(57)【要約】      （修正有）【課題】補体抑制剤を含む組成物、補体関連障害を治療または予防する方法、及びその用途の提供。【解決手段】特定の配列より選択された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３，軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２，ならびに軽鎖ＣＤＲ３を含む、ヒト補体成分５（Ｃ５）タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片、それらを含む薬学的組成物、ならびに補体関連疾患の診断用キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、１１、２１、３１、４１および５１からなる群より選択された重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号２、１２、２２、３２、４２および５２からなる群より選択された重鎖ＣＤＲ２、配列番号３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、ならびに配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含む、ヒト補体成分５（Ｃ５）タンパク質に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
配列番号１、１１、２１、３１、４１および５１のいずれか１つに少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号２、１２、２２、３２、４２および５２のいずれか１つに少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖ＣＤＲ２配列、
配列番号３に少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖ＣＤＲ３配列、
配列番号４に少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号５に少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖ＣＤＲ２配列、ならびに
配列番号６に少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖ＣＤＲ３配列を含む、
ヒトＣ５タンパク質に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
配列番号７、１７、２７、３７、４７または５７に少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；ならびに
配列番号８に少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む、
ヒトＣ５タンパク質に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
配列番号９、１９、２９、３９、４９または５９に少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖；ならびに
配列番号１０に少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖を含む、
ヒトＣ５タンパク質に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む、薬学的組成物。
【請求項６】
配列番号７、１７、２７、３７、４７または５７に少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含むポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列；ならびに
配列番号８に少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含むポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片；ならびに
容器を含む、補体関連疾患の診断用キット。
【請求項１０】
補体関連疾患治療用薬剤の製造のための請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗Ｃ５抗体及び該抗体を用いた補体関連障害の予防及び治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
補体系（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ）は、先天性免疫の第一段階を担当し、感染源を最も迅速に認識して破壊する役割だけでなく、免疫細胞との相互作用を通じて先天性免疫と後天性免疫との橋渡しをする重要な役割を担っている。補体系は古典経路、代替経路（副経路）、レクチン経路と呼ばれる３種の経路を通じて活性化され、その後多様な種類の補体タンパク質が活性化される。補体タンパク質は炎症物質の分泌を活性化させ、免疫細胞と相互作用して炎症反応を調節し、感染源を攻撃できる物質を作り出すなど、外部感染源を効果的に除去する。補体系は、多くの種類の補体調節タンパク質によって補体活性の過度な増加が抑制され、恒常性を維持しており、炎症反応と免疫反応の多様な段階にわたって核心的な役割を担っているため、補体タンパク質と補体調節タンパク質が適切に調節されない場合は多様な疾患を引き起こすと知られている。
【０００３】
古典経路、代替経路、レクチン経路によって補体系が活性化されれば、Ｃ５をＣ５ａとＣ５ｂとに分解するＣ５転換酵素（Ｃ５ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ）が形成される。
【０００４】
Ｃ５は、１８個残基のシグナル配列、及び成熟Ｎ‐末端ベータ鎖（β‐ｃｈａｉｎ）とＣ‐末端アルファ鎖（α‐ｃｈａｉｎ）との間に位置するＡｒｇリッチリンカー配列（ＲＰＲＲ）からなる１６７６個アミノ酸の単一プロ‐Ｃ５ペプチドとして細胞内発現する。成熟Ｃ５は約１９０ｋＤａの分子量を有し、ジスルフィド結合で連結された２個のポリペプチド鎖（α、１１５ｋＤａ及びβ、７５ｋＤａ）からなる。Ｃ５転換酵素は、Ｃ５をアルファ鎖の残基７４と７５との間で切断し、７４個アミノ酸のＣ５ａペプチド及び以降膜攻撃複合体（ＭＡＣ）に混入されるＣ５ｂ断片を放出する。
【０００５】
アナフィラトキシンであるＣ５ａは、白血球と血小板を直接活性化させ、好中球の走化性因子として働く。Ｃ５ｂは補体活性の最終段階でＣ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９と共に膜攻撃複合体を形成し、細胞溶血を誘発する。
【０００６】
補体系が過活性化されれば非正常な免疫反応が現れ、正常細胞の損傷が起きるため、補体系の非正常な活性は自己免疫疾患、補体関連疾患などと関連している。血球溶血疾患とは、遺伝的欠陥によって血球細胞が補体タンパク質の攻撃から保護されず、発病する補体関連疾患である。リュウマチ関節炎、移植などで現れる激しい免疫反応及び組織破壊反応も補体活性に関連し、補体活性によって、免疫反応だけでなく組織損傷によるＶＥＧＦのような物質の溶出で新生血管が形成され、老人性黄斑変性、糖尿病性網膜症につながると報告されている。
【０００７】
すなわち、補体システムは健康の維持に重要な役割を果たす一方で、暫定的には疾病を起こすか又は疾病に寄与することもある。したがって、補体関連疾患の治療と診断に用いるための補体システムの新規な抗体などの開発が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、補体抑制剤を含む組成物、補体関連疾患を治療または予防する方法、及びその用途を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、補体Ｃ５‐結合分子（例えば、Ｃ５‐結合抗体またはその抗原結合断片）、該分子を含む薬学的組成物、該分子及び組成物の製造方法、該分子及び組成物の使用方法、並びに該分子及び組成物の用途を提供する。
【００１０】
本発明は、Ｃ５タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００１１】
また本発明は、配列番号７、１７、２７、３７、４７または５７から選択されるいずれか１つに、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含むポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００１２】
また本発明は、配列番号８、１８、２８、３８、４８または５８に、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含むポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００１３】
また本発明は、前記核酸を含むベクター及び宿主細胞を提供する。
【００１４】
また本発明は、本発明の１種以上のＣ５‐結合分子（例えば、Ｃ５結合抗体またはその抗原結合断片）を含む薬学的組成物を提供する。
【００１５】
また本発明は、Ｃ５結合分子を用いた補体関連疾患の治療または診断方法を提供する。
【００１６】
また本発明は、Ｃ５結合分子及び容器を含む補体関連疾患の診断用キットを提供する。また本発明は、補体関連疾患治療用薬剤を製造するためのＣ５結合分子の用途を提供する。
【００１７】
また本発明は、補体関連疾患治療のためのＣ５結合分子の用途を提供する。
【００１８】
本発明は、Ｃ５タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。本発明による抗体またはその抗原結合断片は、Ｃ５タンパク質に特異的に結合して補体活性化を抑制することで、補体関連疾患の予防または治療を可能にする。
【００１９】
本発明において「抗体」とは、完全な抗体、及びその任意の抗原結合部分または単一鎖を含む。天然発生「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互連結された、少なくとも２個の重鎖（Ｈ）及び２個の軽鎖（Ｌ）を含む糖タンパク質である。それぞれの重鎖は重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖不変領域（ＣＨ）からなる。重鎖不変領域はＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３個のドメインからなる。それぞれの軽鎖は軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖不変領域（ＣＬ）からなる。軽鎖不変領域は１個のドメインＣＬからなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ；Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分化できるが、該相補性決定領域にはフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在している。各ＶＨ及びＶＬは３個のＣＤＲ及び４個のＦＲからなり、これらはアミノ末端からカルボキシ末端まで次の順で配列される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖及び軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを含む。
【００２０】
一実施態様において、本発明のＣ５タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、Ｃ５ベータ鎖（β‐ｃｈａｉｎ）に特異的に結合し、より具体的にＣ５ベータ鎖のＭＧ４ドメインに結合し、さらに具体的に、ベータ鎖のアミノ酸配列を基準に３３２ないし３９８、望ましくは３３２ないし３７８、より望ましくは３３２ないし３６４、さらに望ましくは３３２ないし３４８のアミノ酸残基の配列、及び／または、３５０ないし４２０、望ましくは３６９ないし４０９、より望ましくは３７９ないし３９８、さらに望ましくは３８６ないし３９２のアミノ酸残基の配列に結合する。例えば、結合可能なＣ５タンパク質として、ヒトＣ５タンパク質のアミノ酸配列は配列番号６１、ヒトＣ５タンパク質のベータ鎖のアミノ酸配列は配列番号６２、及びヒトＣ５タンパク質のベータ鎖のＭＧ４ドメインのアミノ酸配列は配列番号６３で表される。その他の種としてウサギ、ラット、サルなどと種間交差反応性も有する。
【００２１】
一実施態様において、本発明のＣ５タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、少なくとも１×１０７Ｍ−１、１×１０８Ｍ−１、１×１０９Ｍ−１、１×１０１０Ｍ−１または１×１０１１Ｍ−１の親和定数（ＫＡ）を有する。
【００２２】
一実施態様において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、下記表１ないし表６に記載された抗体と同じエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片であり、該当配列に少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。補体抑制活性を有する抗体も本発明の範疇に含まれる。また、重鎖と軽鎖の不変領域における自明な一部変形の場合、同一又は類似補体抑制活性を有する範囲で本発明の範疇に含まれる。また、それぞれのこれら抗体はＣ５に結合できるため、ＶＨ、ＶＬ、全長軽鎖及び全長重鎖配列（アミノ酸配列及び該アミノ酸配列をコーディングするヌクレオチド配列）は「混合及び適応」されて、本発明の他のＣ５‐結合抗体を生成することができる。
【００２３】
〔表１〕Ｃ５抗体（ＨＲＡ‐０６‐Ｈ２‐１）
【００２４】
【表１】
2020031650.tif 000002
【００２５】
〔表２〕Ｃ５抗体（ＨＲＡ‐０６‐Ｈ２‐７）
【００２６】
【表２】
2020031650.tif 000003
【００２７】
〔表３〕Ｃ５抗体（ＨＲＡ‐０６‐Ｈ２‐１８）
【００２８】
【表３】
2020031650.tif 000004
【００２９】
〔表４〕Ｃ５抗体（ＨＲＡ‐０６‐Ｈ２‐２４）
【００３０】
【表４】
2020031650.tif 000005
【００３１】
〔表５〕Ｃ５抗体（ＨＲＡ‐０６‐Ｈ１‐９‐Ｈ２‐７）
【００３２】
【表５】
2020031650.tif 000006
【００３３】
〔表６〕Ｃ５抗体（ＨＲＡ‐０６‐Ｈ１‐９‐Ｈ２‐２４）
【００３４】
【表６】
2020031650.tif 000007
【００３５】
本発明において、抗体は上述した抗体を含めて、表１ないし表６に記載された抗体と相同性のアミノ酸を含む抗体；ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、及びＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を有し、これらＣＤＲ配列のうちの１個以上は本願に記載された抗体またはその保存的変形に基づく特定アミノ酸配列を有し、本発明のＣ５‐結合抗体の機能的特性を有する抗体；表１ないし表６に記載された抗体と同じエピトープに結合する抗体；変形された抗体を操作するための出発物質として本願に記載された１種以上のＶＨ及び／またはＶＬ配列を有する抗体を用いて製造され、出発抗体から一部変更された特性を有する抗体を全て含む。
【００３６】
また、本発明における抗体は、抗体の特性を改善するためにＶＨ及び／またはＶＬ内のフレームワーク残基に対して変形が行われたものを含む。
【００３７】
また、本発明における抗体は、Ｃ５タンパク質に特異的に結合する完全ヒト抗体であり得る。これはキメラ抗体などと比べると、ヒト対象体に投与されたときさらに減少した抗原性を有し得る。ヒト抗体は、抗体の可変領域または全長鎖がヒト胚線免疫グロブリン遺伝子を用いたシステムから得られた場合に特定胚線配列の生成物であるか、又は、それから誘導された重鎖または軽鎖可変領域若しくは全長重鎖または軽鎖を含む。このようなシステムは、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを関心抗原で免疫化させるか、又は、ファージディスプレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーを用いてスクリーニングすることを含む。ヒト胚線免疫グロブリン配列の生成物又はそれから誘導されたヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト胚線免疫グロブリンのアミノ酸配列と比べて、ヒト抗体の配列に最も近い配列であるヒト胚線免疫グロブリン配列を選別することで確認することができる。
【００３８】
また、本発明における抗体は、二重特異的または多重特異的抗体であり得る。本発明の抗体またはその抗原結合断片は、２個以上の相異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異的分子であり得る。
【００３９】
一実施態様において、本発明の抗体はＣ５タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体である。例えば、本発明の抗体はＣ５タンパク質に特異的に結合するヒトまたはヒト化モノクローナル抗体、若しくはキメラ抗体であり得、本発明の抗体はヒト重鎖不変領域及びヒト軽鎖不変領域を含む。また、本発明の抗体は単一鎖抗体であり得、Ｆａｂ断片であり得、ｓｃＦｖ（Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）であり得、ＩｇＧアイソタイプであり得る。望ましいＩｇＧアイソタイプは、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４及び／またはＩｇＧ２／４である。一実施態様において、本発明のＩｇＧアイソタイプはＩｇＧ２／４である。ＩｇＧ２／４ハイブリッド不変領域は、ＩｇＧ２のＣＨ１とヒンジ部位がＩｇＧ４のＣＨ２とＣＨ３部位と融合した形態であり得る。
【００４０】
モノクローナル抗体は通常のモノクローナル抗体方法によって産生でき、合成された抗体遺伝子を抗体発現用ベクター、望ましくはｐｃＤＮＡ、ｐＣＩ、ｐＣＭＶ、ｐＣＥＰ４などに挿入して発現及び精製することができる。また、Ｂリンパ球のウイルス性または発癌性形質転換を用いることができ、マウスシステム（ｍｕｒｉｎｅ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて作製したマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて製造することができる。例えば、標準分子生物学技術を用いて、重鎖及び軽鎖免疫グロブリンをコーディングするＤＮＡをマウスハイブリドーマから得、それと共に非マウス免疫グロブリン配列を含ませることができる。また、Ｃ５に対するヒトモノクローナル抗体は、マウス免疫系ではなくヒト免疫系の一部を保有するトランスジェニックまたはトランスクロモソミックマウスを用いて作製することができる。
【００４１】
一実施態様において、本発明はアミノ酸がそれぞれのヒトＶＨまたはＶＬ胚線（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）配列からの抗体フレームワークに置換されたフレームワークを含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００４２】
一実施態様において、本発明のＣ５タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１、２、３、４、５、６、１１、１２、２１、２２、３１、３２、４１、４２、５１または５２に９５％以上の配列同一性を有する１個以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含む。
【００４３】
一実施態様において、本発明のＣ５タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１、２、３、１１、１２、２１、２２、３１、３２、４１、４２、５１または５２と同一の１個以上の重鎖相補性決定領域配列を含む。
【００４４】
一実施態様において、本発明のＣ５タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４、５または６と同一の１個以上の軽鎖相補性決定領域配列を含む。
【００４５】
一実施態様において、本発明のＣ５タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１、１１、２１、３１、４１または５１から選択されるいずれか１つの重鎖ＣＤＲ１、配列番号２、１２、２２、３２、４２または５２から選択されるいずれか１つの重鎖ＣＤＲ２、及び／または配列番号３、１３、２３、３３、４３または５３から選択されるいずれか１つの重鎖ＣＤＲ３を含む。
【００４６】
一実施態様において、本発明のＣ５タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、及び／または配列番号６のＣＤＲ３を含む。
【００４７】
一実施態様において、本発明のＣ５タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７、１７、２７、３７、４７または５７から選択されるいずれか１つの重鎖可変領域を含むか、若しくは、配列番号７、１７、２７、３７、４７または５７から選択されるいずれか１つの重鎖可変領域に少なくとも９０％、９５％、９７％または少なくとも９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む。
【００４８】
一実施態様において、本発明のＣ５タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、配列番号８の軽鎖可変領域を含むか、若しくは、配列番号８の軽鎖可変領域に少なくとも９０％、９５％、９７％または少なくとも９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。
【００４９】
一実施態様において、本発明のＣ５タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、配列番号９、１９、２９、３９、４９または５９から選択されたいずれか１つの重鎖を含むか、若しくは、配列番号９、１９、２９、３９、４９または５９から選択されたいずれか１つの重鎖に少なくとも９０％、９５％、９７％または少なくとも９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む。
【００５０】
一実施態様において、本発明のＣ５タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１０の軽鎖を含むか、若しくは、配列番号１０の軽鎖に少なくとも９０％、９５％、９７％または少なくとも９９％の配列同一性を有する軽鎖を含む。
【００５１】
一実施態様において、本発明のＣ５タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、配列番号６２のＣ５タンパク質のベータ鎖内のエピトープに結合するものを含む。具体的に、Ｃ５タンパク質のベータ鎖アミノ酸配列を基準に３３２ないし３９８、望ましくは３３２ないし３７８、より望ましくは３３２ないし３６４、さらに望ましくは３３２ないし３４８のアミノ酸残基の配列、及び／または、３５０ないし４２０、望ましくは３６９ないし４０９、より望ましくは３７９ないし３９８、さらに望ましくは３８６ないし３９２のアミノ酸残基の配列に対応するエピトープであり得る。
【００５２】
また本発明は、配列番号７、１７、２７、３７、４７または５７から選択されるいずれか１つに、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含むポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００５３】
一実施態様において、本発明の重鎖可変領域を含むポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列を含む核酸は、下記表７の配列を含むか、若しくは、いずれか１つに少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００５４】
〔表７〕重鎖可変領域をコーディングするヌクレオチド配列
【００５５】
【表７】
2020031650.tif 000008
【００５６】
また本発明は、配列番号８に少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含むポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。一実施態様において、本発明の軽鎖可変領域を含むポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列を含む核酸は、下記表８の配列を含むか、若しくは、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００５７】
〔表８〕軽鎖可変領域をコーディングするヌクレオチド配列
【００５８】
【表８】
2020031650.tif 000009
【００５９】
また本発明は、前記核酸を含むベクター及び宿主細胞を提供する。一実施様態において、本発明は、（１）本発明の抗体の重鎖をコーディングする組み換えＤＮＡ断片、及び（２）本発明の抗体の軽鎖をコーディングする第２組み換えＤＮＡ断片を含む宿主細胞を提供する。また他の実施様態において、本発明は、本発明の抗体の重鎖及び軽鎖それぞれをコーディングする組み換えＤＮＡ断片を含む宿主細胞を提供する。一実施態様において、抗体またはその抗原結合断片はヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。
【００６０】
Ｃ５‐結合抗体、鎖または結合断片をコーディングするポリヌクレオチドを発現させるために多様な発現ベクターが用いられ得、哺乳動物宿主細胞から抗体を産生するためにウイルス由来及び非ウイルス発現ベクターの両方が用いられ得る。ｐｃＤＮＡ、ｐＣＩ、ｐＣＭＶ、ｐＣＥＰ４などのベクターとＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＣＨＯ‐ＤＧ４４などの宿主細胞を用いることができる。
【００６１】
Ｃ５‐結合抗体を保有して発現する宿主細胞は、原核または真核細胞であり得る。Ｅ．Ｃｏｌｉ、望ましくはＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８．ＨＢ２１５１、ＢＬ２１などであり得、本発明のポリヌクレオチドをクローニングして発現させるのに有用な原核宿主である。使用に適する他の微生物宿主は、バチルス、例えばバチルスサブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、及び他の腸内バクテリア、例えばサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）及び多様なシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種を含む。本発明のＣ５‐結合ポリペプチドを発現させるため、他の微生物、例えば酵母が使用でき、バキュロウイルスベクターと組み合わせられた昆虫細胞も使用することができる。
【００６２】
望ましい一実施様態において、本発明のＣ５‐結合ポリペプチドを発現させて製造するために哺乳動物宿主細胞が用いられる。例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株または外因性発現ベクターを保有する哺乳動物細胞株であり得る。また、任意の動物またはヒト細胞として、例えば、ＣＨＯ細胞株、Ｃｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、ＨＥＫ細胞株、形質転換されたＢ‐細胞及びハイブリドーマを含めて、免疫グロブリンを分泌できる多数の好適な宿主細胞株を使用でき、望ましくはＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＣＨＯ‐ＤＧ４４を使用することができる。
【００６３】
また本発明は、本発明の１種以上のＣ５‐結合分子（例えば、Ｃ５結合抗体またはその抗原結合断片）を含む薬学的組成物を提供する。
【００６４】
本発明の薬学的組成物は、補体関連疾患に有用である。補体関連疾患とは、疾患の発病が補体システムの活性化の異常、例えば補体欠乏と関連のあるすべての疾患及び病理的状態を含む。例えば、炎症性及び自己免疫疾患、例えばリュウマチ性関節炎（ＲＡ）、退行性関節炎、急性呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）、虚血及び再潅流以後の遠隔組織損傷、心肺バイパス中の補体活性化、皮膚筋炎、天疱瘡、ループス腎炎、糸球体腎炎、糸球体血管炎、心肺バイパス、心臓麻痺−誘導された冠状動脈内皮機能異常、第II型膜増殖性糸球体腎炎、急性腎不全症、抗リン脂質症候群、黄斑変性症、眼内炎、心血管疾患、同種移植、超急性拒絶反応、血液透析、慢性閉塞性肺呼吸困難症候群（ＣＯＰＤ）、喘息、夜間血色素尿症（ＰＮＨ）及び吸引性肺炎を含み、これらに制限されない。
【００６５】
前記組成物は、補体関連疾患の治療または予防に適した１種以上の他の製剤をさらに含むことができる。医薬担体は組成物の向上、安定化、または組成物の製造を容易にする。薬学的に許容される担体は、生理的に相溶可能な溶媒、分散媒質、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌薬、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。
【００６６】
本発明の薬学的組成物は当業界に公知された多様な方法で投与することができる。投与経路及び／または方式は所望の結果によって変わる。投与は静脈内、筋肉内、腹膜内または皮下であるか、または、標的部位に近接して行われることが望ましい。特定の実施様態において、本発明の抗体は眼球の硝子体内に投与できるように製剤化される。投与経路によって、活性化合物、すなわち、抗体、二重特異的及び多重特異的分子は酸の作用及び化合物を不活性化し得る他の天然条件から化合物を保護する物質でコーティングされ得る。
【００６７】
組成物は滅菌されて、流体でなければならない。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティング剤の使用によって、分散液剤の場合は必要な粒度の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持できる。多くの場合、等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトールまたはソルビトール、及び塩化ナトリウムを組成物内に含ませることが望ましい。注射可能な組成物の長期間吸収は吸収を遅延させる作用剤、例えばアルミニウムモノステアレートまたはゼラチンを組成物内に含ませて誘導することができる。
【００６８】
本発明の薬学的組成物は、当業界に公知され通常実施される方法によって製造することができる。例えば、文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、２０ｔｈｅｄ．、２０００］及び［Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、ｅｄ．、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７８］を参照する。薬学的組成物は、望ましくはＧＭＰ条件下で製造される。典型的に、Ｃ５‐結合抗体の治療有効用量または効能用量が本発明の薬学的組成物に用いられる。Ｃ５‐結合抗体は当業者に公知された通常の方法によって薬学的に許容される投与形態で製剤化される。投薬法は所望の最適の反応（例えば、治療反応）を提供するように調整される。
【００６９】
本発明の薬学的組成物のうち活性成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性がなく、特定患者、組成物及び投与方式に対して所望の治療反応達成に効果的な活性成分の量になるように変わり得る。選択された投与量水準は、多様な薬物動態学的因子、例えば使用された本発明の特定組成物、またはそのエステル、塩またはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用された特定化合物の排出速度、処置期間、使用された特定組成物と組み合わせられて使用された他の薬物、化合物及び／または物質、治療を受ける患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康及び以前の病歴及びその他の因子によって変わる。
【００７０】
治療投与量は安全性及び効能が最適化するように滴定する必要がある。抗体を全身投与する場合、投与量範囲は宿主体重１ｋｇ当たり約０．０００１ないし１００ｍｇ、より一般的には０．０１ないし１５ｍｇの範囲である。例示的な治療法は２週に１回、または１ヶ月に１回、または３ヶ月ないし６ヶ月毎に１回の全身投与を伴う。抗体を硝子体内に投与する場合、投与量は約０．０００１ないし約１０ｍｇの範囲である。例示的な治療法は２週に１回、または１ヶ月に１回、または３ヶ月ないし６ヶ月毎に１回の全身投与を伴う。
【００７１】
全身投与の一方法では１ないし１０００μｇ／ｍＬ、一方法では２５ないし５００μｇ／ｍＬの血漿抗体濃度が達成されるように、投与量が調整される。代案的に、頻度を減らして投与することが求められる場合は、抗体を持続放出製剤として投与することができる。投与量及び頻度は患者における抗体の半減期によって変わる。予防的用途としては、相対的に低い投与量を長期間にわたって相対的に間隔を広げて投与する。
【００７２】
また本発明は、Ｃ５結合分子を用いた補体関連疾患の治療または診断方法を提供する。
【００７３】
本発明のＣ５結合分子を用いた補体関連疾患の治療方法は、抗体、その抗原結合断片、またはそれを含む組成物の治療学的に有効な量の投与を含む。本発明で使用する「治療学的に有効な量」という用語は、補体関連疾患の予防または治療に有効な本発明のＣ５結合分子またはそれを含む組成物の量を表す。
【００７４】
本発明の治療剤としてＣ５結合分子またはそれを含む組成物が他の作用剤とともに投与される場合、これら２種の物質は任意の順に順次または同時に投与され得る。Ｃ５‐結合抗体を用いた併用療法に適する作用剤は補体成分の活性を調整できるものであって、当業界に公知された作用剤を含む。例えば、ホスホン酸エステル、ポリアニオン系物質、フッ化スルホニル、ポリヌクレオチド、ピマール酸、様々な抗炎症剤などがある。１以上の治療剤などとの併用療法は付加的であっても良く、相乗作用も引き起こし得る。
【００７５】
本発明は、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組織）から、若しくは、補体関連疾患を患っているか又は発病の危険がある個体から、Ｃ５タンパク質及び／または核酸の発現、及びＣ５タンパク質機能を決定する診断検定を含む。本発明の抗体において、例えば放射線免疫検定、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）及び放射状拡散検定が補体分裂生成物の検出に利用可能である。また、診断検定、予後検定、薬理遺伝学及び臨床試験モニタリングを予後（予測）目的で用いることで、個体の予防的な治療に使用することができる。また、本発明は、個体における補体経路活性の調節異常と関連する障害発生の危険性有無を決定するための予後（または予測）検定を提供する。例えば、Ｃ５遺伝子内の突然変異を生物学的サンプルから検定することができる。このような検定を予後または予測目的で使用することで、Ｃ５タンパク質、核酸の発現または活性を特徴とするか又はそれと関連する障害の発病前に個体を予防的に治療することができる。
【００７６】
また本発明は、Ｃ５結合分子；及び容器を含む補体関連疾患の診断用キットを提供する。本発明の診断用キットは、上述したＣ５結合分子のいずれか１つ以上を含むことができる。容器は固体担体を含み、Ｃ５結合分子は固体担体に付着でき、このような固体担体は多孔性または非多孔性、平面または非平面であり得る。
【００７７】
また本発明は、補体関連疾患の治療用薬剤を製造するためのＣ５結合分子の用途を提供する。薬剤を製造するための本発明のＣ５結合分子またはそれを含む組成物に、許容される担体などを混合することができ、他の作用剤と共に複合製剤として製造されて活性成分の相乗作用を引き起こし得る。
【００７８】
また本発明は、Ｃ５結合分子の用途を提供する。本発明の補体関連疾患を治療するためのＣ５結合分子は、治療用途で用いることができ、補体関連疾患を患っているか又は発病の危険がある個体からＣ５タンパク質及び／または核酸の発現、及びＣ５タンパク質機能を決定する診断検定の用途で用いることができる。
【００７９】
本発明の用途、組成物、治療方法において上述した事項は、相互に矛盾しない限り同様に適用される。
【発明の効果】
【００８０】
本発明によるＣ５結合分子は、補体関連疾患の診断、予防及び治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】本発明の一実施例によるウサギ（Ａ）及びニワトリ（Ｂ）の免疫ライブラリーを用いたバイオパニング（ｂｉｏ−ｐａｎｎｉｎｇ）後、無作為に選別された４０個のクローンの吸光度を示した図である。
【図２】本発明の一実施例によるウサギ及びニワトリ免疫ライブラリーから選別された５種の抗体と対照抗体であるエクリズマブ（ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ）とのヒトＣ５に対する吸光度測定結果を示した図である。
【図３】Ｃ５に対する結合力を有する多数のクローンを５種の変異体サブライブラリーから確保した結果を示した図である。
【図４】本発明の一実施例によるヒト化クローンであるＨＲＡ‐０６クローンを鋳型として用いて作製した、親和性の向上したクローンの結合能を比べた結果を示した図である。
【図５】本発明の一実施例によって製造された抗体が、補体依存的細胞毒性検定法で高い補体依存的細胞毒性抑制能を有することを示した図である。
【図６】本発明の一実施例によって製造された抗体が、Ｃ５ａ生成検定法で高いＣ５ａ生成抑制能を有することを示した図である。
【図７】本発明の一実施例によって製造されたモノクローナル抗体の種間交差反応性を示した図である。
【図８ａ】本発明の一実施例によって製造、精製された抗体のサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示した図である。
【図８ｂ】本発明の一実施例によって製造、精製された抗体のサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示した図である。
【図８ｃ】本発明の一実施例によって製造、精製された抗体のサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示した図である。
【図８ｄ】本発明の一実施例によって製造、精製された抗体のサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示した図である。
【図８ｅ】本発明の一実施例によって製造、精製された抗体のサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示した図である。
【図８ｆ】本発明の一実施例によって製造、精製された抗体のサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示した図である。
【図９】本発明の一実施例による抗体がＣ５のベータ鎖に結合することを示した図である。
【図１０】本発明の一実施例による抗体がＣ５ベータ鎖のＭＧ４ドメインに結合することを示した図である。
【図１１】本発明の一実施例による抗体が、ベータ鎖のＣ‐末端から１個ドメインずつ順次除去された変異体Ｆｃ融合タンパク質内のＭＧ４ドメインに特異的に結合することを示した図である。
【図１２】本発明の一実施例による抗体が、ＭＧ４ドメインが順次除去された変異体内のベータ鎖のＮ‐末端の３３２ないし３４８番目アミノ酸残基に結合することをイムノブロッティング（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）で確認した図である。
【図１３】本発明の一実施例による抗体が、ベータ鎖Ｎ‐末端の３７９ないし３９８番目アミノ酸残基に結合することをＥＬＩＳＡで確認した図である。
【図１４】本発明の一実施例による抗体が、ベータ鎖Ｎ‐末端の３８６ないし３９２（ＭＧ４ドメイン配列基準：５５ないし６１番目アミノ酸配列）番目アミノ酸残基に結合することをＥＬＩＳＡで確認した図である。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
以下、本発明の構成要素と技術的特徴を実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、下記実施例は本発明の内容を例示するものであるだけで、発明の範囲を限定するものではない。
【００８３】
本願の多様な実施例が図面を参照して記載される。以下の説明において、本発明の完全な理解を助けるため、多様な特異的詳細事項、例えば、特異的形態、組成物及び製造方法などが記載されている。しかし、特定の実施例はこれら特異的詳細事項のうちの１つ以上を備えず、または、他の公知された方法及び形態と共に実行され得る。他の例において、公知された工程及び製造技術は、本発明が不要に曖昧にならないように、特定の詳細事項として記載しない。本明細書において、「一実施例」または「実施例」についての参照は実施例に係って記載された特別な特徴、形態、組成または特性が本発明の１つ以上の実施例に含まれることを意味する。したがって、本明細書の多様な位置に記載された「一実施例において」または「実施例」の状況は必ずしも本発明の同じ実施例を意味することではない。さらに、特別な特徴、形態、組成または特性は１つ以上の実施例において如何なる好適な方法によって組み合わせられ得る。
【実施例】
【００８４】
〔実施例１．Ｃ５免疫抗体ライブラリーの作製〕
ヒトＣ５タンパク質（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）５μｇをＲＩＢＩ＋ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳアジュバント（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ、ＵＳＡ）と混合してＮＺＷウサギとニワトリの皮下に注射し、さらに２週間隔でウサギには総３回、ニワトリには総４回注射した。免疫が完了したウサギの脾臓及び骨髓、ニワトリの脾臓、骨髓及びファブリキウス嚢からＴＲＩ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ ＵＳＡ）を使用してトータルＲＮＡを抽出し、オリゴ（ｄＴ）プライマー及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭIII ファーストストランド合成システム（Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してファーストストランドｃＤＮＡを合成した。免疫グロブリンの重鎖可変領域と軽鎖可変領域に特異的な、下記表９（ウサギ）及び表１０（ニワトリ）に示したプライマーを用いて単一鎖Ｆｖライブラリーを作製した。ウサギのｓｃＦｖライブラリーに対してはＶＨの４プライマー及びＶＬの１０（９×Ｖκ及び１×Ｖλ）組合せがコーディング配列増幅のため用られ、ニワトリに対してはＶλ及びＶＨに対して１つの組合せが用いられた。
【００８５】
〔表９〕ウサギ単一鎖ＦｖライブラリーのＶκ、Ｖλ及びＶＨのためのプライマー
【００８６】
【表９】
2020031650.tif 000010
【００８７】
〔表１０〕ニワトリ単一鎖ＦｖライブラリーのＶλ及びＶＨのためのプライマー
【００８８】
【表１０】
2020031650.tif 000011
【００８９】
それぞれの反応において、１μｌのｃＤＮＡは６０ｐｍｏｌの各プライマー、１０μｌの１０Ｘ反応バッファー、８μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５μｌのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及び水と混合し、最終体積を１００μｌにした。ＰＣＲ反応は、９４℃１５秒、５６℃３０秒、及び７２℃９０秒の３０サイクル、最終伸長７２℃１０分の条件で行われた。約３５０ｂｐの増幅断片を１．５％アガロースゲルにローディング及びランニングした後、ＱＩＡＥＸ II ゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）で精製した。二回目のＰＣＲにおいて、一回目のＶＬ及びＶＨ生成物は重複伸長ＰＣＲ（Ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ）によって無作為に結合された。それぞれのＰＣＲ反応は１００ｎｇの精製されたＶＬ及びＶＨ生成物、６０ｐｍｏｌの各プライマー、１０μｌの１０Ｘ反応バッファー、８μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ及び０．５μｌのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含む１００μｌの混合物で行われた。ＰＣＲ反応は、９４℃１５秒、５６℃３０秒、及び７２℃２分の２０サイクル、最終伸長７２℃１０分の条件で行われた。約７００ｂｐのｓｃＦＶ断片をＱＩＡＥＸ II ゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。ｓｃＦｖ断片及びｐＣｏｍｂ３ＸＳＳベクターは、ＳｆｉＩ制限酵素（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって５０℃で８時間切断された。７００ｎｇのＳｆｉＩで切断されたｓｃＦｖは、１６℃で１２時間反応物を培養することで、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて１４００ｎｇのｐＣｏｍｂ３Ｘベクターにライゲーションされ、その後エタノール沈殿した。ライゲーションされたライブラリーは、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ）によってＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８に形質転換された。細胞を３ｍｌのＳｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ（ＳＢ）培地に再懸濁し、３７℃で１時間、２５０ｒｐｍで撹拌して培養した。その後、１０ｍｌのＳＢ培地及び３μｌの１００ｍｇ／ｍｌカルベニシリンを培養液に添加した。ライブラリーサイズは、５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＬｕｒｉａ ｂｒｏｔｈプレートに培養液を０．１、１及び１０μｌプレーティングすることによって決められた。１時間培養した後、４．５μｌの１００ｍｇ／ｍｌカルベニシリンを添加し、さらに１時間培養した。培養液に２ｍｌのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（＞１０１１ｃｆｕ／ｍｌ）、１８３ｍｌのＳＢ培地及び９２．５μｌの１００ｍｇ／ｍｌカルベニシリンを加えて、３７℃で２時間、２５０ｒｐｍで撹拌して培養した。カナマイシン（２８０μｌ）を加え、３７℃、２５０ｒｐｍで一晩撹拌した。翌日、培養液を３０００ｇで１５分間遠心分離した。バクテリアペレットはファージミドＤＮＡ製造のために保存し、上澄液はきれいな遠心分離瓶に移した。上澄液に８ｇのポリエチレングリコール−８０００（ＰＥＧ−８０００、Ｓｉｇｍａ）及び６ｇの塩化ナトリウム（Ｍｅｒｋ）を加え、３０分間氷に保存した後、１５，０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。ファージペレットは１％ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）を含むＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−ＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ）に再懸濁した。
【００９０】
〔実施例２．バイオパニング（ｂｉｏ−ｐａｎｎｉｎｇ）〕
３μｇのヒトＣ５抗体を１６時間、常温で１×１０７磁性ビーズ（ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ２７０‐Ｅｐｏｘｙ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でコーティングした。ビーズをＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で洗浄し、１時間、常温で３％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキングした。コーティングされたビーズを洗浄した後、２時間、常温でファージディスプレイｓｃＦｖと共に培養した。結合されていないファージを除去するため、ビーズを０．５％ＴＰＢＳで洗浄した。結合されたファージを１００μｌの０．１Ｍグリシン‐ＨＣｌで溶出し、６μｌの２Ｍ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ ９．０）で中性化した。溶出されたファージはＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８に感染され、一晩増幅のためにＶＣＳＭ１３ヘルパーファージでレスキューした。インプット及びアウトプットファージ力価は、カルベニシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢプレートにファージが感染されたバクテリアをプレーティングし３７℃で培養することで決められた。翌日、ファージを実施例１と同様に、ＰＥＧ‐８０００及びＮａＣｌ添加によって沈殿した。
【００９１】
〔実施例３．ファージＥＬＩＳＡによるｓｃＦｖ選択〕
バイオパニングから選択されたクローンを分析するため、ヒトＣ５に対してファージディスプレイｓｃＦｖを用いてＥＬＩＳＡを行った。９６ウェルプレートを１００ｎｇのヒトＣ５で一晩４℃でコーティングし、３％ＢＳＡ含有ＰＢＳでブロッキングした。それぞれのファージ培養液を同一量の６％ＢＳＡ含有ＰＢＳと混合した後、ヒトＣ５でコーティングした９６ウェルプレートに添加し、３７℃で２時間培養した。培養終了後、洗浄を行い、ＨＲＰ結合した抗Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＳＡ）で培養した。培養が終わってから洗浄し、０．０５Ｍクエン酸バッファー中で、２，２’‐アジノ‐ビス（３‐エチルベンゾチアゾリン‐６‐スルホン酸）（ＡＢＴＳ、Ａｍｒｅｓｃｏ、ＯＨ、ＵＳＡ）１μｇ／ｍｌ及び０．１％ Ｈ２Ｏ２をそれぞれのウェルに添加して発色させ、４０５ｎｍで吸光度測定を行った。
【００９２】
その結果を図１に示した。
【００９３】
図１のＡはウサギの免疫ライブラリーを示し、図１のＢはニワトリの免疫ライブラリーを示す。ヒトＣ５に対して吸光度０．６以上を示すクローンの遺伝子配列を分析した結果、ウサギ免疫ライブラリーから２種、ニワトリ免疫ライブラリーから３種の相異なる配列を有するｓｃＦｖクローンを確保した。
【００９４】
また、選択された５種のｓｃＦｖクローンに対し、Ｃ５に対する抗Ｃ５ ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質のＥＬＩＳＡを行って、対照抗体であるエクリズマブと結合能を比べた。上述した方法と同様にＨＲＰ−結合された抗ヒトＩｇＧを用いてＣ５に結合する抗体の量を決定し、その結果を図２に示した。
【００９５】
図２に示されたように、５種の選別されたｓｃＦｖクローン全てがエクリズマブより高い吸光度を示した。
【００９６】
〔実施例４．親和性成熟及びヒト化抗体の作製〕
ヒト補体Ｃ５に対して結合力と活性化抑制能を有するｓｃＦｖ抗体断片を構成する６個の抗原相補性決定領域（ＣＤＲ、軽鎖抗原相補性決定領域１−３［ＣＤＲＬ １−３］、重鎖抗原相補性決定領域１−３［ＣＤＲＨ １−３］）部分をヒト胚線ｋａｐｐａ１／ＩＧＨＶ３−２３の８個のフレームワーク（ＦＲＬ １−４、ＦＲＨ １−４）の間に挿入し、ヒト化抗補体Ｃ５ ｓｃＦｖ遺伝子を合成した（ＨＲＡ‐０６、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）。
【００９７】
変異体サブライブラリーを作製するために、同義性コドン（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｃｏｄｏｎｓ）ＮＮＫまたはＭＮＮ（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｍ＝ＡまたはＣ）を含むオリゴヌクレオチドを使用した。ＨＲＡ‐０６ ｓｃＦｖ遺伝子はテンプレートＤＮＡとして使用された。無作為コドンはＰＣＲによってＣＤＲＨ３のみを除いて５個のＣＤＲに導入された。増幅されたｓｃＦｖ断片をＱＩＡＥＸ II ゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）によって精製した。ＳｃＦＶ及びｐＣｏｍｂ３ＸＳＳベクターはＳｆｉＩ制限酵素（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で切断し、ライゲーションの後、エタノール沈殿した。ライゲーションされたライブラリーは実施例１と同様にＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８に形質導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、ファージライブラリーを作製した。作製されたファージライブラリーを基盤に実施例２と同じ方法で抗原を選別した。最後に実施例３と同じ方法でＣ５に対する結合力をファージＥＬＩＳＡで確認した。
【００９８】
図３に示されたように、Ｃ５に対する結合力を有する多数のクローンを５種の変異体サブライブラリーから確保した。
【００９９】
〔実施例５．組み換え抗Ｃ５抗体及び対照群エクリズマブ抗体の作製〕
１．全長ＩｇＧベクター及びｓｃＦｃｖ‐Ｆｃベクターで抗Ｃ５抗体のサブクローニング
Ｈｉｎｄ III（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）及びＸｈｏ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）制限酵素によってｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＩｇＧ２ヒンジ及びＩｇＧ２／４ハイブリッドＣＨ２‐ＣＨ３をコーディングする遺伝子が挿入された。抗Ｃ５ ｓｃＦｖをコーディングする遺伝子は２つのＳｆｉＩ制限部位によってＦｃ領域の５’末端にサブクローニングされた。軽鎖に対し、ヒト免疫グロブリンＣκ遺伝子は哺乳類発現ベクターにサブクローニングされた。重鎖に対し、ヒトＣＨ１及びＩｇＧ２のヒンジからＩｇＧ２／４ハイブリッドＣＨ２‐ＣＨ３領域までの遺伝子は哺乳類発現ベクターにサブクローニングされた。多様な軽鎖及び重鎖は全長ＩｇＧベクターにサブクローニングされた。エクリズマブの抗体配列は日本医薬品医療機器総合機構（ＰＭＤＡ）に登録されているエクリズマブ（製品名：Ｓｏｌｉｒｉｓ）の審査報告書に明示された抗体配列に基づいて重鎖及び軽鎖遺伝子を合成した。
【０１００】
２．形質導入及びタンパク質の精製
形質導入は過発現組み換えタンパク質に対して行われた。培養体積のｍｌ当り２μｇの哺乳類発現ベクターと４μｇのポリエチレンイミン／ｍｌ（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ、ＵＳＡ）を培養体積の１／１０に該当する１５０ｍＭ塩化ナトリウムに混合し、常温で１５分間放置した。混合物にＨＥＫ ２９３Ｆ細胞（２×１０６細胞／ｍｌ）を加え、５日間、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３発現培養液、３７℃、７％ＣＯ２及び１３５ｒｐｍの撹拌条件下で培養した。細胞培養液の上澄液は回収し、ＩｇＧ及びＦｃ融合タンパク質の精製のため、タンパク質Ａ親和性ゲルクロマトグラフィーの対象にした。
【０１０１】
〔実施例６．モノクローナル抗体の結合能測定〕
実施例５の方法で産生した抗体の補体Ｃ５結合能を測定するため、ＥＬＩＳＡを行った。Ｃ５をコーティングした９６ウェルプレートに抗体を濃度毎に希釈して添加し、反応させた。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）で標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を二次抗体として用いてＡＢＴＳ（２，２’‐アジノビス［３‐エチルベンゾチアゾリン‐６‐スルホン酸］‐ジアンモニウム塩）で発色させ、吸光度を実施例３と同様に測定した。
【０１０２】
実験に用いたモノクローナル抗体は、親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）されたヒト化抗Ｃ５抗体６種（ＨＲＡ‐０６‐Ｈ２‐１、ＨＲＡ‐０６‐Ｈ２‐７、ＨＲＡ‐０６‐Ｈ２‐１８、ＨＲＡ‐０６‐Ｈ２‐２４、ＨＲＡ‐０６‐Ｈ１‐９‐Ｈ２‐７、ＨＲＡ‐０６‐Ｈ１‐９‐Ｈ２‐２４）と陽性対照群抗体エクリズマブ、陰性対照群抗体パリビズマブ（ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）であり、実験結果は図３に示した。
【０１０３】
図４に示されたように、抗補体Ｃ５抗体は全てＣ５に対して結合力を示し、親和性成熟されたヒト化抗Ｃ５抗体６種はエクリズマブに比べて高い吸光度を示した。
【０１０４】
〔実施例７．試験管内の補体依存的細胞毒性検定〕
ＣＤ‐２０発現ヒトバーキットリンパ腫細胞株であるＲａＪｉを、１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＰＭＩ １６４０で維持した。標的細胞は洗浄後、１×１０６細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。抗ＣＤ２０ヒトＩｇＧであるリツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、Ｒｏｃｈｅ）を３μｇ／ｍｌの濃度でＣＤＣ溶液に希釈した。同一体積の標的細胞及び敏感性抗体を９６ウェルプレートに１００μｌ／ｗｅｌｌの体積になるように混合し、常温で５分間放置した。ヒト補体血清を追加することで検定が始まり、その結果、各ウェル当り１５０μｌの最終体積になり、最終濃度は４％血清であった。２時間培養した後、１５μｌのテトラゾリウム塩（ＷＳＴ‐１、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ、Ｊａｐａｎ）を添加し、プレートをさらに２時間培養した。生きている細胞は４５０ｎｍのＯＤで測定した。抗Ｃ５抗体の効果は、標的細胞及び敏感性抗体混合物の添加前に３０分間３７℃で血清と前培養することで評価した。同一濃度のパリビズマブをＩｇＧ対照群として使用した。細胞生存率のパーセントは下記式によって計算した。
【０１０５】
％生存率＝（テスト抗体−背景）／（テスト抗体なし−背景）×１００
その結果を図５に示した。
【０１０６】
図５に示されたように、本発明によって作製された親和性成熟されたヒト化抗Ｃ５抗体はＣＤＣ抑制能を示し、抗体全てがエクリズマブと比べて高い細胞生存力を示した。
【０１０７】
〔実施例８．試験管内のＣ５ａ産生量測定〕
標的細胞、敏感性抗体及び血清を２時間培養した後、細胞は遠心分離によってペレット化し、上澄液は製造社のマニュアルに従ってＢＤ ＯｐｉＥＩＡＴＭ Ｈｕｍａｎ Ｃ５ａ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ II（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用しサンドイッチＥＬＩＳＡによってＣ５ａ量を検定した。
【０１０８】
その結果を図６に示した。
【０１０９】
図６に示されたように、本発明によって作製された親和性成熟されたヒト化抗Ｃ５抗体は全てＣ５ａ生成抑制能を示し、親和性成熟されたヒト化抗Ｃ５抗体４種は全てエクリズマブと比べて高い抑制力を示した。
【０１１０】
〔実施例９．モノクローナル抗体の種間交差反応性の測定〕
モノクローナル抗体がヒト以外の他の種の補体Ｃ５に結合するか否かを確認するため、イムノブロッティングを行った。ヒトＣ５タンパク質とヒト（Ｓｉｇｍａ）、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）、ＢＡＬＢ／ｃマウス、ウィスターラット、ＮＺＷウサギの血清を希釈したものをそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥし、分離されたタンパク質をニトロセルロース膜に移動させた。本発明によって作製された抗補体Ｃ５抗体ＨＲＡ‐０６‐Ｈ２‐１を用いてイムノブロッティングを行った。
【０１１１】
その結果を図７に示した。
【０１１２】
図７に示されたように、抗補体Ｃ５抗体はヒト（Ｓｉｇｍａ）、アカゲザル、ウィスターラット、ＮＺＷウサギのＣ５に結合力を示した。
【０１１３】
〔実施例１０．サイズ排除クロマトグラフィー〕
精製した抗体をＷａｔｅｒｓ ２４８９ ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）及びＺｅｎｉｘ−Ｃ ３００ ｃｏｌｕｍｎ（Ｓｅｐａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ、ＵＳＡ）を用いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ；ｓｉｚｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）分析を行った。移動相組成物（１５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）及び流速（１．０ｍＬ／分）を維持し、タンパク質の濃度は２８０ｎｍでコラム溶出液の吸光度をモニタリングして決定した。分画濃度はピーク領域の和でそれぞれのピーク領域を除することで計算された。
【０１１４】
その結果を図８に示した。図８ａないし図８ｆは、それぞれａ）ＨＲＡ‐０６‐Ｈ２‐１、ｂ）ＨＲＡ‐０６‐Ｈ２‐７、ｃ）ＨＲＡ‐０６‐Ｈ２‐１８、ｄ）ＨＲＡ‐０６‐Ｈ２‐２４、ｅ）ＨＲＡ‐０６‐Ｈ１‐９‐Ｈ２‐７及びｆ）ＨＲＡ‐０６‐Ｈ１‐９‐Ｈ２‐２４を示す。
【０１１５】
図８に示されたように、抗補体Ｃ５抗体の物理化学的特性では凝集が殆ど生じないことが確認された。
【０１１６】
〔実施例１１．エピトープマッピング〕
１．Ｃ５ベータ鎖への抗体の結合確認
補体Ｃ５タンパク質のリデューシング（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）を行ったものと行っていないものそれぞれをＳＤＳ−ＰＡＧＥし、抗補体Ｃ５抗体でイムノブロッティングすることで、ベータ鎖結合如何を確認した。その結果を図９に示した。
【０１１７】
図９のＡはエクリズマブを抗体として使用して結合を確認した結果であり、図９のＢは本発明によるＨＲＡ‐０６‐Ｈ２‐１を抗体として使用した結果である。周知のようにエクリズマブはＣ５（補体タンパク質全体）に結合し、リデューシングを行った２レーンでアルファ鎖に結合することを確認した。一方、本発明によるＨＲＡ‐０６‐Ｈ２‐１抗体はＣ５（補体タンパク質全体）に結合し、リデューシングを行った２レーンでベータ鎖に結合することを確認した。
【０１１８】
２．Ｆｃ融合タンパク質でＣ５ベータ鎖変異ドメインを製造及び結合部位の確認
ベータ鎖の順次除去変異体及びＣ５のベータ鎖を構成する６個のドメインがｃＤＮＡから増幅された。プライマーは５’及び３’末端でＳｆｉＩ制限位置に添加されるようにデザインされた（表１１）。ベータ鎖の順次除去変異体は、表１２に示されたようなプライマー組合せによって増幅された。増幅されたＰＣＲ断片はＳｆｉＩで切断され、クローニング位置の３’部分でヒトＩｇＧ１のヒンジ部位及びＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを含むように変形されたｐＣＥＰ４ベクターにクローニングされた。このようなクローンは実施例５と同様に形質導入され、Ｆｃ融合タンパク質は精製された。
【０１１９】
〔表１１〕ベータ鎖ドメインの増幅のためのプライマー配列
【０１２０】
【表１１】
2020031650.tif 000012
【０１２１】
〔表１２〕ベータ鎖ドメイン及びベータ鎖除去変異体を製造するためのプライマー組合せ
【０１２２】
【表１２】
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【０１２３】
それぞれのドメインを含むタンパク質に対してそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、抗補体Ｃ５抗体（ＨＲＡ‐０６‐Ｈ２‐１）でイムノブロッティングを実施した。その結果を図１０及び図１１に示した。
【０１２４】
図１０のＡはＣ５ベータ鎖及び作製されたＦｃ融合タンパク質の構造を示した模式図であり、図１０のＢはイムノブロッティングの結果である。図１０に示されたように、本発明によって作製されたＨＲＡ‐０６‐Ｈ２‐１抗体はＭＧ４ドメインを有するＦｃ融合タンパク質に結合することが確認された。
【０１２５】
図１１のＡはＣ５ベータ鎖及び作製されたＦｃ融合タンパク質の構造を示した模式図であり、図１１のＢはイムノブロッティングの結果である。図１１に示されたように、ＭＧ４ドメインを含むＦｃ融合タンパク質のみとＨＲＡ‐０６‐Ｈ２‐１抗体が結合することを確認した。
【０１２６】
３．Ｆｃ融合タンパク質でＭＧ４ドメインを作製及び結合部位の確認
ベータ鎖のＭＧ４ドメインとＭＧ４ドメインのＮ‐末端から順次除去した５種の変異体をクローニングした。プライマーは５’及び３’末端全てにＳｆｉＩ制限位置が添加されるようにデザインされた（表１３）。増幅されたＰＣＲ断片をＳｆｉＩで切断し、クローニング位置の３’部分でヒトＩｇＧ１のヒンジ部位及びＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを含むように変形されたｐＣＥＰ４ベクターにクローニングされた。その後、実施例５と同様にこれらクローンを形質導入し、Ｆｃ融合タンパク質を精製した。精製されたＦｃ融合タンパク質に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、イムノブロッティングを上記のように行った。
【０１２７】
〔表１３〕ＭＧ４ドメインの増幅のためのプライマー配列
【０１２８】
【表１３】
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【０１２９】
その結果を図１２に示した。図１２のＡはＭＧ４ドメイン及び順次除去されて作製されたＦｃ融合タンパク質を示し、図１２のＢはＨＲＡ‐０６‐Ｈ２‐１抗体でイムノブロッティングした結果である。図１２に示されたように、ベータ鎖のＮ‐末端から３３２−３４８番目配列が除去された変異体に対して結合がなされていないことが確認でき、ベータ鎖のＭＧ４ドメイン内３３２−３４８番目アミノ酸残基配列が抗体結合可能性の高い配列であることが分かる。
【０１３０】
４．ヒト／マウスハイブリッドＭＧ４ドメインから抗体結合部位を確認
Ｃ５ベータ鎖のヒト／マウスハイブリッドＭＧ４ドメインを重複伸長ＰＣＲによって作製した。プライマーは５’及び３’末端全てにＳｆｉＩ制限位置が添加されるようにデザインされた（表１４）。ＰＣＲ断片をＳｆｉＩで切断し、ＳｆｉＩ切断されたｐＣｏｍｂ３Ｘベクターにクローニングされた。このようなクローンはＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８に形質導入された。それぞれのヒト／マウスＭＧ４ハイブリッドから単一コロニーを、６００ｎｍで吸光度が１．０に達するまで培養した。ファージ感染はＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（１０１１ｐｆｕ／ｍｌ）の添加によって行われ、３７℃で２時間培養された。カナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）を添加し、一定撹拌下、３７℃で一晩培養した。バクテリアは３０００ｇで１５分間遠心分離することで除去された。
【０１３１】
〔表１４〕ヒト／マウスハイブリッドＭＧ４ドメインを増幅させるためのプライマー配列
【０１３２】
【表１４】
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【０１３３】
ファージＥＬＩＳＡは次のように行われた。抗Ｃ５ ＩｇＧ２／４であるＨＲＡ‐０６‐Ｈ２‐７を０．１Ｍ炭酸水素ナトリウムバッファー（ｐＨ８．６）で希釈し、抗体１００ｎｇを４℃で９６ウェルプレートに一晩中コーティングした。それぞれのウェルを、ツイン２０を０．０５％含むＴＢＳ内の５％スキームミルク１００μｌを添加することでブロッキングし、３７℃で１時間培養した。ファージを６％ＢＳＡ／ＰＢＳで２倍に希釈し、希釈された５０μｌのファージをそれぞれのウェルに添加して３７℃で２時間培養した。プレートを洗浄し、希釈されたＨＲＰ−結合された抗Ｍ１３抗体（１：５０００）５０μｌを添加して３７℃で１時間培養した。プレートを洗浄した後、５０μｌのＡＢＴＳ基質溶液をそれぞれのウェルに添加し、吸光度を４０５ｎｍで測定した。
【０１３４】
その結果を図１３及び図１４に示した。
【０１３５】
図１３のＡはヒト／マウスハイブリッドＭＧ４ドメインを示し、図１３のＢはＥＬＩＳＡ結果である。図１３に示されたように、ＨＲＡ‐０６‐Ｈ２‐７抗体はベータ鎖配列を基準に３７９−３９８のアミノ酸残基配列がヒトの配列である場合に結合し、これは抗体の該当部分に対する結合可能性を示す。
【０１３６】
図１４は、配列結合部位をより具体的に確認した結果である。図１４のＡはヒト／マウスハイブリッドＭＧ４ドメインを示し、図１４のＢはＥＬＩＳＡ結果である。図１４に示されたように、ＨＲＡ‐０６‐Ｈ２‐７抗体はベータ鎖配列を基準に３８６−３９２のアミノ酸残基配列（ＭＧ４ドメイン配列基準：５５−６１番目アミノ酸配列）がヒトの配列である場合に結合し、これは抗体の該当部分に対する結合可能性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図８ｅ】
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【図８ｆ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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