(57)【要約】      （修正有）【課題】ナノ構造送達系又は薬学的組成物の標的組織中への能動的かつ選択的な輸送のために使用される、ナノ構造送達系又は薬学的組成物の提供。【解決手段】少なくとも一種のポリマー及び／又は少なくとも一種の脂質と少なくとも一種のポリメチン色素を含有するナノ構造送達系であって、標的化単位として作用する少なくとも一種のポリメチン色素が、標的組織中へのナノ構造送達系の標的輸送をもたらす、ナノ構造送達系。薬学的組成物と、該系と場合によっては医薬活性成分とを標的組織中へ輸送するための、また肝臓及び／又は腎臓疾患を治療するためのナノ構造送達系。【選択図】図２
2020111579.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一種のポリマー及び／又は少なくとも一種の脂質と少なくとも一種のポリメチン色素を含有するナノ構造送達系であって、前記少なくとも一種のポリメチン色素が標的化単位として、標的組織中へのナノ構造送達系の標的輸送をもたらす、ナノ構造送達系。
【請求項２】
少なくとも一種のポリメチン色素が、標的組織の細胞中へのナノ構造送達系の取込みをもたらす、少なくとも一種の組織特異的トランスポーターを有する、請求項１に記載のナノ構造送達系。
【請求項３】
少なくとも一種のポリメチン色素が、少なくとも一種の組織特異的トランスポーターによって認識され、標的組織の細胞の細胞表面で該トランスポーターと相互作用して、ナノ構造送達系が好ましくは細胞表面に蓄積し、固定化され、好ましくは標的組織の細胞内に取り込まれる、請求項１又は２に記載のナノ構造送達系。
【請求項４】
ナノ構造送達系が少なくとも一種の活性医薬成分を更に含有する、請求項１から３の何れか一項に記載のナノ構造送達系。
【請求項５】
少なくとも一種のポリメチン色素が、一般構造Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶ：
2020111579.tif 000011
2020111579.tif 000012
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2020111579.tif 000014
の対称又は非対称ポリメチンであり、
上式中、
ａ．  ｎは数値０、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０を表し、
ｂ．  Ｒ１−Ｒ１７は、同一でも異なっていてもよく、水素、一又は複数のアルキル、ｔｅｒｔ−アルキル、シクロアルキル−（「アルキル」及び「シクロアルキル」基はまたオレフィン構造を含む）又はアリール、カルボキシアリール、ジカルボキシアリール、ヘテロアリール又はヘテロ脂環式基、アルキルオキシ、アルキルメルカプト、アリールオキシ、アリールメルカプト、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールメルカプト基、ヒドロキシル、ニトロ又はシアノ基、アルキル置換又は環状アミン官能基及び／又は２つのオルト位の基、例えば、Ｒ３とＲ４、Ｒ１３とＲ１４及び／又はＲ１とＲ２及びＲ１１とＲ１２及び／又はＲ７とＲ９は、一緒に更なる芳香族環、ヘテロ芳香族環、脂肪族環又はヘテロ脂肪族環を形成してもよく、
ｃ．  Ｒ１−Ｒ１７置換基の少なくとも一つは、該ポリメチン色素の親水性を決定する、可溶化及び／又はイオン化可能な又はイオン化された置換基、例えばＳＯ３−、（−ＳＯ３Ｈ）、ＰＯ３２、ＣＯＯＨ、ＯＨ又はＮＲ３＋、シクロデキストリン又は糖を有し、該置換基はまたスペーサー基によってポリメチン色素に結合されていてもよく、
ｄ．  Ｒ１−Ｒ１７置換基の少なくとも一つは、反応性基（リンカー）、例えばイソシアネート、イソチオシアネート、ヒドラジン、アミン、モノ−及びジクロロ−又はモノ−及びジブロモトリアジン、アジリジン、エポキシド、ハロゲン化スルホニル、酸ハロゲン化物、カルボン酸無水物、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、イミドエステル、カルボン酸、グリオキサール、アルデヒド、マレイミド又はヨードアセトアミド及びホスホラミダイト誘導体又はアジド、アルキン又はオレフィンを有し、該置換基はまたスペーサー基によってポリメチン色素に結合されていてもよく、
ｅ．  芳香族、ヘテロ芳香族、脂肪族又はヘテロ脂肪族スペーサー基は、構造要素、例えば［（ＣＨ２）ａ−Ｙ−（ＣＨ２）ｂ］ｃ又は［（Ｃ６Ｈ４）ａ−Ｙ−（Ｃ６Ｈ４）ｂ］からなり、ここで、Ｙは同一でも異なっていてもよく、ＣＲ２−、Ｏ−、Ｓ−、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨ−、ＮＲ−、ＣＯＯ−又はＣＯＮＲ官能基を含み、該基はＲ１−Ｒ１７置換基の一つに結合し、ａとｂは、同じでも異なっていてもよく、０−１８の数値を有し、ｃの数値は０−１８であり、
ｆ．  対応するｎ＝２、３、４又は５のＲ８及びＲ９置換基は２×、３×、４×又は５×が存在していてもよく、これらは同一でも異なっていてもよい、
請求項１から４の何れか一項に記載のナノ構造送達系。
【請求項６】
少なくとも一種のポリメチン色素が、ＤＹ６３５、ＤＹ−６８０、ＤＹ−７８０、ＤＹ−８８０、ＤＹ−７３５、ＤＹ−８３５、ＤＹ−８３０、ＤＹ−７３０、ＤＹ−７５０、ＤＹ−８５０、ＤＹ−７７８、ＤＹ−８７８、ＤＹ−７０４、ＤＹ−８０４、ＤＹ−７５４、ＤＹ−８５４、ＤＹ−７００、ＤＹ−８００、ＩＣＧ及びＤＹ−ＩＲＤＹＥ８００ＣＷからなる群から選択される、請求項１から５の何れか一項に記載のナノ構造送達系。
【請求項７】
少なくとも一種のポリマーが、ポリエステル、ポリ（メタ）アクリレート、ポリスチレン誘導体、ポリアミド、ポリウレタン、ポリアクリロニトリル、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド及びポリオキサゾリンと好ましくはランダム、グラジエント、交互、ブロック、グラフト又はスターコポリマー等の様々な組成物でのそれらのコポリマーからなる群から選択され、あるいは少なくとも一種の脂質が、飽和及び不飽和脂肪酸、好ましくはコレステロール、パームエチル酸、リン脂質、スフィンゴ脂質及び糖脂質からなる群から選択される、請求項１から６の何れか一項に記載のナノ構造送達系。
【請求項８】
少なくとも一種の組織特異的トランスポーターが、ＯＡＴＰ１Ｂ１、ＯＡＴＰ−Ｃ、ＯＡＴＰ２、ＬＳＴ−１、ＯＡＴＰ１Ｂ３、ＯＡＴＰ８、ＯＡＴＰ２Ｂ１、ＯＡＴＰ１Ａ２、ＮａＤＣ３、ＳＤＣＴ２、ＮＴＣＰ、ＯＣＴ１、ＯＣＴ３、ＯＡＴ２、ＯＡＴ１、ＯＡＴ３、ＰＧＴ、ＯＣＴ２、ＯＡＴ１、ＯＡＴＰ４Ａ１、ＯＡＴＰ４Ｃ１からなる群から選択される、請求項１から７の何れか一項に記載のナノ構造送達系。
【請求項９】
少なくとも一種の活性医薬成分が、低分子物質、特にインダクター又は造影剤と、高分子物質、特に核酸及びタンパク質で、好ましくは、グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、インターカレート剤、抗体、インターフェロン、ホスホイノシトール−３キナーゼ阻害剤、コキシブ、ＪＮＫ阻害剤からなる群から選択されるものからなる群から選択される、請求項１から８の何れか一項に記載のナノ構造送達系。
【請求項１０】
請求項１から９の何れか一項に記載のナノ構造送達系と、適切な賦形剤及び添加剤を含む薬学的組成物。
【請求項１１】
ナノ構造送達系又は薬学的組成物の標的組織中への能動的かつ選択的な輸送のために使用される、請求項１から９の何れか一項に記載のナノ構造送達系又は請求項１０に記載の薬学的組成物であって、輸送が標的ユニットとしての少なくとも一種のポリメチン色素によって誘導される、ナノ構造送達系又は薬学的組成物。
【請求項１２】
ナノ構造送達系又は薬学的組成物の標的組織の細胞中への取込みのために使用される、請求項１から９の何れか一項に記載のナノ構造送達系又は請求項１０に記載の薬学的組成物であって、少なくとも一種のポリメチン色素が、ナノ構造送達系又は薬学的組成物の標的組織の細胞中への取込みを誘導する、少なくとも一種の組織特異的トランスポーターを有する、ナノ構造送達系又は薬学的組成物。
【請求項１３】
ナノ構造送達系及び／又はその成分の標的組織中への蓄積のために使用される、請求項１から９の何れか一項に記載のナノ構造送達系又は請求項１０に記載の薬学的組成物であって、ナノ構造送達系及び／又はその成分の標的組織中への蓄積が、少なくとも一種のポリメチン色素の蛍光特性によって検出可能である、ナノ構造送達系又は薬学的組成物。
【請求項１４】
医薬として使用される、請求項１から９の何れか一項に記載のナノ構造送達系又は請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
肝臓及び／又は腎臓の疾患の治療に使用される、請求項１から９の何れか一項に記載のナノ構造送達系又は請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の肝臓及び／又は腎臓の疾患の治療に使用される、請求項１から９の何れか一項に記載のナノ構造送達系又は請求項１０に記載の薬学的組成物であって、疾患が、肝臓及び／又は腎臓への損傷を含む感染症、肝不全、肝硬変、肝臓の代謝疾患、肝臓の排泄機能障害、肝腫瘍、原発性肝腫瘍、腎腫瘍、原発腎腫瘍、腎炎症状、慢性及び急性腎不全及び引き続く肝臓及び／又は腎臓への損傷を引き起こす疾患からなる群から選択される、ナノ構造送達系又は薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、一又は複数種のポリマー及び／又は脂質、並びに一又は複数の標的化単位（ターゲティングユニット）、特に標的組織中へのナノ構造送達系の標的（ターゲテッド）輸送のためのポリメチン色素を含有するナノ構造送達（デリバリー）系に関する。本発明はまた、特定の標的組織中への一又は複数種の活性医薬成分の標的特異的輸送（細胞特異的ターゲティング）と、疾患の予防及び／又は治療のための本発明に係るナノ構造送達系の使用に関する。
【０００２】
従来から、例えば病理状態の診断において臓器機能又はタンパク質発現を検出するため、あるいはプロテオミクス解析のために、臨床診断においてカップリング色素と共にナノ粒子を使用することが知られており、そこでは、カップリング色素、通常はシアニン類等の蛍光色素が、その蛍光と吸収特性が測定されるマーカーとして使用されている。
【０００３】
国際公開第２０１２／０１３２４７Ａ１号は、臓器機能、特に肝臓又は腎臓の機能を判定するためのポリメチン蛍光色素の使用を開示しており、そこでは、色素が組織又は血液もしくは尿のような体液中でマーカーとして使用され、放射活性的に活性化され、ついで色素の蛍光発光が検出され、データが検出され、解析されて、判定中の臓器機能が判定される。
【０００４】
国際公開第２０１０／１１６２０９Ａ１号では、セレクチンの異常分泌に基づく臨床症状が報告されている。
【０００５】
加えて、活性成分を所定の組織中へ標的化の形で輸送するナノ粒子の使用もまた従来から知られている（C. Sheridan, Proof of concept for next-generation nanoparticle drugs in humans. Nat Biotechnol, 2012 30(6): pp. 471-3；S.E. Gratton等, The effect of particle design on cellular internalization pathways. Proc Natl Acad Sci USA, 2008 105(33): pp. 11613-8）。
【０００６】
「薬物ターゲティング」又は「標的薬物送達」としても知られている活性成分の標的又は細胞特異的輸送は、所望される作用部位での活性成分の標的化されかつ選択的な蓄積及び放出を意味するものと理解され、活性成分の作用効果が増加し、周囲組織に対する全身性副作用が低減される。輸送される活性成分は、しばしば、抗体、ペプチド又は小分子、例えばオリゴヌクレオチドもしくは核酸を含む。
【０００７】
従来から知られている活性成分を輸送するナノ粒子は、腫瘍治療に使用され、次の機構に従って機能する：ナノ粒子にシェル層又は抗体の何れかが付与される。ナノ粒子が水性シェル層で被覆されると、免疫系に識別不能にさせられる。このナノ粒子が注入され、免疫系によって攻撃されないならば、腫瘍において「漏出性」であり、正常血管と比較して有意に大きい開口（開窓）を有する有窓血管を通って拡散し、正常細胞と比較して亢進した透過性をまた有する周囲の細胞によって吸収される。欠点は、所望される細胞がナノ粒子ばかりでなく、ナノ粒子が血管を通って非特異的に輸送される他の細胞（正常細胞）もまた取り入れてしまうことである。これは、重篤な副作用につながることがある。別の欠点は、この輸送が腫瘍組織に限られること、すなわち、肝臓や腎臓のような如何なる他の組織にも如何なる輸送も行われないことである。この輸送は、受動的な形で起こり、取込みは非特異的、つまり非選択的である。第二の方法では、ナノ粒子に、合成後にその表面に抗体が付与される。これらの構築物は、これら抗体が結合する抗原と共に細胞を標的とする。この輸送機構もまた受動的で非選択的である。
【０００８】
上述のナノ粒子、リポソーム又は高分子の受動的集積のこれらプロセスは、ＥＰＲ 効果（「透過性・滞留性亢進」）と呼ばれ、受動的薬物ターゲティングである。既に述べたように、利点は、これら輸送プロセスが能動的ではなく、選択的ではないという点を含む。
【０００９】
特定の標的組織中へのその能動的輸送が特別な標的化単位によって選択的に起こり、（薬学的）活性成分を標的組織中に同時に輸送でき（「薬物ターゲティング」；細胞特異的ターゲティング）、標的化単位による標的組織における送達系と場合によっては（薬学的）活性成分の蓄積が達成されるばかりでなく、それを追跡し検証することもできる、能動的かつ選択的輸送及び／又は送達系の記載は従来技術のどこにもない。
【００１０】
従って、標的組織中への送達系及び活性成分の能動的かつ選択的輸送をもたらす改良された輸送及び／又は送達系を提供することに対して必要性がある。疾患の治療における活性医薬成分の輸送のためにそのような輸送及び／又は送達系を使用することに対してもまた必要性がある。
【００１１】
このような輸送系が本発明で利用可能にされる。本発明は、標的組織中へ様々な活性医薬成分（例えば、親水性、親油性、疎水性、両親媒性、アニオン性及びカチオン性物質）を能動的かつ選択的に輸送するために（活性成分の標的又は細胞特異的輸送あるいは「薬物ターゲティング」）様々な方法で組み合わせることができる独特の治療診断（theragnostic）系に関する。
【００１２】
その最初の主題では、本発明は、少なくとも一種のポリマー及び／又は少なくとも一種の脂質と少なくとも一種のポリメチン色素を含有するナノ構造送達系であって、少なくとも一種のポリメチン色素が標的化単位として、標的組織中へのナノ構造送達系の標的輸送をもたらす、ナノ構造送達系に関する。
【００１３】
本発明のナノ構造送達系がポリマーを含む場合、それはここでは「ナノ粒子」と称される；脂質を含む場合、ここでは「リポソーム」と称される。本発明に係るナノ構造送達系が、ポリマーと脂質の両方を含む場合、ここでは、「ナノ粒子」又は「リポソーム」と称される。従って、「ナノ粒子」及び「リポソーム」なる用語は、本発明では同義語として使用され、また、ポリマーと脂質の両方を含むナノ構造送達系にも関する。
【００１４】
ナノ粒子は、サイズが１μｍより小さく、複数の分子から構成されうる構造である。それらは、体積に対する表面の比率が高いことを一般に特徴とし、よってより大きな化学反応性を提供する。これらナノ粒子はポリマーから構成され得、これらポリマーは、所定の単位（モノマー）が繰り返し単位であることを特徴とする。ポリマーはこれらモノマーの化学反応（重合）によって互いに共有結合されている。これらのポリマーの幾つかが疎水性を有する場合、それらは、水性環境中でナノスケール構造（例えば、ナノ粒子、ミセル、小胞）を形成しうる。それらの疎水性のため、脂質はまたナノ粒子（ミセル、リポソーム）を形成するために使用されうる。
【００１５】
本発明の好ましい実施態様は、少なくとも一種のポリマーが、ポリエステル、ポリ（メタ）アクリレート、ポリスチレン誘導体、ポリアミド、ポリウレタン、ポリアクリロニトリル、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド及びポリオキサゾリンと好ましくはランダム、グラジエント、交互、ブロック、グラフト又はスターコポリマー等の様々な組成物でのそれらのコポリマーからなる群から選択され、あるいは少なくとも一種の脂質が、飽和及び不飽和脂肪酸、好ましくはコレステロール、パームエチル酸（palm ethyl acid）、リン脂質、スフィンゴ脂質及び糖脂質からなる群から選択されるナノ構造送達系に関する。本発明に係るポリマー及び／又は脂質は、好ましくは生体適合性ポリマー及び／又は脂質である。
【００１６】
本発明に係るポリマーは、特に好ましくは、疎水性、親水性、両親媒性、アニオン性及び／又はカチオン性ポリマーである。ポリマーは、特に好ましくは、ＰＬＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬ、ＰＧＡ、ＰＤＭＡＥＭＡ、ＰＭＭＡ、ＰＭＡＡ、ＰＥＩ、ＰＥｔＯｘ、ＰＥＧからなる群から選択される。
【００１７】
本発明に係るナノ構造送達系の輸送を能動的かつ選択的にもたらす物質は、この発明の意味において「標的化単位」と称される。本発明に係る標的化単位は、ポリメチン色素である。「標的化単位」及び「ポリメチン色素」なる用語は、この発明では同義的に使用される。既に上述されたように、ポリメチン色素は、生理学的状態、例えば臓器機能を判定するためのマーカーとしてあるいは組織中のナノ粒子のようなある種の物質、分子又は化学的構築物の蓄積の証拠又は検出体として作用する物質として従来技術では使用されている。例えばインドシアニングリーン（ＩＣＧ）、ＩＲＤｙｅ８００のような、従来から知られているポリメチン色素の作用機序は、何らかの細胞特異的な取込みの媒介では決してなく、「マーカー」又は「標識」として、又は「光増感剤」として、またＩＣＧの場合には非特異的なシアニン色素としての使用である。標的化単位としての、すなわち、一般にナノ粒子又は本例におけるような本発明に係るナノ構造送達系のような他の物質を特定の標的組織中に能動的かつ選択的に標的化態様で輸送することができる物質としてのポリメチン色素の効果は、従来技術のどこにも記載されておらず示されてもいない。これは、当業者が認識していなかった本発明に係る標的化単位としてのポリメチン色素の異質の新規な技術的効果である。ポリメチン色素は均一な特徴のある化学的性質及び構造を有していため、本発明によって請求された範囲全体においてこの発明の意味の標的単位としてポリメチン色素を使用することができる。
【００１８】
本発明の好ましい実施態様は、少なくとも一種のポリメチン色素が、一般構造Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶ：
2020111579.tif 000003
2020111579.tif 000004
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2020111579.tif 000006
の対称又は非対称ポリメチンであり、
上式中、
ａ．  ｎは数値０、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０を表し、
ｂ．  Ｒ１−Ｒ１７は、同一でも異なっていてもよく、水素、一又は複数のアルキル、ｔｅｒｔ−アルキル、シクロアルキル−（「アルキル」及び「シクロアルキル」基はまたオレフィン構造を含む）又はアリール、カルボキシアリール、ジカルボキシアリール、ヘテロアリール又はヘテロ脂環式基、アルキルオキシ、アルキルメルカプト、アリールオキシ、アリールメルカプト、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールメルカプト基、ヒドロキシル、ニトロ又はシアノ基、アルキル置換又は環状アミン官能基及び／又は２つのオルト位の基、例えば、Ｒ３とＲ４、Ｒ１３とＲ１４及び／又はＲ１とＲ２及びＲ１１とＲ１２及び／又はＲ７とＲ９は、一緒に更なる芳香族環、ヘテロ芳香族環、脂肪族環又はヘテロ脂肪族環を形成してもよく、
ｃ．  Ｒ１−Ｒ１７置換基の少なくとも一つは、該ポリメチン色素の親水性を決定する、可溶化及び／又はイオン化可能な又はイオン化された置換基、例えばＳＯ３−、（−ＳＯ３Ｈ）、ＰＯ３２、ＣＯＯＨ、ＯＨ又はＮＲ３＋、シクロデキストリン又は糖を有し、該置換基はまたスペーサー基によってポリメチン色素に結合されていてもよく、
ｄ．  Ｒ１−Ｒ１７置換基の少なくとも一つは、反応性基（リンカー）、例えばイソシアネート、イソチオシアネート、ヒドラジン、アミン、モノ−及びジクロロ−又はモノ−及びジブロモトリアジン、アジリジン、エポキシド、ハロゲン化スルホニル、酸ハロゲン化物、カルボン酸無水物、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、イミドエステル、カルボン酸、グリオキサール、アルデヒド、マレイミド又はヨードアセトアミド及びホスホラミダイト誘導体又はアジド、アルキン又はオレフィンを有し、該置換基はまたスペーサー基によってポリメチン色素に結合されていてもよく、
ｅ．  芳香族、ヘテロ芳香族、脂肪族又はヘテロ脂肪族スペーサー基は、構造要素、例えば［（ＣＨ２）ａ−Ｙ−（ＣＨ２）ｂ］ｃ又は［（Ｃ６Ｈ４）ａ−Ｙ−（Ｃ６Ｈ４）ｂ］からなり、ここで、Ｙは同一でも異なっていてもよく、ＣＲ２−、Ｏ−、Ｓ−、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨ−、ＮＲ−、ＣＯＯ−又はＣＯＮＲ官能基を含み、該基はＲ１−Ｒ１７置換基の一つに結合し、ａとｂは、同じでも異なっていてもよく、０−１８の数値を有し、ｃの数値は０−１８であり、
ｆ．  対応するｎ＝２、３、４又は５のＲ８及びＲ９置換基は２×、３×、４×又は５×が存在していてもよく、これらは同一でも異なっていてもよい、
ナノ構造送達系に関する。
【００１９】
本発明によれば、「標的化単位」及び「ポリメチン色素」なる用語は同義的に使用される。
標的化単位（ポリメチン色素）は、ポリマーにリンカーによって結合している：
一般的構造のポリマー−リンカー−標的化単位：
ポリマー＾リンカー＾標的化単位
【００２０】
本発明に係るリンカーの一般構造を、次のように説明することができる：少なくとも一つの構造単位（ポリマー及び／又は標的化単位）が反応性基（リンカー）、例えばイソシアネート、イソチオシアネート、ヒドラジン、アミン、モノ−及びジクロロ−又はモノ−及びジブロモトリアジン、アジリジン、エポキシド、ハロゲン化スルホニル、酸ハロゲン化物、カルボン酸無水物、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、イミドエステル、カルボン酸、グリオキサール、アルデヒド、マレイミド又はヨードアセトアミド及びホスホラミダイト誘導体又はアジド、 アルキン又はオレフィンを有し、ここで、これらの置換基はまたスペーサー基によってポリメチン色素及び／又はポリマーに結合されていてもよい。標的化単位は、これらの反応性基によって共有結合でポリマー（又はその逆）に結合される。 
【００２１】
ポリマー及び／又は標的化単位とリンカーとの間の化学結合は、生体安定性又は生分解性であるように選択することができる。一又は複数の異なる標的化単位は、ポリマーに結合されうる。同様に、様々な標的化単位を備えたポリマーをナノ粒子において組み合わせることができる。従って、ポリマーと標的化単位、あるいは両方さえも異なっていてもよい。ポリマーの代わりに、脂質をまた上記のものと同じ条件で使用することができ、従ってリポソームをナノ粒子の代わりに使用することができる。
【００２２】
本発明の好ましい実施態様では、ナノ構造送達系の少なくとも一種のポリメチン色素は、好ましくは、ＤＹ−６３５、ＤＹ−６８０、ＤＹ−７８０、ＤＹ−８８０、ＤＹ−７３５、ＤＹ−８３５、ＤＹ−８３０、ＤＹ−７３０、ＤＹ−７５０、ＤＹ−８５０、ＤＹ−７７８、ＤＹ−８７８、ＤＹ−７０４、ＤＹ−８０４、ＤＹ−７５４、ＤＹ−８５４、ＤＹ−７００、ＤＹ−８００、ＩＣＧ及びＤＹ−ＩＲＤＹＥ８００ＣＷからなる群から選択される、ＤＹ色素である。また、ポリメチン色素ＤＹ−６３０、ＤＹ−６３１、ＤＹ−６３２、ＤＹ−６３３、ＤＹ−６３４、ＤＹ−６３６、ＤＹ−６４７、ＤＹ−６４８、ＤＹ−６４９、ＤＹ−６５９、ＤＹ−６５１、ＤＹ−６５２、ＤＹ−５９０、ＤＹ−５４８、ＤＹ−４９５及びＤＹ−４０５もまた好ましい。これらは、肝細胞又は腎実質細胞への選択的な輸送をもたらす標的化単位としてのポリメチン色素を含む。本発明に係る肝細胞標的化単位並びに本発明に係る実質細胞標的化単位の一般構造とまた対応する例を図８の表２にまとめる。これらの標的化単位は、細胞型（肝細胞又は腎実質細胞）に対して選択的であり、この細胞をナノ粒子又はリポソームに、それらが化学結合によって後者に結合されているとき、選択的に移動させることができる。標的化単位の選択性は、標的細胞によって発現される、流入トランスポーターとの相互作用のためにここでは生じる。標的単位はまた赤から赤外領域において蛍光特性を有する。これらの蛍光特性はまたナノ構造送達系、より特定的にはナノ粒子又はリポソームに移行させることができ、色素の蓄積を検出することができるだけでなく、（ナノ粒子及び／又はリポソームに結合されたとき）ナノ粒子及び／又はリポソームの血液中及び組織中における蓄積を検出することもできる。
【００２３】
標的化単位として、本発明に係るポリメチン色素はナノ構造送達系を標的組織中に選択的に輸送する。選択性は、「正しい」組織中で前記組織中のみへの成功裏の輸送に対して重要であり、従来技術と比較しての非常に大きな利点を構成する。ポリメチン染料は、組織特異的トランスポーターのためのトランスポーターリガンドとして働く。好ましい実施態様では、少なくとも一種のポリメチン色素は、少なくとも一種の組織特異的トランスポーターのためのトランスポーターリガンドとして働く。次の性質は、ポリメチン色素がそのようなトランスポーターリガンドとして適切であるために重要である：（１）疎水性及び（２）特定の構造との組合わせ。これらの特性は、組織特異的トランスポーターによってリガンドとして認識されるために（色素の選択性）重要である。
【００２４】
ポリメチン色素がポリマー又は脂質に結合され、ナノ粒子又はリポソームの合成後に外にエクスポートされる場合、それはナノ粒子及び／又はリポソームへのその選択性を移動させる。ついで、ナノ粒子及び／又はリポソームの選択性のために非常に重要である次のプロセスが、全身投与又は局所適用後に生じる：
・（少なくとも一種の）曝露されたポリメチン染料と共にナノ粒子又はリポソームが様々な組織を通って流れる。
・ポリメチン色素が、その疎水性及び構造に基づき、組織特異的な側底膜型又は頂端流入トランスポーターによって検出され、細胞表面でそれらと一体化される。 
・流入トランスポーターとのポリメチン色素の相互作用は、共有的で安定な結合を持つこのナノ粒子又はリポソームがあまりに大きいので、このトランスポーターによるナノ構造送達系又はナノ粒子又はリポソーム全体の直接の移送は生じさせない。代わりに、流入トランスポーターとのポリメチン色素の相互作用は、細胞表面へのナノ粒子又はリポソームの蓄積と固定化を生じる。
・細胞表面上のナノ粒子又はリポソームの蓄積及び固定化は、細胞膜とナノ粒子又はリポソームとの間の相互作用を増大させるので、ナノ粒子又はリポソームの細胞取り込み（エンドサイトーシス）がある。
【００２５】
本発明の好ましい実施態様は、少なくとも一種のポリメチン色素が、少なくとも一種の組織特異的トランスポーターによって検出され、標的組織の細胞の細胞表面でこれと相互作用し、ナノ構造送達系が細胞表面に好ましくは蓄積し、そこに固定化され、好ましくは標的組織の細胞内に取り込まれる、ナノ構造送達系に関する。
【００２６】
細胞選択性は、ナノ粒子又はリポソームに結合され、対応する組織特異的流入トランスポーターによって検出される、ポリメチン色素の特異的相互作用を通じて得られる。本発明に係るポリメチン染料のための流入トランスポーターは、肝細胞及び腎実質細胞に対して定義されている。
【００２７】
本発明に係るポリメチン染料は、肝細胞の側底膜型の流入トランスポーターによって特異的に取り込まれるが、ナノ粒子を肝細胞に特異的にする。現在の情報及びＦＤＡによれば、次のものが肝細胞の流入トランスポーターに入る：
2020111579.tif 000007
これらのトランスポーターのリガンドは、特に、例えば、表２（図８ａ−ｅ）、左欄に示されるもののような構造を有する全てのポリメチン色素を含む。
【００２８】
腎実質細胞（主に近位尿細管細胞）の基底膜の流入トランスポーターによって特異的に取り込まれる本発明に係るポリメチン色素はナノ粒子をこれらの細胞型に特異的なものにする。現在の情報及びＦＤＡによれば、次のものが腎実質細胞（主に近位尿細管細胞）の流入トランスポーターに入る：
2020111579.tif 000008
これらのトランスポーターのリガンドは、特に、例えば、表２（図８ａ−ｅ）、右欄に示されるもののような構造を有する全てのポリメチン色素を含む。
【００２９】
なお好ましい本発明の一実施態様は、よって、少なくとも一種のポリメチン色素が少なくとも一の組織特異的トランスポーターによる標的組織の細胞中へのナノ構造送達系の取込みをもたらす、ナノ構造送達系に関する。組織特異的トランスポーターは、ＯＡＴＰ１Ｂ１、ＯＡＴＰ−Ｃ、ＯＡＴＰ２、ＬＳＴ−１、ＯＡＴＰ１Ｂ３、ＯＡＴＰ８、ＯＡＴＰ２Ｂ１、ＯＡＴＰ１Ａ２、ＮａＤＣ３、ＳＤＣＴ２、ＮＴＣＰ、ＯＣＴ１、ＯＣＴ３、ＯＡＴ２、ＯＡＴ１、ＯＡＴ３、ＰＧＴ、ＯＣＴ２、ＯＡＴ１、ＯＡＴＰ４Ａ１、ＯＡＴＰ４Ｃ１からなる群から特に好ましく選択される。
【００３０】
「組織特異的トランスポーター」、「トランスポーター」及び「流入トランスポーター」なる用語は、本発明において同義語として使用される。
【００３１】
「ナノ構造送達系」、「ナノ粒子」及び「リポソーム」なる用語は、組織特異的トランスポーターによる標的組織への輸送及び該標的組織中への取込に関連して、本発明において使用される。
【００３２】
ナノ構造送達系及び／又はナノ粒子又はリポソームの標的組織への取り込み後に、ポリメチン色素は放出され、場合によっては本発明によってカバーされる活性医薬成分がまた放出される。
【００３３】
ナノ構造送達系の成分としてのナノ粒子の放出：
１．エンドソームの酸性化→ナノ粒子の不安定化、自発的又は酵素的切断によるポリマーの分解；
２．（エンドソームを透過させることができる）活性物質の放出；
３．活性成分の放出、ポリマーからの色素の脱着；
４．ポリマー成分が、様々な代謝経路に供給され、色素が分泌される。
【００３４】
ナノ構造送達系の成分としてのリポソームの放出：
１．エンドソームによる取込み→酸性化→エンドサイトーシス又は細胞膜とのリポソームの直接融合後のエンドソーム膜とのリポソームの融合；
２．双方の経路が、細胞質への活性成分の直接放出を生じる；
３．標的化単位（ポリメチン色素）が生体内で不安定な結合によって脂質に結合している場合、この結合を切断することができ、脂質が分泌される。生体内で安定な結合を使用する場合、ポリメチン色素は脂質に結合したままとなる。続いて、脂質の分解がある場合、ポリメチン色素は、小さな脂質ラジカルと共に分泌されうる。おそらく脂質の一部はポリメチン色素と共に細胞膜中に取り込まれうる。
【００３５】
本発明の他の特に好ましい実施態様は、ナノ構造送達系が少なくとも一種の活性医薬成分を更に含むナノ構造送達系に関する。少なくとも一種の活性医薬成分は、好ましくは、低分子物質、特に阻害剤、誘導原（inductor）又は造影剤並びに高分子物質、特に潜在的に治療に使用可能な核酸（例えば低分子干渉型ＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ）及びタンパク質（例えば、抗体、インターフェロン、サイトカイン）からなる群から選択される。次の表は、本発明のナノ構造送達系を介してのその特定の投与が新規な治療選択肢を可能にする活性成分の例を記載している：
2020111579.tif 000009
【００３６】
活性医薬成分は、特に好ましくは、親油性、疎水性、親水性、両親媒性、アニオン性及び／又はカチオン性の活性医薬成分である。
【００３７】
「活性医薬成分」なる用語は、本発明によれば、薬理効果を有する任意の有機又は無機分子、物質又は化合物を意味するものと理解される。「活性医薬成分」なる用語は、「薬物」及び「医薬」なる用語とここでは同義に使用される。
【００３８】
本発明に係るナノ構造送達系は、今のところ独特であり、様々な物質、特に活性な医薬成分（例えば、親水性又は親油性小分子、また核酸も）を特定の標的組織中に能動的かつ選択的に輸送するために様々な方法と組み合わすことができる治療診断系（theragnostic system）である。活性医薬成分の輸送は、標的細胞上の組織特異的トランスポーターと相互作用するナノ構造送達系の構成要素としての標的化単位、ポリメチン色素によってもたらされる。ポリメチン色素（ＤＹ）、活性医薬成分及びポリマー及び／又は脂質並びにそれらの多様なパラメーターの選択を通して、それぞれの用途、特に輸送される活性な医薬成分及び／又は標的組織に個別に合わせられたナノ粒子及び／又はリポソームを製造することが可能である。このようにして、一又は複数種の医薬成分をナノ構造送達系の成分として特定の組織又は細胞型（標的組織）中に効率的に輸送し、そこでそれらを放出させることが可能である。活性医薬成分は、ナノ粒子又はリポソームに封入されていないと生物学的利用能が殆ど無いか又は無いもの、あるいはインビボで安定性が殆ど無いか無いもの、あるいは特定の臓器及び／又は細胞においてのみ作用することができるものを含みうる。標的組織中におけるナノ構造送達系（ナノ粒子又はリポソーム）、及び／又はその成分、例えばポリマー、脂質又は活性医薬成分の特異性及び蓄積を、非毒性のポリメチン色素の赤から赤外領域の蛍光特性によって、検証し、追跡する、つまり検出することができる。
【００３９】
本発明の意味における「標的組織」は、ナノ構造送達系及び／又はその成分、特に活性医薬成分の輸送が可能で合理的である全ての組織、臓器又は細胞を含む。標的組織は、そこへの一又は複数種の活性医薬成分の輸送が例えば疾患の治療又は診断のために可能で合理的である特に全ての組織、臓器又は細胞を含む。本発明において好ましい標的組織の例は、限定されないが、肝臓、腎臓及び腫瘍、特にこれらの組織に由来するもの、例えば肝細胞癌又はグラヴィッツ腫瘍を含む。「標的組織」、「標的細胞」、「標的組織の細胞」及び「臓器（器官）」なる用語は、この文脈では同意語として使用される。
【００４０】
ポリマー又は脂質上での本発明に係るポリメチン色素（以下、ＤＹ）のコンジュゲーションのため、官能化ポリマー（例えば、ＤＹ−ＰＬＧＡ、ＤＹ−ＰＬＡ、ＤＹ−ＰＣＬ）及び／又は官能化脂質が生成される。次に、これらが、好ましくは、単一又は二重エマルジョン技術又は沈殿技術により、ナノ粒子及び／又はリポソームを製造するために使用される。ナノ粒子及び／又はリポソームを、それぞれの状況に個別に適合させることがここでは可能である。様々な可能性を、表１に例として列挙する（図１）。ポリメチン色素の脂質又はポリマーとの特別な組合せを通して、高度に選択的なナノ構造送達系を得ることができるように、ポリメチン色素を、様々な異なったポリマー及び／又は脂質とコンジュゲートさせることができる。官能化ポリマーの合成は、図２に概略的に図示され、実施例１に詳細に例証されている。本発明に係る官能化ポリマー又は脂質、ナノ粒子及びリポソームの製造、並びに活性医薬成分の包含は、従来から知られている伝統的な方法に従って実施することができる。好ましい製造方法は、本発明における実施例及び図面に開示する。
【００４１】
本発明の別の主題は、本発明に係るナノ構造送達系並びに適切な賦形剤及び添加剤を含む薬学的組成物に関する。
【００４２】
本発明に係る「賦形剤及び添加剤」は、活性医薬成分ではないが、薬学的組成物の定性的な特性に影響を与えるため、特にそれらを改善するために薬学的組成物中の活性医薬成分と一緒に処方されうる任意の薬理学的に許容可能で治療的に好都合な物質を含むことが理解される。添加剤及び／又は賦形剤は、好ましくは、如何なる言及できる有害な薬理効果を持っていないか、又は意図される治療に関して何らかの有害な薬理効果を少なくとも持っていない。適切な賦形剤及び添加剤は、例えば、薬学的に許容可能な有機又は無機酸、塩基、塩及び／又は緩衝物質を含む。無機酸の例は、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、及びリン酸を含み、特に塩酸及び硫酸が好ましい。適切な有機酸の例は、リンゴ酸、酒石酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、ギ酸、及びプロピオン酸、特に好ましくはアスコルビン酸、フマル酸、及びクエン酸を含む。薬学的に許容可能な塩基の例は、アルカリ水酸化物、アルカリ炭酸塩及びアルカリイオン、好ましくはナトリウムを含む。これらの物質の混合物は、特にｐＨを調整し、緩衝するために使用されうる。本発明の意味において好ましい緩衝物質は、またＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、ＭＯＰＳ、並びに他の生理学的に許容可能な緩衝物質を含む。更なる適切な賦形剤及び添加剤は、可溶化剤又は希釈剤、安定剤、懸濁媒介物、保存料、充填剤（フィラー）及び／又は結合剤、並びに従来から知られている他の通常の賦形剤及び添加剤を含む。賦形剤の選択並びに使用されるその量は、活性医薬成分と、それがどのように投与されるかに依存する。本発明に係る薬学的組成物は、好ましくは非経口投与され、特に静脈内投与される。懸濁液及び溶液の形の調製物並びに容易に再構成可能な乾燥調製物は、全ての非経口用途に適している。
【００４３】
本発明に係る薬学的組成物は、当該技術分野において知られている任意の方法により製造することができる。
【００４４】
本発明に係る薬学的組成物の成分の投薬は、様々な要因、例えば活性医薬成分の種類、疾患、本発明に係る薬学的組成物が投与される患者（哺乳動物、好ましくはヒト）の病態、及びそれが如何に投与されるか、例えば非経口、静脈内、又は何らかの他の方法によるかに依存する。当業者はそのようなパラメーターに精通しているので、用量の決定は当業者の一般的な技術的知識に依存する。
【００４５】
本発明の他の主題は、標的組織中へのナノ構造送達系又は薬学的組成物の能動的かつ選択的輸送のための本発明に係るナノ構造送達系又は薬学的組成物の使用であって、輸送が標的化単位としての少なくとも一種のポリメチン色素によってもたらされる、使用に関する。少なくとも一種のポリメチン色素が、特に好ましくは、少なくとも一の組織特異的トランスポーターによる標的組織の細胞内へのナノ構造送達系又は薬学的組成物の取込みをもたらす。標的組織におけるナノ構造送達系及び／又はその成分の蓄積は、特に好ましくは、少なくとも一種のポリメチン色素の蛍光特性によって、検出されうる。少なくとも一種のポリメチン色素に加えて、少なくとも一種のポリマー、少なくとも一種の脂質及び／又は少なくとも一種の活性医薬成分が、ナノ構造送達系（ナノ粒子又はリポソーム）の構成要素として理解されるべきである。
【００４６】
本発明の他の主題は、医薬品として使用される本発明に係るナノ構造送達系又は薬学的組成物に関する。
【００４７】
本発明の他の主題は、疾患、及び肝臓及び／又は腎臓、好ましくは肝臓及び／又は腎臓への損傷を含む感染症、例えば、マラリア及びＣ型肝炎、肝不全、例えば、薬物誘発性肝不全及び劇症肝不全、肝硬変、例えば、肝臓のアルコール誘発性肝硬変、肝臓の代謝性疾患、例えば、ウィルソン病及びモイレングラハト病、肝臓の排泄機能障害、肝腫瘍、原発性肝腫瘍、例えば、肝細胞癌、血管肉腫及び肝芽腫、腎腫瘍、原発性腎腫瘍、例えば、明細胞癌、乳頭癌及び嫌色素癌、様々なタイプの腎炎、慢性及び急性腎不全及び肝臓及び／又は腎臓に引き続いて損傷をもたらす疾患、例えば、敗血症の治療に使用される本発明に係るナノ構造送達系又は薬学的組成物に関する。
【００４８】
本発明に係るナノ構造送達系及び標的化単位、特にポリメチン色素は、一分子での診断を治療と組み合わせるための独特の可能性を提供する。よって、遊離の標的化構造を含めることによって治療効果について予測することができるだけでなく、ナノ粒子又はリポソーム上の同じ標的化構造を用いて治療をモニターし管理することもできる。リンカー領域における標的化構造の高い柔軟性のため、標的化単位は様々な脂質及びポリマーに化学的に結合されうる。標的化単位の化学構造のため、それは、生物学的標的化単位（例えば、抗体又はペプチド）とは対照的に非常に安定であり、化学精製及び分析に利用可能である。従って、高い再現性と制御性が合成において可能である。組織特異的トランスポーターのリガンドとしての標的化単位の性質のため、これらはポリマーからの脱離後にインビボで除去され得、細胞内蓄積及び毒性が回避される。マルチスペクトル光音響トモグラフィーの分野における現在の造影法の発達のため、標的化単位は直接検出することができる。また、しかしながら、コンピューター支援Ｘ線断層撮影法又は磁気共鳴断層撮影法のための本発明に係る造影剤をまた、それらがまた局在化できるように、ナノ粒子又はリポソームに封入することもできる。
【００４９】
赤から赤外領域において蛍光を発し、ついでそのバイオトランスポーターに対する選択性のために肝臓及び腎臓によってまた非常に効果的に排出される、標的化単位としての色素を介して診断と治療を組み合わせる、様々な細胞特異的系は今のところ独特である。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
本発明を図面に基づいて例示して説明する：
【図１】本発明に係るナノ粒子の可能な変化とナノ粒子自体の物理化学的性質及び生物学的因果関係に対するその影響の概要を示す（表１）。
【図２】本発明に係るポリマーの官能化の概略図である。Ａ：ＰＬＧＡのカルボン酸末端基にポリメチン色素ＤＹ６３５をＥＤＣカップリングさせてＤＹ６３５−ＰｌＧＡ−ＮＰ（あるいはＤＹ６３５−ＰＬＧＡとも称される；二つの用語は本発明において同義語として使用される）を形成する官能化ＰＬＧＡポリマーの合成；Ｂ：ＵＶ及びＩＲ検出器での官能化ＰＬＧＡポリマーのＳＥＣエルグラム（elugram）。合成及び官能化は実施例１にも詳細に記載されている。
【図３】本発明に係るナノ粒子の設計と製造を示す。個々の超音波工程は灰色の針（矢印）によって特徴付けられる。詳細な説明は実施例２にも見出すことができる。Ａ：単一乳化技術によるナノ粒子の構造とその製造。疎水性ポリマーは濃い灰色で示され、疎水性活性成分は中間の灰色で示され、水中の界面活性剤は薄い灰色で示されている。Ｂ：二重乳化技術によるナノ粒子の構造とその製造。これは、濃い灰色の疎水性ポリマーと白色で示される疎水性の活性成分を示している。次に上方の薄い灰色層はまた界面活性剤を伴う水である。Ｃ：本発明に係るナノ粒子に対する可能な変化とナノ粒子自体の物理化学的性質及び生物学的因果関係に対するその影響（表１）の概観（断面）。疎水性ポリマー又は脂質は黒で示され、可能な医薬活性、つまりガラクトースと肝細胞への細胞特異的取込みのためのトランスポーターとしてのＤＹ６３５は灰色で示されており、ここで、本発明に係るナノ粒子のみがその細胞特異性を保持している。
【図４】本発明に係るナノ粒子の特徴付けの結果を示す。ボックスプロットは、０．２５から０．７５分位を含む。中央値は、水平バーとしてプロットされ、平均値はキューブとしてプロットされている。ウィスカはそれぞれ最高及び最低値を表す。Ａ：ＰＬＧＡナノ粒子のサイズは、ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ充填ＰＬＧＡナノ粒子（およそ１８０ｎｍ）のサイズと異ならない。しかしながら、ＤＹ６３５−ＰＬＧＡナノ粒子は、有意に大きい（およそ２６０ｎｍ）。Ｂ：ＰＬＧＡナノ粒子のゼータ電位は僅かに負である。ＤＹ６３５−ＰＬＧＡナノ粒子の使用のため、電位は弱い正のゼータ電位に変動する（有意ではない）。ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩポリプレックス（ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ＋ＰＬＧＡナノ粒子）の充填のため、ゼータ電位は有意に変化し、強い正となる（＋７６ｍＶ）。Ｃ：エンドトキシンの量を決定するために、２５ｍｇＮＰ／ｍＬの濃度のナノ粒子（ＮＰ）溶液、例えばインビボでまた使用されるものを調べた。エンドトキシン負荷は試料中、０．４ｎｇ／ｍＬと０．６ｎｇ／ｍＬの間で変動していた。しかしながら、その値はＦＤＡ限界値（２．５ｎｇ／ｍＬ）を常に下回った。Ｄ：２５ｍｇ／ｍＬのＮＰ溶液もまた溶血及び凝集アッセイに使用された。ナノ粒子を、インビボ実験でまた使用されるもののようなＤＹ６３５−ＰＬＧＡアッセイに対して使用された。これの更なる説明は実施例３に見出すことができる。
【図５】インビトロでのＨｅｐａ１−６細胞中へのＲＮＡｉの取込み動態及び特徴付けを示す。Ａ：時間及び濃度依存的ＲＮＡｉを記載する図（ヒートマップ）。時間は、一方の軸に、他の軸のｓｉＲＮＡ濃度（ｎｇ／１０００００細胞）に対して、時間（ｈ）でプロットされる。未処理対照と比較してのＨＭＧＣＲ発現の変化は、パーセントの灰色のスケール（グラフの上に示されたスケール）でイメージ化されている。ヒートマップ中の点については、１、５、１０、２５、５０、１００、２００及び４００ｎｇ／１０００００細胞のｓｉＲＮＡ濃度を使用し、１２、１６、２４、３２、４０又は４８時間後に検査した。３通りの独立した複製を時間の各点について作製した。ついで、結果を、未処理のＨｅｐａ１−６細胞のＨＭＧＣＲ遺伝子発現レベルに対して相対化し、ＨＰＲＴ遺伝子発現を利用して正規化した。Ｂ：０及び３０分（ｍｉｎ）後のＨｅｐａ１−６細胞中へのナノ粒子の取込み。ＤＹ６３５を、Ｃｙ５チャンネルのＬＳＭ上に可視化した。細胞を洗浄し固定した後、細胞核をＤＡＰＩで染色した。この方法の更なる説明は実施例４に見出すことができる。
【図６】肝臓、腎臓、脾臓及び心臓における本発明に係るナノ粒子の臓器特異性及び動態を示す。Ａ：ＤＹ６３５対ＤＹ６３５−ＰＬＧＡ−ＮＰの減衰動態の比較。肝臓での３ＲＯＩからの平均。エラーバーはＳＥＭを示す。Ｂ＋Ｃ：異なる時点でのＩＶＭ上のＣｙ５（ＤＹ６３５）チャンネルの画像（Ｂ 薄い灰色ないし白、Ｃ 薄い灰色）とＤＡＰＩ（バックグラウンド）の画像の重ね合わせ。Ｄ−Ｇ：ＰＬＧＡ−ＮＰ注入後１０分後の５μｍの臓器断面。画像において、ＤＹ６３５−ＰＬＧＡ−ＮＰ及び／又はＤＹ６３５（Ｃｙ５チャネル、画像に緑で示される）と細胞核（ＤＡＰＩ染色、画像に赤で示される）が重ねられている。Ｆ，Ｇ：ここでの染色は、位相差で可視化された肝臓構造上でまた重ねられている（画像に青で示される）。更なる説明は実施例５に見出すことができる。
【図７】本発明に係るナノ粒子の分泌経路を示す。ＤＹ６３５−ＰＬＧＡ−ＮＰの分泌経路：Ａ：血漿収縮率の計算のために、ＤＹ６３５−ＰＬＧＡナノ粒子を含む未処理の血漿中において標準曲線が準備される。胆汁中にＤＹ６３５を含む標準シリーズを胆汁分泌のために使用した。Ｂ：これは胆汁中のＤＹ６３５「回収」パーセンテージを示している。測定点は、Ａからのデータに基づきコンピュータで作製された。曲線は、オフセットを近似させてＯｒｉｇｉｎＰｒｏ８．５，ＱｕｉｃｋＦｉｔ：指数関数的減衰を使用することによって近似した。
【図８−１】本発明に係る標的化単位、すなわちポリメチン染料を示す。図８は、ポリマー及び／又は脂質に対するリンカーを特定する、肝細胞標的化単位の一般構造と腎実質細胞標的化単位の一般構造、並びにそのような肝細胞標的化単位及び腎実質細胞標的化単位の例を示す（表２）。標的化単位は一つの細胞型（肝細胞又は腎実質細胞）に対して選択性を有しており、該単位が化学結合によって細胞に結合すると、この細胞をナノ粒子又はリポソームに選択的に移送することができる。標的化単位の選択性は、標的細胞によって発現される流入トランスポーターとの相互作用により生じる。標的化単位はまた赤から赤外領域に蛍光特性を有している。これらの蛍光特性をナノ構造送達系、より特定的にはナノ粒子又はリポソームに移すことができ、その結果、血液及び組織中において色素の蓄積を検出することができるだけでなく、（それがナノ粒子及び／又はリポソームに結合しているならば）ナノ粒子及び／又はリポソームの蓄積もまた検出することができる。
【図８−２】表２の続き
【図８−３】表２の続き
【図８−４】表２の続き
【図８−５】表２の続き
【図９】活性医薬成分の輸送における本発明に係るナノ構造送達系の効果を示す。Ａ：ＨＭＧＣＲに向けてｓｉＲＮＡを輸送するナノ構造送達系の２回の注射後、及び／又は対照物質の２回の注射後の血漿コレステロールレベル。この図は中央値バープロットを示し、エラーバーは標準偏差の平均誤差を記載し、バー内の数は各群中の動物の数を記載し、中央値バーグラフ記述を示し、バー内の数字は各グループの動物数を記載し、有意性は両側Ｕ検定によって決定された（**有意水準０．０１）。図９Ａ：これらの結果は、ここに記載されたアプローチ法によって血漿コレステロール濃度を有意に低下させることができることを示している。臓器特異的ナノ構造送達系が最大の効果を示している。臓器特異的ナノ構造送達系を介して、臓器特異的で強い効果が肝細胞において達成されることは、図９Ｂから明らかである。しかしながら、非特異的ナノ構造送達系はＨＭＧＣＲの特異的なダウンレギュレーションも弱いダウンレギュレーションも示さない。
【図１０】ヒト側底肝細胞トランスポーターとの、標的化単位としての本発明に係るポリメチン色素ＤＹ−６３５の発明に係る相互作用を示す。図１０Ａ、Ｂは平均値のバープロットを示し、誤差バーは標準偏差の平均誤差を記載する。ここでの全ての実験はそれぞれ６回実施された。有意性は両側Ｕ検定によって決定された（**有意水準０．０１、*有意水準０．０１）。
【００５１】
本発明を実施例に基づいて以下に実証するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００５２】
実施例１：官能化ポリマーの合成
合成されたナノ粒子は、疎水性ポリマーのポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）に基づき、これは生体適合性かつ生分解性である。このポリマーは、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）等のカップリング試薬によって、その活性なカルボン酸基（「酸末端」）に基づいて、アミン官能化色素に共有結合させることができる。ポリメチン色素ＤＹ−６３５をここで使用した（図２参照）。全ての１００番目のポリマー鎖を官能化した。ポリマーを、ついで透析によって遊離色素ＤＹ−６３５から分離させ、沈殿によって精製した。特徴付けは、ＵＶ／Ｖｉｓ検出器とＲＩ（屈折率）検出器が組み合わせられたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に基づいた。図２は、合成及びＳＥＣエルグラムのグラフィックプロットを示している。
【００５３】
実施例２：ナノ粒子の製造
ポリマーの官能化後（実施例１）、界面活性物質（界面活性剤）、つまりここではポリビニルアルコール（ＰＶＡ）の助けを借りて、ナノ粒子の形成を促進する、高周波数超音波を使用して、単一エマルジョン（Ａ）及び二重エマルジョン（Ｂ）によってナノ粒子を製造した。従って、疎水性ポリマーは、水と混和しない溶媒（２５ｍｇ／ｍｌ）である酢酸エチルに溶解させた。使用した界面活性剤は、超純水に０．３％ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）であり、全ポリマー濃度は２．５ｍｇ／ｍＬであった。酢酸エチル中のポリマー懸濁液を、界面活性剤と共に水に加え、超音波を使用してナノ粒子を形成した（Ａ）。親水性物質が封入される場合、親水性物質を最初に水に溶解し、ついで酢酸エチル中のポリマーに添加し、超音波処理を行った。次に、界面活性剤と共に水を加え、超音波を使用してナノ粒子を再び形成した。図３は、この乳化技術によって得られた結果を示している。
【００５４】
このようにして製造されたおよそ２００ｎｍの直径を有するナノ粒子を、全有機溶媒（酢酸エチル）が蒸発し、よって粒子が水中で安定するまで、空気流中において撹拌した。過剰な界面活性剤を除去するために、ナノ粒子を少なくとも２回、超純水で十分に洗浄した。これは、超音波浴中でのボルテックスとインキュベーションによって裏付けられうる。最後に、粒子を凍結乾燥し、その質量を測定した。
【００５５】
実施例３：ナノ粒子の特徴付け
ＤＹ−６３５コンジュゲートＰＬＧＡのナノ粒子（ＤＹ６３５−ＰＬＧＡ−ＮＰ）を一定のパラメータを用いて製造し、再現した。このために使用されたアッセイを以下に説明する：
−  サイズ：動的光散乱器（例えばZetasizer (Malvern Instruments GmbH)）による又は電子顕微鏡写真による、脱イオン水に溶解した様々なナノ構造送達系のサイズの測定。
−  形状：電子顕微鏡写真による形状の決定。
−  電荷：電気泳動シグナルを決定することによりZetasizer (Malvern Instruments GmbH)を使用する脱イオン水に溶解した様々なナノ構造送達系の測定（ゼータ電位、表面電荷）。
−  エンドトキシン：D. E. Guilfoyle等, Evaluation of a chromogenic procedure for use with the Limulus lysate assay of bacterial endotoxins drug products. J Parenter Sci Technol, 1985, 39(6): pp. 233-6に従ってのＬＡＬ発色アッセイによるエンドトキシン測定。
−  溶血：生理学的緩衝液中で１時間、粒子と共にインキュベートされた赤血球のヘモグロビン濃度の測定。上清中の測定可能なヘモグロビン濃度は赤血球膜に損傷があるときは、増加する。
−  凝集：生理的緩衝液中のポリマーと共にインキュベートされた赤血球の吸収の測定。細胞凝集体を伴う試料は均一に分散した未凝集細胞よりも低い吸収を示す。
【００５６】
結果を図４に示す。Ａ：サイズ、Ｂ：電荷、Ｃ：エンドトキシン負荷。サイズ測定では、動的光散乱器を使用し、電荷はゼータ電位によって決定した。Ｄ：加えて、ＤＹ６３５−ＰＬＧＡ−ＮＰが血中に如何なるリジン特性も有しておらず、これらは赤血球の凝集にはつながらないことが示された。Ｅ及びＦ：粒子は電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）で円形又は球形の形状を有しており、無負荷で標的化なしの場合（Ｅ）並びに負荷ありで標的化の場合（Ｆ）である。
【００５７】
実施例４：ＲＮＡｉによる薬物関連効果の誘発とインビトロでの取込み（「概念実証」）
図６Ａの手順：  ６ウェルプレート（９．６ｃｍ２当たり１０００００細胞）において、標準的な培養条件（３７℃、５％ＣＯ２、ＤＭＥＭ４．５ｇ／Ｌグルコース、１０％熱失活ウシ胎仔血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）下でＨｅｐａ１−６細胞を培養した。２４時間後、実施例７Ｂに記載されたようにして調製された様々な濃度のナノ構造送達系をウェルに添加し、様々な時間、インキュベートした（濃度及びインキュベーション時間は図５Ａで分かる）。インキュベーション時間後、細胞をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄し、ＲＬＴ緩衝液（Qiagen GmbH）を用いて溶解し、それに１％のβメルカプトエタノールを添加した。ｍＲＮＡをライセートから単離し、ＲＴ−ｑＰＣＲで分析した。ついで、値を、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ発現レベルで正規化し、ＨＭＧＣＲ発現レベル（ＨＭＧＣＲ：３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−コエンザイム−Ａ−レダクターゼ補酵素又はＨＭＧ−ＣｏＡ）を非トランスフェクトＨｅｐａ１−６細胞と比較した。
【００５８】
図６Ｂの手順：  Ｈｅｐａ１−６細胞をチャンバースライド（Nunc, Thermo Scientific GmbH）（５０００細胞／１．５ｃｍ２）上で標準的な培養条件下で培養した。２４時間後、細胞を１００μｇ／ｍＬ（最終濃度）のＤＹ−６３５修飾ナノ構造送達系（実施例７Ｂに記載のように製造）と混合した。ナノ構造送達系と共に標準的な培養条件下で３０分間インキュベートした後、細胞をＨＢＳＳで洗浄し、１５分間、５％ホルマリン液（ｐＨ７）で固定した。その後、顕微鏡スライドを細胞と共に洗浄し、細胞核をＤＡＰＩで染色した。レーザー走査顕微鏡による分析のため、細胞をＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ（Vector Labs, Inc.）で湿らし、カバーガラスで密閉した。ナノ構造送達系が、６３３ｎｍ（励起）におけるＤＹ−６３５での修飾によって検出され、細胞核が４６０ｎｍ（励起）で可視化された。
【００５９】
結果は図５に示される。Ａ：ＨＭＧＣＲ遺伝子発現は、Ｈｅｐａ１−６細胞中でｓｉＲＮＡトランスフェクションにより、最大７０％までダウンレギュレートすることができた。ＨＭＧＣＲ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−コエンザイム−Ａ−レダクターゼ又はＨＭＧ−ＣｏＡ）は中央代謝−コレステロール生合成の重要な酵素を具体化している。この実験で実証されたこの代謝遺伝子のダウンレギュレーションは、ナノ構造送達系による本発明に係る活性成分の輸送の効果を示している。更に、上昇した血漿コレステロールレベルは、動脈硬化症の発症において最も重要である。本発明に係るナノ構造送達系を使用するここで提示された治療法は、スタチン類を用いた伝統的な治療法に対する興味深い代替法であり、特にこれは先天的に上昇したコレステロールレベル（家族性高コレステロール血症）のヒトに対する遺伝子輸送の方向の最初のものである。Ｂ：これは、ＤＹ６３５−ＰＬＧＡ−ＮＰが３０分以内にＨｅｐａ１−６細胞（マウス肝細胞株）により取込まれることを示す。ナノ粒子のそのような急速かつ強烈な取込みは、従来技術において以前には記載されていない。
【００６０】
実施例５：インビボでのターゲティング：臓器特異性と分泌経路の説明
この実験のためのナノ構造送達系の製造は、実施例２（Ｂ）に記載の通りに実施した。注射のために、凍結乾燥されたナノ構造送達系を、オービタルミキサーと超音波浴を用いて、無菌の５％グルコース溶液（Glucosteril G5, Fresenius SE&Co KGaG）に溶解させた。
【００６１】
手順（図６Ａ）：マウス又はラットに静脈（頚静脈）を経由してカテーテルを挿入した。次に、生体顕微鏡を使用して実験施設内で肝臓を準備した。次に、ＤＹ−６３５（１３ｐｍｏｌ／ｇ体重（ＢＷ））又はＤＹ−６３５修飾を担持するナノ構造送達系（６．５μｇ／ｇＢＷ）を静脈注入し、ＤＹ−６３５の比蛍光を経時的に肝臓において６３３ｎｍで測定し、様々な関心領域（ＲＯＩ）を経時的に記録した画像において定量化した。図６は、ＤＹ−６３５（図６Ｂ）又はＤＹ−６３５修飾ナノ構造送達系（図６Ｃ）の測定の代表的な画像を示す。ＤＹ−６３５又はＤＹ−６３５修飾ナノ構造送達系は６３３ｎｍでのＤＹ−６３５の蛍光により表した。肝臓構造は４５０ｎｍでのＮＡＤＨ／ＮＡＤＨ＋の自発蛍光によって表された。臓器特異性を表すために、雄マウスに中心静脈カテーテルを通して１ｇＢＷ当たり６．５μｇのＤＹ−６３５−修正送達系を注射した。注射の１０分後、動物を痛みを伴わせないで安楽死させ、臓器を取出し、組織学的検査のために低温調製した。次に、５μｍ厚の臓器切片をクリオトームで調製し、これらをＤＡＰＩで対比染色した。ついで、全ての臓器を、ＤＡＰＩ染色細胞核（４３０ｎｍ）に関して、またナノ粒子（６３５ｎｍ）に関して、同じ設定で調べた。
【００６２】
結果を図６に示す。Ｃ：ＤＹ６３５−ＰＬＧＡ−ＮＰナノ粒子は、僅か１分後に肝細胞に取り込まれ（敷石状のシグナルに富む領域）、１分及び１０分後に画像化された（１ｍｉｎ、１０ｍｉｎ）。約５０分（５０ｍｉｎ）後、ほぼ全てのＤＹ６３５色素が肝臓から排除された。同様の結果がＤＹ６３５で見出された。Ｂ：全体として、結果は、純色素ＤＹ６３５での以前の研究で得られたものと同様である。Ａ：これは、肝臓中におけるＤＹ６３５の減衰率を示している。ＤＹ６３５及びＤＹ６３５−ＰＬＧＡ−ＮＰからの肝臓におけるＤＹ６３５強度の減衰率の変化は、ＤＹ６３５色素がＰＬＧＡポリマーに細胞内でもなお結合しており、ＰＬＧＡの加水分解後にだけ放出され、排除されることを示している。Ｄ−Ｇ：これは、様々な臓器切片によって確認された臓器特異性を示している。ＤＹ６３５−ＰＬＧＡ−ＮＰ（緑色）の注入後、肝臓は著しい蓄積を示している。しかしながら、脾臓（Ｅ）、心臓（Ｆ）及び腎臓（Ｇ）では、ナノ粒子（脾臓、心臓）は殆ど見えないか又はナノ粒子は全く（腎臓）見えない。
【００６３】
実施例６：ナノ粒子ＤＹ６３５−ＰＬＧＡの分泌経路
この実験に基づき、ＤＹ６３５−ＰＬＧＡナノ粒子及び／又はポリメチン染料ＤＹ６３５の血漿減衰率及び胆汁分泌を調べた。これは、器具（頸静脈、頸動脈、総胆管中のカテーテル）と共に雄ラット（系統：ＲｃｃＨａｎ：ＷＩＳＴ）を使用して行われた。次に、試験される物質が、静脈カテーテルを介して注入される。その後、血液が動脈カテーテルから短い間隔で採取され、胆汁が総胆管のカテーテルから採取される。その後、血液は更に血漿まで処理される。ついで、ＤＹ６３５の量が、校正曲線に基づいて蛍光定量法によって測定された。ＤＹ６３５−ＰＬＧＡ−ＮＰは、せいぜい４分後に動脈血中で検出することができ、ＤＹ６３５−ＰＬＧＡ−ＮＰの注射後２０分までに、つまり１５分（ｍｉｎ）以内に、臓器中にほぼ完全に取り込まれた。既に説明されたように、ＤＹ６３５は最初にナノ粒子から放出されなければならず、その後ＤＹ６３５が胆汁中に分泌されるので、若干の遅延があった（図６、Ａ）。胆汁中のＤＹ６３５の（計算値）９５％回収は肝細胞に対するＤＹ６３５−ＰＬＧＡ−ＮＰの高い特異性をまた示している（図６、Ｂ）。
【００６４】
実施例７：ナノ粒子中への活性医薬成分の封入
標的化単位を用いてのポリマー又は脂質の官能化（実施例１）後、ナノ粒子を、単一乳化（Ａ）及び二重乳化（Ｂ）によって製造した。
【００６５】
（Ａ）単一乳化からのナノ粒子
親水性物質を含める場合、単一乳化技術を使用した。この場合、活性成分は、疎水性相互作用により疎水性ポリマーのコアに封入される。ついで、活性成分を、適当な有機溶媒中にポリマーと一緒に溶解した。有機溶媒は、ポリマーと活性成分の双方に対して中立である場合、すなわち、それが如何なる化学変化をもそこでもたらさず、その安定性に影響を持たない場合、適切である。酢酸エチルを本例では使用した。混合物に親水性溶液を塗布した。ナノ粒子の安定化のため、また収率を向上させるために、二重乳化ナノ粒子（二重乳化ナノ粒子参照）の場合、界面活性剤を親水性溶液に添加してもよい。二相は、試料中に垂直に浸漬された電極と同軸に放出された高エネルギー超音波で混合した。これはナノ粒子を生じた。
【００６６】
（Ｂ）二重乳化ナノ粒子
製造では、疎水性ポリマーを適切な溶媒中に高濃度で溶解させた。有機溶媒は、ポリマーと活性成分の双方に対して中立である場合、すなわち、それがそれらを化学的に変化させず、その安定性に影響を持たない場合、適切である。酢酸エチルを本例では使用した。ポリマーの濃度は、ポリマーのサイズ、疎水性、溶解性及び安定性に依存する。ここでの適当な濃度は２から５０ｍｇ／ｍＬの間である。活性成分は、適切な濃度で超純水に溶解した。活性成分の適切な濃度は、活性成分の化学的性質及びナノ粒子の容量（capacitance）に依存する。その後、有機溶媒に溶解したシェルポリマーを、水溶液中に溶解した活性成分と層化した。ポリマーと有機溶媒は、試料中に少なくとも１０倍過剰に存在していなければならなかった。外側が疎水性である粒子を、試料中に浸漬した電極と同軸に高エネルギー超音波を放出することにより形成した。それによって、活性成分は、内部のナノ粒子の親水性基との相互作用のために疎水性コアに封入された。第二工程では、適切な界面活性剤を適切な濃度で超純水に溶解させた。界面活性剤濃度は、それが十分なナノ粒子を生成する場合は適切である。濃度は周囲条件に依存し、実験的に決定されなければならない。これは通常０．０１から５％（ｗ／ｖ）の間である。ついで、ポリマーの濃度が開始量の僅か少なくとも１／１０になるように十分な界面活性剤を試料に加えた。再び二相を形成し、試料中に垂直に浸漬された電極と同軸に放出された高周波超音波により混合した。 界面活性物質（界面活性剤）、すなわち、本例ではポリビニルアルコールを混合することによって、水溶性ナノスケール粒子の形成が確実となった。
【００６７】
例証のために、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と複合化された親水性の低分子干渉型ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）がＰＬＧＡナノ粒子中に封入されたバッチを記載する。ＰＬＧＡは、２００鎖毎に一つの鎖が色素分子を担持するように、最初にＤＹ−６３５で修飾した：
（１）２．４μＬのＰＥＩ（１ｍｇ／ｍＬ）を２μＬのｓｉＲＮＡ（１μｇ／μＬ）と混合し、４５．６μＬの超純水と混合した。混合物は、アニオン性ｓｉＲＮＡとカチオン性ＰＥＩが互いに相互作用し、ＰＥＩが密なメッシュ網目状にｓｉＲＮＡに結合しこれを安定化させるので、ポリプレックスとして以下では称される。
（２）３２５ｍｇのＤＹ−６３５共役ＰＬＧＡを全１２．３５μＬの酢酸エチル中に溶解させた。
（３）（２）からの９０μＬのポリマー溶液を（１）からの５０μＬのポリプレックスと、高周波数の超音波（上記のように放出）を用いて混合した。
（４）超純水中１ｍＬのＰＶＡ０．３重量％を混合物に添加し、これをついで超音波に曝露した。
（５）得られたナノ粒子を精製し、凍結乾燥した。
【００６８】
精製（（Ａ）及び（Ｂ）に対して）
このようにして製造されたナノ粒子は、容器のサイズと材料、超音波の強度及び物質濃度の関数である直径を有しており、１２０から２２０ｎｍのサイズを有していた。安定した条件下で、ナノ粒子の製造後、溶媒を除去した。過剰の界面活性剤を除去するために、ナノ粒子を、遠心分離し、上清を除去し、滅菌された超純水中でナノ粒子を再懸濁することによって数回（少なくとも２回）洗浄した。ついで、粒子を凍結乾燥し、その質量を測定した。
【００６９】
実施例８：リポソーム中への活性医薬成分の封入
標的化単位を用いてのポリマー又は脂質の官能化（実施例１）後、リポソームを、次のようにして製造した：
１．例えば、クロロホルム／メタノール（２：１ｖｏｌ／ｖｏｌ）中の１：１のＤＯＰＣ：ＤＳＰＣ（１，２−ジオレオリル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン：１，２−ジステアロール−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリン）＋３０％のコレステロール＋５％のＮ−ｄｏｄ−ＤＯＰＥからの５０ｍＭの脂質溶液の製造。使用前に、ＤＯＰＣをポリメチン色素で修飾することができる。
２．ロータリーエバポレーターでのクロロホルム／メタノール溶媒の蒸発（およそ３０分、９０ｒｐｍ）。
３．ついで、脂質を１ｍＬの７：３ｖｏｌ／ｖｏｌ混合ＤＭＳＯ：ＥｔＯＨに溶解した。
４．ついで、活性成分として親水性デキストランを適当な緩衝液、つまりＰＢＳ（リン酸緩衝溶液）に溶解し、１ｍｇ／ｍＬの濃度を得た。
５．ついで、０．３ｍＬの脂質溶液をデキストラン溶液に滴下して加え、滴下中、磁気撹拌器で７５０ｒｐｍに撹拌を維持した。
６．ついで、リポソームを小型押出機で分離した。
７．次に、のリポソーム溶液を１ｍＬの容器に分割し、交互に液体窒素で凍結させ、ついで熱水で１０回解凍した。
８．次に、リポソームを押出機で１０回分離した。
９．ついで、リポソームを、１６時間ＰＢＳに対して調製透析カセット（ＭＷＣＯ＝２０ｋＤａ）で透析した。
１０．次に、リポソームを凍結乾燥し、貯蔵し又は使用した。
【００７０】
実施例９：ＤＹ−６３５修飾ナノ構造送達系でのＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＣＲ）に対するｓｉＲＮＡの臓器特異的輸送によるコレステロール生合成への影響
雄ＦＶＢ／ＮＲｊマウス（１０週齢）を、１ｋｇ体重当たり６．５μｇのナノ構造送達系を注射する静脈内注射によって、ＤＹ−６３５修飾ナノ構造送達系を用いて２４時間の間隔で２回処置した。送達系は、実施例７（Ｂ）に記載のようにして製造し、ＨＭＧＣＲに対する３μｇのｓｉＲＮＡ又は３μｇのスクランブルｓｉＲＮＡ（効果なしのｓｉＲＮＡ）を製造するために１０８μｇのＰＥＩで修飾されたＰＬＧＡを３ｍｇのＤＹ−６３５に封入した。二回目の注射から１６時間後に動物を痛みを伴わせずに安楽死させ、血液と臓器の両方を分析のため取り除いた。血液を、ヘパリンリチウムモノベット（monovette）で取出し、血漿に処理した。治療の有効性を決定するために、総コレステロールを血漿中において定量し、特異性のために、様々な臓器における遺伝子発現の変化をｑＰＣＲで定量した。これらの値を、健康なＦＶＢ／ＮＲｊマウス（１０週齢）及び対照群のコレステロール及びＨＭＧＣＲ発現レベルと比較した。比較群は次の構成であった：
−  ＤＹ−６３５で修飾され、よって肝細胞特異的ナノ構造送達系と、効果のないスクランブルｓｉＲＮＡを用いた処置；
−  如何なるＤＹ−６３５修正も含んでいないがその他は治療コンストラクトと異ならなかったナノ構造送達系を用いた処置；
−  動物は５％グルコース溶液のみを受けた。
【００７１】
実施例１０：肝細胞トランスポーターとのＤＹ−６３５の相互作用の検出
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞をヒト組織特異的な肝細胞トランスポーターでトランスフェクトした。ついで、これら組織特異的トランスポーター中への標的化単位としてのポリメチン色素ＤＹ−６３５の取込みを図１０Ａでは調査した。このために、細胞を９６ウェルプレート上に播種し、標準条件下で２４時間インキュベートし、ついで、培地を変えた後、ＤＹ−６３５と共に５分インキュベートした（ウェルの最終濃度：１０μｍｏｌ／Ｌ）。次に、細胞を溶解し、ライセートを蛍光定量法で測定した。取り込まれたＤＹ−６３５の量を、対照のために特異的に阻害されている各トランスポーターを使用してＤＹ−６３５標準曲線によって定量した（使用された阻害剤及び最終濃度は次の表３に示す）。この実験では、ＤＹ−６３５がＮＴＣＰの基質であることが見出された。ＯＣＴ１による取込みは無視できるとして評価することができる。図１０Ｂにおいて、ＤＹ−６３５が阻害剤として側底膜型肝細胞トランスポーターに結合するかどうかの問題を調べた。この目的のために、組織特異的トランスポーターでトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を播種し、上記のようにしてインキュベートした。２４時間後、細胞を、放射性標識トランスポーター特異的基質あるいは特異的阻害剤又はＤＹ−６３５を含む放射性特異的基質（１０μｍｏｌ／Ｌの最終濃度）の何れかと共に５分間インキュベートした（基質とその濃度は以下の表３に示される）。ついで、細胞を洗浄し、ウェルで溶解した。取込みを定量化するために、基質の放射線放出を使用した。ここでは、ＤＹ−６３５がＯＡＴＰ１Ｂ１及びＯＡＴＰ１Ｂ３に対する強力な指示薬であることが見出された。ＯＡＴ２及びＯＣＴ１もまたＤＹ−６３５によって阻害される。これは、組織特異的肝細胞トランスポーターとのＤＹ−６３５の強力な相互作用を例証している。ナノ構造トランスポーター系の表面へのＤＹ−６３５の曝露により肝細胞の細胞表面上での固定化が起こり、続くナノ粒子のエンドサイトーシスを生じると結論付けることができる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
2020111579.tif 000022
【図８−２】
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【図８−３】
2020111579.tif 000024
【図８−４】
2020111579.tif 000025
【図８−５】
2020111579.tif 000026
【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年3月16日(2020.3.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発明の詳細な説明に記載の発明。
【外国語明細書】
2020111579000001.pdf