(57)【要約】      （修正有）【課題】べと病に対する広範囲な耐性を有する新規なホウレンソウ植物及びその子孫の提供。【解決手段】Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）に対する広範囲な耐性を付与するＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａからの特定の配列を有する移入遺伝子座をそのゲノムに含み、受託番号ＰＴＡ−１２０５３３または受託番号ＰＴＡ−１２０５３４の下で寄託されている、農学的エリートＳｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａホウレンソウ植物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する広範囲な耐性を付与するＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａからの移入遺伝子座をそのゲノムに含むＳｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａホウレンソウ植物。
【請求項２】
Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）の、レース７、１０、１１、１２、１３、及び１４に対して前記広範囲な耐性を含む、請求項１記載の前記ホウレンソウ植物。
【請求項３】
Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ  （Ｐｆｓ）のレース１〜１４及びＵＡ４７１２に対して、前記広範囲な耐性を含む、請求項１記載の前記ホウレンソウ植物。
【請求項４】
近交植物として定義される、請求項１記載の前記ホウレンソウ植物。
【請求項５】
ハイブリッド植物として定義される、請求項１記載の前記ホウレンソウ植物。
【請求項６】
農学的エリート植物として定義される、請求項１記載の前記ホウレンソウ植物。
【請求項７】
前記移入遺伝子座が、配列番号１または２に対して、少なくとも９５％同等の配列でＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａゲノムに隣接するように定義される、前記ホウレンソウ植物。
【請求項８】
該遺伝子座を含む種子の代表的サンプルが、受託番号ＰＴＡ−１２０５３３または受託番号ＰＴＡ−１２０５３４の下で寄託された、請求項６記載の前記農学的エリートホウレンソウ植物。
【請求項９】
請求項１に記載の前記植物を生成する種子。
【請求項１０】
請求項１記載の前記植物の植物部分。
【請求項１１】
植物部分が、胚、分裂組織、子葉、花粉、葉、葯、根、雌しべ、花、細胞、及び茎から成る群から選択される、請求項１０記載の前記植物部分。
【請求項１２】
Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する広範囲の耐性を付与するＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａからの対立遺伝子を含み、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａに遺伝子的に連結されている全ての、または、幾つかの遺伝子座を欠く、組換え染色体セグメント。
【請求項１３】
Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａからの少なくとも第一の遺伝子座を含むとして更に定義される、請求項１２記載の前記染色体セグメント。
【請求項１４】
Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する広範囲の耐性を付与するＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａからの該対立遺伝子を含む種子の代表的サンプルが、受託番号ＰＴＡ−１２０５３３、または、受託番号ＰＴＡ−１２０５３４の下で寄託された、請求項１２記載の前記染色体セグメント。
【請求項１５】
請求項１４記載の前記染色体セグメントを含む、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａホウレンソウ植物。
【請求項１６】
請求項１４記載の前記染色体セグメントを含む、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａホウレンソウ種子。
【請求項１７】
該耐性を付与するＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａからの染色体セグメントを有する少なくとも第一の遺伝子多型、または遺伝子連鎖不均衡を植物のゲノムに存在することに基づく該植物の選択を含み、前記遺伝子座が、配列番号１若または２、もしくはそれに少なくとも９５％同等の配列に対応する遺伝子座によりＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａに隣接する、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する広範囲な耐性を有する植物を選択する方法。
【請求項１８】
前記植物が、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａからの少なくとも１つの移入遺伝子座をそのゲノムに含む、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ植物である、請求項１７記載の前記方法。
【請求項１９】
前記植物が、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａ植物である、請求項１７記載の前記方法。
【請求項２０】
表現型アッセイで、該広範囲の耐性の存在を確認するステップを更に含む、請求項１７記載の前記方法。
【請求項２１】
該遺伝子座を含む子孫植物生成するために、遺伝子座を含む該植物を別のホウレンソウ植物と交配することを更に含む、請求項１７記載の前記方法。
【請求項２２】
Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）に対して、広範囲な耐性を付与する少なくとも１つの遺伝子座をそのゲノムに含む農学的エリートホウレンソウ植物を生成するための方法であって、前記方法は、
（ｉ）第一のホウレンソウ植物を第二のホウレンソウ植物と交配し、前記第一の植物が、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．  ｓｐ．  Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対して広範囲の耐性を付与するＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａからの少なくとも１つの遺伝子座をそのゲノムに含み、前記第二の植物は該遺伝子座を欠き、
（ｉｉ）該遺伝子座を含む該交配からもたらされる少なくとも第一の子孫ホウレンソウ植物を選択する、ことを含む、前記方法。
【請求項２３】
（ｉｉｉ）次世代の子孫植物を生成するために、子孫植物のホウレンソウをそれ自身、または別のホウレンソウ植物と交配するステップを更に含む、請求項２２記載の前記方法。
【請求項２４】
ステップ（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）が少なくとも約３回〜約１０回繰り替えされる、請求項２３記載の前記方法。
【請求項２５】
前記第一の植物がＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａ植物で、前記第二の植物がＳｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ植物である請求項２２記載の前記方法。
【請求項２６】
選択が、配列番号１及び２で記載された遺伝子多型の検出に基づく子孫のゲノム内に、または、該遺伝子座と遺伝子連鎖不均衡にある、該遺伝子座を同定することを含み、前記遺伝子座は、配列番号１または２、もしくは、それに対して少なくとも９５％同等の配列に対応する遺伝子座によりＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａゲノムに隣接する、請求項２２記載の前記方法。
【請求項２７】
Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ  （Ｐｆｓ）に対する広範囲の耐性を含み、農学的エリートＳｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ植物内に、耐性を付与するＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａからの染色体セグメントを移入することを含む、農学的エリートのホウレンソウ植物を生成する方法であって、該遺伝子座が、配列番号１または２、もしくは、少なくともそれと９５％同等の配列におけるＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａの対立遺伝子に対応する遺伝子座に隣接するＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａゲノムの領域に位置すると定義された前記方法。
【請求項２８】
該遺伝子移入が、反復親としてＳｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ植物を用いて、少なくとも約３〜１０世代の戻し交配により該遺伝子座以外の該植物におけるＳｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａゲノムの本質的に全てを回収することを含む、請求項２７記載の前記方法。
【請求項２９】
表現型アッセイによる広範囲な耐性の存在を確認するステップを更に含む、請求項２７記載の前記方法。
【請求項３０】
該遺伝子座を含む少なくとも第一の植物を同定し、及び該遺伝子座を含む子孫植物を生成するために別のホウレンソウ植物に該遺伝子座を含む植物と交配させることを、更に含む請求項２７記載の前記方法。
【請求項３１】
Ｓ．ｏｌｅｒａｃｅａ内に、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ  （Ｐｆｓ）に対する広範囲な耐性を付与するＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａから遺伝子座を移入することにより入手可能なホウレンソウ植物またはその子孫。
【請求項３２】
前記広範囲な耐性が、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．  ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅ  （Ｐｆｓ）のレース７、１０、１１、１２、１３及び１４に対する耐性を含む、請求項３１記載の前記ホウレンソウ植物。
【請求項３３】
前記広範囲な耐性が、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）の全ての公知のレースに対する耐性を含む、請求項３１記載のホウレンソウ植物。
【請求項３４】
近交植物として定義される、請求項３１記載の前記ホウレンソウ植物。
【請求項３５】
ハイブリッド植物として定義される、請求項３１記載の前記ホウレンソウ植物。
【請求項３６】
農学的エリート植物として定義される、請求項３１記載の前記ホウレンソウ植物。
【請求項３７】
前記移入遺伝子座が、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａゲノムにおいて、配列番号１または２により隣接すると定義される、請求項３１記載の前記ホウレンソウ植物。
【請求項３８】
該遺伝子座を含む種子の代表的サンプルが、受託番号ＰＴＡ−１２０５３３、または、受託番号ＰＴＡ−１２０５３４の下で寄託される、請求項３１記載の前記ホウレンソウ植物。
【請求項３９】
請求項３１の前記植物を生成する種子。
【請求項４０】
請求項３１の前記植物の植物部分。
【請求項４１】
植物部分が、胚、分裂組織、子葉、花粉、葉、葯、根、雌しべ、花、細胞、及び茎から成る群から選択される、請求項４０記載の植物部分。
【請求項４２】
請求項１に記載のホウレンソウ植物の採取した葉を含む食物製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の育種分野に関し、より具体的には、べと病に対する望ましい耐性を有するホウレンソウ植物を生成するための方法及び組成物に関する。
【０００２】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１３年１０月８日に出願された米国仮出願第６１／８８８，５０１号、及び２０１３年１１月４日に出願された米国仮出願第６１／８９９，７８０号の利益を主張し、その全体を参照することにより本明細書に組み入れられたものとする。
【０００３】
配列リストの移入      
２０１４年１０月７日に作成された、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓで稼働するシステムで定量して２キロバイトである「ＳＥＭＢ０１３ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」のファイル名に含まれる配列リストは、本明細書と共に電子出願され、それを参照することにより、本明細書に組み入れられたものとする。
【背景技術】
【０００４】
植物の病変耐性は、植物育種において、特に食用作物の生産のために、重要な形質である。植物真菌病原体、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．  ｓｐ．  Ｓｐｉｎａｃｉａｅにより引き起こされるべと病は、全世界に及ぶホウレンソウ、特に、最も一般的に栽培されるホウレンソウ品種である、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａに対する経済的に重要な病変である。新しい分離株は、現在、発見され、毎年命名されているが、現在、べと病を引き起こす１４レースの病原体が公的に認定されている。今日まで、ホウレンソウ中のＤＭに対する耐性が品種特異的であると考えられていた。ホウレンソウ植物の耐性を克服するための病原体の新たな株の能力が、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する有効なレベルの耐性を有するホウレンソウ品種の開発を困難で、かつ益々重要にしている。
【発明の概要】
【０００５】
１つの態様において、本発明は、そのゲノム中に、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する広範囲の耐性を付与するＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａからの移入遺伝子座を含むＳｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａホウレンソウ植物を提供する。実施形態において、広範囲の耐性は、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）の７、１０、１１、１２、１３、及び１４レース、または、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）の１〜１４レース及びＵＡ４７１２に対する耐性を含む。他の実施形態において、ホウレンソウ植物は、近交系植物、またはハイブリッド植物、または農学的エリート植物として定義されている。別の実施形態において、移入遺伝子座が、配列番号１または２に対して、少なくとも９５％同一の配列により、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａゲノムに隣接するように定義される。更に別の実施形態において、該遺伝子座を含む、種子の代表的なサンプルは、受託番号ＰＴＡ−１２０５３３または受託番号ＰＴＡ−１２０５３４の下で寄託されている。他の実施形態において、本発明は、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．  ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対して、広範囲の耐性を付与するＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａからの移入遺伝子座をゲノムに含むＳｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａホウレンソウ植物、またはそのような植物の植物部分を提供する。尚、別の実施形態において、植物部分は、胚、分裂組織、子葉、花粉、葉、葯、根、雌しべ、花、細胞、及び茎からなる群から選択される。別の実施形態において、本発明は、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する広範囲の耐性を付与するＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａからの移入遺伝子座をそのゲノムに含むホウレンソウ植物の収穫した葉を含む食物製品を提供する。
【０００６】
別の態様において、本発明は、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対して広範囲の耐性を付与するＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａからの対立遺伝子を含み、そしてＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａにそれを遺伝子的に連結されている、全て、または、いくつかの遺伝子座を欠く、組換え染色体セグメントを提供する。１つの実施形態において、染色体セグメントは、更に、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａからの少なくとも第一の遺伝子座を含むものとして定義される。別の実施形態において 、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．  ｓｐ．  Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する広範囲の耐性を付与するＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａからの該対立遺伝子を含む種子の代表的サンプルは、受託番号ＰＴＡ−１２０５３３または受託番号ＰＴＡ−１２０５３４の下で寄託されている。本発明の他の実施形態は、染色体セグメントを含む、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａホウレンソウ植物、またはホウレンソウ種子を提供し、ここに、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．  ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する広範囲の耐性を付与するＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａからの該対立遺伝子を含む代表的な種子サンプルは、受託番号ＰＴＡ−１２０５３３または受託番号ＰＴＡ−１２０５３４の下で寄託されている。
【０００７】
別の態様において、本発明は、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する広範囲の耐性を有する植物を選択し、少なくとも第一の遺伝多型、または、該耐性を付与するＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａからの染色体セグメントとの遺伝子的連鎖不均衡を植物ゲノム中の存在することに基づく該植物を選択することを含む方法を提供し、ここに、遺伝子座は、配列番号１若しくは２、または、少なくとも９５％それと同一の配列により、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａのゲノムに隣接する。実施形態において、植物は、そのゲノムに少なくとも１つのＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａからの移入遺伝子座を含むＳｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａである。別の実施形態において、植物は、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａ植物である。更に別の実施形態では、方法は、更に、表現型アッセイによる該広範囲な耐性の存在を確認するステップを含む。更に別の実施形態において、方法は、更に、該遺伝子座を含む子孫植物を生成するために、遺伝子座を含む該植物と別のホウレンソウ植物との交配を含む。
【０００８】
別の態様において、本発明は、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ  （Ｐｆｓ）に対する広範囲の耐性を付与する少なくとも１つの遺伝子座をそのゲノムに含む、農学的エリートのホウレンソウ植物を生成するための方法を提供し、方法は、（ｉ）第一のホウレンソウ植物と第二のホウレンソウ植物を交配し、ここで、第一の植物は、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．  ｓｐ．  Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する広範囲の耐性を付与するＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａからの少なくとも１つの遺伝子座をそのゲノムに含み、そして、第二の植物は遺伝子座を欠き；及び（ｉｉ）該遺伝子座を含む該交配からもたらされる少なくとも第一の子孫ホウレンソウを選択する；ことを含む。別の実施形態において、方法は、更に、（ｉｉｉ）それ自体または別のホウレンソウ植物との子孫植物のホウレンソウ植物を交配して、次世代の子孫ホウレンソウ植物を生成するステップを含む。別の実施形態において、ステップ（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）は、少なくとも約３回から約１０回繰り返される。尚、別の実施形態において、第一の植物は、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａの植物であり、第二の植物は、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａの植物である。更に別の実施形態において、選択は、配列番号１及び２で説明する遺伝子多型の検出することに基づく子孫のゲノムにおける、または、該遺伝子配座と遺伝子的連鎖不均衡における該遺伝子座の識別を含み、ここに、遺伝子座は、配列番号１または２、もしくはそれと９５％同一の配列に対応する遺伝子座によりＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａのゲノムに隣接している。
【０００９】
本発明の別の態様は、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅ  （Ｐｆｓ）に対する広範囲の耐性を含み、耐性を付与するＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａからの染色体セグメントを農学的エリートＳｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ植物に遺伝子移入を含む農学的エリートホウレンソウ植物を生産する方法を提供し、ここで、該遺伝子座は、配列番号１または２、もしくはそれと少なくとも９５％同一の配列における、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａに対応する遺伝子座に隣接するＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａゲノム領域に位置すると定義される。１つの実施形態において、該遺伝子移入は、反復親として、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ植物を用いて、戻し交配の少なくとも約３〜１０世代により、該遺伝子座以外の該植物における全てのＳｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａのゲノムを本質的に再生することを含む。別の実施形態において、方法は更に、表現型アッセイにより前記広範囲の耐性の存在を確認するステップを含む。別の実施形態において、方法は、更に、該遺伝子座を含む少なくとも第一の植物を識別すること、別のホウレンソウ植物に該遺伝子座を含む植物を交配して、該遺伝子座を含む子孫植物を生成することを含む。
【００１０】
別の態様において、本発明は、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ  （Ｐｆｓ）の  Ｓ．ｏｌｅｒａｃｅａ内への広範囲の耐性を付与するＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａからの遺伝子座の移入により、得ることができるホウレンソウ植物またはその子孫を提供する。１つの実施形態において、広範囲の耐性は、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．  ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ  （Ｐｆｓ）の少なくとも、７、１０、１１、１２、１３、及び１４レースに対する耐性を含み、または、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）の全ての公知のレースに対する耐性を含む。他の実施形態において、ホウレンソウ植物は、近交植物、またはハイブリッド植物、または農学的エリート植物として定義される。別の実施形態において、移入遺伝子座は、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａのゲノムにおける、配列番号１または２に隣接するものと定義される。他の実施形態において、本発明は、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）の  Ｓ．ｏｌｅｒａｃｅａ内への広範囲の耐性を付与するＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａからの移入遺伝子座により得られるホウレンソウ植物またはその子孫、若しくはそのような植物部分を生成する種子を提供する。更に別の実施形態において、植物部分は、胚、分裂組織、子葉、花粉、葉、葯、根、雌しべ、花、細胞、及び茎から成る群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．  ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅのレースＰｆｓ１２で感染させ、そして一様に耐性を有することが判明した、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａの２つのアクセッション（ＧＢ１８６０及びＧＢ１８６１））を示す。
【図２】フラグメントＳＤＡ００５４３、及びＳＤＡ００４１９の配列アラインメントを示し、それは、Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａからのＤＭに対する耐性のためのＱＴＬに隣接した領域、及びＳ．ｏｌｅｒａｃｅａ、及び、Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａ対立遺伝子間の多型ヌクレオチドを表す。配列リストの簡単な説明 ：  配列番号１−Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａからのフラグメントＳＤＡ００５４３の配列であり、それはＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａからのＤＭに対する耐性のためのＱＴＬに隣接した領域を表す。  配列番号２−Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａからのフラグメントＳＤＡ００４１９の配列であり、それはＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａからのＤＭに対する耐性のためのＱＴＬに隣接した領域を表す。  配列番号３−Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａからのフラグメントＳＤＡ００５４３の配列であり、それはＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａからのＤＭに対する耐性のためのＱＴＬに隣接した領域を表す。  配列番号４−Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａからのフラグメントＳＤＡ００４１９の配列であり、それはＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａからのＤＭに対する耐性のためのＱＴＬに隣接した領域を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、べと病（ＤＭ）に対する耐性を有するホウレンソウ品種の開発のための方法及び組成物を提供する。本発明は、ＤＭに対する広範囲の耐性を付与する初めての遺伝子座を含む、ホウレンソウ植物、及びその生産のための方法を提供することにより著しい進歩を表す。特に、本発明は、ＤＭに対する広範囲の耐性を付与するＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａから遺伝子座を提供する。この遺伝子座は、栽培ホウレンソウ植物、Ｓ．ｏｌｅｒａｃｅａに遺伝子移入することができ、そして、ＤＭに対する耐性を提供する。Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａからの遺伝子移入領域は、ＧＢ１８６０、ＧＢ１８６１または任意の他のＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａのアクセッションから取得することができる。本発明によれば、移入遺伝子座対立遺伝子は、新たに特定ホウレンソウ品種または栽培品種の任意の望ましいゲノム背景に遺伝子移入することができる。例えば、下記に説明する通り、ＤＭに対する耐性を示すホウレンソウ植物は、ＤＭに対する耐性を付与する遺伝子座を含むハイブリッド植物を生成するために、ＤＭに対する耐性がないホウレンソウ植物と交配することができる。このようなハイブリッドは、更に、他のホウレンソウ植物と交配してもよく、そして、選択は、任意の望ましい遺伝子的背景の新しいＤＭ耐性品種を得るために、本発明に基づき実施する。
【００１３】
ＤＭの特定レースに対する耐性を付与する対立遺伝子は、以前ホウレンソウ中で同定されているが、そのような対立遺伝子は、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａのレースのサブセットに対してのみ耐性を付与した。また、耐性対立遺伝子は、一般的に、栽培ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）、または栽培ホウレンソウに類似している野生ホウレンソウ属のＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａで同定される。
【００１４】
本発明は、ＤＭの耐性を付与する遺伝子座を提供し、そして野生ホウレンソウ属Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａから得られる。Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａは、伝統的に、農業のための適切な形質として見られなかったが、それは種子休眠の問題など、一緒に機能するのが困難であると見られる形質を示すからである。驚くべきことに、出願人は、遺伝子座がＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）の任意のレースに対して高い耐性を付与することを見い出した。これらの結果は、意外であり、予想外であった。以前のレポートは、Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａは、Ｐ．ｆａｒｉｎｏｓａのレース４に対して耐性を有することはなく（Ｂｒａｎｄｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＨｏｒｔＳｃｉｅｎｃｅ  ２７（２０）：１１１８−１１１９，１９９２）、Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａは、レース３に対してのみ耐性があることを見い出した（Ｅｅｎｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｚａａｄｂｅｌａｎｇｅｎ，  １９７６）。Ｂｒａｎｄｅｎｂｅｒｇｅｒらは、Ｐ．ｆａｒｉｎｏｓａのレース４に対する耐性のための、２つのＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａアクセッションを含む、７０７ホウレンソウのアクセッションを評価した。１つのＳ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａ、及び１つのＳ．ｏｌｅｒａｃｅａのアクセッションのみが、高レベルの耐性を運び、単一のＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａエントリは運ばないように見えたことが判明した。
【００１５】
更に、出願人は、Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａからの耐性対立遺伝子が遺伝され、正常に、Ｓ．ｏｌｅｒａｃｅａに遺伝子移入することができることを見出した。従って、本発明は、Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａの非栽培ホウレンソウ種からの新規な対立遺伝子を提供することにより重要な利点を表し、これは、農学エリート形質に結合された、広範囲のＤＭ耐性を有するホウレンソウ植物を生産するために、栽培ホウレンソウに遺伝子移入することができる。発明の一態様は、従って、ＤＭに対する広範囲の耐性を提供するが、一般的に、Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａ内のそれに結合する遺伝子座を欠く、Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａからの遺伝子座を含む、組み換え染色体セグメント、または、「低下した遺伝子移入」、並びに、その生成のための方法を提供する。染色体セグメントから欠けているＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａからの遺伝子座は、特定の実施形態において、あまり望ましくない農学的特性に関連するかもしれず、そして、例えば、Ｓ．ｏｌｅｒａｃｅａからの遺伝子座で置換してもよく、農学エリート形質との組み合わせで広範囲のＤＭ耐性を提供する。本発明の一実施形態において、そのような染色体セグメントにおける、ＤＭに対する広範囲の耐性を提供するＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａからの遺伝子座は、ＳＤＡ００５４３（配列番号：１）、及びＳＤＡ００４１９（配列番号：２）に対応する遺伝子座により、隣接したＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａからの領域を含む。更なる実施形態において、染色体セグメントは、野生型Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａにおける該領域の外側で見出された、Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａから一部、または、全ての遺伝子座を欠いているとして定義される。更なる実施形態において、ＤＭに対する広範囲の耐性を提供するＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａからの遺伝子座は、アクセッションＧＢ１８６０及びＧＢ１８６１から選択された遺伝子的供給源からであってもよく、その種子の代表的には、それぞれ受託番号ＰＴＡ−１２０５３３及び受託番号ＰＴＡ−１２０５３４の元で寄託された。
【００１６】
本発明に基づき、方法は、ＤＭに対する広範囲の耐性を付与する対立遺伝子を含む遺伝子座を検出するために提供される。１つの実施形態において、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、及び、配列アラインメントＳＤＡ００５４３（配列番号：１及び３）、及びＳＤＡ００４１９（配列番号：２及び４）における挿入／欠失（ＩＮＤＥＬ）を含む遺伝子マーカーは、隣接した耐性遺伝子座を提供する。図２は、本明細書に記載の配列アラインメントを示す。本発明と共に使用するための、他のそのようなマーカーは、また、本明細書に記載されている。従って、本発明は、広範囲のＤＭ耐性を示す農学的エリート近交体、またはハイブリッド品種を生成するために、Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａからの遺伝子座を起源とし、そしてＳ．ｏｌｅｒａｃｅａの遺伝子背景内に遺伝子を移入し得るＤＭに対する望ましい耐性を付与する遺伝子型をゲノムに含むホウレンソウ植物を同定し、選択する方法を提供する。従って、任意のそのような方法により作製されたホウレンソウ植物及びその部分は、ＤＭ耐性を付与する遺伝子座に対して、ホウレンソウゲノム中で遺伝子的に連結された多型の同定に使用することができる核酸配列として、本発明の部分を形成する。本発明は、また、そのような植物由来の食品、及びその生産方法を提供する。
【００１７】
Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａからＤＭ−耐性の対立遺伝子と連鎖不平衡にある遺伝子マーカーを提供することにより、本発明は、本質的に任意のホウレンソウゲノムへのＤＭ−耐性形質の効率的な導入を可能にする。これは、また、高価で、時間がかかり、かつ潜在的に信頼できない表現型アッセイの代替を可能にすることにより、かなりの経済化をもたらす。更に、育種プログラムは、特定の遺伝子型を標的化することにより、特定の有利な表現型の頻度を高めるように確実に設計できる。これらの連携が忠実であるので、保持された予測能力を確実にするために、連続的に監視することができ、その結果、繁殖決定を確保できる。
【００１８】
本発明に基づき、当業者は、本明細書に記載された、所定のＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａから、望ましいＤＭ−耐性表現型を有する生殖質源候補を識別することができる。Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａは、野生種であるので、アクセッションは、それがウズベキスタン及びタジキスタンを含む中央アジアなどで、通常見出される地域から収集できる。更に、Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａのアクセッションは、Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ  （ＣＧＮ），Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、及び、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  （ＵＳＤＡ）を含む遺伝子バンクから利用できる。Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａの収集トリップは、ＣＧＮにより２０１１年に実施され、Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａの全地球アクセッション数は５９に増加した（例えば、Ｋｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｔｈｅ  ＣＧＮ  Ｓｐｉｎａｃｈ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ａｎｄ  Ｒｅｃｅｎｔ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ  Ｅｘｐｅｄｉｔｉｏｎｓを参照されたい（ｓｐｉｎａｃｈ．ｕａｒｋ．ｅｄｕ／Ｓｅｓｓｉｏｎ％２０ＩＩ％２０ＰＤＦｓ／Ｃｈｉｒｓ％２０Ｋｉｋ．ｐｄｆで利用可能））。本発明の一実施形態は、Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａの任意の追加のアクセッションからＤＭに対する広範囲の耐性を付与する遺伝子座を得るために、本発明の物質及び方法を使用することを含む。本明細書に提供された多型マーカーを含むがそれに限定されない情報を用いて、Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａからのＤＭ耐性は、そうでなければ、Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａに関連付けられた僅かな農学的特徴なしで、Ｓ．ｏｌｅｒａｃｅａの品種に遺伝子移入することができる。
【００１９】
本発明の技術は、遺伝子的に、そのような表現型を付与する対立遺伝子と連鎖する遺伝子マーカーを同定することにより、望ましい病変−耐性表現型を識別するために使用できる。本発明に基づき、当業者は、例えば、配列番号１〜４で示されたものなど、Ｓ．ｏｌｅｒａｃｅａ、及びＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａ対立遺伝子を整列させることにより明白になるＳＮＰ、及び、または、ＩＮＤＥＬに基づく分子マーカーアッセイを開発することができる。実施形態において、本発明によるＤＭ−耐性ホウレンソウ植物を同定するのに有用な分子マーカーアッセイは、配列番号１及び２に基づき設計してもよい。そのような技術は、また、単独で、または遺伝子アッセイと組み合わせて、望ましい植物を同定するための表現型アッセイを含むことができ、それにより、また、本明細書に記載の方法で新品種の生産のために使用することができる形質に関連したマーカーの遺伝子型を同定する。
【００２０】
本発明は、所定の遺伝子的背景にＤＭに対する耐性を付与するＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａから少なくとも第一の遺伝子座の移入のために提供される。順調なホウレンソウの生産は、様々な栽培実践に注意を払う。これらは、適切な施肥のために特別な注意を払った土壌管理、適切な間隔を有する作物の確立、雑草防除、及び受粉用のミツバチまたは他の昆虫の導入、灌漑、及び害虫管理を含む。
【００２１】
ホウレンソウ作物は種子から、または移植から確立することができる。移植は、直接播種からの生産作物に比べて早い収穫をもたらすことができる。移植は、特に、三倍体種と比べてより高い種子コストが、直接播種をリスクにするところでは、完全な植物が急速に立ち上がることを達成するのに役立つ。
べと病に対する耐性を有するホウレンソウ植物の開発：
【００２２】
本開示はＤＭに対する広範囲の耐性を付与する、Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａからの遺伝子座、並びに、望ましい生殖質への遺伝子座の追跡及び遺伝子移入のために使用することができるそのような遺伝子座に遺伝子的に連結されたマーカーを、マーカー支援の選抜、及び／または、マーカー支援の戻し交配などにより予測し、同定する。
【００２３】
本発明は、従って、任意のそのようなＱＴＬの追跡及び遺伝子移入、所定の遺伝子的背景に他の耐性遺伝子座との任意の組み合わせを意図する。ＱＴＬにより付与されたＤＭに対する耐性は、マーカー支援選択を介して、本明細書に記載の一次遺伝子座を使用して、ある遺伝子型から別の遺伝子型へ遺伝子を移入されることを当業者は理解するであろう。従って、ＤＭに対する耐性を有する生殖質は選択できる。このＱＴＬを用いて、育種者は、ＤＭに対する耐性を有するホウレンソウ植物を選択するか、または本明細書に記載された領域でのマーカー支援選択を使用して育種中に、そのような表現型を追跡することができる。
【００２４】
ほとんどの育種目的のために、商業的育種者は、しばしば「栽培型」または「エリート」と呼ばれる生殖質内で動作することができる。この生殖質は、園芸性能を評価するとき、それは、一般的に、良好に機能するため、植物育種に使用することが容易である。栽培型が提供する性能上の利点は、時には対立遺伝子の多様性の欠如により相殺される。これは、より良好な全体的性能を有する栽培生殖質で作業するとき育種者が受け入れるトレードオフであり、対立遺伝子の多様性の欠如である。遺伝子的に多様なソースで育種するときよりも、栽培物質で作業するとき進行が速くなるので、育種者は、一般的に、このトレードオフを受け入れる。
【００２５】
これに対して、育種者が種内または種間交配をおこなうとき、逆のトレードオフが発生する。これらの例では、育種者は、一般的には、栽培生殖質を未栽培型と交配する。そのような交配において、育種者は、非栽培型からの新規な対立遺伝子へのアクセスを得ることができるが、供与親に関連する遺伝子的抗力を克服する必要がある。この育種戦略の難しさのため、このアプローチは、しばしば生殖能力と繁殖力の問題で失敗する。この育種アプローチの難点は、多くの作物に及ぼし、１９４４年トマトに初めて記載された重要な病変耐性の表現型と例示されている（Ｓｍｉｔｈ，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．  Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．４４：４１３−１６）。この交配では、線虫病耐性は、栽培トマトに、Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ（ＰＩ１２８６５７）から転送された。育種者は、遺伝抗力を克服し、この形質を運ぶ成功した系列を解放することができる前に、集中的な育種にもかかわらず、それは１９７０年代半ばまでなかった。確かに、今日でも、トマト育種者は、唯一の親からハイブリッド品種にこの病変耐性遺伝子を提供する。
【００２６】
新規な耐性遺伝子を許容可能な商業型に移入する方法は、長く、しばしば困難なプロセスであり、及びこのようなリンケージドラッグ（ｌｉｎｋａｇｅ  ｄｒａｇ）、エピスタシス（ｅｐｉｓｔａｓｉｓ）、低遺伝性などの要因により複雑になる場合がある。形質の遺伝率は、０〜１．０の間で変化する遺伝子的差異に起因する表現型の変化の割合である。従って、１．０に近い遺伝率を有する形質は、環境により大きく影響されない。これらの品種は、栽培者が一様な市場仕様の作物を生産することを可能にするので、当業者は、高い遺伝的園芸形質を有する市販の系列を作成することの重要性を認識している。
【００２７】
ＤＭ耐性に関連するゲノム領域、ＱＴＬ、多型性核酸、及び対立遺伝子：
出願者は、提示されたとき、ＤＭに対するホウレンソウ植物の広範囲の耐性を付与するＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａからの遺伝子座を発見した。本明細書に概説する方法を用いて、ＱＴＬは、隣接する配列ＳＤＡ００５４３（配列番号：１）、及びＳＤＡ００４１９（配列番号：２）で、または、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含む、少なくとも９５％同一の配列で定義された遺伝子座における、Ｓ．ｏｌｅｒａｃｅａの連鎖群６（ＬＧ６）に対応する，Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａの領域に位置し、当業者は、多型が異なる集団においてそのような領域内に存在し得ることを理解するであろう。多くの遺伝子マーカーは、Ｓ．ｏｌｅｒａｃｅａゲノム全体に配置することができ、そして、マーカーは、隣接した配列ＳＤＡ００５４３（配列番号１及び３）、及び配列ＳＤＡ００４１９（配列番号２及び４）内のＳＮＰ、及び／または、ＩＮＤＥＬから、及びＳ．ｏｌｅｒａｃｅａゲノム全体に配置された他のフラグメントで開発することができ、本発明に基づく、Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａの遺伝子移入の存在または非存在を同定するために使用することができることを、当業者は、更に、理解するであろう。マーカーの例としては、例えば、Ｋｈａｔｔａｋら（Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ  １４８：３１１−３１８，  ２００６）に記載されている。本明細書に記載された遺伝子座、及びＤＭ−耐性を付与する対立遺伝子の同定は、同一領域、及びそれに遺伝子的に連結した（連鎖不均衡において）領域におけるその他いずれかのマーカーの使用を可能にする。従って、使用してもよいそのような他のマーカー例は、Ｄｍ−１（Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ９８：８９４−９００，  ２００８）を含むが、それに限定されない。Ｄｍ−１は、レース６に対する耐性を予測し、及び増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）由来のＰｆｓ−１に連結された共優性の配列特徴化増幅領域（ＳＣＡＲ）    マーカーである。
【００２８】
本明細書中で同定したゲノム領域、ＱＴＬ、及び多型マーカーは、任意の公的に利用可能な物理的、または遺伝子マップに対して、そのようなマップ上の本明細書に記載された領域を配置するために、マップを描くことができる。当業者は、また、ホウレンソウにおけるＤＭに対する耐性に関連するＱＴＬに遺伝子的に連結され、及び，ＱＴＬまたはホウレンソウにおけるＤＭに対する耐性に関連するマーカーの約４０ｃＭ、２０ｃＭ、１０ｃＭ、５ｃＭ、または、１ｃＭ内でマップを描く追加の多型核酸が使用できることを理解するであろう。
【００２９】
従って、上記のマーカー及び対立遺伝子の状態は例示的なものである。当業者は、本開示と一致するホウレンソウにおいて、ＤＭに対する耐性に関連する他の多型核酸マーカー及びその対立遺伝子状態を有するホウレンソウ植物を同定する方法を理解するであろう。当業者は、また、ホウレンソウにおけるＤＭに対する耐性との関連性を決定するために、ゲノム領域に位置する、または、ＱＴＬに連結される、または、本明細書で同定された他のマーカーに連結される、他の多型核酸マーカーの対立遺伝子状態を同定する方法を理解するであろう。
【００３０】
ホウレンソウにおけるＤＭに対する耐性と関連するゲノム遺伝子座の遺伝子移入：
ＤＭに対する広範囲の耐性を付与するＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａから遺伝子移入されたゲノム領域を含むホウレンソウ植物（Ｓ．ｏｌｅｒａｃｅａ）、及び同物を得る方法が本明細書に提供される。マーカー支援の遺伝子移入は、第一の生殖質から第二の生殖質へ、１つまたは複数のマーカーにより定義された染色体領域の転送を伴う。遺伝子移入のゲノム領域を含む交配された子孫は、第一の生殖質（例えば、ＤＭに対する耐性を備えた生殖質）から、所望の遺伝子移入したゲノム領域における特徴的なマーカーの組み合わせにより、及び、連結された、若しくは、未連結の両方の第二の生殖質の所望の遺伝子背景に特徴的なマーカーを同定することができる。
【００３１】
ＱＴＬを含む生殖質源から外来の連結されたＤＮＡの非存在下で、ＱＴＬの遺伝子移入を可能とする、識別されたＤＭ−耐性のあるＱＴＬに連結され、及び直接隣接しているか、または、隣接しているかのいずれかであるマーカーが、本明細書に提供される。当業者は、本明細書に記載のＤＭに対する耐性に関連するＱＴＬを含むより小さいゲノム領域に遺伝子移入しようとするとき、ＱＴＬを含む、より大きいゲノム領域に直接隣接しているテロメア近位、またはセントロメア近位マーカーのいずれかが、より小さいゲノム領域に遺伝子移入するために使用できることを認識するであろう。
【００３２】
ＤＭに対する耐性と関連している遺伝子移入領域を含むホウレンソウ植物または生殖質で、ここで、少なくとも、１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、または９９％の残存配列が、植物、もしくは、そうでない場合、通常は別の表現型関連のゲノム領域を含む生殖質の特徴的なマーカーを運ぶホウレンソウ植物または生殖質が、特定の実施形態に提供される。更に、密接に連結された領域、隣接した、及び／または、直接隣接したゲノム領域、ＱＴＬ、及びホウレンソウ植物、若しくは、そうでなければ、通常は表現型と関連するゲノム領域を含む生殖質に、特徴的なマーカーを運ぶゲノム配列を含む、本明細書で提供されるマーカーを有するホウレンソウ植物が、また、提供される。
【００３３】
分子支援の育種技術：
本発明の実施において使用することができる遺伝子マーカーとしては、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、単純配列反復（ＳＳＲ）、単純配列長多型（ＳＳＬＰ）、一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入／欠失多型（Ｉｎｄｅｌ）、タンデム反復数（ＶＮＴＲ）、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、イソ酵素、及び当業者に公知のその他のものが挙げられるが、それに限定されない。マーカーの発見と作物の開発は、マーカー支援の育種活動への応用に対する初期のフレームワークを提供する（米国特許出願番号：２００５／０２０４７８０；２００５／０２１６５４５；２００５／０２１８３０５；及び、２００６／００５０４５３８）。得られた「遺伝子地図」は、特徴的遺伝子座（多型核酸マーカーまたは対立遺伝子を同定することができる他の遺伝子座）の互いの相対的な位置を表す。
【００３４】
単一ヌクレオチド変化をわずかに含有する多型は、多くの方法でアッセイすることができる。例えば、検出は、単一鎖配座多型（Ｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ８（２）：２７１−２７８，１９８９）；変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（Ｍｙｅｒｓ  ＥＰＯ  ０２７３０８５，１９８５）；または切断フラグメント長多型（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，Ｇａｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，ＭＤ  ２０８７７）を含む、電気泳動法技術により作製することができるが、ＤＮＡ配列決定機の幅広い普及は、しばしば、直接、配列増幅産物を容易につくれるようになる。多型配列の差異が分かると、迅速なアッセイは、一般的には、特定の対立遺伝子のＰＣＲ増幅のいくつかのバージョン（ＰＡＳＡ，  Ｓｏｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（１）：８２−８７，１９９２）または、複数の特定の対立遺伝子のＰＣＲ増幅（ＰＡＭＳＡ，  Ｄｕｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１（６）：７００−７０２，１９９１）を含む子孫の検査のために設計することができる。
【００３５】
セットとして、多型マーカーは、系列や品種の同一性の程度を知らせるために植物をフィンガープリントするための有用なツールとして役立つ（ＵＳ６，２０７，３６７）。これらのマーカーは、表現型との関連付けを決定するための基礎を形成し、遺伝子的利得を稼働させるために使用することができる。本発明の方法の特定の実施形態において、多型核酸は、ホウレンソウ植物で、ＤＭに対する耐性に関連する遺伝子型を検出し、ＤＭに対する耐性に関連する遺伝子型でホウレンソウ植物を識別し、ＤＭに対する耐性に関連する遺伝子型でホウレンソウ植物を選択するために使用できる。本発明の方法の特定の実施形態において、多型核酸は、そのゲノム中にＤＭに対する耐性に関連する移入遺伝子座を含むホウレンソウ植物を生産するために使用することができる。本発明の方法の特定の実施形態において、多型核酸は、ＤＭに対する耐性に関連した遺伝子座を含む子孫ホウレンソウ植物を育種するのに用いることができる。
【００３６】
特定の遺伝子的マーカーは、「優性」または「共優性」マーカーを含めてもよい。「共優性」マーカーは２個または複数の対立遺伝子（二倍体の個体当たり２個）の存在を明らかにした。「優性」マーカーは、単一の対立遺伝子の存在を明らかにした。マーカーは、好ましくは、二倍体遺伝子座の両方の対立遺伝子の存在、または三倍体または四倍体の遺伝子座における複数の対立遺伝子存在は、容易に検出可能であり、それらは環境変化に自由であり、即ち、その遺伝率が１であるように、共優性の様式で遺伝する。マーカー遺伝子型は、一般的には、二倍体生物において各遺伝子座における２つのマーカー対立遺伝子を含む。各遺伝子座のマーカー対立遺伝子組成物は、ホモ接合性またはヘテロ接合性のいずれかになり得る。ホモ接合性は、遺伝子座における両対立遺伝子が、同一のヌクレオチド配列により特徴付けられる状態である。ヘテロ接合性は、遺伝子座における対立遺伝子の異なる状態を指す。
【００３７】
遺伝子的多型の存在または非存在を決定するための核酸ベースの分析（すなわち、遺伝子型決定用）は、同定、選択、遺伝子移入などの育種プログラムで使用することができる。遺伝子多型の分析のための多様な遺伝子マーカーは、当業者に利用可能であり、公知である。分析は、遺伝子、遺伝子の部分、ＱＴＬ、対立遺伝子、またはＤＭ耐性表現型と連結するか、または関連している遺伝子マーカーを含むか、または連結されているゲノム領域を選択するために使用することができる。
【００３８】
本明細書で使用される場合、核酸分析方法には、ＰＣＲベースの検出方法（例えば、ＴａｑＭａｎアッセイ）、マイクロアレイ法、質量分析ベースの方法、及び／または、全ゲノム配列決定を含む、核酸配列法が挙げられるが、それに限定されない。特定の実施形態において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡのサンプル中の多型部位の検出は、核酸増幅法の使用を介して容易にすることができる。そのような方法は、具体的には、多型部位にまたがるか、またはその部位、及び、遠位または近位のいずれかに位置する配列を含むポリヌクレオチドの濃度を高める。そのような増幅された分子は、ゲル電気泳動、蛍光検出法、または他の手段により容易に検出することができる。
【００３９】
そのような増幅を達成する一つの方法は、その二本鎖形態での多型を定義する近位配列にハイブリダイズすることができるプライマー対を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．  Ｑｕａｎｔ．  Ｂｉｏｌ．５１：２６３−２７３，１９８６；ＥＰ５０，４２４；ＥＰ８４，７９６；ＥＰ２５８，０１７；ＥＰ２３７，３６２；ＥＰ２０１，１８４；ＵＳ４，６８３，２０２；ＵＳ４，５８２，７８８；及びＵＳ４，６８３，１９４）。質量分析法に基づくＤＮＡを入力するための方法も使用することができる。そのような方法は、ＵＳ６，６１３，５０９、及び、６，５０３，７１０に開示され、その参照が本明細書に見出される。
【００４０】
ＤＮＡ配列における多型は、ＵＳ５，４６８，６１３；５，２１７，８６３；５，２１０，０１５；５，８７６，９３０；６，０３０，７８７；６，００４，７４４；６，０１３，４３１；５，５９５，８９０；５，７６２，８７６；５，９４５，２８３；５，４６８，６１３；６，０９０，５５８；５，８００，９４４；５，６１６，４６４；７，３１２，０３９；７，２３８，４７６；７，２９７，４８５；７，２８２，３５５；７，２７０，９８１；及び７，２５０，２５２を含む、当該分野で公知の効果的な様々な方法により検出され、入力されるが、それに限定されない。これら全ては、その全体を参照することにより、本明細書に組み入れられたものとする。しかしながら、本発明の組成物及び方法は、ゲノムＤＮＡサンプル中の多型を入力する任意の多型タイピング法と組み合わせて使用することができる。使用されるこれらのゲノムＤＮＡサンプルとしては、植物から直接単離されたゲノムＤＮＡ、クローニングされたゲノムＤＮＡ、または増幅されたゲノムＤＮＡを含むが限定されない。
【００４１】
例えば、ＵＳ５，４６８，６１３、及び、５，２１７，８６３に開示されているように、ＤＮＡ配列における多型は、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブへのハイブリッド化により検出することができる。ＵＳ５，４６８，６１３は、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドのハイブリッド化を開示し、ここで、核酸配列中の単一または複数のヌクレオチドの変異は、ヌクレオチド変異を含む配列を増幅し、膜上にスポットし、標識された配列特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いて処理するプロセスにより核酸中に検出することができる。
【００４２】
ＵＳ５，８００，９４４に開示するように、標的核酸配列は、また、プローブ連結方法により検出することができ、ここで、目的の配列は増幅し、プローブの標識化部分を検出するために、プローブにハイブリダイズして、その後、連結する。
【００４３】
マイクロアレイは、また、多型の検出のために使用することができ、ここで、オリゴヌクレオチドプローブセットは、一点での標的配列の差が部分的プローブのハイブリッド化をもたらすように、単一配列を表すために重ね方式で組み立てられる（Ｂｏｒｅｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １３：５１３−５２３，  ２００３；  Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２１：３８５２−３８５８，２００５）。いずれかのマイクロアレイでは、遺伝子、及び／または、非コード領域を表すことができる複数の標的配列が、存在することが予想され、ここで各標的配列は、単一のプローブよりむしろ一連の重複オリゴヌクレオチドで表される。このプラットフォームは、複数の多型のハイスループットスクリーニングを提供する。マイクロアレイに基づく方法による標的配列の入力は、ＵＳ６，７９９，１２２：６，９１３，８７９；及び６，９９６，４７６に開示されている。
【００４４】
標的核酸配列は、また、ＵＳ５，６１６，４６４に開示されるように、標的核酸配列の隣接部分に相同的な配列を有する少なくとも一対のプローブを用い、及び標的核酸配列に対するプローブの塩基対形成の際に幹を形成するために、非共有結合する側鎖を有する、プローブ連結法により検出することができる。側鎖の少なくとも一方は、幹の他方の側鎖メンバーと共有結合で架橋を形成できる光活性化可能基を有する。
【００４５】
ＳＮＰ及びＩｎｄｅｌを検出するための他の方法としては、単一塩基伸長（ＳＢＥ）法が挙げられる。ＳＢＥ法の例としては、ＵＳ６，００４，７４４；６，０１３，４３１；５，５９５，８９０；５，７６２，８７６；及び５，９４５，２８３が挙げられるがそれに限定されない。ＳＢＥ法は、プライマーの伸長の際に、検出可能なヌクレオチド残基を組み込むために、多型に隣接するヌクレオチドプライマーの伸長を基礎とする。特定の実施形態において、ＳＢＥ法は３つの合成オリゴヌクレオチドを使用する。２つのオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲプライマーとして機能し、アッセイすべき多型を含む領域に隣接するゲノムＤＮＡの遺伝子座の配列に相補的である。多型を含むゲノム領域の増幅に続いて、ＰＣＲ産物を、第三のオリゴヌクレオチド（伸長プライマーと呼ばれる）と混合し、それは、ＤＮＡポリメラーゼ、及び２個の別個に標識されたジデオキシヌクレオチド三リン酸の存在下で多型に隣接して増幅されたＤＮＡにハイブリダイズするように設計されている。多型がテンプレートに存在する場合、標識化されたジデオキシヌクレオシド三リン酸の一方が単一塩基鎖伸長においてプライマーに加えることができる。対立遺伝子の存在は、その後、伸長プライマーに追加された２つの別個のラベルのいずれかを決定することにより推定される。ホモ接合体サンプルは、２つの標識化された塩基の一方のみが組み込まれることになるので、その結果、２つの標識の１つのみが検出される。ヘテロ接合性のサンプルは、両方の対立遺伝子が存在有するので、両方の標識（別の伸長プライマー分子へ）を直接組み込み、その結果、両方の標識が検出される。
【００４６】
多型を検出するための別の方法では、ＳＮＰ及びＩｎｄｅｌは、ＵＳ５，２１０，０１５；５，８７６，９３０；及び６，０３０，７８７で開示した方法により検出することができ、ここで、５′位に蛍光レポーター色素、及び３′位にクエンチャー色素を有するオリゴヌクレオチドプローブは、プローブの５′位、及び３′位末端に共有結合で連結される。プローブがそのままである場合、クエンチャー色素に対するレポーター色素の近位性は、例えば、Ｆｏｒｓｔｅｒタイプのエネルギー移動によりレポーター色素の蛍光を抑制することになる。ＰＣＲの間、前方及び後方のプライマーは、多型に隣接する標的ＤＮＡの特定配列にハイブリダイズし、一方、ハイブリダイゼーションプローブは、増幅されたＰＣＲ産物内の多型を含有する配列にハイブリダイズする。その後のＰＣＲサイクルにおいて、５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、プローブを切断し、クエンチャー色素からレポーター色素を分離し、そしてレポーターの蛍光増加をもたらす。
【００４７】
別の実施形態において、関心対象の単数の遺伝子座、または、複数の遺伝子座は、核酸配列決定技術を用いて直接配列決定することができる。核酸配列決定の方法は、当該分野で公知であり、そして、４５４Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社（Ｂｒａｎｆｏｒｄ，  ＣＴ）、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社（Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社  （Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（Ｌｉｎｃｏｌｎ，  ＮＥ）、ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）、及びＶｉｓｉＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｈｏｕｓｔｏｎ，  ＴＸ）で提供される技術が挙げられる。そのような核酸配列決定技術は、Ｒ．Ｆ．  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１１：１５４４−１５４６，  ２００６  での総説の通り、パラレルビーズアレイ、連結による配列決定、キャピラリー電気泳動、電子マイクロチップ、「バイオチップ」マイクロアレイ、平行マイクロチップ、単分子アレイなどの形式を含む。
【００４８】
本発明の方法に使用されるマーカーは、好ましくは、後続の集団について実施する推論のために、順番にその起源を診断する必要がある。これまでの経験は、特定のＳＮＰ対立遺伝子が、特定種の現存個体数の独立した起源に由来する可能性は、非常に低いことを示唆するため、ＳＮＰマーカーは、遺伝子の地図作りのために理想的である。このように、ＳＮＰマーカーは、ＱＴＬの遺伝子移入を追跡し、及び支援するのに有用であると思われる。
【００４９】
定義
以下の定義は，本発明をより良く定義し、本発明の実施において当業者を導くために提供される。特に指示のない限り、用語は、当業者による従来の使用法に基づき理解されるべきである。
【００５０】
本明細書で使用する用語「植物」は、植物細胞、植物プロトプラスト、ホウレンソウ植物を再生することが可能な組織培養した植物細胞、植物カルス、植物塊、及び、植物、または花粉、花、種子、葉、茎などの植物部分において無傷である植物細胞を含む。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「ＤＭ」または「べと病」とは、病原体Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅで、引き起こされるホウレンソウなどの植物の病変を指す。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「レース（ｒａｃｅ）」は、ＤＭを引き起こす可能性のあるＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）の公式に指定された菌株を指す。本明細書で使用される場合、「分離株（ｉｓｏｌａｔｅ）」は、ＤＭを引き起こす可能性があるＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．  ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅ  （Ｐｆｓ）の新たに発生し、未だ公式に命名されていない株を指す。本発明に基づくＤＭに対する耐性を有するホウレンソウ植物は、ＤＭ耐性を付与するＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａからの遺伝子移入を運ぶ。ＤＭ耐性は、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．  ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅの一つまたはそれ以上の既知のレースであってもよく、もしくは、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅの１つ若しくはそれ以上の分離株に対して耐性があり得ることである。別の実施形態において、本発明の植物は、少なくともＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．  ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ  Ｐｆｓの７、１０、１１、１２、１３、及び／または、１４に対して耐性があると定義され得る。
【００５３】
本明細書で使用する場合、用語「集団」は、共通の親の起源を共有する植物の集団を意味する。
【００５４】
本明細書で使用される用語「品種」及び「栽培品種」は、それらの遺伝子的系統及び性能により同じ種内の他の品種から識別することができる類似の植物群を意味する。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「対立遺伝子」は、染色体上の所定の遺伝子座でのゲノム配列の２つまたは複数の代替形態の１つを指す。
【００５６】
「量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）は「表現型の発現度に影響を与える少なくとも第一の対立遺伝子をコードする染色体上の位置である。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「マーカー」は、生物間を区別するために使用することができる検出可能な特性を意味する。このような特性の例としては、遺伝子マーカー、生化学的マーカー、代謝産物、形態的特徴、及び農学的特徴が挙げられるが、それに限定されない。
【００５８】
本明細書で使用する用語「表現型」は、遺伝子発現により影響され得る細胞または生物の検出可能な特徴を意味する。
【００５９】
本明細書で使用する用語「遺伝子型」は、植物の特定の対立遺伝子の構成を意味する。
【００６０】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子移入」は、遺伝子座に関連して使用されるとき、戻し交配を介するなどを通して、新たな遺伝子背景に導入された遺伝子座を指す。遺伝子座への遺伝子移入は、このように、植物育種方法を介して、及び／または、分子遺伝学的方法により達成することができる。そのような分子遺伝学的方法としては、様々な植物形質転換技術、及び／または、相同組換え、非相同組換え、部位特異的組換え、及び／または、遺伝子座置換若しくは遺伝子座変換をもたらすゲノム修飾を提供する方法が挙げられるが、それに限定されない。
【００６１】
本明細書で使用される場合、核酸マーカー、及び／または、ゲノム領域の文脈で使用するとき、用語「連結された」は、マーカー、及び／または、ゲノム領域が、同一の結合基または染色体に、減数分裂で一緒に分離する傾向にあるように配置されていることを意味する。
【００６２】
本明細書で使用される場合、植物の遺伝子型に関連して使用されるとき、「表す（ｄｅｎｏｔｉｎｇ）」という用語は、それにより植物の特定の遺伝子型を有することが示されている任意の方法を指す。これは、特定の遺伝子型を有する植物を同定する任意の手段を含む。特定の遺伝子型の指示が含まれてもよいが、それにより植物の遺伝子型が提供される書面または電子媒体またはデータベースのいずれかのタイプのいずれかのエントリに限定されない。特定の遺伝子型の兆候も含むことができるが、しかし、植物が物理的にマークされているか、またはタグ付けされている任意の方法に限定されない。本発明において有用な物理的マーキングまたはタグの例示的な例としては、バーコード、無線周波数識別（ＲＦＩＤ）ラベルなどを含むが、これらに限定されない。
【００６３】
寄託情報
受託番号をＧＢ１８６０及びＧＢ１８６１と指定した、Ｓｐｉｎａｃｉａ ｔｅｔｒａｎｄｒａの種子寄託は、本出願時期の前からＳｅｍｉｎｉｓ  Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  Ｓｅｅｄｓ社により維持されている。少なくとも２５００種の種子寄託は、また、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）を用いておこなった。ＡＴＣＣのアドレスは、１０８０１ユニバーシティブールバード、マナッサス、バージニア州２０１１０−２２０９  ＵＳＡ（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  Ｖａ．  ２０１１０−２２０９）である。アクセッションはアクセッション受託番号ＰＴＡ−１２０５３３及びＰＴＡ−１２０５３４が割り当てられている。これらのアクセッションの寄託日は、２０１３年８月１４日である。寄託へのアクセスは、要望に応じて本出願の係属中も利用できる。寄託は、最新の要望の後３０年、または５年間に、公共寄託で、または特許の法的拘束力の期間内でのどちらか長い方で維持され、そしてその期間内で実行不可能な場合に代替される。出願人は、この特許、または、植物品種保護法（７Ｕ．Ｓ．Ｃ．２３２１以下参照）を含む、品種保護の任意の他の形態に基づき付与された権利の侵害を放棄するものではない。
【実施例】
【００６４】
以下に開示された実施形態は、種々の形態で実施できる本発明の単なる代表例である。従って、以下の実施例に開示された特定の構造、機能、及び手順の詳細は、限定するものとして解釈すべきではない。
【実施例１】
【００６５】
Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａにおけるべと病に対する広範囲の耐性の同定
Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａは、利用可能なホウレンソウ属の遺伝子バンクコレクションの小サブセットを表わす。Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａの４つのアクセッションは研究に組み入れられた。そのような実施例２に記載のアッセイなどの病変テストは、４つのＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａのアクセッション：３つの追加のＳ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａのアクセッション、及び、おそらくＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａと推定される未知の種の１つのアクセッションを含むように設計した。Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａなどの非栽培ホウレンソウのアクセッションは、植物育種で問題を引き起こす、種子休眠の困難な問題を示した。本研究では、他のエントリと比較して、Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａ種子は、Ｂｒｅｎｎｅｒによる研究と一致して、発芽の深刻な不足に苦労したが（Ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ｓｐｉｎａｃｈ  Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  ｐａｐｅｒ  ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ａｔ  Ｔｈｅ  Ｔ．Ｅ．  Ｍｏｒｅｌｏｃｋ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｐｉｎａｃｈ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，  Ｆａｙｅｔｔｅｖｉｌｌｅ，  ＡＲ，  ２００９）、それは、いくつかの種子が１月の作付けに続いて秋に発芽した９個のＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａのアクセッションから観察された。
【００６６】
病変アッセイは、公式に指定されたレースＰｆｓ１０、１２、及び１４を用いておこなった。本研究で使用されたＳ．  ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａエントリとは対照的に、ＧＢ１８６０とＧＢ１８６１と指定された２つのＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａのアクセッションは、試験した全てのレースに対して耐性を運ぶことが見出された。これらの結果は、均一かつ明確に耐性反応を示し、レースＰｆｓ１２に感染した２０の成熟植物において確認された（図１）。
【００６７】
Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａは、複数のレースに対する耐性を示したという知見は、以前の報告とは対照的であった。Ｂｒａｎｄｅｎｂｅｒｇｅｒと共同研究者は、レース４の耐性のために７０７のホウレンソウアクセッションを評価し、２つのアクセッションは、Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａであった（Ｈｏｒｔｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７（２０）：１１１８−１１１９，  １９９２）。１つのＳ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａ及び１つのＳ．  ｏｌｅｒａｃｅａアクセッションのみがハイレベルの耐性を示し、単独のＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａエントリは示さなかった。また、Ｅｅｎｉｎｋらは、Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａが、３レースに対してのみ耐性があることを見い出した（Ｚａａｄｂｅｌａｎｇｅｎ，  １９７６）。
【００６８】
次のステップとして、すべてのレースに耐性があることが判明した、２つのＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａアクセッション、ＧＢ１８６０及びＧＢ１８６１は、エリートＳ．ｏｌｅｒａｃｅａの近交系のＯＥＢ−６６−１０５６Ｆに交配させ、耐性Ｆ１植物を選択した。その後、戻し交配は、選択されたＦ１植物と近交系ＯＥＢ−６６−１０５６Ｆとの間で行われた。２つＢＣ１ファミリーは、「８」と「１５」にそれぞれ指定された、耐性を有するＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａのアクセッションの内の１つから誘導された。これらの２つのファミリーは、ＤＭレースに対する耐性Ｐｆｓ７、１０、１１、１２、１３、及び１４の病変テストで試験した。ＢＣ１ファミリーの「８」は、試験した全てのレースに対して耐性を運ぶことが見出された（表１）。同様に、ＢＣ１ファミリーの「１５」は、また、レースＰｆｓ１０を例外として、これらのレースに対して耐性を有していた。予想された通りに、耐性は、Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａ植物への導入の不均一な性質と一致し、ＢＣ１ファミリーと分離することが分かった。試験した全ての公式に指定されたレースに対する耐性に基づき、２つのＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａのアクセッションは、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅに広範囲の耐性を運ぶように見えた。これらの結果は、ホウレンソウにおけるＤＭに対する耐性が、常に、レース特異性があるという以前の知見とは対照的に驚くべきものであった。また、ＢＣ１ファミリーの研究は、Ｓ  ｔｅｔｒａｎｄｒａからＤＭに対する耐性が遺伝性であり、Ｓ．ｏｌｅｒａｃｅａに移入することができることを実証した。
【表１】
2020036609.tif 000002
感染レベルは、感受性対照群と比較して決定した。ＢＣ１ファミリー当たり８〜１０個体の４〜６サンプルを、Ｐｆｓ７、１０、１１、１２、１３または１４に感染させた。スコア０は未感染を示す。スコア１００は、完全な感染を示す。上記の平均感染率１％は、陰影により示した
【００６９】
追加のＢＣ１ファミリーは、ＤＭレースＰｆｓ１０、１１、１２、１３、及び１４に対する耐性を子葉で試験した。１０個のサンプルは、耐性または感受性のために各ファミリーで評価した（Ｒ−耐性；Ｓ−感受性；ＮＴ−未試験）。３８、２７、３２のＢＣファミリーは、試験したすべてのレースに耐性を運んだ。
【表２】
2020036609.tif 000003
【実施例２】
【００７０】
べと病に対する耐性に対してホウレンソウのアクセッションをスクリーニングするためのアッセイ：
べと病に対する耐性についてホウレンソウのアクセッションをスクリーニングするために使用した試験は、植物の新品種保護のための国際機関（ＵＰＯＶ）に由来する。「Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｓ  ｏｎ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔｎｅｓｓ，  Ｕｎｉｆｏｒｍｉｔｙ，  ａｎｄ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  Ｌ．  Ｓｐｉｎａｃｈ」ＵＰＯＶ  Ｃｏｄｅ：ＳＰＩＮＡ＿ＯＬＥ，  ＣＰＶＯ−ＴＰ／０５５／５は、２０１３年２月２７日に採択され、発効した。 手順は以下の通りである：
【００７１】
Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．  ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅのレースは、宿主植物上で生きて維持され、Ｎａｋｔｕｉｎｂｏｕｗ  （Ｐ．Ｏ．  Ｂｏｘ  ４０，  ＮＬ−２３７０  ＡＡ，  Ｒｏｅｌｏｆａｒｅｎｄｓｖｅｅｎ，  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手可能であり、または、最大１年間−２０℃で貯蔵された胚珠と一緒に植物材料として入手可能である。
【００７２】
試験の実行：植物の生長段階：最初の子葉／葉；１１日齢の植物；温度：日中１５℃；夜間１２℃；光：発芽後１５時間／日；成長方法：ポット中の土壌、または温室若しくは成長室のトレイ内。
【００７３】
接種の方法：７日前に感染させた宿主植物から採取した胞子形成葉は、殺菌した水道水で完全に漱いだ（最大１５０ｍｌ／２２４植物）。胞子の懸濁液は、寒冷紗を通して濾過し、接種材料は、葉をカバーしているが、未だ実行されない試験植物上にスプレーした。１５０ｍｌの懸濁液は、３×２２４植物に十分であった。胞子密度は、２０，００〜１００，０００分生子／ｍｌ（水）にすべきである。胞子懸濁液は、新鮮に使用するべきである。ホウレンソウべと病は、風で運ばれるので、胞子形成植物は、任意の交配汚染を防ぐために密閉容器または隔離室に保管すべきである。
【００７４】
耐性の調節は、レースの同一性を保証するために、各々の繁殖世代において、各々試験することが必要とされる。苗の発育及び培養中の光や湿度条件は重要である。約８０〜９０％ＲＨの最適湿度は、植物の成長と真菌の増殖を可能にし、強い光が胞子の発芽及び感染を阻害する。試験は直射日光に対する保護のため冬に行われるべきである。接種後、植物は３日間プラスチックの下に置くべきである。この後、プラスチックは、昼間にわずか上げるべきである。
【００７５】
試験の所要時間：接種後７日で、増殖胞子を収穫した；接種：１１日間：接種の読み取り：１０日間；試験した植物数：５６植物；感染の評価：耐性は通常完全であった。時々、壊疽斑点が感染結果として見られた。感受性植物は、胞子形成の様々な程度を示している。胞子形成は、多くの湿気のある背軸側に始まり、葉上の灰色のカバーとして表われる。
【００７６】
レースを識別するための個別品種：レースＰｆｓ：１〜８及び１０〜１３のＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅが、表３に基づく「個別品種」の標準セットで定義される。
【表３】
2020036609.tif 000004
【実施例３】
【００７７】
Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａにおけるべと病の耐性に対するマッピング：
Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａの病変アッセイ及び不均一性の観点から、耐性に関連するマーカーが好ましい対立遺伝子の効率的かつ正確な選択のために同定された。Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａから継承された、ＤＭに対する耐性は、ＢＣ１集団にマッピングし、それは実施例１で記載した通りに発育した。合計５４の個体群は、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．  ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅレース１２を用いた表現型となった。これらＢＣ１の個体群は強い耐性、または完全に影響を受けやすい応答のいずれかを示し、２クラスで採点した。Ｓ．  ｏｌｅｒａｃｅａにおける耐性を含む連結グループ６（ＬＧ６）の狭い区間内に位置するマーカーは、さらなる研究のために選択した（表４）（Ｋｈａｔｔａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ  １４８：３１１−３１８，  ２００６）。マッピング研究は、標準インターバルマッピングを使用して、ｍａｐＱＴＬで実施した。
【００７８】
耐性遺伝子座は、変換されたＳＳＲマーカー配列により、例えば、Ｐｆｓレース１２に対する耐性を有するＳＤＡ００４１９（配列番号２及び４）により線引きされた間隔でのマーカーの統計学的に有意な関連性（＞ＬＯＤ＝３）に基づき検出され、実証された（表４）。ＱＴＬは、大きな影響を持っているように見え、そして観察された変動の約６５％を説明した。Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａからのＤＭ耐性の概略の位置は、公共マップの第６染色体上、０．０ｃＭで、マーカーＥ３３／Ｍ６２〜２３１の間、及び１０．３ｃＭで、Ｅ３９／Ｍ４７〜２０３の間であった（Ｋｈａｔｔａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ  １４８：３１１−３１８，  ２００６）。
【００７９】
この結果は、Ｓ．ｏｌｅｒａｃｅａにおけるＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対するレース特異性耐性は、Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａからの広範囲な耐性と同一直線上にあることを示した。両方の耐性の性質及び起源が異なっているので、これは驚くべきことである。
【表４】
2020036609.tif 000005
【実施例４】
【００８０】
Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅの新分離株は、Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａからの耐性を破壊しない：
新規なＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．  ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅの病原性分離株は、定期的に、世界的に発生する。現在までに、１４のレースが公式に命名され、最近は、年に１回の割合で、命名されている。実施例１に記載の通り、２つのＢＣ１ファミリーを、耐性破壊株による葉ディスクアッセイで試験した。ＳＥ４７１２、ＳＥ４７１２は、２０１３年の春に、米国、カリフォルニア州の野外から単離した。その後、それをＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａに関する国際ワーキンググループ（ＩＷＰＧ）によりＵＡ４７１２と改名された。ＤＭに対する既存の耐性を破ることが示されているが、未だ、公式なレース指定を受けていない。
【００８１】
ＢＣ１ファミリー当たり８〜１０個体群の内４〜６個のサンプルを分離株ＵＡ４７１２に感染させた。感染レベルは、感受性対照群と比較して決定した。０スコアは、未感染を示す。両方ＢＣ１ファミリーのすべての個体群は、ＵＡ４７１２を単離するために耐性があるように思われた（表５）。この観察結果は、Ｓ．  ｔｅｔｒａｎｄｒａからの、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する広範囲な耐性と一致している。
【表５】
2020036609.tif 000006
【図１】
2020036609.tif 000007
【図２】
2020036609.tif 000008
【配列表】
2020036609000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月14日(2019.11.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する広範囲な耐性を付与するＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａからの移入遺伝子座をそのゲノムに含む農学的エリートＳｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａホウレンソウ植物であって、
広範囲な耐性が、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）のレース７、１０、１１、１２、１３、及び１４に対する耐性を含み、移入遺伝子座が、配列番号１及び２に対して、少なくとも９９％同一の配列を含み、該遺伝子座を含む種子の代表的サンプルが、受託番号ＰＴＡ−１２０５３３または受託番号ＰＴＡ−１２０５３４の下で寄託されている農学的エリートＳｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａホウレンソウ植物。
【請求項２】
近交植物である、請求項１記載の前記ホウレンソウ植物。
【請求項３】
ハイブリッド植物である、請求項１記載の前記ホウレンソウ植物。
【請求項４】
請求項１に記載の前記植物を生成する種子。
【請求項５】
Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａからの移入遺伝子座を含む請求項１記載の前記植物の植物部分。
【請求項６】
植物部分が、胚、分裂組織、子葉、花粉、葉、葯、根、雌しべ、花、細胞、及び茎から成る群から選択される、請求項５記載の前記植物部分。
【請求項７】
Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）の複数レースに対して耐性を付与する少なくとも１つの遺伝子座をそのゲノムに含む農学的エリートホウレンソウ植物を生成するための方法であって、前記方法は、
（ｉ）第一のホウレンソウ植物を第二のホウレンソウ植物と交配し、前記第一の植物が、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．  ｓｐ．  Ｓｐｉｎａｃｉａｅの少なくともレース７、１０、１１、１２、１３、及び１４に対して耐性を付与するＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａからの少なくとも１つの遺伝子座をそのゲノムに含み、該少なくとも１つの遺伝子座が、配列番号１及び２に対して、少なくとも９９％同一の配列を含み、該少なくとも１つの遺伝子座を含む種子が、受託番号ＰＴＡ−１２０５３３または受託番号ＰＴＡ−１２０５３４の下で寄託され、前記第二の植物は該少なくとも１つの遺伝子座を欠き、
（ｉｉ）該少なくとも１つの遺伝子座を含む該交配からもたらされる少なくとも第一の子孫ホウレンソウ植物を選択する、ことを含む、前記方法。
【請求項８】
（ｉｉｉ）次世代の子孫ホウレンソウ植物を生成するために、子孫ホウレンソウ植物をそれ自身、または別のホウレンソウ植物と交配するステップを更に含む、請求項７記載の前記方法。
【請求項９】
ステップ（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）が少なくとも約３回〜約１０回繰り替えされる、請求項８記載の前記方法。
【請求項１０】
前記第一の植物がＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａ植物で、前記第二の植物がＳｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ植物である請求項７記載の前記方法。
【請求項１１】
選択が、配列番号１及び２で記載された遺伝子多型の検出に基づく子孫のゲノム内に、または、該遺伝子座と遺伝子連鎖不均衡にある、該少なくとも１つの遺伝子座を同定することを含み、前記遺伝子座は、配列番号１及び２、もしくは、それに対して少なくとも９９％同一の配列に対応する遺伝子座によりＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａゲノムに隣接する、請求項７記載の前記方法。
【請求項１２】
Ｓ．ｏｌｅｒａｃｅａ内に、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ  （Ｐｆｓ）の複数レースに対する耐性を付与するＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａから遺伝子座を移入することにより入手可能な農学的エリートホウレンソウ植物またはその子孫であって、
耐性が、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）の少なくともレース７、１０、１１、１２、１３、及び１４に対する耐性を含み、移入遺伝子座が、配列番号１及び２に対して、少なくとも９９％同一の配列によりＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａゲノムに隣接し、該遺伝子座を含む種子の代表的サンプルが、受託番号ＰＴＡ−１２０５３３または受託番号ＰＴＡ−１２０５３４の下で寄託され、前記子孫が、Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａからの前記遺伝子移入を含む、前記農学的エリートホウレンソウ植物またはその子孫。
【請求項１３】
近交植物である、請求項１２記載の前記ホウレンソウ植物。
【請求項１４】
ハイブリッド植物である、請求項１２記載の前記ホウレンソウ植物。
【請求項１５】
前記移入遺伝子座が、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａゲノムにおいて、配列番号１または２により隣接する、請求項１２記載の前記ホウレンソウ植物。
【請求項１６】
請求項１２の前記植物を生成する種子。
【請求項１７】
Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａからの前記移入遺伝子座を含む請求項１２の前記植物の植物部分。
【請求項１８】
植物部分が、胚、分裂組織、子葉、花粉、葉、葯、根、雌しべ、花、細胞、及び茎から成る群から選択される、請求項１７記載の植物部分。
【請求項１９】
請求項１に記載のホウレンソウ植物の採取した葉を含み、Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａからの前記遺伝子移入を含む、食物製品。
【外国語明細書】
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【配列表】
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