(57)【要約】【課題】本発明は、従来技術よりも優れた気分障害の新規な診断方法および／または治療方法を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、抗ＳＩＴＨ−１抗体及び抗ＨＨＶ−６抗体の抗体レベルを指標とした、気分障害の診断方法および／または治療方法を提供することにより、上記課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
嗅上皮細胞にＳＩＴＨ−１遺伝子を導入してなる形質転換嗅上皮細胞。
【請求項２】
嗅上皮細胞にＳＩＴＨ−１遺伝子を導入してなることを特徴とする気分障害モデル動物。
【請求項３】
気分障害治療薬の候補物質をスクリーニングするスクリーニング方法であって、
請求項２に記載の気分障害モデル動物に被験物質を与える工程と、
上記気分障害モデル動物の
（ａ）行動異常試験
（ｂ）ストレス脆弱性試験
（ｃ）嗅球のアポトーシス検出試験
（ｄ）視床下部の異常検出試験
（ｅ）脳ストレス因子の異常検出試験
の少なくとも1つを指標として、上記被験物質が気分障害治療薬の候補物質であると判定する工程、
とを備えることを特徴とする前記スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、気分障害を診断、治療又は予防する方法に関し、具体的には、特定の遺伝子を指標とした気分障害の新規の診断、治療又は予防する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
気分障害は、うつ病や躁うつ病に代表される精神障害であり、近年増加傾向にあって大きな社会問題となっている。気分障害の治療の基本は薬物療法であり、三環系抗うつ薬、選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）、セロトニン・ノルアドレナリン再取り込み阻害薬（ＳＮＲＩ）などが用いられている。
【０００３】
ヒトヘルペスウイルス−６（ＨＨＶ;ｈｕｍａｎ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）は、ＡＩＤＳ患者の末梢血から見出されたウイルスで、ヘルペスウイルスβ亜科に属する。ＨＨＶ−６にはＨＨＶ−６  バリアントＡ（ＨＨＶ−６Ａ）とＨＨＶ−６  バリアントＢ（ＨＨＶ−６Ｂ）の２つのバリアントが存在する。ＨＨＶ−６Ｂは、乳幼児期にほとんどのヒトが初感染し、発症した場合は突発性発疹となる。ＨＨＶ−６Ｂは、初感染の急性期において、非常に高率で脳内に移行して潜伏感染を生じ、それが成人となった後も維持される（非特許文献１）。なお、潜伏感染とは、ウイルスが宿主細胞内で感染性のウイルス粒子を産生せずに存続し続ける感染状態をいう。ＨＨＶ−６Ｂは、脳内では主として前頭葉や海馬領域などのグリア細胞に潜伏感染していることが示唆されている（非特許文献２および３）。また、ＨＨＶ−６は末梢血中のマクロファージにも潜伏感染しており、日常生活の疲労等により再活性化して唾液中に放出される（特許文献１）。
【０００４】
ＨＨＶ−６の潜伏感染状態には、ウイルス産生は全く行われないが、比較的安定で遺伝子発現が活発な状態である「中間段階（intermediate stage）」が存在することが知られており、中間段階で発現するタンパク質としてＳｍａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｓｔａｇｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｏｆ  ＨＨＶ−６−１（以下、「ＳＩＴＨ−１」と称する）が同定されている（特許文献２）。このＳＩＴＨ−１に対する抗体が、うつ病などの気分障害患者から特異的に検出されることから、被験者検体中の抗ＳＩＴＨ−１抗体を検出・測定することを特徴とする気分障害の診断方法が開発されている（同上）。また、グリア細胞特異的発現プロモーターを連結したＳＩＴＨ−１遺伝子を、アデノウイルスベクターを用いてマウスの脳内に導入し、発現させたところ、マウスが精神疾患様の行動異常を起こすことが示されている（同上）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】日本国特許第４２１８８４２号
【特許文献２】日本国特許第４９２００８４号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kondo K et al., J infect Dis, 167:1197-1200, 1993
【非特許文献２】Tuke et al., Multiple Sclerosis, 10: 355-359, 2004
【非特許文献３】Donati et al., Journal of Virology Vol. 79, No. 15:9439-9448, 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、気分障害発症のメカニズムは未だ十分に解明されているとはいえない。特に、気分障害の診断や治療においては、更なる診断方法や治療方法の開発が望まれている。
【０００８】
したがって、本発明は、従来技術よりも優れた気分障害の新規な診断方法および／または治療方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の課題を解決するべく、従来技術よりも高い感度と特異度で気分障害を診断および／または治療する方法について、鋭意検討を重ねた。その結果、生物学的試料中における特定の抗体のレベルを測定することにより、高感度かつ高特異度で気分障害を診断および／または治療することが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
【００１１】
［１］被験者が気分障害を有するか否かを診断するためのデータ取得方法であって、
該被験者から分離された生物学的試料中において、抗ＳＩＴＨ−１抗体の抗体レベルを検出する検出過程、及び
該被験者から分離された生物学的試料中において、抗ＨＨＶ−６抗体の抗体レベルを検出する検出過程、
を含むことを特徴とする診断のためのデータ取得方法。
【００１２】
［２］被験者が気分障害を有しているか否かを診断する診断方法であって、
該被験者から分離された生物学的試料中の抗ＳＩＴＨ−１抗体レベルを測定した結果、その値が高く、かつ、
該被験者から分離された生物学的試料中の抗ＨＨＶ−６抗体レベルを測定した結果、その値が低い場合に、該被験者が気分障害を有していると診断する方法。
【００１３】
［３］［２］に記載の診断方法を行うための診断キット。
【００１４】
［４］被験者の嗅上皮細胞へのＨＨＶ−６感染を抑制することを特徴とする気分障害の治療方法。
【００１５】
［５］被験者にＨＨＶ−６感染阻害剤を投与することを特徴とする気分障害の治療方法。
【００１６】
［６］被験者から分離された生物学的試料中の抗ＳＩＴＨ−１抗体レベルを測定した結果、その値が高い被験者に、ＨＨＶ−６感染阻害剤を投与することを特徴とする気分障害の治療方法。
【００１７】
［７］［２］に記載の方法により気分障害を有していると診断された被験者に、ＨＨＶ−６感染阻害剤を投与することを特徴とする気分障害の治療方法。
【００１８】
［８］被験者の嗅上皮細胞にＨＨＶ−６感染阻害剤を投与することを特徴とする［６］又は［７］に記載の気分障害の治療方法。
【００１９】
［９］被験者から分離された生物学的試料中の抗ＨＨＶ−６抗体レベルを測定した結果、その値が低い被験者に対し、ＨＨＶ−６感染阻害剤を投与することを特徴とする、気分障害の治療方法。
【００２０】
［１０］被験者の嗅上皮細胞へＨＨＶ−６感染阻害剤を投与することを特徴とする、［９］に記載の治療方法。
【００２１】
［１１］ＨＨＶ−６感染阻害剤を含むことを特徴とする気分障害治療剤。
【００２２】
［１２］嗅上皮細胞にＳＩＴＨ−１遺伝子を導入してなる形質転換嗅上皮細胞。
【００２３】
［１３］嗅上皮細胞にＳＩＴＨ−１遺伝子を導入してなることを特徴とする気分障害モデル動物。
【００２４】
［１４］気分障害治療薬の候補物質をスクリーニングするスクリーニング方法であって、
［１３］に記載の気分障害モデル動物に被験物質を与える工程と、
上記気分障害モデル動物の
（ａ）行動異常試験
（ｂ）ストレス脆弱性試験
（ｃ）嗅球のアポトーシス検出試験
（ｄ）視床下部の異常検出試験
（ｅ）脳ストレス因子の異常検出試験
の少なくとも1つを指標として、上記被験物質が気分障害治療薬の候補物質であると判定する工程、
とを備えることを特徴とする前記スクリーニング方法。
【発明の効果】
【００２５】
本発明は、気分障害に関与する特定の遺伝子を指標とすることにより、従来技術よりも高い感度と特異度で被験者が気分障害か否かを診断することができる。本発明はまた、気分障害に関与するウイルスの嗅上皮への感染を阻害することにより、あるいは、当該ウイルスが発現する気分障害に関与する特定の遺伝子が引き起こす障害に対処することにより、被験者の気分障害を有効に治療または予防することができる。また、本発明の気分障害モデル動物は、嗅覚系細胞の障害、視床下部の異常、脳ストレス応答因子の異常発現およびストレス脆弱性を示すという優れた特性を有する。本発明はさらに、気分障害に関与する特定の遺伝子を導入した気分障害モデル動物を用いることにより、気分障害の候補物質を効率的にスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、尾懸垂試験における無動時間の結果を示す。（Ａ）ｅｍｐｔｙ／Ａｄｖ鼻腔投与マウス３０匹とＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウス３０匹の尾懸垂試験を１０分間実施し、無動時間を比較した結果を示す図である。（Ｂ）ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与前２週間からＳＳＲＩを投与したマウス２１匹の尾懸垂試験を１０分間実施し、無動時間を比較した結果を示す図である（ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ−ＳＳＲＩ）。
【図２】図２は、脳内におけるうつ病関連因子の遺伝子発現の結果を示す。（Ａ）ＣＲＨ遺伝子の結果を示す図である。（Ｂ）ＲＥＤＤ１遺伝子の結果を示す図である。（Ｃ）Ｕｒｏｃｏｒｔｉｎ遺伝子の結果を示す図である。
【図３】図３は、嗅球におけるアポトーシス関連因子の遺伝子発現の結果を示す。（Ａ）アポトーシス抑制因子Ｂｃｌ−２の遺伝子発現の結果を示す図である。（Ｂ）アポトーシス促進因子Ｂａｘの遺伝子発現の結果を示す図である。（Ｃ）アポトーシス指標Ｂａｘ／Ｂｃｌ−２比を示す図である。
【図４】図４は、嗅球のＴＵＮＥＬ染色の結果を示す。（Ａ）ｅｍｐｔｙ／Ａｄｖ鼻腔投与マウスとＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスの嗅球のＴＵＮＥＬ染色像を示す図である。（Ｂ）嗅球のＴＵＮＥＬ染色陽性細胞数を計数した結果を示す図である。
【図５】図５は、嗅上皮の抗ＳＩＴＨ−１抗体による免疫組織染色の結果を示す。ｅｍｐｔｙ／Ａｄｖ鼻腔投与マウスとＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスの嗅上皮細胞の免疫組織染色像を示す図である。
【図６】図６は、ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスのストレス脆弱性試験の結果を示す。
【図７】図７は、ＨＨＶ−６感染Ｕ３７３におけるＳＩＴＨ−１の発現の結果を示す。
【図８】図８は、ＨＨＶ−６感染Ｕ３７３におけるＳＩＴＨ−１の発現の結果を示す。
【図９】図９は、ＳＩＴＨ−１の構造および機能を示す。（Ａ）ＳＩＴＨ−１の構造、ＨＨＶ−６Ｂゲノム内のＳＩＴＨ−１  ｍＲＮＡの位置、ならびにＩ型およびＩＩ型のＨＨＶ−６Ｂ潜伏転写産物（Ｈ６ＬＴ）を示す図である。（Ｂ）ＨＨＶ−６Ｂを感染させたときのＳＩＴＨ−１  ｍＲＮＡ量とＨ６ＬＴ  ｍＲＮＡ量の比率を示す図である。（Ｃ）哺乳類ツーハイブリッドシステムにより、ＳＩＴＨ−１とＣＡＭＬとの結合を示す図である。（Ｄ）ＳＩＴＨ−１をＵ３７３細胞内で構成的に発現させたときの免疫蛍光染色の結果を示す図である。（Ｅ）ｆｕｒａ  ２−ＡＭにより細胞内カルシウム濃度を測定した結果を示す図である。
【図１０】図１０は、抗ＳＩＴＨ−１抗体価、ストレス、および自殺企図の関連を示す。（Ａ）唾液中のＨＨＶ−６Ｂ  ＤＮＡコピー数と１週間の労働時間との関連を比較した結果を示す図である。（Ｂ）アストロサイトでＳＩＴＨ−１を発現しているマウスの末梢血における抗ＳＩＴＨ−１  ＩｇＧ抗体価を示す図である。（Ｃ）健常者（対照）と自殺企図患者の血漿中の抗ＳＩＴＨ−１抗体の量を調べた間接蛍光抗体アッセイの結果を示す図である。（Ｄ）健常者（対照）および自殺企図患者における抗ＳＩＴＨ−１抗体価を示す図である。
【図１１】図１１は、アストロサイトでＳＩＴＨ−１を発現しているマウスにおける気分障害様の行動を示す。（Ａ）ウイルスベクターの投与後（ｐ．ｉ．）３週目に、脳スライスを、間接蛍光抗体法により染色した結果を示す図である。（Ｃ−Ｅ、Ｉ、Ｊ）ウイルスベクターの投与後３週目または５週目のマウス全脳におけるｍＲＮＡの発現を示す図である。（Ｆ、Ｋ）ウイルスベクターの投与後３週目（Ｆ）または５週目（Ｋ）のプレパルス・インヒビションの割合を示す図である。（Ｇ、Ｌ）ウイルスベクターの投与後３週目（Ｇ）または５週目（Ｌ）の尾懸垂試験の結果を示す図である。（Ｈ）ウイルスベクターの投与後５週目の回転輪活動を示す図である。
【図１２】図１２は、ＳＩＴＨ−１への暴露およびその臨床症状を示す。（Ａ）自殺企図の方法（飛び降り、薬物中毒、自傷行為、および自絞）間での、抗ＳＩＴＨ−１抗体価の比較を示す図である。（Ｂ）健常者（対照）と自殺企図患者における抗ＳＩＴＨ−１抗体Ａｖｉｄｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ（ＡＩ）を示す図である。（Ｃ）抗ＳＩＴＨ−１  ＡＩとベックうつ病特性尺度（ＢＤＩ）全スコアとの関連を示す図である。（Ｄ）健常者（対照）、気分障害（ＭＤ）を患う患者、統合失調症または他の精神疾患（ＳＣＨ）を患う患者、および他の精神疾患（Ｏｔｈｅｒｓ）を患う患者間における抗ＳＩＴＨ−１抗体ＡＩの比較を示す図である。（Ｅ）ＭＤを患うと診断された患者と健常者（対照）における、抗ＨＨＶ−６Ｂ抗体および抗ＳＩＴＨ−１抗体ＡＩとの関係を示す図である。
【図１３】図１３は、ＨＨＶ−６Ｂ潜伏遺伝子ＳＩＴＨ−１の同定結果を示す。（Ａ）ＳＩＴＨ−１クローニングのためのプライマー設計および同定されたＳＩＴＨ−１を示す図である。上のパネルは、直接繰り返し（ＤＲ）配列を含むＨＨＶ−６Ｂの構造を示す図である。下のパネルは、ＨＨＶ−６Ｂ潜伏転写産物Ｈ６ＬＴの構造を示す図である。（Ｂ）ダブルネストＲＴ−ＰＣＲにより、潜伏転写産物を増幅した結果を示す。（Ｃ）潜伏関連遺伝子からのｍＲＮＡの構造を決定するために使用される、３’−および５’−ＲＡＣＥプライマーを示す図である。（Ｄ）５’−ＲＡＣＥおよび３’−ＲＡＣＥにより増幅された産物の電気泳動の結果を示す図である。
【図１４】図１４は、ＳＩＴＨ−１遺伝子の細胞特異的発現の結果を示す。
【図１５】図１５は、ＳＩＴＨ−１遺伝子のＣＡＭＬ  ｍＲＮＡ発現への影響を調べた結果を示す。
【図１６】図１６は、抗ＳＩＴＨ−１抗体の抗原特異性の試験（吸着実験を用いたＥＬＩＳＡ）の結果を示す。
【図１７】図１７は、現在の年齢、精神疾患の発症年齢、および自殺行為（ＳＢ）が始まった年齢による対象の分布を示す。（Ａ）健常者（対照）および自殺企図患者の現在の年齢の分布を示した図である。（Ｂ）自殺企図患者の精神疾患の発症年齢の分布を示した図である。（Ｃ）自殺企図患者における、ＳＢが始まった年齢の分布を示した図である。
【図１８】図１８は、Ａｖｉｄｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘアッセイのための適当な尿素濃度の同定の結果を示す。
【図１９】図１９は、自殺企図した代表的な対象の血漿における抗ＳＩＴＨ−１抗体の間接蛍光抗体検出の結果を示す。（Ａ）自殺企図患者および健常者（対照）からの血漿におけるＳＩＴＨ−１の免疫蛍光染色の結果を示す図である。（Ｂ）自殺企図患者および健常者（対照）における人口統計学および抗体反応性の詳細（年齢、性別、抗ＳＩＴＨ−１抗体の存在、自己抗体の存在）を示した図である。
【図２０】図２０は、自殺企図を予測するために、抗ＳＩＴＨ−１抗体価の感度および特異性を調べた結果を示す。
【図２１】図２１は、アストロサイト内にＳＩＴＨ−１を発現している（ＳＩＴＨ−１）、および発現していない（ｖｅｃｔｏｒ）マウスの体重を調べた結果を示す。投与後（ｐ．ｉ．）３週間（Ａ）および投与後５週間（Ｂ）での結果を示す。
【図２２】図２２は、ウイルス特異的抗体の概算の結果を示す。
【図２３】図２３は、異なる人種間に渡る、抗ＳＩＴＨ−１抗体価および抗ＳＩＴＨ−１  ＡＩの比較の結果を示す。（Ａ）日本人対照、アフリカ系アメリカ人および白人の年齢を比較した結果を示す図である。（Ｂ）日本人対照からの血漿、ならびにアフリカ系アメリカ人および白人の血清における抗ＳＩＴＨ−１抗体価を示す図である。（Ｃ）日本人対照からの血漿、ならびにアフリカ系アメリカ人および白人の血清における抗ＳＩＴＨ−１抗体ＡＩを示す図である。
【図２４】図２４は、ＳＩＴＨ−１と慢性疲労症候群（ＣＦＳ）との関連を調べた結果を示す。（Ａ）健常者（対照）とＣＦＳを患う患者の現在の年齢の分布を示す図である。（Ｂ）抗ＳＩＴＨ−１抗体ＡＩとＣＦＳの初期兆候である疲労との関連を調べた結果を示す図である。（Ｃ−Ｅ）心配（Ｃ）、抑うつ気分（Ｄ）、および自尊心の低下（Ｅ）の抑うつ状態の有無でのＣＦＳ患者における抗ＳＩＴＨ−１抗体ＡＩを示す図である。
【図２５】図２５は、うつ病患者から採取された検体中のＨＨＶ−６量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の実施の一形態について、以下に詳細に説明する。なお、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上（Ａ、またはＡより大きい）Ｂ以下（Ｂ、またはＢより小さい）」を意味する。
【００２８】
〔１〕用語の説明
まず、本願明細書にて用いられる主な用語について、その意味を説明する。
【００２９】
本発明において、「気分障害」とは、ある程度の期間にわたって持続する気分（感情）の変調により、苦痛を感じたり、日常生活に何らかの支障をきたしたりする状態のことをいう。代表的なものとして、うつ症状のみが現れるうつ病や、躁状態とうつ状態を繰り返す躁うつ病が挙げられる。気分障害には様々な原因が考えられているが、詳細はわかっていないことも多い。医学的には米国精神医学会によって導入された精神障害の診断と統計の手引き（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ＤＳＭ）または国際疾病基準である疾病及び関連保健問題の国際統計分類（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ：ＩＣＤ）によって定められた診断基準により操作的に診断される。
【００３０】
「生物学的試料」は、抗体の量、抗体価、またはＨＨＶ−６量を測定しうる生体由来の試料であれば特に限定されない。好ましくは、血液、血清、血漿、脳脊髄液、唾液、鼻汁、汗、リンパ液、及び母乳からなる群から選択される１種または２種以上である。抗体を検出する場合、生物学的試料は、好ましくは、血液、血清、血漿、又は脳脊髄液である。また、抗ＳＩＴＨ−１抗体の検出に用いる生物学的試料、抗ＨＨＶ−６抗体の検出に用いる生物学的試料、及びＨＨＶ−６量の測定に用いる生物学的試料は、同じでも異なっていてもよい。ＨＨＶ−６量の測定に用いる生物学的試料としては、唾液をより好ましく使用することができる。
【００３１】
本発明において、「ＨＨＶ−６」とは、ヒトヘルペスウイルス−６（ＨＨＶ；ヒトヘルペスウイルス）であり、β−ヘルペスウイルスに属する。ＨＨＶ−６にはＨＨＶ−６  バリアントＡ（ＨＨＶ−６Ａ）とＨＨＶ−６  バリアントＢ（ＨＨＶ−６Ｂ）の２つのバリアントが存在するが、本発明においてＨＨＶ−６は、好ましくは、ＨＨＶ−６Ｂである。
【００３２】
本発明において、「ＳＩＴＨ−１」とは、Ｓｍａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｓｔａｇｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｏｆ  ＨＨＶ−６（ＨＨＶ−６の潜伏感染中間段階転写物によってコードされる小タンパク質）−１であり、ヒトヘルペスウイルス−６の潜伏感染に関与する因子、より詳細にはヘルペスウイルスの潜伏感染時に発現するタンパク質として発見された。さらに、本発明者は、ＳＩＴＨ−１が、アストロサイト系細胞での非増殖感染においても発現することを本明細書実施例で見出した（図１４）。ＳＩＴＨ−１タンパク質は、１５９アミノ酸からなる、分子量約１７．５ｋＤａのタンパク質である（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＨＶ７６３９１３．１およびＨＶ７６３９１４．１）。ＳＩＴＨ−１タンパク質をコードする核酸の塩基配列（配列番号２）については後述する。
【００３３】
本発明において、「抗体」とは、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ及びこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）を意味する。例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体及びヒト化抗体が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００３４】
本発明において、「抗ＳＩＴＨ−１抗体」とは、ＳＩＴＨ−１タンパク質を認識する抗体であり、ＳＩＴＨ−１タンパク質に特異的に結合し得る完全な分子及び抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含むことを意味する。抗ＳＩＴＨ−１抗体は、好ましくは、ＩｇＧである。
【００３５】
限定されるものではないが、本発明においては、抗ＳＩＴＨ−１抗体は、抗原結合力のより高い抗体、すなわち高アビディティ抗体であってよい。感染初期のＩｇＧ抗体は抗原結合力が弱く、感染の経過に従って高アビディティの抗体が産生される。このような高アビディティ抗体は、例えばアッセイ系における被験者抗体の洗浄過程において、タンパク質変性剤添加洗浄液を用いて洗浄することにより、検出・測定することができる。このようなタンパク質変性剤として、例えば、尿素、グアニジン塩、ドデシル硫酸Ｎａなどを使用することができるが、好ましくは尿素である。
【００３６】
本発明において、「抗ＨＨＶ−６抗体」とは、ＨＨＶ−６を認識する抗体であり、ＨＨＶ−６粒子に特異的に結合し得る完全な分子及び抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含むことを意味する。抗ＨＨＶ−６抗体は、好ましくは、ＨＨＶ−６Ｂを認識する抗体である。また抗ＨＨＶ−６抗体は、好ましくは、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡである。限定されるものではないが、生物学的試料が血液、血漿、血清等の場合はＩｇＧが好ましく、唾液、鼻汁の場合はＩｇＡが好ましい。また限定されるものではないが、抗ＨＨＶ−６抗体はＨＨＶ−６の中和抗体であってもよい。また、抗ＨＨＶ−６抗体は、高アビディティ抗体であってもよい。
【００３７】
本発明において、「抗体レベル」とは、生物学的試料中に含まれる当該抗体の量あるいは抗体価をいう。これらの値の測定は、公知の方法を用いて行うことが可能である。限定されるものではないが、例えば、（間接）蛍光抗体法、ドットブロットアッセイ法、ウエスタンブロット法、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を含む）、放射性イムノアッセイ法（ＲＩＡ）、及び免疫拡散アッセイ法のような伝統的な免疫組織学的方法を利用したアッセイ法で検出できる。あるいは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの画像解析等によって検出することもできる。
【００３８】
また、高アビディティ抗体の抗体レベルを判定する指標としてＡｖｉｄｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘを用いることもできる。Ａｖｉｄｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘは、例えば、アッセイ系における被験者抗体の洗浄過程において、タンパク質変性剤添加洗浄液を用いて測定した抗体量を、タンパク質変性剤非添加の通常の洗浄液を用いて測定した抗体量で除算して得ることができる。このようなタンパク質変性剤として、例えば、尿素、グアニジン塩、ドデシル硫酸Ｎａなどを使用することができるが、より好ましくは尿素である。
【００３９】
〔２〕抗ＳＩＴＨ−１抗体および／または抗ＨＨＶ−６抗体のレベルと気分障害との関係等について
本発明者らは、抗ＳＩＴＨ−１抗体の抗体レベルが高い気分障害患者では、抗ＳＩＴＨ−１抗体の抗体レベルが低い気分障害患者と比べ、抗ＨＨＶ−６抗体の値が有意に低いことを見出した（図１２Ｅ）。これは、ＳＩＴＨ−１がＨＨＶ−６の潜伏感染特異的タンパク質であること、一般に再活性化したウイルスが増加すると当該ウイルスに対する抗体が増加すること、を考慮すると、予想外の驚くべき結果であった。以上の知見により、抗ＳＩＴＨ−１抗体測定による気分障害診断法の感度・特異度を著しく向上させることが可能となった。すなわち、健常者にも抗ＳＩＴＨ−１抗体の抗体レベルが高い者（偽陽性者）が一部ながら存在するが、抗ＳＩＴＨ−１抗体レベルが高い被験者の中から、抗ＨＨＶ−６抗体の抗体レベルが低い被験者を選抜することにより、抗ＳＩＴＨ−１抗体が偽陽性の健常者の多くが除かれて、当該被験者が気分障害患者である確率が大きく向上する。
【００４０】
従って、本発明の一態様は、被験者が気分障害を有しているか否かを診断する診断方法であって、該被験者から分離された生物学的試料中の抗ＳＩＴＨ−１抗体レベルを測定した結果、その値が高く、かつ、該被験者から分離された生物学的試料中の抗ＨＨＶ−６抗体レベルを測定した結果、その値が低い場合に、該被験者が気分障害を有していると診断する方法である。なお、このような診断のためのデータ取得方法も本発明の一態様である。また、本発明の一態様として、抗ＳＩＴＨ−１抗体、好ましくは高アビディティ抗ＳＩＴＨ−１抗体の抗体レベルの指標として、Ａｖｉｄｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘを用いてもよい。Ａｖｉｄｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘの値が高い時、高アビディティ抗体の抗体レベルが高いと判断できる。
【００４１】
また、本発明者らは、抗ＳＩＴＨ−１抗体の抗体レベルが高い患者の方が、抗ＳＩＴＨ−１抗体の抗体レベルが低い患者と比べ、気分障害の症状がより重いことを見出した（図１２Ｃ）。従って、本発明の一態様は、被験者の気分障害の程度を診断する診断方法であって、該被験者から分離された生物学的試料中の抗ＳＩＴＨ−１抗体レベルを測定した結果、その値が高い場合に、気分障害の症状がより重篤であると判断する診断方法である。
【００４２】
なお、後述のとおり、ＨＨＶ−６が嗅上皮細胞に頻回感染することにより、気分障害の症状は一層重篤となるため、測定する抗ＳＩＴＨ−１抗体は、高アビディティ抗体であってよい。以上のような、本発明の診断のためのデータ取得方法も本発明の一態様である。
【００４３】
当業者は、健常者における定量値（正常値）、典型的な気分障害患者の定量値（疾患値）や、軽度、中度または重度の気分障害患者の定量値（疾患値）を参考に、適切に閾値を設定することができる。すなわち、一般に診断薬における閾値（いわゆるカットオフ値）は、臨床試験から得られた健常者や患者の多くの測定値を基に、その目的に合わせて当業者が適切に設定するものであり（例えば、スクリーニング検査のように、疾患群を見逃さないことを最優先として二次検査以降で確定診断するような場合には、特異度よりも感度を優先し、カットオフ値を低く設定する、気分障害の症状の程度を診断する場合には、軽度、中度、重度の気分障害患者の定量値を参考に閾値を高く設定する等）、本明細書に開示されている記載から、当業者は容易に診断のための閾値を決定することができる。
【００４４】
すなわち、例えば「抗体レベルの値が高い」ということは、測定した抗体レベルが前記閾値（例えば、健常者の抗体レベルの値）を上回るか否かによって判断することができ、「抗体レベルの値が低い」ということは、測定した抗体レベルが前記閾値を下回るか否かによって判断することができる。
【００４５】
なお、本発明の診断を行うためのデータを取得する方法も、本発明の一態様である。すなわち、上記診断方法の各工程を含むことを特徴とする診断のためのデータ取得方法も本発明に含まれる。
【００４６】
ＨＨＶ−６の抗体レベルは、ＨＨＶ−６脳炎のリスク評価にも使用することができる。具体的にはＨＨＶ−６の抗体レベルが低い場合にはＨＨＶ−６脳炎リスクはより高く、抗体レベルが高い場合にはＨＨＶ−６脳炎リスクはより低いと評価することができる。また前者の場合には、被験者に対し予防的に抗ウイルス薬等の投薬を行うことができる。
【００４７】
本発明において、「キット」とは、本発明の検出方法又は診断方法を実施するためのものであればよく、具体的な構成、材料、機器等は、特に限定されるものではないが、抗ＳＩＴＨ−１抗体を免疫学的に検出するために、以下のいずれかの物質が含まれていることが好ましい：（１）ＳＩＴＨ−１タンパク質、（２）（１）の部分断片（エピトープ保有ペプチドを含むことが好ましい）、（３）（１）又は（２）を固定化した検出器具。また、抗ＨＨＶ−６抗体を免疫学的に検出するために、以下のいずれかの物質が含まれていることが好ましい：（１）ＨＨＶ−６コートタンパク質、（２）（１）の部分断片（エピトープ保有ペプチドを含むことが好ましい）、（３）（１）又は（２）を固定化した検出器具。
【００４８】
本発明において上記（１）又は（２）を固定化する対象は、固体または不溶性材料（例えば、濾過、沈殿、磁性分離などにより反応混合物から分離することができる材料）である担体であれば特に限定されない。また、固体担体の形状は、ビーズ、磁性ビーズ、薄膜、微細管、フィルター、プレート、マイクロプレート、カーボンナノチューブ、センサーチップなどを含むがこれらに限定されない。薄膜やプレートなどの平坦な固体担体は、当該技術分野で知られているように、ピット、溝、フィルター底部などを設けてもよい。
【００４９】
また、本発明において上記（１）又は（２）を固定化する対象は、上記（１）又は（２）を発現させるための細胞であってもよい。特に（間接）蛍光抗体法により測定を行う場合、このような態様が好ましい。なお、細胞は、公知技術に基づき当業者が適宜選択することができる。例えば、ヒト由来細胞、サル由来細胞、昆虫細胞を好ましく使用することができ、最も好ましくはヒト由来細胞である。
【００５０】
本発明において、「治療」とは、気分障害の症状を完治又は軽減させること、気分障害の症状の悪化を抑制することを含む。本発明において、「予防」とは、気分障害の症状の発症を抑制すること、又は遅延させることを含む。
【００５１】
〔３〕ＨＨＶ−６と気分障害との関係等について
ところで、本発明者らは、本発明者らが見出した前記の気分障害と抗ＨＨＶ−６抗体量との関係、及び、ＨＨＶ−６が嗅上皮に感染するということ（文献１１）から、ＨＨＶ−６の嗅上皮細胞への感染と気分障害との関係に着目し、鋭意研究を続けた結果、驚くべき結果を得た。
【００５２】
すなわち、本発明者らが、マウスの嗅上皮細胞（本書面において、嗅神経鞘細胞を含む嗅上皮の細胞をいう。）においてＳＩＴＨ−１遺伝子を発現させたところ、当該マウス（以下「ＳＩＴＨ−１発現マウス」と称する。）は、嗅覚系細胞の障害、さらにはストレス脆弱性を生じ、気分障害を発症したのである。これは、ＨＨＶ−６が脳内各器官に感染又は移行しなくとも、嗅上皮細胞でＳＩＴＨ−１が発現するだけで気分障害が引き起こされることを意味しており、驚くべき結果であった。
【００５３】
上記嗅覚系細胞の障害の一例として、嗅球細胞のアポトーシスが挙げられる。ＳＩＴＨ−１発現マウスは対照マウスと比べ、嗅球において、アポトーシスの指標となるＢａｘ／Ｂｃｌ−２比が増大し（実施例２．３の項）、ＴＵＮＥＬ染色による嗅球の組織観察においても、より多くのアポトーシス細胞が検出された（実施例２．４の項）。
【００５４】
また、ＳＩＴＨ−１発現マウスでは、全脳においてＣＲＨ（副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン）とウロコルチン（Ｕｒｃｏｒｔｉｎ）の異常産生が見られた（実施例２．３の項）。これらは視床下部のバイオマーカーであることから、視床下部に何らかの異常が生じていることを強く示唆している。また脳ストレス応答因子であるＲＥＤＤ１の発現上昇も見られた（実施例２．３の項）。
【００５５】
そしてＳＩＴＨ−１発現マウスは、マイルドなストレスに晒すと気分障害症状を引き起こし（実施例２．５の項）、ストレス脆弱性を示した。なお、ストレス脆弱性とは、弱いストレッサーに対して適切な応答ができない状態をいう。
【００５６】
さらに、ＳＩＴＨ−１発現マウスは、行動異常試験（尾懸垂試験）の結果、無動時間が延長し、うつ状態になっていることが分かった（実施例２．２の項）。この行動異常はＳＳＲＩ（選択的セロトニン再取り込み阻害薬）投与によって改善された（実施例２．２の項）。
【００５７】
以上の一連の結果から、本発明者らは、ＨＨＶ−６による気分障害発症について、次のような作用機序を見出した。
【００５８】
すなわち、ＨＨＶ−６が嗅上皮に感染しＳＩＴＨ−１タンパク質を発現すると、嗅覚系が障害され嗅球細胞のアポトーシスを生じる。このような嗅覚系の機能障害により、強い不正なシグナルが視床下部に伝達された結果、不正なストレス応答を起こしやすくなる状態である「ストレス脆弱性」を生じる。そして「ストレス脆弱性」が生じると、環境中のマイルドなストレスであっても過敏に反応してしまい、気分障害を発症する。なお、本発明は、この作用機序に限定されるものではない。
【００５９】
上記のとおり、本発明者らは、ＨＨＶ−６が嗅上皮細胞に感染してＳＩＴＨ−１を発現することで、さまざまな障害が生じることを見出した。ここで障害とは、嗅覚系細胞の障害、視床下部の異常、脳ストレス応答因子の異常発現、ストレス脆弱性、並びに、気分障害である。なお、限定されるものではないが、嗅覚系細胞の障害の一例として嗅覚系細胞のアポトーシス増加が、視床下部の異常の例としてＣＲＨ及び／又はウロコルチンの異常産生が、異常発現する脳ストレス応答因子の一つとしてＲＥＤＤ１が、それぞれ挙げられる。
【００６０】
従って、本発明は、嗅上皮細胞へのＨＨＶ−６感染を抑制することを特徴とする上記障害の治療方法を提供する。
【００６１】
なお、本明細書において、「治療」及び「予防」の定義は上記のとおりであるが、いずれの場合も本発明の作用機序は同じである。従って、「治療方法」および「予防方法」は、それぞれ「予防方法」および「治療方法」に置換可能である。すなわち、被験者がＳＩＴＨ−１による障害を生じていない場合、「治療」は「予防」を意味する。よって、本発明の一態様として、被験者の嗅上皮細胞へのＨＨＶ−６感染を抑制することを特徴とする気分障害の予防方法、被験者にＨＨＶ−６感染阻害剤を投与することを特徴とする気分障害の予防方法、が当然に含まれる。
【００６２】
本発明において、嗅上皮細胞へのＨＨＶ−６の感染を抑制するための、ＨＨＶ−６感染阻害剤を用いることができる。
【００６３】
本発明におけるＨＨＶ−６感染阻害剤としては、ＨＨＶ−６の細胞への感染を阻害するものであればよいが、好ましくは、抗ＨＨＶ−６抗体、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ＨＨＶ−６ワクチン、糖加水分解酵素（グリコシダーゼ）阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、ペプチド、糖鎖、糖鎖ポリペプチド、糖誘導体、等であり、より好ましくは、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ＨＨＶ−６ワクチンである。また、これらを適宜組み合わせてもよい。抗ＨＨＶ−６抗体としては、中和抗体を好ましく使用できる。
【００６４】
このようなＨＨＶ−６感染阻害剤は、嗅上皮細胞へのＨＨＶ−６感染を抑制できる任意の態様で投与することができる。例えば、ＨＨＶ−６ワクチンを皮下に接種すると免疫誘発が起こり、抗ＨＨＶ−６抗体が増加してＨＨＶ−６感染を抑制できる。限定されるものではないが、ＨＨＶ−６感染阻害剤は、嗅上皮に投与することが好ましい。実際の治療にあたっては、これらのＨＨＶ−６感染阻害剤を、適量を鼻腔に噴霧する等して嗅上皮に投与することができる。
【００６５】
従って、本発明の一態様は、被験者の抗ＨＨＶ−６抗体量を増加させることにより、該被験者の嗅上皮細胞へのＨＨＶ−６感染を抑制することを特徴とする気分障害の治療方法、であってよい。この治療方法には、抗ＨＨＶ−６抗体を被験者の嗅上皮細胞に直接投与する態様と、ＨＨＶ−６ワクチンを投与して抗ＨＨＶ−６抗体を間接的に増加させる態様の両方が含まれる。
【００６６】
本発明で用いるＨＨＶ−６ワクチンは、好ましくは不活化ワクチンまたは弱毒化ワクチン、より好ましくは不活化ワクチンである。不活化ＨＨＶ−６ワクチンは、公知のウイルス不活化処理、例えば、ホルマリン化学処理、熱や放射線などの物理的処理によってウイルスの複製能を失わせることにより、作製することができる。このワクチンには、適宜アジュバントを添加してもよい。当業者は公知のアジュバントを適宜選択し、使用することができる。限定するものではないが、アルミニウム塩アジュバント（水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム等）、乳化剤アジュバント（ＣＦＡ、ＩＦＡ、スクワレン、ＭＦ５９等）、ポリマー微粒子アジュバント（リポソーム、バイオポリマー等）、Ｔｏｌｌ様受容体（ｄｓＲＮＡ、ＣｐＧ−オリゴＤＮＡ、ＬＰＳ、βグルカン等）、イノシトール５リン酸（ＷＯ２０１４／０６５２２９）等を好ましく使用することができる。
【００６７】
なお、イノシトール５リン酸等のアジュバントは、ワクチンなしで単独で鼻腔に噴霧してもよい。これにより免疫が賦活化されて鼻腔中に存在するＨＨＶ−６に対する抗体の産生が高められることにより、ＨＨＶ−６感染を抑制することができる。
【００６８】
また、本発明で用いるワクチンは、限定されるものではないが、好ましくは経鼻ワクチンである。ＨＨＶ−６ワクチンを鼻粘膜に噴霧し、鼻汁中に主に抗ＨＨＶ−６  ＩｇＡ抗体を産生させることにより、ＨＨＶ−６の鼻腔から脳への侵入を抑制することができる。
【００６９】
経鼻ワクチンを使用するにあたっては、適宜鼻腔での付着性を向上させる物質、例えばゲル化剤や増粘剤を用いてもよい。なお、経鼻ワクチンを用いる場合に、ワクチンをカチオン性ナノ粒子に内包させることによって、アジュバントを用いることなく、全身性及び粘膜免疫応答を引き起こす技術が開発されており（日本国特許第５３４４５５８号）、また、不活性化ウイルス粒子抗原を経粘膜に投与する場合に、ペネトラチン又はその改変ペプチドを共に経鼻投与することにより該ウイルスに対する免疫を効率よく誘導する技術も開発されている（日本国公開特許公報２０１２−２１９０４１号）。本発明においてこのような技術を使用することもできる。また、本発明において、嗅上皮細胞でのＳＩＴＨ−１発現を抑制することのできるｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡなどの干渉ＲＮＡを、気分障害治療剤として用いることもできる。このような干渉ＲＮＡは、ＳＩＴＨ−１遺伝子の塩基配列と公知技術に基づき、当業者が容易に作成することができる。そして、このような干渉ＲＮＡを含む治療剤を、嗅上皮に噴霧して嗅上皮細胞で発現させることで、気分障害を治療することができる。このような干渉ＲＮＡを用いた気分障害の治療方法も本発明の一態様である。
【００７０】
〔４〕本発明の治療方法の対象
本発明の治療方法の対象の一例として、生物学的試料中の抗ＳＩＴＨ−１抗体の抗体レベルの高い被験者が挙げられる。このような被験者は、未だ気分障害について診断を受けていない被験者であってよい。また、生物学的試料中の抗ＳＩＴＨ−１抗体の抗体レベルが高く、かつ、ＤＳＭやＩＣＤなどに基づき、気分障害患者として診断された患者（以下「気分障害患者」と称する）は、本発明の好ましい対象の一例である。
【００７１】
また、本発明の治療方法の対象として、限定されるものではないが、抗ＳＩＴＨ−１抗体の抗体レベルが高い被験者が好ましく、本発明の気分障害診断方法により陽性と判断された被験者がより好ましい。抗ＳＩＴＨ−１抗体の抗体レベルが高い被験者は、上記作用機序で気分障害を発症している可能性が高く、本発明の気分障害診断方法により陽性と判断された被験者は、更にその可能性が高い。本発明の治療方法により、このような被験者のＨＨＶ−６の嗅上皮細胞への頻回感染を防ぎ、発症あるいは症状悪化を抑制することができる。
【００７２】
ところで、ウイルスに対する免疫能は、遺伝的要因による個体差が大きい。ここで、ＨＨＶ−６への免疫能が低い被験者、すなわち、被験者から分離された生物学的試料中の抗ＨＨＶ−６抗体レベルを測定した結果、その値が低い被験者は、気分障害を発症していなくても、上記作用機序から、ＨＨＶ−６による気分障害の高リスク者であることは明らかである。実施例３．１の項には、血清中の抗ＨＨＶ−６抗体量が少ない場合、ＨＨＶ−６の感染に晒され、宿主細胞において発現するＳＩＴＨ−１量が多くなることが示されている。従って、このような被験者は、上記治療方法（予防方法）の対象として好ましい。また、気分障害の高リスク者か否かを判別するために、抗ＨＨＶ−６抗体量を測定することを特徴とする実験データ取得方法も本発明の一態様である。
【００７３】
ところで、ヒトは疲労度が高まると、潜伏感染しているＨＨＶ−６が再活性化し、唾液に放出されることが知られているが（日本国特許第４２１８８４２号）、その結果、ＨＨＶ−６の嗅上皮への暴露リスクは高まることになる。一般に再活性化したウイルスが増加すると当該ウイルスに対する抗体が増加する。しかしながら、驚くべきことに、上記のとおり、抗ＳＩＴＨ−１抗体陽性の気分障害患者の検体中の抗ＨＨＶ−６抗体レベルは低いにもかかわらず、このような患者の検体中のＨＨＶ−６量は、抗ＳＩＴＨ−１抗体陰性の気分障害患者と比べて有意に多いことが確認された（図２５）。これは、上記作用機序により初めて説明することができることからも、上記作用機序は裏付けられている。そして、この結果から、抗ＳＩＴＨ−１抗体陽性の被験者であり、かつ、該被験者から分離された生物学的試料中のＨＨＶ−６量を測定した結果、その値が高い被験者は、本発明のＨＨＶ−６感染阻害剤を用いた治療方法の対象として有効であることは明らかである。
【００７４】
さらには、被験者から分離された生物学的試料中の抗ＨＨＶ−６抗体レベルを測定した結果その値が低く、かつ、該被験者から分離された生物学的試料中のＨＨＶ−６量を測定した結果その値が高い被験者は、気分障害を発症していなくても、上記作用機序から、ＨＨＶ−６による気分障害の高リスク者であることは明らかであり、上記治療方法（予防方法）の対象として好ましい。
【００７５】
なお、生物学的試料中のＨＨＶ−６量の測定は、従来公知の方法でよく、当業者であれば適宜設定可能であるが、ウイルス核酸を測定する方法、ウイルスタンパク質を測定する方法等が挙げられる（日本国特許第４２１８８４２号）。
【００７６】
〔５〕気分障害の治療剤、気分障害の治療方法、形質転換細胞、気分障害モデル動物等
Ｂｃｌ−２（Ｂ細胞リンパ腫−２）ファミリータンパク質は、アポトーシス制御の中心的役割を担っている。Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質は、ＢａｘやＢｉｄ等のアポトーシス促進因子と、Ｂｃｌ−２やＢｃｌ−ＸＬ等のアポトーシス抑制因子とに分けられ、両者の細胞内でのバランスにより、アポトーシスが起こるか否かが決定される（文献１２）。一方、気分安定薬や、アミトリプチリン、デシプラミン、イミプラミン、フルオキセチン、レボキセチン、トラニルシプロミン、ベンラファキシン（これらの塩を含む）といった気分障害治療剤は、脳におけるＢｃｌ−２発現を促進することが知られている（文献１３〜文献１６）。また、アポトーシス促進因子Ｂｉｄのアンタゴニスト（ＢＯ−１１Ａ７、ＢＩ−２Ａ７）を投与することにより、マウスの精神障害様行動異常が抑制されることが示されている（文献１７）。
【００７７】
以上の事実を踏まえた上で、本発明者が見出した上記気分障害の作用機序、特に嗅上皮細胞におけるＳＩＴＨ−１発現がアポトーシス抑制因子Ｂｃｌ−２の発現を抑制することを考慮すると、上記の薬剤はＢｃｌ−２発現を促進し、ＢｉｄのアンタゴニストはＢｉｄ発現を抑制することから、これらの薬剤やＢｉｄのアンタゴニストは、ＳＩＴＨ−１発現により生じる気分障害の治療薬として使用することができることは明らかである。
【００７８】
なお、このようなＢｉｄのアンタゴニストとして公知のものを使用できる（ＵＳ２０１００２６１７８８、ＵＳ７７４１５２１、ＷＯ２００６００４６２２）が、好ましくは、ＢＯ−１１Ａ７又はＢＩ−２Ａ７、より好ましくはＢＯ−１１Ａ７である。
【００７９】
すなわち、本発明の一態様は、抗ＳＩＴＨ−１抗体の抗体レベルが高い被験者、本発明の気分障害診断方法により陽性と判断された被験者に対して、アミトリプチリン、デシプラミン、イミプラミン、フルオキセチン、レボキセチン、トラニルシプロミン、ベンラファキシン及びこれらの塩から選択される気分障害治療薬、気分安定薬、又はＢｉｄのアンタゴニストのいずれかを投与することを特徴とする気分障害の治療方法である。
【００８０】
また、本発明は、ＨＨＶ−６感染阻害剤を含む上記障害の治療剤（予防剤を含む）を提供する。
【００８１】
さらに、ＨＨＶ−６感染阻害剤の、上記障害の治療（予防を含む）のための使用も、本発明に含まれる。
【００８２】
本発明は、嗅上皮細胞にＳＩＴＨ−１遺伝子を導入してなることを特徴とする形質転換細胞を提供する。この嗅上皮細胞は、好ましくはヒト嗅上皮細胞である。このような細胞を用いることにより、嗅上皮細胞においてＳＩＴＨ−１遺伝子が発現することによって生じる不正シグナルを抑える物質をスクリーニングすることが可能となる。
【００８３】
限定されるものではないが、不正シグナルの例として、ＧＡＢＡトランスポーター、ＧＡＢＡ受容体、嗅覚受容体、アドレナリン受容体、グルタミン酸トランスポーター、グルタミン酸受容体等の発現異常が挙げられる。従って、嗅上皮細胞における、これらの全て又は一部の発現量を指標として、嗅覚系細胞への不正シグナルを抑える物質をスクリーニングすることができる。
【００８４】
さらに本発明は、嗅上皮細胞にＳＩＴＨ−１遺伝子を導入してなることを特徴とする上記障害モデル動物を提供する。
【００８５】
嗅上皮細胞に導入するＳＩＴＨ−１遺伝子としては、ＳＩＴＨ−１タンパク質（以下、「（ａ）のタンパク質」と称する場合もある。）をコードする配列番号２のポリヌクレオチドが挙げられる。また、配列番号１のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、嗅上皮細胞に導入すると嗅覚系細胞でアポトーシスを誘導するタンパク質（以下、「（ｂ）のタンパク質」と称する場合もある。）をコードする遺伝子が挙げられる。
【００８６】
上記「１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意味する。このように、上記（ｂ）のタンパク質は、上記（ａ）のタンパク質の変異タンパク質であるといえる。なお、ここでいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００８７】
また、嗅上皮細胞に導入する別のＳＩＴＨ−１遺伝子としては、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、９０％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上、より好ましくは９９．５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、嗅上皮細胞に導入すると嗅覚系細胞でアポトーシスを誘導するタンパク質（以下、「（ｃ）のタンパク質」と称する場合もある。）をコードする遺伝子が挙げられる。
【００８８】
アミノ酸配列の同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算によって決定してもよい。あるいは、アミノ酸配列の同一性パーセントは、Needleman, S. B. 及びWunsch, C. D. （J. Mol. Biol., 48: 443-453, 1970）のアルゴリズムに基づき、ウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用いた配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Henikoff, S. 及びHenikoff, J. G.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919, 1992）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
【００８９】
当業者が使用するその他の配列比較プログラムを用いてもよい。アミノ酸配列の同一性パーセントは、例えば、Altschulら(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて、配列情報と比較し、決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でNational Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）、あるいはDNA Data Bank of Japan（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は、同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は、通常、デフォルト値を用いて行う。その他、アミノ酸配列の同一性パーセントは、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．７（ゼネティックス製）などのプログラム、または、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなどを用いて決定してもよい。その際、検索は、デフォルト値を用いて行ってもよい。
【００９０】
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、ヒトヘルペスウイルス−６（ＨＨＶ−６）の潜伏感染時に特異的に発現するタンパク質として単離・同定されたものであり、ＳＩＴＨ−１タンパク質と称する。ＳＩＴＨ−１タンパク質は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、１５９アミノ酸からなる、分子量約１７．５ｋＤａのタンパク質である。ＳＩＴＨ−１タンパク質は、ＳＩＴＨ−１遺伝子によってコードされている。このＳＩＴＨ−１遺伝子のｃＤＮＡは、配列番号３に示すように、１７９５塩基対（約１．７９ｋｂｐ）のサイズを有しており、９５４番目から９５６番目の塩基配列が開始コドン（Ｋｏｚａｋ  ＡＴＧ）であり、１４３１番目から１４３３番目の塩基配列が終止コドン（ＴＡＡ）である。したがって、上記ＳＩＴＨ−１遺伝子は、配列番号３に示す塩基配列のうち、９５４番目から１４３０番目までの塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域として有しており、このＯＲＦは、４７７塩基対（約０．４８ｋｂｐ）のサイズを有している。ＳＩＴＨ−１のｃＤＮＡのうち、ＯＲＦ領域を表す塩基配列を配列番号２に示す。なお、配列番号２に示す塩基配列は、ストップコドンの３塩基を含んで記載している。
【００９１】
さらに、導入するＳＩＴＨ−１遺伝子として、配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、嗅上皮細胞に導入すると嗅覚系細胞でアポトーシスを誘導するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
【００９２】
上記「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ」するとは、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
【００９３】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の具体的な例として、例えば、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。また、上記ハイブリダイゼーションは、後述する文献１０に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができ、特に限定されるものではない。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズし難くなる）。
【００９４】
なお、本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「核酸」又は「核酸分子」と交換可能に使用される。「ポリヌクレオチド」はヌクレオチドの重合体を意味する。
【００９５】
したがって、本明細書での用語「遺伝子」には、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）を包含する。アンチセンス鎖は、プローブとして又はアンチセンス薬剤として利用できる。
【００９６】
「ＤＮＡ」には、例えばクローニングや化学合成技術、又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡ等が含まれる。すなわち、ＤＮＡとは、動物のゲノム中に含まれる形態であるイントロンなどの非コード配列を含む「ゲノム」形ＤＮＡであってもよいし、また逆転写酵素やポリメラーゼを用いてｍＲＮＡを経て得られるｃＤＮＡ、すなわちイントロンなどの非コード配列を含まない「転写」形ＤＮＡであってもよい。
【００９７】
さらに、本発明に係る遺伝子は、上記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に記載のアミノ酸をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。また、これらのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの翻訳領域の末端及び／又は内部に調節配列やポリアデニル配列等の任意のポリヌクレオチドが含まれていてもよい。また、本発明に係るタンパク質が複数の対立遺伝子によってコードされ得る場合には、全ての対立遺伝子、それらの転写産物、およびｃＤＮＡがかかる核酸に含まれる。
【００９８】
なお、本明細書において、「核酸」なる語には、任意の単純ヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドからなるポリヌクレオチド、例えばｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、等が含まれる。「修飾ヌクレオチド」には、イノシン、アセチルシチジン、メチルシチジン、メチルアデノシン、メチルグアノシンを含むリン酸エステルの他、紫外線や化学物質の作用で後天的に発生し得るヌクレオチドも含まれる。
【００９９】
用語「塩基配列」は、「核酸配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（それぞれＡ、Ｇ、Ｃ及びＴと省略される）の配列として示される。また、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの「塩基配列」は、ＤＮＡ分子又はポリヌクレオチドに対してのデオキシリボヌクレオチドの配列を意図し、そしてＲＮＡ分子又はポリヌクレオチドに対してのリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ）の対応する配列（ここで特定されるデオキシヌクレオチド配列における各チミジンデオキシヌクレオチド（Ｔ）は、リボヌクレオチドのウリジン（Ｕ）によって置き換えられる）を意図する。
【０１００】
例えば、デオキシリボヌクレオチドの略語を用いて示される「配列番号２又は３の配列を有するＲＮＡ分子」とは、配列番号２又は３の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ又はＣが、対応するリボヌクレオチドＡ、Ｇ又はＣによって置換され、そしてデオキシヌクレオチドＴが、リボヌクレオチドＵによって置き換えられる配列を有するＲＮＡ分子を示すことを意図する。また、「配列番号２又は３に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド又はそのフラグメント」とは、配列番号２又は３の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ及び/又はＴによって示される配列を含むポリヌクレオチド又はその断片部分を意図する。
【０１０１】
上記ＳＩＴＨ−１遺伝子の嗅上皮細胞への導入方法は、従来公知の手法を用いることができ、特に限定されるものではないが、アデノウイルスベクターを用いる方法、レトロウイルスベクターを用いる方法、遺伝子のトランスフェクションによる方法等が挙げられる。また、一般的なトランスジーン（トランスジェニックマウス作成）による遺伝子導入を用いてもよい。
【０１０２】
導入の対象となる動物は、実験動物として利用可能なものであれば特に限定されるものではないが、哺乳動物が好ましく、例えば、マウス、ラット、サル等を挙げることができる。本発明のモデル動物は、気分障害の治療法の検討、薬剤の効果の検討、判定、薬剤以外の治療方法（温熱療法等）の評価等に好適に利用することができる。特に本発明のモデル動物は、上記のとおりＢｃｌ−２の発現が抑制されているが、これは精神障害様行動異常と関係が深いことが示唆されている（文献１７）ことを考慮すると、気分障害のモデル動物として非常に優れた特徴を有しているといえる。
【０１０３】
〔６〕気分障害治療薬の候補物質をスクリーニングするスクリーニング方法
さらに、本発明の上記障害モデル動物は、上記障害治療薬、好ましくは気分障害治療薬の候補物質をスクリーニングする方法に用いることができる。すなわち、本発明のモデル動物に上記障害治療薬の候補物質を投与した後に、驚愕反応試験、尾懸垂試験、自発運動量試験、ストレス脆弱性試験等、公知の行動異常試験を行った結果、異常行動が改善されていれば、上記候補物質は気分障害及び／又はストレス脆弱性を改善する作用を有していると判断し得る。
【０１０４】
また、本発明のモデル動物に上記障害の治療薬の候補物質を投与した後に、本発明のモデル動物の脳内のバイオマーカーを検出・測定した結果、異常が改善されていれば、上記候補物質は抗障害作用を有していると判断し得る。このようなバイオマーカーとして、嗅球のアポトーシスを検出するマーカー、視床下部の異常を検出するマーカー、及び／又は、脳ストレス応答因子が挙げられる。限定されるものではないが、嗅球のアポトーシスを検出するマーカーとしてＢｃｌ−２が、視床下部の異常を検出するマーカーとしてＣＲＨやウロコルチンが、脳ストレス応答因子の一つとしてＲＥＤＤ１が、それぞれ挙げられる。
【０１０５】
上記のとおり本発明のモデル動物は健常動物と比べて、Ｂｃｌ−２量が減少し、ＣＲＨ量やウロコルチン量が増大し、ＲＥＤＤ１の発現が上昇するといった異常を生じるため、これらの少なくとも1つの異常が改善されていることを指標に治療薬の候補物質のスクリーニングを行うことができる。さらに、上記行動異常試験によるスクリーニングと、上記バイオマーカー検出によるスクリーニングは、適宜併用することもできる。
【０１０６】
従って、本発明のモデル動物に被験物質を投与し、該モデル動物の脳内の上記バイオマーカーの少なくとも１つを検出及び／又は測定した結果、異常が改善されていた場合に、該被験物質が気分障害治療薬の候補物質であると判定することを特徴とする、気分障害のスクリーニング方法は、本発明の一態様である。
【０１０７】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。さらに、各実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を組み合わせることにより、新しい技術的特徴を形成することができる。以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。
【実施例】
【０１０８】
（１）  ＳＩＴＨ−１発現アデノウイルスの調製
モデル動物に感染し、ＳＩＴＨ−１を発現させるウイルスとして組換えアデノウイルスを構築した。組換えアデノウイルスの構築は、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（Takara bio）の標準プロトコールに従った。
【０１０９】
グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターを含むｐＧｆａ２Ｌａｃプラスミドは、Ｋａｚｕｙｏｓｈｉ  Ｉｋｕｔａ博士（オリジナルは、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｂｒｅｎｎｅｒ博士）から提供を受けた。
【０１１０】
ｐＧｆａ２Ｌａｃプラスミドより得たＧＦＡＰプロモーターと、ＰＣＲによって増幅したＳＩＴＨ−１遺伝子とを、標準的な方法で、アデノウイルスコスミドベクターにクローニングした（Ａｄ−ＧＦＡＰ−ＳＩＴＨ−１）。このＡｄ−ＧＦＡＰ−ＳＩＴＨ−１コスミドベクター、および対照として目的遺伝子が挿入されていないコスミドベクター（ｐＡｘｃｗｉｔ）をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。
【０１１１】
ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎児血清を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。組換えアデノウイルスを２９３細胞で調製し、Ａｄｅｎｏ−Ｘ  Ｖｉｒｕｓ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（Clontech）を用いて精製した。さらに、精製したウイルスの力価はＡｄｅｎｏ−Ｘ  ｒａｐｉｄ  ｔｉｔｅｒ  ｋｉｔｓ（Clontech）によって決定した。
【０１１２】
（２）  ＳＩＴＨ−１発現アデノウイルスを鼻腔投与したマウス
嗅上皮細胞にＳＩＴＨ−１を発現させた際の行動および遺伝子発現の変化を解析するために、ＳＩＴＨ−１発現アデノウイルス（ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ）をマウスの鼻腔に投与した。対照として、ＳＩＴＨ−１遺伝子が挿入されていないコスミドベクター由来のアデノウイルス（ｅｍｐｔｙ／Ａｄｖ）を使用した。
【０１１３】
（２．１）  ＳＩＴＨ−１発現アデノウイルスの鼻腔投与
８週齢のＣ５７ＢＬ／６ＮＣｒＳｌｃマウスは、室温２４±１℃、消灯１２時間、点灯１２時間の照明時間で飼育した。マウスにイソフルランで麻酔をかけた後、鼻腔に２．５×１０７ｉｆｕ相当のＳＩＴＨ−１／Ａｄｖもしくはｅｍｐｔｙ／Ａｄｖを滴下し、呼吸と共に吸引させ、飼育ケージに戻した。
【０１１４】
（２．２）  ＳＩＴＨ−１発現アデノウイルスを鼻腔投与したマウスの尾懸垂試験
ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖもしくはｅｍｐｔｙ／Ａｄｖの鼻腔投与から７日後に、１０分間の尾懸垂試験を行い、無動時間をＴａｉｌＳｕｓｐＳｃａｎＴｏｐＳｃａｎ（CleverSys社）で計測した。尾懸垂試験は、尾の端から１ｃｍの箇所をテーピングすることにより、各マウスを懸垂して行った。懸垂の間に、活動的ではなく全く動かない場合に、マウスは無動であるとした。なお、いずれの群のマウスも３０匹ずつ実験に用いた。
【０１１５】
ｅｍｐｔｙ／Ａｄｖ鼻腔投与マウスとＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスの無動時間を比較した結果を図１Ａに示す。統計学的有意（*は、Ｐ＜０．０５を示し、**は、Ｐ＜０．０１を示し、***は、Ｐ＜０．００１を示す）は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−ｔｅｓｔを用いて算出した。
【０１１６】
図１Ａより、ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスの無動時間はｅｍｐｔｙ／Ａｄｖ鼻腔投与マウスの無動時間よりも有意に増加していた。従って、ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスは、うつ病様行動を示すことが明らかとなった。
【０１１７】
続いて、抗うつ薬のＳＳＲＩ（選択的セロトニン再取り込み阻害薬）がＳＩＴＨ−１／Ａｄｖの鼻腔投与によって誘導される無動時間の増加を抑制するかについて検討した。６週齢のマウスに飲料水として８０ｍｇ／Ｌ  Ｆｌｕｏｘｅｔｉｎｅ溶液を与え（文献１８）、２週間飼育した。２週間後にＳＩＴＨ−１／Ａｄｖを鼻腔投与し、鼻腔投与後７日目に１０分間の尾懸垂試験を行った。ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖの鼻腔投与後も８０ｍｇ／Ｌ  Ｆｌｕｏｘｅｔｉｎｅ溶液を与えて飼育した。このようなＳＳＲＩ投与群としてマウス２１匹を実験に使用した。ＳＳＲＩの投与による無動時間への影響を図１Ｂに示す。統計学的有意（*は、Ｐ＜０．０５を示し、**は、Ｐ＜０．０１を示し、***は、Ｐ＜０．００１を示す）は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−ｔｅｓｔを用いて算出した。
【０１１８】
図１Ｂより、ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスで観察された無動時間の増加は、ＳＳＲＩの投与により抑制されたことから、ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖの鼻腔投与で誘導されるうつ病様行動はＳＳＲＩの投与によって改善されることが示された。なお、ＦｌｕｏｘｅｔｉｎｅはＢｃｌ−２発現を促進する（文献１３）ことを考慮すると、この結果は、Ｂｃｌ−２発現を促進する気分障害治療剤が、ＳＩＴＨ−１発現により生じる気分障害の治療薬として使用できることを裏付けている。
【０１１９】
（２．３）  ＳＩＴＨ−１発現アデノウイルスを鼻腔投与したマウスの遺伝子発現解析
ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖを鼻腔投与した結果、遺伝子発現が変化するかを検討するために、尾懸垂試験から２４時間後に、ｅｍｐｔｙ／Ａｄｖ鼻腔投与マウスおよびＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスの嗅球と脳を採取した。嗅球と脳のＲＮＡを精製し、うつ病に関わる因子およびアポトーシス関連因子のｍＲＮＡ量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで定量した。リファレンス遺伝子として、β−アクチン遺伝子を用いた。
【０１２０】
うつ病に関わる因子として、嗅球を除く全脳のＣＲＨ、ＲＥＤＤ１、およびＵｒｏｃｏｒｔｉｎ遺伝子の発現量を図２に示す。なお、図２（Ｂ）のＤｄｉｔ４は、ＲＥＤＤ１の別名である。さらに、嗅球のＢｃｌ−２、Ｂａｘ遺伝子の発現量およびその比（Ｂａｘ／Ｂｃｌ−２）を図３に示す。統計学的有意（*は、Ｐ＜０．０５を示し、**は、Ｐ＜０．０１を示し、***は、Ｐ＜０．００１を示す）は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−ｔｅｓｔを用いて算出した。
【０１２１】
うつ病に関わる因子については、ｅｍｐｔｙ／Ａｄｖ鼻腔投与マウス２５匹とＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウス２５匹の全脳（嗅球を除く）の各遺伝子の発現量を比較した。一方、アポトーシス関連因子については、ｅｍｐｔｙ／Ａｄｖ鼻腔投与マウス２０匹とＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウス２０匹の嗅球のアポトーシス関連遺伝子の発現量を比較した。
【０１２２】
図２より、ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスの全脳におけるＣＲＨ、ＲＥＤＤ１、およびＵｒｏｃｏｒｔｉｎ遺伝子の発現量は、ｅｍｐｔｙ／Ａｄｖ鼻腔投与マウスよりも有意に増加していた。従って、ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスは、うつ病患者と同様に、ＣＲＨ、ＲＥＤＤ１、およびＵｒｏｃｏｒｔｉｎの発現増加を示すことが明らかとなった。
【０１２３】
また、図３より、ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスの嗅球において、ｅｍｐｔｙ／Ａｄｖ鼻腔投与マウスよりもアポトーシス抑制因子であるＢｃｌ−２の発現が有意に低下していた（図３Ａ）。一方、アポトーシス促進因子であるＢａｘの発現量に有意な差は見られなかった（図３Ｂ）。アポトーシス指標となるＢａｘ／Ｂｃｌ−２比を求めた結果、ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスの嗅球で有意な上昇が認められた（図３Ｃ）。
【０１２４】
従って、ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスは、嗅球においてアポトーシスが誘導されており、この結果は、うつ病患者で観察される嗅球の萎縮に関連していると考えられる。
【０１２５】
（２．４）  ＳＩＴＨ−１発現アデノウイルスを鼻腔投与したマウスの免疫組織染色
尾懸垂試験から２４時間後に、ｅｍｐｔｙ／Ａｄｖ鼻腔投与マウスおよびＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスを１０％中性緩衝ホルマリン溶液で固定し、頭蓋骨上顎部位のパラフィン切片を作製した。
【０１２６】
（２．４．１）  マウス頭蓋骨上顎部位パラフィン切片のＴＵＮＥＬ染色
パラフィン切片スライドのＴＵＮＥＬ染色は、ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（TaKaRa Bio）の標準プロトコールに従った。核の対比染色としてＰＩを含む封入剤ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ＰＩ（VECTOR Laboratories）を使用した。
【０１２７】
蛍光顕微鏡で観察した結果を図４Ａに、嗅球に存在するＴＵＮＥＬ染色細胞数を計数した結果を図４Ｂに示す。図４Ａでは、アポトーシスによって断片化されたゲノムがＴＵＮＥＬ染色により緑色に染色されており、細胞の核がＰＩにより赤色に染色されている。図４Ｂにおいて、統計学的有意（*は、Ｐ＜０．０５を示し、**は、Ｐ＜０．０１を示し、***は、Ｐ＜０．００１を示す）は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−ｔｅｓｔを用いて算出した。ｅｍｐｔｙ／Ａｄｖ鼻腔投与マウスと比較して、ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスの嗅球で、ＴＵＮＥＬ染色された細胞が多数観察された。この結果は、遺伝子発現解析の結果と一致しており、ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖの鼻腔投与は、嗅球のアポトーシスを誘導することが示された。
【０１２８】
（２．４．２）  マウス嗅上皮細胞のＳＩＴＨ−１発現
ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖを鼻腔投与することにより、嗅上皮細胞でＳＩＴＨ−１タンパク質が発現していることを確認するために、パラフィン切片の免疫組織染色を行った。パラフィン切片スライドは、脱パラフィン処理した後に、９８℃のＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ  Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ９．０）に２０分間浸すことで抗原の賦活化を行った。賦活化後のスライドにＩｍａｇｅ−ｉＴ（商標）  ＦＸ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ（Life technologies）を滴下し、室温で３０分間静置することでブロッキング反応を行った。
【０１２９】
その後、Ｃａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ（TOYOBO）でウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体およびマウス抗ＧＦＡＰ抗体（Abcam）を１００倍希釈した溶液を滴下し、４℃で一晩静置した。反応終了後にスライドグラスを０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液で３回洗浄した。
【０１３０】
Ｃａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＡでＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（invitrogen）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（invitrogen）をそれぞれ２５０倍、４００倍希釈した溶液を滴下し、３７℃で１時間静置した。
【０１３１】
反応終了後にスライドグラスを０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液で３回洗浄し、スライドを乾燥させ、封入剤ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（Life technologies）を用いてカバーグラスを固定した。蛍光顕微鏡で観察した結果を図５に示す。
【０１３２】
図５において、矢印で示す細胞はＳＩＴＨ−１タンパク質の発現が見られるアストロサイトである。図５より、抗ＳＩＴＨ−１抗体と抗ＧＦＡＰ抗体の両方で染色される細胞はＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスの嗅上皮細胞でのみ観察された。すなわち、ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖの鼻腔投与により、マウスの嗅上皮細胞でＳＩＴＨ−１タンパク質が発現することを確認できた。
【０１３３】
（２．５）  ＳＩＴＨ−１発現アデノウイルスを鼻腔投与したマウスのストレス脆弱性試験
ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖを鼻腔投与することにより、マウスがストレスに対して過敏になり脆弱性が増す可能性を検討するために、ストレス脆弱性の検討を行った。
【０１３４】
８週齢のマウスを単離飼育し、ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖを投与する３日前から、飲料水として、水と１％スクロース溶液を与え、２種類の飲料の飲水割合を平衡化させた。３日後にＳＩＴＨ−１／Ａｄｖを鼻腔投与し、半数のマウスのケージを２０度に傾けて飼育した。２４時間毎に飲水量を記録した。
【０１３５】
ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与後７日目において、水平の飼育ケージで単離飼育したマウス（ｎｏｒｍａｌ；ｎ＝２０）と２０度に傾けたケージで単離飼育したマウス（ｓｌａｎｔ；ｎ＝２０）の１％スクロース溶液の飲水割合（１％スクロース溶液の飲水量／全飲水量（水の飲水量＋１％スクロース溶液の飲水量））を図６に示した。統計学的有意（*は、Ｐ＜０．０５を示し、**は、Ｐ＜０．０１を示し、***は、Ｐ＜０．００１を示す）は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−ｔｅｓｔを用いて算出した。
【０１３６】
図６より、ケージを傾けるマイルドストレスの付与によりＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスのスクロース嗜好性は低下していた。従って、ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスはマイルドストレスに対して過敏になり、うつ病患者で観察される「喜びの喪失」行動を示すことから、嗅上皮アストロサイトにおけるＳＩＴＨ−１タンパク質の発現はストレス脆弱性を引き起こすと考えられる。
【０１３７】
（３）  ＨＨＶ−６感染阻害剤によるＳＩＴＨ−１発現の抑制
ＨＨＶ−６感染阻害剤によって、ＨＨＶ−６宿主細胞におけるＳＩＴＨ−１発現が抑制されるかどうかを検証した。
【０１３８】
（３．１）  ＨＨＶ−６中和抗体によるＳＩＴＨ−１の発現抑制
ＨＨＶ−６感染阻害剤としてＨＨＶ−６の中和抗体を用いて、実験を行った。中和抗体として抗ＨＨＶ−６Ｂ  ｐ９８（ｇＨ）モノクローナル抗体を使用した。また、健常人血清においても抗ＨＨＶ−６抗体が含まれていることから、１０倍の希釈系列を作成して実験に使用した。
【０１３９】
健常人血清を５６℃で３０分間置いた（非働化）。ＨＨＶ−６  ＨＳＴ株ウイルス液（２．９×１０６ｆｆｕ／ｍｌ）と、非働化した健常人血清（希釈なし、培地（１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）にて１０倍、１００倍希釈）又は抗ＨＨＶ−６Ｂ  ｐ９８（ｇＨ）モノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ：ＯＨＶ−３）（培地にて１０倍希釈）、及び対照として培地のみを同量混合し、３７℃で１時間反応させた。
【０１４０】
次に、処理したウイルス液をＵ３７３アストロサイトーマ細胞に遠心法で細胞１個に対するウイルス数（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ＭＯＩ）３で感染させ、ＣＯ２インキュベーターにて、３７℃で４８時間培養した。得られた感染細胞からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Qiagen）を用いて、標準プロトコールに従い、ＲＮＡを精製した。さらに、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Takara Bio）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。
【０１４１】
最後にＳＩＴＨ−１、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現量をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Life Technologies）を用いて測定した。測定は、下記の条件で２回行った。リアルタイムＰＣＲ条件：Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（Perfect Real Time）（Takara Bio Inc.）  １２．５μｌ、ＰＣＲフォワードプライマー（１００μＭ）  ０．２２５μｌ、ＰＣＲリバースプライマー（１００μＭ）  ０．２２５μｌ、ＴａｑＭａｎプローブ（１０μＭ）  ０．６２５μｌ、Ｒｏｘ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｄｙｅ  ０．５μｌ、ｃＤＮＡ  ２μｌ、ＰＣＲ等級水  ８．９２５μｌの計２５μｌ。初期ステップが、９５℃で３０秒、次に、９５℃で５秒、６０℃で３１秒を４５サイクル。
【０１４２】
プローブ及びプライマーの配列は下記の通りである：
ＳＩＴＨ−１フォワードプライマー：配列番号４、
ＳＩＴＨ−１リバースプライマー：配列番号５、
ＳＩＴＨ−１プローブ：配列番号６（５’末端にＦＡＭ配列、および３’末端にＴＡＭＲＡ配列が付加されている）、
ＧＡＰＤＨフォワードプライマー：配列番号７、
ＧＡＰＤＨリバースプライマー：配列番号８、および
ＧＡＰＤＨプローブ：配列番号９（５’末端にＦＡＭ配列、および３’末端にＴＡＭＲＡ配列が付加されている）。
【０１４３】
なお、データの解析は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．４（Applied Biosystems）を用いた。得られた結果を図７に示した。
【０１４４】
その結果、健常人血清については希釈するほどＳＩＴＨ−１発現量が増加した（図７Ａ）ことから、健常人血清に含まれる抗ＨＨＶ−６抗体によりＨＨＶ−６感染が妨げられ、ＳＩＴＨ−１の発現が抑制されたと考えられる。また、ＨＨＶ−６を感染前に血清ならびに抗ＨＨＶ−６Ｂ  ｐ９８（ｇＨ）モノクローナル抗体と反応させることで、Ｕ３７３細胞でのＳＩＴＨ−１の発現が抑制された（図７Ｂ）。
【０１４５】
以上から、抗ＨＨＶ−６抗体を増加させることにより、ＳＩＴＨ−１の発現を抑制することが示された。
【０１４６】
（３．２）  ヘパリン、抗ヘパラン硫酸ペプチドによるＳＩＴＨ−１の発現抑制
ＨＨＶ−６感染阻害剤としてヘパリン及び抗ヘパラン硫酸ペプチドを用いて、実験を行った。
【０１４７】
Ｕ３７３アストロサイトーマ細胞をトリプシン−ＥＤＴＡを用いて剥離し、培地（１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）を加えて、１×１０５細胞／ｍＬとした。次にＵ３７３細胞とノボ・ヘパリン（持田製薬）１０単位／ｍＬ又はａｎｔｉ−３−ＯＳ  Ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ（ＨＳ）  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ  ｓａｌｔ（Sigma-Aldrich）０．１ｍＭ、及び対照として培地のみとを４℃で１時間反応させた。培地にて、得られた細胞を３回洗浄した。そしてＨＨＶ−６  ＨＳＴ株ウイルス液（２．９×１０６ｆｆｕ／ｍｌ）を洗浄したＵ３７３細胞に遠心法にて、ＭＯＩ３で感染させた。ＣＯ２インキュベーターにて、３７℃で４８時間培養した。
【０１４８】
得られた感染細胞からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Qiagen）を用いて、標準プロトコールに従い、ＲＮＡを精製した。さらに、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Takara Bio）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。最後にＳＩＴＨ−１、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現量を上記３．１と同様の方法で測定した。得られた結果を図８に示す。
【０１４９】
ヘパリン、抗ヘパラン硫酸ペプチドのいずれを用いた場合も、ＨＨＶ−６感染前にＵ３７３細胞と反応させることで、Ｕ３７３細胞でのＳＩＴＨ−１の発現が抑制された（図８Ａ、８Ｂ）。
【０１５０】
（４）  ＳＩＴＨ−１の構造および機能
（４．１）  ＳＩＴＨ−１の同定
ヒトヘルペスウイルス−６バリアントＢ（ＨＨＶ−６Ｂ）は、子供時代に多くの人々に感染し、突発性発疹を引き起こし、持続的感染または潜伏感染を確立する。ここでは、まず、脳特異的ＨＨＶ−６Ｂ潜伏タンパク質を同定することを行った。ＨＨＶ−６Ｂ潜伏タンパク質の同定は、下記の方法により行った。
【０１５１】
（４．１．１）  ＳＩＴＨ−１  ｍＲＮＡの単離方法
すなわち、我々は、マクロファージ初代培養細胞を含む、以前に公開されたＨＨＶ−６Ｂ潜伏感染システムを用いた（文献１および４）。再活性化刺激を用いて、促進ＨＨＶ−６Ｂ潜伏転写産物発現の中間状態に入るように誘導した、ＨＨＶ−６Ｂを潜伏感染させたマクロファージ（ＭΦ）の初代培養細胞からｍＲＮＡを単離した。これらの初代培養細胞から精製したｍＲＮＡを用いて、ランダムプライマー、センス転写産物の逆転写プライマーとしてＩＥ４ＲＢ（配列番号１０）、およびアンチセンス転写産物の逆転写プライマーとしてＩＥ２ＦＢ（配列番号１１）を用いて、逆転写反応を行った。
【０１５２】
続いて、プライマーＩＥ４ＲＢおよびＩＥ２ＦＢを用いたＰＣＲ、およびそれに続く内部プライマーＩＥ４ＲＡ（配列番号１２）およびＩＥ２ＦＡ（配列番号１３）を用いたダブルネスト（ｄｏｕｂｌｅ−ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲにより、逆転写産物（ｃＤＮＡ）を増幅した。Ｈ６ＬＴと逆方向にコードされたｍＲＮＡの存在を確認するために、ランダムプライマー、Ｈ６ＬＴと同じ方向にコードされたｍＲＮＡ（センス鎖）についての逆転写プライマーとしてＩＥ４ＲＢ、および逆方向にコードされたｍＲＮＡ（アンチセンス鎖）についての逆転写プライマーとしてＩＥ２ＦＢを用いて、逆転写反応を行った。
【０１５３】
以前に報告された方法（文献４および９）を用いて５’−ＲＡＣＥおよび３’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲを行った。約２０個のｄＡ残基をｃＤＮＡの５’末端に付加し、そこにアンカープライマーＲＬ−１（配列番号１４）をアニールした。
【０１５４】
ＰＣＲの最初の１０サイクルについて、Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Roche Diagnostics）ならびにプライマーＮ２（配列番号１５）およびαＲ１（配列番号１６）を、下記の条件下で使用した：９４℃で１分間の熱変性；５５℃で１分間のアニーリング；および７２℃で１分間の伸長反応。次のＰＣＲ増幅において、ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Toyobo）ならびにプライマーＮ１（配列番号１７）およびαＲ１を、下記の条件下で使用した：９４℃で１分間の熱変性；６５℃で３０秒間のアニーリング；および６８℃で１分間の伸長反応（１５サイクル）。ＰＣＲ増幅産物の塩基配列を決定した。
【０１５５】
続いて、ｃＤＮＡ−３’末端のポリＡテールに、アンカープライマーＲＬ−１をアニールした。ＰＣＲの最初の１０サイクルについて、Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Roche Diagnostics）ならびにプライマーＮ２およびαＦ１  （配列番号１８）を、下記の条件下で使用した：９４℃で１分間の熱変性；５５℃で１分間のアニーリング；および７２℃で１分間の伸長反応。次のＰＣＲ増幅において、ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Toyobo）ならびにプライマーＮ１（配列番号１９）およびαＦ１を、下記の条件下で使用した：９４℃で１分間の熱変性；６５℃で３０秒間のアニーリング；および６８℃で１分間の伸長反応（１５サイクル）。ＰＣＲ増幅産物の塩基配列を決定した（図１３Ｃ参照）。
【０１５６】
（４．１．２）  結果
上記の方法で得られた脳特異的ＨＨＶ−６Ｂ潜伏タンパク質を、ＳＩＴＨ−１（ＨＨＶ−６の中間段階の転写産物によりコードされた小タンパク質）−１と名付けた（図９Ａおよび図１３Ａ−Ｄ）。
【０１５７】
なお、図９Ａで示されたＩ型およびＩＩ型のＨＨＶ−６Ｂ潜伏転写産物（Ｈ６ＬＴ）は、以前に報告されていたものである（文献２および４）。図９Ａ中、細線は、イントロンを示し、濃い矢印は、エクソンを示し、白色のボックスは、オープンリーディングフレームを示す。
【０１５８】
図１３Ｂでは、ダブルネストＲＴ−ＰＣＲにより潜伏転写産物を増幅させた結果を示す。レーン１−３は、ＨＨＶ−６Ｂを潜伏感染させたマクロファージ（ＭΦ）の初代培養細胞からｍＲＮＡを単離した結果である。レーン４−６は、対照として、ＨＨＶ−６Ｂを増殖感染させたＭＴ−４細胞を、同じ方法を用いて試験した結果である。また、逆転写反応のために、以下に示すプライマーが用いられた：レーン１および４ではランダムプライマー、レーン２および５ではＩＥ４ＲＢ、レーン３および６ではＩＥ２ＦＢ。
【０１５９】
図１３Ｂより、潜伏感染させたＭΦについてのセンス鎖増幅産物が、遺伝子産物Ｈ６ＬＴから増幅された３５１ｂｐの産物であることが確認された。それはまた、潜伏感染に特異的であることも確認された（レーン２）。対照的に、９２５ｂｐの産物がアンチセンス鎖で増幅された（レーン３）。ＨＨＶ−６Ｂにより増殖感染させたＭＴ−４細胞のｍＲＮＡを用いると、３５１ｂｐの産物のみがセンス鎖から増幅された（レーン４−６）。さらに、ＨＨＶ−６Ｂ  ＤＮＡから、１２４２ｂｐの産物を増幅した（レーン７）。
【０１６０】
また、図１３Ｄより、５’−ＲＡＣＥおよび３’−ＲＡＣＥによって、１２８４ｂｐおよび５２７ｂｐの産物が増幅されたことが確認された。図１３Ｄにおいて、レーン１は、５’−ＲＡＣＥ産物を示し、レーン２は、３’−ＲＡＣＥ産物を示す。Ｍは、サイズマーカーを示す。
【０１６１】
（４．２）  ＳＩＴＨ−１の組織特異的発現
ＳＩＴＨ−１の発現態様を調べるために、マクロファージ（ＭΦ）細胞株ＴＨＰ−１およびＨＬ−６０、ならびにアストロサイト細胞株Ｕ３７３およびＡ１７２にＨＨＶ−６Ｂを感染させた。各細胞の培養およびウイルスの感染は、下記の方法で行った。
【０１６２】
（４．２．１）  ウイルスおよび細胞
マクロファージ細胞株ＴＨＰ−１およびＨＬ−６０を、１０％ウシ胎児血清を含有するＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地（ＲＰＭＩ  １６４０）で培養した。アストロサイトーマ細胞株Ｕ３７３およびＡ１７２を、１０％ウシ胎児血清を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ＨＨＶ−６ＢのＨＳＴ株を用いて、遠心分離により（３７℃、２０００ｇ、３０分）、１の感染の多重度（ＭＯＩ）でＴＨＰ−１およびＨＬ−６０細胞に、１０のＭＯＩでＵ３７３およびＡ１７２細胞に感染させた。
【０１６３】
（４．２．２）  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ＢｉｏＲｏｂｏｔ  ＥＺ１およびＥＺ１  ＲＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Qiagen）を用いて、上記ウイルス感染後７日目の細胞から全ＲＮＡを精製した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Takara Bio）を用いて、全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＴａｑＭａｎ  Ｐｒｏｂｅ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｘ）（Roche Diagnostics）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Life Technologies）を用いて、ｍＲＮＡ量を２回定量した。下記のプライマーおよびプローブを用いて、ＨＨＶ−６Ｂセンス転写産物（「Ｈ６ＬＴ」ともいう。）を測定した。ＳＩＴＨ−１およびＧＡＰＤＨについては、上記（３．１）のプライマーを使用した。
【０１６４】
Ｈ６Ｓフォワードプライマー：配列番号２０、
Ｈ６Ｓリバースプライマー：配列番号２１、および
Ｈ６Ｓプローブ：配列番号２２（５’末端にＦＡＭ配列、および３’末端にＴＡＭＲＡ配列が付加されている）。
【０１６５】
（４．２．３）  結果
図９Ｂおよび図１４より、ＨＨＶ−６Ｂは、アストロサイトおよびマクロファージの両方に、潜伏的に感染するが、ＳＩＴＨ−１の発現が選択的にアストロサイト細胞株（グリア細胞）で生じることを確認できた。また、これらの細胞内でウイルスの複製は観察されなかった。なお、図１４において、測定値は、ＳＩＴＨ−１とＧＡＰＤＨとの比率として示し、値は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。
【０１６６】
（４．３）  ＳＩＴＨ−１とカルシウムシグナル調節シクロフィリンリガンド（ＣＡＭＬ）との結合
ＳＩＴＨ−１と結合するタンパク質を探索するために、酵母ツーハイブリッドスクリーニングを行った。続いて、得られたＳＩＴＨ−１結合タンパク質について、哺乳類ツーハイブリッドアッセイにより、ＳＥＡＰ活性を測定した。
【０１６７】
（４．３．１）  酵母ツーハイブリッドスクリーニング
Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２（Clontech Laboratories）を用いて、標準的なプロトコールに従い、ＳＩＴＨ−１タンパク質と相互作用するタンパク質についてスクリーニングした。
【０１６８】
ＳＩＴＨ−１をｐＡＳ２−１ベクターにクローン化し、ＳＩＴＨ−１とＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＮＡ−ＢＤ）との融合タンパク質を作製した。ＰＣＲにより、ＳＩＴＨ−１  ｃＤＮＡからＳＩＴＨ−１を増幅した。
【０１６９】
ＳＩＴＨ−１との相互作用を調べるために、標準的なプロトコールに従って、選択培養培地（ヒスチジン、ロイシンおよびトリプトファン不含）を用いることにより、ヒト胎児脳のＭａｔｃｈｍａｋｅｒ  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｐＡＣＴ２（Clontech Laboratories）およびＰｒｅｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｍｏｕｓｅ  １７−ｄａｙ  Ｅｍｂｒｙｏ（Clontech Laboratories）に対して、ｐＡＳ２−１−ＳＩＴＨ−１をスクリーニングした。約３０個の酵母クローンが得られ、塩基配列を決定し、その多くがＣＡＭＬまたはＣＡＭＬ断片を含むものとして同定された。
【０１７０】
（４．３．２）  哺乳類ツーハイブリッドアッセイ
Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Takara Bio）を用いて、哺乳類細胞内でのＳＩＴＨ−１とＣＡＭＬとの結合を確認した。ＳＩＴＨ−１をｐＭ（ＧＡＬ４）プラスミドにクローン化した（ｐＭ−ＳＩＴＨ−１）。ヒトＣＡＭＬおよびマウスＣＡＭＬをｐＶＰ−１６プラスミドにクローン化した（ｐＶＰ１６−ＨｓＣＡＭＬ、ｐＶＰ１６−ＭｍＣＡＭＬ）ＰＣＲにより、ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６−ＣＡＭＬプラスミド（Invitrogen）からヒトＣＡＭＬを増幅した。ＰＣＲにより、マウス胎児脳ｃＤＮＡからマウスＣＡＭＬを増幅した。２９３Ｔ細胞にｐＧ５ＳＥＡＰレポータープラスミド; ｐＭ−ＳＩＴＨ−１もしくはｐＭ（ＧＡＬ４）プラスミド; ｐＶＰ１６−ＨｓＣＡＭＬ、ｐＶＰ１６−ＭｍＣＡＭＬもしくはｐＶＰ１６プラスミド; および内部コントロールとしてのｐＭｅｔＬｕｃコントロールプラスミドを共導入した。
【０１７１】
Ｇｒｅａｔ  ＥｓｃＡＰｅ  ＳＥＡＰ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｅ  Ｋｉｔ（Takara Bio）を用いて、ＳＥＡＰ活性を測定した。Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Takara Bio）を用いて、分泌されたルシフェラーゼの活性を測定した。
【０１７２】
（４．３．３）  結果
図９Ｃより、ＳＩＴＨ−１は、ヒトおよびマウスの両方において、脳で高発現しているタンパク質であるＣＡＭＬに結合することを確認できた。なお、図９Ｃにおいて、***は、Ｐ＜０．０００５を示す。
【０１７３】
（４．４）  ＳＩＴＨ−１のＣＡＭＬ  ｍＲＮＡ発現への影響
ＳＩＴＨ−１がＣＡＭＬ  ｍＲＮＡの発現に影響を与えているかを調べるために、ＳＩＴＨ−１を発現させた細胞におけるＣＡＭＬ  ｍＲＮＡの発現状態を調べた。続いて、ＳＩＴＨ−１を発現させた細胞における細胞内カルシウム濃度を調べた。ＳＩＴＨ−１の細胞内での発現および発現量の測定（ｍＲＮＡおよびタンパク質）、ならびに細胞内カルシウム濃度の測定は、下記の方法で行った。
【０１７４】
（４．４．１）  構成的ＳＩＴＨ−１発現Ｕ３７３細胞の作製
標準的な方法に従って、Ｒｅｔｒｏ−Ｘ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Takara Bio）を用いて、ＳＩＴＨ−１発現組み換えレトロウイルスを調製した。レトロウイルスベクターｐＱＣＸＩＰにＳＩＴＨ−１をクローン化した（ｐＱＣ−ＳＩＴＨ−１−ＩＰ）。このベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）早期段階プロモーターの制御下で、ＳＩＴＨ−１、ＩＲＥＳおよびピューロマイシン耐性についての遺伝子を構成的に発現するように作製することができる。
【０１７５】
パッケージング細胞ＧＰ２−２９３およびリン酸カルシウム法を用いて、エンベロープベクターｐ１０Ａ１とｐＱＣ−ＳＩＴＨ−１−ＩＰまたはｐＱＣＸＩＰ（挿入なし）を共導入した。組み換えレトロウイルスをＧＰ２−２９３細胞内で調製し、導入の４８時間後にウイルス上清を回収した。Ｕ３７３−ＭＧアストロサイトーマ細胞に組み換えレトロウイルスを感染させた。感染後、細胞を１μｇ／ｍＬ  ピューロマイシン（Calbiochem）で処理し、構成的にＳＩＴＨ−１を発現するＵ３７３細胞（Ｕ３７３-ＳＩＴＨ−１）またはレトロウイルスベクターを感染させたＵ３７３細胞 （挿入なし; Ｕ３７３-Vector）を選択した。
【０１７６】
（４．４．２）  ＣＡＭＬ  ｍＲＮＡの測定
ＢｉｏＲｏｂｏｔ  ＥＺ１およびＥＺ１  ＲＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Qiagen）を用いて、Ｕ３７３-ＳＩＴＨ−１およびＵ３７３−Ｖｅｃｔｏｒ細胞から全ＲＮＡを精製した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Takara Bio）を用いて、全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（Takara Bio）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Life Technologies）を用いて、ヒトＣＡＭＬ  ｍＲＮＡを２回定量した。下記のプライマーを用いて測定を行った：
ＨｓＣＡＭＬフォワードプライマー：配列番号２３、および
ＨｓＣＡＭＬリバースプライマー：配列番号２４。
【０１７７】
（４．４．３）  抗体の作製
ＰＣＲにより増幅したＳＩＴＨ−１をｐＥＴ−４２ａ（＋）ＤＮＡプラスミドにクローン化した（ｐＥＴ４２−ＳＩＴＨ−１）。次いで、シャペロン―コンピテントｐＧ−ＴＦ２／ＢＬ２１細胞内でＧＳＴタグ化ＳＩＴＨ−１タンパク質を発現させた。ウサギに精製したＧＳＴタグ化ＳＩＴＨ−１タンパク質を投与し、抗ＳＩＴＨ−１ウサギポリクローナル抗体を作製した。
【０１７８】
（４．４．４）  免疫蛍光染色
Ｕ３７３-ＳＩＴＨ−１およびＵ３７３−Ｖｅｃｔｏｒ細胞を、冷アセトン／メタノールで１０分間固定した。固定した細胞を、３７℃で１時間、抗ＳＩＴＨ−１ウサギポリクローナル抗体および抗ＣＡＭＬヤギポリクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology）と反応させた。
【０１７９】
ＰＢＳでの洗浄後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４ロバ抗ウサギ二次抗体（Molecular Probes）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ロバ抗ヤギ二次抗体 （Molecular Probes）を加えて、３７℃で３０分間反応させた。次いで、ＰＢＳでの洗浄を繰り返した。サンプルをカバーグラスと共にスライド上に載せた後、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１顕微鏡およびＣＣＤカメラ（ＤＰ７０, Olympus）を用いて、同じ光学条件下でそれらを観察した。
【０１８０】
（４．４．５）  細胞内カルシウム濃度の測定
ＳＩＴＨ−１を発現するＵ３７３細胞［ＳＩＴＨ−１（＋）］またはＳＩＴＨ−１を発現しないＵ３７３細胞［ＳＩＴＨ−１（−）］を、グラススライド上で培養した。蛍光カルシウム試薬ｆｕｒａ−２  ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ（ｆｕｒａ−２ＡＭ, Molecular Probes）を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地に加えて、暗条件下で、３７℃で３０分間反応させ、細胞に試薬を取り込ませた。
【０１８１】
スライド上で細胞を洗浄し、続いて、カルシウムの有無条件下で、Ｈａｎｋｓ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）に浸した。ｃａｌｃｉｕｍ  ＡＴＰａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ（１００ｎＭ, Calbiochem）で細胞を刺激した。ＣＣＤカメラ（ＩＸ７１, ＤＰ７０, Olympus）およびＬｕｍｉｎａ  Ｖｉｓｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Mitani Corporation）を備えた顕微鏡の下で、３４０ｎｍおよび３８０ｎｍの励起波長でのイメージを得た。ＩｍａｇｅＪ（NIH）を用いて、６個の細胞の平均輝度を測定した。
【０１８２】
（４．４．６）  結果
図９Ｄおよび図１５より、ＳＩＴＨ−１は、ＣＡＭＬ  ｍＲＮＡの発現レベルを変えることなく、ＣＡＭＬタンパク質のアストロサイトへの蓄積を引き起こすことを確認できた。ＣＡＭＬタンパク質の発現は、ＳＩＴＨ−１を発現しないＵ３７３細胞（対照）で弱かったが、ＳＩＴＨ−１を発現するＵ３７３細胞で増加した（図９Ｄ）。ＳＩＴＨ−１はまた、神経毒性を生じ得るアストロサイトにおけるカルシウム流入の増加を促進することを確認できた（図９Ｅ）。すなわち、細胞外カルシウムが存在する場合に、ＴＧ刺激により、ＳＩＴＨ−１が細胞内へのカルシウム流入を促進する機能を有することが判明した。なお、図９Ｄにおいて、赤色は、ＳＩＴＨ−１を示し、緑色は、ＣＡＭＬを示す。スケールバーは、１００μｍである。図９Ｅでは、タプシガルギン（ＴＧ）を用いて、０時点で細胞を刺激した。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。また、図１５では、測定値は、ＨｓＣＡＭＬとＧＡＰＤＨとの比率として示し、値は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。
【０１８３】
（５）  抗ＳＩＴＨ−１抗体価、ストレス、および自殺企図の関連
（５．１）  ＨＨＶ−６Ｂと労働時間との関連
ＨＨＶ−６Ｂの再活性化が労働時間と関連しているか調べるため、２９人の健常なボランティアで試験した。具体的には、下記の方法により試験を行った。
【０１８４】
（５．１．１）  試験対象
ストレスと唾液中のＨＨＶ−６Ｂとの関係を調べるために、２９人の健常なボランティア（４２．６±１．８［平均±ｓ．ｅ．ｍ．］歳；１５人の女性および１４人の男性）を試験に登録した。株式会社総医研ホールディングスによる広告を用いて、健常なボランティアを募集した（文献５）。慢性的に薬剤もしくは補助ビタミンを摂取している参加者、または４０ｋｇ未満の体重である参加者は除外された。試験の１ヶ月以内に献血を受けた参加者、血液ヘモグロビンレベルが１２．０ｇ／ｄＬ未満の参加者、または睡眠時間が７時間未満の参加者はまた除外された。
【０１８５】
（５．１．２）  唾液サンプル
製造者のプロトコールに従って、ＢｉｏＲｏｂｏｔ  ＥＺ１  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎおよびＥＺ１  ｖｉｒｕｓ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ  ｖ２．０（Qiagen）を用いた自動単離により、４００μＬの唾液サンプルからウイルスＤＮＡを抽出した。９０μＬの溶出バッファーでＤＮＡを溶出した。
【０１８６】
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍを備えたリアルタイムＰＣＲにより、唾液サンプル中のＨＨＶ−６Ｂ  ＤＮＡのコピー数を定量した。２５μＬ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ; Takara Bio Inc., Otsu, Japan）、０．４５μＬ  ＰＣＲフォワードプライマー（１００μｍ）、０．４５μＬ  ＰＣＲリバースプライマー（１００μｍ）、１．２５μＬ  ＴａｑＭａｎ  ｐｒｏｂｅ（１０μＭ）、１μＬ  Ｒｏｘ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｄｙｅ、５  μＬ  ウイルスＤＮＡ、および１６．８５μＬ  ＰＣＲ等級水を含む全量５０μＬで２回の増幅を行った。下記のプライマーがリアルタイムＰＣＲのために使用された：
ＨＨＶ−６Ｂフォワードプライマー：配列番号２５、
ＨＨＶ−６Ｂリバースプライマー：配列番号２６、 および
ＨＨＶ−６Ｂプローブ：配列番号２７（５’末端にＦＡＭ配列、および３’末端にＴＡＭＲＡ配列が付加されている）。
【０１８７】
熱プロファイルは、９５℃で３０分間、その後、９５℃で５秒間および６０℃で３１秒間を５０サイクルであった。Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．４（Life Technologies）を用いて、データ解析を行った。
【０１８８】
（５．１．３）  結果
図１０Ａより、２９人の健常なボランティア（１５人の女性および１４人の男性）において、唾液（持続的ＨＨＶ−６Ｂの主要な保存場所）中のＨＨＶ−６Ｂ  ＤＮＡコピー数および１週間にわたって記録された労働時間が正の相関を示すことを確認できた。このことは、ストレスが持続的ＨＨＶ−６Ｂの再活性化を増大させることを示唆している。
【０１８９】
なお、図１０Ａにおいて、ρ = ０．４４であり、Ｐ＜０．０５である。また、スピアマンの順位相関係数により検定が行われた。
【０１９０】
（５．２）  ＳＩＴＨ−１  ＩｇＧ抗体
脳へのＨＨＶ−６Ｂ感染を血漿抗ＳＩＴＨ−１抗体試験により評価し得ることを証明するために、マウスにコントロールベクターまたはＳＩＴＨ−１を投与した後、末梢血における抗ＳＩＴＨ−１  ＩｇＧ抗体価を調べた。コントロールベクターまたはＳＩＴＨ−１の投与、および抗ＳＩＴＨ−１  ＩｇＧ抗体価の測定は、下記の方法で行った。
【０１９１】
（５．２．１）  マウスおよびＳＩＴＨ−１投与
妊娠したＣ５７ＢＬ／６ＣｒＳｌｃマウスをＳＬＣ  Ｊａｐａｎから購入した。マウスを、温度および湿度制御条件下、各々１２時間の明暗サイクル（９時に着灯）、食餌および水へのアクセス自由な条件で、動物室内の標準的なケージで維持した。誕生の日に、３０Ｇシリンジを用いて、新生児マウスの脳の右側頭葉にＡｄ−ＧＦＡＰ−ＳＩＴＨ１（ＳＩＴＨ１）またはＡｘｃｗｉｔ（ベクター）組み換えアデノウイルスを投与した。すべての動物実験は、動物実験規制に基づいて行われ、東京慈恵会医科大学の動物実験委員会により承認された。
【０１９２】
（５．２．２）  間接蛍光抗体（ＩＦＡ）アッセイ
標準的な分子生物学的な手法を用いて、ＳＩＴＨ−１をＣＭＶプロモーター（pＦＬＡＧ-ＳＩＴＨ−１−ＣＭＶ２）の制御下でpＦＬＡＧ−ＣＭＶ２（Sigma-Aldrich）にクローン化した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ（Invitrogen）を用いて、Ｌａｂ−Ｔｅｋ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｓｌｉｄｅｓ（Nunc）上で培養したＨＥＫ２９３Ｔ細胞にpＦＬＡＧ-ＳＩＴＨ−１−ＣＭＶ２を導入した。
【０１９３】
免疫反応エンハンサー溶液Ｃａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Toyobo）を用いて、血漿を１６０倍に希釈した。血漿をスライド上で、４℃で一晩反応させた。ＰＢＳ−０．０５％  ＴｗｅｅＮ２０で洗浄後、スライドを、３７℃で１時間、Ｃａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎで２００倍に希釈したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗ヒト二次抗体（Molecular Probes）と反応させた。ＰＢＳ−０．０５％  ＴｗｅｅＮ２０で洗浄後、カバーグラスをスライド上に載せた。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１顕微鏡およびＣＣＤカメラを用いて、すべてのサンプルを同じ条件下で観察した。
【０１９４】
（５．２．３）  結果
図１０Ｂより、ＳＩＴＨ−１がマウスアストロサイトで産生されるときに、血液中のＳＩＴＨ−１  ＩｇＧ抗体価が増大することを確認できた。このことは、これらの細胞が血液脳関門を構成しているとの示唆と一致している。
【０１９５】
なお、図１０Ｂにおいて、値は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．であり、ＲＬＵは、相対発光量を示す。
【０１９６】
（５．３）  抗ＳＩＴＨ−１抗体価と自殺企図との関連
続いて、抗ＳＩＴＨ−１抗体価と自殺企図との関連を調べるために、自殺企図により病院に収容された精神疾患を患う患者を集めた（図１７Ａ−Ｃ）。試験は、患者が病院に収容された日に（すなわち、患者が自殺企図を行った直後に）回収された血漿サンプルについて行われた。血漿中の抗ＳＩＴＨ−１抗体を検出するために、上記の間接蛍光抗体アッセイが使用された。
【０１９７】
（５．３．１）  対象
自殺企図と血漿抗ＳＩＴＨ−１抗体価との関係を調べるために、自殺を企図して失敗し、東京都立松沢病院で緊急治療を受けた６６人の患者（３１人の男性、３５人の女性）を試験に登録した（文献３）。
【０１９８】
ＤＳＭ−ＩＶ  １軸疾患のための構築された臨床インタビュー（ｃｌｉｎｉｃｉａｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ（ＳＣＩＤ−Ｉ, ＣＶ））を用いて、これらの対象を診断した。試験集団は、主要な抑うつ疾患を患う３３人の患者、双極性障害を患う１１人の患者、統合失調症を患う１１人の患者、および他の精神疾患を患う１１人の患者から構成された。精神衛生の相談歴のない４０人の健常なボランティア（１１人の男性、２９人の女性）を対照群とした。ＨＨＶ−６Ｂ再活性化に関連するストレス以外の要因として、薬剤性過敏症症候群や強度の免疫抑制が知られている。しかしながら、この試験での患者は、これらの状態を示す症状を全く有していなかった。
【０１９９】
（５．３．２）  結果
図１０ＣおよびＤより、対照群よりも自殺企図した集団において、抗ＳＩＴＨ−１抗体価が有意に高いことを示した。抗ＳＩＴＨ−１抗体は、６６人の自殺企図者のうち３８人（５７．６％）で陽性であることを確認できた。
【０２００】
なお、図１０Ｃにおいて、スケールバーは、１００μｍである。また、図１０Ｄにおいて、横線は、平均値を示し、**は、Ｐ＜０．０１を示す。
【０２０１】
また、自殺企図を予測するために、抗ＳＩＴＨ−１抗体価の感度および特異性を調べた結果を図２０に示す。図２０において、黒丸は感度を示し、白丸は特異性を示す。また、Ｘ軸は、抗ＳＩＴＨ−１抗体価を示す。抗ＳＩＴＨ−１抗体価の感度は、７０．０％の特異性で５７．６％であり（１０．１％カットオフ）、８２．５％の特異性で、３３．３％であった（１５．６％カットオフ）。
【０２０２】
（５．４）  対象における精神疾患と年齢との関連
続いて、対象の年齢と精神疾患の発症等との関連性を調べるために、下記の実験を行った。
【０２０３】
（５．４．１）  試験
（５．３．１）と同じ東京都立松沢病院で緊急治療を受けた６６人の患者（３１人の男性、３５人の女性）を自殺企図群、精神科受診歴のない４０人の健常者（１１人の男性、２９人の女性）を対照群として、精神疾患と年齢、発症年齢との関係を分析した。
【０２０４】
（５．４．２）  結果
対照群の年齢は、３８．８±２．１歳（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）であり、自殺企図群の年齢は、３８．７±１．８歳（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）であった（図１７Ａ）。したがって、２つの集団間で有意な差は観察されなかった（ｎ．ｓ．は、有意な差はなかったことを示す）。自殺企図群の疾患発症の平均年齢は、２６．９±１．７歳（± ｓ．ｅ．ｍ．）であり（図１７Ｂ）、自殺企図群のＳＢが開始された平均年齢は、３１．２ ± ２．１歳であった（図１７Ｃ）。
【０２０５】
（６）  アストロサイトにおけるＳＩＴＨ−１発現の影響
（６．１）  ＳＩＴＨ−１とストレス等との関連
ＨＨＶ−６Ｂのアストロサイトへの不稔感染または持続的な感染の間に産生され得る潜伏タンパク質ＳＩＴＨ−１の影響を調べるために、ＧＦＡＰプロモーターの制御下でＳＩＴＨ−１を発現するアデノウイルスベクターをマウス脳へ投与して、アストロサイト特異的にＳＩＴＨ−１を産生させる実験を行った。マウスへの投与は、上記と同様の方法により行った。
【０２０６】
（６．１．１）  免疫蛍光染色
３週齢のＳＩＴＨ−１発現マウスからの全脳の免疫染色のために、最初に4% PFAを用いて、組織を還流固定した。２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でスライスをブロック後、それらを、２５℃で１６時間、抗ＳＩＴＨ−１ウサギ抗体（１：１０００希釈）および抗ＧＦＡＰポリクローナルニワトリ抗体（Abcam；１：５００希釈）と反応させた。
【０２０７】
ＰＢＳでの洗浄後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４ロバ抗ウサギ二次抗体（１：４００希釈）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗ニワトリ二次抗体（Molecular Probes；１：４００希釈）を加えて、３７℃で３０分間反応させて、ＳＩＴＨ−１およびＧＦＡＰを検出した。次いで、ＰＢＳでの洗浄を繰り返した。サンプルをカバーグラスと共にスライド上に載せた後、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１顕微鏡およびＣＣＤカメラ（ＤＰ７０, Olympus）を用いて、それらを観察した。
【０２０８】
（６．１．２）  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ＳＩＴＨ−１を発現するアデノウイルスベクターをマウス脳へ投与した３週目と５週目の試料を用いて、リアルタイムＲＴ＝ＰＣＲを行った。ＢｉｏＲｏｂｏｔ  ＥＺ１およびＥＺ１  ＲＮＡ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Qiagen）を用いて、マウス全脳から全ＲＮＡを精製した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Takara Bio）を用いて、全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。
【０２０９】
ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＴａｑＭａｎ  Ｐｒｏｂｅ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｘ）（Roche Diagnostics）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ （Life Technologies）を用いて、ｍＲＮＡ量を２回定量した。下記のプライマーおよびプローブを用いて、ＣＲＨ、マウスＢＤＮＦ、およびβ−アクチン（ＡＣＴＢ）を測定した。ＳＩＴＨ−１については、上記（３）のプライマーを使用した。
【０２１０】
ＢＤＮＦフォワードプライマー：配列番号２８、
ＢＤＮＦリバースプライマー：配列番号２９、
ＢＤＮＦプローブ：配列番号３０（５’末端にＦＡＭ配列、および３’末端にＴＡＭＲＡ配列が付加されている）、
ＭｍＡＣＴＢフォワードプライマー：配列番号３１、
ＭｍＡＣＴＢリバースプライマー：配列番号３２、および
ＭｍＡＣＴＢプローブ：配列番号３３（５’末端にＦＡＭ配列、および３’末端にＴＡＭＲＡ配列が付加されている）。
【０２１１】
ＣＲＨフォワードプライマー：配列番号３４、
ＣＲＨリバースプライマー：配列番号３５、および
ＣＲＨプローブ：配列番号３６（５’末端にＦＡＭ配列、および３’末端にＴＡＭＲＡ配列が付加されている）。
【０２１２】
（６．１．３）  プレパルス阻害測定
ＳＲ−ＬＡＢ  ｓｔａｒｔｌｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ（San Diego Instruments）を用いて、ＰＰＩを測定した。試験セッションは、３２個のトライアルからなり、各トライアルは、１２０ｄＢの刺激と対をなすプレパルス音（０、７４、７８、８２または８６ｄＢ）からなる。
ＰＰＩの割合は、下記の通り計算した：
［（プレパルス無しのトライアルのＡＳＲ増幅）−（プレパルス有りのトライアルのＡＳＲ増幅）］/（プレパルス無しのトライアルのＡＳＲ増幅）×１００、
ここで、ＡＳＲは、聴覚驚愕反応である。
【０２１３】
（６．１．４）  尾懸垂試験
上記（２．２）に記載された方法と同様の方法で行った。
【０２１４】
（６．１．５）  歩行活性の測定
投与後（ｐ．ｉ．）５週目の回転輪活動を測定した。回転輪活動は、回転輪（幅５ｃｍ×直径２０ｃｍ）を備えたケージ（幅９ｃｍ×奥行２２ｃｍ×高さ９ｃｍ）内にマウスを個々に入れ、コンピューターシステム（CLEA Japan）を用いて、回転輪活動の量（１回転＝３カウント）を測定した。４８時間にわたる全活性、暗期での活性、および明期での活性を示す。
【０２１５】
（６．１．６）  結果
図１１は、ＳＩＴＨ−１とストレス等との関連を調べた結果を示す。図１１Ａにおいて、赤色は、ＳＩＴＨ−１を示し、緑色は、ＧＦＡＰを示す。また、スケールバーは、図１１Ａで１００μｍであり、図１１Ｂで１ｍｍである。図１１Ｄ−Ｌにおいて、白色カラム（Ｖｅｃｔｏｒ）は、対照アデノウイルスベクターを投与したときの結果を示し、黒色カラム（ＳＩＴＨ−１）は、ＳＩＴＨ−１保持アデノウイルスを投与したときの結果を示す。図１１Ｃ−Ｅ、Ｉ、Ｊは、ウイルスベクターの投与後（ｐ．ｉ．）３週目または５週目のマウス全脳におけるｍＲＮＡの発現を示した結果であり、β―アクチン（ＡＣＴＢ）との比率を示す。図１１Ｆ、Ｋは、対となるプレパルス（７４、７８、８２および８６ｄＢ）およびパルス（１２０ｄＢ）刺激を与えた際の３週目（Ｆ）または５週目（Ｋ）のプレパルス・インヒビションの割合を示す。図１１Ｇ、Ｌは、ウイルスベクターの投与後（ｐ．ｉ．）３週目（Ｇ）または５週目（Ｌ）の尾懸垂試験の結果を示す。０〜５分間、５〜１０分間、および０〜１０分間の時間ブロックにおける無動（秒単位で）の持続を示している。なお、図１１において、値は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。また、*は、Ｐ＜０．０５を示し、***は、Ｐ＜０．００５を示す。
【０２１６】
図１１ＡおよびＢより、投与後３週目でアストロサイトにＳＩＴＨ−１が発現していることを確認できた。このＳＩＴＨ−１の発現は、投与後（ｐ．ｉ．）５週目よりも３週目で、より大きいことを確認できた（図１１Ｃ）。
【０２１７】
また、図１１Ｄ−Ｇにより、投与後（ｐ．ｉ．）３週目で、ＣＲＨの増加、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の増加、音響驚愕反応のプレパルス抑制（ＰＰＩ）の低下、および尾懸垂試験（ＴＳＴ）における無動時間の短縮を確認できた。ここで示されたすべてのマーカーは、重度のストレス、不安、および過敏についてのものであった。
【０２１８】
さらに、図１１Ｈ、ＪおよびＬ、ならびに図２１より、投与後（ｐ．ｉ．）５週目で、回転輪活動およびＢＤＮＦ発現の減少、ならびにＴＳＴでの延長した無動状態を確認できた。ここで示されたすべてのマーカーは、抑うつについてものであった。図１１Ｉより、５週目で、ＣＲＨのレベルは、通常に戻った。
【０２１９】
これらのデータは、ＳＩＴＨ−１がその産生の早期段階において、増加したＣＲＨにより過敏および不安を誘導し、ＳＩＴＨ−１の産生が時間と共に減少するにつれて抑うつを生じたことを示す。
【０２２０】
（７）  ＳＩＴＨ−１への暴露および臨床症状
（７．１）  ＳＩＴＨ−１産生と自殺企図との関連
ＳＩＴＨ−１の産生は、動物モデルにおいて気分障害様の行動を生じたので、ＳＩＴＨ−１産生と自殺企図患者の症状との関係を調べた。ＳＩＴＨ−１産生の測定は、上記（５．３）と同様の方法で、抗ＳＩＴＨ−１抗体価を比較することにより行った。対象（自殺企図患者）についても、上記（５．３）と同様である。
【０２２１】
（７．１．１）結果
図１２Ａでは、様々な自殺企図の方法（飛び降り、薬物中毒、自傷行為、および自絞）との関連を調べた。図１２Ａより、高い抗ＳＩＴＨ−１抗体価により示されるように、高いレベルのＳＩＴＨ−１に最近曝された患者は飛び降り自殺を企図する傾向があった。したがって、このマーカーは、より重篤な自殺企図患者を識別できることが示唆される。この結果は、ＳＩＴＨ−１産生の早期段階における不安および過敏を示したマウスモデルでの結果と一致している。
【０２２２】
（７．２）  Ａｖｉｄｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ（ＡＩ）アッセイのための適当な尿素濃度の決定
ＡＩアッセイにおける適当な尿素濃度を決定するために、ＳＩＴＨ−１抗原に結合したビーズ（ＳＩＴＨ−１−ＴＭ２融合タンパク質）を作製した。続いて、ＳＩＴＨ−１−ＴＭ２融合タンパク質と血漿とを反応させた後、０、２、４、６、または８Ｍの尿素で洗浄したときの抗ＳＩＴＨ−１抗体価を測定した。
【０２２３】
（７．２．１）  ＳＩＴＨ−１タマビジン融合タンパク質およびＳＩＴＨ−１ビオチンの作製
抗原としてのＳＩＴＨ−１とアビジン様結合タンパク質タマビジン２（Ｅ．ｃｏｌｉで発現）との融合タンパク質を用いたビーズ―ＥＬＩＳＡ法によりＳＩＴＨ−１抗体を検出するために（文献８）、下記の構築体を作製した：
ｐＴｒｃ９９Ａプラスミド内でのＳＩＴＨ−１とタマビジン２との融合タンパク質（ｐＴｒｃ９９Ａ-ＳＩＴＨ−１−ＴＭ２）；ｐＥＴ１０４．１−ＤＥＳＴベクタープラスミドにＳＩＴＨ−１を挿入することにより作製されたＢｉｏＥａｓｅタグ化融合ＳＩＴＨ−１（ｐＥＴ１０４．１−ＳＩＴＨ−１）;およびタマビジン２（ｐＴｒｃ９９Ａ−ＴＭ２）。突然変異タマビジン２遺伝子（ＬＡＴＭ２）をｐＫＫ２３３−２プラスミドにクローン化した（ｐＫＫ２３３−２-ＬＡＴＭ２）。
【０２２４】
Takakura et alの方法に従って（文献８）、ｐＴｒｃ９９Ａ-ＳＩＴＨ−１−ＴＭ２、ｐＴｒｃ９９Ａ-ＳＩＴＨ−１-ビオチン、およびｐＴｒｃ９９Ａ−ＴＭ２プラスミドを用いて、ＳＩＴＨ−１−ＴＭ２融合タンパク質、ＳＩＴＨ−１-ビオチン融合タンパク質、またはＴＭ２タンパク質をＥ．ｃｏｌｉのＢＬ２１株に発現させた。
【０２２５】
Ｅ．ｃｏｌｉを、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｉｎｓｔａｎｔ  ＬＢ  ｍｉｄｕｍ（Novagen）中、１８℃で６４時間培養した。溶液を遠心分離することによりＥ．ｃｏｌｉペレットを回収し、それをＣｏｍｐｌｅｔｅ−０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）に懸濁し、超音波断片化にかけることにより、可溶性タンパク質を得た。遠心分離により、細胞片および不可溶性タンパク質を除去した。ＳＩＴＨ−１とタマビジンとの融合タンパク質（ＳＩＴＨ−１−ＴＭ２）、ＳＩＴＨ−１-ビオチン融合タンパク質（ＳＩＴＨ−１−ｂｉｏｔｉｎ）、およびタマビジンタンパク質（ＴＭ２）のためのライセートとして、上清を用いた。
【０２２６】
（７．２．２）  抗ＳＩＴＨ−１  ＩｇＧ抗体ＥＬＩＳＡ
血漿中の抗ＳＩＴＨ−１  ＩｇＧ抗体価の測定方法は、下記のとおりである。すなわち、１ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬ  ＥＺ−Ｌｉｎｋ  ＮＨＳ−ＰＥＧ１２−ｂｉｏｔｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Pierce）と１０ｍＬ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０  Ａｍｉｎｅ  ｂｅａｄｓ（Invitrogen）とを、室温で３０分間反応させることによりビオチン化磁気ビーズを作製した。ビオチン化磁気ビーズを０．１％  ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄し、続いて、２０ｍＬ  ０．０１％  ａｚｉｄｅ／１×ＰＢＳ（−）に懸濁した。タンパク質濃度が２ｍｇ／μＬになるように、ＳＩＴＨ−１−ＴＭ２ライセートまたはＴＭ２ライセートをビオチン化ビーズに加えて、室温で１時間、溶液を反応させた。ビーズをＴＢＳ／０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄し、続いて、ビオチン化のために使用した磁気ビーズ溶液の量と等量の２０．０１％  ｓｏｄｉｕｍ  ａｚｉｄｅ／１×ＰＢＳ（−）溶液に懸濁して、ＳＩＴＨ−１−ＴＭ２ビーズまたはＴＭ２ビーズを得た。ＳＩＴＨ−１−ＴＭ２ビーズ（５μＬ）を、２００μＬ希釈ヒト血漿（ＬＡＴＭ２ライセートで１：１０００に希釈）または２００μＬのマウス血漿（ＬＡＴＭ２ライセートで１：１００に希釈）と、室温で１時間反応させた。
【０２２７】
ＳＩＴＨ−１特異的高アビディティ抗体を測定するために、２００μＬの０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０−ＴＢＳまたは２００μＬの０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０中、０、２、４、６、または８Ｍの尿素−ＴＢＳでビーズを３回洗浄した。
【０２２８】
洗浄後、ビーズを、２００μＬ  ペルオキシダーゼ共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson ImmunoResearch Laboratories; ＬＡＴＭ２ライセートで１：１００００に希釈）と、室温で１時間反応させた。続いて、ビーズを０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳで３回洗浄した。上清を除去した後、各サンプルに５０μＬ  ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｆｅｍｔｏ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Pierce）を加え、ビーズを白色の９６ウェルプレートに移した。
【０２２９】
ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｆｅｍｔｏ  Ｌｕｍｉｎｏｌ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ（５０μＬ; Pierce）を加えて、ＴｒｉＳｔａｒ  ＬＢ  ９４１  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Berthold Technologies）を用いることにより、発光強度（ＲＬＵ）を、４１秒毎に４５回測定し、値を合計した。各アッセイのために、同じ標準血漿がアッセイされた。各サンプルの値は、標準血漿で標準化された。
【０２３０】
（７．２．３）結果
図１８より、対象サンプルは、抗ＳＩＴＨ−１抗体について陽性であることを確認できた。また、対象の血漿サンプル中の高アビディティ抗ＳＩＴＨ−１抗体は、２Ｍ尿素での洗浄後においても、抗原に結合したままであることを確認できた。
【０２３１】
（７．３）  抗ＳＩＴＨ−１抗体Ａｖｉｄｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ
抗体ＡＩは、抗原への過去の暴露または反復暴露で増加するので、ＳＩＴＨ−１産生の反復による影響を調べるために、抗ＳＩＴＨ−１抗体Ａｖｉｄｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ（ＡＩ）を調べた。
【０２３２】
（７．３．１）  抗ＳＩＴＨ−１  ＩｇＧ抗体ＥＬＩＳＡ
通常のＥＬＩＳＡ法は、特異性が低く、結合力が低い抗体を検出する可能性がある。
【０２３３】
そこで、ＳＩＴＨ−１特異的高アビディティ抗体を測定するために、上記（７．２．２）の洗浄工程のみを修正してアッセイを行った（その他の工程は、（７．２．２）と同様である。）。
【０２３４】
すなわち、２００μＬの０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０−ＴＢＳまたは２００μＬの０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０中、２Ｍ  尿素−ＴＢＳでビーズを３回洗浄した。４個のウェルの合計で、各サンプルを測定した：２個のウェルでは、洗浄溶液は、尿素を含んでおらず、他の２個のウェルでは、高結合力の抗ＳＩＴＨ−１抗体を測定するために、洗浄溶液は、２Ｍの尿素を含んでいた。
【０２３５】
（７．３．２）  抗ＳＩＴＨ−１抗体Ａｖｉｄｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘの測定
抗ＳＩＴＨ−１抗体ＡＩを計算するために、低アビディティの抗ＳＩＴＨ−１抗体を測定する必要がある。低アビディティの抗ＳＩＴＨ−１抗体を測定するために、上記と同じ方法（ただし、２Ｍ尿素による洗浄は行わない）を用いて、血漿抗ＳＩＴＨ−１  ＩｇＧ抗体価を測定した。
【０２３６】
ＳＩＴＨ−１特異的低アビディティ抗体の抗体価を決定するために、我々は、ＳＩＴＨ−１−ＴＭ２ビーズの代わりにＴＭ２ビーズ、ならびに３８人の患者および４７人の健常なボランティアからの血漿サンプルを用いて、血漿の非特異的反応を調べた。低結合力の抗ＳＩＴＨ−１抗体について陽性の血漿サンプルを用いて、ＡＩを下記の通り得た：
ＡＩ（％）＝（尿素を用いて洗浄されたときに測定された抗ＳＩＴＨ−１抗体価／尿素無しで洗浄されたときに測定された抗ＳＩＴＨ−１抗体価）。
【０２３７】
（７．３．３）  抗体吸着実験
血漿中の抗ＳＩＴＨ−１  ＩｇＧ抗体がＳＩＴＨ−１に特異的に結合することを確認するために、我々は、血漿中の抗ＳＩＴＨ−１抗体がＳＩＴＨ−１抗原を除去できるかについて調べた。ＳＩＴＨ−１-ビオチンライセートまたはＬＡＴＭ２ライセートを、室温で１時間、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ＨＰ  ＳｐｉｎＴｒａｐ（GE Healthcare）と反応させた（ＳＩＴＨ−１カラムまたはＬＡＴＭ２カラム）。カラムを遠心分離し、フロースルーを捨てた。続いて、２００μＬ血漿（ＬＡＴＭ２ライセートで１：８００に希釈）を、４℃で一晩、このカラムと反応させた。遠心分離後、フロースルーを回収した。
【０２３８】
続いて、このフロースルーを、最終血漿希釈率が１：２０００になるまで希釈した（ＬＡＴＭ２ライセートで１：２．５に希釈）。上記のＥＬＩＳＡ法に従って、血漿中の抗ＳＩＴＨ−１抗体価を測定した。血漿中の抗ＳＩＴＨ−１抗体価の比率として、結果を示す（ここで、抗ＳＩＴＨ−１抗体は、非吸着血漿中の抗ＳＩＴＨ−１抗体価に吸収された）。
【０２３９】
（７．３．４）  結果
図１６では、非吸着血漿［吸着（−）］と、抗原としてＳＩＴＨ−１-ビオチンを用いて抗体が吸着している血漿［吸着（＋）］について、抗ＳＩＴＨ−１抗体価を測定した。非吸着血漿についての値を１００％と規定し、ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ検定により評価した。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．であり、***は、Ｐ＜０．００５を示す。図１６より、使用された抗ＳＩＴＨ−１抗体は、ＳＩＴＨ−１に特異的な抗体であることを確認できた。
【０２４０】
図２２より、ＴＭ２タンパク質結合陰性対照ビーズを用いた患者および健常者（対照）からの非特異的抗体価は、１．１２±２．０５×１０８  ＲＬＵ（平均±２ＳＤ）であった。図２２において、横線は、平均を示し、ボックスは、± ２ＳＤを示す。この結果に基づき、３．１７×１０８  ＲＬＵ（平均＋２ＳＤ）またはそれ以上の測定値を有する血漿は、ＳＩＴＨ−１に特異的な抗体について陽性であると概算した。
【０２４１】
図１２Ｂ、図２２より、抗ＳＩＴＨ−１抗体ＡＩは、対照よりも自殺企図患者においてより高かった。
【０２４２】
（７．４）  自殺企図患者における抗ＳＩＴＨ−１抗体の間接蛍光抗体アッセイ
自殺企図患者におけるＳＩＴＨ−１タンパク質の発現状態を調べるために、間接蛍光抗体アッセイにより血漿中のＳＩＴＨ−１タンパク質を調べた。間接蛍光抗体アッセイは、上記（５．２．２）と同様の方法により行った。続いて、自殺企図患者および対照である健常者の人口統計学および抗体反応性の詳細（年齢、性別、抗ＳＩＴＨ−１抗体の存在、自己抗体の存在）を調べた。
【０２４３】
（７．４．１）  結果
図１９Ａより、対照である健常者に比して自殺企図患者では、より多くのＳＩＴＨ−１タンパク質が発現していることが確認された。一方、図１９Ｂより、対照４および対照５が自己抗体について陽性であることが示され、その結果、抗ＳＩＴＨ−１抗体の存在または非存在を決定することを困難にしていた。図１９Ｂにおいて、＋は陽性、±は弱い陽性、−は陰性、ＮＤは未決定をそれぞれ示す。スケールバーは、１００μｍである。なお、抗体が決定され得る血漿サンプルについての結果は、ＥＬＩＳＡによる抗体の測定のための結果と同様であった（図１０Ｄ）。
【０２４４】
（７．５）  異なる人種間に渡る、抗ＳＩＴＨ−１抗体価および抗ＳＩＴＨ−１  ＡＩの比較
ＨＨＶ−６Ｂが、米国、欧州および日本において子供時代に感染する主なウイルスバリアントであり、ＨＨＶ−６  バリアントＡ（ＨＨＶ−６Ａ）に感染することは稀である。しかしながら、ＨＨＶ−６Ａは、アフリカの集団において感染率が高いウイルスバリアントである。ＨＨＶ−６Ａは、ＳＩＴＨ−１をコードしていないが、ＳＩＴＨ−１と相同なタンパク質であるＵ９１をコードしており、ＨＨＶ−６Ａ増殖感染の中早期段階で産生される。ＳＩＴＨ−１およびＵ９１は、機能は異なるものの、約９０％のアミノ酸同一性を有し、両者に対する抗体は交差性があると考えられるため、ＨＨＶ−６Ａが潜伏感染している可能性のある被験者でのＳＩＴＨ−１定量におけるＵ９１の影響を調べた。４０人の健常なアフリカ系アメリカ人および３８人の白人からの商業的に利用可能な血清をKohjin Bioから入手した。また、自殺企図患者の対照として得た４０人の健常な日本人から得た血漿をコントロールとして使用した。
【０２４５】
（７．５．１）  結果
図２３（Ａ）より、日本人対照、アフリカ系アメリカ人および白人の間で年齢の差異は見られなかった。図２３（Ｂ）より、３者における抗ＳＩＴＨ−１抗体価に差はなかった。しかし、図２３（Ｃ）より、抗ＳＩＴＨ−１抗体ＡＩは、日本人や白人よりもアフリカ系アメリカ人においてより高かった。
【０２４６】
なお、図２３（Ｂ）および（Ｃ）において、横線は、平均値を示し、***は、Ｐ＜０．００１を示し、ｎ．ｓ．は、有意な差はなかったことを示す。図２３（Ｂ）および（Ｃ）は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−ｔｅｓｔによる検定を行っている。
【０２４７】
（７．６）  ＳＩＴＨ−１とベックうつ病特性尺度（ＢＤＩ）全スコアとの関連
自殺企図患者におけるＳＩＴＨ−１がＢＤＩ全スコアと関連しているかを調べるために、抗ＳＩＴＨ−１抗体Ａｖｉｄｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ（ＡＩ）とＢＤＩ全スコアを比較する実験を行った。上記と同様の方法により、抗ＳＩＴＨ−１抗体Ａｖｉｄｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘの測定を行った。
【０２４８】
（７．６．１）  結果
ＳＩＴＨ−１産生後に長く抑うつ状態を示したマウスモデルと一致して、ベック抑うつ評価尺度（ＢＤＩ）スコア（抑うつ重度の指標）は、抗ＳＩＴＨ−１  ＡＩと正に相関することを確認できた（図１２Ｃ）。
【０２４９】
（７．７）  種々の精神疾患における抗ＳＩＴＨ−１抗体ＡＩの比較
健常者（対照）と気分障害（ＭＤ）を患う患者、統合失調症または他の精神疾患（ＳＣＨ）を患う患者、および他の精神疾患（Ｏｔｈｅｒｓ）を患う患者における抗ＳＩＴＨ−１抗体ＡＩを比較するために実験を行った。上記と同様の方法により、抗ＳＩＴＨ−１抗体Ａｖｉｄｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘの測定を行った。
【０２５０】
（７．７．１）  結果
図１２Ｄより、抗ＳＩＴＨ−１抗体ＡＩは、自殺企図集団における精神医学的診断と関連して、健常者（対照）よりも気分障害を患う対象においてより高いことを確認できた。
【０２５１】
（７．８）  ＣＦＳと抗ＳＩＴＨ−１抗体との関係
大阪市立大学病院疲労クリニカルセンターでの最初の相談後に慢性疲労症候群（ＣＦＳ）と診断された３８人の対象（１１人の男性、２７人の女性）、および年齢が一致する対照として４７人の健常なボランティアを試験に登録した。米国疾病管理予防センターの診断基準（１９９４年に改訂）を用いて、ＣＦＳを診断した。大阪市立大学病院により開発されたＣｈａｌｄｅｒ疲労質問票１７および６４項目の疲労質問票（Ｃｈａｌｄｅｒ  Ｆａｔｉｇｕｅ  Ｓｃａｌｅ  １７  ａｎｄ  ａ  ６４−ｉｔｅｍ  ｆａｔｉｇｕｅ  ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）の日本語版を用いて、ＣＦＳ対象により経験された広範囲にわたる症状をスコアした（文献６）。この試験は、東京慈恵会医科大学の倫理委員会、東京都立松沢病院、東京都医学総合研究所、株式会社総医研ホールディングス、総医研クリニック、および大阪市立大学により承認された。各対象から、書面でのインフォームドコンセントを得た。
【０２５２】
（７．８．１）結果
図２４（Ａ）より、健常者集団とＣＦＳ患者群との間に年齢の有意差は見られなかった。ＨＨＶ−６とＣＦＳとの関係は、長年にわたる議論の対象であり、ＣＦＳを患う患者は、しばしばうつ病性障害を有していた。図２４（Ｂ）では、抗ＳＩＴＨ−１抗体ＡＩとＣＦＳの主症状である疲労との間に相関はないことが示された。患者の疲労度を定量するために、Ｃｈａｌｄｅｒ疲労質問票を用いた。ｎ．ｓ．は、有意な差はなかったことを示す。図２４Ｃ−Ｅでは、ＳＩＴＨ−１は、ＣＦＳに伴う抑うつ気分と関連があると思われるが、ＣＦＳ自体とは関連がないことが示された。なお、図２４Ｃ−Ｅにおいて、横線は、平均値を示し、*はＰ＜０．０５、**はＰ＜０．０１、***はＰ＜０．００５をそれぞれ示している。
【０２５３】
（７．９）  抗ＨＨＶ−６Ｂ抗体と抗ＳＩＴＨ−１抗体ＡＩとの関連
ＭＤ（気分障害）を患うと診断された対象と健常者（対照）における、抗ＨＨＶ−６Ｂ抗体価と抗ＳＩＴＨ−１抗体ＡＩとの関連を調べるために実験を行った。上記と同様の方法により、抗ＨＨＶ−６Ｂ抗体価および抗ＳＩＴＨ−１抗体Ａｖｉｄｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘの測定を行った。
【０２５４】
（７．９．１）  結果
図１２Ｅでは、ＭＤを患うと診断された患者と健常者（対照）における、抗ＨＨＶ−６Ｂ抗体および抗ＳＩＴＨ−１抗体ＡＩとの関係を示している。図１２Ｅにおいて、低ＡＩは、各集団の平均よりも低いＡＩを有する対象を示し、高ＡＩは、中央値よりも高いＡＩを有する対象を示す。また、横線は、中央値を示し、*は、Ｐ＜０．０５を示している。ｎ．ｓ．は、有意な差はなかったことを示す。ＭＤ群での抗ＳＩＴＨ−１抗体ＡＩ中央値は２６．５％、対照群での抗ＳＩＴＨ−１抗体ＡＩ中央値は１４．２％であった。
【０２５５】
図１２Ｅより、高い抗ＳＩＴＨ−１抗体ＡＩを有する気分障害を患う患者はまた、低い抗ＨＨＶ−６Ｂ抗体価を有することを確認できた。健常者群では高い抗ＳＩＴＨ−１抗体ＡＩを有する群と、低い抗ＨＨＶ−６Ｂ抗体価を有する群とで、抗ＨＨＶ−6抗体価に差はなかった。
【０２５６】
ここで、高い抗ＳＩＴＨ−１抗体ＡＩを有する患者において、ＨＨＶ−６Ｂはしばしば再活性化される可能性があるので、ＨＨＶ−６Ｂ抗体価は一般に高いことが予測される。したがって、これらの患者は、低い抗ＨＨＶ−６Ｂ免疫応答を示すと考えられる。
【０２５７】
（７．１０）  気分障害患者における抗ＳＩＴＨ−１抗体とＨＨＶ−６量との関係
うつ病と診断された患者における、抗ＳＩＴＨ−１抗体とＨＨＶ−６量との関係を調べるために実験を行った。上記と同様の方法により抗ＳＩＴＨ−１抗体価とＨＨＶ−６量の測定を行った。なお、東京慈恵会医科大学附属病院及び同柏病院を受診し、うつ病と診断された患者４０人（１７人の女性および２３人の男性）を対象とした。抗ＳＩＴＨ−１抗体陽性者は１９人、抗ＳＩＴＨ−１抗体陰性者は２１人であった。
【０２５８】
（７．１０．１）  結果
図２５より、抗ＳＩＴＨ−１抗体陽性のうつ病患者の検体中のＨＨＶ−６量は、抗ＳＩＴＨ−１抗体陰性のうつ病患者の検体中のＨＨＶ−６量と比べて、有意に多いことが確認された。なお*は、Ｐ＜０．０５を示す。
【０２５９】
この結果は、唾液中のＨＨＶ−６が嗅上皮でのＳＩＴＨ−１発現を介して、気分障害の発症を促進する効果が、うつ病などの気分障害の発症後も持続していることを示しており、唾液中のＨＨＶ−６を減少させることや、嗅上皮への感染を防止することで、うつ病などの気分障害の治療が可能であることを示している。
【０２６０】
（８）  その他
上記実施例において、統計学的解析が用いられる場合、特に記載がなければ、下記の方法により行われた。
【０２６１】
統計学的解析
２つの異なる集団を比較するために、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−ｔｅｓｔを非パラメーター検定として用い、ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ検定をパラメーター検定として用いた。２つの対応する集団を比較するために、ｐａｉｒｅｄ  ｔ検定をパラメーター検定として用いた。Ｐ＜０．０５を有意であるとした。変数間の相関を決定するために、スピアマンの順位相関係数を用いた。ＳＰＳＳ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １９（IBM）およびＰｒｉｓｍ５（GraphPad）を用いて、統計学的解析を行った。
【０２６２】
＜参考文献＞
〔文献１〕K. Kondo, T. Kondo, T. Okuno, M. Takahashi, K. Yamanishi, Latent human herpesvirus 6 infection of human monocytes/macrophages. J. Gen. Virol. 72, 1401 （1991）
〔文献２〕K. Kondo et al., Recognition of a novel stage of betaherpesvirus latency in human herpesvirus 6. J. Virol. 77, 2258 （2003）
〔文献３〕N. Hayashi et al., Psychiatric disorders and clinical correlates of suicidal patients admitted to a psychiatric hospital in Tokyo. BMC Psychiatry 10, 109 （2010）
〔文献４〕K. Kondo, K. Shimada, J. Sashihara, K. Tanaka-Taya, K. Yamanishi, Identification of human herpesvirus 6 latency-associated transcripts. J. Virol. 76, 4145 （2002）
〔文献５〕T. Sugino, T. Shirai, Y. Kajimoto, O. Kajimoto, L-ornithine supplementation attenuates physical fatigue in healthy volunteers by modulating lipid and amino acid metabolism. Nutr. Res. 28, 738 （2008）
〔文献６〕H. Koyama et al., Fatigue is a predictor for cardiovascular outcomes in patients undergoing hemodialysis. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 5, 659 （2010）
〔文献７〕W. Kamitani et al., Glial expression of Borna disease virus phosphoprotein induces behavioral and neurological abnormalities in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 8969 （2003）
〔文献８〕Y. Takakura et al., Tamavidins--novel avidin-like−ｂｉｏｔｉｎ-binding proteins from the Tamogitake mushroom. FEBS J. 276, 1383 （2009）
〔文献９〕K. Kondo, J. Xu, E. S. Mocarski, Human cytomegalovirus latent gene expression in granulocyte-macrophage progenitors in culture and in seropositive individuals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11137 （1996）
〔文献１０〕J.Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory（1989）
〔文献１１〕Harberts et al, PNAS vol. 108 No. 33, 13734-13739, 2011
〔文献１２〕Oltvai ZN, Milliman CL, Korsmeyer SJ. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death. Cell. 1993 Aug 27;74(4):609-19
〔文献１３〕Kosten et al. Neuropsychopharmacology, 2008 Jun; 33(7):1545-58
〔文献１４〕Huang et al. J Pharmacol Sci. 2007 May; 104(1):61-72
〔文献１５〕Murray et al. Eur J Pharmacol. 2007 Aug 13;569(1-2):41-7
〔文献１６〕Xu et al. Neuropsychopharmacology, 2003 Jan; 28(1):53-62
〔文献１７〕Malkesman et al. Molecular Psychiatry 17, 770-780, 2012
〔文献１８〕Nancy A Shanahan, Lady P Velez, Virginia L Masten,and Stephanie C Dulawa Essential role for orbitofrontal 5-HT1B receptors in OCD-like behavior and SRI response in mice Biol Psychiatry. 2011 Dec 1; 70(11): 1039-1048
【産業上の利用可能性】
【０２６３】
本発明により、従来技術よりも高い感度と特異度で被験者が気分障害か否かを診断することができるため、気分障害の治療及び／又は予防に有効な新たな方法を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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