(57)【要約】【課題】生体分子の搬送制御を行いつつも、合成開始点の制御も的確に実行する。【解決手段】この生体分子分析装置は、ナノポアを有する薄膜と、前記薄膜に接して配置され電解質溶液を含む液槽と、前記液槽に接する電極と、前記電極に接続される測定部と、前記測定部の測定結果に従い、前記電極に印加する電圧を制御する制御部とを備え、前記電解質溶液には、生体分子が導入され、前記生体分子の第１の端部には制御鎖、及び分子モータが接続され、前記制御鎖は、その上流においてプライマと結合され、その下流にスペーサを有することを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノポアを有する薄膜と、
前記薄膜に接して配置され電解質溶液を含む液槽と、
前記液槽に接する電極と、
前記電極に接続される測定部と、
前記測定部の測定結果に従い、前記電極に印加する電圧を制御する制御部と
を備え、
前記電解質溶液には、生体分子が導入され、
前記生体分子の第１の端部には制御鎖、及び分子モータが接続され、
前記制御鎖は、その上流においてプライマと結合され、その下流にスペーサを有する
ことを特徴とする生体分子分析装置。
【請求項２】
前記分子モータの寸法は、前記ナノポアの大きさよりも大きい、請求項１に記載の生体分子分析装置。
【請求項３】
前記生体分子は、前記生体分子の第２の端部に前記ナノポアに導入するための導入鎖を更に備え、
前記導入鎖は、少なくとも前記生体分子の側の端部が二本鎖構造であり、前記生体分子とは反対側の端部が一本鎖構造である、請求項１又は２に記載の生体分子分析装置。
【請求項４】
前記生体分子は、前記第１の端部において前記制御鎖及び第１の分子モータとしての前記分子モータと接続され、前記第１の端部とは別の第２の端部において前記第１の分子モータとは別の第２の分子モータと接続され、
前記第１の分子モータは、前記プライマと第１のスペーサとしての前記スペーサを介して配置され、
前記第２の分子モータは、前記生体分子と第２のスペーサを介して配置される、請求項１に記載の生体分子分析装置。
【請求項５】
前記第１の分子モータは、ポリメラーゼであり、
前記第２の分子モータは、ヘリカーゼである、請求項４記載の生体分子分析装置。
【請求項６】
前記生体分子の両端には更にストッパ分子が接続され、
前記ストッパ分子の寸法は、前記ナノポアの大きさよりも大きい、請求項１に記載の生体分子分析装置。
【請求項７】
前記液槽は、前記薄膜の第１の面側に位置する第１の液槽と、前記薄膜の第２の面側に位置する第２の液槽とを備え、
前記第２の液槽は隔壁により複数に分割され、
前記第１の液槽に設けられる第１の電極と、
前記第２の液槽の分割された液槽毎に設けられる第２の電極と、
を備える、請求項１に記載の生体分子分析装置。
【請求項８】
生体分子を分析する生体分子分析方法において、
上流においてプライマと結合され且つその下流にスペーサを有する制御鎖と、分子モータとを第１の端部に接続された生体分子を、ナノポアを有する薄膜に接して配置され電解質溶液を含む液槽に導入する工程と、
前記液槽に電圧を印加して前記生体分子を前記ナノポアに導入する工程と、
前記ナノポアに導入された前記生体分子において、前記プライマを前記分子モータに接触させる工程と、
前記プライマと前記分子モータの接触後の前記生体分子の合成反応により前記生体分子を前記ナノポアの内部において搬送する工程と、
前記搬送の間における前記ナノポアに流れる電流の変化を計測する工程と
を含む、生体分子分析方法。
【請求項９】
前記生体分子の第２の端部に前記ナノポアに導入するための導入鎖を接続する工程であって、前記導入鎖は、少なくとも前記生体分子の側の端部が二本鎖構造であり、前記生体分子とは反対側の端部が一本鎖構造である工程と、
前記導入鎖の前記一本鎖構造を前記ナノポアに導入させ、前記生体分子の二本鎖構造を引き剥がして一本鎖構造とする工程と
を更に備えた、請求項８に記載の生体分子分析方法。
【請求項１０】
前記生体分子は、前記第１の端部において前記制御鎖及び第１の分子モータとしての前記分子モータと接続され、第２の端部において前記第１の分子モータとは別の第２の分子モータと接続され、
前記第１の分子モータは、前記プライマと第１のスペーサとしての前記スペーサを介して配置され、
前記第２の分子モータは、前記生体分子と第２のスペーサを介して配置される、請求項８に記載の生体分子分析方法。
【請求項１１】
前記第２の分子モータにより、前記生体分子の相補鎖を解離させる工程を更に備え、
前記第１の分子モータは、前記第２の分子モータによる前記相補鎖の解離後の前記生体分子を、前記プライマに基づいて合成する、請求項１０に記載の生体分子分析方法。
【請求項１２】
前記第１の分子モータは、ポリメラーゼであり、
前記第２の分子モータは、ヘリカーゼである、請求項１０記載の生体分子分析方法。
【請求項１３】
前記生体分子の両端には更に第１のストッパ分子及び第２のストッパ分子が接続され、
前記第１及び第２のストッパ分子の寸法は、前記ナノポアの大きさよりも大きい、請求項８に記載の生体分子分析方法。
【請求項１４】
生体分子を分析する生体分子分析方法において、
二本鎖構造を有する生体分子の第１の端部に制御鎖を接続し、前記制御鎖の前記生体分子とは反対側の端部に導入鎖を接続する工程であって、前記制御鎖は、分子モータ、及び前記分子モータと前記生体分子との間にスペーサを備え、前記導入鎖は、二本鎖構造を有する工程と、
前記生体分子を、ナノポアを有する薄膜に接して配置され電解質溶液を含む液槽に導入する工程と、
前記液槽に電圧を印加して、前記導入鎖を前記ナノポアに導入して前記導入鎖の二本鎖構造を解離させる工程と、
前記導入鎖の二本鎖構造の解離後、前記生体分子の相補鎖を前記分子モータと接触させ、これにより前記生体分子の二本鎖構造の解離を開始させる工程と、
前記生体分子の解離反応により前記生体分子を前記ナノポアの内部において搬送する工程と、
前記搬送の間における前記ナノポアに流れる電流の変化を計測する工程と
を含む、生体分子分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子（生体ポリマ）の分析用装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
次世代ＤＮＡシーケンサの分野では、伸長反応や蛍光ラベルを行うことなく、生体分子（以下「ＤＮＡ」という。）の塩基配列を電気的に直接計測する方法が注目されている。具体的には、ナノポアＤＮＡシーケンシング方式の研究開発が活発に進められている。この方式は、試薬を用いることなくＤＮＡ鎖を直接計測し、塩基配列を決定する方式である。
【０００３】
このナノポアＤＮＡシーケンシング方式では、薄膜に形成された細孔（以下「ナノポア」という。）をＤＮＡ鎖が通過することで生じる封鎖電流を計測することにより、塩基配列を計測する。すなわち、ＤＮＡ鎖に含まれる個々の塩基種の違いにより封鎖電流が変化するので、封鎖電流量を計測することで塩基種を順次同定することができる。この方式では、鋳型ＤＮＡの酵素による増幅を行わず、蛍光体等の標識物も用いない。このため、高スループットで、低ランニングコストであり、且つ長塩基のＤＮＡ解読が可能となる。
【０００４】
ナノポアＤＮＡシーケンシング方式においてＤＮＡを分析する際に使用する生体分子分析用デバイスは、一般的に、電解質溶液が満たされている第１及び第２の液槽と、その第１及び第２の液槽を仕切る薄膜と、第１及び第２の液槽に設けられる第１及び第２の電極とを備える。生体分子分析用デバイスはアレイデバイスとして構成することもできる。アレイデバイスは、薄膜によって仕切られる液室の組を複数個備えるデバイスをいう。例えば第１の液槽を共通槽とし、第２の液槽を複数個の個別槽とする。この場合、共通槽と個別槽の各々に電極を配置する。
【０００５】
この構成において、第１の液槽と第２の液槽の間に電圧が印加され、且つナノポアにはナノポア径に応じたイオン電流が流れる。また、ナノポアには、印加した電圧に応じた電位勾配が形成される。生体分子を第１の液槽に導入すると、拡散及びこの発生した電位勾配に応じて、生体分子がナノポアを介し第２の液槽へ送られる。このとき、ナノポアを封鎖する、各核酸の封鎖率に応じて生体分子内の分析が実施される。なお、生体分子分析装置は、生体分子分析用デバイスに設けられた電極の間に流れるイオン電流（封鎖信号）を測定する測定部を有し、測定されたイオン電流（封鎖信号）の値に基づいて生体分子の配列情報を取得する。
【０００６】
ナノポアＤＮＡシーケンシング方式の課題の１つとして、ナノポアを通過するＤＮＡの搬送制御が挙げられる。ＤＮＡ鎖に含まれる個々の塩基種の違いを封鎖電流量で計測するには、計測時の電流ノイズ及びＤＮＡ分子の揺らぎの時定数から、ＤＮＡのナノポア通過速度を１塩基辺り１００μｓ以上にする必要があると考えられている。しかし、ＤＮＡのナノポア通過速度は通常１塩基当たり１μｓ以下と速く、各塩基由来の封鎖電流を十分に計測することが困難である。
【０００７】
搬送制御法の一つとして、ＤＮＡポリメラーゼが合成反応をする際や、ヘリカーゼが二本鎖ＤＮＡのうち一本鎖を解く際に鋳型となる一本鎖を送り制御する力を利用して、ナノポアを通過するＤＮＡの搬送制御を実現する方法がある（例えば、非特許文献１参照）。ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型となるＤＮＡに対して、プライマを結合し、一本鎖部をナノポアに通過させ、ポリメラーゼがプライマ末端に結合することで、合成反応が生じるため、ＤＮＡが電界で引っ張られる力に抗ってＤＮＡの搬送が実現される。この際、塩基種に応じたイオン電流信号を測定部において取得することが出来る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Gerald M Cherf et al.、Nat.Biotechnol. 2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
一方でこの搬送制御法では、合成開始点の制御を的確に行うことが求められる。ポリメラーゼは、一本鎖と二本鎖の境を探し出し合成を開始する。この場合、ナノポア近傍においてのみ合成を実現し、ナノポア近傍からは離れた電解質溶液（反応溶液）中では合成が起きないよう仕組みが必要となる。しかし、従来の装置では、ポリメラーゼによる合成が、ナノポアから離れた電解質溶液中で開始されてしまい、生体分子の分析を的確に行うことができないという問題があった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、本発明の生体分子分析装置は、ナノポアを有する薄膜と、前記薄膜に接して配置され電解質溶液を含む液槽と、前記液槽に接する電極と、前記電極に接続される測定部と、前記測定部の測定結果に従い、前記電極に印加する電圧を制御する制御部とを備え、前記電解質溶液には、生体分子が導入され、前記生体分子の第１の端部には制御鎖、及び分子モータが接続され、前記制御鎖は、その上流においてプライマと結合され、その下流にスペーサを有することを特徴とする。
また、本発明の生体分子分析方法は、生体分子を分析する生体分子分析方法において、上流においてプライマと結合され且つその下流にスペーサを有する制御鎖と、分子モータとを第１の端部に接続された生体分子を、ナノポアを有する薄膜に接して配置され電解質溶液を含む液槽に導入する工程と、前記液槽に電圧を印加して前記生体分子を前記ナノポアに導入する工程と、前記ナノポアに導入された前記生体分子において、前記プライマを前記分子モータに接触させる工程と、前記プライマと前記分子モータの接触後の前記生体分子の合成反応により前記生体分子を前記ナノポアの内部において搬送する工程と、前記搬送の間における前記ナノポアに流れる電流の変化を計測する工程とを含む。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、生体分子の搬送制御を行いつつも、合成開始点の制御も的確に実行することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】第１の実施の形態に係る生体分子分析装置の構成の概略を説明する概略図である。
【図２】スペーサ１１３の効果につき説明する概略図である。
【図３Ａ】制御鎖１１１及び分子モータ１１０の作用を説明する概念図である。
【図３Ｂ】、第１の実施の形態における生体分子１０９の計測の手順を示すフローチャートである。
【図４】スペーサ１１３の効果に関する実験の結果を示す。
【図５】分子モータ１１０の効果に関する実験のデータを示している。
【図６】鋳型となる生体分子としてアデニン（Ａ）及びシトシン（Ｃ）のみが一塩基ずつ繰り返し（例えば５０個ずつ）形成される生体分子（モデルサンプル配列）に対し封鎖電流計測を行った結果を示す。
【図７】生体分子分析装置７００の別の構成例を説明する概略図である。
【図８】生体分子計測装置１００及び７００による計測の手順を示すフローチャートである。
【図９Ａ】第２の実施の形態に係る生体分子計測装置における計測対象である生体分子１０９の構造を説明する概略図である。
【図９Ｂ】第２の実施の形態における生体分子１０９の計測の概要を説明する概略図である。
【図９Ｃ】第２の実施の形態における生体分子１０９の計測の概要を説明する概略図である。
【図１０Ａ】第３の実施の形態に係る生体分子計測装置における計測対象である生体分子１０９の構造を説明する概略図である。
【図１０Ｂ】第３の実施の形態における生体分子１０９の計測の概要を説明する概略図である。
【図１０Ｃ】第３実施の形態における生体分子１０９の計測の概要を説明する概略図である。
【図１０Ｄ】第３実施の形態における生体分子１０９の計測の概要を説明する概略図である。
【図１１Ａ】第４の実施の形態に係る生体分子計測装置における計測対象である生体分子１０９の構造を説明する概略図である。
【図１１Ｂ】第４実施の形態における生体分子１０９の計測の概要を説明する概略図である。
【図１１Ｃ】第４の実施の形態における生体分子１０９の計測の概要を説明する概略図である。
【図１２】第５実施の形態における生体分子１０９の計測の概要を説明する概略図である。
【図１３】第５実施の形態における生体分子１０９の計測における印加電圧及び信号の波形を示すタイミングチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、図面に基づいて、本発明の実施の形態を説明する。なお、添付の図面は、本発明の原理に則った具体的な実施例を示しているが、それらは本発明の理解のためのものであり、決して本発明を限定的に解釈するために用いられるものではない。
【００１４】
［第１の実施の形態］
図１に、第１の実施の形態に係る生体分子分析装置の構成の概略を説明する。この装置は、封鎖電流方式にてイオン電流を測定する生体分子分析用デバイスであり、ナノポア１０１が形成された薄膜１０２と、薄膜１０２を挟んで薄膜１０２と接するように配置され、その内部に電解質溶液１０３が満たされた一対の液槽１０４（第１の液槽１０４Ａ及び第２の液槽１０４Ｂ）と、第１の液槽１０４Ａ及び第２の液槽１０４Ｂの各々に接する一対の電極１０５（第１の電極１０５Ａ及び第２の電極１０５Ｂ）とを備える。測定時には、一対の電極１０５の間に電圧源１０７から所定の電圧が印加され、一対の電極１０５の間に電流が流れる。電極１０５の間に流れる電流の大きさは、電流計１０６により計測され、その計測値はコンピュータ１０８により分析される。
【００１５】
電解質溶液１０３には、例えばＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌが用いられる。後述する分子モータを導入しない第２の液槽１０４Ｂ中の溶液には、生体分子の自己相補鎖形成抑制のために４Ｍ以上のＵｒｅａや、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＮａＯＨを混在することも可能である。また、生体分子の安定化のため、緩衝剤を混在させることも可能である。緩衝剤としては、ＴｒｉｓやＥＤＴＡやＰＢＳなどが用いられる。第１の電極１０５Ａ及び第２の電極１０５Ｂは、例えばＡｇ、ＡｇＣｌ、Ｐｔを材料として構成され得る。
【００１６】
電解質溶液１０３の内部には、測定対象としての生体分子１０９（ＤＮＡ鎖等）が導入される。生体分子１０９は、その一端に、例えばポリメラーゼからなる分子モータ１１０と、制御鎖１１１とを備えている。更に、制御鎖１１１は、分子モータ１１０から遠い側の一端においてプライマ１１２と結合される一方、分子モータ１１０に近い側の一端において、スペーサ１１３を有している。このスペーサ１１３の存在により、プライマ１１２は、分子モータ１１０とは接触しておらず、生体分子１０９がナノポア１０１中に到達するまでは合成反応は進行しない。分子モータ１１０がナノポア１０１に到達し、これにより制御鎖１１１に変形等が生じ、プライマ１１２が分子モータ１１０と接触することにより、初めて合成反応が開始される。このため、上記の構造により、分子モータ１１０の合成開始タイミングを制御することができ、測定歩留まりを向上させることが可能となる。この点は、後で詳しく説明する。
【００１７】
なお、図１に例示した装置は、１つの薄膜１０２が１つのナノポア１０１のみを有しているが、これはあくまでも一例であり、薄膜１０２に複数個のナノポア１０１を形成し、複数個のナノポア１０１の各々の領域を隔壁で分離して構成されるアレイデバイスとすることも可能である。アレイデバイスにおいては、第１の液槽を共通槽とし、第２の液槽を複数個の個別槽とすることができる。この場合、共通槽と個別槽のそれぞれに電極を配置することができる。
【００１８】
図１の生体分子分析装置は、電極の間に流れるイオン電流（封鎖信号）を測定する測定部、及びその測定結果に基づいて第１の電極１０５Ａ、第２の電極１０５Ｂへの印加電圧を制御する制御部としてのコンピュータ１０８を備える。コンピュータ１０８は、測定されたイオン電流（封鎖信号）の値に基づいて生体分子１０９の配列情報を取得する。一方で、ナノポア１０１内に電極を設けることで、トンネル電流を取得すること、又はトランジスタ特性変化を検出することでも生体分子１０９の情報を得ることが可能である。
【００１９】
ここで、測定対象である生体分子１０９と、制御鎖１１１、プライマ１１２、及びスペーサ１１３に関し、更に詳しく説明する。
【００２０】
この図１の装置において、第１の電極１０５Ａと第２の電極１０５Ｂの間に電圧を印加すると、ナノポア１０１が形成された薄膜１０２の両面の間に電位差が生じ、上側の液槽１０４Ａに溶解している生体分子１０９が、下側に位置する液槽１０４Ｂの方向に泳動される。電流計１０６は、電圧の印加によって電極間に流れる電流を増幅するアンプとＡＤＣ（Analog to Digital Converter）を有している（図示せず）。ＡＤＣの出力である検出値がコンピュータ１０８に出力される。コンピュータ１０８は、検出された電流値を収集し記録する。
【００２１】
生体分子１０９に結合させる制御鎖１１１は、別途提供され、サンプル調整の前処理を行った上で、液槽１０４Ａに導入される。液槽１０４Ａの電解質には、分子モータ１１０の駆動に適したバッファを共存させる。バッファ中には、用いた分子モータに適したバッファを利用し、一般には（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどを混在させる。
【００２２】
生体分子分析装置では、生体分子がナノポアを通過する際に搬送制御を行う必要がある。この第１の実施の形態の装置での搬送制御は主に分子モータ１１０により行われる。分子モータ１１０による搬送制御はナノポア１０１の近傍でのみ開始される必要がある。発明者による鋭意検討の結果、読取り対象である生体分子１０９に対し、制御鎖１１１を結合し、更に制御鎖１１１において分子モータ１１０側においてスペーサ１１３を設けることによって、ナノポア１０１近傍に生体分子１０９が到達した場合にのみ分子モータ１１０による搬送制御を開始することが可能となることが見出された。
【００２３】
この場合、制御鎖１１１は、以下の（ａ）〜（ｄ）を満たすことが好適である。
（ａ）生体分子１０９の上流（測定対象の生体分子とは分子モータ１１０を挟んで反対側）に制御鎖１１１が存在する。
（ｂ）制御鎖１１１の上流（分子モータ１１０からは遠い側）にはプライマ１１２が結合している。すなわち、制御鎖１１１の遠い側は、プライマ結合サイトとされている。
（ｃ）制御鎖１１１の下流にはスペーサ１１３が存在する。
（ｄ）スペーサ１１３の長さは、一例として２ｍｅｒ以上とすることができる。
【００２４】
電解質溶液中１０３において、ナノポア１０１の上流側及び下流側に第１の電極１０５Ａ、第２の電極１０５Ｂを介して電圧が電圧源１０７から印加されると、ナノポア１０１の近傍において電界が発生し、その力により生体分子１０９がナノポア１０１に導入され、通過する。一方で、分子モータ１１０の寸法Ｄｍはナノポア１０１の直径Ｄｎよりも大きいため、分子モータ１１０はナノポア１０１を通過することができない。その際、ナノポア１０１近傍に滞在する分子モータ１１０に対して制御鎖１１１中のプライマ１１２が近づくことで、合成反応が開始される。
【００２５】
その結果、分子モータ１１０が相補鎖を伸長する際の力により生体分子１０９がナノポア１０１から上流側（第１の電極１０５Ａ側）に引き上げられ、その際に取得される信号変化から、核酸から構成される生体分子１０９の分析が行われる。このような分析の結果は、試験、診断、治療、創薬、基礎研究などの分野に有用である。実際に、上記の通りに用意した生体分子１０９を、ナノポア１０１のない電解質溶液中で合成反応をさせた際には合成反応が生じず、ナノポア１０１を有する薄膜１０２を用いた電流計測を行ったところ、分子搬送由来の生体分子の通過信号が確認された。
【００２６】
以下、上記の制御鎖１１１の構成が合成開始制御に寄与することを具体的に説明する。
図１の装置において、電圧の印加開始当初は、ナノポア１０１に生体分子１０９が到達していないため、ナノポア１０１の直径Ｄｎに応じた電流が電流計１０６において計測される。その後、生体分子１０９が液槽１０４Ａに導入され、電界によりナノポア１０１の近傍に達する。
【００２７】
生体分子１０９に結合する制御鎖１１１中にスペーサ１１３が存在しない場合の不具合につき、図２を参照して説明する。図２に示すように、スペーサ１１３が存在せず、プライマ１１２が分子モータ１１０に接触している場合、分子モータ１１０は生体分子１０９がナノポア１０１に導入される前にプライマ１１２から合成反応（伸長反応）を開始してしまう。生体分子１０９がナノポア１０１に導入される前に合成反応が完了してしまうと、生体分子１０９はナノポア１０１を通過することが出来ないか、あるいは、伸長反応が進行したことにより、ナノポア１０１を通過して本装置により計測が可能な生体分子１０９の長さ（解析長）が短くなってしまう。ナノポア方式は、他の方式に比べ生体分子１０９より大きな解析長さで計測が可能な点が長所であるが、上記のように伸長反応が進んでしまうと、その長所が失われてしまう。
【００２８】
これらの歩留まり低下要因を解消する方策の一つとして、ブロックオリゴマによる反応制御により解消する手段をとることが可能な場合もある（G.M. Cherf et. al.、Nat.biotechnol. (2012)）。しかし、プライマ及びブロックオリゴマの二種類の分子の利用は、両者が同時に結合することを必要とし、結合が確率過程で起こっている以上、歩留まり低下の要因の一つになる。全ての発生原因を解消するためには、予め合成反応がストップする機構が組み込まれており、複数の確率過程が存在しないことが必要である。
【００２９】
上記を解決する手段として、第１の実施の形態では、制御鎖１１１の上流側（分子モータ１１０から遠い側）にプライマ１１２を設けるとともに、下流側（分子モータ１１０に近い側）にスペーサ１１３を設ける。プライマ１１２の末端と分子モータ１１０とは、スペーサ１１３により隔離されている。これにより、分子モータ１１０がナノポア１０１に到達する前においては（図２の符号α、β）、合成反応は開始されない。生体分子１０９がナノポア１０１を通過し、その後分子モータ１１０がナノポア１０１に到達し、これにより分子モータ１１０とプライマ１１２の一端が接触したときに、初めて合成反応及び搬送制御を開始させることが出来る（図２の符号γ）。
【００３０】
この制御鎖１１１の動作、及び生体分子の分析方法につき、図３Ａ及び図３Ｂを参照して更に詳しく説明する。図３Ａは、制御鎖１１１及び分子モータ１１０の作用を説明する概念図であり、図３Ｂは、第１の実施の形態における生体分子１０９の計測の手順を示すフローチャートである。図３Ａに概略的に示すように、生体分子１０９は制御鎖１１１が結合した状態で電解質溶液１０３を含む液槽１０４Ａ中に導入される。電解質溶液１０３中には分子モータ１１０が溶解している。生体分子１０９と分子モータ１１０、及び制御鎖１１１は電解質溶液１０３中で結合する。なお、制御鎖１１１や分子モータ１１０を他の溶液中で生体分子１０９に結合させた後、液槽１０４Ａに導入させることも可能である。
【００３１】
制御鎖１１１は、上流においてプライマ１１２と結合され且つその下流にスペーサ１１３を有し、プライマ１１２と分子モータ１１０は、スペーサ１１３により隔離される。このように、プライマ１１２及びスペーサ１１３で構成される制御鎖１１１を有する生体分子１０９が電解質溶液１０３中に溶解している液槽１０４Ａ、１０４Ｂに対し、第１の電極１０５Ａ、第２の電極１０５Ｂを介して第１の電圧Ｖ１が印加される（図３ＢのステップＳ１）。これにより、分子モータ１１０が結合した生体分子１０９は、図３Ａの（ａ）に示すように、ナノポア１０１近傍に発生している電位勾配によってナノポア１０１へ導入される。
【００３２】
生体分子１０９のナノポア１０１への導入後は、両電極１０５Ａ、１０５Ｂ間の電圧を第２の電圧Ｖ２に切り替える（図３ＢのステップＳ２）。これにより、生体分子１０９は更に下流側に移動し、分子モータ１１０がナノポア１０１側に近づく。分子モータ１１０の寸法Ｄｍはナノポア１０１の直径Ｄｎよりも大きいため（Ｄｍ＞Ｄｎ）、分子モータ１１０がナノポア１０１の入口（液槽１０４Ａ側）に到達すると、ナノポア１０１を通過して出口側（液槽１０４Ｂ側）に進むことは出来ず、ナノポア１０１の入口に止まる。一方、負電荷を帯びている生体分子１０９はさらに下流方向に進み、制御鎖１１１はスペーサ１１３を中心に形状変化を起こす。すると、分子モータ１１０は、制御鎖１１１中のプライマ１１２の末端と接触し、結合する（図３Ａの（ｂ））。これにより、プライマ１１２の末端に結合した分子モータ１１０は、合成反応を開始する。
【００３３】
分子モータ１１０とプライマ１１２の結合（接触）後は、両電極１０５Ａ、１０５Ｂ間の電圧を第３の電圧Ｖ３に切り替え（図３ＢのステップＳ３）、これにより生体分子１０９の引き上げ（搬送）動作及びシーケンシングが開始される。分子モータ１１０による合成反応が開始されると、生体分子１０９がナノポア１０１を通過する力Ｆ２よりも、引き上げる力Ｆ１が強いため、生体分子１０９は電界方向とは逆向きに搬送される。この搬送の間において、生体分子１０９の特性に由来した信号（電流の変化）を電流計１０６及びコンピュータ１０８で検出すること（シーケンシング）が可能となる。
【００３４】
ここで、印加電圧に関して、生体分子１０９の導入の際に用いられる第１の電圧Ｖ１と、分子モータ１１０をプライマ１１２と結合させる際に印加する第２の電圧Ｖ２と、計測時の第３の電圧Ｖ３は全て同じでも良い。一方で、分子モータ１１０の種類に応じて結合力、引き上げ力が異なるため、異なる電圧を用いた方が所望の信号が検出できる場合もある。生体分子１０９の通過速度に寄与する力Ｆ２は、引き上げ力Ｆ１、電界に加え、ナノポア１０１の内壁での摩擦力によって決まる。その為、ナノポア１０１の寸法（直径、厚さ等）に応じても印加電圧Ｖ１〜Ｖ３を調整する必要がある。
【００３５】
第１の実施の形態では、一例として、分子モータ１１０としてポリメラーゼを使用し、生体分子１０９及びプライマ１１２として表１に示した配列のＤＮＡを使用する。「Ｚ」で示される位置にはｉＳｐＣ３をスペーサ１１３として配置することができる。
【００３６】
【表１】
2020031557.tif 000003
【００３７】
図４は、スペーサ１１３の効果に関する実験例を示している。
この実験では、バッファ溶液中に、制御鎖１１１が結合され且つスペーサ１１３を有する生体分子１０９を導入し、電気泳動によりその制御鎖結合生体分子の溶液内合成反応を確認した。更に分子モータ１１０として用いる分子としてポリメラーゼ、及び相補鎖を形成するｄＮＴＰもバッファ溶液中に導入した。また、比較対象（リファレンス）として、分子モータ１１０として用いるポリメラーゼ、及び相補鎖を形成するｄＮＴＰを導入しない場合における伸長反応も計測した。分子モータ１１０として用いる分子（ポリメラーゼ）は分子Ａ、分子Ｂの２種類を検討した。
【００３８】
図４中、「oligo  ＋」は、スペーサ１１３が存在する場合を示している。また、「polymerase  ＋」「「polymerase  -」」は、分子モータ１１０としてのポリメラーゼがバッファ溶液中に存在した状態での実験であるか（＋）、又はそうでないのか（−）を示している。「ｄNTP  ＋」「ｄNTP  -」は、相補鎖を形成するｄＮＴＰがバッファ溶液中に存在した状態での実験であるのか（＋）、又はそうでないのか（−）を示している。
【００３９】
また、塩の影響を確認するため、バッファ中に０．３ＭのＫＣｌを添加したバッファ溶液中での伸長反応結果も確認した。図４中、「0.3M KCl +」「0.3M KCl -」は、０．３ＭのＫＣｌがバッファ溶液中に添加されているか否かを示している。Ｂ１〜Ｅ１は分子Ａを用いた際の実験結果であり、Ｆ１〜Ａ２は分子Ｂを用いた際の実験結果である。
【００４０】
分子Ａ、Ｂとも、反応が可能なバッファ条件（Ｂ１、Ｆ１）で出現するバンドの位置と、伸長反応が不可能なバッファ条件（Ｃ１、Ｇ１）で出現するバンドの位置が同じであった。このことから、伸長反応可能なバッファ条件で、伸長反応が起きなかったことが分かる。またＤ１及びＨ１の結果から、両分子とも、０．３ＭＫＣｌ中での伸長反応も抑制されていることが分かった。以上から生体分子１０９に接続された制御鎖１１１においてスペーサ１１３が存在することで、バッファ溶液中での伸長反応が抑制されることが分かった。
【００４１】
図５は、分子モータ１１０及びスペーサ１１３を有する部分二本鎖ＤＮＡである生体分子１０９において、分子モータ１１０が部分二本鎖ＤＮＡに接触することで、伸長反応が開始され、生体分子１０９を搬送することが可能となるか否かを確認するための実験のデータを示している。この実験では、図４と同じ溶液条件を、ナノポア１０１を有する薄膜１０２で分離された液槽１０４Ａ、１０４Ｂ内のバッファ溶液に設定した。そして、そのバッファ溶液に、図４と同様の、分子モータ１１０（ＢＳＴポリメラーゼ）及びスペーサ１１３を有する制御鎖１１１に接続された生体分子１０９を溶解させ、封鎖電流計測を行なった。
【００４２】
封鎖電流計測では、生体分子１０９が存在しない状態で計測される電流値を基準（ポア電流）とし、生体分子１０９を封入した際に観測される電流の減少（ナノポア１０１の生体分子１０９による封鎖）をモニタし、分子の通過速度や状態を観測する。
【００４３】
生体分子１０９がナノポア１０１を通過し終わると、取得電流値は、基準であるポア電流に戻る。この封鎖時間から生体分子１０９のナノポア１０１の通過速度が計算されるとともに、封鎖量から生体分子の特性を解析することができる。封鎖電流計測で用いた印加電圧は、この実験では全て０．１Ｖに設定された。
【００４４】
分子モータ１１０を用いた実験では、予め鋳型となる生体分子１０９とプライマ１１２を結合させて部分二本鎖ＤＮＡを生成した後、分子モータ１１０との結合のため、１０分間３７℃においてバッファ溶液中でインキュベーションを行った。その後、分子モータ１１０と結合された部分二本鎖ＤＮＡを、計測溶液である０．３ＭのＫＣｌに混合させた。ＤＮＡ量は１０ｎＭになるように調整した。
【００４５】
図５（ａ）は、分子モータ１１０とは結合していない、プライマ１１２を結合させたのみの生体分子１０９を計測した場合の封鎖信号、及び、封鎖時間と封鎖量の散布図を示す。封鎖信号の波形ばらつきはあるものの、取得された信号の封鎖時間は１ｍｓ以下であり、生体分子１０９は非常に速い速度でナノポア１０１を通過していることが分かる。
【００４６】
次に、生体分子１０９が、ポリメラーゼからなる分子モータ１１０と結合された状態において、同様に封鎖信号を取得した結果を図５（ｂ）に示す。図５（ａ）の条件では確認されなかった長時間（〜数千ｍｓ）の封鎖信号が取得された。封鎖時間と封鎖量の散布図からも、封鎖時間１ｍｓ以上の信号が複数検出されていることが分かる（破線の円で示す）。この１ｍｓ以上の封鎖時間の信号は、分子モータ１１０がナノポア１０１に到達後、伸長反応が進行したことに基づくものと考えられる。
【００４７】
更に、ポリメラーゼからなる分子モータ１１０は生体分子１０９と結合しているが、計測溶液中に基質を入れなかった場合の封鎖信号取得結果を図５（ｃ）に示す。電流減少が長時間維持される現象が確認された。
電流の減少、即ちポアの閉塞が確認された後、電流値が自発的にポア電流に戻ることがなかった。図中三角印で示す時間にて、印加電圧の反転をおこなうと、ポア電流に戻る現象が確認された。しかし数秒の後に再び電流が減少する様子が確認され、前述の現象が再び繰り返されることとなった。この現象は図５（ｂ）では確認されなかった。
【００４８】
以上のことから以下のことが推察される。図５（ａ）では、図５Ａの左側に記載のように、鋳型となる生体分子１０９とプライマ１１２が結合したサンプルの通過現象を観察しており、ナノポア１０１ではプライマ１１２の鋳型からの引き剥がし（unzipping）が観察されていると推察される。
【００４９】
一方、図５（ｃ）では、前述の図４の電気泳動による溶液内合成反応を確認の結果からも、ポリメラーゼからなる分子モータ１１０による伸長反応が進まず、ナノポア１０１近傍で止まっている状態が観測されたものと推察される。
【００５０】
これに対して、図５（ｂ）では基質が溶液中に存在するため、ポリメラーゼからなる分子モータ１１０により、プライマ１１２からの伸長反応を行うことが出来るようになったため、ポリメラーゼによる搬送由来の封鎖現象が確認できるようになったと推察される。なお、図５（ｂ）で確認されなかった封鎖現象の封鎖時間を解析すると、平均１６００ｍｓであり、今回用いた鋳型の長さ５３ｎｔから換算すると３０ｍｓ／ｎｔの速度で通過したことになる。これはポリメラーゼによる搬送時間にほぼ等しい。
【００５１】
以上のことから、スペーサ１１３による溶液中での搬送停止、及びナノポア１０１近傍での生体分子１０９の搬送開始及び合成の開始が実現できたと考えられる。
【００５２】
図６に、鋳型となる生体分子としてアデニン（Ａ）及びシトシン（Ｃ）のみが一塩基ずつ繰り返し（例えば５０個ずつ）形成される生体分子（モデルサンプル配列）を用いて、図５と同様に封鎖電流計測を行った結果を示す。図６の上側のグラフは、封鎖電流の波形を示しており、下側のグラフは、２つの閾値電流に従って封鎖電流の波形を規格化した規格化波形である。
【００５３】
図６の上側のグラフに示すように、封鎖電流の波形を、２つの閾値電流（ＣＡＣＡＣ、ＡＣＡＣＡ）に従って規格化し、規格化波形のパルスの数をカウントすると、測定対象とされたモデルサンプル配列中のアデニン及びシトシンの数と同数のパルスが観測された。この図６の実験結果からも、測定された封鎖電流の信号は、スペーサ１１３の下流にある鋳型（生体分子１０９）の特性（塩基配列）を反映した信号であり、隣接する塩基が与える信号の差を、分解可能な速度で伸長反応が起きていると考えられる。
【００５４】
次に、スペーサ１１３の材料について検討する。制御鎖１１１中に含まれるスペーサ１１３の材料としては、以下のものを用いると良い。スペーサ１１３は塩基を含まない、直鎖状連結体である。スペーサ１１３の配置長はプライマ１１２の連結部から２塩基以上、即ち約０．６×２ｎｍ以上の長さを有することが条件である。適当なリンカーの例は当該分野で良く知られており（ＩＤＴホームページより（http://sg.idtdna.com/site/Catalog/Modifications/Category/6)、 Diehl et al.Nature Methods、2006、3(7):551-559参照）、限定されるものではないが、鎖中に配置でき、C3 Spcer、PC spacer、Spacer9、Spacer18、dSpacerを含むが、それに限定されない。上記以外にも、直鎖上炭素鎖、直鎖状アミノ酸、直鎖脂肪酸、直鎖状糖鎖などでもよい。
【００５５】
図７に、図１の生体分子分析装置とは異なる生体分子分析装置７００の構成例を示す。図１の装置と同一の構成要素については同一の符号を付しているので、重複する説明は省略する。図１の装置との相違点は、薄膜１０２Ｂが複数のナノポア１０１を有しており、薄膜１０２Ａの下の液槽１０４Ｂが隔壁（具体的には薄膜１０２Ｃの側壁）により複数の空間に分割されていることである。薄膜１０２Ａを固定する薄膜１０２Ｂ及び１０２Ｃにおいて、ナノポア１０１に対応する位置に貫通穴が設けられ、薄膜１０２Ｃの貫通穴の側壁により、複数の空間が形成されている。複数の空間の各々には、第２の電極１０５Ｂが設けられている。なお、液槽１０４Ａは、下側に位置する複数の空間に対する共通液槽として用いられる。複数の空間は隔壁により互いに絶縁されている。このため、各ナノポア１０１を流れる電流を独立に計測することができる。
【００５６】
薄膜１０２Ｂ及び１０２Ｃに設けられた貫通孔の各々において露出する薄膜１０２Ａは、電圧の印加によるナノポア１０１の形成の際に２個以上のナノポア１０１が形成され難い面積であり、かつ、強度上許容される面積であることが好適である。一例として、当該面積は、例えば１００〜５００ｎｍ程度とすることができる。また、薄膜１０２Ａの膜厚は、ＤＮＡの一塩基分解能を達成するため、一塩基相当の実効膜厚を有するナノポア１０１を形成可能な膜厚とするのが好適である。一例として、膜厚は７ｎｍ程度かそれ以下とするのが適当である。
【００５７】
液槽１０４Ａと液槽１０４Ｂは、図１の場合と同様に、電解質溶液１０３で満たされている。図７の場合、電解質溶液１０３の容量は、マイクロリットルオーダー又はミリリットルオーダーである。
【００５８】
電解質溶液１０３には、例えばＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌが用いられる。これらの溶液に対して、分子モータ１１０を導入しない液槽１０４Ｂには生体分子１０９の自己相補鎖形成抑制のために４Ｍ以上のＵｒｅａや、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＮａＯＨを混在させることも可能である。また、生体分子１０９の安定化のため、緩衝剤を混在させることも可能である。緩衝剤としては、ＴｒｉｓやＥＤＴＡやＰＢＳなどが用いられる。
【００５９】
以下では、前述した生体分子分析装置の作製方法について説明する。いわゆる封鎖電流方式で生体分子の分析に用いられる生体分子分析装置の基本的な構成自体は当技術分野で既知であり、その構成要素も当業者であれば容易に理解することができる。例えば、米国特許第５７９５７８２号、“ScientificReports 4、5000、 2014、Akahori、 et al.”、“Nanotechnology 25(27):275501、2014、Yanagi、 et al.”、“Scientific Reports、5、 14656、 2015、Goto、 et al.”、“Scientific Reports 5、16640、 2015”に具体的なデバイスが開示されている。
【００６０】
ナノポア１０１が形成される薄膜１０２は、中心に細孔を有するタンパク質が埋め込まれた両親媒性分子層からなる脂質二重層（バイオポア）であってもよいし、半導体微細加工技術で形成できる材質からなる薄膜（ソリッドポア）であってもよい。半導体微細加工技術で形成できる材質としては、例えば窒化ケイ素（ＳｉＮ）、酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、酸窒化ケイ素（ＳｉＯＮ）、酸化ハフニウム（ＨｆＯ２）、二硫化モリブデン（ＭｏＳ２）、グラフェンなどがある。薄膜の厚さは、１Å（オングストローム）〜２００ｎｍ、好ましくは１Å〜１００ｎｍ、より好ましくは１Å〜５０ｎｍ、例として約５ｎｍである。
【００６１】
半導体微細加工技術による薄膜は、一例として以下の手順で作製することができる。まず、厚さ７２５μｍの８インチＳｉウエハの表面に、Ｓｉ３Ｎ４／ＳｉＯ２／Ｓｉ３Ｎ４をそれぞれ膜厚１２ｎｍ／２５０ｎｍ／１００ｎｍでその順に成膜する。また、Ｓｉウエハの裏面に、Ｓｉ３Ｎ４を１１２ｎｍ成膜する。
【００６２】
次に、Ｓｉウエハ表面最上部のＳｉ３Ｎ４を５００ｎｍ四方で反応性イオンエッチングにより除去する。同様に、Ｓｉウエハ裏面のＳｉ３Ｎ４を１０３８μｍ四方で反応性イオンエッチングにより除去する。裏面については更に、エッチングにより露出したＳｉ基板をＴＭＡＨ（Tetramethylammonium hydroxide）により更にエッチングする。Ｓｉエッチングの間は、表面側のＳｉＯのエッチングを防ぐため、ウエハ表面を保護膜（ProTEKTMB3primer and ProTEKTMB3、 Brewer Science、 Inc.）で覆うのが好ましい。中間層のＳｉＯはポリシリコンであってもよい。
【００６３】
次に、当該保護膜を取り除いた後、５００ｎｍ四方で露出しているＳｉＯ層をＢＨＦ溶液（ＨＦ／ＮＨ４Ｆ＝１／６０、８ｍｉｎ）で取り除く。これにより、膜厚１２ｎｍの薄膜Ｓｉ３Ｎ４が露出した仕切り体が得られる。ポリシリコンが犠牲層に選択された場合はＫＯＨによるエッチングにより薄膜が露出される。この段階では、薄膜にナノポアは設けられていない。
【００６４】
ナノポア１０１の寸法は、分析対象である生体分子の種類に応じて適切な寸法を選択することができる。一例として、ナノポア１０１の寸法は、例えば０．９ｎｍ〜１００ｎｍ、好ましくは０．９ｎｍ〜５０ｎｍであり、具体的にはおよそ０．９ｎｍ以上１０ｎｍ以下にすることができる。例えば直径が約１．４ｎｍであるｓｓＤＮＡ（１本鎖ＤＮＡ）の分析に用いるナノポア１０１の径は、好ましくは、１．４ｎｍ〜１０ｎｍ程度、より好ましくは１．４ｎｍ〜２．５ｎｍ程度、具体的にはおおよそ約１．６ｎｍとすることができる。
【００６５】
また、例えば直径が約２．６ｎｍであるｄｓＤＮＡ（２本鎖ＤＮＡ）の分析に用いるナノポア１０１の径は、好ましくは３ｎｍ〜１０ｎｍ程度、より好ましくは３ｎｍ〜５ｎｍ程度とすることができる。
【００６６】
ナノポア１０１の深さは、薄膜の厚さを調整することにより調整することができる。ナノポア１０１の深さは、生体分子を構成するモノマ単位の２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは５倍以上の大きさとする。例えば生体分子が核酸から構成されている場合には、ナノポア１０１の深さは、塩基３個以上の大きさ、例えば約１ｎｍ以上とすることが好ましい。これにより、生体分子をその形状と移動速度を制御しながらナノポア１０１に進入させることができ、高感度及び高精度な解析が可能となる。また、ナノポア１０１の形状は、基本的には円形であるが、楕円形や多角形とすることも可能である。
【００６７】
ナノポア１０１を有する薄膜を複数枚備えるアレイ型の装置構成の場合には、ナノポア１０１を有する薄膜を規則的に配列することが好ましい。複数の薄膜１１１Ａを配置する間隔は、使用する電極、電気測定系の能力に応じて、０．１μｍ〜１０μｍ、好ましくは０．５μｍ〜４μｍとすることができる。
【００６８】
なお、薄膜中にナノポア１０１を形成する方法は、特に限定されるものではなく、例えば透過型電子顕微鏡などによる電子ビーム照射や電圧印加による絶縁破壊などを用いることができる。例えば“ItaruYanagi et al.、Sci. Rep. 4、 5000 (2014)”に記載されている方法を使用することができる。
【００６９】
ナノポア１０１の形成は、例えば以下の手順で行うことができる。仕切り体を生体分子分析用デバイス等にセットする前に、Ar/O2 plasma(SAMCO Inc.、 Japan)により、１０Ｗ、２０ｓｃｃｍ、２０Ｐａ、４５ｓｅｃの条件で、Ｓｉ３Ｎ４薄膜を親水化する。次に、生体分子分析用デバイスに仕切り体をセットする。その後、薄膜を挟む上下の液槽を、１Ｍ  ＫＣｌ、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ-１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５溶液で満たし、各液槽のそれぞれに電極１１５Ａ、１１５Ｂを導入する。
【００７０】
電圧の印加は、ナノポア１０１の形成時だけでなく、ナノポア１０１が形成された後にナノポア１０１を介して流れるイオン電流の計測時にも行われる。ここでは、下側に位置する液槽をｃｉｓ槽と呼び、上側に位置する液槽をｔｒａｎｓ槽と呼ぶ。また、ｃｉｓ槽側の電極に印加する電圧Ｖｃｉｓを０Ｖに設定し、ｔｒａｎｓ槽側の電極に電圧Ｖｔｒａｎｓを印加する。電圧Ｖｔｒａｎｓは、パルス発生器（例えば41501B SMU AND Pulse Generator Expander、 Agilent Technologies、 Inc.）により発生する。
【００７１】
パルス印加後の電流値は、電流計（例えば4156B PRECISION SEMICONDUCTOR ANALYZER、 Agilent Technologies、 Inc.）で読み取ることができる。パルス電圧の印加前に形成されたナノポア１０１の直径に応じて電流値条件（閾値電流）を選択し、順次、ナノポア１０１の直径を大きくしつつ、目的とする直径を得ることができる。
【００７２】
ナノポア１０１の直径は、イオン電流値から見積もった。条件選択の基準は表２の通りである。
【００７３】
【表２】
2020031557.tif 000004
【００７４】
ここで、ｎ番目のパルス電圧印加時間ｔｎ（ただし、ｎ＞２の整数。）は、次式で決定される。
【００７５】
【数１】
2020031557.tif 000005
【００７６】
ナノポア１０１の形成は、パルス電圧を印加する方法以外に、ＴＥＭによる電子線照射によっても行うことができる（A. J. Storm et al.、 Nat. Mat. 2 (2003)）。
【００７７】
上下２つの液槽に設けられた電極に電源から電圧が印加されると、ナノポア１０１の近傍に電場が生じ、液中で負に帯電した生体分子は、ナノポア１０１内を通過する。その際、前述した封鎖電流Ｉｂが流れる。
【００７８】
薄膜に接触する測定溶液を収納できる液槽は、封鎖電流の測定に影響を及ぼさない材質、形状及び大きさで、適宜設けることができる。これらの液槽を仕切る薄膜に接液するように測定溶液が注入される。
【００７９】
電極は、測定溶液中の電解質と電子授受反応（ファラデー反応）を行うことが可能な材質で作製されることが好ましく、典型的には、ハロゲン化銀又はハロゲン化アルカリ銀で作製される。電位安定性及び信頼性の観点からは、銀又は銀塩化銀を使用することが好ましい。
【００８０】
電極は、分極電極となる材質で作製されてもよく、例えば金や白金などで作製されてもよい。その場合、安定的なイオン電流を確保するために測定溶液に電子授受反応を補助することができる物質、例えばフェリシアン化カリウム又はフェロシアン化カリウムなどを添加することが好ましい。あるいは、電子授受反応を行うことが可能な物質、例えばフェロセン類をその分極電極表面に固定化することが好ましい。
【００８１】
電極の構造は、全てが前記材質で構成されていてもよく、あるいは前記材質が下地材（銅、アルミニウムなど）の表面に被覆されていてもよい。電極の形状は特に限定されるものではないが、測定溶液と接液する表面積が大きくなる形状が好ましい。電極は配線と接合されて、測定回路へと電気的信号が送られる。
【００８２】
図７の生体分子分析装置は、上記の構成を要素として含む。上述のナノポア方式の生体分子分析装置は、使用手順や使用量などを記載した説明書と共に提供され得る。制御鎖は、即時使用可能な状態で提供されてもよいし、計測対象となる生体分子のみが結合していない状態で構成・提供されてもよい。そのような形態及び調製は、当業者であれば理解することができる。ナノポアデバイスに関しても同様に、即時使用可能な状態でナノポアが形成されている状態で提供されてもよいし、提供先で形成される状態で提供されてもよい。
【００８３】
図８は、生体分子計測装置１００及び７００による計測の手順を示すフローチャートである。先ず、測定対象とする生体分子１０９を溶液から抽出し（ステップＳ１１）、この生体分子１０９を制御鎖１１１と結合させる（ステップＳ１２）。この制御鎖１１１は、後に回収用に用いるビーズ表面の修飾基と結合可能な分子が修飾されたものとすることができる。生体分子１０９は、例えば対象生物の細胞液から抽出して得ることができる。生体分子１０９は抽出後、制御鎖１１１を結合し回収される。回収の際、ビーズを用いることが一般的であり、ビーズ表面には制御鎖に修飾された分子と結合可能な分子が修飾されている。
【００８４】
ビーズ表面には例えばストレプトアビジンが結合していることが多い。この場合、制御鎖１１１の３’端にビオチンが修飾されていることで、制御鎖１１１が連結可能であったサンプルのみをビーズにて回収することが出来る。ストレプトアビジンとビオチンの結合対象は逆であっても構わない。ビーズによってターゲットサンプル（計測対象の生体分子１０９）の回収後（ステップＳ１３）、場合によってはビーズを外してもよい（ステップＳ１４）。ビーズを外す際にはビーズ直径以下のポーラス構造を有するメンブレンの両端に８００ｍＶ以上の電界をかけることによって外すことも可能である。または、ＳＡ−ビオチン結合の下流にジスルフィド結合サイトを用意することで還元剤により解離させることも可能である。
【００８５】
その後、抽出された生体分子１０９を計測溶液中に溶解させ、図１又は図７に示す生体分Ｓ位分析装置に注入する。その後、電圧を印加することにより生体分子１０９がナノポア１０１で導入され、所望の電圧印加により生体分子１０９の分析を行う。
【００８６】
以上説明したように、第１の実施の形態の生体分分析装置及び分析方法によれば、生体分子の搬送制御を行いつつも、合成開始点の制御も的確に実行することができる。
【００８７】
［第２の実施の形態］
次に、本発明の第２の実施の形態に係る生体分子分析装置を、図９Ａ〜図９Ｃを参照して説明する。この第２の実施の形態の生体分子分析装置の全体構成は、第１の実施の形態と同様であるので、重複する説明は省略する。この第２の実施の形態は、計測対象とする生体分子１０９の構成が第１の実施の形態とは異なっている。
【００８８】
第１の実施の形態では、一本鎖ＤＮＡの生体分子１０９を計測対象とする場合を例として説明した。この第２の実施の形態では、二本鎖ＤＮＡの生体分子１０９を計測対象としている。
【００８９】
二本鎖ＤＮＡの場合、生体分子１０９に対して未処理のまま電気泳動によりナノポア１０１に導入することが出来ない。そこで、この第２の実施の形態では、図９Ａに示すように、計測対象としての二本鎖のゲノム断片９０１の一端に導入鎖９０４を付加する。導入鎖９０４は、測定対象としてのゲノム断片９０１の側は少なくとも二本鎖構造を有する。ただし、ナノポア１０１への導入が可能となるよう、ゲノム断片９０１とは反対側の、導入鎖９０４の先端部分は１本鎖の突出末端９０３とされる。
【００９０】
ゲノム断片９０１の基端側には、第１の実施の形態と同様に、分子モータ１１０を含む分子モータ結合サイト９０２を介して制御鎖１１１が接続される。制御鎖１１１には、第１の実施の形態と同様にプライマ１１２が付加されるが、プライマ１１２と分子モータ１１０の間には、第１の実施の形態と同様にスペーサ１１３が設けられる。
【００９１】
次に、この第２の実施の形態の生体分子分析装置において、図９Ａで説明した生体分子１０９を計測する方法の概要を、図９Ｂ及び図９Ｃを参照して説明する。
図９Ａのゲノム断片９０１が、例えば図１の装置の液槽１０４Ａに導入され、両電極１０５Ａ及び１０５Ｂの間に電圧が印加されると、図９Ａのゲノム断片９０１の導入鎖９０４がナノポア１０１に導入される。
【００９２】
図９Ｂに示すように、導入鎖９０４の突出末端９０３がナノポア１０１に導入されると、導入鎖９０４の二本鎖ＤＮＡが引き剥がされ（unzippingされ）、これに続いてゲノム断片９０１の二本鎖ＤＮＡも引き剥がされる。その後、図９Ｃに示すように、分子モータ１１０がナノポア１０１に到達すると、分子モータ１１０とプライマ１１２が接触し、これにより１本鎖とされたゲノム断片９０１’において伸長反応が開始される。以後の動作は第１の実施の形態と略同一である。この第２の実施の形態の構成によれば、二本鎖構造を有する生体分子も、図１のようなナノポア方式の装置により分析することが可能になる。
【００９３】
［第３の実施の形態］
次に、本発明の第３の実施の形態に係る生体分子分析装置を、図１０Ａ〜図１０Ｄを参照して説明する。この第３の実施の形態の生体分子分析装置の全体構成は、第１の実施の形態と同様であるので、重複する説明は省略する。この第３の実施の形態は、計測対象とする生体分子の構成が第１の実施の形態とは異なっている。第２の実施の形態の生体分子の構成と同一の構成については、図１０Ａにおいて同一の符号を付し、以下では重複する説明は省略する。
【００９４】
この第３の実施の形態の生体分子１０９は、第１の実施の形態と同様に、測定対象であるゲノム断片９０１の一端に導入鎖９０４を付加する。ただし、この第３の実施の形態では、導入鎖９０４とゲノム断片との間に、第２の制御鎖１０１１を接続している。この第２の制御鎖１０１１は、第２の分子モータ９１１を備えるとともに、ゲノム断片９０１との接続部分にはスペーサ１１３’が設けられている。すなわち、この第３の実施の形態では、生体分子としてのゲノム断片９０１は、第１の端部において制御鎖１１１及び第１の分子モータ１１０と接続され、第２の端部において第１の分子モータ１１０とは第２の分子モータ９１１と接続されている。第２の分子モータ９１１は、二本鎖を解離させるか、若しくは相補鎖を分解する作用を有する。第１の分子モータ１１０は、ポリメラーゼであり、第２の分子モータ９１１は、ヘリカーゼである。
【００９５】
次に、第３の実施の形態において、生体分子１０９をナノポア１０１に導入する方法を説明する。計測対象である生体分子１０９の上流には、図９Ａと同様に、分子モータ結合サイト９０２を介して制御鎖１１１を結合させる。下流には、二本鎖解離作用もしくは、生体分子の相補鎖を分解する分子モータ９１１及びその上流にスペーサ１１３’を有する第２の制御鎖１０１１を結合する。第２の制御鎖１０１１の下流には導入鎖９０４が連結している。
【００９６】
検査対象である生体細胞より生体分子９０１を抽出し、第１の制御鎖１１１、分子モータ結合サイト９０２、及び導入鎖９０４が連結した第２の制御鎖１０１１を結合した後、生体分子１０９を回収する。そして、回収された生体分子１０９を、薄膜１０２が接する液槽１０４Ａに導入する。薄膜１０２に電圧が印加されると、生体分子１０９は導入鎖９０４よりナノポア１０１に導入される。これにより図１０Ｂに示すように、導入鎖９０４の二本鎖構造は解離を開始する。
【００９７】
その後、導入鎖９０４の解離が完了し、第２の分子モータ９１１がナノポア１０１に到達すると、ヘリカーゼからなる第２の分子モータ９１１はゲノム断片９０１の相補鎖と接触する。これにより、図１０Ｃに示すように、ゲノム断片９０１の相補鎖の解離及び分解が開始される。分子モータ９１１はゲノム断片９０１の相補鎖の分解または解離が終了するとゲノム断片９０１から遊離する。
【００９８】
ゲノム断片９０１の分解又は解離が終了すると、図１０Ｄに示すように、ポリメラーゼからなる第１の分子モータ１１０がナノポア１０１に到達する。これにより、第１の実施の形態におけるのと同様に、プライマ１１２と第１の分子モータ１１０が接触することで伸長反応が開始され、１本鎖となったゲノム断片９０１の分析が開始され得る。
【００９９】
以上説明したように、この第３の実施の形態によれば、導入鎖９０４の解離の終了後、第２の分子モータ９１１により二本鎖ＤＮＡであるゲノム断片９０１の解離を開始することができ、ナノポア方式において二本鎖ＤＮＡの迅速かつ正確な分析が可能になる。
【０１００】
［第４の実施の形態］
次に、本発明の第４の実施の形態に係る生体分子分析装置を、図１１Ａを参照して説明する。この第４の実施の形態の生体分子分析装置の全体構成は、第１の実施の形態と同様であるので、重複する説明は省略する。この第４の実施の形態は、計測対象とする生体分子の構成が第１の実施の形態とは異なっている。第４の実施の形態の生体分子の構成と同一の構成については、図１１Ａにおいて図１と同一の符号を付し、以下では重複する説明は省略する。
【０１０１】
この第４の実施形態では、計測対象の二本鎖構造のゲノム断片９０１の一端に、分子モータ結合サイト１１６が接続され、更に分子モータ結合サイト１１６の他端に導入鎖１１０２が接続されている。分子モータ結合サイト１１６は、ヘリカーゼからなる分子モータ１１０１を備えている。この点、前述の実施の形態が、ポリメラーゼからなる分子モータを備えているのと異なっている。ヘリカーゼからなる分子モータは、ポリメラーゼとは異なり、二本鎖構造の生体分子を解離させて一本鎖構造とすることができる。ヘリカーゼからなる分子モータ１１０１は、分子モータ結合サイト１１６中の制御鎖の一本鎖領域に結合する。導入鎖１１０２は、突出末端１１０３を有するが、突出末端１１０３は一本鎖ではなく、スペーサを用いる。
【０１０２】
次に、第４の実施の形態において、ゲノム断片９０１をナノポア１０１に導入する方法を図１１Ｂ及び図１１Ｃを参照して説明する。まず、測定対象であるゲノムを有する細胞からゲノム断片９０１を抽出・精製の後、導入鎖１１０２が結合された分子モータ結合サイト１１６を結合する。なお、ゲノム断片９０１の分子モータ結合サイト１１６が結合された側とは反対側の一端に、ビーズなど生体分子を抽出するための機構と結合可能なサイトを結合させても良い。
【０１０３】
その後、ゲノム断片９０１を抽出するための機構を切断した後、抽出したゲノム断片９０１を、ナノポア１０１を有する薄膜１０２と接する計測溶液に導入する。図１又は図７の装置において、両電極１０５Ａ、１０５Ｂの間に電圧が印加されると、ゲノム断片９０１の導入鎖１１０２はナノポア１０１に導入される。導入鎖１１０２は、図１１Ｂに示すように、ナノポア１０１に導入されると、二本鎖領域の相補鎖が解離を開始する。この相補鎖の解離が終了し、ヘリカーゼからなる分子モータ１１０１がナノポア１０１に到達すると、この分子モータ１１０１がゲノム断片９０１の一端と接触する。これにより、ヘリカーゼによる相補鎖の解離が開始され、ゲノム断片９０１が１本鎖となり、ナノポア１０１を通過可能となる。これにより、ゲノム断片９０１がナノポア１０１の内部において搬送され、ゲノム断片９０１のナノポア方式による分析が開始される。
【０１０４】
［第５の実施の形態］
次に、本発明の第５の実施の形態に係る生体分子分析装置を、図１２及び図１３を参照して説明する。この第５の実施の形態の生体分子分析装置の全体構成は、第１の実施の形態と同様であるので、重複する説明は省略する。
【０１０５】
この第５の実施の形態は、計測対象とする生体分子の構成と、そのための装置の動作が第１の実施の形態とは異なっている。この第５の実施の形態では、生体分子の分析精度向上のため、生体分子を繰り返し解析可能な往復動制御を実行可能なよう、生体分子が構成される。ここで往復動制御とは、生体分子１０９がナノポア１０１の中を上下に複数回移動することで、１つの生体分子１０９に対し繰り返し測定を行うことを可能にした制御のことを言う。
【０１０６】
また、生体分子分析装置は、そのような往復動制御が可能にする電圧印加を与えるよう構成されている。具体的には、生体分子１０９の両端に、ナノポア１０１よりも寸法が大きいストッパ分子１２０１、１２０２を結合させることで、往復動制御が可能とされている。往復動制御が行われることにより、同一の生体分子に対し繰り返し測定を行うことができ、測定精度を向上させることができる。
【０１０７】
図１２を参照して、この第５の実施の形態における往復動制御による生体分子の分析手順の概要を説明する。往復動制御による繰り返し解析は、生体分子１０９をナノポア１０１の近傍にトラップし、電圧印加の極性を繰り返し反転することで、往復運動を行うことで実現する。
【０１０８】
まず、図１２（ａ）に示すように、計測対象である生体分子１０９の一端に、制御鎖１１１を介して第１のストッパ分子１２０１を結合し、第１の液槽１０４Ａに封入する。
【０１０９】
その後、図１２（ｂ）に示すように、両電極１０５Ａ、１０５Ｂの間に第１の電圧（Ｖ１）を印加すると、電気泳動により生体分子１０９がナノポア１０１に導入される（通過する）。第１のストッパ分子１２０１の大きさがナノポア１０１の直径よりも大きいため、第１のストッパ分子１２０１はナノポア１０１を通過することができず、生体分子１０９がナノポア１０１にトラップされる。
【０１１０】
生体分子１０９がナノポア１０１を通過すると、図１２（ｂ）の右側に示すように、第２の液槽１０４Ｂに封入された第２のストッパ分子１２０２と、生体分子１０９の他端が結合する。このようにして生体分子１０９の両端が、薄膜１０２の両側に位置する状態で、それぞれ第１のストッパ分子１２０１、及び第２のストッパ分子１２０２と接続されることにより、生体分子１０９は第１のストッパ分子１２０１及び第２のストッパ分子１２０２との間で、ナノポア１０１の内部を往復運動することができる。
【０１１１】
生体分子１０９がナノポア１０１を通過し、両端が第１及び第２のストッパ分子１２０１、１２０２で接続された状態が得られると、続いて、生体分子１０９には、分子モータ１１０を有するプライマ結合サイトが結合される。なお、第１の電圧Ｖ１の極性を反転させることで、制御鎖１１１中のプライマ１１２及び分子モータ１１０の結合が容易になる。
【０１１２】
次に、図１２（ｃ）に示すように、第１の電圧Ｖ１に代えて第２の電圧Ｖ２が両電極１０５Ａ及び１０５Ｂの間に印加され、分子モータ１１０がナノポア１０１に到達すると、分子モータ１１０と制御鎖１１１中のプライマ１１２が接触し、これにより生体分子１０９の伸長反応が開始され、第１の実施の形態と同様にして生体分子の分析が行われる。伸長反応が生体分子１０９の末端まで進行すると、分子モータ１１０は生体分子１０９から遊離する（図１２（ｃ）の右側参照）。
【０１１３】
その後、図１２（ｄ）に示すように、第２の電圧Ｖ２に代えて第３の電圧Ｖ３が印加されると、分子モータ１１０によって合成された生体分子１０９の相補鎖１０９Ｃは、電圧Ｖ３の作用により引き剥がされ（unzipping）、生体分子１０９から遊離する。
【０１１４】
続いて、図１２（ｅ）に示すように、第３の電圧Ｖ３に代えて、第３の電圧Ｖ３とは極性が異なる第４の電圧Ｖ４が印加されると、プライマ１１２、及び分子モータ１１０の結合が行われ、これにより、生体分子１０９は図１２（ｂ）の状態に戻る。その後、第２の電圧Ｖ２が印加されることにより、再度生体分子１０９の計測が繰り返される。
【０１１５】
１つの生体分子１０９において十分な回数の計測が繰り返された後、図１２（ｆ）に示すように、第４の電圧Ｖ４に代えて第５の電圧Ｖ５が両電極１０５Ａ、１０５Ｂの間に印加される。これにより、第１のストッパ分子１２０１又は第２のストッパ分子１２０２は生体分子１０９から分離する。これにより、測定が完了した生体分子１０９とは別の新たな生体分子に対し、上述した測定が開始可能な状態となる。ここで第５の電圧Ｖ５は、ストッパ分子１２０１、１２０２と生体分子１０９との結合サイトの力よりも大きな電界を発生させることができる電圧である。例えば、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ及びｂｉｏｔｉｎによる結合を利用した際には、膜厚７ｎｍのナノポアを利用した際に８００ｍＶの電圧印加を行うと切断することができる。
【０１１６】
図１３は図１２（ａ）〜（ｆ）の工程が実行されている際に得られる信号の波形、及び印加される電圧の波形の変化を示すグラフである。図１３では、同様の電圧波形が繰り返し入力されている。このような電圧波形が繰り返し入力されることで、その結果として複数の信号群が得られ、計測対象の生体分子１０９の測定精度を向上させることができる。なお、信号群の中には、生体分子に由来の信号及び、搬送制御が停止したことが判定される信号が含まれる。
【０１１７】
コンピュータ１０８は、電流計１０６で検出される電流値を検出し、所定の電流又はこれに対応する電圧が検出されることにより、それをトリガとして両電極１０５Ａ及び１０５Ｂの間に印加される電圧の値を切り換える（Ｖ１→Ｖ２→Ｖ３→Ｖ４）。
例えば、図１３では、信号群（ｍ）において、第２の電圧Ｖ２を印加している際に、分析対象である生体分子１０９に由来の信号１２１１が得られる。信号１２１１は、生体分子１０９の核酸の配列等に応じて振動する信号となる。
【０１１８】
その後、生体分子１０９が移動して、生体分子１０９の末端まで分析が終わると、信号１２１１の塩基配列に基づく振動は終了し、略一定の電圧１２１２に落ち着く。コンピュータ１０８は、この所定の電圧１２１２を検出することにより、第２の電圧Ｖ２から、生体分子１０９を初期位置に戻すための電圧である第３の電圧Ｖ３に切り替える。生体分子１０９が初期位置に戻る行程においても、電流計１０６により検出される電流値は、生体分子１０９の構造に基づき振動する。この電流値が所定値に落ち着くと、初期位置への復帰が完了したと判断され、印加電圧Ｖ３は逆特性の第４の電圧Ｖ４に切り替わる。これにより、プライマ１１２、及び分子モータ１１０の生体分子１０９への結合が再度行われ、生体分子１０９の再計測が開始され、信号群（ｍ＋１）が得られる。生体分子１０９への複数回（ｎ回）の計測が終わると、第５の電圧Ｖ５が印加され、これにより１つの生体分子１０９への計測が終了する。
【０１１９】
なお、前述したように、生体分子１０９は、例えば対象生物の細胞液から抽出して得ることができる。生体分子１０９は抽出後、制御鎖１１１を結合し回収される。回収の際、ビーズを用いることが一般的であり、ビーズ表面には制御鎖に修飾された分子と結合可能な分子が修飾されている。前述のストッパ分子１２０１、１２０２は、制御鎖結合分子の回収用に用いられたビーズをそのまま使うことも可能である。または、ビーズによる回収後に生体分子を外し、再びストッパ分子を結合させる行程を経て計測を行うことも可能である。
【０１２０】
以上、本発明のいくつかの実施の形態を説明したが、これらの実施の形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施の形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施の形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
【符号の説明】
【０１２１】
１００，７００…生体分子分析装置、１０１…ナノポア、１０２…薄膜、１０３…電解質溶液、１０４Ａ，１０４Ｂ…液槽、１０５Ａ…第１の電極、１０５Ｂ…第２の電極、１０６…電流計、１０７…電圧源、１０８…コンピュータ、１０９…生体分子（ＤＮＡ鎖等）、１１０，９１１，１１０１…分子モータ、１１１，１０１１…制御鎖、１１２…プライマ、１１３，１１３’…スペーサ、１１６，９０２…分子モータ結合サイト、９０１…ゲノム断片、９０３，１１０３…突出末端、１２０１，１２０２…ストッパ分子、９０４，１１０２…導入鎖。
【図１】
2020031557.tif 000006
【図２】
2020031557.tif 000007
【図３Ａ】
2020031557.tif 000008
【図３Ｂ】
2020031557.tif 000009
【図４】
2020031557.tif 000010
【図５】
2020031557.tif 000011
【図６】
2020031557.tif 000012
【図７】
2020031557.tif 000013
【図８】
2020031557.tif 000014
【図９Ａ】
2020031557.tif 000015
【図９Ｂ】
2020031557.tif 000016
【図９Ｃ】
2020031557.tif 000017
【図１０Ａ】
2020031557.tif 000018
【図１０Ｂ】
2020031557.tif 000019
【図１０Ｃ】
2020031557.tif 000020
【図１０Ｄ】
2020031557.tif 000021
【図１１Ａ】
2020031557.tif 000022
【図１１Ｂ】
2020031557.tif 000023
【図１１Ｃ】
2020031557.tif 000024
【図１２】
2020031557.tif 000025
【図１３】
2020031557.tif 000026