインメントスコアがその最大達成値から数(quantity) X だけ減少するとき; １以上の負のスコアを与える残基アラインメントの蓄積のため、累積スコアがゼロ以下となるとき; または、いずれかの配列の末端に到達するとき。BLAST アルゴリズムのパラメータ W、T および X は、アラインメントの感度および速度を決定する。BLASTN プログラム(ヌクレオチド配列用)は、11のワード長(W)、10の期待値(E)、M=5、N=-4 および両鎖比較をデフォルトとして用いている。アミノ酸配列に関して、BLASTP プログラムは、3のワード長、および 10の期待値(E)、および BLOSUM62 スコアリングマトリックス(Henikoff and Henikoff、(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 を参照)、50のアラインメント(B)、10の期待値(E)、M=5、N=-4、および両鎖比較をデフォルトとして用いている。
【０１０５】
BLAST アルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析をも実行する(例えば Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 を参照)。BLAST アルゴリズムによって提供される類似性の一つの尺度は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる可能性の指標を提供する最小合計確率(P(N))である。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が約 0.2 未満、より好ましくは約 0.01 未満、最も好ましくは約 0.001 未満であるとき、核酸は参照配列と類似すると考えられる。
【０１０６】
２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性も、ALIGN プログラム(バージョン 2.0)に組み込まれているE. Meyers および W. Miller のアルゴリズム(Comput. Appl. Biosci. 4:11-17 (1988))を使用し、PAM120 重み付き残基表、12のギャップ長ペナルティおよび 4のギャップペナルティを用いて決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、GCG ソフトウェアパッケージ(www.gcg.com において入手可能)中の GAP プログラムに組み込まれている Needleman および Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) アルゴリズムを使用し、Blossom 62 マトリックスまたは PAM250 マトリックスのいずれか、および 16、14、12、10、8、6 または 4 のギャップ重みおよび 1、2、3、4、5 または 6 の長さ重みを用いて決定することができる。
【０１０７】
上記した配列同一性のパーセンテージ以外の、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることの別の指標は、以下に記載する通り、第一の核酸にコードされるポリペプチドが、第二の核酸にコードされるポリペプチドに対して作成された抗体と免疫学的に交差反応性であることである。したがって、例えば２つのペプチドが保存的置換のみによって異なる場合、ポリペプチドは通常、第二のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、以下に記載する通り、該２つの分子またはそれらの相補体がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であることのさらなる別の指標は、同じプライマーを用いて該配列を増幅できることである。
【０１０８】
本明細書において、“核酸”の語句は、“ポリヌクレオチド”の用語と互換的に用いられ、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび一本鎖または二本鎖いずれかの形態におけるその重合体をいう。該用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、かつ、参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される、合成、天然および非天然の、既知のヌクレオチド類似体または改変された骨格残基または結合を含む核酸を包含する。かかる類似体の例としては、これらに限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホルアミダート、メチルホスホナート、キラル-メチルホスホナート、2-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸(PNA)が挙げられる。
【０１０９】
特に断りの無い限り、特定の核酸配列は、明示される配列のみならず、その保存的に改変された変異体(例えば縮重コドン置換)および相補配列をも黙示的に包含する。具体的には、以下において詳細に記載する通り、縮重コドン置換は、１以上の選択された(または全ての)コドンの３番目の位置が混合塩基(mixed-base)および/またはデオキシイノシン残基によって置換されている配列を生成することによって達成し得る(Batzer et al., (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et al., (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; および Rossolini et al., (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98)。
【０１１０】
“作動可能に連結”の語句は、２以上のポリヌクレオチド(例えばDNA)のセグメント間の機能的関係をいう。通常、それは転写調節配列と転写される配列との機能的関係をいう。例えば、プロモーターまたはエンハンサー配列は、それが適切な宿主細胞または他の発現系においてコード配列の転写を刺激または調節する場合、該コード配列に作動可能に連結している。一般的に、転写される配列に作動可能に連結しているプロモーター転写調節配列は、該転写される配列と物理的に連続しており、即ち、それはシス作用性である。しかし、いくつかの転写調節配列、例えばエンハンサーは、それが転写を増強するコード配列と物理的に連続しているかまたは近接して位置している必要がない。
【０１１１】
本明細書において、“ポリペプチド”および“タンパク質”の用語は、アミノ酸残基の重合体をいうために互換的に用いられる。該用語は、天然アミノ酸の重合体および非天然アミノ酸の重合体のみならず、１以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的化学的模倣物であるアミノ酸重合体に適用される。特に断りのない限り、特定のポリペプチド配列は、その保存的に改変された変異体をも黙示的に包含する。
【０１１２】
“対象”の用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳類および非哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類を含む。特記した場合を除き、本明細書において“患者”または“対象”の用語は互換的に用いられる。
【０１１３】
“抗癌剤”の用語は、細胞増殖性障害、例えば癌を処置するために用いることができるあらゆる物質を意味し、細胞傷害性物質、化学療法剤、放射線治療および放射線治療剤、標的化された抗癌剤、および免疫治療剤を含む。
【０１１４】
“腫瘍”とは、悪性であるか良性であるかに関わらず、腫瘍性の細胞成長および増殖、ならびに全ての前癌性および癌性の細胞および組織をいう。
【０１１５】
“抗腫瘍活性”の用語は、腫瘍細胞の増殖速度、生存度または転移活性の低下を意味する。抗腫瘍活性を示す一つの可能な方法は、治療の間に生じる異常細胞の増殖速度の低下、または腫瘍サイズ安定性または減少を示すことである。かかる活性は、これらに限定されないが、異種移植モデルを含む受け入れられたインビトロまたはインビボの腫瘍モデルを用いて評価することができる。
【０１１６】
“悪性腫瘍(malignancy)”の用語は、非良性腫瘍または癌をいう。本明細書において用いる場合、“癌”の用語は、調節解除された又は制御されない細胞増殖に特徴付けられる悪性腫瘍を含む。例示的な癌としては、以下が挙げられる: 癌腫、肉腫、白血病およびリンパ腫。“癌”の用語は、原発性悪性腫瘍(例えば、その細胞が対象の体における元の腫瘍の部位以外の部位へ移動していないもの)および二次悪性腫瘍(例えば、転移、即ち元の腫瘍の部位とは異なる二次的部位への腫瘍細胞の移動から生じるもの)を含む。
【０１１７】
本発明の様々な側面を、以下のセクションおよびサブセクションにおいてさらに詳細に説明する。
【０１１８】
LRP6 および Wntシグナル伝達経路
本発明は、LRP6 多価抗体およびその使用に関する。LRP6 に向けられた分子による Wnt シグナル伝達の阻害は、古典的 Wnt シグナル伝達の喪失をもたらす。したがって、多価抗体による LRP6 受容体機能の拮抗作用は Wnt リガンドシグナル伝達を阻害し、異常な古典的 Wnt シグナル伝達に関連する疾患、例えば癌を助けるものとなる。特に、LRP6 多価抗体は、様々な疾患環境において、Wnt1 または Wnt3a クラスのタンパク質によって媒介されるシグナル伝達を特異的に増大または減少させることができる。
【０１１９】
Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路の誤調節は、様々なヒト疾患、例えば癌および骨障害と関連している。これらの疾患において Wnt シグナル伝達のバランスを回復させる分子は、治療的可能性を有し得る。ファージに基づくパニングを用いて、Wnt シグナル伝達を阻害または増強する LRP6 抗体が同定された。注目すべきことに、２つのクラスの LRP6 拮抗性抗体が同定された。１つのクラスの抗体は Wnt1 によって表される Wnt タンパク質を特異的に阻害し、他方、第２のクラスは Wnt3a によって表される Wnt タンパク質を特異的に阻害する。エピトープマッピング実験により、Wnt1 特異的 LRP6 抗体および Wnt3a 特異的 LRP6 抗体がそれぞれ LRP6 の１番目のβ-プロペラおよび３番目のβ-プロペラに結合することが示され、Wnt1 および Wnt3a タンパク質は LRP6 の異なるβ-プロペラ領域に結合することが示唆される(その内容全体が参照により本明細書に取り込まれている、2008年10月31日出願の国際出願番号PCT/EP2008/064821を参照されたい)。
【０１２０】
LRP6 のプロペラ 3 ドメインのさらなる特徴決定により、抗体との相互作用に関与するかかるドメイン中の残基が同定された。水素-重水素交換(HDx)質量分析(MS)を用いてプロペラ 3 の YWTD-EGF 領域内の抗体結合部位が同定され、該部位はプロペラ 3 ドメインのブレード(blade) 1 および 6 間の凹面に相当するものであった。
【０１２１】
Wnt シグナル伝達経路は、胚発生および出生後の組織維持において重要である。これは、細胞の増殖、運動および細胞生存の時間的および空間的調節を制御する特定の遺伝子セットを指揮することによって達成される(Barker and Clevers (2006) Nature Rev. 5:997 において概説されている)。この経路の適切な調節は、組織恒常性を維持するために重要である。この経路の慢性的活性化は、制御されない細胞増殖および生存を促進し、その結果、細胞増殖性疾患、例えば癌の発生を駆動し得る。あるいは、この経路の異常な阻害は、多くの疾患状態、例えば骨量の減少および他の骨疾患をもたらし得る。Wnt タンパク質は、Frizzled 受容体および、低密度リポタンパク質受容体(LDLR)関連タンパク質(LRP)のメンバーである２つの細胞表面受容体: LRP5 および LRP6 のうち一方と相互作用することによって、下流のシグナル伝達を開始する(He et al.,(2004) Development 31:1663-1677 において概説されている)。
【０１２２】
古典的 Wnt シグナル伝達におけるLRP6 の役割は、遺伝的研究を通じて明らかにされた。LRP6 を欠く突然変異体マウスは、いくつかの個々の Wnt 遺伝子における突然変異と同様の複合的表現型を示した(Pinson et al.、(2000) Nature 407:535-538)。アフリカツメガエル胚において、ドミナントネガティブの LRP6 がいくつかの Wnt タンパク質によるシグナル伝達を遮断した一方、LRP6 の過剰発現は Wnt/β-カテニンシグナル伝達を活性化した(Tamai et al.、(2000) Nature 407:530-535)。さらに、細胞が古典的 Wnt シグナル伝達に応答するために LRP6 または LRP5 のいずれかの発現が必要であることが示されている(前掲の He et al.、2004 において概説されている)。
【０１２３】
LRP5 と LRP6 は相同性が高く、その細胞外および細胞内ドメインにおいてそれぞれ 73% および 64% の同一性を有する。それらは胚形成の間および成熟組織において広く共発現しており、いくらかの機能的冗長性を有する。
【０１２４】
LRP5 および LRP6 の細胞外ドメインは、３つの基本的ドメインを含む: 1) YWTD(チロシン、トリプトファン、スレオニン、アスパラギン酸)型β-プロペラ領域、2) EGF(上皮成長因子)様ドメイン、および 3) LDLRタイプA(LA)ドメイン。
【０１２５】
YWTD型β-プロペラ領域は、各々 43-50 アミノ酸残基の６つの YWTD リピートを含み、６枚羽根のβ-プロペラ構造を形成する。LRP5 および LRP6 の中には、各々の後に保存されたシステイン残基を有する約 40 アミノ酸残基を含む EGF様ドメインが続き、次いで３つの LA ドメインが続く、４つの YWTD型β-プロペラ領域が存在する。(Springer et al.、(1998) J. Mol. Biol. 283:837-862; Jeon et al.、(2001) Nat. Struct. Biol. 8:499-504)。β-プロペラ-EGF様ドメインは、細胞外リガンドと結合するようである。LRP6 の細胞外ドメインは、アミノ酸残基 19 から 1246 によって規定され、それぞれβ-プロペラ領域 1、2、3 および 4 に対応する、アミノ酸残基 43-324、352-627、654-929 および957-1250 における４つのβ-プロペラドメインを含む。プロペラドメイン 1-2 はアミノ酸 19-629 を含み、プロペラドメイン 3-4 はアミノ酸 631-1246 を含む。
【０１２６】
LRP6 抗体
本発明は、LRP6(例えばヒトLRP6、カニクイザル LRP6)に特異的に結合する抗体を提供する。いくつかの態様において、本発明は、ヒトおよびカニクイザルの両方の LRP6 に特異的に結合する抗体を提供する。
【０１２７】
β-カテニンシグナル伝達を活性化することができる Wnt タンパク質は２つのクラスに分けることができ、それらは、内容全体が参照により本明細書に取り込まれている2008年10月31日出願の国際出願番号PCT/EP2008/064821において記載される通り、シグナル伝達のために LRP6 の異なるβ-プロペラ領域を必要とする。加えて、二量体 LRP6 抗体(例えば IgG)は、例えば内在性 LRP6 の二量体化を通じて、細胞を Wnt シグナル伝達に対して強く感作させる。これらの結果は、β-プロペラ 1 およびβ-プロペラ 3 が Wnt1 および Wnt 3 のシグナル伝達活性に異なって必要とされることを示唆する。これらの知見は、Wnt に誘導される LRP6 活性化に関する新たな見識を提供し、様々な疾患において Wnt シグナル伝達を調節する LRP6 抗体の開発のための道を開くものである。さらに、LRP6 抗体の断片の IgG 形式への変換は、LRP6 受容体をクラスター化させ、リガンドタンパク質の存在下において Wnt シグナルを増強することができる抗体をもたらす。
【０１２８】
一つの態様において、抗体は Wnt シグナルを増強するが、但し、本発明の二パラトープ抗体によっては増強が生じないことを条件とする。かかる態様において、Wnt シグナルは、Wnt リガンドの存在下において、抗体の断片の全長 IgG LRP6 抗体への変換によって活性化および増強される。例えば、Wnt 1 Fab は LRP6 受容体のβ-プロペラ 1 ドメインに結合し、Wnt リガンド、例えば Wnt 3 の非存在下において Wnt 1 経路を遮断する。Wnt リガンド、例えば Wnt 3 の存在下では、Wnt 1 Fab は Wnt 1 経路を介するシグナル伝達を遮断するが、Wnt 3 経路を介してシグナル活性化が生じ得、それによりシグナルが産生される。Wnt 1 Fab が全長 Wnt 1 IgG に変換されると、該Wnt 1 IgG は２つの LRP6 受容体のβ-プロペラ 1 ドメインに結合し、Wnt リガンド、例えば Wnt 3 の存在下において Wnt 1 経路を遮断するが; シグナル活性化が Wnt 3 経路を介して生じ、それが増強される。作用の理論を提供する必要はないが、１つの可能なメカニズムは、IgG クラスターが各 LRP6 受容体のβ-プロペラ 1 ドメインに結合することによって２以上の LRP6 受容体を一緒にし、それが Wnt 3 リガンドの存在下において Wnt 3 経路を介するより強いシグナルをもたらすというものである。LRP6 受容体の二量体化は、おそらくは LRP6 を含む様々な相互作用のアビディティーの増大を通じて、Wnt シグナル伝達を促進する。
【０１２９】
LRP6 受容体のβ-プロペラ 3 ドメインに結合し、Wnt 3 経路を遮断する Wnt 3 Fab を用いて、逆の結果が得られる。Wnt 1 リガンドの存在下において、Wnt 3 Fab は Wnt 3 経路を遮断するが、Wnt 1 経路を活性化してシグナルを生成する。Wnt 3 Fab が全長 Wnt 3 IgG に変換されると、該 Wnt 3 IgG は２つの LRP6 受容体のβ-プロペラ 3 領域に結合し、Wnt 1 リガンドの存在下において、Wnt 1 経路を介するシグナル伝達を阻害する。一つの態様において、抗体は、Wnt シグナルの増強を回避する。いくつかの態様において、本発明は、ヒトおよびカニクイザル両方の LRP6 に特異的に結合する抗体を提供する。一つの態様において、LRP6 抗体は拮抗性抗体である。別の態様において、LRP6 抗体は作動性抗体である。
【０１３０】
異なる Wnt タンパク質がシグナル伝達のために LRP6 の異なるβ-プロペラドメインを必要とし、かつ、LRP6 のクラスター化または二量体化が Wnt シグナル伝達を増強するため、LRP6 抗体を用いる治療は、様々な抗体の組合せを用いることによって制御および“微調整”することができる。
【０１３１】
一つの態様において、LRP6 抗体は、単量体の抗体またはそれらの断片、例えば単鎖抗体、ユニボディ等として用いられる。一つの態様において、LRP6 のβ-プロペラ 1 領域に結合する単量体の LRP6 抗体が、LRP6 のβ-プロペラ 3 領域に結合する単量体の LRP6 抗体と組み合わせて用いられる。別の態様において、LRP6 抗体は多量体の抗体またはそれらの断片、例えば二特異性、二パラトープ性 LRP6 抗体として用いられる。
【０１３２】
Wnt リガンドに加えて、LRP6 プロペラ 1 抗体は、他のプロペラ 1 結合性リガンド(例えばスクレロスチン、Dkk1)との相互作用を阻害すると期待される。同様に、プロペラ 3 抗体は、他のプロペラ 3 結合性リガンド(例えば Dkk1)との相互作用を阻害すると期待される。さらに、プロペラ 1 および 3 結合性抗体は、他のWnt シグナル伝達モジュレーター、例えば R-スポンジンの活性に影響を及ぼすと期待し得る。
【０１３３】
本発明はまた、LRP6 タンパク質(例えばヒトおよび/またはカニクイザルのLRP6)に特異的に結合する抗体であって、以下の表 1 に示す VH CDR のいずれかのアミノ酸配列を有する VH CDR を含む抗体を提供する。特に、本発明は、LRP6 タンパク質(例えばヒトおよび/またはカニクイザルのLRP6)に特異的に結合する抗体であって、以下の表 1 に示す VH CDR のいずれかのアミノ酸配列を有する１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の VH CDR を含む(あるいは該VH CDRからなる)抗体を提供する。
【０１３４】
本発明は、LRP6 タンパク質(例えばヒトおよび/またはカニクイザルの LRP6)に特異的に結合する抗体であって、配列番号 14、34、36、44、60 および 62 のアミノ酸配列を有する VH ドメインを含む抗体を提供する。本発明は、LRP6 タンパク質(例えばヒトおよび/またはカニクイザルのLRP6)に特異的に結合する抗体であって、配列番号 13、33、35、43、59 および 61 のアミノ酸配列を有する VL ドメインを含む抗体を提供する。
【０１３５】
本発明は、LRP6 タンパク質(例えばヒトおよび/またはカニクイザルの LRP6)に特異的に結合する抗体であって、配列番号 82、89、106、108、128、130 および 138 のアミノ酸配列を有する VH ドメインを含む抗体を提供する。本発明は、LRP6 タンパク質(例えばヒトおよび/またはカニクイザルの LRP6)に特異的に結合する抗体であって、配列番号 81、90、105、107、127 および 129 のアミノ酸配列を有する VL ドメインを含む抗体を提供する。
【０１３６】
本発明の他の抗体は、突然変異しているが、CDR 領域において、表 1 に記載される配列中に示される CDR 領域と少なくとも 60%、70%、80%、90%、95% または 98% の同一性を有するアミノ酸を含む。いくつかの態様において、それは、表 1 に記載される配列中に示される CDR 領域と比較した場合に CDR 領域においてわずか 1、2、3、4 または 5 個のアミノ酸が突然変異しているが、元の抗体のエピトープに対するその特異性を依然として維持している突然変異体アミノ酸配列を含む。
【０１３７】
本発明の他の抗体は、突然変異しているが、フレームワーク領域において、表 1 に記載される配列中に示されるフレームワーク領域と少なくとも 60%、70%、80%、90%、95% または 98% の同一性を有するアミノ酸を含む。いくつかの態様において、それは、表 1 に記載される配列中に示されるフレームワーク領域と比較した場合に、フレームワーク領域においてわずか 1、2、3、4、5、6 または 7 個のアミノ酸が突然変異しているが、元の抗体のエピトープに対するその特異性を依然として維持している突然変異体アミノ酸配列を含む。
【０１３８】
本発明はまた、LRP6 タンパク質(例えばヒトおよび/またはカニクイザルの LRP6)に特異的に結合する抗体の VH、VL、全長重鎖および全長軽鎖をコードする核酸配列を提供する。かかる核酸配列は、哺乳類細胞における発現のために最適化することができる(例えば、β-プロペラ 1 抗体についての MOR08168、MOR08545 および MOR06706、ならびにβ-プロペラ 3 抗体についてのMOR06475、MOR08193 および MOR08473 に関する表1)。
【０１３９】
本発明の LRP6 抗体は、別個のLRP6 β-プロペラ領域に結合する。プロペラ 1 抗体は、β-プロペラ 1 ドメインに結合し、プロペラ 1 依存性の Wnt、例えば Wnt1、Wnt2、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt9、Wnt10A、Wnt10B を遮断する。プロペラ 3 抗体は、β-プロペラ 3 ドメインに結合し、プロペラ 3 依存性の Wnt、例えば Wnt3a およびWnt3 を遮断する。
【０１４０】
【表１−１】
2020063262.tif 000002
【表１−２】
2020063262.tif 000003
【表１−３】
2020063262.tif 000004
【表１−４】
2020063262.tif 000005
【表１−５】
2020063262.tif 000006
【表１−６】
2020063262.tif 000007
【表１−７】
2020063262.tif 000008
【表１−８】
2020063262.tif 000009
【表１−９】
2020063262.tif 000010
【表１−１０】
2020063262.tif 000011
【表１−１１】
2020063262.tif 000012
【表１−１２】
2020063262.tif 000013
【表１−１３】
2020063262.tif 000014
【表１−１４】
2020063262.tif 000015
【表１−１５】
2020063262.tif 000016
【表１−１６】
2020063262.tif 000017
【表１−１７】
2020063262.tif 000018
【表１−１８】
2020063262.tif 000019
【表１−１９】
2020063262.tif 000020
【表１−２０】
2020063262.tif 000021
【表１−２１】
2020063262.tif 000022
【表１−２２】
2020063262.tif 000023
【表１−２３】
2020063262.tif 000024
【表１−２４】
2020063262.tif 000025
【０１４１】
本発明の他の抗体は、アミノ酸またはアミノ酸をコードする核酸が変異されているが、表１に記載の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性を有するものを含む。いくつかの実施形態では、表１に記載の配列に示されている可変領域と比較した場合、可変領域において１、２、３、４または５以下のアミノ酸が変異されているが、実質的に同一の治療活性を保持している変異アミノ酸配列を含む。
【０１４２】
これらの抗体の各々はＬＲＰ６に結合できるので、ＶＨ、ＶＬ、全長軽鎖および全長重鎖配列（アミノ酸配列およびアミノ酸配列をコードする配列）を「組み合わせて適合させ」て、本発明の他のＬＲＰ６抗体を作成できる。かかる「組み合わせて適合させ」たＬＲＰ６抗体は、当該技術分野で知られている結合アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ、および実施例の節に記載の他のアッセイ）を用いて試験してもよい。これらの鎖が組み合わせて適合されている場合、特定のＶＨ／ＶＬ対の対由来のＶＨ配列は、構造的に類似したＶＨ配列で置換されるべきである。同様に、特定の全長重鎖／全長軽鎖の対由来の全長重鎖配列は、構造的に類似した全長重鎖配列で置換されるべきである。同様に、特定のＶＨ／ＶＬの対由来のＶＬ配列は、構造的に類似したＶＬで置換されるべきである。同様に、特定の全長重鎖／全長軽鎖の対由来の全長軽鎖配列は、構造的に類似した全長軽鎖配列で置換されるべきである。したがって、一態様では、本発明は：配列番号１４、３４、３６、４４、６０および６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号１３、３３、３５、４３、５９および６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；配列番号８２、１０６、１０８、１２８、１３０および１３８からなる群から選択される重鎖；ならびに配列番号８１、９０、１０５、１０７、１２７、１２９および１３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有し；ＬＲＰ６（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＬＲＰ６）に特異的に結合するものである、単離されたモノクローナル抗体またはそれらの断片を提供する。
【０１４３】
別の態様では、本発明は、表１に記載の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの組合せを含む、ＬＲＰ６のβプロペラ１ドメインに結合する、ＬＲＰ６抗体を提供する。該抗体のＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１、２１および４７に示される。該抗体のＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号２、２２および４８に示される。該抗体のＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号３、２３および４９に示される。該抗体のＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号４、２４および５０に示される。該抗体のＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号５、２５および５１に示される。該抗体のＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号６、２６および５２に示される。ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔ系を用いて描写される（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ９１−３２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３；およびＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２７３，９２７−９４８）。
【０１４４】
他の態様では、本発明は、表１に記載の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの組合せを含む、ＬＲＰ６のβプロペラ３ドメインに結合する、ＬＲＰ６抗体を提供する。該抗体のＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号６９、９３および１１５に示される。該抗体のＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号７０、９４および１１６に示される。該抗体のＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号７１、９５および１１７に示される。該抗体のＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号７２、９６および１１８に示される。該抗体のＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号７３、９７および１１９に示される。該抗体のＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号７４、９８および１２０に示される。ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔ系を用いて描写される（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ９１−３２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３；およびＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２７３，９２７−９４８）。
【０１４５】
これらの各抗体がＬＲＰ６に結合でき、抗原結合特異性がＣＤＲ１、２および３領域により主として与えられることに鑑みると、ＶＨ  ＣＤＲ１、２および３配列ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、２および３配列を「組み合わせて適合させ」てよい（すなわち、異なる抗体由来のＣＤＲを組み合わせて適合させることができる）が、各抗体は、本発明の他のＬＲＰ６結合分子を作成するために、ＶＨ  ＣＤＲ１、２および３ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、２および３を含有しなければならない。かかる「組み合わせて適合させ」たＬＲＰ６抗体は、当該技術分野で知られている結合アッセイおよび実施例に記載のもの（例えばＥＬＩＳＡ）を用いて試験してもよい。ＶＨ  ＣＤＲ配列が組み合わせて適合されている場合、特定のＶＨ配列由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、構造的に類似したＣＤＲ配列で置換されるべきである。同様に、ＶＬ  ＣＤＲ配列が組み合わせて適合されている場合、特定のＶＬ配列由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、構造的に類似したＣＤＲ配列で置換されるべきである。一以上のＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲ領域配列を、本発明のモノクローナル抗体について本明細書に示されるＣＤＲ配列由来の構造的に類似した配列で置換することにより、新たなＶＨおよびＶＬ配列が構築できることを、当業者は容易に理解する。
【０１４６】
したがって、本発明は、配列番号１、２１および４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２、２２および４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３、２３および４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号４、２４および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５、２５および５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；ならびに、配列番号６、２６および５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含み；ＬＲＰ６に結合するものである、単離されたＬＲＰ６  β−プロペラ１モノクローナル抗体またはそれらの断片を提供する。
【０１４７】
したがって、本発明は、配列番号６９、９３および１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号７０、９４および１１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号７１、９５および１１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号７２、９６および１１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号７３、９７および１１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；ならびに、配列番号７４、９８および１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含み；ＬＲＰ６に結合するものである、単離されたＬＲＰ６  β−プロペラ３モノクローナル抗体またはそれらの断片を提供する。
【０１４８】
具体的な実施形態では、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号６の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１４９】
具体的な実施形態では、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号２１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号２３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号２６の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１５０】
具体的な実施形態では、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号４７の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号４８の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号４９の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号５０の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５１の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号５２の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１５１】
具体的な実施形態では、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号６９の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号７０の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号７１の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号７２の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号７３の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号７４の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１５２】
具体的な実施形態では、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号９３の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号９４の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号９５の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号９６の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号９７の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号９８の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１５３】
具体的な実施形態では、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号１１５の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１１６の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１１７の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１１８の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１１９の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号１２０の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１５４】
具体的な実施形態では、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号１４のＶＨおよび配列番号１３のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号３４のＶＨおよび配列番号３３のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号３５のＶＨおよび配列番号３６のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号４３のＶＨおよび配列番号４４のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号６０のＶＨおよび配列番号５９のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号６２のＶＨおよび配列番号６１のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号８２のＶＨおよび配列番号８１のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号９０のＶＨおよび配列番号８９のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号１０６のＶＨおよび配列番号１０５のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号１０８のＶＨおよび配列番号１０７のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号１２８のＶＨおよび配列番号１２７のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号１３０のＶＨおよび配列番号１２９のＶＬを含む。具体的な実施形態では、ＬＲＰ６に結合する抗体は、配列番号１３８のＶＨおよび配列番号１３７のＶＬを含む。
【０１５５】
一実施形態では、ＬＲＰ６抗体はアンタゴニスト抗体である。一実施形態では、ＬＲＰ６抗体はアゴニスト抗体である。特定の実施形態では、ＬＲＰ６に結合する抗体は表１に記載の抗体である。
【０１５６】
本明細書で用いる場合、抗体の可変領域または全長鎖がヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を用いる系から獲得される場合、該ヒト抗体は、特定の生殖系列配列「の産物」であるかまたはそれ「に由来する」、重鎖もしくは軽鎖可変領域または全長重鎖もしくは軽鎖を含む。かかる系は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を担持するトランスジェニックマウスを対象とする抗原で免疫するか、あるいは対象とする抗原でファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることを含む。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはそれ「に由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較して、ヒト抗体配列と配列において最も近い（すなわち、最大の同一性％）ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することにより、それ自体同定できる。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはそれ「に由来する」ヒト抗体は、例えば、天然に存在する体細胞変異あるいは部位特異的突然変異の意図的導入のために、生殖系列配列と比較した場合、アミノ酸の相違を含有してもよい。しかしながら、ＶＨまたはＶＬフレームワーク領域において、選択されたヒト抗体は典型的には、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と、アミノ酸配列において少なくとも９０％同一であり、かつ、他の種の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖系列配列）と比較した場合、ヒトであるとヒト抗体を同定するアミノ酸残基を含有する。場合によっては、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と、アミノ酸配列において少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは少なくとも９５％、またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一でありうる。典型的には、組換えヒト抗体は、ＶＨまたはＶＬフレームワーク領域においてヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と、１０以下のアミノ酸の相違を示すだろう。場合によっては、ヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と、５以下、または４、３、２あるいは１以下のアミノ酸の相違を示しうる。
【０１５７】
本明細書に開示される抗体は、一本鎖抗体、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、ドメイン抗体、ナノ抗体（ｎａｎｏｂｏｄｙ）およびユニボディ（ｕｎｉｂｏｄｙ）の誘導体でありうる。「一本鎖抗体」（ｓｃＦｖ）は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインが対合して一価分子を形成する、Ｖドメインに連結したＶＬドメインを含む、単一のポリペプチド鎖からなる。一本鎖抗体は、当該技術分野で知られている方法により調製できる（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照）。「ｄｉｓｂｕｄ」は２つの鎖からなり、各鎖は、短いペプチドリンカーにより結合され、同一ポリペプチド鎖上で軽鎖可変領域に結合された重鎖可変領域を含み、同一鎖上の２つの領域はお互いに対合しないが、他方の鎖の相補ドメインと二重特異性分子を形成するものである。二重特異性抗体の調製方法は、当該技術分野で知られている（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８，およびＰｏｌｊａｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照）。ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）は、抗体の重鎖あるいは軽鎖のいずれかの可変領域に相当する、抗体の小さい機能的結合単位である。ドメイン抗体は、細菌、酵母およびほ乳類細胞系で良好に発現する。ドメイン抗体およびそれらの産生方法のさらなる詳細は、当該技術分野で知られている（例えば、米国特許第６，２９１，１５８号；同第６，５８２，９１５号；同第６，５９３，０８１号；同第６，１７２，１９７号；同第６，６９６，２４５号；欧州特許第０３６８６８４号および同第０６１６６４０号；国際公開第０５／０３５５７２号，同第０４／１０１７９０号，同第０４／０８１０２６号，同第０４／０５８８２１号，同第０４／００３０１９号および同第０３／００２６０９号を参照）。ナノ抗体は抗体の重鎖に由来する。ナノ抗体は典型的に、単一の可変ドメインおよび２つの定常ドメイン（Ｃ２およびＣ３）を含み、元の抗体の抗原結合能を保持する。ナノ抗体は当該技術分野で知られている方法により調製できる（例えば、米国特許第６，７６５，０８７号，同第６，８３８，２５４号，国際公開第０６／０７９３７２号を参照）。ユニボディはＩｇＧ４の１つの軽鎖および１つの重鎖からなる。ユニボディはＩｇＧ４抗体のヒンジ領域の除去により作製できる。ユニボディおよびそれらの調製方法のさらなる詳細は、国際公開第２００７／０５９７８２号に見出される。
【０１５８】
Ｗｎｔリガンドに加えて、ＬＲＰ６プロペラ１抗体は、他のプロペラ１結合リガンド（例えば、スクレロスチン、Ｄｋｋ１）との相互作用を阻害することが期待される。同様に、プロペラ３抗体は、他のプロペラ３結合リガンド（例えば、Ｄｋｋ１）との相互作用を阻害することが期待される。さらに、プロペラ１および３結合抗体は、他のＷｎｔシグナル修飾因子（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）、例えばＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ、の活性に影響を及ぼすことが期待される。
【０１５９】
相同抗体（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）
さらに別の実施形態では、本発明は、表１に記載の配列と相同なアミノ酸配列であって、ＬＲＰ６タンパク質（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＬＲＰ６）に結合し、表１に記載の抗体の所望の機能的特性を保持している抗体またはそれらの断片を提供する。
【０１６０】
例えば、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体（またはその機能的断片）であって、該重鎖可変領域は配列番号１４、３４、３６、４４、６０および６２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み；該軽鎖可変領域は配列番号１３、３３、３７、４３、５９および６１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含み；ＬＲＰ６（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＬＲＰ６）のβ−プロペラ１に結合し、Ｗｎｔレポーター遺伝子アッセイまたは本明細書に記載のＷｎｔ指向性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）シグナル伝達（ＬＲＰ６のリン酸化反応、β−カテニンの安定化および核移行ならびに細胞増殖／生存）の他の測定において測定できる、β−プロペラ１依存性Ｗｎｔタンパク質のシグナル伝達活性を阻害する抗体を提供する。具体的な例では、かかる抗体は、馴化培地を用いるまたはトランスフェクトされた細胞を用いる場合、Ｗｎｔ１アッセイにおいて１０ｎＭ未満のＥＣ５０値を有する。
【０１６１】
例えば、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体（またはその機能的断片）であって、該重鎖可変領域は配列番号８２、８９、１０６、１０８、１２８、１３０および１３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含み；該軽鎖可変領域は配列番号８１、９０、１０５、１０７、１２７、１２９および１３７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含み；ＬＲＰ６（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＬＲＰ６）のβ−プロペラ３に結合し、Ｗｎｔレポーター遺伝子アッセイまたは本明細書に記載のＷｎｔ指向性シグナル伝達（ＬＲＰ６のリン酸化反応、β−カテニンの安定化および核移行ならびに細胞増殖／生存）の他の測定において測定できる、β−プロペラ３依存性Ｗｎｔタンパク質のシグナル伝達活性を阻害する抗体を提供する。具体的な例では、かかる抗体は、馴化培地を用いるまたはトランスフェクトされた細胞を用いる場合、Ｗｎｔ３ａアッセイにおいて１０ｎＭ未満のＥＣ５０値を有する。
【０１６２】
さらにプロペラ１抗体に関して、可変重鎖親ヌクレオチド配列は配列番号１６、３８および６４に示されている。可変軽鎖親ヌクレオチド配列は配列番号１５、３７および６３に示されている。ほ乳類細胞での発現のために最適化された全長重鎖配列は、配列番号２０、４２および６８に示されている。ほ乳類細胞での発現のために最適化された全長軽鎖配列は、配列番号１９、４１および６７に示されている。本発明の他の抗体は、変異されたアミノ酸または核酸を含むが、上述の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％同一性を有する。いくつかの実施形態では、上述の配列に示される可変領域と比べると１、２、３、４または５以下のアミノ酸が可変領域においてアミノ酸欠失、挿入または置換により変異している、変異アミノ酸配列を含む。
【０１６３】
さらにプロペラ３抗体に関して、可変重鎖親ヌクレオチド配列は配列番号８４、１１０および１３２に示されている。可変軽鎖親ヌクレオチド配列は配列番号８３、１０９および１３１に示されている。ほ乳類細胞での発現のために最適化された全長重鎖配列は、配列番号８８、９１、１１４、１３６および１４０に示されている。ほ乳類細胞での発現のために最適化された全長軽鎖配列は、配列番号８７、９２、１１３、１３５および１３９に示されている。本発明の他の抗体は、変異されたアミノ酸または核酸を含むが、上述の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％同一性を有する。いくつかの実施形態では、上述の配列に示される可変領域と比べると１、２、３、４または５以下のアミノ酸が可変領域においてアミノ酸欠失、挿入または置換により変異している、変異アミノ酸配列を含む。
【０１６４】
他の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、表１に記載の配列と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一でありうる。他の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、１、２、３、４または５以下のアミノ酸位置でのアミノ酸置換を除き同一でありうる。
【０１６５】
表１に記載のプロペラ１抗体のＶＨおよびＶＬ領域と高い（すなわち、８０％以上の）同一性を有するＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体は、それぞれ配列番号１４、３４、６０、１３、３３および５９をコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば部位特異的またはＰＣＲ介在突然変異誘発）により得ることができ、次いで本明細書に記載の機能的アッセイを用いて保持される機能について、コードされる変化された抗体を試験できる。
【０１６６】
表１に記載のプロペラ３抗体のＶＨおよびＶＬ領域と高い（すなわち、８０％以上の）同一性を有するＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体は、それぞれ配列番号８２、１０６、１２８、８１、１０５および１２７をコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば部位特異的またはＰＣＲ介在突然変異誘発）により得ることができ、次いで本明細書に記載の機能的アッセイを用いて保持される機能について、コードされる変化された抗体を試験できる。
【０１６７】
他の実施形態では、重鎖および／または軽鎖ヌクレオチド配列の可変領域は、上記の配列と６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一でありうる。
【０１６８】
本明細書で用いる場合、２つの配列間の「同一性パーセント」は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入することが必要なギャップ数、および各ギャップの長さを考慮に入れて、当該配列により共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性％は同一位置の数／位置の総数×１００に等しい）。２つの配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、下記非限定的な例に記載の通り、数学的なアルゴリズムを用いて実施できる。
【０１６９】
さらにまたはあるいは、本発明のタンパク質配列はさらに「クエリー配列」として用いて、公開データベースに対する検索を実行し、例えば関連配列を同定できる。例えば、かかる検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−１０のＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）を用いて実行することができる。
【０１７０】
保存的修飾を有する抗体
特定の実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を有し、これらのＣＤＲ配列の一以上は、本明細書に記載の抗体に基づいて特定されるアミノ酸配列またはその保存的修飾を有し、そして本発明のＬＲＰ６抗体の所望の機能的特性を保持するものである。
【０１７１】
したがって、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域からなる、単離されたプロペラ１モノクローナル抗体またはその機能的断片であって：該重鎖可変領域ＣＤＲ１アミノ酸配列が、配列番号１、２１および４７ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され；該重鎖可変領域ＣＤＲ２アミノ酸配列が、配列番号２、２２および４８ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され；該重鎖可変領域ＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号３、２３および４９ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され；該軽鎖可変領域ＣＤＲ１アミノ酸配列が、配列番号４、２４、５０ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され；該軽鎖可変領域ＣＤＲ２アミノ酸配列が、配列番号５、２５および５１ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され；該軽鎖可変領域ＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号６、２６および５２ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され；ＬＲＰ６に特異的に結合し、Ｗｎｔレポーター遺伝子アッセイまたは本明細書に記載のＷｎｔ指向性シグナル伝達（例えば、ＬＲＰ６のリン酸化反応、β−カテニンの安定化および核移行ならびに細胞増殖／生存）の他の測定において測定できる、Ｗｎｔシグナル伝達経路を阻害することによりＬＲＰ６活性を阻害するものである、抗体またはそれらの断片を提供する。
【０１７２】
したがって、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域からなる、単離されたプロペラ３モノクローナル抗体またはその機能的断片であって：該重鎖可変領域ＣＤＲ１アミノ酸配列が、配列番号６９、９３および１１５ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され；該重鎖可変領域ＣＤＲ２アミノ酸配列が、配列番号７０、９４および１１６ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され；該重鎖可変領域ＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号７１、９５および１１７ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され；該軽鎖可変領域ＣＤＲ１アミノ酸配列が、配列番号７２、９６および１１８ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され；該軽鎖可変領域ＣＤＲ２アミノ酸配列が、配列番号７３、９７および１１９ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され；該軽鎖可変領域ＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号７４、９８および１２０ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され；ＬＲＰ６に特異的に結合し、Ｗｎｔレポーター遺伝子アッセイまたは本明細書に記載のＷｎｔ指向性シグナル伝達（例えば、ＬＲＰ６のリン酸化反応、β−カテニンの安定化および核移行ならびに細胞増殖／生存）の他の測定において測定できる、Ｗｎｔシグナル伝達経路を阻害することによりＬＲＰ６活性を阻害するものである、抗体またはそれらの断片を提供する。
【０１７３】
同じエピトープに結合する抗体
本発明は、表１に記載のＬＲＰ６抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。さらなる抗体はそれゆえ、ＬＲＰ結合アッセイにおいて本発明の他の抗体と交差競合する（例えば、統計的に有意に競合的に結合を阻害する）能力に基づいて同定できる。ＬＲＰ６タンパク質（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＬＲＰ６）と本発明の抗体の結合を阻害する試験抗体の能力は、試験抗体がＬＲＰ６への結合について当該抗体と競合できることを示し；かかる抗体は、理論に縛られないが、それが競合する抗体とＬＲＰ６タンパク質上の同じまたは関連する（例えば、構造的に類似する、または空間的に近接した）エピトープに結合しうる。ある実施形態では、本発明の抗体とＬＲＰ６上の同じエピトープに結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。かかるヒトモノクローナル抗体は、本明細書に記載の通りに調製し、単離できる。
【０１７４】
操作および修飾された抗体
本発明の抗体はさらに、修飾された抗体を設計するための出発物質として、本明細書に示される一以上のＶＨおよび／またはＶＬ配列を有する抗体を用いて調製でき、この修飾された抗体は、出発抗体とは異なる特徴を有しうる。一方または両方の可変領域（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）、例えば一以上のＣＤＲ領域および／または一以上のフレームワーク領域における一以上の残基を修飾することにより、抗体を操作できる。さらにまたはあるいは、例えば抗体のエフェクター機能を変化させるために、定常領域内の残基を修飾することにより、抗体を操作できる。
【０１７５】
実施できる可変領域操作の一種が、ＣＤＲ移植（ＣＤＲ  ｇｒａｆｔｉｎｇ）である。抗体は、６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基によって主として標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲ外の配列よりも個々の抗体間でより多様である。ＣＤＲ配列はほとんどの抗体−抗原相互作用に関与するため、異なる特徴を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列上に移植した特定の天然に存在する抗体由来のＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特定の天然に存在する抗体の特徴を模倣する組換え抗体を発現することが可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８６：１００２９−１００３３；Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号，ならびにＱｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６２号および同第６，１８０，３７０号を参照）。
【０１７６】
したがって、本発明の別の実施形態は、配列番号１、２１および４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列；配列番号２、２２および４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列；配列番号３、２３および４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列をそれぞれ含む重鎖可変領域；ならびに、配列番号４、２４および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列；配列番号５、２５および５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列；および配列番号６、２６および５２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３配列をそれぞれ有する軽鎖可変領域を含む、単離されたプロペラ１モノクローナル抗体またはそれらの断片に関する。それゆえ、かかる抗体は、モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲ配列を含有するが、これらの抗体とは異なるフレームワーク配列を含有しうる。
【０１７７】
したがって、本発明の別の実施形態は、配列番号６９、９３および１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列；配列番号７０、７６、１００および１１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列；配列番号７１、９５および１１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列をそれぞれ含む重鎖可変領域；ならびに、配列番号７２、９６および１１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列；配列番号７３、９７および１１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列；および配列番号７４、９８および１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３配列をそれぞれ有する軽鎖可変領域を含む、単離されたプロペラ３モノクローナル抗体、またはそれらの断片に関連する。それゆえ、かかる抗体はモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲ配列を含有するが、これらの抗体とは異なるフレームワーク配列を含有しうる。
【０１７８】
かかるフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベースまたは公表された参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子のための生殖系列ＤＮＡ配列は、「Ｖａｓｅ］ヒト生殖系列配列データベース（ｗｗｗ．ｍｒｃ−  ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅでインターネット上で入手可能）、ならびに、それぞれの内容が出典明示により本明細書に明確に組み込まれる；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ９１−３２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３；およびＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２７３：９２７−９４８；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）  Ｊ．  ｆｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７：７７６−７９８；およびＣｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｅｕｒ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４：８２７−８３６において、見出しうる。
【０１７９】
本発明の抗体に使用するためのフレームワーク配列の例は、選択された本発明の抗体により用いられるフレームワーク配列、例えば、コンセンサス配列および／または本発明のモノクローナル抗体により使用されるフレームワーク配列と構造的に類似のものである。ＶＨ  ＣＤＲ１、２および３配列ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、２および３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子において見られるものと同一の配列を有するフレームワーク領域上に移植でき、あるいは該ＣＤＲ配列は、生殖系列配列と比較して一以上の変異を含有するフレームワーク領域上に移植できる。例えば、場合によっては、抗体の抗原結合能力を維持または向上するために、フレームワーク領域内の残基を変異させることが有益であるということが見出されている（例えば、Ｑｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６２号および同第６，１８０，３７０号を参照）。
【０１８０】
別の種類の可変領域修飾は、ＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を変異させることにより、対象とする抗体の一以上の結合特性（例えば親和性）を改善することであり、「親和性成熟」として知られる。部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ介在突然変異誘発を実施して変異を導入でき、抗体結合または他の対象とする機能的特徴に対する効果は、本明細書に記載され、実施例に提供される通り、インビトロおよびインビボアッセイで評価できる。（上記に議論されるような）保存的修飾を導入してもよい。突然変異は、アミノ酸置換、付加または欠失でありうる。さらにＣＤＲ領域内の典型的には１、２、３、４または５以上の残基が変化される。
【０１８１】
したがって、別の実施形態では、配列番号１、２１および４７を有する群から選択されるアミノ酸配列または配列番号１、２１および４７と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１領域；配列番号２、２２および４８からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号２、２２および４８と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２領域；配列番号３、２３および４９からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号３、２３および４９と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域；配列番号４、２４および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列または４、２４および５０と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１領域；配列番号５、２５および５１からなる群から選択されるアミノ酸配列または５、２５および５１と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２領域；ならびに配列番号６、２６および５２からなる群から選択されるアミノ酸配列または６、２６および５２と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３領域からなる、単離されたプロペラ１モノクローナル抗体またはそれらの断片を提供する。
【０１８２】
したがって、別の実施形態では、配列番号６９、９３および１１５を有する群から選択されるアミノ酸配列または配列番号６９、９３および１１５と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１領域；配列番号７０、９４および１１６からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号７０、９４および１１６と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２領域；配列番号７１、９５および１１７からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号７１、９５および１１７と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域；配列番号７２、９６および１１８からなる群から選択されるアミノ酸配列または７２、９６および１１８と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１領域；配列番号７３、９７および１１９からなる群から選択されるアミノ酸配列または７３、９７および１１９と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２領域；ならびに配列番号７４、９８および１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列または７４、９８および１２０と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３領域からなる、単離されたプロペラ３モノクローナル抗体またはそれらの断片を提供する。
【０１８３】
別のフレームワークまたはスキャフォールド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）への抗体断片の移植  生じるポリペプチドが少なくとも一つのＬＲＰ６に特異的に結合する結合領域を含む限り、多種多様の抗体／免疫グロブリンフレームワークまたはスキャフォールドが使用できる。かかるフレームワークまたはスキャフォールドは、ヒト免疫グロブリンの５種の主なイディオタイプまたはそれらの断片を含み、また、好ましくはヒト化性状（ａｓｐｅｃｔ）を有する、他の動物種の免疫グロブリンを含む。新たなフレームワーク、スキャフォールドおよび断片が、当業者により発見および開発され続けている。
【０１８４】
一態様では、本発明は、本発明のＣＤＲが移植できる非免疫グロブリンスキャフォールドを用いた、非免疫グロブリンをベースとする抗体を生成することに関する。標的ＬＲＰ６タンパク質（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＬＲＰ６）に特異的な結合領域を含む限り、既知または将来的な非免疫グロブリンフレームワークおよびスキャフォールドが使用できる。既知の非免疫グロブリンフレームワークまたはスキャフォールドには、フィブロネクチン（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、アンキリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ  ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｌｔｄ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，およびＡｂｌｙｎｘ  ｎｖ，Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、リポカリン（Ｐｉｅｒｉｓ  Ｐｒｏｔｅｏｌａｂ  ＡＧ，Ｆｒｅｉｓｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、小モジュラー免疫医薬（ｓｍａｌｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏ−ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（Ｔｒｕｂｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）、マキシボディ（ｍａｘｙｂｏｄｉｅｓ）（Ａｖｉｄｉａ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）、プロテインＡ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ  ＡＧ，Ｓｗｅｄｅｎ）、およびアフィリン（ガンマクリスタリン（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ）またはユビキチン）（Ｓｃｉｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＧｍｂＨ，Ｈａｌｌｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１８５】
フィブロネクチンスキャフォールドはフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（例えば、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインの第１０モジュール（１０Ｆｎ３ドメイン））に基づく。フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインは、それら自体が互いをパックしてタンパク質のコアを形成する、２つのベータシート間に分布する７または８個のβ鎖を有し、さらにベータ鎖と互いに結合し、溶媒に曝されるループ（ＣＤＲに類似する）を含む。ベータシートサンドイッチの各端に、かかるループが少なくとも３個存在し、該端はベータ鎖の方向に垂直なタンパク質の境界である（米国特許第６，８１８，４１８号を参照）。これらのフィブロネクチンをベースとするスキャフォールドは、免疫グロブリンではないが、全体的な折りたたみ（ｆｏｌｄ）は、最も小さな機能的抗体フラグメントであり、ラクダおよびラマＩｇＧの全抗原認識ユニットを含む、重鎖可変領域のものと極めて関連している。この構造のため、非免疫グロブリン抗体は、抗体のものと性質および親和性において類似する抗原結合特性を模倣する。これらのスキャフォールドは、インビボでの抗体の親和性成熟のプロセスと類似の、インビトロでのループランダム化およびシャッフル戦略において用いることができる。これらのフィブロネクチンをベースとする分子は、該分子のループ領域が標準的なクローニング技術を用いる本発明のＣＤＲで置換する場合に、スキャフォールドとして用いることができる。
【０１８６】
アンキリン技術は、異なる標的に結合するために用いることができる可変領域を保持するためのスキャフォールドとして、アンキリン由来反復モジュールを備えるタンパク質を用いることに基づく。アンキリン反復モジュールは、２つの逆平行αヘリックスおよびβターンからなる３３アミノ酸のポリペプチドである。可変領域の結合は、多くの場合、リボソームディスプレイを用いて最適化される。
【０１８７】
アビマーは、ＬＲＰ６などの天然のＡドメイン含有タンパク質に由来する。これらのドメインは、本来タンパク質間相互作用のために用いられ、ヒトでは２５０種以上のタンパク質が構造的にＡドメインに基づいている。アビマーは、アミノ酸リンカーを介して結合した多数の異なる「Ａドメイン」モノマー（２〜１０個）からなる。標的抗原に結合しうるアビマーは、例えば米国特許出願公開第２００４０１７５７５６号、同第２００５００５３９７３号、同第２００５００４８５１２号および同第２００６０００８８４４号に記載された方法論を用いて作成できる。
【０１８８】
アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）親和性リガンドは、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインの１個のスキャフォールドに基づいた３ヘリックスバンドルからなる、小さく単純なタンパク質である。プロテインＡは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来の表面タンパク質である。このスキャフォールドドメインは５８アミノ酸からなり、そのうち１３個がランダム化されて、多数のリガンド変異体を有するアフィボディライブラリーを生じる（例えば、米国特許第５８３１０１２号参照）。アフィボディ分子は抗体を模倣し、１５０ｋＤａである抗体の分子量と比較して、それらは６ｋＤａの分子量を有する。その小さなサイズにもかかわらず、アフィボディ分子の結合部位は抗体のものと同様である。
【０１８９】
アンチカリンは、Ｐｉｅｒｉｓ  ＰｒｏｔｅｏＬａｂ  ＡＧ社により開発された製品である。それらは、化学的に感受性または不溶性の化合物の生理学的輸送または貯蔵に通常関与する広範なグループの小さく強固なタンパク質であるリポカリンに由来する。多様な天然リポカリンがヒト組織または体液中に生じる。タンパク質構造は免疫グロブリンに類似しており、強固なフレームワークの上端に超可変ループを有する。しかしながら、抗体またはその組換え断片とは異なり、リポカリンは、単一免疫グロブリンドメインよりも僅かに大きな１６０〜１８０アミノ酸残基を有する単一ポリペプチド鎖からなる。結合ポケットを構成する４個のループのセットは、顕著な構造可塑性を示し、多様な側鎖に耐容性である。したがって結合部位は、高い親和性および特異性で異なる形の所定の標的分子を認識するため、特許方法で再形成してよい。リポカリンファミリーの一タンパク質である、Ｐｉｅｒｉｓ  Ｂｒａｓｓｉｃａｅのビリン結合タンパク質（ＢＢＰ）は、４個のループのセットを変異させてアンチカリンを開発するために使用されている。アンチカリンについて記載する特許出願の一例は、ＰＣＴ国際公開第１９９９１６８７３号である。
【０１９０】
アフィリン分子は、タンパク質および低分子に対する特異的親和性について設計されている、小さな非免疫グロブリンタンパク質である。新たなアフィリン分子は、各々異なるヒト由来スキャフォールドタンパク質に基づく、２個のライブラリーから極めて速やかに選択しうる。アフィリン分子は免疫グロブリンタンパク質に対して何ら構造的相同性を示さない。現在、２種のアフィリンスキャフォールドが使用されており、一方はヒトの構造的眼レンズタンパク質であるガンマクリスタリンであり、他方は「ユビキチン」スーパーファミリータンパク質である。いずれのヒトスキャフォールドも極めて小さく、高い温度安定性を示し、ｐＨ変化および変性剤にほぼ耐性である。この高い安定性は、主として該タンパク質の伸長ベータシート構造のためである。ガンマクリスタリン由来タンパク質の例は国際公開第２００１０４１４４号に記載されており、「ユビキチン様」タンパク質の例は国際公開第２００４１０６３８号に記載されている。
【０１９１】
タンパク質エピトープ模倣物（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍｉｍｅｔｉｃ）（ＰＥＭ）は、タンパク質間相互作用に関与する主な二次構造である、タンパク質のベータヘアピン二次構造を模倣する、中間サイズの環状ペプチド様分子（ＭＷ  １−２ｋＤａ）である。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域を変えることにより、ＦａｂがサイレントＩｇＧ１形態に変換される。例えば、表１における抗体ＭＯＲ０８１６８、ＭＯＲ０８５４５、ＭＯＲ０６７０６、ＭＯＲ０６４７５、ＭＯＲ０８１９３およびＭＯＲ０８４７３は、アミノ酸配列：
ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号２０９）を付加すること、および、軽鎖がラムダである場合：ＣＳで、あるいは軽鎖がカッパである場合：Ｃで軽鎖を置換することにより、ＩｇＧ１形態に変換されうる。本明細書で用いる場合、「サイレントＩｇＧ１」とは、Ｆｃを介するエフェクター機能（例えばＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ）を低下させるようにアミノ酸配列が変化されたＩｇＧ１  Ｆｃ配列である。かかる抗体は、典型的にＦｃ受容体への結合性の低下を呈するだろう。いくつかの実施形態では、ＦａｂがＩｇＧ２形態に変換される。例えば、表１における抗体ＭＯＲ０８１６８、ＭＯＲ０８５４５、ＭＯＲ０６７０６、ＭＯＲ０６４７５、ＭＯＲ０８１９３およびＭＯＲ０８４７３は、定常配列をＩｇＧ２の重鎖に関する定常配列：ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号２１０）で置換することにより、ＩｇＧ２形態に変換されうる。
【０１９３】
ヒトまたはヒト化抗体
本発明は、ＬＲＰ６（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＬＲＰ６）に特異的に結合する完全ヒト抗体を提供する。キメラ抗体またはヒト化抗体と比較して、本発明のヒトＬＲＰ６抗体は、ヒト対象に投与した時、さらに低下した抗原性を有する。
【０１９４】
ヒトＬＲＰ６抗体は、当該技術分野で知られている方法を用いて生成できる。例えば、非ヒト抗体を操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ヒト抗体に変換するために用いられるヒト化（ｈｕｍａｎｅｅｒｉｎｇ）技術。米国特許出願公開番号第２００５０００８６２５号は、非ヒト抗体のものに対して同じ結合特性を維持しあるいはより良い結合特性を提供しながら、抗体中のヒト可変領域で非ヒト抗体可変領域を置換するためのインビボでの方法について記載している。この方法は、完全ヒト抗体による非ヒト参照抗体の可変領域のエピトープガイド置換（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｇｕｉｄｅｄ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）に依存する。得られるヒト抗体は、一般に、参照非ヒト抗体と構造的に関連しないが、参照抗体と同じ抗原上の同じエピトープと結合する。簡潔には、試験抗体と抗原の結合に応答するレポーター系の存在下で、限定量の抗原との結合について、「コンペティター」と参照抗体（試験抗体）の多様なハイブリッドのライブラリーとの間の細胞における競合を設定することによって、連続エピトープガイド相補性置換（ｓｅｒｉａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｇｕｉｄｅｄ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）アプローチが可能となる。該コンペティターは、一本鎖Ｆｖ断片などの、参照抗体またはその誘導体でありうる。コンペティターはまた、参照抗体と同じエピトープに結合する抗原の天然または人工リガンドであってもよい。コンペティターに唯一要求されることは、それが参照抗体と同じエピトープと結合し、抗原結合について参照配列と競合することである。試験抗体は、非ヒト参照抗体と共通する１つの抗原結合Ｖ領域およびヒト抗体のレパートリーライブラリーのような多様な供給源からランダムに選択された他のＶ領域を有する。参照抗体と共通のＶ領域は、抗原上の同じエピトープに同じ配向で試験抗体を配置するガイドとして作用し、したがって選択は参照抗体に対して最も高い抗原結合忠実度に偏向している。
【０１９５】
多様なレポーターシステムを用いて、試験抗体と抗原間の所望の相互作用を検出できる。例えば、相補レポーター断片は、抗原および試験抗体とそれぞれ連結して、試験抗体が抗原に結合する場合にのみ、断片相補性によるレポーター活性化が生じる。試験抗体−および抗原−レポーター断片融合体がコンペティターと共に発現される場合、レポーター活性化は、抗原に対する試験抗体の親和性と比例する、コンペティターと競合する試験抗体の能力に依存することとなる。他の用いられるレポーターシステムは、米国特許出願番号第１０／２０８，７３０号（公開番号第２００３０１９８９７１号）に開示される再アクチベーターの自己阻害レポーター再活性化システム（ＲＡＩＲ）、あるいは米国特許出願番号第１０／０７６，８４５号（公開番号第２００３０１５７５７９号）に開示される競合活性化を含む。
【０１９６】
連続エピトープガイド相補性置換システムにより選択を行い、コンペティター、抗原およびレポーター成分とともに試験抗体を単独で発現する細胞を同定する。これらの細胞において、各試験抗体は、限定量の抗原との結合について、コンペティターと一対一で競合する。レポーターの活性は、試験抗体と結合する抗原の量に比例し、したがって抗原に対する試験抗体の親和性および試験抗体の安定性に比例する。試験抗体は、試験抗体として発現した場合の参照抗体の活性と比較したその活性に基づいてまず選択される。１回目の選択の結果は、「ハイブリッド」抗体のセットであり、これはそれぞれ、参照抗体由来の同じ非ヒトＶ領域およびライブラリー由来のヒトＶ領域を含み、そして参照抗体と同じ抗原上のエピトープに結合する。１回目で選択した一以上のハイブリッド抗体は、参照抗体のものと同等またはそれ以上の抗原に対する親和性を有する。
【０１９７】
第２のＶ領域置換工程において、第１段階で選択したヒトＶ領域は、同種ヒトＶ領域の多様なライブラリーでの残留非ヒト参照抗体Ｖ領域のヒト置換の選択のためのガイドとして用いられる。１回目で選択したハイブリッド抗体は、２回目の選択のためのコンペティターとして用いてもよい。２回目の選択の結果は、参照抗体とは構造的に異なるが、同じ抗原への結合に関して参照抗体と競合する、完全ヒト抗体のセットである。選択したヒト抗体のいくつかは、参照抗体と同じ抗原上の同じエピトープに結合する。これらの選択したヒト抗体のうち、一以上が参照抗体のものと同等またはそれ以上の親和性で同じエピトープと結合する。
【０１９８】
上記のマウスまたはキメラＬＲＰ６抗体の１つを参照抗体として用いて、この方法は、同じ結合特異性および同じまたはより良い結合親和性を有する、ヒトＬＲＰ６に結合するヒト抗体を生成するために容易に使用できる。加えて、かかるヒトＬＲＰ６抗体はまた、通常ヒト抗体を製造している企業、例えばＫａｌｏＢｉｏｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から商業的に入手可能である。
【０１９９】
ラクダ抗体
ラマ種（Ｌａｍａ  ｐａｃｃｏｓ、Ｌａｍａ  ｇｌａｍａおよびＬａｍａ  ｖｉｃｕｇｎａ）などの新世界メンバーを含む、ラクダおよびヒトコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｂａｃｔｒｉａｎｕｓおよびＣａｌｅｌｕｓ  ｄｒｏｍａｄｅｒｉｕｓ）ファミリーのメンバーから得た抗体タンパク質は、サイズ、構造の複雑性およびヒト対象に対する抗原性について、特徴付けられている。天然に見出されるほ乳類のこのファミリー由来の特定のＩｇＧ抗体は軽鎖を欠き、それゆえ、他の動物由来の抗体における２つの重鎖および２つの軽鎖を有する典型的な４鎖の四次構造とは構造的に異なる。国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４号（１９９４年３月３日公開の国際公開第９４／０４６７８号）を参照されたい。
【０２００】
ＶＨＨと同定される小さな１個の可変ドメインであるラクダ抗体の領域を遺伝子操作によって入手して、標的に高い親和性を有し、「ラクダナノ抗体」として知られる低分子量抗体由来タンパク質を得ることができる。１９９８年６月２日公開の米国特許第５，７５９，８０８号を参照されたい：Ｓｔｉｊｌｅｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：１２５６−１２６１；Ｄｕｍｏｕｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  ４２４：７８３−７８８；Ｐｌｅｓｃｈｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  １４：４４０−４４８；Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８９：４５６−６２；およびＬａｕｗｅｒｅｙｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）ＥＭＢＯ  Ｊ  １７：３５１２−３５２０も参照されたい。ラクダ抗体および抗体断片の操作されたライブラリーは、例えばＡｂｌｙｎｘ，Ｇｈｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍから商業的に入手可能である。非ヒト起源の他の抗体として、ラクダ抗体のアミノ酸配列を組換え的に変化させて、ヒト配列により似た配列を得てもよい、すなわち、ナノ抗体を「ヒト化」してよい。したがって、ヒトに対するラクダ抗体の天然の低い抗原性をさらに低下させうる。
【０２０１】
ラクダナノ抗体はヒトＩｇＧ分子の約１０分の１の分子量を有し、該タンパク質はわずか数ナノメートルの物理的直径を有する。小さなサイズの一つの帰結は、より大きな抗体タンパク質には機能的に不可視の抗原部位に結合するというラクダ抗体の能力であり、すなわちラクダナノ抗体は、従来の免疫学的技術を用いると隠される抗原を検出する試薬として、そして可能性のある治療薬物として、有用である。したがって、小さなサイズのさらに別の帰結は、ラクダナノ抗体、標的タンパク質の溝または小さな割れ目の特定の部位に結合することの結果として、阻害でき、したがって伝統的な抗体のものよりも伝統的な低分子量薬物の機能により似た能力を提供できることである。
【０２０２】
低分子量およびコンパクトなサイズは、さらに、極めて熱安定であり、極端なｐＨおよびタンパク分解に安定であり、かつ低い抗原性をラクダナノ抗体にもたらす。別の帰結は、ラクダナノ抗体は循環系から組織に容易に移動することおよび血液脳関門を通過して神経組織に作用する障害を処置しうることである。ナノ抗体はさらに、薬物の血液脳関門通過を促進しうる。２００４年８月１９日公開の米国特許番号第２００４０１６１７３８号を参照されたい。ヒトへの低抗原性と組み合わさったこれらの特徴は、大きな治療的可能性を示す。さらに、これらの分子は、大腸菌などの原核生物において十分に発現され、バクテリオファージで融合タンパク質として発現され、かつ機能的である。
【０２０３】
したがって、本発明の特徴は、ＬＲＰ６に対する高い親和性を有するラクダ抗体またはナノ抗体である。本明細書における特定の実施形態では、ラクダ抗体またはナノ抗体はラクダ科動物において天然に生産され、すなわち他の抗体について本明細書に記載の技術を用いて、ＬＲＰ６またはそのペプチド断片でラクダを免疫して産生される。あるいは、ＬＲＰ６ラクダナノ抗体が操作される、すなわち例えば、本明細書の実施例に記載の通り、標的としてＬＲＰ６を用いるパニング手法を用いて、適切に変異誘発したラクダナノ抗体タンパク質を提示する、例えばファージディスプレイライブラリーから選択して産生される。操作されたナノ抗体は、４５分から２週間の受容対象における半減期を有するように、さらに遺伝子工学操作によりカスタマイズしてもよい。特定の実施形態では、ラクダ抗体またはナノ抗体は、例えば国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４号に記載の通り、本発明のヒト抗体の重鎖または軽鎖のＣＤＲ配列を、ナノ抗体またはシングルドメイン抗体フレームワーク配列内に移植することにより、獲得される。
【０２０４】
多価抗体
本発明は、一以上の標的受容体上の２つの異なる結合部位に対する、少なくとも２つの受容体結合ドメインを含む多価抗体（例えば、二パラトープ（ｂｉｐａｒａｔｏｐｉｃ）、二重特異性の抗体）を特徴づける。１つの抗体内での二以上の結合特異性の結合により、臨床的利点が提供される（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １５：１５９−１６３；Ａｌｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４５４：９０−９４；Ｚｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １３：３６１−３６７；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）ＪＢＣ  ２７９：２８５６−２８６５；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）ＪＢＣ  ２８０：１９６６５−１９６７２；Ｍａｒｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ  ２６：６４９−６５８；Ｍａｒｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ  Ｄｅｖｅｌｏｐ  ９：１８４−１９３；Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｊ  Ｉｍｍｕｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２１８：６５−７４；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １１：１２９０−１２９７；Ｄｉｍａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｊ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ３９３：６７２−６９２；およびＭｉｃｈａｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）ｍＡｂｓ  １：１２８−１４１）。
【０２０５】
本発明は、多価抗体（例えば、単一のＬＲＰ６二パラトープあるいは二重特異性の抗体）が、プロペラ１（例えばＷｎｔ１）およびプロペラ３（例えばＷｎｔ３）リガンドを介するシグナル伝達の両方を阻害する能力を有する、という発見に基づく。またさらに、予想外に、多価抗体（例えば、単一のＬＲＰ６二パラトープあるいは二重特異性の抗体）はＷｎｔシグナルの著しい増強作用（ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を全く提示しない。多価抗体は異なるＬＲＰ６  βプロペラ領域に結合する。プロペラ１抗体はβプロペラ１ドメインに結合し、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ９、Ｗｎｔ１０Ａ、Ｗｎｔ１０Ｂなどのプロペラ１依存性Ｗｎｔを阻止し、Ｗｎｔ１シグナル伝達経路を阻害する。プロペラ３抗体はβプロペラ３ドメインに結合し、Ｗｎｔ３ａおよびＷｎｔ３などのプロペラ３依存性Ｗｎｔを阻止し、Ｗｎｔ３シグナル伝達経路を阻害する。ＬＲＰ６抗体はプロペラ１およびプロペラ３リガンドを２つの分離したクラスに区別し、ＬＲＰ６標的受容体の異なるエピトープに結合する。ＬＲＰ６抗体の断片（例えばＦａｂ）の、全長ＩｇＧ抗体への変換は、Ｗｎｔ１またはＷｎｔ３リガンドなどの別のタンパク質の存在下で、Ｗｎｔシグナルを増強（強化）させる抗体をもたらす。
【０２０６】
多価抗体は、従来の抗体を超える利点、例えば、標的のレパートリーの拡大、新たな結合特異性を有すること、増大した有効性、およびシグナル増強が全く無いこと、を提供する。単一のＬＲＰ６多価抗体は、同じ細胞の単一のＬＲＰ６標的受容体上の多重のプロペラ領域に結合することができ、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害することができる。一実施形態では、多価抗体は、プロペラ１、プロペラ２、プロペラ３およびプロペラ４からなる群から選択されるβプロペラ領域の任意の組合せに結合する。一実施形態では、多価抗体は、ＬＲＰ６のプロペラ１およびプロペラ３ドメインに結合する。それゆえ、単一のＬＲＰ６多価抗体は、多重のβプロペラ領域に結合し、各ドメインにより介されるＷｎｔシグナル伝達を阻害することにより、作用の増大した有効性を有する。例えば、単一のＬＲＰ６多価抗体は、プロペラ１およびプロペラ３の両方に結合することにより、それぞれ、プロペラ１およびプロペラ３に介されるＷｎｔシグナル伝達の両方を阻害する。作用の増大した有効性は、ＬＲＰ６多価抗体の増大した結合力あるいはより良好な結合に起因しうる。
【０２０７】
一実施形態では、多価抗体は、ｓｃＦｖをＩｇＧ抗体に連結することにより産生される。ｓｃＦｖを作製するために用いられるＶＨおよびＶＬドメインは、同一または異なる抗体に由来しうる。ｓｃＦｖは少なくとも１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む。
【０２０８】
ＩｇＧ抗体のＦｃ領域およびｓｃＦｖ断片は、多くの異なる配向で共に連結されてもよい。一実施形態では、ｓｃＦｖはＦｃ領域のＣ末端に連結される。他の実施形態では、ｓｃＦｖはＦｃ領域のＮ末端に連結される。他の実施形態では、ｓｃＦｖ（複数）はＦｃ領域のＮ末端およびＣ末端の両方に連結される。別の実施形態では、ｓｃＦｖは抗体の軽鎖に連結されうる。本発明の多価抗体は、標的受容体の多重の結合部位に同時に結合することができる。本発明の多価抗体の受容体結合ドメインは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７または８以上の結合部位に結合することができる。各受容体結合ドメインは、同一結合部位に対して特異的でありうる。本発明の多価抗体は、同一の標的受容体上の異なるエピトープ、例えばＬＲＰ６のβプロペラ１ドメインまたはβプロペラ３ドメイン、に対して特異的である、一以上の受容体結合ドメインを含む。あるいは、本発明の多価抗体は、異なる標的受容体、例えば、ＬＲＰ６、ならびにＥｒｂ、ｃｍｅｔ、ＩＧＦＲ１、ＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄおよびＮｏｔｃｈ受容体などのＬＲＰ６ではない受容体上のエピトープに対して特異的である、一以上の受容体結合ドメインを含む。
【０２０９】
本発明の多価抗体内の各受容体結合ドメインはまた、従来の抗体と比較して抗原に対する異なる（すなわち、より高いあるいはより低い）親和性を有することができる。
【０２１０】
一実施形態では、本発明の多価抗体は、ＬＲＰ６標的受容体上の第一のエピトープに対する少なくとも一つの受容体結合ドメイン、および同一のＬＲＰ６標的受容体上の第二のエピトープに対する第二の受容体結合ドメインを含む、二パラトープな抗体である。
【０２１１】
本発明の多価抗体は、ある抗体の少なくとも１つのＣＤＲ、ある抗体の少なくとも２つのＣＤＲ、ある抗体の少なくとも３つのＣＤＲ、ある抗体の少なくとも４つのＣＤＲ、ある抗体の少なくとも５つのＣＤＲ、またはある抗体の少なくとも６つのＣＤＲを含む。本発明の多価抗体は、ある抗体の少なくとも１つのＶＨドメイン、ある抗体の少なくとも１つのＶＬドメイン、またはある抗体の少なくとも１つのＶＨドメインおよび１つのＶＬドメインを含む。ｓｃＦｖ分子は、ＶＨ−リンカー−ＶＬ配向またはＶＬ−リンカー−ＶＨ配向で構築できる。
【０２１２】
本発明のｓｃＦｖ分子またはそれらを含む融合タンパク質の安定性は、従来の対照のｓｃＦｖ分子または全長抗体の生物物理学的特性（例えば、熱安定性）を参照して評価されうる。一実施形態では、本発明の多価抗体は、対照の結合分子（例えば、従来のｓｃＦｖ分子）よりも、セ氏約０．１、約０．２５、約０．５、約０．７５、約１、約１．２５、約１．５、約１．７５、約２、約２．５、約約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、約１０度、約１１度、約１２度、約１３度、約１４度、または約１５度大きい熱安定性を有する。
【０２１３】
ｓｃＦｖ分子は、最適化された長さおよび／またはアミノ酸組成を有するｓｃＦｖリンカーを含む。本発明の好ましいｓｃＦｖリンカーは、従来の抗体に比べて少なくとも約２℃または３℃、本発明の多価抗体の熱安定性を改善する。一実施形態では、本発明の多価抗体は、従来の抗体に比べて１℃改善された熱安定性を有する。別の実施形態では、本発明の多価抗体は、従来の抗体に比べて２℃改善された熱安定性を有する。別の実施形態では、本発明の多価抗体は、従来の抗体に比べて４、５、６、７、８、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５℃改善された熱安定性を有する。例えば、本発明のｓｃＦｖ分子と従来技術を用いて作製されたｓｃＦｖ分子の間、あるいは、ｓｃＦｖ分子とｓｃＦｖ  ＶＨおよびＶＬが由来した抗体のＦａｂ断片の間で、比較がなされうる。熱安定性は当該技術分野で知られている方法を用いて測定できる。例えば、一実施形態では、Ｔｍが測定されうる。Ｔｍを測定するための方法およびタンパク質安定性を決定する他の方法は、以下に詳細に記載される。
【０２１４】
一実施形態では、該ｓｃＦｖリンカーは、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３からなる、または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４配列を含む。他の例示的なリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６を含む、または、からなる。本発明のｓｃＦｖリンカーは、長さを変化させることができる。一実施形態では、本発明のｓｃＦｖリンカーは、長さにおいて約５から約５０アミノ酸である。別の実施形態では、本発明のｓｃＦｖリンカーは、長さにおいて約１０から約４０アミノ酸である。別の実施形態では、本発明のｓｃＦｖリンカーは、長さにおいて約１５から約３０アミノ酸である。別の実施形態では、本発明のｓｃＦｖリンカーは、長さにおいて約１５から約２０アミノ酸である。リンカー長におけるバリエーションは活性を維持または増強することができ、活性試験において優れた有効性を生じさせる。ｓｃＦｖリンカーは、当該技術分野で知られている技術を用いてポリペプチド配列内に導入できる。例えば、ＰＣＲ突然変異誘発が用いられうる。修飾はＤＮＡ配列解析により確認できる。プラスミドＤＮＡを用いて、産生されるポリペプチドの安定な産生のために宿主細胞を形質転換させることができる。
【０２１５】
一実施形態では、本発明のｓｃＦｖ分子は、ＶＨドメインとＶＬドメインの間に挿入された（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４のアミノ酸配列を有し、該ＶＨおよび該ＶＬドメインはジスルフィド結合により連結されるものである、ｓｃＦｖリンカーを含む。
【０２１６】
本発明のｓｃＦｖ分子はさらに、ＶＬドメインにおけるアミノ酸をＶＨドメインにおけるアミノ酸と連結する、少なくとも１つのジスルフィド結合を含む。ジスルフィド結合を提供するために、システイン残基が必要である。ジスルフィド結合は、例えば、ＶＬのＦＲ４とＶＨのＦＲ２を連結するため、またはＶＬのＦＲ２とＶＨのＦＲ４を連結するために、本発明のｓｃＦｖ分子に含まれうる。ジスルフィド結合するための例示的な位置には：Ｋａｂａｔの番号付けで、ＶＨの４３、４４、４５、４６、４７、１０３、１０４、１０５および１０６、ならびにＶＬの４２、４３、４４、４５、４６、９８、９９、１００および１０１が挙げられる。ＶＨおよびＶＬドメインをコードする遺伝子の修飾は、当該技術分野で知られている技術、例えば部位特異的突然変異誘発、を用いて実施されうる。
【０２１７】
ｓｃＦｖにおける変異は、ｓｃＦｖの安定性を変化させ、ｓｃＦｖにおいて変異の無い多価抗体と比べて、変異ｓｃＦｖを含む抗体の全体の安定性を改善する。ｓｃＦｖへの変異は、実施例で示されるように生成できる。変異ｓｃＦｖの安定性は、実施例で示される通り、Ｔｍ、変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）温度、凝集温度などの測定を用いて、変異無しのｓｃＦｖに対して比較される。変異ｓｃＦｖの結合能力はＥＬＩＳＡなどのアッセイを用いて決定できる。
【０２１８】
一実施形態では、本発明の多価抗体は、変異ｓｃＦｖが多価抗体に改善された安定性を授けるように、ｓｃＦｖにおいて少なくとも１つの変異を含む。別の実施形態では、本発明の多価抗体は、変異ｓｃＦｖが多価抗体に改善された安定性を授けるように、ｓｃＦｖにおいて少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の変異を含む。別の実施形態では、本発明の多価抗体は、変異ｓｃＦｖが多価抗体に改善された安定性を授けるように、ｓｃＦｖにおいて変異の組み合わせを含む。
【０２１９】
本発明の二パラトープな抗体などの多価抗体が本明細書において開示される。これらの二パラトープな抗体はＬＲＰ６の一以上のエピトープに結合する。ｓｃＦｖは、ＧｌｙＳｅｒリンカーなどのリンカーを用いて、例えばヒンジ領域でＦｃ領域に連結される。一実施形態では、本発明は、ＦｃのＣＨ３領域に並べられた（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）２リンカーを用いて、ＬＲＰ６のβプロペラ３ドメインに結合するｓｃＦＶに連結された、ＬＲＰ６のβプロペラ１ドメインに結合する、抗体または抗原結合断片に関する。一実施形態では、ＬＲＰ６  βプロペラ１ドメインに結合する全長ＩｇＧ抗体を用いて、ＬＲＰ６  βプロペラ３ドメインに結合する抗体のｓｃＦｖ断片を結合させる（ａｔｔａｃｈ）ことができる。
【０２２０】
本発明の二パラトープな抗体などの多価抗体は、表２に示される重鎖および軽鎖配列の任意の組合せを用いて構築できる。
【表２】
2020063262.tif 000026
【０２２１】
したがって、本発明はプロペラ１ＩｇＧ抗体およびプロペラ３ｓｃＦｖを用いて構築される二パラトープな抗体に関する。一実施形態では、二パラトープな抗体は、配列番号１６６、１７１、１７３、１７５、１９５、２０１および２０７からなる群から選択される任意の重鎖配列；ならびに配列番号１７０、１９３、１９９および２０５からなる群から選択される任意の軽鎖配列を用いて構築される。一実施形態では、二パラトープな抗体は、配列番号１６６／１７０、１７１／１７０、１７３／１７０、１７５／１７０、２０１／１９９、２０７／２０５および１９５／１９３からなる群から選択される重鎖および軽鎖配列を含む。
【０２２２】
一実施形態では、二パラトープな抗体は、重鎖配列番号１６６および軽鎖配列番号１７０を含む。一実施形態では、二パラトープな抗体は、重鎖配列番号１７１および軽鎖配列番号１７０を含む。一実施形態では、二パラトープな抗体は、重鎖配列番号１７３および軽鎖配列番号１７０を含む。一実施形態では、二パラトープな抗体は、重鎖配列番号１７５および軽鎖配列番号１７０を含む。一実施形態では、二パラトープな抗体は、重鎖配列番号２０１および軽鎖配列番号１９９を含む。一実施形態では、二パラトープな抗体は、重鎖配列番号２０７および軽鎖配列番号１０５を含む。一実施形態では、二パラトープな抗体は、重鎖配列番号１９５および軽鎖配列番号１９３を含む。
【０２２３】
別の実施形態では、二パラトープな抗体は、ｓｃＦｖがＩｇＧの軽鎖に結合されることによる、「代替の二パラトープな抗体」である。一実施形態では、二パラトープな抗体は、重鎖配列番号１７７および軽鎖配列番号１８１を含む。
【０２２４】
別の実施形態では、ＬＲＰ６  βプロペラ３ドメインに結合する全長ＩｇＧ抗体を用いて、ＬＲＰ６  βプロペラ１ドメインに結合する抗体のｓｃＦｖ断片を結合し、「逆二パラトープ」といわれる。一実施形態では、本発明の逆二パラトープな抗体は、プロペラ３ＩｇＧ抗体およびプロペラ１ｓｃＦｖを用いて構築される。一実施形態では、逆二パラトープな抗体は、配列番号１８７および１８９からなる群から選択される任意の重鎖配列；ならびに配列番号１８５の軽鎖配列を用いて、構築される。一実施形態では、逆二パラトープな抗体は、重鎖配列番号１８７および軽鎖配列番号１８５を含む。一実施形態では、逆二パラトープな抗体は、重鎖配列番号１８９および軽鎖配列番号１８５を含む。
【０２２５】
本発明はまた、それぞれ、配列番号１、２１および４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列、配列番号２、２２および４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列、配列番号３、２３および４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域；配列番号４、２４および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列、配列番号５、２５および５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列、配列番号６、２６および５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を有し；それぞれ、配列番号６９、９３および１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列、配列番号７０、９４および１１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列、配列番号７１、９５および１１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域；配列番号７２、９６および１１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列、配列番号７３、９７および１１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列、配列番号７４、９８および１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域と結合された二パラトープな抗体であって；ＬＲＰ６（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＬＲＰ６）に結合し、Ｗｎｔレポーター遺伝子アッセイまたは本明細書に記載のＷｎｔ指向性シグナル伝達（例えば、ＬＲＰ６のリン酸化反応、β−カテニンの安定化および核移行ならびに細胞増殖／生存）の任意の他の測定において測定できる、ＬＲＰ６生物活性を阻害するものである抗体に関する。
【０２２６】
本発明の多価抗体で用いることができる抗体は、ヒト、マウス、キメラ、およびヒト化モノクローナル抗体である。
【０２２７】
本発明の多価抗体は、当該技術分野で知られている方法を用いて、構成要素である受容体結合ドメインをコンジュゲートすることにより調製されうる。例えば、多価抗体の各受容体結合ドメインは別々に生成でき、次いで互いにコンジュゲートできる。受容体結合ドメインがタンパク質あるいはペプチドである場合、様々なカップリングまたは架橋剤が共有結合コンジュゲーションのために使用できる。架橋剤の例には、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロへキサン−ｌ−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １６０：１６８６；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：８６４８を参照）。他の方法は、Ｐａｕｌｕｓ（１９８５）Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓ．  Ｍｉｔｔ．  Ｎｏ．  ７８：１１８−１３２；Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１−８３およびＧｌｅｎｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３９：２３６７−２３７５に記載のものを含む。コンジュゲート剤はＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、両者ともＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から入手可能である。
【０２２８】
受容体結合ドメインが抗体である場合、それは２個の重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によりコンジュゲートされうる。特定の実施形態では、コンジュゲーションより前に、奇数、例えば１個のスルフヒドリル残基を含有するようにヒンジ領域が修飾される。
【０２２９】
あるいは、受容体結合ドメインは同じベクター内でコードされ、同じ宿主細胞で発現されそして組み立てられてもよい。この方法は、多価抗体が、ｍＡｂｘｍＡｂ、ｍＡｂｘＦａｂ、ＦａｂｘＦ（ａｂ’）２またはリガンドｘＦａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。多価抗体を調製するための方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号；米国特許第５，４５５，０３０号；米国特許第４，８８１，１７５号；米国特許第５，１３２，４０５号；米国特許第５，０９１，５１３号；米国特許第５，４７６，７８６号；米国特許第５，０１３，６５３号；米国特許第５，２５８，４９８号；および米国特許第５，４８２，８５８号に記載されている。
【０２３０】
多価抗体とそれらの標的との結合は、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ解析、バイオアッセイ（例えば、増殖阻害）またはウェスタンブロットアッセイにより確認できる。これらのアッセイはそれぞれ、一般に、対象とする複合体に特異的な標識付き試薬（例えば、抗体）を用いることにより、特定の対象とするタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。
【０２３１】
別の態様では、本発明は、ＬＲＰ６に結合する本発明の抗体の少なくとも２つの異なる受容体結合ドメインを含む多価抗体を提供する。該受容体結合ドメインは、タンパク質融合または共有もしくは非共有結合によって一体に連結されうる。例えば、本発明の抗体を、本発明の抗体の定常領域、例えばＦｃまたはヒンジ領域に結合する抗体と架橋することにより、四価抗体が獲得できる。
【０２３２】
多価抗体の配向
本発明は、例えば、抗体可変領域、抗体断片（例えば、Ｆａｂ）、ｓｃＦｖ、一本鎖二重特異性抗体またはＩｇＧ抗体を含む、多重の受容体結合ドメイン（「ＲＢＤ」）を有する多価抗体に関する。ＲＢＤの例は、Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片；Ｆ（ａｂ）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の一本のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなる、ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；ならびに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）の構成要素である。ＲＢＤはまた、シングルドメイン抗体、マキシボディ、ユニボディ、ミニボディ、二重特異性抗体、三重特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖの構成要素である（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：１１２６−１１３６を参照）。
【０２３３】
本発明の多価抗体は、生じた多価抗体が機能的活性を保持する（例えば、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する）限り、少なくとも１つの受容体結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、一本鎖二重特異性抗体、抗体可変領域）を用いて、任意の配向で生成される。任意の数の受容体結合ドメインが、生じた多価抗体が機能的活性を保持する（例えば、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する）限り、ＦｃのＣ末端および／またはＮ末端に付加されうることが理解されるべきである。ある実施形態では、１、２、３以上の受容体結合ドメインがＦｃ領域のＣ末端に連結される。他の実施形態では、１、２、３以上の受容体結合ドメインがＦｃ領域のＮ末端に連結される。他の実施形態では、１、２、３以上の受容体結合ドメインがＦｃ領域のＮ末端およびＣ末端の両方に連結される。例えば、本発明の多価抗体は、Ｆｃ領域のＣ末端および／またはＮ末端に連結される同じ種類の１より多くの受容体結合ドメイン、例えばｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＩｇＧを含みうる。あるいは、本発明の多価抗体は、Ｆｃ領域のＣ末端および／またはＮ末端に連結される異なる種類の１より多くの受容体結合ドメイン、例えばｓｃＦｖ−二重特異性抗体−Ｆｃ−ＩｇＧを含みうる。別の実施形態では、１、２、３より多くの受容体結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）が、ＩｇＧのＣ末端に連結される。別の実施形態では、１、２、３より多くの受容体結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）が、ＩｇＧのＮ末端に連結される。別の実施形態では、１、２、３より多くの受容体結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）が、ＩｇＧのＮ末端およびＣ末端に連結される。
【０２３４】
他の実施形態では、本発明の多価抗体は、Ｃ末端に連結される異なる種類の１より多くの受容体結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖ−二重特異性抗体−Ｆｃ−ＩｇＧ；二重特異性抗体−ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＩｇＧ；ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ−二重特異性抗体−Ｆｃ−ＩｇＧ；ｓｃＦｖ−二重特異性抗体−ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＩｇＧ；二重特異性抗体−ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＩｇＧ；抗体可変領域−ｓｃＦｖ−二重特異性抗体−Ｆｃ−ＩｇＧ；などを用いて生成される。任意の数の受容体結合ドメインの置換（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）を有する多価抗体が生成されうる。これらの多価抗体は、ここに記載される方法およびアッセイを用いて、機能性について試験できる。
【０２３５】
他の実施形態では、本発明の多価抗体は、Ｎ末端に連結される異なる種類の１より多くの受容体結合ドメイン、例えば、ＩｇＧ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ−二重特異性抗体；ＩｇＧ−Ｆｃ−二重特異性抗体−ｓｃＦｖ；ＩｇＧ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ−二重特異性抗体；ＩｇＧ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ−二重特異性抗体−ｓｃＦｖ；ＩｇＧ−Ｆｃ−二重特異性抗体−ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ；ＩｇＧ−Ｆｃ−抗体可変領域−ｓｃＦｖ−二重特異性抗体；などを用いて生成される。
【０２３６】
さらに他の実施形態では、本発明の多価抗体は、Ｆｃ領域のＣ末端およびＮ末端に連結される単一の受容体結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、一本鎖二重特異性抗体、抗体可変領域）を用いて生成される。別の実施形態では、多重の受容体結合ドメインは、例えば、Ｆｃ領域のＣ末端およびＮ末端に連結される少なくとも１、２、３、４、５、５、７、８より多くの受容体結合ドメインＦｃ領域のＮ末端に連結される。例えば、本発明の多価抗体は、Ｆｃ領域のＣ末端およびＮ末端に連結される１より多くのｓｃＦｖ、例えば、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ；−ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖなどを含むことができる。他の実施形態では、本発明の多価抗体は、Ｎ末端に連結される異なる種類の１より多くの受容体結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ−二重特異性抗体；ｓｃＦｖ−Ｆｃ−二重特異性抗体−ｓｃＦｖ；ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ−二重特異性抗体；ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ−二重特異性抗体−ｓｃＦｖ；ｓｃＦｖ−Ｆｃ−二重特異性抗体−ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ；ｓｃＦｖ−Ｆｃ−抗体可変領域−ｓｃＦｖ−二重特異性抗体；などを用いて生成される。任意の数の受容体結合ドメインの置換（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）を有する多価抗体が生成されうる。これらの多価抗体は、ここに記載される方法およびアッセイを用いて、機能性について試験できる。
【０２３７】
リンカーの長さ
リンカーの長さが、ｓｃＦｖの可変領域がどのようにして折りたたまれ、相互作用するかということに、大きな影響を及ぼすことが知られている。実際、短いリンカーが用いられる場合（例えば、５−１０アミノ酸の間；５−２０アミノ酸の間）、鎖内の折りたたみは妨げられ、鎖間の折りたたみは、機能的エピトープ結合部位を形成するために２つの可変領域を集めることを必要とする。リンカーの配向および大きさの例に関しては、出典明示により本明細書に組み込まれる、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９３  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９０：６４４４−６４４８、米国特許出願公開第２００５／０１００５４３号、同第２００５／０１７５６０６号、同第２００７／００１４７９４号、ならびにＰＣＴ国際公開第２００６／０２０２５８号および同第２００７／０２４７１５号を参照のこと。
【０２３８】
受容体結合ドメインが様々な長さのリンカー領域により離されてもよいことも理解される。受容体結合ドメインは、リンカー配列により、お互い、Ｃｋａｐｐａ／ｌａｍｂｄａ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３またはＦｃ領域全体から、離されうる。かかるリンカー配列は、アミノ酸の無作為な組合せ（ａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）または制限されたアミノ酸の組を含んでもよい。かかるリンカー配列は、可動性でも強固でもよい。
【０２３９】
本発明の多価抗体は、その受容体結合ドメイン、Ｃｋａｐｐａ／ｌａｍｂｄａドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインまたはＦｃ領域の一以上の間に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５以上のアミノ酸残基のリンカー配列を含む。リンカー配列は任意の天然に存在するアミノ酸から構成されてもよい。いくつかの実施形態では、アミノ酸グリシンおよびセリンはリンカー配列内のアミノ酸を含む。別の実施形態では、リンカー領域の配向はグリシンリピート（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎのセットを含み、ここにｎは１以上の正の整数である。
【０２４０】
一実施形態では、リンカーには（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３が挙げられるが、これらに限定されるものではない。別の実施形態では、より良好な溶解度のため、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー内にＧｌｕおよびＬｙｓ残基を散在させることができる。別の実施形態では、リンカーには（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）、（ＧｌｙＳｅｒ）または（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）の多重の繰り返しが挙げられる。別の実施形態では、リンカーには（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）＋（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）＋（ＧｌｙＳｅｒ）の組み合わせおよび倍数が挙げられる。別の実施形態では、ＳｅｒがＡｌａで交換されうる、例えば（Ｇｌｙ４Ａｌａ）または（Ｇｌｙ３Ａｌａ）。また別の実施形態では、リンカーはモチーフ（ＧｌｕＡｌａＡｌａＡｌａＬｙｓ）ｎを含み、ここにｎは１以上の正の整数である。
【０２４１】
ヒンジ領域
本発明の多価抗体は、抗体ヒンジ領域の全部または少なくとも一部分を含みうる。該ヒンジ領域またはその部分は、受容体結合ドメイン、ＣＨ１、Ｃｋａｐｐａ／ｌａｍｂｄａ、ＣＨ２またはＣＨ３に直接結合されてもよい。一実施形態では、ヒンジ領域またはその部分は、可変長リンカー領域を介して、受容体結合ドメイン、ＣＨ１、Ｃｋａｐｐａ／ｌａｍｂｄａ、ＣＨ２またはＣＨ３に結合されてもよい。
【０２４２】
本発明の多価抗体は、１、２、３、４、５、６以上のヒンジ領域またはそれらの部分を含むことができる。該ヒンジ領域またはそれらの部分は、同一あるいは異なりうる。一実施形態では、本発明の多価抗体は、ヒトＩｇＧ１分子由来のヒンジ領域またはその部分を含む。さらなる実施形態では、ヒンジ領域またはその部分は、天然に存在するシステイン残基を除去するため、天然に存在しないシステイン残基を導入するため、または天然に存在する残基を天然に存在しないシステイン残基で置換するために、操作されてもよい。いくつかの実施形態では、本発明の多価抗体は、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号２１１）またはＥＰＫＳＣ（配列番号２１２）を含む以下のアミノ酸配列を含む、少なくとも１つのヒンジ領域またはその部分を含有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒンジ領域またはその部分を操作して、少なくとも一つの天然に存在するシステイン残基を別のアミノ酸残基で置換してもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも一つの天然に存在するシステイン残基がセリンで置換される。
【０２４３】
部位特異的コンジュゲーションに有用な天然に存在しないシステイン残基は、本発明の多価抗体内に操作されうる。かかるアプローチ、組成物および方法は、あらゆる目的のために出典明示により本明細書に組み込まれる、２００８年１月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／０２２，０７３号、発明の名称「部位特異的コンジュゲーションのためのシステイン操作された抗体（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）」および２００５年９月２２日に出願された米国特許出願公開第２００７００９２９４０号に例示される。
【０２４４】
タンパク質安定性を評価するための方法
多価抗体の安定性を評価するために、マルチドメインタンパク質の最も安定性の悪いドメインの安定性を、本発明の方法および以下に記載のものを用いて予測した。
【０２４５】
かかる方法は、最も安定性の悪いドメインが最初に変性（ｕｎｆｏｌｄ）するか、協調的に変性するマルチドメインユニット（すなわち、単一の変性転移を示すマルチドメインタンパク質）の全体の安定性閾値を制限する場合の、多重の熱変性転移の決定を可能にさせる。最も安定性の悪いドメインは多くのさらなる方法で同定されうる。突然変異誘発を実行して、どのドメインが全体の安定性を制限するのか精査（ｐｒｏｂｅ）できる。さらに、マルチドメインタンパク質のプロテアーゼ耐性を、最も安定性の悪いドメインが、ＤＳＣまたは他の分光法を介して、本来変性されるだろうと知られている条件下で実行することができる（Ｆｏｎｔａｎａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｆｏｌｄ．  Ｄｅｓ．，２：Ｒ１７−２６；Ｄｉｍａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３９３：６７２−６９２）。一旦、最も安定性の悪いドメインが同定されれば、このドメイン（またはその部分）をコードする配列を、本発明の方法での試験配列として用いることができる。
【０２４６】
ａ）熱安定性
本発明の組成物の熱安定性は、当該技術分野で知られている多数の非限定的な生物物理学的または生化学的技術を用いて解析できる。特定の実施形態では、熱安定性は分析分光測定により評価される。
【０２４７】
例示的な分析分光測定方法は示差操走査型熱量測定（ＤＳＣ）である。ＤＳＣは、ほとんどのタンパク質またはタンパク質ドメインの変性に伴って起こる熱吸収（ｈｅａｔ  ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）に感受性である熱量計を用いる（例えばＳａｎｃｈｅｚ−Ｒｕｉｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７：１６４８−５２，１９８８を参照）。タンパク質の熱安定性を決定するために、タンパク質のサンプルを熱量計に挿入し、ＦａｂまたはＦｖが変性するまで温度を上昇させる。該タンパク質が変性する温度がタンパク質全体の安定性を示す。
【０２４８】
別の例示的な分析分光測定方法は円二色性（ＣＤ）分光測定である。ＣＤ分光測定は、組成物の光学活性を、温度上昇の関数として測定する。円二色性（ＣＤ）分光測定は、構造的非対称により上昇する左旋偏光−対−右旋偏光の吸収の差を測定する。無秩序なまたは変性された構造が、秩序立ったまたは折りたたまれた構造のものとは非常に異なるＣＤスペクトルを生じる。ＣＤスペクトルは温度上昇の変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）効果に対するタンパク質の感度を反映し、それゆえ、タンパク質の熱安定性を示す（ｖａｎ  Ｍｉｅｒｌｏ  ａｎｄ  Ｓｔｅｅｍｓｍａ，Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７９（３）：２８１−９８，２０００を参照）。
【０２４９】
熱安定性を測定するための別の例示的な分析分光測定方法は蛍光発光分光測定である（ｖａｎ  Ｍｉｅｒｌｏ  ａｎｄ  Ｓｔｅｅｍｓｍａ，ｓｕｐｒａを参照）。熱安定性を測定するためのさらに別の例示的な分析分光測定方法は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光測定（例えばｖａｎ  Ｍｉｅｒｌｏ  ａｎｄ  Ｓｔｅｅｍｓｍａ，ｓｕｐｒａを参照）。
【０２５０】
本発明の組成物の熱安定性は生化学的に測定できる。熱安定性を評価するための例示的な生化学的方法は、熱挑戦アッセイ（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ａｓｓａｙ）である。「熱挑戦アッセイ」において、本発明の組成物は一定期間、様々な温度上昇に供される。例えば、一実施形態では、試験ｓｃＦｖ分子またはｓｃＦｖ分子を含む分子は、例えば１−１．５時間、様々な温度上昇に供される。次いで、タンパク質の活性が関連する生化学的アッセイにより評価される。例えば、もしタンパク質が結合タンパク質（例えば、本発明のｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ含有ポリペプチド）であれば、該結合タンパク質の結合活性が、機能的あるいは定量的ＥＬＩＳＡにより決定されうる。
【０２５１】
かかるアッセイは、ハイ−スループット形式、ならびに大腸菌およびハイ−スループットスクリーニングを用いる、実施例で開示されるものにおいて実行されうる。ｓｃＦｖ変種（ｖａｒｉａｎｔ）のライブラリーは当該技術分野で知られている方法を用いて構築されうる。ｓｃＦｖ発現は誘導することができ、ｓｃＦｖは熱挑戦に付すことができる。挑戦された試験サンプルは、結合に関してアッセイすることができ、安定であるｓｃＦｖはスケールアップし、さらに特徴付けすることができる。
【０２５２】
熱安定性は、上記技術のいずれか（例えば分光分析技術）を用いて、本発明の組成物の融解温度（Ｔｍ）を測定することにより評価される。融解温度は、組成物の分子の５０％が折りたたまれた状態にある、熱転移曲線の中点における温度である（例えば、Ｄｉｍａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ３９３：６７２−６９２を参照）。一実施形態では、ｓｃＦｖのためのＴｍ値は、約４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、１００℃である。一実施形態では、ＩｇＧのためのＴｍ値は、約４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、１００℃である。一実施形態では、多価抗体のためのＴｍ値は、約４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、１００℃である。
【０２５３】
熱安定性はまた、分析熱量測定技術（例えば、ＤＳＣ）を用いて、本発明の組成物の比熱または熱容量（Ｃｐ）を測定することにより評価される。組成物の比熱は、１ｍｏｌの水の温度を１℃上昇させるために必要な（例えば、ｋｃａｌ／ｍｏｌで表した）エネルギーである。大きなＣｐは変性したまたは不活性なタンパク質組成物の顕著な特徴である。組成物の熱容量における変化（ΔＣｐ）は、その熱転移の前および後に組成物の比熱を決定することにより測定される。熱安定性はまた、変性のギブス自由エネルギー（ΔＧ）、変性のエンタルピー（ΔＨ）、または変性のエントロピー（ΔＳ）を含めた熱力学安定性の他のパラメーターを測定または決定することにより評価することができる。
【０２５４】
前記生化学的アッセイ（例えば熱挑戦アッセイ）の一以上を用いて、組成物の５０％がその活性（例えば結合活性）を保持する温度（すなわちＴｃ値）を決定する。
【０２５５】
さらに、ｓｃＦｖへの変異は、未変異のｓｃＦｖに比べてｓｃＦｖの熱安定性を変化させる。変異ｓｃＦｖが多価抗体に組み込まれる場合、該変異ｓｃＦｖは多価抗体全体に熱安定性を授ける。一実施形態では、ｓｃＦｖは、該ｓｃＦｖに熱安定性を授ける単一突然変異（ｓｉｎｇｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）を含む。別の実施形態では、ｓｃＦｖは、該ｓｃＦｖに熱安定性を授ける多重突然変異（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）を含む。一実施形態では、ｓｃＦｖにける多重突然変異は該ｓｃＦｖの熱安定性に相加効果がある。
【０２５６】
ｂ）％凝集
本発明の組成物の安定性は、その凝集傾向を測定することによって決定される。凝集は、非限定的な生化学的あるいは生物物理学的技術により測定できる。例えば、本発明の組成物の凝集は、クロマトグラフィー、例えばサイズ−排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて評価することができる。ＳＥＣはサイズに基づいて分子を分離する。カラムには、イオンおよび小さな分子をその内部に受け入れるが、大きなものは受け入れないポリマーゲルの半個体ビーズが充填される。タンパク質組成物がカラムの頂部にアプライされると、コンパクトな折りたたまれたタンパク質（すなわち非凝集タンパク質）は、大きなタンパク質凝集体が利用できるよりも大きな容量の溶媒を通って分布する。その結果、大きな凝集体はカラムを通ってより迅速に移動し、このようにして、混合物はその成分に分離でき、または分画することができる。各画分はそれがゲルから溶出されるにつれ、（例えば、光散乱によって）別々に定量することができる。したがって、本発明の組成物の％凝集は、画分の濃度を、ゲルにアプライされたタンパク質の全濃度と比較することにより、決定することができる。安定な組成物は実質的に単一の画分としてカラムから溶出され、溶出プロフィールまたはクロマトグラムにおいては実質的に単一のピークとして出現する。
【０２５７】
ｃ）結合親和性
本発明の組成物の安定性は、その標的結合親和性を決定することにより評価することができる。結合親和性を決定するための種々の方法が当該技術分野で知られている。結合親和性を決定するための例示的な方法は、表面プラズモン共鳴を使用する。表面プラズモン共鳴は、例えばＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ  ａｎｄ  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を用いる、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出による、リアルタイムの生物特異的相互作用の解析を可能とする、光学的現象である。さらなる説明に関しては、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｌｉｎ．  ５１：１９−２６；Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｉ（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：６２０−６２７；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．  ８：１２５−１３１；およびＪｏｈｎｎｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９８：２６８−２７７を参照のこと。
【０２５８】
延長された半減期を有する抗体
本発明は、インビボで延長された半減期を有する、ＬＲＰ６タンパク質の特異的に結合する抗体および多価抗体を提供する。多くの要因がインビボでのタンパク質の半減期に影響しうる。例えば、腎臓ろ過、肝臓における代謝、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）による分解および免疫原性応答（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（例えば、抗体によるタンパク質中和ならびにマクロファージおよび樹状細胞による取り込み）。多様な戦略を用いて本発明の抗体の半減期を延長することができる。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ｒｅＣＯＤＥ ＰＥＧ、抗体スキャフォールド、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合リガンドおよび糖質障壁との化学的結合；アルブミン、ＩｇＧ、ＦｃＲｎおよびトランスフェリンなどの血清タンパク質と結合するタンパク質との遺伝的融合；ナノ抗体、Ｆａｂ、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、アフィボディおよびアンチカリンなどの血清タンパク質と結合する他の結合部分とのカップリング（遺伝的または化学的）；ｒＰＥＧ、アルブミン、アルブミンのドメイン、アルブミン結合タンパク質およびＦｃとの遺伝的融合；またはナノ担体、遅延放出製剤または医薬デバイスへの導入による。
【０２５９】
インビボでの抗体の血清循環を延長するため、多機能リンカー有りまたは無しで、高分子量ＰＥＧなどの不活性ポリマー分子を本抗体に、抗体のＮもしくはＣ末端またはリシン残基のイプシロンアミノ基とＰＥＧの部位特異的コンジュゲーションにより結合してもよい。抗体をペグ化するため、本抗体は、典型的には、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と、一以上のＰＥＧ基が抗体またはそれらの断片に結合するような条件下で、反応させる。ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または同様の反応性水溶性ポリマー）を用いたアシル化反応またはアルキル化反応により実施できる。本明細書で用いる場合、用語「ポリエチレングリコール」は、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−もしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなどの、他のタンパク質を誘導体化するために用いられているあらゆる形態のＰＥＧを含む。特定の実施形態では、ペグ化される抗体は、非グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体である。生物学的活性の最小限の損失をもたらす直鎖または分枝鎖ポリマー誘導体化が用いられる。コンジュゲーションの程度は本抗体とＰＥＧ分子の適切なコンジュゲーションを確保するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析により密接にモニターできる。未反応のＰＥＧは、サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーにより抗体−ＰＥＧコンジュゲートから分離できる。ＰＥＧ誘導体化抗体は、当業者によく知られている方法を用いて、例えば本明細書に記載のイムノアッセイにより、結合活性およびインビボでの有効性を試験してもよい。タンパク質をペグ化する方法は、当該技術分野において知られており、本発明の抗体に適用できる。例えば、ＮｉｓｈｉｍｕｒａらによるＥＰ０１５４３１６およびＩｓｈｉｋａｗａらによるＥＰ０４０１３８４を参照されたい。
【０２６０】
他の修飾されたペグ化技術は、ｔＲＮ合成酵素およびｔＲＮＡを含む再構成系を介して生合成タンパク質に化学的に特定された側鎖を導入する、再構成化学的直交操作技術（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＲｅＣＯＤＥ  ＰＥＧ）を含む。この技術は、大腸菌、酵母および哺乳類細胞において３０個を超える新しいアミノ酸の取り込みを可能とする。ｔＲＮＡは非天然アミノ酸をアンバーコドンが位置する任意の位置で取り込み、アンバーを終止コドンから化学的に特定したアミノ酸の取り込みを伝達するものに変換する。
【０２６１】
組換えペグ化技術（ｒＰＥＧ）も血清半減期延長のために用いることができる。この技術は、既存の医薬タンパク質の末尾に３００〜６００アミノ酸の構造不定の（ｕｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ）タンパク質を遺伝的に融合することを含む。かかる構造不定のタンパク質鎖の見かけの分子量は、その実際の分子量よりも約１５倍大きいため、該タンパク質の血清半減期は大きく延長される。化学的コンジュゲーションおよび再精製を必要とする従来のＰＥＧ化と対照的に、製造工程がかなり単純化され、産物が均一である。
【０２６２】
ポリシアル化がもう一つの技術であり、これは天然ポリマーポリシアル酸（ＰＳＡ）を用いて活性時間を延長し、本発明の抗体などの治療ペプチドおよびタンパク質の安定性を改善する。ＰＳＡはシアル酸（糖）のポリマーである。タンパク質および治療ペプチド薬物送達に用いられる場合、ポリシアル酸は、コンジュゲーションにより保護的な微小環境を提供する。これは循環中の治療タンパク質の活性時間を延長し、免疫系により認識されるのを防ぐ。ＰＳＡポリマーは人体において天然に見出される。これはある種の細菌によって採用されており、それらの細胞壁を覆うために数百万年にわたって進化させてきた。これらの天然ポリシアル化細菌は、分子擬態のおかげで、体の防御システムの追跡を免れることができる。天然の究極のステルス技術であるＰＳＡは、かかる細菌から大量に、あらかじめ定められた物理的特徴で容易に産生できる。細菌のＰＳＡは、人体におけるＰＳＡと化学的に同一であるため、タンパク質と結合させても、完全に非免疫原性である。
【０２６３】
別の技術は抗体に連結したヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）誘導体の使用を含む。ＨＥＳはロウトウモロコシ（ｗａｘｙ  ｍａｉｚｅ）デンプン由来の修飾された天然ポリマーであり、体の酵素により代謝できる。ＨＥＳ溶液は通常、不充分な血液量を代替し、血液のレオロジー特性を改善するために投与される。抗体のＨＥＳ化は、分子の安定性の上昇により、ならびに腎クリアランスの低下によって循環半減期の延長を可能とし、増加した生物学的活性をもたらす。ＨＥＳの分子量などの様々なパラメーターを変化させることにより、広範なＨＥＳ抗体コンジュゲートを設計できる。
【０２６４】
インビボでの延長された半減期を有する抗体は、ＩｇＧ定常ドメインまたはそのＦｃＲｎ結合断片（好ましくはＦｃまたはヒンジＦｃドメイン断片）に、一以上のアミノ酸修飾（すなわち置換、挿入または欠失）を導入して生成してもよい。例えば国際公開第９８／２３２８９号；同第９７／３４６３１号；および米国特許第６，２７７，３７５号を参照されたい。
【０２６５】
さらに、インビボでより安定であるかまたはインビボでより延長された半減期を有する抗体または抗体フラグメントを作成するために、抗体をアルブミンとコンジュゲートさせてもよい。本技術は当該技術分野でよく知られており、例えば国際公開第９３／１５１９９号、同第９３／１５２００号および同第０１／７７１３７号；ならびに欧州特許４１３，６２２を参照されたい。
【０２６６】
抗体結合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）
本発明は、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）タンパク質またはポリペプチド（またはそれらの、好ましくは少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０または少なくとも１００アミノ酸の断片）に組換え技術によって融合された、または化学的に結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）され（共有および非共有の結合を含む）て融合タンパク質を生成するＬＲＰ６タンパク質に特異的に結合する抗体およびそれらの多価抗体を提供する。特に、本発明は、ここに記載される抗体の抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ＶＨドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ、ＶＬドメインまたはＶＬ  ＣＤＲ）、および異種タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含む融合タンパク質を提供する。タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを融合または結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）するための方法は、当業者に公知である。例えば、米国特許番号５，３３６，６０３号、５，６２２，９２９号、５，３５９，０４６号、５，３４９，０５３号、５，４４７，８５１号、および５，１１２，９４６号明細書；欧州特許番号ＥＰ３０７，４３４号およびＥＰ３６７，１６６号明細書；国際公開番号ＷＯ９６／０４３８８およびＷＯ９１／０６５７０号公報；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：１０５３５−１０５３９；  Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５４：５５９０−５６００；およびＶｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１１３３７−１１３４１を参照のこと。
【０２６７】
追加の融合タンパク質は遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング（ｍｏｔｉｆ−ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）、エクソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（まとめて「ＤＮＡシャッフリング」と呼ばれる）の技術を経て生成されてもよい。ＤＮＡシャッフリングは、発明の抗体（例えば、高い親和性および低い解離速度の多価、二重パラトピック（ｂｉｐａｒａｔｏｐｉｃ）または二重特異性抗体またはそれらの断片）の活性を改変するために用いられ得る。一般に、米国特許番号５，６０５，７９３号；５，８１１，２３８号；５，８３０，７２１号；５，８３４，２５２号；および５，８３７，４５８号；Ｐａｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ８：７２４−３３；Ｈａｒａｙａｍａ，  （１９９８）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １６（２）：７６−８２；Ｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２８７：２６５−７６；およびＬｏｒｅｎｚｏ  ａｎｄ  Ｂｌａｓｃｏ，  （１９９８）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４（２）：３０８−３１３を参照（各々の特許および出版物はその全体が出展明示として本明細書に組み込まれる）。抗体またはそれらの断片、またはコード化抗体またはそれらの断片は、組換の前にエラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法によってランダム変異導入に供されて改変され得る。ＬＲＰ６タンパク質に特異的に結合する多価抗体またはそれらの断片をコードするポリヌクレオチドは、１個以上の異種分子の、１個以上の成分、モチーフ、片（ｓｅｃｔｉｏｎ）、部分（ｐａｒｔ）、ドメイン、断片等と再結合し得る。
【０２６８】
さらに、抗体またはそれらの断片は、精製を促進するペプチドのような、マーカー配列と融合し得る。一の実施形態において、マーカーアミノ酸配列はヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、多数のものが市販されている中でも、とりわけｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ、９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）で提供されるタグのようなものである。Ｇｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４に記載のように、例えば、ヘキサ−ヒスチジンは融合タンパク質の便利な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８４）  Ｃｅｌｌ  ３７：７６７）由来のエピトープに相当するヘマグルチニン（”ＨＡ”）タグ、および「フラッグ（ｆｌａｇ）」タグを含むが、これらに限定されるものではない。
【０２６９】
他の実施形態において、本発明の抗体またはそれらの断片は診断または検出剤と結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）する。このような抗体は、特定の治療の有効度を測定するといった、臨床試験手順の一部として、発現、成長、発育および／または疾病もしくは疾患の重症度を監視または予見するために有用となり得る。そのような診断および検出は抗体に、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどのような、しかしこれらに限定されない様々な酵素；ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンのような、しかしこれらに限定されない補欠分子族；ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン  フルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンなどのような、しかしこれらに限定されない蛍光物質；ルミノールなどのような、しかしこれらに限定されない発光物質；ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンなどのような、しかしこれらに限定されない生物発光体；ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉおよび１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、三重水素（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎおよび１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｌ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、および１１７すずなどのような、しかしこれらに限定されない放射性物質；および様々な陽電子放射断層撮影に使用する陽電子放出金属、および放射性でない常磁性金属イオン、などを含むがこれらに限定されない検出可能な物質を組み合わせることによって達成できる。
【０２７０】
本発明はさらに、治療的部分（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）と結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）した抗体またはそれらの断片の使用を包含する。抗体またはそれらの断片は、細胞毒素、例えば細胞増殖抑制剤または細胞破壊剤、治療剤、または放射性金属イオン、例えばアルファ放射体などの治療的部分、と結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）し得る。細胞毒素または細胞毒性薬は細胞に有害ないかなる剤を含む。
【０２７１】
さらに、抗体またはそれらの断片は、既知の生物学的応答を変更する治療的部分または薬物部分（ｄｒｕｇ  ｍｏｉｅｔｙ）と結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）し得る。治療的部分または薬物部分は古典的な化学治療薬に制限されると解釈されるものではない。例えば、薬物部分は所望の生物活性を有するタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドであり得る。そのようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、コレラ毒素、またはジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノゲン活性化因子、アポトーシス剤、血管新生阻害剤などのタンパク質；または例えばリンフォカインなどの生物反応修飾物質、を含み得る。
【０２７２】
一の実施形態において、抗体、またはそれらの断片は、細胞毒素、薬物（例えば免疫抑制剤）または放射性毒素などの治療的部分と結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）する。このような結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）は本明細書において「免疫結合体（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」と称する。１つ以上の細胞毒素を含む免疫結合体は、「免疫毒素（ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ）」と称する。細胞毒素または細胞毒性薬は細胞に有害（例えば、死滅させる）ないかなる剤を含む。例として、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ｔコルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ａｎｔｈｒａｃｉｎ  ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにこれらの類似体または相同体が含まれる。治療剤にはまた、例えば、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６-メルカプトプリン、６-チオグアニン、シタラビン、５-フルオロウラシルデカルバジン（５-ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ  ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル（ｔｈｉｏｅｐａ  ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ-ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）、及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アンスラマイシン（ＡＭＣ）、ならびに有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）も含まれる。
【０２７３】
本発明の抗体と結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）できる治療的細胞毒素の他の例として、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、メイタンシンおよびアウリスタチン、ならびにこれらの誘導体が含まれる。カリケアマイシン抗体結合体の一例は、市販される（ＭｙｌｏｔａｒｇＴｍ；Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ）。
【０２７４】
細胞毒素は当分野で利用できるリンカー技術を用いて、本発明の抗体と結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）できる。細胞毒素を抗体に結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）させるために用いられているリンカーの型の例として、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィドおよびペプチド含有リンカーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。リンカーは、例えば、リソソームコンパートメント（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）内で低いｐＨにより開裂されやすい、または、カテプシン(例えば、カテプシンＢ、Ｃ、Ｄ）などの、腫瘍組織で優先的に発現されるプロテアーゼなどの、プロテアーゼにより開裂されやすい、ものから選ぶことができる。
【０２７５】
抗体への治療剤の結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）のための細胞毒素の型、リンカーおよび方法のさらなる考察のために、Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．  ５５：１９９−２１５；  Ｔｒａｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ５２：３２８−３３７；  Ｐａｙｎｅ，  （２００３）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３：２０７−２１２；  Ａｌｌｅｎ，  （２００２）  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２：７５０−７６３；  Ｐａｓｔａｎ  ａｎｄ  Ｋｒｅｉｔｍａｎ，  （２００２）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．  Ｄｒｕｇｓ  ３：１０８９−１０９１；  Ｓｅｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，  （２００１）  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．  ５３：２４７−２６４を参照のこと。
【０２７６】
本発明の抗体はまた、放射性同位体と結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）して、放射性免疫結合体とも呼ばれる、細胞毒性放射性医薬品を生成することができる。診断または治療の用途のために抗体と結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）できる放射性同位体の例は、ヨウ素１３１、インジウム１１１、イットリウム９０およびルテチウム１７７を含むが、これらに限定されるものではない。放射性免疫結合体を調製する方法は当分野にて確立されている。放射性免疫結合体の例は商業的に利用可能であり、Ｚｅｖａｌｉｎ登録商標（ＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）およびＢｅｘｘａｒ登録商標（Ｃｏｒｉｘａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含み、さらに類似の方法も本発明の抗体を用いる放射性免疫結合体の調製のために使用できる。いくらかの実施形態において、大環状キレート剤は、リンカー分子を介して抗体と付着できる１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）である。そのようなリンカー分子は当分野において周知であり、それぞれの全体が出展明示により組み込まれる、Ｄｅｎａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４（１０）：２４８３−９０；  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．  １０（４）：５５３−７；およびＺｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  ２６（８）：９４３−５０に記載される。
【０２７７】
抗体に治療的部分を結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ）させるための技術は周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  ｐｐ．  ２４３−５６  （Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．  １９８５）；  Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，  ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  （２ｎｄ  Ｅｄ．），  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  ｐｐ．  ６２３−５３  （Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．  １９８７）；  Ｔｈｏｒｐｅ，  “Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”，  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ８４：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  ｐｐ．  ４７５−５０６  （１９８５）；  “Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｒｅｓｕｌｔｓ，  Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  ｐｐ．  ３０３−１６  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５），およびＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８２）  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  ６２：１１９−５８を参照のこと。
【０２７８】
抗体はまた、特に免疫測定法または標的抗原の精製に有用な固相担体（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ）に付着させ得る。このような固相担体はガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンを含むが、これらに限定されるものではない。
【０２７９】
抗体の作成方法
（ｉ）抗体をコードする核酸
本発明は、上記ＬＲＰ６抗体鎖のセグメントまたはドメインを含む多価エピトープ結合タンパク質、例えば抗体およびそれらの抗原結合断片をコードする実質的に精製された核酸分子を提供する。本発明の核酸のいくつかは、配列番号１４、１９、３４および６０に示されるプロペラ１抗体重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、および／または配列番号１３、２０、３３および５９に示される軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、核酸分子は、表１に同定されたものである。他の本発明の核酸分子のいくつかは、表１に同定されたもののヌクレオチド配列と実質的に（例えば少なくとも６５、８０％、９５％または９９％）同一であるヌクレオチド配列を含む。本発明の核酸のいくつかは、配列番号８２、１０６および１２８に示される重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、および／または配列番号８１、１０５および１２７に示される軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、核酸分子は、表１に同定されたものである。他の本発明の核酸分子のいくつかは、表１に同定されたもののヌクレオチド配列と実質的に（例えば少なくとも６５、８０％、９５％または９９％）同一であるヌクレオチド配列を含む。適切な発言ベクターから発現される場合、これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、ＬＲＰ６抗原結合能を示しうる。
【０２８０】
上記ＬＲＰ６抗体の重鎖または軽鎖由来の少なくとも１個のＣＤＲ領域、および通常３個全てのＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドも、本発明において提供される。他のポリヌクレオチドのいくつかは、上記ＬＲＰ６抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域の全てまたは実質的に全てをコードする。コードの縮重のため、多様な核酸配列が各免疫グロブリンアミノ酸配列をコードする。
【０２８１】
本発明の核酸分子は、抗体の可変領域および定常領域の両方をコードし得る。本発明の核酸配列のいくつかは、配列番号１４、１９、３４および６０に記載の成熟重鎖可変領域配列と実質的に（例えば少なくとも８０％、９０％または９９％）同一の成熟重鎖可変領域配列をコードするヌクレオチドを含む。他の核酸配列のいくつかは、配列番号１３、２０、３３および５９に記載の成熟軽鎖可変領域配列と実質的に（例えば少なくとも８０％、９０％または９９％）同一の成熟軽鎖可変領域配列をコードするヌクレオチドを含む。
【０２８２】
本発明の核酸分子は、抗体の可変領域および定常領域の両方をコードし得る。本発明の核酸配列のいくつかは、配列番号８２、１０６および１２８に記載の成熟重鎖可変領域配列と実質的に（例えば少なくとも８０％、９０％または９９％）同一の成熟重鎖可変領域配列をコードするヌクレオチドを含む。他の核酸配列のいくつかは、配列番号８１、１０５および１２９に記載の成熟軽鎖可変領域配列と実質的に（例えば少なくとも８０％、９０％または９９％）同一の成熟軽鎖可変領域配列をコードするヌクレオチドを含む。
【０２８３】
ポリヌクレオチド配列は、新たな（ｎｏｖｏ）固相ＤＮＡ合成またはＬＲＰ６抗体またはその結合断片をコードする既存の配列（例えば下記実施例に記載の配列）のＰＣＲ変異導入法によって作成できる。核酸の直接化学合成は、当分野で既知の、Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７９，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ６８：９０のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ６８：１０９，  １９７９のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａ．  Ｌｅｔｔ．，  ２２：１８５９，  １９８１のジエチルホスホラミダイト法；および米国特許４，４５８，０６６の固相担体法などの方法によって実施できる。ＰＣＲによるポリヌクレオチド配列への変異の導入は、例えばＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｈ．Ａ．  Ｅｒｌｉｃｈ  （Ｅｄ．），  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ，  ＮＹ，  １９９２；  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｅｄ．），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ，  １９９０；  Ｍａｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９：９６７，；およびＥｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １：１７に記載のとおりに実施できる。
【０２８４】
上記抗体を製造するための発現ベクターおよび宿主細胞も本発明において提供される。それらの抗体断片をコードするポリヌクレオチドを発現するため、多様な発現ベクターが使用できる。ウイルス性および非ウイルス性発現ベクターのどちらも、哺乳類宿主細胞において抗体を製造するために使用することができる。非ウイルス性ベクターおよび系は、プラスミド、典型的にはタンパク質もしくはＲＮＡを発現するための発現カセットを有する、エピソームベクターおよびヒト人工染色体（例えばＨａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １５：３４５，  １９９７を参照）を含む。例えば、抗体ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの哺乳類（例えばヒト）細胞での発現に有用な非ウイルス性ベクターは、ｐＴｈｉｏＨｉｓ  Ａ、Ｂ＆Ｃ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ  Ａ、Ｂ＆Ｃ、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）、ＭＰＳＶベクターおよび他のタンパク質を発現するために当分野で既知の多様な他のベクターを含む。有用なウイルス性ベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０に基づくベクター、パピローマウイルス、ＨＢＰ  Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒウイルス、ワクシニアウイルスベクターおよびＳｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔウイルス（ＳＦＶ）を含む。Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）  ｓｕｐｒａ；  Ｓｍｉｔｈ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４９：８０７；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）  Ｃｅｌｌ  ６８：１４３を参照のこと。
【０２８５】
発現ベクターの選択は、ベクターが発現される、意図する宿主細胞に依存する。典型的には、発現ベクターは、抗体またはそれらの断片をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結しているプロモーターおよび他の調節配列（例えばエンハンサー）を含む。いくつかの態様において、誘導性プロモーターを用いて、誘導条件下以外での挿入配列の発現を防止する。誘導性プロモーターは、例えばアラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーターまたは熱ショックプロモーターを含む。形質転換された生物の培養は、発現産物が宿主細胞によってより耐容性である配列をコードするために集団に圧力を加えることなしに、非誘導性条件下で拡大されうる。プロモーターに加えて、抗体またはそれらの断片の効果的な発現のために、他の調節要素も要求または所望される。これらの要素は典型的には、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接リボソーム結合部位または他の配列を含む。加えて、発現の効率は、使用する細胞系に適切なエンハンサーを含めることで向上し得る（例えばＳｃｈａｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）  Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．  ２０：１２５，；およびＢｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １５３：５１６を参照）。例えば、ＳＶ４０エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーを使用して、哺乳類宿主細胞における発現を増加させ得る。
【０２８６】
発現ベクターは、挿入されたＬＲＰ６抗体配列によってコードされるポリペプチドとの融合タンパク質を形成する挿入シグナル配列位置も提供し得る。非常に多くの場合、挿入されたＬＲＰ６抗体配列は、ベクターに含まれる前にシグナル配列と連結される。ＬＲＰ６抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする配列を受け取るために使用されるベクターは、定常領域またはそれらの一部をコードする場合もある。このようなベクターは定常領域を有する融合タンパク質として可変領域の発現が可能であり、それにより無傷の（ｉｎｔａｃｔ）抗体またはそれらの断片の製造を導く。典型的には、かかる定常領域はヒトである。
【０２８７】
抗体を有し、そして発現する宿主細胞は、原核または真核細胞であってよい。大腸菌は、本発明のポリヌクレオチドをクローニングおよび発現するのに有用な原核宿主の一つである。使用に適した他の微生物宿主は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの桿菌、およびサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）および多様なシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）などの他の腸内細菌、を含む。これらの原核宿主において、典型的には宿主細胞に適合性の発現調節配列（例えば複製起点）を含む発現ベクターも作成できる。加えて、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベータ−ラクタマーゼプロモーター系またはファージラムダ由来のプロモーター系などの、任意の数の多様な周知のプロモーターが存在している。典型的には、プロモーターは、任意にはオペレーター配列で、発現を制御し、転写および翻訳を開始し完了するためのリボソーム結合部位などを有する。酵母のような他の微生物もまた、本発明のＬＲＰ６抗体を発現するために使用できる。バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞も使用できる。
【０２８８】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明の抗体を発現、製造するために、哺乳類宿主細胞が使用される。例えば、それは内因性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞系（例えば実施例に記載の１Ｄ６．Ｃ９骨髄腫ハイブリドーマクローン）または外因性発現ベクターを有する哺乳類細胞系（例えば以下に例示するＳＰ２／０骨髄腫細胞）であってよい。これらはあらゆる通常の死に至るものかあるいは通常もしくは異常な不死動物またはヒト細胞系を含む。例えば、ＣＨＯ細胞系、多様なＣｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、形質転換Ｂ細胞およびハイブリドーマを含む、無傷な免疫グロブリンを分泌できる多数の好適な宿主細胞系が開発されている。ポリペプチドを発現するための哺乳類組織細胞培養の使用は、一般に、例えばＷｉｎｎａｃｋｅｒ，  ＦＲＯＭ  ＧＥＮＥＳ  ＴＯ  ＣＬＯＮＥＳ，  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎ．Ｙ．，  Ｎ．Ｙ．，  １９８７に記載されている。哺乳類宿主細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーターおよびエンハンサー（例えば、Ｑｕｅｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  ８９：４９−６８，  １９８６を参照）などの発現制御配列ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位および転写終止配列などの必要なプロセッシング情報部位を含み得る。これらの発現ベクターは、通常、哺乳類遺伝子または哺乳類ウイルス由来のプロモーターを含む。好適なプロモーターは、構造性、細胞型特異的、発生段階特異的（ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）、および／または調節可能もしくは制御可能であり得る。有用なプロモーターは、メタロチオネインプロモーター、構造性アデノウイルス後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ  ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構造性ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（例えばヒト初期ＣＭＶプロモーター）、構造性ＣＭＶプロモーターおよび当分野で既知のプロモーターとエンハンサーの組合せを含むが、これらに限定されない。
【０２８９】
目的のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入する方法は、細胞宿主の型に依存して変化する。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは一般に、原核細胞について利用されるが、一方で、リン酸カルシウム処置またはエレクトロポレーションは他の細胞宿主に使用できる（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａを参照）。他の方法は、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム処置、リポソーム介在形質転換、インジェクションおよびマイクロインジェクション、弾道法、ビロソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン：核酸複合体、裸ＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２との融合体（Ｅｌｌｉｏｔ  ａｎｄ  Ｏ’Ｈａｒｅ，  Ｃｅｌｌ  ８８：２２３，  １９９７）、ＤＮＡの薬剤向上取り込みおよびエクスビボ形質導入、を含む。組換えタンパク質の長期間高収率生産のために、安定な発現がしばしば所望される。例えば、抗体ドメインまたは結合断片を安定的に発現する細胞系は、ウイルス性複製起点または内因性発現要素および選択可能なマーカー遺伝子を含む本発明の発現ベクターを用いて製造できる。ベクターの導入後、富化培地中で細胞を１〜２日間増殖させた後、選択培地に移す。選択可能なマーカーの目的は、選択に対する耐性を与えることであり、その存在が選択培地中で導入した配列の発現に成功している細胞の増殖を可能とする。耐性で、安定な、トランスフェクトされた細胞は、細胞型に適切な組織培養技術を用いて増殖できる。
【０２９０】
（ｉｉ）抗体の生成
モノクローナル抗体は実施例に記載される方法を用いて作成される。これらの抗体またはそれらの断片は、実施例の項にて開示される多価抗体（例えば、二重特異性／二重パラトピック）を生成するために使用できる。例えば、二重パラトピックなＬＲＰ６抗体はｓｃＦｖ、例えばＬＲＰ６のプロペラ３ドメインと結合するｓｃＦｖ、と全長ＩｇＧモノクローナル抗体を連結することにより生成できる。
【０２９１】
あるいは、モノクローナル抗体は、慣用的なモノクローナル抗体方法論、例えばＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  １９７５  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：  ４９５の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む多様な技術によって作成できる。モノクローナル抗体を作成するための多くの技術、例えばＢリンパ球のウイルス性または発がん性遺伝子による形質転換が使用できる。
【０２９２】
ハイブリドーマを調製するための動物系は、マウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ作成は、十分に確立された方法である。融合体についての免疫化プロトコルおよび免疫した脾細胞の単離のための技術は、当分野で既知である。融合パートナー（例えばマウス骨髄腫細胞）および融合手法も既知である。
【０２９３】
本発明のキメラまたはヒト化抗体は、上記のとおりに調製したマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて調製できる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、目的のマウスハイブリドーマから得られ、非マウス（例えばヒト）免疫グロブリン配列を含むように、標準的な分子生物学の技術を用いて操作できる。例えばキメラ抗体を作成するために、当分野で既知の方法を用いて、マウス可変領域をヒト定常領域と連結させることができる（例えばＣａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。ヒト化抗体を作成するために、当分野で既知の方法を用いて、マウスＣＤＲ領域をヒトフレームワークに挿入できる。例えばＷｉｎｔｅｒの米国特許第５２２５５３９号およびＱｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許５５３０１０１；５５８５０８９；５６９３７６２および６１８０３７０を参照のこと。
【０２９４】
いくらかの実施形態において、本発明の抗体はヒトモノクローナル抗体である。このような、ＬＲＰ６に対するヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりもヒト免疫系の一部を担持するトランスジェニックまたはトランスクロモソームマウスを用いて生成できる。これらのトランスジェニックおよびトランスクロモソームマウスは、それぞれＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと本明細書において称するマウスを含み、集合的に、「ヒトＩｇマウス」と称する。
【０２９５】
ＨｕＭＡｂマウス登録商標（Ｍｅｄａｒｅｘ，  Ｉｎｃ．）は、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的変異と共に、再配列されていないヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子小座を含む（例えばＬｏｎｂｅｒｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：  ８５６−８５９を参照）。したがって、マウスはマウスＩｇＭまたはκの低下した発現を示し、免疫化に応答して、導入したヒト重鎖および軽鎖トランスジーンがクラススイッチおよび体細胞変異を起こして、高い親和性のヒトＩｇＧκモノクローナルを作成する（Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  ｓｕｐｒａ；  ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｉｎ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，  （１９９４）  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９−１０１；  Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，  （１９９５）  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：  ６５−９３，およびＨａｒｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，  （１９９５）  Ａｎｎ．  Ｎ．  Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ７６４：５３６−５４６）。ＨｕＭＡｂマウスの作成および使用ならびにこのようなマウスによって担持されるゲノム修飾は、出展明示により全体が本明細書に組み込まれる、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：６２８７−６２９５；  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５：  ６４７−６５６；  Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４：３７２０−３７２４；  Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１１７−１２３；  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １２：８２１−８３０；  Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５２：２９１２−２９２０；  Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７９−５９１；およびＦｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：  ８４５−８５１にさらに記載される。さらに、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙの米国特許第５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；５，７８９，６５０；５，８７７，３９７；５，６６１，０１６；５，８１４，３１８；５，８７４，２９９；および５，７７０，４２９号、Ｓｕｒａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，５４５，８０７号、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙのＰＣＴ公開ＷＯ９２１０３９１８、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９７１１３８５２、ＷＯ９８／２４８８４およびＷＯ９９／４５９６２およびＫｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．のＰＣＴ公開ＷＯ０１／１４４２４を参照のこと。
【０２９６】
他の実施形態において、本発明のヒト抗体は、ヒト重鎖トランスジーンおよびヒト軽鎖トランスクロモソームを担持するマウスのようなトランスジーンおよびトランスクロモソーム上にヒト免疫グロブリン配列を担持するマウスを用いて、産生できる。このようなマウスは、本明細書において「ＫＭマウス」と称し、Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．のＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８に詳細に記載されている。
【０２９７】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別のトランスジェニック動物系が当分野で利用可能であり、本発明のＬＲＰ６抗体の産生に使用できる。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，  Ｉｎｃ．）と称される別のトランスジェニック系が使用できる。このようなマウスは、例えばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，９３９，５９８；６，０７５，１８１；６，１１４，５９８；６，１５０，５８４および６，１６２，９６３号に記載されている。
【０２９８】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別のトランスクロモソーム動物系が当分野で利用可能であり、本発明のＬＲＰ６抗体の産生に使用できる。例えば、「ＴＣマウス」と称されるヒト重鎖トランスクロモソームおよびヒト軽鎖トランスクロモソームの両方を担持するマウスが使用でき；このようなマウスはＴｏｍｉｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７：７２２−７２７に記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖トランスクロモソームを担持するウシが当分野で既知であり（Ｋｕｒｏｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：８８９−８９４）、本発明のＬＲＰ６抗体の産生に使用できる。
【０２９９】
本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のスクリーニングライブラリーのファージディスプレイ法を用いて調製してもよい。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法は、当分野で確立されており、下記実施例に記載されている。例えばＬａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，２２３，４０９；５，４０３，４８４および５，５７１，６９８号；Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，４２７，９０８および５，５８０，７１７号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，９６９，１０８および６，１７２，１９７号；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，８８５，７９３；６，５２１，４０４；６，５４４，７３１；６，５５５，３１３；６，５８２，９１５および６，５９３，０８１を参照のこと。
【０３００】
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト抗体応答が免疫化によって発生され得るようにヒト免疫細胞が再構築されているＳＣＩＤマウスを用いて調製できる。このようなマウスは、例えばＷｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，４７６，９９６および５，６９８，７６７号に記載されている。
【０３０１】
（ｉｉｉ）フレームワークまたはＦｃ操作
操作された本発明の抗体は、例えば抗体の特性を改善するために、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に修飾が施されているものを含む。典型的には、このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるために行われる。例えば一つのアプローチは、１個以上のフレームワーク残基を対応する生殖系配列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に「復帰変異（ｂａｃｋ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）」することである。より具体的には、体細胞変異を起こした抗体が、その抗体から由来する生殖系配列とは異なるフレームワーク残基を含み得る。このような残基は、抗体フレームワーク配列と抗体に由来する生殖系配列を比較することで同定できる。フレームワーク領域配列をその生殖系配置に戻すため、体細胞変異は、例えば部位特異的変異誘発による生殖系配列への「復帰変異」であり得る。このような「復帰変異」された抗体も、本発明に含まれる。
【０３０２】
他の型のフレームワーク修飾は、Ｔ細胞エピトープを除去するための、フレームワーク領域内または１個以上のＣＤＲ領域内の１以上の残基での突然変異を含み、それによって抗体の潜在的な免疫原性を低下させる。このアプローチは「脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」とも称され、Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許公開２００３０１５３０４３号により詳細に記載されている。
【０３０３】
フレームワークまたはＣＤＲ領域内で行われる修飾に加えてまたはそれとは別に、本発明の抗体は、典型的には、血清半減期、補体結合、Ｆｃレセプター結合および／または抗原依存的細胞毒性などの、抗体の１個以上の機能的特徴を変化させるための、Ｆｃ領域内の修飾を含むように操作し得る。さらに、本発明の抗体は、化学的に修飾（例えば１個以上の化学的部分を抗体に付着させることができる）させるかまたはその糖鎖形成を変化させ、再度抗体の１個以上の機能的特徴を変化させるために、修飾し得る。これらの実施形態の各々については以下にさらに詳細に記載する。Ｆｃ領域での残基の番号は、Ｋａｂａｔ（上記）によるものである。
【０３０４】
ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域内のシステイン残基数が変化、例えば増加または減少するように修飾され得る。このアプローチはＢｏｄｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域内のシステイン残基数を変化させて、例えば、軽鎖と重鎖の会合を促進し、あるいは抗体の安定性を上昇または低下させる。
【０３０５】
多価抗体のＦｃヒンジ領域を修飾してその生物学的半減期を上昇させることができる。多様なアプローチが可能である。例えば、Ｗａｒｄの米国特許第６，２７７，３７５号に記載のとおり、下記変異の１つ以上を導入できる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。あるいは、生物学的半減期を上昇させるために、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，８６９，０４６および６，１２１，０２２号に記載のとおり、ＣＨ１またはＣＬ領域内で抗体を変化させて、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２個のループから得たサルベージレセプター結合エピトープを含める。多価抗体のＦｃヒンジ領域を修飾して、例えば、それにより投与量の調整を経る良好な臨床管理を認める、投与量、毒性およびクリアランスの調整のために、その生物学的半減期を低下させることができる。
【０３０６】
少なくとも１個のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換してＦｃ領域を変化させて、抗体のエフェクター機能を変化させることができる。例えば、１個以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置換して、抗体がエフェクターリガンドについて変化した親和性を有するが親抗体の抗原結合能を保持するようにできる。親和性が変化されたエフェクターリガンドは、例えばＦｃレセプターまたは補体のＣ１成分であり得る。このアプローチは、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，６２４，８２１および５，６４８，２６０号にさらに詳細に記載されている。
【０３０７】
１個以上のアミノ酸は、抗体が変化したＣ１ｑ結合および／または低下もしくは消滅した補体依存的細胞傷害性（ＣＤＣ）を有するように、異なるアミノ酸残基で置換され得る。このアプローチはＩｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第６，１９４，５５１号にさらに詳細に記載されている。
【０３０８】
１個以上のアミノ酸残基が変化させて抗体の補体を固定化する能力を変化させることができる。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．のＰＣＴ公開ＷＯ９４／２９３５１にさらに詳細に記載されている。
【０３０９】
Ｆｃ領域は、１個以上のアミノ酸を修飾することにより修飾して、抗体の抗体依存的細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を仲介する能力を向上しおよび／またはＦｃγレセプターに対する多価抗体の親和性を向上させることができる。このアプローチはＰｒｅｓｔａのＰＣＴ公開ＷＯ００／４２０７２にさらに詳細に記載されている。さらに、ＦｃγＲｌ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位がマッピングされており、改善された結合を有する変異体が記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ，  Ｒ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｎ．  ２７６：６５９１−６６０４を参照）。
【０３１０】
抗体のグリコシル化を修飾できる。例えば、非グリコシル化抗体を作成する（すなわち抗体がグリコシル化を欠く）ことができる。グリコシル化は、例えば抗体の抗原に対する親和性を上昇させるために、変化されうる。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１個以上のグリコシル化部位を変化することによって実施できる。例えば、１個以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の削除をもたらし、それによってこの部位でのグリコシル化を削除する、１個以上のアミノ酸置換が行われ得る。このような非グリコシル化は、抗体の抗原に対する親和性を上昇させ得る。このようなアプローチは、Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，７１４，３５０および６，３５０，８６１号にさらに詳細に記載されている。
【０３１１】
さらにまたはあるいは、フコシル残基の量が減少している低フコシル化抗体または増加した二分ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体などの、グリコシル化の型が変化した抗体を作成できる。このような変化したグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能を増加することが示されている。このような炭水化物修飾は、例えば、変化されたグリコシル化機構を有する宿主細胞において抗体を発現することによって、達成できる。変化されたグリコシル化機構を有する細胞は、当分野において記載されており、本発明の組換え抗体を発現し、それによって変化したグリコシル化を有する抗体を産生する宿主細胞として使用できる。例えば、Ｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．のＥＰ１，１７６，１９５は、細胞系で発現される抗体が低フコシル化を示すように、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊されている細胞系を記載する。ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５は、Ａｓｎ（２９７）結合糖にフコースを結合させる能力が低下し、また宿主細胞において発現される抗体の低フコシル化をもたらすＣＨＯ細胞系変異体であるＬｅｃｌ３細胞を記載する（Ｓｈｉｅｌｄｓ，  Ｒ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７：２６７３３−２６７４０も参照）。ＵｍａｎａらによるＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４３４２は、細胞系で発現される抗体が増加した二分（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）ＧｌｃＮａｃ構造を示し、抗体の増加したＡＤＣＣ活性をもたらすように、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えばベータ（１，４））−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎｔＩＩＩ））を発現するように操作された細胞系を記載する（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １７：１７６−１８０も参照）。
【０３１２】
抗体を修飾してその生物学的半減期を上昇させることができる。多様なアプローチが可能である。例えば、Ｗａｒｄの米国特許第６，２７７，３７５号に記載のとおり、下記変異の１つ以上を導入できる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。あるいは、生物学的半減期を上昇させるために、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，８６９，０４６および６，１２１，０２２号に記載のとおり、ＣＨ１またはＣＬ領域内で抗体を変化させて、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２個のループから得たサルベージレセプター結合エピトープを含める。
【０３１３】
（ｉｖ）改変された抗体を操作する方法
上記のとおり、本明細書に示すＶＨおよびＶＬ配列または全長重鎖および軽鎖配列を有する抗体を用いて、全長重鎖および／または軽鎖配列、ＶＨおよび／またはＶＬ配列、またはそれに結合した定常領域を修飾して、新たな抗体を作成できる。したがって、本発明の他の態様において、本発明の抗体の構造的特徴を用いて、ヒトＬＲＰ６との結合およびＬＲＰ６の１個以上の機能的特徴の阻害（例えばＷｎｔシグナル伝達活性）などの、本発明の抗体の少なくとも１個の機能的特徴を保持する、構造的に関連した抗体を作成する。
【０３１４】
例えば、本発明の抗体またはその変異体の１個以上のＣＤＲ領域を既知のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組換え的に結合して、上記のとおり、本発明のさらなる組換え操作された抗体を作成できる。他の型の修飾は、前節に記載のものを含む。操作方法の出発物質は、本明細書で提供されるＶＨおよび／またはＶＬ配列の１個以上またはそのＣＤＲ配列の１個以上である。操作された抗体を作成するためには、本明細書で提供されるＶＨおよび／またはＶＬ配列の１個以上またはそのＣＤＲ配列の１個以上を有する抗体を実際に作成する（すなわちタンパク質として発現する）必要はない。むしろ、配列に含まれる情報を出発物質として用いて、元の配列に由来する「第二世代」配列を作成し、当該「第二世代」配列が調製され、タンパク質として発現される。
【０３１５】
したがって、他の実施形態において、本発明は、配列番号１、２１および４７からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２、２２および４８からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、および／または配列番号３、２３および４９からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域抗体配列；ならびに配列番号４、２４および５０からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号５、２５および５１からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、および／または配列番号６、２６および５２からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域抗体配列からなるプロペラ１  ＬＲＰ６抗体を作成する方法であって；重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも１個のアミノ酸残基を変化させて、少なくとも１個の変化した抗体配列を作成し；そして変化した抗体配列をタンパク質として発現させる、方法を提供する。
【０３１６】
したがって、他の実施形態において、本発明は、配列番号６９、９３および１１５からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号７０、９４および１１６からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、および／または配列番号７１、９５および１１７からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域抗体配列；ならびに配列番号９１、１０７および１１８からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号７３、９７および１２１からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、および／または配列番号７４、９８および１２０からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域抗体配列からなるプロペラ３  ＬＲＰ６抗体を作成する方法であって；重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも１個のアミノ酸残基を変化させて、少なくとも１個の変化した抗体配列を作成し；そして変化した抗体配列をタンパク質として発現させる、方法を提供する。
【０３１７】
したがって、他の実施形態において、本発明は、配列番号１、２１、４７、６９、９３および１１５からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２、２２、４８、７０、９４および１１６からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、および／または配列番号３、２３、４９、７１、９５および１１７からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域抗体配列；ならびに配列番号４、２４、５０、７２、９６および１１８からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号５、２５、５１、７３、９７および１１９からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、および／または配列番号６、２６、５２、７４、９８および１２０からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域抗体配列からなる多価特異的（例えば、二重パラトピック）  ＬＲＰ６抗体を作成する方法であって；重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも１個のアミノ酸残基を変化させて、少なくとも１個の変化した抗体配列を作成し；そして変化した抗体配列をタンパク質として発現させる、方法を提供する。変化した抗体配列はまた、固定されたＣＤＲ３配列または米国公開ＵＳ２００５０２５５５５２号に記載の最小必須結合決定部分およびＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列の多様性を有する抗体ライブラリーをスクリーニングすることによっても調製できる。スクリーニングは、ファージディスプレイ技術などの、抗体ライブラリーから抗体をスクリーニングするための適切ないかなるスクリーニング技術に従って、実施できる。
【０３１８】
標準的な分子生物学技術を用いて、変化した抗体配列を調製し、発現させることができる。変化した抗体配列によってコードされる抗体は、本明細書に記載の抗体の１個、数個または全ての機能的特性を保持するものであり、ここで該機能的特性は、ヒトおよび／またはカニクイザルＬＲＰ６との特異的結合；抗体がＬＲＰ６と結合し、Ｗｎｔ遺伝子アッセイにおける標準的な（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）Ｗｎｔシグナル伝達活性の阻害によってＬＲＰ６の生物活性を阻害すること、を含むがこれらに限定されない。
【０３１９】
変化した抗体の機能的特性は、当分野において利用可能でありそして／または本明細書に記載の標準的なアッセイ、例えば実施例に記載のもの（例えばＥＬＩＳＡ）を用いて、評価できる。
【０３２０】
本発明の抗体を操作する方法のある実施形態において、抗体コーディング配列の全部または一部にわたってランダムにまたは選択的に変異を導入でき、そして得られた修飾抗体は、結合活性および／または本明細書に記載の他の機能的特性についてスクリーニングされ得る。変異方法は当分野において記載されている。例えば、ＳｈｏｒｔによるＰＣＴ公開ＷＯ  ０２／０９２７８０は、飽和変異誘発、合成ライゲーションアセンブリまたはそれらの組合せを用いた抗体変異体の作成およびスクリーニング法を記載する。あるいは、Ｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．によるＰＣＴ公開ＷＯ  ０３／０７４６７９は、抗体の物理化学的特性を最適化するための計算スクリーニング法を用いる方法を記載する。
【０３２１】
抗体の特徴づけ
本発明の抗体および多価抗体は多様な機能的アッセイによって特徴付けられる。例えば、本明細書に記載されるＷｎｔ遺伝子アッセイにおける標準的なＷｎｔシグナル伝達活性の阻害による生物活性を阻害する能力、ＬＲＰ６タンパク質（例えばヒトおよび／またはカニクイザルＬＲＰ６）との親和性、エピトープ結合、タンパク質分解に対する耐性、およびＷｎｔ経路を阻止する能力によって、特徴付けられる。加えて、抗体はＦａｂ断片との交差結合の後のアゴニスト作用を高める能力によって特徴付けられる。
【０３２２】
多価抗体（例えば、単一の二重パラトピックまたは二重特異性抗体）は、プロペラ１（例えばＷｎｔ１）およびプロペラ３（例えばＷｎｔ３）リガンドの両方を阻害する能力を有する。さらに、そして予想外なことに、多価抗体（例えば、単一の二重パラトピックまたは二重特異性抗体）はＷｎｔシグナルの顕著な相乗作用を全く示さない。多価抗体は異なるＬＲＰ６  β−プロペラ領域と結合する。例えば、二重パラトピック抗体は、ＬＲＰ６のβ−プロペラ１ドメインと結合するレセプター結合ドメインを含み、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ９、Ｗｎｔ１０Ａ、Ｗｎｔ１０Ｂなどのプロペラ１依存Ｗｎｔを阻止してＷｎｔ１シグナル伝達を阻害し、さらにまたＬＲＰ６のβ−プロペラ３ドメインと結合するエピトープ結合ドメインを有し、Ｗｎｔ３ａおよびＷｎｔ３などのプロペラ３依存Ｗｎｔを阻止してＷｎｔ３シグナル伝達を阻害する。
【０３２３】
多価抗体は、例えば、標的のレパートリーを拡大する、新たな結合特異性、増加した効力を有する、およびシグナル効力（ｓｉｇｎａｌ  ｐｏｔｅｎｃｙ）を有さない、などによる、従来の抗体からの利点を提供する。単一のＬＲＰ６多価抗体は、同一細胞の単一のＬＲＰ６標的条の複数のβ−プロペラ領域に結合して、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害できる。一の実施形態において、多価抗体はプロペラ１、プロペラ２、プロペラ３およびプロペラ４からなる群から選択されるβ−プロペラ領域のいかなる組合せとも結合する。一の実施形態において、多価抗体はＬＲＰ６のプロペラ１およびプロペラ３ドメインに結合する。従って、単一のＬＲＰ６多価抗体は、複数のβ−プロペラ領域と結合して、各々の領域を介するＷｎｔシグナル伝達を阻害する作用の増加した効力を有する。例えば、ＬＲＰ６二重パラトピック抗体はβ−プロペラ１およびβ−プロペラ３ドメインの両方にそれぞれ結合することによりプロペラ１を介するおよびプロペラ３を介するＷｎｔシグナル伝達の両方を阻害する。単一特異性抗体と比べて、作用の増加した効力は、二重パラトピック抗体の増加した親和性か、より良い結合によるものであり得る。
【０３２４】
様々な方法を用いてＬＲＰ６−介在Ｗｎｔシグナル伝達を測定できる。例えば、Ｗｎｔシグナル伝達経路は、（ｉ）β−カテニンの存在量および局在の測定、（ｉｉ）ＬＲＰ６または他の下流Ｗｎｔシグナル伝達タンパク質（例えばＤＶＬ）のリン酸化反応の測定、および（ｉｉｉ）特異的な遺伝子の特徴または遺伝子標的（例えば、ｃ−ｍｙｃ、Ｃｙｃｌｉｎ−Ｄ、Ａｘｉｎ２）の測定、によって監視できる。
【０３２５】
ＬＲＰ６と結合する抗体の能力は、目的の抗体を直接ラベルして検出でき、あるいは該抗体はラベルされていなくてもよく、当分野で既知の多様なサンドイッチアッセイ形式を用いて間接的に検出できる。
【０３２６】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、参照ＬＲＰ６抗体とＬＲＰ６ポリペプチドの結合を阻止しまたはそれと競合する。これらは上記完全ヒト抗体であり得る。これらはまた、参照抗体と同じエピトープと結合する他のマウス、キメラまたはヒト化ｔ抗体であってもよい。参照抗体結合を阻止しまたはそれと競合する能力は、試験下の抗体が参照抗体によって定義されるものと同じまたは類似のエピトープと、あるいは参照ＬＲＰ６結合抗体が結合するエピトープと十分に近接しているエピトープと結合することを示す。このような抗体は、参照抗体について同定された有利な特性を共有している可能性が特に高い。参照抗体を阻止しまたはそれと競合する能力は、例えば競合結合アッセイによって測定できる。競合結合アッセイにより、試験下の抗体は、ＬＲＰ６ポリペプチドなどの共通の抗原と参照抗体の特異的結合を阻害する能力について試験される。過剰の試験抗体が実質的に参照抗体の結合を阻害する場合、試験抗体は抗原との特異的結合について参照抗体と競合する。実質的阻害は、試験抗体が参照抗体の特異的結合を通常少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％または９０％低下させることを意味する。
【０３２７】
ＬＲＰ６タンパク質との結合について、参照ＬＲＰ６抗体と抗体との競合を評価するために使用できる多数の既知の競合結合アッセイが存在する。例えば、固相直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９：２４２−２５３を参照）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３７：３６１４−３６１９を参照）；固相直接標識化アッセイ、固相直接標識化サンドイッチアッセイ（Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，  上記を参照）；Ｉ−１２５ラベルを用いた固相直接ラベルＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）  Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２５：７−１５を参照）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６：５４６−５５２）；および直接標識化ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）  Ｓｃａｎｄ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３２：７７−８２）を含む。典型的には、このようなアッセイは、固体表面と結合した精製抗体または未標識化試験抗体および標識化参照抗体のいずれかを有する細胞の使用を含む。競合阻害は試験抗体の存在下での固体表面または細胞と結合したラベルの量を測定して測定される。通常、試験抗体は過剰に存在する。抗体、例えば、競合アッセイによって同定された二重特異性または二パラトープＬＲＰ６抗体（競合抗体）は、参照抗体と同じエピトープと結合する抗体および参照抗体が結合するエピトープと立体障害が起こる程度に十分に近接している隣接エピトープと結合する抗体を含む。
【０３２８】
選択した抗体が固有のエピトープと結合するかを決定するため、商業的に入手可能な試薬（例えばＰｉｅｒｃｅ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬからの試薬）を用いて各抗体をビオチニル化できる。未標識抗体およびビオチニル化抗体を用いた競合試験は、ＬＲＰ６ポリペプチド被覆ＥＬＩＳＡプレートを用いて実施できる。ビオチニル化抗体は、ストレプ−アビジン−アルカリフォスファターゼプローブで検出できる。精製された抗体のアイソタイプを決定するため、アイソタイプＥＬＩＳＡを実施できる。例えば、マイクロタイタープレートのウェルを１μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧで、４℃で一夜被覆できる。１％のＢＳＡでブロックした後、プレートを１μｇ／ｍｌ以下の抗体または精製したアイソタイプコントロールと、周囲温度で１〜２時間反応させる。次いでウェルをヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭ特異的アルカリフォスファターゼ複合化プローブと反応できる。次いでプレートを現像し、分析して、精製した抗体のアイソタイプを決定できる。
【０３２９】
抗体とＬＲＰ６ポリペプチドを発現する生きた細胞との結合を示すため、フローサイトメトリーが使用できる。簡潔には、０．１％のＢＳＡおよび１０％の胎児ウシ血清を含むＰＢＳ中の多様な濃度の抗体とＬＲＰ６を発現する細胞系（標準的な成長条件下で増殖する）を混合し、３７℃で１時間インキュベートできる。洗浄後、細胞を一次抗体染色と同じ条件下でフルオレセイン標識化抗ヒトＩｇＧ抗体と反応させる。１個の細胞を通過させる光および側面散乱特性を用いるＦＡＣＳｃａｎによって試料を分析できる。蛍光顕微鏡を用いる別のアッセイを、フローサイトメトリーアッセイに加えてまたはそれと代えて使用してもよい。細胞は、上記の通り正確に染色でき、蛍光顕微鏡で試験できる。この方法は、個々の細胞の可視化が可能であるが、抗原の密度に依存する感受性が消え得る。
【０３３０】
抗体はさらに、ウェスタンブロッティングによってＬＲＰ６ポリペプチドまたは抗原性断片との反応性について試験できる。簡潔には、精製したＬＲＰ６ポリペプチドもしくは融合タンパク質またはＬＲＰ６を発現する細胞由来の細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に供することができる。電気泳動後、分離した抗原をニトロセルロース膜に移し、１０％胎児ウシ血清でブロックし、試験抗体で探索する。ヒトＩｇＧ結合は、抗ヒトＩｇＧアルカリフォスファターゼを用いて検出でき、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質錠（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）で現像できる。
機能的アッセイの例は、下記実施例にも記載されている。
【０３３１】
本発明の抗体の結合特性
（ｉ）結合特異性
本発明は１個以上の標的レセプターの異なる結合部位に特異性を有する多重レセプター結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、一本鎖二重特異性抗体、抗体可変領域）を含む抗体および多価抗体を提供する。
【０３３２】
一の実施形態において、本発明の多価抗体は、同一の結合特異性の、レセプター結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。他の実施形態において、本発明の多価抗体は非同一の結合特異性の、レセプター結合ドメインを含む。
【０３３３】
（ｉｉ）結合親和性
本発明の抗体または多価抗体はその１個以上の同種抗原と高い結合親和性を有し得る。例えば、本明細書に記載されるエピトープ結合タンパク質は、少なくとも２×１０５Ｍ１ｓ−１、少なくとも５×１０５Ｍ１ｓ−１、１０６Ｍ１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ１ｓ−１、または少なくとも１０８Ｍ１ｓ−１の会合速度定数またはＫｏｎ速度（エピトープ結合タンパク質（ＲＢＰ）＋抗原−＞ＲＢＰ−Ａｇ）を有し得る。
【０３３４】
一の実施形態において、抗体または多価抗体は５×１０−１ｓ−１未満、１０−１ｓ−１未満、５×１０−２ｓ−１未満、１０−２ｓ−１未満、５×１０−３ｓ−１未満、１０−３ｓ−１未満、５×１０−４ｓ−１未満、または１０−４ｓ−１未満のＫｏｆｆ速度（ＲＢＰ−Ａｇ−＞ＲＢＰ＋Ａｇ）を有し得る。抗体または多価抗体は、５×１０−５ｓ−１未満、１０−５ｓ−１未満、５×１０−６ｓ−１未満、１０−６ｓ−１未満、５×１０−７ｓ−１未満、１０−７ｓ−１未満、５×１０−８ｓ−１未満、１０−８ｓ−１未満、５×１０−９ｓ−１未満、１０−９ｓ−１未満、または５×１０−１０ｓ−１未満のＫｏ
ｆｆ速度を有し得る。
【０３３５】
他の実施形態において、抗体または多価抗体は、少なくとも１０２Ｍ−１、少なくとも５×１０２Ｍ−１、少なくとも１０３Ｍ−１、少なくとも５×１０３Ｍ−１、少なくとも１０４Ｍ−１、少なくとも５×１０４Ｍ−１、少なくとも１０５Ｍ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１、少なくとも１０６Ｍ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも５×１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも５×１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも５×１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも５×１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも５×１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１、少なくとも５×１０１３Ｍ−１、少なくとも１０１４Ｍ−１、少なくとも５×１０１４Ｍ−１、少なくとも１０１５Ｍ−１、または少なくとも５×１０１５Ｍ−１の親和性定数またはＫａ（Ｋｏｎ／Ｋｏｆｆ）を有し得る。
【０３３６】
さらに他の実施形態において、抗体または多価抗体は、５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１５Ｍ未満、または１０−１５Ｍ未満の解離定数またはＫｄ（Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）を有し得る。
【０３３７】
本明細書に記載の方法に基づいて用いられる抗体または多価抗体は、本明細書で記載される方法または当業者に既知の方法（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ＳＥＴ）（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を用いる評価として、３０００ｐｍ未満、２５００ｐＭ未満、２０００ｐＭ未満、１５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、７５０ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、２５０ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１５０ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、７５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、１ｐＭ未満の解離定数（Ｋｄ）を有し得る。本明細書に記載の方法に基づいて用いられる抗体または多価抗体は、本明細書で記載される方法または当業者に既知の方法（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ＳＥＴ）を用いる評価として、２５から３０００ｐｍ、２５から２５００ｐＭ、２５から２０００ｐＭ、２５から１５００ｐＭ、２５から１０００ｐＭ、２５から７５０ｐＭ、２５から５００ｐＭ、２５から２５０ｐＭ、２５から１００ｐＭ、２５から７５ｐＭ、２５から５０ｐＭの解離定数（Ｋｄ）を有し得る。本明細書に記載の方法に基づいて用いられる抗体または多価抗体は、本明細書で記載される方法または当業者に既知の方法（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ＳＥＴ）を用いる評価として、５００ｐＭ、１００ｐＭ、７５ｐＭ、５０ｐＭの解離定数（Ｋｄ）を有し得る。
【０３３８】
（ｉｉｉ）多価抗体の相対的結合親和性
本発明は、単離された状態で、タンパク質内で同様のまたはよりよい機能性を示す（すなわち、独立して発現または単離されたドメインと比較して、レセプター結合ドメインは多価抗体の一部としての類似した特性を示す）機能性を保持し得る多重レセプター結合ドメインを担持するタンパク質を提供することが理解される。例えば、単離されたエピトープＹ特異性ｓｃＦｖは結合親和性、アゴニストまたはアンタゴニスト機能を含む特異的な機能特性を示す。本発明の多価抗体内のレセプター結合ドメインとして発現される同じｓｃＦｖは、単離されたｓｃＦｖと比べて同様の結合親和性またはより良いおよび／またはアゴニストまたはアンタゴニスト特性を示すであろうことが理解される。
【０３３９】
一の実施形態において、本発明の多価抗体は同一の単離（多価抗体の他の成分の無い）レセプター結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）より低い結合親和性を有するレセプター結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。他の実施形態において、本発明の多価抗体は同一の単離（多価抗体の他の成分の無い）レセプター結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）より高い結合親和性を有するレセプター結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。他の実施形態において、本発明の多価抗体は対応する単離（多価抗体の他の成分の無い）レセプター結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）と本質的に同じ結合親和性を有するレセプター結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。
【０３４０】
結合親和性は、ＥＬＩＳＡ、ＢｉａＣｏｒｅ登録商標、ＫｉｎＥｘＡ登録商標、細胞表面レセプター結合、結合アッセイの競合阻害、ＳＥＴなどの、当分野で既知の多くの技術によって規定どおりに分析できる。本発明の多価抗体の結合親和性は、実施例に提示される技術によって分析できる。
【０３４１】
多価抗体のレセプター結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、当分野で既知のいかなるアッセイによって計測されるものとして、同一の機能的な単離レセプター結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）よりも、９９％未満、９５％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、または１０％未満の、固有のエピトープに対する結合親和性を示す。他の実施形態において、多価抗体のレセプター結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、いかなる実施例に提示される技術によって計測されるものとして、同一の機能的な単離レセプター結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）よりも、９９％未満、９５％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、または１０％未満の、固有のエピトープに対する結合親和性を示す。
【０３４２】
多価抗体のレセプター結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、当分野で既知のいかなるアッセイによって計測されるものとして、同一の機能的な単離レセプター結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）よりも、９９％より大きい、９５％より大きい、９０％より大きい、８０％より大きい、７０％より大きい、６０％より大きい、５０％より大きい、４０％より大きい、３０％より大きい、２０％より大きい、または１０％より大きい、固有のエピトープに対する結合親和性を示す。他の実施形態において、多価抗体のレセプター結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、いかなる実施例に提示される技術によって計測されるものとして、同一の機能的な単離レセプター結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）よりも、９９％より大きい、９５％より大きい、９０％より大きい、８０％より大きい、７０％より大きい、６０％より大きい、５０％より大きい、４０％より大きい、３０％より大きい、２０％より大きい、または１０％より大きい、固有のエピトープに対する結合親和性を示す。
【０３４３】
（ｉｖ）エピトープ結合および活性のためのアッセイ
本発明の抗体および多価抗体について、当分野で既知のいかなる方法により、特異的（すなわち、免疫特異的）結合の測定を行い得る。使用できる免疫アッセイは、いくつかを挙げれば、ウエスタンブロット、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル内沈降反応免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインＡ免疫アッセイなどの技術を用いる競合および非競合アッセイ系を含むが、これらに限られるものではない。このようなアッセイは所定のものであり、当業者に既知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，  ｅｄｓ，  １９９４，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。模範的な免疫アッセイは下記に簡潔に（しかし、制限することを意図せずに）説明される。
【０３４４】
免疫沈降法は、一般に、タンパク質ホスファターゼおよび／またはプロテアーゼインヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）で補足されたＲＩＰＡバッファー（１％  ＮＰ-４０またはＴｒｉｔｏｎ Ｘ-１００、1％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ ７．２）、１％ Ｔｒａｓｙｌｏｌ）のような細胞溶解バッファー中で細胞集団を細胞溶解し、関心のあるエピトープ結合性タンパク質を該細胞ライセートに加え、４℃で或る時間（例えば、１〜４時間）にわたってインキュベートし、プロテインＡおよび／またはプロテインＧセファロースビーズを該細胞ライセートに加え、４℃で約１時間またはそれ以上インキュベートし、細胞溶解バッファー中で該ビーズを洗浄し、該ビーズをＳＤＳ／サンプルバッファーに再懸濁させることを含む。関心のあるタンパク質が特定の抗原を免疫沈降させる能力を、例えばウエスタンブロット分析によりアッセイすることが可能である。抗原への該エピトープ結合性タンパク質の結合を増強しバックグラウンドを減少させる（例えば、該細胞ライセートをセファロースビーズで予め清澄化する）ために修飾されうるパラメーターに関しては、当業者に認識可能であろう。免疫沈降法に関する更なる考察に関しては、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．, ｅｄｓ， １９９４，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ． １，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １０．１６．１を参照のこと。
【０３４５】
ウエスタンブロット分析は、一般に、タンパク質サンプルを調製し、ポリアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じた８％〜２０％のＳＤＳ-ＰＡＧＥ）における該タンパク質サンプルの電気泳動を行い、該ポリアクリルアミドゲルからのタンパク質サンプルをニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロンのような膜へトランスファーし、該膜をブロッキング溶液（例えば、３％ ＢＳＡまたは脱脂乳を含有するＰＢＳ）中でブロッキングし、該膜を洗浄バッファー（例えば、ＰＢＳ-Ｔｗｅｅｎ２０）中で洗浄し、ブロッキングバッファーで希釈された一次抗体で該膜をブロッキングし、該膜を洗浄バッファー中で洗浄し、ブロッキングバッファー中で希釈された酵素基質（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリフォスファターゼ）または放射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）に結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）された二次抗体（これは該一次抗体を認識する）で該膜をブロッキングし、該膜を洗浄バッファー中で洗浄し、該抗原の存在を検出することを含む。検出されるシグナルを増加させるためおよびバックグラウンドノイズを減少させるために修飾されうるパラメーターに関しては、当業者に認識可能であろう。ウエスタンブロット法に関する更なる考察は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，  １９９４，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １０．８．１を参照のこと。
【０３４６】
ＥＬＩＳＡは、抗原を調製し、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルを該抗原でコートし、検出可能な化合物、例えば酵素基質（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリフォスファターゼ）のような結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）された関心のあるエピトープ結合性タンパク質を該ウェルに加え、ある時間にわたってインキュベートし、該抗原の存在を検出することを含む。ＥＬＩＳＡにおいては、関心のあるエピトープ結合性タンパク質は、検出可能な化合物に結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）される必要はなく、その代わりに、検出可能な化合物に結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）された二次抗体（これは、関心のあるタンパク質を認識する）が該ウェルに加えられ得る。さらに、該抗原で該ウェルをコートする代わりに、関心のあるタンパク質で該ウェルをコートすることが可能である。この場合、関心のある抗原を該コート化ウェルに加えた後で、検出可能な化合物に結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）された二次抗体を加えることが可能である。検出されるシグナルを増強するために修飾されうるパラメーターおよび当技術分野で公知のＥＬＩＳＡにおける他の変数に関しては、当業者に認識可能であろう。ＥＬＩＳＡに関する更なる考察は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，  １９９４，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，  １１．２．１を参照のこと。
【０３４７】
抗原への抗体または多価抗体の結合親和性および他の結合特性は、例えば平衡法（例えば、酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または放射免疫アッセイ（ＲＩＡ））または動力学（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ登録商標分析）および他の方法、例えば間接結合アッセイ、競合結合アッセイ、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過）、ＦＡＣＳを含む当技術分野で公知の種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ法により決定され得る。これらおよび他の方法においては、検査されている１以上の成分上の標識を利用することが可能であり、および／または、色素原標識、蛍光標識、発光標識または同位体標識（これらに限定されるものではない）を含む種々の検出方法を利用することが可能である。結合アフィニティおよび動力学の詳細な説明は、抗体-免疫原相互作用を中心に説明しているＰａｕｌ，  Ｗ．Ｅ．ｅｄｓ，  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ４ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  （１９９９）において見出され得る。競合結合アッセイの一例としては、漸増量の未標識抗原の存在下、関心のあるエピトープ結合性タンパク質と共に標識抗原をインキュベートし、標識抗原に結合したエピトープ結合性タンパク質を検出することを含む放射免疫アッセイが挙げられる。特定の抗原に対する、関心のあるエピトープ結合性タンパク質のアフィニティ、および結合オフ速度（ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆｆ−ｒａｔｅ）は、スキャッチャードプロット分析によるデータから決定されうる。また、二次抗体との競合は、ラジオイムノアッセイを用いて決定されうる。この場合、漸増量の未標識二次抗体の存在下、標識化合物に結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）された関心のあるエピトープ結合性タンパク質と共に該抗原をインキュベートする。
【０３４８】
予防的および治療的使用
本発明はまた、本発明の抗体または多価抗体の、癌、炎症および自己免疫疾患を含むが、それに限定されない疾患、疾患の障害、障害に関連する１以上の症状の予防、診断、管理、治療、改善のための、単独または他の治療との組み合わせでの使用を包含する。本発明はまた、癌、炎症および自己免疫疾患を含むが、それに限定されない疾患、疾患の障害、障害に関連する１以上の症状の予防、診断、管理、治療、改善のための部分（例えば、治療剤または治療薬）と結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）または融合した本発明の抗体の、単独または他の治療との組み合わせでの使用を包含する。
【０３４９】
多数の細胞型が様々な通常の細胞表面抗原を発現し、それは細胞の定義されたサブセットを区別する抗原の特定の組み合わせである。本発明の抗原を使用して、細胞の無関係な他の集団と交差反応なしに、細胞の特異的サブセットを標的とすることが可能である。さらに、本発明の多価抗体は１から数個（２、３、４、５、６、７、８、９、１０等）の非−標的細胞集団に存在する細胞表面抗原に結合するレセプター結合ドメインを含むが、それはレセプター結合ドメインのセットの組み合わせられた親和性を有し、有効なレベルの標的細胞集団への結合（すなわち、治療的に有効なレベルの結合）をもたらす。言い換えると、いくつかのレセプター結合ドメインは特定の細胞型の標的化の促進に関与しており、それは個々の単離されたドメイン（例えば、多価抗体から単離されたもの）との結合によっては達成されないであろうものであり、または多価抗体の一部としてではない１以上の、しかし全てではない（例えばサブセット）レセプター結合ドメイン（コントロールペプチド）を同じ細胞にさらすことによっても達成されないであろう。各々のレセプター結合ドメインの相対的な親和性寄与は、関心のある特異的な細胞集団を標的とするためだけに調整されることが予想される。そのような親和性の改変は、親和性成熟、部位特異的変異、および当分野で既知の他のものなどの、当分野で受け入れられた技術で実施され得る。各々のレセプター結合ドメインの相対的な親和性寄与が多価抗体におけるレセプター結合ドメインの相対的な配向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）を変えることによって変化され得ることもまた、期待される。
【０３５０】
従って、一の実施形態において本明細書で記載されることは、本発明の多価抗体を用いて、細胞集団（例えば、哺乳類（例えば、ヒト）におけるｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ）を同定、枯渇、調節（例えば、活性化、阻害）させる方法である。いくつかの実施形態において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの標的細胞集団に対する、または哺乳類（例えば、ヒト）に投与した時の、本発明の多価抗体によって示される増加する親和性は、多価抗体から単離されたレセプター結合ドメインの１以上の、しかし全てではない（例えば、サブセット）を含む「コントロールエピトープ結合タンパク質」と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、または少なくとも２５倍である。いくつかの実施形態において、本発明の多価抗体によって示される増加する親和性は、「コントロールエピトープ結合タンパク質」の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１５０％である。
【０３５１】
いくつかの実施形態において、本発明の多価抗体は、多価抗体から単離されたレセプター結合ドメインの１以上の、しかし全てではない（例えば、サブセット）を含むコントロールレセプター結合ドメインと比較して、特定の抗原への増加する親和性を有する。いくつかの実施形態において、本発明の多価抗体によって示される増加する親和性は、コントロールレセプター結合ドメインの少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、または少なくとも１００倍、または少なくとも１０００倍である。いくつかの実施形態において、本発明の多価抗体によって示される増加する親和性は、コントロールレセプター結合ドメインの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。
【０３５２】
他の実施形態において、Ｘ個のレセプター結合ドメイン（ここで、Ｘは２から６の任意の正の整数）を含む本発明の多価抗体は、（抗体、ｓｃＦＶなどの、しかしそれに限定されない）コントロールレセプター結合タンパク質に比較して特定の抗原に対して（ｉｎ  ｖｉｔｒｏにてまたは哺乳類（例えば、ヒト）に投与した時に）増加する親和性を示す、ここで、コントロールレセプター結合タンパク質はＸ−Ｙ（ここで、ＸおよびＹは２から６までの任意の正の整数であり、ＸはＹより大きい）個のレセプター結合ドメインを含み、コントロールレセプター結合ドメインタンパク質の少なくとも一つのレセプター結合ドメインは本発明のタンパク質に存在するレセプター結合ドメインと同じエピトープに特異的である。言い換えると、本発明は、少なくとも一つのレセプター結合ドメインが本発明のタンパク質と共通の抗原に特異的であるところの、より多いまたはより少ないレセプター結合ドメインを有するコントロールレセプター結合タンパク質と比較して、特定の標的に対して増加した親和性を有する多価抗体を提供する。
【０３５３】
多価抗体におけるこのような親和性の変化は、このような治療的タンパク質（例えば、表１に記載の任意の抗体）の毒性の減少を許容する。本発明のタンパク質が、「仕立てられて適合した（ｔａｉｌｏｒ−ｆｉｔ）」親和性および／またはｉｎ  ｖｉｖｏにて毒性を減少するための親和性を示し得ることが理解される。また、そういうものとして、本発明は動物に、コントロール受容体結合タンパク質より、低い毒性を示す本発明の多価抗体を提供する。
【０３５４】
親和性の変化は、コントロールレセプター結合ドメインタンパク質の、（サイトカイン発現／放出／結合、遺伝子発現、形態変化、走化性、カルシウム流出など、成長およびシグナル伝達、を含むがそれらに限定されない）機能アッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅにより決定される結合測定、またはＫｉｎＥｘａ測定などの、すぐに利用できるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法で評価され得ることが理解される。いくつかの実施形態において、コントロールレセプター結合タンパク質は本発明の多価抗体から単離された少なくとも１個以上のレセプター結合ドメインを含み得る。例えば、８エピトープ結合ドメインを有する本発明のタンパク質に対して、コントロールレセプター結合タンパク質は、本発明のタンパク質およびコントロールタンパク質の両方に認識される抗原に特異的な少なくとも１のレセプター結合ドメインを有する、１、２、３、４、５、または６のレセプター結合ドメイン、を含み得る。
【０３５５】
一の実施形態において、本発明の多価抗体は特に、多重細胞表面抗原の発現により決定される中和細胞の同定、枯渇、活性化、阻害、または標的化のために用いられる。
【０３５６】
特定の実施形態において、本発明は、乳癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、扁平上皮癌、黒色腫を含むがこれらに限定されない、Ｗｎｔシグナル伝達経路に関連する癌の治療の方法を提供する。
【０３５７】
抗体はまた、骨粗鬆症、骨関節炎、腎多嚢胞病、糖尿病、統合失調症、血管系の病気、心臓病、非発癌の増殖性病、繊維症、およびアルツハイマー病などの神経変性疾患を含むがこれらに限定されない、Ｗｎｔシグナル伝達の以上または血管に関連する他の障害の治療または予防に使用できる。Ｗｎｔシグナル伝達経路は組織修復と再生における重要な役割を果たす。Ｗｎｔシグナル伝達に細胞を感作させる剤は、骨疾患、粘膜炎、急性および慢性の腎疾患および他のものなどの多くの症状の組織再生を促進するために使用できる。
【０３５８】
ＬＲＰ６抗体との併用療法に好適な剤は、標準的な（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性を調節できる、当分野で既知の標準治療剤（例えば、ＰＩ３キナーゼ剤）を含む。
【０３５９】
診断的使用
一の態様において、本発明は、生物学的サンプル（例えば血液、血清、細胞、組織）または癌に罹患しているかまたは癌を発症するリスクを有する個体由来のサンプルにおける、ＬＲＰ６タンパク質および／または核酸発現ならびびにＬＲＰ６タンパク質機能を測定するための、診断アッセイを含む。
【０３６０】
競合アッセイなどの診断アッセイは、共通の結合パートナー上の限られた数の結合部位について試験サンプルと分析物が競合するラベルアナログ（トレーサー）の能力に依存する。結合パートナーは一般に、競合の前または後に非可溶化され、次いで結合パートナーに結合しているトレーサーおよび分析物を結合していないトレーサーおよび分析物から分離する。この分離は傾斜法（結合パートナーが予め非可溶化された場合）または遠心分離法（競合反応後に結合パートナーを沈殿させる場合）によって実施される。試験サンプル分析物の量は、マーカー物質の量によって測定したとき、結合したトレーサーの量に反比例する。既知量の分析物で用量応答曲線を作成し、試験結果と比較して、試験サンプル中に存在する分析物の量を定量的に決定する。これらのアッセイは、検出マーカーとして酵素が使用される場合にはＥＬＩＳＡと呼ばれる。この形態のアッセイにおいて、抗体とＬＲＰ６抗体間の競合的結合は、血清サンプル中の抗体、より具体的には血清サンプル中の抗体の物差しである結合ＬＲＰ６タンパク質をもたらす。
【０３６１】
このアッセイの重要な利点は、測定が抗体を直接中和することで行われることである（すなわち、ＬＲＰ６タンパク質、特にエピトープの結合と干渉するもの）。このようなアッセイ、特にＥＬＩＳＡ試験の形態のアッセイは、臨床的環境および通常の血液スクリーニングに相当に利用される。
【０３６２】
本発明はまた、個体がＬＲＰ６に関連した障害を発症するリスクを有するかどうかを決定するための予後（予測）アッセイを提供する。例えば、ＬＲＰ６遺伝子における変異が生物学的サンプルにおいてアッセイされ得る。このようなアッセイは、予後または予測目的のために使用され、それによってＬＲＰ６タンパク質、核酸発現または活性によって特徴付けられるかまたはそれに関連した障害の発症前に、予防的に処置できる。
【０３６３】
本発明の別の態様は、個体におけるＬＲＰ６核酸発現またはＬＲＰ６タンパク質活性を測定するための方法であって、それによってその個体に適切な治療または予防薬を選択する方法を提供する（本明細書において「薬理ゲノミクス」と称する）。薬理ゲノミクスは、個体の遺伝子型（例えば特定の剤に応答する個体の能力を測定するために試験した個体の遺伝子型）に基づいて、個体の治療または予防処置のための剤（例えば薬物）を選択できる。
【０３６４】
本発明のさらに別の態様は、臨床試験におけるＬＲＰ６タンパク質の発現または活性に対する剤（例えば薬物）の影響を監視することに関する。
【０３６５】
医薬組成物
本発明の抗体または多価抗体を含む医薬組成物または無菌組成物を製造するためには、医薬上許容される担体または賦形剤と混合する。組成物は追加的に癌（乳癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、扁平上皮癌および、黒色腫）の治療または予防に好適な１以上の治療剤を含めることができる。
【０３６６】
治療および診断剤の製剤は、例えば凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液、ローションまたは懸濁液の形態で、生理的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することにより製造され得る（例えば、Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．, （２００１）  Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ‘ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．；  Ｇｅｎｎａｒｏ  （２０００）  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．； Ａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  (ｅｄｓ．)  （１９９３）  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  ＮＹ；  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （ｅｄｓ．）  （１９９０）  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：  Ｔａｂｌｅｔｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  ＮＹ；  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．）  （１９９０）  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：  Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  ＮＹ；  Ｗｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ  （２０００）  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ.Ｙ.を参照のこと）。
【０３６７】
治療のための投与計画の選択は、該物質の血清または組織ターンオーバー速度、症状のレベル、該物質の免疫原性、および生物学的マトリックスにおける標的細胞の接近性を含む幾つかの要因に左右される。ある実施形態においては、投与計画は、許容される副作用レベルと調和させて、患者に送達される治療用物質の量を最大にする。したがって、送達される生物学的製剤の量は、部分的には、個々の物質および治療される状態の重症度に左右される。抗体、サイトカインおよび小分子の適当な用量を選択する際の指針は入手可能である（例えば、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ  （１９９６）  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂ．  Ｌｔｄ，  Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，  ＵＫ；  Ｋｒｅｓｉｎａ  （ｅｄ．）  （１９９１）  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．；  Ｂａｃｈ  （ｅｄ．）  （１９９３）  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．；  Ｂａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４８：６０１−６０８；  Ｍｉｌｇｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４１：１９６６−１９７３；  Ｓｌａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４４：７８３−７９２；  Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４２：６１３−６１９；  Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４８：２４−３２；  Ｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４３：１５９４−１６０２を参照のこと）。
【０３６８】
適当な用量の決定は、例えば、治療に影響を及ぼすことまたは治療に影響を及ぼすと予想されることが当分野で既知であるまたは疑われるパラメーターおよび要因を用いて、臨床医によってなされる。一般に、投与は、最適用量より若干少ない量から開始され、ついで、いずれかの負の副作用との対比において所望のまたは最適な効果が達成されるまで、少しずつ投与量を増加させる。重要な診断尺度には、例えば炎症の症状の尺度、または産生される炎症サイトカインのレベルが含まれる。
【０３６９】
本発明の医薬組成物における有効成分の実際の投与レベルは、患者にとって毒性となることなく個々の患者、組成物および投与方法に関する所望の治療応答を達成するのに有効な有効成分量が得られるよう様々なレベルとなり得る。選択される投与レベルは、使用される本発明の個々の組成物またはそれらのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時点、使用される個々の化合物の排泄速度、治療の持続期間、使用される個々の組成物と組合せて使用される他の薬物、化合物および／または物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身健康状態および既往歴ならびに医学分野で公知の他の要因を含む種々の薬物動態学的要因に左右される。
【０３７０】
本発明の抗体を含む組成物は、連続的注入により、または例えば１日、１週間または週１〜７回の間隔での投与により投与され得る。投与は、静脈内、皮下、局所、経口的、鼻腔内、直腸、筋肉内、脳内に、または吸入により行われ得る。特定の投与プロトコルは、有意な望ましくない副作用を回避する最大用量または投与頻度を含むものである。週当たりの合計用量は、少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも０．２μｇ／ｋｇ、少なくとも０．５μｇ／ｋｇ、少なくとも１μｇ／ｋｇ、少なくとも１０μｇ／ｋｇ、少なくとも１００μｇ／ｋｇ、少なくとも０．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも５０ｍｇ／ｋｇであり得る（例えば、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４９：４２７−４３４；  Ｈｅｒｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４６：１６９２−１６９８；  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．  Ｐｓｙｃｈ．  ６７：４５１−４５６；  Ｐｏｒｔｉｅｌｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００３）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ５２：１３３−１４４を参照のこと）。多価抗体の所望の用量は、モル／ｋｇ体重に基づいた抗体またはポリペプチドの場合とほぼ同じである。多価抗体の所望の血漿濃度は、モル／ｋｇ体重に基づいた抗体の場合とほぼ同じである。該用量は、少なくとも１５μｇ、少なくとも２０μｇ、少なくとも２５μｇ、少なくとも３０μｇ、少なくとも３５μｇ、少なくとも４０μｇ、少なくとも４５μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも５５μｇ、少なくとも６０μｇ、少なくとも６５μｇ、少なくとも７０μｇ、少なくとも７５μｇ、少なくとも８０μｇ、少なくとも８５μｇ、少なくとも９０μｇ、少なくとも９５μｇ、または少なくとも１００μｇであり得る。対象に投与される投与回数は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２またはそれ以上であり得る。
【０３７１】
本発明の抗体の場合、患者に投与される投与量は０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ（患者の体重１ｋｇ当たりのｍｇ）であり得る。該投与量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜２ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、または０．０１〜０．１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重１ｋｇ当たりのｍｇ）であり得る。
【０３７２】
本発明の抗体の投与量は、キログラム（ｋｇ）単位の患者の体重とｍｇ／ｋｇ単位の投与用量とを掛け算することにより算出され得る。本発明の抗体の投与量は、１５０μｇ／ｋｇ未満、１２５μｇ／ｋｇ未満、１００μｇ／ｋｇ未満、９５μｇ／ｋｇ未満、９０μｇ／ｋｇ未満、８５μｇ／ｋｇ未満、８０μｇ／ｋｇ未満、７５μｇ／ｋｇ未満、７０μｇ／ｋｇ未満、６５μｇ／ｋｇ未満、６０μｇ／ｋｇ未満、５５μｇ／ｋｇ未満、５０μｇ／ｋｇ未満、４５μｇ／ｋｇ未満、４０μｇ／ｋｇ未満、３５μｇ／ｋｇ未満、３０μｇ／ｋｇ未満、２５μｇ／ｋｇ未満、２０μｇ／ｋｇ未満、１５μｇ／ｋｇ未満、１０μｇ／ｋｇ未満、５μｇ／ｋｇ未満、２．５μｇ／ｋｇ未満、２μｇ／ｋｇ未満、１．５μｇ／ｋｇ未満、１μｇ／ｋｇ未満、０．５μｇ／ｋｇ未満、または０．５μｇ／ｋｇ（患者の体重１ｋｇ当たりのμｇ）であり得る。
【０３７３】
本発明の抗体の単位用量は０．１ｍｇ〜２０ｍｇ、０．１ｍｇ〜１５ｍｇ、０．１ｍｇ〜１２ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、０．１ｍｇ〜８ｍｇ、０．１ｍｇ〜７ｍｇ、０．１ｍｇ〜５ｍｇ、０．１〜２．５ｍｇ、０．２５ｍｇ〜２０ｍｇ、０．２５〜１５ｍｇ、０．２５〜１２ｍｇ、０．２５〜１０ｍｇ、０．２５〜８ｍｇ、０．２５ｍｇ〜７ｍｇ、０．２５ｍｇ〜５ｍｇ、０．５ｍｇ〜２．５ｍｇ、１ｍｇ〜２０ｍｇ、１ｍｇ〜１５ｍｇ、１ｍｇ〜１２ｍｇ、１ｍｇ〜１０ｍｇ、１ｍｇ〜８ｍｇ、１ｍｇ〜７ｍｇ、１ｍｇ〜５ｍｇ、または１ｍｇ〜２．５ｍｇであり得る。
【０３７４】
本発明の抗体の投与量は、対象において少なくとも０．１μｇ／ｍｌ、少なくとも０．５μｇ／ｍｌ、少なくとも１μｇ／ｍｌ、少なくとも２μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも６μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも１５μｇ／ｍｌ、少なくとも２０μｇ／ｍｌ、少なくとも２５μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１００μｇ／ｍｌ、少なくとも１２５μｇ／ｍｌ、少なくとも１５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１７５μｇ／ｍｌ、少なくとも２００μｇ／ｍｌ、少なくとも２２５μｇ／ｍｌ、少なくとも２５０μｇ／ｍｌ、少なくとも２７５μｇ／ｍｌ、少なくとも３００μｇ／ｍｌ、少なくとも３２５μｇ／ｍｌ、少なくとも３５０μｇ／ｍｌ、少なくとも３７５μｇ／ｍｌまたは少なくとも４００μｇ／ｍｌの血清力価を達成し得る。あるいは、本発明の抗体の投与量は、対象において少なくとも０．１μｇ／ｍｌ、少なくとも０．５μｇ／ｍｌ、少なくとも１μｇ／ｍｌ、少なくとも２μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも６μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも１５μｇ／ｍｌ、少なくとも２０μｇ／ｍｌ、少なくとも２５μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１００μｇ／ｍｌ、少なくとも１２５μｇ／ｍｌ、少なくとも１５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１７５μｇ／ｍｌ、少なくとも２００μｇ／ｍｌ、少なくとも２２５μｇ／ｍｌ、少なくとも２５０μｇ／ｍｌ、少なくとも２７５μｇ／ｍｌ、少なくとも３００μｇ／ｍｌ、少なくとも３２５μｇ／ｍｌ、少なくとも３５０μｇ／ｍｌ、少なくとも３７５μｇ／ｍｌまたは少なくとも４００μｇ／ｍｌの血清力価を達成し得る。
【０３７５】
本発明の抗体の投与は反復可能であり、それらの投与は、少なくとも１日間、２日間、３日間、５日間、１０日間、１５日間、３０日間、４５日間、２ヶ月間、７５日間、３ヶ月間または少なくとも６ヶ月間、隔てられ得る。
【０３７６】
個々の患者に対する有効量は、治療される状態、患者の全身健康状態、投与の方法、経路および用量ならびに副作用の重症度などの要因によって様々となり得る（例えば、Ｍａｙｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ＳＯＰｓ  ｆｏｒ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  Ｆｌａ．；  Ｄｅｎｔ  （２００１）  Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｕｒｃｈ  Ｐｕｂｌ．，  Ｌｏｎｄｏｎ，  ＵＫを参照のこと）。
【０３７７】
投与の経路は、例えば、皮膚適用、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、脳脊髄内、病変内への注射または注入、あるいは徐放系またはインプラントによるものであり得る（例えば、Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８３）  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６；  Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８１）  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．  １５：１６７−２７７；  Ｌａｎｇｅｒ， （１９８２）  Ｃｈｅｍ．  Ｔｅｃｈ．  １２：９８−１０５；  Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８５）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：３６８８−３６９２；  Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８０）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４０３０−４０３４；米国特許第６，３５０，４６６および６，３１６，０２４号を参照のこと）。必要に応じて、該組成物は、可溶化剤、および注射部位の疼痛を低減するための局所麻酔薬、例えばリドカインをも含み得る。また、例えば吸入器またはネブライザーの使用およびエアゾール化剤の配合により、肺投与も行われうる。例えば、米国特許第６，０１９，９６８、５，９８５，３２０、５，９８５，３０９、５，９３４，２７２、５，８７４，０６４、５，８５５，９１３、５，２９０，５４０および４，８８０，０７８号；ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／４４０１３、ＷＯ９８／３１３４６およびＷＯ９９／６６９０３号公報（各々の全体を出典明示により本明細書に組み入れる）を参照のこと。
【０３７８】
また、本発明の組成物は、当技術分野で公知の種々の方法の１以上を用いて、１以上の投与経路で投与されうる。当業者に理解されるとおり、投与の経路および／または方法は、所望の結果に応じて様々となろう。本発明の抗体に関する選択される投与経路には、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口投与経路、例えば注射または注入が含まれる。非経口投与は経腸および局所投与以外の投与方法に相当しうるものであり、通常は注射によるものであり、限定的なものではないが静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外および胸骨内の注射および注入を包含する。一の実施形態において、本発明の抗体は注入により投与される。他の実施形態において、本発明の抗体は皮下に投与される。
【０３７９】
本発明の抗体が制御放出または徐放系で投与される場合には、制御放出または徐放を達成するためにポンプが使用され得る（例えば、Ｌａｎｇｅｒ，  ｓｕｐｒａ；  Ｓｅｆｔｏｎ，  １９８７，  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｆ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．  １４：２０；  Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０，  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７；  Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３２１：５７４を参照のこと）。本発明の治療用物質の制御放出または徐放を達成するためには、高分子物質が使用され得る（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ  （ｅｄｓ．），  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  Ｆｌａ．  （１９７４）；  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，  Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，  Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ  （ｅｄｓ．），  Ｗｉｌｅｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８４）；  Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ，  １９８３，  Ｊ．，  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｓｃｉ．  Ｒｅｖ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２３：６１を参照のこと；  また、Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０；  Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ２５：３５１；  Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．  ７  １：１０５；  米国特許第５，６７９，３７７号；  米国特許第５，９１６，５９７号；  米国特許第５，９１２，０１５号；  米国特許第５，９８９，４６３号；  米国特許第５，１２８，３２６号；  ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／１５１５４号公報；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／２０２５３号公報も参照のこと）。徐放製剤において使用される重合体の具体例には、限定的なものではないが以下のものが含まれる：ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリラート）、ポリ（メチルメタクリラート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コ−ビニルアセタート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、およびポリオルトエステル。１の実施形態において、徐放製剤において使用される高分子は不活性であり、浸出性不純物を含有せず、貯蔵時に安定であり、無菌であり、生分解性である。制御放出または徐放系は予防または治療標的に接近して配置され、したがって、全身投与量のごく一部を要するに過ぎない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ｓｕｐｒａ，  ｖｏｌ．  ２，  ｐｐ．  １１５−１３８  （１９８４）を参照のこと）。
【０３８０】
制御放出系はＬａｎｇｅｒ  （（１９９０），  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３）による総説において考察されている。本発明の１以上の抗体を含む徐放製剤を製造するためには、当業者に既知の任意の技術が用いられ得る。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号，PCT公開ＷＯ９１／０５５４８号公報，PCT公開ＷＯ９６／２０６９８号公報，  Ｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６），  ”Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｈｙ  ｏｆ  ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｇｅｌ，”  Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ＆  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３９：１７９−１８９，  Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５），  ”Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｌｕｎｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｌｏｎｇ−Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ，”  ＰＤＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５０：３７２−３９７，  Ｃｌｅｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７），  ”Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｆｏｒ  ａ  ｂＦＧＦ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”  Ｐｒｏ．  Ｉｎｔ’ｌ．  Ｓｙｍｐ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌ．  Ｂｉｏａｃｔ．  Ｍａｔｅｒ．  ２４：８５３−８５４，  およびＬａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７），  ”Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｌｏｃａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”  Ｐｒｏｃ．  Ｉｎｔ’ｌ．  Ｓｙｍｐ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．  Ｂｉｏａｃｔ．  Ｍａｔｅｒ．  ２４：７５９−７６０（各々の全体を出典明示により本明細書に組み入れる）を参照のこと。
【０３８１】
本発明の抗体を局所投与する場合、それは、軟膏剤、クリーム剤、経皮パッチ、ローション剤、ゲル剤、シャンプー、噴霧剤、エアゾール剤、溶液剤（水剤）、乳剤または当業者によく知られた他の形態で製剤化され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  １９ｔｈ  ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．  （１９９５）を参照のこと。非噴霧可能局所剤形の場合、局所適用に適しており幾つかの場合には水より大きな粘性率を有する担体または１以上の賦形剤を含む粘性ないし半固体または固体形態が典型的に使用される。適当な製剤には、溶液剤（水剤）、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、散剤、リニメント剤、ロウ剤などが含まれるがこれらに限定されるものではなく、これらは、所望により、滅菌され、または例えば浸透圧のような種々の特性に影響を及ぼすための補助物質（例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤、バッファーまたは塩）と混合される。他の適当な局所剤形には、噴霧可能なエアゾール剤が含まれ、この場合、有効成分は、いくつかの場合には固体または液体不活性担体と組合されており、加圧揮発性物質（例えば、気体プロペラント、例えばフレオン）との混合物として、またはスクィーズボトル内に充填される。所望により、医薬組成物および剤形に保湿剤または湿潤剤も加えられうる。そのような追加的成分の具体例は当分野で周知である。
【０３８２】
抗体を含む組成物を鼻腔内に投与する場合には、それは、エアゾール形態、噴霧剤、ミストまたは滴剤の形態で製剤化され得る。
【０３８３】
第２の治療剤、例えばサイトカイン、ステロイド、化学療法剤、抗生物質または放射線による共投与または治療のための方法は当分野で既知である（例えば、Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （ｅｄｓ．）  （２００１）  Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  １０．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄ．，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．；  Ｐｏｏｌｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  （ｅｄｓ．）  （２００１）  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｐｈｉｌａ．，  Ｐａ．；  Ｃｈａｂｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇｏ  （ｅｄｓ．）  （２００１）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｐｈｉｌａ．，  Ｐａ．を参照のこと）。治療用物質の有効量は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも約３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％、症状を軽減し得る。
【０３８４】
本発明の抗体と組合せて投与されうる追加的な療法（例えば、予防または治療剤）は、本発明の抗体から５分未満を隔てて、３０分未満を隔てて、１時間未満を隔てて、約１時間を隔てて、約１〜約２時間を隔てて、約２時間〜約３時間を隔てて、約３時間〜約４時間を隔てて、約４時間〜約５時間を隔てて、約５時間〜約６時間を隔てて、約６時間〜約７時間を隔てて、約７時間〜約８時間を隔てて、約８時間〜約９時間を隔てて、約９時間〜約１０時間を隔てて、約１０時間〜約１１時間を隔てて、約１１時間〜約１２時間を隔てて、約１２時間〜１８時間を隔てて、１８時間〜２４時間を隔てて、２４時間〜３６時間を隔てて、３６時間〜４８時間を隔てて、４８時間〜５２時間を隔てて、５２時間〜６０時間を隔てて、６０時間〜７２時間を隔てて、７２時間〜８４時間を隔てて、８４時間〜９６時間を隔てて、または９６時間〜１２０時間を隔てて投与され得る。それらの２以上の療法は患者の１回の同じ来院時に投与され得る。
【０３８５】
本発明の抗体およびその他の療法は周期的に投与されうる。周期的（ｃｙｃｌｉｎｇ）療法は、ある期間にわたる第１療法（例えば、第1の予防または治療剤）の投与、およびそれに続く、ある期間にわたる第２療法（例えば、第２の予防または治療剤）の投与、および場合によってはそれに続く、ある期間にわたる第３療法（例えば、予防または治療剤）などの投与、ならびにこの連続的投与の反復を含み、該周期は、それらの療法の１つに対する耐性の発生を低減するため、および／またはそれらの療法の１つの副作用を回避または軽減するため、および／またはそれらの療法の効力を改善するためのものである。
【０３８６】
ある実施形態において、本発明の多価抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける適切な分布が確保されるよう製剤化され得る。例えば、血液−脳関門（ＢＢＢ）は多数の高親水性化合物を排除する。本発明の治療用化合物が（所望により）ＢＢＢを通過することを保証するために、それらは例えばリポソーム中に製剤化されうる。リポソームの製造方法に関しては、例えば、米国特許第４，５２２，８１１、５，３７４，５４８および５，３９９，３３１号を参照のこと。リポソームは、標的化薬物送達を促進するよう特定の細胞または器官へ選択的に輸送される１以上の部分を含み得る（例えば、Ｖ．Ｖ．  Ｒａｎａｄｅ  （１９８９）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２９：６８５を参照のこと）。典型的な標的化部分には、ホラートまたはビオチン（例えば、Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌの米国特許第５，４１６，０１６号を参照のこと）；マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １５３：１０３８）；抗体（Ｐ．Ｇ．  Ｂｌｏｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３５７：１４０；  Ｍ．  Ｏｗａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ３９：１８０）；界面活性剤プロテインＡ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １２３３：１３４）；ｐ１２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：９０９０）（Ｋ．  Ｋｅｉｎａｎｅｎ；  Ｍ．Ｌ．  Ｌａｕｋｋａｎｅｎ  （１９９４）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３４６：１２３；  Ｊ．Ｊ．  Ｋｉｌｌｉｏｎ；  Ｉ．Ｊ．  Ｆｉｄｌｅｒ  （１９９４）  Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２７３も参照のこと）が含まれる。
【０３８７】
本発明は、本発明の抗体を含む医薬組成物を、単独でまたは他の療法と組合せて、それを要する対象に投与するための方法を提供する。本発明の組合せ療法の療法（例えば、予防または治療剤）は同時または連続的に対象に投与され得る。本発明の組合せ療法の療法（例えば、予防または治療剤）は周期的にも投与され得る。周期的（ｃｙｃｌｉｎｇ）療法は、ある期間にわたる第１療法（例えば、第１の予防または治療剤）の投与、およびそれに続く、ある期間にわたる第２療法（例えば、第２の予防または治療剤）の投与、ならびにこの連続的投与の反復を含み、該周期は、それらの療法（例えば、剤）の１つに対する耐性の発生を低減するため、および／またはそれらの療法（例えば、剤）の１つの副作用を回避または低減するため、および／またはそれらの療法の効力を改善するためのものである。
【０３８８】
本発明の組合せ療法の療法（例えば、予防または治療剤）は同時に対象に投与され得る。「同時」なる語は、厳密に同一時点での療法（例えば、予防または治療剤）の投与に限定されるものではなく、本発明の抗体がその他の療法と共に作用して、それらがそれ以外の様態で投与された場合に比べて増加した利益をもたらし得るように或る順序および時間間隔で、本発明の抗体を含む医薬組成物が対象に投与されることを意味する。例えば、各療法は、同時に、または異なる時点においていずれかの順序で連続的に対象に投与され得るが、それらは、所望の治療または予防効果が得られるよう時間的に十分に接近して投与されるべきである。各療法は、任意の適当な形態および任意の適当な経路で、別々に対象に投与されうる。種々の実施形態においては、該療法（例えば、予防または治療剤）は、１５分未満を隔てて、３０分未満を隔てて、１時間未満を隔てて、約１時間を隔てて、約１〜約２時間を隔てて、約２時間〜約３時間を隔てて、約３時間〜約４時間を隔てて、約４時間〜約５時間を隔てて、約５時間〜約６時間を隔てて、約６時間〜約７時間を隔てて、約７時間〜約８時間を隔てて、約８時間〜約９時間を隔てて、約９時間〜約１０時間を隔てて、約１０時間〜約１１時間を隔てて、約１１時間〜約１２時間を隔てて、２４時間を隔てて、４８時間を隔てて、７２時間を隔てて、または１週間を隔てて、対象に投与され得る。他の実施形態において、２以上の療法（例えば、予防または治療剤）は患者の同一来院時に投与され得る。
【０３８９】
該組合せ療法の予防または治療剤は同一医薬組成物中で対象に投与され得る。あるいは、該組合せ療法の予防または治療剤は別々の医薬組成物中で同時に対象に投与され得る。該予防または治療剤は、同じまたは異なる投与経路により対象に投与され得る。
【０３９０】
本発明は完全に説明され、さらに以下の実施例および請求項により例示されるが、これは一例であり、さらなる限定を意味するものではない。
【実施例】
【０３９１】
方法および材料
【０３９２】
１：パンニング、抗体同定および特性化
【０３９３】
（ａ）パンニング
【０３９４】
（ｉ）ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）パンニング
【０３９５】
ヒトＬＲＰ６を認識する抗体の選択のために、いくつかのパンニング戦略を応用した。ヒトＬＲＰ６タンパク質に対する治療的抗体を、抗体変異体タンパク質の源として、市販のファージディスプレイライブラリーであるＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ライブラリーを用いて高結合親和性を有するクローンを選択することによって作出した。
【０３９６】
ファージミドライブラリーは、ＨｕＣＡＬ（登録商標）コンセプト（Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６：５７−８６）に基づくものであり、そして、ファージ表面上でＦａｂ提示するためのＣｙｓＤｉｓｐｌａｙＴＭ（ＬｏｈｎｉｎｇによるＷＯ０１／０５９５０）を採用する。
【０３９７】
詳細には、現在のプロジェクトにおいて用いられたＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ライブラリーは、（Ｒｏｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ）に記載されている。ヘルパーファージＶＣＳＭ１３を用いて産生された、またはＨｙｐｅｒファージを用いて産生されたファージミド（Ｒｏｎｄｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９：７５−７８）が抗−ＬＲＰ６抗体の選択のために使用された。
【０３９８】
（ｉｉ）ＬＲＰ６に対する全体細胞パンニング
【０３９９】
全体細胞パンニングのために、ｅＧＦＰに融合したＬＲＰ６のアミノ末端断片（アミノ酸１−１４８２）を発現する細胞株ＨＥＫ２９３−ｈＬＲＰ６ΔＣ−ｅＧＦＰを用いた。特異的ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）抗体ファージミドを、培養後、ＬＲＰ６を発現する細胞株を溶出し、続いて、ＨＥＫ２９３−ＬＲＰ５／６−ｓｈＲＮＡ細胞への後−吸着を行った。結果として生じたＨｕＣＡＬファージ−含有上清を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞上にタイターし、そして、ヘルパーファージを用いたＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞の感染の後に、レスキューした。ポリクローナル増幅ファージ出力を、再度タイターし、そして、連続的選択工程において使用した。
【０４００】
（ｉｉｉ）ＬＲＰ６に対するＦｃ捕獲パンニング
【０４０１】
Ｆｃ捕獲パンニングについては、Ｆｃ−捕獲ＬＲＰ６−Ｆｃを用いてブロックしたファージを培養して、そして、異なる濃度のＰＢＳＴを、および異なる回数のＰＢＳを用いて非特異的ファージを洗い流した。
【０４０２】
残存するファージを、溶出し、そして、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細菌の感染のために直ちに使用した。増幅、ファージ生産、および出力タイター測定は、ＬＲＰ６に対する全体細胞パンニングにおいて前述したように実施した。
【０４０３】
（ｉｖ）ＬＲＰ６に対する差次的全体細胞パンニング
【０４０４】
ＨＥＫ２９３−ｈＬＲＰ６ΔＣ−ｅＧＦＰ細胞上の抗体選択、および組換えヒトＬＲＰ６−Ｆｃ上の選択を用いる差次的全体細胞パンニングを、全体細胞パンニングについて、およびＦｃ捕獲パンニングについて前述したように実施した。
【０４０５】
選択プロセスの間、非特異的ファージを、異なる濃度のＰＢＳを、および異なる期間のＰＢＳＴを用いて除去した。
【０４０６】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１のファージ感染、増幅、ファージ生産、および出力タイター測定を、ＬＲＰ６に対する全体細胞パンニングにおいて前述したように実施した。
【０４０７】
（ｖ）ＬＲＰ６に対する半溶液パンニング
【０４０８】
半溶液パンニングのために、組換えヒトＬＲＰ６−Ｆｃ、およびＢＳＡを、トシル活性化Ｍ−２８０−Ｄｙｎａビーズに共有結合した。
【０４０９】
回転器上で、ＬＲＰ６−被覆ビーズとともに、前処理したファージを培養した。ビーズを、次に、磁気選別機を用いて回収し、そして、ＰＢＳＴおよびＰＢＳで洗浄した。ビーズ−結合ファージを、溶出し、そして、直ちにＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細菌の感染のために用いた。ファージ感染、増幅、ファージ生産、および出力タイター測定は、ＬＲＰ６に対する全体細胞パンニングにおいて前述したように実施した。
【０４１０】
（ｂ）選択されたＦａｂ断片のマイクロ発現、およびサブクローニング
【０４１１】
可溶性Ｆａｂの迅速な発現を促進するために、選択されたＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ファージのＦａｂをコードする挿入物を、発現ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿ＦＨ、またはｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿ＦＳにサブクローン化した。ＴＧ１−Ｆの形質転換の後、ＨｕＣＡＬ（登録商標）−Ｆａｂ断片を含有するペリプラズム抽出物の単一クローン発現、および調製を、前述のようにして行った（Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３））。
【０４１２】
２：スクリーニング
【０４１３】
（ｉ）ＨＥＫ２９３−ｈＬＲＰ６ΔＣ−ｅＧＦＰ細胞でのＦＡＣＳスクリーニング
【０４１４】
パンニング戦略全体細胞パンニング、差次的全体細胞パンニング、および半溶液パンニングによって選択されたクローンを、ＨＥＫ２９３−ｈＬＲＰ６ΔＣ−ｅＧＦＰ細胞、およびＨＥＫ２９３−ＬＲＰ５／６−ｓｈＲＮＡ細胞に対するフローサイトメトリーによって、カウンタースクリーニングのためにスクリーニングした。上記のＦｃ捕獲パンニング戦略の第一次的ヒットも、フローサイトメトリーによって試験した。
【０４１５】
細胞を、７０〜８０％密集度で採取し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、そして、９６ウェルＵ−底マイクロタイタープレートにおいて細菌細胞溶解物で染色した。抗体結合を、蛍光色素−接合検出抗体で明らかにした。染色した細胞を二度洗浄し、そして、ＦＡＣＳＡｒｒａｙ機器（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて平均蛍光強度を、測定および分析した。
【０４１６】
（ｉｉ）組換えヒトＬＲＰ６−Ｆｃ上でのＦｃ−捕獲スクリーニング
【０４１７】
Ｆｃ−捕獲パンニングにおいて選択されたクローンを、Ｆｃ−捕獲−ＥＬＩＳＡ装置においてスクリーニングした。
【０４１８】
Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）３８４ウェルプレートを、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的抗体で被覆した。ＰＢＳＴで洗浄し、ウェルをブロッキングした後、組換えヒトＬＲＰ６−Ｆｃを添加した。被覆したプレートを洗浄した後、細胞溶解物を添加し、そして、基質Ａｔｔｏｐｈｏｓを有するＡＰ−接合ヤギＩｇＧ抗−ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）２を用いて結合Ｆａｂ断片を検出した。蛍光を、Ｔｅｃａｎプレートリーダーを用いて５３５ｎｍで読み取った。
【０４１９】
３：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＨｕＣＡＬ（登録商標）−Ｆａｂ抗体の発現、および精製
【０４２０】
ＴＧ−１細胞におけるｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ１１＿Ｆａｂ＿ＦＨまたはｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨによってコードされるＦａｂ断片の発現を、ＩＰＴＧの添加によって誘導した。Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ドイツ）によって単離したＦａｂ断片およびリゾチームを用いて細胞を、破壊した。タンパク質濃度を、ＵＶ−分光光度法によって測定した。ＨＰ−ＳＥＣによって天然（ｎａｔｉｖｅ）状態で、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて変性し、還元した状態で、Ｆａｂ断片の純度を分析した。
【０４２１】
４：親和性決定
【０４２２】
（ｉ）表面プラズモン共鳴測定
【０４２３】
ＫＤ値の測定のために、表面プラズモン共鳴技術を適用した。ＬＲＰ６−Ｆｃ−融合物を捕獲するために、抗−ヒト−Ｆｃ−捕獲ＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、スウェーデン）を使用し、続いて、異なる濃度でリガンド（Ｆａｂ）注入を行った。
【０４２４】
（ｉｉ）Ｓｅｃｔｏｒ  ｉｍａｇｅｒ  ６０００（ＭＳＤ）用いたＫＤ決定のための溶液平衡滴定（ＳＥＴ）方法
【０４２５】
溶液平衡滴定（ＳＥＴ）によるＫＤ決定のために、抗体タンパク質のモノマー画分を使用した（分析的ＳＥＣによる分析によって、少なくとも９０％モノマー含有量；それぞれ、ＦａｂについてＳｕｐｅｒｄｅｘ７５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、またはＩｇＧについてはＴｏｓｏｈ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））。
【０４２６】
溶液における親和性決定は、基本的には、文献（Ｆｒｉｇｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ７７：３０５−３１９）において説明されたように行った。ＳＥＴ方法の感度および精度を向上させるために、伝統的なＥＬＩＳＡからＥＣＬベースの技術（Ｈａｅｎｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３９：１８２−１８４）に、それを、移した。
【０４２７】
特注フィティングモデルを適用するＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ）ソフトウェアでデータを評価した。Ｆａｂ分子のＫＤ決定のために、Ａｂｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ９：４５６−４６１に従い修正したフィットモデル（上記のＨａｅｎｅｌ  ｅｔ  ａｌによる）を用いた。
【０４２８】
【数１】
2020063262.tif 000027
【０４２９】
［Ｆａｂ］ｔ：適用した総Ｆａｂ濃度
ｘ：適用した総可溶性抗原濃度（結合部位）
Ｂｍａｘ：抗原なしのＦａｂの最大シグナル
ＫＤ：親和性
【０４３０】
５：親和性成熟後のスクリーニング
【０４３１】
ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞上のＥＣ５０決定
【０４３２】
ＡＣＳ測定において親ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞についてＥＣ５０値を測定した。典型的な抗体滴定曲線は、１０〜１２の異なる抗体希釈を含有し、そして、約１５０〜２００μｇ／ｍＬ（最終濃度）の濃度で、滴定は開始した。Ａｃｃｕｔａｓｅを用いて細胞を採取し、ＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁し、９６ウェルプレートのウェルに撒き、そして、抗体希釈物で染色した。ＥＣ５０値を、非線形回帰分析を用いるプログラムＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍで決定した。
【０４３３】
６：ＩｇＧへの変換
【０４３４】
ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ４、ヒトＩｇＧ４＿Ｐｒｏ、およびヒトＩｇＧ１ｆ  ＬＡＬＡについて、全長ＩｇＧを発現させるために、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変ドメイン断片をＦａｂ発現ベクターから適切なｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈＩｇベクターにサブクローニングした。
【０４３５】
７：ヒトＩｇＧの一過的発現および精製
【０４３６】
等量の、ＩｇＧ（ｐＭＯＲＰＨ４）の重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターＤＮＡ、またはＩｇＧ重鎖および軽鎖発現ベクター（ｐＭＯＲＰＨ２）で真核性ＨＫＢ１１細胞をトランスフェクトした。除菌の後、溶液に、標準プロテインＡ親和性クロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳＵＲＥ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を受けさせた。タンパク質濃度を、ＵＶ−分光光度法によって測定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、変性、還元、および非還元条件下で、またはＨＰ−ＳＥＣによって、天然（ｎａｔｉｖｅ）状態で、かつ、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒを用いることによって、ＩｇＧの純度を、分析した。
【０４３７】
８：Ｗｎｔレポーター遺伝子分析
【０４３８】
抗−ＬＲＰ６抗体のＷｎｔシグナルを阻害する能力を、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ａ応答ルシフェラーゼレポーター遺伝子分析において試験した。Ｗｎｔ３ａ調整培地で、または、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａ、もしくは他のＷｎｔ発現プラスミドの共−トランスフェクションによって、細胞を、刺激した。
【０４３９】
（ｉ）調整培地でのＷｎｔ３ａレポーター遺伝子分析
【０４４０】
１０４ＨＥＫ２９３−ＳＴＦ細胞／ウェルを、９６ウェル組織培養プレートに撒き、そして、１００μＬ培地において、３７℃／５％ＣＯ２で一晩細胞を培養した。
【０４４１】
次の日、純粋物において、またはＷｎｔ３ａ−調整培地における希釈物において、様々な抗−ＬＲＰ６抗体希釈物、およびＤＫＫ１希釈物（陽性対照）を調製した。６０μＬ／ウェルの上清を９６ウェル組織培養プレートから除去し、そして、６０μＬ／ウェルの調整培地／抗体希釈物で交換した。
【０４４２】
３７℃／５％ＣＯ２での１６〜２４時間の培養の後、１００μＬ  ＢｒｉｇｈｔＧｌｏルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、添加し、そして、プレートを、１０分間、培養した。発光読み出し（Ｔｅｃａｎプレートリーダー）のために、細胞溶解物を、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｔ＃３９１７）に移した。
【０４４３】
同様の分析は、Ｗｎｔ３またはＷｎｔ３ａ過剰−発現細胞（たとえば、ＣＨＯ−Ｋ１、ＴＭ３、ＬまたはＨＥＫ２９３細胞）の共培養を用いて行うこともできる。
【０４４４】
（ｉｉ）一時的にトランスフェクトした細胞でのＷｎｔ１／Ｗｎｔ３ａレポーター遺伝子分析
【０４４５】
３ｘ１０４ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞／ウェルを、９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に撒き、そして、表３において説明したように、１００μＬ培地において、３７℃／５％ＣＯ２で細胞を、培養した。１２〜１６時間後、空ベクターＷｎｔ発現プラスミド１ｎｇ／ウェル；ｐＴＡ−Ｌｕｃ−１０ｘＳＴＦ（ホタルルシフェラーゼコンストラクト）５０ｎｇ／ウェル；またはｐｈＲＬ−ＳＶ４０（Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼコンストラクト）０．５ｎｇ／ウェルで細胞をトランスフェクトした。
【０４４６】
上で列挙したプラスミドおよび０．２μＬ  ＦｕＧｅｎｅ６／ウェル（Ｒｏｃｈｅ）を含有するトランスフェクションプレミックス（１０μＬ／ウェル）を調製した。トランスフェクションプレミックスを、ＲＴ（室温）で１５分培養し、そして、ウェルに撒いた。プレートを、４００ｒｐｍで２分間、ＲＴ（室温）で振盪し、そして、３７℃／５％ＣＯ２で４時間、培養した。その間、抗体を、培地において希釈し、そして、トランスフェクトした細胞（７５μＬ／ウェル）に添加した。
【０４４７】
１８〜２４時間後、７５μＬ／ウェルＤｕａｌＧｌｏルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、そして、ホタルルシフェラーゼ活性の読み出しの前の細胞溶解のためにプレートを１０分間、振盪した。発光読み出しの後、７５μＬ／ウェルＤｕａｌＧｌｏ  Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏｗ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、そして、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性を決定するために発光を再度測定した。
【０４４８】
分析のために、ホタルルシフェラーゼ活性およびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性の間の比を計算した。抗−ＬＲＰ６抗体のＩＣ５０−決定のために、相対的ルシフェラーゼ値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて分析した。
【０４４９】
同様の分析は、Ｗｎｔ１または他のＷｎｔ１クラスリガンド過剰発現細胞（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１、ＴＭ３、ＬまたはＨＥＫ２９３細胞）の共−培養を用いて行うこともできる。
【０４５０】
９：ＦＡＣＳ酵素反応性研究
【０４５１】
ネズミおよびカニクイザルＬＲＰ６に対する交差−種反応性を、ＦＡＣＳ分析によって、細胞で測定した。ＦＡＣＳ染色は、本質的に上記のように行った。ヒトＵ２６６細胞（ＬＲＰ６の非発現）を、陰性対照として用いた。
【０４５２】
ネズミＬＲＰ６に対する交差反応性を、ネズミＮＩＨ−３Ｔ３細胞上で試験した。カニクイザル細胞株Ｃｙｎｏｍ−Ｋ１上で、および一時的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞上で、カニクイザルＬＲＰ６に対する交差反応性を試験した。
【０４５３】
ヒト細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ／１７上でのカニクイザル交差反応性を試験するために、メーカーの使用説明書にしたがって、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞を一時的にトランスフェクトした。ヒトＬＲＰ６発現プラスミドｐＣＭＶ６＿ＸＬ４＿ＬＲＰ６およびシャペロン−コードプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｆｌａｇ＿ＭＥＳＤの混合物で、または、ｐｃＤＮＡ３．１−ｎＶ５−ＤＥＳＴ＿ｃｙｎｏＬＲＰ６およびｐｃＤＮＡ３．１−ｆｌａｇ＿ＭＥＳＤの混合物（カニクイザルＬＲＰ６の過剰発現）で、細胞をトランスフェクトした。５０μｇのＬＲＰ６発現プラスミドおよび２０μｇのＭＥＳＤ発現プラスミドを、Ｔ１７５フラスコごとに用いた。２４時間後、細胞を分離し、そして、ヤギ抗ヒトＬＲＰ６コントロール抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で、および抗−ＬＲＰ６  ＨｕＣＡＬ抗体で染色した。模造−トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞を、陰性対照染色（低内因性ＬＲＰ６発現）のために用いた。
【０４５４】
１０：バインダー最適化
【０４５５】
親和性成熟ライブラリーの作出
【０４５６】
選択した抗体断片の親和性および生物学的活性を増大させるために、トリヌクレオチド指向突然変異生成を用いるカセット突然変異生成によってＬ−ＣＤＲ３およびＨＣＤＲ２領域を、並行して最適化した。一方、フレームワーク領域は、一定を保持した。
【０４５７】
標準クローニング手順、およびエレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）への多様化したクローンの形質転換によって、異なる親和性成熟ライブラリーを、作出した。ランダムにピックアップしたクローンの配列決定は、１００％の多様性を示した。ピックアップしたクローンの内には、親バインダ−は、見出されなった。最後に、全てのライブラリーのファージを別異に調製した。
【０４５８】
１１：ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１異種移植
【０４５９】
ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１トランスジェニックマウスからの腫瘍を、ヌードマウスの乳房脂肪体への移植に先立ち、ＦＶＢマウスの乳房脂肪体において、腫瘍片として、５代培養した。移植後１１日、腫瘍が約１１０ｍｍ３の平均容量に到達したとき、マウスを、１群ごとに８マウスを有する３群に無作為に選択し、そして３日ごとに、服薬させた（ＤｅＡｌｍｅｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６７：５３７１−９）。
【０４６０】
１２：生化学分析における阻害
【０４６１】
１０％ウシ胎仔血清を追加したＤ−ＭＥＭにおいて、３７℃で５％ＣＯ２でＨＥＫ２９３細胞を増殖させた。細胞を、３ｘ１０４／ウェルで９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に撒き、そして、０．２μＬ／ウェルＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）と混合した０．５ｎｇ／ｍｌ  ｐｈＲＬ−ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ）、５０ｎｇ／ウェルＳＴＦレポーター、および０．１ｎｇ／ウェルＷｎｔ発現プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後、抗体をＰＢＳに希釈し、そして、トランスフェクトした細胞に添加した。１８時間培養後、ホタルルシフェラーゼおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性を、ＤｕａｌＧｌｏルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）用いて測定した。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼは、トランスフェクション効率を標準化するために用いた。
【０４６２】
試験した全てのＩｇＧフォーマットは、Ｗｎｔ１（２、６、７Ａ、７Ｂ、９、１０Ａ、１０Ｂ）作出正準シグナルの強力かつ完全な阻害を有する。全ては、Ｗｎｔ３／３Ａ作出シグナルの存在下で、ベル型の相乗作用曲線を生じさせる。
【０４６３】
１３：ＦＡＣＳ−ベースの競合分析
【０４６４】
ＦＡＣＳベースの競合分析のために、抗−ＬＲＰ６  Ｆａｂおよび陰性対照Ｆａｂ  ＭＯＲ０３２０７を、メーカーの使用説明書にしたがって、ＥＣＬタンパク質ビオチン化モジュール（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてビオチン化した。ビオチン化したＦａｂをＨＥＫ２９３−ｈＬＲＰ６ΔＣ−ｅＧＦＰ細胞上のＦＡＣＳ染色に、一定のＦａｂ濃度（２０ｎＭ最終濃度）で用いて、そして、１００−倍モル過剰の非ラベルＦａｂと競合させた。１時間、４℃でプレートシェーカー上で細胞を、Ｆａｂ希釈物とともに培養した。細胞１ｘをＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、それらを、暗闇下で、プレートシェーカー上で、４℃で１時間、ＰＥ−接合ストレプトアビジン（Ｄｉａｎｏｖａ）とともに培養した。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、そして、ＦＡＣＳ  Ａｒｒａｙ（ＢＤ）を用いて蛍光を測定した。同様に、非ビオチン化抗−ＬＲＰ６  Ｆａｂを、１００倍モル過剰のＬＲＰ６−結合タンパク質ＳＯＳＴと競合させ、そして、細胞に対するＦａｂの結合を、ＰＥ−接合抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）によってモニターした。
【０４６５】
１４：免疫ブロット分析
【０４６６】
総細胞溶解物を、ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ−４０、０．５％  デオキシコール酸ナトリウム、０．１％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で、調製した。溶解物を、タンパク質濃度について標準化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し、ニトロセルロースメンブレンにトランスファーし、そして、指定の抗体でプローブした。ｐＴ１４７９  ＬＲＰ６抗体は、満足のいく結果を達成するためには、メンブレン抽出物の作出を必要とする。メンブレン抽出物の作出のために、細胞を、４つの冷凍−解凍サイクルを行うことによって低張緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＫＣｌ）において溶解し、そして、非可溶性メンブレン画分を、ＲＩＰＡ緩衝液を用いて可溶化した。プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ）および１ｘホスファターゼインヒビターカクテル（Ｕｐｓｔａｔｅ）を、溶解緩衝液に添加した。ウェスタンブロット分析において用いられる市販の抗体は、ウサギ抗−ＬＲＰ６、ウサギ抗−ｐＴ１４７９  ＬＲＰ６、およびウサギ抗−ｐＳ１４９０  ＬＲＰ６抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含む。
【０４６７】
実施例１：ＦＡＣＳによる内因性ＬＲＰ６に対する抗−ＬＲＰ６抗体の特異的結合
【０４６８】
ＬＲＰ６の内因性細胞表面発現の検出は、抗−ＬＲＰ６抗体およびＦＡＣＳ分析を用いて多数の腫瘍細胞について検討した。図１Ａに示すように、ＰＡ１細胞は、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６  ｍＲＮＡの両方を発現するのに対して、Ｕ２６６およびＤａｕｄｉ細胞は、ＬＲＰ６  ｍＲＮＡを発現しない。ＰＡ１細胞は、プロペラ１抗−ＬＲＰ６  ＩｇＧでの有意な染色を示すが、Ｕ２６６およびＤａｕｄｉ細胞はそうではない。より重要なことに、Ｕ２６６細胞は、抗−ＬＲＰ６抗体によって染色されないが、それらは、ＬＲＰ６を発現し、抗−ＬＲＰ６抗体の特異性を実証する。さらに、ＰＡ１細胞の抗−ＬＲＰ６抗体染色は、ＬＲＰ６  ｓｈＲＮＡを用いた内因性ＬＲＰ６の欠失に際して有意に減少しており、さらに、ＬＲＰ６抗体の特異性を実証する。
【０４６９】
さらなる研究において、ＰＡ１細胞におけるｓｈＲＮＡによるＬＲＰ６のノックダウンは、ＬＲＰ６に対するＰｒｏｐ１およびＰｒｏｐ３抗体の特異性をさらに確認する（図１Ｂ参照）。ノックダウンは、ＬＲＰ６に向けたショートヘアピンＲＮＡをコードするレンチウイルスで細胞を感染させること、および感染した細胞の安定なプールを選択することによって、達成した。研究のために使用されたｓｈＲＮＡ感染方法は、Ｗｉｅｄｅｒｓｃｈａｉｎらによる２００９  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ８：４９８−５０４  Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｆｅｂ  ２５において説明されている。
【０４７０】
実施例２：プロペラ１およびプロペラ３抗−ＬＲＰ６  ＦａｂによるＷｎｔ１およびＷｎｔ３ａレポーター遺伝子分析の差次的阻害
【０４７１】
異なる抗−ＬＲＰ６  ＦａｂをインビトロＷｎｔレポーター分析において試験した。Ｗｎｔ１またはＷｎｔ３Ａリガンドを、一時的に発現させ、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７  ＳＴＦ細胞（遺伝子レポーター分析）そして、様々な濃度の抗−ＬＲＰ６  Ｆａｂ断片で処理した。ＳＴＦ分析は、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｎａｔｕｒｅ；４６１：６１４−２０．Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｓｅｐ  １６によって説明されるプロトコルを用いて実施した。図２Ａに見られるように、プロペラ１抗−ＬＲＰ６  Ｆａｂ（ＭＯＲ０８１６８、ＭＯＲ０８５４５、ＭＯＲ０６７０６）は、Ｗｎｔ３Ａ−依存性シグナリングに対する大きな効果なしに特異的にＷｎｔ１−依存性シグナリングを減少させた。逆に、図２Ｂに示されるように、プロペラ３抗−ＬＲＰ６  Ｆａｂ（ＭＯＲ０６４７５、ＭＯＲ０８１９３、ＭＯＲ０８４７３）は、Ｗｎｔ１−依存性Ｗｎｔ１−依存性シグナリングに対する有意な効果なしに特異的にＷｎｔ３Ａ−依存性シグナリングを減少させた。結果は、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３Ａ活性が異なるＬＲＰ６  Ｆａｂ断片（エピトープ）によって別々にブロックされることを実証する。
【０４７２】
実施例３：異なる種のＬＲＰ６に対する抗−ＬＲＰ６抗体の結合。
【０４７３】
交差反応性を示すために、マウス起源（ＮＩＨ  ３Ｔ３）およびヒト（ＨＥＫ２９３Ｔ／１７）の内因性ＬＲＰ６を発現する細胞、または、カニクイザルＬＲＰ６を発現する一時的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３／Ｔ１７細胞を、処理し、そして、上記のようにしてフローサイトメトリーを受けさせた。図３は、結果の発見の結果を要約し、そして、全ての抗−ＬＲＰ６抗体が、ヒト、マウス、およびカニクイザルＬＲＰ６に結合することを示す。
【０４７４】
実施例４：プロペラ１およびプロペラ３抗−ＬＲＰ６抗体に対するＷｎｔの感度に基づくそれらの分類。
【０４７５】
Ｗｎｔの感度に基づきそれらを評価するために、プロペラ１およびプロペラ３抗−ＬＲＰ６抗体、様々なＷｎｔリガンドを、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７  ＳＴＦ細胞（遺伝子レポーター分析）に一時的に発現させて、そして、プロペラ１またはプロペラ３抗−ＬＲＰ６抗体で処理した。Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｎａｔｕｒｅ；４６１：６１４−２０．Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｓｅｐ  １６によって説明されたプロトコルを用いてＳＴＦ分析を実施した。結果を図４に示し、図４は、特定のＷｎｔの活性阻害が、ＬＲＰ６の特異的プロペラ領域に対する抗体結合／ブロッキングに基づくことを示す。図４は、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ９、Ｗｎｔ１０Ａ、Ｗｎｔ１０Ｂによって誘導されるシグナリングがプロペラ１抗−ＬＲＰ６  Ｆａｂによって特異的に阻害されることができるが、一方、Ｗｎｔ３およびＷｎｔ３Ａによって誘導されるシグナリングは、プロペラ３抗−ＬＲＰ６  Ｆａｂによって特異的に阻害されることができることを示す。
【０４７６】
実施例５：Ｆａｂ断片からＩｇＧへのＬＲＰ６抗体の変換は、他のクラスのＷｎｔによって誘導されるＷｎｔシグナルを促進する。
【０４７７】
かなり予想外の観察結果において、Ｆａｂ断片からのＬＲＰ６抗体の、ＩｇＧへの変換は、Ｗｎｔシグナルを促進する。２９３Ｔ／１７  ＳＴＦレポーター分析において、プロペラ１抗−ＬＲＰ６  ＩｇＧは、Ｗｎｔ１−依存性を阻害し、そして、Ｗｎｔ３Ａ−依存性シグナリングを促進する。同様に、図５に示されるように、プロペラ３抗−ＬＲＰ６  ＩｇＧは、Ｗｎｔ３Ａ−依存性を阻害し、そして、Ｗｎｔ１−依存性シグナリングを促進する。この発見は、Ｗｎｔシグナル経路は、プロペラ１およびプロペラ３抗体を用いて、修飾、または「微調整」してもよいことを示唆する。同様の効果は、他の細胞背景（例えば、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＭＤＡ−ＭＢ４３５、ＰＡ−１、ＴＭ３および３ｔ３細胞−データは示さず）におけるＳＴＦレポーター分析において観察された。
【０４７８】
実施例６：Ｗｎｔ１またはＷｎｔ３Ａ−誘導ＬＲＰ６リン酸化を特異的に阻害するプロペラ１またはプロペラ３抗−ＬＲＰ６  Ｆａｂ。
【０４７９】
ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞を、Ｗｎｔ１またはＷｎｔ３Ａ発現プラスミドで一時的にトランスフェクトし、そして、プロペラ１またはプロペラ３抗−ＬＲＰ６  Ｆａｂで処理した。図６に示すように、プロペラ１抗−ＬＲＰ６  Ｆａｂは、たとえば、Ｔ１４７９およびＳ１４９０部位のＬＲＰ６のＷｎｔ１−誘導リン酸化を特異的に阻害するが、プロペラ３抗体はそうではない。対照的に、プロペラ３抗−ＬＲＰ６は、ＬＲＰ６のＷｎｔ３Ａ−誘導リン酸化を特異的に阻害するが、プロペラ１抗体はそうではない。これらの結果は、抗体は、ＬＲＰ６の異なるプロペラドメインに結合し、特異的Ｗｎｔリガンドをブロックすることを支持する。
【０４８０】
実施例７：プロペラ１抗−ＬＲＰ６  ＩｇＧを用いるＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍異種移植モデルにおけるＷｎｔ標的遺伝子の発現の阻害。
【０４８１】
ＬＲＰ６抗体は、広く認められているＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１として知られる遺伝的に改変されたマウスモデル技術において、インビボで、さらに特性化された。ＩｇＧフォーマットにおける抗−ＬＲＰ６抗体が、Ｗｎｔシグナルおよびインビボの腫瘍増殖を阻害することができたかどうかを決定するために、実験を行った。ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１トランスジェニックマウスに由来する乳房腫瘍は、Ｗｎｔ１依存性であり；テトラサイクリン−制御システムを用いてＷｎｔ１発現を遮断すること（Ｇｕｎｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）、上記）またはＦｚ８ＣＲＤＦｃを用いてＷｎｔ活性をブロッキングすること（ＤｅＡｌｍｅｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６７：５３７１−５３７９）は、インビボで腫瘍増殖を阻害する。ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍におけるＷｎｔシグナルに対する抗−ＬＲＰ６抗体の効果を測定するために、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍を移植したマウスに、単回投与の５ｍｇ／ｋｇ  Ｗｎｔ１クラス−特異的拮抗抗−ＬＲＰ６抗体を静脈注射投与した。抗体の血清濃度、ならびにβ−カテニン標的遺伝子Ａｘｉｎ２のｍＲＮＡ発現を、２週間以上の期間、分析した。ＬＲＰ６抗体の消失β−相半減期は、約１０８時間であった。抗体注入に対応して、Ａｘｉｎ２  ｍＲＮＡ発現の有意な減少が、腫瘍において観察され、そして、血清における抗体レベルが減少した際、Ａｘｉｎ２発現は、抗体注入後１週間で次第に回復した。これらの結果は、Ｗｎｔ１クラス−特異的抗−ＬＲＰ６抗体がＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１異種移植におけるＷｎｔシグナルを抑制すること、およびこの抑制が、血清におけるＬＲＰ６抗体の濃度と相関することを示唆する。腫瘍増殖に対する抗−ＬＲＰ６抗体の効果を試験するために、マウスに、プロペラ１−、プロペラ３−特異的抗−ＬＲＰ６抗体、またはアイソタイプ対応対照抗体を投与した。マウスに、２０ｍｇ／ｋｇの初回投与量を、続いて、３日ごとに、１０ｍｇ／ｋｇを、静脈投与した。この実験において、プロペラ３−特異的抗−ＬＲＰ６抗体は、腫瘍回帰を引き起こさなかったが、プロペラ１は、引き起こした。合わせると、これらの結果は、プロペラ１−特異的抗−ＬＲＰ６抗体が、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１異種移植の回帰を誘導することを実証する。
【０４８２】
ヌードマウスにおけるＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍異種移植を、１時間〜１４日の範囲の異なる時点でＭＯＲ０８１６８、プロペラ１抗−ＬＲＰ６  ＩｇＧで処理した。図７は、抗体のＰＫ血清濃度およびＷｎｔ標的遺伝子Ａｘｉｎ２のｍＲＮＡ発現との逆相関を示す。腫瘍におけるＡｘｉｎ２遺伝子発現レベルは、ＭＯＲ０８１６８処理で阻害され、そして、血清から抗体が除去されるにつれて戻った。
【０４８３】
Ａｘｉｎ２に加えて、付加的な遺伝子の発現に対するＭＯＲ０８１６８の効果を評価した。ＭＯＲ０８１６８（５ｍｇ／ｋｇ）の単回投与プラスまたはマイナスのＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１同種移植片腫瘍の経時変化実験をプロファイルするためにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｏｕｓｅ  ４３０  ２．０  Ａｒｒａｙｓを、使用した。全部で６つの時点（０、１、３、８、２４、３３６時間）があり、そして、時点ごとに３つの反復があった。抗体での処理でのＡｘｉｎの最大阻害を実証するデータに基づき、推定上Ｗｎｔ経路阻害に応答する差次的に発現した遺伝子を決定する最良の代表的時点として、８時間を選択した。Ｒ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒフレームワークを、利用して、そして、０時間の時点および８時間の時点の間で差次的に発現した遺伝子を決定するために、Ｌｉｍｍａ  ｐａｃｋａｇｅを採用した。．０５の調整Ｐ−値が、差次的に発現した遺伝子のセットを決定するための閾値として使用された。このカットオフに基づき、９７２遺伝子にマップされ差次的に発現したと呼ばれる１２７０プローブセットがある。図８Ａは、＜０．０１の調整Ｐ−値で＞２倍上方制御された遺伝子を示す表であり、そして、図８Ｂは、＜０．０１の調整Ｐ−値で＞２倍下方制御された遺伝子を示す表である。
【０４８４】
実施例８：ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１同種移植片モデルにおけるプロペラ１およびプロペラ３抗−ＬＲＰ６抗体の抗−腫瘍活性。
【０４８５】
ＬＲＰ６プロペラ１および３抗体の抗−腫瘍活性が、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１同種移植片モデルにおいて評価された。ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍断片を、メスヌードマウスに、皮下（ｓ．ｃ．）移植した。移植の１１日後、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍を有するマウス（ｎ＝８、平均１２１ｍｍ３；範囲：１００−１４７ｍｍ３）を、ビヒクルＩｇＧ（１０ｍｇ／ｋｇ、静脈内投与（ｉ．ｖ．）、３日ごと（ｑ３ｄ））、ＬＲＰ６−プロペラ１Ａｂ  ＭＯＲ０８１６８（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、ｑ３ｄ）、またはＬＲＰ６−プロペラ３Ａｂ  ＭＯＲ０６４７５（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、ｑ３ｄ）で処理し、そして、３日ごとに腫瘍を測った。ＬＲＰ６−プロペラ１ＭＯＲ０８１６８Ａｂは、腫瘍回帰を投与量−依存的に誘導した（−５５％、ｐ＜０．０５）（図９参照）。
【０４８６】
実施例９：ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ３同種移植片モデルにおけるプロペラ１およびプロペラ３抗−ＬＲＰ６抗体の抗−腫瘍活性。
【０４８７】
ＬＲＰ６プロペラ１および３抗体の抗−腫瘍活性を、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ３同種移植片モデルにおいて評価した。ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ３腫瘍断片を、メスヌードマウスに皮下（ｓ．ｃ．）移植した。移植の１５日後、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ３腫瘍を有するマウス（ｎ＝６、平均２０９ｍｍ３；範囲：１１３−３３７ｍｍ３）をビヒクルＩｇＧ（１０ｍｇ／ｋｇ、静脈内投与（ｉ．ｖ．）、１週間に２回（２ｑｗ））、ＭＯＲ０８１６８  ＬＲＰ６−プロペラ１Ａｂ（３ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、ｑｗ）、またはＭＯＲ０６４７５  ＬＲＰ６−プロペラ３Ａｂ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、２ｑｗ）で処理し、そして、腫瘍を１週間で２回測った。ＭＯＲ０６４７５  ＬＲＰ６−プロペラ３Ａｂは、抗腫瘍活性（Ｔ／Ｃ＝３４％、ｐ＜０．０５）を実証した（図１０参照）。
【０４８８】
実施例１０：インビボでＷｎｔ３Ａを阻害するプロペラ１および３抗−ＬＲＰ６抗体の能力の評価
【０４８９】
Ｗｎｔ３クラスＷｎｔシグナルをインビボで阻害するＬＲＰ６−プロペラ１および３抗体の能力を、Ｗｎｔ３Ａ分泌Ｌ細胞で共−移植したＰＡ１−ＳＴＦレポーター細胞からなる共−移植システムにおいて試験した。メスヌードマウスを、１０ｘ１０ｅ６  ＰＡ１−ＳＴＦ細胞および０．５ｘ１０ｅ６  Ｌ−Ｗｎｔ３Ａ細胞で皮下移植し、そして、５の群に無作為抽出した。２４時間後、ビヒクル、ＭＯＲ０８１６８  ＬＲＰ６−プロペラ１Ａｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）、またはＭＯＲ０６４７５  ＬＲＰ６−プロペラ３Ａｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）の単一の静脈内投与をマウスに受けさせ、そして、６時間、２４時間、４８時間、７２時間および１６８時間後に、Ｘｅｎｏｇｅｎによってイメージングした。ＭＯＲ０６４７５は、少なくとも７２時間、Ｗｎｔ３ａ誘導シグナリングを阻害することができたのに対して、Ｍｏｒ０８１６８は、Ｗｎｔ３Ａ誘導シグナリングを増大させた（図１１）。  
【０４９０】
実施例１１：ＨＤｘ  ＭＳによるＬＲＰ６  ＰＤ３／４およびその抗体複合体のエピトープマッピング
【０４９１】
プロペラ３のＹＷＴＤ−ＥＧＦ領域内の抗体結合部位を同定するために、水素重水素交換（ＨＤｘ）質量分析（ＭＳ）を使用した。ＬＲＰ６プロペラドメイン３−４（ＰＤ３／４）は、１２のシステインおよび４Ｎ−結合グリコシル化部位を有する。全ての４Ｎ−結合グリコシル化部位は、プロペラ３ドメイン（６３１−９３２）に位置する。ＨＤｘＭＳによって、１００％近くの範囲（タンパク質の量については、構造情報を得ることができた）をプロペラ４ドメインにおいて、そして、約７０％範囲をプロペラ３ドメインにおいて、マッピングした。４グリコシル化部位を直接に囲む領域は、検出されないままである（図１２Ａ）。Ｆａｂ０６７４５の存在下で、２つの弱く溶媒保護したペプチドがプロペラ３において見出された。（Ｐｈｅ６３６−Ｌｅｕ６４７、Ｔｙｒ８４４−Ｇｌｕ８５６；図１１Ａ）。このことは、エピトープに関与する残基、または残基の断片が、保護されたペプチド上であるか、または空間的に近傍にあることを示唆する。ＬＲＰ６  ＰＤ３４の結晶構造に基づき、溶媒保護領域は、Ｐｒｏｐ３のブレード１および６の間の凹面表面に相当する。
【０４９２】
ＬＲＰ６  ＰＤ３４に対するＳｃＦｖ０６４７５の相互作用を妨害する変異
【０４９３】
ブレード１および６の縁が、Ｗｎｔ３ａシグナリングの抗体仲介阻害に関与することを確認するために、結合において、ＨＤｘによって含意される領域もおおよそカバーする一連のＬＲＰ６表面変異を、構築した（Ｒ６３８Ａ、Ｗ７６７Ａ、Ｙ７０６Ａ／Ｅ７０８Ａ、Ｗ８５０Ａ／Ｓ８５１Ａ、Ｒ８５２／Ｒ８５３Ａ、およびＤ８７４Ａ／Ｙ８７５Ａ）。変異体タンパク質が確実に適切に折りたたまれるように、差次的静的光散乱（ＤＳＬＳ）熱融解分析を行った。温度変性実験は、野生型および変異体タンパク質の凝集温度、Ｔａｇｇ（５０％のタンパク質が変性する温度）が類似していたことを示した。このように、変異は、タンパク質の折畳みまたは安定性に対する効果を有さなかった。
【０４９４】
ｓｃＦｖ  ＭＯＲ０６４７５に対する変異体ＬＲＰ６の結合能力をＥＬＩＳＡによって測定した。ＨＤｘＭＳ実験における溶媒保護を示したペプチドに位置する残基の変異（Ｒ６３８、Ｗ８５０／Ｓ８５１、およびＲ８５２／Ｒ８５３）は、抗体結合において劇的な減少を示した（図１２Ｂ参照）。ＨＤｘにおいて溶媒保護を示さないペプチドに位置する残基の変異（Ｙ７０６／Ｅ７０８）も、抗体結合能力において変化を示さなかった（図１１Ｂ）。このように、結合分析データは、ＨＤｘＭＳによりマッピングされるように、結合界面と、十分に一致しており、残基Ｒ６３８、Ｗ８５０、Ｓ８５１、Ｒ８５２、およびＲ８５３がエピトープに直接的にかかわることを示唆する。
【０４９５】
まとめると、これらの結果は、異なるＷｎｔタンパク質が、シグナリングのために、異なるＬＲＰ６のプロペラ領域を必要とすることを示している。Ｗｎｔ１クラスのＷｎｔタンパク質（Ｗｎｔ１、１、２、６、７Ａ、７Ｂ、９、１０Ａ、１０Ｂ）は、Ｗｎｔ１シグナルのために、ＬＲＰ６のプロペラ１を必要とし、そして、それらは、プロペラ１特異的抗−ＬＲＰ６抗体によって阻害することができる。Ｗｎｔ３ＡクラスのＷｎｔタンパク質（Ｗｎｔ３およびＷｎｔ３ａ）は、Ｗｎｔ３シグナリングのためにＬＲＰ６のプロペラ３を必要とし、そして、それらは、プロペラ３特異的抗−ＬＲＰ６抗体によって阻害することができる（図１３）。別の予想外の発見は、Ｗｎｔリガンドの存在下での、二価ＩｇＧフォーマットにおける抗体のＷｎｔ−増強活性であった。ＩｇＧフォーマットにおいて試験された全ての抗体は、ＳＴＦ  Ｌｕｃレポーター遺伝子分析において、Ｗｎｔ１またはＷｎｔ３Ａシグナリングを増進した。興味深いことに、Ｗｎｔ１を阻害し、そして、Ｗｎｔ３Ａ分析において不活性であった大半のＦａｂは、いまだＩｇＧとしてＷｎｔ１を阻害したが、Ｗｎｔ３Ａシグナリングを増強し、そして、逆の場合も同じであった。Ｗｎｔ３Ａを阻害した大半のＦａｂは、ＩｇＧとしてＷｎｔ１活性を増強した。いくつかのフォーマットを試験したように（ＩｇＧ１ＬＡＬＡ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＧ４＿Ｐｒｏ）効果は、ＩｇＧフォーマットと独立であった。これらのデータは、異なるＷｎｔタンパク質が、シグナリングのために、異なるＬＲＰ６のプロペラに結合することを示す。二価ＬＲＰ６抗体を用いたＬＲＰ６の二量化は、それだけでＷｎｔシグナルを刺激するに十分ではないが、他のクラスのＷｎｔタンパク質によって開始するＷｎｔシグナルを増強することができる。これらの発見は、異なる正準Ｗｎｔリガンドが、ＬＲＰ６上の異なる結合部位を用いること、および全ての二価抗体が、非−ブロックＷｎｔＦａｂ（一本鎖抗体、ユニボディ）の存在下で、ＩｇＧフォーマットにおけるＷｎｔ活性を増進することを実証する。最終フォーマットとしての任意の種類の一価構造は、Ｗｎｔ相乗作用を回避する。また、Ｗｎｔ１−およびＷｎｔ３Ａインヒビター活性の両方を有する二重特異性ＩｇＧまたはＩｇＧ−様分子のコンストラクトは、相乗作用を回避する。このように、ＬＲＰ６抗体コンストラクト、Ｗｎｔ経路を制御および「微調整」するように設計することができる。
【０４９６】
実施例１２：二パラトープＬＲＰ６抗体の作出
【０４９７】
この実施例は、二パラトープ抗−ＬＲＰ６  ＩｇＧ−ｓｃＦｖ抗体の生産および特性化を説明する。異なるドメイン配向性（たとえば、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ）を含有する様々な抗−ＬＲＰ６  ｓｃＦｖ’および異なるリンカー長（たとえば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４）を最初に発現させ、精製し、特性化した。ｓｃＦｖ試験の結果に基づき、異なる二パラトープ抗−ＬＲＰ６  ＩｇＧ−ｓｃＦｖ’を調製し、さらに評価した。ｓｃＦｖは、ＣＬまたはＣＨ３のＣ−末端、およびＶＬまたはＶＨのＮ−末端を含むＩｇＧ内の様々な位置に置いてもよい。さらに、Ｇｌｙ４Ｓｅｒおよび（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）２を含むＩｇＧにｓｃＦｖを接続するために様々なリンカーを使用してもよい。
【０４９８】
（ａ）材料および方法
【０４９９】
（ｉ）抗−ＬＲＰ６  ｓｃＦｖの作出
【０５００】
全てのｓｃＦｖ−変異体をコードする遺伝子をＧｅｎｅａｒｔによって合成した。両方の配向性において、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡ−断片（Ｎ−末端シグナル配列およびＣ−末端６ｘＨｉｓ−ｔａｇを有する、２つの異なるリンカー：（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４によって隔てられるＶＨ−ＶＬおよびＶＬ−ＶＨ）を、ＮｄｅＩ／ＸｂａＩを介して、Ｇｅｎｅａｒｔベクターから、ベクターｐＦＡＢ１５−ＦｋｐＡに直接的にクローン化し、結果として得たコンストラクトを、ｐＦａｂ１５−ＭＯＲ０６４７５−ＶＨ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３−ＶＬ、ｐＦａｂ１５−ＭＯＲ０６４７５−ＶＨ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４−ＶＬ、ｐＦａｂ１５−ＭＯＲ０６４７５−ＶＬ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３−ＶＨ、ｐＦａｂ１５−ＭＯＲ０６４７５−ＶＬ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４−ＶＨ、ｐＦａｂ１５−ＭＯＲ０８１６８−ＶＨ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３−ＶＬ、ｐＦａｂ１５−ＭＯＲ０８１６８−ＶＨ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４−ＶＬ、ｐＦａｂ１５−ＭＯＲ０８１６８−ＶＬ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３−ＶＨ、ｐＦａｂ１５−ＭＯＲ０８１６８−ＶＬ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４−ＶＨ、ｐＦａｂ１５−ＭＯＲ０８５４５−ＶＨ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３−ＶＬ、ｐＦａｂ１５−ＭＯＲ０８５４５−ＶＨ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４−ＶＬ、ｐＦａｂ１５−ＭＯＲ０８５４５−ＶＬ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３−ＶＨ、およびｐＦａｂ１５−ＭＯＲ０８５４５−ＶＬ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４−ＶＨと呼んだ。
【０５０１】
（ｉｉ）二パラトープ抗−ＬＲＰ６  ＩｇＧ−ｓｃＦｖの作出
【０５０２】
抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８  ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５ｓｃＦｖ
【０５０３】
コドン−最適化ＶＨ−配列を含有するベクターｐＲＳ５ａ  ＭＯＲ０８１６８  ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ（Ｇｅｎｅａｒｔによって合成）を、二パラトープコンストラクトの作出のための源として用いた。最初に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位指定突然変異生成（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって、ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ（プライマー番号１：５’−ａｇｃｇｔｇａｔｇｃａｃｇａａｇｃｇｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃ−３’（配列番号：２１３）およびプライマー番号２：５’−ｇｔａｇｔｇｇｔｔｇｔｇｃａｇｃｇｃｔｔｃｇｔｇｃａｔｃａｃｇｃｔｇ−３’（配列番号；２１４））をコードする配列の３’−端にＡｆｅＩ−部位を、導入した。ＭＯＲ０６４７５ｓｃＦｖ（（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４−リンカーによって隔てられたＶＬ−ＶＨ−配向性）をコードする遺伝子をＧｅｎｅａｒｔによって合成した。ＡｆｅＩ−部位および（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）２−リンカーをコードする配列を含有する５’−プライマー、ならびに、ＡｓｃＩ−部位を含有する３’−プライマーを、全体のＭＯＲ０６４７５−ｓｃＦｖ−遺伝子の増幅のために用いた（プライマー番号３：５’−ｔｇａｔｇｃａｃｇａａｇｃｇｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｃｃａｇａａｇａｇｃｃｔｇａｇｃｃｔｇｔｃｃｃｃｃｇｇｃａａｇｇｇｃｇｇｃｔｃｃｇｇｃｇｇａａｇｃｇａｔａｔｃ−３’（配列番号：２１５）およびプライマー番号４：５’−ｇａｇｃｇｇｃｃｇｃｃｃｇｇｃｇｃｇｃｃｔｃａｔｃａｇｃｔｇｇａｃａｃｔｇｔｃａｃｃａｇｇｇ−３’（配列番号：２１６））。そして、ＰＣＲ−産物を、ＡｆｅＩ／ＡｓｃＩを介して、ベクターｐＲＳ５ａ  ＭＯＲ０８１６８  ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡにクローニングして、結果として、最終コンストラクトｐＲＳ５ａ  ＭＯＲ０８１６８  ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ−６４７５ｓｃ−ｆｖを得た。コドン−最適化ＶＬのＭＯＲ０８１６８をコードする遺伝子をＧｅｎｅａｒｔによって合成した。ＡｇｅＩ−部位を含有する５’−プライマー、およびＨｉｎｄＩＩＩ−部位を含有する３’−プライマーを、全体ＭＯＲ０８１６８−ＶＬ−遺伝子の増幅のために用いた（プライマー番号５：（５’−ｇｃｔｔｃｃｇｇａｃａｃｃａｃｃｇｇｔｇａｃａｔｃｇａｇｃｔｇａｃｃｃａｇｃｃ−３’配列番号：２１７）およびプライマー番号６：５’−ｃａｇｃａｃｇｇｔａａｇｃｔｔｇｇｔｇｃｃｔｃｃｇｃｃｇａａｃａｃｃａｇ−３’（配列番号：２１８））。そして、ＰＣＲ−産物を、ＡｇｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを介してベクターｐＲＳ５ａ−ｈｌａｍｂｄａにクローニングして、結果として、最終コンストラクトｐＲＳ５ａ  ＭＯＲ０８１６８  ｈｌａｍｂｄａを得た。
【０５０４】
Ｌｙｓ（Ｋ）なしの抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８  ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５ｓｃＦｖ
【０５０５】
ＣＨ３におけるＣ−末端リシンの除去のために、ベクターｐＲＳ５ａ  ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ−６４７５ｓｃＦｖ（配列番号：１６５）を、鋳型ＤＮＡとして用いた。Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  ＸＬ部位指向性突然変異生成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、次のプライマー、５’−ｃｔｇｔｃｃｃｃｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｔｃｃｇｇｃ−３’（配列番号：２１９）５’−ｇｃｃｇｇａｇｃｃｇｃｃｇｃｃｇｇｇｇｇａｃａｇ−３’（配列番号：２２０）と組み合わせて用いた。部位指向性変異誘発を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅプロトコルにしたがって行い、結果として得た新コンストラクトを、ｐＲＳ５ａ  ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ＭＯＲ０８１６８ｏｐｔ  ６４７５  ｓｃＦｖ  Ｋと呼んだ。
【０５０６】
コドン−最適化ＶＬ−配列（Ｇｅｎｅａｒｔによって合成）を含有するベクターｐＲＳ５ａ  ＭＯＲ０８１６８  ｈｌａｍｂｄａ（作出は、抗−ＬＲＰ６＿ＭＯＲ０８１６８  ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ＿６４７５ｓｃＦｖについて説明される）を、ＬＣの発現についていかなる変更もなしに用いた。
【０５０７】
ＡｓｐＡｌａに対する抗−ＬＲＰ６＿ＭＯＲ０８１６８  ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５ｓｃＦｖ  ＡｓｐＰｒｏ  （ＤＰからＤＡへ）
【０５０８】
ベクターｐＲＳ５ａ  ＭＯＲ０８１６８  ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ−６４７５ｓｃＦｖ（配列番号：１６５）を、ｓｃＦｖのＶＨにおけるＤＡへのＤＰの置換のための鋳型ＤＮＡとして使用した。Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  ＸＬ部位指向性突然変異生成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、次のプライマーと組み合わせて使用した。５’−ｃｃａｔｇａｃｃａａｃａｔｇｇａｃｇｃｃｇｔｇｇａｃａｃｃｇｃｃａｃｃ−３’（配列番号：２２１）、５’−ｇｇｔｇｇｃｇｇｔｇｔｃｃａｃｇｇｃｇｔｃｃａｔｇｔｔｇｇｔｃａｔｇｇ−３’（配列番号：２２２）。部位指向性変異誘発を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅプロトコルにしたがって行い、結果として得た新コンストラクトを、ｐＲＳ５ａ  ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ＭＯＲ０８１６８ｏｐｔ  ６４７５  ｓｃＦｖ  ＤＰからＤＡへ、と呼んだ。
【０５０９】
コドン−最適化ＶＬ−配列（Ｇｅｎｅａｒｔによって合成）を含有するベクターｐＲＳ５ａ  ＭＯＲ０８１６８  ｈｌａｍｂｄａ（作出は、抗−ＬＲＰ６＿ＭＯＲ０８１６８  ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ＿６４７５ｓｃＦｖについて説明される）を、ＬＣの発現についていかなる変更もなしに用いた。
【０５１０】
抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８  ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５ｓｃＦｖ  ＡｓｐＰｒｏからＴｈｒＡｌａへ（ＤＰからＴＡへ）
【０５１１】
ベクターｐＲＳ５ａ  ＭＯＲ０８１６８  ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ−６４７５ｓｃＦｖ（配列番号：１６５）を、ｓｃＦｖのＶＨにおけるＴＡへのＤＰの置換のための鋳型ＤＮＡとして使用した。Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  ＸＬ部位指向性突然変異生成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、次のプライマーと組み合わせて使用した。５’−ｃａｃｃａｔｇａｃｃａａｃａｔｇａｃｃｇｃｃｇｔｇｇａｃａｃｃｇｃｃａｃｃ−３’（配列番号：２２３）、５’−ｇｇｔｇｇｃｇｇｔｇｔｃｃａｃｇｇｃｇｇｔｃａｔｇｔｔｇｇｔｃａｔｇｇｔｇ−３’（配列番号：２２４）。部位指向性変異誘発を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅプロトコルにしたがって行い、結果として得た新コンストラクトを、ｐＲＳ５ａ  ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ＭＯＲ０８１６８ｏｐｔ  ６４７５  ｓｃＦｖ  ＤＰからＴＡへ、と呼んだ。
【０５１２】
コドン−最適化ＶＬ−配列（Ｇｅｎｅａｒｔによって合成）を含有するベクターｐＲＳ５ａ  ＭＯＲ０８１６８  ｈｌａｍｂｄａ（作出は、抗−ＬＲＰ６＿ＭＯＲ０８１６８  ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ＿６４７５ｓｃＦｖについて説明される）を、ＬＣの発現についていかなる変更もなしに用いた。
【０５１３】
抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ６４７５ｓｃＦｖ  ａｔ  ＶａｌＬｅｕ  （ＶＬ）
【０５１４】
コドン−最適化ＶＨ−配列（Ｇｅｎｅａｒｔによって合成）を含有するベクターｐＲＳ５ａ  ＭＯＲ０８１６８  ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡを、ＨＣの発現についていかなる変更もなしに用いた。
【０５１５】
コドン−最適化ＭＯＲ０６４７５ｓｃＦｖおよびＭＯＲ０８１６８−ＶＬをコードする遺伝子をＤＮＡ２．０によって合成し、そして、ＡｇｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを介して、ベクターｐＲＳ５ａ  ｈｌａｍｂｄａ  ＭＯＲ０８１６８にクローニングした。結果として得たベクターを、ｐＲＳ５ａ  ｈｌａｍｂｄａ  ＭＯＲ０８１６８  ６４７５ｓｃＦｖ  ａｔ  ＶＬと呼んだ。
【０５１６】
抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０６４７５ｈＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ８１６８ｓｃｆｖ  （ＶＨ−３−ＶＬ）、ここで、３は、ＶＨおよびＶＬ鎖の間の（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３アミノ酸リンカーを表す。
【０５１７】
ＭＯＲ０６４７５−ＶＨを、次のプライマーでベクターｐＭ２  ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ＭＯＲ０６４７５から増幅した。５’−ｇｔｔｃｃｔｇｇｔｃｇｃｇａｔｃｃｔｇｇａａｇｇｇｇｔｇｃａｃｔｇｃｃａｇｇｔｇｃａａｔｔｇａａａｇａａａｇｃｇ−３’（配列番号：２２５）、５’−ｃｔｔｇｇｔｇｇａｇｇｃｔｇａｇｃｔａａｃ−３’（配列番号：  ２２６）。ＰＣＲ−産物を、ＮｒｕＩ／ＢｌｐＩを介してベクターｐＲＳ５ａ  ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ＭＯＲ０８１６８  ６４７５ｓｃＦｖにクローニングし、結果として得たベクターを、ｐＲＳ５ａ  ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ＭＯＲ０６４７５  ６４７５ｓｃＦｖと呼んだ。ＭＯＲ０８１６８ｓｃＦｖを、次のプライマーでベクターｐＲＳ５ａ  ＭＯＲ０８１６８  ｓｃＦｖ（ＶＨ−３−ＶＬ）から増幅した。５’−ｇｃａｃｇａａｇｃｇｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｃｃａｇａａｇａｇｃｃｔｇａｇｃｃｔｇｔｃｃｃｃｃｇｇｃａａｇｇｇｃｇｇｃｔｃｃｇｇｃｇｇａａｇｃｃａｇｇｔｔｃａａｔｔｇｇｔｔｇａａａｇｃ−３’（配列番号：２２７）、５’−ｇｇｇｃｃｃｔｃｔａｇａｇｃｇｇｃｃｇｃｃｃｇｇｃｇｃｇｃｃｔｃａｔｃａｃａｇａａｃｇｇｔａａｇｃｔｔｇｇｔｇｃｃ−３’（配列番号：２２８）。ＰＣＲ−産物を、ＡｆｅＩ／ＸｂａＩを介して、ベクターｐＲＳ５ａ  ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ＭＯＲ０６４７５  ６４７５ｓｃＦｖにクローニングし、結果として得た最終ベクターを、ｐＲＳ５ａ  ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ＭＯＲ０６４７５  ８１６８ｓｃＦｖ（ＶＨ−３−ＶＬ）と呼んだ。
【０５１８】
次のプライマーを用いて、ベクターｐＭ２  ｈｋａｐｐａ  ＭＯＲ０６４７５から、ＭＯＲ０６４７５−ＶＬを増幅した。５’−ｇａｃａｃｃａｃｃｇｇｔｇａｔａｔｃｇｔｇｃｔｇａｃｃｃａｇａｇｃ−３’（配列番号：２２９）、５’−ｇｃａｇｃｃａｃｃｇｔａｃｇｔｔｔａａｔｔｔｃａａｃ−３’（配列番号：２１０）。ＰＣＲ−産物を、ＡｇｅＩ／ＢｓｉＷＩを介してベクターｐＲＳ５ａ  ｈｋａｐｐａ  ＭＯＲ０６６５４にクローニングし、結果として得たベクターをｐＲＳ５ａ  ｈｋａｐｐａ  ＭＯＲ０６４７５と呼んだ。
【０５１９】
抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０６４７５ｈＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ８１６８ｓｃｆｖ  （ＶＨ−４−ＶＬ）、ここで、４は、ＶＨおよびＶＬ鎖の間の（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４アミノ酸リンカーを表す。
【０５２０】
ＭＯＲ０６４７５−ＶＨを、次のプライマーで、ベクターｐＭ２  ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ＭＯＲ０６４７５から増幅した。５’−ｇｔｔｃｃｔｇｇｔｃｇｃｇａｔｃｃｔｇｇａａｇｇｇｇｔｇｃａｃｔｇｃｃａｇｇｔｇｃａａｔｔｇａａａｇａａａｇｃｇ−３’（配列番号：２１１）、５’−ｃｔｔｇｇｔｇｇａｇｇｃｔｇａｇｃｔａａｃ−３’（配列番号：２１２）。
【０５２１】
ＰＣＲ−産物を、ＮｒｕＩ／ＢｌｐＩを介してベクターｐＲＳ５ａ  ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ＭＯＲ０８１６８  ６４７５ｓｃＦｖにクローニングし、結果として得たベクターを、ｐＲＳ５ａ  ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ＭＯＲ０６４７５  ６４７５ｓｃＦｖと呼んだ。ＭＯＲ０８１６８ｓｃＦｖを、次のプライマーで、ベクターｐＲＳ５ａ  ＭＯＲ０８１６８  ｓｃＦｖ（ＶＨ−４−ＶＬ）から増幅した。５’−ｇｃａｃｇａａｇｃｇｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｃｃａｇａａｇａｇｃｃｔｇａｇｃｃｔｇｔｃｃｃｃｃｇｇｃａａｇｇｇｃｇｇｃｔｃｃｇｇｃｇｇａａｇｃｃａｇｇｔｔｃａａｔｔｇｇｔｔｇａａａｇｃ−３’（配列番号：２１３）、５’−ｇｇｇｃｃｃｔｃｔａｇａｇｃｇｇｃｃｇｃｃｃｇｇｃｇｃｇｃｃｔｃａｔｃａｃａｇａａｃｇｇｔａａｇｃｔｔｇｇｔｇｃｃ−３’（配列番号：２１４）。
【０５２２】
ＭＯＲ０６４７５−ＶＬを、次のプライマーを用いて、ベクターｐＭ２  ｈｋａｐｐａ  ＭＯＲ０６４７５から増幅した。５’−ｇａｃａｃｃａｃｃｇｇｔｇａｔａｔｃｇｔｇｃｔｇａｃｃｃａｇａｇｃ−３’（配列番号：２１５）、５’−ｇｃａｇｃｃａｃｃｇｔａｃｇｔｔｔａａｔｔｔｃａａｃ−３’（配列番号：２１６）。
【０５２３】
ＰＣＲ−産物を、ＡｇｅＩ／ＢｓｉＷＩを介してベクターｐＲＳ５ａ  ｈｋａｐｐａ  ＭＯＲ０６６５４にクローニングし、結果として得たベクターをｐＲＳ５ａ  ｈｋａｐｐａ  ＭＯＲ０６４７５と呼んだ。
【０５２４】
（ｉｉｉ）抗−ＬＲＰ６−ｓｃＦｖの発現
【０５２５】
電気的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細菌株Ｗ３１１０を、プラスミド−ＤＮＡで形質転換した。前培養物（５００ｍｌフラスコ中、１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌおよび０．４％グルコースを含有する１５０ｍｌＬＢ−培地）に、単一コロニーを接種し、３７℃／２３０ｒｐｍで一晩培養した。発現培養物（２Ｌフラスコ中、１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌを含有する６ｘ５００ｍｌＳＢ−培地）に０．１のＯ．Ｄ６００になるように前培養を接種し、そして、おおよそ０．６のＯ．Ｄ６００になるまで２５℃／２３０ｒｐｍで培養した。そして、ＩＰＴＧ（Ｒｏｃｈｅ）を、０．４ｍＭの最終濃度にまで添加し、培養物を、２５℃／２３０ｒｐｍで一晩培養した。細胞を、遠心分離（２０分  ４６００ｒｐｍ、４℃）によって採取し、そして、細胞沈殿物を、−２０℃で冷凍した。
【０５２６】
（ｉｖ）抗−ＬＲＰ６−ｓｃＦｖの精製
【０５２７】
３Ｌ発現物からの沈殿物を、５０ｍｌ溶解−緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２０ｍＭ  イミダゾール、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４；５０ｍｌ緩衝液ごとにＥＤＴＡなしで１タブレットＣｏｍｐｌｅｔｅ、Ｒｏｃｈｅ＃１１８３６１７０００１、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４およびＢｅｎｚｏｎａｓｅ）に再懸濁した。細胞懸濁液を、加圧型細胞破壊装置（Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓ）（２ｘ、１０００ｂａｒで）によって処理し、４℃、１６０００ｘｇで３０分間、遠心分離した。１ｍｌ  ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ）を、１０ｍｌ溶解−緩衝液で平衡化した。上清を、Ｓｔｅｒｉｃｕｐろ過器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通じてろ過し、そして、平衡化カラム（１ｍｌ／分）にロードした。溶解緩衝液（２０ｍｌ）でカラムを洗浄し、そして、結合したタンパク質を、３ｍｌ溶出緩衝液（２５０ｍＭイミダゾールを除いて溶解緩衝液と同様）で溶出した。溶出液を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５−カラム（ＨｉＬｏａｄ１６／６０、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に直接ロードし、１３０ｍｌ  ＰＢＳ（１ｍｌ／分）で平衡化した。走行（Ｒｕｎ）は、１ｍｌ／分でＰＢＳを用いて行い、溶出液を、１．５ｍｌ分画において回収し、そして、１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−Ｇｅｌ（ＮｕＰａｇｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分析した。適切な断片をプールし、０．２μｍろ過器を通してろ過し、４℃で保存した。全ての精製タンパク質を、（酸化および還元化サンプルを用いて）ＬＣ−ＭＳによって、およびＳＥＣ−ＭＡＬＳ（凝集分析）によって分析した。
【０５２８】
（ｖ）二パラトープ抗−ＬＲＰ６  ＩｇＧ−ｓｃＦｖの一過的発現
【０５２９】
３．２Ｌ  ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞を、ＢｉｏＷａｖｅ２０において、振動１０ｒｐｍ、角度７°、エアレーション２５Ｌ／時間、Ｏ２２５％、ＣＯ２６％でＭ１１Ｖ３培地：Ｌｏｔ＃Ｄ０７６６８Ｂに、２Ｅ６生存細胞／ｍＬの密度にまで採種した。細胞を、１．８Ｌ  ＤＮＡ：ＰＥＩ−ＭＩＸ（プラスミド：ｐＲＳ５ａ  ＭＯＲ０８１６８  ｈＩｇＧ１  ＬＡＬＡ−６４７５ｓｃ−Ｆｖ  ５ｍｇ＋ｐＲＳ５ａ  ＭＯＲ０８１６８  ｈｌａｍｂｄａ  ５ｍｇ＋２０ｍｇＰＥＩ）で一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションの６時間後、イーストレイトを有する５Ｌ  Ｆｅｅｄｉｎｇ  ｍｅｄｉａ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）：Ｌｏｔ＃０９−０２１を培養物に添加した。そして、細胞をさらに、振動２４ｒｐｍ、角度ｅ：７°、エアレーション２５Ｌ／時間、Ｏ２２５％、ＣＯ２０〜６％で培養した。トランスフェクションの７日後、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓろ過器０．２μｍを用いる交差流ろ過法によって細胞を、除去した。その後、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓからの１０ｋＤａカットオフろ過器を用いる交差流ろ過法で無細胞材料を、１．７５Ｌに濃縮した。濃縮後、濃縮物を、ｓｔｅｒｉｃｕｐろ過器（０．２２μｍ）を通して、滅菌ろ過した。滅菌上清を４℃で保存した。全ての説明した二パラトープ抗−ＬＲＰ６−ｓｃＦｖ変異体を、同様の様式で発現させた。
【０５３０】
（ｖｉ）二パラトープ抗−ＬＲＰ６  ＩｇＧ−ｓｃＦｖの精製
【０５３１】
ＡＥＫＴＡ  １００  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  Ａｉｒクロマトグラフィーシステムで、６℃で、冷却キャビネットにおいて、２５ｍｌのｓｅｌｆ−ｐａｃｋｅｄ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ｒｅｓｉｎ（全て、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とともに新たに殺菌した（０．２Ｍ  ＮａＯＨ／３０％イソプロパノール）ＸＫ１６／２０カラムを用いて二パラトープＩｇＧの精製を行った。５ｂａｒの圧力制限でのローディングを除き、全ての流動率は、３．５ｍｌ／分であった。カラムを、３ＣＶのＰＢＳ（１０ｘ、Ｇｉｂｃｏから作製）で平衡化し、そして、濃縮滅菌ろ過発酵上清（１．３５Ｌ）を２．０ｍｌ／分、オーバーナイト（ｏ／ｎ）でロードした。カラムを８ＣＶのＰＢＳで洗浄した。そして、ＩｇＧを、５０ｍＭクエン酸塩、７０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５で開始し、１２ＣＶにおいて、５０ｍＭクエン酸塩、７０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ２．５に直線的に下がるｐＨ勾配で溶出し、続いて、同一のｐＨ２．５緩衝液の２ＣＶ一定の工程を行った。二パラトープＩｇＧは、おおよそｐＨ３．８の単一の対称ピークにおける勾配の間で溶出し、そして、４ｍｌ画分に集められた。画分を、左の傾斜、主要ピーク、および右の傾斜の３つのプールにプールした。２Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０を用いてゆっくりと、撹拌して、プールを、直ちにｐＨ７．０に滴定した。プールを、滅菌ろ過し（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ、０．２２μｍ）、ＯＤ２８０ｎｍを、Ｌａｍｂｄａ  ３５  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で測定し、そして、タンパク質濃度を、配列データに基づき計算した。プールを、凝集（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）および純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＳ）について別々に試験し、そして、結果に基づき、中央のプールのみ（３５ｍｌ、２．５５ｍｇ／ｍｌタンパク質で）をさらに用いた。全ての説明した二パラトープ抗−ＬＲＰ６−ｓｃＦｖ変異体を同様の様式で精製した。
【０５３２】
（ｖｉｉ）タンパク質マイクロアレイによる交差反応性分析
【０５３３】
マイクロアレイは、Ｐｒｏｔａｇｅｎ  ＡＧ（ＵＮＩｃｈｉｐ（登録商標）ＡＶ−ＶＡＲ−ＥＰ）によって製造された特注の高−密度タンパク質チップであり、ニトロセルロース被覆ガラススライド上で４通りにプリントされた３８４の前もって定め、そして、精製したヒトタンパク質を含有した。タンパク質は、遺伝子オントロジーに基づき、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を用いてＮ−末端Ｈｉｓ−ｔａｇ融合タンパク質として発現し、そして、固定した金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を用いて精製される細胞外または分泌タンパク質として分類される。抗体のハイブリダイゼーションは、Ｐｒｏｔａｇｅｎ  ＡＧによって開発されたプロトコルでプログラムしたＴＥＣＡＮ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ＨＳ４００Ｐｒｏを用いて行った。第１の抗体を５μｇ／ｍｌの最終濃度で試験した。Ｃｙ５−接合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗−ｈｓＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２、特異的断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、コード番号１０９−１７５−０９７）である第２の標識した抗体を、７．５μｇ／ｍｌの最終濃度で用いた。マイクロアレイイメージ取得は、赤色レーザー（６３５ｎｍ）を備えたＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  ４２００Ａ蛍光マイクロアレイスキャナー（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＣＡ）を用いた行った。イメージ分析は、ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ  ｖ６．０ソフトウェアを用いた行った。データ分析は、Ｐｒｏｔａｇｅｎ  ＵＮＩｃｈｉｐ（登録商標）Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｏｌ  ｖ１．８を用いて行った。プリントされた抗原に直接的に対する第２の抗体の結合に由来する非特異的交差反応性を測定するために、第２の抗体も、第１の抗体の使用なしにＵＮＩｃｈｉｐ（登録商標）上で培養した。対応する抗原に標準化した交差反応性のレベルを測定するために、飽和濃度（２０ｆｍｏｌ／スポット）での蛍光シグナル強度値を１００％として設定した。４％の抗原シグナルよりも多い所与のタンパク質についての全てのシグナル強度が、それらも、第２の標識した抗体のみとともに、それぞれのコントロールにおいても見出されなかった場合には、陽性ヒットと考えられた。
【０５３４】
（ｖｉｉｉ）示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって測定されるコンフォメーションの安定性
【０５３５】
深ウェルプレート自動サンプラーを備えたＭｉｃｒｏｃａｌからの毛細管細胞マイクロ熱量計ＶＰ−ＤＳＣを用いてＤＳＣを測定した。ソフトウェア  Ｏｒｉｇｉｎ  ７．５でデータを分析した。サンプル（４００μｌ）を、Ｎｕｎｃ商標からの２ｍｌ深ウェルプレートに添加した。ＰＢＳ  ｐＨ７．０におけるサンプルを、１ｍｇ／ｍｌで分析した。参照サンプルは、検体と同一の緩衝液、通常、ＰＢＳ、４００μｌを含有した。３．３℃分−１の加熱率で、２０℃および１００℃の間で、熱変性に関連する熱変化を、測定した。見かけの融解温度（Ｔｍ）は、検体の５０％が折りたたまれていない温度遷移中点に相当した。
【０５３６】
（ｉｘ）血清安定性研究
【０５３７】
精製したタンパク質を、３５μｌラット血清またはマウス血清（Ｇｅｎｅ  Ｔｅｘ）に溶解し、結果として、０．３ｍｇ／ｍｌの最終濃度とした。プレート培養器において、３７℃でサンプルを、培養した。４μｌそれぞれのサンプルを、異なる時点で取得し、１０μｌサンプル緩衝液（４ｘ、ＮｕＰａｇｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２６μｌ水を、添加し、そして、サンプルを、−２０℃に凍結した。１２μｌのそれぞれのサンプルを、１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−Ｇｅｌ（ＮｕＰａｇｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にロードし、電気泳動を、３５分間、２００Ｖで行った。タンパク質転写を、１時間、３０Ｖで、Ｂｏｒａｔｅ緩衝液（５０ｍＭ  ホウ酸塩、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ）において、ＰＶＤＦ−メンブレン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対して行った。メンブレンを、ＴＢＳＴ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ８０）で少し洗浄し、そして、５％粉乳を含有するＴＢＳＴにおいて、ＲＴ／シェーカーで、２時間、培養した。メンブレンを、ＴＢＳＴにおいて少し洗浄し、そして、１：１０．０００で希釈した、ＰＯＤ−接合ヤギ−抗−ヒトＩｇＧ、Ｆａｂ特異的断片（Ｄｉａｎｏｖａ）、または１：５００で希釈した抗−Ｈｉｓ  ＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ）を含有するＴＢＳＴにおいて、ＲＴ／シェーカーで、１時間、培養した。メンブレンを、ＴＢＳＴにおいて、ＲＴ／シェーカーで、５分間、３回、洗浄した。シグナル検出は、ＢＭ  Ｂｌｕｅ  ＰＯＤ基質（Ｒｏｃｈｅ）またはＥＣＬ／ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。
【０５３８】
（ｂ）結果
【０５３９】
（ｉ）抗−ＬＲＰ６−ｓｃＦｖｓの発現、精製および特性化
【０５４０】
全てのｓｃＦｖ’を、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０において、うまく発現させ、そして、親和性クロマトグラフィー、およびそれに続くサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。予想されたサイズ（ＭＯＲ０６４７５（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４：それぞれ２６．７４および２７．０６ｋＤａ、ＭＯＲ０８１６８（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４：それぞれ２６．５および２６．８５ｋＤａ、ＭＯＲ０８５４５（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４：それぞれ２５．９９および２６．３１ｋＤａを、還元化および酸化サンプルで行うＬＣ−ＭＳ分析によって、およびＳＤＳ  ＰＡＧＥによって、全ての精製サンプルについて確認した。＞９５％の純度が得られた。図１４は、１．５μｇのそれぞれの精製タンパク質が１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（ＮｕＰａｇｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にローディングされた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ  Ｓｅｅ  Ｂｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；（１）：ＭＯＲ０６４７５−ＶＨ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４−ＶＬ；（２）ＭＯＲ０６４７５−ＶＬ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４−ＶＨ；（３）ＭＯＲ０８１６８−ＶＨ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４−ＶＬ；（４）ＭＯＲ０８１６８−ＶＬ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４−ＶＨ；（５）ＭＯＲ０８５４５−ＶＨ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４−ＶＬ；（６）ＭＯＲ０８５４５−ＶＬ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４−ＶＨ  （７）ＭＯＲ０６４７５−ＶＨ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３−ＶＬ；（８）ＭＯＲ０６４７５−ＶＬ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３−ＶＨ  （９）ＭＯＲ０８１６８−ＶＨ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３−ＶＬ；（１０）ＭＯＲ０８１６８−ＶＬ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３−ＶＨ；（１１）ＭＯＲ０８５４５−ＶＨ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３−ＶＬ；（１２）ＭＯＲ０８５４５−ＶＬ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３−ＶＨ。
【０５４１】
熱安定性を、ＤＳＣによって、全てのＳｃＦｖ’について比較した。融解温度（Ｔｍ）は、ＭＯＲ０６４７５変異体について、有意に高かった。最高のＴｍ（６４．７℃）は、ＭＯＲ０６４７５−ＶＬ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４−ＶＨについて観察され、したがって、この分子は、産生された他のコンストラクトよりも、潜在的に、より安定であると信じられる。
【０５４２】
ＭＯＲ０６４７５、ＭＯＲ０８１６８、およびＭＯＲ０８５４５  ｓｃＦｖおよびＦａｂコンストラクト、ならびにいくつかの二パラトープフォーマットの活性を、ＨＥＫ２９３ＳＴＦ分析において評価した（図１７および１８）。まとめると、データは、プロペラ１ＩｇＧ（ＭＯＲ０８１６８）が、ＳＴＦ分析において、Ｗｎｔ３などのプロペラ３リガンドを増強しながら、Ｗｎｔ１などのプロペラ１リガンドを阻害することを示す。プロペラ３ｓｃＦｖ６４７５は、Ｗｎｔ１などのプロペラ１リガンドに対する活性がないながら、Ｗｎｔ３などのプロペラ３リガンドを阻害する。さらに、ＭＯＲ０８１６８／６４７５二パラトープ抗体は、プロペラ１およびプロペラ３リガンドの両方に対する活性を有し、そして、ＨＥＫ２９３  Ｗｎｔ  ＳＴＦ分析において、適用されるいかなる濃度においても、増強する活性を有さない。
【０５４３】
（ｉｉ）二パラトープ抗−ＬＲＰ６  ＩｇＧ−ｓｃＦｖの発現、精製、および特性化
【０５４４】
この研究において産生される二パラトープ抗−ＬＲＰ６  Ｉｇ−ｓｃＦｖフォーマットの略図は、図１５に提示される。図１５Ａは、ＩｇＧのＣ−末端に付着するｓｃＦｖ  ｓｃＦｖを表し；１５Ｂは、ＦｃのＮ−末端に付着したｓｃＦｖ  ｓｃＦｖを；１５Ｃは、ＦｃのＣ−末端に付着するｓｃＦｖ  ｓｃＦｖを表し；そして、１５Ｄは、ＦｃのＮ−およびＣ−末端に付着するｓｃＦｖ  ｓｃＦｖを表す。
【０５４５】
現実験における二パラトープ抗体は、ｈＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ＣＨ３のＣ−末端に融合したｓｃＦｖを有する二パラトープ完全−ＩｇＧである。この特定の研究において、ｓｃＦｖは、完全−ＩｇＧからの（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）２−リンカーによって分離された。ｓｃＦｖは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーを有するＶＬ−ＶＨ配向性からなる。
【０５４６】
二パラトープ抗−ＬＲＰ６  ＩｇＧ−ｓｃＦｖ’を、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞において、一時的に発現し、そして、ｐＨ４．５から２．５への勾配溶出で、親和性クロマトグラフィーによって、精製した。予想されたサイズの１９７．４ｋＤａを、ＬＣ−ＭＳ分析および９７％を超える純度を有するＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した。ＳＥＣ  ＭＡＬＳによって決定される凝集は、５％より少なかった。図１６は、精製二パラトープ抗−ＬＲＰ  ＩｇＧ−ｓｃｆＶのＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析である。サンプルを、１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（ＮｕＰａｇｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にロードした。Ｍａｒｋｅｒ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍａｒｋ１２；（１）：非−還元化；（２）：還元化。
【０５４７】
二パラトープ抗−ＬＲＰ６  ＩｇＧ  ｓｃＦｖおよび親抗−ＬＲＰ６  ＩｇＧは、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定して、それぞれ、０．０２１および０．０２３μＭのＫｄで、ｐＨ６．０で、ヒトＦｃＲｎに結合した。両方のフォーマットは、ｐＨ７．４でのヒトＦｃＲｎに対する低レベルの結合を実証し、そのため、このＢｐＡｂは、インビボで標準ＩｇＧとして振舞うことが予想される（ＰＫ特性は、ＩｇＧ１と同様）（図１９参照）。
【０５４８】
二パラトープ抗−ＬＲＰ６  ＩｇＧ  ｓｃＦｖは、３７℃でマウスおよびラットの両方の血清において、安定であり、３３６時間（データ示さず）まで試験し、そして、３８４精製細胞外または分泌タンパク質（データ示さず）を含有するｃｕｓｔｏｍ  Ｐｒｏｔａｇｅｎ  Ｕｎｉｃｈｉｐ上で評価した場合、＞４％結合を示さなかった。
【０５４９】
（ｃ）議論
【０５５０】
様々な抗−ＬＲＰ６  ｓｃＦｖ’は、最終二パラトープ抗体の最適化を可能にするために、最初に特性化された。両配向性における、および２つの異なるリンカー長を有するＳｃＦｖ’をＥ．ｃｏｌｉで発現した。抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０６４７５、８１６８および８５４５を、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーとともに、ＶＨ−ＶＬおよびＶＬ−ＶＨ  ｓｃＦｖ’として発現した。全てのＭＯＲ０６４７５およびＭＯＲ０８１６８変異体を、うまく発現し、低レベル（＜５％）の凝集体で精製した。予想されたサイズを有する正しく処理されたタンパク質が得られた。熱安定性データは、大半の安定なｓｃＦｖフォーマットが、６４．７℃のＴｍを有するＭＯＲ０６４７５−ＶＬ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４−ＶＨであることを示した。全ての試験したＭＯＲ０８１６８  ｓｃＦｖフォーマットは、５０−５２℃のＴｍで有意に減少した熱安定性を示した。
【０５５１】
ＶＬおよびＣＨ３でのｓｃＦｖを有する二パラトープ抗−ＬＲＰ６  ＩｇＧ’、ならびに修飾された変異体（ＣＨ３におけるＣ−末端Ｌｙｓ（Ｋ）なし、ｓｃＦｖのＶＨにおけるＡｓｐＡｌａ（ＤＡ）へのＡｓｐＰｒｏ（ＤＰ）の、およびＴｈｒＡｌａ（ＴＡ）へのＡｓｐＰｒｏ（ＤＰ）の置換あり）を、うまく発現させ、そして、細胞培養物から、低レベル（＜５％）の凝集体で精製した。予想されたサイズの約１９７−１９８ｋＤａを決定した。コンストラクト抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８  ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５ｓｃＦｖ、および抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ６４７５ｓｃＦｖ  ａｔ  ＶＬ、ならびに変異したコンストラクト（ＣＨ３におけるＣ−末端Ｌｙｓ（Ｋ）の欠失、およびＡｓｐＰｒｏ（ＤＰ）からＡｓｐＡｌａ（ＤＡ）への、およびＡｓｐＡｌａ（ＤＰ）からＴｈｒＡｌａ（ＴＡ）への置換）は、ＶＬ−ＶＨ配向性を有するｓｃＦｖからなり、そして、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーによって分離された。それぞれ、ｈＩｇＧ１  ＬＡＬＡのＣＨ３ドメインに、およびｈｌａｍｂｄａ  のＶＬに、ｓｃＦｖを付着させるために、（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）２リンカーを用いた。しかしながら、前に議論したように、ｓｃＦｖは、代わりのリンカーによって分離されるＶＨ−ＶＬからなってもよく、さらに、ｓｃＦｖは、代わりのリンカーを用いて、ＣＬのＣ−末端およびＶＨのＮ−末端を含むＩｇＧ内の別の位置に付着させてもよい。ＭＯＲ０８１６８ｓｃＦｖを有するコンストラクトは、ＶＨ−ＶＬ配向性を有するｓｃＦｖからなるものであり、そして、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーによって分離された。（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）２リンカーは、ｈＩｇＧ１  ＬＡＬＡのＣＨ３ドメインにｓｃＦｖを付着させるために用いた。
【０５５２】
二パラトープ抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８  ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃＦｖは、血清中で安定であった（３３６時間まで試験した）。予想どおり、二パラトープは、ｐＨ６．０でヒトＦｃＲｎに結合し、低レベルの結合がｐＨ７．４で見られた。親抗体は、同様の反応速度論で結合した。
【０５５３】
実施例１３：二パラトープ抗体  抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖのインビボ評価
【０５５４】
二パラトープ抗体  抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖがＷｎｔ３クラスＷｎｔシグナルをインビボで阻害する能力を、Ｗｎｔ３Ａ分泌Ｌ細胞を共−移植したＰＡ１−ＳＴＦレポーター細胞からなる共−移植システムにおいて試験した。メスヌードマウスに、１０ｘ１０ｅ６  ＰＡ１−ＳＴＦ細胞および０．５ｘ１０ｅ６  Ｌ−Ｗｎｔ３Ａ細胞を皮下移植し、そして、５の群に、無作為抽出した。２４時間後、マウスに、単一静脈内投与のビヒクル、ＭＯＲ０８１６８  ＬＲＰ６−プロペラ１Ａｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＭＯＲ０６４７５  ＬＲＰ６−プロペラ３Ａｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）、または二パラトープ抗体  抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖ（１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇ）を、受けさせ、そして、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、および１６８時間後Ｘｅｎｏｇｅｎによってイメージングした。二パラトープ抗体  抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖは、Ｗｎｔ３Ａ誘導シグナリングの投与量−関連性阻害を示し、１ｍｇ／ｋｇで２４時間で最大阻害を示し、４８時間でベースラインに戻り、そして、３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇで、少なくとも７２時間、継続的な阻害を示した。１０ｍｇ／ｋｇで投与されるＭＯＲ０６４７５  ＬＲＰ６−プロペラ３Ａｂは、少なくとも７２時間Ｗｎｔ３ａ誘導シグナリングを阻害することができたのに対して、１０ｍｇ／ｋｇで投与されるＭＯＲ０８１６８  ＬＲＰ６−プロペラ１Ａｂは、Ｗｎｔ３ａ誘導シグナリングを増大させた（図２０）。
【０５５５】
ＭＯＲ０８１６８  ＬＲＰ６−プロペラ１Ａｂと比較した、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍におけるＷｎｔシグナルに対する二パラトープ抗体  抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖの効果を測定するために、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍を移植したマウスに、５ｍｇ／ｋｇの二パラトープ抗体  抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖの単回投与、または５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲ０８１６８  ＬＲＰ６−プロペラ１抗体の単回投与を、静脈注射で投与した。二パラトープ抗体、およびプロペラ１抗体の血清濃度、ならびにβ−カテニン標的遺伝子Ａｘｉｎ２のｍＲＮＡ発現を、二週間の期間以上、分析した。二パラトープ抗体の最終β−相半減期は、おおよそ４８時間であったのに対して、ＬＲＰ６抗体のものは、約７２時間であった。Ａｘｉｎ２  ｍＲＮＡ発現の有意な減少が、二パラトープ抗体、またはプロペラ１抗体を投与したマウスから得られた腫瘍において観察され、そして、Ａｘｉｎ２発現は、二パラトープ抗体  抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖ、およびＭＯＲ０８１６８  ＬＲＰ６−プロペラ１抗体の間で観察される有意な相違がなく、次第に回復した（図２１）。
【０５５６】
二パラトープ抗体  抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖの抗−腫瘍活性を、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１同種移植片モデルにおいて評価した。ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍断片を、メスヌードマウスに、皮下（ｓ．ｃ．）移植した。移植の７日後、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍（ｎ＝８、平均１３７ｍｍ３；範囲：８１−２７２ｍｍ３）を有するマウスを、ビヒクルＩｇＧ、ＭＯＲ０８１６８  ＬＲＰ６−プロペラ１Ａｂ（３ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、ｑｗ）、または二パラトープ抗体  抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖ（３ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、２ｑｗ）で処理し、そして、腫瘍を、１週間に２回測った。ＭＯＲ０８１６８  ＬＲＰ６−プロペラ１Ａｂおよび二パラトープ抗体  抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖ抗体の両方が、腫瘍回帰（それぞれ、−９３％、ｐ＜０．０５、および−９１％、ｐ＜０．０５）を誘導した（図２２参照）。二パラトープ抗体  抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖの投与量依存性を、評価し、図２３に描く。
【０５５７】
β−カテニンｓｉＲＮＡまたは優性阻害のＴＣＦ−４による結腸直腸がん細胞におけるＷｎｔシグナルの阻害は、迅速な細胞周期停止を引き起こし、そして、腸分化プログラムを誘導する（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｅｔｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｃｅｌｌ，１１１，２４１−２５０；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｅｔｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），ＥＭＢＯ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，４，６０９−６１５）。拮抗ＬＲＰ６抗体によるＷｎｔシグナルの阻害が、ネズミＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１乳房腫瘍において同様の帰結を有するかどうかを決定するために、ミルクの主要成分である脂質についてのＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色によって、分泌分化を、研究した。ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍関連マウスを、ＰＢＳの単回投与（コントロール）、または５ｍｇ／ｋｇ抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖで、処理し、処理の２４時間、７２時間、または５日後、冷凍ネズミ腫瘍同種移植片の切片を、５μｍの厚さで切った。スライドを、３０−６０分間、室温で、空気乾燥し、そして、氷冷１０％ホルマリン中で、５〜１０分間、固定した。スライドを、直ちにｄＨ２０中で、３回すすいだ。Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色キット（Ｐｏｌｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒ＆Ｄ、Ｃａｔ＃ｋ０４３）を用いて、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色を、行った。スライドを、ＳｃａｎＳｃｏｐｅ  ＣＳ／ＧＬ  ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｐｅｒｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でスキャンし、そして、組織切片を、陽性−画素数でＩＨＣカラーデコンボリューションアルゴリズムを用いてＩｍａｇｅＳｃｏｐｅ  ｖ１０．２．１．２３１５ソフトウェア（Ａｐｅｒｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分析した。Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色の代表的画像を、図２４Ａに、そして、定量化を図２４Ｂに示す。グラフは、平均±ＳＥＭ値、７２時間群におけるｎ＝４、２４時間群におけるｎ＝３、５日群におけるｎ＝２、およびＰＢＳ（コントロール）についてのｎ＝１を表し、そして、実験の経時変化の間におけるＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色における増大を実証する。全体的に、これらの結果は、乳房腫瘍細胞におけるＷｎｔシグナルの阻害が、細胞周期停止、および分泌分化プログラムの誘導を引き起こすかもしれないことを示唆する。
【０５５８】
二パラトープ抗体  抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖの抗−腫瘍活性を、さらに、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１胸異種移植モデルにおいて評価した。５０％マトリゲルにおける５ｘ１０ｅ６  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、メスヌードマウスに、皮下（ｓ．ｃ．）移植した。移植の３１日後、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍（ｎ＝７、平均１６５ｍｍ３；範囲９９−２３８ｍｍ３）を有するマウスを、ビヒクル、または二パラトープ抗体  抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖ（３ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、ｑｗ）で処理して、そして、腫瘍を、１週間に２回測った。毎週３ｍｇ／ｋｇ投与された二パラトープ抗体  抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖ抗体は、腫瘍増殖を有意に、遅延させた（Ｔ／Ｃ＝２３％、ｐ＜０．０５）（図２５参照）。
【０５５９】
実施例１４：ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１モデルにおける付加的二パラトープ抗体のインビボ評価
【０５６０】
実施例１０に説明されるように、プロペラ３抗体ＭＯＲ０６４７５およびプロペラ１ＭＯＲ０８１６８  ｓｃｆｖドメインからなる付加的抗−ＬＲＰ６逆二パラトープ抗体を、作出した。ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖと比較したＷｎｔ１シグナルをインビボで阻害するこれら二パラトープ抗体（ＭＯＲ０６４７５ｈＩｇＧ１  ＬＡＬＡ＿８１６８ｓｃｆｖ＿（ＶＨ−３−ＶＬ）およびＭＯＲ０６４７５ｈＩｇＧ１  ＬＡＬＡ＿８１６８ｓｃｆｖ＿（ＶＨ−４−ＶＬ）の能力を、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１モデルにおいて決定した。ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍を移植したマウスに、単回投与で上記抗体のそれぞれの５ｍｇ／ｋｇを、ｉ．ｖ．で投与した。それぞれの抗体（ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖ、ＭＯＲ０６４７５ｈＩｇＧ１  ＬＡＬＡ＿８１６８ｓｃｆｖ＿（ＶＨ−３−ＶＬ）、およびＭＯＲ０６４７５ｈＩｇＧ１  ＬＡＬＡ＿８１６８ｓｃｆｖ＿（ＶＨ−４−ＶＬ）の血清濃度、ならびにβ−カテニン標的遺伝子Ａｘｉｎ２のｍＲＮＡ発現を、５日の期間を超えて、分析した（評価した時点は、０、２、７、２４、７２、および１２０時間であった）。逆二パラトープ抗体の両方が、ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖと同一の最大程度まで、ａｘｉｎ２  ｍＲＮＡ発現における有意な減少を示した。しかしながら、ａｘｉｎ２  ｍＲＮＡ発現の減少の期間は、ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖで観察されたものよりも少なく、シグナルは、逆二パラトープ分子の両方について、２４時間の時点で、ベースラインに戻った。このことは、これら分子の減少した露出と整合的であり、血清レベルが、５μｇ／ｍｌ未満に落ちるのは、ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖについての１２０時間と比較して、２４時間であった。
【０５６１】
実施例１５：組換えＬＲＰ６  ＰＤ１／２およびＰＤ３／４に対する二パラトープ抗体の結合親和性
【０５６２】
ＬＲＰ６のプロペラドメイン１−２（ＰＤ１／２、アクセス番号ＮＰ００２３２７のアミノ酸残基１９〜６２９）およびＬＲＰ６のプロペラドメイン３−４（ＰＤ３／４、アクセス番号ＮＰ００２３２７のアミノ酸６３１−１２４６）に対する抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖ、ＭＯＲ０８１６８、およびＭＯＲ６４７５の結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ−１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を介して評価した。親和性測定のために、抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的抗体（＃１０９−００５−０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）緩衝液に希釈し、そして、全ての４−フローセルについて、標準アミン結合化学を用いて〜２０００ＲＵの密度にまでＣＭ４チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ−１００５−３４）上に固定した。１：１比率の０．４Ｍ  ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）および０．１Ｍ  ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）の７分注入でカルボキシメチルデキストラン表面を、活性化した。過剰反応性エステルを、次に、１Ｍエタノールアミンでブロックした。抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖを、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中で１０μｇ／ｍｌで調製し、そして、流動率１０μｌ／分で〜７０ＲＵの密度まで、ＣＭ４チップの別個のフローセル上で捕獲した。ＰＤ１／２およびＰＤ３／４を、５０ｎＭで開始する２倍濃度系列で調製し、そして、１分間、３０μｌ／分で注入した。このことは、抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖ−捕獲表面、および捕獲リガンドなしのコントロール表面上で、４０分解離相を可能にした。次に、表面を、１０ｍＭグリシン（ｐＨ２．２）で２回、再生させた。抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖ  ＰＤ１／２およびＰＤ３／４に対する二重結合分析のために、抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖを、抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的抗体を固定したＣＭ４チップ上に捕獲した。１００ｎＭの飽和濃度でのＰＤ３／４を、次に、３０分間、３０μｌ／分の流動率で表面上を流した。飽和濃度の１００ｎＭ  ＰＤ１／２を、ＰＤ３／４の直後に注入した。解離定数（ＫＤ）、会合（ｋｏｎ）、および解離（ｋｏｆｆ）速度を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてベースライン減算修正結合曲線から、計算した。
【０５６３】
ＰＤ１／２およびＰＤ３／４に対する抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖ（二パラトープ抗体）結合を、ＭＯＲ０８１６８（プロペラ１抗体）およびＭＯＲ６４７５（プロペラ３抗体）のものと比較した。図２６Ａは、対応するＬＲＰ６受容体ドメインであるＰＤ１／２およびＰＤ３／４に対する分子の親和性を示す。ＰＤ１／２およびＰＤ３／４に対する抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖの決定したＫＤは、それぞれ、ＰＤ１／２に対するＭＯＲ０８１６８およびＰＤ３／４に対するＭＯＲ６４７５のものと同様であった。図２６Ｂは、それぞれのタンパク質に対する抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖ結合の会合および解離相を示す。ＰＤ１／２に対する抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖの結合についてのオフ速度はＰＤ３／４のものよりも遅い。ＰＤ１／２およびＰＤ３／４が続いて注入されたことが実証されたさらなる研究は、予想どおり、抗−ＬＲＰ６  ＭＯＲ０８１６８ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖが両方のプロペラドメインコンストラクトに対して結合することができることを示した（図２６Ｃ）。
【０５６４】
実施例１６：ｓｃＦｖ０８１６８およびｓｃＦｖ０６４７５の熱安定性を向上させるｓｃＦｖ変異
【０５６５】
この実施例は、プロペラ１およびプロペラ３抗体のｓｃＦｖｓにおいて作られた変異、および熱安定性によって決定されるｓｃＦｖの安定性に対する変異の個別および組み合わせの効果を記述する。ｓｃＦｖの安定性における向上は、変異ｓｃＦｖを含む抗体コンストラクトの全般的な安定性に言い換えることができる。
【０５６６】
材料および方法
【０５６７】
コンストラクト
【０５６８】
ＩｇＧベースの二パラトープ分子について、図２７（ＭＯＲ０８１６８ＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ６４７５  ｓｃｆｖ）において「９０１」と表記される二パラトープ抗体を作るために、ｓｃＦｖ０６４７５を、ＧｌｙＧｌｙＳｅｒリンカーを介してＭＯＲ０８１６８ＩｇＧ１のＣ−末端に融合した、あるいは、図２７において「９０２」と表記される二パラトープ抗体を作るために、ｓｃＦｖ０８１６８を、ＧＧＳリンカーを介してＭＯＲ０６４７５  ＩｇＧ１のＣ−末端に融合した。詳細な情報についてはこの特許出願の別の箇所を参照されたい。
【０５６９】
ｓｃＦｖ０６４７５およびｓｃＦｖ０８１６８についてのフォーカストライブラリーの理性的設計
【０５７０】
点変異の選択のために、ｓｃＦｖ０６４７５およびｓｃＦｖ０８１６８を安定化する２つの取り組み、配列コンセンサス分析およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＭＯＥ）において相同性モデリングを用いる構造ベースの変異設計を用いた。
【０５７１】
配列コンセンサス分析について、ｓｃＦｖ０６４７５のＶＨおよびＶＬドメインの、およびｓｃＦｖ０８１６８のＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸配列を、ＮＣＢＩの非冗長タンパク質配列データベースに対して、ＢＬＡＳＴした。それぞれのＢＬＡＳＴランの後、クエリー配列、およびトップ２５０相同性配列を、ｃｌｕｓｔａｌＷプログラムによって、配列した。組織内コンピュータープログラムを、配列した配列のうちでの残基位置ごとにもっとも共通するアミノ酸を数えるために用いた。クエリー配列におけるアミノ酸が配列した配列プールにおける最も共通するアミノ酸と異なるそれぞれ位置において、その野生型アミノ酸から最も共通するアミノ酸に残基を変異させるように変異を設計した。
【０５７２】
ｓｃＦｖ０６４７５の相同性モデルおよびｓｃＦｖ０８１６８の相同性モデルをＭＯＥにおいて構築した。まず、配列を、ＭＯＥの「配列エディター」モジュールに読み込んだ。相同性配列を有する既存のＸ線構造を、ＭＯＥの「抗体モデラー」において検索した。Ｘ線構造３Ｌ５Ｘおよび１Ｗ７２が、ＭＯＥによって、それぞれｓｃＦｖ０６４７５およびｓｃＦｖ０８１６８のための相同性モデルを構築するための適した鋳型として同定された。次に、エネルギーを最小化するためにＣＨＡＲＭＭ２７力場を用いてＭＯＥによって、相同性モデルを、構築した。
【０５７３】
ＭＯＥによって産生されたモデルに、ＮＡＭＤにおけるＭＤシミュレーションおよびエネルギー最小化の５段階を受けさせた。全体モデルは、第１から第３段階における５０００工程について、および原子の異なるセットに適用される３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ／Ａ２の制限で、最小化したエネルギーであった。第１段階において、制限を、ＣＤＲにおける側鎖原子を除く全ての原子に適用した。第２段階において、制限を、ＣＤＲにおける残基を除く全ての原子に適用した。第３段階において、制限を骨格原子にのみ適用した。次に、モデルを、第４段階において、５０Ｋで１００ｐｓで真空において、骨格原子に対して適用される３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ／Ａ２の制限で、シミュレーションした。最後および第５段階において、モデルは、骨格原子に適用される３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ／Ａ２の制限で５０００工程について最小化したエネルギーであった。ＭＤシミュレーションおよび最小化のこれらの５段階の後のモデルを、構造ベースの変異設計のための相同性モデルとして捉えた。
【０５７４】
野生型相同性モデルについて変異体モデルを構築した。ＶＭＤの「ｐｓｆｇｅｎ」モジュールの「変異」コマンドを、残基を設計したアミノ酸へ変異させるために用いた（Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｈｕｍｐｈｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ，１４：３３−３８）。そして、変異モデルは、最小化した、および６段階でシミュレーションしたエネルギーであった。エネルギー最小化の５０００工程を、第１から第４段階において行った。３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ／Ａ２の制限を第１段階における変異した残基の側鎖を除く全ての原子に適用した。同一強度の制限を、第２段階における変異した残基を除く全ての原子に適用した。変異した残基に対する５Å内の残基の側鎖原子に対する制限を、第３段階において除去した。変異した残基に対する５Å内の残基の骨格原子に対する制限を、同様に、第４段階において、解除した。第４段階におけるものと同一の制限を適用して、変異したモデルを、５０Ｋで１００ｐｓで真空において、シミュレーションした。シミュレーション軌道の最後のスナップショットは、次に、第４階におけるものと同一の制限で再度、５０００工程について最小化したエネルギーであった。これらの最小化モデルを、変異体の相同性モデルと捉えた。
【０５７５】
Ｅ．ｃｏｌｉシステムにおけるプレートベースのライブラリー構築、発現、および精製
【０５７６】
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬ部位指向性突然変異生成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてハイスループット突然変異生成を行った。プライマー設計ソフトウェアＭｕｔａｐｒｉｍｅｒにしたがって、プライマーを設計し、そして、標準化した濃度を有する９６ウェルフォーマットにおいてＩＤＴから注文した。変異体ストランド合成反応量を、５０から２５μｌにスケールダウンした。９６ウェルＰＣＲプレートにおいて、反応を行った。サイクルの後、０．５μｌＤｐｎＩ酵素を、それぞれの増幅反応物に添加し、そして、親ｄｓＤＮＡを消化するように３７℃で２時間、培養した。９６ウェルＰＣＲプレートにおいて、２０μｌ  Ａｃｅｌｌａ化学コンピテント細胞に２μｌのＤｐｎＩ消化突然変異生成反応物を添加することによって、形質転換を行った。
【０５７７】
発現および精製のために、３つの個別コロニーを、それぞれの形質転換プレートからピックアップした。自己誘導培地を用いて２つの９６ウェル深−ウェルプレートにおいて発現を行った。細菌培養物のアリコートを、グリセロールストックとして保存し、シーケンシング分析のために送った。それぞれの個別コロニーについて２つのプレートから組み合わせた細菌沈殿物を、溶解し、そしてＰｒｏｍｅｇａからのＭａｇｎｅＨｉｓタンパク質精製システムで精製した。ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ機器を、ハイスループット精製のために設置した。タンパク質純度を改善するために１Ｍ  ＮａＣｌを、溶解および洗浄緩衝液に添加した。タンパク質を、ＰＢＳにおける１００μｌの３００ｍＭイミダゾールで溶出した。示差走査蛍光法（ＤＳＦ）に最適な量のタンパク質を決定するために、タンパク質の量を、Ｃｏｏｍａｓｉｅ  ｐｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏ）で少しチェックした。
【０５７８】
ＤＳＦおよび示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）による熱安定性変異のスクリーニング
【０５７９】
それぞれのサンプルについて精製されたタンパク質の量に依存して、通常１０〜２０μｌの溶出物を、ＤＳＦ分析に用いた。特に、１０〜２０μｌのサンプルを、ＰＢＳにおいて、２５μｌの総量で、１：１０００の最終希釈度でＳｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した。サンプルを、ＢｉｏＲａｄ  ＣＦＸ１０００によって流した（２５℃２分間、そして、３０秒で増分０．５℃、２５〜９５℃）。ヒットを野生型ｓｃＦｖを超える２Ｃより上のＴｍと特定した。ｓｃＦｖ結合活性を、一点ＥＬＩＳＡによって測定した。
【０５８０】
哺乳動物細胞におけるタンパク質生産
【０５８１】
ＨｉｓタグとともにｓｃＦｖ０６４７５またはｓｃＦｖ０８１６８を有する哺乳動物コンストラクトｐＲＳ５ａに変異を導入した。コンストラクトを、５０ｍｌの２９３Ｔ懸濁液細胞に一時的に発現させた。手短にいえば、最適なトランスフェクション効率のために、ＰＥＩを、１：３でＤＮＡ５０μｇと混合した。ｍｌごとに１．４  ｅ６での細胞を、トランスフェクションに用いた。２５０ｍｌのろ紙フラスコにおける８０ｒｐｍ振盪しながらのＣＯ２チャンバーにおける６日の培養の後に、トランスフェクトした細胞を、回収した。最適なタンパク質回復のために、上清を約１ｍｌに濃縮した。製造者の指示にしたがい、ＭａｇｎｅＨｉｓキットによって、タンパク質を手動で精製した。緩衝液の変更をして一晩ＰＢＳにおいて精製タンパク質を透析した。透析の前または後のタンパク質サンプルをＤＳＦ分析に用いた。
【０５８２】
ｓｃＦｖｓについての親和性測定
【０５８３】
ＬＲＰ６タンパク質に対するｓｃＦｖｓの結合ＥＣ５０をＥＬＩＳＡによって測定した。Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、一晩４℃で３μｇ／ｍｌでＬＲＰ６−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｙｔｅｍｓ、カタログ番号：１５０５−ＬＲ）で被覆した。プレートを、１時間、５０μｌの２％ＢＳＡでブロッキングし、そして、洗浄液で５回洗浄した。それに応じて、サンプルを、１％ＢＳＡで希釈した。プレートを、１時間、室温で、培養し、そして、３回洗浄した。検出を、１％ＢＳＡにおける１：２０００希釈度の５０μｌ  ｐｅｎｔａＨｉｓ−ＨＲＰ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｔ．Ｎｏ．１０１４９９２）を添加し、１時間室温で培養し、３回洗浄するすることによって行った。５０μｌの基質試薬ＡプラスＢ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加し、そして、色に応じて、５〜２０分間、培養した。反応を、２５μｌの停止溶液を添加することによって、停止し、続いて、４５０ｎｍでプレート読み取りを行った。
【０５８４】
反応速度論実験を、ＢｉｏＲａｄのＰｒｏｔｅｏｎ  ＸＰＲ３６バイオセンサーを用いて行った。全ての実験を、泳動用緩衝液としてのＰＢＳＴ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を有するリン酸塩緩衝生理食塩水）を用いて室温で行った。新たに調製したＥＤＣ（４００ｍＭ）およびｓＮＨＳ（１００ｍＭ）の混合物を用いて、ＧＬＭチップ上の６つの垂直的経路の全てを、３０μｌ／分の流動率で５分間、活性化した。抗−ＨｉｓマウスＩｇＧ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：ＭＡＢ０５０）を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ＰＨ５．０において、２０μｇ／ｍｌに希釈し、３０μｌ／分の流動率で別個の垂直的経路に沿って、５分間チップに連結した。未反応のｓＮＨＳ群を非活性化するために、３０μｌ／分で５分間、１Ｍエタノールアミンを、注入した。そして、２μｇ／ｍｌ  ＭＯＲ０８１６８  ｓｃＦｖ野生型、または２μｇ／ｍｌ  ＭＯＲ０８１６８  Ｄ１変異体を、１００μｌ／分で１５秒間、異なる垂直的経路上に固定し、続いて、水平方向に３０μｌ／分で泳動用緩衝液の１分間注入を二度行った。６番目の垂直的経路を、チャネル参照として用いて、そして、このチャネル上には、リガンドを固定しなかった。３６０ＫＤホモ二量体抗原ＬＲＰ６−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：１５０５−ＬＲ）の希釈系列を、３００、１００、３３、１１、および３．７ｎＭの最終濃度で調製し、そして、それぞれの水平的経路に沿って、３０μｌ／分で注入した。会合を、５分間、モニターし、解離を、２０分間モニターした。リアルタイムベースラインドリフト補正のために列参照としての機能を果たすために緩衝液を、６番目経路に注入した。水平方向に１８秒間、１００μｌ／分で０．８５％リン酸を適用し、続いて、垂直方向への同一の泳動条件を行うことによって、チップ表面を再生した。Ｐｒｏｔｅｏｎ上の反応速度論分析を、Ｐｒｏｔｅｏｎ  Ｍａｎａｇｅｒ  ｖ．２．１．１において行った。リアルタイムベースラインドリフトを補正するために、それぞれの相互作用スポットデータを、チャネル参照、続いて、列参照によって減算した。加工したデータは、二価検体モデルに全体的に適合した。
【０５８５】
結果
【０５８６】
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプレートベースの突然変異生成、発現および精製は、フォーカストライブラリーからのより効率的なスクリーニングを可能にした。
【０５８７】
下流の分析を促進する高産生量を達成するために、発現に対するリーダー配列の効果を試験した。図２８Ａに示すように、試験したこれら７つのリーダーのうちの精製タンパク質の最大の量を、ｐｅｌＢを有するリーダーが、産生したことが示された。ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＸＬ−１  ＢｌｕｅおよびＷ３１１０を含むいくつかの細菌株を、ＩＰＴＧ誘導での発現について試験した。図２８Ｂに示すように、ＢＬ２１におけるｓｃＦｖ０６４７５（ＤＥ３）の発現レベルは、ＸＬ−１  ｂｌｕｅにおけるものよりも高く、そして、Ｗ３１１０におけるものよりもわずかに高かった。突然変異生成クローニング、形質転換および発現を促進するために、クローニングおよび発現が、高効率で同一の細菌株において行うことができるので、Ａｃｅｌｌａ（ＢＬ２１の誘導体）を、全ての次の実験のために用いた。ＭａｇｎｅＨｉｓキットを用いてＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒによって、細胞溶解物からタンパク質を精製した。ｓｃＦｖ０８１６８についての推測の産生量は、深ウェル培養プレートからの組み合わせたウェルサンプルごとに約１０μｇであり、その２μｇをＤＳＦ熱安定性分析のために用いた。プレートベースのＨＴＰスクリーニングは、プライマーから向上した熱安定性を有するヒットへ約１週間に有意に時間を短縮した。
【０５８８】
フォーカストライブラリーからの単一点変異によるｓｃＦｖ熱安定性向上
【０５８９】
向上した熱安定性のためのヒットを、一貫して野生型より少なくとも１℃上のＴｍの向上として特定した。ｓｃＦｖ０６４７５について、全部で５１の配列確認変異体からの９のヒットがあり、そして、ｓｃＦｖ０８１６８について、全部で８３の配列確認変異体からの１５のヒットがあった。選択したヒットを、ｓｃＦｖ０６４７５について、図２８に、ｓｃＦｖ０８１６８について、図２９に示す。
【０５９０】
ｓｃＦｖ０６４７５およびｓｃＦｖ０８１６８を安定化する点変異の選択のために、２つの取り組み、配列コンセンサス分析および構造ベースの変異設計を用いた。ｓｃＦｖ０６４７５のＶＨドメインに相同性があるトップ２５０配列のうち、ＶＨ：３４位置を、Ｍｅｔ（４５％）またはＶａｌ（４８％）のいずれかに共通して連結した（テキストにおける全てのナンバリングシステムは、Ｋａｂａｔシステムからのものである）。しかし、この位置は、ｓｃＦｖ０６４７５の野生型配列におけるＧｌｙ残基であった。その位置でのより一般的なアミノ酸に野生型アミノ酸を変異させるために、２つの変異体、ＶＨ：Ｇ３４ＭおよびＶＨ：Ｇ３４Ｖを設計した。図２８にリストされるように、２つの異なるプロトコルによって発現および精製した場合、ＶＨ：Ｇ３４Ｖ変異体は、野生型ｓｃＦｖ０６４７５よりも一貫してより高い安定性を示した。おそらくＰＣＲ手順におけるエラーによって引き起こされた誤った配列によって、ＶＨ：Ｇ３４Ｍ変異体は、細菌において十分に発現しなかった。
【０５９１】
ｓｃＦｖ０８１６８における残基を、そのトップ２５０相同性配列におけるコンセンサスアミノ酸に変異させために、同一の配列コンセンサス分析に基づき、ＶＨ：Ｉ３４Ｍ、ＶＨ：Ｇ５０Ｓ、ＶＨ：Ｗ５２ａＧ、およびＶＨ：Ｈ５８Ｙの変異を設計した。図３０に示すように、これらの変異は、それぞれ、７．５℃、３．０℃、７．０℃、および３．５℃、ｓｃＦｖ０８１６８のＴｍを向上させた。
【０５９２】
構造ベースの取り組みにおいて、ｓｃＦｖ０６４７５の相同性モデル、およびｓｃＦｖ０８１６８の相同性モデルを、まずＭＯＥで、次に、ＮＡＭＤで最小化したエネルギーで構築した。これらのモデルを、次に、局所的相互作用を増進する見込みのある変異について視覚的に調査した。タンパク質安定性の５つの生物物理学的理解に基づき、ｓｃＦｖ０６４７５およびｓｃＦｖ０８１６８の様々な残基に対する変異を設計した。
【０５９３】
第１の取り組みは、パッキングを向上させるタンパク質コアにおける側鎖のサイズを増大させることであった。タンパク質コアに面する側鎖を有する少しの疎水性残基を、これら残基の周りのパッキングを向上させるように、より大きい側鎖に変異させた。スクリーニングの後、この取り組みによって設計した３つの変異がｓｃＦｖ０８１６８の安定性を向上させることが見出された。図３０にリストするように、ＶＨ：Ｉ３４Ｆ、ＶＬ：Ｖ４７Ｌ、およびＶＬ：Ｇ６４Ｖ変異は、それぞれ、４．０℃、２．５℃、および２．０℃、ｓｃＦｖ０８１６８の融解温度を向上させた。
【０５９４】
第２の取り組みは、ｐｉ−ｐｉスタッキング相互作用を形成する芳香族残基に疎水性残基を変異させることであった。野生型ｓｃＦｖ０６４７５相同性モデルにおいて、図３３ａに示すように、ＶＨ：Ｉ３７残基の側鎖は、ＶＨ：Ｗ１０３およびＶＬ：Ｆ９８の２つの芳香族残基のすぐ近傍にあった。ＶＨ：Ｉ３７の任意の非水素側鎖原子およびＶＨ：Ｗ１０３の任意の非水素側鎖原子の間の最も近い距離は、３．８２Ａであった。ＶＨ：Ｉ３７およびＶＬ：Ｆ９８の間の対応する距離は、３．７７Åであった。図３３ｂに示すように、Ｐｈｅ残基がＶＨ：Ｉ３７Ｆ変異を通してこの局所的領域に導入された場合に、２つの垂直ｐｉ−ｐｉスタッキング相互作用が、形成された：１つは、ＶＨ：Ｆ３７およびＶＨ：Ｗ１０３の間のもの、そして、もう１つは、ＶＨ：Ｆ３７およびＶＬ：Ｆ９８の間のもの。ｓｃＦｖ６４７５の融解温度は、この変異によって、６１から６４．５℃に向上しているので、新たに形成されたｐｉ−ｐｉスタッキング相互作用は、この局在領域における当初の疎水性相互作用より強くなければならない（図２８）。ＶＨ：Ｍ９５Ｆ変異も、ＶＨ：Ｗ５０およびＶＨ：Ｆ１００とｐｉ−ｐｉスタッキング相互作用を形成することによって、ｓｃＦｖ０６４７５の安定性を向上させた（図２９）。Ｔｍは、６１から６４．５℃に向上した。
【０５９５】
第３の取り組みは、塩橋を形成させるように非荷電残基を荷電残基に変異させることであった。ｓｃＦｖ６４７５のＶＨ：Ｋ４３残基は、相同性モデルにおいて、隣接残基とともに塩橋を形成しなかった。ｓｃＦｖ０６４７５の相同性モデルにおいてＶＨ：Ｖ８５側鎖は、ＶＨ：Ｋ４３に直接的に面しているので（図３３ｅ）、それは、ＶＨ：Ｋ４３と塩橋を形成するように負荷電に変異させた。図３３ｆに示すように、変異ＶＨ：Ｅ８５側鎖非水素原子およびＶＨ：Ｋ４３側鎖非水素原子の間の距離は、２．６１Åの短さであることができ、このことは、塩橋が、２つの残基の間で確立できたことを示唆した。図２９にリストしたＶＨ：Ｖ８５Ｅ変異に対するｓｃＦｖ６４７５の向上した安定性は、確かに、この位置における設計理性的根拠を支持した。
【０５９６】
第４の取り組みは、水素結合を確立するために、極性残基に疎水性残基を変異させることであった。図３３ｃに説明するように、疎水性ＶＨ：Ｖ３３残基は、ｓｃＦｖ０８１６８の相同性モデルにおいて、極性残基ＶＨ：Ｎ１００ａに近かった。ＶＨ：Ｖ３３Ｎ変異を通してこの領域に極性残基を挿入した場合、余分な水素結合がＶＨ：Ｎ３３およびＶＨ：Ｎ１００ａの間で形成することができた。相同性モデリングは、ＶＨ：Ｎ３３のＮＤ２原子およびＶＨ：Ｎ１００ａのＯＤ原子の１つの間の距離が２．８０Åの短さであることができたことを示唆し、図３３ｄに示すように、これは、水素結合の範囲内であった。図２９に示すように、このＶＨ：Ｖ３３Ｎ変異は、ｓｃＦｖ０８１６８の安定性を、２．０℃向上させた。同様に、ｓｃＦｖ０６４７５上のＶＬ：Ｄ９３Ｎ変異の安定性増進（図２９参照）が、ＶＬ：Ｑ２７およびＶＬ：Ｑ９０を有する向上した水素結合形状に起因すると考えることができた。
【０５９７】
ＶＬ：Ｔ７８およびＶＨＳ４９の２つの極性残基が、いずれも、純粋に疎水性の側さによって囲まれているという、ｓｃＦｖ０８１６８の相同性モデルにおける驚くべき観察に基づき、そうでなければ疎水性環境において、２つの極性残基を非−極性残基に変異させるために、第５の取り組みを、活用した。ＶＬ：Ｔ７８およびＶＨ：Ｓ４９の２つの極性残基は、いずれも、純粋に疎水性の側鎖によって囲まれていた。図２９にリストされるように、ＶＬ：Ｔ７８ＶおよびＶＨ：Ｓ４９Ａ変異は、ｓｃＦｖ０８１６８の融解温度をそれぞれ、２．５℃および５．５℃に増大させた。
【０５９８】
一点ＥＬＩＳＡを、結合活性を評価するために行った。ＬＲＰ６に対する結合活性の減少または喪失に起因して、特定のヒットを、除外した。たとえば、ｓｃＦｖ０８１６８の変異ＶＨ  Ｗ０５２ａＧは、７℃、Ｔｍを向上させたが、野生型ｓｃＦｖ０８１６８と比較して、より少ない結合活性を示した。したがって、それは、さらなる分析のためには選択しなかった。
【０５９９】
溶出緩衝液における３００ｍＭイミダゾールの存在は、ｓｃＦｖ０６４７５において観察されるように、時に、ＤＳＦによるＴｍの全般的な変化を引き起こした。しかしながら、効果は、Ｔｍの序列に影響を与えなかった。図２８に示すように、ｓｃＦｖ０６４７５について、Ｅ．ｃｏｌｉにおける場合と、哺乳動物細胞における場合とで産生されるタンパク質に相違もあった。それどころか図３０および図３１に示すように、イミダゾールの存在は、ｓｃＦｖ８１６８のＴｍに対して最小の効果を有する。なお、図３１に示すように、ｓｃＦｖ０８１６８について、Ｅ．ｃｏｌｉから、または哺乳動物から産生されたタンパク質についてのＴｍ値は、変化がないままであった。Ｔｍにおける変化があろうとなかろうと、Ｔｍ序列は、同一のままであった。
【０６００】
哺乳動物細胞において産生されるタンパク質における熱安定性の効果を確認するために、これらの変異を、哺乳動物発現ベクターのためのコンストラクトに導入し、そして、２９３Ｔ懸濁液細胞において発現させた。それらを、ＭａｇｎｅＨｉｓビーズによって精製した。Ｔｍをチェックして、そして、ヒットを、ｓｃＦｖ０８１６８について、図３１に示すように、哺乳動物細胞において発現するタンパク質における向上した熱安定性について、確認した。ｓｃＦｖ０８１６８についての最も高い熱安定性向上を有する単一点変異は、７．５℃の向上を有するＶＨ：Ｉ３４Ｍである。
【０６０１】
熱安定性をさらに向上させる変異の組み合わせ
【０６０２】
熱安定性をさらに向上させるために、ｓｃＦｖの熱安定性を向上させた単一変異を、ｓｃＦｖ０８１６８における二重変異を作成するために組み合わせた。図３１に示すように、ＶＨ：Ｉ３４ＭおよびＶＨ：Ｓ４９Ａの２つの変異の組み合わせによる１２．５℃の向上を示した、Ｄ１を含む大半の二重変異体について付加的な効果が、観察されたが、その一方、単一変異は、それぞれ、Ｔｍにおいて、７．５および５．５℃増大をもたらした。
【０６０３】
結合および機能活性について特性化した熱安定性変異体
【０６０４】
親和性分析ＥＬＩＳＡ  ＥＣ５０を、ｓｃＦｖ０８１６８およびｓｃＦｖ０６４７５野生型および変異体の両方について行った。図３２に示すように、ｓｃＦｖ０８１６８について、二重変異体Ｄ１を含む、野生型よりも少し活性であるように見える少しの変異体とともに、野生型ｓｃＦｖ０８１６８とほとんど同等のＥＣ５０を、ヒットは示した。図３２に示すように、このことは、Ｐｒｏｔｅｏｎ親和性測定およびＳＴＦ細胞ベースの分析活性で確認した（この出願において、前に説明したように行った（材料および方法、セクション８））。ｓｃＦｖ０８１６８変異体のオクテットによる親和性序列は、それらが野生型（データは示さず）と同等であることを示した。Ｐｒｏｔｅｏｎ反応速度論分析において、Ｄ１のＫＤは、２．５５ｎＭであり、一方、野生型のＫＤは３．８２ｎＭであった（図３２）。
【０６０５】
ｓｃＦｖ０６４７５について、ＥＬＩＳＡおよびＰｒｏｔｅｏｎ反応速度論分析により検出されるように、活性に影響を与える２つの変異があった。特に、ＥＬＩＳＡにおいて、ＶＨ：Ｇ３４ＶおよびＶＨ：Ｉ３７Ｆは、野生型の０．７６ｎＭと比較して、それぞれＥＣ５０が２７ｎＭおよび４．３ｎＭであることを示した。Ｐｒｏｔｅｏｎ分析において、ＶＨ：Ｇ３４ＶおよびＶＨ：Ｉ３９Ｆは、オフ速度における有意な降下を示した（データは示さず）。
【０６０６】
二パラトープ分子の向上した熱安定性
【０６０７】
ＩｇＧベースの融合分子９０２および変異体バージョン９０２Ｔについて、第１のＴｍピークは、４７℃から６２℃にシフトした。このピークは、ｓｃＦｖ０８１６８アンフォールディングに対応した。第２のピークは、７２℃から７６℃にシフトした。図３４に示すように、このピークは、Ｆａｂ０６４７５に対応した。
【０６０８】
議論
【０６０９】
配列分析および相同性モデリングに基づく理性的設計は、ｓｃＦｖｓについての熱安定性変異を産生した。最新の実施例において、ヒット率は、ｓｃＦｖ０８１６８およびｓｃＦｖ０６４７５の両方について、約１８％であった。最も有意な向上は、野生型に対して、ｓｃＦｖ０８１６８における単一点変異ＶＨ：Ｉ３４Ｍによって、Ｔｍにおいて７．５℃増大したことであった。配列の観点から、この位置は、Ｍｅｔに高度に保存されていた。構造的には、この位置におけるより大きい疎水性側鎖が、この残基の周囲のパッキングを向上させることができた。ｓｃＦｖ０８１６８変異体における別の点変異ＶＨ：Ｓ４９Ａは、Ｔｍを５℃上昇させた。この変異は、相同性モデリングによって選定した。この位置は、ＡｌａよりもＳｅｒに、より保存されているが、この残基の周囲に極性側鎖がないことによって、構造的には、Ａｌａが、よりフィットするかもしれない。
【０６１０】
相同性モデリングを用いる構造ベースの変異設計のために、機構の組み合わせを利用した。ｓｃＦｖ０６４７５およびｓｃＦｖ０８１６８において、陽性ヒットは、５つの生物物理学的考慮のそれぞれによって発見された：パッキング向上、より多いＰｉ−Ｐｉスタッキング、より多い水素結合、より多い塩橋、および埋もれた極性群の除去。図２９および３０にリストするような総計１０の安定化変異が同定されたことは、機構のこの組み合わせによるものであった。
【０６１１】
熱安定性を向上させることが同定された変異（「有益な変異」）の組み合わせは、それらが異なる領域に位置した場合には、さらに、熱安定性を向上させる。このことは、ｓｃＦｖ０８１６８の場合において、実証された。有益な変異ＶＨ：Ｉ３４ＭおよびＶＨ：Ｓ４９Ａが組み合わせられる際、Ｔｍは、４９℃での野生型に対して、６２．５℃にさらに増大した。これは、野生型に対する１３．５℃の増大であった、その一方、それぞれの個別の変異ＶＨＩ３４ＭおよびＶＨ：Ｓ４９Ａは、それぞれ７．５℃および５℃Ｔｍを上昇させた。このことは、相加効果についての明白な現れであった。
【０６１２】
Ｉ３４Ｍは、ｓｃＦｖ０８１６８のＣＤＲ１−Ｈに非常に近かったが、しかしながら、該変異は、多数の分析によって証明されるように、結合親和性に影響を与えなかった。ＣＤＲは、全般的なｓｃＦｖまたは完全抗体安定性に役割を果たす。有意な向上は、変異が結合親和性および特異性に影響を与えない限り、説明された方法を用いてＣＤＲ領域に近い残基の設計を通して、達成されるかもしれない。
【０６１３】
大半の安定化変異は、ＶＨ上に位置していた。図２９および３０にリストされた１５の安定性変異のうち、１１が、ＶＨドメイン上で変異しており、その一方、４のみが、ＶＬドメイン上であった。
【０６１４】
ＩｇＧまたは他のフォーマット（例えば、血清アルブミン融合）に組み込まれる場合、安定化したＶＨおよびＶＬは、分子の熱安定性において、劇的な向上をもたらした。ＩｇＧ融合について、より低いＴｍの４７℃は、ｓｃＦｖ０８１６８のＴｍに対応したのに対して、最大のピークは、７２であった。５℃は、ＣＨ２およびＦａｂ０６４７５のＴｍに対応する。２つの変異ＶＨ：Ｉ３４ＭおよびＶＨ：Ｓ４９Ａの組込みは、４７℃から６２℃へｓｃＦｖ０８１６８のＴｍを向上させたが、その一方、６４７５におけるＶＨ：Ｍ９５Ｆの組込みは、ＦａｂのＴｍを、７２．５℃から７６℃にさらに向上させた。向上は、ｓｃＦｖ自体においてのみならず、ＶＨおよびＶＬの向上した安定性によって、Ｆａｂにおいても、示された。このことは、全般的な抗体安定性を向上させるためのより一般的な戦略を提供するかもしれない。
【０６１５】
Ｅ．ｃｏｌｉシステムにおけるＨＴＰスクリーニングを加味した理性的設計は、非常に迅速なターンアラウンドタイムおよび高ヒット率を提供した。Ｅ．ｃｏｌｉからの材料で測定したＴｍは、哺乳動物からのものと、または、同一のままの序列と、相関した。このことは、スクリーニングプロセスを、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＨＴＰとして実行されるものに、非常に単純化した。プレートベースの突然変異生成、形質転換、発現および精製が、１週間よりも短いものへ時間を短縮した。本明細書において説明される方法を用いて、多数の変異が、ｓｃＦｖｓまたは他の抗原結合断片において作成し、そして、熱安定性について、スクリーニングすることができる。そして、これらの変異したｓｃＦｖｓまたは抗原結合断片は、より大きい抗体コンストラクトにこのような安定性を与えるために、二パラトープ抗体などのより大きい抗体コンストラクトの成分として使用することができる。
【図１Ａ】
2020063262.tif 000028
【図１Ｂ】
2020063262.tif 000029
【図２Ａ】
2020063262.tif 000030
【図２Ｂ】
2020063262.tif 000031
【図３】
2020063262.tif 000032
【図４】
2020063262.tif 000033
【図５】
2020063262.tif 000034
【図６】
2020063262.tif 000035
【図７】
2020063262.tif 000036
【図８Ａ−１】
2020063262.tif 000037
【図８Ａ−２】
2020063262.tif 000038
【図８Ｂ−１】
2020063262.tif 000039
【図８Ｂ−２】
2020063262.tif 000040
【図８Ｂ−３】
2020063262.tif 000041
【図９Ａ】
2020063262.tif 000042
【図９Ｂ】
2020063262.tif 000043
【図１０】
2020063262.tif 000044
【図１１】
2020063262.tif 000045
【図１２Ａ】
2020063262.tif 000046
【図１２Ｂ】
2020063262.tif 000047
【図１３】
2020063262.tif 000048
【図１４】
2020063262.tif 000049
【図１５】
2020063262.tif 000050
【図１６】
2020063262.tif 000051
【図１７】
2020063262.tif 000052
【図１８】
2020063262.tif 000053
【図１９】
2020063262.tif 000054
【図２０】
2020063262.tif 000055
【図２１】
2020063262.tif 000056
【図２２】
2020063262.tif 000057
【図２３】
2020063262.tif 000058
【図２４Ａ】
2020063262.tif 000059
【図２４Ｂ】
2020063262.tif 000060
【図２５】
2020063262.tif 000061
【図２６Ａ】
2020063262.tif 000062
【図２６Ｂ−１】
2020063262.tif 000063
【図２６Ｂ−２】
2020063262.tif 000064
【図２６Ｃ】
2020063262.tif 000065
【図２７】
2020063262.tif 000066
【図２８】
2020063262.tif 000067
【図２９】
2020063262.tif 000068
【図３０】
2020063262.tif 000069
【図３１】
2020063262.tif 000070
【図３２】
2020063262.tif 000071
【図３３】
2020063262.tif 000072
【図３４】
2020063262.tif 000073
【配列表】
2020063262000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月27日(2019.12.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＲＰ６標的受容体の２つの異なる結合部位に対する少なくとも２つの受容体結合ドメインを含む二重特異性抗体およびその抗体断片であって、第１の受容体結合ドメインはβ−プロペラ１ドメインに結合し、第２の受容体結合ドメインは同じＬＲＰ６標的受容体上のβ−プロペラ３ドメインに結合し、前記ＬＲＰ６標的受容体のβ−プロペラ１ドメインおよびβ−プロペラ３ドメインへの前記第１および第２の受容体結合ドメインの結合がＷｎｔ−１およびＷｎｔ−３またはＷｎｔ−３ａシグナル伝達経路を阻害し、かつ、前記二重特異性抗体およびその抗体断片がＷｎｔシグナルの有意な増強を示さない、二重特異性抗体およびその抗体断片。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６１５】
Ｅ．ｃｏｌｉシステムにおけるＨＴＰスクリーニングを加味した理性的設計は、非常に迅速なターンアラウンドタイムおよび高ヒット率を提供した。Ｅ．ｃｏｌｉからの材料で測定したＴｍは、哺乳動物からのものと、または、同一のままの序列と、相関した。このことは、スクリーニングプロセスを、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＨＴＰとして実行されるものに、非常に単純化した。プレートベースの突然変異生成、形質転換、発現および精製が、１週間よりも短いものへ時間を短縮した。本明細書において説明される方法を用いて、多数の変異が、ｓｃＦｖｓまたは他の抗原結合断片において作成し、そして、熱安定性について、スクリーニングすることができる。そして、これらの変異したｓｃＦｖｓまたは抗原結合断片は、より大きい抗体コンストラクトにこのような安定性を与えるために、二パラトープ抗体などのより大きい抗体コンストラクトの成分として使用することができる。
本発明は、以下の態様を含む。
［１］
ＬＲＰ６標的受容体の２つの異なる結合部位に対する少なくとも２つの受容体結合ドメインを有する単離された多価抗体であって、第１の受容体結合ドメインは、標的受容体上の第１の結合部位に結合し、第２の受容体結合ドメインは、同じＬＲＰ６標的受容体上の第２の結合部位に結合し、該第１および第２の受容体結合ドメインは、ＬＲＰ６標的受容体の第１および第２の結合部位への第１および第２の受容体結合ドメインの結合が古典的Ｗｎｔシグナル変換経路を阻害するように、互いに連結されており、該抗体または抗原結合断片は、Ｗｎｔシグナルの有意な増強を示さない、多価抗体。
［２］
約ナノモル親和性の標的受容体に対する親和性を有する、［１］に記載の抗体。
［３］
約１ピコモル親和性の標的受容体に対する親和性を有する、［１］に記載の抗体。
［４］
第１および第２の受容体結合ドメインが、ＩｇＧ抗体、ｓｃＦｖ断片、一本鎖ダイアボディ、抗体模擬物および抗体可変ドメインからなる群から選択される、［１］に記載の抗体。
［５］
多価抗体、二価抗体、二重特異性抗体、および二パラトープ(biparatopic)抗体からなる群から選択される、［１］に記載の抗体。
［６］
第１の受容体結合ドメインがＩｇＧ抗体であり、第２の受容体結合ドメインがｓｃＦｖ断片であり、該ＩｇＧ抗体およびｓｃＦｖ断片は、ＩｇＧ抗体およびｓｃＦｖ断片がそれぞれＬＲＰ６の第１および第２のエピトープに結合することができる空間分布にて、リンカーにより互いに連結されている、［１］に記載の抗体。
［７］
リンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３からなる群から選択されるＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーである、［６］に記載の抗体。
［８］
ＬＲＰ６標的受容体の第１のエピトープがβ−プロペラ１ドメインである、［１］に記載の抗体。
［９］
ＬＲＰ６標的受容体の第２のエピトープがβ−プロペラ３ドメインである、［１］に記載の抗体。
［１０］
ＬＰＲ６  β−プロペラ１ドメインに結合し、配列番号：１、配列番号：２１および配列番号：４７からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号：２、配列番号：２２および配列番号：４８からなる群から選択されるＣＤＲ２；および配列番号：３、配列番号：２３および配列番号：４９からなる群から選択されるＣＤＲ３；ならびに配列番号：４、配列番号：２４および配列番号：５０からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号：５、配列番号：２５および配列番号：５１からなる群から選択されるＣＤＲ２；および配列番号：６、配列番号：２６および配列番号：５２からなる群から選択されるＣＤＲ３を含む、［１］に記載の抗体。
［１１］
ＬＰＲ６  β−プロペラ３ドメインに結合し、配列番号：６９、配列番号：９３および配列番号：１１５からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号：７０、配列番号：９４および配列番号：１１６からなる群から選択されるＣＤＲ２；および配列番号：７１、配列番号：９５および配列番号：１１７からなる群から選択されるＣＤＲ３；ならびに配列番号：７２、配列番号：９６および配列番号：１１８からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号：７３、配列番号：９７および配列番号：１１９からなる群から選択されるＣＤＲ２；および配列番号：７４、配列番号：９８および配列番号：１２０からなる群から選択されるＣＤＲ３を含む、［１］に記載の抗体。
［１２］
ＩｇＧ重鎖抗体が、配列番号：１８、６６および１０１からなる群から選択され、軽鎖が配列番号：１７、８６および８５からなる群から選択される、［６］に記載の抗体。
［１３］
ｓｃＦｖが、配列番号：１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２および１６４からなる群から選択される、［６］に記載の抗体。
［１４］
ｓｃＦｖ断片が、未変異ｓｃＦｖ断片と比較してｓｃＦｖの安定性を改善する少なくとも１つのアミノ酸変異を含み、該アミノ酸変異は図２９−３２から選択される、［１３］に記載の抗体。
［１５］
Ｗｎｔ１シグナル経路およびＷｎｔ３シグナル変換経路からなる群から選択される古典的Ｗｎｔシグナル変換経路を阻害する機能活性を有する、［１］に記載の抗体。
［１６］
細胞集団を枯渇させる、細胞集団の増殖を阻害するか、または減少させる、細胞集団からの炎症性メディエーターの分泌を阻害するか、または減少させる、細胞集団からの細胞質顆粒の分泌を阻害するか、または減少させる機能活性を有し、該細胞集団は腫瘍細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＷｎｔ依存性細胞からなる群から選択される、［１］に記載の抗体。
［１７］
ＬＲＰ６標的受容体上のβ−プロペラ１ドメインに結合するＩｇＧ抗体およびＬＲＰ６標的上のβ−プロペラ３ドメインに結合するｓｃＦｖを含む単離された二パラトープ抗体であって、該ＩｇＧ抗体およびｓｃＦｖは、β−プロペラ１ドメインおよびβ−プロペラ３ドメインへのＩｇＧ抗体およびｓｃＦｖのそれぞれの結合が、古典的Ｗｎｔシグナル変換経路を阻害するように、リンカーにより連結されており、該二パラトープ抗体は、Ｗｎｔシグナルの有意な増強を示さない、抗体。
［１８］
約ナノモル親和性の標的受容体に対する親和性を有する、［１７］に記載の抗体。
［１９］
約１ピコモル親和性の標的受容体に対する親和性を有する、［１７］に記載の抗体。
［２０］
リンカーが、ＬＲＰ６のβ−プロペラ１ドメインおよびＬＲＰ６のβ−プロペラ３ドメインへのＩｇＧ抗体およびｓｃＦｖ断片のそれぞれの結合を可能にする空間分布を含む、［１７］に記載の抗体。
［２１］
ｓｃＦｖが、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカーにより、ＩｇＧ抗体のＦｃ結合部位に連結されており、該Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３からなる群から選択される、［１７］に記載の抗体。
［２２］
ＩｇＧ抗体のＦｃ結合部位がＣＨ３ドメインである、［２１］に記載の抗体。
［２３］
ｓｃＦｖが、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカーにより、ＩｇＧ抗体の軽鎖に連結されており、該Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３からなる群から選択される、［１７］に記載の抗体。
［２４］
ｓｃＦｖが、未変異ｓｃＦｖ断片と比較してｓｃＦｖの安定性を改善する少なくとも１つのアミノ酸変異を含み、該アミノ酸変異は図２９−３２から選択される、［２０］に記載の抗体。
［２５］
配列番号：１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号：３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号：４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号：６の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含むＬＲＰ６のβ−プロペラ１ドメインに結合する抗体、ならびに、配列番号：６９の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：７０の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号：７１の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号：７２の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：７３の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号：７４の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含むＬＲＰ６のβ−プロペラ３ドメインに結合するｓｃＦｖを含む、［１７］に記載の抗体。
［２６］
配列番号：１６６の位置４５４のＬｙｓ欠失をさらに含む、［２５］に記載の抗体。
［２７］
配列番号：１６６の位置６７７でＰｒｏからＡｌａへの変異をさらに含む、［２５］に記載の抗体。
［２８］
配列番号：１６６の位置６７６−６７７でＡｓｐＰｒｏからＴｈｒＡｌａへの変異をさらに含む、［２５］に記載の抗体。
［２９］
配列番号：１６６、１７１、１７３、１７５、１９５、２０１および２０７からなる群から選択される重鎖配列と配列番号：１７０、１９３、１９９および２０５からなる群から選択される軽鎖配列を共に含む、［１７］に記載の抗体。
［３０］
配列番号：１６６／１７０、１７１／１７０、１７３／１７０、１７５／１７０、２０１／１９９、２０７／２０５および１９５／１９３からなる群から選択される重鎖および軽鎖配列の組合せを含む、［１７］に記載の抗体。
［３１］
配列番号：１６６／１７０を有する重鎖および軽鎖配列を含む、［１７］に記載の抗体。
［３２］
配列番号；１７７の重鎖配列および配列番号：１８１を含む軽鎖配列を含む、［２３］に記載の抗体。
［３３］
Ｗｎｔ１シグナル経路およびＷｎｔ３シグナル変換経路からなる群から選択される古典的Ｗｎｔシグナル変換経路を阻害する機能活性を有する、［１７］に記載の抗体。
［３４］
細胞集団を枯渇させる、細胞集団の増殖を阻害するか、または減少させる、細胞集団からの炎症性メディエーターの分泌を阻害するか、または減少させる、細胞集団からの細胞質顆粒の分泌を阻害するか、または減少させる機能活性を有し、該細胞集団は、腫瘍細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＷｎｔ依存性細胞からなる群から選択される、［１７］に記載の抗体。
［３５］
ＬＲＰ６標的受容体上のβ−プロペラ３ドメインに結合するＩｇＧ抗体およびＬＲＰ６標的上のβ−プロペラ１ドメインに結合するｓｃＦｖを含む単離された二パラトープ抗体であって、該ＩｇＧ抗体およびｓｃＦｖは、β−プロペラ３ドメインおよびβ−プロペラ１ドメインへのＩｇＧ抗体およびｓｃＦｖのそれぞれの結合が、古典的Ｗｎｔシグナル変換経路を阻害するように、リンカーにより連結されており、該二パラトープ抗体は、Ｗｎｔシグナルの有意な増強を示さない、抗体。
［３６］
約ナノモル親和性の標的受容体に対する親和性を有する、［３５］に記載の抗体。
［３７］
約１ピコモル親和性の標的受容体に対する親和性を有する、［３５］に記載の抗体。
［３８］
リンカーが、ＬＲＰ６のβ−プロペラ３ドメインおよびＬＲＰ６のβ−プロペラ１ドメインへのＩｇＧ抗体およびｓｃＦｖのそれぞれの結合を可能にする空間分布を含む、［３５］に記載の抗体。
［３９］
ｓｃＦｖが、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカーにより、ＩｇＧ抗体のＦｃ結合部位に連結されており、該Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３からなる群から選択される、［３５］に記載の抗体。
［４０］
ＩｇＧ抗体のＦｃ結合部位がＣＨ３ドメインである、［３９］に記載の抗体。
［４１］
ｓｃＦｖが、未変異ｓｃＦｖ断片と比較してｓｃＦｖの安定性を改善する少なくとも１つのアミノ酸変異を含み、該アミノ酸変異は図２９−３２から選択される、［３５］に記載の抗体。
［４２］
配列番号：６９の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：７０の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号：７１の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号：７２の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：７３の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号：７４の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含むＬＲＰ６のβ−プロペラ３ドメインに結合する抗体、ならびに、配列番号：１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号：３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号：４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号：５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号：６の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含むＬＲＰ６のβ−プロペラ１ドメインに結合するｓｃＦｖを含む、［３５］に記載の抗体。
［４３］
ｓｃＦｖ  ＶＨおよびＶＬが、３つのアミノ酸を含むリンカーで連結されている、［４２］に記載の抗体。
［４４］
ｓｃＦｖ  ＶＨおよびＶＬが、４つのアミノ酸を含むリンカーで連結されている、［４２］に記載の抗体。
［４５］
配列番号：１８７および１８９からなる群から選択される重鎖配列；ならびに配列番号：１８５を含む軽鎖配列を含む、［４２］に記載の抗体。
［４６］
Ｗｎｔ１シグナル経路およびＷｎｔ３シグナル変換経路からなる群から選択される古典的Ｗｎｔシグナル変換経路を阻害する機能活性を有する、［３５］に記載の抗体。
［４７］
細胞集団を枯渇させる、細胞集団の増殖を阻害するか、または減少させる、細胞集団からの炎症性メディエーターの分泌を阻害するか、または減少させる、細胞集団からの細胞質顆粒の分泌を阻害するか、または減少させる機能活性を有し、該細胞集団は、腫瘍細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＷｎｔ依存性細胞からなる群から選択される、［３５］に記載の抗体。
［４８］
［１］、［１７］および［３５］に記載の多価抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
［４９］
配列番号：１６６、１７１、１７３、１７５、１９５、２０１および２０７からなる群から選択される重鎖配列；ならびに配列番号：１７０、１９３、１９９および２０５からなる群から選択される軽鎖配列を含む多価抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
［５０］
配列番号：１６６、１７１、１７３、１７５、１９５、２０１および２０７と少なくとも９８％配列同一性；ならびに配列番号：１７０、１９３、１９９および２０５からなる群から選択される軽鎖配列を有する多価抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
［５１］
配列番号：１６６および配列番号：１７０を含む多価抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
［５２］
配列番号：１６６および配列番号：１７０と少なくとも９８％配列同一性を含む多価抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
［５３］
配列番号：１７７からなる群から選択される配列；ならびに配列番号：１８１の軽鎖配列を含む多価抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
［５４］
配列番号：１７７と少なくとも９８％配列同一性；ならびに配列番号：１８１の軽鎖配列を含む多価抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
［５５］
配列番号：１８７および１８９からなる群から選択される配列；ならびに配列番号：１８５の軽鎖配列を含む多価抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
［５６］
配列番号：１８７または１８９と少なくとも９８％配列同一性；ならびに配列番号：１８５の軽鎖配列を含む多価抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
［５７］
［４８］−［５６］に記載の核酸を含むベクター。
［５８］
標的受容体の２つの異なる結合部位に対する少なくとも２つの受容体結合ドメインを有する［１］−［４７］から選択される多価抗体、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
［５９］
（ａ）ＬＲＰ６標的受容体の第１の結合部位に結合する第１の受容体結合ドメインを提供すること；（ｂ）ＬＲＰ６標的受容体の第２の結合部位に結合する第２の受容体結合ドメインを提供すること；および（ｃ）第１の受容体結合ドメインを第２の受容体結合ドメインに連結すること、を含む［１］、［１７］または［３５］に記載の多価抗体を得る方法。
［６０］
第１または第２の受容体結合ドメインが、ＩｇＧ抗体、ｓｃＦｖ断片、一本鎖ダイアボディ、抗体模擬物および抗体可変ドメインからなる群から選択される、［５９］に記載の方法。
［６１］
第１および第２の受容体結合ドメインが、第１および第２の受容体結合ドメインがＬＲＰ６の第１および第２のエピトープにそれぞれ結合することができる空間分布にて、リンカーにより互いに連結されている、［５９］に記載の方法。
［６２］
リンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３からなる群から選択されるＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーである、［６１］に記載の方法。
［６３］
アミノ酸変異が、未変異第１または第２の受容体結合ドメインと比較して、第１または第２の受容体結合ドメインの安定性を改善するように、第１または第２の受容体結合ドメインに少なくとも１つのアミノ酸変異を導入することをさらに含む方法であって、該アミノ酸変異は図２９−３２から選択される、［５９］に記載の方法。
［６４］
ＬＲＰ６を発現する癌を有する対象を選択すること、および標的受容体の２つの異なる結合部位に対する少なくとも２つの受容体結合ドメインを有する［１］−［４７］のいずれかに記載の多価抗体を含む有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法。
［６５］
対象がヒトである、［６４］に記載の方法。
［６６］
ＬＲＰ６を発現する癌を有する対象を選択すること、および標的受容体の２つの異なる結合部位に対する少なくとも２つの受容体結合ドメインを有する［１］−［４７］のいずれかに記載の多価抗体を含む有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法であって、該癌は、乳癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、扁平上皮癌および黒色腫からなる群から選択される、方法。
［６７］
癌が乳癌である、［６６］に記載の方法。
［６８］
ＬＲＰ６に対する多価抗体を使用して、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路が介在する疾患を処置する方法。
［６９］
任意の癌の標準治療と組み合わせて、ＬＲＰ６を発現する癌を有する対象を選択すること、および配列番号：１６６／１７０、１７１／１７０、１７３／１７０、１７５／１７０、２０１／１９９、２０７／２０５および１９５／１９３からなる群から選択される重鎖および軽鎖配列を有する多価抗体を含む有効量の組成物を、該対象に投与することを含む癌を処置する方法。
［７０］
乳癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、扁平上皮癌および黒色腫からなる群から選択される癌の処置のための医薬の製造における、前記［１］〜［６９］のいずれかに記載の多価抗体の使用。
［７１］
古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：１４のＶＨ；配列番号：１３のＶＬ；配列番号：８２のＶＨ；配列番号：８１のＶＬを有する多価抗体。
［７２］
薬物としての使用のための、配列番号：１４のＶＨ；配列番号：１３のＶＬ；配列番号：８２のＶＨ；配列番号：８１のＶＬを有する多価抗体。
［７３］
古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路が介在する癌の処置における使用のための、配列番号：１６６および配列番号：１７０を有する多価抗体
［７４］
薬物としての使用のための配列番号：１６６および配列番号：１７０を有する多価抗体。
［７５］
医薬としての使用のための、［１］−［４７］のいずれかに記載の多価抗体。
［７６］
ＬＲＰ６を発現する癌の処置のための医薬としての使用のための、［１］−［４７］のいずれかに記載の多価抗体。
［７７］
ＬＲＰ６を発現する癌の処置のための医薬としての使用のための多価抗体であって、該癌が、乳癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、扁平上皮癌および黒色腫からなる群から選択される、［１］−［４７］のいずれかに記載の多価抗体。

【外国語明細書】
2020063262000001.pdf