(57)【要約】【課題】細胞の増殖を促進し得る化合物の提供。【解決手段】下記式（Ｉ）で示される化合物の光学活性体、またはその塩を含む、培地添加用組成物：2020120649.tif 000085 ｛式中、各記号は明細書中で定義される通りである。｝。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で示される化合物の光学活性体、またはその塩を含む、培地添加用組成物：
【化１】
2020120649.tif 000079
｛式中、Ｘは、単結合、−ＣＨ２ＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、または−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝。
【請求項２】
Ｘが、−ＮＨＣＯ−である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｒ２が、炭素数１〜６のアルキル基であり、ｎが０である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
Ｒ１が、−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり、Ｙが、炭素数１〜６のアルキル基を有するメチレン基であり、Ｗが、Ｎ（Ｒ４）であり、Ｚが、単結合であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基または炭素数１〜６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
アリール基が、フェニル基である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
光学活性体がＲ体である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
式（Ｉ）で示される化合物が、以下からなる群から選択される化合物である、請求項６に記載の組成物。
【化２】
2020120649.tif 000080
【化３】
2020120649.tif 000081
【化４】
2020120649.tif 000082
【化５】
2020120649.tif 000083
【請求項８】
Ｒ１が、−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり、Ｙが、単結合であり、Ｗが、Ｎ（Ｒ４）であり、Ｒ４が、水素原子であり、Ｚが、炭素数１〜６のアルキル基を有するメチレン基であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基または炭素数１〜６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
アリール基が、水酸基で置換されているフェニル基である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
光学活性体がＲ体である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
式（Ｉ）で示される化合物が、以下で示される化合物である、請求項１０に記載の組成物。
【化６】
2020120649.tif 000084
【請求項１２】
細胞増殖促進用である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
細胞が、正常細胞株、がん細胞株および幹細胞からなる群から選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
スフェア形成、オルガノイド形成、またはＣｙｓｔ形成の促進に用いられる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の培地添加用組成物を含む、培地。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の培地添加用組成物を培地へ添加することを含む、細胞増殖を促進させる方法。
【請求項１７】
細胞が、正常細胞株、がん細胞株および幹細胞からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞増殖用組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞を用いた実験は、生命現象の作用機序の解明や疾患の治療法の確立等を目的として、生命科学分野をはじめとする多くの分野において極めて頻繁に行われている。例えば、創薬の分野における一例として、治療標的となるがん細胞に対して候補化合物を作用させ、がん細胞の増殖を抑制し得る化合物をスクリーニングする方法がある。かかるスクリーニングにおいては、数万種の候補化合物をスクリーニングすることもあり、このような態様では均質な細胞を大量に準備する必要がある。しかし、ヒト等の高等生物の細胞は、比較的分裂が早い細胞であっても１日程度の期間を要し、また、がん細胞や幹細胞には１回の細胞分裂に要する期間が数か月以上にも及ぶものも存在し、迅速な細胞調達を妨げる要因となっている。かかる背景から、分裂の遅い細胞の増殖を促進し得る手段の構築が求められており、例えば、特定の構造を有するチオール化合物が造血前駆細胞の増殖を促進することや、ポリプレニル系化合物が肝細胞の増殖を促進すること等が報告されている（特許文献１、２）。
【０００３】
一方で、創薬スクリーニングの分野において、近年、細胞の３次元培養が注目されている。３次元培養は、in vitroとin vivoの中間を担う細胞培養技術である。３次元培養では、細胞はスフェア（スフェロイドともいう）等の立体構造を形成し得、従って、通常の２次元培養と比較して、より生体に近いアッセイが可能となり得る。従って、３次元培養は、２次元培養を用いた創薬スクリーニングでは特定できなかった疾患治療用化合物を特定できる可能性がある（非特許文献１）。
【０００４】
かかる背景から、本発明者らは３次元培養下の細胞の増殖を促進し得る化合物を探索し、その結果、本発明者らが新規に合成した新規化合物が、３次元培養下における細胞の増殖を極めて良好に促進させることができた（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表平１１−５０４０００号公報
【特許文献２】国際公開第２００８／１５５９２０号
【特許文献３】ＰＣＴ／ＪＰ２０１８／０２８２０５号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Breslin S et al, Drug Discov Today. 2013 Mar;18(5-6):240-9.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、３次元培養下の細胞の増殖を促進し得る化合物の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題に対して鋭意検討した結果、本発明者らが新規に合成した新規化合物の光学異性体のうち、特定の光学異性体が３次元培養下の細胞の増殖を顕著に促進することを見出し、かかる知見に基づいてさらに研究を進めることによって本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
【０００９】
［１］下記式（Ｉ）で示される化合物の光学活性体、またはその塩を含む、培地添加用組成物：
【００１０】
【化１】
2020120649.tif 000002
【００１１】
｛式中、Ｘは、単結合、−ＣＨ２ＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、または−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝。
［２］Ｘが、−ＮＨＣＯ−である、［１］に記載の組成物。
［３］Ｒ２が、炭素数１〜６のアルキル基であり、ｎが０である、［１］または［２］に記載の組成物。
［４］Ｒ１が、−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり、Ｙが、炭素数１〜６のアルキル基を有するメチレン基であり、Ｗが、Ｎ（Ｒ４）であり、Ｚが、単結合であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基または炭素数１〜６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、［１］〜［３］のいずれかに記載の組成物。
［５］アリール基が、フェニル基である、［４］に記載の組成物。
［６］光学活性体がＲ体である、［５］に記載の組成物。
［７］式（Ｉ）で示される化合物が、以下からなる群から選択される化合物である、［６］に記載の組成物。
【００１２】
【化２】
2020120649.tif 000003
【００１３】
【化３】
2020120649.tif 000004
【００１４】
【化４】
2020120649.tif 000005
【００１５】
【化５】
2020120649.tif 000006
［８］Ｒ１が、−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり、Ｙが、単結合であり、Ｗが、Ｎ（Ｒ４）であり、Ｒ４が、水素原子であり、Ｚが、炭素数１〜６のアルキル基を有するメチレン基であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基または炭素数１〜６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、［１］〜［３］のいずれかに記載の組成物。
［９］アリール基が、水酸基で置換されているフェニル基である、［８］に記載の組成物。
［１０］光学活性体がＲ体である、［９］に記載の組成物。
［１１］式（Ｉ）で示される化合物が、以下で示される化合物である、［１０］に記載の組成物。
【化６】
2020120649.tif 000007
［１２］細胞増殖促進用である、［１］〜［１１］のいずれかに記載の組成物。
［１３］細胞が、正常細胞株、がん細胞株および幹細胞からなる群から選択される、［１２］に記載の組成物。
［１４］スフェア形成、オルガノイド形成、またはＣｙｓｔ形成の促進に用いられる、［１］〜［１３］のいずれかに記載の組成物。
［１５］［１］〜［１４］のいずれかに記載の培地添加用組成物を含む、培地。
［１６］［１］〜［１４］のいずれかに記載の培地添加用組成物を培地へ添加することを含む、細胞増殖を促進させる方法。
［１７］細胞が、正常細胞株、がん細胞株および幹細胞からなる群から選択される、［１６］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、３次元培養下における細胞の増殖を促進し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明組成物を添加した培地において培養されたＭＤＣＫ細胞のＣｙｓｔ形成を、共焦点蛍光顕微鏡を用いて観察した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書において使用する用語を以下に定義する。
【００１９】
本明細書において、ｎ−はノルマル、ｉ−はイソ、ｓｅｃ−はセカンダリーおよびｔｅｒｔ−はターシャリーを各々意味する。また、本明細書において、ｏ−はオルト、ｍ−はメタおよびｐ−はパラを各々意味する。
【００２０】
「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子である。「ハロゲノ基」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨードである。
【００２１】
「アルキル基」および「炭素数１〜１０のアルキル基」とは、直鎖または分岐状のアルキル基を意味し、具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ネオペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、ｎ−ヘキシル、２−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル等の基が挙げられる。「炭素数１〜６のアルキル基」とは、直鎖または分岐状のアルキル基を意味し、具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ネオペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、ｎ−ヘキシル、２−ヘキシル等の基が挙げられる。
【００２２】
「アリール基」とは、少なくとも１つの環が芳香族であり、各環が５〜８の環原子を有する単環式、二環式、三環式および四環式炭素環式基が挙げられ、具体的には、フェニル、インデニル、ナフチル、フルオレニル等が挙げられる。特に、アリール基は、炭素数６〜１０の環であるフェニル、インデニル、ナフチルであり得る。
【００２３】
「アルキレン基」および「炭素数１〜６のアルキレン基」とは、直鎖または分岐状のアルキレン基を意味し、具体的には、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン等の基が挙げられる。
【００２４】
「アルキル基」、「アリール基」および「アルキレン基」は、置換基を有していてもよく、そのような置換基としては、例えば以下が挙げられる。尚、「アルキル基」の場合には下記（１）〜（４０）が挙げられ、「アリール基」および「アルキレン基」の場合には下記（１）〜（４１）が挙げられる。
【００２５】
(1)ハロゲノ基、
(2)水酸基、
(3)シアノ基、
(4)ニトロ基、
(5)カルボキシル基、
(6)アルケニル基（Ｃ２−１０アルケニル基；例、ビニル、アリル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、へキセニル、ヘプテニル、ブタジエニル、ヘキサトリエニル、およびその各異性体）、
(7)アルキニル基（Ｃ２−１０アルキニル基；例、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、および、その各異性体）、
(8)ハロゲノアルキル基（例、モノフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、モノフルオロエチル、ジフルオロエチル、トリフルオロエチル、クロロメチル、クロロエチル、ジクロロエチル、およびその各異性体）、
(9)環状アルキル基（環中にヘテロ原子を含んでもよい）（例、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、アジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル）、
(10)アリール基（例、フェニル、ナフチル）、
(11)ヘテロアリール基（例、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、フリル、チオフェニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル（例、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル）、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル（例、１，２，３−オキサジアゾリル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル）、チアジアゾリル（例、１，２，３−チアジアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル）、ベンゾフリル、ベンゾチオフェニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズイミダゾリル、インダゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、プリニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、プテリジニル、イミダゾオキサゾリル、イミダゾチアゾリル、イミダゾイミダゾリル）、
(12)アルコキシ基（例、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、２−ペンチルオキシ、３−ペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、２−ヘキシルオキシ）、
(13)アルキルチオ基（例、メチルチオ、エチルチオ、ｎ−プロピルチオ、イソプロピルチオ、ｎ−ブチルチオ、イソブチルチオ、ｓｅｃ−ブチルチオ、ｔｅｒｔ−ブチルチオ、ｎ−ペンチルチオ、イソペンチルチオ、ｔｅｒｔ−ペンチルチオ、ネオペンチルチオ、２−ペンチルチオ、３−ペンチルチオ、ｎ−ヘキシルチオ、２−ヘキシルチオ）、
(14)アリール基（上記(10)と同義）で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、
(15)アリール基（上記(10)と同義）で置換された、アルキルチオ基（上記(13)と同義）、(16)ヘテロアリール基（上記(11)と同義）で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、
(17)ヘテロアリール基（上記(11)と同義）で置換された、アルキルチオ基（上記(13)と同義）、
(18)環状アルキル（環中にヘテロ原子を含んでもよい）オキシ基（例、シクロプロピルオキシ、シクロブチルオキシ、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシ、テトラヒドロフラニルオキシ、テトラヒドロピラニルオキシ、アジリジニルオキシ、アゼチジニルオキシ、ピロリジニルオキシ、ピペリジニルオキシ、モルホリニルオキシ）、
(19)アリールオキシ基（例、アリール基（上記(10)と同義）が酸素原子に結合した基）、(20)ヘテロアリールオキシ基（例、ヘテロアリール基（上記(11)と同義）が酸素原子に結合した基）、
(21)ハロゲノアルコキシ基（例、ハロゲノアルキル基（上記(8)と同義）が酸素原子に結合した基）、
(22)ハロゲノアルキルチオ基（例、ハロゲノアルキル基（上記(8)と同義）が硫黄原子に結合した基）、
(23)水酸基で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、
(24)アルコキシ基（上記(12)と同義）で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、(25)アミノ基、
(26)アルキル基でモノまたはジ置換されたアミノ基、
ここで、「アルキル基」とは、Ｃ１−６アルキル基が挙げられ、具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ネオペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、ｎ−ヘキシル、２−ヘキシル等が挙げられる。
(27)カルバモイル基、
(28)アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）でモノまたはジ置換されたカルバモイル基（例、メチルカルバモイル、エチルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、エチルメチルカルバモイル）、
(29)スルファモイル基、
(30)アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）でモノまたはジ置換されたスルファモイル基（例、メチルスルファモイル、エチルスルファモイル、ジメチルスルファモイル、ジエチルスルファモイル、エチルメチルスルファモイル）、
(31)アルカノイル基（例、水素原子若しくはアルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）が炭素原子に結合したカルボニル基）、
(32)アロイル基（例、アリール基（上記（10）と同義）が炭素原子に結合したカルボニル基）、
(33)アルキルスルホニルアミノ基（例、アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）で置換されたスルホニルアミノ基）、
(34)アリールスルホニルアミノ基（例、アリール基（上記（10）と同義）で置換されたスルホニルアミノ基）、
(35)へテロアリールスルホニルアミノ基（例、ヘテロアリール基（上記（11）と同義）で置換されたスルホニルアミノ基）、
(36)アシルアミノ基（例、アシル基で置換されたアミノ基）、
ここで、「アシル基」とは、Ｃ１−６アルキル基、またはＣ６−１０アリール基を有するアシル基である。ここで、「Ｃ１−６アルキル基」とは、上記「アルキル基」のうち、炭素数が１〜６のものであり、「Ｃ6−１０アリール基」とは、上記「アリール基」のうち、炭素数が６〜１０のものである。アシル基としては、具体的には、アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、イソブチロイル基、バレロイル基、イソバレロイル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、アクリロイル基、メタクリロイル基、クロトノイル基、イソクロトノイル基、ベンゾイル基、ナフトイル基等が挙げられる、
(37)アルコキシカルボニルアミノ基（例、アルコキシ基（上記(12)と同義）で置換されたカルボニルアミノ基）、
(38)アルキルスルホニル基（例、アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）で置換されたスルホニル基）、
(39)アルキルスルフィニル基（例、アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）で置換されたスルフィニル基）、
(40)アルコキシカルボニル基（例、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基）、
(41)アルキル基（Ｃ1−１０アルキル基；例、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ネオペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、ｎ−ヘキシル、２−ヘキシル等）等が挙げられる。
【００２６】
置換基が２以上存在する場合は、それらは同一でも異なっていてもよい。
【００２７】
式（Ｉ）に示される化合物は、塩の形態であってもよい。前記式（Ｉ）で表される化合物の塩としては、例えば、塩酸及び臭化水素酸等の無機酸との塩ならびに酢酸、プロピオン酸、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸及び安息香酸等の有機酸との塩が挙げられる。
【００２８】
式（Ｉ）に示される化合物は、置換基の種類によってはＥの立体配置を有するＥ体およびＺの立体配置を有するＺ体の幾何異性体が存在する場合がある。本発明はこれらＥ体、Ｚ体またはＥ体およびＺ体を任意の割合で含む混合物を包含するものである。
【００２９】
［合成方法１］式（Ｉ）に示される化合物の合成
【００３０】
【化７】
2020120649.tif 000008
【００３１】
｛式中、Ｘは、単結合、−ＣＨ２ＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、または−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝
【００３２】
上記式（Ｉ）に示される化合物は、下記反応式で表されるように、ケトン化合物（ｋ）とＨ２Ｎ−Ｘ−Ｒ１（式中、ＸおよびＲ１は前記の意味を表し、例えば、ヒドラジド化合物等）とを反応させることにより合成することができる。前記原料それぞれを１当量ずつ用い、トルエン、１,４−ジオキサン、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の溶媒中、１００℃以上の温度範囲で、１時間から３日間反応を行なうのが好ましい。
【００３３】
［反応式１］
【００３４】
【化８】
2020120649.tif 000009
【００３５】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｘおよびｎは、前記の意味を表す。）
上記、ｋおよび１００のうちのあるものは、市販品として購入が可能であり、それ以外のものも公知の合成方法に準じて合成することができる。
【００３６】
［合成方法２］ケトン化合物およびヒドラジド化合物の組合せからなる化合物の合成
前記、合成方法１に準じた方法で、Ｈ２Ｎ−Ｘ−Ｒ１のうち、Ｘが−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１が−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり、ＷがＮ（Ｒ４）であり、Ｙが置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｚ、Ａｒおよびｎが前記の意味を表すヒドラジド化合物を用いることにより、式（Ｉ）に示される化合物うち、ケトン化合物およびヒドラジド化合物の組合せからなる化合物を合成することができる。
上記、ヒドラジド化合物のあるものは、市販品として購入が可能であり、それ以外のものも公知の合成方法に準じて合成することができる。
【００３７】
［合成方法３］ケトン化合物およびアミン化合物の組合せからなる化合物の合成
前記のケトン化合物（ｋ）［例えば、２’，４’−ジヒドロキシ−３’−メチルプロピオフェノン(ｋ−１)等］と、Ｈ２Ｎ−Ｘ−Ｒ１のうち、Ｘが単結合または−ＣＨ２ＣＯＯ−であり、Ｒ１が前記の意味を表す所望の一級アミン［例えば、ｎ−オクチルアミン(Ａ−３)等］またはその塩［例えば、グリシンエチル塩酸塩(Ａ−１)等］を用いることにより、式（Ｉ）に示される化合物のうち、ケトン化合物およびアミン化合物の組合せからなる化合物を合成することができる。前記原料それぞれを１当量ずつ用い、トルエン、１,４−ジオキサン、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の溶媒中、１００℃以上の温度範囲で、１時間から２４時間反応を行なうのが好ましい。アミンの塩としては、塩酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩等を用いることができる。
【００３８】
上記、一級アミンのあるものは、市販品として購入が可能であり、それ以外のものも公知の合成方法に準じて合成することができる。
【００３９】
［合成方法４］ウレア化合物の合成
前記のケトン化合物（ｋ）［例えば、２’，４’−ジヒドロキシ−３’−メチルプロピオフェノン(ｋ−１)等］を、公知の合成方法に準じて、アンモニアのメタノール溶液に溶解させ、アンモニアガスを注入しながら撹拌することで、イミン化合物（ｋ−１’）を合成し、その後、対応するイソシアネート［例えば、フェニルイソシアネート（Ａ−５）］と反応させることで、式（Ｉ）に示される化合物のうち、Ｘが−ＣＯＮＨ−であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびｎが前記の意味を表す、ウレア化合物を合成することができる。
【００４０】
上記、イソシアネートのあるものは、市販品として購入が可能であり、それ以外のものも公知の合成方法に準じて合成することができる。
【００４１】
合成方法１〜合成方法４において、反応終了後の反応混合物は、蒸留水を加えて析出させる、または析出しない場合は、有機溶媒抽出後濃縮といった通常の後処理を行ない、目的の化合物を得ることができる。また、精製の必要が生じたときには、再結晶、カラムクロマトグラフ、薄層クロマトグラフ、液体クロマトグラフ分取等の任意の精製方法によって分離、精製することができる。
【００４２】
[光学活性体の取得]
上述の方法により合成される化合物のうち、光学異性体を有するものについては、光学活性体（ユートマー）が存在し得る。光学活性体の取得は、結晶化による方法、酵素反応を用いる方法、又はＨＰＬＣを用いる方法（例、光学活性担持法）等の自体公知の方法を用いて行うことができる。また、光学活性体を、不斉合成法等を用いて調製することもできる。尚、本明細書において「光学活性体」とは、少なくとも細胞増殖を促進する活性において、ユートマーと判断される光学異性体を含む概念である。
【００４３】
本明細書における３次元細胞培養（３Ｄ細胞培養）とは、例えば、包埋培養法、マイクロキャリア培養法、スフェア培養法などを用いて細胞を３次元的な環境にて培養することを意味する。包埋培養は、マトリゲル（登録商標）、Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）、寒天、メチルセルロース、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、アガロース、アルギン酸塩等の固形または半固体のゲル基材の中に細胞を埋め込み、固定させて培養する方法である。マイクロキャリア培養法は、水よりも僅かに重い微粒子（以下、マイクロキャリアともいう）の表面上に細胞を単層に増殖させ、当該微粒子をフラスコ等の培養容器内で撹拌し、浮遊状態での培養を行うものである。スフェア培養は、目的の細胞が、数十〜数百個から成る凝集塊（以下、スフェアまたはスフェロイドともいう）を形成させた後、当該凝集塊を培地中で静置または振とうして培養する方法である。また、本発明における３次元細胞培養（３Ｄ細胞培養）として、ヒアルロン酸、脱アシル化ジェランガム、キサンタンガムなどの多糖類又はこれらの派生物を培地中で分散させることにより、不定型な３次元ネットワークを形成させ、これをスキャフォールドとして接着細胞を培地中に浮遊した状態に維持することにより、より生体内に近い３次元的な状態において細胞を培養する手法も用いることができる。この際、３次元細胞培養中の細胞は、該３次元ネットワークにトラップされており沈殿しないため、振とう、回転操作等を要することなく培養することが可能となる。３次元細胞培養は、自体公知の方法により実施することができる（例えば、ＷＯ２０１４／０１７５１３を参照）。
【００４４】
化合物
以下に詳述される本発明の組成物、培地、各種方法、及び各種剤に用いる化合物の光学活性体は、式（Ｉ）：
【００４５】
【化９】
2020120649.tif 000010
【００４６】
｛式中、Ｘは、単結合、−ＣＨ２ＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、または−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝で示される化合物の光学活性体である。以下、本発明の組成物、培地、方法、剤に用いる化合物の光学活性体またはその塩を総称して、「本発明に用いられる光学活性体」とも称する場合がある。
【００４７】
一態様において、前記式（Ｉ）中のＸが単結合である場合は、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアルキル基（より好ましくは、置換基を有していない炭素数１〜１０のアルキル基、特に好ましくは、オクチル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基（より好ましくは、置換基を有していない炭素数１〜６のアルキル基、特に好ましくは、エチル基）であり、ｎ＝０である。
【００４８】
また、Ｘが−ＣＨ２ＣＯＯ−である場合は、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアルキル基（好ましくは、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基、特に好ましくは、エチル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基（より好ましくは、置換基を有していない炭素数１〜６のアルキル基、特に好ましくは、エチル基）であり、Ｒ３は、水素原子であるか、あるいは、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアルキル基（より好ましくは、置換基を有している炭素数１〜６のアルキル基、特に好ましくは、ベンジル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基（より好ましくは、置換基を有していない炭素数１〜６のアルキル基、特に好ましくは、エチル基）であり、ｎ＝０である。
【００４９】
また、Ｘが−ＣＯＮＨ−である場合は、Ｒ１は、置換基を有していてもよいアリール基（より好ましくは、置換基を有していないアリール基、特に好ましくは、フェニル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基（より好ましくは置換基を有していない炭素数１〜６のアルキル基、特に好ましくは、エチル基）であり、ｎ＝０である。
【００５０】
また、Ｘが−ＮＨＣＯ−である場合は、Ｒ１は、−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり、ここで、Ｙが、単結合である場合は、Ｗは、Ｎ（Ｒ４）（より好ましくは、Ｎ（Ｒ４）であって、Ｒ４が水素原子または炭素数１〜６のアルキル基であり、特に好ましくは、Ｎ（Ｒ４）であって、Ｒ４が、水素原子）であるか、酸素原子であり、Ｚは、単結合または置換基を有していてもよいアルキレン基（より好ましくは、単結合または置換基を有しているアルキレン基、特に好ましくは、メチル基を有するメチレン基）であり、Ａｒは置換基（より好ましくは、ハロゲン原子、水酸基、メチル基、またはメトキシ基）を有していてもよいアリール基（より好ましくは、水酸基を有するアリール基もしくは置換基を有していないアリール基、特に好ましくは、水酸基を有するフェニル基もしくは置換基を有していないフェニル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基（より好ましくは、置換基を有していない炭素数１〜６のアルキル基、特に好ましくは、エチル基）であり、ｎ＝０である。
【００５１】
また、Ｘが−ＮＨＣＯ−、かつ、Ｒ１が−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒ、かつ、Ｙが、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基（より好ましくは、炭素数１〜６のアルキル基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基、特に好ましくはメチル基又はエチル基で置換されたメチレン基）である場合は、Ｗは、Ｎ（Ｒ４）（より好ましくは、Ｎ（Ｒ４）であって、式中Ｒ４が、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基であり、特に好ましくは、Ｎ（Ｒ４）であって、式中Ｒ４が、水素原子）であり、Ｚは、単結合であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基（より好ましくは、置換基を有しているアリール基、特に好ましくは、ハロゲノ基、水酸基、メチル基もしくはエトキシ基を有する、フェニル基またはナフチル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基（より好ましくは、置換基を有していない炭素数１〜６のアルキル基、特に好ましくは、メチル基、エチル基、またはイソプロピル基）であり、ｎ＝０である。
【００５２】
好ましい一態様において、本発明に用いられる光学活性体は、Ｘが、−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ２が、炭素数１〜６のアルキル基であり、ｎが０であり、Ｒ１が、−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり、Ｙが、炭素数１〜６のアルキル基を有するメチレン基であり、Ｗが、Ｎ（Ｒ４）であり、Ｚが、単結合であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基または炭素数１〜６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基（好ましくは、フェニル基）であり、Ｒ体であり得る。また、別の好ましい一態様において、本発明に用いられる光学活性体は、Ｘが、−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ２が、炭素数１〜６のアルキル基であり、ｎが０であり、Ｒ１が、−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり、Ｙが、単結合であり、Ｗが、Ｎ（Ｒ４）であり、Ｒ４が、水素原子であり、Ｚが、炭素数１〜６のアルキル基を有するメチレン基であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基または炭素数１〜６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基であり、Ｒ体であり得る。
【００５３】
特に好ましい一態様において、本発明に用いられる光学活性体は、以下で示される化合物の光学活性体であって、且つ、Ｒ体の光学異性体である。
【００５４】
【化１０】
2020120649.tif 000011
【００５５】
【化１１】
2020120649.tif 000012
【００５６】
【化１２】
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【００５７】
【化１３】
2020120649.tif 000014
【化１４】
2020120649.tif 000015
【００５８】
培地添加用組成物
本発明は、本発明に用いられる光学活性体を有効成分として含む、培地添加用組成物（以下、「本発明の組成物」と称することがある）を提供する。本発明の組成物は、細胞培地、特に３次元細胞培養培地に添加することにより、細胞増殖の促進、スフェア形成の促進、オルガノイド形成の促進、およびＣｙｓｔ形成の促進のいずれかまたはこれらの任意の組合せを達成することができる。
【００５９】
すなわち、本発明の組成物の用途は、具体的には、以下に例示される：
（１）細胞増殖促進；
（２）スフェア形成促進；
（３）オルガノイド形成促進；
（４）Ｃｙｓｔ形成促進；
（５）細胞増殖促進およびスフェア形成促進；
（６）細胞増殖促進およびオルガノイド形成促進；
（７）細胞増殖促進およびＣｙｓｔ形成促進；
（８）スフェア形成促進およびオルガノイド形成促進；
（９）スフェア形成促進およびＣｙｓｔ形成促進；
（１０）オルガノイド形成促進およびＣｙｓｔ形成促進；
（１１）細胞増殖促進、スフェア形成促進およびオルガノイド形成促進；
（１２）細胞増殖促進、スフェア形成促進およびＣｙｓｔ形成促進；
（１３）細胞増殖促進、オルガノイド形成促進およびＣｙｓｔ形成促進；
（１４）スフェア形成促進、オルガノイド形成促進およびＣｙｓｔ形成促進；または、
（１５）細胞増殖促進、スフェア形成促進、オルガノイド形成促進およびＣｙｓｔ形成促進。
【００６０】
本発明の組成物は、有効成分として本発明に用いられる光学活性体を１種、または２種以上を組み合わせて含有していてもよい。
【００６１】
また、本発明の組成物は、本発明に用いられる光学活性体以外のその他の成分を含有していてもよい。本発明の所望の効果を得られる限り特に限定されないが、かかる成分には、例えば、水、生理食塩水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセリン、プロピレングリコール、ブチレングリコール、およびメタノール、エタノール、ブタノール、プロパノール等の各種アルコール、等が含まれ得る。また、本発明の組成物は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。滅菌方法は特に制限はなく、例えば、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、オートクレーブ滅菌、フィルター滅菌等が挙げられる。フィルター滅菌（以下、ろ過滅菌という場合もある）を行う際のフィルター部分の材質は特に制限されないが、例えば、グラスファイバー、ナイロン、ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）、親水性ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）、セルロース混合エステル、セルロースアセテート、ポリテトラフルオロエチレン等が挙げられる。フィルターの細孔の大きさは特に制限されないが、好ましくは、０．１μｍ〜１０μｍ、より好ましくは、０．１μｍ〜１μｍ、最も好ましくは、０．１μｍ〜０．５μｍである。これらの滅菌処理は、当該組成物が固形でも溶液の状態でもよい。
【００６２】
本発明の組成物中の有効成分としての本発明に用いられる光学活性体の配合量は、本発明の組成物を培地（特に、３次元細胞培養培地）に添加した際に、当該培地が、本発明の所望の効果を発揮できる濃度となるものであれば特に限定されない。なお、本発明の所望の効果を発揮できる濃度としては、例えば、本発明に用いられる光学活性体の培地（特に、３次元細胞培養培地）中の濃度の下限値は、通常０．００１μＭ以上、好ましくは０．０１μＭ以上、より好ましくは０．１μＭ以上、さらに好ましくは１μＭ以上、特に好ましくは１０μＭ以上であり得る。また、その濃度の上限値は、通常１００μＭ以下、好ましくは５０μＭ以下、特に好ましくは１０μＭ以下であり得る。
【００６３】
本発明の組成物は、提供時あるいは保存時に任意の形状であり得る。当該組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤のような製剤化された固体、適切な溶媒並びに溶解剤で溶解した溶液あるいは懸濁液のような液体、又は基板や担体に結合させた状態であり得る。製剤化される際の添加物としては、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤；乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニット等の賦形剤；ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤；ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤；脂肪酸エステル等の界面活性剤；グリセリン等の可塑剤等が挙げられる。これらの添加物は上記のものに限定されることはなく、当業者が利用可能であれば自由に選択することができる。
【００６４】
本発明の組成物の培地（特に、３次元細胞培養培地）への添加により、細胞増殖促進等が達成される細胞種としては、所望の効果を得られる限り特に限定されないが、精子や卵子などの生殖細胞、生体を構成する体細胞、正常細胞株、がん細胞株、前駆細胞、幹細胞、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等の細胞種が挙げられる。なお、これらの細胞の由来も特に限定されないが、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハタネズミ、カモノハシ、イルカ、クジラ、イヌ、ネコ、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ゾウ、コモンマーモセット、リスザル、アカゲザル、チンパンジー、ヒト等の哺乳動物由来の細胞が好ましい。また、細胞が由来する組織または臓器も、本発明の所望の効果を得られる限り特に限定されないが、前記組織としては、皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳または神経組織等の組織が挙げられるが、これらに限定されず、また、前記臓器としては、肝臓、肺、腎臓、心臓、膵臓、胃、脾臓、小腸、大腸、生殖器等の臓器が挙げられるが、これらに限定されない。なお、オルガノイド形成の促進を目的とする場合、オルガノイドは小腸由来細胞が好ましい場合がある。また、Ｃｙｓｔ形成の促進を目的とする場合、Ｃｙｓｔは腎臓由来細胞が好ましい場合がある。
【００６５】
なお、正常細胞株としては、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２（マウス胚線維芽細胞）、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＭＤＢＫ（ウシ腎臓由来細胞）、ＭＤＣＫ（イヌ腎臓尿細管上皮細胞）、ＣＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣由来細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎臓上皮由来細胞）、ＮＩＨ３Ｔ３（マウス胎児線維芽細胞）、ＨｅｐａＲＧ（肝細胞、登録商標）、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）、ヒト初代培養肝細胞等が挙げられる。これらの中では、特にＭＤＣＫ、ＨＵＶＥＣ、ＣＨＯ−Ｋ１およびＶｅｒｏ細胞が好ましい。また、がん細胞株の例としては、以下に限定されるものではないが、ヒト乳がん細胞株としてＨＢＣ−４、ＢＳＹ−１、ＢＳＹ−２、ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−７／ＡＤＲ  ＲＥＳ、ＨＳ５７８Ｔ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡ−Ｎ、ＢＴ−５４９、Ｔ４７Ｄ、ヒト子宮頸がん細胞株としてＨｅＬａ、ヒト肺がん細胞株としてＡ５４９、ＥＫＶＸ、ＨＯＰ−６２、ＨＯＰ−９２、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５２２、ＤＭＳ２７３、ＤＭＳ１１４、ヒト大腸がん細胞株としてＣａｃｏ−２、ＣＯＬＯ−２０５、ＨＣＣ−２９９８、ＨＣＴ−１５、ＨＣＴ−１１６、ＨＴ−２９、ＫＭ−１２、ＳＷ−６２０、ＷｉＤｒ、ヒト前立腺がん細胞株としてＤＵ−１４５、ＰＣ−３、ＬＮＣａＰ、ヒト中枢神経系がん細胞株としてＵ２５１、ＳＦ−２９５、ＳＦ−５３９、ＳＦ−２６８、ＳＮＢ−７５、ＳＮＢ−７８、ＳＮＢ−１９、ヒト卵巣がん細胞株としてＯＶＣＡＲ−３、ＯＶＣＡＲ−４、ＯＶＣＡＲ−５、ＯＶＣＡＲ−８、ＳＫＯＶ３、ＩＧＲＯＶ−１、ヒト腎がん細胞株としてＲＸＦ−６３１Ｌ、ＡＣＨＮ、ＵＯ−３１、ＳＮ−１２Ｃ、Ａ４９８、ＣＡＫＩ−１、ＲＸＦ−３９３Ｌ、７８６−０、ＴＫ−１０、ヒト胃がん細胞株としてＭＫＮ４５、ＭＫＮ２８、Ｓｔ−４、ＭＫＮ−１、ＭＫＮ−７、ＭＫＮ−７４、皮膚がん細胞株としてＬＯＸ−ＩＭＶＩ、ＬＯＸ、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ、ＳＫ−ＭＥＬ−２、ＳＫ−ＭＥＬ−５、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、ＵＡＣＣ−６２、ＵＡＣＣ−２５７、Ｍ１４、白血病細胞株としてＣＣＲＦ−ＣＲＭ、Ｋ５６２、ＭＯＬＴ−４、ＨＬ−６０ＴBRＰＭＩ８２２６、ＳＲ、ＵＴ７／ＴＰＯ、Ｊｕｒｋａｔ等が挙げられる。これらの中では、ヒト卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３、ヒト子宮頸がん細胞株ＨｅＬａ、ヒト悪性黒色腫由来細胞株Ａ３７５、ヒト上皮様細胞がん由来細胞株Ａ４３１、ヒト胃腺がん由来細胞株ＡＧＳ、ヒト前立腺がん由来細胞株ＬＮＣａｐ ｃｌｏｎｅ ＦＧＣ、ヒト結腸腺がん由来細胞株ＨＣＴ１１６、ヒト肺胞基底上皮腺がん由来細胞株Ａ５４９、およびヒト前立腺がん由来細胞ＤＵ１４５が特に好ましい。さらに、幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、がん幹細胞、毛包幹細胞などが挙げられる。多能性幹細胞としては、前記幹細胞のうち、ＥＳ細胞、胚性生殖幹細胞、ｉＰＳ細胞が挙げられる。前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。幹細胞としては、ｉＰＳ細胞および間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が特に好ましい。
【００６６】
一態様において、本発明の組成物を添加した３次元細胞培養培地を用いてＭＳＣ等の幹細胞の培養を行う場合、該細胞の形質（例、未分化性）を維持したまま、その細胞増殖を促進することができる。ＭＳＣの未分化性の維持は、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）にて細胞表面マーカーの発現を解析することにより確認でき（例えば、ＷＯ２０１６／１３６９８６を参照）、ＭＳＣの細胞表面マーカーとしてはＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５などが陽性であることが挙げられる。従って、本発明は、ＭＳＣ等の幹細胞の大量生産に好適に用いることもできる。
【００６７】
本明細書において「本発明の組成物」との語は、「本発明の剤」または「本発明の培地添加用剤」との語に置き換えることができる。
【００６８】
培地
本発明は、本発明に用いられる光学活性体または本発明の組成物を含む、培地（以下、「本発明の培地」と称することがある）を提供する。本発明の培地を用いることにより、細胞増殖の促進、スフェア形成の促進、オルガノイド形成の促進、およびＣｙｓｔ形成の促進のいずれかまたはこれらの任意の組合せを達成することができる。なお、本発明の培地は、特に３次元細胞培養培地であることが好ましい。
【００６９】
本発明の培地に有効成分として含まれる本発明に用いられる光学活性体の濃度は、本発明の所望の効果を得られる限り特に限定されないが、例えば、その濃度の下限値は、通常０．００１μＭ以上、好ましくは０．０１μＭ以上、より好ましくは０．１μＭ以上、さらに好ましくは１μＭ以上、特に好ましくは１０μＭ以上であり得る。また、その濃度の上限値は、通常１００μＭ以下、好ましくは５０μＭ以下、特に好ましくは１０μＭ以下であり得る。
【００７０】
本発明の培地は、本発明に用いられる光学活性体または本発明の組成物が配合されている以外は、公知の培地の組成と同様とすることができる。
【００７１】
一態様において、本発明の培地は、市販される培地（特に３次元細胞培養培地）に、本発明に用いられる光学活性体または組成物を添加することにより調製することができる。本発明に用いられる光学活性体または本発明の組成物を添加することにより本発明の培地とし得る市販の培地としては、所望の効果を得られる限り特に限定されないが、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’s ５Ａ ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’s Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ（ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’s Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’s Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’s Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’s培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（インビトロジェン社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ １０（ケンブレックス社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ １５（ケンブレックス社製）、ＨＰＧＭ（ケンブレックス社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、ＱＢＳＦ−６０（クオリティバイオロジカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣＳＦＭ（インビトロジェン社製）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（登録商標）培地（ギブコ社製）、ｍＴｅＳＲ１培地（ステムセルテクノロジー社製）、ｍＴｅＳＲ２培地（ステムセルテクノロジー社製）、リプロＦＦ（リプロセル社製）、リプロＦＦ２（リプロセル社製）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社製）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０３Ｎ（味の素社製）、ＰＳＧｒｏ ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ培地（システムバイオサイエンス社製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）培地（バイオロジカルインダストリーズ社製）、ＣＳＴＩ−７培地（細胞科学研究所社製）、ＭｅｓｅｎＰＲＯ ＲＳ培地（ギブコ社製）、ＭＦ−Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）、間葉系幹細胞用培地（プロモセル社製）、Ｓｆ−９００ＩＩ（インビトロジェン社製）、Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ（インビトロジェン社製）等の培地が挙げられる。また、これらの培地に、脱アシル化ジェランガム等の多糖類を添加して３次元細胞培養培地化した培地を用いることができる。このような３次元細胞培養培地としては、例えば、ＦＣｅＭ（登録商標）（和光純薬工業株式会社製）が挙げられるが、これに限定されない。
【００７２】
また、上記の培地に、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、各種アミノ酸、各種ビタミン、抗生物質、血清、脂肪酸、糖、細胞増殖因子、分化誘導因子、細胞接着因子、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモン、レクチン、細胞外マトリックス、生理活性物質等を目的に応じて添加してもよい。
【００７３】
本発明の培地における細胞の培養（特に３次元細胞培養）は、細胞培養に一般的に用いられるシャーレ、フラスコ、プラスチックバック、テフロン（登録商標）バック、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等の培養容器を用いて実施することができる。培養する（接着性の）細胞が、培養容器へ接着しないよう、これらの培養容器は細胞低接着性であることが望ましい。細胞非接着性の培養容器としては、培養容器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないもの、あるいは培養容器の表面が、細胞との接着性を低減させる目的で人工的に処理されているものを使用できる。このような容器の例としては、スミロンセルタイトプレート（住友ベークライト株式会社製）、ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）プレート（住友ベークライト株式会社製）、超低接着表面プレート（コーニング社製）、ヌンクロンスフェラプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）等が挙げられるが、これに限定されない。
【００７４】
細胞増殖促進方法、スフェア形成促進方法、オルガノイド形成促進方法、およびＣｙｓｔ形成促進方法
本発明は、本発明に用いられる光学活性体または本発明の組成物を培地へ添加することを含む、細胞増殖を促進する方法、スフェア形成を促進する方法、オルガノイド形成を促進する方法、またはＣｙｓｔ形成を促進する方法（以下、これらをまとめて、「本発明の方法」と称することがある）を提供する。
【００７５】
本発明の方法において用いられる培地は、所望の効果を得られる限り特に限定されない。好ましくは、３次元細胞培養培地である。また、本発明の方法における細胞培養条件（例えば、温度、二酸化炭素濃度、培養期間等）は自体公知の方法を用いればよく、あるいは、目的に応じて、適宜改変してもよい。例えば、細胞を培養する際の温度は、動物細胞であれば通常２５℃〜３９℃、好ましくは３３℃〜３９℃（例、３７℃）である。二酸化炭素濃度は、通常、培養の雰囲気中、４体積％〜１０体積％であり、４体積％〜６体積％が好ましい。培養期間は、通常１乃至３５日間であるが、培養の目的に合わせて適宜設定すればよい。
【００７６】
細胞凝集塊（スフェア）を形成させる方法は、特に制限は無く、当業者が適宜選択することができる。その例としては、細胞非接着表面を有する容器を用いた方法、ハンギングドロップ法、旋回培養法、３次元スキャフォールド法、遠心法、電場や磁場による凝集を用いた方法等が挙げられる。例えば、細胞非接着表面を有する容器を用いた方法については、目的の細胞を、細胞接着を阻害する表面処理を施した培養容器中にて培養し、スフェアを形成させることができる。この細胞非接着性培養容器を使用する場合は、まず、目的の細胞を採取した後にその細胞浮遊液を調製し、当該培養容器中に播種して培養を行なう。一週間ほど培養を続けると、細胞は自発的にスフェアを形成する。このとき用いる細胞非接着性表面としては、一般に用いられるシャーレなどの培養容器の表面に、細胞接着を阻害する物質をコートしたものなどを用いることができる。このような物質としては、アガロース、寒天、ポリ−ＨＥＭＡ（ポリ−（２−ハイドロキシ−エチルメタクリレート）２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）と他のモノマー（例えばブチルメタクリレート等）との共重合体、ポリ（２−メトキシメチルアクリレート）、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、メビオールジェル（登録商標）などが挙げられるが、細胞毒性がなければ、これらに限定されるものではない。
【００７７】
また、細胞凝集塊（スフェア）を形成させる方法として、ＮＡＴＵＲＥ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．２８，ＮＯ．４，ＡＰＲＩＬ  ２０１０，３６１−３６６、ＮＡＴＵＲＥ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，ＶＯＬ．６，ＮＯ．５，２０１１，６８９−７００、ＮＡＴＵＲＥ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，ＶＯＬ．６，ＮＯ．５，２０１１，５７２−５７９、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７，２０１１，９７−１１１、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｖ  ａｎｄ  Ｒｅｐ，６，２０１０，２４８−２５９等に記載された方法を用いることもできる。
【００７８】
また、スフェアを形成させる培養の際に用いる培地中に、スフェアの形成を早める、またはその維持を促進する成分を含有させることもできる。このような効果を有する成分の例としては、ジメチルスルホキシド、スーパーオキシドジスムターゼ、セルロプラスミン、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル、トコフェロール、フラボノイド、尿酸、ビリルビン、含セレン化合物、トランスフェリン、不飽和脂肪酸、アルブミン、テオフィリン、フォルスコリン、グルカゴン、ジブチルリルｃＡＭＰなどを挙げることができる。含セレン化合物としては、亜セレン酸ナトリウム、セレン酸ナトリウム、ジメチルセレニド、セレン化水素、セレノメチオニン、Ｓｅ− メチルセレノシステイン、セレノシスタチオニン、セレノシステイン、セレノホモシステイン、アデノシン−５’−ホスホセレン酸、Ｓｅ−アデノシルセレノメチオニン、Ｙ−２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）、Ｈ−１１５２、Ｗｆ−５３６等のＲＯＣＫ阻害剤が挙げられる。また、目的とするサイズの均一な細胞凝集塊を得るためには、使用する細胞非付着性培養容器上に、目的とする細胞凝集塊と同一径の複数の凹みを導入することもできる。これらの凹みが互いに接しているか、あるいは目的とする細胞凝集塊の直径の範囲内であれば、細胞を播種した際、播種した細胞は凹みと凹みの間で細胞凝集塊を形成することなく、確実に凹みの中でその容積に応じた大きさの細胞凝集塊を形成し、均一サイズの細胞凝集塊集団を得ることができる。この際の凹みの形状としては半球または円錐上が好ましい。
【００７９】
あるいは、細胞接着性を有する支持体を基にスフェアを形成させることもできる。この様な支持体の例としては、コラーゲン、ポリロタキサン、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ハイドロゲル等を挙げることができる。
【００８０】
また、フィーダー細胞と共培養することにより、スフェアを形成させることもできる。スフェア形成を促進させるためのフィーダー細胞としては、如何なる接着性細胞でも用いることが可能であるが、好適には各種細胞に応じたフィーダー細胞が望ましい。限定されるものではないが、例えば肝臓や軟骨由来の細胞のスフェアを形成させる場合、そのフィーダー細胞の例としてはＣＯＳ−１細胞や血管内皮細胞が好適な細胞種として挙げられる。
【００８１】
また、スフェアを形成させる方法としてハンギングドロップ法を選択することもできる。ハンギングドロップ法としては、例えば細胞懸濁液の液滴（容量として１０〜５０μＬ程度）を培養容器の蓋等の天井側に点着し、載せた液滴がぶら下がるように逆さの状態で培養する方法が挙げられる。このように培養することで、細胞は平面との接触により受ける影響が最小限となり、液滴の下部においてスフェアを形成する。このような液滴は、ＧｒａｖｉｔｙＰＬＵＳ Ｐｌａｔｅ（パーキンエルマー社製）の様な特殊な培養容器を用いて調製することもできる。具体的には、１００〜１０００００個、好ましくは２００〜１００００個、より好ましくは５００〜１００００個の細胞を含む液滴を用いてスフェアを調製することができる。スフェアを形成させるためには、６〜４８時間培養することが好ましい。
【００８２】
スフェアの大きさは、細胞種及び培養期間によって異なり特に限定されないが、球形状または楕円球形状であるとした際には２０μｍ乃至１０００μｍ、好ましくは４０μｍ乃至５００μｍ、より好ましくは５０μｍ乃至３００μｍ、最も好ましくは８０μｍ乃至２００μｍの直径を有する。
【００８３】
このようなスフェアは、そのまま静置培養を続けることでも１０日以上、好ましくは１３日以上、さらに好ましくは３０日以上の期間において増殖能を保持し得るが、さらに静置培養中に定期的に機械的分割を行うことで、またはさらに単細胞化処理と凝集を行うことで、実質的に無期限に増殖能を保持し得る。
【００８４】
スフェアの培養に用いられる培養容器は、一般的に動物細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、細胞培養フラスコ、スピナーフラスコ、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル、ＥＺＳＰＨＥＲＥ（ＡＧＣテクノグラス社製）、スミロンセルタイトプレート（住友ベークライト社製）等が挙げられる。
【００８５】
これらの培養容器のうち、多数の抗がん剤の評価、医薬品候補化合物又は医薬品の評価を実施する際には、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレートが好適に用いられる。これらのプレートのウェル底形状は、特に制限されないが、平底、Ｕ字型、Ｖ字型のものを用いることが可能であり、好ましくはＵ字型のものが用いられる。これらの培養器材の材質は特に制限されないが、例えば、ガラス、ポリ塩化ビニル、セルロース系ポリマー、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン等のプラスチック等が挙げられる。
【００８６】
包埋培養を行う際に用いられる培地は、細胞接着因子を含むことが可能であり、その例としては、マトリゲル（登録商標）、Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシン、セレクチン、ヒアルロン酸、フィブリン等が挙げられる。これらの細胞接着因子は、２種類以上を組み合わせて添加することもできる。また更に、包埋培養に用いられる培地に対して寒天、グァーガム、タマリンドガム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、タマリンドガム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アガロース、タマリンドシードガム、プルラン等の増粘剤を更に混合することができる。これらの増粘剤は、２種類以上を組み合わせて添加することもできる。
【００８７】
オルガノイド（幹細胞または前駆細胞を３次元的な環境下で生体外にて培養し、形成されたミニ臓器）またはＣｙｓｔ（上皮細胞により形成される管腔構造）を形成させる方法は、特に制限は無く、当業者が適宜選択することができる。その例としては、上記の包埋培養を用いた方法が挙げられる。具体的には、目的の細胞または組織を、上記の細胞接着因子を含む包埋培養用培地中にて培養し、オルガノイドまたはＣｙｓｔを形成させることができる。例えば、目的の細胞または組織を採取した後にその浮遊液を調製し、包埋培養用の培地中に播種して培養を行なう。３〜１４日間培養を続けると、細胞は自発的にオルガノイドまたはＣｙｓｔを形成する。
【００８８】
本発明の方法において用いられる培地（特に３次元細胞培養培地）は、本発明の培地を用いればよい。
【００８９】
本発明の方法における、培地中の本発明に用いられる光学活性体または本発明の組成物の濃度および細胞種等は、「培地添加用組成物」において説明したものと同様である。
【００９０】
以下の実施例において本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
【実施例】
【００９１】
以下に、各化合物の合成方法および構造式を示す。尚、１Ｈ−ＮＭＲはプロトン核磁気共鳴スペクトラムを表し、２７０ＭＨｚまたは４００ＭＨｚにて、重ジメチルスルホキシド中で測定した。ケミカルシフト値は、重ジメチルスルホキシドの値を２．４９ｐｐｍとして記載した。また、ｓとの記載はシングレットを表し、以下同様にｂｒｓはブロードシングレットを、ｄはダブレットを、ｄｄはダブルダブレットを、ｔはトリプレットを、ｑはカルテットを、ｍはマルチプレットをそれぞれ表す。
【００９２】
［合成例１］ケトンおよびヒドラジドを原料とした化合物の合成
（材料と方法）
以下に図示されるケトン４種［１−（２，４−ジヒドロキシ−３−メチルフェニル）プロパン−１−オン（以下、ｋ−１と略称する。）、１−（２，４−ジヒドロキシ−３−メチルフェニル）エタン−１−オン（以下、ｋ−２と略称する。）、１−（２，４，６−トリヒドロキシ−３−メチルフェニル）プロパン−１−オン（以下、ｋ−３と略称する。）、１−（２，４−ジヒドロキシ−３−メチルフェニル）−３−メチルブタン−１−オン（以下、ｋ−５と略称する。）］及びヒドラジド１０種［２−（フェニルアミノ）アセトヒドラジド（以下、Ｈ−１と略称する。）、２−（ｏ−トリルアミノ）アセトヒドラジド（以下、Ｈ−２と略称する。）、２−（ｍ−トリルアミノ）アセトヒドラジド（以下、Ｈ−３と略称する。）、２−（ｐ−トリルアミノ）アセトヒドラジド（以下、Ｈ−４と略称する。）、２−［（４−フルオロフェニル）アミノ］アセトヒドラジド（以下、Ｈ−５と略称する。）、２−（ナフタレン−１−イルアミノ）アセトヒドラジド（以下、Ｈ−６と略称する。）、２−（フェニルアミノ）ブタンヒドラジド（以下、Ｈ−７と略称する。）、２−［（４−エトキシフェニル）アミノ］アセトヒドラジド（以下、Ｈ−９と略称する。）、２−［（４−ヒドロキシフェニル）アミノ］アセトヒドラジド（以下、Ｄ−２と略称する。）、２−［（２−ヒドロキシフェニル）アミノ］アセトヒドラジド（以下、Ｄ−４と略称する。）］より化合物を合成した。
【００９３】
【化１５】
2020120649.tif 000016
【００９４】
合成した３４化合物を第１表に記載する。表中、Ｍｅとの記載はメチルを表し、以下同様に、Ｅｔとの記載はエチルを、ｎ−Ｐｒはノルマルプロピルを、ｉ−Ｂｕはイソブチルを、Ｐｈはフェニルを、Ｎａｐｈはナフチルをそれぞれ表す。（Ｒ３）ｎにおける「−」との記載は無置換を表し、構造式に記載された番号は、（Ｒ３）ｎの置換位置を表す。
［第１表］
【００９５】
【化１６】
2020120649.tif 000017
【００９６】
【表１】
2020120649.tif 000018
【００９７】
第１表に記載した化合物の１Ｈ−ＮＭＲの測定結果を第２表に記す。
【００９８】
［第２表］
【００９９】
【表２−１】
2020120649.tif 000019
【０１００】
【表２−２】
2020120649.tif 000020
【０１０１】
【表２−３】
2020120649.tif 000021
【０１０２】
【表２−４】
2020120649.tif 000022
【０１０３】
以下に各化合物及び合成中間体の化合物の合成法を記載する。
【０１０４】
４種のケトンのうち、ｋ−１、ｋ−２およびｋ−５については公知の方法により合成が可能である（Sum TH et al., Tetrahedron. 2015 Jul 1;71(26-27): 4557-4564.）。また、１０種のヒドラジドのうち、Ｈ−１、Ｈ−２、Ｈ−３、Ｈ−４、Ｈ−５、Ｈ−６、Ｈ−９、Ｄ−２及びＤ−４は公知の方法により合成が可能である（Samal RP et al., Chem Biol Drug Des. 2013 Jun;81(6):715-29.等）。従って、以下、ｋ−３およびＨ−７の合成法につき詳述する。
【０１０５】
［ｋ−３の合成］
２，４，６−トリヒドロキシベンズアルデヒド(２．２２ｇ、１４．４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４０ｍＬ）に溶解させ、氷冷下ＮａＢＨ３ＣＮ（２．７ｇ、４３ｍｍｏｌ）、酢酸（８ｍＬ）を加えて室温で２時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチル（５０ｍＬ）で希釈し、水（５０ｍＬｘ２）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル５０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２０／８０〜５０／５０）で精製し、中間化合物（１．２０ｇ、８．５６ｍｍｏｌ、収率５９％）を白色固体として得た。
【０１０６】
上記のようにして得られた中間化合物（１．０４ｇ，７．４２ｍｍｏｌ）を、プロピオン酸（７ｍＬ）に懸濁させ、プロピオン酸無水物（１．１５ｍＬ，８．９０ｍｍｏｌ）、ＢＦ３−Ｅｔ２Ｏ（１．１２ｍＬ、８．９０ｍｍｏｌ）を加えて１３０℃で１時間加熱還流した。放冷後、反応溶液を酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈し、水(１００ｍＬｘ３）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(１００ｍＬｘ２）、ブライン（１００ｍＬ）で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１００ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜４５／５５）で精製し、得られた固体をヘキサンで洗浄してｋ−３（０．４１ｇ）を薄橙色固体として得た。ろ液を減圧下濃縮し、得られた残渣を再度中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜５０／５０）で精製し、ｋ−３（０．７０ｇ）を薄橙色固体として得た。以上まとめて、ｋ−３（１．１１ｇ、５．６６ｍｍｏｌ、収率７６％）を薄橙色固体として得た。
【０１０７】
［Ｈ−７の合成］
２−ブロモ酪酸メチル（８．０ｇ、４４ｍｍｏｌ）、アニリン(８．０ｍＬ、８８ｍｍｏｌ）をトルエン(１０ｍＬ）に溶解させ、５時間加熱還流した。放冷後、反応溶液を水(３０ｍＬ）、２Ｍ塩酸（２５ｍＬ）、水（３０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）、ブライン（３０ｍＬ）で順次洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１００ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１／９９〜１０／９０）で精製し、中間化合物（５．１１ｇ、２６．４ｍｍｏｌ、収率６０％）を黄色液体として得た。
上記のようにして得られた中間化合物（５．１１ｇ、２６．４ｍｍｏｌ）をメタノール(２６ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン・１水和物（１２．８ｍＬ、２６４ｍｍｏｌ）を加えて室温で４．５時間撹拌した。水（１５０ｍＬ）を加えて、塩化メチレン（３０ｍＬｘ５）で抽出した。有機層を飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた固体をＩＰＥで洗浄し、Ｈ−７（４．６０ｇ、２３．８ｍｍｏｌ、収率９０％）を白色固体として得た。
【０１０８】
［ｋ−１：Ｈ−１の合成］
ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５５ｍｍｏｌ）、Ｈ−１（１１０ｍｇ、０．６６６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ、１００℃で１４時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１１ｍＬ）を加え、再度１００℃で撹拌後、熱時ろ過してｋ−１：Ｈ−１（７０．１ｍｇ、０．２１４ｍｍｏｌ、収率３９％）を薄黄色固体として得た。
【０１０９】
［ｋ−１：Ｈ−２の合成］
ｋ−１（５０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、Ｈ−２（６９ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．５５ｍＬ）に溶解させ１００℃で１８時間撹拌した。放冷後、蒸留水（６ｍＬ）を加えてデカンテーションし、残った固体を塩化メチレン、酢酸エチルで順次洗浄した。得られた残渣をＤＭＳＯ（０．２ｍＬ）に溶解させ、水を加えて析出した固体をメタノールで洗浄し、ｋ−１：Ｈ−２（１９．６ｍｇ、０．０５７４ｍｍｏｌ、収率２１％）を薄橙色固体として得た。
【０１１０】
［ｋ−１：Ｈ−３の合成］
ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５５ｍｍｏｌ）、Ｈ−３（１１９ｍｇ、０．６６６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１４時間撹拌した。同温で蒸留水（１１ｍＬ）を加えて放冷後、析出した固体をろ取、メタノールで洗浄してｋ−１：Ｈ−３（９８．９ｍｇ、０．２９０ｍｍｏｌ、収率５２％）を白色固体として得た。
【０１１１】
［ｋ−１：Ｈ−４の合成］
ｋ−１（５０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、Ｈ−４（６５ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．５５ｍＬ）に溶解させ１００℃で１９時間撹拌した。放冷後、蒸留水（６ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取、酢酸エチルで洗浄してｋ−１：Ｈ−４（２８．６ｍｇ、０．０８３８ｍｍｏｌ、収率３０％）を薄黄色固体として得た。
【０１１２】
［ｋ−１：Ｈ−５の合成］
ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５５ｍｍｏｌ）、Ｈ−５（１２２ｍｇ、０．６６６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１４時間撹拌した。同温で蒸留水（１１ｍＬ）を加えて放冷後、析出した固体をろ取、メタノールで洗浄してｋ−１：Ｈ−５（５５．６ｍｇ、０．１６１ｍｍｏｌ、収率２９％）を薄黄色固体として得た。
【０１１３】
［ｋ−１：Ｈ−６の合成］
ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５５ｍｍｏｌ）、Ｈ−６（１４３ｍｇ、０．６６６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１４時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１１ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取、塩化メチレンで洗浄してｋ−１：Ｈ−６（８６．５ｍｇ、０．２２９ｍｍｏｌ、収率４１％）を茶色固体として得た。
【０１１４】
［ｋ−１：Ｈ−７の合成］
ｋ−１（５０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、Ｈ−７（５４ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．５５ｍＬ）に溶解させ１００℃で１７時間撹拌した。放冷後、蒸留水（６ｍＬ）を加えてデカンテーションし、残渣を塩化メチレン（０．５ｍＬ）に溶解させた。ヘキサン（０．５ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取してｋ−１：Ｈ−７（５６．８ｍｇ、０．１６０ｍｍｏｌ、収率５７％）を白色固体として得た。
【０１１５】
［ｋ−１：Ｈ−９の合成］
ｋ−１（１５０ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）、Ｈ−９（２２６ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．５５ｍＬ）に懸濁させ１００℃で１７時間撹拌した。放冷後、蒸留水（２０ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜６０／４０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ−１：Ｈ−９（４０．２ｍｇ、０．１０８ｍｍｏｌ、収率１３％）を白色固体として得た。
【０１１６】
［ｋ−２：Ｈ−１の合成］
ｋ−２（８０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ−１（９５．４ｍｇ、０．５７８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．０ｍＬ）に溶解させ１００℃で１５時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取、塩化メチレンで洗浄してｋ−２：Ｈ−１（８０．４ｍｇ、０．２５７ｍｍｏｌ、収率５３％）を黄色固体として得た。
【０１１７】
［ｋ−２：Ｈ−２の合成］
ｋ−２（８０ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ−２（１１２ｍｇ、０．６２５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１９時間撹拌した。放冷後、蒸留水（３０ｍＬ）、酢酸エチル（３０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜８０／２０）で精製してｋ−２：Ｈ−２（３４ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、収率２１％）を薄黄色固体として得た。
【０１１８】
［ｋ−２：Ｈ−３の合成］
ｋ−２（８０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ−３（１０４ｍｇ、０．５７８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１５時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を塩化メチレン（３ｍＬ）に溶解させ、ヘキサン（３ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取した。得られた固体を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５０／５０〜８０／２０）で精製してｋ−２：Ｈ−３（４６．９ｍｇ、０．１４３ｍｍｏｌ、収率３０％）を薄黄色固体として得た。
【０１１９】
［ｋ−２：Ｈ−４の合成］
ｋ−２（８０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ−４（１１２ｍｇ、０．６２５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１９時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えてデカンテーションし、残渣を塩化メチレンで洗浄してｋ−２：Ｈ−４（５８．７ｍｇ、０．１７９ｍｍｏｌ、収率３７％）を薄黄色固体として得た。
【０１２０】
［ｋ−２：Ｈ−５の合成］
ｋ−２（８０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ−５（１０６ｍｇ、０．５７８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１５時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を塩化メチレン（３ｍＬ）に溶解させ、ヘキサン（１ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取した。得られた固体を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５０／５０〜８０／２０）で精製してｋ−２：Ｈ−５（３６．６ｍｇ、０．１１０ｍｍｏｌ、収率２３％）を白色固体として得た。
【０１２１】
［ｋ−２：Ｈ−６の合成］
ｋ−２（１００ｍｇ、０．６０２ｍｍｏｌ）、Ｈ−６（１５５ｍｇ、０．７２２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１５時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を塩化メチレンで洗浄してｋ−２：Ｈ−６（５９．３ｍｇ、０．１６３ｍｍｏｌ、収率２７％）を薄茶色固体として得た。
【０１２２】
［ｋ−２：Ｈ−７の合成］
ｋ−２（８０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ−７（１２１ｍｇ、０．６２６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．５５ｍＬ）に溶解させ１００℃で１７時間撹拌した。放冷後、蒸留水（２０ｍＬ）、酢酸エチル（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５〜５０／５０）で精製してｋ−２：Ｈ−７（１０９ｍｇ、０．３１９ｍｍｏｌ、収率６６％）を薄黄色固体として得た。
【０１２３】
［ｋ−２：Ｈ−９の合成］
ｋ−２（１００ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）、Ｈ−９（１６４ｍｇ，０．７８４ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．２ｍＬ）に懸濁させ１００℃で１８時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１２ｍＬ）、酢酸エチル（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜６０／４０）で精製し、得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ−２：Ｈ−９（６３．１ｍｇ、０．１７７ｍｍｏｌ、収率３０％）を薄黄色固体として得た。
【０１２４】
［ｋ−３：Ｈ−１の合成］
ｋ−３（２００ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）、Ｈ−１（２５３ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２．０ｍＬ）に溶解させ１００℃で３日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０〜７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ−３：Ｈ−１（２５．０ｍｇ，０．０７２８ｍｍｏｌ、収率７．１％）を薄茶色固体として得た。
【０１２５】
［ｋ−３：Ｈ−２の合成］
ｋ−３（２００ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）、Ｈ−２（２３７ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、メタノールで洗浄した。得られた固体を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０〜７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ−３：Ｈ−２（１０．３ｍｇ、０．０２８８ｍｍｏｌ、収率２．８％）を薄茶色固体として得た。
【０１２６】
［ｋ−３：Ｈ−３の合成］
ｋ−３（２００ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）、Ｈ−３（２１９ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で５日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０〜７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ−３：Ｈ−３（１７．９ｍｇ、０．０５０１ｍｍｏｌ、収率４．９％）を薄茶色固体として得た。
【０１２７】
［ｋ−３：Ｈ−４の合成］
ｋ−３（２００ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）、Ｈ−４（２３７ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０〜７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ−３：Ｈ−４（１７．９ｍｇ、０．０５０１ｍｍｏｌ、収率４．９％）を薄茶色固体として得た。
【０１２８】
［ｋ−３：Ｈ−５の合成］
ｋ−３（２００ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）、Ｈ−５（２２４ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で６日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を塩化メチレン（３ｍＬ）に溶解させ、ヘキサン（１ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０〜７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ−３：Ｈ−５（１３．７ｍｇ、０．０３７９ｍｍｏｌ、収率３．７％）を薄茶色固体として得た。
【０１２９】
［ｋ−３：Ｈ−６の合成］
ｋ−３（１００ｍｇ、０．５１０ｍｍｏｌ）、Ｈ−６（１２１ｍｇ、０．５６１ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０〜７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ−３：Ｈ−６（１７．０ｍｇ、０．０４３２ｍｍｏｌ、収率８．５％）を橙色固体として得た。
【０１３０】
［ｋ−３：Ｈ−７の合成］
ｋ−３（２００ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）、Ｈ−７（２５６ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で３日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０〜７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄しｋ−３：Ｈ−７（２８．３ｍｇ、０．７６２ｍｍｏｌ、収率７．５％）を白色固体として得た。
【０１３１】
［ｋ−３：Ｈ−９の合成］
ｋ−３（２００ｍｇ，１．０２ｍｍｏｌ）、Ｈ−９（２７７ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えて析出した固体をろ別し、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０〜７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ−３：Ｈ−９（１１．２ｍｇ、０．０２８９ｍｍｏｌ、収率２．８％）を薄茶色固体として得た。
【０１３２】
［ｋ−５：Ｈ−１の合成］
ｋ−５（１００ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ−１（９５．２ｍｇ、０．５７６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、塩化メチレン、メタノールで順次洗浄してｋ−５：Ｈ−１（３８．１ｍｇ、０．１０７ｍｍｏｌ、収率２２％）を黄色固体として得た。
【０１３３】
［ｋ−５：Ｈ−２の合成］
ｋ−５（１００ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ−２（１１２ｍｇ、０．６２５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で３日撹拌した。蒸留水（１０ｍＬ）を加えてデカンテーションし、残渣を塩化メチレン（２ｍＬ）に溶解させ、芒硝乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣に塩化メチレン（１ｍＬ）を加え、超音波に晒して析出した固体をろ取してｋ−５：Ｈ−２（１８．６ｍｇ、０．０５０３ｍｍｏｌ、収率１０％）を黄色固体として得た。
【０１３４】
［ｋ−５：Ｈ−３の合成］
ｋ−５（１００ｍｇ、０．４８０ｍｍｏｌ）、Ｈ−３（１０３ｍｇ、０．５７６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、塩化メチレンで洗浄してｋ−５：Ｈ−３（４４．６ｍｇ、０．１２１ｍｍｏｌ、収率２５％）を黄色固体として得た。
【０１３５】
［ｋ−５：Ｈ−４の合成］
ｋ−５（１００ｍｇ，０．４８０ｍｍｏｌ）、Ｈ−４（１１２ｍｇ，０．６２５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で３日撹拌した。蒸留水（１０ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、塩化メチレンで洗浄してｋ−５：Ｈ−４（４４．４ｍｇ、０．１２０ｍｍｏｌ、収率２５％）を黄色固体として得た。
【０１３６】
［ｋ−５：Ｈ−５の合成］
ｋ−５（１００ｍｇ、０．４８０ｍｍｏｌ）、Ｈ−５（１０６ｍｇ、０．５７６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取してｋ−５：Ｈ−５（３７．４ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ、収率２１％）を黄色固体として得た。
【０１３７】
［ｋ−５：Ｈ−６の合成］
ｋ−５（１００ｍｇ、０．４８０ｍｍｏｌ）、Ｈ−６（１２４ｍｇ、０．５７６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で５日撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２０／８０〜５０／５０）で精製した。得られた固体をメタノールで洗浄してｋ−５：Ｈ−６（２８．１ｍｇ、０．０６９３ｍｍｏｌ、収率１４％）を薄黄色固体として得た。
【０１３８】
［ｋ−５：Ｈ−７の合成］
ｋ−５（１００ｍｇ、０．４８０ｍｍｏｌ）、Ｈ−７（１２１ｍｇ、０．６２６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、酢酸エチル、塩化メチレン、メタノールで順次洗浄してｋ−５：Ｈ−７（４３．６ｍｇ、０．１１４ｍｍｏｌ、収率２４％）を白色固体として得た。
【０１３９】
［ｋ−５：Ｈ−９の合成］
ｋ−５（１５０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、Ｈ−９（１９６ｍｇ、０．９３７ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．４ｍＬ）に懸濁させ１００℃で３日撹拌した。放冷後、蒸留水（１２ｍＬ）、塩化メチレン（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜５０／５０）で精製しｋ−５：Ｈ−９（７２．０ｍｇ、０．１８０ｍｍｏｌ、収率２５％）を薄黄色固体として得た。
【０１４０】
また、化合物番号ｋ−１：Ｄ−２及びｋ−１：Ｄ−４ついても、上記の合成法に準じた方法により合成することができる。
【０１４１】
［合成例２］ｋ−１：Ａ−１の合成
【０１４２】
【化１７】
2020120649.tif 000023
【０１４３】
ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）、グリシンエチル塩酸塩(Ａ−１）（１００ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、酢酸ナトリウム（６４ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で２時間撹拌した。放冷後、水（２０ｍＬ）、酢酸エチル（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜５０／５０）で精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄してｋ−１：Ａ−１（２１．９ｍｇ、０．０８２５ｍｍｏｌ、収率１５％）を黄色固体として得た。
【０１４４】
1H-NMR(270MHz);δ9.69(s, 1H), 7.32(d, J=8.1Hz, 1H), 6.30(d, J=10.8Hz, 1H), 5.76(s, 1H), 4.48(s, 2H), 4.19(q, J=8.1Hz, 2H), 2.67(q, J=8.1Hz, 2H), 1.94(s, 3H), 1.24(t, J=8.1Hz, 3H), 1.08(t, J=8.1Hz, 3H).
【０１４５】
［合成例３］ｋ−１：Ａ−２の合成
【０１４６】
【化１８】
2020120649.tif 000024
【０１４７】
ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）、グリシンベンジルｐ−トルエンスルホナート(Ａ−２）（２４３ｍｇ、０．７２１ｍｍｏｌ）、酢酸ナトリウム（６４ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で２時間撹拌した。放冷後、水（２０ｍＬ）、酢酸エチル（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５〜５０／５０）で精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄してｋ−１：Ａ−２（２５．０ｍｇ、０．０７６４ｍｍｏｌ、収率１４％）を黄色固体として得た。
【０１４８】
1H-NMR(270MHz);δ9.69(s, 1H), 7.45-7.35 (m, 6H), 7.32(d, J=10.8Hz, 1H), 6.31(d, J=10.8Hz, 1H), 5.23(s, 2H), 4.56(s, 2H), 2.70(q, J=8.1Hz, 2H), 1.94(s, 3H), 1.08(t, J=8.1Hz, 3H).
【０１４９】
［合成例４］ｋ−１：Ａ−３の合成
【０１５０】
【化１９】
2020120649.tif 000025
【０１５１】
ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ、ｎ−オクチルアミン(Ａ−３）（１２０ｍＬ、０．７２ｍｍｏｌ）を加えて室温で２時間、１００℃で１７時間撹拌した。放冷後、水（２０ｍＬ）、酢酸エチル（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００〜２０／８０）で精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄してｋ−１：Ａ−３（６０．１ｍｇ、０．２０６ｍｍｏｌ、収率３７％）を黄色固体として得た。
【０１５２】
1H-NMR(270MHz);δ9.52(s, 1H), 7.25(d, J=8.1Hz, 1H), 6.20(d, J=8.1Hz, 1H), 5.31 (t, J=8.1Hz, 2H), 2.73(q, J=8.1Hz, 2H), 1.90(s, 3H), 1.64(m, 2H), 1.30-1.05(m, 10H), 1.11(t, J=8.1Hz, 3H), 0.86(t, J=8.1Hz, 3H).
【０１５３】
［合成例５］ｋ−１：Ａ−５の合成
【０１５４】
【化２０】
2020120649.tif 000026
【０１５５】
ｋ−１（３００ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）を２Ｍアンモニア／メタノール溶液（１７ｍＬ、３３ｍｍｏｌ）に溶解させ、室温で１週間撹拌した。その間、毎日アンモニアガスを１５分バブリングした。反応溶液を減圧下濃縮し、４−（１−イミノプロピル）−２−メチルベンゼン−１，３−ジオール（ｋ−１’）とｋ−１の混合物（２９２ｍｇ、ｋ−１’:ｋ−１＝１:０．２）を黄土色固体として得た。上記のようにして得られたｋ−１’とｋ−１の混合物（２９２ｍｇ）をＴＨＦ（６．５ｍＬ）に溶解させ、氷冷下、フェニルイソシアネート（Ａ−５）（１５８ｍＬ、１．４６ｍｍｏｌ）を加えた。同温で３０分撹拌後、水（３０ｍＬ）、酢酸エチル（３０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５〜４５／５５）で精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄してｋ−１：Ａ−５（１６０ｍｇ、０．５３６ｍｍｏｌ、２工程収率３２％）を薄黄色固体として得た。
【０１５６】
1H-NMR(270MHz);δ13.74(s, 1H), 10.22(s, 1H), 10.11(s, 1H), 7.63(d, J=8.1Hz, 2H), 7.53 (d, J=8.1Hz, 1H), 7.32 (t, J=8.1Hz, 2H), 7.06 (t, J=8.1Hz, 1H), 6.49 (d, J=8.1Hz, 1H), 2.84(q, J=8.1Hz, 2H), 2.00(s, 3H), 1.24(t, J=8.1Hz, 3H).
【０１５７】
［合成例６］ｋ−１：Ｈ−１０の合成
【０１５８】
【化２１】
2020120649.tif 000027
【０１５９】
ｋ−１（１００ｍｇ，０．５５ｍｍｏｌ）、４−フェニルセミカルバジド(Ｈ−１０）（１０９ｍｇ，０．７２１ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で３．５時間撹拌した。放冷後、水（２０ｍＬ）、酢酸エチル（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜５０／５０）で精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄してｋ−１：Ｈ−１０（１９．１ｍｇ、０．０６１０ｍｍｏｌ、収率１１％）を白色固体として得た。
【０１６０】
1H-NMR(270MHz):δ13.50(s, 1H), 9.75(s, 1H), 9.59(s, 1H), 8.82(s, 1H), 7.49(d, J=8.1Hz, 2H), 7.30(t, J=8.1Hz, 2H), 7.21(d, J=8.0Hz, 1H), 6.99(t, J=8.1Hz, 1H), 6.39(d, J=8.1Hz, 1H), 2.70(q, J=8.1Hz, 2H), 1.99(s, 3H), 1.14(t, J=8.1Hz, 3H).
【０１６１】
［合成例７］ｋ−１：Ｉ−１の合成
【０１６２】
【化２２】
2020120649.tif 000028
【０１６３】
ヒドラジン一水和物（０．２６ｍＬ、５．３ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（５．３ｍＬ）に溶解させ、氷冷下ベンジルイソシアネート（１０１）（０．３２４  ｍＬ、２．６３  ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。室温で３時間撹拌し、析出した固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、１０２（３５２ｍｇ、２．１３ｍｍｏｌ、収率８２％）を白色固体として得た。
【０１６４】
上記のようにして得られた１０２（１５５ｍｇ、０．９３８ｍｍｏｌ）、ｋ−１（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．４ｍＬ）に溶解させ１００℃で３．５時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加え、析出した固体をろ取、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜５５／４５）にて精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｉ−１（５５ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、収率２４％）を白色固体として得た。
【０１６５】
1H-NMR(400MHz);δ9.59(s, 1H), 9.56(s, 1H), 7.40-7.25(m, 5H), 7.17(d, J=12.0Hz, 1H), 6.84(t, J=8.0Hz, NH), 6.37(d, J=12.0Hz, 1H), 4.34(d, J=8.0Hz, 2H), 2.65(q, J=8.0Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.08(t, J=8.0Hz, 3H).（NHの一つのシグナルは観測されな
かった。）
【０１６６】
［合成例８］ｋ−１：Ｉ−３の合成
【０１６７】
【化２３】
2020120649.tif 000029
【０１６８】
ヒドラジン一水和物（０．２０ｍＬ、４．２ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（４．２ｍＬ）に溶解させ、氷冷下４−クロロベンジルイソシアネート（１０３）（０．２７８ｍＬ、２．０９ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。室温で１．５時間撹拌し、析出した固体をろ取後、減圧下乾燥し、１０４（３１５ｍｇ、１．５８ｍｍｏｌ、収率７５％）を白色固体として得た。
【０１６９】
上記のようにして得られた１０４（１８７ｍｇ、０．９３７ｍｍｏｌ）、ｋ−１（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．４ｍＬ）に溶解させ１００℃で２２時間撹拌した。反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜６５／３５）にて精製し、得られた精製物を酢酸エチルに溶解させ、ヘキサンを加えて析出した固体をろ取後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｉ−３（１５５ｍｇ、０．４２８ｍｍｏｌ、収率５９％）を白色固体として得た。
【０１７０】
1H-NMR(400MHz);δ9.63(s, 1H), 9.56(s, 1H), 7.41(d, J=8.0Hz, 2H), 7.34(d, J=8.0Hz, 2H), 7.17(d, J=8.0Hz, 1H), 6.89(t, J=8.0Hz, NH), 6.36(d, J=8.0Hz, 1H), 4.31(d, J=8.0Hz, 2H), 2.65(q, J=8.0Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.08(t, J=8.0Hz, 3H).（NHの一つのシグナルは観測されなかった。）
【０１７１】
［合成例９］ｋ−１：Ｉ−６の合成
【０１７２】
【化２４】
2020120649.tif 000030
【０１７３】
ヒドラジン一水和物（０．２３ｍＬ、４．８ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（８ｍＬ）に溶解させ、氷冷下４−メチルベンジルイソシアネート（１０５）（３５０ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。室温で２時間撹拌し、析出した固体をろ取後、減圧下乾燥し、１０６（２９７ｍｇ、１．６６ｍｍｏｌ、収率６９％）を白色固体として得た。
【０１７４】
上記のようにして得られた１０６（１６８ｍｇ、０．９３７ｍｍｏｌ）、ｋ―１（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２．８ｍＬ）に懸濁させ１００℃で２２時間撹拌した。反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜６０／４０）にて精製し、得られた精製物を酢酸エチル（３０ｍＬ）に溶解させ、水（２０ｍＬ）、飽和食塩水（３０ｍＬ）で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた固体を塩化メチレンで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｉ−６（１１８ｍｇ、０．３４６ｍｍｏｌ、収率４８％）を白色固体として得た。
【０１７５】
1H-NMR(400MHz);δ9.56(s, 1H), 9.55(s, 1H), 7.20(d, J=8.0Hz, 2H), 7.16(d, J=8.0Hz, 2H), 7.15(d, J=8.0Hz, 1H), 6.78(t, J=8.0Hz, NH), 6.36(d, J=8.0Hz, 1H), 4.29(d, J=8.0Hz, 2H), 2.64(q, J=8.0Hz, 2H), 2.28(s, 3H), 1.97(s, 3H), 1.07(t, J=8.0Hz, 3H).（NHの一つのシグナルは観測されなかった。）
【０１７６】
［合成例１０］ｋ−１：Ｉ−７の合成
【０１７７】
【化２５】
2020120649.tif 000031
【０１７８】
ヒドラジン一水和物（０．２１ｍＬ、４．３ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（４．３ｍＬ）に溶解させ、氷冷下４−メトキシベンジルイソシアネート（１０７）（３５０ｍｇ、２．１５ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。室温で２時間撹拌し、析出した固体をろ取後、減圧下乾燥し、１０８（３８１ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ、収率９３％）を白色固体として得た。
【０１７９】
上記のようにして得られた１０８（１８３ｍｇ、０．９３７ｍｍｏｌ）、ｋ−１（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２．８ｍＬ）に懸濁させ１００℃で５時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加え、析出した固体をろ取、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１５／８５〜６５／３５）にて精製し、得られた固体を塩化メチレンで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｉ−７（５５．０ｍｇ、０．１５４ｍｍｏｌ、収率２１％）を白色固体として得た。
【０１８０】
1H-NMR(400MHz);δ9.55(s, 2H), 7.25(d, J=8.0Hz, 2H), 7.16(d, J=8.0Hz, 1H), 6.91(d, J=8.0Hz, 2H), 6.75(t, J=8.0Hz, NH), 6.36(d, J=8.0Hz, 1H), 4.26(d, J=8.0Hz, 2H), 3.73(s, 3H), 2.63(q, J=8.0Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.07(t, J=8.0Hz, 3H).（NHの一つのシグナルは観測されなかった。）
【０１８１】
上記の合成法に準じた方法により合成した化合物を第３表に記載する。
［第３表］
【０１８２】
【化２６】
2020120649.tif 000032
【０１８３】
【表３】
2020120649.tif 000033
【０１８４】
また、第３表に記載した化合物の１Ｈ−ＮＭＲの測定結果を第４表に記す。
【０１８５】
［第４表］
【０１８６】
【表４】
2020120649.tif 000034
【０１８７】
［合成例１１］ｋ−１：Ｂ−１の合成
【０１８８】
【化２７】
2020120649.tif 000035
【０１８９】
２−ブロモプロピオン酸メチル（１０９）（５００ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（６ｍＬ）に溶解させ、アニリン（０．３６ｍＬ、３．９ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（０．５４ｇ、３．９ｍｍｏｌ）を加えて室温で２１時間撹拌した。酢酸エチル（３０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２／９８〜１５／８５）で精製し、１１０（３４３ｍｇ、１．９１ｍｍｏｌ、収率６４％）を薄黄色液体として得た。
【０１９０】
上記のようにして得られた１１０（３４０ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）をメタノール（３．８ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．１８ｍＬ、３．８ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で２４時間撹拌した。ヒドラジン一水和物（０．３６ｍＬ、７．４ｍｍｏｌ）を追加して６０℃で更に１７時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝０／１００〜２０／８０）で精製し、１１１（３２１ｍｇ、１．７９ｍｍｏｌ、収率９４％）を白色固体として得た。
【０１９１】
上記のようにして得られた１１１（１６８ｍｇ、０．９３７ｍｍｏｌ）、ｋ−１（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．４ｍＬ）に溶解させ１００℃で１９時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加え、析出した固体をろ取、乾燥して得られた黄色固体を塩化メチレンで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｂ−１（１７３ｍｇ、０．５０７ｍｍｏｌ、収率７０％）を薄黄色固体として得た。
【０１９２】
1H-NMR(400MHz):δ10.82(s, 1H), 9.71(s, 1H), 7.25(d, J=8.0Hz, 1H), 7.07(t, J=8.0Hz, 2H), 6.63(d, J=8.0Hz, 2H), 6.56(t, J=8.0Hz, 1H), 6.39(d, J=8.0Hz, 1H), 5.93(d, J=12Hz, NH), 4.28(m, 1H), 2.80(q, J=8.0Hz, 2H), 1.95(s, 3H), 1.40(d, J=8.0Hz, 3H), 1.03(t, J=8.0Hz, 3H).(NHの一つのシグナルは観測されなかった。)
【０１９３】
［合成例１２］ｋ−１：Ｂ−２の合成
【０１９４】
【化２８】
2020120649.tif 000036
【０１９５】
２−ブロモイソ吉草酸エチル（１１２）（７００ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（７ｍＬ）に溶解させ、アニリン（０．４０ｍＬ、４．４ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（０．６０ｇ、４．４ｍｍｏｌ）を加えて室温で２１時間、８０℃で６時間、１２０℃で２０時間撹拌した。酢酸エチル（３０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００〜５／９５）で精製し、１１３（１１０ｍｇ、０．４９７ｍｍｏｌ、収率１５％）を黄色液体として得た。
【０１９６】
上記のようにして得られた１１３（９６ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）をメタノール（１ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．０４２ｍＬ、０．８７ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で４時間、ヒドラジン一水和物（０．２ｍＬ、４．１ｍｍｏｌ）を追加して２０時間、ヒドラジン一水和物（０．１ｍＬ、２．１ｍｍｏｌ）を追加して更に２３時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝０／１００〜５／９５）で精製し、１１４（８０．７ｍｇ、０．３８９ｍｍｏｌ、収率９０％）を白色固体として得た。
【０１９７】
上記のようにして得られた１１４（７５ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）、ｋ−１（５０ｍｇ、０．２８  ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．６ｍＬ）に溶解させ１００℃で１８時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜７５／２５）にて精製し、得られた固体を塩化メチレン／ＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｂ−２（３７．６ｍｇ、０．１０２ｍｍｏｌ、収率３６％）を白色固体として得た。
【０１９８】
1H-NMR(400MHz):δ10.83(s, 1H), 9.72(s, 1H), 7.26(d, J=8.0Hz, 1H), 7.05(t, J=8.0Hz, 2H), 6.71(d, J=8.0Hz, 2H), 6.53(t, J=8.0Hz, 1H), 6.39(d, J=8.0Hz, 1H), 5.78(d, J=12Hz, NH), 3.97(m, 1H), 2.82(q, J=8.0Hz, 2H), 2.03(m, 1H), 1.95(s, 3H), 1.06(t, J=8.0Hz, 3H), 0.97(d, J=8.0Hz, 6H).(NHの一つのシグナルは観測されなかった。)
【０１９９】
［合成例１３］ｋ−１：Ｂ−３の合成
【０２００】
【化２９】
2020120649.tif 000037
【０２０１】
２−ブロモ−ｎ−オクタン酸（１１５）（６００ｍｇ、２．７ｍｍｏｌ）をメタノール（５．５ｍＬ）に溶解させ、濃塩酸（３滴）を加えて５０℃で１８時間撹拌した。放冷後、ジエチルエーテル（３０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して１１６（５８８ｍｇ、２．４８ｍｍｏｌ、収率９２％）を黄色液体として得た。
【０２０２】
上記のようにして得られた１１６（５８５ｍｇ、２．４７ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５ｍＬ）に溶解させ、アニリン（０．２９ｍＬ、３．２ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（０．４４ｇ、３．２ｍｍｏｌ）を加えて室温で２１時間、６０℃で１６時間撹拌した。酢酸エチル（３０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１／９９〜５／９５）で精製し、１１７（２７７ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ、収率４５％）を黄色液体として得た。
【０２０３】
上記のようにして得られた１１７（２５６ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）をメタノール（２．２ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．１０ｍＬ、２．２ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で４時間、ヒドラジン一水和物（０．５０ｍＬ、１０．３ｍｍｏｌ）を追加して２０時間、ヒドラジン一水和物（０．２５ｍＬ、５．２ｍｍｏｌ）を追加して更に２３時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝０／１００〜５／９５）で精製し、１１８（２６８ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ、収率９９％）を薄黄色固体として得た。
【０２０４】
上記のようにして得られた１１８（１４４ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）、ｋ−１（８０ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．９ｍＬ）に溶解させ１００℃で１８時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５〜７５／２５）、続けて中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝１／９９〜５／９５）、にて精製し、得られた固体を塩化メチレン／ＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１:Ｂ−３（８８．７ｍｇ、０．２１６ｍｍｏｌ、収率４９％）を白色固体として得た。
【０２０５】
1H-NMR(400MHz):δ10.82(s, 1H), 9.72(s, 1H), 7.25(d, J=8.0Hz, 1H), 7.06(t, J=8.0Hz, 2H), 6.65(d, J=8.0Hz, 2H), 6.54(t, J=8.0Hz, 1H), 6.39(d, J=8.0Hz, 1H), 5.87(d, J=8.0Hz, NH), 4.19(m, 1H), 2.81(q, J=8.0Hz, 2H), 1.95(s, 3H), 1.73(q, J=8.0Hz, 2H), 1.33(m, 4H), 1.27(m, 4H), 1.03(t, J=8.0Hz, 3H), 0.86(t, J=8.0Hz, 3H).(NHの一つのシグナルは観測されなかった。)
【０２０６】
［合成例１４］ｋ−１：Ｂ−５の合成
【０２０７】
【化３０】
2020120649.tif 000038
【０２０８】
フェニルプルビン酸（１１９）（１．０ｇ、６．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解させ、氷冷下ＤＢＵ（１．０ｍＬ、６．７ｍｍｏｌ）、ヨウ化メチル（０．４２ｍＬ、６．７ｍｍｏｌ）を加えて室温で３時間撹拌した。酢酸エチル（３０ｍＬ）、１Ｍ塩酸（５０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００〜１３／８７）で精製し、１２０ａ（２９８ｍｇ、１．６７ｍｍｏｌ、収率２７％）を白色固体として得た。
【０２０９】
上記のようにして得られた１２０ａ（２９５ｍｇ、１．６６ｍｍｏｌ）をメタノール（６．６ｍＬ）、酢酸（０．６６ｍＬ）、２ＭエチルアミンＴＨＦ溶液（０．８７ｍＬ、１．７ｍｍｏｌ）に溶解させ、氷冷下ピコリンボラン（０．３５ｇ、３．３ｍｍｏｌ）を加えて室温で２．５時間撹拌した。４Ｍ塩酸（３ｍＬ）を加えて５０℃で３０分加熱し、放冷後、酢酸エチル（２０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２／９８〜３０／７０）で精製し、１２０ｂ（４８．９ｍｇ、０．２３６ｍｍｏｌ、収率１４％）を得た。
【０２１０】
上記のようにして得られた１２０ｂ（４５ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）をメタノール（０．９ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．０２１ｍＬ、０．４３ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で３時間、メタノール（０．９ｍＬ）、ヒドラジン一水和物（０．０２１ｍＬ、０．４３ｍｍｏｌ）を追加して１２時間、メタノール（０．９ｍＬ）、ヒドラジン一水和物（０．０２１ｍＬ、０．４３ｍｍｏｌ）を追加して更に３時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝０／１００〜２０／８０）で精製し、１２０ｃ（３２ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、収率６８％）を薄黄色液体として得た。
【０２１１】
上記のようにして得られた１２０ｃ（３０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）、ｋ−１（２５ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．３ｍＬ）に溶解させ１００℃で１８時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝１０／９０〜６０／４０）にて精製し、得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｂ−５（１８．４ｍｇ、０．０４９８ｍｍｏｌ、収率３６％）を白色固体として得た。
【０２１２】
1H-NMR(400MHz):δ9.72(s, 1H), 7.30-7.10(m, 6H), 6.38(d, J=8.0Hz, 1H), 3.62(m, J=8.0Hz, 1H), 2.86(q, J=8.0Hz, 2H), 2.66(q, J=8.0Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.04(d, J=8.0Hz, 2H), 0.98(t, J=8.0Hz, 3H), 0.92(t, J=8.0Hz, 3H).(NHの二つのシグナルとOHの一つのシグナルは観測されなかった。)
【０２１３】
［合成例１５］ｋ−１：Ｃ−１の合成
【０２１４】
【化３１】
2020120649.tif 000039
【０２１５】
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（１２１）（０．７０ｇ、４．０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１３ｍＬ）に溶解させ、ＷＳＣ（０．８４ｇ、４．４ｍｍｏｌ）、フェニルヒドラジン（１２２）（０．４７ｍＬ、４．８ｍｍｏｌ）を加えて室温で４時間撹拌した。水（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮し得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１５／８５〜６５／３５）にて精製し、１２３（８５３ｍｇ、３．２２ｍｍｏｌ、収率８１％）を無色アモルファスとして得た。
【０２１６】
上記のようにして得られた１２３（０．６４ｇ、２．４ｍｍｏｌ）に４Ｍ塩酸／ジオキサン（６ｍＬ）を加えて室温で３時間撹拌した。析出した固体をろ取し、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（アミンシリカゲル３０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝０／１００〜８／９２）にて精製し、１２４（２９０ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ、収率７３％）を、薄黄色固体として得た。
【０２１７】
上記のようにして得られた１２４（１２０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で２２時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２０／８０〜９０／１０）にて精製し、得られた固体を塩化メチレンで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｃ−１（２０．２ｍｇ、０．０６１７ｍｍｏｌ、収率１１％）を黄色固体として得た。
【０２１８】
1H-NMR(400MHz):δ9.89 (s, 1H), 9.67(s, 1H), 7.83(s, 1H), 7.25(d, J=8.0Hz, 1H), 7.14(t, J=8.0Hz, 2H), 6.77(d, J=8.0Hz, 2H), 6.71(t, J=8.0Hz, 1H), 6.29(d, J=8.0Hz, 1H), 4.35(s, 2H), 2.74(q, J=8.0Hz, 2H), 1.92(s, 3H), 1.13(t, J=8.0Hz, 3H).(NHの一つのシグナルは観測されなかった。)
【０２１９】
［合成例１６］ｋ−１：Ｃ−２の合成
【０２２０】
【化３２】
2020120649.tif 000040
【０２２１】
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（１２１）（０．７０ｇ、４．０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１３ｍＬ）に溶解させ、ＷＳＣ（０．８４ｇ、４．４ｍｍｏｌ）、ベンジルアミン（１２５）（０．５２ｍＬ、４．８ｍｍｏｌ）を加えて室温で３時間撹拌した。水（２０ｍＬ）、塩化メチレン（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜６５／３５）にて精製し、１２６（９３７ｍｇ、３．５４ｍｍｏｌ、収率８９％）を無色液体として得た。
【０２２２】
上記のようにして得られた１２６（０．９３ｇ、３．５ｍｍｏｌ）にＴＦＡ（７ｍＬ）を加えて室温で３．５時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（アミンシリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝１０／９０〜９５／５）にて精製し、１２７（４５７ｍｇ、２．７８ｍｍｏｌ、収率７９％）を、薄黄色液体として得た。
【０２２３】
上記のようにして得られた１２７（１２０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で２２時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜８０／２０）にて精製し、得られた固体をＩＰＥ、塩化メチレンで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｃ−２（２９．９ｍｇ、０．０９０８ｍｍｏｌ、収率１７％）を黄色固体として得た。
【０２２４】
1H-NMR(400MHz):δ9.63 (s, 1H), 8.55(m, NH), 7.40-7.20(m, 6H), 6.25(d, J=8.0Hz, 1H), 4.32(d, J=8.0Hz, 2H), 4.29(s, 2H), 2.70(q, J=8.0Hz, 2H), 1.91(s, 3H), 1.09(t, J=8.0Hz, 3H).(OHの一つのシグナルは観測されなかった。)
【０２２５】
［合成例１７］ｋ−１：Ｄ−１の合成
【０２２６】
【化３３】
2020120649.tif 000041
【０２２７】
３−ベンジルオキシアニリン（１２９）（２．４４ｇ、１２．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２４ｍＬ）に溶解させ、酢酸ナトリウム（１．１０ｇ、１３．５ｍｍｏｌ）、ブロモ酢酸エチル（１２８）（１．４９ｍＬ、１３．５ｍｍｏｌ）を加えて室温で４時間撹拌した。水（３００ｍＬ）、酢酸エチル（１５０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル５０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２／９８〜１０／９０）にて精製し、１３０（２．８２ｇ、９．８８ｍｍｏｌ、収率８１％）を薄黄色固体として得た。
【０２２８】
上記のようにして得られた１３０（１．０ｇ、３．５ｍｍｏｌ）をメタノール（１８ｍＬ）に懸濁させ、１０％Ｐｄ／Ｃ（０．１ｇ）を加えて水素雰囲気下室温で５時間撹拌した。反応溶液をセライトろ過し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝３／９７〜３５／６５）にて精製し、１３１（２９５ｍｇ、１．５１ｍｍｏｌ、収率４３％）を薄黄色液体として得た。
【０２２９】
上記のようにして得られた１３１（０．２９ｇ、１．５ｍｍｏｌ）をエタノール（３．５ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．３２ｍＬ、６．５ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で１８時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝１／９９〜１０／９０）で精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、１３２（２３９ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ、収率８８％）を薄黄色固体として得た。
【０２３０】
上記のようにして得られた１３２（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で２１時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝５／９５〜５０／５０）にて精製した。得られた固体を水、およびＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｄ−１（９５．９ｍｇ、０．２７９ｍｍｏｌ、収率５１％）を白色固体として得た。
【０２３１】
1H-NMR(270MHz);δ 13.66(s, 1H), 10.76(s, 1H), 9.70(s, 1H), 8.98(s, 1H), 7.25(d, J=10.8Hz, 1H), 6.86(t, J=10.8Hz, 1H), 6.40(d, J=8.1Hz, 1H), 6.20-5.95(m, 3H), 5.87(t, J=5.4Hz, NH), 3.88(d, J=5.4Hz, 2H), 2.78(q, J=8.0Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.05(t, J=8.1Hz, 3H).
【０２３２】
［合成例１８］ｋ−１：Ｄ−３の合成
【０２３３】
【化３４】
2020120649.tif 000042
【０２３４】
合成例１７の工程中で得られた１３０（１．２ｇ、４．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１２ｍＬ）に溶解させ、炭酸カリウム（１．１６ｇ、８．４ｍｍｏｌ）、ヨードエタン（１．３５ｍＬ、１６．８ｍｍｏｌ）を加えて１００℃で３時間、ヨードエタン（０．７ｍＬ、８．７ｍｍｏｌ）を追加して１．５時間、室温で２０時間撹拌した。水（１００ｍＬ）、酢酸エチル（５０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２／９８〜１０／９０）にて精製し、１３３（１．２１ｇ、３．８６ｍｍｏｌ、収率９２％）を無色液体として得た。
【０２３５】
上記のようにして得られた化合物１３３（１．２ｇ、３．９ｍｍｏｌ）をメタノール（１９ｍＬ）に溶解させ、１０％Ｐｄ／Ｃ（０．１ｇ）を加えて水素雰囲気下室温で１５時間撹拌した。反応溶液をセライトろ過し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５〜２５／７５）にて精製し、１３４（１９４ｍｇ、０．８６９ｍｍｏｌ、収率２２％）を得た。
【０２３６】
上記のようにして得られた１３４（０．２０ｇ、０．９０ｍｍｏｌ）をエタノール（２．２ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．２２ｍＬ、４．５ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で１８時間、ヒドラジン一水和物（０．２２ｍＬ、４．５ｍｍｏｌ）を追加して更に６０℃で２４時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝１／９９〜６／９４）で精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、１３５（１５１ｍｇ、０．７２２ｍｍｏｌ、収率８０％）を薄黄色固体として得た。
【０２３７】
上記のようにして得られた１３５（１５０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で２３時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１５／８５〜８０／２０）にて精製した。得られた固体をＩＰＥ／塩化メチレン（１／１）の混合溶媒で洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｄ−３（１１８ｍｇ、０．３１８ｍｍｏｌ、収率５８％）を黄色固体として得た。
【０２３８】
1H-NMR(270MHz);δ 13.68(s, 1H), 10.78(s, 1H), 9.69(s, 1H), 9.00(s, 1H), 7.26(d, J=8.1Hz, 1H), 6.91(t, J=8.1Hz, 1H), 6.40(d, J=8.1Hz, 1H), 6.11(d, J=8.1Hz, 1H), 6.10-6.05(m, 2H), 4.12(s, 2H), 3.42(q, J=8.1Hz, 2H), 2.79(q, J=8.1Hz, 2H), 1.96(s, 3H), 1.13(t, J=8.1Hz, 3H), 1.05(t, J=8.1Hz, 3H).
【０２３９】
［合成例１９］ｋ−１：Ｅ−１の合成
【０２４０】
【化３５】
2020120649.tif 000043
【０２４１】
アミノフェノール（１３７）（５００ｍｇ、４．６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）に溶解させ、炭酸水素ナトリウム（０．７７ｇ、９．２ｍｍｏｌ）を加えて氷冷下クロロギ酸フェニル（１３６）（０．６１ｍＬ、４．８ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した。同温で２時間撹拌し、酢酸エチル（２０ｍＬ）、２Ｍ塩酸（２０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、１３８（０．９４ｇ、４．１ｍｍｏｌ、収率８９％）を白色固体として得た。
【０２４２】
上記のようにして得られた１３８（０．９４ｇ、４．１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（１．０ｍＬ、２１ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で２３時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル３０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝０／１００〜１２／８８）で精製して１３９（６６４ｍｇ、３．９７ｍｍｏｌ、収率９７％）を薄黄色固体として得た。
【０２４３】
上記のようにして得られた１３９（１２０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１６時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜８０／２０）、続けて中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝１／９９〜５／９５）にて精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄してｋ−１：Ｅ−１（１９．７ｍｇ、０．０５９８ｍｍｏｌ、収率１１％）を白色固体として得た。
【０２４４】
1H-NMR(400MHz);δ 9.70(s, 1H), 9.60(s, 1H), 9.38(s, 1H), 8.73(s, 1H), 7.21(d, J=8.0Hz, 1H), 7.06(t, J=8.0Hz, 1H), 7.05(s, 1H), 6.82(d, J=8.0Hz, 1H), 6.39(d, J=8.0Hz, 2H), 5.76(s, 1H), 2.69(q, J=8.0Hz, 2H), 1.99(s, 3H), 1.13(t, J=8.0Hz, 3H).
【０２４５】
［合成例２０］ｋ−１：Ｆ−１の合成
【０２４６】
【化３６】
2020120649.tif 000044
【０２４７】
ヒドラジン一水和物（０．５８ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（６ｍＬ）に溶解させ、氷冷下ヘキサメチレンジイソシアネート（１４０）（０．４８ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ）を加えて室温で１．５時間、ヒドラジン一水和物（０．２９ｍＬ、６．０ｍｍｏｌ）を追加して２時間撹拌した。生じた固体をろ取、減圧下乾燥し、１４１（０．６０ｇ、２．６ｍｍｏｌ、収率８７％）を白色固体として得た。
【０２４８】
上記のようにして得られた１４１（１００ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）、ｋ−１（２３３ｍｇ、１．２９ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．４ｍＬ）に懸濁させ１００℃で２０時間撹拌した。放冷後、塩化メチレンを加えて不溶物をろ別し、ろ液を減圧下濃縮した。得られた固体を塩化メチレンおよび水で洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｆ−１（８８．６ｍｇ、０．１５９ｍｍｏｌ、収率３７％）を薄黄色固体として得た。
【０２４９】
1H-NMR(400MHz);δ 9.44(s,4H), 7.15(d, J=8.0Hz, 2H), 6.40-6.30(m, 2H), 3.13(q, J=8.0Hz, 4H), 2.63 (q, J=8.0Hz, 4H),1.97(s, 6H), 1.47(m, 4H), 1.38(m, 4H),1.07(t, J=8.0Hz, 6H).
【０２５０】
［合成例２１］ｋ−１：Ｇ−１の合成
【０２５１】
【化３７】
2020120649.tif 000045
【０２５２】
Ｎ−メチル−アニリン（１４２）（０．５０ｇ、４．７ｍｍｏｌ）をエタノール（９ｍＬ）に溶解させ、炭酸カリウム（０．９７ｇ、７．０ｍｍｏｌ）、ブロモ酢酸エチル（１２８）（０．５７ｍＬ、５．１ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で２１時間撹拌した。不溶物をろ別し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣に酢酸エチル（３０ｍＬ）、水（３０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００〜５／９５）にて精製し１４３（４９６ｍｇ、２．５７ｍｍｏｌ、収率５５％）を薄黄色液体として得た。
【０２５３】
上記のようにして得られた１４３（０．４９ｇ、２．６ｍｍｏｌ）をメタノール（５ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．２５ｍＬ、５．１ｍｍｏｌ）を加えて５５℃で１５時間撹拌した。ヒドラジン一水和物（０．５０ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）を追加して６０℃で更に１８時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、１４４（３８９ｍｇ、２．１７ｍｍｏｌ、収率８３％）を白色固体として得た。
【０２５４】
上記のようにして得られた１４４（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１７時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜８０／２０）にて精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｇ−１（９２ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ、収率４９％）を白色固体として得た。
【０２５５】
1H-NMR(270MHz);δ 13.64(s, 1H), 10.86(s, 1H), 9.67(s, 1H), 7.24(d, J=10.8Hz, 1H), 7.15(t, J=10.8Hz, 2H), 6.71(d, J=8.1Hz, 2H), 6.62(t, J=8.1Hz, 1H), 6.38(d, J=8.1Hz, 1H), 4.23(s, 2H), 3.04(s, 3H), 2.89(q, J=8.1Hz, 2H), 1.93(s, 3H), 1.05(t, J=8.1Hz, 3H).
【０２５６】
［合成例２２］ｋ−１：Ｌ−１の合成
【０２５７】
【化３８】
2020120649.tif 000046
【０２５８】
上記の合成例２１に準じた方法により、レゾルシノールを出発原料とし、ｋ−１：Ｌ−１（６５ｍｇ、白色固体）を合成した。
【０２５９】
1H-NMR(270MHz);δ 13.63(s, 1H), 10.99(s, 1H), 9.74(s, 1H), 9.46(s, 1H), 7.28(d, J=8.1Hz, 1H), 7.07(t, J=8.1Hz, 1H), 6.45-6.35(m, 4H), 4.72(s, 2H), 2.81(q, J=8.1Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.08(t, J=8.1Hz, 3H).
【０２６０】
［合成例２３］ｋ−１：Ｍ−１の合成
【０２６１】
【化３９】
2020120649.tif 000047
【０２６２】
上記の合成例２１に準じた方法により、３−メルカプトフェノールを出発原料とし、ｋ−１：Ｍ−１（１１９ｍｇ、白色固体）を合成した。
【０２６３】
1H-NMR(270MHz);δ13.64(s, 1H), 10.96(s, 1H), 9.72(s, 1H), 9.57(s, 1H), 7.26(d, J=8.1Hz, 1H), 7.11(t, J=8.1Hz, 1H), 6.82(d, J=8.1Hz, 1H), 6.80(s, 1H), 6.62(d, J=8.1Hz, 1H), 6.40(d, J=8.1Hz, 1H), 3.88(s, 2H), 2.78(q, J=8.1Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.06(t, J=8.1Hz, 3H).
【０２６４】
［合成例２４］ｋ−１：Ｇ−２の合成
【化４０】
2020120649.tif 000048
【０２６５】
Ｎ−エチル−アニリン（１４５）（０．５０ｇ、４．１ｍｍｏｌ）をエタノール（８ｍＬ）に溶解させ、炭酸カリウム（０．８６ｇ、６．２ｍｍｏｌ）、ブロモ酢酸エチル（１２８）（０．５０ｍＬ、４．１ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で２１時間撹拌した。不溶物をろ別し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣に酢酸エチル（３０ｍＬ）、水（３０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００〜５／９５）にて精製し１４６（４７３ｍｇ、２．２８ｍｍｏｌ、収率５６％）を薄黄色液体として得た。
【０２６６】
上記のようにして得られた１４６（０．４７ｇ、２．３ｍｍｏｌ）をメタノール（４．５ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．２２ｍＬ、４．５ｍｍｏｌ）を加えて５５℃で１５時間撹拌した。ヒドラジン一水和物（０．４４ｍＬ、９．１ｍｍｏｌ）を追加して６０℃で更に１８時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、１４７（３０９ｍｇ、１．６０ｍｍｏｌ、収率７０％）を白色固体として得た。
【０２６７】
上記のようにして得られた１４７（１４０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１７時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜８０／２０）にて精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｇ−２（９６ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ、収率４９％）を白色固体として得た。
【０２６８】
1H-NMR(270MHz);δ 13.66(s, 1H), 10.82(s, 1H), 9.68(s, 1H), 7.25(d, J=8.1Hz, 1H), 7.13(t, J=8.1Hz, 2H), 6.65(d, J=8.1Hz, 2H), 6.59(t, J=8.1Hz, 1H), 6.38(d, J=10.8Hz, 1H), 4.17(s, 2H),3.46(q, J=8.1Hz, 2H), 2.79(q, J=8.1Hz, 2H), 1.94(s, 3H), 1.13(t, J=8.1Hz, 3H), 1.03(t, J=8.1Hz, 3H).
【０２６９】
［合成例２５］ｋ−１：Ｊ−１の合成
【０２７０】
【化４１】
2020120649.tif 000049
【０２７１】
氷冷したＴＨＦ（１０ｍＬ）に水素化アルミニウム（１．０ｇ、２６ｍｍｏｌ）、３−シアノフェノール（１４８）（０．６３ｇ、５．３ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１．５時間、６０℃で３．５時間撹拌した。放冷後、水素化アルミニウム（１．０ｇ、２６ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（１０ｍＬ）を追加して６０℃で更に１６時間撹拌した。反応溶液を氷冷し、水（１．５ｍＬ）、１５％水酸化ナトリウム水溶液（１．５ｍＬ）、水（４．５ｍＬ）を順次加えて室温で３時間撹拌した。懸濁溶液をセライトろ過し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝０／１００〜８／９２）にて精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、１４９（４７７ｍｇ、３．８７ｍｍｏｌ、収率７３％）を白色固体として得た。
【０２７２】
上記のようにして得られた１４９（２００ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（２ｍＬ）、水（２ｍＬ）に溶解させ、炭酸水素ナトリウム（０．２７ｇ、３．２ｍｍｏｌ）を加えて氷冷下クロロギ酸フェニル（１３６）（０．２２ｍＬ、１．７ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した。室温で２０時間撹拌し、酢酸エチル（２０ｍＬ）、水（２０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５〜３５／６５）にて精製し１５０（３６９ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ、収率９５％）を無色液体として得た。
【０２７３】
上記のようにして得られた１５０（３６５ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（３．８ｍＬ）に懸濁させ、ヒドラジン一水和物（０．１８ｍＬ、３．８ｍｍｏｌ）を加えて室温で２．５時間、ヒドラジン一水和物（０．１８ｍＬ、３．８ｍｍｏｌ）を追加して５５℃で更に２０時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた固体をＩＰＥ／塩化メチレン（３／１）で洗浄後、減圧下乾燥し、１５１（２３３ｍｇ、１．２９ｍｍｏｌ、収率８６％）を白色固体として得た。
【０２７４】
上記のようにして得られた１５１（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１５時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝１０／９０〜５５／４５）にて精製した。得られた精製物に水を加えて析出した固体をろ取後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｊ−１（１０２ｍｇ、０．２９７ｍｍｏｌ、収率５４％）を白色固体として得た。
【０２７５】
1H-NMR(270MHz);δ13.45(brs, 1H), 9.57(s, 1H), 9.53(s, 1H), 9.36(s, 1H), 7.17(d, J=8.1Hz, 1H), 7.11(d, J=8.1Hz, 1H), 6.80-6.60(m, 4H), 6.37(d, J=8.1Hz, 1H), 4.25(d, J=5.4Hz, 2H), 2.65(q, J=8.1Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.08(t, J=8.1Hz, 3H).
【０２７６】
［合成例２６］ｋ−１：Ｊ−５の合成
【０２７７】
【化４２】
2020120649.tif 000050
【０２７８】
４−ベンジル−３−チオセミカルバジド（１５５）（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ−１）（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１７時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５〜８０／２０）、続けて中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜５０／５０）にて精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：J−５（４９．９ｍｇ、０．１４５ｍｍｏｌ、収率２６％）を白色固体として
得た。
【０２７９】
1H-NMR(400MHz);δ10.61(brs, 1H), 9.69(s, 1H), 8.43(brs, 1H), 7.40-7.20(m, 6H), 6.40 (d, J=8.0Hz, 1H), 4.78(d, J=8.0Hz, 2H), 2.74(q, J=8.1Hz, 2H), 1.99(s, 3H), 1.09(t, J=8.1Hz, 3H). (NHの一つのシグナルは観測されなかった。)
【０２８０】
［合成例２７］ｋ−１：Ｊ−６の合成
【０２８１】
【化４３】
2020120649.tif 000051
【０２８２】
チオセミカルバジド（１５２）（０．５０ｇ、５．５ｍｍｏｌ）をメタノール（５．５ｍＬ）に懸濁させ、ヨウ化メチル（０．４１ｍＬ、６．６ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で１．５時間、反応容器のふたを開けて７０℃で５０分撹拌した。放冷後、ベンジルアミン（０．６１ｍＬ、５．５ｍｍｏｌ）を加えて５５℃で１７時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた残渣をＩＰＥ／塩化メチレン（１／４）の混合溶媒で洗浄した。得られた粗精製物を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（アミンシリカゲル３０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝０／１００〜１５／８５）にて精製し、得られた固体を塩化メチレンで洗浄後、減圧下乾燥し、１５６（６２６ｍｇ、３．８１ｍｍｏｌ、収率６９％）を橙色固体として得た。
【０２８３】
上記のようにして得られた１５６（１２０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で２７時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝１０／９０〜８０／２０）にて精製し、得られた粗精製物に塩化メチレン、水を加えて分液した。有機層を無水硫酸マグネシウムにて乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜６０／４０）にて精製しｋ−１：Ｊ−６（２９．９ｍｇ、０．０９１６ｍｍｏｌ、収率１７％）を黄色アモルファスとして得た。
【０２８４】
1H-NMR(270MHz);δ14.51(brs, 1H), 9.39(s, 1H), 7.36-7.05 (m, 6H), 6.32(d, J=8.1Hz, 1H), 6.20 (m, NH), 5.30(brs, NH), 4.34(d, J=5.4Hz, 2H), 2.84(q, J=8.1Hz, 2H), 1.96(s, 3H), 0.96(t, J=8.1Hz, 3H).
【０２８５】
［合成例２８］ｋ−１：Ｎ−１の合成
【化４４】
2020120649.tif 000052
【０２８６】
２−ヒドロキシベンジルアルコール（１．０ｇ、８．１ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１０ｍＬ）、水（１０ｍＬ）に懸濁させ、炭酸水素ナトリウム（２．０ｇ、２４ｍｍｏｌ）を加えて氷冷下クロロギ酸フェニル（２．０ｍＬ、１６ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した。徐々に室温まで昇温して５．５時間撹拌し、塩化メチレン（２０ｍＬ）、水（２０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２／９８〜３５／６５）にて精製し、３−（ヒドロキシメチル）フェニル  フェニル  カーボネート（１．４５ｇ、５．９４ｍｍｏｌ、収率７３％）を白色固体として得た。
【０２８７】
上記のようにして得られた３−（ヒドロキシメチル）フェニル  フェニル  カーボネートを塩化メチレン（７ｍＬ）に溶解させ、ピリジン（０．７２ｍＬ、８．９ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰを少量加えて氷冷下クロロギ酸フェニル（０．９０ｍＬ、７．１ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した。室温で２時間撹拌し、塩化メチレン（１０ｍＬ）、水（３０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝３／９７〜２５／７５）にて精製し、３−［（フェノキシカルボニル）オキシ］ベンジル  フェニル  カーボネート（２．２０ｇ、６．０４ｍｍｏｌ、収率１０２％）を無色液体として得た。
【０２８８】
上記のようにして得られた３−［（フェノキシカルボニル）オキシ］ベンジル  フェニル  カーボネート（２．２ｇ、６．０ｍｍｏｌ）をエタノール（１０ｍＬ）に懸濁させ、ヒドラジン一水和物（２．９ｍＬ、６０ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で２１時間撹拌した。不溶物をろ別し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝０／１００〜１０／９０）にて精製し、得られた固体を塩化メチレンで懸濁洗浄して３−ヒドロキシベンジル  ヒドラジンカルボキシレート（８０８ｍｇ、４．４４ｍｍｏｌ、収率７４％）を白色固体として得た。
【０２８９】
上記のようにして得られた３−ヒドロキシベンジル  ヒドラジンカルボキシレート（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、２’，４’−ジヒドロキシ−３’−メチルプロピオフェノン（１００）（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に懸濁させ１００℃で２２時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝２／９８〜３０／７０）にて精製し、得られた精製物に水を加えて析出した固体をろ取し、ｋ−１：Ｎ−１（８５．５ｍｇ、０．２４８ｍｍｏｌ、収率４５％）を白色固体として得た。
【０２９０】
1H-NMR(270MHz);δ13.45(brs, 1H), 10.78(brs, 1H), 9.63 (s, 1H), 9.49 (s, 1H), 7.21(d, J=8.1Hz, 1H), 7.18(t, J=8.1Hz, 1H), 6.84(d, J=8.1Hz, 1H), 6.83(s, 1H), 6.73(d, J=8.1Hz, 1H), 6.38(d, J=8.1Hz, 1H), 5.14(s, 2H), 2.75(q, J=8.1Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.03(t, J=8.1Hz, 3H).
【０２９１】
以下に、上述の各化合物を用いて行った作用試験の結果を記載する。
【０２９２】
［参考例１］細胞増殖活性の検討
上述の各化合物を３次元培地に添加した際の細胞の増殖促進効果を検討した。具体的には、前培養（接着培養）したＳＫＯＶ３細胞（ヒト卵巣がん由来細胞株）を回収し、３次元細胞培養培地（「ＦＣｅＭ（登録商標）」（日産化学株式会社））に懸濁し、細胞懸濁液を調製した。該細胞懸濁液を３８４ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３８２７）のウェルに１ウェル当たり１０００ ｃｅｌｌｓ／４０μＬ／ウェルになるように播種した。プレートに播種された細胞懸濁液を３７℃、５％ＣＯ２下で一晩静置した。次いで、各化合物のＤＭＳＯ希釈溶液を、終濃度５μＭ（または、５μＭおよび１０μＭの２段階）となるように４．４４μＬを添加した（添加後撹拌なし）。各化合物の添加後、３７℃、５％ＣＯ２下で４日間静置培養した。５日目の培養液に対してＡＴＰ試薬４４．４μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ, Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、１５分間室温で静置した。ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、細胞増殖を評価した。
【０２９３】
結果を第５表および第６表に示す。なお、増殖率は、対照（化合物を含まないＤＭＳＯを添加した細胞）を基準（１００％）として算出した。また、表に示される値は、２試験の結果の平均値である。
【０２９４】
［第５表］
【０２９５】
【表５】
2020120649.tif 000053
【０２９６】
［第６表］
【０２９７】
【表６】
2020120649.tif 000054
【０２９８】
［参考例２］ＳＫＯＶ３細胞に対する作用の検討１
特許文献１（ＷＯ２０１４／０１７５１３）の方法に従い、０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三昌株式会社製）及び１５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬヒトＨＢ−ＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）を含有するＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地（シグマアルドリッチ社製）の組成物をホモミキサーにて調製した。また、対照として、脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。次いで、ヒト卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に懸濁した後、３８４ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３８２７）のウェルに１ウェル当たり１０００ ｃｅｌｌｓ／４０μＬ／ウェルになるように分注した（３次元培養（３Ｄ））。単層培養（２Ｄ）は、ヒト卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３を上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に懸濁した後、３８４ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製、＃３７１２）のウェルに１ウェル当たり４００個／４０μＬになるように分注した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養した。培養1日目に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した化合物（ｋ−１：Ｈ−
７またはｋ−１：Ｈ−１０）を終濃度０、０．５、１、５、１０、２０μＭになるように、それぞれ４．４μＬずつ添加し、引き続き培養を４日間継続した。５日目の培養液に対してＡＴＰ試薬４４．４μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ, Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、１５分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。化合物無添加のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を第７表に示す。本試験の結果、ＳＫＯＶ３細胞を３次元培養（３Ｄ）した条件において、ｋ−１：Ｈ−７およびｋ−１：Ｈ−１０が幅広い濃度で細胞増殖促進作用を示し、さらにＳＫＯＶ３細胞は培地内でスフェアを形成していた。一方、ＳＫＯＶ３細胞を単層培養（２Ｄ）下で培養した場合は、ｋ−１：Ｈ−７およびｋ−１：Ｈ−１０を培地に添加しても、良好な細胞増殖促進効果は見られなかった。
【０２９９】
［第７表］
【０３００】
【表７】
2020120649.tif 000055
【０３０１】
［参考例３］ＳＫＯＶ３細胞に対する作用の検討２
特許文献１（ＷＯ２０１４／０１７５１３）の方法に従い、０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三昌株式会社製）及び１５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、３０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）を含有するＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地（シグマアルドリッチ社製）の組成物をＦＣｅＭ−ｓｅｒｉｅｓ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（和光純薬工業社製）にて調製した。また、単層培養として、脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。次いで、ヒト卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に懸濁した後、３８４ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３８２７）のウェルに１ウェル当たり１０００ ｃｅｌｌｓ／３６μＬ／ウェルになるように分注した（３次元培養（３Ｄ））。単層培養（２Ｄ）は、ヒト卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３を上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に懸濁した後、３８４ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製、＃３７１２）のウェルに１ウェル当たり４００ｃｅｌｌｓ／３６μＬになるように分注した。分注後に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した各化合物を終濃度０、１、５、１０、２０μＭになるように、それぞれ４μＬずつ添加した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で４日間培養した。４日目の培養液に対してＡＴＰ試薬４０μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、１５分間プレートシェーカー（アズワン社製、Ｍｉｃｒｏ  ｐｌａｔｅ  ｍｉｘｅｒ  ＮＳ−Ｐ）で室温にて撹拌した後、ＥｎＳｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。化合物無添加のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を第８表に示す。
【０３０２】
［第８表］
【０３０３】
【表８】
2020120649.tif 000056
【０３０４】
本試験の結果、ＳＫＯＶ３細胞を３次元培養（３Ｄ）した条件において、ｋ−１：Ｉ−１、ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｄ−１、ｋ−１：Ｊ−１、ｋ−１：Ｄ−２、ｋ−１：Ｉ−１０、及びｋ−１：Ｎ−１が幅広い濃度で細胞増殖促進作用を示し、さらにＳＫＯＶ３細胞は培地内でスフェアを形成していた。一方、ＳＫＯＶ３細胞を単層培養（２Ｄ）下で培養した場合は、ｋ−１：Ｉ−１、ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｄ−１、ｋ−１：Ｊ−１、ｋ−１：Ｄ−２、ｋ−１：Ｉ−１０、及びｋ−１：Ｎ−１を培地に添加しても、良好な細胞増殖促進効果は見られなかった。
【０３０５】
［参考例４］小腸オルガノイドへの作用の検討
マウス小腸約２０ｃｍを摘出し、氷上で脂肪組織及び血管組織を取り除いた後、ＰＢＳで内容物を十分に洗浄、ハサミで切り開き２ｍｍ程度に断片化した。１５ｍＬのＰＢＳで２０回洗浄し、上清を除去後、２５ｍＬのＧｅｎｔｌｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社製）を添加し２０ｒｐｍで撹拌しながら１５分間室温にてインキュベーションした。上清を除去後、沈殿物に１０ｍＬの冷０．１％ ＢＳＡ／ＰＢＳを添加し３回ピペッティングを行い、上清を７０μｍセルストレイナー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）で濾過し、ろ液を回収した。残った沈殿物へ同様に０
．１％ ＢＳＡ／ＰＢＳの添加とピペッティング、濾過を３回繰り返し、ろ液を４段階分調製した。各ろ液を４℃、２９０ｇにて５分間遠心し、上清除去後、１０ｍＬの冷０．１％ ＢＳＡ／ＰＢＳで再度懸濁し、４℃、２００ｇにて３分間遠心した。上清を除去後、１０ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２（和光純薬社製）を添加して懸濁し、１ｍＬを分取して顕微鏡下で観察し、小腸断片（陰窩、Ｃｒｙｐｔ）が十分にあるろ液を選択し、Ｃｒｙｐｔ数を血球計算板にて計数した。細胞懸濁液と等量の冷Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）Ｍａｔｒｉｘ ＧＦＲ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を添加、混合し、すばやく３７℃に温めておいた
２４ウェルプレートに５００ｃｒｙｐｔｓ／５０μＬ／ウェルとなるよう分注した。プレートを３７℃で１０分間静置し、ゲル化を完了させ、各ウェルに７５０μＬのＩｎｔｅｓｔｉＣｕｌｔ（登録商標）Ｏｒｇａｎｏｉｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を添加し、さらにＤＭＳＯに溶解した化合物（ｋ−１：Ｈ−７）を終濃度５μＭになるよう加えた。コントロールとして化合物未添加のウェルを作成した。７日間培養後、形成された小腸オルガノイドの数と直径を顕微鏡下で計測し、無添加（対照）と比較したものを第９表に示す。本試験の結果、ｋ−１：Ｈ−７がマウスの小腸オルガノイド培養においてオルガノイド形成を促進することが明らかになった。この際、オルガノイドの直径は大きく変わっておらず、ｋ−１：Ｈ−７の添加によりＣｒｙｐｔからのオルガノイド形成率が向上した。
【０３０６】
［第９表］
【０３０７】
【表９】
2020120649.tif 000057
【０３０８】
［参考例５］各種ヒトがん細胞への作用１
各種ヒト由来がん細胞を下記の通り各々の培地にて前培養（単層培養）を行った。ヒト子宮頸がん由来細胞株ＨｅＬａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（以下、ＡＴＣＣと記載する。）社製、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（以下、ＤＭＥＭと略称する。）（和光純薬工業社製））、ヒト悪性黒色腫由来細胞株Ａ３７５（ＡＴＣＣ社製、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）、ヒト上皮様細胞がん由来細胞株Ａ４３１（ＡＴＣＣ社製、１０％ ＦＢＳ及び１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（ＭＥ
Ｍ Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（以下、ＮＥＡＡと略称する。）（和光純薬工業社製））含有Ｅａｇｌｅ'ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（以下、ＥＭＥＭと略称する。）（和光純薬工業社製））、ヒト胃腺がん由来細胞株ＡＧＳ(ＤＳファーマバイオメディカル社製、１０％ＦＢＳ含有Ｈａｍ'ｓ Ｆ−１２（和光純薬工業社製））、ヒト前立腺がん由来細胞株ＬＮＣａＰ ｃｌｏｎｅ ＦＧＣ（ＡＴＣＣ社製、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０（和光純薬工業社製））、ヒト結腸腺がん由来細胞株ＨＣＴ１１６（ＤＳファーマバイオメディカル社製、１０％ＦＢＳ含有ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ Ｍｅｄｉｕｍ（シグマアルドリッチ社製））、ヒト肺胞基底上皮腺がん由来細胞株Ａ５４９（ＤＳファーマバイオメディカル社製、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）、ヒト前立腺がん由来細胞ＤＵ１４５（ＡＴＣＣ社製、１０％ＦＢＳ含有ＥＭＥＭ）。対数増殖期にある上記細胞をＰＢＳ洗浄後、接着細胞は０．２５ｗ／ｖ％トリプシン−1ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（和光純薬工業社製）を添加して３７℃にて１〜５分間インキュベートして剥離し、各々の培地を添加、遠心して同培地で再懸濁後、各々単細胞にて回収した。
【０３０９】
前述の各種細胞を脱アシル化ジェランガム含有または不含の各培地に懸濁し（脱アシル化ジェランガム濃度は０．０１５ ｗ／ｖ ％、ただしＲＰＭＩ１６４０のみ０．０２０ ｗ／ｖ ％）、１０００〜１２０００ ｃｅｌｌｓ／１３５ μＬ／ウェルの細胞濃度にて、９６穴低接着Ｕ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、脱アシル化ジェランガム不含培地）、または低接着平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、脱アシル化ジェランガム含有培地）に播種した（いずれも３Ｄ培養）。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて一晩静置培養後、化合物（ｋ−１：Ｈ−７またはｋ−１：Ｈ−１０）のＤＭＳＯ溶液を、終濃度５μＭまたは１０μＭとなるように、各培地に添加した。各化合物溶液の添加量は、１５μＬ／ウェルであった。対照としては培地に溶解したＤＭＳＯ溶液を添加した（ＤＭＳＯ終濃度０．１％）。引き続き３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて４日間培養後、ＷＳＴ−８溶液（同仁化学研究所社製）を１５μＬ／ウェルにて添加し、同インキュベーターで１〜２時間反応後、吸光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ １９０）にて４５０ｎｍの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。更に化合物無添加（対照）の吸光度を１００％としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を算出した。化合物無添加（対照）と比較した際に、１１９％以下の値を示すものを−、１２０％以上の値を示すものを○、１５０％以上の値を示すものを◎として第１０表に示す。
【０３１０】
［第１０表］
【０３１１】
【表１０】
2020120649.tif 000058
【０３１２】
本試験の結果、複数のがん細胞株においてｋ−１：Ｈ−７およびｋ−１：Ｈ−１０が３次元条件下で増殖活性を亢進させることが明らかになった。この際、低接着Ｕ底プレート、低接着平底プレートのどちらを用いてもがん細胞株は、スフェアを形成していた。
【０３１３】
［参考例６］各種ヒトがん細胞への作用２
各種ヒト由来がん細胞を下記の通り各々の培地にて前培養（単層培養）を行った。ヒト卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３（ＤＳファーマバイオメディカル社製、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）含有ＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地（シグマアルドリッチ社製））、ヒト肺胞基底上皮腺がん由来細胞株Ａ５４９（ＤＳファーマバイオメディカル社製、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（和光純薬工業社製））、ヒト子宮頸がん由来細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ社製、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）、ヒト悪性黒色腫由来細胞株Ａ３７５（ＡＴＣＣ社製、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）、ヒト上皮様細胞がん由来細胞株Ａ４３１（ＡＴＣＣ社製、１０％ ＦＢＳ及び１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（ＭＥＭ ＮＥＡＡ、和光純薬工業社製）含有ＥＭＥＭ（和光純薬工業社製））、ヒト胃腺がん由来細胞株ＡＧＳ(ＤＳファーマバイオメディカル社製、１０％ＦＢＳ含有Ｈａｍ'ｓ Ｆ−１２（和光純薬工業社製））、ヒト前立腺がん由来細胞ＤＵ１４５（ＡＴＣＣ社製、１０％ＦＢＳ含有ＥＭＥＭ）。対数増殖期にある上記細胞をＰＢＳ洗浄後、接着細胞は０．２５ｗ／ｖ ％トリプシン−１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（和光純薬工業社製）を添加して３７℃にて１〜５分間インキュベートして剥離し、各々の培地を添加、遠心して同培地で再懸濁後、各々単細胞にて回収した。
【０３１４】
前述の各種細胞を脱アシル化ジェランガム含有または不含の各培地に懸濁し（脱アシル化ジェランガム濃度は０．０１５ ｗ／ｖ ％）、７００〜２０００ ｃｅｌｌｓ／９０ μＬ／ウェルの細胞濃度にて、９６穴低接着Ｕ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃４５２０、脱アシル化ジェランガム不含培地）、または低接着平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃３４７４、脱アシル化ジェランガム含有培地）に播種した（いずれも３Ｄ培養）。引き続き、ＤＭＳＯに溶解させた化合物（ｋ−１：Ｉ−１、ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｄ−１、またはｋ−１：Ｊ−１）を、終濃度５μＭまたは１０μＭとなるように、各培地に添加した。各化合物溶液の添加量は１０μＬ／ウェルであった。対照としては培地に溶解したＤＭＳＯ溶液を添加した（ＤＭＳＯ終濃度０．１％）。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて４日間培養後、４日目の培養液に対してＡＴＰ試薬４０μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、１５分間プレートシェーカー（アズワン社製、Ｍｉｃｒｏ  ｐｌａｔｅ  ｍｉｘｅｒ  ＮＳ−Ｐ）で室温にて撹拌した後、ＥｎＳｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。化合物無添加のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を算出した。化合物無添加（対照）と比較した際に、１１９％以下の値を示すものを−、１２０％以上の値を示すものを○、１５０％以上の値を示すものを◎として第１１表及び第１２表に示す。試験未実施は空欄とした。
【０３１５】
［第１１表］
【０３１６】
【表１１】
2020120649.tif 000059
【０３１７】
［第１２表］
【０３１８】
【表１２】
2020120649.tif 000060
【０３１９】
本試験の結果、複数のがん細胞株においてｋ−１：Ｉ−１、ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｄ−１、及びｋ−１：Ｊ−１が３次元条件下で増殖活性を亢進させることが明らかになった。この際、低接着Ｕ底プレート、低接着平底プレートのどちらを用いてもがん細胞株は、スフェアを形成していた。
【０３２０】
［参考例７］ＭＤＣＫ細胞への作用１
イヌ腎臓尿細管上皮細胞（ＭＤＣＫ細胞、ＤＳファーマバイオメディカル社製）を１０％ ＦＢＳ及び１％ ＮＥＡＡ含有ＥＭＥＭ培地にて前培養した。冷Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）Ｍａｔｒｉｘ ＧＦＲ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を２４穴プレートに５０μＬずつ塗り広げ、３７℃にて１５分間インキュベートし固化させた。前述のＭＤＣＫ細胞を２００００ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度で培地に懸濁し、さらに冷Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）Ｍａｔｒｉｘ ＧＦＲを２０μＬ／ｍＬ加えて１ｍＬ／ウェルにて播種した。終濃度１０
μＭとなるように培地に溶解したｋ−１：Ｈ−７を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下、インキュベーターにて７日間培養した。対照（化合物無添加）として、ＤＭＳＯを終濃度０．１％となるよう添加した。７日後、ＰＢＳで洗浄後（１ｍＬ／ウェル）、４％ Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ／ＰＢＳ（和光純薬社製）を添加し（１ｍＬ／ウェル）、室温にて２０分間固定した。その後、上清を除去し、ＩＦバッファー（０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（シグマアルドリッチ社製）、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（シグマアルドリッチ社製）含有ＰＢＳ）を１ｍＬ／ウェル添加し３０分間静置し、除去した。浸透化バッファー（０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（シグマアルドリッチ社製）／ＰＢＳ）を１ｍＬ／ウェル添加し、室温で３０分間インキュベートした。上清を除去し、ＩＦバッファーにて５分置きに３回洗浄し、ブロッキングバッファー（１％ＢＳＡ（シグマアルドリッチ社製）／ＩＦバッファー）を０．５ｍＬ／ウェル添加して３０分間インキュベートした。上清を除去し、ブロッキングバッファーに抗βカテニン抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を１００倍希釈して２５０μＬ／ウェルで添加し、４℃、遮光にて一晩インキュベートした。翌日、ＩＦバッファーで５分置きに３回洗浄し、ブロッキングバッファーに２次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）とＰｈａｌｌｏｉｄｉｎ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を各々２５０倍希釈し２５０μＬ／ウェルにて添加し、室温、遮光下で６０分間インキュベートした。ＩＦバッファーで５分置きに３回洗浄後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を滴下し蛍光顕微鏡（Ａｒｒａ
ｙＳｃａｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にて観察及び解析を行った。
【０３２１】
本試験の結果、ＭＤＣＫ細胞がＭａｔｒｉｇｅｌ上で内腔を有するＣｙｓｔを形成する際に、化合物ｋ−１：Ｈ−７存在下でＣｙｓｔ１つあたりの面積がＣｏｎｔｒｏｌ対象を１００とした時２０％以上増大していることが明らかになった。第１３表にその結果を示した。
【０３２２】
［第１３表］
【０３２３】
【表１３】
2020120649.tif 000061
【０３２４】
［参考例８］ＭＤＣＫ細胞への作用２
イヌ腎臓尿細管上皮細胞（ＭＤＣＫ細胞、ＤＳファーマバイオメディカル社製）を１０％ ＦＢＳ及び１％ ＮＥＡＡ含有ＥＭＥＭ培地にて前培養した。冷Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）Ｍａｔｒｉｘ ＧＦＲ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を２４穴プレートに５０μＬずつ塗り広げ、３７℃にて１５分間インキュベートし固化させた。前述のＭＤＣＫ細胞を１００００ ｃｅｌｌｓ／ｍＬで培地に懸濁し、さらに冷Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）Ｍａｔｒｉｘ ＧＦＲを２０μＬ／ｍＬ加えて１ｍＬ／ウェルにて播種した。終濃度５μＭ及び１０μＭとなるように培地に溶解した化合物（ｋ−１：Ｉ−１またはｋ−１：Ｂ−１）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下、インキュベーターにて６日間培養した。対照（化合物無添加）として、ＤＭＳＯを終濃度０．１％となるよう添加した。６日後、Ｃｅｌｌ３ｉＭａｇｅｒ（スクリーン社製）にて形成したＣｙｓｔの大きさ及び個数を測定した。全体のＣｙｓｔのうち、７０μｍ以上のＣｙｓｔの割合を第１４表に示す。
【０３２５】
［第１４表］
【０３２６】
【表１４】
2020120649.tif 000062
【０３２７】
また、ＰＢＳで洗浄後（１ｍＬ／ウェル）、４％ Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ／ＰＢＳ（和光純薬社製）を添加し（１ｍＬ／ウェル）、室温にて２０分間固定した。その後、上清を除去し、ＩＦバッファー（０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（シグマアルドリッチ社製）、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（シグマアルドリッチ社製）含有ＰＢＳ）を１ｍＬ／ウェル添加し３０分間静置し、除去した。浸透化バッファー（０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（シグマアルドリッチ社製）／ＰＢＳ）を１ｍＬ／ウェル添加し、室温で３０分間インキュベートした。上清を除去し、ＩＦバッファーにて５分置きに３回洗浄し、ブロッキングバッファー（１％ＢＳＡ（シグマアルドリッチ社製）／ＩＦバッファー）を０．５ｍＬ／ウェル添加して３０分間インキュベートした。上清を除去し、ブロッキングバッファーに抗βカテニン抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を１００倍希釈して２５０μＬ／ウェルで添加し、室温で６０分間インキュベートした。ＩＦバッファーで５分置きに３回洗浄し、ブロッキングバッファーに２次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）とＰｈａｌｌｏｉｄｉｎ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を各々２５０倍希釈し２５０μＬ／ウェルにて添加し、室温、遮光下で６０分間インキュベートした。ＩＦバッファーで５分置きに３回洗浄後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を滴下し共焦点蛍光顕微鏡（ＦＶ１２００  ＩＸ８３、オリンパス社製）にて観察を行った。
【０３２８】
本試験の結果、ＭＤＣＫ細胞がＭａｔｒｉｇｅｌ上で内腔を有するＣｙｓｔを形成する際に、化合物ｋ−１：Ｉ−１、ｋ−１：Ｂ−１存在下で全体のＣｙｓｔのうち、７０μｍ以上のＣｙｓｔの割合が増大していることが明らかになった（表１３）。また、共焦点蛍光顕微鏡での観察の結果、化合物ｋ−１：Ｉ−１、又はｋ−１：Ｂ−１存在下で、正常なＣｙｓｔを形成していることが確認された（図１）。
【０３２９】
［参考例９］ヒト間葉系幹細胞への作用１
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ、東洋紡社製）を、ＭＦ−ｍｅｄｉｕｍ間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡社製）を用いた単層培養法（２Ｄ）にて前培養した。３次元培養法（３Ｄ）では、脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物にｈＭＳＣを懸濁した後、６ウェル平底超低接着表面プレート（コーニング社製、＃３４７１）に１．２×１０５ cells／２ｍＬ／ウェルとなるように播種した。２Ｄでは、ｈＭＳＣを脱アシル化ジェランガム不含培地組成物に懸濁した後、６ウェル平底プレート（コーニング社製、＃３５１６）に４．０×１０４ cells／２ｍＬ／ウェルとなるように播種した。引き続き、終濃度１０μＭとなるように、培地に溶解した化合物（ｋ−１：Ｈ−７またはｋ−１：Ｈ−１０）の溶液を添加し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターにて７日間培養した。対照として、ＤＭＳＯを終濃度０．１％となるよう添加した。７日後、３次元培養法ではウェルから細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄して上清を除去後、トリプシン０．２５ ｗ／ｖ ％トリプシン−１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（和光純薬工業社製）を添加して３７℃にて２〜５分間インキュベートしてスフェアを単細胞に分散させ、培地を添加、遠心して上清を除去した。その後、同培地で再懸濁した後、一部をトリパンブルー（和光純薬工業社製）で懸濁して全自動セルカウンターＴＣ２０（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）にて生細胞数をカウントした。
【０３３０】
単層培養法では細胞をＰＢＳ洗浄後、０．２５ｗ／ｖ％トリプシン−１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ溶液を添加して３７℃にて２〜５分間インキュベートして剥離し、培地を添加、遠心して上清を除去した。その後、同培地で再懸濁した後、一部をトリパンブルー（和光純薬工業社製）で懸濁してＴＣ−２０（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）にて生細胞数をカウントした。
【０３３１】
上記細胞懸濁液に、ＣＤ３４抗体（ＡＰＣ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、ＣＤ７３（ＢＶ４２１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、ＣＤ２９（ＢＢ５１５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を添加し、氷上で３０分間インキュベートした。２％ ＳＭバッファー（２％ ＦＢＳ／ＰＢＳ）で２回洗浄した後、１μｇ／ｍＬのＰｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）を含むＳＭを添加し、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ベクトン・ディッキンソン社製）にて解析を行った。第１５表に化合物無添加（対照）の細胞数を１としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を算出した。第１６表に無添加並びに化合物添加条件で３次元培養（３Ｄ）した細胞のＣＤ３４、ＣＤ７３、及びＣＤ２９の陽性率または陰性率を示した。
【０３３２】
［第１５表］
【０３３３】
【表１５】
2020120649.tif 000063
【０３３４】
［第１６表］
【０３３５】
【表１６】
2020120649.tif 000064
【０３３６】
本試験の結果、ｋ−１：Ｈ−７およびｋ−１：Ｈ−１０は、２次元及び３次元細胞培養条件でｈＭＳＣの細胞数を増加させる効果が認められた。３次元細胞培養条件では、ｈＭＳＣはスフェアを形成していた。その際、細胞表面マーカーであるＣＤ３４の陰性率、ＣＤ７３、及びＣＤ２９の陽性率は化合物添加によって変化しなかった（第１６表）。以上の結果より、ｋ−１：Ｈ−７およびｋ−１：Ｈ−１０はｈＭＳＣの未分化性を維持したまま細胞増殖を亢進させることが明らかになった。
【０３３７】
［参考例１０］ヒト間葉系幹細胞への作用２
骨髄由来ヒト間葉系幹細胞（ＢＭ−ｈＭＳＣ、プロモセル社製）を、間葉系幹細胞増殖培地（プロモセル社製）を用いた単層培養法（２Ｄ）にて前培養した。３次元培養法（３Ｄ）では、脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物にｈＭＳＣを懸濁した後、９６ウェル平底超低接着表面プレート（コーニング社製、＃３４７４）に６０００ cells／９０μＬ／ウェルとなるように播種した。また、ＥＺＳＰＨＥＲＥを用いた３次元培養法（ＥＺＳＰＨＥＲＥ）では、ｈＭＳＣを脱アシル化ジェランガム不含培地組成物に懸濁した後、９６ウェルＥＺＳＰＨＥＲＥプレート（旭テクノグラス社製、＃４８６０−９００）に２０００cells／９０μＬ／ウェルとなるように播種した。２Ｄでは、ｈＭＳＣを脱アシル化ジェランガム不含培地組成物に懸濁した後、９６ウェル平底プレート（コーニング社製、＃３５８５）に２０００cells／９０μＬ／ウェルとなるように播種した。引き続き、終濃度１μＭ、５μＭ、１０μＭ及び２０μＭとなるように、培地に溶解した化合物（ｋ−１：Ｉ−１、ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｄ−１、またはｋ−１：Ｊ−１）を１０μＬ／ウェル添加し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターにて４日間培養した。対照として、ＤＭＳＯを終濃度０．１％となるよう添加した。４日後、培養液に対してＡＴＰ試薬１００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、２分間プレートシェーカー（アズワン社製、Ｍｉｃｒｏ  ｐｌａｔｅ  ｍｉｘｅｒ  ＮＳ−Ｐ）で室温にて撹拌し、１０分間室温にて静置した後、Ｅｎｓｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。化合物無添加のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を算出し、その結果を第１７表に示す。
【０３３８】
［第１７表］
【０３３９】
【表１７】
2020120649.tif 000065
【０３４０】
本試験の結果、ｋ−１：Ｉ−１、ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｄ−１、及びｋ−１：Ｊ−１は、３次元細胞培養条件でＢＭ−ｈＭＳＣの増殖活性を亢進させることが明らかになった。３次元細胞培養条件では、ＢＭ−ｈＭＳＣはスフェアを形成していた。また、ｋ−１：Ｂ−１及びｋ−１：Ｊ−１は、２次元細胞培養条件においてもｈＭＳＣの増殖活性を亢進させることが明らかになった。
【０３４１】
［参考例１１］線維芽細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２への作用
マウス胚線維芽細胞Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２（ＤＳファーマバイオメディカル社製）は、１０（ｖ／ｖ）％ＦＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）とＬ−グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン安定化溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むＢＭＥ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて培養を行った。対数増殖期にある上記細胞をＰＢＳにて洗浄後、０．２５ｗ／ｖ ％トリプシン−１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（和光純薬工業社製）を添加して３７℃にて３分間インキュベートして剥離し、培地を添加、遠心して上清を除去した。
【０３４２】
前述の各種細胞を脱アシル化ジェランガム含有または不含の各培地に懸濁し（脱アシル化ジェランガム濃度は０．０１５ ｗ／ｖ ％、７００〜２０００ ｃｅｌｌｓ／９０ μＬ／ウェルの細胞濃度にて、９６穴低接着Ｕ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃４５２０、脱アシル化ジェランガム不含培地）に播種した（３Ｄ培養）。播種後、ＤＭＳＯに溶解させた化合物（ｋ−１：Ｉ−１、ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｄ−１、またはｋ−１：Ｊ−１）を、終濃度１μＭまたは５μＭとなるように、各培地に添加した。各化合物溶液の添加量は、１０μＬ／ウェルであった。対照としては培地に溶解したＤＭＳＯ溶液を添加した（ＤＭＳＯ終濃度０．１％）。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて４日間培養後、培養液に対してＡＴＰ試薬１００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、１５分間プレートシェーカー（アズワン社製、Ｍｉｃｒｏ  ｐｌａｔｅ  ｍｉｘｅｒ  ＮＳ−Ｐ）で室温にて撹拌した後、ＥｎＳｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。化合物無添加のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を算出した。化合物無添加（対照）と比較した際に、１１９％以下の値を示すものを−、１２０％以上の値を示すものを○、１５０％以上の値を示すものを◎として第１８表に示す。試験未実施は空欄とした。
【０３４３】
［第１８表］
【０３４４】
【表１８】
2020120649.tif 000066
【０３４５】
本試験の結果、線維芽細胞においてｋ−１：Ｉ−１、ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｄ−１、及びｋ−１：Ｊ−１が３次元条件下で増殖活性を亢進させることが明らかになった。この際、低接着Ｕ底プレートを用いたとき線維芽細胞は、スフェアを形成していた。
【０３４６】
［参考例１２］ハンギングドロップ法で培養した細胞への作用
ヒト上皮様細胞がん由来細胞株Ａ４３１（ＡＴＣＣ社製）は、１０％ ＦＢＳ及び１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（ＭＥＭ ＮＥＡＡ、和光純薬工業社製）含有ＥＭＥＭ（和光純薬工業社製））を用いて培養を行った。また、骨髄由来ヒト間葉系幹細胞（ＢＭ−ｈＭＳＣ、プロモセル社製）は、間葉系幹細胞増殖培地（プロモセル社製）を用いて培養を行った。対数増殖期にあるそれぞれの上記細胞をＰＢＳにて洗浄後、０．２５ｗ／ｖ ％トリプシン−1ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（和光純薬工業社製）を添加して３７℃にて３分間インキュベートして剥離し、培地を添加、遠心して上清を除去した。
引き続き、それぞれの細胞を上記培地に１０００００ ｃｅｌｌｓ／２ｍＬとなるように懸濁し、更にＤＭＳＯに溶解させた化合物（ｋ−１：Ｈ−１、ｋ−１：Ｈ−７、またはｋ−１：Ｂ−１）を、終濃度５μＭとなるように培地に添加した。本細胞懸濁液を３．５ｃｍディッシュ（ファルコン社製、＃３５１００８）のフタの裏面に１０μＬずつ１５滴播種し、液滴を作成した。この際、対照としてはＤＭＳＯを添加した培地（ＤＭＳＯ終濃度０．０５％）を１０μＬずつ１５滴播種した。このフタを２ｍＬのＰＢＳを添加した３．５ｃｍディッシュに戻し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて２日間培養した。培養した液滴を１．５ｍＬのチューブに回収し、最終容量が１５０μＬになるように培地を添加した。更にＡＴＰ試薬１５０μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し縣濁させ、１０分間室温で静置した後、Ｅｎｓｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。化合物無添加のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を第１９表及び第２０表に示す。
【０３４７】
［第１９表］
【０３４８】
【表１９】
2020120649.tif 000067
【０３４９】
［第２０表］
【０３５０】
【表２０】
2020120649.tif 000068
【０３５１】
本試験の結果、ｋ−１：Ｈ−１、ｋ−１：Ｈ−７、及びｋ−１：Ｂ−１は、ハンギングドロップ法で３次元細胞培養した条件においてもＡ４３１細胞株及び骨髄由来ヒト間葉系幹細胞の細胞数を増加させる効果が認められた。この際、Ａ４３１細胞株及び骨髄由来ヒト間葉系幹細胞はハンキングドロップ法で液滴の中にスフェアを形成していた。
【０３５２】
［参考例１３］ヒト多能性幹細胞（ｈｉＰＳ細胞）に対する作用
ｈｉＰＳ細胞株２５３Ｇ１（理化学研究所より分譲）は、ビトロネクチンＶＴＮ−Ｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）をコーティングしたディッシュ上にてｍＴｅＳＲ１（登録商標）培地（ステムセルテクノロジーズ社製）を用いて培養を行った。増殖期にある上記細胞をＰＢＳ（富士フイルム和光純薬社製）にて洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を添加して３７℃にて３分間インキュベートして剥離液を除去した後、培地を添加してピペッティングにより剥離した。この後、遠心して上清を除去した。
【０３５３】
前述の細胞を１０μＭのＹ−２７６３２（富士フイルム和光純薬社製）を含有する培地に懸濁し、１００００ ｃｅｌｌｓ／２００ μＬ／ウェルの細胞濃度にて、９６穴ＥＺＳＰＨＥＲＥプレート（ＡＧＣテクノグラス社製、＃４８６０−９００）に播種した。播種後、希釈したＤＭＳＯに溶解させた化合物（ｋ−１：Ｈ−１、ｋ−１：Ｈ−７、ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｄ−１、ｋ−１：Ｊ−１、またはｋ−１：Ｉ−１０）を、終濃度５μＭとなるように各培地に添加した。各化合物溶液の添加量は、２μＬ／ウェルであった。対照としては培地に溶解したＤＭＳＯ溶液を添加した（ＤＭＳＯ終濃度０．０５％）。毎日半量の培地交換を行い、合わせて化合物濃度が一定になるように各化合物溶液も添加した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて３日間培養後、培養上清液を１００μＬ除去した後、残った培養液に対してＡＴＰ試薬１００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、１５分間プレートシェーカー（アズワン社製、Ｍｉｃｒｏ  ｐｌａｔｅ  ｍｉｘｅｒ  ＮＳ−Ｐ）で室温にて撹拌した後、１５０μＬを９６穴プレート  平底  白色／透明（Ｆａｌｃｏｎ社製）に移し、ＥｎＳｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。ＤＭＳＯ添加のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を第２１表に示す。
【０３５４】
［第２１表］
【０３５５】
【表２１】
2020120649.tif 000069
【０３５６】
本試験の結果、ヒト多能性幹細胞においてｋ−１：Ｈ−１、ｋ−１：Ｈ−７、ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｄ−１、ｋ−１：Ｊ−１、及びｋ−１：Ｉ−１０が３次元条件下で増殖活性を亢進させることが明らかになった。
【０３５７】
［参考例１４］血管内皮細胞への作用
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）をＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）培地にて前培養（単層培養）を行った。対数増殖期にある上記細胞をＰＢＳ洗浄後、接着細胞はＤｅｔａｃｈＫｉｔ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を添加して３７℃にて３分間インキュベートして剥離し、培地を添加、遠心して同培地で再懸濁した。
【０３５８】
前述の細胞を脱アシル化ジェランガム含有または不含の各培地に懸濁し（脱アシル化ジェランガム濃度は０．０１５ ｗ／ｖ ％）、７００〜２０００ ｃｅｌｌｓ／９０ μＬ／ウェルの細胞濃度にて、９６穴低接着Ｕ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃４５２０、脱アシル化ジェランガム不含培地）、または低接着平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃３４７４、脱アシル化ジェランガム含有培地）に播種した（いずれも３Ｄ培養）。引き続き、ＤＭＳＯに溶解させた化合物（ｋ−１：Ｈ−１、ｋ−１：Ｈ−７、ｋ−１：Ｉ−１、ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｄ−１、またはｋ−１：Ｊ−１）を、終濃度５μＭまたは１０μＭとなるように、各培地に添加した。各化合物溶液の添加量は１０μＬ／ウェルであった。対照としては培地に溶解したＤＭＳＯ溶液を添加した（ＤＭＳＯ終濃度０．１％）。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて４日間培養後、４日目の培養液に対してＡＴＰ試薬１００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、１５分間プレートシェーカー（アズワン社製、Ｍｉｃｒｏ  ｐｌａｔｅ  ｍｉｘｅｒ  ＮＳ−Ｐ）で室温にて撹拌した後、ＥｎＳｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。化合物無添加のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を［第２２表］に示す。
【０３５９】
［第２２表］
【０３６０】
【表２２】
2020120649.tif 000070
【０３６１】
本試験の結果、ヒト臍帯静脈内皮細胞においてｋ−１：Ｈ−１、ｋ−１：Ｈ−７、ｋ−１：Ｉ−１、ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｄ−１、及びｋ−１：Ｊ−１が３次元条件下で増殖活性を亢進させることが明らかになった。この際、低接着Ｕ底プレート、低接着平底プレートのどちらを用いてもヒト臍帯静脈内皮細胞は、スフェアを形成していた。
【０３６２】
［参考例１５］動物細胞株への作用
各種動物細胞株を下記の通り各々の培地にて前培養（単層培養）を行った。チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株ＣＨＯ−Ｋ１（ＤＳファーマバイオメディカル社製、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）含有Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地（富士フイルム和光純薬社製））、アフリカミドリザル腎臓上皮由来細胞株Ｖｅｒｏ（ＪＣＲＢ細胞バンクより分譲、５％ＦＢＳ含有Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製））。対数増殖期にある上記細胞をＰＢＳ洗浄後、接着細胞は０．２５ｗ／ｖ ％トリプシン−１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（富士フイルム和光純薬社製）を添加して３７℃にて３分間インキュベートして剥離し、各々の培地を添加、遠心して同培地で再懸濁した。
【０３６３】
前述の各種動物細胞を脱アシル化ジェランガム含有または不含の各培地に懸濁し（脱アシル化ジェランガム濃度はＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地は０．０２ ｗ／ｖ ％、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地は０．０１５ ｗ／ｖ ％）、７００〜２０００ ｃｅｌｌｓ／９０ μＬ／ウェルの細胞濃度にて、９６穴低接着Ｕ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃４５２０、脱アシル化ジェランガム不含培地）、または低接着平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃３４７４、脱アシル化ジェランガム含有培地）に播種した（いずれも３Ｄ培養）。引き続き、ＤＭＳＯに溶解させた化合物（ｋ−１：Ｈ−１、ｋ−１：Ｈ−７、ｋ−１：Ｉ−１、ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｄ−１、またはｋ−１：Ｊ−１）を、終濃度５μＭまたは１０μＭとなるように、各培地に添加した。各化合物溶液の添加量は１０μＬ／ウェルであった。対照としては培地に溶解したＤＭＳＯ溶液を添加した（ＤＭＳＯ終濃度０．１％）。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて４日間培養後、４日目の培養液に対してＡＴＰ試薬１００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、１５分間プレートシェーカー（アズワン社製、Ｍｉｃｒｏ  ｐｌａｔｅ  ｍｉｘｅｒ  ＮＳ−Ｐ）で室温にて撹拌した後、ＥｎＳｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。化合物無添加のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を算出した。化合物無添加（対照）と比較した際に、１１９％以下の値を示すものを−、１２０％以上の値を示すものを○、１５０％以上の値を示すものを◎として第２３表及び第２４表に示す。
【０３６４】
［第２３表］
【０３６５】
【表２３】
2020120649.tif 000071
【０３６６】
［第２４表］
【０３６７】
【表２４】
2020120649.tif 000072
【０３６８】
本試験の結果、複数の動物細胞株においてｋ−１：Ｈ−１、ｋ−１：Ｈ−７、ｋ−１：Ｉ−１、ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｄ−１、及びｋ−１：Ｊ−１が３次元条件下で増殖活性を亢進させることが明らかになった。この際、低接着Ｕ底プレート、低接着平底プレートのどちらを用いても動物細胞株は、スフェアを形成していた。
【０３６９】
[実施例]
［エナンチオマーの取得］
前述の［化合物の合成例］で合成したｋ−１：Ｂ−１（ラセミ体）を下記分取条件に従ってＷａｔｅｒｓ社製超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）にて光学分割を行い、以下の２つのエナンチオマーを取得した。両エナンチオマーの比旋光度は、旋光度計Ｐ−１０２０（日本分光社製）を用いて測定した。また、エナンチオマーの立体配置（Ｒ体、Ｓ体）は、Ｘ線結晶構造解析によって決定した。
【０３７０】
化合物ＧＡ−００２Ａ（ｋ−１：Ｂ−１の左旋性エナンチオマー）；保持時間１１．９５分、分取量４７５．１ｍｇ、光学純度９９．９ｅｅ％、純度９９．０％、比旋光度[α]２２Ｄ  −１０．５（ｃ＝０．１０１９、エタノール）、立体配置Ｒ体
【０３７１】
化合物ＧＡ−００２Ｂ（ｋ−１：Ｂ−１の右旋性エナンチオマー）；保持時間１４．８５分、分取量４７４．０ｍｇ、光学純度９９．９ｅｅ％、純度９９．１％、比旋光度[α]２２Ｄ  ＋１２．６（ｃ＝０．１０１２、エタノール）、立体配置Ｓ体
＜分取条件＞
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＩＡ−３＜ダイセル社製、２０＊２５０ｍｍ、５μｍ＞、弱溶媒：ＣＯ２（７０％）、強溶媒：ＭｅＯＨ（３０％）、カラム温度：４０℃、総チャージ量：１ｇ、流速：１５ｍＬ／分
【０３７２】
〔エナンチオマーの合成〕
【０３７３】
【化４５】
2020120649.tif 000073
【０３７４】
（式中、Ｂｎはベンジル基を示す）
Ｄ−アラニンメチル塩酸塩（１５７）（１．４０ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）、３−ベンジルオキシフェニルボロン酸（１５８）（３．４３ｇ、１５．１ｍｍｏｌ）、酢酸銅（ＩＩ）一水和物（３．００ｇ、１５．１ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブ４Ａ（ＭＳ４Ａ；２０ｇ）を塩化メチレン（２００ｍＬ）に溶解させ、トリエチルアミン（４．１７ｍＬ、３０．１ｍｍｏｌ）を加えて酸素雰囲気下室温で２３時間撹拌した。反応溶液をセライトろ過し、ろ液を半分まで減圧下濃縮、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮した。得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１／９９〜１０／９０）にて精製し、１５９（５９５ｍｇ、２．０９ｍｍｏｌ、収率２１％）を黄色液体として得た。
【０３７５】
【化４６】
2020120649.tif 000074
【０３７６】
（式中、Ｂｎはベンジル基を示す）
上記のようにして得られた１５９（５９５ｍｇ、２．０９ｍｍｏｌ）をメタノール（２１ｍＬ）に溶解させ、パラジウム炭素エチレンジアミン複合体（２４１ｍｇ）を加えて水素雰囲気下、室温で３．５時間撹拌した。パラジウム炭素をろ別し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜３０／７０）にて精製し、１６０（４１３ｍｇ、２．１２ｍｍｏｌ、ｑｕａｎｔ．）を黄色液体として得た。
【０３７７】
【化４７】
2020120649.tif 000075
【０３７８】
上記のようにして得られた１６０（４１３ｍｇ、２．１２ｍｍｏｌ）をメタノール（４．２ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（１．０ｍＬ、２１ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で３．５時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮、トルエン共沸して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝１／９９〜１０／９０）にて精製し、１６１（３９１ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ、収率９５％）を褐色アモルファスとして得た。
【０３７９】
【化４８】
2020120649.tif 000076
【０３８０】
上記のようにして得られた１６１（７２ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）、２’，４’−ジヒドロキシ−３’−メチルプロピオフェノンｋ−１（６０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．６７ｍＬ）に溶解させ１００℃で３日撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝５／９５〜５０／５０）にて精製し、得られた精製物を蒸留水、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）／ヘキサン、蒸留水で順次懸濁洗浄して、ＧＡ−００５Ａ（ＺＸ−０１−Ｒ（４０．５ｍｇ、０．１１３ｍｍｏｌ、収率３４％））を薄茶色固体として得た。比旋光度は、旋光度計Ｐ−１０２０（日本分光社製）を用いて測定した。
1H-NMR(270MHz); ;δ13.65(s, 1H), 10.75(s, 1H), 9.70(s, 1H), 8.97(s, 1H), 7.25(d, J=8.1Hz, 1H), 6.83(t, J=8.1Hz, 1H), 6.39(d, J=8.1Hz, 1H), 6.15-5.95(m, 3H), 5.81(d, J=8.1Hz, 1H), 4.18(m, 1H), 2.78(q, J=8.1Hz, 2H), 1.95(s, 3H), 1.37(d, J=8.1Hz, 3H), 1.03(t, J=8.1Hz, 3H).
化合物ＧＡ−００５Ａ；光学純度９９．９ｅｅ％、純度９９．２％、比旋光度[α]２２Ｄ−１１．４（ｃ＝０．０２６４、エタノール）、立体配置Ｒ体
【０３８１】
［試験例１］光学異性体のＳＫＯＶ３細胞増殖に対する作用効果評価
ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）含有ＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地（シグマアルドリッチ社製）にて前培養（単層培養）を行った。対数増殖期にある上記細胞をＰＢＳ洗浄後、接着細胞は０．２５ｗ／ｖ ％トリプシン−１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（富士フイルム和光純薬社製）を添加して３７℃にて３分間インキュベートして剥離し、上記培地を添加、遠心して同培地で再懸濁した。
【０３８２】
特許文献１（ＷＯ２０１４／０１７５１３）の方法に従い、０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三昌株式会社製）及び１５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、３０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）を含有するＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地（シグマアルドリッチ社製）の組成物をＦＣｅＭ−ｓｅｒｉｅｓ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（和光純薬工業社製）にて調製した。次いで、上記で調製したＳＫＯＶ３細胞を上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に懸濁した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり２０００ ｃｅｌｌｓ／９０μＬ／ウェルになるように分注した（３次元培養（３Ｄ））。引き続き、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した化合物（ｋ−１：Ｂ−１（ラセミ体）、ＧＡ−００２Ａ、またはＧＡ−００２Ｂ）を上記培地にて希釈し、各化合物の終濃度が１、５、１０、２０μＭになるように、当該希釈液をそれぞれ１０μＬずつ添加した。一部のウェルにはコントロールとしてＤＭＳＯのみを添加した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で４日間培養した。４日目の培養液に対してＡＴＰ試薬１００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ, Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、２分間プレートシェーカー（アズワン社製、Ｍｉｃｒｏ  ｐｌａｔｅ  ｍｉｘｅｒ  ＮＳ−Ｐ）で室温にて撹拌した後に１０分静置した。１００μＬを９６ウェル平底白色プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃３９１２）に移し、Ｅｎｓｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。コントロールのＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を表２５に記載する。
【０３８３】
[第２５表]
【０３８４】
【表２５】
2020120649.tif 000077
【０３８５】
本試験の結果、ＳＫＯＶ３細胞を培養した際に、ｋ−１：Ｂ−１（ラセミ体）及びｋ−１：Ｂ−１の左旋性エナンチオマー体ＧＡ−００２Ａは細胞増殖促進作用を示し、ｋ−１：Ｂ−１の右旋性エナンチオマー体ＧＡ−００２Ｂは効果をほとんど示さなかった。
【０３８６】
［試験例２］本発明化合物のＳＫＯＶ３細胞増殖に対する作用評価
ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を１５％ウシ胎児血清（以下、ＦＢＳと略称する。Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）含有ＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地（シグマアルドリッチ社製）にて前培養（単層培養）を行った。対数増殖期にある上記細胞をＰＢＳ洗浄した。接着細胞は、０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシン−１ｍｍｏｌ／Ｌエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液（富士フイルム和光純薬社製）を添加して３７℃にて３分間インキュベートして、剥離した。上記培地を添加し、遠心して同培地で再懸濁した。
特許文献１（ＷＯ２０１４／０１７５１３）の方法に従い、０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三昌株式会社製）及び１５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、３０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）を含有するＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地（シグマアルドリッチ社製）の組成物をＦＣｅＭ−ｓｅｒｉｅｓ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（富士フイルム和光純薬社製）にて調製した。次いで、上記で調製したＳＫＯＶ３細胞を上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に懸濁した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）に１ウェル当たり２０００  ｃｅｌｌｓ／９０μＬ／ウェルになるように分注した（３Ｄ−ＦＣｅＭ）。同様に上記で調製した細胞を１５％ＦＢＳ／ＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地に懸濁し、９６ウェルＵ底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃４５１５、３Ｄ−Ｕ）に１ウェル当たり７００  ｃｅｌｌｓ／９０μＬ／ウェルになるように分注した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解したＧＡ−００５Ａを上記培地にて希釈し、終濃度が５μＭ、１０μＭになるように、当該希釈液をそれぞれ１０μＬずつ添加した。一部のウェルにはコントロールとしてＤＭＳＯのみを添加した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で４日間培養した。４日目の培養液に対してＡＴＰ試薬１００μＬ［ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ，  Ｐｒｏｍｅｇａ社製］を添加し、プレートシェーカー（Ｍｉｃｒｏ  ｐｌａｔｅ  ｍｉｘｅｒ  ＮＳ−Ｐ、アズワン社製）で室温にて２分間撹拌した後に１０分静置した。１００μＬを９６ウェル平底白色プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃３９１２）に移し、Ｅｎｓｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。コントロールのＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたとき、各々の終濃度における相対値を下記に記載する。
３Ｄ−ＦＣｅＭ；２２１％（５μＭ）、２０３％（１０μＭ）
３Ｄ−Ｕ；２９０％（５μＭ）、３１０％（１０μＭ）
【０３８７】
［試験例３］マウス腸管オルガノイド培養に対する作用
７週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスを日本チャールス・リバー社より購入した。馴化期間後、麻酔下にて小腸および結腸を摘出した。摘出した小腸、結腸からＩｎｔｅｓｔｉＣｕｌｔ（商標）Ｏｒｇａｎｏｉｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍのプロトコールに従ってクリプトを回収した。具体的には、１ｍＬの冷ＰＢＳで腸管内を洗浄した後に縦に切開し、１ｍＬ冷ＰＢＳで３回洗浄した。冷ＰＢＳで満たした１０ｃｍペトリデッシュに腸管を移して再度よく洗い、１５ｍＬ冷ＰＢＳを入れた５０ｍＬチューブに２ｍｍ断片に切りながら移した。１０ｍＬピペッターで断片を３回攪拌して３０秒間静置後（断片の沈降後）、上清を静かに除去し、これを１５回以上繰り返した。上清除去後、２５ｍＬのＧｅｎｔｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）にて１５分間（小腸）または２０分間（結腸）、室温で２０ｒｐｍで攪拌しながらインキュベーションした。静置して断片沈降後に上清を除去し、１０ｍＬの０．１％ＢＳＡ／冷ＰＢＳで３回攪拌し、断片沈降後に上清を取り、７０μｍのセルストレイナーを通してチューブに回収した。これをさらに３回繰り返してＦｌａｃｔｉｏｎ１〜４を作成した。４℃にて２９０ｇ×５分間遠心し、上清を除去して１０ｍＬの０．１％ＢＳＡ／冷ＰＢＳにて再度懸濁し、１５ｍＬチューブに移した。４℃にて２００ｇ×３分間遠心し、上清を除いてペレットを作成した。前述のペレットに１０ｍＬの冷ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を添加して再懸濁し、そのうち１ｍＬを６穴プレートに移して顕微鏡下で観察し、クリプトが多く含まれるＦｌａｃｔｉｏｎをそれぞれ決定した。懸濁液１０μＬに含まれるクリプト数を顕微鏡下でカウントして濃度を定め、８００クリプト／チューブとなるように１５ｍＬチューブに分注し、４℃、２００ｇ×５分間遠心した。上清を除き、２００μＬのＩｎｔｅｓｔｉＣｕｌｔ（商標）Ｏｒｇａｎｏｉｄ  Ｍｅｄｉｕｍを各チューブに添加し、攪拌した。さらに２００μＬ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ ＧＦＲ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）を添加し混ぜた後に、予め３７℃に温めた２４穴プレートに５０μＬずつ分注して３７℃インキュベーターで１０分間温め、ドーム状に固化させた。７５０μＬのＩｎｔｅｓｔｉＣｕｌｔ（商標）Ｏｒｇａｎｏｉｄ  Ｍｅｄｉｕｍを各ウェルに添加し、ＤＭＳＯに溶解したＧＡ−００２Ａ或いはＧＡ−００５Ａを終濃度１０μＭにて添加した（ＤＭＳＯ換算で０．０２５％以下）。この際、一部のウェルにはコントロールとしてＤＭＳＯのみを添加した。引き続き、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて静置培養し、２−３日おきに培地を交換した。経時的にＣｅｌｌ３ｉＭａｇｅｒ  ｄｕｏｓ（ＳＣＲＥＥＮホールディングス社）にてオルガノイドを画像解析した。画像解析には、培養１日目に播種クリプト数として直径３０−２００μｍのクリプト数を測定し、その後経時的に７０μｍ以上に成長したものをオルガノイドとして数え、クリプトからのオルガノイド形成率を算出した。その際、同時に計測したオルガノイドの直径平均を算出した。オルガノイド形成率（％）および平均直径（μｍ）を下表に示す。
【０３８８】
【表２６】
2020120649.tif 000078
【０３８９】
また、培養９日目の小腸オルガノイドおよび培養２１日目の結腸オルガノイドの培養上清を除去し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して、細胞から全ＲＮＡ（リボ核酸）を単離した。本ＲＮＡについて、タカラバイオ社ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを用いてｃＤＮＡを合成し、ＴａｑｍａｎＡｓｓａｙ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社）を用いた遺伝子発現解析を実施し、ＤＭＳＯ、ＧＡ−００２Ａ又はＧＡ−００５Ａを添加したオルガノイドにおける小腸、結腸或いは腸管特異的な遺伝子の発現量を解析した。更に、内部標準であるグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｇａｐｄｈ）の発現量との比較を行った。Ｇａｐｄｈの発現量を１とした際の相対的発現量が０．５以上確認された遺伝子とサンプルを以下に示す。
【０３９０】
小腸オルガノイド
小腸特異的遺伝子Ｌｙｚ１；    ＤＭＳＯ、ＧＡ−００２Ａ、ＧＡ−００５Ａ
結腸オルガノイド
結腸特異的遺伝子Ｍｕｃ２；    ＤＭＳＯ、ＧＡ−００２Ａ、ＧＡ−００５Ａ
小腸オルガノイド及び結腸オルガノイド
腸管特異的遺伝子Ｖｉｌ１；    ＤＭＳＯ、ＧＡ−００２Ａ、ＧＡ−００５Ａ
【０３９１】
以上の結果から、ＧＡ−００２Ａ及びＧＡ−００５Ａはマウス小腸及び結腸オルガノイドの形成率を大幅に改善し、平均直径の増大も認められた。また、形成された小腸及び結腸オルガノイドはそれぞれ部位特異的なマーカー遺伝子を発現していることが確認された。以上より、ＧＡ−００２Ａ及びＧＡ−００５Ａは腸管オルガノイドの形成を促進する効果を示すことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０３９２】
本発明によれば、細胞増殖の促進、スフェア形成の促進、オルガノイド形成の促進、およびＣｙｓｔ形成の促進のいずれかまたはこれらの任意の組合せを達成することができる。本発明により調製された細胞等は、例えば、創薬の分野において非常に有用である。
【図１】
2020120649.tif 000086