(57)【要約】      （修正有）【課題】均質な抗体集団の提供。【解決手段】モノクローナルＩｇＧ２抗体であって：軽鎖ポリペプチドと；ヒンジ領域を有する重鎖ポリペプチドと、を含み、前記抗体が前記重鎖または軽鎖ポリペプチドにおいてアミノ酸修飾を含み、その結果、前記修飾が、前記軽鎖ポリペプチドの最もＣ末端側のシステイン残基を通じて前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域におけるアミノ酸とのみ主に鎖間ジスルフィド結合を形成する軽鎖ポリペプチドを提供する、モノクローナルＩｇＧ２抗体。【選択図】図１Ｂ
2020063298.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の抗体、抗体処方物、方法、核酸、ベクター、細胞等。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２００７年９月１４日に出願された米国仮特許出願第６０／９７２，６８８号（この内容は、その全体において参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は概して、好ましい形態のモノクローナル抗体の富化および／または回収における向上を生じる方法に関する。さらに詳細には、本発明は組み換えＩｇＧ２抗体タンパク質ヒンジの領域におけるジスルフィド異質性を排除するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
１９６０年代には、均質なヒトＩｇＧ骨髄腫タンパク質に対する特定のポリクローナルウサギ抗血清で行われた広範囲な研究によって、それぞれ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４と命名されたヒトＩｇＧの４個の別個のサブグループの存在が明らかになった。この４個のサブクラスによって、ｙ重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列において大きい相同性が示される。この４個のＩｇＧサブクラスは、２つの重鎖の間のジスルフィド結合を含んでいる分子の一部である「ヒンジ領域」のアミノ酸組成および構造において最も目立つ相違を示す。Ｆａｂアーム（抗原を結合するフラグメント）と両方の重鎖の２つのカルボキシルドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）との間の領域によって、分子の可塑性を規定することが補助される。
【０００４】
上部のヒンジ（アミノ末端に向かう）セグメントによって、Ｆａｂアームの間の角度の変動（Ｆａｂ−Ｆａｂ間の可塑性）、および各々の個々のＦａｂの回転の可塑性が許容される。下部のヒンジ領域（カルボキシル末端へ向かう）の可塑性によって、Ｆｃ領域に対するＦａｂアームの位置（Ｆａｂ−Ｆｃ可塑性）を決定することが補助される。ヒンジ依存性のＦａｂ−ＦａｂおよびＦａｂ−Ｆｃの可塑性は、補体活性化およびＦｃ受容体結合などのさらなるエフェクター機能を誘引するのに重要であり得る。
【０００５】
インビボでのタンパク質のジスルフィド結合形成は、複雑な過程であり、これは環境の酸化還元電位および専門的なチオール−ジスルフィド交換酵素によって影響される（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。ジスルフィドは、小胞体中への新生鎖の分泌の間または直後に細胞中で形成される（非特許文献１）。同じタンパク質のいくつかの立体配置アイソフォームであって、ただし異なるジスルフィド構造を有するアイソフォームが、ジスルフィド形成プロセスの失敗、タンパク質構造における３つ以上のシステイン残基の近接近性、または不対システイン残基の表面露出に起因して、哺乳動物細胞において組み換えタンパク質産生の間に生成され得る。
【０００６】
ほとんどの現在研究されている治療用のｍＡｂはＩｇＧ１またはＩｇＧ４サブタイプのｍＡｂであるが、ＩｇＧ２抗体が、そのエフェクター機能のレベルが低いことに起因して特定の適応については他のサブクラスのものよりも好ましい場合もある（Ｃａｎｆｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３、１４８３〜１４９１、１９９１）。しかし、組み換えＩｇＧ２型モノクローナル抗体においてジスルフィド結合の割り当てを考証する構造的情報は限られている。
【０００７】
抗体治療における近年の進歩では、抗体構造の理解を向上することおよび生物学的機能に対するその関係に新たな関心が生じている。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２サブクラスは、循環中で最も豊富であり、長時間作用性であり、かつ安定な免疫グロブリンであるので、大変注目されている。
【０００８】
いくつかの以前の報告では、ＩｇＧ２分子は、遊離のチオール基を含み、かつγグロブリンの他のサブクラスに比較した場合構造的に異種であることが示唆されている。１つの報告では、遊離のチオール基の含量は、５、５’−ジチオ（２、２’−ジニトロ）ベンゾアート（ＤＴＮＢ）との反応によって４つのヒトＩｇＧ抗体類の全てについて測定された（Ｓｃｈａｕｅｎｓｔｅｉｎら  １９８６  Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８０：１７４〜１７９）。覆われていない遊離のチオール（ヒトＩｇＧ１モルあたり約０．２４）がＩｇＧ２サブクラスに割り当てられた。４つのヒトＩｇＧサブクラスの全てがチオレドキシンレダクターゼおよびＮＡＤＰＨでのチオレドキシンによる鎖間ジスルフィド結合の還元に供されたことも他に報告されている。ＩｇＧ２は、２つのエフェクターにおいて他のサブクラスとは異なっていることが見出された：１）ＩｇＧ２は還元に対して耐性であって、２）ＮＡＤＰＨ試薬を消費した。後者の知見によって、その試薬は、不安定な鎖間または表面露出された混合されたジスルフィドの還元によって消費されることが示唆された。さらに別の研究では、ＩｇＧ２の共有結合二量体は、プールされたヒトγグロブリンおよびいくつかの正常な血清で検出された（Ｙｏｏら、２００３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７０：３１３４〜３１３８）。二量体の臭化シアン切断分析によって、ヒンジ中の１つ以上のシステイン残基が二量体のアセンブリに関与することが示され、さらに、ＩｇＧ２のヒンジにおける遊離または不安定なシステインの存在も示唆される。Ｐｈｉｌｌｉｐｓらによる研究（Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，３１：１２０１〜１２１０、１９９４）では、沈殿および電子顕微鏡分析を用いて、ＩｇＧ２分子の多重の形状および二価のハプテンを有するそれらの複合体が、そしてヒトγグロブリンの他の３つのサブクラスについては単一の形態のみが特定された。この影響力の大きい研究では、ＩｇＧ２サブクラス内に存在する構造的な異質性に言及したものはまだ誰もいない。ＩｇＧ４ヒンジにおけるセリンからプロリンへの変異は、ＨＬ「半抗体」を排除することによって、およびＨ２Ｌ２四量体の形成を増強することによって異質性を減少するということが報告されている（Ａｎｇａｌら、１９９３、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３０：１０５〜１０８、その全体が参照によって本明細書に援用される）。さらに、ＩｇＧ１に由来するヒンジ領域と組み合わせた、ＩｇＧ２抗体のＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを有するハイブリッドＩｇＧアイソタイプは、高レベルの発現に有用であることが報告されている（その全体が参照によって本明細書に援用される、特許文献１）。
【０００９】
近年の報告によれば、抗体フラグメント主にＦａｂおよびＦａｂ’の軽く２００を超える構造が決定されている（Ｓａｐｈｉｒｅら、２００２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３１９：９−１８）。インタクトな抗体の結晶は、１０回しか報告されておらず、これらの結晶のうち７個だけが部分的または完全な構造を提供した。これらの構造の全てがマウスＩｇＧまたはヒトＩｇＧ１抗体のいずれかであったが、ヒトＩｇＧ２ではなかった（Ｓａｐｈｉｒｅら、２００２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３１９：９〜１８）。全長ヒンジを有するＩｇＧの構造全体は３回しか報告されていない：ｍＡｂ  ２３１、マウスＩｇＧ２ａ（Ｈａｒｒｉｓら、１９９２，Ｎａｔｕｒｅ、３６０：３６９〜３７２；Ｌａｒｓｏｎら、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：１７〜１９）、ｍＡｂ  ６１．１．３、マウスＩｇＧ１（Ｈａｒｒｉｓら、１９９８、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７５：８６１〜８７２）；およびＨＩＶ−１のｇｐ１２０に対するヒトＩｇＧ１  ｂ１２（Ｓａｐｈｉｒｅら、２００１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、  ２９３：１１５５〜１１５９；Ｓａｐｈｉｒｅら、２００２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３１９：９〜１８）。ＰＤＢナンバー１ＨＺＨ由来のヒンジに近いヒトＩｇＧ１抗体の結晶画像のフラグメントが利用可能である（Ｓａｐｈｉｒｅら、２００１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３：：１１５５−１１５９）。オンラインでの質量分析による逆相クロマトグラフィーを用いることによるインタクトな抗体の現在開発されている分析方法が報告されており、これによってヒトＩｇＧ２抗体の異質性の発見および特徴付けを促進することが補助されている（Ｄｉｌｌｏｎら、２００４、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，１０５３：２９９〜３０５）。
【００１０】
近年では、ＩｇＧ２サブクラスにおける構造の異質性が観察されているが、この異質性の背景にある理由は、まだ説明されていない。例えば、特許文献２、Ｄｉｌｌｏｎら、（その全体が参照によって本明細書に援用される）は、抗体を含んでいる、高分子量タンパク質を分析する逆相ＬＣ／ＭＳ法を考察している。さらに、特許文献３、Ｄｉｌｌｏｎら、（その全体が参照によって本明細書に援用される）は、還元／酸化カップリング試薬および必要に応じてカオトロピック剤を用いる組み換えＩｇＧタンパク質の調製を供することによって特定のＩｇＧアイソフォームを一過性に富化する方法に関する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第７、１４８、３２１号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／０１６１３９９号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００６／０１９４２８０号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８４）１０７，３０５〜３２９
【非特許文献２】Ｈｏｕｅｅ−Ｌｅｖｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（２００２）３５３、３５〜４４
【非特許文献３】ＲｉｔｚおよびＢｅｃｋｗｉｔｈ、Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｔｈｉｏｌ−ｒｅｄｏｘ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００１）５５、２１〜４８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の実施形態は、所望の高次構造のアイソフォームが産生される抗体サブタイプの同質性の集団の効率的かつ経済的な産生、精製、および分析を提供することに関する。さらに詳細には、本発明は、改善された貯蔵安定性を含めて改善された薬学的特性を生じるヒトＩｇＧ２抗体を操作することによって、同質性のＩｇＧ２ジスルフィド型を作製する方法を記載する。本明細書において下にさらに記載されるとおり、ＩｇＧ２分子のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入によって、ジスルフィド異質性の排除を促進し得、従ってＩｇＧ２抗体の構造的に均質な、さらに活性の単一の高次構造のアイソフォームが産生される。
【００１４】
上記によれば、本明細書では、モノクローナルＩｇＧ２抗体が提供され、この抗体は：軽鎖ポリペプチド；およびヒンジ領域を有する重鎖ポリペプチドを含んでおり、ここでこの抗体は、重鎖または軽鎖ポリペプチドにおいてアミノ酸修飾を含み、その結果その修飾によって、軽鎖ポリペプチドの最もＣ末端側のシステイン残基を通じて重鎖ポリペプチドのヒンジ領域におけるアミノ酸との鎖間ジスルフィド結合を主に形成する軽鎖ポリペプチドが提供される。特定の局面では、この修飾は、重鎖ポリペプチド修飾を含む。特定の局面では、この修飾は、重鎖ポリペプチドのＥｕ位置１３１でシステイン残基の置換または欠失を含んでもよい。特定の局面では、このヒンジ領域は、重鎖ポリペプチドのＥｕアミノ酸２００〜２３８を含む。特定の局面では、この軽鎖ポリペプチドの最もＣ末端側のシステイン残基は軽鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１４のシステイン残基である。特定の局面では、この軽鎖ポリペプチドは常に、軽鎖ポリペプチドの最もＣ末端側のシステイン残基を通じて重鎖ポリペプチドのヒンジ領域におけるアミノ酸とのみ鎖間ジスルフィド結合を形成する。
【００１５】
また本明細書では、モノクローナルＩｇＧ２抗体が提供され、この抗体は：軽鎖ポリペプチドと；ヒンジ領域を有する重鎖ポリペプチドを含んでおり、ここでこの抗体は、重鎖または軽鎖ポリペプチドにおいてアミノ酸修飾を含み、その結果その修飾によって、軽鎖ポリペプチドの最もＣ末端側のシステイン残基を通じて重鎖ポリペプチドのヒンジ領域の外側のアミノ酸との鎖間ジスルフィド結合を主に形成する軽鎖ポリペプチドが提供される。特定の局面では、この軽鎖ポリペプチドの最もＣ末端側のシステイン残基は軽鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１４のシステイン残基である。特定の局面では、ヒンジ領域の外側のアミノ酸は重鎖ポリペプチドのＥｕ位置１３１のシステイン残基である。特定の局面では、この重鎖ポリペプチド修飾は、ヒンジ領域内にシステイン残基の変異を含む。変異されたシステイン残基は、例えば、重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１９または２２０であってもよい。特定の局面では、この軽鎖ポリペプチドの最もＣ末端側のシステイン残基は軽鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１４のシステイン残基である。
【００１６】
特定の局面では、この重鎖ポリペプチド修飾は、重鎖ポリペプチドのヒンジ領域において１つ以上のアミノ酸の挿入を含む。特定の局面では、１つ以上のアミノ酸の上記挿入は、重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１９と２２０との間である。他の局面では、１つ以上のアミノ酸の前記挿入は、前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１８と２１９との間である。
【００１７】
特定の局面では、この重鎖ポリペプチド修飾は、重鎖ポリペプチドのヒンジ領域において１つ以上のアミノ酸の欠失を含む。特定の局面では、このヒンジ領域は、重鎖ポリペプチドのＥｕアミノ酸２００〜２３８を含む。特定の局面では、この軽鎖ポリペプチドは常に、軽鎖ポリペプチドの最もＣ末端側のシステイン残基を通じて重鎖ポリペプチドのヒンジ領域の外側のアミノ酸とのみ鎖間ジスルフィド結合を形成する。
【００１８】
特定の局面では、この軽鎖修飾は、軽鎖ポリペプチドのＣ末端領域における１つ以上のアミノ酸の挿入または付加である。特定の局面では、この挿入は、軽鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１４と２１５との間である。特定の局面では、この修飾は、軽鎖ポリペプチドの最もＣ末端側のシステイン残基の後の１つ以上のアミノ酸の付加である。特定の局面では、この軽鎖修飾はＥｕ位置２１５にセリン残基の置換変異を含み、この置換はセリンよりもかさ高いアミノ酸を提供する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、治療用抗体処方物が提供され、この処方物は：目的の治療標的に結合する、複数のＩｇＧ２抗体であって、ここでこの処方物が主に、この抗体の単一の高次構造のアイソフォームを含み、この抗体が少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む抗体と；薬学的に受容可能なキャリアとを含む。特定の局面では、この修飾は、抗体の重鎖ポリペプチド修飾を含んでいる。特定の局面では、この重鎖ポリペプチド修飾は、重鎖ポリペプチドのＥｕ位置１３１でシステイン残基の置換を含む。特定の局面では、この重鎖ポリペプチド修飾は、重鎖ポリペプチドのＥｕ位置１３１でシステイン残基の欠失を含む。
【００２０】
特定の局面では、この重鎖ポリペプチド修飾は、ヒンジ領域内にシステイン残基の変異を含む。特定の局面では、このシステイン残基の変異は、重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１９でシステイン残基の変異を含む。
【００２１】
特定の局面では、このシステイン残基の変異は、重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２２０でシステイン残基の変異を含む。
【００２２】
特定の局面では、この重鎖ポリペプチド修飾は、重鎖ポリペプチドのヒンジ領域において１つ以上のアミノ酸の挿入を含む。１つ以上のアミノ酸の上記挿入は、例えば、重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１９と２２０との間であっても、または２１８と２１９との間であってもよい。
【００２３】
特定の局面では、この重鎖ポリペプチド修飾は、重鎖ポリペプチドのヒンジ領域において１つ以上のアミノ酸の欠失を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、この軽鎖修飾は、軽鎖ポリペプチドのＣ末端領域における１つ以上のアミノ酸の挿入または付加を含む。特定の局面では、１つ以上のアミノ酸の上記挿入は、軽鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１４と２１５との間である。特定の局面では、この挿入は、軽鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１４と２１５との間である。特定の局面では、この修飾は、軽鎖ポリペプチドの最もＣ末端側のシステイン残基の後の１つ以上のアミノ酸の付加である。この軽鎖修飾は、特定の局面では、Ｅｕ位置２１５でのセリン残基の置換変異であり、この置換はセリンよりもかさ高いアミノ酸を提供する。
【００２５】
また、本明細書においては、修飾されたＩｇＧ２抗体を作製する方法が提供され、この方法は：ＩｇＧ２抗体の重鎖または軽鎖のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して修飾を作製する工程であって、その結果、少なくとも１つのコードされたアミノ酸を修飾する工程と；宿主細胞に核酸を導入する工程と；宿主細胞を培養して、その結果、複数の修飾されたＩｇＧ２抗体が発現されかつ分泌される工程とを包含し；ここでこの複数の修飾されたＩｇＧ２抗体は主に単一の高次構造のアイソフォームである。
【００２６】
特定の局面では、この修飾は、抗体の重鎖ポリペプチド修飾を含む。特定の局面では、この重鎖ポリペプチド修飾は、重鎖ポリペプチドのＥｕ位置１３１でシステイン残基の置換または欠失を含む。他の局面では、この重鎖ポリペプチド修飾は、ヒンジ領域内にシステイン残基の変異を含む。特定の局面では、このシステイン残基の変異は、重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１９または２２０でシステイン残基の変異を含む。特定の局面では、この重鎖ポリペプチド修飾は、重鎖ポリペプチドのヒンジ領域において１つ以上のアミノ酸の挿入を含む。１つ以上のアミノ酸の上記挿入は、例えば、重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１９と２２０との間であっても、またはＥｕ位置２１８と２１９との間であってもよい。特定の局面では、この重鎖ポリペプチド修飾は、重鎖ポリペプチドのヒンジ領域において１つ以上のアミノ酸の欠失を含む。
【００２７】
特定の局面では、上記修飾は、軽鎖修飾であり、かつ軽鎖のポリペプチドのＣ末端領域における１つ以上のアミノ酸の挿入を含む。特定の局面では、１つ以上のアミノ酸の上記挿入は、軽鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１４と２１５との間である。特定の局面では、この修飾は、軽鎖ポリペプチドの最もＣ末端側の残基の後の１つ以上のアミノ酸の付加である。特定の局面では、この軽鎖修飾は、Ｅｕ位置２１５でのセリン残基の置換変異を含んでおり、この置換はセリンよりもかさ高いアミノ酸を提供する。
【００２８】
本明細書ではまた、上記のモノクローナルＩｇＧ２抗体をコードする核酸分子、この核酸分子を含むベクター、およびこのベクターを含む宿主細胞も提供される。特定の局面では、宿主細胞は以下からなる群より選択され得る：ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＮＳＯ、ＢＫ、ＨｅＬａ、ＣＶ１、Ｃｏｓ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＰＣ１２  およびＷＩ３８細胞。本明細書ではまた、上記のＩｇＧ２抗体を発現するハイブリドーマ細胞も提供される。
【００２９】
本明細書ではまた、構造的同質性が増大した抗ＲＡＮＫＬ抗体も提供される。例えば、ＲＡＮＫＬに対する抗体は、その全体が参照によって本明細書に援用される、国際公開第０３／００２７１３号に記載され、かつ配列番号６０として本明細書に示される可変領域アミノ酸配列を含んでいる重鎖および配列番号６１として本明細書に示される可変領域アミノ酸配列を含んでいる軽鎖によって例示される。従って、修飾は、この軽鎖ポリペプチドが軽鎖の最もＣ末端側のシステイン残基を通じてヒンジ領域におけるアミノ酸とのみ主に鎖間ジスルフィド結合を形成するように、本発明による抗ＲＡＮＫＬ抗体に対してなされてもよい。このような修飾は、抗ＲＡＮＫＬ抗体の重鎖ポリペプチドのＥｕ位置１３１でシステイン残基の置換または欠失を有してもよい。他の、修飾は、この軽鎖が軽鎖の最もＣ末端側のシステイン残基を通じてヒンジ領域の外側のアミノ酸とのみ主に鎖間ジスルフィド結合を主に形成するように、抗ＲＡＮＫＬ抗体に対してなされてもよい。このような修飾は、抗ＲＡＮＫＬ抗体のヒンジ領域におけるシステイン残基の置換または欠失を有してもよい。例示的な置換または欠失は抗ＲＡＮＫＬ抗体の重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１９または２２０であってもよい。本明細書で考慮される抗ＲＡＮＫＬ抗体に対するさらなる修飾としては、重鎖ポリペプチドのヒンジ領域における１つ以上のアミノ酸の挿入、または軽鎖ポリペプチドのＣ末端領域における１つ以上のアミノ酸の挿入が挙げられる。
【００３０】
本明細書ではまた、構造的同質性の増大した抗ＥＧＦＲ抗体である。例えば、ＥＧＦＲに対する抗体は、その全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許第６，２３５，８８３号に開示され、かつ配列番号５７として本明細書に示される可変領域アミノ酸配列を含んでいる重鎖、および配列番号４９として本明細書に示される可変領域アミノ酸配列を含んでいる軽鎖によって例示される。他の実施形態は、配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８および  ５０〜５７のうちのいずれか１つとして本明細書に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を含んでおり、かつ配列番号３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７または４９のうちのいずれか１つとして本明細書に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含んでいる抗体を包含する。従って、修飾は、軽鎖ポリペプチドが、軽鎖の最もＣ末端側のシステイン残基を通じてヒンジ領域のアミノ酸とのみ主に鎖間ジスルフィド結合を形成するように、本発明による抗ＥＧＦＲ抗体に対してなされ得る。このような修飾は、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖ポリペプチドのＥｕ位置１３１でシステイン残基の置換または欠失を有してもよい。この軽鎖が軽鎖の最もＣ末端側のシステイン残基を通じてヒンジ領域の外側のアミノ酸とのみ主に鎖間ジスルフィド結合を形成するように、抗ＲＡＮＫＬ抗体に対して他の修飾がなされてもよい。このような修飾は、抗ＥＧＦＲ抗体のヒンジ領域においてシステイン残基の置換または欠失を有してもよい。例示的な置換または欠失は、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１９または２２０であってもよい。本明細書で考慮される抗ＥＧＦＲ抗体に対するさらなる修飾としては、重鎖ポリペプチドのヒンジ領域における１つ以上のアミノ酸の挿入、または軽鎖ポリペプチドのＣ末端領域における１つ以上のアミノ酸の挿入が挙げられる。
【００３１】
本明細書ではまた、構造的同質性の増大した抗ＩＬ−１Ｒ抗体も提供される。１つの特定の実施形態では、この抗体は抗ＩＬ−１Ｒの１型抗体である。例えば、ＩＬ−１Ｒに対する抗体は、その全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００４／０９７７１２号に記載され、配列番号６２、６４、６５、７８、８０または８１のうちのいずれか１つとして本明細書に示される可変領域アミノ酸配列を含んでいる重鎖と、配列番号６３、６６、７９または８２のうちのいずれか１つとして本明細書に示される可変領域アミノ酸配列を含んでいる軽鎖によって例示される。他の実施形態としては、配列番号６７〜７５のうちいずれか１つとして本明細書に示される重鎖アミノ酸配列を含んでおり、配列番号７６〜７７のうちのいずれか１つとして本明細書に示される軽鎖アミノ酸配列を含んでいる抗体が挙げられる。従って、軽鎖ポリペプチドが、軽鎖の最もＣ末端側のシステイン残基を通じてヒンジ領域のアミノ酸とのみ主に鎖間ジスルフィド結合を形成するように、本発明による抗ＩＬ−１Ｒ抗体に対して修飾がなされもよい。このような修飾は、抗ＩＬ−１Ｒ抗体の重鎖ポリペプチドのＥｕ位置１３１でシステイン残基の置換または欠失を有してもよい。この軽鎖が軽鎖の最もＣ末端側のシステイン残基を通じてヒンジ領域の外側のアミノ酸とのみ主に鎖間ジスルフィド結合を形成するように、抗ＩＬ−１Ｒ抗体に対して他の修飾がなされてもよい。このような修飾は、抗ＩＬ−１Ｒ抗体のヒンジ領域のシステイン残基に置換または欠失を有してもよい。例示的な置換または欠失は、抗ＩＬ−１Ｒ抗体の重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１９または２２０であってもよい。本明細書で考慮される抗ＩＬ−１Ｒ抗体に対するさらなる修飾としては、重鎖ポリペプチドのヒンジ領域における１つ以上のアミノ酸の挿入、または軽鎖ポリペプチドのＣ末端領域における１つ以上のアミノ酸の挿入が挙げられる。
【００３２】
本明細書ではまた、修飾されたＩｇＧ２抗体の処方された安定性およびインビボの安定性を向上する方法が提供され、この方法は：ＩｇＧ２抗体の重鎖または軽鎖のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を修飾する工程であって、その結果、少なくとも１つのコードされたアミノ酸を修飾する工程と；宿主細胞に核酸を導入する工程と；宿主細胞を培養して、その結果、複数の修飾されたＩｇＧ２抗体が発現されかつ分泌される工程とを包含し；ここでこの複数の修飾されたＩｇＧ２抗体は主に単一の高次構造のアイソフォームである。
【００３３】
本明細書ではまた、修飾されたＩｇＧ２治療用抗体の効力を増大させる方法が提供され、この方法は：ＩｇＧ２抗体の重鎖または軽鎖のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を修飾する工程であって、その結果、少なくとも１つのコードされたアミノ酸を修飾する工程と；宿主細胞に核酸を導入する工程と；宿主細胞を培養して、その結果、複数の修飾されたＩｇＧ２抗体が発現されかつ分泌される工程とを包含し；ここでこの複数の修飾されたＩｇＧ２抗体は主に単一の高次構造のアイソフォームである。
【００３４】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし、詳細な説明および特定の実施例は、本発明のいくつかの実施形態を示しているが、例示のために示されるのに過ぎないことが理解されるべきである。なぜなら、本発明の趣旨および範囲内の種々の変化および改変がこの詳細な説明から当業者には明らかとなるからである。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
モノクローナルＩｇＧ２抗体であって：
軽鎖ポリペプチドと；
ヒンジ領域を有する重鎖ポリペプチドと、を含み、
前記抗体が前記重鎖または軽鎖ポリペプチドにおいてアミノ酸修飾を含み、その結果、前記修飾が、前記軽鎖ポリペプチドの最もＣ末端側のシステイン残基を通じて前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域におけるアミノ酸とのみ主に鎖間ジスルフィド結合を形成する軽鎖ポリペプチドを提供する、モノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目２）
前記修飾が重鎖ポリペプチド修飾を含む、項目１に記載のモノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目３）
前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置１３１にシステイン残基の置換を含む、項目２に記載のモノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目４）
前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置１３１にシステイン残基の欠失を含む、項目２に記載のモノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目５）
前記ヒンジ領域が、前記重鎖ポリペプチドのＥｕアミノ酸２００〜２３８を含む、項目１に記載のモノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目６）
前記軽鎖の前記最もＣ末端側のシステイン残基が前記軽鎖のＥｕ位置２１４のシステイン残基である、項目１に記載のモノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目７）
前記軽鎖ポリペプチドが常に、前記軽鎖ポリペプチドの最もＣ末端側のシステイン残基を通じて前記重鎖ポリペプチドの前記ヒンジ領域のアミノ酸でのみ鎖間ジスルフィド結合を形成する、項目１に記載のモノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目８）
モノクローナルＩｇＧ２抗体であって：
軽鎖ポリペプチドと；
ヒンジ領域を有する重鎖ポリペプチドと、を含み、
前記抗体が前記重鎖または軽鎖ポリペプチドにおいてアミノ酸修飾を含み、その結果、前記修飾が、前記軽鎖ポリペプチドの最もＣ末端側のシステイン残基を通じて前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域の外側のアミノ酸とのみ主に鎖間ジスルフィド結合を形成する軽鎖ポリペプチドを提供する、モノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目９）
前記ヒンジ領域の外側の前記アミノ酸が前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置１３１のシステイン残基である、項目８に記載のモノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目１０）
前記重鎖ポリペプチド修飾が前記ヒンジ領域内にシステイン残基の変異を含む、項目８に記載のモノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目１１）
システイン残基の前記変異が、前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１９にシステイン残基の変異を含む、項目１０に記載のモノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目１２）
システイン残基の前記変異が、前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２２０にシステイン残基の変異を含む、項目１０に記載のモノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目１３）
前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドの前記ヒンジ領域に１つ以上のアミノ酸の挿入を含む、項目８に記載のモノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目１４）
１つ以上のアミノ酸の前記挿入が、前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１９と２２０との間である、項目１３に記載のモノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目１５）
１つ以上のアミノ酸の前記挿入が、前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１８と２１９との間である、項目１３に記載のモノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目１６）
前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドの前記ヒンジ領域に１つ以上のアミノ酸の欠失を含む、項目８に記載のモノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目１７）
前記ヒンジ領域が、前記重鎖ポリペプチドのＥｕアミノ酸２００〜２３８を含む、項目８に記載のモノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目１８）
前記軽鎖の前記最もＣ末端側のシステイン残基が前記軽鎖のＥｕ位置２１４のシステイン残基である、項目８に記載のモノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目１９）
前記軽鎖ポリペプチドが常に、前記軽鎖ポリペプチドの最もＣ末端側のシステイン残基を通じて前記重鎖ポリペプチドの前記ヒンジ領域の外側のアミノ酸とのみ鎖間ジスルフィド結合を形成する、項目８に記載のモノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目２０）
前記軽鎖修飾が、前記軽鎖ポリペプチドのＣ末端領域に１つ以上のアミノ酸の挿入を含む、項目１または８のいずれかに記載のモノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目２１）
１つ以上のアミノ酸の前記挿入が、前記軽鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１４と２１５との間である、項目２０に記載のモノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目２２）
前記軽鎖修飾が、前記軽鎖ポリペプチドの最もＣ末端側のシステイン残基の後に１つ以上のアミノ酸の追加を含む、項目２０に記載のモノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目２３）
前記軽鎖修飾が、Ｅｕ位置２１５にセリン残基の置換変異を含み、前記置換がセリンよりもかさ高いアミノ酸を提供する、項目１または８のいずれかに記載のモノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目２４）
治療用抗体処方物であって：
目的の治療標的に結合し、かつ少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、ここで前記修飾が単一の高次構造のアイソフォームを生じる、複数のＩｇＧ２抗体と、
薬学的に受容可能なキャリアと、を含む治療用抗体処方物。
（項目２５）
前記修飾が前記抗体の重鎖ポリペプチド修飾を含む、項目２４に記載の治療用抗体処方物。
（項目２６）
前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置１３１にシステイン残基の置換を含む、項目２５に記載の治療用抗体処方物。
（項目２７）
前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置１３１にシステイン残基の欠失を含む、項目２５に記載の治療用抗体処方物。
（項目２８）
前記重鎖ポリペプチド修飾が前記ヒンジ領域内にシステイン残基の変異を含む、項目２５に記載の治療用抗体処方物。
（項目２９）
システイン残基の前記変異が前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１９にシステイン残基の変異を含む、項目２８に記載の治療用抗体処方物。
（項目３０）
システイン残基の前記変異が前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２２０にシステイン残基の変異を含む、項目２８に記載の治療用抗体処方物。
（項目３１）
前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域に１つ以上のアミノ酸の挿入を含む、項目２５に記載の治療用抗体処方物。
（項目３２）
１つ以上のアミノ酸の前記挿入が前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１９と２２０との間である、項目３１に記載の治療用抗体処方物。
（項目３３）
１つ以上のアミノ酸の前記挿入が前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１８と２１９との間である、項目３１に記載の治療用抗体処方物。
（項目３４）
前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域に１つ以上のアミノ酸の欠失を含む、項目３１に記載の治療用抗体処方物。
（項目３５）
修飾されたＩｇＧ２抗体を作製する方法であって：
ＩｇＧ２抗体の重鎖または軽鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を修飾し、その結果、少なくとも１つのコードされたアミノ酸を修飾する工程と；
前記核酸を宿主細胞に導入する工程と；
前記宿主細胞を培養して、その結果複数の修飾されたＩｇＧ２抗体を発現および分泌させる工程と、を包含し、
前記複数の修飾されたＩｇＧ２抗体が主に単一の高次構造のアイソフォームである、方法。
（項目３６）
前記修飾が前記抗体の重鎖ポリペプチド修飾を含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置１３１にシステイン残基の置換を含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置１３１にシステイン残基の欠失を含む、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
前記重鎖ポリペプチド修飾が前記ヒンジ領域内にシステイン残基の変異を含む、項目３６に記載の方法。
（項目４０）
システイン残基の前記変異が、前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１９にシステイン残基の変異を含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
システイン残基の前記変異が、前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２２０にシステイン残基の変異を含む、項目３９に記載の方法。
（項目４２）
前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域に１つ以上のアミノ酸の挿入を含む、項目３６に記載の方法。
（項目４３）
１つ以上のアミノ酸の前記挿入が、前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１９と２２０との間である、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
１つ以上のアミノ酸の前記挿入が、前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１８と２１９との間である、項目４２に記載の方法。
（項目４５）
前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域に１つ以上のアミノ酸の欠失を含む、項目３６に記載の方法。
（項目４６）
前記修飾が、軽鎖修飾であり、かつ前記軽鎖ポリペプチドのＣ末端領域に１つ以上のアミノ酸の挿入を含む、項目３５に記載の方法。
（項目４７）
前記修飾が、前記軽鎖ポリペプチドのＣ末端での１つ以上のアミノ酸の追加である、項目３５に記載の方法。
（項目４８）
項目１〜２３のいずれかに記載のモノクローナルＩｇＧ２抗体をコードする核酸。
（項目４９）
項目４８の核酸分子を含むベクター。
（項目５０）
項目４９に記載のベクターを含んでいる宿主細胞。
（項目５１）
前記宿主細胞が、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＮＳＯ、ＢＫ、ＨｅＬａ、ＣＶ１、Ｃｏｓ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＰＣ１２およびＷＩ３８細胞からなる群より選択される、項目５０に記載の宿主細胞。
（項目５２）
項目１〜２３のいずれかに記載のＩｇＧ２抗体を発現するハイブリドーマ細胞。
（項目５３）
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に標的化されたモノクローナルＩｇＧ２抗体であって、前記抗体は：
配列番号４９を含む軽鎖ポリペプチド４９；および
配列番号５７を含む重鎖ポリペプチドであって、ヒンジ領域を有する重鎖ポリペプチド、を含み、
前記抗体が前記重鎖または軽鎖ポリペプチドにおいてアミノ酸修飾を含み、その結果、前記修飾が、前記軽鎖ポリペプチドの最もＣ末端側のシステイン残基を通じて前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域におけるアミノ酸とのみ主に鎖間ジスルフィド結合を形成する軽鎖ポリペプチドを提供する、モノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目５４）
前記修飾が重鎖ポリペプチド修飾を含み、前記重鎖ポリペプチド修飾が前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置１３１でシステイン残基の置換または欠失を含む、項目５３に記載のモノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目５５）
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に標的化されたモノクローナルＩｇＧ２抗体であって、前記抗体は：
配列番号４９を含む軽鎖ポリペプチド；および
配列番号５７を含む重鎖ポリペプチドであって、ヒンジ領域を有する重鎖ポリペプチド、を含み、
前記抗体が前記重鎖または軽鎖ポリペプチドにおいてアミノ酸修飾を含み、その結果、前記修飾が、前記軽鎖ポリペプチドの最もＣ末端側のシステイン残基を通じて前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域の外側のアミノ酸とのみ主に鎖間ジスルフィド結合を形成する軽鎖ポリペプチドを提供する、モノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目５６）
前記重鎖ポリペプチド修飾が前記ヒンジ領域内にシステイン残基の変異を含む、項目５５に記載のモノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目５７）
前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域に１つ以上のアミノ酸の挿入を含む、項目５５に記載のモノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目５８）
前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域に１つ以上のアミノ酸の欠失を含む、項目５５に記載のモノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目５９）
核因子κＢリガンド受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）に標的化されたモノクローナルＩｇＧ２抗体であって、前記抗体は：
配列番号６１を含む軽鎖ポリペプチド；および
配列番号６０を含む重鎖ポリペプチドであって、ヒンジ領域を有する重鎖ポリペプチド、を含み、
前記抗体が前記重鎖または軽鎖ポリペプチドにおいてアミノ酸修飾を含み、その結果、前記修飾が、前記軽鎖ポリペプチドの最もＣ末端側のシステイン残基を通じて前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域におけるアミノ酸とのみ主に鎖間ジスルフィド結合を形成する軽鎖ポリペプチドを提供する、モノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目６０）
前記修飾が重鎖ポリペプチド修飾を含み、前記重鎖ポリペプチド修飾が前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置１３１でシステイン残基の置換または欠失を含む、項目５９に記載のモノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目６１）
核因子κＢリガンド受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）に標的化されたモノクローナルＩｇＧ２抗体であって、前記抗体は：
配列番号６１を含む軽鎖ポリペプチド；および
配列番号６０を含む重鎖ポリペプチドであって、ヒンジ領域を有する重鎖ポリペプチド、を含み、
前記抗体が前記重鎖または軽鎖ポリペプチドにおいてアミノ酸修飾を含み、その結果、前記修飾が、前記軽鎖ポリペプチドの最もＣ末端側のシステイン残基を通じて前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域の外側のアミノ酸とのみ主に鎖間ジスルフィド結合を形成する軽鎖ポリペプチドを提供する、モノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目６２）
前記重鎖ポリペプチド修飾が前記ヒンジ領域内にシステイン残基の変異を含む、項目６１に記載のモノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目６３）
前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域に１つ以上のアミノ酸の挿入を含む、項目６１に記載のモノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目６４）
前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域に１つ以上のアミノ酸の欠失を含む、項目６１に記載のモノクローナルＩｇＧ２抗体。
（項目６５）
修飾されたＩｇＧ２抗体の処方された安定性およびインビボの安定性を向上する方法であって、前記方法は：
ＩｇＧ２抗体の重鎖または軽鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を修飾し、その結果、少なくとも１つのコードされたアミノ酸を修飾する工程と；
前記核酸を宿主細胞に導入する工程と；
前記宿主細胞を培養して、その結果複数の修飾されたＩｇＧ２抗体を発現および分泌させる工程と、を包含し、
前記複数の修飾されたＩｇＧ２抗体が主に単一の高次構造のアイソフォームである、方法。
（項目６６）
前記修飾が前記抗体の重鎖ポリペプチド修飾を含む、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置１３１にシステイン残基の置換を含む、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置１３１にシステイン残基の欠失を含む、項目６６に記載の方法。
（項目６９）
前記重鎖ポリペプチド修飾が前記ヒンジ領域内にシステイン残基の変異を含む、項目６６に記載の方法。
（項目７０）
システイン残基の前記変異が、前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１９にシステイン残基の変異を含む、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
システイン残基の前記変異が、前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２２０にシステイン残基の変異を含む、項目６９に記載の方法。
（項目７２）
前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域に１つ以上のアミノ酸の挿入を含む、項目６６に記載の方法。
（項目７３）
１つ以上のアミノ酸の前記挿入が、前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１９と２２０との間である、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
１つ以上のアミノ酸の前記挿入が、前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１８と２１９との間である、項目７２に記載の方法。
（項目７５）
前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域に１つ以上のアミノ酸の欠失を含む、項目６６に記載の方法。
（項目７６）
前記修飾が、軽鎖修飾であり、かつ前記軽鎖ポリペプチドのＣ末端領域に１つ以上のアミノ酸の挿入を含む、項目６５に記載の方法。
（項目７７）
前記修飾が、前記軽鎖ポリペプチドのＣ末端での１つ以上のアミノ酸の追加である、項目６５に記載の方法。
（項目７８）
修飾されたＩｇＧ２治療用抗体の効力を増大させる方法であって：
ＩｇＧ２抗体の重鎖または軽鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を修飾し、その結果、少なくとも１つのコードされたアミノ酸を修飾する工程と；
前記核酸を宿主細胞に導入する工程と；
前記宿主細胞を培養して、その結果複数の修飾されたＩｇＧ２抗体を発現および分泌させる工程と、を包含し、
前記複数の修飾されたＩｇＧ２抗体が主に単一の高次構造のアイソフォームである、方法。
（項目７９）
前記修飾が前記抗体の重鎖ポリペプチド修飾を含む、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置１３１にシステイン残基の置換を含む、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置１３１にシステイン残基の欠失を含む、項目７９に記載の方法。
（項目８２）
前記重鎖ポリペプチド修飾が前記ヒンジ領域内にシステイン残基の変異を含む、項目７９に記載の方法。
（項目８３）
システイン残基の前記変異が、前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１９にシステイン残基の変異を含む、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
システイン残基の前記変異が、前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２２０にシステイン残基の変異を含む、項目８２に記載の方法。
（項目８５）
前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域に１つ以上のアミノ酸の挿入を含む、項目７９に記載の方法。
（項目８６）
１つ以上のアミノ酸の前記挿入が、前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１９と２２０との間である、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
１つ以上のアミノ酸の前記挿入が、前記重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１８と２１９との間である、項目８５に記載の方法。
（項目８８）
前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域に１つ以上のアミノ酸の欠失を含む、項目７９に記載の方法。
（項目８９）
前記修飾が、軽鎖修飾であり、かつ前記軽鎖ポリペプチドのＣ末端領域に１つ以上のアミノ酸の挿入を含む、項目７８に記載の方法。
（項目９０）
前記修飾が、前記軽鎖ポリペプチドのＣ末端での１つ以上のアミノ酸の追加である、項目７８に記載の方法
【図面の簡単な説明】
【００３５】
本明細書の以下の図面の部分は本発明の局面をさらに例示するために含まれる。本発明は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこの図面を参照することによってさらによく理解され得る。
【図１Ａ】図１は、ジスルフィド接続を示しているヒトＩｇＧサブタイプの模式図である。ＩｇＧ１（図１Ａ）、ＩｇＧ２（図１Ｂ）、ＩｇＧ３（図１Ｃ）およびＩｇＧ４（図１Ｄ）が示されている。ＩｇＧ１は、重鎖ヒンジ領域における最初のＣｙｓ残基を介して軽鎖が接続されることが提唱された唯一のアイソタイプである。
【図１Ｂ】図１は、ジスルフィド接続を示しているヒトＩｇＧサブタイプの模式図である。ＩｇＧ１（図１Ａ）、ＩｇＧ２（図１Ｂ）、ＩｇＧ３（図１Ｃ）およびＩｇＧ４（図１Ｄ）が示されている。ＩｇＧ１は、重鎖ヒンジ領域における最初のＣｙｓ残基を介して軽鎖が接続されることが提唱された唯一のアイソタイプである。
【図１Ｃ】図１は、ジスルフィド接続を示しているヒトＩｇＧサブタイプの模式図である。ＩｇＧ１（図１Ａ）、ＩｇＧ２（図１Ｂ）、ＩｇＧ３（図１Ｃ）およびＩｇＧ４（図１Ｄ）が示されている。ＩｇＧ１は、重鎖ヒンジ領域における最初のＣｙｓ残基を介して軽鎖が接続されることが提唱された唯一のアイソタイプである。
【図１Ｄ】図１は、ジスルフィド接続を示しているヒトＩｇＧサブタイプの模式図である。ＩｇＧ１（図１Ａ）、ＩｇＧ２（図１Ｂ）、ＩｇＧ３（図１Ｃ）およびＩｇＧ４（図１Ｄ）が示されている。ＩｇＧ１は、重鎖ヒンジ領域における最初のＣｙｓ残基を介して軽鎖が接続されることが提唱された唯一のアイソタイプである。
【図２Ａ】図２は、抗ＲＡＮＫＬのＩｇＧ２抗体の４つの構造的なアイソフォームに相当する模式図である。この形態は、構造型アイソフォームＩｇＧ２−Ａ、（図２Ａ）、ＩｇＧ２−Ｂ１（図２Ｂ）、ＩｇＧ２−Ｂ２（図２Ｃ）およびＩｇＧ２−Ａ／Ｂ（図２Ｄ）と呼ばれる。
【図２Ｂ】図２は、抗ＲＡＮＫＬのＩｇＧ２抗体の４つの構造的なアイソフォームに相当する模式図である。この形態は、構造型アイソフォームＩｇＧ２−Ａ、（図２Ａ）、ＩｇＧ２−Ｂ１（図２Ｂ）、ＩｇＧ２−Ｂ２（図２Ｃ）およびＩｇＧ２−Ａ／Ｂ（図２Ｄ）と呼ばれる。
【図２Ｃ】図２は、抗ＲＡＮＫＬのＩｇＧ２抗体の４つの構造的なアイソフォームに相当する模式図である。この形態は、構造型アイソフォームＩｇＧ２−Ａ、（図２Ａ）、ＩｇＧ２−Ｂ１（図２Ｂ）、ＩｇＧ２−Ｂ２（図２Ｃ）およびＩｇＧ２−Ａ／Ｂ（図２Ｄ）と呼ばれる。
【図２Ｄ】図２は、抗ＲＡＮＫＬのＩｇＧ２抗体の４つの構造的なアイソフォームに相当する模式図である。この形態は、構造型アイソフォームＩｇＧ２−Ａ、（図２Ａ）、ＩｇＧ２−Ｂ１（図２Ｂ）、ＩｇＧ２−Ｂ２（図２Ｃ）およびＩｇＧ２−Ａ／Ｂ（図２Ｄ）と呼ばれる。
【図３】図３は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２サブタイプの模式図であって、ＩｇＧ抗体のＥｄｅｌｍａｎまたはＥｕのナンバリング習慣を示している。軽鎖（ＬＣ）は破線で示される。特定のＨＣヒンジ領域およびＬＣアミノ酸のＥＵのナンバーが示される。ＩｇＧ２ヒンジ領域の配列は配列番号５に示され、ＩｇＧ１のヒンジ領域の配列は配列番号６に示される。可変性のジスルフィド結合相互作用は点線で示される。
【図４】図４は、異なるＩｇＧ２システイン変異体の模式図である。野性型ＩｇＧ２抗体、およびＣｙｓ２１９Ｓｅｒ（Ｃ２１９Ｓ）、Ｃｙｓ２２０Ｓｅｒ（Ｃ２２０Ｓ）およびＣｙｓ１３１Ｓｅｒ（Ｃ１３１Ｓ）重鎖変異体が示される。各々の抗体のヒンジ領域配列は配列番号７（ＷＴおよびＣ１３１Ｓ）、配列番号８（Ｃ２１９Ｓ）、および配列番号９（Ｃ２２０Ｓ）に示されるとおりである。軽鎖（ＬＣ）は、破線で示され、可変性のジスルフィド結合相互作用が点線で示される。
【図５】図５は、λ軽鎖またはκ軽鎖のいずれかを有するＩｇＧ２抗体の模式図である。軽鎖は破線によって示される。各々の抗体のヒンジ領域配列は配列番号７として示される。可変性のジスルフィド結合相互作用は点線で示される。
【図６】図６は、単一のＩｇＧ２重鎖のＣＨ１およびヒンジ領域を示しているＩｇＧ２の三次元モデルである。また、ＩｇＧ１の公開された構造由来の重鎖とジスルフィド結合するＬＣのＣｙｓ残基も示される。ヒトＩｇＧ２におけるＬＣ  Ｃｙｓ２１４残基の１つの可能性のある方向を図示するために、ヒトＩｇＧ４ＦａｂのＬＣ  Ｃｙｓ２１４残基の位置を示す。ヒトＩｇＧ４の配列においてＬＣのＣｙｓ２１４にジスルフィド結合するＣＨ１のＣｙｓは、ヒトＩｇＧ２におけるＣｙｓ１３１の位置と整列する。
【図７】図７は、抗ＲＡＮＫＬ抗体に対して作製されたＩｇＧ２システイン変異体の模式図である。野性型（ＷＴ）ＩｇＧ２抗体、およびＣｙｓ１３１Ｓｅｒ（Ｃ１３１Ｓ）変異体が示される。各々の抗体のヒンジ領域配列は配列番号７として示される。可変性のジスルフィド結合相互作用は点線で示される。
【図８】図８は、野性型およびＣｙｓ１３１Ｓｅｒ変異体の模式図である。Ｃｙｓ１３１からＳｅｒ１３１への変異によって、構造的アイソフォームＩｇＧ２−Ａで見出される重鎖ジスルフィド間結合が妨げられる。
【図９】図９は、抗ＲＡＮＫＬ（実線）および抗ＲＡＮＫＬ（Ｃｙｓ１３１Ｓｅｒ）の変異体（点線）のＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示す。
【図１０】図１０は、抗ＲＡＮＫＬ（下部のトレース）および抗ＲＡＮＫＬ変異体（上部のトレース）のｐＨ７．５でのＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析を示す。
【図１１】図１１は、抗ＲＡＮＫＬ（下部のトレース）および抗ＲＡＮＫＬ変異体（上部のトレース）のｐＨ５でのＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析を示す。
【図１２】図１２は、抗ＲＡＮＫＬ（下部のトレース）および抗ＲＡＮＫＬ変異体（上部のトレース）の非還元のＣＥ−ＳＤＳ分析を示す。
【図１３】図１３は、抗ＲＡＮＫＬ（下部のトレース）および抗ＲＡＮＫＬ変異体（上部のトレース）の還元性のＣＥ−ＳＤＳ分析を示す。
【図１４】図１４は、非還元性のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる抗ＲＡＮＫＬ（Ｃｙｓ１３１Ｓｅｒ）変異体および抗ＲＡＮＫＬ野性型の分析を示す。サンプルは各々のレーンで示される。
【図１５】図１５は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる抗ＲＡＮＫＬ（Ｃｙｓ１３１Ｓｅｒ）変異体および抗ＲＡＮＫＬ野性型の分析を示す。サンプルは各々のレーンで示される。
【図１６】図１６は、抗ＲＡＮＫＬ（上部のトレース）および抗ＲＡＮＫＬ（Ｃｙｓ１３１Ｓｅｒ）変異体（下部のトレース）のＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す。
【図１７】図１７は、抗ＲＡＮＫＬ（上部のトレース）および抗ＲＡＮＫＬ（Ｃｙｓ１３１Ｓｅｒ）変異体（上部のトレース）の非還元のＬｙｓ−Ｃペプチドマッピングを示す。
【図１８】図１８は、抗ＲＡＮＫＬ（上部のトレース）および抗ＲＡＮＫＬ変異体（下部のトレース）の還元のＬｙｓ−Ｃペプチドマッピングを示す。
【図１９Ａ】図１９は、抗ＩＬ−１Ｒ抗体に対して作製されたＩｇＧ２システイン変異体の模式図である。図１９には野性型（ＷＴ）ＩｇＧ２抗体、Ｃｙｓ２１９Ｓｅｒ（Ｃ２１９Ｓ）およびＣｙｓ１３１Ｓｅｒ（Ｃ１３１Ｓ）変異体が示される。図１９Ｂは、ペプチドマッピング分析に従ってジスルフィド接続性を示す。各々の抗体のヒンジ領域配列は配列番号７（ＷＴおよびＣ１３１Ｓ）、および配列番号８（Ｃ２１９Ｓ）に示される。軽鎖（ＬＣ）は、破線で示され、可変性のジスルフィド結合相互作用が点線で示される。
【図１９Ｂ】図１９は、抗ＩＬ−１Ｒ抗体に対して作製されたＩｇＧ２システイン変異体の模式図である。図１９には野性型（ＷＴ）ＩｇＧ２抗体、Ｃｙｓ２１９Ｓｅｒ（Ｃ２１９Ｓ）およびＣｙｓ１３１Ｓｅｒ（Ｃ１３１Ｓ）変異体が示される。図１９Ｂは、ペプチドマッピング分析に従ってジスルフィド接続性を示す。各々の抗体のヒンジ領域配列は配列番号７（ＷＴおよびＣ１３１Ｓ）、および配列番号８（Ｃ２１９Ｓ）に示される。軽鎖（ＬＣ）は、破線で示され、可変性のジスルフィド結合相互作用が点線で示される。
【図２０】図２０は、抗ＩＬ−１Ｒ野性型および産生された変異体のＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す。安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（参照標準）、および一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞から産生された野性型抗ＩＬ−１Ｒが示される。抗ＩＬ−１Ｒ  Ｃ２１９ＳおよびＣ１３１Ｓ変異体が示される。
【図２１】図２１は、ＩＬ−６産生阻害アッセイの結果を示しているグラフである。ＩＬ−６のコントロール産生の割合は、抗体濃度の関数としてｐＭでプロットする。抗ＩＬ−１Ｒ野性型ならびにＣ１３１ＳおよびＣ２１９Ｓ変異体の結果を示しており、算出されたＩＣ５０値はグラフの上の表に示す。
【図２２】図２２は、抗ＥＧＦｒ抗体に対して作製されたＩｇＧ２システイン変異体の模式図である。野性型（ＷＴ）ＩｇＧ２抗体、Ｃｙｓ２１９Ｓｅｒ（Ｃ２１９Ｓ）、Ｃｙｓ２２０Ｓｅｒ（Ｃ２２０Ｓ）変異体およびＣ２１９Ｓ／Ｃ２２０Ｓ二重変異体が示される。各々の抗体のヒンジ領域配列は、配列番号７（ＷＴおよびＣ１３１Ｓ）、配列番号８（Ｃ２１９Ｓ）、配列番号９（Ｃ２２０Ｓ）、および  配列番号１０（Ｃ２１９Ｓ／Ｃ２２０Ｓ）に示される。軽鎖（ＬＣ）は、破線で示され、可変性のジスルフィド結合相互作用が点線で示される。
【図２３】図２３は、非還元性ＣＥ−ＳＤＳによるＩｇＧ２分子の分離を示す。（Ａ）抗ＥＧＦｒ  および（Ｂ）骨髄腫患者から単離された市販のヒトＩｇＧ２は、構造的なアイソフォームに典型的な二重性を示す（「出発材料」として示される）。システイン／システイン酸化還元電位の適用によって、ジスルフィド架橋の再配置がもたらされ、これがアイソフォーム１の減少およびアイソフォーム２の増大を生じる（「再折り畳み」として示される）。（Ｃ）単一のシステイン変異体Ｃ２１９Ｓ（図に示す）およびＣ２２０Ｓ（データ示さず）は、同質性の構造で予想される単一のピークで解像される。再折り畳み処理は変異体に影響しない。
【図２４Ａ】図２４は、抗ＥＧＦｒジスルフィド架橋ヘテロペプチドのＬＣ−ＭＳ分析を示す。（Ａ）複雑なヒンジジスルフィド架橋ペプチドに関与する４つのトリプシンペプチドの配列。この複合体では、ヒンジ領域を提示するトリプシンペプチド、Ｈ１６（配列番号１１）が、鎖間結合ＣＨ１−ＣＬに通常関与する、トリプシンペプチドＨ１０（配列番号１２）およびＬ１８に共有結合することが見出される。（Ｂ）抗ＥＧＦｒ参照材料のトリプシンペプチドマッピング。１〜７と表示される４つのペプチドの異なる配列をＬＣ−ＭＳで分離する。Ｃ２１９および／またはＣ２２０で変異されている抗ＥＧＦｒでは、これらのヒンジ複合体ジスルフィドがペプチドに連結することは示されず、むしろ予想される直線的に対のヒンジ領域の完全な回復が示される。８〜１０と表示されるこれらのペプチドは２１９／２２０Ｃ−Ｓヒンジ二量体であり、抗ＥＧＦｒヒンジ二量体６，７とは１つの残基が異なる。（Ｄ）これらのＩｇＧ２分子のヒンジ複合ジスルフィド連結ペプチドの模式図。
【図２４Ｂ】図２４は、抗ＥＧＦｒジスルフィド架橋ヘテロペプチドのＬＣ−ＭＳ分析を示す。（Ａ）複雑なヒンジジスルフィド架橋ペプチドに関与する４つのトリプシンペプチドの配列。この複合体では、ヒンジ領域を提示するトリプシンペプチド、Ｈ１６（配列番号１１）が、鎖間結合ＣＨ１−ＣＬに通常関与する、トリプシンペプチドＨ１０（配列番号１２）およびＬ１８に共有結合することが見出される。（Ｂ）抗ＥＧＦｒ参照材料のトリプシンペプチドマッピング。１〜７と表示される４つのペプチドの異なる配列をＬＣ−ＭＳで分離する。Ｃ２１９および／またはＣ２２０で変異されている抗ＥＧＦｒでは、これらのヒンジ複合体ジスルフィドがペプチドに連結することは示されず、むしろ予想される直線的に対のヒンジ領域の完全な回復が示される。８〜１０と表示されるこれらのペプチドは２１９／２２０Ｃ−Ｓヒンジ二量体であり、抗ＥＧＦｒヒンジ二量体６，７とは１つの残基が異なる。（Ｄ）これらのＩｇＧ２分子のヒンジ複合ジスルフィド連結ペプチドの模式図。
【図２４Ｃ】図２４は、抗ＥＧＦｒジスルフィド架橋ヘテロペプチドのＬＣ−ＭＳ分析を示す。（Ａ）複雑なヒンジジスルフィド架橋ペプチドに関与する４つのトリプシンペプチドの配列。この複合体では、ヒンジ領域を提示するトリプシンペプチド、Ｈ１６（配列番号１１）が、鎖間結合ＣＨ１−ＣＬに通常関与する、トリプシンペプチドＨ１０（配列番号１２）およびＬ１８に共有結合することが見出される。（Ｂ）抗ＥＧＦｒ参照材料のトリプシンペプチドマッピング。１〜７と表示される４つのペプチドの異なる配列をＬＣ−ＭＳで分離する。Ｃ２１９および／またはＣ２２０で変異されている抗ＥＧＦｒでは、これらのヒンジ複合体ジスルフィドがペプチドに連結することは示されず、むしろ予想される直線的に対のヒンジ領域の完全な回復が示される。８〜１０と表示されるこれらのペプチドは２１９／２２０Ｃ−Ｓヒンジ二量体であり、抗ＥＧＦｒヒンジ二量体６，７とは１つの残基が異なる。（Ｄ）これらのＩｇＧ２分子のヒンジ複合ジスルフィド連結ペプチドの模式図。
【図２４Ｄ】図２４は、抗ＥＧＦｒジスルフィド架橋ヘテロペプチドのＬＣ−ＭＳ分析を示す。（Ａ）複雑なヒンジジスルフィド架橋ペプチドに関与する４つのトリプシンペプチドの配列。この複合体では、ヒンジ領域を提示するトリプシンペプチド、Ｈ１６（配列番号１１）が、鎖間結合ＣＨ１−ＣＬに通常関与する、トリプシンペプチドＨ１０（配列番号１２）およびＬ１８に共有結合することが見出される。（Ｂ）抗ＥＧＦｒ参照材料のトリプシンペプチドマッピング。１〜７と表示される４つのペプチドの異なる配列をＬＣ−ＭＳで分離する。Ｃ２１９および／またはＣ２２０で変異されている抗ＥＧＦｒでは、これらのヒンジ複合体ジスルフィドがペプチドに連結することは示されず、むしろ予想される直線的に対のヒンジ領域の完全な回復が示される。８〜１０と表示されるこれらのペプチドは２１９／２２０Ｃ−Ｓヒンジ二量体であり、抗ＥＧＦｒヒンジ二量体６，７とは１つの残基が異なる。（Ｄ）これらのＩｇＧ２分子のヒンジ複合ジスルフィド連結ペプチドの模式図。
【図２５】図２５は、配列番号１３〜２２に示される、ヒンジ領域のＩｇＧ２の挿入変異体を示す。
【図２６】図２６は、抗ＩＬ−１Ｒ抗体に対してなされた配列２〜４（配列番号１４〜１６）の挿入変異体の模式図である。
【図２７】図２７は、抗ＩＬ−１Ｒ抗体に対してなされた配列９〜１０（配列番号２１〜２２）の挿入変異体の模式図である。
【図２８】図２８は、抗ＩＬ−１Ｒ抗体に対してなされた配列５〜８（配列番号１７〜２０）の挿入変異体の模式図である。
【図２９】図２９は、酸化還元富化型１および３とのコントロールの抗ＩＬ−１Ｒ抗体および抗ＩＬ−１ＲサンプルのＲＰ−ＨＰＬＣを示す。この型は、それぞれ０．９ＭのＧｕＨＣｌの有無のもとでレドックス緩衝液中で富化された。
【図３０】図３０は、１つの実験からの代表的なデータを示しており、これは抗ＩＬ−１Ｒ１のＩｇＧ２コントロール抗体（黒四角）、酸化還元富化型１（上向き三角）、および酸化還元富化型３（下向き三角）によるヒト軟骨細胞におけるＩＬ−１ｂ誘導性のＩＬ−６産生の阻害を示している。ＩＬ−６の阻害は、各々の抗体サンプルの濃度の関数としてプロットする。
【図３１】図３１Ａ〜Ｂは、コントロールの抗体（ひし形）、酸化還元富化型１（上向き三角）および酸化還元富化型３（下向き三角）による軟骨細胞（Ａ）および全血分析（Ｂ）におけるＩＬ−１ｂ誘導性のＩＬ−６の阻害についてのＩＣ５０を示す（ｎ＝６）。黒いバーは平均を示す。＊Ｐ＞０．０５；＊＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図３２Ａ】図３２Ａ〜Ｃは、細胞培養培地からの未精製ＩｇＧ２サンプルの逆相ＨＰＬＣ分析を示す。示されるのは、野性型（ＷＴ）サンプル（Ａ）、ｃＡｃ挿入構築物（Ｂ）（配列番号３２に示されるヒンジ領域）、およびｃＰＰｃ構築物（Ｃ）（配列番号３３として示されるヒンジ領域）についての結果である。
【図３２Ｂ】図３２Ａ〜Ｃは、細胞培養培地からの未精製ＩｇＧ２サンプルの逆相ＨＰＬＣ分析を示す。示されるのは、野性型（ＷＴ）サンプル（Ａ）、ｃＡｃ挿入構築物（Ｂ）（配列番号３２に示されるヒンジ領域）、およびｃＰＰｃ構築物（Ｃ）（配列番号３３として示されるヒンジ領域）についての結果である。
【図３２Ｃ】図３２Ａ〜Ｃは、細胞培養培地からの未精製ＩｇＧ２サンプルの逆相ＨＰＬＣ分析を示す。示されるのは、野性型（ＷＴ）サンプル（Ａ）、ｃＡｃ挿入構築物（Ｂ）（配列番号３２に示されるヒンジ領域）、およびｃＰＰｃ構築物（Ｃ）（配列番号３３として示されるヒンジ領域）についての結果である。
【図３３】図３３は、κ軽鎖を有するＩｇＧ２抗体変異体の模式図である。軽鎖は破線によって示される。配列１１〜１３（配列番号２３〜２５）が示される。各々の抗体のヒンジ領域配列は配列番号７として示される。
【図３４】図３４は、λ軽鎖を有するＩｇＧ２抗体変異体の模式図である。軽鎖は破線によって示される。配列１４〜１６（配列番号２６〜２８）が示される。各々の抗体のヒンジ領域配列は配列番号７として示される。
【図３５】図３５は、λ軽鎖を有するＩｇＧ２抗体変異体の模式図である。軽鎖は破線によって示される。配列１７〜１９（配列番号２９〜３１）が示される。各々の抗体のヒンジ領域配列は配列番号７として示される。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
ＩｇＧ２サブクラスにおいて抗体の構造的な異質性が観察されているが、この異質性の背景にある理由はまだ説明されていない。例えば、米国特許出願公開第２００６／１９４２８０号、Ｄｉｌｌｏｎら、（その全体が参照によって本明細書に援用される）は、還元／酸化カップリング試薬および必要に応じてカオトロピック剤を用いる組み換えＩｇＧタンパク質の調製を供することによって特定のＩｇＧアイソフォームを一過性に富化する方法に関する。しかし、再折り畳み方法は、ＩｇＧアイソフォームの富化された集団を生じ得るが、その効果は一時的であって、その抗体は、アイソフォームのさらに異質な集団へと経時的に復帰し得る。従って、本明細書に記載される本発明の実施形態は、インビボで安定であって、かつ経時的に同質のままである同質性の抗体集団を産生する方法を提供する。
【００３７】
従って、本発明の実施形態は、構造的に同質の組み換えタンパク質に、およびこのような構造的に同質の組み換えタンパク質を産生する方法に関する。一実施形態では、この組み換えタンパク質は組み換え抗体である。一実施形態では、この組み換えタンパク質は免疫グロブリンタンパク質である。別の実施形態では、この組み換えタンパク質はＩｇＧ２アイソタイプの抗体である。構造的に同質の組み換えタンパク質を含んでいる溶液は、異種の組み換えタンパク質を有する溶液と比較してインビボまたはインビトロで活性を改善した。
【００３８】
上記に従って、本明細書に記載されるのは、ＩｇＧ２抗体の別個の構造的アイソフォームの特徴である。本発明の実施形態は、従来受容されている免疫グロブリン構造モデルとは異なるＩｇＧ２構造を有する修飾された抗体を包含する。例えば、本明細書に記載の方法によって産生される種々の構造的アイソフォームは、野性型アイソフォームと比較して鎖間ジスルフィド結合のいくつかを選択的に排除することが見出された。
【００３９】
従って、本発明の実施形態は、抗体の同質の集団の効率的および経済的な産生、精製および分析をもたらし、ここで抗体の単一の所望される高次構造のアイソフォームが産生される。さらに詳細には、実施形態は、抗体の同質の集団を作製する方法を包含し、ここでこの集団は、複数のジスルフィド型を呈するＩｇＧ２抗体の野性型集団に比べて、単一のＩｇＧ２ジスルフィド型を含む。一実施形態では、これらの抗体のアミノ酸配列は、所定の型へ折り畳むようにだけ修飾される。別の実施形態では、この抗体は、改善された薬学的特性を提供するように修飾される。下にさらに詳細に記載されるように、ＩｇＧ２分子におけるアミノ酸残基の置換、欠失または挿入は、ジスルフィド異質性の排除を容易にし、それによって構造的同質性の、ＩｇＧ２抗体のさらに活性な単一の高次構造アイソフォームを生じることが見出された。異質の抗体集団に比べて等しいかまたは改善された力価を有するだけでなく、抗体の構造的に同質の集団は、製造および処理が簡易であるという追加的な利点を有する。
【００４０】
本明細書に記載される実施形態は、モノクローナルＩｇＧ２抗体を包含し、この抗体は、軽鎖ポリペプチドと、ヒンジ領域を有する重鎖ポリペプチドとを含んでおり、この抗体は、重鎖または軽鎖のポリペプチドにアミノ酸修飾を含み、その結果この軽鎖ポリペプチドはこの軽鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１４でＣ末端システイン残基を通じて重鎖ポリペプチドのヒンジ領域におけるアミノ酸と主に鎖間ジスルフィド結合を形成する。特定の局面では、この修飾は、重鎖ポリペプチド修飾を含む。特定の局面では、この修飾は、重鎖ポリペプチドのＥｕ位置１３１でシステイン残基の置換または欠失を含んでもよい。特定の局面では、このヒンジ領域は、重鎖ポリペプチドのＥｕアミノ酸２００〜２３８を含む。特定の局面では、この軽鎖ポリペプチドは常に、軽鎖ポリペプチドの最もＣ末端側のシステイン残基を通じて重鎖ポリペプチドのヒンジ領域におけるアミノ酸とのみ鎖間ジスルフィド結合を形成する。
【００４１】
本明細書において用いる場合、主に形成する、主にそれだけ形成するなどの用語は、標準的な方法を用いて検出する場合、実質的な集団が単一の高次構造アイソフォームで存在する抗体を指す。代表的には、実質的な集団は少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、さらに代表的には総集団のうち少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。
【００４２】
当業者に理解されるとおり、鎖間ジスルフィド結合は異なる抗体鎖上の２つのシステインの間のジスルフィド結合である。代表的には、鎖間ジスルフィド結合は、重鎖システインと軽鎖システインとの間であるか、または異なる重鎖上の２つのシステインの間である。鎖間ジスルフィド結合は、同じ鎖上の２つのシステインの間のジスルフィド結合である。代表的には、鎖間ジスルフィド結合は、重鎖システインと重鎖システインとの間であるか、または同じ軽鎖上の軽鎖システインと軽鎖システインとの間のジスルフィド結合である。
【００４３】
また本明細書では、軽鎖ポリペプチド、およびヒンジ領域を有している重鎖ポリペプチドを有しているモノクローナルＩｇＧ２抗体も提供され、この抗体は、重鎖または軽鎖ポリペプチドにおいてアミノ酸修飾を含み、その結果その軽鎖ポリペプチドは、この軽鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１４でＣ末端システイン残基を通じて重鎖ポリペプチドのヒンジ領域の外側のアミノ酸と主に鎖間ジスルフィド結合を形成する。特定の局面では、ヒンジ領域の外側のアミノ酸は重鎖ポリペプチドのＥｕ位置１３１のシステイン残基である。特定の局面では、この重鎖ポリペプチド修飾は、ヒンジ領域内にシステイン残基の変異を含む。変異されたシステイン残基は、例えば、重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１９または２２０であってもよい。特定の局面では、この重鎖ポリペプチド修飾は、重鎖ポリペプチドのヒンジ領域において１つ以上のアミノ酸の挿入を有する。１つ以上のアミノ酸の上記挿入は、例えば、重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１９と２２０との間であっても、または位置２１８と２１９との間であってもよい。他の局面では、この重鎖ポリペプチド修飾は、重鎖ポリペプチドのヒンジ領域において１つ以上のアミノ酸の欠失を含む。いくつかの局面では、このヒンジ領域は、重鎖ポリペプチドのＥｕアミノ酸２００〜２３８を含む。
【００４４】
特定の局面では、この軽鎖ポリペプチドは常に、軽鎖ポリペプチドの最もＣ末端側のシステイン残基を通じて重鎖ポリペプチドのヒンジ領域の外側のアミノ酸とのみ鎖間ジスルフィド結合を形成する。
【００４５】
別の実施形態では、ＩｇＧ２抗体は、改善された薬学的特性が得られるように修飾される。薬学的特性としては溶解度、代謝、および吸収、ならびに貯蔵安定性などの特性が挙げられる。従って、本発明に従って修飾されている、薬学的使用のために処方されるＩｇＧ２抗体は驚くべき改善された有効（保存）期間を有する。
【００４６】
他の実施形態としては、治療用抗体処方物が挙げられ、これは目的の治療標的に結合する複数のＩｇＧ２抗体、および薬学的に受容可能なキャリアを含んでおり、この処方物は主に、この抗体の単一の高次構造のアイソフォームを含み、この抗体は、少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。特定の実施形態では、この修飾はこの抗体の重鎖ポリペプチド修飾を含む。この重鎖ポリペプチド修飾としては、例えば、重鎖ポリペプチドのＥｕの１３１位置でのシステイン残基の置換または欠失を挙げることができる。特定の局面では、この重鎖ポリペプチド修飾は、ヒンジ領域内にシステイン残基の変異を含む。この変異は例えば、重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１９、またはＥｕ位置２２０のシステイン残基の変異であってもよい。他の局面では、この重鎖ポリペプチド修飾は、重鎖ポリペプチドのヒンジ領域において１つ以上のアミノ酸の挿入または欠失を含む。１つ以上のアミノ酸の上記挿入は、例えば、重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１９と２２０との間であっても、または位置２１８と２１９との間であってもよい。
【００４７】
いくつかの実施形態では、この軽鎖修飾は、軽鎖ポリペプチドのＣ末端領域に１つ以上のアミノ酸の挿入を含む。特定の局面では、１つ以上のアミノ酸の上記挿入は、軽鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１４と２１５との間である。
【００４８】
ＩｇＧ２抗体の構造
図１に示されるとおり、ＩｇＧサブタイプは特に、その重鎖結合間および重鎖／軽鎖結合において、予測されるジスルフィド結合構造を有する（Ｆｒａｎｇｉｏｎｅ，Ｂ．ら（１９６９）Ｎａｔｕｒｅ  ２２１，１４５〜１４８）。ヒンジ領域において、いくつかの例示されるＩｇＧアイソタイプの間に多くの相違が見出され得る。表１は、コア・ヒンジ領域と名付けられたヒンジ領域のサブセット内のＩｇＧアイソタイプの中の相違を例示する。表１に示されるとおり、ＩｇＧ２コア・ヒンジは、ＩｇＧ１のコア・ヒンジよりも３アミノ酸短い（Ｄａｎｇｌ，Ｊ．Ｌ．ら（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ．７，１９８９〜１９９４）。さらにＩｇＧ２コア・ヒンジはＩｇＧ１よりも多くのシステインを有する。
【００４９】
【表１】
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このヒンジ領域は、種々の方法で規定されている（その各々が参照によって全体として本明細書に援用される、Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．３１，１６９−２１７；Ｄａｎｇｌ，ら、（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ．７，１９８９〜１９９４）。  本明細書において用いる場合、このＩｇＧ２ヒンジ領域は、Ｅｕナンバリング習慣を用いて、Ｃｙｓ２００〜Ｐ２３８のアミノ酸残基を含む（その全体が参照によって本明細書に援用される、Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．ら、（１９６９）Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．６３：７８〜８５）。従って、ＩｇＧヒンジ領域に対する修飾としては、Ｅｕ位置２００〜２３８を含むＩｇＧ２抗体の部分に対する任意の修飾を挙げることができる。
【００５０】
本明細書においては、図２に示されるようなＩｇＧ２サブタイプ内にジスルフィド異質性が存在するという発見がもたらされる。図３は、可能性のあるジスルフィド結合パターンに関してＩｇＧ２とＩｇＧ１との間の相違を強調している。Ｅｕナンバリングに従って、軽鎖（ＬＣ）は、ＩＧ１における重鎖（ＨＣ）のＣｙｓ２２０に結合される。対称的に、ＩｇＧ２抗体中のＬＣ  Ｃｓ２１４は、ＨＣ上の３つ以上の可能性のあるジスルフド結合パターンに近接していると予想される。Ｃ１３１、Ｃ２１９およびＣ２２０（図３）。従って、本明細書の実施例に提供されるとおり、ＩｇＧ２抗体がそれらのヒンジ領域における異なるジスルフィド結合に基づく複数の高次構造アイソフォームで存在するということが発見である。従って、ＩｇＧ２のＬＣ  ２１４はＨＣ  Ｃ１３１、Ｃ２１９およびＣ２２０とのジスルフィド結合を形成し、これによって別個の高次構造アイソフォームが生じることが示されている。
【００５１】
本明細書ではまた、ＨＣ−ＨＣおよびＨＣ−ＬＣジスルフィド結合に関与するシステインに対する変異が同質性のＩｇＧ２高次構造アイソフォームをもたらすという驚くべき発見が提供される。ＨＣシステインに対する変異によって、別個のジスルフィド接合性および高次構造の特性を有する抗体の同質性の集団がもたらされた。詳細には、図４に示すとおり、Ｃｙｓ２１９のセリンへの変異、Ｃｙｓ２２０のセリンへの変異およびＣｙｓ１３１のセリンへの変異は、同質性のＩｇＧ２集団をもたらした。いくつかの実施形態では、この変異抗体は、野性型抗体以上の力価を保持していた。
【００５２】
本明細書ではまた、挿入変異を含んでおり、その結果、重鎖ヒンジ領域と軽鎖との間で作製されたジスルフィド結合が破壊されるＩｇＧ２抗体が提供される。実施例１１に示されるとおり、代表的な実施形態では、１、２、３、４、５またはそれ以上のアミノ酸を重鎖（ＨＣ）ヒンジ領域ポリペプチドに挿入する。代表的には、挿入のポイントは、ＨＣヒンジ領域のＣ２１９とＣ２２０の間、またはＫ２１８とＣ２１９との間である。しかし、本発明の実施形態は、抗体内のジスルフィド結合を変化させ、抗体の同質性の集団をもたらす他の挿入を包含する。
【００５３】
本明細書で提示される変異の例は、ＩｇＧ２κについて行われたが、同じ変異をＩｇＧγ抗体について同様に行うことができる。ＩｇＧ２λ抗体はκ軽鎖の代わりにλ軽鎖を有する。例えば、λ軽鎖はＣ末端でシステインＣ２１４後にセリンＳ２１５を有する（図５を参照のこと）。
【００５４】
抗体アミノ酸配列に対する修飾
本発明の一実施形態は、構造的およびジスルフィド異質性を減少するように修飾されているＩｇＧ２抗体を含む。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするポリヌクレオチドへ適切なヌクレオチド変化を導入することによって調製される。あるいは、このアミノ酸変化は、抗体のペプチド合成の間になされてもよい。このような修飾としては例えば、抗体のポリペプチド配列からの欠失、および／またはその配列への挿入、および／またはその配列内の置換が挙げられる。欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせは、最終構築物で到達するように行われるが、ただしこの最終構築物は所望の同質性の特徴を保有する。このアミノ酸変更は、配列が作製される時点で本発明の抗体のアミノ酸配列に導入され得る。
【００５５】
通常ジスルフィド結合形成に関与するシステインは、当該分野で公知の任意の種々の方法によってジスルフィド結合を形成できなくすることができる。例えば、ヒンジシステインは、ジスルフィド結合できない、セリンなどの別のアミノ酸で置換されてもよい。代表的には、セリンは、システインに対するその構造類似性に基づいて選択される。Ｃｙｓ→Ｓｅｒの置換は単一のシステイン側鎖のイオウ原子を酸素に変化させるという正味の影響を有する。システイン残基のジスルフィド結合能力を無くする他のアミノ酸置換を想定することができる。例えば、Ｃｙｓ→Ａｌａ、Ｃｙｓ→ＴｈｒまたはＣｙｓ→Ｖａｌ置換が構築されてもよい。置換のための残基はまた、ＢＬＯＳＵＭ６２  などのアミノ酸置換マトリックスの検査によって特定することもできる（Ｓ．Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，、Ｊ．Ｇ．Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５）。これらの置換は目的のシステイン残基のジスルフィド結合能力を無くする。しかし、これらの変異による試験結果の解釈には、これらの置換された残基と元のシステインとの間の追加の構造的相違を考慮する必要があることに注意すべきである。これらの置換で得られるデータおよび特には、機能の変更を示唆しているデータは、ジスルフィド結合能力を除去する結果であり得るが、また、溶媒相互作用における変化またはポリペプチド折り畳みにおける変化の結果でもあり得る（完全にまたは部分的に）。あるいは、一連の変異体を構築してもよく、ここでは目的のシステイン残基が、システインのアミノ酸側鎖から逸脱するアミノ酸側鎖の特定の影響を評価するという時間がかかりかつ面倒な性質にもかかわらず、残りの天然に存在するアミノ酸の全てに対して変異されている。
【００５６】
アミノ酸置換は、周知の分子生物学的技術、例えば、修飾されるべきヒンジ領域をコードする核酸配列の部位指向性変異誘発によって達成することができる。適切な技術としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（２００１）およびＡｕｓｕｂｅｌら、２００６，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙに記載される技術が挙げられる。変異体ヒンジ領域を有する免疫グロブリンを作製するための他の技術は、置換されるべきシステインをコードするコドンが置換アミノ酸をコードするコドンで置き換えられている、ヒンジ領域をコードする配列を有するオリゴヌクレオチドを合成する工程を包含する。次いで、このオリゴヌクレオチドは、必要に応じて、可変領域およびＦｃ配列などの他の適切な抗体配列を含んでいるベクター骨格に連結され得る。
【００５７】
別の実施例では、ヒンジシステインが欠失されてもよい。アミノ酸欠失は、修飾されるべきヒンジ領域をコードする核酸配列の部位指向性の突然変異などの標準的な分子生物学的技術によって達成され得る。適切な技術としては、上掲のＳａｍｂｒｏｏｋら、およびＡｕｓｂｅｌらに記載の技術が挙げられる。可変ヒンジ領域を有する免疫グロブリンを作製するための他の技術は、修飾されるべきシステインをコードするコドンが欠失されているヒンジ領域をコードする配列を含んでいるオリゴヌクレオチドを合成する工程を包含する。次いで、このオリゴヌクレオチドは、必要に応じて、可変領域およびＦｃ配列などの他の適切な抗体配列を含んでいるベクター骨格に連結され得る。
【００５８】
アミノ酸配列挿入は、抗体の軽鎖内の１残基から百以上の残基を含んでいるポリペプチドまでの長さにおよぶカルボキシル末端融合物を含む。他の挿入としては、軽鎖または重鎖内の単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を挙げることができる。代表的な実施形態では、１、２、３、４、５またはそれ以上のアミノ酸をＨＣヒンジ領域配列に挿入する。代表的には、挿入のポイントは、ＨＣヒンジ領域のＣ２１９とＣ２２０の間、またはＫ２１８とＣ２１９との間である。挿入されるアミノ酸は任意のアミノ酸であってもよい。代表的には、挿入されるアミノ酸は、グリシンまたはプロリンであろう。２つ以上のアミノ酸を配列に挿入する場合、挿入されたアミノ酸は、全てがグリシンであっても、全てがプロリンであっても、またはグリシン、プロリンもしくは任意の他のアミノ酸の任意の組み合わせであってもよい。
【００５９】
アミノ酸欠失変異体は、少なくとも１つのアミノ酸残基が抗体分子から除去されている。
【００６０】
別のタイプの変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子中で少なくとも１つのアミノ酸残基が異なる残基によって置き換えられている。保存的置換は表２で「保存的置換」の見出しのもとに示されている。表２に示されるか、またはアミノ酸分類を参照して下にさらに記載される、保存的置換もしくは好ましい置換が導入されてもよく、その産物がスクリーニングされてもよい。
【００６１】
【表２】
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抗体の生物学的特性における実質的な修飾は、（ａ）置換の領域でポリペプチド骨格の構造を例えば、シートまたはらせんの高次構造として維持すること、（ｂ）この分子の荷電または疎水性を標的部位で維持すること、または（ｃ）側鎖のかさを維持すること、に対する効果が有意に異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、以下の共通の側鎖特性に基づいてグループに分けられる：
（１）疎水性：ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の方向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【００６２】
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスで入れ替える工程を要するであろう。
【００６３】
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該分野で公知の種々の方法によって調製される。これらの方法としては限定するものではないが、天然の供給源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）、またはオリゴヌクレオチド媒介性（または部位指向性）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異、および抗体の初期に調製された変異体もしくは非変異体バージョンのカセット変異誘発による調製が挙げられる。
【００６４】
変異誘発は、当該分野で公知の任意の技術に従って行ってもよく、この技術としては限定するものではないが、修飾されるべき免疫グロブリンの重鎖ヒンジ領域の配列内に１つ以上の修飾を有しているオリゴヌクレオチドを合成する工程が挙げられる。部位特異的な変異誘発では、所望の変異のＤＮＡ配列をコードする特異的なオリゴヌクレオチド配列の使用を通じた変異体の産生、および十分な数の隣接するヌクレオチドによって、十分なサイズおよび配列複雑性のプライマー配列を得て、横断されている欠失接合部の両側に安定な二重鎖を形成することが可能になる。代表的には、約１７〜約７５個のヌクレオチドまたはそれ以上の長さのプライマーであって、配列の接合部の両側の約１０〜約２５個以上の残基が変更されているプライマーが好ましい。１つ以上の位置で種々の異なる変異体を導入しているこのような多数のプライマーを用いて、変異体のライブラリーを作製してもよい。
【００６５】
部位特異的変異誘発または部位指向性変異誘発の技術は、その全体が参照によって本明細書に援用される、Ａｕｓｕｂｅｌら、２００６，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，によって例示されるとおり、当該分野で周知である。一般には、部位指向性の突然変異誘発は、最初に、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列をその配列内に含んでいる、一本鎖のベクターまたは二重鎖のベクターの二本鎖のメルティング分離物を得ることによって行われる。所望の変異した配列を保有しているオリゴヌクレオチドプライマーが一般には合成的に調製される。次いで、このプライマーを一本鎖ベクターとアニーリングして、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼのようなＤＮＡ重合化酵素に供して、変異を保有する鎖の合成を完了する。このように、ヘテロ二重鎖を形成し、ここでは１つの鎖が元の非変異配列をコードし、第二の鎖が所望の変異を保有する。次いで、このヘテロ二重鎖ベクターを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＣＨＯ細胞などの適切な細胞を形質転換またはトランスフェクトして、変異した配列の配置を保有している組み換えベクターを含むクローンを選択する。
【００６６】
あるいは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのような市販の熱安定性酵素を用いるＰＣＲの使用によって、変異誘発オリゴヌクレオチドプライマーを、適切なクローニングベクターまたは発現ベクターにクローニングできる増幅性のＤＮＡフラグメントに組み込んでもよい。例えば、ＰＣＲ媒介性の変異誘発手順については、その全体が本明細書に援用されているＴｏｒｎｉｃら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８（６）：１６５６，１９８７，およびＵｐｅｎｄｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１８（１）：２９〜３０，３２，１９９５を参照のこと。熱安定性ポリメラーゼに加えて熱安定性リガーゼを使用するＰＣＲを用いて、増幅性のＤＮＡフラグメントにリン酸化変異誘発オリゴヌクレオチドを組み込んでもよく、このＤＮＡフラグメントを次に、適切なクローニングまたは発現ベクターにクローニングしてもよい（例えば、その全体が参照によって本明細書に援用される、Ｍｉｃｈａｅｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１６（３）：４１０〜２，１９９４を参照のこと）。
【００６７】
配列決定
当該分野で公知の任意の種々の配列決定反応を用いてアミノ酸修飾を有する抗体または抗体フラグメントをコードするヌクレオチド配列を直接配列決定してもよい。配列決定反応の例としては、Ｍａｘｉｍ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５６０，１９７７）またはＳａｎｇｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３，１９７７）によって開発された技術に基づく反応が挙げられる。任意の種々の自動化配列決定手順を利用することが可能であるということも考えられ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９：４４８，１９９５）、これには、質量分析による配列決定が挙げられる（例えば、国際公開第９４／１６１０１号，Ｃｏｈｅｎら、Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，３６：１２７〜１６２，１９９６、およびＧｒｉｆｆｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３８：１４７〜１５９，１９９３を参照のこと）。
【００６８】
抗原特異性
本発明の実施形態は、任意の適切な抗原結合特異性の抗体に適用可能である。好ましくは、本発明の抗体は、生物学的に関連のあるポリペプチドである抗原に特異的である。さらに好ましくは、本発明の抗体は、ヒトなどの哺乳動物における疾患または障害の治療または診断のために有用である。
【００６９】
本明細書に記載のような修飾されたＩｇＧ２抗体は特に、治療用抗体、例えば、遮断抗体、アゴニスト抗体、中和抗体または抗体コンジュゲートとして有用である。治療用抗体の非限定的な例としては抗ＩＬ−１Ｒ（米国特許出願公開第２００４／０９７７１２号に記載）、抗ＲＡＮＫＬ（国際公開第０３／００２７１３号に記載）、抗ＥＧＦｒ（米国特許第６，２３５，８８３号に記載）、抗ＩＬ−４受容体（米国特許出願公開第２００５／０１１２６９４号および米国特許第７，１８６，８０９号に記載）、抗ＨＧＦ（米国特許出願公開第２００５／０１１８６４３号に記載）、抗Ａｎｇ−１および抗Ａｎｇ−２（米国特許出願公開第２００３／０１２４１２９号および国際公開第０３／０３０８３３号に記載）、抗Ａｎｇ−４、抗ＯＸ−４０、抗ＧＭ−ＣＳＦ、抗ＮＧＦ、抗グルカゴン受容体、抗スクレロスチン、抗ＩＬ−１７Ｒ、抗ＣＤ３０、抗ＩＬ１８、抗アクチビン、抗ＶＥＧＦ、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ１１、抗ＣＤ１８、抗ＣＤ４０、抗組織因子（ＴＦ）、抗ＨＥＲ２，および抗ＴｒｋＣ抗体が挙げられる。非ポリペプチド抗原に対する抗体（例えば、腫瘍関連糖脂質抗原）も考慮される。上述の引用文献の各々はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００７０】
本発明の一実施形態は、構造的同質性が増大した抗ＲＡＮＫＬ抗体である。例えば、ＲＡＮＫＬに対する抗体は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、国際公開第０３／００２７１３号に記載され、かつ配列番号６０として本明細書に示される可変領域アミノ酸配列を含んでいる重鎖および配列番号６１として本明細書に示される可変領域アミノ酸配列を含んでいる軽鎖によって例示される。他の実施形態としては、配列番号５８として本明細書に示される重鎖アミノ酸配列を含んでおり、かつ配列番号５９として本明細書に示される軽鎖アミノ酸配列を含んでいる抗体が挙げられる。したがって、修飾は、この軽鎖ポリペプチドが軽鎖の最もＣ末端側のシステイン残基を通じてヒンジ領域におけるアミノ酸とのみ主に鎖間ジスルフィド結合を形成するように、本発明による抗ＲＡＮＫＬ抗体に対してなされてもよい。このような修飾は、抗ＲＡＮＫＬ抗体の重鎖ポリペプチドのＥｕ位置１３１でシステイン残基の置換または欠失を有してもよい。この軽鎖が軽鎖の最もＣ末端側のシステイン残基を通じてヒンジ領域の外側のアミノ酸とのみ主に鎖間ジスルフィド結合を形成するように、抗ＲＡＮＫＬ抗体に対して他の修飾がなされてもよい。このような修飾は、抗ＲＡＮＫＬ抗体のヒンジ領域におけるシステイン残基の置換または欠失を有してもよい。例示的な置換または欠失は抗ＲＡＮＫＬ抗体の重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１９または２２０であってもよい。本明細書で考慮される抗ＲＡＮＫＬ抗体に対するさらなる修飾としては、重鎖ポリペプチドのヒンジ領域における１つ以上のアミノ酸の挿入、または軽鎖ポリペプチドのＣ末端領域における１つ以上のアミノ酸の挿入が挙げられる。
【００７１】
本発明の一実施形態は、構造的同質性が増大した抗ＥＧＦＲ抗体である。例えば、ＥＧＦＲに対する抗体は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２３５，８８３号に開示され、かつ配列番号５７として本明細書に示される可変領域アミノ酸配列、および配列番号４９として本明細書に示される軽鎖アミノ酸配列を含んでいる重鎖によって例示される。他の実施形態は、配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８および５０〜５７のうちのいずれか１つとして本明細書に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を含んでおり、かつ配列番号３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７または４９のうちのいずれか１つとして本明細書に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含んでいる抗体を包含する。したがって、修飾は、軽鎖ポリペプチドが、軽鎖の最もＣ末端側のシステイン残基を通じてヒンジ領域のアミノ酸とのみ主に鎖間ジスルフィド結合を形成するように、本発明による抗ＥＧＦＲ抗体に対してなされ得る。このような修飾は、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖ポリペプチドのＥｕ位置１３１でシステイン残基の置換または欠失を有してもよい。この軽鎖が軽鎖の最もＣ末端側のシステイン残基を通じてヒンジ領域の外側のアミノ酸とのみ主に鎖間ジスルフィド結合を形成するように、抗ＥＧＦＲ抗体に対して他の修飾がなされてもよい。このような修飾は、抗ＥＧＦＲ抗体のヒンジ領域においてシステイン残基の置換または欠失を有してもよい。例示的な置換または欠失は、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１９または２２０であってもよい。本明細書で考慮される抗ＥＧＦＲ抗体に対するさらなる修飾としては、重鎖ポリペプチドのヒンジ領域における１つ以上のアミノ酸の挿入、または軽鎖ポリペプチドのＣ末端領域における１つ以上のアミノ酸の挿入が挙げられる。
【００７２】
本発明の一実施形態は、構造的同質性が増大した抗ＩＬ−１Ｒ抗体である。１つの特定の実施形態では、この抗体は抗ＩＬ−１Ｒの１型抗体である。例えば、ＩＬ−１Ｒに対する抗体は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００４／０９７７１２号に記載され、配列番号６２、６４、６５、７８、８０または８１のうちのいずれか１つとして本明細書に示される可変領域アミノ酸配列を含んでいる重鎖と、配列番号６３、６６、７９または８２のうちのいずれか１つとして本明細書に示される可変領域アミノ酸配列を含んでいる軽鎖によって例示される。他の実施形態としては、配列番号６７〜７５のうちいずれか１つとして本明細書に示される重鎖アミノ酸配列を含んでおり、かつ配列番号７６〜７７のうちのいずれか１つとして本明細書に示される軽鎖アミノ酸配列を含んでいる抗体が挙げられる。したがって、軽鎖ポリペプチドが、軽鎖の最もＣ末端側のシステイン残基を通じてヒンジ領域のアミノ酸とのみ主に鎖間ジスルフィド結合を形成するように、本発明による抗ＩＬ−１Ｒ抗体に対して修飾がなされもよい。このような修飾は、抗ＩＬ−１Ｒ抗体の重鎖ポリペプチドのＥｕ位置１３１でシステイン残基の置換または欠失を有してもよい。この軽鎖が軽鎖の最もＣ末端側のシステイン残基を通じてヒンジ領域の外側のアミノ酸とのみ主に鎖間ジスルフィド結合を形成するように、抗ＩＬ−１Ｒ抗体に対して他の修飾がなされてもよい。このような修飾は、抗ＩＬ−１Ｒ抗体のヒンジ領域のシステイン残基に置換または欠失を有してもよい。例示的な置換または欠失は、抗ＩＬ−１Ｒ抗体の重鎖ポリペプチドのＥｕ位置２１９または２２０であってもよい。本明細書で考慮される抗ＩＬ−１Ｒ抗体に対するさらなる修飾としては、重鎖ポリペプチドのヒンジ領域における１つ以上のアミノ酸の挿入、または軽鎖ポリペプチドのＣ末端領域における１つ以上のアミノ酸の挿入が挙げられる。
【００７３】
上記抗原がポリペプチドである場合、それは、膜貫通分子（例えば、受容体）または成長因子などのリガンドであってもよい。例示的な抗原としては、分子、例えば、レニン；成長ホルモン、例としては、ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；アンジオポイエチン−１（Ａｎｇ−１）、アンジオポイエチン−２（Ａｎｇ−２）、アンジオポイエチン−４（Ａｎｇ−４）、ＯＸ−４０、ＧＭ−ＣＳＦ、ＮＧＦ、グルカゴン受容体、スクレロスチン、ＩＬ−１７Ｒ、ＣＤ３０、ＩＬ１８、アクチビン、ＶＥＧＦ、ＩｇＥ、ＣＤ１１、ＣＤ１８、ＣＤ４０、組織因子（ＴＦ）、ＨＥＲ２、ＴｒｋＣ凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子（ＴＦ）、およびフォン・ヴィレブランド因子；凝固因子、例えば、プロテインＣ；心房性ナトリウム利尿因子；肺サーファクタント；プラスミノーゲンアクチベーター、例えばウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子−αおよび−β；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（正常Ｔ細胞発現および分泌活性（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｎｏｒｍａｌｌｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ））；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン；ミュラー阻害物質；レラキシンＡ鎖；レラキシンＢ鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えば、βラクタマーゼ；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、例えばＣＴＬＡ−４；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子の受容体、例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦｒ）；インターロイキン受容体、例えば、ＩＬ−１ＲおよびＩＬ−４Ｒ；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６）、または神経成長因子、例えば、ＮＧＦ−β；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞成長因子、例えば、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ；上皮成長因子（ＥＧＦ）；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）例えばＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β、例としては、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、またはＴＧＦ−β５；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ４０；エリスロポイエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）；核因子κＢリガンド受容体活性化因子（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｋａｐｐａ  Ｂ  Ｌｉｇａ���ｄ）（ＲＡＮＫ−Ｌ）；インターフェロン、例えば、インターフェロンα、−β、およびγ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０；スーパーオキシドディスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；分解促進因子；ウイルス抗原、例えば、ＨＩＶエンベロープの一部；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節性タンパク質；インテグリン、例えば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４およびＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体；ならびに上記の任意のポリペプチドのフラグメントが挙げられる。
【００７４】
本発明によって包含される抗体の例示的な抗原としては、ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、およびＣＤ４６；ＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバー、例えば、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体；細胞接着分子、例えば、ＬＦＡ−１、Ｍａｃ１、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、α４／β７インテグリン、およびαｖ／β３インテグリン、例としては、そのαまたはβサブユニット（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８または抗ＣＤ１１ｂ抗体）；成長因子、例えば、ＶＥＧＦ；組織因子（ＴＦ）；ＴＧＦ−β；αインターフェロン（α−ＩＦＮ）；インターロイキン、例えばＩＬ−８；ＩｇＥ；血液型抗原Ａｐｏ２、死受容体；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ−４；プロテインＣなどが挙げられる。本明細書の最も好ましい標的はＶＥＧＦ、ＴＦ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４０、ＴＧＦ−β、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、Ａｐｏ２およびＣ２４である。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、腫瘍抗原に特異的に結合し得る。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、腫瘍抗原に特異的に結合し得、この腫瘍抗原は、クラスター分化因子（すなわち、ＣＤタンパク質）ではない。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤタンパク質に特異的に結合し得る。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤ３またはＣＤ４以外のＣＤタンパク質に特異的に結合し得る。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤ１９またはＣＤ２０以外のＣＤタンパク質に特異的に結合し得る。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤ４０以外のＣＤタンパク質に特異的に結合し得る。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤ１９またはＣＤ２０に特異的に結合し得る。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤ４０に特異的に結合し得る。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤ１１に特異的に結合し得る。
【００７６】
一実施形態では、本発明の抗体は細胞生存調節因子に特異的に結合し得る。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は細胞成長調節因子に特異的に結合し得る。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は細胞周期調節に関与する分子に特異的に結合し得る。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は組織発達または細胞分化に関与する分子に特異的に結合し得る。他の実施形態では、本発明の抗体は、細胞表面分子に特異的に結合し得る。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、細胞表面受容体ポリペプチドではない腫瘍抗原に特異的に結合し得る。
【００７７】
一実施形態では、本発明の抗体はリンホカインに特異的に結合し得る。一実施形態では、本発明の抗体はサイトカインに特異的に結合し得る。
【００７８】
一実施形態では、本発明の抗体は、血管形成に関与する分子に特異的に結合し得る。別の実施形態では、本発明の抗体は、血管形成に関与する分子に特異的に結合し得る。
【００７９】
可溶性抗原、またはそのフラグメントは、必要に応じて他の分子にコンジュゲートされて、抗体を作製するための免疫原として用いられ得る。受容体などの膜貫通分子については、これらの分子のフラグメント（例えば、受容体の細胞外ドメイン）を免疫原として用いてもよい。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞を、免疫原として用いてもよい。このような細胞は、天然の供給源（例えば、癌細胞株）由来であってもよいし、または膜貫通分子を発現するように組み換え技術によって形質転換されている細胞であってもよい。抗体を調製するために有用な他の抗原およびその形態は当業者には明らかであろう。
【００８０】
本発明の抗体は、単一特異性であっても、二重特異性であっても、三重特異性であってもよく、またはそれ以上の多特異性抗体であってもよい。多特異性抗体は、単一分子の種々のエピトープに特異的であってもよく、または異なる分子上のエピトープに特異的であってもよい。多価特異的な抗体を設計および作製するための方法は当該分野で公知である。例えば、Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７〜５３９；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７〜１５５３；国際公開第９３／１７７１５号を参照のこと。
【００８１】
ベクターの構築
本発明の免疫グロブリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組み換え技術を用いて得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列を単離して、ハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞から単離して配列決定してもよい。あるいは、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドシンセサイザーまたはＰＣＲ技術を用いて合成してもよい。一旦得られれば、免疫グロブリンをコードする配列を、宿主細胞中で異種ポリヌクレオチドを複製および発現し得る組み換えベクターに挿入する。当該分野で入手可能でありかつ公知である多くのベクターを本発明の目的に用いてもよい。適切なベクターの選択は主に、ベクターに挿入すべき核酸の大きさ、およびそのベクターで形質転換されるべき特定の宿主細胞に依存する。各々のベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現、またはその両方）およびそのベクターが存在する特定の宿主細胞との適合性次第で、種々の成分を含む。このベクター成分としては一般には、限定するものではないが、以下が挙げられる：複製起点（特に、ベクターが原核生物細胞に挿入される場合）、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸挿入および転写終止配列。
【００８２】
組み換え抗体の産生
哺乳動物細胞で組み換え抗体を作製するための方法は公知である。このような方法では、抗体産生は、タンパク質発現の誘導を包含する。ＩｇＧ抗体またはＩｇＧ抗体フラグメントをコードする核酸は、プロモーター、好ましくは哺乳動物細胞で機能的なコントロール可能なプロモーターとの作動的な会合によって都合よく発現可能にされる。このような組み換え構築物は、適切な宿主（例えば、細菌、マウスまたはヒト）におけるＩｇＧ抗体タンパク質の発現のために設計される。本明細書においてタンパク質およびポリペプチドの発現のために適切なプロモーターが広範に利用可能であり、かつ当該分野で周知である。調節領域に連結されている誘導性プロモーターまたは構成的なプロモーター（例えば、転写または翻訳因子のためのエンハンサー、オペレーターおよび結合領域）が好ましい。「誘導性」プロモーターは、本明細書では制御可能なプロモーターと定義され、これには誘導性プロモーター（すなわち、アクチベーターまたはインデューサーの存在によって活性化または誘導されるまで不活性である正の調節を受けやすい）として、または活性化プロモーター（すなわち、レプレッサーが存在しない限り、不活性であり負の調節を受けやすく、リプレッサーの除去または活性化があれば、プロモーター活性の増大が生じる）として代表的には呼ばれるプロモーターである。本明細書に考慮されるプロモーターとしては例えば、限定するものではないが、当該分野で公知のようにｔｒｐ、ｌｐｐ、ｔａｃ、およびｌａｃプロモーター、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｌａｃＵＶ５；バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のＰ１０またはポリヘドリン遺伝子プロモーター（例えば、米国特許第５，２４３，０４１号、同第５，２４２，６８７号、同第５，２６６，３１７号、同第４，７４５，０５１号、および同第５，１６９，７８４号を参照のこと）および他の真核生物発現系由来の誘導性プロモーターが挙げられる。タンパク質の発現のために、このようなプロモーターは、ｔｒｐオペロンのオペレーター領域のようなコントロール領域との作動可能な連結においてプラスミド中に挿入される。
【００８３】
哺乳動物細胞に加えて、ＩｇＧ２分子も、当該分野で公知の技術を用いて任意の他の適切な真核生物または原核生物の宿主細胞中に産生され得る。例えば、この分子は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌中に産生されてもよい。さらなる例としては、この分子は、バキュロウイルスを用いて形質転換された昆虫細胞中で産生されてもよい。
【００８４】
疾患、障害または状態を処置する方法においては、このような疾患、障害および状態の予防的方法または予防する方法に加えて、有効量の組み換えポリペプチドとは、当該分野で公知のような、所望の生物学的または生理学的な効果を生じるポリペプチドの量である。特に処置方法、ならびに疾患、障害または状態に関連する症状を緩和する方法に関して、有効な量とは、治療上有効な量と同義に用いられる。このような方法では、必要な被験体とは、任意の動物、例えば、ヒトであって、疾患、障害または状態の症状を呈しているか、発症するリスクがあるか、または有していると診断される被験体である。
【００８５】
本明細書に提供される抗体修飾は、例えば、哺乳動物細胞で産生されるＩｇＧ抗体の同質性を増大するのに特定の用途を見出す。いくつかの実施形態では、本発明は、ＩｇＧ２分子の改良された産生に特に関する。異なるジスルフィド結合型の存在に起因する、このようなタンパク質の異質性は、本明細書に記載される修飾の使用の結果として有意に減少される。これらの有益な結果は、当業者に公知のＬＣおよびＬＣ／ＭＳ方法を用いてこのような異質性をモニターすることによって評価され得る。
【００８６】
詳細には、哺乳動物細胞系で分泌される抗体はグリコシル化される。好ましくは、この抗体は、細胞培養中での成長に適合した哺乳動物産生細胞によって分泌される。工業的に一般に用いられるこのような細胞の例は、ＣＨＯ，ＶＥＲＯ、ＮＳＯ、ＢＫ、ＨｅＬａ、
ＣＶ１（Ｃｏｓを含む）、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３骨髄腫細胞株（例えば、マウス）、ＰＣ１２およびＷＩ３８細胞である。典型的な宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であり、これはいくつかの複合の組み換えタンパク質、例えば、サイトカイン、凝固因子、および抗体の産生のために広範に用いられている（Ｂｒａｓｅｌら、１９９６，Ｂｌｏｏｄ  ８８：２００４〜２０１２；Ｋａｕｆｍａｎら、１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６３：６３５２〜６３６２；ＭｃＫｉｎｎｏｎら、１９９１，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ６：２３１〜２３９；Ｗｏｏｄら、１９９０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４５：３０１１〜３０１６）。ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠損突然変異体細胞株（Ｕｒｌａｕｂら、１９８０，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：４２１６〜４２２０），ＤＸＢ１１およびＤＧ−４４は、選り抜きのＣＨＯ宿主細胞株である。なぜなら、効率的なＤＨＦＲ選択性および増幅性の遺伝子発現系によって、これらの細胞中の高レベルの組み換えタンパク質発現が可能になるからである（Ｋａｕｆｍａｎ  Ｒ．Ｊ．，１９９０，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８５：５２７〜５６６）。さらに、これらの細胞は、接着性または懸濁の培養物として操作することが容易であって、比較的良好な遺伝子安定性を呈する。ＣＨＯ細胞およびそれらで発現される組み換えタンパク質は、広く特徴づけられて、規制当局によって臨床的な製造における用途が承認されている。
【００８７】
宿主細胞は、上記の発現ベクターで形質転換されるかまたはトランスフェクトされて、プロモーターを誘導するため、形質転換体を選択するため、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために必要に応じて修飾された従来の栄養培地中で培養される。
【００８８】
トランスフェクションとは、任意のコード配列が現実に発現されるか否かにかかわらず宿主細胞による発現ベクターの取り込みをいう。トランスフェクションの多数の方法、例えば、ＣａＰＯ４沈殿およびエレクトロポレーションが、当業者に公知である。首尾よいトランスフェクションが一般には、このベクターの操作の任意の指示が宿主細胞内で生じるとき、認識される。
【００８９】
形質転換とは、ＤＮＡが複製可能になるように、染色体外エレメントとして、または染色体構成要素によって、原核生物宿主へＤＮＡを導入する工程を意味する。用いられる宿主細胞次第で、このような細胞に適切な標準的な技術を用いて形質転換を行う。塩化カルシウムを使用するカルシウム処理は一般には、実質的な細胞壁障壁を含む細菌細胞について用いられる。形質転換のための別の方法は、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを使用する。用いられるさらに別の技術はエレクトロポレーションである。
【００９０】
組み換え修飾されたＩｇＧ２抗体の調製は好ましくは細胞培養の培地中で達成される。この組み換え抗体はその培養中で細胞によって産生され、引き続き精製される。組み換えタンパク質の調製は、細胞培養上清、細胞抽出物であってもよいが、好ましくはそれらから部分的に精製された画分である。部分的に精製されたとは、いくつかの断片化手順（単数または複数）が行われているが、所望のタンパク質またはタンパク質高次構造よりも多くのポリペプチド種（少なくとも１０％）が存在することを意味する。組み換えタンパク質は、かなり高濃度であってもよい。いくつかの濃度範囲は、０．１〜２０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは０．５〜１５ｍｇ／ｍｌであり、さらにより好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌである。
【００９１】
組み換えの修飾されたＩｇＧ２抗体の調製は、ポリペプチドを発現するのに適切な培養条件下で組み換え宿主細胞を培養することによって最初に調製され得る。このポリペプチドはまた、トランスジェニック動物の産生物として、例えば、このポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでいる体細胞または胚細胞によって特徴づけられる、トランスジェニックのウシ、ヤギ、ブタまたはヒツジの乳汁の成分として発現されてもよい。次いで、公知のプロセスを用いて、このような培養物または成分から（例えば、培養培地または細胞抽出物または体液から）得られた発現ポリペプチドを精製するか、または部分的に精製してもよい。限定するものではないが、濾過、遠心分離、沈殿、相分離、アフィニティー精製、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ；フェニルエーテル、ブチルエーテルまたはプロピルエーテルなどの樹脂を用いる）、ＨＰＬＣ、または上記のいくつかの組み合わせのうちの１つ以上の工程を含む分画が本明細書で用いられてもよいが、本発明の有利な方法では、米国特許出願公開第２００５／０１６１３９９号，および同第２００６／１９４２８０号（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載の様な高分子量治療タンパク質のＬＣ分画および精製を使用してもよい。
【００９２】
本明細書に記載されるＬＣおよびＬＣ／ＭＳ方法はまた、他の精製方法、例えば、ポリペプチドに結合する剤を含有しているアフィニティーカラムを用いるポリペプチドの精製；１つ以上の工程が溶出を含んでいる、コンカナバリンＡアガロース、ヘパリントヨパール（商標）またはＣｉｂａｃｒｏｍ  ｂｌｕｅ  ３ＧＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）などのアフィニティー樹脂での１回以上のカラム工程；および／またはイムノアフィニティークロマトグラフィーと組み合わせてもよい。このポリペプチドは精製を容易にする形態で発現されてもよい。例えば、このポリペプチドは、マルトース結合ポリペプチド（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはチオレドキシン（ＴＲＸ）などの融合ポリペプチドとして発現されてもよい。このような融合ポリペプチドの発現および精製のためのキットは、それぞれ、ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢ（登録商標）（Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．），ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ（登録商標）（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）およびＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）から市販されている。このポリペプチドは、エピトープでタグ化されて、このようなエピトープに関連する特定の抗体を用いることによって引き続いて精製されてもよい。このようなエピトープの１つ（ＦＬＡＧ（商標））は、ＫＯＤＡＫ（登録商標）（Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，Ｃｏｎｎ．）から市販されている。発現されたポリペプチドを親和性精製するために、ポリペプチドに結合するポリペプチド、例えば、組み換えタンパク質に対するモノクローナル抗体、を含んでいるアフィニティーカラムを利用することも可能である。他のタイプのアフィニティー精製工程は、プロテインＡカラムであってもまたはプロテインＧカラムであってもよく、このアフィニティー剤は、Ｆｃドメインを含むタンパク質に結合する。ポリペプチドは、従来の技術を用いて、例えば、高い塩溶出緩衝液中で、アフィニティーカラムから取り出され、次いで利用されるアフィニティーマトリックスに依存して使用のための低い塩緩衝液中にまたはｐＨもしくは他の成分を変化させることによって透析されてもよいし、あるいはアフィニティー部分の天然に存在する物質を用いて競合的に除去されてもよい。本発明の一実施形態では、組み換えタンパク質の調製は、プロテインＡアフィニティーカラムで部分的に精製されてもよい。
【００９３】
前述の精製工程のうちいくつか、または全てを、種々の組み合わせで、本発明の方法における使用のための組み換えＩｇＧ２の適切な調製物を調製するために、および／またはこのような組み換えポリペプチドをさらに精製するために、組み換え体タンパク質の調製物と還元／酸化カップリング試薬剤とを接触した後に使用してもよい。他の哺乳動物ポリペプチドを実質的に含まないポリペプチドが単離されたポリペプチドとして規定される。本明細書に記載されるレドックス試薬系剤の方法と組み合わせてもよい特定のＬＣ方法は米国特許出願公開第２００５／０１６１３９９号、および米国特許出願公開第２００６／１９４２８０号、各々がその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）にさらに詳細に記載される。
【００９４】
このポリペプチドはまた、公知の従来の化学合成によって産生されてもよい。合成手段によってポリペプチドを構築するための方法は、当業者に公知である。合成的に構築されたポリペプチド配列は、そのポリペプチドの意図される使用に応じて最終精製の所望の程度でグリコシル化されてもよい。このポリペプチドが例えばインビボで投与されるべき場合、比較的高い程度の純度が所望される。このような場合、このポリペプチドは精製され、他のポリペプチドに対応するポリペプチドバンドは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析の際に検出できない。当業者には、このポリペプチドに対応する複数のバンドが、示差的なグリコシル化、示差的な翻訳後プロセシングなどに起因してＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化できるということが理解されるであろう。最も好ましいのは、本発明のポリペプチドが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の際に単一のポリペプチドバンドで示されるように、実質的に均一まで精製されることである。このポリペプチドバンドは、銀染色、クマシーブルー染色、および／または（ポリペプチドが放射性標識される場合は）オートラジオグラフィーによって可視化され得る。
【００９５】
修飾された抗体の構造的アイソフォームの特徴付け
タンパク質の高次構造、および混合物中のタンパク質の高次構造の相対的な割合の決定は、任意の種々の分析技術および／または定量技術を用いて行ってもよい。タンパク質の高次構造の間の活性において相違が存在する場合、混合物中の高次構造の相対的な割合を決定することは、活性アッセイ（例えば、リガンドに対する結合、酵素活性、生物学的活性など）の方法によって行うことができる。タンパク質の生物学的活性も用いてもよい。あるいは、タンパク質１ｍｇあたりの活性単位として活性を表現する結合アッセイを用いてもよい。
【００９６】
クロマトグラフィー、電気泳動、濾過、または他の精製技術などの分離技術の間に、２つの高次構造が示差的に分離されるならば、その混合物中の高次構造の相対的な割合を、このような精製技術を用いて決定してもよい。例えば、組み換えＩｇＧの少なくとも２つの異なる高次構造が、疎水性相互作用クロマトグラフィーの方法で分離され得る。さらに、遠ＵＶ円偏光二色性がタンパク質の二次構造組成を評価するために用いられて以降（Ｐｅｒｃｚｅｌら、１９９１，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｒｇ．４：６６９〜６７９）、このような技術で、タンパク質の選択的高次構造が存在するか否かを決定できる。高次構造を決定するために用いられるさらに別の技術は、蛍光分光であって、これを使用して、トリプトファンおよびチロシン蛍光に割り当て可能な三次構造において相補的な相違を得ることができる。高次構造における相違、したがって高次構造の相対的な割合を決定するために用いられ得る他の技術は、融解転移（Ｔｍ’ｓ）および成分エンタルピー、ならびにカオトロープ変性を測定するための示差走査熱量測定である、凝集状態を測定するためのオンラインのＳＥＣである。本明細書で以下に詳細に記載されるいくつかの実施形態では、本発明は、タンパク質の異質性を決定するためにＬＣ／ＭＳ検出を用いる。
【００９７】
単離という用語は、混合物中で他の成分と離れた混合物中の少なくとも１つの成分の物理的な分離を意味する。タンパク質の成分を分離すること、またはタンパク質の特定の高次構造は、このような成分を分離する傾向である任意の精製方法を用いて達成され得る。したがって、下に記載されるＲＰ−ＨＰＬＣに加えて、多数のクロマトグラフィー工程を使用してもよく、これには限定するものではないが、ＨＩＣ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティー、およびＳＥＣが挙げられる。他の精製方法は、ほんの２〜３例を挙げれば、濾過（例えば、接線流濾過）、電気泳動技術（例えば、電気泳動、電気溶出、等電点電気泳動）、および相分離（例えば、ＰＥＧ−デキストラン相分離）である。さらに、所望の高次構造にタンパク質を含む組み換えタンパク質の調製の分画は、所望の高次構造を有するタンパク質の収率をさらに最適化するために、本発明の方法において再度処置してもよい。
【００９８】
活性のアッセイ
本発明の免疫グロブリンは、その物理的／化学的特性および生物学的機能について、当該分野で公知の種々のアッセイによって特徴づけられ得る。本発明の一局面では、参照（一般には野性型対応物）免疫グロブリンに対して本発明の変更された免疫グロブリンを比較することが重要である。特に、本発明の方法に従って発現される本発明の変更された免疫グロブリンの量は、類似の培養条件下で発現される参照免疫グロブリンのものに比較できる。タンパク質の定量のための方法は当該分野で周知である。例えば、発現されるタンパク質のサンプルは、クマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でその定量的な強度について比較され得る。あるいは、目的の特定のバンド（単数または複数）（例えば、全長のバンド）は、例えば、ウエスタンブロットゲル分析および／またはＡＭＥ５−ＲＰアッセイによって検出され得る。
【００９９】
精製された免疫グロブリンはさらに一連のアッセイによって特徴づけられ得、このアッセイとしては限定するものではないが、Ｎ末端配列決定、アミノ酸分析、非変性サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）、質量分析、イオン交換クロマトグラフィーおよびトリプシン消化が挙げられる。
【０１００】
本発明の特定の実施形態では、本明細書で産生される免疫グロブリンは、その生物学的活性について分析される。いくつかの実施形態では、本発明の免疫グロブリンは、その抗原結合活性について試験される。当該分野で公知であり、かつ本明細書で用いられ得る抗原結合アッセイとしては限定するものではないが、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光免疫アッセイおよびプロテインＡイムノアッセイなどの技術を用いる任意の直接または競合的な結合アッセイが挙げられる。
【０１０１】
イムノコンジュゲート
本発明はまた、化学療法剤（本明細書において上記で規定されかつ記載される）、毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物由来の低分子毒素または酵素的に活性な毒素であって、そのフラグメントおよび／または変異体を含むもの）、または放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）などの細胞傷害性剤に対してコンジュゲートされた本発明の免疫グロブリンポリペプチドを含んでいるイムノコンジュゲートに関する。
【０１０２】
抗体および１つ以上の低分子毒素、例えば、カリケアマイシン、メイタンシン（米国特許第号５，２０８，０２０号）、トリコテセン、およびＣＣ１０６５のコンジュゲートも本明細書において考慮される。
【０１０３】
本発明の一実施形態では、免疫グロブリンは１つ以上のメイタンシン分子（例えば、１抗体分子あたり約１〜約１０個のメイタンシン分子）にコンジュゲートされる。メイタンシンは例えば、Ｍａｙ−ＳＳ−Ｍｅに変換されて、これがＭａｙ−ＳＨ３に還元されてもよく、修飾された抗体と反応されて（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７〜１３１（１９９２））メイタンシノイド−抗体イムノコンジュゲートが作製されてもよい。
【０１０４】
用いられ得る酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントとしてはジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉのタンパク質、ジアンチンのタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａのタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａのインヒビター、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓのインヒビター、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが挙げられる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。
【０１０５】
本発明はさらに、本発明の免疫グロブリンと核酸分解活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えば、デオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮａｓｅ）との間で形成されるイムノコンジュゲートを考慮する。
【０１０６】
放射性コンジュゲート抗体の産生のためには種々の放射性同位体が利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２およびＬｕの放射性同位体が挙げられる。
【０１０７】
本発明の免疫グロブリンおよび細胞傷害性剤のコンジュゲートは、種々の二機能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−メレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンソイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて作製され得る。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載のように調製され得る。炭素１４標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体に対する放射性ヌクレオチドのコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと。このリンカーは、細胞中の細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能リンカー」であってもよい。例えば、酸易分解性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７〜１３１（１９９２））を用いてもよい。
【０１０８】
あるいは、免疫グロブリンおよび細胞傷害性剤を含んでいる融合タンパク質を、例えば、組み換え技術またはペプチド合成によって作製してもよい。
【０１０９】
さらに別の実施形態では、本発明の免疫グロブリンは、腫瘍プレターゲティングにおける利用のための「受容体」（例えば、ストレプトアビジン）にコンジュゲートされてもよく、ここでは抗体受容体コンジュゲートが患者に投与され、続いて、洗浄剤を用いて循環から未結合のコンジュゲートが取り除かれ、次いで細胞傷害性剤（例えば、放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートされている「リガンド」（例えば、アビジン）の投与がなされる。
【０１１０】
抗体誘導体
本発明の抗体および抗体変異体は、当該分野で公知であり、かつ容易に利用可能である追加の非タンパク質部分を含むように修飾されてもよい。好ましくは、抗体の誘導体化のために適切な部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例としては限定するものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、およびそれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水におけるその安定性のおかげで製造に利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量のものであってもよく、分岐であっても、または未分岐であってもよい。抗体に結合されたポリマーの数は、変化してもよいし、２つ以上のポリマーが結合される場合は、それらは同じ分子であっても異なる分子であってもよい。一般には、誘導体化に用いられるポリペプチドの数またはタイプは、限定するものではないが、抗体誘導体が規定の条件下で治療に用いられるか否かにかかわらず、改良されるべき抗体の特定の特性または機能を含む考慮に基づいて決定され得る。
【０１１１】
融合タンパク質
本明細書に提供される抗体修飾は、複数の高次構造に適合し得るか、および／または２つ以上のドメインを含み得る組み換えＩｇＧ２分子の異質性を効率的に減少することが見出されている。ドメインとは、ポリペプチド鎖のその領域に局在化され得る特定の三次構造および／または特定の活性に適合するポリペプチドの連続領域である。例えば、あるタンパク質の１つのドメインは、１つのリガンドに結合親和性を有し得、あるタンパク質の１つのドメインは別のリガンドに結合親和性を有し得る。熱安定性の意味では、ドメインは、タンパク質の協同的な変性ユニットを指してもよい。２つ以上のドメインを含むこのようなタンパク質は、１つのタンパク質として天然に存在することが見出されてもよいし、または融合タンパク質として遺伝的に操作されてもよい。さらに、ポリペプチドのドメインはサブドメインを有してもよい。
【０１１２】
本明細書に提供される抗体修飾はまた、他のタイプの組み換えＩｇＧ２タンパク質の調製に有用であり、このタンパク質としては、免疫グロブリン分子もしくはその一部、およびキメラ抗体（例えば、マウス抗原結合領域にカップリングされたヒト定常領域を有する抗体）、またはそのフラグメントが挙げられる。免疫グロブリン分子をコードするＤＮＡを操作して、単鎖抗体、親和性増強抗体、またはポリペプチドベースの他の抗体などの組み換えタンパク質をコードし得るＤＮＡを作製する多くの技術が公知である（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋら、１９８９，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：９３４〜９３８；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２７；Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９８７，Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：７３１〜７３４；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４〜１５３６；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：３９４〜３９７を参照のこと）。完全ヒト抗体（例えば、トランスジェニック動物を用いて調製され、必要に応じてインビトロでさらに修飾される）、およびヒト化抗体の調製も本発明で用いられ得る。ヒト化抗体という用語はまた、単鎖抗体を包含する。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許第０，１２５，０２３号Ｂ１；Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号；Ｂｏｓｓら、欧州特許第０，１２０，６９４号Ｂ１；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、国際公開第８６／０１５３３号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、欧州特許第０，１９４，２７６  Ｂ１；Ｗｉｎｔｅｒ，米国特許第５，２２５，５３９号；Ｗｉｎｔｅｒ，欧州特許第０，２３９，４００号Ｂ１；Ｑｕｅｅｎら、欧州特許第０  ４５１  ２１６号Ｂ１；およびＰａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．ら、欧州特許第０  ５１９  ５９６号Ａ１を参照のこと。本明細書で提供される抗体修飾はまた、抗体および細胞傷害性物質または発光物質を含んでいるコンジュゲートの調製の間に用いられてもよい。このような物質としては以下が挙げられる：メイタンシン誘導体（例えば、ＤＭ１）；エンテロトキシン（例えば、黄色ブドウ球菌のエンテロトキシン）；ヨウ素同位体（例えば、ヨウ素−１２５）；テクニウム同位体（例えば、Ｔｃ−９９ｍ）；シアニン蛍光色素（例えば、Ｃｙ５．５．１８）；およびリボソーム不活性化タンパク質（例えば、ボウガニン、ゲロニンまたはサポリン−Ｓ６）。
【０１１３】
種々の融合タンパク質の調製はまた、本明細書に提供される修飾された抗体を用いて調製され得る。このような融合タンパク質の例としては、組み換えＩｇＧ（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）分子の一部との融合物として発現されるタンパク質、ジッパー部分との融合タンパク質として発現されるタンパク質、およびサイトカインと成長因子の融合タンパク質（すなわち、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−３、ＭＧＦとＩＬ−３）などの新規な多機能タンパク質が挙げられる。国際公開第９３／０８２０７号および同９６／４０９１８号は、それぞれ免疫グロブリン融合タンパク質およびジッパー融合タンパク質を含めて、ＣＤ４０Ｌと称する分子の種々の可溶性オリゴマー型の調製を記載する；そこに考察される技術は他のタンパク質に適用可能である。任意の上記の分子が、限定するものではないが、細胞受容体分子の細胞外ドメイン、酵素、ホルモン、サイトカイン、免疫グロブリン分子の一部、ジッパードメインおよびエピトープを含めて、融合タンパク質として発現され得る。
【０１１４】
薬学的処方物
本発明の抗体を含んでいる治療用処方物は、水溶液、凍結乾燥処方物または他の乾燥処方物の形態で、所望の程度の純度を有する抗体を、必要に応じて生理的に許容される担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版  Ｏｓｏｌ，Ａ．編集．（１９８０））と混合することによって貯蔵のために調製される。受容可能な担体、賦形剤または安定剤は、使用される投与量および濃度で受容者にとって無毒であり、これにはリン酸塩、クエン酸塩、ヒスチジンおよび他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；アミノ酸、例えば、グルタミン酸、プロリン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン；単糖類、二糖類および他の炭水化物、例としては、グルコース、マンノース、またはデキストリン；ＥＤＴＡなどのキレート剤；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；ナトリウムなどの塩を形成する対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）および／または非イオン性サーファクタントＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
【０１１５】
本明細書の処方物はまた処置されている特定の適応のために必須である２つ以上の活性化合物、好ましくは、お互いに有害ではない補完的な活性を有するものを含んでもよい。このような分子は意図される目的に有効である量で組み合されて適切に存在する。
【０１１６】
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって調製されたマイクロカプセル中に、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレエート）マイクロカプセルに、コロイド状の薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中に、またはマクロエマルジョン中にトラップされてもよい。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版  Ｏｓｏｌ，Ａ．編集．（１９８０）に開示される。
【０１１７】
インビボ投与に用いるべき処方物は、無菌でなければならない。これは無菌濾過膜を通じて濾過によって容易に達成される。
【０１１８】
徐放性の調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例としては、本発明の免疫グロブリンを含んでいる固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形された物品の形態、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルである。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール）、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射用マイクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。ポリマー、例えば、エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸は１００日間にわたって分子の放出をし得るが、特定のヒドロゲルがタンパク質を放出するのはより短期間である。カプセル化された免疫グロブリンが、長期間身体にとどまる場合、それらは、３７℃での湿気に対する曝露の結果として変性または凝集し得、それによって生物学的活性の損失および免疫原性の可能な変化が生じる。合理的なストラテジーが、関与する機構に依存して安定化のために考案され得る。例えば、凝集機構は、チオ−ジスルフィド交換を通じた分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見されている場合、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾すること、酸性溶液からの凍結乾燥、湿度を制御すること、適切な添加物を用いること、および特定のポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成され得る。これに関して、本明細書に記載されるようなシステイン残基を形成するジスルフィドの還元／排除が特に有利であり得る。
【０１１９】
使用
本発明の免疫グロブリンは、例えば、インビトロおよびインビボの診断方法および治療方法の両方を含む、その免疫グロブリンが認識する特定のポリペプチドを精製、検出および標的化するために用いられ得る。
【０１２０】
一局面では、本発明の免疫グロブリンは、生物学的サンプル中で特異的な抗原を定性的におよび定量的に測定するためのイムノアッセイで用いられ得る。抗原−抗体結合を検出するための従来の方法としては、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または組織免疫組織化学が挙げられる。多くの方法は、検出目的のために抗体に結合した標識を用い得る。抗体とともに用いられる標識は、抗体に対するその結合を妨げない任意の検出可能な官能基（部分）である。多くの標識が公知であって、これには、放射性同位体である３２Ｐ、３２Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、および１３１Ｉ、蛍光体、例えば、希土類キレート、またはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルセリフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼ、および細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、複素環オキシダーゼ、例えば、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定なフリーラジカル、造影放射性ヌクレオチド（例えば、テクネシウム）などが挙げられる。特定の標識に関連するシグナルの発生および検出は、２つ以上の相互作用部分、例えば、リガンド−受容体対、酵素−基質対および蛍光共鳴エネルギー移動対の間の相互作用に直接的または間接的に関与し得る。
【０１２１】
従来の方法は、それらの標識が免疫グロブリンポリペプチドに対して共有結合するために利用可能である。例えば、カップリング剤、例えば、ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、ビス−イミデート、ビス−ジアゾ化ベンジジンなどを用いて、上記の蛍光、化学発光および酵素標識によって抗体をタグ化してもよい。例えば、米国特許第３，９４０，４７５号（蛍光定量法）および米国特許第３，６４５，０９０号（酵素）；Ｈｕｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  １４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：１０１４〜１０２１（１９７４）；Ｐａｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４０：２１９〜２３０（１９８１）；ならびにＮｙｇｒｅｎ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ３０：４０７〜４１２（１９８２）を参照のこと。本明細書で好ましい標識は、西洋わさびペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼなどの酵素である。免疫グロブリンポリペプチドに対するこの酵素を含む、このような標識のコンジュゲーションは、免疫アッセイ技術の当該分野で標準的な徒手的手順である。例えば、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ−ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，編集．Ｊ．Ｊ．ＬａｎｇｏｎｅおよびＨ．Ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ，第７３巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８１），ｐｐ．１４７〜１６６を参照のこと。このような結合方法は、本発明の免疫グロブリンポリペプチド内での使用に適切である。
【０１２２】
免疫グロブリンを標識する代わりに、抗原を、検出可能な物質で標識された競合する抗原標準および未標識の抗体を利用する競合イムノアッセイによって体液中でアッセイしてもよい。このアッセイでは、この生物学的サンプル、標識抗原標準および抗体を組み合わせて、未標識の抗体に結合された標識された抗原標準の量を決定する。生物学的サンプル中の試験された抗原の量は、抗体に結合した標識された抗原標準の量に反比例する。
【０１２３】
本発明の免疫グロブリンは、親和性精製剤として用いられてもよい。このプロセスでは、免疫グロブリンポリペプチドは、当該分野で周知の方法を用いて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂またはろ紙などの固体相上に固定される。この固定された免疫グロブリンを、精製されるべき抗原を含んでいるサンプルと接触させ、その後にその支持体を適切な溶媒で洗浄し、この溶媒は、固定された抗体に結合している、精製されるべき抗原以外のサンプル中の実質的に全ての物質を除去する。最終的に、この支持体を、免疫グロブリンから抗原を遊離する別の適切な溶媒で、例えば、グリシン緩衝液ｐＨ５．０で洗浄する。
【０１２４】
本発明の免疫グロブリンは、インビトロおよびインビボの両方のアッセイで特異的な抗原活性を部分的にまたは完全に遮断するためにアンタゴニストとして用いられ得る。さらに、本発明の免疫グロブリンの少なくともいくつかは、他の種から抗原活性を中和し得る。したがって、本発明の抗体は、例えば、抗原を含有している細胞培養物中で、ヒト被験体において、または本発明の抗体が交差反応する抗原を有している他の哺乳動物被験体（例えば、チンパンジー、ヒヒ、マーモセット、カニクイザルおよびアカゲザル、ブタまたはマウス）において、特異的な抗原活性を阻害するために用いられ得る。一実施形態では、本発明の免疫グロブリンは、抗原活性が阻害されるように免疫グロブリンと抗原とを接触させることによって、抗原活性を阻害するために用いられ得る。好ましくは、この抗原はヒトタンパク質分子である。
【０１２５】
別の実施形態では、本発明の免疫グロブリンは、障害に罹患している被験体において抗原（ここでこの抗原活性は有害である）を阻害するための方法で用いられ得、この方法は、被験体において抗原活性が阻害されるように、この被験体に対して本発明の免疫グロブリンを投与する工程を包含する。好ましくは、この抗原はヒトタンパク質分子であって、この被験体とはヒト被験体である。あるいは、この被験体は、本発明の抗体が結合する抗原を発現する哺乳動物であってもよい。なおさらに、この被験体は、抗原が導入されている（例えば、抗原の投与によって、または抗原導入遺伝子の発現によって）哺乳動物であってもよい。本発明の免疫グロブリンは、治療目的のためにヒト被験体に投与され得る。さらに、本発明の免疫グロブリンは、獣医用に、またはヒト疾患の動物モデルとして免疫グロブリンが交差反応する抗原を発現している非ヒト哺乳動物（例えば、霊長類、ブタまたはマウス）に投与され得る。後者に関して、このような動物モデルは、本発明の抗体の治療有効性を評価する（例えば、投薬量および投与の時間経過を試験すること）ために有用であり得る。治療上有用である本発明の遮断抗体としては、例えば、限定するものではないが、抗ＶＥＧＦ、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ１１、抗インターフェロンおよび抗組織因子抗体が挙げられる。本発明の免疫グロブリンは、限定するものではないが、悪性および良性の腫瘍；非白血病およびリンパ性悪性疾患；神経、グリア、星状細胞、視床下部および他の腺、マクロファージ、上皮、間質性および胞胚腔の障害；ならびに炎症性、血管原性および免疫障害を含む１つ以上の抗原分子の異常な発現および／または活性に関連する疾患、障害または状態を診断、処置、阻害または予防するために用いられ得る。
【０１２６】
一局面では、本発明の遮断抗体は、リガンド抗原に特異的であって、リガンド抗原に関与するリガンド−受容体相互作用を遮断するかまたは干渉すること、これによって対応するシグナル経路および他の分子または細胞事象を阻害することによって抗原活性を阻害する。本発明はまた、必ずしもリガンド結合を妨げる必要はないが、受容体活性化を妨げ、それによってリガンド結合により正常には開始される任意の応答を阻害する受容体特異的抗体を特徴とする。本発明はまた、リガンド−受容体複合体に優先的にまたは排他的に結合する抗体を包含する。本発明の免疫グロブリンは、特定の抗原受容体のアゴニストとしても作用し、それによってリガンド媒介性の受容体活性化の全てのまたは部分的な活性のいずれかを強化、増強または活性化し得る。
【０１２７】
特定の実施形態では、細胞傷害性剤とコンジュゲートされた免疫グロブリンを含んでいるイムノコンジュゲートが患者に投与される。好ましくは、イムノコンジュゲートおよび／またはそれに結合する抗原が、細胞に内部移行されて、そのイムノコンジュゲートが結合する標的細胞を殺傷するのにおけるそのイムノコンジュゲートの治療有効性が増大される。一実施形態では、この細胞傷害性剤は標的細胞中の核酸を標的化するかまたは干渉する。このような細胞傷害性剤の例としては、本明細書で注記される任意の化学療法剤（メイタンシノイドまたはカリケアマイシン）、放射性同位体、またはリボヌクレアーゼ、またはＤＮＡエンドヌクレアーゼが挙げられる。
【０１２８】
本発明の修飾された抗体は、治療において単独でまたは他の組成物と組み合わせていずれかで用いられ得る。例えば、本発明の抗体は、別の抗体、化学療法剤（単数または複数）（化学療法剤のカクテルを含む）、他の細胞毒性剤（単数または複数）、抗血管形成剤（単数または複数）、サイトカイン、および／または増殖阻害剤（単数または複数）と同時投与されてもよい。本発明の抗体が腫瘍増殖を阻害する場合、その抗体と、これも腫瘍増殖を阻害する１つ以上の他の治療剤（単数または複数）とを組み合わせることが特に所望され得る。例えば、抗ＶＥＧＦ抗体遮断ＶＥＧＦ活性を、転移性乳癌の処置において、抗ＥｒｂＢ抗体（例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標）抗ＨＥＲ２抗体）と組み合わせてもよい。あるいは、またはさらに、この患者は、放射線治療（例えば、外部ビーム照射または抗体などの放射性標識剤での治療）を併用して受けてもよい。上で注記されるこのような併用療法としては、併用投与（ここでは２つ以上の剤が同じまたは別の処方物中に含まれる）、および別々の投与（この場合、本発明の免疫グロブリンの投与は、追加の治療（単数または複数）の投与の前および／または後に行ってもよい）が挙げられる。
【０１２９】
本発明の免疫グロブリン（および追加の治療剤）は、非経口、皮下、腹腔内、肺内および鼻腔内を含む任意の適切な方法、および局所的な処置に望まれる場合には、病巣内投与によって投与される。非経口的注入としては筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下の投与が挙げられる。さらに、免疫グロブリンはパルス注入によって、特に抗体の漸減用量で投与されることが適切である。好ましくは、この投薬量は、その投与が短期であるかまたは慢性的であるかに部分的に依存して、注射によって、最も好ましくは静脈内または皮下注射によって、与えられる。
【０１３０】
本発明の免疫グロブリン組成物は、適正医療行為に従ったやり方で、処方、投薬および投与される。この状況での考慮のための要因としては、処置されるべき特定の障害、処置されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、その剤の送達の部位、投与方法、投与の計画、および医療従事者に公知の他の要因が挙げられる。免疫グロブリンは必ずではないが、該当の障害を予防または処置するために現在用いられている１つ以上の剤とともに必要に応じて処方される。このような他の剤の有効量は、処方物中に存在する本発明の免疫グロブリンの量、障害または処置のタイプ、および上記で考察される他の要因に依存する。これらは一般には、本明細書において上で用いられたのと同じ投薬量で、かつ投与経路で、または従来使用される投薬量の約１〜９９％で用いられる。
【０１３１】
疾患の予防または処置については、本発明の免疫グロブリンの適切な投薬量（単独で用いられるか、または化学療法剤などの他の剤と組み合わせて用いられる）は、処置されるべき疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度および経過、免疫グロブリンが予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、事前の治療、患者の臨床病歴、および免疫グロブリンに対する応答、ならびに担当医の裁量に依存する。免疫グロブリンは適切には、一回または一連の処置で患者に投与される。疾患のタイプおよび重症度に依存して、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の免疫グロブリンが、例えば、１回以上の別々の投与によろうと、または連続注入によろうと、患者への投与のための初回候補投薬量である。代表的な一日投薬量は、上述の要因に依存して、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上にわたってもよい。数日間以上にわたる反復投与については、その条件次第で、疾患症状の望ましい抑制が生じるまで処置が維持される。抗体または抗体フラグメントの好ましい投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。したがって、１回以上の用量の約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ（またはその任意の組み合わせ）が患者に投与されてもよい。このような用量は、間欠的に、例えば、毎週、または３週毎に投与されてもよい（例えば、その結果、患者は約２〜約２０、例えば、約６用量の抗体を与えられる）。最初により高用量を、続いて１回以上の低用量を投与してもよい。例示的な投薬レジメンは、免疫グロブリンの約４ｍｇ／ｋｇの初期ローディング用量、続いて約２ｍｇ／ｋｇという毎週の維持用量を投与する工程を包含する。しかし、他の投薬レジメンが有用である場合もある。この治療の進行は従来の技術およびアッセイによって容易にモニターされる。
【０１３２】
製品
本発明の別の実施形態では、上記の障害の処置のために有用な材料を含んでいる製品が提供される。製品は、容器、およびその容器に付随した表示または添付文書を含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどが挙げられる。その容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。その容器は、その条件を処置するのに有効な組成物を保持し、無菌のアクセスポートを備えてもよい（例えば、その容器は、皮下注射針で穿刺可能な栓を有している静脈内溶液バッグまたはバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の免疫グロブリンである。この表示または添付文書は、この組成物が癌などの選ばれた状態を処置するのに用いられることを示す。さらに、この製品は（ａ）本明細書に含まれる組成物を含む第一の容器であって、その組成物が本発明の免疫グロブリンを含む第一の容器と；（ｂ）そこに組成物が含まれる第二の容器であって、その組成物がさらなる細胞毒性剤を含む第二の容器とを備えてもよい。本発明のこの実施形態における製品はさらに、その第一および第二の免疫グロブリン組成物が癌を処置するために用いられ得ることを示している添付文書を備えてもよい。あるいは、またはさらに、その製品はさらに、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル溶液、およびデキストラン溶液などの薬学的に受容可能な緩衝液を含んでいる第二（または第三）の容器を備えてもよい。他の緩衝液、希釈剤、フィルター、ニードルおよびシリンジを含んでいる商業的観点および使用者の観点から望まれる他の材料がさらに含まれてもよい。
【実施例】
【０１３３】
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態を実証するために含まれる。当業者には、以下の実施例に開示される技術が本発明の実施において十分機能することが本発明者らによって発見された技術に相当し、したがって、その実施のための好ましい形態を構成すると考えられ得るということが理解されるはずである。しかし、当業者は、本発明の開示に照らして、開示されている特定の実施形態で多くの変化をおこなうことが可能であり、さらに本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様のまたは類似の結果が得られるということを理解すべきである。
【０１３４】
以下の実施例は、組み換え抗体分子の構造的に均一な集団を生じるように抗体を修飾する方法を提供する。
【０１３５】
（実施例１）
ＩＧＧ２のＣＨ１およびヒンジ近接性のモデリング
ＩｇＧ２抗体の三次元モデルを作製して、野性型抗体分子におけるジスルフィド結合の位置を研究した。このモデルでは、ＩｇＧ２のＣＨ１のＣｙｓ残基（Ｃｙｓ−１３１）とヒンジ残基Ｃｙｓ−２１９およびＣｙｓ−２２０の密接な空間近接性、ならびに鎖間ジスルフィド結合軽鎖Ｃｙｓ残基（Ｃｙｓ−２１４）を図示した。ＩｇＧ２抗体の三次元モデルは以下のように構築した。
【０１３６】
ヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体の抗ＥＧＦｒのＣＨ１アミノ酸配列（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２３５，８８３号に記載される）を、ＩｇＧ４抗体の公知のＣＨ１構造に対してモデリングした（ｐｄｂアクセッションコード１ａｄ９；Ｂａｎｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｊ．およびＢｒａｄｙ，Ｒ．Ｌ．（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ２９：１６１〜１７１）。抗ＥＧＦｒのＣＨ１配列とテンプレートとの間のアミノ酸配列同一性は、９６％であって、全てのＣｙｓ残基の位置および同一性は完全に保存されていた。得られたＩｇＧ２のＣＨ１モデルは、ヒンジ領域を含むヒトＩｇＧ１のＣＨ１構造上に重ね合わされた（ｐｄｂアクセッションコード１ｈｚｈ；Ｓａｐｈｉｒｅ，Ｅ．Ｏ．，ら、（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：１１５５〜１１５９）。次いで、ＩｇＧ２  ＣＨ１モデルをＣＨ１ドメインのＣ末端のβ鎖の末端でＩｇＧ１構造に計算的に融合して、偽ＩｇＧ２のＣＨ１およびヒンジを作製した。次いで、ＩｇＧ１構造から残ったアミノ酸を、抗ＥＧＦｒ配列における対応する残基へ計算的に変異させて、最終のＩｇＧ２のＣＨ１およびヒンジの図示を作製した。ＩｇＧ１またはＩｇＧ４由来のＬＣのＣｙｓ残基の位置は、それぞれ１ｈｚｈおよび１ａｄ９からとられた；１ａｄ９の定常軽鎖ドメインが抗ＥＧＦｒのドメインと同一であり、１ｈｚｈの定常軽鎖ドメインは、Ｃｙｓ−２１４から離れた単一の残基で抗ＥＧＦｒとは異なるということが注目される。図６に示される軽鎖Ｃｙｓ残基は、その方向が異なる。しかし、この残基での可撓性が、その残基がその軽鎖の最後のアミノ酸であるために予想される。三次元のモデリングは、ＭＯＥ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）を用いて行い、かつ図６はＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）を用いて作製した。
【０１３７】
したがって、前述の抗体配列は、図６に示されるようなＩｇＧ２抗体の三次元モデルを作製するために有用であった。このモデルでは、４つのシステインについて、位置（ＨＣ）１３１、（ＨＣ）２１９、（ＨＣ）２２０および（ＬＣ）２１４が、密接な空間近接性にある（図６）。このことは、これらのシステイン残基が別のジスルフィド連結を生じ、これらのシステイン残基の修飾が、ＩｇＧ２抗体の構造的アイソフォームを生じ得るという発見を支持する。
【０１３８】
（実施例２）
モノクローナル抗体である抗ＲＡＮＫＬの変異
抗ＲＡＮＫＬは、核因子κＢリガンド受容体活性化因子（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｋａｐｐａ  Ｂ  Ｌｉｇａｎｄ）（ＲＡＮＫ−Ｌ）に対するヒトモノクローナルＩｇＧ２抗体である。抗ＲＡＮＫＬは、分子間ジスルフィド結合を通じて連結される２つのＨＣおよび２つのＬＣから構成される。各々のＨＣは、４４８個のアミノ酸を生じるようにコードされ、κサブタイプに属する各々のＬＣは、Ｃ末端でＣｙｓ残基を有する２１５個のアミノ酸からなる。上記で考察されるとおり、溶液中のヒトＩｇＧ２抗体は、鎖間ジスルフィド架橋のなかに異質性を呈する。
【０１３９】
ＣＬのなかのジスルフィド接続性を簡略にするために、抗ＲＡＮＫＬの変異型であるＣＨ１ドメインおよびヒンジを作製した。この変異型では、両方の重鎖の第三のＣｙｓ残基であるＣｙｓ１３１を、セリン残基で置き換えて（図７）Ｃ１３１Ｓ突然変異体を作製した。要するに、野性型抗ＲＡＮＫＬをコードするＤＮＡをＷＯ０３／００２７１３（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されるように得た。次いで、抗ＲＡＮＫＬのＣ１３１Ｓ突然変異体を、部位指向性の変異誘発による周知の方法を用いて構築した。次いで、Ｃ１３１Ｓ突然変異体を、標準的な方法によってＣＨＯ細胞で発現した。次いで、その分泌された抗体を精製した。最終産物の濃度は３．８ｍｇ／ｍＬであった。野性型抗体は、３１．９ｍｇ／ｍＬおよび６１．２ｍｇ／ｍＬで得た。野性型および変異型の抗ＲＡＮＫＬタンパク質の両方とも１０ｍＭの酢酸ナトリウム、５％ソルビトール、ｐＨ５．２で処方した。
【０１４０】
図８は、主要ＩｇＧ２−抗ＲＡＮＫＬ抗体の構造的アイソフォームの野性型重鎖および軽鎖の予想されるジスルフィド接続性を示す。前の実施例の構造的分析では、ＬＣはまた、ヒンジのＣｙｓ残基を通じてＨＣに結合して別の構造的アイソフォームを形成することが可能であることが実証された。したがって、ＨＣのＣｙｓ１３１をＣ１３１Ｓ型のＳｅｒ残基で置換する場合、ＬＣのＣ末端Ｃｙｓ２１４は、ＨＣのヒンジの他のＣｙｓ残基（Ｃｙｓ２１９、２２０）のうちの１つとジスルフィド結合を形成し、それによって４鎖のジスルフィド結合抗体が維持されることが予想された。
【０１４１】
軽鎖は、もはやＣ１３１Ｓ突然変異体における位置１３１でジスルフィド結合を作製することができないので、抗ＲＡＮＫＬ（Ｃｙｓ１３１Ｓｅｒ）突然変異体は、多数の可能なアイソフォームで存在する野性型抗ＲＡＮＫＬよりも均一なプロフィールを呈することが予想された（図２を参照のこと）。以下の２つの実施例は、Ｃ１３１Ｓ突然変異体抗ＲＡＮＫＬ抗体の構造および活性の特徴を記載する。
【０１４２】
（実施例３）
抗ＲＡＮＫＬ突然変異体抗体の構造的特徴付け
抗ＲＡＮＫＬのＣ１３１Ｓ変異型は、下に記載されるような種々の分析技術（ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＣＥＸ−ＨＰＬＣ、ＣＥ−ＳＤＳ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて野性型抗ＲＡＮＫＬと隣り合わせで特徴づけた。変異型のジスルフィド結合はまた、非還元性のペプチドマッピング技術で特徴づけた。
【０１４３】
抗ＲＡＮＫＬ抗体のＳＥ−ＨＰＬＣ
ＳＥ−ＨＰＬＣは、非変性条件下でタンパク質の分子サイズまたは流体力学的容積を決定するための信頼できる技術である。抗ＲＡＮＫＬのＳＥ−ＨＰＬＣ分析を行って、その純度を決定した。この方法は、２つのＴｏｓｏ  Ｈａｓｓ  ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラムを連続して、そして２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ  ７．０を移動相として利用して、凝集物および低分子量のクリップ型からモノマーの抗ＲＡＮＫＬを識別した。この溶出プロフィールは、低濃度（３．８ｍｇ／ｍＬ）の抗ＲＡＮＫＬ  Ｃｙｓ１３１Ｓｅｒ突然変異体に起因して２８０ｎｍではなく２１５ｎｍでモニターした。凝集物、Ｍａｉｎ  Ｐｅａｋおよびクリップ型についての結果は、相対的な面積の割合として表した。
【０１４４】
抗ＲＡＮＫＬ（Ｃｙｓ１３１Ｓｅｒ）突然変異体のＳＥ−ＨＰＬＣ分析からの結果を、抗ＲＡＮＫＬ野性型タンパク質の溶出プロフィール（実線）と重なったクロマトグラム（点線）として図９に示す。図９に示されるとおり、突然変異体の溶出プロフィールは、１つのメインのピークによって支配され、またマイナーな凝集体ピークを有する。この突然変異体の組み込み結果は、野性型抗ＲＡＮＫＬで得られる結果と極めて匹敵する。抗ＲＡＮＫＬ（ｃｙｓ１３１Ｓｅｒ）突然変異体のメインのピークと野性型のピークとの間の溶出位置におけるわずかな相違にかかわらず、ＳＥ−ＨＰＬＣの結果、その突然変異体がちょうど抗ＲＡＮＫＬ野性型と同様に２つのＨＣおよび２つのＬＣのポリペプチド鎖から構成されるという結論が全く支持される。メインのピークの溶出において観察される相違は、ＨＣおよびＬＣポリペプチドの異なる化学量論を示唆するほど十分大きくはない。
【０１４５】
抗ＲＡＮＫＬのＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析
抗ＲＡＮＫＬの荷電異質性は代表的には、ＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析を用いて評価される。抗ＲＡＮＫＬの種々の表面荷電変異体は、ｐＨ７．５で弱い陽イオン荷電カラムに結合すること、続いて塩勾配を使用する溶出によって分離された。この方法は、抗ＲＡＮＫＬ結合およびＮａＣｌ含有勾配での溶出の間に２１５ｎｍでプロフィールをモニタリングするとき、ｐＨ７．５で２０ｍＭのリン酸ナトリウムを用いて４０℃でＤｉｏｎｅｘ  ＰｒｏＰａｃ  ＷＣＸ  １０カラムを用いた。この流速は、０．６ｍＬ／分であって、注入量は１８０μｇのタンパク質であった。この方法は、酸性の変異体をＰｒｅ−Ｐｅａｋｓとして、塩基性の変異体を特定のＰｏｓｔ  Ｓｈｏｕｌｄｅｒ、およびＰｏｓｔ  Ｐｅａｋｓとして分離した。Ｐｒｅ−Ｐｅａｋｓ，  Ｐｏｓｔ  ＳｈｏｕｌｄｅｒおよびＰｏｓｔ  Ｐｅａｋｓについての結果、ならびにＭａｉｎ  Ｐｅａｋは、面積の割合として表された。溶出の間の直線勾配は、１分あたり約１．２５ｍＭのＮａＣｌの流速で０〜７９ｎＭのＮａＣｌであった。
【０１４６】
追加のＣＥＸ−ＨＰＬＣ技術を抗ＲＡＮＫＬ（Ｃｙｓ１３１Ｓｅｒ）突然変異体の分析のために用いた。荷電の変異体を生じ得る一次配列の修飾に基づく抗体のＩｇＧ２サブタイプを主に分離するのではなく、ｐＨ５の移動相を使用するこの方法は、図８に記載されるＩｇＧ２サブタイプの構造的アイソフォームを分離する。この手順は、Ｄｉｏｎｅｘ  ＰｒｏＰａｃ  ＷＣＸ  １０カラムおよび２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５を用いた。このタンパク質は、ＮａＣｌ勾配で溶出され、２１５ｎｍでモニターされた。溶出されたピークＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの特徴は、相対的な面積の割合として表現された。カラムの温度は、外界温度であって、流速は０．８ｍＬ／分であった。溶出の直線勾配は、１分あたり約１．１ｍＭのＮａＣｌの増加で１００〜１７５ｍＭのＮａＣｌであった。
【０１４７】
抗ＲＡＮＫＬおよび野性型のｐＨ７．５でのＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析は図１０に示される。抗ＲＡＮＫＬ（Ｃｙｓ１３１Ｓｅｒ）の溶出クロマトグラムは下側に示される野性型のクロマトグラムに比較して上側に示される。溶出位置は、野性型よりもわずかにはやく溶出する突然変異体と匹敵しており、これはわずかに多くの酸性の暴露面を示唆している。野性型についての約３９分で遅く溶出するショルダーは、突然変異体のクロマトグラムには存在せず、これはいくらか広くただし対称的なピークを呈している。このショルダーは、抗ＲＡＮＫＬ野性型の特徴であって、構造的アイソフォームＩｇＧ２−Ｂ２で富化されることが示された（抗ＲＡＮＫＬについての４つの可能な構造の図解については図２を参照のこと）。このＩｇＧ２−Ｂ２の構造的アイソフォームは、ＨＣ  Ｃｙｓ１３１がＳｅｒ残基によって置換されるとき可能な構造ではない。したがって、ＣＥＸ−ＨＰＬＣ  ｐＨ７．５の方法によって抗ＲＡＮＫＬ（Ｃｙｓ１３１Ｓｅｒ）突然変異体を分析するとき、遅い溶出ショルダーは存在しないということは驚くべきことではない。
【０１４８】
次いで、野性型ＲＡＮＫＬの構造的アイソフォームの部分的精製および富化のために用いられたＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析（ｐＨ５）を使用して、抗ＲＡＮＫＬ突然変異体のプロフィールを評価した。下の図１１は、抗ＲＡＮＫＬ野性型のプロフィール（青）に比較した突然変異体について得られたプロフィール（赤）を示す。
【０１４９】
抗ＲＡＮＫＬのＣＥ−ＳＤＳ分析
ＣＥ−ＳＤＳは最初、ＳＤＳでの処理後に非還元条件下で行い、７０℃で加熱し、分子が変性された後にいずれの露出した遊離のチオール基もヨードアセトアミドで遮断する。抗ＲＡＮＫＬをＳＤＳでインキュベートした場合、そのタンパク質は全般的に負の電荷を呈し、陰極に向かって電場中を移動した。ＣＥ−ＳＤＳはＳＤＳ後の分子サイズ（流体力学的容積）に基づいて分離し、熱がそのタンパク質を変性した。この分析は、非還元条件および還元条件の両方を用いて行った。その分析は、ＵＶ／ＰＤＡ検出を備えるＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ３Ｄキャピラリー電気泳動システムで行った。そのキャピラリーは、ＣＥ標準のベアー融合シリカキャピラリであって、ＣＥ−ＳＤＳサンプルおよび泳動緩衝液はＢｉｏ−Ｒａｄから供給された。
【０１５０】
抗ＲＡＮＫＬは、Ｐｅａｋ１ＡおよびＰｅａｋ１Ｂとして特定された異質のスプリットの主要なピークとして非還元条件下で移動した。スプリットの主要なピークはＩｇＧ２サブタイプのジスルフィド媒介アイソフォームの別の指標である。非還元条件下では、その結果は、相対的面積の割合のもとで、Ｐｒｅ  Ｐｅａｋｓ、Ｍａｉｎ  Ｐｅａｋｓ（Ｐｅａｋ１Ａ＋Ｐｅａｋ１Ｂ）およびＰｏｓｔ  Ｐｅａｋｓとして表わされた。抗ＲＡＮＫＬは、還元ＣＥ−ＳＤＳについては２−メルカプトエタノールで還元された。溶出プロフィールは、別個のＬＣおよびＨＣを示し、その結果は、ＬＣ、ＨＣおよび非主要として、相対面積割合において報告される。
【０１５１】
これらの結果は図１２に示され、この図では、抗ＲＡＮＫＬ野性型について得られた結果に比較した変異の電気泳動図を提示している。図１２に示されるとおり、抗ＲＡＮＫＬ突然変異体の電気泳動図によって、対称的な主要なピークが示され、これは抗ＲＡＮＫＬ野性型について観察されるとおり予想されるＩｇＧ２特徴的な徴候のスプリットを欠いていた。突然変異体についてのスプリットの主要ピークの欠失によって、ジスルフィド構造は２つの形態の間で異なることが示唆された。突然変異体の対称的なピークによって、１つまたは２〜３個の構造的アイソフォームしか存在しないことが示唆される。
【０１５２】
次に、ＣＥ−ＳＤＳを、ＳＤＳでの処置後還元条件下で行い、７０℃の加熱およびＤＴＴでＨＣおよびＬＣを遊離した。野性型に比較して得られた突然変異体の電気泳動図を図１３に示す。
【０１５３】
両方の構築物についてＬＣに対するＨＣの比は、２．１という値を呈し、これは、ＨＣおよびＬＣポリペプチドについての平均質量値を用いる計算に基づいた２．１という理論値とよく匹敵した。この結果によって、この突然変異体は野性型とちょうど同じく、２つのＨＣおよび２つのＬＣポリペプチド鎖でアセンブルされたということが強調された。
【０１５４】
抗ＲＡＮＫＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
抗ＲＡＮＫＬ（Ｃｙｓ１３１Ｓｅｒ）を、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって抗ＲＡＮＫＬ野性型と隣り合わせで分析して、ＳＤＳおよび熱変性後に抗ＲＡＮＫＬおよび変異体のサイズ分布をモニターした。この方法は、完全にアセンブルされていない分子であってもよいし（１つまたは２つのＬＣのいずれかを欠く）、またはペプチド結合切断によって断片化されてもよい、共有結合したマルチマーまたは潜在的なフラグメントの検出に有用な非還元条件下でプレ・キャストした４〜２０％のポリアクリルアミドゲルを用いた。遊離のＬＣおよびＨＣはまた、非還元条件下で検出され得る。抗ＲＡＮＫＬは、非還元条件下で、１１６．２５〜２００ｋＤａという分子量マーカーの位置で、約１５０ｋＤａというみかけの分子量を有するインタクトな分子として移動した。低レベルの共有結合した二量体もこの方法によって検出された。
【０１５５】
ジスルフィド結合は、抗ＲＡＮＫＬをそのサブユニットであるＬＣおよびＨＣに還元するために２−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトール（ＤＴＴ）のいずれかで破壊してもよい。抗ＲＡＮＫＬは、還元剤としてＤＴＴを使用することによって還元した。なぜならこの試薬を用いれば観察されるスメアおよびアーチファクトが最小限であったからである。抗ＲＡＮＫＬのＨＣおよびＬＣは、それぞれ、ほぼ５０ｋＤａおよび２６ｋＤａというみかけの分子量で移動した。ペプチド結合切断によって産生されるフラグメントはまた、還元条件下でおよび非還元条件下で検出された。Ｂｉｏ−Ｓａｆｅクマシー染色を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分けられた抗ＲＡＮＫＬのペプチドバンドを可視化した。
【０１５６】
非還元性のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は図１４に示す。非還元のゲルの結果によって、この突然変異体構築物がわずかに高レベルのマイナーな改変、例えば、共有結合した凝集体（自然には二量体である可能性が高い）を呈したことが示される。なぜなら移動位置によって、２００ｋＤａの分子量標準より大きいサイズが示されたからである。この突然変異体は、たとえマイナー型のレベルが抗ＲＡＮＫＬ（Ｃｙｓ１３１Ｓｅｒ）突然変異体を示すサンプル中でわずかに高いとしても、野性型抗ＲＡＮＫＬに比較して同様のアレイのマイナーな低分子型を提示した。
【０１５７】
還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果は、図１５に示しており、抗ＲＡＮＫＬ突然変異体および野性型の匹敵するバンドパターンを示す。ゲル中のマイナーなバンドの強度は、２つの構築物の間でわずかに変化したが、その変動は、１つの構築物の異なる調製物から十分に予想される範囲内である。
【０１５８】
抗ＲＡＮＫＬのＲＰ−ＨＰＬＣ分析
ＲＰ−ＨＰＬＣを用いてＩｇＧ２サブクラスに固有の構造的アイソフォームを部分的に分離した。サンプルを、６４℃で移動相Ａ（０．１％のＴＦＡが９５／３．９／１．１（ｖ／ｖ／ｖ）のＨ２Ｏ／ｎ−プロパノール／ＡＣＮ中に含有される）中で平衡にしたＺｏｒｂａｘ  ３００  ＳＢ  Ｃ８  カラム（５μ，２．１×１５０ｍｍ）上に注入して、０．５ｍＬ／分の流速で溶出した。溶出の与えられた勾配は、移動相Ｂ（０．１％のＴＦＡが１０／７０／２０（ｖ／ｖ／ｖ）のＨ２Ｏ／ｎ−プロパノール／ＡＣＮ／の中に含有される）で２５〜３０％で２３分にわたり、溶出されたタンパク質は２１５ｎｍでモニターした。図１６は、野性型のクロマトグラムと比較した抗ＲＡＮＫＬ突然変異体のクロマトグラムを示す。示されるとおり、ＲＰ−ＨＰＬＣによって、野性型構築物よりも数分遅く溶出された突然変異体の疎水性の増大した性質が実証された。構造的アイソフォームに相当し、かつ野性型に存在した、十分規定された４つのピーク１、２、３および４は、突然変異体のプロフィールには明らかに存在しなかった。
【０１５９】
抗ＲＡＮＫＬのペプチドマッピング
ＨＣにおけるＣｙｓ１３１の除去は、ヒンジ領域に関するジスルフィド接続性を簡単にすることが期待された。ジスルフィド接続性を試験する最も直接的な方法は、非還元条件下でペプチドマッピングを行うことであった。エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃを用いる非還元性のペプチドマッピングを、突然変異体および野性型抗ＲＡＮＫＬ構築物に適用した。抗ＲＡＮＫＬのペプチドマッピングは、非還元条件について下に概説されるように行い、Ｃｙｓ残基を含んでいるペプチドの間のジスルフィド接続性を確立した。この確立された非還元性の消化はまた、下に概説されるようなＴＣＥＰでの処置によって還元して、配列を特定する目的のための還元マッピングを得た。
【０１６０】
Ｌｙｓ−Ｃ消化。  ３μＬのサンプルを３０〜６０ｍｇ／ｍＬで７μＬの８ＭのＧｕＨＣｌ、０．１ＭのＮａＯＡｃ、２０ｍＭのＮＥＭ、ｐＨ５．０の緩衝液と混合し、これを３７℃で３時間インキュベートし、続いて４Ｍの尿素、２０ｍＭのＮＨ２ＯＨ、０．１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０の緩衝液中に３０倍希釈した。エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃを添加して、酵素対基質の比が１：１０（ｗ／ｗ）まで添加し、その消化を３７℃で一晩行った。非還元性ペプチドマッピング分析については、ＴＦＡをこのサンプル消化物に０．１％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで添加して、反応をクエンチし、そのペプチドを液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析（ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）によって直接分析した。還元されたペプチドマッピング分析については、ＴＥＣＰを消化したサンプルに対して１０ｍＭという最終濃度まで添加して、サンプルを室温で約３０分間インキュベートして、ジスルフィド連結ペプチドを還元した。ＴＦＡを分析前に０．１％（ｖ／ｖ）という最終濃度まで添加した。
【０１６１】
オンラインのＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳペプチド分析。  ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳシステムは、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステムと、エレクトロスプレーインターフェースを備えたＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱイオントラップ質量分析計とから構成された。用いたカラムは、６０℃に設定したＶｙｄａｃ  ２１４ＴＰ５２カラム（Ｃ−４，３００Åの細孔、５μｍの粒子サイズ、２．１ｍｍの内径×２５０ｍｍの長さ）であった。移動相Ａは、Ｈ２Ｏ：ＴＦＡ混合物で１０００：１の比（ｖ／ｖ）であり、移動相Ｂは、ＡＣＮ：Ｈ２Ｏ：ＴＦＡ混合物で９００：１００：１の比（ｖ／ｖ／ｖ）であった。ペプチドフラグメントは、９０分にわたり０〜４５％Ｂの直線勾配、または１２０分にわたる０〜５０％Ｂの直線勾配を用いて０．２ｍＬ／分の流速で溶出した。ＬＣＱのＡＰＩ電源は、４．５ｋＶに設定され、Ｎ２圧力は８０ｐｓｉであり、キャピラリーの温度は２２０℃に設定された。ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳの泳動は、約１０分で転換して、質量分析計に入る塩の混入を回避した。ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳデータ獲得プログラムの設定のために、３つの異なるスキャンモード（フルスキャン、ズームスキャン、およびＭＳ／ＭＳスキャン）を行った。第一に、フルスキャンの最も豊富なペプチドイオンピーク（ｍ／ｚ  ３００〜２０００）を前駆体イオンとして選択した。第二に、ズームスキャンを行って、前駆体イオンの荷電状態を測定した。最終的に、ＭＳ／ＭＳスキャンを用いて、３５％という相対衝突エネルギーを用いる衝突誘起解離（ＣＩＤ）を用いて前駆体の配列を決定した。
【０１６２】
図１７は、抗ＲＡＮＫＬ野性型（上）および抗ＲＡＮＫＬ変異体（下）の非還元性Ｌｙｓ−ＣマップのＵＶクロマトグラムを示す。２つのマップの間の最も明白な相違は、その変異体のマップがＨＣのヒンジ（Ｈ１０−１１−１２、Ｈ１０−１１およびＨ１１）ペプチドおよびＨ６／Ｈ７−８ペプチドをＬＣのＬ１２ペプチドと一緒にして含んでいるジスルフィド変異体ペプチドを識別する極めて疎水性の遅く溶出するペプチドを含まないことであった；これらのペプチドは予想どおり、抗ＲＡＮＫＬ野性型のマップに存在した。ＨＣのＣｙｓ１３１およびＬＣのＣｙｓ２１４；Ｈ６／Ｈ７−８／Ｌ１２を接続し、約８５分で溶出するジスルフィド連結ペプチドはしかし、予想どおり、変異体では失われていた。代わりに、Ｈ６（Ｃｙｓ１３１Ｓｅｒ）／Ｈ７−８ペプチド（図１７でＨ６Ｍ／Ｈ７−８として表示される）は、約８７分で溶出し、抗ＲＡＮＫＬ（Ｃｙｓ１３１Ｓｅｒ）変異体のマップに存在した。６９７４Ｄａの質量値を有するペプチドが、約８０分の溶出位置で変異体のマップで観察され；このペプチドは、ジスルフィド連結ペプチド（Ｌ１２−Ｈ１１−１２）２に相当し、これは、ＨＣのヒンジ領域に対するＬＣの連結を示した。
【０１６３】
還元されたＬｙｓ−Ｃペプチドマップは、抗ＲＡＮＫＬ野性型プロフィール（上）および抗ＲＡＮＫＬ（Ｃｙｓ１３１Ｓｅｒ）変異体（下）で図１８に示される。このマップは、抗ＲＡＮＫＬ野性型のマップにのみ存在した、約６０分で十分解像されたＨ６ペプチド、および抗ＲＡＮＫＬ（Ｃｙｓ１３１Ｓｅｒ）変異体のマップにのみ存在する、対応するＨ６Ｍペプチド（これは、約６７分のＨ６Ｃｙｓ１３１Ｓｅｒ変異体に相当する）以外はほとんど同一であった。
【０１６４】
結論
ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＣＥ−ＳＤＳおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる抗ＲＡＮＫＬ（Ｃｙｓ１３１Ｓｅｒ）変異体の評価によって、構築された分子は、ジスルフィド結合によって一緒に保持されるＬＣおよびＨＣの各々の２つのコピーを含んでいる４つのポリペプチド抗体として発現および精製されることが確認された。ＳＥ−ＨＰＬＣによる溶出位置によって、野性型抗ＲＡＮＫＬに比較した場合、変異体についてわずかに大きい流体力学半径が示唆された。ｐＨ７．５のＣＥＸ−ＨＰＬＣによる、および非還元性ＣＥ−ＳＤＳによるプロフィールは、抗ＲＡＮＫＬ野性型について観察されるプロフィールよりも抗ＲＡＮＫＬ（Ｃｙｓ１３１Ｓｅｒ）変異体についてさらに均一でかつ簡単であった。非還元性ＣＥ−ＳＤＳ、ＣＥＸ−ＨＰＬＣ（ｐＨ５）およびＲＰ−ＨＰＬＣ分析によって、代表的なＩｇＧ２サブタイプ抗体を示す、野性型抗ＲＡＮＫＬについて観察されるよりも抗ＲＡＮＫＬ（Ｃｙｓ１３１Ｓｅｒ）変異体についてジスルフィド媒介性の構造的アイソフォームの複雑性の少ないアレイが示された。非還元性のペプチドマッピングによって、ＨＣのＣｙｓ１３１がＳｅｒ残基によって置換されるとき、ＬＣはＬＣのＣｙｓ２１５（ＥｄｅｌｍａｎのナンバリングではＣｙｓ２１４）およびＨＣの４つのＣｙｓ残基のうちの１つを通じてＨＣのヒンジ領域に接続されることが示された。まとめると、これらの結果によって、Ｃｙｓ１３１の変異体は、ＩｇＧ２抗体における構造的な相同性の増大を生じることが確認される。
【０１６５】
（実施例４）
抗ＲＡＮＫＬ変異体抗体の力価分析
抗ＲＡＮＫＬの変異型は、均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイによってインビトロで力価を評価するために野性型抗ＲＡＮＫＬと隣り合わせで特徴づけた。抗ＲＡＮＫＬの力価は、それが、ＲＡＮＫ−Ｌのその同族の受容体である「核因子κＢ受容体活性化因子」（ＲＡＮＫ）に対する結合をブロックする能力によって定量される。均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイを利用して、定量的な結果を得た。要するに、ＲＡＮＫ−Ｌを、３３７ｎｍの光で励起させた場合６２０ｎｍで光を発光するユーロピウム＋３（Ｅｕ＋３）で標識した。この受容体は、組み換え技術ＲＮＡＫ−ＦＬＡＧを用いて融合タンパク質として産生され、これはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）に結合された抗ＦＬＡＧ抗体で標識された。ＡＰＣは、６２０ｎｍで光によって励起されるとき６６５ｎｍの光を発光する発蛍光団である。従って、Ｅｕ＋３標識されたＲＡＮＫ−ＬがＲＡＮＫ−ＦＬＡＧ／抗−ＦＬＡＧ−ＡＰＣ複合体に結合するとき、三次の複合体は３３７ｎｍの光で励起されたとき６３５ｎｍの光を発光する。抗ＲＡＮＫＬをＥｕ＋３、ＲＡＮＫ−ＬおよびＲＡＮＫ−ＦＬＡＧ／抗ＦＬＡＧ−ＡＰＣとともにインキュベートした場合、６６５ｎｍの蛍光強度は用量依存性の様式で減少した。
【０１６６】
各々の試験サンプルの力価を、参照標準に比較して、そのデータを、参照標準に比較した相対力価として報告した。変異体抗ＲＡＮＫＬの力価は、ＨＴＲＦアッセイによって評価した。得られた結果によって、９２％の相対力価を有する変異体は、アッセイ中で１０１％の相対力価を示した野性型に対して匹敵する活性を有することが示された。ＨＴＲＦアッセイを３つの複製のサンプル調製物で１回行い、その結果を下の表３にまとめる。
【０１６７】
【表３】
2020063298.tif 000005
これらの結果、抗ＲＡＮＫＬ（Ｃｙｓ１３１Ｓｅｒ）変異体は、ＨＴＲＦベースの力価アッセイでインビトロで試験した場合、野性型に対して匹敵する活性を示したことが示される。
【０１６８】
（実施例５）
抗ＩＬ−１Ｒ抗体の変異体
ＩｇＧ２抗体におけるジスルフィド結合形成システインに対する変異体の効果をさらに理解するために、２つの変異体抗ＩＬ−１Ｒ抗体を作製して、下に示されるように特徴づけた（図１９Ａを参照のこと）。第一の変異体（Ｃ２１９Ｓ）は、ジスルフィド構造３型について富化されていると予想され、ここではＬＣジスルフィド結合がＣ１３１に強制されている（図１９Ｂを参照のこと）。第二の変異体（Ｃ１３１Ｓ）は、ジスルフィド構造１型について富化されていると予想され、ここではＬＣジスルフィド結合がＨＣヒンジ領域に強制されている（図１９Ｂを参照のこと）。この抗ＩＬ−１Ｒのヌクレオチドおよびコードされたアミノ酸配列は、米国特許出願公開第２００４／０９７７１２号、Ｖａｒｎｕｍら、（その全体が参照によって本明細書に援用される）に示される。Ｃ２１９ＳおよびＣ１３１Ｓ変異体は、上記の実施例２に記載されるような標準的な部位指向性の変異誘発を用いて作製された。その変異体は、ＤＮＡ配列決定によって確認され、その変異した発現構築物をＣＯＳ細胞に一過性にトランスフェクトした。分泌された抗体を精製し、次いで次の２つの実施例に記載されるように特徴づけた。
【０１６９】
（実施例６）
抗ＩＬ−１Ｒ変異体抗体の構造的特徴付け
実施例５で作製されるＣ２１９およびＣ１３１Ｓ変異体抗体を、ＲＰ−ＨＰＬＣで分析して、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞および一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞由来の野性型抗ＩＬ−１Ｒと比較した。ＲＰ−ＨＰＬＣ手順は以下のとおり行った。
【０１７０】
要するに、バイナリ・ポンプを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステムにＵＶ検出器を装備し、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００キャピラリーＨＰＬＣシステムを、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源を装備したＭｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑ−  ＴＯＦ  Ｍｉｃｒｏ質量分析計にオンラインで接続した。このタンパク質を、７５℃で作動するＺｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ  Ｃ８カラム（１５０×２．１ｍｍ、５μｍ）上に注入した。この流速は０．５ｍＬ／分であった。移動相Ａは０．１％のＴＦＡを含んでいる水であった。移動相Ｂは、７０％のイソプロピルアルコール、２０％のアセトニトリル、および０．１％のＴＦＡ水溶液であった。サンプルを１０％Ｂというローディング条件で注入して、２分にわたって１９％Ｂまで増大した。１．１％Ｂ／分という直線溶出勾配で２分で開始して、２４分で終わった。次いで、そのカラムを９５％のＢを用いて５分間フラッシュした。そのカラムを５分間のローディング条件で再度平衡化した。バイナリ・ポンプを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステムを標準分析に用い、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００キャピラリーＨＰＬＣシステムを、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源を装備したＭｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑ−ＴＯＦ  Ｍｉｃｒｏ質量分析計にオンラインで接続した。
【０１７１】
その結果を図２０に示す。そのクロマトグラムによって、野性型抗ＩＬ−１Ｒは４つのピークに分かれたが、Ｃ２１９ＳおよびＣ１３１Ｓは各々単一のピークとして、異なる保持時間で溶出したことが示される。詳細には、Ｃ２１９およびＣ１３１変異体は、野性型ＩｇＧ２の遅れて溶出する型と同時に溶出し、これによって、この変異体が野性型ＩｇＧ２の遅れて溶出する型と同様の可塑性の増大および力価の増大を保有することが示唆される。溶出するアイソフォームのオンラインの質量分析計によって測定される質量は、システインからセリンへの置換と一致していた。これらのデータによって、Ｃ２１９またはＣ１３１のいずれかの変異体が単一の構造的アイソフォームの富化を生じることが強力に示唆される。
【０１７２】
（実施例７）
抗ＩＬ−１Ｒ変異体抗体の力価
各々の抗ＩＬ−１Ｒ変異体の力価を、下に記載されるように軟骨細胞および全血のバイオアッセイを用いて野性型と比較した。
【０１７３】
これらの研究における抗体を、インターロイキン−１細胞表面受容体１型（ＩＬ−１ＲＩ）に特異的に結合するように設計した；これは、インターロイキン−１β（ＩＬ−１ｂ）リガンドと競合し、それによってＩＬ−６の産生を含めて、ＩＬ−１媒介性の細胞事象を阻害する。従って、この抗体の生物活性を、一次的なヒト軟骨細胞およびヒト全血によってＩＬ−１ｂ誘発性のＩＬ−６産生の阻害をモニタリングすることによって評価した。
【０１７４】
軟骨細胞アッセイについては、ＩＬ−Ｉ受容体ｍＡｂ（抗ＩＬ−１Ｒ）ならびにＣ２１９ＳおよびＣ１３１Ｓ変異体を、アッセイ培地中で４０ｎＭ〜１．５２５６ｐＭまで連続希釈した。この希釈された試験抗体（５０μＬ）を、１００μＬの溶液で１００００細胞／ウェルという密度でヒト軟骨細胞を播種した９６ウェルプレートのウェルに添加した。最終抗体濃度は１０ｎＭ〜０．３８１５ｐＭにおよんだ。３０分のインキュベーション後、５０μＬの組み換えヒトＩＬ−１βを１０ｐＭという最終濃度まで添加した。一晩のインキュベーション後、その抗体活性を電気化学発光検出（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いるＩＬ−６イムノアッセイを用いて分析した。ＩＬ−６産生の阻害は、最大ＩＬ−１β活性の割合として算出した。各々の試験抗体についての阻害応答曲線を確立して、対応するＩＣ５０値（シグナルを５０％まで減少する抗体の濃度）は、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いて導いた。
【０１７５】
全血アッセイについては、抗体を１０ポイントのＩＣ５０曲線について半対数増分における１０ｎＭ〜０．０００３ｎＭの５０％ヒト全血（最終濃度）で評価した。抗体との４５分のプレインキュベーション後、血液を３０ｐＭ（〜ＩＣ５０）という最終濃度について組み換えＩＬ−１βで刺激した。一晩のインキュベーション後、その抗体活性を電気化学発光検出（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いるＩＬ−６イムノアッセイを用いて分析した。ＩＬ−６産生の阻害は、最大ＩＬ−１β活性の割合として算出した。ＩＣ５０値は、６つの別のドナー（２つの異なる日の３つのドナー）を用いて算出した（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェア）。
【０１７６】
バイアッセイのデータはＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて分析した。ＩＣ５０値は非線形回帰（勾配変化）によって導いた。用量応答曲線が不完全である場合、その底部を０に拘束した。有意性は、チューキー多重比較事後検定による１元ＡＮＯＶＡを用いて算出した。Ｐ値が０．０５未満を有意とみなした。
【０１７７】
図２１に代表的な結果を示す。反復したアッセイの結果を下の表４にまとめる。図２１および表４に示されるように、抗ＩＬ−１Ｒ  Ｃ１３１Ｓおよび抗ＩＬ−１Ｒ  Ｃ２１９Ｓは一貫して、最初のヒト軟骨細胞およびヒトの全血によるＩＬ−１ｂ誘導性のＩＬ−６産生の阻害において野性型に比較して２〜３倍大きい力価を示した。
【０１７８】
【表４】
2020063298.tif 000006
（実施例８）
抗ＥＧＦＲ抗体の変異
実施例１に示さるとおり、近い空間的近接性（図６）の、位置（ＨＣ）１３１、２１９、２２０および（ＬＣ）２１４の４つのシステインの抗体位置の三次元構造に基づくＩｇＧ２抗体配列のモデリングによって、これらの残基の可変性の配列がＩｇＧ２の構造的アイソフォームを生じ得ることが示唆されている。空間的に近いシステインの変異がこれらの形態を排除し得る可能性を以下のとおり試験した。
【０１７９】
２つの特異的なシステインからセリンへの変異体は、２１９または２２０のいずれかの位置での部位指向性の変異誘発によって調製した（図２２を参照のこと）。部位指向性の変異誘発は、完全ヒトモノクローナル抗体抗ＥＧＦｒ（その全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許第６，２３５，８８３号にｍＡｂＥ７．６．３として記載）をコードするベクターでのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位指向性変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いることによって行い、その所望の変異体の存在はＤＮＡ配列決定によって確認した。所望の変異を有する発現プラスミドを、ジヒドロ葉酸還元酵素活性を欠いている懸濁適合ＣＨＯ細胞中に安定にトランスフェクトした。目的の抗体を発現する細胞を、グリシン、ヒポキサンチンおよびチミンを欠いている培地中での増殖によって選択した。トランスフェクションおよび選択からの回収後、ＣＨＯ細胞プールをスピナーフラスコ中で増殖させた。発現された抗体を、収集された細胞培養上清から、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。変異体Ｃ２１９ＳおよびＣ２２０Ｓは、野性型抗ＥＧＦｒと比較した場合、発現および精製の特徴に有意な相違を呈さなかった。
【０１８０】
（実施例９）
抗ＥＧＦＲ変異体抗体の構造の特徴付け
変異体抗ＥＧＦｒ抗体を次に、非還元性ＣＥ−ＳＤＳおよび天然ペプチドマッピングによって以下のように比較して分析した。
【０１８１】
変異体抗体のジスルフィド結合異質性の評価
第一に、抗体の見かけの大きさを非還元性のキャピラリー電気泳動のドデシル硫酸ナトリウム（ｎｒＣＥ−ＳＤＳ）によって評価し、完全に変性した分子でゲル篩い分け法を行った。
【０１８２】
要するに、２．５ｍｇ／ｍｌという最小濃度の抗体サンプルを以下の手順に従って１ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで希釈した：１５０μｇの抗体溶液を１０μｌのヨードアセトアミド（ＩＡＭ）と合わせて、３μｌの内部標準（１０ｋＤａ分子量マーカー、Ｂｅｃｋｍａｎ）を添加し、その溶液をＣＥ−ＳＤＳサンプル緩衝液（ＢｉｏＲａｄ）で１５０μｌにした。その溶液を混合し、遠心分離し、７５℃で水浴中で１０分間加熱した。その混合物を室温で冷却し、１２，０００ｒｐｍで６分間遠心分離し、注射のためにサンプルバイアルに移した。
【０１８３】
ｎｒＣＥ−ＳＤＳ分析方法をまた、システイン／システイン酸化還元電位を用いて再折り畳み手順に供した抗ＥＧＦｒ分子でも行い、ジスルフィド結合の配置が別個の構造的アイソフォームを担ったか否かを確認した。酸化還元−再折り畳み抗体を作製するために、天然の抗体サンプルを６ｍＭのシステインおよび０．６ｍＭのシスチンが含まれる０．２ＭのＴｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）で９６時間、２〜８℃で処理した。次いでサンプルをその処方物の緩衝液で透析した。ヒト骨髄腫由来のヒトＩｇＧ２を、その元の処方物の緩衝液、４０ｍＭのリン酸塩、および１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４に透析した。次いで、再折り畳みされたサンプルを上記のようにｎｒＣＥ−ＳＤＳに供した。その結果を（図２３）に示す。図２３Ａによって、野性型抗ＥＧＦｒが、ｎｒＣＤ−ＳＤＳ中に２つのピークによって提示される２つの構造的アイソフォームに存在することが示される。酸化還元電位での野性型抗ＥＧＦｒの処理によって、構造的アイソフォームが修飾され、その結果、アイソフォーム２の増大（６０％から８８％へ）をともなうアイソソーム１の有意な減少（４０％から１２％へ）が生じる。この結果、この構造的アイソフォームはジスルフィド結合配置に基づいて別個であることが確認される。骨髄腫患者から単離した市販のＩｇＧ２分子について同様の結果が得られた（図２３Ｂ）。対照的に、変異体抗ＥＧＦｒは代表的なＩｇＧ２の二重性を失い、ｎｒＣＥ−ＳＤＳによって単一ピークに解像された（図２３Ｃ）。従って、この構造的アイソフォームは、グリコシル化に関連せず、ただし（ＨＣ−ＬＣ）２の形態の完全な共有構造の存在に依存することが示された。
【０１８４】
ペプチドマッピング
野性型およびＣ２１９Ｓ抗ＥＧＦｒのジスルフィド構造は、非還元性ペプチドマッピングによって検討した。遊離のシステインは、（Ｂｕｒｅｓ  ら，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：１２１７２）によって記載されるとおり酸性ｐＨでＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）でアルキル化された。ＮＥＭアルキル化後、その溶液を緩衝液交換して、酵素消化を非還元性分子で行った。要するに、ＮＥＭ標識材料を、１０％ｗ／ｗのトリプシン含有０．１ＭのＴｒｉｓ／２Ｍの尿素ｐＨ８．３を１ｍｇ／ｍＬの濃度で用いて３７℃で４時間、消化した。その消化反応を１０％ＴＦＡの１０μＬの添加でクエンチした。次いで、このトリプシン消化サンプルを６０℃で加熱するカラムを備えたＲＰ−ＨＰＬＣを介して分析した。移動相は、（Ａ）水に含まれる０．１２％のＴＦＡ（ｗ：ｖ）、および（Ｂ）４０：４０：２０のアセトニトリル：イソプロパノール：水（ｗ：ｖ）に含まれる０．１１％のＴＦＡから構成された。分離は、移動相Ａ中で調整した、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ５（２．１×２５０ｍｍ）カラム上で２０分間行った。１００μｇの消化物を注入して、ペプチドフラグメントを０〜６５％のＢの勾配で０．２ｍＬ／分の流速で、１６５分溶出させた。ペプチド溶出は、２１４ｎｍのＵＶ吸収およびオンラインの質量獲得によってモニターした。
【０１８５】
ジスルフィド対の割り当ては、質量分析を用いて架橋したペプチドの特定によって行った。全ての質量分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００ポンプ（Ａｇｉｌｅｎｔ，ＵＳＡ）に接続されたエレクトロスプレー源を装備したＬＣＱ  Ｄｅｃａイオン・トラップ装置（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｎｎｉｇａｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて行った。分析は、５．０ｋＶというスプレー電圧を用いて正のイオンモードで行い、ＭＳキャピラリー温度は２２５℃で維持した。その装置は、カフェイン、ＭＲＦＡペプチドおよびＵｌｔｒａｍａｒｋ１６２１の混合物を用いて５００〜２０００というｍ／ｚ範囲で較正した。重鎖および軽鎖のエレクトロスプレーイオン化質量スペクトルのデコンボリューションは、ＸｃａｌｉｂｕｒソフトウェアについてＰｒｏＭａｓｓを用いて行った。タンパク質消化のためのスペクトルデータは、２００〜２０００ｍ／ｚの範囲でオンラインで獲得した。ＭＳ／ＭＳ分析はデータ依存性の方式で行った。衝突データは、４０％の相対衝突エネルギーを用いて得た。
【０１８６】
その結果を図２４に示しており、変異体の天然のトリプシンのペプチドマッピングは、ヒンジダイマーの定量的回収ならびに従来の鎖間接続ＣＨ１−ＣＬから予想されるＨ１０−Ｌ１８ヘテロペプチドの定量的回収を示したことが実証される（図２４）。
【０１８７】
結論として、ｎｒＣＥ−ＳＤＳおよび天然のペプチドマッピングによって分析した場合、その変異体分子は、野性型とは異なって挙動した。これらの結果によって、単一のシステイン残基の変異はＩｇＧ２構造的アイソフォームを特異的に廃して、同質の構造を有する抗体を有する溶液を生じたことが示される。
【０１８８】
（実施例１０）
抗ＥＧＦｒ変異体抗体の生物学的活性の特徴付け
変異体のＣ２１９Ｓ、Ｃ２２０Ｓおよび野性型の抗ＥＧＦｒの力価を、以下のように行うＥＧＦｒリガンドおよびリン酸化バイアッセイによって比較する。抗ＥＧＦｒは、ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦｒ）に対する完全ヒト組み換えＩｇＧ２モノクローナル抗体である。従って、力価は、その抗体が細胞表面でリガンド−受容体結合を阻害し、それによってシグナル伝達経路のリガンド誘導性活性を妨げる能力によって測定する。２つの力価アッセイを用いて、ＥＧＦ媒介性のＥＧＦｒの自己リン酸化の遮断、またはレポーター遺伝子発現アッセイによる細胞増殖の阻害のいずれかを測定する。ＥＧＦｒ自己リン酸化の阻害を測定するために、９６ウェルの組織培養プレートにＡ４３１細胞を播種する。参照標準および試験サンプルの連続希釈を行って、０．１１２５ｍｇ／ｍｌ〜０．０２μｇ／ｍｌにおよぶ濃度範囲を得る。５０μｌの各々の連続希釈をＡ４３１細胞を含んでいる組織培養プレートに添加する。各々の細胞にまた、作業希釈範囲まで希釈した５０μｌのｒｈＥＧＦを添加する。そのプレートを３７℃でかつ１０％のＣＯ２で６０分間インキュベートする。その上清を廃棄して、細胞を１ウェルあたり１０５μｌの緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ，１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で溶解した。そのプレートを２〜８℃で６０分間インキュベートする。８５μｌのこの細胞の溶解液を、Ｅ７５２  ＥＧＦ抗体でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに添加する。そのプレートを室温でかつ暗野で９０分間インキュベートする。次いで、そのプレートを洗浄して１００μｌのＨＲＰコンジュゲートした検出抗体を各々のウェルに添加する。そのプレートを６０分間インキュベートし、次いで洗浄した後に１００μｌの基質の添加をする。そのプレートを１５〜２５分間発色する。その発色は、５０μｌの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加することによって停止して、そのプレートを４５０ｎｍおよび６５０ｎｍで読み取る。各々の試験サンプルの力価は、三通り計算して、平均値を報告する。
【０１８９】
遺伝子発現アッセイは、ヒトＥＧＦｒおよびＥＧＦｒシグナル伝達に応答するルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物を発現する操作された細胞株を用いて行った。抗ＥＧＦｒは、ＥＧＦｒに対する結合についてＴＧＦ−αと競合し、ルシフェラーゼ産生の用量依存性の阻害を生じる。ルシフェラーゼ産生は、細胞溶解およびルシフェリンの添加後に発光によって測定される。参照標準、コントロールおよび試験サンプルをアッセイ培地中で４４０ｎｇ／ｍｌに希釈する。４００〜８７ｎｇ／ｍｌという濃度範囲への連続希釈を調製する。固定濃度のＴＧＦ−αの等容積を各々の試験管に添加する。アッセイウェル中の最終濃度は細胞の添加後、１１０〜２２ｎｇ／ｍｌの抗ＥＧＦｒである。懸濁物中の細胞増殖物を４つの９６ウェルプレートに添加し、抗ＥＧＦｒの２５μｌの各々の連続希釈する。代表的な用量応答によって、約８７ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０値でのシグモイド反応が示される。このシグナル反応を測定して、アイソフォームの力価は、サンプルの反応を参照標準の反応と比較することによって測定する。
【０１９０】
両方のバイオアッセイによって示されるとおり、両方の変異体は、これらのアッセイにおいて野性型と同様の力価を有する。
【０１９１】
（実施例１１）
ＩｇＧ２抗体のヒンジ領域における挿入変異によるジスルフィド異質性の排除
上で考察したとおり、ヒトＩｇＧ２抗体は、ヒンジでのジスルフィド異質性に起因して構造的改変を有する。ジスルフィド異質性は、ＩｇＧ２抗体の重鎖でのみ生じる、ヒンジ中での反応性でかつ固有のシステイン２１９−システイン２２０（Ｃ２１９Ｃ２２０）モチーフによって誘導される。この例では、ジスフルフィド異質性は、図２５に示されるように重鎖の残基Ｃ２１９とＣ２２０の間、または上に１、２またはそれ以上のアミノ酸残基を挿入することによって排除される。
【０１９２】
ヒトＩｇＧ２のヒンジにおける２つのタンデムシステイン（抗ＩＬ−１Ｒ重鎖アミノ酸番号２１９および２２０）の間または上の１つ以上のアミノ酸の挿入は、２つのジスルフィド結合を分離するか、またはヒンジセクションを延長し、それによって均質なジスルフィド型の産生を強制することによって上部ヒンジ領域中のＣ２１９および／またはＣ２２０の反応性を低下するように設計する。これらの変異体から産生された予想されるジスルフィド型は３型であって、ＬＣのＣ２１４がＨＣのＣ１３１とジスルフィド結合を形成している。これは、天然のシステイン残基を変異することなく行われる（図２６〜２８）。挿入された残基は、グリシン、プロリン、セリンおよび他のアミノ酸残基を含んでいるリストから選択される。
【０１９３】
図２５〜２８に示される挿入変異は、部位指向性の挿入変異誘発を用いて作製される。配列２〜４の異なるバージョンが作製される。配列２の１バージョンでは、単一のグリシンがＣ２１９とＣ２２０との間に挿入される。配列２の別のバージョンでは、単一のプロリンがＣ２１９とＣ２２０との間に挿入される。配列３および４の異なるバージョンでは、図２６に示すように、２もしくは３つのグリシン、２もしくは３つのプロリン、または２もしくは３つのグリシンまたはプロリンの組み合わせがＣ２１９とＣ２２０との間に挿入される。
【０１９４】
配列９および１０の異なるバージョンは、図２７に示される挿入変異誘発によって作製された。配列９の１バージョンでは、単一のグリシンがＫ２１８とＣ２１９との間に挿入される。配列９の別のバージョンでは、単一のプロリンがＫ２１８とＣ２１９との間に挿入される。配列１０の異なるバージョンでは、２つのグリシン、２つのプロリン、または１つのグリシンおよび１つのプロリンの組み合わせがＫ２１８とＣ２１９との間に挿入される。
【０１９５】
配列５〜８の異なるバージョンをまた、図２８に示される挿入変異誘発によって作製する。配列１〜４および９〜１０で行われるとおり、グリシン、プロリンまたは他のアミノ酸の異なる組み合わせを用いて、Ｋ２１８とＣ２１９との間に、またＣ２１９とＣ２２０の間にも１または２つのアミノ酸を挿入する。
【０１９６】
ＩｇＧ２ヒンジ領域の挿入変異誘発によって、ＬＣ２１４と、ＨＣ２１９またはＨＣ２２０との間のジスルフィド結合形成が妨げられる。いくつかのまたは全ての変異体では、ＬＣ  Ｃ２１４は、ＨＣ  Ｃ１３１とのジスルフィド結合を形成する。
【０１９７】
挿入変異における構造的アイソフォームの異質性を分析して、異質性が変異によって減少されることが示される。ＣＤ−ＳＤＳ、ＣＥＸおよびＲＰ−ＨＰＬＣ分析によって、野性型ＩｇＧ２抗体に比較して、挿入変異体のいくつかまたは全てで構造的異質性の有意な減少が示される。ある場合には、ジスルフィド構造は、完全に同質性を呈する。
【０１９８】
挿入変異の力価は、抗ＩＬ−１Ｒ抗体に特異的なバイオアッセイを用いて分析する。軟骨細胞および全血のＩＬ−６産生バイオアッセイを、実施例７で記載のとおり行って、それらの標的分子について力価の増強を呈する挿入変異の多くまたは全てが明らかになる。
【０１９９】
（実施例１２）
酸化還元変換によるＩｇＧ２抗体高次構造のアイソフォームの富化
酸化還元変換
封入体状態からタンパク質の酸化的再折り畳みは、組み換えタンパク質の微生物産生においては通常の手順であるが、哺乳動物の細胞産生では通常は行われない。しかし、ＩｇＧ２の異質性は、ジスルフィドに関連すると考えられ、酸化還元処理に対するその型の反応性を試験した。野性型の抗ＩＬ−１Ｒ抗体（その全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００４／０９７７１２に記載される）を、グアニジンＨＣｌ（ＧｕＨＣｌ）の有無において種々の酸化還元条件に供した。
【０２００】
抗ＩＬ−１Ｒ抗体を以下の２つの緩衝液のうちの一方において３ｍｇ／ｍＬでインキュベートした：１）２００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）；２）２００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０（０．９ＭのＧｕＨＣｌ含有）。システインおよびシスタミンの組み合わせを６ｍＭ：０．６ｍＭのモル比で添加した。そのサンプルは２〜８℃で２４〜４８時間おいた。これらの実験で用いたＧｕＨＣｌの最適濃度０．９Ｍは、抗体の二次構造または三次構造全体に影響することが公知の温度未満であって（Ｔｅｅｒｉｎｅｎら、２００６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６１：６８７〜６９７）、これは、ＩｇＧ２κの別の高次構造の形成を可能にする、構造のマイナーな変化のみを誘導する。従って、酸化還元処理のパラメーターを変化することによって、ＲＰ−ＨＰＬＣのピーク１およびピーク３を、それぞれゼロおよび０．９ＭのＧｕＨＣｌを用いて優先的に富化した（図２９）。この再折り畳みした材料は、コントロール（非酸化還元）でみられるピークと整列した単一の均質な種として本質的に溶出した。さらに、いくつかの他のＩｇＧ２のｍＡｂを同じ条件を用いて酸化還元処理した。ＲＰ−ＨＰＬＣの結果によって、試験した全てのＩｇＧ２のｍＡｂが酸化還元処理に反応性であったことが示された。一般には、ＲＰ−ＨＰＬＣのピーク３および１は、その抗体がそれぞれ、ＧｕＨＣｌの存在の有無において酸化還元に曝されるとき、優先的に富化された。この富化された形態は、酸化還元溶液から取り出された後さらなる変換を示さず、ＰＢＳ緩衝液中に保管された。
【０２０１】
（実施例１３）
酸化還元再折り畳みＩｇＧ２抗体高次構造アイソフォームの生理活性
ＩｇＧ２酸化還元再折り畳み高次構造アイソフォームの生理活性を試験して各々のアイソフォームがバルクの未処理の抗体の力価を保持していたか否かを決定した。
【０２０２】
再折り畳みされた抗ＩＬ−１Ｒアイソフォームを実施例７に記載のとおり軟骨細胞および全血アッセイを用いて試験した。ＩＬ−１Ｒバイオアッセイの結果、酸化還元富化材料のＩｌ−６阻害における相違が示され（図３０）、再折り畳みされた材料がバルクの異質の抗体よりも少なくとも強力、またはそれより強力であることが実証される。平均して、酸化還元富化された材料の間のＩＣ５０値において統計学的に有意な相違があり、そして１型は３型よりもほぼ３倍低い活性を示した（図３１Ａ〜Ｂ）。
【０２０３】
再折り畳みされた抗ＩＬ−４Ｒ抗体を、ＩＬ−４Ｒ活性の阻害を測定する生理活性アッセイを用いて試験した。その結果を下の表５に示しており、再折り畳みされた材料が、バルクの異質性抗体と少なくとも同じく強力、またはそれよりも強力であったことが示される。
【０２０４】
【表５】
2020063298.tif 000007
再折り畳みされた抗ＨＧＦ抗体をＨＧＦシグナル伝達活性の阻害を測定する生理活性アッセイを用いて試験した。その結果を下の表６に示しており、これは、再折り畳みされた材料が、バルクの異質性抗体と少なくとも同じく強力、またはそれよりも強力であってことを示す。
【０２０５】
【表６】
2020063298.tif 000008
ヒトグルカゴン受容体に対する再折り畳みされた抗体を、その抗体の力価を測定する生理活性アッセイを用いて試験した。その結果を下の表７に示しており、これは、再折り畳み材料が、バルクの異質性抗体と少なくとも同じく強力、またはそれよりも強力であってことを示す。
【０２０６】
【表７】
2020063298.tif 000009
再折り畳みされた抗ＥＧＦｒ抗体を、実施例１０に記載のＥＧＦｒレポーター遺伝子発現アッセイを用いて試験した。その結果を下の表８に示しており、これは、再折り畳み材料が、バルクの異質性抗体と同様の生理活性を有することを示す。
【０２０７】
【表８】
2020063298.tif 000010
（実施例１４）
ＩｇＧ２抗体の挿入変異の構造の特徴付け
実施例１１に記載のヒンジ領域挿入変異体を、抗ＩＬ−１Ｒ抗体で作製した。変異体は、配列２（配列番号１４）のアラニンの挿入によって作製して、ヒンジ領域配列ＣＡＣＶＥＣＰＰＣ（配列番号３２）を有するＩｇＧ２抗体を作製し、配列３（配列番号１５）の２つのプロリンの挿入によって、ヒンジ領域配列ＣＰＰＣＶＥＣＰＰＣ（配列番号３３）を有するＩｇＧ２抗体を作製した。
【０２０８】
構造的な異質性をＲＰ−ＨＰＬＣによって分析し、その結果を図３２に示す。野性型（ＷＴ）のサンプル（図３２Ａ）は、他のヒトＩｇＧ２サンプルでみられるような代表的な４つのピークプロフィールを示した。ｃＡｃ構築物（図３２Ｂ）は改善された同質性を示した。ｃＰＰｃ構築物（図３２Ｃ）は、検出可能な量のピーク１および２がない高い程度の同質性を示した。これらの結果によって、ジスルフィド交換を停止させるために必要であり得る、システインの間の重要な距離および方向が得られたことが示唆される。
【０２０９】
（実施例１５）
ＩｇＧ２抗体の軽鎖のＣ末端領域における挿入変異によるジスルフィド異質性の排除
上記で考察されるとおり、ヒトＩｇＧ２抗体は、ヒンジでのジスルフィドの異質性に起因して構造的変異体を有する。このジスルフィド異質性は、ＩｇＧ２抗体の軽鎖のＣ末端システイン残基（Ｃ２１４）と反応するヒンジにおける反応性および固有のシステイン２１９−システイン２２０（Ｃ２１９Ｃ２２０）モチーフによって誘導される。この実施例では、ジスルフィド異質性は、図３３および３４に示されるように軽鎖の残基Ｃ２１４およびＣ２１５の後ろに１、２またはそれ以上のアミノ酸残基を挿入することによって排除される。
【０２１０】
ヒトＩｇＧ２の軽鎖のＣ末端領域の残基Ｃ２１４およびＣ２１５後の１つ以上のアミノ酸の挿入は、重鎖のヒンジセクションからＣ末端システインを分離し、それによって同質性のジスルフィド型の産生を強制することによってＣ２１４の酸化還元電位を低くするように設計されている。これらの変異体から産生される予想されるジスルフィド型は、３型であって、ＬＣのＣ２１４がＨＣのＣ１３１とのジスルフィド結合を形成する。これは、天然のシステイン残基を変異することなく行われる（図３３〜３６）。この挿入された残基は、グリシン、プロリン、セリンおよび他のアミノ酸残基を含む列挙から選択される。
【０２１１】
図３３〜３５に示される挿入変異は、部位指向性の挿入変異誘発を用いて作製される。配列１１〜１３の異なるバージョンは、κ軽鎖を有するＩｇＧ２抗体変異体について作製される。配列１１の１バージョンでは、単一のグリシンをＣ２１４の後に挿入する。配列１１の別のバージョンでは、単一のプロリンをＣ２１４の後ろに挿入する。配列１１のさらに別のバージョンでは、単一のセリンをＣ２１４の後ろに挿入する。配列１２および１３の異なるバージョンでは、２もしくは３つのグリシン、２もしくは３つのプロリン、２もしくは３つのセリン、あるいは２もしくは３つのグリシンまたはプロリンまたはセリンの組み合わせのいずれかを図３３に示されるようにＣ２１４の後に挿入する。
【０２１２】
配列１４、１５および１６の異なるバージョンをまた、図３４に示されるλ軽鎖を有するＩｇＧ２抗体変異体の挿入変異誘発によって作製する。配列１４の１バージョンでは、単一のグリシンをＣ２１４とＣ２１５との間に挿入する。配列１４の別のバージョンでは、単一のプロリンをＣ２１４およびＣ２１５に挿入する。配列１４のさらに別のバージョンでは、単一のセリンをＣ２１４とＣ２１５との間に挿入する。配列１５および１６の別のバージョンでは、２もしくは３つのグリシン、２もしくは３つのプロリン、２もしくは３つのセリン、あるいは２もしくは３つのグリシンまたはプロリンまたはセリンの組み合わせのいずれかをＣ２１４とＣ２１５との間に挿入する。
【０２１３】
配列１７、１８および１９の異なるバージョンをまた、図３５に示されるλ軽鎖を有するＩｇＧ２抗体変異体について挿入変異誘発によって作製する。配列１７の１つのバージョンでは、単一のグリシンをＳ２１５の後ろに挿入する。配列１７の別のバージョンでは、単一のプロリンをＳ２１５の後ろに挿入する。配列１７のさらに別のバージョンでは、単一のセリンをＳ２１５の後ろに挿入する。配列１８および１９の異なるバージョンでは、２もしくは３つのグリシン、２もしくは３つのプロリン、２もしくは３つのセリン、あるいは２もしくは３つのグリシンまたはプロリンまたはセリンの組み合わせがＳ２１５の後ろに挿入される。
【０２１４】
ＩｇＧ２軽鎖Ｃ末端領域の挿入変異誘発は、ＬＣ２１４とＨＣ２１９またはＨＣ２２０のいずれかとの間のジスルフィド結合形成を妨げる。いくつかのまたは全ての変異では、ＬＣのＣ２１４は、ＨＣのＣ１３１とジスルフィド結合を形成する。
【０２１５】
挿入変異における構造的アイソフォームの異質性を分析して、この変異によって異質性が減少することが示されている。ＣＤ−ＳＤＳ、ＣＥＸおよびＲＰ−ＨＰＬＣ分析で、野性型のＩｇＧ２抗体に比較して挿入変異のいくつかまたは全てで構造的異質性の有意な減少が示される。いくつかの場合には、ジスルフィド構造は、完全に同質性であると考えられる。
【０２１６】
挿入変異の力価は抗ＬＩ−１Ｒ抗体に特異的なバイオアッセイを用いて分析される。軟骨細胞および全血のＩＬ−６産生のバイオアッセイは、実施例７に記載のように行われ、これによって挿入変異の多くまたは全てがその標的分子について力価の増強を示すことが明らかになる。
【０２１７】
（実施例１６）
追加の抗ＥＧＦＲ抗体の変異および特徴付け
実施例８で作製され、かつ実施例９および１０で特徴づけられた抗ＥＧＦＲ抗体変異体に加えて、抗ＥＧＦＲ抗体に対する他の変異を作製した。本実施例は、変異体の作製ならびにそれらの構造的および生物学的活性の特徴付けを記載する。
【０２１８】
抗ＥＧＦＲ抗体（米国特許第６，２３５，８８３号にｍＡｂ  Ｅ７．６．３として記載され、配列番号５７として本明細書に示される可変領域を含んでいる）の重鎖に対する種々の変異が作製された。その変異体を消化し、次いで上記の例で記載される技術と同様の技術を用いて、ＣＨＯ安定プールまたはＣＯＳ一過性産生系のいずれかで発現した。単一のシステインからセリンへの変異を有する抗体を作製するように、いくつかの変異体を設計した。２つまたは３つのシステインからセリンへの変異体を組み込むように他の変異体を設計した。ＣＨＯ細胞対ＣＯＳ細胞のどちらで発現するかの決定は、都合だけに基づいて行い、いずれかの発現系で所定の構築物を発現できるかできないかには基づかなかった。下の表９に行った変異をまとめている。
【０２１９】
【表９】
2020063298.tif 000011
変異体抗体を精製し、次いで上記の実施例に記載されたように、天然および還元のＬｙｓ−Ｃペプチドマッピング、非還元性ＣＥ−ＳＤＳおよびＮＥＭ／ＣｎＢｒ／トリプシン／ｄＳＥＣ分離、および複合ジスルフィド−連結ペプチドの単離を用いて分析した。Ｃ１３１Ｓ変異の部分的な還元およびアルキル化も行った。非還元性ＣＥ−ＳＤＳによって、変異型と野性型との間で明確な相違が示された。ペプチドマッピングによって、抗ＥＧＦＲ参照および野性型におけるヒンジペプチドの回収が低いことが示され、このことは、ヒンジに関する複雑なジスルフィド連結構造の存在を示している。しかし、ペプチドマッピングは、２１９および２２０の位置で変異体についてのヒンジペプチドの良好な回収を示し、このことは、このヒンジに関与する複雑なジスルフィド−連結構造がないことを示している。
【０２２０】
ｎｒＣＥ−ＳＤＳによるＣ２２６Ｓ分子の分離は、野性型とは異なったプロフィールを有し、異なるピーク１／ピーク２比を呈した。Ｃ２２６Ｓのペプチドマッピングは、野性型参照に比較して複雑なジスルフィド−連結の同じ分布を示し、このことはこのヒンジに関与する複雑なジスルフィド−連結構造の存在を示している。
【０２２１】
変異体Ｃ１３１Ｓの分析によって、ヒンジおよび軽鎖に関与する型が１つだけ観察されることが示された。従って、Ｃ１３１Ｓを有する構造的な型は、異質性を示す野性型よりも簡易である。この観察を確認することで、部分還元−アルキル化実験によって、Ｃ２２０への軽鎖の接続が示された。
【０２２２】
次いで、各々の精製された変異体の生物学的活性を、実施例１０において上記されるＥＬＩＳＡ結合アッセイおよび力価アッセイを用いて評価した。ヒンジ領域において変異体を有する分子の、この力価およびＥＬＩＳＡ結合アッセイの結果は、参照および野性型に匹敵した。しかし、ヒンジ領域の外側の重鎖において変異（Ｃ１３１Ｓ）を有する分子の力価およびＥＬＩＳＡ結合アッセイの結果は、参照および野性型よりも２０〜２５％低かった。
【０２２３】
従って、これらの実験によって、表９に列挙される抗ＥＧＦＲ重鎖システイン残基の変異が力価に影響を生じず、１００％活性である分子を生じることが示される。さらに、これらのデータによって、２１９または２２０での単一の残基の変異が構造的アイソフォームの異質性を廃するのに十分であることが示される。これらの実験によってまた重鎖残基Ｃ１３１の変異体が低い力価を生じ、野性型で観察される多重の分布とは異なりＣ２２０に連結された軽鎖を有している均質な構造型を生じることが示される。結局のところ、Ｃ２２６の変異は、野性型複合体と同様である（ヒンジ−ＨＣ−ＬＣ）複合体を有する構造的アイソフォームを維持している。
【０２２４】
（実施例１７）
ＩｇＧ２抗体の挿入変異体の構造、安定性および生物学的活性の特徴付け
実施例１４に記載される結果に基づいて確認および拡張するために、以下の実験を行った。この実施例では、ジスルフィド異質性を、重鎖のＣ２１９およびＣ２２０の残基の間に２つのアミノ酸残基を挿入することによって２つの異なるｍＡｂ中で排除した。さらに、抗ＩＬ−１Ｒ１の挿入変異体を処方安定性、酸化還元環境でのジスルフィド安定性、および生物学的活性について試験した。下に示されるとおり、挿入変異体は、異質性が少なく、血液様の酸化還元環境においてさらに安定であって、力価の有意な増大を示した。試験したいくつかの挿入残基のなかでも、ｃＰＰｃ挿入変異体は、生物学的活性の増大および酸化還元処理に対する非反応性に加えて、野性型ｍＡｂに対して、全体的な最大の処方安定性を示した。
【０２２５】
いくつかの挿入変異体構築物（表１０に示される）を、抗ＩＬ−１ＲＩのＩｇＧ２のｍＡｂについて調製し、それらの特性について試験した。
【０２２６】
【表１０】
2020063298.tif 000012
ジスルフィド  接続性
挿入変異のジスルフィド接続性を、非還元性Ｌｙｓ−Ｃペプチドマッピングに加えてＥＳＩ−ＭＳをタンデムで用いて非還元性逆相（ＲＰ）分析によって評価した。前の実施例に考察されるとおり、ＩｇＧ２  ｍＡｂのインタクトなＲＰ分析は、ＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームを評価するための鋭敏かつ選択的な方法である。野性型の（ＷＴ）抗ＩＬ−１ＲＩのＩｇＧ２のｍＡｂは、ＲＰ−ＨＰＬＣによって代表的な４つのピークの異質ＩｇＧ２プロフィールを提示した。ＲＰ分析による挿入変異体の分析では、ジスルフィドアイソフォーム分布上の重鎖（ＨＣ）のＣｙｓ２１９／Ｃｙｓ２２０の前および間にアミノ酸を挿入することの影響が示された。４つの挿入変異体（ｃＡｃ、ＰＮｃｃ、およびＡＮｃｃ）のうちの３つが複数のピークを呈したが、異なる分布では、ＷＴに匹敵していた。Ｃｙｓ２１９／Ｃｙｓ２２０の前に作製された２つの挿入によって、ＲＰのピーク２の量の顕著な増大および他のピークの量の引き続く減少が示された。これによって、２つのアミノ酸の距離によりヒンジ領域を低下することによって、ジスルフィド分布が中間アイソフォーム（ＲＰピーク２）へシフトすることが可能であるが、ジスルフィド異質性を完全には排除しないことが示唆される。他方では、２つのタンデムシステイン（Ｃｙｓ２１９／Ｃｙｓ２２０）の間のアミノ酸の挿入は、ジスルフィド異質性を排除した。２つのタンデムシステインの間の１つのアミノ酸（ｃＡｃ）の挿入は、システイン上に作製された挿入に匹敵する結果を生じ、これによって単一アラニンアミノ酸挿入が、ジスルフィド異質性を排除するのに最も有効ではない場合もあることが示唆される。しかし、アラニンより大きい単一アミノ酸の異なる選択によって、ジスルフィド異質性を停止することが可能である。その後の質量分析によって、ＩｇＧ２のＲＰピークの間の有意な質量の相違が示された。
【０２２７】
抗ＩＬ−１Ｒ１挿入変異体の正確なジスルフィド接続性を確認するため、非還元性Ｌｙｓ−Ｃペプチドマッピングを行った。ｍＡｂとＬｙｓ−Ｃプロテアーゼとのインキュベーションによって、ペプチド骨格の予測可能な断片化を行い、それによってＲＰ−ＬＣ／ＭＳ分析で引き続き分析して、その分子のジスルフィド接続性を決定することが可能である。非還元性ペプチドマッピングについてのプロトコールおよび質量分析による特定を含む、ＩｇＧ２ジスルフィド接続性の詳細な特徴付けは、上の実施例に記載される。さらに、ＩｇＧ２アイソフォームを規定する特定のジスルフィド連結ペプチドのグループ分けは、実施例３に詳細に記載され、下におよび表１１にまとめて記載される。
【０２２８】
【表１１】
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ＩｇＧ２挿入変異体（ｃＡｃ挿入変異体は、サンプルが不十分なせいで除外した）およびＩｇＧ２  ＷＴ材料の非還元性Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼペプチドマップは、いくつかの後期溶出ピークを除いて同じクロマトグラフィーのプロフィールを示した。これらのピークは、予想されるＬＣからＨＣへのジスルフィド連結ペプチド（Ｐ１）、および２つの他の別個のジスルフィドペプチドを含み、ここでこのヒンジは、１つまたは両方のＣ−末端ＬＣペプチド、およびＣｙｓ１３１を含んでいる１つまたは両方のＨＣペプチド（Ｐ２，Ｐ３）に共有結合される。この抗ＩＬ−１ＲＩのｍＡｂのｃＰＰｃ挿入変異体は、ＬＣからＨＣへのジスルフィド架橋が予想されるジスルフィド架橋されたペプチドＰ１のみを含み（Ｐ１＝ＬＣフラグメントＬ１２＋ＨＣ  ジスルフィド−連結フラグメントＨ６−７−８）、ペプチドＰ２もＰ３も含まない（Ｐ２＝Ｌ１２フラグメント＋Ｈ６−７−８フラグメント＋２つのＨ１１−１２フラグメント、Ｐ３＝２つのＬ１２フラグメント＋２つのＨ６−７−８フラグメント＋２つのＨ１１−１２フラグメント）構築物であった。他のＩＬ−１ＲＩ  ｍＡｂ構築物（ＷＴ、ＡＮｃｃ、およびＰＮｃｃ）は、ジスルフィド−架橋されたペプチドＰ１、Ｐ２、およびＰ３の全てを含んだが、Ｐ１がこの変異体では部分的に富化された。
【０２２９】
安定性（処方された）
抗ＩＬ−１ＲＩ挿入変異体の安定性を、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に２ｍｇ／ｍＬで含有されるタンパク質を処方すること、およびそのサンプルを上昇した温度（３７℃および４５℃）でインキュベートすること、およびサイズ排除クロマトグラフィーによってモニタリングすることによって試験した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、連続した（２つのＴｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ×１（カラム７．８内径×３０ｃｍ、５μｍの粒子）で、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  ＣＡ  ＵＳＡ）で行った。この装置に２０μｇをロードして２ｍｇ／ｍＬでサンプルを分析した。移動相は、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭの塩化ナトリウム、５％のエタノール（ｐＨ７．０）を含んだ。この流速は、０．５ｍＬ／ｍｉｎであって、カラム温度は２５℃で制御した。そのシグナルは、２１５ｎｍおよび２８０ｎｍの波長での吸光度によってモニターした。
【０２３０】
ｃＰＰｃ挿入変異体は、主要なピークの損失の速度が遅い、経時的に大きい安定性を示した。凝集体およびクリップの相対増大パーセントはＷＴおよび他の構築物に比較してｃＰＰｃ挿入変異体について有意に低かった。さらに、その構造的安定性は、示差走査熱量測定を用いて評価した。抗ＩＬ−１Ｒ１サンプルを、１℃／分という走査速度で、３０℃から９５℃までＰＢＳ中で０．５ｍｇ／ｍＬでモニターした。サンプルをＭｉｃｒｏＣａｌ  ＶＰ−キャピラリー示差走査熱量測定システムを用いて分析した。
【０２３１】
挿入変異体の熱融解プロフィールをＷＴと比較した。ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中で熱安定性に有意差は検出できなかった。従って、処方された安定性は、本明細書に記載の挿入変異体では改善されていた。
【０２３２】
安定性（酸化還元）
以前に考察したとおり、ＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームは、酸化還元環境におかれた場合、不安定でかつ不活性変換される。この抗ＩＬ−１ＲＩのｃＰＰｃ挿入変異体を酸化還元の安定性について試験した。なぜならこれは、単一のＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームから構成されることが示されたからである。このサンプルを、４μＭのシステインの出発濃度を含有しているＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液中で約１ｍｇ／ｍＬでインキュベートした。このシステイン濃度は、定常状態の酸化還元環境では維持されなかった。なぜなら、システインは水溶液中では急速にシスチンに変換するからである。このサンプルを最大１４４時間までインキュベートして、ジスルフィド変換についてＲＰクロマトグラフィーによってモニターした。この抗体を、Ｚｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ  Ｃ８カラム（１５０×２．１ｍｍ、５μｍまたは５０×１ｍｍ、３．５μｍ）を用いて、インタクトなＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。そのカラム温度は７５℃であって、その流速は０．５ｍＬ／分であった。移動相Ａは４％のＩＰＡ／１％のＡＣＮ／０．１１％のＴＦＡであり、移動相Ｂは７０％のＩＰＡ／２０％のＡＣＮ／０．１０％のＴＦＡであった。
【０２３３】
実験の経過にわたってｃＰＰｃ挿入変異体についてＲＰでは変換は見られなかった。変異体とは対照的に、ＷＴは、同様の酸化還元条件のもとでＲＰピーク１に変換された。これらのデータによって、ｃＰＰｃ挿入変異体がインビボにおいて循環中で安定であることが強力に示唆される。
【０２３４】
生物学的活性
抗ＩＬ−１ＲＩ挿入変異体の力価は、軟骨細胞のバイオアッセイを用いてＷＴと比較した。この抗ＩＬ−１ＲＩのＩｇＧサンプルをアッセイ培地で４００ｎＭから１．５ｐＭまで連続希釈した。希釈された試験抗体（５０μｌ）を、１００μｌの容積に１０，０００細胞／ウェルの密度でヒト軟骨細胞を播種された９６−ウェルプレートのウェルに添加した。最終抗体濃度は、１００ｎＭから０．３８ｐＭまでにおよんだ。３０分のインキュベーション後、５０μｌの組み換え体ヒトＩＬ−１βを最終濃度１０ｐＭまで添加した。一晩のインキュベーション後、電気化学発光検出（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）によるＩＬ−６のイムノアッセイを用いて抗体活性を分析した。ＩＬ−６産生の阻害は、最大ＩＬ−１β活性の割合として算出した。各々の試験抗体の阻害応答曲線を確立して、対応するＩＣ５０値（シグナルを５０％まで低下する抗体の濃度）は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて導いた。
【０２３５】
３つの独立した実験からのデータによって、ＷＴの抗ＩＬ−１ＲＩのｍＡｂが、いずれの変異体よりも活性が有意に弱かった（ｐ＜０．００１）ことが示される。いずれの変異体の間にも有意な相違はなかった（ｐ＞０．０５）。このデータは、酸化還元的富化によって研究したＩｇＧ２アイソフォームの間の活性の有意な相違を示した、上記の実施例１３の結果と一致している。
【０２３６】
挿入変異体の一過性の産生の間、挿入変異体構築物の少なくとも１つでより高い収率が観察された。さらに、挿入変異体構築物の少なくとも１つは、産生の間に少ないＩｇＧフラグメントを示した。これらのデータによって、ＩｇＧ２ヒンジにおいてシステインを再構築することは、収率に影響を有し得ることが示唆される。理論で束縛されるものではないが、これらのデータによって、ＩｇＧヒンジ内およびその周囲のジスルフィド結合形成は、ＩｇＧの発現および収率に影響し得るタンパク質折り畳みのボトルネックを生じることが示される。
【０２３７】
本実施例および先行する実施例に示される結果によって、産生およびインビボ安定性について分子のジスルフィド構造を安定化する方法でＩｇＧ２  ｍＡｂのヒンジを操作することが可能であることが示される。
【０２３８】
本明細書に開示されかつ特許請求される組成物および／または方法の全ては、本発明の開示に照らして過度の実験なしに作製および行うことができる。本発明の組成物および方法は、いくつかの実施形態に関して記載されているが、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、バリエーションが、本明細書に記載される、組成物および／または方法に、ならびにその方法の工程にまたはその方法の工程の順序に適用され得ることが当業者には明白であろう。さらに詳細には、化学的におよび生理学的に両方で関連する特定の剤を、本明細書に記載の剤について置き換えても、同じまたは同様の結果が達成され得るということが明白であろう。当業者に明白な全てのこのような類似の置換および修飾は、添付の請求項の範囲によって規定されるとおり本発明の趣旨、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。
【０２３９】
本明細書全体を通じて引用される引用文献は、それが本明細書に示されるものに対して例示的な手順または補充的な他の詳細を提供する程度まで、全てが参照によって本明細書に詳細に援用される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
2020063298.tif 000042
【図２３】
2020063298.tif 000043
【図２４Ａ】
2020063298.tif 000044
【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２５】
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【図２６】
2020063298.tif 000049
【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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