(57)【要約】【課題】  本発明は、ＲＮＡウイルスからウイルスＲＮＡを簡単に単離する方法及びウイルスをより正確に定量する方法を提供することを目的とする。【解決手段】  実施形態に従うウイルス単離方法は、（Ｓ１）試料中のＲＮＡウイルスから内包物を放出させること、（Ｓ２）試料にプロテイナーゼＫを添加すること、及び（Ｓ３）得られた混合液からＲＮＡを回収することを含む。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｓ１）試料中のＲＮＡウイルスから内包物を放出させること、
（Ｓ２）前記試料にプロテイナーゼＫを添加すること、及び
（Ｓ３）得られた混合液からＲＮＡを回収すること
を含むウイルスＲＮＡ単離方法。
【請求項２】
前記ＲＮＡウイルスは、不活性化されたＲＮＡウイルスである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記不活性化されたＲＮＡウイルスは、ホルマリン処理、ＵＶ照射処理、液状過熱処理、乾燥過熱処理、界面活性剤処理、酸処理、アルカリ処理及び／又はアルキル化剤処理により不活性化されたＲＮＡウイルスである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＮＡウイルスは、エンテロウイルス、カルディオウイルス、ライノウイルス、アフトウイルス、カリシウイルス、ヘパトウイルス、オルビウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、アビビルナウイルス、ピスチビルナウイルス、エントモビルナウイルス、ルビウイルス、ペスティウイルス、フラヴィウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ニューモウイルス、パラミクソウイルス、モルビリウイルス、ベシクロウイルス、リッサウイルス、コロナウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス又はレンチウイルスに属するＲＮＡウイルスである請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（Ｓ１）は、ＲＮＡウイルスの電気的処理又は化学的処理により行われる請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記電気的処理は、ＲＮＡウイルスに電圧を印加することである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記化学的処理は、酵素、界面活性剤、カオトロピック試薬、金属器レート剤、還元剤、有機溶媒又はその組合せからなる群から選択される変性試薬をＲＮＡウイルスに接触させることである請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記工程（Ｓ３）の後、回収した前記ＲＮＡにプロテアーゼを接触させることを更に含む請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記プロテアーゼは、プロテイナーゼＫである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（Ｓ１１）試料中のＲＮＡウイルスから内包物を放出させること、
（Ｓ１２）前記試料にプロテイナーゼＫを添加すること、
（Ｓ１３）得られた混合液からＲＮＡを回収すること、及び
（Ｓ１４）前記工程（Ｓ１３）によって得られたＲＮＡ溶液に含まれる前記ＲＮＡの存在量から、前記試料中の前記ＲＮＡウイルスのコピー数を決定すること
を含むウイルス定量方法。
【請求項１１】
前記ＲＮＡウイルスは、不活性化されたＲＮＡウイルスである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記不活性化されたＲＮＡウイルスは、液状過熱処理、乾燥過熱処理、界面活性剤処理、酸処理、アルカリ処理及び／又はアルキル化剤処理により不活性化されたＲＮＡウイルスである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＲＮＡウイルスは、エンテロウイルス、カルディオウイルス、ライノウイルス、アフトウイルス、カリシウイルス、ヘパトウイルス、オルビウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、アビビルナウイルス、ピスチビルナウイルス、エントモビルナウイルス、ルビウイルス、ペスティウイルス、フラヴィウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ニューモウイルス、パラミクソウイルス、モルビリウイルス、ベシクロウイルス、リッサウイルス、コロナウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス又はレンチウイルスに属するＲＮＡウイルスである請求項１０〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記工程（Ｓ１１）は、ＲＮＡウイルスの電気的処理又は化学的処理により行われる請求項１０〜１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記電気的処理は、ＲＮＡウイルスに電圧を印加することである請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記化学的処理は、酵素、界面活性剤、カオトロピック試薬、金属器レート剤、還元剤、有機溶媒又はその組合せからなる群から選択される変性試薬をＲＮＡウイルスに接触させることである請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記工程（Ｓ１３）の後、回収した前記ＲＮＡにプロテアーゼを接触させることを更に含む請求項１０〜１６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記プロテアーゼは、プロテイナーゼＫである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記工程（Ｓ１１）〜（Ｓ１４）が１つの装置上で行われる請求項１０〜１８の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスＲＮＡ単離方法及びウイルス定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス感染症の診断、ウイルスを用いた基礎研究又はウイルス製剤の製造などの分野において、ウイルスを用いる際、安全性の観点から不活性化されたウイルスを使用する場合が多い。特に、体外診断用キットやウイルス定量装置の校正用抗原には不活化ウイルスを用いる。
【０００３】
不活化ウイルスは、ウイルスをホルマリン処理やＵＶ処理することによって製造される。不活化ウイルスは通常、核酸とタンパク質、及びタンパク質同士が架橋されている。上記の分野においては、このような不活化ウイルスを正確に定量することが求められる。しかしながら不活化ウイルスを定量するには核酸とタンパク質との架橋を切断し、核酸を単離する必要がある。架橋された核酸の単離工程は煩雑な手順を必要とし、完全に核酸を単離することが難しい。
【０００４】
不活化ウイルスを定量する方法として、ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法など、抗体を用いた方法がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ＥＬＩＳＡ法及びイムノクロマト法は、操作に時間がかかり、かつ操作が煩雑である。また不活化ウイルスを正確に定量することは困難である場合があり、方法によって得られる結果が異なることもあった。このような状況において、不活化ウイルスを正確に定量する方法の開発が求められている。
【０００６】
本発明は、ＲＮＡウイルスからウイルスＲＮＡを簡単に単離する方法及びウイルスをより正確に定量する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
実施形態に従うウイルス単離方法は、（Ｓ１）試料中のＲＮＡウイルスから内包物を放出させること、（Ｓ２）試料にプロテイナーゼＫを添加すること、及び（Ｓ３）得られた混合液からＲＮＡを回収することを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、実施形態のウイルスＲＮＡ単離方法を示すフローチャートである。
【図２】図２は、実施形態のウイルスＲＮＡ単離方法の工程を示す模式図である。
【図３】図３は、実施形態のウイルス定量方法を示すフローチャートである。
【図４】図４は、例１の実験結果を示すグラフである。
【図５】図５は、例１の実験結果を示すグラフである。
【図６】図６は、例２の実験結果を示すグラフである。
【図７】図７は、例２の実験結果を示すグラフである。
【図８】図８は、例３の実験結果を示すグラフである。
【図９】図９は、例４の実験結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
実施形態によれば、ウイルスＲＮＡ単離方法と、当該単離方法によって単離されたＲＮＡを用いたウイルス定量方法とが提供される。以下、各方法について説明する。
【００１０】
・ウイルスＲＮＡ単離方法
図１は、実施形態のウイルスＲＮＡ単離方法の一例を示すフローチャートである。当該方法は、（Ｓ１）試料中のＲＮＡウイルスから内包物を放出させること、（Ｓ２）試料にプロテイナーゼＫを添加すること、及び（Ｓ３）得られた混合液からＲＮＡを回収することを含む。
【００１１】
以上の方法によってＲＮＡウイルスからＲＮＡが単離される原理について図２を用いて説明する。図２は、実施形態のウイルスＲＮＡ単離方法の工程を示す模式図である。図２の（ａ）に示すように、ＲＮＡウイルス１は、例えばウイルスエンベロープ２に内包されたゲノムＲＮＡ３及びタンパク質４を含む。タンパク質４は、ポリメラーゼ又は核タンパク質などである。
【００１２】
図２では予め不活性化処理されたＲＮＡウイルス１を用いる例を示す。不活性化処理によりＲＮＡウイルス１のＲＮＡ３とタンパク質４とが架橋されて複合体を形成している。
【００１３】
ＲＮＡウイルス１は、例えば、液体試料５に含まれている。図２には便宜上液体試料５にＲＮＡウイルス１が１つ含まれた例を示すが、通常ＲＮＡウイルス１は液体試料５中に複数含まれる。
【００１４】
例えば、ＲＮＡウイルス１の内包物、即ちＲＮＡ３及びタンパク質４を液体試料５中に放出させるために液体試料５に変性試薬を添加する。変性試薬によりＲＮＡウイルス１のウイルスエンベロープ２が溶解するか或いはウイルスエンベロープ２に穴が開き、ＲＮＡウイルス１の内包物が液体試料５中に放出される（図２の（ｂ））。
【００１５】
次に液体試料５にプロテイナーゼＫを添加する。プロテイナーゼＫは、タンパク質のアミノ酸のカルボキシル基側のペプチド結合を酵素反応により切断することでタンパク質とＲＮＡの架橋を切断すると考えられる。したがって、液体試料５中でＲＮＡ３とタンパク質４との架橋を切断することができる。故に、ＲＮＡ３及びタンパク質４はそれぞれ分離され、ＲＮＡ３は、他のＲＮＡ３やタンパク質４等の結合物のない精製された状態となる（図２の（ｃ））。
【００１６】
その後、図２の（ｃ）に示す得られた混合液からＲＮＡ３を回収する（図２の（ｄ））。
【００１７】
以上の方法によれば、プロテイナーゼＫによってＲＮＡ３とタンパク質４との間の架橋が切断されるため、簡単な操作でタンパク質４が付着していないＲＮＡ３を得ることができる。即ち、ＲＮＡ３を単離することができる。このようにＲＮＡを単離することによって、例えば、この後に行われ得るウイルス定量工程で反応を阻害するタンパク質や架橋を除去できるので非常に高感度にウイルスの定量を行うことができる。
【００１８】
実施形態のウイルスＲＮＡ単離方法に用いられるウイルスは、ＲＮＡウイルスである。ＲＮＡウイルスは、例えば、エンテロウイルス、カルディオウイルス、ライノウイルス、アフトウイルス、カリシウイルス、ヘパトウイルス、オルビウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、アビビルナウイルス、ピスチビルナウイルス、エントモビルナウイルス、ルビウイルス、ペスティウイルス、フラヴィウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ニューモウイルス、パラミクソウイルス、モルビリウイルス、ベシクロウイルス、リッサウイルス、コロナウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス又はレンチウイルスに属するＲＮＡウイルスである。
【００１９】
実施形態の方法は、プロテイナーゼＫによって架橋を切断するため、ＲＮＡ及びタンパク質が架橋されている不活性化処理されたＲＮＡウイルス１のＲＮＡ３を単離するのに特に有用である。不活性化処理されたウイルスは、例えば、ホルマリン処理、ＵＶ照射処理、液状過熱処理、乾燥過熱処理、界面活性剤処理、酸処理、アルカリ処理又はアルキル化剤処理されたウイルスである。
【００２０】
或いは、不活性化処理していないＲＮＡウイルス１を用いても同様にＲＮＡ３を単離することができる。
【００２１】
ＲＮＡウイルス１を含む液体試料５は、例えば、ＲＮＡウイルス１を宿主細胞培養用培地又は検体輸送用培地などの培地、リン酸緩衝液等の緩衝液或いは生理食塩水などの液体媒体に含ませたものである。
【００２２】
工程（Ｓ１）における内包物の放出は、例えば、図２に示す液体試料５への変性試薬の添加のような、ウイルスの化学的処理により行うことができる。変性試薬は、例えば、酵素、界面活性剤、カオトロピック試薬、金属器レート剤、還元剤、有機溶媒又はその組合せからなる群から選択される。
【００２３】
或いは、内包物の放出は電気的処理によっても行うことができる。電気的処理とは、例えば、ＲＮＡウイルスに電圧を印加することである。例えば、電源と接続された少なくとも２つの電極を試料に接触させ、電極に電圧を印加することによってウイルスへの電圧印加をおこなうことができる。電圧の印加によって、ウイルスエンベロープを部分的又は全て破壊することができる。その結果、内包物が試料中に放出される。
【００２４】
プロテイナーゼＫ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）は、プロテアーゼＫ、エンドペプチターゼＫとも呼ばれるプロテアーゼの１種であるタンパク質である。プロテイナーゼＫは、架橋を切断する活性を有する限りにおいて、そのペプチド配列の一部を含むペプチド断片であってもよい。
【００２５】
工程（Ｓ２）においてプロテイナーゼＫを添加した後、液体試料５を２５〜６５℃で使用可能であるが、５５℃３時間静置することがより好ましい。それによって、架橋を十分に切断することができる。
【００２６】
工程（Ｓ３）におけるＲＮＡ３の回収は、溶液から核酸を回収する公知の何れかの方法を用いて行われればよい。例えば、回収は次のように行われる。工程（Ｓ２）で得られた混合物をフィルターでろ過してＲＮＡをフィルターに吸着させる。次いでフィルターをタンパク質変性剤又はタンパク質可溶化剤などで洗浄してタンパク質を洗い流した後、フィルターを溶出緩衝液などで処理してＲＮＡを溶出させる。
【００２７】
例えば、工程（Ｓ１）〜（Ｓ３）は、公知の核酸抽出方法又は公知の核酸抽出キットを用いて行われてもよい。その場合、これらの方法におけるウイルスの内包物を放出させる工程の後に、プロテイナーゼＫを添加する工程を加えればよい。
【００２８】
更なる実施形態において、実施形態のＲＮＡ単離方法は、工程（Ｓ３）の後、単離されたＲＮＡを含むＲＮＡ溶液にプロテアーゼを接触させる工程を含んでもよい。それによって、回収されたＲＮＡに架橋が残留していた場合にそれを切断することができる。その結果、ＲＮＡを更に精製することができる。プロテアーゼは、例えば、プロテイナーゼＫである。
【００２９】
・ウイルス定量方法
図３は、実施形態のウイルス定量方法を示すフローチャートである。当該方法は、上記ウイルスＲＮＡ単離方法において単離されたＲＮＡを定量することによって試料中のウイルスを定量する方法である。
【００３０】
当該方法は、以下の工程を含む。（Ｓ１１）試料中のＲＮＡウイルスから内包物を放出させること、（Ｓ１２）試料にプロテイナーゼＫを添加すること、（Ｓ１３）得られた混合液からＲＮＡを回収すること、（Ｓ１４）前記工程（Ｓ１３）によって得られたＲＮＡ溶液に含まれるＲＮＡの存在量から、試料中のＲＮＡウイルスのコピー数を決定すること。
【００３１】
工程（Ｓ１１）〜（Ｓ１３）は、上記工程（Ｓ１）〜（Ｓ３）と同様に行うことができる。工程（Ｓ１１）〜（Ｓ１３）を行うことによって、単離されたＲＮＡを含むＲＮＡ溶液が得られる。
【００３２】
工程（Ｓ１４）においては、例えば、まずＲＮＡ溶液に含まれるＲＮＡを定量する。ＲＮＡの定量は、例えば、用いるＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡに存在することが知られている特定の配列を定量すればよい。次に、その結果から試料中のウイルスのコピー数を決定する。工程（Ｓ１４）は、溶液中の核酸の存在量からウイルスのコピー数を決定する公知の方法によって行われればよく、例えばＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、キャピラリー電気泳動法、ＲＮＡシークエンシングなどを用いて行うことができる。
【００３３】
以上に説明した実施形態のウイルス定量方法によれば、プロテイナーゼＫを用いてＲＮＡを単離するため、ＲＮＡがＲＮＡ定量工程を阻害するタンパク質や架橋構造を含まず、非常に高感度にＲＮＡウイルスを定量することが可能である。特に不活性化処理されたＲＮＡウイルスの定量を行う際にも簡単な操作で正確にウイルスを定量することができる。
【００３４】
また、実施形態のウイルス定量方法は、まずＲＮＡを単離するため、ウイルス定量工程にＲＴ−ＰＣＲ法やキャピラリー電気泳動法などの手順が簡単な方法を選択することができる。したがって、場所を選ばずにウイルスのコピー数評価を行うことができる。
【００３５】
例えば、市販の不活化ウイルスは不活化前のウイルスのプラークアッセイ法などによる大まかなコピー数評価しか行われていない場合が多い。プラークアッセイ法では、手技や実験条件によりプラークの数が変化したり、プラーク数を目視により計数したりするため、精度に偏りがある。このような市販品に掲載されたコピー数と、使用する直前のコピー数には隔たりがある可能性があった。対して、実施形態の方法によれば簡単な操作で正確にコピー数の評価を行うことができるので、市販の不活化ウイルスを使用する際、その都度、実施形態の方法を用いてウイルスのコピー数を評価すれば、その後正確な診断や実験が可能である。例えば、前記工程（Ｓ１１）〜（Ｓ１４）は１つのウイルス定量装置上で行うことも可能である。
【００３６】
＜例＞
［例１］
ホルマリンで不活性化処理されたインフルエンザＡ型ウイルス（Ｈ３／Ｎ２）溶液（ロットＡ１及びＡ２）から、実施形態の単離方法（実施例１）及びＱｉａｇｅｎｖｉｒａｌＲＮＡｍｉｎｉｋｉｔ（比較例１）を用いてＲＮＡの抽出を行なった。
【００３７】
実施形態の単離方法（実施例１）は、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＦＦＰＥ ＲＮＡ ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して行った。即ち、ウイルス溶液をカオトロピック試薬及び界面活性剤で溶解した溶解液に、プロテイナーゼＫを５６０μｇ添加した後、５５℃で３時間静置し、反応を行った。反応後、キット付属のフィルターにＲＮＡを吸着させ、塩酸グアニジン溶液でフィルターを洗浄後、キット付属のＥｌｕｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒによりフィルターからの溶出を行った。
【００３８】
Ｑｉａｇｅｎ ｖｉｒａｌ ＲＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔを用いた方法（比較例１）においては、キット付属のプロトコールに従ってＲＮＡを抽出した。
【００３９】
各々の方法で抽出したＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法によるインフルエンザＡ型ウイルスのコピー数評価を行なった。ＲＴ−ＰＣＲには以下の表１に示すプライマー、及び表２に示すプローブを使用した。使用したＰＣＲ反応条件を表３に示す。
【表１】
2020065459.tif 000003
【００４０】
【表２】
2020065459.tif 000004
【００４１】
【表３】
2020065459.tif 000005
ＲＴ−ＰＣＲの結果を図４に示す。実施例１（プロテイナーゼＫ処理あり）では、ロットＡ１が１．８９×１０６コピー、ロットＡ２が１．２４×１０６コピーであった。対して、比較例１（プロテイナーゼＫ処理無し）では、ロットＡ１が２．７×１０４コピー、ロットＡ２が４．２×１０４であった。この結果から明らかであるように、実施例１の方が、比較例１よりも検出されたウイルスコピー数が多くなった。したがって、実施形態の単離方法を用いた場合、より高感度にウイルスを定量できることが示唆された。
【００４２】
次に、上記ロットＡ１及びロットＡ２のウイルスについて、イムノアッセイ（Ｒａｐｉｉｍ（登録商標） Ｅｙｅ１０、及びインフルエンザウイルスキットＲａｐｉｉｍ（登録商標）Ｆｌｕ−ＡＢを使用）によって感度測定を行った（比較例２）。その結果を図５に示す。イムノアッセイにおけるＡ１及びＡ２の感度比率（Ａ１／Ａ２）は、１．４であった。
【００４３】
続いて、ＲＴ−ＰＣＲで得られたコピー数（実施例１、比較例１）についてＡ１／Ａ２値を算出した。その結果、実施例１のＡ１／Ａ２値は１．５２であり、イムノアッセイ（比較例２）と近い値であった。対して、比較例１では０．６４であり、イムノアッセイ（比較例２）とは異なった。以上の結果から、実施形態の単離方法で得られたＲＮＡによるコピー数評価結果はイムノアッセイと同等の感度比率を示すことが明らかとなった。したがって、プロテイナーゼＫを用いた方が正確にウイルスを定量できることが示唆された。
【００４４】
［例２］
ホルマリンで不活性化処理を行なったインフルエンザＡ型ウイルス（Ｈ３／Ｎ２）溶液を用いて実施例１と同じ方法によりＲＮＡ抽出を行なった（実施例２）。また、対照サンプルとしてホルマリン未処理のインフルエンザＡ型ウイルス（Ｈ３／Ｎ２）溶液を用いて、実施例１と同じ方法によりＲＮＡ抽出を行なった（実施例３）。各々のＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法によるインフルエンザＡ型（Ｈ３／Ｎ２）ウイルスのコピー数評価を行なった。
【００４５】
ＲＴ−ＰＣＲは、市販のプライマーキットＨｕｍａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｓｕｂｔｙｐｅ（Ｈ３）ｇｅｎｅｓｉｇＡｄｖａｎｃｅｄＫｉｔ（Ｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎ）を使用して行った。ＲＴ−ＰＣＲ反応条件を表４に示す。
【表４】
2020065459.tif 000006
ＲＴ−ＰＣＲの結果を図６に示す。実施例２（ホルマリン処理）のコピー数は１．２４×１０７コピーであった。対して、実施例３（ホルマリン未処理）では、１．５×１０７コピーであった。ホルマリン未処理／ホルマリン不活性化処理のコピー数比率は１．２であった。
【００４６】
上記と同様のホルマリン不活性化処理ウイルスサンプル及びホルマリン未処理ウイルスサンプルを用いて、イムノアッセイによる感度測定を行った（それぞれ比較例３、４）。その結果を図７に示す。イムノアッセイによるホルマリン未処理／ホルマリン不活性化処理の感度比率は１．１９であった。
【００４７】
実施形態の方法で単離したＲＮＡ溶液（実施例２、３）によるウイルコピー数評価は、ＲＴ−ＰＣＲとイムノアッセイ（比較例３、４）とほぼ同等の感度比率傾向を示した。したがって、実施形態の方法によれば、不活性化処理したウイルスも、不活性化処理していないウイルスと同様の精度で、またイムノアッセイと同様の感度比率でウイルスコピー数を評価できることが明らかとなった。
【００４８】
［例３］
ホルマリンで不活性化処理を行なったインフルエンザＡ型（Ｈ１Ｎ１）ウイルス溶液を、各々１／１０、１／１００、１／２００の希釈率で段階希釈を行い実施例１と同じ方法によりＲＮＡ抽出を行った（実施例４）。また、対照サンプルとして不活性化処理を行なっていないインフルエンザＡ型（Ｈ１Ｎ１）ウイルス溶液を、各々１／１０、１／１００、１／２００の希釈率で段階希釈を行い実施例１と同じ方法によりＲＮＡ抽出を行った（実施例５）。
【００４９】
各々抽出されたＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法によりインフルエンザＡ型（Ｈ１Ｎ１）ウイルスのコピー数評価を行なった。
【００５０】
ＲＴ−ＰＣＲには、市販のプライマーキットＨｕｍａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ（Ｈ１Ｎ１） ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｅｓｉｇ ＡｄｖａｎｃｅｄＫｉｔ（Ｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎ）を使用し、表４に示すＰＣＲ反応条件により、ＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００５１】
結果を図８に示す。図８は、上記各々のウイルス溶液の得られたコピー数と希釈率との関係を示す。コピー数と希釈率との関係は実施例４及び実施例５の両方で線形を示し、また両者がほぼ同じ傾きを示した。したがって、実施形態の方法によれば、不活性化処理したウイルスも、不活性化処理していないウイルスと同様の精度でウイルスコピー数を評価できることが明らかとなった。
【００５２】
［例４］
βプロピオラクトンで不活性化処理を行なったＲＳウイルスＡ型溶液を段階希釈したウイルス溶液から実施例１と同じ方法によりＲＮＡ抽出を行った（実施例６）。
【００５３】
各々の抽出されたＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法によるＲＳウイルスＡ型ウイルスのコピー数評価を行なった。ＲＴ−ＰＣＲには、市販のプライマーキットＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＳｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓｔｙｐｅＡ（ＲＳＶ−Ａ）ｇｅｎｅｓｉｇＡｄｖａｎｃｅｄＫｉｔ（Ｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎ）を使用し、表４に示すＰＣＲ反応条件により、ＲＴ−ＰＣＲを行った。各々のＲＳウイルス溶液におけるタンパク質量と、ＲＴ−ＰＣＲによって得られたコピー数との関係を図９に示す。タンパク質量とコピー数との関係は線形性を持つことが明らかとなった。このことから、実施形態の方法によれば、感度よくウイルスを定量することが可能であることが示された。
【符号の説明】
【００５４】
１…ＲＮＡウイルス
３…ＲＮＡ
４…タンパク質
５…液体試料
【図１】
2020065459.tif 000007
【図２】
2020065459.tif 000008
【図３】
2020065459.tif 000009
【図４】
2020065459.tif 000010
【図５】
2020065459.tif 000011
【図６】
2020065459.tif 000012
【図７】
2020065459.tif 000013
【図８】
2020065459.tif 000014
【図９】
2020065459.tif 000015
【配列表】
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