(57)【要約】【課題】  コロラドハムシに対する抵抗性が高められた植物及びその製造方法、並びに植物におけるコロラドハムシに対する抵抗性の判定方法を提供すること。【解決手段】  Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ及びＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ由来の、スピロソラン骨格２３位水酸化酵素遺伝子及びスピロソラン骨格２３位アセチル基転移酵素遺伝子が、コロラドハムシ抵抗性を担うレプチンの生合成に関与していることを、見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡを含む、スピロソラン骨格２３位への水酸基導入に用いられるための組成物
（ａ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：１、３又は５に記載のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
【請求項２】
下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡ及び下記（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡを含む、スピロソラン骨格２３位へのアセトキシ基導入に用いられるための組成物
（ａ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：１、３又は５に記載のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ
（ｅ）配列番号：８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号：８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号：８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｈ）配列番号：７、９又は１１に記載のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつスピロソラン骨格２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
【請求項３】
下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡを含む、植物におけるレプチニン蓄積量の向上に用いられるための組成物
（ａ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：１、３又は５に記載のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ
【請求項４】
下記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡを含む、植物におけるレプチン蓄積量の向上に用いられるための組成物
（ａ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：１、３又は５に記載のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ
（ｅ）配列番号：８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号：８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号：８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｈ）配列番号：７、９又は１１に記載のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつスピロソラン骨格２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
【請求項５】
下記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡを含む、植物へのコロラドハムシに対する抵抗性向上に用いられるための組成物
（ａ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：１、３又は５に記載のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ
（ｅ）配列番号：８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号：８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号：８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｈ）配列番号：７、９又は１１に記載のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつスピロソラン骨格２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
【請求項６】
下記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡが導入された、コロラドハムシに対する抵抗性が高められた植物体を再生しうる形質転換植物細胞
（ａ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：１、３又は５に記載のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ
（ｅ）配列番号：８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号：８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号：８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｈ）配列番号：７、９又は１１に記載のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつスピロソラン骨格２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換植物細胞から再生された、コロラドハムシに対する抵抗性が高められた形質転換植物。
【請求項８】
コロラドハムシに対する抵抗性が高められた植物の製造方法であって、
下記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡを、植物細胞に導入する工程、及び
前記工程においてＤＮＡが導入された形質転換植物細胞から植物を再生する工程
を含む方法。
（ａ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：１、３又は５に記載のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ
（ｅ）配列番号：８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号：８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号：８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｈ）配列番号：７、９又は１１に記載のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつスピロソラン骨格２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
【請求項９】
植物におけるコロラドハムシに対する抵抗性を判定する方法であって、
被検植物における、
下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡと下記（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡとの存在若しくは発現を検出する工程、及び
前記工程にて、前記ＤＮＡの存在又は発現が検出された場合に、前記被検植物は、コロラドハムシに対する抵抗性を有すると判定する工程
を、含む方法。
（ａ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：１、３又は５に記載のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ
（ｅ）配列番号：８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号：８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号：８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｈ）配列番号：７、９又は１１に記載のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつスピロソラン骨格２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
【請求項１０】
コロラドハムシに対する抵抗性を有する植物を製造する方法であって、
コロラドハムシに対する抵抗性を有する植物と任意の植物とを交配させる工程と、
前記工程における交配により得られた植物において、コロラドハムシに対する抵抗性を、請求項９に記載の方法により判定する工程と、
コロラドハムシに対する抵抗性を有すると判定された植物を選抜する工程と
を、含む方法。
【請求項１１】
コロラドハムシに対する抵抗性を有する植物を製造する方法であって、
下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡを有する植物と、下記（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡを有する植物とを交配させる工程と、
前記工程における交配により得られた植物において、コロラドハムシに対する抵抗性を、請求項９に記載の方法により判定する工程と、
コロラドハムシに対する抵抗性を有すると判定された植物を選抜する工程と
を、含む方法。
（ａ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：１、３又は５に記載のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ
（ｅ）配列番号：８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号：８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号：８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｈ）配列番号：７、９又は１１に記載のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつスピロソラン骨格２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コロラドハムシに対する抵抗性が高められた植物及び該植物を再生しうる植物細胞に関する。また、本発明は、前記植物の製造方法、及び植物へのコロラドハムシに対する抵抗性向上に用いられるための組成物に関する。さらに、本発明は、植物におけるコロラドハムシに対する抵抗性を判定する方法に関する。また、本発明は、スピロソラン骨格２３位への水酸基若しくはアセトキシ基の導入に用いられるための組成物、又は植物におけるレプチニン若しくはレプチンの蓄積量向上に用いられるための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
コロラドハムシ（学名；Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ、英名：Ｃｏｌｏｒａｄｏ  ｐｏｔａｔｏ  ｂｅｅｔｌｅ）は、コウチュウ目カブトムシ亜目（多食亜目）ハムシ科の昆虫である。ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）の植物に寄生し、葉を食する害虫であり、特に、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ等）において最大の虫害をもたらし、殺虫剤である農薬を使わない場合には生産量の４０〜８０％損失の生じ得るという報告もある（非特許文献１）。コロラドハムシ（ＣＰＢ）は、日本には上陸していないが、北米から欧州、アジアの世界各地に生育域を広げている（非特許文献１）。近年、中国にも定着し、２０１０年には２７万平方ｋｍに分布し、生育域を大きいところでは４５ｋｍ／年で拡散している（非特許文献２）。そのため、ＣＰＢ抵抗性ジャガイモ等の育種は、日本においても急務であり、また世界的に重要な課題である。
【０００３】
この点に関し、ＣＰＢに対して抵抗性を示すジャガイモとして、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｃｈａｃｏｅｎｓｅ（野生種）が知られている。また、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ由来のＣＰＢ抵抗性ジャガイモは、レプチンを蓄積することによって当該抵抗性を発揮できることが明らかになっている（非特許文献３及び４）。さらに、これらレプチンは、通常の栽培種であるジャガイモ（Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ等）において蓄積されているソラニンやチャコニンから、２段階の反応を経て生合成されると予想されている（非特許文献５）。また、これらレプチンの生合成を担う遺伝子は、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ由来の染色体第２番と第８番にあることが示唆されている（非特許文献６）。
【０００４】
しかしながら、このＳ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅは、栽培化されていない野生種であり、通常の食用のジャガイモと比較して収量や栽培性が著しく劣るため、農業生産に適さないという問題がある。そのため、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ由来の系統を、通常のジャガイモ（Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ等）と交配することによって、後代でＣＰＢ抵抗性を有する系統を得ることが試みられている。優良な実用品種としてのジャガイモを育種するためには、ＣＰＢ抵抗性に不要なＳ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ由来のゲノム領域を除去する必要があり、通常、その除去はＳ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ等との戻し交雑によって行なわれる。しかしながら、前述のとおり、レプチン生合成を担う遺伝子が同定されておらず、またそれら遺伝子の座上情報も、第２番、第８番という大まかなものしか明らかになっていない。そのため、当該遺伝子の存在等を指標とする個体選抜を行なうことができず、ＣＰＢ抵抗性を有する実用品種を得るに至っていない。
【０００５】
また、ジャガイモ等の植物にＣＰＢ抵抗性を付与する方法としては、遺伝子組換えやゲノム編集等によって、レプチン生合成を担う遺伝子をジャガイモ等に導入する方法も考えられる。しかしながら、上述のとおり、前記遺伝子が同定されていないため、かかる方法によってもＣＰＢ抵抗性植物を製造するに至っていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＭａｈａｒｉｊａｙａとＶｏｓｍａｎ（２０１５）Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ  ４：１３３−１４２
【非特許文献２】Ｌｉｕら  （２０１２）Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｉａ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ  ｅｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔａ  １４３：２０７−２１７
【非特許文献３】ＳｔｕｒｃｋｏｗとＬｏｗ（１９６１）Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｉａ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ  ｅｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔａ  ４：１３３−１４２
【非特許文献４】Ｓｉｎｄｅｎら（１９８６）Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ  １５：１０５７−１０６２
【非特許文献５】Ｓａｇｒｅｄｏら（１９９９）Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ．９８：３９−４６
【非特許文献６】Ｓａｇｒｅｄｏら（２００６）Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ．１１４：１３１−４２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、植物にＣＰＢ抵抗性を付与する遺伝子、すなわちレプチンの生合成を担う遺伝子を同定することにある。また、本発明の目的は、同定された遺伝子を用い、ＣＰＢに対する抵抗性が高められた植物を効率的に製造する方法を提供することにある。さらに、本発明の目的は、前記遺伝子の存在等を指標とし、植物におけるＣＰＢに対する抵抗性を効率的に判定する方法を提供することにもある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述のとおり、ＣＰＢ抵抗性ジャガイモであるＳ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅにおいて、その抵抗性を付与するレプチンは、ソラニンやチャコニン（ソラニダン骨格を有する化合物）から生合成されることが予想されている。本発明者らは、この生合成に関し、同じナス科植物であるトマト（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）における、α−トマチン（スピロソラン骨格を有する化合物）の代謝過程（図１の上段  参照）に着目した。そして、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅにおいては、このトマトにおけるα−トマチンの代謝過程同様の２３位水酸化酵素（「２３ＤＯＸ」とも称する）及び２３位アセチル基転移酵素（「２３ＡＣＴ」とも称する）が、α−ソラニンやα−チャコニンを基質とする、レプチニン生成を介したレプチン生合成に関与していると想定した（図１の下段  参照）。
【０００９】
そこで、先ずは、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ及びＳ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅのそれぞれについて、これら酵素をコードする遺伝子の同定を試みた。なお、α−トマチンの代謝過程に２３ＤＯＸ及び２３ＡＣＴが関与することは明らかになっていたが、それらの配列は明らかとなっていなかった。そのため、先ずは、トマトの発現データベースから、前記代謝過程に関与することが想定される遺伝子の配列を選抜し、それらの全長ＯＲＦ配列を決定した。次いで、得られたＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの配列に基づき、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅにおける相同遺伝子をスクリーニングし、ＲＡＣＥ法により、それらの全長ＯＲＦ配列も決定した。
【００１０】
そして、このようにして得ることができたＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ及びＳ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅの各遺伝子がコードする酵素を、大腸菌にて合成し、それらの酵素活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏにて分析した。その結果、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ及びＳ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅの２３ＤＯＸ〈各々「Ｓｌ２３ＤＯＸ」及び「Ｓｃ２３ＤＯＸ」とも称する）は、各々α−トマチンの２３位に水酸基を導入し、さらにＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ及びＳ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅの２３ＡＣＴ〈各々「Ｓｌ２３ＡＣＴ」及び「Ｓｃ２３ＡＣＴ」とも称する）は、当該水酸基をアセチル化できることが明らかになった。
【００１１】
しかしながら、従前の予想とは異なり、α−ソラニン等を基質としても、前記２３ＤＯＸによって、当該化合物の２３位に水酸基は導入されず、また当該水酸基は、前記２３ＡＣＴによってアセチル化されることなく、レプチンを生成することはできなかった。
【００１２】
一方、前記２３ＤＯＸ遺伝子を導入したジャガイモ（Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）においては、レプチニンの生成が検出され、さらに前記２３ＤＯＸ遺伝子及び２３ＡＣＴ遺伝子を導入したジャガイモにおいては、レプチンの生成が認められた。
【００１３】
以上のことから、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅにおいては、従前想定されていたような、ソラニダン骨格を有する化合物（α-ソラニン、α-チャコニン）からレプチンが生合成されるわけではなく、スピロソラン骨格を有する化合物２３位への水酸基、次いでアセトキシ基の導入を経て、更にこれら化合物のスピロソラン骨格がソラニダン骨格に各々変換されることによって、レプチンが生合成されていることが明らかになった。
【００１４】
また、Ｓｃ２３ＤＯＸ遺伝子とＳｃ２３ＡＣＴ遺伝子を認識する各プライマーセット作成した。さらに、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅと２倍体のレプチンを作らないジャガイモの交雑種を作成した。そして、これら交雑種について、前記プライマーセットを用いたＰＣＲ、及びレプチン生成量の解析を行なった結果、ＤＮＡマーカー（Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅの２３ＤＯＸ遺伝子及び２３ＡＣＴ遺伝子）の存在と、レプチン蓄積との遺伝的挙動が一致することが確認された。
【００１５】
さらに、ＣＰＢ抵抗性を有さないＳ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍにて、２３ＤＯＸ遺伝子及び２３ＡＣＴ遺伝子の有無について解析したところ、驚くべきことに、前記２３ＤＯＸ及び２３ＡＣＴと高い配列同一性を有するタンパク質（Ｓｔ２３ＤＯＸ及びＳｔ２３ＡＣＴ）をコードする各遺伝子を有していることが明らかになった。
【００１６】
また、これら遺伝子がコードする各タンパク質を、大腸菌にて合成し、それらの酵素活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏにて分析した。その結果、上述のＳｌ２３ＤＯＸ及びＳｃ２３ＤＯＸ同様に、Ｓｔ２３ＤＯＸは、α−トマチンの２３位に水酸基を導入できることが明らかになった。さらに、Ｓｔ２３ＡＣＴについても、上述のＳｌ２３ＡＣＴ及びＳｃ２３ＡＣＴ同様に、前記水酸基をアセチル化できることが明らかになった。
【００１７】
そして、以上の知見に基づき、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、より詳しくは、以下を提供するものである。
＜１＞  下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡを含む、スピロソラン骨格２３位への水酸基導入に用いられるための組成物
（ａ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：１、３又は５に記載のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
＜２＞  前記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡ及び下記（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡを含む、スピロソラン骨格２３位へのアセトキシ基導入に用いられるための組成物
（ｅ）配列番号：８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号：８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号：８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｈ）配列番号：７、９又は１１に記載のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつスピロソラン骨格２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
＜３＞  前記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡを含む、植物におけるレプチニン蓄積量の向上に用いられるための組成物。
＜４＞  前記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡを含む、植物におけるレプチン蓄積量の向上に用いられるための組成物。
＜５＞  前記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡを含む、植物へのコロラドハムシに対する抵抗性向上に用いられるための組成物。
＜６＞  前記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡが導入された、コロラドハムシに対する抵抗性が高められた植物体を再生しうる形質転換植物細胞。
＜７＞  ＜６＞に記載の形質転換植物細胞から再生された、コロラドハムシに対する抵抗性が高められた形質転換植物。
＜８＞  コロラドハムシに対する抵抗性が高められた植物の製造方法であって、
前記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡを、植物細胞に導入する工程、及び前記工程においてＤＮＡが導入された形質転換植物細胞から植物を再生する工程を含む方法。
＜９＞  植物におけるコロラドハムシに対する抵抗性を判定する方法であって、
被検植物における、前記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡと前記（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡとの存在若しくは発現を検出する工程、及び前記工程にて、前記ＤＮＡの存在又は発現が検出された場合に、前記被検植物は、コロラドハムシに対する抵抗性を有すると判定する工程を、含む方法。
＜１０＞  コロラドハムシに対する抵抗性を有する植物を製造する方法であって、
コロラドハムシに対する抵抗性を有する植物と任意の植物とを交配させる工程と、前記工程における交配により得られた植物において、コロラドハムシに対する抵抗性を、＜９＞に記載の方法により判定する工程と、コロラドハムシに対する抵抗性を有すると判定された植物を選抜する工程とを、含む方法。
＜１１＞  コロラドハムシに対する抵抗性を有する植物を製造する方法であって、
前記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡを有する植物と、前記（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡを有する植物とを交配させる工程と、
前記工程における交配により得られた植物において、コロラドハムシに対する抵抗性を、＜９＞に記載の方法により判定する工程と、
コロラドハムシに対する抵抗性を有すると判定された植物を選抜する工程と
を、含む方法。
【００１８】
なお、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ由来の２３ＤＯＸ遺伝子のヌクレオチド配列、及び該配列がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号：１及び２に各々示す。Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ由来の２３ＤＯＸ遺伝子のヌクレオチド配列、及び該配列がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号：３及び４に各々示す。Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ由来の２３ＤＯＸ遺伝子のヌクレオチド配列、及び該配列がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号：５及び６に各々示す。
【００１９】
また、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ由来の２３ＡＣＴ遺伝子のヌクレオチド配列、及び該配列がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号：７及び８に各々示す。Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ由来の２３ＡＣＴ遺伝子のヌクレオチド配列、及び該配列がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号：９及び１０に各々示す。Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ由来の２３ＡＣＴ遺伝子のヌクレオチド配列、及び該配列がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号：１１及び１２に各々示す。
【発明の効果】
【００２０】
本発明において同定された、水酸化酵素遺伝子及び/又はアセチル基転移酵素遺伝子を用いることによって、スピロソラン骨格２３位に水酸基又はアセトキシ基を導入することが可能となり、またレプチニン又はレプチンを生成することも可能となる。さらに、本発明によれば、レプチンの生合成能を増強し、レプチンを蓄積させることにより、植物のＣＰＢに対する抵抗性等を高めることも可能となる。すなわち、ＣＰＢに対する抵抗性が高められた植物を効率的に提供することが可能となる。また、本発明によれば、前記遺伝子の発現又は存在を指標とし、植物におけるＣＰＢに対する抵抗性等を効率的に判定することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】トマト（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、ＣＰＢ抵抗性ジャガイモ（Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ）及びＣＰＢ非抵抗性ジャガイモ（Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）におけるグリコアルカロイドを示す、概略図である。図中枠線内は、各ナス科植物において生成されるステロイドグリコアルカロイドを示し、図中左側の、スピロソラン骨格３位及びソラニダン骨格の３位における「Ｒ」は、これら骨格に酸素原子を介して結合する糖複合体を意味する。また、図中上段（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの枠線内）においては、トマトにおけるα−トマチン（スピロソラン骨格を有する化合物）の代謝過程にて、当該骨格の２３位に２３位水酸化酵素（２３ＤＯＸ）によって水酸基が導入され、さらに当該水酸基に２３位アセチル基転移酵素（２３ＡＣＴ）によってアセチル基が導入されることを示す。
【図２】Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ由来２３ＤＯＸ発現用ベクター、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ由来２３ＤＯＸ発現用ベクター及びＳ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ由来２３ＤＯＸ発現用ベクターを各々導入した大腸菌（図中、各々「Ｓｌ２３ＤＯＸ」、「Ｓｃ２３ＤＯＸ」及び「Ｓｔ２３ＤＯＸ」にて示す）の粗抽出画分を用い、２３位水酸化酵素活性を検出した結果を示す、ＬＣ−ＭＳのチャートデータである。図中、縦軸は強度を示し、横軸は保持時間を示す（図中の表記については、図４、７、９、１３及び１４において同様である）。
【図３】図２に示したピーク（１）〜（４）のマススペクトルである。図中、縦軸は強度を示し、横軸は質量電荷比を示す（図中の表記については、図５、８、１０及び１５において同じである）。
【図４】Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ由来２３ＡＣＴ発現用ベクター、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ由来２３ＡＣＴ発現用ベクター、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ由来２３ＡＣＴ発現用ベクター及び空ベクターを各々導入した大腸菌（図中、各々「Ｓｌ２３ＡＣＴ」、「Ｓｃ２３ＡＣＴ」、「Ｓｔ２３ＡＣＴ」及び「２３ヒドロキシ−トマチン＋陰性対照」にて示す）の粗抽出画分を用い、２３位アセチル基転移酵素を検出した結果を示す、ＬＣ−ＭＳのチャートデータである。図中、「２３アセトキシ−トマチン」は、その標品についてのチャートデータを示す。
【図５】図４に示したピーク（１）〜（４）のマススペクトルである。
【図６】形質転換に使用したベクターの構造を示す図である。図中、導入する遺伝子部分のＴ−ＤＮＡのライトボーダー（ＲＢ）、レフトボーダー（ＬＢ）、それらボーダーの内部の構造、及び制限酵素認識部位を示す。
【図７】ＣＰＢ非抵抗性ジャガイモ（図中「Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ」）、Ｓｃ２３ＤＯＸを発現させたジャガイモ（図中「Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  Ｓｃ２３ＤＯＸ−ｏｘ−＃９」）及びＣＰＢ抵抗性ジャガイモの花（図中「Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅの花」）について分析した結果を示す、ＬＣ−ＭＳのチャートデータである。
【図８】図７に示したピーク（１）〜（４）のマススペクトルである。
【図９】空ベクターを導入したＣＰＢ非抵抗性ジャガイモ（図中「ベクターコントロール」）、Ｓｃ２３ＤＯＸ及びＳｃ２３ＡＣＴを発現させたジャガイモ（図中「Ｓｃ２３ＤＯＸ＋Ｓｃ２３ＡＣＴ共発現」）及びＣＰＢ抵抗性ジャガイモの花（図中「Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅの花」）について分析した結果を示す、ＬＣ−ＭＳのチャートデータである。
【図１０】図９に示したピーク（ピークＩ及びＩＩ、並びにレプチンＩ及びＩＩ）のマススペクトルである。
【図１１】ＣＰＢ抵抗性を示さないジャガイモ品種及びジャガイモ育種に使われる系統、並びにＣＰＢ抵抗性野生種である「Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ  ＰＩ  ４５８３１０」から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲによりＳｃ２３ＤＯＸ遺伝子を検出した結果を示す、ゲル電気泳動の写真である。図中、「Ｍ」は１００ｂｐマーカーを示し、「１」は男爵薯についての解析結果を示し、「２」はメークインについての解析結果を示し、「３」はさやかについての解析結果を示し、「４」はサッシーについての解析結果を示し、「５」はコナフブキについての解析結果を示し、「６」はデジレーについての解析結果を示し、「７」は９７Ｈ３２−６についての解析結果を示し、「８」は西海３５号についての解析結果を示し、「９」は北海８７号についての解析結果を示し、「１０」はＶＴｎ  ６２−３３−３についての解析結果を示し、「１１」はＷ５５３−４についての解析結果を示し、「１２」はＳ．  ｃｈａｃｏｅｎｓｅ  （ＰＩ  ４５８３１０）  についての解析結果を示す（図中の表記については、図１２において同様である）。
【図１２】ＣＰＢ抵抗性を示さないジャガイモ品種及びジャガイモ育種に使われる系統、並びにＣＰＢ抵抗性野生種である「Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ  ＰＩ  ４５８３１０」から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲによりＳｃ２３ＡＣＴ遺伝子を検出した結果を示す、
【図１３】レプチンを発現しているＳ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ  ＰＩ  ４５８３１０から得た実生３系統と、レプチンを発現していないジャガイモ系統  ９７Ｈ３２−６とを交配し、獲得した雑種について、ステロイドグリコアルカロイドを解析した結果を示す、、ＬＣ−ＭＳのチャートデータである。図中、「９７Ｈ３２−６」は９７Ｈ３２−６について解析した結果を示し、「２−３４」、「２−１９」及び「２−３」は、各々表１に示す雑種  ＰＩ  ４５８３１０−２×９７Ｈ３２−６  ３４及びＰＩ  ４５８３１０−２×９７Ｈ３２−６  １９及びＰＩ  ４５８３１０−２×９７Ｈ３２−６  ３について解析した結果を示す。
【図１４】空ベクターを導入したＣＰＢ非抵抗性ジャガイモ品種コナフブキ（図中「ベクターコントロール」）及びＳｃ２３ＤＯＸを発現させたコナフブキ（図中「Ｓｃ２３ＤＯＸ  ♯１５」）について分析した結果を示す、ＬＣ−ＭＳのチャートデータである。図中の囲み枠においては、保持時間１４．５〜１５．５分のチャートデータを拡大して示してある。
【図１５】図１４に示したピーク（レプチンＩ及びＩＩ）のマススペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
＜本発明の組成物について＞
後述の実施例において示すとおり、本発明者らによって、トマト（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）及びＣＰＢ抵抗性ジャガイモ  Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅにおける、２３位水酸化酵素（２３ＤＯＸ）遺伝子（Ｓｌ２３ＤＯＸ遺伝子及びＳｃ２３ＤＯＸ遺伝子）が各々単離され、それらの配列が同定された。そして、レプチニンの生合成が認められないジャガイモ  Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍに、前記２３ＤＯＸ遺伝子を導入した結果、スピロソラン骨格を有するステロイドグリコアルカロイドの２３位に水酸基が導入され、さらにスピロソラン骨格がソラニダン骨格に変換されることによって、当該ジャガイモにおいて、レプチニンの有意な生合成が認められるようになった。
【００２３】
さらに、２３ＤＯＸ遺伝子をＳ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍも有しているものの、その発現量が十分ではないため、当該ジャガイモにおいてレプチニンの生合成が認められないということも明らかにした。
【００２４】
したがって、本発明は、スピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質（以下、「本発明の２３ＤＯＸ」とも称する）をコードするＤＮＡを含む、スピロソラン骨格２３位への水酸基導入に用いられるための組成物、又は、植物におけるレプチニン蓄積量の向上に用いられるための組成物を、提供する。
【００２５】
また、後述の実施例において示すとおり、本発明者らによって、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ及びＳ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅにおける、２３位アセチル基転移酵素（２３ＡＣＴ）遺伝子（Ｓｌ２３ＡＣＴ遺伝子及びＳｃ２３ＡＣＴ遺伝子）も単離され、それらの配列が同定された。そして、レプチンの生合成が認められず、ＣＰＢに対する抵抗性を有さないジャガイモ  Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍに、前記２３ＤＯＸ遺伝子及び前記２３ＡＣＴ遺伝子を導入した結果、スピロソラン骨格を有するステロイドグリコアルカロイドにおいて、２３ＤＯＸにより導入された水酸基がさらにアセチル化され、またスピロソラン骨格がソラニダン骨格に変換されることによって、当該ジャガイモにおいて、ＣＰＢ抵抗性に関与するレプチンの有意な生合成が認められるようになった。
【００２６】
また、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍの品種の中でも、育成過程でＳ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅを用いて作出されているが、レプチンを生産しない９７Ｈ３２−６やコナフブキ等の品種では、Ｓｃ２３ＡＣＴ遺伝子を有しているということを明らかにした。
【００２７】
さらに、２３ＡＣＴ遺伝子をＳ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍも有してはいるものの、その発現量が十分ではないため、当該ジャガイモにおいてレプチンの生合成が認められないということも明らかにした。
【００２８】
したがって、本発明はまた、本発明の２３ＤＯＸをコードするＤＮＡと、スピロソラン骨格の２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質（以下、「本発明の２３ＡＣＴ」とも称する）をコードするＤＮＡを含む、スピロソラン骨格２３位へのアセトキシ基導入に用いられるための組成物、植物におけるレプチン蓄積量の向上に用いられるための組成物、又は植物へのＣＰＢに対する抵抗性向上に用いられるための組成物 をも、提供する。
【００２９】
本発明において、水酸基又はアセトキシ基が導入される基質としては、少なくともスピロソラン骨格を有していればよく、例えば、スピロソラン配糖体が挙げられる。
【００３０】
本発明において、２３位に水酸基が導入される基質としては、例えば、α−トマチン、α−デヒドロトマチン、α−ソラマリン、β−ソラマリン、それぞれのアグリコンが挙げられ、また、２３位の水酸基にアセチル基が導入される基質としては、例えば、レプチニン、２３ヒドロキシトマチン、２３ヒドロキシデヒドロトマチンが挙げられる。
【００３１】
本発明において、「レプチニン」としては、例えば、レプチニンＩ（３β‐［２‐Ｏ，４‐Ｏ‐ビス（α‐Ｌ‐ラムノピラノシル）‐β‐Ｄ‐グルコピラノシロキシ］ソラニド‐５‐エン‐２３β‐オール）、レプチニンII（３β‐［（３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐２‐Ｏ‐α‐Ｌ‐ラムノピラノシル‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシル）オキシ］ソラニド‐５‐エン‐２３β‐オール）が、挙げられる。
【００３２】
本発明において、「レプチン」としては、例えば、レプチンＩ（３β‐［２‐Ｏ，４‐Ｏ‐ビス（α‐Ｌ‐ラムノピラノシル）‐β‐Ｄ‐グルコピラノシロキシ］  ソラニド‐５‐エン‐２３β‐オール  ２３‐アセテート）、３β‐［２‐Ｏ，４‐Ｏ‐ビス（α‐Ｌ‐ラムノピラノシル）‐β‐Ｄ‐グルコピラノシロキシ］ソラニド‐５‐エン‐２３β‐オール）、レプチンII（３β‐［（３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐２‐Ｏ‐α‐Ｌ‐ラムノピラノシル‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシル）オキシ］ソラニド‐５‐エン‐２３β‐アセテート）が、挙げられる。
【００３３】
また、本発明の「組成物」の態様としては、後述の「本発明のＤＮＡ」が有効成分として含まれていればよいが、他の成分が混合されているものであってもよい。このような他の成分としては特に制限はなく、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、保存剤が挙げられる。
【００３４】
＜本発明のＤＮＡについて＞
前述の組成物の有効成分として含有される「本発明の２３ＤＯＸをコードするＤＮＡ」の例として、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ由来の２３ＤＯＸをコードするｃＤＮＡの配列を配列番号：１に示す。当該配列がコードするタンパク質（Ｓｃ２３ＤＯＸ）のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。「本発明の２３ＤＯＸをコードするＤＮＡ」の別の例として、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ由来の２３ＤＯＸをコードするｃＤＮＡの配列を配列番号：５に示す。当該配列がコードするタンパク質（Ｓｌ２３ＤＯＸ）のアミノ酸配列を配列番号：６に示す。なお、Ｓｌ２３ＤＯＸ遺伝子は、トマト第２染色体のＳｏｌｙｃ０２ｇ０６２４６０に座乗する。「本発明の２３ＤＯＸをコードするＤＮＡ」の別の例として、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ由来の２３ＤＯＸをコードするｃＤＮＡの配列を配列番号：３に示す。当該配列がコードするタンパク質（Ｓｔ２３ＤＯＸ）のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。
【００３５】
前述の組成物の有効成分として含有される「本発明の２３ＡＣＴをコードするＤＮＡ」の例として、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ由来の２３ＡＣＴをコードするｃＤＮＡの配列を配列番号：７に示す。当該配列がコードするタンパク質（Ｓｃ２３ＡＣＴ）のアミノ酸配列を配列番号：８に示す。「本発明の２３ＡＣＴをコードするＤＮＡ」の別の例として、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ由来の２３ＡＣＴをコードするｃＤＮＡの配列を配列番号：１１に示す。当該配列がコードするタンパク質（Ｓｌ２３ＡＣＴ）のアミノ酸配列を配列番号：１２に示す。なお、Ｓｌ２３ＡＣＴ遺伝子は、トマト第８染色体のＳｏｌｙｃ０８ｇ０７５２１０に座上する。「本発明の２３ＡＣＴをコードするＤＮＡ」の別の例として、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ由来の２３ＡＣＴをコードするｃＤＮＡの配列を配列番号：９に示す。当該配列がコードするタンパク質（Ｓｔ２３ＡＣＴ）のアミノ酸配列を配列番号：１０に示す。
【００３６】
現在の技術水準においては、当業者であれば、前記「本発明の２３ＤＯＸをコードするＤＮＡ」又は「本発明の２３ＡＣＴをコードするＤＮＡ」（これら２種のＤＮＡについて「本発明のＤＮＡ」とも総称する）の配列情報が得られた場合、そのヌクレオチド配列に対して種々の改変を行い、スピロソラン骨格の２３位に水酸基を導入する活性を有するタンパク質、又はスピロソラン骨格の２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質をコードする変異遺伝子の製造を行うことが可能である。さらに、自然界においても、ヌクレオチド配列が変異することは起こり得ることである。
【００３７】
したがって、本発明の２３ＤＯＸをコードするＤＮＡには、スピロソラン骨格の２３位に水酸基を導入する活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。また、本発明の２３ＡＣＴをコードするＤＮＡには、スピロソラン骨格の２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号：８．１０又は１２に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。
【００３８】
ここで「複数」とは、２３ＤＯＸ又は２３ＡＣＴのアミノ酸配列全体においては、通常、１００アミノ酸以内（例えば、９０アミノ酸以内、８０アミノ酸以内、７０アミノ酸以内）、好ましくは６０アミノ酸以内（例えば、５０アミノ酸以内、４０アミノ酸以内）、より好ましくは３０アミノ酸以内（例えば、２０アミノ酸以内、１０アミノ酸以内）、特に好ましくは数個のアミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、２アミノ酸以内）である。
【００３９】
また、各ヌクレオチド配列に対して変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法、又はこれに準ずる方法により、例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製）等）を用いて、あるいは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットを用いて行うことができる。
【００４０】
さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、特定のＤＮＡが得られた場合、そのＤＮＡの配列情報を利用して、同種若しくは他の植物から、各活性を有するタンパク質をコードする相同遺伝子を単離することが可能である。このような相同遺伝子を取得するための植物としては、ナス科植物が挙げられ、例えば、ソラヌム・パンドゥラエフォルメ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｐａｎｄｕｒａｅｆｏｒｍｅ）、ソルヌム・ヴェルバサイフォリウム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｖｅｒｂａｓｃｉｆｏｌｉｕｍ）、ソラヌム・ペンネリ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ）、ソラヌム・エチオピクム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ａｅｔｈｉｏｐｉｃｕｍ）、アメリカイヌホオズキ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ）、イヌホオズキ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｎｉｇｒｕｍ）、ワルナスビ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｃａｒｏｌｉｎｅｎｓｅ）、タマリロ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｂｅｔａｃｅｕｍ）、ヒヨドリジョウゴ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｒａｔｕｍ）、ツノナス（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍａｍｍｏｓｕｍ）、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）、ペピーノ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｕｒｉｃａｔｕｍ）、タマサンゴ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｃａｐｓｉｃｕｍ、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｃｈａｃｏｅｎｓｅ等のナス属に属する植物、トウガラシ（ピーマン、パプリカ）（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ）、アヒ・アマリージョ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｂａｃｃａｔｕｍ）、ウルピカ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｃａｒｄｅｎａｓｉｉ）、シネンセ種（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｃｈｉｎｅｎｓｅ）、キダチトウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、ロコト（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）等のトウガラシ属に属する植物、シュッコンタバコ（Ｎ．ａｌａｔａ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｐｐ．）等のタバコ属に属する植物、チョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ  ｍｅｔｅｌ）、アメリカチョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ  ｉｎｏｘｉａ）、シロバナヨウシュチョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ）等のチョウセンアサガオ属に属する植物、コダチチョウセンアサガオ（Ｂｒｕｇｍａｎｓｉａ  ａｒｂｏｒｅａ）、キダチチョウセンアサガオ（Ｂｒｕｇｍａｎｓｉａ  ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ）等のキダチチョウセンアサガオ属に属する植物、ホオズキ（Ｐｈｙｓａｌｉｓ  ａｌｋｅｋｅｎｇｉ  ｖａｒ．  ｆｒａｎｃｈｅｔｉｉ）、オオブドウホオズキ（トマティージョ，Ｔｏｍａｔｉｌｌｏ）（Ｐｈｙｓａｌｉｓ  ｉｘｏｃａｒｐａ他）等のホオズキ属に属する植物、イガホオズキ属に属する植物、ハダカホオズキ属に属する植物、ペチュニア属に属する植物、ハシリドコロ属に属する植物、ヒヨス属に属する植物、ベラドンナ属に属する植物、マンドラゴラ属に属する植物、クコ属に属する植物、カリブラコア属に属する植物が、挙げられる。
【００４１】
また、本発明のＤＮＡの相同遺伝子を取得するための植物としては、２３アセトキシルスピロソランを含有している植物が好ましく、このような植物としては、例えば、イヌホオズキ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｎｉｇｒｕｍ）が知られている（Ｅｉｃｈ，Ｓｏｌｏａｎａｃｅａｅ  ａｎｄ  Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌａｃｅａｅ：Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ（２００８），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、表７．３）。さらに、「本発明の２３ＤＯＸをコードするＤＮＡ」の相同遺伝子を取得するための植物としては、２３ヒドロキシスピロソランを含有している植物が好ましく、このような植物としては、例えば、ソラヌム・パンドゥラエフォルメ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｐａｎｄｕｒａｅｆｏｒｍｅ）、ソルヌム・ヴェルバサイフォリウム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｖｅｒｂａｓｃｉｆｏｌｉｕｍ）等が知られている（Ｅｉｃｈ，  Ｓｏｌｏａｎａｃｅａｅ  ａｎｄ  Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌａｃｅａｅ：Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  （２００８），  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、表７．３）。
【００４２】
相同遺伝子を取得するための方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３，１９７５）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０−１３５４，１９８５、Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７−４９１，１９８８）等が挙げられる。相同遺伝子を単離するためには、通常、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、「１ＸＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、３７℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「０．５ＸＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、４２℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「０．２ＸＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃」程度の条件が挙げられる。このようにハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほど高い同一性を有するＤＮＡの単離を期待し得る。ただし、上記のＳＳＣ、ＳＤＳ及び温度の条件の組み合わせは例示であり、ＤＮＡの濃度、ＤＮＡの長さ、ハイブリダイゼーションの反応時間等を適宜組み合わせることにより、必要なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００４３】
したがって、本発明の２３ＤＯＸをコードするＤＮＡには、スピロソラン骨格の２３位に水酸基を導入する活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号：１、３又は５に記載のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡも含まれる。また、本発明の２３ＡＣＴをコードするＤＮＡには、スピロソラン骨格の２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号：７、９又は１１に記載のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡも含まれる。また、前記各ヌクレオチド配列において遺伝暗号の縮重に基づく配列（縮重配列）を含むＤＮＡも、本願発明の各ＤＮＡに含まれる。
【００４４】
取得された相同遺伝子がコードするタンパク質は、通常、配列番号：２、４若しくは６に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：８、１０若しくは１２に記載のアミノ酸配列と高い同一性を有する。高い同一性とは、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上）、さらに好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の配列の同一性である。配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等を利用して（例えば、デフォルト、すなわち初期設定のパラメータを用いて）決定することができる。
【００４５】
したがって、本発明の２３ＤＯＸをコードするＤＮＡには、配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡも含まれる。また、本発明の２３ＡＣＴをコードするＤＮＡには、配列番号：８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡも含まれる。
【００４６】
ＤＮＡがコードするタンパク質が、スピロソラン骨格の２３位に水酸基を導入する活性又はスピロソラン骨格の２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するか否かは、例えば、後述の実施例に記載するように、当該ＤＮＡをコードするタンパク質を大腸菌等を用いて合成し、得られたタンパク質に、２価鉄イオン、アスコルビン酸及び２−オキソグルタル酸の存在下、スピロソラン骨格を有する化合物（例えば、α−トマチン又は２３ヒドロキシ−トマチン）を添加し、反応させる。そして、得られた反応産物を、一般に報告されているＭａｔｓｕｄａら（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．Ａｎａｌ．１５：１２１−１２４，２００４）やＫｏｚｕｋｕｅら（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５２：２０７９−２０８３，２００４）やＮａｋａｙａｓｕら（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７５：１２０−１３３）の液体クロマトグラフィーを用いたグリコアルカロイドの分析方法を用いて分析することにより、判定することができる（例えば、前記反応産物を、液体クロマトグラフィーに供し、得られた画分は、質量分析やＵＶまたは多波長検出器等を用いて分析することができる）。なお、分析における諸条件については、当業者であれば、適宜設定することが可能である。
【００４７】
「本発明のＤＮＡ」としては、それらの形態に特に制限はなく、ｃＤＮＡの他、ゲノムＤＮＡ、及び化学合成ＤＮＡが含まれる。これらＤＮＡの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムＤＮＡは、例えば、植物からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣ等が利用できる）を作成し、これを展開して、２３ＤＯＸ遺伝子（例えば、配列番号：１、３又は５に記載のＤＮＡ）又は２３ＡＣＴ遺伝子（例えば、配列番号：７、９又は１１に記載のＤＮＡ）のヌクレオチド配列を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、２３ＤＯＸ遺伝子又は２３ＡＣＴ遺伝子に特異的なプライマーを作成し、これを利用したＰＣＲを行うことによって調製することも可能である。また、ｃＤＮＡは、例えば、植物から抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをλＺＡＰ等のベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、ＰＣＲを行うことにより調製することが可能である。また、市販のＤＮＡ合成機を用いれば、目的のＤＮＡを合成により調製することも可能である。
【００４８】
また、本発明のＤＮＡは、上述の組成物において、ベクターに挿入された態様で含まれていてもよい。かかるベクターとしては、特に制限はなく、例えば、植物細胞内で挿入ＤＮＡを発現させることが可能なものが挙げられる。本発明にかかるベクターは、本発明のＤＮＡを恒常的又は誘導的に発現させるためのプロモーターを含有し得、またエンハンサー、ターミネーター、選択マーカー等を適宜含有するものであってもよい。
【００４９】
また、後述のアグロバクテリウムを介する方法により、本発明の形質転換植物細胞を調製する場合においては、本発明のＤＮＡは、上述の組成物において、アグロバクテリウムに導入された態様で含まれていてもよい。
【００５０】
なお、かかるベクター及びアグロバクテリウムのより詳細な態様については、以下の＜本発明の植物細胞について  １＞にて例示する。
【００５１】
＜本発明の植物細胞について  １＞
本発明のＣＰＢに対する抵抗性が高められた植物体を再生しうる植物細胞として、前述の本発明の２３ＤＯＸをコードするＤＮＡ及び本発明の２３ＡＣＴをコードするＤＮＡのうちの少なくとも１のＤＮＡが導入されることにより形質転換された植物細胞が挙げられる。
【００５２】
本発明の植物細胞の由来する植物としては特に制限はなく、例えば、ジャガイモ等のナス科植物が挙げられる。本発明の植物細胞は、これら植物種に限定されないが、特に、ソラニダン環のグリコアルカロイドを生産する通常のジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）が好ましい。通常のジャガイモ以外の植物としては、限定されないが、Ｓｏｌａｎｕｍ種の中で塊茎を形成するＰｏｔａｔｏｅサブセクションに含まれる植物種が挙げられる（Ｈａｗｋｅｓ，Ｔｈｅ  Ｐｏｔａｔｏ（１９９０），Ｓｍｉｔｈｏｎｉａｎ  Ｉｎｓｔ．  Ｐｒｅｓｓ、表６．１）。
【００５３】
なお、２３ＤＯＸ遺伝子及び２３ＡＣＴ遺伝子の発現量が少ない、またはこれら遺伝子を有していない植物種に対しては、ＣＰＢに対する抵抗性が高めるために、本発明の２３ＤＯＸをコードするＤＮＡ及び本発明の２３ＡＣＴをコードするＤＮＡの双方を導入することが望ましい。一方、後述の実施例において示すように、Ｓ.ｔｕｂｅｒｏｓｕｍにおいては生来少なくともＳｃ２３ＡＣＴ遺伝子を有しているものもある。そのような植物種に対しては少なくとも本発明の２３ＤＯＸをコードするＤＮＡを導入することが望ましい。また逆に、生来少なくとも２３ＤＯＸ遺伝子を有している植物種に対しては、少なくとも本発明の２３ＡＣＴをコードするＤＮＡを導入することが望ましい。
【００５４】
本発明の植物細胞には、植物培養細胞、栽培植物の植物体全体、植物器官（例えば、葉、花、茎、根、塊茎、根茎、種子等）、または植物組織（例えば、表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）のいずれであってもよい。さらに、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス、未熟胚、花粉等が含まれる。
【００５５】
本発明のＤＮＡの植物宿主への導入方法としては、アグロバクテリウム感染法等の間接導入法や、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法、リポソーム法、マイクロインジェクション法といった直接導入法等が挙げられる。
【００５６】
例えば、アグロバクテリウム感染法を用いる場合、以下のようにして本発明のＤＮＡを導入した形質転換植物細胞を作出することができる。
【００５７】
先ず、形質転換用組換えベクターを作製し、次いでアグロバクテリウムにより形質転換を行う。形質転換用組換えベクターは、本発明のＤＮＡを含む断片を適当な制限酵素で切断後、必要に応じて適切なリンカーを連結し、植物細胞用のクローニングベクターに挿入することにより得ることができる。クローニング用ベクターとしては、ｐＢＥ２１１３Ｎｏｔ、ｐＢＩ２１１３Ｎｏｔ、ｐＢＩ２１１３、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＧＡ４８２、ｐＧＡＨ、ｐＢＩＧ等のバイナリーベクター系のプラスミドやｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ、ｐＭＯＮ２００等の中間ベクター系のプラスミドを用いることができる。
【００５８】
バイナリーベクター系プラスミドを用いる場合、上記のバイナリーベクターの境界配列（ＬＢ，ＲＢ）間に、本発明のＤＮＡを挿入し、この組換えベクターを大腸菌中で増幅する。次いで、増幅した組換えベクターをアグロバクテリウム・チュメファシエンスＥＨＡ１０５、Ｃ５８、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、Ｃ５８Ｃ１ＲｉｆＲ等にエレクトロポレーション法等により導入し、本発明のＤＮＡを導入したアグロバクテリウムを植物の形質転換に用いればよい。その他、三者接合法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２：８７１１（１９８４））によって、本発明のＤＮＡを含む形質転換に用いるアグロバクテリウムを調製することができる。すなわち、本発明のＤＮＡを含むプラスミドを保有する大腸菌やヘルパープラスミド（例えばｐＲＫ２０１３）を保有する大腸菌とアグロバクテリウムを混合培養し、リファンピシリン及びカナマイシンを含む培地上で培養することにより形質転換用の接合体アグロバクテリウムを得ることができる。
【００５９】
植物細胞内で、外来遺伝子である本発明のＤＮＡを発現させるためには、本発明の前後に植物用のプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等を連結することが望ましい。本発明において利用可能なプロモーターとしては、例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）由来の３５Ｓプロモーター、トウモロコシのユビキチン（ＵＢＩ）プロモーター、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子プロモーター、オクトピン（ＯＣＴ）合成酵素遺伝子プロモーター等が挙げられる。エンハンサーとしては、ウイルス起源の翻訳エンハンサーや植物起源の翻訳エンハンサーを用いることができる。ウイルス起源の翻訳エンハンサーとしては、例えば、タバコモザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルスＲＮＡ４、ブロモモザイクウイルスＲＮＡ３、ポテトウイルスＸ、タバコエッチウイルス等の配列が挙げられる。また、植物起源の翻訳エンハンサーとして、ダイズのβ−１，３グルカナーゼ（Ｇｌｕ）由来の配列、タバコのフェレドキシン結合性サブユニット（ＰｓａＤｂ）由来の配列等が挙げられる。ターミネーターとしては、例えば、ＣａＭＶ由来やＮＯＳ遺伝子由来のターミネーター等を用いることができる。ただし、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターは上記のものに限定されず、植物体内で機能することが知られているものであればいずれも使用することができる。これらのプロモーター、エンハンサー、ターミネーターは、発現させようとする本発明のＤＮＡが機能し得るように連結する。
【００６０】
なお、本発明のＤＮＡをジャガイモで発現させる場合に用いられるプロモーターとしては、特に制限なく、前記３５Ｓプロモーター等の植物全体において目的遺伝子の発現を可能とするプロモーターであってもよく、目的遺伝子を塊茎以外の部位にて発現させることを可能とするＳ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ由来のプロモーターであってもよい。当該プロモーターとしては、例えばＳ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅの２３ＤＯＸ遺伝子又は２３ＡＣＴ遺伝子のプロモーターが挙げられる。これらは、Ｓｃ２３ＤＯＸコーディング領域やＳｃ２３ＡＣＴコーディング領域の上流数ｋｂを単離することにより、当業者であれば適宜調製できる。
【００６１】
さらに、効率的に目的の形質転換植物細胞を選択するために、選択マーカー遺伝子を用いることが好ましい。選択マーカーとしては、カナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴII）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｔｐ）、ビアラホス耐性遺伝子（ｂａｒ及びｐａｔ）等が挙げられる。本発明のＤＮＡ及び選択マーカー遺伝子は、単一のベクターに一緒に組み込んでも良いし、それぞれ別個のベクターに組み込んだ２種類の組換えＤＮＡを用いてもよい。
【００６２】
さらに、本発明の２３ＤＯＸをコードするＤＮＡ及び本発明の２３ＡＣＴをコードするＤＮＡの両方を導入する場合には、後述の実施例において示すように、これらＤＮＡを単一のベクターに一緒に組み込んでも良いし、それぞれ別個のベクターに組み込んだ２種類の組換えＤＮＡを用いてもよい。
【００６３】
また、本発明のＤＮＡの植物宿主への導入方法としては、上述の間接導入法及び直接導入法の他、ゲノム編集法による遺伝子挿入を用いてもよい。ゲノム編集法は、部位特異的なヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９等のＤＮＡ二本鎖切断酵素）を利用して、標的遺伝子を改変する方法である。例えば、ＺＦＮｓ（米国特許６２６５１９６号、８５２４５００号、７８８８１２１号、欧州特許１７２０９９５号）、ＴＡＬＥＮｓ（米国特許８４７０９７３号、米国特許８５８６３６３号）、ヌクレアーゼドメインが融合されたＰＰＲ（ｐｅｎｔａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅｒｅｐｅａｔ）（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ５３：１１７１−１１７９（２０１２））等の融合タンパク質や、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（米国特許８６９７３５９号、国際公開２０１３／１７６７７２号）、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１（Ｚｅｔｓｃｈｅ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３（３）：７５９−７１，（２０１５））やＴａｒｇｅｔ−ＡＩＤ（Ｋ．Ｎｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｈｙｂｒｉｄ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ａｎｄ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ８７２９，（２０１６））等のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とタンパク質の複合体を用いる方法が挙げられる。
【００６４】
＜本発明の植物細胞について  ２＞
後述の実施例において示すとおり、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍは２３ＤＯＸ遺伝子及び２３ＡＣＴ遺伝子を有している。しかしながら、それらの発現量が低いため、レプチンを十分に蓄積することができない。すなわち、これら内在性の遺伝子の発現を増強させることにより、レプチン蓄積量も向上し、ＣＰＢに対する抵抗性も増強させることが可能となる。
【００６５】
したがって、本発明は、
下記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の内在性ＤＮＡの発現が増強された、ＣＰＢに対する抵抗性が高められた植物体を再生しうる植物細胞をも提供する。
（ａ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：１、３又は５に記載のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ
（ｅ）配列番号：８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号：８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号：８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｈ）配列番号：７、９又は１１に記載のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつスピロソラン骨格２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
【００６６】
内在性の遺伝子の発現を増強させる方法としては、例えば、ゲノム編集や相同組換えにより、内在性２３ＤＯＸ遺伝子及び／又は内在性２３ＡＣＴ遺伝子の各上流にあるプロモーターを、相同組換え等により他のプロモーターに置換する方法が挙げられる。「他のプロモーター」としては、例えば、上述のＣａＭＶ由来の３５Ｓプロモーター、トウモロコシのＵＢＩプロモーター、ＮＯＳ遺伝子プロモーター、ＯＣＴ合成酵素遺伝子プロモーター、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅの２３ＤＯＸ遺伝子のプロモーター、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅの２３ＡＣＴ遺伝子のプロモーターが挙げられる。ここで用いられるゲノム編集としては、特に制限はないが、ＳＤＮ−２（Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ  ２、標的配列に相同的な短いＤＮＡ断片（鋳型）を人為的に合成し、切断の際に、これを人工制限酵素と合わせて導入することによって、１又は数塩基程度の変異を計画的に誘発させるタイプのゲノム編集）、ＳＤＮ−３（Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ  ３、数千塩基対程度の交雑可能な同種又は近縁種由来ではない遺伝子（トランスジーン）を含む長いＤＮＡ断片を相同な配列で挟む形で導入することによって、ゲノム上の所定部位に当該ＤＮＡ断片を形成させるタイプのゲノム編集）が挙げられる。より具体的には、以下に示す方法によって、内在性２３ＤＯＸ遺伝子及び内在性２３ＡＣＴ遺伝子の発現を増強することができる。
【００６７】
先ず、Ｓｔ２３ＤＯＸ遺伝子の開始コドンの部位を含む２０ヌクレオチドを認識するｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質と、Ｓｔ２３ＤＯＸ遺伝子のプロモーター、ＣａＭＶ由来の３５Ｓプロモーター及びＳｔ２３ＤＯＸ遺伝子を連結したＤＮＡとを、エレクトロポレーション法により茎切片にある細胞内に導入する。細胞内に取り込まれたｇＲＮＡとＣａｓ９複合体が、Ｓｔ２３ＤＯＸ遺伝子プロモーターとＳｔ２３ＤＯＸ遺伝子の間でＤＮＡを切断し、その際にゲノム編集のＳＤＮ−３の現象が起きることで、Ｓｔ２３ＤＯＸ遺伝子のすぐ上流にＣａＭＶ由来の３５Ｓプロモーターを挿入することができる。処理を行った後の茎切片を植物ホルモンを含むＭＳ培地（ゼアチン  ２ｐｐｍ，インドール−３−酢酸  ０．０５ｐｐｍ及び寒天０．８％を含む）、２５℃にて、１６時間照明（光量子束密度３２μＥ／ｍ２ｓ）／８時間無照明の条件下で週間ごとに継代することで、再分化した個体を得ることができる。再分化した個体からＤＮＡを抽出しＣａＭＶ由来の３５Ｓプロモーターを挿入した個体を選抜する。ＣａＭＶ由来の３５Ｓプロモーターが挿入された個体は、内在性のＳｔ２３ＤＯＸ遺伝子の発現量を上げることができ、レプチニンを産生することができる。この植物体の茎を、同様にＳｔ２３ＡＣＴ遺伝子の開始コドンの部位を含む２０塩基を認識するｇＲＮＡと、Ｃａｓ９タンパク質と、Ｓｔ２３ＡＣＴ遺伝子のプロモーター、ＣａＭＶ由来の３５Ｓプロモーター、Ｓｔ２３ＡＣＴ遺伝子を連結したＤＮＡとを、エレクトロポレーション法により茎切片にある細胞内に導入する。その結果、内在性のＳｔ２３ＤＯＸ遺伝子の発現量及び内在性のＳｔ２３ＡＣＴ遺伝子の発現量を上げることができ、レプチンを産生することが可能となる。
【００６８】
また、内在性２３ＤＯＸ遺伝子及び／又は内在性２３ＡＣＴ遺伝子の発現を活性化する因子（転写活性化因子）をコードするＤＮＡを導入することによっても、当該内在性遺伝子の発現を増強することができる。さらに、内在性２３ＤＯＸ遺伝子及び／又は内在性２３ＡＣＴ遺伝子の発現を抑制する因子（転写抑制因子）をコードするＤＮＡをゲノム編集等で破壊することによっても、当該内在性遺伝子の発現を増強することができる。なお、当業者であれば、文献等の記載に基づき、グリコアルカロイド生合成遺伝子群の転写制御因子を適宜選択し、それらを対象とすることによって、内在性２３ＤＯＸ遺伝子及び／又は内在性２３ＡＣＴ遺伝子の発現を増強することができる。例えば、当業者であれば、グリコアルカロイド生合成遺伝子群の転写因子として知られているＪＲＥ４（Ｔｈａｇｕｎら  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２０１６  ５７：９６１−７５  参照）を対象とすることによって、前記内在性遺伝子の発現を容易に増強することができる。
【００６９】
＜本発明の植物、及びその製造方法について  １＞
本発明は、前記植物細胞から再生された植物体を提供する。植物細胞からの植物体の再生は、その細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。例えば、「植物細胞培養マニュアル」山田康之  編著、講談社サイエンティフィク、１９８４、「形質転換プロトコール［植物編］」、田部井豊  編、株式会社化学同人、２０１２年９月２０日出版等に記載の方法に従って、形質転換植物細胞から植物体を再生することができる。
【００７０】
一旦、ゲノム内に本発明のＤＮＡが導入された形質転換植物や前記内在性ＤＮＡの発現が増強された植物が得られれば、これら植物から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることが可能である。よって、本発明の植物には、再分化した当代である「Ｔ０世代」の他、その植物の自殖や他殖の種子から得られた後代等、Ｔ０世代を元にした、あらゆる栽培や育種の手段により得られ得る世代や個体をも包含する。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。したがって、本発明には、本発明の植物細胞、該細胞を含む植物、該植物の子孫及びクローン、並びに該植物、その子孫、及びクローンの繁殖材料が含まれる。
【００７１】
また、本発明は、本発明の２３ＤＯＸをコードするＤＮＡ及び本発明の２３ＡＣＴをコードするＤＮＡを、植物細胞に導入する工程、及び前記工程においてＤＮＡが導入された形質転換植物細胞から植物を再生する工程を含むことを特徴とする、ＣＰＢに対する抵抗性が高められた植物の製造方法をも提供するものである。
【００７２】
なお、このようにして得られる、本発明のＤＮＡを導入した形質転換植物、及びその次世代等において、当該ＤＮＡが組み込まれていることの確認は、これらの細胞及び組織から常法に従ってＤＮＡを抽出し、公知の手法（例えば、ＰＣＲ法、サザンブロット法）を用いて導入した本発明のＤＮＡを検出することにより行うことができる。
【００７３】
また、本発明は、植物細胞において、本発明の２３ＤＯＸをコードする内在性ＤＮＡ及び本発明の２３ＡＣＴをコードする内在性ＤＮＡの発現を増強する工程、及び前記工程において前記内在性ＤＮＡの発現が増強された植物細胞から植物を再生する工程を含むことを特徴とする、ＣＰＢに対する抵抗性が高められた植物の製造方法をも提供するものである。
【００７４】
なお、このようにして得られる、内在性ＤＮＡの発現が増強された植物、及びその次世代等において、当該ＤＮＡの発現が増強されていることの確認は、これらの細胞及び組織から常法に従ってｍＲＮＡ又はタンパク質を抽出し、公知の手法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法）を用い、本発明のＤＮＡの発現を、当該ＤＮＡがコードするｍＲＮＡ又はタンパク質の発現の検出を通して行うことができる。
【００７５】
また、このようにして得られる、本発明の植物において、ＣＰＢに対する抵抗性が高められているかどうかの確認は、例えば、当該植物について、ＣＰＢを用い、圃場での成虫数と食害数の調査、円盤状に切った葉上での成虫の摂食速度調査、切り離した地上部での幼虫生育や幼虫生存率の調査（非特許文献４  参照）を行い、その結果を、コントロール（例えば、本発明のＤＮＡが導入されていない植物、本発明の内在性ＤＮＡの発現が増強されていない植物（例えば、野生型））のそれと比較することにより、ＣＰＢへの抵抗性が高められたことを確認することができる。
【００７６】
また、上述のとおり、ＣＰＢへの抵抗性は、レプチンの蓄積量に応じる。したがって、上記液体クロマトグラフィーを用いたグリコアルカロイドの分析方法により、レプチン量を測定し、当該量がコントロールのそれより多ければ、ＣＰＢへの抵抗性は高められたと確認することもできる。
【００７７】
＜本発明の判定方法について＞
本発明の、植物におけるＣＰＢに対する抵抗性を判定する方法は、被検植物における、本発明の２３ＤＯＸをコードするＤＮＡと本発明の２３ＡＣＴをコードするＤＮＡとの存在若しくは発現を検出する工程、及び前記工程にて、前記ＤＮＡの存在又は発現が検出された場合に、前記被検植物は、ＣＰＢに対する抵抗性を有すると判定することを特徴とする。
【００７８】
本発明のＤＮＡの「存在」の検出は、被検植物における当該ＤＮＡ、又はそれらの発現制御領域のヌクレオチド配列を解析することを特徴とする。なお、検出対象となる「本発明の２３ＤＯＸをコードするＤＮＡ」及び「本発明の２３ＡＣＴをコードするＤＮＡ」は、上述のとおりである。
【００７９】
例えば、本発明の２３ＤＯＸをコードするＤＮＡと本発明の２３ＡＣＴをコードするＤＮＡが被検植物のゲノムＤＮＡ上に存在していなければ、当該植物はＣＰＢ抵抗性を有していないものと判定することができる。また、２３ＤＯＸ遺伝子及び２３ＡＣＴ遺伝子が存在していても、これら遺伝子において、ヌクレオチドの挿入や欠失が認められれば、ＣＰＢ抵抗性が低減又は消失していることとなる。したがって、本発明の２３ＤＯＸをコードするＤＮＡ及び本発明の２３ＡＣＴのヌクレオチド配列を解析することによって、ＣＰＢ抵抗性を有しているか否かを判定することができる。
【００８０】
また、２３ＤＯＸ遺伝子及び２３ＡＣＴ遺伝子の発現を制御する領域（エンハンサー、プロモーター、サイレンサー、インスレーター）のヌクレオチド配列を解析することによって、ＣＰＢ抵抗性を有しているか否かを判定することもできる。
【００８１】
２３ＤＯＸ遺伝子及び２３ＡＣＴ遺伝子、又はそれらの発現制御領域のヌクレオチド配列の解析に際しては、それら配列をＰＣＲにより増幅した増幅産物を用いることができる。前記ＰＣＲを実施する場合において、用いられるプライマーは、前記遺伝子又はそれらの発現制御領域を、各々特異的に増幅できるものである限り制限はなく、それらの配列情報に基づいて適宜設計することができる。
【００８２】
なお、ＣＰＢ抵抗性を有しているか否かを判定する方法においては、例えば、「対照のヌクレオチド配列」と比較する工程を含むことができる。被検植物における２３ＤＯＸ遺伝子及び２３ＡＣＴ遺伝子のヌクレオチド配列と比較する「対照のヌクレオチド配列」は、例えば、Ｓｌ２３ＤＯＸ、Ｓｌ２３ＡＣＴ、Ｓｔ２３ＤＯＸ、Ｓｔ２３ＡＣＴ、Ｓｃ２３ＤＯＸ及びＳｃ２３ＡＣＴを各々コードするヌクレオチド配列が挙げられる。
【００８３】
検出した被検植物における前記遺伝子又はそれらの発現制御領域のヌクレオチド配列と、前記対照のヌクレオチド配列とを比較することにより、被検植物においてＣＰＢ抵抗性を有しているか否かを判定することができる。例えば、前記対照のヌクレオチド配列と比較して、ヌクレオチド配列において大きな相違がある場合（特に、新たな終止コドンの出現やフレームシフトにより、コードするタンパク質の分子量やアミノ酸配列に大きな変化が生じる場合）、被検植物はＣＰＢ抵抗性を有していない植物である蓋然性が高いと判定される。
【００８４】
一方、後述の実施例において示すとおり、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍにおいて、Ｓｔ２３ＤＯＸ遺伝子及びＳｔ２３ＡＣＴ遺伝子を有しているものの、それら遺伝子の発現量が少ないため、ＣＰＢ抵抗性が発揮されない。したがって、被検植物における２３ＤＯＸ遺伝子及び２３ＡＣＴ遺伝子の各発現制御領域と比較する場合には、Ｓｌ２３ＤＯＸ遺伝子、Ｓｌ２３ＡＣＴ遺伝子、Ｓｃ２３ＤＯＸ遺伝子及びＳｃ２３ＡＣＴ遺伝子の各発現制御領域は、陽性の対照ヌクレオチド配列として用いられ、Ｓｔ２３ＤＯＸ遺伝子及びＳｔ２３ＡＣＴ遺伝子の各発現制御領域は、陰性の対照ヌクレオチド配列として用いられる。
【００８５】
すなわち、検出した被検植物における発現制御領域のヌクレオチド配列が、Ｓｌ２３ＤＯＸ遺伝子、Ｓｌ２３ＡＣＴ遺伝子、Ｓｃ２３ＤＯＸ遺伝子及びＳｃ２３ＡＣＴ遺伝子の各発現制御領域と高い同一性（例えば、９０％以上の同一性、好ましくは９５％以上（９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上。１００％の同一性）を有する場合には、被検植物はＣＰＢ抵抗性を有している植物である蓋然性が高いと判定され、一方、Ｓｔ２３ＤＯＸ遺伝子及びＳｔ２３ＡＣＴ遺伝子の各発現制御領域と高い同一性（例えば、９０％以上の同一性、好ましくは９５％以上（９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上。１００％の同一性）を有する場合には、被検植物はＣＰＢ抵抗性を有している植物である蓋然性が低いと判定される。
【００８６】
なお、前述のとおり、２３ＤＯＸ遺伝子及び２３ＡＣＴ遺伝子を有していても、それらの発現量が低いため、ＣＰＢ抵抗性を発揮できない植物もある。したがって、前記２３ＤＯＸ及び２３ＡＣＴをコードするヌクレオチド配列を指標とする判定結果と、前記２３ＤＯＸ遺伝子及び２３ＡＣＴ遺伝子の発現制御領域のヌクレオチド配列を指標とする判定結果とを、組み合わせて、被検植物がＣＰＢ抵抗性を有しているか否かを判定することが望ましい。
【００８７】
また、本発明のＤＮＡの「存在」の検出は、本発明のＤＮＡの存在位置の目印となるＤＮＡ配列からなるＤＮＡマーカーを検出することによっても行なうことができる。かかるＤＮＡマーカーは、２３ＤＯＸ遺伝子及び２３ＡＣＴ遺伝子内に各々存在するか、これら遺伝子に各々隣接するか、あるいは近傍に存在するＤＮＡマーカーを用いればよい。
【００８８】
本発明において利用可能なＤＮＡマーカーは、特に制限されず、一般的に知られている種々のＤＮＡマーカーを好適に用いることができる。例えば、ＳＳＲ（単純反復配列）マーカー等のマイクロサテライトマーカー、ＲＦＬＰ（制限酵素断片長多型）マーカー、ＳＮＰ（一塩基多型）マーカーが挙げられる。
【００８９】
なお、本発明の判定方法における、被検植物からのＤＮＡの調製は、常法、例えば、ＣＴＡＢ法を用いて行うことができる。ＤＮＡを調製するための植物としては、成長した植物体のみならず、種子、幼植物体、塊茎を用いることもできる。また、ヌクレオチド配列の決定は、常法、例えば、ジデオキシ法やマキサム−ギルバート法などにより行なうことができる。塩基配列の決定においては、市販のシークエンスキット及びシークエンサーを利用することができる。
【００９０】
被検植物における２３ＤＯＸ遺伝子及び２３ＡＣＴ遺伝子、又はそれらの発現制御領域のヌクレオチド配列が、対照のヌクレオチド配列と相違するか否かは、上記した直接的なヌクレオチド配列の決定以外に、種々の方法により間接的に解析することができる。このような方法としては、例えば、サザンブロッティング、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造多型）法、制限酵素断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を利用したＲＦＬＰ法やＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ）、アレル特異的オリゴヌクレオチド（Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション法、リボヌクレアーゼＡミスマッチ切断法が挙げられる。
【００９１】
また、本発明の判定方法においては、被験植物における、本発明の２３ＤＯＸをコードするＤＮＡ及び本発明の２３ＡＣＴをコードするＤＮＡの発現を検出することを特徴とするものである。
【００９２】
ここで「ＤＮＡの発現の検出」には、転写レベルにおける検出及び翻訳レベルにおける検出の双方を含む意である。さらに、「発現の検出」には、発現の有無の検出のみならず、発現の程度の検出も含む意であり、またＤＮＡの発現産物の分子量を検出することも含む意でもある。
【００９３】
本発明のＤＮＡの転写レベルにおける検出は、常法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法やノーザンブロッティング法により実施することができる。前記ＰＣＲを実施する場合において用いられるプライマーは、本発明のＤＮＡを特異的に増幅できるものである限り制限はなく、当該ＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいて適宜設計することができる。
【００９４】
一方、翻訳レベルにおける検出は、常法、例えば、ウェスタンブロッティング法やＥＬＩＳＡ法により、実施することができる。ウェスタンブロッティングに用いる抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、これら抗体の調製方法は、当業者に周知である。
【００９５】
前記発現を検出した結果、被験植物において、本発明のＤＮＡの発現量が、ＣＰＢ抵抗性植物（例えば、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ）のそれよりも有意に低ければ、またはＣＰＢ非抵抗性植物（例えば、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）のそれよりも低い又は同等である場合には（例えば、本発明のＤＮＡが実質的に発現していなければ）、または本発明のＤＮＡの発現産物の分子量がＣＰＢ抵抗性植物における分子量と有意に異なれば、被験植物はＣＰＢ抵抗性を有していない、又は低いと判定される。
【００９６】
＜本発明の植物、及びその製造方法について  ２＞
本発明は、前記判定方法を利用した、ＣＰＢに対する抵抗性を有する植物を製造する方法を提供する。
【００９７】
かかる製造方法として、ＣＰＢに対する抵抗性を有する植物と任意の植物とを交配させる工程と、前記工程における交配により得られた植物において、ＣＰＢに対する抵抗性を、前述の方法により判定する工程と、ＣＰＢに対する抵抗性を有すると判定された植物を選抜する工程と
を、含む方法が、挙げられ、
また、本発明の２３ＤＯＸをコードするＤＮＡを有する植物と、本発明の２３ＡＣＴをコードするＤＮＡを有する植物とを交配させる工程と、
前記工程における交配により得られた植物において、ＣＰＢに対する抵抗性を、前述の方法により判定する工程と、
ＣＰＢに対する抵抗性を有すると判定された植物を選抜する工程と
を、含む方法が、挙げられる。
【００９８】
「ＣＰＢに対する抵抗性を有する植物」としては、当該抵抗性又はレプチン生合成能を有している限り、特に制限はなく、例えば、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅが挙げられる。
【００９９】
前記品種と交配させる「任意の植物」としては、例えば、ＣＰＢに対する抵抗性を有していない品種、ＣＰＢに対する抵抗性を有する植物品種とＣＰＢに対する抵抗性を有していない品種との交配により得られた植物が挙げられるが、これらに制限されない。また、「任意の植物」としては、ＣＰＢに対する抵抗性以外の他の特性を有しているものであってもよい。「他の特性」としては特に制限はなく、例えば、ＣＰＢ以外の害虫に対する抵抗性、各種病害に対する抵抗性、多収性、早生性が挙げられる。
【０１００】
「本発明の２３ＤＯＸをコードするＤＮＡを有する植物」としては、２３ＤＯＸをコードするＤＮＡを少なくとも有していればよく、例えば、Ｓｃ２３ＤＯＸをコードするＤＮＡを少なくとも有する植物：Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅが挙げられる。「本発明の２３ＡＣＴをコードするＤＮＡを有する植物」としては、２３ＤＯＸをコードするＤＮＡを少なくとも有していればよく、例えば、Ｓｃ２３ＡＣＴをコードするＤＮＡを少なくとも有する植物：Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（コナフブキ、９７Ｈ３２−６及び西海３５号、サクラフブキ、パールスターチ等）が挙げられる。
【０１０１】
また、本発明の製造方法を利用すれば、ＣＰＢ抵抗性植物を、幼植物の段階等で選抜することが可能となり、当該形質を有する品種の育成を、短期間で行うことが可能となる。したがって、本発明は、ＣＰＢに対する抵抗性を有する植物を育種する方法を提供するものでもある。
【０１０２】
かかる方法において、ＣＰＢ抵抗性品種と任意の植物品種（植物系統）とを交雑し、または、本発明の２３ＤＯＸをコードするＤＮＡを有する植物と、本発明の２３ＡＣＴをコードするＤＮＡを有する植物とを交雑し、上述のとおり、本発明のＤＮＡの存在又は発現を指標として選抜することにより、育種することができる。より具体的な選抜育種方法として、例えば、任意の植物品種（例えば、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）と本発明のＤＮＡを有する植物品種（例えば、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ）を交雑させ雑種を得て、得られた雑種と前記任意の植物品種を戻し交雑し、本発明のＤＮＡを有する雑種を選抜し、さらに戻し交雑を行う方法が挙げられる。戻し交雑及び選抜は、数回、好ましくは２〜１０回繰り返す行うことが好ましい。このような方法により、本発明のＤＮＡを有する実用品種を得ることができる。
【０１０３】
本発明は、またこのようにして作出された、ＣＰＢに対する抵抗性を有する植物をも提供する。当該植物において、少なくとも本発明のＤＮＡを有していれば特に制限はないが、全染色体における前記任意の植物品種における置換率が５０％以上（例えば、６０％以上）であることが好ましく、７０％以上（例えば、８０％以上）であることがより好ましく、９０％以上（例えば、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）であることがさらに好ましい。なお、置換率は、ゲノム全域に存在するＤＮＡマーカーを解析し、前記任意の植物品種における割合を算出することにより、得ることができる。また、ＤＮＡマーカー選抜による育種は、例えば、Ｈａｍｗｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，１７９：４５１−４５９の記載に沿って行うことができる。
【０１０４】
＜本発明の判定方法に用いられるキットについて＞
上述のとおり、本発明の２３ＤＯＸをコードするＤＮＡ及び２３ＡＣＴをコードするＤＮＡを検出することによって、植物におけるＣＰＢに対する抵抗性の有無を判定することができる。したがって、本発明は、上述の判定方法により、植物におけるＣＰＢに対する抵抗性を判定するための薬剤であって、下記（ａ）〜（ｄ）から選択される少なくとも１の化合物を含む薬剤
（ａ）本発明の２３ＤＯＸをコードする遺伝子、その転写産物又はその相補的ヌクレオチドにハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオド
（ｂ）本発明の２３ＡＣＴをコードする遺伝子、その転写産物又はその相補的ヌクレオチドにハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオド
（ｃ）本発明の２３ＤＯＸに結合する抗体
（ｄ）本発明の２３ＡＣＴに結合する抗体。
【０１０５】
本発明に係るオリゴヌクレオドは、上記検出方法に合わせ、プライマーの態様であってもよく、プローブの態様であってもよい。
【０１０６】
プライマーは、本発明の２３ＤＯＸをコードする遺伝子又は本発明の２３ＡＣＴをコードする遺伝子（ゲノムＤＮＡ）、その転写産物（ｍＲＮＡ）又はその相補的ヌクレオチド（ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ）にハイブリダイズし、該転写産物等の増幅及び検出を可能とする限り特に限定されない。プライマーは、ＤＮＡのみであってもよく、またその一部又は全部において、架橋化核酸等の人工核酸（修飾核酸）によって置換されているものであってもよい。プライマーのサイズは、少なくとも約１５ヌクレオチド長以上あればよく、好ましくは１５〜１００ヌクレオチド長、より好ましくは１８〜５０ヌクレオチド長、さらに好ましくは２０〜４０ヌクレオチド長である。また、このようなプライマーは、上記検出方法に合わせ、当業者であれば公知の方法により設計し、作製することができる。
【０１０７】
プローブは、本発明の２３ＤＯＸをコードする遺伝子又は本発明の２３ＡＣＴをコードする遺伝子、その転写産物又はその相補的ヌクレオチドにハイブリダイズし、それらの検出を可能とする限り特に限定されない。プローブはＤＮＡ、ＲＮＡ、人工核酸又はそれらのキメラ分子等であり得る。プローブは、１本鎖又は２本鎖のいずれでもよい。プローブのサイズは、少なくとも約１５ヌクレオチド長以上あればよく、好ましくは１５〜１０００ヌクレオチド長、より好ましくは２０〜５００ヌクレオチド長、さらに好ましくは３０〜３００ヌクレオチド長である。このようなプローブは、当業者であれば公知の方法により作製することができる。また、プローブは、マイクロアレイのように、基板上に固定された形態で提供されてもよい。
【０１０８】
抗体は、本発明の２３ＤＯＸ又は２３ＡＣＴに特異的に結合し得る限り特に限定されない。例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよく、また抗体の機能的断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ等）であってもよい。このような抗体は、当業者であれば公知の方法により作製することができる。また、抗体は、ＥＬＩＳＡ法や抗体アレイ等に用いるべく、プレート等の基板上に固定された形態で提供されてもよい。
【０１０９】
また、本発明のキットに含まれるオリゴヌクレオチド又は抗体は、検出方法に合わせ、標識用物質で標識されていてもよい。標識用物質としては、例えば、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ＤＥＡＣ、Ｒ６Ｇ、ＴｅｘＲｅｄ、Ｃｙ５等の蛍光物質、β−Ｄ−グルコシダ―ゼ、ルシフェラーゼ、ＨＲＰ等の酵素、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質が挙げられる。
【０１１０】
また、前記オリゴヌクレオチド又は抗体は、組成物として許容される他の成分を含む態様であってもよい。このような他の成分としては、例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩、二次抗体等が挙げられる。
【０１１１】
また、本発明のキットは、上記オリゴヌクレオチド、抗体の他、標識の検出に必要な基質、陽性対照や陰性対照、あるいは試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液等を組み合わせてもよい。さらに、かかるキットには、当該キットの使用説明書を含めることができる。
【０１１２】
以上、本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。例えば、本発明の植物細胞、植物、及びその製造方法、並びに本発明の判定方法、及び当該判定方法を用いた植物の製造方法は、本発明の組成物同様に、ＣＰＢに対する抵抗性のみならず、レプチンの生成等も対象とすることができる。すなわち、本発明は、以下の態様も提供することができる。
＜１２＞  下記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡが導入された、レプチンの蓄積量が高められた植物体を再生しうる植物細胞
（ａ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：１、３又は５に記載のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつスピロソラン骨格の２３位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ
（ｅ）配列番号：８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号：８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号：８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつスピロソラン骨格２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質を、コードするＤＮＡ
（ｈ）配列番号：７、９又は１１に記載のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつスピロソラン骨格２３位の水酸基をアセチル化する活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
＜１３＞  前記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の内在性ＤＮＡの発現が増強された、レプチンの蓄積量が高められた植物体を再生しうる植物細胞。
＜１４＞  ＜１２＞又は＜１３＞に記載の植物細胞から再生された、レプチンの蓄積量が高められた植物。
＜１５＞  レプチンの蓄積量が高められた植物の製造方法であって、
前記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡを、植物細胞に導入する工程、及び
前記工程においてＤＮＡが導入された形質転換植物細胞から植物を再生する工程
を含む方法。
＜１６＞  植物におけるレプチンの生成能を判定する方法であって、
被検植物における、
前記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡと前記（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡとの存在若しくは発現を検出する工程、及び
前記工程にて、前記ＤＮＡの存在又は発現が検出された場合に、前記被検植物は、レプチンの生成能を有すると判定する工程
を、含む方法。
＜１７＞  レプチンの生成能を有する植物を製造する方法であって、
レプチンの生成能を有する植物と任意の植物とを交配させる工程と、
前記工程における交配により得られた個体において、レプチンの生成能を、＜１６＞に記載の方法により判定する工程と、
レプチンの生成能を有すると判定された植物を選抜する工程と
を、含む方法。
＜１８＞  レプチンの生成能を有する植物を製造する方法であって、
前記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡを有する植物と、前記（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡを有する植物とを交配させる工程と、
前記工程における交配により得られた植物において、レプチンの生成能を、＜１６＞に記載の方法により判定する工程と、
レプチンの生成能を有すると判定された植物を選抜する工程と
を、含む方法。
【０１１３】
また、上述のとおり、本発明によれば、レプチンの生成能を有する植物を得ることができる。よって、本発明は、ＣＰＢのみならず、レプチンによって摂食が抑制される生物、レプチンを忌避する生物、レプチンによって成育が抑制される生物、レプチンによって殺される生物等を対象とすることもできる。
【０１１４】
なお、本明細書で引用した全ての文献は、そのまま参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１１５】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１１６】
野生種のジャガイモ  Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅは、レプチン（レプチンI、レプチンII）を蓄積することにより、ＣＰＢに対する抵抗性を発揮することが明らかになっている。さらに、これらレプチンの蓄積は、図１の下段に示すとおり、ソラニダン（α−チャコニン、α−ソラニン）の２３位が水酸化されることにより、レプチニンI、レプチニンIIが生成され、更にこれら化合物２３位の水酸基がアセチル化されることによって、生じていると想定されている（非特許文献５  参照）。しかしながら、レプチン生成を担い、ひいてはＳ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅにＣＰＢ抵抗性を付与する遺伝子は、同定されていない。
【０１１７】
そこで、かかる遺伝子を同定すべく、本発明者らは、同じナス科植物であるトマト（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）における、スピロソラン配糖体（α−トマチン）の代謝過程（図１の上段）に着目した。そして、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅにおけるレプチン生成においては、このトマトにおけるスピロソラン配糖体の代謝過程同様に、２３位水酸化酵素（「２３ＤＯＸ」とも称する）及び２３位アセチル基転移酵素（「２３ＡＣＴ」とも称する）が関与していると想定し、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅにおけるこれら酵素をコードする遺伝子の同定を、以下に示す方法にて試みた。なお、トマトにおいてもこれら酵素をコードする遺伝子の配列は明らかになっていない。そのため、先ずはその配列を同定することから始めた。
【０１１８】
（実施例１）  ２３ＤＯＸ遺伝子の取得
トマトにおいて、前記スピロソラン配糖体の代謝（トマチンからエスクレオサイドＡの生成）は、果実の成熟過程において生じることが明らかになっている。そこで、トマトの果実において発現する水酸化酵素（ジオキシゲナーゼ）をコードする遺伝子の同定を試みた。
【０１１９】
具体的には先ず、矮性トマト品種  マイクロトムの果実からＲＮＡ抽出用キット（製品名：ＲＮｅａｓｙ、キアゲン社製）を用いてＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲ用ｃＤＮＡ合成キット（製品名；ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（登録商標）  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｋｉｔ、東洋紡社製）を使ってｃＤＮＡを作成した。
【０１２０】
一方、トマトの発現データベース（Ｓｏｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｎｅｔｗｏｒｋ：ｈｔｔｐｓ：／／ｓｏｌｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｎｅｔ／）で果実に特異的に発現しているジオキシゲナーゼの構造を持つタンパク質をコードする配列（Ｓｏｌｙｃ０２ｇ０６２４６０）を見出した。
【０１２１】
そして、前記トマト果実のｃＤＮＡを鋳型とし、前記配列を基に合成したプライマーＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＴＣＴＡＴＣＡＡＡＴＣＡＧ（配列番号：１３）、ＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＡＡＴＡＣＣＡＣＡＡＴＡＡＡＴＣＴＴＧ（配列番号：１４）を用いて、アニール温度５５℃にてＰＣＲ（３０サイクル、タカラバイオ社製  Ｅｘ  ｔａｑ  ＨＳを使用）を行い、遺伝子を増幅した。これをｐＭＤ１９ベクター（タカラ社製）へクローニングして、遺伝子断片を取得し全長配列を決定した（この遺伝子がコードするタンパク質を「Ｓｌ２３ＤＯＸ」とも称する。また、このアミノ酸配列を配列番号：６に示す）。
【０１２２】
次に、レプチンを発現しているＳ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ  ＰＩ  ４５８３１０（ＵＳＤＡ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｇｅｎｂａｎｋより入手した種子を播種）の葉からＲＮｅａｓｙ（キアゲン社製）を用いてＲＮＡを抽出し、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｋｉｔ（東洋紡社製）を使ってｃＤＮＡを調製した。Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅのヌクレオチド配列については網羅的な解析が進められていないこともあり、大概の配列は不明であったため、前記Ｓｌ２３ＤＯＸ遺伝子の配列をもとに作成したディジェネレートプライマーＣＴＷＡＡＡＣＣＡＡＡＣＡＣＴＹＣＡＹＷＡＴＧＧＧＡＡＴ（配列番号：１５）、ＧＧＧＴＧＴＴＹＷＴＣＡＴＣＹＡＣＷＡＲＴＴＣＴＴＴＴＧＧ（配列番号：１６）を用い、アニール温度５５℃にてＰＣＲ（３０サイクル、東洋紡社製  ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏを使用）を行った。得られたＰＣＲ増幅産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（サーモフィッシャー社製）へクローニングして遺伝子断片を取得し、部分配列を決定した。
【０１２３】
次いで、ｃＤＮＡ断片の全長ＯＲＦ配列を決定するためにＲＡＣＥ法を行なった。より具体的には、先ず、ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用い、そのキットのプロトコルに従って、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅのＲＮＡからＲＡＣＥ用ｃＤＮＡの合成を行った。次に、このＲＡＣＥ用ｃＤＮＡを鋳型とし、５’−ＲＡＣＥにおいては、キットに添付のユニバーサルプライマーと遺伝子特異的プライマー  ＴＧＧＴＧＡＴＴＡＣＣＣＴＧＡＧＧＣＣＡＡＡＡＧＡ（配列番号：１７）を用い、３’−ＲＡＣＥにおいては、遺伝子特異的プライマー  ＧＧＴＣＧＡＴＴＧＣＡＴＴＣＴＣＣＴＧＴＣＣＡＣ（配列番号：１８）とキットに添付のユニバーサルプライマーを用い、アニール温度５８℃にて、各々についてＰＣＲ（３５サイクル、タカラバイオ社製  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＨＳを使用）を行った。
【０１２４】
そして、増幅した遺伝子を、ｐＭＤ１９ベクター（タカラ社製）へクローニングして、遺伝子断片のシークエンス解析を行った。その結果５’−ＲＡＣＥにより得られた断片には開始コドンと予想される配列が見出され、３’−ＲＡＣＥによって得られた断片には終止コドンが見出された。
【０１２５】
次に、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅのｃＤＮＡに対し、得られたＲＡＣＥ断片の塩基配列を元に作成したプライマー  ＣＡＴＡＴＧＧＣＡＴＣＴＡＣＣＡＡＡＴＣＡＧＴＴＡＡＡＧＴ（配列番号：１９）及びＧＴＣＧＡＣＴＣＡＡＡＣＡＣＣＧＣＡＡＴＡＡＧＴＣＴＴＧＡ（配列番号：２０）を用い、アニール温度５５℃にてＰＣＲ（３５サイクル、タカラバイオ社製  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳを使用）を行った。得られたＰＣＲ増幅産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）へクローニングして、遺伝子断片を取得し、全長配列を決定した（決定した配列がコードするアミノ酸配列を配列番号：２に示す。また当該遺伝子がコードするタンパク質を、以下「Ｓｃ２３ＤＯＸ」とも称する）。なお、Ｓｌ２３ＤＯＸとＳｃ２３ＤＯＸのアミノ酸レベルの配列同一性は８７％であった。
【０１２６】
（実施例２）  ２３ＡＣＴ遺伝子の取得
上記水酸化酵素同様に、トマトの果実において発現するアセチル基転移酵素をコードする遺伝子の同定を試みた。具体的には先ず、トマトの発現データベース（Ｓｏｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｎｅｔｗｏｒｋ：ｈｔｔｐｓ：／／ｓｏｌｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｎｅｔ／）で果実で発現しているアセチル基転移酵素の構造を持つタンパク質をコードする配列（Ｓｏｌｙｃ０８ｇ０７５２１０）を見出した。トマト果実のｃＤＮＡに対し、この配列を基に合成したプライマー  ＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＡＣＡＧＣＡＴＣＡＡＧＴＴＴＴＧＴＡＴＣＴＡＴＧ（配列番号：２１）及びＧＴＣＧＡＣＣＴＡＧＡＧＡＴＴＣＧＴＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＣ（配列番号：２２）を用いて、アニール温度５５℃にてＰＣＲ（４０サイクル、タカラバイオ社製  ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＨＳを使用）を行い、遺伝子を増幅した。これをｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（サーモフィッシャー社製）へクローニングして、遺伝子断片を取得し、全長配列を決定した（以下、この遺伝子がコードするタンパク質を「Ｓｌ２３ＡＣＴ」とも称する。また、このアミノ酸配列を配列番号：１２に示す）。
【０１２７】
次に、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅの葉から抽出したＲＮＡを、次世代シークエンサーを用いて網羅的に解読し、ＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ）データベースを作成した。このＥＳＴデータベースにて、Ｓｌ２３ＤＯＸをクエリ配列としてｂｌａｓｔを行い、アセチル基転移酵素をコードすると思われる遺伝子の３’側断片を見出した。
【０１２８】
次に、当該遺伝子の５’側断片を得、ひいては全長ＯＲＦ配列を決定するために、ＲＡＣＥ法を行なった。ＲＡＣＥ法はＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて行った。より具体的には、キットのプロトコルに従い、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅのＲＮＡからＲＡＣＥ用ｃＤＮＡの合成を行った。さらに、このＲＡＣＥ用ｃＤＮＡを鋳型とし、キットに添付のユニバーサルプライマーと遺伝子特異的プライマーＴＧＣＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＣＡＴＴＣＡＣＡＴＧＧ（配列番号：２３）を用い、アニール温度５８℃にてＰＣＲ（３５サイクル、タカラバイオ社製  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＨＳを使用）を行い、遺伝子を増幅した。次いで、得られた増幅産物をｐＭＤ１９ベクター（タカラ社製）へクローニングして、遺伝子断片のシークエンス解析を行った。その結果、５’−ＲＡＣＥにより得られた断片には開始コドンと予想される配列が見出された。
【０１２９】
そして、アセチル基転移酵素をコードすると思われる遺伝子の全長ＯＲＦ配列を決定すべく、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅのｃＤＮＡを鋳型とし、前記各断片の塩基配列を元に作製したプライマー  ＣＡＴＡＴＧＧＣＡＧＣＡＴＣＡＡＧＴＴＧＴＧＴＡＴ（配列番号：２４）及びＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＴＴＡＧＴＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＧＡ（配列番号：２５）を用い、アニール温度５５℃にてＰＣＲ（３０サイクル、タカラバイオ社製  ＰｒｉｍｅＳｔａｒを使用）を行い、遺伝子を増幅した。得られたＰＣＲ産物を、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（サーモフィッシャー社製）へクローニングして、遺伝子断片を取得し、全長配列を決定した（Ｓｃ２３ＡＣＴ。そのアミノ酸配列を、配列番号：８に示す）。なお、Ｓｌ２３ＡＣＴとＳｃ２３ＡＣＴのアミノ酸の同一相同性は８０％であった。
【０１３０】
（実施例３）  ２３ＤＯＸのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素活性の検出
実施例１にて同定した遺伝子がコードするタンパク質が、想定したように、α-トマチン又はα−ソラニンを基質として、これら化合物の２３位に水酸基を導入できるかどうかを、以下に示す方法にて検証した。
【０１３１】
先ず、２３ＤＯＸを大腸菌において合成すべく、Ｓｌ２３ＤＯＸ遺伝子及びＳｃ２３ＤＯＸ遺伝子をｐＣｏｌｄ  ＰｒｏＳ２ベクター（タカラバイオ社製）にそれぞれつなぎ、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。得られた組み換え大腸菌を３７℃でＯＤ６００値が０．５になるまで培養し、１５℃に冷却し３０分間放置した。終濃度が０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加えて、１５℃で２４時間浸とう培養し、組み換えタンパク質の発現を誘導した。
【０１３２】
次に、発現誘導を行った大腸菌体を回収し、ソニケーションバッファー［５０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ジチオトレイトール、１０％  グリセロール］に懸濁し、超音波破砕機で菌体を破砕した後、遠心分離を行い、上清から粗抽出画分を得た。これに、５０μＭ  基質を含む１００ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．２，５ｍＭ  ２−オキソグルタル酸，１０ｍＭ  アスコルビン酸ナトリウム及び２００μＭ  ＦｅＳＯ４含有）を加え、反応をさせた。
【０１３３】
得られた反応産物を、ＬＣ−ＭＳ（ウォーターズ社製、製品名：ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ  ＡＣＱＵＩＴＹ）を用い分析した。なお、カラムはＡＣＱＵＩＴＹ  ＨＳＳ  Ｔ３  １．８μｍ  φ２．１×１００ｍｍ（ウォーターズ社製）を用いた。ＬＣ分析において、移動相Ａ：０．１％  ギ酸水、Ｂ：アセトニトリルでグラジエント溶出を行った。グラジエント溶出は、０−３分，９０％  Ａ／１０％  Ｂで保持後、３−３３分，９０％  Ａ／１０％  Ｂから５７．５％  Ａ／４２．５％  Ｂ、３３−３８分，  ５７．５％  Ａ／４２．５％  Ｂから０％  Ａ／１００％  Ｂ、３８−４３分，１００％  Ｂで保持することによって行なった。
【０１３４】
その結果、図２及び３に示すとおり、α−トマチンを基質にした場合に、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ由来のもの（Ｓｌ２３ＤＯＸ）のみならず、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ由来の２３ＤＯＸ（Ｓｃ２３ＤＯＸ）についても、２３位に水酸基が導入された産物が得られることが明らかになった。
【０１３５】
しかしながら、図には示していないが、α−ソラニンを基質にした場合には、Ｓｌ２３ＤＯＸ及びＳｃ２３ＤＯＸの双方において、新たな反応生成物を得ることはできなかった。
【０１３６】
（実施例４）  ２３ＡＣＴのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素活性の検出
実施例２にて同定した遺伝子がコードするタンパク質が、想定したように、２３ヒドロキシ−トマチン、又はレプチニンI又はレプチニンIIを基質として、これら化合物２３位の水酸基をアセチル化できるかどうかを、以下に示す方法にて検証した。
【０１３７】
先ず、２３ＡＣＴをｉｎ  ｖｉｔｒｏにて合成すべく、Ｓｌ２３ＡＣＴ遺伝子及びＳｃ２３ＡＣＴ遺伝子をｐＣｏｌｄ  ＰｒｏＳ２（タカラバイオ社製）にそれぞれつなぎ、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。得られた組み換え大腸菌を３７℃でＯＤ６００値が０．５になるまで培養し、１５℃に冷却し３０分間放置した。終濃度が０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加えて、１５℃で２４時間振とう培養し、組み換えタンパク質の発現を誘導した。発現誘導を行った大腸菌体を回収し、ソニケーションバッファー［５０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ジチオトレイトール、１０％  グリセロール］に懸濁し、超音波破砕機で菌体を破砕した後、遠心分離を行い、上清から粗抽出画分を得た。これに、５０μＭの基質を含む１００ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．２、４００μＭ  アセチルＣｏＡ含有）を加え、反応させた。
【０１３８】
得られた反応産物を、ＬＣ−ＭＳ（ウォーターズ社製、製品名：ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ  ＡＣＱＵＩＴＹ）を用い分析した。なお、カラムはＡＣＱＵＩＴＹ  ＨＳＳ  Ｔ３  １．８μｍ  φ２．１×１００ｍｍ（ウォーターズ社製）を用いた。ＬＣ分析において、移動相Ａ：０．１％  ギ酸水、Ｂ：アセトニトリルでグラジエント溶出を行った。グラジエント溶出は、０−３０分，  ９０％  Ａ／１０％  Ｂから４５％  Ａ／５５％  Ｂ、３０−３１分，  ４５％  Ａ／５５％  Ｂから１００％  Ｂ、３１−３５分，１００％  Ｂで保持することによって行なった。
【０１３９】
その結果、図４及び５に示すとおり、２３ヒドロキシトマチンを基質にした場合に、Ｓｌ２３ＡＣＴ又はＳｃ２３ＡＣＴの存在下では、２３位にアセトキシ基が導入された産物を得られることが明らかになった。
【０１４０】
一方、図には示していないが、レプチニンＩやレプチニンＩＩを基質にした場合には、Ｓｌ２３ＡＣＴ及びＳｃ２３ＡＣＴのいずれにおいても、新たな反応生成物を得ることはできなかった。
【０１４１】
以上のとおり、今回同定した遺伝子がコードする、トマト及びＳ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅの２３ＤＯＸ及び２３ＡＣＴは、α−トマチン（スピロソラン骨格）２３位における水酸化反応及びアセチル化反応を触媒することが明らかになった。その一方で、従前想定されていたα−ソラニン（ソラニダン骨格）からレプチンに至る反応過程において、これら酵素の関与は認められなかった。すなわち、２３ＤＯＸ及び２３ＡＣＴは、スピロソラン骨格を有する化合物特異的に作用する酵素であることが示唆された。
【０１４２】
（実施例５）  ２３ＤＯＸ遺伝子を導入したジャガイモにおける、ステロイドグリコアルカロイドの解析
次に、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ由来の２３ＤＯＸ遺伝子を導入した形質転換ジャガイモを作製し、この形質転換体において、レプチニンI及びレプチニンIIが生成されるかどうかを、以下に示す方法にて検証した。
【０１４３】
先ず、Ｓｃ２３ＤＯＸ遺伝子をｐＲＩ２０１ベクター（タカラバイオ社製）につなぎ、ｐＲＩ２０１＿Ｓｃ２３ＤＯＸベクターを作成した（図６の上部  参照）。これをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０５株に導入した。ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスを、５０ｐｐｍのカナマイシンを含むＹＥＢ液体培地［５ｇ／ｌビ−フエキス、１ｇ／ｌ酵母エキス、５ｇ／ｌペプトン、５ｇ／ｌ蔗糖、２ｍＭ硫酸マグネシウム（ｐＨ７．２）］にて２８℃、１２時間振とう培養した。培養液１．５ｍｌを１０，０００ｒｐｍで３分間遠心して集菌後、１．５ｍｌの３％蔗糖を含むＭＳ培地［Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．，１５，４７３−４９７（１９６２）参照］に再懸濁し、感染用菌液とした。
【０１４４】
試験管内で培養したジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）品種「サッシー」の節を含まない３−５ｍｍに切断した茎をアグロバクテリウム感染用の材料とした。これを上記のアグロバクテリウムの菌液に浸した後、滅菌済みの濾紙上に置いて過剰のアグロバクテリウムを除去した。これをシャーレ内の植物ホルモンを含むＭＳ培地（アセトシリンゴン  １００μＭ、ゼアチン  ２ｐｐｍ、インドール−３−酢酸  ０．０５ｐｐｍ及び寒天  ０．８％を含む）上に置き、３日間培養した。培養は、２５℃にて、１６時間照明（光量子束密度３２μＥ／ｍ２ｓ）／８時間無照明の条件下で行った。次いで、アセトシリンゴンの代わりにカルベニシリン２５０ｐｐｍを含んだ培地で２週間ごとに継代した。再分化した個体を得ることができた。
【０１４５】
得られた再分化個体（＃９）の葉約１００ｍｇを液体窒素で凍結させ、ミキサーミルで破砕した（１／３０ｓｅｃ，２ｍｉｎ）。破砕した葉に３００μＬのメタノールを加え、１０分間ソニーケーションした。遠心分離（１５０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ）を行い、上清を回収した。この抽出操作を三度繰り返し、回収した上清を減圧乾固し、残渣を２００μＬメタノールに再溶解した。再溶解液２０μＬを１８０μＬのメタノールに溶かし、ＬＣ−ＭＳ（ウォーターズ社製、製品名：ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ  ＡＣＱＵＩＴＹ）を用い、グリコアルカロイドを分析した。カラムはＡＣＱＵＩＴＹ  ＨＳＳ  Ｔ３  １．８μｍ  φ２．１×１００ｍｍ（ウォーターズ社製）を用いた。ＬＣ分析においては、移動相Ａ：０．１％ギ酸水、Ｂ：アセトニトリルでグラジエント溶出を行った。グラジエント溶出は、０−３０分，９０％  Ａ／１０％  Ｂから４５％  Ａ／５５％  Ｂ、３０−３１分，４５％  Ａ／５５％  Ｂから１００％  Ｂ、３１−３５分，１００％  Ｂで保持することによって行なった。レプチニンを含む標品としてＳ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ  ＰＩ  ４５８３１０の花からの抽出物を用い、それと比較した。
【０１４６】
その結果、図７及び８に示すとおり、レプチニンの生成が認められなかったＳ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍにおいて、Ｓｃ２３ＤＯＸを発現させることによって、レプチニンＩ及びレプチニンＩＩの生産が可能となることが明らかになった。
【０１４７】
（実施例６）  ２３ＤＯＸ遺伝子及び２３ＡＣＴ遺伝子を導入したジャガイモの毛状根におけるステロイドグリコアルカロイドの解析
次に、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ由来の２３ＤＯＸ遺伝子及び２３ＡＣＴ遺伝子を導入した形質転換ジャガイモを作製し、この形質転換体において、レプチンI及びレプチンIIが生成されるかどうかを、以下に示す方法にて検証した。
【０１４８】
先ず、Ｓｃ２３ＤＯＸ遺伝子とＳｃ２３ＡＣＴ遺伝子の両方をｐＢｉｎ＋２０１につないだベクターｐＢｉｎ＋２０１＿Ｓｃ２３ＤＯＸ＿Ｓｃ２３ＡＣＴを作成し（図６の下部  参照）、これをアグロバクテリウム・リゾゲネスＣ１５８３４株に導入した。ベクターを含むアグロバクテリウムを、５０ｐｐｍのカナマイシンを含むＹＥＢ液体培地［５ｇ／ｌビ−フエキス、１ｇ／ｌ酵母エキス、５ｇ／ｌペプトン、５ｇ／ｌ蔗糖、２ｍＭ硫酸マグネシウム（ｐＨ７．２）］にて２８℃、１２時間振とう培養した。培養液をＹＥＢ寒天培地（２％  アガロース）にスプレッドし、暗所２８℃で７２時間培養した。試験管内で培養したジャガイモ品種「サッシー」を１−１．５ｃｍに切断し、茎の根側の先端をリゾゲネスのコロニーに付着させ、プラントボックス内でＢ５培地（０．３％  ゲルライト、２％  スクロースを含む）に根側の先端が上向きになるように突き立てた。これを暗所２０℃で２０日間培養し、毛状根の形成が確認された茎の上部を切り取りＭＳ培地（０．３％  ゲルライト、２％  スクロース、２５０ｐｐｍ  セフォタキシムを含む）に移し、暗所２５℃で７日間培養し、除菌した。伸びた毛状根の先端１ｃｍを切り取りＢ５培地（０．３％  ゲルライト、２％  スクロース、２５０ｐｐｍ  セフォタキシムを含む）に移し、暗所２５℃で７日間培養した。得られた毛状根を切片に分け、Ｂ５液体培地（２％  スクロースを含む）に移し、２０℃暗所（１００ｒｐｍ）でさらに１４日間振とう培養した。切片から増殖したもの１００ｍｇを液体窒素で凍結させ、ミキサーミルで破砕した（１／３０ｓｅｃ，２ｍｉｎ）。破砕物に３００μＬのメタノールを加え、１０分間ソニーケーションした。遠心分離（１５０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ）を行い、上清を回収した。この抽出操作を三度繰り返し、回収した上清を減圧乾固し、残渣を２００μＬメタノールに再溶解した。再溶解液２０μＬを１８０μＬのメタノールに溶かし、ＬＣ−ＭＳ（ウォーターズ社製、製品名：ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ  ＡＣＱＵＩＴＹ）を用いグリコアルカロイドを分析した。なお、カラムはＡＣＱＵＩＴＹ  ＢＥＨ  Ｃ−１８  １．７μｍ  φ２．１×１００ｍｍ（ウォーターズ社製）を用いた。ＬＣ分析において、移動相Ａ：０．１％  ギ酸水、Ｂ：アセトニトリルでグラジエント溶出を行った。グラジエント溶出は、０−３分，９０％  Ａ／１０％  Ｂで保持後、３−３３分，９０％  Ａ／１０％  Ｂから５７．５％  Ａ／４２．５％  Ｂ、３３−３８分，５７．５％  Ａ／４２．５％  Ｂから０％  Ａ／１００％  Ｂ、３８−４３分，１００％  Ｂで保持することによって行なった。レプチンを含む標品としてＳ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ  ＰＩ  ４５８３１０の花からの抽出物を用い、それと比較した。
【０１４９】
その結果、図９及び１０に示すとおり、レプチンの生成が認められなかったＳ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍにおいて、Ｓｃ２３ＤＯＸ及びＳｃ２３ＡＣＴを発現させることによって、レプチンＩ及びレプチンＩＩの生産が可能となることが明らかになった。
【０１５０】
以上のことから、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅにおいては、従前想定されていたような、ソラニダン骨格を有する化合物（ソラニン、チャコニン）からレプチンが生成されるのではなく、スピロソラン骨格を有する化合物２３位への水酸基、次いでアセトキシ基の導入を経て、更に当該化合物のスピロソラン骨格がソラニダン骨格に変換されることによって、レプチンが生成されていることが明らかになった。
【０１５１】
（実施例７）  ジャガイモ品種やジャガイモ育種に使われる系統におけるＳｃ２３ＤＯＸ遺伝子の存在可否についての検定
ＣＰＢ抵抗性を示さないＳ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍはＳｃ２３ＤＯＸ遺伝子を有していないことを確認すべく、以下に示す解析を行なった。
【０１５２】
ＣＰＢ抵抗性を示さないジャガイモ品種やジャガイモ育種に使われる系統（「男爵薯」、「メークイン」、「さやか」、「サッシー」、「コナフブキ」、「デジレー」、「９７Ｈ３２−６」、「西海３５号」、「北海８７号」、「ＶＴｎ  ６２−３３−３」、「Ｗ５５３−４」）及びＣＰＢ抵抗性野生種である「Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ  ＰＩ  ４５８３１０」から、ＣＴＡＢ法（Ｈｏｓａｋａ  ａｎｄ  Ｈａｎｎｅｍａｎ  Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，  １９９８，  １０３：２６５−２７１）によりＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡに対し、プライマー  ＧＧＣＡＴＣＴＡＣＣＡＡＡＴＣＡＧＴＴＡＡＡＧ（配列番号：２６）及びプライマー  ＧＴＣＴＴＧＡＡＡＡＣＡＴＣＡＣＴＧＧＧＡＧ（配列番号：２７）を用い、アニール温度６０℃にてＰＣＲ（３５サイクル、ＢｉｏＬｉｎｅ社  ＢＩＯＴＡＱを使用）を行い、遺伝子を増幅した。得られた結果を図１１に示す。
【０１５３】
その結果、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ  ＰＩ  ４５８３１０で約１７００ベースの増幅断片が見られた。また、その育成過程でＳ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅを用いているコナフブキ及び西海３５号でも増幅断片が見られた。しかしながら、これらの増幅断片は、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅのそれよりも約２００ベース大きく、約２０００ベースであった。さらに、これらの塩基配列を決定した結果、Ｓｃ２３ＤＯＸ遺伝子とは異なる配列であることが確認できた（この配列については、実施例１０  参照のほど）。
【０１５４】
したがって、調べた範囲では、ＣＰＢ抵抗性ジャガイモであるＳ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ  ＰＩ  ４５８３１０の他、前記品種や育種に使われる素材の中にはＳｃ２３ＤＯＸ遺伝子を持つものは検出されなかった。
【０１５５】
（実施例８）  ジャガイモ品種やジャガイモ育種に使われる系統におけるＳｃ２３ＡＣＴ遺伝子の存在可否についての検定
実施例７同様に、ＣＰＢ抵抗性を示さないＳ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍはＳｃ２３ＡＣＴ遺伝子を有していないことを確認すべく、以下に示す解析を行なった。
【０１５６】
ジャガイモ品種やジャガイモ育種に使われる系統（「男爵薯」、「メークイン」、「さやか」、「サッシー」、「コナフブキ」、「デジレー」、「９７Ｈ３２−６」、「西海３５号」、「北海８７号」、「ＶＴｎ  ６２−３３−３」、「Ｗ５５３−４」、「Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ  ＰＩ  ４５８３１０」）から、前記ＣＴＡＢ法によってＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡに対し、プライマー  ＧＡＴＴＡＴＧＡＡＴＴＴＴＡＣＡＡＴＴＴＧ（配列番号：２８）及びプライマー  ＴＡＣＡＧＧＴＡＧＴＧＡＣＡＡＣＧＡＧＧＡＴＣ（配列番号：２９）を用い、アニール温度６０℃にてＰＣＲ（４０サイクル、ＢｉｏＬｉｎｅ社  ＢＩＯＴＡＱを使用）を行い、遺伝子を増幅した。得られた結果を図１２に示す。
【０１５７】
その結果、驚くべきことに、ＣＰＢ抵抗性を示さないコナフブキ、９７Ｈ３２−６及び西海３５号も、Ｓｃ２３ＡＣＴ遺伝子を持っていることが明らかになった。コナフブキ、９７Ｈ３２−６及び西海３５号は、その育成過程でＳ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ（Ｗ８４及びｃｈｃ５２５−３）を用いている（浅間ら，北海道立農業試験場集報，１９８２，４８：７５−８４，ＰｈｕｍｉｃｈａｉらＧｅｎｏｍｅ，２００５，４８：９７７−９８４）。また、Ｗ８４及びｃｈｃ５２５−３がレプチンを蓄積しているとの報告はない。しかしながら、Ｓｃ２３ＡＣＴ遺伝子を有していることが明らかになったコナフブキ及び９７Ｈ３２−６に、Ｓｃ２３ＤＯＸ遺伝子を導入することによって、これらジャガイモにおいても、レプチン生成能が発揮されることが期待できる。
【０１５８】
したがって、Ｓｃ２３ＡＣＴ遺伝子を検出することによって、このようなレプチン生成能を潜在的に持つ素材を容易に明らかにすることができることがわかった。
【０１５９】
また、コナフブキを育成過程で用いているサクラフブキ、パールスターチについても、前記解析を行なった。その結果、図には示していないが、これらもＳｃ２３ＡＣＴを持っていることが明らかとなった。
【０１６０】
（実施例９）  Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅとジャガイモを交配した後代における、ステロイドグリコアルカロイドと遺伝子の解析
Ｓｃ２３ＤＯＸ遺伝子及びＳｃ２３ＡＣＴ遺伝子と、レプチン蓄積との相関を確認すべく、以下に示す解析を行なった。
【０１６１】
先ず、レプチンを発現しているＳ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ  ＰＩ  ４５８３１０から実生５系統を得た。これらはいずれもレプチンを蓄積していることを確認した。
【０１６２】
次に、この５系統と、レプチンを発現していないジャガイモ系統  ９７Ｈ３２−６を交配し、雑種種子を獲得した。そして、雑種種子を生育させた２６３個体の葉から、Ｈａｔｔｏｒｉら（Ｂｒｅｅｄ．Ｓｃｉ．５７：３０５−３１４）の方法によりＤＮＡを抽出し、実施例７及び８に記載の方法にて、Ｓｃ２３ＤＯＸ遺伝子及びＳｃ２３ＡＣＴ遺伝子を各々増幅した。また、雑種種子を生育させた葉約１００ｍｇから実施例３に記載の方法にて、各ステロイドグリコアルカロイドを解析した。得られた結果を表１に示す。さらに、３系統についてはＬＣ−ＭＳの分析データを、図１３に示す。
【０１６３】
【表１】
2020036591.tif 000002
【０１６４】
その結果、前記雑種全ての個体において、Ｓｃ２３ＤＯＸ遺伝子とＳｃ２３ＡＣＴ遺伝子を持つことが明らかとなった。また、このことから、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ  ＰＩ  ４５８３１０の実生個体はＳｃ２３ＤＯＸ遺伝子をホモで持つこと、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ  ＰＩ  ４５８３１０の実生個体かジャガイモ系統９７Ｈ３２−６か、その両方がＳｃ２３ＡＣＴ遺伝子をホモに持つことが明らかとなった。
【０１６５】
さらに、表１に示すとおり、前記雑種全ての個体においてレプチンの蓄積が認められたことから、Ｓｃ２３ＤＯＸ遺伝子及びＳｃ２３ＡＣＴ遺伝子の存在とレプチン蓄積とは相関していることが確認された。
【０１６６】
なお、このようにして得られたＳｃ２３ＤＯＸ遺伝子及びＳｃ２３ＡＣＴ遺伝子を有し、レプチンを生産している系統に対し、更に９７Ｈ３２−６を戻し交雑し、雑種種子を得ることができる。そして、前記と同様の方法にて、これら遺伝子の存在の有無を解析することによって、レプチンを生産する雑種種子を判別することも可能となる。
【０１６７】
（実施例１０）  Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍにおける２３ＤＯＸ遺伝子についての検証
ジャガイモ（Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）のゲノムデータベース（Ｓｐｕｄ  ＤＢ：ｈｔｔｐ：／／ｓｏｌａｎａｃｅａｅ．ｐｌａｎｔｂｉｏｌｏｇｙ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）にある配列を対象とした、ｔｂｌａｓｔ解析では、Ｓｃ２３ＤＯＸに最も相同性の高い配列（ＰＧＳＣ０００３ＤＭＴ４０００８１９１４）でも同一性は７９％と低く、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍには２３ＤＯＸ遺伝子は存在していないものと考えていた。
【０１６８】
しかし驚くべきことに、実施例７において示したとおり、Ｓ．ｃｈａｃｏｅｎｓｅ  ＰＩ  ４５８３１０のＳｃ２３ＤＯＸ遺伝子由来の増幅産物（約１７００ベース）より約２００ベース大きい、約２０００ベースの断片の増幅が、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍにおいて認められた。そして、これらの塩基配列を決定した結果、Ｓｃ２３ＤＯＸ遺伝子と極めて近い配列が増幅していることが明らかになった。
【０１６９】
そこで、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ品種サッシーのｃＤＮＡに対し、プライマー  ＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＴＣＴＡＣＣＡＡＡＴＣＡＧＴＴＡＡＡＧ（配列番号：３０）及びプライマー  ＴＣＡＡＡＣＡＣＣＧＣＡＡＴＡＡＧＴＣＴＴＧＡＡＡ（配列番号：３１）を用い、アニール温度５５℃にてＰＣＲ（４０サイクル、タカラバイオ社製  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲを使用）を行った。得られたＰＣＲ増幅産物をｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）へクローニングして、遺伝子断片を取得し、全長配列を決定した（決定したヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を配列番号：４に示す。また当該遺伝子がコードするタンパク質を、以下「Ｓｔ２３ＤＯＸ」とも称する）。なお、Ｓｔ２３ＤＯＸとＳｃ２３ＤＯＸのアミノ酸レベルの配列同一性は９４％であった。また、更なる解析の結果、Ｓｔ２３ＤＯＸ遺伝子は、サッシーの他に、少なくともコナフブキ、サクラフブキ、パールスターチ、西海３５号、男爵薯にもあることがわかった。
【０１７０】
（実施例１１）  Ｓｔ２３ＤＯＸのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素活性の検出
実施例１０にて同定したＳｔ２３ＤＯＸ遺伝子に関し、実施例３に記載の方法と同様にして解析を行った。その結果、図２及び３に示すとおり、α−トマチンを基質にした場合に、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ由来のもの（Ｓｔ２３ＤＯＸ）についても、２３位に水酸基が導入された産物が得られることが明らかになった。すなわち、Ｓｔ２３ＤＯＸは、Ｓｃ２３ＤＯＸ及びＳｌ２３ＤＯＸ同様に、レプチニン生成に関与し得ることが明らかになった。一方、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（品種サッシー）においては、レプチニン生成を介したＣＰＢ抵抗性は認められない。したがって、以上のことから、少なくとも品種サッシーにおいて、Ｓｔ２３ＤＯＸはレプチニンの十分な生成に資する程発現していないことが示唆される。
【０１７１】
（実施例１２）  Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍにおける２３ＡＣＴ遺伝子についての検証
ジャガイモ（Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）のゲノムデータベース（Ｓｐｕｄ  ＤＢ：  ｈｔｔｐ：／／ｓｏｌａｎａｃｅａｅ．ｐｌａｎｔｂｉｏｌｏｇｙ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）にある配列を対象とした、ｔｂｌａｓｔ解析では、Ｓｃ２３ＡＣＴに最も相同性の高い配列（ＰＧＳＣ０００３ＤＭＴ４０００２３８００）でも、同一性は７５％と低く、またＮ末に余分な３０アミノ酸が付加していることが確認された。そのため、Ｓｃ２３ＡＣＴと全長が似た長さのものでは同一相同性で５０％を越えるものは見つからず、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍには２３ＡＣＴ遺伝子は存在していないものと考えていた。
【０１７２】
しかし驚くべきことに、実施例８で行った検定プライマー作成時にＳ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍにも極めてＳｃ２３ＡＣＴ遺伝子に近い配列があることが示唆された。そこで品種サッシーのゲノムに対し、プライマー  ＣＡＴＡＴＧＧＣＡＧＣＡＴＣＡＡＧＴＴＧＴＧＴ（配列番号：３２）及びプライマー  ＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＴＴＡＧＴＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＧ（配列番号：３３）を用い、アニール温度５５℃にてＰＣＲ（４０サイクル、タカラバイオ社製  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳを使用）を行った。得られたＰＣＲ増幅産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）へクローニングして、遺伝子断片を取得し、全長配列を決定した（決定したヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を配列番号：１０に示す。また当該遺伝子がコードするタンパク質を、以下「Ｓｔ２３ＡＣＴ」とも称する）。なお、Ｓｔ２３ＡＣＴとＳｃ２３ＡＣＴのアミノ酸レベルの配列同一性は９１％であった。
【０１７３】
（実施例１３）  Ｓｔ２３ＡＣＴのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素活性の検出
実施例１２にて同定したＳｔ２３ＡＣＴ遺伝子に関し、実施例４に記載の方法と同様にして解析を行った。その結果、図４及び５に示すとおり、２３ヒドロキシトマチンを基質にした場合に、Ｓｔ２３ＡＣＴの存在下では、２３位にアセトキシ基が導入された産物を得られることが明らかになった。すなわち、Ｓｔ２３ＡＣＴは、Ｓｃ２３ＡＣＴ及びＳｌ２３ＡＣＴ同様に、レプチン生成に関与し得ることが明らかになった。一方、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（品種サッシー）においては、レプチン蓄積によるＣＰＢ抵抗性は認められない。したがって、以上のことから、少なくとも品種サッシーにおいては、上述のＳｔ２３ＤＯＸ同様に、Ｓｔ２３ＡＣＴはレプチンの十分な生成に資する程発現していないことが示唆される。
【０１７４】
（実施例１４）  Ｓｃ２３ＡＣＴ遺伝子を持つコナフブキへの、Ｓｃ２３ＤＯＸ遺伝子導入
実施例８ではコナフブキはＳｃ２３ＡＣＴの配列を有することを明らかにしたが、この配列が機能し、コナフブキが２３ＡＣＴ活性を発現していることを確認するため、コナフブキにてＳｃ２３ＤＯＸ遺伝子を導入したジャガイモの毛状根におけるステロイドグリコアルカロイドの解析を行った。
【０１７５】
具体的には、実施例６同様に、Ｓｃ２３ＤＯＸ遺伝子をｐＢｉｎ＋２０１につないだベクターｐＢｉｎ＋２０１＿Ｓｃ２３ＤＯＸを作成し、これをアグロバクテリウム・リゾゲネスＣ１５８３４株に導入した。ベクターを含むアグロバクテリウムを、５０ｐｐｍのカナマイシンを含むＹＥＢ液体培地［５ｇ／ｌビ−フエキス、１ｇ／ｌ酵母エキス、５ｇ／ｌペプトン、５ｇ／ｌ蔗糖、２ｍＭ硫酸マグネシウム（ｐＨ７．２）］にて２８℃、１２時間振とう培養した。培養液をＹＥＢ寒天培地（２％  アガロース）にスプレッドし、暗所２８℃で７２時間培養した。試験管内で培養したジャガイモ品種「コナフブキ」を１−１．５ｃｍに切断し、茎の根側の先端をリゾゲネスのコロニーに付着させ、プラントボックス内でＢ５培地（０．３％  ゲルライト、２％  スクロースを含む）に根側の先端が上向きになるように突き立てた。これを暗所２０℃で２０日間培養し、毛状根の形成が確認された茎の上部を切り取りＭＳ培地（０．３％  ゲルライト、２％  スクロース、２５０ｐｐｍ  セフォタキシムを含む）に移し、暗所２５℃で７日間培養し、除菌した。伸びた毛状根の先端１ｃｍを切り取りＢ５培地（０．３％  ゲルライト、２％  スクロース、２５０ｐｐｍ  セフォタキシムを含む）に移し、暗所２５℃で７日間培養した。得られた毛状根を切片に分け、Ｂ５液体培地（２％  スクロースを含む）に移し、２０℃暗所（１００ｒｐｍ）でさらに１４日間振とう培養した。切片から増殖したもの１００ｍｇを液体窒素で凍結させ、ミキサーミルで破砕した（１／３０ｓｅｃ，２ｍｉｎ）。破砕物に３００μＬのメタノールを加え、１０分間ソニーケーションした。遠心分離（１５０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ）を行い、上清を回収した。この抽出操作を三度繰り返し、回収した上清を減圧乾固し、残渣を２００μＬメタノールに再溶解した。再溶解液２０μＬを１８０μＬのメタノールに溶かし、ＬＣ−ＭＳ（ウォーターズ社製、製品名：ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ  ＡＣＱＵＩＴＹ）を用いグリコアルカロイドを分析した。なお、カラムはＡＣＱＵＩＴＹ  ＨＳＳ  Ｔ3  １．8μｍ  φ２．１×１００ｍｍ（ウォーターズ社製）を用いた。ＬＣ分析において、移動相Ａ：０．１％  ギ酸水、Ｂ：アセトニトリルでグラジエント溶出を行った。グラジエント溶出は、０−３０分，９０％  Ａ／１０％  Ｂから４５．０％  Ａ／５５．０％  Ｂ、３０−３１分，４５．０％  Ａ／５５．０％  Ｂから０％  Ａ／１００％  Ｂ、３１−３５分，１００％  Ｂで保持することによって行なった。
【０１７６】
その結果、図１４及び１５に示すとおり、レプチンの生成が認められなかったコナフブキにおいて、Ｓｃ２３ＤＯＸ遺伝子だけを強制的に発現させることによって、レプチンＩ及びレプチンＩＩの生産が可能となることが確認された。
【０１７７】
以上のことから、Ｓｃ２３ＡＣＴ遺伝子を持っている系統や品種では、Ｓｃ２３ＤＯＸ遺伝子だけを導入することでレプチンを生成できるようになることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１７８】
以上説明したように、本発明によれば、同定された、水酸化酵素遺伝子及び/又はアセチル基転移酵素遺伝子を用いることによって、スピロソラン骨格２３位に水酸基又はアセトキシ基を導入することが可能となり、またレプチニン又はレプチンを生成することも可能となる。さらに、本発明によれば、レプチンを生合成させ蓄積させることにより、植物のＣＰＢに対する抵抗性等を高めることも可能となる。すなわち、ＣＰＢに対する抵抗性が高められた植物を効率的に提供することが可能となる。また、本発明によれば、前記遺伝子の存在等を指標とし、植物におけるＣＰＢに対する抵抗性等を効率的に判定することもできる。したがって、本発明は、ＣＰＢによる虫害を受けるナス科植物の栽培等において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１７９】
配列番号：１３〜３３
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列
【図１】
2020036591.tif 000003
【図２】
2020036591.tif 000004
【図３】
2020036591.tif 000005
【図４】
2020036591.tif 000006
【図５】
2020036591.tif 000007
【図６】
2020036591.tif 000008
【図７】
2020036591.tif 000009
【図８】
2020036591.tif 000010
【図９】
2020036591.tif 000011
【図１０】
2020036591.tif 000012
【図１１】
2020036591.tif 000013
【図１２】
2020036591.tif 000014
【図１３】
2020036591.tif 000015
【図１４】
2020036591.tif 000016
【図１５】
2020036591.tif 000017
【配列表】
2020036591000001.app