(57)【要約】      （修正有）【課題】疫病菌の検出方法としてより迅速な方法である、ＬＡＭＰ法用プライマーセットの提供。【解決手段】ＬＡＭＰ法により、疫病菌由来の核酸を増幅するためのプライマーセットであって、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマーがそれぞれ特定の配列を有するポリヌクレオチド等であるプライマーセット、並びに、上記プライマーセットを用いて、検体から抽出された核酸を鋳型にＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行うこと、を含む疫病菌の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＡＭＰ法により、疫病菌由来の核酸を増幅するためのプライマーセットであって：
配列番号１の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号１の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて５’側から１番目のＣのＴへの置換、２２番目のＧのＣへの置換、および３０番目のＧのＡへの置換からなる群より選択される１〜３個の変異を含むポリヌクレオチドであって、Ｆ２領域（配列番号８）とＦ１ｃ領域（配列番号７）との間に１〜６ヌクレオチドの配列が挿入していてもよいポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて５’側から２番目のＴのＣへの置換、３番目のＣと４番目のＴとの間へのＣの挿入、５番目のＧのＣへの置換、２３番目のＴと２４番目のＡとの間へのＴＡの挿入、３０番目のＣのＡ／Ｔ／Ｇへの置換、３８番目のＡのＴ／Ｇ／Ｃへの置換、３９番目のＡと４０番目のＧとの間へのＧの挿入、および４０番目のＧのＡ／Ｔ／Ｃへの置換からなる群より選択される１〜８個の変異を含むポリヌクレオチドであって、Ｂ２領域（配列番号１０）とＢ１ｃ領域（配列番号９）との間に１〜６ヌクレオチドの配列が挿入していてもよいポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて５’側から３番目のＡのＧへの置換、８番目のＧのＡへの置換、１２番目のＧのＡへの置換、および１７番目のＣのＴへの置換からなる群より選択される１〜４個の変異を含むポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、ならびに
配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、５’側から６番目のＣのＡ／Ｔ／Ｇへの置換、６番目のＣと７番目のＧとの間へのＣの挿入、８番目のＡと９番目のＣとの間へのＣの挿入、１３番目のＣのＧへの置換、および１５番目のＡと１６番目のＣとの間へのＧの挿入からなる群より選択される１〜５個の変異を含むポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー
を含むプライマーセット。
【請求項２】
配列番号１の配列により示されるポリヌクレオチドであって、Ｆ２領域（配列番号８）とＦ１ｃ領域（配列番号７）との間に１〜６ヌクレオチドの配列が挿入していてもよいポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチドであって、Ｂ２領域（配列番号１０）とＢ１ｃ領域（配列番号９）との間に１〜６ヌクレオチドの配列が挿入していてもよいポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー
を含む請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
配列番号１の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー
を含む請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項４】
配列番号１１の配列により示されるポリヌクレオチドであって、Ｆ２領域（配列番号８）とＦ１ｃ領域（配列番号１６）との間に１〜６ヌクレオチドの配列が挿入していてもよいポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号１２の配列により示されるポリヌクレオチドであって、Ｂ２領域（配列番号１０）とＢ１ｃ領域（配列番号１７）との間に１〜６ヌクレオチドの配列が挿入していてもよいポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号１３の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー
を含む請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項５】
配列番号１１の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号１２の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号１３の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー
を含む請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項６】
さらに、
配列番号５の配列により示されるポリヌクレオチドまたは配列番号５の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて５’側から７番目のＧのＡへの置換、および１１番目のＡのＴ／Ｇ／Ｃへの置換からなる群より選択される１〜２個の変異を含むポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、ならびに
配列番号６の配列により示されるポリヌクレオチドまたは配列番号６の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて５’側から２番目のＧと３番目のＴとの間へのＣの挿入、１２番目のＧのＡ／Ｔ／Ｃへの置換、１６番目のＡのＧへの置換、および１９番目のＴのＧへの置換からなる群より選択される１〜４個の変異を含むポリヌクレオチドからなるＬＢプライマーから選択される１つ以上を含む請求項１〜５のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項７】
さらに、
配列番号５の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、
および
配列番号６の配列により示されるポリヌクレオチドポリヌクレオチドからなるＬＢプライマーから選択される１つ以上を含む請求項１〜５のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項８】
さらに、
配列番号１４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、
および
配列番号１５の配列により示されるポリヌクレオチドポリヌクレオチドからなるＬＢプライマーから選択される１つ以上を含む請求項１〜５のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項９】
前記ＬＦプライマーおよび前記ＬＢプライマーの双方を含む請求項６〜８のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項１０】
ＬＡＭＰ法により、疫病菌由来の核酸を増幅するためのプライマーセットであって：
配列番号１８の配列により示されるポリヌクレオチドであって、Ｆ２領域（配列番号２５）とＦ１ｃ領域（配列番号７）との間に１〜６ヌクレオチドの配列が挿入していてもよいポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号１９の配列により示されるポリヌクレオチドであって、Ｂ２領域（配列番号２７）とＢ１ｃ領域（配列番号２６）との間に１〜６ヌクレオチドの配列が挿入していてもよいポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号２０の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号２１の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー
を含むプライマーセット。
【請求項１１】
配列番号１８の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号１９の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号２０の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号２１の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー
を含む請求項１０に記載のプライマーセット。
【請求項１２】
さらに、
配列番号２２または２４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、
および
配列番号２３の配列により示されるポリヌクレオチドポリヌクレオチドからなるＬＢプライマーから選択される１つ以上を含む請求項１０または１１に記載のプライマーセット。
【請求項１３】
さらに、
配列番号２２の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、
および
配列番号２３の配列により示されるポリヌクレオチドポリヌクレオチドからなるＬＢプライマーから選択される１つ以上を含む請求項１０または１１に記載のプライマーセット。
【請求項１４】
前記ＬＦプライマーおよび前記ＬＢプライマーの双方を含む請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項１５】
疫病菌の検出方法であって、
検体から核酸を抽出すること、
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いて、前記核酸を鋳型にＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行うこと、
増幅産物があると判断された場合に検体に疫病菌が存在すると判断することを含む、検出方法。
【請求項１６】
疫病菌Phytophthora nicotianaeおよび疫病菌Phytophthora cactorumの検出方法であって、
検体から核酸を抽出すること、
請求項１〜９のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いて、前記核酸を鋳型にＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行うこと、
増幅産物があると判断された場合に検体に前記疫病菌のいずれか１つ以上が存在すると判断することを含む、検出方法。
【請求項１７】
検体がイチゴ苗栽培の土壌である請求項１５または１６に記載の検出方法。
【請求項１８】
疫病菌Phytophthora infestansの検出方法であって、
検体から核酸を抽出すること、
請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いて、前記核酸を鋳型にＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行うこと、
増幅産物があると判断された場合に検体に前記疫病菌が存在すると判断することを含む、検出方法。
【請求項１９】
検体がナス科の植物である請求項１８に記載の検出方法。
【請求項２０】
疫病菌Phytophthora nicotianae、疫病菌Phytophthora cactorum、および疫病菌Phytophthora infestansの検出方法であって、
検体から核酸を抽出すること、
請求項１３に記載のプライマーセットを用いて、前記核酸を鋳型にＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行うこと、
増幅産物があると判断された場合に検体に前記疫病菌のいずれか１つ以上が存在すると判断することを含む、検出方法。
【請求項２１】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のプライマーセット、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を含む、疫病菌の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疫病菌由来の核酸を増幅するためのプライマーセットおよび疫病菌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
疫病は疫病菌（Phytophthola属菌）が誘起する土壌病害である。主にイチゴなどの農産物の産地で発生して問題となるのはPhytophthora nicotianae、Phytophthora cactorumである。疫病菌は植物のクラウン（樹冠）と根の基部から感染し、クラウンの褐変と根の腐敗を引き起こして植物体を萎凋・枯死させる。疫病の病徴はイチゴの最重要病害の１つである炭疽病と似ているため、一見しただけでは疫病と炭疽病の区別は難しい。そのため産地ではしばしば疫病と炭疽病を混同して処理されている。
疫病は、発病圃場の罹病残渣や土壌が伝染原となる。これらの伝染源や、感染苗の持ち込みによる疫病の拡大を防止するために、疫病の検出方法が開発されてきた。
【０００３】
イチゴ疫病菌を検出する方法として、ＰＣＲ法を利用した方法が複数報告されている（例えば、非特許文献１）。また、非特許文献２、３においては、ＬＡＭＰ法を利用した方法が報告されている。非特許文献２、３で報告されているＬＡＭＰ法では、Phytophthora nicotianaeのＤＮＡ配列情報に基づき設計したプライマーが用いられている。これらの遺伝子診断方法を用いることによって、農産物栽培における疫病菌の早期検出が期待できる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Plant Disease  95: 1270-1278, 2011
【非特許文献２】Journal of Phytopathology,163(3), 185-193,2015
【非特許文献３】関西病虫研報（59）：9-14 (2017)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＰＣＲ法にはサーマルサイクラーや電気泳動装置が必須であるため、非特許文献１に記載の方法は研究施設内で行う方法となる。一方、ＬＡＭＰ法はＰＣＲ法よりも処理時間が短く、高額機器も不要で目視での検定も可能であり、実用のために好ましい技術である。しかしながら、非特許文献２、３に記載のＬＡＭＰ法を利用した方法では、Phytophthora cactorumを十分な感度で検出できることは確認されていない。
【０００６】
本発明は、ＬＡＭＰ法を用いた疫病菌の検出方法として、農産地で特に問題となる疫病菌を高感度で検出することができる方法の提供を課題とするものである。より具体的には、本発明は、上記の方法に利用できる疫病菌由来の核酸を増幅するためのプライマーセットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題の解決のために鋭意検討し、農産地で特に問題となる疫病菌の検出に適した新規プライマーセットを見出し、この知見を基に検討を重ねて本発明を完成させた。
【０００８】
即ち、本発明は以下＜１＞〜＜２１＞を提供するものである。
＜１＞ＬＡＭＰ法により、疫病菌由来の核酸を増幅するためのプライマーセットであって：
配列番号１の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号１の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて５’側から１番目のＣのＴへの置換、２２番目のＧのＣへの置換、および３０番目のＧのＡへの置換からなる群より選択される１〜３個の変異を含むポリヌクレオチドであって、Ｆ２領域（配列番号８）とＦ１ｃ領域（配列番号７）との間に１〜６ヌクレオチドの配列が挿入していてもよいポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて５’側から２番目のＴのＣへの置換、３番目のＣと４番目のＴとの間へのＣの挿入、５番目のＧのＣへの置換、２３番目のＴと２４番目のＡとの間へのＴＡの挿入、３０番目のＣのＡ／Ｔ／Ｇへの置換、３８番目のＡのＴ／Ｇ／Ｃへの置換、３９番目のＡと４０番目のＧとの間へのＧの挿入、および４０番目のＧのＡ／Ｔ／Ｃへの置換からなる群より選択される１〜８個の変異を含むポリヌクレオチドであって、Ｂ２領域（配列番号１０）とＢ１ｃ領域（配列番号９）との間に１〜６ヌクレオチドの配列が挿入していてもよいポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて５’側から３番目のＡのＧへの置換、８番目のＧのＡへの置換、１２番目のＧのＡへの置換、および１７番目のＣのＴへの置換からなる群より選択される１〜４個の変異を含むポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、ならびに
配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、５’側から６番目のＣのＡ／Ｔ／Ｇへの置換、６番目のＣと７番目のＧとの間へのＣの挿入、８番目のＡと９番目のＣとの間へのＣの挿入、１３番目のＣのＧへの置換、および１５番目のＡと１６番目のＣとの間へのＧの挿入からなる群より選択される１〜５個の変異を含むポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー
を含むプライマーセット。
【０００９】
＜２＞配列番号１の配列により示されるポリヌクレオチドであって、Ｆ２領域（配列番号８）とＦ１ｃ領域（配列番号７）との間に１〜６ヌクレオチドの配列が挿入していてもよいポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチドであって、Ｂ２領域（配列番号１０）とＢ１ｃ領域（配列番号９）との間に１〜６ヌクレオチドの配列が挿入していてもよいポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー
を含む＜１＞に記載のプライマーセット。
＜３＞配列番号１の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー
を含む＜１＞に記載のプライマーセット。
＜４＞配列番号１１の配列により示されるポリヌクレオチドであって、Ｆ２領域（配列番号８）とＦ１ｃ領域（配列番号１６）との間に１〜６ヌクレオチドの配列が挿入していてもよいポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号１２の配列により示されるポリヌクレオチドであって、Ｂ２領域（配列番号１０）とＢ１ｃ領域（配列番号１７）との間に１〜６ヌクレオチドの配列が挿入していてもよいポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号１３の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー
を含む＜１＞に記載のプライマーセット。
＜５＞配列番号１１の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号１２の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号１３の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー
を含む＜１＞に記載のプライマーセット。
【００１０】
＜６＞さらに、
配列番号５の配列により示されるポリヌクレオチドまたは配列番号５の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて５’側から７番目のＧのＡへの置換、および１１番目のＡのＴ／Ｇ／Ｃへの置換からなる群より選択される１〜２個の変異を含むポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、ならびに
配列番号６の配列により示されるポリヌクレオチドまたは配列番号６の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて５’側から２番目のＧと３番目のＴとの間へのＣの挿入、１２番目のＧのＡ／Ｔ／Ｃへの置換、１６番目のＡのＧへの置換、および１９番目のＴのＧへの置換からなる群より選択される１〜４個の変異を含むポリヌクレオチドからなるＬＢプライマーから選択される１つ以上を含む＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載のプライマーセット。
＜７＞さらに、
配列番号５の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、
および
配列番号６の配列により示されるポリヌクレオチドポリヌクレオチドからなるＬＢプライマーから選択される１つ以上を含む＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載のプライマーセット。
＜８＞さらに、
配列番号１４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、
および
配列番号１５の配列により示されるポリヌクレオチドポリヌクレオチドからなるＬＢプライマーから選択される１つ以上を含む＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載のプライマーセット。
＜９＞上記ＬＦプライマーおよび上記ＬＢプライマーの双方を含む＜６＞〜＜８＞のいずれかに記載のプライマーセット。
【００１１】
＜１０＞ＬＡＭＰ法により、疫病菌由来の核酸を増幅するためのプライマーセットであって：
配列番号１８の配列により示されるポリヌクレオチドであって、Ｆ２領域（配列番号２５）とＦ１ｃ領域（配列番号７）との間に１〜６ヌクレオチドの配列が挿入していてもよいポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号１９の配列により示されるポリヌクレオチドであって、Ｂ２領域（配列番号２７）とＢ１ｃ領域（配列番号２６）との間に１〜６ヌクレオチドの配列が挿入していてもよいポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号２０の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号２１の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー
を含むプライマーセット。
＜１１＞配列番号１８の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号１９の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号２０の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号２１の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー
を含む＜１０＞に記載のプライマーセット。
【００１２】
＜１２＞さらに、
配列番号２２または２４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、
および
配列番号２３の配列により示されるポリヌクレオチドポリヌクレオチドからなるＬＢプライマーから選択される１つ以上を含む＜１０＞または＜１１＞に記載のプライマーセット。
＜１３＞さらに、
配列番号２２の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、
および
配列番号２３の配列により示されるポリヌクレオチドポリヌクレオチドからなるＬＢプライマーから選択される１つ以上を含む＜１０＞または＜１１＞に記載のプライマーセット。
＜１４＞上記ＬＦプライマーおよび上記ＬＢプライマーの双方を含む＜１１＞〜＜１３＞のいずれかに記載のプライマーセット。
【００１３】
＜１５＞疫病菌の検出方法であって、
検体から核酸を抽出すること、
＜１＞〜＜１４＞のいずれかに記載のプライマーセットを用いて、上記核酸を鋳型にＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行うこと、
増幅産物があると判断された場合に検体に疫病菌が存在すると判断することを含む、検出方法。
＜１６＞疫病菌Phytophthora nicotianaeおよび疫病菌Phytophthora cactorumの検出方法であって、
検体から核酸を抽出すること、
＜１＞〜＜９＞のいずれかに記載のプライマーセットを用いて、上記核酸を鋳型にＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行うこと、
増幅産物があると判断された場合に検体に上記疫病菌のいずれか１つ以上が存在すると判断することを含む、検出方法。
＜１７＞検体がイチゴ苗栽培の土壌である＜１５＞または＜１６＞に記載の検出方法。
＜１８＞疫病菌Phytophthora infestansの検出方法であって、
検体から核酸を抽出すること、
＜１０＞〜＜１４＞のいずれかに記載のプライマーセットを用いて、上記核酸を鋳型にＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行うこと、
増幅産物があると判断された場合に検体に上記疫病菌が存在すると判断することを含む、検出方法。
＜１９＞検体がナス科の植物である＜１８＞に記載の検出方法。
＜２０＞疫病菌Phytophthora nicotianae、疫病菌Phytophthora cactorum、および疫病菌Phytophthora infestansの検出方法であって、
検体から核酸を抽出すること、
＜１３＞に記載のプライマーセットを用いて、上記核酸を鋳型にＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行うこと、
増幅産物があると判断された場合に検体に上記疫病菌のいずれか１つ以上が存在すると判断することを含む、検出方法。
＜２１＞＜１＞〜＜１４＞のいずれかに記載のプライマーセット、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を含む、疫病菌の検出用キット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、ＬＡＭＰ法によって疫病菌由来の核酸を増幅するための新規なプライマーセットが提供される。このプライマーセットを用いて、農産地で特に問題となる疫病菌である、Phytophthora nicotianaeおよびPhytophthora cactorumのいずれも高感度で検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーと標的二本鎖ＤＮＡとの位置関係を示す図である。
【図２】実施例において、プライマーセット１を用いたＬＡＭＰ法による増幅を行い、吸光度変化をリアルタイム測定した結果を示す図である。
【図３】実施例においてプライマーセット１を用いたＬＡＭＰ法による増幅を行った増幅産物の会合曲線を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態について更に詳しく述べる。
本明細書中において、核酸の塩基配列中のＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔは、それぞれ、デオキシリボヌクレオチド中のアデニン塩基、シトシン塩基、グアニン塩基、チミン塩基を示す。ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの混合塩基を示す。また、本明細書中で、「／」を用いて複数の塩基が記載されているときは、記載されているいずれの塩基でもよいことを示し、例えば「Ｃ／Ｔ」と記載されているときは、シトシン塩基であってもチミン塩基であってもよいことを示す。
【００１７】
ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ-Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ)法は、Ｎｏｔｏｍｉらによって開発され、日本特許第３３１３３５８号公報、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, ２８, ｅ６３, ２０００、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ, ２９０, １１９５-１１９８, ２００２、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ, ４７, Ｎｏ.９, １７４２-１７４３,２００１に報告されている核酸の増幅方法である。一般的に、ＬＡＭＰ法は、ＰＣＲを用いた方法に比べ増幅効率が優れていると共に、サンプル中の不純物の影響も受けにくい。そのため、簡便なサンプルの前処理で目的の核酸の増幅を行うことが可能である。
【００１８】
＜ＬＡＭＰ法に用いるプライマー＞
ＬＡＭＰ法におけるプライマーおよびプライマー設計について、以下説明する。
ＬＡＭＰ法に用いられるプライマーセットは、少なくとも、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーを含む。図１は、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーと標的二本鎖ＤＮＡとの位置関係を示した図である。
ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーは、各々二つの領域を含む。即ち、ＦＩＰはＦ１ｃとＦ２を含み、ＢＩＰはＢ２とＢ１ｃを含む。Ｆ３プライマーはＦ３領域を含んでいる。Ｂ３プライマーはＢ３領域を含む。各プライマーはそれぞれ以下のように設計する。
【００１９】
（１）ＦＩＰプライマー：標的核酸のＦ２領域を３´端に持ち、５´末端側に標的核酸のＦ１ｃと同じ配列を持つように設計する。
（２）Ｆ３プライマー：標的核酸のＦ３領域を持つように設計する。
（３）ＢＩＰプライマー：標的核酸のＢ２領域を３´端に持ち、５´末端側に標的核酸のＢ１ｃと同じ配列を持つように設計する。
（４）Ｂ３プライマー：標的核酸のＢ３領域を持つように設計する。
【００２０】
ここで、Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃ領域は、二本鎖を構成する一方の鎖のＤＮＡの５'末端側から３'末端側方向にかけてこの順で設定された領域である。またＢ３、Ｂ２、Ｂ１、Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ３ｃ領域は、その相補鎖のＤＮＡの５'末端側から３'末端側方向にかけてこの順で設定された領域である。このときＢ３とＢ３ｃ、Ｂ２とＢ２ｃ、Ｂ１とＢ１ｃ、Ｆ１ｃとＦ１、Ｆ２ｃとＦ２、Ｆ３ｃとＦ３は相補鎖である。
【００２１】
このようなＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマーおよびＢ３プライマーを用いてＬＡＭＰ増幅を行なうと、図１の二本鎖ＤＮＡの夫々の鎖から、ダンベル型のステム・アンド・ループ構造の増幅産物が得られる。その増幅機構については、例えば、Ｗｅｂサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｉｋｅｎ．ｃｏ．ｊｐ／、または特開２００２−１８６７８１号公報を参照することが可能である。
【００２２】
ＦＩＰプライマーは、Ｆ２領域とＦ１ｃ領域とが直接結合したポリヌクレオチドであっても、Ｆ２領域とＦ１ｃ領域との間に、１〜６ヌクレオチドの配列をスペーサーとして含むポリヌクレオチドであってもよい。また、ＢＩＰプライマーは、Ｂ２領域とＢ１ｃ領域とが直接結合したポリヌクレオチドであっても、Ｂ２領域とＢ１ｃ領域に対応する配列との間に、１〜６ヌクレオチドの配列をスペーサーとして含むポリヌクレオチドであってもよい。
【００２３】
このようなスペーサーとして使用される配列の例としては、Ａ、Ｔ、ＴＴ、ＴＴＴ、ＴＴＴＴ、ＴＴＴＴＡ、ＴＴＴＴＴ、ＴＴＴＴＴＴもしくは制限酵素認識配列（ＧＡＡＴＴＣ；制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位、ＧＧＡＴＴＣ；制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位、ＣＴＧＣＡＣ；制限酵素ＰｓｔＩ認識部位、ＧＡＴＡＴＣ；制限酵素ＥｃｏＲＶ認識部位）このようなスペーサーの挿入によってプライマーセットをＬＡＭＰ法に用いる場合の特異性が大きく変化しないか、またはむしろ向上することが知られている（Journal of Virological Methods 193(2013)232-237）。ただし、ＦＩＰプライマーにおいて、Ｆ２領域とＦ１ｃ領域は直接結合していることが好ましい。また、ＢＩＰプライマーにおいて、Ｂ２領域とＢ１ｃ領域は直接結合していることが好ましい。
【００２４】
プライマーセットは、上記４種のプライマーのほかにループプライマーを含むことが好ましい。ループプライマーとしては、ＬＦプライマー、ＬＢプライマー、またはＬＦプライマーおよびＬＢプライマーを用いることが好ましい。ＬＦプライマーおよびＬＢプライマーは、増幅反応の起点となるダンベル構造の５'末端側のループの１本鎖部分に相補的な配列を持つループプライマーである。ＬＦプライマーは、図１中のＦ１領域とＦ２領域の間の配列に相補的な配列を持つようにすれば設計でき、ＬＢプライマーは、図１中のＢ１領域とＢ２領域の間の配列に相補的な配列を持つように設計できる。ＬＦプライマー及びＬＢプライマーを用いることにより、ＤＮＡ合成の起点を増やすことが可能となり、増幅効率が上がり、増幅に要する時間を１／３〜１／２に短縮することが可能となる。
【００２５】
＜プライマーセット＞
本発明のプライマーセットはＬＡＭＰ法により疫病菌由来の核酸を増幅するためのプライマーセットである。本発明のプライマーセットは、疫病菌株のリボゾームＤＮＡ配列情報に基づき設計されている。
【００２６】
本発明のプライマーセットは、リボゾームＤＮＡ配列情報に基づいて設計されたプライマーセットであるため、ゲノムＤＮＡ配列情報に基づき設計されたプライマーセットを用いた場合より、迅速に高感度な疫病菌の検出が可能であると考えられる。リボゾームは、細胞における存在量が核と比較して多いためである。
【００２７】
実施例では、複数の疫病菌株のリボゾームＤＮＡ配列のアライメントを行い、保存性の高い領域において、Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１ｃ、Ｂ１ｃ、Ｂ２、Ｂ３領域、さらにＬＦプライマー及びＬＢプライマーの領域が選択されている。
【００２８】
実施例に示すプライマーセット１は、既知の複数の疫病菌（Phytophthora cactorum）株のリボゾームＤＮＡ配列情報のアライメントを表１に示すように行い、そのうちのAY670706の配列を基に設計したものである。後述するように、プライマーセット１を用いたＬＡＭＰ法によっては、Phytophthora cactorum のみでなく、Phytophthora nicotianaeの検出が可能であった。
【００２９】
表１に示すアライメントで菌株の間でみられる、変異部位における所定の塩基の置換や塩基の挿入について、それらの変異を任意に選択した変異を、プライマーセット１において含むプライマーセットはプライマーセット１と同様に使用可能である。このようなプライマーセットの一例として、実施例ではプライマーセット２が示されている。
【００３０】
また、実施例に示すプライマーセット３は、既知の複数の疫病菌（Phytophthora infestans）株のリボゾームＤＮＡ配列情報のアライメントを表１２に示すように行い、そのうちのGU258150株の配列を基に設計したものである。後述するように、プライマーセット３を用いたＬＡＭＰ法によっては、hytophthora infestansのみでなく、Phytophthora cactorum 、Phytophthora nicotianaeの検出が可能であった。
【００３１】
プライマーセットにおける各プライマーは、上記の範囲で変異や上述のスペーサーの挿入のあるポリヌクレオチドが混合プライマーとして調製されたものであってもよい。
【００３２】
プライマーセットにおける各プライマーは、それぞれの塩基配列情報をもとに、一般的なＤＮＡ合成機で合成することができる。
【００３３】
また、プライマーセットにおけるプライマー量比は特に限定されず、ＬＡＭＰ法において一般的である量比で用いればよい。例えば、ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーを同モル量、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーを同モル量とし、ＦＩＰプライマーの５０％〜１０％のモル量でＦ３プライマーを用いることができる。例えば、反応液１２．５マイクロリットルで目視判定する場合、１サンプル当たり、Ｆ３プライマーとＢ３プライマーはそれぞれ２．５ピコモル、ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーはそれぞれ２０ピコモル、ＬＦプライマーとＬＢプライマーはそれぞれ１０ピコモルとすることができる。反応液２５マイクロリットルで目視判定もしくはカネカ温調機能付き吸光度計  ＭｙＡｂｓｃｏｐｅ（登録商標）、エンドポイント濁度測定装置ＬＴ−１６（ニッポンジーン）もしくはＬＡＭＰ法用ＬＦ−８ Ｐｌｕｓ（ニッポンジーン）を使用する場合、１サンプル当たり、Ｆ３プライマーとＢ３プライマーはそれぞれ５ピコモル、ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーはそれぞれ４０ピコモル、ＬＦプライマーとＬＢプライマーはそれぞれ２０ピコモルで用いることができる。またＧｅｎｅｌｙｚｅｒ Ｆ（ＴＯＳＨＩＢＡ ＭＥＤＩＣＡＬ)、Ｇｅｎｉｅ（登録商標）ＩＩＩ（ニッポンジーン）を用いたモニタリングを行う場合、反応液２５マイクロリットルで１サンプル当たり、Ｆ３プライマーとＢ３プライマーはそれぞれ５ピコモル、ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーはそれぞれ２０ピコモル、ＬＦプライマーとＬＢプライマーはそれぞれ１０ピコモルで用いることができる。
【００３４】
＜ＬＡＭＰ法：核酸の増幅＞
ＬＡＭＰ法によるＤＮＡの増幅反応においては、検体から抽出された核酸と、プライマーセットと、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素と、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰ）と、緩衝液とを含む反応液を、等温で一定時間静置すればよい。ＲＴ−ＬＡＭＰ法を行う場合は、さらに逆転写酵素を上記反応液に添加すればよい。
【００３５】
温度は、５０℃以上７５℃以下が好ましく、６０℃以上６５℃以下がより好ましく、６３℃がさらに好ましい。静置時間は、１５分以上であればＤＮＡの増幅を検出できるが、１５分以上１２０分以内が好ましく、２０分以上９０分以内がより好ましい。
【００３６】
鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、ｄＮＴＰｓ及び緩衝液としては、例えば、Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ増幅試薬キット（栄研化学社製）に含まれる各試薬を使用できる。
またＬＡＭＰ法用ＤＮＡ増幅試薬セット-動物種・植物病検査専用Ａ−(ニッポンジーン)及びＬＡＭＰ法用ＤＮＡ増幅試薬セット−動物種・植物病検査専用Ｂ−(ニッポンジーン)も使用可能である。等温増幅蛍光測定装置ＧｅｌｙｚｅｒTM Ｆシリーズ（ＴＯＳＨＩＢＡ ＭＥＤＩＣＡＬ）もしくは等温増幅蛍光測定装置Ｇｅｎｉｅ（登録商標）ＩＩＩ(ニッポンジーン)を使用する際は遺伝子増幅用試薬Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＯＳＨＩＢＡ ＭＥＤＩＣＡＬ）もしくはＩｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｆｏｒ Ｇｅｎｉｅ（登録商標）ＩＩＩ（ニッポンジーン）も使用可能である。
【００３７】
＜疫病菌の検出＞
上記のプライマーセットを用いて核酸の増幅を行うことにより、簡便、安価、高速に、疫病菌を検出することが可能である。具体的には、検体に含まれる核酸をＬＡＭＰ増幅反応に供し、増幅反応の結果生じた増幅産物の有無を判定することにより、検体中の疫病菌を検出することができる。
【００３８】
実施例において、Phytophthora cactorumのリボゾームＤＮＡ配列情報に基づき設計されたプライマーセット（プライマーセット１、プライマーセット２など）は、いずれの疫病菌の検出に用いることもできるが、特にPhytophthora nicotianaeおよびPhytophthora cactorumのいずれの検出に用いることもできるため有用である。また、実施例において、Phytophthora infestansのリボゾームＤＮＡ配列情報に基づき設計されたプライマーセット３は、いずれの疫病菌の検出に用いることもでき、Phytophthora infestans Phytophthora nicotianae、Phytophthora cactorumの検出に用いることが好ましく、Phytophthora infestansの検出に用いることがより好ましい。実施例のプライマーセット４はPhytophthora infestansの検出に用いることが好ましい。
【００３９】
ここで「検体」としては、疫病が発生しうる全ての植物が挙げられる。検体となるうる植物としては、例えば、イチゴ、ならびに、ナス、トマト、およびジャガイモなどのナス科の植物が挙げられる。イチゴは、疫病が発生しやすく、発生した場合の生産者への被害額も大きくなるため、イチゴを検体とする本発明の方法は特に有用である。また、イチゴ栽培で特に問題となる疫病菌は、Phytophthora nicotianae、Phytophthora cactorumであるため、上述のようにPhytophthora cactorumのリボゾームＤＮＡ配列情報に基づき設計されたプライマーセット（プライマーセット１またはプライマーセット２など）は、イチゴ検体中の疫病菌の検出に用いることが好ましい。
【００４０】
ナス科の植物の栽培で特に問題となる疫病菌はPhytophthora infestansであるため、ナス科の植物を検体とする場合には、プライマーセット３またはプライマーセット４を用いた検出を行うことが好ましい。
【００４１】
植物において検体とする部位としては、葉、実、茎、根等、いずれの部位を用いてもよい。疫病菌は特に根を検体とすると検出しやすい。または苗全体を用いてもよい。
また、土壌、特に上記植物の栽培のための土壌を検体とすることもできる。上述のように疫病菌が産出する厚膜胞子は数年間土壌中で生存可能であり、上記植物の栽培のための土壌を検体として疫病菌の有無を確認することにより、疫病の発生や拡大を未然に防止することが可能である。より確実な検出を行うために土壌は、疫病菌を選択的に成長させる培地による前培養を行って検体とすることも好ましい。
【００４２】
検体から、核酸を抽出し、ＬＡＭＰ法による増幅反応を行う。核酸の抽出は、公知の方法で行えばよい。
増幅産物の有無の判断は、例えば、ＬＡＭＰ法による核酸の増幅反応を行った後の反応液を肉眼で観察し、反応液の白濁が確認された場合に菌が存在すると判断できる。また、この反応液にＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ等の蛍光インターカレーターを加え、ＵＶ照射下で核酸の増幅を示す発光が確認された場合に菌が存在すると判断できる。この判断は目視で行うことも可能である。
【００４３】
ＬＡＭＰ法による増幅産物の有無の判断は、本発明のプライマーセットの代わりに水を加えた陰性対照（ネガティブコントロール）との対比で行うことも好ましい。陰性対照を用いることにより、偽陽性に基づく判断を防止することができる。また、本発明のプライマーセットによってＬＡＭＰ反応が正常に進行する系となっていることを確認するために陽性対照（ポジティブコントロール）を用いてもよい。
【００４４】
カネカ社性の温調機能付き吸光度計（ＭｙＡｂｓｃｏｐｅ（登録商標））もしくはエンドポイント濁度測定装置ＬＴ−１６（株式会社ニッポンジーン）、ＬＡＭＰ法用ＬＦ−８ Ｐｌｕｓ（株式会社ニッポンジーン）を用いて増幅産物量に応じた吸光度の変化を測定してもよい。増幅産物の有無に加えて、増幅産物の量を判断することが可能である。
【００４５】
また、ＬＡＭＰ反応で得られる一本鎖核酸の二本鎖への会合をモニタリングして会合曲線解析を行うことにより、増幅された核酸の検出が可能である。このような会合の解析は、例えば、東芝メディカルシステムズ株式会社の等温増幅蛍光測定装置Ｇｅｎｅｌｙｚｅｒ ＦもしくはＧｅｎｉｅ(登録商標)ＩＩＩ(ニッポンジーン)を用いて行うことができる。測定の際は、上記測定装置の専用試薬を用いればよい。
【００４６】
＜疫病菌検出用キット＞
また、本発明の検出方法を使用するために必要な各種の試薬類は、予めパッケージングしてキット化することができる。具体的には、上記プライマーセット、核酸合成の基質となる４種類のｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）、鎖置換活性を有する鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、補助因子としての塩類（マグネシウム塩又はマンガン塩等）、酵素や鋳型を安定化する保護剤、さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類をキットとして提供できる。
【００４７】
キットは、陽性対照（ポジティブコントロール）を含んでいてもよい。陽性対照としては、例えば、本発明のプライマーセットにより増幅される領域を含んだＤＮＡが挙げられる。
【実施例】
【００４８】
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００４９】
実施例において、下記の各菌株についてのＤＮＡ調製物（原液）は以下のように用意した。
ＰＤＡ培地上で２５℃約３日間培養後、新しく伸長した菌糸を白金耳でエッペンドルフチューブに移し、J Gen Plant Pathol 72: 348-350 (2006)（Saitoh K, Togashi K, Arie T, Teraoka T "A simple method for a mini-preparation of fungal DNA"）に記載の方法に従ってDNAを抽出した。なおDNAは滅菌蒸留水に溶出・希釈した。
Phytophthora cactorum (栃木県佐野市)
Phytophthora cactorum (栃木県真岡市)
Phytophthora cactorum (MAFF103068)（TOCHIGI)
Phytophthora nicotianae (MAFF237653)（佐賀県小城郡午津町)
Phytophthora infestans (MAFF236317)
colletotrichum gloeosporioides OTT-512
Fusarium oxysporum f. sp.fragariae KMK
【００５０】
また、実施例において、設計された各プライマーセット（プライマー）は、標準的なオリゴＤＮＡで合成し、滅菌蒸留水で１００μＭに希釈したものをマスターミックスとして冷凍保存した。夫々のプライマーについて、所定の濃度に希釈して一定量確保した。希釈したプライマーも−２０℃で冷凍保存した。
【００５１】
＜Phytophthora cactorumのリボゾームＤＮＡ配列情報に基づくプライマーセット＞
［プライマーセットの設計］
表１に複数の既知の複数の疫病菌（Phytophthora cactorum）株のリボゾームＤＮＡ配列情報のアライメントを示す。菌株間で保存性が高い領域において、Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１ｃ、Ｂ１ｃ、Ｂ２、Ｂ３領域を選択した。それぞれ、表１において、対応する部位は、PcＦ３、PcFIP（Ｆ２）、PcFIP（Ｆ１）、PcBIP（Ｂ１）、PcBIP（Ｂ２）、PcＢ３である。さらにループプライマーに対応する領域として、PcLFおよびPcLBを選択した。プライマーセット１はPhytophthora cactorumのリボゾームＤＮＡ配列（AY670706）（18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; 及び 28S ribosomal RNA gene, partial sequence）の配列情報を基に設計した。既報のＬＡＭＰプライマーは上記と同様internal transcribed spacer 2でデザインされているが位置が異なる。また、既報のＰＣＲプライマーはＬＡＭＰプライマーとさらに異なりinternal transcribed spacer 1から5.8S ribosomal RNAにかけて位置している。
【００５２】
【表１】
2020120607.tif 000002
2020120607.tif 000003
【００５３】
【表２】
2020120607.tif 000004
【００５４】
【表３】
2020120607.tif 000005
【００５５】
さらにプライマーセット１において、一部のみの塩基を変更したプライマーセット２を用意した。表において、小文字の部分がプライマーセット１とプライマーセット２とで塩基が相違する部位である。
【００５６】
【表４】
2020120607.tif 000006
【００５７】
［疫病菌の検出、特異性］
ＬＡＭＰ反応はＬｏｏｐａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ増幅試薬キットとＬｏｏｐａｍｐ蛍光・目視検出試薬（栄研化学https://genome.e-mp.jp/products/mokusi.html）とプライマーセット１を使用して行った。１サンプル当たり、１μＬのＤＮＡ調製物と６．２５μＬの２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ、０．５μＬのＥｎｚｙｍｅ ｍｉｘ、０．５μＬの蛍光試薬、０．５μＬのＦ３プライマー（５μＭ）、０．５μＬのＢ３プライマー（５μＭ）、０．５μＬのＦＩＰプライマー（４０μＭ）、０．５μＬのＢＩＰプライマー（４０μＭ）、０．５μＬのＬＦプライマー（２０μＭ）、０．５μＬのＬＢプライマー（２０μＭ）、１．２５μＬの滅菌蒸留水を加えることで計１２．５μＬに調製した。
ＬＡＭＰ反応は６３℃６０分のあと９５℃２分とすることで行った。
その後、ＬＡＭＰ増幅物により生じる蛍光を目視で比較した。結果を表５に示す。以下で示す結果においては、蛍光が確認されたもの（陽性）を「＋」、蛍光が確認されなかったもの（陰性）を「−」で示す。
プライマーセット１を用いたＬＡＭＰ反応で陽性であったが、炭疽病菌、萎黄病菌に対しては、陰性であった。
【００５８】
【表５】
2020120607.tif 000007
1.Phytophthora cactorum (栃木県佐野市)
2.colletotrichum gloeosporioides OTT-512
3.Fusarium oxysporum fsp.fragariae KMK
4.水
【００５９】
カネカ温調機能付き吸光度計ＭｙＡｂｓｃｏｐｅ（登録商標）を用いた検出を行った。ＬＡＭＰ法用ＤＮＡ増幅試薬セット−動物種・植物病検査専用Ａ（ニッポンジーン）を利用した。２．０μＬのＤＮＡ調製物（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃａｃｔｏｒｕｍ（ＭＡＦＦ１０３０６８）およびＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ（ＭＡＦＦ２３７６５３）と２．５μＬの１０×反応バッファーＡ、１．４μＬのｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ、１．０μＬの増幅酵素、１．０μＬの検出液、１．０μＬのＦ３プライマー（５μＭ）、１．０μＬのＢ３プライマー（５μＭ）、１．０μＬのＦＩＰプライマー（４０μＭ）、１．０μＬのＢＩＰプライマー（４０μＭ）、１．０μＬのＬＦプライマー（２０μＭ）、１．０μＬのＬＢプライマー（２０μＭ）、１１．１μＬの滅菌蒸留水を加えることで計２５．０μＬに調製した。
ネガティブコントロールとしてＤＮＡではなく滅菌蒸留水２．０μＬを添加した。ＬＡＭＰ反応は６３℃６０分。Ｇセンサで吸光度変化をリアルタイム測定した。結果を図２に示す。
【００６０】
さらに、会合曲線解析による判定を行った。
２．０μＬの調製物（ＤＮＡ調製物（Phytophthora cactorum(MAFF103068)およびPhytophthora nicotianae(MAFF237653)ならびに滅菌蒸留水）、１５μＬのＩＳＯ−００４（Ｇｅｎｅｌｙｚｅｒ Ｆ用試薬）、１．０μＬのPcF3（５μＭ）、１．０μＬのPcB3（５μＭ）、０．５μＬのPcFIP（４０μＭ）、０．５μＬのPcBIP（４０μＭ）、０．５μＬのPcLF（２０μＭ）、０．５μＬのPcLB（２０μＭ）、４．０μＬ滅菌蒸留水を加えることで計２５．０μＬに調製した。調製したサンプルをＧｅｎｅｌｙｚｅｒ Ｆ（ＴＯＳＨＩＢＡ ＭＥＤＩＣＡＬ）にセットし、６３℃３０分処理後、９５℃２分間処理でＬＡＭＰ反応を停止させた後、暫時的に１５分間で８０℃まで下げた。その間に会合による蛍光をモニタリングした。３つの結果を図３に合わせて示す。図３中、黒点線はP. cactorum MAFF103068、灰細線はP. nicotianae MAFF237653、灰太色線：水を示す。ＤＮＡ調製物において会合による蛍光値のピークが確認された。
【００６１】
［既報のプライマーセットとの比較］
非特許文献２、３に記載のイチゴ疫病菌検出用各プライマーセット（表６、表７）を用意し、標準的なオリゴＤＮＡで合成し、さらにＨＰＬＣ精製後、滅菌蒸留水で１００μＭに希釈したものをマスターミックスとして冷凍保存し、プライマーセット１と同様に用いて、プライマーセット１を用いた例と疫病菌の検出感度を種々比較した（表８〜１１）。
【００６２】
【表６】
2020120607.tif 000008
【００６３】
【表７】
2020120607.tif 000009
【００６４】
表８〜１１の比較において、ＬＡＭＰ反応はＬｏｏｐａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ増幅試薬キットとＬｏｏｐａｍｐ蛍光・目視検出試薬（栄研化学https://genome.e-mp.jp/products/mokusi.html）とプライマーセット１、非特許文献２のプライマーセット、および非特許文献２のプライマーセットとをそれぞれ用いて行った。１サンプル当たり、１．５μＬのＤＮＡ調製物と６．２５μＬの２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ、０．５μＬのＥｎｚｙｍｅ ｍｉｘ、０．５μＬの蛍光試薬、０．５μＬのＦ３プライマー（５μＭ）、０．５μＬのＢ３プライマー（５μＭ）、０．５μＬのＦＩＰプライマー（４０μＭ）、０．５μＬのＢＩＰプライマー（４０μＭ）、０．５μＬのＬＦプライマー（２０μＭ）、０．５μＬのＬＢプライマー（２０μＭ）、０．７５μＬの滅菌蒸留水を加えることで計１２．５μＬに調製した。
ＬＡＭＰ反応は６３℃６０分のあと９５℃２分とすることで行った。
その後、ＬＡＭＰ増幅物により生じる蛍光を目視で比較した。
【００６５】
プライマーセット１および非特許文献２のプライマーセットを用いて各種疫病菌の検出を行った。結果を表８に示す。表８に示す結果から、プライマーセット１を用いたＬＡＭＰ法では非特許文献２のプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法で検出できていない疫病菌も検出できていることがわかる。
【００６６】
【表８】
2020120607.tif 000010
１．Phytophthora cactorum (栃木県真岡市)
２．Phytophthora cactorum (栃木県佐野市)
３．Phytophthora cactorum (MAFF103068,TOCHIGI)
４．Phytophthora nicotianae (MAFF237653,佐賀県小城郡午津町)
５．水
【００６７】
Phytophthora cactorum (栃木県真岡市) の検出感度につき、プライマーセット１および非特許文献２のプライマーセット、プライマーセット１および非特許文献３のプライマーセットをそれぞれ比較した。結果を表９に示す。表９に示す結果から、プライマーセット１を用いたＬＡＭＰ法は非特許文献２または非特許文献３のプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法より高感度であることがわかる。
【００６８】
【表９】
2020120607.tif 000011
【００６９】
表１０に記載の２種の疫病菌の検出感度につき、プライマーセット１および非特許文献３のプライマーセットを比較した。表１０に示す結果から、プライマーセット１を用いたＬＡＭＰ法では、非特許文献３のプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法では検出できてないPhytophthora cactorumおよびPhytophthora nicotianaeをいずれも検出できることがわかる。
【００７０】
【表１０】
2020120607.tif 000012
【００７１】
【表１１】
2020120607.tif 000013
【００７２】
プライマーセット１とプライマーセット２は同程度の検出感度であった。
【００７３】
［土壌および果実からの疫病菌の検出］
疫病菌（Phytophthora cactorum(MAFF103068)）を培養したＰＤＡ培地を細かくブロック状にしたあとイチゴ苗の土壌に置き常温下で６日間放置した。６日後ＰＤＡ培地は乾燥し小さくなっていた。放置後の土壌からＤＮＡ抽出キット（ZR Soil Microbe DNA MiniPrep（ZYMO RESEACH））を用いてＤＮＡを抽出した。
また、疫病菌（Phytophthora cactorum(MAFF103068)）を培養したＰＤＡ培地をリンゴの皮をメスで剥いだ箇所に置き、接種箇所にテープを貼って保湿し８日間放置した。８日後置いた培地は乾燥し小さくなっていたが、接種した箇所を中心に皮が黒く変色していた。三澤知央著イチゴ疫病の診断方法と防除対策.植物防疫,62(9), 485-489(2008)を参照した。
【００７４】
ＬＡＭＰ反応はＬｏｏｐａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ増幅試薬キットとＬｏｏｐａｍｐ蛍光・目視検出試薬（栄研化学https://genome.e-mp.jp/products/mokusi.html）とプライマーセット１を使用して行った。ＤＮＡ調製物としては１．５μＬ、土壌抽出物についてはキットを用いて得られたＤＮＡを１．５μＬ、リンゴについては反応液に蒸留水１．５μＬ加えて計１２．５μＬに調製後、８日放置後のリンゴの接種箇所につまようじを刺しそれを反応液に浸して用いた。反応液は、６．２５μＬの２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ、０．５μＬのＥｎｚｙｍｅ ｍｉｘ、０．５μＬの蛍光試薬、０．５μＬのＦ３プライマー（５μＭ）、０．５μＬのＢ３プライマー（５μＭ）、０．５μＬのＦＩＰプライマー（４０μＭ）、０．５μＬのＢＩＰプライマー（４０μＭ）、０．５μＬのＬＦプライマー（２０μＭ）、０．５μＬのＬＢプライマー（２０μＭ）、０．７５μＬの滅菌蒸留水を加えることで計１２．５μＬに調製したものを用いた。
【００７５】
ＬＡＭＰ反応は６３℃６０分とすることで行った。
その後、ＬＡＭＰ増幅物により生じる蛍光を目視で比較した。結果を表１２に示す。表１２において、１は土壌抽出物、２はリンゴ接種物、３はポシティブコントロール（P. cactorum ＭＡＦＦ１０３０６８をＰＤＡ培地上で培養し伸長した菌糸から抽出したＤＮＡ）、４は水である。表１２からわかるように、土壌中に疫病菌が潜伏しているもののイチゴ苗に病徴が顕在化していない段階で検出することができた。また、リンゴで増殖した疫病菌も検出することができた。
【００７６】
【表１２】
2020120607.tif 000014
【００７７】
＜Phytophthora infestans株のリボゾームＤＮＡ配列情報に基づくプライマーセット＞
［プライマーセットの設計］
表１３に複数の既知の複数のジャガイモ疫病菌（Phytophthora infestans）株のリボゾームＤＮＡ配列情報のアライメントを示す。菌株間で保存性が高い領域において、Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１ｃ、Ｂ１ｃ、Ｂ２、Ｂ３領域を選択した。それぞれ、表１３において、対応する部位は、PiF3、PcFIP(F2)、PiFIP(F1)、PiBIP(B1)、PiBIP(B2)、PiB3である。さらにループプライマーに対応する領域として、PiLFおよびPiLBを選択した。ループプライマーを含む、プライマーセットを設計した。internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene, complete sequence; and internal transcribed spacer 2, partial sequence (Acsession No. GU258150)の配列情報を基にプライマーセット３を設計した（表１４）。さらにプライマーセット３において、ＬＦプライマーのみを表１５に示すPiLF2に変更したプライマーセット４を設計した。
【００７８】
【表１３】
2020120607.tif 000015
2020120607.tif 000016
【００７９】
【表１４】
2020120607.tif 000017
【００８０】
【表１５】
2020120607.tif 000018
【００８１】
【表１６】
2020120607.tif 000019
【００８２】
［疫病菌の検出］
プライマーセット３を用いてPhytophthora infestans(MAFF236317)ＤＮＡ調製物につき、ＬＡＭＰ法を行った。Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ増幅試薬キットとＬｏｏｐａｍｐ蛍光・目視検出試薬（栄研化学https://genome.e-mp.jp/products/mokusi.html）を用い、１サンプル当たり、１.５μＬのＤＮＡ調製物と６．２５μＬの２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ、０．５μＬのＥｎｚｙｍｅ ｍｉｘ、０．５μＬの蛍光試薬、０．５μＬのＦ３プライマー（５μＭ）、０．５μＬのＢ３プライマー（５μＭ）、０．５μＬのＦＩＰプライマー（４０μＭ）、０．５μＬのＢＩＰプライマー（４０μＭ）、０．５μＬのＬＦプライマー（２０μＭ）、０．５μＬのＬＢプライマー（２０μＭ）、０．７５μＬの滅菌蒸留水を加えることで計１２．５μＬに調製した。
ＬＡＭＰ反応は６３℃６０分のあと９５℃２分とすることで行った。
その後、ＬＡＭＰ増幅物により生じる蛍光を目視で比較した。結果を表１７に示す。表１７に示す結果からわかるように、プライマーセット３を用いたＬＡＭＰ反応は高い感度を示した。
【００８３】
【表１７】
2020120607.tif 000020
【００８４】
Phytophthora infestansの保存性が高い塩基配列でデザインしたプライマーセット３およびプライマーセット４による、Phytophthora nicotianaeおよびPhytophthora cactorumの検出を試験した。Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ増幅試薬キットとＬｏｏｐａｍｐ蛍光・目視検出試薬（栄研化学https://genome.e-mp.jp/products/mokusi.html）を用い、１サンプル当たり、１.５μＬのＤＮＡ調製物と６．２５μＬの２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ、０．５μＬのＥｎｚｙｍｅ ｍｉｘ、０．５μＬの蛍光試薬、０．５μＬのＦ３プライマー（５μＭ）、０．５μＬのＢ３プライマー（５μＭ）、０．５μＬのＦＩＰプライマー（４０μＭ）、０．５μＬのＢＩＰプライマー（４０μＭ）、０．５μＬのＬＦプライマー（２０μＭ）、０．５μＬのＬＢプライマー（２０μＭ）、０．７５μＬの滅菌蒸留水を加えることで計１２．５μＬに調製した。
ＬＡＭＰ反応は６３℃６０分のあと９５℃２分とすることで行った。
その後、ＬＡＭＰ増幅物により生じる蛍光を目視で比較した。結果を表１８に示す。表１８に示す結果からわかるように、プライマーセット３がプライマーセット４より高い汎用性を示した。
【００８５】
【表１８】
2020120607.tif 000021
【図１】
2020120607.tif 000022
【図２】
2020120607.tif 000023
【図３】
2020120607.tif 000024
【配列表】
2020120607000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月10日(2019.6.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＡＭＰ法により、疫病菌由来の核酸を増幅するためのプライマーセットであって：
配列番号１の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号１の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて５’側から１番目のＣのＴへの置換、２２番目のＧのＣへの置換、および３０番目のＧのＡへの置換からなる群より選択される１〜３個の変異を含むポリヌクレオチドであって、Ｆ２領域（配列番号８）とＦ１ｃ領域（配列番号７）との間に１〜６ヌクレオチドの配列が挿入していてもよいポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて５’側から２番目のＴのＣへの置換、３番目のＣと４番目のＴとの間へのＣの挿入、５番目のＧのＣへの置換、２３番目のＴと２４番目のＡとの間へのＴＡの挿入、３０番目のＣのＡ／Ｔ／Ｇへの置換、３８番目のＡのＴ／Ｇ／Ｃへの置換、３９番目のＡと４０番目のＧとの間へのＧの挿入、および４０番目のＧのＡ／Ｔ／Ｃへの置換からなる群より選択される１〜８個の変異を含むポリヌクレオチドであって、Ｂ２領域（配列番号１０）とＢ１ｃ領域（配列番号９）との間に１〜６ヌクレオチドの配列が挿入していてもよいポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて５’側から３番目のＡのＧへの置換、８番目のＧのＡへの置換、１２番目のＧのＡへの置換、および１７番目のＣのＴへの置換からなる群より選択される１〜４個の変異を含むポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、
配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチド、または配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、５’側から６番目のＣのＡ／Ｔ／Ｇへの置換、６番目のＣと７番目のＧとの間へのＣの挿入、８番目のＡと９番目のＣとの間へのＣの挿入、１３番目のＣのＧへの置換、および１５番目のＡと１６番目のＣとの間へのＧの挿入からなる群より選択される１〜５個の変異を含むポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー、
配列番号５の配列により示されるポリヌクレオチドまたは配列番号５の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて５’側から７番目のＧのＡへの置換、および１１番目のＡのＴ／Ｇ／Ｃへの置換からなる群より選択される１〜２個の変異を含むポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、ならびに
配列番号６の配列により示されるポリヌクレオチドまたは配列番号６の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて５’側から２番目のＧと３番目のＴとの間へのＣの挿入、１２番目のＧのＡ／Ｔ／Ｃへの置換、１６番目のＡのＧへの置換、および１９番目のＴのＧへの置換からなる群より選択される１〜４個の変異を含むポリヌクレオチドからなるＬＢプライマーを含むプライマーセット。
【請求項２】
配列番号１の配列により示されるポリヌクレオチドであって、Ｆ２領域（配列番号８）とＦ１ｃ領域（配列番号７）との間に１〜６ヌクレオチドの配列が挿入していてもよいポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチドであって、Ｂ２領域（配列番号１０）とＢ１ｃ領域（配列番号９）との間に１〜６ヌクレオチドの配列が挿入していてもよいポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー
を含む請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
配列番号１の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、
配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー、配列番号５の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、
および
配列番号６の配列により示されるポリヌクレオチドポリヌクレオチドからなるＬＢプライマー
を含む請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項４】
配列番号１１の配列により示されるポリヌクレオチドであって、Ｆ２領域（配列番号８）とＦ１ｃ領域（配列番号１６）との間に１〜６ヌクレオチドの配列が挿入していてもよいポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号１２の配列により示されるポリヌクレオチドであって、Ｂ２領域（配列番号１０）とＢ１ｃ領域（配列番号１７）との間に１〜６ヌクレオチドの配列が挿入していてもよいポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号１３の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー
を含む請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項５】
配列番号１１の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号１２の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号１３の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、
配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー、配列番号１４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、
および
配列番号１５の配列により示されるポリヌクレオチドポリヌクレオチドからなるＬＢプライマー
を含む請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項６】
ＬＡＭＰ法により、疫病菌由来の核酸を増幅するためのプライマーセットであって：
配列番号１８の配列により示されるポリヌクレオチドであって、Ｆ２領域（配列番号２５）とＦ１ｃ領域（配列番号７）との間に１〜６ヌクレオチドの配列が挿入していてもよいポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号１９の配列により示されるポリヌクレオチドであって、Ｂ２領域（配列番号２７）とＢ１ｃ領域（配列番号２６）との間に１〜６ヌクレオチドの配列が挿入していてもよいポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号２０の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、
配列番号２１の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー、配列番号２２または２４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、
および
配列番号２３の配列により示されるポリヌクレオチドポリヌクレオチドからなるＬＢプライマー
を含むプライマーセット。
【請求項７】
配列番号１８の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号１９の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号２０の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号２１の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー
を含む請求項６に記載のプライマーセット。
【請求項８】
配列番号２２の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマーを含む請求項７に記載のプライマーセット。
【請求項９】
疫病菌の検出方法であって、
検体から核酸を抽出すること、
請求項１〜８のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いて、前記核酸を鋳型にＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行うこと、および、
増幅産物があると判断された場合に検体に疫病菌が存在すると判断することを含む、検出方法。
【請求項１０】
疫病菌Phytophthora nicotianaeおよび疫病菌Phytophthora cactorumの検出方法であって、
検体から核酸を抽出すること、
請求項１〜５のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いて、前記核酸を鋳型にＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行うこと、および、
増幅産物があると判断された場合に検体に前記疫病菌のいずれか１つ以上が存在すると判断することを含む、検出方法。
【請求項１１】
検体がイチゴ苗栽培の土壌である請求項９または１０に記載の検出方法。
【請求項１２】
疫病菌Phytophthora infestansの検出方法であって、
検体から核酸を抽出すること、
請求項６〜８のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いて、前記核酸を鋳型にＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行うこと、および、
増幅産物があると判断された場合に検体に前記疫病菌が存在すると判断することを含む、検出方法。
【請求項１３】
検体がナス科の植物である請求項１２に記載の検出方法。
【請求項１４】
疫病菌Phytophthora nicotianae、疫病菌Phytophthora cactorum、および疫病菌Phytophthora infestansの検出方法であって、
検体から核酸を抽出すること、
請求項８に記載のプライマーセットを用いて、前記核酸を鋳型にＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行うこと、および、
増幅産物があると判断された場合に検体に前記疫病菌のいずれか１つ以上が存在すると判断することを含む、検出方法。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のプライマーセット、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を含む、疫病菌の検出用キット。