(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトCS1に結合する新規抗体及び抗体薬物結合体、並びに形質細胞腫瘍、例えば、多発性骨髄腫と診断された対象を処置するためのそれらの使用の提供。【解決手段】公知のヒトCS1結合抗体、LucX及びそのヒト化抗体PDL241、エロツズマブ及びLuc34.3.8が結合するエピトープとは異なるエピトープでヒトCS1に特異的に結合するインビボで優れた抗増殖特性を示す新規抗体、及びその抗体薬物結合体の提供。本抗体は、カニクイザルCS1と交差反応しカニクイザルでの安全性試験が可能である。【選択図】図８
2020111583.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトCS1を発現する細胞の結合について、表3に挙げる抗体から選択される対照抗体と競合する抗体。
【請求項２】
対照抗体が抗体Hu34C3である、請求項1記載の抗体または結合断片。
【請求項３】
実施例6の競合結合検定において、対照抗体の結合を少なくとも20％減少させる、請求項2記載の抗体。
【請求項４】
（i）3つのCDRを含むVH鎖；および（ii）3つのCDRを含むVL鎖を含み、
VH CDR#1は式
2020111583.tif 000070
を有し、式中：
X1は芳香族残基であり；
VH CDR#2は式
2020111583.tif 000071
を有し、式中：
X2は極性残基または酸残基であり、
X3は極性残基、非極性残基または酸性残基であり、
X4は芳香族残基であり、
X5は脂肪族残基であり、
X6は脂肪族残基であり、かつ
X7は小型残基であり；
VH CDR#3は式
2020111583.tif 000072
を有し、式中：
X8は芳香族残基であり；
VL CDR#1は式
2020111583.tif 000073
を有し、式中：
X9は極性残基または芳香族残基であり、
X10は極性残基または塩基性残基であり、かつ
X11は極性残基または脂肪族残基であり；
VL CDR#2は
2020111583.tif 000074
であり；かつ
VL CDR#3は式
2020111583.tif 000075
を有し、式中：
X12は芳香族残基である、請求項1記載の抗体。
【請求項５】
VH CDR#2が式
2020111583.tif 000076
を有し、式中：
X2はS、DまたはEであり；
X3はS、E、GまたはNであり；
X4はYまたはFであり；
X5はVまたはLであり；
X6はVまたはLであり；かつ
X7はGまたはSであり；
VH CDR#3が式
2020111583.tif 000077
を有し、式中：
X8はYまたはFであり；
VL CDR#1が式
2020111583.tif 000078
を有し、式中：
X9はSまたはFであり；
X10はS、NまたはRであり；かつ
X11はNまたはLであり；かつ
VL CDR#3が式
2020111583.tif 000079
を有し、式中：
X12はFまたはYである、請求項4記載の抗体。
【請求項６】
VH CDR#1が、
2020111583.tif 000080
から選択され；
VH CDR#2が、
2020111583.tif 000081
から選択され；
VH CDR#3が、
2020111583.tif 000082
から選択され；
VL CDR#1が、
2020111583.tif 000083
から選択され；
VL CDR#2が、
2020111583.tif 000084
から選択され；
VL CDR#3が、
2020111583.tif 000085
から選択される、請求項4記載の抗体。
【請求項７】
配列がSEQ ID NO:8に対応するVH鎖および配列がSEQ ID NO:10に対応するVL鎖を含む、請求項1記載の抗体。
【請求項８】
配列がSEQ ID NO:34に対応する重鎖および配列がSEQ ID NO:35に対応する軽鎖を含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の抗体。
【請求項９】
IgG1である、請求項1記載の抗体。
【請求項１０】
実施例5の競合結合検定において、ヒトCS1を発現する細胞の結合について、PDL241、エロツズマブおよびLuc34.3.8からなる群より選択される対照抗体と競合しない、請求項1記載の抗体。
【請求項１１】
遊離スルフヒドリル基をもつ1つまたは複数の還元システイン残基を有する、請求項1記載の抗体。
【請求項１２】
リンカーによって請求項1〜11のいずれか一項記載の抗体に連結された細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質を含む、抗体薬物結合体（「ADC」）。
【請求項１３】
1〜10の範囲の薬物 対 抗体比平均値を有する、請求項12記載のADC。
【請求項１４】
2〜4の範囲の薬物 対 抗体比平均値を有する、請求項12記載のADC。
【請求項１５】
リンカーがリソソーム酵素によって切断可能である、請求項12記載のADC。
【請求項１６】
リソソーム酵素がカテプシンBである、請求項13記載のADC。
【請求項１７】
リンカーが構造式（IVa）もしくは（IVb）またはその塩のセグメントを含む、請求項16記載のADC：
2020111583.tif 000086
式中：
ペプチドは、リソソーム酵素によって切断可能なペプチド（C→Nで図示され、カルボキシ「末端」およびアミノ「末端」は示していない）を表し；
Tは、1つもしくは複数のエチレングリコール単位または1つのアルキレン鎖、あるいはその組み合わせを含むポリマーを表し；
Raは、水素、アルキル、スルホネートおよびメチルスルホネートから選択され；
pは0〜5の範囲の整数であり；
qは0または1であり；
xは0または1であり；
yは0または1であり；
2020111583.tif 000087
は、リンカーの細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質への連結点を表し；かつ
*は、リンカーの残りの部分への連結点を表す。
【請求項１８】
ペプチドが
2020111583.tif 000088
ならびにこれらの塩からなる群より選択される、請求項17記載のADC。
【請求項１９】
リソソーム酵素がβ-グルクロニダーゼである、請求項15記載のADC。
【請求項２０】
リンカーが切断不可能でる、請求項12記載のADC。
【請求項２１】
リンカーが、1〜6つのエチレングリコール単位を有するポリエチレングリコールセグメントを含む、請求項12記載のADC。
【請求項２２】
細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質がカリケアマイシン、メイタンシノイド、オーリスタチンおよびドキソルビシンからなる群より選択される、請求項12記載のADC。
【請求項２３】
細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質がMMAEまたはMMAFである、請求項12記載のADC。
【請求項２４】
構造式（I）の化合物またはその塩である、請求項12記載のADC：
（I）  [D-L-XY]n-Ab
式中：
Dは抗悪性腫瘍薬であり；
Lはリンカーであり；
Abは抗体であり；
XYは、リンカーLを抗体Abに連結する共有結合を表し；かつ
nは2〜8の範囲の整数である。
【請求項２５】
nが2、3または4である、請求項24記載のADC。
【請求項２６】
リンカーLがリソソーム酵素によって切断可能である、請求項24記載のADC。
【請求項２７】
XYが、抗体Ab上のアミノ基と形成される連結である、請求項24記載のADC。
【請求項２８】
XYがアミドまたはチオ尿素である、請求項26記載のADC。
【請求項２９】
XYが、抗体Ab上のスルフヒドリル基と形成される連結である、請求項24記載のADC。
【請求項３０】
XYがチオエーテルである、請求項29記載のADC。
【請求項３１】
XYが、マレイミドとスルフヒドリル基との間で形成される連結である、請求項29記載のADC。
【請求項３２】
構造式（I）の化合物が式（IIa）の構造を有する、請求項24記載のADC：
2020111583.tif 000089
式中、Abは抗体Hu34C3である。
【請求項３３】
nが2または4である、請求項32記載のADC。
【請求項３４】
Dがオーリスタチンである、請求項32記載のADC。
【請求項３５】
以下の構造を有する、請求項24記載のADC：
2020111583.tif 000090
式中、Abは抗体Hu34C3であり、かつnは2または4である。
【請求項３６】
請求項12〜35のいずれか一項記載のADCならびに担体、賦形剤および/または希釈剤を含む、組成物。
【請求項３７】
ヒトにおける医薬用途のために製剤化される、請求項36記載の組成物。
【請求項３８】
単位剤形である、請求項37記載の組成物。
【請求項３９】
請求項1〜11のいずれか一項記載の抗体を、構造式（III）D-L-Rxのシントンと、シントンが該抗体にシントンを共有結合させる条件下で接触させることによって形成される、ADC：式中、Dは細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質であり、Lはリンカーであり、かつRxは、シントンを該抗体に共有結合することが可能な官能基を含む。
【請求項４０】
抗体がHu34C3である、請求項39記載のADC。
【請求項４１】
細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質がオーリスタチンである、請求項39記載のADC。
【請求項４２】
Rxがマレイミドを含む、請求項39記載のADC。
【請求項４３】
抗体がHu34C3であり、かつ細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質がMMAEである、請求項39記載のADC。
【請求項４４】
接触させる段階が、ADCがDAR 2、3または4を有するような条件下で実施される、請求項39〜43のいずれか一項記載のADC。
【請求項４５】
請求項39記載のADCならびに賦形剤、担体および/または希釈剤を含む、組成物。
【請求項４６】
ヒトにおける医薬用途のために製剤化される、請求項45記載の組成物。
【請求項４７】
単位剤形である、請求項46記載の組成物。
【請求項４８】
請求項1〜11のいずれか一項記載の抗体を、構造式（III）D-L-Rxのシントンと、シントンが該抗体にシントンを共有結合させる条件下で接触させる段階を含む、ADCの作製法：式中、Dは細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質であり、Lはリンカーであり、かつRxは、シントンを該抗体に共有結合することが可能な官能基を含む。
【請求項４９】
抗体がHu34C3である、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質がオーリスタチンである、請求項48記載の方法。
【請求項５１】
Rxがマレイミドを含む、請求項48記載の方法。
【請求項５２】
抗体がHu34C3であり、かつ細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質がMMAEである、請求項48記載の方法。
【請求項５３】
形質細胞腫瘍を患っている対象に、治療的恩典を提供するのに十分な量の請求項12〜35のいずれか一項記載のADCを投与する段階を含む、形質細胞腫瘍を処置する方法。
【請求項５４】
形質細胞腫瘍が多発性骨髄腫である、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
ADCを単剤療法として投与する、請求項53記載の方法。
【請求項５６】
ADCを、多発性骨髄腫を処置するために一般に用いられる別の薬剤に対して補助的にまたは該薬剤と共に付加的に投与する、請求項53記載の方法。
【請求項５７】
他の薬剤がボルテゾミブ、ポマリドマイド、レナリドマイドおよびデキサメタゾンの1つまたは複数である、請求項53記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1.  関連出願の相互参照
本出願は、2014年10月31日提出の米国特許仮出願第62/073,824号の、35 U.S.C. § 119(e)の下での恩典を主張し、その内容は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
2.  配列リストの参照
本出願は配列リストを含み、これはASCIIフォーマットで電子的に提出しており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。2015年10月22日に作製した前記ASCIIコピーは、381493-838US(136841)_SL.txtと命名し、サイズは77,289バイトである。
【０００３】
3.  分野
本出願は、特に、公知の抗CS1抗体とは異なるエピトープに結合する新しい抗CS1抗体、新しい抗CS1抗体を含む抗体薬物結合体（「ADC」）、新しい抗体およびADCを含む組成物、新しい抗体およびADCの作製法、ならびに生物学的プロセスを調節し、疾患を処置するための新しい抗体およびADCの使用法に関する。
【背景技術】
【０００４】
4.  背景
多発性骨髄腫（「MM」）は、骨髄中の過剰の単型的形質細胞ならびに血清および/または尿中のモノクローナル免役グロブリンのレベル上昇によって特徴付けられる、生殖後（postgerminal）成熟B細胞から生じる不治の悪性病変である（Lonial et al., 2012, J Clin Oncol 30:1953-1959（非特許文献1））。一般的な臨床的続発症には、溶解性骨病変、骨折、骨髄抑制、および腎不全が含まれる。米国において、推定年間診断数は20,000件である（Lonial et al., 2012, J Clin Oncol 30:1953-1959（非特許文献1））。MMはすべての血液悪性病変の15％およびすべての悪性病変の2％を占める（Lonial et al., 2012, J Clin Oncol 30:1953-1959（非特許文献1））。高用量化学療法および幹細胞移植の進歩により、MMにおける全生存（OS）および無再発の疾患期間が改善された（Lonial et al., 2012, J Clin Oncol 30:1953-1959（非特許文献1））が、再発は不可避である。プロテアソーム阻害剤（現在承認されている：Velcade(登録商標)（ボルテゾミブ）、Kyprolis(登録商標)（カルフィルゾミブ））、ならびに免疫調節薬のサリドマイド、Revlimid(登録商標)（レナリドマイド）、およびPomalyst(登録商標)（ポマリドマイド）などの、より新しい治療薬が、新しく診断された、再発した、または難治性疾患の患者で臨床的恩典を示した（Lonial et al., 2012, J Clin Oncol 30:1953-1959（非特許文献1））。これらの治療の進歩にもかかわらず、再発性または難治性MMの長期コントロールは、ほとんどのMM患者にとって医学的に必要なままである。免疫調節薬（IMiD）およびプロテアソーム阻害剤の両方に抵抗性の進行性疾患は、特に不良な予後を伴う（Lonial et al., 2012, J Clin Oncol 30:1953-1959（非特許文献1））。したがって、既存の第一世代薬剤を増強し、患者の転帰を改善し続けるために、さらなる新規治療薬がおおいに必要とされている。
【０００５】
CS1（SLAMF7、CRACC、19A、APEX-1、およびFOAP12としても公知）は、多発性骨髄腫（MM）における治療的抗体の新しい標的抗原として出現した、細胞表面糖タンパク質である（Lonial et al., 2012, J Clin Oncol 30:1953-1959（非特許文献1））。エロツズマブはCS1を標的とするヒト化モノクローナル免役グロブリンG1抗体である（例えば、PCT公報WO 2004/100898（特許文献1）、WO 2005/102387（特許文献2）、WO 2008/019376（特許文献3）、およびWO 2008/019378（特許文献4）を参照されたく；米国特許第8,088,898号（特許文献5）、第8,133,981号（特許文献6）、第8,008,450号（特許文献7）、第8,445,646号（特許文献8）、第8,349,330号（特許文献9）、第8,461,306号（特許文献10）、第8,444,980号（特許文献11）、第8,436,146号（特許文献12）、第7,709,610号（特許文献13）、第8,632,772号（特許文献14）、および第7,842,293号（特許文献15）も参照されたい）。エロツズマブは、前臨床試験において、単独または他の承認薬剤との組み合わせで用いた場合に、有望な抗骨髄腫活性を示している。例えば、エロツズマブおよびレナリドマイドは、一定の相補的作用機序を有する。レナリドマイドは、NK細胞の数および抗MM細胞傷害活性を高めることが明らかにされている（Lonial et al., 2012, J Clin Oncol 30:1953-1959（非特許文献1））。エロツズマブは、主にNK細胞媒介性ADCCを通じて作用する（Lonial et al., 2012, J Clin Oncol 30:1953-1959（非特許文献1））。第三相臨床試験、ELOQUENT-2は、再発性または難治性多発性骨髄腫の患者において、レナリドマイドおよびデキサメタゾン単独と比べて、レナリドマイドおよびデキサメタゾンと併用してのエロツズマブの有効性および安全性を評価した。再発性または難治性多発性骨髄腫の患者において、エロツズマブをレナリドマイドおよびデキサメタゾンに加えると、対照治療としてのレナリドマイドおよびデキサメタゾンと比べて、無増悪生存期間および奏功率が改善され、骨髄腫細胞を選択的に標的とさせるための、自然免疫系の直接活性化および関与が、処置転帰において臨床的に意味があり、統計学的に有意な改善を提供しうることを示していた。具体的には、無増悪生存期間のカプラン・マイヤー曲線は、経時的に2群間の早期かつ漸増的な分離を示した。エロツズマブを投与した患者は、対照群と比べて、疾患進行または死亡のリスクにおける30％の相対低減を示した（Lonial et al., 2015, N Engl J Med, 373:621-631（非特許文献2））。
【０００６】
エロツズマブによる結果は有望であるが、一部には、疾患が進行したMM患者は免疫系が障害されていることが多い（Pratt, 2007, Br J Haematol 138:563-579（非特許文献3））ため、抗骨髄腫効果を主にNK細胞媒介性ADCCを介して発揮しない、新規治療法を同定する必要が残されている（Zonder, 2012, Blood, 120:552-559（非特許文献4））。障害された免疫系によって有効にはたらく治療法が望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】WO 2004/100898
【特許文献２】WO 2005/102387
【特許文献３】WO 2008/019376
【特許文献４】WO 2008/019378
【特許文献５】米国特許第8,088,898号
【特許文献６】米国特許第8,133,981号
【特許文献７】米国特許第8,008,450号
【特許文献８】米国特許第8,445,646号
【特許文献９】米国特許第8,349,330号
【特許文献１０】米国特許第8,461,306号
【特許文献１１】米国特許第8,444,980号
【特許文献１２】米国特許第8,436,146号
【特許文献１３】米国特許第7,709,610号
【特許文献１４】米国特許第8,632,772号
【特許文献１５】米国特許第7,842,293号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Lonial et al., 2012, J Clin Oncol 30:1953-1959
【非特許文献２】Lonial et al., 2015, N Engl J Med, 373:621-631
【非特許文献３】Pratt, 2007, Br J Haematol 138:563-579
【非特許文献４】Zonder, 2012, Blood, 120:552-559
【発明の概要】
【０００９】
5.  概要
1つの局面において、本開示は、文献に報告されている抗CS1抗体、特に抗体LucX（およびそのヒト化型、PDL241）、エロツズマブおよびLuc34.3.8（例えば、PCT公報WO 2004/100898、WO 2005/102387、およびWoo, et al., 2013, Arthritis Res Ther 15(6):R207参照）が結合するエピトープとは異なるエピトープで、ヒトCS1（「HuCS1」；SEQ ID NO:1）に特異的に結合する、新しい抗体、および/または結合断片を提供する。新しい抗体の1つは独特のエピトープに結合する。この抗体はインビボですぐれた抗増殖特性を示す。エロツズマブとは異なり、本明細書に記載の新しい抗体および結合断片はすべて、カニクイザルCS1（「CmCS1」；SEQ ID NO:3）と交差反応する。この特性は、カニクイザルでの安全性試験を可能にするため、好都合である。
【００１０】
新しい抗体および/または結合断片は一般には、本明細書においてVH CDR#1、VH CDR#2、およびVH CDR#3と呼ぶ（N→Cの順に）3つの相補性決定領域（「CDR」）を有する可変重（VH）鎖、ならびに本明細書においてVL CDR#1、VL CDR#2、およびVL CDR#3と呼ぶ（N→Cの順に）3つの相補性決定領域を有する可変軽（VL）鎖を含む。いくつかの例示的抗CS1抗体の重鎖および軽鎖のVHおよびVL領域のアミノ酸配列が決定され、それらのCDRが同定されている。抗体Mu27H1を例外として、本明細書において開示する例示的抗CS1抗体のそれぞれの重鎖および軽鎖CDRの配列は、高度の類似性を示す。したがって、本明細書において開示する、重鎖CDRの任意の組み合わせおよび軽鎖CDRの任意の組み合わせ、ならびにVHおよびVL鎖の任意の組み合わせを含む抗CS1抗体が企図される。抗CS1抗体に組み込み得るCDR、VH鎖およびVL鎖の具体的な例示的態様、ならびにHuCS1の結合について参照抗体と競合する抗CS1抗体の具体的な例示的態様を、詳細な説明の項で提供する。
【００１１】
本明細書に記載の抗CS1抗体は、Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、scFv（単鎖Fv）、サロボディ（surrobody）（代替軽鎖作成物を含む）、単一ドメイン抗体、ラクダ化抗体などを含むが、それらに限定されない、ヒトCS1に特異的に結合する、全長抗体、二重特異性抗体、二重可変ドメイン抗体、多重鎖もしくは単鎖抗体、および/または結合断片の形であり得る。それらは、例えば、IgA（例えば、IgA1またはIgA2）、IgD、IgE、IgG（例えば、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4）、またはIgMを含む、任意のアイソタイプのものであり得るか、またはそれから誘導され得る。いくつかの態様において、抗CS1抗体はIgG（例えば、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4）である。抗CS1抗体は、ヒトまたは非ヒト起源のものであり得る。非ヒト起源の例には、哺乳動物起源（例えば、サル、齧歯類、ヤギ、およびウサギ）を含むが、それに限定されない。
【００１２】
本明細書に記載の抗CS1抗体および/または結合断片は、当技術分野において公知の、半減期を延ばす、ADCCを増大または減少させるなどの、抗体および/または結合断片の特性を変える改変および/または変異も含み得る。
【００１３】
用途によっては、HuCS1への高い親和性を有する抗CS1抗体を有することが望ましいこともあれば；親和性は重要でないこともある。治療的用途などの、一定の用途のために、少なくとも約100nMの親和性が望ましい。特異的な親和性が望まれる適用のために、抗CS1抗体は、少なくとも約100nM、またはさらに高い、例えば、少なくとも約90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、15nM、10nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.1nM、0.01nM、またはそれ以上の親和性で、HuCS1に特異的に結合する。抗CS1抗体の親和性は、例えば、ELISA、等温滴定熱量測定（ITC）、ビアコア、または蛍光偏光検定などの、当技術分野において周知の、または本明細書に記載の技術を用いて決定することができる。
【００１４】
もう1つの局面において、本開示は、リンカーによって本明細書において開示する抗CS1抗体および/または結合断片に連結された細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質を含む、抗体薬物結合体（ADC）を提供する。細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質は、細胞、特に癌ならびに/または腫瘍細胞の成長および/または複製を阻害すること、ならびに/またはそれらを死滅させることが公知の、任意の作用物質であり得る。細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性特性を有する多くの作用物質が、文献において公知である。細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質のクラスの非限定例には、例としてであって、限定としてではなく、アルキル化剤、DNA挿入剤（例えば、小溝結合剤などの溝結合剤）、トポイソメラーゼI阻害剤、トポイソメラーゼII阻害剤、細胞周期調節剤、キナーゼ阻害剤、タンパク質合成阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ミトコンドリア阻害剤、RNA/DNA代謝拮抗剤および有糸分裂阻害剤が含まれる。抗体への結合部位を含むまたはそれを含むように改変されていてもよいこれらの作用物質の任意のもの、または他の細胞傷害性および/もしくは細胞増殖抑制性作用物質が、本明細書において開示するADCに含まれてもよい。具体的態様において、細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質は、有糸分裂阻害剤である。もう1つの具体的態様において、オーリスタチン、例えば、モノメチルオーリスタチンE（「MMAE」）またはモノメチルオーリスタチンF（「MMAF」）である。
【００１５】
ADCの細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質を抗体に連結しているリンカーは、本質的に長い、短い、可動性、剛性、親水性もしくは疎水性であってもよく、または可動性セグメント、剛性セグメントなどの、異なる特徴を有するセグメントを含んでもよい。リンカーは、細胞外環境に対して化学的に安定、例えば、血流中で化学的に安定であってもよく、または細胞外環境において安定でなく、細胞傷害性および/もしくは細胞増殖抑制性作用物質を放出する連結を含んでもよい。いくつかの態様において、リンカーは、細胞内でのADCの内部移行後に細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質を放出するよう設計された連結を含む。いくつかの具体的態様において、リンカーは、細胞内で特異的または非特異的に開裂する、および/もしくは犠牲になる、またはそれ以外に分解するよう設計された連結を含む。ADCの状況において、薬物を抗体に連結するのに有用な、多様なリンカーが当技術分野において公知である。これらのリンカー、ならびに他のリンカーのいずれを用いて、細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質を本明細書に記載のADCの抗体に連結してもよい。
【００１６】
ADCの抗体に連結された細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質の数は変動し得（「薬物 対 抗体比」または「DAR」と呼ぶ）、抗体上の利用可能な結合部位の数、および単一のリンカーに連結した作用物質の数によってのみ限定されることになる。典型的には、リンカーは単一の細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質をADCの抗体に連結することになる。複数の細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質を含むADCの態様において、各作用物質は同じでも、異なっていてもよい。ADCが使用および/または保存条件下で許容されないレベルの凝集を示さないかぎり、20、またはさらに高いDARを有するADCが企図される。いくつかの態様において、本明細書に記載のADCは、約1〜10、1〜8、1〜6、または1〜4の範囲のDARを有してもよい。一定の具体的態様において、ADCはDAR 2、3または4を有してもよい。
【００１７】
いくつかの態様において、ADCは構造式（I）の化合物またはその塩である：
（I）  [D-L-XY]n-Ab
式中、各「D」は、他とは独立に、細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質を表し；各「L」は、他とは独立に、リンカーを表し；「Ab」は、本明細書に記載の抗CS1抗体または結合断片などの、抗CS1抗原結合部分を表し；各「XY」は、リンカー上の官能基Rxと抗体上の「相補的」官能基Ryとの間で形成される連結を表し、かつnはADCのDARを表す。1つの具体的態様において、各「D」は同じであり、各「L」は同じであり、かつ「Ab」は抗体または結合断片である。具体的態様において、ADCは、「D」がオーリスタチン、例えば、MMAEまたはMMAFであり、「L」がリソソーム酵素によって切断可能なリンカーであり、「XY」がマレイミドとスルフヒドリル基との間で形成される連結であり、「Ab」が抗体Hu34C3またはその結合断片であり、かつnが2、3または4である、構造式（I）の化合物である。
【００１８】
もう1つの局面において、本開示は、本明細書に記載の抗CS1抗体および/またはADCを含む組成物を提供する。組成物は一般には、本明細書に記載の1つまたは複数の抗CS1抗体、結合断片および/もしくはADC、ならびに/またはその塩、および1つまたは複数の賦形剤、担体もしくは希釈剤を含む。組成物は、医薬用途、または他の用途のために製剤化されてもよい。1つの具体的態様において、組成物は、医薬用途のために製剤化され、抗CS1抗体Hu34C3、またはその薬学的に許容される塩、および1つまたは複数の賦形剤、担体もしくは希釈剤を含む。もう1つの具体的態様において、組成物は、医薬用途のために製剤化され、「D」がオーリスタチン、例えば、MMAEまたはMMAFであり、「L」がリソソーム酵素によって切断可能なリンカーであり、「Ab」が抗体Hu34C3またはその結合断片であり、かつnが2、3または4である、構造式（I）のADCまたはその薬学的に許容される塩、および1つまたは複数の賦形剤、担体もしくは希釈剤を含む。
【００１９】
医薬用途のために製剤化された組成物を、複数回投与に適したバルク形態で包装してもよく、または1回投与に適した単位用量の形態で包装してもよい。バルク包装しようが、単位用量の形態で包装しようが、組成物は、凍結乾燥物などの乾燥形態、または液体形態で提示してもよい。単位用量液体組成物は、1回投与に適した量の抗体またはADCをあらかじめ充填したシリンジの形態で、都合よく包装してもよい。
【００２０】
同様に提供するのは、本明細書に記載の新しい抗CS1抗体をコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドで形質転換またはポリヌクレオチドを形質移入した宿主細胞、ならびに本明細書に記載の様々な抗CS1抗体およびADCの作製法である。
【００２１】
抗CS1抗体、結合断片およびADCは、形質細胞および多発性骨髄腫細胞などの、CS1を発現している細胞上のCS1に結合し、増殖を阻害し、かつ/または細胞死を誘導する。したがって、もう1つの局面において、本開示は、形質細胞腫瘍、例えば、多発性骨髄腫と診断された、ヒト対象などの対象の処置法を提供する。方法は、一般には、治療的恩典を提供するのに有効な量の、本明細書に記載の抗CS1抗体、結合断片および/またはADCを対象に投与する段階を含む。対象は、意義不明の単クローン性免役グロブリン血症（MGUS）、形質細胞腫、くすぶり型-無症候性多発性骨髄腫、または症候性多発性骨髄腫と診断されてもよい。形質細胞腫瘍、例えば、多発性骨髄腫は、新しく診断されてもよく、または再発性、もしくは再発性かつ難治性であってもよい。抗CS1抗体および/または結合断片は、典型的には、静脈内注入として、0.5〜20mg/kgの範囲の用量で、1週間に1回〜1ヶ月に1回投与する。抗CS1 ADCは、典型的には、静脈内注入として、0.15mg/kg〜10mg/kgの範囲の用量で、1週間に1回、2週間毎に1回、3週間毎に1回、または1ヶ月に1回投与する。
【００２２】
抗CS1抗体、結合断片および/またはADCは、単一の治療剤（単剤療法）として、または典型的には、形質細胞腫瘍、例えば、MMの処置のために用いられる治療剤であるが必ずしもそうではない治療剤と共に付加的にもしくはそれらに対して補助的に、投与してもよい。治療剤に応じて、抗CS1抗体、結合断片またはADCを、1週間に1回、2週間毎に1回、3週間毎に1回から1ヶ月に1回投与してもよい。治療剤は、典型的には、それらの承認された用量、投与経路、および投与頻度で使用することになるが、より低い用量で用いてもよい。
【００２３】
ADCは、静脈内注入および/または注射ならびに皮下注射を含むが、それらに限定されない、様々な経路または投与様式によって投与してもよい。投与する量は、当技術分野において周知のとおり、投与経路、投薬スケジュール、処置中の癌の病期、ならびに患者の年齢および体重などの他のパラメーターに依存することになる。治療的恩典を提供すると予期される具体的な投薬スケジュールの例を、詳細な説明に提供する。
【００２４】
抗CS1抗体エロツズマブは、臨床試験において、レナリドマイドおよびデキサメタゾンなどの、現行の標準治療に対して補助的にまたはそれらと共に付加的に投与した場合に、多発性骨髄腫の処置において著しい見込みを示した。本明細書において提示するデータに基づいて、本明細書に記載の抗CS1ADCは、単剤療法として投与した場合、多発性骨髄腫と診断された対象に治療的恩典を提供することになる。
[本発明1001]
ヒトCS1を発現する細胞の結合について、表3に挙げる抗体から選択される対照抗体と競合する抗体。
[本発明1002]
対照抗体が抗体Hu34C3である、本発明1001の抗体または結合断片。
[本発明1003]
実施例6の競合結合検定において、対照抗体の結合を少なくとも20％減少させる、本発明1002の抗体。
[本発明1004]
（i）3つのCDRを含むVH鎖；および（ii）3つのCDRを含むVL鎖を含み、
VH CDR#1は式
2020111583.tif 000003
を有し、式中：
X1は芳香族残基であり；
VH CDR#2は式
2020111583.tif 000004
を有し、式中：
X2は極性残基または酸残基であり、
X3は極性残基、非極性残基または酸性残基であり、
X4は芳香族残基であり、
X5は脂肪族残基であり、
X6は脂肪族残基であり、かつ
X7は小型残基であり；
VH CDR#3は式
2020111583.tif 000005
を有し、式中：
X8は芳香族残基であり；
VL CDR#1は式
2020111583.tif 000006
を有し、式中：
X9は極性残基または芳香族残基であり、
X10は極性残基または塩基性残基であり、かつ
X11は極性残基または脂肪族残基であり；
VL CDR#2は
2020111583.tif 000007
であり；かつ
VL CDR#3は式
2020111583.tif 000008
を有し、式中：
X12は芳香族残基である、本発明1001の抗体。
[本発明1005]
VH CDR#2が式
2020111583.tif 000009
を有し、式中：
X2はS、DまたはEであり；
X3はS、E、GまたはNであり；
X4はYまたはFであり；
X5はVまたはLであり；
X6はVまたはLであり；かつ
X7はGまたはSであり；
VH CDR#3が式
2020111583.tif 000010
を有し、式中：
X8はYまたはFであり；
VL CDR#1が式
2020111583.tif 000011
を有し、式中：
X9はSまたはFであり；
X10はS、NまたはRであり；かつ
X11はNまたはLであり；かつ
VL CDR#3が式
2020111583.tif 000012
を有し、式中：
X12はFまたはYである、本発明1004の抗体。
[本発明1006]
VH CDR#1が、
2020111583.tif 000013
から選択され；
VH CDR#2が、
2020111583.tif 000014
から選択され；
VH CDR#3が、
2020111583.tif 000015
から選択され；
VL CDR#1が、
2020111583.tif 000016
から選択され；
VL CDR#2が、
2020111583.tif 000017
から選択され；
VL CDR#3が、
2020111583.tif 000018
から選択される、本発明1004の抗体。
[本発明1007]
配列がSEQ ID NO:8に対応するVH鎖および配列がSEQ ID NO:10に対応するVL鎖を含む、本発明1001の抗体。
[本発明1008]
配列がSEQ ID NO:34に対応する重鎖および配列がSEQ ID NO:35に対応する軽鎖を含む、本発明1001〜1007のいずれかの抗体。
[本発明1009]
IgG1である、本発明1001の抗体。
[本発明1010]
実施例5の競合結合検定において、ヒトCS1を発現する細胞の結合について、PDL241、エロツズマブおよびLuc34.3.8からなる群より選択される対照抗体と競合しない、本発明1001の抗体。
[本発明1011]
遊離スルフヒドリル基をもつ1つまたは複数の還元システイン残基を有する、本発明1001の抗体。
[本発明1012]
リンカーによって本発明1001〜1011のいずれかの抗体に連結された細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質を含む、抗体薬物結合体（「ADC」）。
[本発明1013]
1〜10の範囲の薬物 対 抗体比平均値を有する、本発明1012のADC。
[本発明1014]
2〜4の範囲の薬物 対 抗体比平均値を有する、本発明1012のADC。
[本発明1015]
リンカーがリソソーム酵素によって切断可能である、本発明1012のADC。
[本発明1016]
リソソーム酵素がカテプシンBである、本発明1013のADC。
[本発明1017]
リンカーが構造式（IVa）もしくは（IVb）またはその塩のセグメントを含む、本発明1016のADC：
2020111583.tif 000019
式中：
ペプチドは、リソソーム酵素によって切断可能なペプチド（C→Nで図示され、カルボキシ「末端」およびアミノ「末端」は示していない）を表し；
Tは、1つもしくは複数のエチレングリコール単位または1つのアルキレン鎖、あるいはその組み合わせを含むポリマーを表し；
Raは、水素、アルキル、スルホネートおよびメチルスルホネートから選択され；
pは0〜5の範囲の整数であり；
qは0または1であり；
xは0または1であり；
yは0または1であり；
2020111583.tif 000020
は、リンカーの細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質への連結点を表し；かつ
*は、リンカーの残りの部分への連結点を表す。
[本発明1018]
ペプチドが
2020111583.tif 000021
ならびにこれらの塩からなる群より選択される、本発明1017のADC。
[本発明1019]
リソソーム酵素がβ-グルクロニダーゼである、本発明1015のADC。
[本発明1020]
リンカーが切断不可能でる、本発明1012のADC。
[本発明1021]
リンカーが、1〜6つのエチレングリコール単位を有するポリエチレングリコールセグメントを含む、本発明1012のADC。
[本発明1022]
細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質がカリケアマイシン、メイタンシノイド、オーリスタチンおよびドキソルビシンからなる群より選択される、本発明1012のADC。
[本発明1023]
細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質がMMAEまたはMMAFである、本発明1012のADC。
[本発明1024]
構造式（I）の化合物またはその塩である、本発明1012のADC：
（I）  [D-L-XY]n-Ab
式中：
Dは抗悪性腫瘍薬であり；
Lはリンカーであり；
Abは抗体であり；
XYは、リンカーLを抗体Abに連結する共有結合を表し；かつ
nは2〜8の範囲の整数である。
[本発明1025]
nが2、3または4である、本発明1024のADC。
[本発明1026]
リンカーLがリソソーム酵素によって切断可能である、本発明1024のADC。
[本発明1027]
XYが、抗体Ab上のアミノ基と形成される連結である、本発明1024のADC。
[本発明1028]
XYがアミドまたはチオ尿素である、本発明1026のADC。
[本発明1029]
XYが、抗体Ab上のスルフヒドリル基と形成される連結である、本発明1024のADC。
[本発明1030]
XYがチオエーテルである、本発明1029のADC。
[本発明1031]
XYが、マレイミドとスルフヒドリル基との間で形成される連結である、本発明1029のADC。
[本発明1032]
構造式（I）の化合物が式（IIa）の構造を有する、本発明1024のADC：
2020111583.tif 000022
式中、Abは抗体Hu34C3である。
[本発明1033]
nが2または4である、本発明1032のADC。
[本発明1034]
Dがオーリスタチンである、本発明1032のADC。
[本発明1035]
以下の構造を有する、本発明1024のADC：
2020111583.tif 000023
式中、Abは抗体Hu34C3であり、かつnは2または4である。
[本発明1036]
本発明1012〜1035のいずれかのADCならびに担体、賦形剤および/または希釈剤を含む、組成物。
[本発明1037]
ヒトにおける医薬用途のために製剤化される、本発明1036の組成物。
[本発明1038]
単位剤形である、本発明1037の組成物。
[本発明1039]
本発明1001〜1011のいずれかの抗体を、構造式（III）D-L-Rxのシントンと、シントンが該抗体にシントンを共有結合させる条件下で接触させることによって形成される、ADC：式中、Dは細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質であり、Lはリンカーであり、かつRxは、シントンを該抗体に共有結合することが可能な官能基を含む。
[本発明1040]
抗体がHu34C3である、本発明1039のADC。
[本発明1041]
細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質がオーリスタチンである、本発明1039のADC。
[本発明1042]
Rxがマレイミドを含む、本発明1039のADC。
[本発明1043]
抗体がHu34C3であり、かつ細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質がMMAEである、本発明1039のADC。
[本発明1044]
接触させる段階が、ADCがDAR 2、3または4を有するような条件下で実施される、本発明1039〜1043のいずれかのADC。
[本発明1045]
本発明1039のADCならびに賦形剤、担体および/または希釈剤を含む、組成物。
[本発明1046]
ヒトにおける医薬用途のために製剤化される、本発明1045の組成物。
[本発明1047]
単位剤形である、本発明1046の組成物。
[本発明1048]
本発明1001〜1011のいずれかの抗体を、構造式（III）D-L-Rxのシントンと、シントンが該抗体にシントンを共有結合させる条件下で接触させる段階を含む、ADCの作製法：式中、Dは細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質であり、Lはリンカーであり、かつRxは、シントンを該抗体に共有結合することが可能な官能基を含む。
[本発明1049]
抗体がHu34C3である、本発明1048の方法。
[本発明1050]
細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質がオーリスタチンである、本発明1048の方法。
[本発明1051]
Rxがマレイミドを含む、本発明1048の方法。
[本発明1052]
抗体がHu34C3であり、かつ細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質がMMAEである、本発明1048の方法。
[本発明1053]
形質細胞腫瘍を患っている対象に、治療的恩典を提供するのに十分な量の本発明1012〜1035のいずれかのADCを投与する段階を含む、形質細胞腫瘍を処置する方法。
[本発明1054]
形質細胞腫瘍が多発性骨髄腫である、本発明1053の方法。
[本発明1055]
ADCを単剤療法として投与する、本発明1053の方法。
[本発明1056]
ADCを、多発性骨髄腫を処置するために一般に用いられる別の薬剤に対して補助的にまたは該薬剤と共に付加的に投与する、本発明1053の方法。
[本発明1057]
他の薬剤がボルテゾミブ、ポマリドマイド、レナリドマイドおよびデキサメタゾンの1つまたは複数である、本発明1053の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
6.  図面の簡単な説明
【図１Ａ−１】図1Aは、ヒトCS1のアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）、ならびにコードするポリヌクレオチド配列（SEQ ID NO:2）を提供する。シグナルペプチドを点線の下線で示し；Igドメイン#1に下線を引き；Igドメイン#2に二重線の下線を引き、膜貫通ドメインを強調している。
【図１Ａ−２】図1A-1の続きを示す図である。
【図１Ｂ−１】図1Bは、カニクイザルCS1のアミノ酸配列（SEQ ID NO:3）、ならびにコードするポリヌクレオチド配列（SEQ ID NO:4）を提供する。シグナルペプチドを点線の下線で示し；Igドメイン#1に下線を引き；Igドメイン#2に二重線の下線を引き、膜貫通ドメインを強調している。
【図１Ｂ−２】図1B-1の続きを示す図である。
【図２Ａ−１】図2Aは、本明細書に記載の様々な抗体のVH鎖のアミノ酸配列を提供する。CDR配列をKabatナンバリングシステム（例示している）に従って太字の下線を引いた文字で示す。CDR内のヒト生殖細胞系の変化に二重線の下線を引き；Hu34C3に比べて親和性を増大させる変異を強調している。図2Aは、SEQ ID NO:5、7、8、12、14、16、17、21、23、24、28、30、および32を、それぞれ出現の順に開示する。
【図２Ａ−２】図2A-1の続きを示す図である。
【図２Ｂ−１】図2Bは、本明細書に記載の様々な抗体のVL鎖のアミノ酸配列を提供する。CDR配列をKabatナンバリングシステム（例示している）に従って太字の下線を引いた文字で示す。CDR内のヒト生殖細胞系の変化に二重線の下線を引き；Hu34C3に比べて親和性を増大させる変異を強調し、マウスフレームワーク逆突然変異を太字、イタリックの点線の下線を引いた文字で示す。図2Bは、SEQ ID NO: 6、9、10、11、13、15、18、19、20、22、25、26、27、29、31、および33を、それぞれ出現の順に開示する。
【図２Ｂ−２】図2B-1の続きを示す図である。
【図３Ａ】図3Aは、抗体Hu34C3におけるジスルフィド架橋を示す図である。重鎖および軽鎖の可変領域を灰色で示し；定常領域を黒色で示す。鎖内ジスルフィド架橋を白色で示し；鎖間ジスルフィド架橋を黒色の点描で示す。数字は鎖内のアミノ酸の位置を意味し、アミノ酸は1〜220（軽鎖）または1〜447（重鎖）まで連続に番号付け（N→Cの方向に）している。鎖間ジスルフィド架橋の1つまたは複数を還元してスルフヒドリル基を生じてもよく、これは本明細書に記載のADCにおける薬物の結合のために用いてもよい。
【図３Ｂ】図3Bは、抗体Hu34C3の軽鎖の予想アミノ酸配列（SEQ ID NO:35）を示す図である。鎖内ジスルフィド架橋に含まれるCys残基、ならびに鎖内ジスルフィド架橋を形成し、ADCにおける薬物のための可能な結合部位を提供するCys残基を示す。下線を引いた残基は定常領域に対応するものを示す。
【図３Ｃ】図3Cは、抗体Hu34C3の重鎖の予想アミノ酸配列（SEQ ID NO:34）を示す図を提供する。鎖内ジスルフィド架橋に含まれるCys残基、ならびに鎖内ジスルフィド架橋を形成し、ADCにおける薬物のための可能な結合部位を提供するCys残基を示す。同様に、N-連結グリコシル化部位（Asn-297）も示す。下線を引いた残基は定常領域に対応するものを示す。
【図４】図4は、例示的な新しい抗CS1抗体は抗体PDL241と競合せず、したがって抗体PDL241が結合するエピトープとは異なるヒトCS1のエピトープに結合することを示すグラフである。
【図５】図5は、例示的なヒト化抗CS1抗体は抗体PDL241と競合せず、したがって抗体PDL241が結合するエピトープとは異なるヒトCS1のエピトープに結合することを示すグラフである。
【図６】図6は、例示的なヒト化抗CS1抗体は抗体エロツズマブと競合せず、したがって抗体エロツズマブが結合するエピトープとは異なるヒトCS1のエピトープに結合することを示すグラフである。
【図７】図7は、例示的なヒト化抗CS1抗体は抗体Luc34.3.8と競合せず、したがって抗体Luc34.3.8が結合するエピトープとは異なるヒトCS1のエピトープに結合することを示すグラフである。
【図８】図8は、ヒト化抗CS1抗体Hu34C3が独特のエピトープに結合することを示すグラフである。
【図９Ａ】例示的なヒト化抗CS1抗体のMMAE ADCがU266異種移植モデルにおいてインビボで有効であることを示すグラフを提供する。
【図９Ｂ】例示的なヒト化抗CS1抗体のMMAE ADCがU266異種移植モデルにおいてインビボで有効であることを示すグラフを提供する。
【図１０】図10は、例示的なヒト化抗CS1抗体Hu34C3を含むADCは、インビトロで他の抗CS1抗体を含むADCよりも有効であることを示すグラフを提供する。
【図１１】図11は、例示的なヒト化抗CS1抗体Hu34C3を含むADCは、インビボで他の抗CS1抗体を含むADCよりも強力であることを示すグラフを提供する。
【図１２】図12は、Hu34C3に比べてHuCS1に対する増大した親和性を有する抗体Hu34C3の変異体を含むADCのインビトロ抗増殖活性を示すグラフを提供する。
【図１３】図13は、Hu34C3に比べてHuCS1に対する増大した親和性を有する抗体Hu34C3の変異体を含むADCのインビボ抗腫瘍活性を示すグラフを提供する。
【図１４Ａ】図14Aは、OPM-2細胞における、抗体Hu34C3およびピロロベンゾジアゼピンを含むADCのインビトロ抗増殖活性を示すグラフを提供する。
【図１４Ｂ】図14Bは、L-363細胞における、抗体Hu34C3およびピロロベンゾジアゼピンを含むADCのインビトロ抗増殖活性を示すグラフを提供する。
【図１４Ｃ】図14Cは、MM1.S細胞における、抗体Hu34C3およびピロロベンゾジアゼピンを含むADCのインビトロ抗増殖活性を示すグラフを提供する。
【図１４Ｄ】図14Dは、MOLP-8細胞における、抗体Hu34C3およびピロロベンゾジアゼピンを含むADCのインビトロ抗増殖活性を示すグラフを提供する。
【図１５】図15は、OPM-2異種移植片における、抗体Hu34C3およびピロロベンゾジアゼピンを含むADCのインビボ抗腫瘍活性を示すグラフを提供する。
【図１６】図16Aは、MM1.S細胞における、抗体Hu34C3のS239C変異体およびピロロベンゾジアゼピンを含むADCのインビトロ抗増殖活性を示すグラフを提供する。図16Bは、L-363細胞における、抗体Hu34C3のS239C変異体およびピロロベンゾジアゼピンを含むADCのインビトロ抗増殖活性を示すグラフを提供する。
【図１７】図17Aは、OPM-2細胞における、抗体Hu34C3およびトポイソメラーゼI阻害剤を含むADCのインビトロ抗増殖活性を示すグラフを提供する。図17Bは、L-363細胞における、抗体Hu34C3およびトポイソメラーゼI阻害剤を含むADCのインビトロ抗増殖活性を示すグラフを提供する。
【図１８】図18は、OPM-2異種移植片における、抗体Hu34C3およびトポイソメラーゼI阻害剤を含むADCのインビボ抗腫瘍活性を示すグラフを提供する。
【図１９Ａ】Hu34C3に比べて、低いADCC、増大した半減期および/または低減した飲作用を有するHu34C3のFc変異体を含むADCのインビボ抗腫瘍活性を示すグラフを提供する。
【図１９Ｂ】Hu34C3に比べて、低いADCC、増大した半減期および/または低減した飲作用を有するHu34C3のFc変異体を含むADCのインビボ抗腫瘍活性を示すグラフを提供する。
【図２０】図20は、Hu34C3のMMAE ADCは、対応するMMAF ADCよりもインビボで驚くほど有効であることを示すグラフを提供する。
【図２１】図21は、DAR平均値4まで負荷したHu34C3のMMAE ADC結合体の粗製製剤のクロマトグラフィ分離を示すグラフである。1抗体あたりゼロMMAE分子（「E0」）、1抗体あたり2MMAE分子（「E2」）、1抗体あたり4MMAE分子（「E4」）、1抗体あたり6MMAE分子（「E6」）および1抗体あたり8MMAE分子（「E8」）を含む、様々なHu34C3 ADCピークの保持時間をX軸上に示す。
【図２２Ａ】濃縮ADCであるHu34C3-MMAE E2のインビボ活性を比較するグラフを提供する。
【図２２Ｂ】濃縮ADCであるHu34C3-MMAE E4のインビボ活性を比較するグラフを提供する。
【図２３Ａ】動物モデルL-363モデルにおける、濃縮ADCであるHu34C3-MMAE E2およびHu34C3-MMAE E4のインビボ活性を比較するグラフを提供する。
【図２３Ｂ】動物モデルMM1.Sモデルにおける、濃縮ADCであるHu34C3-MMAE E2およびHu34C3-MMAE E4のインビボ活性を比較するグラフを提供する。
【図２３Ｃ】動物モデルMOLP-8異種移植モデルにおける、濃縮ADCであるHu34C3-MMAE E2およびHu34C3-MMAE E4のインビボ活性を比較するグラフを提供する。
【図２４Ａ】ADC Hu34C3-MMAE E2がラットにおいてHu34C3-MMAE E4よりも毒性が低いことを示すグラフを提供する。
【図２４Ｂ】ADC Hu34C3-MMAE E2がラットにおいてHu34C3-MMAE E4よりもよく耐容されることを示すグラフを提供する。
【図２４Ｃ】ADC Hu34C3-MMAE E2がラットにおいてHu34C3-MMAE E4よりもよく耐容されることを示すグラフを提供する。
【図２４Ｄ】ADC Hu34C3-MMAE E2がラットにおいてHu34C3-MMAE E4よりもよく耐容されることを示すグラフを提供する。
【図２５】図25は、エフェクター細胞陰性マウスにおける、ADC Hu34C3-MMAE E2単独およびボルテゾミブとの併用によるOPM-2異種移植片の成長阻害を示すグラフを提供する。
【図２６Ａ】エフェクター細胞陰性マウスにおける、ADC Hu34C3-MMAE E2単独およびカーフィルゾミブとの併用によるOPM-2異種移植片の成長阻害を示すグラフを提供する。1.5mg/kgの用量でのカーフィルゾミブによる結果を示すグラフを提供する。
【図２６Ｂ】エフェクター細胞陰性マウスにおける、ADC Hu34C3-MMAE E2単独およびカーフィルゾミブとの併用によるOPM-2異種移植片の成長阻害を示すグラフを提供する。3mg/kgの用量でのカーフィルゾミブによる結果を示すグラフを提供する。
【図２７】図27は、エフェクター細胞陰性マウスにおける、ADC Hu34C3-MMAE E2単独ならびにポマリドマイドおよび/またはデキサメタゾンとの併用によるOPM-2異種移植片の成長阻害を示すグラフを提供する。
【図２８】図28は、エロツズマブおよびレナリドマイドの併用により前処置したエフェクター細胞陰性マウスにおける、ADC Hu34C3-MMAE E2の異なる用量によるL-363異種移植片の成長阻害を示すグラフを提供する。
【図２９】図29は、ADC Hu34C3-MMAE E2の、単独で、ならびにボルテゾミブ、ポマリドマイドおよび/またはレナリドマイドとデキサメタゾンに対して補助的に投与した場合の、抗腫瘍活性を示すグラフを提供する。
【図３０】図30は、抗体PDL241（それぞれSEQ ID NO:38およびSEQ ID NO:39）、エロツズマブ（それぞれSEQ ID NO:36およびSEQ ID NO:37）、およびLuc34.3.8（それぞれSEQ ID NO:40およびSEQ ID NO:41）のVHおよびVL配列を提供する。太線の下線領域はCDRを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
7.  詳細な説明
本開示は、HuCS1に特異的に結合し、CmCS1と交差反応性である抗体、抗体を含むADC、抗体および/またはADCを含む組成物、抗CS1抗体をコードするポリヌクレオチド、抗CS1抗体を産生可能な宿主細胞、抗CS1抗体およびADCの作製法、ならびに抗CS1抗体ADCの様々な使用法に関する。
【００２７】
当業者であれば理解するであろうとおり、抗体および/または結合断片は本質的に「モジュール式」である。本開示の全体を通して、抗体および/または結合断片を含む、様々な「モジュール式」の様々な具体的態様を記載する。具体的な拘束力のない例として、VH CDR、VH鎖、VL CDRおよびVL鎖の様々な具体的態様を記載する。すべての具体的態様は、各具体的組み合わせが明白に記載されたかのように、互いに組み合わせてもよい。
【００２８】
本明細書において開示するADCは本質的に「モジュール式」である。本開示の全体を通して、ADCを含む、様々な「モジュール式」の様々な具体的態様を記載する。具体的な非限定例として、ADCを構成し得る抗体、リンカー、ならびに細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質の具体的態様を記載する。記載するすべての具体的態様は、各具体的組み合わせが個々に明白に記載されたかのように、互いに組み合わせてもよい。
【００２９】
当業者であれば、本明細書に記載の様々な抗CS1抗体およびADCは塩、およびいくつかの具体的態様において、薬学的に許容される塩の形態であり得ることも理解するであろう。十分に酸性、十分に塩基性、または両方の官能基を有する、本開示の抗CS1抗体および/またはADCは、いくつかの無機塩基、ならびに無機および有機酸のいずれと反応して塩を形成することもできる。または、四級窒素を有するものなどの、本来荷電している化合物は、適切な対イオンとの塩、例えば、臭化物、塩化物、またはフッ化物などのハロゲン化物を形成することもできる。
【００３０】
酸付加塩を形成するために一般的に用いられる酸は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸、およびp-トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、p-ブロモフェニル-スルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸などの有機酸である。塩基付加塩には、水酸化、炭酸、炭酸水素アンモニウムおよびアルカリまたはアルカリ土類金属などの、無機塩基から誘導されるものが含まれる。
【００３１】
7.1.  略号
本明細書に記載の抗体、結合断片、ADCおよびポリヌクレオチドは、多くの態様において、それらのそれぞれのポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列によって記載する。特に記載がないかぎり、ポリペプチド配列はN→Cの配向で提供し；ポリヌクレオチド配列は5'→3'の配向で提供する。以下の表1に示すとおり、ポリペプチド配列のために、遺伝的にコードされたアミノ酸に対し通常の3文字または1文字略号を用いる。
【００３２】
（表１）コードされたアミノ酸略号
2020111583.tif 000024
【００３３】
一定の配列は、一定のクラス（例えば、脂肪族、疎水性など）に属するアミノ酸残基を指定する構造式によって定義される。本明細書において用いられる遺伝的にコードされたアミノ酸が属する様々なクラスを、以下の表2に示す。いくつかのアミノ酸は複数のクラスに属してもよい。スルフヒドリル基を含むシステイン、および高次構造的に制約されているプロリンは、クラスに割り当てられない。
【００３４】
（表２）コードされたアミノ酸クラス
2020111583.tif 000025
【００３５】
本明細書において開示する様々な例示的および他の抗体に対して用いる略号を、以下の表3に提供する。
【００３６】
（表３）抗体略号
2020111583.tif 000026
【００３７】
7.2.  定義
本明細書において他に定義されていない限り、本開示に関して用いられる科学的および技術的用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。
【００３８】
本明細書において用いられる「エロツズマブ」は、米国特許第7,709,610号（「第'610号特許」）において「HuLuc63」として開示されている、モノクローナルヒト化IgG1抗体を意味する。VH鎖の配列は第'610号特許においてSEQ ID NO:41として開示され；VL鎖の配列は第'610号特許においてSEQ ID NO:44として開示されている。これらの配列を図30に示す。
【００３９】
本明細書において用いられる「PDL241」は、US Pub. No. 2006/0024296においてLucXとして開示されている抗体から誘導される、モノクローナルヒト化IgG1抗体を意味する。VHおよびVL鎖の配列を図30に示す。
【００４０】
本明細書において用いられる「Luc34.3.8」は、米国特許第US 8,445,646号（「第'646号特許」）において「Luc34」として記載されている、マウスモノクローナルIgG1抗体を意味する。VH鎖の配列は第'646号特許においてSEQ ID NO:7として開示され；VL鎖の配列は第'646号特許においてSEQ ID NO:8として開示されている。これらの配列を図30に示す。
【００４１】
7.3.  抗CS1抗体
本開示の1つの局面は、文献に報告されている抗CS1抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープで、ヒトHuCS1（SEQ ID NO:1）に特異的に結合し、かつPDL241、エロツズマブおよびLuc34.3.8が結合するエピトープとは異なるエピトープに特異的に結合する、新しい抗CS1抗体に関する。さらに、エロツズマブとは異なり、新しい抗体はCmCS1と交差反応し、これは、カニクイザルでそれらの生物学的特性を試験または確認することが可能になるという利点を提供する。
【００４２】
本明細書において用いられる「抗体」（Ab）なる用語は、特定の抗原、ここではHuCS1に特異的に結合するか、またはそれと免疫学的に反応性である、免役グロブリン分子を意味する。本開示の抗CS1抗体はHuCS1に結合して、CS1を発現する細胞の増殖を阻害し、いくつかの場合には、CS1を発現する細胞に対して細胞傷害性である。本開示の抗CS1抗体は、軽鎖および重鎖両方の可変ドメインに、超可変領域としても公知の、相補性決定領域（CDR）を含む。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク（FR）と呼ばれる。当技術分野において公知のとおり、抗体の超可変領域を線引きするアミノ酸の位置/境界は、状況および当技術分野において公知の様々な定義に応じて変動し得る。可変ドメイン内のいくつかの位置は、1組の基準の下では超可変領域内であるとみなされ得る一方、異なる組の基準の下では超可変領域外であるとみなされるため、これらの位置は混成超可変位置と考えてもよい。これらの位置の1つまたは複数は、拡大された超可変領域において見出すこともできる。本開示は、これらの混成超可変位置における改変を含む抗体を提供する。天然重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、主にβシート構造を取ることにより3つのCDRによって連結された4つのFR領域を含み、これらは、βシート構造を連結しかつ場合によってはβシート構造の一部を形成する、ループを形成する。各鎖中のCDRはFR領域によってすぐそばにまとめられ、もう一方の鎖からのCDRと共に、抗体の標的結合部位の形成に貢献する。Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987) を参照されたい。本明細書において用いられる免役グロブリンアミノ酸残基の番号付けは、特に記載がないかぎり、Kabatらの免役グロブリンアミノ酸残基の番号付けシステムに従って行う。
【００４３】
下記の実施例1に記載の方法を用いて、HuCS1に結合し、CmCS1と交差反応性である、多くの抗体を同定した。さらに、HuCS1に対して良好な親和性を有し、インビトロおよび/またはインビボ検定で良好な抗腫瘍活性を有する、いくつかの抗CS1抗体を同定し、それらのCDRならびに可変重鎖および軽鎖の配列を決定した。VH鎖、VL鎖およびCDRの配列を図2に提供する。競合検定において証明したとおり、すべての抗体は、文献に報告されている抗CS1抗体が結合するエピトープ、特にPDL241、エロツズマブおよびLuc34.3.8が結合するエピトープとは異なるエピトープに結合する。抗体Mu34C3およびそのヒト化型Hu34C3は、独特のエピトープに結合する。
【００４４】
本開示の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、霊長類化抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体、二重可変ドメイン抗体などを含むが、それらに限定されない、本質的にポリクローナル、モノクローナル、遺伝子操作された、および/またはそれ以外に改変されたものであってもよい。様々な態様において、抗体は抗体の定常領域のすべて、または一部を含む。いくつかの態様において、定常領域は下記から選択されるアイソタイプである：IgA（例えば、IgA1またはIgA2）、IgD、IgE、IgG（例えば、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4）、およびIgM。具体的な態様において、本明細書に記載の抗体はIgG1定常領域アイソタイプを含む。
【００４５】
本明細書において用いられる「モノクローナル抗体」なる用語は、ハイブリドーマ技術によって産生された抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一クローンから、当技術分野において利用可能または公知の任意の手段によって誘導される。本開示において有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術、またはその組み合わせの使用を含む、当技術分野において公知の多様な技術を用いて調製することができる。ヒトにおける抗CS1抗体のインビボでの使用を含む、本開示の多くの使用において、キメラ、霊長類化、ヒト化、またはヒト抗体を適切に用いることができる。
【００４６】
本明細書において用いられる「キメラ」抗体なる用語は、ラットまたはマウス抗体などの、非ヒト免役グロブリン由来の可変配列、および典型的にはヒト免役グロブリン鋳型から選択されるヒト免役グロブリン定常領域を有する抗体を意味する。キメラ抗体の産生法は当技術分野において公知である。例えば、Morrison, 1985, Science 229(4719):1202-7；Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214-221；Gillies et al., 1985, J. Immunol. Methods 125:191-202；米国特許第5,807,715号；第4,816,567号；および第4,816397号を参照されたく、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００４７】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免役グロブリン由来の最小限の配列を含むキメラ免役グロブリンである。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここでCDR領域のすべて、または実質的にすべては非ヒト免役グロブリンのものに対応し、かつFR領域のすべて、または実質的にすべてはヒト免役グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、免役グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも一部、典型的にはヒト免役グロブリンコンセンサス配列のものも含み得る。抗体のヒト化の方法は当技術分野において公知である。例えば、Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-7；Queenらへの米国特許第5,530,101号：第5,585,089号：第5,693,761号：第5,693,762号：および第6,180,370号；EP239400；PCT公報WO 91/09967；米国特許第5,225,539号；EP592106；EP519596；Padlan, 1991, Mol. Immunol., 28:489-498；Studnicka et al., 1994, Prot. Eng. 7:805-814；Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973；および米国特許第5,565,332号を参照されたく、これらはすべてその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００４８】
「ヒト抗体」には、ヒト免役グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、かつヒト免役グロブリンライブラリから、または1つもしくは複数のヒト免役グロブリンについて遺伝子導入した動物から単離され、内因性免役グロブリンを発現しない抗体が含まれる。ヒト抗体は、ヒト免役グロブリン配列由来の抗体ライブラリを用いてのファージディスプレイ法を含む、当技術分野において公知の様々な方法によって作製することができる。米国特許第4,444,887号および第4,716,111号；ならびにPCT公報WO 98/46645；WO 98/50433；WO 98/24893；WO 98/16654；WO 96/34096；WO 96/33735；およびWO 91/10741を参照されたく、これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる。ヒト化抗体は、機能的内因性免役グロブリンを発現することができないが、ヒト免役グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて産生することもできる。例えば、PCT公報WO 98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；米国特許第5,413,923号：第5,625,126号：第5,633,425号：第5,569,825号：第5,661,016号：第5,545,806号：第5,814,318号：第5,885,793号：第5,916,771号：および第5,939,598号を参照されたく、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。加えて、Medarex（Princeton、NJ）、Astellas Pharma（Deerfield、IL）、Amgen（Thousand Oaks、CA）およびRegeneron（Tarrytown、NY）などの会社は、前述のものに類似の技術を用いて、選択した抗原に対するヒト抗体を提供するために関与することができる。選択したエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導選択」と呼ばれる技術を用いて生成することができる。このアプローチにおいて、選択した非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を用いて、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導する（Jespers et al., 1988, Biotechnology 12:899-903参照）。
【００４９】
「霊長類化抗体」は、サル可変領域およびヒト定常領域を含む。霊長類化抗体の産生法は当技術分野において公知である。例えば、米国特許第5,658,570号；第5,681,722号；および第5,693,780号を参照されたく、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００５０】
本開示の抗CS1抗体は、全長（無傷）抗体分子、ならびにHuCS1に特異的に結合することが可能な結合断片の両方を含む。抗体結合断片の例には、例としてであるが、限定ではなく、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv断片、単鎖Fv断片および単一ドメイン断片が含まれる。
【００５１】
Fab断片は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第1の定常ドメイン（CH1）を含む。Fab'断片は、抗体ヒンジ領域からの1つまたは複数のシステインを含む、重鎖CH1ドメインのカルボキシル末端での少数の残基の付加により、Fab断片とは異なる。F(ab')断片は、F(ab')2ペプシン消化産物のヒンジシステインでのジスルフィド結合の切断により産生される。抗体断片のさらなる化学カップリングは当業者には公知である。FabおよびF(ab')2断片は、無傷抗体のFc断片を欠き、動物の循環からより速やかに除去され、無傷抗体よりも少ない非特異的組織結合を有し得る（例えば、Wahl et al., 1983, J. Nucl. Med. 24:316参照）。
【００５２】
「Fv」断片は、完全な標的認識および結合部位を含む抗体の最小断片である。この領域は、緊密に非共有結合した1つの重鎖および1つの軽鎖可変ドメインの二量体（VH-VL二量体）からなる。各可変ドメインの3つのCDRが相互作用して、VH-VL二量体の表面上の標的結合部位を定義するのは、この配置においてである。しばしば、6つのCDRが抗体に標的結合特異性を与える。しかし、いくつかの場合に、単一の可変ドメイン（または標的に特異的なCDRを3つしか含まないFvの半分）でも、全結合部位よりも親和性は低いが、標的を認識し、結合する能力を有し得る。
【００５３】
「単鎖Fv」または「scFv」抗体結合断片は、抗体のVHおよびVLドメインを含み、ここでこれらのドメインは単一のポリペプチド鎖で存在する。一般に、Fvポリペプチドは、scFvが標的結合のために望まれる構造を形成することを可能にする、VHドメインとVLドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。
【００５４】
「単一ドメイン抗体」は、HuCS1に対して十分な親和性を示す、単一のVHまたはVLドメインからなる。具体的態様において、単一ドメイン抗体はラクダ化抗体である（例えば、Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25-38参照）。
【００５５】
本開示の抗CS1抗体は、二重特異性抗体であってもよい。二重特異性抗体は、同じまたは異なる抗原上の2つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する、モノクローナルの、しばしばヒトまたはヒト化抗体である。本開示において、結合特異性の一方はCS1に対するものであり得、他方は任意の他の抗原、例えば、細胞表面タンパク質、受容体、受容体サブユニット、組織特異性抗原、ウイルス由来タンパク質、ウイルスによりコードされたエンベロープタンパク質、細菌由来タンパク質、または細菌表面タンパク質などに対するものであり得る。
【００５６】
本開示の抗CS1抗体には誘導体化抗体が含まれる。例えば、誘導体化抗体は、典型的にはグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護/ブロック基による誘導体化、タンパク質切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結により修飾されるが、それらに限定されない。多くの化学的修飾はいずれも、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むが、それらに限定されない、公知の技術によって実施することができる。加えて、誘導体は、例えば、ambrx技術を用いて、1つまたは複数の非天然アミノ酸を含むことができる（例えば、Wolfson, 2006, Chem. Biol. 13(10):1011-2参照）。
【００５７】
抗CS1抗体または結合断片は、その配列が少なくとも1つの定常領域仲介性生物学的エフェクター機能を変更するように改変されている、抗体または断片であってもよい。例えば、いくつかの態様において、抗CS1抗体は、非改変抗体に比べて、少なくとも1つの定常領域仲介性生物学的エフェクター機能を低減する、例えば、Fc受容体（FcγR）への結合を低減するように改変されていてもよい。FcγR結合は、抗体の免役グロブリン定常領域セグメントを、FcγR相互作用に必要な特定の領域で変異させることにより、低減することができる（例えば、Canfield and Morrison, 1991, J. Exp. Med. 173:1483-1491；およびLund et al., 1991, J. Immunol. 147:2657-2662参照）。抗体のFcγR結合能力の低減は、オプソニン化、食作用および抗原依存性細胞傷害活性（「ADCC」）などの、FcγR相互作用に依拠する他のエフェクター機能も低減し得る。
【００５８】
本明細書に記載の抗CS1抗体または結合断片は、非改変抗体に比べて、少なくとも1つの定常領域仲介性生物学的エフェクター機能を獲得または改善する、例えば、FcγR相互作用を増強するように改変されている、抗体および/または結合断片を含む（例えば、US 2006/0134709参照）。例えば、本開示の抗CS1抗体は、対応する野生型定常領域よりも高い親和性で、FcγRIIA、FCγRIIBおよび/またはFcγRIIIAに結合する定常領域を有し得る。
【００５９】
したがって、本開示の抗体は、オプソニン化、食作用、またはADCCの増大または減少をもたらす、生物活性の変更を有していてもよい。そのような変更は当技術分野において公知である。例えば、ADCC活性を低減させる抗体の改変は、米国特許第5,834,597号に記載されている。例示的なADCC低下変種は「変異体3」に対応し（米国特許第5,834,597号の図4に示す）、ここで残基236は欠失し、残基234、235および237（EUナンバリングを用いて）はアラニンで置換されている。
【００６０】
いくつかの態様において、本開示の抗CS1抗体は、低レベルのフコースを有するか、またはフコースを欠いている。フコースを欠いている抗体は、特に低用量の抗体で、ADCC活性の増強に関連づけられている。Shields et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:26733-26740；Shinkawa et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:3466-73を参照されたい。無フコース抗体の調製法には、ラット骨髄腫YB2/0細胞（ATCC CRL 1662）における成長が含まれる。YB2/0細胞は低レベルのFUT8 mRNAを発現し、これはポリペプチドのフコシル化に必要な酵素である、α-1,6-フコシルトランスフェラーゼをコードする。
【００６１】
さらにもう1つの局面において、抗CS1抗体または結合断片は、例えば、免役グロブリン定常領域セグメントをFcRn相互作用に関与する特定の領域で変異させることにより、胎児Fc受容体、FcRnに対するそれらの結合親和性を増大または減少させる改変を含む（例えば、WO 2005/123780参照）。特定の態様において、IgGクラスの抗CS1抗体を、重鎖定常領域のアミノ酸残基250、314、および428の少なくとも1つが単独で、またはその任意の組み合わせで、例えば、250位および428位で、もしくは250位および314位で、もしくは314位および428位で、もしくは250位、314位、および428位で置換されるように変異させ、250位および428位は特定の組み合わせである。250位について、置換アミノ酸残基は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン、またはチロシンを含むが、それらに限定されない、スレオニン以外の任意のアミノ酸残基であり得る。314位について、置換アミノ酸残基は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、またはチロシンを含むが、それらに限定されない、ロイシン以外の任意のアミノ酸残基であり得る。428位について、置換アミノ酸残基は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、またはチロシンを含むが、それらに限定されない、メチオニン以外の任意のアミノ酸残基であり得る。適切なアミノ酸置換の具体的組み合わせは、米国特許第7,217,797号の表1に同定されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。そのような変異はFcRnへの結合を増大させ、これは抗体を分解から保護し、その半減期を延長する。
【００６２】
さらに他の局面において、抗CS1抗体は、例えば、Jung and Plueckthun, 1997, Protein Engineering 10:9, 959-966；Yazaki et al., 2004, Protein Eng. Des Sel. 17(5):481-9. Epub 2004 Aug 17；および米国特許出願第2007/0280931号に記載のとおり、その超可変領域の1つまたは複数に挿入された1つまたは複数のアミノ酸を有する。
【００６３】
HuCS1に対する高い親和性を有する抗CS1抗体および/または結合断片は、治療的および診断的使用のために望ましいこともある。したがって、本開示は、HuCS1に対して高い結合親和性を有する抗体を企図する。具体的態様において、抗CS1抗体はHuCS1に少なくとも約100nMの親和性で結合するが、より高い親和性、例えば、少なくとも約90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、15nM、10nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.1nM、0.01nM、またはさらに高い親和性を示してもよい。いくつかの態様において、抗体はHuCS1に約1pM〜約100nMの範囲の親和性、または前述の値のいずれかの間の範囲の親和性で結合する。
【００６４】
HuCS1に対する抗CS1抗体の親和性は、例えば、ELISA、等温滴定熱量測定（ITC）、ビアコア、または蛍光偏光検定などであるが、それらに限定されない、当技術分野において周知の、または本明細書に記載の技術を用いて決定することができる。
【００６５】
いくつかの態様において、抗CS1抗体および/または結合断片のCDRのアミノ酸配列は以下のとおりである。
2020111583.tif 000027
【００６６】
いくつかの態様において、抗CS1抗体および/または結合断片のCDRのアミノ酸配列は以下の配列から選択される。
2020111583.tif 000028
【００６７】
いくつかの態様において、抗CS1抗体および/または結合断片の各CDRは、他とは独立に、表3に提供する抗体のそれぞれのCDRに配列が対応するように選択される。
【００６８】
いくつかの態様において、抗CS1抗体および/または結合断片はIgG1であり、SEQ ID NO:5、14、21、28、30または32の任意の1つに配列が対応するVH鎖；およびSEQ ID NO:6、15、22、29、31または33の任意の1つに配列が対応するVL鎖を含む。いくつかの態様において、抗CS1抗体および/または結合断片はIgG1であり、SEQ ID NO:5に配列が対応するVH鎖；およびSEQ ID NO:6に配列が対応するVL鎖を含む。いくつかの態様において、抗CS1抗体および/または結合断片はIgG1であり、SEQ ID NO:14に配列が対応するVH鎖；およびSEQ ID NO:15に配列が対応するVL鎖を含む。いくつかの態様において、抗CS1抗体および/または結合断片はIgG1であり、SEQ ID NO:21に配列が対応するVH鎖；およびSEQ ID NO:22に配列が対応するVL鎖を含む。いくつかの態様において、抗CS1抗体および/または結合断片はIgG1であり、SEQ ID NO:28に配列が対応するVH鎖；およびSEQ ID NO:29に配列が対応するVL鎖を含む。いくつかの態様において、抗CS1抗体および/または結合断片はIgG1であり、SEQ ID NO:30に配列が対応するVH鎖；およびSEQ ID NO:31に配列が対応するVL鎖を含む。いくつかの態様において、抗CS1抗体および/または結合断片はIgG1であり、SEQ ID NO:32に配列が対応するVH鎖；およびSEQ ID NO:33に配列が対応するVL鎖を含む。いくつかの態様において、抗CS1抗体はIgGであり、表3に提供する抗体のVHおよびVLに配列が対応するVHおよびVLを有する。
【００６９】
いくつかの態様において、抗CS1抗体および/または結合断片はヒトへの投与に適している。具体的態様において、抗CS1抗体はヒト化されている。もう1つの具体的態様において、抗CS1抗体および/または結合断片のCDRのアミノ酸配列は下記から選択される。
2020111583.tif 000029
【００７０】
いくつかの態様において、抗CS1抗体および/または結合断片はIgG1であり、SEQ ID NO:7、8、12、16、17、23または24の任意の1つに配列が対応するVH鎖およびSEQ ID NO:9、10、11、13、18、19、20、25、26または27の任意の1つに配列が対応するVL鎖を含む。いくつかの態様において、抗CS1抗体および/または結合断片はIgG1であり、SEQ ID NO:8に配列が対応するVH鎖およびSEQ ID NO:10に配列が対応するVL鎖を含む。いくつかの態様において、抗CS1抗体および/または結合断片はIgG1であり、SEQ ID NO:12に配列が対応するVH鎖およびSEQ ID NO:13に配列が対応するVL鎖を含む。いくつかの態様において、抗CS1抗体および/または結合断片はIgG1であり、SEQ ID NO:16に配列が対応するVH鎖およびSEQ ID NO:19に配列が対応するVL鎖を含む。いくつかの態様において、抗CS1抗体および/または結合断片はIgGであり、SEQ ID NO:24に配列が対応するVL鎖およびSEQ ID NO:27に配列が対応するVL鎖を含む。
【００７１】
いくつかの態様において、抗CS1抗体および/または結合断片は、インビトロ検定におけるCS1を発現する細胞上のヒトCS1の結合について、参照抗体と競合する。参照抗体は本明細書に記載の任意の抗CS1抗体であり得る。いくつかの態様において、参照抗体は表3に提供する抗体である。具体的態様において、参照抗体は、抗体CS1.AD159.34C3（「Mu34C3」）；抗体CS1.AD159.31D2（「Mu31D2」）；抗体CS1.AD159.27A12（「Mu27A12」）；抗体CS1.AD159.12D10（「Mu12D10」）；抗体CS1.AD159.14C11（「Mu14C11」）；抗体CS1.AD159.27H1（「Mu27H1」）；抗体CS1.AD159.28A6（「Mu28A6」）；および抗体CS1.AD15930C1（「Mu30C1」）から選択される。いくつかの態様において、参照抗体は、表3に提供する抗体のヒト化型である。いくつかの態様において、参照抗体はMu34C3、Mu27A12、Mu12D10、Mu14C11、Mu27A12、Mu12D10、Mu14C11、Mu27H1、Mu28A6またはMu30C1のヒト化型である。具体的態様において、参照抗体はHu34C3である。
【００７２】
競合についての検定には、放射性材料標識イムノアッセイ（RIA）、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）、サンドイッチELISA、蛍光標識細胞分取（FACS）検定およびビアコア検定が含まれるが、それらに限定されない。
【００７３】
参照抗体と試験抗体（種またはアイソタイプに無関係に）との間の抗体競合検定を行う際に、まず参照抗体をフルオロフォア、ビオチンまたは酵素（または放射性）標識などの検出可能な標識で標識して、その後の同定を可能にしてもよい。この場合、HuCS1を発現する細胞を非標識試験抗体とインキュベートし、標識した参照抗体を加え、結合した標識の強度を測定する。試験抗体が重複エピトープに結合することにより標識した参照抗体と競合すれば、強度は試験抗体なしで行った対照反応に比べて低減することになる。
【００７４】
この検定の具体的態様において、検定条件（例えば、指定の密度の細胞）下で最大結合の80％を生じる標識した参照抗体の濃度（「conc80％」）をまず判定し、競合検定を10×conc80％の非標識試験抗体およびconc80％の標識参照抗体で実施する。
【００７５】
阻害を、以下の式に従って計算する阻害定数、すなわちKiとして表すことができる：
Ki = IC50/(1+[参照Ab濃度]/Kd)
式中、IC50は参照抗体の結合の50％低減を生じる試験抗体の濃度であり、Kdは参照抗体の解離定数、すなわちそのHuCS1に対する親和性の尺度である。本明細書において開示する抗CS1抗体と競合する抗体は、本明細書に記載の検定条件下で、10pM〜10nMのKiを有し得る。
【００７６】
様々な態様において、用いる特定の検定条件下での最大結合の80％の参照抗体濃度、および参照抗体濃度よりも10倍高い試験抗体濃度で、試験抗体が参照抗体の結合を少なくとも約20％以上、例えば、少なくとも約20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％もしくはそれ以上、または前述の値のいずれかの間の範囲のパーセンテージ減少させるならば、試験抗体は参照抗体と競合すると考える。
【００７７】
抗体がHuCS1の結合について本明細書に記載の参照抗体と競合するかどうかを評価するのに有用な、具体的な検定および検定条件を、上記の実施例6に提供する。
【００７８】
7.4.  抗CS1抗体をコードするポリヌクレオチド、抗体の発現系および作製法
本開示は、本開示の抗CS1抗体の免役グロブリン軽鎖および重鎖遺伝子をコードする核酸分子、そのような核酸分子を含むベクター、および抗CS1抗体を産生可能な宿主細胞を含む。
【００７９】
本開示の抗CS1は、宿主細胞内での免役グロブリン軽鎖および重鎖遺伝子の組換え発現によって調製することができる。抗体を組換えによって発現させるために、軽鎖および重鎖が宿主細胞内で発現され、任意に、宿主細胞を培養する培地中に分泌され、その培地から抗体を回収し得るように、抗体の免役グロブリン軽鎖および重鎖をコードするDNA断片を有する1つまたは複数の組換え発現ベクターを宿主細胞に形質移入する。標準の組換えDNA法を用いて、抗体重鎖および軽鎖遺伝子を得、これらの遺伝子を組換え発現ベクターに組み込み、ベクターを、Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition（Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Cold Spring Harbor, N. Y., 1989）、Current Protocols in Molecular Biology（Ausubel, F.M. et ., eds., Greene Publishing Associates, 1989）および米国特許第4,816,397号に記載のものなどの、宿主細胞内に導入する。
【００８０】
そのような抗CS1抗体をコードする核酸を生成するために、まず軽鎖および重鎖可変領域をコードするDNA断片を得る。これらのDNAは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて、軽鎖および重鎖可変配列をコードする生殖細胞系DNAまたはcDNAの増幅および改変によって得ることができる。ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系DNA配列は当技術分野において公知である（例えば、「VBASE」ヒト生殖細胞系配列データベースを参照されたく；Kabat, E. A. et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242；Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 22T:116-198；およびCox et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:827-836も参照されたく；そのそれぞれの内容は参照により本明細書に組み入れられる）。
【００８１】
抗CS1抗体関連VHおよびVLセグメントをコードするDNA断片が得られれば、これらのDNA断片を標準の組換えDNA技術によりさらに操作して、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子に、Fab断片遺伝子に、またはscFv遺伝子に変換することができる。これらの操作において、VLまたはVHをコードするDNA断片を、抗体定常領域または可動性リンカーなどの、別のタンパク質をコードする別のDNA断片に機能的に連結する。この文脈で用いられる「機能的に連結」なる用語は、2つのDNA断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように、2つのDNA断片をつなぐことを意味することが意図される。
【００８２】
VHをコードするDNAを重鎖定常領域（CHl、CH2、CH3および、任意に、CH4）をコードする別のDNA分子に機能的に連結することにより、VH領域をコードする単離DNAを全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野において公知であり（例えば、Kabat, E.A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）、これらの領域を含むDNA断片は標準のPCR増幅によって得ることができる。重鎖定常領域はIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgMまたはIgD定常領域であり得るが、一定の態様において、IgG1またはIgG4定常領域である。Fab断片重鎖遺伝子のために、VHをコードするDNAを、重鎖CH1定常領域だけをコードする別のDNA分子に機能的に連結することができる。
【００８３】
VLをコードするDNAを軽鎖定常領域、CLをコードする別のDNA分子に機能的に連結することにより、VL領域をコードする単離DNAを全長軽鎖遺伝子（ならびにFab軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野において公知であり（例えば、Kabat, et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）、これらの領域を含むDNA断片は標準のPCR増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域はカッパまたはラムダ定常領域であり得るが、一定の態様において、カッパ定常領域である。scFv遺伝子を作製するために、VHおよびVL配列が連続する単鎖タンパク質として発現され、VLおよびVH領域は可動性リンカーによって連結され得るように、VHおよびVLをコードするDNA断片を、可動性リンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列(Gly4〜Ser)3（SEQ ID NO:127）をコードする別の断片に機能的に連結する（例えば、Bird et al., 1988, Science 242:423-426；Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554を参照されたい）。
【００８４】
本開示の抗CS1抗体を発現させるために、遺伝子が転写および翻訳調節配列に機能的に連結されるように、前述のとおりに得た、部分または全長軽鎖および重鎖をコードするDNAを発現ベクター中に挿入する。この文脈において、「機能的に連結」なる用語は、ベクター内の転写および翻訳調節配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を制御する、それらの所期の機能を果たすように、抗体遺伝子をベクター中に連結することを意味することが意図される。発現ベクターおよび発現調節配列は、用いる発現宿主細胞と適合性であるように選択する。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を、別々のベクター中に挿入することもでき、または、より典型的には、両方の遺伝子を同じ発現ベクター中に挿入する。
【００８５】
抗体遺伝子を標準の方法（例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的制限部位の連結、または制限部位がない場合は、平滑末端連結）によって発現ベクター中に挿入する。抗CS1抗体関連軽鎖または重鎖配列の挿入前に、発現ベクターは抗体定常領域配列をすでに有することもできる。例えば、抗CS1モノクローナル抗体関連VHおよびVL配列を全長抗体遺伝子に変換するための1つのアプローチは、VHセグメントがベクター内のCHセグメントに機能的に連結され、VLセグメントがベクター内のCLセグメントに機能的に連結されるように、それらの配列をそれぞれ重鎖定常領域および軽鎖定常領域をすでにコードしている発現ベクター中に挿入することである。加えて、または代替的に、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることもできる。抗体鎖遺伝子を、シグナルペプチドがインフレームで抗体鎖遺伝子のアミノ末端に連結されるように、ベクター中にクローニングすることができる。シグナルペプチドは免役グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免役グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。
【００８６】
抗体鎖遺伝子に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を調節する制御配列を有する。「制御配列」なる用語は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を調節する、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。そのような制御配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA, 1990に記載されている。当業者であれば、制御配列の選択を含む、発現ベクターの設計は、形質転換する宿主細胞の選択、望まれるタンパク質の発現レベルなどの因子に依存し得ることを理解するであろう。哺乳動物宿主細胞の発現に適した制御配列には、サイトメガロウイルス（CMV）由来のプロモーターおよび/またはエンハンサー（CMVプロモーター/エンハンサーなどの）、シミアンウイルス40（SV40）由来のプロモーターおよび/またはエンハンサー（SV40プロモーター/エンハンサーなどの）、アデノウイルス由来のプロモーターおよび/またはエンハンサー（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（AdMLP））ならびにポリオーマ由来のプロモーターおよび/またはエンハンサーなどの、哺乳動物細胞においてタンパク質を高いレベルで発現させるウイルスエレメントが含まれる。ウイルス制御エレメント、およびその配列のさらなる記載については、Stinskiによる米国特許第5,168,062号、Bellらによる米国特許第4,510,245号、およびSchaffnerらによる米国特許第4,968,615号を参照されたい。
【００８７】
抗体鎖遺伝子および制御配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を制御する配列（例えば、複製起源）および選択マーカー遺伝子などの、さらなる配列を有し得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、すべてAxelらによる、米国特許第4,399,216号、第4,634,665号および第5,179,017号参照）。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、G418、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する。適切な選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子（メトトレキサート選択/増幅でDHFR-宿主細胞において用いるため）およびneo遺伝子（G418選択のため）が含まれる。 軽鎖および重鎖を発現させるために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを標準の技術により宿主細胞に形質移入する。「形質移入」なる用語の様々な形態は、外来性DNAを原核または真核宿主細胞に導入するために一般に用いられる多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、DEAE-デキストラン形質移入などを含むことが意図される。
【００８８】
本開示の抗体を原核または真核宿主細胞のいずれかで発現させることが可能である。一定の態様において、抗体の発現を、適正に折りたたまれた免疫学的に活性な抗体を最適に分泌する、真核細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞において実施する。本開示の組換え抗体を発現するための哺乳動物宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣（CHO細胞）（例えば、Kaufman and Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601-621に記載されているとおり、DHFR選択マーカーと共に用いられる、Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載のDHFR- CHO細胞を含む）、NSO骨髄腫細胞、COS細胞およびSP2細胞が含まれる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入するとき、宿主細胞において抗体を発現させるのに十分な時間、または宿主細胞を成長させる培地に抗体を分泌させるのに十分な時間、宿主細胞を培養することにより抗体を産生する。抗体は標準のタンパク質精製法を用いて培地から回収することができる。宿主細胞は、Fab断片またはscFv分子などの、無傷の抗体の一部を産生するためにも用いることができる。上記手順の変形も本開示の範囲内である。例えば、本開示の抗CS1抗体の軽鎖または重鎖のいずれか（しかし、両方ではない）をコードするDNAを宿主細胞に形質移入することが望ましいこともある。
【００８９】
HuCS1への結合に必要でない軽鎖および重鎖のいずれか、または両方をコードするDNAの一部または全てを除去するために、組換えDNA技術を用いることもできる。そのような切断DNA分子から発現させた分子も、本開示の抗体に包含される。
【００９０】
本開示の抗CS1抗体の組換え発現のために、宿主細胞に本開示の2つの発現ベクター、すなわち、重鎖由来ポリペプチドをコードする第1のベクターおよび軽鎖由来ポリペプチドをコードする第2のベクターを同時形質移入することができる。2つのベクターは同じ選択マーカーを含むことができ、またはそれらはそれぞれ別の選択マーカーを含むことができる。または、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方をコードする単一のベクターを用いることもできる。
【００９１】
いったん核酸が抗hCS1抗体の1つまたは複数の部分をコードすれば、さらなる変更または変異をコード配列に導入して、例えば、異なるCDR配列を有する抗体、Fc受容体に対する親和性が低減した抗体、または異なるサブクラスの抗体をコードする核酸を生成することができる。
【００９２】
本開示の抗CS1抗体を、化学合成によって産生することもできる（例えば、Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, Illに記載の方法により）。変種抗体を無細胞プラットフォームを用いて生成することもできる（例えば、Chu et al., Biochemia No. 2, 2001 (Roche Molecular Biologicals)およびMurray et al., 2013, Current Opinion in Chemical Biology, 17:420-426参照）。
【００９３】
いったん本開示の抗CS1抗体を組換え発現によって産生したら、それを免役グロブリン分子の精製のために当技術分野において公知の任意の方法により、例えば、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、アフィニティ、およびサイジングカラムクロマトグラフィ）、遠心分離、較差溶解度により、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準技術により精製することができる。さらに、本開示の抗CS1抗体および/または結合断片を、本明細書に記載の、またはそれ以外に当技術分野において公知の異種ポリペプチド配列に縮合して、精製を容易にすることもできる。
【００９４】
いったん単離すれば、抗CS1抗体は、望まれるならば、例えば、高性能液体クロマトグラフィ（例えば、Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology, Work and Burdon, eds., Elsevier, 1980参照）により、またはSuperdex(商標) 75カラム（Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden）でのゲルろ過クロマトグラフィにより、さらに精製することができる。
【００９５】
7.5.  抗CS1抗体薬物結合体
本開示のもう1つの局面は、本明細書に記載の抗CS1抗体を含む抗体薬物結合体（ADC）に関する。ADCは一般に、1つまたは複数のリンカーによってそれに連結された1つまたは複数の細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質を有する、本明細書に記載の抗CS1抗体および/または結合断片を含む。具体的態様において、ADCは構造式（I）の化合物またはその塩である：
（I）  [D-L-XY]n-Ab
式中、各「D」は、他とは独立に、細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質（「薬物」）を表し；各「L」は、他とは独立に、リンカーを表し；「Ab」は、本明細書に記載の抗CS1抗体または結合断片などの、抗CS1抗原結合部分を表し；各「XY」は、リンカー上の官能基Rxと抗体上の「相補的」官能基Ryとの間で形成される連結を表し、かつnはADCに連結された薬物の数、またはADCの薬物 対 抗体比（DAR）を表す。
【００９６】
ADCを構成し得る様々な抗体（Ab）の具体的態様は、前述の抗CS1抗体および/または結合断片の様々な態様を含む。
【００９７】
構造式（I）のADCおよび/または塩のいくつかの具体的態様において、各Dは同じであり、かつ/または各Lは同じである。
【００９８】
本明細書に記載のADCを構成し得る、細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質（D）およびリンカー（L）の具体的態様、ならびにADCに連結された細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質の数を、以下により詳細に記載する。
【００９９】
7.5.1.   細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質
細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質は、細胞、特に癌および/または腫瘍細胞の成長および/もしくは複製を阻害すること、ならびに/またはそれらを死滅させることが公知の、任意の作用物質であり得る。細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性特性を有する多くの作用物質が、文献において公知である。細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質のクラスの非限定例には、例としてであるが、限定ではなく、放射性核種、アルキル化剤、トポイソメラーゼI阻害剤、トポイソメラーゼII阻害剤、DNA挿入剤（例えば、小溝結合剤などの溝結合剤）、RNA/DNA代謝拮抗剤、細胞周期調節剤、キナーゼ阻害剤、タンパク質合成阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ミトコンドリア阻害剤、および有糸分裂阻害剤が含まれる。
【０１００】
一定のこれらの様々なクラス内の作用物質の具体的な非限定例を以下に提供する。
【０１０１】
アルキル化剤：アサリー（asaley）（（L-ロイシン, N-[N-アセチル-4-[ビス-(2-クロロエチル)アミノ]-DL-フェニルアラニル]-, エチルエステル；NSC 167780；CAS登録番号3577897））；AZQ（（1,4-シクロヘキサジエン-1,4-ジカルバミン酸, 2,5-ビス(1-アジリジニル)-3,6-ジオキソ-, ジエチルエステル；NSC 182986；CAS登録番号57998682））；BCNU（（N,N'-ビス(2-クロロエチル)-N-ニトロソ尿素；；NSC 409962；CAS登録番号154938））；ブスルファン（1,4-ブタンジオールジメタンスルホネート；NSC 750；CAS登録番号55981）；(カルボキシフタラト)白金（NSC 27164；CAS登録番号65296813）；CBDCA（（シス-(1,1-シクロブタンジカルボキシラト)ジアミン白金(II)）；NSC 241240；CAS登録番号41575944））；CCNU（（N-(2-クロロエチル)-N'-シクロヘキシル-N-ニトロソ尿素；NSC 79037；CAS登録番号13010474））；CHIP（イプロプラチン；NSC 256927）；クロランブシル（NSC 3088；CAS登録番号305033）；クロロゾトシン（（2-[[[(2-クロロエチル)ニトロソアミノ]カルボニル]アミノ]-2-デオキシ-D-グルコピラノース；NSC 178248；CAS登録番号54749905））；シスプラチナム（シスプラチン；NSC 119875；CAS登録番号15663271）；クロメソン（NSC 338947；CAS登録番号88343720）；シアノモルホリノドキソルビシン（NCS 357704；CAS登録番号88254073）；シクロジソン（NSC 348948；CAS登録番号99591738）；ジアンヒドロガラクチトール（5,6-ジエポキシズルシトール；NSC 132313；CAS登録番号23261203）；フルオロドパン（fluorodopan）（（5-[(2-クロロエチル)-(2-フルオロエチル)アミノ]-6-メチル-ウラシル；NSC 73754；CAS登録番号834913）；ヘプスルファム（NSC 329680；CAS登録番号96892578）；ヒカントン（NSC 142982；CAS登録番号23255938）；メルファラン（NSC 8806；CAS登録番号3223072）；メチルCCNU（（1-(2-クロロエチル)-3-(トランス-4-メチルシクロヘキサン)-1-ニトロソ尿素；NSC 95441；13909096）；マイトマイシンC（NSC 26980；CAS登録番号50077）；ミトゾラミド（mitozolamide）（NSC 353451；CAS登録番号85622953）；ナイトロジェンマスタード（（ビス(2-クロロエチル)メチルアミン塩酸塩；NSC 762；CAS登録番号55867）；PCNU（（1-(2-クロロエチル)-3-(2,6-ジオキソ-3-ピペリジル)-1-ニトロソ尿素；NSC 95466；CAS登録番号13909029））；ピペラジンアルキル化剤（（1-(2-クロロエチル)-4-(3-クロロプロピル)-ピペラジン2塩酸塩；NSC 344007））；ピペラジンジオン（NSC 135758；CAS登録番号41109802）；ピポブロマン（（N,N'-ビス(3-ブロモプロピオニル)ピペラジン；NSC 25154；CAS登録番号54911））；ポルフィロマイシン（N-メチルマイトマイシンC；NSC 56410；CAS登録番号801525）；スピロヒダントインマスタード（NSC 172112；CAS登録番号56605164）；テロキシロン（トリグリシジルイソシアヌレート；NSC 296934；CAS登録番号2451629）；テトラプラチン（NSC 363812；CAS登録番号62816982）；チオテパ（N,N',N''-トリ-1,2-エタンジイルチオホスホラミド；NSC 6396；CAS登録番号52244）；トリエチレンメラミン（NSC 9706；CAS登録番号51183）；ウラシルナイトロジェンマスタード（デスメチルドパン；NSC 34462；CAS登録番号66751）；Yoshi-864（（ビス(3-メシロキシプロピル)アミン塩酸塩；NSC 102627；CAS登録番号3458228）。
【０１０２】
トポイソメラーゼI阻害剤：カンプトテシン（NSC 94600；CAS登録番号7689-03-4）；様々なカンプトテシン誘導体および類縁体（例えば、NSC 100880、NSC 603071、NSC 107124、NSC 643833、NSC 629971、NSC 295500、NSC 249910、NSC 606985、NSC 74028、NSC 176323、NSC 295501、NSC 606172、NSC 606173、NSC 610458、NSC 618939、NSC 610457、NSC 610459、NSC 606499、NSC 610456、NSC 364830、およびNSC 606497）；モルホリンイソキソルビシン（morpholinisoxorubicin）（NSC 354646；CAS登録番号89196043）；SN-38（NSC 673596；CAS登録番号86639-52-3）。
【０１０３】
トポイソメラーゼII阻害剤：ドキソルビシン（NSC 123127；CAS登録番号25316409）；アモナフィド（ベンズイソキノリンジオン；NSC 308847；CAS登録番号69408817）；m-AMSA（（4'-(9-アクリジニルアミノ)-3'-メトキシメタンスルホンアニリド；NSC 249992；CAS登録番号51264143））；アントラピラゾール誘導体（（NSC 355644）；エトポシド（VP-16；NSC 141540；CAS登録番号33419420）；ピラゾロアクリジン（（ピラゾロ[3,4,5-kl]アクリジン-2(6H)-プロパンアミン, 9-メトキシ-N,N-ジメチル-5-ニトロ, モノメタンスルホネート；NSC 366140；CAS登録番号99009219）；ビスアントレン塩酸塩（NSC 337766；CAS登録番号71439684）；ダウノルビシン（NSC 821151；CAS登録番号23541506）；デオキシドキソルビシン（NSC 267469；CAS登録番号63950061）；ミトキサントロン（NSC 301739；CAS登録番号70476823）；メノガリル（NSC 269148；CAS登録番号71628961）；N,N-ジベンジルダウノマイシン（NSC 268242；CAS登録番号70878512）；オキサントラゾール（oxanthrazole）（NSC 349174；CAS登録番号105118125）；ルビダゾン（NSC 164011；CAS登録番号36508711）；テニポシド（VM-26；NSC 122819；CAS登録番号29767202）。
【０１０４】
DNA挿入剤：アントラマイシン（CAS登録番号4803274）；チカマイシンA（CAS登録番号89675376）；トメイマイシン（CAS登録番号35050556）；DC-81（CAS登録番号81307246）；シビロマイシン（CAS登録番号12684332）；ピロロベンゾジアゼピン誘導体（CAS登録番号945490095）；SGD-1882（(S)-2-(4-アミノフェニル)-7-エトキシ-8-(3-(((S)-7-メトキシ-2-(4-メトキシフェニル)-5-オキソ-5,11a-ジヒドロ-1H-ベンゾ[e]ピロロ[1,2-a][1,4]ジアゼピン-8-イル)オキシ)プロポキシ)-1H-ベンゾ[e]ピロロ[1,2-a][1,4]ジアゼピン-5(11aH)-オン）；SG2000（SJG-136；(11aS,11a'S)-8,8'-(プロパン-1,3-ジイルビス(オキシ))ビス(7-メトキシ-2-メチレン-2,3-ジヒドロ-1H-ベンゾ[e]ピロロ[1,2-a][1,4]ジアゼピン-5(11aH)-オン)；NSC 694501；CAS登録番号232931576）。
【０１０５】
RNA/DNA代謝拮抗剤：L-アラノシン（NSC 153353；CAS登録番号59163416）；5-アザシチジン（NSC 102816；CAS登録番号320672）；5-フルオロウラシル（NSC 19893；CAS登録番号51218）；アシビシン（NSC 163501；CAS登録番号42228922）；アミノプテリン誘導体N-[2-クロロ-5-[[(2,4-ジアミノ-5-メチル-6-キナゾリニル)メチル]アミノ]ベンゾイル]L-アスパラギン酸（NSC 132483）；アミノプテリン誘導体N-[4-[[(2,4-ジアミノ-5-エチル-6-キナゾリニル)メチル]アミノ]ベンゾイル]L-アスパラギン酸（NSC 184692）；アミノプテリン誘導体N-[2-クロロ-4-[[(2,4-ジアミノ-6-プテリジニル)メチル]アミノ]ベンゾイル]L-アスパラギン酸1水和物（NSC 134033）；アンチフォ（an antifo）（（Nα-(4-アミノ-4-デオキシプテロイル)-Nγ-ヘミフタロイル-L-オルニチン；NSC 623017））；ベイカー可溶性アンチフォル（Baker's soluble antifol）（NSC 139105；CAS登録番号41191042）；ジクロロアリルローソン（dichlorallyl lawsone）（（2-(3,3-ジクロロアリル)-3-ヒドロキシ-1,4-ナフトキノン；NSC 126771；CAS登録番号36417160）；ブレキナル（NSC 368390；CAS登録番号96201886）；フトラフル（（プロドラッグ；5-フルオロ-1-(テトラヒドロ-2-フリル)-ウラシル；NSC 148958；CAS登録番号37076689）；5,6-ジヒドロ-5-アザシチジン（NSC 264880；CAS登録番号62402317)；メトトレキサート（NSC 740；CAS登録番号59052）；メトトレキサート誘導体（N-[[4-[[(2,4-ジアミノ-6-プテリジニル)メチル]メチルアミノ]-1-ナフタレニル]カルボニル]L-グルタミン酸；NSC 174121）；PALA（（N-(ホスホノアセチル)-L-アスパルテート；NSC 224131；CAS登録番号603425565）；ピラゾフリン（NSC 143095；CAS登録番号30868305）；トリメトレキサート（NSC 352122；CAS登録番号82952645）。
【０１０６】
DNA代謝拮抗剤：3-HP（NSC 95678；CAS登録番号3814797）；2'-デオキシ-5-フルオロウリジン（NSC 27640；CAS登録番号50919）；5-HP（NSC 107392；CAS登録番号19494894）；α-TGDR（α-2'-デオキシ-6-チオグアノシン；NSC 71851 CAS登録番号2133815）；アフィディコリングリシネート（NSC 303812；CAS登録番号92802822）；ara C（シトシンアラビノシド；NSC 63878；CAS登録番号69749）；5-アザ-2'-デオキシシチジン（NSC 127716；CAS登録番号2353335）；β-TGDR（β-2'-デオキシ-6-チオグアノシン；NSC 71261；CAS登録番号789617）；シクロシチジン（NSC 145668；CAS登録番号10212256）；グアナゾール（NSC 1895；CAS登録番号1455772）；ヒドロキシ尿素（NSC 32065；CAS登録番号127071）；イノシングリコジアルデヒド（NSC 118994；CAS登録番号23590990）；マクベシンII（NSC 330500；CAS登録番号73341738）；ピラゾロイミダゾール（NSC 51143；CAS登録番号6714290）；チオグアニン（NSC 752；CAS登録番号154427）；チオプリン（NSC 755；CAS登録番号50442）。
【０１０７】
細胞周期調節剤：シリビニン（CAS登録番号22888-70-6）；エピガロカテキンガレート（EGCG；CAS登録番号989515）；プロシアニジン誘導体（例えば、プロシアニジンA1［CAS登録番号103883030］、プロシアニジンB1［CAS登録番号20315257］、プロシアニジンB4［CAS登録番号29106512］、アレカタンニンB1［CAS登録番号79763283］）；イソフラボン（例えば、ゲニステイン［4',5,7-トリヒドロキシイソフラボン；CAS登録番号446720］、ダイゼイン［4',7-ジヒドロキシイソフラボン、CAS登録番号486668］；インドール-3-カルビノール（CAS登録番号700061）；ケルセチン（NSC 9219；CAS登録番号117395）；エストラムスチン（NSC 89201；CAS登録番号2998574）；ノコダゾール（CAS登録番号31430189）；ポドフィロトキシン（CAS登録番号518285）；ビノレルビンタートレート（NSC 608210；CAS登録番号125317397）；クリプトフィシン（NSC 667642；CAS登録番号124689652）。
【０１０８】
キナーゼ阻害剤：アファチニブ（CAS登録番号850140726）；アキシチニブ（CAS登録番号319460850）；ARRY-438162（ビニメチニブ）（CAS登録番号606143899）；ボスチニブ（CAS登録番号380843754）；カボザンチニブ（CAS登録番号1140909483）；セリチニブ（CAS登録番号1032900256）；クリゾチニブ（CAS登録番号877399525）；ダブラフェニブ（CAS登録番号1195765457）；ダサチニブ（NSC 732517；CAS登録番号302962498）；エルロチニブ（NSC 718781；CAS登録番号183319699）；エベロリムス（NSC 733504；CAS登録番号159351696）；ホスタマチニブ（NSC 745942；CAS登録番号901119355）；ゲフィチニブ（NSC 715055；CAS登録番号184475352）；イブルチニブ（CAS登録番号936563961）；イマチニブ（NSC 716051；CAS登録番号220127571）；ラパチニブ（CAS登録番号388082788）；レンバチニブ（CAS登録番号857890392）；ムブリチニブ（CAS 366017096）；ニロチニブ（CAS登録番号923288953）；ニンテダニブ（CAS登録番号656247175）；パルボシクリブ（CAS登録番号571190302）；パゾパニブ（NSC 737754；CAS登録番号635702646）；ペガプタニブ（CAS登録番号222716861）；ポナチニブ（CAS登録番号1114544318）；ラパマイシン（NSC 226080；CAS登録番号53123889）；レゴラフィニブ（CAS登録番号755037037）；AP 23573（リダフォロリムス）（CAS登録番号572924540）；INCB018424（ルキソリチニブ）（CAS登録番号1092939177）；ARRY-142886（セルメチニブ）（NSC 741078；CAS登録番号606143-52-6）；シロリムス（NSC 226080；CAS登録番号53123889）；ソラフェニブ（NSC 724772；CAS登録番号475207591）；スニチニブ（NSC 736511；CAS登録番号341031547）；トファシチニブ（CAS登録番号477600752）；テムシロリムス（NSC 683864；CAS登録番号163635043）；トラメチニブ（CAS登録番号871700173）；バンデタニブ（CAS登録番号443913733）；ベムラフェニブ（CAS登録番号918504651）；SU6656（CAS登録番号330161870）；CEP-701（レサウルチニブ（lesaurtinib））（CAS登録番号111358884）；XL019（CAS登録番号945755566）；PD-325901（CAS登録番号391210109）；PD-98059（CAS登録番号167869218）；PI-103（CAS登録番号371935749）、PP242（CAS登録番号1092351671）、PP30（CAS登録番号1092788094）、トリン1（CAS登録番号1222998368）、LY294002（CAS登録番号154447366）、XL-147（CAS登録番号934526893）、CAL-120（CAS登録番号870281348）、ETP-45658（CAS登録番号1198357797）、PX 866（CAS登録番号502632668）、GDC-0941（CAS登録番号957054307）、BGT226（CAS登録番号1245537681）、BEZ235（CAS登録番号915019657）、XL-765（CAS登録番号934493762）を含むATP競合TORC1/TORC2阻害剤。
【０１０９】
タンパク質合成阻害剤：アクリフラビン（CAS登録番号65589700）；アミカシン（NSC 177001；CAS登録番号39831555）；アルベカシン（CAS登録番号51025855）；アストロマイシン（CAS登録番号55779061）；アッジスロマイシン（NSC 643732；CAS登録番号83905015）；ベカナマイシン（CAS登録番号4696768）；クロルテトラサイクリン（NSC 13252；CAS登録番号64722）；クラリスロマイシン（NSC 643733；CAS登録番号81103119）；クリンダマイシン（CAS登録番号18323449）；クロモサイクリン（CAS登録番号1181540）；シクロヘキシミド（CAS登録番号66819）；ダクチノマイシン（NSC 3053；CAS登録番号50760）；ダルホプリスチン（CAS登録番号112362502）；デメクロサイクリン（CAS登録番号127333）；ジベカシン（CAS登録番号34493986）；ジヒドロストレプトマイシン（CAS登録番号128461）；ジリスロマイシン（CAS登録番号62013041）；ドキシサイクリン（CAS登録番号17086281）；エメチン（NSC 33669；CAS登録番号483181）；エリスロマイシン（NSC 55929；CAS登録番号114078）；フルリスロマイシン（CAS登録番号83664208）；フラマイセチン（ネオマイシンB；CAS登録番号119040）；ゲンタマイシン（NSC 82261；CAS登録番号1403663）；チゲサイクリン（CAS登録番号220620097）などのグリシルサイクリン；ハイグロマイシンB（CAS登録番号31282049）；イセパマイシン（CAS登録番号67814760）；ジョサマイシン（NSC 122223；CAS登録番号16846245）；カナマイシン（CAS登録番号8063078）；テリスロマイシン（CAS登録番号191114484）、セスロマイシン（CAS登録番号205110481）、およびソリスロマイシン（CAS登録番号760981837）などのケトライド；リンコマイシン（CAS登録番号154212）；リメサイクリン（CAS登録番号992212）；メクロサイクリン（NSC 78502；CAS登録番号2013583）；メタサイクリン（ロンドマイシン（rondomycin）；NSC 356463；CAS登録番号914001）；ミデカマイシン（CAS登録番号35457808）；ミノサイクリン（NSC 141993；CAS登録番号10118908）；ミオカマイシン（CAS登録番号55881077）；ネオマイシン（CAS登録番号119040）；ネチルマイシン（CAS登録番号56391561）；オレアンドマイシン（CAS登録番号3922905）；エペレゾリド（CAS登録番号165800044）、リネゾリド（CAS登録番号165800033）、ポシゾリド（posizolid）（CAS登録番号252260029）、ラデゾリド（CAS登録番号869884786）、ランベゾリド（CAS登録番号392659380）、ステゾリド（CAS登録番号168828588）、テジゾリド（CAS登録番号856867555）などのオキサゾリジノン；オキシテトラサイクリン（NSC 9169；CAS登録番号2058460）；パロモマイシン（CAS登録番号7542372）；ペニメピサイクリン（CAS登録番号4599604）；ペプチジルトランスフェラーゼ阻害剤、例えば、クロラムフェニコール（NSC 3069；CAS登録番号56757）とアジダムフェニコール（CAS登録番号13838089）、フロルフェニコール（CAS登録番号73231342）、およびチアムフェニコール（CAS登録番号15318453）などの誘導体、ならびにレタパムリン（CAS登録番号224452668）、チアムリン（CAS登録番号55297955）、バルネムリン（CAS登録番号101312929）などのプロイロムチリン；ピルリマイシン（CAS登録番号79548735）；ピューロマイシン（NSC 3055；CAS登録番号53792）；キヌプリスチン（CAS登録番号120138503）；リボスタマイシン（CAS登録番号53797356）；ロキタマイシン（CAS登録番号74014510）；ロリテトラサイクリン（CAS登録番号751973）；ロキシスロマイシン（CAS登録番号80214831）；シソマイシン（CAS登録番号32385118）；スペクチノマイシン（CAS登録番号1695778）；スピラマイシン（CAS登録番号8025818）；プリスチナマイシン（CAS登録番号270076603）、キヌプリスチン/ダルホプリスチン（CAS登録番号126602899）、およびヴァージニアマイシン（CAS登録番号11006761）などのストレプトグラミン；ストレプトマイシン（CAS登録番号57921）；テトラサイクリン（NSC 108579；CAS登録番号60548）；トブラマイシン（CAS登録番号32986564）；トロレアンドマイシン（CAS登録番号2751099）；タイロシン（CAS登録番号1401690）；ベルダマイシン（CAS登録番号49863481）。
【０１１０】
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤：アベキノスタット（CAS登録番号783355602）；ベリノスタット（NSC 726630；CAS登録番号414864009）；キダミド（CAS登録番号743420022）；エンチノスタット（CAS登録番号209783802）；ギビノスタット（CAS登録番号732302997）；モセチノスタット（CAS登録番号726169739）；パノビノスタット（CAS登録番号404950807）；キシノスタット（CAS登録番号875320299）；レスミノスタット（CAS登録番号864814880）；ロミデプシン（CAS登録番号128517077）；スルフォラファン（CAS登録番号4478937）；チオウレイドブチロニトリル（Kevetrin(商標)；CAS登録番号6659890）；バルプロ酸（NSC 93819；CAS登録番号99661）；ボリノスタット（NSC 701852；CAS登録番号149647789）；ACY-1215（ロシリノスタット（rocilinostat）；CAS登録番号1316214524）；CUDC-101（CAS登録番号1012054599）；CHR-2845（テフィノスタット（tefinostat）；CAS登録番号914382608）；CHR-3996（CAS登録番号1235859138）；4SC-202（CAS登録番号910462430）；CG200745（CAS登録番号936221339）；SB939（プラシノスタット（pracinostat）；CAS登録番号929016966）。
【０１１１】
ミトコンドリア阻害剤：パンクラチスタチン（NSC 349156；CAS登録番号96281311）；ローダミン-123（CAS登録番号63669709）；エデルホシン（NSC 324368；CAS登録番号70641519）；d-アルファ-トコフェロールスクシネート（NSC 173849；CAS登録番号4345033）；化合物11β（CAS登録番号865070377）；アスピリン（NSC 406186；CAS登録番号50782）；エリプチシン（CAS登録番号519233）；ベルベリン（CAS登録番号633658）；セルレニン（CAS登録番号17397896）；GX015-070（オバトクラックス(登録商標)；1H-インドール, 2-(2-((3,5-ジメチル-1H-ピロル-2-イル)メチレン)-3-メトキシ-2H-ピロル-5-イル)-；NSC 729280；CAS登録番号803712676）；セラストロール（トリプテリン；CAS登録番号34157830）；メトホルミン（NSC 91485；CAS登録番号1115704）；ブリリアントグリーン（NSC 5011；CAS登録番号633034）；ME-344（CAS登録番号1374524556）。
【０１１２】
有糸分裂阻害剤：アロコルヒチン（NSC 406042）；MMAE（モノメチルオーリスタチンE；CAS登録番号474645-27-7）およびMMAF（モノメチルオーリスタチンF；CAS登録番号745017-94-1；ハリコンドリンB（NSC 609395）などのオーリスタチン；コルヒチン（NSC 757；CAS登録番号64868）；コルヒチン誘導体（N-ベンゾイル-デアセチルベンズアミド；NSC 33410；CAS登録番号63989753）；ドラスタチン10（NSC 376128；CAS登録番号110417-88-4）；メイタンシン（NSC 153858；CAS登録番号35846-53-8）；ロゾキシン（rhozoxin）（NSC 332598；CAS登録番号90996546）；タキソール（NSC 125973；CAS登録番号33069624）；タキソール誘導体（（2'-N-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]グルタラメートタキソール；NSC 608832）；チオコルヒチン（3-デメチルチオコルヒチン；NSC 361792）；トリチルシステイン（NSC 49842；CAS登録番号2799077）；ビンブラスチンスルフェート（NSC 49842；CAS登録番号143679）；ビンクリスチンスルフェート（NSC 67574；CAS登録番号2068782）。
【０１１３】
抗体への結合部位を含むまたはそれを含むように改変されていてもよいこれらの作用物質の任意のものが、本明細書において開示するADCに含まれてもよい。
【０１１４】
具体的態様において、細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質は、有糸分裂阻害剤である。
【０１１５】
もう1つの具体的態様において、細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質は、オーリスタチン、例えば、モノメチルオーリスタチンE（「MMAE」）またはモノメチルオーリスタチンF（「MMAF」）である。
【０１１６】
7.5.2.  リンカー
本明細書に記載のADCにおいて、細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質は抗体にリンカーによって連結されている。ADCの細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質を抗体に連結しているリンカーは、短い、長い、疎水性、親水性、可動性もしくは剛性であってもよく、またはリンカーが異なる特性を有するセグメントを含み得るように、それぞれ独立に前述の特性の1つまたは複数を有するセグメントで構成されてもよい。リンカーは、複数の作用物質を抗体上の単一の部位に共有結合するように多価であってもよく、または単一の作用物質を抗体上の単一の部位に連結するように一価であってもよい。
【０１１７】
当業者であれば理解するであろうとおり、リンカーは、1つの位置で細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質への共有結合を形成し、もう1つの位置で抗体への共有結合を形成することにより、細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質を、抗体に連結する。共有結合は、リンカー上の官能基と作用物質および抗体上の官能基との間の反応によって形成される。本明細書において用いられる「リンカー」なる表現は、（i）リンカーを細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質に共有結合することが可能な官能基とリンカーを抗体に共有結合することが可能な官能基を含む、非結合型のリンカー；（ii）リンカーを抗体に共有結合することが可能な官能基を含み、細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質に共有結合している、または逆もまた同様である、部分的結合型のリンカー；および（iii）細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質と抗体の両方に共有結合している、完全結合型のリンカーを含むことが意図される。本明細書に記載のリンカーおよびADC、ならびにリンカー-作用物質を抗体に結合するために用いるシントンのいくつかの具体的態様において、リンカー上の官能基を含む部分およびリンカーと抗体との間で形成される共有結合を、それぞれRxおよびXYとして具体的に示す。
【０１１８】
リンカーは、好ましくは、細胞外の条件に対して化学的に安定であるが、そうでなくてもよく、細胞内で開裂する、犠牲になる、および/またはそれ以外に特異的に分解するよう設計されていてもよい。または、細胞内で特異的に開裂または分解するよう設計されていないリンカーを用いてもよい。安定または不安定なリンカーの選択は、細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質の毒性に依存し得る。正常な細胞に対して毒性の作用物質については、安定なリンカーが好ましい。選択的または標的指向性で、正常な細胞に対しては毒性がより低い作用物質を用いてもよく、細胞外環境に対するリンカーの化学的安定性は重要性が低い。ADCにおいて薬物を抗体に連結するのに有用な多様なリンカーが当技術分野において公知である。これらのリンカー、ならびに他のリンカーのいずれを用いて、本明細書に記載のADCの細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質を抗体に連結してもよい。
【０１１９】
多くの細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質を単一の抗体分子に連結するために用い得る多価リンカーの例は、例えば、WO 2009/073445；WO 2010/068795；WO 2010/138719；WO 2011/120053；WO 2011/171020；WO 2013/096901；WO 2014/008375；WO 2014/093379；WO 2014/093394；WO 2014/093640に記載されており、それらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。例えば、Mersanaらによって開発されたフレキシマー（Fleximer）リンカー技術は、良好な物理化学的特性を有する高DARのADCを可能にする能力を有する。以下に示すとおり、Mersanaの技術は、薬物分子を可溶化ポリアセタール骨格に、一連のエステル結合を介して組み込むことに基づいている。この方法は、良好な物理化学的特性を維持しながら、高負荷ADC（20までのDAR）を提供する。
【０１２０】
樹枝状リンカーのさらなる例は、US 2006/116422；US 2005/271615；de Groot et al (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4490-4494；Amir et al (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4494-4499；Shamis et al (2004) J. Am. Chem. Soc. 126:1726-1731；Sun et al (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215；Sun et al (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768；King et al (2002) Tetrahedron Letters 43:1987-1990において見出すことができ、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。
【０１２１】
使用し得る一価リンカーの例は、例えば、Nolting, 2013, Antibody-Drug Conjugates, Methods in Molecular Biology 1045:71-100；Kitson et al., 2013, CROs/CMOs - Chemica Oggi - Chemistry Today 31(4):30-38；Ducry et al., 2010, Bioconjugate Chem. 21:5-13；Zhao et al., 2011, J. Med. Chem. 54:3606-3623；米国特許第7,223,837号；米国特許第8,568,728号；米国特許第8,535,678号；およびWO2004010957に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。
【０１２２】
例としてであるが、限定ではなく、本明細書に記載のADCに含まれ得る、いくつかの切断可能および切断不可能なリンカーを以下に記載する。
【０１２３】
7.5.2.1.  切断可能なリンカー
一定の態様において、選択したリンカーはインビボで切断可能である。切断可能なリンカーは、化学的または酵素的に不安定または分解可能な連結を含み得る。切断可能なリンカーは、一般には、薬物を遊離するために、細胞質における還元、リソソーム中の酸性条件への曝露、または細胞内の特異的プロテアーゼもしくは他の酵素による切断などの、細胞内部でのプロセスに頼っている。切断可能なリンカーは、一般には、化学的または酵素的のいずれかで切断可能な1つまたは複数の化学結合を組み込む一方で、リンカーの残りは切断不可能である。一定の態様において、リンカーは、ヒドラゾンおよび/またはジスルフィド基などの、化学的に不安定な基を含む。化学的に不安定な基を含むリンカーは、原形質といくつかの細胞質画分との間の差異を示す特性を利用する。ヒドラゾン含有リンカーのための、薬物放出を促進する細胞内条件は、エンドソームおよびリソソームの酸性環境であり、その一方で、ジスルフィド含有リンカーは、高いチオール濃度、例えば、グルタチオンを含むサイトゾル中で還元される。一定の態様において、化学的に不安定な基を含むリンカーの原形質安定性は、化学的に不安定な基の近くの置換基を用いて立体障害を導入することによって増大し得る。
【０１２４】
ヒドラゾンなどの酸に不安定な基は、血中の中性pH環境（pH7.3〜7.5）での全身循環中は無傷のままで、ADCが細胞の弱酸性のエンドソーム（pH5.0〜6.5）およびリソソーム（pH4.5〜5.0）画分中に内部移行すると、加水分解を受けて薬物を放出する。このpH依存性放出メカニズムは、薬物の非特異的放出に関連していた。リンカーのヒドラゾン基の安定性を高めるために、リンカーを化学修飾、例えば、置換により変更して、循環中の損失を最小限にしながら、リソソームでのより効率的放出を達成するための調節を可能にしてもよい。
【０１２５】
ヒドラゾン含有リンカーは、さらなる酸に不安定な切断部位および/または酵素的に不安定な切断部位などの、さらなる切断部位を含んでもよい。例示的なヒドラゾン含有リンカーを含むADCには以下の構造が含まれる：
2020111583.tif 000030
式中、DおよびAbはそれぞれ細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質（薬物）ならびにAbを表し、nは抗体に連結された薬物-リンカーの数を表す。リンカー（Ig）などの一定のリンカーにおいて、リンカーは2つの切断可能な基−ジスルフィドおよびヒドラゾン部分を含む。そのようなリンカーについて、無修飾遊離薬物の有効な放出は酸性pHまたはジスルフィド還元および酸性pHを必要とする。（Ih）および（Ii）などのリンカーは、単一のヒドラゾン切断部位で有効であることが示されている。
【０１２６】
全身循環中は無傷のままで、ADCが酸性の細胞区画に内部移行すると、加水分解を受けて薬物を放出する、さらなるリンカーには、カーボネートが含まれる。そのようなリンカーは、細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質が酸素を通じて共有結合され得る場合に、有用であり得る。
【０１２７】
リンカーに含まれ得る、酸に不安定な他の基には、シス-アコニチル含有リンカーが含まれる。シス-アコニチル化学は、酸性条件下でのアミド加水分解を加速させるために、アミド結合に並置されたカルボン酸を用いる。
【０１２８】
切断可能なリンカーは、ジスルフィド基も含み得る。ジスルフィドは生理的pHで熱力学的に安定で、サイトゾルが細胞外環境に比べて著しく還元性の環境を提供する、細胞内への内部移行後に薬物を放出するよう設計されている。ジスルフィド結合の切断は、一般には、ジスルフィド含有リンカーが循環中は妥当に安定であり、サイトゾル中で薬物を選択的に放出するように、（還元された）グルタチオン（GSH）などの、細胞質チオール補助因子の存在を必要とする。細胞内酵素のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、またはジスルフィド結合を切断可能な類似の酵素も、細胞内でのジスルフィド結合の優先的切断に貢献し得る。GSHは、循環中のGSHまたは最も豊富な低分子量チオールであるシステインの、約5μMという非常に低い濃度に比べて、細胞中に0.5〜10mMの範囲の濃度で存在すると報告されている。不規則な血流が低酸素状態を引き起こす腫瘍細胞は、還元酵素の活性増強と、したがってより高いグルタチオン濃度をもたらす。一定の態様において、ジスルフィド含有リンカーのインビボでの安定性は、リンカーの化学修飾、例えば、ジスルフィド結合の近くの立体障害の利用により、増強してもよい。
【０１２９】
例示的なジスルフィド含有リンカーを含むADCには以下の構造が含まれる：
2020111583.tif 000031
式中、DおよびAbはそれぞれ薬物および抗体を表し、nは抗体に連結された薬物-リンカーの数を表し、Rは各出現時に、例えば、水素またはアルキルから独立に選択される。一定の態様において、ジスルフィド結合の近くの立体障害が増大すると、リンカーの安定性が増大する。（Ij）および（Il）などの構造は、1つまたは複数のR基をメチルなどの低級アルキルから選択すると、インビボでの安定性増大を示す。
【０１３０】
用い得る切断可能なリンカーのもう1つの型は、酵素によって特異的に切断されるリンカーである。そのようなリンカーは、典型的にはペプチド系であるか、または酵素の基質として作用するペプチド領域を含む。ペプチド系リンカーは、化学的に不安定なリンカーよりも、原形質および細胞外環境で安定である傾向がある。リソソームのタンパク質分解酵素は、内因性阻害剤およびリソソームに比べて血液の不利に高いpH値により、血中では非常に低い活性を有するため、ペプチド結合は一般に良好な血清安定性を有する。薬物の抗体からの放出は、リソソームプロテアーゼ、例えば、カテプシンおよびプラスミンの作用により、特異的に起こる。これらのプロテアーゼは、一定の腫瘍細胞中では、高いレベルで存在し得る。
【０１３１】
例示的態様において、切断可能なペプチドは、Gly-Phe-Leu-Gly（SEQ ID NO:128）、Ala-Leu-Ala-Leu（SEQ ID NO:129）などのテトラペプチドまたは
2020111583.tif 000032
などのジペプチドから選択される。一定の態様において、より長いペプチドは疎水性であるため、より長いペプチドよりもジペプチドが好ましい。
【０１３２】
ドキソルビシン、マイトマイシン、カンプトテシン、ピロロベンゾジアゼピン、タリソマイシンおよびオーリスタチン/オーリスタチンファミリーメンバーなどの薬物を抗体に連結するのに有用な、様々なジペプチド系の切断可能なリンカーが記載されている（Dubowchik et al., 1998, J. Org. Chem. 67:1866-1872；Dubowchik et al., 1998, Bioorg. Med. Chem. Lett. 8(21):3341-3346；Walker et al., 2002, Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:217-219；Walker et al., 2004, Bioorg. Med. Chem. Lett.14:4323-4327；Sutherland et al., 2013, Blood 122: 1455-1463；およびFrancisco et al., 2003, Blood 102:1458-1465を参照されたく、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる）。これらのジペプチドリンカー、またはこれらのジペプチドリンカーの修飾型はすべて、本明細書に記載のADCにおいて用い得る。用い得る他のジペプチドリンカーには、Seattle Genetics' Brentuximab Vendotin SGN-35（Adcetris(商標)）、Seattle Genetics SGN-75（抗-CD-70、Val-Cit-モノメチルオーリスタチンF（MMAF）、Seattle Genetics SGN-CD33A（抗-CD-33、Val-Ala-(SGD-1882)）、Celldex Therapeuticsグレンバツムマブ（CDX-011）（抗-NMB、Val-Cit-モノメチルオーリスタチンE（MMAE）、およびCytogen PSMA-ADC（PSMA-ADC-1301）（抗-PSMA、Val-Cit-MMAE）などのADCにおいて見出されるものが含まれる。
【０１３３】
酵素的に切断可能なリンカーは、酵素的切断の部位から薬物を空間的に分離するための、1つの自己犠牲スペーサーを含み得る。薬物のペプチドリンカーへの直接連結は、薬物のアミノ酸付加物のタンパク質分解による放出を引き起こし、それによりその活性を損ない得る。自己犠牲スペーサーの使用は、アミド結合の加水分解後に、完全に活性で、化学的に無修飾の薬物の脱離を可能にする。
【０１３４】
1つの自己犠牲スペーサーは二官能性パラ-アミノベンジルアルコール基であり、これはペプチドにアミノ基を通じて連結されて、アミド結合を形成する一方で、アミン含有薬物はカルバメート官能基を通じてリンカーのベンジル性ヒドロキシル基に連結されていてもよい（PABC）。得られるプロドラッグはプロテアーゼ仲介切断後に活性化され、1,6-脱離反応を引き起こして、無修飾薬物、二酸化炭素、およびリンカー基の残りを放出する。以下のスキームは、p-アミドベンジルエーテルの切断および薬物の放出を示す：
2020111583.tif 000033
式中、X-Dは無修飾薬物を表す。
【０１３５】
この自己犠牲基の複素環式変種も記載されている。例えば、US 7,989,434を参照されたく、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１３６】
いくつかの態様において、酵素的に切断可能なリンカーはβ-グルクロン酸系リンカーである。薬物の容易な放出は、リソソーム酵素のβ-グルクロニダーゼによるβ-グルクロニドグリコシド結合の切断を通じて実現し得る。この酵素はリソソーム内に豊富に存在し、いくつかの腫瘍型において過剰発現されるが、細胞外での酵素活性は低い。β-グルクロン酸系リンカーを用いて、ADCがβ-グルクロニドの親水性による凝集を起こす傾向を回避してもよい。いくつかの態様において、疎水性薬物に連結されたADCのためのリンカーとして、β-グルクロン酸系リンカーが好ましい。以下のスキームは、β-グルクロン酸系リンカーを含むADCからの薬物の放出を示す。
2020111583.tif 000034
【０１３７】
オーリスタチン、カンプトテシンおよびドキソルビシン類縁体、CBI小溝結合剤、ならびにプシンベリンなどの薬物を抗体に連結するのに有用な、様々な切断可能なβ-グルクロン酸系リンカーが記載されている（Nolting, Chapter 5 ''Linker Technology in Antibody-Drug Conjugates,'' In: Antibody-Drug Conjugates: Methods in Molecular Biology, vol. 1045, pp. 71-100, Laurent Ducry (Ed.), Springer Science & Business Medica, LLC, 2013；Jeffrey et al., 2006, Bioconjug. Chem. 17:831-840；Jeffrey et al., 2007, Bioorg. Med. Chem. Lett. 17:2278-2280；およびJiang et al., 2005, J. Am. Chem. Soc. 127:11254-11255を参照されたく、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる）。これらのβ-グルクロン酸系リンカーはすべて、本明細書に記載のADCにおいて用い得る。
【０１３８】
加えて、フェノール基を含む細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質をリンカーに、フェノール性酸素を通じて共有結合することができる。WO 2007/089149に記載されている、1つのそのようなリンカーは、ジアミノ-エタン「SpaceLink」を伝統的な「PABO」系自己犠牲基と共に用いてフェノールを送達する方法に頼っている。リンカーの切断を以下に模式的に示し、ここでDはフェノール性ヒドロキシル基を有する細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質を表す。
2020111583.tif 000035
【０１３９】
切断可能なリンカーは、切断不可能な部分もしくはセグメントを含んでいてもよく、かつ/または切断可能なセグメントもしくは部分は、それ以外は切断不可能なリンカーに含まれて、それを切断可能にしてもよい。例としてにすぎないが、ポリエチレングリコール（PEG）および関連ポリマーはポリマー骨格に切断可能な基を含んでいてもよい。例えば、ポリエチレングリコールまたはポリマーリンカーは、ジスルフィド、ヒドラゾンまたはジペプチドなどの、1つまたは複数の切断可能な基を含んでいてもよい。
【０１４０】
リンカーに含まれ得る他の分解可能な連結には、PEGカルボン酸または活性化PEGカルボン酸と生理活性物質上のアルコール基との反応によって形成されるエステル連結が含まれ、ここでそのようなエステル基は一般に生理的条件下で加水分解して生理活性物質を放出する。加水分解により分解可能な連結には、カーボネート連結；アミンとアルデヒドとの反応により生じるイミン連結；アルコールをリン酸基と反応させることにより形成されるリン酸エステル連結；アルデヒドとアルコールの反応生成物であるアセタール連結；ギ酸とアルコールの反応生成物であるオルトエステル連結；およびポリマーの末端、およびオリゴヌクレオチドの5'ヒドロキシル基を含むが、それらに限定されない、ホスホラミダイト基によって形成されるオリゴヌクレオチド連結が含まれるが、それらに限定されない。
【０１４１】
一定の態様において、リンカーは酵素的に切断可能なペプチド部分、例えば、構造式（IVa）もしくは（IVb）またはその塩を含むリンカーを含む：
2020111583.tif 000036
式中：
ペプチドは、リソソーム酵素によって切断可能なペプチド（C→Nで図示され、カルボキシ「末端」およびアミノ「末端」は示していない）を表し；
Tは、1つもしくは複数のエチレングリコール単位または1つのアルキレン鎖、あるいはその組み合わせを含むポリマーを表し；
Raは、水素、アルキル、スルホネートおよびメチルスルホネートから選択され；
pは0〜5の範囲の整数であり；
qは0または1であり；
xは0または1であり；
yは0または1であり；
2020111583.tif 000037
は、リンカーの細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質への連結点を表し；かつ
*は、リンカーの残りの部分への連結点を表す。
【０１４２】
一定の態様において、ペプチドはトリペプチドまたはジペプチドから選択される。特定の態様において、ジペプチドは、
2020111583.tif 000038
から選択される。一定の態様において、ジペプチドは：Cit-Val；およびAla-Valから選択される。
【０１４３】
本明細書に記載のADCに含まれ得る構造式（IVa）のリンカーの具体的な例示的態様には、以下に示すリンカーが含まれる（下記のとおり、リンカーはリンカーを抗体に共有結合するのに適した基を含む）。
2020111583.tif 000039
2020111583.tif 000040
【０１４４】
本明細書に記載のADCに含まれ得る構造式（IVb）のリンカーの具体的な例示的態様には、以下に示すリンカーが含まれる（下記のとおり、リンカーはリンカーを抗体に共有結合するのに適した基を含む）。
2020111583.tif 000041
2020111583.tif 000042
2020111583.tif 000043
2020111583.tif 000044
【０１４５】
一定の態様において、リンカーは酵素的に切断可能なペプチド部分、例えば、構造式（IVc）もしくは（IVd）またはその塩を含むリンカーを含む：
2020111583.tif 000045
式中：
ペプチドは、リソソーム酵素によって切断可能なペプチド（C→Nで図示され、カルボキシ「末端」およびアミノ「末端」は示していない）を表し；
Tは、1つもしくは複数のエチレングリコール単位または1つのアルキレン鎖、あるいはその組み合わせを含むポリマーを表し；
Raは、水素、アルキル、スルホネートおよびメチルスルホネートから選択され；
pは0〜5の範囲の整数であり；
qは0または1であり；
xは0または1であり；
yは0または1であり；
2020111583.tif 000046
は、リンカーの細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質への連結点を表し；かつ
*は、リンカーの残りの部分への連結点を表す。
【０１４６】
本明細書に記載のADCに含まれ得る構造式（IVc）のリンカーの具体的な例示的態様には、以下に示すリンカーが含まれる（下記のとおり、リンカーはリンカーを抗体に共有結合するのに適した基を含む）。
2020111583.tif 000047
2020111583.tif 000048
【０１４７】
本明細書に記載のADCに含まれ得る構造式（IVd）のリンカーの具体的な例示的態様には、以下に示すリンカーが含まれる（下記のとおり、リンカーはリンカーを抗体に共有結合するのに適した基を含む）。
2020111583.tif 000049
2020111583.tif 000050
2020111583.tif 000051
2020111583.tif 000052
【０１４８】
一定の態様において、構造式（IVa）、（IVb）、（IVc）、または（IVd）を含むリンカーは、酸性媒質への曝露によって切断可能なカーボネート部分をさらに含む。特定の態様において、リンカーは細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質に酸素を通じて連結される。
【０１４９】
7.5.2.2.  切断不可能なリンカー
切断可能なリンカーは一定の利点を提供し得るが、本明細書に記載のADCを構成するリンカーは、切断可能でなくてもよい。切断不可能なリンカーでは、薬物の放出は、原形質といくつかの細胞質画分との間の差異を示す特性に依存しない。薬物の放出は、抗原仲介性飲食作用およびリソソーム画分への送達によりADCが内部移行し、ここで抗体が細胞内タンパク質分解を通じてアミノ酸のレベルにまで分解された後に起こると推論される。このプロセスは、薬物、リンカー、およびリンカーが共有結合したアミノ酸残基によって形成される薬物誘導体を放出する。切断不可能なリンカーとの結合体からのアミノ酸薬物代謝物は、切断可能なリンカーとの結合体と比べて、親水性が高く、かつ一般には膜透過性が低く、それにより傍観者効果が低く、かつ非特異的毒性が低くなる。一般に、切断不可能なリンカーを有するADCは、切断可能なリンカーを有するADCよりも、循環中に高い安定性を有する。切断不可能なリンカーはアルキレン鎖であってもよく、または、例えば、ポリアルキレングリコールポリマー、アミドポリマーに基づくなどの、本質的にポリマー性であってもよく、またはアルキレン鎖、ポリアルキレングリコールおよび/もしくはアミドポリマーのセグメントを含んでいてもよい。
【０１５０】
薬物を抗体に連結するために用いられる、様々な切断不可能なリンカーが記載されている。Jeffrey et al., 2006, Bioconjug. Chem. 17;831-840；Jeffrey et al., 2007, Bioorg. Med. Chem. Lett. 17:2278-2280；およびJiang et al., 2005, J. Am .Chem. Soc. 127:11254-11255を参照されたく、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。これらのリンカーはすべて、本明細書に記載のADCに含まれ得る。
【０１５１】
一定の態様において、リンカーはインビボで切断不可能な、例えば、構造式（VIa）、（VIb）、（VIc）もしくは（VId）またはその塩のリンカーである（下記のとおり、リンカーはリンカーを抗体に共有結合するのに適した基を含む）：
2020111583.tif 000053
式中：
Raは、水素、アルキル、スルホネートおよびメチルスルホネートから選択され；
Rxはリンカーを抗体に共有結合することが可能な官能基を含む部分であり；かつ
2020111583.tif 000054
はリンカーの細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質への連結点を表す。
【０１５２】
本明細書に記載のADCに含まれ得る構造式（VIa）〜（VId）のリンカーの具体的な例示的態様には、以下に示すリンカーが含まれる（下記のとおり、リンカーはリンカーを抗体に共有結合するのに適した基を含み、かつ
2020111583.tif 000055
は細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質への連結点を表す）。
2020111583.tif 000056
【０１５３】
7.5.2.3.  リンカーを抗体に連結するために用いる基
様々な基を用いて、リンカー-薬物シントンを抗体に連結してADCを得てもよい。連結基は、本質的に求電子性であり得：マレイミド基、活性化ジスルフィド、NHSエステルおよびHOBtエステルなどの活性エステル、ハロホルメート、酸ハロゲン化物、ハロアセトアミドなどのハロゲン化アルキルおよびベンジルが含まれる。以下に論じるとおり、本開示に従って用いることができる、「自己安定化」マレイミドおよび「架橋ジスルフィド」に関係する新興の技術もある。用いる具体的な基は、部分的には、抗体への連結部位に依存することになる。
【０１５４】
抗体結合条件下で自発的に加水分解して、安定性が改善されたADC種を生じる、「自己安定化」マレイミド基の一例を以下の図に示す。US20130309256 A1；およびLyon et al., Nature Biotech published online, doi:10.1038/nbt.2968を参照されたい。
2020111583.tif 000057
【０１５５】
Polythericsは、天然の蝶番であるジスルフィド結合の還元から誘導される対のスルフヒドリル基の架橋法を開示している。Badescu et al., 2014, Bioconjugate Chem. 25:1124-1136を参照されたい。反応を以下の図に示す。この方法の利点は、IgGの完全な還元（4対のスルフヒドリルを生じる）と、続く4当量のアルキル化剤との反応による、高いDAR4のADCを合成する能力である。「架橋ジスルフィド」を含むADCは高い安定性を有することも主張される。
2020111583.tif 000058
【０１５６】
同様に、以下に示すとおり、対のスルフヒドリル基を架橋することが可能なマレイミド誘導体（1、下記）が開発された。WO2013/085925を参照されたい。
2020111583.tif 000059
【０１５７】
7.5.2.4.  リンカー選択の考察
当業者には公知のとおり、特定のADCのために選択したリンカーは、抗体への連結部位（例えば、lys、cysまたは他のアミノ酸残基）、薬物ファルマコフォアの構造的制約および薬物の親油性を含むが、それらに限定されない、様々な因子によって影響を受け得る。ADCのために選択する具体的なリンカーは、具体的な抗体/薬物の組み合わせのために、これらの異なる因子の平衡を保つようなものであるべきである。ADCにおけるリンカーの選択によって影響を受ける因子の再検討については、Nolting, Chapter 5 ''Linker Technology in Antibody-Drug Conjugates,'' In: Antibody-Drug Conjugates: Methods in Molecular Biology, vol. 1045, pp. 71-100, Laurent Ducry (Ed.), Springer Science & Business Medica, LLC, 2013を参照されたい。
【０１５８】
例えば、ADCは、抗原陽性腫瘍細胞の近くに存在する傍観者抗原陰性細胞を死滅させることが観察されている。ADCによる傍観者細胞死滅のメカニズムは、ADCの細胞内処理中に形成された代謝産物が役割を果たし得ることを示している。抗原陽性細胞中でADCの代謝により生成した中性の細胞傷害性代謝物は、傍観者細胞死滅において役割を果たすようである一方、荷電代謝物は膜を通過しての培地中への拡散が妨げられると考えられ、したがって傍観者死滅に影響することができない。一定の態様において、リンカーは、ADCの細胞性代謝物によって引き起こされる傍観者死滅効果を減弱させるように選択する。一定の態様において、リンカーは、傍観者死滅効果を増大させるように選択する。
【０１５９】
リンカーの特性は、使用および/または保存条件下でのADCの凝集にも影響をおよぼし得る。典型的には、文献に報告されたADCは、抗体分子1個あたり3〜4個以下の薬物分子を含む（例えば、Chari, 2008, Acc Chem Res 41:98-107を参照されたい）。より高い薬物 対 抗体比（「DAR」）を得る試みは、特に薬物およびリンカーの両方が疎水性である場合、ADCの凝集によって失敗することが多かった（King et al., 2002, J Med Chem 45:4336-4343；Hollander et al., 2008, Bioconjugate Chem 19:358-361；Burke et al., 2009 Bioconjugate Chem 20:1242-1250）。多くの場合、3〜4よりも高いDARは、効力を高める手段として有利であり得る。細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質が本質的に疎水性である場合、特に3〜4よりも大きいDARが望まれる場合は、ADC凝集を低減する手段として、比較的親水性のリンカーを選択することが望ましい。したがって、一定の態様において、リンカーは保存および/または使用中にADCの凝集を低減する化学部分を組み込む。リンカーは、ADCの凝集を低減するために、荷電基または生理的pHで荷電される基などの、極性基または親水基を組み込んでもよい。例えば、リンカーは、塩などの荷電基、または生理的pHで、例えば、カルボキシレートを脱プロトン化する、もしくは、例えば、アミンをプロトン化する基を組み込んでもよい。
【０１６０】
多くの細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質を抗体に連結するために用い得る、20という高いDARを生じると報告されている多価リンカーの例が、WO 2009/073445；WO 2010/068795；WO 2010/138719；WO 2011/120053；WO 2011/171020；WO 2013/096901；WO 2014/008375；WO 2014/093379；WO 2014/093394；WO 2014/093640に記載されており、これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１６１】
特定の態様において、保存または使用中のADCの凝集は、サイズ排除クロマトグラフィ（SEC）により判定して、約10％未満である。特定の態様において、保存または使用中のADCの凝集は、サイズ排除クロマトグラフィ（SEC）により判定して、10％未満、例えば、約5％未満、約4％未満、約3％未満、約2％未満、約1％未満、約0.5％未満、約0.1％未満であるか、またはさらに低い。
【０１６２】
7.6.  抗CS1抗体薬物結合体の作製法
本明細書に記載のADCは、周知の化学を用いて合成してもよい。選択する化学は、特に、細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質の同一性、リンカーおよびリンカーを抗体に連結するために用いる基に依存することになる。一般には、式（I）のADCを以下のスキームに従って調製してもよい：
D-L-Rx＋Ab-Ry→（I）  [D-L-XY]n-Ab
式中、D、L、Ab、XYおよびnは前に定義したとおりであり、かつRxおよびRyは、前述のとおり、互いに共有結合を形成することが可能な相補的基を表す。
【０１６３】
基RxおよびRyの同一性は、シントンD-L-Rxを抗体に連結するのに用いる化学に依存することになる。一般には、用いる化学は抗体の完全性、例えば、その標的に結合するその能力を変えるべきではない。好ましくは、結合した抗体の結合特性は、非結合抗体のものと酷似することになる。分子を抗体などの生体分子に結合するための様々な化学および技術が当技術分野において公知であり、特に抗体への結合については周知である。例えば、Amon et al., ''Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,'' in: Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. Eds., Alan R. Liss, Inc., 1985；Hellstrom et al., ''Antibodies For Drug Delivery,'' in: Controlled Drug Delivery, Robinson et al. Eds., Marcel Dekker, Inc., 2nd Ed. 1987；Thorpe, ''Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,'' in: Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al., Eds., 1985；''Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy,'' in: Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al., Eds., Academic Press, 1985；Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58；PCT公報WO 89/12624を参照されたい。シントンを抗体に連結するために、これらの化学のいずれを用いてもよい。
【０１６４】
利用できるリジン残基への連結シントンのために有用ないくつかの官能基Rxおよび化学が公知で、例として、NHS-エステルおよびイソチオシアネートが含まれるが、それらに限定されない。
【０１６５】
システイン残基の利用できる遊離スルフヒドリル基への連結シントンのために有用ないくつかの官能基Rxおよび化学が公知で、例として、ハロアセチルおよびマレイミドが含まれるが、それらに限定されない。
【０１６６】
しかし、結合化学は利用可能な側鎖基に限定されない。アミンなどの側鎖は、適切な小分子をアミンに連結することにより、ヒドロキシルなどの他の有用な基に変換してもよい。この戦略を用いて、多官能性小分子を抗体の利用できるアミノ酸残基の側鎖に結合することにより、抗体上の利用可能な連結部位の数を増やすことができる。次いで、シントンをこれらの「変換した」官能基に共有結合するのに適した官能基Rxをシントンに含める。
【０１６７】
抗体を、結合のためのアミノ酸残基を含むように操作してもよい。ADCにおいて薬物を結合するのに有用な、遺伝子によりコードされていないアミノ酸残基を含むように抗体を操作するためのアプローチは、Axup et al., 2012, Proc Natl Acad Sci U S A. 109(40):16101-16106によって記載されており、シントンをコードされていないアミノ酸に連結するのに有用な化学および官能基と同様である。
【０１６８】
典型的には、シントンを、例えば、利用できるリジン残基の一級アミノ基または利用できるシステイン残基のスルフヒドリル基を含む、抗体のアミノ酸残基の側鎖に連結する。遊離スルフヒドリル基は、鎖間ジスルフィド結合を還元することによって得てもよい。
【０１６９】
Ryがスルフヒドリル基である連結のために（例えば、Rxがマレイミドであるとき）、抗体を一般にはまず完全または部分的に還元して、システイン残基間の鎖間ジスルフィド架橋を切断する。例示的なヒト化抗CS1抗体Hu34C3のために、スルフヒドリル基への結合に適した基を含む薬物-リンカーシントンの連結のために還元し得る具体的なシステイン残基および鎖間ジスルフィド架橋は、図3A〜3Cに示す、軽鎖中のCys220（Eu番号付けシステム）；ならびにヒトIgG1重鎖中のCys220、Cys226、およびCys229（Eu番号付けシステム：Kabatの番号付けでは、それぞれ、Cys233、Cys239、およびCys242）の鎖間ジスルフィド架橋である。
【０１７０】
ジスルフィド架橋に関与しないシステイン残基を、1つまたは複数のコドンの変異によって抗体中に操作してもよい。これらの不対システインを還元することで、結合に適したスルフヒドリル基が生じる。操作したシステインを組み込むのに好ましい位置には、例として、ヒトIgG1重鎖上のS112C、S113C、A114C、S115C、A176C、S180C、S252C、V286C、V292C、S357C、A359C、S398C、S428C（Kabatの番号付け）およびヒトIgカッパ軽鎖上のV110C、S114C、S121C、S127C、S168C、V205C（Kabatの番号付け）が含まれるが、それらに限定されない（例えば、米国特許第7,521,541号、米国特許第7,855,275号および米国特許第8,455,622号を参照されたい）。
【０１７１】
当業者であれば理解するであろうとおり、抗体分子に連結する細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質の数は、ADCの集合が本質的に不均一であるように、変動してもよく、ここで、連結した作用物質を1つ含む抗体もあれば、2つ、3つなどを含む抗体もある（および含まない抗体もある）。不均一度は、特に、細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質を連結するために用いる化学に依存することになる。例えば、連結のために抗体を還元してスルフヒドリル基を生じる場合、1分子あたりゼロ、2、4、6または8つの連結した作用物質を有する抗体の不均一混合物が生成することが多い。さらに、連結化合物のモル比を限定することにより、1分子あたりゼロ、1、2、3、4、5、6、7または8つの連結した作用物質を有する抗体が生成することが多い。したがって、状況に応じて、規定のDARは抗体の集合の平均値であり得ることが理解されるであろう。例えば、「DAR4」は、特定のDARピークを単離するための精製に供されておらず、かつ抗体1つあたり異なる数の細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質（例えば、抗体1つあたり0、2、4、6、8つの作用物質）を有するADC分子の不均一混合物を含み得るが薬物 対 抗体比平均値4を有する、ADC製剤を意味し得る。同様に、いくつかの態様において、「DAR2」は、薬物 対 抗体比平均値2の不均一ADC製剤を意味する。
【０１７２】
濃縮製剤が望まれる場合、規定の数の連結した細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質を有する抗体を、不均一混合物の精製により、例えば、カラムクロマトグラフィ、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィにより得てもよい。
【０１７３】
不均一ADC製剤を、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィ（「HIC」）により処理して、関心対象の指定のDAR（または複数の指定のDARの混合物）を有するADCに富む製剤を得てもよい。そのような濃縮製剤は本明細書において「EX」と示し、ここで「E」は、ADC製剤が処理され、特定のDARを有するADCに富むことを示しており、「X」は、ADC分子1つあたりの連結した細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質の数を表す。2つの特定のDARを有するADCの混合物に富む製剤は「EXEY」、3つの特定のDARの場合は「EXEYEZ」などと示し、ここで「E」は、指定のDARを濃縮するためにADC製剤が精製されていることを示し、「X」、「Y」および「Z」は濃縮したDARを表す。具体例として、「E2」は、ADC分子1つあたり2つの連結した細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質を有するADCを主に含むように濃縮された、ADC製剤を意味する。「E4」は、ADC分子1つあたり4つの連結した細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質を有するADCを主に含むように濃縮された、ADC製剤を意味する。「E2E4」は、2つのADC群（一群はADC分子1つあたり2つの連結した細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質を有するものであり、もう一群はADC分子1つあたり4つの連結した細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質を有するもの）を主に含むように濃縮された、ADC製剤を意味する。
【０１７４】
本明細書において用いられる、濃縮「E」製剤は、一般には、規定のDARのADCにおいて少なくとも約80％の純度であるが、少なくとも約85％、90％、95％、98％、またはさらに高い純度などの、より高いレベルの純度が得られることもあり、それが望ましい。例えば、「EX」製剤は、一般には、ADC分子1つあたりXの連結した細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質を有するADCにおいて少なくとも約80％の純度である。例えば、「EXEY」製剤などの、「より高次の」濃縮製剤について、ADC分子1つあたりXおよびYの連結した細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質を有するADCの総計は、一般には、製剤中の総ADCの少なくとも約80％をなすことになる。同様に、濃縮「EXEYEZ」製剤において、ADC分子1つあたりX、YおよびZの連結した細胞傷害性および/または細胞増殖抑制性作用物質を有するADCの総計は、製剤中の総ADCの少なくとも約80％をなすことになる。
【０１７５】
いくつかの態様において、ヒト化抗体Hu34C3を含むADCの不均一混合物から濃縮または高度に精製したADC製剤が企図される。例えば、クロマトグラフィ精製、例えば、HICを行ったHu34C3のADCの混合物は、抗体1つあたりの連結した薬物およびリンカーの濃縮された分布を有し得る。Hu34C3 E2は、抗体1つあたり主に2つの薬物分子を含む濃縮ADC群を意味する。Hu34C3 E4は、抗体1つあたり主に4つの薬物分子を含む濃縮ADC群を意味する。Hu34C3 E2E4は、抗体1つあたり主に2つおよび4つの薬物分子を含む濃縮ADC群である。いくつかの態様において、Hu34C3 ADCを、Hu34C3 E2、Hu34C3 E4、またはHu34C3 E2E4まで濃縮する。具体的態様において、Hu34C3 E2はHu34C3-MMAE E2、すなわち抗体1つあたり2つのMMAE分子を有するHu34C3の製剤である。もう1つの具体的態様において、Hu34C3 E4はHu34C3-MMAE E4、すなわち抗体1つあたり4つのMMAE分子を有するHu34C3の製剤である。
【０１７６】
純度は、当技術分野において公知のとおり、様々な方法によって評価し得る。具体例として、ADC製剤をHPLCまたは他のクロマトグラフィによって分析し、純度を得られたピークの曲線下面積を解析することによって評価してもよい。
【０１７７】
DAR平均値4を有するヒト化抗体Hu34C3を含むADCの不均一混合物、ならびに2つおよび4つの連結した作用物質を含む高度に精製または濃縮した製剤を得るための具体的方法を、実施例の項に提供する。これらの具体的方法は、他の抗CS1抗体、リンカーならびに/または細胞傷害性および/もしくは細胞増殖抑制性作用物質を含む不均一および/または濃縮ADCを得るための日常的な技術を用いて改変してもよい。
【０１７８】
7.7.  組成物
本明細書に記載の抗体および/またはADCは、抗体および/またはADCならびに1つまたは複数の担体、賦形剤および/または希釈剤を含む組成物の形であってもよい。組成物は、獣医学的用途またはヒトにおける薬学適用途などの具体的な用途のために製剤化されてもよい。組成物の形態（例えば、乾燥粉末、液体製剤など）ならびに用いる賦形剤、希釈剤および/または担体は、抗体および/またはADCの所期の用途、ならびに、治療的用途のためには、投与の様式に依存することになる。
【０１７９】
治療的用途のために、組成物を薬学的に許容される担体を含む無菌の医薬組成物の一部として供給してもよい。この組成物は、任意の適切な形態であり得る（患者に投与する所望の方法に依存して）。医薬組成物は患者に、経口、経皮、皮下、鼻内、静脈内、筋肉内、腫瘍内、硬膜下腔内、表面または局所などの、様々な経路によって投与することができる。任意の所与の症例における最も適切な投与経路は、特定の抗体および/またはADC、対象と、疾患の性質および重症度、ならびに対象の身体の状態に依存することになる。典型的には、医薬組成物は静脈内または皮下投与することになる。
【０１８０】
医薬組成物は、1回分の用量につき所定の量の本明細書に記載の抗体および/またはADCを含む、単位剤形で都合よく提供することができる。単位用量に含まれる抗体および/またはADCの量は、処置中の疾患、ならびに当技術分野において周知の他の因子に依存することになる。そのような単位用量は、1回の投与に適した量の抗体および/もしくはADCを含む凍結乾燥粉末の形、または液体の形であってもよい。乾燥粉末単位剤形は、シリンジ、適切な量の希釈剤および/または投与のために有用な他の構成要素と共に、キットで包装してもよい。液体の形の単位用量は、1回の投与に適した量の抗体および/またはADCをあらかじめ充填したシリンジの形で都合よく供給してもよい。
【０１８１】
医薬組成物は、複数回の投与に適した量のADCを含むバルクの形で供給してもよい。
【０１８２】
医薬組成物は、所望の純度を有する抗体および/またはADCを、当技術分野において典型的に用いられる任意の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤（これらはすべて本明細書において「担体」と呼ぶ）、すなわち、緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張化剤、非イオン性界面活性剤、抗酸化剤、および他の様々な添加剤と混合することにより、凍結乾燥製剤または水溶液としての保存のために調製してもよい。Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980)を参照されたい。そのような添加剤は、用いる用量および濃度で、受容者に対して非毒性であるべきである。
【０１８３】
緩衝剤は、生理的条件に近い範囲のpHを維持するのに役立つ。緩衝剤は多様な濃度で存在し得るが、典型的には約2mM〜約50mMの範囲の濃度で存在することになる。本開示による使用に適した緩衝剤には、クエン酸緩衝液（例えば、クエン酸一ナトリウム-クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸-クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸-クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸緩衝液（例えば、コハク酸-コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸-水酸化ナトリウム混合物、コハク酸-コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸緩衝液（例えば、酒石酸-酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸-酒石酸カリウム混合物、酒石酸-水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸-フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸-フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム-フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝液（例えば、グルコン酸-グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸-水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸-グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸緩衝液（例えば、シュウ酸-シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸-水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸-シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝液（例えば、乳酸-乳酸ナトリウム混合物、乳酸-水酸化ナトリウム混合物、乳酸-乳酸カリウム混合物など）および酢酸緩衝液（例えば、酢酸-酢酸ナトリウム混合物、酢酸-水酸化ナトリウム混合物など）などの、有機酸および無機酸の両方ならびにこれらの塩が含まれる。加えて、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液およびトリスなどのトリメチルアミン塩を用いることもできる。
【０１８４】
保存剤を加えて微生物の増殖を遅らせてもよく、約0.2％〜1％（w/v）の範囲の量で加えることができる。本開示による使用に適した保存剤には、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、ベンザルコニウムハロゲン化物（例えば、塩化物、臭化物、およびヨウ化物）、塩化ヘキサメトニウム、およびメチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロへキサノール、および3-ペンタノールが含まれる。時に「安定化剤」として公知の等張化剤は、本開示の液体組成物を確実に等張とするために加えることができ、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールなどの、多価糖アルコール、例えば、三価以上の糖アルコールが含まれる。安定化剤は、機能が充填剤から治療薬を可溶化する、または変性もしくは容器の壁への付着を防止する役に立つ添加剤の範囲であり得る、広い範疇の賦形剤を意味する。典型的な安定化剤は、多価糖アルコール（上に挙げたとおり）；アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、L-ロイシン、2-フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなどのアミノ酸、イノシトールなどのシクリトールをを含む、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール（myoinisitol）、ガラクチトール、グリセリンなどの有機糖または糖アルコール；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α-モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウムなどの硫黄含有還元剤；低分子量ポリペプチド（例えば、10残基以下のペプチド）；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコースなどの単糖；ラクトース、マルトース、スクロースおよびトレハロースなどの二糖；およびラフィノースなどの三糖；ならびにデイストランなどの多糖であり得る。安定化剤は、ADCの重量あたり0.5〜10重量％の範囲の量で存在してもよい。
【０１８５】
非イオン性界面活性剤または洗剤（「湿潤剤」としても公知）を加えて、糖タンパク質を可溶化するのを助け、ならびに、タンパク質の変性を引き起こすことなく、製剤を剪断面圧力に曝露させる、撹拌誘導性の凝集に対して糖タンパク質を保護してもよい。適切な非イオン性界面活性剤には、ポリソルベート（20、80など）、ポリオキサマー（184、188など）、およびプロニックポリオールが含まれる。非イオン性界面活性剤は、約0.05mg/mL〜約1.0mg/mL、例えば、約0.07mg/mL〜約0.2mg/mLの範囲で存在してもよい。
【０１８６】
さらなる様々な賦形剤には、充填剤（例えば、デンプン）、キレート剤（例えば、EDTA）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンE）、および共溶剤が含まれる。
【０１８７】
静脈内注入による投与に適した水性組成物の具体的態様は、20mg/mL Hu34C3抗体および/またはADC、例えば、Hu34C3 E2を含む。Hu34C3抗体および/またはADC組成物は、滅菌水または注射もしくは注入に適した他の溶液（例えば、0.9％食塩水、リンゲル液、乳酸リンゲル液など）による再構成後に、前記水性組成物を提供する、50mg、100mg、または200mgのHu34C3抗体および/またはADCを含む、例えば、バイアル中の凍結乾燥粉末の形であってもよい。組成物の具体的態様、または他の態様は、Hu34C3抗体および/またはADCの1回投与に適した量の組成物をあらかじめ充填した、注射および/または注入に適したシリンジまたは他の装置の形であってもよい。
【０１８８】
7.8.  使用法
本明細書に記載の抗体および/またはADCを含む医薬組成物を用いて、形質細胞腫瘍、例えば、MMを処置する。典型的には、医薬組成物を用いて、新しく診断されたものから再発性、および再発性かつ難治性の範囲の、意義不明の単クローン性免役グロブリン血症（MGUS）、形質細胞腫、くすぶり型-無症候性MM、および症候性MMを処置することができる。
【０１８９】
医薬組成物を、放射線療法、手術、化学療法、幹細胞移植、および処置中の骨髄腫の病期に基づく有効な処置戦略を開発するための支持療法などの、他の処置戦略と併用することもできる。
【０１９０】
1975年以来最も広く用いられている病期分類システムは、疾患の臨床病期（I期、II期、またはIII期）が4つの尺度に基づくDurie-Salmonシステムである（例えば、Durie and Salmon, 1975, Cancer, 36:842-854参照）。これらの4つの尺度は：（1）血清および/または尿中のモノクローナル（M）タンパク質（異常タンパク質としても公知）のレベル；（2）溶解性骨病変の数；（3）ヘモグロビン値；および（4）血清カルシウムレベルである。これらの3つの病期は、腎機能によってさらに分けることができ、A（比較的正常な腎機能、血清クレアチニン値＜2.0mg/dL）およびB（異常な腎機能、クレアチニン値≧2.0mg/dL）に分類される。新しい、より単純な代替法は国際病期分類システム（International Staging System）（ISS）である（例えば、Greipp et al., 2003, ''Development of an international prognostic index (IPI) for myeloma: report of the international myeloma working group'', The Hematology参照）。ISSは2つの血液検査結果、ベータ2-ミクログロブリン（β2-M）およびアルブミンの評価に基づいており、これによって患者を、治療の種類に関係なく、3つの予後群に分類する。
【０１９１】
医薬組成物の選択した用量範囲および経路での投与は、典型的には、欧州血液骨髄移植学会（EBMT）によって定義された有益な反応を誘発する。反応のEBMT基準を以下に挙げる。
2020111583.tif 000060
1EBMT：欧州血液骨髄移植学会；IBMTR：国際骨髄移植登録機構；ABMTR：自家血液および骨髄移植登録機構。
2非分泌型骨髄腫のみの患者では、骨髄中の形質細胞の初期数の＞50％の低減（部分奏功）または初期数の25〜49％の低減（最小奏功）が必要とされる。
3非分泌型骨髄腫では、骨髄形質細胞は＞25％、絶対数で少なくとも10％増加すべきで；MRI検査は選択した患者において有用であり得る。
【０１９２】
処置の転帰を評価するために用い得るさらなる基準には、「完全奏功に近い奏功」および「最良部分奏功」が含まれる。「完全奏功に近い奏功」は、「完全奏功」（CR）であるが、免疫固定法で陽性の基準と定義される。「最良部分奏功」は、Mタンパク質の90％を超える減少と定義される（例えば、Multiple Myeloma Research Foundation, Multiple Myeloma: Treatment Overview 9 (2005)参照）。
【０１９３】
MMに関連する少なくとも1つの症状を臨床的に示している個人で組成物の投与が反応を誘発する程度は、部分的には、疾患の重症度、例えば、I期、II期、またはIII期に依存し、また部分的には、患者が新しく診断された、または再発性、もしくは再発性かつ難治性MMを有するのいずれかに依存する。したがって、いくつかの態様において、医薬組成物の投与は完全奏功を誘発する。
【０１９４】
他の態様において、医薬組成物の投与は最良部分奏功または部分奏功を誘発する。
【０１９５】
他の態様において、医薬組成物の投与は最小奏功を誘発する。
【０１９６】
他の態様において、医薬組成物の投与は疾患が進行して、EBMTにより「不変」または「プラトー」と分類される反応をもたらすのを防止する。
【０１９７】
抗CS1 ADCを単独（単剤療法）で、あるいは他の抗癌療法および/または標的指向もしくは非標的指向抗癌剤に対して補助的にまたはそれらと共に付加的に投与してもよい。単剤療法として投与する場合、1つまたは複数の抗CS1 ADCを用いてもよい。単剤療法として投与するか、あるいは他の治療法または薬剤に対して補助的にまたはそれらと共に付加的に投与するかにかかわらず、全体の処置計画が治療的恩典を提供するような量の抗CS1 ADCを投与する。
【０１９８】
本明細書に記載の抗体および/またはADCと併用し得る治療剤には、標的指向薬剤、通常の化学療法剤、および支持療法剤が含まれるが、それらに限定されない。異なるクラス、例えば、標的指向剤、通常の化学療法剤、および支持療法剤、ならびに/またはサブクラスからの1つまたは複数の治療剤を、本明細書に記載の組成物中で組み合わせることもできる。例として、標的指向薬剤を、それらの作用機序に応じて、いくつかの異なるサブクラスに分けることができる。当業者には明らかであろうとおり、薬剤は複数の作用機序を有することがあり、したがって1つまたは複数のサブクラスに分類することができよう。本明細書に記載の組成物および方法の目的のために、以下のサブクラスが同定された：血管新生抑制剤、成長因子シグナル伝達の阻害剤、免疫調節剤、タンパク質合成、折りたたみおよび/または分解の阻害剤、遺伝子発現の阻害剤、アポトーシス促進剤、シグナル伝達を阻害する薬剤ならびに「他の」作用機序を有する薬剤。典型的には、「他の」サブクラスに入る薬剤の作用機序は不明であるか、またはあまり特徴付けられていない。
【０１９９】
例えば、いくつかの態様において、ベバシズマブ、スニチニブ、ソラフェニブ、バンデタニブ、アフリベルセプト、エタラシズマブ（MEDI-522）、シレンギチド、TKI258、CP-751,871、アタシセプト、リツキシマブ、アレムツズマブ、アルデスロイキン、アトオリズマブ、トシリズマブ、シルツキシマブ、テムシロリムス、エベロリムス、NPI-1387、MLNM3897、HCD122、SGN-40、HLL1、huN901-DM1、アチプリモド、ナタリズマブ、ボルテゾミブ、NPI-0052、タネスピマイシン、ベリノスタット、パノビノスタット、マパツムマブ、レクサツムマブ、AMG951、オブリメルセン、プリチデプシン、SCIO-469、P276-00、エンザスタウリン、チピファルニブ、ペリホシン、イマチニブ、ダサチニブ、ダラツムマブ、SAR650984、MOR202、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ポマリドマイド、レナリドマイドおよびサリドマイドなどの、標的指向薬剤を本明細書に記載の抗体および/またはADCと組み合わせて、MM患者を処置するために用いることができる。
【０２００】
他の態様において、チェックポイント阻害剤（抗PD1、抗PDL1、抗TIM3、抗AG3、抗CTLA4を含む）、BTK阻害剤（イブルチニブおよびCC-292などの）、T細胞アゴニスト（抗OX40、抗GITRなどの）または非T細胞アゴニスト（抗CD40などの）などのADCCを増強する薬剤（抗KIRまたは抗CD137などの）、免疫活性化を増強する薬剤を本明細書に記載の抗体および/またはADCと組み合わせて、MM患者を処置するために用いることができる。
【０２０１】
もう1つの例として、アルキル化剤（例えば、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、メルファラン、イホスファミド、ウラムスチン、クロラムブシル、カルムスチン、メクロエタミン（mechloethamine）、チオテパ、ブスルファン、テモゾロマイド、ダカルバジン）、代謝拮抗剤（例えば、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド、Ara-C、カペシタビン、5FU（5-フルオロウラシル）、アザチオプリン、メルカプトプリン（6-MP）、6-チオグアニン、アミノプテリン、ペメトレキセド、メトトレキサート）、植物アルカロイドおよびテルペノイド（例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、エトポシド、VP-16、テニポシド、イリノテカン、トポテカン）、抗腫瘍抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、ダウノルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、ミトキサントロン、アドリアマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシンC、カルミノマイシン、エスペラミシン）、ならびに他の薬剤（例えば、ダリナパルシン）などの通常の化学療法剤を本明細書に記載の抗体および/またはADCと組み合わせて、MM患者を処置するために用いることができる。
【０２０２】
もう1つの例として、抗CS1抗体またはADCを投与している患者の輸注反応を、アセトアミノフェン/パラセタモール、ジフェンヒドラミン、H2-ブロッカー、またはステロイド（デキサメタゾン、プレドニソン、およびプレドニソロンなどの）を含む、静脈内コルチコステロイドを投与および/または前投薬を行うことによって管理することができる。コルチコステロイド投与および/または前投薬は、輸注反応を予防するための十分に確立された指針（Lonial, et al., 2012, J Clin Oncol 30:1953-1959）を用いて、抗CS1抗体またはADCの投与の前に行うことになる。
【０２０３】
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体および/またはADCをデキサメタゾンと組み合わせて、MM患者を処置するために用いる。他の態様において、本明細書に記載の抗体および/またはADCをポマリドマイド、またはポマリドマイドおよびデキサメタゾンと組み合わせて、MM患者を処置するために用いる。他の局面において、本明細書に記載の抗体および/またはADCをレナリドマイド、またはレナリドマイドおよびデキサメタゾンと組み合わせて、MM患者を処置するために用いる。他の態様において、本明細書に記載の抗体および/またはADCをサリドマイド、またはサリドマイドおよびデキサメタゾンと組み合わせて、MM患者を処置するために用いる。さらに他の態様において、本明細書に記載の抗体および/またはADCをボルテゾミブ、ボルテゾミブおよびデキサメタゾン、またはパノビノスタット、パノビノスタットおよびボルテゾミブ、パノビノスタットとボルテゾミブおよびデキサメタゾンと組み合わせて、MMを処置するために用いる。さらに他の態様において、本明細書に記載の抗体および/またはADCをメルファラン、メルファランおよびプレドニソン（MP）、MPおよびサリドマイド（MPT）、またはMPおよびボルテゾミブ（VMP）と組み合わせて、MMを処置するために用いる。さらに他の態様において、本明細書に記載の抗体および/またはADCをシクロホスファミド、シクロホスファミドおよびサリドマイドおよびデキサメタゾン（CTD）、またはシクロホスファミドおよびボルテゾミブおよびデキサメタゾン（CyBorD）と組み合わせて、MMを処置するために用いる。
【０２０４】
もう1つの例として、ビスホスホネート（例えば、パミドロネート、ゾレドロン酸）、イバンドロネート、硝酸ガリウム、デノスマブ、ダルベポチン（darbepotin）アルファ、エポエチンアルファ、エルトロンボパグ、およびペグフィルグラスチムなどの支持療法剤を本明細書に記載の抗体および/またはADCと組み合わせて、MM患者を処置するために用いることができる。
【０２０５】
いくつかの態様において、Hu34C3 E2をデキサメタゾンと組み合わせて、MM患者を処置するために用いる。他の態様において、Hu34C3 E2をポマリドマイド、またはポマリドマイドおよびデキサメタゾンと組み合わせて、MM患者を処置するために用いる。他の局面において、Hu34C3 E2をレナリドマイド、またはレナリドマイドおよびデキサメタゾンと組み合わせて、MM患者を処置するために用いる。さらに他の態様において、Hu34C3 E2をボルテゾミブ、および任意にデキサメタゾンと組み合わせて、MMを処置するために用いる。さらに他の局面において、Hu34C3 E2をボルテゾミブおよびIMiD（例えば、サリドマイド、ポマリドマイド、レナリドマイド）、ならびに任意にデキサメタゾンと組み合わせて、MMを処置するために用いる。さらに他の態様において、Hu34C3 E2をメルファラン、メルファランおよびプレドニソン（MP）、MPおよびサリドマイド（MPT）、またはMPおよびボルテゾミブ（VMP）と組み合わせて、MMを処置するために用いる。さらに他の態様において、Hu34C3 E2をシクロホスファミド、シクロホスファミドおよびサリドマイドおよびデキサメタゾン（CTD）、またはシクロホスファミドおよびボルテゾミブおよびデキサメタゾン（CyBorD）と組み合わせて、MMを処置するために用いる。
【０２０６】
7.9.  用量および投与計画
投与する抗体および/またはADCの量は、処置中の特定の疾患、投与の様式、所望の治療的恩典、疾患の病期または重症度、患者の年齢、体重および他の特徴などを含むが、それらに限定されない、様々な因子に依存することになる。有効用量の決定は当業者の能力の範囲内である。
【０２０７】
有効用量は最初はインビボ動物モデルから、または臨床的に推定してもよい。多様な疾患に適した動物モデルが当技術分野において公知である。初期用量を、例えば、エロツズマブで得た臨床データなどの、他の抗CS1抗体による臨床データから推定してもよい。
【０２０８】
1つの態様において、本明細書に記載の抗CS1抗体および/またはADC組成物を、食塩水でさらに希釈し、静脈内注入により、7日毎に1回、14日毎に1回、21日毎に1回、または28日毎に1回投与する。一定の態様において、最初の周期のために、注入を180分かけて行う。いくつかの態様において、その後の注入は90分かけて行う。
【０２０９】
単剤療法として投与する場合、本明細書に記載の方法において用いる抗CS1抗体の用量は、典型的には、7、14、21、または28日毎に静脈内注射または注入により投与する場合、0.5mg/kg〜20mg/kgの間の範囲である。いくつかの態様において、抗CS1抗体、例えば、Hu34C3は、医薬組成物中に、少なくとも約0.5mg/kg、少なくとも約0.75mg/kg、少なくとも約1mg/kg、少なくとも約2mg/kg、少なくとも約2.5mg/kg、少なくとも約3mg/kg、少なくとも約4mg/kg、少なくとも約5mg/kg、少なくとも約6mg/kg、少なくとも約7mg/kg、少なくとも約8mg/kg、少なくとも約9mg/kg、少なくとも約10mg/kg、少なくとも約11mg/kg、少なくとも約12mg/kg、少なくとも約13mg/kg、少なくとも約14mg/kg、少なくとも約15mg/kg、少なくとも約16mg/kg、少なくとも約17mg/kg、少なくとも約18mg/kg、少なくとも約19mg/kg、および少なくとも約20mg/kgの用量割合での静脈内投与に適した濃度、または重量/体積パーセンテージ、または重量で存在する。いくつかの態様において、Hu34C3抗体を0.6mg/kg、0.9mg/kg、1.4mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、または8mg/kgで21日毎に1回投与する。例えば、Hu34C3抗体を4mg/kgで21日毎に1回投与することができる。一定の態様において、Hu34C3抗体を5mg/kgで21日毎に1回投与する。一定の態様において、Hu34C3抗体を6mg/kgで21日毎に1回投与する。一定の態様において、Hu34C3抗体を7mg/kgで21日毎に1回投与する。いくつかの態様において、Hu34C3抗体を0.4mg/kg、0.6mg/kg、1mg/kg、1.3mg/kg、2mg/kg、2.6mg/kg、3.3mg/kg、4mg/kg、4.6mg/kg、または5.3mg/kgで14日毎に1回投与する。例えば、Hu34C3抗体を2.6mg/kgで14日毎に1回投与することができる。一定の態様において、Hu34C3抗体を3.3mg/kgで14日毎に1回投与する。一定の態様において、Hu34C3抗体を4mg/kgで14日毎に1回投与する。一定の態様において、Hu34C3抗体を4.6mg/kgで14日毎に1回投与する。いくつかの態様において、Hu34C3抗体を0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.5mg/kg、0.7mg/kg、1mg/kg、1.3mg/kg、1.7mg/kg、2mg/kg、2.3mg/kg、または2.6mg/kgで7日毎に1回投与する。例えば、Hu34C3抗体を1.3mg/kgで7日毎に1回投与することができる。一定の態様において、Hu34C3抗体を1.7mg/kgで7日毎に1回投与する。
【０２１０】
本明細書に記載の方法において用いるADCの単剤療法の用量は、典型的には、0.15mg/kg〜10mg/kgの間の範囲である。いくつかの態様において、Hu34C3 E2を0.6mg/kg〜6mg/kgの間の用量範囲で用いる。いくつかの態様において、Hu34C3 E2などのADCは、医薬組成物中に、少なくとも約0.15mg/kg、0.3mg/kg、0.6mg/kg、少なくとも約1.2mg/kg、少なくとも約2mg/kg、少なくとも約2.4mg/kg、少なくとも約3.6mg/kg、少なくとも約4.8mg/kg、少なくとも約5.4mg/kg、および少なくとも約6.0mg/kg、少なくとも約7.0mg/kg、少なくとも約8mg/kg、少なくとも約9mg/kg、少なくとも約10mg/kgの用量割合での静脈内投与に適した濃度、または重量/体積パーセンテージ、または重量で存在する。いくつかの態様において、Hu34C3 E2を0.6mg/kg、0.9mg/kg、1.4mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、または8mg/kgで21日毎に1回投与する。例えば、Hu34C3 E2を4mg/kgで21日毎に1回投与することができる。一定の態様において、Hu34C3 E2を5mg/kgで21日毎に1回投与する。一定の態様において、Hu34C3 E2を6mg/kgで21日毎に1回投与する。一定の態様において、Hu34C3 E2を7mg/kgで21日毎に1回投与する。いくつかの態様において、Hu34C3 E2を0.4mg/kg、0.6mg/kg、1mg/kg、1.3mg/kg、2mg/kg、2.6mg/kg、3.3mg/kg、4mg/kg、4.6mg/kg、または5.3mg/kgで14日毎に1回投与する。例えば、Hu34C3 E2を2.6mg/kgで14日毎に1回投与することができる。一定の態様において、Hu34C3 E2を3.3mg/kgで14日毎に1回投与する。一定の態様において、Hu34C3 E2を4mg/kgで14日毎に1回投与する。一定の態様において、Hu34C3 E2を4.6mg/kgで14日毎に1回投与する。いくつかの態様において、Hu34C3 E2を0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.5mg/kg、0.7mg/kg、1mg/kg、1.3mg/kg、1.7mg/kg、2mg/kg、2.3mg/kg、または2.6mg/kgで7日毎に1回投与する。例えば、Hu34C3 E2を1.3mg/kgで7日毎に1回投与することができる。一定の態様において、Hu34C3 E2を1.7mg/kgで7日毎に1回投与する。
【０２１１】
他の化学療法剤などの他の薬剤に対して補助的にまたはそれらと共に付加的に投与する場合、抗体および/またはADCを他の薬剤と同じスケジュールで、または異なるスケジュールで投与してもよい。同じスケジュールで投与する場合、抗体および/またはADCを他の薬剤の前、後、または同時に投与してもよい。いくつかの態様において、抗体および/またはADCを、標準治療に対して補助的にまたはそれらと共に付加的に投与する場合、抗体および/またはADCを標準治療の開始の前、例えば、標準治療の開始の1日、数日、1週間、数週間、1ヶ月、または数ヶ月も前に開始してもよい。
【０２１２】
いくつかの態様において、抗体および/またはADCをデキサメタゾンとの組み合わせで投与してもよい。例えば、Hu34C3 E2を、28日周期の20mg/週または40mg/週で経口錠剤として提供する低用量デキサメタゾンとの組み合わせで、0.15mg/kg〜10mg/kgの間で毎週、2週間毎、3週間毎または毎月投与することができる。他の態様において、Hu34C3 E2を、28日周期の第1〜第4日、第9〜第12日、および第17〜第20日に40mgで経口的に提供する高用量デキサメタゾンとの組み合わせで、0.15mg/kg〜10mg/kgの間で毎週、2週間毎、3週間毎または毎月投与することもできる。他の態様において、Hu34C3 E2を、輸注関連反応を阻止するためのデキサメタゾンとの組み合わせで、0.15mg/kg〜10mg/kgの間で毎週、2週間毎、3週間毎または毎月投与することもできる。デキサメタゾンは、Hu34C3 E2の投与の1〜24時間前に、8mg、32mgまたは40mgで経口または静脈内に提供してもよい。
【０２１３】
他の態様において、抗体および/またはADCを、低用量デキサメタゾンと共に、またはこれを伴わずに、ポマリドマイドとの組み合わせで投与してもよい。例えば、Hu34C3 E2を、28日周期の20mg/週または40mg/週で経口錠剤として提供する低用量デキサメタゾンとの組み合わせ、および反復28日周期の21日間は毎日経口で4mg/日のポマリドマイドと、7日間は薬物なしの組み合わせで、0.15mg/kg〜10mg/kgの間で毎週、2週間毎、3週間毎または毎月投与することができる。
【０２１４】
他の態様において、抗体および/またはADCを、低用量デキサメタゾンと共に、またはこれを伴わずに、レナリドマイドとの組み合わせで投与してもよい。例えば、Hu34C3 E2を、28日周期の20mg/週または40mg/週で経口錠剤として提供する低用量デキサメタゾンとの組み合わせ、および第1日から第21日まで経口で25mgのレナリドマイドとの組み合わせで、0.15mg/kg〜10mg/kgの間で毎週、2週間毎、3週間毎または毎月投与することができる。
【０２１５】
いくつかの態様において、抗体および/またはADCを、低用量デキサメタゾンと共に、またはこれを伴わずに、ボルテゾミブとの組み合わせで投与してもよい。例えば、Hu34C3 E2を、最初の8周期は第1、4、8、および11日と、次いで進行するまで第1、8、および15日に1.3mg/m2 IVまたは皮下のボルテゾミブとの組み合わせで、0.15mg/kg〜10mg/kgの間で毎週、2週間毎、3週間毎または毎月投与することができる。他の態様において、Hu34C3 E2を、最初の8周期は第1、4、8、および11日と、次いで第1、8、および15日（疾患進行まで）に1.3mg/m2 IVまたは皮下のボルテゾミブ、ならびに第1、8、15日（最初の2周期）、第1＆11日（3〜8周期）と、第1および15日（それ以上の周期すべて）に経口または静脈内で8mgの低用量デキサメタゾンとの組み合わせで、0.15mg/kg〜10mg/kgの間で毎週、2週間毎、3週間毎または毎月投与することができる。当業者であれば理解するであろうとおり、ボルテゾミブの1.3、1.0、または0.7mg/m2/日を含む他の用量を用いてもよい。さらなる投与計画は、1週間に1回の投与も含み得る。
【実施例】
【０２１６】
8.  実施例
以下の実施例は、本明細書に記載の抗体およびADCの例示的態様の一定の特徴および特性を強調しており、これらは例示のために提供するにすぎず、限定的ではない。
【０２１７】
実施例1.  新規エピトープに結合する抗CS1抗体の生成
様々な抗CS1抗体を生成し、同定するために用いる方法を以下に記載する。
【０２１８】
1.1.  全長ヒトCS1をコードするプラスミドの調製
全長ヒトCS1（FL-HuCS1）cDNAをラージ細胞からCS1遺伝子に隣接しているプライマーを用いて単離した。PCR産物をゲル精製し、FL-HuCS1の安定な発現を可能にするベクター中に連結した。FL-HuCS1をコードするプラスミドを大規模で精製し、DNA塩基配列決定により確認した。
【０２１９】
1.2.  カニクイザルCS1の細胞外ドメインをコードするプラスミドの調製
カニクイザルCS1（CmCS1）の細胞外ドメイン（ECD）をコードするDNAを活性化PBMC細胞からCmCS1のECDに隣接しているプライマーを用いて単離した。PCR産物をゲル精製し、ヒトIgG1（ヒトFc-γ1）の定常領域をコードするベクター中に連結した。CmCS1 ECD-huIgG1をコードするプラスミドを大規模で精製し、DNA塩基配列決定により確認した。
【０２２０】
1.3.  全長hCS1を安定に発現するNS0細胞の調製
50μgのFL-HuCS1をコードするプラスミドを直線化し、エタノール中で沈澱させ、洗浄し、500μLの滅菌PBS中に再懸濁した。NS0細胞（ECACC Catalog # 85110503）を冷PBS中で2回洗浄し、PBS中2×107細胞/mLで再懸濁した。500μLのNS0細胞懸濁液（1×107細胞に対応）を再懸濁した直線化FL-HuCS1プラスミドと混合した。細胞を1.5Vおよび3μFでBioRad Gene pulserを用いて電気穿孔した。電気穿孔の後、細胞を100mLのDMEM完全培地に加え、T75フラスコ中に播種した。形質移入の24時間後、G418をDMEM完全培地に1μg/mLで加えた。第10日に、陽性形質移入体をフローサイトメトリーにより同定し、48穴および24穴プレート中で増殖させた。陽性形質移入体を再度スクリーニングし、FL-HuCS1を高発現するクローンを増殖させ、免疫化い用いた。
【０２２１】
1.4.  カニクイザルCS1の細胞外ドメインを安定に発現するHEK-293細胞の調製
CmCS1 ECD-HuIgG1プラスミドを用いて、HEK-293細胞を安定に形質移入した。形質移入は、Lipofectamine（Invitrogen）を製造者の指示に従い推奨通りに用いて実施した。簡単に言うと、HEK-293細胞を10cmプレート上で成長させ、冷PBS中で2回洗浄し、Opti-MEM培地でカバーした。Lipofectamine（10μL）をCmCS1 ECD-huIgG1プラスミド（2μg）と10分間混合し、次いで調製したHEK-293細胞に加えた。形質移入の24時間後、G418をDMEM完全培地に1μg/mLで加えた。G418耐性細胞を96穴プレートにサブクローニングし、CmCS1 ECD-huIgG1高発現クローンをELISAで同定した。
【０２２２】
1.5.  cmCS1 ECD-huIgG1の精製
CmCS1 ECD-huIgG1融合タンパク質を発現する安定な形質移入体を、600mLのグルコース添加剤を含むDMEM完全培地中で5日間増殖させた。融合タンパク質をプロテインAセファロースカラム上で精製し、1×PBSに対して透析した。CmCS1 ECD-huIgG1の還元型および非還元型をクーマシー染色によって分析した。CmCS1 ECD-huIgG1を抗HuIgG1を用いてのウエスタンブロットでも分析し、N-末端配列決定により確認した。
【０２２３】
1.6.  免疫化戦略
FL-huCS1を発現する照射NS0細胞または精製した組換えCmCS1 ECD-huIgG1融合タンパク質を用いて、BALB/cおよびSJLマウスを足蹠から免疫化した。簡単に言うと、マウスを全量25μL中10μgのCmCS1 ECD-huIgG1タンパク質または500万個の照射NSO-huCS1細胞および等量のGerbuMMアジュバントで後足蹠に免疫化した。足蹠免疫化を3日または4日間隔で4回実施した。NSO-huCS1細胞を最初の2回の免疫化に用い、CmCS1 ECD-huIgG1融合タンパク質をその後の追加免疫に用いた。
【０２２４】
1.7.  ハイブリドーマの調製
NSO-huCS1およびCmCS1 ECD-huIgG1で免疫化したマウスを屠殺した。膝窩リンパ節をマウスから摘出した。リンパ球をリンパ節から単離し、リンパ球をマウス骨髄腫細胞系統NS0と、電気融合（BTX ECM2001）装置を用いて融合させることにより、ハイブリドーマを生成した。融合細胞を96穴プレートに2×106細胞/プレートの密度で播種した。うまく融合した細胞の選択を、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（HAT）を含む培地を用いて行った。
【０２２５】
1.8.  抗CS1抗体の同定
ハイブリドーマによって分泌された抗体の特異性を、ELISAによるヒトCS1 ECD-huIgG1およびCmCS1 ECD-huIgG1への結合、ならびに陰性対照CLL1 ECD-huIgG1への非結合によって判定した。ヒトCS1-ECD-huIgG1、CmCS1 ECD-huIgG1、またはCLL1 ECD-huIgG1を、ヤギ抗ヒトIgG（Fc特異的）抗体であらかじめコーティングしたプレート上に捕捉した。ハイブリドーマ上清をタンパク質に結合させ、HRP結合ロバ抗マウスIgG（H+L）抗体で検出した。ヒトおよびカニクイザルの両方を認識したが、CLL融合タンパク質を認識しなかったハイブリドーマを、内因性に発現するOPM-2細胞上のhuCS1分子への結合について、標準のフローサイトメトリープロトコルを用いて、さらに試験した。簡単に言うと、OPM-2細胞をハイブリドーマ上清と氷上で30分間インキュベートした。徹底的に洗浄した後、細胞をフィコエリトリン結合ヤギ抗マウスIgG特異的抗体と氷上で30分間インキュベートした。細胞を再度洗浄し、Becton Dickinson FACSCaliburで細胞表面結合抗体の存在について分析した。免疫化戦略のパラメーターの概要および同定したクローンの数を、以下の表4に提供する。ヒト/カニクイザルCS1交差反応性抗体の大多数はSJL系統で生成し（N＝28）、一方、BALB/cマウスにおける同様の免疫化は単一のヒト/カニクイザルCS1交差反応性抗体をもたらした。
【０２２６】
（表４）抗CS1抗体のための免疫化戦略の概要
2020111583.tif 000061
【０２２７】
実施例2.  新しい抗CS1抗体はPDL241が結合するエピトープとは異なるエピトープに結合する
例示的抗CS1抗体を、公知の抗CS1抗体PDL241とのフローサイトメトリーに基づく競合検定で試験した。競合検定により、本明細書に記載の抗体がPDL241が結合するものとは異なるエピトープに結合することを確認する。
【０２２８】
2.1.  方法
ヒトCS1を形質移入した293s細胞（データポイントごとに300,000細胞）をAF488標識したPDL241抗体と、様々な濃度でインキュベートした。80％の最大結合が起こる濃度を特定し（6μg/mL）、その後の競合検定に用いた。
【０２２９】
競合検定のために、形質移入した293s細胞（データポイントごとに300,000細胞）を10倍過剰の非標識試験抗体（60μg/mL）と（氷上で）30分間インキュベートした。インキュベーション後、6μg/mLのAF488標識PDL241を細胞に加え、氷上で30分間インキュベートした。このインキュベーション後、細胞をPBS＋1％FBSで洗浄し、AF488標識PDL241の結合をフローサイトメトリーで判定した。AF488標識PDL241結合を20％阻害しなかった任意の抗体を、PDL241と競合せず、PDL241が結合するものとは異なるエピトープに結合すると考える。抗体MSL109を陰性対照として試験し、PDL241とは異なるエピトープに結合することが以前に判明している（Woo, 2013, Arthritis Res Ther 15(6):R207参照）エロツズマブを陽性対照として試験した。
【０２３０】
2.2.  結果
結果を図4に示す。抗体Mu4F2だけがPDL241と競合し、PDL241と同じエピトープに結合する。Mu12D10、Mu14C11、Mu27A12、Mu27H1、Mu28A6、Mu31D2、Mu34C3およびMu30C1を含む、試験した他の抗体はすべて、PDL241と競合せず、PDL241が結合するものとは別のエピトープに結合する。
【０２３１】
実施例3.  例示的抗体を含む抗体薬物結合体はインビトロでL-363細胞の増殖を阻害する
HuCS1およびCmCS1に結合し、PDL241との結合について競合しない抗体を、ADCとして結合した場合の細胞の増殖を阻害するそれらの能力について試験した。
【０２３２】
3.1.  方法
すべての抗体を、モノメチルオーリスタチンE（「MMAE」；オーリスタチン微小管阻害剤）、モノメチルオーリスタチンF（「MMAF」；オーリスタチン微小管阻害剤）およびデュオカルマイシン（DNA損傷薬）のそれぞれに、以前に記載された方法（Doronina et al., 2003, Nat Biotechnology 21(7):778-784；Polson et al., 2007, Blood 1102:616-623）を用いて結合した。各ADCの薬物負荷はほぼ同等であった。HuCS1を発現する10,000〜20,000個の細胞（L-363ヒト多発性骨髄腫細胞）を96穴プレートに播種し、異なる量のADCを細胞に加えた。ADCの添加の4日後、細胞生存度をCellTiter-Blue(登録商標) Cell Viability Assay（Promega）を用いて測定し、IC50値を計算した。
【０２３３】
3.2.  結果
試験したすべてのADCのIC50値を、以下の表5に提供する。試験したすべてのADCは細胞の増殖を阻害した。
【０２３４】
（表５）様々な例示的ADCのIC50（nM）
2020111583.tif 000062
【０２３５】
実施例4.  例示的抗CS1抗体のヒト化
抗体Mu34C3、Mu31D2およびMu27A12を含む、ADCとしての3つの最も強力な増殖阻害剤の基礎を形成した抗体を、ヒト化のために選択し、標準の方法を用いてヒト化した。
【０２３６】
4.1.  ヒト化プロセスの概要
用いたヒト化プロセスの概要を以下の流れ図に示す：
2020111583.tif 000063
【０２３７】
様々な段階は以下のとおりであった：
1.  マウス配列（ドナー配列）のフレームワークおよびCDR残基を決定する
2.  MOEソフトウェアにより既存の抗体に対する相同性に基づいてVH-VL構造モデルを作製する
3.   CDRループ構造のために重要な、CDRの5Å以内またはVH/VL界面近くの残基、および、バーニアゾーン残基を含むVH/VL界面の残基を同定する
4.  Kabatナンバリングスキームに従って残基を割り当てる
5.  重鎖および軽鎖CDRのカノニカル構造を決定する
6.  可能なアクセプターフレームワークと同じCDRカノニカル構造を有する、ヒトVHおよびVLフレームワーク配列を同定する
7.  マウスドナー配列に最良の同一性および最高の類似性を有する、ヒト接合領域配列（JHおよびJk）を同定する
8.  マウスドナー配列を、同じ（または最も類似した）CDRカノニカル構造を有する可能なヒトアクセプター配列と整列させる。これは、下記を比較することにより、VHおよびVL配列で別々に行う：
a.  全V領域の同一性および類似性
b.  CDR残基を除く、全V領域の同一性および類似性
c.  CDRループ構造およびVH/VL界面のために重要なフレームワーク残基
d.  CDRループ構造およびVH/VL界面のために重要なCDR配列およびフレームワーク残基
9.  すべての整列からの残基を考慮し、アクセプター配列としてVHのために1つまたは2つの最良のヒトフレームワーク配列およびVLのために1〜2つの配列を同定する。2つの選択したVHまたはVL配列は、異なるサブグループからであるべきである。
10.  ドナーマウスCDR配列を選択したヒトフレームワーク配列上に移植して、ヒト化抗体VHおよびVL配列を作製する
a.  N連結グリコシル化部位（N{P}S/T）がないことを確認するためにチェックする
b.  N末端GlnをGluに変更することを考慮する
c.  可能な脱アミド化（NG、NS、NN）、異性化（DG、DS、DH）、タンパク質分解（DP）部位についてスクリーニングし、さらなる傾向操作（liability engineering）について目印を付ける
11.  ヒト化およびマウスドナー配列を比較して、2つの間で異なり、CDRループ構造またはVH/VL界面のために重要な、フレームワーク残基を同定する。これらは逆突然変異候補である。
【０２３８】
4.2.  CDR移植した、ヒト化抗CS1抗体を構築するための、ヒト生殖細胞系配列選択
前述の方法を適用することにより、モノクローナル抗体Mu34C3、Mu27A12およびMu31D2のVHおよびVL鎖のCDR配列を、異なるヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列上に移植した。
【０２３９】
4.2.1.  Mu34C3のヒト化
モノクローナル抗体Mu34C3のVHおよびVL配列との整列に基づき、以下の公知のヒト配列を選択した：
1.  重鎖アクセプター配列を構築するためのIGHV3-7*01およびIGHJ6*01
2.  軽鎖アクセプター配列を構築するためのIGKV2-29*02およびIGKJ4*01
【０２４０】
Mu34C3の対応するVHおよびVLCDRを前記アクセプター配列に移植することにより、CDR移植し、ヒト化し、かつ改変したVHおよびVL配列を調製した。調製したVH配列を図2Aに示し；調製したVL配列を図2Bに示す。
【０２４１】
Hu34C3VH.1（SEQ ID NO:7）は、IGHV3-7*01およびIGHJ6*01フレームワーク配列を含む、CDR移植した、ヒト化Mu34C3/Mu27A12 VHである。
【０２４２】
Hu34C3VH.1b（SEQ ID NO:8）は、Hu34C3VH.1（SEQ ID NO:7）に基づくデザインで、3つのCDRヒト生殖細胞系変化、L60V、L63VおよびS65Gを有する。
【０２４３】
Hu34C3VL.1（SEQ ID NO:9）は、IGKV2-29*02およびIGKJ4*01フレームワーク配列を含む、CDR移植した、ヒト化Mu34C3/Mu27A12 VLである。
【０２４４】
Hu34C3VL.1a（SEQ ID NO:10）は、Hu34C3VL.1（SEQ ID NO:9）に基づき、2つのフレームワーク逆突然変異I2VおよびY87Fを有する、ヒト化デザインである。
【０２４５】
Hu34C3VL.1b（SEQ ID NO:11）は、1つのフレームワーク逆突然変異（I 2V）を有する、Hu34C3VL.1（SEQ ID NO:9）とHu34C3VL.1a（SEQ ID NO:10）との間の中間デザインである。
【０２４６】
4.2.2.  Mu27A12のヒト化
モノクローナル抗体Mu27A12のVHおよびVL配列との整列に基づき、以下の公知のヒト配列を選択した：
1.  重鎖アクセプター配列を構築するためのIGHV3-7*01およびIGHJ6*01
2.  軽鎖アクセプター配列を構築するためのIGKV2-29*02およびIGKJ4*01
【０２４７】
Mu27A12の対応するVHおよびVLCDRを前記アクセプター配列に移植することにより、CDR移植し、ヒト化し、かつ改変したVHおよびVL配列を調製した。調製したVH配列を図2Aに示し；調製したVL配列を図2Bに示す。
【０２４８】
Hu27A12VH.1（SEQ ID NO:23）は、IGHV3-7*01およびIGHJ6*01フレームワーク配列を含む、CDR移植した、ヒト化Mu34C3/Mu27A12 VHである。
【０２４９】
Hu27A12VH.1b（SEQ ID NO:24）は、Hu27A12VH.1に基づくデザインで、3つのCDRヒト生殖細胞系変化、L60V、L63VおよびS65Gを有する。
【０２５０】
Hu27A12VL.1（SEQ ID NO:25）は、IGKV2-29*02およびIGKJ4*01フレームワーク配列を含む、CDR移植した、ヒト化Mu34C3/Mu27A12 VLである。
【０２５１】
Hu27A12VL.1a（SEQ ID NO:26）は、Hu27A12VL.1（SEQ ID NO:25）に基づき、2つのフレームワーク逆突然変異I2VおよびY87Fを有する、ヒト化デザインである。
【０２５２】
Hu27A12VL.1b（SEQ ID NO:27）は、1つのフレームワーク逆突然変異I2Vを有する、Hu27A12VL.1（SEQ ID NO:25）とHu27A12VL.1a（SEQ ID NO:26）との間の中間デザインである。
【０２５３】
4.2.3.  Mu31D2のヒト化
モノクローナル抗体Mu31D2のVHおよびVL配列との整列に基づき、以下の公知のヒト配列を選択した：
1.  重鎖アクセプター配列を構築するためのIGHV3-7*01およびIGHJ4*01
2.  軽鎖アクセプター配列を構築するためのIGKV2-28*01およびIGKJ4*01
【０２５４】
Mu31D2の対応するVHおよびVLCDRを前記アクセプター配列に移植することにより、CDR移植し、ヒト化し、かつ改変したVHおよびVL配列を調製した。調製したVH配列を図2Aに示し；調製したVL配列を図2Bに示す。
【０２５５】
Hu31D2VH.1（SEQ ID NO:16）は、IGHV3-7*01およびIGHJ4*01フレームワーク配列を含む、CDR移植した、ヒト化Mu31D2 VHである。逆突然変異破は存在しない。
【０２５６】
Hu31D2VH.1a（SEQ ID NO:17）は、Hu31D2VH.1に基づくヒト化デザインで、3つのCDRヒト生殖細胞系変化、L60V、L63VおよびS65Gを含む。逆突然変異破は存在しない。
【０２５７】
Hu31D2VL.1（SEQ ID NO:18）は、IGKV2-28*01およびIGKJ4*01フレームワーク配列を含む、CDR移植した、ヒト化Mu31D2 VLである。
【０２５８】
Hu31D2VL.1a（SEQ ID NO:19）は、Hu31D2VL.1（SEQ ID NO:18）に基づき、2つのフレームワーク逆突然変異I2VおよびY87Fを有する、ヒト化デザインである。
【０２５９】
Hu31D2VL.1b（SEQ ID NO:20）は、1つのフレームワーク逆突然変異I2Vを有する、Hu31D2VL.1（SEQ ID NO:18）とHu31D2VL.1a（SEQ ID NO:19）との間の中間デザインである。
【０２６０】
実施例5.  ヒト化抗体はPDL241、エロツズマブおよびLuc34.3.8が結合するエピトープとは異なるエピトープに結合する
ヒト化抗体Hu34C3、Hu31D2およびHu27A12を、公知の抗CS1抗体PDL241、エロツズマブおよびLuc34.3.8とのフローサイトメトリーに基づく競合検定で試験した。競合検定により、抗体Hu34C3、Hu31D2およびHu27A12がPDL241、エロツズマブおよびLuc34.3.8が結合するものとは異なるエピトープに結合することを確認する。
【０２６１】
5.1.  PDL241競合検定の方法
ヒトCS1を形質移入した293s細胞をAF488標識したPDL241抗体と、様々な濃度でインキュベートした。80％の最大結合が起こる濃度を特定した（5μg/mL）。形質移入した293s細胞（データポイントごとに300,000細胞）を10倍過剰の非標識試験抗体（50μg/mL）と30分間（氷上で）インキュベートした。インキュベーション後、5μg/mLのAF488標識PDL241を細胞に加え、氷上で30分間インキュベートした。このインキュベーション後、細胞をPBS＋1％FBSで洗浄し、AF488標識PDL241の結合をフローサイトメトリーで判定した。AF488標識PDL241結合を20％阻害しなかった任意の抗体を、PDL241と競合せず、PDL241が結合するものとは異なるエピトープに結合すると考える。抗体MSL109を陰性対照として試験し、PDL241とは異なるエピトープに結合することが以前に判明している（Woo, 2013, Arthritis Res Ther 15(6):R207参照）エロツズマブを陽性対照として試験した。
【０２６２】
5.2.  PDL241競合検定の結果
検定の結果を図5に提供する。Hu27A12、Hu34C3およびHu31D2は、PDL241と競合せず、PDL241とは異なるエピトープに結合する。
【０２６３】
5.3.  エロツズマブ競合検定の方法
同様の実験を10μg/mLのAF488標識したエロツズマブで実施した。形質移入した293s細胞（データポイントごとに300,000細胞）を10倍過剰の非標識抗体（100μg/mL）と30分間（氷上で）インキュベートした。インキュベーション後、10μg/mLのAF488標識エロツズマブを細胞に加え、氷上で30分間インキュベートした。このインキュベーション後、細胞をPBS＋1％FBSで洗浄し、AF488標識エロツズマブの結合をフローサイトメトリーで判定した。AF488標識エロツズマブ結合を20％阻害しなかった任意の抗体を、エロツズマブと競合せず、エロツズマブが結合するものとは異なるエピトープに結合すると考える。抗体MSL109を陰性対照として試験し、エロツズマブとは異なるエピトープに結合することが以前に判明している（Woo, 2013, Arthritis Res Ther 15(6):R207参照）PDL241を陽性対照として試験した。
【０２６４】
5.4.  エロツズマブ競合検定の結果
検定の結果を図6に提供する。Hu27A12、Hu34C3およびHu31D2は、エロツズマブと競合せず、エロツズマブとは異なるエピトープに結合する。
【０２６５】
5.5.  Luc34.3.8競合検定の方法
同様の実験を2μg/mLのAF488標識したLuc34.3.8で実施した。HuCS1を発現するL-363細胞（ヒト多発性骨髄腫細胞系統）（データポイントごとに300,000細胞）を10倍過剰の非標識試験抗体（20μg/mL）と30分間（氷上で）インキュベートした。インキュベーション後、2μg/mLのAF488標識Luc34.3.8を細胞に加え、氷上で30分間インキュベートした。このインキュベーション後、細胞をPBS＋1％FBSで洗浄し、AF488標識PDL241の結合をフローサイトメトリーで判定した。AF488標識Luc34.3.8結合を20％阻害しなかった任意の抗体を、Luc34.3.8と競合せず、Luc34.3.8が結合するものとは異なるエピトープに結合すると考える。抗体MSL109を陰性対照として試験し、Luc34.3.8とは異なるエピトープに結合することが以前に判明している（Williams et al.への米国特許第8,433,646号参照）エロツズマブを陽性対照として試験した。
【０２６６】
5.6.  Luc34.3.8競合検定の結果
検定の結果を図7に提供する。Hu27A12、Hu34C3およびHu31D2は、Luc34.3.8と競合せず、Luc34.3.8とは異なるエピトープに結合する。
【０２６７】
実施例6.  抗体Hu34C3は別のエピトープに結合する
本明細書に記載の様々な例示的抗CS1抗体で実施したフローサイトメトリーに基づく競合実験は、Hu34C3は、PDL241、エロツズマブおよびLuc34.3.8が結合するエピトープとは異なるエピトープに結合することに加えて、独特のエピトープに結合することを示す。
【０２６８】
6.1.  方法
ヒトCS1を形質移入した293s細胞をAF488標識したHu34C3抗体と、様々な濃度でインキュベートした。80％の最大結合が起こる濃度を特定した（10μg/mL）。競合検定のために、形質移入した293s細胞（データポイントごとに300,000細胞）を10倍過剰の非標識試験抗体（100μg/mL）と30分間（氷上で）インキュベートした。インキュベーション後、10μg/mLのAF488標識Hu34C3を細胞に加え、氷上で30分間インキュベートした。このインキュベーション後、細胞をPBS＋1％FBSで洗浄し、AF488標識Hu34C3の結合をフローサイトメトリーで判定した。AF488標識Hu34C3結合を20％阻害しなかった任意の抗体を、Hu34C3と競合せず、Hu34C3が結合するものとは異なるエピトープに結合すると考える。抗体MSL109を陰性対照として試験し、Hu34C3とは異なるエピトープに結合することが本明細書において判明しているエロツズマブを陽性対照として試験した。
【０２６９】
6.2.  結果
競合検定の結果を図8に示す。試験した抗CS1抗体（Hu27A12およびHu31D2を含む）はどれも、Hu34C3と競合せず、Hu34C3は独特のエピトープに結合することを示している。
【０２７０】
実施例7.  抗体Hu34C3はすぐれた結合特性を有する
3つの例示的ヒト化抗体Hu27A12、Hu34C3およびHu31D2の結合親和性をフローサイトメトリーで評価し、エロツズマブのものと比較した。
【０２７１】
7.1.  方法
L-363細胞を異なる量の試験抗体と氷上で30分間インキュベートした。細胞をPBS＋1％FBSで3回洗浄した。PE結合ヤギ抗ヒトFc抗体を細胞に加え、氷上で30分間インキュベートした。細胞をPBS＋1％FBSで3回洗浄し、結合をフローサイトメトリーで定量した。
【０２７２】
7.2.  結果
結果を以下の表6に提供する。
【０２７３】
（表６）ヒト化抗体の結合特性
2020111583.tif 000064
aGeoMean（最大）＝任意の試験した濃度の抗体によって得られた最大蛍光値。
【０２７４】
試験したすべての抗体は、エロツズマブと比べてすぐれた結合親和性を示し、抗体Hu34C3は試験した他の抗体と比べてすぐれた最大結合を示す。
【０２７５】
実施例8.  DAR平均値4を有するHu34C3-MMAE ADCの調製
DAR平均値4を有するHu34C3-MMAE ADCを、2段階の化学工程−Hu34C3のジスルフィド還元と、続いて、以下に示すマレイミドカプロイルバリン-シトルリンパラアミノベンジルアルコール（「PABA」）モノメチルオーリスタチン（「vcMME」）でのアルキル化（結合）により調製した。
2020111583.tif 000065
【０２７６】
最初の段階において、Hu34C3の限られた数の鎖間ジスルフィド結合をトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン（「TCEP」）（≧0.8当量）で還元する。次いで、部分的に還元したHu34C3をDMSO中でvcMMAE（≧1.8当量）に結合する。残存する未反応のvcMMAEをN-アセチル-L-システインで反応停止させる。
【０２７７】
得られたADC製剤のクロマトグラフィ分離を示す図21を参照して、ADCは、還元された鎖間ジスルフィド架橋の数に応じて、ゼロ個の連結MMAE分子（「E0」ピーク）、2個の連結MMAE分子（「E2］ピーク）、4個の連結MMAE分子（「E4」ピーク）、6個の連結MMAE分子（「E6」ピーク）および8個の連結MMAE分子（「E8」ピーク）を有する抗体を含む不均一混合物である。
【０２７８】
クロマトグラフィにより濃縮E2およびE4ピークを分離および単離する方法は、Hamblett et al., Clin Cancer Res 2004; 10:7063-7070によって記載されている。
【０２７９】
実施例9.  DAR平均値4を有するMMAF ADCの調製
DAR平均値4を有するHu34C3-MMAF ADCを、実施例8の方法により、結合段階においてマレイミドカプロイルモノメチルオーリスタチンFを用いて調製した。
【０２８０】
実施例10.  Hu34C3を含むが、Hu31D2およびHu27A12を含まないMMAE ADCは、多発性骨髄腫のインビボモデルにおいて抗腫瘍特性を示す
抗体Hu34C3、Hu31D2およびHu27A12をそれぞれMMAEと、実施例8の手順を用いてDAR平均値4まで結合した。これらのADCを、Miyakawa et al., 2004, Biochemical and Biophysical Research Communications 313:258-262によって記載されたU266多発性骨髄腫インビボモデルで試験した。MSL109およびMMAEとDAR4まで結合したMSL109（上記のとおりに調製）を対照として試験した。
【０２８１】
簡単に言うと、2×106のU266ヒト多発性骨髄腫細胞をNOD/Scid/γc null（NSG）マウスに静脈内注射した。U266細胞は骨髄腔に浸潤して、腫瘍塊を形成し、これは正常骨髄に置き換わる。陽性HuCS1染色を、マウス骨髄組織におけるU266腫瘍細胞で検出する。骨髄中の腫瘍細胞の成長は、骨の溶骨性病変と、後肢麻痺および被毛の乱れの身体症状をきたす海綿骨の損失を引き起こす。
【０２８２】
U266細胞接種の28日後、マウスを示した群に無作為に割り付け、5mg/kgのADCで4日毎に3回（q4dx3）処置した。マウスを臨床症状について採点し、骨髄（大腿骨）中のHuCS1陽性U266細胞の数を判定した。臨床症状は、0（有害な身体症状なし）から5（重度の有害な身体症状）までの範囲の重症度レベルで採点した。この試験に含まれた研究者の先入観を避けるため、盲検とした。Hu34C3 MMAE DAR4による処置は、アイソタイプ対照に比べて、臨床症状（図9A）およびU266細胞数（図9B）の両方を有意に低減した。驚くことに、Hu27A12 MMAE DAR4およびHu31D2 MMAE DAR4はこのモデルでは無効であった。Hu27A12およびHu31D2はHu34C3と競合せず、Hu34C3のものとは異なるCS1上のエピトープに結合する。この差がインビボで観察された有効性の欠如に寄与しているのかもしれない。
【０２８３】
実施例11.  例示的な新しい抗CS1抗体を含むADCは、インビトロで多発性骨髄腫細胞の増殖を阻害する
いくつかの例示的な新しい抗CS1抗体を、実施例8に記載のとおりに、MMAEにDAR平均値4まで結合し、インビトロおよびインビボで、ヒト多発性骨髄腫細胞系統、MOLP-8に対して試験した。MSL109 MMAE DAR4を対照として試験した。インビトロ増殖検定を実施例3に記載のとおりに実施した。Hu34C3 MMAE DAR4およびMu176.1.1 MMAE DAR4はほぼ同等のインビトロ効力を示し、いずれもインビトロで試験した6つの他の抗体よりもすぐれていた（図10）。
【０２８４】
図10は、投与した抗体薬物結合体のナノモル濃度（「試験ADC（nM）」）に対する多発性骨髄腫細胞の生存パーセント（「生存％」）を示す。黒丸、実線はMu176.1.1 MMAE DAR4投与後の細胞生存を示し；白四角、破線はMu176.2.3 MMAE DAR4投与後の細胞生存を示し；白三角、点線はMu176.3.3 MMAE DAR4投与後の細胞生存を示し；白逆三角、鎖線はMu176.4.1 MMAE DAR4投与後の細胞生存を示し；白菱形、破線はMu176.7.1 MMAE DAR4投与後の細胞生存を示し；白丸、点線はMu176.8.1 MMAE DAR4投与後の細胞生存を示し；黒四角、実線はMu176.9.1 MMAE DAR4投与後の細胞生存を示し；黒三角、破線はHu34C3 MMAE DAR4投与後の細胞生存を示し；黒逆三角、実線はMSL109 MMAE DAR4投与後の細胞生存を示す。
【０２８５】
実施例12.  抗体Hu34C3を含むADCは、インビボで多発性骨髄腫細胞の増殖を阻害する
上記実施例11で試験したのと同じ抗体パネルを、MOLP-8由来異種移植片においてインビボで試験した。SCIDマウスの右側腹部に10×106のヒト多発性骨髄腫由来MOLP-8生細胞を皮下に接種した。注入量は、無血清培地およびMatrigel（BD、Franklin Lakes、NJ）の1：1混合物からなる0.1mLであった。腫瘍体積が約160mm3になれば、担癌マウスを等しい腫瘍体積平均値の群に分類した。必要なコホートへの無作為化および腫瘍のサイズマッチングの直後に治療を開始した。治療開始時のマウスの体重は約25gであった。腫瘍体積を1週間に2〜3回評価した。腫瘍の寸法を電子カリパスで測定し、腫瘍体積を式：V＝1/2×長さ×幅×高さを用いて計算した。試験第0日を細胞接種の日と定義した。マウスを示したADCにより3mg/kg q4dx3（4日毎に1回、合計3回）で処置した。驚くことに、Hu34C3 MMAE DAR4は有意なインビボ活性を示す唯一のADCであった。Mu176.1.1 MMAE DAR4はインビトロでHu34C3に匹敵する活性を有していたが、インビボでは有意に劣っていた。クローン176.1.1はHu34C3と競合せず、CS1上の異なるエピトープに結合する。この差がインビボで観察された有効性の欠如に寄与しているのかもしれない（図11）。
【０２８６】
図11は、示した抗体薬物結合体の投与後の日数（「細胞接種後の日数」）に対する立方ミリメートルでの異種移植腫瘍体積（「腫瘍体積（mm3）」）を示す。白右向き三角、破線はMSL109 MMAE DAR4投与後の体積を示し；白丸、点線はMu176.1.1 MMAE DAR4投与後の体積を示し；黒右向き三角、鎖線はMu176.2.3 MMAE DAR4投与後の体積を示し；黒三角、実線はMu176.3.3 MMAE DAR4投与後の体積を示し；網掛け右向き三角、破線はMu176.4.1 MMAE DAR4投与後の体積を示し；黒丸、点線はMu176.7.1 MMAE DAR4投与後の体積を示し；白四角、実線はMu176.8.1 MMAE DAR4投与後の体積を示し；黒四角、点線はMu176.9.1 MMAE DAR4投与後の体積を示し；白左向き三角、実線はHu34C3 MMAE DAR4投与後の体積を示す。
【０２８７】
12.1.  親和性がより高いHu34C3の変異体の生成
Hu34C3よりも高いHuCS1結合親和性を有するHu34C3のいくつかの変異体を、Hu34C3のVH鎖およびVL鎖におけるCDRの各残基を系統的に変異させることにより同定した。変異体のVHおよびVL領域ならびにそれぞれのCDRの配列を、配列Hu34C3 S55E（SEQ ID NO:12）およびHu34C3 N30L（SEQ ID NO:13）として図2に示す。それらの結合親和性（FACSにより判定し、Hu34C3に比べて）を以下の表7に提供する。
【０２８８】
（表７）
2020111583.tif 000066
【０２８９】
実施例13.  親和性がより高いHu34C3の変異体を含むADCは、インビトロで多発性骨髄腫細胞の増殖を阻害する
Hu34C3のN30L、S55EおよびN30L/S55E変異体をHEK293細胞中で標準の方法を用いて産生し、MMAEにDAR4まで結合し、L-363細胞によるインビトロ増殖検定においてHu34C3-MMAE DAR4と比較した。S55E、N30LおよびS55E/N30L変異体はすべて、野生型に比べて強い活性を示した（図12）。
【０２９０】
図12は、ナノモル濃度の示した抗体薬物結合体（「抗体濃度（nM）」）の投与後の多発性骨髄腫細胞の細胞生存パーセンテージ（「生存％」）を示す。黒丸、点線はMSL109 MMAE DAR4の効果を示し；黒菱形、破線はHu34C3 MMAE DAR4の効果を示し；白丸、鎖線は単一変異N30Lを有するHu34C3 MMAE DAR4の効果を示し；白四角、実線は単一変異S55Eを有するHu34C3 MMAE DAR4の効果を示し；白三角、実線は二重変異S55E/N30Lを有するHu34C3 MMAE DAR4の効果を示す。
【０２９１】
実施例14.  親和性がより高いHu34C3の変異体を含むADCは、インビボで腫瘍増殖を阻害する
SCIDマウスの右側腹部に10×106のヒト多発性骨髄腫由来L-363生細胞を皮下に接種した。注入量は、無血清培地およびMatrigel（BD、Franklin Lakes、NJ）の1：1混合物からなる0.1mLであった。腫瘍体積が約100mm3になれば、担癌マウスを等しい腫瘍体積平均値の群に分類した。必要なコホートへの無作為化および腫瘍のサイズマッチングの直後に治療を開始した。治療開始時のマウスの体重は約25gであった。腫瘍体積を1週間に2〜3回評価した。腫瘍の寸法を電子カリパスで測定し、腫瘍体積を式：V＝1/2×長さ×幅×高さを用いて計算した。試験第0日を細胞接種の日と定義した。マウスをMSL109 MMAE DAR4（対照）、Hu34C3 MMAE DAR4、Hu34C3 N30L MMAE DAR4、またはHu34C3 S55E/N30L MMAE DAR4のいずれかにより3mg/kg q4dx4（4日毎に1回、合計4回）で処置した。試験したADCはすべて有効であった。興味深いことに、HuCS1への親和性が増強された変異体を含むADCは、インビボ検定において野生型Hu34C3を含むADCよりも有効ではなかった。（図13）。
【０２９２】
図13は、示した抗体薬物結合体を複数回用量（白星で示す）で数日間投与した後（「細胞移植後の日数」）の立方ミリメートルでの異種移植腫瘍体積（「腫瘍体積（mm3）」）を示す。黒四角、破線はMSL109 MMAE DAR4を示し；白丸、点線はHu34C3 MMAE DAR4を示し；白四角、実線は単一変異N30Lを有するHu34C3 MMAE DAR4を示し；白三角、実線は二重変異S55E/N30Lを有するHu34C3 MMAE DAR4を示す。
【０２９３】
実施例15.  Hu34C3およびピロロベンゾジアゼピンのADCはインビトロで多発性骨髄腫細胞の増殖を阻害する
Hu34C3およびアイソタイプ対照抗体、AB095をPBD（ピロロベンゾジアゼピンSGD-1882）と、2段階の化学工程：ジスルフィド還元と、続いて、マレイミドカプロイルバリン-アラニン（「val-ala」）ピロロベンゾジアゼピン（「PBD」）でのアルキル化（結合）によりDAR平均値2まで結合した。
2020111583.tif 000067
【０２９４】
最初の段階において、限られた数の鎖間ジスルフィド結合をトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン（「TCEP」）（≧2当量）で還元する。次いで、部分的に還元した抗体をDMSO中でvaPBD（≧5当量）に結合する。残存する未反応のvaPBDをN-アセチル-L-システインで反応停止させる。得られた反応混合物を分取S300サイズ排除クロマトグラフィカラムにかけ、得られたADC−Hu34C3-PBD DAR2およびAB095-PBD DAR2−をインビトロでヒト多発性骨髄腫細胞系統、OPM-2、L-363、MM1.SおよびMOLP-8に対して試験した。インビトロ増殖検定を実施例3に記載のとおりに実施した。Hu34C3-PBD DAR2はアイソタイプ対照抗体（AB095-PBD DAR2）よりもすぐれたインビトロ効力を示した。図14A、14B、14C、および14Dは、それぞれOPM-2、L-363、MM1.S、およびMOLP-8細胞の結果を示す。
【０２９５】
実施例16.  Hu34C3およびピロロベンゾジアゼピンのADCはインビボで腫瘍増殖を阻害する
OPM-2異種移植片を調製し、前に記載のとおりに実施した。The Jackson LaboratoryからのNSGマウス（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ）（系統コード05557）を用いた。この系統はエフェクター細胞を欠き、すべての抗体のADCCメカニズムを排除する。破傷風トキソイドを標的とする抗体、AB095を対照として試験した。試験ADCの投与を、等しい質量のPBD成分が送達されるように標準化した。結果を図15に示す。Hu34C3 PBD DAR2は用量群のアイソタイプ対照（AB095 PBD DAR2）よりも統計学的に高い抗腫瘍活性を示さなかった。
【０２９６】
実施例17.  変異体Hu34C3およびピロロベンゾジアゼピンのADCはインビトロで多発性骨髄腫細胞の増殖を阻害する
Hu34C3およびアイソタイプ対照抗体、AB095を239位のセリンをシステインに変異させることにより改変した（S239C）。これらの変異抗体（Hu34C3 S239CおよびAB095 S239C）をPBD（ピロロベンゾジアゼピン）と、実施例15に記載のとおりに結合し、インビトロでヒト多発性骨髄腫細胞系統、L-363およびMM1.Sに対して試験した。インビトロ増殖検定を実施例3に記載のとおりに実施した。Hu34C3 S239C-PBDは、OPM-2およびL-363細胞で、アイソタイプ対照抗体（AB095  S239C-PBD）よりもすぐれたインビトロ効力を示した（それぞれ図16Aおよび16B）。
【０２９７】
実施例18.  Hu34C3およびトポイソメラーゼI阻害剤のADCはインビトロで多発性骨髄腫細胞の増殖を阻害する
Hu34C3およびアイソタイプ対照抗体、AB095をSN-38と、実施例8に記載の2段階化学工程により、それぞれ個別に結合し、それぞれの場合にDAR4材料を生成した。SN-38のフェノール性OHによりSN-38が付着しているリンカー-薬物部分（「SN-38リンカー-薬物」）、またはSN-38の3級OHによりSN-38が付着しているリンカー-薬物部分（「CL-38リンカー-薬物」）のいずれかで、結合を実施した。
2020111583.tif 000068
【０２９８】
反応に続き、粗製混合物をG25樹脂脱塩カラムにかけて過剰の試薬を除去し、インビトロでヒト多発性骨髄腫細胞系統、OPM-2およびL-363に対して試験した。インビトロ増殖検定を実施例3に記載のとおりに実施した。SN-38のフェノール性OHにより付着しているSN-38と結合した、DAR平均値4であるHu34C3（「Hu34C3-SN38 DAR4」）およびSN-38の3級OHにより付着しているSN-38と結合した、DAR平均値4であるHu34C3（「Hu34C3-CL38 DAR4」）は、アイソタイプ対照（SN-38のフェノール性OHにより付着しているSN-38と結合した、DAR平均値4であるAB095（「AB095-SN38 DAR4」）およびSN-38の3級OHにより付着しているSN-38と結合した、DAR平均値4であるAB095（「AB095-CL38 DAR4」）で観察されたものよりも統計学的有意に高い抗増殖活性を示さなかった（それぞれ図17Aおよび図17B）。
【０２９９】
実施例19.  Hu34C3およびトポイソメラーゼI阻害剤のADCはインビボで腫瘍増殖を阻害する
OPM-2異種移植片を調製し、前に記載のとおりに実施した。The Jackson LaboratoryからのNSGマウス（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ）（系統コード05557）を用いた。この系統はエフェクター細胞を欠き、すべての抗体のADCCメカニズムを排除する。破傷風トキソイドを標的とする抗体、AB095を対照として試験した。試験ADCの投与を、等しい質量のSN38成分が送達されるように標準化した。
【０３００】
Hu34C3-SN38 DAR4はアイソタイプ対照（AB095-SN38 DAR4）よりも統計学的有意に改善された抗腫瘍活性を示さなかった（図18）。
【０３０１】
実施例20.  Hu34C3の抗腫瘍活性はADCCに依存しない
抗腫瘍活性を増強する試みにおいて、Hu34C3のFc領域を改変した。ADCC活性、FcRn結合、および飲作用を変更する、いくつかの変異を作製した。これらの変異体のMMAE DAR4 ADCを、以前に記載のとおり（van Rhee, et al., 2009 Mol. Cancer Therapeutics 8: 2616-24）、SCIDマウスのOPM-2異種移植モデルにおいてインビボで試験した。破傷風トキソイドを標的とするIgG1アイソタイプ抗体、AB095のMMAE ADCを対照として試験した。結果を図19Aに示す。抗体Hu34C3 mut1は、CD16への結合を低減し、ADCC活性を有意に阻害する変異を含む、IgG1アイソタイプ抗体である。抗体Hu34C3 mut2は、同様の変異を含む、IgG2アイソタイプ抗体である。驚くことに、野生型Hu34C3に比べてADCC活性を失った変異体は、野生型Hu34C3と同様のインビボ活性を維持していた。これは、抗体Hu34C3の抗腫瘍活性はADCC活性に依存しないが、主にMMAEペイロードを送達するその能力によることを示唆している。これは、抗腫瘍活性がADCC依存的である他の抗CS1抗体とは対照的である（例えば、Hsi et al., 2008, Clin Cancer Res 14(9):2775-2784；Woo, 2013, Arthritis Res Ther 15(6):R207参照）。
【０３０２】
図19Aは、示した抗体薬物結合体を複数回用量（白星で示す）で数日間投与した後（「細胞移植後の日数」）の立方ミリメートルでの異種移植腫瘍体積（「腫瘍体積（mm3）」）を示す。黒四角、破線はMSL109 MMAE DAR4を示し；黒星、実線はHu34C3 MMAE DAR4を示し；白三角、実線はHu34C3 mut1 MMAE DAR4を示し；白丸、点線はHu34C3 mut2 MMAE DAR4を示す。
【０３０３】
同様の実験を、循環インビボ半減期が増大し、飲作用が低減したHu34C3変異体を含むADCで実施した；これらの変異体はHu34C3に基づくADCの抗腫瘍活性を有意に低下させた。結果を図19Bに示す。抗体Hu34C3 mut3は、ADCCおよび半減期を変える変異を含む、IgG1アイソタイプ抗体である。抗体Hu34C3 mut4は、ADCC、半減期および飲作用を変える変異を含む、IgG1アイソタイプ抗体である。
【０３０４】
図19Bは、示した抗体薬物結合体を複数回用量（白星で示す）で数日間投与した後（「細胞移植後の日数」）の立方ミリメートルでの異種移植腫瘍体積（「腫瘍体積（mm3）」）を示す。黒四角、破線はMSL109 MMAE DAR4を示し；黒星、実線はHu34C3 MMAE DAR4を示し；黒丸、実線はHu34C3 mut3 MMAE DAR4を示し；白丸、点線はHu34C3 mut4 MMAE DAR4を示す。
【０３０５】
実施例21.  Hu34C3-MMAE DAR4 ADCはインビボでHu34C3-MMAF ADCよりも有効である
Hu34C-MMAE DAR4 ADCの抗腫瘍活性を、実施例12に記載のとおり、MOLP-8異種移植インビボモデルで、Hu34C3-MMAF DAR4 ADCと比較した。抗体MSL109（10mg/kgで投与）、MSL109-MMAE（6mg/kgで投与）およびMSL109-MMAF（6mg/kgで投与）を対照として試験した。試験ADCを6mg/kgで4日毎に3回投与した。公開された報告は、MMAF ADCはより強力な毒素であると示唆している（例えば、Doronina et al., 2006 Biocon. Chem 170(1):114-124参照）。驚くことに、このMOLP-8異種移植モデルにおいて、Hu34C3-MMAE ADCはHu34C3-MMAF ADCよりも有意にすぐれた活性を示した（図20）。
【０３０６】
図20は、示した抗体薬物結合体を数日間投与した後（「細胞移植後の日数」）の立方ミリメートルでの異種移植腫瘍体積（「腫瘍体積（mm3）」）を示す。白丸、破線は10mg/kg用量のMSL109を示し；白三角、実線は6mg/kg用量のMSL109 MMAE DAR4を示し；黒逆三角、実線は6mg/kg用量のMSL109 MMAF DAR4を示し；黒四角、点線は6mg/kg用量のHu34C3 MMAE DAR4を示し；白菱形、破線は6mg/kg用量のHu34C3 MMAF DAR4を示す。
【０３０７】
実施例22.  濃縮Hu34C3-MMAE DAR2およびHu34C3-MMAE DAR4の単離
実施例8に記載のとおりに調製したHu34C3-MMAE DAR4の粗製製剤は、0個の連結MMAE分子を有する抗体、2個の連結MMAE分子を有する抗体、4個の連結MMAE分子を有する抗体、6個の連結MMAE分子を有する抗体および8個の連結MMAE分子を有する抗体からなる、DAR平均値4を有する不均一混合物を生じる（例えば、図21参照）。2分子の連結MMAEを有するHu34C3 ADCの濃縮製剤（すなわち、Hu34C3-MMAE E2、図22〜29において「Hu34C3 E2」と呼ぶ）および4分子の連結MMAEを有するもの（すなわち、Hu34C3-MMAE E4、図22〜24において「Hu34C3 E4」と呼ぶ）を、実施例8に記載のとおりに調製したHu34C3-MMAE DAR4から単離した。加えて、2または4分子の連結MMAEを有するHu34C3 ADCの濃縮製剤（すなわち、Hu34C3-MMAE E2E4、図28において「Hu34C3 E2E4」と呼ぶ）をHu34C3-MMAE DAR4製剤から単離した。
【０３０８】
図21に示すとおり、異なるDARを有するHu34C3-MMAEの抗体薬物結合体製剤をクロマトグラフィによって分離することができる。分離の方法はHamblett et al., Clin Cancer Res 2004; 10:7063-7070によって記載されている。
【０３０９】
単離のために、粗製結合反応混合物を、1/3量の4.5M (NH4)2SO4を加えることによりカラム結合塩条件に調節して、110mSの導電率を得た。このロード材料を、70mLのGE Butyl-HP樹脂を充填し、緩衝液A［1.5M (NH4)2SO4、20mM PO4、pH7］で平衡化した2.6×150cmカラムにポンプで注入した。ロードし、基準線まで洗浄した後、非結合抗体Hu34C3（「E0」）を、緩衝液AおよびBの90mS段階勾配混合物で溶離した（緩衝液B＝20mM PO4 pH7＋25％IPA）（保持時間＝3分）。Hu34C3 E2を、緩衝液AおよびBの60mS段階勾配混合物で溶離した（保持時間＝4分）。最後に、Hu34C3 E4を、緩衝液A＋Bの30mS段階勾配で溶離した（保持時間＝5分）。Hu34C3 E2の溶離プールを、Pellicon(登録商標)タンジェント流ろ過システム（膜XL-30kD）で、15mM MES緩衝液pH6.0を用いて、緩衝液交換し、濃縮した。「E6」（6個のMMAE分子を含む濃縮Hu34C3-MMAE）および「E8」（8個のMMAE分子を含む濃縮Hu34C3-MMAE）の製剤も、この勾配で単離することができる。最終材料をUV/Vis（A-280）で定量し、HICにより純度を、およびサイズ排除クロマトグラフィ（「SEC」）により凝集％を評価した。
【０３１０】
実施例23.  Hu34C3-MMAE E2およびHu34C3-MMAE E4は多発性骨髄腫のLP-1 LMCマウスモデルにおいてインビボで有効である
luc2（Promega、Madison、WI、USA）およびmCherry（Clontech、Mountain View、CA、USA）の融合作成物をLenti Xレンチウイルスベクター（Clontech）中にクローニングした。ヒト多発性骨髄腫細胞系統、LP-1にレンチウイルス粒子を48時間形質導入し、融合作成物を安定に発現する細胞のプールを2μg/mLのピューロマイシンを用いて2週間選択し、その後LP-1 luc2-mCherry（LP-1-LMC）と呼んだ。LP-1-LMC細胞をインビトロで第3継代まで増殖させた。第-1日に、雌SCIDベージュマウスを3グレイで全身照射して、腫瘍細胞生着の増大を可能にした。第0日に、マウス1匹あたり500万個のLP-1-LMC細胞を尾静脈から静脈内接種した。第22日または第30日に、生物発光シグナルの全身ROI分析に基づき、動物を処置群にサイズマッチングさせた。段階分け時の平均生物発光シグナルは約5×106光子/秒であった。データ計算をLiving Image、Version 4.4を用いて行った。
【０３１１】
Hu34C3-MMAE E2およびHu34C3-MMAE E4の有効性を全身LP-1-LMC異種移植片において評価した。ADCの用量を、等しい質量のMMAE成分が送達され、IgG成分では2倍差となるように、標準化した。用量レベルの範囲全域で、単一用量を腹腔内に投与した。Hu34C3-MMAE E2またはHu34C3-MMAE E4で処置したマウスすべてで、任意の腫瘍細胞の検出可能な徴候はなかった。このモデルでは、E2およびE4製剤の間で有効性の差はなかった（図22）。
【０３１２】
図22Aは、動物サイズマッチングおよび示した用量での抗体薬物結合体の投与後の日数（「サイズマッチ後の日数」）に対する生物発光シグナル（「標準化フラックス（p/s）」）を示す。破線は無処置動物を示し；網掛け四角、実線は3mg/kgのHu34C3-MMAE E2（「Hu34C3 E2」）で処置した動物を示し；黒四角、実線は6mg/kgのHu34C3-MMAE E2で処置した動物を示し；白四角、点線は9mg/kgのHu34C3-MMAE E2で処置した動物を示す。動物にサイズマッチング後の第0日に投与した。
【０３１３】
図22Bは、動物サイズマッチングおよび示した用量での抗体薬物結合体の投与後の日数（「サイズマッチ後の日数」）に対する生物発光シグナル（「標準化フラックス（p/s）」）を示す。破線は無処置動物を示し；網掛け四角、実線は1.5mg/kgのHu34C3-MMAE E4で処置した動物を示し；黒四角、実線は3mg/kgのHu34C3-MMAE E4で処置した動物を示し；白四角、点線は4.5mg/kgのHu34C3-MMAE E4で処置した動物を示す。動物にサイズマッチング後の第0日に投与した。
【０３１４】
実施例24.  Hu34C3-MMAE E2およびHu34C3-MMAE E4は多発性骨髄腫のL-363、MM1.SおよびMOLP-8異種移植モデルにおいてインビボで有効である
L-363、MM1.SおよびMOLP-8異種移植片を調製し、試験を実施例12に一般に記載のとおりに実施した。The Jackson LaboratoryからのNSGマウス（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ）（系統コード05557）を用いた。この系統はエフェクター細胞を欠き、すべての抗体のADCCメカニズムを排除する。この系統を用いることで、ADDC活性とは無関係にHu34C3-MMAE E2およびHu34C3-MMAE E4 ADC活性の評価が可能になる。破傷風トキソイドを標的とする抗体である、非結合抗体AB095（10mg/kgで投与）および非結合Hu34C3（10mg/kgで投与）を対照として試験した。試験ADCの投与を、等しい質量のMMAE成分が送達され、IgG成分では2倍差となるように、標準化した（すなわち、Hu34C3-MMAE E2は10mg/kgで投与し；Hu34C3-MMAE E4は5mg/kgで投与した）。結果を図23に示す。L-363（図23A）およびMM1.S（図23B）モデルにおいて、標準化したMMAE送達質量に基づいて比較した場合、Hu34C3-MMAE E2はHu34C3-MMAE E4よりも有意に良好な抗腫瘍活性を示した。Hu34C3-MMAE E2およびHu34C3-MMAE E4はMOLP-8モデルでは同様に有効であった（図23C）。非結合Hu34C3はこのモデルで活性を示さなかった。
【０３１５】
図23Aは、癌細胞移植後の日数（「細胞移植後の日数」）に対する立方ミリメートルでの異種移植片体積（「腫瘍体積（mm3）」）を示す。抗体薬物結合体の静脈内投与を矢印で示す（「I.V.投与日」）。結果：白丸、点線は10mg/kg AB095で処置した動物を示し；白四角、実線は10mg/kg Hu34C3で処置した動物を示し；白逆三角、実線は10mg/kgのHu34C3-MMAE E2で処置した動物を示し；黒四角、破線は5mg/kgのHu34C3-MMAE E4で処置した動物を示す。
【０３１６】
図23Bは、癌細胞移植後の日数（「細胞移植後の日数」）に対する立方ミリメートルでの異種移植片体積（「腫瘍体積（mm3）」）を示す。抗体薬物結合体の静脈内投与を矢印で示す（「I.V.投与日」）。結果：白丸、点線は10mg/kg AB095で処置した動物を示し；白四角、実線は10mg/kg Hu34C3で処置した動物を示し；白逆三角、実線は10mg/kgのHu34C3-MMAE E2で処置した動物を示し；黒四角、破線は5mg/kgのHu34C3-MMAE E4で処置した動物を示す。
【０３１７】
図23Cは、癌細胞移植後の日数（「細胞移植後の日数」）に対する立方ミリメートルでの異種移植片体積（「腫瘍体積（mm3）」）を示す。抗体薬物結合体の腹腔内投与を矢印で示す（「投与日i.p.」）。結果：白丸、点線は10mg/kg AB095で処置した動物を示し；白四角、実線は10mg/kg Hu34C3で処置した動物を示し；白三角、実線は10mg/kgのHu34C3-MMAE E2で処置した動物を示し；黒丸、破線は5mg/kgのHu34C3-MMAE E4で処置した動物を示す。
【０３１８】
試験したすべてのインビボモデルにおいて、Hu34C3-MMAE E2は、MMAE成分で標準化したHu34C3-MMAE E4とほぼ同等、またはそれよりもすぐれた抗腫瘍活性を有していた。
【０３１９】
実施例25.  Hu34C3-MMAE E2はラットにおいてHu34C3-MMAE E4よりも毒性が低い
Sprague-Dawleyラットに単一用量の粗製Hu34C3-MMAE DAR4（30mg/kg）、Hu34C3-MMAE E4（40mg/kg）またはHu34C3-MMAE E2（80mg/kg）を静脈内に投与した。ラットを苦痛の徴候（被毛の乱れ、反応性および体重減少）について毎日観察し、確立されたプロトコルに従って安楽死させた。血液試料をADCの注射の5日後および10日後に採取した。これらの試料を、細胞数および血液化学の変化について、VetScanおよびHemavet機器を用いて分析した。
【０３２０】
結果を図24に示す。有意な毒性がHu34C3-MMAE DAR4およびHu34C3-MMAE E4を投与したラットで観察され、これらの処置群では最終的にすべての動物が死亡した（図24A）。Hu34C3抗体はラットCS1に結合しないため、観察された毒性は結合したMMAEによるか、またはADCの代謝および排出後に放出され得る非結合MMAEによると推測することができる。
【０３２１】
図24Aは、抗体薬物結合体の投与後の日数（「日数」）に対する動物の生存パーセント（「生存パーセント」）を示す。太い実線は30mg/kg用量のDAR平均値4を有する不均一なHu34C3 MMAE混合物を示し；破線は40mg/kg用量のHu34C3-MMAE E4を示し；細い実線は80mg/kg用量のHu34C3-MMAE E2を示す。
【０３２２】
興味深いことに、等価の用量のMMAEをHu34C3-MMAE E2によって送達した場合、すべての動物は生存していた。さらなる調査により、Hu34C3-MMAE E2で処置した動物はHu34C3-MMAE E4で処置した動物よりも多くの血小板、多くの好中球を有し（図24B＆24C）、肝臓の損傷が少ない（ALTレベルで評価して）（図24D）ことも明らかとなった。図24Bおよび24Cにおいて、Hu34C3-MMAE DAR4で処置した4匹のラットのうち3匹は血液学的評価の前に死亡した。
【０３２３】
図24Bは、抗体薬物結合体に対する動物の血小板の濃度（「血小板（1000s/μL）」）を示す。MMAEへの曝露をx軸上にμmol/m2で示す。網掛けの丸はビヒクルで処置した動物を示し；網掛けの三角は30mg/kgのHu34C3 MMAE DAR4で処置した動物を示し；黒三角は30mg/kgのHu34C3-MMAE E4で処置した動物を示し；黒丸は40mg/kgのHu34C3-MMAE E4で処置した動物を示し；白三角は60mg/kgのHu34C3-MMAE E2で処置した動物を示し；白丸は80mg/kgのHu34C3-MMAE E2で処置した動物を示し；白四角は100mg/kgのHu34C3-MMAE E2で処置した動物を示す。
【０３２４】
図24Cは、抗体薬物結合体に対する動物の好中球の濃度（「好中球（1000s/μL）」）を示す。MMAEへの曝露をx軸上にμmol/m2で示す。網掛けの丸はビヒクルで処置した動物を示し；網掛けの三角は30mg/kgのHu34C3 MMAE DAR4で処置した動物を示し；黒三角は30mg/kgのHu34C3-MMAE E4で処置した動物を示し；黒丸は40mg/kgのHu34C3-MMAE E4で処置した動物を示し；白三角は60mg/kgのHu34C3-MMAE E2で処置した動物を示し；白丸は80mg/kgのHu34C3-MMAE E2で処置した動物を示し；白四角は100mg/kgのHu34C3-MMAE E2で処置した動物を示す。
【０３２５】
図24Dは、抗体薬物結合体に対するy軸上の動物のALTレベル（単位/L）を示す。MMAEへの曝露をx軸上にμmol/m2で示す。網掛けの丸はビヒクルで処置した動物を示し；網掛けの三角は30mg/kgのHu34C3 MMAE DAR4で処置した動物を示し；黒三角は30mg/kgのHu34C3-MMAE E4で処置した動物を示し；黒丸は40mg/kgのHu34C3-MMAE E4で処置した動物を示し；白三角は60mg/kgのHu34C3-MMAE E2で処置した動物を示し；白丸は80mg/kgのHu34C3-MMAE E2で処置した動物を示し；白四角は100mg/kgのHu34C3-MMAE E2で処置した動物を示す。
【０３２６】
これらのデータは、用量を標準化（送達したMMAEの質量）して比較した場合に、Hu34C3-MMAE E2がラットにおいてHu34C3-MMAE E4よりも毒性が低いことを示す。
【０３２７】
実施例26.  Hu34C3-MMAE E2はカニクイザルにおいてHu34C3-MMAE E4よりもよく耐容される
非GLP用量範囲検出試験において、Hu34C3-MMAE E2をカニクイザルに3週間毎（Q3W）の投与間隔で合計2用量（第1日および第22日）を30分間のIV注入により投与し、第29日に剖検した。この試験で用いた試験材料は、Hu34C3-MMAE E2、Hu34C3-MMAE E4、Hu34C3-MMAE DAR4および非結合Hu34C3抗体の比較を含んでいた。
【０３２８】
結果を以下の表8にまとめている。
【０３２９】
（表８）カニクイザルにおける非GLP用量範囲検出試験の概要
2020111583.tif 000069
好中球の有害な減少は、最小限〜中等度の骨髄低細胞性に、組織病理学的に相関していた。
【０３３０】
一般に、24mg/kgのHu34C3-MMAE E2用量で観察された効果の大きさは、≧6mg/kgのHu34C3-MMAE E4または12mg/kg Hu34C3-MMAE DAR4で観察された効果の大きさとほぼ同等であった。さらに、6および12mg/kgのHu34C3-MMAE E4ならびに12mg/kg Hu34C3-MMAE DAR4の用量での効果は、大きさが有害であった（＜1000細胞/μL）が、Hu34C3-MMAE E2のこれらの同じ用量での効果は大きさが有害ではなかった。異なる薬物 対 抗体比での効果の大きさの差は、Hu34C3-MMAE E2がより高い用量でより良好な耐容性をもたらすことを示している。
【０３３１】
実施例27.  ボルテゾミブと併用してのHu34C3-MMAE E2の、エフェクター細胞陰性マウスにおけるOPM-2異種移植片の阻害に対する活性
ボルテゾミブ（[(1R)-3-メチル-1-[[(2S)-1-オキソ-3-フェニル-2-[(ピラジニルカルボニル)アミノ]プロピル]アミノ]ブチル]ボロン酸としても公知；商標VELCADEとしてMillennium Pharmaceuticals, Inc.、Cambridge、MA 02139によって市販）と併用してのHu34C3-MMAE E2の有効性を、OPM-2の皮下異種移植片で判定した（van Rhee, et al., 2009 Mol. Cancer Therapeutics 8: 2616-24）。この実験ではエフェクター細胞陰性マウスを用いた（NSG系統）。Hu34C3-MMAE E2またはボルテゾミブによる処置は有意な腫瘍成長阻害をきたした（それぞれ54％および58％のTGImax値）（図25）。Hu34C3-MMAE E2およびボルテゾミブの組み合わせは、Hu34C3-MMAE E2またはボルテゾミブ単独に比べて、腫瘍成長の阻害の有意な増強（TGImax 93％）を示した。
【０３３２】
図25は、マウスにおける癌細胞導入後の時間（「細胞接種後の日数」）に対する立方ミリメートルでの異種移植腫瘍体積（「腫瘍体積（mm3）」）を示す。ボルテゾミブ投与の日を網掛けの逆三角で示し、抗体薬物結合体投与（「ADC投与」）の日を黒逆三角で示す。結果：黒丸、点線は3mg/kgのAB095-MMAE E2（「AB095 E2」）の効果を示し；白四角、実線は1mg/kgのボルテゾミブの効果を示し；白三角、破線は3mg/kgのHu34C3-MMAE E2の効果を示し；黒逆三角、実線は3mg/kgのHu34C3-MMAE E2と併用しての1mg/kgのボルテゾミブの効果を示す。
【０３３３】
実施例28.   カルフィゾミブと併用してのHu34C3-MMAE E2の、エフェクター細胞陰性マウスにおけるOPM-2異種移植片の阻害に対する活性
カルフィゾミブ（(S)-4-メチル-N-((S)-1-(((S)-4-メチル-1-((R)-2-メチルオキシラン-2-イル)-1-オキソペンタン-2-イル)アミノ)-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イル)-2-((S)-2-(2-モルホリノアセトアミド)-4-フェニルブタンアミド)ペンタンアミドとしても公知；商標KyprolisとしてOnyx Pharmaceuticals, Inc.、South San Francisco、CAによって市販）と併用してのHu34C3-MMAE E2の有効性を、OPM-2の皮下異種移植片で判定した。この実験ではエフェクター細胞陰性マウスを用いた（NSG系統）。Hu34C3-MMAE E2による処置は有意な腫瘍成長阻害をきたした（45％のTGImax値）。カルフィゾミブによる処置は腫瘍サイズに有意に影響をおよぼさなかった（＜10％のTGImax）（図26Aおよび26B）。Hu34C3-MMAE E2およびカルフィゾミブの組み合わせは、Hu34C3-MMAE E2単独とほぼ同等のレベルで腫瘍成長を阻害した（TGImax 43％（図26A）およびTGImax 59％（図26B））。
【０３３４】
実施例29.  Hu34C3-MMAE E2はエフェクター細胞陰性マウスにおけるOPM-2異種移植片の阻害に対し単剤療法として有効であり、ポマリドマイドおよび/またはデキサメタゾンとの併用でも有効である
ポマリドマイド（4-アミノ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)イソインドール-1,3-ジオンとしても公知；商標POMALYSTとしてCelgene Corporation、Summit、NJ 07901によって市販）および/またはデキサメタゾン（（8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17R)-9-フルオロ-11,17-ジヒドロキシ-17-(2-ヒドロキシアセチル)-10,13,16-トリメチル-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-ドデカヒドロ-3H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-オンとしても公知）と併用してのHu34C3-MMAE E2の有効性を、OPM-2細胞の皮下異種移植片で判定した（van Rhee et al., 2009 Mol. Cancer Therapeutics 8: 2616-24）。この実験ではエフェクター細胞陰性マウスを用いた（NSG系統）。ビヒクル（PBS/DMSO）を対照として試験した。ADCを3または6mg/kg i.p.で投与し；ポマリドマイドを20mg/kg i.p.で、およびデキサメタゾンを10mg/kg i.p.で投与した。
【０３３５】
単剤としてのHu34C3-MMAE E2による処置は、低（3mg/kg）および中（6mg/kg）用量レベルで有意な腫瘍成長阻害をきたし、それぞれTGImax値は70％および97％であった。6mg/kgのHu34C3-MMAE E2で処置した8匹のマウスのうち5匹は、完全奏功を示した。低用量Hu34C3-MMAE E2およびデキサメタゾンの組み合わせは、単剤Hu34C3-MMAE E2（TGImax 70％）からほとんど改善を示さなかった（TGImax 73％）が、デキサメタゾン単独（TGImax 25％）に比べると腫瘍成長阻害の増強を示した。低用量Hu34C3-MMAE E2およびポマリドマイドの組み合わせは、Hu34C3-MMAE E2単独（TGImax 70％）またはポマリドマイド単独（TGImax 34％）に比べて腫瘍成長阻害の増強を示し（TGImax 94％）、また8匹のマウスのうち3匹で完全奏功も誘導した（図27）。
【０３３６】
図27は、癌細胞導入後の時間（「細胞接種後の日数」）に対する立方ミリメートルでの異種移植腫瘍体積（「腫瘍体積（mm3）」）を示す。黒逆三角は抗体薬物結合体投与日（「ADC投与：3または6mg/kg」）を示し；網掛け逆三角は20mg/kgのポマリドマイド投与日を示し；白三角は10mg/kgのデキサメタゾン投与日を示す。結果：黒丸、点線は6mg/kgのAB095-MMAE E2の効果を示し；黒三角、破線はデキサメタゾン単独の効果を示し；白逆三角、実線はポマリドマイド単独の効果を示し；黒逆三角、実線はポマリドマイドおよびデキサメタゾンの効果を示し；白丸、点線は3mg/kgのHu34C3-MMAE E2の効果を示し；白四角、実線は3mg/kgのHu34C3-MMAE E2およびデキサメタゾンの効果を示し；白菱形、点線は3mg/kgのHu34C3-MMAE E2、デキサメタゾン、およびポマリドマイドの効果を示し；白三角、破線は3mg/kgのHu34C3-MMAE E2およびポマリドマイドの効果を示し；黒丸、破線は6mg/kgのHu34C3-MMAE E2の効果を示す。
【０３３７】
実施例30.  Hu34C3-MMAE E2はエフェクター細胞陽性マウスのL-363異種移植片においてエロツズマブ/レナリドマイドよりも有効である
Hu34C3-MMAE E2の有効性を、L-363細胞の皮下異種移植片で判定した（Tai et al., 2008 Blood 112(4): 1329-37）。これらの異種移植片をエロツズマブ（10mg/kg）およびレナリドマイド（50mg/kg）で2週間処置した。エロツズマブは1週間に2回投与し；レナリドマイドは1週間に5回投与した。この2週間の処置終了時に、エロツズマブ/レナリドマイド処置群は52％TGImaxを有していた。これらの腫瘍を再度無作為化し、エロツズマブ/レナリドマイド処置を継続するか、またはHu34C3-MMAE E2E4（Hu34C3-MMAE E2およびHu34C3-MMAE E4の50：50混合物）を投与した。Hu34C3MMAE E2E4による処置は有意な腫瘍成長の遅延を誘導した（TGImax＝75％）が、エロツズマブ/レナリドマイド処置は成長のわずかな遅延を示した（図28）。
【０３３８】
図28は、癌細胞導入後の時間（「移植後の日数」）に対する立方ミリメートルでの異種移植腫瘍体積（「腫瘍体積（mm3）」）を示す。黒三角はレナリドマイド投与日（「Len投与」）を示し；黒四角はエロツズマブ投与日（「Elo投与」）を示し；かつ網掛け三角は抗体薬物結合体投与日（「ADC投与」）を示す。結果：黒丸、実線はビヒクル投与（「PBS対照」）の効果を示し；白逆三角、鎖線は10mg/kgのAB095-MMAE E2E4投与の効果を示し；白三角、破線は50mg/kgのレナリドマイドと併用しての10mg/kgのエロツズマブ投与の効果を示し；黒三角、破線は10mg/kgのHu34C3-MMAE E2E4投与の効果を示し；黒逆三角、実線は3mg/kgのHu34C3-MMAE E2E4の効果を示す。
【０３３９】
実施例31.  エフェクター細胞陰性マウスにおけるボルテゾミブで前処置したOPM-2異種移植片のHu34C3-MMAE E2による成長阻害
Hu34C3-MMAE E2の有効性を、OPM-2細胞の皮下異種移植片で判定した（van Rhee et al., 2009 Mol. Cancer Therapeutics 8: 2616-24）。これらの異種移植片はボルテゾミブで1週間に2回、2週間処置した。この2週間の処置終了時に、このボルテゾミブ処置群で中等度の反応が見られた（66％TGImax）。これらの腫瘍を再度無作為化し、ボルテゾミブ処置を継続するか、またはレナリドマイド＋デキサメタゾン、ポマリドマイド、Hu34C3-MMAE E2、もしくはHu34C3-MMAE E2＋ポマリドマイド処置に切り換えた。Hu34C3-MMAE E2（5mg/kg）＋ポマリドマイドの組み合わせ（90％TGImax）は、Hu34C3-MMAE E2またはポマリドマイド単独での処置に比べて、有意に高い有効性を示した。Hu34C3-MMAE E2は、2倍のレベル（10mg/kg）で投与した場合、ポマリドマイドと併用しての中用量Hu34C3-MMAE E2（5mg/kg）とほぼ同等の有効性を示した（図29）。
【０３４０】
図29は、癌細胞導入後の時間（「細胞接種後の日数」）に対する立方ミリメートルでの異種移植腫瘍体積（「腫瘍体積（mm3）」）を示す。黒菱形はボルテゾミブ投与日を示し；黒丸はポマリドマイド投与日を示し；黒星はレナリドマイド投与日を示し；網掛け三角はデキサメタゾン投与日を示し；かつ黒逆三角は抗体薬物結合体投与日（「ADC投与」）を示す。結果：白丸、破線はビヒクル投与（「PBS対照」）を示し；黒四角、実線は1mg/kgのボルテゾミブ投与の効果を示し；白逆三角、鎖線は10mg/kgのデキサメタゾンと併用しての50mg/kgのレナリドマイドの効果を示し；太線の白逆三角、破線は20mg/kgのポマリドマイド投与の効果を示し；網掛けの丸、点線は5mg/kgのHu34C3-MMAE E2の効果を示し；白三角、破線は20mg/kgのポマリドマイドと併用しての5mg/kgのHu34C3-MMAE E2の効果を示し；黒丸、実線は10mg/kgのHu34C3-MMAE E2の効果を示す。
【０３４１】
本出願において引用するすべての出版物、特許、特許出願および他の文書は、それぞれ個々の出版物、特許、特許出願または他の文書がすべての目的のために参照により組み入れられると個別に示されたのと同程度に、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０３４２】
様々な具体的態様を例示し、記載してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更を行い得ることが理解されるであろう。
【図１Ａ−１】
2020111583.tif 000091
【図１Ａ−２】
2020111583.tif 000092
【図１Ｂ−１】
2020111583.tif 000093
【図１Ｂ−２】
2020111583.tif 000094
【図２Ａ−１】
2020111583.tif 000095
【図２Ａ−２】
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【図２Ｂ−１】
2020111583.tif 000097
【図２Ｂ−２】
2020111583.tif 000098
【図３Ａ】
2020111583.tif 000099
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
2020111583.tif 000101
【図４】
2020111583.tif 000102
【図５】
2020111583.tif 000103
【図６】
2020111583.tif 000104
【図７】
2020111583.tif 000105
【図８】
2020111583.tif 000106
【図９Ａ】
2020111583.tif 000107
【図９Ｂ】
2020111583.tif 000108
【図１０】
2020111583.tif 000109
【図１１】
2020111583.tif 000110
【図１２】
2020111583.tif 000111
【図１３】
2020111583.tif 000112
【図１４Ａ】
2020111583.tif 000113
【図１４Ｂ】
2020111583.tif 000114
【図１４Ｃ】
2020111583.tif 000115
【図１４Ｄ】
2020111583.tif 000116
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2020111583.tif 000119
【図１８】
2020111583.tif 000120
【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
2020111583.tif 000124
【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
2020111583.tif 000135
【図２６Ｂ】
2020111583.tif 000136
【図２７】
2020111583.tif 000137
【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
2020111583.tif 000140
【配列表】
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