(57)【要約】【課題】構造安定性および温度応答性を有するナノ構造体を実現すること。【解決手段】親水性ブロックと疎水性ブロックとを含む第１の両親媒性分子が複数個集合して構成される第１の領域と、第１の両親媒性分子とは異なる第２の両親媒性分子が複数個集合して構成される第２の領域とを含む壁部で囲まれている中空体であって、上記壁部の第２の領域が固相から液相に転移する相転移温度において上記第１の領域は固相である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性ブロックと疎水性ブロックとを含む第１の両親媒性分子が複数個集合して構成される第１の領域と、第１の両親媒性分子とは異なる第２の両親媒性分子が複数個集合して構成される第２の領域とを含む壁部で囲まれている中空体であって、
上記壁部の第２の領域が固相から液相に転移する相転移温度において上記第１の領域は固相である、ナノ構造体。
【請求項２】
親水性ブロックと疎水性ブロックとを含む第１の両親媒性分子が複数個集合して構成される第１の領域と、第１の両親媒性分子とは異なる第２の両親媒性分子が複数個集合して構成される第２の領域とを含む壁部で囲まれている中空体であって、
上記第１の両親媒性分子は、親水性ペプチドブロックと疎水性ペプチドブロックとを含む両親媒性ペプチド鎖であり、
上記第２の両親媒性分子は、脂質である、ナノ構造体。
【請求項３】
上記第２の両親媒性分子は、脂質である、請求項１に記載のナノ構造体。
【請求項４】
上記第２の両親媒性分子は、リン脂質である、請求項３に記載のナノ構造体。
【請求項５】
上記第１の両親媒性分子は、親水性ペプチドブロックと疎水性ペプチドブロックとを含む両親媒性ペプチド鎖である、請求項１、３又は４に記載のナノ構造体。
【請求項６】
上記疎水性ペプチドブロックがヘリックス構造を形成している、請求項５に記載のナノ構造体。
【請求項７】
２５℃で動的光散乱法によって測定した、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４の生理食塩水中の平均流体力学的直径が１０〜５００ｎｍである、請求項１〜６の何れか１項に記載のナノ構造体。
【請求項８】
上記第１の両親媒性分子と上記第２の両親媒性分子との占有表面積の比は、４０：６０〜９５：５である、請求項１〜７の何れか１項に記載のナノ構造体。
【請求項９】
剤を保持している、請求項１〜８の何れか１項に記載のナノ構造体。
【請求項１０】
請求項９に記載のナノ構造体を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れか１項に記載のナノ構造体の製造方法であって、
上記第１の両親媒性分子と、上記第２の両親媒性分子とを含む水系媒体を加熱して、中空体を作製する工程を含む、ナノ構造体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノ構造体、およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年ナノテクノロジーの重要性が高まっており、ナノサイズ物質特有の性質を活かした種々の新規機能性材料が開発されてきた。このようなナノサイズの機能性材料は、エネルギー、エレクトロニクス、および医薬等の幅広い分野への応用が期待されている。例えば、医薬分野においては、リン脂質からなるナノ粒子であるリポソーム等が、薬剤送達システム（ＤＤＳ）におけるキャリアとして利用されている。
【０００３】
また、ペプチドで構成されるナノ構造体として、非特許文献１には、親水性ブロックと疎水性ヘリックスブロックとを有する両親媒性ペプチド鎖を用いて種々の形状のペプチドナノ構造体を作製したことが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】M Ueda et al., Advances in Biosinpired and Biomedical Materials, volume 1, 19-30 (2017)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
より効率的に薬剤を送達しうるキャリアの開発が望まれる。そこで、本発明の一態様は、構造安定性および温度応答性を有するナノ構造体を実現することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係るナノ構造体は、親水性ブロックと疎水性ブロックとを含む第１の両親媒性分子が複数個集合して構成される第１の領域と、第１の両親媒性分子とは異なる第２の両親媒性分子が複数個集合して構成される第２の領域とを含む壁部で囲まれている中空体であって、上記壁部の第２の領域が固相から液相に転移する相転移温度において上記第１の領域は固相である。
【０００７】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係るナノ構造体は、親水性ブロックと疎水性ブロックとを含む第１の両親媒性分子が複数個集合して構成される第１の領域と、第１の両親媒性分子とは異なる第２の両親媒性分子が複数個集合して構成される第２の領域とを含む壁部で囲まれている中空体であって、上記第１の両親媒性分子は、親水性ペプチドブロックと疎水性ペプチドブロックとを含む両親媒性ペプチド鎖であり、上記第２の両親媒性分子は、脂質である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の一態様によれば、構造安定性および温度応答性を有するナノ構造体を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ナノ構造体の一例を示す模式図である。
【図２】ナノ構造体の製造方法の一例を示す模式図である。
【図３】実施例１におけるＴＥＭ画像（Ａ〜Ｄ、Ｆ〜Ｉ）、ｃｒｙｏ−ＴＥＭ画像（Ｅ）、およびＤＬＳ分析の結果（Ｊ）を示す図である。
【図４】実施例１におけるＴＥＭ画像を示す図である。
【図５】実施例１におけるＴＥＭ画像を示す図である。
【図６】実施例１におけるＴＥＭ画像およびＤＬＳ分析の結果を示す図である。
【図７】実施例２におけるＣＤ測定の結果を示す図である。
【図８】実施例２におけるＣＤ測定の結果を示す図である。
【図９】実施例３におけるＦＲＥＴ解析の結果を示す図である。
【図１０】実施例３におけるＬａｕｒｄａｎテストの結果を示す図である。
【図１１】実施例３におけるＬａｕｒｄａｎテストおよびＤＳＣ測定の結果を示す図である。
【図１２】実施例４における放出実験の結果を示す図である。
【図１３】実施例４における放出実験の結果を示す図である。
【図１４】実施例４における放出実験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（概要）
本発明の一態様に係るナノ構造体は、親水性ブロックと疎水性ブロックとを含む第１の両親媒性分子が複数個集合して構成される第１の領域と、第１の両親媒性分子とは異なる第２の両親媒性分子が複数個集合して構成される第２の領域とを含む壁部で囲まれている中空体であって、上記壁部の第２の領域が固相から液相に転移する相転移温度において上記第１の領域は固相である。本発明の一態様に係るナノ構造体は、構造安定性および温度応答性といった機能を有する。
【００１１】
本発明の他の態様に係るナノ構造体は、親水性ブロックと疎水性ブロックとを含む第１の両親媒性分子が複数個集合して構成される第１の領域と、第１の両親媒性分子とは異なる第２の両親媒性分子が複数個集合して構成される第２の領域とを含む壁部で囲まれている中空体であって、上記第１の両親媒性分子は、親水性ペプチドブロックと疎水性ペプチドブロックとを含む両親媒性ペプチド鎖であり、上記第２の両親媒性分子は、脂質である。
【００１２】
（第１の両親媒性分子）
第１の両親媒性分子としては、両親媒性ペプチド鎖等が挙げられる。なお、以下、第１の両親媒性分子が有する親水性ブロックを「第１の親水性ブロック」と称し、第１の両親媒性分子が有する疎水性ブロックを「第１の疎水性ブロック」と称する場合がある。
【００１３】
「第１の親水性ブロック」とは、親水性を示す領域を指す。第１の親水性ブロックが有する「親水性」という物性の具体的な程度は、特に限定されないが、少なくとも、第１の親水性ブロックが、第１の両親媒性分子の他の領域と比較して相対的に親水性が強い領域であり、当該他の領域と共に両親媒性分子を形成することによって、第１の両親媒性分子全体として両親媒性を実現することが可能となる程度の親水性を有していればよい。あるいは、第１の両親媒性分子が媒体中で自己組織化して、自己集合体を形成することが可能となる程度の親水性を有していればよい。
【００１４】
「第１の疎水性ブロック」とは、疎水性を示す領域を指す。第１の疎水性ブロックが有する「疎水性」という物性の具体的な程度は、特に限定されないが、少なくとも、第１の疎水性ブロックが、第１の両親媒性分子の他の領域と比較して相対的に疎水性が強い領域であり、当該他の領域と共に第１の両親媒性分子を形成することによって、第１の両親媒性分子全体として両親媒性を実現することが可能となる程度の疎水性を有していればよい。あるいは、第１の両親媒性分子が媒体中で自己組織化して、自己集合体を形成することが可能となる程度の疎水性を有していればよい。
【００１５】
一例では、「第１の親水性ブロック」と「第１の疎水性ブロック」とは、両親媒性分子内で互いに隣接している。一例では、「第１の親水性ブロック」と「第１の疎水性ブロック」とは、一方が鎖状の両親媒性分子の一端側に、他方が当該両親媒性分子の他端側に配されている。
【００１６】
（両親媒性ペプチド鎖）
本明細書において「ペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合した化合物を指す。本明細書において「アミノ酸」は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、およびそれらの修飾および／または化学的変更による誘導体を包含する概念であり、また、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸等を包含する。好ましくは、α−アミノ酸である。本発明において「両親媒性ペプチド鎖」は、ペプチドをベースとする両親媒性の分子であり、一部にペプチド以外の構成要素が存在していてもよい。そのような構成要素として、例えば、Ｎ末端またはＣ末端の修飾、ブロック間の非ペプチドリンカー等が挙げられる。
【００１７】
「親水性ペプチドブロック」とは、親水性を示す領域を指し、一部にペプチド以外の構成要素が存在していてもよい。親水性ペプチドブロックが有する「親水性」という物性の具体的な程度は、特に限定されないが、少なくとも、親水性ペプチドブロックが、両親媒性ペプチド鎖の他の領域と比較して相対的に親水性が強い領域であり、当該他の領域と共に両親媒性ペプチド鎖を形成することによって、両親媒性ペプチド鎖全体として両親媒性を実現することが可能となる程度の親水性を有していればよい。あるいは、両親媒性ペプチド鎖が媒体中で自己組織化して、自己集合体を形成することが可能となる程度の親水性を有していればよい。
【００１８】
親水性ペプチドブロックを構成するアミノ酸の種類は特に限定されない。親水性ペプチドブロックを構成するアミノ酸としては、例えば、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）、リジン、およびヒスチジン等が挙げられる。「親水性」は、例えば、親水性ペプチドブロックを構成するアミノ酸の側鎖による水素結合によってもたらされてもよいし、親水性ペプチドブロックを構成するアミノ酸の主鎖のカルボニル基による水素結合によってもたらされてもよい。親水性ペプチドブロックを構成するアミノ酸は、非イオン性（電荷がない）であることが好ましい。水和による親水性の方がイオンによる親水性よりも弱いため、親水性ペプチドブロックの長さを選択することによって自己集合体の形状をコントロールし易いという利点がある。また、ナノ構造体の表面が非イオン性のポリマーで覆われることで、生体内において異物として認識されにくいという利点がある。このような非イオン性アミノ酸として、サルコシンが好ましい。
【００１９】
親水性ペプチドブロックは複数種のアミノ酸から構成されていてもよい。親水性ペプチドブロックを構成するアミノ酸の種類および比率は、親水性ペプチドブロック全体として親水性となるように当業者によって適宜決定される。
【００２０】
親水性ペプチドブロックを構成するアミノ酸の数は、特に限定されないが、５〜８０個が好ましく、１５〜４０個がより好ましく、２０〜３５個がさらに好ましく、一例においては２６個が特に好ましい。アミノ酸の数が５個以上である場合、親水性の度合いが十分となり、自己集合体が目的の形状を取り易くなり得る。また、アミノ酸の数が８０個以下である場合、親水性ブロックが大きくなり過ぎず、自己集合体が目的の形状を取り易くなり得る。
【００２１】
「疎水性ペプチドブロック」とは、疎水性を示す領域を指し、一部にペプチド以外の構成要素が存在していてもよい。疎水性ペプチドブロックが有する「疎水性」という物性の具体的な程度は、特に限定されないが、少なくとも、疎水性ペプチドブロックが、両親媒性ペプチド鎖の他の領域と比較して相対的に疎水性が強い領域であり、当該他の領域と共に両親媒性ペプチド鎖を形成することによって、両親媒性ペプチド鎖全体として両親媒性を実現することが可能となる程度の疎水性を有していればよい。あるいは、両親媒性ペプチド鎖が媒体中で自己組織化して、自己集合体を形成することが可能となる程度の疎水性を有していればよい。
【００２２】
疎水性ペプチドブロックを構成するアミノ酸の種類は特に限定されないが、好ましくは疎水性アミノ酸である。疎水性ペプチドブロックを構成するアミノ酸としては、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、チロシン、トリプトファン、アミノイソ酪酸、ノルロイシン、α−アミノ酪酸、およびシクロヘキシルアラニン等が挙げられる。疎水性ペプチドブロックは、ヘリックス構造を形成していることが好ましい。ヘリックス構造を形成している場合、構造が強固であり、稠密に平行に配向するという利点がある。このようなヘリックス構造を形成するものとして、ロイシン−アミノイソ酪酸、ポリアラニン、ポリグリシン、およびポリプロリン等が挙げられる。
【００２３】
疎水性ペプチドブロックは複数種のアミノ酸から構成されていてもよい。疎水性ペプチドブロックを構成するアミノ酸の種類および比率は、疎水性ペプチドブロック全体が疎水性となるように当業者によって適宜決定される。
【００２４】
疎水性ペプチドブロックを構成するアミノ酸の数は、特に限定されないが、８〜３０個が好ましく、８〜２０個がより好ましく、１２〜１６個がさらに好ましく、一例においては１４個または１６個が特に好ましい。
【００２５】
親水性ペプチドブロックと疎水性ペプチドブロックとの長さの比率は、特に限定されないが、アミノ酸の個数比で１：１〜３：１であることが好ましい。
【００２６】
親水性ペプチドブロックと疎水性ペプチドブロックとは、どちらがＮ末端側であってもよいが、合成の容易性の観点から、親水性ペプチドブロックがＮ末端側であることが好ましい。
【００２７】
また、親水性ペプチドブロックと疎水性ペプチドブロックとは、リンカーを介して結合していてもよいし、リンカーを介さず直接結合していてもよい。リンカーはペプチドから構成されるものでもよいし、非ペプチドのものでもよい。
【００２８】
また、両親媒性ペプチド鎖のＮ末端およびＣ末端は、安定性（ｐＨや温度等の条件によって分子が変化することなく外部環境に対して安定なナノ構造体が得られる）の観点から、修飾（保護）されていることが好ましい。また、両親媒性ペプチド鎖のＮ末端またはＣ末端に蛍光物質等が結合して標識されていてもよい。
【００２９】
両親媒性ペプチド鎖は、好ましい一例において、親水性ペプチドブロックがサルコシンを繰り返し単位として含み、疎水性ペプチドブロックが（ロイシン−アミノイソ酪酸）を繰り返し単位として含む。より好ましい一例において、両親媒性ペプチド鎖は、下記式（Ｉ）で表されることが好ましい。ｍは、特に限定されないが、５〜８０であることが好ましく、１５〜４０であることがより好ましく、２０〜３５であることがさらに好ましく（２０〜３０、２２〜２８、または２４〜２８等であってもよい）、特に好ましい一例では２６である。ｎは、特に限定されないが、４〜１５であることが好ましく、４〜１０であることがより好ましく、６〜８であることがさらに好ましく、特に好ましい一例では７または８である。疎水性ペプチドブロックのポリ（ロイシン−アミノイソ酪酸）は、ロイシンのキラリティーが同じである場合、ヘリックス構造を形成する。一例において、ロイシンはＬ−ロイシンである。Ｒ１としては、特に限定されないが、活性をもたない保護基が挙げられ、具体的にはケトール基およびアセチル基等が挙げられる。Ｒ２としては、特に限定されないが、活性をもたない保護基が挙げられ、具体的にはアルコキシ基（例えば、炭素数１〜４のアルコキシ基）およびベンジルエステル基等が挙げられる。
【化１】
2020111523.tif 000002
【００３０】
さらに好ましい一例において、下記式（ＩＩ）で表されることが好ましい。ｍおよびｎは、上記と同様である。
【化２】
2020111523.tif 000003
【００３１】
両親媒性ペプチド鎖の一例としては、例えば、ポリ（サルコシン）２６−ｂ−（Ｌ−Ｌｅｕ−Ａｉｂ）７（図１のＡ）、ポリ（サルコシン）２６−ｂ−（Ｌ−Ｌｅｕ−Ａｉｂ）８（Ｓ２６Ｌ１６）等が挙げられる。
【００３２】
両親媒性ペプチド鎖の合成法は、特に限定されず、公知のペプチド合成法を用いることができる。ペプチド合成は、例えば、液相法によるペプチド縮合等によって行うことができる。
【００３３】
ナノ構造体の壁部のうち第１の壁部（第１の領域）が両親媒性ペプチド鎖を含んで構成される場合、当該両親媒性ペプチド鎖は、１種類であってもよいし、複数種類であってもよい。
【００３４】
（第２の両親媒性分子）
第２の両親媒性分子は、第１の両親媒性分子とは異なる両親媒性分子を指し、例えば、脂質等が挙げられる。以下、第２の両親媒性分子が有する親水性ブロックを「第２の親水性ブロック」と称し、第２の両親媒性分子が有する疎水性ブロックを「第２の疎水性ブロック」と称する場合がある。
【００３５】
「第２の親水性ブロック」とは、親水性を示す領域を指す。第２の親水性ブロックが有する「親水性」という物性の具体的な程度は、特に限定されないが、少なくとも、第２の親水性ブロックが、第２の両親媒性分子の他の領域と比較して相対的に親水性が強い領域であり、当該他の領域と共に両親媒性分子を形成することによって、第２の両親媒性分子全体として両親媒性を実現することが可能となる程度の親水性を有していればよい。あるいは、第２の両親媒性分子が媒体中で自己組織化して、自己集合体を形成することが可能となる程度の親水性を有していればよい。
【００３６】
第２の親水性ブロックを構成する成分の種類は特に限定されない。第２の親水性ブロックを構成する成分には、例えば、リン酸基、アミン基、水酸基、カルボキシル基、硫酸基、ニトロ基等が含まれる。これらの親水性の官能基は、例えば、自身が鎖の一部又は全部を構成していてもよいし（例えば、他の官能基との結合に使われていてもよい）、他の化学構造（特に限定されないが、例えば、鎖状又は環状の炭化水素基、鎖状又は環状のエーテル基等）上に配置をされていてもよい。
【００３７】
「第２の疎水性ブロック」とは、疎水性を示す領域を指す。第２の疎水性ブロックが有する「疎水性」という物性の具体的な程度は、特に限定されないが、少なくとも、第２の疎水性ブロックが、第２の両親媒性分子の他の領域と比較して相対的に疎水性が強い領域であり、当該他の領域と共に第２の両親媒性分子を形成することによって、第２の両親媒性分子全体として両親媒性を実現することが可能となる程度の疎水性を有していればよい。あるいは、第２の両親媒性分子が媒体中で自己組織化して、自己集合体を形成することが可能となる程度の疎水性を有していればよい。
【００３８】
第２の疎水性ブロックを構成する成分の種類は特に限定されない。第２の疎水性ブロックを構成する成分には、例えば、中鎖炭化水素基；長鎖炭化水素基；１つ以上の芳香族基、脂環式基または複素環基で置換された中鎖炭化水素基や長鎖炭化水素基；等が含まれる。また、中鎖炭化水素基または長鎖炭化水素基は、飽和であっても不飽和であってもよい。第２の両親媒性分子は、第２の疎水性ブロックとして、１つの中鎖炭化水素基または長鎖炭化水素基のみを含むもの（例えば、１本鎖の脂質）であってもよいし、複数の中鎖炭化水素基または長鎖炭化水素基を含むもの（例えば、２本鎖の脂質）であってもよい。第１の両親媒性分子の種類に応じて適宜決定される。本発明に用いられる脂質は、特に限定されない。
【００３９】
中鎖炭化水素基または長鎖炭化水素基を構成する炭素の数は、特に限定されないが、５個以上であることが好ましく、１０個以上であることがより好ましく、１２個以上であることがさらに好ましい。中鎖炭化水素基または長鎖炭化水素基を構成する炭素の数は、２０個以下であることが好ましい場合があり、１８個以下であることがより好ましい場合がある。一例においては１２、１４、または１６個が特に好ましい。長鎖炭化水素基の長さは相転移温度に影響するため、所望の中空体の相転移温度に応じて適宜決定される。
【００４０】
第２の親水性ブロックと第２の疎水性ブロックとの原子数の比は、１：３〜１：５であることが好ましい。
【００４１】
一例では、「第２の親水性ブロック」と「第２の疎水性ブロック」とは、両親媒性分子内で互いに隣接している。一例では、「第２の親水性ブロック」と「第２の疎水性ブロック」とは、一方が鎖状の両親媒性分子の一端側に、他方が当該両親媒性分子の他端側に配されている。
【００４２】
（脂質）
本明細書において「脂質」とは、水系媒体中において、第２の親水性ブロックが外側（水相）に向かって配向し、第２の疎水性ブロックが内側に向かって配向して層（典型的な一例では脂質二重層）を形成し得る任意の脂肪酸誘導体を指す。「脂質」には、天然の脂質だけでなく、人工脂質も包含される。
【００４３】
脂質としては、例えば、リン脂質等が挙げられる。リン脂質としては、例えば、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ（図１のＡ））、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）等が挙げられる。
【００４４】
ナノ構造体の壁部のうち第２の壁部（第２の領域）が脂質を含んで構成される場合、当該脂質は、１種類であってもよいし、複数種類であってもよい。
【００４５】
（中空体）
本発明の一実施形態のナノ構造体は、第１の両親媒性分子（例えば、両親媒性ペプチド鎖）が複数個集合して構成される第１の壁部（壁部全体における第１の領域）と、第２の両親媒性分子（例えば、脂質）が複数個集合して構成される第２の壁部（壁部全体における第２の領域）とを含む壁部で囲まれた中空体である。第１の両親媒性分子（例えば、両親媒性ペプチド鎖）と第２の両親媒性分子（例えば、脂質）との集合の仕方は特に限定されないが、一例において、自己集合的な配向会合による。より具体的な一例では、疎水性相互作用による集合である。
【００４６】
以下、第１の両親媒性分子が両親媒性ペプチド鎖であり、第２の両親媒性分子が脂質である場合を例に説明をする。
【００４７】
第１の壁部は層構造を有していてもよく、例えば、親水性ペプチドブロックが第１の壁部の内表面層および外表面層に配置され、疎水性ペプチドブロックが第１の壁部の内部層に配置され得る。より具体的には、中空体の第１の壁部は、隣接する両親媒性ペプチド鎖において、親水性ペプチドブロックが反対側に配置されるように会合し得る。そのため、一部の両親媒性ペプチド鎖における親水性ペプチドブロックで構成される第１の親水層と、疎水性ペプチドブロックで構成される疎水層と、残りの両親媒性ペプチド鎖における親水性ペプチドブロックで構成される第２の親水層とからなる３層構造を有し得る。
【００４８】
第２の壁部は層構造を有していてもよく、例えば、第２の親水性ブロックが第２の壁部の内表面層および外表面層に配置され、第２の疎水性ブロックが第２の壁部の内部層に配置され得る。より具体的には、中空体の第２の壁部は、脂質２重層構造を有し得る。
【００４９】
第１の壁部および第２の壁部がこのような構造である場合、中空体の外表面層が親水性であるため、水との親和性が良好であり、生体への適用性がより高い。また、中空体の内表面層が親水性であるため、親水性の剤を好適に保持（好ましくは内包）することができる。また、ナノ構造体の第２の壁部が固相から液相（液晶状態を含む液体状）に転移する相転移温度未満では、両親媒性ペプチド鎖の疎水層と脂質の疎水層との疎水性相互作用により、保持した剤の漏れ出しを抑制することができる。
【００５０】
中空体において、両親媒性ペプチド鎖が複数個集合して第１の壁部を構成し、脂質が複数個集合して第２の壁部を構成する。中空体が第１の壁部と第２の壁部とを有することにより、中空体の相転移温度は、第２の壁部の相転移温度よりも高い温度を示す。中空体は、第１の壁部の堅さにより、構造安定性を有し、低い温度において固相、高い温度において液相となる第２の壁部の性質により、温度応答性を有する。構造安定性は、例えば、４℃で中空体を保存したときに、少なくとも１ヵ月間構造を維持している場合、十分な構造安定性を有しているといえる。
【００５１】
中空体は、図１のＢに示すように、第１の壁部（Peptide membrane）と第２の壁部（Lipid domain（Lipid Gate））とが相分離した構造である。つまり、中空体は、両親媒性ペプチド鎖と脂質との均一混和した構造ではない。第１の壁部と第２の壁部とが相分離した構造であることにより、第２の壁部の相転移温度以上で開くゲートのサイズを十分に確保することができる。これにより、中空体が剤を内包している場合、第２の壁部の相転移温度以上で、ゲートのサイズよりも小さい剤をゲートから放出することができる。
【００５２】
中空体が有する第１の壁部と第２の壁部の数は特に限定されず、それぞれ少なくとも１つ有していればよく、複数有していてもよい。一例では、中空体の外表面において、第２の壁部が、第１の壁部に取り囲まれた１個または複数個の島状の領域として分布している。この場合は、１つの連続した第１の壁部の中に、１個または複数個の第２の壁部が島状に分布した状態で、中空体の外表面が構成されている。中空体の外表面における第２の壁部の形状は特に限定されないが、一例では、円形状又は楕円形状である。第２の壁部の相転移温度以上になると、外表面における第２の壁部の形状に応じたゲートが開きうる。
【００５３】
中空体において、第１の両親媒性分子と第２の両親媒性分子との占有表面積の比は特に限定されないが、例えば、４０：６０〜９５：５であることが好ましく、６９：３１〜９０：１０であることがより好ましい。第１の両親媒性分子と第２の両親媒性分子とのモル比は、第１の両親媒性分子および第２の両親媒性分子の種類により適宜決定される。
【００５４】
本実施形態において、中空体の形状は特に限定されない。細胞内への取り込み易さの観点からは球状を有していることが好ましく、剤の保持性の高さの観点からは、第２の壁部が固相から液相に転移する相転移温度未満において閉じた構造（すなわち開口を有さない構造）であることが好ましい。
【００５５】
中空体の大きさは特に限定されないが、例えば、生体内利用に適した大きさという観点から、平均流体力学的直径（hydrodynamic diameter）が１０〜５００ｎｍであることが好ましく、３０〜２５０ｎｍであることがより好ましく、５０〜１００ｎｍであることがさらに好ましい。上記平均流体力学的直径は、２５℃で動的光散乱法によって測定した、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４の生理食塩水中の平均流体力学的直径である。
【００５６】
中空体における第１の壁部の厚みは、両親媒性ペプチド鎖の長さに依存し得るが、例えば、２〜１０ｎｍとすることができる。中空体における第２の壁部の厚みは、脂質の長さに依存し得るが、例えば、３〜７ｎｍとすることができる。
【００５７】
一例において、中空体は、相転移温度未満においては閉じた構造となる。また、中空体は、相転移温度以上においては脂質が複数個集合して構成される第２の壁部が液相となるため、第２の壁部においてゲートが開いた構造となる。中空体において、第２の壁部が固相から液相に転移する相転移温度は、３０〜４０℃であり、当該相転移温度において第１の壁部は固相である。生体内で中空体を、第２の壁部の相転移温度以上に温めてゲートが開いた構造にする方法としては、例えば、光（例えば赤外光）を照射すると熱を発生して周辺を温める機能を有する分子と併用することにより、中空体の温度を当該相転移温度以上にすることができる。また、中空体が、第２の壁部の相転移温度以上の温度である炎症部位に到達すると、中空体の温度が当該相転移温度以上となる。
【００５８】
上記の通り、一例では、第２の壁部が固相から液相に転移する相転移温度において、第１の壁部は固相である。換言すれば、第１の壁部は、第２の壁部と比較して、固相から液相に転移する相転移温度がより高い。第１の壁部は、第２の壁部と比較して、固相から液相に転移する相転移温度が、例えば１０℃以上高く、２０℃以上高いことが好ましい。
【００５９】
中空体は、第１の両親媒性分子（例えば、両親媒性ペプチド鎖）と、第２の両親媒性分子（例えば、脂質）とを含む水系媒体を加熱することによって作製する。例えば、図２に示すように、両親媒性ペプチド鎖と脂質とを水系媒体に分散し、次いで加熱することによって作製し得る。これにより、両親媒性ペプチド鎖と脂質とが会合して、球形状になる。このとき、上述したように、第１の壁部と第２の壁部とが相分離した構造となる。
あるいは、予め加熱した状態の水系媒体に、第１の両親媒性分子（例えば、両親媒性ペプチド鎖）と、第２の両親媒性分子（例えば、脂質）とを分散して、そのまま所定時間の加熱を継続してもよい。
【００６０】
なお、本明細書において「水系媒体」とは、水を主成分とする液体を意図する。本明細書において「水を主成分とする液体」とは、液体に占める水の体積の割合が他の成分と比較して最も多いことを指し、好ましくは液体の体積の合計の５０％を超え１００％以下の量が水であることを指す。水系媒体は、例えば、生理食塩水、注射用蒸留水、その他ｐＨ緩衝溶液等の生体に安全に適用し得る液体であることが好ましい。
【００６１】
両親媒性ペプチド鎖は予め有機溶剤（エタノール、ジメチルホルムアミド、またはメタノール等）に溶解させ、この溶液を水系媒体に添加（例えば、インジェクション）してもよい。有機溶剤は、生体に安全に適用し得る液体であることが好ましく、エタノールがより好ましい。予め有機溶剤に溶解されておくことにより、両親媒性ペプチド鎖同士が結晶ではなく解離した状態で水系媒体中に添加されるため、効率的に中空体を形成させることができる。そのため、一例において、「水系媒体」には、当該有機溶剤が含有され得る。
【００６２】
中空体の作製において、水系媒体に対する両親媒性ペプチド鎖と脂質との量は、特に限定されないが、例えば、水中への分散性の観点から、０．００１〜１００ｍｇ／ｍＬであることが好ましく、０．０１〜１０ｍｇ／ｍＬであることがより好ましい。両親媒性ペプチド鎖の量は、特に限定されないが、例えば、収率を高める観点から、脂質１モルに対して、０．５モルより多く、１２モル未満であることが好ましく、１モル以上、４モル以下であることがより好ましい。
【００６３】
水系媒体を予め下記の加熱温度に加熱をしておかない場合は、両親媒性ペプチド鎖と脂質との水系媒体への分散は、４〜３０℃で行うことが好ましい。水系媒体への分散の温度は、上記範囲内において、用いる脂質の固相から液相に転移する相転移温度に応じて、適宜設定すればよい。例えば、相転移温度が高く、室温では水系媒体と混和せず分離する脂質の場合、当該脂質の相転移温度よりも高い温度で行うことが好ましい。また、両親媒性ペプチド鎖と脂質とを均一に分散させるために、撹拌することが好ましい。
【００６４】
加熱温度は、特に限定されないが、例えば、３０〜９０℃とすることが好ましい。また、加熱時間は、特に限定されないが、例えば、１０分〜２４時間とすることが好ましい。
【００６５】
上記で球形状を有するもので説明したが、中空体の形状はこれに限られず、楕円形状等であってもよい。
【００６６】
なお、上記では第１の両親媒性分子が両親媒性ペプチド鎖であり、第２の両親媒性分子が脂質である場合を例に説明したが、第１の両親媒性分子および第２の両親媒性分子が他の分子である場合も適宜参照することができる。
【００６７】
（剤の保持）
本発明の一実施形態のナノ構造体は、剤を保持（好ましくは内包）している。本明細書において「剤を内包している」とは、剤が中空体に共有結合されることなく、中空体の内部に存在していることを指す。典型的には、剤は液体に溶解または懸濁された状態で内包されている。当該液体は、親水性の液体であり得、上述の水系媒体であり得る。
【００６８】
中空体に剤を保持（好ましくは内包）させる方法は特に限定されず、好ましい一例では、剤を含有する液体（溶液または懸濁液）中で中空体を形成させる。例えば、剤を含有する水系媒体に第１および第２の両親媒性分子（例えば、両親媒性ペプチド鎖と脂質と）を分散し、次いで加熱して中空体を作製する。あるいは、予め加熱した状態の水系媒体に、剤と、第１の両親媒性分子（例えば、両親媒性ペプチド鎖）と、第２の両親媒性分子（例えば、脂質）とを分散して、そのまま所定時間の加熱を継続してもよい。
すなわち、本実施形態のナノ構造体の製造方法は、一例において、剤と、第１の両親媒性分子（例えば、両親媒性ペプチド鎖）と、第２の両親媒性分子（例えば、脂質）とを含む水系媒体を加熱することによって、中空体の作製と剤の保持とを同時進行で行う工程を含む。この方法では、効率的且つ容易に剤を保持（好ましくは内包）させることができる。
【００６９】
剤の大きさは、中空体の内径より小さいものであれば特に限定されないが、５０ｎｍ以下であることが好ましく、２０ｎｍ以下であることがより好ましい。一例において、剤の分子量は、１０００００以下、好ましくは５００００以下、より好ましくは１００００以下である。
【００７０】
一例において、剤は親水性である。なお、「親水性の剤」には、疎水性の剤の表面を親水化処理したものも包含される。
【００７１】
剤としては、例えば、医薬、食品（特には機能性食品）における有効成分、化粧品分野における有効成分、イメージングシステム用分子プローブ、各種研究用試薬等が挙げられ、有機化合物、無機化合物、タンパク質や核酸等の生体分子等であり得る。ナノ構造体が内包している剤は、１種類であってもよいし、複数種類であってもよい。本実施形態のナノ構造体によれば、これまで単独では細胞に取り込まれない薬剤、あるいは取り込まれ難かった薬剤を、細胞に効率的に取り込ませることができる。
【００７２】
また、本実施形態のナノ構造体は、その構造中にペプチドを含むため、生分解性を有する。そのため、ナノ構造体は、生体内（例えば、細胞内）において生分解され、生体内（例えば、細胞内）において、剤が放出されてもよい。一例において、剤の放出は、例えば、１日以上、２日以上、または４日以上持続され得る。生分解は、例えば、プロテイナーゼやペプチダーゼ等のプロテアーゼによって起こり得る。
【００７３】
本実施形態のナノ構造体は、クラスリンを介したエンドサイトーシスによってエネルギー依存的に取り込まれ得る（但し、これに限定される意図ではない）。クラスリンは多くの生物種が保有するタンパク質であるため、本実施形態のナノ構造体は多くの生物種の細胞に対して利用することができる。
【００７４】
本実施形態のナノ構造体は、第１および第２の両親媒性分子（例えば、両親媒性ペプチド鎖および脂質）の種類を変えることにより、ナノ構造体の構造安定性、温度応答性、大きさ、形状、組織選択性、生体内での分解速度、内包する剤の放出特性（徐放性等）等を調節することができる。
【００７５】
（さらなる応用）
本実施形態では、ナノ構造体を含む医薬組成物も提供される。当該医薬組成物は、剤として医薬を含んでいる。医薬としては、対象疾患に適したものを特に限定することなく用いることができるが、具体的には、抗癌剤、抗菌剤、抗ウィルス剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、ステロイド剤、ホルモン剤、および血管新生阻害剤等が挙げられる。
【００７６】
医薬組成物は、投与経路は特に限定されないが、経口投与、静脈内または動脈内への血管内投与、腸内投与等の手法によって全身投与されてもよいし、経皮投与、舌下投与等の手法によって局所投与されてもよい。一例では、静脈注射で投与されることが好ましい。本実施形態の薬剤組成物を患者に投与する際の投与量は、内包される医薬の種類、対象の年齢、性別、体重、病状、投与経路、投与回数、および投与期間等に応じて適宜設定すればよい。また、投与の対象生物も特に限定されず、例えば、植物および動物が挙げられ、魚類、両生類、爬虫類、鳥類または哺乳類（哺乳動物）等の動物であることが好ましく、哺乳動物であることがより好ましい。哺乳動物の種類は特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒトを除く霊長類等の実験動物；イヌ、ネコ等の愛玩動物（ペット）；ウシ、ウマ、ブタ等の家畜；ヒトが挙げられる。
【００７７】
医薬組成物の剤型は特に限定されないが、親水性液体にナノ構造体が分散した液剤であり得る。親水性液体としては、水、アルコール、緩衝溶液等が挙げられる。また、医薬組成物は、ナノ構造体の他に、保存剤、安定化剤、緩衝剤、浸透圧調整剤、着色剤、香味料、甘味料、抗酸化剤、粘度調整剤等をさらに含んでいてもよい。
【００７８】
本実施形態のナノ構造体は、剤を内包し、細胞内に容易に取り込まれて、細胞内で剤を放出（例えば、徐放）し得る。そのゆえ、本実施形態の医薬組成物は、単独で投与する場合よりも効率的に医薬を細胞内へ送達することができるため、少ない量で長期間にわたって医薬の効果を奏し得る。
【００７９】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【実施例】
【００８０】
〔実施例１：ペプチド−脂質ハイブリッドベシクル（ＰＬＨＶ）の形態１〕
（試料調製）
ポリ（サルコシン）２６−ｂ−（Ｌ−Ｌｅｕ−Ａｉｂ）７の両親媒性ポリペプチド（以下、「Ｓ２６Ｌ１４」とも称する）およびポリ（サルコシン）２６−ｂ−（Ｌ−Ｌｅｕ−Ａｉｂ）８（Ｓ２６Ｌ１６）を既報の参考文献１、２のように合成した。Ｓ２６Ｌ１４の合成は、１ＨＮＭＲ分光法およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分光測定法によって確認した。
【００８１】
【化３】
2020111523.tif 000004
【００８２】
ペプチド−脂質ハイブリッドベシクル、ペプチド集合体、およびリポソームを、エタノールインジェクション法によって調製した。２０ｍｇのＳ２６Ｌ１４および１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）２０ｍｇをそれぞれエタノール４００μＬに溶解し、１ｍｇ／２０μＬのストック溶液とした。Ｓ２６Ｌ１４と、ＤＭＰＣとのモル比が０：１、１：４、１：２、１：１、２：１、４：１、１２：１、および１：０になるように、Ｓ２６Ｌ１４ストック溶液と、ＤＭＰＣストック溶液とを混合した。Ｓ２６Ｌ１４とＤＭＰＣとの混合物１０μＬ、Ｓ２６Ｌ１４のみ１０μＬ、およびＤＭＰＣのみ１０μＬをそれぞれ生理食塩水（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）１ｍＬに添加（インジェクション）し、２５℃で３０分間撹拌し、次いで撹拌を停止して分散液を９０℃で１時間加熱し、風冷によって室温に戻した。このようにして、Ｓ２６Ｌ１４とＤＭＰＣとのモル比が１：４、１：２、１：１、２：１、４：１、および１２：１のＳ２６Ｌ１４＋ＤＭＰＣの試料、Ｓ２６Ｌ１４のみの試料、およびＤＭＰＣのみの試料を得た（濃度は全て０．３５ｍＭ）。なお、１：４、１：２、１：１、２：１、４：１、および１２：１の比でＳ２６Ｌ１４およびＤＭＰＣを混合した混合物から調製したペプチド−脂質ハイブリッドベシクルを、それぞれＰＬＨＶ１−４、ＰＬＨＶ１−２、ＰＬＨＶ１−１、ＰＬＨＶ２−１、ＰＬＨＶ４−１、およびＰＬＨＶ１２−１と称する。
【００８３】
脂質としてＤＭＰＣの代わりに１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）または１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）を用いた以外は上述の方法と同様にして、Ｓ２６Ｌ１４と、脂質とのモル比が１：１のＳ２６Ｌ１４＋ＤＰＰＣおよびＳ２６Ｌ１４＋ＤＳＰＣの試料を得た。
【００８４】
両親媒性ポリペプチドとして、Ｓ２６Ｌ１４の代わりにＳ２６Ｌ１６を用い、混合物を９０℃の食塩水にインジェクションして３０分間撹拌し、撹拌を停止して９０℃で１時間加熱処理し、風冷によって室温に戻した以外は上述の方法と同様にして、Ｓ２６Ｌ１６とＤＭＰＣとのモル比が、１：１のＳ２６Ｌ１６＋ＤＭＰＣの試料、Ｓ２６Ｌ１６＋ＤＰＰＣの試料、およびＳ２６Ｌ１６＋ＤＳＰＣの試料を得た。
【００８５】
（透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ））
ＴＥＭ画像は、ＪＥＭ−１２３０（ＪＥＯＬ社製）を用いて、８０ｋＶの加速電圧で取得した。観察するために、分散液のドロップを炭素コートＣｕ格子（Okenshoji Co., Ltd., Japan）上に載せ、２％酢酸サマリウムで逆染色し、過剰な液体を濾紙で除去した。
【００８６】
（動的光散乱（ＤＬＳ））
生理食塩水中の分子集合体の流体力学的直径（hydrodynamic diameter）をＨｅ−Ｎｅレーザーを用いるＥＬＳＺ−２ＰＬ（大塚電子社製）によって分析した。測定は２５℃で行った。
【００８７】
（リン脂質定量測定）
ＰＬＨＶ１−１分散液を透析によって洗浄し、フリーのＳ２６Ｌ１４およびＤＭＰＣを除去した。その後、ＰＬＨＶ１−１におけるＳ２６Ｌ１４およびＤＭＰＣの濃度を、リン脂質定量測定キット（PHOSPHOLIPID C AUTOKIT 2-10 DEGC 120TST, Wako, Japan）を用いた２２０ｎｍおよび６００ｎｍにおけるＵＶ吸光度から推定した。
【００８８】
（結果および考察）
ＴＥＭ画像を図３のＡ〜ＤおよびＦ〜Ｉ、図４のＡ〜Ｆ、図５、並びに図６のＡ、Ｂに示す。図３のＡ〜ＤおよびＦ〜Ｉのスケールバー、並びに図４のＡ〜Ｃは、２００ｎｍを示す。ｃｒｙｏ−ＴＥＭ画像を図３のＥに示す。図３のＥのスケールバーは、１００ｎｍを示す。ＤＬＳの結果を図３のＪ、図６のＣ、および表１に示す。リン脂質定量測定の結果を表２に示す。
【００８９】
【表１】
2020111523.tif 000005
【００９０】
【表２】
2020111523.tif 000006
【００９１】
モル比１：１のＳ２６Ｌ１４とＤＭＰＣとの組み合わせ、およびモル比１：１のＳ２６Ｌ１６とＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、およびＤＳＰＣとの組み合わせから調製した集合体の形態を、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって観察したところ、７５ｎｍの均一な直径を有するベシクルの集合体を得た（図３のＤおよび図４のＡ〜Ｄ）。Ｓ２６Ｌ１４は、８０ｎｍの均一な直径および２００ｎｍの長さを有するナノチューブを形成した。一方、ＤＭＰＣは、１０〜１００００ｎｍの様々な直径を有するリポソームを形成した（図３のＡ）。ＰＬＨＶの集合体の構造は、それらの純成分とは明らかに異なっていた。動的光散乱（ＤＬＳ）分析も、集合体の間で様々なサイズを示した（図３のＪおよび表１）；ＰＬＨＶ、Ｓ２６Ｌ１４ナノチューブ、およびＤＭＰＣリポソームは、それぞれ直径が７６ｎｍ、１４５ｎｍ、および２２８６ｎｍであった。これらの結果は、Ｓ２６Ｌ１４とＤＭＰＣとが共集合して、ハイブリッドベシクルを形成したことを示す。ＰＬＨＶの「均一な」サイズは、おそらくハイブリッド膜内に位置する均一な湾曲部（図５）を有する湾曲したシートドメインを形成しているＳ２６Ｌ１４に起因している。
【００９２】
次に、ＰＬＨＶに関して混合比の効果を調べた。Ｓ２６Ｌ１４／ＤＭＰＣの比１：４および１：２において、リポソームのようなハイブリッド集合体が観察された。集合体のサイズは均一ではなく、５０〜２０００ｎｍの範囲であった（図３のＢおよびＣ）。ＰＬＨＶの膜厚は、ＤＭＰＣリポソームと同じであった（図３のＡ）。１：１、２：１、および４：１のモル比で、７５ｎｍの均一な直径を有するＰＬＨＶを産出した（図３のＣ〜Ｇ）。動的光散乱（ＤＬＳ）測定から、これらのＰＬＨＶは約０．１の多分散性指数を示した（表１）。一方、１２：１の混合物は、分散液において、７５ｎｍのサイズのハイブリッドベシクルだけでなく、ナノチューブも見られた（図３のＨ）。これらの形態の結果を、算出された占有表面積の比によって、以下のように説明する。Ｓ２６Ｌ１４のα−へリックスブロックおよびＤＭＰＣの占有表面積は、それぞれ１．５０ｎｍ２（参考文献３）および０．６６ｎｍ２（参考文献４、５）とみなされる。１：４のモル比については、Ｓ２６Ｌ１４：ＤＭＰＣの表面積比が３６：６４であった。この混合比においては、脂質膜側の寄与が支配的であって、リポソームのような集合体が観察された。１：１、２：１、および４：１のモル比については、Ｓ２６Ｌ１４：ＤＭＰＣの表面積比は、それぞれ６９：３１、８２：１８、および９０：１０であった（表１）。これらの比については、ＰＬＨＶの形態は、Ｓ２６Ｌ１４の寄与によって支配されていた。ＰＬＨＶ１−１におけるＳ２６Ｌ１４およびＤＭＰＣの組成比は、透析してフリーのＳ２６Ｌ１４およびＤＭＰＣを除去した後に評価した。Ｓ２６Ｌ１４の含有量は、２２０ｎｍにおける吸光度によって推定した。ＤＭＰＣの含有量は、リン脂質定量測定キットを用いて測定した。結果によると、ＰＬＨＶ１−１は、１：０．８３のモル比で、Ｓ２６Ｌ１４およびＤＭＰＣから構成され、最初のモル比１：１に近かった（表２）。
【００９３】
ＰＬＨＶ１−１のベシクルを４℃で１ヵ月間保存し、それらの構造安定性をＴＥＭ観察およびＤＬＳ分析によって評価した（図６）。ベシクルの形状は、上記期間の間維持していた。ポリペプチドリッチなハイブリッドベシクルは、一般的なリポソームと比較して、高い安定性が見られた。したがって、これらのハイブリッドベシクルは、ＤＤＳキャリアとして用いるのに十分な安定性（すなわち、少なくとも１ヵ月）を有していることが示された。
【００９４】
〔実施例２：ペプチド−脂質ハイブリッドベシクル（ＰＬＨＶ）の形態２〕
（円偏光二色性（ＣＤ））
光学距離が１ｃｍのセルを用いてＪＡＳＣＯ  Ｊ−７２０（ＪＥＯＬ社製）によってＣＤ測定を行った。データは２５℃で記録した。０．３５ｍＭの分散液をＣＤデータ収集前に５倍に希釈し、測定試料とした。
【００９５】
（結果および考察）
ＣＤ測定の結果を図７および８に示す。
【００９６】
ＰＬＨＶ１−１、ＰＬＨＶ４−１、Ｓ２６Ｌ１４ナノチューブ、およびＤＭＰＣリポソームの分散液の円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルから、ハイブリッドベシクルにおいてペプチドドメインの存在が示された。データから、Ｓ２６Ｌ１４ナノチューブおよびＰＬＨＶの両方とも、２２２ｎｍおよび２０８ｎｍに２つの極小を有する、α−へリックスの配置の特性を示した（図７）。ＰＬＨＶ１−１、ＰＬＨＶ４−１、およびＳ２６Ｌ１４ナノチューブのθ２２２／θ２０８比は、それぞれ１．２４、１．４９、および１．６９であった。比の値＞１はα−へリックスの束の形成を示すので（参考文献６、７）、Ｓ２６Ｌ１４が堅くパッキングしていることは明らかである。ＰＬＨＶについてのθ２２２／θ２０８比に見られた減少は、Ｓ２６Ｌ１４膜に挿入したＤＭＰＣがナノチューブを形成したＳ２６Ｌ１４のパッキングを緩めているためのものである。これは、ＰＬＨＶ１−１およびＰＬＨＶ４−１は、ナノチューブを形成していないが、球状のベシクルを形成しているという結果である。さらに、２６℃、３８℃、および４２℃における、ＰＬＨＶ１−１、ＰＬＨＶ４−１、およびＳ２６Ｌ１４集合体のＣＤスペクトルは、温度がペプチドの二次構造および束形成に影響を及ぼさないことを示した（図８）。
【００９７】
〔実施例３：相分離および相転移〕
（蛍光分光計）
ＪＡＳＣＯ  ＦＰ−６５００蛍光分光計（ＪＥＯＬ社製）を用いて、２５℃、透過型セルで、集合させた分散液の蛍光スペクトルを得た。
【００９８】
（ＦＲＥＴ（Forster共鳴エネルギー転移）解析）
ＰＬＨＶの均一性／不均一性を調べるために、Ｎ−（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル）−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＮＢＤ−ＰＥ）およびＮ−（ｌｉｓｓａｍｉｎｅローダミン  Ｂ  スルホニル）−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（Ｒｈｏｄ−ＰＥ）を用いて、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）分析を行った。ＦＲＥＴ測定で、ＮＢＤ−ＰＥおよびＲｈｏｄ−ＰＥは、それぞれドナーおよびアクセプターとして振る舞う。
【００９９】
分光計（Microplate Flash Reader, PerkinElmer, Waltham, MA, USA）を用いて、ベシクルのＦＲＥＴ実験を行った。ＮＢＤ−ＰＥ／ローダミン（Ｒｈｏｄ）−ＰＥドナー／アクセプター対について、励起波長を４６０ｎｍにセットし、４８０〜６５０ｎｍの放出スペクトルを得た。既知の濃度のドナーおよびアクセプターでラベルされたベシクルを含むリポソームにおいてＦＲＥＴを測定した。
【０１００】
０．８ｍｏｌ％のＮＢＤ−ＰＥおよびＲｈｏｄ−ＰＥでハイブリッドベシクルをラベルした。要するに、ポリペプチドおよびＤＭＰＣから構成されるハイブリッドベシクルについて、Ｓ２６Ｌ１４、ＤＭＰＣ、ＮＢＤ−ＰＥ、およびＲｈｏｄ−ＰＥのストックエタノール溶液を所望の比（Ｓ２６Ｌ１４：ＤＭＰＣ：ＮＢＤ−ＰＥ：Ｒｈｏｄ−ＰＥ＝７３：７３：０．５８：０．５８または０ｎｍｏｌ）になるように混合し、同時に生理食塩水（１ｍＬ）に添加（インジェクション）した。これにより、Ｓ２６Ｌ１４（７３ｎｍｏｌ）、ＤＭＰＣ（７３ｎｍｏｌ）、およびＮＢＤ−ＰＥ（０．５８ｎｍｏｌ）を含み、かつ、Ｒｈｏｄ−ＰＥ（０．５８ｎｍｏｌ）を含む／含まないＰＬＨＶ１−１試料を調製した。次いで、実施例１に記載した方法と同様に、混合物を撹拌し、加熱した。同様に、ＦＲＥＴ解析のためのコントロール試料として、特定の混合比（ＤＭＰＣ：ＮＢＤ−ＰＥ：Ｒｈｏｄ−ＰＥ＝７３：０．５８：０．５８または０ｎｍｏｌ、および１４６：０．５８：０．５８または０ｎｍｏｌ）を有する、ＮＢＤ−ＰＥおよびＲｈｏｄ−ＰＥを含む２種類のＤＭＰＣリポソーム試料を調製した。以下、ＮＢＤ−ＰＥ（０．５８ｎｍｏｌ）を含み、かつ、Ｒｈｏｄ−ＰＥ（０．５８ｎｍｏｌ）を含む／含まない、７３ｎｍｏｌ／ｍＬのＤＭＰＣリポソームを「ＤＭＰＣ−７３」とも称し、１４６ｎｍｏｌ／ｍＬのＤＭＰＣリポソームを「ＤＭＰＣ−１４６」とも称する。
さらに、アクセプターの非存在下および存在下におけるＦＲＥＴ効率Ｅを下記式（１）に従って計算するために、各ドナー（ＮＢＤ−ＰＥのみ）ラベルされたベシクルも調製した。
【０１０１】
Ｅ（％）＝（ＩＤ−ＩＤＡ）／（ＩＤ）×１００    …（１）
ここで、ＩＤは、ドナーのみでラベルされたベシクルを含むサンプルのドナー強度であり、ＩＤＡは、ドナーおよびアクセプターの両方でラベルされたベシクルのドナー強度である。
【０１０２】
（Ｌａｕｒｄａｎテスト）
ＰＬＨＶ、Ｓ２６Ｌ１４ナノチューブ、およびＤＭＰＣリポソームの膜の流動性をＮ，Ｎ−ジメチル−６−ドデカノイル−２−ナフチルアミン（Ｌａｕｒｄａｎ）で測定した。Ｌａｕｒｄａｎは、周囲の環境の極性に感受性の高い蛍光色素である。全体の分極値ＧＰ３４０は、下記式（２）によって算出される。
【０１０３】
ＧＰ３４０＝（Ｉ４４０−Ｉ４９０）／（Ｉ４４０＋Ｉ４９０）    …（２）
ここで、Ｉ４４０およびＩ４９０は、３４０ｎｍで励起したＬａｕｒｄａｎの４４０ｎｍおよび４９０ｎｍでの発光強度である。循環水槽によって、温度範囲は１０〜４２℃に制御した。
【０１０４】
（示差走査熱量（ＤＳＣ））
ＤＳＣはリポソームおよび他の分子の相転移を検出するのに広く用いられている。所望の濃度の２０μＬの自己集合したハイブリッドベシクル、ＤＭＰＣリポソーム、またはペプチドナノチューブを蓋で密閉したアルミニウムパン上に置いた。生理食塩水のみを置いた参照試料パンも用いた。走査試料の温度範囲は１℃／分の加熱率で１０〜６０℃とした。
【０１０５】
（結果および考察：相分離）
ＦＲＥＴ解析の結果を図９に示し、Ｌａｕｒｄａｎテストの結果を図１０に示す。
【０１０６】
ＰＬＨＶ１−１において、４６０ｎｍでのＮＢＤ−ＰＥの励起は、Ｒｈｏｄ−ＰＥの強い発光強度を伴う蛍光スペクトルを与え（図９のＡ）、ＦＲＥＴ効率はＤＭＰＣ−７３分散液と同様であった（図９のＢ）。ＰＬＨＶ１−１およびＤＭＰＣ−１４６におけるＦＲＥＴ色素対の濃度は同じであるものの、ＦＲＥＴ効率は色素／脂質比がより高いＤＭＰＣ−７３の系に近かった（図９のＣ）。このことから、図９のＣに示すように、ＰＬＨＶ１−１は不均一相分離した膜を有し、ＤＭＰＣおよびＳ２６Ｌ１４ドメインの両方が存在していることが明らかとなった。
【０１０７】
Ｌａｕｒｄａｎ剤（Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−ドデカノイル−２−ナフチル−アミン）は、リポソームの不均一性をモニターするための分子プローブとしても用いることができる（参考文献８〜１０）。Ｌａｕｒｄａｎは、秩序液体相（Ｌｏ相）および無秩序液体相（Ｌｄ相）における脂質膜から生じた、それぞれ４４０ｎｍおよび４９０ｎｍにおける特定の発光ピークを示す（参考文献９、１０）。図１０は、４２℃での、ＰＬＨＶ１−１、ＰＨＬＶ４−１、Ｓ２６Ｌ１４ナノチューブ、およびＤＭＰＣリポソーム分散液におけるＬａｕｒｄａｎの蛍光スペクトルを示す。ＤＭＰＣ分散液において、４９０ｎｍで単一ピークが観測され、Ｓ２６Ｌ１４ナノチューブの分散液において、４４０ｎｍで単一ピークが観測された。これらの結果は、ＤＭＰＣリポソームおよびＳ２６Ｌ１４ナノチューブが、それぞれ均一な無秩序相および秩序相を示した。一方、ＰＬＨＶ１−１およびＰＨＬＶ４−１は、４４０ｎｍおよび４９０ｎｍの両方で発光ピークを示し、ハイブリッドベシクルにおける無秩序なＤＭＰＣドメインおよび秩序のあるＳ２６Ｌ１４ドメインの共存在を示した。
【０１０８】
（結果および考察：相転移）
３４０ｎｍの励起光を用いることによって、４４０ｎｍおよび４９０ｎｍにおけるＬａｕｒｄａｎの発光強度から計算された、全体の分極ＧＰ３４０値は、膜表面の水和の度合いの有用な指標として示されている（式（２））（参考文献１１、１２）。温度の関数としてのＧＰ３４０値を調べて、相転移温度を評価した。１０〜４２℃のＳ２６Ｌ１４ナノチューブのＧＰ３４０値は一定であり、当該温度範囲に亘って相転移温度（Ｔｍ）は示されなかった（図１１のＡ）。一方、ＤＭＰＣのＧＰ３４０値は〜２５℃において劇的な変化が見られ、ＤＭＰＣの既知のＴｍに対応していた。ＰＬＨＶ１−１およびＰＬＨＶ４−１のＧＰ３４０値は、〜３５℃において減少が見られた。膜の相転移を確認するために、示差走査熱量（ＤＳＣ）測定も行った。ＰＬＨＶ１−１およびＤＭＰＣリポソームのサーモグラムは、ＰＬＨＶ１−１が３８度の相転移温度を有し、ＤＭＰＣリポソームが〜２３℃の値を有していることが示された（図１１のＢ）。さらに、ＤＳＣ分析の結果も、Ｓ２６Ｌ１４ナノチューブは１４〜４６℃に相転移温度を有していないことを示した（図１１のＢ）。上述したように、様々な温度におけるＰＬＨＶのＣＤスペクトル（図８）は、４２℃は、ＰＬＨＶにおけるペプチドの二次構造およびペプチド間の束形成に影響を与えないことを示した。これらの結果による考察によると、脂質ドメインおよびＳ２６Ｌ１４に相当するハイブリッドベシクルの相転移は、スペクトルに影響を与えなかった。
【０１０９】
３８℃におけるＰＬＨＶの相転移は、ＰＬＨＶが相分離したＤＭＰＣおよびＳ２６Ｌ１４ドメインを有しており、Ｓ２６Ｌ１４ドメインが上述した温度範囲に亘ってＴｍを有していなかったため、ＤＭＰＣドメインによるものである。１３℃の大きなＴｍのシフトは、Ｓ２６Ｌ１４の堅いヘリックス束のドメインによって囲まれている点、小さなＤＭＰＣドメインである点から生じている。参考文献１３、１４には、様々なサイズの脂質ナノディスクを用いて、サイズがより小さい脂質ドメインが、よりＴｍ値が高くなることを報告されている。これらの研究によると、１０℃のＴｍのシフトは、ドメイン内の脂質において協同性を失うことによるものであり、その小さいサイズ、および、周りのドメインの環境と境界に位置する脂質との相互作用によるものであった。追加の３℃のＴｍのシフトは、脂質ドメインに挿入されたペプチドの小さな一部分から生じている、または脂質ドメインを囲むペプチド膜の堅さによるものであると仮定している。
【０１１０】
興味深いことに、Ｌａｕｒｄａｎテストによると、ＰＬＨＶ１−１と比べて、ＰＬＨＶ４−１はわずかに大きな相転移温度のシフトを示した（図１１のＡ）。このわずかな相転移シフトの原因として考えられるＰＬＨＶの２つの可能性のあるモデルがある：ＰＬＨＶにおいて、より小さいサイズの脂質ドメインを有するベシクル、またはより少ない数の脂質ドメインを有するベシクルである。ドメインの数は相転移に影響を及ぼすことができないため、ＰＬＨＶ４−１におけるＤＭＰＣドメインはＰＬＨＶ１−１に存在するＤＭＰＣドメインよりも小さいと結論付けられる。
【０１１１】
〔実施例４：放出実験〕
（ＦＩＴＣ−ＰＥＧ２ＫおよびＦＩＴＣ−ＰＥＧ５Ｋの合成）
ＦＩＴＣ−ＰＥＧ２ＫおよびＦＩＴＣ−ＰＥＧ５Ｋの合成方法、および得られたＦＩＴＣ−ＰＥＧ２ＫおよびＦＩＴＣ−ＰＥＧ５ＫのＮＭＲおよびＭＳスペクトルを以下に示す。
【化４】
2020111523.tif 000007
【０１１２】
ＦＩＴＣ−ＰＥＧ２ＫのＮＭＲおよびＭＳスペクトル
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）７．９９−６．５４（ｍ，ＦＩＴＣ），３．８８（ｍ，２Ｈ，ＰＥＧ−ＣＨ２），３．６６（ＰＥＧ−ＣＨ２ＣＨ２），３．４０（ｓ，３Ｈ，ＰＥＧ−ＯＣＨ３）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｃ１１３Ｈ１９８Ｎ２Ｏ５１ＳＮａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋ｍ／ｚ２４５４．２７；ｆｏｕｎｄ：２４５４．１４。
【０１１３】
ＦＩＴＣ−ＰＥＧ５ＫのＮＭＲおよびＭＳスペクトル
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）７．９８−６．５６（ｍ，ＦＩＴＣ），３．８８（ｍ，２Ｈ，ＰＥＧ−ＣＨ２），３．６５（ＰＥＧ−ＣＨ２ＣＨ２），３．３８（ｓ，３Ｈ，ＰＥＧ−ＯＣＨ３）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｃ２４９Ｈ４７１Ｎ２Ｏ１１９Ｓ＋［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ５４２６．０５；ｆｏｕｎｄ：５４２７．５９。
【０１１４】
（ＦＩＴＣ−ＰＥＧ内包および放出実験）
自己消光特性を示す濃度である３ｍＭのＦＩＴＣ−ＰＥＧを用いて、ＰＬＨＶの内包特性および放出特性を調べた。所望のモル比のハイブリッドベシクルおよびＤＭＰＣリポソームストック溶液をＦＩＴＣ−ＰＥＧを含む生理食塩水に添加（インジェクション）し、２時間撹拌し、次いで、９０℃で１時間加熱した。次いで、試料を遠心分離速度２０００ｒｐｍ、４℃で、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製の遠心分離フィルターユニット（３０ｋＤａ分子量カットオフ）に通して、フリーのＦＩＴＣ−ＰＥＧを除去した。ＦＩＴＣ−ＰＥＧの内包効率を下記式（３）のように算出した。
【０１１５】
（Ｆａｆ／Ｆｂｆ）×１００    …（３）
ここで、Ｆａｆは、遠心分離フィルターに通した後の蛍光強度であり、Ｆｂｆは、遠心分離フィルターに通す前の蛍光強度である。蛍光発光アッセイを用いて、ハイブリッドベシクルおよびＤＭＰＣリポソームからのＦＩＴＣ−ＰＥＧ放出を測定した。要するに、１００μＬの、ＦＩＴＣ−ＰＥＧを内包したハイブリッドベシクルまたはＤＭＰＣリポソームを２０ｍＬの生理食塩水に添加（インジェクション）し、均一に混合した。０．５、１、２、および４時間の間隔で、１ｍＬの試料を取り出し、氷上で冷却して、更なる薬剤放出を停止した。ＦＩＴＣ−ＰＥＧの放出率は、以下の式（４）を用いて算出した。
【０１１６】
放出率（％）＝（Ｆ−Ｆ０）／（Ｆ１００−Ｆ０）×１００    …（４）
ここで、Ｆは、特定の点での試料の蛍光強度であり、Ｆ０は、サンプルのバックグラウンドの蛍光であり、Ｆ１００は、溶解緩衝液によって溶解したキャリアからの最大蛍光放出であり、３つの試料の平均である。溶解緩衝液（コード番号：ＣＫ１２、ロット番号：ＫＵ７４９、Dojindo Molecular Technologies, INC., Japan）（５μＬ）を、ＦＩＴＣ−ＰＥＧを内包したハイブリッドベシクル分散液（１ｍＬ）に添加し、分散液を６０℃で１０分加熱し、Ｆ１００値を得た。４９０ｎｍの励起波長、および５２０ｎｍの発光波長で、ＪＡＳＣＯ  ＦＰ−６５００蛍光分光計（ＪＥＯＬ社製）を用いた。本放出実験で用いられた温度は、４℃、３７℃、および４２℃であった。ＰＥＧの分子量は２および５ｋＤａであった。
【０１１７】
（結果および考察）
フルオロセインイソシアネートでラベルされたポリエチレングリコール（Ｍｗ：２０００）（ＦＩＴＣ−ＰＥＧ２Ｋ）を、ＦＩＴＣの蛍光を消光する十分高いＦＩＴＣ−ＰＥＧ２Ｋ濃度で、ＰＬＨＶに被包した。ＤＭＰＣリポソーム、ＰＬＨＶ１−１、およびＰＬＨＶ４−１におけるＦＩＴＣ−ＰＥＧ２Ｋの放出効果は、それぞれ３．９％、７．１％、および５．８％であった。ＦＩＴＣ−ＰＥＧ２Ｋ放出実験は、４℃、３７℃、および４２℃で行われた。図１２に示すように、ＦＩＴＣ−ＰＥＧ２Ｋは、一定温度下で時間の関数として放出された。ＦＩＴＣ−ＰＥＧ２Ｋの被包は、上述したすべての集合体について、４℃で４時間維持した（図１２のＡ〜Ｃ）。ＤＭＰＣリポソームについて、７０％を超えるＦＩＴＣ−ＰＥＧ２Ｋが、３７℃および４２℃において迅速に放出された。これは、ＤＭＰＣリポソームが、３７℃および４２℃において無秩序な相であることによるものである（図１１）。一方、ＰＬＨＶ１−１は、４２℃でのみＦＩＴＣ−ＰＥＧ２Ｋを放出し（図１２のＢ）、３７℃はＴｍよりも低いため、ＦＩＴＣ−ＰＥＧ２Ｋは３７℃では被包されたままであった。従って、ＤＭＰＣドメインは、温度応答性のゲートとして振る舞っていた。同様の方法におけるＰＬＨＶ４−１について、ＦＩＴＣ−ＰＥＧ２Ｋは３７℃で放出されなかった。しかしながら、４２℃において、ゆっくりとした放出が観測された（図６のＣ）。おそらく、ＤＭＰＣドメインのサイズがより小さいと、ＰＬＨＶ４−１からのＦＩＴＣ−ＰＥＧ２Ｋの放出率が減少した。さらに、他の小さな疎水色素ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ（ＳＲＢ）も、３７℃でナノ粒子の内側にトラップされたままであり、４２℃でＰＬＨＶ１−１およびＰＬＨＶ４−１から放出された（図１３）。４２℃で４時間加熱した後、ＳＲＢでは、ＦＩＴＣ−ＰＥＧ２Ｋよりもより多くの放出が観測された。これらの結果も、脂質ドメインのサイズが、トラップされる物質のサイズおよび放出率を潜在的に定めることができることを支持している。それゆえ、この結果は、ハイブリッドベシクルが薬剤を閉じ込め、かつ放出することができることを示している。より大きな分子量を有する、フルオロセインイソシアネートでラベルされたポリエチレングリコール（Ｍｗ：５０００）（ＦＩＴＣ−ＰＥＧ５Ｋ）の放出動態を評価した。ＰＬＨＶ１−１からのＦＩＴＣ−ＰＥＧ５Ｋの放出は、４２℃で抑制された（図１２のＤ）。一方、ＤＭＰＣリポソームは、３７℃（破線）および４２℃（実線）の両方でＦＩＴＣ−ＰＥＧ２Ｋと同様にＦＩＴＣ−ＰＥＧ５Ｋを放出した（図１４）。
【０１１８】
＜参考文献一覧＞
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【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明のナノ構造体は、例えば、細胞内へ剤を輸送するためのキャリアとして、医薬、食品、化粧品等の分野において広く利用することができる。
【図１】
2020111523.tif 000008
【図２】
2020111523.tif 000009
【図３】
2020111523.tif 000010
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020111523.tif 000014
【図８】
2020111523.tif 000015
【図９】
2020111523.tif 000016
【図１０】
2020111523.tif 000017
【図１１】
2020111523.tif 000018
【図１２】
2020111523.tif 000019
【図１３】
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【図１４】
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