(57)【要約】【課題】クロノバクター属菌７菌種を、迅速かつ簡便に識別できる微生物の識別方法、微生物の識別装置及びプログラムを提供する。【解決手段】本発明の微生物の識別方法は、試料を質量分析して得られたマススペクトルにおける、バイオマーカー由来のピークの質量電荷比を、前記マススペクトルから抽出する抽出ステップと、質量電荷比に基づいて、試料に含まれているクロノバクター属菌の菌種を識別する識別ステップとを有し、バイオマーカーとしてリボソーム関連タンパク質Ｌ３２、Ｌ２５、Ｌ２４、ＲａｉＡ及びＬ２０を用いる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を質量分析して得られたマススペクトルにおける、バイオマーカー由来のピークの質量電荷比を、前記マススペクトルから抽出する抽出ステップと、
前記質量電荷比に基づいて、前記試料に含まれているクロノバクター属菌の菌種を識別する識別ステップとを有し、
前記バイオマーカーとしてリボソーム関連タンパク質Ｌ３２、Ｌ２５、Ｌ２４、ＲａｉＡ及びＬ２０を用いる
微生物の識別方法。
【請求項２】
前記マススペクトルに現れたピークの質量電荷比と、前記バイオマーカーの質量の理論値とを比較して、前記マススペクトルにおける前記バイオマーカー由来のピークを選択する選択ステップを有する
請求項１に記載の微生物の識別方法。
【請求項３】
前記識別ステップは、前記質量電荷比と、前記クロノバクター属菌の菌種毎に算出した前記バイオマーカーの質量の理論値とを比較して、前記菌種を識別する
請求項１に記載の微生物の識別方法。
【請求項４】
前記クロノバクター属菌は、C. sakazakii、C. malonaticus、C. dublinensis、C. turicensis、C. universalis、C. condimenti及びC. muytjensiiである
請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物の識別方法。
【請求項５】
試料を質量分析して得られたマススペクトルにおける、バイオマーカー由来のピークの質量電荷比を、前記マススペクトルから抽出する抽出部と、
前記質量電荷比に基づいて、前記試料に含まれているクロノバクター属菌の菌種を識別する識別部とを有し、
前記バイオマーカーとしてリボソーム関連タンパク質Ｌ３２、Ｌ２５、Ｌ２４、ＲａｉＡ及びＬ２０を用いる
微生物の識別装置。
【請求項６】
前記マススペクトルに現れたピークの質量電荷比と、前記バイオマーカーの質量の理論値とを比較して、前記マススペクトルにおける前記バイオマーカー由来のピークを選択する選択部をさらに備える
請求項５に記載の微生物の識別装置。
【請求項７】
前記識別部は、前記質量電荷比と、前記クロノバクター属菌の菌種毎に算出した前記バイオマーカーの質量の理論値とを比較して、前記菌種を識別する
請求項５に記載の微生物の識別装置。
【請求項８】
前記クロノバクター属菌は、C. sakazakii、C. malonaticus、C. dublinensis、C. turicensis、C. universalis、C. condimenti及びC. muytjensiiである
請求項５〜７のいずれか１項に記載の微生物の識別装置。
【請求項９】
コンピュータに請求項１〜４のいずれかに記載の微生物の識別方法を実行させるためのプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の識別方法、微生物の識別装置及びプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
クロノバクター属菌は、７菌種存在し、乳児クロノバクター感染症の原因菌として知られている。いくつかの事例において、疫学調査により、乳児用調製粉乳（粉ミルク）がクロノバクター属菌の感染源であることが報告されている。そのため、粉ミルクにはクロノバクター属菌に関するコーデックス規格が設定されている。
【０００３】
クロノバクター属菌は、乳児が感染すると、乳児に敗血症や髄膜炎などの重篤な症状を引き起こす恐れがある。そのため、クロノバクター属菌が粉ミルクの製品や製造工程から検出された場合は、製品や製造設備の周囲などの外部環境に存在する菌種を検出し、外部環境から検出された菌種と、製品や製造工程から検出された菌種とを比較することにより汚染源を調査し、迅速に対策を講じる必要がある。
【０００４】
細菌などの微生物の菌種の簡便な識別手法として、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（MALDI-TOF MS）を用いたタンパク質解析法が知られている（特許文献１、特許文献２を参照）。MALDI-TOF MSを用いると、ごく微量の微生物試料を用いて短時間で分析結果を得ることができ、かつ多検体の連続分析も容易であるため、簡便かつ迅速な微生物同定が可能となる。この方法では、MALDI-TOF MSで得られたマススペクトルのピークの約半分がリボソーム関連タンパク質由来であることを利用する。所定のリボソーム関連タンパク質をバイオマーカーとし、微生物の質量分析から得たマススペクトルに現れたピークの質量電荷比を既知微生物のリボソーム関連タンパク質の計算質量（質量の理論値）と比較し、マススペクトルに現れたピークにバイオマーカーを帰属させる。そして、マススペクトルのピークに帰属したバイオマーカーを指標として、試料に含まれる微生物を識別する。
【０００５】
特許文献１には、細胞内部から漏出させたリボソームサブユニットタンパク質のMALDI-TOF MSで得られたマススペクトルと、比較対象の細胞株のリボソームサブユニットタンパク質の質量であることが同定されたマススペクトルのデータベースと比較し、MALDI-TOF MSで得られたマススペクトルとデータベースマススペクトルの一致性を指標として細胞の種類を迅速に識別することが開示されている。特許文献１では、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）の菌種の同定や菌株分類を行っている。
【０００６】
特許文献２には、リボソームタンパク質をバイオマーカーとし、MALDI-TOF MSにより得たマススペクトルのピークをバイオマーカーに帰属し、マススペクトルのピークに帰属したバイオマーカーを指標として大腸菌群の血清型を識別することが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第４８１８９８１号公報
【特許文献２】特許第６２３８０６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
微生物の分類レベルによって質量に違いが出るピーク（リボソーム関連タンパク質）が異なるため、MALDI-TOF MSにより得たマススペクトルを用いてクロノバクター属菌を識別するためには、クロノバクター属菌の識別に利用可能なバイオマーカーを選定する必要がある。しかし、クロノバクター属菌の一部の菌種のように、互いに遺伝的にごく近縁の微生物を高い再現性で識別可能なバイオマーカーを選定するのは一般に困難であり、クロノバクター属菌の菌種の識別に好適に利用可能なバイオマーカーは未だ確立されていないのが現状である。
【０００９】
また、微生物の菌種同定手法として１６ＳｒＲＮＡ遺伝子解析法が広く使用されているが、クロノバクター属菌の一部の菌種は遺伝的に非常に近縁であることから全７菌種を識別できない。その他には、ＭＬＳＴ（Multilocus Sequence Typing）法やＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction、ポリメラーゼ連鎖反応）法によるクロノバクター属菌の菌種識別法が知られているが、いずれも操作が煩雑なため、分析に時間を要する。
【００１０】
そのため、クロノバクター属菌７菌種を、迅速かつ簡便に識別できる微生物の識別方法が求められている。
【００１１】
そこで、本発明は、上記のような問題に鑑みてなされたものであり、クロノバクター属菌７菌種を、迅速かつ簡便に識別できる微生物の識別方法、微生物の識別装置及びプログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明による微生物の識別方法は、試料を質量分析して得られたマススペクトルにおける、バイオマーカー由来のピークの質量電荷比を、前記マススペクトルから抽出する抽出ステップと、前記質量電荷比に基づいて、前記試料に含まれているクロノバクター属菌の菌種を識別する識別ステップとを有し、前記バイオマーカーとしてリボソーム関連タンパク質Ｌ３２、Ｌ２５、Ｌ２４、ＲａｉＡ及びＬ２０を用いる。
【００１３】
本発明の微生物の識別装置は、試料を質量分析して得られたマススペクトルにおける、バイオマーカー由来のピークの質量電荷比を、前記マススペクトルから抽出する抽出部と、前記質量電荷比に基づいて、前記試料に含まれているクロノバクター属菌の菌種を識別する識別部とを有し、前記バイオマーカーとしてリボソーム関連タンパク質Ｌ３２、Ｌ２５、Ｌ２４、ＲａｉＡ及びＬ２０を用いる。
【００１４】
本発明のプログラムは、コンピュータに上記の微生物の識別方法を実行させる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、リボソーム関連タンパク質Ｌ３２、Ｌ２５、Ｌ２４、ＲａｉＡ及びＬ２０をバイオマーカーとして、MALDI-TOF MSにより得たマススペクトルからクロノバクター属菌の菌種を識別するので、クロノバクター属菌７菌種を、迅速かつ簡便に識別できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の実施形態の微生物の識別装置の構成を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明者は鋭意検討を重ねた結果、クロノバクター属菌の菌種（C. sakazakii、C. malonaticus、C. dublinensis、C. turicensis、C. universalis、C. condimenti及びC. muytjensiiの７菌種）を質量分析によって識別するためのバイオマーカーとしてリボソーム関連タンパク質Ｌ３２、Ｌ２５、Ｌ２４、ＲａｉＡ及びＬ２０が好適に利用できることを見い出し、本発明に至った。以下で説明する発明は、この知見に基づくものである。なお、以下の実施形態は説明のための単なる例示であって、本発明は以下の実施形態に限定されるものではなく、かかる実施形態に当業者が適宜設計変更を加えたものも、本発明の特徴を備えている限り、本発明の範囲に包含される。
【００１８】
（１）本発明の実施形態の微生物の識別装置の全体構成
図１に示すように、本実施形態の微生物の識別装置１は、質量分析部２と、識別処理部３と、表示部４を備えている。質量分析部２は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（MALDI-TOF MS）により試料の質量分析を行う質量分析装置（以下、MALDI-TOF MS装置という。）である。質量分析部２は、MALDI-TOF MSにより、試料のマススペクトルデータを得る。質量分析部２には、公知のMALDI-TOF MS装置を用いることができる。なお、試料に含まれるリボソーム関連タンパク質、特に上記のバイオマーカーのリボソーム関連物質のマススペクトルを得ることができれば、質量分析部２の構成は限定されず、例えば、他のソフトなイオン化法を用いた質量分析装置などや他の質量分析手法を用いることもできる。また、本実施形態では、「（３−２）MALDI-TOF MSによる分析」において説明する方法により作製した試料を用いている。MALDI-TOF MSによる質量分析用試料の作製方法として一般的な手法により作製した試料も、本実施形態の質量分析に用いることができる。
【００１９】
識別処理部３は、質量分析部２から取得したマススペクトルデータを、バイオマーカーを用いて解析し、試料に含まれている菌種を識別する。識別処理部３は、取得部５と、選択部６と、抽出部７と、識別部８と、記憶部９とを備えている。識別処理部３は、各部を個別のハードウエアとし、ハードウエアの集合体として実現してもよく、その実体をパーソナルコンピュータ（ＰＣ）やワークステーションとし、例えばＰＣの記憶装置としての記憶部９に保存されたプログラムによって各部の機能を実行することで実現してもよい。取得部５は、質量分析部２が試料を分析して得たマススペクトルのデータを、質量分析部２から取得し、選択部６に送出する。選択部６は、取得部５からマススペクトルデータを受け取ると、クロノバクター属菌の菌種毎に各バイオマーカーの質量の理論値が記載されたバイオマーカー質量データベースを読み出す。
【００２０】
バイオマーカー質量データベースは、クロノバクター属菌の菌種毎に各バイオマーカーの質量の理論値を算出し、データベース化したものであり、予め記憶部９に保存されている。バイオマーカーは、上述の通り、リボソーム関連タンパク質Ｌ３２、Ｌ２５、Ｌ２４、ＲａｉＡ及びＬ２０であり、本実施形態では５つのバイオマーカーが用いられる。なお、バイオマーカーの質量の理論値は、同じバイオマーカーであっても、菌種によって異なる場合がある。そのため、バイオマーカー質量データベースには、菌種毎にバイオマーカーの質量の理論値を登録している。
【００２１】
選択部６は、マススペクトルに現れたピークの質量電荷比（ｍ／ｚ）と、バイオマーカーの質量の理論値とを比較して、マススペクトルにおけるバイオマーカー由来のピークを選択する（選択ステップ）。より具体的には、選択部６は、マススペクトルデータからピークの質量電荷比を読み取り、読み取ったピークの質量電荷比と各バイオマーカーの質量の理論値を比較し、質量電荷比がバイオマーカーの質量の理論値と５００ｐｐｍ以内の誤差で一致したピークをバイオマーカーに帰属できたものとする。選択部６は、この作業を他のバイオマーカーについても行い、バイオマーカーに帰属できたピークをバイオマーカー由来のピークとして選択する。選択部６は、バイオマーカー由来のピークを選択したマススペクトルデータを抽出部７に送出する。
【００２２】
抽出部７は、マススペクトルにおけるバイオマーカー由来のピークの質量電荷比を、マススペクトルデータから抽出する（抽出ステップ）。より具体的には、抽出部７は、マススペクトルデータを選択部６から受け取ると、選択部６が選択したバイオマーカー由来のピークの質量電荷比を、バイオマーカーと関連付けて、マススペクトルデータから抽出する。例えば、抽出部７は、バイオマーカーのリボソーム関連タンパク質の名称と当該バイオマーカーに由来するピークの質量電荷比とを関連付ける。抽出部７は、バイオマーカー由来のピークの質量電荷比を識別部８に送出する。
【００２３】
識別部８は、バイオマーカー由来のピークの質量電荷比に基づいて、試料に含まれているクロノバクター属菌の菌種を識別する（識別ステップ）。識別部８は、バイオマーカー由来のピークの質量電荷比を受け取ると、記憶部９から上記で説明したバイオマーカー質量データベースを読み出し、MALDI-TOF MSのマススペクトルから得たバイオマーカー由来のピークの質量電荷比（バイオマーカーの質量の実測値）と、バイオマーカー質量データベースに登録されたバイオマーカーの質量の理論値とを比較する。識別部８は、バイオマーカー毎に順次比較し、質量の実測値が質量の理論値に５００ｐｐｍ以内の誤差で一致した菌種を候補として絞っていく。識別部８は、比較作業を繰り返していった結果、候補となる菌種が１つに絞られたとき、当該菌種を試料に含まれている菌種として識別する。識別部８は、識別した菌種を例えば液晶モニターなどでなる表示部４に表示させ、作業者に識別結果を確認させることができる。また、識別部８は、識別結果を記憶部９に記憶することもできる。このとき、図示しない入力デバイスにより、作業者が試料の名称を識別処理部３に入力し、識別部８が、試料の名前と共に識別結果を、記憶部９に記憶することもできる。
【００２４】
なお、作製した試料によっては、MALDI-TOF MSによる質量分析のマススペクトルにおいて、バイオマーカーのリボソーム関連タンパク質に由来するピークの内のいくつかが検出されない場合がある。しかし、本実施形態では、バイオマーカーとしてリボソーム関連タンパク質Ｌ３２、Ｌ２５、Ｌ２４、ＲａｉＡ及びＬ２０を用いているので、そのような場合であっても、試料に含まれるクロノバクター属菌の菌種を識別できる。また、マススペクトルにおいて、バイオマーカーに由来するピークのいくつかが検出されず、菌種の識別が難しいような場合は、同一のサンプルに対してMALDI-TOF MSによる質量分析を繰り返し行ったり、後述する試料の作製方法のタンパク質抽出液をサンプルプレートに固定する段階やタンパク質を抽出する段階まで遡って再調製した試料を用いてMALDI-TOF MSによる質量分析を行ったりして、再度、マススペクトルを得る。その結果、前回の質量分析では検出されなかったバイオマーカー由来のピークが検出され、試料に含まれている菌種の識別が可能となる。
【００２５】
（２）作用及び効果
以上の構成において、微生物の識別装置１は、試料を質量分析して得られたマススペクトルにおける、バイオマーカー由来のピークの質量電荷比を、マススペクトルから抽出し（抽出ステップ）、質量電荷比に基づいて、試料に含まれているクロノバクター属菌の菌種を識別し（識別ステップ）、バイオマーカーとしてリボソーム関連タンパク質Ｌ３２、Ｌ２５、Ｌ２４、ＲａｉＡ及びＬ２０を用いるように構成した。
【００２６】
よって、微生物の識別装置１は、リボソーム関連タンパク質Ｌ３２、Ｌ２５、Ｌ２４、ＲａｉＡ及びＬ２０をバイオマーカーとして、MALDI-TOF MSにより得たマススペクトルからクロノバクター属菌の菌種を識別するので、クロノバクター属菌７菌種を、迅速かつ簡便に識別できる。
【００２７】
（３）バイオマーカーの選定
本発明では、クロノバクター属菌７菌種のそれぞれについて、各リボソーム関連タンパク質の質量の理論値と、クロノバクター属菌７菌種の基準株のMALDI-TOF MSにより得られた各リボソーム関連タンパク質の質量電荷比とを比較することで、クロノバクター属菌７菌種を識別できるリボソーム関連タンパク質を選定し、選定したリボソーム関連タンパク質をバイオマーカーとした。以下では、バイオマーカーの選定について説明する。なお、バイオマーカーの選定に用いたクロノバクター属菌７菌種の基準株は、表１の通りである。表１中のＪＣＭは、入手先が理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（Japan Collection of Microorganisms）であることを意味し、ＬＭＧは、入手先がベルギー微生物保存機関(Laboratorium voor Microbiologie)であることを意味し、ＡＴＣＣは、入手先がアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）であることを意味する。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
（３−１）リボソーム関連タンパク質の質量の理論値の算出
最初に、リボソーム関連タンパク質の質量の理論値を算出した。まず、タンパク質のアミノ酸配列が掲載された公知のデータベースUniprotKB（Universal Protein Resource Knowledgebase）から、クロノバクター属菌の各菌種のリボソーム関連タンパク質のアミノ酸配列情報を入手した。そして、スイス生物情報科学機構により提供されているプロテオミクスのサーバーExPASy (Expert Protein Analysis System)のツールCompute pI/Mw tool（アミノ酸配列から分子量を計算するソフトウエア）を利用して、クロノバクター属菌の各菌種のリボソーム関連タンパク質のアミノ酸配列からリボソーム関連タンパク質の質量の理論値を算出した。
【００３０】
リボソームでの翻訳によって合成された発現タンパク質は、翻訳後の修飾により開始末端メチオニン残基が切断されることが多い。メチオニン残基は、開始末端のメチオニン残基に隣接するアミノ酸残基（末端から２番目のアミノ酸残基）がグリシン、アラニン、セリン、プロリン、バリン、スレオニン、システインのいずれかである場合に、選択的に切断されやすいことが知られている（蛋白質 核酸 酵素, Vol.40, No.4, p.389-398 (1995)）。そのため、本発明では、末端から２番目のアミノ酸残基がグリシン、アラニン、セリン、プロリン、バリン、スレオニン、システインのいずれかであるリボソーム関連タンパク質は、メチオニン残基の切断を考慮するために、算出した質量の理論値から１３１．１９Ｄａを差し引いて、質量の理論値を補正した。また、MALDI-TOF MSで観測されるイオンは主にプロトン化分子［Ｍ＋Ｈ］＋であるため、本発明では、プロトンの質量１．０１Ｄａを算出した質量の理論値に加算して、質量の理論値を補正した。
【００３１】
（３−２）MALDI-TOF MSによる分析
続いて、MALDI-TOF MSにより、クロノバクター属菌の基準株を試料として質量分析し、マススペクトルを得た。ここでは、C. sakazakiiの基準株の質量分析を行う場合を例としてMALDI-TOF MSによりマススペクトルを得る方法を説明するが、バイオマーカーとしたリボソーム関連タンパク質の分子量関連ピークを観測する手法は他にも多く知られており、以下の方法はあくまでも典型例であって、本発明の適用範囲がこれに限定されるものではない。
【００３２】
まず、トリプチケースソイ寒天培地（TSA：Trypticase Soy Agar、BD(BBL)社製）にC. sakazakiiの基準株を塗抹し、３７℃で２４時間培養した。次に、培地に生育したC. sakazakiiのコロニーを培地の半分程度回収し、超純水（ミリＱ水）３００μｌに懸濁した。懸濁液に、残留農薬・ＰＣＢ試験用エタノール（富士フイルム和光純薬社製）９００μｌを添加し、混合後、遠心分離（遠心分離の条件：２１，５００×ｇ、２ｍｉｎ、２５℃）した。上清を除去し、同じ条件で再度遠心分離した。上清を除去して得られた沈殿を、高濃度のぎ酸（特級、富士フイルム和光純薬社製）を用いて調製した濃度７０％のぎ酸溶液７０μｌに懸濁し、残留農薬・ＰＣＢ試験用アセトニトリル（富士フイルム和光純薬社製）７０μｌを添加した後、懸濁液を混合した。懸濁液を遠心分離（遠心分離の条件：２１，５００×ｇ、２ｍｉｎ、２５℃）し、その上清をタンパク質抽出液とした。なお、基準株の培養条件やリボソーム関連タンパク質の抽出手法は、上記に限定されず、最終的にリボソーム関連タンパク質の分子量関連ピークを観測するのに充分な量のリボソーム関連タンパク質を細胞内部から取り出すことができればよく、従来公知の培養方法やリボソーム関連タンパク質の抽出・精製方法を任意に用いてもよい。
【００３３】
マトリックス剤としてシナピン酸を用い、シナピン酸（富士フイルム和光純薬社製）１０ｍｇを、１％の濃度でトリフルオロ酢酸（特級、富士フイルム和光純薬社製）を含む５０％の濃度のアセトニトリル溶液に溶解してマトリックス剤溶液を調製した。MALDI-TOF測定用のサンプルプレートに、このマトリックス剤溶液を１μｌ滴下し、風乾した。その後、マトリックス剤溶液を滴下したサンプルプレートの領域に、タンパク質抽出液を１μｌ滴下し、乾燥させた。その後、タンパク質抽出液を滴下した領域に再度マトリックス剤溶液を１μｌ滴下し、乾燥させて、C. sakazakii基準株の試料を得た。なお、MALDI-TOFMS測定のための試料調製手法は上記に限定されず、従来公知のタンパク質のMALDI-TOFMS測定で用いられる試料調製法に従って行えばよい。上記ではマトリックス剤としてシナピン酸を用いたが、CHCA（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid）などを用いることもできる。
【００３４】
測定には、MALDI-TOF MS装置として、autoflex speed（Bruker社製）を用い、測定用ソフトウエアとして、装置に付属するflex controlを用いた。測定用ソフトウエアにおいて、ポジティブリニアモードを選択し、スペクトルレンジをｍ／ｚ３０００〜２００００に設定して作製した試料の質量分析を実施し、C. sakazakii基準株のマススペクトルを得た。マススペクトルの解析には、装置付属の解析用ソフトウエアflex analysisを用いた。解析では、シグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）比が３以上、相対強度の閾値（Relative Intensity Threshold）が１％以上のピークを対象とし、C. sakazakii基準株のマススペクトルデータから当該ピークの質量電荷比を読み取り、読み取ったピークの質量電荷比とC. sakazakii基準株のリボソーム関連タンパク質の質量の理論値を比較した。そして、ピークの質量電荷比がC. sakazakii基準株のリボソーム関連タンパク質の質量の理論値と５００ｐｐｍ以内の誤差で一致したピークに当該リボソーム関連タンパク質を帰属できたものとし、マススペクトルのピークにリボソーム関連タンパク質を帰属させた。この結果を、リボソーム関連タンパク質の質量の理論値と共に、表２に示す。表２では、C. sakazakiiとC. malonaticusについて示している。表２中のグレーの箇所は、当該リボソーム関連タンパク質に該当するピークが観察されなかったことを意味する。なお、単位は［Ｄａ］である。この作業を、クロノバクター属菌のすべての菌種の基準株に対して行った。なお、マススペクトルの取得・解析手法は上記に限定されず、従来公知の装置・測定モード・スペクトルレンジ・解析用ソフトウエア・Ｓ／Ｎ比・相対強度などを適宜選択・組み合わせればよい。
【００３５】
【表２】
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【００３６】
（３−３）バイオマーカーの選定
クロノバクター属菌の菌種毎に算出された各リボソーム関連タンパク質の質量の理論値と、各菌種の基準株の質量分析結果から得られた各リボソーム関連タンパク質に帰属したピークの質量電荷比とを用いて、クロノバクター属菌の菌種を識別できるバイオマーカーとなるリボソーム関連タンパク質を探索した。その結果、５個のリボソーム関連タンパク質（Ｌ３２、Ｌ２５、Ｌ２４、ＲａｉＡ及びＬ２０）の質量パターン（質量の理論値のパターン）からクロノバクター属菌の基準株７菌種を識別できることがわかり、リボソーム関連タンパク質Ｌ３２、Ｌ２５、Ｌ２４、ＲａｉＡ及びＬ２０をバイオマーカーとして選定した。リボソーム関連タンパク質によっては質量分析のマススペクトルにおいてピークとして観測されにくいものもあるため、これら５個のバイオマーカーを組み合わせることでクロノバクター属菌の菌種の識別が可能となった。
【００３７】
菌種毎のバイオマーカーの質量の理論値と、各基準株の質量分析結果から得られたバイオマーカーの質量電荷比、すなわち、バイオマーカーの質量の実測値とを表３に示す。表３中には、同一のリボソーム関連タンパク質において、ローマ数字と質量の理論値が記載された菌種と、ローマ数字のみが記載された菌種とがある。表３では、同一のリボソーム関連タンパク質において、同じローマ数字が付された菌種は質量の理論値が同じことを意味している。例えば、C. malonaticusのＬ３２の欄は、ローマ数字のＩが記載されている。これは、C. malonaticusのＬ３２の質量の理論値が、C. sakazakiiのＬ３２の質量の理論値と同じ値であることを意味している。また、「登録なし」と記載されている場合は、登録なしの欄に対応する菌種とリボソーム関連タンパク質のアミノ酸配列が、アミノ酸配列のデータベース（UniprotKB）に登録されておらず、質量の理論値が計算できなかったことを意味している。また、空欄は、マススペクトルに現れたピークに、当該リボソーム関連タンパク質に対応するピークがなかったことを意味している。上記の「（１）本発明の実施形態の微生物の識別装置の全体構成」で説明した、マススペクトルのピークへのバイオマーカーの帰属及び試料に含まれる菌種の識別に用いたバイオマーカー質量データベースは、例えば、質量の理論値を示した表３の表であり、菌種毎に、各バイオマーカーの質量の理論値をまとめたものである。
【００３８】
【表３】
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【００３９】
（３−４）バイオマーカーの検証
バイオマーカーの検証として、表３に示した各基準株の質量分析結果から得られた質量電荷比を利用して、リボソーム関連タンパク質Ｌ３２、Ｌ２５、Ｌ２４、ＲａｉＡ及びＬ２０をバイオマーカーとして基準株７菌種を識別できるか検証した。
【００４０】
まず、C. sakazakiiのデータを用いて、本発明のバイオマーカーによって試料に含まれている菌種がC.sakazakiiであることを識別できるか検証した。バイオマーカーＬ２０の理論値と、C. sakazakiiのＬ２０の質量電荷比を比較すると、理論値のＩの質量に一致するので、菌種をC. sakazakiiとC. condimentiに絞ることができた。次に、バイオマーカーＬ２５の理論値と、C. sakazakiiのＬ２５の質量電荷比を比較すると、理論値のＩの質量に一致する。よって、C. sakazakiiのデータの菌種がC. sakazakiiであることが識別できた。なお、今回はバイオマーカーのＬ２０とＬ２５を用いて７菌種からC. sakazakiiを識別したが、例えば、Ｌ２５に相当するピークが全く検出されなかった場合でも、Ｌ２４に相当するピークが検出されていれば、C. sakazakiiとC. condimentiとではＬ２４の理論値が異なるので、Ｌ２０とＬ２４を用いてC. sakazakiiを識別することができた。
【００４１】
次に、C. malonaticusのデータを用いて、本発明のバイオマーカーによって試料に含まれている菌種がC. malonaticusであることを識別できるか検証した。バイオマーカーＬ２０の理論値と、C. malonaticusのＬ２０の質量電荷比を比較すると、理論値のＩＩの質量に一致する。よって、C. malonaticusのデータの菌種がC. malonaticusであることが識別できた。なお、今回はバイオマーカーのＬ２０を用いて７菌種からC. malonaticusを識別したが、例えば、Ｌ２０に相当するピークが全く検出されなかった場合でも、C. malonaticusはＲａｉＡの理論値が他の６菌種と異なるので、ＲａｉＡを用いてC. malonaticusを識別することができた。
【００４２】
次いで、C. dublinensisのデータを用いて、本発明のバイオマーカーによって試料に含まれている菌種がC. dublinensisであることを識別できるか検証した。バイオマーカーＬ２０の理論値と、C. dublinensisのＬ２０の質量電荷比を比較すると、理論値のＩＩＩの質量に一致するので、菌種をC. dublinensisとC. universalisとC. muytjensiiに絞ることができた。次に、バイオマーカーＬ２５の理論値と、C. dublinensisのＬ２５の質量電荷比を比較すると、理論値のＩＩに一致する。よって、C. dublinensisのデータの菌種がC. dublinensisであることが識別できた。なお、今回はバイオマーカーのＬ２０とＬ２５を用いて７菌種からC. dublinensisを識別したが、例えば、Ｌ２０に相当するピークが全く検出されなかった場合でも、バイオマーカーのＲａｉＡとＬ２５を用いてC. dublinensisを識別できた。具体的には、ＲａｉＡの理論値と、C. dublinensisのＲａｉＡの質量電荷比を比較することで、菌種をC. sakazakiiとC. dublinensisとC. muytjensiiに絞ることができ、その後、Ｌ２５の理論値と、C. dublinensisのＬ２５の質量電荷比を比較することで、C. dublinensisを識別することができた。
【００４３】
続いて、C. turicensisのデータを用いて、本発明のバイオマーカーによって試料に含まれている菌種がC. turicensisであることを識別できるか検証した。バイオマーカーＬ２４の理論値と、C. turicensisのＬ２４の質量電荷比を比較すると、理論値のＩＩの質量に一致するので、菌種をC. turicensisとC. universalisに絞ることができた。次に、バイオマーカーＬ２５の理論値と、C. turicensisのＬ２５の質量電荷比を比較すると、理論値のＩＩに一致する。よって、C. turicensisのデータの菌種がC. turicensisであることが識別できた。なお、今回はバイオマーカーのＬ２４とＬ２５を用いて７菌種からC. turicensisを識別したが、例えば、Ｌ２４に相当するピークが全く検出されなかった場合でも、バイオマーカーのＬ３２とＬ２５を用いてC. turicensisを識別できた。具体的には、Ｌ３２の理論値と、C. turicensisのＬ３２の質量電荷比を比較することで、菌種をC. turicensisとC. universalisに絞ることができ、その後、Ｌ２５の理論値と、C. turicensisのＬ２５の質量電荷比を比較することで、C. turicensisを識別することができた。
【００４４】
次いで、C. universalisのデータを用いて、本発明のバイオマーカーによって試料に含まれている菌種がC. universalisであることを識別できるか検証した。バイオマーカーＬ２４の理論値と、C. universalisのＬ２４の質量電荷比を比較すると、理論値のＩＩの質量に一致するので、菌種をC. universalisとC. turicensisに絞ることができた。次に、バイオマーカーＬ２５の理論値と、C. universalisのＬ２５の質量電荷比を比較すると、理論値のＩに一致する。よって、C. universalisのデータの菌種がC. universalisであることが識別できた。なお、今回はバイオマーカーのＬ２４とＬ２５を用いて７菌種からC. universalisを識別したが、例えば、Ｌ２４に相当するピークが全く検出されなかった場合でも、バイオマーカーのＬ３２とＬ２５を用いてC. universalisを識別できた。また、Ｌ２５に相当するピークが全く検出されなかった場合でも、 C. universalisはＲａｉＡの理論値が他の６菌種と異なるので、ＲａｉＡを用いてC. universalisを識別することができた。さらに、今回のケースでC. universalisとC. turicensisのＬ２０に相当するピークが検出されていれば、Ｌ３２とＬ２０、又は、Ｌ２４とＬ２０を用いてC. universalisを識別できた。
【００４５】
続いて、C. condimentiのデータを用いて、本発明のバイオマーカーによって試料に含まれている菌種がC. condimentiであることを識別できるか検証した。バイオマーカーＬ２０の理論値と、C. condimentiのＬ２０の質量電荷比を比較すると、理論値のＩの質量に一致するので、菌種をC. condimentiとC. sakazakiiに絞ることができた。次に、バイオマーカーＬ２５の理論値と、C. condimentiのＬ２５の質量電荷比を比較すると、理論値のＩＩに一致する。よって、C. condimentiのデータの菌種がC. condimentiであることが識別できた。なお、今回は、C. condimentiのＬ２４に相当するピークが検出されなかったため、バイオマーカーのＬ２０とＬ２５を用いて７菌種からC. condimentiを識別したが、例えば、Ｌ２０及びＬ２５に相当するピークが全く検出されなかった場合でも、Ｌ２４に相当するピークが検出されれば、C. condimentiはＬ２４の理論値が他の６菌種と異なるので、Ｌ２４を用いてC. condimentiを識別することができた。
【００４６】
最後に、C. muytjensiiのデータを用いて、本発明のバイオマーカーによって含まれている菌種がC. muytjensiiであることを識別できるか検証した。バイオマーカーＬ２０の理論値と、C. muytjensiiのＬ２０の質量電荷比を比較すると、理論値のＩＩＩの質量に一致するので、菌種をC. muytjensiiとC. dublinensisとC. universalisに絞ることができた。次に、バイオマーカーＬ２５の理論値と、C. muytjensiiのＬ２５の質量電荷比を比較すると、理論値のＩに一致するので、菌種をC. muytjensiiとC. universalisに絞ることができた。バイオマーカーＬ２４の理論値と、C. muytjensiiのＬ２４の質量電荷比を比較すると、理論値のＩに一致する。よって、C. muytjensiiのデータの菌種がC. muytjensiiであることが識別できた。なお、今回はバイオマーカーのＬ２０とＬ２５とＬ２４を用いて７菌種からC. muytjensiiを識別したが、例えば、Ｌ２４に相当するピークが全く検出されなかった場合でも、C. muytjensiiとC. universalisではＬ３２の理論値が異なるので、Ｌ２４のかわりにＬ３２を用いてC. muytjensiiを識別することができた。同様にＬ２４のかわりにＲａｉＡを用いてもC. muytjensiiを識別できた。
【００４７】
以上から、リボソーム関連タンパク質Ｌ３２、Ｌ２５、Ｌ２４、ＲａｉＡ及びＬ２０をバイオマーカーとして用いることで、クロノバクター属菌７菌種を識別できることを確認できた。また、本発明では、５つのリボソーム関連タンパク質Ｌ３２、Ｌ２５、Ｌ２４、ＲａｉＡ及びＬ２０をバイオマーカーとして用いているので、菌種を識別できるバイオマーカーの組み合わせが複数存在する。そのため、本発明では、マススペクトルにおいてバイオマーカーに相当するピークが、例えば、１つ検出されなかった場合でも、他のバイオマーカーの組み合わせにより、菌種の識別を行うことができる場合がある。そのため、本発明では、他の組み合わせにより菌種を識別できる分だけ、MALDI-TOF MSによるマススペクトルを測定しなおすケースを減らすことができ、より簡便に菌種を特定できる。
【００４８】
（３−５）バイオマーカーを用いた菌種識別の妥当性の検証
リボソーム関連タンパク質Ｌ３２、Ｌ２５、Ｌ２４、ＲａｉＡ及びＬ２０をバイオマーカーとして用いて行った菌種の識別結果が妥当であるか検証した。検証は、MALDI-TOF MSの結果からバイオマーカーを用いて菌種を識別する本発明の手法による識別結果と、クロノバクター属菌７菌種をすべて識別できるとされている遺伝子解析手法であるMultilocus Sequence Typing（ＭＬＳＴ）法による識別結果とを比較することで行った。ＭＬＳＴ法は、真菌及び細菌の株型別を行う分子疫学的解析方法であり、解析する遺伝子の内、ｆｕｓＡの塩基配列を比較することでクロノバクター属菌７菌種を識別できるとされている（J. Clin. Microbiol., Vol.50, No.9, p.3031-3039 (2012)）。検証では、種々の環境や食品から分離されたクロノバクター属菌３０株に対して、本発明の手法とＭＬＳＴ方法とにより菌種の識別を行った。
【００４９】
本発明の手法による菌種の識別は、上記で説明した方法と同じであるので、説明は省略する。ここでは、ＭＬＳＴ法による各菌株のｆｕｓＡ遺伝子の塩基配列の解析方法について、クロノバクター属菌３０株から選んだ１株をＭＬＳＴ法により識別する場合を例として説明する。まず、選択したクロノバクター属菌の菌株を培養した。そして、培養したクロノバクター属菌からＤＮＡを抽出した。遺伝子抽出用試薬PrepＭan Ultra（Applied Biosystems社製）１００μｌに、培養したクロノバクター属菌のコロニーを少量懸濁し、１００℃で１０分加熱処理した。その後、遠心分離（遠心分離の条件：２１，５００×ｇ、３分、２５℃）し、上清をＤＮＡ抽出液として得た。
【００５０】
ＤＮＡ抽出液に抽出されたクロノバクター属菌のＤＮＡに対してプライマー（Forward-GAAACCGTATGGCGTCAG、Reverse-AGAACCGAAGTGCAGACG）を用いて遺伝子領域ｆｕｓＡの増幅反応を行った。増幅産物をillustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（GE Healthcare社製）を用いて精製後、プライマー（Forward-GCTGGATGCGGTAATTGA、Reverse-CCCATACCAGCGATGATG）を用いてサイクルシーケンス反応を実施した。増幅反応及びサイクルシーケンス反応の条件（ＰＣＲ条件）は表４の通りである。
【００５１】
【表４】
2020031592.tif 000006
【００５２】
サイクルシーケンス反応により得た増幅産物を、DyeEx 2.0 Spin Kit（QIAGEN社製）を用いて精製した後、シーケンサーによりｆｕｓＡの塩基配列を解析した。得られた塩基配列をＭＬＳＴ解析用のデータベースPubMLSTに入力し、ｆｕｓＡの塩基配列パターンから菌種の識別を行った。この作業を、他のクロノバクター属菌に対しても行い、クロノバクター属菌３０株すべての菌種を識別した。本発明の手法による解析結果と、ＭＬＳＴ法による解析結果を表５に示す。
【００５３】
【表５】
2020031592.tif 000007
【００５４】
表５では、MALDI-TOF MSにより観測され、バイオマーカーが帰属されたピークの質量電荷比も示している。表５中のＭＡＬＤＩという行が、本発明の手法による識別結果を示し、ＭＬＳＴという行が、ＭＬＳＴ法による識別結果を示している。表５に示すように、本発明の手法による識別結果が、全てＭＬＳＴ法による識別結果と一致した。よって、本発明の手法によるクロノバクター属菌７菌種の識別結果が妥当であることが確認できた。
【００５５】
なお、菌株によっては、帰属するピークが観測されなかったバイオマーカーがあった。しかし、他のバイオマーカーの質量パターンを組み合わせることで、検証に用いたクロノバクター属菌３０株の菌種を１菌種に絞ることができた。例えば、B-1391では、バイオマーカーＬ３２、Ｌ２５、Ｌ２４のピークが観測されなかったが、ＲａｉＡ（ｍ／ｚ １２７８８．６）のピークにより、菌種をC. universalisと同定することができた。検証に用いたクロノバクター属菌３０株は、C. sakazakii２３株、C. malonaticus３株、C. universalis２株、C. turicensis１株、C. dublinensis１株と識別された。
【００５６】
（４）比較例
比較例として、微生物の同定手法としてよく用いられている16S rRNA遺伝子解析（500 bp）によりクロノバクター属菌の基準株７菌種を識別する実験を行った。
【００５７】
まず、クロノバクター属菌の基準株をそれぞれ培養した。次いで、遺伝子抽出用試薬PrepＭan Ultra（Applied Biosystems社製）１００μｌに、培養したクロノバクター属菌の基準株のコロニーを少量懸濁し、１００℃で１０分加熱処理した。その後、遠心分離（遠心分離の条件：２１，５００×ｇ、３分、２５℃）し、上清をＤＮＡ抽出液として得た。
【００５８】
得られたＤＮＡ抽出液について、FAST MicroSeq 500 16S rDNA PCR Kit（Applied Biosystems社製）を用いて、クロノバクター属菌から抽出したＤＮＡの16S rRNA遺伝子領域の増幅を行った。増幅産物をGFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（GE Healthcare）を用いて精製後、MicroSeq 500 16S rDNA Bacterial Sequencing Kit（Applied Biosystems社製）を用いてサイクルシーケンス反応を行った。増幅反応及びサイクルシーケンス反応の条件（ＰＣＲ条件）は表６の通りである。
【００５９】
【表６】
2020031592.tif 000008
【００６０】
サイクルシーケンス反応により得た増幅産物をDyeEx 2.0 Spin Kit（QIAGEN社製）を用いて精製した後、シーケンサー（ABI PRISMジェネティックアナライザー3500xL、Applied Biosystems社製）によりクロノバクター属菌から抽出したＤＮＡの塩基配列を解析した。データベースEZ taxonに解析した塩基配列を入力し、相同性が９９％以上の菌種を基準株の菌種として識別した。この作業を他の基準株に対しても行った。その結果、表７に示すように、C. sakazakii及びC. malonaticusでは、どちらの基準株の識別結果も相同性が９９％以上となり、C. sakazakiiとC. malonaticusとを識別することができなかった。また、C. turicensis及びC. universalisについても、どちらの基準株の識別結果も相同性が９９％以上となり、C. turicensisとC. universalisとを識別することができなかった。
【００６１】
【表７】
2020031592.tif 000009
【符号の説明】
【００６２】
１    識別装置
２    質量分析部
３    識別処理部
４    表示部
５    取得部
６    選択部
７    抽出部
８    識別部
９    記憶部
【図１】
2020031592.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月19日(2019.4.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の識別方法、微生物の識別装置及びプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
クロノバクター属菌は、７菌種存在し、乳児クロノバクター感染症の原因菌として知られている。いくつかの事例において、疫学調査により、乳児用調製粉乳（粉ミルク）がクロノバクター属菌の感染源であることが報告されている。そのため、粉ミルクにはクロノバクター属菌に関するコーデックス規格が設定されている。
【０００３】
クロノバクター属菌は、乳児が感染すると、乳児に敗血症や髄膜炎などの重篤な症状を引き起こす恐れがある。そのため、クロノバクター属菌が粉ミルクの製品や製造工程から検出された場合は、製品や製造設備の周囲などの外部環境に存在する菌種を検出し、外部環境から検出された菌種と、製品や製造工程から検出された菌種とを比較することにより汚染源を調査し、迅速に対策を講じる必要がある。
【０００４】
細菌などの微生物の菌種の簡便な識別手法として、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（MALDI-TOF MS）を用いたタンパク質解析法が知られている（特許文献１、特許文献２を参照）。MALDI-TOF MSを用いると、ごく微量の微生物試料を用いて短時間で分析結果を得ることができ、かつ多検体の連続分析も容易であるため、簡便かつ迅速な微生物同定が可能となる。この方法では、MALDI-TOF MSで得られたマススペクトルのピークの約半分がリボソーム関連タンパク質由来であることを利用する。所定のリボソーム関連タンパク質をバイオマーカーとし、微生物の質量分析から得たマススペクトルに現れたピークの質量電荷比を既知微生物のリボソーム関連タンパク質の計算質量（質量の理論値）と比較し、マススペクトルに現れたピークにバイオマーカーを帰属させる。そして、マススペクトルのピークに帰属したバイオマーカーを指標として、試料に含まれる微生物を識別する。
【０００５】
特許文献１には、細胞内部から漏出させたリボソームサブユニットタンパク質のMALDI-TOF MSで得られたマススペクトルと、比較対象の細胞株のリボソームサブユニットタンパク質の質量であることが同定されたマススペクトルのデータベースと比較し、MALDI-TOF MSで得られたマススペクトルとデータベースマススペクトルの一致性を指標として細胞の種類を迅速に識別することが開示されている。特許文献１では、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）の菌種の同定や菌株分類を行っている。
【０００６】
特許文献２には、リボソームタンパク質をバイオマーカーとし、MALDI-TOF MSにより得たマススペクトルのピークをバイオマーカーに帰属し、マススペクトルのピークに帰属したバイオマーカーを指標として大腸菌群の血清型を識別することが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第４８１８９８１号公報
【特許文献２】特許第６２３８０６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
微生物の分類レベルによって質量に違いが出るピーク（リボソーム関連タンパク質）が異なるため、MALDI-TOF MSにより得たマススペクトルを用いてクロノバクター属菌を識別するためには、クロノバクター属菌の識別に利用可能なバイオマーカーを選定する必要がある。しかし、クロノバクター属菌の一部の菌種のように、互いに遺伝的にごく近縁の微生物を高い再現性で識別可能なバイオマーカーを選定するのは一般に困難であり、クロノバクター属菌の菌種の識別に好適に利用可能なバイオマーカーは未だ確立されていないのが現状である。
【０００９】
また、微生物の菌種同定手法として１６ＳｒＲＮＡ遺伝子解析法が広く使用されているが、クロノバクター属菌の一部の菌種は遺伝的に非常に近縁であることから全７菌種を識別できない。その他には、ＭＬＳＴ（Multilocus Sequence Typing）法やＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction、ポリメラーゼ連鎖反応）法によるクロノバクター属菌の菌種識別法が知られているが、いずれも操作が煩雑なため、分析に時間を要する。
【００１０】
そのため、クロノバクター属菌７菌種を、迅速かつ簡便に識別できる微生物の識別方法が求められている。
【００１１】
そこで、本発明は、上記のような問題に鑑みてなされたものであり、クロノバクター属菌７菌種を、迅速かつ簡便に識別できる微生物の識別方法、微生物の識別装置及びプログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明による微生物の識別方法は、試料を質量分析して得られたマススペクトルにおける、バイオマーカー由来のピークの質量電荷比を、前記マススペクトルから抽出する抽出ステップと、前記質量電荷比に基づいて、前記試料に含まれているクロノバクター属菌の菌種を識別する識別ステップとを有し、前記バイオマーカーとしてリボソーム関連タンパク質Ｌ３２、Ｌ２５、Ｌ２４、ＲａｉＡ及びＬ２０を用いる。
【００１３】
本発明の微生物の識別装置は、試料を質量分析して得られたマススペクトルにおける、バイオマーカー由来のピークの質量電荷比を、前記マススペクトルから抽出する抽出部と、前記質量電荷比に基づいて、前記試料に含まれているクロノバクター属菌の菌種を識別する識別部とを有し、前記バイオマーカーとしてリボソーム関連タンパク質Ｌ３２、Ｌ２５、Ｌ２４、ＲａｉＡ及びＬ２０を用いる。
【００１４】
本発明のプログラムは、コンピュータに上記の微生物の識別方法を実行させる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、リボソーム関連タンパク質Ｌ３２、Ｌ２５、Ｌ２４、ＲａｉＡ及びＬ２０をバイオマーカーとして、MALDI-TOF MSにより得たマススペクトルからクロノバクター属菌の菌種を識別するので、クロノバクター属菌７菌種を、迅速かつ簡便に識別できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の実施形態の微生物の識別装置の構成を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明者は鋭意検討を重ねた結果、クロノバクター属菌の菌種（C. sakazakii、C. malonaticus、C. dublinensis、C. turicensis、C. universalis、C. condimenti及びC. muytjensiiの７菌種）を質量分析によって識別するためのバイオマーカーとしてリボソーム関連タンパク質Ｌ３２、Ｌ２５、Ｌ２４、ＲａｉＡ及びＬ２０が好適に利用できることを見い出し、本発明に至った。以下で説明する発明は、この知見に基づくものである。なお、以下の実施形態は説明のための単なる例示であって、本発明は以下の実施形態に限定されるものではなく、かかる実施形態に当業者が適宜設計変更を加えたものも、本発明の特徴を備えている限り、本発明の範囲に包含される。
【００１８】
（１）本発明の実施形態の微生物の識別装置の全体構成
図１に示すように、本実施形態の微生物の識別装置１は、質量分析部２と、識別処理部３と、表示部４を備えている。質量分析部２は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（MALDI-TOF MS）により試料の質量分析を行う質量分析装置（以下、MALDI-TOF MS装置という。）である。質量分析部２は、MALDI-TOF MSにより、試料のマススペクトルデータを得る。質量分析部２には、公知のMALDI-TOF MS装置を用いることができる。なお、試料に含まれるリボソーム関連タンパク質、特に上記のバイオマーカーのリボソーム関連物質のマススペクトルを得ることができれば、質量分析部２の構成は限定されず、例えば、他のソフトなイオン化法を用いた質量分析装置などや他の質量分析手法を用いることもできる。また、本実施形態では、「（３−２）MALDI-TOF MSによる分析」において説明する方法により作製した試料を用いている。MALDI-TOF MSによる質量分析用試料の作製方法として一般的な手法により作製した試料も、本実施形態の質量分析に用いることができる。
【００１９】
識別処理部３は、質量分析部２から取得したマススペクトルデータを、バイオマーカーを用いて解析し、試料に含まれている菌種を識別する。識別処理部３は、取得部５と、選択部６と、抽出部７と、識別部８と、記憶部９とを備えている。識別処理部３は、各部を個別のハードウエアとし、ハードウエアの集合体として実現してもよく、その実体をパーソナルコンピュータ（ＰＣ）やワークステーションとし、例えばＰＣの記憶装置としての記憶部９に保存されたプログラムによって各部の機能を実行することで実現してもよい。取得部５は、質量分析部２が試料を分析して得たマススペクトルのデータを、質量分析部２から取得し、選択部６に送出する。選択部６は、取得部５からマススペクトルデータを受け取ると、クロノバクター属菌の菌種毎に各バイオマーカーの質量の理論値が記載されたバイオマーカー質量データベースを読み出す。
【００２０】
バイオマーカー質量データベースは、クロノバクター属菌の菌種毎に各バイオマーカーの質量の理論値を算出し、データベース化したものであり、予め記憶部９に保存されている。バイオマーカーは、上述の通り、リボソーム関連タンパク質Ｌ３２、Ｌ２５、Ｌ２４、ＲａｉＡ及びＬ２０であり、本実施形態では５つのバイオマーカーが用いられる。なお、バイオマーカーの質量の理論値は、同じバイオマーカーであっても、菌種によって異なる場合がある。そのため、バイオマーカー質量データベースには、菌種毎にバイオマーカーの質量の理論値を登録している。
【００２１】
選択部６は、マススペクトルに現れたピークの質量電荷比（ｍ／ｚ）と、バイオマーカーの質量の理論値とを比較して、マススペクトルにおけるバイオマーカー由来のピークを選択する（選択ステップ）。より具体的には、選択部６は、マススペクトルデータからピークの質量電荷比を読み取り、読み取ったピークの質量電荷比と各バイオマーカーの質量の理論値を比較し、質量電荷比がバイオマーカーの質量の理論値と５００ｐｐｍ以内の誤差で一致したピークをバイオマーカーに帰属できたものとする。選択部６は、この作業を他のバイオマーカーについても行い、バイオマーカーに帰属できたピークをバイオマーカー由来のピークとして選択する。選択部６は、バイオマーカー由来のピークを選択したマススペクトルデータを抽出部７に送出する。
【００２２】
抽出部７は、マススペクトルにおけるバイオマーカー由来のピークの質量電荷比を、マススペクトルデータから抽出する（抽出ステップ）。より具体的には、抽出部７は、マススペクトルデータを選択部６から受け取ると、選択部６が選択したバイオマーカー由来のピークの質量電荷比を、バイオマーカーと関連付けて、マススペクトルデータから抽出する。例えば、抽出部７は、バイオマーカーのリボソーム関連タンパク質の名称と当該バイオマーカーに由来するピークの質量電荷比とを関連付ける。抽出部７は、バイオマーカー由来のピークの質量電荷比を識別部８に送出する。
【００２３】
識別部８は、バイオマーカー由来のピークの質量電荷比に基づいて、試料に含まれているクロノバクター属菌の菌種を識別する（識別ステップ）。識別部８は、バイオマーカー由来のピークの質量電荷比を受け取ると、記憶部９から上記で説明したバイオマーカー質量データベースを読み出し、MALDI-TOF MSのマススペクトルから得たバイオマーカー由来のピークの質量電荷比（バイオマーカーの質量の実測値）と、バイオマーカー質量データベースに登録されたバイオマーカーの質量の理論値とを比較する。識別部８は、バイオマーカー毎に順次比較し、質量の実測値が質量の理論値に５００ｐｐｍ以内の誤差で一致した菌種を候補として絞っていく。識別部８は、比較作業を繰り返していった結果、候補となる菌種が１つに絞られたとき、当該菌種を試料に含まれている菌種として識別する。識別部８は、識別した菌種を例えば液晶モニターなどでなる表示部４に表示させ、作業者に識別結果を確認させることができる。また、識別部８は、識別結果を記憶部９に記憶することもできる。このとき、図示しない入力デバイスにより、作業者が試料の名称を識別処理部３に入力し、識別部８が、試料の名前と共に識別結果を、記憶部９に記憶することもできる。
【００２４】
なお、作製した試料によっては、MALDI-TOF MSによる質量分析のマススペクトルにおいて、バイオマーカーのリボソーム関連タンパク質に由来するピークの内のいくつかが検出されない場合がある。しかし、本実施形態では、バイオマーカーとしてリボソーム関連タンパク質Ｌ３２、Ｌ２５、Ｌ２４、ＲａｉＡ及びＬ２０を用いているので、そのような場合であっても、試料に含まれるクロノバクター属菌の菌種を識別できる。また、マススペクトルにおいて、バイオマーカーに由来するピークのいくつかが検出されず、菌種の識別が難しいような場合は、同一のサンプルに対してMALDI-TOF MSによる質量分析を繰り返し行ったり、後述する試料の作製方法のタンパク質抽出液をサンプルプレートに固定する段階やタンパク質を抽出する段階まで遡って再調製した試料を用いてMALDI-TOF MSによる質量分析を行ったりして、再度、マススペクトルを得る。その結果、前回の質量分析では検出されなかったバイオマーカー由来のピークが検出され、試料に含まれている菌種の識別が可能となる。
【００２５】
（２）作用及び効果
以上の構成において、微生物の識別装置１は、試料を質量分析して得られたマススペクトルにおける、バイオマーカー由来のピークの質量電荷比を、マススペクトルから抽出し（抽出ステップ）、質量電荷比に基づいて、試料に含まれているクロノバクター属菌の菌種を識別し（識別ステップ）、バイオマーカーとしてリボソーム関連タンパク質Ｌ３２、Ｌ２５、Ｌ２４、ＲａｉＡ及びＬ２０を用いるように構成した。
【００２６】
よって、微生物の識別装置１は、リボソーム関連タンパク質Ｌ３２、Ｌ２５、Ｌ２４、ＲａｉＡ及びＬ２０をバイオマーカーとして、MALDI-TOF MSにより得たマススペクトルからクロノバクター属菌の菌種を識別するので、クロノバクター属菌７菌種を、迅速かつ簡便に識別できる。
【００２７】
（３）バイオマーカーの選定
本発明では、クロノバクター属菌７菌種のそれぞれについて、各リボソーム関連タンパク質の質量の理論値と、クロノバクター属菌７菌種の基準株のMALDI-TOF MSにより得られた各リボソーム関連タンパク質の質量電荷比とを比較することで、クロノバクター属菌７菌種を識別できるリボソーム関連タンパク質を選定し、選定したリボソーム関連タンパク質をバイオマーカーとした。以下では、バイオマーカーの選定について説明する。なお、バイオマーカーの選定に用いたクロノバクター属菌７菌種の基準株は、表１の通りである。表１中のＪＣＭは、入手先が理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（Japan Collection of Microorganisms）であることを意味し、ＬＭＧは、入手先がベルギー微生物保存機関(Laboratorium voor Microbiologie)であることを意味し、ＡＴＣＣは、入手先がアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）であることを意味する。
【００２８】
【表１】
2020031592.tif 000011
【００２９】
（３−１）リボソーム関連タンパク質の質量の理論値の算出
最初に、リボソーム関連タンパク質の質量の理論値を算出した。まず、タンパク質のアミノ酸配列が掲載された公知のデータベースUniprotKB（Universal Protein Resource Knowledgebase）から、クロノバクター属菌の各菌種のリボソーム関連タンパク質のアミノ酸配列情報を入手した。そして、スイス生物情報科学機構により提供されているプロテオミクスのサーバーExPASy (Expert Protein Analysis System)のツールCompute pI/Mw tool（アミノ酸配列から分子量を計算するソフトウエア）を利用して、クロノバクター属菌の各菌種のリボソーム関連タンパク質のアミノ酸配列からリボソーム関連タンパク質の質量の理論値を算出した。
【００３０】
リボソームでの翻訳によって合成された発現タンパク質は、翻訳後の修飾により開始末端メチオニン残基が切断されることが多い。メチオニン残基は、開始末端のメチオニン残基に隣接するアミノ酸残基（末端から２番目のアミノ酸残基）がグリシン、アラニン、セリン、プロリン、バリン、スレオニン、システインのいずれかである場合に、選択的に切断されやすいことが知られている（蛋白質 核酸 酵素, Vol.40, No.4, p.389-398 (1995)）。そのため、本発明では、末端から２番目のアミノ酸残基がグリシン、アラニン、セリン、プロリン、バリン、スレオニン、システインのいずれかであるリボソーム関連タンパク質は、メチオニン残基の切断を考慮するために、算出した質量の理論値から１３１．１９Ｄａを差し引いて、質量の理論値を補正した。また、MALDI-TOF MSで観測されるイオンは主にプロトン化分子［Ｍ＋Ｈ］＋であるため、本発明では、プロトンの質量１．０１Ｄａを算出した質量の理論値に加算して、質量の理論値を補正した。
【００３１】
（３−２）MALDI-TOF MSによる分析
続いて、MALDI-TOF MSにより、クロノバクター属菌の基準株を試料として質量分析し、マススペクトルを得た。ここでは、C. sakazakiiの基準株の質量分析を行う場合を例としてMALDI-TOF MSによりマススペクトルを得る方法を説明するが、バイオマーカーとしたリボソーム関連タンパク質の分子量関連ピークを観測する手法は他にも多く知られており、以下の方法はあくまでも典型例であって、本発明の適用範囲がこれに限定されるものではない。
【００３２】
まず、トリプチケースソイ寒天培地（TSA：Trypticase Soy Agar、BD(BBL)社製）にC. sakazakiiの基準株を塗抹し、３７℃で２４時間培養した。次に、培地に生育したC. sakazakiiのコロニーを培地の半分程度回収し、超純水（ミリＱ水）３００μｌに懸濁した。懸濁液に、残留農薬・ＰＣＢ試験用エタノール（富士フイルム和光純薬社製）９００μｌを添加し、混合後、遠心分離（遠心分離の条件：２１，５００×ｇ、２ｍｉｎ、２５℃）した。上清を除去し、同じ条件で再度遠心分離した。上清を除去して得られた沈殿を、高濃度のぎ酸（特級、富士フイルム和光純薬社製）を用いて調製した濃度７０％のぎ酸溶液７０μｌに懸濁し、残留農薬・ＰＣＢ試験用アセトニトリル（富士フイルム和光純薬社製）７０μｌを添加した後、懸濁液を混合した。懸濁液を遠心分離（遠心分離の条件：２１，５００×ｇ、２ｍｉｎ、２５℃）し、その上清をタンパク質抽出液とした。なお、基準株の培養条件やリボソーム関連タンパク質の抽出手法は、上記に限定されず、最終的にリボソーム関連タンパク質の分子量関連ピークを観測するのに充分な量のリボソーム関連タンパク質を細胞内部から取り出すことができればよく、従来公知の培養方法やリボソーム関連タンパク質の抽出・精製方法を任意に用いてもよい。
【００３３】
マトリックス剤としてシナピン酸を用い、シナピン酸（富士フイルム和光純薬社製）１０ｍｇを、１％の濃度でトリフルオロ酢酸（特級、富士フイルム和光純薬社製）を含む５０％の濃度のアセトニトリル溶液に溶解してマトリックス剤溶液を調製した。MALDI-TOF測定用のサンプルプレートに、このマトリックス剤溶液を１μｌ滴下し、風乾した。その後、マトリックス剤溶液を滴下したサンプルプレートの領域に、タンパク質抽出液を１μｌ滴下し、乾燥させた。その後、タンパク質抽出液を滴下した領域に再度マトリックス剤溶液を１μｌ滴下し、乾燥させて、C. sakazakii基準株の試料を得た。なお、MALDI-TOFMS測定のための試料調製手法は上記に限定されず、従来公知のタンパク質のMALDI-TOFMS測定で用いられる試料調製法に従って行えばよい。上記ではマトリックス剤としてシナピン酸を用いたが、CHCA（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid）などを用いることもできる。
【００３４】
測定には、MALDI-TOF MS装置として、autoflex speed（Bruker社製）を用い、測定用ソフトウエアとして、装置に付属するflex controlを用いた。測定用ソフトウエアにおいて、ポジティブリニアモードを選択し、スペクトルレンジをｍ／ｚ３０００〜２００００に設定して作製した試料の質量分析を実施し、C. sakazakii基準株のマススペクトルを得た。マススペクトルの解析には、装置付属の解析用ソフトウエアflex analysisを用いた。解析では、シグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）比が３以上、相対強度の閾値（Relative Intensity Threshold）が１％以上のピークを対象とし、C. sakazakii基準株のマススペクトルデータから当該ピークの質量電荷比を読み取り、読み取ったピークの質量電荷比とC. sakazakii基準株のリボソーム関連タンパク質の質量の理論値を比較した。そして、ピークの質量電荷比がC. sakazakii基準株のリボソーム関連タンパク質の質量の理論値と５００ｐｐｍ以内の誤差で一致したピークに当該リボソーム関連タンパク質を帰属できたものとし、マススペクトルのピークにリボソーム関連タンパク質を帰属させた。この結果を、リボソーム関連タンパク質の質量の理論値と共に、表２に示す。表２では、C. sakazakiiとC. malonaticusについて示している。表２中のグレーの箇所は、当該リボソーム関連タンパク質に該当するピークが観察されなかったことを意味する。なお、単位は［Ｄａ］である。この作業を、クロノバクター属菌のすべての菌種の基準株に対して行った。なお、マススペクトルの取得・解析手法は上記に限定されず、従来公知の装置・測定モード・スペクトルレンジ・解析用ソフトウエア・Ｓ／Ｎ比・相対強度などを適宜選択・組み合わせればよい。
【００３５】
【表２】
2020031592.tif 000012
【００３６】
（３−３）バイオマーカーの選定
クロノバクター属菌の菌種毎に算出された各リボソーム関連タンパク質の質量の理論値と、各菌種の基準株の質量分析結果から得られた各リボソーム関連タンパク質に帰属したピークの質量電荷比とを用いて、クロノバクター属菌の菌種を識別できるバイオマーカーとなるリボソーム関連タンパク質を探索した。その結果、５個のリボソーム関連タンパク質（Ｌ３２、Ｌ２５、Ｌ２４、ＲａｉＡ及びＬ２０）の質量パターン（質量の理論値のパターン）からクロノバクター属菌の基準株７菌種を識別できることがわかり、リボソーム関連タンパク質Ｌ３２、Ｌ２５、Ｌ２４、ＲａｉＡ及びＬ２０をバイオマーカーとして選定した。リボソーム関連タンパク質によっては質量分析のマススペクトルにおいてピークとして観測されにくいものもあるため、これら５個のバイオマーカーを組み合わせることでクロノバクター属菌の菌種の識別が可能となった。
【００３７】
菌種毎のバイオマーカーの質量の理論値と、各基準株の質量分析結果から得られたバイオマーカーの質量電荷比、すなわち、バイオマーカーの質量の実測値とを表３に示す。表３中には、同一のリボソーム関連タンパク質において、ローマ数字と質量の理論値が記載された菌種と、ローマ数字のみが記載された菌種とがある。表３では、同一のリボソーム関連タンパク質において、同じローマ数字が付された菌種は質量の理論値が同じことを意味している。例えば、C. malonaticusのＬ３２の欄は、ローマ数字のＩが記載されている。これは、C. malonaticusのＬ３２の質量の理論値が、C. sakazakiiのＬ３２の質量の理論値と同じ値であることを意味している。また、「登録なし」と記載されている場合は、登録なしの欄に対応する菌種とリボソーム関連タンパク質のアミノ酸配列が、アミノ酸配列のデータベース（UniprotKB）に登録されておらず、質量の理論値が計算できなかったことを意味している。また、空欄は、マススペクトルに現れたピークに、当該リボソーム関連タンパク質に対応するピークがなかったことを意味している。上記の「（１）本発明の実施形態の微生物の識別装置の全体構成」で説明した、マススペクトルのピークへのバイオマーカーの帰属及び試料に含まれる菌種の識別に用いたバイオマーカー質量データベースは、例えば、質量の理論値を示した表３の表であり、菌種毎に、各バイオマーカーの質量の理論値をまとめたものである。
【００３８】
【表３】
2020031592.tif 000013
【００３９】
（３−４）バイオマーカーの検証
バイオマーカーの検証として、表３に示した各基準株の質量分析結果から得られた質量電荷比を利用して、リボソーム関連タンパク質Ｌ３２、Ｌ２５、Ｌ２４、ＲａｉＡ及びＬ２０をバイオマーカーとして基準株７菌種を識別できるか検証した。
【００４０】
まず、C. sakazakiiのデータを用いて、本発明のバイオマーカーによって試料に含まれている菌種がC.sakazakiiであることを識別できるか検証した。バイオマーカーＬ２０の理論値と、C. sakazakiiのＬ２０の質量電荷比を比較すると、理論値のＩの質量に一致するので、菌種をC. sakazakiiとC. condimentiに絞ることができた。次に、バイオマーカーＬ２５の理論値と、C. sakazakiiのＬ２５の質量電荷比を比較すると、理論値のＩの質量に一致する。よって、C. sakazakiiのデータの菌種がC. sakazakiiであることが識別できた。なお、今回はバイオマーカーのＬ２０とＬ２５を用いて７菌種からC. sakazakiiを識別したが、例えば、Ｌ２５に相当するピークが全く検出されなかった場合でも、Ｌ２４に相当するピークが検出されていれば、C. sakazakiiとC. condimentiとではＬ２４の理論値が異なるので、Ｌ２０とＬ２４を用いてC. sakazakiiを識別することができた。
【００４１】
次に、C. malonaticusのデータを用いて、本発明のバイオマーカーによって試料に含まれている菌種がC. malonaticusであることを識別できるか検証した。バイオマーカーＬ２０の理論値と、C. malonaticusのＬ２０の質量電荷比を比較すると、理論値のＩＩの質量に一致する。よって、C. malonaticusのデータの菌種がC. malonaticusであることが識別できた。なお、今回はバイオマーカーのＬ２０を用いて７菌種からC. malonaticusを識別したが、例えば、Ｌ２０に相当するピークが全く検出されなかった場合でも、C. malonaticusはＲａｉＡの理論値が他の６菌種と異なるので、ＲａｉＡを用いてC. malonaticusを識別することができた。
【００４２】
次いで、C. dublinensisのデータを用いて、本発明のバイオマーカーによって試料に含まれている菌種がC. dublinensisであることを識別できるか検証した。バイオマーカーＬ２０の理論値と、C. dublinensisのＬ２０の質量電荷比を比較すると、理論値のＩＩＩの質量に一致するので、菌種をC. dublinensisとC. universalisとC. muytjensiiに絞ることができた。次に、バイオマーカーＬ２５の理論値と、C. dublinensisのＬ２５の質量電荷比を比較すると、理論値のＩＩに一致する。よって、C. dublinensisのデータの菌種がC. dublinensisであることが識別できた。なお、今回はバイオマーカーのＬ２０とＬ２５を用いて７菌種からC. dublinensisを識別したが、例えば、Ｌ２０に相当するピークが全く検出されなかった場合でも、バイオマーカーのＲａｉＡとＬ２５を用いてC. dublinensisを識別できた。具体的には、ＲａｉＡの理論値と、C. dublinensisのＲａｉＡの質量電荷比を比較することで、菌種をC. sakazakiiとC. dublinensisとC. muytjensiiに絞ることができ、その後、Ｌ２５の理論値と、C. dublinensisのＬ２５の質量電荷比を比較することで、C. dublinensisを識別することができた。
【００４３】
続いて、C. turicensisのデータを用いて、本発明のバイオマーカーによって試料に含まれている菌種がC. turicensisであることを識別できるか検証した。バイオマーカーＬ２４の理論値と、C. turicensisのＬ２４の質量電荷比を比較すると、理論値のＩＩの質量に一致するので、菌種をC. turicensisとC. universalisに絞ることができた。次に、バイオマーカーＬ２５の理論値と、C. turicensisのＬ２５の質量電荷比を比較すると、理論値のＩＩに一致する。よって、C. turicensisのデータの菌種がC. turicensisであることが識別できた。なお、今回はバイオマーカーのＬ２４とＬ２５を用いて７菌種からC. turicensisを識別したが、例えば、Ｌ２４に相当するピークが全く検出されなかった場合でも、バイオマーカーのＬ３２とＬ２５を用いてC. turicensisを識別できた。具体的には、Ｌ３２の理論値と、C. turicensisのＬ３２の質量電荷比を比較することで、菌種をC. turicensisとC. universalisに絞ることができ、その後、Ｌ２５の理論値と、C. turicensisのＬ２５の質量電荷比を比較することで、C. turicensisを識別することができた。
【００４４】
次いで、C. universalisのデータを用いて、本発明のバイオマーカーによって試料に含まれている菌種がC. universalisであることを識別できるか検証した。バイオマーカーＬ２４の理論値と、C. universalisのＬ２４の質量電荷比を比較すると、理論値のＩＩの質量に一致するので、菌種をC. universalisとC. turicensisに絞ることができた。次に、バイオマーカーＬ２５の理論値と、C. universalisのＬ２５の質量電荷比を比較すると、理論値のＩに一致する。よって、C. universalisのデータの菌種がC. universalisであることが識別できた。なお、今回はバイオマーカーのＬ２４とＬ２５を用いて７菌種からC. universalisを識別したが、例えば、Ｌ２４に相当するピークが全く検出されなかった場合でも、バイオマーカーのＬ３２とＬ２５を用いてC. universalisを識別できた。また、Ｌ２５に相当するピークが全く検出されなかった場合でも、 C. universalisはＲａｉＡの理論値が他の６菌種と異なるので、ＲａｉＡを用いてC. universalisを識別することができた。さらに、今回のケースでC. universalisとC. turicensisのＬ２０に相当するピークが検出されていれば、Ｌ３２とＬ２０、又は、Ｌ２４とＬ２０を用いてC. universalisを識別できた。
【００４５】
続いて、C. condimentiのデータを用いて、本発明のバイオマーカーによって試料に含まれている菌種がC. condimentiであることを識別できるか検証した。バイオマーカーＬ２０の理論値と、C. condimentiのＬ２０の質量電荷比を比較すると、理論値のＩの質量に一致するので、菌種をC. condimentiとC. sakazakiiに絞ることができた。次に、バイオマーカーＬ２５の理論値と、C. condimentiのＬ２５の質量電荷比を比較すると、理論値のＩＩに一致する。よって、C. condimentiのデータの菌種がC. condimentiであることが識別できた。なお、今回は、C. condimentiのＬ２４に相当するピークが検出されなかったため、バイオマーカーのＬ２０とＬ２５を用いて７菌種からC. condimentiを識別したが、例えば、Ｌ２０及びＬ２５に相当するピークが全く検出されなかった場合でも、Ｌ２４に相当するピークが検出されれば、C. condimentiはＬ２４の理論値が他の６菌種と異なるので、Ｌ２４を用いてC. condimentiを識別することができた。
【００４６】
最後に、C. muytjensiiのデータを用いて、本発明のバイオマーカーによって含まれている菌種がC. muytjensiiであることを識別できるか検証した。バイオマーカーＬ２０の理論値と、C. muytjensiiのＬ２０の質量電荷比を比較すると、理論値のＩＩＩの質量に一致するので、菌種をC. muytjensiiとC. dublinensisとC. universalisに絞ることができた。次に、バイオマーカーＬ２５の理論値と、C. muytjensiiのＬ２５の質量電荷比を比較すると、理論値のＩに一致するので、菌種をC. muytjensiiとC. universalisに絞ることができた。バイオマーカーＬ２４の理論値と、C. muytjensiiのＬ２４の質量電荷比を比較すると、理論値のＩに一致する。よって、C. muytjensiiのデータの菌種がC. muytjensiiであることが識別できた。なお、今回はバイオマーカーのＬ２０とＬ２５とＬ２４を用いて７菌種からC. muytjensiiを識別したが、例えば、Ｌ２４に相当するピークが全く検出されなかった場合でも、C. muytjensiiとC. universalisではＬ３２の理論値が異なるので、Ｌ２４のかわりにＬ３２を用いてC. muytjensiiを識別することができた。同様にＬ２４のかわりにＲａｉＡを用いてもC. muytjensiiを識別できた。
【００４７】
以上から、リボソーム関連タンパク質Ｌ３２、Ｌ２５、Ｌ２４、ＲａｉＡ及びＬ２０をバイオマーカーとして用いることで、クロノバクター属菌７菌種を識別できることを確認できた。また、本発明では、５つのリボソーム関連タンパク質Ｌ３２、Ｌ２５、Ｌ２４、ＲａｉＡ及びＬ２０をバイオマーカーとして用いているので、菌種を識別できるバイオマーカーの組み合わせが複数存在する。そのため、本発明では、マススペクトルにおいてバイオマーカーに相当するピークが、例えば、１つ検出されなかった場合でも、他のバイオマーカーの組み合わせにより、菌種の識別を行うことができる場合がある。そのため、本発明では、他の組み合わせにより菌種を識別できる分だけ、MALDI-TOF MSによるマススペクトルを測定しなおすケースを減らすことができ、より簡便に菌種を特定できる。
【００４８】
（３−５）バイオマーカーを用いた菌種識別の妥当性の検証
リボソーム関連タンパク質Ｌ３２、Ｌ２５、Ｌ２４、ＲａｉＡ及びＬ２０をバイオマーカーとして用いて行った菌種の識別結果が妥当であるか検証した。検証は、MALDI-TOF MSの結果からバイオマーカーを用いて菌種を識別する本発明の手法による識別結果と、クロノバクター属菌７菌種をすべて識別できるとされている遺伝子解析手法であるMultilocus Sequence Typing（ＭＬＳＴ）法による識別結果とを比較することで行った。ＭＬＳＴ法は、真菌及び細菌の株型別を行う分子疫学的解析方法であり、解析する遺伝子の内、ｆｕｓＡの塩基配列を比較することでクロノバクター属菌７菌種を識別できるとされている（J. Clin. Microbiol., Vol.50, No.9, p.3031-3039 (2012)）。検証では、種々の環境や食品から分離されたクロノバクター属菌３０株に対して、本発明の手法とＭＬＳＴ方法とにより菌種の識別を行った。
【００４９】
本発明の手法による菌種の識別は、上記で説明した方法と同じであるので、説明は省略する。ここでは、ＭＬＳＴ法による各菌株のｆｕｓＡ遺伝子の塩基配列の解析方法について、クロノバクター属菌３０株から選んだ１株をＭＬＳＴ法により識別する場合を例として説明する。まず、選択したクロノバクター属菌の菌株を培養した。そして、培養したクロノバクター属菌からＤＮＡを抽出した。遺伝子抽出用試薬PrepＭan Ultra（Applied Biosystems社製）１００μｌに、培養したクロノバクター属菌のコロニーを少量懸濁し、１００℃で１０分加熱処理した。その後、遠心分離（遠心分離の条件：２１，５００×ｇ、３分、２５℃）し、上清をＤＮＡ抽出液として得た。
【００５０】
ＤＮＡ抽出液に抽出されたクロノバクター属菌のＤＮＡに対してプライマー（Forward-GAAACCGTATGGCGTCAG、Reverse-AGAACCGAAGTGCAGACG）を用いて遺伝子領域ｆｕｓＡの増幅反応を行った。増幅産物をillustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（GE Healthcare社製）を用いて精製後、プライマー（Forward-GCTGGATGCGGTAATTGA、Reverse-CCCATACCAGCGATGATG）を用いてサイクルシーケンス反応を実施した。増幅反応及びサイクルシーケンス反応の条件（ＰＣＲ条件）は表４の通りである。
【００５１】
【表４】
2020031592.tif 000014
【００５２】
サイクルシーケンス反応により得た増幅産物を、DyeEx 2.0 Spin Kit（QIAGEN社製）を用いて精製した後、シーケンサーによりｆｕｓＡの塩基配列を解析した。得られた塩基配列をＭＬＳＴ解析用のデータベースPubMLSTに入力し、ｆｕｓＡの塩基配列パターンから菌種の識別を行った。この作業を、他のクロノバクター属菌に対しても行い、クロノバクター属菌３０株すべての菌種を識別した。本発明の手法による解析結果と、ＭＬＳＴ法による解析結果を表５に示す。
【００５３】
【表５】
2020031592.tif 000015
【００５４】
表５では、MALDI-TOF MSにより観測され、バイオマーカーが帰属されたピークの質量電荷比も示している。表５中のＭＡＬＤＩという行が、本発明の手法による識別結果を示し、ＭＬＳＴという行が、ＭＬＳＴ法による識別結果を示している。表５に示すように、本発明の手法による識別結果が、全てＭＬＳＴ法による識別結果と一致した。よって、本発明の手法によるクロノバクター属菌７菌種の識別結果が妥当であることが確認できた。
【００５５】
なお、菌株によっては、帰属するピークが観測されなかったバイオマーカーがあった。しかし、他のバイオマーカーの質量パターンを組み合わせることで、検証に用いたクロノバクター属菌３０株の菌種を１菌種に絞ることができた。例えば、B-1391では、バイオマーカーＬ３２、Ｌ２５、Ｌ２４のピークが観測されなかったが、ＲａｉＡ（ｍ／ｚ １２７８８．６）のピークにより、菌種をC. universalisと同定することができた。検証に用いたクロノバクター属菌３０株は、C. sakazakii２３株、C. malonaticus３株、C. universalis２株、C. turicensis１株、C. dublinensis１株と識別された。
【００５６】
（４）比較例
比較例として、微生物の同定手法としてよく用いられている16S rRNA遺伝子解析（500 bp）によりクロノバクター属菌の基準株７菌種を識別する実験を行った。
【００５７】
まず、クロノバクター属菌の基準株をそれぞれ培養した。次いで、遺伝子抽出用試薬PrepＭan Ultra（Applied Biosystems社製）１００μｌに、培養したクロノバクター属菌の基準株のコロニーを少量懸濁し、１００℃で１０分加熱処理した。その後、遠心分離（遠心分離の条件：２１，５００×ｇ、３分、２５℃）し、上清をＤＮＡ抽出液として得た。
【００５８】
得られたＤＮＡ抽出液について、FAST MicroSeq 500 16S rDNA PCR Kit（Applied Biosystems社製）を用いて、クロノバクター属菌から抽出したＤＮＡの16S rRNA遺伝子領域の増幅を行った。増幅産物をGFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（GE Healthcare）を用いて精製後、MicroSeq 500 16S rDNA Bacterial Sequencing Kit（Applied Biosystems社製）を用いてサイクルシーケンス反応を行った。増幅反応及びサイクルシーケンス反応の条件（ＰＣＲ条件）は表６の通りである。
【００５９】
【表６】
2020031592.tif 000016
【００６０】
サイクルシーケンス反応により得た増幅産物をDyeEx 2.0 Spin Kit（QIAGEN社製）を用いて精製した後、シーケンサー（ABI PRISMジェネティックアナライザー3500xL、Applied Biosystems社製）によりクロノバクター属菌から抽出したＤＮＡの塩基配列を解析した。データベースEZ taxonに解析した塩基配列を入力し、相同性が９９％以上の菌種を基準株の菌種として識別した。この作業を他の基準株に対しても行った。その結果、表７に示すように、C. sakazakii及びC. malonaticusでは、どちらの基準株の識別結果も相同性が９９％以上となり、C. sakazakiiとC. malonaticusとを識別することができなかった。また、C. turicensis及びC. universalisについても、どちらの基準株の識別結果も相同性が９９％以上となり、C. turicensisとC. universalisとを識別することができなかった。
【００６１】
【表７】
2020031592.tif 000017
【符号の説明】
【００６２】
１    識別装置
２    質量分析部
３    識別処理部
４    表示部
５    取得部
６    選択部
７    抽出部
８    識別部
９    記憶部
【配列表フリーテキスト】
【００６３】
配列番号１：フォワードプライマー
配列番号２：リバースプライマー
配列番号３：フォワードプライマー
配列番号４：リバースプライマー