(57)【要約】      （修正有）【課題】複合両親媒性ペプチドナノミセル及びその製造方法、応用を提供する。【解決手段】具体的にはインテグリンαｖβ３を標的する新規な複合両親媒性ペプチドナノミセル、及びその蛍光イメージング、光線力学的治療、音響力学的治療及び光音響併用治療における応用を開示する。標的複合両親媒性ペプチドナノミセルは良好な生体適合性、カプセル化物質の蛍光イメージング、光線力学的治療及び光熱治療機能によって、インビボでの標識やトレース、生物医学イメージング及び腫瘍の早期診断、治療等の分野への普及が期待でき、生命の健康及び個別化医療などの観点から良好な経済的および社会的利益を生み出すことができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カプセル化成分が蛍光物質のローズベンガルである複合両親媒性ペプチドナノミセル。
【請求項２】
ホストはアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）トリペプチド配列を含有するＣ１８−ＧＲＲＲＲＲＲＲＲＧＤＳ（Ｃ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ）両親媒性ペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の複合両親媒性ペプチドナノミセル。
【請求項３】
直径が１０〜１００ｎｍ、電位が−２０〜４０ｍＶであることを特徴とする請求項２に記載の複合両親媒性ペプチドナノミセル。
【請求項４】
ａ．両親媒性ペプチドＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳを超純水に溶解して、濃度が１０ｇ／ｍｌの溶液を製造するステップと、
ｂ．ローズベンガルを超純水に溶解して、濃度が２ｇ／ｍｌの溶液を製造するステップと、
ｃ．上記両親媒性ペプチド溶液とローズベンガル溶液とを体積比２：１−１：１で十分に混合し、遮光しながら超音波洗浄機に移し、機器のパラメータを温度１０−３０℃、時間１０−４０分間、電力５−３５ｋＨｚとし、複合両親媒性ペプチドナノミセル生成物を得るステップと、
ｄ．上記複合両親媒性ペプチドナノミセルを、分子量カットオフが５００−１５００ダルトンの透析バッグに移し、４８−７２時間透析して、インテグリンαｖβ３を標的とする複合両親媒性ペプチドナノミセルを得るステップと、を含むことを特徴とする請求項１−３のいずれか一項に記載の複合両親媒性ペプチドナノミセルの製造方法。
【請求項５】
請求項１−３のいずれか一項に記載の複合両親媒性ペプチドナノミセルの黒色腫、子宮頸癌の蛍光イメージングにおける応用。
【請求項６】
請求項１−３のいずれか一項に記載の複合両親媒性ペプチドナノミセルの、黒色腫、子宮頸癌の光熱治療剤及び光音響治療剤の製造における応用。
【請求項７】
請求項１−３のいずれか一項に記載の複合両親媒性ペプチドナノミセルの、黒色腫、子宮頸癌の光線力学的治療剤及び音響力学的治療剤の製造における応用。
【請求項８】
上咽頭癌の新規な光線力学的治療剤とすることを特徴とする請求項１−３に記載の複合両親媒性ペプチドナノミセル。
【請求項９】
上咽頭癌の新規な音響力学的治療剤とすることを特徴とする請求項１−３に記載の複合両親媒性ペプチドナノミセル。
【請求項１０】
上咽頭癌の新規な光線力学、音響力学的併用治療剤とすることを特徴とする請求項１−３に記載の複合両親媒性ペプチドナノミセル。
【請求項１１】
静脈内注射も腫瘍内注射も可能であり、上咽頭癌に対する複数種の治療方法を実現することを特徴とする請求項１−３に記載の複合両親媒性ペプチドナノミセル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な両親媒性ペプチド自己組織化ミセル及び製造プロセス、並びにその潜在的な光線力学的及び音響力学的治療剤としての生物医学的応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
上咽頭癌は中国南部の一般的な悪性腫瘍の１つで、主に広東省及び広西チワン族自治区などの地域で発生し、高頻度地域の人々の健康に大きな害を及ぼす。放射線療法は遠隔転移を伴わない上咽頭癌の治療のための最適な選択肢であり、早期の上咽頭癌に対する良好な制御率を示す。末期の上咽頭癌の場合、放射線療法と化学療法を組み合わせたモードが臨床的によく使用される。しかしながら、放射線療法に伴う急性毒性・副作用及び化学療法における人体に対する化学療法薬の毒性・副作用は比較的大きく、耐性が弱い一部の人はその副作用に耐えることができないため、治療計画の実施に新たな困難をもたらしてしまう。さらに、遠隔転移は上咽頭癌の治療の失敗のもう１つの要因である。
【０００３】
黒色腫は臨床的に一般的な皮膚粘膜及び色素膜悪性腫瘍であり、罹患率の増加が最も速い悪性腫瘍の１つでもあり、年間増加率が３％−５％である。黒色腫は中国では罹患率が低いが、近年は倍増しており、毎年、約２万人の新規患者が発生している。現在、皮膚黒色腫の病因の唯一の証拠は、紫外線に過度にさらされることに関連しているが、アジア（中国を含む）及びアフリカ地区の黒色腫患者の原発巣はほとんど、かかと、手のひら、指及び爪下など紫外線との接触が非常に少ない部分にあり、その病因はまだ不明である。近年、黒色腫の分子生物学的特徴、臨床組織学的特徴及び遺伝的変異の関係に関する研究が深まるにつれて、特定のタイプが特定の遺伝的変異に関連していることを見出した。現在、黒色腫の診断は主に、典型的な臨床症状及び身体的兆候に依存し、病理検査は確定診断及び病期分類のゴールドスタンダードであり、免疫組織化学染色は黒色腫を識別するための主要な補助手法である。Ｓ−１００、ＨＭＢ−４５及びビメンチンは黒色腫を診断するための特異的な指標である。黒色腫の治療は主に外科的治療、術後補助治療、放射線療法及び全身治療によって行われる。
【０００４】
また、子宮頸癌の場合、世界中、年間罹患率が５１００００人、死亡数が２８８０００人であり、乳癌の罹患率に次いで２番目であり、そのうち３／４の症例が発展途上国では発生している。高齢者、経済状態が悪い患者や子宮頸癌塗抹検査に参加しない患者の一部は進行して腫瘍で死亡してしまう。子宮頸癌の組織学的分類によると、約８０％は扁平上皮癌、１５％は腺癌であり、腺癌の予後は良くないと考えられているが、現在、治療方法においてほかの子宮頸癌と異なることを証明できる証拠はない。子宮頸塗抹検査は早期の子宮頸癌を検出するための最も重要な方法であり、前浸潤病変が疑われる患者の場合、コルポスコピー、子宮頸管内膜掻爬（ＥＣＣ）等の検査を行い、膀胱又は直病変が疑われる患者の場合、膀胱鏡又は直腸鏡検査の生検を行う必要があり、また、組織学的に明らかなように、ＩＢ１期又はそれ以上の場合、骨盤腹部ＣＴ又はＭＲＩ検査がすすめられ、それにより臨床的な病期分類を決定し、後続の治療計画に非常に重要であり、子宮頸癌の治療は主に手術、及び放射線療法と化学療法に依存している。
【０００５】
従って、黒色腫及び子宮頸癌は中国の人々の健康を深刻に損なう疾患の１つになっており、早期発見及び効果的な治療は現在の研究の重点となっている。
【０００６】
蛍光イメージングは生体検査及び医療イメージング等の分野に広く使用されており、一般的な光学イメージング技術であり、サンプルは非常に高い透過性、感度及び選択性等の利点を有するが、従来の有機染料はいくつかの致命的な欠陥もあり、例えば性質が不安定であり、光で漂白されやすく、長期間使用することはできるなどが挙げられる。従って、蛍光色素の使用中の欠陥を如何に克服するかは現在の研究の重点となっている。
【０００７】
両親媒性ペプチドは天然のリン脂質分子と類似する両親媒性特性、豊富な分子構造、ユニークかつ新規なアセンブリ構造及び特殊の生物学的機能を持ち、ポリペプチドの自己組織化の研究のホットスポット分野である。両親媒性ポリペプチドの分子構造は界面活性剤と類似する疏水性セグメント及び親水性末端を有し、疎水性セグメント間の疎水性相互作用及び親水性ポリペプチドセグメント間の水素結合の共同駆動下で、ポリペプチド分子は自己組織化して規則的なナノ／ミクロン構造を形成することができる。
【０００８】
両親媒性ペプチドが有する脂肪族疎水性尾部は疏水性相互作用によって疎水性コアを形成し、疎水性材料をカプセル化でき、親水性頭部には、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）トリペプチド配列を有し、腫瘍細胞中の高発現インテグリンαｖβ３を特異的に識別できる。ポリペプチドは天然の優良な組織分子として、特殊の生物学的活性及び良好な生体適合性を有し、材料にユニークな生物学的機能を付与でき、簡単な合成及び化学修飾もポリペプチド分子の顕著な利点である。また、両親媒性ペプチドはＰＨに対する高感度を有し、ＰＨ値が４未満である場合、球状ナノミセルに自己組織化された両親媒性ペプチドは分解して単一のポリペプチド配列を形成する。細胞が飲作用及び受容体エンドサイトーシス作用によって複合両親媒性ペプチドナノミセルを細胞に取り込んだ後、酸性環境のリソソームはそれを異物として分解し、ＰＨに対する複合両親媒性ペプチドナノミセルの高感度はミセルに包まれた活物質の細胞内での放出に有利である。
【０００９】
ナノ技術の継続的な発展に伴って、ナノ技術と高感度の蛍光分子を組み合わせて蛍光分子をカプセル化した分子イメージングプローブを開発することは、上記問題を克服することに新たな戦略を提供する。近年、両親媒性ペプチドナノミセルは毒性が低く、生体適合性が良好で、特殊の生物学的活性がある等の利点によって日々注目を集めている。研究からわかるように、蛍光小分子は両親媒性ペプチドナノミセルによってカプセル化された後、蛍光安定性と構造安定性がいずれも大幅に向上する。蛍光両親媒性ペプチドナノプローブの表面のＲＧＤポリペプチドリガンドが病変領域で高発現リガンドに特異的に作用する場合、カプセル化された蛍光プローブによって病変部位を強調表示でき、それにより診断の精度及び感度を向上させ、このような標的造影剤は現在の研究分野のホットスポットとなっている。インテグリンαＶβ３は腫瘍組織の最も一般的な標的の１つであり、αＶサブユニット（ＣＤ５１、１５００００）及びβ３サブユニット（ＣＤ６１、１０５０００）からなり、ここでα鎖の細胞外ドメインはアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列を含有するポリペプチドを特異的に識別し、インテグリンと細胞外マトリックスの接着を媒介する。インテグリンαＶβ３は正常組織器官及び成熟血管内皮細胞では発現せず又は低発現し、複数種の腫瘍（肺癌、膠芽腫、乳癌、黒色腫、子宮頸癌、骨肉腫等を含む）の細胞表面及び新生血管内皮細胞では高発現し、腫瘍の血管新生、浸潤及び転移において重要な役割を果たす。特異的に標識された外因性ＲＧＤポリペプチドが体内に入ると、インテグリンαＶβ３部位と高選択的に結合し、それによりＲＧＤポリペプチドは特異的なリガンド標的組織とし、且つ各種のイメージング方法によってトレースすることができる。
【００１０】
光線力学療法及び音響力学療法は近年、ＦＤＡに承認された、光及び超音波の励起作用を使用して疾患を治療するための新しい方法である。光線力学療法とは、光を照射して感光剤が分解して一重項酸素ＲＯＳを放出して腫瘍細胞を殺す療法であり、音響力学療法とは、超音波の作用下で超音波感受性薬剤が励起されて、腫瘍細胞を殺す一重項酸素ＲＯＳを放出する療法である。音響力学療法及び光線力学療法は腫瘍部位にレーザー又は超音波作用を提供するだけでよく、且つレーザーや超音波は人体にほとんど無害であるため、非侵襲的療法であり、特に手術を受けることができない高齢者や虚弱な患者などの場合、手術、化学療法及び放射線療法による患者の苦痛を大幅に軽減させ、さらに、腫瘍部位のみを治療する治療計画によって、正常組織及び器官の損傷を軽減させる。
【００１１】
光線力学療法、音響力学療法の欠点の１つとして、治療薬の感光剤、超音波感受性薬剤が体内で分解し、循環時間が短く、蛍光消光等が生じる。ローズベンガルは感光剤、超音波感受性薬剤として一定期間使用されており、良好な光感度を持ち、無毒で安定した化合物であり、一重項酸素量子収率が０．７５である。しかし、ローズベンガルの親水性によって、標的組織に集まり難く、光線力学療法、音響力学療法での応用が大幅に制限される。
【００１２】
ナノプローブは近年出現した新しい腫瘍治療方法であり、研究したところ、ナノミセルを治療薬のキャリアとすることで、インビボでの安定性を大幅に向上させ、さらに構造修飾によって標的治療を実現でき、上記問題を完璧に解決できることを見出した。ポリペプチドは良好な生分解性及び生体適合性を有し、材料にユニークな生物学的機能を付与でき、簡単な合成及び化学修飾もポリペプチド分子の顕著な利点である。中でも、両親媒性ペプチドは疎水基及び親水基の両方を含有し、脂肪族疎水基が疏水性相互作用によって疎水性コアを形成し、疎水性材料をカプセル化でき、水中で自己組織化して安定したミセルを形成する。また、両親媒性ペプチドはＰＨに対する高感度を有し、ＰＨ値が４未満である場合、球状ナノミセルに自己組織化された両親媒性ペプチドは分解して単一のポリペプチド配列を形成する。細胞が飲作用及び受容体エンドサイトーシス作用によって複合両親媒性ペプチドナノミセルを細胞に取り込んだ後、酸性環境のリソソームはそれを異物として分解し、ＰＨに対する複合両親媒性ペプチドナノミセルの高感度はミセルに包まれた活物質の細胞内での放出に有利である。自己組織化可能な両親媒性ペプチドの内部に感光剤、超音波感受性薬剤をカプセル化してナノ系を形成することで、インビボでの安定性を大幅に向上させる。そして、自己組織化されたナノ薬物が腫瘍内注射の方法又は静脈内注射の方法によって患者の体内に送達できることで、治療方法が柔軟であり、ほかの治療方法による患者の苦痛を回避できる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従来技術の問題を解決するために、本発明は、複合両親媒性ペプチドナノミセル及びその製造方法、応用を提供し、従来技術でよく使用されている蛍光物質のローズベンガル（単独使用）が迅速に消失し、腫瘍部位での蓄積が悪い等の問題を解決し、及び両親媒性ペプチドナノミセルの多機能応用（例えば、生体イメージング、薬物放出、腫瘍治療等）を実現する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の技術案は以下のとおりである。
カプセル化成分が蛍光物質のローズベンガルである複合両親媒性ペプチドナノミセル。
ホストはアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）トリペプチド配列を含有するＣ１８−ＧＲＲＲＲＲＲＲＲＧＤＳ（Ｃ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ）両親媒性ペプチドである。
前記複合両親媒性ペプチドナノミセルは直径が１０〜１００ｎｍ、電位が−２０〜４０ｍＶである。
【００１５】
複合両親媒性ペプチドナノミセルの製造方法であって、
ａ．両親媒性ペプチドＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳを超純水に溶解して、濃度が１０ｇ／ｍｌの溶液を製造するステップと、
ｂ．ローズベンガルを超純水に溶解して、濃度が２ｇ／ｍｌの溶液を製造するステップと、
ｃ．上記両親媒性ペプチド溶液とローズベンガル溶液とを体積比２：１−１：１で十分に混合し、遮光しながら超音波洗浄機に移し、機器のパラメータを温度１０−３０℃、時間１０−４０分間、電力５−３５ｋＨｚとし、複合両親媒性ペプチドナノミセル生成物を得るステップと、
ｄ．上記複合両親媒性ペプチドナノミセルを、分子量カットオフが５００−１５００ダルトンの透析バッグに移し、４８−７２時間透析して、インテグリンαｖβ３を標的とする複合両親媒性ペプチドナノミセルを得るステップと、を含む。
複合両親媒性ペプチドナノミセルの黒色腫、子宮頸癌の蛍光イメージングにおける応用。
複合両親媒性ペプチドナノミセルの、黒色腫、子宮頸癌の光熱治療剤及び光音響治療剤の製造における応用。
複合両親媒性ペプチドナノミセルの、黒色腫、子宮頸癌の光線力学的治療剤及び音響力学的治療剤の製造における応用。
複合両親媒性ペプチドナノミセルの、上咽頭癌の新規な光線力学的治療剤の製造における応用。
複合両親媒性ペプチドナノミセルの、上咽頭癌の新規な音響力学的治療剤の製造における応用。
複合両親媒性ペプチドナノミセルの、上咽頭癌の新規な光線力学・音響力学併用治療剤の製造における応用。
複合両親媒性ペプチドナノミセルであって、静脈内注射も腫瘍内注射も可能であり、上咽頭癌に対する複数種の治療方法を実現する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の有益な効果について、本発明に係るインテグリンαｖβ３を標的とする複合両親媒性ペプチドナノミセル及び選択的構築方法は新規なバイオプローブの発展、蛍光造影剤の製造プロセスの拡張、蛍光プローブの生物学的利用率の向上、腫瘍新生血管の早期分子診断、光線力学的治療及び光熱治療の実現に非常に重要である。
以下、図面及び発明を実施するための形態を参照して本発明を更に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は本発明に係る標的複合両親媒性ペプチドナノミセルの一般構造及びプロセスである。
【図２Ａ】図２は新規標的複合両親媒性ペプチドナノミセル蛍光プローブのナノ材料安定性（図２Ａ）及びローズベンガル担持率（図２Ｂ）を示す図である。
【図２Ｂ】図２は新規標的複合両親媒性ペプチドナノミセル蛍光プローブのナノ材料安定性（図２Ａ）及びローズベンガル担持率（図２Ｂ）を示す図である。
【図３Ａ】図３は新規標的複合両親媒性ペプチドナノミセル蛍光プローブがそれぞれ黒色腫細胞（Ｂ１６）（図３Ａ）、子宮頸癌細胞（Ｈｅｌａ）（図３Ｂ）、線維芽細胞（Ｌ９２９）（図３Ｃ）に適用される場合の細胞毒性効果を示す図である。
【図３Ｂ】図３は新規標的複合両親媒性ペプチドナノミセル蛍光プローブがそれぞれ黒色腫細胞（Ｂ１６）（図３Ａ）、子宮頸癌細胞（Ｈｅｌａ）（図３Ｂ）、線維芽細胞（Ｌ９２９）（図３Ｃ）に適用される場合の細胞毒性効果を示す図である。
【図３Ｃ】図３は新規標的複合両親媒性ペプチドナノミセル蛍光プローブがそれぞれ黒色腫細胞（Ｂ１６）（図３Ａ）、子宮頸癌細胞（Ｈｅｌａ）（図３Ｂ）、線維芽細胞（Ｌ９２９）（図３Ｃ）に適用される場合の細胞毒性効果を示す図である。
【図４Ａ】図４は標的複合両親媒性ペプチドナノミセルがそれぞれ黒色腫細胞（Ｂ１６）（図４Ａ）及び子宮頸癌細胞（Ｈｅｌａ）（図４Ｃ）に応用される場合の光音響効果を示す図、及び標的複合両親媒性ペプチドナノミセルがそれぞれ黒色腫細胞（Ｂ１６）（図４Ｂ）及び子宮頸癌細胞（Ｈｅｌａ）（図４Ｄ）に応用される場合の異なる時間における光音響効果を示す図である。
【図４Ｂ】図４は標的複合両親媒性ペプチドナノミセルがそれぞれ黒色腫細胞（Ｂ１６）（図４Ａ）及び子宮頸癌細胞（Ｈｅｌａ）（図４Ｃ）に応用される場合の光音響効果を示す図、及び標的複合両親媒性ペプチドナノミセルがそれぞれ黒色腫細胞（Ｂ１６）（図４Ｂ）及び子宮頸癌細胞（Ｈｅｌａ）（図４Ｄ）に応用される場合の異なる時間における光音響効果を示す図である。
【図４Ｃ】図４は標的複合両親媒性ペプチドナノミセルがそれぞれ黒色腫細胞（Ｂ１６）（図４Ａ）及び子宮頸癌細胞（Ｈｅｌａ）（図４Ｃ）に応用される場合の光音響効果を示す図、及び標的複合両親媒性ペプチドナノミセルがそれぞれ黒色腫細胞（Ｂ１６）（図４Ｂ）及び子宮頸癌細胞（Ｈｅｌａ）（図４Ｄ）に応用される場合の異なる時間における光音響効果を示す図である。
【図４Ｄ】図４は標的複合両親媒性ペプチドナノミセルがそれぞれ黒色腫細胞（Ｂ１６）（図４Ａ）及び子宮頸癌細胞（Ｈｅｌａ）（図４Ｃ）に応用される場合の光音響効果を示す図、及び標的複合両親媒性ペプチドナノミセルがそれぞれ黒色腫細胞（Ｂ１６）（図４Ｂ）及び子宮頸癌細胞（Ｈｅｌａ）（図４Ｄ）に応用される場合の異なる時間における光音響効果を示す図である。
【図５Ａ】図５は標的複合両親媒性ペプチドナノミセルの異なる時間及び異なる濃度における光熱効果及び光音響効果を示す図であり、（図５Ａ）はＰＡＲＮのＵＳ又はＬａｓｅｒ下での異なる期間（１、３、５ｍｉｎ）におけるＲＯＳ、（図５Ｂ）はＰＡＲＮ及びＲＢのＵＳ作用下での異なるＲＢ濃度（０、２、４、６、８、１０μｇ／ｍｌ）におけるＲＯＳ、（図５Ｃ）はＰＡＲＮ及びＲＢのＬａｓｅｒ作用下での異なるＲＢ濃度（０、２、４、６、８、１０μｇ／ｍｌ）におけるＲＯＳである。
【図５Ｂ】図５は標的複合両親媒性ペプチドナノミセルの異なる時間及び異なる濃度における光熱効果及び光音響効果を示す図であり、（図５Ａ）はＰＡＲＮのＵＳ又はＬａｓｅｒ下での異なる期間（１、３、５ｍｉｎ）におけるＲＯＳ、（図５Ｂ）はＰＡＲＮ及びＲＢのＵＳ作用下での異なるＲＢ濃度（０、２、４、６、８、１０μｇ／ｍｌ）におけるＲＯＳ、（図５Ｃ）はＰＡＲＮ及びＲＢのＬａｓｅｒ作用下での異なるＲＢ濃度（０、２、４、６、８、１０μｇ／ｍｌ）におけるＲＯＳである。
【図５Ｃ】図５は標的複合両親媒性ペプチドナノミセルの異なる時間及び異なる濃度における光熱効果及び光音響効果を示す図であり、（図５Ａ）はＰＡＲＮのＵＳ又はＬａｓｅｒ下での異なる期間（１、３、５ｍｉｎ）におけるＲＯＳ、（図５Ｂ）はＰＡＲＮ及びＲＢのＵＳ作用下での異なるＲＢ濃度（０、２、４、６、８、１０μｇ／ｍｌ）におけるＲＯＳ、（図５Ｃ）はＰＡＲＮ及びＲＢのＬａｓｅｒ作用下での異なるＲＢ濃度（０、２、４、６、８、１０μｇ／ｍｌ）におけるＲＯＳである。
【図６】図６は本発明に係る複合両親媒性ペプチドナノミセルのＣＮＥ−２Ｚ細胞に対する毒性である。
【図７】図７は本発明に係る複合両親媒性ペプチドナノミセルの静脈内注射時における光線力学、音響力学的治療による上咽頭癌マウスの腫瘍成長の制御状況変化を示す図である。
【図８】図８は本発明に係る複合両親媒性ペプチドナノミセルの腫瘍内注射時における光線力学、音響力学的治療による上咽頭癌マウスの腫瘍成長の制御状況変化を示す図である。
【図９】図９は本発明に係る複合両親媒性ペプチドナノミセルの静脈内注射時における光線力学、音響力学的治療中の上咽頭癌マウスの腫瘍変化を示す図である。
【図１０】図１０は本発明に係る複合両親媒性ペプチドナノミセルの腫瘍内注射時における光線力学、音響力学的治療中の上咽頭癌マウスの腫瘍変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、実施例によって本発明を詳細に説明するが、単に本発明をさらに説明し、本発明の保護範囲を限定するものではなく、当業者は上記発明の概要に基づき本発明に非本質的な改良や調整を行うことができる。
【００１９】
本発明に使用される製造原料はすべて市販によって入手される。
実施例１：２ｍｌの両親媒性ペプチド配列Ｃ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ溶液（寧波康貝生化有限公司製、型番：８１７８７０、ロット番号：１７０４０７０１））（１０ｍｇ／ｍｌ）と１ｍｌのメチレンブルー溶液（２ｍｇ／ｍｌ）を均一に混合し、混合溶液を遮光しながら超音波洗浄機に移し、条件を２５℃、３０分間、２８ｋＨｚとした。分子量カットオフが１０００ダルトンの透析バッグを超純水で洗浄し、その後、該混合溶液を透析バッグに移し、超純水透析液が入ったビーカーに入れて透析液に浮上させ、該透析液は体積が２０００ｍｌ、ＰＨ値が７．４であり、磁子を入れて磁気攪拌器に置き、室温下で、回転数を１２０回転とし、２時間透析すると、透析液が青色になり、透析バッグ中の混合溶液が透明になり、４８時間まで継続的に透析し、紫外分光光度計で透析バッグ溶液を測定したところ、メチレンブルーの特徴的な吸収ピークがなかったことを分かり、メチレンブルーが両親媒性ペプチドナノミセルにカプセル化されていないことを示した。以上からわかるように、本発明によって合成された両親媒性ペプチド配列Ｆメチレンブルーをカプセル化して最終生成物を生成することは非常に困難である。
【００２０】
実施例２：２ｍｌの両親媒性ペプチドＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）と１ｍｌのクルクミン（２ｍｇ／ｍｌ、酢酸に溶解）を均一に混合し、混合溶液を遮光しながら超音波洗浄機に移し、条件を２５℃、３０分間、２８ｋＨｚとした。分子量カットオフが１０００ダルトンの透析バッグを超純水で洗浄し、その後、該混合溶液を透析バッグに移し、超純水透析液が入ったビーカーに入れて透析液に浮上させ、該透析液は体積が２０００ｍｌ、ＰＨ値が７．４であり、磁子を入れて磁気攪拌器に置き、室温下で、回転数を１２０回転とし、３時間透析すると、透析バッグ内に黄色沈殿が析出し、透析時間の増加に伴って、黄色沈殿物も徐々に増加し、透析バッグによって純水が混合液中に入り、クルクミンが水に不溶で析出した。以上からわかるように、本発明の両親媒性ペプチド配列はクルクミンをよくカプセル化できない。
【００２１】
実施例３：２ｍｌの両親媒性ペプチドＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ溶液（寧波康貝生化有限公司製、型番：８１７８７０、ロット番号：１７０４０７０１）（１０ｍｇ／ｍｌ）と１ｍｌのローズベンガル溶液（２ｍｇ／ｍｌ、）を均一に混合し、混合溶液を遮光しながら超音波洗浄機に移し、条件を２５℃、３０分間、２８ｋＨｚとした。分子量カットオフが１０００ダルトンの透析バッグを超純水で洗浄し、その後、該混合溶液を透析バッグに移し、超純水透析液が入ったビーカーに入れて透析液に浮上させ、該透析液は体積が２０００ｍｌ、ＰＨ値が７．４であり、磁子を入れて磁気攪拌器に置き、室温下で、回転数を１２０回転とし、４時間ごとに透析水を交換し、４８時間透析して、蛍光両親媒性ペプチド自己組織化ナノミセルを得た。テストしたところ、大部分のローズベンガルが本発明のポリペプチド配列にカプセルされ、自己組織化ナノミセルを形成したことを分かった。
【００２２】
ナノ粒度計を用いて粒径を測定し、２日間ごとに粒径を再測定したところ、複合両親媒性ペプチドの安定性が優れ、且つ正電荷が細胞の取り込みに有利であることを分かった。（図２参照）
【００２３】
紫外分光光度計を用いてＯＤ値を測定し、担持率を計算したところ、ローズベンガルの濃度の増加に伴って、複合両親媒性ペプチドナノミセルの担持率が安定する傾向があることを分かった。（図２参照）
【００２４】
黒色腫及び子宮頸癌（αｖβ３陽性）細胞、及び線維芽細胞をそれぞれ９６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０４細胞で播種し、３７℃で４８時間インキュベートし、細胞がいっぱいになった後、それぞれ培地で調製された異なる濃度の複合両親媒性ペプチドナノミセル（本実施例に応じて合成された）及び対応する濃度のローズベンガル（対照）を添加し、２４時間培養後、培地を吸引し、ＣＣＫ８法で処理した後、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで細胞生存率を測定した。（図３）に示すように、ローズベンガルの濃度の増加に伴って、複合両親媒性ペプチドナノミセルによる細胞死滅作用が純ローズベンガルの作用よりも遥かに高くなり、且つ線維芽細胞のような正常細胞に対する複合両親媒性ペプチドナノミセルの毒性が弱く、２０μｇ／ｍｌの濃度では、線維芽細胞の細胞生存率が８０％以上に達し、複合両親媒性ペプチドナノミセルが良好な生体適合性を有することを示し、且つこの濃度を後続実験の最適濃度とした。
【００２５】
実施例４：３ｍｌの両親媒性ペプチドＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）と２ｍｌのローズベンガル溶液（２ｍｇ／ｍｌ）を均一に混合し、混合溶液を遮光しながら超音波洗浄機に移し、条件を２５℃、４０分間、２８ｋＨｚとした。分子量カットオフが１０００ダルトンの透析バッグを超純水で洗浄し、その後、該混合溶液を透析バッグに移し、超純水透析液が入ったビーカーに入れて透析液に浮上させ、該透析液は体積が２０００ｍｌ、ＰＨ値が７．４であり、磁子を入れて磁気攪拌器に置き、室温下で、回転数を１２０回転とし、４時間ごとに透析水を交換し、６０時間透析して、蛍光両親媒性ペプチド自己組織化ナノミセルを得た。
【００２６】
黒色腫及び子宮頸癌（αｖβ３陽性）細胞をそれぞれ９６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０４細胞で播種し、３７℃で４８時間インキュベートし、細胞がいっぱいになった後、それぞれ２０μｇ／ｍｌの複合両親媒性ペプチドナノミセル（本実施例に応じて合成された）及び対応する濃度のローズベンガル（対照）を添加し、４時間培養後、培地を吸引し、超音波又はレーザーで異なる時間処理し、２４時間培養し続け、ＣＣＫ８法で処理した後、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで細胞生存率を測定した。（図４）に示すように、時間の増加に伴って、複合両親媒性ペプチドナノミセルによる細胞死滅作用が増加し、従って、３分間を後続実験の最適治療時間とした。
【００２７】
また、黒色腫及び子宮頸癌（αｖβ３陽性）細胞をそれぞれ９６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０４細胞で播種し、３７℃で４８時間インキュベートし、細胞がいっぱいになった後、それぞれ２０μｇ／ｍｌの複合両親媒性ペプチドナノミセル（本実施例に応じて合成された）及び対応する濃度のローズベンガル（対照）を添加し、４時間培養後、培地を吸引し、超音波又はレーザーで３分間処理し、２４時間培養し続け、ＣＣＫ８法で処理した後、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで細胞生存率を測定した。（図４）に示すように、黒色腫細胞及び子宮頸癌細胞に対する複合両親媒性ペプチドナノミセルの光音響効果及び光熱効果を示した。
【００２８】
実施例５：１ｍｌの両親媒性ペプチドＣ１８ＧＲ７ＲＧＤＳ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）と１ｍｌのローズベンガル溶液（２ｍｇ／ｍｌ）を均一に混合し、混合溶液を遮光しながら超音波洗浄機に移し、条件を２５℃、２０分間、２８ｋＨｚとした。分子量カットオフが１０００ダルトンの透析バッグを超純水で洗浄し、その後、該混合溶液を透析バッグに移し、超純水透析液が入ったビーカーに入れて透析液に浮上させ、該透析液は体積が２０００ｍｌ、ＰＨ値が７．４であり、磁子を入れて磁気攪拌器に置き、室温下で、回転数を１２０回転とし、７２時間透析して、蛍光両親媒性ペプチド自己組織化ナノミセルをえた。
【００２９】
複合両親媒性ペプチドナノミセル２０μｇ／ｍｌ及び対応する濃度のローズベンガル２ｍｌを調製し、各群に２０μｌのＤＰＢＦ（１，３−ジフェニルイソベンゾフラン）を添加し、紫外可視分光光度計を用いて５４８ｎｍでＯＤ値を測定し、その後、エネルギーが１．５Ｗ／ｃｍ２の８０８ナノレーザーをそれぞれ０、１、３、５分間照射し、又は１Ｗ／ｃｍ２の超音波を０、１、３、５分間印加し、紫外可視分光光度計を用いて５４８ｎｍでＯＤ値を測定した。結果は（図５）に示され、時間の増加に伴って、複合ナノミセルのＯＤ値が低下し、且つ３分間を後続実験の最適治療時間として選択した。
【００３０】
異なる濃度の複合両親媒性ペプチドナノミセル及び対応する濃度のローズベンガル２ｍｌを調製し、各群に２０μｌのＤＰＢＦ（１，３−ジフェニルイソベンゾフラン）を添加し、紫外可視分光光度計を用いて５４８ｎｍでＯＤ値を測定し、次にエネルギーが１．５Ｗ／ｃｍ２の８０８ナノレーザーを３分間照射し、又は１Ｗ／ｃｍ２の超音波を３分間印加し、紫外可視分光光度計を用いて５４８でＯＤ値を測定した。結果は（図５）に示され、ＤＰＢＦ（１，３−ジフェニルイソベンゾフラン）が酸化された後、５４８ｎｍでの吸収ピークが減少するため、光照射後又は超音波後の感光剤又は超音波感受性薬剤で生じた活性酸素ＲＯＳの定量化に使用したところ、複合ナノミセルで生じた活性酸素が多いことを分かった。
【００３１】
本発明によって得られた複合両親媒性ペプチドナノミセルは、一般プロセス及び構造が（図１）に示される。ナノ材料の安定性及びローズベンガルの担持率変化を示す図は（図２）に示される。図２から分かったように、材料の安定性が優れ、３０日間以内に粒径があまり変化せず、すべて１０−４０ｎｍであり、ナノスケールの物質は細胞膜を介して細胞に入りやすく、ローズベンガルの担持率はローズベンガルの質量の増加に伴って、飽和状態になる傾向がある。調製された標的複合両親媒性ペプチドナノミセルは良好な生体適合性及び安全性を示した（図３参照）。複合両親媒性ペプチドナノミセルは黒色腫及び子宮頸癌細胞において良好な音響力学的効果を示し（図４参照）、且つ複合両親媒性ペプチドナノミセルは良好な光線力学的効果及び生体力学的効果を示した（図５参照）。
【００３２】
本発明に係る黒色腫及び子宮頸癌のインテグリンαＶβ３を標的とする複合両親媒性ペプチドを蛍光イメージング、光線力学的治療及び光熱治療材料とすることで、黒色腫及び子宮頸癌の非侵襲性（又は低侵襲性）治療計画を豊富にするだけでなく、新規な腫瘍診断治療モードの開発、現在の臨床治療の副作用の軽減、正常組織に対する損傷の軽減、癌の診断治療効率及び正確性の向上に非常に重要であり、さらに、前記両親媒性ペプチドを黒色腫及び子宮頸癌の新規な標的診断治療とする臨床応用の促進において実用性が高い。
【００３３】
実施例６：まず、１６４０培地を用いてそれぞれ０、２０、４０、６０、８０、１００μｇ／ｍｌのナノミセル溶液とローズベンガル溶液を調製し、ＣＮＥ−２Ｚ細胞を９６ウェルプレートに１ウェルあたり２×１０４細胞の密度で播種し、濃度別に５ウェルに播種し、異なる濃度での純ローズベンガル水溶液とナノミセル溶液の細胞に対する毒性を比較する。４８時間培養し、細胞を８０％増殖させた後、実験群の設定に従って、元の培地のかわりに、それぞれ異なる体積のナノミセルとローズベンガル溶液を含有する培地を投与した。投与後、暗所において３７℃で２４時間培養し、その後、新鮮な培地（１００μｌ）及びＣＣＫ−８試薬（１０μｌ）を添加し、続いて、マイクロリーダーを用いて４５０ｎｍの波長で蛍光分析を行った。以下の式に基づき細胞生存率を計算し、最大値と最小値を除外する。
細胞生存率＝（ＯＤ−ＯＤｂｌｋ）平均／（ＯＤ０−ＯＤｂｌｋ）平均×１００％
【００３４】
図６に示すように、純ローズベンガルは、ＣＮＥ−２Ｚ細胞に対する毒性が小さく、且つ濃度の増加に伴って、毒性が増加する傾向がなかった一方、合成されたナノミセルはＣＮＥ−２Ｚ細胞に対する毒性が大きく、且つ濃度が増加するほど、細胞生存率が低くなり、２０μｇ／ｍｌでは生存率が５０％に下がった。
【００３５】
実施例７：ＣＮＥ−２Ｚ腫瘍を接種した２０匹のヌードマウスモデルをランダムに５群に分け、対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、非治療群（ＲＢＮｓ）、光線力学的治療群（ＲＢＮｓ＋Ｌａｓｅｒ）、音響力学的治療群（ＲＢＮｓ＋ＵＳ）、併用治療群（ＲＢＮｓ＋Ｌａｓｅｒ＋ＵＳ）の５群の実験を設定した。対照群はなんの薬物も投与せず、ＲＢＮｓ群は２００μｌのＲＢＮｓを静脈内注射した後に治療せず、ＲＢＮｓ＋Ｌａｓｅｒ群は２００μｌのＲＢＮｓを静脈内注射し、５時間後、腫瘍部位にレーザー（８０８ｎｍ、１．５Ｗ／ｃｍ２、２ｃｍ、３分間）治療を行い、ＲＢＮｓ＋ＵＳ群は２００μｌのＲＢＮｓを静脈内注射し、５時間後、腫瘍部位に超音波（３ＭＨｚ、３Ｗ／ｃｍ２、デューティサイクル５０％、３分間）治療を行い、ＲＢＮｓ＋Ｌａｓｅｒ＋ＵＳ群は２００μｌのＲＢＮｓを静脈内注射し、５時間後、腫瘍部位にまずレーザー（８０８ｎｍ、１．５Ｗ／ｃｍ２、２ｃｍ、３分間）治療を行い、続いて超音波（３ＭＨｚ、３Ｗ／ｃｍ２、デューティサイクル５０％、３分間）治療を行なった。腫瘍内注射の治療群の場合、群分け状況は静脈内注射の治療群と類似し、対照群以外の群にそれぞれ１５０μｌのＲＢＮｓを腫瘍内注射し、注射後、腫瘍部位にレーザー（８０８ｎｍ、１．５Ｗ／ｃｍ２、２ｃｍ、３分間）及び超音波（３ＭＨｚ、３Ｗ／ｃｍ２、デューティサイクル５０％、３分間）をタイムリーに印加して治療を行った。
【００３６】
図７、９に示すように、静脈内注射時、併用治療群（ＲＢＮｓ＋Ｌａｓｅｒ＋ＵＳ）はＣＮＥ−２Ｚ腫瘍に対して顕著な抑制作用を示した。図８、１０に示すように、腫瘍内注射時、レーザーのみを印加した光線力学的治療群（ＲＢＮｓ＋Ｌａｓｅｒ）、超音波をのみを印加した音響力学的治療群（ＲＢＮｓ＋ＵＳ）及び併用治療群（ＲＢＮｓ＋Ｌａｓｅｒ＋ＵＳ）はいずれも腫瘍の成長に対して顕著な抑制作用を示した。
【００３７】
本発明は具体的な実施例を参照して本発明の原理及び実施形態を説明したが、上記実施例は単に本発明の方法及びその趣旨を理解するためのものである。なお、当業者は本発明の原理を逸脱せずに本発明に種々の改良や修飾を行うことができ、これらの改良や修飾も本発明の特許請求の範囲の保護範囲に属する。
【図１】
2020111562.tif 000002
【図２Ａ】
2020111562.tif 000003
【図２Ｂ】
2020111562.tif 000004
【図３Ａ】
2020111562.tif 000005
【図３Ｂ】
2020111562.tif 000006
【図３Ｃ】
2020111562.tif 000007
【図４Ａ】
2020111562.tif 000008
【図４Ｂ】
2020111562.tif 000009
【図４Ｃ】
2020111562.tif 000010
【図４Ｄ】
2020111562.tif 000011
【図５Ａ】
2020111562.tif 000012
【図５Ｂ】
2020111562.tif 000013
【図５Ｃ】
2020111562.tif 000014
【図６】
2020111562.tif 000015
【図７】
2020111562.tif 000016
【図８】
2020111562.tif 000017
【図９】
2020111562.tif 000018
【図１０】
2020111562.tif 000019
【外国語明細書】
2020111562000001.pdf
2020111562000002.pdf
2020111562000003.pdf
2020111562000004.pdf