(57)【要約】【課題】本発明は、グルコースから高い効率で脂肪族化合物または芳香族化合物を合成可能な、糖代謝経路が改変された微生物を提供する。【解決手段】以下の特徴を有する、糖代謝経路が改変された微生物：（１）ホスホトランスフェラーゼ系を喪失していること、（２）ガラクトースパーミアーゼおよびグルコキナーゼの発現を備えていること、（３）解糖系とトリカルボン酸回路を繋ぐ代謝経路を喪失していること、ならびに（４）（４a）キシロースとトリカルボン酸回路を繋ぐ代謝経路を備えていること、または（４b）(i)６-ホスホグルコン酸を２-ケト-３-デオキシ-６-ホスホグルコン酸に代謝する経路を喪失していること、および(ii)L-セリンをピルビン酸およびアンモニアに代謝する経路を喪失していること。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の特徴を有する、糖代謝経路が改変された微生物：
（１）ホスホトランスフェラーゼ系を喪失していること、
（２）ガラクトースパーミアーゼおよびグルコキナーゼの発現を備えていること、
（３）解糖系とトリカルボン酸回路を繋ぐ代謝経路を喪失していること、ならびに
（４）（４a）キシロースとトリカルボン酸回路を繋ぐ代謝経路を備えていること、または
（４b）(i)６-ホスホグルコン酸を２-ケト-３-デオキシ-６-ホスホグルコン酸に代謝する経路を喪失していること、および
(ii)L-セリンをピルビン酸およびアンモニアに代謝する経路を喪失していること。
【請求項２】
（１）ホスホトランスフェラーゼ系を喪失していることが、ホスホエノールピルビン酸をピルビン酸に代謝する経路を喪失していることを含む、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
（１）ホスホエノールピルビン酸をピルビン酸に代謝する経路を喪失していることが、ptsHおよび/またはptsIによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していることを含む、請求項２に記載の微生物。
【請求項４】
（２）ガラクトースパーミアーゼおよびグルコキナーゼの発現を備えていることが、微生物がgalPを含む発現ベクターおよびglkを含む発現ベクターを含有することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項５】
（３）解糖系とトリカルボン酸回路を繋ぐ代謝経路を喪失していることによってシキミ酸経路が阻害されないことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項６】
（３）解糖系とトリカルボン酸回路を繋ぐ代謝経路を喪失していることが、以下を含む、請求項５に記載の微生物：
（i）2-ケト-3-デオキシ-6-ホスホグルコン酸をピルビン酸とグリセルアルデヒド-3-リン酸に代謝する経路を喪失していること、
（ii）ホスホエノールピルビン酸をピルビン酸に代謝する経路を喪失していること、
（iii）ピルビン酸をホスホエノールピルビン酸に代謝する経路を喪失していること、
（iv）ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に代謝する経路を喪失していること、および
（v）オキサロ酢酸をホスホエノールピルビン酸に代謝する経路を喪失していること。
【請求項７】
（３）（i）2-ケト-3-デオキシ-6-ホスホグルコン酸をピルビン酸とグリセルアルデヒド-3-リン酸に代謝する経路を喪失していることが、edaによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していることを含む、請求項６に記載の微生物。
【請求項８】
（３）（ii）ホスホエノールピルビン酸をピルビン酸に代謝する経路を喪失していることが、pykAおよびpykFによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していることを含む、請求項６または７に記載の微生物。
【請求項９】
（３）（iii）ピルビン酸をホスホエノールピルビン酸に代謝する経路を喪失していることが、ppsAによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していることを含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１０】
（３）（iv）ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に代謝する経路を喪失していることが、ppcによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していることを含む、請求項６〜９のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１１】
（３）（v）オキサロ酢酸をホスホエノールピルビン酸に代謝する経路を喪失している
ことが、pckAによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していることを含む、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１２】
（４a）キシロースとトリカルボン酸回路を繋ぐ代謝経路を備えていることが、キシロースをピルビン酸とグルコアルデヒドに代謝する経路を備えていることを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１３】
（４a）キシロースをピルビン酸とグルコアルデヒドに代謝する経路を備えていることが、以下を含む、請求項１２に記載の微生物：
（i）キシロースをキシロノラクトンに代謝する経路を備えていること、
（ii）キシロノラクトンをキシロン酸に代謝する経路を備えていること、
（iii）キシロン酸を2-ケト-3-デオキシ-キシロン酸に代謝する経路を備えていること、および
（iv）2-ケト-3-デオキシ-キシロン酸をグルコアルデヒドとピルビン酸に代謝する経路を備えていること。
【請求項１４】
（４a）（i）キシロースをキシロノラクトンに代謝する経路を備えていることが、xdhによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む、請求項１３に記載の微生物。
【請求項１５】
（４a）（ii）キシロノラクトンをキシロン酸に代謝する経路を備えていることが、xylCによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む、請求項１３または１４に記載の微生物。
【請求項１６】
（４a）（iii）キシロン酸を2-ケト-3-デオキシ-キシロン酸に代謝する経路を備えていることが、yjhGによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１７】
（４a）（iv）2-ケト-3-デオキシ-キシロン酸をグルコアルデヒドとピルビン酸に代謝する経路を備えていることが、yjhHによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１８】
シキミ酸経路の中間代謝産物から脂肪族化合物を合成する代謝経路をさらに備えている、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１９】
脂肪族化合物が、ムコン酸である、請求項１８に記載の微生物。
【請求項２０】
シキミ酸経路の中間代謝産物からムコン酸を合成する代謝経路を備えていることが、以下を含む、請求項１９に記載の微生物：
（i）デヒドロシキミ酸をプロトカテク酸に代謝する経路を備えていること、
（ii）プロトカテク酸をカテコールに代謝する経路を備えていること、および
（iii）カテコールをムコン酸に代謝する経路を備えていること。
【請求項２１】
（i）デヒドロシキミ酸をプロトカテク酸に代謝する経路を備えていることが、aroZによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む、請求項２０に記載の微生物。
【請求項２２】
（ii）プロトカテク酸をカテコールに代謝する経路を備えていることが、aroYによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む、請求項２０または２１に記載の微生物。
【請求項２３】
（iii）カテコールをムコン酸に代謝する経路を備えていることが、catAによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項２４】
シキミ酸経路の中間代謝産物から芳香族化合物を合成する代謝経路をさらに備えている、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項２５】
芳香族化合物が、サリチル酸である、請求項２４に記載の微生物。
【請求項２６】
シキミ酸経路の中間代謝産物からサリチル酸を合成する代謝経路を備えていることが、以下を含む、請求項２５に記載の微生物：
（i）コリスミ酸をイソコリスミ酸に代謝する経路を備えていること、および
（ii）イソコリスミ酸をサリチル酸に代謝する経路を備えていること。
【請求項２７】
（i）コリスミ酸をイソコリスミ酸に代謝する経路を備えていることが、menFによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む、請求項２６に記載の微生物。
【請求項２８】
（ii）イソコリスミ酸をサリチル酸に代謝する経路を備えていることが、pchBによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む、請求項２６または２７に記載の微生物。
【請求項２９】
（４b）（i）６-ホスホグルコン酸を２-ケト-３-デオキシ-６-ホスホグルコン酸に代謝する経路を喪失していることが、eddによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していることを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項３０】
（４b）（ii）L-セリンをピルビン酸およびアンモニアに代謝する経路を喪失していることが、以下を含む、請求項１〜１１および２９のいずれか１項に記載の微生物：
（A）sdaAによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していること、
（B）sdaBによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していること、および
（C）tdcGによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していること。
【請求項３１】
さらに以下の特徴を有する、請求項２９または３０に記載の微生物：
(a)オキサロ酢酸とアセチルCoAをクエン酸とCoAに代謝する経路が増幅されている、
(b)イソクエン酸をグリオキシル酸とコハク酸に代謝する経路が増幅されている、
(c)グリオキシル酸をリンゴ酸に代謝する経路が増幅されている、および
(d)リンゴ酸をオキサロ酢酸に代謝する経路が増幅されている。
【請求項３２】
(a)オキサロ酢酸とアセチルCoAをクエン酸とCoAに代謝する経路が増幅されていることが、gltAによってコードされるタンパク質によって代謝される経路が増幅されていることを含む、請求項３１に記載の微生物。
【請求項３３】
(b)イソクエン酸をグリオキシル酸とコハク酸に代謝する経路が増幅されていることが、(i)aceAによってコードされるタンパク質によって代謝される経路が増幅されていることおよび(ii)iclRによってコードされるタンパク質によるaceAの転写抑制が喪失されていることを含む、請求項３１または３２に記載の微生物。
【請求項３４】
(c)グリオキシル酸をリンゴ酸に代謝する経路が増幅されていることが、(i)aceBによってコードされるタンパク質によって代謝される経路が増幅されていることおよび(ii)iclRによってコードされるタンパク質によるaceBの転写抑制が喪失されていることを含む、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項３５】
(d)リンゴ酸をオキサロ酢酸に代謝する経路が増幅されていることが、mdhによってコードされるタンパク質によって代謝される経路が増幅されていることを含む、請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項３６】
シキミ酸経路の中間代謝産物からピルビン酸の合成を伴う代謝経路をさらに備えている、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項３７】
シキミ酸経路の中間代謝産物からピルビン酸の合成を伴う代謝経路を備えていることが、以下を含む、請求項３６に記載の微生物：
（i）コリスミ酸をイソコリスミ酸に代謝する経路を備えていること、および
（ii）イソコリスミ酸をサリチル酸に代謝する経路を備えていること。
【請求項３８】
（i）コリスミ酸をイソコリスミ酸に代謝する経路を備えていることが、menFによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む、請求項３７に記載の微生物。
【請求項３９】
（ii）イソコリスミ酸をサリチル酸に代謝する経路を備えていることが、pchBによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む、請求項３７または３８に記載の微生物。
【請求項４０】
シキミ酸経路の中間代謝産物からピルビン酸の合成を伴う代謝経路を備えていることが、以下を含む、請求項３６に記載の微生物：
（i）コリスミ酸を3-ヒドロキシ安息香酸に代謝する経路を備えていること、
（ii）3-ヒドロキシ安息香酸をゲンチシン酸に代謝する経路を備えていること、
（iii）ゲンチシン酸をマレイルピルビン酸に代謝する経路を備えていること、および
（iv）マレイルピルビン酸をマレイン酸に代謝する経路を備えていること。
【請求項４１】
（i）コリスミ酸を3-ヒドロキシ安息香酸に代謝する経路を備えていることが、hyg5によってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む、請求項４０に記載の微生物。
【請求項４２】
（ii）3-ヒドロキシ安息香酸をゲンチシン酸に代謝する経路を備えていることが、3hb6hによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む、請求項４０または４１に記載の微生物。
【請求項４３】
（iii）ゲンチシン酸をマレイルピルビン酸に代謝する経路を備えていることが、mpsによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項４４】
（iv）マレイルピルビン酸をマレイン酸に代謝する経路を備えていることが、hbzFによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項４５】
大腸菌である、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項４６】
請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の微生物を培地で培養することを含む、脂肪族化合物の製造方法。
【請求項４７】
請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の微生物を培地で培養することを含む、芳香族化合物の製造方法。
【請求項４８】
培地がグルコースおよびキシロースを含む、請求項４６または４７に記載の製造方法。
【請求項４９】
培地中のグルコースおよびキシロースの濃度比が１：１である、請求項４８に記載の製造方法。
【請求項５０】
微生物が大腸菌である、請求項４６〜４９のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（１）ホスホトランスフェラーゼ系を喪失していること、（２）ガラクトースパーミアーゼおよびグルコキナーゼの発現を備えていること、（３）解糖系とトリカルボン酸回路を繋ぐ代謝経路を喪失していること、ならびに（４）（４a）キシロースとトリカルボン酸回路を繋ぐ代謝経路を備えていること、または（４b）(i)６-ホスホグルコン酸を２-ケト-３-デオキシ-６-ホスホグルコン酸に代謝する経路を喪失していること、および(ii)セリンをピルビン酸に代謝する経路を喪失していること、という特徴を有する、糖代謝経路が改変された微生物およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌を宿主とした有用物質の生産では、基質となる糖を高収率で目的化合物へと変換することが重要である。しかしながら、大腸菌が取り込んだ糖は目的化合物の生産以外にも細胞増殖やエネルギー生産に使用されるため、実際に得られる収率は理論収率よりもかなり低い値となる点が課題である。目的化合物の生産経路と競合する、大腸菌に内在する代謝経路を破壊する代謝改変は、この課題に対する有効な解決策の一つである。しかし、そのような代謝改変が行われた大腸菌は、目的化合物の収率が向上するが、生存に必要な代謝経路が破壊されているため、最少培地では増殖できずに死滅する点がしばしば問題となる。特に解糖系からトリカルボン酸回路への炭素流を遮断するような代謝経路の破壊は、大腸菌が細胞増殖に必須な代謝物生産およびエネルギー生産が行えず致死となる（非特許文献１）。このような状況下、糖を目的化合物の生産経路にのみ消費させるべく、解糖系とトリカルボン酸回路との間の炭素流を完全に遮断するような代謝経路の改変がなされた大腸菌は、その有用性から高いニーズが予測されるものの、上記の課題により実現されないままであった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Lior Zelcbuch et al., PLOS ONE, (2015) 10(3): e0122957
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、グルコースから高い効率で脂肪族化合物または芳香族化合物を合成可能な、糖代謝経路が改変された微生物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明者らは、glkおよびgalPが導入され、ptsHおよびptsIが破壊されることによって、グルコースの取り込み機構がホスホトランスフェラーゼ系からガラクトースパーミアーゼ及びグルコキナーゼを組み合わせた系に置き換えられ、かつpykFおよびpykAが破壊されることによって、ピルビン酸キナーゼによるホスホエノールピルビン酸をピルビン酸に代謝する経路が遮断されたCFT5株を元に、さらに、ppc、pckA、ppsAおよびedaが破壊されたCFTf株を作製した。CFTf株は、CFT5株の特徴に加えて、グルコースの中間代謝産物（2-ケト-3-デオキシ-6-ホスホグルコン酸またはホスホエノールピルビン酸）とピルビン酸およびオキサロ酢酸を繋ぐ代謝経路を喪失しており、グルコース由来の炭素源がトリカルボン酸回路に供給されないため、グルコースだけでは増殖することができなかった。さらに、本発明者らは、xdh、xylC、yjhHおよびyjhGをCFTf株に導入することによって、CFTfx株を作製した。CFTfx株は、CFTf株の特徴に加えて、キシロースを資化することによってトリカルボン酸回路に炭素源を供給することが可能な株であり、グルコースとキシロースの存在下で増殖することができた。さらに、本発明者らは、CFTfx株に、aroZ、aroYおよびcatAを導入した株（CFTfZYcx株）、menFおよびpchBを導入した株（CFTfmIx株）を作製した。CFTfZYcx株およびCFTfmIx株は、キシロースで増殖し、グルコースでムコン酸またはサリチル酸を製造することができた。特に、グルコースの中間代謝産物である2-ケト-3-デオキシ-6-ホスホグルコン酸およびホスホエノールピルビン酸とピルビン酸およびオキサロ酢酸を繋ぐ代謝経路を喪失した大腸菌CFTf株、CFTfx株、CFTfmIx株、CFTfZYcx株は、生存できないものと思われていたが、実際は増殖し、ムコン酸またはサリチル酸を合成できたことは予想外であった。
【０００６】
さらに、本発明者らは、上記した通り、CFTf株は、グルコース由来の炭素源が解糖系からトリカルボン酸回路に直接供給されないが、解糖系の下流で目的物質とともにピルビン酸を産生できれば、トリカルボン酸回路に炭素源としてピルビン酸を供給することができる。発明者らは、上記のようにキシロースを資化することによってトリカルボン酸回路に炭素源を供給することなく、グルコースだけの供給で解糖系を利用した有用物質の産生を、増殖を継続しながら行えることを着想した。そこで、本発明者らは、解糖系からトリカルボン酸回路へのグルコース由来の炭素源の供給をさらに厳密に制限するべく、edd、sdaA、sdaBおよびtdcGが破壊された株を作製した。さらに、発明者らは、トリカルボン酸回路の代謝効率を強化するべく、上記株にgltA、aceA、iclR、aceBおよびmdhを導入した株を作製した。加えて、本発明者らは、得られた株に、menFおよびpchBをさらに導入した株およびhyg5、3hb6h、mpsおよびhbzFをさらに導入した株をそれぞれ作製し、グルコースのみを供給することによってサリチル酸の製造と株の増殖、マレイン酸の製造と株の増殖を実現し、その生産効率は従来報告されていた以上であったことを確認した。
発明者らは、これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下を提供する。
［１］以下の特徴を有する、糖代謝経路が改変された微生物：
（１）ホスホトランスフェラーゼ系を喪失していること、
（２）ガラクトースパーミアーゼおよびグルコキナーゼの発現を備えていること、
（３）解糖系とトリカルボン酸回路を繋ぐ代謝経路を喪失していること、ならびに
（４）（４a）キシロースとトリカルボン酸回路を繋ぐ代謝経路を備えていること、または
（４b）(i)６-ホスホグルコン酸を２-ケト-３-デオキシ-６-ホスホグルコン酸に代謝する経路を喪失していること、および
(ii)L-セリンをピルビン酸およびアンモニアに代謝する経路を喪失していること。
［２］（１）ホスホトランスフェラーゼ系を喪失していることが、ホスホエノールピルビン酸をピルビン酸に代謝する経路を喪失していることを含む、［１］に記載の微生物。
［３］（１）ホスホエノールピルビン酸をピルビン酸に代謝する経路を喪失していることが、ptsHおよび/またはptsIによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していることを含む、［２］に記載の微生物。
［４］（２）ガラクトースパーミアーゼおよびグルコキナーゼの発現を備えていることが、微生物がgalPを含む発現ベクターおよびglkを含む発現ベクターを含有することを含む、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の微生物。
［５］（３）解糖系とトリカルボン酸回路を繋ぐ代謝経路を喪失していることによってシキミ酸経路が阻害されないことを特徴とする、［１］〜［４］のいずれか１つに記載の微生物。
［６］（３）解糖系とトリカルボン酸回路を繋ぐ代謝経路を喪失していることが、以下を含む、［５］に記載の微生物：
（i）2-ケト-3-デオキシ-6-ホスホグルコン酸をピルビン酸とグリセルアルデヒド-3-リン酸に代謝する経路を喪失していること、
（ii）ホスホエノールピルビン酸をピルビン酸に代謝する経路を喪失していること、
（iii）ピルビン酸をホスホエノールピルビン酸に代謝する経路を喪失していること、
（iv）ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に代謝する経路を喪失していること、および
（v）オキサロ酢酸をホスホエノールピルビン酸に代謝する経路を喪失していること。
［７］（３）（i）2-ケト-3-デオキシ-6-ホスホグルコン酸をピルビン酸とグリセルアルデヒド-3-リン酸に代謝する経路を喪失していることが、edaによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していることを含む、［６］に記載の微生物。
［８］（３）（ii）ホスホエノールピルビン酸をピルビン酸に代謝する経路を喪失していることが、pykAおよびpykFによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していることを含む、［６］または［７］に記載の微生物。
［９］（３）（iii）ピルビン酸をホスホエノールピルビン酸に代謝する経路を喪失していることが、ppsAによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していることを含む、［６］〜［８］のいずれか１つに記載の微生物。
［１０］（３）（iv）ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に代謝する経路を喪失していることが、ppcによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していることを含む、［６］〜［９］のいずれか１つに記載の微生物。
［１１］（３）（v）オキサロ酢酸をホスホエノールピルビン酸に代謝する経路を喪失していることが、pckAによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していることを含む、［６］〜［１０］のいずれか１つに記載の微生物。
［１２］（４a）キシロースとトリカルボン酸回路を繋ぐ代謝経路を備えていることが、キシロースをピルビン酸とグルコアルデヒドに代謝する経路を備えていることを含む、［１］〜［１１］のいずれか１つに記載の微生物。
［１３］（４a）キシロースをピルビン酸とグルコアルデヒドに代謝する経路を備えていることが、以下を含む、［１２］に記載の微生物：
（i）キシロースをキシロノラクトンに代謝する経路を備えていること、
（ii）キシロノラクトンをキシロン酸に代謝する経路を備えていること、
（iii）キシロン酸を2-ケト-3-デオキシ-キシロン酸に代謝する経路を備えていること、および
（iv）2-ケト-3-デオキシ-キシロン酸をグルコアルデヒドとピルビン酸に代謝する経路を備えていること。
［１４］（４a）（i）キシロースをキシロノラクトンに代謝する経路を備えていることが、xdhによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む、［１３］に記載の微生物。
［１５］（４a）（ii）キシロノラクトンをキシロン酸に代謝する経路を備えていることが、xylCによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む、［１３］または［１４］に記載の微生物。
［１６］（４a）（iii）キシロン酸を2-ケト-3-デオキシ-キシロン酸に代謝する経路を備えていることが、yjhGによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む、［１３］〜［１５］のいずれか１つに記載の微生物。
［１７］（４a）（iv）2-ケト-3-デオキシ-キシロン酸をグルコアルデヒドとピルビン酸に代謝する経路を備えていることが、yjhHによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む、［１３］〜［１６］のいずれか１つに記載の微生物。
［１８］シキミ酸経路の中間代謝産物から脂肪族化合物を合成する代謝経路をさらに備えている、［１］〜［１７］のいずれか１つに記載の微生物。
［１９］脂肪族化合物が、ムコン酸である、［１８］に記載の微生物。
［２０］シキミ酸経路の中間代謝産物からムコン酸を合成する代謝経路を備えていることが、以下を含む、［１９］に記載の微生物：
（i）デヒドロシキミ酸をプロトカテク酸に代謝する経路を備えていること、
（ii）プロトカテク酸をカテコールに代謝する経路を備えていること、および
（iii）カテコールをムコン酸に代謝する経路を備えていること。
［２１］（i）デヒドロシキミ酸をプロトカテク酸に代謝する経路を備えていることが、aroZによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む、［２０］に記載の微生物。
［２２］（ii）プロトカテク酸をカテコールに代謝する経路を備えていることが、aroYによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む、［２０］または［２１］に記載の微生物。
［２３］（iii）カテコールをムコン酸に代謝する経路を備えていることが、catAによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む、［２０］〜［２２］のいずれか１つに記載の微生物。
［２４］シキミ酸経路の中間代謝産物から芳香族化合物を合成する代謝経路をさらに備えている、［１］〜［１７］のいずれか１つに記載の微生物。
［２５］芳香族化合物が、サリチル酸である、［２４］に記載の微生物。
［２６］シキミ酸経路の中間代謝産物からサリチル酸を合成する代謝経路を備えていることが、以下を含む、［２５］に記載の微生物：
（i）コリスミ酸をイソコリスミ酸に代謝する経路を備えていること、および
（ii）イソコリスミ酸をサリチル酸に代謝する経路を備えていること。
［２７］（i）コリスミ酸をイソコリスミ酸に代謝する経路を備えていることが、menFによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む、［２６］に記載の微生物。
［２８］（ii）イソコリスミ酸をサリチル酸に代謝する経路を備えていることが、pchBによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む、［２６］または［２７］に記載の微生物。
［２９］（４b）（i）６-ホスホグルコン酸を２-ケト-３-デオキシ-６-ホスホグルコン酸に代謝する経路を喪失していることが、eddによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していることを含む、［１］〜［１１］のいずれか１つに記載の微生物。
［３０］（４b）（ii）L-セリンをピルビン酸およびアンモニアに代謝する経路を喪失していることが、以下を含む、［１］〜［１１］および［２９］のいずれか１つに記載の微生物：
（A）sdaAによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していること、
（B）sdaBによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していること、および
（C）tdcGによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していること。
［３１］さらに以下の特徴を有する、［２９］または［３０］に記載の微生物：
(a)オキサロ酢酸とアセチルCoAをクエン酸とCoAに代謝する経路が増幅されている、
(b)イソクエン酸をグリオキシル酸とコハク酸に代謝する経路が増幅されている、
(c)グリオキシル酸をリンゴ酸に代謝する経路が増幅されている、および
(d)リンゴ酸をオキサロ酢酸に代謝する経路が増幅されている。
［３２］(a)オキサロ酢酸とアセチルCoAをクエン酸とCoAに代謝する経路が増幅されていることが、gltAによってコードされるタンパク質によって代謝される経路が増幅されていることを含む、［３１］に記載の微生物。
［３３］(b)イソクエン酸をグリオキシル酸とコハク酸に代謝する経路が増幅されていることが、(i)aceAによってコードされるタンパク質によって代謝される経路が増幅されていることおよび(ii)iclRによってコードされるタンパク質によるaceAの転写抑制が喪失されていることを含む、［３１］または［３２］に記載の微生物。
［３４］(c)グリオキシル酸をリンゴ酸に代謝する経路が増幅されていることが、(i)aceBによってコードされるタンパク質によって代謝される経路が増幅されていることおよび(ii)iclRによってコードされるタンパク質によるaceBの転写抑制が喪失されていることを含む、［３１］〜［３３］のいずれか１つに記載の微生物。
［３５］(d)リンゴ酸をオキサロ酢酸に代謝する経路が増幅されていることが、mdhによってコードされるタンパク質によって代謝される経路が増幅されていることを含む、［３１］〜［３４］のいずれか１つに記載の微生物。
［３６］シキミ酸経路の中間代謝産物からピルビン酸の合成を伴う代謝経路を備えている、［３１］〜［３５］のいずれか１つに記載の微生物。
［３７］シキミ酸経路の中間代謝産物からピルビン酸の合成を伴う代謝経路を備えていることが、以下を含む、［３６］に記載の微生物：
（i）コリスミ酸をイソコリスミ酸に代謝する経路を備えていること、および
（ii）イソコリスミ酸をサリチル酸に代謝する経路を備えていること。
［３８］（i）コリスミ酸をイソコリスミ酸に代謝する経路を備えていることが、menFによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む、［３７］に記載の微生物。
［３９］（ii）イソコリスミ酸をサリチル酸に代謝する経路を備えていることが、pchBによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む、［３７］または［３８］に記載の微生物。
［４０］シキミ酸経路の中間代謝産物からピルビン酸の合成を伴う代謝経路を備えていることが、以下を含む、［３６］に記載の微生物：
（i）コリスミ酸を3-ヒドロキシ安息香酸に代謝する経路を備えていること、
（ii）3-ヒドロキシ安息香酸をゲンチシン酸に代謝する経路を備えていること、
（iii）ゲンチシン酸をマレイルピルビン酸に代謝する経路を備えていること、および
（iv）マレイルピルビン酸をマレイン酸に代謝する経路を備えていること。
［４１］（i）コリスミ酸を3-ヒドロキシ安息香酸に代謝する経路を備えていることが、hyg5によってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む、［４０］に記載の微生物。
［４２］（ii）3-ヒドロキシ安息香酸をゲンチシン酸に代謝する経路を備えていることが、3hb6hによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む、［４０］または［４１］に記載の微生物。
［４３］（iii）ゲンチシン酸をマレイルピルビン酸に代謝する経路を備えていることが、mpsによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む、［４０］〜［４２］のいずれか１つに記載の微生物。
［４４］（iv）マレイルピルビン酸をマレイン酸に代謝する経路を備えていることが、hbzFによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む、［４０］〜［４３］のいずれか１つに記載の微生物。
［４５］大腸菌である、［１］〜［４４］のいずれか１つに記載の微生物。
［４６］［１８］〜［２３］のいずれか１つに記載の微生物を培地で培養することを含む、脂肪族化合物の製造方法。
［４７］［２４］〜［２８］のいずれか１つに記載の微生物を培地で培養することを含む、芳香族化合物の製造方法。
［４８］培地がグルコースおよびキシロースを含む、［４６］または［４７］に記載の製造方法。
［４９］培地中のグルコースおよびキシロースの濃度比が１：１である、［４８］に記載の製造方法。
［５０］微生物が大腸菌である、［４６］〜［４９］のいずれか１つに記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の糖代謝経路が改変された微生物に所望の脂肪族化合物や芳香族化合物を合成する遺伝子を導入することにより、グルコースによる脂肪族化合物や芳香族化合物の高い効率で合成できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ATCC31882株の糖代謝経路を示す図である。
【図２】CFT5株の糖代謝経路を示す図である。
【図３】CFTf株の糖代謝経路を示す図である。
【図４】CFTfx株の糖代謝経路を示す図である。
【図５】CFTfZYcx株の糖代謝経路を示す図である。
【図６】CFTfmIx株の糖代謝経路を示す図である。
【図７】グルコースおよびキシロース含有培地におけるCFTfZYcx株の増殖曲線を示す図である。縦軸：OD600  横軸：培養時間
【図８】グルコースおよびキシロース含有培地におけるCFTfZYcx株の培地中のグルコース濃度を示す図である。縦軸：Glucose, Xylose (g/L)  横軸：培養時間
【図９】グルコースおよびキシロース含有培地におけるCFTfZYcx株の培地中のムコン酸濃度を示す図である。縦軸：MA (g/L)  横軸：培養時間
【図１０】グルコースおよびキシロース含有培地におけるCFTfZYcx株の消費グルコース当たりのムコン酸産生量を示す図である。縦軸：MA-g/Glucose-g  横軸：培養時間
【図１１】グルコースおよびキシロース含有培地におけるCFTfmIx株の培地中のサリチル酸濃度を示す図である。fmlX(G20 X0)：(グルコース20g/L キシロース0g/L)  fmlX(G16 X4)：(グルコース16g/L キシロース4g/L)  fmlX(G10 X10)：(グルコース10g/L キシロース10g/L)  fmlX(G4 X16)：(グルコース4g/L キシロース16g/L)  fmlX(G0 X20)：(グルコース0g/L キシロース20g/L)  縦軸：SA (g/L)  横軸：培養時間
【図１２】a:各株の増殖曲線を示す図である。b:各株の培地中のグルコース濃度を示す図である。c:各株の培地中のサリチル酸濃度を示す図である。d:各株のグルコース当たりのサリチル酸生産量および48時間後の培地中のサリチル酸濃度を示す図である。e:代謝においてgltA、aceAおよびaceBが触媒する経路を示す図である。
【図１３】a:各株の増殖曲線を示す図である。b:各株の培地中のグルコース濃度を示す図である。c:各株の培地中のマレイン酸濃度を示す図である。d:各株のグルコース当たりのマレイン酸生産量および72時間後の培地中のマレイン酸濃度を示す図である。e:代謝においてsdaBおよびtdcGが触媒する経路を示す図である。
【図１４】a:各株の増殖曲線を示す図である。b:各株の培地中のグルコース濃度を示す図である。c:各株の培地中のマレイン酸濃度を示す図である。d:各株のグルコース当たりのマレイン酸生産量および48時間後の培地中のマレイン酸濃度を示す図である。e:代謝においてgltA、aceA、aceBおよびmdhが触媒する経路を示す図である。
【図１５】a:CFT5912株の培地中のマレイン酸濃度を示す図である。b: CFT5912株のの培地中のマレイン酸濃度およびグルコース濃度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．糖代謝経路が改変された微生物
本発明は、糖代謝経路が改変された微生物（以下、本発明の微生物I）を提供する。
【００１１】
本明細書において、糖代謝経路は、グルコース等の糖を増殖のため及び各種化合物の合成のために分解及び変換する種々の代謝経路を指す。具体的には、糖代謝経路は、ホスホトランスフェラーゼ系、解糖系（エムデン-マイヤーホフ経路、ペントースリン酸経路）、トリカルボン酸回路等の代謝経路を含むが、これらに限定されない。当業者であれば、糖としてグルコース以外の糖、あるいは糖の分解産物等を用いた糖代謝経路を容易に想定することができる。
【００１２】
本明細書において、糖代謝経路の改変は、糖代謝経路を構成する１つ以上の代謝経路を改変することを含む。代謝経路の改変は、該代謝経路を触媒するタンパク質をコードする遺伝子を改変することによって実施することができる。糖代謝経路を触媒するタンパク質をコードする遺伝子の改変は、本分野の公知の方法で実施することができ、例えば、糖代謝経路を触媒するタンパク質をコードする遺伝子を除去する、該遺伝子の発現を抑制する、該遺伝子の発現を増強する、該遺伝子を導入するなどの方法が挙げられる。
【００１３】
本明細書において、微生物は、改変の対象となる糖代謝経路を有する微生物であれば特に制限されない。好適に使用できる微生物として、例えば、大腸菌（Escherichia coli）等のエシェリヒア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、枯草菌（Bacillus subtillis）等のバチルス属細菌、ストレプトミセス属細菌、ストレプトコッカス属細菌等が挙げられる。その中でも、大腸菌が特に好ましい。
【００１４】
本発明の微生物Iとして大腸菌を用いる場合には、シキミ酸経路（フェニルアラニン合成経路）の活性化により、デヒドロシキミ酸やコリスミ酸をより高生産できるという観点から、フェニルアラニン高生産株が好ましい。そのような大腸菌としては、例えば、ATCC31882株、ATCC31883株、ATCC31884株が挙げられるが、ATCC31882株がより好ましい。
【００１５】
本発明の微生物Iは、以下の特徴を有する。
（１）ホスホトランスフェラーゼ系を喪失していること、
（２）ガラクトースパーミアーゼおよびグルコキナーゼの発現を備えていること、
（３）解糖系とトリカルボン酸回路を繋ぐ代謝経路を喪失していること、ならびに
（４）（４a）キシロースとトリカルボン酸回路を繋ぐ代謝経路を備えていること、または
（４b）(i)６-ホスホグルコン酸を２-ケト-３-デオキシ-６-ホスホグルコン酸に代謝する経路を喪失していること、および
(ii)L-セリンをピルビン酸およびアンモニアに代謝する経路を喪失していること。
【００１６】
本発明の微生物Iは、ホスホトランスフェラーゼ系（以下、PTSと記載する場合もある）を喪失している。ホスホトランスフェラーゼ系を備える微生物は、グルコースの中間代謝産物であるホスホエノールピルビン酸がピルビン酸に代謝されるため、結果的にグルコースがトリカルボン酸回路で消費され、シキミ酸経路による芳香族化合物（チロシン、フェニルアラニンおよびトリプトファン）の生産効率が低下する。そこで、本発明の微生物Iは、ホスホトランスフェラーゼ系を喪失していることが要求される。
【００１７】
本明細書において、ホスホトランスフェラーゼ系は、微生物内に糖を取り込み、ホスホエノールピルビン酸をピルビン酸に代謝すると同時に、ホスホエノールピルビン酸から遊離したリン酸基をグルコースに転移させてグルコース-6-リン酸に代謝する経路を指す。ホスホトランスフェラーゼ系は、HPr（ptsHによってコードされるタンパク質）およびEnzyme I（ptsIによってコードされるタンパク質）、IICBGlc（ptsGによってコードされるタンパク質）およびIIAGlc（crrによってコードされるタンパク質）によって代謝される。
【００１８】
ホスホトランスフェラーゼ系の喪失は、具体的には、本発明の微生物IにおけるptsH、ptsI、ptsGおよびcrrからなる群から選択される遺伝子（以下、pts遺伝子群と記載する場合もある）によってコードされるタンパク質によって代謝される１つ以上の経路の喪失を含む。また、ホスホトランスフェラーゼ系の喪失は、そこに制限されないが、ホスホエノールピルビン酸をピルビン酸に代謝する経路の喪失が好ましい。上記の通り、ホスホトランスフェラーゼ系は、微生物内に糖を取り込み、ホスホエノールピルビン酸をピルビン酸に代謝すると同時に、ホスホエノールピルビン酸から遊離したリン酸基をグルコースに転移させてグルコース-6-リン酸に代謝する。ホスホトランスフェラーゼ系のうち、ホスホエノールピルビン酸をピルビン酸に代謝する経路を喪失することができれば、シキミ酸経路による芳香族アミノ酸（チロシン、フェニルアラニンおよびトリプトファン）の生産効率が低下を抑制することができる。従って、ホスホトランスフェラーゼ系を喪失していることは、ptsHおよび/またはptsIによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していることが好ましい。
【００１９】
pts遺伝子群によってコードされるタンパク質によって代謝される１つ以上の経路の喪失は、染色体上のpts遺伝子群から選択される１以上の遺伝子（好ましくは、ptsHおよび/またはptsI）の一部または全部の欠損を含む。ptsH、ptsI、ptsGおよびcrrの遺伝子配列は公知である。そのGene ID又はNCBI No.については、ptsHは例えば、946886 (Escherichia coli)、939259 (Bacillus subtilis)、ptsIは例えば、946879 (Escherichia coli)、939253 (Bacillus subtilis)、ptsGは例えば、945651 (Escherichia coli)、939255 (Bacillus subtilis)、crrは例えば、946880 (Escherichia coli)、5184534 (Clostridium botulinum)としてそれぞれNCBIのデータベースに登録されている。本発明においては、一例として、ptsHは配列番号１で表される塩基配列、ptsIは配列番号２で表される塩基配列、ptsGは配列番号３で表される塩基配列、crrは配列番号４で表される塩基配列をそれぞれ含む。
染色体上のpts遺伝子群から選択される１以上の遺伝子の全部の欠損は、具体的には、染色体上の配列番号１〜４から選択される１以上の塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含む核酸の欠損であってよい。ここで、実質的に同一は、例えば、配列番号１の場合、配列番号１で表される塩基配列と約90％以上、好ましくは約93％以上、さらに好ましくは約95％以上、特に好ましくは約98％以上の同一性を指す。塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。
染色体上のpts遺伝子群から選択される１以上の遺伝子の一部の欠損とは、例えば、配列番号１の場合、配列番号１で表される塩基配列を含む核酸から5〜10ヌクレオチド、10〜50ヌクレオチド、または50〜100ヌクレオチドの欠損を指す。
【００２０】
染色体上のpts遺伝子群から選択される１以上の遺伝子の一部または全部の欠損は、例えば、相同組換えを利用した方法を用いて実施することができる。相同組換えを利用して染色体上のpts遺伝子群から選択される１以上の遺伝子の一部または全部を欠損させる方法としては、pts遺伝子群から選択される１以上の遺伝子の塩基配列の一部または全部が欠損した変異遺伝子を、該変異遺伝子を導入したい微生物内では自立複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドに連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法をあげることができる。該相同組換え用プラスミドを常法により微生物に導入した後、相同組換えによって染色体上に該相同組換え用プラスミドが組込まれた形質転換株を、薬剤耐性を指標にして選択する。得られた形質転換株を該薬剤を含有しない培地で数時間〜1日間培養した後、該薬剤含有寒天培地、および該薬剤非含有寒天培地に塗布し、前者の培地で生育せず、後者の培地で生育できる株を選択することで、染色体上において２回目の相同組換えが生じた株を取得することができる。
【００２１】
染色体上のpts遺伝子群から選択される１以上の遺伝子の一部または全部の欠損は、例えば、CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）及びCRISPR関連（Cas）タンパク質を利用した方法を用いて実施することもできる。CRISPR及びCasタンパク質は、単一のガイドRNA（sgRNA）及びプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）に依存的な様式で標的DNAを切断することで、細菌の適応免疫系として働くことが知られている。ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のCas9ヌクレアーゼは、DNA二重鎖切断（DSB）の修復（相同組換え修復（HR））経路を有する原核生物において、強力なゲノム編集ツールとして広く使用されている(例えば、Appl Environ Microbiol. 2015 Apr;81(7):2506-14)。例えば、相同組換え修復（HR）経路によるDSBの修復中に、pts遺伝子群の標的領域に対するホモロジーアームを含む一部または全部を欠損したpts遺伝子群を含むベクターを共導入することによって、切断部分に該欠損遺伝子を挿入し、pts遺伝子群をノックアウトすることが可能となる。
【００２２】
本発明の微生物Iは、ガラクトースパーミアーゼおよびグルコキナーゼの発現を備えている。ホスホトランスフェラーゼ系を喪失した微生物は、グルコースの取り込みおよびグルコースからグルコース-6-リン酸への代謝を生じない。そこで、グルコースの取り込みおよびグルコースからグルコース-6-リン酸への代謝を補完するために、本発明の微生物Iは、ガラクトースパーミアーゼ(GalP)およびグルコキナーゼ(Glk)の発現を備えていることが要求される。グルコキナーゼは、ヘキソキナーゼであってもよい。
【００２３】
ガラクトースパーミアーゼおよびグルコキナーゼの発現を備えていることは、本発明の微生物IがgalPを含む発現ベクターおよびglkを含む発現ベクターを含有することを含む。galPおよびglkの遺伝子配列は公知である。そのGene ID又はNCBI No.については、galPは例えば、947434 (Escherichia coli)、9126747 (Enterobacter cloacae)、glkは例えば、946858 (Escherichia coli)、2855394 (Bacillus thuringiensis)としてそれぞれNCBIのデータベースに登録されている。本発明においては、一例として、galPは配列番号５で表される塩基配列、glkは配列番号６で表される塩基配列をそれぞれ含む。
galPおよびglkはそれぞれ、具体的には、配列番号５および６で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含む核酸であってよい。ここで、実質的な同一性は、pts遺伝子群における塩基配列の実質的な同一性と同義であってよい。
【００２４】
galPを含む発現ベクターおよびglkを含む発現ベクターは、公知の手段で得ることができる。例えば、galPおよびglkを発現可能になるような態様で発現ベクターに連結し、微生物を該発現ベクターで形質転換することによって得ることができる。
【００２５】
galPを含む発現ベクターおよびglkを含む発現ベクターは、例えば、galPおよびglkをそれぞれ切り出し、該核酸断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、pBR322，pBR325，pUC12，pUC13）；枯草菌由来のプラスミド（例、pUB110，pTP5，pC194）；酵母由来プラスミド（例、pSH19，pSH15）などが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる微生物に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
例えば、微生物がエシェリヒア属菌である場合、trpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーター、T7プロモーターなどが好ましい。
微生物がバチルス属菌である場合、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーターなどが好ましい。
【００２６】
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、選択マーカーなどを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子（以下、amprと略称する場合がある）等が挙げられる。
【００２７】
形質転換は、微生物の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
エシェリヒア属菌は、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），69巻，2110 (1972)やジーン（Gene），17巻，107 (1982)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
バチルス属菌は、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），168巻，111 (1979)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
【００２８】
本発明の微生物Iは、解糖系とトリカルボン酸回路を繋ぐ代謝経路を喪失している。解糖系とトリカルボン酸回路を繋ぐ代謝経路を備える微生物では、解糖系における代謝産物であるピルビン酸からアセチルCoAへの代謝および同様に解糖系における代謝産物であるホスホエノールピルビン酸からオキサロ酢酸への代謝を通じてグルコースがトリカルボン酸回路で消費されるため、シキミ酸経路による芳香族アミノ酸（チロシン、フェニルアラニンおよびトリプトファン）の生産効率が低下する。そこで、本発明の微生物Iは、解糖系とトリカルボン酸回路を繋ぐ代謝経路を喪失していることが要求される。
【００２９】
本明細書において、解糖系は、微生物に取り込まれたグルコースがピルビン酸まで代謝される一連の代謝経路を指す。解糖系は、大別して２種の代謝経路（エムデン-マイヤーホフ経路およびペントースリン酸経路）から構成されている。エムデン-マイヤーホフ経路は、グルコースをピルビン酸まで代謝し、解糖系における主要な代謝経路を担う。一方、ペントースリン酸経路は、エムデン-マイヤーホフ経路とは異なる代謝経路でグルコースをグリセルアルデヒド-3-リン酸まで代謝する経路を担う。また、本明細書において、トリカルボン酸回路は、ピルビン酸から代謝されるアセチルCoAの酸化反応を通じてNADHを生産し、微生物の増殖に寄与する。
【００３０】
解糖系とトリカルボン酸回路を繋ぐ代謝経路の喪失は、そこに制限されないが、シキミ酸経路を阻害しないものであってよい。シキミ酸経路は、ホスホエノールピルビン酸およびエリトロース-4-リン酸を出発物質として、コリスミ酸の合成を経由し、芳香族アミノ酸（チロシン、フェニルアラニンおよびトリプトファン）を合成する。シキミ酸経路の出発物質であるホスホエノールピルビン酸およびエリトロース-4-リン酸はそれぞれ、エムデン-マイヤーホフ経路およびペントースリン酸経路によって中間代謝産物として合成される。解糖系とトリカルボン酸回路を繋ぐ代謝経路のうち、ホスホエノールピルビン酸およびエリトロース-4-リン酸の合成に関わる代謝経路を喪失した微生物は、シキミ酸経路による芳香族アミノ酸の生産効率が低下する。従って、解糖系とトリカルボン酸回路を繋ぐ代謝経路を喪失していることによってシキミ酸経路が阻害されないことが好ましい。
【００３１】
シキミ酸経路を阻害しないように、解糖系とトリカルボン酸回路を繋ぐ代謝経路を喪失していることは、具体的には、以下を含む。
（i）2-ケト-3-デオキシ-6-ホスホグルコン酸をピルビン酸とグリセルアルデヒド-3-リン酸に代謝する経路を喪失していること。
（ii）ホスホエノールピルビン酸をピルビン酸に代謝する経路を喪失していること。
（iii）ピルビン酸をホスホエノールピルビン酸に代謝する経路を喪失していること。
（iv）ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に代謝する経路を喪失していること。
（v）オキサロ酢酸をホスホエノールピルビン酸に代謝する経路を喪失していること。
【００３２】
2-ケト-3-デオキシ-6-ホスホグルコン酸をピルビン酸とグリセルアルデヒド-3-リン酸に代謝する経路は、2-ケト-3-デオキシ-6-ホスホグルコン酸アルドラーゼ（edaによってコードされるタンパク質）によって代謝される。edaの遺伝子配列は公知であり、そのGene ID又はNCBI No.が例えば、946367 (Escherichia coli)、939066 (Bacillus subtilis)でNCBIのデータベースに登録されている。本発明においては、一例として、edaは配列番号７で表される塩基配列を含む。従って、2-ケト-3-デオキシ-6-ホスホグルコン酸をピルビン酸とグリセルアルデヒド-3-リン酸に代謝する経路を喪失していることは、具体的には、eda（配列番号７）によってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していることを含む。
【００３３】
ホスホエノールピルビン酸をピルビン酸に代謝する経路は、ピルビン酸キナーゼＩ（pykFによってコードされるタンパク質）またはピルビン酸キナーゼＩＩ（pykAによってコードされるタンパク質）によって代謝される。pykF、pykAの遺伝子配列は公知であり、そのGene ID又はNCBI No.については、pykFは例えば、946179 (Escherichia coli)、29683989 (Bacillus thuringiensis)、pykAは例えば、946527 (Escherichia coli)、2858301 (Bacillus thuringiensis)としてそれぞれNCBIのデータベースに登録されている。本発明においては、一例として、pykFは配列番号８で表される塩基配列、pykAは配列番号９で表される塩基配列をそれぞれ含む。従って、ホスホエノールピルビン酸をピルビン酸に代謝する経路を喪失していることは、具体的には、pykF（配列番号８）およびpykA（配列番号９）によってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していることを含む。
【００３４】
ピルビン酸をホスホエノールピルビン酸に代謝する経路は、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ（ppsAによってコードされるタンパク質）によって代謝される。ppsAの遺伝子配列は公知であり、そのGene ID又はNCBI No.が例えば、946209 (Escherichia coli)、1042760 (Pseudomonas putida)としてNCBIのデータベースに登録されている。本発明においては、一例として、ppsAは配列番号１０で表される塩基配列を含む。従って、ピルビン酸をホスホエノールピルビン酸に代謝する経路を喪失していることは、具体的には、ppsA（配列番号１０）によってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していることを含む。
【００３５】
ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に代謝する経路は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ppcによってコードされるタンパク質）によって代謝される。ppcの遺伝子配列は公知であり、そのGene ID又はNCBI No.が例えば、948457 (Escherichia coli)、879083 (Pseudomonas aeruginosa)としてNCBIのデータベースに登録されている。本発明においては、一例として、ppcは配列番号１１で表される塩基配列を含む。従って、ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に代謝する経路を喪失していることは、具体的には、ppc（配列番号１１）によってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していることを含む。
【００３６】
オキサロ酢酸をホスホエノールピルビン酸に代謝する経路は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（pckAによってコードされるタンパク質）によって代謝される。pckAの遺伝子配列は公知であり、そのGene ID又はNCBI No.が例えば、886744 (Escherichia coli)、33898676 (Bacillus thuringiensis)としてNCBIのデータベースに登録されている。本発明においては、一例として、pckAは配列番号１２で表される塩基配列を含む。従って、オキサロ酢酸をホスホエノールピルビン酸に代謝する経路を喪失していることは、具体的には、pckA（配列番号１２）によってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していることを含む。
【００３７】
上記eda、pykF、pykA、ppsA、ppcまたはpckAによってコードされるタンパク質によって代謝される経路の喪失は、染色体上のeda、pykF、pykA、ppsA、ppcまたはpckAの一部または全部の欠損を含む。
染色体上のeda、pykF、pykA、ppsA、ppcまたはpckAの全部の欠損は、例えば、染色体上の配列番号７、８、９、１０、１１または１２の塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含む核酸の欠損であってよい。ここで、実質的に同一は、pts遺伝子群における塩基配列の実質的な同一性と同義であってよい。
染色体上のeda、pykF、pykA、ppsA、ppcまたはpckAの一部の欠損とは、例えば、配列番号７の場合、配列番号７で表される塩基配列を含む核酸から5〜10ヌクレオチド、10〜50ヌクレオチド、または50〜100ヌクレオチドの欠損を指す。
【００３８】
染色体上のeda、pykF、pykA、ppsA、ppcまたはpckAの一部または全部の欠損は、pts遺伝子群の一部または全部を欠損させる方法と同一の方法を用いて実施することができる。
【００３９】
本発明の微生物Iは、1実施態様において、キシロースとトリカルボン酸回路を繋ぐ代謝経路を備える（以下、本発明の微生物Ia）。ホスホトランスフェラーゼ系および解糖系とトリカルボン酸回路を繋ぐ代謝経路を喪失した微生物は、グルコースがシキミ酸経路にのみ活用されるため、脂肪族化合物や芳香族化合物の生産には好適である。しかし、トリカルボン酸回路へピルビン酸やオキサロ酢酸の供給が途絶えるため、当該微生物はグルコースのみでは増殖できないという不都合が生じる。そこで、グルコースによるトリカルボン酸回路への炭素源の供給を補完するために、本発明の微生物Iは、キシロースとトリカルボン酸回路を繋ぐ代謝経路を備えていることを要求される。
【００４０】
キシロースとトリカルボン酸回路を繋ぐ代謝経路を備えていることは、そこに制限されないが、トリカルボン酸回路へピルビン酸またはオキサロ酢酸、好ましくはピルビン酸の供給を可能にする代謝経路を備えていることであってよい。上記の通り、グルコースは解糖系を介してトリカルボン酸回路へピルビン酸やオキサロ酢酸を供給するため、キシロースとトリカルボン酸回路を繋ぐ代謝経路もまたトリカルボン酸回路へピルビン酸またはオキサロ酢酸、特にピルビン酸を供給できる場合、当該微生物はキシロース依存的な増殖に適している。従って、キシロースとトリカルボン酸回路を繋ぐ代謝経路を備えていることは、トリカルボン酸回路へピルビン酸またはオキサロ酢酸、好ましくはピルビン酸の供給を可能にする代謝経路を備えていることが好ましい。
【００４１】
キシロースとトリカルボン酸回路を繋ぐ代謝経路を備えていることは、例えば、キシロースをピルビン酸とグルコアルデヒドに代謝する経路を備えていることを含む。
キシロースをピルビン酸とグルコアルデヒドに代謝する経路を備えていることは、具体的には、以下を含む。
（i）キシロースをキシロノラクトンに代謝する経路を備えていること。
（ii）キシロノラクトンをキシロン酸に代謝する経路を備えていること。
（iii）キシロン酸を2-ケト-3-デオキシ-キシロン酸に代謝する経路を備えていること。
（iv）2-ケト-3-デオキシ-キシロン酸をグルコアルデヒドとピルビン酸に代謝する経路を備えていること。
【００４２】
キシロースをキシロノラクトンに代謝する経路は、キシロースデヒドロゲナーゼ（xdhによってコードされるタンパク質）によって代謝される。xdhの遺伝子配列は公知であり、そのGene ID又はNCBI No.が例えば、MG189911.1 (Caulobacter crescentus)、27365478 (Rhodotorula toruloides)としてNCBIのデータベースに登録されている。本発明においては、一例として、xdhは配列番号１３で表される塩基配列を含む。従って、キシロースをキシロノラクトンに代謝する経路を備えていることは、具体的には、xdh（配列番号１３）によってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む。
【００４３】
キシロノラクトンをキシロン酸に代謝する経路は、キシロノラクトナーゼ（xylCによってコードされるタンパク質）によって代謝される。xylCの遺伝子配列は公知であり、そのGene ID又はNCBI No.が例えば、MG681088.1 (Caulobacter crescentus)、3128462 (Haloarcula marismortui)としてNCBIのデータベースに登録されている。本発明においては、一例として、xylCは配列番号１４で表される塩基配列を含む。従って、キシロノラクトンをキシロン酸に代謝する経路を備えていることは、具体的には、xylC（配列番号１４）によってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む。
【００４４】
キシロン酸を2-ケト-3-デオキシ-キシロン酸に代謝する経路は、キシロノラクトナーゼ（yjhGによってコードされるタンパク質）によって代謝される。yjhGの遺伝子配列は公知であり、そのGene ID又はNCBI No.が例えば、946829 (Escherichia coli)、29908275 (Bacillus megaterium)としてNCBIのデータベースに登録されている。本発明においては、一例として、yjhGは配列番号１５で表される塩基配列を含む。従って、キシロン酸を2-ケト-3-デオキシ-キシロン酸に代謝する経路を備えていることは、具体的には、yjhG（配列番号１５）によってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む。
【００４５】
2-ケト-3-デオキシ-キシロン酸をグルコアルデヒドとピルビン酸に代謝する経路は、2-デヒドロ-3-デオキシ-D-吉草酸アルドラーゼ（yjhHによってコードされるタンパク質）によって代謝される。yjhHの遺伝子配列は公知であり、そのGene ID又はNCBI No.が例えば、948825 (Escherichia coli)としてNCBIのデータベースに登録されている。本発明においては、一例として、yjhHは配列番号１６で表される塩基配列を含む。従って、2-ケト-3-デオキシ-キシロン酸をグルコアルデヒドとピルビン酸に代謝する経路を備えていることは、具体的には、yjhH（配列番号１６）によってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む。
【００４６】
上記xdh、xylC、yjhGまたはyjhHによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることは、具体的には、本発明の微生物Iが、配列番号１３、１４、１５または１６で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含む核酸を含有していることであってよい。ここで、実質的の同一性は、pts遺伝子群における塩基配列の実質的な同一性と同義であってよい。
【００４７】
xdh、xylC、yjhGまたはyjhHによってコードされるタンパク質を備えていることは、galPまたはglkによってコードされるタンパク質の発現方法と同一の方法によって実施できる。
【００４８】
本発明の微生物Iはまた、別の実施態様において、(i)６-ホスホグルコン酸を２-ケト-３-デオキシ-６-ホスホグルコン酸に代謝する経路を喪失していること、および(ii)L-セリンをピルビン酸およびアンモニアに代謝する経路を喪失している（以下、本発明の微生物Ｉｂ）。本発明の微生物Iは、上記の通り、グルコースが主にシキミ酸経路に活用されるため、脂肪族化合物や芳香族化合物の生産には好適である。しかし、グルコースを炭素源とした代謝経路は多様であり、ホスホトランスフェラーゼ系および解糖系とトリカルボン酸回路を繋ぐ代謝経路を喪失した微生物であっても、ごく僅かにトリカルボン酸回路へグルコースの供給が残る。結果的にグルコースがシキミ酸経路に供給される前にトリカルボン酸回路で一部消費されるため、シキミ酸経路による芳香族化合物または脂肪族化合物の生産効率を理想的な水準まで上昇させることができない。そこで、シキミ酸経路にグルコースが供給される前におけるトリカルボン酸回路へのグルコースの供給をより厳格に制限するために、本発明の微生物Iは、(i)６-ホスホグルコン酸を２-ケト-３-デオキシ-６-ホスホグルコン酸に代謝する経路を喪失していること、および(ii)L-セリンをピルビン酸およびアンモニアに代謝する経路を喪失していることを要求される。
【００４９】
６-ホスホグルコン酸を２-ケト-３-デオキシ-６-ホスホグルコン酸に代謝する経路は、６-ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（eddによってコードされるタンパク質）によって代謝される。eddの遺伝子配列は公知であり、そのGene ID又はNCBI No.が例えば、946362(Escherichia coli)でNCBIのデータベースに登録されている。本発明においては、一例として、eddは配列番号６０で表される塩基配列を含む。従って、６-ホスホグルコン酸を２-ケト-３-デオキシ-６-ホスホグルコン酸に代謝する経路に代謝する経路を喪失していることは、具体的には、edd（配列番号６０）によってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していることを含む。
【００５０】
L-セリンをピルビン酸およびアンモニアに代謝する経路は、3種のホモログ（sdaAによってコードされるタンパク質、sdaBによってコードされるタンパク質およびtdcGによってコードされるタンパク質）によって代謝される同一の経路である。従って、L-セリンをピルビン酸およびアンモニアに代謝する経路を喪失していることは、具体的には、以下を含む。
（A）sdaAによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していること。
（B）sdaBによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していること。
（C）tdcGによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していること。
【００５１】
L-セリンをピルビン酸およびアンモニアに代謝する経路は、L-セリンデアミナーゼ I（sdaAによってコードされるタンパク質）によって代謝される。sdaAの遺伝子配列は公知であり、そのGene ID又はNCBI No.が例えば、946331(Escherichia coli)でNCBIのデータベースに登録されている。本発明においては、一例として、sdaAは配列番号６１で表される塩基配列を含む。従って、L-セリンをピルビン酸およびアンモニアに代謝する経路を喪失していることは、具体的には、sdaA（配列番号６１）によってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していることを含む。
【００５２】
L-セリンをピルビン酸およびアンモニアに代謝する経路は、L-セリンデアミナーゼ II（sdaBによってコードされるタンパク質）によっても代謝される。sdaBの遺伝子配列は公知であり、そのGene ID又はNCBI No.が例えば、947262 (Escherichia coli)でNCBIのデータベースに登録されている。本発明においては、一例として、sdaBは配列番号６２で表される塩基配列を含む。従って、L-セリンをピルビン酸およびアンモニアに代謝する経路に代謝する経路を喪失していることは、具体的には、sdaB（配列番号６２）によってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していることを含む。
【００５３】
L-セリンをピルビン酸およびアンモニアに代謝する経路は、L-セリンデアミナーゼ III（tdcGによってコードされるタンパク質）によっても代謝される。tdcGの遺伝子配列は公知であり、そのGene ID又はNCBI No.が例えば、2847724 (Escherichia coli)でNCBIのデータベースに登録されている。本発明においては、一例として、tdcGは配列番号６３で表される塩基配列を含む。従って、L-セリンをピルビン酸およびアンモニアに代謝する経路に代謝する経路を喪失していることは、具体的には、tdcG（配列番号６３）によってコードされるタンパク質によって代謝される経路を喪失していることを含む。
【００５４】
上記edd、sdaA、sdaBまたはtdcGによってコードされるタンパク質によって代謝される経路の喪失は、染色体上のedd、sdaA、sdaBまたはtdcGの一部または全部の欠損を含む。
染色体上のedd、sdaA、sdaBまたはtdcGの全部の欠損は、例えば、染色体上の配列番号６０、６１、６２または６３の塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含む核酸の欠損であってよい。ここで、実質的に同一は、pts遺伝子群における塩基配列の実質的な同一性と同義であってよい。
染色体上のedd、sdaA、sdaBまたはtdcGの一部の欠損とは、例えば、配列番号６０の場合、配列番号６０で表される塩基配列を含む核酸から5〜10ヌクレオチド、10〜50ヌクレオチド、または50〜100ヌクレオチドの欠損を指す。
【００５５】
染色体上のedd、sdaA、sdaBまたはtdcGの一部または全部の欠損は、pts遺伝子群の一部または全部を欠損させる方法と同一の方法を用いて実施することができる。
【００５６】
本発明の微生物Ibは、グルコースによるトリカルボン酸回路への炭素源の供給をより厳格に制限されており、わずかな炭素源を増殖に利用するためにはトリカルボン酸回路の代謝効率を上昇させる必要がある。従って、本発明の微生物Ibはさらに、以下の特徴を有する。
(a)オキサロ酢酸とアセチルCoAをクエン酸とCoAに代謝する経路が増幅されている、
(b)イソクエン酸をグリオキシル酸とコハク酸に代謝する経路が増幅されている、
(c)グリオキシル酸をリンゴ酸に代謝する経路が増幅されている、および
(d)リンゴ酸をオキサロ酢酸に代謝する経路が増幅されている。
【００５７】
オキサロ酢酸とアセチルCoAをクエン酸とCoAに代謝する経路は、クエン酸シンターゼ（gltAによってコードされるタンパク質）によって代謝される。gltAの遺伝子配列は公知であり、そのGene ID又はNCBI No.が例えば、945323(Escherichia coli)としてNCBIのデータベースに登録されている。本発明においては、一例として、gltAは配列番号６４で表される塩基配列を含む。従って、オキサロ酢酸とアセチルCoAをクエン酸とCoAに代謝する経路が増幅されていることは、具体的には、gltA（配列番号６４）によってコードされるタンパク質によって代謝される経路が増幅されていることを含む。
【００５８】
イソクエン酸をグリオキシル酸とコハク酸に代謝する経路は、イソクエン酸リアーゼ（aceAによってコードされるタンパク質）によって代謝される。aceAの遺伝子配列は公知であり、そのGene ID又はNCBI No.が例えば、948517(Escherichia coli)としてNCBIのデータベースに登録されている。本発明においては、一例として、aceAは配列番号６５で表される塩基配列を含む。また、aceAの転写は、DNA結合性転写リプレッサー（DNA-binding transcriptional repressor）IclR（iclRによってコードされるタンパク質）によって抑制される。iclRの遺伝子配列は公知であり、そのGene ID又はNCBI No.が例えば、948524(Escherichia coli)としてNCBIのデータベースに登録されている。本発明においては、一例として、iclRは配列番号６６で表される塩基配列を含む。従って、イソクエン酸をグリオキシル酸とコハク酸に代謝する経路が増幅されていることは、具体的には、(i)aceA（配列番号６５）によってコードされるタンパク質によって代謝される経路が増幅されていることおよび(ii)iclR（配列番号６６）によってコードされるタンパク質によるaceAの転写抑制が喪失されていることを含む。
【００５９】
グリオキシル酸をリンゴ酸に代謝する経路は、リンゴ酸シンターゼ（aceBによってコードされるタンパク質）によって代謝される。aceBの遺伝子配列は公知であり、そのGene ID又はNCBI No.が例えば、948512(Escherichia coli)としてNCBIのデータベースに登録されている。本発明においては、一例として、aceBは配列番号６７で表される塩基配列を含む。また、aceBの転写は、aceAと同様、DNA結合性転写リプレッサー（DNA-binding transcriptional repressor）IclR（iclRによってコードされるタンパク質）によって抑制される。従って、グリオキシル酸をリンゴ酸に代謝する経路が増幅されていることは、具体的には、(i)aceB（配列番号６７）によってコードされるタンパク質によって代謝される経路が増幅されていることおよび(ii)iclR（配列番号６６）によってコードされるタンパク質によるaceBの転写抑制が喪失されていることを含む。
【００６０】
リンゴ酸をオキサロ酢酸に代謝する経路は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（mdhによってコードされるタンパク質）によって代謝される。mdhの遺伝子配列は公知であり、そのGene ID又はNCBI No.が例えば、947854(Escherichia coli)としてNCBIのデータベースに登録されている。本発明においては、一例として、mdhは配列番号６８で表される塩基配列を含む。従って、リンゴ酸をオキサロ酢酸に代謝する経路が増幅されていることは、具体的には、mdh（配列番号６８）によってコードされるタンパク質によって代謝される経路が増幅されていることを含む。
【００６１】
上記gltA、aceA、iclR、aceBまたはmdhによってコードされるタンパク質によって代謝される経路が増幅されていることは、具体的には、本発明の微生物Ibが、配列番号６４、６５、６６、６７または６８で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含む核酸を含有していることであってよい。ここで、実質的の同一性は、pts遺伝子群における塩基配列の実質的な同一性と同義であってよい。
【００６２】
gltA、aceA、iclR、aceBまたはmdhによってコードされるタンパク質を増幅されていることは、galPまたはglkによってコードされるタンパク質の発現方法と同一の方法によって実施できる。
【００６３】
２．シキミ酸経路が改変された微生物
本発明はまた、シキミ酸経路の中間代謝産物から脂肪族化合物または芳香族化合物を合成する代謝経路をさらに備えている、本発明の微生物Ia（以下、本発明の微生物IIa）を提供する。
【００６４】
本明細書において、シキミ酸経路は、ホスホエノールピルビン酸およびエリトロース-4-リン酸を出発物質として、コリスミ酸の合成を経由し、チロシン、フェニルアラニンおよびトリプトファンを合成する代謝経路を指す。従来から、シキミ酸経路の中間代謝産物をさらに別の化合物に代謝する遺伝子を微生物に導入することによって、当該微生物に所望の化合物を合成させる方法が知られている。本発明の微生物Iaは、シキミ酸経路による芳香族アミノ酸の生産効率が上昇しているため、シキミ酸経路の中間代謝産物から脂肪族化合物または芳香族化合物を合成する代謝経路をさらに備えてよい。
【００６５】
本明細書において、シキミ酸経路の改変は、シキミ酸経路を構成する１つ以上の代謝経路を改変することを含む。代謝経路の改変は、該代謝経路を触媒するタンパク質をコードする遺伝子を改変することによって実施することができる。シキミ酸経路を触媒するタンパク質をコードする遺伝子の改変は、本分野の公知の方法で実施することができ、例えば、シキミ酸経路を触媒するタンパク質をコードする遺伝子を除去する、該遺伝子の発現を抑制する、該遺伝子の発現を増強する、該遺伝子を導入するなどの方法が挙げられる。
【００６６】
シキミ酸経路の中間代謝産物から合成できる脂肪族化合物は、例えば、ムコン酸、3-カルボキシムコン酸、アジピン酸などが挙げられる。ムコン酸を合成する場合、シキミ酸経路の中間代謝産物から脂肪族化合物を合成する代謝経路を備えていることは、例えば、以下を含む。
（i）デヒドロシキミ酸をプロトカテク酸に代謝する経路を備えていること。
（ii）プロトカテク酸をカテコールに代謝する経路を備えていること。
（iii）カテコールをムコン酸に代謝する経路を備えていること。
【００６７】
デヒドロシキミ酸をプロトカテク酸に代謝する経路は、3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ（aroZによってコードされるタンパク質）によって代謝される。aroZの遺伝子配列は公知であり、そのGene ID又はNCBI No.が例えば、CP020754.1（Bacillus thuringiensis）、3508050（Aspergillus fumigatus）としてNCBIのデータベースに登録されている。本発明においては、一例として、aroZは配列番号１７で表される塩基配列を含む。従って、デヒドロシキミ酸をプロトカテク酸に代謝する経路を備えていることは、具体的には、aroZ（配列番号１７）によってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む。
【００６８】
プロトカテク酸をカテコールに代謝する経路は、プロトカテク酸デカルボキシラーゼ（aroYによってコードされるタンパク質）によって代謝される。aroYの遺伝子配列は公知であり、そのGene ID又はNCBI No.が例えば、KX774258.1（Klebsiella pneumoniae）、AIC46024.1（Bacillus subtilis）としてNCBIのデータベースに登録されている。本発明においては、一例として、aroYは配列番号１８で表される塩基配列を含む。従って、プロトカテク酸をカテコールに代謝する経路を備えていることは、具体的には、aroY（配列番号１８）によってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む。
【００６９】
カテコールをムコン酸に代謝する経路は、カテコール-1,2-ジオキシゲナーゼ（catAによってコードされるタンパク質）によって代謝される。catAの遺伝子配列は公知であり、そのGene ID又はNCBI No.が例えば、AF363241.1（Pseudomonas putida）、36794313（Streptomyces himastatinicus）としてNCBIのデータベースに登録されている。本発明においては、一例として、catAは配列番号１９で表される塩基配列を含む。従って、カテコールをムコン酸に代謝する経路を備えていることは、具体的には、catA（配列番号１９）によってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む。
【００７０】
また、シキミ酸経路の中間代謝産物から合成できる芳香族化合物は、例えば、サリチル酸、4-アミノ安息香酸、4-ヒドロキシ安息香酸、3-ヒドロキシ安息香酸、2-アミノ安息香酸、チロシン、フェノールなどが挙げられる。サリチル酸を合成する場合、シキミ酸経路の中間代謝産物から芳香族化合物を合成する代謝経路を備えていることは、例えば、以下を含む。
（i）コリスミ酸をイソコリスミ酸に代謝する経路を備えていること。
（ii）イソコリスミ酸をサリチル酸に代謝する経路を備えていること。
【００７１】
コリスミ酸をイソコリスミ酸に代謝する経路は、イソコリスミ酸シンターゼ（menFによってコードされるタンパク質）によって代謝される。menFの遺伝子配列は公知であり、そのGene ID又はNCBI No.が例えば、946712（Escherichia coli）、881821（Pseudomonas aeruginosa）としてNCBIのデータベース登録されている。本発明においては、一例として、menFは配列番号２０で表される塩基配列を含む。従って、コリスミ酸をイソコリスミ酸に代謝する経路を備えていることは、具体的には、menF（配列番号２０）によってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む。
【００７２】
イソコリスミ酸をサリチル酸に代謝する経路は、イソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ（pchBによってコードされるタンパク質）によって代謝される。pchBの遺伝子配列は公知であり、そのGene ID又はNCBI No.が例えば、881846（Pseudomonas aeruginosa）、1232194（Sinorhizobium meliloti）としてNCBIのデータベース登録されている。本発明においては、一例として、pchBは配列番号２１で表される塩基配列を含む。従って、イソコリスミ酸をサリチル酸に代謝する経路を備えていることは、具体的には、pchB（配列番号２１）によってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む。
【００７３】
上記aroZ、aroY、catA、menFまたはpchBによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることは、具体的には、本発明の微生物Iaが、配列番号１７、１８、１９、２０または２１で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含む核酸を含有していることであってよい。ここで、実質的な同一性は、pts遺伝子群における塩基配列の実質的な同一性と同義であってよい。
【００７４】
aroZ、aroY、catA、menFまたはpchBによってコードされるタンパク質の発現は、galPまたはglkによってコードされるタンパク質の発現方法と同一の方法によって実施できる。
【００７５】
ムコン酸、サリチル酸以外の脂肪族化合物または芳香族化合物を合成する場合も、当業者であれば、シキミ酸経路の中間代謝産物から目的の脂肪族化合物または芳香族化合物を合成する公知の代謝経路を探索して、当該代謝経路を触媒する遺伝子を前記の方法に従い本発明の微生物Iaに導入することによって、目的の微生物を取得することができる。
【００７６】
本発明はまた、シキミ酸経路の中間代謝産物からピルビン酸の合成を伴う代謝経路をさらに備えている、本発明の微生物Ib（以下、本発明の微生物IIb）を提供する。
【００７７】
本発明の微生物Ibは、上記の通り、グルコースがトリカルボン酸回路に供給されないため、増殖のためにグルコースを用いることができない。しかし、シキミ酸経路の中間代謝産物からピルビン酸の合成を伴って所望の化合物に代謝する遺伝子を本発明の微生物Ibに導入することによって、本発明の微生物IIbはグルコースの供給によって所望の化合物を生産させつつ増殖させることが可能である。従って、本発明の微生物Ibは、シキミ酸経路の中間代謝産物からピルビン酸の合成を伴う代謝経路をさらに備えてよい。
【００７８】
シキミ酸経路の中間代謝産物からピルビン酸の合成を伴う代謝経路は公知であり、Shuhei Noda et al. Trends in Biotechnology, Vol.15, No.8, 785-796, 2017に開示されている。そのような経路としては、例えば、コリスミ酸からフェノールを合成する経路、コリスミ酸からo-アミノ安息香酸を合成する経路、コリスミ酸からp-アミノ安息香酸を合成する経路、コリスミ酸からサリチル酸を合成する経路、コリスミ酸から3-ヒドロキシ安息香酸を合成する経路およびコリスミ酸から4-ヒドロキシ安息香酸を合成する経路、コリスミ酸からマレイン酸を合成する経路などが挙げられる。
【００７９】
シキミ酸経路の中間代謝産物からピルビン酸の合成を伴う代謝経路を備えていることが、コリスミ酸からサリチル酸を合成する経路を備えていることである場合、以下を含む。
（i）コリスミ酸をイソコリスミ酸に代謝する経路を備えていること。
（ii）イソコリスミ酸をサリチル酸に代謝する経路を備えていること。
【００８０】
コリスミ酸をイソコリスミ酸に代謝する経路およびイソコリスミ酸をサリチル酸に代謝する経路は、本発明の微生物IIaに記載の経路と同一であってよい。
【００８１】
また、シキミ酸経路の中間代謝産物からピルビン酸の合成を伴う代謝経路が、コリスミ酸からマレイン酸を合成する経路を備えていることである場合、以下を含む。
（i）コリスミ酸を3-ヒドロキシ安息香酸に代謝する経路を備えていること。
（ii）3-ヒドロキシ安息香酸をゲンチシン酸に代謝する経路を備えていること。
（iii）ゲンチシン酸をマレイルピルビン酸に代謝する経路を備えていること。
（iv）マレイルピルビン酸をマレイン酸に代謝する経路を備えていること。
【００８２】
コリスミ酸を3-ヒドロキシ安息香酸に代謝する経路は、3-ヒドロキシ安息香酸シンターゼ（hyg5によってコードされるタンパク質）によって代謝される。hyg5の遺伝子配列は公知であり、NCBIのデータベース登録されている。本発明においては、一例として、hyg5は配列番号６９で表される塩基配列を含む。従って、コリスミ酸を3-ヒドロキシ安息香酸に代謝する経路を備えていることは、具体的には、hyg5（配列番号６９）によってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む。
【００８３】
3-ヒドロキシ安息香酸をゲンチシン酸に代謝する経路は、3-ヒドロキシ安息香酸6-ヒドロキシラーゼ（3hb6hによってコードされるタンパク質）によって代謝される。3hb6hの遺伝子配列は公知であり、NCBIのデータベース登録されている。本発明においては、一例として、3hb6hは配列番号７０で表される塩基配列を含む。従って、3-ヒドロキシ安息香酸をゲンチシン酸に代謝する経路を備えていることは、具体的には、3hb6h（配列番号７０）によってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む。
【００８４】
ゲンチシン酸をマレイルピルビン酸に代謝する経路は、マレイルピルビン酸シンターゼ（mpsによってコードされるタンパク質）によって代謝される。mpsの遺伝子配列は公知であり、NCBIのデータベース登録されている。本発明においては、一例として、mpsは配列番号７１で表される塩基配列を含む。従って、ゲンチシン酸をマレイルピルビン酸に代謝する経路を備えていることは、具体的には、mps（配列番号７１）によってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む。
【００８５】
マレイルピルビン酸をマレイン酸に代謝する経路は、マレイルピルビン酸ヒドラーゼ（hbzFによってコードされるタンパク質）によって代謝される。hbzFの遺伝子配列は公知であり、NCBIのデータベース登録されている。本発明においては、一例として、hbzFは配列番号７２で表される塩基配列を含む。従って、マレイルピルビン酸をマレイン酸に代謝する経路を備えていることは、具体的には、hbzF（配列番号７２）によってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることを含む。
【００８６】
上記hyg5、3hb6h、mpsまたはhbzFによってコードされるタンパク質によって代謝される経路を備えていることは、具体的には、本発明の微生物Ibが、配列番号６９、７０、７１または７２で表される塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含む核酸を含有していることであってよい。ここで、実質的な同一性は、pts遺伝子群における塩基配列の実質的な同一性と同義であってよい。
【００８７】
hyg5、3hb6h、mpsまたはhbzFによってコードされるタンパク質の発現は、galPまたはglkによってコードされるタンパク質の発現方法と同一の方法によって実施できる。
【００８８】
３．脂肪族化合物または芳香族化合物の製造方法
本発明はまた、本発明の微生物IIaを培地で培養することを含む、脂肪族化合物または芳香族化合物の製造方法（以下、本発明の製造方法）を提供する。
【００８９】
微生物の培養条件は、選択する微生物に依存する。当業者であれば、微生物に応じて適切な培地及び培養条件を選択することができ、特に限定するものではない。例えば大腸菌の培養条件は、以下及び実施例に記載した通りである。
【００９０】
培地は液体培地であっても固体培地であってもよいが、培地に分泌される脂肪族化合物または芳香族化合物の回収のし易さという観点から、液体培地であることが好ましい。培地は、脂肪族化合物または芳香族化合物の合成のための炭素源および微生物の増殖のための炭素源を含むものであればよい。
【００９１】
炭素源としては、特に限定するものではないが、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、グリセロール、グルコース-6-リン酸、フルクトース-6-リン酸、フルクトース-1,6-ビスリン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、グリセルアルデヒド−３−リン酸、1,3-ビスホスホグリセリン酸、3-ホスホグリセリン酸、2-ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸、アセチルCoAから選択される１以上の炭素源が挙げられ、グルコースおよびキシロースの組み合わせが好ましい。培地中に添加する炭素源の量は、炭素源の種類、微生物の種類等に応じて適宜調整され得るが、通常、20〜200 g/Lであり、好ましくは20〜50 g/Lである。また、炭素源がグルコースおよびキシロースの組み合わせである場合、培地中のグルコースおよびキシロースの濃度比は１：１であることが好ましい。
【００９２】
微生物の培養に必要な他の成分としては特に制限はないが、マグネシウム塩、ナトリウム塩、鉄塩、マンガン塩等の金属塩が添加されていることが好ましい。金属塩としては、塩化ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸鉄(II)、硫酸鉄(III)、塩化鉄(II)、塩化鉄(III)、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム二水和物、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化銅、硫酸マンガン、塩化マンガンが挙げられる。さらに必要に応じ、ビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシンといったビタミン類、核酸関連物質等を培地に添加してもよい。また、培地に含まれる窒素原としては、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニンであれば足り、酵母抽出物、ポリペプトン、トリペプトン、カゼイン及びその代謝物、コーンスティープリカー、大豆タンパク質、肉エキス、魚肉エキスは含有されていてもよいし、されていなくてもよい。
【００９３】
また、培地には、タンパク質の発現を誘導するための物質、例えばIPTG等や、細胞の選択のために使用する抗生物質、例えば、ペニシリン系、β-ラクタム系、マクロライド系、クロラムフェニコール系、テトラサイクリン系、アミノグリコシド系、ケトライド系、ポリエンマクロライド系、グリコペプチド系、核酸系、ポリドンカルボン酸系等の抗生物質を添加してもよい。
【００９４】
培養の条件としては、微生物が培地中で増殖することができ、かつ目的の脂肪族化合物または芳香族化合物を効率よく合成できる条件であればよく、当業者であれば、微生物の種類、用いる培地等に合わせて、培養温度、空気の添加の有無、酸素の濃度、二酸化炭素の濃度、培地のpH、培養の際の振盪速度、培養時間、湿度等を適宜調整し、設定することができるが、培養温度に関しては通常25℃〜40℃であり、大腸菌等の場合は増殖速度を最大にし易いという観点から、好ましくは37℃である。また、大腸菌を培養するために好適な培地のpHは7.0であり、培養の際の振盪速度としては、通常180〜300 rpmであり、好ましくは180〜200 rpmである。
【００９５】
培養物からの脂肪族化合物または芳香族化合物の回収は、当分野で通常用いられる方法で行えばよく、特に限定するものではないが、例えば、必要に応じ、濾過、遠心分離、各種クロマトグラフィー等を用いた精製等の方法を単独でまたは組み合わせることができる。
【実施例】
【００９６】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されない。
【００９７】
実施例１  大腸菌の新規株CFTfの作製
（１）大腸菌CFT5株
本実施例で使用される大腸菌CFT5株は、国際公開公報2017/033965に記載の方法に従って製造された株である。親株として、大腸菌のL-フェニルアラニン過剰産生株(ATCC31882)（図１）を元に、glk（グルコキナーゼをコードする遺伝子）及びgalP（ガラクトースパーミアーゼをコードする遺伝子）の高発現ベクターを導入し、ptsH（HPrをコードする遺伝子）およびptsI（Enzyme Iをコードする遺伝子）（ホスホトランスフェラーゼ系）を欠損させることによって、グルコースの取り込みおよびそのリン酸化を担う機構が、生来のホスホトランスフェラーゼ系がガラクトースパーミアーゼ及びグルコキナーゼを組み合わせた系に置き換えられているCFT1株を作製した。大腸菌は、通常、glk及びgalPをゲノム内に保有しているが、グルコースの取り込みおよびそのリン酸化への寄与の程度は、ホスホトランスフェラーゼ系に比べてかなり小さい。従って、ptsHおよびptsIの欠損を補完するためには、内在性のglk及びgalPに加えて、外因性のglk及びgalPの発現が要求された。CFT1株では、取り込まれたグルコースがグルコース-6-リン酸に代謝される際に使用されるリン酸基は、ATPから供給されるのであって、ホスホエノールピルビン酸からは供給されない。次に、CFT1株のpykF（ピルビン酸キナーゼＩをコードする遺伝子）を欠損させることによってCFT2株を作製し、さらにpykA（ピルビン酸キナーゼＩＩをコードする遺伝子）を欠損させることによって、ピルビン酸キナーゼによるホスホエノールピルビン酸をピルビン酸に代謝する経路が遮断されたCFT3株を作製した。さらに、CFT3株にてpheA（コリスミ酸ムターゼをコードする遺伝子）を欠損させることによってCFT4株を作製し、さらにtyrA（コリスミ酸ムターゼをコードする遺伝子）を欠損させることによって、フェニルアラニンを合成できないCFT5株を作製した（図２）。
【００９８】
（２）プラスミドpTΔppc、pTΔpckA、pTΔppsA、pTΔedaの作製
CFT5株のppc（ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子）、pckA（ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子）、ppsA（ホスホエノールピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子）、eda（2-ケト-3-デオキシ-6-ホスホグルコン酸アルドラーゼをコードする遺伝子）の４つの遺伝子を破壊するためのプラスミドを作製した。プラスミドpTargetF（Yu Jiang et al. (Appl Environ Microbiol. 2015 Apr;81(7):2506-14)）をテンプレートとして、プライマーsgRNA ppc Fw、sgRNA ppc Rvを用いてPCRによって直鎖DNAを増幅、精製した。In-Fusion HD Cloning Kitを用いて該直鎖DNAを環状化した。次に、環状化されたDNAを大腸菌に形質転換し、スペクチノマイシン100 μg/Lを含むLB培地で一晩培養した。培養液からプラスミドを抽出、精製し、次いでEcoRI、HindIIIで処理、精製し、得られたDNAをベクターDNAとして用いた。次に、大腸菌ATCC31882をテンプレートとし、プライマーHomSeq Up ppc Fw、HomSeq Up ppc Rv及びHomSeq Dw ppc Fw、HomSeq Dw ppc Rvをそれぞれ用いてPCRによって２つの直鎖DNAを増幅した。さらに、該2つの直鎖DNAをテンプレートとして、プライマーHomSeq Up ppc Fw、HomSeq Dw ppc Rvを用いてオーバーラップPCRによって直鎖DNAを増幅、精製し、得られた直鎖DNAをインサートDNAとして用いた。ベクターDNAとインサートDNAをIn-Fusion HD Cloning Kitにより連結、環状化し、環状化されたDNAを大腸菌に形質転換し、スペクチノマイシン100 μg/Lを含むLB培地で一晩培養した。培養液からプラスミドを抽出、精製し、プラスミドpTΔppcとして用いた。
プラスミドpTΔpckA、pTΔppsA、pTΔedaについても、pTΔppcと同様の方法で作製した。なお、pTΔppc作成時のみ、制限酵素EcoRIの代わりにSalIを用いた。pTΔppc、pTΔpckA、pTΔppsA、pTΔedaの作製に用いたプライマーを表１、２に示す。
【００９９】
【表１】
2020184993.tif 000002
【０１００】
【表２】
2020184993.tif 000003
【０１０１】
（３）CFT5株のppc、pckA、ppsA、edaの破壊
Yu Jiang et al. (Appl Environ Microbiol. 2015 Apr;81(7):2506-14)に記載の方法に従い、プラスミドpCas及びpTΔppcを用いて、CFT5株のppcを破壊した。さらに、pCas及びpTΔpckA、pTΔppsA、pTΔedaをそれぞれ用いて、pckA、ppsA、edaも破壊し、CFTf株を作製した（図３）。CFTf株は、CFT5株のppc、pckA、ppsA、edaが破壊されたことによって、取り込まれたグルコースはピルビン酸にもオキサロ酢酸にも代謝されず、かつピルビン酸もオキサロ酢酸もホスホエノールピルビン酸に代謝されない株である。従って、CFTf株は、グルコースの中間代謝産物（2-ケト-3-デオキシ-6-ホスホグルコン酸またはホスホエノールピルビン酸）とピルビン酸およびオキサロ酢酸との間の代謝経路を喪失しており、グルコース由来の炭素源がトリカルボン酸回路に供給されないため、グルコースだけでは増殖することができなかった。
【０１０２】
実施例２  大腸菌の新規株CFTfxの作製
（１）Dahms経路導入プラスミド(pXYL)の作製
プラスミドpZE12（Expressys）をKpnI、HindIIIで処理、精製し、得られたDNAをベクターDNA1として用いた。次に、Caulobacter crescentusが保有するxdh（キシロースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子）であって、そのコドンをEscherichia coliにおける発現のために最適化した塩基配列を含むDNAを人工遺伝子合成サービス(Invitrogen GeneArt)にて入手した。このDNAをテンプレートとして、プライマーpZ-xdh Fw、pZ-xdh Rvを用いてPCRによって直鎖DNAを増幅、精製し、得られた直鎖DNAをインサートDNA1（xdhをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド）として用いた。ベクターDNA1とインサートDNA1をIn-Fusion HD Cloning Kitにより連結、環状化し、環状化されたDNAを大腸菌に形質転換し、アンピシリン 100 μg/Lを含むLB培地で一晩培養した。培養液からプラスミドを抽出、精製し、プラスミド1として用いた。さらに、精製したプラスミド1をHindIII、EcoRVで処理、精製し、得られたDNAをベクターDNA2として用いた。次に、Caulobacter crescentusが保有するxylC（キシロノラクトナーゼをコードする遺伝子）であって、そのコドンをEscherichia coliにおける発現のために最適化した塩基配列を含むDNAを人工遺伝子合成サービス(Invitrogen GeneArt)にて入手した。このDNAをテンプレートとして、プライマーpZ-xylC Fw、pZ-xylC Rvを用いてPCRによって直鎖DNAを増幅、精製し、得られた直鎖DNAをインサートDNA2（xylCをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド）として用いた。ベクターDNA2とインサートDNA2をIn-Fusion HD Cloning Kitにより連結、環状化し、環状化されたDNAを大腸菌に形質転換し、アンピシリン 100 μg/Lを含むLB培地で一晩培養した。培養液からプラスミドを抽出、精製し、プラスミド2として用いた。さらに、精製したプラスミド2をテンプレートとして、プライマーpZ-xdh-xylC Inv. Rv、pZ-xdh-xylC Inv. Fwを用いてPCRによって直鎖DNAを増幅、精製し、得られたDNAをベクターDNA3として用いた。次に、ATCC31882のyjhG（キシロネートデヒドラターゼをコードする遺伝子）およびyjhH（2-デヒドロ-3-デオキシ-D-吉草酸アルドラーゼをコードする遺伝子）をテンプレートとして、プライマーyjhH Fw、yjhG Rvを用いてPCRによって直鎖DNAを増幅、精製し、得られた直鎖DNAをインサートDNA3（yjhGをコードする塩基配列およびyjhHをコードする塩基配列が連結されたポリヌクレオチド）として用いた。ベクターDNA3とインサートDNA3をIn-Fusion HD Cloning Kitにより連結、環状化し、環状化されたDNAを大腸菌に形質転換し、アンピシリン 100 μg/Lを含むLB培地で一晩培養した。培養液からプラスミドを抽出、精製し、プラスミドpXYLとして用いた。pXYLの作製に用いたプライマーを表３に示す。
【０１０３】
【表３】
2020184993.tif 000004
【０１０４】
（２）CFTf株へのpXYLの導入
CFTf株に対しpXYLをエレクトロポレーション法により導入し、CFTfx株を作製した（図４）。CFTfx株は、pXYLからキシロースデヒドロゲナーゼ、キシロノラクトナーゼ、キシロネートデヒドラターゼおよび2-デヒドロ-3-デオキシ-D-吉草酸アルドラーゼを発現することによってDahms経路が導入され、トリカルボン酸回路にグルコースに代わりキシロース由来の炭素源を供給することが可能となる。Dahms経路の導入については、大腸菌が本来持たないキシロース資化経路であるDahms経路を大腸菌に導入し、エチレングリコールやグリコール酸の生産に成功したと報告されている (Huaiwei Liu et al., Appl Microbiol Biotechnol, (2013) 97:3409-3417; L.-K. Li et al., Biochemical Engineering Journal, 129 (2018) 113-118)。しかし、これらの報告では大腸菌内在のキシロース資化経路を破壊し、培地中にペプトンや酵母抽出物を添加することで細胞増殖に必要な栄養源を補っている。すなわち、これらの報告では、Dahms経路導入の目的はあくまでも基質となる糖（キシロース）から目的化合物を生産する経路の構築であり、CFTfx株のように細胞増殖に必要な代謝物やエネルギーの生産を目的としたものではない。具体的には、CFTfx株は、培地から取り込んだキシロースをキシロースデヒドロゲナーゼによってキシロノラクトンに代謝し、さらにキシロノラクトナーゼによってキシロン酸に代謝し、さらにキシロネートデヒドラターゼによって2-ケト-3-デオキシ-キシロン酸に代謝し、最終的に2-デヒドロ-3-デオキシ-D-吉草酸アルドラーゼによってグルコアルデヒドとピルビン酸に代謝することによって、キシロースからトリカルボン酸回路に炭素源を供給することが可能な株である。また、CFTfx株は、グルコース由来の炭素源がトリカルボン酸回路に供給されないため、グルコースだけでは増殖することができず、キシロース由来の炭素源もまたシキミ酸経路にホスホエノールピルビン酸を供給しないため、キシロースだけでは増殖することができない。しかし、CFTfx株は、グルコースとキシロースの両者を含有する培地では増殖することができた。
【０１０５】
実施例３  大腸菌の新規株CFTfZYcxの作製
（１）ムコン酸生産経路導入プラスミド(pZYc)の作製
プラスミドpSAK（Shuhei Noda et al. (Nat Commun. 2017 Oct 27;8(1):1153)）をテンプレートとして、プライマーpZYc vector Fw、pZYc vector Rvを用いてPCRによって直鎖DNAを増幅、精製し、得られたDNAをベクターDNAとして用いた。次に、プラスミドpZA23-ZYc（Ryosuke Fujiwara et al. (ACS Synth Biol. 2018 Nov 16;7(11):2698-2705)）のaroZ（3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼをコードする遺伝子）、aroY（プロトカテク酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子）およびcatA（カテコール-1,2-ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子）をテンプレートとして、プライマーpZYc insert Fw、pZYc insert Rvを用いてPCRによって直鎖DNAを増幅、精製し、得られた直鎖DNAをインサートDNA（aroZ遺伝子をコードする塩基配列、aroY遺伝子をコードする塩基配列およびcatA遺伝子をコードする塩基配列が連結されたポリヌクレオチド）として用いた。ベクターDNAとインサートDNAをNEBuilder HiFi Assemblyにより連結、環状化し、環状化されたDNAを大腸菌に形質転換し、クロラムフェニコール 30 μg/Lを含むLB培地で一晩培養した。培養液からプラスミドを抽出、精製し、プラスミドpZYcとして用いた。pZYcの作製に用いたプライマーを表４に示す。
【０１０６】
【表４】
2020184993.tif 000005
【０１０７】
（２）CFTfx株へのpZYcの導入
CFTfx株に対しpZYcをエレクトロポレーション法により導入し、CFTfZYcx株を作製した（図５）。CFTfZYcx株は、pZYcから3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ、プロトカテク酸デカルボキシラーゼおよびカテコール-1,2-ジオキシゲナーゼを発現することによって、ムコン酸を生合成することが可能な株である。具体的には、CFTfZYcx株は、解糖系から生合成されるホスホエノールピルビン酸とペントースリン酸経路で生合成されるエリトロース-4-リン酸の縮合反応から開始されるシキミ酸経路の中間産物であるデヒドロシキミ酸を3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼによってプロトカテク酸に代謝し、さらにプロトカテク酸デカルボキシラーゼによってカテコールに代謝し、最終的にカテコール-1,2-ジオキシゲナーゼによってムコン酸に代謝することができる。
【０１０８】
実施例４  大腸菌の新規株CFTfmIxの作製
（１）サリチル酸生産経路導入プラスミド(pZA23mI)の作製
プラスミドpZA23（Expressys）をKpnIで処理、精製し、得られたDNAをベクターDNAとして用いた。次に、プラスミドpZE12-menF-IPL（Shuhei Noda et al. (Metab Eng. 2016 Jan;33:119-129)）のmenF（イソコリスミ酸シンターゼをコードする遺伝子）およびpchB（イソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼをコードする遺伝子）をテンプレートとして、プライマーpZA23ｍI Fw、pZA23mI Rvを用いてPCRによって直鎖DNAを増幅、精製し、得られた直鎖DNAをインサートDNA（menFをコードする塩基配列およびpchBをコードする塩基配列が連結されたポリヌクレオチド）として用いた。ベクターDNAとインサートDNAをGibson assemblyキットにより連結、環状化し、環状化されたDNAを大腸菌に形質転換し、カナマイシン20 μg/Lを含むLB培地で一晩培養した。培養液からプラスミドを抽出、精製し、プラスミドpZE23mIとして用いた。pZE23mIの作製に用いたプライマーを表５に示す。
【０１０９】
【表５】
2020184993.tif 000006
【０１１０】
（２）CFTfx株へのpZA23mIの導入
CFTfx株に対しpZA23mIをエレクトロポレーション法により導入し、CFTfmIx株を作製した（図６）。CFTfmIx株は、pZA23mIからイソコリスミ酸シンターゼおよびイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼを発現することによって、サリチル酸を生合成することが可能な株である。具体的には、CFTfmIx株は、解糖系から生合成されるホスホエノールピルビン酸とペントースリン酸経路で生合成されるエリトロース-4-リン酸の縮合反応から開始されるシキミ酸経路の中間産物であるコリスミ酸をイソコリスミ酸シンターゼによってイソコリスミ酸に代謝し、最終的にイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼによってサリチル酸に代謝することができる。
【０１１１】
実施例５  CFTfZYcx株の増殖および発酵試験
培養プレート上のCFTfZYcx株のコロニーを前培養培地へ植菌し、下記の条件で一晩振盪培養を行った。
培養器：試験管
前培養培地：LB培地（表６）
培養体積：5 mL
温度：37℃
振盪速度：200 rpm
【０１１２】
【表６】
2020184993.tif 000007
【０１１３】
前培養液全量を15 mLチューブに移し5000 g、5 minの条件で遠心し、集菌した。上清を廃棄し、1 ｍL のPBS(-) bufferで洗浄し、5000 g、5 minの条件で遠心し、集菌した。再度、上清を廃棄し、1 ｍL のPBS(-) bufferで洗浄し、5000 g、5 minの条件で遠心し、集菌した。上清を廃棄し、1 ｍL のPBS(-) bufferを加え、菌体を懸濁させた。菌体懸濁液の波長600 nmにおける光学密度(OD600)を測定した。初期OD600＝0.1となるように本培養培地に菌体懸濁液を植菌し、下記の条件で本培養を行った。
培養器：試験管
本培養培地：M9+AAA培地（表７）
培養体積：5 mL
温度：37℃
振盪速度：200 rpm
【０１１４】
【表７】
2020184993.tif 000008
【０１１５】
本培養液から300 μLを1.5 mLチューブにサンプリングし、その内の50 μLをOD600の測定に用いた。残り250 μLを15000 rpm、5 min遠心分離し、上清を新しい1.5 mLチューブに移した。HPLCを用いて、下記の条件で上清中のグルコース濃度、ムコン酸濃度を測定した。Yeast extractを含まず、グルコースおよびキシロースの混合糖のみを炭素源として用いた場合であっても、CFTfZYcx株は増殖することが可能であった（図７）。また同様に、Yeast extractを含まず、グルコースおよびキシロースの混合糖のみを炭素源として用いた場合であっても、CFTfZYcx株はムコン酸を産生することが可能であり、得られるムコン酸の産生効率は、培養72時間後に0.3 g/g（消費されたグルコース/産生されたムコン酸）に達した（図８〜１０）。この産生効率は、Yeast extractとグルコースを含む培地でムコン酸を合成するように遺伝子導入した大腸菌を培養することによって得られるムコン酸の産生効率とほぼ同等の値であった（Zhang, H. et al. (2015) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 8266-8271）。さらに、Yeast extractを含まない培地における培養では、最も高い産生効率であった。
カラム：SCR-102H  (島津製作所）
移動相：5 mM p-トルエンスルホン酸
検出装置：CDD-20A（島津製作所）
【０１１６】
実施例６  CFTfmIx株の発酵試験
培養プレート上のCFTfmIx株のコロニーを前培養培地へ植菌し、下記の条件で一晩振盪培養を行った。
培養器：試験管
前培養培地：LB培地（表８）
培養体積：5 mL
温度：37℃
振盪速度：200 rpm
【０１１７】
【表８】
2020184993.tif 000009
【０１１８】
前培養液全量を15 mLチューブに移し5000 g、5 minの条件で遠心し、集菌した。上清を廃棄し、1 ｍL のPBS(-) bufferで洗浄し、5000 g、5 minの条件で遠心し、集菌した。再度、上清を廃棄し、1 ｍL のPBS(-) bufferで洗浄し、5000 g、5 minの条件で遠心し、集菌した。上清を廃棄し、1 ｍL のPBS(-) bufferを加え、菌体を懸濁させた。菌体懸濁液の波長600 nmにおける光学密度(OD600)を測定した。初期OD600＝0.1となるように本培養培地に菌体懸濁液を植菌し、下記の条件で本培養を行った。
培養器：試験管
本培養培地：M9+AAA培地（表９）
培養体積：5 mL
温度：37℃
振盪速度：200 rpm
【０１１９】
【表９】
2020184993.tif 000010
【０１２０】
本培養液から300 μLを1.5 mLチューブにサンプリングし、その内の50 μLをOD600の測定に用いた。残り250 μLを15000 rpm、5 min遠心分離し、上清を新しい1.5 mLチューブに移した。HPLCを用いて、下記の条件で上清中のサリチル酸濃度を測定した。培地に含まれるグルコース/キシロースの比率は１：１が最もサリチル酸の産生効率が高かった（図１１）。
カラム：PBr  (ナカライテスク）
移動相：0.2 %リン酸水溶液：メタノール＝4：6
検出装置：SPD-20A（島津製作所）
【０１２１】
実施例７  プラスミドコンストラクトの作製
本実施例では表１０〜１２（Ref2. Metabolic design of a platform Escherichia coli strain producing various chorismate derivatives；Ref3. Engineering a synthetic pathway for maleate in Escherichia coli）に記載の株およびプラスミドを使用した。遺伝子クローニングのためにE. coli NovaBlueコンピテントセル(Novagen, Cambridge, MA, USA)を使用した。KOD-Multi & Epi DNAポリメラーゼ(Toyobo, Osaka, Japan)および表１３、１４に記載のプライマーセットを用いてPCRを実施した。NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)を用いて各遺伝子を各プラスミドに組み込んだ。
pSAKmIを以下の通りに構築した。プライマーペアmi_laca_fwおよびmi_laca_rvと共に鋳型としてpZE12mIを用いてPCRにより Escherichia coli K-12 MG1655由来menFおよびPseudomonas aeruginosa由来pchBを含むサリチル酸生産のための遺伝子セットを増幅した。増幅した断片をpSAKのKpnIおよびEcoRI部位にクローニングし、得られたプラスミドをpSAKmIと名付けた。
pSAKmI-gltAを以下の通りに構築した。プライマーペアglta_smai_fwおよびglta_smai_rvと共に鋳型としてE. coli K-12 MG1655の染色体DNAを用いてPCRによりgltAの遺伝子断片を増幅した。増幅した断片をpSAKmIのSmaI部位にクローニングし、得られたプラスミドをpSAKmI-gltAと名付けた。
pSAKmI-gltA-aceBAを以下の通りに構築した。プライマーペアaceba_mlui_fwおよびaceba_mlui_rvと共に鋳型としてE. coli K-12 MG1655の染色体DNAを用いてPCRによりacebaの遺伝子断片を増幅した。また、プライマーペアinv_pz_mlui_fwおよびinv_pz_mlui_rvと共に鋳型としてpSAKmI-gltAを用いてPCRによりプラスミド断片pSAKmI-gltAを増幅した。各PCR断片を互いにコンジュゲートし、得られたプラスミドをpSAKmI-gltA-aceBAと名付けた。
pSAKmI-aceBAを以下の通りに構築した。プライマーペアaceba_smai_fwおよびaceba_smai_rvと共に鋳型としてE. coli K-12 MG1655の染色体DNAを用いてPCRによりaceBAの遺伝子断片を増幅した。増幅した断片をpSAKmIのSmaI部位にクローニングし、得られたプラスミドをpSAKmI-aceBAと名付けた。
pSAKmI-aceBA-gltAを以下の通りに構築した。プライマーペアglta_mlui_fwおよびglta_mlui_rvと共に鋳型としてE. coli K-12 MG1655の染色体DNAを用いてPCRによりacebaの遺伝子断片を増幅した。また、プライマーペアinv_pz_mlui_fwおよびinv_pz_mlui_rvと共に鋳型としてpSAKmI-aceBAを用いてPCRによりプラスミド断片pSAKmI-aceBAを増幅した。各PCR断片を互いにコンジュゲートし、得られたプラスミドをpSAKmI-aceBA-gltAと名付けた。
pZE12-Pt-Maleを以下の通りに構築した。プライマーペアmale_trc_fwおよびmale_trc_rvと共に鋳型としてppT2t01を用いてPCRによりRhodococcus sp. strain NCIMB 12038由来mps2、P. alcaligenes NCIMB 9867由来hbzF Streptomyces hygroscopicus ATCC 29253由来hyg5およびRhodococcus jostii RHA1由来3hb6hを含むマレイン酸生産のための遺伝子セットを増幅した。また、プライマーペアinv_12_trc_fwおよびinv_12_trc_rvと共に鋳型としてpZE12-Ptrcを用いてPCRによりプラスミド断片pZE12-Ptrcを増幅した。各PCR断片を互いにコンジュゲートし、得られたプラスミドをpZE12-Pt-Maleと名付けた。
pSAK-gltAを以下の通りに構築した。プライマーペアglta_pZ_kpni_fwおよびglta_pZ_ecori_rvと共に鋳型としてE. coli K-12 MG1655の染色体DNAを用いてPCRによりgltAの遺伝子断片を増幅した。増幅した断片をpSAKのKpnIおよびEcoRI部位にクローニングし、得られたプラスミドをpSAK-gltAと名付けた。
pSAK-gltA-aceBAを以下の通りに構築した。プライマーペアinv_glta_to_pz_top_fwおよびinv_pz_top_rvと共に鋳型としてpSAKmI-gltA-aceBAを用いてPCRによりプラスミド断片pSAK-gltA-aceBAを増幅した。また、プライマーペアinv_pz_mlui_fwおよびinv_pz_mlui_rvと共に鋳型としてpSAKmI-gltAを用いてPCRによりプラスミド断片pSAKmI-gltAを増幅した。増幅した断片をセルフライゲートし、得られたプラスミドをpSAK-gltA-aceBAと名付けた。
pSAK-gltA-aceBA-mdhを以下の通りに構築した。プライマーペアmdh_mlui_fwおよびmdh_mlui_rvと共に鋳型としてE. coli K-12 MG1655の染色体DNAを用いてPCRによりmdhの遺伝子断片を増幅した。また、プライマーペアinv_pz_mlui_fwおよびinv_pz_mlui_rvと共に鋳型としてpSAK-gltA-aceBAを用いてPCRによりプラスミド断片pSAK-gltA-aceBAを増幅した。各PCR断片を互いにコンジュゲートし、得られたプラスミドをpSAK-gltA-aceBA-mdhと名付けた。
pTF-ΔsdaBおよびpTF-ΔtdcGを以下の通りに構築した。表１３、１４の適切なプライマーペアと共に鋳型としてE. coli K-12 MG1655の染色体DNAを用いてPCRによりeda、sdaBおよびtdcG遺伝子欠損のための遺伝子断片をそれぞれ増幅した。また、プライマーペアinv_ptf_fwおよびinv_ptf_rvと共に鋳型としてpTargetFを用いてPCRによりプラスミド断片pTFを増幅した。各PCR断片をpTF断片に組み込み、得られたプラスミドをpTF-ΔsdaBおよびpTF-ΔtdcGとそれぞれ名付けた。
pTF-N20ΔsdaBおよびpTF-N20ΔtdcGを以下の通りに構築した。N20配列をpTF-Δeda、pTF-ΔsdaBおよびpTF-ΔtdcGに導入するために、表１３、１４の適切なプライマーペアと共に鋳型としてpTF-Δeda、pTF-ΔsdaBおよびpTF-ΔtdcGを用いてPCRによりプラスミド断片pTF-Δeda、pTF-ΔsdaBおよびpTF-ΔtdcGをそれぞれ増幅した。また、プライマーペアinv_ptf_fwおよびinv_ptf_rvと共に鋳型としてpTargetFを用いてPCRによりプラスミド断片pTFを増幅した。結果得られる断片をセルフライゲートし、得られたプラスミドをpTF-N20ΔsdaBおよびpTF-N20ΔtdcGとそれぞれ名付けた。
pTF-N20_for_ΔsdaAを以下の通りに構築した。プライマーペアinv_n20_sdaa_fwおよびinv_n20_sdaa_rvと共に鋳型としてpTargetFを用いてPCRにより、sdaAを不活性化するためのユニバーサルN20配列を持ったpTargetFに対する遺伝子断片を増幅した。増幅した断片をセルフライゲートし、得られたプラスミドをpTF-N20_for_ΔsdaAと名付けた。
pTF-N20ΔsdaAを以下の通りに構築した。表１３、１４の適切なプライマーペアと共に鋳型としてE. coli K-12 MG1655の染色体DNAを用いてPCRによりsdaA遺伝子欠損のための遺伝子断片を増幅した。増幅した遺伝子断片をpTF-N20_for_ΔsdaAのHindIIIおよびEcoRI部位にクローニングし、得られたプラスミドをpTF-N20ΔsdaAと名付けた。
【０１２２】
【表１０】
2020184993.tif 000011
【０１２３】
【表１１】
2020184993.tif 000012
【０１２４】
【表１２】
2020184993.tif 000013
【０１２５】
【表１３】
2020184993.tif 000014
【０１２６】
【表１４】
2020184993.tif 000015
【０１２７】
染色体遺伝子の不活性化
染色体遺伝子の欠損のために使用したプライマー(edd, iclR)は表１３、１４に記載した。親株としては実施例１のCFTf株を使用した。Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit (Funakoshi, Tokyo, Japan)を用いて、製造者プロトコルに従って各遺伝子を欠失させた。欠失のための遺伝子断片およびリコンビナーゼは、Gene Pulser IIを用いることによって各株に導入した。各遺伝子を不活性化するために用いた断片は、表１３、１４に記載の適切なプライマーと共にQuick & Easy E. coli Gene Deletion KitのFRT-PGK-gp2-neo-FRTテンプレートDNAを用いてPCRにより増幅した。染色体遺伝子(sdaA, sdaB, tdcG)を欠失させるため、pTargetFおよびpCasを伴うCRISPR-Cas9 two plasmidsシステム（Multigene Editing in the Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System）を採用した。各遺伝子を不活性化させるため、pTargetF由来の適切なプラスミドを使用した。作成した株とその表現型は表１０、１１に説明した。
【０１２８】
実施例８  CFT573株およびCFT573株の発酵試験
培地として1L当たり以下を含むM9Y培地を使用した。
glucose, 10 g; yeast extract, 5 g; NaCl, 0.5 g; Na2HPO4・12H2O, 17.1 g; KH2PO4, 3 g; NH4Cl, 2 g; MgSO4・7H2O, 246 mg; CaCl2・2H2O, 14.7 mg; FeSO4・7H2O, 2.78 mg; thiamine hydrochloride, 10 mg; L-phenylalanine, 100 mg; L-tyrosine, 40 mg; および L-tryptophan, 40 mg; 更に、終濃度10 mMになるようにピルビン酸Naを加えた。
プレートよりコロニーを取り、試験管で前培養した（3mL）。前培養液を本培養に移した（5mL, 初期OD600=0.05）。24時間ごとにサンプリングし（300μLを回収）、以下の条件でサリチル酸濃度を測定した。
CP-Sil 8 CB-MSキャピラリーカラム(30 mx0.25 mmx0.25 μm; Agilent)を備えたGCMS-QP2010 Ultra (Shimadzu, Kyoto, Japan)を用いてGC-MSを実施した。キャリアガスとしてヘリウムを使用し、流速2.1 mL/minを維持した。導入量はスプリット比１：１０で1μLとした。オーブン温度は最初1分間、150℃を維持し、12℃/minで240℃まで昇温させ、120℃/minで300℃まで昇温させ、3分間、300℃を維持した。総稼働時間は10分だった。その他の設定は以下の通りであった：表面温度250℃、イオン源温度200℃、70 eVの電子衝撃イオン化。
なお、測定のためにサンプルは以下の通りに前処理を行った。分析前に50 mL N-メチル-N-トリメチルシリルトリフルオロアセタミド(MSTFA)および20 mLピリジン中で80℃、60分間、サリチル酸の乾燥残渣を誘導体化した(MacKenzie et al., 1987; Mawhinney et al., 1986)。内部標準としてソルビトールを使用した。
結果を図１２に示す。
【０１２９】
実施例９  CFT591株の発酵試験
培地として1L当たり以下を含むM9Y培地を使用した。
glucose, 10 g; yeast extract, 5 g; NaCl, 0.5 g; Na2HPO4・12H2O, 17.1 g; KH2PO4, 3 g; NH4Cl, 2 g; MgSO4・7H2O, 246 mg; CaCl2・2H2O, 14.7 mg; FeSO4・7H2O, 2.78 mg; thiamine hydrochloride, 10 mg; L-phenylalanine, 100 mg; L-tyrosine, 40 mg; および L-tryptophan, 40 mg; 更に、終濃度10 mMになるようにピルビン酸Naを加えた。
プレートよりコロニーを取り、試験管で37℃で前培養した（3mL）。前培養液を本培養に移した（5mL, 37℃, 初期OD600=0.05）。24時間ごとにサンプリングし（300μLを回収）、以下の条件でマレイン酸濃度を測定した。
CP-Sil 8 CB-MSキャピラリーカラム(30 mx0.25 mmx0.25 μm; Agilent)を備えたGCMS-QP2010 Ultra (Shimadzu)を用いてGC-MSを実施した。キャリアガスとしてヘリウムを使用し、流速2.1 mL/minを維持した。導入量はスプリット比１：１０で1μLとした。生産されたマレイン酸、ゲンチジン酸および3HBAの量を以下の通りに定量した。オーブン温度は最初1分間、150℃を維持し、12℃/minで240℃まで昇温させ、120℃/minで300℃まで昇温させ、最終的に3分間、300℃を維持した。総稼働時間は10分だった。その他の設定は以下の通りであった：表面温度250℃、イオン源温度200℃、70 eVの電子衝撃イオン化。
なお、測定のためにサンプルは以下の通りに前処理を行った。分析前に50 mL N-メチル-N-トリメチルシリルトリフルオロアセタミド(MSTFA)および20 mLピリジン中で80℃、60分間、マレイン酸、ゲンチジン酸および3HBAの乾燥残渣を誘導体化した(MacKenzie et al., 1987; Mawhinney et al., 1986)。内部標準としてソルビトールを使用した。
結果を図１３に示す。
【０１３０】
実施例１０  CFT5912株の発酵試験
培地として1L当たり以下を含むM9Y培地を使用した。
glucose, 10 g; yeast extract, 5 g; NaCl, 0.5 g; Na2HPO4・12H2O, 17.1 g; KH2PO4, 3 g; NH4Cl, 2 g; MgSO4・7H2O, 246 mg; CaCl2・2H2O, 14.7 mg; FeSO4・7H2O, 2.78 mg; thiamine hydrochloride, 10 mg; L-phenylalanine, 100 mg; L-tyrosine, 40 mg; および L-tryptophan, 40 mg; 更に、終濃度6 mMになるようにalpha-ケトグルタル酸Naを加えた。
プレートよりコロニーを取り、試験管で37℃で前培養した（3mL）。前培養液を本培養に移した（5mL, 37℃, 初期OD600=0.05）。24時間ごとにサンプリングし（300μLを回収）、実施例９と同様の条件でマレイン酸濃度を測定した。
結果を図１４に示す。
【０１３１】
実施例１１  CFT5912株の発酵試験
培地として1L当たり以下を含むM9Y培地を使用した。
glucose, 50 g; yeast extract, 10 g; NaCl, 0.5 g; Na2HPO4・12H2O, 17.1 g; KH2PO4, 3 g; NH4Cl, 2 g; MgSO4・7H2O, 246 mg; CaCl2・2H2O, 14.7 mg; FeSO4・7H2O, 2.78 mg; thiamine hydrochloride, 10 mg; L-phenylalanine, 100 mg; L-tyrosine, 40 mg; および L-tryptophan, 40 mg; 更に、終濃度6 mMになるようにalpha-ケトグルタル酸Naを加えた。
400 mLの可動範囲を備えた1.0 Ljジャーファーメンター中でバッチスケール培養を実施した。1% yeast extractを追加したM9Y培地をこのスケールにおけるマレイン酸生産のために用いた。ジャーファーメンター中の培養培地(400 mL)を20 mLの前培養で接種した。培養中pHを7.0に維持するために、NH4OHを培地に自動的に加えた。撹拌速度を200から800 rpmに自動的に調節し、必要に応じて、空気（予め37℃に暖気）を供給することによってDOを1.0-3.0 ppmに維持した。本実施例において、培養開始から2.5時間後に培地にIPTGを加えた。溶存酸素濃度は培養１８時間まで1.0 ppm, １８時間以降を3.0 ppmで制御した。
結果を図１５に示す。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明の微生物を用いることにより、グルコースによる脂肪族化合物や芳香族化合物の高い効率で合成できる。本出願は、日本で出願された特願2019-089294（出願日：令和1年5月9日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
【図１】
2020184993.tif 000016
【図２】
2020184993.tif 000017
【図３】
2020184993.tif 000018
【図４】
2020184993.tif 000019
【図５】
2020184993.tif 000020
【図６】
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【図７】
2020184993.tif 000022
【図８】
2020184993.tif 000023
【図９】
2020184993.tif 000024
【図１０】
2020184993.tif 000025
【図１１】
2020184993.tif 000026
【図１２】
2020184993.tif 000027
【図１３】
2020184993.tif 000028
【図１４】
2020184993.tif 000029
【図１５】
2020184993.tif 000030
【配列表】
2020184993000001.app