(57)【要約】【課題】パーキンソン病の新たな原因遺伝子の提供及び新たなモデル動物の提供。【解決手段】パーキンソン病の遺伝子検査方法であって、被験者由来の試料におけるプロサポシン遺伝子変異を検出する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
パーキンソン病の遺伝子検査方法であって、被験者由来の試料におけるプロサポシン遺伝子変異を検出する方法。
【請求項２】
プロサポシン遺伝子変異が、サポシンＤドメインをコードする領域の変異である請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
プロサポシン遺伝子変異検出試薬を含有するパーキンソン病診断薬。
【請求項４】
プロサポシン遺伝子変異が、サポシンＤドメインをコードする領域の変異である請求項３記載の診断薬。
【請求項５】
プロサポシン遺伝子変異を有するパーキンソン病モデル非ヒト動物。
【請求項６】
プロサポシン遺伝子変異が、サポシンＤドメインをコードする領域の変異である請求項５記載のモデル非ヒト動物。
【請求項７】
プロサポシン遺伝子変異を有するパーキンソン病モデル非ヒト動物を用いるパーキンソン病予防治療薬のスクリーニング方法。
【請求項８】
プロサポシン遺伝子変異が、サポシンＤドメインをコードする領域の変異である請求項７記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パーキンソン病診断薬及びパーキンソン病モデル非ヒト動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病（以下ＰＤ）は我が国で２番目に多い神経変性疾患である。ＰＤは中脳黒質ドパミン神経細胞脱落を主病態とする疾患であり、振戦、無動、筋固縮および姿勢反射障害を主症状とした運動障害が中高年を好発年齢として発症し経年的に進行する。治療法は主に内服治療によるドパミン補充療法を中心とした対症療法に留まり根本治療は未だ開発されていない。疾患進行に伴い対症療法の効果は損なわれることも多く、重度進行例では歩行困難や転倒により寝たきり状態に至ってしまうことも多い。
【０００３】
ＰＤはその大部分が家族歴のない孤発性発症であるが、５〜１０％には明らかな家族歴を有する遺伝性ＰＤが存在する。これまで遺伝性ＰＤの原因遺伝子産物の機能解析により黒質ドパミン神経細胞死におけるミトコンドリア障害、酸化ストレス、ユビキチン・プロテアーゼ系の障害、オートファジー・リソソーム系の障害など様々な病態の関与が示された（特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Annu Rev Pathol 2011.6;193-222.
【非特許文献２】J Biol Chem 2010.285;20423-20427
【非特許文献３】J Biol Chem 2003.24; 25009-25013
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、遺伝性ＰＤの新たな原因遺伝子の提供及び新たなモデル動物の提供にある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、リソソーム機能に着目し、リソソーム機能に関与するプロサポシン（ＰＳＡＰ）遺伝子に注目し、ＰＤ患者のＰＳＡＰ遺伝子を検討してきたところ、常染色体優性遺伝性ＰＤ患者にＰＳＡＰ遺伝子変異が存在すること、さらに当該ＰＳＡＰ遺伝子変異を有するＰＤ患者の臨床症状が孤発性ＰＤの臨床症状に酷似していることも見出した。さらに、マウスにＰＳＡＰ遺伝子変異を導入したところ、ＰＤ患者と同様の運動障害とドパミン神経脱落を生じることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔８〕を提供するものである。
【０００８】
〔１〕パーキンソン病の遺伝子検査方法であって、被験者由来の試料におけるプロサポシン遺伝子変異を検出する方法。
〔２〕プロサポシン遺伝子変異が、サポシンＤドメインをコードする領域の変異である〔１〕記載の検出方法。
〔３〕プロサポシン遺伝子変異検出試薬を含有するパーキンソン病診断薬。
〔４〕プロサポシン遺伝子変異が、サポシンＤドメインをコードする領域の変異である〔３〕記載の診断薬。
〔５〕プロサポシン遺伝子変異を有するパーキンソン病モデル非ヒト動物。
〔６〕プロサポシン遺伝子変異が、サポシンＤドメインをコードする領域の変異である〔５〕記載のモデル非ヒト動物。
〔７〕プロサポシン遺伝子変異を有するパーキンソン病モデル非ヒト動物を用いるパーキンソン病予防治療薬のスクリーニング方法。
〔８〕プロサポシン遺伝子変異が、サポシンＤドメインをコードする領域の変異である〔７〕記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に従い、被験者のプロサポシン遺伝子変異を検出すればプロサポシン遺伝子変異陽性ＰＤと診断できる。また、本発明のモデル動物を用いれば、新たなＰＤ予防治療薬の探索に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】３家系の常染色体優性遺伝性ＰＤ病におけるプロサポシン遺伝子変異を示す。３家系のプロサポシン遺伝子変異はいずれもサポシンＤ領域をコードする部位のヘテロ接合体変異である。II−２の配列を配列番号１に、II−１の配列を配列番号２に、II−３の配列を配列番号３に示した。
【図２】プロサポシン遺伝子変異を持つＰＤ病患者の皮膚線維芽細胞の電子顕微鏡像を示す。弱拡大像（上、スケールバーは５．０μｍ）と強拡大（下、スケールバーは１．０μｍ）を示す。Ｎは核を示す。リソソーム様構造物は二重膜小胞を含有する。
【図３】ｉＰＳ細胞由来中脳ドパミン神経細胞のａｕｔｏｐｈａｇｉｃ  ｆｌｕｘ  ａｓｓａｙ結果を示す。
【図４】ＰＳＡＰ−ＰＤではｉＰＳ細胞由来中脳ドパミン神経細胞のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００不溶性画分のα−シヌクレインが増加することを示す。
【図５】サポシンＤドメインの遺伝子変異（Ｃ５０９Ｓ）導入マウスは加齢に伴う運動障害を呈することを示す。
【図６】サポシンＤドメインの遺伝子変異（Ｃ５０９Ｓ）導入マウスにおける黒質チロシンヒドロキシラーゼ陽性神経細胞の脱落を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明におけるプロサポシン遺伝子変異陽性ＰＤの診断においては、被験者由来の試料におけるプロサポシン遺伝子変異を検出する。
【００１２】
近年、ＰＤ病態解明においてリソソーム機能異常の関与が多く報告されている。特に、リソソーム機能異常を来たす疾患群であるリソソーム病の関与が特に注目されている。一部のリソソーム病では細胞内スフィンゴ脂質の代謝に関与する酵素の欠損によりその基質となるスフィンゴ脂質が蓄積するスフィンゴリピドーシスを発症し、重度の中枢神経系障害を伴うことが知られている（非特許文献２）。ＰＤにおけるリソソーム病の病態の重要性は、リソソーム病の一型である神経セロイドリポフスチン症の原因遺伝子であるＡＴＰ１３Ａ２遺伝子が遺伝性ＰＤの原因遺伝子でもあることや、リソソーム病で最も発症頻度の高いゴーシェ病の原因遺伝子であるＧＢＡ遺伝子変異がＰＤ発症の最大の遺伝的リスクであることからも示唆される。さらに、リソソームではＰＤ患者の脳病理に特徴的にみられるレビー小体という封入体の主要構成蛋白であるα−シヌクレインの分解が行われる（非特許文献３）。
プロサポシン（ＰＳＡＰ）遺伝子は極めて稀ではあるが、その病的変異はリソソーム病を起こし得る遺伝子である。しかしながら、ＰＤ患者において、ＰＳＡＰ遺伝子変異が生じているか否かは全く不明であった。本発明者の検討により、初めて３家系の常染色体優性遺伝性ＰＤ患者にＰＳＡＰ遺伝子変異が生じていることが見出された（図１）。
ＰＳＡＰ遺伝子変異は、全てサポシンＤドメインをコードする領域に認められたことから、サポシンＤドメインをコードする領域の変異が遺伝性ＰＤ診断のために、特に有用である。
【００１３】
さらに、サポシンＤドメインの変異としては、サポシンＤドメインの３対のジスルフィド結合を構成する６つのシステイン残基のうち少なくとも１つを置換する変異や、６つのシステイン残基をコードする領域の近傍の変異が好ましい。ここで、６つのシステイン残基は、ヒトの場合はＣ４０９、Ｃ４１２、Ｃ４４０、Ｃ４５１、Ｃ４７６、Ｃ４８２であり、マウスの場合はＣ４４２、Ｃ４４５、Ｃ４７３、Ｃ４８４、Ｃ５０９、Ｃ５１５である。このうち、Ｃ４０９、Ｃ４１２、Ｃ４４０及びＣ４８２から選ばれるシステイン残基が、他のアミノ酸残基に置換されている変異が好ましい。
【００１４】
被験者としては、ＰＤ患者で遺伝子検査を希望するヒトが挙げられる。特に常染色体優性遺伝性のＰＤ家族歴がある場合に被検者として適しているが、孤発例・常染色体劣性遺伝性のＰＤ例においても施行は可能である。また、検査に用いる試料としては、遺伝子を含むヒト由来の試料であればよく、例えば血液、尿、汗、だ液、組織の一部等が挙げられる。
【００１５】
ＰＳＡＰ遺伝子変異の検出手段としては、従来公知の手段、例えば、ＤＮＡシークエンス、ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ、ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法を用いることができる。従って、本発明のＰＳＡＰ遺伝子変異の検出試薬としては、これらの検出手段に用いる試薬が挙げられる。
【００１６】
被験者由来の試料にＰＳＡＰ遺伝子変異が検出されると、その被験者はＰＳＡＰ遺伝子変異陽性ＰＤと診断できる。本発明者の検討によれば、ＰＳＡＰ遺伝子変異陽性ＰＤ患者の臨床症状は孤発性ＰＤの臨床的特徴に酷似するので、ＰＳＡＰ遺伝子変異は遺伝性ＰＤの原因遺伝子としてだけでなく、孤発性ＰＤの病態メカニズムの形成にも深く関与すると考えられる。
【００１７】
また、後記実施例に示すように、ＰＳＡＰ変異を有するＰＤ（ＰＳＡＰ−ＰＤ）由来皮膚線維芽細胞について電子顕微鏡による形態学的解析を行ったところリソソーム様構造物の異常な蓄積をみとめた（図２）。この構造物は二重膜小胞を含んでいることからオートリソソームであると考えられた。そして、その蓄積はリソソーム機能障害を示唆する所見として矛盾のないものであり、サポシンＤドメイン変異によりリソソーム機能障害が引き起こされることが示された。また、ＰＳＡＰ−ＰＤ中脳ドパミン神経細胞におけるリソソーム機能異常を証明するためにリソソーム阻害薬であるＥ６４ｄとペプスタチンＡを用いたａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｆｌｕｘ  ａｓｓａｙを行った。その結果、図３に示すように、ＰＳＡＰ−ＰＤ由来の中脳ドパミン神経細胞はａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｆｌｕｘの低下をみとめておりリソソーム機能障害が示された。また、ＰＳＡＰ−ＰＤ由来ドパミン細胞におけるα−シヌクレインを評価したところ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００不溶性α−シヌクレインが増加しており、凝集傾向のあるα−シヌクレインが蓄積することを示唆する。
【００１８】
本発明は、またＰＳＡＰ遺伝子変異を有するＰＤモデル非ヒト動物及びこのモデル非ヒト動物を用いるＰＤ予防治療薬のスクリーニング法を提供する。
【００１９】
ＰＳＡＰ遺伝子変異としては、前記のサポシンＤドメインをコードする領域の変異が好ましく、特にサポシンＤ分子の中で３対のジスルフィド結合を形成する６つのシステイン残基のうち少なくとも１つのアミノ酸が置換される変異、もしくは６つのシステイン残基をコードする領域の近傍の変異が好ましい。ここで、６つのシステイン残基は、ヒトの場合はＣ４０９、Ｃ４１２、Ｃ４４０、Ｃ４５１、Ｃ４７６、Ｃ４８２であり、マウスの場合はＣ４４２、Ｃ４４５、Ｃ４７３、Ｃ４８４、Ｃ５０９、Ｃ５１５である。このうち、Ｃ４４２、Ｃ４４５、Ｃ４７３、Ｃ４８４及びＣ５１５から選ばれるシステイン残基が、他のアミノ酸残基に置換されている変異が好ましい。
【００２０】
非ヒト動物としては、非ヒト哺乳動物が好ましい。非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが挙げられるが、病態動物モデル系の作製の面から、個体発生及び生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易な齧歯動物、とりわけマウス又はラットが好ましい。
【００２１】
非ヒト動物にＰＳＡＰ遺伝子変異を導入するには、通常染色体上の遺伝子を改変するのに用いられている方法を適用することができる。好ましくは、相同組換え領域とＣｒｅ−ｌｏｘＰシステム領域とを有するターゲティングベクターが用いられる。以下、マウスの場合について説明する。
まず、マウスＰＳＡＰ遺伝子変異を生じさせるための相同組換え領域を作製する。相同組換え領域は、データベース等より得た塩基配列情報をもとに、変異させるＰＳＡＰ遺伝子の領域を決定する。特にサポシンＤ分子の中で３対のジスルフィド結合を形成する６つのシステイン残基のうち少なくとも１つのアミノ酸が置換される変異、もしくは６つのシステイン残基をコードする領域の近傍の変異が好ましい。この遺伝子変異（Ｃ５０９Ｓ）はサポシンＤ分子内に３対あるジスルフィド結合の１対を破壊することが予想される。サポシンＤドメインの遺伝子変異による疾患は非常に稀であるが、ヒトでサポシンＢやサポシンＣ内の１対のジスルフィド結合を破壊する変異でサポシンＢおよびＣの欠損が引き起こされる変異が知られている。４つのサポシン分子はそれぞれが相同性の非常に高い分子であることからサポシンＤ内のジスルフィド結合を破壊する変異もまた病的意義を持つ可能性が高いと予想される。また、家族性ＰＤに見出した変異もサポシンＤ内の３対のジスルフィド結合に形成するシステイン残基をコードする箇所の変異が含まれている。
【００２２】
また、ターゲティングベクターには、ベクターが取り込まれた細胞や目的とする相同組換えの起こっている可能性の高い細胞を選択するためのマーカー遺伝子を含むＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用いる。２つのｌｏｘＰ間に挿入されるマーカー遺伝子としては、例えばネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｙｇ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）、ジフテリアトキシンＡフラグメント遺伝子（ＤＴ−Ａ）、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）等の薬剤選択に通常用いられる遺伝子が用いられる。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子は、ネオマイシン類似体であるＧ４１８を用いることにより相同組換えが生じた細胞の選抜を可能にするポジティブ選択用マーカー遺伝子である。また、目的細胞を選抜するためのネガティブ選択に用いるマーカー遺伝子、例えばチミジンキナーゼ遺伝子（選択剤としてガンシクロビル等を用い、それに対する感受性により非相同組換え体を選抜除去する）、ジフテリアトキシンＡフラグメント遺伝子（ＤＴ−Ａにより発現されたジフテリア毒素により、非相同組換え体を選抜除去する）等をポジティブ選択用マーカー遺伝子と共に用いることもできる。ターゲティングベクターにおいて、ポジティブ選択用マーカー遺伝子は、上流と下流の相同領域に挟まれた領域に位置するのが好ましく、リコンビナーゼ存在下でマーカー遺伝子が切り出されることからリコンビナーゼ標的配列に挟まれた領域に位置するのがさらに好ましい。ネガティブ選択用マーカー遺伝子は、上流又は下流の相同領域の外側の領域に位置するのが好ましい。
【００２３】
斯かるターゲティングベクターの調製は、通常のＤＮＡ組換え技術により行うことができ、例えば、常法に従ってクローニングしたＰＳＡＰ変異遺伝子やＢＡＣクローンを利用して、これを適当な制限酵素で切断して得られる断片、又はＰＣＲ法などにより増幅して調製したＤＮＡ断片等を、合成されたリンカーＤＮＡやレポーター遺伝子、薬剤耐性マーカー遺伝子を含む断片等と、前記のような設計に従って適当な順序で結合させればよい。
【００２４】
次に、調製した相同組換え用ターゲティングベクターを、通常キメラ動物の作出に用いられる適当な細胞に導入する。ここで用いる細胞は、例えば卵細胞や胚性幹細胞（ＥＳ細胞）が挙げられるが、生体のあらゆる種類の細胞に分化することができる多分化能を有している点でＥＳ細胞が好ましい。
【００２５】
ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）から樹立され、未分化状態を保ったまま増殖・培養可能な細胞株であり、ＥＳ細胞を用いる遺伝子導入の方法は、マウスについては確立されている（Ｍａｎｓｏｕｒ，Ｓ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３６：３４８（１９８８））。ＥＳ細胞としては、既に樹立された細胞株を用いてもよく、例えばマウスの場合、ＴＴ２、Ｃ５７ＢＬ／６等のマウス系統由来のＥＳ細胞が挙げられる。あるいは、新たに樹立したものを用いてもよい。ＥＳ細胞は、常法に従って継代培養すればよい。
【００２６】
ターゲティングベクターの細胞への導入は、通常の方法、例えば、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等によって行うことができる。このうち、簡便で多数の細胞を処理できることから、エレクトロポレーション法が好適に用いられる。エレクトロポレーション法による遺伝子導入の条件は、通常の動物細胞への遺伝子導入の条件を用いればよい。
【００２７】
ターゲティングベクターを導入したＥＳ細胞は、常法に従い、フィーダー細胞上で培養することで、単一細胞由来のコロニーを得ることができる。このとき、相同組換えが生じたＥＳ細胞では、ベクター中のＰＳＡＰ遺伝子変異とともにマーカー遺伝子も染色体に組み込まれているため、マーカー遺伝子の発現に基づいて、例えば適当な期間薬剤存在下で培養することにより、目的のＥＳ細胞を選択することができる。また、当該コロニーから抽出したゲノムＤＮＡを用いて、ＰＣＲ法又はサザンハイブリダイゼーション法等により、相同組換えが生じたＥＳ細胞を選択することもできる。ＰＣＲ法の場合は、例えば、相同領域の外側に設計したプライマーと、マーカー遺伝子内に設計したプライマーを用い、ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、所望の長さのバンドが得られるかどうかで判断することができる。サザンハイブリダイゼーション法の場合は、例えば、相同組換えによる切断パターンの変化を観察しやすい制限酵素でゲノムＤＮＡを消化したＤＮＡ断片と、相同領域の外側に設計したプローブ及びマーカー遺伝子に設計したプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行い、目的の位置にバンドが得られるかどうかで判断することができる。
【００２８】
次に、相同組換えを生じたＥＳ細胞を用いて、インジェクション法又はアグリゲーション法等の通常のキメラ動物の作出に用いられる方法に従い、キメラ動物を作製する。具体的には、相同組換えを生じたＥＳ細胞を胚形成の初期の適当な時期、例えば８細胞期の胚又は胚盤胞に注入し、得られた胚を偽妊娠状態の雌の仮親の子宮内に移植することにより、正常なＰＳＡＰ遺伝子座をもつ細胞とＥＳ細胞由来のＰＳＡＰ遺伝子座変異をもつ細胞とから構成されるキメラ動物が得られる。宿主胚をどのような系統の動物から得るのかの選択は、常法に従い毛色等の表現型によりＥＳ細胞由来の細胞と宿主胚由来の細胞とを区別することができるように行えばよい。
【００２９】
キメラ動物の生殖細胞の一部がＥＳ細胞由来のＰＳＡＰ遺伝子座変異をもつ場合には、キメラ個体を正常個体と交配することにより得られた個体群より、全ての組織がＥＳ細胞由来のＰＳＡＰ遺伝子座変異をもつ細胞で構成された個体（ＰＳＡＰ  Ｆ／＋）を毛色等の判別法により選別することができる。
例えば、Ｊ１株のマウスＥＳ細胞とＣ５７ＢＬ／６Ｊ系の宿主胚を用いて得られたキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊ系と交配する場合は、娩出される産仔は、キメラマウスの生殖細胞が相同組換えＥＳ細胞に由来していれば該ＥＳ細胞が由来するマウスと同じ野生色（アグーチ）を呈し、宿主胚に由来していれば該宿主胚が由来するマウスと同じ黒色を呈する。
【００３０】
かくして得られた個体は、相同組換えＥＳ細胞由来ＰＳＡＰ遺伝子座変異を一方の相同染色体に有するヘテロ接合型である（ＰＳＡＰ  Ｆ／＋）。このＦ１ヘテロ接合型の個体同士を交配すれば、Ｆ２ヘテロ接合型及びＦ２ホモ接合型（ＰＳＡＰ  Ｆ／Ｆ）の個体を得ることができる。ＰＳＡＰ遺伝子変異の機能を組織特異的に欠損させるには、ホモ接合型を用いることが好ましい。
【００３１】
ＰＳＡＰ  Ｆ／Ｆマウスは上述の方法等により作製できるが、既存のＰＳＡＰ  Ｆ／Ｆマウスを用いてもよく、例えば、Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００４；１３（２１）：２７０９−２７２３に記載のマウスが挙げられる。
【００３２】
本発明者が、このＰＳＡＰ遺伝子変異を有するマウスを高齢まで飼育したところ、加齢により、ＰＤ患者と同様の運動障害及びドパミン神経脱落を生じることが判明した。従って、ＰＳＡＰ遺伝子変異を有する非ヒト動物は、パーキンソン病モデル非ヒト動物として有用である。ここで、運動障害は、ロータロッド法による運動機能低下により確認できる。また、ドパミン細胞の脱落は、抗チロシンキナーゼ（ＴＨ）抗体による染色で測定できる。
【００３３】
ＰＳＡＰ遺伝子変異を有するパーキンソン病モデル非ヒト動物を用いれば、パーキンソン病予防治療薬のスクリーニングに応用することができる。例えば、このＰＳＡＰ遺伝子変異を有するモデル非ヒト動物に、被検薬物を投与してその経過を観察すれば、その被検薬物がパーキンソン病の予防治療薬として有用であるか否かが容易に判定できる。
【実施例】
【００３４】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
【００３５】
実施例１
３家系の常染色体優性遺伝性ＰＤ患者の遺伝子解析を行った結果、ＰＳＡＰ遺伝子の病的変異があることを見出した（図１）。３家系にみられたＰＳＡＰ遺伝子変異は全てサポシンＤドメインをコードする領域にみとめられた。ＰＳＡＰ遺伝子変異を持つＰＤ患者の臨床症状が孤発性ＰＤの臨床的特徴に酷似している点は、ＰＳＡＰ遺伝子変異が孤発性ＰＤ発症の病態メカニズムにも関与する可能性を示唆するものと考えられた。ＰＳＡＰはリソソーム機能に関与する蛋白であり、ＰＳＡＰ遺伝子変異を持つパーキンソン病患者（ＰＳＡＰ−ＰＤ）におけるリソソーム機能障害に着目した。まず、ＰＳＡＰ−ＰＤ由来皮膚線維芽細胞について電子顕微鏡による形態学的解析を行ったところリソソーム様構造物の異常な蓄積をみとめた（図２）。この構造物は二重膜小胞を含んでいることからオートリソソームであると考えられた。そして、その蓄積はリソソーム機能障害を示唆する所見として矛盾のないものであり、サポシンＤドメイン変異によりリソソーム機能障害が引き起こされることが示された。
【００３６】
実施例２
人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ；  ｉＰＳＣ）から分化させたドパミン神経細胞の解析を行った。具体的には、採血で得られた単球に山中因子（Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ）を発現したセンダイウイルスベクターを用いてｉＰＳＣを樹立した。中脳ドパミン神経細胞への分化はＰｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０１８；１１５：Ｅ５８１５−５８２３に従い行った。ＰＳＡＰ−ＰＤ中脳ドパミン神経細胞におけるリソソーム機能異常を証明するためにリソソーム阻害薬であるＥ６４ｄとペプスタチンＡを用いたａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｆｌｕｘ  ａｓｓａｙを行った。具体的には、健常対照およびＰＳＡＰ−ＰＤ由来の中脳ドパミン神経細胞の培地に上記２剤を添加した。薬剤処理２４時間後に細胞をＲＩＰＡバッファーで回収しその細胞溶解液についてウェスタンブロット法を用いてオートファゴソームマーカーであるＬＣ３の蛋白量を評価した。
すなわち、ｉＰＳ細胞由来中脳ドパミン神経細胞の培地にリソソーム阻害薬であるＥ６４ｄ（１５μＭ）・ペプスタチンＡ（Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ  ３０μＭ）を添加し２４時間後に細胞を回収してオートファゴソームマーカーであるＬＣ３に対する抗体を用いてウェスタンブロット法を行った。薬剤未添加細胞は定常状態の細胞でありＰＳＡＰ−ＰＤ患者由来中脳ドパミン神経細胞ではＬＣ３−ＩＩ／ＧＡＰＤＨ比が上昇している（図３）。薬剤添加後のＬＣ３−ＩＩ／ＧＡＰＤＨと未添加細胞のＬＣ３−ＩＩ／ＧＡＰＤＨとの比を計算しａｕｔｏｐｈａｇｉｃ  ｆｌｕｘを評価した。蛋白量の評価はＩｍａｇｅ  Ｊソフトを用いたｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙで行った。ローディングコントロールとして抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いた。統計解析はスチューデントのｔ検定で行った（ｎ＝４、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
図３に示すように、ＰＳＡＰ−ＰＤ由来の中脳ドパミン神経細胞はａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｆｌｕｘの低下をみとめておりリソソーム機能障害が示された。
【００３７】
さらにＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＴＸ）不溶性のα−シヌクレインを評価した。具体的には、健常対照細胞とＰＳＡＰ−ＰＤ由来ドパミン神経細胞を１％ＴＸ含有トリス緩衝液に溶解し２０分氷上で静置した後に１００，０００ｇの超遠心を２０分行った。得られた沈殿物はＴＸ不溶性画分（ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ）、上清はＴＸ可溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ）画分としてそれぞれについてウェスタンブロット法をもちいてα−シヌクレインの量を評価した。図４のごとくＴＸ  ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ中のα−シヌクレインが増加しており、凝集傾向のあるα−シヌクレインが蓄積することを示唆する所見である。
【００３８】
実施例３
ＰＳＡＰ遺伝子のサポシンＤドメイン遺伝子変異を導入したマウスについて運動障害の有無と中脳黒質ドパミン神経細胞脱落の有無の評価を試みた。サポシンＤドメイン遺伝子変異導入マウスはＨｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００４；１３（２１）：２７０９−２７２３記載のマウス（Ｃ５０９Ｓ）を用いた。
サポシンＤ変異導入マウスの運動障害および中脳ドパミン神経細胞数の評価は、ヘテロ接合体（ＰＳＡＰwt/mt）マウス、ホモ接合体（ＰＳＡＰmt/mt）マウスを用いて野生型（ＷＴ）マウスとの比較を行うことで解析した。
まず運動障害についてはロータロッド法により解析した。具体的には０〜７０週齢マウスについて自動タイマーと落下センサーを備えた回転式機械による加速回転試験を実施した。ＰＳＡＰwt/mtマウス、ＰＳＡＰmt/mtマウスおよびＷＴをそれぞれ５匹（全てオス）ずつゴムで覆った直径３ｃｍの回転ロッド上に置き回転速度を３ｒｐｍから３５ｒｐｍまで５分かけて加速した。回転の開始からマウスが転倒するまでの時間（秒）が記録された。図５に示すように３５週齢からＰＳＡＰmt/mtマウスの転倒までの時間が短縮傾向を示し始め、特に７０週齢においてはＰＳＡＰwt/mtとＰＳＡＰmt/mtともにＷＴに対して有意な時間短縮を認めた（ｎ＝５、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
次に中脳黒質ドパミン神経細胞数の評価を行った。図６左図では、ＰＳＡＰwt/mtマウス、ＰＳＡＰmt/mtマウスの抗チロシンヒドロキシラーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ；ＴＨ）抗体で染色される細胞数がＷＴに比べて顕著に減少していることを示している。ＴＨはカテコラミン生合成系の第一段階でドパミン生合成の律速酵素でありＬ−チロシンからＬ−ＤＯＰＡを生合成する。Ｌ−ＤＯＰＡはその後脱炭酸反応を経てドパミンに変換される。中脳黒質ドパミン神経細胞では必ずＴＨがあるため、抗ＴＨ抗体で染色される細胞数の低下はドパミン神経細胞の脱落を示すものと考えられる。図６右図のごとく１８月齢におけるドパミン神経細胞数の計測を行いＰＳＡＰwt/mtマウス、ＰＳＡＰmt/mtマウスにおける有意なドパミン神経細胞数減少を認めた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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