(57)【要約】      （修正有）【課題】効率的にバイオマスを糖化することができる、新規アラビノフラノシダーゼの提供。【解決手段】下記（ａ）〜（ｄ）から選ばれるアミノ酸配列からなり、且つアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質：（ａ）特定のアミノ酸配列；（ｂ）上記の（ａ）の１番から３０１番で示されるアミノ酸配列；（ｃ）（ａ）又は（ｂ）で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列；（ｄ）（ａ）又は（ｂ）で示されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｄ）から選ばれるアミノ酸配列からなり、且つアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質：
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２の１番から３０１番で示されるアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｄ）（ａ）又は（ｂ）で示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項２】
請求項１記載のアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
下記（ｅ）〜（ｈ）から選ばれるヌクレオチド配列からなる、請求項２記載のポリヌクレオチド：
（ｅ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）配列番号１の７３番から９７５番で示されるヌクレオチド配列；
（ｇ）（ｅ）又は（ｆ）で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列；
（ｈ）（ｅ）又は（ｆ）で示されるヌクレオチド配列において、１又は複数個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列。
【請求項４】
請求項２又は３記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５】
請求項２又は３記載のポリヌクレオチド、又は請求項４記載のベクターを宿主に導入することを含む、形質転換体の製造方法。
【請求項６】
請求項２又は３記載のポリヌクレオチド、又は請求項４記載のベクターが導入された形質転換体。
【請求項７】
請求項１記載のアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質を含有する、バイオマス糖化剤。
【請求項８】
請求項１記載のアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質、又は請求項７記載のバイオマス糖化剤を用いる、バイオマスからの糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なアラビノフラノシダーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、作物や木材の収穫後の残渣等、農業生産の副産物として生じるセルロース系バイオマスの利用に対する研究開発が注目されている。セルロース系バイオマス（以下バイオマスと記載）は，セルロース，ヘミセルロース及びリグニンから構成されており、これら３成分は強固に絡み合っている。これら３成分のうち、セルロース及びヘミセルロースの分解産物である糖はエタノールや化成品の原料となる。
【０００３】
セルロースはグルコースがβ−１，４結合でつながった多糖であり、ヘミセルロースはグルコース以外のヘテロ多糖であり，ヘミセルロースの中に最も豊富に存在するアラビノキシランは，主にキシロースがβ−１，４結合でつながったキシラン骨格に側鎖としてアラビノースやガラクトース，グルクロン酸，フェルラ酸等が結合している。セルロース及びヘミセルロースを分解する酵素はセルラーゼ及びヘミセルラーゼであり、バイオマス糖化酵素と総称されている。
【０００４】
バイオマスは複雑に絡み合った構造をとっているため、分解されにくい。セルロースやヘミセルロースを効率よく分解するにはセルラーゼ及びヘミセルラーゼが共に必須であり、酵素の種類や組成が大きく影響するため、糖化酵素の開発は重要課題である。
【０００５】
バイオマスの分解を向上するため、セルラーゼにＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ由来のキシラナーゼやアラビノフラノシダーゼ等のヘミセルラーゼが添加された酵素組成物が開発されている（特許文献１）。またＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．の高いキシラナーゼ活性を有するキシラナーゼが添加された酵素粗組成が開発されている（特許文献２）。
【０００６】
糖質加水分解酵素（ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ；ＧＨ）であるα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼは、α−１，２又はα−１，３又はα−１，５結合したアラビノース側鎖を非還元末端側から加水分解でき、そしてＥＣ３．２．１．５５に分類される。また、アミノ酸配列の相同性に基づく分類では、ＧＨ４３，５１，５４，６２に分類されている。
例えば、非特許文献１には、ペニシリウムカプスラタム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｏｐｓｕｌａｔｕｍ）から６４．５ｋＤａ及び６２．７ｋＤａのα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼについてその特性が開示され、また、特許文献３には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ及びそのアミノ酸配列が開示されている。
【０００７】
しかしながら、従来のアラビノフラノシダーゼは、バイオマスを糖化し得る、糖化酵素としては満足できるものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２０１１−５１５０８９号公報
【特許文献２】特開２０１７−１２００６号公報
【特許文献３】国際公開第２００６／１２５４３８号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Appl. Environ. Microbiol.,１９９６，６２，１６８−１７３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、効率的にバイオマスを糖化することができる、新規アラビノフラノシダーゼを提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、優れたアラビノフラノシダーゼ活性を有すると共に、アラビノキシラン分解活性が高い新規アラビノフラノシダーゼを見出し、当該アラビノフラノシダーゼを用いることによりバイオマスの糖化を効率よく行うことができることを見出した。
【００１２】
すなわち、本発明は、下記１）〜７）に係るものである。
１）下記（ａ）〜（ｄ）から選ばれるアミノ酸配列からなり、且つアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質：
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２の１番から３０１番で示されるアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｄ）（ａ）又は（ｂ）で示されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
２）１）のアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
３）２）のポリヌクレオチドを含むベクター。
４）２）のポリヌクレオチド、又は３）のベクターを宿主に導入することを含む、形質転換体の製造方法。
５）２）のポリヌクレオチド、又は３）のベクターを導入された形質転換体。
６）１）のアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質を含有するバイオマス糖化剤。
７）１）のアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質、又は６）のバイオマス糖化剤を用いる、バイオマスからの糖の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、優れたアラビノフラノシダーゼ活性を有すると共に、アラビノキシラン分解活性が高く、バイオマスの糖化率が高いアラビノフラノシダーゼを提供する。当該のアラビノフラノシダーゼを使用することによって、市販のアラビノフラノシダーゼ又はそれを含む組成物を使用する場合と比べて、より効率のよいバイオマスの糖化を実現することができる。したがって、本発明によれば、バイオマスから効率的且つ安価に糖を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌアラビノフラノシド及び小麦アラビノキシランの構造。
【図２】各種α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ添加による小麦ふすまの糖化性。
【図３】Ｆ８１ＡＢＦを発現した糖化酵素による小麦ふすまの糖化性。
【図４】ＧＨ６２のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼのマルチプルアライメント。
【図５】ＧＨ６２のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの分子系統樹。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の配列同一性は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Science, 1985, 227:1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎのホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１６】
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも９０％の同一性」とは、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性をいう。
【００１７】
本明細書において、「１又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、１個以上３０個以下、好ましくは２０個以下、より好ましくは１０個以下、さらに好ましくは５個以下のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。また本明細書において、「１又は複数個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列」としては、１個以上９０個以下、好ましくは６０個以下、より好ましくは３０個以下、より好ましくは１５個以下、より好ましくは１０個以下のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列が挙げられる。
【００１８】
本明細書において、「バイオマス」とは、植物や藻類が生産するヘミセルロース成分を含むセルロース系及び／又はリグノセルロース系バイオマスをいう。バイオマスの具体例としては、カラマツやヌマスギ等の針葉樹や、アブラヤシ（幹部）、ヒノキ等の広葉樹等から得られる各種木材；ウッドチップ等の木材の加工物又は粉砕物；木材から製造されるウッドパルプ、綿の種子の周囲の繊維から得られるコットンリンターパルプ等のパルプ類；新聞紙、ダンボール、雑誌、上質紙等の紙類；バガス（サトウキビの搾りかす）、パーム空果房（ＥＦＢ）、稲わら、とうもろこし茎若しくは葉等の植物の茎、葉、果房等；籾殻、パーム殻、ココナッツ殻等の植物殻類、藻類等からなる群より選ばれる１種以上が挙げられる。このうち、入手容易性及び原料コストの観点から、木材、木材の加工物又は粉砕物、植物の茎、葉、果房等が好ましく、バガス、ＥＦＢ、アブラヤシ（幹部）がより好ましく、バガスがさらに好ましい。上記バイオマスは、単独で又は２種以上を混合して使用してもよい。また上記バイオマスは乾燥されていてもよい。
【００１９】
本明細書において、「アラビノフラノシダーゼ活性」とは、アラビノース含有多糖中のα−１，２若しくはα−１，３結合した側鎖、又はα−１，２及びα−１，３結合した側鎖を切断し、α−Ｌ−アラビノース残基を加水分解する活性をいう。
タンパク質のアラビノフラノシダーゼ活性は、例えば、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌアラビノフラノシドを基質として当該タンパク質と反応させ、遊離するp-ニトロフェノールを測定することによって決定することができる。アラビノフラノシダーゼ活性の測定の具体的手順は、後述の実施例に詳述されている。
【００２０】
（１．アラビノフラノシダーゼ）
本発明のアラビノフラノシダーゼは、下記（ａ）〜（ｄ）から選ばれるアミノ酸配列からなり、且つアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質である。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２の１番から３０１番で示されるアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｄ）（ａ）又は（ｂ）で示されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
ここで、上記（ｂ）のタンパク質は、配列表に記載のとおり、（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列から菌体外分泌シグナルペプチドを除いた成熟タンパク質である。
【００２１】
すなわち、本発明のアラビノフラノシダーゼは、一実施形態において、配列番号２で示されるアミノ酸配列（ａ）又は配列番号２の１番から３０１番で示されるアミノ酸配列（ｂ）、からなるタンパク質である。当該アラビノフラノシダーゼとしては、糸状菌Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．由来のアラビノフラノシダーゼＦ８１ＡＢＦ（以下、「Ｆ８１ＡＢＦ」とも称する）が好ましい例として挙げられる。Ｆ８１ＡＢＦは、そのアミノ酸配列からＧＨ６２に分類されるアラビノフラノシダーゼである。
【００２２】
別の態様において、本発明のアラビノフラノシダーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列（ａ）又は配列番号２の１番から３０１番で示されるアミノ酸配列（ｂ）と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列（ｃ）からなり、且つアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質である。また別の態様において、本発明のアラビノフラノシダーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列（ａ）又は配列番号２の１番から３０１番で示されるアミノ酸配列（ｂ）において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列（ｄ）からなり、且つアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質である。
該タンパク質は、例えば、上述した配列番号２で示されるアミノ酸配列又は配列番号２の１番から３０１番で示されるアミノ酸配列からなるＦ８１ＡＢＦの天然又は人工的に作製された変異体が挙げられる。当該変異体は、例えば、上記Ｆ８１ＡＢＦをコードする遺伝子に対して紫外線照射や部位特異的変異導入（Site-Directed Mutagenesis）のような公知の突然変異導入法により突然変異を導入し、当該突然変異を有する遺伝子を発現させ、所望のアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質を選択することによって、作製することができる。このような変異体作製の手順は、当業者に周知である。
【００２３】
本発明のアラビノフラノシダーゼは、従来単離又は精製されているアラビノフラノシダーゼとは異なるアミノ酸配列を有する。例えば、Ｆ８１ＡＢＦと、市販酵素ＡＢＦＵＭ及びＡＢＦＡＮに相当するＥＡＫ８５７７１．１、ＥＡＡ５９５６２．１、並びに前記特許文献３に記載のＣＡＭ０７２４５．１についてそれぞれアミノ酸配列の相同性解析の結果、ＥＡＫ８５７７１．１、ＥＡＡ５９５６２．１及びＣＡＭ０７２４５．１は、Ｆ８１ＡＦＢとそれぞれ６６％、７２％及び８２％の配列同一性を示す（図４）。
また、ＣＡＺＹ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／）に登録されている真核生物由来のＧＨ６２のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ６７タンパク質のアミノ酸配列についてマルチプルアライメントを行い、近隣結合法により分子系統樹を作成すると大きく２つのグループに分類されるが、これによると、Ｆ８１ＡＢＦは、ＥＡＫ８５７７１．１及びＣＡＭ０７２４５．１とは同一のグループに属し、ＥＡＡ５９５６２．１とは別のグループに属する（図５）。
【００２４】
（２．アラビノフラノシダーゼの生産方法）
本発明のアラビノフラノシダーゼは、例えば、上記本発明のアラビノフラノシダーゼをコードするポリヌクレオチドを発現させることにより生産することができる。好ましくは、本発明のアラビノフラノシダーゼは、本発明のアラビノフラノシダーゼをコードするポリヌクレオチドを導入した形質転換体から生産することができる。例えば、本発明のアラビノフラノシダーゼをコードするポリヌクレオチド、又はそれを含むベクターを宿主に導入して形質転換体を得た後、該形質転換体を適切な培地で培養すれば、該形質転換体に導入した本発明のアラビノフラノシダーゼをコードするポリヌクレオチドから本発明のアラビノフラノシダーゼが生産される。生産されたアラビノフラノシダーゼを該培養物から単離又は精製することにより、本発明のアラビノフラノシダーゼを取得することができる。
【００２５】
本発明のアラビノフラノシダーゼをコードするポリヌクレオチドは、上記（ａ）〜（ｄ）から選ばれるアミノ酸配列からなり、且つアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり得る。また本発明のアラビノフラノシダーゼをコードするポリヌクレオチドは、一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は人工核酸の形態であり得、あるいはｃＤＮＡ、又はイントロンを含まない化学合成ＤＮＡであり得る。
本発明のアラビノフラノシダーゼをコードするポリヌクレオチドの好ましい例としては、下記（ｅ）〜（ｈ）から選ばれるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
（ｅ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）配列番号１の７３番から９７５番で示されるヌクレオチド配列；
（ｇ）（ｅ）又は（ｆ）で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列；
（ｈ）（ｅ）又は（ｆ）で示されるヌクレオチド配列において、１又は複数個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列。
ここで、上記（ｆ）のポリヌクレオチドは、配列表に記載のとおり、（ｅ）のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列から菌体外分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを除いた成熟タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００２６】
本発明のアラビノフラノシダーゼをコードするポリヌクレオチドは、糸状菌Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．等から、当該分野で用いられる任意の方法を用いて単離することができる。例えば、当該ポリヌクレオチドは、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．の全ゲノムＤＮＡを抽出した後、配列番号１の塩基配列を元に設計したプライマーを用いたＰＣＲにより標的遺伝子を選択的に増幅し、増幅した遺伝子を精製することで得ることができる。あるいは、本発明のアラビノフラノシダーゼをコードするポリヌクレオチドは、該アラビノフラノシダーゼのアミノ酸配列に基づいて、化学的又は遺伝子工学的に合成することができる。例えば、該ポリヌクレオチドは、上述した本発明のアラビノフラノシダーゼのアミノ酸配列に基づいて、化学的に合成することができる。ポリヌクレオチドの化学合成には、核酸合成受託サービス（例えば、株式会社  医学生物学研究所、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社等より提供されている）を利用することができる。さらに、合成したポリヌクレオチドをＰＣＲ、クローニング等により増幅することもできる。
【００２７】
またあるいは、本発明のアラビノフラノシダーゼをコードするポリヌクレオチドは、上記の手順で合成されたポリヌクレオチドに対して、上述した紫外線照射や部位特異的変異導入のような公知の突然変異導入法により突然変異を導入することによって、作製することができる。例えば、本発明のアラビノフラノシダーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１のポリヌクレオチドに公知の方法で突然変異導入し、得られたポリヌクレオチドを発現させてアラビノフラノシダーゼ活性を調べ、所望のアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを選択することによって、得ることができる。
【００２８】
ポリヌクレオチドへの部位特異的変異導入は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法など（村松ら編、「改訂第４版  新遺伝子工学ハンドブック」、羊土社、ｐ．８２−８８）の任意の手法により行うことができる。必要に応じてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ等の各種の市販の部位特異的変異導入用キットを使用することもできる。
【００２９】
本発明のアラビノフラノシダーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターの種類としては、特に限定されず、遺伝子のクローニングに通常用いられるベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣ等が挙げられる。プラスミドベクターが好ましく、例えば、市販のタンパク質発現用プラスミドベクター、例えばシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２（いずれもタカラバイオ株式会社製）等を好適に用いることができる。
【００３０】
上記ベクターは、ＤＮＡの複製開始領域又は複製起点を含むＤＮＡ領域を含み得る。あるいは、上記ベクターにおいては、本発明のアラビノフラノシダーゼをコードするポリヌクレオチド（すなわち本発明のアラビノフラノシダーゼ遺伝子）の上流に、該遺伝子の転写を開始させるためのプロモーター領域、ターミネーター領域、又は発現されたタンパク質を細胞外へ分泌させるための分泌シグナル領域などの制御配列が作動可能に連結されていてもよい。本明細書において、遺伝子と制御配列が「作動可能に連結されている」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域による制御の下に発現し得るように配置されていることをいう。
【００３１】
上記プロモーター領域、ターミネーター、分泌シグナル領域等の制御配列の種類は、特に限定されず、導入する宿主に応じて、通常使用されるプロモーターや分泌シグナル配列を適宜選択して用いることができる。例えば、本発明のベクターに組み込むことができる制御配列の好適な例としては、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ由来ｃｂｈ１プロモーター配列（Ｃｕｒｒ，Ｇｅｎｅｔ，１９９５，２８（１）：７１−７９）が挙げられる。あるいは、その他のセロビオハイドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、βグルコシダーゼ、キシラナーゼ、βキシロシダーゼなどの糖化酵素を発現するプロモーターを使用してもよい。あるいは、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼなどの代謝経路の酵素のプロモーターを使用してもよい。
【００３２】
あるいは、上記本発明のベクターには、該ベクターが適切に導入された宿主を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤の耐性遺伝子）がさらに組み込まれていてもよい。あるいは、宿主に栄養要求性株を使用する場合、要求される栄養の合成酵素をコードする遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込んでもよい。またあるいは、生育のために特定の代謝を必須とする選択培地を用いる場合、該代謝の関連遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込んでもよい。このような代謝関連遺伝子の例としては、アセトアミドを窒素源として利用するためのアセトアミダーゼ遺伝子が挙げられる。
【００３３】
上記本発明のアラビノフラノシダーゼをコードするポリヌクレオチドと、制御配列及びマーカー遺伝子との連結は、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７：６１−６８）などの当該分野で公知の方法によって行うことができる。連結した断片のベクターへの導入手順は、当該分野で周知である。
【００３４】
上記ベクターを導入する形質転換体の宿主の例としては、細菌、糸状菌などの微生物が挙げられる。細菌の例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌などが挙げられ、このうち、大腸菌及びバチルス属細菌（例えば、枯草菌又はその変異株）が好ましい。枯草菌変異株の例としては、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００７，１０４（２）：１３５−１４３に記載のプロテアーゼ９重欠損株ＫＡ８ＡＸ、ならびにＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２０１１，３３（９）：１８４７−１８５２に記載の、プロテアーゼ８重欠損株にタンパク質のフォールディング効率を向上させたＤ８ＰＡ株を挙げることができる。糸状菌の例としては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、リゾプス属（Ｒｉｚｈｏｐｕｓ）などが挙げられ、このうち、酵素生産性の観点からはトリコデルマ属が好ましい。
【００３５】
宿主へのベクターの導入の方法としては、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法などの当該分野で通常使用される方法を用いることができる。導入が適切に行われた株をマーカー遺伝子の発現、栄養要求性などを指標に選択することで、ベクターが導入された目的の形質転換体を得ることができる。
【００３６】
あるいは、本発明のアラビノフラノシダーゼをコードするポリヌクレオチド、制御配列及びマーカー遺伝子を連結した断片を、宿主のゲノムに直接導入することもできる。例えば、ＳＯＥ−ＰＣＲ法などにより、上記連結断片の両端に宿主のゲノムと相補的な配列を付加したＤＮＡ断片を構築し、これを宿主に導入して、宿主ゲノムと該ＤＮＡ断片との間に相同組換えを起こさせることによって、本発明のアラビノフラノシダーゼをコードするポリヌクレオチドが宿主のゲノムに導入される。
【００３７】
斯くして得られた、本発明のアラビノフラノシダーゼをコードするポリヌクレオチド又はそれを含むベクターが導入された形質転換体を適切な培地で培養すれば、該ベクター上のアラビノフラノシダーゼ遺伝子が発現して本発明のアラビノフラノシダーゼが生成される。当該形質転換体の培養に使用する培地は、当該形質転換体の微生物の種類にあわせて、当業者が適宜選択することができる。
【００３８】
あるいは、本発明のアラビノフラノシダーゼは、無細胞翻訳系を使用して本発明のアラビノフラノシダーゼをコードするポリヌクレオチド又はその転写産物から発現させてもよい。「無細胞翻訳系」とは、宿主となる細胞を機械的に破壊して得た懸濁液にタンパク質の翻訳に必要なアミノ酸等の試薬を加えて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写翻訳系又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系を構成したものである。
【００３９】
上記培養物又は無細胞翻訳系にて生成された本発明のアラビノフラノシダーゼは、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、単離又は精製することができる。このとき、形質転換体内のベクター上で本発明のアラビノフラノシダーゼをコードするポリヌクレオチドと分泌シグナル配列が作動可能に連結されている場合、生成されたアラビノフラノシダーゼは細胞外に分泌されるため、より容易に培養物から回収され得る。培養物から回収されたアラビノフラノシダーゼは、公知の手段でさらに精製されてもよい。
【００４０】
（３．バイオマス糖化剤）
上記本発明のアラビノフラノシダーゼは、後述の実施例に示す通り、従来公知のアラビノフラノシダーゼと比較して、バイオマスを糖化する活性が顕著に高い。したがって、本発明のアラビノフラノシダーゼは、バイオマス糖化のために、バイオマス糖化剤に含有して使用することができる。
【００４１】
本発明のバイオマス糖化剤は、上記本発明のアラビノフラノシダーゼを含有する。該バイオマス糖化剤は、好ましくはバイオマス糖化用の酵素組成物である。本発明のバイオマス糖化剤は、本発明のアラビノフラノシダーゼを含み、また糖化効率の向上の観点から、好ましくはさらにセルラーゼを含む。ここで、セルラーゼとは、セルロースのβ−１，４−グルカンのグリコシド結合を加水分解する酵素を指し、エンドグルカナーゼ、エクソグルカナーゼ又はセロビオハイドロラーゼ、及びβ−グルコシダーゼなどと称される酵素の総称である。当該セルラーゼの例としては、市販のセルラーゼ製剤や、動物、植物、微生物由来のセルラーゼが挙げられ得る。これらのセルラーゼは、単独で使用されても２種以上の組合せで使用されてもよい。糖化効率の向上の観点から、セルラーゼは、セロビオハイドロラーゼ及びエンドグルカナーゼからなる群より選ばれる１種以上を含むことが好ましい。
【００４２】
本発明のバイオマス糖化剤において、本発明のアラビノフラノシダーゼと併用され得るセルラーゼの具体例としては、これらに限定されるものではないが、トリコデルマ・リーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）由来のセルラーゼ；トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）由来のセルラーゼ；バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｎ１４５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７２７）、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｎ２５２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７４７４）、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｎ１１５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７２６）、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｎ４４０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７２８）、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｎ６５９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７３０）などの各種バチルス株由来のセルラーゼ；パイロコッカス・ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）由来の耐熱性セルラーゼ；フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）由来のセルラーゼ、などが挙げられる。これらの中で、糖化効率の向上の観点から、トリコデルマ・リーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、又はフミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）由来のセルラーゼが好ましい。また、上記の微生物に対して外来性に導入したセルラーゼ遺伝子を発現させて得られた組換えセルラーゼを用いてもよい。具体例としては、トリコデルマ・リーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）に対してアスペルギルス・アクリータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子を導入して得られたＸ３ＡＢ１株（Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１２）１７４１−９）が生産するセルラーゼＪＮ１１が挙げられる。上記セルラーゼを含むセルラーゼ製剤の具体例としては、セルクラスト（登録商標）１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）、ＴＰ−６０（明治製菓株式会社製）、Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２（ノボザイムズ社製）、ＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅＴＭＤＵＥＴ（ジェネンコア社製）、及びウルトラフロ（登録商標）Ｌ（ノボザイムズ社製）が挙げられ、これらのセルラーゼ製剤を本発明のアラビノフラノシダーゼと併用してもよい。
【００４３】
また、セルラーゼの１種であるβ−グルコシダーゼの具体例としては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のβ−グルコシダーゼ（例えば、ノボザイムズ社製ノボザイム１８８及びメガザイム社製β−グルコシダーゼ）、ならびにトリコデルマ・リーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）又はペニシリウム・エメルソニイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）由来のβ−グルコシダーゼなどが挙げられる。このうち、糖化効率向上の観点から、ノボザイム１８８、トリコデルマ・リーゼ由来のβ−グルコシダーゼが好ましく、トリコデルマ・リーゼ由来のβ−グルコシダーゼがより好ましい。
【００４４】
また、セルラーゼの１種であるエンドグルカナーゼの具体例としては、トリコデルマ・リーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｒｉｔｉｃｕｓ）、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、サーモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）由来の酵素などが挙げられる。このうち、糖化効率向上の観点から、トリコデルマ・リーゼ、フミコーラ・インソレンス、バチルス、セルロモナス由来のエンドグルカナーゼが好ましく、トリコデルマ・リーゼ由来のエンドグルカナーゼがより好ましい。
【００４５】
本発明のバイオマス糖化剤は、上記本発明のアラビノフラノシダーゼ以外のヘミセルラーゼを含有していてもよい。ここで、ヘミセルラーゼとは、へミセルロースを加水分解する酵素を指し、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、ガラクタナーゼなどと称される酵素の総称である。本発明のアラビノフラノシダーゼ以外のヘミセルラーゼの具体例としては、トリコデルマ・リーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）由来のヘミセルラーゼ；バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｎ５４６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７２９）由来のキシナラーゼ；アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、又はバチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）由来のキシラナーゼ；サーモマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）、オウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、サーモアスクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、カルドセラム（Ｃａｌｄｏｃｅｌｌｕｍ）、又はサーモモノスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属由来のキシラナーゼ；バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）由来のβ−キシロシダーゼ；セレノモナス・ルミナンティウム（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）由来β―キシロシダーゼ、などが挙げられる。このうち、糖化効率向上の観点から、本発明の酵素組成物は、バチルス・エスピー、アスペルギルス・ニガー、トリコデルマ・ビリデ若しくはストレプトマイセス由来のキシラナーゼ、又はセレノモナス・ルミナンティウム由来のβ−キシロシダーゼを含有することが好ましく、バチルス・エスピー若しくはトリコデルマ・ビリデ由来のキシナラーゼ、又はセレノモナス・ルミナンティウム由来のβ−キシロシダーゼを含有することがより好ましい。
【００４６】
本発明のバイオマス糖化剤の総タンパク質量中における、本発明のアラビノフラノシダーゼの含有量は、０．１質量％以上７０質量％以下の範囲であればよい。本発明の酵素組成物の総タンパク質量中における、上記セルラーゼの含有量は、１０質量％以上９９質量％以下の範囲であればよい。また、本発明のバイオマス糖化剤の総タンパク質量中における、本発明のアラビノフラノシダーゼ以外のヘミセルラーゼの含有量は、０．０１質量％以上３０質量％以下の範囲であればよい。本発明のバイオマス糖化剤における、本発明のアラビノフラノシダーゼと上記セルラーゼとのタンパク質量比（本発明のアラビノフラノシダーゼ／セルラーゼ）は、０．００１以上１００以下の範囲であればよい。
【００４７】
（４．糖の製造方法）
本発明のアラビノフラノシダーゼ又はこれを含有するバイオマス糖化剤は、バイオマスから糖を製造するために用いられる。すなわち、本発明の糖の製造方法は、バイオマスを、上記本発明のアラビノフラノシダーゼ又はこれを含有するバイオマス糖化剤で糖化処理する工程が含まれる。
バイオマスは、前述したとおりであるが、入手容易性、原料コスト、及び糖化効率向上の観点からは、該バイオマスとしては、木材、木材の加工物又は粉砕物、植物の茎、葉又は果房などが好ましく、バガス、ＥＦＢ、アブラヤシ（幹部）、エリアンサスがより好ましく、バガスがさらに好ましい。該バイオマスは、単独で又は２種以上を混合して使用してもよい。また該バイオマスは乾燥されていてもよい。
【００４８】
バイオマスを糖化処理する際には、粉砕効率向上、糖化効率向上、及び生産効率向上（すなわち糖生産時間の短縮）の観点から、糖化処理する工程の前に、当該バイオマスを前処理する工程をさらに含むことが好ましい。
【００４９】
上記前処理としては、例えば、アルカリ処理、粉砕処理及び水熱処理からなる群より選ばれる１種以上が挙げられる。糖化効率向上の観点からは、該前処理としてはアルカリ処理が好ましい。
【００５０】
上記アルカリ処理とは、バイオマスを、後述する塩基性化合物と反応させることをいう。該アルカリ処理の方法としては、バイオマスを、後述する塩基性化合物を含むアルカリ溶液に浸漬する方法（以下、「浸漬処理」ということがある）や、バイオマスと塩基性化合物とを混合して、後述する粉砕処理にかける方法（以下、「アルカリ混合粉砕処理」ということがある）などが挙げられる。
【００５１】
上記粉砕処理とは、バイオマスを機械的に粉砕して小粒子化することをいう。バイオマスを小粒子化することにより、糖化効率がより向上する。また、該粉砕処理により、バイオマスに含まれるセルロースの結晶構造が破壊されると、糖化効率がなお向上する。該粉砕処理は公知の粉砕機を用いて行うことができる。用いられる粉砕機に特に制限はなく、バイオマスを小粒子化することができる装置であればよい。該粉砕処理は、上述した塩基性化合物によるアルカリ処理と組み合わせてもよい。該粉砕処理は、アルカリ処理の前又は後に行ってもよく、あるいは、粉砕処理と並行してアルカリ処理、例えば上述したアルカリ混合粉砕処理を行ってもよい。アルカリ混合粉砕処理では、例えば、アルカリ溶液に浸漬したバイオマスを粉砕処理にかけてもよく（湿式粉砕）、又は固体のアルカリとバイオマスとを一緒に粉砕処理にかけてもよいが（乾式粉砕）、このうち、乾式粉砕が好ましい。
【００５２】
上記水熱処理とは、バイオマスを、水分の存在下で加熱処理することをいう。該水熱処理は、公知の反応装置を用いて行うことができ、用いられる反応装置に特に制限はない。
【００５３】
バイオマスの糖化処理の条件は、本発明のアラビノフラノシダーゼ又はこれを含有するバイオマス糖化剤及び併用するその他酵素が失活しない条件であれば特に限定されない。適切な条件は、バイオマスの種類や前処理工程の手順、使用する酵素の種類により当業者が適宜決定することができる。
【００５４】
上記糖化処理においては、バイオマスを含む懸濁液に、本発明のアラビノフラノシダーゼ又はこれを含有するバイオマス糖化剤を添加することが好ましい。懸濁液中のバイオマスの含有量は、糖化効率又は糖生産効率向上（すなわち糖生産時間の短縮）の観点から、好ましくは０．５質量％以上、より好ましくは３質量％以上、さらに好ましくは５質量％以上であり、そして好ましくは３０質量％以下、より好ましくは２５質量％以下、さらに好ましくは２０質量％以下である。
【００５５】
上記懸濁液に対する本発明のアラビノフラノシダーゼ又はこれを含有するバイオマス糖化剤の使用量は、上記前処理条件、ならびに併用する酵素の種類及び性質により適宜決定されるが、バイオマス質量に対して、本発明のアラビノフラノシダーゼの質量に換算して、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．００２質量％以上、さらに好ましく０．００５質量％以上であり、そして１００質量％以下、より好ましくは５０質量％以下、さらに好ましくは２０質量％以下である。
【００５６】
上記糖化処理の反応ｐＨとしては、糖化効率又は糖生産効率向上（すなわち糖生産時間の短縮）、及び生産コスト低減の観点から、好ましくはｐＨ３．５以上、さらに好ましくはｐＨ４．０以上であり、そして好ましくはｐＨ６．０以下、より好ましくはｐＨ５．５以下である。
【００５７】
上記糖化処理の反応温度は、糖化効率の向上、糖化効率又は糖生産効率向上（すなわち糖生産時間の短縮）、生産コスト低減、及び同時に使用するセルラーゼの至適温度の観点から、５０〜８０℃が好ましい。該糖化処理の反応時間は、バイオマスの種類若しくは量、酵素量などに合わせて適宜設定することができるが、糖化効率又は糖生産効率向上（すなわち糖生産時間の短縮）、及び生産コスト低減の観点から、好ましくは１〜５日間、より好ましくは１〜４日間、さらに好ましくは１〜３日間である。
【００５８】
上述した実施形態に関し、本発明においてはさらに以下の態様が開示される。
＜１＞下記（ａ）〜（ｄ）から選ばれるアミノ酸配列からなり、且つアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質：
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２の１番から３０１番で示されるアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｄ）（ａ）又は（ｂ）で示されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
＜２＞＜１＞のアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
＜３＞下記（ｅ）〜（ｈ）から選ばれるヌクレオチド配列からなる、＜２＞のポリヌクレオチド：
（ｅ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）配列番号１の７３番から９７５番で示されるヌクレオチド配列；
（ｇ）（ｅ）又は（ｆ）で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列；
（ｈ）（ｅ）又は（ｆ）で示されるヌクレオチド配列において、１又は複数個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列。
＜４＞＜２＞又は＜３＞のポリヌクレオチドを含むベクター。
＜５＞＜２＞又は＜３＞のポリヌクレオチド、又は＜４＞のベクターを宿主に導入することを含む、形質転換体の製造方法。
＜６＞＜２＞又は＜３＞のポリヌクレオチド、又は＜４＞のベクターが導入された形質転換体。
＜７＞＜１＞のアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質を含有する、バイオマス糖化剤。
＜８＞＜１＞のアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質、又は＜７＞のバイオマス糖化剤を用いる、バイオマスからの糖の製造方法。
＜９＞＜５＞における宿主がトリコデルマ属の糸状菌である、＜５＞の製造方法又は＜６＞の形質転換体。
＜１０＞バイオマス糖化剤の総タンパク質量中における、アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質の含有量が０．１質量％以上７０質量％以下である、＜７＞のバイオマス糖化剤。
【実施例】
【００５９】
＜実施例１＞アラビノフラノシダーゼの製造
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．由来アラビノフラノシダーゼＦ８１ＡＢＦを製造した。
【００６０】
（１）アラビノフラノシダーゼＲＮＡの単離及びｃＤＮＡの合成
土壌より単離された糸状菌Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．をキシランによる誘導条件下で培養した。培養４日後、Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ（メルクミリポア）を用いてろ過することにより菌糸及び培養上清を得た。得られた菌糸は、液体窒素中にて速やかに凍結後、マルチビーズショッカー（安井器械）を用いて破砕した。得られた破砕細胞から、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてＲＮＡ溶液を得た。ＲＮＡ溶液から、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  II  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ライフテクノロジーズ）を用いてｃＤＮＡを合成した。 
【００６１】
（２）Ｆ８１ＡＢＦ発現用ベクターの作製
特開２０１７−１２００６号公報にて構築されたｐＵＣ−ｃｂｈ１−ａｍｄＳを鋳型として、表１に示したフォワードプライマー１（配列番号６）とリバースプライマー１（配列番号７）を用いてＰＣＲすることで、ａｍｄＳ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｒａｎｓ由来アセトアミダーゼ）をほぼ除いた約７．２ｋｂｐ断片（Ａ）を増幅した。また、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ由来のｐｙｒ４（配列番号３）を鋳型として、表１に示したフォワードプライマー２（配列番号８）とリバースプライマー２（配列番号９）を用いてＰＣＲすることで、約２．７ｋｂｐ断片（Ｂ）を増幅した。得られたＤＮＡ断片（Ａ）及び（Ｂ）は、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）のプロトコルに従って処理し、コンピテントセルＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（タカラバイオ）へと形質転換した。アンピシリン耐性株として得られた形質転換体の中から、コロニーＰＣＲにより目的の遺伝子が挿入されたプラスミドを保持する菌株を選別した。選別した形質転換体をＬＢ寒天培地を用いて培養し（３７℃、１日間）、得られた細胞からＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてプラスミドを回収、精製した。得られたベクターを、ｐＵＣ−ｃｂｈ１−ｐｙｒ４と名付けた。
【００６２】
上記ｐＵＣ−ｃｂｈ１−ｐｙｒ４を鋳型とし、表１に示したフォワードプライマー３（配列番号１０）とリバースプライマー３（配列番号１１）を用いてＰＣＲすることで約１０ｋｂｐ断片（Ｃ）を増幅した。次いで上記（１）にて得られたｃＤＮＡを鋳型として、表１に示したフォワードプライマー４（配列番号１２）とリバースプライマー４（配列番号１３）を用いてＰＣＲすることで、推定シグナル配列を含むＦ８１ＡＢＦプレタンパク質（配列番号２）の遺伝子領域（配列番号１）約１．０ｋｂｐ断片（Ｄ）を増幅した。得られたＤＮＡ断片（Ｃ）及び（Ｄ）を上記と同様の手法でベクターに組み込み、Ｆ８１ＡＢＦ遺伝子を含む発現ベクターｐＵＣ−Ｐｃｂｈ１−Ｆ８１ＡＢＦ−ｐｙｒ４を作製した。
【００６３】
【表１】
2020065514.tif 000002
【００６４】
（３）形質転換体の作製
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉＪＮ１１株（Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１２）１７４１−９に示されるＸ３ＡＢ１株）に対して上記（２）で構築したベクターの形質転換を行った。導入はプロトプラストＰＥＧ法で行った。形質転換体は選択培地（２％ グルコース、１．１Ｍ ソルビトール、２％ アガー、０．２％ ＫＨ2ＰＯ４（ｐＨ５．５）、０．０６％ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０６％ ＣｓＣｌ2、０．０６％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ2Ｏ、０．０６％ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ１；％はいずれもｗ／ｖ％）にて選抜した。Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ１の組成は以下のとおりである：０．５ｇ ＦｅＳＯ４・７Ｈ2Ｏ、０．２ｇ ＣｏＣｌ2、０．１６ｇ ＭｎＳＯ４・Ｈ2Ｏ、０．１４ｇ ＺｎＳＯ４・７Ｈ2Ｏを蒸留水にて１００ｍＬにメスアップ。選抜した形質転換体を植え継ぎにより安定化した後、コロニーＰＣＲにより目的の遺伝子が安定に保持された菌株をさらに選別した。 
【００６５】
（４）形質転換体の培養
胞子を２×１０５個／ｍＬになるように５０ｍＬのシード培地（５００ｍＬ容三角フラスコ）に接種し、２８℃で往復振とう２２０ｒｐｍにて２日間振盪培養（ＰＲＥＣｉ：ＰＲＸＹｇ−９８−Ｒ型）を行った。本培養：２５０ｍｌジャーファーメンター（Ｂｉｏｔｔ製）にて行った。１００ｍＬの本培養液に対して１０ｍＬの前培養液を植菌し、２８℃、ｐＨ４．５、通気量０．５ｖｖｍ、ＤＯ３ｐｐｍ制御により約５日間培養した。なおｐＨ制御には５％アンモニア水を使用した。培養液は遠心分離によって沈殿画分と培養液上清に分離後、フィルターろ過した。使用した培地組成は下記のとおりである。
【００６６】
シード培地組成（三角フラスコ培養） 
（ＮＨ４）２ＳＯ４                                   ０．１４％
ＫＨ２ＰＯ４                                         ０．２％
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ                                 ０．０３％
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                                 ０．０３％
ハイポリペプトンＮ                                   ０．１％
Ｂａｃｔ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ                 ０．０５％
Ｔｗｅｅｎ  ８０                                     ０．１％
Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ＊                         ０．１％
Ｔａｒｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ４．０）＊＊   １０％
グルコース                                           １％
【００６７】
Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００ｍｌ）
・Ｈ３ＢＯ３                                 ６ｍｇ
・（ＮＨ４）  ６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ       ６ｍｇ
・ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ                   １００ｍｇ
・ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ                     ４０ｍｇ
・ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ                       ８ｍｇ
・ＺｎＣｌ２                             ２００ｍｇ
【００６８】
Ｔａｒｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ４．０）酒石酸緩衝液  １Ｌ
Ａ：０．５Ｍ    Ｃ４Ｈ４Ｎａ２Ｏ６・２Ｈ２Ｏ    ９２．０３２ｇ／８００ｍｌ
Ｂ：０．５Ｍ    Ｃ４Ｈ６Ｏ６                    １５．００９ｇ／２００ｍｌ
Ａ：Ｂ＝４：１でｐＨ４に調整
【００６９】
本培養培地 (1000 ml)
（ＮＨ４）２ＳＯ４                        ０．４２％
ＫＨ２ＰＯ４                              ０．２％
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ                      ０．０３％
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                      ０．０３％
ハイポリペプトンＮ                        ０．１％
Ｂａｃｔ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ      ０．０５％
Ｔｗｅｅｎ  ８０                          ０．１％
Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ＊              ０．１％
Ａｎｔｉｆｏａｍ  ＰＥ−Ｌ                ０．２％
Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ＊＊            ０．１％
ＦＤ−１０１                            １０％
【００７０】
（５）Ｆ８１ＡＢＦの精製
上記（４）で得た培養上清を用い、下記の条件にて精製を行った。
装置：ＨＰＬＣ分取システムＰＬＣ−５６１（ＧＬサイエンス）
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ２０００ＳＷ  ２１．５ｘ３００ｍｍ（東ソー）
溶離液：２０ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ５）、
流速：４ｍＬ／ｍｉｎ、
モニター波長：２８０ｎｍ
２８分前後に溶出するピークにＦ８１ＡＢＦが含まれることが確認されたことから、２７分〜２８分までのフラクションを分取した。さらに下記条件にてゲルろ過による精製を行った。
【００７１】
装置：ＨＰＬＣ分取システムＰＬＣ−５６１（ＧＬサイエンス）
カラム：ＰＯＲＯＳ  ＨＳ  ２０μｍカラム  ４．６×１００ｍｍ
（ライフテクノロジーズ）
溶離液Ａ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  バッファー（ｐＨ８）
溶離液Ｂ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  バッファー（ｐＨ８）１Ｍ  ＮａＣｌ
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
モニター波長：２８０ｎｍ
リニアグラジエント：５ｍｉｎ  Ａ：Ｂ＝１００：０、
１５ｍｉｎ  Ａ：Ｂ＝２０：８０
９分前後に溶出するピークに大部分の純粋なＦ８１ＡＢＦが含まれることが確認されたことから、７分〜１１分までのフラクションを分取し、濃縮・脱塩したサンプルをＦ８１ＡＢＦ粗酵素液とした。 
【００７２】
（６）タンパク質濃度測定
精製したＦ８１ＡＢＦは、アラビノフラノシダーゼプレタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）から推定シグナル配列（１−２４位）を除いた成熟アラビノフラノシダーゼ（配列番号２の２５−３２５位で示されるアミノ酸配列）である。なお、シグナル配列の予測にはｓｉｇｎａｌＰ（Ｂｅｎｄｔｓｅｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０：７８３−７９５，２００４）を用いた。タンパク質の濃度は、ｂｒａｄｆｏｒｄ法にて測定した。ｂｒａｄｆｏｒｄ法では、Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔプロテインアッセイ（ＢｉｏＲａｄ）を使用し、ウシγグロブリンを標準タンパク質とした検量線をもとにタンパク質量を計算した。
【００７３】
＜実施例２＞Ｆ８１ＡＢＦのα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性
Ｆ８１ＡＢＦと市販品α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性の比較を行った。カビ等の真核微生物由来のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼは，ＧＨ４３，５１，５４及び６２に分類されている。Ｆ８１ＡＢＦはＧＨ６２に属する。市販品は表２に示したＭｅｇａｚｙｍｅ社のＡＦＡＭ２（ＧＨ４３）、ＡＦＡＳＥ（ＧＨ５１）、ＡＢＦＡＮ（ＧＨ６２）、ＡＢＦＵＭ（ＧＨ６２）を用いた。基質はｐ−ニトロフェニル−α−Ｌアラビノフラノシド（図１Ａ）及び小麦アラビノキシランを用い（図１Ｂ）、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を測定した。
【００７４】
【表２】
2020065514.tif 000003
【００７５】
（１）ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌアラビノフラノシド分解活性
２０μＬの２．５ ｍＭ ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌアラビノフラノシド（pNP-Ara、Ｓｉｇｍａ）、２０μＬの２５０ ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ５）、４０μＬのイオン交換水を混合した８０μＬの基質溶液に対して、適宜希釈した酵素溶液を２０μＬずつ添加し、５０℃で１０分間反応した。１００μＬの０．４Ｍ 炭酸ナトリウム溶液を添加し、反応を停止させると同時に反応液をアルカリ性にすることで、酵素分解により遊離したｐ−ニトロフェニルを黄色に発色させた。反応溶液を吸光度４２０ｎｍにて測定した。１ｕｎｉｔ（Ｕ）は１分間に１μｍｏｌのp-ニトロフェノールを遊離する酵素量とした。
結果を表３に示す。Ｆ８１ＡＢＦのｐＮＰ−Ａｒａ分解活性（ｐＮＰＡ）は０．４６Ｕ／ｍｇと低いもののＡＢＦＡＮと同等の活性を示した。
【００７６】
【表３】
2020065514.tif 000004
【００７７】
（２）小麦アラビノキシラン分解活性
５０μＬの１．０％（ｗ/ｖ）小麦アラビノキシラン、低粘性（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）、２０μＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ５）、２０μＬのイオン交換水を混合した。９０μＬの基質溶液に対し、適宜希釈した酵素溶液を１０μＬ添加し、５０℃で１０分間反応した。１００μＬのＤＮＳ溶液（１．６％水酸化ナトリウム、０．５％３，５−ジニトロサリチル酸、３０％酒石酸ナトリウムカリウム）を添加し反応を停止させた後、９９．９℃にて１０分間加熱処理した。冷却後、反応溶液を吸光度５４０ｎｍにて測定した。対照は、９０μＬの基質溶液に１００μＬのＤＮＳ溶液を添加し、混和した後に１０μＬの酵素溶液を加えたものを使用した。１ｕｎｉｔ（Ｕ）は１分間に１μｍｏｌのＬ−アラビノース相当の還元糖を遊離する酵素量とした。結果を前記表３に併せて示す。Ｆ８１ＡＢＦの小麦アラビノキシラン分解活性（ＷＡＸ）は１２１．３Ｕ／ｍｇであり、市販酵素と比較して最も高い値を示した。
【００７８】
＜実施例３＞バイオマス糖化におけるＦ８１ＡＢＦの利用性
実施例２よりＦ８１ＡＢＦはアラビノキシラン分解活性が市販酵素と比較して高いことから、バイオマスの糖化性に効果を示すことが期待された。そこでバイオマスとしてアラビノキシランを多く含む小麦ふすまの糖化に対するＦ８１ＡＢＦの効果を調べた。
【００７９】
（１）セルラーゼの調製
セルラーゼとしてＪＮ１１を使用した。ＪＮ１１は、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１２）１７４１−９に示されるＸ３ＡＢ１株であり、実施例１（４）と同様の手順で培養することで調製した。
【００８０】
（２）糖化反応
蓋つきスクリュー管（株式会社マルエム製、Ｎｏ．３、φ２１×４５ｍｍ）に、基質として小麦ふすまを乾燥原料換算で５０ｍｇと、０．１ｍＬの０．５Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５）を添加し、ここに上記（１）で調製したＪＮ１１（酵素タンパク量として６ｍｇ／ｇ−基質）、及び実施例１（５）で調製したＦ８１ＡＢＦ酵素液（酵素タンパク量として０．１ｍｇ／ｇ−基質）を添加後、基質濃度が５ｗｔ％になるように水を添加して反応液を調製した。比較のため、Ｍｅｇａｚｙｍｅ社のＡＦＡＭ２（ＧＨ４３）、ＡＦＡＳＥ（ＧＨ５１）、ＡＢＦＡＮ（ＧＨ６２）及びＡＢＦＵＭ（ＧＨ６２）、（いずれも０．１ｍｇ／ｇ−基質）を添加した反応液を調製した。対照としては、酵素としてＪＮ１１のみを添加した反応液を調製した。各反応液は、５０℃、１５０ｒｐｍで往復振とうしながら２日間糖化反応させた。なお、各酵素の量はｂｒａｄｆｏｒｄ法にて測定したタンパク質量を基準にした。反応終了後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）にて上清を回収し、ＤＸ５００クロマトグラフィーシステム（日本ダイオネクス社製）にて上清中のグルコース、キシロース、アラビノースの濃度を測定した。ＪＮ１１を用いた際に得られるグルコース、キシロース、アラビノース糖量を１００％とし、各種α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼを添加することにより得られた糖量を相対値として算出した。
【００８１】
結果を図２に示す。Ｆ８１ＡＢＦを０．１ ｍｇ/ｇ添加することでアラビノース生成量は大幅に増加し、１２３％を示した。またグルコース及びキシロース生成量が１０６％及び１０５％増量した。グルコース、キシロース及びアラビノースの３種類の糖の生成量が向上したのはＦ８１ＡＢＦ添加時のみであり、各種市販酵素では見られなかった。この結果から、Ｆ８１ＡＢＦは小麦ふすまのヘミセルロースの分解を介してセルロースの分解を促進する、バイオマスの糖化に適した酵素であることが示された。
【００８２】
＜実施例４＞バイオマス糖化におけるＦ８１ＡＢＦ発現糖化酵素の利用
実施例３より小麦ふすまの糖化にＦ８１ＡＢＦが有効であることが示されたことから、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉにＦ８１ＡＢＦの遺伝子を導入し、Ｆ８１ＡＢＦを発現した糖化酵素を調製し、小麦ふすまの糖化性を調べた。
【００８３】
（１）発現用ベクターの作製
ｐＵＣ１１８を鋳型として、表１に示したフォワードプライマー５（配列番号１４）とリバースプライマー５（配列番号１５）を用いてＰＣＲすることで約３．２ｋｂｐ断片（Ａ）を増幅した。また、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ由来のｃｒｅ１の上流から下流領域（配列番号４）を鋳型として、表１に示したフォワードプライマー６（配列番号１６）とリバースプライマー６（配列番号１７）を用いてＰＣＲすることで、約２．９ｋｂｐ断片（Ｂ）を増幅した。得られたＤＮＡ断片（Ａ）及び（Ｂ）は、実施例１の（２）と同様の手法でベクターに組み込み、ｐＵＣ−ｃｒｅ１を作製した。
【００８４】
上記ｐＵＣ−ｃｒｅ１を鋳型とし、表１に示したフォワードプライマー７（配列番号１８）とリバースプライマー７（配列番号１９）を用いてＰＣＲすることでｃｒｅ１遺伝子領域を除いた約６．３ｋｂｐ断片（Ｃ）を増幅した。また配列番号４を鋳型として、表１に示したフォワードプライマー８（配列番号２０）とリバースプライマー８（配列番号２１）を用いてＰＣＲすることで、ｃｒｅ１遺伝子下流の約５００ｂｐ断片（Ｄ）を増幅した。さらにＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ由来のｐｙｒ４（配列番号３）を鋳型として、表１に示したフォワードプライマー９（配列番号２２）とリバースプライマー９（配列番号２３）を用いてＰＣＲすることで、約２．７ｋｂｐ断片（Ｅ）を増幅した。得られたＤＮＡ断片（Ｄ）及び（Ｅ）をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）のプロトコルに従って処理し、（Ｄ）−（Ｅ）の順に連結したＤＮＡ断片（Ｆ）を調製した。得られたＤＮＡ断片（Ｃ）及び（Ｆ）を実施例１の（２）と同様の手法でベクターに組み込み、ｐＵＣ−ｃｒｅ１−ｐｙｒ４を作製した。
【００８５】
上記ｐＵＣ−ｃｒｅ１１−ｐｙｒ４を鋳型とし、表１に示したフォワードプライマー１０（配列番号２４）とリバースプライマー１０（配列番号２５）を用いてＰＣＲすることで約９．５ｋｂｐ断片（Ｇ）を増幅した。またｅｇ１遺伝子のプロモーター領域（配列番号５）を鋳型として、表１に示したフォワードプライマー１１（配列番号２６）とリバースプライマー１１（配列番号２７）を用いてＰＣＲすることで、約１．５ｋｂｐ断片（Ｈ）を増幅した。実施例１（１）にて得られたｃＤＮＡを鋳型として、表１に示したフォワードプライマー１２（配列番号２８）とリバースプライマー１２（配列番号２９）を用いてＰＣＲすることで、推定シグナル配列を含むＦ８１ＡＢＦプレタンパク質（配列番号２）の遺伝子領域（配列番号１）約１．０ｋｂｐ断片（Ｉ）を増幅した。さらに特開２０１７−１２００６号公報にて構築されたｐＵＣ−ｃｂｈ１−ａｍｄＳを鋳型として、表１に示したフォワードプライマー１３（配列番号３０）とリバースプライマー１３（配列番号３１）を用いてＰＣＲすることで、ｃｂｈ１のターミネーター領域として約０．６ｋｂｐ断片（Ｊ）を増幅した。得られたＤＮＡ断片（Ｈ）、（Ｉ）及び（Ｊ）をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）のプロトコルに従って処理し、（Ｈ）−（Ｉ）−（Ｊ）の順に連結したＤＮＡ断片（Ｋ）を調製した。得られたＤＮＡ断片（Ｇ）及び（Ｋ）を実施例１の（２）と同様の手法でベクターに組み込み、ｐＵＣ−Ｐｅｇ１−Ｆ８１ＡＢＦ−Δｃｒｅ１−ｐｙｒ４を作製した。
【００８６】
（２）形質転換体の作製
トリコデルマ・リーゼ  ＪＮ１１株（Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１２）１７４１−９に示されるＸ３ＡＢ１株）に対して上記（１）で構築したベクターの形質転換を行った。導入は実施例１の（３）に記載の通り行い、得られた形質転換体をＴＫ１６とした。
【００８７】
（３）糖化酵素ＴＫ１６の調製
（２）にて得られた菌株を用い、実施例１（４）と同様の手順で培養することで調製した。
【００８８】
（４）糖化反応
（３）にて得られたＴＫ１６糖化酵素を用い、実施例３（２）と同様の手順で小麦ふすまの糖化を行った。結果を図３に示す。小麦ふすまをＴＫ１６で糖化することで、グルコース、キシロース及びアラビノースの生成糖量はそれぞれ１０３％、１０６％及び１２７％向上した。この結果から、Ｆ８１ＡＢＦを導入したＴＫ１６はバイオマス糖化酵素として有用であることが示された。
【００８９】
＜実施例５＞ＧＨ６２のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ相同性比較
（１）アライメント解析
Ｆ８１ＡＢＦと市販酵素ＡＢＦＵＭ及びＡＢＦＡＮに相当するＥＡＫ８５７７１．１及びＥＡＡ５９５６２．１、前記特許文献３のＣＡＭ０７２４５．１の成熟ペプチドについてそれぞれアミノ酸配列の相同性解析を行った。解析は遺伝情報処理ソフトウェアであるGenetyx Ver.１２(株式会社ゼネティクス)のｆａｓｔｐプログラムを用いた。結果、ＥＡＫ８５７７１．１、ＥＡＡ５９５６２．１及びＣＡＭ０７２４５．１は、Ｆ８１ＡＦＢとそれぞれ６６、７２及び８２％同一性を示した。これら４種類のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼのマルチプルアライメントを図４に示す。
【００９０】
（２）分子系統樹解析
ＣＡＺＹ  （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／）に登録されている真核生物由来のＧＨ６２のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ６７タンパク質のアミノ酸配列についてｃｌｕｓｔａｌＸにてマルチプルアライメントを行い、近隣結合法（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ−Ｊｏｉｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ：ＮＪ法）により分子系統樹を作成した。Ｇｅｎｅｔｙｘ Ｖｅｒ．１２にて６７タンパク質の中に市販酵素ＡＢＦＵＭ及びＡＢＦＡＮに相当するＥＡＫ８５７７１．１及びＥＡＡ５９５６２．１、ＷＯ２００６１２５４３８号のＣＡＭ０７２４５．１が含まれている。結果を図５に示す。ＧＨ６２のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼは大きく２つのグループに分類され、Ｆ８１ＡＢＦはグループ１に属した。実施例５（１）において最も高い相同性を示したＣＡＭ０７２４５．１が同じグループ１であることが示された。一方で、またＥＡＫ８５７７１．１が最も相同性が低かったが、分子系統樹解析から同じグループ１であることが示された。一方で、ＥＡＡ５９５６２．１はＥＡＫ８５７７１．１より相同性が高いものの、グループ２に属した。
【図１】
2020065514.tif 000005
【図２】
2020065514.tif 000006
【図３】
2020065514.tif 000007
【図４】
2020065514.tif 000008
【図５】
2020065514.tif 000009
【配列表】
2020065514000001.app