(57)【要約】【課題】木質系及び草本系のバイオマスのリグニンを迅速、効率的、及び安価に分解することが可能な新規な細菌、並びにこの細菌を用いたバイオマスの処理方法を提供する。【解決手段】リグニン分解活性を有する酵素を産生する、受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８７６にて特定されるオクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｓｐ．）属に属するＹＴ１５１株である細菌の提供による。また、木質系及び草本系の少なくともいずれかのバイオマスと、この細菌及びその分泌物の少なくともいずれかとを接触させる工程を有するバイオマスの処理方法の提供による。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグニン分解活性を有する酵素を産生する、受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８７６にて特定されるオクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｓｐ．）属に属するＹＴ１５１株である細菌。
【請求項２】
前記酵素が、過酸化水素非要求性のマンガンペルオキシダーゼ様酵素を含む請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
木質系及び草本系の少なくともいずれかのバイオマスと、請求項１又は２に記載の細菌及びその分泌物の少なくともいずれかと、を接触させる工程を有するバイオマスの処理方法。
【請求項４】
前記バイオマスと、前記細菌及びその分泌物の少なくともいずれかとを、過酸化水素非存在下で接触させる請求項３に記載のバイオマスの処理方法。
【請求項５】
リグニンを含有する被処理物と、請求項１又は２に記載の細菌及びその分泌物の少なくともいずれかと、を接触させる工程を有するリグニンの処理方法。
【請求項６】
前記被処理物と、前記細菌及びその分泌物の少なくともいずれかとを、過酸化水素非存在下で接触させる請求項５に記載のリグニンの処理方法。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の細菌又はその分泌物を含有するバイオマスの処理剤。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の細菌又はその分泌物を含有するリグニンの処理剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な細菌、バイオマスの処理方法、リグニンの処理方法、バイオマスの処理剤、及びリグニンの処理剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、地球温暖化防止の観点から、二酸化炭素排出量の削減が求められている。生物由来の資源であるバイオマスを利用するバイオ資源は非化石燃料であり、これを燃焼しても、大気中の二酸化炭素量は実質的に増加しないものとして取り扱われる、いわゆるカーボンニュートラル効果を得ることができる。
【０００３】
従来、バイオエタノールなどのバイオ燃料の原料として、トウモロコシやサトウキビなどの農作物（第１世代バイオマス）が用いられている。しかし、第１世代バイオマスは食糧としても利用されることから、バイオ燃料の原料として大量に消費されると、食糧供給量の減少や食糧価格の高騰などの弊害が生ずる。そこで、近年、食糧とは競合しない木質系及び草本系のバイオマス（第２世代バイオマス）をバイオ燃料の原料として利用するための研究及び開発が進められている。
【０００４】
木質系及び草本系のバイオマスはセルロースを含むので、このセルロースを酵素糖化してグルコースに分解し、さらにグルコースを発酵させることでバイオエタノールを得ることができる。しかし、セルロースは、難分解性の高分子であるリグニンと絡み合った状態で存在しているため、そのままの状態ではセルロースを効率的に酵素糖化することはできない。このため、木質系及び草本系のバイオマスをバイオ燃料の原料として用いる場合には、酸やアルカリによる化学的処理、或いは水熱処理等の物理的処理などの前処理を行ってリグニンを低分子化又は除去することが必要とされている。しかし、木質系及び草本系のバイオマスを化学的に前処理すると、リグニンを含有する大量の廃液（黒液）が生成する。生成した黒液は焼却処分等せざるを得ないため、エネルギーコストがかかるといった課題がある。また、木質系及び草本系のバイオマスを水熱処理する場合には、やはりエネルギーコストの面で課題がある。
【０００５】
そこで、木質系及び草本系のバイオマスからリグニンを効率的に除去する方法として、特定の糸状菌を用いてリグニンを分解処理する方法が提案されている（特許文献１）。また、ある種の白色腐朽菌を用いて草本系バイオマスのリグニンを分解する方法が提案されている（特許文献２）。さらに、特定の細菌を用いて木質系及び草本系のバイオマスのリグニンを低分子化する方法が提案されている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−３２５６０４号公報
【特許文献２】特開２０１０−３５４４６号公報
【特許文献３】特開２０１１−１９３８４８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１〜３で提案されたいずれの方法であっても、リグニンの分解に長時間を要する、或いはリグニンを十分に分解・除去することが困難である等の不都合があり、さらなる改善が求められていた。
【０００８】
本発明は、このような従来技術の有する問題点に鑑みてなされたものであり、その課題とするところは、木質系及び草本系のバイオマスのリグニンを迅速、効率的、及び安価に分解することが可能な新規な細菌を提供することにある。また、本発明の課題とするところは、上記の新規な細菌を用いたバイオマスの処理方法、リグニンの処理方法、バイオマスの処理剤、及びリグニンの処理剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明によれば、以下に示す細菌が提供される。
［１］リグニン分解活性を有する酵素を産生する、受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８７６にて特定されるオクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｓｐ．）属に属するＹＴ１５１株である細菌。
［２］前記酵素が、過酸化水素非要求性のマンガンペルオキシダーゼ様酵素を含む前記［１］に記載の細菌。
【００１０】
また、本発明によれば、以下に示すバイオマスの処理方法が提供される。
［３］木質系及び草本系の少なくともいずれかのバイオマスと、前記［１］又は［２］に記載の細菌及びその分泌物の少なくともいずれかと、を接触させる工程を有するバイオマスの処理方法。
［４］前記バイオマスと、前記細菌及びその分泌物の少なくともいずれかとを、過酸化水素非存在下で接触させる前記［３］に記載のバイオマスの処理方法。
【００１１】
さらに、本発明によれば、以下に示すリグニンの処理方法が提供される。
［５］リグニンを含有する被処理物と、前記［１］又は［２］に記載の細菌及びその分泌物の少なくともいずれかと、を接触させる工程を有するリグニンの処理方法。
［６］前記被処理物と、前記細菌及びその分泌物の少なくともいずれかとを、過酸化水素非存在下で接触させる前記［５］に記載のリグニンの処理方法。
【００１２】
また、本発明によれば、以下に示すバイオマスの処理剤及びリグニンの処理剤が提供される。
［７］前記［１］又は［２］に記載の細菌又はその分泌物を含有するバイオマスの処理剤。
［８］前記［１］又は［２］に記載の細菌又はその分泌物を含有するリグニンの処理剤。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、木質系及び草本系のバイオマスのリグニンを迅速、効率的、及び安価に分解することが可能な新規な細菌を提供することができる。また、本発明によれば、上記の新規な細菌を用いたバイオマスの処理方法、リグニンの処理方法、バイオマスの処理剤、及びリグニンの処理剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＹＴ１５１株の一形態を示す位相差顕微鏡写真である。
【図２】ＹＴ１５１株の他の形態を示す位相差顕微鏡写真である。
【図３】ＹＴ１５１株の２，６−ＤＭＰ酸化酵素活性の測定結果を示す図である。
【図４】ＹＴ１５１株の２，６−ＤＭＰ酸化酵素活性の測定結果を示す図である。
【図５】ＹＴ１５１株の２，６−ＤＭＰ酸化酵素活性の測定結果を示す図である。
【図６】ＹＴ１５１株の２，６−ＤＭＰ酸化酵素活性の測定結果を示す図である。
【図７】ＹＴ１５１株の分子系統樹を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（細菌）
以下、本発明の実施の形態について説明するが、本発明は以下の実施の形態に限定されるものではない。本発明者らは、スギ（杉）を唯一の炭素源とする培地で生育する微生物のスクリーニングを行った（詳細は後述）。その結果、リグニン分解活性を有する酵素を産生する細菌として、オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｓｐ．）属に属するＹＴ１５１株を見出した。このＹＴ１５１株は、本発明者らにより、受領日：２０１９年２月７日に受託番号「ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８７６」として、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託された。
【００１６】
本発明の一実施形態であるオクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｓｐ．）属に属するＹＴ１５１株（以下、単に「ＹＴ１５１株」とも記す）は、リグニン分解活性を有する酵素を産生する細菌である。リグニン分解活性を有する酵素には、例えば、ラッカーゼ（Ｌａｃ）、マンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）、及びリグニンペルオキシダーゼ（ＬｉＰ）などが少なくとも含まれていると考えられる。
【００１７】
マンガンペルオキシダーゼ及びリグニンペルオキシダーゼは、いずれも、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の存在下でリグニンやそのモデル化合物（例えば、２，６−ジメトキシフェノール（２，６−ＤＭＰ））の酸化を触媒する酵素である。マンガンペルオキシダーゼは、その酵素活性の発現にマンガンイオン（Ｍｎ２＋）を要求するマンガン要求性の酵素であり、リグニンペルオキシダーゼはマンガン非要求性の酵素である。また、ラッカーゼも、リグニンやそのモデル化合物（２，６−ＤＭＰ等）の酸化を触媒する酵素であるが、過酸化水素を要求しない過酸化水素非要求性の酵素である。２，６−ＤＭＰの酸化反応を以下に示す。２，６−ＤＭＰの酸化により生じた式（Ａ）で表される化合物は極大吸収を４６９ｎｍ（黄色）に有するため、吸光度を測定することでリグニン分解活性を有する酵素の存在及び酵素活性の強さを確認することができる。ＹＴ１５１株は、過酸化水素要求下及び非要求下のいずれの条件下であっても、リグニン分解活性を有する酵素を産生する細菌である。さらなる検討の結果、本発明者らは、ＹＴ１５１株が、マンガンイオン存在下で強い２，６−ＤＭＰ酸化活性を示すとともに、マンガンイオン非存在下では極めて微弱な２，６−ＤＭＰ酸化活性を示し、かつ、過酸化水素非存在下であっても２，６−ＤＭＰ酸化活性を示す、これまでにないタイプのマンガンペルオキシダーゼ様酵素を産生する細菌であることを見出した。
【００１８】
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【００１９】
ＹＴ１５１株が産生するマンガンペルオキシダーゼ様酵素を含むマンガンペルオキシダーゼは、２価のマンガンイオン（Ｍｎ２＋）を酸化して３価のマンガンイオン（Ｍｎ３＋）を生じさせる反応を触媒する。生成する３価のマンガンイオン（Ｍｎ３＋）は、非常に反応性が高く、自然界ではシュウ酸やマロン酸などの有機酸によりキレート化し、Ｍｎ３＋−有機酸錯体を形成して安定化する。形成されるＭｎ３＋−有機酸錯体は比較的小さいため、酵素から容易に拡散し、リグニンを分解する際の酸化剤として機能すると考えられる。すなわち、ＹＴ１５１株が産生するマンガンペルオキシダーゼ様酵素などのマンガンペルオキシダーゼは、ラッカーゼと異なり、生成する３価のマンガンイオン（Ｍｎ３＋）が、酵素タンパク質が容易に入り込むことのできないリグニン骨格構造中にも比較的容易に入り込んで、リグニンをより効率的かつ速やかに分解することが期待される。
【００２０】
ＹＴ１５１株は、例えば、スギを唯一炭素源とするスギ培地を用いて好気的条件下で培養し、増殖させることができる。培養液のｐＨは６．０〜８．０であることが好ましい。培養温度は２０〜３７℃であることが好ましい。また、ＹＴ１５１株は、ＬＢ培地を用いて培養し、増殖させることもできる。
【００２１】
さらに、スギ微粉末などの木質系炭素源；ケナフ微粉末、トマト茎微粉末、稲・麦ワラ微粉末などの草本系炭素源；を唯一の炭素源とする培地を用いて培養する、すなわち、栄養要求性に基づく選択圧をかけた状態で培養することで、リグニンの分解活性を有する酵素の産生を促すことができるために好ましい。
【００２２】
（バイオマスの処理方法）
本発明のバイオマスの処理方法の一実施形態は、木質系及び草本系の少なくともいずれかのバイオマスと、前述の細菌（ＹＴ１５１株）及びその分泌物の少なくともいずれかと、を接触させる工程を有する。ＹＴ１５１株を液体培地で培養すると、リグニン分解活性を有する酵素は菌体外に分泌される。このため、リグニン分解活性を有する酵素は、培養液や培養液上清などのＹＴ１５１株の分泌物を含む組成物に含有されている。したがって、ＹＴ１５１株をバイオマスに直接的に接触させることの他、ＹＴ１５１株の分泌物をバイオマスに接触させることでも、バイオマスのリグニンを酸化して分解し、低分子化することができる。
【００２３】
ＹＴ１５１株は、過酸化水素非存在下であってもリグニン分解活性（２，６−ＤＭＰ酸化活性）を示す、これまでにないタイプのマンガンペルオキシダーゼ様酵素を産生する細菌である。このため、バイオマスと、細菌（ＹＴ１５１株）及びその分泌物の少なくともいずれかとを、過酸化水素非存在下で接触させることでも、バイオマスのリグニンを酸化して分解し、低分子化することができる。すなわち、過酸化水素を用いない系でリグニンを分解可能であることから、処理工程や処理コストの削減に寄与する。勿論、コストなどに影響を及ぼさない範囲で過酸化水素を用いてもよい。なお、さらに二価のマンガンイオン（Ｍｎ２＋）の存在下でバイオマスと、細菌（ＹＴ１５１株）及びその分泌物の少なくともいずれかとを接触させることで、より効率的にリグニンを酸化分解することができるために好ましい。
【００２４】
木質系バイオマスの具体例としては、間伐材、林地残材、建築廃材、製材廃材などを挙げることができる。また、草本系バイオマスの具体例としては、稲ワラ、もみ殻、麦ワラ、青刈りトウモロコシ、牧草、葦、竹などを挙げることができる。さらに、海外における有望な草本系バイオマスとしては、イネ科のエリアンサス、ネピアグラス、及び麦ワラなどを挙げることができる。
【００２５】
本実施形態のバイオマスの処理方法によれば、リグニン分解活性を有する酵素を産生するＹＴ１５１株又はその分泌物を用いることで、バイオマスに含まれる難分解性のリグニンを選択的に分解して低分子化し、バイオマスに含まれるセルロースやキシランを分解しやすい状態にすることができる。このため、本実施形態のバイオマスの処理方法は、木質系及び草本系のバイオマスを原料としてバイオエタノールを生産する際のバイオマスの前処理方法として好適である。
【００２６】
（リグニンの処理方法）
本発明のリグニンの処理方法の一実施形態は、リグニンを含有する被処理物と、前述の細菌（ＹＴ１５１株）又はその分泌物と、を接触させる工程を有する。前述の通り、リグニン分解活性を有する酵素は、培養液や培養液上清などのＹＴ１５１株の分泌物を含有する組成物に含有されている。したがって、ＹＴ１５１株を被処理物に直接的に接触させることの他、ＹＴ１５１株の分泌物を被処理物に接触させることでも、被処理物に含まれるリグニンを酸化して分解し、低分子化することができる。
【００２７】
前述の通り、ＹＴ１５１株は、過酸化水素非存在下であってもリグニン分解活性（２，６−ＤＭＰ酸化活性）を示す、これまでにないタイプのマンガンペルオキシダーゼ様酵素を産生する細菌である。このため、リグニンを含有する被処理物と、細菌（ＹＴ１５１株）及びその分泌物の少なくともいずれかとを、過酸化水素非存在下で接触させることでも、リグニンを酸化して分解し、低分子化することができる。すなわち、過酸化水素を用いない系でリグニンを分解可能であることから、処理工程や処理コストの削減に寄与する。勿論、コストなどに影響を及ぼさない範囲で過酸化水素を用いてもよい。なお、さらに二価のマンガンイオン（Ｍｎ２＋）の存在下で被処理物と、細菌（ＹＴ１５１株）及びその分泌物の少なくともいずれかとを接触させることで、より効率的にリグニンを酸化分解することができるために好ましい。
【００２８】
リグニンを含有する被処理物としては、例えば、木質系及び草本系のバイオマスを化学的に又は高温高圧水で前処理した際に生成する、或いはパルプ製造時に生成する廃液（黒液）などを挙げることができる。このような黒液は難分解性のリグニンを大量に含有するため、従来は焼却処理せざるを得ないものであった。本実施形態のリグニンの処理方法によれば、リグニン分解活性を有する酵素を産生するＹＴ１５１株又はその分泌物を用いることで、黒液中のリグニンを分解して低分子化することができる。これにより、焼却処理することなく黒液を処分しうることが期待され、エネルギーコスト削減の観点で有効である。
【００２９】
（バイオマス及びリグニンの処理剤）
本発明のバイオマス及びリグニンの処理剤（以下、単に「処理剤」とも記す）の一実施形態は、いずれも、前述の細菌（ＹＴ１５１株）又はその分泌物を含有する。処理剤は、固形物であってもよく、液状物であってもよい。固形の処理剤としては、例えば、従来公知の方法に従って製造される微生物製剤などを挙げることができる。また、液状の処理剤としては、ＹＴ１５１株を液体培養して得られる培養液及びその濃縮物などを挙げることができる。さらに、この培養液を乾燥及び製造助剤を添加して製造される固形剤としてもよい。これらの処理剤を、木質系及び草本系の少なくともいずれかのバイオマスや、リグニンを含有する被処理物と混合等して用いることができる。なお、処理剤は、二価のマンガンイオン（Ｍｎ２＋）をさらに含有することが、バイオマスやリグニンの処理効率をより高めることができるために好ましい。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、実施例、比較例中の「部」及び「％」は、特に断らない限り質量基準である。
【００３１】
＜リグニン分解菌の探索＞
（集積培養）
以下に示す組成（残部は水）のスギ培地を５００μＬ／ｗｅｌｌ（ｉｎ  Ｄｅｅｐ  Ｓｑｕａｒｅ  Ｐｌａｔｅ）に１００μＬずつ分注した。プレートシールで封止した後、１２１℃で１５分間オートクレーブをかけて滅菌した。
【００３２】
［スギ培地（スギ２％、ｐＨ７．０〜７．５）］
・スギ（間伐材）４０ｍｅｓｈ：２．０％
・硫酸アンモニウム：１．０％
・硝酸ナトリウム：１．０％
・リン酸二水素カリウム：０．５％
・リン酸水素二カリウム：０．１％
・硫酸マグネシウム七水和物：０．１％
・硫酸第一鉄：２０ｍｇ／Ｌ
・塩化ナトリウム：０．１％
・塩化カルシウム二水和物：０．０５％
・酵母エキス：０．１％
【００３３】
岐阜県の畑で採取した土壌サンプルを滅菌した生理食塩水に懸濁させて懸濁液を得た。スギ培地が入ったウェルに懸濁液を２０μＬずつ入れ、３０℃、１，２００ｒｐｍ、１〜２週間振とう培養した。プレート遠心機を使用し、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。得られた上清の２，６−ＤＭＰ酸化酵素活性を測定し、活性を示したウェルの培養液５０μＬをＬＢ培地に植菌した。２，６−ＤＭＰ酸化酵素活性の測定とＬＢ培地への植菌を２〜４回繰り返した後、得られた培養液を希釈してＬＢ寒天培地に植菌した。３０℃、３００ｒｐｍの条件で振とう培養した後、形成された単一コロニーのそれぞれについて２，６−ＤＭＰ酸化酵素活性を測定し、高い活性を示した細菌を単離した。単離した細菌を「ＹＴ１５１株」とし、ＬＢＡ寒天培地に植菌して４℃で保存した。また、単離したＹＴ１５１株の形態を示す位相差顕微鏡写真を図１及び２に示す。図１及び２に示すように、ＹＴ１５１株は短桿菌であると考えられる。なお、グラム染色によりＹＴ１５１株を染色したところ、難染色性であることがわかった。
【００３４】
（２，６−ＤＭＰ酸化酵素活性の測定）
培養液の上清５０μＬ又は７０μＬをマイクロプレートに分注し、波長４６９ｎｍの吸光度を測定した。４５℃で５分間保温した後、以下に示す組成の基質混合液５０μＬを添加し、４５℃で１０分間反応させた。基質混合液の色を目視で確認した後、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を２ｍｏｌ／Ｌとなるように添加した。さらに、４５℃で１０分間反応させた後、基質混合液の色を目視で確認した。基質混合液の色が透明から黄色に変化した場合に、２，６−ＤＭＰ酸化酵素活性を有すると判断することができる。単離したＹＴ１５１株の２，６−ＤＭＰ酸化酵素活性の測定結果を図３〜５に示す。
【００３５】
［基質混合液］
・２，６−ＤＭＰ：５ｍｍｏｌ／Ｌ
・硫酸マンガン：５ｍｍｏｌ／Ｌ
・酢酸緩衝液（ｐＨ７．０）：１００ｍｍｏｌ／Ｌ
【００３６】
図３は反応前（活性測定前）の基質混合液の状態を示す。図４は反応後（過酸化水素添加前）の基質混合液の状態を示し、図５は反応後（過酸化水素添加後）の基質混合液の状態を示す。なお、図３〜５中、左端及び中央のウェルがＹＴ１５１株の培養上清に対応し、右端のウェルが対照に用いた西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に対応する。図４に示すように、ＹＴ１５１株の培養上清は過酸化水素添加前であっても２，６−ＤＭＰ酸化酵素活性を示した。このことから、ＹＴ１５１株は、過酸化水素を要求しない酵素を産生する細菌であると考えられる。さらに、図４及び５に示すように、過酸化水素を添加して反応させたことで、基質混合液の色（黄色）がより濃厚になった。
【００３７】
（マンガンイオン存在下と非存在下（ＥＤＴＡ添加区）における２，６−ＤＭＰ酸化酵素活性の測定）
マイクロプレートを用いて、以下に示す組成の１００μＬの反応液で、室温（２０℃）で１時間反応させた。陰性コントロールとして、植菌していないＬＢ培地を用いた。２，６−ＤＭＰ酸化酵素活性を目視で確認した結果を図６に示す。
【００３８】
［反応液］
・ＹＴ１５１株の培養上清又はＬＢ培地：１０μＬ
・２，６−ＤＭＰ：５ｍｍｏｌ／Ｌ
・塩化マンガン又はＥＤＴＡ：１ｍｍｏｌ／Ｌ
・トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）：５０ｍｍｏｌ／Ｌ
【００３９】
図６中、左上のウェルが、ＹＴ１５１株の培養上清のマンガンイオン存在下での反応後の状態に対応する。また、左下のウェルが、ＹＴ１５１株の培養上清のマンガンイオン非存在下（ＥＤＴＡ添加区）での反応後の状態に対応する。さらに、右上のウェルが、陰性コントロールとして用いたマンガンイオン存在下のＬＢ培地に対応する。（ＥＤＴＡ添加区）そして、右下のウェルが、陰性コントロールとして用いたマンガンイオン非存在下（ＥＤＴＡ添加区）のＬＢ培地に対応する。図６に示すように、ＹＴ１５１株の培養上清は、マンガンイオン非存在下では２，６−ＤＭＰ酸化活性が極めて微弱であるのに対し、マンガンイオン存在下では強い活性を示すことがわかる。このことから、ＹＴ１５１株は、過酸化水素非要求性であるとともに、マンガンイオン要求性である、新たなタイプのマンガンペルオキシダーゼ様酵素を産生する細菌であるといえる。
【００４０】
＜単離した菌株の同定＞
単離したＹＴ１５１株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列（約１，５００ｂｐ）を解析し、菌株の同定を行った。菌株の培養条件及び１６Ｓ  ｒＤＮＡの抽出から塩基配列決定までの手順等を以下に示す。
【００４１】
［培養条件］
・培地：ＬＢ寒天培地
・培養温度：３０℃
・培養時間：４８時間
・その他の条件：好気培養
【００４２】
［１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列解析］
・ＤＮＡ抽出：アクロモペプチダーゼ（和光純薬社製）
・ＰＣＲ増幅：ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）
・サイクルシーケンス：ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
・使用プライマー：ＰＣＲ  増幅；９Ｆ，１５１０Ｒ
：シークエンス；９Ｆ，７８５Ｆ，８０２Ｒ，１５１０Ｒ
・シークエンス：ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１３０  ｘ１  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
・塩基配列決定：ＣｈｒｏｍａｓＰｒｏ  １．７（Ｔｅｃｈｎｅｌｙｓｉｕｍ  Ｐｔｙ社製）
【００４３】
ＹＴ１５１株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列は、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍの基準株に対して相同率９９．６％であり、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｃｉｃｅｒｉの基準株に対して相同率９９．８％であることが判明した。この結果から、ＹＴ１５１株を、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｃｉｃｅｒｉに近縁なＯｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｓｐ．属に属する菌株であると同定した。分子系統樹を図７に示す。
【００４４】
Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｃｉｃｅｒｉ  Ｃａ−３４Ｔ（ＤＯ６４７０５６）の配列には４０塩基以上の挿入があり、分子系統解析時に考慮されないことが知られている。また、ＢＬＡＳＴ検索時は、挿入配列部が連続する不一致箇所となってスコア計算時に減算されるため、挿入配列部を含む約１７０ｂｐが削除され、比較塩基数が１，２６７ｂｐまで短くなる。この挿入部分を考慮したＹＴ１５１株とＯｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｃｉｃｅｒｉ  Ｃａ−３４Ｔ（ＤＱ６４７０５６）間の相同率は９６．２％であった。図７に示すように、１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列に基づく分子系統解析の結果、ＹＴ１５１株はＯｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ属の種で形成されるクラスター内に含まれ、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｃｉｃｅｒｉ  Ｃａ−３４Ｔ（ＤＱ６４７０５６）と系統枝を形成した。しかし、両者の間には距離が認められ、互いにやや異なる分子系統学的位置を示した。また、その外側にはＯｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ  ＣＣＵＧ  ２４６９４Ｔ（ＡＭ１１４４１１）が系統樹を形成した。ＹＴ１５１株は、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ  ＣＣＵＧ  ２４６９４Ｔ（ＡＭ１１４４１１）の１６Ｓ  ｒＤＮＡ部分塩基配列と５塩基の相違点が認められた。また、ＹＴ１５１株と、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｃｉｃｅｒｉ  Ｃａ−３４Ｔ（ＤＯ６４７０５６）の１６Ｓ  ｒＤＮＡ部分塩基配列との間には、上記の挿入以外に９塩基の相違が認められ、２塩基で挿入／欠損を認めたが、残りの７塩基は明確に異なった。以上の結果から、ＹＴ１５１株は、既知種ではＯｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ及びＯｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｃｉｃｅｒｉの近縁であり、系統的にはＯｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｃｉｃｅｒｉに近縁であると考えられる。よって、１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列に基づく分子系統解析の結果から、ＹＴ１５１株をＯｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｃｉｃｅｒｉに近縁なＯｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ．ｓｐ属に属する菌株であると同定した。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明の細菌は、これまで処理が困難であったバイオマスのリグニンを迅速、効率的、及び安価に分解処理しうる菌として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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