(57)【要約】      （修正有）【課題】冷感刺激のない表皮細胞ＴＲＰＭ８活性化剤の提供。【解決手段】脂肪酸メントールエステル及びカワラヨモギの抽出物を含有する表皮細胞ＴＲＰＭ８活性化剤。サフラワー油メントールエステル又はリノール酸メントールエステルから選ばれる1種以上、及びカワラヨモギの抽出物を含有する表皮細胞賦活剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪酸メントールエステルおよびカワラヨモギの抽出物を含有する表皮細胞ＴＲＰＭ８活性化剤。
【請求項２】
サフラワー油メントールエステル又はリノール酸メントールエステルから選ばれる1種以上、およびカワラヨモギの抽出物を含有する表皮細胞ＴＲＰＭ８活性化剤。
【請求項３】
サフラワー油メントールエステル又はリノール酸メントールエステルから選ばれる1種以上、およびカワラヨモギの抽出物を含有する表皮細胞賦活剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表皮細胞ＴＲＰＭ８活性化剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＴＲＰ（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）チャネルについては１９８９年にショウジョウバエＴＲＰ遺伝子が同定されてから、多様な研究がなされてきた。多くが細胞膜に存在し、細胞へのカルシウムイオン流入を担っている。膜電位、温度、浸透圧、ｐＨ、細胞の酸化還元状態、内在性化学物質、外来性化学物質など、様々な化学的・物理的刺激により制御されることが分かっており、生体内では温度や痛みといった感覚受容をはじめとした重要な生理機能に関わっている（非特許文献１）。
【０００３】
哺乳類のＴＲＰチャネルはＴＲＰＡ、ＴＲＰＣ、ＴＲＰＭ、ＴＲＰＶ、ＴＲＰＭＬ、ＴＲＰＰの６つのサブファミリーに分類されており、それぞれに活性化温度閾値が存在している。ＴＲＰＶ１は４３℃以上、ＴＲＰＶ２は５２℃以上で活性化するなど、高温で活性化するＴＲＰチャネルがある一方、ＴＲＰＭ８は８〜２８℃、ＴＲＰＡ１は１７℃以下で活性化するなど、低温で活性化するＴＲＰチャネルも存在している。また、これらＴＲＰチャネルは状態により活性化温度閾値が変化するものがあることが分かっている。
【０００４】
ＴＲＰＭ８は、低温で活性化されるＴＲＰチャネルであり、メントールの受容体として同定された。ＴＲＰＭ８発現細胞に関する電気生理学的な研究より、知覚神経終末のＴＲＰＭ８にリガンドが結合することによって、ＴＲＰＭ８チャネルのカルシウムイオン流入量を増加させて、冷感を与えることができることが報告されている（非特許文献２）。さらに、表皮細胞のＴＲＰＭ８を活性化することは、細胞賦活効果（非特許文献３）や、生理活性物質であるＰＧＥ２（プロスタグランジンＥ２）生成を抑制（非特許文献４）することによる美白、抗炎症効果も示唆されるなど、効果は多岐に渡り、広く皮膚状態改善に有用であると期待されている。
【０００５】
ＴＲＰＭ８を活性化することができる成分としては、メントールをはじめとし、ヒドロキシシトロネラール、ゲラニオール、リナロール（非特許文献５）、ヒメフウロの抽出物、ニームの抽出物（特許文献１）などが挙げられる。これらの成分はＴＲＰＭ８を活性化することが知られているが、肌への塗布時に冷感を伴う成分であることが知られている。先述のようにＴＲＰＭ８の活性化剤は、多くの皮膚状態改善効果をもたらすことが期待されており非常に有用であるにも関わらず、塗布時に冷感刺激を伴うことから、寒冷地や冬季などでは好まれない、冷感刺激に過敏な消費者には向かない、温感の付与が好まれるマッサージ用途には向かないなど、剤形や用途が大きく制限されてしまうことが弊害となっていた。
【０００６】
また、前述のように、ＴＲＰＭ８の活性化は美白につながることが示唆されている。美白剤の中には、ＴＲＰＭ８活性化作用を持つ成分としてユーカリやペパーミントが知られるが、いずれも冷感を促してしまう。冷感のない美白剤単独ですぐれたＴＲＰＭ８活性化作用があるものはこれまで見つかっていなかった。
【０００７】
このような背景から、冷感刺激のない表皮細胞ＴＲＰＭ８活性化剤が求められていた。
【０００８】
脂肪酸メントールは、脂肪酸とL-メントールをエステル結合させた化合物であり、メラニン産生阻害効果（特許文献２）、脂質代謝改善（特許文献３）などが知られている。脂肪酸メントールの一種であるサフラワー油メントールエステルはサフラワー油とメントールをエステル結合させたものであり、複数種の脂肪酸残基を含む。脂肪酸残基の種類としては、リノール酸を多く含み、その他パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸などが含まれる。
カワラヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ｃａｐｉｌｌａｒｉｓ  Ｔｈｕｎｂ）は、キク科ヨモギ属の多年草であり、頭花は消炎、解熱などの作用があることから、生薬として用いられ、生薬名ではインチンコウと呼ばれる。カワラヨモギ抽出物にはチロシナーゼ生合成阻害効果（特許文献４）、プロテアーゼ阻害効果（特許文献５）、ＳＣＦ結合阻害効果（特許文献６）など多くの効果が知られる。
しかしながらこれら成分にＴＲＰＭ８活性化効果があるということは知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１８―１６５７５号公報
【特許文献２】特開２００７―１６１５９１公報
【特許文献３】特開２００７―９９６３３号公報
【特許文献４】特開平８−１０４６４６号公報
【特許文献５】特開平１０−２９１９２６号公報
【特許文献６】特開２００８―３１０９５号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】生化学 ２００９年  第８１巻 第１１号９６２―９８３
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ  ２００１  Oｃｔ４  ４１３（６８５５）  ４８０
【非特許文献３】Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２０１３  Ｎｏｖ４０（１１）  ９１９−２２
【非特許文献４】Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０１５  Ｊｕｎ３０  １１２（２６）
【非特許文献５】ＢｒＪ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００４  Ｆｅｂ１４１（４）  ７３７−４５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、冷感刺激のない表皮細胞ＴＲＰＭ８活性化剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するため、本発明者らが、鋭意研究した結果、脂肪酸メントールおよびカワラヨモギの抽出物を含有することで、上記の課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち本発明は、次の成分Ａ、Ｂを含む表皮細胞ＴＲＰＭ８活性化剤である。
Ａ成分：脂肪酸メントール
Ｂ成分：カワラヨモギの抽出物
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、脂肪酸メントールおよびカワラヨモギの抽出物を用いた、冷感刺激のない表皮細胞ＴＲＰＭ８活性化剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明で用いる脂肪酸メントールの脂肪酸残基としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などが使用でき、特にリノール酸が顕著な効果を有する。また、サフラワー油や、菜種油、綿実油、大豆油のような油脂類から酵素合成により、混合脂肪酸のメントールエステルを作成することが可能であり、特にサフラワー油メントールエステルを用いることが望ましい。
【００１６】
本発明に用いるカワラヨモギ抽出物の抽出部位は、根、葉、茎、花などが使用可能で特に限定されないが、頭花の抽出物が特に顕著な効果を有する。また、その抽出溶媒は特に限定されず、例えば、水、メタノール、エタノール、プロピルアルコール等の低級アルコール或いは、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、等の多価アルコール等があげられる。
【００１７】
本願発明で用いるカワラヨモギ抽出物の抽出法は、特に限定されない。例えば、乾燥植物１質量部に対して１〜１００質量部の水および１，３ブチレングリコールもしくはエタノールの混合液を用い、５〜７０℃の温度で、１〜７日間抽出するのが好ましい。抽出後は、ろ過を行い、そのままの状態でも利用できるが、必要ならば、その効果に影響のない範囲で更に脱臭、脱色などの精製処理を行うことも出来る。更には、凍結乾燥等をして粉末の状態で用いることも出来る。
【００１８】
本発明の組成物には、上記の必須成分のほかに、必要に応じ一般的に化粧料などに用いられる成分を配合することも可能である。例えば、パール剤、保湿剤、増粘剤、水溶性高分子、香料、殺菌剤、防腐剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、キレート剤、紫外線吸収剤、抗炎症剤、抗酸化剤、清涼剤、生薬抽出物やビタミン類、の添加物を適時配合することができる。これら成分を含有させる場合の配合割合は、その種類や目的に応じて適宜選択することができる。
【実施例】
【００１９】
以下、本願発明の実施例について具体的に説明するが、本願発明はこれらの実施例により限定されるものではない。また、特記しない限り配合量は質量％で示す。
【００２０】
[試験１]ＴＲＰＭ８活性化度・細胞賦活度測定
紫外線が皮膚に当たることで発生するＰＧＥ２（プロスタグランジンＥ２）は、ＴＲＰＭ８の活性化により生成が抑制されることが分かっている。そこで、紫外線を照射した表皮細胞のＰＧＥ２量を指標としてＴＲＰＭ８活性化度を測定した。加えて、細胞賦活度を測定した。
【００２１】
〔サンプル調製〕
カワラヨモギ抽出物はカワラヨモギの頭花を５０％１，３ブチレングリコール溶液にて抽出した。カワラヨモギ抽出物を１０５℃環境下で６時間静置したときの乾燥残分は１．２６重量％であった。脂肪酸メントールとして用いたサフラワー油メントールエステルは、サフラワー油２５０ｇにL−メントール１４０ｇ、精製水７０ｇ、リパーゼ４６０，０００単位を混和し、室温で７２時間攪拌することによりメントールエステルを作成した。作成したメントールエステルを精製し、サフラワー油メントールエステルを得た。サフラワー油は、複数の脂肪酸を含んでいるので、最終的には、パルミチン酸メントールエステルが６．７１％、ステアリン酸メントールエステルが１．２８％、オレイン酸メントールエステルが１７．６％、リノール酸メントールエステルが７３．７％含まれていることを確認した。
調製したカワラヨモギ抽出物、サフラワー油メントールエステル、およびメントールは１０ｍｇを１ｇのＤＭＳＯに溶解させたのち、９ｇの蒸留水と混合し、サンプルとした。サフラワー油メントールエステルとカワラヨモギ抽出物の混合物は、上記で調製したそれぞれのサンプルを１：１で混合することでサンプルとした。コントロールは１０％ＤＭＳＯ溶液とした。
【００２２】
〔細胞の培養・紫外線処理〕
ヒト正常表皮ケラチノサイト（ＫＵＲＡＢＯ）のトリプシン処理を行い、正常ヒト表皮角化細胞増殖用培地（ＫＵＲＡＢＯ）で細胞を分散させ、２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように細胞を播種し、４８時間、３７℃で培養を行なった。
培地を取り除き、ＰＢＳ（−）を５００μＬ添加したのち、プレートの蓋を外した状態で２０ｍJ／ｃｍ２のＵＶＢを照射した。照射直後にＰＢＳ（−）を取り除き、４９０μＬの培地を加えた。ＴＲＰＭ８のアンタゴニストとして、１ｍＭのＡＭＴＢ（Ｎ−（３−Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−２−［（３−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｏｘｙ］−Ｎ−（２−ｔｈｉｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚａｍｉｄ）塩酸塩（富士フイルム和光純薬）水溶液、もしくは蒸留水を５μＬ加えた。５分間３７℃で静置したのち、サンプルを５μＬ加え、２４時間、３７℃で培養を行った。
【００２３】
〔ＰＧＥ２量定量〕
培地を回収し、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２  Ｐａｒａｍｅｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ｂｉｏｔｅｃｈｎｅ）を用いてＰＧＥ２量を定量した。
〔解析〕
ＴＲＰＭ８活性化によるＰＧＥ２抑制率をＴＲＰＭ８活性化率と定め、ＴＲＰＭ８活性化率を以下の式１により求めた。
【００２４】
【数１】
2020090466.tif 000002
【００２５】
〔細胞賦活度測定〕
培地を回収したのちに、細胞が付着した２４ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌにＰＢＳ（−）５００μＬを加えて、取り除いた。Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（ＤＯＪＩＮＤＯ）４０μＬを培地３６０μＬと混合し、各ｗｅｌｌに加えた。１時間３７℃で静置したのち、２００μＬを９６ｗｅｌｌプレートに移した。４５０ｎｍの吸光度を測定し、以下の式から生細胞率を求めた。
【００２６】
【数２】
2020090466.tif 000003
【００２７】
【表１】
2020090466.tif 000004
【００２８】
【表２】
2020090466.tif 000005
【００２９】
[試験２]冷感刺激測定 
サフラワー油メントールエステルとカワラヨモギ抽出物の組み合わせによる表皮細胞ＴＲＰＭ８活性化によって冷感刺激が生じるかを確認した。
【００３０】
〔サンプル調製〕
脂肪酸メントールとして用いたサフラワー油メントールエステルとカワラヨモギ抽出物の調製は先述の方法で行った。ＴＲＰＭ８活性化剤として知られるペパーミント抽出物は３０％のエタノール溶液を用いて抽出した。ペパーミント抽出物を１０５℃環境下で６時間静置したときの乾燥残分は１．００重量％であった。これらを美容液に１％ずつ配合することでサンプルとした。また、メントールを美容液に１％加えることでＰＣ（ポジティブコントロール）とし、脂肪酸メントール、カワラヨモギ抽出物、ペパーミント、メントールをどれも含まず、水に置きかえた美容液をＮＣ（ネガティブコントロール）とした。美容液は以下の組成（表３）で試験を行った。
【００３１】
【表３】
2020090466.tif 000006
〔冷感刺激測定〕
調製した美容液を人肌程度に温め、ＮＣを３としたときの、各処理区の冷感を５段階で評価した。被験者は９人で実施し、被験者からは各試験区を判別、特定できない状況で実施した。
【００３２】
【表４】
2020090466.tif 000007
【００３３】
表１からわかるように、ＴＲＰＭ８活性化効果が知られているメントールでは２８．０６％のＴＲＰＭ８活性化率を示した。サフラワー油メントールエステルとカワラヨモギ抽出物ではともにメントールに満たないＴＲＰＭ８活性化率となったが、サフラワー油メントールエステルとカワラヨモギ抽出物を組み合わせることで４０．０２％となり、メントールを上回るＴＲＰＭ８活性化率を示した。さらに、サフラワー油メントールエステルメントールやカワラヨモギ抽出物の単独使用と比較し、これらを組み合わせて使用することで高いＴＲＰＭ８活性化力を示すことが分かった。
また、表２より、コントロールでは、紫外線を照射した後にコントロールを添加すると生細胞数が６１．７３％となっており、生細胞数の減少が起こったが、サフラワー油メントールエステルとカワラヨモギ抽出物を添加することで、生細胞数が７５．２８％まで増加した。このことから、サフラワー油メントールエステルとカワラヨモギ抽出物の組み合わせによって、表皮細胞ＴＲＰＭ８活性化による細胞賦活効果も確認された。
【００３４】
表４から分かるように、ＰＣでは被験者９人中７人が５と回答し、多くがＮＣと比較してＰＣに冷感を感じた一方、サンプルでは全員が２〜４の範囲内であった。サンプルの平均値は３となり、ＮＣと同等であった。このことから、サンプルには冷感効果がないと判断できる。一方で、美白剤としても知られるＴＲＰＭ８活性化剤であるペパーミントは、メントールと同様に９人中７人が冷感を感じ、高い冷感付与効果を持つことが確認できた。
以上の結果から、脂肪酸メントールとカワラヨモギ抽出物の組み合わせを用いることで、冷感刺激をもたらさずに表皮細胞ＴＲＰＭ８を活性化でき、細胞賦活効果を付与できることが分かった。
【００３５】
次に、本発明の処方例を示すが、本発明はこれに限定されるものでない。
【００３６】
処方例１
（１）化粧用クリーム（質量％）
ａ）ミツロウ・・・２．０
ｂ）ステアリルアルコール・・・５．０
ｃ）ステアリン酸・・・８．０
ｄ）スクワラン・・・１０．０
ｅ）自己乳化型グリセリルモノステアレート・・・３．０
ｆ）ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）・・・１．０
ｇ）サフラワー油メントールエステル・・・０．５
ｈ）カワラヨモギ抽出液・・・１．０
ｉ）１，３−ブチレングリコール・・・５．０
ｊ）水酸化カリウム・・・０．３
ｋ）防腐剤・酸化防止剤・・・適量
ｌ）精製水・・・残部
製法
ａ）〜ｇ）までを加熱溶解し、８０℃に保つ。ｈ）〜ｌ）までを加熱溶解し、８０℃に保ち、ａ）〜ｇ）に加えて乳化し、４０℃まで撹拌しながら冷却する。
【００３７】
処方例２
（２）乳液（  質量％  ）
ａ）ミツロウ・・・０．５
ｂ）ワセリン・・・２．０
ｃ）スクワラン・・・８．０
ｄ）ソルビタンセスキオレエート・・・０．８
ｅ）ポリオキシエチレンオレイルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）・・・１．２
ｆ）リノール酸メントールエステル・・・０．３
ｇ）カワラヨモギ抽出液・・・０．５
ｈ）１，３−ブチレングリコール・・・７．０
ｉ）カルボキシビニルポリマー・・・０．２
ｊ）水酸化カリウム・・・０．１
ｋ）精製水・・・残部
ｌ）防腐剤・酸化防止剤・・・適量
ｍ）エタノール・・・７．０
製法
ａ）〜ｆ）までを加熱溶解し、８０℃に保つ。ｇ）〜ｌ）までを加熱溶解し、８０℃に保ち、ａ）〜ｆ）に加えて乳化し、５０℃まで撹拌しながら冷却する。５０℃  でｍ）を添加し、４０℃まで攪拌、冷却する。
【００３８】
処方例３
（３）化粧水（質量％）
ａ）カワラヨモギ抽出液・・・１．０
ｂ）グリセリン・・・５．０
ｃ）ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（２０Ｅ．Ｏ．）・・・１．０
ｄ）エタノール・・・６．０
ｅ）香料・・・適量
ｆ）防腐剤・酸化防止剤・・・適量
ｇ）精製水・・・残部
ｈ）オレイン酸メントールエステル・・・・０．１
製法
ａ）〜ｈ）までを混合し、均一に溶解する。
【００３９】
処方例４
（４）洗顔料（質量％）
ａ）ステアリン酸・・・１２  ．０
ｂ）ミリスチン酸・・・１４  ．０
ｃ）ラウリン酸・・・５．０
ｄ）ホホバ油・・・３．０
e)サフラワー油メントールエステル・・・０．１
ｆ）グリセリン・・・１０．０
ｇ）ソルビトール・・・１５．０
ｈ）１，３−ブチレングリコール・・・１０．０
ｉ）ＰＯＥ（２０）グリセロールモノステアリン酸・・・２．０
ｊ）水酸化カリウム・・・５．０
ｋ）水・・・残部
ｌ）香料・・・適量
ｍ）カワラヨモギ抽出液・・・１．０
製法
ａ）〜ｉ）までを加熱溶解し７０℃に保つ。ｋ）にｊ）を溶解後ａ）〜ｉ）に加えケン化する。その後ｌ）、ｍ）を入れ攪拌しながら冷却する。
【００４０】
処方例５
（３）化粧水（質量％）
ａ）カワラヨモギ抽出液・・・１．０
ｂ）グリセリン・・・５．０
ｃ）ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（２０Ｅ．Ｏ．）・・・１．０
ｄ）エタノール・・・６．０
ｅ）リノール酸メントールエステル・・・０．０１
ｆ）香料・・・適量
ｇ）防腐剤・酸化防止剤・・・適量
ｈ）精製水・・・残部
製法
ａ）〜ｈ）までを混合し、均一に溶解する。