(57)【要約】      （修正有）【課題】ガンを患っている患者の生存時間の予後を決定するためのin vitro方法、及びガンの治療及び予防に使用する化合物の提供。【解決手段】ｉ）患者由来のサンプル中のＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対の発現レベルを決定すること、ｉｉ）前記発現レベルを所定の基準値と比較すること、及びｉｉｉ）発現レベルが所定の基準値よりも低い場合には予後良好を提供し、発現レベルが所定の基準値よりも高い場合には予後不良を提供することからなる工程を含むin vitro方法の提供。また、ガンの治療及び予防において使用するための、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γアンタゴニストである特定のアミノ酸からなる化合物、又はＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ遺伝子発現阻害剤の提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガンを患っている患者の生存時間の予後を決定するためのin vitro方法であって、ｉ）前記患者由来のサンプル中のＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対の発現レベルを決定すること、ｉｉ）前記発現レベルを所定の基準値と比較すること、及びｉｉｉ）発現レベルが所定の基準値よりも低い場合には予後良好を提供し、発現レベルが所定の基準値よりも高い場合には予後不良を提供することからなる工程を含む、in vitro方法。
【請求項２】
ガンを患っている患者であって、従来の処置で処置された患者の生存時間を予測するためのin vitro方法であって、ｉ）前記患者由来のサンプル中のＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対の発現レベルを決定すること、ｉｉ）前記発現レベルを所定の基準値と比較すること、及びｉｉｉ）発現レベルが所定の基準値よりも低い場合には予後良好を提供し、発現レベルが所定の基準値よりも高い場合には予後不良を提供することからなる工程を含む、in vitro方法。
【請求項３】
ガンを患っている患者であって、従来の処置で処置された患者の応答を予測するためのin vitro方法であって、ｉ）前記患者由来のサンプル中のＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対の発現レベルを決定すること、ｉｉ）前記発現レベルを所定の基準値と比較すること、及びｉｉｉ）発現レベルが所定の基準値よりも低い場合には応答良好を提供し、発現レベルが所定の基準値よりも高い場合には応答不良を提供することからなる工程を含む、in vitro方法。
【請求項４】
ガンが神経膠芽腫である、請求項１〜３に記載のin vitro方法。
【請求項５】
従来の処置がテモゾロミド及び放射線である、請求項２〜４に記載のin vitro方法。
【請求項６】
ガンの治療及び予防において使用するための、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γアンタゴニストである化合物又はＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ遺伝子発現阻害剤である化合物。
【請求項７】
ガンの治療及び予防において同時使用、個別使用又は逐次使用するための複合調製物としての、ｉ）ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γアンタゴニスト若しくはＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ遺伝子発現阻害剤、及びｉｉ）化学療法剤、及びｉｉｉ）放射線療法又は放射線療法剤。
【請求項８】
アミノ酸配列ＲＰＭＰＲＬＴＦＱＡＧＤＰＹＹＩ（配列番号：１）を含むペプチド又はその機能保存変異体。
【請求項９】
ガンの治療及び予防において使用するための、請求項８に記載のペプチド。
【請求項１０】
神経膠芽腫の治療及び予防において同時使用、個別使用又は逐次使用するための複合調製物としての、ｉ）配列番号：１の配列又はその機能保存変異体の化合物、及びｉｉ）テモゾロミド、及びｉｉｉ）放射線療法。
【請求項１１】
ガンの治療及び予防において使用するための治療用組成物であって、薬学的に許容し得る賦形剤と共に請求項６に記載の化合物を含む、治療用組成物。
【請求項１２】
それを必要とする被験体におけるガンの予防及び治療のための薬物として使用するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、ｉ）候補化合物を提供する工程、及びｉｉ）ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γを遮断又はアンタゴナイズする候補化合物を選択する工程を含む、方法。
【請求項１３】
ガンを治療又は予防する方法であって、治療有効量のＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γアンタゴニストである化合物又はＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ遺伝子発現阻害剤である化合物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、ガンを患っている患者の生存時間の予後を決定するためのin vitro方法であって、ｉ）前記患者由来のサンプル中のＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対の発現レベルを決定すること、ｉｉ）前記発現レベルを所定の基準値と比較すること、及びｉｉｉ）発現レベルが所定の基準値よりも低い場合には予後良好を提供し、発現レベルが所定の基準値よりも高い場合には予後不良を提供することからなる工程を含むin vitro方法に関する。
【０００２】
本発明はまた、ガンの治療及び予防において使用するための、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γアンタゴニストである化合物又はＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ遺伝子発現阻害剤である化合物に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景：
ガン細胞では、ＤＮＡメチル化パターンが異常であることが多い。したがって、遺伝子間領域の低メチル化が起こり、転位因子の活性化及びゲノム不安定性の増加を介して腫瘍形成をもたらし得る。遺伝子プロモーターの局所的低メチル化は、ガン遺伝子発現を促進し得る一方、遺伝子プロモーターの局所的高メチル化は、ガン細胞における腫瘍抑制機能の喪失につながり得る。この最後の点に基づいて、ＤＮＡメチル化によってサイレンシングされた腫瘍サプレッサー遺伝子（ＴＳＧ）を活性化することを目的に、薬物開発は、ＤＮＡメチル化阻害剤に焦点を当てている。しかし、特異性がなければ、ＤＮＭＴ阻害剤は、ＴＳＧだけではなくガン遺伝子及び転位因子の脱メチル化も促進し得る。したがって、非特異的ＤＮＭＴ阻害剤の使用は、抗腫瘍形成的又は腫瘍形成促進的であり得る。その上、この最後の点は、いくつかの論文で例証されている。実際、文献では、５−アザ−２’−デオキシシチジン処置（非特異的ＤＮＭＴ阻害剤）は、非侵襲性乳ガン細胞株ＭＣＦ−７細胞及びＺＲ−７５−１の侵襲性を増加させ、転移促進遺伝子を劇的に誘導したことが報告されている［Chik F et al., 2011］。５−アザ−２’−デオキシシチジン処置はまた、星状細胞からの神経膠腫のインデューサーとして、及び神経膠腫細胞の腫瘍形成特性のエンハンサーとして報告されている。それにもかかわらず、５−アザ−２’−デオキシシチジンは、骨髄異形成症候群の処置について、Food and Drug Administration of the United Statesによって承認されており、患者の生存率について、有意だが通常は一過性の改善を示す。この疑う余地のない臨床的有用性にもかかわらず、非特異的ＤＮＭＴ阻害剤の使用の二重効果は、特異的ＤＮＭＴ阻害剤の開発の根拠を提供する。加えて、特異的ＤＮＭＴ阻害剤はまた、特定のＤＮＭＴの異常な機能性を有する腫瘍をターゲティングすることを可能にし得る。特異的ＤＮＭＴ阻害剤の開発はまた、非特異的ＤＮＭＴ阻害剤の使用に関連するオフターゲット効果を減少させ得る。
【０００４】
現在、特定のＤＮＭＴを特異的にターゲティングするために、いくつかの分子が開発されている。したがって、ＤＮＭＴ１は、ＲＧ１０８、ＭＧ９８又はプロカインアミドを使用することによって阻害され得る一方、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂは、それぞれテアフラビン３，３’−ジガラート又はナナオマイシンＡを使用することによって特異的に阻害され得る［Amato R et al., 2012; Kuck D et al., 2010; Kuck D et al., 2010; Lee B et al., 2005及びRajavelu A et al., 2001］。これらの特異的ＤＮＭＴ阻害剤を同定するために、いくつかの戦略が開発されている：ドッキングベースのバーチャルスクリーニング法、天然産物のスクリーニング、既に公知のＤＮＭＴ阻害剤の誘導体の設計及び作製、ＤＮＭＴの結晶構造研究を使用することによるＤＮＭＴ阻害剤の分子モデリング、又はＤＮＭＴをターゲティングするｓｉＲＮＡの設計［Kuck D et al., 2010; Medina-Franco J et al., 2011; Suzuki T et al., 2010; Yoo J et al., 2012; Yoo J et al., 2012及びVenza M et al., 2013］。最近の論文において、本発明者らは、特定のＤＮＭＴ／タンパク質−ｘ相互作用に対しても、ＤＮＭＴ阻害剤が施され得ることを実証した。
【発明の概要】
【０００５】
本研究では、本発明者らは、ＤＮＭＴ３ＡとＤＮＭＴ３Ａ結合タンパク質（Ｄ３Ａ−ＢＰ）との間に存在する相互作用の存在が、多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）を患っている患者であって、より短い全生存期間を有し、その神経膠腫細胞がテモゾロミド／放射線照射処置に対して耐性表現型を示した患者の亜集団の同定を可能にするかを知るための問いかけをした。次いで、神経膠腫形成のマウスモデルにおけるテモゾロミド／放射線照射処置誘導性細胞死の割合及びＴＭＺの感度を増加させるために、本発明者らは、生存の予後不良及び／又はテモゾロミド／放射線照射処置に対する応答に関連するＤＮＭＴ３Ａ／Ｄ３Ａ−ＢＰ相互作用を特異的に阻害することを目的とする戦略を開発することが可能かを知ろうとした。
【０００６】
したがって、本発明は、ガンを患っている患者の生存時間の予後を決定するためのin vitro方法であって、ｉ）前記患者由来のサンプル中のＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対の発現レベルを決定すること、ｉｉ）前記発現レベルを所定の基準値と比較すること、及びｉｉｉ）発現レベルが所定の基準値よりも低い場合には予後良好を提供し、発現レベルが所定の基準値よりも高い場合には予後不良を提供することからなる工程を含むin vitro方法に関する。
【０００７】
本発明はまた、ガンの治療及び予防において使用するための、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γアンタゴニストである化合物又はＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ遺伝子発現阻害剤である化合物に関する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
発明の詳細な説明
予後予測方法
本発明の第１態様は、ガンを患っている患者の生存時間の予後を決定するためのin vitro方法であって、ｉ）前記患者由来のサンプル中のＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対の発現レベルを決定すること、ｉｉ）前記発現レベルを所定の基準値と比較すること、及びｉｉｉ）発現レベルが所定の基準値よりも低い場合には予後良好を提供し、発現レベルが所定の基準値よりも高い場合には予後不良を提供することからなる工程を含むin vitro方法に関する。
【０００９】
本発明はまた、ガンを患っている患者であって、従来の処置で処置された患者の生存時間を予測するためのin vitro方法であって、ｉ）前記患者由来のサンプル中のＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対の発現レベルを決定すること、ｉｉ）前記発現レベルを所定の基準値と比較すること、及びｉｉｉ）発現レベルが所定の基準値よりも低い場合には予後良好を提供し、発現レベルが所定の基準値よりも高い場合には予後不良を提供することからなる工程を含むin vitro方法に関する。
【００１０】
本発明はまた、ガンを患っている患者であって、従来の処置で処置された患者の応答を予測するためのin vitro方法であって、ｉ）前記患者由来のサンプル中のＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対の発現レベルを決定すること、ｉｉ）前記発現レベルを所定の基準値と比較すること、及びｉｉｉ）発現レベルが所定の基準値よりも低い場合には応答良好を提供し、発現レベルが所定の基準値よりも高い場合には応答不良を提供することからなる工程を含むin vitro方法に関する。
【００１１】
本明細書で使用される「従来の処置」という用語は、ガンの処置に使用され得るいかなる化合物、化合物の組み合わせ、化学療法処置及び放射線療法剤の組み合わせ、並びに化学療法処置及び放射線の組み合わせを示す。例えば、神経膠芽腫の処置の場合、従来の処置は、テモゾロミド及び放射線の組み合わせの使用であり得る。
【００１２】
したがって、本発明はまた、神経膠芽腫を患っている患者であって、放射線及びテモゾロミドで処置された患者の生存時間の予測するための方法であって、ｉ）前記患者由来のサンプル中のＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対の発現レベルを決定すること、ｉｉ）前記発現レベルを所定の基準値と比較すること、及びｉｉｉ）発現レベルが所定の基準値よりも低い場合には予後良好を提供し、発現レベルが所定の基準値よりも高い場合には予後不良を提供することからなる工程を含む方法に関する。
【００１３】
本発明はまた、神経膠芽腫を患っている患者であって、放射線及びテモゾロミドで処置された患者の応答を予測するための方法であって、ｉ）前記患者由来のサンプル中のＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対の発現レベルを決定すること、ｉｉ）前記発現レベルを所定の基準値と比較すること、及びｉｉｉ）発現レベルが所定の基準値よりも低い場合には応答良好を提供し、発現レベルが所定の基準値よりも高い場合には応答不良を提供することからなる工程を含む方法に関する。
【００１４】
一実施態様では、ガンは、任意の固形ガン又は液体ガンであり得る。典型的には、ガンは、胆管ガン（例えば、末梢型ガン、遠位胆管ガン、肝内胆管ガン）、膀胱ガン、骨ガン（例えば、骨芽細胞腫、骨軟骨腫、血管腫、軟骨粘液線維腫、骨肉腫、軟骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、骨巨細胞腫、脊索腫、リンパ腫、多発性骨髄腫）、脳及び中枢神経系のガン（例えば、髄膜腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、神経膠芽腫、上衣腫、神経膠腫、髄芽腫、神経節膠腫、シュワン腫、胚細胞腫、頭蓋咽頭腫）、乳ガン（例えば、非浸潤性乳管ガン、浸潤性腺管ガン、浸潤性小葉ガン、非浸潤性小葉ガン、女性化乳房）、キャッスルマン病（例えば、巨大リンパ節過形成、脈管濾胞性リンパ節増殖症）、子宮頸ガン、結腸直腸ガン、子宮内膜ガン（例えば、子宮内膜腺ガン、腺棘細胞ガン、乳頭状漿液性腺ガン、明細胞）、食道ガン、膀胱ガン（粘液性腺ガン、小細胞ガン）、消化管カルチノイド腫瘍（例えば、絨毛ガン、破壊性絨毛腺ガン）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓ガン（例えば、腎細胞ガン）、咽頭ガン及び下咽頭ガン、肝臓ガン（例えば、血管腫、肝腺腫、限局性結節性過形成、肝細胞ガン）、肺ガン（例えば、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン）、中皮腫、形質細胞腫、鼻腔ガン及び副鼻腔ガン（例えば、感覚神経芽腫、正中線肉芽腫）、上咽頭ガン、神経芽細胞腫、口腔ガン及び口腔咽頭ガン、卵巣ガン、膵臓ガン、陰茎ガン、下垂体ガン、前立腺ガン、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫（例えば、胎児性横紋筋肉腫、胞巣状横紋筋肉腫、多形性横紋筋肉腫）、唾液腺ガン、皮膚ガン（例えば、黒色腫、非黒色腫皮膚ガン）、胃ガン、精巣ガン（例えば、精上皮腫、非精上皮腫性胚細胞ガン）、胸腺ガン、甲状腺ガン（例えば、濾胞ガン、未分化ガン、低分化ガン、甲状腺髄様ガン、甲状腺リンパ腫）、膣ガン、外陰ガン及び子宮ガン（例えば、子宮平滑筋肉腫）からなる群より選択され得る。
【００１５】
特定の実施態様では、神経膠芽腫は、多形性神経膠芽腫である。
【００１６】
典型的には、本発明のサンプルは、血液、血漿、血清サンプル又はガン生検であり得る。特定の実施態様では、前記サンプルは、神経膠芽腫生検である。
【００１７】
本明細書で使用される「ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ａ」（Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ番号：１７８８；ｍＲＮＡ配列参照：ＮＭ＿０２２５５２．４；タンパク質配列参照：Ｑ９Ｙ６Ｋ１）の「ＤＮＭＴ３Ａ」という用語は、de novo  ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（すなわち、de novoゲノムＤＮＡのメチル化パターンの確立に関与する酵素、例えば正常な発生に及びガンを含む多くの疾患に関与する酵素）を示す。
【００１８】
ＤＮＭＴ３Ａのタンパク質配列（配列番号：３）は、
【化１】
2020120665.tif 000002
である。
【００１９】
本明細書で使用される「ＩＳＧＦ３γ」（Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ番号：１０３７９；ｍＲＮＡ配列参照：ＮＭ＿００６０８４．４；タンパク質配列参照：Ｑ００９７８）という用語は、Ｉ型ＩＦＮによるシグナリングを媒介する転写因子を示す。ＩＳＧＦ３γは、ＩＦＮ刺激応答因子（ＩＳＲＥ）に結合して、細胞を抗ウイルス状態に駆動するインターフェロン刺激遺伝子の転写を活性化する。
【００２０】
別の実施態様では、本発明は、ガンを患っている患者の全生存（ＯＳ）の予後を決定するためのin vitro方法であって、ｉ）前記患者由来のサンプル中のＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対の発現レベルを決定すること、ｉｉ）前記発現レベルを所定の基準値と比較すること、及びｉｉｉ）発現レベルが所定の基準値よりも低い場合には予後良好を提供し、発現レベルが所定の基準値よりも高い場合には予後不良を提供することからなる工程を含むin vitro方法に関する。
【００２１】
別の実施態様では、本発明はまた、ガンを患っている患者であって、従来の処置で処置された患者の全生存（ＯＳ）を予測するための方法であって、ｉ）前記患者由来のサンプル中のＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対の発現レベルを決定すること、ｉｉ）前記発現レベルを所定の基準値と比較すること、及びｉｉｉ）発現レベルが所定の基準値よりも低い場合には予後良好を提供し、発現レベルが所定の基準値よりも高い場合には予後不良を提供することからなる工程を含む方法に関する。
【００２２】
別の実施態様では、本発明はまた、神経膠芽腫を患っている患者であって、放射線及びテモゾロミドで処置された患者の全生存（ＯＳ）を予測するための方法であって、ｉ）前記患者由来のサンプル中のＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対の発現レベルを決定すること、ｉｉ）前記発現レベルを所定の基準値と比較すること、及びｉｉｉ）発現レベルが所定の基準値よりも低い場合には予後良好を提供し、発現レベルが所定の基準値よりも高い場合には予後不良を提供することからなる工程を含む方法に関する。
【００２３】
本明細書で使用される「全生存（ＯＳ）」という用語は、（本発明にしたがって）ガンなどの疾患と診断されたか又はその処置を開始した後、一定期間にわたって依然として生存している研究又は処置群の人々の割合を示す。
【００２４】
本明細書で使用される「予後良好」という用語は、処置後の翌３年間の生存可能性が５０％を超える患者を示す。
【００２５】
本発明はまた、神経膠芽腫に罹患している患者のテモゾロミド及び放射線処置に対する反応性を予測するための方法であって、ｉ）前記患者由来のサンプル中のＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対の発現レベルを決定すること、ｉｉ）工程ｉ）で決定した発現レベルをその所定の基準値と比較すること、からなる工程を含み、工程ｉ）で決定した発現レベルがその所定の基準値よりも低い場合には、患者の処置に対する反応性が良好であり、工程ｉ）で決定した発現レベルがその所定の基準値よりも高い場合には、患者の処置に対する反応性が悪いと予測する、方法に関する。
【００２６】
一実施態様では、本発明の方法によれば、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対の発現レベルの決定は、患者の処置の開始の前又は後に決定され得る。
【００２７】
別の実施態様では、神経膠芽腫に罹患している患者は、最大外科的切除、放射線療法、及びテモゾロミドとの同時アジュバント化学療法からなる標準的な処置で主に処置される。
【００２８】
上記で使用される「の発現レベルの決定」という用語は、コントロールを参照するかにかかわらず、定性的及び／又は定量的な検出（レベルの測定）を含む。典型的には、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対の発現レベルは、例えば、サンプルに対して実施される酵素標識及び媒介性イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリーアセスメント又はｑＲＴ−ＰＣＲによって測定され得る。
【００２９】
「基準値」は、健常被験体（すなわち、いかなるガン、特に神経膠芽腫も患っていない被験体）であり得る。特に、前記コントロールは、健常被験体である。
【００３０】
サンプル中のＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対の発現レベルの検出は、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γタンパク質又はＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ遺伝子のレベルを測定することによって実施され得る。
【００３１】
ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γタンパク質の検出の場合、前記方法は、サンプルと、サンプル中に存在するＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γタンパク質と選択的に相互作用することができる結合パートナーとを接触させることを含み得る。結合パートナーは、一般に、ポリクローナル又はモノクローナル、特にモノクローナルであり得る抗体である。
【００３２】
タンパク質の存在は、競合アッセイ、直接反応アッセイ又はサンドイッチ型アッセイなどのイムノアッセイを含む標準的な電気泳動技術及び免疫診断技術を使用して検出され得る。このようなアッセイとしては、限定されないが、ウエスタンブロット；凝集試験；ＥＬＩＳＡなどの酵素標識及び酵素媒介性イムノアッセイ；ビオチン／アビジン型アッセイ；ラジオイムノアッセイ；免疫電気泳動；免疫沈降などが挙げられる。反応としては、一般に、蛍光標識、化学発光標識、放射性標識、酵素標識若しくは色素分子などの標識の顕在化、又は抗原と、それと反応する１つ以上の抗体との間の複合体形成を検出するための他の方法が挙げられる。
【００３３】
上記アッセイは、一般に、抗原−抗体複合体が結合している固相支持体から液相中に未結合タンパク質を分離することを含む。本発明の実施において使用され得る固体支持体としては、基材、例えばニトロセルロース（例えば、膜又はマイクロタイターウェルの形態）；ポリ塩化ビニル（例えば、シート又はマイクロタイターウェル）；ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズ又はマイクロタイタープレート）；ポリフッ化ビニリジン；ジアゾ化紙；ナイロン膜；活性化ビーズ、磁気応答性ビーズなどが挙げられる。
【００３４】
より具体的には、試験すべきタンパク質に対する一連の抗体でマイクロタイタープレートのウェルをコーティングするＥＬＩＳＡ法を使用し得る。次いで、マーカータンパク質を含有するか又は含有すると疑われるサンプルをコーティングウェルに追加する。抗体−抗原複合体の形成を可能にするのに十分なインキュベーション期間後、プレートを洗浄して未結合の部分を除去し得、検出可能に標識された二次結合分子を追加する。二次結合分子を任意の捕捉サンプルマーカータンパク質と反応させ、プレートを洗浄し、当技術分野で周知の方法を使用して二次結合分子の存在を検出する。
【００３５】
目的のタンパク質を検出するための様々な免疫酵素染色方法が当技術分野で公知である。例えば、免疫酵素相互作用は、様々な酵素、例えばペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又は様々な色素原、例えばＤＡＢ、ＡＥＣ又はＦａｓｔ  Ｒｅｄ；又は蛍光標識、例えばＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒなどを使用して視覚化され得る。対比染色は、このような染色が他の検出試薬及び使用される可視化戦略と適合する限り、Ｈ＆Ｅ、ＤＡＰＩ、ヘキストを含み得る。当技術分野で公知のように、増幅試薬は、染色シグナルを強化するために使用され得る。例えば、チラミド試薬が使用され得る。本発明の染色方法は、自動、半自動又は手動システムを含む当業者に明らかな任意の適切な方法又はシステムを使用して行われ得る。
【００３６】
本発明の方法は、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γタンパク質発現をコントロール基準と比較することからなるさらなる工程を含み得る。
【００３７】
ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ遺伝子の検出の場合、「ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γの発現レベル」という用語は、転写産物、例えばＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ遺伝子をコードするｍＲＮＡの量又は濃度を指す。典型的には、ｍＲＮＡ発現のレベルは、細胞１個当たりの転写産物、又は組織１マイクログラム当たりのナノグラムなどの単位で表され得る。タンパク質のレベルは、例えば、組織１マイクログラム当たりのナノグラム、又は培養培地１ミリリットル当たりのナノグラムとして表され得る。あるいは、発現レベルを記載するために、相対単位が用いられ得る。
【００３８】
遺伝子の発現レベルの測定は、当技術分野で周知の様々な技術によって実施され得る。
【００３９】
典型的には、遺伝子の発現レベルは、ｍＲＮＡの量を決定することによって決定され得る。ｍＲＮＡの量を決定するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、最初に、サンプル（例えば、患者から調製された細胞又は組織）に含まれる核酸を、標準的な方法にしたがって、例えば溶解酵素若しくは化学的溶液を使用して抽出するか、又は製造業者の説明書にしたがって核酸結合樹脂によって抽出する。次いで、抽出したｍＲＮＡを、ハイブリダイゼーション（例えば、ノーザンブロット分析、in situハイブリダイゼーション）及び／又は増幅（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）によって検出する。
【００４０】
他の増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写介在増幅法（ＴＭＡ）、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）及び核酸配列ベースの増幅法（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。
【００４１】
少なくとも１０個のヌクレオチドを有する核酸であって、目的のｍＲＮＡに対して配列相補性又は相同性を示す核酸は、本明細書では、ハイブリダイゼーションプローブ又は増幅プライマーとして利用される。このような核酸は、同程度のサイズの相同領域と同一である必要はないが、典型的には少なくとも約８０％同一、より具体的には８５％同一、さらにより具体的には９０〜９５％同一であると理解される。特定の実施態様では、ハイブリダイゼーションを検出するために、検出可能な標識などの適切な手段と組み合わせて、核酸を使用することが有利であろう。
【００４２】
典型的には、例えば、開示されるプローブを使用したターゲット核酸分子の検出を可能にするために、核酸プローブは、１つ以上の標識を含む。in situハイブリダイゼーション手順などの様々な用途において、核酸プローブは、標識（例えば、検出可能な標識）を含む。「検出可能な標識」は、サンプル中のプローブ（特に、結合又はハイブリダイゼーションしたプローブ）の存在又は濃度を示す検出可能なシグナルを産生するために使用され得る分子又は材料である。したがって、標識核酸分子は、サンプル中のターゲット核酸配列（例えば、ゲノムターゲット核酸配列）（標識されたユニークな特異的核酸分子は、これに結合又はハイブリダイゼーションする）の存在又は濃度の指標を提供する。１つ以上の核酸分子（例えば、開示される方法によって作製されたプローブ）と結合した標識は、直接的に又は間接的に検出され得る。標識は、光子（高周波数、マイクロ波周波数、赤外線周波数、可視周波数及び紫外線周波数の光子を含む）の吸収、放出及び／又は散乱を含む任意の公知の又はまだ未発見の機構によって検出され得る。検出可能な標識としては、着色、蛍光、リン光並びに発光分子及び材料、ある物質を別の物質に変換して検出可能な差異を提供する触媒（例えば、酵素）（例えば、無色物質を着色物質に変換することによって、若しくはその逆によって、又は沈殿物を産生するか、若しくはサンプルの濁度を増加させることによって）、抗体結合相互作用によって検出され得るハプテン、並びに常磁性及び磁性分子又は材料が挙げられる。
【００４３】
検出可能な標識の具体例としては、蛍光分子（又は、蛍光色素）が挙げられる。多数の蛍光色素が当業者に公知であり、例えばLife Technologies（以前はInvitrogen）から選択され得る（例えば、The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologiesを参照のこと）。核酸分子（例えば、ユニークな特異的結合領域）に結合（例えば、化学的にコンジュゲート）され得る特定のフルオロフォアの例は、Nazarenko et al.の米国特許第５，８６６，３６６号に提供されており、例えば、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナートスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、アクリジン及び誘導体、例えばアクリジン及びアクリジンイソチオシアナート、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノ−Ｎ−［３ビニルスルホニル］フェニル］ナフタルイミド−３，５−ジスルホナート（ルシファーイエローＶＳ）、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、ブリリアントイエロー、クマリン及び誘導体、例えばクマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１）；シアノシン；４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’，５’’ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナートフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミン五酢酸；４，４’−ジイソチオシアナートジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナートスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアナート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシン及び誘導体、例えばエオシン及びエオシンイソチオシアナート；エリスロシン及び誘導体、例えばエリスロシンＢ及びエリスロシンイソチオシアナート；エチジウム；フルオレセイン及び誘導体、例えば５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’７’ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、及びＱＦＩＴＣ  Ｑ（ＲＩＴＣ）；２’，７’−ジフルオロフルオレセイン（OREGON GREEN（登録商標））；フルオレスカミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアナート；４−メチルウンベリフェロン；オルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラロザニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレン及び誘導体、例えばピレン、ピレンブチラート及びスクシンイミジル１−ピレンブチラート；リアクティブレッド４（シバクロンブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）；ローダミン及び誘導体、例えば６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Ｒｈ���ｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアナート、ローダミングリーン、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１及びスルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアナート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸及びテルビウムキレート誘導体である。他の適切なフルオロフォアとしては、約６１７nmで発光するチオール反応性ユーロピウムキレート（Heyduk and Heyduk, Analyt. Biochem. 248:216-27, 1997; J. Biol. Chem. 274:3315-22, 1999）、並びにＧＦＰ、リサミン（登録商標）、ジエチルアミノクマリン、フルオレセインクロロトリアジニル、ナフトフルオレセイン、４，７−ジクロロローダミン及びキサンテン（Lee et al.の米国特許第５，８００，９９６号に記載されている）及びその誘導体が挙げられる。当業者に公知の他のフルオロフォア、例えばLife Technologies (Invitrogen; Molecular Probes (Eugene, Oreg.)）から入手可能なものも使用され得、ALEXA FLUOR（登録商標）シリーズの色素（例えば、米国特許第５，６９６，１５７号、米国特許第６，１３０，１０１号及び米国特許第６，７１６，９７９号に記載されている）、ＢＯＤＩＰＹシリーズの色素（例えば、米国特許第４，７７４，３３９号、米国特許第５，１８７，２８８号、米国特許第５，２４８，７８２号、米国特許第５，２７４，１１３号、米国特許第５，３３８，８５４号、米国特許第５，４５１，６６３号及び米国特許第５，４３３，８９６号に記載されているジピロメテンホウ素ジフルオリド色素）、カスケードブルー（米国特許第５，１３２，４３２号に記載されているスルホン化ピレンのアミン反応性誘導体）及びマリーナブルー（米国特許第５，８３０，９１２号）が挙げられる。
【００４４】
上記蛍光色素に加えて、蛍光標識は、蛍光ナノ粒子、例えば半導体ナノ結晶、例えばQUANTUM DOTTM（例えば、Life Technologies (QuantumDot Corp, Invitrogen Nanocrystal Technologies, Eugene, Oreg.)から入手される；米国特許第６，８１５，０６４号；米国特許第６，６８２，５９６号；及び米国特許第６，６４９，１３８号も参照のこと）であり得る。半導体ナノ結晶は、サイズ依存性の光学的及び／又は電気的特性を有する微視的な粒子である。一次エネルギー源を半導体ナノ結晶に照射すると、二次的なエネルギーの放出が、半導体ナノ結晶において使用される半導体材料のバンドギャップに相当する周波数で起こる。この放出は、特定の波長の発光又は蛍光として検出され得る。異なるスペクトル特徴を有する半導体ナノ結晶が、米国特許第６，６０２，６７１号に記載されている。例えば、Bruchez et al., Science 281 :20132016, 1998; Chan et al., Science 281:2016-2018, 1998；及び米国特許第６，２７４，３２３号に記載されている技術によって、様々な生物学的分子（ｄＮＴＰ及び／又は核酸を含む）又は基質にカップリングされ得る半導体ナノ結晶。様々な組成の半導体ナノ粒子の形成が、例えば、米国特許第６，９２７，０６９号；米国特許第６，９１４，２５６号；米国特許第６，８５５，２０２号；米国特許第６，７０９，９２９号；米国特許第６，６８９，３３８号；米国特許第６，５００，６２２号；米国特許第６，３０６，７３６号；米国特許第６，２２５，１９８号；米国特許第６，２０７，３９２号；米国特許第６，１１４，０３８号；米国特許第６，０４８，６１６号；米国特許第５，９９０，４７９号；米国特許第５，６９０，８０７号；米国特許第５，５７１，０１８号；米国特許第５，５０５，９２８号；米国特許第５，２６２，３５７号及び米国特許出願公開第２００３／０１６５９５１号並びにＰＣＴ公開公報第９９／２６２９９号（１９９９年５月２７日に公開）に開示されている。異なるスペクトル特徴に基づいて同定可能な別々の半導体ナノ結晶集団が生産され得る。例えば、組成、サイズ又はサイズ及び組成に基づいて異なる色の光を発光する半導体ナノ結晶が生産され得る。例えば、サイズに基づいて異なる波長（５６５nm、６５５nm、７０５nm又は８００nmの発光波長）で発光する量子ドット（これは、本明細書に開示されるプローブ中の蛍光標識として適切である）は、Life Technologies (Carlshad, Calif.)から入手可能である。
【００４５】
さらなる標識としては、例えば、放射性同位体（例えば、３Ｈ）、金属キレート、例えば放射性又は常磁性金属イオンのＤＯＴＡ及びＤＰＴＡキレート、例えばＧｄ３＋、並びにリポソームが挙げられる。
【００４６】
核酸分子と共に使用され得る検出可能な標識としては、酵素、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ又はβ−ラクタマーゼも挙げられる。
【００４７】
あるいは、酵素が、金属学的検出スキームにおいて使用され得る。例えば、銀in situハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）手順は、ハイブリダイゼーションしたゲノムターゲット核酸配列の同定及び位置決定のための金属学的検出スキームを含む。金属学的検出方法は、アルカリホスファターゼなどの酵素を、水溶性金属イオン及び酵素のレドックス不活性基質と組み合わせて使用することを含む。基質は、酵素によってレドックス活性物質に変換され、レドックス活性物質は、金属イオンを還元して、検出可能な沈殿物の形成を引き起こす（例えば、米国特許出願公開第２００５／０１００９７６号、ＰＣＴ公開公報第２００５／００３７７７号及び米国特許出願公開第２００４／０２６５９２２号を参照のこと）。金属学的検出方法はまた、水溶性金属イオン、酸化剤及び還元剤と共に酸化還元酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ）を使用して、やはり検出可能な沈殿物を形成することを含む（例えば、米国特許第６，６７０，１１３号を参照のこと）。
【００４８】
開示される方法を使用して作製されたプローブは、核酸の検出、例えばＩＳＨ手順（例えば、蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、色素産生in situハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）、及び銀in situハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ））又は比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）に使用され得る。
【００４９】
in situハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、中期又は間期染色体調製物との関連でターゲット核酸配列（例えば、ゲノムターゲット核酸配列）を含有するサンプル（例えば、スライド上にマウントされた細胞又は組織サンプル）を、ターゲット核酸配列（例えば、ゲノムターゲット核酸配列）に特異的にハイブリダイゼーション可能な又はそれに特異的な標識プローブと接触させることを含む。場合により、スライドを前処理して、例えば均一なハイブリダイゼーションに干渉し得るパラフィン又は他の材料を除去する。二本鎖核酸を変性させるために、サンプル及びプローブは両方とも、例えば加熱によって処理される。（適切なハイブリダイゼーションバッファー中で製剤化された）プローブ及びサンプルは、ハイブリダイゼーションが起こる（典型的には平衡を達成する）のを可能にする条件下及び十分な時間で合わされる。染色体調製物を洗浄して過剰なプローブを除去し、標準的な技術を使用して、染色体ターゲットの特異的な標識の検出を実施する。
【００５０】
例えば、ビオチニル化プローブは、フルオレセイン標識アビジン又はアビジン−アルカリホスファターゼを使用して検出され得る。蛍光色素の検出のために、蛍光色素は直接検出され得るか、又はサンプルは、例えば、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートアビジンと共にインキュベーションされ得る。必要であれば、ＦＩＴＣシグナルの増幅は、ビオチンコンジュゲートヤギ抗アビジン抗体と共にインキュベーションし、洗浄し、ＦＩＴＣコンジュゲートアビジンと共に二次インキュベーションすることによって行われ得る。酵素活性による検出のために、サンプルは、例えば、ストレプトアビジンと共にインキュベーションされ、洗浄され、ビオチンコンジュゲートアルカリホスファターゼと共にインキュベーションされ、再度洗浄され、（例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）バッファーで）前平衡化され得る。in situハイブリダイゼーション手順の一般的な記載については、例えば、米国特許第４，８８８，２７８号を参照のこと。
【００５１】
ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ及びＳＩＳＨのための多数の手順が当技術分野で公知である。例えば、ＦＩＳＨを実施するための手順は、米国特許第５，４４７，８４１号；米国特許第５，４７２，８４２号；及び米国特許第５，４２７，９３２号；及び例えば、Pir1kel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83:2934-2938, 1986; Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:9138-9142, 1988;及びLichter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:9664-9668, 1988に記載されている。ＣＩＳＨは、例えば、Tanner et al., Am.1. Pathol. 157:1467-1472, 2000及び米国特許第６，９４２，９７０号に記載されている。さらなる検出方法は、米国特許第６，２８０，９２９号に提供されている。
【００５２】
感度、解像度又は他の所望の特性を改善するために、多数の試薬及び検出スキームが、ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ及びＳＩＳＨ手順と併せて用いられ得る。上記で議論されているように、ＦＩＳＨを実施する場合、フルオロフォア（蛍光色素及びQUANTUM DOTS（登録商標）を含む）で標識されたプローブは、光学的に直接検出され得る。あるいは、プローブは、非蛍光分子、例えばハプテン（例えば、以下の非限定的な例：ビオチン、ジゴキシゲニン、ＤＮＰ、及び様々なオキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ニトロアリール、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、チオ尿素、ロテノン、クマリン、クマリンをベースとした化合物、ポドフィロトキシン、ポドフィロトキシンをベースとした化合物、及びその組み合わせ）、リガンド又は他の間接的に検出可能な部分で標識され得る。次いで、このような非蛍光分子で標識されたプローブ（及びそれらが結合するターゲット核酸配列）は、サンプル（例えば、プローブが結合した細胞又は組織サンプル）を、標識検出試薬、例えば選択されたハプテン又はリガンドに特異的な抗体（又は、レセプター若しくは他の特異的な結合パートナー）と接触させることによって検出され得る。検出試薬は、フルオロフォア（例えば、QUANTUM DOTS（登録商標））で、若しくは別の間接的に検出可能な部分で標識され得るか、又はフルオロフォアで標識され得る１つ以上のさらなる特異的結合剤（例えば、二次抗体又は特異的抗体）と接触され得る。
【００５３】
他の例では、プローブ又は特異的結合剤（例えば、抗体、例えば一次抗体、レセプター又は他の結合剤）は、蛍光発生組成物又は発色性組成物を検出可能な蛍光、着色又は別様に検出可能なシグナル（例えば、ＳＩＳＨにおける検出可能な金属粒子の沈着のように）に変換することができる酵素で標識される。上記に示されているように、酵素は直接的に、又はリンカーを介して間接的に関連プローブ又は検出試薬に結合され得る。適切な試薬（例えば、結合試薬）及び化学反応（例えば、リンカー及び結合化学反応）の例は、米国特許出願公開第２００６／０２４６５２４号；米国特許出願公開第２００６／０２４６５２３号及び米国特許出願公開第２００７／０１１７１５３号に記載されている。
【００５４】
当業者であれば、標識プローブ−特異的結合剤のペアを適切に選択することによって、多重検出スキームを作成して、単一のアッセイにおいて（例えば、単一の細胞若しくは組織サンプルにおいて、又は複数の細胞若しくは組織サンプルにおいて）複数のターゲット核酸配列（例えば、ゲノムターゲット核酸配列）の検出を促進し得ることを認識するであろう。例えば、第１のターゲット配列に対応する第１のプローブは、ビオチンなどの第１のハプテンで標識され得る一方、第２のターゲット配列に対応する第２のプローブは、ＤＮＰなどの第２のハプテンで標識され得る。サンプルをプローブに曝露した後、結合したプローブは、サンプルを第１の特異的結合剤（この場合には、第１のフルオロフォア、例えば５８５nmで発光する第１のスペクトル的に区別可能なQUANTUM DOTS（登録商標）で標識されたアビジン）及び第２の特異的結合剤（この場合には、第２のフルオロフォア（例えば、７０５nmで発光する例えば第２のスペクトル的に区別可能なQUANTUM DOTS（登録商標））で標識された抗ＤＮＰ抗体又は抗体フラグメント）と接触させることによって検出され得る。さらなるプローブ／結合剤ペアは、他のスペクトル的に区別可能なフルオロフォアを使用して、多重検出スキームに追加され得る。直接的及び間接的な多数のバリエーション（１工程、２工程又はそれ以上）が想定され得、これらは全て、開示されるプローブ及びアッセイとの関連で適切である。
【００５５】
プローブは、典型的には、１０〜１０００、例えば１０〜８００、より具体的には１５〜７００、典型的には２０〜５００ヌクレオチド長の一本鎖核酸を含む。プライマーは、典型的には、増幅すべき目的の核酸に完全に又はほぼ完全にマッチするように設計された１０〜２５ヌクレオチド長のより短い一本鎖核酸である。プローブ及びプライマーは、それらがハイブリダイゼーションする（すなわち、高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件（最高融解温度Ｔｍ、例えば５０％ホルムアミド、５×又は６×ＳＣＣに相当する。ＳＣＣは、０．１５M ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸Ｎａである）下で、それらが特にハイブリダイゼーションする）核酸に「特異的」である。
【００５６】
上記増幅方法及び検出方法において使用される核酸プライマー又はプローブは、キットとしてアセンブルされ得る。このようなキットは、コンセンサスプライマー及び分子プローブを含む。特定のキットはまた、増幅が起こったかを決定するために必要な成分も含む。キットはまた、例えば、ＰＣＲバッファー及び酵素；ポジティブコントロール配列、反応コントロールプライマー；並びに特異的配列を増幅及び検出するための説明書を含み得る。
【００５７】
特定の実施態様では、本発明の方法は、卵丘細胞から抽出された全ＲＮＡを提供する工程、より具体的には定量的又は半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、前記ＲＮＡを増幅及び特異的プローブに対するハイブリダイゼーションに供する工程を含む。
【００５８】
別の特定の実施態様では、発現レベルは、ＤＮＡチップ分析によって決定される。このようなＤＮＡチップ又は核酸マイクロアレイは、基材（これは、マイクロチップ、スライドガラス又はマイクロスフィアサイズのビーズであり得る）に化学的に結合された様々な核酸プローブからなる。マイクロチップは、ポリマー、プラスチック、樹脂、多糖、シリカ又はシリカベースの材料、炭素、金属、無機ガラス又はニトロセルロースから構成され得る。プローブは、約１０〜約６０塩基対であり得る核酸、例えばｃＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドを含む。発現レベルを決定するために、場合により最初に逆転写に供された試験被験体由来のサンプルを標識し、ハイブリダイゼーション条件でマイクロアレイと接触させると、マイクロアレイ表面に結合されたプローブ配列に相補的なターゲット核酸間で複合体が形成される。次いで、ハイブリダイゼーションした標識複合体を検出し、定量又は半定量し得る。標識は、様々な方法によって、例えば放射性標識又は蛍光標識によって達成され得る。マイクロアレイハイブリダイゼーション技術の多くの変法が、当業者に利用可能である（例えば、Hoheisel, Nature Reviews, Genetics, 2006, 7:200-210を参照のこと）。
【００５９】
遺伝子の発現レベルは、絶対発現レベル又は正規化発現レベルとして表され得る。典型的には、発現レベルは、遺伝子の発現を、患者のガン病期の決定に関連しない遺伝子、例えば構成的に発現されるハウスキーピング遺伝子の発現と比較することによって、前記遺伝子の絶対発現レベルを補正することによって正規化される。正規化のために適切な遺伝子としては、ハウスキーピング遺伝子、例えばアクチン遺伝子ＡＣＴＢ、リボソーム１８Ｓ遺伝子、ＧＵＳＢ、ＰＧＫ１及びＴＦＲＣが挙げられる。本発明によれば、使用したハウスキーピング遺伝子は、ＧＡＰＤＨ、ＧＵＳＢ、ＴＢＰ及びＡＢＬ１であった。この正規化は、あるサンプル、例えば患者サンプルと別のサンプルとの、又は異なる供給源のサンプル間での発現レベルの比較を可能にする。
【００６０】
典型的には、「閾値」、「閾値レベル」、「基準値」又は「カットオフ値」は、実験的、経験的又は理論的に決定され得る。閾値はまた、当業者によって認識されるように、既存の実験的及び／又は臨床的条件に基づいて任意に選択され得る。特に、当業者であれば、本発明の方法にしたがって得られたＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対の発現レベルを，規定の閾値と比較し得る。
【００６１】
特に、前記閾値は、健常個体の集団のＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対の平均発現レベルである。本明細書で使用される「健常個体」という用語は、健康である（すなわち、ガン、特に神経膠芽腫を患っておらず、いかなる医療ケアも必要としない）ことが公知のヒトを示す。
【００６２】
一般に、当業者であれば、生物学的サンプル（特に、例えば健康であることが公知の１００人の個体の神経膠芽腫ガンの生検）中のＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対の発現レベルを決定し得る。次いで、周知の統計分析にしたがって、得られた発現レベルの平均値を決定して、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対の平均発現レベルを得る。次いで、前記値は正常であるとみなされて、閾値を構成する。次いで、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対の発現レベルをこの閾値と比較することによって、医師は、ガンを分類及び予後予測することができる。
【００６３】
したがって、医師は、ガンを患っている重大かつ致命的な状態の被験体の適切な医療ケアを適合及び最適化することができる。前記予後予測の決定は、経過観察及び臨床的意思決定に非常に適切である。
【００６４】
本発明はまた、本発明の方法に有用なキットであって、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ発現を検出するための手段を含むキットに関する。
【００６５】
本発明によれば、本発明のキットは、抗ＤＮＭＴ３Ａタンパク質抗体及び抗ＩＳＧＦ３γ；並びに前記ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ抗体に結合するシグナリングシステムにカップリングされた別の分子、又はＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ遺伝子のｍＲＮＡに結合する任意の分子（例えば、プローブ）を含み得る。
【００６６】
典型的には、抗体又は抗体の組み合わせは、即時使用可能な溶液の形態である。一実施態様では、キットは、即時使用可能な溶液を含む容器を含む。任意の他の形態が本発明によって包含され、当業者であれば、前記形態をルーチンに適合させて、免疫組織化学において使用し得る。
【００６７】
別の実施態様では、本発明は、患者のガン処置応答をモニタリングするためのin vitro方法であって、患者由来のサンプル中のＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対の発現レベルを測定する工程を含むin vitro方法に関する。
【００６８】
したがって、本発明は、抗ガン治療、より具体的には抗神経膠芽腫治療をモニタリングするためのバイオマーカーとしてのＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対の使用に関する。
【００６９】
本発明の別の態様は、高い発現レベルのＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対を有するガンを患っている患者の処置において使用するための、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対のアンタゴニスト又はＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対の発現阻害剤である化合物に関する。
【００７０】
特に、本発明はまた、高い発現レベルのＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対を有する神経膠芽腫を患っている患者の処置において使用するための、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対のアンタゴニスト又はＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対の発現阻害剤である化合物に関する。
【００７１】
治療方法
本発明の第２の態様は、ガンの治療及び予防において使用するための、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γアンタゴニストである化合物又はＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ遺伝子発現阻害剤である化合物に関する。
【００７２】
「ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γアンタゴニスト」は、ＤＮＭＴ３Ａ及び／又はＩＳＧＦ３γの天然リガンドのものと反対の生物学的効果を有する天然又は合成化合物を意味する。本発明によれば、アンタゴニストは、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対に結合し、これらのタンパク質のリガンドと競合することによって、これらのタンパク質の作用を遮断する。アンタゴニストは、天然リガンドの作用を遮断するその能力によって定義される。「ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γアンタゴニスト」という用語は、現在公知の又は将来同定されるであろう任意のＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γアンタゴニストを指し、被験体への投与時に、被験体におけるＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γタンパク質の活性化に関連する生物学的活性（そうでなければその天然リガンドに対するＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γの結合から生じる下流生物学的効果のいずれかを含む）の阻害をもたらす任意の化学実体を含み、あるいは、このようなアンタゴニストは、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γタンパク質のリガンド結合部位又はその一部を占有し、それにより、その正常な生物学的活性が防止又は減少されるように、レセプターがその天然リガンドにアクセス不可能にすることによって作用し得る。一実施態様では、本発明のアンタゴニストは、タンパク質ＩＳＧＦ３γに対するタンパク質ＤＮＭＴ３Ａの結合を遮断し得る。したがって、「ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γアンタゴニスト」は、ＤＮＭＴ３Ａタンパク質又はＩＳＧＦ３γタンパク質に結合する化合物であり得る。
【００７３】
本発明によれば、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γアンタゴニストは、配列番号：３の位置８５〜９９、１０３〜１２９、１７８〜２０７、２３５〜２４６、２５６〜２７３、３３１〜３６０、４０９〜４３３又は５４７〜５７４においてＤＮＭＴ３Ａタンパク質に結合し得、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用を阻害する。
【００７４】
したがって、本発明はまた、それを必要とする被験体におけるガンの予防及び治療のための薬物として使用するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、ｉ）候補化合物を提供する工程、及びｉｉ）ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γを遮断又はアンタゴナイズする候補化合物を選択する工程を含む方法に関する。
【００７５】
さらなる態様では、本発明は、それを必要とする被験体におけるガンの治療及び予防のための薬物として使用するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γを発現する細胞、組織サンプル又は生物を提供して、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ対を提供する工程、
（ｉｉ）候補化合物、例えば小有機分子、内部抗体、ペプチド又はポリペプチドを提供する工程、
（ｉｉｉ）ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γの活性を測定する工程、
（ｉｖ）及び、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γを遮断し、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γの作用を遮断し、又はＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ発現を阻害する候補化合物を積極的に選択する工程
を含む方法に関する。
【００７６】
ＤＮＭＴ３ＡとＩＳＧＦ３γとの間の相互作用を遮断することができるか、又はＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ発現を阻害することができる化合物を同定するために、試験が使用され得る。例えば、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３相互作用をアッセイし、この相互作用を阻害する能力を有する分子を同定するための生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システムを使用する試験が展開し得る。この目的のために、インターＤＮＭＴ３Ａ及びＩＳＧＦ３ｇのｃＤＮＡを、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）実験用に設計されたベクター（ｐＥＹＦＰ及びｐｈＲｌｕｃ、Invitrogen）に挿入する。次に、これらのベクターをＵ２５１細胞（ＧＢＭ細胞株）にトランスフェクションする。アッセイを検証したら、ＢＲＥＴを化合物ライブラリーのスクリーニングに使用する：シグナルの減少は、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３ｇ相互作用を阻害する能力を有する分子の印として解釈される。
【００７７】
「ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ遺伝子発現阻害剤」は、ＤＮＭＴ３Ａ遺伝子発現又はＩＳＧＦ３γ遺伝子発現又はその両方を阻害する天然又は合成化合物を意味する。
【００７８】
このような化合物を同定するために、試験が使用され得る。例えば、ＤＮＭＴ３Ａ及びＩＳＧＦ３発現を阻害する化合物の能力を分析するために、ｑＰＣＲ及びＥＬＩＳＡ実験が実施され得る。
【００７９】
本発明はまた、ガンの治療及び予防において同時使用、個別使用又は逐次使用するための複合調製物としての、ｉ）本発明の化合物、及びｉｉ）化学療法剤に関する。
【００８０】
本発明はまた、ガンの治療及び予防において同時使用、個別使用又は逐次使用するための複合調製物としての、ｉ）本発明の化合物、及びｉｉ）化学療法剤、及びｉｉｉ）放射線療法又は放射線療法剤に関する。
【００８１】
本明細書で使用される「放射線療法」は、ガンマ線、Ｘ線、電子又は光子、外部放射線療法又はキュリー療法からなり得る。
【００８２】
本明細書で使用される「放射線療法剤」という用語は、限定されないが、ガンを処置又は改善するために有効な当業者に公知の任意の放射線療法剤を指すことを意図する。例えば、放射線療法剤は、小線源治療又は放射線核種治療において投与されるものなどの薬剤であり得る。このような方法は、場合により、１つ以上のさらなるガン治療、例えば限定されないが、化学療法及び／又は別の放射線療法の投与をさらに含み得る。
【００８３】
本発明によれば、化学療法剤は、テモゾロミド、５−アザ−２’−デオキシシチジン、テアフラビン３，３’−ジガラート、ゼブラリン、デシタビン、４−アミノ−Ｎ−（４−アミノフェニル）、キノリン系ＳＧＩ−１０２７のベンズアミド類似体（ＰＭＩＤ：２４６７８０２４又は２３２９４３０４であり得る。
【００８４】
一実施態様では、本発明におけるガンは、神経膠芽腫である。
【００８５】
一実施態様では、本発明は、神経膠芽腫の治療及び予防において同時使用、個別使用又は逐次使用するための複合調製物としての、ｉ）本発明の化合物、及びｉｉ）化学療法剤、及びｉｉｉ）放射線療法に関する。
【００８６】
特定の実施態様では、本発明は、神経膠芽腫の治療及び予防において同時使用、個別使用又は逐次使用するための複合調製物としての、ｉ）本発明の化合物、及びｉｉ）テモゾロミド、及びｉｉｉ）放射線療法に関する。
【００８７】
典型的には、本発明の化合物としては、限定されないが、小有機分子、抗体、内部抗体、ナノボディ及びポリペプチドが挙げられる。
【００８８】
一実施態様では、本発明の化合物は、低分子量化合物、例えば（天然又は非天然）小有機分子であり得る。
【００８９】
「小有機分子」という用語は、医薬品において一般に使用される有機分子と同程度のサイズの（天然又は非天然）分子を指す。この用語は、生物学的高分子（例えば、タンパク質、核酸など）を排除する。特定の有機小分子は、最大約１００００Ｄａ、より具体的には最大５０００Ｄａ、より具体的には最大２０００Ｄａ、最も具体的には最大約１０００Ｄａのサイズの範囲内である。
【００９０】
一実施態様では、本発明の化合物は、抗体、内部抗体又はナノボディである。ＤＮＭＴ３Ａ又はＩＳＧＦ３γタンパク質に対する抗体、内部抗体又はナノボディは、公知の方法にしたがって、適切な抗原又はエピトープを、例えばブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ及びマウスから選択される宿主動物に投与することによって生じ得る。当技術分野で公知の様々なアジュバントは、抗体産生を増強するために使用され得る。本発明の実施において有用な抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体であり得る。ＤＮＭＴ３Ａ又はＩＳＧＦ３γタンパク質に対するモノクローナル抗体は、培養液中の連続細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用して調製及び単離され得る。生産及び単離のための技術としては、限定されないが、Kohler and Milstein (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Cote et al., 1983）；及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole et al. 1985）が挙げられる。あるいは、一本鎖抗体の生産について記載されている技術（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）は、抗ＤＮＭＴ３Ａ又は抗ＩＳＧＦ３γタンパク質一本鎖抗体を生産するために適合され得る。本発明の実施において有用な化合物としては、限定されないが、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（これは、インタクトな抗体分子のペプシン消化によって生成され得る）及びＦａｂフラグメント（これは、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成され得る）を含む抗ＤＮＭＴ３Ａ又は抗ＩＳＧＦ３γ抗体フラグメントも挙げられる。あるいは、ＤＮＭＴ３Ａ又はＩＳＧＦ３γタンパク質に対する所望の特異性を有するフラグメントの迅速な同定を可能にするために、Ｆａｂ及び／又はｓｃＦｖ発現ライブラリーが構築され得る。
【００９１】
ヒト化抗ＤＮＭＴ３Ａ又は抗ＩＳＧＦ３γ抗体及びそれらの抗体フラグメントはまた、公知の技術にしたがって調製され得る。「ヒト化抗体」は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含有する非ヒト（例えば、齧歯類）キメラ抗体の形態である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（ＣＤＲ）由来の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基であって、所望の特異性、親和性及び能力を有する残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体に見られない残基を含み得る。抗体性能をさらに改良するために、これらの改変がなされる。一般に、ヒト化抗体は、超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。ヒト化抗体はまた、場合により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含むであろう。ヒト化抗体を作製するための方法は、例えばWinter（米国特許第５，２２５，５３９号）及びBoss（Celltech、米国特許第４，８１６，３９７号）によって記載されている。
【００９２】
次いで、本発明のために、ＤＮＭＴ３Ａ又はＩＳＧＦ３γの中和抗体が選択される。
【００９３】
一実施態様では、本発明の化合物は、抗ＤＮＭＴ３Ａ抗体である。
【００９４】
特定の実施態様では、本発明の抗体は、Abcamが買収したａｂ２３５６５抗体又はSantaCruzが買収したＨ−２９５抗体であり得る。
【００９５】
別の実施態様では、本発明の化合物は、抗ＩＳＧＦ３γ抗体である。
【００９６】
一実施態様では、本発明の化合物は、アプタマーである。アプタマーは、分子認識の点で抗体の代替物を代表する分子クラスである。アプタマーは、高い親和性及び特異性を有する任意のクラスのターゲット分子を実質的に認識する能力を有するオリゴヌクレオチド又はオリゴペプチド配列である。こようなリガンドは、Tuerk C. and Gold L., 1990に記載されているように、ランダム配列ライブラリーの試験管内進化法（ＳＥＬＥＸ）によって単離され得る。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成によって取得可能である。このライブラリーでは、各メンバーは、ユニークな配列の最終的には化学的に改変された線状オリゴマーである。このクラスの分子の可能な改変、使用及び利点は、Jayasena S.D., 1999に概説されている。ペプチドアプタマーは、ツーハイブリッド法（Colas et al., 1996）によってコンビナトリアルライブラリーから選択されたプラットフォームタンパク質（例えば、E. coliチオレドキシンＡ）によってディスプレイされた、立体配座的に制限された抗体可変領域からなる。
【００９７】
次いで、本発明のために、ＤＮＭＴ３Ａ又はＩＳＧＦ３γの中和アプタマーが選択される。
【００９８】
一実施態様では、本発明の化合物は、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質である。
【００９９】
特定の実施態様では、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、ＤＮＭＴ３Ａ又はＩＳＧＦ３γの機能的等価物であり得る。本明細書で使用されるＤＮＭＴ３Ａ又はＩＳＧＦ３γの「機能的等価物」は、ＤＮＭＴ３Ａ又はＩＳＧＦ３γに結合することができる化合物である。「機能的等価物」又は「機能保存変異体」という用語は、ＤＮＭＴ３Ａ又はＩＳＧＦ３γのフラグメント、突然変異体及び突然変異タンパク質を含む。したがって、「機能的に等価な」という用語は、アミノ酸配列の変更、例えば１つ以上のアミノ酸の欠失、置換又は付加によって得られるＤＮＭＴ３Ａ又はＩＳＧＦ３γの任意の等価物を含む。アミノ酸置換は、例えば、アミノ酸配列をコードするＤＮＡの点突然変異によって行われ得る。
【０１００】
機能的等価物は、可溶型のＤＮＭＴ３Ａ又はＩＳＧＦ３γを含む。適切な可溶型のこれらのタンパク質又はその機能的等価物は、例えば、化学的方法、タンパク質分解方法又はリコンビナント方法によって膜貫通ドメインが除去された切断型のタンパク質を含み得る。
【０１０１】
特に、機能的等価物は、対応するタンパク質と少なくとも８０％相同である。特定の実施態様では、機能的等価物は、任意の従来の分析アルゴリズム、例えばPileup配列分析ソフトウェア（Program Manual for the Wisconsin Package, 1996）によって評価した場合に少なくとも９０％相同である。
【０１０２】
本明細書で使用される「機能的に等価なフラグメント」という用語もまた、ＤＮＭＴ３Ａ又はＩＳＧＦ３γの任意のフラグメント又はフラグメントアセンブリを意味し得る。
【０１０３】
機能的に等価なフラグメントは、本明細書で同定されたＤＮＭＴ３Ａ又はＩＳＧＦ３γと同じタンパク質ファミリーに属し得る。「タンパク質ファミリー」は、共通の機能を共有し、共通の配列相同性を示す一群のタンパク質を意味する。相同タンパク質は、非ヒト種に由来し得る。特に、機能的に等価なタンパク質配列間の相同性は、完全タンパク質のアミノ酸配列の全体にわたって少なくとも２５％である。より具体的には、相同性は、タンパク質又はタンパク質フラグメントのアミノ酸配列の全体にわたって少なくとも５０％、さらにより具体的には７５％である。より具体的には、相同性は、配列の全体にわたって８０％超である。より具体的には、相同性は、配列の全体にわたって９０％超である。より具体的には、相同性は、配列の全体にわたって９５％超である。
【０１０４】
当業者に明らかであるように、本発明のポリペプチドは、任意の適切な手段によって生産され得る。本発明にしたがって使用するための十分な量の本発明のペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質又はそれらの機能的等価物を生産するために、発現は、好都合には、適切な条件下で、本発明のポリペプチドを含有するリコンビナント宿主細胞を培養することによって達成され得る。特に、ポリペプチドは、リコンビナント手段によって、コード核酸分子から発現させることによって生産される。様々な異なる宿主細胞においてポリペプチドをクローニング及び発現するための系が周知である。
【０１０５】
リコンビナント型で発現される場合、ポリペプチドは、宿主細胞においてコード核酸から発現させることによって生成され得る。特定の系の個々の要件に応じて、任意の宿主細胞が使用され得る。適切な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母及びバキュロウイルス系が挙げられる。異種ポリペプチドの発現のための当技術分野で利用可能な哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞などが挙げられる。細菌は容易に操作及び成長し得るので、細菌はまた、リコンビナントタンパク質の生産のための宿主である。一般的な細菌宿主は、E coliである。
【０１０６】
特定の実施態様では、本発明の治療方法において使用されるポリペプチドは、その治療効果を改善するために改変され得ることが企図される。治療用化合物のこのような改変は、毒性を減少させ、循環時間を増加させ、又は生体内分布を改変するために使用され得る。例えば、潜在的に重要な治療用化合物の毒性は、生体内分布を改変する様々な薬物担体ビヒクルと組み合わせることによって有意に減少させ得る。例えば、ジペプチドの追加は、内因性トランスポーターを使用することによって、血液網膜関門を通過する眼内の循環剤の透過性を改善し得る。
【０１０７】
薬物のバイアビリティを改善するための戦略は、水溶性ポリマーの利用である。様々な水溶性ポリマーが、生体内分布を改変し、細胞取り込みの様式を改善し、生理学的障壁を通過する透過性を変化させ；体からのクリアランス速度を改変することが示されている。ターゲティング又は持続放出効果のいずれかを達成するために、末端基として、骨格の一部として、又はポリマー鎖上のペンダント基として薬物部分を含有する水溶性ポリマーが合成されている。
【０１０８】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、その高度の生体適合性及び改変の容易性を考慮して、薬物担体として広く使用されている。様々な薬物、タンパク質及びリポソームへの結合は、滞留時間を改善し、毒性を減少させることが示されている。ＰＥＧは、鎖の末端のヒドロキシル基を通じて、及び他の化学的方法を介して、活性剤にカップリングされ得る；しかしながら、ＰＥＧそれ自体は、１分子当たり多くとも２つの活性剤に制限される。異なるアプローチでは、ＰＥＧの生体適合特性を保持するが、１分子当たりの結合点が多数であるというさらなる利点を有し（より大きな薬物ローディングを提供する）、様々な用途に適するように合成的に設計され得る新規生体材料として、ＰＥＧとアミノ酸とのコポリマーを探索した。
【０１０９】
当業者であれば、薬物の有効な改変のためのＰＥＧ化技術を把握している。例えば、ＰＥＧ及び三官能性モノマー、例えばリジンの交互ポリマーからなる薬物送達ポリマーが、VectraMed (Plainsboro, N.J.)によって使用されている。ＰＥＧ鎖（典型的には、２０００ダルトン以下）は、安定なウレタン結合を介してリジンのａ−及びｅ−アミノ基に連結される。このようなコポリマーは、ポリマー鎖に沿って所定の間隔で厳密にコントロールされた反応性ペンダント基（リジンのカルボン酸基）を提供しながら、ＰＥＧの望ましい特性を保持する。反応性ペンダント基は、誘導体化、架橋又は他の分子とのコンジュゲーションに使用され得る。これらのポリマーは、ポリマーの分子量、ＰＥＧセグメントの分子量、及び薬物とポリマーとの間の切断可能な結合を変化させることによって、長く循環する安定なプロドラッグを生産するのに有用である。ＰＥＧセグメントの分子量は、薬物／連結基複合体の間隔及びコンジュゲートの分子量当たりの薬物の量（より小さなＰＥＧセグメントは、より大きな薬物ローディングを提供する）に影響を及ぼす。一般に、ブロックコポリマーコンジュゲートの全体的な分子量の増加は、コンジュゲートの循環半減期を増加させるであろう。それにもかかわらず、コンジュゲートは、容易に分解可能であるか、又は許容限度糸球体ろ過（例えば、６０キロダルトン未満）未満の分子量を有しなければならない。
【０１１０】
ポリマー骨格は、循環半減期及び生体内分布の維持において重要であることに加えて、リンカーは、ターゲット組織における特定のトリガー、典型的には酵素活性によって骨格ポリマーから放出されるまで、治療剤をプロドラッグ形態に維持するために使用され得る。例えば、生体内分布の特定部位への送達が必要である場合、この種の組織活性化薬物送達が特に有用であり、治療剤は、病変部位又はその近くに放出される。活性化薬物送達において使用するための連結基ライブラリーは当業者に公知であり、酵素動態、活性酵素の蔓延、及び選択される疾患特異的酵素の切断特異性に基づき得る。このようなリンカーは、治療送達について本明細書に記載されるタンパク質又はタンパク質フラグメントの改変において使用され得る。
【０１１１】
一実施態様では、本発明のペプチドは、ペプチドＰ１（配列番号：１）である。
【０１１２】
したがって、本発明はまた、アミノ酸配列：ＲＰＭＰＲＬＴＦＱＡＧＤＰＹＹＩ（配列番号：１）を含むペプチド又はその機能保存変異体に関する。
【０１１３】
したがって、配列番号：１のアミノ酸配列を含むペプチド又は機能保存変異体は、ガンを治療又は予防するために使用され得る。
【０１１４】
したがって、特定の実施態様によれば、本発明は、ガンの治療及び予防において同時使用、個別使用又は逐次使用するための複合調製物としての、ｉ）ペプチドＰ１（配列番号：１）又はその機能保存変異体である化合物、及びｉｉ）テモゾロミドに関する。
【０１１５】
したがって、特定の実施態様によれば、本発明は、神経膠芽腫の治療及び予防において同時使用、個別使用又は逐次使用するための複合調製物としての、ｉ）ペプチドＰ１（配列番号：１）又はその機能保存変異体である化合物、及びｉｉ）テモゾロミドに関する。
【０１１６】
したがって、特定の実施態様によれば、本発明は、ガンの治療及び予防において同時使用、個別使用又は逐次使用するための複合調製物としての、ｉ）ペプチドＰ１（配列番号：１）である化合物、及びｉｉ）テモゾロミド、及びｉｉｉ）放射線療法に関する。
【０１１７】
したがって、特定の実施態様によれば、本発明は、神経膠芽腫の治療及び予防において同時使用、個別使用又は逐次使用するための複合調製物としての、ｉ）ペプチドＰ１（配列番号：１）である化合物、及びｉｉ）テモゾロミド、及びｉｉｉ）放射線療法に関する。
【０１１８】
一実施態様では、化合物は、ペプチドＰ１の機能的に等価なフラグメントである。
【０１１９】
一実施態様では、配列番号：１のペプチドＰ１は、化学療法剤、特にテモゾロミドに対して感受性ガン細胞に使用される。
Ｐ１：配列番号：１：ＲＰＭＰＲＬＴＦＱＡＧＤＰＹＹＩ
Ｐ１ｍｕｔ：配列番号：２：ＲＰＭＰＲＬＴＡＱＡＧＡＰＹＹＩ
【０１２０】
特定の実施態様では、本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列を含むペプチド又はその機能保存変異体に関する。
【０１２１】
本発明はまた、本明細書で上記に記載される配列番号：１を含むペプチドの機能保存変異体であるペプチドを包含する。
【０１２２】
一実施態様では、本発明のペプチドは、配列番号：１と１、２又は３アミノ酸異なり得る。
【０１２３】
別の実施態様では、本発明のペプチドは、配列番号：１と４又は５アミノ酸異なり得る。
【０１２４】
一実施態様では、本発明のペプチドは、前記配列番号：１の全体にわたって少なくとも７５％、特により好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の同一性を含み、腫瘍細胞増殖を依然として減少させることができるか、又は腫瘍細胞においてＰＣＤを依然として誘導することができる。
【０１２５】
一実施態様では、本発明のペプチドは、配列番号：１に示されているアミノ酸配列、又は配列番号：１と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％若しくは９９．９％の同一性を含むその変異体であって、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用を依然として破壊することができるその変異体からなる。
【０１２６】
新たに作製したペプチドがＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用の破壊を誘導するかを検証するために、上記試験が実施され得る。
【０１２７】
本発明の一実施態様では、前記ペプチドは、本明細書で上記に定義される配列番号：１のアミノ酸配列を含む５０アミノ酸長未満のアミノ酸配列である。
【０１２８】
本発明の別の実施態様では、前記可溶性ペプチドは、本明細書で上記に定義される配列番号：１のアミノ酸配列を含む４５アミノ酸長未満のアミノ酸配列である。
【０１２９】
本発明の別の実施態様では、前記可溶性ペプチドは、本明細書で上記に定義される配列番号：１のアミノ酸配列を含む４０アミノ酸長未満のアミノ酸配列である。
【０１３０】
本発明の別の実施態様では、前記可溶性ペプチドは、本明細書で上記に定義される配列番号：１のアミノ酸配列を含む３０アミノ酸長未満のアミノ酸配列である。
【０１３１】
本発明の別の実施態様では、前記可溶性ペプチドは、本明細書で上記に定義される配列番号：１のアミノ酸配列を含む２０アミノ酸長未満のアミノ酸配列である。
【０１３２】
本発明の別の実施態様では、前記可溶性ペプチドは、本明細書で上記に定義される配列番号：１のアミノ酸配列を含む１５アミノ酸長未満のアミノ酸配列である。
【０１３３】
いくつかの実施態様では、本発明のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質、特にペプチドＰ１は、少なくとも１つの細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）と連結される。
【０１３４】
「細胞透過性ペプチド」又は「ＣＰＰ」という用語は互換的に使用され、カチオン性細胞透過性ペプチド（輸送ペプチド、担体ペプチド又はペプチドトランスダクションドメインとも称される）を指す。本明細書で示されているように、ＣＰＰは、所定の細胞培養集団の細胞の３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％内で（その間の全ての整数を含む）、ＣＰＰに融合されたペプチドの細胞透過性を誘導する能力を有し、全身投与時にin vivoで複数の組織内における高分子のトランスロケーションを可能にする。細胞透過性ペプチドはまた、適切な条件下で細胞と接触させると、受動拡散よりも有意に大きな条件で外部環境から細胞内環境（細胞質、細胞小器官、例えばミトコンドリア又は細胞の核を含む）に入るペプチドを指し得る。このような透過性ペプチドは、Fonseca S.B. et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 2009, 61: 953-964、Johansson et al., Methods in Molecular Biology, 2011, Vol. 683, Chapter 17、Bechara and Sagan, (2013) FEBS letters 587, 1693-1702.; Jones and Sayers (2012), Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society 161, 582-591; Khafagy el and Morishita, (2012) Advanced drug delivery reviews 64, 531-539; Malhi and Murthy, (2012) Expert opinion on drug delivery 9, 909-935、国際公開公報第２００４／０１１５９５号及び国際公開公報第２００３／０１１８９８号に記載されているものであり得る。これらのＣＰＰは全て、参照により組み入れられる。
【０１３５】
特定の実施態様では、細胞透過性ペプチドは、Ｔａｔペプチド、ポリアルギニンペプチド、ＨＡ２−Ｒ９ペプチド、ペネトラチンペプチド、トランスポータンペプチド、Vectocell（登録商標）ペプチド、マウロカルシンペプチド、デカリジンペプチド、ＨＩＶ−Ｔａｔ由来ＰＴＤ４ペプチド、Ｂ型肝炎ウイルストランスロケーションモチーフ（ＰＴＭ）ペプチド、ｍＰｒＰ１−２８ペプチド、ＰＯＤ、ｐＶＥＣ、ＥＢ１、Ｒａｔｈ、ＣＡＤＹ、ヒスタチン５、Ａｎｔｐペプチド、Ｃｙｔ８６−１０１ペプチド、ＤＰＴペプチドを含み又はからなる。
【０１３６】
別の特定の実施態様では、本発明のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、２つ、３つ又はそれ以上の透過性ペプチドに連結される。
【０１３７】
別の実施態様では、本発明の化合物は、ＤＮＭＴ３Ａ又はＩＳＧＦ３γ遺伝子発現の阻害剤である。
【０１３８】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もまた、本発明において使用するためのＤＮＭＴ３Ａ又はＩＳＧＦ３γ発現阻害剤として機能し得る。
【０１３９】
ＤＮＭＴ３Ａ又はＩＳＧＦ３γ遺伝子発現は、ＤＮＭＴ３Ａ又はＩＳＧＦ３γ遺伝子発現が特異的に阻害されるように、被験体又は細胞と、低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）又は低分子二本鎖ＲＮＡの生成を引き起こすベクター若しくは構築物とを接触させることによって減少され得る（すなわち、ＲＮＡ干渉又はＲＮＡｉ）。その配列が公知の遺伝子について、適切なｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡをコードするベクターを選択するための方法は、当技術分野で周知である（例えば、Tuschl, T. et al. (1999); Elbashir, S. M. et al. (2001); Hannon, GJ. (2002); McManus, MT. et al. (2002); Brummelkamp, TR. et al. (2002)；米国特許第６，５７３，０９９号及び米国特許第６，５０６，５５９号；並びに国際公開公報第０１／３６６４６号、国際公開公報第９９／３２６１９号及び国際公開公報第０１／６８８３６号を参照のこと）。
【０１４０】
一実施態様では、ｍｉＲＮＡは、ＤＮＭＴ３Ａ又はＩＳＧＦ３γ遺伝子発現の阻害剤として使用され得る。例えば、ｍｉＲＮＡ−２９ａ及びｂ、ｍｉＲＮＡ−１４３、ｍｉＲＮＡ−１０１並びにｍｉＲＮＡ  ３６９は、ＤＮＭＴ３Ａ遺伝子発現を阻害するために使用され得、ｍｉＲＮＡ−１０６は、ＩＳＧＦ３Ｇ遺伝子発現を阻害するために使用され得る。
【０１４１】
リボザイムもまた、本発明において使用するためのＤＮＭＴ３Ａ又はＩＳＧＦ３γ遺伝子発現阻害剤として機能し得る。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機構は、相補的ターゲットＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、それに続くエンドヌクレアーゼ切断を含む。それにより、ＤＮＭＴ３Ａ又はＩＳＧＦ３γ  ｍＲＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ切断を特異的及び効率的に触媒する人工ヘアピン又はハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は、本発明の範囲内で有用である。最初に、リボザイム切断部位（これらとしては、典型的には、以下の配列ＧＵＡ、ＧＵＵ及びＧＵＣが挙げられる）についてターゲット分子をスキャンすることによって、任意のＲＮＡターゲット候補内の特異的リボザイム切断部位を同定する。同定したら、切断部位を含有するターゲット遺伝子の領域に対応する約１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド配列を不適切なものにし得る予測構造的特徴（例えば、二次構造）について評価し得る。また、例えば、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへのアクセシビリティを試験することによって、候補ターゲットの適切性を評価し得る。
【０１４２】
ＤＮＭＴ３Ａ又はＩＳＧＦ３γ遺伝子発現阻害剤として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムは両方とも、公知の方法によって調製され得る。これらとしては、例えば、固相ホスホラミダイト化学合成などによるによる化学合成技術が挙げられる。あるいは、アンチセンスＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のin vitro又はin vivo転写によって作製され得る。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７又はＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターが組み込まれた多種多様なベクターに組み込まれ得る。本発明のオリゴヌクレオチドに対する様々な改変は、細胞内安定性及び半減期を増加させる手段として導入され得る。可能な改変としては、限定されないが、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチドフランキング配列を分子の５’及び／若しくは３’末端に付加すること、又はホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエート若しくは２’−Ｏ−メチルをオリゴヌクレオチド骨格内で使用することが挙げられる。
【０１４３】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ及びリボザイムは、単独で又はベクターに結合してin vivo送達され得る。その最も広い意味において、「ベクター」は、細胞（特に、ＤＮＭＴ３Ａ又はＩＳＧＦ３γを発現する細胞）へのアンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ又はリボザイム核酸の運搬を促進することができる任意のビヒクルである。特に、ベクターは、ベクターの非存在下で起こり得る分解の程度と比べて減少した分解で、核酸を細胞に輸送する。一般に、本発明において有用なベクターとしては、限定されないが、アンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ又はリボザイム核酸配列の挿入又は組み込みによって操作されたプラスミド、ファージミド、ウイルス、ウイルス源又は細菌源に由来する他のビヒクルが挙げられる。ウイルスベクターは特定の種類のベクターであり、限定されないが、以下のウイルス：レトロウイルス、例えばモロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳ガンウイルス、及びラウス肉腫ウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン・バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；及びＲＮＡウイルス、例えばレトロウイルスに由来する核酸配列が挙げられる。命名されていないが当技術分野で公知の他のベクターを容易に用い得る。
【０１４４】
特定のウイルスベクターは、非必須遺伝子が目的の遺伝子で置換されている非細胞変性真核生物ウイルスをベースとするものである。非細胞変性ウイルスとしては、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）が挙げられ、その生活環は、ゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写と、それに続くプロウイルスの宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを含む。レトロウイルスは、ヒト遺伝子治療試験に承認されている。最も有用なのは、複製欠損性（すなわち、所望のタンパク質の合成を指令することができるが、感染性粒子を製造することができない）レトロウイルスである。このような遺伝子改変レトロウイルス発現ベクターは、in vivoにおける高効率な遺伝子トランスダクションについて一般的な有用性を有する。複製欠損性レトロウイルスを生産するための標準的なプロトコール（外因性遺伝物質をプラスミドに組み込む工程、プラスミドでパッケージング細胞株をトランスフェクションする工程、パッケージング細胞株によってリコンビナントレトロウイルスを生産する工程、組織培養培地からウイルス粒子を回収する工程、及びウイルス粒子をターゲット細胞に感染させる工程を含む）は、Kriegler, 1990及びMurry, 1991に提供されている。
【０１４５】
特定の用途のための特定のウイルスは、遺伝子治療におけるヒトへの使用が既に承認されている二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルス及びアデノ随伴（ＡＡＶ）ウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、複製欠損性となるように操作され得、広範囲の細胞型及び種に感染することができる。それはさらに、熱安定性及び脂質溶媒安定性；造血細胞を含む多様な系統の細胞における高いトランスダクション頻度；並びに、重複感染阻害がないので複数回のトランスダクションが可能であるなどの利点を有する。報告によれば、アデノ随伴ウイルスを部位特異的にヒト細胞ＤＮＡに組み込むことにより、挿入突然変異誘発の可能性及びレトロウイルス感染に特徴的な挿入遺伝子の発現の変動性を最小限にし得る。加えて、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択圧の非存在下で１００継代回以上にわたって組織培養液中で観察されており、これは、アデノ随伴ウイルスのゲノム組み込みが、比較的安定な事象であることを意味する。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外でも機能し得る。
【０１４６】
他のベクターとしては、プラスミドベクターが挙げられる。プラスミドベクターは当技術分野で広く記載されており、当業者に周知である。例えば、Sambrook et al., 1989を参照のこと。ここ数年間では、プラスミドベクターは、in vivoにおいて抗原コード遺伝子を細胞に送達するためのＤＮＡワクチンとして使用されている。それらは、ウイルスベクターの多くと同じ安全上の懸念がないので、特に有利である。しかしながら、宿主細胞と適合性のプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内で作動可能にコードされた遺伝子からペプチドを発現し得る。いくつかの一般に使用されるプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０及びｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが挙げられる。他のプラスミドは、当業者に周知である。加えて、プラスミドは、ＤＮＡの特定のフラグメントを除去及び付加する制限酵素及びライゲーション反応を使用してカスタム設計され得る。プラスミドは、様々な非経口経路、粘膜経路及び局所経路によって送達され得る。例えば、ＤＮＡプラスミドは、筋肉内、眼、皮内、皮下、又は他の経路によって注射され得る。それはまた、鼻腔内スプレー又は点鼻液、直腸坐剤によって、及び経口的に投与され得る。それはまた、遺伝子銃を使用して表皮又は粘膜表面に投与され得る。プラスミドを水溶液に加えてもよいし、金粒子上に乾燥してもよいし、又は別のＤＮＡ送達システム（限定されないが、リポソーム、デンドリマー、コクリエート及びマイクロカプセル化を含む）と併用してもよい。
【０１４７】
特定の実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はリボザイム核酸配列は、異種調節領域、例えば異種プロモーターのコントロール下にある。プロモーターは、ミュラーグリア細胞、小膠細胞、内皮細胞、周皮細胞及び星状細胞に特異的であり得る。例えば、ミュラーグリア細胞における特異的発現は、グルタミン合成酵素遺伝子のプロモーターを通じて得られ得る。プロモーターはまた、例えば、ウイルスプロモーター、例えばＣＭＶプロモーター又は任意の合成プロモーターであり得る。
【０１４８】
本発明の別の目的は、ガンを治療及び予防するための方法であって、治療有効量のＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γアンタゴニストである化合物又はＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ遺伝子発現阻害剤である化合物を、それを必要とする被験体に投与することを含む方法に関する。
【０１４９】
一実施態様では、本発明は、神経膠芽腫を治療及び予防するための方法であって、治療有効量のＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γアンタゴニストである化合物又はＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ遺伝子発現阻害剤である化合物を、それを必要とする被験体に投与することを含む方法に関する。
【０１５０】
治療用組成物
本発明の別の目的は、ガンの治療及び予防において使用するための治療用組成物であって、本発明の化合物を含む治療用組成物に関する。
【０１５１】
一実施態様では、本発明は、神経膠芽腫の治療及び予防において使用するための治療用組成物であって、本発明の化合物を含む治療用組成物に関する。
【０１５２】
治療用組成物を形成するために、本発明の任意の治療剤は、薬学的に許容し得る賦形剤及び場合により持続放出マトリックス、例えば生分解性ポリマーと組み合わせられ得る。
【０１５３】
「薬学的に」又は「薬学的に許容し得る」は、必要に応じて哺乳動物、特にヒトに投与した場合に、有害反応、アレルギー反応又は他の望ましくない反応を引き起こさない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容し得る担体又は賦形剤は、任意の種類の無毒の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、封入材料又は製剤化助剤を指す。
【０１５４】
当然のことながら、医薬組成物の形態、投与経路、投与量及びレジメンは、処置すべき症状、病気の重症度、患者の年齢、体重及び性別などに依存する。
【０１５５】
本発明の医薬組成物は、局所投与、経口投与、鼻腔内投与、非経口投与、眼内投与、静脈内投与、筋肉内投与又は皮下投与などのために製剤化され得る。
【０１５６】
特に、医薬組成物は、注射可能な製剤のための薬学的に許容し得るビヒクルを含有する。これらは、特に、等張滅菌生理食塩水溶液（リン酸一ナトリウム又は二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム又は塩化マグネシウムなど又はこのような塩の混合物）、又は乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物（これは、場合に応じて滅菌水又は生理学的食塩水が追加されると、注射液の構成を可能にする）であり得る。
【０１５７】
投与に使用される用量は、様々なパラメータに応じて、特に使用される投与様式、関連病変、あるいは所望の処置期間に応じて適合され得る。
【０１５８】
加えて、他の薬学的に許容し得る形態としては、例えば、錠剤又は他の経口投与用固体；徐放性カプセルが挙げられ；任意の他の形態が現在使用され得る。
【０１５９】
本発明の医薬組成物は、さらなる治療活性剤を含み得る。本発明はまた、本発明の化合物及びさらなる治療活性剤を含むキットに関する。
【０１６０】
一実施態様では、前記治療活性剤は、抗ガン剤であり得る。
【０１６１】
以下の図面及び実施例によって、本発明をさらに説明する。しかしながら、これらの実施例及び図面は、決して本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】高レベルのＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用は、予後不良因子である。カプラン・マイヤー曲線は、高（Ｈ）レベル及び低（Ｌ）レベルのＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用を有する患者間の全生存（ＯＳ）の差異を示す。ｐ値は、コックス比例ハザード生存回帰試験を実施することによって得られる。
【図２】ＤＮＭＴ３ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用の特異的破壊。Ａ及びＢ．ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用に対する、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ結合領域を模倣するペプチドの影響。画像及びグラフは、３回の独立したプルダウン実験の代表的なものである。Ｉ：インプット。ｔ検定を実施することによって、ｐ値を得た。
【図３】確立された腫瘍のスイスヌードマウスモデルにおける、Ｐ１ペプチドをＴＭＺと合わせた処置の効果。Ａ．実験の設計。腫瘍の確立は、２．１０６個のＰＣＴＣ−ＧＢＭを注射して、体積が１００mm3±３３．３に等しい腫瘍が形成されたことを示す。次いで、示されている処置でマウスを処置した。Ｄ：日、ｗ：週、ｉｔ：腫瘍内、ｉｐ：腹腔内。Ｂ．グラフは、確立された腫瘍の腫瘍重量に対する４つの検討処置の影響を示す。白丸は、マウスを表す。黒丸は、各処置について得られた平均±標準偏差を表す。ｔ検定を実施することによって、ｐ値を得た。
【実施例】
【０１６３】
材料及び方法
患者の特徴。
外科的切除の日から死亡まで、全生存を測定した。各腫瘍の悪性度では、本研究に含まれる患者全員が、同様の管理及び同様の処置（ＧＢＭのためのテモゾロミド（ＴＭＺ）を含む）を受けた。フランスの法律及びFrench National Committee of Ethicの勧告にしたがって、患者の資料及び記録（診断、年齢、性別、死亡日、カルノフスキー・パフォーマンス・スコア（ＫＰＳ））を秘密厳守で使用した。
【０１６４】
初代培養腫瘍細胞（ＰＣＴＣ）。
Laennec Hospital (Nantes/Saint-Herblain, France)の脳神経外科サービスから入手した新鮮な脳腫瘍組織を採取し、切除後３０分以内に加工した。臨床プロトコールはフランスの倫理法によって承認され、被験者全員からインフォームド・コンセントを得た。以前に記載されている技術にしたがって、機械的解離後に、初代培養腫瘍細胞を得た。簡潔に言えば、腫瘍組織を１〜５mm3切片に切断し、１０％ＦＢＳ及び抗生物質を含むＤＭＥＭを含む６０mm2組織培養皿にプレーティングした。加えて同時に、細分化した腫瘍切片を、ＰＢＳ中で２００U/mlコラゲナーゼＩ（Sigma, France）及び５００U/ml ＤＮａｓｅＩ（Sigma, France）と共に、激しく一定撹拌しながら３７℃で１時間インキュベーションした。単一細胞懸濁液を70 mm cell strainer (BD Falcon, France)でろ過し、ＰＢＳで洗浄し、ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳに懸濁した。続いて、コンフルエントになったら細胞培養物を１：２に分割し、３〜５継代前に実験を行った。
【０１６５】
近接ライゲーションin situアッセイ（Ｐ−ＬＩＳＡ）。
細胞を、カバースリップ上で２４時間培養した。次いで、細胞を、４％パラホルムアルデヒドＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を用いて室温で１５分間固定した。透過処理を、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳを用いて室温で２０分間実施する。製造業者の説明書（Olink Bioscience, Sweden）にしたがって、ブロッキング、染色、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、増幅及び検出工程を行った。全てのインキュベーションを湿度チャンバー内で実施した。増幅及び検出工程を暗室で実施した。ApoTomeモジュール（Ｘ６３及び開放値１．４）を備えるAxiovert 200M microscopy system (Zeiss, Le Pecq, France)を使用することによって、蛍光を可視化した。ＤＡＰＩを含むProLong Gold antifade reagent (Life Technologies, France)を使用することによって、調製物をマウントした。構造化照明顕微鏡法で、画像取得を行った。デコンボリューション（3.5 Huygens Essential software (SVI)）後、Amira.4.1.1 programを使用することによって、３Ｄ図を得た。最後に、www.cb.uu.se/~amin/BlobFinderからダウンロード可能なフリーウェア「BlobFinder」を使用することによって、画像を分析した。したがって、核を自動的に同定することができるので、本発明者らは、核１個当たりのいずれかのシグナル数を得た。
【０１６６】
エピトープマッピング。
MultiPep peptide synthesizer (Intavis AG, Cologne, Germany)を使用して、ペプチドを、４００nmol/cm2のローディング容量でAmino-PEG500-UC540膜上にスポットした。合成後、膜を乾燥させ、次いで、９５％トリフルオロ酢酸、３％トリイソプロピル、２％Ｈ２Ｏを含有するカクテルで１時間切断することによって、キャッピングされた側鎖を脱保護した。トリフルオロ酢酸を除去し、膜をジクロロメタンでリンスし、続いてジメチルホルムアルデヒドでリンスし、次いでエタノールでリンスした。膜を飽和させてから、検討リコンビナントタンパク質と共に室温で２時間インキュベーションした。その後、それを３回洗浄し、蛍光色素にカップリングされた抗体を使用して、陽性ペプチドを明らかにした。Typhoon (GE Healthcare, France)を使用して、蛍光を決定した。スポットしたペプチドに対する検討リコンビナントタンパク質の結合強度を、ImageJソフトウェアを使用した定量によって決定し、配列特異的な正規化単位に変換した。所定のアミノ酸をカバーする各ペプチドについて得られた強度を加え、ペプチドの数で割った。
【０１６７】
プルダウンアッセイ。
GST/His Tagged-Protein Interaction Pull-Down Kits (Thermo Scientific, France)を使用することによって、プルダウンアッセイを実施した。簡潔に言えば、ベイトタンパク質１００μgを、穏やかに混合しながら４℃で１時間インキュベーションしてカラム上に固定化した。洗浄後、プレイタンパク質１μgを、回転プラットホーム上で穏やかに揺動運動させながら４℃で１時間かけて追加した。洗浄及び溶出後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法によって、「ベイト−プレイ」の相互作用を分析した。検討ペプチドを３７℃で１時間プレインキュベーションすることによって、競合プルダウン実験を行った。
【０１６８】
ウエスタンブロット分析。
簡潔に言えば、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、タンパク質をサイズ分画した。タンパク質をニトロセルロース又はＰＶＤＦ膜上に転写した。SNAP i.（商標）Protein Detection System (Millipore, France)を使用することによって、飽和及びブロッティングを行った。ECL（商標）(Amersham Biosciences, France)及び／又はSuperSignal west femto Maximum Sensitivity (Thermo Scientific, France)化学発光試薬を使用して、タンパク質の検出を実施した。FusionX7 Imager (Fisher Scientific, France)を使用して、タンパク質の検出を実施した。
【０１６９】
エレクトロポレーションによる細胞へのペプチドの移入。
エレクトロポレーションのために、ＮＬＳ配列をペプチドに追加した。指数増殖期中に、細胞をトリプシン処理によって回収し、元の培地に再懸濁した。それらをＰＢＳ、ｐＨ７．２（０．１４M ＮａＣｌ、２mM ＫＣｌ、８mM Ｎａ２ＨＰＯ４及び１．５mM ＮａＨ２ＰＯ４）で洗浄し、細胞０．６×１０６個／mlの濃度で元の培養培地に再懸濁した。次に、細胞懸濁液０．８mlをペプチド（５０μg/ml）と混合し、室温で１０分間放置し、disposable 0.4 cm Bio-Rad electroporation cuvette (Bio-Rad, France)に追加した。等容量のＤＭＳＯを、コントロール（未処置とも称される）として使用するためのペプチドを含まない細胞懸濁液に追加した。最初に、蛍光色素lucifer yellow (Sigma, France)の取り込みによるフローサイトメトリーによって、各細胞株のエレクトロポレーション効率を決定した。Gene-Pulser (Bio-Rad, France)で細胞を１パルスに暴露して、エレクトロポレーションを行った。以下のパラメータを使用した：キュベットギャップ０．４cm、電圧０．３kV、時定数３５ミリ秒及びコンデンサ９６０μF。エレクトロポレーション後、細胞を、室温で１０分間放置することによって回収し、次いで、エレクトロポレーションチャンバーから取り出し、ＰＢＳで２回洗浄し、元の培養培地２mlに再懸濁した。
【０１７０】
グローバルＤＮＡメチル化の尺度。
QiaAmp DNA mini Kit (Qiagen, France)を使用することによって、ＤＮＡを抽出した。次に、製造業者の説明書にしたがってMethylamp Global DNA methylation Quantification kit (Euromedex-Epigentek, France)を使用して、５−メチルシトシンの存在を定量することによって、グローバルＤＮＡメチル化を推定した。
【０１７１】
細胞死の尺度。
トリパンブルー染色０．４％及びCountess（登録商標）Automated Cell Counter (Life Technologies, France)を使用することによって、細胞死の割合を評価した。以前に記載されているように、テモゾロミド（２５μM）及び放射線照射（２Gy）を使用して、細胞死を誘導した。
【０１７２】
増殖アッセイ及び倍加時間。
Doubling Time Online Calculator website (Roth V. 2006, http://www.doubling-time.com/compute.php)を使用し、１０３個の細胞の増殖を１２０時間にわたってカウントすることによって、倍加時間（すなわち、量のサイズが２倍になるために必要な時間）を計算した。Countess（登録商標）Automated Cell Counter (Life Technologies, France)を使用して、細胞数を１２０時間にわたって２４時間ごとに決定した。
【０１７３】
遊走アッセイ−スクラッチ試験。
スクラッチ技術を使用して、細胞遊走アッセイを実施した。細胞を８０〜９０％で６ウェルプレートにプレーティングし、（細胞増殖の影響を排除するために）１０μg/mlマイトマイシンＣ（Sigma, Farnce）で２時間処理した。次いで、細胞をスクラッチした。顕微鏡検査によって、細胞遊走をモニタリングした。各サンプルについて取得した画像を定量的に分析した。各画像について、スクラッチの一方の側と他方の側との間の距離を測定した。時間０から最後の時点（２４時間）までの画像を比較することによって、本発明者らは、測定した距離に基づいて各スクラッチ閉鎖の距離を得る。
【０１７４】
浸潤アッセイ。
全ての手順は、製造業者の説明書（QCM 24-Well Collagen-Based Cell Invasion Assay, Millipore, France）にしたがっていた。簡潔に言えば、２×１０５個の細胞を含有する無血清培地２００μlを浸潤チャンバーに播種し、完全培地５００μlを含有する２４ウェルプレートに入れた。３７℃で７２時間インキュベーションした後、チャンバーから培地を除去し、チャンバーを染色溶液中に室温で２０分間置くことによって、細胞を染色した。チャンバーの上面から、非浸潤細胞を慎重に除去した。染色されたチャンバーを、抽出バッファー２００μlを含有するクリーンウェルに室温で１５分間挿入した。チャンバーから抽出した染色溶液１００μlを９６ウェルプレートに移し、分光光度計を用いて光学密度を５６０nmで測定した。
【０１７５】
腫瘍形成アッセイ。
培養細胞をトリプシン処理によって回収し、洗浄し、生理食塩水バッファーに再懸濁した。細胞懸濁液を、等容量のmatrigel matrix (Becton Dickinson, France)と共に２ｘ１０６個の細胞を含むＰＢＳ ０．０５mlとして、７／８週齢のヌードＮＭＲＩ−ｎｕ雌性マウス（Janvier, France）の側腹部に皮下（ｓ．ｃ．）注射した。腫瘍確立の後、腫瘍内注射（ｉｔ）によって、マウスをテモゾロミド及び／又はペプチドで処置した。腫瘍重量を求めるために、各腫瘍を外科的に摘出し、計量する。Institutional Animal Care and the French National Committee of Ethicsのガイドラインにしたがって、動物を使用した全ての実験手順を行った。
【０１７６】
統計分析。
全ての実験を少なくともトリプケートで行った。スチューデントｔ検定を使用して、平均の差の有意性を計算した。カプラン・マイヤー法にしたがって生存曲線をプロットし、（例えば、対応する図に示されているように）コックス比例ハザード生存回帰分析によって比較した。ピアソン検定を使用して、２つのパラメータ間の相関の有意性を計算した。
【０１７７】
結果
高レベルのＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用は、テモゾロミド／放射線照射誘導性細胞死に対する低レベルの感受性と相関する。
ＤＮＭＴ３ＡとＤＮＭＴ３Ａ結合タンパク質（Ｄ３ＡＢＰ）との間の相互作用の存在が、その神経膠腫細胞がテモゾロミド／放射線照射処置に対して耐性表現型を有するＧＢＭ患者の亜集団の同定を可能にし得るかを決定するために、本発明者らは、患者由来の生検から３１個の初代培養腫瘍細胞（ＰＣＴＣ）を確立した。次いで、これらのＰＣＴＣを使用して、特定のＤＮＭＴ３Ａ／Ｄ３Ａ−ＢＰ相互作用の数とテモゾロミド／放射線照射誘導性（ＴＭＺ／ＩＲ誘導性）細胞死の割合との間の推定相関を評価した（データは示さず）。本発明者らなどがその存在を既に実証しているので［Fuks F et al., 2001及びHervouet E et al., 2009］、本発明者らの研究では、本発明者らは、ＤＮＭＴ３Ａ／ＨＤＡＣ１、ＤＮＭＴ３Ａ／ＡＰ２α、ＤＮＭＴ３Ａ／ＧＡＴＡ１及びＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用に焦点を当てた。近接ライゲーションin situアッセイ（Ｐ−ＬＩＳＡ）を使用して、目的の相互作用をモニタリングした。トリパンブルー法を使用することによって、ＴＭＺ／ＩＲ誘導性細胞死の割合を推定した（データは示さず）。目的のＤＮＭＴ３Ａ／Ｄ３Ａ−ＢＰ相互作用の数及びＴＭＺ／ＩＲ誘導性細胞死の割合を互いにプロットした（データは示さず）。ピアソン相関検定を使用した統計分析により、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用の数とＴＭＺ／ＩＲ誘導性細胞死の割合との間においてのみ、有意な逆相関が示された（ｐ＝０．００２）（データは示さず）。これらの結果により、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γは、ＴＭＺ／ＩＲ処置に対する神経膠腫細胞の予後不良応答において重要な役割を果たし得ることが示唆された。
【０１７８】
高レベルのＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用は、予後不良因子である。
腫瘍生検に見られるＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用レベルに基づいて、３１人の患者を２つの群に分けた。１５人の患者由来の腫瘍は、（ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用の中央値１２．５よりも高い）高レベルのＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用を発現した一方、１６人の患者は、１２．５以下のＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用を有していた。カプラン・マイヤー法によって全生存曲線を推定し、コックス比例ハザード生存回帰分析と比較した（図１）。その腫瘍が高レベルのＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用を有していた患者と、その腫瘍が有していなかった者との間では、全生存について有意差が観察された（ｐ＝０．００９２）。これらのデータは、高レベルのＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用が予後不良因子であることを示している。
【０１７９】
ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用の特異的破壊。
高レベルのＤＮＭＴ３ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用は、テモゾロミド／放射線照射処置に対する予後不良応答に関連し、全生存の予後不良に関連していたという二重事実は、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用を治療ターゲットとして使用することができることを示唆している。
【０１８０】
ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用を阻害することを目的とする治療戦略を開発するために、本発明者らは、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用を特性評価することを目的とする一連の実験を実施した。この一連の実験では、ＩＳＧＦ３γとのＤＮＭＴ３Ａ相互作用のアミノ酸領域を同定するために、エピトープマッピング分析を実施した。したがって、ＤＮＭＴ３Ａの一次配列を、１０残基が重複する１２ｍｅｒのペプチドに分解し、ニトロセルロース膜に共有結合させた。ＧＳＴタンパク質（２μg）のインキュベーションも抗ＩＳＧＦ３γ抗体の使用も陽性ペプチドの検出を誘導しないことを観察するために、２つのネガティブコントロールを実施した（データは示さず）。次いで、ＧＳＴ−ＩＳＧＦ３γタンパク質２μgを膜と共にインキュベーションした。次いで、Thyphoon及び抗ＩＳＧＦ３γ抗体を使用することによって、ＧＳＴ−ＩＳＧＦ３γとの相互作用について陽性ペプチドを検出した（データは示さず）。蛍光定量後、ＧＳＴ−ＩＳＧＦ３γと相互作用するＤＮＭＴ３Ａのアミノ酸の配列を決定した（データは示さず）。したがって、本発明者らは、ＤＮＭＴ３Ａタンパク質配列の配列８５〜９９、１０３〜１２９、１７８〜２０７、２３５〜２４６、２５６〜２７３、３３１〜３６０、４０９〜４３３及び５４７〜５７４がＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用に関与していたことを観察した。
【０１８１】
ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用に対するこれらのアミノ酸ドメインの影響を検証するために、本発明者らは、これらのドメインからペプチドを生成して、これらのペプチドが、プルダウンアッセイにおいてＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用を阻害する能力を試験した（データは示さず）。このようにして、本発明者らは、Ｐ１（ＲＰＭＰＲＬＴＦＱＡＧＤＰＹＹＩ、配列番号：１）のみがＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用を阻害したことを認めた（図２Ａ）。１）突然変異Ｐ１ペプチド（Ｐ１ｍｕｔ、ＲＰＭＰＲＬＴＡＱＡＧＡＰＹＹＩ、配列番号：２）は、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用を阻害せず（図２Ａ）、２）漸増濃度のＰ１ペプチドの存在下では、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用が減少した（図２Ｂ）という事実によって、Ｐ１がＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用を阻害する効率も補強された。
【０１８２】
次に、近接ライゲーションin situアッセイ（Ｐ−ＬＩＳＡ）を使用して、細胞におけるＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用をモニタリングした。これらの実験では、本発明者らは、ＰＣＴＣ（ＰＣＴＣ＃１と称される）を使用した。エレクトロポレーションを使用して、Ｐ１を細胞にトランスフェクションした。エレクトロポレーションの１２時間後に、Ｐ−ＬＩＳＡを実施した。このようにして、本発明者らは、Ｐ１ｍｕｔの非存在下においてＰ１で細胞を処置した場合に、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用を表す赤色の点が減少したことを認めた（データは示さず）。
【０１８３】
全てのこれらの結果により、Ｐ１ペプチドは、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用の破壊を誘導したことが示された。
【０１８４】
Ｐ１ペプチドの特異的効果。
ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用を阻害するように、Ｐ１を設計した。しかしながら、Ｐ１はまた、ＤＮＭＴ３とＤ３Ａ−ＢＰとの間に存在する他の相互作用に影響を与える可能性があった。この点を調査するために、本発明者らは、目的のＤＮＭＴ３Ａ／Ｄ３Ａ−ＢＰ相互作用に対するＰ１の影響を分析した。本発明者らは、Ｐ１が、ＰＣＴＣ＃１におけるＤＮＭＴ３Ａ／ＧＡＴＡ１、ＤＮＭＴ３Ａ／ＡＰ２γ及びＤＮＭＴ３Ａ／ＨＤＡＣ１相互作用の完全性に対して効果を有しないことを認めた。
【０１８５】
全ての相互作用の分析は不可能であるので、本発明者らは、Ｐ１が多数のＤＮＭＴ３Ａ／Ｄ３Ａ−ＢＰ相互作用を阻害したならば、低メチル化表現型が観察され得るだろうと仮定した。推定Ｐ１誘導性ＤＮＡ低メチル化を観察するために、ＰＣＴＣ＃１をＰ１で３０日間処置した（データは示さず）。他のＤＮＭＴ阻害剤（５−アザ−２−デオキシシチジン（５−アザ）、テアフラビン３，３ジガラート（ＤＮＭＴ３Ａ阻害剤、以下ではＴＦＤと称される）又はペプチド（ＵＰペプチド、ＤＮＭＴ１／ＰＣＮＡ／ＵＨＲＦ１相互作用を阻害するペプチド））もまた、コントロール条件として使用した。５−メチルシトシンのグローバルレベルをモニタリングするＥＬＩＳＡにより、Ｐ１は５−メチルシトシンのグローバルレベルに対して効果を有していなかった一方、５−アザ、ＴＦＤ及びＵＰ処置はＤＮＡメチル化のグローバルレベルを減少させたことが明らかになった（データは示さず）。
【０１８６】
これらのデータに基づいて、本発明者らは、Ｐ１が、グローバルＤＮＡ低メチル化を促進せずに、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用を特異的に破壊すると思われると結論する。
【０１８７】
ガン特質／表現型に対するＰ１ペプチドの影響。
次いで、本発明者らは、増殖レベル、浸潤、遊走及びアポトーシスの回避（又はより具体的には、治療処置によって誘導されるアポトーシスの感受性）を含むいくつかのガン特質／表現型に対するＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用のＰ１誘導性破壊の影響を決定した。この目的のために、前記のように、細胞をＰ１及びＴＤＦで処置した。
【０１８８】
治療処置によって誘導されるアポトーシスの感受性に対するＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用のＰ１誘導性破壊の影響を評価するために、抗ＧＢＭ処置では、テモゾロミド（ＴＭＺ）及び放射線照射を合わせるので［Cheray M et al., 2013 and Louis D et al., 2007］、本発明者らは、テモゾロミド＋放射線照射誘導性細胞死の割合を測定した。結果は、Ｐ１及びＴＤＦ処置細胞の細胞死の割合が増加し、Ｐ１処置細胞の細胞死の割合は、ＴＤＦで得られたものよりも高かったことを示している。したがって、本発明者らは、Ｐ１がテモゾロミド＋放射線照射誘導性細胞死の増感剤として作用すると結論する。
【０１８９】
増殖に対するＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用のＰ１誘導性破壊の影響を推定するために、本発明者らは、倍加時間を計算した。本発明者らは、Ｐ１及びＴＦＤ処置が両方とも、細胞の倍加時間に対して効果を有しないことを見出した（データは示さず）。
【０１９０】
次に、遊走能力に対するＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用のＰ１誘導性破壊の影響を、スクラッチ試験アッセイを実施することによって推定した。結果は、Ｐ１処置が細胞遊走を減少させた一方、ＴＦＤ処置は細胞遊走に対して効果を有していなかったことを示している。
【０１９１】
次に、細胞浸潤に対するＰ１及びＴＦＤ処置の影響を、コラーゲンベースの細胞浸潤アッセイを実施することによって推定した。結果は、Ｐ１が細胞浸潤特徴を改変しなかった一方、ＴＤＦ処置は細胞浸潤を促進したことを示している。
【０１９２】
これらのデータを要約すると、本発明者らは、ペプチド／処置がガン特質を増強した場合には−１とし、ペプチド／処置がガン特質を改変しなかった場合には０とし、ペプチド／処置がガン特質を阻害した場合には＋１とすることによって、ガン特質のモデュレーションスコア（ＳＭｏＣＨ）を作成及び計算した。したがって、正のＳＭｏＣＨは、検討ペプチド／処置は、それがガン特質を促進するよりも阻害するので、その利益／リスクバランスが、検討ペプチド／処置を抗ガン治療において使用するのに有利であることを示唆している。結果は、Ｐ１処置がこの状況にあることを示しているので、本発明者らは、Ｐ１処置が抗ガン治療において効率的であり得ると結論した。
【０１９３】
確立された腫瘍のスイスヌードマウスモデルにおける、Ｐ１ペプチドをＴＭＺと合わせた処置の効果。
標準的な抗ＧＢＭ処置は、化学療法剤としてテモゾロミドを使用するので、次に、本発明者らは、確立された腫瘍のスイスヌードマウスモデルにおける、Ｐ１ペプチドをＴＭＺと合わせた処置の効果を調査した。この目的のために、（高レベルのＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用を有する）２ｘ１０６個の神経膠腫細胞を１６匹のスイスヌードマウスに皮下注射した（図３Ａ）。次に、腫瘍体積が１００mm3になったら、４匹のマウスを無作為に処置せず、ＴＭＺ、ＴＭＺ＋Ｐ１、ＴＭＺ＋Ｐ１ｍｕｔ又はＰ１（それぞれＴ１及びＴ５と称される）で処置した。３週間の処置後、未処置マウスとＴＭＺのみで処置したマウスとの間、及び未処置マウスとＰ１で処置したマウスとの間では、統計学的差が観察されなかったので（図３Ｂ）、本発明者らは、ＴＭＺ処置が、腫瘍成長を制限するために非効率的であったことを認めた。より興味深いことに、本発明者らは、ＴＭＺ＋Ｐ１処置が腫瘍体積を減少させた一方、ＴＭＺ＋Ｐ１ｍｕｔ処置は腫瘍成長を減少させるために非効率的であることを認めた。したがって、本発明者らのデータにより、Ｐ１とＴＭＺとの併用は、腫瘍成長のＴＭＺ誘導性減少を促進したことが示された。
【０１９４】
Ｐ１ペプチドの使用は、グローバルＤＮＡ低メチル化及びＭＧＭＴ脱メチル化を促進しない。
【０１９５】
神経膠腫では、ＭＧＭＴメチル化は、ＴＭＺ及び放射線照射を含む抗神経膠腫処置の応答良好に関連する［Esteller M et al., 2000 and Hegi M et al., 2005］。したがって、本発明者らは、Ｐ１の使用が、ＭＧＭＴのメチル化レベルをモデュレーションし得るかを分析した。ｑＭＳＰ実験により、細胞をＰ１で処置した場合、ＭＧＭＴのメチル化レベルは不変のままであることが示された（データは示さず）
【０１９６】
参考文献：
本出願を通して、様々な参考文献が、本発明が関係する技術水準を説明する。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年4月15日(2020.4.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガンの治療及び予防における使用のための、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γアンタゴニストであり、そしてＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用を阻害する化合物を含む、医薬組成物。
【請求項２】
ガンの治療及び予防における同時、個別又は逐次使用のための複合調製物としての、ｉ）ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用を阻害するＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γアンタゴニスト、及びｉｉ）化学療法剤及びｉｉｉ）放射線療法又は放射線療法剤。
【請求項３】
アミノ酸配列ＲＰＭＰＲＬＴＦＱＡＧＤＰＹＹＩ（配列番号：１）又は配列番号：１と少なくとも７５％同一性を含むその変異体を含み、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用を破壊することができるペプチドを含む医薬組成物であって、ペプチドは５０アミノ酸長未満のアミノ酸配列である、医薬組成物。
【請求項４】
ガンの治療及び予防における使用のための、請求項３に記載のペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項５】
神経膠芽腫の治療及び予防において同時使用、個別使用又は逐次使用するための複合調製物としての、ｉ）配列番号：１の配列又は配列番号：１と少なくとも７５％同一性を含むその変異体の、ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用を破壊することができる化合物、及びｉｉ）テモゾロミド及びｉｉｉ）放射線療法。
【請求項６】
さらに許容しうる賦形剤を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
それを必要とする被験体におけるガンの予防及び治療のための薬物として使用するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、ｉ）候補化合物を提供する工程、及びｉｉ）ＤＮＭＴ３Ａ／ＩＳＧＦ３γ相互作用を遮断又はアンタゴナイズする候補化合物を選択する工程を含む、方法。
【外国語明細書】
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