(57)【要約】【課題】本発明が解決しようとする課題は、長く続く、生理的に放出されるインスリンの補充療法を糖尿病患者に提供することである。【解決手段】本発明は、（ａ）脱分化した膵島細胞と間葉幹細胞及び／または脂肪幹細胞、または（ｂ）再分化した膵島細胞と間葉幹細胞及び／または脂肪幹細胞を含む新膵島に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物であって、
（ａ）脱分化した膵島細胞と、間葉幹細胞もしくは脂肪幹細胞とを、または
（ｂ）再分化した膵島細胞と、間葉幹細胞もしくは脂肪幹細胞とを
含み、膵島細胞／幹細胞ハイブリッド細胞を含まない、前記組成物。
【請求項２】
前記膵島細胞と幹細胞が、約１：１００、１：７５、１：５０、１：２５、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、２５：１、５０：１、７５：１、または１００：１の膵島細胞：幹細胞の比で前記組成物に存在する請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
さらにヒドロゲルを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が被包される請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
組成物を生成する方法であって、前記方法が、
（１ａ）膵島からの外への増殖及び血清によって誘導される脱分化を介して膵島細胞を増やし、脱分化した膵島細胞を作出すること、または
（１ｂ）膵島からの外への増殖及び血清によって誘導される脱分化とその後の生体外での再分化を介して膵島細胞を増やし、再分化した膵島細胞を作出することと、
間葉幹細胞または脂肪幹細胞を増やすことと、
前記組成物の形成を促進する疎水性で超低接着性の表面上にて前記脱分化したまたは再分化した膵島細胞を前記間葉幹細胞または脂肪幹細胞と共に共培養することとを含み、
前記組成物が、膵島細胞／幹細胞ハイブリッド細胞を含まない、前記方法。
【請求項６】
糖尿病を患っている対象を治療する方法における使用のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記方法が、
前記対象にて最終的にインスリンを産生するのに十分な量の前記組成物を非経口で投与することを含む、組成物。
【請求項７】
前記糖尿病が、Ｉ型糖尿病及びＩＩ型糖尿病及び、たとえば、膵臓癌及び膵炎に伴うもののような他の型の糖尿病から選択される請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記対象の血中グルコースがインスリン注射の投与によって及び／または経口薬剤によってさらに制御される請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物の前記膵島細胞が前記対象に対して同種である請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物の前記間葉幹細胞または脂肪幹細胞が前記対象に対して同種である請求項６に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、腹腔内投与、皮下投与または肝臓の門脈への投与を介して前記対象に投与される請求項６に記載の組成物。
【請求項１２】
同種のＭＳＣ及び／またはＡＳＣの補助療法が、静脈内投与、動脈内投与または腹腔内投与を介して前記対象に投与される請求項６に記載の組成物。
【請求項１３】
前記方法が、投与の前に前記組成物を包装することをさらに含む請求項６に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物が前記対象に対して異種である請求項６に記載の組成物。
【請求項１５】
前記間葉幹細胞及び／または脂肪幹細胞が前記対象に対して異種である請求項６に記載の組成物。
【請求項１６】
対象または医療提供者への送達のために包装される請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が凍結される請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物が新鮮である請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
２型糖尿病または前２型糖尿病の対象を治療する方法における使用のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記方法が、
脱分化した膵島細胞と、間葉幹細胞もしくは脂肪幹細胞とを、または再分化した膵島細胞と、間葉幹細胞もしくは脂肪幹細胞とを前記対象に投与することを含み、
前記膵島細胞と前記幹細胞が、約１：１００、１：７５、１：５０、１：２５、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、２５：１、５０：１、７５：１、または１００：１の膵島細胞：幹細胞の比で存在し、
膵島からの外への増殖及び血清によって誘導される脱分化を介して前記膵島を増やして脱分化した膵島細胞を作出し、または膵島からの外への増殖及び血清によって誘導される脱分化とその後の生体外での再分化を介して膵島を増やして再分化した膵島細胞を作出し、
組成物の形成を促進する疎水性で超低接着性の表面上で前記膵島細胞が前記間葉幹細胞または脂肪幹細胞と共に共培養されており、
前記膵島細胞は前記対象に対して同種であり、
前記間葉幹細胞または脂肪幹細胞は前記対象に対して同種であり、
前記対象の治療は前記対象にて最終的にインスリンを産生するのに十分である、組成物。
【請求項２０】
前記対象への前記投与が腹腔内、皮下を介する、または肝臓の門脈へのものである請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記膵島細胞の早過ぎる拒絶がラパマイシンによって治療される請求項１９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１５年９月１０日に出願された米国仮特許出願番号６２／２１６，９２０及び２０１５年１２月７日に出願された米国仮特許出願番号６２／２６４，２３８の利益を主張し、それらの開示は双方ともその全体がこの参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
技術分野
本出願はバイオテクノロジー、医学及び細胞培養の分野に関する。それは具体的には、たとえば、幹細胞と膵島細胞とを含む組成物（「新膵島」または「細胞集塊」としても特定される）を作出する方法に関する。それはまた、たとえば、インスリン依存性糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、または損傷した耐糖能の治療のための幹細胞と膵島細胞とを含む新膵島の利用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
インスリンを産生するβ細胞は、ドナーの膵臓から単離されると、一般に生体外ではほとんど増殖せず、すなわち、インスリン依存性糖尿病の治療のために適当な細胞数を生成するのに十分には増殖しない。この決定を克服し、長く続く、生理的に放出されるインスリンの補充療法を糖尿病患者に提供するように考案された現在の技法及び多数の前臨床的療法（膵島及び膵臓の移植、前駆細胞導出療法等）は、ドナー細胞の不足と、たとえば、日和見感染及び悪性腫瘍のような患者にとって新しい有害効果を招く患者の免疫系の抑制の必要性との双方が妨げになっている。それぞれ５名までのドナーを必要とする反復膵島移植の必要性を合わせた好適な膵臓ドナーの大きな不足はこれらの高価な治療法の一般的な可用性を妨げ続けている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｄ．Ｒ．Ｂｕｒｎｅｔｔ，Ｌ．Ｍ．Ｈｕｙｅｔｔ，Ｈ．Ｃ．Ｚｉｓｓｅｒ，Ｆ．Ｊ．Ｄｏｙｌｅ，及びＢ．Ｄ．Ｍｅｎｓｈ，“Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｓｐａｃｅ  ｏｆｆｅｒｓ  ｆａｓｔｅｒ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｔｈａｎ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｓｐａｃｅ，”Ｄｉａｂｅｔｅｓ，６３：２４９８―５０５，（２０１４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
免疫隔離を促進し、この課題を克服するためにインスリン産生細胞のミクロ及びマクロの被包方式が調べられている。しかしながら、利用される被包材が異物を意味し、治療の失敗を生じるまたは拒絶反応抑制剤の長期の使用を必要とする自己免疫応答を誘導する可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書に記載されているのは、（ａ）脱分化した膵島細胞と間葉幹細胞及び／または脂肪幹細胞、または（ｂ）再分化した膵島細胞と間葉幹細胞及び／または脂肪幹細胞を含む新膵島である。
【０００７】
さらに本明細書に記載されているのは新膵島を生成する方法であり、該方法は、新膵島の形成を促進する／可能にする表面上で（ａ）脱分化した膵島細胞と間葉幹細胞及び／または脂肪幹細胞、または（ｂ）再分化した膵島細胞と間葉幹細胞及び／または脂肪幹細胞を培養することを含む。実施形態では、表面は疎水性表面及び／または超低接着性表面である。
【０００８】
記載されているのはまた対象を治療する方法であり、該方法は本明細書に記載されている新膵島を対象に提供することを含む。さらに記載されているは、たとえば、本明細書に記載されているような新膵島を対象に提供することによって１型糖尿病または２型糖尿病を患っている対象を治療する方法である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】新膵島の形成及びインスリン依存性糖尿病またはインスリン非依存性糖尿病の治療におけるその使用の図式的概観を示す図である。
【図２】培養された膵島細胞の外への増殖及び上皮間葉転換を示す図である。画像はすべて１０倍拡大である。パネルＡ：トランスジェニックＣ５７Ｂｌ／６ｉｎｓ１ｇｆｐマウスから新しく単離された膵島全体であり、緑色蛍光タンパク質の遺伝子（ｇｆｐ）はインスリン１（ｉｎｓ１）遺伝子のプロモータの制御下にある１。膵島β細胞は緑色である。パネルＢ：培養６日後のｉｎｓ１ｇｆｐ＋膵島全体である。有意なインスリン遺伝子の発現が依然として明らかである（緑色の細胞）が、細胞は膵島から外に増え、増殖している。これらの外に増えている細胞では、インスリン遺伝子の発現は下方調節され、細胞はもはや緑色ではない。パネルＣ：１日培養し、固定し、インスリンタンパク質を視覚化する（赤色）ためにモルモット抗インスリン抗体とｃｙ３を結合した抗モルモット抗体を用いたインスリンタンパク質についての免疫細胞化学法によって解析した分離したｉｎｓ１ｇｆｐ＋マウス膵島細胞である。画像は、非常に少ないｇｐｆ＋細胞が存在する一方でほぼ半分の細胞はインスリンを含有するが、緑色ではないことを示す。これは、上皮間葉転換に起因して、β細胞がインスリン遺伝子を発現を失うにつれてそれらが付着し、増殖することを示している。パネルＤ：ＥｄＵの存在下で２日間培養した分離したｉｎｓ１ｇｆｐ＋膵島細胞である。細胞を固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（核、青色）によって及びＥｄＵ（赤色）のために染色した。分裂していない細胞は明るい緑色で丸い上皮細胞の形態を有する一方で、分裂している細胞（赤色、核）は長い間葉系の外観を呈するようになり、かすかに緑色であるにすぎず、これはインスリン遺伝子の下方調節を示し、その上皮間葉転換を説明している。
【図３】ＮＩ出発物質の相対的な継代（Ｐ）依存性の遺伝子発現プロファイルを示す図である。継代１、２及び３（それぞれＰ１、Ｐ２及びＰ３）でのマウス、イヌ、及びヒトの培養した膵島細胞（左）及びＭ／ＡＳＣ（右）の遺伝子発現プロファイル（Ｌｏｇ１０ＲＱ）。双方の細胞型についての遺伝子発現プロファイルはすべて種特異的な新しく単離した膵島のものに対して正規化した。全体的に、マウス、イヌ及びヒトでは、ＡＳＣの遺伝子発現プロファイルは継代した膵島細胞のものとは異なり、膵島細胞の継代は膵島細胞に関連する遺伝子の発現を次第に減らす。データ：９５％信頼区間を伴った平均値、６回の独立した実験の代表。Ψ：ｈＡＳＣにて発現されるが、ヒト膵島細胞では発現されない、それぞれの正規化を妨げる。＊：発現されなかった。
【図４】マウス（４Ａ）及びイヌ（４Ｂ）のＡＳＣの表現型検査を示す図である。４Ａ及び４Ｂ：左上のパネル：プラスチックに接着性の集密ＡＳＣ培養の明視野画像、右上のパネル：骨形成性の分化（アリザリンレッドによるカルシウム染色）、左下のパネル：脂肪生成性の分化（オイルレッド−Ｏ染色）、右下のパネル：軟骨形成性の分化（アルシアンブルー染色）。赤い縮尺棒＝５０μｍ。４Ｃ：ＩＦＮγに曝露したイヌＡＳＣの、曝露しなかったｃＡＳＣに正規化したＩＤＯ−１の遺伝子発現（４つの独立した実験の平均値±標準誤差）。イヌＡＳＣをＩＦＮγに曝露するとＩＤＯ−１の遺伝子発現は３．４倍刺激される。４Ｄ：培養したマウス及びイヌのＡＳＣを、ＣＤ４４の陽性発現、及びＣ４５、ＣＤ３４及びＩ−Ａ［ｂ］及びＤＬＡ−ＤＲ移植抗原の陰性発現についてＦＡＣＳによって調べた。Ｍ／ＡＳＣはすべてプラスチック接着性及び３血球系分化を受ける能力を特徴とする一方で非ヒトＭ／ＡＳＣのすべてがヒトに由来するものと同じセットの細胞表面エピトープを発現するわけではなく、ほとんどがＣＤ４４を発現する一方でＣＤ９０の発現は可変性である。ＣＤ９０のイヌＭ／ＡＳＣによる発現は可変性である。
【図５】新膵島の形成及び画像化を示す図である。図３Ａは、新膵島の形成を受けているマウス細胞の画像及び模式図を示し、そこで、（１）緑色蛍光タンパク質陽性（ｇｆｐ＋）マウスＭＳＣは培養で増殖し、（２）マウス膵島細胞は培養で増殖し、（３）超低接着プレートにて細胞は共培養され、容易に新膵島を形成する。新膵島はその後、再分化培地（ＲＤＭ）にて培養することができる。
【図６】左、中央及び右のパネル：マウス（左）、イヌ（中央）及びヒト（右）の新膵島新膵島、ＡＳＣ（緑色）、膵島細胞（赤色）及び核（青色）の画像（６３×拡大）を示す図である。形態及び細胞の組成はマウス、イヌ及びヒトの新膵島新膵島の間で有意に異なることはない。
【図７】形成前と形成後のｃＮＩにおけるセルトラッカーグリーンで染色したイヌＡＳＣ及び染色しなかったイヌＩＣの百分率を示す図である。７Ａ：緑色の及び染色されなかった（ｉ）ＡＳＣのみ（最も左のパネル）、（ｉｉ）ＩＣのみ（中央左のパネル）、（ｉｉｉ）共培養開始時の細胞（中央右のパネル）、（ｉｖ）回収し、単個細胞調製物に分離した共培養後２４時間における共培養物から形成された分離したＮＩ（ｉｉｉ、最も右のパネル）の百分率を示す代表的なＦＡＣＳ散乱プロット（ｘ＝前方散乱；ｙ＝蛍光）を示す図である。ＡＳＣの９６．９％は共培養に先立って効果的に緑色に染色され、染色されなかったＩＣの０．１％のみが自家蛍光である。共培養開始の際、細胞のおよそ４７％がＡＳＣであり、５３％がＩＣであり、形成後ＮＩ内では細胞のおよそ５１％がＡＳＣであり、４９％がＩＣである。７Ｂ：図７Ａで実施した実験のｎ＝１２の独立した反復の共培養後２４時間でのＮＩにおけるＡＳＣ及びＩＣの百分率の棒グラフであり（平均値±標準誤差）、一貫してＮＩはほぼ５０％ＩＣと５０％のＡＳＣとで構成されることを示している。棒間での差異は統計的に有意ではない。
【図８−１】マウス、イヌ及びヒトの新膵島の遺伝子発現プロファイルを示す図である。データはすべて２つのハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチン及びβ２ミクログロブリンに対して正規化されている。８Ａ：マウス（上）及びイヌ（下）の新膵島における膵島関連遺伝子の遺伝子発現プロファイル。遺伝子発現プロファイルは、再分化したマウス新膵島（上左）、新しく単離したマウス膵島（上右）及び新しく形成されたマウス新膵島（マウス正規化）から、以下の１４の膵島関連遺伝子についてから得られた：インスリン１（ｉｎｓ１）、インスリン２（ｉｎｓ２）、グルカゴン（ｇｃｇ）、ソマトスタチン（ｓｓｔ）、膵臓十二指腸ホメオボックス−１（ｐｄｘ１）、インスリン転写因子ｍａｆＡ（ｍａｆａ）、ｎｋ６ホメオボックス１（ｎｋｘ６．１）、膵臓ポリペプチド（ｐｐｙ）、ｇｌｕｔ−１、ｇｌｕｔ−２、ｕｃｎ３、ｋｃｊ１１、ｓｕｒ２及びｇｌｐ１受容体（ｇｌｐ１ｒ）。遺伝子発現プロファイルは、再分化したイヌ新膵島（下左）、新しく単離したイヌ膵島（下右）及び新しく形成されたイヌ新膵島（イヌ正規化）から、以下の６つの膵島関連遺伝子について得られた：インスリン（ｉｎｓ）、ｇｃｇ、ｓｓｔ、ｎｋｘ６．１、ｓｕｒ１、及びｇｌｐ１ｒ。新しく形成されたマウス及びイヌの新膵島は双方とも、低レベルの調べた膵島関連遺伝子を発現し、高レベルのこれら遺伝子を生じる再分化を受ける能力を有する。
【図８−２】８Ｂ：（上）：インスリン１（ｉｎｓ１）、インスリン２（ｉｎｓ２）、グルカゴン（ｇｃｇ）、ソマトスタチン（ｓｓｔ）、膵臓ポリペプチド（ｐｐｙ）、膵臓十二指腸ホメオボックス−１（ｐｄｘ１）、インスリン転写因子ｍａｆＡ（ｍａｆａ）、グルコーストランスポーター２（ｇｌｕｔ−２）、血管内皮増殖因子α（ｖｅｇｆ−α）及び幹細胞由来因子１（ｃｘｃｌ−１２）についての遺伝子発現プロファイルが、Ｐ１マウス膵島細胞とＰ５マウスＭＳＣ（左）またはＰ２マウス膵島細胞とＰ５マウスＭＳＣ（右）から生成された新しく形成されたマウス新膵島から得られ、新しく単離したマウス膵島に対して正規化した。（中央）：Ｐ１イヌ膵島細胞とＰ２イヌＡＳＣ（左）またはＰ２イヌ膵島細胞とＰ２イヌＡＳＣ（右）から生成され、新鮮なイヌ膵島に対して正規化された新しく形成されたイヌ新膵島における膵島関連遺伝子、インスリン（ｉｎｓ）、ｇｃｇ、ｐｄｘ１及びスルホニル尿素受容体１（ｓｕｒ１）、ならびにＡＳＣ関連遺伝子ｖｅｇｆ−α、ｃｘｃｌ１２、及び形質転換増殖因子β１（ｔｇｆβ−１）の遺伝子発現プロファイル。（下）：新しく単離されたヒト膵島に対して正規化されたＰ１ヒト膵島細胞とＰ３ヒトＡＳＣ（左）またはＰ２ヒト膵島細胞とＰ２ヒトＡＳＣから生成された新しく形成されたヒト新膵島におけるｉｎｓ、ｇｃｇ、ｓｓｔ、ｐｐｙ、ｐｄｘ１、ｍａｆａ、ｎｋ６ホメオボックス１（ｎｋｘ６．１）、ウロコルチン３（ｕｃｎ３）、ｓｕｒ１、ｖｅｇｆ−α、ｃｘｃｌ１２、ｔｇｆβ−１、及びｉｇｆ−１についての遺伝子発現プロファイル。このパネルは、種（マウス、イヌ、ヒト）を越えて（ａ）脱分化し、継代された膵島細胞から作られた新膵島は低レベルの膵島細胞遺伝子を発現し、（ｂ）膵島細胞遺伝子の発現は継代に伴って低下することを明らかにしている。８Ｃ：５０の新しく単離したＣ５７Ｂｌ／６マウスの膵島（白棒）に対比させた脱分化したＰ１膵島細胞とＰ５のＭＳＣを含む５０の新しく形成されたＣ５７Ｂｌ／６マウスの新膵島（斜線棒）によるグルコースで刺激したインスリン分泌（ＧＳＩＳ）。実験は２つ組で実施した。２５ｍＭのグルコースへの６０分間の曝露に応答して新膵島は新しく単離した膵島が放出するインスリンのおよそ１％を放出する（約０．５ｎｇ対約５０ｎｇのインスリン）。これは、パネルＢで見られた継代にわたるインスリン遺伝子発現の低下に匹敵する。
【図９】自然発症糖尿病ＮＯＤマウスにおける同種ＮＩ処置で確立した正常血糖値を示す図である。Ｌｉｎｂｉｔで正常化し（０日目）、その後、Ｌｉｎｂｉｔ療法後の２０日目に２×１０５個のＣ５７Ｂｌ／６のＮＩ／ｋｇ（ｎ＝６、白棒）または溶媒（ｎ＝６、黒棒）をｉ．ｐ．で注入したＮＯＤマウスの血中グルコースのレベル（平均値±標準誤差）。溶媒で処置したマウスの血中グルコースのレベルはＬｉｎｂｉｔが失効する（ほぼ３５日目）と上昇した一方で、ＮＩ処置したマウスでは正常血糖値が長期間維持されたということは、ＩＣのインスリン産生細胞への再分化及びＮＩが介在する同種及び自己免疫の攻撃からの免疫防御を意味している。正常な血中グルコースのレベル：点線。＊溶媒処置群に対してＰ＜０．０５。
【図１０】ＮＩ処置及び集塊処置したＳＴＺ糖尿病Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおける血中グルコースのレベル、ならびにＮＩに含有されるＩＣの内分泌細胞への生体内再分化を示す図である。１０Ａ：経時的な血中グルコースのレベルが、（ｉ）溶媒、（ｉｉ）２×１０５個のＡＳＣ集塊／ｋｇ体重、（ｉｉｉ）２×１０５個のＩＣ集塊／ｋｇ体重、または（ｉｖ）２×１０５個のＮＩ／ｋｇ体重で７日目にすべてｉ．ｐ．処置したＳＴＺ糖尿病マウスの群にて示される。＊：溶媒処置群に対してｐ＜０．０５.★：ＡＳＣ集塊処置群に対してｐ＜０．０５。１０Ｂ：（左）ＮＩ注射の２１週後のＮＩ処置した正常血糖値のマウスに由来する代表的な大網の蛍光画像（緑色、ｅＧＦＰ＋細胞）（縮尺棒＝２００μｍ）。（右）ＮＩの生着及び有意な内分泌再分化を示す、投与に先立ったＮＩに対して正規化した大網の遺伝子発現（平均値±標準誤差）。１０Ｃ：非糖尿病マウスに対して正規化した溶媒処置した糖尿病マウスに対比させたＡＳＣ集塊、ＩＣ集塊、及びＮＩで処置した糖尿病マウスの膵臓全体に由来するＩｎｓ１及びＩｎｓ２の発現プロファイル（平均値±標準誤差）。膵臓のインスリン遺伝子の発現レベルは高血糖の溶媒処置マウスのそれに対比させた処置群すべてにおいて同様に低下したので、ＮＩ処置マウスで見られた血中グルコースの制御は当然、大網ＮＩからのインスリン分泌によって達成されたことになる。
【図１１】図１０Ａ〜１０Ｃにてマウスを処置するのに使用されたＣ５７Ｂｌ／６のＩＣ集塊及びＡＳＣ集塊の形態及び生存性を示す図である。形成後、生存率のためにＰＩ（赤色）とＦＤＡ（緑色、方法を参照）で染色したＰ１のＩＣのみの集塊（左）及びＰ１のＡＳＣのみの集塊の蛍光画像。ｉ．ｐ．注射に先立ってＡＳＣのみ及びＩＣのみの集塊は＞９５％生存可能である。縮尺棒（赤色）＝１５０μｍ
【図１２】ＳＴＺで誘導した高血糖の３週間後、溶媒またはイヌの新膵島によりｉ．ｐ．で処置したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける血中グルコースのプロファイル及び用量設定試験を示す図である。溶媒処置（白棒）に比べて２×１０５個（黒棒）及び８×１０４個（斜線棒）の新膵島／ｋｇ体重の用量は、血中グルコースのレベルを長期にわたって低下させる。しかしながら、２×１０５個の新膵島／体重（「ｂｗ」）ｋｇの方が有効な用量である。
【図１３】イヌ新膵島の除去による正常血糖値の反転を示す図である。ＳＴＺ糖尿病のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのイヌ新膵島によるｉ．ｐ．処置（黒棒）は溶媒処置の動物（白棒）に比べて持続した正常血糖値を引き起こす一方で、そのような処置動物からのイヌ新膵島の除去は高血糖の再発を生じる。
【図１４】ｉ．ｐ．投与された同系及び異種のＮＩはＳＴＺ−糖尿病マウスの血中グルコースのレベルを正常化する。１４Ａ：２×１０５個の同系新膵島／ｋｇ体重（黒棒、ｎ＝６）または溶媒（白棒、ｎ＝６）によりｉ．ｐ．処置したＳＴＺ糖尿病Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの経時的な血中グルコースのレベル。１４Ｂ：２×１０５個のイヌ新膵島／ｋｇ体重（黒棒、ｎ＝５）または溶媒（白棒、ｎ＝５）により処置したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの経時的な血中グルコースのレベル。図１４Ａ及び１４Ｂ双方では、ＮＩ投与に先立って先ず０日目にＬｉｎｂｉｔによって血中グルコースのレベルを正常化した。いったんＬｉｎｂｉｔからのインスリンが枯渇すると（投与後３０〜４０日）、溶媒処置マウスは高血糖になる一方で、ＮＩ処置したマウス（同系及び異種）は正常血糖値のままであり、これはＮＩが長期間にわたって血中グルコースのレベルを制御することを示している。＊溶媒処置群に対してＰ＜０．０５。
【図１５】糖尿病の発症直後にイヌ新膵島または溶媒で処置した糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒの生存プロットを示す図である。２×１０５個（四角）及び８×１０４個（丸）の新膵島／ｋｇ体重の用量で処置した糖尿病動物は、溶媒処置動物（三角）、または驚くべきことに非糖尿病対照動物（菱形）よりも有意に長く生存する。
【図１６】新膵島処置したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの、腹腔内耐糖能試験（ＩＰＧＴＴ）及びイヌインスリンＥＬＩＳＡを示す図である。（上）：ＩＰＧＴＴの実験プロトコール。（下左）：溶媒処置ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（丸、ｎ＝３）に対比させた２×１０５個の新膵島／ｋｇ体重で処置したマウス（四角、ｎ＝５）のＩＰＧＴＴ。２×１０５個の新膵島／ｋｇ体重で処置したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスではＩＰＧＴＴは正常である一方で、溶媒処置した動物の血中グルコースのレベルは有意に高いままである。（下右）：耐糖能試験の間に採取されていた溶媒（左の棒、ｎ＝３）及びイヌ新膵島で処置した（中央、斜線棒、ｎ＝５）ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに由来する血清、ならびに非糖尿病Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（中央、黒棒、ｎ＝２、ＥＬＩＳＡ特異性について陰性対照）及び健常なイヌ（白棒、ＥＬＩＳＡ特異性について陽性対照）に由来する血清の２つ組試料で行われたイヌ特異的なインスリンＥＬＩＳＡ。溶媒処置マウスではなく、イヌ新膵島処置したマウスで血中グルコースの上昇にはイヌインスリンの放出が伴い、イヌ新膵島からのインスリンの放出は正常なＩＰＧＴＴに関与することを示している。
【図１７】ＮＩ処置したＮＯＤマウスにて膵島炎が残ることを示す図である。持続する高悪性度の膵島炎の存在を示す処置１１週後の正常血糖値のＮＩ処置したＮＯＤマウスに由来するヘマトキシリンエオシン染色した膵臓切片の代表的な画像（４０×）。縮尺棒（白色）＝２００μｍ
【図１８】ＮＯＤマウスにおけるＮＩの生着、生存及びインスリンの発現を示す図である。１８Ａ：ＤｉＲ標識したｅＧＦＰ＋ＮＩによって１０週間前に処置したＮＯＤマウスの蛍光生体内画像は上腹部にその位置を示す。１８Ｂ：ｉ．ｐ．で投与したｅＧＦＰ＋Ｃ５７Ｂｌ／６マウスのＮＩは大網にて生着したままであり、処置後１１週目で自然発症糖尿病ＮＯＤマウスにて正常血糖値を維持した（図９を参照）。（左の画像）（１０×）：Ｃ５７Ｂｌ／６ｅＧＦＰ＋ＮＩで処置したＮＯＤマウスの代表的な大網（緑色、赤い矢印を参照のこと）。この画像はＮＩが大網にホーミングし、そこで生着することを実証し、ＮＩの拒絶がないことを示している。（右の画像）（１０×）：単一の生着したＮＩの拡大画像。毛細血管（黄色の矢印）に近いその位置を示す。１８Ｃ：（左のパネル）：主要画像：ＤＮＡ（Ｄａｐｉ、青色）及びインスリンタンパク質（赤色）について免疫組織化学法によって染色した図１８Ｂで示した大網の切片（１０×画像）。インスリンタンパク質が明瞭に検出された。挿入画像：一次の抗インスリン抗体を省略した陰性対照。（右のパネル）：主要画像：ＤＮＡ（青色）及びインスリンタンパク質（赤色）について染色した溶媒処置の糖尿病ＮＯＤマウスの大網の切片（１０×）。挿入画像：同じ切片の４０×拡大（縮尺棒＝１０μｍ）。どちらの拡大もインスリンは検出されなかった。これらの画像は、生着したＮＩによる大網の位置及びインスリンの合成を明らかにしている。縮尺棒＝指示されない限り１００μｍ。
【図１９】イヌ新膵島で処置したＳＴＺ−糖尿病のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの血中グルコースのレベルを示す図である。動物は糖尿病の発症の３ヵ月後に新膵島処置し、長期で経過観察した。確立した糖尿病を伴う動物はイヌ新膵島（黒棒）による処置に続いて正常血糖を示す一方で、溶媒処置したもの（白棒）はほぼ３６日目にＬｉｎｂｉｔによるインスリンの放出が失効したのち高血糖のままである。これは、新膵島がずっと以前に発症した糖尿病にて正常血糖値を確立するのに有効であることを実証している。
【図２０】同種新膵島で処置した自己免疫性ＴＩＤＭのＮＯＤマウスの血中グルコースのレベルを示す図である。自然発症糖尿病のメスＮＯＤマウスを徐放性インスリンペレット（Ｌｉｎｂｉｔ、ｓ．ｃ．）によって処置して高血糖を制御した。Ｌｉｎｂｉｔ療法後２０日目にＣ５７Ｂｌ／６マウスに由来する同種新膵島（Ｐ２膵島細胞とＰ５のｇｆｐ＋ＭＳＣから生成した；ｎ＝５、黒棒）または溶媒（ｎ＝３、白棒）によってマウスを処置した。これらのデータは同種免疫及び自己免疫の攻撃の双方に対する新膵島が誘導する免疫隔離の結果、正常血糖値が維持されることを実証している。
【図２１】新膵島は非糖尿病マウスにて低血糖を誘導しないことを示す図である。（上のパネル）：Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに由来する２×１０５個の新膵島／ｋｇ体重を非糖尿病のＣ５７Ｂｌ／６マウスにｉ．ｐ．で投与した。処置した動物を１２週目まで経過観察した。血中グルコースのレベルを毎週評価した。どの時点でも低血糖が観察されなかったということは、マウス新膵島による生理的なインスリンの放出を実証している。新膵島は生着したままであり、拒絶されなかった。（下のパネル）：（ａ）２×１０５個の新しく形成されたＤｉＲ標識したイヌ新膵島（Ｐ２のイヌ膵島細胞＋Ｐ４のイヌＡＳＣ、灰色の線、ｎ＝６）または（ｂ）０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２（対照、黒線、ｎ＝３）のいずれかでｉ．ｐ．処置したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの血中グルコースのレベル。新膵島は生着したままである（図１８Ａを参照のこと）。どの時点でも低血糖は観察されなかった。これらのデータはさらに、イヌ新膵島による生理的なインスリンの放出を実証している。
【図２２−１】同種新膵島に含有されるＭＳＣも培養膵島細胞も抗体形成を誘導しないことを示す図である。すべてのパネルで、細胞を対照マウスまたは処置マウスに由来する血清と共にインキュベートし、次いでフィコエリスリン（ＰＥ）標識した抗マウスＩｇＧと共にインキュベートし、次いでＦＡＣＳによって解析した。パネルＡ及びＢでは、血清は、処置後１２週での新膵島処置によって正常血糖値にしたＮＯＤマウスまたは溶媒処置、未処置の対照ＮＯＤマウスから採取した。２２Ａ：新膵島に由来するＣ５７Ｂｌ／６Ｇｆｐ＋ＭＳＣのＦＡＣＳ解析。上の列はアイソタイプ抗体（陰性対照、上左）で染色したＭＳＣのヒストグラムを示し、ＭＳＣは未処置のＮＯＤマウスに由来する血清と共にインキュベートした（中央と右）。下の列は同種新膵島で処置した（左３つのパネル）または溶媒で処置した（右のパネル）ＮＯＤマウスに由来する血清と共にインキュベートしたＭＳＣのＦＡＣＳヒストグラムを示す。同種ＭＳＣに対する抗体反応の証拠はない。２２Ｂ：新膵島に由来するＣ５７Ｂｌ／６の培養した膵島細胞のＦＡＣＳ解析。上の列はアイソタイプ抗体（陰性対照、上左）で染色した膵島細胞のヒストグラムを示し、膵島細胞は未処置のＮＯＤマウスに由来する血清と共にインキュベートした（中央と右）。下の列は同種新膵島で処置した（左３つのパネル）または溶媒で処置した（右のパネル）ＮＯＤマウスに由来する血清と共にインキュベートした膵島細胞のＦＡＣＳヒストグラムを示す。これらのデータは同種の培養した膵島細胞に対する抗体反応がないことを実証している。
【図２２−２】２２Ｃ：陽性対照。（上のヒストグラム）：溶媒処置後１４日目で採取したＮＯＤマウス血清と共にインキュベートし、その後、ＰＥ標識した抗マウスＩｇＧ共にインキュベートしたイヌＡＳＣ。（下のヒストグラム）：イヌＡＳＣでｉ．ｐ．処置した１４日後に採取したＮＯＤマウス血清と共にインキュベートし、その後、ＰＥ標識した抗マウスＩｇＧ共にインキュベートしたイヌＡＳＣ。これらのデータは、ＮＯＤマウスが異種細胞に対して強力な免疫応答を開始しないことを実証している。
【図２３】ＮＯＤマウスが処置されるＮＩ（ＭＳＣ及びＩＣ）を生成するのに使用される細胞に対するＩｇＧの応答を示す図である。示されるのは、血清及びｃｙ３標識した抗マウスＩｇＧ抗体と共にインキュベートしたＰ１のＣ５７Ｂｌ／６のＭＳＣ及びＰ５のＣ５７Ｂｌ／６の培養したＩＣについてのＦＡＣＳ解析の要約である。血清は、図２で示した実験における溶媒処置及びＮＩ処置のＮＯＤマウスに由来した。血清は屠殺時に採取した（７７日目）。陽性対照として、膵島のｉ．ｐ．投与の１４日後にインタクトのＣ５７Ｂｌ／６（同種）膵島で処置したＮＯＤマウスからも血清を採取し、上記のようにＦＡＣＳによって評価した。Ｃｙ３＋：血清とのインキュベートの際に検出されたＣｙ３＋細胞の百分率（平均値±標準誤差）。７％未満の応答は陰性であると見なされた。（ｉ）ＮＯＤマウスは正常血糖のままであった（図２を参照）及び（ｉｉ）ＦＡＣＳデータはさもなければ免疫能力のあるＮＯＤマウスにおけるこれらの細胞に対してＩｇＧの応答を示さないので、抗体が介在するＮＩの拒絶はありそうにないと思われる。＊他の処置に対してｐ＜０．０５。
【図２４】ｉ．ｐ．投与の１４日後のＮＩ処置した（Ｎ＝３）ＮＯＤマウスに対比させた膵島処置した（Ｎ＝３）ＮＯＤマウスの脾臓由来のヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞及び調節性Ｔ細胞（ａ〜ｄ）及び大網（ｅ）の百分率を示す図である。（ａ）及び（ｂ）については示されるのは、（ａ）ＣＤ４＋または（ｂ）ＣＤ８＋でもあるＣＤ３＋細胞の百分率である。（ｃ）及び（ｄ）については示されるのは（ｃ）ＣＤ２５＋または（ｄ）ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋でもあったＣＤ４＋細胞の百分率である。ヘルパーＴ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞の比率は膵島処置したマウスよりもＮＩ処置したマウスで低い一方で調節性Ｔ細胞の比率が有意に増え、ＮＩは部分的に免疫調節を介してＮＯＤマウスにて正常血糖を回復するのに役立ったことを示唆している（図２を参照のこと）。（ｅ）ＮＩ処置したＮＯＤマウスの大網におけるＦｏｘｐ３陽性細胞の百分率は膵島処置した動物に比べて顕著に増加した。大網をＦｏｘｐ３について染色し、補完情報に記載されているように陽性細胞の百分率を計数した。＊膵島処置群に対してｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
開示される方法、細胞及び新膵島は、単一の膵臓ドナーから単離された及び培養された膵島細胞の十分な治療用量を生成する限定された能力を克服し、それを必要とする対象にそれらを提供する。
【００１１】
本明細書で使用されるとき、膵島は、アルファ細胞、ベータ細胞、デルタ細胞、ガンマ細胞及びイプシロン細胞を含むが、これらに限定されない、哺乳類膵臓の膵島にて見いだされる細胞のいずれかを含んでもよい。一実施形態では、膵島は少なくともインスリンを発現するベータ細胞を含む。
【００１２】
本明細書で使用されるとき、新膵島は、骨髄由来の間葉幹細胞及び／または脂肪由来の幹細胞と、脱分化した膵島細胞、及び／または再分化した膵島細胞とを含む。再分化した膵島はアルファ細胞、ベータ細胞、デルタ細胞、ガンマ細胞及びイプシロン細胞を含むが、これらに限定されない、哺乳類膵臓の膵島にて見いだされる細胞のいずれかを含んでもよい。従って、本明細書の膵島は好ましくは、とりわけ、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓十二指腸ホメオボックス−１、インスリン転写因子ｍａｆＡ、ｎｋ６ホメオボックス−１等（たとえば、図８Ａ〜８Ｃを参照のこと）を産生し、それらはグルコースを上手く調節するのに役立つ可能性があるので、本明細書で達成される驚くべき良好な結果を説明する。一実施形態では、新膵島は少なくともインスリンを発現するベータ細胞を含む。
【００１３】
実施形態には、膵臓膵島に近似するサイズである試験管内で生成された新膵島が含まれる。そのような新膵島は、骨髄由来の間葉幹細胞（ＭＳＣ）及び／または脂肪由来の幹細胞（ＡＳＣ）、脱分化した膵島細胞（インスリンを発現しない）及び／または再分化した膵島細胞を含んでもよい。上皮間葉転換（ＥＭＴ）を介して脱分化している培養で増やした膵島細胞を次いでＭＳＣ及び／またはＡＳＣと共に新膵島細胞集塊に凝集させ、それは自然に再分化し、対象に投与されると調節されたインスリン分泌を再開する。あらゆる臓器と同様に膵島は、本質的に周皮細胞として強力な抗炎症性作用、複合免疫防御作用、生存及び組織修復を支える作用を発揮する少数のＭＳＣ及び／またはＡＳＣを持つ。脱分化した細胞を含有する新膵島は再分化を起こすように処理されてもよく、再分化はインスリンを発現する再分化した膵島細胞を含む新膵島を生じる。培養で増やした膵島細胞とはるかに多数の健常なＭＳＣ及び／またはＡＳＣで構成される新膵島の試験管内での創製は、ＭＳＣ及び／またはＡＳＣの多面的作用が介在して、これらの新膵島が、たとえば、１型糖尿病、２型糖尿病、及び他の型のインスリン依存性糖尿病または損傷した耐糖能のような損傷した血糖管理を伴う対象に投与されると、炎症、免疫及び他の損傷に耐えるのを可能にする。
【００１４】
新膵島のＭＳＣ／ＡＳＣの成分は、膵島由来成分（脱分化した膵島細胞または再分化した膵島細胞）の免疫隔離、防御及び高い生存を提供し、それによって新膵島の拒絶を防ぎ、生着を高める。新膵島における正常なＭＳＣ及び／またはＡＳＣの強力な免疫調節活性の増幅は膵島細胞の自己免疫隔離及び同種免疫隔離を提供し、それによって拒絶反応抑制剤または被包手段の必要性を排除する。さらに、新膵島のＭＳＣ／ＡＳＣ成分は肝細胞増殖因子及び他の因子の放出を介して上皮間葉転換の反転を誘導し得るので、脱分化した膵島細胞のインスリン産生細胞への生体内での再分化を促す。
【００１５】
膵島細胞を免疫隔離するためには、膵島細胞をＡＳＣまたはＭＳＣと融合させることよりもＡＳＣまたはＭＳＣと共に脱分化した／再分化した膵島細胞の新膵島を作り出すことの方が一般に効率的である。細胞を融合することは有効であるが、それは高度に非効率的であり、細胞の約３０％のみしか融合せず、大半の細胞は精製過程で失われる。さらに、異なる細胞型の融合は悪性腫瘍の発生と関連しているので、融合した細胞は治療用途には安全ではない可能性がある２。
【００１６】
さらなる実施形態では、新膵島は腹腔内（ｉ．ｐ．）に投与される。哺乳類の大網の異物及び種々の細胞型を取り込む能力は新膵島の耐久性があり且つ自発的な生着を促し、ついで、それは対象に生理的に、すなわち、肝臓の門脈にインスリンを送達し、さらに、優れた腹膜のグルコース感知によって皮下空間のそれに最適化される（参照によって本明細書に組み入れられるＤ．Ｒ．Ｂｕｒｎｅｔｔ，Ｌ．Ｍ．Ｈｕｙｅｔｔ，Ｈ．Ｃ．Ｚｉｓｓｅｒ，Ｆ．Ｊ．Ｄｏｙｌｅ，及びＢ．Ｄ．Ｍｅｎｓｈ，“Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｓｐａｃｅ  ｏｆｆｅｒｓ  ｆａｓｔｅｒ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｔｈａｎ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｓｐａｃｅ，”Ｄｉａｂｅｔｅｓ，６３：２４９８―５０５，（２０１４）を参照のこと）。インスリン送達の生理的な経路は、インスリン抵抗性、インスリンが高める脂肪生成、及び高濃度のインスリンへの末梢組織の潜在的に有害な曝露を減らし得る。これらの理由で、大網は新膵島の移植に独特に適しており、加えて、必要性が生じれば、大網切除（大網の一部または全部の外科的除去）を介して新膵島を対象から取り出すことができる。
【００１７】
さらなる実施形態では、新膵島の早すぎる拒絶の証拠があるのであれば、ラパマイシンによる短い初回治療単位を対象に投与して新膵島の生存及び機能を改善するであろう。この治療法のレシピエントが大網を欠いているまたは損傷した大網を有するのであれば、門脈内移植または好適な被包手段が利用されることになる。
【００１８】
開示されている方法には新膵島の生成の方法が含まれた。
【００１９】
そのような方法の非限定例の１つは、以下を含む：
（ａ）試験管内で膵島細胞を脱分化させること、
（ｂ）脱分化した膵島細胞を間葉幹細胞及び／または脂肪由来の幹細胞との培養に入れること、及び
（ｃ）脱分化した膵島細胞と間葉幹細胞及び／または脂肪由来の幹細胞との新膵島を形成すること。
【００２０】
脱分化した膵島細胞は新膵島を形成するのに先立って増殖させてもよい。
【００２１】
そのような方法の追加の例は、以下を含む：
（ａ）試験管内で膵島細胞を脱分化させること、
（ｂ）脱分化した膵島細胞を間葉幹細胞及び／または脂肪由来の幹細胞との培養に入れること、
（ｃ）脱分化した膵島細胞と間葉幹細胞及び／または脂肪由来の幹細胞との新膵島を形成すること、及び
（ｄ）生体内で新膵島における膵島細胞を再分化させること。
【００２２】
脱分化した膵島細胞は新膵島を形成する幹細胞との培養の前に増殖させてもよい。
【００２３】
そのような方法のさらに別の例は、以下を含む：
（ａ）試験管内で膵島細胞を脱分化させること、
（ｂ）脱分化した膵島細胞を間葉幹細胞及び／または脂肪由来の幹細胞との培養に入れること、
（ｃ）脱分化した膵島細胞と間葉幹細胞及び／または脂肪由来の幹細胞との新膵島を形成すること、及び
（ｄ）試験管内で新膵島における膵島細胞を再分化させることとを含む。
【００２４】
脱分化した膵島細胞は新膵島を形成する幹細胞との培養の前に増殖させてもよい。
【００２５】
そのような方法の別の例は、以下を含む：
（ａ）試験管内で膵島細胞を脱分化させること、
（ｂ）試験管内で膵島細胞を再分化させること、
（ｃ）再分化した膵島細胞を間葉幹細胞及び／または脂肪由来の幹細胞との培養に入れること、及び
（ｄ）再分化した膵島細胞と間葉幹細胞及び／または脂肪由来の幹細胞との新膵島を形成すること。
【００２６】
脱分化した膵島細胞は再分化に先立って増殖させてもよい。
【００２７】
方法の上記例のそれぞれでは、新膵島はヒドロゲルでコーティングされてもよい。そのようなコーティングは、新膵島が形成されるステップの後で、または新膵島を対象に注入するもしくは提供するのに先立って行われてもよい。
【００２８】
方法の上記例のそれぞれでは、新膵島は被包手段の中に含有されてもよい。そのような被包は新膵島が形成されるステップの後で、または新膵島を対象に注入するもしくは提供するのに先立って行われてもよい。
【００２９】
種々の実施形態では、新膵島は免疫特権が与えられてもよい。本明細書で使用されるとき、「免疫特権を与えられた」は、免疫特権を与えられていない細胞または新膵島よりも強力ではない免疫応答を引き出す本明細書に記載されている新膵島を指す。種々の実施形態では、「免疫特権を与えられた」細胞または新膵島に対する免疫応答は、免疫特権を与えられていない細胞または新膵島に対する免疫応答よりも０、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５％または１００％以下であり得る。
【００３０】
分化した膵島細胞は、たとえば、インスリンを発現するが、試験管内では増殖しないまたは最少限しか増殖しない。単離された膵島細胞は試験管内で脱分化するように誘導されてもよい。本明細書で使用されるとき、「脱分化した」膵島細胞または膵島細胞核は、グルコースで負荷をかけられた場合、もはやインスリンを発現しない、または産生しない細胞または核である。脱分化の過程は本明細書では上皮間葉転換または「ＥからＭへの」転換とも呼ばれる。脱分化した膵島細胞は分化した膵島細胞よりも優れた比率で培養にて増殖し得る。膵島細胞の脱分化はこれらの細胞におけるインスリンの発現、インスリンの合成、インスリンの保存、及び／またはグルコースが誘導するインスリンの分泌を直ちに減らすまたは停止させる。単離された膵島細胞は好適な宿主（たとえば、齧歯類、イヌ、ヒト、または他の哺乳類）に由来してもよい。
【００３１】
脱分化した膵島細胞は試験管内で増殖させて、他の細胞型と共培養されてもよい大きなプールの細胞を形成してもよい。
【００３２】
増殖に関連する脱分化は膵島細胞にとって接着性である条件にて膵島細胞を培養することによって達成されてもよい。種々の実施形態では、膵島細胞は、ラミニン５１１またはラミニン４１１によってコーティングされているまたはコーティングされていない表面上で培養されてもよい。脱分化は任意で脱分化培地で行われてもよい。脱分化培地にはグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）受容体アゴニストが含まれてもよい。具体的な実施形態では、ＧＬＰ−１受容体アゴニストはＧＬＰ−１、エキセナチド、リラグルチド、リキシセナチド、アルビグルチド、タスポグルチド及び／またはエキセンジン−４であってもよい。ＧＬＰ−１受容体アゴニストは脱分化培養培地にて０．１〜１００ｎＭ、１〜５０ｎＭまたは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｎＭの濃度で存在してもよい。
【００３３】
ラミニン（たとえば、ラミニン４１１及び５１１）上で単離された膵島及び／または膵島細胞を培養すること、及び好適な培地の添加は、培養における細胞の接着を改善し、細胞の生存を支え、増殖を適度に増やし得る。脱分化のために、膵島細胞は付着を可能にする好適な基材上に置かれてもよい。具体的な実施形態では、基材はラミニン４１１及び／またはラミニン５１１を含んでもよい。さらに具体的な実施形態では、β細胞は、ラミニン４１１及び／またはラミニン５１１でコーティングされた組織培養用のフラスコまたはウェルに入れられてもよく、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、アルファＭＥＭ、ＣＭＲＬ、ＰＩＭまたは他の好適な培養培地に入れられてもよく、１０％〜２０％のウシ胎児血清または他の種特異的な血清または血小板溶解物、及びグルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシンで補完されてもよい。培養培地はまた少なくとも１０ｎＭのエキセンジン−４で補完されてもよい。
【００３４】
新膵島が培養されてもよい血清の例には、ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍから利用可能な血清が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な非限定例には、ウシ胎児血清、仔ウシ血清、成熟ウシ血清、ニワトリ血清、ヤギ血清、ブタ血清、ウサギ血清、ヒツジ血清、ウマ血清、イヌ血清、ヒヒ血清、コヨーテ血清、ガチョウ血清、マウス血清、ラット血清、アカゲザル血清、血清代替物、及びヒト血清が挙げられる。
【００３５】
ＭＳＣ及びＡＳＣは良好に増殖し、且つインスリンを産生しない未分化の成人幹細胞である。
【００３６】
脱分化した膵島細胞は良好に増殖するが、インスリンを発現または分泌することはなく、またはインスリンを最少限にしか発現または分泌しない。一部の実施形態では、脱分化した膵島細胞を増殖させてその後の操作のために十分な数を生成する。ある特定の実施形態では、いったん十分な脱分化した膵島細胞が生成されると、膵島細胞またはβ細胞に特異的な再分化培地で細胞を処理する。膵島細胞の再分化はインスリンの産生を回復し、生理的なインスリンの発現、合成、貯蔵及びグルコース感受性のインスリン放出の再発現を生じる。
【００３７】
記載されているのは、再分化した膵島細胞を生成する脱分化した膵島細胞の再分化である。再分化は、本明細書で使用されるとき、生理的なインスリンの発現、合成、貯蔵及びグルコース感受性のインスリン放出の回復した発現を有する再分化した膵島細胞を生成するための脱分化した膵島細胞の処理を指す。ある特定の実施形態では、再分化は２ステップの過程であってもよい。
【００３８】
第１のステップでは、低レベルのグルコースを含有する培養培地に脱分化した膵島細胞を曝露してもよい。低レベルのグルコースは、１、２、３、４、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、及び６ｍＭのＤ−グルコースから選択されてもよい。培地は、たとえば、インスリン／トランスフェリン／セレニウム（ＩＴＳ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、イヌ血清またはヒト血小板溶解物のような他の成分を含有してもよい。第１ステップは、低レベルのグルコースを含有する培養培地にて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１〜１４、２〜１３、３〜１２、４〜１０、または５〜９日間、脱分化した膵島細胞を培養することを含んでもよい。
【００３９】
第２のステップでは、高レベルのグルコースを含有する培養培地に脱分化した膵島細胞を曝露してもよい。高レベルのグルコースは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、及び３５ｍＭのＤ−グルコースから選択されてもよい。培地は、たとえば、インスリン／トランスフェリン／セレニウム（ＩＴＳ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、イヌ血清またはヒト血小板溶解物、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント、ニコチンアミド、アクチビンＡ、Ａｌｋ−５阻害剤ＩＩ、トリヨードサイロニン及びグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体アゴニストのような他の成分を含有してもよい。ニコチンアミドは、０．１〜１００ｍＭ、１〜５０ｍＭ、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｍＭの濃度で培養培地に存在してもよい。アクチビンＡは、０．１〜１００ｍＭ、１〜５０ｍＭ、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｍＭの濃度で培養培地に存在してもよい。ＧＬＰ−１受容体アゴニストは、０．１〜１００ｍＭ、１〜５０ｍＭ、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｍＭの濃度で培養培地に存在してもよい。Ａｌｋ−５阻害剤ＩＩは、０．１〜１００ｍＭ、１〜５０ｍＭ、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｍＭの濃度で培養培地に存在してもよい。トリヨードサイロニンは、０．１〜１００ｍＭの濃度で培養培地に存在してもよい。ＧＬＰ−１受容体アゴニストはエキセンジン−４であってもよい。第２のステップは、高レベルのグルコースを含有する培養培地にて、脱分化した膵島細胞を１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、１０〜２８、１１〜２７、１２〜２６、１３〜２５、または１４〜２９日間培養することを含んでもよい。
【００４０】
一部の実施形態では、その後の増殖しているＭＳＣまたはＡＳＣとの培養のために出発物質（脱分化した膵島細胞）の量での実質的な増大を介してインスリン産生細胞を生成するための方法が提供される。
【００４１】
本明細書に記載されているような新膵島の形成のための方法が開示される。そのような新膵島は近似的に膵臓で見いだされる膵島のサイズであってもよい。新膵島は、たとえば、当該技術で既知の方法によって形成されてもよい。非限定例では、新膵島は、疎水性の超低接着性の表面上での細胞の培養によって形成される。
【００４２】
疎水性及び／または超低接着性の表面の例には、未処理のポリスチレン、低付着性のヒドロゲル層、及び非荷電表面が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
記載されているのはまた、記載されている新膵島を用いて、インスリンを必要とする対象及び／または１型糖尿病（「Ｔ１ＤＭ」）または２型型糖尿病（「Ｔ２ＤＭ」）を患っているまたは損傷した耐糖能または前糖尿病を患っている対象を治療する方法である。一部の実施形態では、新膵島は腹腔内に（ｉ．ｐ．）及び／または対象の大網に投与される。ある特定の実施形態では、新膵島はｓ．ｃ．で、ｉ．ｖ．で、またはさもなければ、非経口で対象に投与される。ある特定の実施形態では、新膵島の対象への投与はインスリンの産生、分泌及びグルコース応答性を高める及び／または回復する。ある特定の実施形態では、投与に先立って、ヒドロゲルまたはたとえば、ゲルフォームもしくはトロンビン凝固体のような他のＦＤＡが認可した物質で新膵島をコーティングして生体内での新膵島の生存をさらに向上させてもよい。新膵島が脱分化した膵島細胞を含有する実施形態では、新膵島のよる対象の治療の後これらの細胞は対象にて再分化を受けてもよい。
【００４４】
新膵島で対象を治療する方法は、Ｔ１ＤＭ、Ｔ２ＤＭまたは損傷した耐糖能を患っている対象に十分な用量の新膵島を提供してインスリンの産生、分泌及びグルコース応答性を高める及び／または回復することを含む。この用量は、投与の経路、治療される対象における病状の程度、及び治療法に対する対象の応答に応じて変化することが当業者によって理解される、たとえば、動物モデルにてｉ．ｐ．投与される新膵島の用量を考察する以下の実施例５を参照のこと。ある特定の実施形態では、治療法に対する最初の応答に応じて新膵島のその後の用量が対象に投与され得る。
【００４５】
本明細書に記載されている方法の高い効率（すなわち、生細胞の非常に少ない損失）は現在従来型の治療と比べて単一の膵臓から得ることができる数で有意な増加を提供する。たとえば、イヌの膵臓から得ることができる膵島の平均数に基づいて、最初の継代まで膵島細胞を増殖させることは、平均で、１０ｋｇのイヌのための７７４回用量の新膵島を生成する能力を生じる。膵島細胞を２回目の継代まで増殖させると、平均で、１０ｋｇのイヌのための１，５５０回治療用量の新膵島を生成する能力を生じる。これらの数をヒトの治療のための基準として使用すると、ヒトの膵臓当たり、７０ｋｇのヒトについて１，０００〜２，０００回用量の新膵島を得ることができると推定される。対照的に、現在のヒトでの膵島移植は単回ヒト用量に対してほぼ４つの膵臓を必要とする。さらに、インスリン非依存性を達成するには反復投与を必要とすることが多い。
【００４６】
「治療すること」または「治療」は完全な治癒を必要としない。それは、基礎疾患の症状が少なくとも軽減されること、及び／または症状を引き起こす基礎的な細胞性の、生理的なまたは生化学的な原因またはメカニズムの１以上が軽減される及び／または排除されることを意味する。インスリン必要量が低減され得る。末端器官の損傷が軽減され得る。拒絶反応抑制剤の必要性が低減され、または排除され得る。低減されるは、本文脈で使用されるとき、疾患の生理的な状態だけでなく、疾患の分子的状態を含む疾患の状態に対して相対的であることを意味することが理解される。
【００４７】
インスリン及び／または経口血糖降下剤（または薬）の投与によって治療（特に早期段階での）が支援されてもよい。そのような薬剤には、ビグアニド（たとえば、メトフォルミン）、スルホニル尿素（たとえば、グリメピリド、グリブリド、またはグリピジド）、メグリチニド（たとえば、レパグリニド）、ジフェニルアラニン誘導体（たとえば、ナテグリニド）、チアゾリジンジオン（たとえば、ピオグリタゾン）、ＤＰＰ−４阻害剤（たとえば、シタグリプチン、サキサグリプチン、リナグリプチン）、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤（たとえば、アカルボースまたはミグリトール）、胆汁酸捕捉剤（たとえば、コレセベラム）、等が挙げられる。そのような薬剤、補助薬及び／または中間治療（複数可）の投与量及び投与は当業者によって及び治療される対象に応じて容易に決定され、ここで繰り返される必要はない。
【００４８】
記載されているのはまた、投与前の新膵島の生存を確保し、さらに投与後生体内で新膵島の生存を高めながら、治療される対象から遠く離れて新膵島の調製を可能にする当該技術で既知の新膵島の調製及び包装の方法である。たとえば、種々のインプラントが当業者に周知である。被包及びマイクロ被包の手段及び方法も周知である。
【００４９】
包装は、対象または医療施術者への送達のための、たとえば、注射器、無菌バッグ、点滴バッグ、ビン等への新鮮なまたは凍結した新膵島の包装のような当該技術で既知の手段によって達成されてもよい。プラズマライトＡ、ｐＨ７．４は新膵島を包装するのに極めて有用である。
【００５０】
齧歯類及びイヌのモデルを含む動物モデルの使用は、ヒト糖尿病のための治療を開発することにおいて有用なツールを提供することが当業者によって十分に理解されている（Ａｉｌｅｅｎ，Ｊ．Ｆ．Ｋｉｎｇ，“Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，”Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２０１２  Ｊｕｎ；１６６（３）：８７７―８９４）。実際、Ｋｉｎｇが指摘するように、本明細書で開示されているようにヒト糖尿病の多様性をさらに良好に表すには１を超える動物モデルを提供することが理想的である。提供される記載は、当業者が過度の実験を行うことなく、ヒトにてＴ１ＤＭ、Ｔ２ＤＭ及び損傷した耐糖能を治療するための新膵島を作製し、使用するのを可能にする。
【００５１】
一部の実施形態では、対象は、哺乳類、たとえば、齧歯類、イヌ、ネコ、ウマまたはヒトであってもよい。さらなる実施形態では、新膵島における細胞は、対象または新膵島における他の細胞に関して同種細胞、異種細胞または同種と異種の細胞の組み合わせであってもよい。
【００５２】
本明細書で使用されるとき、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」（含む）」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」（含有する）」、「ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ」（によって特徴づけられる）」及びそれらの文法的同等物は、追加の、引用されていない要素または方法ステップを排除しないが、さらに拘束的な用語「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（からなる）」及び「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（から実質的になる）」も含む包括的な用語または非限定的な用語である。
【実施例】
【００５３】
以下の実施例は説明目的のみのために提供され、本明細書で具体的に開示されている実施形態に本開示を限定するとして解釈されるべきではない。
【００５４】
すべての組織と同様に膵島は、免疫調節、抗炎症及び他の保護的栄養効果を局所で発揮する周皮細胞としての少数の間葉幹細胞を持つので３〜９、我々は仮説を立て、大幅により多数のＭＳＣ／ＡＳＣと共に内分泌膵島細胞を含む新膵島（ＮＩ）を形成することができるかどうか、及びそのような新膵島が、有効な（ｉ）被包手段なしでの自己免疫−隔離、（ｉｉ）生体内での、同種新膵島の生存利益で、それによって拒絶反応抑制剤の必要性を減らすまたは排除すること、（ｉｉｉ）膵島細胞の生体内での再分化、及びそれによる（ｉｖ）適正で且つ生理的なインスリン分泌及びＴ１ＤＭ齧歯類での正常血糖値の長持ちする維持を提供するかどうかを調べた。
【００５５】
骨髄由来の間葉幹細胞（ＭＳＣ）または脂肪組織由来の脂肪幹細胞（ＡＳＣ）の固有で十分に裏付けられた多面的で且つ大部分同等の作用は、膵島サイズの細胞集塊または新膵島（ＮＩ）にて等しい数の膵島細胞と組み合わせると、同種免疫や自己免疫の攻撃及び炎症性の損傷から投与されたβ細胞を遮蔽し、且つβ細胞の生存を高め、血管生成を誘導するように利用される。生理的には、膵島における総細胞数の約２％のみが微細血管環境で周皮細胞様の細胞として位置づけられるＭＳＣを表すと考えられている。膵島内でのそれらの細胞防御機能は、骨髄及び他の臓器におけるそれら、すなわち、血管の保護及び安定化、抗炎症性、栄養性及び免疫調節性の活性に匹敵すると思われる。ほぼ膵島サイズのそのようなＮＩを、上皮間葉転換（ＥＭＴ）と付随する脱分化とを介して、培養で増殖させたＣ５７Ｂｌ／６の膵島細胞と骨髄由来のＭＳＣから試験管内で生成した。それぞれ約５００の膵島細胞と約５００のＭＳＣで構成される５×１０３個のＮＩを大部分ヒトのＴ１ＤＭに類似するＴ１ＤＭの自己免疫形態を発症する自然発症糖尿病である免疫能力のあるＮＯＤマウスの腹腔内（ｉ．ｐ．）に投与した。この同種処置プロトコールは、膵臓または膵島の移植のレシピエントにおける最も共通する臨床的な状況をモデル化するので選択された。拒絶反応抑制剤または被包手段を使用しないことによって我々は、ＮＩにおける多数のＭＳＣが、膵島細胞が生存し、正常に機能する内分泌細胞に再分化し、それによって自己免疫Ｔ１ＤＭのＮＯＤマウスにて長持ちする血糖管理を確立するのを可能にすることを綿密に調べた。ＮＩ処置した糖尿病ＮＯＤマウスは正常に育った一方で、溶媒で処置した糖尿病ＮＯＤマウスは高血糖のままであり、死に始めた。これらの最初のデータは、ＮＩが生存し、生着し、生体内で機能的な内分泌細胞に再分化すること、及び同種免疫及び自己免疫の防御が達成されることを意味した。重要なことに、ｉ．ｐ．投与に続いて、ＮＩは、大網によって取り込まれ、長期に生着し、生理的にインスリンを産生する細胞に再分化した。ＮＯＤマウスは、ＮＩを形成するのに使用されるＭＳＣ及び膵島細胞に対する液性の同種免疫応答を開始しなかった。ＮＩ処置した糖尿病動物は、膵島で処置した動物に比べてその大網及び脾臓にて調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の数で有意な増加を示した。ＮＩを非糖尿病動物に注射した場合、それらもまた低血糖を引き起こすことなく大網にて生着し、生存し、これは調節されたインスリン分泌をさらに実証している。大網からのインスリンの分泌は膵臓からの分泌のように肝臓の門脈系に発生し、それは生理的であり、送達されたインスリンの約５０％の不活化を生じる。これは、筋肉、脂肪組織、脈管構造及び他の臓器の肝臓後曝露を超生理的な潜在的に低血糖を誘導するインスリンレベル及びさもなければ、インスリンを皮下で与える場合に生成される有害なインスリンレベルを制限する。ストレプトゾシン（ＳＴＺ）糖尿病マウスをＭＳＣまたは膵島細胞のみのいずれかで構成された同様のサイズの細胞集塊で処置した場合、ＮＩ処置した正常血糖値の動物に比べた血中グルコースのレベルは溶媒処置対照に比べて最少限に低下したにすぎなかった。このことは、ＮＩの治療有効性はＭＣＳと膵島細胞の協調に決定的に依存することを明瞭に実証した。最後に、ＳＴＺ糖尿病のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスをイヌのＮＩ（ｃＮＩ）による同一プロトコールでｉ．ｐ．処置した場合、正常血糖値が迅速に及び永続的に誘導され、腹腔内の耐糖能試験（ＩＰ  ＧＴＴ）は正常化された。重要なことに、ＩＰ  ＧＴＴの間に放出されたインスリンはイヌ特異的であり、ｃＮＩを外科的に取り除くと、高血糖が再発生した。総合すれば、現在のデータは、仮設を立てたようにＭＳＣまたはＡＳＣ（Ｍ／ＡＳＣ）の複雑で多面的な作用を容易に利用して培養された膵島細胞を保護することができ、ＮＩにてそれらを組み合わせ、ｉ．ｐ．投与すると、自己免疫Ｔ１ＤＭのマウスにて長期の血糖管理を促すことを実証している。従って、我々はこれらの観察結果がＴ１ＤＭの治療のための有意な転換適用性を有すると結論付けている。
【００５６】
試薬：使用された試薬及びその供給源を以下の表で列挙する。
【００５７】
【表１−１】
2020111619.tif 000002
【表１−２】
2020111619.tif 000003
【００５８】
実施例１：膵島の単離
齧歯類から：密閉チャンバーにてイソフルラン（３〜５％）によってマウスを安楽死させ、直ちに無菌正中切開のために手術台に載せた。膵臓を露出させ、膵管を見つけた。総胆管をクランプで固定し、総胆管を介して解離緩衝液（ハンクス緩衝化生理食塩水溶液（ＨＢＳＳ）、Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋、＋２５ｍＭのＨＥＰＥＳ＋ＮａＨＣＯ３）中の５ｍｌ／マウスまたは１５ｍｌ／ラットの１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＰによって膵臓を膨張させた。消化溶液（解離緩衝液中１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＰ）を含有する無菌の円錐管に膨張した膵臓を取り出した。円錐管を３７℃の振盪水槽（１２０ｒｐｍ）に入れ、内容物を１５分間消化した。等量の冷解離緩衝液によって消化を止めた。消化した組織を４００μｍの篩を介して新しい円錐管に濾過し、４℃にて２分間ブレーキをかけないで１２００ｒｐｍで遠心分離した。ペレットを２０ｍｌの解離緩衝液で洗浄し、再び遠心分離した（１２００ｒｐｍで４℃にて２分間ブレーキをかけないで）。さらに膵島を精製するために、ペレットをＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７溶液１０ｍｌに再懸濁させ、１０ｍｌの無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２を重層して勾配を設定した。勾配のあるものを２０００ｒｐｍで４℃にて２０分間ブレーキをかけないで遠心分離し、培地とＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７の間の界面から２０ｍｌの解離緩衝液を含有する５０ｍｌの円錐管に膵島を回収した。次いで膵島を１２００ｒｐｍで２分間遠心分離し、２０ｍｌの解離緩衝液で洗浄し、再び遠心し、膵島培養培地に再懸濁させ、無菌のペトリ皿に入れた。３７℃、５％ＣＯ２の加湿したインキュベータにてｐＨ７．４で膵島を一晩回復させた。
【００５９】
イヌから：ＮＩＨの共同協定を介して安楽死させたイヌから新鮮な膵臓を得て、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＰ溶液を用いて総胆管を介して膨張させた。Ｖｒａｂｅｌｏｖａ，ｅｔ  ａｌ．及びＷｏｏｌｃｏｔｔ，ｅｔ  ａｌ．１０，１１によって記載された技法の改変版に従って膨張させた膵臓からイヌの膵島を単離した。手短には、膨張させたイヌ膵臓を１５〜２０の小片に切断し、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＰ溶液２０ｍｌを含有する５０ｍｌの試験管に入れた。１２０ｒｐｍに設定した振盪器を伴う３７℃の水槽に試験管を入れた。５分間隔で採取した小試料から得たジチゾン染色した試料の顕微鏡検査によって溶液における膵島含量をモニターした。およそ５０％の膵島が腺房組織から離れるまで消化を続け、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ＋１％ＢＳＡで補完した２０ｍｌのＨＢＳＳで消化を止めた。次いで組織を４００μｍの篩に穏やかに通し、４℃にて１００×ｇで１０秒間遠心分離した。ペレットを１回洗浄し、２００×ｇ（４℃）で１０秒間遠心分離した。１０ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１．１１９にてペレットを再懸濁させ、１０ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１．０７７上にゆっくり層を形成し、続いて１０ｍｌの無血清培地の別の層を形成することによって３層の密度勾配を生成した。勾配を４℃にて７５０×ｇで２０分間ブレーキをかけないで遠心した。上の界面から膵島を回収し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ＋１％ＢＳＡで補完したＨＢＳＳを含有する５０ｍｌの試験管に移した。精製した膵島懸濁液を無血清培地で洗浄し、２００×ｇ（４℃）で１０秒間２回遠心分離し、４０μｍの細胞濾過器に通した。各調製物から５つの５０μｌアリコートを回収し、膵島の収量を評価するのに用いた。最後に、５％ＣＯ２のインキュベータにおける２０％ＦＢＳで補完したＲＰＭＩ１６４０培地にて手で採取した（腺房細胞の内容物を取り除くために）膵島を３７℃で培養した。
【００６０】
ヒトから：ヒトの膵島はＰｒｏｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）から購入した。
【００６１】
実施例２：膵島細胞の培養及び脱分化
齧歯類の膵島細胞：回収したマウスの膵島を手で採取し、４０μｍのフィルター濾過器の上で膵島を捕捉することによってさらに精製した。膵島を以下のように培養した。ラミニン５１１をコーティングしたウェル上に全膵島を置き、ＲＰＭＩ１６４０＋２０％ＦＢＳ＋ＧＰＳにて９０％集密になるまで膵島細胞を膵島から外に増殖させることによって膵島細胞を培養し、それは可逆性のＥＭＴを介して脱分化を生じた。この方法によって培養することはさらに膵島細胞を精製し、残りの外分泌細胞を取り除く。継代：マウス膵島細胞をほぼ９０％集密に増殖させた。次いでそれらをトリプシン処理し（１×トリプシン−ＥＤＴＡで５〜１０分間）、６００×ｇで５分間遠心分離してペレットにし、ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋２０％ＦＢＳ＋ＧＰＳで洗浄し、Ｔ７５フラスコに播いた。継代した膵島細胞をＤＭＥＭ−Ｆ１２＋２０％ＦＢＳ＋ＧＰＳにて培養した。この方法で培養することは膵島細胞をさらに精製し、腺房細胞及び導管細胞を取り除く。
【００６２】
イヌの膵島細胞：初期培養：回収したイヌの膵島を手で採取し、４０μｍのフィルター濾過器の上で膵島を捕捉することによってさらに精製した。マウスについて上で記載したように膵島全体として細胞を培養した。継代：齧歯類の膵島細胞についての上記を参照のこと。
【００６３】
ヒトの膵島細胞：齧歯類について上述のように膵島全体として細胞を培養し、継代した。
【００６４】
実施例３：ＡＳＣ及びＭＳＣの単離及び培養
ＡＳＣ（マウス及びイヌ）：無菌の条件下で、安楽死させた非糖尿病のマウスまたは非糖尿病のイヌ（ＮＩＨの組織共同合意）からおよそ３〜１５ｇの腹部脂肪試料を回収し、１×ＰＢＳをおよそ３０ｍｌ含有する別々の無菌の５０ｍｌ円錐管に氷上で入れた。脂肪試料を細かく刻み、３ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ１を含有するＰＢＳの試験管に入れ、３７℃の振盪している水槽にておよそ１時間消化した。試験管を遠心分離し（６００×ｇ、１０分間）、細胞内容物をペレットにした。上清を慎重に取り除き、無菌のＰＢＳでペレットを２回洗浄し、次いで培養のために１０ｍｌのＤＭＥＭ−Ｆ１２＋ＧＰＳ＋１０％ＦＢＳにて再懸濁させた。３７℃の加湿した５％ＣＯ２インキュベータにてｐＨ７．４で細胞を培養した。培養培地を週２回交換した。最初の培養物が７０〜８０％集密に達すると、１×トリプシン−ＥＤＴＡに３〜５分間曝露することによって付着細胞を継代し、さらに継代したか、または１０％ＤＭＳＯにて凍結保存した。
【００６５】
非糖尿病のヒトＡＳＣ：ＡＳＣはＰ１にてＬｏｎｚａ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入し、上述のように培養した。
【００６６】
ＭＳＣ（齧歯類から）：安楽死させたマウスの洗い流した大腿骨から得られた細胞懸濁液を、ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ＋ＧＰＳを含有するＴ２５フラスコに入れた。３７℃の加湿した５％ＣＯ２インキュベータにて細胞を培養した。培養培地を週に２回交換した。最初の培養物が７０〜８０％集密に達すると、１×トリプシン−ＥＤＴＡによって細胞を３〜５分で剥離し、継代したか、または１０％ＤＭＳＯにて凍結した。
【００６７】
新膵島の形成に先立って、培養したＭＳＣまたはＡＳＣを、（ｉ）ＣＤ４４及びＣＤ９０の発現ならびにＣＤ４５、ＣＤ３４、及びＤＬＡ−ＤＲ抗原の陰性発現についてＦＡＣＳによって、ならびに（ｉｉ）以前記載された１５ように３血球系分化（脂肪生成性、骨形成性、軟骨形成性）を受ける能力によって特徴付ける。新膵島の形成に先立って、培養し、脱分化したイヌ膵島細胞を（ａ）ＦＡＣＳによって調べ、ＤＬＡ−ＤＲ、ＣＤ９０及びＣＤ１３３の発現について陰性であることを確認し、（ｂ）インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、ｐｄｘ−１及びｎｋｘ６．１の残留膵島細胞の遺伝子発現についてｒｔＰＣＲによって調べる。以下のようにフルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いて細胞の生存率を評価した。１×染色液（１００μｌのＰＢＳに溶解した５ｍｇ／ｍｌのＦＤＡを１μＬと１ｍｇ／ｍｌのＰＩを５μＬ）を１００μｌのＰＢＳにて細胞と混合し、室温にて３０秒間インキュベートし、蛍光顕微鏡を用いて細胞を画像化した。赤色、緑色及び合計の細胞数について４視野を数えた。
【００６８】
実施例４：インドールアミン２,３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ−１）の誘導
以下のようにイヌインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）に応答したＩＤＯ−１の誘導についてイヌＡＳＣをＰ２にて調べた。それぞれＤＭＥＭ−Ｆ１２＋１０％イヌ血清中の０．５×１０６個のイヌ由来のＡＳＣを８枚の３５ｍｍ培養皿に播いた。１０ｎｇ／ｍｌのイヌＩＦＮγを４枚の皿に加えた。３７℃の加湿５％ＣＯ２インキュベータでの一晩の培養の後、すべての皿から細胞を回収し、ｒｔＰＣＲによってＩＤＯ−１の遺伝子発現についてアッセイした。ＩＦＮγ処理した培養物に由来する結果を同じ継代数の未曝露のものに対して正規化し、Ｌｏｇ１０ＲＱとして表した。
【００６９】
実施例５：新膵島の形成及び試験管内の性状分析
論理的根拠：（Ａ）膵島に天然に存在するよりも（ｉｉ）大幅により多くのＭＳＣ／ＡＳＣと組み合わせた（ｉ）脱分化し、培養で増やした膵島細胞を含む新膵島が形成され得るかどうかを調べること。（Ｂ）そのような新膵島が膵島細胞関連の遺伝子を発現するまたは発現するように誘導することができるかどうか、及びどの程度そうできるのかを決定すること。
【００７０】
方法
膵島細胞の外への増殖：（１）膵島細胞をトリプシンで解離し、ラミニン５１１及び／またはラミニン４１１（２０μｇ/ｍｌ）を予めコーティングした組織培養（ＴＣ）用のウェルもしくはフラスコに入れ、または（２）膵島全体をラミニン５１１及び／またはラミニン４１１をコーティングしたＴＣ用ウェルに入れた。図１を参照のこと。双方の場合、細胞を培養し、２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋グルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＰＳ）＋エキセンジン４（齧歯類細胞の培養では１０ｎＭでのＧｌｐ−１）によって補完されたＲＰＭＩまたは他の好適な増殖培地でほぼ集密まで増殖させた（サプリメントはすべて市販されている）。この方法はおよそ１〜２週間を要する。インスリンの存在についての免疫組織化学法（ＩＨＣ）、インスリンの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、グルコース刺激インスリン放出アッセイ（ＧＳＩＳ）、遺伝子発現プロファイル（ｒｔＰＣＲ）から、及びインスリン１遺伝子プロモータの制御下での緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）についてトランスジェニックのマウス細胞株１から判断して、膵島細胞はわずか数日以内に脱分化状態になった。図２及び８Ａ〜８Ｃを参照のこと。
【００７１】
新膵島の形成：ＡＳＣ（Ｐ１〜Ｐ４）またはＭＳＣ（Ｐ１〜Ｐ５）及び膵島細胞（Ｐ１〜Ｐ２）を超低付着性表面の培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋ，ＭＥ）にて１：１の比で共培養し、一晩でＮＩを形成させた。対照のＡＳＣ及び膵島細胞の集塊を同じ方法で形成した。それらの生体内投与に先立って、膵島及びＭＳＣに関連する遺伝子（以下参照）の発現についてｒｔＰＣＲによってＮＩの試料を調べた。
【００７２】
共焦点顕微鏡のための染色：ＡＳＣまたはＭＳＣをセルトラッカーグリーン（緑色）で染色し、継代した膵島細胞を製造元の指示書に従って親油性トラッカーＤｉｌ（赤色）によって染色した。細胞染色の後、ＮＩが形成され、それを回収し、１０％のホルマリンで固定し、共焦点顕微鏡観察に先立って４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）で染色した。
【００７３】
新膵島の親油性トラッカーＤｉｒ標識は、製造元の指示書に従って行った。
【００７４】
新膵島の再分化：新膵島の再分化は、２ステップ法にて市販の添加剤を用いて試験管内で達成された。ステップ１：５．６ｍＭのＤ−グルコースを含有し、（ａ）１％のＢＳＡ分画Ｖ、（ｂ）ＩＴＳ−Ｇ、（ｃ）ＧＰＳで補完した無血清ＤＭＥＭにて、齧歯類、イヌまたはヒト起源の新膵島を６〜８日間培養した。ステップ２：６〜８日後、この培地を再分化培地（ＲＤＭ）に置き換え、２週間培養した。ＲＤＭは、２５ｍＭのグルコースを含有し、（ａ）Ｎ２サプリメントＡ（市販）、（ｂ）ＳＭ−１サプリメント（市販）、（ｃ）１０ｍＭのニコチンアミド（市販）、（ｄ）１０ｎＭのエキセンジン４（市販）、（ｅ）２ｎＭのアクチビンＡ（市販）によって補完されたＤＭＥＭである。以下で記載されるように、再分化を膵島及びＭＳＣに関連する遺伝子の発現についてのｒｔＰＣＲによって試験し、確認した。
【００７５】
新膵島の細胞比の評価：各種（マウス、イヌ、ヒト）について、ＡＳＣ及びイヌ、マウスのＩＣの付着性培養物を上述のように回収した。ＩＣから区別できるようにＡＳＣをセルトラッカーグリーンで緑色に染めた。染色効率をＦＡＣＳによって評価し、９５％以上であると判定された。ＩＣは未染色のままであった。２ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＢＳにて各ウェル当たり０．５ｘ１０６個のＡＳＣ及び０．５ｘ１０６個のＩＣを用いて上述のように６穴の超低接着性プレートにて一晩でＮＩが形成された。翌日、ＮＩを回収し、ウェル当たり１ｍｌのＡｃｃｕｍａｘとの３０分間のインキュベートによって単個細胞調製物に解離した。次いで単個細胞調製物を１×ＰＢＳ＋１％ＢＳＡに再懸濁させ、未染色（ＩＣ）細胞に対比させた緑色（ＡＳＣ）の百分率についてＦＡＣＳ（ＢＤ  ＦＡＣＳｃａｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって解析した。
【００７６】
ｒｔＰＣＲ：混入するＤＮＡを排除するＤＮＡ分解酵素の消化ステップを含むＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニキットを用い、製造元の指示書に従って、１×１０６個の細胞試料からＲＮＡを抽出した。４２℃にて６０分間ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素を用いて逆転写を行った。種特異的なＴａｑＭａｎプライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＡＢＳ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用い、製造元の指示書に従って、２つ組にてリアルタイムＰＣＲを行った。反応はすべてＵＮＧと共にＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ＩＩを伴った２０μＬの総容量で行った。反応条件は、５０℃で２分間、その後９５℃にて１０分間で出発し、９５℃で１５秒間の溶解及び６０℃で１分間のアニーリングを４０サイクルだった。試料はすべて２つ組で実行し、計算には平均閾値サイクル（Ｃｔ）値を用いた。ＡＢＳ７５００リアルタイムＰＣＲシステムを用いてリアルタイムＰＣＲをモニターした。各標的遺伝子の相対的定量（ＲＱ、標準化）は機器と共に提供されるＡＢＳソフトウエアを用いたＣｔ法によって、及び２つの内部ハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチン及びβ２−ミクログロブリン（Ｂ２ｍ）に対する正規化によって算出された。ＲＱは、指示されたような外部対照に対する正規化を介して、機械と共に提供されるソフトウエアを用いることによって算出された。結果はｌｏｇ１０（ＲＱ）±ｌｏｇ１０（ＲＱｍｉｎ及びＲＱｍａｘ）として提示される。ｌｏｇ１０（ＲＱ）２より大きいまたはｌｏｇ１０（ＲＱ）−２に満たない差異を有意と見なした。利用したＰＣＲプライマーを以下の表に列挙する。
【００７７】
【表２−１】
2020111619.tif 000004
【表２−２】
2020111619.tif 000005
【００７８】
結果
ＩＣ及びＭ／ＡＳＣの増殖及び性状分析：ＮＩの出発物質、すなわち、培養したＩＣ及びＭ／ＡＳＣは以下のように得た。上記実施例で記載されたように、非糖尿病のマウス、イヌ及びヒトから新しく単離された膵島を生存率について調べ、培養に入れ、増殖させ、継代した。ＩＣは膵島の外に増え、増殖し、可逆的過程であるＥＭＴを受けるにつれて脱分化する。培養したＩＣは継代と共に低下する残りのＩＣ関連の遺伝子発現プロファイルを保持し、Ｍ／ＡＳＣのそれとは異なる遺伝子発現パターンを示す（図３）。ＮＩの形成及び実験にはＩＣはすべてＰ１〜Ｐ２で使用した。ＭＳＣ及びＡＳＣは非糖尿病のマウス、イヌ及びヒトから入手し、実施例３で記載されたように培養し、性状分析した。ＭＳＣ及びＡＳＣはすべて、プラスチック接着性、３血球系分化を受ける能力、特徴的な細胞表面エピトープの発現、及び重要なことに、Ｉ−Ａ［ｂ］（マウス）／ＤＬＡ−ＤＲ（イヌ）／ＨＬＡ−ＤＲ（ヒト）移植抗原の発現の欠如の最低限の基準を満たした。イヌＡＳＣのＩＦＮγへの曝露は、膵島炎のような炎症状態におけるＴ細胞の応答の重要な阻害剤であるインドールアミン２,３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ−１）遺伝子の発現を有意に誘導した（図４Ａ〜４Ｄ）。Ｍ／ＡＳＣはＮＩの形成及び実験についてＰ１〜Ｐ５で使用した。ＩＣ及びＭ／ＡＳＣは双方とも核型決定され（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｅｘａｓ  Ａ＆Ｍ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，ＴＸ）、正常であることが見いだされた。
【００７９】
新膵島の形成及び画像化：図１は新膵島の形成及び提案された使用の模式図を示す。図で示されるように、脱分化した膵島細胞とＡＳＣまたはＭＳＣを用いて、Ｔ１ＤＭまたはＴ２ＤＭを治療するための膵島細胞に特異的なタンパク質を産生するように誘導することができる新膵島を形成した；脱分化した膵島細胞とＡＳＣまたはＭＳＣ。膵島細胞は先ず膵島（マウス、イヌ、またはヒト）から外に増殖し、脱分化し、１以上の継代のために増殖することができた。いったん脱分化すると、そのような細胞は、それぞれ、有意に低下した膵島細胞特異的な遺伝子またはタンパク質を発現し、産生し、またはそれらを発現せず、産生しない。ＡＳＣまたはＭＡＣは常法によって４回継代まで培養した。いったん十分な数の各細胞型が利用できると、２つの細胞型を低接着性フラスコで共培養して膵島サイズの新膵島を形成することができる。
【００８０】
図２は、本明細書に記載されている方法で培養している膵島細胞から結果的に生じる外向きの増殖及び上皮間葉転換を説明している。この現象を説明するのに役立つように、緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）がインスリン１（ｉｎｓ１）遺伝子のプロモータの制御下にあるトランスジェニックＣ５７Ｂｌ／６ｉｎｓ１ｇｆｐ＋マウスを使用した１。膵島のβ細胞のみがインスリン１遺伝子を発現するので、この系統から単離されるインスリン遺伝子を発現しているβ細胞は緑色に見えるので容易に特定できる。パネルＡはｉｎｓ１−ｇｆｐ＋マウスから単離された膵島全体を示す。これらの膵島は上述のようなラミニン５１１をコーティングしたプレートで培養された。図２のパネルＢは培養６日後のｉｎｓ１ｇｆｐ＋の膵島全体のものである。膵島が付着した場合、依然として有意なインスリン遺伝子の発現があった一方で、細胞は膵島から離れ、増殖し、これらの細胞では、インスリン遺伝子の発現が下方調節される（細胞はもはや緑色ではない）。このことは図２のパネルＣでさらに完全に説明されており、それは、培養に先立ってトリプシン処理して膵島を分離し、次いで固定し、インスリンタンパク質（赤色）用に染色したｉｎｓ１ｇｆｐ＋膵島細胞を示す。細胞が緑色または黄色である場合、ｉｎｓ１遺伝子は依然として活発に転写され、翻訳されている。細胞が赤色のみに見える場合、インスリンタンパク質は存在するが、緑色（または黄色）の欠如は遺伝子が下方調節されていることを示す。最後に、図２のパネルＤは細胞分裂を追跡するＥｄＵの存在下で増殖させたｉｎｓ1ｇｆｐ＋膵島細胞を示す。これらの細胞を固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ（核、青色）で染色し、ＥｄＵ（赤色）について染色した。ｉｎｓ1遺伝子の翻訳が起きている細胞は緑色に見える。分裂している細胞の核は赤色に見える。画像で見ることができるように、分裂していない細胞は明るい緑色であり、丸い上皮の形態を有する一方で、分裂している（赤い核）細胞は細長い間葉の外観を呈し、わずかに緑色であるに過ぎないということは、インスリン遺伝子発現の下方調節を示している。
【００８１】
超低接着方式にて骨髄由来のＭＳＣまたはその脂肪由来の類似体であるＡＳＣ（Ｍ／ＡＳＣ）を培養にて増やしたマウス膵島細胞とともに１：１の比（最適であると見いだされた）で一晩共培養することによって１５０μｍのほぼ膵島サイズのＮＩを調製した。マウス細胞を用いたこの方法の例を図５にて示す。そのようなマウスＮＩの潜在的な転換関連性をさらに評価するために、我々は、同等のＮＩがイヌ及びヒト双方のＩＣ及びＭ／ＡＳＣから容易に生成され得ることを確認した。緑色蛍光タンパク質陽性（ｇｆｐ＋）Ｃ５７Ｂｌ／６マウスのＭＳＣとＣ５７Ｂｌ／６マウスの膵島細胞を増殖させた。２種類の細胞型を次いで低接着性プレートで培養し、新膵島を形成した。ＡＳＣ（緑色）と膵島細胞（赤色）の単一のマウス、イヌ及びヒトの新膵島の共焦点画像（６３×拡大）を図６のそれぞれ左、中央及び右の画像にて示す。図で分かるように、マウス、イヌまたはヒト起源のいずれの新膵島についても、内分泌細胞及び幹細胞は新膵島全体にわたって均等に分布する。ＮＩにおける各細胞型の百分率を以下のようにさらに評価した。イヌＡＳＣをセルトラッカーグリーンで染色し、未染色の膵島細胞と１：１の比で上記のように共培養した。ＮＩが形成された後、Ａｃｃｕｍａｘによってそれらを単個細胞に解離させ、オンラインの方法で記載されているようにＦＡＣＳによって解析したが、それは形成の２４時間後で、ＮＩがおよそ５０％のＭ／ＡＳＣと５０％のＩＣで構成されていることを明らかにし（図７Ａ）、さらに双方の細胞型は形成後のＮＩ内にて１：１の比のままであることを示している。
【００８２】
マウス、イヌ、及びヒト新膵島の遺伝子発現プロファイル及びグルコースで刺激したインスリンの分泌：これらの新膵島は十分なレベルのインスリンを発現しないが、培養して、培養された膵島細胞は上皮間葉転換を受けると、それらは上記で要点を述べた再分化プロトコールを用いて試験管内で再分化され得、それらは膵島細胞の遺伝子を再発現する。図５に示すように２つの細胞型であるＩＣとＭ／ＡＳＣを合わせてＮＩを形成したら、ＮＩの遺伝子発現パターンは双方の細胞型の特徴を示した。図８Ａは、新しく単離したマウスまたはイヌの膵島（右側）に比べた、再分化培地に曝露した１４日後のマウス（上）及びイヌ（下）の新膵島の膵島遺伝子発現プロファイル（左側）を示す。遺伝子発現プロファイルの双方のセットを新しく形成された、脱分化したマウス（上）及びイヌ（下）の新膵島のものに対して正規化した。これらの結果は、新しく形成されたマウス及びイヌの新膵島が低レベルの調べたすべての膵島関連遺伝子を発現しており、高レベルのこれら遺伝子を発現するための再分化を受ける能力を有することを示している。新しく形成されたＮＩは、インタクトな膵島よりもほぼ１００倍少ないけれども試験管内でグルコースに応答してインスリンを分泌することができた。図８Ｂは、それらの種に由来する新しく単離された膵島と比べた、ＭＳＣまたはＡＳＣとＰ１（左）またはＰ２（右）の膵島細胞から作製した新しく形成されたマウス（上、イヌ（中央）及びヒト（下）の新膵島の遺伝子発現プロファイルを示す（正規化）。このパネルから分かるように、新しく形成されたマウス、イヌ及びヒトの新膵島はすべて、低レベルの膵島関連遺伝子と同様にＡＳＣ／ＭＳＣに関連した遺伝子（ｖｅｇｆ−α、ｃｘｃｌ１２、ｔｇｆβ１及びｉｆｇ１）を発現し、これらの種のそれぞれについて、膵島細胞遺伝子の発現は高い膵島細胞継代数に伴って低下する。図８Ｃで示すように、２５ｍＭのグルコースに応答して５０の新しく形成されたＣ５７Ｂｌ／６マウスの新膵島（Ｐ１の膵島細胞とＰ５のＭＳＣ、斜線棒）によるグルコース刺激でのインスリンの分泌（ＧＳＩＳ）は５０の新しく単離されたＣ５７Ｂｌ／６マウスの膵島（白棒）のおよそ１％である。これは、図８Ｂで見られたインスリン遺伝子発現の低下に匹敵する。
【００８３】
結論：総合すると、これらの結果は、（ｉ）培養した膵島細胞とＭＳＣまたはＡＳＣのいずれかとの新膵島は試験管内で容易に形成することができること、（ｉｉ）種（マウス、イヌ、ヒト）を超えて、そのような新膵島は外観及び遺伝子発現プロファイルで類似しており、低レベルの膵島関連遺伝子を発現していること、（ｉｉｉ）種（マウス、イヌ、ヒト）を超えて、そのような新膵島は試験管内で再分化して膵臓内分泌関連の遺伝子を再発現することができることを示している。さらに、これらの結果は、これらの新膵島がインスリン依存性の及びインスリン非依存性の糖尿病のヒト及び動物を治療することにおいて治療上使用され得ることを示唆している。
【００８４】
実施例６：齧歯類新膵島でｉ．ｐ．処置した自然発症糖尿病ＮＯＤマウス及びＳＴＺ糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける生体内の用量設定及び原理の証明試験
動物モデル
動物が関与する試験はすべて、実験動物の管理と使用に関するＮＩＨ指針に沿って行われ、機関の獣医及びＩＡＣＵＣのメンバーによって監督され、認可された。マウス及びラットはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）またはＨａｒｌａｎ（Ｈａｓｌｅｔｔ，ＭＩ）から購入し、一定の温度と湿度、１２：１２の規則的な明暗周期で靴箱型のケージに収容した。指示されない限り、マウス及びラットはすべて標準の餌及び水道水に自由にアクセスさせた。マウスの実験はすべて、１５〜３５ｇの間の体重のメスＣ５７Ｂｌ／６、メスＮＯＤまたはメスＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを用いて実施した。ラットの実験はすべて５３８〜６５０ｇの間の体重のオスのスプラーグドーリー系ラットで実施した。
【００８５】
ポリデキストラン粒子の大網による取り込みのプロトコール
５３８〜６５０ｇの間の体重の２歳のスプラーグドーリー系ラット４頭を麻酔し、生理食塩水に１：１で懸濁した５ｍｌのポリデキストラン粒子（ＰＤＰ；無菌セファデックスＧ−２５、粒径８７〜５１０μｍ）でｉ．ｐ．処置した。投与の７日後、動物を屠殺し、その大網及び他の臓器を摘出し、ＰＤＰの存在について調べた。
【００８６】
糖尿病モデル
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）：非肥満糖尿病／重症複合免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）及びＣ５７Ｂｌ／６マウスを、２０ｍＭのクエン酸緩衝液ｐＨ４．５に新しく溶解した５０〜７５ｍｇ／ｋｇ体重のＳＴＺの３〜５回のｉ．ｐ．投与（１日１回の投与）によって糖尿病にした。別々の３日で非絶食時血中グルコースのレベルが３００ｍｇ超／ｄＬである場合マウスを糖尿病であると見なした。
【００８７】
自然発症：メスＮＯＤマウスは１２〜２０週齢で自然発症性にＴ１ＤＭを発症する。別々の３日で非絶食時血中グルコースのレベルが３００ｍｇ超／ｄＬである場合マウスを糖尿病であると見なした。インスリン処置：結果及び図面で指示されている場合、インスリンは徐放性の皮下インスリンペレット（Ｌｉｎｂｉｔ）を介して糖尿病動物に投与した。イソフルランで動物を麻酔し、１〜３のＬｉｎｂｉｔペレットを製造元の指示書に従って皮膚のすぐ下に挿入した。尾静脈の血中グルコース濃度を数日間モニターして動物が高血糖でも低血糖でもないことを保証した。
【００８８】
血中グルコースのモニタリング：動物試験すべてにおいて、尾静脈の試料採取を介して、ワンタッチウルトラ２血糖計（検出のレベル、２０〜６００ｍｇのグルコース／ｄＬ）を用いて血中グルコースの濃度を週に２回評価した。麻酔：吸入齧歯類麻酔方式（Ｅｕｔｈａｎｅｘ，Ｐａｌｍｅｒ，ＰＡ）を用いて１〜５％のイソフルランで動物を麻酔した。温めた外科用ウォーターベッド（Ｅｕｔｈａｎｅｘ，Ｐａｌｍｅｒ，ＰＡ）を用いて直腸温を３７℃で維持した。
【００８９】
Ｃ５７Ｂｌ／６マウス由来の同種ＮＩによる糖尿病ＮＯＤマウスの処置
糖尿病ＮＯＤマウスの血中グルコースのレベルをＬｉｎｂｉｔによって正常化し、Ｌｉｎｂｉｔ投与後２０日目に軽いイソフルラン麻酔を用いて、Ｐ５のｅＧＦＰ＋ＭＳＣ及びＰ１の膵島細胞で構成されたＮＩ（０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に懸濁させた２ｘ１０５個のＮＩ／ｋｇ体重；Ｎ＝６）または溶媒（０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地；Ｎ＝６）を無菌的にｉ．ｐ．で投与した。その後の外来性のインスリンはどちらの群にも与えなかった。ＮＩ投与後１０週目に、マウスを安楽死させ、その大網、肝臓、脾臓、肺、腎臓及び膵臓を摘出し、ｅＧＦＰ＋ＮＩの存在について蛍光顕微鏡によって調べた。血清も採取してＮＩを構成する細胞に対する同種ＩｇＧ応答について調べた。この試験の陽性対照として、３頭のＮＯＤの追加の群にＬｉｎｂｉｔを与え、０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２に懸濁させた２ｘ１０５個の新しく単離した同種膵島／ｋｇ体重によってｉ．ｐ．で処置した。これらのマウスを膵島投与の１４日後に安楽死させ、その血清を採取し、上記のように調べた。
【００９０】
同系のＮＩ、ＡＳＣ集塊またはＩＣ集塊によるＳＴＺ糖尿病Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの処置
１０週齢のＳＴＺ糖尿病の血中グルコース管理した（Ｌｉｎｂｉｔによって）ｗｔＣ５７Ｂｌ／６マウスの４群に、（ｉ）０．５ｍＬの溶媒（無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２；Ｎ＝６）、または２ｘ１０５個／ｋｇ体重の（ｉｉ）新しく形成したＮＩｓ（Ｐ５のｅＧＦＰ＋ＭＳＣｓとＰ１のＩＣｓ；Ｎ＝６）、（ｉｉｉ）Ｐ１のＡＳＣのみで構成された集塊（Ｎ＝５）、または（ｉｖ）Ｐ１のＩＣのみで構成された集塊（Ｎ＝５）をｉ．ｐ．で投与した。示されたようにマウスを経過観察した。安楽死の際、大網、膵臓、脾臓、肝臓、肺及び腎臓を摘出し、ｅＧＦＰ＋ＮＩの存在について蛍光顕微鏡によって調べた。加えて、膵島に関連する遺伝子発現プロファイルを大網及び膵臓のすべてで得た。
【００９１】
マウスまたはイヌのＮＩによる非糖尿病マウスの処置
マウスのＮＩ：２〜４、１２週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスそれぞれの６群に、（ｉ）０．５ｍｌ無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２に懸濁させた２ｘ１０５個／ｋｇ体重の新しく形成した同系ＮＩ（Ｐ５のＭＳＣとＰ１のＩＣ）、または（ｉｉ）０．５ｍｌ無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２（溶媒）のいずれかをｉ．ｐ．で投与した。１２週までマウスを経過観察した。イヌのＮＩ：９週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの２群を、（ｉ）０．５ｍｌ無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２に懸濁させた２ｘ１０５個／ｋｇ体重の新しく形成したｃＮＩ（Ｎ＝６）または（ｉｉ）０．５ｍｌ無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２（溶媒、Ｎ＝３）のいずれかによってｉ．ｐ．で処置した。マウスを１０週間経過観察した。
【００９２】
結果
臨床的に高度に情報を与える自己免疫のＴ１ＤＭモデルにおける我々の主要仮説を調べるために、我々は先ず、（ｉ）その生存、（ｉｉ）ＮＩに含有される膵島細胞の機能的なインスリン産生細胞への生体内での再分化、及び（ｉｉｉ）移植された細胞集塊のＭＳＣが介在する細胞性、同種及び自己の免疫防御の反映として、試験管内で生成された同種ＮＩのｉ．ｐ．投与が自然発症糖尿病ＮＯＤマウスにて正常血糖値を取り戻すことができるかどうかを調べた。
【００９３】
自然発症糖尿病ＮＯＤマウスの同種ＮＩによる処置：他者が、膵島前駆細胞及び脱分化した膵島β細胞は生体内で機能的な内分泌細胞に分化することができることを見いだしたので、我々は、Ｔ細胞が介在する自己免疫型のＴ１ＤＭを発症する自然発症糖尿病ＮＯＤマウスにｉ．ｐ．投与した本明細書に記載されているような同種マウスＮＩが正常血糖値を取り戻すかどうかを調べた。Ｔ１ＤＭ患者が同種の膵臓または膵島の移植を受ける最も一般的な臨床的状況に密接に類似するので、このプロトコールを選択した。生体内での追跡及び死後局在化を円滑にするために、投与されるＮＩはＤｉＲによって二重に標識し、組織すべてで構成的に発現されるｅＧＦＰ遺伝子についてトランスジェニックのＣ５７Ｂｌ／６マウスに由来するＰ５のＭＳＣと野生型のＣ５７Ｂｌ／６マウスに由来するＰ１のＩＣで構成された（図５を参照のこと）。他者が、血中グルコースのレベルのインスリンによる正常化は、移植された細胞に対する糖毒性効果を同時に低下させるインスリン産生細胞への膵島細胞の生体内での再分化を高めることを明らかにした。従って、移植されたＮＩに対する糖毒性効果の可能性を回避するために、及び移植されたＩＣの内分泌再分化を刺激するために、投与後３０〜４０日間続く効果があるインスリン放出ペレット（Ｌｉｎｂｉｔ）の皮下投与によって１２頭の自然発症糖尿病メスＮＯＤマウスの血中グルコースのレベルを正常化した。
【００９４】
次いでこれらのマウスを２群に分け、同種Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに由来する２ｘ１０５個のＮＩ／ｋｇ体重（Ｎ＝６）または溶媒（Ｎ＝６）（図９）のいずれかによってｉ．ｐ．処置した。予想通り、Ｌｉｎｂｉｔ処置の３５〜４０日後までに溶媒処置したＮＯＤマウスでは高血糖が再発生した一方で際立って、ＮＩ処置した動物における血中グルコースのレベルは正常に近いままだった（図９）。正常血糖の同様の回復は、同系ＮＩで処置したストレプトゾトシン（ＳＴＺ）糖尿病Ｃ５７Ｂｌ／６マウス、及び異種（イヌ）ＮＩで処置したＳＴＺ−糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスについての同様の実験にて達成された（図１４Ａ及び１４Ｂ）。
【００９５】
総合して、これらのデータは、（ｉ）ＮＩは生着し、生存すること、（ｉｉ）ＮＩ内のＩＣは生体内で再分化して、インスリンの新しい内在性の供給源を持つマウスを提供すること、（ｉｉｉ）ＮＩに含有されるＭＳＣはＮＯＤマウスにてインスリン産生細胞の細胞性保護及び同種免疫隔離や自己免疫隔離を効果的に提供し、この臨床的に高度に関連するＴ１ＤＭモデルにて血糖管理を明らかに確立することを示している。
【００９６】
ＮＩ内での膵島細胞とＭ／ＡＳＣの協調は糖尿病動物にて正常血糖を確立するのに必須である。ＮＩにおけるＩＣとＭ／ＡＳＣの間での協調をさらに検証するために、２つの実験を行ったが、それを図１０Ａ〜１０Ｃにて要約する。これらでは、免疫能のあるＣ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＴ１ＤＭの容易に制御できるストレプトゾトシン（ＳＴＺ）モデルを使用した。第１の群では、ＳＴＺ−糖尿病Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを２ｘ１０５個／ｋｇ体重の同系ＮＩまたは溶媒でｉ．ｐ．処置した。第２の群では、ＳＴＺ−糖尿病Ｃ５７Ｂｌ／６マウスをＡＳＣ（Ｐ１）または継代したＩＣ（Ｐ１）のいずれかのみで構成される２ｘ１０５個／ｋｇ体重の対照集塊で処置した（図１１）。重要なことに、それぞれ生成された細胞集塊における細胞の総数はＮＩにおけるそれと同一だった（集塊当たり約１，０００個の細胞）。ＮＩ処置した群の３頭のマウス及び対照群のマウスすべてを１２週目で安楽死させた。残りの３頭のＮＩ処置したマウスは２１週間経過観察した。同系ＮＩによってｉ．ｐ．処置したＳＴＺ−糖尿病Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにて長期（２１週間）の正常血糖値が得られた。重大なことに、ＡＳＣまたは培養したＩＣのみで構成された同一に生成された対照集塊による処置は、ＩＣ集塊を与えた場合、最少限にしか血中グルコースのレベルを低下させず（図１０Ａ）、これはインスリン産生細胞の最適な再分化を促すにはＩＣ及び幹細胞の双方がＮＩ内に存在しなければならないことを実証している。
【００９７】
生体内の再分化：ＮＯＤマウスの実験（図９）ならびに回収した大網（図１８Ｂ）からのデータはＮＩが生体内で再分化し、十分なインスリンを産生してマウスを正常血糖にすることを暗に意味している。実際、２１週目に正常血糖のＮＩ処置したＣ５７Ｂｌ／６マウスから回収した大網は、ＮＩの生着と、それらが処置されたＮＩに比べて有意に増加したインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及びＰｄｘ１遺伝子の発現との双方を示した（図１０Ｂ）。このことは、膵島のホルモンを発現している膵島細胞の有効な生体内での再分化を明瞭に実証している。さらに、ＳＴＺ−糖尿病マウスの膵臓全体におけるｉｎｓ１及びＩｎｓ２の発現が予想通り、動物すべてで有意に低下し（図１０Ｃ）、これはＮＩ処置したマウスにおける正常血糖値が大網に生着したＮＩによって提供される生理的なインスリン分泌によって達成されたのであって、残存する膵臓インスリンによっては達成されたのではないことを示している。
【００９８】
実施例７：イヌの新膵島でｉ．ｐ．処置されたＳＴＺ−糖尿病のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける生体内の用量設定及び原理の証明試験
論理的根拠：実施例５において、ＡＳＣと脱分化した膵島細胞との新しく形成された新膵島は、低レベルの膵島関連遺伝子ならびにＡＳＣ／ＭＳＣ関連の遺伝子を発現することが示された。そのような新膵島の内分泌由来成分が試験管内で再分化して高レベルの膵島関連遺伝子を再発現する能力を有することも観察された。他者は、内分泌前駆細胞が生体内で再分化してインスリンを産生することを示した。従って我々は、（ｉ）イヌＡＳＣと脱分化した膵島細胞を含む新膵島が用量依存性に高血糖を元に戻し、動物の生存に影響を与えることができるのかどうか、及び（ｉｉ）新膵島の除去が高血糖への戻りを生じるかどうかを調べ、新膵島がＴ１ＤＭの得られる治療に専ら関与することを確認した。
【００９９】
方法
新膵島：イヌＡＳＣ（継代２）とイヌの培養した膵島細胞（継代１）から新膵島を形成した。
【０１００】
糖尿病モデル：クエン酸緩衝液中の５０ｍｇ／ｋｇ体重のストレプトゾトシン（ＳＴＺ）の５回のｉ．ｐ．投与によって非肥満の糖尿病／重症複合免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスを糖尿病にした。別々の３日で血中グルコースのレベルが３００ｍｇ超／ｄＬになったら、血中グルコースのレベルを制御し、それによって糖毒性の細胞損傷を回避するために、０日目にてそれぞれマウスに徐放性インスリンペレット（Ｌｉｎｂｉｔ，Ｌｉｎｓｈｉｎ，Ｃａｎａｄａ）をｓ．ｃ．で１回与えた。これらのペレットはおよそ３６日で失効した（図１２を参照のこと）。（ａ）２００，０００個のまたは（ｂ）８０，０００個の新しく形成した再分化していないイヌ由来の新膵島／ｋｇ体重、または（ｃ）溶媒（ＤＭＥＭ−Ｆ１２）によってｉ．ｐ．で動物を処置した。一部の試験では、ＮＩを７６日目に外科的に取り除き、さらに２週間マウスを経過観察した。
【０１０１】
腹腔内耐糖能試験（ＧＴＴ）：処置後５５日目に、３頭の溶媒処置マウスと５頭のイヌ新膵島処置マウスを５時間絶食させ、その際、ワンタッチウルトラ２血糖計（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ；６００ｍｇのグルコース／ｄＬの検出限界のレベル）を用いてベースラインの血中グルコースのレベルを評価した。次いで動物を麻酔し、イソフルラン麻酔のもとでｉ．ｐ.注射を介して２ｇのグルコース／ｋｇ体重（無血清培地に溶解し、フィルターで無菌化した）を投与した。グルコース投与後、３０分、６０分及び１２０分に血中グルコースのレベルを評価した。
【０１０２】
処置プロトコール
ＮＯＤ同種処置：メスＮＯＤマウスが高血糖である（別々の３日で非絶食時血中グルコースが３００ｍｇ超／ｄＬ）ことが確認されたら、Ｌｉｎｂｉｔペレットでそれらをｓ.ｃ.処置した。動物の血中グルコースのレベルが正常化されたら、動物を麻酔し（イソフルラン）、Ｐ５のｇｆｐ＋ＭＳＣとＰ１の膵島細胞で構成された新膵島（０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に懸濁させた２×１０５個の新膵島／ｋｇ体重；ｎ＝６）または溶媒（０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地；ｎ＝３）をｉ．ｐ．で投与した。どちらの群の動物にもその後の外来性のインスリンは与えなかった。血中グルコースのレベル及び体重を週に２回評価し、マウスを１０週間経過観察した。新膵島投与後１０週目に動物を屠殺し、その血清、大網、肝臓、脾臓、肺及び腎臓及び膵臓を摘出し、新膵島及びインスリンの存在について調べた。大網以外のどこにも何も見いだされなかった。
【０１０３】
ＳＴＺ−糖尿病動物のＣ５７Ｂｌ／６同系処置：ＳＴＺ−糖尿病の血中グルコースを制御した（Ｌｉｎｂｉｔによって）Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを麻酔し、（ａ）ＤｉＲで染色し、０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地（溶媒）に懸濁させた新しく形成した２×１０５個のｇｆｐ＋マウス新膵島（Ｐ５のｇｆｐ＋ＭＳＣとＰ１の膵島細胞）（ｎ＝３）、または（ｂ）ＤｉＲで染色し、ゲルフォームに埋め込んだ新しく形成した２×１０５個のｇｆｐ＋マウス新膵島（ｎ＝３）のいずれかをｉ．ｐ．で投与した。対照群の動物を麻酔し、０．５ｍｌの溶媒でｉ．ｐ．処置した（ｎ＝３）。血中グルコースのレベル及び体重をベースラインで評価し、次いで１８週間動物すべてにおいて週に２回評価した。週に１回、イソフルランの麻酔下でＬｉｃｏｒ，Ｐｅａｒｌ  Ｉｍｐｕｌｓｅ撮像装置を用いて動物を調べ、新膵島を追跡した。屠殺の際に、大網、膵臓、脾臓、肝臓、肺及び腎臓を摘出し、新膵島の存在について調べた。大網以外のどこにも何も見いだされなかった。
【０１０４】
非糖尿病マウスの処置：マウス新膵島の投与：２〜４頭の非糖尿病の１２週齢のメスＣ５７Ｂｌ／６マウス（２１．９ｇの平均体重）の６群を麻酔し、（ａ）０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２に懸濁させた新しく形成した２×１０５個のマウス新膵島（Ｐ５のｇｆｐ＋ＭＳＣとＰ１の膵島細胞）（追跡目的で異なる時点で屠殺した５群）、または（ｂ）０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２（溶媒；１群）のいずれかをｉ．ｐ．で投与した。血中グルコースのレベル及び体重をベースラインで評価し、次いで１２週目まで週２回評価した。イヌ新膵島の投与：体重１９．７〜２４．８ｇの非糖尿病の９週齢のメスＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの２群を麻酔し、（ａ）０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２に懸濁させた新しく形成し、ＤｉＲ染色した２×１０５個のイヌ新膵島（Ｎ＝６）、または（ｂ）０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２（溶媒；ｎ＝３）のいずれかをｉ．ｐ．で投与した。血中グルコースのレベル及び体重をベースラインで評価し、次いで１０週間、週に２回評価した。週に１回、イソフルランの麻酔下でＬｉｃｏｒ，Ｐｅａｒｌ  Ｉｍｐｕｌｓｅ撮像装置を用いて動物を調べ、新膵島を追跡した。屠殺の際に、大網、膵臓、脾臓、肝臓、肺及び腎臓を摘出し、新膵島の存在について調べた。大網以外のどこにも何も見いだされなかった。
【０１０５】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤ少し前に発症した糖尿病、異種処置：その血中グルコースのレベルがＬｉｎｂｉｔペレットによって制御されている体重１７〜２９ｇのメス２０週齢のＳＴＺ−糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの群（群当たりｎ＝５）を麻酔し、（ａ）２×１０５個または（ｂ）８×１０４個のゲルフォームに埋め込だ新しく形成した再分化していないｃ新膵島／ｋｇ体重、または（ｃ）溶媒（ＤＭＥＭ−Ｆ１２）によってｉ．ｐ．で処置した。新膵島はＰ１の膵島細胞とＰ２のイヌＡＳＣで構成された。血中グルコースのレベル及び体重を週に２回評価し、マウスを１３週間経過観察した。処置後５５日目に高用量群にてＩＰ  ＧＴＴを行い、１０週目にマウスの高用量群から新膵島を外科的に取り除いた。
【０１０６】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤずっと以前に発症した糖尿病、異種処置：クエン酸緩衝液中の７５ｍｇ／ｋｇ体重のＳＴＺの３回のｉ．ｐ．投与によって、体重１８．４〜２２．８ｇの１１週齢のメスＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを糖尿病にした。別々の３日における３００ｍｇ超／ｄＬの血中グルコースのレベルによって糖尿病状態を確認した。動物が糖尿病であると確認されたら、ｓ.ｃ.のＬｉｎｂｉｔペレットを用いたインスリン療法によって血中グルコースのレベルをほぼ３カ月間制御した。新膵島または溶媒の投与に先立って動物がすべて依然として糖尿病であることを確認するために、Ｌｉｎｂｉｔを失効させ、マウスに高血糖を再発症させた。マウスを再びＬｉｎｂｉｔで処置し（０日目）、血中グルコースのレベルを制御し、糖毒性の新膵島損傷を防いだ。次いで麻酔したマウスを（ｉ）ゲルフォームに埋め込んだ２×１０５個のｃ新膵島／ｋｇ体重、または溶媒（０．５ｍｌのＤＭＥＭ−Ｆ１２）のいずれかでｉ．ｐ．処置した。新膵島はＰ１の膵島細胞とＰ２のイヌＡＳＣで構成された。血中グルコースのレベル及び体重を週に２回評価し、マウスを１１週間経過観察した。ＩＰ  ＧＴＴ：処置後５５日目に３頭の溶媒処置マウス及び５頭のｃ新膵島処置マウスを５時間絶食させ、その際、ベースラインの血中グルコースのレベルを評価した。次いで動物を麻酔し、麻酔下でｉ．ｐ.注射を介して２ｇのグルコース／ｋｇ体重（０．５ｍｌの無血清培地に溶解し、フィルターで無菌化した）を投与した。グルコース投与後、３０分、６０分及び１２０分に尾静脈の血中グルコースのレベルを評価した。
【０１０７】
イヌのインスリンについてのＥＬＩＳＡ：耐糖能試験の間に集めた溶媒処置及び新膵島処置のマウスに由来する血清を、製造元の指示書に従って、マウスのインスリンと交差反応しないイヌ特異的なインスリンの存在についてＥＬＩＳＡ（Ｍｅｒｃｏｄｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって調べた。交差反応についてのそれぞれ陽性及び陰性の対照としてイヌの血清ならびにＣ５６Ｂｌ／６マウスの血清も解析した。
【０１０８】
抗体反応試験：新膵島またはＡＳＣの投与後１４日以上の新膵島処置したまたはイヌＡＳＣ処置したＮＯＤマウスから得た約５００μｌの血清と共に、約５×１０４個の細胞（投与された新膵島を作り出すのに使用されたＭＳＣ、ＡＳＣまたは膵島細胞）のアリコートをそれぞれインキュベートした。細胞を血清と共に室温で３０分間インキュベートした。３０分後、細胞を６００×ｇで５分間遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させ、ｃｙ３を結合したヤギ抗マウス（希釈）ＩｇＧ抗体と共にインキュベートした。細胞を室温にて暗所でさらに２０分間インキュベートした。次いで１ｍｌの１×ＰＢＳ＋１％のＢＳＡを加え、細胞をボルテックスで撹拌し、遠心分離し、４００μｌの固定緩衝液（１％ホルムアルデヒド）に再懸濁させ、ＦＡＣＳ（ＢＤ  ＦＡＣＳｃａｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によって解析した。７％超の細胞のシフトを陽性反応と見なし、血清は試験細胞に対する抗体を含有することを示した。ゲルフォームに埋め込む新膵島：新膵島の個々の用量を１５ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに集め、２００×ｇで２分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットをそれぞれ０．２ｍｌの無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２に再懸濁させた。次いで新膵島の懸濁液を０．５×０．５×０．５ｃｍの無菌ゲルフォームのブロックに負荷し、マウスへのｉ．ｐ．投与に先立ってそれを３７℃のインキュベータにて３時間インキュベートした。ゲルフォームに埋め込んだ新膵島を無菌条件下で且つ麻酔下でレシピエントマウスの腹腔脂肪体及び大網にて外科的に移植した。二層縫合で腹部切開を閉じた。
【０１０９】
生体内画像化：Ｌｉ−Ｃｏｒ，Ｐｅａｒｌ  Ｉｍｐｕｌｓｅ撮像装置を用いて、麻酔したマウスにてＤｉＲ染色した新膵島の生体内画像化を行った。
【０１１０】
結果
ＳＴＺの１ヵ月後にｉ．ｐ．投与された２×１０５個の新膵島／ｋｇ体重の用量は正常血糖値を達成し、維持し、動物の生存を促進する。ＳＴＺで誘導したＴ１ＤＭ糖尿病の確立のほぼ１ヵ月後、５頭のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの３群をそれぞれ、０．５ｍｌの無血清培地（ＤＭＥＭ−Ｆ１２）に懸濁させた（ａ）２００，０００個または（ｂ）８０，０００個の新しく形成した再分化していないイヌ由来の新膵島／ｋｇ体重、または溶媒（０．５ｍｌの無血清培地）によってｉ．ｐ．で処置した。ＳＴＺ投与の約１ヵ月後（図１２、１３、１４Ａ及び１４Ｂにおける０日目）Ｌｉｎｂｉｔを１回与え、血中グルコースのレベルが安定した、Ｌｉｎｂｉｔ投与の１２日後、新膵島または溶媒を投与した。溶媒で処置した動物はインスリン療法にもかかわらず、２１日目までに死亡し始めた（図１５を参照のこと）。図１２、１３、１４Ａ及び１４Ｂで示されるように、いったんＬｉｎｂｉｔが切れると、溶媒処置した（白棒）残りの動物は再び高血糖になった。新膵島処置した糖尿病動物（黒棒及び斜線棒）は、正常化された血中グルコースのレベルを示し、２００，０００個の新膵島／ｋｇ体重用量の方が８０，０００個の新膵島／ｋｇ体重用量よりも効果的に高血糖を制御した。図１５が明らかにしているように、溶媒処置した糖尿病群（三角）及び驚くべきことに健常対照の非糖尿病群（菱形）よりも処置群（四角及び丸）の方が死亡率が有意に低かった。
【０１１１】
腹腔内耐糖能試験（ＩＰ  ＧＴＴ）は２×１０５個の新膵島／ｋｇ体重で処置した動物では正常であり、血中グルコースの上昇にはイヌのインスリンの放出が伴った：ＩＰ  ＧＴＴ（２ｇのグルコース／ｋｇ体重）は、方法に記載されているように２×１０５個のイヌ新膵島／ｋｇ体重用量または溶媒のいずれかで処置されているＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにてイヌ新膵島処置の５４日後（Ｌｉｎｂｉｔ療法の６６日後）に行った。図１６で分かるように、新膵島処置した動物のＩＰ  ＧＴＴは正常であった一方で、溶媒処置したマウスの血中グルコースのレベルはグルコース投与の２時間後上昇したままだった。
【０１１２】
耐糖能試験の間に集めた溶媒処置及び新膵島処置のマウスに由来する血清を、方法に記載されているようにマウスのインスリンと交差反応しないイヌ特異的なインスリンの存在についてＥＬＩＳＡによって調べた。図１６で分かるように、イヌのインスリンは新膵島処置の血清（斜線棒）にて検出されたが、溶媒処置マウスでは検出されなかった。健常なＣ５７Ｂｌ／６マウスの血清も同様に調べ、イヌのインスリンとマウスのインスリンの間で有意な交差反応はないことを保証した。有意な交差反応は観察されなかった。
【０１１３】
新膵島の回収は高血糖を再確立する：７６日目に、２×１０５個の新膵島／ｋｇ体重処置群から新膵島を取り出した。図１３が明らかにしているように、イヌ新膵島の取り出しは溶媒処置動物（白棒）と同様に動物のこの群（黒棒）にて高血糖の再確立を生じた。
【０１１４】
結論：実施例６で提示された結果は、少し前に発症した糖尿病動物にｉ．ｐ．投与された新しく形成したイヌ新膵島は、Ｔ１ＤＭの齧歯類にて、生体内で再分化して適正で且つ生理的なインスリン分泌及び耐久性のある、しかし、可逆性の正常血糖値の維持を提供すること実証している。加えて、大網の除去を介して集塊を除去する能力は臨床的に保証される場合、この技術の安全性の特徴である。
【０１１５】
実施例８：新膵島の追跡及び血管形成
論理的根拠：（Ａ）大網が種々のサイズの細胞及び異物を蓄積することは周知である。従って我々は仮説を立て、新膵島はｉ．ｐ．で送達されると大網によって取り込まれ、大網にて生着するかどうかを調べた。そのような位置は２つの利点を提供する：（ｉ）膵臓についての場合のように、大網からの血液は門脈系を介して直接肝臓に流れる。従って新膵島によって作られたインスリンは生理的な方法で送達されることになる。（ｉｉ）新膵島を取り除くことが安全性または他の理由で望ましいのであれば、大網は有意な悪影響がなく取り除くことができる。（Ｂ）ＭＳＣ及びＡＳＣは強力な血管形成因子及び生存因子を発現するので、我々はまた生着した新膵島の幹細胞成分が新膵島のための血液供給の発生を高めるかどうかも調べた。
【０１１６】
方法
野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに由来するＰ２の膵島細胞と、生体内で新膵島の追跡を円滑にするＧＦＰ＋遺伝子についてトランスジェニックであるＣ５７Ｂｌ／６マウスに由来するＰ５のＭＳＣとの低接着性容器における共培養から、マウスの新膵島を生成した。以下で示すように、実験の１群では、形成後、赤外線で励起できるカルボシアニンプローブＤｉＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）によって新膵島を染色し、生体内での追跡を可能にした。
【０１１７】
Ｐ２のイヌ膵島細胞と、生きている動物での追跡を可能にするＤｉＲで染色されているＰ４のイヌＡＳＣとの低接着性容器における共培養からイヌの新膵島を形成した。
【０１１８】
糖尿病モデル及び同種処置：メス非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスはおよそ１２〜２０週齢で自然発生的にＴ１ＤＭを発症する。メスＮＯＤマウスが高血糖（別々の３日で血中グルコース３００ｍｇ超／ｄＬ）であることが確認されたら、それらをＬｉｎｂｉｔペレットでｓ.ｃ.処置した。動物の血中グルコースのレベルが正常化されたら、新膵島（０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に懸濁させた２ｘ１０５個の新膵島／ｋｇ体重）または溶媒（０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地）を各５頭の動物の群にｉ．ｐ．投与した。その後の外来性のインスリンは各群の動物に与えなかった。血中グルコースのレベル及び体重を週に２回評価し、マウスを１０週間経過観察した。新膵島投与後１０週目に、動物を屠殺し、その血清、大網、肝臓、脾臓、腎臓及び膵臓を摘出した。
【０１１９】
イヌの新膵島の投与：ＤｉＲ標識したイヌの新膵島を６頭のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにｉ．ｐ．投与し、Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｐｅａｒｌ  Ｉｍｐｕｌｓｅ（商標）撮像装置を用いてイソフルラン麻酔下にてマウスを１０週間毎週調べ、新膵島を追跡した。
【０１２０】
同系新膵島の投与：一方は非糖尿病動物にて、もう一方は糖尿病動物にて２つの同系投与実験を行った。
【０１２１】
（Ａ）非糖尿病動物：非糖尿病Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの６群に、（ａ）０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２に懸濁させた２×１０５個の新しく形成したｇｆｐ＋マウス新膵島（５群）、または０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２（溶媒、１群）をｉ．ｐ．投与した。血中グルコースのレベル（ワンタッチウルトラ２血糖計）及び体重をベースラインで評価し、次いで全動物にて週に２回評価した。１２週目までの種々の時点で、動物の群を屠殺し、その血清、大網、肝臓、脾臓、肺、腎臓及び膵臓を摘出した。
【０１２２】
（Ｂ）糖尿病動物：ＳＴＺ−糖尿病Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの２群に、（ａ）ＤｉＲで染色し、０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２に懸濁させた２×１０５個の新しく形成したｇｆｐ＋マウス新膵島、または（ｂ）０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２（溶媒）のいずれかをｉ．ｐ．投与した。血中グルコースのレベル（ワンタッチウルトラ（商標）２血糖計）及び体重をベースラインで評価し、次いで全動物にて週に２回１３週間評価した。週に１回、Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｐｅａｒｌ  Ｉｍｐｕｌｓｅ撮像装置を用いてイソフルラン麻酔下にて動物を調べ、新膵島を追跡した。
【０１２３】
免疫組織化学法：大網及び他の臓器を以前記載されたように摘出し、固定し、包埋した１３。大網の切片を脱パラフィン化し、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）によってＤＮＡについて、及び製造元の指示書に従ってモルモット抗インスリン抗体（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）とｃｙ３を結合した抗モルモット抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を用いてインスリンタンパク質について、免疫組織化学法によって染色した。
【０１２４】
結果
新膵島はマウスの大網にて自然に生着し、インスリンを産生する。我々は、注射されたＮＩはマウスの十分に血管が発達した大網にホーミングし、付着し、生着し、それは肝臓の門脈系への生理的なインスリン分泌の利点を提供するという仮説を立てた。実際、図１８Ａで示すように、ＤｉＲ標識したＮＩで１０週前に処置された正常血糖のＮＯＤマウスの蛍光生体内画像化は、上部腹部におけるそれらの持続した位置を明らかにしている。
【０１２５】
図９で示された実験に由来するＮＩ処置したＮＯＤマウスの安楽死の際、図１８Ａで検出されたようなＤｉＲ標識したｅＧＦＰ＋ＮＩの腹腔内での生着パターン及び機能をさらに評価するために、我々は、ｅＧＦＰ＋ＮＩの存在について大網、膵臓、脾臓、肝臓、肺及び腎臓を組織学的に調べた。ＮＩは動物の大網でのみ検出された（図１８Ｂ）。さらに、大網の切片はインスリンについて陽性に染まった（図１８Ｃ、左のパネル）が、陰性対照（図１８Ｃ、挿入図）及び溶媒処置の糖尿病ＮＯＤマウスに由来する大網はインスリン染色を示さなかった（図１８Ｃ、右のパネル）。膵臓は予想どおり、高悪性度の膵島炎を有することが示され（図１７）、これは正常血糖値は膵島の回復によっては達成されず、むしろ、大網に生着したＮＩによる生理的なインスリンの分泌を介して達成されることを示している。重要なことに、調べた臓器のいずれにおいても腫瘍形成または異所性の不良分化（脂肪−、骨−、軟骨形成−）についての組織学的な証拠はなかった。
【０１２６】
結論：総合すれば、前述の結果は、種を超えて（ｉ）ｉ．ｐ．で投与される新膵島はそれらが長期にとどまり、再分化し、生理的な方法でインスリンを分泌する大網に生着し、拒絶されないことを明らかにしている。（ｉｉ）新膵島の幹細胞成分の血管形成特性は新膵島で血管形成するのに役立ち、必要とされる酸素、栄養、及び肝臓の門脈への新膵島からのインスリンの最適な送達をそれらに提供する。
【０１２７】
実施例９：ずっと前に発症した糖尿病の新膵島処置
論理的根拠：我々は実施例５にて、新膵島は少し前に発症したＴ１ＤＭを治療するのに有効であることを示した。我々はここで、新膵島がずっと前に発症したＴ１ＤＭを治療するのにも有効であるかどうかを調べた。
【０１２８】
方法
新膵島：イヌＡＳＣ（継代２）とイヌの培養した膵島細胞（継代１）とから新膵島を形成した。
【０１２９】
糖尿病モデル：クエン酸緩衝液中の７５ｍｇ／ｋｇ体重のストレプトゾトシン（ＳＴＺ）の３回のｉ．ｐ．投与によって非肥満の糖尿病／重症複合免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスを糖尿病にした。別々の３日での３００ｍｇ超／ｄＬの血中グルコースのレベルによって糖尿病状態を確認した。動物が糖尿病であると確認されたら、ｓ.ｃ.のＬｉｎｂｉｔペレットを用いたインスリン療法でほぼ３ヵ月間その血中グルコースのレベルを制御した。新膵島または溶媒の投与に先立って動物すべてが依然として糖尿病であることを確認するために、Ｌｉｎｂｉｔを失効させ、マウスはすべて高血糖を再発症した。マウスを再びＬｉｎｂｉｔで処置し（図１９の０日目）、血中グルコースのレベルを制御し、糖毒性の細胞損傷を防いだ。
【０１３０】
ＩＰ  ＧＴＴ及びインスリンＥＬＩＳＡを実施例５に記載されているように行い、結果を実施例６（少し前の発症）における動物のものと組み合わせ、図１６にて提示した。
【０１３１】
結果
ＳＴＺで誘導したＴ１ＤＭの３ヵ月後、それぞれ５頭の糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの２群を、（ａ）０．５ｍｌの無血清培地（ＤＭＥＭ−Ｆ１２）に懸濁させた２００，０００個の新しく形成したイヌ由来の新膵島／ｋｇ体重、または（ｂ）溶媒によってｉ．ｐ．で処置した。実験設計の概観は図１９にて与えられている。図１９で示すように、ずっと前に発症した糖尿病の動物はイヌ新膵島による処置に続いて正常血糖を示す（黒棒）が、溶媒で処置された動物はいったんインスリンペレットが失効すると高血糖のままである（白棒）。
【０１３２】
結論：上記のデータは、少し前に発症した糖尿病と同様に、ずっと前に発症した糖尿病で正常血糖値を確立するのにも新膵島は有効であることを実証している。
【０１３３】
実施例１０：自然発症糖尿病ＮＯＤマウスの同種マウス新膵島による処置
論理的根拠：我々は実施例５及び７にてイヌ新膵島がＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにてＳＴＺが誘導した糖尿病を元に戻すことができることを示した。上記で提示されたＮＯＤ／ＳＣＩＤのデータは、イヌに由来する細胞から生成された新膵島が生体内で安全に且つ効果的に再分化を受けてインスリンを産生し、生理的な様式でそれを長期に分泌することを示しているが、ＮＯＤ／ＳＣＩＤモデルは糖尿病誘発性の自己免疫及び同種免疫の攻撃から移植された細胞を保護するという課題には対処していない。ＡＳＣ及びＭＳＣは強力な免疫調節特性を示す１６。我々は、新膵島の幹細胞成分が局所の免疫隔離を提供するという仮説を立て、新膵島が、自然発症糖尿病ＮＯＤマウスに同種で投与された場合、正常血糖値を回復できるかどうかを調べた。
【０１３４】
方法
野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに由来するＰ２の膵島細胞と、ＧＦＰ＋遺伝子についてトランスジェニックのＣ５７Ｂｌ／６マウスに由来するＰ５のＭＳＣの低接着性容器における共培養からマウスの新膵島を生成した。
【０１３５】
自然発症糖尿病モデル及び同種処置：メスＮＯＤマウスが高血糖（別々の３日で３００ｍｇ超／ｄＬの血中グルコース）であると確認されたら、Ｌｉｎｂｉｔペレットでそれらをｓ.ｃ.処置した。動物の血中グルコースのレベルが正常化されたら、新膵島（０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に懸濁させた２×１０５個の新膵島／ｋｇ体重）または溶媒（０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地）を各５頭の動物の群にｉ．ｐ．投与した。いずれの群の動物にもその後の外来性のインスリンは与えなかった。血中グルコースのレベル及び体重を週に２回評価し、マウスを長期間経過観察した。
【０１３６】
結果
ｉ．ｐ．投与された２００，０００個用量の同種新膵島／ｋｇ体重は自然発症糖尿病のＮＯＤマウスにて正常血糖値を達成し、維持する。溶媒処置した及び新膵島処置したＮＯＤマウスの血中グルコースのレベルを図２０にて示す。要約すると、血中グルコースのレベルは同種新膵島で処置したマウス（黒棒）では正常化されたが、溶媒処置したマウス（白棒）は高血糖のままだった。
【０１３７】
結論：これらのデータは、イヌ新膵島と同様にマウス新膵島は（ｉ）生体内で再分化して適正なインスリン分泌を提供し、正常血糖値を取り戻し、維持すること、及び重要なことに、（ｉｉ）仮設を立てたようにそれらは被包されることなく同種及び自己の免疫攻撃双方に対する免疫隔離を提供することを実証している。
【０１３８】
実施例１１：新膵島は非糖尿病マウスにて低血糖を誘導しない
論理的根拠：前の実施例から、新膵島は、大網に生着し、それらが再分化してインスリンを産生し、分泌するのは明らかである。しかしながら、インスリン分泌が構成的で且つ非生理的であったなら、これは低血糖の症状の出現を招く可能性がある。従って、我々は非糖尿病動物への新膵島の投与が低血糖を生じることになるのかどうかを調べた。
【０１３９】
方法
野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに由来するＰ２の膵島細胞と、ＧＦＰ＋遺伝子についてトランスジェニックであるＣ５７Ｂｌ／６マウスに由来するＰ５のＭＳＣとの低接着性容器における共培養から、マウスの新膵島を生成した。
【０１４０】
Ｐ２のイヌ膵島細胞とＰ４のイヌＡＳＣとの低接着性容器における共培養からイヌの新膵島を形成した。
【０１４１】
マウス新膵島の投与：それぞれ２〜４頭の非糖尿病Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの６群に、（ａ）０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２に懸濁させた新しく形成した２×１０５個のマウス新膵島（５群）、または（ｂ）０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２（溶媒；１群）のいずれかをｉ．ｐ．で投与した。血中グルコースのレベル（ワンタッチウルトラ２血糖計）及び体重をベースラインで評価し、次いで週に２回１２週目まで評価した。
【０１４２】
イヌ新膵島の投与：ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの２群に（ａ）新しく形成した２×１０５個のイヌ新膵島（Ｎ＝６）、または（ｂ）０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２（溶媒；Ｎ＝３）のいずれかをｉ．ｐ．で投与した。血中グルコースのレベル（ワンタッチウルトラ２血糖計）及び体重をベースラインで評価し、次いで週に２回１０週間評価した。
【０１４３】
結果
新膵島は非糖尿病マウスにて低血糖を引き起こさない。実施例８及び図１８Ｂで示すように、ｉ．ｐ．で投与されたマウスまたはイヌの新膵島は大網にて生着する。図２１の上のパネルで分かるように、マウス新膵島で処置されたＣ５７Ｂｌ／６マウスの血中グルコースのレベルは正常で且つ溶媒処置したマウスのそれと同等のままである。イヌ新膵島で処置したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスについて同様の結果が得られた（図２１、下のパネル）。
【０１４４】
結論：これらのデータは、マウスまたはイヌの細胞のいずれかから形成され、生着した新膵島は生理的にであって、構成的にではなくインスリンを放出することを実証している。
【０１４５】
実施例１２：新膵島に含有される同種ＭＳＣ及び培養した膵島細胞はレシピエントにて抗体反応を引き出さない。
論理的根拠：先行する実施例は、本明細書に記載されている新膵島が同種で使用されて拒絶されることなく糖尿病動物にて正常血糖を取り戻すことを示している。新膵島によって同種で処置された動物が新膵島を構成する細胞型のいずれかに対して抗体を産生するかどうかをさらに調べるために以下の試験を企てた。
【０１４６】
方法
野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに由来するＰ２の膵島細胞とＣ５７Ｂｌ／６マウスに由来するＰ５のＭＳＣとの低接着性容器における共培養からマウスの新膵島を生成した。
【０１４７】
抗体反応試験：試験血清を（ａ）１×１０５個のｇｆｐ＋Ｃ５７Ｂｌ／６のＭＳＣ、または（ｂ）１×１０５個の培養したＣ５７Ｂｌ／６の膵島細胞と共に３０分間インキュベートした。陽性対照を１×１０５個のイヌＡＳＣとともにインキュベートした。陽性対照の血清を１×１０５個のイヌＡＳＣと共にインキュベートした。血清とのインキュベートの後、細胞を遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させ、フィコエリスリン（ＰＥ）標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と共にインキュベートした。細胞を室温にて暗所でさらに２０分間インキュベートした。次いで１ｍｌの１×ＰＢＳ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）＋１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加えた。細胞をボルテックスで撹拌し、次いで遠心分離し、固定緩衝液（１％ホルムアルデヒド）に再懸濁させ、ＦＡＣＳ（ＢＤ  ＦＡＣＳｃａｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，１０，０００個の細胞を数えた）によって解析した。
【０１４８】
結果
血清は
（ｉ）新膵島処置の１２週後、２×１０５個の新膵島／ｋｇ体重によってｉ．ｐ．処置されているＮＯＤマウス（実施例８を参照のこと）
（ｉｉ）溶媒処置の１２週後、溶媒によってｉ．ｐ．処置されているＮＯＤマウス（実施例８を参照のこと）
（ｉｉｉ）注入されていないＮＯＤマウス（ナイーブのマウス）
から得られた。
【０１４９】
新膵島由来のマウスＭＳＣ及び新膵島由来のマウス膵島細胞を回収した血清と共にインキュベートし、次いでフィコエリスリン（ＰＥ）標識した抗マウスＩｇＧ抗体と共にインキュベートした。次いで血清に曝露した細胞を方法にて上述のようなＦＡＣＳによって解析し、投与されたＭＳＣまたは膵島細胞に対するＩｇＧ抗体が処置されたマウスの血清に存在するかどうかを判定した。
【０１５０】
ＡＳＣの異種投与が免疫応答を引き出すことは知られているので、イヌＡＳＣ投与後１４日目のＮＯＤマウスに由来する血清に曝露されたＡＳＣをＰＥ標識した抗マウスＩｇＧ抗体と共にインキュベートし、ＦＡＣＳによって解析し、陽性対照として使用した。
【０１５１】
新膵島で処置したマウスが新膵島におけるＭＳＣまたは膵島細胞に対して同種免疫応答を発生したのであれば、そのときはＰＥ標識した抗マウスＩｇＧ抗体は血清に曝露した細胞に結合し、ＦＡＣＳ解析にて細胞はシフトして（ＰＥ陽性）見えることになる。ＦＡＣＳにおける細胞の７％超（ＰＥ陽性細胞の％）のシフトを陽性の同種抗体反応と見なした。
【０１５２】
図２２Ａ〜２２Ｃで示すように、同種新膵島で処置したマウスの血清は同種のマウスＭＳＣ（図２２Ａ）または膵島細胞（図２２Ｂ）に対するＩｇＧ抗体を含有していなかった。加えて、これらのデータは溶媒処置したＮＯＤマウスの血清がＭＳＣまたは脱分化した膵島細胞に対する予め形成されたＩｇＧ抗体を含有しなかったことを示唆している。予想どおり、イヌＡＳＣ（陽性対照）で処置したマウスの血清は細胞の９５％におけるシフトによって（図２２Ｃ）証拠付けされるようにイヌＡＳＣに対する高レベルのＩｇＧ抗体を含有した。
【０１５３】
ＮＯＤマウスは、ＮＩのＭＳＣ及び膵島細胞に対する同種免疫ＩｇＧ反応を開始しない。ＮＩに含有される膵島細胞及びＭＳＣが液性免疫攻撃から保護されるかどうかを調べるために、我々は、正常血糖のＮＩ処置したＮＯＤマウスの血清が投与されたＮＩを生成するのに使用されたＭＳＣまたは培養ＩＣのいずれかに対して向けられたＩｇＧ抗体を含有するかどうかを評価した。ＮＩ処置した正常血糖のＮＯＤマウスの血清がＭＳＣに向けられたＩｇＧ抗体も培養ＩＣに向けられたＩｇＧ抗体も含有しなかった一方で、陽性対照として使用され、同一数の同種（Ｃ５７Ｂｌ／６）の新しく単離された膵島細胞のｉ．ｐ．投与は強力な抗体反応を引き出した（図２３）。同種ＮＩを形成するのに使用された細胞に対するＩｇＧ抗体反応の欠如は、長期の正常血糖値の達成と共にさらに、本明細書に記載されているようなＮＩがその膵島細胞成分及びＭＳＣ成分に対する液性の同種免疫防御も提供することを示している。
【０１５４】
自己免疫応答の阻害。インスリン産生細胞によって自己免疫性のＴ１ＤＭを有効に治療するのに欠かせないのは、それらの細胞の自己免疫隔離であり、図９で提示された結果は、ＮＩ内のＩＣは処置されたＮＯＤマウスの自己免疫攻撃から保護されることを意味している。ＮＯＤマウスにおけるβ細胞の自己免疫破壊は、ヒトＴ１ＤＭでのように、自己反応性のＣＤ４＋Ｔｈ１細胞が介在し、マクロファージ、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴ細胞による膵島への浸潤が関与する膵島炎を特徴とする。単独でまたは膵島と合わせての同種ＡＳＣの投与は、ある程度、調節性Ｔ細胞の増殖を促進し、ここで確認されたＴｇｆｂ１の発現を介して免疫細胞の増殖を抑制することによって（図３、８Ａ及び８Ｂ）、及びイヌにおけるＩＤＯの上方調節によって（図４Ｃ）、糖尿病の動物及びヒトにて高血糖を緩和するまたは防ぐことが以前示されている。ＮＩのＭ／ＡＳＣ成分が同様のメカニズムを介してＮＯＤマウスの自己免疫攻撃から膵島細胞を保護する可能性を検証するために、我々は以下のような既知のＭＳＣ免疫調節メカニズムの精選セットをここで調べた。我々は、糖尿病ＮＯＤマウスの別の群を同種Ｃ５７Ｂｌ／６の膵島（Ｎ＝３）または同種ＮＩ（Ｎ＝３）でｉ．ｐ．処置した。１４日後、そのようなマウスを安楽死させ、その血液、膵臓、腎臓、肺、脾臓及び大網を摘出した。膵臓を組織学的に調べ、予想どおり膵島炎を示すことを明らかにした。脾臓を摘出し、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦＯＸＰ３、ＣＤ２５の陽性細胞の百分率についてＦＡＣＳによって調べた。摘出した大網をＦｏｘｐ３＋細胞の存在についてＩＨＣによって調べた。ＣＤ３／ＣＤ４及びＣＤ３／ＣＤ８二重陽性細胞の百分率は、膵島処置したＮＯＤマウスに対比させたＮＩ処置したＮＯＤマウスの脾臓細胞にて有意に低かったのに対して、ＣＤ４／ＣＤ２５二重陽性及びＣＤ４／ＣＤ２５／Ｆｏｘｐ３三重陽性のＴｒｅｇの百分率は膵島処置したＮＯＤマウスに対比させたＮＩ処置したＮＯＤマウスの脾臓にて有意に高かった（ＦＡＣＳ解析、図２４パネルａ〜ｄ）。同様に、ＮＩ処置したマウスの大網のＩＨＣ解析は溶媒処置したマウスのそれに対比させてＦｏｘｐ３陽性細胞の有意な増加を示した（図２４、パネルｅ）。調べた動物の数が少ないが、これらの結果は他の知見及びＮＩ及び特にＭ／ＡＳＣ成分が糖尿病誘発性自己免疫反応の調節を介してＴ１糖尿病マウスにて正常血糖を促進するという我々の仮説と一致する。上記のマウスの大網をＫｉ６７についても染色し、ＮＩ移植に関連する有意な細胞分裂があったかどうかを調べた。何も見いだされなかった。
【０１５５】
結論：上記のデータは、新膵島の投与が新膵島を構成するどの細胞型に対しても抗体反応を引き出さないということを示しており、新膵島が免疫隔離を提供し、拒絶反応抑制剤及び被包手段の必要性を排除するという仮説をさらに支持している。
【０１５６】
今日までの及び上で提示した我々の広範な試験管内及び生体内のデータは、同系及び同種の新膵島及び複数の種に由来する新膵島によるマウスにおける実験的Ｔ１ＤＭの治療は正常血糖値を効果的に取り戻すことができ、すなわち、Ｔ１ＤＭを治療することができ、且つ長期の経過観察の間、これを治療することができることを実証している。たとえば、新膵島の腫瘍形成性の形質転換または異所性の分化不良のような有害事象は観察されなかった。この新規の治療法は、１型糖尿病のペット動物（イヌ、ネコ）及びヒトの双方にてインスリン依存性の糖尿病の治療として使用することができる。
【０１５７】
実施例１３：同種膵島細胞を含有する新膵島を用いたインスリン依存性糖尿病の治療
インスリン依存性糖尿病を患っていると特定されたヒト対象に由来するＡＳＣ及び／またはＭＳＣと同種供給源に由来する膵島細胞とを用いて上記実施例で記載されているようにヒト細胞を含有する新膵島を生成する。得られる新膵島が対象に投与される。治療の数週間後、対象は改善された血糖管理を示す。
【０１５８】
実施例１４：同種膵島細胞と同種ＭＳＣ及び／またはＡＳＣを含有する新膵島を用いたインスリン依存性糖尿病の治療
幹細胞及び膵島細胞が、インスリン依存性糖尿病を患っていると特定されたヒト対象に対して同種である供給源に由来するＭＳＣ及び／またはＡＳＣと膵島細胞とを用いて上記実施例で記載されているようにヒト細胞を含有する新膵島を生成する。得られる新膵島が対象に投与される。治療の数週間後、対象は改善された血糖管理を示す。
【０１５９】
実施例１５：異種膵島細胞及び／または同種ＭＳＣ及び／またはＡＳＣを含有する新膵島を用いたインスリン依存性糖尿病の治療
幹細胞及び／または膵島細胞が、インスリン依存性糖尿病を患っていると特定されたヒト対象に対して異種である供給源に由来するＭＳＣ及び／またはＡＳＣと膵島細胞とを用いて上記実施例で記載されているようにヒト細胞を含有する新膵島を生成する。得られる新膵島が対象に投与される。治療の数週間後、対象は改善された血糖管理を示す。
【０１６０】
実施例１６：同種膵島細胞と補助的ＡＳＣ及び／またはＭＳＣを含有する新膵島を用いたインスリン依存性糖尿病の治療
インスリン依存性糖尿病を患っていると特定されたヒト対象に由来するＭＳＣ及び／またはＡＳＣと同種供給源に由来する膵島細胞とを用いて上記実施例で記載されているようにヒト細胞を含有する新膵島を生成する。得られる新膵島が対象に投与され、補助的ヒトＡＳＣ／ＭＳＣも対象に投与される。治療の数週間後、対象は改善された血糖管理を示す。
【０１６１】
実施例１７：同種膵島細胞と同種ＭＳＣ及び／またはＡＳＣと補助的ＡＳＣ及び／またはＭＳＣを含有する新膵島を用いたインスリン依存性糖尿病の治療
幹細胞及び膵島細胞が、インスリン依存性糖尿病を患っていると特定されたヒト対象に対して同種である供給源に由来するＡＳＣ及び／またはＭＳＣと膵島細胞とを用いて上記実施例で記載されているようにヒト細胞を含有する新膵島を生成する。得られる新膵島が対象に投与され、補助的ヒトＡＳＣ／ＭＳＣも対象に投与される。治療の数週間後、対象は改善された血糖管理を示す。
【０１６２】
実施例１８：異種膵島細胞及び／または同種ＭＳＣ及び／またはＡＳＣと補助的ＡＳＣ及び／またはＭＳＣを含有する新膵島を用いたインスリン依存性糖尿病の治療
幹細胞及び／なたは膵島細胞が、インスリン依存性糖尿病を患っていると特定されたヒト対象に対して異種である供給源に由来するＡＳＣ及び／またはＭＳＣと膵島細胞とを用いて上記実施例で記載されているようにヒト細胞を含有する新膵島を生成する。得られる新膵島が対象に投与され、補助的ヒトＡＳＣ／ＭＳＣも対象に投与される。治療の数週間後、対象は改善された血糖管理を示す。
【０１６３】
実施例１９：再分化した膵島細胞及び／または同種ＭＳＣ及び／またはＡＳＣを含有する新膵島を用いたインスリン依存性糖尿病の治療
幹細胞及び／または膵島細胞が、インスリン依存性糖尿病を患っていると特定されたヒト対象に対して同種である供給源に由来するＡＳＣ及び／またはＭＳＣと膵島細胞とを用いて上記実施例で記載されているようにヒト細胞を含有する新膵島を生成する。新膵島は生体外で再分化した。再分化した新膵島が対象に投与される。治療の数週間後、対象は改善された血糖管理を示す。
【０１６４】
実施例２０：再分化した膵島細胞及び／または同種ＭＳＣ及び／またはＡＳＣと補助的ＡＳＣ及び／またはＭＳＣを含有する新膵島を用いたインスリン依存性糖尿病の治療
幹細胞及び／または膵島細胞が、インスリン依存性糖尿病を患っていると特定されたヒト対象に対して同種である供給源に由来するＡＳＣ及び／またはＭＳＣと膵島細胞とを用いて上記実施例で記載されているようにヒト細胞を含有する新膵島を生成する。新膵島は生体外で再分化する。再分化した新膵島が対象に投与され、補助的ヒトＡＳＣ／ＭＳＣも対象に投与される。治療の数週間後、対象は改善された血糖管理を示す。
【０１６５】
実施例２１：同種膵島細胞を含有する新膵島を用いた２型糖尿病の治療
インスリン療法は２型糖尿病を患っている患者で使用されている、たとえば、参照によって本明細書に援用される、Ｋ．Ｈｏｒｖａｔｈ，Ｋ．Ｊｅｉｔｌｅｒ，Ａ．Ｂｅｒｇｈｏｌｄ，Ｓ．Ｈ．Ｅｂｒａｈｉｍ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒａｔｚｅｒ，Ｊ．Ｐｌａｎｋ，Ｔ．Ｋａｉｓｅｒ，Ｔ．Ｒ．Ｐｉｅｂｅｒ及びＡ．Ｓｉｅｂｅｎｈｏｆｅｒ，“Ｌｏｎｇ‐ａｃｔｉｎｇ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｖｅｒｓｕｓ  ＮＰＨ  ｉｎｓｕｌｉｎ  （ｈｕｍａｎ  ｉｓｏｐｈａｎｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ）  ｆｏｒ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ，”Ｃｏｃｈｒａｎｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００７，Ｉｓｓｕｅ，２，Ａｒｔ．Ｎｏ．：ＣＤ００５６１３，ＤＯＩ：１０．１００２／１４６５１８５８．ＣＤ００５６１３．ｐｕｂ３を参照のこと。２型糖尿病を患っていると特定されたヒト対象に由来するＡＳＣ及び／またはＭＳＣと同種供給源に由来する膵島細胞とを用いて上述の実施例で記載されているようにヒト細胞を含有する新膵島を生成する。得られる新膵島が対象に投与される。治療の数週間後、対象は改善された血糖管理を示す。その間、対象は経口血糖降下剤及び／またはインスリンで治療される。
【０１６６】
実施例２２：同種膵島細胞と同種ＭＳＣ及び／またはＡＳＣを含有する新膵島を用いた２型糖尿病の治療
幹細胞及び膵島細胞が２型糖尿病を患っていると特定されたヒト対象に対して同種である供給源に由来するＡＳＣ及び／またはＭＳＣと膵島細胞とを用いて上述の実施例で記載されているようにヒト細胞を含有する新膵島を生成する。得られる新膵島が対象に投与される。治療の数週間後、対象は改善された血糖管理を示す。その間、対象は経口血糖降下剤及び／またはインスリンで治療される。
【０１６７】
実施例２３：異種膵島細胞及び／または同種ＭＳＣ及び／またはＡＳＣを含有する新膵島を用いた２型糖尿病の治療
幹細胞及び／または膵島細胞が２型糖尿病を患っていると特定されたヒト対象に対して異種である供給源に由来するＡＳＣ及び／またはＭＳＣと膵島細胞とを用いて上述の実施例で記載されているようにヒト細胞を含有する新膵島を生成する。得られる新膵島が対象に投与される。治療の数週間後、対象は改善された血糖管理を示す。その間、対象は経口血糖降下剤及び／またはインスリンで治療される。
【０１６８】
実施例２４：同種膵島細胞と補助的ＡＳＣ及び／またはＭＳＣを含有する新膵島を用いた２型糖尿病の治療
２型糖尿病を患っていると特定されたヒト対象に由来するＡＳＣ及び／またはＭＳＣと同種供給源に由来する膵島細胞とを用いて上述の実施例で記載されているようにヒト細胞を含有する新膵島を生成する。得られる新膵島が対象に投与され、補助的ヒトＡＳＣ／ＭＳＣも対象に投与される。治療の数週間後、対象は改善された血糖管理を示す。その間、対象は経口血糖降下剤及び／またはインスリンで治療される。
【０１６９】
実施例２５：同種膵島細胞と同種ＭＳＣ及び／またはＡＳＣと補助的ＡＳＣ及び／またはＭＳＣを含有する新膵島を用いた２型糖尿病の治療
幹細胞及び膵島細胞が２型糖尿病を患っていると特定されたヒト対象に対して同種である供給源に由来するＡＳＣ及び／またはＭＳＣと膵島細胞とを用いて上述の実施例で記載されているようにヒト細胞を含有する新膵島を生成する。得られる新膵島が対象に投与され、補助的ヒトＡＳＣ／ＭＳＣも対象に投与される。治療の数週間後、対象は改善された血糖管理を示す。その間、対象は経口血糖降下剤及び／またはインスリンで治療される。
【０１７０】
実施例２６：異種膵島細胞及び／または同種ＭＳＣ及び／またはＡＳＣと補助的ＡＳＣ及び／またはＭＳＣを含有する新膵島を用いた２型糖尿病の治療
幹細胞及び／または膵島細胞が２型糖尿病を患っていると特定されたヒト対象に対して異種である供給源に由来するＡＳＣ及び／またはＭＳＣと膵島細胞とを用いて上述の実施例で記載されているようにヒト細胞を含有する新膵島を生成する。得られる新膵島が対象に投与され、補助的ヒトＡＳＣ／ＭＳＣも対象に投与される。治療の数週間後、対象は改善された血糖管理を示す。その間、対象は経口血糖降下剤及び／またはインスリンで治療される。
【０１７１】
実施例２７：再分化した膵島細胞及び／または同種ＭＳＣ及び／またはＡＳＣを含有する新膵島を用いた２型糖尿病の治療
幹細胞及び／または膵島細胞が２型糖尿病を患っていると特定されたヒト対象に対して同種である供給源に由来するＡＳＣ及び／またはＭＳＣと膵島細胞とを用いて上述の実施例で記載されているようにヒト細胞を含有する新膵島を生成する。新膵島は生体外で再分化する。再分化した新膵島が対象に投与される。治療の数週間後、対象は改善された血糖管理を示す。その間、対象は経口血糖降下剤及び／またはインスリンで治療される。
【０１７２】
実施例２８：再分化した膵島細胞及び／または同種ＭＳＣ及び／またはＡＳＣと補助的ＡＳＣ及び／またはＭＳＣを含有する新膵島を用いた２型糖尿病の治療
幹細胞及び／または膵島細胞が２型糖尿病を患っていると特定されたヒト対象に対して同種である供給源に由来するＡＳＣ及び／またはＭＳＣと膵島細胞とを用いて上述の実施例で記載されているようにヒト細胞を含有する新膵島を生成する。新膵島は生体外で再分化する。再分化した新膵島が対象に投与され、補助的ヒトＡＳＣ／ＭＳＣも対象に投与される。治療の数週間後、対象は改善された血糖管理を示す。その間、対象は経口血糖降下剤及び／またはインスリンで治療される。
【０１７３】
実施例２９：新膵島の投与
新膵島がインスリン依存性糖尿病を患っている対象に静脈内で投与される上述の実施例のいずれか１つに記載されているように生成される新膵島。治療の数週間後、対象は改善された血糖管理を示す。
【０１７４】
実施例３０：新膵島の投与
新膵島が２型糖尿病を患っている対象に静脈内で投与される上述の実施例のいずれか１つに記載されているように生成される新膵島。治療の数週間後、対象は改善された血糖管理を示す。
【０１７５】
実施例３１：新膵島の投与
新膵島がインスリン依存性糖尿病を患っている対象に皮下で投与される上述の実施例のいずれか１つに記載されているように生成される新膵島。治療の数週間後、対象は改善された血糖管理を示す。
【０１７６】
実施例３２：新膵島の投与
新膵島が２型糖尿病を患っている対象に皮下で投与される上述の実施例のいずれか１つに記載されているように生成される新膵島。治療の数週間後、対象は改善された血糖管理を示す。
【０１７７】
実施例３３：新膵島を用いた前糖尿病の治療
上述の実施例のいずれか１つに記載されているように生成された新膵島が損傷した耐糖能または前糖尿病を患っている対象に投与される。治療の数週間後、対象は改善された血糖管理を示す。
【０１７８】
参考文献（そのそれぞれの全体の内容がこの参照によって本明細書に援用される）
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１２．  Ｌａｎｇｅ，Ｃ．，Ｆ．Ｔoｇｅｌ，Ｈ．Ｉｔｔｒｉｃｈ，Ｆ．Ｃｌａｙｔｏｎ，Ｃ．Ｎｏｌｔｅ−Ｅｒｎｓｔｉｎｇ，Ａ．Ｒ．Ｚａｎｄｅｒ，及びＣ．Ｗｅｓｔｅｎｆｅｌｄｅｒ：Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｆｒｏｍ  ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｎａｌ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｉｎ  ｒａｔｓ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．６８：１６１３−７，２００５．
１３．  Ｔoｇｅｌ，Ｆ．，Ｚ．Ｈｕ，Ｋ．Ｗｅｉｓｓ，Ｊ．Ｉｓａａｃ，Ｃ．Ｌａｎｇｅ，及びＣ．Ｗｅｓｔｅｎｆｅｌｄｅｒ：Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｎａｌ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８９：Ｆ３１−４２，２００５．
１４．  Ｔoｇｅｌ，Ｆ．，Ｋ．Ｗｅｉｓｓ，Ｙ．Ｙａｎｇ，Ｚ．Ｈｕ，Ｐ．Ｚｈａｎｇ，及びＣ．Ｗｅｓｔｅｎｆｅｌｄｅｒ：Ｖａｓｃｕｌｏｔｒｏｐｉｃ，  ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎｆｕｓｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｆｒｏｍ  ａｃｕｔｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ｉｎｊｕｒｙ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９２：Ｆ１６２６−３５，２００７．
１５．  Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，Ｍ．Ｆ．，Ａ．Ｍ．Ｍａｃｋａｙ，Ｓ．Ｃ．Ｂｅｃｋ，Ｒ．Ｋ．Ｊａｉｓｗａｌ，Ｒ．Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｊ．Ｄ．Ｍｏｓｃａ，Ｍ．Ａ．Ｍｏｏｒｍａｎｄ．Ｗ．Ｓｉｍｏｎｅｔｔｉ，Ｓ．Ｃｒａｉｇ，及びＤ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ：Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４：１４３−７，１９９９．
１６．  Ｃｒｏｐ，Ｍ．Ｊ．，Ｃ．Ｃ．Ｂａａｎ，Ｓ．Ｓ．Ｋｏｒｅｖａａｒ，Ｊ．Ｎ．Ｍ．ＩＪｚｅｒｍａｎｓ，Ｉ．Ｐ．Ｊ．Ａｌｗａｙｎ，Ｗ．Ｗｅｉｍａｒ，及びＭ．Ｊ．Ｈｏｏｇｄｕｉｊｎ：Ｄｏｎｏｒ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓ  Ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，８７：８９６−９０６，２００９
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４】
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【外国語明細書】
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