(57)【要約】      （修正有）【課題】複製能を有する制御組換えウイルスの有効量を含んでなるワクチン組成物、該組成物を用いる、免疫化における使用、および免疫化する方法の提供。【解決手段】複製能を有する制御ヘルペスウイルスの有効量を含み、ヘルペスウイルスが、そのゲノム中に挿入された、熱ショックプロモーターに加えてトランス活性化因子応答性プロモーターの役割を果たす核酸配列又は熱ショックプロモーターの役割を果たす核酸配列と機能的に連結された、小分子制御因子により活性化されるトランス活性化因子の遺伝子と、ヘルペスウイルスの複製必須遺伝子と機能的に連結されたトランス活性化因子応答性プロモーターとを含む組み換え体ヘルペスウイルス。【選択図】図１
2020063286.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘルペス性疾患に対する免疫化のための組成物であって、前記組成物が複製能を有する制御ヘルペスウイルスの有効量を含み、
前記複製能を有するヘルペスウイルスが、そのゲノム中に挿入された、熱ショックプロモーターに加えてトランス活性化因子応答性プロモーターの役割を果たす核酸配列又は熱ショックプロモーターの役割を果たす核酸配列と機能的に連結された、小分子制御因子により活性化されるトランス活性化因子の遺伝子と、前記複製能を有するヘルペスウイルスの１つ又は複数の複製必須遺伝子と機能的に連結された、１つ又は複数のトランス活性化因子応答性プロモーターとを含む組み換え体ヘルペスウイルスであり、
（ａ）前記組成物が、前記ヘルペス性疾患の治療又は予防を必要とする哺乳類対象の身体の接種部位領域に投与され、（ｂ）前記哺乳類対象の前記接種部位領域が、前記接種部位領域における、トランス活性化因子を活性化する小分子制御因子の有効濃度の存在下での、活性化熱線量の投与からなる局所的活性化治療に曝露され、
前記局所的活性化治療が、前記組み換えヘルペスウイルスの前記接種部位領域における１回の複製周期を引き起こし、前記免疫化が、前記ヘルペス性疾患の重症度、持続期間又は死亡率を、複製欠陥を有する弱毒型ヘルペスウイルスを用いた免疫化よりも効率的に低下させることを特徴とする、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の免疫化のための組成物において、前記接種部位領域が、皮膚領域若しくは皮下領域、又は粘膜であることを特徴とする、組成物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の免疫化のための組成物において、前記組み換え体ヘルペスウイルスが、ヘルペスウイルスの１つ又は複数の複製必須遺伝子と機能的に連結された、１つ又は複数の熱ショックプロモーターをさらに含むことを特徴とする、組成物。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れか一項に記載の免疫化のための組成物において、前記複製能を有する制御ヘルペスウイルスが、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、及びバラ疹ウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来することを特徴とする、組成物。
【請求項５】
請求項１乃至３の何れか一項に記載の免疫化のための組成物において、前記複製能を有する制御ヘルペスウイルスが、ＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２に由来し、前記トランス活性化因子応答性プロモーターと機能的に連結された前記複製必須ウイルス遺伝子が、少なくともＩＣＰ４遺伝子又はＩＣＰ８遺伝子の全コピーを含むことを特徴とする、組成物。
【請求項６】
請求項１乃至５の何れか一項に記載の免疫化のための組成物において、前記複製能を有する制御ヘルペスウイルスが、別の病原体からの遺伝子、免疫調節性ポリペプチドをコードする異種遺伝子、及び別のポリペプチドをコードする異種遺伝子の少なくとも１つをさらに含むことを特徴とする、組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の免疫化のための組成物において、前記別の病原体からの遺伝子が、インフルエンザウイルス表面抗原、インフルエンザウイルス内部タンパク質、又は後者タンパク質の部分をコードし、免疫化がインフルエンザウイルス媒介性の疾患に対するものであることを特徴とする、組成物。
【請求項８】
請求項６に記載の免疫化のための組成物において、前記別の病原体からの遺伝子が、ＨＩＶ表面抗原、ＨＩＶ内部タンパク質、又は後者タンパク質の部分をコードすることを特徴とする、組成物。
【請求項９】
請求項１乃至８の何れか一項に記載の免疫化のための組成物において、前記小分子制御因子により活性化されるトランス活性化因子が、切断されたプロゲステロン受容体からのリガンド結合ドメインを含有し、トランス活性化因子を活性化できるプロゲステロン受容体拮抗薬によって活性化されることを特徴とする、組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の免疫化のための組成物において、前記複製能を有する制御ヘルペスウイルスが、ＨＳＶ−ＧＳ１、ＨＳＶ−ＧＳ２、ＨＳＶ−ＧＳ３、及びＨＳＶ−ＧＳ４からなる明細書に記載のウイルス組み換え体の群から選択されることを特徴とする、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、どちらもその内容全体があらゆる図面を含めて参照により本明細書に援用される、２０１４年８月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／０７０，４４３号明細書；および２０１４年１０日１０月に出願された米国仮特許出願第６２／１２２，０８８号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
配列表への言及
本出願は、電子形態の配列表と共に出願される。配列表は、２０１５年８月２５日に作成された、４ＫＢサイズの「ＶＩＲ２ＡＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題されたファイルとして提供される。配列表の電子形態情報は、その内容全体が参照により本明細書に援用される。
【０００３】
本発明は、特定の複製能を有する制御ウイルスと、免疫化のためのそれらの使用とに関する。
【背景技術】
【０００４】
予防接種は、その２００年以上の歴史にわたって無数の人命を救った、恐らく最も費用効率が高い医学的介入である。その最も壮観な成功の中には、天然痘の撲滅だけでなく、ジフテリア、破傷風、および麻痺性灰白髄炎の実質的な消滅が数えられる。Ａｎｄｒｅ，Ｆ．Ｅ．（２００３）Ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ：ｐａｓｔ  ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｓ，ｐｒｅｓｅｎｔ  ｒｏａｄｂｌｏｃｋｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｒｏｍｉｓｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１：５９３−５。さらに、予防接種は、世界の少なくとも一部で、黄熱病、百日咳、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）Ｂ型、麻疹、おたふく風邪、風疹、腸チフス、および狂犬病を制御している。依然として、重大な感染症は、予防不能なままであり、また治療的ワクチンによって治療できない。さらに、いくつかのワクチンの有効性は、期待に満たない。明らかに、新規ワクチンの創造は日常的になっておらず、特定の疾患に対する免疫化剤の開発は、新規アプローチを必要としてもよい。以下の例は、現在の難題のいくつかを例示する。
【０００５】
１０才の米国人およびヨーロッパの小児の約５０％は、単純ヘルペスウイルスＨＳＶ−１について血清陽性である。Ｓｔａｎｂｅｒｒｙ，Ｌ．Ｒ．Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｉｎ：Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｐｌｏｔｋｉｎ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．）５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ．２００８．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ。有病率は、６０〜７０年以内に７０〜８０％に増大する。単純ヘルペスウイルスＨＳＶ−２有病率は青年期に上昇し、ヨーロッパおよび米国では、それぞれ２０％および３０％のピークに達する。皮膚障害がある対象では、潜在的に生命にかかわる感染症が起こり得る。目のＨＳＶ感染は、結膜、角膜または網膜に影響を及ぼすことがあり、失明を引き起こし得る。周産期ヘルペス感染症としては、脳炎または播種性感染症が挙げられる。ＨＩＶ患者などの免疫機能が低下した対象における感染症もまた、生命にかかわることもある。ＨＳＶ感染症は多数の合併症を有し、顕著な罹患率および死亡率をもたらす。急性性器ヘルペス感染症が、ＨＩＶ獲得リスクを顕著に高めることは、注目に値する。ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２感染症は、侵入部位における複製と、そこで潜伏期が確立される知覚神経節への神経繊維に沿ったウイルスの拡散を伴う。ウイルスは、周期的に／散発性に再活性化して、末梢に戻り、末梢で自己複製し得る。いくつかの予防的および治療的ワクチン候補が開発されて、臨床的に試験された。Ｓｔａｎｂｅｒｒｙ，Ｌ．Ｒ．（２００８）。現時点で、効果的な治療的または予防的ワクチンは入手不能である。成功裏の治療的または予防的ワクチンは、強力な抗体だけでなく、Ｔ細胞（Ｔｈ−１）応答もまた惹起すべきであると主張されている。Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ａ．Ｌ．ａｎｄ  Ｍｉｋｌｏｓｋａ，Ｚ．（２００１）Ｔｈｅ  ｈｏｌｙ  ｇｒａｉｌ：ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｈｅｒｐｅｓ  ８（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １）：６Ａ−１０Ａ。
【０００６】
予防的なＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２ワクチンを開発するという目標は、あまりにも野心的かもしれないこと、そして焦点は、治療的ワクチンの生成に置かれるべきであることが提言されている。この点において、帯状ヘルペス（帯状疱疹）の予防に有効性を示すワクチンが開発できたことは、望みを与える。Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｒｐｅｓ  ｚｏｓｔｅｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐａｉｎｆｕｌ  ａｎｄ  ｄｅｂｉｌｉｔａｔｉｎｇ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１１（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２）：Ｓ４３−Ｓ４８。後者の疾患は、別のアルファヘルペスウイルスである、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の知覚神経節における再活性化によって引き起こされる。弱毒生Ｏｋａ株から製造されたワクチンは、疾患負荷または帯状疱疹後神経痛を低下させるのに、＞６０％有効である。この保護は、増強された細胞媒介性免疫応答と関係がある。Ｏｋａ株はまた、水疱瘡／水痘予防のために、高度に効果的な弱毒生ワクチンを開発するのにも使用された。Ｇｅｒｓｈｏｎ，Ａ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｖａｒｉｃｅｌｌａ  ｖａｃｃｉｎｅ．Ｉｎ：Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｐｌｏｔｋｉｎ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．）５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ．２００８．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ。したがって、効果的な単純ヘルペスワクチンを創造することは、不可能なはずはないと主張し得る。なおもより効果的な帯状疱疹ワクチン（または再活性化し得ない水痘ワクチン）の開発が、有意義な目標であることに留意されたい。
【０００７】
インフルエンザは、典型的に、突然の発熱、咽喉痛、咳嗽、頭痛、筋痛、悪寒、食欲不振、および疲労によって特徴付けられる。Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｃ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｉｎ：Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｐｌｏｔｋｉｎ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．）５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ．２００８．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｂｅｌｓｈｅ，Ｒ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅ−ｌｉｖｅ．Ｉｎ：Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｐｌｏｔｋｉｎ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．）５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ．２００８．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ。インフルエンザは、罹患率は高いが、死亡率は比較的低い疾患である。季節性罹患率は、典型的に５％〜２０％である。疾患の合併症からの死者数は、相当数である。ＷＨＯによると、全世界の年間死者数は、２５万人から５０万人の間である。インフルエンザウイルスはエンベロープに覆われて、セグメント化マイナスセンスＲＮＡゲノムを含有する。球状ウイルス粒子は、赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）からなるスパイクを有する。ＨＡは、それに対して宿主抗体応答が向けられる、主要な抗原である。Ａ型インフルエンザウイルスは、それらのエンベロープタンパク質ＨＡおよびＮＡの特性に基づいて、亜群に分類される。１６のＨ（Ａ）および９のＮ（Ａ）亜型が、目下知られている。現在のところ、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、およびＨ３Ｎ２亜型のインフルエンザウイルスが、ヒトの間に流行している。インフルエンザタイプＡはまた、家禽をはじめとする鳥類、ブタ、ウマ、イヌに感染し、海洋哺乳類にさえも感染する。全ての既知のＨＡおよびＮＡ亜型は、野生水鳥から単離され得て、それは世界的流行Ａ型ウイルス遺伝子の天然リザバーおよび起源を構成する。宿主における複製および選択の誤りがちな様式の理由から、Ａ型インフルエンザおよびＢウイルスは、それらの２つの表面抗原、ＨＡおよびＮＡタンパク質に漸進的な抗原性変化を被る。抗原ドリフトとして知られているこの現象は、継続的な警戒、そしてワクチン製造のために使用される株の毎年の再調査／更新を余儀なくさせる。世界的流行は、抗原性の移行、すなわち、新規ＨＡ亜型のみ、または新規ＨＡおよびＮＡ亜型双方のどちらかを含有する、新規Ａ型インフルエンザウイルスのヒト集団への導入に起因する。
【０００８】
不活性化全ウイルスインフルエンザワクチンは、１９４５年以来使用されている。典型的に、ワクチンウイルスは、有胚鶏卵の尿膜腔内で増殖されている。より最近では、このようなワクチンはまた、哺乳類細胞株内で増幅されたウイルスからも製造されている。１９７０年代以来、ほとんどの不活性化ワクチンは、サブウイルスまたは分割ワクチンである。使用されている典型的なワクチンは、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２亜型Ａ型インフルエンザ株からのＨＡと、Ｂ型インフルエンザ株（ＴＩＶと称される）とを含んでなる、三価ワクチンである。不活性化ウイルスワクチン（ＴＩＶ）の変わりやすい有効性、短い保護持続期間、非経口投与（使用される主要経路）に対する有害反応、および効果的細胞性免疫誘導の不在が、弱毒生インフルエンザウイルスワクチン（ＬＡＩＶ）の開発を導いた。鼻腔内ワクチンは、温度感受性および寒冷適応インフルエンザウイルスＡおよびＢ株をベースとして製造された。
【０００９】
ワクチンの有効性および有効性データの更新された系統的レビューおよびメタ分析が、つい先頃出版された。Ｏｓｔｅｒｈｏｌｍ，Ｍ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２：３６−４４。分析は、１９６７〜２０１１年に米国で実施され出版された調査に、焦点を合わせている。研究は、科学的な厳密さを保証して、可能な限りバイアスを排除するように意図された、基準セットに基づいて選択された。全ての基準は、ワクチン有効性（９５％ＣＩ＞０）を示す１７の無作為化対照試験によって満たされ、その内、８試験はＴＩＶに、９試験はＬＡＩＶに関連した。試験は、２４のインフルエンザ流行期をカバーして、ほぼ５４，０００人の参加者を含んだ。ＴＩＶに対する有意な有効性を明らかにした試験の内、６試験には１８〜６４才の参加者、１試験には６〜２３ヶ月齢の小児が関与し、１試験は全ての年齢群を含んで、合わせた効果を報告した。これらの試験によって明らかにされた平均ワクチン有効性は、６２％であった。いずれの試験も、６５才以上の成人、または２〜１７才の子供におけるワクチン効果を特に試験しなかったことに留意されたい。特に興味深いのは、そのどちらにおいてもワクチンと流行株の間に良好な一致があった、２回の流行期にわたり実施された小児における研究である。Ｈｏｂｅｒｍａｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ  ａｃｕｔｅ  ｏｔｉｔｉｓ  ｍｅｄｉａ  ｉｎ  ｙｏｕｎｇ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ．ＪＡＭＡ  ２９０：１６０８−１６。最初の流行期のワクチン有効性は６６％であり、２回目の流行期では７％であった。ＬＡＩＶについて、６ヶ月齢〜７才の小児における８研究からの平均有効性は、７８％であった。Ｏｓｔｅｒｈｏｌｍ，Ｍ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）。１８〜４９才の対象に関する３研究は、有意な保護がないことを明らかにした。６０才を超える人々に関する１研究は、４２％の全体的有効性を示したが、６０〜６９才における有効性は、７０才を超える人々における有効性よりも大幅に低いようであった。８〜１７才の子供または５０〜５９才の成人に関する、適格な研究はない。
【００１０】
組み入れ規準を満たす１４の観察的な研究のいずれも、季節性インフルエンザワクチンの有効性を報告しなかった。Ｏｓｔｅｒｈｏｌｍ，Ｍ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）。これらの研究は、１７の埋め込みまたはコホート分析を含んだ。１７の分析の内、６つ（３５％）は、治療され、検査で確認されたインフルエンザに対する有意な有効性を示した。６〜５９ヶ月齢の小児では、有意なワクチン有効性が、８回の流行期の内、３回の（３８％）流行期で見られた。このような２つの研究の１つは、６５才以上の対象におけるワクチン有効性を報告した。これらのデータに基づいて、目下利用できるインフルエンザワクチンは、ウイルス学的に確認された疾患に対する中程度の保護を提供し、その保護は長続きしないと結論付け得る。数流行期にわたる保護は、得られない。最大リスク集団、すなわち、６５才以上の人々の保護の証拠は、確かに非常に脆弱である。より効果的なワクチンが、明らかに必要である。現在のワクチンは、保護的効果のために、ＨＡ抗体の誘導に大きく依存する。将来のインフルエンザワクチンは、強力な（エフェクター）Ｔ細胞応答を誘導できるべきであり、すなわちより完全な免疫応答を誘導すべきであることが提案されている。Ｏｓｔｅｒｈａｕｓ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｔｏｗａｒｄｓ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｂ  ３６６：２７６６−７３；Ｔｈｏｍａｓ，Ｐ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １２：４８−５４。
【００１１】
ＨＩＶ／ＡＩＤＳは、サハラ以南のアフリカにおける主な死亡原因であり、世界の死亡率の重要な原因である。ＨＩＶは、特徴的に緩慢な感染症を引き起こすレトロウイルスであるレンチウイルスであり、それは活性化された宿主免疫応答の存在下で、長い潜伏期後に疾患を生じさせる。ＨＩＶにはＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２が含まれ、ＨＩＶ−１はより高悪性度かつより迅速に拡散するウイルスである。感染過程の第１段階として、ウイルスエンベロープタンパク質ｇｐ１２０は、標的細胞表面のＣＤ４受容体、次にＣＣＲ−５またはＣＸＣＲ−４共受容体と結合する。ＣＤ４は、Ｔヘルパーリンパ球、単球マクロファージ、濾胞性ＤＣ、皮膚のランゲルハンス細胞、および中枢神経系の小膠細胞内に存在する。
現時点で、ＨＩＶ／ＡＩＤＳに対して利用できる効果的ワクチンはない。いくつかの観察は、ワクチンが有効であるためには、かなりの細胞性免疫応答を始動しなくてはならないことを示唆する。いくつかのワクチン候補が、臨床試験で試験された。最近の重要な治験は、Ｔ細胞応答を誘導するためにウイルスベクターを利用した。有効性をさらに増大させるために、これらの治験はプライムブースト措置もまた実施した。このような第ＩＩＩ相試験の１つは、ＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原を発現するカナリアポックスのプライミングと、ＨＩＶｇｐ１２０ブーストとの組み合わせを使用した。ＨＩＶ−１予防に向けた傾向が見られたが、ワクチンは、感染後ウイルス負荷またはＣＤ４＋細胞数に対する有益な効果を生じなかった。Ｄｒａｐｅｒ，Ｓ．Ｊ．ａｎｄ  Ｈｅｅｎｅｙ，Ｊ．Ｌ．（２０１０）Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８：６２−７３；Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＨＩＶ  ｖａｃｃｉｎｅｓ−ｌｅｓｓｉｏｎｓ  ｌｅａｒｎｅｄ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｗａｙ  ｆｏｒｗａｒｄ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＨＩＶ  ＡＩＤＳ  ５：４２８−３４。様々なＨＩＶタンパク質を発現する複製能力がないＡｄ５をワクチンとして使用する、別の最近の一連の治験は、いかなる有効性の徴候も示さなかった。後者の経験、ならびに狭いＣＴＬ応答がＣＴＬ回避変異体の出現をもたらし得るという認識は、将来のワクチン候補には、幅広いＣＴＬ応答をはじめとする、完全な免疫応答を誘導できるべきであることを示唆する。Ｇｏｕｌｄｅｒ，Ｐ．Ｊ．Ｒ．ａｎｄ  Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｄ．Ｉ．（２００４）ＨＩＶ  ａｎｄ  ＳＩＶ  ＣＴＬ  ｅｓｃａｐｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：６３０−４０；Ｂａｒｏｕｃｈ，Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｅｖｅｎｔｕａｌ  ＡＩＤＳ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｉｎ  ａ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ  ｂｙ  ｖｉｒａｌ  ｅｓｃａｐｅ  ｆｒｏｍ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：３３５−９。
【００１２】
結核は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）によって引き起こされる。Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｉｎ：Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｐｌｏｔｋｉｎ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．）５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ．２００８．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ。疾患は、広範な予防接種プログラムにもかかわらず、世界（ｗｏｒｄ）人口のおよその３分の１がこの微生物に感染する、巨大な公衆衛生問題に相当する。潜在型結核感染は、疾患の前臨床状態である。疾患の発生は、潜在的感染症の確立時点から、数週間または数１０年以内に起こり得る。結核からの年間死亡数は、数百万の範囲にある。Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に対するヒト耐性の根底にある正確な免疫学的機序は、未だに解明されていない。しかし、進行性疾患が、Ｔｈ２または混合Ｔｈ１／Ｔｈ２反応に関連する一方で、純粋なＴｈ１反応は、保護と関連があることが知られている。Ｓｕｒｃｅｌ，Ｈ−Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｔｈ１／Ｔｈ２  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｉｎ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｔｏ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８１：１７１−６；Ｓｃｈａｕｆ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｇｅｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｔｏ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ  ｏｆ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６８：１０５６−９。カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチンは、目下使用されている最も古いワクチンである。不運にも、ワクチンが効くかどうかという質問は、確定的に答えられていない。０〜８０％の間の有効率が報告されている。ＢＣＧ予防接種によって引き起こされる正確な免疫応答、ならびに宿主内の作用機序は、良く分かっていない。Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ａｎｉｍａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｈａｖｅ  ｂｅｅｎ  ｉｎｆｒｅｑｕｅｎｔ．Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．（１９８５）Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ＢＣＧ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ａｄｖ．Ｔｕｂｅｒｃ．Ｒｅｓ．２２：１−９７。それでもなお、入手できる情報は、保護的効果がＣＤ４Ｔ細胞によって移入され得るが、血清では移入され得ないことを示唆する。さらに、ワクチン接種動物中ではＴ細胞応答がより迅速であり、より迅速なマクロファージ活性化がもたらされた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
新しい、より効果的なワクチンが明らかに必要である。本発明は、複製能を有する制御ウイルスを含んでなるワクチン組成物、ならびに後者の（ｌａｔｔｅｒ）組成物を利用する免疫化方法に関する。
【００１４】
ＳａｆｅＳｗｉｔｃｈまたはＳａｆｅＳｗｉｔｃｈ様遺伝子スイッチによって制御される、複製能を有するウイルスおよびウイルス対は、米国特許第７，９０６，３１２号明細書および米国特許第８，１３７，９４７号明細書で、概して開示された。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
一実施形態では、本発明は、複製能を有する制御ヘルペスウイルスの有効量を含んでなる組成物を含んでなる、改善されたワクチンを提供する。改善されたワクチンは、弱毒型ヘルペスウイルスおよび複製能を有する制御ヘルペスウイルスが、同一野性型ウイルスに由来するという条件で、同等量の複製欠陥弱毒型ヘルペスウイルスを含んでなる比較ワクチンと比較すると、哺乳類攻撃モデルにおいて優れた防御免疫を誘導する。この野性型ウイルスはまた、哺乳類攻撃モデルにおける攻撃ウイルスでもあり、すなわち、評価される防御免疫は、この野性型ウイルスを対象とする。ヒトのデータは未だに入手できないため、妥当な哺乳類攻撃モデルを使用して改善が確立されたことに留意されたい。適切な哺乳類攻撃モデルは、関心のある野性型ウイルスによる選択された哺乳類種動物の感染が、動物において、ヒト宿主で誘発される疾患または病状の適切な側面の顕在化を再現性良くもたらすものである。利用できれば、小型哺乳類動物モデルが好ましく、マウスモデルが最も好ましい。「防御免疫」は、野性型ウイルスの接種によって誘発される疾患または病状の側面の後者の（ｌａｔｔｅｒ）顕在化を予防し、または重症度または持続期間を軽減し／低下させる、またはそれから帰結する死亡率を低下させる、免疫応答と理解される。
【００１６】
本発明の複製能を有する制御ヘルペスウイルスは、以下の特性の組を有する：
（１）哺乳類対象の身体領域への投与時に、複製能を有する制御ウイルスが、活性化不在下において身体領域で本質的に非自己複製のままであり、または代案としては（すなわち、異なる実施形態では）、複製能を有する制御ウイルスと同様の組成物中で、同様の量で、同様の対象の同様の身体領域に投与された複製欠陥比較ウイルスと、同様の低い効率で自己複製する、
（２）身体領域の局在性活性化処置への曝露が、複製能を有する制御ウイルスが、身体領域中で１周期の複製を受けるように活性化させる、
（３）活性化に際して、複製能を有する制御ウイルスは、哺乳類対象において免疫応答を誘導するのに十分な効率で自己複製し、この免疫応答は、複製能を有する制御ウイルスがそれに由来する野性型ウイルスによる感染を低下させ、および／または前記野性型ウイルスによる感染に引き続く疾患重症度、疾患持続期間または死亡率を低下させる上で、複製欠陥比較ウイルスによって同様の対象において誘導される免疫応答よりも、効果的である（複製能を有する制御ウイルスおよび複製欠陥比較ウイルスは、同様の組成物中で、同様の量で、同様の対象の同様の身体領域に投与される）。
【００１７】
複製欠陥比較ウイルスは、複製能を有する制御組換えヘルペスウイルスと同一の野性型ウイルスに由来するウイルスであり、複製能を有する制御組換えヘルペスウイルスに対して、比較の役割を果たす。このような複製欠陥比較ウイルスでは、複製能を有する制御ウイルス中では意図的制御の対象となる遺伝子の内、少なくとも１つが無効化される。無効化は、遺伝子が機能性遺伝子産物を発現できないようにする、操作または事象の結果を指す。野性型ウイルスは、対象または環境から単離されたウイルスであり、生体外でまたは動物において増殖するが、いかなる意図的選択または変異プロセスも受けていない。
複製欠陥比較ウイルスまたは複製能を有する制御ウイルスがそれに由来する野性型ウイルスと比較した、複製能を有する制御ヘルペスウイルスの複製効率は、伝染性ウイルス数（プラーク形成単位またはｐｆｕ）またはウイルス粒子数を測定できるようにする、任意の方法によって推定され得る。ウイルス複製効率を推定するための生化学的方法もまた、利用し得る。これらの方法は、ウイルスＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質産物量の定量化を目的とし、適切な組織化学的または免疫組織化学的方法、および増幅の生化学的アッセイおよび核酸検出（例えばリアルタイムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、プローブハイブリダイゼーション）またはウイルスタンパク質産物の検出（例えば、ウエスタンブロットまたはその他の免疫学的アッセイ）を含んでもよい。活性化された複製能を有する制御ウイルスは、比較されるウイルスがそれに由来する野性型ウイルスが本質的に定量的に１回の複製周期を完了する、同数の伝染性ウイルスまたはウイルス粒子接種後の時点で、より高いレベルの伝染性ウイルスまたはウイルス粒子、またはウイルスＤＮＡなどの生化学的相関物が測定されれば、比較ウイルスよりも高い効率で自己複製するとされる。活性化されていない複製能を有する制御ウイルスは、比較されるウイルスがそれに由来する野性型ウイルスが本質的に定量的に１回の複製周期を完了する、同数の伝染性ウイルスまたはウイルス粒子による接種後の時点で、より低いレベルの伝染性ウイルスまたはウイルス粒子、またはウイルスＤＮＡなどの生化学的相関物が測定されれば、複製能を有する制御ウイルスがそれに由来する野性型ウイルスまたは比較ウイルスよりも低い効率で自己複製するとされる。後の時点で行われた測定には、より早期に行われた測定よりも多くの重み付けが与えられるべきであろう（活性化されていない複製能を有する制御ウイルスが関与する比較の場合のみ）。活性化された複製能を有する制御ウイルスの複製効率を判定するための典型的な生体外実験は、一段成長曲線である。この種の実験はまた、実施例セクションでも例示される。
【００１８】
活性化されていない複製能を有する制御ウイルスの生体内複製挙動を特徴付けるために使用される「本質的に非自己複製」という用語は、活性化されていない複製能を有する制御ウイルスが、それが由来する野性型ウイルスよりも少なくとも１０倍低い効率で自己複製することを意味する。より好ましくは、活性化されていない複製能を有する制御ウイルスの複製効率は、それが由来する野性型ウイルスよりも少なくとも２５倍低い。なおもより好ましくは、活性化されていない複製能を有する制御ウイルスの複製効率は、それが由来する野性型ウイルスよりも少なくとも１００倍低い。
【００１９】
「複製欠陥比較ウイルスと同様に低い効率で自己複製する」という用語は、比較ウイルスの効率の１０倍以下、好ましくは比較ウイルスの効率の５倍以下、より好ましくは比較ウイルスの効率の２倍以下、最も好ましくは比較ウイルスの効率よりも検出可能に高くない、活性化されていない複製能を有する制御ウイルスの複製効率を指す。５倍高い複製効率とは、それに対してウイルスが投与された身体領域中の比較ウイルスについて測定されたものとの比較で、活性化されていない複製能を有する制御ウイルスの５倍高い測定値、またはその生化学的相関物の５倍高いレベルを指し、それによって、測定は、比較されるウイルスがそれに由来する野性型ウイルスが（本質的に定量的に）少なくとも１回の複製周期を完了した時点後になされる。
【００２０】
「同様の対象」とは、同一生物種、同一性別、およびほぼ同年齢からの対象を指す。用語は統計学的意味を有すると理解され得て、その場合、比較ウイルスを投与された同様の対象は、複製能を有する制御ウイルスを投与された対象群と同一の哺乳類種、同一の性別または混合性別で、ほぼ同一の年齢または年齢分布の対象群である。
【００２１】
「同様の組成物で、同様の量で、同様の身体領域に」は、それが比較される組成物、量または身体領域と同一の、または合理的な努力で達成され得る非常に類似した、組成物、量または身体領域を指す。
【００２２】
特定の実施形態では、ワクチン組成物は、そのゲノムが小分子制御因子活性化トランス活性化因子の遺伝子を含んでなり、その遺伝子が熱ショックプロモーターの役割を果たす核酸配列と、または熱ショックプロモーターならびにトランス活性化因子応答性プロモーターの役割を果たす核酸配列と、機能的に連結する、複製能を有する制御組換えヘルペスウイルス；および複製必須遺伝子とも称される効率的複製に必要な１つまたは複数のウイルス遺伝子と機能的に連結する、１つまたは複数のトランス活性化因子応答性プロモーターを含んでなる。哺乳類対象の身体領域へのウイルス投与に引き続いて、それは、有効濃度の適切な小分子制御因子の身体領域中の存在下において、身体領域を活性化熱線量の対象とすることで活性化され得る。このような活性化処置は、１周期のウイルス複製をもたらす。便宜上、後者の複製能を有する制御ヘルペスウイルスは、本明細書で、加熱および小分子制御因子活性化ウイルスと称される。複製能を有する制御ヘルペスウイルスは、別の病原体からの（（異種）トランス活性化因子をコードする遺伝子に加えて）発現可能異種遺伝子、免疫調節性ポリペプチドをコードする発現可能異種遺伝子、または別のポリペプチドをコードする発現可能異種遺伝子、またはこのような遺伝子の任意の組み合わせをさらに含んでなり得る。このような異種遺伝子は、トランス活性化因子応答性プロモーターの制御下、または例えば、構成的活性型プロモーターなどの別のプロモーターの制御下で発現され得る。例えば、免疫調節性ポリペプチドのための異種遺伝子は、サイトカインまたはケモカインをコードする遺伝子であり得る。異種遺伝子はまた、例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ遺伝子などのウイルスの局所播種、感染または複製を促進する、タンパク質をコードする遺伝子であり得る。特定の異種遺伝子は、別の病原体（すなわち、複製能を有する制御ウイルスまたはそれが由来する野性型ウイルス以外の病原体）のタンパク質（抗原）の遺伝子であり得る。例えば、本発明の複製能を有する制御ヘルペスウイルスは、そのゲノムに挿入された、インフルエンザ表面抗原ＨＡおよび／またはＮＡの発現可能遺伝子を含有し得る。さらなる例として、異種遺伝子は、末端反復配列が欠損しており、発現されると複製欠陥ウイルス粒子を生じる、レトロウイルスの修飾ゲノムＲＮＡをコードしてもよい。このようなウイルス粒子は、個々に発現されるウイルスタンパク質よりも強力な免疫原になると考え得る。
【００２３】
別の特定の実施形態では、ワクチン組成物は、複製能を有する制御組換えヘルペスウイルスを含んでなり、そのゲノムは、小分子制御因子活性化トランス活性化因子の遺伝子を含んでなり、その遺伝子は、構成的活性型またはトランス活性化因子促進プロモーターの役割を果たす核酸配列、第１の複製必須ウイルス遺伝子と機能的に連結する熱ショックプロモーターの役割を果たす核酸配列、および第２の複製必須ウイルス遺伝子と機能的に連結するトランス活性化因子応答性プロモーターと機能的に連結する。哺乳類対象の身体領域へのウイルス投与に引き続いて、それは、有効濃度の適切な小分子制御因子の身体領域中の存在下において、身体領域を活性化熱線量の対象とすることで活性化され得る。このような活性化処置は、１周期のウイルス複製をもたらす。複製能を有する制御組換えウイルスは、別の病原体からの異種遺伝子、免疫調節性ポリペプチドをコードする異種遺伝子、または別のポリペプチド、またはその双方をコードする異種遺伝子をさらに含んでなり得る。このような異種遺伝子は、トランス活性化因子応答性プロモーターの制御下、または例えば、構成的活性型プロモーターなどの別のプロモーターの制御下で発現され得る。後者の複製能を有する制御ヘルペスウイルスは、本明細書で、加熱および小分子制御因子活性化ウイルスとも称される。「トランス活性化因子促進プロモーター」という用語は、トランス活性化因子不在下で、必然的にいくつかの残効性を有して、その活性がトランス活性化因子のレベル増大の関数として増大するプロモーターを指す（自動活性化プロモーターとも称される）。「トランス活性化因子応答性プロモーター」は、それを活性化するトランス活性化因子の不在下では、理想的には不活性のプロモーターである。
【００２４】
なおも別の実施形態では、ワクチン組成物は、複製能を有する制御組換えヘルペスウイルスを含んでなり、そのゲノムは、小分子制御因子活性化トランス活性化因子の遺伝子を含んでなり、その遺伝子は、構成的活性型またはトランス活性化因子促進プロモーターの役割を果たす核酸配列、および複製必須ウイルス遺伝子と機能的に連結するトランス活性化因子応答性プロモーターと機能的に連結する。哺乳類対象の身体領域へのウイルスの投与に引き続いて、それは、身体領域を有効濃度の適切な小分子制御因子の対象とすることで、活性化され得る。このような活性化処置は、少なくとも１周期のウイルス複製をもたらす。複製能を有する制御ウイルスは、別の病原体からの異種遺伝子、免疫調節性ポリペプチドをコードする異種遺伝子、または別のポリペプチド、またはその双方をコードする異種遺伝子をさらに含んでなり得る。このような異種遺伝子は、トランス活性化因子応答性プロモーターの制御下、または例えば、構成的活性型プロモーターなどの別のプロモーターの制御下で発現され得る。便宜上、後者の複製能を有する制御ウイルスは、本明細書で、小分子制御因子活性化ウイルスと称される。
【００２５】
一実施形態では、複製能を有する制御ヘルペスウイルスが提供され、そのゲノムは、小分子制御因子活性化トランス活性化因子遺伝子を含んでなり、その遺伝子は、熱ショックプロモーターの役割を果たす核酸配列、または熱ショックプロモーターならびにトランス活性化因子応答性プロモーターの役割を果たす核酸配列、および１つまたは複数の複製必須ウイルス遺伝子と機能的に連結する、１つまたは複数のトランス活性化因子応答性プロモーターと機能的に連結し、それにおいては、複製能を有する制御ヘルペスウイルスがＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２に由来する場合は、複製必須ウイルス遺伝子の１つはＩＣＰ４遺伝子またはＩＣＰ８遺伝子であり、または複製必須ウイルス遺伝子の内２つはＩＣＰ４およびＩＣＰ８遺伝子であり、あるいは複製能を有する制御ヘルペスウイルスが別のヘルペスウイルスに由来する場合は、これらの遺伝子の機能性類似体またはオルソログである。このようなヘルペスウイルスを含んでなるワクチン組成物もまた、提供される。
【００２６】
一実施形態では、複製能を有する制御ヘルペスウイルスが提供され、そのゲノムは、小分子制御因子活性化トランス活性化因子遺伝子を含んでなり、その遺伝子は、構成的活性型またはトランス活性化因子促進プロモーターの役割を果たす核酸配列、第１の複製必須ウイルス遺伝子と機能的に連結する、熱ショックプロモーターの役割を果たす核酸配列、および第２の複製必須ウイルス遺伝子と機能的に連結する、トランス活性化因子応答性プロモーターと機能的に連結し、それにおいては、第２の複製必須ウイルス遺伝子は、複製能を有する制御ヘルペスウイルスがＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２に由来する場合は、ＩＣＰ４遺伝子であり、または複製能を有する制御ヘルペスウイルスが別のヘルペスウイルスに由来する場合は、この遺伝子の機能性アナログまたはオルソログである。このようなヘルペスウイルスを含んでなるワクチン組成物もまた、提供される。
【００２７】
一実施形態では、哺乳類対象において、複製能を有する制御ヘルペスウイルスがそれに由来する野性型ウイルスに対する防御免疫を誘導するために使用される、複製能を有する制御ヘルペスウイルスの有効量を含んでなる組成物が提供され、それによって、複製能を有する制御ヘルペスウイルスのゲノムは、小分子制御因子活性化トランス活性化因子の遺伝子を含んでなり、その遺伝子は、熱ショックプロモーターの役割を果たす核酸配列、または熱ショックプロモーターならびにトランス活性化因子応答性プロモーターの役割を果たす核酸配列、および１つまたは複数の複製必須ウイルス遺伝子と機能的に連結する１つまたは複数のトランス活性化因子応答性プロモーターと機能的に連結し、防御免疫は、哺乳類対象の皮膚または粘膜内のまたはその直下の領域に、組成物を投与するステップと、小分子制御因子の有効量を含んでなる組成物を哺乳類対象に投与するステップと、前記領域を複製能を有する制御ヘルペスウイルスの活性化をもたらす加熱処置の対象とするステップとによって誘導される。
【００２８】
本発明の複製能を有する制御ウイルスは、ヘルペスウイルス科（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスに由来する。より具体的な実施形態では、複製能を有する制御組換えヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、およびバラ疹ウイルスから選択されるウイルスに由来する。
【００２９】
特定の実施形態は、加熱および小分子制御因子活性化ウイルスまたは小分子制御因子活性化ウイルスを含んでなるワクチン組成物に関し、それによってウイルスはＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２に由来し、トランス活性化因子制御複製必須ウイルス遺伝子は、ＩＣＰ４遺伝子またはＩＣＰ８遺伝子の全コピーである。より具体的な実施形態では、ウイルスはＨＳＶ−ＧＳ１と同一であり、またはＨＳＶ−ＧＳ１に由来する。さらなる実施形態は、加熱および小分子制御因子活性化ウイルスまたは小分子制御因子活性化ウイルスを含んでなる組成物に関し、それによってウイルスはＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２に由来し、第１のトランス活性化因子制御複製必須ウイルス遺伝子は、ＩＣＰ４遺伝子の全コピーであり、第２のトランス活性化因子制御または熱ショックプロモーター駆動性複製必須ウイルス遺伝子は、ＩＣＰ８遺伝子である。より具体的な実施形態では、ウイルスはＨＳＶ−ＧＳ３と同一であり、またはＨＳＶ−ＧＳ３に由来する。その他の実施形態では、加熱および小分子制御因子活性化ウイルスまたは小分子制御因子活性化ウイルスは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２に由来して、機能性ＩＣＰ４７遺伝子を欠く。このウイルスはＨＳＶ−ＧＳ４と同一であり得て、またはそれに由来する。
【００３０】
加熱および小分子制御因子活性化ウイルスまたは小分子制御因子活性化ウイルスを含んでなるワクチン組成物の特定の実施形態では、小分子制御因子活性化トランス活性化因子は、プロゲステロン受容体からのリガンド結合ドメインを含有し、リガンド結合ドメインと相互作用してトランス活性化因子を活性化できる、プロゲステロン受容体拮抗薬またはその他の分子によって活性化される。代案としては、それはエクジソン受容体からのリガンド結合領域を含有し、リガンド結合領域と相互作用してトランス活性化因子を活性化できる、エクジステロイド、ジアシルヒドラジンまたはその他の分子によって活性化される。さらに別の代案では、それは、細菌テトラサイクリンリプレッサーからのリガンド結合領域を含有し、テトラサイクリンリプレッサードメインと相互作用してトランス活性化因子を活性化できる、テトラサイクリンまたはその他の分子によって活性化される。加熱および小分子制御因子活性化ウイルスまたは小分子制御因子活性化ウイルスを含んでなる組成物のさらに別の実施形態では、小分子制御因子活性化トランス活性化因子は、エストロゲン受容体からのリガンド結合ドメインを含有し、リガンド結合ドメインと相互作用してトランス活性化因子を活性化できる、エストロゲン受容体拮抗薬またはその他の分子によって活性化される。さらなる実施形態では、小分子制御因子活性化トランス活性化因子は、ｍＴＯＲからのＦＫＢＰ１２配列を含有するポリペプチドとＦＲＢ配列を含有するポリペプチドとの複合体であり、双方のポリペプチドと相互作用してトランス活性化因子を活性化できる、ラパマイシン、ラパマイシン誘導体またはその他の分子によって活性化される。
【００３１】
加熱および小分子制御因子活性化ヘルペスウイルス（ｈｅｐｒｅｓｖｉｒｕｓ）または小分子制御因子活性化ヘルペスウイルスを含んでなる、本発明のワクチン組成物は、複製能を有する制御ウイルスの宿主域と重複する宿主域を有してトランス活性化因子応答性プロモーターと機能的に連結する複製必須遺伝子を有する、第２のウイルスをさらに含んでなり得て、その結果、複製能を有する制御ウイルスのトランス活性化因子の発現および活性化は、同時感染した第２のウイルスの制御複製必須遺伝子の発現もまたもたらし、それによって第２のウイルスが複製できるようにする。後者の組成物によって引き起こされる免疫応答は、複製能を有する制御ウイルスだけでなく、第２のウイルスも対象とすることが期待される。第２のウイルスは、アデノウイルスであり得て、トランス活性化因子応答性プロモーターと機能的に連結する（第２のウイルスの）複製必須遺伝子は、Ｅ１またはＥ４遺伝子のどちらかまたはこれらの遺伝子の双方であり得る。
【００３２】
代案としては、加熱および小分子制御因子活性化ヘルペスウイルスまたは小分子制御因子活性化ヘルペスウイルスを含んでなる本発明の組成物は、複製能を有する制御ウイルスの宿主域と重複する宿主域を有する第２のウイルスをさらに含んでなり得て、それによって第２のウイルスは、複製必須遺伝子を欠き、またはそれらの非機能性バージョンのみを含有して、その結果、複製必須遺伝子の欠損している機能性産物がトランスに提供される場合にのみ、自己複製し得る。この組成物中では、複製能を有する制御ウイルスは、後者の（第２のウイルスの）複製必須遺伝子の機能性バージョンを含んでなり、その遺伝子は、トランス活性化因子応答性プロモーターと機能的に連結し、その結果、複製能を有する制御ウイルスのトランス活性化因子の発現および活性化は、第２のウイルスの制御複製必須遺伝子の発現もまたもたらし、それによって第２のウイルスを補完する。後者の組成物によって引き起こされる免疫応答は、複製能を有する制御ウイルスのみでなく、第２のウイルスもまた対象とするはずである。第２のウイルスは、非機能性Ｅ１および／またはＥ４遺伝子を有するアデノウイルスであり得て、複製能を有する制御ウイルスから発現される複製必須遺伝子は、Ｅ１および／またはＥ４遺伝子であり得る。
【００３３】
その他の実施形態は、加熱および小分子制御因子活性化ヘルペスウイルスまたは小分子制御因子活性化ヘルペスウイルスの有効量と、加熱および小分子制御因子活性化ヘルペスウイルスまたは小分子制御因子活性化ヘルペスウイルスの複製を制御するトランス活性化因子を活性化できる小分子制御因子の有効量とを含んでなる、ワクチン組成物に関する。
【００３４】
本発明はまた、免疫化における、複製能を有する制御ヘルペスウイルスの有効量を含んでなるワクチン組成物の使用にも関する。特定の実施形態では、本発明は、免疫化における、加熱および小分子制御因子活性化ヘルペスウイルスまたは小分子制御因子活性化ヘルペスウイルスの有効量を含んでなる組成物の使用に関与する。ウイルスは、別の病原体からの異種遺伝子、免疫調節性ポリペプチドをコードする異種遺伝子、または別のポリペプチドをコードする異種遺伝子の１つまたは複数を含んでなり得る。このような異種遺伝子は、トランス活性化因子応答性プロモーターの制御下、または例えば、構成的活性型プロモーターなどの別のプロモーターの制御下で発現され得る。ウイルスおよび小分子制御因子の有効量は、同一組成物中に存在し得る。後者の組成物は、それが投与された後に活性化処置を受けた哺乳類対象において、同様の対象において、複製欠陥比較ウイルスによって誘導される免疫応答よりも、複製能を有する制御ウイルスがそれに由来する野性型ウイルスによる感染を低下させ、および／または前記野性型ウイルスの感染に引き続く、疾患重症度、疾患持続期間または死亡率を低下させるのに、より効果的な免疫応答を誘導できる（複製能を有する制御ウイルスおよび比較ウイルスは同様の組成物中で、同様の量で、同様の対象の同様の身体領域に投与される）。
【００３５】
本発明は、その中で本発明の組成物が対象に投与される、免疫化方法もまた包含する。免疫化方法の一実施形態は、（１）発現可能異種遺伝子もまた含有してもよい、加熱および小分子制御因子活性化ヘルペスウイルスの有効量を含んでなる本発明の組成物を哺乳類対象の身体領域に投与するステップと、（２）（加熱および小分子制御因子活性化ヘルペスウイルスのトランス活性化因子を活性化できる小分子制御因子である）有効濃度の適切な小分子制御因子の身体領域中の存在下で、前記身体領域を活性化熱線量に曝露させるステップとを含んでなる。関連方法では、ウイルスおよび小分子制御因子の有効量が単一組成物中で同時投与されて、身体領域が活性化熱線量に曝露される。
【００３６】
関連方法では、発現可能異種遺伝子もまた含有してもよい、小分子制御因子活性化ヘルペスウイルスの有効量を含んでなる本発明の組成物が身体領域に投与されて、身体領域は有効濃度の小分子制御因子に曝露される。さらなる関連方法では、ウイルスおよび小分子制御因子の有効量は、単一組成物中で同時投与される。上記の方法の派生方法では、加熱および小分子制御因子活性化ヘルペスウイルスは、有効濃度の小分子制御因子の存在下で、身体領域（接種領域）の活性化熱線量への２回以上の曝露によって２回以上活性化され得て、あるいは小分子制御因子活性化ウイルスは、身体領域の有効濃度の小分子制御因子への２回以上の曝露によって再活性化され得る（２回以上の活性化が、ウイルスクリアランスに先だって起こるという条件で）。
【００３７】
本発明の組成物がそれに投与される身体領域（接種部位領域）は、対象の身体表面または体内の任意の領域であり得て、その領域に、例えば、熱線量および／または有効用量の適切な小分子制御因子などの活性化処置が施され得る。身体領域は、対象の体躯または四肢の任意の場所に位置する皮膚または皮下の領域であり得る。好ましくは、組成物の投与は、対象の上肢に位置する、皮膚または皮下の領域への投与であり得る。投与はまた、対象の肺または気道、または開口部粘膜への投与であり得る。もう一つの好ましい身体領域は、対象の鼻粘膜である。
【００３８】
一実施形態では、（１）加熱および小分子制御因子活性化ウイルスの有効量を含んでなる組成物を哺乳類対象の身体領域に投与するステップと、（２）有効濃度の（加熱および小分子制御因子活性化ウイルスのトランス活性化因子を活性化できる小分子制御因子である）適切な小分子制御因子の身体領域中の存在下で、前記身体領域を活性化熱線量に曝露させるステップとを含んでなる、免疫化する方法が提供される。一実施形態では、ウイルスおよび小分子制御因子の有効量が単一組成物中で同時投与されて、身体領域が活性化熱線量に曝露される。一実施形態では、ウイルスおよび小分子制御因子の有効量が別々に同時投与されて、身体領域が活性化熱線量に曝露される。一実施形態では、組成物は、本明細書に記載される任意のワクチン組成物である。一実施形態では、ウイルスは、本明細書に記載される複製能を有する制御ヘルペスウイルスを含んでなる、任意のウイルス組成物である。一実施形態では、方法は、対象をヘルペス性疾患または病状に対して免疫化する方法である。一実施形態では、ステップ（１）および（２）は、任意選択的に少なくとも１週間、１ヶ月間などの間隔で、さらに２回以上のサイクルにわたり反復される。任意選択的に、組成物の投与は、対象の体肢に位置する、皮膚または皮下の領域への投与であり得る。
【００３９】
一実施形態では、（１）加熱および小分子制御因子活性化ヘルペスウイルスの有効量を含んでなる組成物を哺乳類対象の身体領域に投与するステップと、（２）有効濃度の（加熱および小分子制御因子活性化ヘルペスウイルスのトランス活性化因子を活性化できる小分子制御因子である）適切な小分子制御因子の身体領域中の存在下で、前記身体領域を活性化熱線量に曝露させるステップとを含んでなる、対象において実質的にウイルスの１周期の複製を達成する方法が提供される。任意選択的に、先行する活性化処置後の１日から数日間以内にステップ２を反復することで、複数の複製周期が達成され得る。一実施形態では、ウイルスおよび小分子制御因子の有効量が単一組成物中で同時投与されて、身体領域が活性化熱線量に曝露される。一実施形態では、ウイルスおよび小分子制御因子の有効量が別々に同時投与されて、身体領域が活性化熱線量に曝露される。一実施形態では、組成物は、本明細書に記載される任意のワクチン組成物である。一実施形態では、ウイルスは、本明細書に記載される複製能を有する制御ヘルペスウイルスを含んでなる、任意のウイルス組成物である。一実施形態では、方法は、対象をヘルペス性疾患または病状に対して免疫化する方法である。任意選択的に、組成物の投与は、対象の体肢に位置する、皮膚または皮下の領域への投与であり得る。
【００４０】
一実施形態では、
（ｉ）選択された野性型ヘルペスウイルスからの核酸配列を選択された遺伝子内挿入部位の側面に挿入することで、第１の前駆型組換えベクターを調製するステップと、
（ｉｉ）熱ショックプロモーターの役割を果たす核酸配列または熱ショックプロモーターならびにトランス活性化因子応答性プロモーターの役割を果たす核酸配列と機能的に連結する、小分子制御因子活性化トランス活性化因子の遺伝子を含んでなる、トランス活性化因子遺伝子カセットを側面のウイルスヌクレオチド配列間の部位にある第１の前駆物質組換えベクター中に挿入することで、第１の組換えベクターを調製するステップと、
（ｉｉｉ）第１の組換えベクターと野性型ビリオンＤＮＡとで同時形質導入された細胞内の組換えによって、野性型ヘルペスウイルスゲノム中に遺伝子カセットを導入し、子孫ウイルスのゲノム内の遺伝子カセットの存在を検出することで第１の組換えウイルスを同定し、それからビリオンＤＮＡを調製するステップと、
（ｉｖ）野性型ヘルペスウイルスからの核酸配列を制御のために選択された複製必須ウイルス遺伝子のプロモーター領域側面に挿入することで、第２の前駆型組換えベクターを調製するステップと、
（ｖ）トランス活性化因子応答性プロモーターを側面のウイルスヌクレオチド配列間の部位にある第２の前駆型組換えベクターに挿入することで、第２の組換えベクターを調製するステップと、
（ｖｉ）第２の組換えベクターと第１の組換えウイルスのビリオンＤＮＡとの細胞同時形質導入組換えによって、トランス活性化因子応答性プロモーターを第１の組換えウイルスのゲノム内に導入し、子孫ウイルスのゲノム内のトランス活性化因子応答性プロモーターの存在を検出することで、第２の組換えウイルスを同定し、トランス活性化因子遺伝子カセットとトランス活性化因子制御複製必須ウイルス遺伝子との双方を含有する、子孫ウイルスの系統を調製するステップとを含んでなる、複製能を有する制御ヘルペスウイルスを製造する方法が提供される。一実施形態では、トランス活性化因子応答性プロモーターが野性型ヘルペスウイルス中に挿入されて、第１の組換えウイルスが生成され、トランス活性化因子カセットが第１の組換えウイルス中に挿入される。
【００４１】
方法のいずれでも、特に「発明の詳細な説明」をはじめとする）本出願に記載される任意のステップを含んでなるとして、さらに特徴付けられ得る。本発明は、本明細書に記載される組成物を同定、試験および／または製造する方法にさらに関する。本開示は、医薬品、特にワクチン、本明細書で開示される組成物の調合物にさらに関する。本開示は、例えば、ヘルペス性疾患または病状などの疾患の治療または予防法において、組成物を使用する方法にさらに関する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、ルシフェラーゼ標的遺伝子を制御する、抗黄体ホルモン（ミフェプリストン）装備および熱活性化（または加熱および抗黄体ホルモン（ミフェプリストン）活性化）ＳａｆｅＳｗｉｔｃｈを提示する。Ｖｉｌａｂｏａ，Ｎ．ａｎｄ  Ｖｏｅｌｌｍｙ，Ｒ．（２００９）Ｄｅｌｉｂｅｒａｔｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ．Ｉｎ：Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓｍｙｔｈ  Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ，Ｎ．ｅｄ．）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，ｐｐ．６１９−３６からの転載。
【図２】図２は、ヒト系統の安定形質移入細胞内のＳａｆｅＳｗｉｔｃｈ性能に関する。上部パネル：４３℃での活性化加熱処置（ＨＳ）の１日後における標的遺伝子活性。下部パネル：ミフェプリストン（Ｍｉｆ）の存在下における、加熱活性化（４３℃／２時間）の１日（１ｄ）および６日（６ｄ）後の遺伝子活性、および活性化の可逆性。＊Ｍｉｆは、ＨＳの１日後に洗い流された。Ｖｉｌａｂｏａ，Ｎ．ａｎｄ  Ｖｏｅｌｌｍｙ，Ｒ．（２００９）からの転載。
【図３】図３は、Ｖｅｒｏ細胞内のＨＳＶ−ＧＳ１を用いた一段成長実験に関する。（Ａ）複製の制御可能性。４つの基本的な条件が試験された。（１）１０ｎＭミフェプリストンの存在下（活性化処置）における、４３．５℃で３０分間の加熱処置（２）加熱処置のみ、（３）ミフェプリストン曝露のみ、および（４）無処理。加熱処置は、感染直後（すなわち、ウイルス接種材料除去の直後）に施された。（Ｂ）活性化処置の存在下または不在下における、野性型１７ｓｙｎ＋株およびＨＳＶ−ＧＳ１の複製効率の比較。加熱処置は、感染の４時間後に適用された。Ｍｉｆ：ミフェプリストン。ＰＦＵ／ｍｌ値および標準偏差が示される。
【図４】図４は、ＨＳＶ−ＧＳ３を用いた一段増殖実験に関する。（Ａ）ＩＣＰ８発現プラスミド（ＨＳＶ−ＧＳ３）で形質移入されたＥ５細胞（１７ｓｙｎ＋）またはＥ５細胞内における、活性化処置の存在下または不在下における、野性型１７ｓｙｎ＋株およびＨＳＶ−ＧＳ３の複製効率の比較。（Ｂ）Ｖｅｒｏ細胞内のＨＳＶ−ＧＳ３の複製の制御。（Ｃ）ＳＣＣ−１５細胞内の類似実験で試験された４つの基本的な条件の説明については、図３の説明文を参照されたい。これらの実験では、加熱処置が感染直後に施された。ＰＦＵ／ｍｌ値および標準偏差が示される。
【図５】図５は、ＨＳＶ−ＧＳ３で感染させたＶｅｒｏ細胞内における、ウイルスＤＮＡ複製および転写の制御に関する。複数の感染培養物が、パネルに示される処理を受けた。加熱処置（４３．５℃で３０分間）は、感染の４時間後に施され、培養物のセットが１、４、１２、および２４時間後に収集されて、ＤＮＡおよびＲＮＡが抽出され、それぞれｑＰＣＲおよびＲＴ−ｑＰＣＲによって分析された。Ｕｌｉ：ウリプリスタル。（Ａ）ＨＳＶ  ＤＮＡ。（Ｂ）ＩＣＰ４  ＲＮＡ。（Ｃ）ｇＣ  ＲＮＡ。値および標準偏差は、各パネル中の最大値に対して正規化された。
【図６】図６は、マウス足蹠モデルにおける、ＨＳＶ−ＧＳ３  ＤＮＡ複製および転写の制御、およびＨＳＶ−ＧＳ３とＫＤ６の間の複製収率の比較に関する。成体非近交系マウスは、軽く擦過された後肢の足蹠に、１×１０５ＰＦＵのＨＳＶ−ＧＳ３またはＫＤ６が接種された。感染の時点で、示される用量のウリプリスタルが腹腔内投与された。ウイルス投与の３時間後に、４５℃で１０分間の局在性の加熱処置が実施された。マウスは、加熱処置の２４時間後（パネルＡ〜Ｃ）、または４日後（パネルＤ）に殺処分されて、ＤＮＡおよびＲＮＡが肢および後根神経節（ＤＲＧ）から単離され、それぞれＰＣＲおよびＲＴ−ｑＰＣＲによって分析された。（Ａ）ＨＳＶ  ＤＮＡ。（Ｂ）ＩＣＰ４  ＲＮＡ。（Ｃ）ｇＣ  ＲＮＡ。（Ｄ）加熱処置の４日後のＨＳＶ  ＤＮＡ。値および標準偏差は、各パネル中の最大値に対して正規化された。ＮＤ：検出なし。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本明細書において、下でまたは他の箇所で特に断りのない限り、全ての用語は、関連技術分野におけるそれらの通常の意味を有するのもとする。
【００４４】
「ウイルスの複製」または「ウイルス／ウイルス性複製」は、ウイルス粒子の増殖を意味するものと理解される。複製は、例えば、ウイルスのプラーク形成単位（ｐｆｕ）などの伝染性ウイルスの数の判定によって測定されることが多い。しかし、複製はまた、例えば、リアルタイムＰＣＲ法などのウイルスＤＮＡ量の測定、例えば、遺伝子転写物のＲＴ−ＰＣＲなどのウイルス遺伝子発現レベルの測定などの生化学的方法によっても評価され得る。しかし閾値効果のために、ウイルスＤＮＡまたはウイルス遺伝子転写物またはタンパク質産物のレベルのわずかな増大は、対応するウイルス複製のわずかな増大に転換されなくてもよいものと理解される。
【００４５】
「タンパク質毒性ストレス」は、タンパク質アンフォールディングの増大をもたらし、新規合成ポリペプチドの成熟を低下させ、または適切に折り畳みできないタンパク質の合成を引き起こす、物理的または化学的傷害である。
【００４６】
「小分子制御因子」は、本発明に関連して使用される、トランス活性化因子の低分子量リガンドであると理解される。小分子制御因子は、トランス活性化因子を活性化できる。小分子制御因子は、必ずしもそうではないが、典型的に、約１０００ダルトン（１ｋＤａ）より小さい。
【００４７】
「トランス活性化因子」という用語は、小分子制御因子によって活性化されると、トランス活性化因子応答性プロモーターによって制御される遺伝子の転写にプラス方向の影響を及ぼし得る、非ウイルス性で、典型的に、遺伝子操作された転写因子を指すために、本明細書で使用される。
【００４８】
「活性化」は、トランス活性化遺伝子に関連して使用されると、遺伝子の発現速度が、活性化前よりも活性化後に、測定可能な程度に大きいことを意味する。トランス活性化因子に関連して使用されると、「活性」または「活性化」は、トランス活性化能力がある、トランス活性化因子の形態を指す。
【００４９】
「熱ショック遺伝子のプロモーター」、「熱ショック遺伝子プロモーター」、および「熱ショックプロモーター」は、同意語として使用される。「熱ショックプロモーターの役割を果たす核酸」は、熱ショックプロモーター、または熱ショックプロモーター内に存在するタイプの配列要素を含有する核酸であり得て、その要素は、機能的に連結する遺伝子に加熱活性化をもたらす。
【００５０】
本明細書では、そのゲノムが外来性（異種）非ウイルスまたはウイルス遺伝子を含むウイルスは、「ウイルス」または「ウイルスベクター」のどちらかで言及される。
【００５１】
「複製能を有する制御ウイルス」は、その複製能力が意図的に活性化され得る、遺伝子スイッチの制御下にある組換えウイルスである。
【００５２】
「組換えウイルス」は、特に、実験者によって改変されているウイルスを指す。多くの場合、「組換えウイルス」は、単に「ウイルス」と称される。
【００５３】
「複製必須遺伝子」または「効率的複製に必須の遺伝子」は、その機能喪失が複製効率を１０倍以上低下させるウイルス遺伝子として、本明細書において自由裁量で定義される。複製効率は、例えば、一段増殖実験で推定され得る。多くのウイルスでは、どの遺伝子が複製必須遺伝子であるかは周知である。例えば、ヘルペスウイルスについては、Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，Ｙ．（１９９６）Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｅｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｉｙ．Ｎａｇｏｙａ  Ｌ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．５９：１０７−１９を参照されたい。
【００５４】
「複製能を有する制御ウイルスの有効量」は、対象への単回または反復投与と、それに続く活性化に際して、複製能を有する制御ウイルスがそれに由来する野性型ウイルスによる感染に対する対象の耐性を検出可能に促進し、および／または前記野性型ウイルスによる感染に引き続いて疾患重症度、疾患持続期間または死亡率を検出可能に低下させるような、ウイルスの量である。同様の組成物中で同様の対象の同様の身体領域に投与される、複製欠陥比較ウイルスの対応量は、このような機能性免疫のより低いレベルを誘導する。
【００５５】
「小分子制御因子の有効量」は、所望の経路によって対象に投与されると、加熱および小分子制御因子活性化ウイルスを（加熱処置との併用で）同時活性化でき、または小分子制御因子活性化ウイルスを活性化できる量であり、それによって対象が同時に接種されているまたは接種されるであろうウイルスは、接種部位領域において１周期の複製（または小分子制御因子活性化ウイルスの場合は、少なくとも１周期の複製）を受ける。
【００５６】
「対象」または「哺乳類対象」は、哺乳類動物またはヒトである。
【００５７】
「熱ショック遺伝子」は、遺伝子を含有する細胞が、その通常の増殖温度を超える温度に曝露されると、その活性が増大される、任意の真核生物からの任意の遺伝子として、本明細書で定義される。典型的に、このような遺伝子は、細胞が通常曝露される温度が３〜１０℃上昇すると、活性化される。熱ショック遺伝子は、「古典的」熱ショックタンパク質の遺伝子、すなわち、Ｈｓｐ１１０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ４０、およびＨｓｐ２０−３０を含んでなる。それらはまた、ＭＤＲ１、ユビキチン、ＦＫＢＰ５２、ヘムオキシダーゼ、およびその他のタンパク質の遺伝子などのその他の加熱誘導性遺伝子も含む。これらの遺伝子のプロモーターである「熱ショックプロモーター」は、そのモジュールが交互の方向に配列される、タイプＮＧＡＡＮまたはＡＧＡＡＮの完全なまたは不完全な配列モジュールからなる、熱ショック要素（ＨＳＥ）と称される、特徴的な配列要素を含有する。（Ａｍｉｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｋｅｙ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ  ８：３７６１−３７６９；Ｘｉａｏ，Ｈ．ａｎｄ  Ｌｉｓ，Ｊ．Ｔ．（１９８８）Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｕｓｅｄ  ｔｏ  ｄｅｆｉｎｅ  ｋｅｙ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１１３９−１１４２；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｆｉｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ａｎｄ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｆａｃｔｏｒ−ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：１６７−１７３）。これらの要素は、全ての真核細胞で高度に保存され、例えば、ミバエからの熱ショックプロモーターは、カエルの細胞内で機能性であり加熱制御される。（Ｖｏｅｌｌｍｙ，Ｒ．ａｎｄ  Ｒｕｎｇｇｅｒ，Ｄ．（１９８２）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ｈｅａｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｏｏｃｙｔｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：１７７６−１７８０）。ＨＳＥ配列は、熱ショック転写因子（ＨＳＦ；Ｗｕ，Ｃ．（１９９５）Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１１，４４１−４６９で概説される）の結合部位である。加熱またはタンパク質毒性ストレスに曝露された脊椎動物細胞内における、熱ショック遺伝子の活性化に関与する主な要因は、熱ショック転写因子１である（本明細書で「ＨＳＦ１」と称される）（Ｂａｌｅｒ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｇｅｎｅｓ  ｉｓ  ａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄ  ｂｙ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｒａｐｉｄ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｆ��ｃｔｏｒ  ＨＳＦ１．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：２４８６−２４９６；ＭｃＭｉｌｌａｎ，Ｄ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｆａｃｔｏｒ  １  ａｂｏｌｉｓｈｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅａｔ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，７５２３−７５２８）。本明細書で考察される複製能を有する制御ウイルスで使用される好ましいプロモーターは、誘導性ｈｓｐ７０遺伝子からのものである。特に好ましい熱ショックプロモーターは、ヒトｈｓｐ７０Ｂ遺伝子のプロモーターである（Ｖｏｅｌｌｍｙ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ７０，０００−ｄａｌｔｏｎ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，４９４９−４９５３）。
【００５８】
「ワクチン」は、典型的に、死滅、複製欠陥または別の様式で弱毒化された微生物を含んでなる、組成物を指す。本明細書では、用語は拡大されて、それらが投与された対象において免疫応答を誘導し得る、複製能を有する制御ウイルスを含んでなる組成物もまた含む。
【００５９】
背発明景の下で間接的に触れたように、それぞれ、効果的またはより効果的であるためには、ヘルペス、ＨＩＶ、結核またはインフルエンザなどの疾患を予防または治療するための改善されたワクチン候補は、強力なエフェクターＴ細胞反応もまた含む、均衡のとれた免疫応答を惹起する必要があるというのが、現行の考えのようである。本発明は、活性化されると、それぞれの野性型ウイルスに近い効率で自己複製する、複製能を有する制御ウイルスに関する。本発明者らは、これらの組換えウイルスおよびそれらが発現する任意の異種タンパク質が、均衡のとれた免疫応答を惹起する、強力な免疫原になるという仮説を立てた。
【００６０】
提案される免疫化の新規アプローチは、注意深く制御された様式で、選択されたウイルスベクターに非弱毒型複製能を持たせることを意図する。基本的概念は、種痘として知られている、天然痘予防に対する歴史的アプローチを参照して例示されてもよい。Ｆｌｏｗｅｒ，Ｄ．Ｒ．（２００８）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｓｍａｌｌｐｏｘ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ．Ｉｎ：Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｐｌｏｔｋｉｎ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．）５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ．２００８．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ。最初のワクチンより前にさかのぼる手法は、天然痘から回復しつつあるヒトからの乾燥瘡蓋または膿疱性体液を典型的に皮下に、健康人に接種することに関する。それが慣例的に実施されていた当時（ヨーロッパおよび米国では１９世紀初頭まで、アフリカおよびアジアの辺境では２０世紀の少なくとも後半まで）、手法は、約０．５〜２％の感染後致死率を有し、これは疾患によって引き起こされる約２０〜３０％の死亡率と比較して遜色がない。種痘は、ヒトに天然痘に対する免疫を持たせるのに効果的であった。この手法がこれほど功を奏したいくつかの理由があるかもしれない一方で、一つには接種部位の選択に関連するようである：天然痘（すなわち、痘瘡ウイルス）は、小さなエアロゾル液滴の形態で肺に入る。ウイルスは、そこから迅速に広がる。皮下接種された場合、進行はより緩慢であり、免疫系が初期段階で疾患に追いつける。かなりの感染後致死率の理由から、Ｅｄｗａｒｄ  Ｊｅｎｎｅｒの予防接種法が一般的に利用できるようになると、それは迅速に種痘法に取って代わった。種痘は、別の深刻な問題を抱えていることが、さらに注目される痘苗を接種された人々は、一定期間、感染性である。この期間中、特に、彼らは典型的に病気でなく、または軽度にのみ病気であるため、彼らは動き回ることができ、ウイルスを未感作の人々に拡散する。
【００６１】
種痘によって例示される、無害の局所部位に病原性微生物因子を投与し、因子を局限定期間にわたり局所的に激しく増殖させ、その結果、強力な先天性および適応性免疫応答を誘発することで、対象において免疫を誘導する基本手順は、（１）免疫化ウイルス因子の増殖が、選択される接種領域に効果的に限定され、ならびに短い時間に限定されることが保証され得る、（２）接種部位または他の箇所における顕著なウイルス複製再発の可能性が、予防され得る、（３）免疫化対象による病原性ウイルスの内転移可能性が排除され得るのであれば、安全にされ得る。本明細書で考察される複製能を有する制御ウイルスが関与する新規免疫法は、この必要な安全性を提供するという特定の目的で開発されている。野性型ウイルスは、少なくとも１つの選択された複製必須遺伝子を，広範なダイナミックレンジを有し、すなわち、本質的にオン／オフスイッチとして機能する遺伝子スイッチの制御下に置くことで、遺伝的に改変されている。最も好ましいのは、例えば、Ｖｉｌａｂｏａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｇｅｎｅ  ｓｗｉｔｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｌｉｂｅｒａｔｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．Ｓｙｎｄｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：１０７で考察された、加熱および小分子制御因子活性化（二重応答性）遺伝子スイッチである。ＳａｆｅＳｗｉｔｃｈと称されるこの種の特定の遺伝子スイッチ（加熱および抗黄体ホルモンによって同時活性化される）は、実施例で使用され、図１に例示される。特に指示がない限り、続く説明は、その複製が、このような二重応答遺伝子スイッチの制御下に置かれているウイルスに関する。しかし、説明はまた、本発明のその他の複製能を有する制御ウイルス（すなわち、その他の加熱および小分子制御因子活性化ウイルスおよび小分子制御因子活性化ウイルス）にも関連がある。
【００６２】
このように修飾されたウイルス、複製能を有する制御（組換え）ウイルスの複製は、二重応答遺伝子スイッチが、適切な小分子制御因子を備え、ならびに一過性の加熱処置（火傷または疼痛を引き起こすレベル未満であるが、熱のある患者において遭遇されてもよいレベルを超える）によって起動された場合にのみ起こる。ひとたび遺伝子スイッチが活性化されたら、ウイルスは、ウイルスタンパク質の完全補体（または所望のウイルスタンパク質補体、そして任意選択的に、異種ＲＮＡまたはタンパク質）を発現し、野性型ウイルスに近い効率で自己複製する。
【００６３】
加熱は、容易に焦点を合わせることができる。（小分子制御因子の存在下における）二重応答遺伝子スイッチの活性化を始動する、複製能を有する制御ウイルスが投与された身体領域（すなわち、接種部位）に焦点を置いた加熱の投与は、加熱領域に厳密に限定されるウイルス複製をもたらす。加熱および小分子制御因子に対する二重の必要性は、偶発的ウイルス複製に対する、高レベルの安全保証を提供することを意図する。小分子制御因子の不在下では、ウイルスの活性化／再活性化は、実質的に不可能である。同様に、同時の加熱処置の不在下では、ウイルス複製は、通常は活性化されない。
【００６４】
装備小分子制御因子は、いくつかの基準を満たす必要がある。最重要であるのはその物質が安全であり；悪影響は、最大でも極めて低率で生じるべきであり、通常穏和な性質であるべきである。理想的には、選択される小分子制御因子は、ヒトの治療で使用されない化学物質に属するであろう。しかし、さもなければヒトの治療のために開発されていない任意の物質が、免疫法において小分子調節剤として使用され得る前に、それは大規模な前臨床および臨床試験を受けなればならない。さもなければ免疫化の対象になる特定集団に投与されることがない、既知の良好に特性解析された原薬を選択する方が、より効率的なこともある。代案としては、（１）免疫化後、少なくとも最初の数週間以内に、対象に投与される必要がなく、（２）好ましくは医療管理下で、短期散発型投与にのみに適応される、既知の原薬が選択されてもよい。したがって、潜在的な低レベルのリスクは、その間に免疫化ウイルスが全身性に存在する期間中の原薬投与の回避によって、さらに低下される。医療管理下における散発型の原薬使用は、免疫化ウイルスの任意の顕著な偶発性複製が迅速に診断され、抗ウイルス手段が遅滞なく取られることを保証するであろう。本明細書に記載される例証的システムでは、装備小分子制御因子は、例えば、ミフェプリストンまたはウリプリスタルなどのプロゲステロン受容体（ＰＲ）拮抗物質または抗黄体ホルモンである。ミフェプリストンおよびウリプリスタルは、典型的に、免疫化後に間もなく投与される必要がなく、まれにのみ（そして集団の特定区分でのみ）および医療管理下でのみ使用されるという、後者の要件を満たす。ミフェプリストンおよびウリプリスタルは、優れた安全記録を有する。
【００６５】
新規免疫法がどのように実施され得るかは、以下の具体例で例示される。複製能を有する制御ウイルスの有効量と、小分子制御因子の有効量とを含んでなる組成物は、対象に皮内または皮下投与される。投与後間もなく、加熱パッチが活性化されて、対象または医師のどちらかによって、接種部位に適用される。約４３．５〜４５．５℃（皮膚に接触するパッチ表面の温度）での加熱は、約１０〜６０分間にわたる。後者の加熱処置は、１周期のウイルス複製を始動するであろう。もう１周期の複製が所望であれば、後から適切な時点で、接種部位に、もう１つの活性化パッチが適用される。免疫法が逐次加熱処置を伴う場合、小分子制御因子はまた、逐次投与される必要があってもよい。代案としては、徐放製剤を使用して、その間にウイルス複製が所望される期間にわたる、接種部位領域中の有効濃度の小分子制御因子の存在が保証されてもよい。
【００６６】
より一般的には、本発明の複製能を有する制御ウイルスが投与される身体領域、すなわち、接種部位領域は、任意の適切な方法によって加熱されてもよい。熱は、加熱表面または加熱液体、超音波、赤外線、またはマイクロ波または高周波照射への直接接触をはじめとする、異なる手段によって標的領域に送達され、またはその中で生成されてもよい。上記特定例で提案されるように、実用的かつ安価な解決策は、機械的擾乱によって結晶化され得て、使用される化学物質の融解温度で熱を放出する過冷却液体を含有する、パッチ（または例えば、鼻の粘膜表面を加熱するための円柱または錐体などのその他の形状の類似装置など）を加熱することで提供されてもよい。有用な化学物質は、約４８℃の融解温度を有するチオ硫酸ナトリウム五水和物であってもよい。米国特許第３，９５１，１２７号明細書、米国特許第４，３７９，４４８号明細書、および米国特許第４，４６０，５４６号明細書。技術は容易に利用でき、既にいくつかの医療製品で使用されている。
【００６７】
「活性化熱線量」は、接種部位領域中の細胞内において、ＨＳＦ１の一過性の活性化を引き起こす熱線量である。この転写因子の活性化は、熱線量に曝露されていない細胞内に存在するレベルを超える、加熱誘導性熱ショック遺伝子のＲＮＡ転写物の検出可能に増大したレベルによって証明される。代案としては、それは、このような熱ショック遺伝子のタンパク質産物の量の検出可能な増大として証明されてもよい。さらに、活性化熱線量は、有効濃度の適切な小分子制御因子の存在下における、複製能を有する制御ウイルスの複製の発生によって証明されてもよい。
【００６８】
活性化熱線量は、約１分間〜約１８０分間にわたり、約４１℃〜約４７℃の温度で、標的領域に送達され得る。熱線量は、曝露温度と曝露時間の双方の関数であることに留意されたい。したがって、同様の熱線量は、温度範囲下端の曝露温度と時間範囲上端の曝露時間との組み合わせ、または温度範囲上端の曝露温度と時間範囲下端の曝露時間との組み合わせによって達成され得る。好ましくは、熱曝露は、約５分間〜約１５０分間にわたる、約４２℃〜約４６℃の温度である。最も好ましくは、加熱処置は、約１０分間〜約６０分間にわたり、約４３．５℃〜約４５．５℃の温度で施される。
【００６９】
接種部位領域中の小分子制御因子の有効濃度は、適切な熱線量もまた受けた領域中の感染細胞内で、複製能を有する制御ウイルスが（１周期の）複製ができるようにする濃度である。有効濃度が何であるかは、その標的トランス活性化因子に対する小分子制御因子の親和性に依存する。このような有効濃度がどのようにして得られるか、そしてどれほど長く維持されるかもまた、特定の小分子制御因子の薬物動態に依存し、それは次に、小分子制御因子の投与経路、小分子制御因子の代謝および排出経路、検査される対象、すなわち、対象のタイプ（ヒトまたはその他の哺乳類）、その年齢、病状、体重などに依存する。これは、投与される組成物のタイプ、すなわち、組成物が調節物質の即時放出または徐放を可能にするどうかにさらに依存する。いくつかの良好に特性解析された小分子制御因子トランス活性化因子システムでは、特定の実験対象における有効濃度が推定されており、文献から入手できる。これは、プロゲステロン受容体、エクジソン受容体、エストロゲン受容体、およびテトラサイクリンリプレッサーに基づくシステム、ならびにダイマライザーシステム、すなわち、ラパマイシンまたは（非免疫抑制類似体をはじめとする）類似体、またはＦＫ５０６または類似体によって活性化されるトランス活性化因子にあてはまる。例えば、ラットにおける有効濃度のミフェプリストンは、体重１ｋｇ当たりわずか５μｇのミフェプリストン（５μｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．（腹腔内）投与によって得られ得る。小分子制御因子が経口投与される場合、量はおよそ２倍（約１０μｇ／ｋｇ）でなければならない。Ｗａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８１８０−８４。選択された経路による投与時に有効濃度をもたらす小分子制御因子の量は、当該小分子制御因子の有効量と称される。有効濃度をもたらす小分子制御因子の有効量がどのように判定され得るかは、十分に当業者の技能の範囲内であり、実施例セクションでもまた取り扱われる。
【００７０】
新規免疫法がどのように実施されてもよいかという前述の特定例では、本発明の複製能を有する制御ウイルス（加熱および小分子制御因子活性化ウイルス）と、適切な小分子制御因子とが、単一組成物中で同時投与される。複製能を有する制御ウイルスおよび小分子制御因子はまた、別々の組成物中で投与され得る。免疫化ウイルスおよび小分子制御因子の局所同時投与は、小分子制御因子の可能な副次的影響の最小化、免疫化期間中にウイルスが全身性に自己複製し得るという既にわずかである可能性のさらなる低下、および小分子制御因子排除の環境影響の最小化をはじめとするいくつかの理由から、有利なようである。これらの利点にもかかわらず、小分子制御因子は、例えば、経口経路などの全身経路によって投与されてもよく、それは、特定の投与経路について試験された選択された原薬の製剤が、既に利用可能である場合に、好ましいこともある。複製能を有する制御ウイルスの接種、適切な熱線量の投与、および小分子制御因子の有効量の投与の相対的タイミングは、二重応答遺伝子スイッチ抑制の動作必要条件に派生的である。典型的に、免疫化ウイルスの接種は、加熱処置に先行する。これは、熱ショック転写因子（ＨＳＦ１）の加熱活性化が一過性であり、活性化因子が最大で、活性化後の数時間以内に不活性状態に戻るためである。ウイルスゲノム中に存在する二重応答性トランス活性化因子遺伝子は、後者の短時間の因子活性中に、ＨＳＦ１媒介転写のために利用可能でなくてはならない。後者の遺伝子が転写に利用可能になるためには、免疫化ウイルスは、宿主細胞に吸着されて細胞に侵入し、解体してそのゲノムを細胞転写機構に提示しなくてはならない。好ましくはないが、免疫化ウイルス投与の直後に（または直前にさえ）接種部位領域を熱曝露させることが可能である。典型的に、接種部位領域は、ウイルス投与の約３０分間〜約１０時間後の時点で熱曝露されるが、加熱処置は、なおも後時に施されてもよい。小分子制御因子の投与については、１日から数日間にわたり、全身的に、または特に接種部位領域中において、有効濃度を維持することが可能なので、典型的により融通性があるであろう。その結果、小分子制御因子は、ウイルス投与に先だって、その時点で、またはそれに引き続いて、投与され得て、唯一の必要条件は、標的トランス活性化因子が、ウイルス複製を可能にするその役割を果たすのに要する時間にわたり、調節物質が接種部位領域中に有効濃度で存在することである。典型的に、この時間は、一周期の誘導性ウイルス複製の完了に要する時間に相当する。典型的に、１周期のウイルス複製は、約１日以内に完成する。
【００７１】
先に間接的に触れたように、新規免疫法では、複製能を有する制御ウイルスを１回または数回自己複製させてもよい。複製は、先の１周期の複製の１日から数日後に再誘導されてもよい。このような反復される複製は、対象におけるウイルス負荷の増大に役立つであろう。１周期の複製が起こるためには、複製能を有する制御ウイルスで感染させた標的細胞に、活性化熱線量を投与する必要があり、後者の細胞がその一部である組織（接種領域）は、有効濃度の小分子制御因子を含有しなくてはならない。
【００７２】
免疫化は、投与される複製能を有する制御ウイルスの一部が、焦点／局在性加熱処置を受け得る狭い画定領域内で細胞に感染し、後者の細胞内のウイルスの複製が（疾病または過度の不快感を引き起こすことなく）所望の免疫応答を引き起こすという条件で、任意の適切な経路により得る。免疫化ウイルスが投与される身体領域（接種部位領域）は、対象の体躯または四肢の任意の場所に位置する、皮膚または皮下領域であってもよい。好ましくは、複製能を有する制御ウイルスを含んでなる本発明の組成物の投与は、対象の上肢に位置する、皮膚または皮下領域への投与であってもよい。投与はまた、対象の肺または気道、または開口部粘膜への投与であってもよい。これは、対象の鼻粘膜を含む。
【００７３】
二重応答遺伝子スイッチは、（１）熱およびトランス活性化因子に応答性のプロモーターまたはプロモーターカセットと機能的に連結する、小分子制御因子活性化トランス活性化因子遺伝子、および（２）目的遺伝子を調節するためのトランス活性化因子に対して応答性のプロモーターからなる。Ｖｉｌａｂｏａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎｏｖｅｌ  ｇｅｎｅ  ｓｗｉｔｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｎｄ  ｔｉｍｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：２９０−８。図１は、ミフェプリストン（およびウリプリスタル）依存キメラトランス活性化因子ＧＬｐ６５（またはｇｌｐ６５）が組み込まれた、二重応答遺伝子スイッチ（「ＳａｆｅＳｗｉｔｃｈ」と称される特定の遺伝子スイッチ）の一例を示す。このトランス活性化因子は、酵母転写因子ＧＡＬ４からのＤＮＡ結合ドメイン、ヒトプロゲステロン受容体からの領域トランケート型リガンド結合、およびヒトＲｅｌＡタンパク質からのトランス活性化領域を含んでなる。Ｂｕｒｃｉｎ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｇｕｌａｂｌｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：３５５−６０；Ｙｅ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｌｉｇａｎｄ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３４６：５５１−６１。遺伝子スイッチおよび標的遺伝子を含有する細胞内では、例えば、ミフェプリストンなどの小分子制御因子、または活性化加熱処置の不在下で、標的遺伝子が発現されることは予期されない。細胞が適切な強度の加熱処置を受けると、妥当な強度、（内在性）熱ショック転写因子１（ＨＳＦ１）が活性化されて、トランス活性化因子遺伝子からの転写が開始される。短時間後に、ＨＳＦ１は不活性化されて、ＨＳＦ１駆動性のトランス活性化因子の発現が中断する。小分子制御因子不在下では、合成されたトランス活性化因子は不活性のままであり、最終的に分解によって除去される。しかし、小分子制御因子の存在下では、トランス活性化因子は活性化されて、それ自身の遺伝子からのならびに標的遺伝子からの発現を媒介する。結果として、小分子制御因子がなおも存在する限り、特定のトランス活性化因子レベルが維持され、標的タンパク質は（理論的には）合成され続ける。小分子制御因子の除去／排除は、トランス活性化因子の不活性化を引き起こす。標的ならびにトランス活性化因子遺伝子発現は低減して、最終的に中断され、システムはそれ自体をリセットするであろう。
【００７４】
ミフェプリストン装備および熱活性化ＳａｆｅＳｗｉｔｃｈは、一過性形質移入形式および安定細胞株形式で生体外で、そして遺伝子スイッチおよび標的遺伝子のマウス腓腹筋筋肉中への電気穿孔後に生体内で、広範に試験された。Ｖｉｌａｂｏａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）。遺伝子スイッチとルシフェラーゼ標的遺伝子とを安定して含有する細胞株を用いた実験から得られた結果が、図２に転載される。データは、システムが意図されたように機能したことを示す。ミフェプリストン不在下では、細胞が活性化加熱処置を受けた場合でさえ、本質的に、標的化タンパク質発現は起こらなかった。ミフェプリストン存在下における加熱処置は、標的遺伝子発現の活性化をもたらしたが、不在下ではもたらさなかった。熱閾値が比較的上昇したことに留意されたい。４３℃で１時間の加熱処置でさえ、準最大活性化のみをもたらした。標的遺伝子発現の活性化は、明確に加熱用量依存性である。単回加熱処置は、持続性の標的遺伝子発現を少なくとも６日間誘導したが、ミフェプリストンの継続的存在下でのみ誘導した。活性化に引き続くミフェプリストンの除去は、標的遺伝子発現の中断をもたらした（動揺性の標的遺伝子産物の消失によって証明される）。
【００７５】
ラパマイシンまたは非免疫抑制ラパマイシン誘導体の存在下で、加熱処置によって活性化される、相似性の二重応答遺伝子スイッチもまた、開発された。Ｍａｒｔｉｎ−Ｓａａｖｅｄｒａ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｈｅａｔ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ，ｒａｐａｍｙｃｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｓｗｉｔｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｔｉｇｈｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０：１０６０−１。ＺＦＨＤ１結合部位を含有するプロモーター（最初に、Ｒｉｖｅｒａ，Ｖ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ａ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：１０２８−３２に記載された）、またはＧＡＬ４プロモーターによって駆動される、標的遺伝子をトランス活性化できる、２つの異なるバージョンがそれぞれ調製された。
【００７６】
二重応答遺伝子スイッチまたは関連遺伝子スイッチに組み込まれ得る（ｔｈａｎ  ｃａｎ  ｂｅ）小分子制御因子活性化トランス活性化因子のその他の例としては、テトラサイクリン／ドキシサイクリン制御ｔｅｔ−ｏｎリプレッサー（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９２）Ｔｉｇｈｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，５５４７−５５５１；Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８，１７６６−１７６９）および昆虫エクジソン受容体のリガンド結合領域を含有するトランス活性化因子（Ｎｏ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｅｃｄｙｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，３３４６−３３５１）が挙げられる。後者のタイプの厳密にリガンド依存性のトランス活性化因子は、Ｐａｌｌｉおよび同僚によって開発されたＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈトランス活性化因子である。Ｐａｌｌｉ，Ｓ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｅｃｄｙｓｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１３０８−１５；Ｋｕｍａｒ，Ｍ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｈｉｇｈｌｙ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｏｃｋｅｔ  ｏｆ  ｅｃｄｙｓｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｈａｎｇｅ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｗｏ  ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ  ｅｃｄｙｓｏｎｅ  ａｇｏｎｉｓｔｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：２７２１１−１８。ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈトランス活性化因子は、ポナステロンＡまたはムリステロンＡなどのエクジステロイドによって、またはＲＳＬ−１（ＲＨ−５８４９としてもまた知られており、最初にＲｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ  Ｃｏｍｐａｎｙによって合成された）などの合成ジアシルヒドラジンによって活性化され得る。Ｄｈａｄｉａｌｌａ，Ｔ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎｅｗ  ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｃｄｙｓｔｅｒｏｉｄａｌ  ａｎｄ  ｊｕｖｅｎｉｌｅ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．４３：５４５−６９。それらが宿主細胞遺伝子の広範な調節解除もまた引き起こすことなく、標的遺伝子の活性を制御するために用いられ得るという条件で、そしてさらに関連小分子調節因子がそれらの有効濃度で宿主に対して許容できる低い毒性を有するという条件で、その他の小分子制御トランス活性化因子が使用されてもよい。
【００７７】
上で考察される二重応答遺伝子スイッチに関連する遺伝子スイッチは、（１）熱応答性プロモーターと機能的に連結する、小分子制御因子活性化トランス活性化因子遺伝子、および（２）目的遺伝子を調節するためのトランス活性化因子に対して応答性のプロモーターからなる。上で考察される二重応答遺伝子スイッチとは異なり、トランス活性化因子遺伝子は自己活性化されない。結果として、単回活性化加熱処置に引き続く、このような遺伝子スイッチの活性時間は、自己活性化トランス活性化因子遺伝子を含有する対応する二重応答遺伝子スイッチよりも実質的に短い。
【００７８】
ＨＳＶ−１由来ウイルスによる、新規免疫化アプローチが本明細書で例示される。その他の各種ヘルペスウイルスをはじめとするその他のウイルスが、本発明の複製能を有する制御ウイルスの骨格として用いられ得る。これらとしては、αヘルペスウイルスであるＨＳＶ２および水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）およびバラ疹ウイルス（ＨＳＶ６およびＨＳＶ７）をはじめとするβヘルペスウイルス；およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）およびカポジ（Ｋａｒｐｏｓｉ’ｓ）肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）などのγヘルペスウイルスが挙げられる。好ましい本発明の複製能を有する制御ウイルスは、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ２または水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）に由来する。
【００７９】
異なる実施形態では、複製能を有する制御ウイルスの２つの複製必須遺伝子は、それらを加熱および小分子制御因子の二重抑制の下に置く二重応答遺伝子スイッチによって制御されないが、熱ショックプロモーターおよびトランス活性化因子応答性プロモーターによって、個々に調節される（少なくとも１つの複製必須遺伝子は熱ショックプロモーターによって制御され、少なくとも１つの複製必須遺伝子はトランス活性化因子応答性プロモーターによって制御される）。トランス活性化因子は、構成的プロモーターから、または自己活性化（トランス活性化因子促進）プロモーターから発現される。１つの複製必須遺伝子が熱ショックプロモーターによって制御され、もう１つが活性化トランス活性化因子応答性プロモーターによって制御される場合、複製もまた、加熱および小分子制御因子によって二重に制御される。しかし、このタイプの複製能を有する制御ウイルスは、いくつかの理由から好ましさに劣る。第１に、活性化ＨＳＦ１、ひいては熱ショックプロモーターは、数時間以内に不活性化される傾向がある。したがって、熱ショックプロモーター制御下で発現される場合、特定のウイルス遺伝子は、ウイルス複製周期において、それらの正常な役割を果たせないこともある。第２に、熱ショック応答の一過性の性質にも関連するが、２通りに異なって制御される（すなわち、それぞれ熱ショックまたはトランス活性化因子によって制御される）ウイルス遺伝子の発現が、ウイルス生活環の異なる時点で要求される場合、活性化加熱処置および小分子制御因子が異なる時点で施されなくてはならないこともあり、免疫法にかなりの不都合を追加する。非常に類似した発現プロファイルを示す遺伝子のみが、制御のために選択されるという必要条件は、制御ウイルスの設計における顕著な制約に相当する。最後に、活性化刺激の１つ、すなわち、加熱または小分子制御因子の存在下では、２通りに異なって制御される複製必須遺伝子の１つが活性化されて、複製妨害を弱める。双方の複製必須遺伝子が二重に制御される場合は、リガンド存在下で、または宿主細胞が熱曝露された場合に、どちらの遺伝子も活動性されない。したがって、活性化刺激の１つの存在下であってさえも、厳密な複製阻害が維持される。活性化のための適切な熱線量、トランス活性化因子の性質および特性、およびウイルスおよび小分子調節因子の特性および有効濃度などについては、読者は、本明細書の前のセクションを参照されたい。
【００８０】
さらに別の好ましさに劣る実施形態では、複製能を有する制御ウイルスの１つまたは複数の複製必須遺伝子は、加熱および小分子制御因子によって二重に制御されないが、小分子制御因子のみによって制御される。小分子制御因子活性化トランス活性化因子の遺伝子は、構成的プロモーターから、または自己活性化プロモーターから発現される。ウイルス複製の局在の程度を達成するために、小分子調節因子はまた、免疫ウイルスと一緒に、または別々にどちらかで、接種部位に投与される。徐放製剤を使用して、その間にウイルス複製が所望される期間にわたる、接種部位領域中の有効濃度の小分子制御因子の存在が保証されてもよい。トランス活性化因子の性質および特性、およびウイルスおよび小分子調節因子の特性および有効濃度などについては、読者は、本明細書の前のセクションを参照されたい。
【００８１】
本発明の複製能を有する制御ウイルスは、別の感染性因子からの抗原を送達するためのベクターとしてもまた利用され得る。ヘルペスウイルス科（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスは、それらのゲノム中にかなり大きなＤＮＡ挿入物を収容し得て、その挿入が複製効率を顕著に低下させることは予期されない。例えば、インフルエンザウイルス表面抗原または内部タンパク質、ＨＩＶエンベロープまたは内部抗原などをコードする挿入遺伝子は、加熱および／または小分子調節物質制御を受けてもよい。これは抗原発現をウイルス複製に関連づけて、それを接種部位領域に限定する。代案としては、挿入遺伝子は、例えば、非増殖性感染細胞内の発現を可能にする構成的プロモーターなどのその他のプロモーターの制御下に置かれて、より長期間の抗原発現ならびに接種部位領域外のウイルス感染細胞内の発現がもたらされてもよい。
【００８２】
ウイルスは、長きにわたり別の病原体の抗原送達のためのビヒクルとして使用されている。Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ  ｔｈａｔ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ３０２：４９０−５；Ｍｏｓｓ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｌｉｖｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ．Ｎａｔｕｒｅ  ３１１：６７−９。用いられた弱毒型ウイルスベクターには、複製欠陥ウイルスならびにいくらかの複製能力を保持するウイルスが包含された。Ｄｒａｐｅｒ，Ｓ．Ｊ．ａｎｄ  Ｈｅｅｎｅｙ，Ｊ．Ｌ．（２０１０）．Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．８：６２−７１。試験されたウイルスベクターには、ヘルペスウイルスが包含された。弱毒型複製能を有するウイルスが、発現される抗原に対して、複製欠陥ウイルスよりも優れより均衡のとれた免疫応答を誘導することを示唆する証拠がある。Ｐｅｎｇ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ｒａｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  ｎｏｎ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｒｅ  ｂｅｔｔｅｒ  ａｔ  ｅｌｉｃｉｔｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｈｉｇｈ−ｔｉｔｅｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１０２００−９；Ｈａｌｆｏｒｄ，Ｗ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）ＩＣＰ０  ａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓ  Ｓｔａｔ  Ｉ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｌａｔｅｎｃｙ．Ｖｉｒｏｌ．Ｊ．３：４４；Ｈｕａｎｇ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｅｃｔｏｒ  ＭＶＴＴ  ｉｓ  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｔｏ  ＭＶＡ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖｉａ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ４：ｅ４１８０。本発明者らは、野性型に近い効率で自己複製する、本発明の複製能を有する制御ウイルスが、弱毒型ウイルスと同様に強力なまたはさらにより強力でさえある「アジュバント」になり得るという仮説を立てた。
【００８３】
最終的には、ウイルスベクターワクチンの有効性に関する懸念がある。１つの問題は、ワクチンベクターが、免疫応答の誘導について、導入遺伝子産物と競合するかどうかである。逆説的に、ベクター抗原に対する強力な免疫応答は、別の病原体からのベクターが発現する抗原に対する免疫応答を亢進させることもある。Ｔｒｕｃｋｅｎｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｅ．，Ｎｏｒｂｕｒｙ，Ｃ．Ｃ．（２００４）Ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：８６１−８。十分な数で存在する場合、ＣＤ８  Ｔ細胞は、その他の応答ＣＤ８＋細胞を援助し得る。Ｗａｎｇ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐａｔｈｓ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｉｖｅ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ：ＣＤ４−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｈｅｌｐ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：１２８３−９。
【００８４】
もう一つの懸念は、ウイルスに対する既存の免疫が、ワクチンベクターとしてのその使用を妨げるかどうかである。この問題は、固有種であるアデノウイルおよびヘルペスウイルスなどのウイルスだけでなく、通常はヒトに感染しないが、ワクチンベクターとして繰り返し使用されるウイルスにも関連する。あらゆるその他のベクターよりも、アデノウイルス（５型）に対する、既存の免疫の効果に関するより深刻な懸念もあったかもしれない。Ｄｒａｐｅｒ，Ｓ．Ｊ．，Ｈｅｅｎｅｙ，Ｊ．Ｌ．（２０１０）。最近の研究は、異種抗原発現修飾Ａｄ５ベクターによる予防接種時に、既存の免疫が、記憶ＣＤ８  Ｔ細胞の生成に干渉しないことを実証し、効率的な免疫復活応答および後続の攻撃に対する保護の基礎を提供する。Ｓｔｅｆｆｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｐｒｅ−ｅｘｉｓｔｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＣＤ８  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｍｅｍｏｒｙ  ａｎｄ  ｒｅｃａｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ３４８８４。さらに、導入遺伝子産物特異的応答は、再予防接種によって増強され得る。ヘルペスウイルスに対する既存の免疫の問題もまた、複数の研究で調べられている。Ｂｒｏｃｋｍａｎ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ  Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．（２００２）Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｅｌｉｃｉｔ  ｄｕｒａｂｌｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｅｅｘｉｓｔｉｎｇ  ｈｏｓｔ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：３６７８−８７；Ｃｈａｈｌａｖｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｒｉｏｒ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １  ｏｎ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｍｉｃｅ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：１７５１−５８；Ｄｅｌｍａｎ，Ｋ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｒｅｅｘｉｓｔｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ−ｂａｓｅｄ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１：２４６５−７２；Ｈｏｃｋｎｅｌｌ，Ｐ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｇｐ１２０  ｆｒｏｍ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １−ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｍｐｌｉｃｏｎｓ  ｒｅｓｕｌｔ  ｉｎ  ｐｏｔｅｎｔ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ａｎｄ  ｄｕｒａｂｌｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：５５６５−８０；Ｌａｍｂｒｉｇｈｔ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｒｅｅｘｉｓｔｉｎｇ  ａｎｔｉ−ｈｅｒｐｅｓ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｉｎｔｒａ��ｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：３８７−９３；Ｈｅｒｒｌｉｎｇｅｒ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｅ−ｅｘｉｓｔｉｎｇ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １（ＨＳＶ−１）ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  ｂｕｔ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ａｂｏｌｉｓｈ，ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ｂｙ  ａ  ＨＳＶ−１  ｖｅｃｔｏｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：８０９−１９；Ｌａｕｔｅｒｂａｃｈ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｆｔｅｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｖｅｃｔｏｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８６：２４０１−１０；Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ−ｄｅｌｅｔｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｓ  ａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３５７：１８６−９８。これらの研究の大多数は、ヘルペスウイルスが送達する異種抗原への免疫応答に対する、または腫瘍退縮ヘルペスウイルスの抗腫瘍有効性に対する、わずかな影響または比較的軽微な影響のみを報告した。Ｂｒｏｃｋｍａｎ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ  Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．（２００２）；Ｃｈａｈｌａｖｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）；Ｄｅｌｍａｎ，Ｋ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）；Ｈｏｃｋｎｅｌｌ，Ｐ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）；Ｌａｍｂｒｉｇｈｔ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）；Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）。免疫応答の実質的低下を報告する２つの研究が、同定された。Ｈｅｒｒｌｉｎｇｅｒ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）；Ｌａｕｔｅｒｂａｃｈ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）。しかし、妥協モデルが用いられたため、これらの研究の結果は一般化され得ないようである。研究の１つは、使用された変異ＨＳＶ株に辛うじて感染可能な腫瘍モデルを用いた。Ｈｅｒｒｌｉｎｇｅｒ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）。別の研究は、検証するワクチンとして、重度無能力ＨＳＶ株（ＩＣＰ４−、ＩＣＰ２２−、ＩＣＰ２７−、ｖｈｓ−）との組み合わせで、キメラマウス免疫モデルを用いた。Ｌａｕｔｅｒｂａｃｈ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）。全ての研究は、既存の免疫存在下であってさえも、ヘルペスウイルスのワクチン使用が可能であることで一致した。例えば、ヘルペスウイルスに対する既存の免疫が、小児予防接種に対する一般的問題でなくてもよいことも付け加えられてもよい。
【００８５】
本発明の複製能を有する制御ウイルスはまた、同時感染される第２の免疫化ウイルス（またはその他の微生物）の複製／伝播を制御するために用いられ得る。後者の同時制御ウイルス中では、少なくとも１つの複製必須遺伝子が、複製能を有する制御ウイルスの小分子活性化トランス活性化因子に応答性である、プロモーターの制御下に置かれ得る。一例として、Ｅ１および／またはＥ４プロモーターをトランス活性化因子応答性プロモーターで置換することで、同時制御アデノウイルスが構築されてもよい。複本発明の製能を有する制御ヘルペスウイルスによって、この様式で場合により同時制御されるウイルスとしては、乳頭腫ウイルス（皮膚ケラチノサイトにも感染する）、特定のポリオーマウイルス（皮膚線維芽細胞およびケラチノサイトに感染する）、およびパルボウイルスＢ１９（第５病；皮膚線維芽細胞に感染する）がある。同時制御ウイルスは、制御ウイルスと天然に重複する親和性を有してもよいことに留意されたい。特定例では、シュードタイピング（ｐｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇ）によって、「適合親和性」を生じることもまた可能なこともある。本発明の複製能を有する制御ウイルスによって同時制御されてもよいウイルスのグループはさらに拡大されてもよく、制御された相補性の手段による同時制御もまた考慮されるならば、ＲＮＡウイルスを含んでさえなってもよい。（重複する向性を有する）ウイルス対は、例えば、複製必須遺伝子が欠損した同時制御ウイルスと、トランス活性化因子応答性プロモーターの制御下で後者の複製必須遺伝子を発現する、複製能を有する制御ウイルスとからなってもよい。
【００８６】
ウイルスは、免疫検出から逃れて、破壊を回避するための多数の機序を発達させてきた。Ｔｏｒｔｏｒｅｌｌａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｖｉｒａｌ  ｓｕｂｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：８６１−９２６。これらの機序の一部を排除しまたは弱めることは、免疫化ウイルスまたはウイルスベクターの免疫原性をさらに亢進させる。例えば、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２は、タンパク質ＩＣＰ４７を発現する。このタンパク質は、抗原処理ＴＡＰに関連する輸送体構成要素である、ＴＡＰ１およびＴＡＰ２の双方の細胞質表面と結合する。Ａｄｖａｎｉ，Ｓ．Ｊ．ａｎｄ  Ｒｏｉｚｍａｎ，Ｂ．（２００５）Ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｃｏｎｑｕｅｓｔ．Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｗｉｔｈ  ｉｔｓ  ｈｏｓｔ．Ｉｎ：Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｏｓｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎｎａｔｅ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｂｙ  Ｖｉｒｕｓｅｓ（ｅｄ．Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ），ｐｐ．１４１−６１，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ。ＩＣＰ４７は、ＴＡＰの抗原結合部位に結合して、抗原ペプチド結合を競合的に阻害することで、ＭＨＣクラスＩ負荷を特異的に妨害する。ウイルス感染ヒト細胞は、ＭＨＣクラスＩの文脈において、抗原性ペプチド提示が損なわれることが予期され、ＣＤ８＋ＣＴＬによる死滅に対して抵抗性になる。ＩＣＰ４７をコードする遺伝子の欠失または無効化は、免疫化ウイルスの免疫原性を有意に増大させる。
【００８７】
ＩＣＰ４７は、マウスＴＡＰに対して、ヒトＴＡＰに対するよりもはるかに弱いインヒビターであるため、このタンパク質の役割を齧歯類モデルで研究することは困難であった。それでもなお１つの研究は、ＨＳＶ−１  ＩＣＰ４７変異体が、対応する野性型株よりも神経毒性が低いこと、この低下した神経毒性が、保護的ＣＤ８  Ｔ細胞応答に起因することを示すことができた。Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＣＰ）４７  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｎｅｕｒｏｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｂｙ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：３４１−８。潜伏感染ニューロンは、まれであるが検出可能なウイルスタンパク質の発現を示してもよい。Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｌ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｌａｔｅｎｃｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：９７８−８３。これらのタンパク質は、ＭＨＣクラスＩによって、その役割がウイルス再活性化の予防であってもよい、特定のＣＤ８  Ｔ細胞に提示されてもよい。Ｋｈａｎｎａ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｌａｔｅｎｃｙ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：４６３−６９。三叉神経結節腫中における、感染細胞とＣＤ８  Ｔ細胞の同時局在化が観察されている。Ｋｈａｎｎａ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｏｒｙ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ａｎｄ  ｒｅｔａｉｎｅｄ  ｉｎ  ｌａｔｅｎｔｌｙ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｇａｎｇｌｉａ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １８：５９３−６０３。ＣＤ８  Ｔ細胞が潜伏期からのウイルス再活性化を制御すること、この制御がＭＨＣクラスＩ提示に依存することは、サイトメガロウイルスＭＨＣクラスＩインヒビターを発現するＨＳＶ−１組換え体を使用した、マウス研究で実証された。Ｏｒｒ，Ｍ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ＨＳＶ  ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｌａｔｅｎｃｙ  ｉｓ  ａｂｒｏｇａｔｅｄ  ｂｙ  ｖｉｒａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ．Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  ２：１７２−８０。したがって、ＩＣ４７の欠失は、複製能を有する制御ウイルスの免疫原性を亢進させるだけでなく、潜伏期からのその偶発性再活性化の既に低い確率もまた、大幅に低下させることが予期される。
【００８８】
免疫化ウイルス（すなわち、本発明の複製能を有する制御ウイルス）の免疫原性はまた、ウイルスゲノム中にサイトカインまたはその他の免疫系構成要素の発現可能遺伝子を含めることで向上されてもよい。その中で複製欠陥ヘルペスウイルス組換え体が様々なサイトカインを発現する、マウスにおける予防接種試験が比較されて、ウイルス発現ＩＬ−４およびＩＬ−２が、アジュバント効果を有することが実証された。Ｏｓｉｏｒｉｏ，Ｙ．，Ｇｈｉａｓｉ，Ｈ．（２００３）Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＴＨ１  ａｎｄ  ＴＨ２  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｇｅｎｅｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：５７７４−８３。さらには、ＧＭ−ＣＳＦによる樹状細胞機能の調節は、ＢＣＧによって誘導される防御免疫を亢進させ、Ｂ型肝炎ワクチンに対する非応答性を克服することが示される。Ｎａｍｂｉａｒ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ＤＣ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｖａｃｃｉｎｅ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ＧＭ−ＣＳＦ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０：１５３−６１；Ｃｈｏｕ，Ｈ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｈｙｄｒｏｇｅｌ−ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ＧＭ−ＣＳＦ  ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ  ｎｏｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｔｏ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８５：５４６８−７５。
【００８９】
本発明の複製能を有する制御ウイルスの有効量は、対象への投与時に、その中で誘導された複製が、検出可能に亢進された（複製欠陥比較ウイルスによって誘導される免疫に優る）対象の機能性免疫をもたらす量である。この亢進された機能性免疫は、流行している（野性型）ウイルスへの感染または再感染に対する抵抗性の亢進として顕在化してもよく、または現行の感染の抑制／排除の促進と関連していてもよい。したがって、それはまた、前記野性型ウイルスによる感染に引き続く、疾患重症度、疾患持続時間または死亡率の低下によって、顕在化してもよい。代案としては、またはそれに加えて、異質抗原を発現する免疫化ウイルスの場合、免疫は、後者の異質抗原を発現および／または提示する病原体に対する、予防的または治療的免疫に関し得る。いくつかの要素が、ある程度は対象へのウイルス投与部位および経路、ならびに利用される活性化措置（すなわち、加熱および小分子制御因子投与の相対的タイミング、接種部位領域に送達される熱線量、誘導される複製周期数など）をはじめとする、複製能を有する制御ウイルスの有効量を構成するものに、影響を与えることに留意されたい。複製能を有する制御ウイルスの有効量は、用量設定実験において判定される。概して、本発明の複製能を有する制御ウイルスの有効量は、約１０２〜約１０８プラーク形成単位（ｐｆｕ）のウイルスである。より好ましくは、有効量は、約１０３〜約１０７ｐｆｕのウイルス、なおもより好ましくは約１０３〜約１０６ｐｆｕのウイルスである。考えられる限りでは、本発明の複製能を有する制御ウイルスの有効量は、上記の範囲外であってもよい。
【００９０】
本発明のワクチン組成物は、複製能を有する制御ウイルスの有効量と、小分子制御因子もまた組成物の一部として投与される場合は、小分子制御因子の有効量とを含んでなる。それは、特定状況下では（例えば、米国特許出願公開第２００８００３５１４３号明細書で開示されるように）微粉形態で投与されてもよいが、本発明の組成物は、典型的に、本発明のウイルスと、場合によっては、小分子制御因子とを含んでなる水溶液である。それは、対象に、水溶液として（非経口的に）投与されてもよく、または粘膜投与の場合は、その煙霧剤として投与されてもよい。例えば、米国特許第５，９５２，２２０号明細書を参照されたい。本発明の組成物は、緩衝液構成要素を典型的に含む。組成物は、目的の用途と適合性である、典型的に、約６〜約８のｐＨを有する。リン酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、トリス、ビス−トリス、炭酸水素塩、およびそれらの混合物などの多様な従来の緩衝液が用いられてもよい。緩衝液の濃度は、概して約０．０１〜約０．２５％ｗ／ｖ（重量／容量）の範囲にわたる。
【００９１】
複製能を有する制御ウイルスを含んでなる本発明の組成物は、例えば、保存料、ウイルス安定剤、等張化剤および／または粘度増大物質をさらに含み得る。前述のように、それらはまた、適切な小分子制御因子またはこのような小分子制御因子を含んでなる配合物を含んでもよい。
【００９２】
非経口製品で使用される保存料としては、フェノール、ベンジルアルコール、メチルパラベン／プロピルパラベン、およびフェノキシエタノールが挙げられる。フェノキシエタノールは、ワクチンに見られる最も広く使用されている保存料である。保存料は、概して約０．００２〜約１％ｗ／ｖに及ぶ濃度で使用される。Ｍｅｙｅｒ，Ｂ．Ｋ．２００７．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ：ｐａｓｔ  ａｎｄ  ｐｒｅｓｅｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９６：３１５５−６７。保存料は、ウイルスの複製効率に干渉しない、または最小限度にのみ干渉する濃度で、複製能を有する制御ウイルスを含んでなる組成物中に存在してもよい。
【００９３】
モル浸透圧濃度は、等張化剤によって、組成物の意図される使用と適合性の値に調節され得る。例えば、モル浸透圧濃度は、水中の約０．９％ｗ／ｖの塩化ナトリウムとほぼ同等である、正常な生理学的流体のおよその浸透圧に調節されてもよい。適切な浸透圧調節剤の例としては、制限なしに、ナトリウム、カリウム、カルシウム、およびマグネシウムなどの塩化物；デキストロース；グリセロール；プロピレングリコール；マンニトール；ソルビトール；およびそれらの混合物が挙げられる。好ましくは、等張化剤は、１５０〜４５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、より好ましくは約２２０〜約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、最も好ましくは約２７０〜約３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの最終的な浸透圧値を提供する量で用いられる。
【００９４】
示される場合、本発明の組成物は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースをはじめとするセルロースポリマー；グリセロール；カルボマー；ポリビニルアルコール；ポリビニルピロリドン；アルギン酸塩；カラゲナン、グアー、カラヤ、アガロース、ローカストビーンガム、およびトラガカントおよびキサンタンガムなどの１つまたは複数の粘度調節剤をさらに含み得る。このような粘度調節成分は、典型的に、所望の増粘程度を提供するのに有効な量で用いられる。粘度調節剤は、ウイルスの感染性および複製効率に干渉しない、または最小限度にのみ干渉する濃度で、複製能を有する制御ウイルスを含んでなる組成物中に存在してもよい。
【００９５】
組成物が、小分子制御因子もまた含有する場合、このような小分子制御因子の有効量は、粉末、溶液、エマルションまたは粒子の形態で、組成物に包含され得る。これも前に提供されたように、複製能を有する制御ウイルスの有効量と共に同時送達される小分子制御因子の有効量は、接種部位領域に有効濃度の小分子制御因子をもたらす量であり、その有効濃度は、その領域の感染細胞内の複製能を有する制御ウイルスの少なくとも１周期の複製を可能にする。小分子制御因子をより長期期間にわたって有効濃度に維持するために、すなわち、ウイルス（加熱および小分子制御因子活性化ウイルス）の複製が、接種部位領域の２回以上の加熱処置によって再開始される場合、小分子制御因子は徐放製剤の形態で含まれてもよい（以下もまた参照されたい）。
【００９６】
ウイルスを増幅する方法は、実験室技巧において周知である。工業的スケールアップもまた、達成されている。ヘルペスウイルスについては、Ｈｕｎｔｅｒ，Ｗ．Ｄ．（１９９９）Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ，ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｍｕｔａｎｔ  Ｇ２０７：ｓａｆｅｔｙ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：６３１９−２６；Ｒａｍｐｌｉｎｇ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ（ＩＣＰ３４．５  ｎｕｌｌ  ｍｕｔａｎｔ  １７１６）ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：８５９−８６６；Ｍｕｎｄｌｅ，Ｓ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｈｉｇｈ−ｐｕｒｉｔｙ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＳＶ−２  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ＡＣＡＭ５２９  ｉｓ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８（２）：ｅ５７２２４を参照されたい。
ウイルスを精製する様々な方法が、開示されている。例えば、Ｍｕｎｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）およびその中の参考文献；Ｗｏｌｆ，Ｍ．Ｗ．ａｎｄ  Ｒｅｉｃｈｌ，Ｕ．（２０１１）Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ  １０：１４５１−７５を参照されたい。
【００９７】
小分子制御因子が、単一組成物中で、複製能を有する制御ウイルスと共に同時投与され得る一方で、複製能を有する制御ウイルスを含んでなる組成物、および小分子制御因子を含んでなる組成物はまた、別々に投与され得る。後者の組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容可能な担体または賦形剤と共に配合された、小分子制御因子の有効量を含んでなる。
【００９８】
小分子制御因子を含んでなる組成物は、経口的に投与され、吸入スプレー、局所、直腸、鼻、口腔、膣内を経由して、または埋め込み式リザバーによって、非経口的に投与されてもよく、好ましくは、経口投与または注射投与される。組成物は、任意の従来の無毒で薬学的に許容可能な担体、アジュバントまたはビヒクルを含有してもよい。場合によっては、製剤のｐＨを薬学的に許容可能な酸、塩基または緩衝液によって調節し、調合小分子制御因子またはその送達形態の安定性を高めてもよい。非経口という用語は、本明細書の用法では、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、クモ膜下腔内、病巣内、および頭蓋内注射または輸液技術を含む。
【００９９】
経口投与のための小分子制御因子の液体剤形としては、薬学的に許容可能なエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシル剤が挙げられる。さらに、液体剤形は、例えば、水またはその他の溶媒や、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（具体的には、綿実、ラッカセイ、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよび脂肪酸のエステルソルビタンなどの可溶化剤および乳化剤、およびそれらの混合物などの当該技術分野で一般に使用される不活性希釈剤を含有してもよい。不活性希釈剤に加えて、経口組成物は、例えば、湿潤剤、乳化および懸濁剤、甘味剤、着香料、および芳香剤もまた含み得る。
【０１００】
注射用製剤、例えば、無菌注射用水性または油性懸濁液は、適当な分散剤、または湿潤剤、および懸濁剤を使用して、公知の技術に従って製剤化されてもよい。無菌注射用製剤はまた、例えば１，３−ブタンジオール溶液などの無毒の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の無菌注射用溶液、懸濁液またはエマルションであってもよい。用いられてもよい許容できるビヒクルおよび溶媒は、水、米国薬局方リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液である。これに加えて、無菌の不揮発性油が、溶媒または懸濁媒として従来法で用いられる。この目的で、合成モノまたはジグリセリドをはじめとする、あらゆる無刺激不揮発性油が用いられ得る。さらに、オレイン酸などの脂肪酸が、注射剤の調製で使用される。注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通過させる濾過によって、または使用前に滅菌水またはその他の無菌注射用培地中に溶解または分散され得る、無菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって、滅菌され得る。
【０１０１】
小分子制御因子の効果を延長するために、例えば、皮下（または、場合により皮内）または筋肉内注射からの化合物吸収を遅延させることが望ましいことがある。これは、水溶性が劣る結晶性または非晶質物質の液体懸濁液の使用によって、達成されてもよい。次に小分子制御因子の吸収速度は、その溶出速度に左右され、それは次に、結晶サイズおよび結晶形態に左右されてもよい。代案としては、非経口的に投与される小分子制御因子の遅延性吸収は、化合物を油ビヒクルに溶解または懸濁することで達成される。注射用デポー製剤は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー内に、化合物の微小カプセルマトリックスを形成することで製造される。化合物とポリマーの比率および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、化合物放出速度は調節され得る。その他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（酸無水物）が挙げられる。デポー注射用製剤はまた、化合物を身体組織適合性のリポソームまたはマイクロエマルション中に封入することでも調製される。
【０１０２】
直腸内または膣内投与のための組成物は、好ましくは坐薬であり、それは環境温度で固体であるが体温では液体であり、したがって直腸または膣窩洞内で溶融して小分子制御因子を放出する、カカオ脂、ポリエチレングリコールまたは坐薬ワックスなどの適切な非刺激性の賦形剤または担体に、小分子制御因子を混合することで、調製され得る。
【０１０３】
経口投与のための固体剤形としては、カプセル、錠剤、丸薬、粉末、および顆粒が挙げられる。このような固体剤形中では、小分子制御因子は、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなどの、少なくとも１つの不活性の薬学的に許容可能な賦形剤または担体、および／またはａ）デンプン、乳糖、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸などの充填剤または増量剤、ｂ）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、およびアカシアなどのバインダー、ｃ）グリセロールなどの湿潤剤、ｂ）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、ｅ）パラフィンなどの溶解遅延剤、ｆ）四級アンモニウム塩などの吸収促進剤、ｇ）例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセリンなどの湿潤剤、ｈ）カオリンおよびベントナイト粘土などの吸収剤、およびｉ）滑石、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物などの潤滑剤と混合される。カプセル、錠剤、および丸薬の場合、剤形は、緩衝剤もまた含んでなってもよい。
【０１０４】
類似タイプの固体組成物はまた、乳糖または乳糖類、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用する、軟質および硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として用いられてもよい。
【０１０５】
錠剤、糖衣丸、カプセル、丸薬、および顆粒の固体剤形は、腸内コーティングおよび製剤処方技術分野で周知のその他のコーティングなどのコーティングおよびシェルを用いて調製され得る。それらは不透明剤を任意選択的に含有してもよく、または任意選択的に遅延様式で、腸管の特定部分で小分子制御因子のみを放出し、または活性成分を優先的に放出する、組成物でもあり得る。使用され得る包埋組成物の例としては、ポリマー物質、およびワックスが挙げられる。
【０１０６】
小分子制御因子の局所または経皮投与のための剤形としては、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤またはパッチが挙げられる。小分子制御因子は、必要であれば、薬学的に許容できる担体および任意の保存料または緩衝液と共に、無菌条件下で混合される。
【０１０７】
軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、小分子制御因子に加えて、動物性および植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、滑石および酸化亜鉛、またはそれらの混合物などの賦形剤を含有してもよい。
【０１０８】
粉末およびスプレーは、小分子制御因子に加えて、乳糖、滑石、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物などの賦形剤を含有し得る。スプレーは、クロロフルオロヒドロ炭素およびそれらの代替物などの通例の噴霧剤をさらに含有し得る。
【０１０９】
経皮パッチは、身体への化合物の制御送達を供給する追加的利点を有する。このような剤形は、化合物を適切な媒質に溶解または分散することで、製造され得る。吸収促進薬もまた、皮膚を通過する化合物の流動を増大させるために使用され得る。
【０１１０】
肺送達のためには、本発明の小分子制御因子の有効量を含んでなる組成物は、固体または液体微粒子形態に配合されて、例えば、呼吸器系への吸入などの直接投与によって対象に投与される。本発明を実施するために調製される小分子制御因子の固体または液体微粒子形態としては、呼吸に適するサイズの粒子、すなわち、吸入時に口および喉頭を通過して、気管支および肺胞に入るのに十分に小さなサイズ粒子が挙げられる。エアロゾル化した治療薬、特にエアロゾル化した抗生物質の送達は、当該技術分野で公知である（例えば、米国特許第５，７６７，０６８号明細書、および米国特許第５，５０８，２６９号明細書、および国際公開第９８／４３６５０号パンフレットを参照されたい）。抗生物質の肺送達の考察はまた、米国特許第６，０１４，９６９号明細書にもある。
【０１１１】
小分子制御因子の有効量が何であるかは、用いられる特定の小分子制御因子の活性、特定の小分子制御因子の投与経路、投与時間、安定性、および排出速度、ならびに投与される特定の組成物の性質に左右される。それはまた、対象の年齢、体重、総体的な健康、性別および食生活、用いられる特定の小分子制御因子と組み合わせてまたは同時に使用されるその他の薬物、および医療技術分野で周知の同様の要素に左右されてもよい。
【０１１２】
最終的に、小分子制御因子の有効量が何であるかは、接種部位領域においてウイルス複製が実験的に評価される、用量設定実験で評価されなくてはならない。ひとたび動物実験で有効量が評価されたら、ヒト有効量を推定することができてもよい。“Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ．Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｓａｆｅ  ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｄｏｓｅ  ｆｏｒ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ”，Ｕ．Ｓ．ＦＤＡ，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊｕｌｙ  ２００５，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ。例えば、ラットデータから推定されるように、経口投与されるミフェプリストンのヒト有効量（ウイルスの１周期の複製を可能にする）は、約１〜約１００μｇ／ｋｇ体重である。
【０１１３】
本発明の複製能を有する制御ウイルスの１周期の複製のみが所望される場合、小分子制御因子は、単回用量で対象に投与されてもよい。しかし、同一量はまた、分割用量で対象に投与されてもよい。以前考察されたように、比較的短期間内に、ウイルス複製の複数の周期を誘導することが所望される場合、小分子制御因子の有効量（１回）は、目的期間にわたり小分子制御因子の有効濃度を維持できる、徐放製剤中で投与されてもよい。代案としては、小分子制御因子の有効量（１周期のウイルス複製を維持できる）は、繰り返し投与され得て、それによって各投与が、ウイルス複製の加熱活性化と協調される（加熱および小分子制御因子活性化ウイルスの場合）。
【０１１４】
本明細書の値の範囲の列挙は、本明細書で特に断りのない限り、単に、範囲内のそれぞれ別個の値に個々に言及する省略表現の役割を果たすことが意図され、それぞれの別個の値は、あたかもそれが本明細書で個々に列挙されたかのように、本明細書に組み込まれる。
【０１１５】
特に断りがなくまたは文脈上明確に矛盾しない限り、要素または要素群への言及などの用語を使用する本発明の任意の態様または実施形態本明細書の記述は、その特定の要素または要素群「からなる」、「から本質的になる」または「を実質的に含んでなる」、本発明の類似態様または実施形態の支持を提供することが意図される（例えば、特定の要素を含んでなる本明細に記載される組成物は、特に断りがなくまたは文脈上明確に矛盾しない限り、その要素からなる組成物もまた描写するものと理解されるべきである）。
【０１１６】
本発明は、適用法によって許容される最大範囲まで、本明細書に提示される態様または特許請求の範囲で列挙される対象の全ての改変および同等物を含む。
【０１１７】
このように一般的に説明された本発明は、例示のために提供され、本発明の限定は意図されない以下の実施例を参照して、より容易に理解されるであろう。
【実施例】
【０１１８】
実施例１：複製能を有する制御ウイルスの構築
全てのベクターは、骨格として野性型ＨＳＶ−１  １７ｓｙｎ＋株を使用して構築された。この株は、完全に毒性であり、特徴がよく分かっており、完全なゲノム配列が入手できる。ウイルス組換え体の生成は、以前記載されたようなリン酸カルシウム沈殿法によって、精製ビリオンＤＮＡと合わせた遺伝子操作プラスミドのウサギ皮膚細胞（ＲＳ）への相同組換えによって実施された。Ｂｌｏｏｍ，Ｄ．Ｃ．１９９８．ＨＳＶ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１０：３６９−３８６。ＨＳＶ−１ゲノムへの組換えのためのトランス活性化因子またはＧＡＬ４応答性プロモーターの挿入を操作するのに使用された全てのプラスミドは、ＨＳＶ−１  １７ｓｙｎ＋株からクローンされた。プラスミドＩＮ９９４は、次のようにして創造された：ＨＳＶ−１上流組換えアームは、ＤＢ１１２（５’ＧＡＧＣＴＣＡＴＣＡＣＣＧＣＡＧＧＣＧＡＧＴＣＴＣＴＴ３’）およびＤＢ１１３（５’ＧＡＧＣＴＣＧＧＴＣＴＴＣＧＧＧＡＣＴＡＡＴＧＣＣＴＴ３’）による（塩基対９５，４４１〜９６，０９０からの）ＨＳＶ−１  ＤＮＡ（１７＋）の増幅によって、生成された。生成物はＳａｃＩで消化され、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＳａｃＩ制限部位に挿入されて、ｐＵＰが創造された。ＨＳＶ−１下流組換えアームは、プライマーＤＢ１１５−ＫｐｎＩ（５’ＧＧＧＧＴＡＣＣＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＴＧＴＧＡＣ３’）およびＤＢ１２０−ＫｐｎＩ（５’ＧＧＧＧＴＡＣＣＧＧＴＧＴＧＴＧＡＴＧＡＴＴＴＣＧＣ３’）ゲノムＤＮＡ配列を使用して生成され、塩基対９６，０９２〜９６，５３８のＨＳＶ−１（１７＋株）が増幅された。ＰＣＲ産物はＫｐｎＩで消化され，ＫｐｎＩ消化ｐＵにクローン化されてｐＩＮ９９４が創造され、それは遺伝子間ＵＬ４３／４４領域でＨＳＶ−１と組換えられた。
【０１１９】
ＨＳＶ−ＧＳ１は、ＵＬ４３およびＵＬ４４の遺伝子間領域中に挿入されたトランス活性化因子（ＴＡ）遺伝子カセットを含有する。さらに、ＩＣＰ４プロモーターは、短い反復配列の双方のコピー中で、ＧＡＬ４応答性プロモーター（ＧＡＬ４結合部位含有最小プロモーター）で置換されている。第１の組換えプラスミドｐＩＮ：ＴＡ１は、ＨＳＶ−１ＵＬ４３およびＵＬ４４遺伝子の隣接配列間で、ヒトｈｓｐ７０ＢプロモーターおよびＧＡＬ４応答性プロモーターを組み合わせるプロモーターカセット制御下にある、ｇｌｐ６５遺伝子を含有するＤＮＡ断片（Ｖｉｌａｂｏａ  ｅｔ  ａｌ．に記載される）をプラスミドｐＩＮ９９４の多重クローニング部位に挿入することで構築された。ＴＡカセットは、プラスミドＨｓｐ７０／ＧＡＬ４−ＧＬＰ６５（Ｖｉｌａｂｏａ  ｅｔ  ａｌ．２００５）から単離され、３片ライゲーションによってクローン化されて、ＰＣＲによる増幅領域が最小化された。左挿入物では、Ｈｓｐ７０／ＧＡＬ４−ＧＬＰ６５がＢａｍＨＩおよびＢｓｔＸ１で消化されて、得られた２８７５ｂｐのバンドはゲル精製された。このフラグメントは、Ｈｓｐ７０／ＧＡＬ４プロモーターカセットならびにＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン、プロゲステロン受容体リガンド結合領域、およびトランス活性化因子ＧＬＰ６５のｐ６５活性化領域の一部を含有する。右挿入物は、ｐＨｓｐ７０／ＧＡＬ４−ＧＬＰ６５の一部をプライマーＴＡ．２８０３−２８２３．ｆｗｄ（５’ＴＣＧＡＣＡＡＣＴＣＣＧＡＧＴＴＴＣＡＧＣ３’）（配列番号１）およびＢＧＨｐＡ．ｒｅｖ（５’ＣＴＣＣＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣＧＡＴＣＣＡＴＡＧＡＧＣＣＣＡＣＣＧＣＡＴＣＣ３’）（配列番号２）で増幅することで生成された。７６３ｂｐのＰＣＲ産物は、ＢｓｔＸ１およびＮｏｔＩで消化され、結果として得られた６７６ｂｐのバンドは、ゲル精製された。このバンドは、ｐ６５活性化領域の３’末端およびＢＧＨｐＡを含んだ。ベクターでは、ｐＩＮ９９４がＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化され、得られた４０９９ｂｐのフラグメントがゲル精製されて、エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）処理された。次に２つの挿入物はベクターに同時にライゲートされて、無処理ＴＡカセットが創造された。形質転換に引き続いて、コロニー＃１４が増幅され、プラスミドは、制限酵素分析によって、次に配列解析によって確認された。
【０１２０】
１μｇのｐＩＮ：ＴＡ１が、リン酸カルシウム沈殿によって、２μｇの精製ＨＳＶ−１（１７＋）ビリオンＤＮＡと共に、ＲＳ細胞に同時形質移入された。得られたウイルスプールは、溶菌斑を選択することで組換え体についてスクリーニングされ、これらの溶菌斑はＲＳ細胞の９６ウェルプレート上で増幅され、ランダム六量体プライミングによってＴＡフラグメントを標識することで、３２Ｐ標識ＤＮＡプローブによるドットブロットハイブリダイゼーションが調製された。陽性ウェルは、５回にわたり溶菌斑が再形成されて再プローブされ、ＰＣＲおよび配列解析によって、ＴＡを含有することが確認された。この中間組換え体は、ＨＳＶ−１７ＧＳ４３と命名された。
【０１２１】
それをプラスミドｐＢＳ−ＫＳ：ＩＣＰ４Δプロモーター中のＨＳＶ−１  ＩＣＰ４組換えアーム間にクローニングすることで、天然ＩＣＰ４プロモーターの代わりに挿入されたＧＡＬ４応答性プロモーターを含有する、第２の組換えプラスミドｐＢＳ−ＫＳ：ＧＡＬ４−ＩＣＰ４が構築された。これは、ＩＣＰ４転写物を外来性ＧＡＬ４プロモーターの制御下に置いた。この特定のプロモーターカセットは、酵母ＧＡＬ４ＵＡＳ（上流活性化配列）、アデノウイルスＥ１ｂ  ＴＡＴＡ配列、および合成イントロンＩｖｓ８の６つのコピーを含む。このカセットは、ＡａｔＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって、プラスミドｐＧｅｎｅ／ｖ５−ＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）から切除され、得られた４７３ｂｐのフラグメントはゲル精製された。ベクターでは、ｐＢＳ−ＫＳ：ＩＣＰ４ΔプロモーターがＡａｔＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化され、得られた３９６２ｂｐのフラグメントは、ゲル精製されてＳＡＰ処理された。これらの２つのフラグメントのライゲーションは、ＧＡＬ４プロモーターをＩＣＰ４転写開始部位の前に配置させた。形質転換に引き続いて、コロニー＃５は増殖されて試験消化され、配列決定によって確認された。
【０１２２】
１μｇのｐＢＳ−ＫＳ：ＧＡＬ４−ＩＣＰ４は、リン酸カルシウム沈殿によって、４μｇの精製ＨＳＶ−１７ＧＳ４３ビリオンＤＮＡと共に、ＩＣＰ４相補細胞株Ｅ５の細胞に同時形質移入された（ＤｅＬｕｃａ，Ｎ．Ａ．ａｎｄ  Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｐ．Ａ．１９８７．Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １（ＨＳＶ−１）ＩＣＰ４  ｇｅｎｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｙｉｎｇ  ｎｏｎｓｅｎｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：４４９１−４５１１）。得られたウイルスプールは、溶菌斑を選択することで組換え体についてスクリーニングされ、これらの溶菌斑は、Ｅ５細胞の９６ウェルプレート上で増幅され、ランダム六量体プライミングによってＧＡＬ４応答性プロモーターフラグメントを標識することで、３２Ｐ標識ＤＮＡプローブによるドットブロットハイブリダイゼーションが調製された。陽性ウェルは、７回にわたり溶菌斑が再形成されて再プローブされ、ＰＣＲおよび配列解析によって、双方の短い反復配列のコピー中に、ＧＡＬ４応答性プロモーターを含有することが確認された。この組換え体は、ＨＳＶ−ＧＳ１と命名された。
【０１２３】
ｐＢＳ−ＫＳ：ΔＳａｃＩを得るために、プラスミドをＳａｃＩで消化することで、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＫＳ＋のポリリンカーから、ＳａｃＩ部位が消去された。得られた２９５４ｂｐのフラグメントはゲル精製され、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理されて平滑末端が生じ、再度環状化されて自己ライゲートされた。組換えプラスミドＢＳ−ＫＳ：ＩＣＰ４Δプロモーターは、次のようにして構築された：第１の挿入物を生成するために、コスミドＣＯＳ４８（Ｌ．Ｆｅｌｄｍａｎから寄贈された）は、プライマーＨＳＶ１．１３１４２８−１３１４０４（５’ＣＴＣＣＴＣＡＡＧＣＴＴＣＴＣＧＡＧＣＡＣＡＣＧＧＡＧＣＧＣＧＧＣＴＧＣＣＧＡＣＡＣＧ３’）（配列番号３）およびＨＳＶ１．１３０８５９−１３０８８０（５’ＣＴＣＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＧＧＡＧＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＣＡＧＣ３’）（配列番号４）によるＰＣＲを受けた。プライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ部位を領域の５’末端に、ＫｐｎＩおよびＮｃｏＩ部位を３’末端に、それぞれ配置させた。６００ｂｐの一次ＰＣＲ産物はＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで消化され、得られた５８７ｂｐのフラグメントはゲル精製された。ベクターｐＢＳ−ＫＳ：ΔＳａｃＩはＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで消化され、得られた２９１４ｂｐのフラグメントはゲル精製されてＳＡＰ処理された。ライゲーションは第１の挿入物をベクターのポリリンカー中に配置させ、ｐＢＳ−ＫＳ：ＩＣＰ４−３’末端が創造された。第２の挿入物を生成するために、コスミドＣＯＳ４８には、プライマーＨＳＶ１．１３２２７１−１３２２５０（５’ＣＴＣＣＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＧＴＣＣＣＴＴＴＣＣＧＡＴＧＣ３’）（配列番号５）およびＨＳＶ１．１３１７７９−１３１８００（５’ＣＴＣＣＴＣＣＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＴＡＴＧＣＡＴＧＡＧＣＴＣＧＡＣＧＴＣＴＣＧＧＣＧＧＴＡＡＴＧＡＧＡＴＡＣＧＡＧＣ３’）（配列番号６）によるＰＣＲを受けた。これらのプライマーは、ＮｏｔＩおよびＳｐｅＩ部位を領域の５’末端に、ＡａｔＩＩ、ＳａｃＩ、ＮｓｉＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＸｈｏＩ部位を３’末端に、それぞれ配置させた。５４９ｂｐの一次ＰＣＲ産物はＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで消化され、得られた５３０ｂｐのバンドはゲル精製された。このフラグメントはまた、４５ｂｐのＯｒｉＳヘアピンも含んだ。プラスミドＢＳ−ＫＳ：ＩＣＰ４−３’末端はＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで消化され、得られた３４４６ｂｐのバンドはゲル精製されてＳＡＰ処理された。ライゲーションは、ｐＢＳ−ＫＳ：ＩＣＰ４Δプロモーターを生成した。ｐＢＳ−ＫＳ：ＩＣＰ４Δプロモーターへの挿入は、配列解析によって確認された。
【０１２４】
ＨＳＶ−ＧＳ２は、ＵＬ３７およびＵＬ３８の遺伝子間領域中に挿入された、トランス活性化因子（ＴＡ）遺伝子カセットを含有する。さらに、ＩＣＰ４プロモーターは、短い反復配列の双方のコピー中で、ＧＡＬ４応答性プロモーター（ＧＡＬ４結合部位含有最小プロモーター）で置換されている。組換えプラスミドｐＵＬ３７／３８：ＴＡは、ＨＳＶ−１ＵＬ３７およびＵＬ３８遺伝子の隣接配列間で、ヒトｈｓｐ７０ＢプロモーターおよびＧＡＬ４応答性プロモーターを組み合わせるプロモーターカセット制御下にある、ｇｌｐ６５遺伝子を含有するＤＮＡ断片をプラスミドｐＢＳ−ＫＳ：ＵＬ３７／３８のＢｓｐＥ１／ＡｆｌＩＩ部位に挿入することで構築された。ＴＡカセットは、プラスミドＨｓｐ７０／ＧＡＬ４−ＧＬＰ６５（Ｖｉｌａｂｏａ  ｅｔ  ａｌ．２００５）から単離され、３片ライゲーションによってクローン化されて、ＰＣＲによる増幅領域が最小化された。左挿入物では、ｐＨｓｐ７０／ＧＡＬ４−ＧＬＰ６５がＢａｍＨＩ（フィルイン）およびＢｓｔＸ１で消化されて、得られた２８７５ｂｐのバンドがゲル精製された。このフラグメントは、Ｈｓｐ７０／ＧＡＬ４プロモーターカセットならびにＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン、プロゲステロン受容体リガンド結合領域、およびトランス活性化因子ＧＬＰ６５のｐ６５活性化領域の一部を含有する。右挿入物は、プライマーＴＡ．２８０３−２８２３．ｆｗｄおよびＢＧＨｐＡ．ｒｅｖで、ｐＨｓｐ７０／ＧＡＬ４−ＧＬＰ６５の一部を増幅することで生成された。７６３ｂｐのＰＣＲ産物はＢｓｔＸ１およびＮｏｔＩ（フィルイン）で消化され、結果として得られた６７６ｂｐのバンドは、ゲル精製された。このバンドは、ｐ６５活性化領域の３’末端およびＢＧＨｐＡを含んだ。ベクターでは、ｐＢＳ−ＫＳ：ＵＬ３７／３８がＢｓｐＥ１およびＡｆｌＩＩで消化され、得られた３，７７２ｂｐのフラグメントは、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼでフィルインされて、ゲル精製されＳＡＰ処理された。次に２つの挿入物はベクターに同時にライゲートされて、無処理ＴＡカセットが創造された。形質転換に続いて、コロニーが制限酵素消化によってスクリーニングされた。コロニー＃２９は増殖されて、プラスミドは、制限酵素分析によって、次に配列解析によって確認された。
【０１２５】
１μｇのｐＵＬ３７／３８：ＴＡが、リン酸カルシウム沈殿によって、２μｇの精製ＨＳＶ−１（１７＋）ビリオンＤＮＡと共に、ＲＳ細胞に同時形質移入された。得られたウイルスプールは、溶菌斑を選択することで組換え体についてスクリーニングされ、これらの溶菌斑はＲＳ細胞の９６ウェルプレート上で増幅され、ランダム六量体プライミングによってＴＡフラグメントを標識することで、３２Ｐ標識ＤＮＡプローブによるドットブロットハイブリダイゼーションが調製された。陽性ウェルは、６回にわたり溶菌斑が再形成されて再プローブされ、ＰＣＲおよび配列解析によって、ＴＡを含有することが確認された。この中間組換え体は、ＨＳＶ−１７ＧＳ３８と命名された。
【０１２６】
１μｇのｐＢＳ−ＫＳ：ＧＡＬ４−ＩＣＰ４が、リン酸カルシウム沈殿によって、５μｇの精製ＨＳＶ−１７ＧＳ３８ビリオンＤＮＡと共に、Ｅ５細胞に同時形質移入された。得られたウイルスプールは、溶菌斑を選択することで組換え体についてスクリーニングされ、これらの溶菌斑は、Ｅ５細胞の９６ウェルプレート上で増幅され、ランダム六量体プライミングによってＧＡＬ４応答性プロモーターフラグメントを標識することで、３２Ｐ標識ＤＮＡプローブによるドットブロットハイブリダイゼーションが調製された。陽性ウェルは、７回にわたり溶菌斑が再形成されて再プローブされ、ＰＣＲおよび配列解析によって、双方の短い反復配列のコピー中に、ＧＡＬ４応答性プロモーターを含有することが確認された。この組換えは、ＨＳＶ−ＧＳ２と命名された。
【０１２７】
ＨＳＶ−ＧＳ３は、ＵＬ４３およびＵＬ４４の遺伝子間領域中に挿入されたトランス活性化因子（ＴＡ）遺伝子カセットを含有する。さらに、ＩＣＰ４プロモーターは、短い反復配列の双方のコピー中で、ＧＡＬ４応答性プロモーター（ＧＡＬ４結合部位含有最小プロモーター）で置換されている。さらに、ＩＣＰ８プロモーターは、ＧＡＬ４応答性プロモーターで置換された。この組換えウイルスの構築は、第２のＨＳＶ−１複製必須遺伝子（ＩＣＰ８）をＧＡＬ４応答性プロモーター制御下に置くことを伴った。この組換え体の構築のための「骨格」として、ＨＳＶ−ＧＳ１が使用された。ＩＣＰ８組換えプラスミドｐＢＳ−ＫＳ：ＧＡＬ４−ＩＣＰ８が構築された。このプラスミドは、プラスミドｐＢＳ−ＫＳ：ＩＣＰ８Δプロモーター中のＨＳＶ−１ＩＣＰ８組換えアーム間にクローニングすることで、天然ＩＣＰ８プロモーターの代わりに挿入されたＧＡＬ４応答性プロモーターを含有した。これはＩＣＰ８転写物を外来性ＧＡＬ４応答性プロモーターの制御下に置いた。この特定のプロモーターカセットは、酵母ＧＡＬ４ＵＡＳ（上流活性化配列）、アデノウイルスＥ１ｂ  ＴＡＴＡ配列、および合成イントロンＩｖｓ８の６つのコピーからなった。このカセットは、ＡａｔＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって、プラスミドｐＧｅｎｅ／ｖ５−ＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）から切除され、得られた４７３ｂｐのフラグメントはゲル精製された。ベクターでは、ｐＢＳ−ＫＳ：ＩＣＰ８プロモーターがＡａｔＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化され、得られた４５８８ｂｐのフラグメントは、ゲル精製されてＳＡＰ処理された。後者の２つのＤＮＡ断片のライゲーションは、ＧＡＬ４応答性プロモーターカセットをＩＣＰ８転写開始部位の前に配置させた。形質転換に引き続いて、コロニー＃１０は増殖されて試験消化され、配列決定によって確認された。
【０１２８】
１μｇのｐＢＳ−ＫＳ：ＧＡＬ４−ＩＣＰ８が、リン酸カルシウム沈殿によって、１０μｇの精製ＨＳＶ−ＧＳ１ビリオンＤＮＡと共に、Ｅ５細胞に同時形質移入された。培地へのミフェプリストンの添加に引き続いて、形質移入細胞は４３．５℃に３０分間曝露され、次に３７℃で培養された。引き続いて２および３日目に、細胞は、再度４３．５℃で３０分間培養され、次に３７℃に戻された。溶菌斑が選択されて、ミフェプリストンが添加された培地中のＥ５細胞の９６ウェルプレート上で増幅された。プレートは、感染の１時間後に４３．５℃で３０分間インキュベートされて、次に３７℃で培養された。引き続いて２および３日目に、プレートはまた、４３．５℃に３０分間移行され、次に３７℃に戻された。ウェルが９０〜１００％のＣＰＥを示した後、プレートはドットブロットされ、ドットブロットメンブレンは、欠失されたＨＳＶ−１  ＩＣＰ８プロモーターフラグメントを標識することで調製された３２Ｐ標識ＤＮＡプローブとハイブリダイズされた。わずかに陽性のウェルは、８回にわたり溶菌斑が再形成されて再プローブされ、ＰＣＲおよび配列解析によって、ＩＣＰ８プロモーターが欠失し、その場所にＧＡＬ４応答性プロモーターを含有することが確認された。この組換え体は、ＨＳＶ−ＧＳ３と命名された。
【０１２９】
組換えプラスミドｐＢＳ−ＫＳ：ＩＣＰ８Δプロモーターは、ｐＢＳ−ＫＳ：ＩＣＰ４Δプロモーターの創造について上に記載されるものと基本的に同一のストラテジーを使用して構築された：第１の挿入物は、プライマーＨＳＶ１．６１８４１−６１８６５（５’ＣＴＣＣＴＣＡＧＡＡＣＣＣＡＧＧＡＣＣＡＧＧＧＣＣＡＣＧＴＴＧＧ３’）（配列番号７）およびＨＳＶ１．６２０５３−６２０２７（５’ＣＴＣＣＴＣＡＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＣＡＡＧＡＣＧＧＣＡＡＣＣ３’）（配列番号８）を使用して、ＨＳＶ−１  １７ｓｙｎ＋ビリオンＤＮＡからＰＣＲ増幅され、サブクローニングして中間体ベクターｐＢＳ−ＫＳ：ＩＣＰ８−３’末端が得られた。第２の挿入物は、プライマーＨＳＶ１．６２１７３−６２２０３（５’ＣＴＣＣＴＣＧＧＡＧＡＣＣＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧＡＡＴＧＡＡＴＣＣＣＴＣＣ３’）（配列番号９）およびＨＳＶ１．６２３９５−６２３６６（５’ＣＴＣＣＴＣＧＣＧＧＧＧＣＧＴＧＧＧＡＧＧＧＧＣＴＧＧＧＧＣＧＧＡＣＣ３’）（配列番号１０）を使用して同様に得られ、ｐＢＳ−ＫＳ：ＩＣＰ８−３’末端にサブクローニングされて、ｐＢＳ−ＫＳ：ＩＣＰ８Δプロモーターが生成された。
【０１３０】
ＨＳＶ−ＧＳ４：ＵＬ４３およびＵＬ４４の遺伝子間領域中に挿入されたトランス活性化因子（ＴＡ）遺伝子カセットを含有する。さらに、ＩＣＰ４プロモーターは、短い反復配列の双方のコピー中で、ＧＡＬ４応答性プロモーター（ＧＡＬ４結合部位含有最小プロモーター）で置換されており、ＩＣＰ８プロモーターは、ＧＡＬ４応答性プロモーターで置換されている。さらに、ＵＳ１２遺伝子は変異されて、そのタンパク質生成物（ＩＣＰ４７）が非機能性になる。ＩＣＰ４７アミノ酸残基Ｋ３１はＧ３１に、Ｒ３２はＧ３２に変化された。Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７２：４８４−９２；Ｇａｌｏｃｈａ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１５６５−７２。５００ｂｐのＩＣＰ４７コード配列含有フラグメントは、１７ｓｙｎ＋株のビリオンＤＮＡからＰＣＲ増幅された。フラグメントは、２つのプライマー対を使用して、２つの小片（「左手」および「右手」片）としてＰＣＲ増幅された。右手フラグメントでは、変異は、５’ＰＣＲプライマーを通じて導入された。得られた増幅左手および変異右手フラグメントは、ベクターｐＢＳにサブクローニングされて、サブクローン中の配列は配列解析によって確認された。ＩＣＰ４７コドン３１および３２に所望の変異がある５００ｂｐフラグメントを含有するサブクローンは、ｐＢＳ：ｍｕｔ−ＩＣＰ４７と称された。
【０１３１】
１μｇのｐＢＳ：ｍｕｔ−ＩＣＰ４７が、リン酸カルシウム沈殿によって、１０μｇの精製ＨＳＶ−ＧＳ３ビリオンＤＮＡと共に、Ｅ５細胞に同時形質移入された。培地へのミフェプリストンの添加に引き続いて、形質移入細胞は４３．５℃に３０分間曝露され、次に３７℃で培養された。引き続いて２および３日目に、細胞は、再度４３．５℃で３０分間培養され、次に３７℃に戻された。溶菌斑が選択されて、ミフェプリストンが添加された培地中のＥ５細胞の９６ウェルプレート上で増幅された。プレートは、感染の１時間後に４３．５℃で３０分間インキュベートされて、次に３７℃で培養された。引き続いて２および３日目に、プレートはまた、４３．５℃に３０分間移行され、次に３７℃に戻された。ウェルが９０〜１００％のＣＰＥを示した後、プレートはドットブロットされ、ドットブロットメンブレンは、変異ＩＣＰ４７領域に対する、３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズされた。陽性ウェルは、数回にわたり溶菌斑が再形成されて再プローブされ、配列解析によって、予期された変異ＩＣＰ４７遺伝子配列を含有することが確認された。この組換え体は、ＨＳＶ−ＧＳ４と命名された。
【０１３２】
ＨＳＶ−ＧＳ５は、ＵＬ４３およびＵＬ４４の遺伝子間領域中に挿入された発現可能（自己活性化）トランス活性化因子（ＴＡ）遺伝子を含有する。さらに、ＩＣＰ４プロモーターは、短い反復配列の双方のコピー中で、ＧＡＬ４応答性プロモーター（ＧＡＬ４結合部位含有最小プロモーター）で置換されている。組換えプラスミドｐＩＮ：ＴＡ２は、ＨＳＶ−１ＵＬ４３およびＵＬ４４遺伝子の隣接配列間で、自己活性化ｇｌｐ６５遺伝子を含有するＤＮＡ断片をプラスミドｐＩＮ９９４の多重クローニング部位に挿入することで構築される。発現可能ＴＡ遺伝子は、ｐＨｓｐ７０／ＧＡＬ４−ＧＬＰ６５（Ｖｉｌａｂｏａ  ｅｔ  ａｌ．２００５）およびｐＳｗｉｔｃｈ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から恭しく（ｒｅｓｐｅｃｔｆｕｌｌｙ）単離され、３片ライゲーションによってクローン化されて、ＰＣＲによる増幅領域が最小化される。左挿入物では、ｐＳｗｉｔｃｈがＳｓｐＩおよびＢｓｔＸ１で消化され、得られた２４２５ｂｐのバンドがゲル精製される。このフラグメントは、自己活性化プロモーターならびにＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン、プロゲステロン受容体リガンド結合領域、およびトランス活性化因子ＧＬＰ６５のｐ６５活性化領域の一部を含有する。右挿入物は、プライマーＴＡ．２８０３−２８２３．ｆｗｄおよびＢＧＨｐＡ．ｒｅｖで、ｐＨｓｐ７０／ＧＡＬ４−ＧＬＰ６５の一部を増幅することで生成される。７６３ｂｐのＰＣＲ産物はＢｓｔＸ１およびＮｏｔＩで消化され、結果として得られた６７６ｂｐのバンドは、ゲル精製される。このバンドは、ｐ６５活性化領域の３’末端およびＢＧＨｐＡを含む。ベクターでは、ｐＩＮ９９４は最初のＢａｍＨＩで消化され、末端はクレノウＤＮＡポリメラーゼでフィルインされて、ＤＮＡはＮｏｔＩでさらに消化される。得られた４０９９ｂｐのフラグメントは、ゲル精製される。次に２つの挿入物は、ベクターに同時にライゲートされ、無処理発現可能ＴＡ遺伝子が創造される。形質転換に引き続いて、いくつかのコロニーが増殖され、プラスミドＤＮＡが制限対象となり、次に配列解析されてｐＩＮ：ＴＡ２が同定される。
【０１３３】
１μｇのｐＩＮ：ＴＡ２が、リン酸カルシウム沈殿によって、２μｇの精製ＨＳＶ−１ビリオンＤＮＡと共に、ＲＳ細胞に同時形質移入される。得られたウイルスプールは、溶菌斑を選択することで組換え体についてスクリーニングされ、これらの溶菌斑はＲＳ細胞の９６ウェルプレート上で増幅され、ランダム六量体プライミングによってＴＡフラグメントを標識することで、３２Ｐ標識ＤＮＡプローブによるドットブロットハイブリダイゼーションが調製される。陽性ウェルは、数回にわたり溶菌斑が再形成されて再プローブされ、ＰＣＲおよび配列解析によって、ＴＡを含有することが確認される。この中間組換え体は、ＨＳＶ−１７ＧＳ４３Ａと命名される。
【０１３４】
１μｇのｐＢＳ−ＫＳ：ＧＡＬ４−ＩＣＰ４が、リン酸カルシウム沈殿によって、４μｇの精製ＨＳＶ−１７ＧＳ４３ＡビリオンＤＮＡと共に、ＩＣＰ４−相補細胞株Ｅ５の細胞に同時形質移入される。得られたウイルスプールは、溶菌斑を選択することで組換え体についてスクリーニングされ、これらの溶菌斑はＥ５細胞の９６ウェルプレート上で増幅され、ランダム六量体プライミングによってＧＡＬ４応答性プロモーターフラグメントを標識することで、３２Ｐ標識ＤＮＡプローブによるドットブロットハイブリダイゼーションが調製される。陽性ウェルは、数回にわたり溶菌斑が再形成されて再プローブされ、ＰＣＲおよび配列解析によって、双方の短い反復配列のコピー中に、ＧＡＬ４応答性プロモーターを含有することが確認される。この組換え体は、ＨＳＶ−ＧＳ５と命名される。
【０１３５】
ＨＳＶ−ＧＳ６は、ＵＬ４３およびＵＬ４４の遺伝子間領域中に挿入された、自己活性化トランス活性化因子（ＴＡ）遺伝子を含有する。さらに、ＩＣＰ４プロモーターは、短い反復配列の双方のコピー中で、ＧＡＬ４応答性プロモーター（ＧＡＬ４結合部位含有最小プロモーター）で置換される。さらに、ＩＣＰ８プロモーターは、ヒトｈｓｐ７０Ｂプロモーターで置換される。この組換えウイルスの構築は、第２のＨＳＶ−１複製必須遺伝子（ＩＣＰ８）をＨｓｐ７０Ｂプロモーターの制御下に置くことを伴う。この組換え体の構築のための「骨格」として、ＨＳＶ−ＧＳ５が使用される。それをプラスミドｐＢＳ−ＫＳ：ＩＣＰ８ΔプロモーターのＨＳＶ−１ＩＣＰ８組換えアーム間にクローニングすることで、天然ＩＣＰ８プロモーターの代わりに挿入されたｈｓｐ７０Ｂプロモーターを含有するＩＣＰ８組換えプラスミドｐＢＳ−ＫＳ：Ｈｓｐ７０Ｂ−ＩＣＰ８が構築される。ヒトｈｓｐ７０Ｂプロモーターフラグメントを分離するために、コンストラクトｐ１７が、ＢａｍＨＩで消化され、末端はクレノウＤＮＡポリメラーゼでフィルインされて、ＤＮＡはＨｉｎｄＩＩＩでさらに消化される。４５０ｂｐのプロモーターフラグメントは、ゲル精製される。（Ｖｏｅｌｌｍｙ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４９４９−５３）。ベクターでは、ｐＢＳ−ＫＳ：ＩＣＰ８Δプロモーターが、ＺｒａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化される。得られた４５８８ｂｐのフラグメントは、ゲル精製される。後者の２つのＤＮＡ断片のライゲーションは、ｈｓｐ７０ＢプロモーターをＩＣＰ８転写開始部位の前に配置させる。形質転換に引き続いて、いくつかのコロニーは増殖されて、プラスミドＤＮＡが制限対象となり、次に配列解析されてｐＢＳ−ＫＳ：Ｈｓｐ７０Ｂ−ＩＣＰ８が同定される。
【０１３６】
１μｇのｐＢＳ−ＫＳ：Ｈｓｐ７０Ｂ−ＩＣＰ８が、リン酸カルシウム沈殿によって、１０μｇの精製ＨＳＶ−ＧＳ５ビリオンＤＮＡと共に、Ｅ５細胞に同時形質移入される。形質移入細胞は４３．５℃に３０分間曝露され、次に３７℃で培養される。引き続いて２および３日目に、細胞は、再度４３．５℃で３０分間培養され、次に３７℃に戻される。溶菌斑が選択されて、Ｅ５細胞の９６ウェルプレート上で増幅される。プレートは、感染の２〜３時間後に４３．５℃で３０分間培養され、次に３７℃で培養される。引き続いて２および３日目に、プレートはまた、４３．５℃に３０分間移行され、次に３７℃に戻される。ウェルが９０〜１００％のＣＰＥを示した後、プレートはドットブロットされ、ドットブロットメンブレンは、ランダム六量体プライミングによって、ｈｓｐ７０Ｂプロモーターフラグメントを標識することで調製された３２Ｐ標識ＤＮＡプローブとハイブリダイズされる。陽性ウェルは、数回にわたり溶菌斑が再形成されて再プローブされ、ＰＣＲおよび配列解析によって、ＩＣＰ８プロモーターが欠失し、その場所にｈｓｐ７０Ｂプロモーターを含有することが確認される。この組換え体は、ＨＳＶ−ＧＳ６と命名される。
【０１３７】
一般的に知られている分子生物学および生化学的方法が使用された。分子生物学的方法は、例えば、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ＩＳＢＮ：９７８−０−４７１−５０３３８−５に記載される。
【０１３８】
実施例２：複製能を有する制御ウイルスの制御複製
（ａ）ＨＳＶ−ＧＳ１の増殖および複製特性
許容（Ｅ５）および非許容（ＲＳ）細胞の溶菌斑分析
精製ＨＳＶ−ＧＳ１ウイルスの連続希釈が、６０ｍｍシャーレ内のウサギ皮膚（ＲＳ）またはＩＣＰ４相補Ｖｅｒｏベースヘルパー細胞株（Ｅ５）細胞のどちらかのコンフルエントな単層上に播種された。ウイルスは３７℃で１時間吸着されて、次に接種材料が除去され、細胞は完全培地（ＲＳまたはＥ５細胞では、それぞれ５％仔ウシ血清または１０％ウシ胎仔血清が添加された、改変イーグル培地）で覆われた。次にシャーレは７２時間培養され、クリスタルバイオレットで染色されて、あらゆるウイルス溶菌斑が視覚化された。Ｅ５細胞上で１０〜１００個の溶菌斑をもたらす希釈において、非相補ＲＳ細胞上では、溶菌斑は観察されなかった。
【０１３９】
ＨＳＶ−ＧＳ１の増殖分析
６０ｍｍシャーレ内のＲＳまたはＥ５細胞のどちらかのコンフルエントな単層は、上述されるように、感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）が５のＨＳＶ−ＧＳ１で感染され、４８時間培養されて、細胞を培地中に掻き取ることで収集され、−８０℃で冷凍されて、２サイクルの凍結解凍を受けて、感染性ウイルスについて力価測定された。結果は、表１に示される。
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【０１４０】
Ｖｅｒｏ細胞内のＨＳＶ−ＧＳ１複製に対する熱曝露およびミフェプリストンの効果の分析
この実験の目的は、ＨＳＶ−ＧＳ１の複製周期を野性型ベクターＨＳＶ−１  １７ｓｙｎ＋株と比較することであった。Ｖｅｒｏ細胞のコンフルエントな単層は、ｍ．ｏ．ｉ．が３のＨＳＶ−１株１７＋または組換えＨＳＶ−ＧＳ１のどちらかで感染された。ウイルスは３７℃で１時間吸着されて、次に接種材料が除去され、細胞は完全培地（１０％ウシ胎仔血清が添加された改変イーグル培地）で覆われた。加熱処置は、吸着の４時間後に、密封されたシャーレを４３．５℃の水浴内に３０分間浮遊させることで実施された。ミフェプリストン処理（１０ｎＭ）が、初期感染の時点で開始された。次にシャーレは、３７℃で７２時間培養された。感染の０、８、１６、および２８時間後に、２個のシャーレが除去されて、細胞は培地中に掻き取られて収集され、２サイクルの凍結解凍を受けた。次に感染性ウイルスは、コンフルエントなＥ５細胞の２４ウェルプレート上で三連で、各シャーレの溶解産物を力価測定することで判定された。溶菌斑は、クリスタルバイオレットで染色することで、２日後に視覚化された。結果は、選択された実験条件下では、ＨＳＶ−ＧＳ１が、野性型ウイルス１７ｓｙｎ＋と同程度に効率的に、自己複製することを実証する（図３Ｂ）。活性化処置（加熱およびミフェプリストン）の不在下では、ＨＳＶ−ＧＳ１複製は生じないようであった。活性化処置、すなわち、熱曝露およびミフェプリストン存在下の培養は、野性型ウイルス複製にわずかにのみ影響を及ぼしたことにもまた留意されたい。
【０１４１】
宿主細胞熱曝露および小分子制御因子存在の双方に対するＨＳＶ−ＧＳ１複製の依存性分析
この実験の目的は、加熱およびミフェプリストンによるＨＳＶ−ＧＳ１組換えの活性化が、双方の要求に起因するかどうか、そしてミフェプリストンのみまたは加熱のみが複製を誘導するのに十分でないかを判定することであった。実験は、加熱処置が吸着直後に施されたことを除いて、先行するセクションに記載されるように実施された。データは、宿主細胞が、ミフェプリストン存在下で加熱に曝露されない限り、ＨＳＶ−ＧＳ１の複製が生じなかったことを示す（図３Ａ）。
【０１４２】
（ｂ）ＨＳＶ−ＧＳ３の増殖および複製特性
ＨＳＶ−ＧＳ３の複製効率
この実験の目的は、ＨＳＶ−ＧＳ３組換え体の複製周期を野性型ベクターＨＳＶ−１  １７ｓｙｎ＋と比較することであった。Ｅ５細胞のコンフルエントな単層（しかし下記も参照されたい）は、ｍ．ｏ．ｉ．が３のＨＳＶ−１株１７＋または組換えＨＳＶ−ＧＳ３のどちらかで感染された。ウイルスは３７℃で１時間吸着されて、次に接種材料が除去され、細胞は完全培地（１０％ウシ胎仔血清が添加された改変イーグル培地）で覆われた。加熱処置は、感染の４時間後に、密封されたシャーレを４３．５℃の水浴内に３０分間浮遊させることで、吸着後に実施された。ミフェプリストン処理（１０ｎＭ）が、初期感染の時点で開始された。ＨＳＶ−ＧＳ３  Ｎｏ  Ｔｘ（処理なし）セットでは、Ｅ５細胞が、感染の１２時間前に発現可能ＩＣＰ８遺伝子を含有するプラスミドで形質移入された。次にシャーレは、３７℃でさらに培養された。感染の０、４、１２、および２４時間後に、２個のシャーレが除去されて、細胞は培地中に掻き取られて収集され、２サイクルの凍結解凍を受けた。次に感染性ウイルスは、あらかじめＩＣＰ８発現プラスミドで形質移入された、コンフルエントなＥ５細胞の２４ウェルプレート上で三連で、各シャーレの溶解産物を力価測定することで判定された。溶菌斑は、クリスタルバイオレットで染色することで、２日後に視覚化された。結果は、ＨＳＶ−ＧＳ３が、選択された実験条件下で、野生型ウイルスＨＳＶ−１１７ｓｙｎ＋に近い効率で複製されたことを示す（図４Ａ）。
【０１４３】
宿主細胞熱曝露および小分子制御因子存在の双方に対するＨＳＶ−ＧＳ３複製の依存性分析
一段成長実験が実施されて、加熱およびミフェプリストンによるＨＳＶ−ＧＳ３の活性化が、双方の要件に起因するかどうか、そしてミフェプリストンのみまたは加熱単のみが複製を誘導するのに十分でないかが判定された。図４Ｂに示される実験は、Ｖｅｒｏ細胞が使用されおよび加熱処置が吸着直後に施されたことを除いては、先行するセクションに記載されるようにして実施された。力価測定は、ＩＣＰ８発現プラスミドであらかじめ形質移入されたＥ５細胞内で実施された。同様の実験が、ヒト扁平細胞腫瘍系ＳＣＣ−１５で実施された（図４Ｃ）。後者の実験の結果は、ＨＳＶ−ＧＳ３の複製が厳密に制御されることを示す。それは、ミフェプリストン存在下における感染細胞の熱曝露によってのみ引き起こされる。
【０１４４】
その他の実験では、感染性ウイルスの力価測定によるウイルス複製測定は、ウイルスＤＮＡまたはウイルス遺伝子発現の定量法によって置き換えられた。これらの実験では、ミフェプリストンおよび／またはウリプリスタル（小分子調節因子）が試験された。このような一実験は、表２に要約されるデザインを有した。
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【０１４５】
コンフルエントなＶｅｒｏ細胞の３５ｍｍシャーレは、ｍ．ｏ．ｉ．が３のＨＳＶ−ＧＳ３ベクターで感染された。各処置群は、（各時点で）３個の複製シャーレからなった。ウイルスは３７℃で１時間吸着されて、接種材料が除去され、細胞は完全培地（１０％ウシ胎仔血清が添加された改変イーグル培地）で覆われた。薬物（すなわち、ミフェプリストンまたはウリプリスタル）処置が、初期感染の時点で開始された。加熱処置は、水面下のプラットフォーム上で、密封されたシャーレを４３．５℃の水浴内に３０分間浮遊させることで、吸着後に実施された（感染の４時間後に開始された）。シャーレは、３７℃でさらに培養された。加熱処置の１、４、１２、および２４時間後に、３個のシャーレが除去されて、培地が除去され、ＴＲＩｚｏｌを使用してＤＮＡおよびＲＮＡが抽出された。抽出されたＤＮＡは、ＨＳＶ−１  ＤＮＡの定量分析のためにＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲに供した（ＨＳＶＤＮＡポリメラーゼプライマー／プローブを使用する）。抽出されたＲＮＡは、ＩＣＰ４および糖タンパク質Ｃ（ｇＣ）転写物の存在について、Ｔａｑｍａｎ  ＲＴ−ＰＣＲによって分析された。ＤＮＡおよびＲＮＡ量は、細胞遺伝子ＡＰＲＴに対して正規化されて、相対量として提示される。使用されたプライマーは、下の表３に示される。
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【０１４６】
得られた結果は、図５に示される。図５Ａは、ウイルスＤＮＡ複製が、加熱処置および小分子制御因子の双方に依存することを示す。ウリプリスタルでは、ＤＮＡ複製が調節物質用量に依存することが実証された。ＩＣＰ４遺伝子（制御遺伝子）および後期ｇＣ遺伝子（意図的制御を受けない）の発現について、適合するデータが得られた（図５ＢおよびＣ）。
【０１４７】
実施例３：意図的な活性化の不在下における複製能を有する制御ウイルスの生体内自己複製の見かけの不能
この実験の目的は、加熱および小分子制御因子不在下で、ＧＳベクターが、細胞培養においてそのようであるように、マウスにおいて厳密に「オフ」であることを示すことであった。４〜６週齢の非近交系ＮＤ４Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒメスマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．）は、生理食塩水前処理に続いて、軽く擦過された両後肢の足底表面で、同様の量のＨＳＶ−ＧＳ１または１７ｓｙｎ＋野性型ウイルスに感染された。感染の４、８、および２１日後の時点で、４匹のマウスを安楽死させ、肢および後根神経節（ＤＲＧ）が採取されて、ＴＲＩｚｏｌ中で均質化され、ＤＮＡおよびＲＮＡが抽出された。ＤＮＡは、ＨＳＶ−１  ＤＮＡの定量分析のために、ＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲに供され；ＲＮＡは、ＩＣＰ４および糖タンパク質Ｃ（ｇＣ）転写物の存在について、以前記載されたように、ＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲによって、ＲＴに続いて分析された。Ｋｕｂａｔ，Ｎ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｔｈｅ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｌａｔｅｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ（ＬＡＴ）ｅｎｈａｎｃｅｒ／ｒｃｒ  ｉｓ  ｈｙｐｅｒａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｌａｔｅｎｃｙ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｏｆ  ＬＡＴ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：１２５０８−１８。リアルタイムプライマー／プローブ配列は、表３で開示される。
【０１４８】
結果は、肢ならびにＤＲＧ中のＨＳＶ−ＧＳ１遺伝子発現の完全な不在を示した（表４）。ＨＳＶ−ＧＳ１が複製できないことを暗示するこの結果と一致する発見は、ＨＳＶ−ＧＳ１のＤＮＡ量が、野生型ウイルスＨＳＶ１７ｓｙｎ＋のものより数桁低いことであった。８日目における複製効率の差は、それぞれ、肢では１５１倍であり、ＤＲＧでは２００倍であった。
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【０１４９】
実施例４：発明の複製能を有する制御ウイルスの生体内活性化
これらの実験では、マウスモデルにおけるウイルス複製は、ウイルスＤＮＡ定量およびウイルス遺伝子発現の生化学的方法によって推定された。ＤＮＡ量およびウイルス転写物量は、肢（ウイルス接種部位）および後根神経節（ＤＲＧ）（ＨＳＶ急性複製および潜伏部位）の双方で測定された。このような一実験は、表５に要約されるデザインを有した。この実験はまた、ウリプリスタルの最低生体内有効量を判定することを目的とする。
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【０１５０】
非近交系Ｓｗｉｓｓ−ｗｅｂｓｔｅｒメスマウス（４〜６週齢）は、生理食塩水前処理と両後肢の軽い擦過に続いて、１×１０５ｐｆｕのＨＳＶ−ＧＳ３ベクターを接種された。各処置群は、５匹のマウスからなった。薬物療法（ウリプリスタル）は、感染時点でＩＰ投与された。加熱処置は、ウイルス投与の３時間後に、（後肢を水浴内に浸漬させることで）４５℃で１０分間実施された。マウスは、３７℃で１５分間回復させた。マウスを加熱誘導の２４時間後に殺処分され、肢およびＤＲＧが切開されて、ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中でスナップ凍結された。ＤＮＡおよびＲＮＡは、組織をＴＲＩｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で粉砕し、ＤＮＡを境界面から逆抽出することで抽出された。ＤＮＡは、ＨＳＶ−１  ＤＮＡの定量分析のために、ＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲに供された。ＲＮＡは、逆転写（ＲＴ）に続いて、Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲによって、ＩＣＰ４および糖タンパク質Ｃ（ｇＣ）転写物の存在について分析された。ＤＮＡおよびＲＮＡ量は、細胞遺伝子ＡＰＲＴに対して正規化された。
【０１５１】
結果は、図６に示される。図６Ａは、肢における複製が、加熱処置および小分子制御因子の双方に依存することを示す。さらに、ＤＮＡ複製は、調節物質用量に依存した。ＩＣＰ４遺伝子（制御遺伝子）および後期ｇＣ遺伝子（意図的制御を受けない）の発現について、適合するデータが得られた（図６ＢおよびＣ）。（加熱処置不在下において）小分子制御因子は単独では、本質的にＤＮＡ複製を刺激せず、最大でもＩＣＰ４およびｇＣ転写物の発現をわずかに増大させた。
【０１５２】
ＨＳＶ−ＧＳ３および複製欠陥ウイルスＫＤ６（ＩＣＰ４−）の複製収率は、図６Ｄに示される実験で比較された。この実験は、マウスが加熱誘導の２４時間後に殺処分されたことを除いては、先の実験のように実施された。結果は、ウイルスＤＮＡが、本質的に、加熱処置およびウリプリスタルを投与されたＨＳＶ−ＧＳ３感染動物の肢からのサンプル中でのみ、検出され得ることを示した。ＤＲＧ中では非常にわずかのＤＮＡしか見られず、ＫＤ−６感染動物、または活性化されていないＨＳＶ−ＧＳ３感染動物では、本質的に皆無であった。
【０１５３】
実施例５：発明の複製能を有する制御ウイルスを複製欠陥比較ウイルス（ＫＤ６）と比較する免疫化／攻撃実験
この種の実験の目的は、誘発条件下におけるＨＳＶ−ＧＳ３ウイルスによるマウスの免疫化が、致死性用量の野生型ＨＳＶ−１による後続の攻撃に対する、強力な防御免疫応答を引き起こすことを示すことであった。
【０１５４】
（ａ）生存
実験デザイン：
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【０１５５】
ａ）免疫化：マウスは、最初に、表６に示される実験群で免疫化された。各群は、２０匹のマウス（ＮＤ４  Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒメス、４〜６週間）を含んだ。各ベクターは、生理食塩水前処理に続いて、軽く擦過された両後肢の足底表面に塗布された。
【０１５６】
ｂ）誘導：ＨＳＶ−ＧＳ３ベクターは、次のようにして、「ＨＳＶ−ＧＳ３（誘導）」群中で誘導された：ミフェプリストン（０．５ｍｇ／ｋｇ）は、免疫化時点でｉ．ｐ．投与され、２４時間後に再投与された。加熱は、免疫化の３時間後に、両後肢を４３．５℃の水浴に３０分間浸漬することで、適用された。浸漬に続いて、後肢は乾燥され、マウスは乾燥して暖まるまで、加熱ランプで保温された。
【０１５７】
ｃ）攻撃：免疫化の２２日後に、マウスは、生理食塩水前処理に続いて、軽く擦過された両後肢の足底表面に塗布された２０倍致死用量の野性型ＨＳＶ−１  １７ｓｙｎ＋株で攻撃された。次に修正エンドポイントアッセイによって、各免疫化処置の有効性が評価された。修正エンドポイントアッセイは、臨床的評価に基づいて、瀕死（生き残れない）と見なされるマウス（両側性後肢麻痺および中枢神経系障害の徴候、痙攣を示し、食物または水を接種するために自ら移動できないマウス）の安楽死を伴うことに留意されたい。
【０１５８】
結果：
模擬処置群のマウスは、早くも攻撃の６日後に後肢麻痺およびＣＮＳ感染の徴候を示し始めた一方で、全ての３つの免疫化群は、攻撃の８〜９日後まで完全に健康なようであった。表７は、実験終了時に生存したマウスの数を描写する（マウスは攻撃の３０日後まで追跡された）。結果は、全ての処置が、２０倍致死量のＨＳＶ−１攻撃から、少なくともいくらかのマウスを保護できた一方で、誘導ＨＳＶ−ＧＳ３ウイルス処置のみがマウスに実質的保護をもたらし得たことを実証する。
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【０１５９】
さらなる実験が、下に報告される。
【０１６０】
実験デザイン：
ａ）免疫化：マウスは、最初に、表６に示される実験群で免疫化された。各群は、１０匹のマウス（ＮＤ４  Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒメス、４〜６週間）を含んだ。各ベクターは、生理食塩水前処理に続いて、軽く擦過された両後肢の足底表面に塗布された。
【０１６１】
ｂ）誘導：ＨＳＶ−ＧＳ３ベクターは、次のようにして、「ＨＳＶ−ＧＳ３（２回の誘導）」群中で誘導された：ウリプリスタル（５０μｇ／ｋｇ）は、免疫化時点でｉ．ｐ．投与された。加熱は、免疫化の３時間後に、両後肢を４５℃の水浴に１０分間浸漬することで、適用された。浸漬に続いて、後肢は乾燥され、マウスは乾燥して暖まるまで、加熱ランプで保温された。後者の活性化処置は、２４時間後に繰り返された。
【０１６２】
ｃ）攻撃：免疫化のおよそ３週間後に、マウスは、生理食塩水前処理に続いて、軽く擦過された両後肢の足底表面に塗布された２倍致死用量の野性型ＨＳＶ−１  １７ｓｙｎ＋株で攻撃された。次に修正エンドポイントアッセイによって、各免疫化処置の有効性が評価された。修正エンドポイントアッセイは、臨床的評価に基づいて、瀕死（生き残れない）と見なされるマウス（両側性後肢麻痺および中枢神経系障害の徴候、痙攣を示し、食物または水を接種するために自ら移動できないマウス）の安楽死を伴うことに留意されたい。
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【０１６３】
結果：
表９は、実験終了時に生存したマウスの数を描写する（マウスは攻撃の３０日後まで追跡された）。結果は、全ての処置が、２倍致死量のＨＳＶ−１攻撃から、少なくともいくらかのマウスを保護できた一方で、誘導ＨＳＶ−ＧＳ３ウイルス処置のみがマウスに実質的保護をもたらし得たことを実証する。
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【０１６４】
（ｂ）攻撃ウイルスの複製
実験デザイン：
ａ）免疫化：マウスは、表６に示されるように免疫化された。各群は、５匹のマウス（ＮＤ４  Ｓｗｉｓｓメス、４〜６週間）を含んだ。各ベクターは、生理食塩水前処理に続いて、軽く擦過された両後肢の足底表面に塗布された。
【０１６５】
ｂ）誘導：ＨＳＶ−ＧＳ３ベクターは、次のようにして、「ＨＳＶ−ＧＳ３（誘導）」群中で誘導された：ミフェプリストン（０．５ｍｇ／ｋｇ）は、免疫化時点でｉ．ｐ．投与され，２４時間後に再投与された。加熱は、免疫化の３時間後に、両後後（ｒｅａｒ  ｈｉｎｄ）肢を４３．５℃の水浴に３０分間浸漬することで、適用された。浸漬に続いて、後肢は乾燥され、マウスは乾燥して暖まるまで、加熱ランプで保温された。
【０１６６】
ｃ）攻撃：免疫化の２２日後に、マウスは、生理食塩水前処理に続いて、軽く擦過された両後肢の足底表面に塗布された２０倍致死用量の野性型ＨＳＶ−１  １７ｓｙｎ＋株で攻撃された。攻撃の４日後に、マウスを安楽死させ、脚を切開して均質化した。次に組織ホモジネートを希釈して、ウサギ皮膚細胞（ＲＳ）上で、感染性（１７ｓｙｎ＋）ウイルスについて力価測定した。
【０１６７】
結果：
表１０は、力価測定データの結果を描写する。これらの結果は、全ての免疫化処置が、ＨＳＶ−１による攻撃に続いて、脚において複製を（模擬と比較して）ある程度低下できた一方で、ＨＳＶ−ＧＳ３（誘導）マウスが、攻撃の４日後にはるかにより低い（模擬より約２桁低い）攻撃ウイルス力価を示したことを例証する。
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【０１６８】
実施例６：複製能を有する制御ウイルスと同時に自己複製するアデノウイルスベクター
（ａ）複製能を有する制御ウイルスのトランス活性化因子によって活性化される複製必須遺伝子を有するアデノウイルス
ｒＡｄ３は、Ｅ３を包含するヌクレオチド２８，１３０−３０，８２０を欠く。アデノウイルス５型ゲノムに関するヌクレオチド番号は、ＧＩ：３３６９４６３７で定義されるようである。Ｄａｖｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８４，２８９５−２９０８。さらに、それは、最小プロモーターを含有するＧＡＬ４部位と機能的に連結する、完全なＥ１遺伝子を含有する。
【０１６９】
Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：２５０９−２５１４（１９９８））によって開発された、組換えアデノウイルスを生成するための簡易化システムが用いられて、ｒＡｄ３が構築された。このシステムは、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐ．によって市販されている。「ＡｄＥａｓｙ（商標）アデノウイルスベクターシステム」（改訂０６０００２版）と題されたマニュアルは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社によってその顧客のために配布され，同社のウェブサイトでも入手できる。
【０１７０】
変異誘発は、Ｓｔａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって流通されるトランスファーベクターｐＳｈｕｔｔｌｅ（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８））中で実施される。このプラスミドの完全なヌクレオチド配列については、米国特許第７，９０６，３１２の号明細書の図７を参照されたい。「ＡｄＥａｓｙ（商標）Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（改訂０６０００２版）と題されたＳｔｒａｔａｇｅｎｅのマニュアルによれば、ｐＳｈｕｔｔｌｅは、以下のアデノウイルス配列要素を含有する：左逆方向末端反復、カプシド形成シグナル（Ａｄ１〜３３１）、「右アーム相同性領域」（３，５３４〜５７９０）、「左アーム相同性領域」（３４，９３１〜３５，９３５）、および右逆方向末端反復。
【０１７１】
ｐＳｈｕｔｔｌｅの右アーム相同性領域は、相同性領域に加えて、Ｅ１領域の開始部もまた含有するＡｄ配列で置換される。最初に、ｐＳｈｕｔｔｌｅ  ＤＮＡはＮｏｔＩおよびＰｍｅＩで消化され、ベクターフラグメントはゲル精製される。次に、Ａｄ４９６−５７８０を含有するフラグメントが、プラスミドｐＸＣ１（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ）からのＰＣＲ増幅によって得られる。このプラスミドのヌクレオチド配列は、例えば、米国特許第７，９０６，３１２号明細書の図９で報告される。後者のＰＣＲ増幅は、ＳｂｆＩ制限部位を含有する順方向プライマー（Ｅ１遺伝子への読み取り）と、ＰｍｅＩ制限部位を含有する逆方向プライマーとを使用して実施される。得られたＰＣＲフラグメントは、Ｓｂｆ１およびＰｍｅＩで消化される。さらに、プラスミドｐＧｅｎｅ／Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のヌクレオチド４６３４〜３２３を包含するＤＮＡ断片は、ＮｏｔＩ制限部位を含有する適切な順方向プライマーと、ＳｂｆＩ制限部位を含有する逆方向プライマーとを使用して、ＰＣＲ増幅される。ＰＣＲ増幅フラグメントは、ＮｏｔＩおよびＳｂｆ１で消化される。後者の２つの末端消化ＰＣＲフラグメントは、ｐＳｈｕｔｔｌｅベクターフラグメントにライゲートされる。制限分析によって証明されるように後者の３つのフラグメントを含有するプラスミドは、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｅ１−ＧＡＬ４と称される。
【０１７２】
組換えＡｄを調製するために、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｅ１−ＧＡＬ４ＤＮＡはＰｍｅＩ消化によって直線化され、ｐＡｄＥａｓｙ−１  ＤＮＡ（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）と共に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＪ５１８３細胞に同時電気穿孔される。ＢＪ５１８３細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２００１５４）は、導入ウイルス配列間で相同組換えを実施するのに必要な細胞構成要素を有する。組換えＡｄプラスミドの生成と、引き続く組換えＡｄウイルス製造の詳細な方法は、Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ｍａｎｕａｌ“ＡｄＥａｓｙ（商標）Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ”（改訂０６０００２版）で考察される。簡単に述べると、組換えＡｄプラスミドは、制限酵素消化によって特徴付けられる。正しい組換え体の十分な量のＤＮＡの調製後、ＤＮＡはＰａｃＩで消化されてプラスミド配列が分離され、Ａｄ配列を含でなる配列に挿入される。組換えＡｄウイルスを製造するために、消化されたＤＮＡは２９３個の細胞に形質移入される。標準技術を使用して（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）に簡単に記載され；Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｃ．１９９１．Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｖｏｌ．７，ｅｄ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ，ｐｐ．１０９−１２７もまた参照されたい）、ウイルス溶菌斑が単離され、ｒＡｄ３原液が調製される。ウイルス原液は、ＣｓＣｌ勾配遠心分離またはクロマトグラフィー手順によって精製され得る。
【０１７３】
ｒＡｄ３およびＨＳＶ−ＧＳ３ウイルスで同時感染されたヒト線維芽細胞などの哺乳類細胞内では、例えば、ミフェプリストンまたはウリプリスタルなどの有効濃度の小分子調節物質の存在下における適切な熱線量の投与が、双方のウイルスの複製の活性化をもたらす。
【０１７４】
（ｂ）条件的にＡｄ複製必須遺伝子を発現するＨＳＶ−ＧＳウイルスによって補完される複製必須遺伝子を欠くアデノウイルス
Ｅ１Ａ−欠損Ａｄ５（ｒＡｄ４）は、次のようにして調製される：ｐＳｈｕｔｔｌｅの右アーム相同性領域は、より長いＡｄＥ１配列で置換される。最初に、ｐＳｈｕｔｔｌｅ  ＤＮＡはＮｏｔＩおよびＰｍｅＩで消化され、ベクターフラグメントはゲル精製される。次に、Ａｄ４９６−５７８０を含有するフラグメントが、プラスミドｐＸＣ１（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ）からのＰＣＲ増幅によって得られる。後者のＰＣＲ増幅は、ＮｏｔＩ制限部位を含有する順方向プライマー（Ｅ１遺伝子への読み取り）と、ＰｍｅＩ制限部位を含有する逆方向プライマーとを使用して実施される。得られたＰＣＲフラグメントは、Ｎｏｔ１およびＰｍｅＩで消化される。後者の末端消化ＰＣＲフラグメントは、ｐＳｈｕｔｔｌｅベクターフラグメントにライゲートされる。制限分析によって証明されるように後者の３つのフラグメントを含有するプラスミドは、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｅ１と称される。
【０１７５】
組換えＡｄを調製するために、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｅ１ＤＮＡはＰｍｅＩ消化によって直線化され、ｐＡｄＥａｓｙ−１と共に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＪ５１８３細胞に同時電気穿孔される。組換えＡｄプラスミドは、制限酵素消化によって特徴付けられる。正しい組換え体の十分な量のＤＮＡの調製後、ＤＮＡはＰａｃＩで消化されてプラスミド配列が分離され、Ａｄ配列を含でなる配列に挿入される。組換えＡｄを製造するために、消化されたＤＮＡは２９３個の細胞に形質移入される。標準技術を使用して、ウイルス溶菌斑が単離され、ｒＡｄ４原液が調製される。ウイルス原液は、ＣｓＣｌ勾配遠心分離またはクロマトグラフィー手順によって精製され得る。
【０１７６】
ＨＳＶ−ＧＳ７を調製するために、後者のプラスミドの構築で使用されている２つの同一プライマーを使用して、プラスミドｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｅ１−ＧＡＬ４からのＧＡＬ４プロモーターＥ１領域がＰＣＲ増幅され：順方向プライマーとして、ｐＧｅｎｅ／Ｖ５−Ｈｉｓプロモーターフラグメントを増幅するのに用いられている同一順方向プライマーが使用され、逆方向プライマーとして、ｐＸＣ１からのＥ１フラグメントを増幅するのに用いられている同一逆方向プライマーが使用される。（プライマーはリン酸化される。）ＰＣＲフラグメントは、ゲル精製される。ベクターでは、ｐＢＳ−ＫＳ：ＵＬ３７／３８がＢｓｐＥ１およびＡｆｌＩＩで消化され、得られた３，７７２ｂｐのフラグメントは、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理され、ゲル精製され、ＳＡＰ処理されて、次に上記ＰＣＲフラグメントにライゲートされた。形質転換に続いて、コロニーは制限酵素消化によってスクリーニングされ、制限酵素分析によって、次に配列解析によって確認される、正しい挿入があるプラスミドを含有する、１つのコロニーが増殖される。このプラスミドは、ｐＵＬ３７／３８：ＧＡＬ４−Ｅ１と称される。
【０１７７】
１μｇのｐＵＬ３７／３８：ＧＡＬ４−Ｅ１が、リン酸カルシウム沈殿によって、１０μｇの精製ＨＳＶ−ＧＳ３ビリオンＤＮＡと共に、Ｅ５細胞に同時形質移入された。培地へのミフェプリストンの添加に引き続いて、形質移入細胞は４３．５℃に３０分間曝露され、次に３７℃で培養される。引き続いて２および３日目に、細胞は、再度４３．５℃で３０分間培養され、次に３７℃に戻される。溶菌斑が選択されて、ミフェプリストンが添加された培地中のＥ５細胞の９６ウェルプレート上で増幅される。プレートは、感染の１時間後に４３．５℃で３０分間インキュベートされて、次に３７℃で培養される。引き続いて２および３日目に、プレートはまた、４３．５℃に３０分間移行され、次に３７℃に戻される。ウェルが９０〜１００％のＣＰＥを示した後、プレートはドットブロットされ、ドットブロットメンブレンは、アデノウイルスＥ１領域に対する、３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズされる。陽性ウェルは、数回にわたり溶菌斑が再形成されて再プローブされ、配列解析によって、予期されたＧＡＬ４−Ａｄ５  Ｅ１遺伝子配列を含有することが確認される。この組換え体は、ＨＳＶ−ＧＳ７と称される。
【０１７８】
ｒＡｄ４およびＨＳＶ−ＧＳ７ウイルスで同時感染されたヒト線維芽細胞などの哺乳類細胞内では、例えば、ミフェプリストンまたはウリプリスタルなどの有効濃度の小分子調節物質の存在下における適切な熱線量の投与が、双方のウイルスの複製の活性化をもたらす。
【０１７９】
文献、特許、および特許出願をはじめとする、本出願で言及される全ての参考文献は、その内容全体が援用されているものと見なされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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