(57)【要約】【課題】天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを含有するポリペプチド溶液を、ポリペプチドの分解を抑制しながら、宿主細胞からの抽出によって得ること。【解決手段】天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを発現している宿主細胞又はその破砕物から、ポリペプチドを、水を含む抽出溶媒を含有し所定の温度に加熱された水性液中に抽出して、水性液及びこれに溶解したポリペプチドを含有するポリペプチド溶液を得る工程を備える、ポリペプチド溶液を製造する方法が開示される。所定の温度が９０℃以上１３０℃以下である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを発現している宿主細胞又はその破砕物から、前記ポリペプチドを、水を含む抽出溶媒を含有し所定の温度に加熱された水性液中に抽出して、前記水性液及びこれに溶解した前記ポリペプチドを含有するポリペプチド溶液を得る工程を備え、
前記所定の温度が９０℃以上１３０℃以下である、
ポリペプチド溶液を製造する方法。
【請求項２】
前記所定の温度が９０℃以上１２０℃未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抽出溶媒がアルコールを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
当該方法が、前記宿主細胞及び水を含有する培養液中で前記宿主細胞に前記ポリペプチドを発現させる工程を更に備え、
前記培養液を前記所定の温度に加熱することによって、前記ポリペプチドが、前記培養液に含まれていた水を含む前記抽出溶媒を含有する前記水性液中に抽出され、加熱される前記培養液に、前記抽出溶媒に含まれる溶媒として親水性溶媒が更に加えられてもよい、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記親水性溶媒がアルコールである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記アルコールがエタノールを含む、請求項３又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記抽出溶媒における前記アルコールの割合が、前記抽出溶媒の質量を基準として３０質量％以下である、請求項３、５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記水性液が界面活性剤を更に含有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドと、前記ポリペプチドが溶解している溶媒と、を含有し、前記溶媒が水及びアルコールを含み、成形体を得るための成形用原液である、ポリペプチド溶液。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法によって得られたポリペプチド溶液を成形用原液として用いた成形によって、ポリペプチドを含有するポリペプチド成形体を形成する工程を備える、成形体を製造する方法。
【請求項１１】
前記ポリペプチド成形体が繊維又はフィルムである、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを含有するポリペプチド溶液及びこれを製造する方法、並びにポリペプチド成形体を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
非特許文献１は、単離された組換えクモ糸タンパク質を高温及び高圧条件で溶解する方法を開示している。ここでは、熱及び圧力の最適な組合せが１３５℃及び１４０ｐｓｉ（約０．９７ＭＰａ）であることが示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００２−２４１２９０号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】International Journal of Molecular Sciences, “Importance of Heat andPressure for Solubilization of Recombinant Spider Silk Proteins in AqueousSolution”, Int. J. Mol. Sci. 2016, 17(11)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
宿主細胞から天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを抽出する際に、ポリペプチドの分解が生じることがあった。生産効率の観点の他、特に成形体のような機械的特性を要求される用途への応用を考慮しても、ポリペプチドの分解はできるだけ抑制されることが望ましい。
【０００６】
そこで、本発明の一側面の目的は、天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを含有するポリペプチド溶液を、ポリペプチドの分解を抑制しながら、宿主細胞からの抽出によって得ることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意検討の結果、意外にも、特定の温度に加熱された水を抽出溶媒として用いることによって、天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを、その分解を抑制しながら宿主細胞から抽出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明のいくつかの側面は、以下に関する。
［１］
天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを発現している宿主細胞又はその破砕物から、前記ポリペプチドを、水を含む抽出溶媒を含有し所定の温度に加熱された水性液中に抽出して、前記水性液及びこれに溶解した前記ポリペプチドを含有するポリペプチド溶液を得る工程を備え、
前記所定の温度が９０℃以上１３０℃以下である、
ポリペプチド溶液を製造する方法。
［２］
前記所定の温度が９０℃以上１２０℃未満である、［１］に記載の方法。
［３］
前記抽出溶媒がアルコールを更に含有する、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
当該方法が、前記宿主細胞及び水を含有する培養液中で前記宿主細胞に前記ポリペプチドを発現させる工程を更に備え、
前記培養液を前記所定の温度に加熱することによって、前記ポリペプチドが、前記培養液に含まれていた水を含む前記抽出溶媒を含有する前記水性液中に抽出され、加熱される前記培養液に、前記抽出溶媒に含まれる溶媒として親水性溶媒が更に加えられてもよい、［１］又は［２］に記載の方法。
［５］
前記親水性溶媒がアルコールである、［４］に記載の方法。
［６］
前記アルコールがエタノールを含む、［３］又は［５］に記載の方法。
［７］
前記抽出溶媒における前記アルコールの割合が、水及び前記アルコールの合計量に対して３０質量％以下である、［３］、［５］又は［６］に記載の方法。
［８］
前記水性液が界面活性剤を更に含有する、［１］〜［７］のいずれか１項に記載の方法。
［９］
天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドと、前記ポリペプチドが溶解している溶媒と、を含有し、前記溶媒が水及びアルコールを含み、成形体を得るための成形用原液である、ポリペプチド溶液。
［１０］
［１］〜［８］のいずれか１項に記載の方法によって得られたポリペプチド溶液を成形用原液として用いた成形によって、ポリペプチドを含有するポリペプチド成形体を形成する工程を備える、成形体を製造する方法。
［１１］
前記ポリペプチド成形体が繊維又はフィルムである、［１０］に記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の一側面の目的によれば、天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを含有するポリペプチド溶液を、ポリペプチドの分解を抑制しながら、宿主細胞からの抽出によって得ることができる。さらに、本発明の一側面は、特殊な高圧容器を必ずしも必要としない点でも、従来の方法と比較して有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例で得られたポリペプチド溶液中のポリペプチド（改変フィブロイン）のポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析の結果を示す写真である。
【図２】実施例で得られたポリペプチド溶液中のポリペプチド（改変フィブロイン）のポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析の結果を示す写真である。
【図３】実施例で得られたポリペプチド溶液中のポリペプチド（改変フィブロイン）のポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析の結果を示す写真である。
【図４】実施例で得られたポリペプチド溶液中のポリペプチド（改変フィブロイン）のポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明のいくつかの実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１２】
１．ポリペプチド溶液を製造する方法
ポリペプチド溶液を得る方法の一実施形態は、宿主細胞及び水を含有する培養液中で宿主細胞に天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを発現させる工程と、ポリペプチドを発現している宿主細胞又はその破砕物から、ポリペプチドを、水を含む抽出溶媒を含有し所定の温度に加熱された水性液中に抽出して、水性液及びこれに溶解したポリペプチドを含有するポリペプチド溶液を得る工程とを有する。
【００１３】
培養液中での宿主細胞によるポリペプチドの発現は、当業者に理解される通常の方法で行うことができる。
【００１４】
ポリペプチドが抽出される宿主細胞は、培養液から回収された後の、乾燥細胞、又は湿細胞であることができる。さらに、宿主細胞は、生存し宿主細胞を培養したままの状態であってもよいし、何らかの手法で破砕されていてもよい。
【００１５】
より高い精製度の観点から、抽出の前に、宿主細胞又はその破砕物を、陰イオン界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））で洗浄してもよい。この場合の洗浄は、例えば、ポリペプチドを発現している宿主細胞を破砕すること、及び、破砕物のうちポリペプチドを含む不溶性のポリペプチド画分を回収し、これを陰イオン界面活性剤で洗浄することを含む。
【００１６】
あるいは、培養液から宿主細胞又はその破砕物を回収することなく、培養液中で宿主細胞からポリペプチドを抽出することで、工程のより一層の簡略化を図ることもできる。この場合、例えば、培養液を所定の温度に加熱することによって、ポリペプチドを、培養液に含まれていた水を含む抽出溶媒を含有する水性液中に抽出してもよい。この場合、加熱される培養液に、アルコール等の親水性溶媒が抽出溶媒に含まれる溶媒として更に加えられてもよい。
【００１７】
ポリペプチドの水性液中への抽出は、例えば、宿主細胞又はその破砕物を水性液と混合し、その後、宿主細胞又はその破砕物が水性液中に分散している分散液を、加熱しながら攪拌することを含むことができる。抽出が培養液中で行われる場合、培養液がそのまま、又は必要によってアルコール等の親水性溶媒が添加されてから、抽出のための分散液として用いられ得る。
【００１８】
宿主細胞又はその破砕物と混合される水性液の量は、ポリペプチドを溶解できる量であればよいが、乾燥細胞又は乾燥した破砕物に対しては、質量比で１０〜２０倍量であってもよい。水性液の量は、湿細胞に対しては質量比で４〜５倍量であってもよい。
【００１９】
抽出のための水性液の加熱温度（前記所定の温度）は、９０℃以上、１００℃以上、又は１０５℃以上であってもよく、１３０℃以下、１２０℃未満、又は１１０℃以下であってもよい。これら範囲内の温度に加熱された水性液を用いることによって、特に天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドの分解を抑制しながら、ポリペプチド溶液を得ることができる。
【００２０】
水性液によるポリペプチドの抽出は、低圧下で行うことができる。例えば、大気圧下、抽出溶媒の飽和蒸気圧下、又は圧力０．０７０〜０．２７ＭＰａの雰囲気下で、抽出を行ってもよい。低圧下で抽出を行うことによって、ポリペプチドの分解がより一層顕著に抑制され得る。
【００２１】
ポリペプチドの抽出時間は、ポリペプチドが十分に抽出されるように設定すればよいが、ポリペプチドの分解抑制の観点から、例えば、１８０分以内、６０分以内、又は３０分以内であってもよい。
【００２２】
２．水性液
水性液は、水を含む抽出溶媒を含有し、それ自体が水と任意の割合で相溶し得る単一相の均一媒体であることができる。抽出溶媒は、実質的に水のみであってもよいし、実質的に水及び親水性溶媒（特にアルコール）のみからなる混合溶媒であってもよい。水性液は、リン酸系緩衝液、又はトリス系緩衝液であってもよいし、水酸化ナトリウム等の添加によってそのｐＨが調整されていてもよい。ここで、「実質的に水のみ」とは、抽出溶媒全量のうち水の割合が例えば９８質量％以上、又は９９質量％以上であることを意味する。「実質的に水及び親水性溶媒（又はアルコール）のみ」も同様である。
【００２３】
水は、特に限定されないが、ポリペプチド溶液中の夾雑物を低減するという観点から、例えば純水、蒸留水、又は超純水であってもよい。
【００２４】
水と組み合わせる親水性溶媒は、通常、水と相溶し、水とともに単一相を形成し得る溶媒であればよいが、ポリペプチドの溶解性向上の観点から、極性プロトン性溶媒であってもよく、アルコールであってもよい。アルコールは炭素数１〜６の低級アルコール、特にエタノールであってもよい。水及びアルコールを含む抽出溶媒を含有する水性液は、より低温で宿主細胞からポリペプチドを抽出することができる。低温での抽出によって、ポリペプチドの分解を更に抑制することができる。したがって、抽出溶媒が水及びアルコールを含む場合、ポリペプチドの抽出のための水性液の加熱温度は、１００℃以下、又は９５℃以下であってもよい。一方、抽出溶媒が実質的に水のみである場合、ポリペプチドの抽出のための水性液の加熱温度は、１００℃以上、又は１０５℃以上であってもよい。
【００２５】
水及び親水性溶媒を含む抽出溶媒における水以外の親水性溶媒（例えばアルコール）の割合は、水と親水性溶媒が相分離しない範囲で設定すればよいが、例えば、抽出溶媒、又は得られるポリペプチド溶液の質量を基準として、１０質量％以上、又は２０質量％以上であってもよく、５０質量％以下、４０質量％以下又は３０質量％以下であってもよい。
【００２６】
水性液は、界面活性剤を更に含有していてもよい。界面活性剤は特に限定されず、その例としては、陰イオン界面活性剤、陽イオン活性剤、両性界面活性剤、及び非イオン活性剤が挙げられる。
【００２７】
陰イオン界面活性剤としては、脂肪酸塩、α―スルホ脂肪酸エルテル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルエーテル硫酸エステル塩、アルキルエーテル硫酸エステル塩、及びアルキル硫酸トリエタノールアミン等が挙げられる。
【００２８】
陽イオン界面活性剤としては、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウムクロリド、及びアルキルピリジニウムクロリド等が挙げられる。
【００２９】
両性界面活性剤としては、アルキルカルボキシベタイン、アルキルジエチレントリアミノカルボン酸、及びアルキルアミンオキシド等が挙げられる。
【００３０】
非イオン活性剤としては、脂肪酸ジエタノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、及びポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルの具体例としては、オクチルフェノールエトキシレート（CAS番号：9002-93-1、「Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００」、又は「Ｐｅｎｔｅｘ  １２２６」（ミヨシ油脂株式会社製））が挙げられる。
【００３１】
水性液における界面活性剤の割合は特に限定されないが、水性液の質量を基準として０．１質量％以上、０．５質量部以上、又は１質量％以上であってもよい。界面活性剤の割合の上限は特に制限されないが、１０質量％以下、７質量％以下、又は５質量％以下であってもよい。界面活性剤の割合がこれら範囲内にあることで、目的タンパク質を効果的に水性液に溶解することができるとともに、タンパク質が溶解した後のゲル化を抑制することができる。
【００３２】
３．天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチド
天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドは、天然クモ糸タンパク質、及び天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチド（人造クモ糸タンパク質）からなる群より選ばれるクモ糸ポリペプチドを含有していてもよい。
【００３３】
天然クモ糸タンパク質としては、例えば、大吐糸管しおり糸タンパク質、横糸タンパク質、及び小瓶状腺タンパク質が挙げられる。大吐糸管しおり糸は、結晶領域と非晶領域（無定形領域とも言う。）からなる繰り返し領域を持つため、高い応力と伸縮性を併せ持つ。クモ糸の横糸は、結晶領域を持たず、非晶領域からなる繰り返し領域を持つという特徴を有する。横糸は、大吐糸管しおり糸に比べると応力は劣るが、高い伸縮性を持つ。
【００３４】
大吐糸管しおり糸タンパク質は、クモの大瓶状線で産生され、強靭性に優れるという特徴を有する。大吐糸管しおり糸タンパク質としては、例えば、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する大瓶状腺スピドロインＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２、並びに二ワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）に由来するＡＤＦ３及びＡＤＦ４が挙げられる。ＡＤＦ３は、ニワオニグモの２つの主要なしおり糸タンパク質の一つである。天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドは、これらのしおり糸タンパク質に由来するポリペプチドであってもよい。ＡＤＦ３に由来するポリペプチドは、比較的合成し易く、また、強伸度及びタフネスの点で優れた特性を有する。
【００３５】
横糸タンパク質は、クモの鞭毛状腺（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ  ｇｌａｎｄ）で産生される。横糸タンパク質としては、例えばアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する鞭毛状絹タンパク質（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が挙げられる。
【００３６】
天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドである大吐糸管しおり糸由来のタンパク質は、組換えクモ糸タンパク質であってよい。組換えクモ糸タンパク質としては、天然型クモ糸タンパク質の変異体、類似体又は誘導体等が挙げられる。このようなポリペプチドの好適な一例は、大吐糸管しおり糸タンパク質の組換えクモ糸タンパク質（「大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチド」ともいう。）である。
【００３７】
天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドである大吐糸管しおり糸由来のタンパク質として、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。ここで、式１中、（Ａ）ｎモチーフの、Ａはアラニン残基を示す。ｎは２〜２０、４〜２０、８〜２０、１０〜２０、４〜１６、８〜１６、１０〜１６の整数であってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は４０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する）であってもよい。その具体例として配列番号１（ＰＲＴ４１０）、配列番号２（ＰＲＴ７８７）、配列番号３（ＰＲＴ７９９）、配列番号４（ＰＲＴ４１４）、配列番号５（ＰＲＴ２０４）、配列番号６（ＰＲＴ３６３）、配列番号７（ＰＲＴ２０２）、又は配列番号８（ＰＲＴ２０７）で示されるアミノ酸配列を挙げることができる。
【００３８】
天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドであって横糸タンパク質に由来のタンパク質としては、例えば、式２：［ＲＥＰ２］ｏで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式２中、ＲＥＰ２はＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘはアラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びバリン（Ｖａｌ）からなる群から選ばれる一つのアミノ酸を示す。ｏは８〜３００の整数を示す。）を挙げることができる。その具体例としては配列番号９で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号９で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分的な配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＦ３６０９０、ＧＩ：７１０６２２４）のリピート部分及びモチーフに該当するＮ末端から１２２０残基目から１６５９残基目までのアミノ酸配列（ＰＲ１配列と記す。）である。
【００３９】
前記組換えクモ糸タンパク質（ポリペプチド）は、組換えの対象となる天然型クモ糸タンパク質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換した宿主を用いて製造することができる。遺伝子の製造方法は特に制限されず、天然型クモ糸タンパク質をコードする遺伝子をクモ由来の細胞からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅してクローニングするか、若しくは化学的に合成する。遺伝子の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手した天然型クモ糸タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ  ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ  ｐｌｕｓ  １０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結して合成することができる。この際に、タンパク質の精製や確認を容易にするため、前記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を合成してもよい。前記発現ベクターとしては、ＤＮＡ配列からタンパク質を発現し得るプラスミド、ファージ、ウイルスなどを用いることができる。前記プラスミド型発現ベクターとしては、宿主細胞内で目的の遺伝子が発現し、かつそれ自体が増幅することのできるものであればよく、特に限定されない。例えば宿主として大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）を用いる場合は、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクター、ｐＣｏｌｄプラスミドベクターなどを用いることができる。中でも、タンパク質の生産性の観点から、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクターを用いることが好ましい。宿主としては、例えば動物細胞、植物細胞、微生物などを用いることができる。
【００４０】
４．ポリペプチド溶液
宿主細胞からのポリペプチドの抽出によって、天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドと、ポリペプチドが溶解している溶媒とを含有するポリペプチド溶液が得られる。ポリペプチド溶液中の溶媒の一部又は全部が、抽出のために用いられた抽出溶媒であってもよい。ポリペプチド溶液は、不可避的な成分、例えばポリペプチドに含まれていた夾雑物を含み得る。
【００４１】
ポリペプチド溶液は、例えば、ポリペプチドを含有するポリペプチド成形体を得るための成形用原液（ドープ液）として用いることができる。成形用原液（ドープ液）は、例えば、繊維紡糸のための紡糸原液、又はフィルムの成膜のためのキャスト液として有用である。
【００４２】
ポリペプチド溶液の粘度を、紡糸等の成形プロセスに適した粘度に調整してもよい。例えばポリペプチド溶液の粘度は、成形プロセスでの温度において１００〜１０，０００ｃＰ（センチポイズ）であってもよい。ポリペプチド溶液の粘度は、例えばポリペプチドの濃度によって調整することができる。ポリペプチド溶液の粘度は、例えば京都電子工業社製の商品名“ＥＭＳ粘度計”を使用して測定される。
【００４３】
５．ポリペプチドの精製方法
ポリペプチド溶液から不要成分（主として固形分）を除去する工程を経て、ポリペプチドを精製することができる。例えば、ポリペプチドを含む上清の回収によって沈降物を分離してもよい。取扱いの簡便性から、濾過による分離又は遠心分離により沈降物を除去することが好ましい。濾過による分離は、例えば、ろ紙、ろ過膜などを用いて行うことができる。遠心分離の条件は、特に限定されず、例えば、１１０００×ｇで５分間行うことができる。
【００４４】
精製されたポリペプチドを含むポリペプチドの溶液は、凍結乾燥により粉末のポリペプチドを回収することを必要とせず、そのまま成形用原液（ドープ液）として用いることができる。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例を挙げて本発明についてさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４６】
１．ポリペプチド（改変フィブロイン）の準備
（１）改変フィブロイン発現株の作製
ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のクモ糸フィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）に由来する、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである改変フィブロイン、及び、アラネウス・ジアデマタス（Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｓｕ）由来のクモ糸フィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１０．１、ＧＩ：１２６３２８７）に由来する、配列番号５、配列番号６、配列番号７、又は配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである改変フィブロインを設計した。以下、各配列番号に対応する改変フィブロインを下記の名称でいうことがある。
配列番号１：ＰＲＴ４１０
配列番号２：ＰＲＴ７８７
配列番号３：ＰＲＴ７９９
配列番号４：ＰＲＴ４１４
配列番号５：ＰＲＴ２０４
配列番号６：ＰＲＴ３６３
配列番号７：ＰＲＴ２０２
配列番号８：ＰＲＴ２０７
【００４７】
各改変フィブロインをコードする核酸を合成した。それぞれの核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト及び終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。当該核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。合成された核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。
【００４８】
（２）ポリペプチドの発現
得られた発現ベクターによって、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表１）にＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまで、約１５時間のフラスコ培養を行い、シード培養液を得た。
【００４９】
【表１】
2020141558.tif 000003
【００５０】
当該シード培養液を５００ｍｌの生産培地（表２）を添加したジャーファーメンターに、ＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して形質転換大腸菌を培養した。培養の間、培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持した。
【００５１】
【表２】
2020141558.tif 000004
【００５２】
生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  １２０ｇ／１Ｌ）を１ｍｌ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養を２０時間継続した。培養の間、培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持した。その後、１Ｍのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、目的の改変フィブロインを発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後、２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とするタンパク質サイズのバンドの出現により、目的とする改変フィブロインの発現を確認した。
【００５３】
（３）ポリペプチド粉末
ＩＰＴＧを添加してから２０時間後に回収した菌体を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で洗浄し湿菌体を得た。洗浄後の湿菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ  Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ社）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ  グアニジン緩衝液（８Ｍ  グアニジン塩酸塩、１０ｍＭ  リン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集ポリペプチドを遠心分離により回収した。回収した凝集ポリペプチドから凍結乾燥機で水分を除き、各改変フィブロインの凍結乾燥粉末を得た。
【００５４】
２．溶解試験
２−１．温度
ＰＲＴ４１０、ＰＲＴ４１４、ＰＲＴ２０４、ＰＲＴ３６３、ＰＲＴ２０２、又はＰＲＴ２０７の乾燥粉末５０ｍｇを、１０ｍＬのバイヤル瓶に量り取り、そこに純水５ｍＬを加えた。得られた分散液を、スターラー付きアルミブロック恒温槽（ＲＣＨ−２０Ｌ、東京理化器械製）を用いて、温度を段階的に上昇させながら、各温度での水蒸気圧下で攪拌した。目視で粉末の溶解が確認された温度を、「溶解温度」として記録した。確認された各改変フィブロインの溶解温度を表３に示す。
【００５５】
【表３】
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【００５６】
図１は、１１０〜１５０℃の各温度の加熱で溶解したＰＲＴ４１０のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析の結果を示す写真である。特に１１０〜１３０℃の範囲で、タンパク質の分解を抑制しながら、タンパク質の溶液が得られていることが確認された。図中に、発光強度の比較から簡易的に求めた、未加熱のポリペプチド（Ｒ）を１００としたときのポリペプチドの残存度合いを示す。
【００５７】
２−２．溶媒の種類／添加剤
ＰＲＴ７９９の乾燥粉末５０ｍｇを、１０ｍＬのバイヤル瓶に量り取り、そこに表４に示す各種溶媒５ｍＬを加えた。得られた分散液を、スターラー付きアルミブロック恒温槽（ＲＣＨ−２０Ｌ、東京理化器械製）を用いて、温度を１１５℃まで段階的に上昇させながら、各温度での飽和蒸気圧下で攪拌した。目視で乾燥粉末の溶解が確認された温度を、「溶解温度」として記録した。分散液のゲル化の有無も目視で確認した。
【００５８】
表中に示される混合溶媒の比率は、体積比である。一部の溶媒については、水酸化ナトリウム、及び塩酸の添加によってｐＨを調整した。表中で略記される成分の詳細は以下のとおりである。
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００：オクチルフェノールエトキシレート（CAS番号：9002-93-1）
Ｐｅｎｔｅｘ  １２２６：オクチルフェノールエトキシレート（ミヨシ油脂株式会社、CAS番号：9002-93-1）
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
【００５９】
表中、「ゲル化」に関しては、「Ａ」はゲルの発生が実質的に認められなかったことを示し。「Ｂ」はゲルの発生がやや認められたことを示し、「Ｃ」はゲル化の発生がやや多く認められたことを示す。
【００６０】
【表４】
2020141558.tif 000006
【００６１】
ＰＲＴ７９９、及びＰＲＴ７８７について上記と同様の溶解試験を行った。結果を表５に示す。
【００６２】
【表５】
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【００６３】
２−３．湿菌体からの抽出試験
「１．ポリペプチド（改変フィブロイン）の準備」の操作の中で得られた、ＰＲＴ４１０、ＰＲＴ７８７、又はＰＲＴ７９９及び水を含む洗浄後の湿菌体１ｇを、１０ｍＬのバイヤル瓶に量り取り、そこに、抽出用の水性液５ｍＬを加えた。得られた分散液を、スターラー付きアルミブロック恒温槽（ＲＣＨ−２０Ｌ、東京理化器械製）を用いて、１１０℃に加熱しながら、水蒸気圧下で１０分間、攪拌した。その後、湿菌体から抽出された各タンパク質を含むタンパク質溶液を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分析した。
【００６４】
図２は、湿菌体から抽出されたＰＲＴ４１０のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析の結果を示す写真である。図中、各レーンの詳細は以下のとおりである。
１：市販の分子量マーカー
２：純水
３：水／エタノールの混合溶媒（水／エタノール＝７０／３０（体積比））
【００６５】
図３は、湿菌体から抽出されたＰＲＴ７８７のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析の結果を示す写真である。図中、各レーンの水性液の詳細は以下のとおりである。
１：市販の分子量マーカー
２：水／エタノールの混合溶媒（水：エタノール＝７０：３０（体積比））
３：水／エタノールの混合溶媒（水：エタノール＝７０：３０（体積比）、ｐＨ１０（ＮａＯＨによりｐＨ調整））
４：水（ｐＨ１０（ＮａＯＨによりｐＨ調整））
【００６６】
図４は、湿菌体から抽出されたＰＲＴ７９９のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析の結果を示す写真である。図中、各レーンの水性液の詳細は以下のとおりである。
１：市販の分子量マーカー
２：水／エタノールの混合溶媒（水：エタノール＝７０：３０（体積比））
【００６７】
いずれのタンパク質も、分解を抑制しながら、湿菌体から抽出されたことが確認された。
【００６８】
これらの実験結果から、水を抽出溶媒として用いることによって、天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドが発現している宿主細胞から、分解を抑制しながらポリペプチドを回収できることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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