(57)【要約】【課題】食習慣のある清酒製造工程での生産を模した、安全なα−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドの製造方法及び精製方法を提供することを目的とする。【解決手段】エタノールと、マルトースとを含む溶液に、α−グルコシダーゼを添加することにより合成液を調製する工程と、前記合成液を酵素反応させることによりα−エチルイソマルトシド及びα−エチルマルトシドを酵素的に生成する酵素反応工程と、を有する、α−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドの製造方法により解決する。【選択図】図５
2020141608.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エタノールと、マルトースとを含む溶液に、α−グルコシダーゼを添加することにより合成液を調製する工程と、
前記合成液を酵素反応させることによりα−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドを酵素的に生成する酵素反応工程と、
を有する、α−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドの製造方法。
【請求項２】
前記α−グルコシダーゼが、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属糸状菌由来の酵素である、請求項１に記載のα−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドの製造方法。
【請求項３】
前記α−グルコシダーゼが、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来の酵素である、請求項１又は２に記載のα−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドの製造方法。
【請求項４】
前記アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属糸状菌が、α−グルコシダーゼ遺伝子（ａｇｄＡ）を組み込み作製したＡｇｄＡ高発現株である、請求項２又は３に記載のα−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドの製造方法。
【請求項５】
前記アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）属糸状菌が、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２９１２として寄託されたＮＴＡＡ１株である、請求項２〜４のいずれか１項に記載のα−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドの製造方法。
【請求項６】
前記エタノール濃度が、２０〜６０重量％である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のα−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドの製造方法。
【請求項７】
前記マルトース濃度が、１〜１０重量％である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のα−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドの製造方法。
【請求項８】
前記α−グルコシダーゼ濃度が、０．５〜７０Ｕｎｉｔ／１００ｍｌである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のα−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドの製造方法。
【請求項９】
前記酵素反応工程が、１０〜６０℃、１〜４８時間反応させる工程である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のα−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドの製造方法。
【請求項１０】
さらに、前記酵素反応工程の後、８０℃以上で１０分以上加熱することにより、酵素反応を停止する加熱処理工程を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載のα−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドの製造方法。
【請求項１１】
さらに、前記加熱処理工程の後、酵母を添加することにより、酵素反応液中に存在するグルコースを酵母により消費させるインタクトセル処理工程を有する、請求項１０に記載のα−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドの製造方法。
【請求項１２】
さらに、前記インタクトセル処理工程の後、α−エチルマルトシドと、α−エチルイソマルトシドとを分離精製する分離精製工程を有する、請求項１１に記載のα−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドの製造方法。
【請求項１３】
前記分離精製工程が、前記インタクトセル処理した溶液を全糖４０％に調整する工程と、
液体クロマトグラフィーによりα−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドを含むフラクションを回収する工程と、
前記α−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドを含むフラクションを濃縮し、再度液体クロマトグラフィーによりα−エチルマルトシドを含むフラクションと、α−エチルイソマルトシドを含むフラクションをそれぞれ回収する工程と、
回収液を凍結乾燥する工程と、
を有する、請求項１２に記載のα−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−エチル化された糖類を酵素的に製造する方法、具体的には、麹菌由来のα−グルコシダーゼを利用してα−エチルイソマルトシド及びα−エチルマルトシドを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
清酒中に多く含まれる配糖体としてα−エチルグルコシド（α−ＥＧ）が知られている。α−ＥＧは清酒中に０．２４〜０．７１％含まれ、即効性の甘味、遅効性の温和な苦味を呈する呈味物質で、非う蝕性、体重増加抑制効果、肝保護作用、更に保湿効果、あれ肌の予防及び改善作用を持つため化粧品に用いられている。また、α−ＥＧはα−グルコシダーゼの糖転移作用によって生成される配糖体であることが知られている。
【０００３】
α−エチルグルコシド（α−ＥＧ）の製造方法としては、例えば、特開２０１９−２４３６０号公報に、清酒粕を含む醪を蒸留し焼酎を製造する工程において、前記醪にデンプン原料及びα−グルコシターゼを添加して混合する工程と、前記混合する工程で得られた混合物を、１５℃以上２５℃以下の温度で発酵させる工程と、を含む、エチル−α−Ｄ−グルコシドの製造方法が記載されている（特許文献１）。
【０００４】
一方、α−エチルグルコシド（α−ＥＧ）にグルコース１分子が脱水縮合したα−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドが知られている。α−エチルマルトシド又はα−エチルイソマルトシドの合成方法としては、金属触媒を用いたα−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドの合成方法（非特許文献１）、放線菌由来のイソマルトデキストラナーゼを用いたα−エチルイソマルトシドの合成方法（非特許文献２）が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１９−２４３６０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Tomonari，T．，et al．：Chemistry Letters，44，846-848 (2015)
【非特許文献２】Yeon-Kye，K.，et al．: Bioscience，Biotechnology and Biochemistry，59，1367-1369 (1995)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述したように、従来のα−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドの合成方法は、金属触媒を用いた有機化学的な合成方法や、放線菌由来の酵素を用いた合成方法である。そのため、経口摂取を目的としたサプリメントの用途や、化粧水やクリームなどの化粧品の用途に利用される原料とされる場合、金属触媒や放線菌に対する不安から、自然素材や安全素材を志向する消費者が使用する際の心理的な安心感がないことが問題であった。
【０００８】
そこで、本発明は、食習慣のある清酒製造工程での生産を模した、安全なα−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドの製造方法及び精製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らはα−グルコシダーゼ遺伝子（ａｇｄＡ）破壊株を用いて作製した製成酒を分析したところ、偶然にも、α−エチルグルコシド（α−ＥＧ）にグルコース１分子が脱水縮合したα−エチルマルトシドと思われる化合物が減少することが示された。そこで、粗精製α−グルコシダーゼによってα−ＥＭを生産し、核磁気共鳴装置（ＮＭＲ）によって構造解析を行ったところ、α−ＥＭはα−エチルマルトシド（Ｅｔｈｙｌ  α−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ）及びα−エチルイソマルトシド（Ｅｔｈｙｌ  α−ｉｓｏｍａｌｔｏｓｉｄｅ）であることが判明した。
【００１０】
本発明はかかる知見に基づきなされたものであり、エタノールと、マルトースとを含む溶液に、α−グルコシダーゼを添加することにより合成液を調製する工程と、前記合成液を酵素反応させることによりα−エチルイソマルトシド及びα−エチルマルトシドを酵素的に生成する酵素反応工程と、を有する、α−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドの製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、一方で、本発明はアルペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）を用いており、本菌は本国において長い食経験があることから、製造されるα−エチルマルトシド（Ｅｔｈｙｌ  α−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ）及びα−エチルイソマルトシド（Ｅｔｈｙｌ  α−ｉｓｏｍａｌｔｏｓｉｄｅ）は安全性において優れている。更に、酵素精製方法が簡便であることも特長である。
【００１２】
α−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドは清酒中を含め、天然では存在が確認されていなかった新規な配糖体である。前駆物質のα−ＥＧは様々な生理活性を示すことから、α−ＥＭも同様に生理活性を示すことが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】限外濾過処理試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図２】α−ＥＭ、α−ＥＧ及びオリゴ糖生成量に対するα−グルコシダーゼ濃度の影響を検討した結果を示す図である。
【図３】インタクトセル処理前後のα−ＥＭ合成液のクロマトグラムである。
【図４】インタクトセル処理済α−ＥＭ合成液のクロマトグラムである。
【図５】α−ＥＭのクロマトグラムである。
【図６】α−エチルマルトシドのクロマトグラムである。
【図７】α−エチルイソマルトシドのクロマトグラムである。
【図８】α−エチルマルトシドの構造を確認した際の１Ｈ−ＮＭＲチャートである。
【図９】α−エチルイソマルトシドの構造を確認した際の１Ｈ−ＮＭＲチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明に係る実施形態について詳細に説明する。本実施形態に係るα−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドの製造方法は、エタノールと、マルトースとを含む溶液に、α−グルコシダーゼを添加することにより合成液を調製する工程と、前記合成液を酵素反応させることによりα−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドを酵素的に生成する酵素反応工程と、を有する、
【００１５】
本実施形態において生産されるα−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドの構造を下記に示す。
【００１６】
【化１】
2020141608.tif 000003
【００１７】
【化２】
2020141608.tif 000004
【００１８】
α−エチルマルトシド（α−ＥＭ）はα−エチルグルコシド（α−ＥＧ）にグルコース１分子が脱水縮合した構造であり、α−エチルイソマルトシド（α−ＥｉＭ）はα−エチルマルトシド（α−ＥＭ）の構造異性体である。本実施形態においては、α−エチルイソマルトシドとα−エチルマルトシドの混合物として生産される。
【００１９】
本実施形態において、α−グルコシダーゼは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属糸状菌由来の酵素であることが好ましい。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属糸状菌としては、例えば、アスペルギルス・オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ルーチュエンシス（Ａ．ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａ．ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・カワチ（Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ）等を挙げることができる。これらのアスペルギルス属糸状菌は清酒、味噌、醤油、焼酎又は泡盛製造における麹菌として長年利用されてきた実績があるため、食習慣のない他の微生物由来のα−グルコシダーゼと比較してその安全性は極めて高い。
【００２０】
前記アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属糸状菌は、α−グルコシダーゼ遺伝子（ａｇｄＡ）を組み込み作製したＡｇｄＡ高発現株であることが、酵素生産の観点から好ましい。具体的には、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２９１２として寄託されたＮＴＡＡ１株であることが好ましい。
【００２１】
本実施形態において、エタノール濃度は、２０〜６０重量％であることが好ましく、３０〜４０重量％であることがさらに好ましい。エタノール濃度を上記の範囲とすることで、マルトースの加水分解に対する糖転移の割合を高めることができる。
【００２２】
本実施形態において、マルトース濃度は、１〜１０重量％であることが好ましく、２．５〜７．５重量％であることがさらに好ましい。マルトース濃度を上記の範囲とすることで、残存するマルトースを減らし、α−ＥＭやα−ＥｉＭの割合を高めることができる。
【００２３】
本実施形態において、α−グルコシダーゼ濃度は、０．５ｕｎｉｔ／１００ｍｌ以上であることが好ましく、７０ｕｎｉｔ／１００ｍｌ以上であることがさらに好ましい。α−グルコシダーゼ濃度が低いとオリゴ糖濃度が高くなるため、最後にα−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドを分離精製する観点からは、α−グルコシダーゼ濃度を高くした方が精製効率がよくなる。
【００２４】
前記エタノール及び前記マルトースを溶解する溶液は、酵素反応が最適条件で行われる溶液であれば特に限定はないが、後述するように、α−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドを分離精製する観点からは、緩衝液を用いることが好ましく、好ましい緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、グッドバッファー緩衝液等を挙げることができる。また、溶液のｐＨは、α−グルコシダーゼの至適ｐＨを考慮して、４．０〜８．０とすることが好ましい。
【００２５】
本実施形態において、酵素反応工程は、３０〜４０℃、１５〜３０時間反応させることが好ましい。
【００２６】
本実施形態においては、さらに、前記酵素反応工程の後、８０℃以上で１０分以上加熱することにより、酵素反応を停止する加熱処理工程を有することが好ましい。加熱処理工程はα−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドの酵素的生産には影響はないが、残存しているマルトースやその他オリゴ糖を基質として、さまざまなオリゴ糖が生成する可能性があり、後述する分離精製が困難になる可能性があることから、加熱処理により、酵素反応を停止したほうが好ましい。
【００２７】
本実施形態においては、さらに、前記加熱処理工程の後、酵母を添加することにより、酵素反応液中に存在するグルコースを酵母により消費させるインタクトセル処理工程を有することが好ましい。
【００２８】
液体クロマトグラフィーでは、グルコースのフラクションとα−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドのフラクションが近い位置にあるため、グルコース濃度が高いほどα−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドを分離しにくくなる。インタクトセル処理により、酵素反応によって生成したグルコースを酵母が消費し、後述する分離精製工程において、より純度の高いα−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドとすることができる。
【００２９】
酵母の種類は、グルコースを資化できるものであれば特に限定はないが、安全性の面から、従来から清酒製造で利用されているサッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）属の酵母を利用することが好ましい。酵母の添加量は特に限定はないが、多ければそれだけグルコース消費も早くなるため、添加前に前培養した酵母を用いることが好ましい。なお、培地成分の混入を防ぐため、前培養した酵母は蒸留水等で洗浄しておくことが好ましい。
【００３０】
インタクトセル処理工程は、好気的条件下で実施することが、酵母の増殖を促しグルコース消費速度も上がるため好ましい。また、温度は２５〜３５℃、時間は１〜５時間ほどで、溶液中のグルコースをほぼ消費することができる。インタクトセル処理終了後は、遠心分離や濾過などにより、酵母を分離回収することが好ましい。なお、この工程によってグリセロールが生産されることがあるが、微量であるため、後述する分離精製工程には影響しない。
【００３１】
本実施形態においては、さらに、前記インタクトセル処理工程の後、α−エチルマルトシドと、α−エチルイソマルトシドとを分離精製する分離精製工程を有することが好ましい。
【００３２】
前記分離精製工程は、特に限定はないが、例えば、前記インタクトセル処理した溶液を全糖４０％に調整する工程と、液体クロマトグラフィーによりα−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドを含むフラクションを回収する工程と、前記α−エチルイソマルトシド及びα−エチルマルトシドを含むフラクションを濃縮し、再度液体クロマトグラフィーによりα−エチルイソマルトシドを含むフラクションと、α−エチルマルトシドを含むフラクションをそれぞれ回収する工程と、回収液を凍結乾燥する工程と、を有することが好ましい。
【実施例】
【００３３】
１．α−グルコシダーゼの精製
＜目的＞
麹菌が生産するプロテアーゼや、グルコアミラーゼを除去し、α−エチルマルトシド（α−ＥＭ）及びα−エチルイソマルトシド（α−ＥｉＭ）合成に用いるα−グルコシダーゼを精製することを目的とした。
【００３４】
＜方法＞
（１）供試菌株
アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＮＴＡＡ１株（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２９１２）を使用した。この菌株は、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ｎｉａＤ３００株にａｇｄＡを組み込み作製したＡｇｄＡ高発現株である。
【００３５】
（２）培養条件
ＹＰＭ（１：１：５）培地を３００ｍＬ△フラスコ５本に１００ ｍＬ分注し、それぞれＮＴＡＡ１株を１白金耳接種した。３０℃、１３０ｒｐｍで６日間振とう培養した後、Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって菌体を除去し、培養液を得た。
【００３６】
（３）限外濾過
培養液を１００ｋＤａカットの限外ろ過フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ｍＬ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓ Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１００Ｋ：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、４℃、５０００Ｇで遠心ろ過した。
【００３７】
（４）活性測定
α−グルコシダーゼ（以下「ＡＧＬ」という。）活性を糖化力分別定量キット（キッコーマンバイオケミファ株式会社）で測定した。
【００３８】
（５）総タンパク量
試料の総タンパク量をＵＶ法で測定した。ａ＝０．７ｂ（ａ：吸光度、ｂ：タンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）、波長：２８０ｎｍ）とした。
【００３９】
（６）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
試料５０μＬに、２×ＳＤＳ化サンプルバッファーを５０μＬ加えボルテックスで撹拌した後、１００℃で３分煮沸し、ＳＤＳ化した。泳動ゲルの分離ゲルはアクリルアミド濃度１０％のものを作製し、分子量マーカー（Ｂｌｕｅｓｔａｒ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｍａｋｅｒ  ＭＷＰ０３：ＮＩＰＰＯＮ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＥＵＲＯＰＥ  ＧｍｂＨ）を５μＬ、ＳＤＳ化した試料を１０μＬアプライし、２０ｍＡで８０分泳動し、ＣＢＢ染色した。
【００４０】
＜結果＞
（２）の培養によって、培養液が２６０ ｍＬ得られた。このうち、２１０ ｍＬを限外濾過したところ、濾過残液が２１ｍＬ得られた（表１）。限外濾過後ＡＧＬ活性は約６．４倍に濃縮されていた。収量は６４％で一部のＡｇｄＡが失われているが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってＡｇｄＡタンパク質のバンドは濃く検出され、精製度は６．２となった事から、ＡｇｄＡタンパク質以外のタンパク質が除去され、ＡｇｄＡタンパク質が濃縮されていることが示された（図１）。
【００４１】
【表１】
2020141608.tif 000005
【００４２】
２．α−ＥＭの合成
＜目的＞
粗精製ＡｇｄＡを用いてα−ＥＭ及びα−ＥｉＭ（これらをまとめて「α−ＥＭ等」ということがある）を合成することを目的とした。
【００４３】
＜方法＞
（１）合成条件
α−ＥＭ等合成液をエタノール４０％、マルトース５％、酢酸緩衝液１０ｍＭ（ｐＨ５．０）、粗精製α−グルコシダーゼ０．１８ｕｎｉｔ／ｍＬに調製し、３７℃で４８ｈ反応させることによりα−ＥＭ及びα−ＥｉＭを合成した。８０℃で１０ｍｉｎ加熱することで反応を停止させた。
【００４４】
（２）ＨＰＬＣ条件
液体クロマトグラフィーにはＳＩＬ−２０Ａ、ＳＣＬ−１０Ａｖｐ及びＬＣ−２０ＡＤ（株式会社島津製作所）を用い、カラムはＳｈｏｄｅｘ ＳＵＧＡＲ ＳＺ５５３２（６．０×１５０ｍｍ）を用いた。導入量は５μＬ、流速は０．９ｍＬ／ｍｉｎとし、２５％Ｍｉｌｌｉ−Ｑ Ｗａｔｅｒ／７５％アセトニトリルのアイソクラティック条件で行った。検出器はｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−５０１を用いた。
【００４５】
＜結果＞
３７℃で４８ｈ反応させたα−ＥＭ等合成液をＨＰＬＣによって分析したところ、全不揮発成分に対して２．７％のα−ＥＭ等が合成された。α−ＥＭ等のピークは溶出時間４．８ｍｉｎと５．５ｍｉｎに２つ確認され、溶出時間の早いものがα−エチルマルトシド（α−ＥＭ）、遅いものがα−エチルイソマルトシド（α−ＥｉＭ）であった。これらはおよそ１：１９の割合で生産された（図２においては単に「α−ＥＭ」と表記する）。
【００４６】
なお、本実施例では粗精製α−グルコシダーゼを０．１８ｕｎｉｔ／ｍＬに調製しているが、これよりα−グルコシダーゼ濃度を減らした場合にもα−ＥＭ等は生成される（図２）。しかし、オリゴ糖濃度が高くなるため、α−ＥＭ及びα−ＥｉＭの精製を考慮するとα−グルコシダーゼ濃度を高くした方が精製効率は良い。
【００４７】
３．インタクトセル処理によるグルコースの消費
＜目的＞
効率的な精製を行うには、α−ＥＭ及びα−ＥｉＭ以外の不揮発性成分含量が少ないことが合成液として望ましい。前記２で作成したα−ＥＭ等合成液中に多く含まれているグルコースを除去するため、酵母を用いたインタクトセル処理によって、グルコースを消費することを目的とした（表２）。
【００４８】
【表２】
2020141608.tif 000006
【００４９】
＜方法＞
（１）酵母前培養
供試菌株にはきょうかい酵母９０１号を用いた。ＧＹＰ（２：０．５：０．５）培地をα−ＥＭ等合成液の３倍容量調製し、酵母を１白金耳接種後、３０℃で２日間静置培養した。
【００５０】
（２）菌体洗浄
前記（１）で前培養した酵母を２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を捨て、蒸留水で菌体洗浄した後、再度遠心分離を行った。この洗浄工程を２回行い、培地成分を取り除いた。
【００５１】
（３）インタクトセル処理
α−ＥＭ等合成液を減圧蒸留しエタノールを除き、蒸留水で全糖５％に調製した。これに前記（２）で洗浄した酵母を添加し、３０℃で５時間インタクトセル処理を行った。インタクトセル処理後、遠心分離によって酵母を除去した。
【００５２】
（４）ＨＰＬＣ条件
前記（３）によって処理したα−ＥＭ等合成液をＨＰＬＣによって分析した。ＬＣにはＳＩＬ−２０Ａ、ＳＣＬ−１０Ａｖｐ及びＬＣ−２０ＡＤ（株式会社島津製作所）カラムはＳｈｏｄｅｘ  ＳＵＧＡＲ  ＳＺ５５３２（６．０×１５０ｍｍ）を用いた。導入量は５μＬ、流速は０．９ｍＬ／ｍｉｎとし、２５％Ｍｉｌｌｉ−Ｑ Ｗａｔｅｒ／７５％アセトニトリルのアイソクラティック条件で行った。検出器はｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−５０１を用いた。
【００５３】
＜結果＞
本方法によって処理したことで、α−ＥＭ等合成液中のグルコースはＨＰＬＣによって検出されなくなり、ほぼ完全に除去することが出来た（図３）。酵母によってグリセロールが生産されるが、微量であるため、後の精製において支障をきたすことはない。
【００５４】
４．α−ＥＭ及びα−ＥｉＭの精製
＜目的＞
本発明の合成方法により、α−エチルマルトシド（α−ＥＭ）及びα−エチルイソマルトシド（α−ＥｉＭ）の２つの構造異性体を持ったα−エチルマルトシドが合成される。本精製工程では、構造異性体を分離し、純度の高いα−エチルマルトシド（α−ＥＭ）及びα−エチルイソマルトシド（α−ＥｉＭ）を精製することを目的とした。
【００５５】
＜方法＞
（１）α−ＥＭの分取
ＬＣにはＳＩＬ−２０Ａ、ＳＣＬ−１０Ａｖｐ及びＬＣ−２０ＡＤ（株式会社島津製作所）カラムはＡｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−１３０Ｇ ７Ｂ（７．５×５０ｍｍ）（昭和電工株式会社）及びＡｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−９０ ２０Ｆ（２０×３００ｍｍ）（昭和電工株式会社）を用いた。導入量は１００μＬ、流速は５．０ｍＬ／ｍｉｎとし、３５％Ｍｉｌｌｉ−Ｑ Ｗａｔｅｒ／６５％アセトニトリルのアイソクラティック条件で行った。検出器はｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ−５０１を用いた。前記３においてグルコースを除去したα−ＥＭ等合成液を全糖４０％に調整し、試料とした。溶出時間１８．５〜２１．１ｍｉｎのフラクションを回収し、α−エチルマルトシド（α−ＥＭ）及びα−エチルイソマルトシド（α−ＥｉＭ）をまとめて分取した（図４）。
【００５６】
（２）α−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドの単離
前記（１）の移動相組成を２５％Ｍｉｌｌｉ−Ｑ Ｗａｔｅｒ／７５％アセトニトリルに変更し、再度ＨＰＬＣによって分取した。前記（１）で回収したフラクションを濃縮し、α−ＥＭを２０％に調整したものを試料とした。溶出時間３０．３〜３２．５ｍｉｎ、３３．７〜３６．２ｍｉｎのフラクションを回収し、凍結乾燥することでα−エチルマルトシド（Ｅｔｈｙｌ  α−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ）及びα−エチルイソマルトシド（Ｅｔｈｙｌ  α−ｉｓｏｍａｌｔｏｓｉｄｅ）を回収した（図５）。
【００５７】
（３）純度の測定
前記（２） によって精製したα−エチルマルトシド（Ｅｔｈｙｌ  α−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ）及びα−エチルイソマルトシド（Ｅｔｈｙｌ  α−ｉｓｏｍａｌｔｏｓｉｄｅ）をＨＰＬＣによって分析した。ＬＣにはＳＩＬ−２０Ａ、ＳＣＬ−１０Ａｖｐ及びＬＣ−２０ＡＤ（株式会社島津製作所）カラムはＳｈｏｄｅｘ  ＳＵＧＡＲ  ＳＺ５５３２（６．０×１５０ｍｍ）を用いた。導入量は５μＬ、流速は０．９ｍＬ／ｍｉｎとし、２５％Ｍｉｌｌｉ−Ｑ Ｗａｔｅｒ／７５％アセトニトリルのアイソクラティック条件で行った。検出器はｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−５０１を用いた。
【００５８】
＜結果＞
前記（１）において試料１２．５ ｍＬからフラクションを回収したところ、α−ＥＭの回収量は１５７ｍｇで回収率は７３．７％であった。続いて前記（２）により、α−エチルマルトシド（α−ＥＭ）及びα−エチルイソマルトシド（α−ＥｉＭ）を単離したところ、α−エチルマルトシド（α−ＥＭ）が１０．６ｍｇ、α−エチルイソマルトシド（α−ＥｉＭ）が１２８．１ｍｇ得られた。これらの純度を求めたところ、α−エチルマルトシド（α−ＥＭ）は僅かに不純物のピークが検出されたが、純度は９４．８％で、高い精度で精製されていた（図６）。一方で、α−エチルイソマルトシド（α−ＥｉＭ）は不純物が検出されず、極めて高い精度で精製されていた（図７）。
【００５９】
５．構造解析
次に、精製されたα−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドについて１Ｈ−ＮＭＲを用いて、構造を解析した。具体的には、日本電子製ＮＭＲ機器を用い、室温にて５００ＭＨｚ、ＳＣＡＮ回数１２８回程度の条件で行った。データ解析は、ＡＣＬＩＣＥ２ ｆｏｒ ｗｉｎｄｏｗｓ ｖｅｒ．４を用いて行った。
【００６０】
これらの結果を図８及び図９に示す。図８はα−エチルマルトシドの構造を確認した際の１Ｈ−ＮＭＲチャートであり、図９はα−エチルイソマルトシド構造を確認した際の１Ｈ−ＮＭＲチャートである。図８、図９に示すように、α−エチルマルトシド及びα−エチルイソマルトシドであることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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