(57)【要約】      （修正有）【課題】免疫原性を減少させ、同時に、細胞損傷を最小限にし且つ細胞生存能力を維持するための、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）組成物および製造方法の提供。【解決手段】遠心濾過を利用して製造されたＭＳＣ組成物であって、遠心分離によって精製されたＭＳＣ組成物に相対して減少した免疫原性を有するＭＳＣ組成物。一つまたはそれを超える精製済み間葉系幹細胞医薬組成物。遠心濾過を利用して間葉系幹細胞組成物を精製する方法。【選択図】図１
2020120671.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００８年８月１４日出願の米国予備特許出願第６１／０８８，８９８号の優先権を主張し、それらの内容は、本明細書中に援用される。
【０００２】
米国連邦政府後援研究または開発
［不適用］
［マイクロフィッシュ／著作権引例］
［不適用］
本発明は、精製済み間葉系幹細胞組成物および間葉系幹細胞組成物を精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0001]間葉系幹細胞（単数または複数の「ＭＳＣ」）は、骨髄、血液、真皮、骨膜および他の体組織において見出されうるし、そしていろいろな in vivo または in vitro の
因子および影響に依存して、脂肪組織、疎性結合組織、骨組織、軟骨組織、弾性組織、骨髄支質組織、筋組織、線維性結合組織および心臓組織を含めたいろいろな細胞タイプへと分化することができる。このような細胞は、例えば、米国特許第５，１９７，９８５号；第５，２２６，９１４号；第５，４８６，３５９号；第５，８３７，５３９号および第６，０８７，１１３号に開示されているが、それらは、各々独立して、そのまま援用される。
【０００４】
[0002]ＭＳＣは、組織環境に基づいて、筋肉、骨、軟骨、骨髄支質、腱および脂肪などの系統へ分枝し（engraft）且つ選択的に分化することが分かった。それらの細胞由来お
よび表現型ゆえに、これら細胞は、有害な免疫応答を引き起こすことがなく、無関係なヒトドナーに由来する製品の開発を可能にする。
【０００５】
[0003]概して、ＭＳＣは、それらが得られる組織から単離され、精製後、適当な培地中で増える。その培地は、血清タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンなどの血清アルブミン）を含む血清；増殖因子；およびサイトカインのような、ＭＳＣの増量を支持するいろいろな成分を含有する。単離、精製および培養物増量後、それらＭＳＣに、一連の洗浄を、そして場合により、遠心分離を行う。次に、ＭＳＣは、適当な低温保存用基剤、例えば、ジメチルスルホキシド（「ＤＭＳＯ」）を含む低温保存用基剤中で凍結且つ貯蔵することができる。その後、ＭＳＣを、患者への投与直前に融解させる。
【０００６】
[0004]ＭＳＣの増量のための製造工程は、非自己血清の存在下における細胞培養と、非自己トリプシンによる細胞収集を必要とする；いくつかの方法において、非自己血清は、ウシ胎仔血清（「ＦＢＳ」）であり、そして非自己トリプシンは、ブタトリプシンである。動物試薬を用いたヒトＭＳＣ（「ｈＭＳＣ」）の ex vivo 増量は、最終製品中に残留する非ヒト由来の巨大分子（例えば、ブタおよびウシ由来の巨大分子）の存在をもたらす。非ヒト生成物を含む基剤中でｈＭＳＣを増量後、ヒト生成物を含む基剤中で増量したｈＭＳＣに相対して、増加量の異種物質が認められることがありうる。
【０００７】
[0005]ウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）は、ＦＢＳの有意の成分である。ＢＳＡもブタトリプシンも、既知のアレルゲンである。そのようなものとして、それらは、ウシおよびブタ巨大分子に感受性の患者において有害反応の引き金を引くことがありうるし、しかも多重暴露時に非アレルギー性患者を感作させて、アレルギー性反応をもたらすことがあ
りうる（例えば、Colten HR et al., N Engl J Med, 1975, 292:1050; Moneret-Vautrin A. et al., Allergy, 1991, 46:228; Orta M et al., Ann Allergy Asthma Immunol 2003, 90:446; de Benito V. et al., Allergologia et Immunopathologia, 2001, 29:272 を参照されたい）。培養で増量したＭＳＣ中に存在する増加量のＦＢＳも、患者に、望ましくない免疫応答、肺塞栓症、血管収縮、心臓性ショックまたは死亡などの望ましくない副作用を引き起こすかもしれない。残留するＢＳＡまたはブタトリプシンの存在は、免疫原性を増加させ且つレシピエントからのＭＳＣのクリアランスまたは排泄を促進するかもしれない。培養で増量したＭＳＣを含む医薬組成物中に存在する増加量のＦＢＳは、このようなＭＳＣに基づく療法を受けている患者へ、ウイルス、プリオン病および異種タンパク質を伝播するリスクを増加させることがありうる。培養で増量したｈＭＳＣを含む医薬組成物中に存在する増加量のＦＢＳ、具体的には、ＢＳＡは、これら異種物質に対する免疫応答を開始するかもしれない。例えば、患者に投与されたＭＳＣ標品が、ＢＳＡまたは他の異種タンパク質を含有する場合、このような異種タンパク質は、望ましくない免疫応答の引き金を引くかもしれない。異種タンパク質は、細胞性または体液性免疫応答（例えば、抗ウシ血清タンパク質抗体の発生）を引き起こすかもしれないし、それは、特に、このような異種タンパク質が、ＭＳＣ細胞表面膜と結合した状態になるならば、あまり有効でないＭＳＣ分枝を生じるかもしれない。そのようなものとして、新しいアプローチは、培養で増量したＭＳＣを含む医薬組成物中に存在するＦＢＳ、具体的には、ＢＳＡを含めた異種物質の量を減少させる必要がある。新しいアプローチは、培養で増量したＭＳＣ中に存在する糖類、タンパク質および他の巨大分子を含めた異種物質の量を減少させる必要があり、それが、得られたＭＳＣ組成物の安全プロフィールを増加させうると考えられる。
【０００８】
[0006]自己ヒト血清などの代替血清を含む基剤が考えられてきたが、しかしながら、自己血清の使用は、最終ＭＳＣ製品中に必要な細胞の量が、一定量の自己血清中で増殖させることができる量を超える場合は不可能である。更に、自己ヒト血清の使用は、その患者が、ＭＳＣ療法の開始に先んじて血清を供与するのに十分な時間を有し且つ十分に健康であろうということを前提とする。現在慣用的なＭＳＣ培養法は、典型的に、薬学的処置を構成する適当数の細胞を単離し、増量し、収集し、そして精製するのに２〜１０週間を必要とする。いくつかの場合、薬学的処置は、１用量から成る。他の場合、薬学的処置は、２またはそれを超える用量から成る。残念ながら、いくつかの場合、ＭＳＣ療法は、臨床症状の診断または症候から約２週間未満、または臨床症状の診断または症候から約１週間未満、または臨床症状の診断または症候から約４８時間未満に要求される。ＭＳＣ療法が、臨床症状の診断または症候から短時間の内に要求される場合、既に製造され、精製され、そして低温保存されていたｈＭＳＣは、急性疾患の診断または症候時に利用可能であるという有意の利点を示す。
【０００９】
[0007]更に、自己ヒト血清を含めたヒト血清は、疾患、例えば、ウイルス性疾患を、ＭＳＣ医薬組成物のレシピエントへ伝播するリスクの統計的に有意の増加を示す。
[0008]Spees et al. は、ウシ胎仔血清（「ＦＣＳ」）および自己ヒト血清中での連続
継代を含む基剤の組合せに言及している。（Spees et al., Mol Therapy, 2004, 9: 747
）。基剤の連続組合せによって生産された最終組成物は、５０回洗浄サイクル後の標識されたＦＣＳのＳＤＳ−Page 電気泳動によって、試料あたりの残留ＦＣＳに１５倍を超え
る範囲を生じた。自己ヒト血清と、より再現性のある最終組成物を与えることがない十分な洗浄とを必要とするプロトコルは、理論的には興味深いが、ヒトへの投与に適する医薬組成物を製造するのに必要な品質または一貫性（consistency）を与えない。
【００１０】
[0009]アレルギー性患者の中での臨床的反応性についてのリスク用量および限界値は、多数の抗原について決定された。（Moneret-Vautrin A. & Kanny G., Curr Opin Allergy
Clin Immunol, 2004, 4:215; Bindslev-Jensen C et al., Allergy, 2002, 57:741）。
これら限界値は、抗原の経口投与については決定されているが、アレルゲンへの静脈内（
「ＩＶ」）暴露についての限界値は未知である。（Wensing M. et al., J Allergy Clin Immunol, 2002, 110:915; Taylor SL et al., Clin Exp Allergy, 2004, 34:689）。ＭＳＣを含む組成物のＩＶ投与に関する治療的判断は、限界データの不存在と、細胞性および動物に由来する生成物が重篤な有害反応（例えば、アナフィラキシーおよび血清病様疾患）を引き起こすかもしれないということを示している参考文献の報告によって複雑になる。（Moneret-Vautrin A et al., Allergy, 1991, 46:228; Orta M et al., Ann Allergy Asthma Immunol 2003, 90:446; de Benito V. et al., Allergologia et Immunopathologia, 2001, 29:272）。
【００１１】
[00010]一例として、アレルギー性患者の中での臨床的反応性についてのリスク用量お
よび限界値は、多数の抗原について決定されているが、その大部分は、食物アレルゲン範疇に関する（Moneret-Vautrin A. & Kanny G., Curr Opin Allergy Clin Immunol, 2004,
4:21）。これら限界値は、抗原の経口投与について決定されたので、それらは、ＩＶ投
与についての限界値とは異なると考えられる。再度、アレルゲンへのＩＶ暴露についての限界値は、依然として未知である。（Taylor SL et al., Clin Exp Allergy, 2004, 34:689）。限界データの不存在と、細胞性および動物に由来する生成物が重篤な有害反応（例えば、アナフィラキシーおよび血清病様疾患）を引き起こすかもしれないということを示している参考文献の報告は、ウシまたはブタ生成物の存在下で製造された治療薬の使用を除外する。（Orta M. et al., Ann Allergy Asthma Immunol 2003, 90:446）。
【００１２】
[00011]Perotti et al は、臍帯血から低温保存用ＤＭＳＯを除去するのに有用な技法
としての遠心濾過に言及している。（Perotti CG et al., Transfusion, 2004, 44(6):900-906）。Calmels et al. は、造血幹細胞移植片からＤＭＳＯを除去するのに有用な技法としての遠心濾過に言及している。（Calmels B et al., Bone Marrow Transplant., 2003, 31(9):823-828）。Hampson et al. は、培養された骨髄単核細胞を洗浄する方法に言及している。（ＵＳ２００８／０１７５８２５号）。細胞培養物上澄みからの洗浄後残留ＢＳＡレベルは、約３μｇ／ｍｌ未満であると報告された。骨髄単核細胞を洗浄する Cytomate 計測器を用いて、Hampson et al. は、約７０％の洗浄後細胞生存能力を得た。Hampson et al. は、細胞生存能力のこの有意の降下が、その方法の際に加えられた機械力によって引き起こされた細胞損傷のためであったかもしれないということを示した。
【００１３】
[00012]細胞を十分に洗浄することを必要とするプロトコルは、ヒトへの投与に適する
医薬組成物を製造するのに必要な品質または一貫性を与えない。更に、細胞の生存能力およびこのような細胞を含む医薬組成物の効力への十分な洗浄プロトコルの作用は、未知である。
【００１４】
[00013]更に、多くの公表された精製プロトコルは、ＭＳＣ含有中間体生成物の移送を
包含する少なくとも一つの工程を含み、その場合、生成物は、外部環境に暴露される（すなわち、密閉システムではない）。密閉システムは、そのシステムに出入りする物質の量および品質、更には、これら物質が入るまたは出る方法を注意深く制御するので、ＭＳＣ医薬組成物の製造のための密閉製造システムの開発は、当該技術分野における有意の実績であると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第５，１９７，９８５号
【特許文献２】米国特許第５，２２６，９１４号
【特許文献３】米国特許第５，４８６，３５９号
【特許文献４】米国特許第５，８３７，５３９号
【特許文献５】米国特許第６，０８７，１１３号
【特許文献６】ＵＳ２００８／０１７５８２５号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Colten HR et al., N Engl J Med, 1975, 292:1050
【非特許文献２】Moneret-Vautrin A. et al., Allergy, 1991, 46:228
【非特許文献３】Orta M et al., Ann Allergy Asthma Immunol 2003, 90:446
【非特許文献４】de Benito V. et al., Allergologia et Immunopathologia, 2001, 29:272
【非特許文献５】Spees et al., Mol Therapy, 2004, 9: 747
【非特許文献６】Moneret-Vautrin A. & Kanny G., Curr Opin Allergy Clin Immunol, 2004, 4:215
【非特許文献７】Bindslev-Jensen C et al., Allergy, 2002, 57:741
【非特許文献８】Wensing M. et al., J Allergy Clin Immunol, 2002, 110:915
【非特許文献９】Taylor SL et al., Clin Exp Allergy, 2004, 34:689
【非特許文献１０】Moneret-Vautrin A. & Kanny G., Curr Opin Allergy Clin Immunol, 2004, 4:21
【非特許文献１１】Perotti CG et al., Transfusion, 2004, 44(6):900-906
【非特許文献１２】Calmels B et al., Bone Marrow Transplant., 2003, 31(9):823-828
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
[00014]これら挑戦を考慮して、（１）製品中の残留成分について、患者のアレルギー
性反応のリスクを最小限にするであろう限界用量を決定すること；（２）アレルゲンを含めた残留成分の量を限界レベル未満に減少させ、同時に、細胞損傷を最小限にし且つ細胞生存能力を維持するために、ｈＭＳＣ組成物を精製する方法を与えること；そして（３）アレルゲンを含めた限界量未満の残留成分、限られた細胞損傷および高比率の生存可能細胞を含むｈＭＳＣ組成物を与えることが必要である。
【００１８】
[00015]要約すると、医薬ＭＳＣ組成物を製造する方法に関する当該技術分野の状態は
、一つのかなり長い間切実な要求、すなわち、非ヒト血清中で培養されたＭＳＣ組成物の免疫原性を減少させることを含む。更に、本明細書中に記載の且つ請求の範囲に記載の本技術は、驚くべきことに、慣用的な技術分野において、以前には有意の欠点として認識されていなかった挑戦、すなわち、ＭＳＣ集合度を減少させることを確かめた。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
[00016]本技術のいくつかの態様は、遠心分離によって精製されたＭＳＣ組成物に相対
して減少した免疫原性を有するＭＳＣを含む医薬組成物を開示する。
[00017]本技術のいくつかの態様は、医薬組成物中に存在するいずれかのＭＳＣ集合体
について減少したＤ９０を示すＭＳＣを含む医薬組成物を開示する。
【００２０】
[00018]本技術のいくつかの態様は、個々のＭＳＣについて互いに低下した接着を示す
ＭＳＣを含む医薬組成物を開示する。
[00019]本技術のいくつかの態様は、ＭＳＣを含む医薬組成物であって、ここにおいて
、ＭＳＣが、培養で増量後の遠心濾過によって精製されている医薬組成物を開示する。
【００２１】
[00020]本技術のいくつかの態様は、同時に、（ｉ）ＭＳＣ組成物の免疫原性を減少さ
せ；そして（ii）個々のＭＳＣの接着性を低下させることによってＭＳＣ集合体の平均サイズを減少させる遠心濾過によって精製されたＭＳＣを含む医薬組成物を開示する。
【００２２】
[00021]本技術のいくつかの態様は、減少した免疫原性および減少した集合傾向を有す
る精製済みＭＳＣを含む医薬組成物を開示する。本技術の他の態様は、遠心濾過によって精製されたＭＳＣを含む医薬組成物を開示する。その方法は、同時に、（ｉ）ＭＳＣ組成物の免疫原性を減少させ；そして（ii）ＭＳＣ集合体の平均サイズを減少させる。
【００２３】
[00022]本技術のいくつかの態様は、ＭＳＣおよびＤＭＳＯを含む医薬組成物を開示す
る。
[00023]更に、本技術のいくつかの態様は、例えば、ＢＳＡを含む培地中で増量後に存
在するタンパク質などの異種物質の量を減少させるように精製されたＭＳＣを含む医薬組成物を開示する。このような医薬組成物は、例えば、このような組成物の免疫原性の減少によって、優れた安全プロフィールを示す。
【００２４】
[00024]本技術の他の態様は、細胞表面膜分子、細胞外核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）および
他の細胞破片を含めた物質の量を減少させるように精製されたＭＳＣを含む医薬組成物を開示する。このような医薬組成物は、例えば、個々のＭＳＣの接着性を減少させることにより、ＭＳＣ集合体の平均サイズを低下させることによって、優れた安全プロフィールを示すことができる。接着性のこのような減少は、ＭＳＣ集合体の平均サイズの低下を達成することができる。
【００２５】
[00025]更に、本技術のいくつかの態様は、比較しうる量の未精製の培養で増量したＭ
ＳＣに相対して、減少した量の残留ＦＢＳ成分、具体的には、ＢＳＡを有する培養で増量したｈＭＳＣを含む組成物に関する。いくつかのこれら態様において、精製後の培養で増量したＭＳＣを含む組成物中のＢＳＡの量は、比較しうる量の未精製の培養で増量したＭＳＣ中に存在する量よりも約１０〜１，０００倍少ない。
【００２６】
[00026]本技術のまた更に別の態様は、精製済みヒト間葉系幹細胞およびヒト間葉系幹
細胞を精製する方法に関する。より具体的には、特定の態様は、ｈＭＳＣを包含する医薬組成物であって、このような組成物中の細胞外分子、細胞表面分子および膜貫通分子の量が、比較しうる量の未精製の培養で増量したｈＭＳＣに相対して、１対数（本明細書中で用いられる「対数」という用語は、底１０対数を意味する）減少している医薬組成物に関する。他の態様は、約１０μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡを含む一つまたはそれを超える医薬組成物に関する。この本技術のいくつかの態様は、約１８μｍ〜約２５μｍのＤ９０を示すＭＳＣを含む医薬組成物に関する。
【００２７】
[00027]追加の態様において、本技術は、培養で増量したｈＭＳＣを含む医薬組成物を
製造する方法であって、このような組成物中の細胞外分子、細胞表面分子および膜貫通分子の量が、比較しうる量の未精製の培養で増量したｈＭＳＣに相対して、１対数減少している方法に関する。他の態様は、約１０μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡを含む培養で増量したｈＭＳＣを含む医薬組成物を製造する方法に関する。更に別の態様は、約１８μｍ〜約２５μｍのＤ９０を示すｈＭＳＣを含む培養で増量したｈＭＳＣを含む医薬組成物を製造する方法に関する。本技術のいくつかの態様は、医薬ＭＳＣ組成物であって、約１０μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡを含み、そしてＭＳＣが、約１８μｍ〜約２５μｍのＤ９０を示す組成物に関する。
【００２８】
[00028]本技術の更に別の態様は、比較しうる量の未精製の培養で増量したＭＳＣに相
対して、減少した量の糖類、タンパク質および他の巨大分子を含めた異種物質を有する培養で増量したｈＭＳＣを含む組成物に関する。いくつかの態様において、精製後の培養で増量したＭＳＣを含む組成物中の異種物質の量は、比較しうる量の未精製の培養で増量したＭＳＣ中に存在する量より約１対数少ない。
【００２９】
[00029]更に追加の態様において、本技術は、患者、具体的には、このような製品をＩ
Ｖ経路で与えられている患者のアレルギー性反応のリスクを最小限にするであろう一定限界量のｈＭＳＣ製品中の残留成分の決定に関する。
【００３０】
[00030]更に、いくつかの態様において、本技術は、ｈＭＳＣを精製する方法であって
、ｈＭＳＣ標品を洗浄溶液と接触させ、その標品を撹拌し、そして精製済みｈＭＳＣを回収することによってｈＭＳＣ標品を精製する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】[00031]図１は、本技術の態様にしたがって間葉系幹細胞を洗浄し且つ精製するのに用いることができる代表的な装置である。
【図２】[00032]図２は、未精製ＭＳＣ組成物の写真（１０ｘ倍率）である。
【図３】[00033]図３は、遠心分離によって精製されたＭＳＣ組成物の写真（１０ｘ倍率）である。
【図４】[00034]図４は、遠心濾過によって精製されたＭＳＣ組成物の写真（１０ｘ倍率）である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
[00035]本技術のいくつかの態様は、減少した量の異種物質を有する医薬ＭＳＣ組成物
を提供するという以前に認識された挑戦を解決する。本技術のいくつかの態様は、更に、減少した集合傾向を有する医薬ＭＳＣ組成物を提供するというこれまで認識されていない挑戦を確かめ且つ解決する。個々に且つ集合的に、これら二つの解決は、増強された治療的効力および優れた安全プロフィールを示す医薬ＭＳＣ組成物、具体的には、医薬ｈＭＳＣ組成物を提供する。
【００３３】
[00036]少なくとも一つの側面において、本明細書中に記載の技術は、精製済みＭＳＣ
を含む組成物であって、約５５μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡを含む組成物を提供する。本技術のこの側面に関するいくつかの態様において、その組成物は、約４２μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡを含む。いくつかの態様において、組成物は、約２５μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡを含む。いくつかの態様において、組成物は、約１３μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡを含む。いくつかの態様において、組成物は、約１０μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡを含む。他の態様において、組成物は、約７μｇ／ｍＬの残留ＢＳＡ〜約１５μｇ／ｍＬの残留ＢＳＡを含む。更に他の態様において、組成物は、約８μｇ／ｍＬの残留ＢＳＡ〜約１２μｇ／ｍＬの残留ＢＳＡを含む。本技術のこの側面に関するいくつかの態様において、組成物は、精製済みＭＳＣを含み、ここにおいて、組成物は、約５０μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡ；或いは、約４５μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡ；或いは、約４０μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡ；或いは、約３５μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡ；或いは、約３０μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡ；或いは、約２５μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡ；或いは、約２０μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡ；または或いは、約１５μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡを含む。公表された方法によって得られた残留ＢＳＡは、概して、１ｘ１０６個の細胞につき約３０〜７００μｇのＢＳＡであると報告されている（Spees et al., Mol Therapy, 2004, 9: 747）。下の実施例で詳しく説明されるように、本技術に関して公表された組成物および方法の間での２００倍を超えるＢＳＡ減少は、ＭＳＣ医薬組成物の安全域の有意の且つ驚くほど予想外の増加を表す。
【００３４】
[00037]ＢＳＡ含有基剤中でのＭＳＣのインキュベーション中に、ＢＳＡは、ＭＳＣ細
胞表面と結合状態になることがありうる。ＢＳＡを補足した細胞培地中でのＭＳＣのインキュベーション後の全ＢＳＡレベルを正確に評価するために、上澄み中のＢＳＡ、更には、ＭＳＣと結合状態になったＢＳＡを明らかにする測定を得る必要がある。例えば、その懸濁液のアリコート中の細胞は、溶解後、ＢＳＡレベルを測定することができる。この方法では、フリーのＢＳＡおよび細胞に結合したＢＳＡ双方を含む全ＢＳＡレベルを得ることができる。
【００３５】
[00038]更に、本技術のいくつかの態様は、精製済みＭＳＣを含む組成物であって、そ
のＭＳＣが、約１８μｍ〜約３０μｍのＤ９０を示す組成物を提供する。いくつかの態様において、ＭＳＣは、約１８μｍ〜約２５μｍのＤ９０を示す。いくつかの態様において、ＭＳＣは、約２０μｍ〜約２５μｍのＤ９０を示す。いくつかの態様において、ＭＳＣは、約３０μｍ未満；或いは、約２５μｍ未満；または或いは、約２０μｍ未満のＤ９０を示す。
【００３６】
[00039]本技術のいくつかの態様は、医薬ＭＳＣ組成物であって、約５５μｇ／ｍＬ未
満の残留ＢＳＡを含み、そしてＭＳＣが、約１８μｍ〜約３０μｍのＤ９０を示す組成物に関する。本技術のこの側面に関する他の態様において、その組成物は、約４２μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡを含み、そしてＭＳＣは、約１８μｍ〜約３０μｍのＤ９０を示す。更に他の態様において、組成物は、約２５μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡを含み、そしてＭＳＣは、約１８μｍ〜約３０μｍのＤ９０を示す。いくつかの態様において、組成物は、約１３μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡを含み、そしてＭＳＣは、約１８μｍ〜約３０μｍのＤ９０を示す。いくつかの態様において、組成物は、約１０μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡを含み、そしてＭＳＣは、約１８μｍ〜約３０μｍのＤ９０を示す。他の態様において、組成物は、約７μｇ／ｍＬの残留ＢＳＡ〜約１５μｇ／ｍＬの残留ＢＳＡを含み、そしてＭＳＣは、約１８μｍ〜約３０μｍのＤ９０を示す。更に他の態様において、組成物は、約８μｇ／ｍＬの残留ＢＳＡ〜約１２μｇ／ｍＬの残留ＢＳＡを含み、そしてＭＳＣは、約１８μｍ〜約３０μｍのＤ９０を示す。いくつかの態様において、ＭＳＣは、約１８μｍ〜約２５μｍのＤ９０を示し、そして組成物は、約５５μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡを含む。いくつかの態様において、ＭＳＣは、約２０μｍ〜約２５μｍのＤ９０を示し、そして組成物は、約５５μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡを含む。本技術のいくつかの態様は、精製済みＭＳＣを含む組成物であって、ここにおいて、そのＭＳＣは、約１８μｍ〜約２５μｍのＤ９０を示し、そして組成物は、約８μｇ／ｍＬの残留ＢＳＡ〜約１２μｇ／ｍＬの残留ＢＳＡを含む組成物を提供する。いくつかの態様において、ＭＳＣは、約２０μｍ〜約２５μｍのＤ９０を示し、そして組成物は、約８μｇ／ｍＬの残留ＢＳＡ〜約１２μｇ／ｍＬの残留ＢＳＡを含む。
【００３７】
[00040]本明細書中で用いられる「集合体」は、集合、集塊および凝集を含めた一つま
たはそれを超える接着性によって集まって一緒にクラスターになった複数の個々の細胞の全体を意味する。本明細書中で用いられる「集合」は、細胞が集合する傾向を意味する。初めは仮定されたが、後に、この特許出願の実施例部分に詳述される実験によって、精製済みＭＳＣ標品は、減少した集合体形成傾向を示すということが証明された。理論によって拘束されたくはないが、これらＭＳＣ集合体は、投与後に効率よく分散しないし、しかも致命的な肺塞栓を潜在的に引き起こす十分なサイズを有すると考えられる。
【００３８】
[00041]本技術は、ＭＳＣを含む集合体の形成が、肺塞栓をもたらすことがありうると
いうことを最初に認識した。増加量の異種物質は、おそらくは、膜に結合した糖類、タンパク質または他の巨大分子と相互作用する特定の異種物質ゆえに、特に、増加した細胞接着を引き起こすことがありうる。更に、現行のｈＭＳＣ製造実施は、収集されたｈＭＳＣ組成物中に存在する糖類、タンパク質および他の巨大分子（例えば、ＣＤ１０５およびＣＤ１６６）を含めた増加した細胞表面物質を生じる。特定の巨大分子は、内因性であれ外因性であれ、ＭＳＣの接着特性を増加させる。ＭＳＣが一層接着性になるにつれ、それらは、互いに増加した集合傾向を示す。このような集合体は、ｈＭＳＣ医薬組成物のレシピエントの肺塞栓症のリスクを潜在的に増加させるかもしれない。例えば、ＢＳＡは、ＭＳＣ細胞膜と非共有結合を形成して、ＭＳＣの免疫原性も増加させるし、ＭＳＣの接着性も
増加させることができると考えられる。そのようなものとして、本技術は、減少した集合傾向を有するＭＳＣの組成物を提供することによって、以前には認識されていない問題を確かめ且つ解決した。
【００３９】
[00042]そのようなものとして、遠心濾過のような、質量およびサイズについて同時に
選択することによって細胞を処理する技法は、質量、次にサイズについてまたは逆で連続的に選択する技法より好適である。本技術のいくつかの態様は、複数のＭＳＣから成る医薬ＭＳＣ組成物であって、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、そしてその集合体のＤ９０が、約１５０μｍ未満である組成物を含む。本技術のいくつかの態様は、複数のＭＳＣから成る医薬ＭＳＣ組成物であって、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、そしてその集合体のＤ９０が、約１００μｍ未満である組成物を含む。本技術のいくつかの態様は、複数のＭＳＣから成る医薬ＭＳＣ組成物であって、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、そしてその集合体のＤ９０が、約５０μｍ未満である組成物を含む。実際には、本技術のいくつかの態様は、複数のＭＳＣから成る医薬ＭＳＣ組成物であって、検出可能な間葉系幹細胞集合体を含まない組成物を含む。
【００４０】
[00043]本技術のいくつかの態様は、医薬ＭＳＣ組成物であって、約５５μｇ／ｍＬの
残留ＢＳＡを含み、そしてここにおいて、その組成物が、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、そしてその集合体のＤ９０が、約１５０μｍ未満である組成物に関する。本技術のこの側面に関する他の態様において、組成物は、約４２μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡを含み、そしてその組成物は、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、ここにおいて、その集合体のＤ９０は、約１５０μｍ未満である。更に他の態様において、組成物は、約２５μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡを含み、そしてその組成物は、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、ここにおいて、その集合体のＤ９０は、約１５０μｍ未満である。いくつかの態様において、組成物は、約１３μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡを含み、そしてその組成物は、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、ここにおいて、その集合体のＤ９０は、約１５０μｍ未満である。いくつかの態様において、組成物は、約１０μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡを含み、そしてその組成物は、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、ここにおいて、その集合体のＤ９０は、約１５０μｍ未満である。
【００４１】
[00044]本技術のいくつかの態様は、複数のＭＳＣから成る医薬ＭＳＣ組成物であって
、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、ここにおいて、集合体は、１，０００を超えるＭＳＣを含むものではない組成物を含む。本技術のいくつかの態様は、複数のＭＳＣから成る医薬ＭＳＣ組成物であって、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、ここにおいて、集合体は、７５０を超えるＭＳＣを含むものではない組成物を含む。本技術のいくつかの態様は、複数のＭＳＣから成る医薬ＭＳＣ組成物であって、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、ここにおいて、集合体は、５００を超えるＭＳＣを含むものではない組成物を含む。本技術のいくつかの態様は、複数のＭＳＣから成る医薬ＭＳＣ組成物であって、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、ここにおいて、集合体は、２００を超えるＭＳＣを含むものではない組成物を含む。本技術のいくつかの態様は、複数のＭＳＣから成る医薬ＭＳＣ組成物であって、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、ここにおいて、集合体は、１００を超えるＭＳＣを含むものではない組成物を含む。本技術のいくつかの態様は、複数のＭＳＣから成る医薬ＭＳＣ組成物であって、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、ここにおいて、集合体は、５０を超えるＭＳＣを含むものではない組成物を含む。本技術のいくつかの態様は、複数のＭＳＣから成る医薬ＭＳＣ組成物であって、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、ここにおいて、集合体は、１０を超えるＭＳＣを含むものではない組成物を含む。
【００４２】
[00045]ｈＭＳＣを培地中で一定時間インキュベーション後、細胞外分子および細胞膜
に結合した分子を含めた多数の分子は、培地中に存在することがありうる。例えば、このような分子には、ＢＳＡおよび他の非ヒト由来分子などの異種物質が含まれてよい。更に、ｈＭＳＣ自体によって生産された物質は、一定時間インキュベーション後の培地中に存在することがありうる。例えば、このような分子には、サイトカインおよび増殖因子などの分泌タンパク質、更には、ｈＭＳＣの細胞表面上で発現された分子が含まれてよい。培地中で一定時間インキュベーション後のｈＭＳＣを精製して、細胞外分子および細胞膜に結合した分子を含めた培地中に存在する分子を除去することは望ましいことがありうる。このような精製は、ｈＭＳＣの集合傾向を減少させるまたは妨げるかもしれないし、形成されるいずれかのｈＭＳＣ集合体のサイズを減少させるかもしれないし、またはｈＭＳＣ集合体の形成を完全に阻害するかもしれない。
【００４３】
[00046]理論によって拘束されたくはないが、更なる精製は、ＭＳＣ細胞表面上で発現
されるインテグリンなどの接着分子の量を低下させるかもしれないので、本明細書中に開示された最小安全限界値を超えてＭＳＣを精製することは望ましくない。このような接着分子は、ＭＳＣがそれらの治療的作用を発揮するのに必要である。過度に精製されたＭＳＣは、体内の標的部位へ接着するのに必要な接着分子の量を欠いている。いくつかの態様において、全身投与されたＭＳＣは、体内の炎症部位へ向かう。これら炎症部位は、接着分子について一層高い発現プロフィールを示し、そして更に、炎症を起こした組織へのＭＳＣの親和性を増加させる手段として、接着分子上のコンホメーション変化を引き起こす。ＭＳＣが、相当する接着分子を欠いている場合、それらは、炎症を起こした組織へ接着することがなく、そしてアポトーシスまで循環し続ける。したがって、ＭＳＣ上の接着分子の発現を、集合を妨げるのに必要な程度へ減少させることが望まれるが、ＭＳＣ上の接着分子の発現を、炎症を起こした組織部位へそれらが接着する能力を失うような程度へと減少させることは望ましくない。
【００４４】
[00047]除去することが望まれる細胞外分子および細胞表面膜分子などの異種物質には
、ＢＳＡなどの血清タンパク質、およびブタトリプシンなどのｈＭＳＣ培養用の他の非ヒト由来試薬が含まれる。本技術のいくつかの態様において、精製後の培養で増量したｈＭＳＣを含む組成物中の異種物質の量は、比較しうる量の未精製の培養で増量したｈＭＳＣ中の存在量より約１対数少ない。いくつかの態様において、精製後の異種物質の量は、未精製の培養で増量したｈＭＳＣを含む比較しうる量中の存在量より約２対数少ない。いくつかの態様において、精製後の異種物質の量は、未精製の培養で増量したｈＭＳＣを含む比較しうる量中の存在量より約３対数少ない。いくつかの態様において、精製後の異種物質の量は、未精製の培養で増量したｈＭＳＣを含む比較しうる量中の存在量より約４対数少ない。いくつかの態様において、精製後の異種物質の量は、未精製の培養で増量したｈＭＳＣを含む比較しうる量中に存在する量より約５対数少ない。いくつかの態様において、培養で増量したｈＭＳＣ組成物は、異種物質を実質的に含まない。いくつかの態様において、培養で増量したｈＭＳＣを含む組成物中には、検出可能な異種物質が存在しない。
【００４５】
[00048]本技術の追加の態様において、精製後の培養で増量したｈＭＳＣを含む組成物
中の異種物質の量は、比較しうる量の未精製の培養で増量したｈＭＳＣ中に存在する量より約１０〜約１，０００倍少ない。いくつかの態様において、精製後の異種物質の量は、未精製の培養で増量したｈＭＳＣを含む比較しうる量中に存在する量より約２５〜約７５０倍少ない。いくつかの態様において、精製後の異種物質の量は、未精製の培養で増量したｈＭＳＣを含む比較しうる量中に存在する量より約５０〜約５００倍少ない。いくつかの態様において、精製後の異種物質の量は、未精製の培養で増量したｈＭＳＣを含む比較しうる量中に存在する量より約１００〜約３００倍少ない。いくつかの態様において、精製後の異種物質の量は、未精製の培養で増量したｈＭＳＣを含む比較しうる量中に存在する量より約２００倍少ない。
【００４６】
[00049]本技術の他の態様において、精製後の培養で増量したｈＭＳＣを含む組成物中
のＢＳＡの量は、比較しうる量の未精製の培養で増量したｈＭＳＣ中に存在する量より約１対数少ない。いくつかの態様において、精製後のＢＳＡの量は、未精製の培養で増量したｈＭＳＣを含む比較しうる量中に存在する量より約２対数少ない。いくつかの態様において、精製後のＢＳＡの量は、未精製の培養で増量したｈＭＳＣを含む比較しうる量中に存在する量より約３対数少ない。いくつかの態様において、精製後のＢＳＡの量は、未精製の培養で増量したｈＭＳＣを含む比較しうる量中に存在する量より約４対数少ない。いくつかの態様において、精製後のＢＳＡの量は、未精製の培養で増量したｈＭＳＣを含む比較しうる量中に存在する量より約５対数少ない。更に、いくつかの態様において、培養で増量したｈＭＳＣ組成物は、ＢＳＡを実質的に含まないことがありうる。他の態様において、精製後の培養で増量したｈＭＳＣを含む組成物中には、検出可能なＢＳＡが存在しない。
【００４７】
[00050]本技術のいくつかの態様において、精製後の培養で増量したｈＭＳＣを含む組
成物中のＢＳＡの量は、比較しうる量の未精製の培養で増量したｈＭＳＣ中に存在する量より約１０〜約１，０００倍少ない。いくつかの態様において、精製後のＢＳＡの量は、未精製の培養で増量したｈＭＳＣを含む比較しうる量中に存在する量より約２５〜約７５０倍少ない。いくつかの態様において、精製後のＢＳＡの量は、未精製の培養で増量したｈＭＳＣを含む比較しうる量中に存在する量より約５０〜約５００倍少ない。いくつかの態様において、精製後のＢＳＡの量は、未精製の培養で増量したｈＭＳＣを含む比較しうる量中に存在する量より約１００〜約３００倍少ない。いくつかの態様において、精製後のＢＳＡの量は、未精製の培養で増量したｈＭＳＣを含む比較しうる量中に存在する量より約２００倍少ない。
【００４８】
[00051]本技術のいくつかの態様において、精製後の培養で増量したｈＭＳＣを含む組
成物中の細胞外核酸の量は、比較しうる量の未精製の培養で増量したｈＭＳＣ中に存在する量より約１対数少ない。いくつかの態様において、精製後の細胞外核酸の量は、未精製の培養で増量したｈＭＳＣを含む比較しうる量中に存在する量より約２対数少ない。いくつかの態様において、精製後の細胞外核酸の量は、未精製の培養で増量したｈＭＳＣを含む比較しうる量中に存在する量より約３対数少ない。いくつかの態様において、精製後の細胞外核酸の量は、未精製の培養で増量したｈＭＳＣを含む比較しうる量中に存在する量より約４対数少ない。いくつかの態様において、精製後の細胞外核酸の量は、未精製の培養で増量したｈＭＳＣを含む比較しうる量中に存在する量より約５対数少ない。他の態様において、培養で増量したｈＭＳＣ組成物は、細胞外核酸を実質的に含まない。いくつかの態様において、精製後の培養で増量したｈＭＳＣを含む組成物中には、検出可能な細胞外核酸が存在しない。
【００４９】
[00052]本技術のいくつかの態様において、精製後の培養で増量したｈＭＳＣを含む組
成物中のＢＳＡおよび細胞外核酸の量は、各々、比較しうる量の未精製の培養で増量したｈＭＳＣ中に存在する量より約１０〜約１，０００倍少ない。本技術のいくつかの態様において、精製後の培養で増量したｈＭＳＣを含む組成物中のＢＳＡおよび細胞外核酸の量は、各々、比較しうる量の未精製の培養で増量したｈＭＳＣ中に存在する量より約２５〜約７５０倍少ない。本技術のいくつかの態様において、精製後の培養で増量したｈＭＳＣを含む組成物中のＢＳＡおよび細胞外核酸の量は、各々、比較しうる量の未精製の培養で増量したｈＭＳＣ中に存在する量より約５０〜約５００倍少ない。本技術のいくつかの態様において、精製後の培養で増量したｈＭＳＣを含む組成物中のＢＳＡおよび細胞外核酸の量は、各々、比較しうる量の未精製の培養で増量したｈＭＳＣ中に存在する量より約１００〜約３００倍少ない。本技術のいくつかの態様において、精製後の培養で増量したｈＭＳＣを含む組成物中のＢＳＡおよび細胞外核酸の量は、各々、比較しうる量の未精製の培養で増量したｈＭＳＣ中に存在する量より約２００倍少ない。
【００５０】
[00053]更に、本技術のいくつかの態様において、精製後の培養で増量したｈＭＳＣを
含む組成物中の細胞外核酸の量は、比較しうる量の未精製の培養で増量したｈＭＳＣ中に存在する量より約１０〜約１，０００倍少ない。いくつかの態様において、精製後の細胞外核酸の量は、未精製の培養で増量したｈＭＳＣを含む比較しうる量中に存在する量より約２５〜約７５０倍少ない。いくつかの態様において、精製後の細胞外核酸の量は、未精製の培養で増量したｈＭＳＣを含む比較しうる量中に存在する量より約５０〜約５００倍少ない。いくつかの態様において、精製後の細胞外核酸の量は、未精製の培養で増量したｈＭＳＣを含む比較しうる量中に存在する量より約１００〜約３００倍少ない。いくつかの態様において、精製後の細胞外核酸の量は、未精製の培養で増量したｈＭＳＣを含む比較しうる量中に存在する量より約２００倍少ない。他の態様において、精製後の細胞外核酸の量は、未精製の培養で増量したｈＭＳＣを含む比較しうる量中に存在する量より約１０００倍少ない；或いは、約９００倍少ない；或いは、約８００倍少ない；或いは、約７００倍少ない；或いは、約６００倍少ない；或いは、約５００倍少ない；或いは、約４００倍少ない；或いは、約３００倍少ない；或いは、約２００倍少ない；或いは、約１００倍少ない；或いは、約５０倍少ない；または或いは、約２５倍少ない。
【００５１】
[00054]本技術のいくつかの態様において、精製済みＭＳＣは、適当な低温保存用基剤
、例えば、ＤＭＳＯを含む低温保存用基剤中で貯蔵することができる。例えば、いくつかの態様において、医薬ＭＳＣ組成物は、ＭＳＣおよび約２０％のＤＭＳＯを含んでよい。他の態様において、医薬ＭＳＣ組成物は、ＭＳＣおよび約１０％のＤＭＳＯを含んでよい。他の態様において、医薬ＭＳＣ組成物は、ＭＳＣおよび約３．８％のＤＭＳＯを含んでよい。いくつかの態様において、ＤＭＳＯは、精製済みＭＳＣに加えることができる。
【００５２】
[00055]本明細書中で用いられる「処置すること」という用語は、疾患、障害または状
態、または疾患、障害または状態の一つまたはそれを超える症状の進行を逆転させること、予防すること、軽減することまたは阻害することを意味する。本明細書中で用いられる「処置すること」は、更に、哺乳動物の疾患、障害または状態の発生率または発生数を、未処置対照集団と比較して、または処置前の同じ哺乳動物と比較して低下させることを意味してよい。例えば、本明細書中で用いられる「処置すること」は、疾患、障害または状態を予防することを意味してよいし、そしてそれには、疾患、障害または状態の開始を遅延させることまたは予防すること、または疾患、障害または状態に関連した症状を遅延させることまたは予防することが含まれてよい。本明細書中で用いられる「処置すること」は、更に、疾患、障害または状態、またはこのような疾患、障害または状態に関連した症状の重症度を、疾患、障害または状態で苦しむ前に減少させることを意味してよい。疾患、障害または状態の重症度の苦しむ前のこのような予防または減少は、その疾患、障害または状態に苦しむ投与時にはない対象への本明細書中に記載の本技術の組成物の投与に関する。本明細書中で用いられる「処置すること」は、更に、疾患、障害または状態、またはこのような疾患、障害または状態に関連した一つまたはそれを超える症状の再発を予防することも意味してよい。本明細書中で用いられる「療法」、「処置」および「治療的に」という用語は、上に定義のように処置する行為を意味する。
【００５３】
[00056]ｈＭＳＣに関する「培養で増量した」という用語は、標準的な細胞増殖条件下
において（ｉ）造血系由来の細胞を本質的に含まない；および（ii）１０％ＦＢＳ（容量で）を補足した最少必須培地中で１回またはそれを超えてｈＭＳＣを継代して、増加数の未分化ＭＳＣを生じたことを意味する。
【００５４】
[00057]「医薬組成物」という用語は、最終の薬学的に許容しうる生成物およびそのい
ずれかの工程内中間体を含めた、製造工程のいずれかの段階における組成物を意味する。
[00058]本技術の医薬組成物は、間葉系幹細胞を包含する標品を洗浄溶液と接触させ、
その標品および洗浄溶液を撹拌し、そして精製済み間葉系幹細胞を回収することによって生産することができる。
【００５５】
[00059]いくつかの態様において、洗浄溶液は、一つまたはそれを超えるイオン性また
はイオン化可能化合物を含む電解質溶液を包含することができる。このような化合物には、塩化ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム三水和物、塩化カリウムおよび塩化マグネシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カリウムが含まれるが、これに制限されるわけではない。その洗浄溶液は、平衡電解質溶液を含んで成ってよく、その平衡電解質溶液は、正常な重量オスモル濃度を維持するのに適当な濃度のナトリウム、カリウム、塩化物またはその組合せを含んで成る。平衡電解質溶液には、例えば、体液電解質置換療法、組織および細胞の洗浄液、および細胞および他の因子のための希釈剤を含めた、いろいろな設定で用いられる既知の塩溶液が含まれる。
【００５６】
[00060]一つの態様において、例えば、洗浄溶液は、非発熱性等張溶液でありうるが、
それは、毎１００ｍｌの溶液について、約５２６ｍｇの塩化ナトリウム、５０２ｍｇのグルコン酸ナトリウム（Ｃ６Ｈ１１ＮａＯ７）、３６８ｍｇの酢酸ナトリウム三水和物（Ｃ２Ｈ３ＮａＯ２・３Ｈ２Ｏ）、３７ｍｇの塩化カリウムおよび３０ｍｇの塩化マグネシウムが存在する。一つのこのような商業的に入手可能な等張電解質溶液は、Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, Illinois の製品である PlasmaLyte Ａとして販売されている。
【００５７】
[00061]別の態様において、間葉系幹細胞は、例えば、細胞源バッグ、洗浄溶液バッグ
、再循環洗浄バッグ、入口と出口を有する回転メンブランフィルター、濾液バッグ、混合区画、洗浄済み細胞のための最終生成物バッグおよび適当な管を包含する装置中で洗浄する。その装置は、密閉システムであることによって、混入の可能性を減少させることができる。
【００５８】
[00062]細胞源バッグからの未洗浄ＭＳＣは、遠心濾過装置中で洗浄溶液と混合するこ
とができる。次に、得られた洗浄溶液中の間葉系幹細胞懸濁液を、入口を介して回転メンブランフィルターへ供給する。洗浄溶液を含む濾液を、第一出口を介して回転メンブランフィルターから抜き取り、そしてＭＳＣの濃厚懸濁液を、第二出口を介して回転メンブランフィルターから抜き取り、再循環洗浄バッグ中に供給する。次に、ＭＳＣを、再循環洗浄バッグから抜き取り、追加の洗浄溶液と混合し、そして再度、回転メンブランフィルターへ送る。ＭＳＣの再循環洗浄が終わった時点で、洗浄済みＭＳＣを生成物バッグへ送る。
【００５９】
[00063]図１は、ＭＳＣを洗浄するまたは精製するための代表的な装置を示す。このよ
うな装置の一例は、ＵＳＰＮ６，２５１，２９５号に更に記載されている。ＵＳＰＮ６，２５１，２９５号に示される装置には、例えば、頂部口２および底部口１を有する再循環バッグ５；ＭＳＣの希釈懸濁液の入口１１、ＭＳＣの濃厚懸濁液の出口１４および濾液の出口２４を有する回転メンブランフィルター６；および入口２９を有する濾液バッグ３０が含まれてよい。それには、更に、出口４７を有する洗浄済み細胞バッグ４６、出口４５を有する未洗浄細胞バッグ４４、および出口２１を有する洗浄溶液バッグ７の一つまたはそれを超えるものが含まれてよい。バッグ５の頂部口２は、管８によってコネクター４９へ連通している。洗浄溶液バッグ７の口２１は、管１５によってＹコネクター５５へ連通し、そして後者は、クランプＣ１を有する管２０によってコネクター４９へ連通している。未洗浄細胞バッグの口４５は、クランプＣ３を有する管４３によってＹコネクター５３へ、そして次に、管５１によってコネクター４９へ連通している。コネクター４９は、バッグ４４からの洗浄溶液中の未洗浄細胞のための混合区画として役立ち、バッグ５からの洗浄溶液中の細胞およびバッグ７からの洗浄溶液を再循環する。コネクター４９は、管１０によって回転メンブランフィルター６の入口１１へ連通している。スピナー６の濾液出口２４は、管２３によってＹコネクター５４へ、そして管２６によって濾液バッグ３０の入口２９へ連通している。コネクター５５は、クランプＣ２を有する管５２によってコネクター５４へ連通している。コネクター５４は、管４１によって圧力変換器５０へ連通している。スピナー６の出口１４は、管１３によってバッグ５の底部口１へ連通している。Ｙコネクター５３は、クランプＣ４を有する管４８によって洗浄済み細胞バッグ４６の入口４７へ連通している。
【００６０】
[00064]再循環洗浄中に、洗浄溶液中のＭＳＣ懸濁液は、バッグ５から頂部口２を介し
て抜き取られ、そして管８を介して混合区画４９へ流れる。ＭＳＣ懸濁液は、バッグ４４から口４５を介して抜き取られ、そして（クランプＣ３が開き且つクランプＣ４が閉じた状態で）管４３を介してＹコネクター５３へ、そして次に、移送ポンプＰ２によって管５１を介して混合区画４９へ送られる。洗浄溶液は、バッグ７から口２１および管１５を介してコネクター５５へと緩衝液ポンプＰ２によって抜き取られる。クランプＣ１が開いた状態で、洗浄溶液は、管２０を介して混合区画４９へ流れる。洗浄溶液中のＭＳＣ懸濁液は、混合区画４９から管１０を介してスピナー６の入口１１へ流れる。洗浄溶液中のＭＳＣの濃厚懸濁液は、スピナー６の出口１４を介し、管１３および入口１を介して、再循環ポンプＰ３によってバッグ５中へ流れる。濾液は、スピナー６の出口２４および管２３を介してコネクター５４へ、そしてクランプＣ２が閉じた状態で、管２６および入口２９を介して、ポンプＰ４によって濾液バッグ３０中へ流れる。再循環洗浄は、所望の量の標的成分が、ＭＳＣから除去されてしまうまで続ける。次に、クランプＣ１、Ｃ２およびＣ３を閉じ、クランプＣ４を開き、そしてポンプＰ１の方向を、洗浄済みＭＳＣ懸濁液が、バッグ５から管８、５１および４８および口４７を介して洗浄済み細胞バッグ４６中へ流れるように逆転させる。次に、それらライン、バッグおよびスピナーを、クランプＣ１およびＣ３を閉じ、クランプＣ４およびＣ２を開き、そしてポンプＰ２で、連続してポンプＰ１およびＰ３で緩衝液をポンプ輸送して、スピナー、バッグおよび管をすすぎ洗浄することによってすすぎ洗浄する。
【００６１】
[00065]精製工程には、逐次的なまたは同時の遠心分離および濾過が含まれてよい。
[00066]回転メンブランを含む遠心濾過装置は、血液製剤から血小板および抗体を除去
するために開発された。代表的な遠心濾過装置には、例えば、各々独立してそのまま援用されるＵＳＰＮ５，０３４，１３５号；同５，０５３，１２１号；同５，２３４，６０８号；同５，５３６，４７５号；および同６，２５１，２９５号に開示されたものが含まれる。
【００６２】
[00067]一つまたはそれを超える態様において、回転メンブランフィルターは、約３μ
ｍ〜約７μｍの細孔度を有する。別の態様において、メンブランフィルターは、約４μｍの細孔度を有する。
【００６３】
[00068]本技術のいくつかの態様において、細胞の洗浄後生存能力は、約６０％より大
である。他の態様において、細胞の洗浄後生存能力は、約７０％より大である。更なる態様において、細胞の洗浄後生存能力は、約８０％より大である。また更なる態様において、細胞の洗浄後生存能力は、約９０％より大である。更なる態様において、細胞の洗浄後生存能力は、約９５％より大である。
【００６４】
[00069]本技術の特定の態様は、精製済み医薬ＭＳＣ組成物であって、約５５μｇ／ｍ
Ｌの残留ＢＳＡを含み；ここにおいて、その組成物が、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、そしてその集合体のＤ９０が、約１５０μｍ未満であり；そしてここにおいて、ＭＳＣの精製後生存能力が、約８０％より大である組成物に関する。本技術の
この側面に関する他の態様において、その組成物は、約４２μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡを含み；組成物は、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、そしてその集合体のＤ９０は、約１５０μｍ未満であり；そしてＭＳＣの精製後生存能力は、約８０％より大である。更に他の態様において、組成物は、約２５μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡを含み；組成物は、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、そしてその集合体のＤ９０は、約１５０μｍ未満であり；そしてＭＳＣの精製後生存能力は、約８０％より大である。いくつかの態様において、組成物は、約１３μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡを含み；組成物は、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、そしてその集合体のＤ９０は、約１５０μｍ未満であり；そしてＭＳＣの精製後生存能力は、約８０％より大である。いくつかの態様において、組成物は、約１０μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡを含み；組成物は、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、そしてその集合体のＤ９０は、約１５０μｍ未満であり；そしてＭＳＣの精製後生存能力は、約８０％より大である。いくつかの態様において、組成物は、約７μｇ／ｍＬの残留ＢＳＡ〜約１５μｇ／ｍＬの残留ＢＳＡを含み；組成物は、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、そしてその集合体のＤ９０は、約１５０μｍ未満であり；そしてＭＳＣの精製後生存能力は、約８０％より大である。他の態様において、組成物は、約８μｇ／ｍＬの残留ＢＳＡ〜約１２μｇ／ｍＬの残留ＢＳＡを含み；組成物は、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、そしてその集合体のＤ９０は、約１５０μｍ未満であり；そしてＭＳＣの精製後生存能力は、約８０％より大である。
【００６５】
[00070]本技術の特定の態様は、精製済み医薬ＭＳＣ組成物であって、約５５μｇ／ｍ
Ｌの残留ＢＳＡを含み；ここにおいて、その組成物が、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、そしてその集合体のＤ９０が、約１５０μｍ未満であり；そしてここにおいて、ＭＳＣの精製後生存能力が、約７０％より大である組成物に関する。本技術のこの側面に関する他の態様において、その組成物は、約４２μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡを含み；組成物は、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、そしてその集合体のＤ９０は、約１５０μｍ未満であり；そしてＭＳＣの精製後生存能力は、約７０％より大である。更に他の態様において、組成物は、約２５μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡを含み；組成物は、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、そしてその集合体のＤ９０は、約１５０μｍ未満であり；そしてＭＳＣの精製後生存能力は、約７０％より大である。いくつかの態様において、組成物は、約１３μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡを含み；組成物は、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、そしてその集合体のＤ９０は、約１５０μｍ未満であり；そしてＭＳＣの精製後生存能力は、約７０％より大である。いくつかの態様において、組成物は、約１０μｇ／ｍＬ未満の残留ＢＳＡを含み；組成物は、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、そしてその集合体のＤ９０は、約１５０μｍ未満であり；そしてＭＳＣの精製後生存能力は、約７０％より大である。いくつかの態様において、組成物は、約７μｇ／ｍＬの残留ＢＳＡ〜約１５μｇ／ｍＬの残留ＢＳＡを含み；組成物は、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、そしてその集合体のＤ９０は、約１５０μｍ未満であり；そしてＭＳＣの精製後生存能力は、約７０％より大である。他の態様において、組成物は、約８μｇ／ｍＬの残留ＢＳＡ〜約１２μｇ／ｍＬの残留ＢＳＡを含み；組成物は、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、そしてその集合体のＤ９０は、約１５０μｍ未満であり；そしてＭＳＣの精製後生存能力は、約７０％より大である。
【００６６】
[00071]ここで、ここに記載の技術を、次の実施例に関して記載する；しかしながら、
本技術の範囲は、それによって制限されるものではない。本技術の範囲が、上記の具体的な態様に制限されるべきではないということは理解されるはずである。本技術は、具体的に記載されている以外に実施することができるし、そしてなお、請求の範囲の範囲内でありうる。
【実施例】
【００６７】
実施例１：ＩＶ投与用の組成物中の残留異種タンパク質の限界値
[00072]ＭＳＣ医薬組成物の吸収、分布、代謝、排出および毒性（Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion and Toxicity（「ＡＤＭＥＴ」））の性質を証明する場合、ＭＳＣを与えられている齧歯類動物試験集団における散発的且つ予測不能な死亡を報告した。多数のパラメーターを研究する場合、異種タンパク質の残留量、基剤中での増量によって得られた他の破片の残留量、および細胞集合度を、前臨床実験において認められる有害なイベントへの有意の原因因子として識別し、そして後に、有意の原因因子であると証明した。
【００６８】
[00073]本技術は、臨床的反応性限界値が、抗原の経口投与については決定されている
が、抗原へのＩＶ暴露についての限界値は、依然として未知であるということを明らかにし且つ理解している。そのようなものとして、本技術は、安全なＭＳＣ医薬組成物および製造工程が、それゆえに設計されうる前に、抗原へのＩＶ暴露についての限界値を理解する問題が解決される必要があったということを認識した。アナフィラキシーおよび血清病様疾患のような、細胞性および動物に由来する生成物に関連した有害反応を理解するために、ＭＳＣを含む組成物のＩＶ投与の場合、動物モデルを用いて、異種残留物の抗原の可能性を確かめた。
【００６９】
[00074]オボアルブミン（「ＯＶＡ」）は、構造的にＢＳＡと関係していて、ＢＳＡお
よびトリプシンより有意に免疫原性であり、しかも有意の多数の公表された報告で証明されているので、代表する異種タンパク質としてそれを選択した。ＢＳＡは、ＯＶＡと比較して、有意に低いアレルゲンの可能性を有する（Hilton J.et al., Food Chem Toxicol, 1997, 35:1209）。
【００７０】
[00075]ＯＶＡを、全身性の非粘膜腹腔内（ＩＰ）注射によって投与したが、それは、
この経路が、ＩＶ投与に最も関係があると考えられたからである。動物における抗原投与のＩＰおよびＩＶ経路は、同様の結果を引き起こすことが分かった（Shepardet al., Infection and Immunity, 1982, 38: 673）。
【００７１】
[00076]ＭＳＣ医薬組成物中のＢＳＡおよびトリプシン限界耐性の計算のために、検出
可能なＩｇＥ応答の引き金を引かなかったＯＶＡの最低累積用量を選択した。ＩＰ送達された場合に感作の引き金を引かない最低累積ＯＶＡ用量は、平均２０ｇのマウス体重に基づき、５００μｇ／ｋｇに相当する１０μｇ／マウスである。したがって、ＭＳＣでの処置を受けている非感受性患者についてのＭＳＣ医薬組成物中の動物タンパク質残留物の安全な累積用量は、５００μｇ／ｋｇである。その安全限界にしたがって、１００ｋｇの患者は、約５０ｍｇ未満の動物タンパク質を含むＭＳＣ医薬組成物を安全に投与されうると考えられる；４０ｋｇの患者は、約２０ｍｇ未満の動物タンパク質を含むＭＳＣ医薬組成物を安全に投与されうると考えられる；または５ｋｇの小児患者は、約２．５ｍｇ未満の動物タンパク質を含むＭＳＣ医薬組成物を安全に投与されうると考えられる。
【００７２】
[00077]抗原への限界ＩＶ暴露に関連した問題を認識し且つ解決して、安全なＭＳＣ医
薬組成物を生産するのに適する製造工程のパラメーターは、ここで実行しうると考えられる。１処置につき８ｘ１０６個のＭＳＣ／ｋｇ体重を２回ＩＶ注入から成る療法について、ＭＳＣ医薬組成物あたりの残留ＢＳＡおよびトリプシンの限界（５５μｇ／ｍＬに相当する８３０μｇ）を、表１に示されているように計算した。
【００７３】
【表１】
2020120671.tif 000003
【００７４】
実施例２：ＭＳＣ医薬組成物の純度
[00078]肺機能の可能性のある変化への培養で増量したＭＳＣの可能性のある作用をＭ
ＳＣ医薬組成物の純度の関数として評価するために、（１）ＭＳＣ集団；および（２）ビヒクルであって、８５％ PlasmaLyteＡ、１０％ＤＭＳＯおよび５％ＦＢＳ（容量で）か
ら成るものから本質的に成る医薬ｈＭＳＣ組成物を調製した。
【００７５】
[00079]この実施例２に示されている実験を、（無菌成分として購入された）ビヒクル
の Plasma-Lyte Ａ成分の強度、純度および組成についての証明が存在しなかったことを
除いて、２１Ｃ．Ｆ．Ｒ．５８に成文化されているＵ．Ｓ． Food & Drug Administrations Good Laboratory Practice Regulations にしたがって行った。試験品の製造は、Good
Manufacturing Practices にしたがって行った。試験された種選択および動物数は、Expanded Acute Studies のＦＤＡガイドライン、ＩＣＨ Harmonised Tripartite Guidelines、ＦＤＡ Guidance for Human Somatic Cell Therapy and Gene Therapy、および前臨床薬学的試験について一般的に許容される手順で支持した。
【００７６】
[00080]ラット骨髄に由来するＭＳＣの集団を、次のように培養した。収集した骨髄を
、ハンクスの平衡溶液でフラッシした。細胞をプールし、計数し、そして１００ｇで１０分間遠心分離した。次に、細胞を、フラスコ中において、１０％ＦＢＳ、４５％ Ham's 
Ｆ−１２、４５％α−Minimum Essential Medium（「α−ＭＥＭ」）に１００Ｕ／ｍｌのペニシリンＧおよび１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシン硫酸塩を補足したものの中に、１２０ｘ１０＾６個細胞／ｃｍ＾２でプレーティングした。フラスコを、１０％ＣＯ２中において３７℃でインキュベートした。８日後、非付着細胞を除去し、そして残っている細胞を、０．０５％ブタトリプシンおよび０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡで引き離した。付着細胞を、２，０００個細胞／ｃｍ＾２で再プレーティングした。２回の（２）その後の継代を、４日間隔で行った。
【００７７】
[00081]増量後、その細胞懸濁液のアリコートを得て、残留ＢＳＡレベルを評価した。
アリコート中の細胞を溶解させた後、ＥＬＩＳＡを行って残留ＢＳＡを決定したが、それら結果は、表２に示されている。次に、α−ＭＥＭ中のＭＳＣを、既知数のＭＳＣが入っているクリオバイアル（cryovial）中で凍結させた。
【００７８】
[00082]各々の濃度について投与用製剤を調製するために、推定最終懸濁液容量を、９
０％のＭＳＣ生存能力を想定して、クリオバイアルごとの所望の細胞濃度および推定細胞計数から計算した。推定最終懸濁液容量を得るのに必要なビヒクルの量を、コニカル管中に入れた。ＭＳＣ集団が入っているクリオバイアルを、液体窒素貯蔵から水浴へ、半液体に融解するまで移した。約０．５ｍＬのビヒクルを、各々のクリオバイアルへ入れて、完
全な融解を容易にした。ＭＳＣ集団を、コニカル管へ移し、その時点で、その集団を、（Ａ）基本遠心分離（Basic Centrifugation）；かまたは（Ｂ）遠心濾過（Centrifugal Filtering）によって精製した。
【００７９】
[00083]（Ａ）基本遠心分離。細胞／ビヒクル懸濁液を、４℃において５００ｇ力で約
１０分間遠心分離した（Beckman ＧＳ−６ＲローターＧＨ３．８において１，４８０〜１５４０  ３，０００ＲＰＭ）。上澄みを取り出し、別のバイアル中で保持した。ペレット化した細胞を、必要ならば、ビヒクルで再懸濁させた。ＭＳＣを計数し、そして生存能力を確認した。全細胞計数に基づき、所望の最終懸濁液容量を得るのに必要なビヒクルの量を加えて、ｈＭＳＣ医薬組成物を与えた。基本遠心分離によって精製された組成物を、ＥＬＩＳＡによって検定して、残留ＢＳＡを決定したが、それら結果は、表２に示されている。
【００８０】
[00084]（Ｂ）遠心濾過。細胞／ビヒクル懸濁液を、約４μｍの細孔度の回転メンブラ
ンフィルターを有する且つ１５０の Residual Fold Reduction（ＲＦＲ）設定を用いる Cytomate Cell Processing System（Baxter により２００７年に販売されている）におい
て室温で約２５分間洗浄した。ＭＳＣを計数し、そして生存能力を確認した。遠心濾過によって精製された組成物を、ＥＬＩＳＡ検定で検定して、残留ＢＳＡを決定したが、それら結果は、表３に示されている。
【００８１】
[00085]全細胞計数に基づき、所望の最終懸濁液容量を得るのに必要なビヒクルの量を
加えて、ｈＭＳＣ医薬組成物を与えた。全てのｈＭＳＣ医薬組成物を、投与前４時間未満に調製した。被験動物には、大腿カテーテル経由で投与した。下の表２に示されるように、遠心濾過によって精製されたＭＳＣ医薬組成物は、死亡を示さなかったが、伝統的な遠心分離法によって精製されたＭＳＣ医薬組成物は、８０％の死亡率を生じた。それら死因は、肺塞栓であることを確かめた。
【００８２】
【表２】
2020120671.tif 000004
【００８３】
[00086]続いて研究されたいくつかのパラメーターの内、ＭＳＣ組成物中に存在する残
留ＢＳＡの量を、無毒性量（No Observed Adverse Events Level）（「ＮＯＡＥＬ」）限界と比較する第二の分析は、表３にそれら結果が示されているが、最も驚くべき結果を与えた。
【００８４】
【表３】
2020120671.tif 000005
【００８５】
[00087]表２に関する基本遠心分離によって精製されたＭＳＣ組成物を注入された１０
匹のラットの内、７匹のラットは、投与直後に死亡し、１匹は、投与翌日に死亡し、そして２匹は、計画終末剖検まで１４日間生存した。追加の前臨床または臨床的相研究を続行する前に、基本遠心分離によって精製されたＭＳＣ組成物で与えられる安全域を増加させることが望まれた。
【００８６】
[00088]追加の毒物学試験を、遠心濾過によって精製されたＭＳＣ医薬組成物について
行った。この実験では、１２０匹のラットに、１０ｘ１０６個／ｋｇ、４０ｘ１０６個／ｋｇまたは７５ｘ１０６個／ｋｇの細胞を投与した。研究された１２０匹のラットの内、２匹だけが研究中に死亡した。この実験の完全に二成分の結果（すなわち、完全生存または完全致死）を更に支持して、遠心濾過されたＭＳＣ医薬組成物を与えられた被験動物は、基本遠心分離によって精製された場合に致死的であったのと同程度に高い（７５ｘ１０６個細胞／ｋｇ）２回の用量レベルでさえも、ほとんど臨床症状を示さなかったということにも注目した。
【００８７】
[00089]この実験を行った後、全ての細胞処理プロトコルを、遠心濾過に適合させた。
[00090]表３に示されるように、基本遠心分離によって精製されたＭＳＣ組成物は、１
．２９μｇ／ｍＬの残留ＢＳＡを有することが判明し、３ｘ１０６個細胞／ｋｇのＮＯＡＥＬを生じた。比較すると、遠心濾過によって精製されたＭＳＣ組成物は、０．１３μｇ／ｍＬの残留ＢＳＡを有することが判明し、４０ｘ１０６個細胞／ｋｇのＮＯＡＥＬを生じ、したがって、安全域の約１０倍増加を示した。未精製ＭＳＣ組成物と、遠心分離によって精製されたＭＳＣ組成物との間の約２０倍の残留ＢＳＡ低下は、ＮＯＡＥＬ限界を、臨床的に有意に用量（すなわち、１０ｘ１０６個／ｋｇ、４０ｘ１０６個／ｋｇまたは７５ｘ１０６個／ｋｇの細胞）へ増加させなかったし、そしてなお、３７．５ｘ１０６個細胞／ｋｇで完全死亡率を生じたので、更に１０倍の純度増加が、ＮＯＡＥＬ限界を更に１対数増加させ、そして更に、被験動物集団の完全生存をもたらすと考えられるということ認めることは、全く驚くべきことであった。
【００８８】
[00091]ウシおよびブタ残留物を組合せで分析する場合、遠心濾過は、動物タンパク質
の残留レベルを、基本遠心分離に相対して約１，０００倍減少させた。この１，０００倍減少は、ボーラス注入についての最大許容用量を、２０ｘ１０６個細胞／ｋｇ〜６５ｘ１
０６個細胞／ｋｇへ増加させた。
【００８９】
[00092]未精製ＭＳＣ組成物（図２）、遠心分離によって精製されたＭＳＣ組成物（図
３）および遠心濾過によって精製されたＭＳＣ組成物（図４）の１０ｘ倍率下で得られた写真は、遠心濾過によって精製されたＭＳＣ組成物の減少した集合体形成傾向を示す。
【００９０】
[00093]ここで、ここに記載の技術の追加の態様を記載する；しかしながら、本技術の
範囲は、それによって制限されるものではない。本技術の範囲が、下記の具体的な態様に制限されるべきではないということは理解されるはずである。本技術は、具体的に記載されている以外に実施することができるし、そしてなお、請求の範囲の範囲内でありうる。本技術の追加の態様には、以下が含まれる。
【００９１】
[00094]精製済み間葉系幹細胞を含む薬学的に許容しうる組成物であって、一つまたは
それを超える間葉系幹細胞集合体を含み、そしてそれら集合体のＤ９０が、約１５０μｍ未満である薬学的に許容しうる組成物。
【００９２】
[00095]それら集合体のＤ９０が、約１００μｍ未満である、段落[00094]に記載の薬学的に許容しうる組成物。
[00096]それら集合体のＤ９０が、約５０μｍ未満である、段落[00095]に記載の薬学的に許容しうる組成物。
【００９３】
[00097]精製済み間葉系幹細胞の生存能力が、約７０％より大である、段落[00094]〜[00096]のいずれか一つに記載の薬学的に許容しうる組成物。
[00098]精製済み間葉系幹細胞の生存能力が、約８０％より大である、段落[00097]に記載の薬学的に許容しうる組成物。
【００９４】
[00099]ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を更に含む、段落[00094]〜[00098]のいず
れか一つに記載の薬学的に許容しうる組成物。
[000100]約１０％ＤＭＳＯを含む、段落[00099]に記載の薬学的に許容しうる組成物。
【００９５】
[000101]約３．８％ＤＭＳＯを含む、段落[00099]に記載の薬学的に許容しうる組成物
。
[000102]精製済み間葉系幹細胞を含む薬学的に許容しうる組成物であって、約５５μｇ／ｍＬ未満の残留ウシ血清アルブミンを含み、そしてここにおいて、間葉系幹細胞が、約１８μｍ〜約３０μｍのＤ９０を示す薬学的に許容しうる組成物。
【００９６】
[000103]組成物が、約４２μｇ／ｍＬ未満の残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000102]に記載の組成物。
[000104]組成物が、約２５μｇ／ｍＬ未満の残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000103]に記載の組成物。
【００９７】
[000105]組成物が、約１３μｇ／ｍＬ未満の残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000104]に記載の組成物。
[000106]組成物が、約１０μｇ／ｍＬ未満の残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000105]に記載の組成物。
【００９８】
[000107]組成物が、約７μｇ／ｍＬ〜約１５μｇ／ｍＬの残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000102]に記載の組成物。
[000108]組成物が、約８μｇ／ｍＬ〜約１２μｇ／ｍＬの残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000107]に記載の組成物。
【００９９】
[000109]間葉系幹細胞が、約１８μｍ〜約２５μｍのＤ９０を示す、段落[000102]〜[000108]のいずれかに記載の組成物。
[000110]間葉系幹細胞が、約２０μｍ〜約２５μｍのＤ９０を示す、段落[000109]に記載の組成物。
【０１００】
[000111]間葉系幹細胞が、ウシ血清アルブミンを含む基剤中において培養で増量している、段落[000102]〜[000110]のいずれかに記載の組成物。
[000112]間葉系幹細胞が、動物血清を含む基剤中において培養で増量している、段落[000102]〜[000110]のいずれかに記載の組成物。
【０１０１】
[000113]動物血清が、ヒト血清である、段落[000112]に記載の組成物。
[000114]動物血清が、非ヒト血清である、段落[000112]に記載の組成物。
[000115]非ヒト血清が、ウシ血清である、段落[000114]に記載の組成物。
【０１０２】
[000116]非ヒト血清が、ブタ血清である、段落[000114]に記載の組成物。
[000117]精製済み間葉系幹細胞の生存能力が、約７０％より大である、段落[000102]〜[000116]のいずれか一つに記載の組成物。
【０１０３】
[000118]精製済み間葉系幹細胞の生存能力が、約８０％より大である、段落[000117]に記載の組成物。
[000119]ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を更に含む、段落[000102]〜[000118]のいずれか一つに記載の組成物。
【０１０４】
[000120]約１０％ＤＭＳＯを含む、段落[000119]に記載の薬学的に許容しうる組成物。
[000121]約３．８％ＤＭＳＯを含む、段落[000119]に記載の薬学的に許容しうる組成物。
【０１０５】
[000122]精製済み間葉系幹細胞組成物を製造する方法であって、
（ｉ）ex vivo で培養された間葉系幹細胞を含有する標品を得；
（ii）その標品を、洗浄溶液と接触させて、混合物を生じ；
（iii）その混合物を、遠心濾過装置で撹拌し；そして
（iv）精製済み間葉系幹細胞組成物を回収する
という工程を含む方法。
【０１０６】
[000123]その ex vivo で培養される間葉系幹細胞を、ウシ血清アルブミンを含む基剤
中で培養する、段落[000122]に記載の方法。
[000124]その ex vivo で培養される間葉系幹細胞を、動物血清を含む基剤中で培養す
る、段落[000122]に記載の方法。
【０１０７】
[000125]動物血清が、ヒト血清である、段落[000124に記載の方法。
[000126]動物血清が、非ヒト血清である、段落[000124]に記載の組成物。
[000127]非ヒト血清が、ウシ血清である、段落[000126]に記載の組成物。
【０１０８】
[000128]非ヒト血清が、ブタ血清である、段落[000127]に記載の組成物。
[000129]その精製済み間葉系幹細胞組成物が、約５５μｇ／ｍＬ未満の残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000122]〜[000128]のいずれか一つに記載の方法。
【０１０９】
[000130]精製済み間葉系幹細胞組成物が、約４２μｇ／ｍＬ未満の残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000129]に記載の方法。
[000131]精製済み間葉系幹細胞組成物が、約２５μｇ／ｍＬ未満の残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000130]に記載の方法。
【０１１０】
[000132]精製済み間葉系幹細胞組成物が、約１３μｇ／ｍＬ未満の残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000131]に記載の方法。
[000133]精製済み間葉系幹細胞組成物が、約１０μｇ／ｍＬ未満の残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000132]に記載の方法。
【０１１１】
[000134]その精製済み間葉系幹細胞組成物が、約７μｇ／ｍＬ〜約１５μｇ／ｍＬの残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000122]〜[000128]のいずれか一つに記載の方法。
[000135]その精製済み間葉系幹細胞組成物が、約８μｇ／ｍＬ〜約１２μｇ／ｍＬの残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000134]に記載の方法。
【０１１２】
[000136]その精製済み間葉系幹細胞組成物にＤＭＳＯを加えることを更に含む、段落[000122]〜[000135]のいずれか一つに記載の方法。
[000137]その組成物が、約１０％ＤＭＳＯを含む、段落[000136]に記載の方法。
【０１１３】
[000138]その組成物が、約３．８％ＤＭＳＯを含む、段落[000136]に記載の方法。
[000139]精製済み間葉系幹細胞組成物であって、段落[000122]〜[000138]のいずれか一つに記載の方法によって得られた精製済み間葉系幹細胞組成物。
【０１１４】
[000140]精製済み間葉系幹細胞組成物であって、
（ｉ）間葉系幹細胞を、血清を含む基剤中で培養し；
（ii）それら間葉系幹細胞を含む標品を得；
（iii）その標品を、洗浄溶液と接触させて、混合物を生じ；
（iv）その混合物を、遠心濾過装置で撹拌し；そして
（ｖ）精製済み間葉系幹細胞組成物を回収すること
によって生産される精製済み間葉系幹細胞組成物。
【０１１５】
[000141]間葉系幹細胞が、約１８μｍ〜約３０μｍのＤ９０を示す、段落[000140]に記載の組成物。
[000142]間葉系幹細胞が、約１８μｍ〜約２５μｍのＤ９０を示す、段落[000141]に記載の組成物。
【０１１６】
[000143]間葉系幹細胞が、約２０μｍ〜約２５μｍのＤ９０を示す、段落[000142]に記載の組成物。
[000144]その血清が、ウシ血清であり、そしてその組成物が、約５５μｇ／ｍＬ未満の残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000140]〜[000143]のいずれか一つに記載の組成物。
【０１１７】
[000145]その組成物が、約４２μｇ／ｍＬ未満の残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000144]に記載の組成物。
[000146]その組成物が、約２５μｇ／ｍＬ未満の残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000145]に記載の組成物。
【０１１８】
[000147]その組成物が、約１３μｇ／ｍＬ未満の残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000146]に記載の組成物。
[000148]その組成物が、約１０μｇ／ｍＬ未満の残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000147]に記載の組成物。
【０１１９】
[000149]その血清が、ウシ血清であり、そしてその組成物が、約７μｇ／ｍｌ〜約１５μｇ／ｍｌの残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000140]〜[000143]のいずれか一つに記載の組成物。
【０１２０】
[000150]その組成物が、約８μｇ／ｍｌ〜約１２μｇ／ｍｌの残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000149]に記載の組成物。
[000151]精製済み間葉系幹細胞を含む薬学的に許容しうる組成物であって、その間葉系幹細胞を、ウシ血清アルブミンを含む基剤中において培養で増量し；そしてここにおいて、その組成物が、約５５μｇ／ｍＬ未満の残留ウシ血清アルブミンを含む薬学的に許容しうる組成物。
【０１２１】
[000152]その組成物が、約４２μｇ／ｍＬ未満の残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000151]に記載の組成物。
[000153]その組成物が、約２５μｇ／ｍＬ未満の残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000152]に記載の組成物。
【０１２２】
[000154]その組成物が、約１３μｇ／ｍＬ未満の残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000153]に記載の組成物。
[000155]その組成物が、約１０μｇ／ｍＬ未満の残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000154]に記載の組成物。
【０１２３】
[000156]その組成物が、約７μｇ／ｍｌ〜約１５μｇ／ｍｌの残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000151]に記載の組成物。
[000157]その組成物が、約８μｇ／ｍｌ〜約１２μｇ／ｍｌの残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000156]に記載の組成物。
【０１２４】
[000158]精製済み間葉系幹細胞を含む薬学的に許容しうる組成物であって、約５５μｇ／ｍｌ未満の残留ウシ血清アルブミンを含む組成物。
[000159]組成物が、約４２μｇ／ｍＬ未満の残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000158]に記載の組成物。
【０１２５】
[000160]組成物が、約２５μｇ／ｍＬ未満の残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000159]に記載の組成物。
[000161]組成物が、約１３μｇ／ｍＬ未満の残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000160]に記載の組成物。
【０１２６】
[000162]組成物が、約１０μｇ／ｍＬ未満の残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000161]に記載の組成物。
[000163]組成物が、約７μｇ／ｍＬ〜約１５μｇ／ｍＬの残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000158]に記載の組成物。
【０１２７】
[000164]組成物が、約８μｇ／ｍＬ〜約１２μｇ／ｍＬの残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000163]に記載の組成物。
[000165]ＤＭＳＯを更に含む、段落[000158]〜[000164]のいずれか一つに記載の組成物。
【０１２８】
[000166]約１０％ＤＭＳＯを更に含む、段落[000165]に記載の組成物。
[000167]約３．８％ＤＭＳＯを更に含む、段落[000165]に記載の組成物。
[000168]精製済み間葉系幹細胞を含む薬学的に許容しうる組成物であって、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、そしてその集合体のＤ９０が、約１５０μｍ未
満であり；ここにおいて、組成物は、約８μｇ／ｍＬ〜約１２μｇ／ｍＬの残留ウシ血清アルブミンを含み；そしてここにおいて、間葉系幹細胞は、約１８μｍ〜約３０μｍのＤ９０を示す組成物。
【０１２９】
[000169]その集合体のＤ９０が、約１００μｍ未満である、段落[000168]に記載の薬学的に許容しうる組成物。
[000170]その集合体のＤ９０が、約５０μｍ未満である、段落[000169]に記載の薬学的に許容しうる組成物。
【０１３０】
[000171]間葉系幹細胞が、約１８μｍ〜約２５μｍのＤ９０を示す、段落[000168]〜[000170]のいずれか一つに記載の薬学的に許容しうる組成物。
[000172]間葉系幹細胞が、約２０μｍ〜約２５μｍのＤ９０を示す、段落[000171]に記載の薬学的に許容しうる組成物。
【０１３１】
[000173]精製済み間葉系幹細胞を製造する方法であって、
（ｉ）複数の間葉系幹細胞を含む細胞懸濁液を得；
（ii）その懸濁液から間葉系幹細胞を質量および直径に基づいて同時に選択する
という工程を含む方法。
【０１３２】
[000174]その懸濁液を、洗浄溶液と接触させる工程を更に含む、段落[000173]に記載の方法。
[000175]その組成物が、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、そして集合体が、約１５０μｍ未満のそのＤ９０を示す、段落[000174]に記載の方法。
【０１３３】
[000176]集合体が、約１００μｍ未満のそのＤ９０を示す、段落[000175]に記載の方法。
[000177]集合体が、約５０μｍ未満のそのＤ９０を示す、段落[000176]に記載の方法。
【０１３４】
[000178]その組成物が、検出可能な間葉系幹細胞集合体を含まない、段落[000173]に記載の方法。
[000179]精製済み間葉系幹細胞を含む薬学的に許容しうる組成物であって、ここにおいて、間葉系幹細胞が、約１８μｍ〜約３０μｍのＤ９０を示す薬学的に許容しうる組成物。
【０１３５】
[000180]間葉系幹細胞が、約１８μｍ〜約２５μｍのＤ９０を示す、段落[000179]に記載の薬学的に許容しうる組成物。
[000181]間葉系幹細胞が、約２０μｍ〜約２５μｍのＤ９０を示す、段落[000180]に記載の薬学的に許容しうる組成物。
【０１３６】
[000182]ＤＭＳＯを更に含む、段落[000179]〜[000181]のいずれか一つに記載の組成物。
[000183]約１０％ＤＭＳＯを含む、段落[000182]に記載の組成物。
【０１３７】
[000184]約３．８％ＤＭＳＯを含む、段落[000182]に記載の組成物。
[000185]医薬間葉系幹細胞組成物を製造する方法であって、
（ｉ）複数の間葉系幹細胞および間葉系幹細胞集合体を含む間葉系幹細胞懸濁液を得；
（ii）その懸濁液を、洗浄溶液と接触させて、混合懸濁液を生じ；
（iii）その混合懸濁液を、遠心濾過装置で、間葉系幹細胞集合体が約１５０μｍ未満
のＤ９０を示すまで撹拌し；そして
（iv）医薬間葉系幹細胞組成物を回収する
という工程を含む方法。
【０１３８】
[000186]間葉系幹細胞集合体が、約１００μｍ未満のＤ９０を示す、段落[000185]に記載の方法。
[000187]間葉系幹細胞集合体が、約５０μｍ未満のＤ９０を示す、段落[000186]に記載の方法。
【０１３９】
[000188]その医薬間葉系幹細胞組成物が、約１８μｍ〜約３０μｍのＤ９０を示す間葉系幹細胞を含む、段落[000185]〜[000187]のいずれか一つに記載の方法。
[000189]その医薬間葉系幹細胞組成物が、約１８μｍ〜約２５μｍのＤ９０を示す間葉系幹細胞を含む、段落[000188]に記載の方法。
【０１４０】
[000190]その医薬間葉系幹細胞組成物が、約２０μｍ〜約２５μｍのＤ９０を示す間葉系幹細胞を含む、段落[000189]に記載の方法。
[000191]精製済み間葉系幹細胞の集団を含む組成物であって、段落[000185]〜[000190]のいずれか一つに記載の方法によって得られ、ここにおいて、細胞の生存能力が、約７０％より大である組成物。
【０１４１】
[000192]細胞の生存能力が、約８０％より大である、段落[000191]に記載の組成物。
[000193]ＤＭＳＯを更に含む、段落[000185]〜[000192]のいずれか一つに記載の組成物。
【０１４２】
[000194]約１０％ＤＭＳＯを含む、段落[000193]に記載の組成物。
[000195]約３．８％ＤＭＳＯを含む、段落[000193]に記載の組成物。
[000196]精製済み間葉系幹細胞を含む薬学的に許容しうる組成物であって、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、そしてその集合体が、約１５０μｍ未満のＤ９０を示し；そしてここにおいて、間葉系幹細胞は、約１８μｍ〜約３０μｍのＤ９０を示す薬学的に許容しうる組成物。
【０１４３】
[000197]その集合体が、約１００μｍ未満のＤ９０を示す、段落[000196]に記載の薬学的に許容しうる組成物。
[000198]その集合体が、約５０μｍ未満のＤ９０を示す、段落[000197]に記載の薬学的に許容しうる組成物。
【０１４４】
[000199]間葉系幹細胞が、約１８μｍ〜約２５μｍのＤ９０を示す、段落[000196]〜[000198]のいずれか一つに記載の薬学的に許容しうる組成物。
[000200]間葉系幹細胞が、約２０μｍ〜約２５μｍのＤ９０を示す、段落[000199]に記載の薬学的に許容しうる組成物。
【０１４５】
[000201]その組成物が、約７μｇ／ｍＬ〜約１５μｇ／ｍＬの残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000196]〜[000200]のいずれか一つに記載の薬学的に許容しうる組成物。
[000202]その組成物が、約８μｇ／ｍＬ〜約１２μｇ／ｍＬの残留ウシ血清アルブミンを含む、段落[000201]に記載の薬学的に許容しうる組成物。
【０１４６】
[000203]患者への投与用の少なくとも一つの非ヒトタンパク質を含有する細胞懸濁液を選択する方法であって、
（ａ）その細胞懸濁液の代表する少なくとも一つの試料を得；
（ｂ）その試料中に存在するその非ヒトタンパク質のレベルを決定し；そして
（ｃ）その試料が、約４２マイクログラム／ミリリットル未満のその非ヒトタンパク質を含有する場合に、その細胞懸濁液を、患者への投与に適していると識別する
という工程を含む方法。
【０１４７】
[000204]そのヒト細胞が、間葉系幹細胞である、段落[000203]に記載の方法。
[000205]その非ヒトタンパク質が、アルブミンである、段落[000203]に記載の方法。
[000206]その非ヒトタンパク質が、ウシ血清アルブミンである、段落[000203]に記載の方法。
【０１４８】
[000207]工程（ｂ）が、
ｉ．その試料を、少なくとも一つの抗アルブミン抗体と接触させ；そして
ii．その試料中のアルブミンのレベルを定量すること
を含む、段落[000205]または[000206]に記載の方法。
【０１４９】
[000208]その非ヒトタンパク質が、トリプシンである、段落[000203]に記載の方法。
[000209]その非ヒトタンパク質が、ブタトリプシンである、段落[000203]に記載の方法。
【０１５０】
[000210]工程（ｂ）が、
ｉ．その試料を、トリプシンへ選択的に結合する少なくとも一つの物質と接触させ；そして
ii．その試料中のトリプシンのレベルを定量すること
を含む、段落[000208]または[000209]に記載の方法。
【０１５１】
[000211]その少なくとも一つの物質が、トリプシン阻害剤である、段落[000210]に記載の方法。
[000212]その少なくとも一つの物質が、抗トリプシン抗体である、段落[000210]に記載の方法。
【０１５２】
[000213]工程（ｂ）が、
ｉ．その試料を、固定化トリプシン阻害剤と接触させて、固定化トリプシン阻害剤−トリプシンコンジュゲートを形成し；
ii．その固定化コンジュゲートを、抗トリプシン抗体と接触させて、固定化トリプシン阻害剤−トリプシン−抗体複合体を形成し；そして
iii．その複合体によって発生するシグナルを検出すること
を含む、段落[000203]に記載の方法。
【０１５３】
[000214]医薬組成物であって、段落[000203]、[000208]〜[000209]または[000211]〜[000213]のいずれか一つに記載の方法によって選択された医薬組成物。
[000215]対象の疾患または障害を処置するまたは予防する方法であって、
（ａ）非ヒトタンパク質を含む基剤中でヒト細胞をインキュベートし；
（ｂ）約４２マイクログラム／ミリリットル未満のその非ヒトタンパク質を含有するインキュベート済み細胞の懸濁液を選択し；
（ｃ）その細胞懸濁液を、その対象に投与する
という工程を含む方法。
【０１５４】
[000216]そのヒト細胞が、間葉系幹細胞である、段落[000215]に記載の方法。
[000217]その非ヒトタンパク質が、アルブミンである、段落[000215]に記載の方法。
[000218]その非ヒトタンパク質が、ウシ血清アルブミンである、段落[000215]に記載の方法。
【０１５５】
[000219]工程（ｂ）が、
ｉ．その試料を、少なくとも一つの抗アルブミン抗体と接触させ；そして
ii．その試料中のアルブミンのレベルを定量すること
を含む、段落[000217]または[000218]に記載の方法。
【０１５６】
[000220]その非ヒトタンパク質が、トリプシンである、段落[000215]に記載の方法。
[000221]その非ヒトタンパク質が、ブタトリプシンである、段落[000215]に記載の方法。
【０１５７】
[000222]工程（ｂ）が、
ｉ．その試料を、トリプシンへ選択的に結合する少なくとも一つの物質と接触させ；そして
ii．その試料中のトリプシンのレベルを定量すること
を含む、段落[000220]または[000221]に記載の方法。
【０１５８】
[000223]その少なくとも一つの物質が、トリプシン阻害剤である、段落[000222]に記載の方法。
[000224]その少なくとも一つの物質が、抗トリプシン抗体である、段落[000222]に記載の方法。
【０１５９】
[000225]工程（ｂ）が、
ｉ．その試料を、固定化トリプシン阻害剤と接触させて、固定化トリプシン阻害剤−トリプシンコンジュゲートを形成し；
ii．その固定化コンジュゲートを、抗トリプシン抗体と接触させて、固定化トリプシン阻害剤−トリプシン−抗体複合体を形成し；そして
iii．その複合体によって発生するシグナルを検出すること
を含む、段落[000215]に記載の方法。
【０１６０】
[000226]細胞療法製品を製造する方法であって、
（ａ）非ヒトタンパク質を含む溶液中でヒト細胞をインキュベートし；
（ｂ）それら細胞に、一定容量の液体ビヒクルを加えて、薬学的に許容しうる細胞懸濁液を得；
（ｃ）その薬学的に許容しうる細胞懸濁液の代表する少なくとも一つの試料を得；
（ｄ）その試料中に存在するその非ヒトタンパク質の量を定量し；そして
（ｅ）その試料が、約４２マイクログラム／ミリリットル未満のその非ヒトタンパク質を含有する場合に、その細胞懸濁液を患者への投与用に保持する
という工程を含む方法。
【０１６１】
[000227]その試料が、約３０マイクログラム／ミリリットル未満のその非ヒトタンパク質を含有する場合に、その細胞懸濁液を患者への投与用に保持することを更に含む、段落[000226]に記載の方法。
【０１６２】
[000228]その試料が、約２５マイクログラム／ミリリットル未満のその非ヒトタンパク質を含有する場合に、その細胞懸濁液を患者への投与用に保持することを更に含む、段落[000226]に記載の方法。
【０１６３】
[000229]その試料が、約１３マイクログラム／ミリリットル未満のその非ヒトタンパク質を含有する場合に、その細胞懸濁液を患者への投与用に保持することを更に含む、段落[000226]に記載の方法。
【０１６４】
[000230]その試料が、約１０マイクログラム／ミリリットル未満のその非ヒトタンパク
質を含有する場合に、その細胞懸濁液を患者への投与用に保持することを更に含む、段落[000226]に記載の方法。
【０１６５】
[000231]その試料が、約７〜約１５マイクログラム／ミリリットルのその非ヒトタンパク質を含有する場合に、その細胞懸濁液を患者への投与用に保持することを更に含む、段落[000226]に記載の方法。
【０１６６】
[000232]その試料が、約８〜約１２マイクログラム／ミリリットルのその非ヒトタンパク質を含有する場合に、その細胞懸濁液を患者への投与用に保持することを更に含む、段落[000226]に記載の方法。
【０１６７】
[000233]そのヒト細胞が、付着細胞である、段落[000226]に記載の方法。
[000234]そのヒト細胞が、間葉系幹細胞である、段落[000226]に記載の方法。
[000235]その非ヒトタンパク質が、アルブミンである、段落[000226]に記載の方法。
【０１６８】
[000236]その非ヒトタンパク質が、ウシ血清アルブミンである、段落[000226]に記載の方法。
[000237]工程（ｄ）が、
ｉ．その試料を、少なくとも一つの抗アルブミン抗体と接触させ；そして
ii．その試料中のアルブミンのレベルを定量すること
を含む、段落[000235]または[000236]に記載の方法。
【０１６９】
[000238]その非ヒトタンパク質が、トリプシンである、段落[000226]に記載の方法。
[000239]その非ヒトタンパク質が、ブタトリプシンである、段落[000226]に記載の方法。
【０１７０】
[000240]工程（ｄ）が、
ｉ．その試料を、トリプシンへ選択的に結合する少なくとも一つの物質と接触させ；そして
ii．その試料中のトリプシンのレベルを定量すること
を含む、段落[000238]または[000239]に記載の方法。
【０１７１】
[000241]その少なくとも一つの物質が、トリプシン阻害剤である、段落[000240]に記載の方法。
[000242]その少なくとも一つの物質が、抗トリプシン抗体である、段落[000240]に記載の方法。
【０１７２】
[000243]工程（ｄ）が、
ｉ．その試料を、固定化トリプシン阻害剤と接触させて、固定化トリプシン阻害剤−トリプシンコンジュゲートを形成し；
ii．その固定化コンジュゲートを、抗トリプシン抗体と接触させて、固定化トリプシン阻害剤−トリプシン−抗体複合体を形成し；そして
iii．その複合体によって発生するシグナルを検出すること
を含む、段落[000238]または[000239]に記載の方法。
【０１７３】
[000244]細胞療法製品を製造する方法であって、
（ａ）非ヒトトリプシンを含む溶液中でヒト細胞をインキュベートし；
（ｂ）それら細胞に、一定容量の液体ビヒクルを加えて、薬学的に許容しうる細胞懸濁液を得；
（ｃ）その薬学的に許容しうる細胞懸濁液の代表する少なくとも二つの試料を得；
（ｄ）第一試料中に存在するトリプシンレベルを決定し；
（ｅ）トリプシンを選択的に結合する少なくとも一つの物質を含む溶液中で第二試料をインキュベートして、対照を得；
（ｆ）その対照中のトリプシンレベルを決定し；
（ｇ）その第一試料中のトリプシンレベルと、その対照中のトリプシンレベルとを比較して、その細胞懸濁液中のトリプシンレベルを得；そして
（ｈ）その細胞懸濁液が、約３０マイクログラム／ミリリットル未満のトリプシンを含有する場合に、細胞のその細胞懸濁液を患者への投与用に保持する
という工程を含む方法。
【０１７４】
[000245]その細胞懸濁液が、約２５マイクログラム／ミリリットル未満のトリプシンを含有する場合に、その細胞懸濁液を保持することを更に含む、段落[000244]に記載の方法。
【０１７５】
[000246]その細胞懸濁液が、約１３マイクログラム／ミリリットル未満のトリプシンを含有する場合に、その細胞懸濁液を保持することを更に含む、段落[000244]に記載の方法。
【０１７６】
[000247]その細胞懸濁液が、約１０マイクログラム／ミリリットル未満のトリプシンを含有する場合に、その細胞懸濁液を保持することを更に含む、段落[000244]に記載の方法。
【０１７７】
[000248]その細胞懸濁液が、約７〜約１５マイクログラム／ミリリットルのトリプシンを含有する場合に、その細胞懸濁液を保持することを更に含む、段落[000244]に記載の方法。
【０１７８】
[000249]その細胞懸濁液が、約８〜約１２マイクログラム／ミリリットルのトリプシンを含有する場合に、その細胞懸濁液を保持することを更に含む、段落[000244]に記載の方法。
【０１７９】
[000250]そのヒト細胞が、間葉系幹細胞である、段落[000244]に記載の方法。
[000251]その物質が、トリプシン阻害剤である、段落[000244]に記載の方法。
[000252]その物質が、抗トリプシン抗体である、段落[000244]に記載の方法。
【０１８０】
[000253]細胞療法製品であって、段落[0002226]〜[000236]、[000238]〜[000239]また
は[000244]〜[000252]のいずれか一つに記載の方法によって製造された細胞療法製品。
[000254]細胞療法製品であって、段落[000237]に記載の方法によって製造された細胞療法製品。
【０１８１】
[000255]細胞療法製品であって、段落[000240]に記載の方法によって製造された細胞療法製品。
[000256]細胞療法製品であって、段落[000241]に記載の方法によって製造された細胞療法製品。
【０１８２】
[000257]細胞療法製品であって、段落[000242]に記載の方法によって製造された細胞療法製品。
[000258]細胞療法製品であって、段落[000243]に記載の方法によって製造された細胞療法製品。
【０１８３】
[000259]ヒト間葉系幹細胞および少なくとも一つの非ヒトタンパク質を含む薬学的に許
容しうる細胞懸濁液であって、約４２マイクログラム／ミリリットル未満のその非ヒトタンパク質を含有する細胞懸濁液。
【０１８４】
[000260]その試料が、約３０マイクログラム／ミリリットル未満のその非ヒトタンパク質を含有する場合に、その細胞懸濁液を患者への投与用に保持することを更に含む、段落[000259]に記載の細胞懸濁液。
【０１８５】
[000261]その試料が、約２５マイクログラム／ミリリットル未満のその非ヒトタンパク質を含有する場合に、その細胞懸濁液を患者への投与用に保持することを更に含む、段落[000259]に記載の細胞懸濁液。
【０１８６】
[000262]その試料が、約１３マイクログラム／ミリリットル未満のその非ヒトタンパク質を含有する場合に、その細胞懸濁液を患者への投与用に保持することを更に含む、段落[000259]に記載の細胞懸濁液。
【０１８７】
[000263]その試料が、約１０マイクログラム／ミリリットル未満のその非ヒトタンパク質を含有する場合に、その細胞懸濁液を患者への投与用に保持することを更に含む、段落[000259]に記載の細胞懸濁液。
【０１８８】
[000264]その試料が、約７〜約１５マイクログラム／ミリリットルのその非ヒトタンパク質を含有する場合に、その細胞懸濁液を患者への投与用に保持することを更に含む、段落[000259]に記載の細胞懸濁液。
【０１８９】
[000265]その試料が、約８〜約１２マイクログラム／ミリリットルのその非ヒトタンパク質を含有する場合に、その細胞懸濁液を患者への投与用に保持することを更に含む、段落[000259]に記載の細胞懸濁液。
【０１９０】
[000266]その非ヒトタンパク質が、アルブミンである、段落[000259]に記載の方法。
[000267]その非ヒトタンパク質が、ウシ血清アルブミンである、段落[000259]に記載の方法。
【０１９１】
[000268]その非ヒトタンパク質が、トリプシンである、段落[000259]に記載の方法。
[000269]その非ヒトタンパク質が、ブタトリプシンである、段落[000259]に記載の方法。
【図１】
2020120671.tif 000006
【図２】
2020120671.tif 000007
【図３】
2020120671.tif 000008
【図４】
2020120671.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】令和2年5月14日(2020.5.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製済みヒト間葉系幹細胞を含む薬学的に許容しうる組成物であって、一つまたはそれを超える間葉系幹細胞集合体を含み、そして該集合体のＤ９０が、１５０μｍ未満である、薬学的に許容しうる組成物。
【請求項２】
間葉系幹細胞が、遠心濾過によって精製されている、請求項１に記載の薬学的に許容しうる組成物。
【請求項３】
遠心濾過が、回転メンブランを使用し、該メンブランは、３μｍ〜７μｍの細孔度または４μｍの細孔度を有していてもよい、請求項２に記載の薬学的に許容しうる組成物。
【請求項４】
前記集合体のＤ９０が、１００μｍ未満である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬学的に許容しうる組成物。
【請求項５】
前記集合体のＤ９０が、５０μｍ未満である、請求項４に記載の薬学的に許容しうる組成物。
【請求項６】
精製済み間葉系幹細胞の生存能力が、７０％より大である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の薬学的に許容しうる組成物。
【請求項７】
精製済み間葉系幹細胞の生存能力が、８０％より大である、請求項６に記載の薬学的に許容しうる組成物。
【請求項８】
ヒトにおける療法において使用するための請求項１〜７のいずれか一項に記載の薬学的に許容しうる組成物。
【請求項９】
精製済みヒト間葉系幹細胞を含む薬学的に許容しうる組成物であって、５５μｇ／ｍＬ未満の残留ウシ血清アルブミンを含み、該間葉系幹細胞は、１８μｍ〜３０μｍのＤ９０を示し、該間葉系幹細胞は、ウシ血清アルブミンを含む培地中で培養により増量されており、
ウシ血清アルブミンは、ヒトにおける療法において使用するための該間葉系幹細胞の細胞表面と結合状態になっており、
静脈内経路により投与される、
前記組成物。
【請求項１０】
組成物が、４２μｇ／ｍＬ未満の残留ウシ血清アルブミンを含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
組成物が、２５μｇ／ｍＬ未満の残留ウシ血清アルブミンを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
組成物が、１３μｇ／ｍＬ未満の残留ウシ血清アルブミンを含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
組成物が、１０μｇ／ｍＬ未満の残留ウシ血清アルブミンを含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
組成物が、７μｇ／ｍＬ〜１５μｇ／ｍＬの残留ウシ血清アルブミンを含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１５】
組成物が、８μｇ／ｍＬ〜１２μｇ／ｍＬの残留ウシ血清アルブミンを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
間葉系幹細胞が、１８μｍ〜２５μｍのＤ９０を示す、請求項９に記載の組成物。
【請求項１７】
精製済み間葉系幹細胞の生存能力が、７０％より大である、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
精製済み間葉系幹細胞の生存能力が、８０％より大である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
間葉系幹細胞が、遠心濾過によって精製されている、請求項９〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
遠心濾過が、回転メンブランを使用し、該メンブランは、３μｍ〜７μｍの細孔度または４μｍの細孔度を有していてもよい、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２１】
免疫応答、肺塞栓症、血管収縮、または心臓性ショックの予防または治療に有用な医薬としての、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
該予防または治療が、免疫原性の増加およびレシピエントからの間葉系幹細胞のクリアランスまたは排泄の促進を防ぐ、請求項２１に記載の組成物。