(57)【要約】【課題】コンティニュアスフローＰＣＲにおいて、ＰＣＲ増幅効率の低下を防止する。【解決手段】本開示の温度調整装置は、第１の面を有し、核酸の変性温度帯に設定される第１の部材と、第２の面を有し、前記核酸のアニーリング温度帯に設定される第２の部材と、第３の面を有し、前記核酸の伸長温度帯に設定される第３の部材と、を備え、前記第１の面、前記第２の面及び前記第３の面を含む平面が存在し、前記第１の部材、前記第３の部材及び前記第２の部材は、互いに離間するように、前記平面に平行な第１の方向に沿ってこの順に配置され、前記平面に平行であり、前記第１の方向に直交する第２の方向における前記第３の面の長さは、前記第２の方向における前記第１の面の長さ及び前記第２の面の長さよりも短いことを特徴とする。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の面を有し、核酸の変性温度帯に設定される第１の部材と、
第２の面を有し、前記核酸のアニーリング温度帯に設定される第２の部材と、
第３の面を有し、前記核酸の伸長温度帯に設定される第３の部材と、を備え、
前記第１の面、前記第２の面及び前記第３の面を含む平面が存在し、
前記第１の部材、前記第３の部材及び前記第２の部材は、互いに離間するように、前記平面に平行な第１の方向に沿ってこの順に配置され、
前記平面に平行であり、前記第１の方向に直交する第２の方向における前記第３の面の長さは、前記第２の方向における前記第１の面の長さ及び前記第２の面の長さよりも短いことを特徴とする温度調整装置。
【請求項２】
前記第１の部材は、前記第１の方向に突出する第１の凸部を有し、
前記第２の部材は、前記第１の方向の逆方向に突出して前記第１の凸部と対向する第２の凸部を有し、
前記第３の部材は、前記第１の凸部及び前記第２の凸部の対向面間の領域外に配置されることを特徴とする請求項１記載の温度調整装置。
【請求項３】
複数の前記第３の部材をさらに備え、
前記第１の部材及び前記第２の部材は、前記第２の方向に延伸し、
前記複数の前記第３の部材は、前記第２の方向に沿って所定の間隔で配列されることを特徴とする請求項１記載の温度調整装置。
【請求項４】
前記第１の部材は、前記所定の間隔で前記第２の方向に配列され、前記第１の方向に突出する複数の第１の凸部を有し、
前記第２の部材は、前記所定の間隔で前記第２の方向に配列され、前記第１の方向の逆方向に突出して前記複数の第１の凸部と対向する複数の第２の凸部を有し、
前記複数の前記第１の凸部及び前記複数の前記第２の凸部と、前記複数の前記第３の部材とは、前記第２の方向において交互に配置されることを特徴とする請求項３記載の温度調整装置。
【請求項５】
前記第１の部材は、前記変性温度帯に設定されたヒートブロックに接続された第１の電極であり、
前記第２の部材は、前記アニーリング温度帯に設定されたヒートブロックに接続された第２の電極であり、
前記第３の部材は、前記伸長温度帯に設定されたヒートブロックに接続された第３の電極であることを特徴とする請求項１記載の温度調整装置。
【請求項６】
請求項１に記載の温度調整装置と、
核酸溶液の流路を有し、前記平面において前記温度調整装置に接するマイクロ流体デバイスと、を備え、
前記流路は、前記第１の方向に前記核酸溶液が流れる第１の流路と、前記第１の流路に接続され、前記第１の方向の逆方向に前記核酸溶液が流れる第２の流路と、を有し、
前記第１の流路の両端部は、それぞれ前記第１の部材及び前記第２の部材に接触し、
前記第２の流路の両端部は、それぞれ前記第１の部材及び前記第２の部材に接触し、
前記第２の流路の中間部は、前記第３の部材に接触することを特徴とする核酸増幅装置。
【請求項７】
前記流路は、前記第１の流路の端部及び前記第２の流路の端部を接続する屈曲部を有する蛇行流路であり、
前記第１の部材及び前記第２の部材は、前記屈曲部に接触することを特徴とする請求項６記載の核酸増幅装置。
【請求項８】
前記マイクロ流体デバイスは、前記第１の流路及び前記第２の流路の切り替えを制御するバルブと、前記流路の両端にそれぞれ接続されたポンプと、を備え、
前記核酸溶液は、前記バルブ及び前記ポンプの駆動により前記流路を往復することを特徴とする請求項６記載の核酸増幅装置。
【請求項９】
前記核酸溶液は、前記核酸に結合可能な蛍光標識プローブを含み、
前記核酸増幅装置は、前記核酸に結合した前記蛍光標識プローブからの蛍光を検出する検出部をさらに備えることを特徴とする請求項６記載の核酸増幅装置。
【請求項１０】
第１の面を有し、核酸の変性温度帯に設定される第１の部材と、
第２の面を有し、前記核酸のアニーリング温度帯に設定される第２の部材と、を備え、
前記第１の面及び前記第２の面を含む平面が存在し、
前記第１の部材及び前記第２の部材は、互いに離間するように、前記平面に平行な第１の方向に沿って配置され、
前記第１の部材は、前記第１の方向に突出する第１の凸部を有し、
前記第２の部材は、前記第１の方向の逆方向に突出して前記第１の凸部と対向する第２の凸部を有することを特徴とする温度調整装置。
【請求項１１】
前記第１の部材は、前記平面に平行であり、前記第１の方向と直交する第２の方向に所定の間隔で配列された複数の前記第１の凸部を有し、
前記第２の部材は、前記所定の間隔で前記第２の方向に配列された複数の前記第２の凸部を有することを特徴とする請求項１０記載の温度調整装置。
【請求項１２】
前記第１の部材は、前記変性温度帯に設定されたヒートブロックに接続された第１の電極であり、
前記第２の部材は、前記アニーリング温度帯に設定されたヒートブロックに接続された第２の電極であることを特徴とする請求項１０記載の温度調整装置。
【請求項１３】
請求項１０に記載の温度調整装置と、
核酸溶液の流路を有し、前記平面において前記温度調整装置に接するマイクロ流体デバイスと、を備え、
前記流路は、前記第１の方向に前記核酸溶液が流れる第１の流路と、前記第１の流路に接続され、前記第１の方向の逆方向に前記核酸溶液が流れる第２の流路と、を有し、
前記第１の流路の両端部は、それぞれ前記第１の部材及び前記第２の部材に接触し、
前記第２の流路の両端部は、それぞれ前記第１の部材及び前記第２の部材に接触し、
前記第１の凸部及び前記第２の凸部は、前記第１の流路にのみ接触することを特徴とする核酸増幅装置。
【請求項１４】
前記流路は、前記第１の流路の端部及び前記第２の流路の端部を接続する屈曲部を有する蛇行流路であり、
前記第１の部材及び前記第２の部材は、前記屈曲部に接触することを特徴とする請求項１３記載の核酸増幅装置。
【請求項１５】
前記マイクロ流体デバイスは、前記第１の流路及び前記第２の流路の切り替えを制御するバルブと、前記流路の両端にそれぞれ接続されたポンプと、を備え、
前記核酸溶液は、前記バルブ及び前記ポンプの駆動により前記流路を往復することを特徴とする請求項１３記載の核酸増幅装置。
【請求項１６】
前記核酸溶液は、前記核酸に結合可能な蛍光標識プローブを含み、
前記核酸増幅装置は、前記核酸に結合した前記蛍光標識プローブからの蛍光を検出する検出部をさらに備えることを特徴とする請求項１３記載の核酸増幅装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、温度調整装置及び核酸増幅装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸を増幅する方法としてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が広く用いられている。ＰＣＲ法は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）の連続した３つのステップを１サイクルとするサーマルサイクル（温度サイクル）を複数回繰り返して、目的のＤＮＡを増幅する方法である。
（Ａ）鋳型となる二本鎖ＤＮＡを熱変性して一本鎖ＤＮＡにするステップ（熱変性）。
（Ｂ）一本鎖ＤＮＡに相補的なプライマを結合するステップ（アニーリング）。
（Ｃ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを作用させ、プライマから相補鎖合成を行なうことにより二本鎖ＤＮＡを複製するステップ（伸長）。
【０００３】
図１（ａ）は、ＰＣＲのサーマルサイクルを示す模式図である。図１（ａ）に示すように、熱変性、アニーリング及び伸長の各ステップにおいて反応液（核酸溶液）の温度及び反応時間が制御される。典型的には、熱変性は９４℃程度、アニーリングは６０〜６５℃程度、伸長は７２℃程度で実施される。
【０００４】
従来、サーマルサイクルの反応温度及び反応時間を自動で制御するＰＣＲ装置として、サーマルサイクラが用いられている。サーマルサイクラにおいては、金属ブロックに設置されたマイクロプレートのウェルに対し、反応液が導入された反応チューブが挿入され、予め設定した条件となるように金属ブロックの温度が制御される。金属ブロックは、反応チューブやマイクロプレートを設置可能に設計され、温度ばらつきを低減するためにマイクロプレートと同等以上の体積を有している。これにより金属ブロックの熱容量が大きくなるため昇温や降温に時間がかかってしまい、ＰＣＲを実施するには少なくとも３０分以上、典型的には１〜２時間を要する。
【０００５】
ＰＣＲを高速化するため、あるいはＰＣＲ後に分析をそのまま実施するために、反応液が流れる流路を有するマイクロ流体デバイスを用いてＰＣＲを行なう方式が提案されている。例えば非特許文献１には、「変性」、「アニーリング」及び「伸長」に対応する３つの温度帯に設定されたヒートブロック上に蛇行流路を有するマイクロ流体デバイスを接触させ、流路の蛇行回数に応じたサーマルサイクルを実施する核酸増幅装置が記載されている。このような方式はコンティニュアスフローＰＣＲと呼ばれ、各ヒートブロックの温度を予め設定した所定の温度に保持するだけで良い。したがって、反応液の温度遷移がヒートブロックの加熱及び冷却の速度に依存せず、流路長と反応液の流速によって決定される。
【０００６】
また、変性とアニーリングの２つの温度帯を繰り返すサーマルサイクルでＰＣＲを行なう方式も提案されている。この方法は２ステップＰＣＲ（シャトルＰＣＲ）と呼ばれ、プライマのＴｍが高い場合に有用であり、アニーリングステップと伸長ステップとを同時に実施するため、時間の短縮ができる。２ステップＰＣＲを採用したコンティニュアスフローＰＣＲにおいては、アニーリングステップにおいて、耐熱性ポリメラーゼによる相補鎖合成がある程度行なわれる。あるいは、アニーリング温度帯から変性温度帯に温度が上昇する途中において、反応液の温度が伸長温度帯となる際に相補鎖合成が行なわれる。
【０００７】
特許文献１には、２ステップＰＣＲを採用したコンティニュアスフローＰＣＲを実施する核酸増幅装置において、蛇行流路を有するマイクロ流体デバイスの一端部が高温域（変性温度帯）となり、他端部が低温域（アニーリング温度帯）となるように、ヒータ及びクーラを設置することが記載されている（同文献の図１３等参照）。特許文献１の方式においても、各ヒートブロックの温度を変化させる必要がないため、流路を流れる反応液は、ヒートブロックの加熱や冷却速度に依存しない高速な温度遷移が可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１０／０１６７２８８号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Kopp et al., Science, vol. 280, 1998, p. 1046-1048
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、非特許文献１などに記載されるコンティニュアスフローＰＣＲにおいては、従来のサーマルサイクラと同じサーマルサイクルを実施できないという課題がある。
【００１１】
図１（ｂ）は、従来例に係る核酸増幅装置及びそのサーマルサイクルを示す模式図である。図１（ｂ）の上段の図に示すように、非特許文献１と同様にして蛇行流路１０２を有するマイクロ流体デバイス１０５に対し、変性温度帯、アニーリング温度帯及び伸長温度帯にそれぞれ設定したヒートブロック１１１〜１１３を接触させると、図１（ｂ）の下段の図に示すように、流路の対称性に起因して「変性、伸長、アニーリング、伸長、…」というサーマルサイクルになり、従来の「変性、アニーリング、伸長、…」のサイクルを再現できなくなる。
【００１２】
すなわち、変性温度帯のヒートブロックとアニーリング温度帯のヒートブロックとの間に伸長温度帯のヒートブロックを設置すると、アニーリングから変性に至る昇温時に反応液が伸長温度帯を通過するだけでなく、変性からアニーリングに至る降温時にも反応液が伸長温度帯を通過することになる。その結果、反応液が変性温度帯から伸長温度帯に移動する過程において、非特異的なハイブリダイゼーションでの伸長反応に起因する非特異的増幅が発生することがある。
【００１３】
また、特許文献１に記載の２ステップＰＣＲを採用したコンティニュアスフローＰＣＲにおいては、伸長反応が不十分となり増幅効率が低下してしまうという課題がある。
【００１４】
図１（ｃ）は、２ステップＰＣＲを採用した従来例に係る核酸増幅装置及びそのサーマルサイクルを示す模式図である。図１（ｃ）の上段の図に示すように、特許文献１と同様にして蛇行流路１０２を有するマイクロ流体デバイス１０５に対し、変性温度帯及びアニーリング温度帯にそれぞれ設定したヒートブロック１１１及び１１２を接触させると、コンティニュアスフローＰＣＲが高速化されているため、図１（ｃ）の下段の図に示すように、反応液が伸長温度帯となる時間が短くなってしまう。これにより、相補鎖合成が十分に行なわれず、ＰＣＲの増幅効率が低下する。これは、ＰＣＲの伸長ステップにおける相補鎖合成は、ＤＮＡポリメラーゼの結合と基質となるヌクレオチドの取り込みで構成されており、反応時間が短いと伸長が不十分になるためである。一方、ＰＣＲの変性ステップにおける二本鎖ＤＮＡの乖離と、アニーリングステップにおけるプライマの一本鎖ＤＮＡへのハイブリダイズは、１秒以内に完結する高速な反応であることが知られている。
【００１５】
特に、その場検査など大規模検査室以外でＰＣＲを実施する際には、高速化が要求される。しかしながら、上記のようにコンティニュアスフローＰＣＲの高速化による弊害として、非特異的増幅産物の発生やＰＣＲ増幅効率の低下が課題となっている。
【００１６】
そこで、本開示は、コンティニュアスフローＰＣＲにおいて、ＰＣＲ増幅効率の低下を防止する技術を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本開示の温度調整装置は、第１の面を有し、核酸の変性温度帯に設定される第１の部材と、第２の面を有し、前記核酸のアニーリング温度帯に設定される第２の部材と、第３の面を有し、前記核酸の伸長温度帯に設定される第３の部材と、を備え、前記第１の面、前記第２の面及び前記第３の面を含む平面が存在し、前記第１の部材、前記第３の部材及び前記第２の部材は、互いに離間するように、前記平面に平行な第１の方向に沿ってこの順に配置され、前記平面に平行であり、前記第１の方向に直交する第２の方向における前記第３の面の長さは、前記第２の方向における前記第１の面の長さ及び前記第２の面の長さよりも短いことを特徴とする。
【００１８】
本開示に関連する更なる特徴は、本明細書の記述、添付図面から明らかになるものである。また、本開示の態様は、要素及び多様な要素の組み合わせ及び以降の詳細な記述と添付される特許請求の範囲の様態により達成され実現される。
本明細書の記述は典型的な例示に過ぎず、本開示の特許請求の範囲又は適用例を如何なる意味に於いても限定するものではないことを理解する必要がある。
【発明の効果】
【００１９】
以上のように、本開示によれば、コンティニュアスフローＰＣＲにおいて、ＰＣＲ増幅効率の低下を防止することができる。
上記以外の課題、構成及び効果は、以下の実施の形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１（ａ）はＰＣＲのサーマルサイクルを示す模式図であり、図１（ｂ）は従来例に係る核酸増幅装置及びそのサーマルサイクルを示す模式図であり、図１（ｃ）は２ステップＰＣＲを採用した従来例に係る核酸増幅装置及びそのサーマルサイクルを示す模式図である。
【図２】図２（ａ）は第１の実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す平面図であり、図２（ｂ）は第１の実施形態に係るヒートブロックとマイクロ流体デバイスとが接触した状態を示す平面図である。
【図３】図３（ａ）は第１の実施形態に係るヒートブロックの構造を示す斜視図であり、図３（ｂ）は第１の実施形態に係るヒートブロックとマイクロ流体デバイスとが接触した状態を示す斜視図である。
【図４】第２の実施形態に係る温度調整装置の構成を示す斜視図である。
【図５】第３の実施形態に係るヒートブロックとマイクロ流体デバイスとが接触した状態を示す平面図である。
【図６】図６（ａ）は第３の実施形態に係るヒートブロックの構造を示す斜視図であり、図６（ｂ）は第３の実施形態に係るヒートブロックとマイクロ流体デバイスとが接触した状態を示す斜視図である。
【図７】第４の実施形態に係るヒートブロックとマイクロ流体デバイスとが接触した状態を示す平面図である。
【図８】図８（ａ）は第４の実施形態に係るヒートブロックの構造を示す斜視図であり、図８（ｂ）は第４の実施形態に係るヒートブロックとマイクロ流体デバイスとが接触した状態を示す斜視図である。
【図９】図９（ａ）は第５の実施形態に係るヒートブロックの構造を示す斜視図であり、図９（ｂ）は第５の実施形態に係る核酸増幅装置を示す斜視図である。
【図１０】図１０（ａ）は第６の実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す平面図であり、図１０（ｂ）は第６の実施形態に係るヒートブロックとマイクロ流体デバイスとが接触した状態を示す平面図である。
【図１１】図１１（ａ）は第６の実施形態に係るヒートブロックの構造を示す斜視図であり、図１１（ｂ）は第６の実施形態に係るヒートブロックとマイクロ流体デバイスとが接触した状態を示す斜視図である。
【図１２】実施例１及び比較例１における反応液の温度を示すグラフである。
【図１３】実施例１及び比較例１におけるＰＣＲ増幅産物を電気泳動した結果を示す図である。
【図１４】実施例２及び比較例２における反応液の温度を示すグラフである。
【図１５】実施例３及び比較例３における反応液の温度を示すグラフである。
【図１６】実施例３及び比較例３における反応液の温度を示すグラフである。
【図１７】実施例３、実施例３−２及び比較例３におけるＰＣＲ増幅産物を電気泳動した結果を示す図である。
【図１８】実施例４及び比較例４における反応液の蛍光強度をサイクルごとにプロットしたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、当業者に通常理解される意味と同じ意味を有する。以下、添付図面を参照して本開示の種々の実施形態について説明する。ただし、これらの実施形態は本開示を実現するための一例に過ぎず、本開示の技術的範囲を限定するものではない。また、各図において共通の構成については同一の参照番号が付されている。
【００２２】
［第１の実施形態］
＜マイクロ流体デバイスの構成＞
図２（ａ）は、第１の実施形態に係る核酸増幅装置のマイクロ流体デバイス５を示す平面図である。本実施形態に係る核酸増幅装置は、コンティニュアスフローＰＣＲにより核酸を増幅する装置であり、マイクロ流体デバイス５と、後述するヒートブロック１１及び１２を有する温度調整装置とを備える。
【００２３】
マイクロ流体デバイス５は、注入口１、蛇行流路２、排出口３及び位置合わせガイド４を備える。蛇行流路２は、反応液がＸ軸正方向に流れる流路（第１の流路）、反応液がＸ軸負方向に流れる流路（第２の流路）及びこれらを接続する屈曲部を有し、一定の長さ及び一定の間隔でＸ軸方向に蛇行する。反応液には、例えば鋳型ＤＮＡ、プライマ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、耐熱性ポリメラーゼ及び緩衝液などが含まれる。
【００２４】
注入口１及び排出口３は、それぞれ蛇行流路２の始端及び終端に設けられる。反応液は注入口１から蛇行流路２に導入され、排出口３から排出されて回収される。注入口１には、シリコンチューブなどのチューブ及びシリンジポンプなどのポンプが接続されていてもよく、ポンプによって圧力を印加することにより反応液を蛇行流路２に導入することができる。反応液は、蛇行流路２内を連続的に流れるように導入されてもよいし、液滴の状態で導入されてもよい。排出口３には、例えばシリコンチューブ等のチューブが接続されていてもよい。
【００２５】
マイクロ流体デバイス５の材質としては、通常用いられる樹脂（例えばシクロオレフィンコポリマー等）やガラスなどを用いることができる。蛇行流路２は、マイクロ流体デバイス５となる板状の基板に蛇行する溝を加工し、フィルム状の材料を貼り付けることにより作成できる。なお、図の簡略化のため、フィルムの図示は省略している。フィルムの材質は、基板の材質と同じであってもよいし、異なっていてもよい。フィルムは、例えば溝が形成された面全体を覆うように、熱融着などにより基板に貼り付けられる。あるいは、蛇行流路２は、蛇行する溝を形成した基板同士を貼り合わせることにより作成することもできる。以上のようにして蛇行流路２を形成した後、基板の上面において蛇行流路２の両端に対応する箇所に穴を形成して、それぞれ注入口１及び排出口３とする。
【００２６】
＜温度調整装置の構成＞
図２（ｂ）は、ヒートブロック１１及び１２とマイクロ流体デバイス５とが接触した状態を示す平面図である。図２（ｂ）において点線で示すように、ヒートブロック１１及び１２は互いに離間するように、Ｘ軸正方向（第１の方向）に沿って配置される。ヒートブロック１１の上面（第１の面）及びヒートブロック１２の上面（第２の面）はＸＹ平面（第１の面及び第２の面を含む平面）内にあり、マイクロ流体デバイス５の下面と接触する。
【００２７】
ヒートブロック１１（第１の部材）は、核酸の変性温度帯（例えば９４℃〜９８℃）に設定され、ヒートブロック１２（第２の部材）は、核酸のアニーリング温度帯（例えば５５℃〜６５℃）に設定される。このように、本実施形態の核酸増幅装置におけるＰＣＲのサーマルサイクルは、マイクロ流体デバイス５とヒートブロック１１及び１２とを接触させることにより、蛇行流路２を流れる反応液に温度場を形成することで実施される。マイクロ流体デバイス５とヒートブロック１１及び１２との位置関係の詳細については後述する。
【００２８】
図示は省略しているが、本実施形態の温度調整装置は、ヒートブロック１１及び１２の他に、ペルチェ素子などのヒータ、配線、温度センサ等、温度場の形成に必要な機構を備える。ヒートブロック１１及び１２の材質としては、熱伝導性の高い金属を用いることができ、例えばアルミニウム、銅、銀などを用いることができる。
【００２９】
なお、上述のように蛇行流路２が溝及びフィルムにより形成される場合は、フィルムが貼り付けられた面をヒートブロック１１及び１２に接触させることにより、ヒートブロック１１及び１２からの熱を効率的に反応液に伝えることができる。
【００３０】
位置合わせガイド４は、マイクロ流体デバイス５とヒートブロック１１及び１２とを接触させる際の位置決めを正確に行うための目印である。
【００３１】
図３（ａ）は、ヒートブロック１１及び１２の構造を示す斜視図である。図３（ａ）に示すように、ヒートブロック１１は、本体部１１ａと、複数の凸部１１ｂとを有する櫛状に形成され、ヒートブロック１２は、本体部１２ａと、複数の凸部１２ｂを有する櫛状に形成される。本体部１１ａ及び１２ａはＹ軸方向に延伸する略直方体状である。各凸部１１ｂは、本体部１１ａからＸ軸正方向に突出し、各凸部１２ｂは、本体部１２ａからＸ軸負方向に突出し、断熱層となる空気層を介して各凸部１１ｂと対向する。複数の凸部１１ｂ及び複数の凸部１２ｂは、それぞれ所定の間隔でＹ軸方向に配列する。複数の凸部１１ｂ及び複数の凸部１２ｂのＹ軸方向の配列間隔は、蛇行流路２の隣接する２つの流路の間隔の２倍とすることができる。これにより、各凸部１１ｂ及び１２ｂが、蛇行流路２の１つおきの流路に接触することができる。凸部１１ｂ及び凸部１２ｂの数は、図示された数に限定されず、蛇行流路２の蛇行回数に応じて適宜設定することができる。
【００３２】
＜核酸増幅装置の構成＞
図３（ｂ）は、ヒートブロック１１及び１２とマイクロ流体デバイス５とを接触させた状態を示す斜視図である。図３（ｂ）に示すように、マイクロ流体デバイス５は、蛇行流路２の直進部分がヒートブロック１１及び１２の配列方向（Ｘ軸方向）に沿うように、ヒートブロック１１及び１２上に配置される。また、マイクロ流体デバイス５は、注入口１から導入された反応液がまず変性温度帯のヒートブロック１１上を通過して、Ｘ軸正方向（第１の方向）に直進し、アニーリング温度帯のヒートブロック１２上を通過して蛇行し、Ｘ軸負方向（第１の方向の逆方向）に向かうように配置される。
【００３３】
このように、本実施形態においては、反応液が蛇行流路２をＸ軸正方向（第１の方向）に流れる際に、変性温度帯からアニーリング温度帯に降温し、蛇行流路２をＸ軸負方向（第１の方向の逆方向）に流れる際に、アニーリング温度帯から変性温度帯に昇温する。
【００３４】
本体部１１ａは、蛇行流路２のＸ軸負方向側の端部に接触し、本体部１２ａは、蛇行流路２のＸ軸正方向側の端部に接触する。凸部１１ｂ及び１２ｂは、蛇行流路２において反応液がＸ軸正方向に流れる直進部分に接触し、反応液がＸ軸負方向に流れる直進部分には、接触しない。すなわち、凸部１１ｂ及び１２ｂは、反応液が変性温度帯からアニーリング温度帯に移動する際に流れる流路（第１の流路）にのみ接触する。
【００３５】
換言すれば、反応液がＸ軸正方向に流れる流路（第１の流路）がヒートブロック１１及び１２に接触する長さは、Ｘ軸負方向に流れる流路（第２の流路）がヒートブロック１１及び１２に接触する長さよりも長い。これにより、反応液が変性温度帯からアニーリング温度帯に降温する際は、反応液は急激に降温し、反応液がアニーリング温度帯から変性温度帯に昇温する際は、反応液は徐々に昇温する。
【００３６】
なお、各凸部１１ｂ及び１２ｂのＹ軸方向の長さは、蛇行流路２のＹ軸方向の幅以上であり、各凸部１１ｂ及び１２ｂが接する流路に隣接する流路には接触しない程度の長さであればよい。
【００３７】
また、図３（ｂ）に示すように、ヒートブロック１２の本体部１２ａには、マイクロ流体デバイス５を貫通可能な位置合わせピン１４が設けられる。マイクロ流体デバイス５とヒートブロック１１及び１２との接触時には、位置合わせピン１４及び位置合わせガイド４により位置決めし、位置合わせピン１４をマイクロ流体デバイス５に貫通させる。これにより、ヒートブロック１１及び１２とマイクロ流体デバイス５とが正しい位置関係を保って接触し、ヒートブロック１１及び１２が形成する温度場を正しく蛇行流路２に伝達することができる。なお、位置合わせピン１４は、ヒートブロック１１にも同様に設けられていてもよい。
【００３８】
本実施形態の核酸増幅装置を用いたＰＣＲで得られる増幅産物の検出方法としては、反応液中に蛍光物質などで標識したプローブを含ませて流路を蛍光観察する方法や、反応液をマイクロ流体デバイスから回収して電気泳動を行う方法などを採用することができる。
【００３９】
＜技術的効果＞
以上のように、本実施形態の温度調整装置において、変性温度帯に設定されるヒートブロック１１が凸部１１ｂを有し、アニーリング温度帯に設定されるヒートブロック１２が１２ｂを有し、凸部１１ｂ及び１２ｂは、反応液が変性温度帯からアニーリング温度帯に降温される際に流れる流路にのみ接触する。このような構成を採用することにより、反応液が変性温度帯からアニーリング温度帯に降温する際は反応液が急激に降温し、アニーリング温度帯から変性温度帯に昇温する際は反応液が徐々に昇温する。これにより、コンティニュアスフローＰＣＲにおいて、非特異的増幅産物の生成を抑制することができる。
【００４０】
［第２の実施形態］
＜温度調整装置の構成＞
図４は、第２の実施形態に係る温度調整装置の構成を示す斜視図である。図４に示すように、本実施形態の温度調整装置は、プリント基板２００、ヒートブロック２１１及び２１２、櫛型電極２２１及び２２２（第１の部材及び第２の部材）、並びに金属配線２３１及び２３２を備える点で、第１の実施形態と異なっている。
【００４１】
ヒートブロック２１１及び２１２は、Ｙ軸方向に延伸する略直方体状に形成される。ヒートブロック２１１は、核酸の変性温度帯に設定され、ヒートブロック２１２は、核酸のアニーリング温度帯に設定される。図示は省略しているが、ヒートブロック２１１及び２１２は例えばペルチェ素子などのヒータに接触し、該ヒータからの熱がヒートブロック２１１及び２１２に伝達される。
【００４２】
プリント基板２００は、例えばＰＣＢ基板等により形成され、プリント基板２００には櫛型電極２２１及び２２２、並びに金属配線２３１及び２３２が設けられる。金属配線２３１は、ヒートブロック２１１及び櫛型電極２２１を接続し、金属配線２３２は、ヒートブロック２１２及び櫛型電極２２２を接続する。櫛型電極２２１及び２２２、並びに金属配線２３１及び２３２の材質は、例えば銅などの熱容量の小さい金属とすることができる。櫛型電極２２１及び２２２、並びに金属配線２３１及び２３２の熱容量は、プリント基板２００に比較して十分小さく、プリント基板２００の温度はほぼ室温となる。これにより、ヒートブロック２１１及び２１２の熱は櫛型電極２２１及び２２２に供給され、櫛型電極２２１及び２２２の形状に応じた温度場を形成することができる。
【００４３】
櫛型電極２２１の上面形状は第１の実施形態のヒートブロック１１の上面形状と同様であり、櫛型電極２２２の上面形状は、第１の実施形態のヒートブロック１２の上面形状と同様である。図示は省略しているが、マイクロ流体デバイスとして、第１の実施形態と同様のマイクロ流体デバイス５を使用することができ、マイクロ流体デバイス５を櫛型電極２２１及び２２２上に接触させることで、第１の実施形態と同様にして、蛇行流路２を流れる反応液の温度を調整し、ＰＣＲのサーマルサイクルを実施することができる。
【００４４】
＜技術的効果＞
以上のように、本実施形態の温度調整装置は、第１の実施形態のヒートブロック１１及び１２の上面形状と同様の形状を有する櫛型電極２２１及び２２２により、反応液の温度を調整する構成を採用している。これにより、第１の実施形態と同様の効果を奏することができる。また、櫛型電極２２１及び２２２の形状は微細な設計が可能であり、ヒートブロック２１１及び２１２を複雑な形状に形成する必要がないため、本実施形態の温度調整装置は製造が容易である。
【００４５】
［第３の実施形態］
図５は、第３の実施形態に係る核酸増幅装置を示す平面図である。図５に示すように、本実施形態の核酸増幅装置は、マイクロ流体デバイス５と、後述するヒートブロック３１１〜３１３を有する温度調整装置と、を備える。図５において、ヒートブロック３１１〜３１３とマイクロ流体デバイス５とが接触した状態を示している。マイクロ流体デバイス５については、第１の実施形態と同様であるため、説明を省略する。
【００４６】
＜温度調整装置の構成＞
図５に示すように、本実施形態の温度調整装置は、ヒートブロック３１１〜３１３（第１の部材〜第３の部材）を備える。図５において点線で示すように、ヒートブロック３１１の上面（第１の面）、ヒートブロック３１２の上面（第２の面）及びヒートブロック３１３の上面（第３の面）は、ＸＹ平面（第１の面、第２の面及び第３の面を含む平面）内にあり、マイクロ流体デバイス５の下面に接触する。ヒートブロック３１１、３１３及び３１２は、互いに離間するようにＸ軸正方向に沿ってこの順に配置される。マイクロ流体デバイス５は、蛇行流路２の直進部分がヒートブロック３１１、３１３及び３１２の配列方向（Ｘ軸方向）に沿うように、ヒートブロック３１１〜３１３と接触する。
【００４７】
ヒートブロック３１１（第１の部材）は、核酸の変性温度帯（例えば９４℃〜９８℃）に設定され、ヒートブロック３１２（第２の部材）は、核酸のアニーリング温度帯（例えば５５℃〜６５℃）に設定され、ヒートブロック３１３（第３の部材）は、核酸の伸長温度帯（例えば７０℃〜９０℃）に設定される。
【００４８】
図６（ａ）は、ヒートブロック３１１〜３１３の構造を示す斜視図である。図６（ａ）に示すように、ヒートブロック３１１及び３１２は、Ｙ軸方向に延伸する略直方体状に形成される。
【００４９】
ヒートブロック３１３は、Ｙ軸方向に延伸する略直方体状の本体部３１３ａと、複数の凸部３１３ｂ（第３の部材）とを備える。凸部３１３ｂは、本体部３１３ａからＺ軸正方向に突出し、所定の間隔でＹ軸方向に配列する。凸部３１３ｂのＹ軸方向の配列間隔は、蛇行流路２の隣接する２つの流路の間隔の２倍とすることができる。これにより、凸部３１３ｂは、蛇行流路２の１つおきの流路に接触することができる。
【００５０】
Ｙ軸方向における各凸部３１３ｂの上面の長さは、Ｙ軸方向におけるヒートブロック３１１及び３１２の長さよりも短い。また、各凸部３１３ｂの上面のＹ軸方向の長さは、蛇行流路２のＹ軸方向の幅以上とすることができ、各凸部３１３ｂが接する流路に隣接する流路には接触しない程度の長さであればよい。凸部３１３ｂの数は、図示する数に限定されず、蛇行流路２の蛇行回数に応じて適宜設定することができる。
【００５１】
＜核酸増幅装置の構成＞
図６（ｂ）は、ヒートブロック３１１〜３１３とマイクロ流体デバイス５とを接触させた状態を示す斜視図である。図６（ｂ）に示すように、ヒートブロック３１１は、蛇行流路２のＸ軸負方向側の端部に接触し、ヒートブロック３１２は、蛇行流路２のＸ軸正方向側の端部に接触する。各凸部３１３ｂは、反応液がＸ軸負方向に流れる流路（第２の流路）の中間部にのみ接触する。また、マイクロ流体デバイス５は、注入口１から導入された反応液がまず変性温度帯のヒートブロック３１１上を通過して、Ｘ軸正方向（第１の方向）に直進し、アニーリング温度帯のヒートブロック３１２上を通過して蛇行し、Ｘ軸負方向（第１の方向の逆方向）に直進し、伸長温度帯のヒートブロック３１３上を通過するように配置される。
【００５２】
反応液は、変性温度帯のヒートブロック３１１上を通過した後アニーリング温度帯のヒートブロック３１２に到達するまでは、ヒートブロック３１１〜３１３のいずれとも接触しておらず、断熱層として作用する空気と接している。したがって、反応液の温度は、図１（ｃ）に示す従来の２つのヒートブロックによるコンティニュアスフローＰＣＲと同様に降下する。一方、反応液は、アニーリング温度帯のヒートブロック３１２上を通過して変性温度帯のヒートブロック３１１に向かって移動する際に、途中で伸長温度帯に設定したヒートブロック３１３上を通過する。したがって、図１（ｂ）に示す従来の３つのヒートブロックによるコンティニュアスフローＰＣＲと同様に、反応液の温度は、アニーリング温度帯から変性温度帯に昇温する際に、伸長温度帯を経て上昇する。
【００５３】
また、マイクロ流体デバイス５とヒートブロック３１１〜３１３との接触時には、第１の実施形態と同様に、位置合わせピン１４及び位置合わせガイド４により位置決めすることができる。
【００５４】
なお、本実施形態において、ヒートブロック３１３の各凸部３１３ｂの温度を伸長温度帯に設定することができればよく、必ずしも本体部３１３ａを有している必要はない。
【００５５】
＜技術的効果＞
以上のように、本実施形態の温度調整装置は、伸長温度帯に設定され、凸部３１３ｂを有するヒートブロック３１３を備え、凸部３１３ｂは、反応液がアニーリング温度帯から変性温度帯に昇温される流路の中間部に接触する。このような構成を採用することにより、反応液がアニーリング温度帯から変性温度帯に昇温する途中において、伸長温度帯となる時間を十分に確保することができる。これにより、コンティニュアスフローＰＣＲにおいて、ＰＣＲ増幅効率の低下を防止することができる。
【００５６】
［第４の実施形態］
図７は、第４の実施形態に係る核酸増幅装置を示す平面図である。図７に示すように、本実施形態の核酸増幅装置は、マイクロ流体デバイス５と、第１の実施形態のヒートブロック１１及び１２と、第３の実施形態のヒートブロック３１３とを備える。マイクロ流体デバイス５については、第１の実施形態と同様であるため、説明を省略する。
【００５７】
＜温度調整装置の構成＞
図８（ａ）は、ヒートブロック１１、１２及び３１３を示す斜視図である。ヒートブロック１１及び１２の構造については、第１の実施形態の通りであり、ヒートブロック３１３の構造については、第３の実施形態の通りである。図８（ａ）に示すように、ヒートブロック３１３の凸部３１３ｂ（第３の部材）は、凸部１１ｂ及び１２ｂの対向面の間の領域外に配置される。すなわち、凸部１１ｂ及び１２ｂと、凸部３１３ｂとは、Ｙ軸方向において交互に配置される。なお、凸部３１３ｂのＸ軸方向の長さは、凸部１１ｂと凸部１２ｂとの間隔より長くてもよいし、短くてもよい。
【００５８】
＜核酸増幅装置の構成＞
図８（ｂ）は、ヒートブロック１１、１２及び３１３とマイクロ流体デバイス５とが接触した状態を示す斜視図である。図８（ｂ）に示すように、凸部１１ｂ及び１２ｂは、蛇行流路２において反応液がＸ軸正方向に流れる直進部分に接触し、反応液がＸ軸負方向に流れる直進部分には、接触しない。したがって、凸部１１ｂ及び１２ｂは、反応液が変性温度帯からアニーリング温度帯に降温される流路（第１の流路）にのみ接触する。
【００５９】
また、ヒートブロック３１３の凸部３１３ｂは、蛇行流路２において反応液がＸ軸負方向に流れる流路（第２の流路）の中間部に接触する。すなわち、凸部３１３ｂは、反応液がアニーリング温度帯から変性温度帯に昇温される流路の中間部にのみ接触する。これにより、反応液が変性温度帯からアニーリング温度帯に降温する際は、反応液の温度は急激に降下し、反応液がアニーリング温度帯から変性温度帯に昇温する際は、伸長温度帯を経て昇温する。
【００６０】
＜技術的効果＞
以上のように、本実施形態の温度調整装置において、変性温度帯のヒートブロック１１が凸部１１ｂを有し、アニーリング温度帯のヒートブロック１２が凸部１２ｂを有し、凸部１１ｂ及び１２ｂは、反応液が変性温度帯からアニーリング温度帯に降温される際に流れる流路にのみ接触する。また、本実施形態の温度調整装置は、伸長温度帯に設定され、凸部３１３ｂを有するヒートブロック３１３を備え、凸部３１３ｂは、反応液がアニーリング温度帯から変性温度帯に昇温される流路の中間部に接触する。このような構成を採用することにより、非特異的増幅産物の生成を抑制し、ＰＣＲ増幅効率の低下を防止することができる。
【００６１】
［第５の実施形態］
＜温度調整装置の構成＞
図９（ａ）は、第５の実施形態に係る温度調整装置を示す斜視図である。図９（ａ）に示すように、本実施形態の温度調整装置は、ヒートブロック５１１及び５１２を備える。ヒートブロック５１１は、核酸の変性温度帯に設定され、ヒートブロック５１２は、核酸のアニーリング温度帯に設定される。
【００６２】
ヒートブロック５１１は本体部５１１ａ及び複数の凸部５１１ｂを備え、ヒートブロック５１２は本体部５１２ａ及び複数の凸部５１２ｂを備える。凸部５１１ｂ及び凸部５１２ｂは、それぞれ本体部５１１ａ及び本体部５１２ａから離れるに従って先細るテーパ状に形成される。その他の点については、第１の実施形態と同様であるため説明を省略する。
【００６３】
なお、本実施形態のヒートブロック５１１及び５１２と、第３の実施形態のヒートブロック３１３とを組み合わせて用いることもできる。
【００６４】
＜核酸増幅装置の構成＞
図９（ｂ）は、第５の実施形態に係る核酸増幅装置を示す斜視図である。本実施形態の核酸増幅装置は、ヒートブロック５１１及び５１２、マイクロ流体デバイス５、並びに撮像部５０（検出部）を備える。マイクロ流体デバイス５については、第１の実施形態と同様であるため、説明を省略する。なお、マイクロ流体デバイス５のうち、蛇行流路２等の図示は省略している。
【００６５】
撮像部５０は、マイクロ流体デバイス５の上方に配置され、光源３１、レンズ３２、光学フィルタ３３、ＣＣＤ３４、ダイクロイックミラー３５、光学フィルタ３６及びレンズ３７を備える。光源３１から発せられた光は、レンズ３２と光学フィルタ３３を通過してダイクロイックミラー３５により反射され、マイクロ流体デバイス５を照射する。反応液に蛍光標識プローブを添加して蛇行流路２に導入すると、反応液由来の蛍光は、ダイクロイックミラー３５を通過し、光学フィルタ３６及びレンズ３７を通過してＣＣＤ３４により検出される。このように、蛍光標識プローブを反応液に添加し、反応液からの蛍光をＣＣＤ３４により撮影することによって増幅対象の増幅を確認することができ、リアルタイムＰＣＲを実施することができる。
【００６６】
なお、撮像部５０の位置は、マイクロ流体デバイス５の上方に限定されず、蛇行流路２を撮影可能な位置であればよい。また、第１〜第４の実施形態に係る核酸増幅装置についても同様に、撮像部５０を設けてリアルタイムＰＣＲを実施することができる。
【００６７】
＜技術的効果＞
以上のように、本実施形態の温度調整装置は、変性温度帯に設定されるヒートブロック５１１がテーパ状の凸部５１１ｂを有し、アニーリング温度帯に設定されるヒートブロック５１２がテーパ状の凸部５１２ｂを有し、凸部５１１ｂ及び５１２ｂは、反応液が変性温度帯からアニーリング温度帯に降温される際に流れる流路にのみ接触する。このような構成を採用することにより、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。また、凸部５１１ｂ及び５１２ｂをテーパ状に形成しても、第１の実施形態と同様に蛇行流路２に温度場を形成することができるため、第１の実施形態のように直方体状に形成する場合と比較して、安価かつ容易に製造することができる。さらに、本実施形態の核酸増幅装置は、蛇行流路２を撮像可能な位置に撮像部５０を配置することができるため、リアルタイムＰＣＲを実施することができる。
【００６８】
［第６の実施形態］
＜マイクロ流体デバイスの構成＞
図１０（ａ）は、第６の実施形態に係る核酸増幅装置のマイクロ流体デバイス６５を示す平面図である。本実施形態の核酸増幅装置は、マイクロ流体デバイス６５と、後述するヒートブロック６１１〜６１３を有する温度調整装置とを備える。
【００６９】
図１０（ａ）に示すように、マイクロ流体デバイス６５は、注入口１、排出口３、位置合わせガイド４、往復流路６、バルブ７及び８を備える。
【００７０】
注入口１及び排出口３は、それぞれ往復流路６の始端及び終端に設けられ、注入口１から往復流路６に反応液が導入され、排出口３から排出されて回収される。
【００７１】
往復流路６は、注入口１とバルブ７との間、並びにバルブ８と排出口３との間において、Ｙ軸方向に蛇行する。また、往復流路６は、バルブ７及び８の間において流路６１及び６２の２つの流路に分岐する。バルブ７及び８の切り替えにより、反応液が流路６１又は６２のいずれかを流れるように制御することができる。
【００７２】
なお、往復流路６の注入口１及び排出口３は、それぞれ図示しないシリンジポンプ等のポンプに接続される。バルブ７及び８の駆動並びにポンプの駆動は、図示しない駆動機構により、ＰＣＲのサーマルサイクルを実施する際に反応液が往復流路６を往復するように制御される。
【００７３】
本実施形態においては、反応液が注入口１から排出口３へ向かう際に流路６１（第１の流路）をＸ軸正方向に通過し、反応液が排出口３から注入口１へ向かう際に流路６２（第２の流路）をＸ軸負方向に通過するように、バルブ７及び８、ポンプの駆動を制御することとする。より具体的には、注入口１から往復流路６に導入された反応液は、バルブ７、流路６１及びバルブ８を通過して、排出口３まで到達すると、排出口３に接続されたポンプの圧力により逆流する。その後バルブ７及び８が切り替えられ、反応液は、バルブ８、流路６２及びバルブ７を通過して、再び注入口１に到達する。その後、再びバルブ７及び８が切り替えられ、注入口１に接続されたポンプの圧力により反応液が逆流し、流路６１を通過して排出口３まで流れる。以上の繰り返しにより、反応液は往復流路６内を往復する。
【００７４】
位置合わせガイド４は、マイクロ流体デバイス６５とヒートブロック６１１〜６１３とを接触させる際の位置決めを正確に行うための目印である。
【００７５】
＜温度調整装置の構成＞
図１０（ｂ）は、ヒートブロック６１１〜６１３とマイクロ流体デバイス６５とが接触した状態を示す平面図である。図１０（ｂ）において点線で示すように、ヒートブロック６１１の上面（第１の面）、ヒートブロック６１２の上面（第２の面）及びヒートブロック６１３の上面（第３の面）は、ＸＹ平面（第１の面、第２の面及び第３の面を含む平面）内にあり、マイクロ流体デバイス６５の下面に接触する。ヒートブロック６１１、６１３及び６１２は、互いに離間するようにＸ軸正方向に沿ってこの順に配置される。
【００７６】
マイクロ流体デバイス６５は、流路６１及び６２の直進部分がヒートブロック６１１、６１３及び６１２の配列方向（Ｘ軸方向）に沿うように、ヒートブロック６１１〜６１３と接触する。ヒートブロック６１１（第１の部材）は、核酸の変性温度帯に設定され、ヒートブロック６１２（第２の部材）は、核酸のアニーリング温度帯に設定され、ヒートブロック６１３（第３の部材）は、核酸の伸長温度帯に設定される。
【００７７】
このように、本実施形態においては、反応液が変性温度帯からアニーリング温度帯に降温する際に、全体としてＸ軸正方向（第１の方向）に流れ、アニーリング温度帯から変性温度帯に昇温する際に、全体としてＸ軸負方向（第１の方向の逆方向）に流れるように、マイクロ流体デバイス６５と、ヒートブロック６１１〜６１３とを接触させる。
【００７８】
図１１（ａ）は、第６の実施形態に係るヒートブロック６１１〜６１３の構造を示す斜視図である。図１１（ａ）に示すように、ヒートブロック６１１は、本体部６１１ａ及び凸部６１１ｂを有し、ヒートブロック６１２は、本体部６１２ａ及び凸部６１２ｂを有する。本体部６１１ａ及び６１２ａは略直方体状である。凸部６１１ｂは、本体部６１１ａからＸ軸正方向に延伸する。凸部６１２ｂは、本体部６１２ａからＸ軸負方向に延伸し、空気層（断熱層）を介して凸部６１１ｂと対向する。
【００７９】
ヒートブロック６１３は、本体部６１３ａ及び凸部６１３ｂを有する。凸部６１３ｂは、本体部６１３ａからＺ軸正方向に延伸する。凸部６１３ｂ（第３の部材）は、凸部６１１ｂ及び６１２ｂの対向面の間の領域外に配置される。凸部６１３ｂのＸ軸方向の長さは、凸部６１１ｂと凸部６１２ｂとの間隔より長くてもよいし、短くてもよい。凸部６１３ｂのＹ軸方向の長さは、流路６２のＹ軸方向の幅以上であり、ヒートブロック６１１の本体部６１１ａのＹ軸方向の長さ及びヒートブロック６１２の本体部６１２ａのＹ軸方向の長さよりも短い。
【００８０】
図１１（ｂ）は、第６の実施形態に係るヒートブロック６１１〜６１３とマイクロ流体デバイス６５とが接触した状態を示す斜視図である。図１１（ｂ）に示すように、ヒートブロック６１１の本体部６１１ａ上には、注入口１とバルブ７との間の流路、並びに流路６１及び６２のＸ軸負方向側の端部が配置され、ヒートブロック６１２の本体部６１２ａ上には、バルブ８と排出口３との間の流路、並びに流路６１及び６２のＸ軸正方向側の端部が配置される。また、凸部６１１ｂ及び６１２ｂ上には、流路６１が接触し、凸部６１３ｂ上には、流路６２の中間部が接触する。したがって、反応液が変性温度帯からアニーリング温度帯に降温する際は、急激に降温し、アニーリング温度帯から変性温度帯に昇温する際は、伸長温度帯を経て昇温する。
【００８１】
また、図１１（ｂ）に示すように、ヒートブロック６１２の本体部６１２ａには、マイクロ流体デバイス６５を貫通可能な位置合わせピン１４が設けられる。マイクロ流体デバイス６５とヒートブロック６１１〜６１３との接触時には、位置合わせピン１４及び位置合わせガイド４により位置決めすることができる。
【００８２】
＜技術的効果＞
以上のように、本実施形態において、変性温度帯のヒートブロック６１１及びアニーリング温度帯のヒートブロック６１２は、反応液が変性温度帯からアニーリング温度帯に降温される流路６１に接触する凸部６１１ｂ及び６１２ｂを有する。また、伸長温度帯のヒートブロック６１３は、反応液がアニーリング温度帯から変性温度帯に昇温される流路６２の中間部に接する凸部６１３ｂを有する。このような構成を有することにより、反応液が変性温度帯からアニーリング温度帯に降温する際は、反応液は急激に降温し、アニーリング温度帯から変性温度帯に昇温する際は、反応液は伸長温度帯となる時間を十分に確保しつつ昇温する。これにより、非特異的増幅産物の生成を抑制し、ＰＣＲ増幅効率の低下を防止することができる。
【００８３】
なお、本実施形態において、第３の実施形態と同様に、ヒートブロック６１１の凸部６１１ｂ及びヒートブロック６１２の凸部６１２ｂを設けない構成を採用することもできる。この場合は、第３の実施形態と同様の効果を奏することができる。また、本実施形態においても第５の実施形態と同様に、マイクロ流体デバイス６５の上方に撮像部５０を設け、反応液に蛍光標識プローブを添加して、リアルタイムＰＣＲを行うこともできる。
【００８４】
［変形例］
本開示は、上述した実施形態に限定されるものでなく、様々な変形例を含んでいる。例えば、上述した実施形態は、本開示を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備える必要はない。また、ある実施形態の一部を他の実施形態の構成に置き換えることができる。また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることもできる。また、各実施形態の構成の一部について、他の実施形態の構成の一部を追加、削除又は置換することもできる。
【００８５】
変形例として、例えば、第２の実施形態と、第３〜第６の実施形態とを組み合わせることもできる。この場合、第２の実施形態の櫛型電極２３の形状を、各実施形態のヒートブロックの上面形状と同様に形成する。
【００８６】
また、第１〜第６の実施形態において、ＤＮＡを増幅するＰＣＲを例として説明したが、各実施形態は、ウイルスなどのＲＮＡを検出するＲＴ−ＰＣＲに適用することもできる。さらに、流路に反応液を連続して流すのではなく、反応液の液滴をオイル中に浮遊させ、該オイルを流路に導入してＰＣＲを行なう方式（ドロップレットＰＣＲ）に各実施形態を適用することもできる。
【００８７】
第１〜第６の実施形態の核酸増幅装置において、ヒートブロックの上面がＸＹ平面に位置し、マイクロ流体デバイスの下面と接触する場合について説明したが、核酸増幅装置の向きはこれに限定されない。核酸増幅装置の向きは、例えば、図示した状態の上下逆としてもよいし、図示した状態から９０°回転してもよい。
【実施例】
【００８８】
以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００８９】
［実施例１及び比較例１］
図３（ｂ）に示した第１の実施形態の核酸増幅装置（実施例１）と、図１（ｃ）に示した従来例に係る核酸増幅装置（比較例１）を用いてそれぞれコンティニュアスフローＰＣＲを行った実験について説明する。
【００９０】
＜マイクロ流体デバイスの作成＞
シクロオレフィンコポリマー製の平板材料を切削加工し、横（Ｘ軸方向）２５ｍｍ×縦（Ｙ軸方向）９２ｍｍ×厚さ（Ｚ軸方向）２ｍｍの基板を得た。Ｘ軸方向の長さが２１ｍｍ、幅（Ｙ軸方向）６００μｍ×高さ（Ｚ軸方向）３００μｍ、Ｙ軸方向に隣接する流路の間隔が１４００μｍとなるように、４０回蛇行させた溝を基板に形成した。溝が形成された面に対し、厚さ１００μｍのシクロオレフィンコポリマー製フィルムを熱融着により貼り付け、蛇行流路を形成した。これにより、実施例１及び比較例１に係るマイクロ流体デバイスを得た。
【００９１】
＜ヒートブロックの寸法及び配置＞
実施例１においては、第１の実施形態に係る櫛状のヒートブロック１１（変性温度帯）及びヒートブロック１２（アニーリング温度帯）を有する温度調整装置を準備した。蛇行流路の両端から４ｍｍの部分（屈曲部）にそれぞれ本体部１１ａ及び１２ａが接触し、Ｘ軸正方向に流れる流路のみに凸部１１ｂ及び１２ｂが接触するように、マイクロ流体デバイスのフィルムが張り付けられた面に対し、ヒートブロック１１及び１２を接触させた。
【００９２】
凸部１１ｂ及び１２ｂは、それぞれ本体部１１ａ及び１２ａから６ｍｍ突出するように設計した。したがって、Ｘ軸正方向の流路においては、変性温度帯のヒートブロック１１及びアニーリング温度帯のヒートブロック１２が接する長さは、蛇行流路の両端からそれぞれ１０ｍｍとなり、ヒートブロック１１及び１２に接触していない流路の長さ（凸部１１ｂ及び１２ｂの間隔）は１ｍｍとなる。一方、Ｘ軸負方向の流路においては、変性温度帯のヒートブロック１１及びアニーリング温度帯のヒートブロック１２が接する長さはそれぞれ４ｍｍとなり、ヒートブロック１１及び１２に接触していない流路の長さは１３ｍｍとなる。
【００９３】
比較例１においては、図１（ｃ）に示した略直方体状のヒートブロック１１１（変性温度帯）及びヒートブロック１１２（アニーリング温度帯）を有する温度調整装置を使用した。ヒートブロック１１１及び１１２がそれぞれ蛇行流路の両端から４ｍｍの部分（屈曲部）に接触するように、マイクロ流体デバイスに接触させた。すなわち、Ｘ軸正方向及び負方向に流れる流路のいずれにおいても、変性温度帯及びアニーリング温度帯に調整される流路の長さをそれぞれ４ｍｍとし、これらの温度帯に接触していない流路の長さを１３ｍｍとした。
【００９４】
＜反応液の調製＞
ＰＣＲ増幅対象の鋳型ＤＮＡとしてヒトＥＧＦＲ遺伝子を抽出した。ＰＣＲ酵素としてＴＯＹＯＢＯ社製のＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを用い、３ｍＭのＭｇ２＋が含まれるように、キットに付属のＰＣＲ緩衝液を調製し、ヒトＥＧＦＲ遺伝子と、３００ｎＭのプライマ（フォワード側：5’- cttggaggaccgtcgcttggt -3’（配列番号１）、リバース側：5’- tgcctccttctgcatggtattctttct -3’（配列番号２））とを添加して、実施例１及び比較例１に係る反応液Ａを調製した。
【００９５】
＜ＰＣＲの実施＞
実施例１においては、ヒートブロック１１を９５℃、ヒートブロック１２を６０℃に設定した。マイクロ流体デバイスの注入口にシリコンチューブとシリンジポンプを接続して、反応液Ａを１μＬ／ｓの流速で流しながらコンティニュアスフローＰＣＲを実施した。排出口にシリコンチューブを接続して、反応液Ａを回収した。
【００９６】
反応液Ａが蛇行流路を進むにつれて、変性温度帯とアニーリング温度帯からの熱を受けることでサーマルサイクルがなされる。蛇行流路は４０回蛇行しているため、サーマルサイクルが４０回繰り返される。そのため、各ヒートブロック１１及び１２の温度はＰＣＲ実施中に変更しなくても良い。
【００９７】
比較例１においても実施例１と同様にして、ヒートブロック１１１を９５℃、ヒートブロック１１２を６０℃に設定し、ＰＣＲを実施した。
【００９８】
＜反応液の温度測定＞
実施例１及び比較例１のそれぞれについて、ＰＣＲの実施中に、反応液ＡがＸ軸正方向に流れる流路の一つにおいて、反応液Ａの温度が変性温度帯からアニーリング温度帯に降温する場合の反応液Ａの温度を測定した。温度の測定は０．５ｍｍ間隔で行った。
【００９９】
図１２は、実施例１及び比較例１における反応液Ａの降温時の温度を比較したグラフである。図１２のグラフにおける横軸は、蛇行流路のアニーリング温度帯側（Ｘ軸正方向側）の端からの距離を示し、縦軸は反応液Ａの温度を示している。
【０１００】
図１２に示すように、比較例１の流路においては、アニーリング温度帯側の端から１３ｍｍの位置で９０℃となり、アニーリング温度帯側の端から２ｍｍの位置で７０℃となった。したがって、その間に位置する流路の長さ１１ｍｍに亘って７０℃〜９０℃の温度範囲になった。反応液Ａを１μＬ／ｓの流速で移動させた場合、反応液Ａは流路を１秒におよそ５ｍｍ進む。つまり、反応液Ａは２秒以上７０℃〜９０℃の温度となった。
【０１０１】
実施例１の流路においては、アニーリング温度帯側の端から１０．５ｍｍの位置で９０℃となり、アニーリング温度帯側の端から６．５ｍｍの位置で７０℃となった。したがって、７０℃〜９０℃の温度範囲になる流路の長さは４ｍｍであり、その時間は１秒未満となった。以上のことから、実施例１は、比較例１と比較して７０℃〜９０℃の温度範囲になる領域が半分以下となり、時間も半分以下となることがわかった。
【０１０２】
＜増幅産物の電気泳動＞
実施例１及び比較例１におけるヒトＥＧＦＲ遺伝子のＰＣＲ増幅産物について、それぞれ電気泳動を行った。
【０１０３】
図１３は、実施例１及び比較例１における増幅産物を電気泳動した結果を示す図である。図１３の左端に示すレーンＭはサイズマーカであり、２５〜１５００ヌクレオチドの塩基長の断片の泳動長を示している。
【０１０４】
図１３に示すように、実施例１のレーン及び比較例１のレーンにおいて、目的産物であるヒトＥＧＦＲ遺伝子の増幅産物が１５０塩基付近に観察される。しかしながら、比較例１のレーンには、目的産物に加えて１００塩基以下の非特異的増幅産物の増幅が観察された。一方、実施例１のレーンにはこのような非特異的増幅産物が見られないことから、非特異的増幅産物の発生を抑制できたことがわかった。
【０１０５】
［実施例２及び比較例２］
図６（ｂ）に示した第３の実施形態の核酸増幅装置（実施例２）と、図１（ｃ）に示した従来例に係る核酸増幅装置（比較例２）を用いてそれぞれＰＣＲを行った実験について説明する。
【０１０６】
＜マイクロ流体デバイスの作成＞
実施例１及び比較例１と同様にして、実施例２及び比較例２に係るマイクロ流体デバイスを作製した。
【０１０７】
＜ヒートブロックの寸法及び配置＞
実施例２においては、第３の実施形態に係るヒートブロック３１１（変性温度帯）、ヒートブロック３１２（アニーリング温度帯）及びヒートブロック３１３（伸長温度帯）を有する温度調整装置を準備した。蛇行流路の両端から４ｍｍの部分にヒートブロック３１１及び３１２がそれぞれ接触するように、マイクロ流体デバイスに接触させた。また、ヒートブロック３１３の凸部３１３ｂのＸ軸方向の長さを７ｍｍとし、ヒートブロック３１１及び３１２からそれぞれ３ｍｍの間隔を有するように、Ｘ軸負方向の流路の中央部に凸部３１３ｂを接触させた。
【０１０８】
したがって、反応液がＸ軸正方向に流れ、変性温度帯からアニーリング温度帯に降温する過程においては、蛇行流路の端から４ｍｍが変性温度帯のヒートブロック３１１に接触し、１３ｍｍがヒートブロックに接触せず、４ｍｍがアニーリング温度帯のヒートブロック３１２に接触する。一方、反応液がＸ軸負方向に流れ、アニーリング温度帯から変性温度帯に昇温する過程においては、蛇行流路の端から４ｍｍがアニーリング温度帯のヒートブロック３１２に接触し、３ｍｍがヒートブロックに接触せず、７ｍｍが伸長温度帯のヒートブロック３１３に接触し、３ｍｍがヒートブロックに接触せず、４ｍｍが変性温度帯のヒートブロック３１１に接触する。
【０１０９】
比較例２においては、比較例１のヒートブロック１１１及び１１２と同様のものを用いた。
【０１１０】
＜ＰＣＲの実施＞
実施例２において、ヒートブロック３１１を９５℃、ヒートブロック３１２を６０℃、ヒートブロック３１３を７２℃に設定し、上記反応液Ａを用い、ＰＣＲを実施した。
【０１１１】
比較例２においても実施例２と同様にして、ヒートブロック１１１を９５℃、ヒートブロック１１２を６０℃に設定し、ＰＣＲを実施した。
【０１１２】
＜反応液の温度の測定＞
実施例２及び比較例２のそれぞれについて、ＰＣＲの実施中に、反応液ＡがＸ軸負方向に流れる流路の一つにおいて、反応液Ａの温度がアニーリング温度帯から変性温度帯に昇温する場合の反応液Ａの温度を測定した。温度の測定は０．５ｍｍ間隔で行った。
【０１１３】
図１４は、実施例２及び比較例２における反応液Ａの昇温時の温度を比較したグラフである。図１４のグラフにおける横軸は、蛇行流路のアニーリング温度帯側の端からの距離を示し、縦軸は反応液Ａの温度を示している。
【０１１４】
図１４に示すように、比較例２の流路においては、アニーリング温度帯側の端から１３ｍｍの位置で７０℃となり、アニーリング温度帯側の端から１６．５ｍｍの位置で７５℃となり、その間の流路の長さ３．５ｍｍに亘って、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが活性を十分な活性を有する７０℃〜７５℃の温度範囲となった。反応液Ａを１μＬ／ｓの流速で移動させた場合、反応液Ａは流路を１秒におよそ５ｍｍ進む。したがって、反応液Ａが７０〜７５℃の温度となるのは１秒未満であった。
【０１１５】
実施例２の流路においては、アニーリング温度帯側の端から９．５ｍｍの位置で７０℃となり、アニーリング温度帯側の端から１５．５ｍｍの位置で７５℃となった。すなわち、７０℃〜７５℃の温度範囲になる流路の長さは６．０ｍｍであり、比較例２の約２倍であった。以上のことから、実施例２は、比較例２と比較して、反応液Ａがアニーリング温度帯から変性温度帯へ移動する過程において、伸長温度帯である７０℃〜７５℃の温度範囲になる領域が約２倍となり、時間も約２倍となることがわかった。
【０１１６】
［実施例３及び比較例３］
図８（ｂ）に示した第４の実施形態の核酸増幅装置（実施例３）と、図１（ｃ）に示した従来例に係る核酸増幅装置（比較例３）を用いてそれぞれコンティニュアスフローＰＣＲを行った実験について説明する。
【０１１７】
＜マイクロ流体デバイスの作成＞
実施例１及び比較例１と同様にして、実施例３及び比較例３のマイクロ流体デバイスを作製した。
【０１１８】
＜ヒートブロックの寸法及び配置＞
実施例３においては、第４の実施形態に係るヒートブロック１１（変性温度帯）、ヒートブロック１２（アニーリング温度帯）及びヒートブロック３１３（伸長温度帯）を有する温度調整装置を準備した。蛇行流路の両端から４ｍｍの部分（屈曲部）にそれぞれ本体部１１ａ及び１２ａが接触し、Ｘ軸正方向に流れる流路のみに凸部１１ｂ及び１２ｂが接触するように、マイクロ流体デバイスのフィルムが張り付けられた面に対し、ヒートブロック１１及び１２を接触させた。
【０１１９】
凸部１１ｂ及び１２ｂは、それぞれ本体部１１ａ及び１２ａから６ｍｍ突出するように設計した。したがって、Ｘ軸正方向の流路においては、変性温度帯のヒートブロック１１及びアニーリング温度帯のヒートブロック１２が接する長さは、蛇行流路の両端からそれぞれ１０ｍｍとなり、ヒートブロック１１及び１２に接触していない流路の長さ（凸部１１ｂ及び１２ｂの間隔）は１ｍｍとなる。一方、Ｘ軸負方向の流路においては、変性温度帯のヒートブロック１１及びアニーリング温度帯のヒートブロック１２が接する長さはそれぞれ４ｍｍとなり、ヒートブロック１１及び１２に接触していない流路の長さは１３ｍｍとなる。
【０１２０】
また、ヒートブロック３１３の凸部３１３ｂのＸ軸方向の長さを７ｍｍとし、ヒートブロック１１及び１２からそれぞれ３ｍｍの間隔を有するように、反応液がＸ軸負方向に流れる流路の中央部に対し、凸部３１３ｂを接触させた。
【０１２１】
すなわち、反応液がＸ軸負方向に流れ、アニーリング温度帯から変性温度帯に昇温する過程においては、蛇行流路の端から４ｍｍがアニーリング温度帯のヒートブロック１２に接触し、３ｍｍがヒートブロックに接触せず、７ｍｍが伸長温度帯のヒートブロック３１３に接触し、３ｍｍがヒートブロックに接触せず、４ｍｍが変性温度帯のヒートブロック１１に接触する。
【０１２２】
比較例３の温度調整装置におけるヒートブロックは、比較例１のヒートブロック１１１及び１１２と同様であるため説明を省略する。
【０１２３】
＜反応液の調製＞
ＰＣＲ増幅対象の鋳型ＤＮＡとしてヒトＫＲＡＳ遺伝子を抽出した。ＰＣＲ酵素としてＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＫＡＰＡ  Ｔａｑ  Ｅｘｔｒａ  ＤＮＡポリメラーゼを用い、キットに付属のＰＣＲ緩衝液を２ｍＭのＭｇ２＋を含むように調製し、ヒトＫＲＡＳ遺伝子と、５００ｎＭのプライマ（フォワード側：5’- tcacattttcattatttttattataagg -3’（配列番号３）、リバース側：5’- gtatggtcaaggcactcttgcc -3’（配列番号４））とを添加して、反応液Ｂを調製した。
【０１２４】
＜ＰＣＲの実施＞
実施例３においては、変性温度帯のヒートブロックを９５℃、アニーリング温度帯のヒートブロックを６０℃、伸長温度帯のヒートブロックを７２℃に設定した。その他の条件は実施例１と同様にして、反応液Ｂを１μＬ／ｓの流速で流しながらＰＣＲを実施した。
【０１２５】
比較例３においても上記と同様にして、変性温度帯のヒートブロックを９５℃、アニーリング温度帯のヒートブロックを６０℃に設定し、反応液ＢについてＰＣＲを実施した。
【０１２６】
＜反応液の降温時の温度測定＞
実施例３及び比較例３のそれぞれについて、ＰＣＲの実施中に、反応液ＢがＸ軸正方向に流れる流路の一つにおいて、反応液Ｂの温度を変性温度帯からアニーリング温度帯に降温させる場合の反応液Ｂの温度を測定した。温度の測定は０．５ｍｍ間隔で行った。
【０１２７】
図１５は、実施例３及び比較例３における反応液Ｂの降温時の温度を比較したグラフである。図１５のグラフにおける横軸は、蛇行流路のアニーリング温度帯側の端からの距離を示し、縦軸は反応液Ｂの温度を示している。
【０１２８】
図１５に示すように、比較例３の流路においては、アニーリング温度帯側の端から１２．５ｍｍの位置で９０℃となり、アニーリング温度帯側の端から１．５ｍｍの位置で７０℃となるため、その間に位置する流路の長さ１１ｍｍに亘って７０℃〜９０℃の温度範囲になる。反応液を１μＬ／ｓの流速で移動させた場合、反応液は流路を１秒におよそ５ｍｍ進む。したがって、反応液は２秒程度７０℃〜９０℃の温度となった。
【０１２９】
実施例３の流路においては、アニーリング温度帯側の端から１０．０ｍｍの位置で９０℃となり、アニーリング温度帯側の端から６．０ｍｍの位置で７０℃となるため、７０℃〜９０℃の温度範囲になる流路の長さは４ｍｍであり、その時間は１秒未満となる。以上のことから、実施例３は、比較例３と比較して７０℃〜９０℃の温度範囲になる領域が半分以下となり、時間も半分以下となることがわかった。
【０１３０】
＜反応液の昇温時の温度測定＞
さらに、ＰＣＲの実施中に、反応液ＢがＸ軸負方向に流れる流路の一つにおいて、反応液Ｂの温度をアニーリング温度帯から変性温度帯に昇温させる場合の反応液Ｂの温度を測定した。温度の測定は０．５ｍｍ間隔で行った。
【０１３１】
図１６は、実施例３及び比較例３における反応液Ｂの昇温時の温度を比較したグラフである。図１６のグラフにおける横軸は、蛇行流路のアニーリング温度帯側の端からの距離を示し、縦軸は反応液Ｂの温度を示している。
【０１３２】
図１６に示すように、比較例３の流路においては、アニーリング温度帯側の端から１４．５ｍｍの位置で７０℃となり、アニーリング温度帯側の端から１７．０ｍｍの位置で７５℃となり、その間に位置する流路の長さ２．５ｍｍに亘って、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが活性を十分な活性を有する７０℃〜７５℃の温度範囲となった。反応液Ｂを１μＬ／ｓの流速で移動させた場合、反応液Ｂは流路を１秒におよそ５ｍｍ進む。したがって、反応液Ｂが７０℃〜７５℃の温度となるのは０．５秒程度であった。
【０１３３】
実施例３の流路においては、アニーリング温度帯側の端から１１．０ｍｍの位置で７０℃となり、アニーリング温度帯側の端から１５．５ｍｍの位置で７５℃となるため、７０℃〜７５℃の温度範囲になる流路の長さは４．５ｍｍとなり、比較例３の約２倍となった。以上のことから、実施例３は、比較例３と比較して、７０℃〜７５℃の温度範囲になる領域が約２倍となり、時間も約２倍となることがわかった。
【０１３４】
＜増幅産物の電気泳動＞
ここで、第３の実施形態に係るヒートブロック１１、１２及び３１３を用いて、反応液Ｂ（ヒトＫＲＡＳ遺伝子）について、実施例３と同様の条件でＰＣＲを実施し、実施例３−２とした。また、実施例３、実施例３−２及び比較例３におけるヒトＫＲＡＳ遺伝子のＰＣＲ増幅産物について、それぞれ電気泳動を行った。
【０１３５】
図１７は、実施例３、実施例３−２及び比較例３におけるヒトＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物を電気泳動した結果を示す図である。レーンＭはサイズマーカであり、２５〜１５００ヌクレオチドの塩基長の断片の泳動長を示している。
【０１３６】
図１７に示すように、比較例３において目的産物であるヒトＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物が１００塩基付近に薄く観察される。一方、実施例３及び３−２においては、目的産物が１００塩基付近にはっきりと観察できた。以上のことから、第４の実施形態の核酸増幅装置を用いた場合（実施例３）と、第３の実施形態の核酸増幅装置を用いた場合（実施例３−２）のいずれにおいても、ＰＣＲ増幅効率の向上が可能であることがわかった。
【０１３７】
［実施例４及び比較例４］
図１１（ｂ）に示した第６の実施形態に係る核酸増幅装置を用いてコンティニュアスフローＰＣＲを実施し、増幅産物をリアルタイムで検出した実験について説明する。
【０１３８】
＜マイクロ流体デバイスの作成＞
シクロオレフィンコポリマー製の平板材料を切削加工し、横（Ｘ軸方向）８０ｍｍ×縦（Ｙ軸方向）３０ｍｍ×厚さ（Ｚ軸方向）２ｍｍの基板を得た。図１０（ａ）に示す形状の往復流路６となるように、Ｘ軸方向の長さ（注入口１と排出口３とのＸ軸方向の距離）が６０ｍｍ、幅（Ｙ軸方向）６００μｍ×高さ（Ｚ軸方向）３００μｍの溝を基板に形成した。より具体的には、注入口１とバルブ７との間、及びバルブ８と排出口３との間においては、Ｙ軸方向に１４ｍｍに亘って溝を蛇行させた。バルブ７及び８の間においては、流路６１及び６２を形成するために、直進部分のＸ軸方向の長さが２０ｍｍ、隣接する流路の間隔が１４００μｍとなるように、溝を２つに分岐させた。溝が形成された面に対し、厚さ１００μｍのシクロオレフィンコポリマー製フィルムを熱融着により基板に貼り付けた。これにより、実施例４及び比較例４に係るマイクロ流体デバイスを得た。
【０１３９】
＜ヒートブロックの寸法及び配置＞
実施例４及び比較例４においては、第６の実施形態に係るヒートブロック６１１〜６１３を有する温度調整装置を準備した。ヒートブロック６１１の本体部６１１ａ及びヒートブロック６１２の本体部６１２ａの上面の寸法は（Ｘ軸方向）２０ｍｍ×（Ｙ軸方向）２０ｍｍとした。凸部６１１ｂは本体部６１１ａからＸ軸正方向に８ｍｍ突出し、凸部６１２ｂは本体部６１２ａから８ｍｍ突出するように設計した。凸部６１１ｂ及び６１２ｂの間隔は４ｍｍとした。ヒートブロック６１３の凸部６１３ｂのＸ軸方向の長さは１２ｍｍとし、ヒートブロック６１１の本体部６１１ａとヒートブロック６１２の本体部６１２ａからそれぞれ４ｍｍ離れるように配置した。したがって、ヒートブロック６１１の本体部６１１ａとヒートブロック６１２の本体部６１２ａのＸ軸方向の距離は２０ｍｍである。
【０１４０】
ヒートブロック６１１の本体部６１１ａとヒートブロック６１２の本体部６１２ａとの間に流路６１及び６２の直進部分が配置されるように、マイクロ流体デバイスと、ヒートブロック６１１〜６１３とを接触させた。したがって、注入口１とバルブ７との間の流路はヒートブロック６１１の本体部６１１ａに接触し、バルブ８と排出口３との間の流路はヒートブロック６１２の本体部６１２ａに接触する。また、流路６１の直進部分を凸部６１１ｂ及び６１２ｂに接触させ、流路６２の直進部分を凸部６１３ｂに接触させた。
【０１４１】
＜反応液の調製＞
ＰＣＲ増幅対象の鋳型ＤＮＡとしてヒトＥＧＦＲ遺伝子を抽出した。ＰＣＲ酵素としてＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＫＡＰＡ  Ｔａｑ  Ｅｘｔｒａ  ＤＮＡポリメラーゼを用い、キットに付属のＰＣＲ緩衝液を２ｍＭのＭｇ２＋を含むように調製し、ヒトＫＲＡＳ遺伝子と、５００ｎＭのプライマ（フォワード側：5’- cctcacctccaccgtgca -3’（配列番号５）、リバース側：5’- aggcagccgaagggca -3’（配列番号６））と、ＦＡＭ（蛍光色素）で標識したＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（5’- tcatcatgcagctc -3’（配列番号７））を添加して、実施例４及び比較例４に係る反応液Ｃを調製した。このような反応液ＣについてリアルタイムＰＣＲを実施することで、ＥＧＦＲ遺伝子のＴ７９０Ｍ変異を検出することができる。
【０１４２】
＜リアルタイムＰＣＲの実施＞
実施例４においては、ヒートブロック６１１を９５℃（変性温度帯）、ヒートブロック６１２を６０℃（アニーリング温度帯）、ヒートブロック６１３を７２℃（伸長温度帯）に設定した。また、反応液Ｃからの蛍光を検出できるように、マイクロ流体デバイス６５の上部に、図９（ｂ）に示した撮像部５０と同様の撮像部を配置した。
【０１４３】
反応液Ｃを注入口１から導入し、注入口１と排出口３にシリンジポンプを接続して、４５回バルブ７及び８を切り替えて、反応液Ｃを往復させることにより、ＰＣＲを行なった。なお、バルブ７及び８の切り替えにより、変性温度帯からアニーリング温度帯に降温する際には流路６１を反応液Ｃが流れ、アニーリング温度帯から伸長温度帯を経て変性温度帯に昇温させる際には、流路６２を反応液Ｃが流れるようにした。シリンジポンプは、変性温度帯で３秒間反応液Ｃを保持した後、バルブ７及び８を切り替えてアニーリング温度帯に反応液Ｃを送液し、アニーリング温度帯で５秒間保持した後、バルブ７及び８を切り替えて変性温度帯に反応液Ｃを送液した。撮像部により、反応液Ｃが伸長温度帯を通過する際の反応液Ｃの蛍光強度を上部から測定することで、リアルタイムＰＣＲを実施した。
【０１４４】
比較例４においては、ヒートブロック６１３のスイッチを切り、流路６２に対し熱を供給しないようにした。その他の条件は実施例４と同様にして、反応液ＣについてリアルタイムＰＣＲを実施した。
【０１４５】
図１８は、実施例４及び比較例４における反応液Ｃの蛍光強度を示すグラフである。図１８に示すように、実施例４においては、２０サイクル以降に蛍光強度が急増したことにより、ＥＧＦＲ遺伝子Ｔ７９０Ｍ変異型の増幅が確認された。
【０１４６】
比較例４においては、２０サイクル以降に蛍光強度が増加したものの、実施例４と比較して半分程度の蛍光強度であった。このことから、実施例４は、反応液Ｃがアニーリング温度帯から伸長温度帯を経て変性温度帯に昇温する際に、伸長温度帯となる時間が十分に確保されるため、ＰＣＲの増幅効率の向上が可能であることがわかった。
【符号の説明】
【０１４７】
１…注入口、２…蛇行流路、３…排出口、４…位置合わせガイド、５、６５…マイクロ流体デバイス、６…往復流路、７、８…バルブ、１１、１２、１１１、１１２、２１１、２１２、３１１〜３１３、５１１、５１２、６１１〜６１３…ヒートブロック、１４…位置合わせピン、２００…プリント基板、２２１、２２２…櫛型電極、２３１、２３２…金属配線、３１…光源、３２、３７…レンズ、３３、３６…光学フィルタ、３４…ＣＣＤ、３５…ダイクロイックミラー、５０…撮像部
【図１】
2020141629.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020141629.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2020141629.tif 000015
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2020141629.tif 000018
【図１７】
2020141629.tif 000019
【図１８】
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【配列表】
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