(57)【要約】【課題】広範な細胞に導入物質を導入する装置を提供する。【解決手段】細胞１００と、導入物質１１０とを含む混合物１２０に、パルス幅が５ｎｓｅｃ〜１００μｓｅｃ、かつ電界が１．０ｋＶ／ｃｍ〜３０ｋＶ／ｃｍである第一の電気パルスを印加する第一の電気パルス印加手段（第一の電源３１、第一の電気パルス生成部４１、出力制御部４４）と、第一の電気パルス印加後に、パルス幅が２００μｓｅｃ〜１ｓｅｃ、かつ電界が５０Ｖ／ｃｍ〜２，５００Ｖ／ｃｍである第二の電気パルスを混合物１２０に印加する第二の電気パルス印加手段（第二の電源３２、第二の電気パルス生成部４２、出力制御部４４）と、を有する細胞１００への物質導入装置１。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞と、導入物質とを含む混合物に、パルス幅が５ｎｓｅｃ〜１００μｓｅｃ、かつ電界が１．０ｋＶ／ｃｍ〜３０ｋＶ／ｃｍである第一の電気パルスを印加する第一の電気パルス印加手段と、
前記第一の電気パルス印加後に、前記混合物に、パルス幅が２００μｓｅｃ〜１ｓｅｃ、かつ電界が５０Ｖ／ｃｍ〜２，５００Ｖ／ｃｍである第二の電気パルスを印加する第二の電気パルス印加手段と、を有する細胞への物質導入装置。
【請求項２】
前記第二の電気パルス印加手段が、パルス幅および電圧を、所定の範囲で調整することができる調整手段を有する請求項１記載の物質導入装置。
【請求項３】
細胞と、導入物質とを含む混合物に、パルス幅が短く、かつ高い電圧の第一の電気パルスを印加する第一の電気パルス印加手段と、
前記第一の電気パルス印加後に、前記混合物に、パルス幅が２００μｓｅｃ〜１ｓｅｃ、かつ電界が５０Ｖ／ｃｍ〜２，５００Ｖ／ｃｍである第二の電気パルスを印加する第二の電気パルス印加手段と、を有し、
前記第二の電気パルス印加手段が、パルス幅および電圧を、所定の範囲で調整することができる調整手段を有する細胞への物質導入装置。
【請求項４】
前記調整手段が、パルス幅の最小値から最大値までの比（パルス幅の最大値／パルス幅の最小値）を３０倍以上の比となる範囲で設定できる請求項２または３に記載の物質導入装置。
【請求項５】
前記第一の電気パルス印加手段が、パルス幅と電界の積が、０．１ｍｓｅｃ・Ｖ／ｃｍ〜０．２ｓｅｃ・Ｖ／ｃｍである請求項１〜４のいずれか１項に記載の物質導入装置。
【請求項６】
前記第二の電気パルスの電荷、および／または、前記第一の電気パルスと前記第二の電気パルスとのインターバルを調整する他の調整手段を有する請求項１〜５のいずれか１項に記載の物質導入装置。
【請求項７】
細胞と、導入物質とを含む混合物に、パルス幅が５ｎｓｅｃ〜１００μｓｅｃ、かつ電界が１．０ｋＶ／ｃｍ〜３０ｋＶ／ｃｍである第一の電気パルスを印加する第一の電気パルス印加工程と、
前記第一の電気パルス印加後に、前記混合物に、パルス幅が２００μｓｅｃ〜１ｓｅｃ、かつ電界が５０Ｖ／ｃｍ〜２，５００Ｖ／ｃｍである第二の電気パルスを印加する第二の電気パルス印加工程と、を有する細胞への物質導入方法。
【請求項８】
前記第二の電気パルス印加工程が、パルス幅および電圧を、所定の範囲で調整する調整工程を有する請求項７記載の細胞への物質導入方法。
【請求項９】
細胞と、導入物質とを含む混合物に、パルス幅が短く、かつ高い電圧の第一の電気パルスを印加する第一の電気パルス印加工程と、
前記第一の電気パルス印加後に、前記混合物に、パルス幅が２００μｓｅｃ〜１ｓｅｃ、かつ電界が５０Ｖ／ｃｍ〜２，５００Ｖ／ｃｍである第二の電気パルスを印加する第二の電気パルス印加工程と、を有し、
前記第二の電気パルス印加工程が、パルス幅および電圧を、所定の範囲で調整する調整工程を有する細胞への物質導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞への物質導入装置、および細胞への物質導入方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞を形質転換等させるために様々な導入物質を導入する技術が種々検討されている。従来、マイクロインジェクションと呼ばれるガラス針を細胞に刺して導入する手法が検討されていたが、細胞に与える負荷が大きく、細胞が破壊されるなどの問題が生じる場合があった。細胞に導入物質を導入する手法として、電気的手法（電気穿孔法、エレクトロポレーション法）による導入方法が検討されている。
【０００３】
この電気的手法を用いるにあたって、細胞に物質導入効率を向上する目的で複数の電気パルスを組み合わせる方法が提案され、市販されている。例えば、特許文献１は、エレクトロポレーション法により動物細胞に外来遺伝子を導入するにあたり、前記動物細胞に、所定の電場強度の第１電気パルスを、熱量強度の合計が所定のものとなるように与えた後、所定の電場強度の第２電気パルスを、１パルス当たりの熱量強度が所定のものとなるように与えることを特徴とするエレクトロポレーション法による外来遺伝子導入法を開示するものである。
【０００４】
また、複数の電気パルスを組み合わせる方法としては、このほかにも、特許文献２の哺乳類の遺伝子改変方法等や、特許文献３の物質導入方法等、特許文献４の物質導入方法等が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−１４７３９９号公報
【特許文献２】特開２０１５−７０８２５号公報
【特許文献３】特許第６０１１８７３号公報
【特許文献４】特開２０１６−１０６５２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
近年、細胞の外壁である細胞膜に一時的な孔をあけるためのポアリングパルスと物質導入を促すトランスファーパルスを組み合わせたパルスを出力するエレクトロポレータが市販されている。このような市販装置を用いるにあたっては、各メーカーが推奨するプロトコールを用いて細胞への物質導入が試みられている。
【０００７】
しかしながら、そのパルスパラメータについては詳細が開示されていないことが多く、推奨条件として設定されている条件での使用しかできない場合が多い。このため、設定されている条件で導入できない場合、それらの細胞や導入物質は、導入に適さないと判断せざるを得ない。よって、細胞生存率と導入効率が向上されない細胞がいまだに数多く存在している。
係る状況下、本発明の目的は、広範な細胞に導入物質を導入する装置および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、下記の発明が上記目的に合致することを見出し、本発明に至った。すなわち、本発明は、以下の発明に係るものである。
【０００９】
＜Ａ１＞  細胞と、導入物質とを含む混合物に、パルス幅が５ｎｓｅｃ〜１００μｓｅｃ、かつ電界が１．０ｋＶ／ｃｍ〜３０ｋＶ／ｃｍである第一の電気パルスを印加する第一の電気パルス印加手段と、
前記第一の電気パルス印加後に、前記混合物に、パルス幅が２００μｓｅｃ〜１ｓｅｃ、かつ電界が５０Ｖ／ｃｍ〜２，５００Ｖ／ｃｍである第二の電気パルスを印加する第二の電気パルス印加手段と、を有する細胞への物質導入装置。
＜Ａ２＞  前記第二の電気パルス印加手段が、パルス幅および電圧を、所定の範囲で調整することができる調整手段を有する前記＜Ａ１＞記載の物質導入装置。
＜Ａ３＞  細胞と、導入物質とを含む混合物に、パルス幅が短く、かつ高い電圧の第一の電気パルスを印加する第一の電気パルス印加手段と、
前記第一の電気パルス印加後に、前記混合物に、パルス幅が２００μｓｅｃ〜１ｓｅｃ、かつ電界が５０Ｖ／ｃｍ〜２，５００Ｖ／ｃｍである第二の電気パルスを印加する第二の電気パルス印加手段と、を有し、
前記第二の電気パルス印加手段が、パルス幅および電圧を、所定の範囲で調整することができる調整手段を有する細胞への物質導入装置。
＜Ａ４＞  前記調整手段が、パルス幅の最小値から最大値までの比（パルス幅の最大値／パルス幅の最小値）を３０倍以上の比となる範囲で設定できる＜Ａ２＞または＜Ａ３＞に記載の物質導入装置。
＜Ａ５＞  前記第一の電気パルス印加手段が、パルス幅と電界の積が、０．１ｍｓｅｃ・Ｖ／ｃｍ〜０．２ｓｅｃ・Ｖ／ｃｍである＜Ａ１＞〜＜Ａ４＞のいずれかに記載の物質導入装置。
＜Ａ６＞  前記第二の電気パルスの電荷、および／または、前記第一の電気パルスと前記第二の電気パルスとのインターバルを調整する他の調整手段を有する＜Ａ１＞〜＜Ａ５＞のいずれかに記載の物質導入装置。
【００１０】
＜Ｂ１＞  細胞と、導入物質とを含む混合物に、パルス幅が５ｎｓｅｃ〜１００μｓｅｃ、かつ電界が１．０ｋＶ／ｃｍ〜３０ｋＶ／ｃｍである第一の電気パルスを印加する第一の電気パルス印加工程と、
前記第一の電気パルス印加後に、前記混合物に、パルス幅が２００μｓｅｃ〜１ｓｅｃ、かつ電界が５０Ｖ／ｃｍ〜２，５００Ｖ／ｃｍである第二の電気パルスを印加する第二の電気パルス印加工程と、を有する細胞への物質導入方法。
＜Ｂ２＞  前記第二の電気パルス印加工程が、パルス幅および電圧を、所定の範囲で調整する調整工程を有する＜Ｂ１＞記載の細胞への物質導入方法。
＜Ｂ３＞  細胞と、導入物質とを含む混合物に、パルス幅が短く、かつ高い電圧の第一の電気パルスを印加する第一の電気パルス印加工程と、
前記第一の電気パルス印加後に、前記混合物に、パルス幅が２００μｓｅｃ〜１ｓｅｃ、かつ電界が５０Ｖ／ｃｍ〜２，５００Ｖ／ｃｍである第二の電気パルスを印加する第二の電気パルス印加工程と、を有し、
前記第二の電気パルス印加工程が、パルス幅および電圧を、所定の範囲で調整する調整工程を有する細胞への物質導入方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の装置および方法によれば、広範な細胞に導入物質を導入することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明に用いる物質導入により印加する波形の模式図。
【図２】本発明に用いる物質導入装置の一実施形態の構成を示す概要図である。
【図３】本発明の細胞への物質導入のフローを示す図である。
【図４】本発明に関する物質導入実験の結果を示す図である。
【図５】本発明に関する物質導入実験の結果を示す図である。
【図６】本発明に関する物質導入実験の結果を示す図である。
【図７】本発明に関する物質導入実験の結果を示す図である。
【図８】本発明に関する物質導入実験の結果のマップを示す図である。
【図９】本発明に関する物質導入実験の結果のマップを示す図である。
【図１０】本発明に関する物質導入実験の結果を示す図である。
【図１１】本発明に関する物質導入実験の結果を示す図である。
【図１２】本発明に関する物質導入実験の結果を示す図である。
【図１３】本発明に関する物質導入実験の結果を示す図である。
【図１４】本発明に関する物質導入実験の結果を示す図である。
【図１５】本発明に関する物質導入実験の結果を示す図である。
【図１６】本発明に関する物質導入実験の結果を示す図である。
【図１７】本発明に関する物質導入実験の結果を示す図である。
【図１８】本発明に関する物質導入実験の結果を示す図である。
【図１９】本発明に関する物質導入実験の結果を示す図である。
【図２０】本発明に関する物質導入実験の結果を示す図である。
【図２１】本発明に関する物質導入実験の結果を示す図である。
【図２２】本発明に関する物質導入実験の結果を示す図である。
【図２３】本発明に関する物質導入実験の結果を示す図である。
【図２４】本発明に関する物質導入実験の結果を示す図である。
【図２５】本発明に関する物質導入実験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に本発明の実施の形態を詳細に説明するが、以下に記載する構成要件の説明は、本発明の実施態様の一例（代表例）であり、本発明はその要旨を変更しない限り、以下の内容に限定されない。なお、本明細書において「〜」という表現を用いる場合、その前後の数値を含む表現として用いる。
【００１４】
［本発明の第一の物質導入装置］
本発明の第一の細胞への物質導入装置（本発明の第一の物質導入装置）は、細胞と、導入物質とを含む混合物に、パルス幅が５ｎｓｅｃ〜１００μｓｅｃ、かつ電界が１．０ｋＶ／ｃｍ〜３０ｋＶ／ｃｍである第一の電気パルスを印加する第一の電気パルス印加手段と、前記第一の電気パルス印加後に、前記混合物に、パルス幅が２００μｓｅｃ〜１ｓｅｃ、かつ電界が５０Ｖ／ｃｍ〜２，５００Ｖ／ｃｍである第二の電気パルスを印加する第二の電気パルス印加手段と、を有する。
【００１５】
［本発明の第二の物質導入装置］
本発明の第二の細胞への物質導入装置（本発明の第二の物質導入装置）は、細胞と、導入物質とを含む混合物に、パルス幅が短く、かつ高い電圧の第一の電気パルスを印加する第一の電気パルス印加手段と、前記第一の電気パルス印加後に、前記混合物に、パルス幅が２００μｓｅｃ〜１ｓｅｃ、かつ電界が５０Ｖ／ｃｍ〜２，５００Ｖ／ｃｍである第二の電気パルスを印加する第二の電気パルス印加手段と、を有し、前記第二の電気パルス印加手段が、パルス幅および電圧を、所定の範囲で調整することができる調整手段を有する。
【００１６】
［本発明の第一の物質導入方法］
本発明の第一の細胞への物質導入方法（本発明の第一の物質導入方法）は、細胞と、導入物質とを含む混合物に、パルス幅が５ｎｓｅｃ〜１００μｓｅｃ、かつ電界が１．０ｋＶ／ｃｍ〜３０ｋＶ／ｃｍである極短幅の第一の電気パルスを印加する第一の電気パルス印加工程と、前記第一の電気パルス印加後に、前記混合物に、パルス幅が２００μｓｅｃ〜１ｓｅｃ、かつ電界が５０Ｖ／ｃｍ〜２，５００Ｖ／ｃｍである第二の電気パルスを印加する第二の電気パルス印加工程と、を有する。
【００１７】
［本発明の第二の物質導入方法］
また、本発明の第二の細胞への物質導入方法（本発明の第二の物質導入方法）は、細胞と、導入物質とを含む混合物に、パルス幅が短く、かつ高い電圧の第一の電気パルスを印加する第一の電気パルス印加工程と、前記第一の電気パルス印加後に、前記混合物にパルス幅が２００μｓｅｃ〜１ｓｅｃ、かつ電界が５０Ｖ／ｃｍ〜２，５００Ｖ／ｃｍである第二の電気パルスを印加する第二の電気パルス印加工程と、を有し、前記第二の電気パルス印加工程が、パルス幅および電圧を、所定の範囲で調整する調整工程を有する。
【００１８】
本発明の第一および第二の物質導入方法は、本発明の第一および第二の物質導入装置により行うことができ、それぞれ対応する構成は援用して用いることができる。また、本発明の第一の物質導入装置は、本発明の第一の物質導入方法と特に対応し、第二の物質導入装置は、本発明の第二の物質導入方法と特に対応する。
本発明の物質導入装置や物質導入方法によれば、広範な細胞に物質を導入することができる。また、高い細胞生存率と導入効率を両立させることができる。
【００１９】
本発明者らは、現在のエレクトロポレータでは比較的プラスミド等の遺伝子導入が困難とされているＨＬ−６０細胞を用いて、従来使用されていない極短幅の高電気パルスに、広い範囲の低電気パルスを組み合わせたものを印加することで、ＧＦＰ発現プラスミド導入の高効率化が見込めるパルスの組み合わせを見出した。本発明者らは、この実験から、次のような知見を得た。
（１）短幅の高電気パルスを用いることで、細胞への損傷を低減して効率よく物質を導入することができる。
（２）印加する電界の値とエネルギー値をもとに対象細胞がどのような状態（生死および遺伝子導入発現の有無）になるのかを詳細に調査した結果を分布図として表現したところ、細胞への物質導入に関する最適なパルスの組み合わせを、その分布図をもとに推定することができる。
このような知見から、組み合わせパルスを用いてマウス脾臓リンパ球へＳｉＲＮＡの導入も試みた。その結果、現在市販されているエレクトロポレータよりもはるかに高い再現性と導入効率を得られることが確認できた。また、これらの知見は組み合わせて利用することでより優れた生存率と導入効率の両立ができる。本発明によって、これまで導入が難しいとされている細胞種への物質導入の高効率化が図れる。
【００２０】
本発明は細胞への物質導入装置および方法に関する。本発明の物質導入にあたっては、細胞と、導入物質とを含む混合物に、所定の電気パルスを印加することで、導入物質を細胞に導入する。いわゆる電気穿孔法やエレクトロポレーション法、またそのための装置に関する。
【００２１】
細胞は、導入物質を導入する対象となる各種細胞である。細胞としては、微生物や動物細胞、植物細胞など広範な細胞を対象とすることができる。また、細胞の各種器官や組織の細胞を対象とでき、正常細胞や幹細胞、神経細胞、癌細胞、また株化細胞やプライマリー細胞などを対象とすることができる。例えば、プライマリー細胞やＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、株化細胞、浮遊細胞（リンパ球系細胞や癌細胞など）など、従来、導入物質の導入が困難と考えられていた細胞も対象とすることができる。
【００２２】
導入物質は、細胞に導入するための物質である。例えば、核酸や、たんぱく質、核酸とタンパク質の複合体、標識試薬、細胞内物質等の活性化剤や阻害剤などが挙げられる。通常は細胞膜や細胞壁と接しても細胞の外部から細胞内に含まれにくく、本発明により導入される任意の物質を導入物質に適宜採用することができる。これらは、形質転換や一過性発現、ゲノム編集、細胞活性や影響等の評価などの目的で導入される。例えば、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸としては、ｐｌａｓｍｉｄやｄｓＤＮＡ、ｓｓＯＤＮ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡなどがあげられる。タンパク質としてはＣａｓ９など、複合体としてはｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９  ＲＮＰなどがあげられる。タンパク質合成を阻害するものとしては、シクロヘキシミドやアクチノマイシンＤなどがあげられる。標識試薬としては、細胞染色用蛍光標識試薬や、酸化ストレス標識試薬などがあげられる。
【００２３】
混合物は、細胞と、導入物質を含む。また、この混合物は、さらに、細胞や導入物質の分散媒や溶媒等となる化合物を用いることが好ましい。この分散媒や溶媒等となる化合物は、液体や粘性物質等を用いることができる。例えば、水などの溶媒や、バッファー、液体培地などを用いることができる。
混合物における細胞や導入物質の濃度は、導入目的や各種類や組み合わせなどを鑑みて調整出来、特に制限されない。例えば細胞濃度を、１０2〜１０6ｃｅｌｌｓ／μＬ程度とすることが出来、導入物質濃度を０．０１〜１０μｇ／μＬ程度とすることができる。
【００２４】
混合物は、溶液等の流動性が高い状態で調整される場合が多い。このため、混合物は収容容器に収容して物質導入を行うことが好ましい。収容容器は、混合物を収容し、電気パルスを印加することができる容器である。収容容器は、従来からエレクトロポレーションに用いられている各種容器を用いることができる。例えば、キュベット電極ホルダーとキュベット電極を有するキュベット電極保持用容器を用いることができる。収容容器の容量は、導入目的や各種液量等を鑑みて適宜設定することができ、例えば２０〜８００μＬ程度の容量の容器を用いることができる。
【００２５】
［第一の電気パルス］
第一の電気パルス印加手段は、細胞と導入物質とを含む混合物に、パルス幅が短く、かつ高い電圧の第一の電気パルスを印加する。この第一の電気パルス印加手段は、詳しくは後述する第二の電気パルスよりもパルス幅が短く、かつ、高い電圧である。この第二の電気パルスとの比較は、その装置や方法を用いてその実験条件において設定される値より短く、かつ、高いものである。この第一の電気パルスは、いわゆるポアリングパルスとよばれるものを用いることができる。第一の電気パルスは、１回のみ印加するものでもよいし、複数回印加するものでもよい。複数回印加する場合、繰り返し同程度の電気パルスを印加してもよいし、次第に減衰するものや次第に増幅するものなど、パルス幅や電圧を変更してもよい。
【００２６】
第一の電気パルスのパルス幅は、例えば５ｎｓｅｃ〜１００μｓｅｃである。また、電界は、電界が１．０ｋＶ／ｃｍ〜３０ｋＶ／ｃｍである。電界は、電極間距離（ギャップ）を考慮して電圧から換算したものである。電極間距離は、例えば０．２ｃｍ〜２．０ｃｍから設定することができる。この電極間距離に応じて、電圧を設定する。例えば、電極間距離が０．２ｃｍの場合、電圧は、２００Ｖ〜５ｋＶとすることができる。この電圧は、絶対値であり、第一の電気パルスの最大値である。電気パルスは、正極性、負極性のいずれを用いてもよいが、その絶対値として、第二の電気パルスよりも高い電圧である。
【００２７】
パルス幅は短いほど熱量が低下し、細胞に与える損傷が少なくなると考えられ細胞生存率が向上しやすくなるため、５０μｓｅｃ以下が好ましく、３０μｓｅｃ以下がさらに好ましい。電界は、より高いほど、より短時間で十分な電気穿孔を行うことができると考えられるため１．５ｋＶ／ｃｍ以上がより好ましく、２．０ｋＶ／ｃｍ以上がさらに好ましい。
【００２８】
第一の電気パルスとして十分なエネルギーを印加するために、パルス幅が短いとき電界が比較的高いほうが好ましく、パルス幅が長いとき電界は比較的低いほうが好ましい。パルス幅（ｓｅｃ）と電界（Ｖ／ｃｍ）との積（ｓｅｃ・Ｖ／ｃｍ）を、第一の電気パルスの指標とすることができる。この積は、０．１ｍｓｅｃ・Ｖ／ｃｍ〜０．２ｓｅｃ・Ｖ／ｃｍの範囲内であることが好ましい。すなわち、例えば、パルス幅が５ｎｓｅｃのとき、電界は２０ｋＶ／ｃｍ以上が好ましく、パルス幅が１００μｓｅｃのとき、電界は２ｋＶ／ｃｍ以下が好ましい。
【００２９】
または、第一の電気パルスがナノオーダーのパルス幅であるときと、マイクロオーダーのパルス幅であるときとで、電界の範囲を決めてもよい。例えば、パルス幅がナノ秒オーダーのナノ秒パルスの場合として、パルス幅が５ｎｓｅｃ以上１０００ｎｓｅｃ（１μｓｅｃ）未満のとき、比較的高い電界が好ましいため、電界を、２．０ｋＶ／ｃｍ以上や、５．０ｋＶ／ｃｍ以上、１０ｋＶ／ｃｍ以上のように下限を設けてもよい。また、パルス幅がマイクロ秒オーダーのマイクロ秒パルスの場合として、パルス幅が１μｓｅｃ以上１００μｓｅｃ以下の時、比較的低い電界が好ましいため、２０ｋＶ／ｃｍ以下や、１０ｋＶ／ｃｍ以下、８ｋＶ／ｃｍ以下のように上限を設けてもよい。
【００３０】
第一の電気パルス印加手段は、パルス幅が５ｎｓｅｃ〜５００ｎｓｅｃ、かつ電界が５ｋＶ／ｃｍ〜３０ｋＶ／ｃｍである極短幅の第一の電気パルスを印加する第一の電気パルス印加手段を有するものとすることができる。これは本発明の第一および第二の細胞への物質導入装置のいずれの第一の電気パルス印加手段として用いることも好ましい。
このような極短幅の電気パルスを用いることで、電圧が高いため細胞に電気穿孔を安定して行うことができる一方で、パルス幅は短いため細胞全体に与える負荷は小さく、細胞が生存したままで電気穿孔できるものと考えられる。
【００３１】
第一の電気パルス、特に、５〜５００ｎｓｅｃや５〜２００ｎｓｅｃなどのナノ秒オーダーの高電圧矩形波パルスは、従来の半導体スイッチ（ＭＯＳＦＥＴやＩＧＢＴなど）では発生させることが困難である。このような高電圧矩形波パルスは、例えば、次のような構成で発生させることができる。分布定数回路の一種であるパルス形成線路を市販の同軸ケーブルを用いて製作することにより発生することができる。このとき、パルス形成線路のなかでもブルームライン型のパルス形成線路を採用することで出力電圧を２倍にする。さらに、複数（例えば５本）の同軸ケーブルを並列に用い製作しパルス発生装置の特性インピーダンスを２０Ω程度にすることで、実験時試験溶液に満たされたキュベット電極の低抵抗にも整合がとれるようにする。さらに、出力波形が実用に耐えうる矩形波状の波形になるように、短絡スイッチには高電圧大電流に対応でき、かつ高速短絡動作ができるように独自に設計された小型トリガスパークギャップスイッチを採用する。また、周辺機器に対する誤動作がないように、パルス発生装置を動作する際に用いるトリガ信号はすべてフォトカプラと光ファイバーによる光信号化とすることでノイズ耐量を大きく上げることができる。
【００３２】
第一の電気パルスの熱量は、電圧と電流、時間の積から求めることができる。収容容器（キュベット電極など）の抵抗と混合物の量（液量など）、第一の電気パルスの電気パルス幅から求められる。第一の電気パルスの熱量は、３ｍＪ／１００μＬ以上〜３００ｍＪ／１００μＬ以下が好ましい。熱量の下限は、５ｍＪ／１００μＬ以上がより好ましい。熱量の上限は、２５０ｍＪ／１００μＬ以下がより好ましい。熱量が大きくなると細胞にかかる負荷が大きく生存率が低下しやすいが、本発明の第一の電気パルスはこのような少ない熱量でも電気穿孔することができ、物質導入効率に優れたまま生存率も優れたものとすることができる。熱量は、第一の電気パルスのパルス幅に応じて設計してもよく、パルス幅が１０００ｎｓｅｃ（１μｓｅｃ）未満程度のナノ秒パルスの場合、３〜４５ｍＪ／１００μＬ程度としてもよい。また、パルス幅が１μｓｅｃ以上程度のマイクロ秒パルスの場合、２０〜３００ｍＪ／１００μＬ程度としてもよい。
【００３３】
［パルス間隔］
第一の電気パルス印加後、第二の電気パルス印加までのパルス間隔は、特に制限されない。パルス間隔は、例えば５０μｓｅｃ以上とすることができる。好ましくは１００μｓｅｃ以上や、２００μｓｅｃ以上、１ｍｓｅｃ以上、５ｍｓｅｃ以上である。第一の電気パルス印加後に、パルス間隔が短すぎると、第一の電気パルスによるポアリング効果が生じる前に第二の電気パルスによるトランスファーを行うものとなり、十分な物質導入ができない場合がある。
【００３４】
一方、その上限は、特に定めなくてもよいが、例えば、３０ｍｉｎ以下や１０ｍｉｎ以下、５ｍｉｎ以下としてもよい。
【００３５】
第一の電気パルスの効果は継続する傾向がみられるが、操作性や細胞の安定性の観点から、１ｍｉｎ以下や、３０ｓｅｃ以下、１０ｓｅｃ以下、１ｓｅｃ以下や、５００ｍｓｅｃ以下、１００ｍｓｅｃ以下のように上限を設けてもよい。
【００３６】
なお、第一の電気パルスの電界が高いほど、ポアリング効果が生じるまでの時間を空けたほうが良かったり、その効果が継続する傾向がみられる。他方、第一の電気パルスの電界が低いほど、ポアリング効果が直ちに生じて、その効果が比較的短い時間で減少する傾向がみられる。
【００３７】
このため、電界が高い場合として、電界が８．０ｋＶ／ｃｍ以上や、１０．０ｋＶ／ｃｍ以上、１２．０ｋＶ／ｃｍ以上などのようにより高い電界となるときは、パルス間隔（インターバル）を３０ｓｅｃ以上や、６０ｓｅｃ以上、１２０ｓｅｃ以上としてもよい。
一方、電界が低い場合として、電界が５．０ｋＶ／ｃｍ以下などのときは、パルス間隔（インターバル）を３０ｓｅｃ以下や、１０ｓｅｃ以下、１ｓｅｃ以下としてもよい。
【００３８】
［第二の電気パルス印加手段］
第二の電気パルス印加手段は、第一の電気パルス印加後に、混合物に、パルス幅が２００μｓｅｃ〜１ｓｅｃ、かつ電界が５０Ｖ／ｃｍ〜２，５００Ｖ／ｃｍである第二の電気パルスを印加する。このような第一の電気パルスよりもパルス幅が長く、電圧が低い電気パルスを印加することで第一の電気パルスで電気穿孔された細胞膜や細胞壁を、効率よく導入物質が通過して、細胞外から細胞内へ導入物質を導入することができる。この第二の電気パルスは、いわゆるトランスファーパルスである。第二の電気パルスは、１回のみ印加するものでもよいし、複数回印加するものでもよい。複数回印加する場合、繰り返し同程度の電気パルスを印加してもよいし、次第に電気パルスの電界が低減するものや次第に増加するものなど、パルス幅や電圧を変更してもよい。
【００３９】
第二の電気パルスのパルス幅の上限は、５００ｍｓｅｃ以下や、３００ｍｓｅｃ以下としてもよい。また、電界の上限は、２，０００Ｖ／ｃｍ以下や、１，８００Ｖ／ｃｍ以下としてもよい。
【００４０】
電界は、電極間距離（ギャップ）を考慮して電圧から換算したものである。電極間距離は、例えば０．５ｃｍ〜２．０ｃｍから設定することができる。この電極間距離に応じて、電圧を設定する。例えば、電極間距離が０．２ｍｍｍの場合、電圧は、１０Ｖ〜５００Ｖとすることができる。この電圧は、絶対値であり、第二の電気パルスの最大値である。電気パルスは、正極性、負極性のいずれを用いてもよいが、その絶対値として、第一の電気パルスよりも低い電圧である。
【００４１】
また、第二の電気パルスは、第一の電気パルスと反対の電荷であることが好ましい。よって、第一の電気パルスが正の電荷であるとき、第二の電気パルスは負の電荷とすることが好ましい。第一の電気パルスと、第二の電気パルスの電荷が異なるとき、原因は必ずしも明らかではないが、物質の導入効率が向上する傾向がある。
【００４２】
第二の電気パルスは、第一の電気パルスとの組み合わせによっては、第一の電気パルスと同じ電荷であることが好ましい場合もある。特に、５〜５００ｎｓｅｃや５〜２００ｎｓｅｃなどのナノ秒オーダーの高電圧矩形波パルスであり、電界が４．０ｋＶ／ｃｍ以上や４．５ｋＶ／ｃｍ以上のような高いとき、第二の電気パルスは、第一の電気パルスと同じ電荷の方が物質の導入効率が向上する場合がある。このため、１μｓｅｃ以上のパルス幅および／または３．０ｋＶ／ｃｍ以下の電界のときは、第一の電気パルスと第二の電気パルスとは反対の電荷としてもよい。
【００４３】
［調整手段］
本発明の第二の細胞への物質導入装置は、第二の電気パルス印加が、パルス幅、および電圧を、所定の範囲で調整することができる調整手段を有する。また、本発明の第一の細胞への物質導入装置も調整手段を有することが好ましい。
【００４４】
さらに、第一の電気パルスの電界やパルス幅によっては、第一の電気パルスと第二の電気パルスの電荷を同じものか、反対のものかに切り替えることが有効な場合がある。このため、調整手段は、さらに、第二の電気パルス印加にあたって、その電荷の調整手段も有することが好ましい。
【００４５】
第二の電気パルスの調整例について説明する。第二の電気パルスは、第二の電気パルス生成手段（コンデンサ等）への充電量（充電電圧）を、充電電圧の範囲が広範囲かつ微調整が可能である直流充電器により調整することで出力電圧を調整することができる。また高耐圧かつ高速なオンオフスイッチングが可能である半導体スイッチを採用しマイコンによるプログラム制御をすることで、負荷（キュベット電極）への出力時間を調整し、第二の電気パルスのパルス幅や電圧を調整することができる。このとき短時間のパルスや高い電圧でも矩形波出力ができる仕様の半導体素子を採用する。さらに装置内のコンデンサは、広い範囲（低電圧〜高電圧、短時間〜長時間）でも矩形波出力ができるように多数のコンデンサから構成されるコンデンサバンクを採用することができる。
【００４６】
上記の電圧は、事前に設計状態に応じて達成される値を求めておき、目盛りで制御したり、電子制御して任意の値を達成しやすいものとして設定することが好ましい。上記のパルス幅は、事前に設計状態に応じて達成される値を求めておき、目盛りで制御したり、電子制御したり、あるいは、事前に設定済みのプログラム番号などを機械的スイッチなどで選択し設定できることが好ましい。
【００４７】
第一の電気パルスで用いられるキロボルトオーダーの高い電圧から装置内を保護する機構がついており、また誤動作が起こらないように、パルス発生装置を動作する際に用いるトリガ信号はすべてフォトカプラと光ファイバーによる光信号化とすることでノイズ耐量を大きく上げることが好ましい。
【００４８】
本発明者らの知見によれば、第二の電気パルスのパルス幅が指数関数的に異なったり、電界が異なったりするとき、細胞への物質導入効率が大きく変化する場合があることがわかった。
【００４９】
（第二の電気パルスのパルス幅の調整の設定範囲）
このため、パルス幅の設定値を指数関数的に設定できるように、パルス幅の最小値から最大値までの比（パルス幅の最大値／パルス幅の最小値）を３０倍以上の比となる範囲で設定できることが好ましい。この範囲は、５０倍以上とすることが好ましく、１００倍以上が好ましく、２００倍以上がより好ましい。
【００５０】
また、第二の電圧のパルス幅の最大値と最小値との間で任意のパルス幅を選択して設定できるか、少なくとも３段以上の段階的に選択して設定できるものとすることが好ましい。この段階的な設定は、４段以上が好ましく、５段以上がより好ましい。この段階的に設定する各段階での設定値間の差は、パルス幅が短い設定値とパルス幅が長い設定値との比（パルス幅が長い設定値／パルス幅が短い設定値）を、１．５倍以上や２倍以上とするような段階的なものが好ましい。この比が離れすぎると、導入効率に優れた条件を見いだせない場合があるため、例えば、２０倍以下や、１５倍以下、１０倍以下で調整できる設定が設けられていることが好ましい。
【００５１】
例えば、パルス幅の最小値を３００μｓｅｃ、最大値を３００ｍｓｅｃとすると、この設定範囲は１０００倍であり、この範囲に３〜３．３倍ずつパルス幅が長くなる６段以上の段階的な設定のものとすることができる（例えば、３００μｓｅｃ、１ｍｓｅｃ、３ｍｓｅｃ、１０ｍｓｅｃ、３０ｍｓｅｃ、１００ｍｓｅｃ、３００ｍｓｅｃから選択して設定可能）。
【００５２】
（第二の電気パルスの電界の調整の設定範囲）
また、電界は５０Ｖ／ｃｍ〜２，５００Ｖ／ｃｍから、適宜設定できることが好ましいが、５０Ｖ／ｃｍ〜１００Ｖ／ｃｍ程度変化することで細胞への物質導入効率が大きく変化する場合がある。このため、電圧の設定可能範囲について、電圧の下限と上限との差をおよそ２００Ｖ／ｃｍ〜２，０００Ｖ／ｃｍ程度とし、その範囲内で２０Ｖ／ｃｍ〜１００Ｖ／ｃｍごとに電界を選択して設定できるものとすることが好ましい。
【００５３】
例えば、電界の最小値を１００Ｖ／ｃｍ、上限を５００Ｖ／ｃｍとして、その選択可能範囲を４００Ｖ／ｃｍに設定し、この範囲で５０Ｖ／ｃｍごとの設定が可能なものとすることができる（１００（以下、単位は「Ｖ／ｃｍ」）、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００から選択して設定可能）。なお、それぞれの物質導入装置において、電極間距離は一定の場合が多いため、電界は電極間距離の設定を鑑み、実質電圧で制御することができる。
【００５４】
このような調整手段により、パルス幅や電界（電圧）を調整して細胞へ物質導入するとき、対象とする細胞と導入物質とを含む混合物（混合液）は、第二の電気パルスの設定条件を変更するたびに取り替えて行い、適した導入条件を見出すことが好ましい。
【００５５】
また、前述の第二の電気パルスに関するパルス幅および電圧を、所定の範囲で調整する調整手段を「第一の調整手段」として、これと異なる調整を行う他の調整手段（「第二の調整手段」）を有するものとしてもよい。第二の調整手段は、第二の電気パルスの電荷、および／または、第一の電気パルスと第二の電気パルスとのインターバルを調整することができるものとすることができる。第二の電気パルスの電荷は、第一の電気パルスの電荷との組み合わせにより適した条件を検討するほうが有効な場合がある。また、第一の電気パルスと第二の電気パルスとのインターバルは第一の電気パルスの電界やパルス幅によっては、第二の電気パルスまでのインターバルを検討するほうが有効な場合がある。これらの検討を行うために、第二の調整手段は、これらの調整もできるものとしてもよい。
【００５６】
［第一の実施形態］
図１〜３を用いて、本発明の第一の実施形態にかかる物質導入装置および物質導入方法について説明する。図１は、第一の実施形態にかかる物質導入装置により印加する波形の模式図である。図２は、第一の実施形態に係る物質導入装置の概要を示す図である。図３は、第一の実施形態に係る物質導入装置により電圧を印加するフローチャートを示す図である。
【００５７】
図１に示す波形において、第一の電気パルスＰ１は、パルス幅ｔ１（ｓｅｃ）、電圧Ｖ１（Ｖ）の矩形波の電気パルスである。また、第二の電気パルスＰ２は、パルス幅ｔ２（ｓｅｃ）、電圧Ｖ２（Ｖ）の矩形波の電気パルスである。第一の電気パルスＰ１を印加し、パルス間隔ｔ３（ｓｅｃ）後、第二の電気パルスＰ２が印加される。また、第一の電気パルスＰ１は負の電荷であり、第二の電気パルスＰ２は正の電荷である。
【００５８】
図２は、物質導入装置１を示すものである。物質導入装置１は、細胞１００に、導入物質１１０を導入するための装置である。細胞１００および導入物質１１０は、混合液１２０内に含まれ、混合液１２０は、溶媒（分散媒）として水などを含む。混合液１２０は、収容容器２１に収容されており、この収容容器内の混合液には、電圧を印加するために一対の電極２２、２３が取り付けられている。電極２２、２３は、電源３、電気パルス制御部４に接続され、これらにより印加された電圧が収容容器２１内の混合液１２０に印加される。
電源３は、第一の電源３１と、第二の電源３２とを有し、第一の電源３１は第一の電気パルス生成部４１の電源であり、第二の電源３２は第二の電気パルス生成部４２の電源である。第一の電気パルス生成部４１は、パルス幅が短く電圧が高い第一の電気パルスを生成する。第二の電気パルス生成部４２は、パルス幅が長く電圧が低い第二の電気パルスを生成する。これらの電気パルスは、タイミング調整部４３によりそれぞれの電気パルスが発生するタイミングが調整され、図１に示したような波形となるように出力制御部４４にて制御されて電極２２、２３に電圧がかかるように印加される。第二の電気パルス生成部４２は、第二の電気パルス調節部４２１の設定に基づき、そのパルス幅や電圧を変更しながら設定された電気パルスを生成する。
【００５９】
図３は、本発明に係る物質導入装置により、細胞へ物質導入するフローチャートを示したものである。本発明の物質導入方法は、細胞と導入物質とを含む混合物に、第一の電気パルス印加工程Ｓ１を行い、その後、第二の電気パルス印加工程Ｓ２を行う。これにより、物質が導入され、第二の電気パルス印加工程Ｓ２完了後、直ちに、物質導入方法は終了としてもよい。なお、導入物質の種類や導入のための電気パルス印加の影響等を鑑みて、所定期間、培養や馴養を行って、導入物質の発現や効果を確認したり、細胞の生存可否を評価してもよい。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を変更しない限り以下の実施例に限定されるものではない。
【００６１】
［物質導入装置（１）の構成］
（ａ）第一の電気パルス印加手段
パルス幅：１０ｎｓｅｃ〜１０μｓｅｃの範囲で調整可能とした。
電圧：設定値７００Ｖ〜３．０ｋＶ（負極性（Ｎ）、正極性（Ｐ）の切替可能）の範囲で調整可能とした。なお、この電気パルスは、矩形波である。
（ｂ）電気パルス間隔
第一の電気パルスと、第二の電気パルスとの間隔を、１０μｓｅｃ〜１０ｓｅｃで調整可能とし、主に、１０μｓｅｃと１０ｍｓｅｃを用いた。
（ｃ）第二の電気パルス印加手段
パルス幅：パルス幅：１０μｓｅｃ〜１ｓｅｃの範囲で任意のパルス幅を選択して設定できるものとした。
電圧：３．５Ｖ〜４００Ｖの範囲で任意の電圧を選択して設定できるものとした。なお、この電気パルスは、矩形波である。
（ｄ）収容容器
電極間距離０．２ｃｍとなるように電極を配置したプラスチック製の収容容器（容量：１００μＬ）であるキュベット電極を用いた。なお、このキュベット電極にＨＬ−６０細胞および培養液を加えたときの抵抗は、オシロスコープによる電圧電流測定により測定した結果、約４０Ωであった。
なお、電極間距離０．２ｃｍから、電界は、「電圧（Ｖ）／電極間距離（ｃｍ）＝電界（Ｖ／ｃｍ）」の式から計算できる。例えば、電圧が１．０Ｖのとき、電界は、５．０Ｖ／ｃｍである。
【００６２】
［ＨＬ−６０細胞へのＧＦＰ導入試験］
対象細胞：ＨＬ−６０（Human promyelocytic leukemia cells)  ヒト由来、白血病細胞株
導入物質：ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein）  分子量約２７〜２９ｋＤａ
ＨＬ−６０を細胞として、導入物質ＧＦＰを導入した。ＨＬ−６０は、ＲＰＭＩ１６４０培地を分散媒として、細胞濃度約５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、ここに、ＧＦＰ濃度７０μｇ／ｍＬとなるように混合して調製した混合液を、収容容器に収容した。
この収容容器に収容された混合液に電気パルスを印加して培養したときの、細胞の状態（生存、死亡、形状）（明視野で顕微観察）、ＧＦＰ導入の有無（蛍光視野で顕微観察）を評価した。
【００６３】
［実験例１］（第一の電気パルス幅１０μｓｅｃの試験例）
図４に、第一の電気パルスのパルス幅を１０μｓｅｃとしたときの細胞への物質導入結果の概要を示す。図４の条件の上段は、第一の電気パルスの条件である。図４の条件の中段は、第一の電気パルスと、第二の電気パルスの間隔である。図４の条件の下段は、第二の電気パルスの条件である。
条件１の場合、「Ｐ１０μｓ・６００Ｖ」は、第一の電気パルスが、パルス幅１０μｓｅｃ、電圧６００Ｖ、正（Ｐ）の電気パルスであることを示す。また、「ｔ１００μｓ」は、パルス間隔が１００μｓｅｃであることを示す。また、「Ｐ１００ｍｓ・４０Ｖ」は、第二の電気パルスが、パルス幅１００ｍｓｅｃ、電圧４０Ｖ、正（Ｐ）の電気パルスであることを示す。
実験例１においては、１日培養後に、観察した。
【００６４】
図４に示すように、第一の電気パルスをパルス幅１０μｓｅｃ、電圧６００Ｖ〜８００Ｖとして、１００μｓｅｃ後に、第二の電気パルスをパルス幅１００ｍｓｅｃ、電圧４０Ｖ〜６０Ｖで印加することで、明視野観察結果からも明らかなように、細胞が培養されており、蛍光視野観察結果からも明らかなように、蛍光物質（ＧＦＰ）が導入されていることを確認した。
【００６５】
［実験例２］  （第一の電気パルスと第二の電気パルスの荷電変更の試験例）
図５に、実験例１の実験に準じて、第一の電気パルスと、第二の電気パルスの条件を変更したときの試験結果を示す。実験例２においては、第一の電気パルスは正（Ｐ）の電荷として、第二の電気パルスの電荷は負（Ｎ）の電荷とした。
【００６６】
図５に示すように、第一の電気パルスをパルス幅１０μｓｅｃ、電圧６００Ｖ〜８００Ｖの正の電気パルスとして、１００μｓｅｃ後に、第二の電気パルスをパルス幅１００ｍｓｅｃ、電圧４０Ｖ〜６０Ｖの負の電気パルスとして印加することで、明視野観察結果からも明らかなように、細胞が培養されており、蛍光視野観察結果らも明らかなように、蛍光物質（ＧＦＰ）が導入されていることを確認した。
また、実験例１（図４）よりも、実験例２のほうが、蛍光視野で確認される発光強度が強かった。よって、第一の電気パルスと、第二の電気パルスは、異なる電荷としたほうが、より導入物質が導入されやすいと考えられる。
【００６７】
［実験例３］  （単独の電気パルスの試験例）
図６に、パルス幅１０μｓｅｃの電気パルス単独の試験（条件１〜条件３）と、パルス幅１００ｍｓｅｃの電気パルス単独印加時の試験（条件４〜条件６）の試験結果を示す。
【００６８】
１０μｓｅｃで６５６Ｖ〜９８９Ｖの単独の電気パルスでは、物質導入をほぼ確認できなかった。１００ｍｓｅｃとすると、エネルギーが高くなるためか、６０Ｖ、８０Ｖで物質導入が一部確認されたが、個体数は少なく効率は悪かった。
【００６９】
［実験例４］  （極短幅の第一の電気パルス、繰り返し電気パルスの試験例）
図７に、条件１、２に、実験例１の実験に準じて、第一の電気パルスと、第二の電気パルスの条件を変更したときの試験結果を示す。条件１、２はパルス幅を２００ｎｓｅｃの極めて短いものとした実験例である。条件３は、パルス幅を１０μｓｅｃで電圧を４００Ｖとしたものである。また、これらのパルス間隔は、１０ｍｓｅｃとした。
なお、参考に、パルス幅を１．５ｍｓｅｃ、電圧を２０４Ｖとする電気パルスを、５０ｍｓｅｃの間隔で４回繰り返し印加する従来の装置に準じる試験を行った結果を、条件４に示す。
【００７０】
図７に示すように、第一の電気パルスをパルス幅２００ｎｓｅｃ、またはパルス幅１０μｓｅｃとしても、明視野観察結果からも明らかなように、細胞が培養されており、蛍光視野観察結果からも明らかなように、蛍光物質（ＧＦＰ）が導入されていることを確認した。
なお、パルス幅を１．５ｍｓｅｃ、電圧を２０４Ｖとする電気パルスを４回繰り返す（条件４）としても、蛍光物質の導入が確認された。
しかし、第一の電気パルスのパルス幅を２００ｎｓｅｃや１０μｓｅｃとして、第二の電気パルスのパルス幅を１００μｓｅｃとする条件１〜３のほうが、蛍光物質の導入が多かった。
さらに、第一の電気パルスのパルス幅をより短い２００ｎｓｅｃとする条件１、２のほうが、１０μｓｅｃの条件３よりも、明視野で観察される細胞密度が多く、細胞の生残率が高く、物質導入も安定したものとなった。
【００７１】
[実験例５]  （第二の電気パルスの条件検討）
第一の電気パルスを、パルス幅２００ｎｓｅｃ、電圧２ｋＶ（負）とし、パルス間隔１０ｍｓｅｃ後に、第二の電気パルスの条件を種々変更したときの影響を評価した。
第二の電気パルスは、パルス幅３００μｓｅｃ、１ｍｓｅｃ、３ｍｓｅｃ、１０ｍｓｅｃ、３０ｍｓｅｃ、１００ｍｓｅｃ、３００ｍｓｅｃと、段階的に設定できるものとした。さらに、電圧（電界）を段階的に調整することができるものした。
【００７２】
実験例５により、第二の電気パルスのパルス幅、電圧（電界）を変更して培養した観察結果等を、以下の判断基準で評価した。◎は、生存率が高く導入数が極めて高い条件だったものである。〇は、生存率が高く導入数が比較的高い条件だったものである。△は生存率が高く導入数がやや低い条件だったものである。×は生存率がやや低く導入数がやや低い条件だったものである。
【００７３】
パルス幅や、電界、エネルギーが、生存率や導入数に与える影響を、図８、９にマップとしてまとめた。図８、９に示すように、ＨＬ−６０細胞にＧＦＰを導入できるが、第二の電気パルスの条件によって、特に優れた導入条件も見いだせることが確認された。
この実験の結果、パルス幅の影響を受けて、生存率や、導入数は変動することがわかった。エネルギーと電圧が高い図中右上に行くと、生存率と導入数がいずれも低下する場合がある。一方で、生存率と導入数が低下する条件に近い範囲に生存率と導入数が向上する領域があることがわかった。これらの範囲を探索することができるように、パルス幅や電圧・エネルギーを調整する重要性が見出された。
【００７４】
[実験例６]  （培養期間の検討（１））
実験例４等に準じて、第一の電気パルスのパルス幅を５０ｎｓｅｃ（条件１）や１５ｎｓｅｃ（条件２）とした物質導入試験を行った。培養期間１．５日経過時の観察と、３日経過時の観察を行った結果を、図１０に示す。
図１０に示すように、第一の電気パルスのパルス幅を５０ｎｓｅｃ（条件１）や１５ｎｓｅｃ（条件２）とした場合、物質導入量も多く、３日経過後も、細胞は相当数生残しており、発光強度も高い状態が維持された。なお、参考に行ったパルス幅３０ｍｓｅｃ、電圧１０２Ｖのみを印加した培養の場合、３日程度でほぼ死亡したものと考えられ、発光もほとんど観察されなかった。
【００７５】
[実験例７]  （培養期間の検討（２））
図１１、１２に、第一の電気パルスを、パルス幅１ｍｓｅｃ（条件１）、３ｍｓｅｃ（条件２）、５０ｎｓｅｃ（条件３）として、培養したときの結果を示す。図１１は１日目、図１２は２日目である。
５０ｎｓｅｃで導入した細胞は、２日経過後も順調に培養しており、導入物質も多かった。
【００７６】
[実験例８]  （培養期間の検討（３））
図１３に、第一の電気パルスを、５０ｎｓｅｃ（条件１、２）として、培養したときの結果を示す。５０ｎｓｅｃで導入した細胞は、１日経過時点で発光強度が高く、４日経過後も高い発光強度が維持されていた。
【００７７】
［物質導入装置（２）の構成］
物質導入装置（１）の構成に基づき、一部仕様を変更して、以下のような条件で用いることができる物質導入装置（２）を設計した。
（ａ）第一の電気パルス印加手段
パルス幅：１０ｎｓｅｃ〜１０μｓｅｃの範囲で調整可能とした。
電圧：設定値７００Ｖ〜４．０ｋＶ（負極性（Ｎ）、正極性（Ｐ）の切替可能）の範囲で調整可能とした。なお、この電気パルスは、矩形波である。
（ｂ）電気パルス間隔
第一の電気パルスと、第二の電気パルスとの間隔を、１０μｓｅｃ〜２００ｓｅｃで調整可能とし、主に、１００μｓｅｃ、１００ｍｓｅｃ、１００ｓｅｃ、２００ｓｅｃを用いた。
（ｃ）第二の電気パルス印加手段
パルス幅：パルス幅：１０μｓｅｃ〜１ｓｅｃの範囲で任意のパルス幅を選択して設定できるものとした。
電圧：３．５Ｖ〜４００Ｖの範囲で任意の電圧を選択して設定できるものとした。なお、この電気パルスは、矩形波である。
（ｄ）収容容器
電極間距離０．２ｃｍとなるように電極を配置したプラスチック製の収容容器（容量：１００μＬ）であるキュベット電極を用いた。なお、このキュベット電極にＨＬ−６０細胞および培養液を加えたときの抵抗は、オシロスコープによる電圧電流測定により測定した結果、約４０Ωであった。
なお、電極間距離０．２ｃｍから、電界は、「電圧（Ｖ）／電極間距離（ｃｍ）＝電界（Ｖ／ｃｍ）」の式から計算できる。例えば、電圧が１．０Ｖのとき、電界は、５．０Ｖ／ｃｍである。
【００７８】
[実験例９]  （ナノ秒オーダー高電圧矩形波パルスに対する第二の電気パルスの電荷）
前記物質導入装置を用いて、以下の条件での細胞導入試験を行った。
なお、以下において、それぞれの条件の見方は、
「第一の電気パルス」→「電気パルス間隔」→「第二の電気パルス」である。
例えば、条件（ア）の場合、「「N」2kV・200ns」とは、第一の電気パルスについて、電荷が「Ｎ（負）」であり、電圧が２ｋＶであり、パルス幅が２００ｎｓｅｃである。
「（100us、100ms、100s）」とは、電気パルス間隔について、１００μｓｅｃ、１００ｍｓｅｃ、１００ｓの３点の条件変更を行ったものである。
「「P」50V・100ms」は、第二の電気パルスについて、電荷が「Ｐ（正）」であり、電圧が５０Ｖであり、パルス幅が１００ｍｓｅｃである。
【００７９】
・実験例９の条件
（ア）  「N」2kV・200ns  →（100us、100ms、100s）  →  「P」50V・100ms
（イ）  「N」2kV・200ns  →（100us、100ms、100s）  →  「P」70V・100ms
（ウ）  「N」2kV・200ns  →（100us、100ms、100s）  →  「N」50V・100ms
（エ）  「N」2kV・200ns  →（100us、100ms、100s）  →  「N」70V・100ms
【００８０】
細胞導入後、培養を１日行った後の観察結果を、図１４〜１７に示す。図１４は（ア）の条件、図１５は（イ）の条件、図１６は（ウ）の条件、図１７は（エ）の条件の観察結果である。なお、いずれにおいても最も左の図は対照試験として行った第二の電気パルスのみで行った実験結果である。
これらの観察結果から、試験条件ア、イよりもウ、エの方が、発光が強い傾向がみられ、電圧２ｋＶ（電界１０ｋＶ／ｃｍ）、パルス幅２００ｎｓｅｃの高電圧短幅矩形波を第一の電気パルスとするとき、第二の電気パルスの電荷を同じものとしたほうが良い可能性が示唆された。
【００８１】
[実験例１０]  （ナノ秒オーダー高電圧矩形波パルスに対する第二の電気パルスまでのインターバル）
実験例９に準じる条件で、電圧（電界）およびインターバルのさらなる検討を行った。条件は、以下の（ア−１）〜（エ−３）に示すものである。
【００８２】
（ア−１）  「N」2kV・100ns  →（100ms、200s）  →  「N」60V・100ms
（ア−２）  「N」3kV・100ns  →（100ms、200s）  →  「N」60V・100ms
（ア−３）  「N」4kV・100ns  →（100ms、200s）  →  「N」60V・100ms
【００８３】
（イ−１）  「N」2kV・100ns  →（100ms、200s）  →  「N」70V・100ms
（イ−２）  「N」3kV・100ns  →（100ms、200s）  →  「N」70V・100ms
（イ−３）  「N」4kV・100ns  →（100ms、200s）  →  「N」70V・100ms
【００８４】
（ウ−１）  「N」2kV・200ns  →（100ms、200s）  →  「N」60V・100ms
（ウ−２）  「N」3kV・200ns  →（100ms、200s）  →  「N」60V・100ms
【００８５】
（エ−１）  「N」1kV・200ns  →（100ms、200s）  →  「N」70V・100ms
（エ−２）  「N」2kV・200ns  →（100ms、200s）  →  「N」70V・100ms
（エ−３）  「N」3kV・200ns  →（100ms、200s）  →  「N」70V・100ms
【００８６】
培養１日目の観察結果を図１８〜２１に、培養３日目の観察結果を図２２〜２５に示す。図１８、２２は（ア−１）〜（ア−３）の条件、図１９、２３は（イ−１）〜（イ−３）の条件、図２０、２４は（ウ−１）〜（ウ−２）の条件、図２１、２５は（エ−１）〜（エ−３）の条件の観察結果である。
第一の電気パルスの電圧を高いものとするほど、インターバルを長いものとしたほうが、発光が強くなる傾向がみられた。第一の電気パルスの負荷に応じて、インターバルを長くする方が有効な場合があることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明の物質導入装置によれば、効率よく広範な細胞内に導入物質を導入することができ、産業上有用である。また本発明の物質導入方法は、ヒトや動物から取り出した細胞や、菌、植物細胞等を含む混合液等において、導入物質を導入することができ、産業上有用である。
【符号の説明】
【００８８】
１  物質導入装置
１００  細胞
１１０  導入物質
１２０  混合液
２１  収容容器
２２、２３  電極
３  電源
３１  第一の電源
３２  第二の電源
４  電気パルス制御部
４１  第一の電気パルス生成部
４２  第二の電気パルス生成部
４２１  第二の電気パルス調節部
４３  タイミング調整部
４４  出力制御部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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