(57)【要約】【課題】カンナビノイドの大規模作製を可能にして治療的に使用できるシステム及び方法を提案する【解決手段】本発明は、一つ又は複数のカンノビノイド生成物の作成する条件を修正することによって様々な比率でカンノビノイド生成物を作製する装置及び方法を開示している。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）又はカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）を所定量で作製する装置であって、
（ａ）カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）、カンナビノイド酸合成酵素、及び溶媒と両親媒性化合物とを含む反応混合物の第１の自動供給装置、並びに（ｂ）反応を止める第２の自動システムを動作させるように構成される自動供給システムを備えるバイオリアクターと、
テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）又はカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）を回収するように構成される抽出装置と、
テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）又はカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）を所定量で作製するために前記反応混合物のｐＨを変更し、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）から所定量のテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）又はカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）への変換率に影響を与えるために前記反応混合物における前記両親媒性化合物の濃度を調整するように構成される制御装置と、
を備える、装置。
【請求項２】
前記カンナビノイド酸合成酵素がテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡ合成酵素）又はカンナビジオール酸合成酵素（ＣＢＤＡ合成酵素）である、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記カンナビノイド酸合成酵素が固体支持体に固定化される、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記カンナビノイド酸合成酵素が組み換えカンナビノイド酸合成酵素であり、前記装置が該組み換えカンナビノイド酸合成酵素を大規模で作製するシステムを更に備える、請求項２に記載の装置。
【請求項５】
前記ｐＨが約３．８〜約８．０の範囲である、請求項２に記載の装置。
【請求項６】
前記溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びイソプロピルアルコールの１つ又は複数であり、前記反応混合物における該溶媒の量が５％〜３０％（ｗ／ｖ）である、請求項２に記載の装置。
【請求項７】
前記両親媒性化合物が界面活性剤又はシクロデキストリンである、請求項２に記載の装置。
【請求項８】
前記シクロデキストリンがα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン又はγ−シクロデキストリンである、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記シクロデキストリンがスルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム塩又は無作為メチル化β−シクロデキストリンであり、前記反応混合物におけるシクロデキストリンの濃度が２ｍｇ／ｍｌ〜２８ｍｇ／ｍｌである、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記反応混合物におけるシクロデキストリンの濃度が８ｍｇ／ｍｌである、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）又はカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）が、エナンチオマー純度が少なくとも９５％の単一エナンチオマーである、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記カンナビノイド酸合成酵素がＴＨＣＡ合成酵素であり、前記両親媒性化合物がシクロデキストリンであり、シクロデキストリンとカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）との質量対質量比が２８：１であるか、又はシクロデキストリンとカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）とのモル比が７．３：１である、請求項５に記載の装置。
【請求項１３】
前記カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）の９８％が２時間以内にテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）に変換される、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
前記カンナビノイド酸合成酵素がＣＢＤＡ合成酵素であり、前記両親媒性化合物がシクロデキストリンであり、シクロデキストリンとカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）との質量対質量比が１１：１であるか、又はシクロデキストリンとカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）とのモル比が４：１である、請求項５に記載の装置。
【請求項１５】
前記カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）の９８％が２時間以内にカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）に変換される、請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記組み換えカンナビノイド酸合成酵素を大規模で作製するシステムが、該組み換えカンナビノイド酸合成酵素を過剰発現するシステムを含む、請求項４に記載の装置。
【請求項１７】
前記カンナビノイド酸合成酵素が酵母又は大腸菌中で過剰発現される、請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
異なる比率のテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）、又は異なる比率のカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）を作製する装置であって、
（ｉ）（ａ）カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）、カンナビノイド酸合成酵素及び反応混合物の第１の自動供給を実行するように構成される自動供給システム、並びに（ｂ）反応を止める第２の自動システムを備えるバイオリアクターと、
（ｉｉ）前記反応混合物の特性を変更するように構成される制御装置と、
（ｉｉｉ）作製されたテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）又はカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）を回収するように構成される抽出装置と、を備え、
前記反応混合物の特性が反応混合物のｐＨ、反応溶媒の濃度又は両親媒性化合物の濃度の１つ又は複数の特性であり、
前記カンナビノイド酸合成酵素が配列番号１若しくは配列番号３によって表される核酸配列、又は、配列番号２若しくは配列番号４を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含むテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡ合成酵素）である場合に、テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）を作製し、又は
前記カンナビノイド酸合成酵素が配列番号５若しくは配列番号７によって表される核酸配列、または配列番号６若しくは配列番号８を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含むカンナビジオール酸合成酵素（ＣＢＤＡ合成酵素）である場合にカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）を作製し、前記両親媒性化合物が界面活性剤又はシクロデキストリンである装置。
【請求項１９】
前記カンナビノイド酸合成酵素が固体支持体に固定化される、請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
前記カンナビノイド酸合成酵素が天然又は合成カンナビノイド酸合成酵素である、請求項１８に記載の装置。
【請求項２１】
前記カンナビノイド酸合成酵素が組み換えカンナビノイド酸合成酵素であり、前記装置が該組み換えカンナビノイド酸合成酵素を大規模で作製するシステムを更に備える、請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
前記組み換えカンナビノイド酸合成酵素を作製するシステムが、該カンナビノイド酸合成酵素を過剰発現するシステムを含む、請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
前記システムは前記カンナビノイド酸合成酵素を酵母又は大腸菌中で過剰発現する、請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
前記反応混合物が溶媒及び両親媒性化合物を含み、前記反応混合物中の両親媒性化合物は界面活性剤又はシクロデキストリンである請求項１８に記載の装置。
【請求項２５】
前記反応混合物中の前記溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びイソプロピルアルコールの１つ又は複数であり、前記反応混合物における該溶媒の濃度が５％〜３０％（ｗ／ｖ）である、請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
前記反応混合物中の前記両親媒性化合物がシクロデキストリンである、請求項２４に記載の装置。
【請求項２７】
前記反応混合物中の前記シクロデキストリンがα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン又はγ−シクロデキストリンである、請求項２６に記載の装置。
【請求項２８】
前記反応混合物中の前記シクロデキストリンがスルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム塩又は無作為メチル化β−シクロデキストリンであり、前記反応混合物におけるシクロデキストリンの濃度が２ｍｇ／ｍｌ〜２８ｍｇ／ｍｌである、請求項２７に記載の装置。
【請求項２９】
前記反応混合物におけるシクロデキストリンの濃度が８ｍｇ／ｍｌである、請求項２８に記載の装置。
【請求項３０】
このようにして作製された前記テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）又はカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）が、エナンチオマー純度が少なくとも９５％の単一エナンチオマーである、請求項１８記載の装置。
【請求項３１】
前記カンナビノイド酸合成酵素がＴＨＣＡ合成酵素であり、シクロデキストリンとカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）との質量対質量比が２８：１であるか、又はシクロデキストリンとカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）とのモル比が７．３：１である、請求項２６に記載の装置。
【請求項３２】
前記カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）の９８％が２時間以内にテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）に変換される、請求項３１に記載の装置。
【請求項３３】
前記カンナビノイド酸合成酵素がＣＢＤＡ合成酵素であり、シクロデキストリンとカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）との質量対質量比が１１：１であるか、又はシクロデキストリンとカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）とのモル比が４：１である、請求項２６に記載の装置。
【請求項３４】
前記カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）の９８％が２時間以内にカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）に変換される、請求項３３に記載の装置。
【請求項３５】
前記反応混合物の特性が該反応混合物のｐＨであり、前記制御装置により該ｐＨを約３．８〜約８．０の範囲で変更する、請求項１８に記載の装置。
【請求項３６】
前記反応混合物の特性が前記両親媒性化合物の濃度であり、前記制御装置により該反応混合物における該両親媒性化合物の濃度を２ｍｇ／ｍｌ〜２８ｍｇ／ｍｌで変更する、請求項２４に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０１４年８月２５日付けで出願された米国仮特許出願第６２／０４１，５２１号（その内容全体が引用することにより本明細書の一部をなす）の優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明はカンナビノイドの生合成に関する。特に、本発明はカンナビノイドの合成に関与する酵素の作製及び操作、並びに異なる比率での様々なカンナビノイドの同時合成に関する。
【背景技術】
【０００３】
カンナビノイドは、アサ科に属する一年生植物であるカンナビス・サティバ（Cannabis sativa：アサ）中に見られるテルペノフェノール（terpenophenolic）化合物である。この植物は、４００を超える化学物質及びおよそ７０のカンナビノイドを含有する。カンナビノイドは主に腺状突起に蓄積する。天然に存在するカンナビノイドの中でもテトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）が最も活性が高く、緑内障、ＡＩＤＳ消耗症候群、神経障害性疼痛を含む広範な医学的状態の治療、多発性硬化症に伴う痙縮、線維筋痛及び化学療法による嘔気の治療に使用される。ＴＨＣはアレルギー、炎症、感染、癲癇、抑欝、片頭痛、双極性障害、不安障害、薬物依存症及び薬物離脱症候群の治療にも効果的である。
【０００４】
付加的な活性カンナビノイドとしては、急性及び慢性の神経変性に対する保護をもたらすことが知られる強力な抗酸化物質及び抗炎症性化合物であるＴＨＣの異性体のカンナビジオール（ＣＢＤ）、高親和性α２−アドレナリン受容体作動薬、中親和性５−ＨＴ１Ａ受容体拮抗薬及び低親和性ＣＢ１受容体拮抗薬として作用し、抗鬱活性を有する可能性がある大麻中に高濃度で見られるカンナビゲロール（ＣＢＧ）、並びに抗炎症、抗真菌及び抗ウイルス特性を有するカンナビクロメン（ＣＢＣ）が挙げられる。多くの植物性カンナビノイド（phytocannabinoids：フィトカンナビノイド）が様々な疾患における治療可能性を有し、植物防御及び薬理学において関連した役割を果たし得る。したがって、治療特性を有するカンナビノイド及びカンナビノイド様化合物の生物工学的作製が極めて重要である。このように、カンナビノイドは様々な疾患の治療におけるそれらの有益な効果から有望な作用物質であるとみなされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
それらの既知の有益な効果にもかかわらず、カンナビノイドの治療的使用は植物の大規模な生育及び維持と関連した高いコスト、並びに高収率のカンナビノイドを得ることの難しさにより阻まれている。植物組織からのカンナビノイドの抽出、単離及び精製は、カンナビノイドが容易に酸化し、光及び熱による影響を受けやすいために特に困難である。加えて、ＣＢＣＡが主として酵素であるＣＢＣＡ合成酵素によってＣＢＧＡから合成されることが仮定されているが、この酵素は単離又はクローニングされてない。したがって、治療的使用のためのカンナビノイドの大規模作製を可能にする手法を開発する必要がある。本発明はこの必要性に対処するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本発明の目的は上述の当該技術分野における欠点の解決策を提供することである。この目的で、本発明は１つ又は複数のカンナビノイド又はカンナビノイド類似体を作製する方法であって、（ａ）式Ｉによる化合物：
【化１】
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を選択する工程と、（ｂ）式Ｉによる化合物を１つ又は複数のカンナビノイド又はカンナビノイド類似体へと変換する触媒としてカンナビノイド酸合成酵素を選択する工程と、（ｃ）式Ｉの化合物とカンナビノイド酸合成酵素とを溶媒及び両親媒性化合物を含む反応混合物中で反応させる工程と、（ｄ）工程（ｃ）において作製された１つ又は複数のカンナビノイド酸又はカンナビノイド類似体を反応混合物から単離する工程と、（ｅ）任意に、工程（ｃ）において単離されたカンナビノイド酸又はカンナビノイド類似体を脱炭酸する工程とを含む、方法を提供する（式中、Ｒは−ＯＨ、ハロゲン、−ＳＨ又は−ＮＲａＲｂ基から選択され、Ｒ１及びＲ２は各々独立して−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＲａ、任意に置換されたＣ１〜Ｃ１０直鎖若しくは分岐アルキレン、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０直鎖若しくは分岐アルケニレン、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０直鎖若しくは分岐アルキニレン、任意に置換されたＣ３〜Ｃ１０アリール、任意に置換されたＣ３〜Ｃ１０シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン及び（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニレンからなる群から選択されるか、又はＲ１及びＲ２はそれらが結合する炭素原子とともにＣ５〜Ｃ１０環式環を形成し、Ｒ３はＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ及びＣ１〜Ｃ１０直鎖又は分岐アルキルからなる群から選択され、Ｒａ及びＲｂは各々独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ１０）直鎖若しくは分岐アルキル又はＣ３〜Ｃ１０シクロアルキルである）。
【０００７】
好ましくは、カンナビノイド酸合成酵素はカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）合成酵素又はテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）合成酵素である。本発明の好ましい態様では、Ｃ５〜Ｃ１０環式環は酸素、硫黄又は窒素から選択される１つ又は複数のヘテロ原子を含む。本発明の別の好ましい態様では、Ｒ２はＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、Ｃ３Ｈ７、Ｃ４Ｈ９、Ｃ５Ｈ１１、Ｃ６Ｈ１３、Ｃ７Ｈ１５及びＣ８Ｈ１７からなる群から選択される直鎖アルキレンである。好ましくは、Ｒ２は、
【化２】
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からなる群から選択されるＣ２〜Ｃ１０アルケニレンであり、Ｒ４はＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、Ｃ３Ｈ７、Ｃ４Ｈ９、Ｃ５Ｈ１１、Ｃ６Ｈ１３、Ｃ７Ｈ１５及びＣ８Ｈ１７からなる群から選択される直鎖アルキレンである。別の好ましい態様では、Ｒ２は、
【化３】
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からなる群から選択されるＣ２〜Ｃ１０直鎖又は分岐アルキニレンである。
【０００８】
付加的な好ましい実施の形態では、Ｒ２は、
【化４】
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（式中、Ｘは−ＯＨ、−ＳＨ又は−ＮＲａＲｂであり、Ｒａ及びＲｂは各々独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ１０）直鎖若しくは分岐アルキル又はＣ３〜Ｃ１０シクロアルキルである）である。最も好ましくは、Ｒは−ＯＨであり、Ｒ１は−ＣＯＯＨであり、Ｒ２はＣ５Ｈ１１であり、Ｒ３は−Ｈである。
【０００９】
一実施の形態では、カンナビノイド酸合成酵素は、カンナビノイド酸合成酵素遺伝子の１つ又は複数のコピーを生成し、カンナビノイド酸合成酵素遺伝子によってコードされるタンパク質を過剰発現させることによって得られる組み換えカンナビノイド酸合成酵素である。本発明の好ましい態様では、カンナビノイド酸合成酵素遺伝子の１つ又は複数のコピーをｉｎ  ｖｉｖｏで生成し、上記方法はカンナビノイド酸合成酵素遺伝子の１つ又は複数のコピーを真核生物宿主のゲノムに組み込み、タンパク質発現をスケールアップする工程（ｉ）を含む。好ましくは、真核生物宿主はピキア・パストリス（Pichia pastoris）であり、カンナビノイド酸合成酵素遺伝子はタンパク質分泌を標的とするようにα分泌配列でコドン最適化され、６個のタンデムヒスチジン残基でタグ付けされる。工程（ｉ）は、カンナビノイド酸合成酵素遺伝子を１つ又は複数の制限酵素での消化によって線状化し、カンナビノイド酸合成酵素遺伝子をゲル抽出によって抽出し、カンナビノイド酸合成酵素遺伝子をピキア・パストリスプラスミドにライゲートし、プラスミドを細菌細胞に電気穿孔して、１つ又は複数のカンナビノイド酸合成酵素遺伝子コピーのコロニーを生成することを含み得る。
【００１０】
本発明の好ましい態様では、溶媒はＤＭＳＯであり、反応混合物におけるＤＭＳＯの濃度は２０％（ｗ／ｖ）である。付加的な好ましい態様では、両親媒性化合物は界面活性剤又はシクロデキストリンである。好ましい実施の形態では、シクロデキストリンはα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン又はγ−シクロデキストリンである。更により好ましくは、シクロデキストリンはスルホブチルエーテル（sulfobutylether）β−シクロデキストリンナトリウム塩又は無作為メチル化β−シクロデキストリンであり、反応混合物におけるシクロデキストリンの濃度は２ｍｇ／ｍｌ〜２８ｍｇ／ｍｌである。最も好ましい実施の形態では、反応混合物におけるシクロデキストリンの濃度は８ｍｇ／ｍｌである。
【００１１】
一実施の形態では、カンナビノイド又はカンナビノイド類似体は、エナンチオマー純度が少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の単一エナンチオマーである。
【００１２】
好ましい実施の形態では、カンナビノイド酸合成酵素はＴＨＣＡ合成酵素であり、１つ又は複数のカンナビノイド又はカンナビノイド類似体はテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）、ＴＨＣＡ及びＣＢＣＡ、又はそれらの類似体である。好ましい態様では、両親媒性化合物はシクロデキストリンであり、シクロデキストリンと式Ｉの化合物との質量対質量比は２８：１であるか、又はシクロデキストリンと式Ｉの化合物とのモル比は７．３：１である。好ましくは、反応の工程（ｃ）を３．８〜７．２の範囲のｐＨで行い、上記方法により各々の指定したｐＨでＴＨＣＡ、ＣＢＣＡ、又はＴＨＣＡ及びＣＢＣＡを以下の表に示される比率で作製する。
【００１３】
【表１】
2020036617.tif 000007
【００１４】
好ましくは、式Ｉの化合物の９８％が２時間以内に１つ又は複数のカンナビノイド又はカンナビノイド類似体に変換される。
【００１５】
異なる実施の形態では、カンナビノイド酸合成酵素はＣＢＤＡ合成酵素であり、上記方法によりカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）、ＣＢＤＡ及びＣＢＣＡ、又はそれらの類似体を作製する。好ましくは、両親媒性化合物はシクロデキストリンであり、シクロデキストリンと式Ｉの化合物との質量対質量比は１１：１であるか、又はシクロデキストリンと式Ｉの化合物とのモル比は４：１である。好ましくは、工程（ｃ）を３．８〜７．２の範囲のｐＨで行う。好ましい実施の形態では、上記方法により各々の指定したｐＨでＣＢＤＡ、ＣＢＣＡ、又はＣＢＤＡ及びＣＢＣＡを以下の表に示される比率で作製する。
【００１６】
【表２】
2020036617.tif 000008
【００１７】
最も好ましくは、式Ｉの化合物の９８％が２時間以内に１つ又は複数のカンナビノイド又はカンナビノイド類似体に変換される。
【００１８】
異なる実施の形態では、本発明は１つ又は複数の式ＩＩによるカンナビノイド又はカンナビノイド類似体：
【化５】
2020036617.tif 000009
を作製する方法であって、（ａ）式ＩＩＩによる化合物と式ＩＶによる化合物とを：
【化６】
2020036617.tif 000010
式ＩＩＩの化合物と式ＩＶの化合物との反応を触媒する酵素の存在下で反応させ、式ＩＩの化合物を形成する工程と、（ｂ）式ＩＩの化合物とカンナビノイド酸合成酵素とを溶媒及び両親媒性化合物を含む反応混合物中で反応させ、１つ又は複数のカンナビノイド又はカンナビノイド類似体を作製する工程と、（ｃ）工程（ｂ）において作製された１つ又は複数のカンナビノイド又はカンナビノイド類似体を反応混合物から単離する工程と、（ｅ）任意に、工程（ｃ）において単離された１つ又は複数のカンナビノイド又はカンナビノイド類似体を脱炭酸する工程とを含む、方法を提供する（式中、Ｒは−ＯＨ、ハロゲン、−ＳＨ又は−ＮＲａＲｂ基から選択され、Ｒ１及びＲ２は各々独立して−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＲａ、任意に置換された直鎖若しくは分岐（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、任意に置換された直鎖若しくは分岐（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン、任意に置換された直鎖若しくは分岐（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキニレン、任意に置換されたＣ３〜Ｃ１０アリール、任意に置換されたＣ３〜Ｃ１０シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン及び（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニレンからなる群から選択されるか、又はＲ１及びＲ２はそれらが結合する炭素原子とともにＣ５〜Ｃ１０環式環を形成し、Ｒ３はＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ及びＣ１〜Ｃ１０直鎖又は分岐アルキルからなる群から選択され、Ｒ５は直鎖又は分岐（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、直鎖又は分岐（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン、直鎖又は分岐（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキニレン、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン及び−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキニレンからなる群から選択され、ここで任意のアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリール、アリールアルキレン又はシクロアルキル基は−ＯＨ、ハロゲン、−ＮＲｂＲｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、−ＣＮ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ４）ハロアルキル及び（Ｃ１〜Ｃ４）ヒドロキシアルキルからなる群から選択される１つ又は複数の基で更に置換され、Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは各々独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ１０）直鎖若しくは分岐アルキル又はＣ３〜Ｃ１０シクロアルキルである）。
【００１９】
一実施の形態では、Ｒ５は、
【化７】
2020036617.tif 000011
からなる群から選択される（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレンであり、Ｒ４はＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、Ｃ３Ｈ７、Ｃ４Ｈ９、Ｃ５Ｈ１１、Ｃ６Ｈ１３、Ｃ７Ｈ１５及びＣ８Ｈ１７からなる群から選択される直鎖アルキレンである。本発明の好ましい態様では、Ｒ５は、
【化８】
2020036617.tif 000012
であり、Ｒ６は（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン、−ＯＨ、−ＳＨ、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、−ＮＨ２又は−ＮＨＲａから選択される。
【００２０】
別の好ましい実施の形態では、カンナビノイド酸合成酵素は、カンナビノイド酸合成酵素遺伝子の１つ又は複数のコピーを生成し、カンナビノイド酸合成酵素遺伝子によってコードされるタンパク質を過剰発現させることによって得られる組み換えカンナビノイド酸合成酵素である。好ましくは、カンナビノイド酸合成酵素遺伝子の１つ又は複数のコピーをｉｎ  ｖｉｖｏで生成し、上記方法はカンナビノイド酸合成酵素遺伝子の１つ又は複数のコピーを真核生物宿主のゲノムに組み込み、タンパク質発現をスケールアップする工程（ｉ）を含む。好ましくは、真核生物宿主はピキア・パストリスであり、カンナビノイド酸合成酵素遺伝子はタンパク質分泌を標的とするようにα分泌配列でコドン最適化され、６個のタンデムヒスチジン残基でタグ付けされる。工程（ｉ）は、カンナビノイド酸合成酵素遺伝子を１つ又は複数の制限酵素での消化によって線状化し、カンナビノイド酸合成酵素遺伝子をゲル抽出によって抽出し、カンナビノイド酸合成酵素遺伝子をピキア・パストリスプラスミドにライゲートし、プラスミドを細菌細胞に電気穿孔して、１つ又は複数のカンナビノイド酸合成酵素遺伝子コピーのコロニーを生成することを含み得る。
【００２１】
本発明の好ましい態様では、溶媒はＤＭＳＯであり、反応混合物におけるＤＭＳＯの濃度は２０％（ｗ／ｖ）である。付加的な好ましい態様では、両親媒性化合物は界面活性剤又はシクロデキストリンである。好ましい実施の形態では、シクロデキストリンはα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン又はγ−シクロデキストリンである。更により好ましくは、シクロデキストリンはスルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム塩又は無作為メチル化β−シクロデキストリンであり、反応混合物におけるシクロデキストリンの濃度は２ｍｇ／ｍｌ〜２８ｍｇ／ｍｌである。最も好ましい実施の形態では、反応混合物におけるシクロデキストリンの濃度は８ｍｇ／ｍｌである。
【００２２】
一実施の形態では、カンナビノイド又はカンナビノイド類似体は、エナンチオマー純度が少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の単一エナンチオマーである。
【００２３】
好ましい実施の形態では、カンナビノイド酸合成酵素はＴＨＣＡ合成酵素であり、１つ又は複数のカンナビノイド又はカンナビノイド類似体はテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）、ＴＨＣＡ及びＣＢＣＡ、又はそれらの類似体である。好ましい態様では、両親媒性化合物はシクロデキストリンであり、シクロデキストリンと式Ｉの化合物との質量対質量比は２８：１であるか、又はシクロデキストリンと式Ｉの化合物とのモル比は７．３：１である。好ましくは、反応の工程（ｃ）を３．８〜７．２の範囲のｐＨで行い、上記方法によりＴＨＣＡ、ＣＢＣＡ、又はＴＨＣＡ及びＣＢＣＡを上記のような異なる比率で作製する。好ましくは、式Ｉの化合物の９８％が２時間以内に１つ又は複数のカンナビノイド又はカンナビノイド類似体に変換される。
【００２４】
異なる実施の形態では、カンナビノイド酸合成酵素はＣＢＤＡ合成酵素であり、上記方法によりカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）、ＣＢＤＡ及びＣＢＣＡ、又はそれらの類似体を作製する。好ましくは、両親媒性化合物はシクロデキストリンであり、シクロデキストリンと式Ｉの化合物との質量対質量比は１１：１であるか、又はシクロデキストリンと式Ｉの化合物とのモル比は４：１である。好ましくは、工程（ｃ）を３．８〜７．２の範囲のｐＨで行い、上記方法によりＣＢＤＡ、ＣＢＣＡ、又はＣＢＤＡ及びＣＢＣＡを上記のような異なる比率で作製する。最も好ましくは、式Ｉの化合物の７０％が２時間以内に１つ又は複数のカンナビノイド又はカンナビノイド類似体に変換される。
【００２５】
また別の実施の形態では、本発明はテトラヒドロカンナビノール、カンナビクロメン、若しくはテトラヒドロカンナビノール及びカンナビクロメンの両方、又はそれらの類似体を作製する方法であって、（ａ）式Ｉによる化合物：
【化９】
2020036617.tif 000013
を選択する工程と、（ｂ）式Ｉの化合物とテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）合成酵素とを溶媒及び両親媒性化合物を含む反応混合物中で反応させる工程と、（ｃ）反応混合物の少なくとも１つの特性を変更して、テトラヒドロカンナビノール、カンナビクロメン、若しくはテトラヒドロカンナビノール及びカンナビクロメンの両方、又はそれらの類似体を生成物として得る工程と、（ｄ）テトラヒドロカンナビノール、カンナビクロメン、若しくはテトラヒドロカンナビノール及びカンナビクロメンの両方、又はそれらの類似体を反応混合物から単離する工程と、（ｅ）テトラヒドロカンナビノール酸、カンナビクロメン酸、若しくはテトラヒドロカンナビノール酸及びカンナビクロメン酸の両方、又はそれらの類似体を脱炭酸する工程とを含む、方法を提供する（式中、Ｒは−ＯＨ、ハロゲン、−ＳＨ又は−ＮＲａＲｂ基から選択され、Ｒ１及びＲ２は各々独立して−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＲａ、任意に置換されたＣ１〜Ｃ１０直鎖若しくは分岐アルキレン、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０直鎖若しくは分岐アルケニレン、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０直鎖若しくは分岐アルキニレン、任意に置換されたＣ３〜Ｃ１０アリール、任意に置換されたＣ３〜Ｃ１０シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン及び（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニレンからなる群から選択されるか、又はＲ１及びＲ２はそれらが結合する炭素原子とともにＣ５〜Ｃ１０環式環を形成し、Ｒ３はＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ及びＣ１〜Ｃ１０直鎖又は分岐アルキルからなる群から選択され、Ｒａ及びＲｂは各々独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ１０）直鎖若しくは分岐アルキル又はＣ３〜Ｃ１０シクロアルキルである）。
【００２６】
好ましい実施の形態では、ＴＨＣＡ合成酵素は、ＴＨＣＡ合成酵素遺伝子の１つ又は複数のコピーを生成し、ＴＨＣＡ合成酵素遺伝子によってコードされるタンパク質を過剰発現させることによって得られる組み換えＴＨＣＡ合成酵素である。好ましくは、ＴＨＣＡ合成酵素遺伝子の１つ又は複数のコピーをｉｎ  ｖｉｖｏで生成し、上記方法はカンナビノイド酸合成酵素遺伝子の１つ又は複数のコピーを真核生物宿主のゲノムに組み込み、タンパク質発現をスケールアップする工程（ｉ）を含む。好ましくは、真核生物宿主はピキア・パストリスであり、ＴＨＣＡ合成酵素遺伝子はタンパク質分泌を標的とするようにα分泌配列でコドン最適化され、６個のタンデムヒスチジン残基でタグ付けされる。工程（ｉ）は、カンナビノイド酸合成酵素遺伝子を１つ又は複数の制限酵素での消化によって線状化し、カンナビノイド酸合成酵素遺伝子をゲル抽出によって抽出し、カンナビノイド酸合成酵素遺伝子をピキア・パストリスプラスミドにライゲートし、プラスミドを細菌細胞に電気穿孔して、１つ又は複数のカンナビノイド酸合成酵素遺伝子コピーのコロニーを生成することを含み得る。
【００２７】
本発明の好ましい態様では、溶媒はＤＭＳＯであり、反応混合物におけるＤＭＳＯの濃度は２０％（ｗ／ｖ）である。付加的な好ましい態様では、両親媒性化合物は界面活性剤又はシクロデキストリンである。好ましい実施の形態では、シクロデキストリンはα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン又はγ−シクロデキストリンである。更により好ましくは、シクロデキストリンはスルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム塩又は無作為メチル化β−シクロデキストリンであり、反応混合物におけるシクロデキストリンの濃度は２ｍｇ／ｍｌ〜２８ｍｇ／ｍｌである。最も好ましい実施の形態では、反応混合物におけるシクロデキストリンの濃度は８ｍｇ／ｍｌである。
【００２８】
本発明の好ましい態様では、両親媒性化合物はシクロデキストリンであり、シクロデキストリンと式Ｉの化合物との質量対質量比は２８：１であるか、又はシクロデキストリンと式Ｉの化合物とのモル比は７．３：１である。好ましくは、反応混合物の少なくとも１つの特性を変更する工程（ｃ）は反応混合物のｐＨを３．８〜７．２の範囲で変更することを含み、上記方法によりＴＨＣＡ、ＣＢＣＡ、又はＴＨＣＡ及びＣＢＣＡを上記のような異なる比率で作製する。好ましくは、式Ｉの化合物の９８％が２時間以内に１つ又は複数のカンナビノイド又はカンナビノイド類似体に変換される。
【００２９】
異なる実施の形態では、本発明はカンナビジオール、カンナビクロメン、若しくはカンナビジオール及びカンナビクロメンの両方、又はそれらの類似体を作製する方法であって、（ａ）式Ｉによる化合物：
【化１０】
2020036617.tif 000014
を選択する工程と、（ｂ）式Ｉの化合物とカンナビジオール酸（cannabidiolic acid）（ＣＢＤＡ）合成酵素とを溶媒及び両親媒性化合物を含む反応混合物中で反応させる工程と、（ｃ）反応混合物の少なくとも１つの特性を変更して、カンナビジオール、カンナビクロメン、若しくはカンナビジオール及びカンナビクロメンの両方、又はそれらの類似体を生成物として得る工程と、（ｄ）カンナビジオール、カンナビクロメン、若しくはカンナビジオール及びカンナビクロメンの両方、又はそれらの類似体を反応混合物から単離する工程と、（ｅ）カンナビジオール、カンナビクロメン、若しくはカンナビジオール及びカンナビクロメンの両方、又はそれらの類似体を脱炭酸する工程とを含む、方法を提供する（式中、Ｒは−ＯＨ、ハロゲン、−ＳＨ又は−ＮＲａＲｂ基から選択され、Ｒ１及びＲ２は各々独立して−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＲａ、任意に置換されたＣ１〜Ｃ１０直鎖若しくは分岐アルキレン、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０直鎖若しくは分岐アルケニレン、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０直鎖若しくは分岐アルキニレン、任意に置換されたＣ３〜Ｃ１０アリール、任意に置換されたＣ３〜Ｃ１０シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン及び（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニレンからなる群から選択されるか、又はＲ１及びＲ２はそれらが結合する炭素原子とともにＣ５〜Ｃ１０環式環を形成し、Ｒ３はＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ及びＣ１〜Ｃ１０直鎖又は分岐アルキルからなる群から選択され、Ｒａ及びＲｂは各々独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ１０）直鎖若しくは分岐アルキル又はＣ３〜Ｃ１０シクロアルキルである）。
【００３０】
好ましくは、ＣＢＤＡ合成酵素は、ＣＢＤＡ合成酵素遺伝子の１つ又は複数のコピーを生成し、ＣＢＤＡ合成酵素遺伝子によってコードされるタンパク質を過剰発現させることによって得られる組み換えＣＢＤＡ合成酵素である。本発明の好ましい態様では、ＣＢＤＡ合成酵素遺伝子の１つ又は複数のコピーをｉｎ  ｖｉｖｏで生成し、上記方法はＣＢＤＡ合成酵素遺伝子の１つ又は複数のコピーを真核生物宿主のゲノムに組み込み、タンパク質発現をスケールアップする工程（ｉ）を含む。好ましくは、真核生物宿主はピキア・パストリスであり、ＣＢＤＡ合成酵素遺伝子はタンパク質分泌を標的とするようにα分泌配列でコドン最適化され、６個のタンデムヒスチジン残基でタグ付けされる。工程（ｉ）は、ＣＢＤＡ合成酵素遺伝子を１つ又は複数の制限酵素での消化によって線状化し、ＣＢＤＡ合成酵素遺伝子をゲル抽出によって抽出し、ＣＢＤＡ合成酵素遺伝子をピキア・パストリスプラスミドにライゲートし、プラスミドを細菌細胞に電気穿孔して、１つ又は複数のカンナビノイド酸合成酵素遺伝子コピーのコロニーを生成することを含み得る。
【００３１】
本発明の好ましい態様では、溶媒はＤＭＳＯであり、反応混合物におけるＤＭＳＯの濃度は２０％（ｗ／ｖ）である。付加的な好ましい態様では、両親媒性化合物は界面活性剤又はシクロデキストリンである。好ましい実施の形態では、シクロデキストリンはα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン又はγ−シクロデキストリンである。更により好ましくは、シクロデキストリンはスルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム塩又は無作為メチル化β−シクロデキストリンであり、反応混合物におけるシクロデキストリンの濃度は２ｍｇ／ｍｌ〜２８ｍｇ／ｍｌである。最も好ましい実施の形態では、反応混合物におけるシクロデキストリンの濃度は８ｍｇ／ｍｌである。
【００３２】
本発明の好ましい態様では、両親媒性化合物はシクロデキストリンであり、シクロデキストリンと式Ｉの化合物との質量対質量比は２８：１（ｗ／ｗ）であるか、又はシクロデキストリンと式Ｉの化合物とのモル比は７．３：１である。好ましくは、反応混合物の少なくとも１つの特性を変更する工程（ｃ）は、反応混合物のｐＨを３．８〜７．２の範囲で変更することを含み、上記方法によりＣＢＤＡ、ＣＢＣＡ、又はＣＢＤＡ及びＣＢＣＡを上記のような異なる比率で作製する。好ましい実施の形態では、式Ｉの化合物の９８％が２時間以内に１つ又は複数のカンナビノイド又はカンナビノイド類似体に変換される。
【００３３】
異なる実施の形態では、本発明は１つ又は複数のカンナビノイド又はカンナビノイド類似体を作製するシステムであって、該システムが、培地及び複数の細胞を収容し、細胞がカンナビノイド合成酵素を産生及び分泌するように構成される発酵装置と、溶媒及び両親媒性化合物を含む反応混合物中の反応物を含有するバイオリアクターであって、反応物がカンナビノイド酸合成酵素と相互作用して第１のカンナビノイド及び第２のカンナビノイドを形成するように構成される、バイオリアクターと、バイオリアクターの条件を制御するように構成される制御機構とを備え、バイオリアクターの条件が、第２のカンナビノイドの形成量に対する第１のカンナビノイドの形成量に影響を与え、第１のカンナビノイド及び第２のカンナビノイドがカンナビノイド又はカンナビノイド類似体のいずれか１つである、システムを提供する。
【００３４】
好ましい実施の形態では、バイオリアクターはニッケルを含有するカラムバイオリアクターであり、カンナビノイド酸合成酵素はニッケルへと結合するように構成されるタグを含む。幾つかの実施の形態では、バイオリアクターはニッケル及び別の金属の両方を含有するカラムバイオリアクターである。
【００３５】
一実施の形態では、システム内の反応物は式Ｉによる化合物：
【化１１】
2020036617.tif 000015
（式中、Ｒは−ＯＨ、ハロゲン、−ＳＨ又は−ＮＲａＲｂ基から選択され、Ｒ１及びＲ２は各々独立して−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＲａ、任意に置換されたＣ１〜Ｃ１０直鎖若しくは分岐アルキレン、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０直鎖若しくは分岐アルケニレン、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０直鎖若しくは分岐アルキニレン、任意に置換されたＣ３〜Ｃ１０アリール、任意に置換されたＣ３〜Ｃ１０シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン及び（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニレンからなる群から選択されるか、又はＲ１及びＲ２はそれらが結合する炭素原子とともにＣ５〜Ｃ１０環式環を形成し、Ｒ３はＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ及びＣ１〜Ｃ１０直鎖又は分岐アルキルからなる群から選択され、Ｒａ及びＲｂは各々独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ１０）直鎖若しくは分岐アルキル又はＣ３〜Ｃ１０シクロアルキルである）である。
【００３６】
好ましい一実施の形態では、カンナビノイド酸合成酵素はカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）合成酵素であり、第１のカンナビノイド及び第２のカンナビノイドはカンナビジオール酸及びカンナビクロメン酸の一方若しくは両方、又はそれらの類似体である。
【００３７】
別の好ましい実施の形態では、カンナビノイド酸合成酵素はテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）合成酵素であり、第１のカンナビノイド及び第２のカンナビノイドはテトラヒドロカンナビノール酸及びカンナビクロメン酸の一方若しくは両方、又はそれらの類似体である。
【００３８】
好ましくは、カンナビノイド酸合成酵素はバイオリアクター内の反応物と相互作用して、第１のカンナビノイド及び第２のカンナビノイドの両方を形成し、バイオリアクターの条件はｐＨ、溶媒、温度、圧力及び流量の少なくとも１つの関数である。
【００３９】
好ましい実施の形態では、バイオリアクターの条件の変化は、１）第２のカンナビノイドと比べてより多量の第１のカンナビノイドの形成から、２）第１のカンナビノイドと比べてより多量の第２のカンナビノイドの形成へのシフトを引き起こすように構成される。
【００４０】
好ましくは、システム内の溶媒はＤＭＳＯであり、反応混合物におけるＤＭＳＯの濃度は２０％（ｗ／ｖ）である。
【００４１】
また別の好ましい実施の形態では、システム内の両親媒性化合物は界面活性剤又はシクロデキストリンである。好ましくは、シクロデキストリンはα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン又はγ−シクロデキストリンである。更により好ましくは、シクロデキストリンはスルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム塩又は無作為メチル化β−シクロデキストリンであり、反応混合物におけるシクロデキストリンの濃度は２ｍｇ／ｍｌ〜２８ｍｇ／ｍｌである。最も好ましくは、反応混合物におけるシクロデキストリンの濃度は８ｍｇ／ｍｌである。
【００４２】
本発明の一態様では、両親媒性化合物はシクロデキストリンであり、シクロデキストリンと式Ｉの化合物との質量対質量比は２８：１（ｗ／ｗ）であるか、又はシクロデキストリンと式Ｉの化合物とのモル比は７．３：１である。好ましい実施の形態では、システム内の式Ｉの化合物の９８％が２時間以内に１つ又は複数のカンナビノイド又はカンナビノイド類似体に変換される。
【００４３】
本発明の好ましい態様では、システム内のカンナビノイド酸合成酵素はＣＢＤＡ合成酵素であり、バイオリアクターの条件の変化は反応混合物のｐＨを３．８〜７．２の範囲で変更することを含む。好ましくは、上記方法によりＣＢＤＡ、ＣＢＣＡ、又はＣＢＤＡ及びＣＢＣＡを上記のような異なる比率で作製する。
【００４４】
別の好ましい実施の形態では、カンナビノイド酸合成酵素はＴＨＣＡ合成酵素であり、バイオリアクターの条件の変化は反応混合物のｐＨを３．８〜７．２の範囲で変更することを含む。好ましくは、上記方法によりＴＨＣＡ、ＣＢＣＡ、又はＴＨＣＡ及びＣＢＣＡを上記のような異なる比率で作製する。
【００４５】
また別の実施の形態では、本発明は少なくとも１つのカンナビノイド又はカンナビノイド類似体を作製する方法であって、カンナビゲロール、カンナビノイド酸合成酵素、及び溶媒と両親媒性化合物とを含む反応混合物を自動送達システムによって準備する工程と、カンナビゲロールとカンナビノイド酸合成酵素とを反応混合物中で反応させる工程と、溶媒を自動送達システムによって添加して反応を止める工程と、溶媒を除去する工程と、反応によって作製された少なくとも１つのカンナビノイド又はカンナビノイド類似体を回収する工程とを含む、方法を提供する。好ましくは、反応混合物はＤＭＳＯを含み、カンナビノイド酸合成酵素はＣＢＤＡ合成酵素又はＴＨＣＡ合成酵素である。更により好ましくは、カンナビゲロールとカンナビノイド酸合成酵素とを反応させる工程は、反応混合物のｐＨを制御装置によって制御することを含む。このため、本発明の好ましい態様では、上記方法は反応混合物のｐＨを制御して所定量の少なくとも第１のカンナビノイド又は第１のカンナビノイド類似体を作製することと、反応混合物のｐＨを制御して所定量の第１のカンナビノイド又は第１のカンナビノイド類似体及び所定量の第２のカンナビノイド又は第２のカンナビノイド類似体を作製することとを更に含む。好ましい実施の形態では、第１のカンナビノイド又は第１のカンナビノイド類似体はＴＨＣＡ又はＣＢＤＡであり、第２のカンナビノイド又は第２のカンナビノイド類似体はＣＢＣＡである。別の好ましい実施の形態では、第１のカンナビノイド又は第１のカンナビノイド類似体はＴＨＣＡ又はＣＢＤＡであり、第２のカンナビノイド又は第２のカンナビノイド類似体はＣＢＣＡである。
【００４６】
別の実施の形態では、本発明は少なくとも１つのカンナビノイド又はカンナビノイド類似体を作製する方法であって、カンナビゲロールとカンナビノイド酸合成酵素とを溶媒及び両親媒性化合物を含む反応混合物中で反応させることと、溶媒を添加して反応を止めることと、溶媒を除去することと、反応によって作製されたカンナビノイド又はカンナビノイド類似体を回収することとを含む、方法を提供する。本発明の好ましい態様では、カンナビゲロールとカンナビノイド酸合成酵素とを反応させる工程は、反応混合物のｐＨを制御することを含む。好ましくは、反応混合物のｐＨは、第１のカンナビノイド又は第１のカンナビノイド類似体と第２のカンナビノイド又は第２のカンナビノイド類似体との所定の比率を達成するように反応混合物のｐＨを調整することによって制御される。更により好ましくは、反応混合物はＤＭＳＯを含み、カンナビノイド酸合成酵素はＣＢＤＡ合成酵素又はＴＨＣＡ合成酵素である。一実施の形態では、第１のカンナビノイド又は第１のカンナビノイド類似体はＴＨＣＡ又はＣＢＤＡであり、第２のカンナビノイド又は第２のカンナビノイド類似体はＣＢＣＡである。
【００４７】
付加的な実施の形態では、本発明はカンナビゲロール、カンナビノイド酸合成酵素、及び溶媒と両親媒性化合物とを含む反応混合物の第１の自動供給装置、第１の供給装置を受け、反応混合物におけるカンナビゲロールとカンナビノイド酸合成酵素との反応を可能にするように構成されるバイオリアクター、並びに反応を止めるための溶媒の第２の自動供給装置を実行する（deliver）ように構成される自動供給システムと、溶媒を除去し、少なくとも第１のカンナビノイド又はカンナビノイド類似体を回収するように構成される抽出装置とを備える装置を提供する。上記装置は、第１のカンナビノイド又は第１のカンナビノイド類似体及び第２のカンナビノイド又は第２のカンナビノイドを所定の比率で作製するために反応混合物の少なくとも１つの特性を調整するように構成される制御装置を更に備えていてもよい。制御装置は、第１のカンナビノイド又は第１のカンナビノイド類似体の第１の量及び第２のカンナビノイド又は第２のカンナビノイド類似体の第２の量を決定し、第１の量の第１のカンナビノイド又は第１のカンナビノイド類似体及び第２の量の第２のカンナビノイド又は第２のカンナビノイド類似体を作製するために反応混合物の少なくとも１つの特性を調整するように構成されていてもよい。好ましくは、反応混合物はＤＭＳＯを含み、カンナビノイド酸合成酵素はＣＢＤＡ合成酵素又はＴＨＣＡ合成酵素である。本発明の好ましい態様では、第１のカンナビノイド又は第１のカンナビノイド類似体はＴＨＣＡ又はＣＢＤＡであり、第２のカンナビノイド又は第２のカンナビノイド類似体はＣＢＣＡである。
【００４８】
また別の実施の形態では、本発明はテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）又はカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）を異なる比率で作製する装置であって、（ａ）カンナビゲロール、カンナビノイド酸合成酵素、及び溶媒と両親媒性化合物とを含む反応混合物の第１の自動供給装置であって、溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びイソプロピルアルコールの１つ又は複数であり、反応混合物における溶媒の濃度が５％〜３０％（ｗ／ｖ）であり、両親媒性化合物が界面活性剤又はシクロデキストリンであり、反応混合物における両親媒性化合物の濃度が２ｍｇ／ｍｌ〜２８ｍｇ／ｍｌである、第１の自動供給装置、並びに（ｂ）反応を止めるための溶媒の第２の自動供給装置を実行するように構成される自動供給システムを備えるバイオリアクターと、溶媒を除去し、テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）又はカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）を反応混合物から回収するように構成される抽出装置と、テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）又はカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）を異なる比率で作製するために反応混合物のｐＨを変更し、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）から異なる比率のテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）又はカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）への変換率に影響を与えるために反応混合物における両親媒性化合物の濃度を調整するように構成される制御装置とを備える、装置を提供する。好ましい実施の形態では、カンナビノイド酸合成酵素はテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡ合成酵素）又はカンナビジオール酸合成酵素（ＣＢＤＡ合成酵素）である。本発明の一態様では、カンナビノイド合成酵素は固体支持体に固定化される。本発明の別の態様では、カンナビノイド合成酵素は組み換えカンナビノイド合成酵素であり、上記装置は組み換えカンナビノイド合成酵素を大規模で作製するシステムを更に備える。好ましくは、ｐＨは約３．８〜約８．０の範囲である。
【００４９】
本発明の好ましい態様では、溶媒はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びイソプロピルアルコールの１つ又は複数であり、反応混合物における溶媒の濃度は５％〜３０％（ｗ／ｖ）である。本発明の別の好ましい態様では、両親媒性化合物は界面活性剤又はシクロデキストリンである。シクロデキストリンはα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン又はγ−シクロデキストリンであり得る。本発明の一態様では、シクロデキストリンはスルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム塩又は無作為メチル化β−シクロデキストリンであり、反応混合物におけるシクロデキストリンの濃度は２ｍｇ／ｍｌ〜２８ｍｇ／ｍｌである。好ましくは、反応混合物におけるシクロデキストリンの濃度は８ｍｇ／ｍｌである。
【００５０】
一実施の形態では、テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）又はカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）は、エナンチオマー純度が少なくとも９５％の単一エナンチオマーである。
【００５１】
本発明の一態様では、カンナビノイド合成酵素はＴＨＣＡ合成酵素であり、両親媒性化合物はシクロデキストリンである。好ましくは、シクロデキストリンとカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）との質量対質量比は２８：１であるか、又はシクロデキストリンとカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）とのモル比が７．３：１である。本発明の好ましい態様では、上記装置によりテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）を以下の比率で作製する。
【００５２】
【表３】
2020036617.tif 000016
【００５３】
好ましくは、カンナビゲロール酸ＣＢＧＡの９８％が２時間以内にテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）に変換される。
【００５４】
本発明の異なる態様では、カンナビノイド酸合成酵素はＣＢＤＡ合成酵素であり、両親媒性化合物はシクロデキストリンである。好ましくは、シクロデキストリンとカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）との質量対質量比は１１：１であるか、又はシクロデキストリンとカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）とのモル比は４：１である。本発明の好ましい態様では、上記装置によりカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）を以下の比率で作製する。
【００５５】
【表４】
2020036617.tif 000017
【００５６】
好ましくは、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）の９８％が２時間以内にカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）に変換される。
【００５７】
上述の概要及び詳細な説明は例示的かつ説明的なものであり、特許請求される本発明の更なる説明を提供することを意図する。本発明の詳細な理解については、以下の好ましい実施形態の詳細な説明を添付の図面と併せて参照されたい。他の目的、利点及び新規の特徴は以下の本発明の詳細な説明から当業者に容易に明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】ＴＨＣＡ合成酵素活性に対する１０％ＤＭＳＯ（シクロデキストリンなし）の影響を示す図である。粗発酵上清（１０倍濃縮）中の１００μｌのＴＨＣＡ合成酵素を、３５０μｌのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８５）中の５０μｌの２ｍｇ／ｍｌ  ＣＢＧＡと反応させた。ピーク（左から右）：＃１  ＣＢＧＡ（８６．５１％）、＃２  ＴＨＣＡ（１０．４％）、＃３  ＣＢＣＡ（３．０９％）。
【図２】ＴＨＣＡ合成酵素活性に対する２０％ＤＭＳＯ（シクロデキストリンなし）の影響を示す図である。粗発酵上清（１０倍濃縮）中の１００μｌのＴＨＣＡ合成酵素を、３００μｌのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８５）中の５０μｌの２ｍｇ／ｍｌ  ＣＢＧＡと５０μｌのＤＭＳＯの存在下で反応させた。ピーク（左から右）：＃１  ＣＢＧＡ（５４．１８％）、＃２  ＴＨＣＡ（３２．３９％）、＃３  ＣＢＣＡ（１３．４３％）。
【図３】ＴＨＣＡ合成酵素活性に対する１０％ＤＭＳＯ及び２０％シクロデキストリンの影響を示す図である。粗発酵上清（１０倍濃縮）中の１００μｌのＴＨＣＡ合成酵素を、２ｍｇのシクロデキストリンを含有する３５０μｌのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８５）中の５０μｌの２ｍｇ／ｍｌ  ＣＢＧＡと反応させた。ピーク（左から右）：＃１  ＣＢＧＡ（１０．３３％）、＃２  ＴＨＣＡ（７２．３７％）、＃３  ＣＢＣＡ（１７．３％）。
【図４】ＴＨＣＡ合成酵素に対する１０％ＤＭＳＯ及び４０％シクロデキストリンの影響を示す図である。粗発酵上清（１０倍濃縮）中の１５０μｌのＴＨＣＡ合成酵素を、３ｍｇのシクロデキストリンを含有する５２５μｌのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８５）中の７５μｌの２ｍｇ／ｍｌ  ＣＢＧＡと反応させた。ピーク（左から右）：＃１  ＣＢＧＡ（１１．５０％）、＃２  ＴＨＣＡ（７２．０８％）、＃３  ＣＢＣＡ（１６．４２％）。
【図５】ＴＨＣＡ合成酵素活性に対する１０％ＤＭＳＯ及び６０％シクロデキストリンの影響を示す図である。粗発酵上清（１０倍濃縮）中の２００μｌのＴＨＣＡ合成酵素を、４ｍｇのシクロデキストリンを含有する７００μｌのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８５）中の１００μｌの２ｍｇ／ｍｌ  ＣＢＧＡと反応させた。ピーク（左から右）：＃１  ＣＢＧＡ（１０．３６％）、＃２  ＴＨＣＡ（７３．９８％）、＃３  ＣＢＣＡ（１５．６５％）。
【図６】ＣＢＤＡ合成酵素活性に対する１０％ＤＭＳＯ及び２０ｍｇ／ｍｌシクロデキストリンの影響を示す図である。粗発酵上清（１０倍濃縮）中の２００μｌのＣＢＤＡ合成酵素を、４ｍｇのシクロデキストリンを含有する７００μｌのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８５）中の１００μｌの４ｍｇ／ｍｌ  ＣＢＧＡと反応させた。ピーク（左から右）：＃１  ＣＢＤＡ（４０．６３％）、＃２  ＣＢＧＡ（２８．４３％）、＃３  ＣＢＣＡ（３０．９５％）。
【図７】カンナビノイド及び／又はカンナビノイド類似体を作製するシステムのブロック図である。
【図８】カンナビノイド及び／又はカンナビノイド類似体を作製するシステムのブロック図である。
【図９】カンナビノイドを作製する方法を示すフロー図である。
【図１０】制御装置のブロック図である。
【図１１】ＣＢＤＡ合成酵素反応変換率及び生成物比に対する０ｍｇ／ｍｌシクロデキストリンの影響を示す図である。５０μｌの１０倍濃縮発酵上清を、１７５μｌのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）中の２５μｌの５ｍｇ／ｍｌ  ＣＢＧＡと反応させた。ピーク（左から右）：ＣＢＤＡ（１７．９９％）、ＣＢＧＡ（６５．７２％）、ＣＢＣＡ（１６．３０％）。
【図１２】ＣＢＤＡ合成酵素反応変換率及び生成物比に対する２ｍｇ／ｍｌシクロデキストリンの影響を示す図である。５０μｌの１０倍濃縮発酵上清を、２ｍｇ／ｍｌシクロデキストリンを含有する１７５μｌのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）中の２５μｌの５ｍｇ／ｍｌ  ＣＢＧＡと反応させた。ピーク（左から右）：ＣＢＤＡ（２９．５３％）、ＣＢＧＡ（４７．４０％）、ＣＢＣＡ（２３．０８％）。
【図１３】ＣＢＤＡ合成酵素反応変換率及び生成物比に対する８ｍｇ／ｍｌシクロデキストリンの影響を示す図である。５０μｌの１０倍濃縮発酵上清を、８ｍｇ／ｍｌシクロデキストリンを含有する１７５μｌのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）中の８．２５μｌの５ｍｇ／ｍｌ  ＣＢＧＡと反応させた。ピーク（左から右）：ＣＢＤＡ（３３％）、ＣＢＧＡ（４１．９８％）、ＣＢＣＡ（２５．０２％）。
【図１４】ＣＢＤＡ合成酵素反応変換率及び生成物比に対する１２ｍｇ／ｍｌシクロデキストリンの影響を示す図である。５０μｌの１０倍濃縮発酵上清を、１２ｍｇ／ｍｌシクロデキストリンを含有する１７５μｌのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）中の２５μｌの５ｍｇ／ｍｌ  ＣＢＧＡと反応させた。ピーク（左から右）：ＣＢＤＡ（３０．６３％）、ＣＢＧＡ（４５．２２％）、ＣＢＣＡ（２４．１５％）。
【図１５】ＣＢＤＡ合成酵素反応変換率及び生成物比に対する１６ｍｇ／ｍｌシクロデキストリンの影響を示す図である。５０μｌの１０倍濃縮発酵上清を、１６ｍｇ／ｍｌシクロデキストリンを含有する１７５μｌのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）中の２５μｌの５ｍｇ／ｍｌ  ＣＢＧＡと反応させた。ピーク（左から右）：ＣＢＤＡ（２８．５４％）、ＣＢＧＡ（４９．６３％）、ＣＢＣＡ（２１．８４％）。
【図１６】ＣＢＤＡ合成酵素反応変換率及び生成物比に対する２０ｍｇ／ｍｌシクロデキストリンの影響を示す図である。５０μｌの１０倍濃縮発酵上清を、２０ｍｇ／ｍｌシクロデキストリンを含有する１７５μｌのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）中の２５μｌの５ｍｇ／ｍｌ  ＣＢＧＡと反応させた。ピーク（左から右）：ＣＢＤＡ（２９．０５％）、ＣＢＧＡ（５０．０４％）、ＣＢＣＡ（２０．９１％）。
【図１７】ＣＢＤＡ合成酵素反応変換率及び生成物比に対する２８ｍｇ／ｍｌシクロデキストリンの影響を示す図である。５０μｌの１０倍濃縮発酵上清を、２８ｍｇ／ｍｌシクロデキストリンを含有する１７５μｌのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）中の２５μｌの５ｍｇ／ｍｌ  ＣＢＧＡと反応させた。ピーク（左から右）：ＣＢＤＡ（２２．０９％）、ＣＢＧＡ（５９．６０％）、ＣＢＣＡ（１８．３２％）。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
本発明は、異なるカンナビノイド又はカンナビノイド類似体の大規模同時酵素作製のためのシステム及び方法、並びに様々なｐＨ、温度及び水性／親油性条件下でのＴＨＣＡ、ＣＢＤＡ、ＣＢＣＡ又はそれらの類似体の大規模同時合成を触媒する酵素のクローニング、発現及び精製のための方法を提供する。
【００６０】
定義
本明細書で使用される場合、他に指定のない限り、数量を特定していない単数形（the singular forms "a," "an," and "the"）は複数の指示対象を含む。このため例えば、「細胞（a cell）」への言及は複数の細胞を含み、「分子（a molecule）」への言及は１つ又は複数の分子への言及である。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「約」は当業者に理解され、使用される文脈に応じて或る程度異なる。当業者に明らかでない用語が使用される場合、使用される文脈から判断すると、「約」は特定の用語の最大で±１０％を意味する。
【００６２】
「アルキル」という用語は、指定数の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖の飽和炭化水素を指す。例えば、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキルは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、及びネオヘキシル等を含むことを意味するが、これらに限定されない。アルキル基は非置換であっても、又は本明細書で下記の１つ若しくは複数の置換基で任意に置換されていてもよい。
【００６３】
「アルケニル」という用語は、指定数の炭素原子及び少なくとも１つの二重結合を有する直鎖又は分岐鎖の不飽和炭化水素を指す。（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニル基の例としては、エチレン、プロピレン、１−ブチレン、２−ブチレン、イソブチレン、ｓｅｃ−ブチレン、１−ペンテン、２−ペンテン、イソペンテン、１−ヘキセン、２−ヘキセン、３−ヘキセン、イソヘキセン、１−ヘプテン、２−ヘプテン、３−ヘプテン、イソヘプテン、１−オクテン、２−オクテン、３−オクテン、４−オクテン、及びイソオクテンが挙げられるが、これらに限定されない。アルケニル基は非置換であっても、又は本明細書で下記の１つ若しくは複数の置換基で任意に置換されていてもよい。
【００６４】
「アルキニル」という用語は、指定数の炭素原子及び少なくとも１つの三重結合を有する直鎖又は分岐鎖の不飽和炭化水素を指す。（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキニル基の例としては、アセチレン、プロピン、１−ブチン、２−ブチン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ヘキシン、２−ヘキシン、３−ヘキシン、１−ヘプチン、２−ヘプチン、３−ヘプチン、１−オクチン、２−オクチン、３−オクチン及び４−オクチンが挙げられるが、これらに限定されない。アルキニル基は非置換であっても、又は本明細書で下記の１つ若しくは複数の置換基で任意に置換されていてもよい。
【００６５】
「アルコキシ」という用語は指定数の炭素原子を有する−Ｏ−アルキル基を指す。例えば、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ基としては、−Ｏ−メチル、−Ｏ−エチル、−Ｏ−プロピル、−Ｏ−イソプロピル、−Ｏ−ブチル、−Ｏ−ｓｅｃ−ブチル、−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル、−Ｏ−ペンチル、−Ｏ−イソペンチル、−Ｏ−ネオペンチル、−Ｏ−ヘキシル、−Ｏ−イソヘキシル、及び−Ｏ−ネオヘキシルが挙げられる。
【００６６】
「アリール」という用語は３員〜１４員の単環式、二環式、三環式又は多環式の芳香族炭化水素環系を指す。アリール基の例としては、ナフチル、ピレニル及びアントラシルが挙げられる。アリール基は非置換であっても、又は本明細書で下記の１つ若しくは複数の置換基で任意に置換されていてもよい。
【００６７】
「アルキレン」、「アルケニレン」及び「アリーレン」という用語は、単独で又は別の置換基の一部として、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−により例示されるように、それぞれアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アリール、又はヘテロアリール基から誘導される二価ラジカルを意味する。アルキレン、アルケニル又はアリール連結基については、連結基の配向を意味するものではない。
【００６８】
「ハロゲン」及び「ハロ」という用語は−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ又は−Ｉを指す。
【００６９】
「ヘテロ原子」という用語は酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、及び硫黄（Ｓ）を含むことを意味する。
【００７０】
「ヒドロキシル」又は「ヒドロキシ」は−ＯＨ基を指す。
【００７１】
「ヒドロキシアルキル」という用語は、指定数の炭素原子を有し、アルキル基の水素原子の１つ又は複数が−ＯＨ基で置き換えられたアルキル基を指す。ヒドロキシアルキル基の例としては、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、及びそれらの分岐型が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
「シクロアルキル」という用語は、単環式、二環式、三環式又は多環式の３員〜１４員の飽和した、不飽和の又は芳香族の環系を指す。複素環は任意のヘテロ原子又は炭素原子を介して付着していてもよい。シクロアルキルとしては、上記で規定されるアリール及びヘテロアリール（heteroaryls）が挙げられる。シクロアルキル（cycloalkyl）の代表例としては、シクロエチル、シクロプロピル、シクロイソプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロプロペン、シクロブテン、シクロペンテン、シクロヘキセン、フェニル、ナフチル、アントラシル、ベンゾフラニル、及びベンゾチオフェニルが挙げられるが、これらに限定されない。シクロアルキル基は非置換であっても、又は本明細書で下記の１つ若しくは複数の置換基で任意に置換されていてもよい。
【００７３】
「ニトリル」又は「シアノ」という用語はほぼ同じ意味で使用することができ、ヘテロアリール環、アリール環及びヘテロシクロアルキル環の炭素原子に結合した−ＣＮ基を指す。
【００７４】
「アミン」又は「アミノ」という用語は−ＮＲｃＲｄ基（ここで、Ｒｃ及びＲｄは各々独立して水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ８）ハロアルキル、及び（Ｃ１〜Ｃ６）ヒドロキシアルキル基を表す）を指す。
【００７５】
「アルキルアリール」という用語は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル鎖の少なくとも１つの水素原子が、本明細書で下記の１つ又は複数の置換基で任意に置換され得るアリール原子で置き換えられたＣ１〜Ｃ８アルキル基を指す。アルキルアリール基の例としては、メチルフェニル基、エチルナフチル基、プロピルフェニル基、及びブチルフェニル基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
「アリールアルキレン」は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン基の１つ又は複数の水素原子が（Ｃ３〜Ｃ１４）アリール基で置き換えられた二価アルキレンを指す。（Ｃ３〜Ｃ１４）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン基の例としては、１−フェニルブチレン、フェニル−２−ブチレン、１−フェニル−２−メチルプロピレン、フェニルメチレン、フェニルプロピレン、及びナフチルエチレンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
「アリールアルケニレン」は、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニレン基の１つ又は複数の水素原子が（Ｃ３〜Ｃ１４）アリール基で置き換えられた二価アルケニレンを指す。
【００７８】
「アリールアルキニレン」という用語は、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニレン基の１つ又は複数の水素原子が（Ｃ３〜Ｃ１４）アリール基で置き換えられた二価アルキニレンを指す。
【００７９】
「カルボキシル」及び「カルボキシレート」という用語は、下記一般式によって表すことができる部分を含む：
【化１２】
2020036617.tif 000018
【００８０】
式中のＥは結合又はＯであり、Ｒｆは個別にＨ、アルキル、アルケニル、アリール又は薬学的に許容可能な塩である。ＥがＯであり、Ｒｆが上記で規定される通りである場合、この部分は本明細書でカルボキシル基と称され、特にＲｆが水素である場合、式は「カルボン酸」を表す。概して、明示的に示される酸素が硫黄で置き換えられる場合、式は「チオカルボニル」基を表す。
【００８１】
他に指定のない限り、「立体異性体」は、化合物の他の立体異性体を実質的に含まないその化合物の１つの立体異性体を意味する。このため、１つの不斉中心を有する立体異性体的に純粋な化合物は、化合物の反対のエナンチオマーを実質的に含まない。２つの不斉中心を有する立体異性体的に純粋な化合物は、化合物の他のジアステレオマーを実質的に含まない。典型的な立体異性体的に純粋な化合物は、約８０重量％超の化合物の１つの立体異性体及び約２０重量％未満の化合物の他の立体異性体、例えば約９０重量％超の化合物の１つの立体異性体及び約１０重量％未満の化合物の他の立体異性体、又は約９５重量％超の化合物の１つの立体異性体及び約５重量％未満の化合物の他の立体異性体、又は約９７重量％超の化合物の１つの立体異性体及び約３重量％未満の化合物の他の立体異性体を含む。
【００８２】
本発明は、無細胞環境でのカンナビノイド又はカンナビノイド類似体の酵素合成の方法を提供する。カンナビノイド及びカンナビノイド類似体のｅｘ  ｖｉｖｏ製造のための装置も記載される。「類似体」という用語は、天然のカンナビノイドに構造的に関連するが、化学的及び生物学的特性が天然のカンナビノイドとは異なり得る化合物を指す。本文脈において、類似体（単数又は複数）は天然のカンナビノイドの１つ又は複数の不要な副作用を示さない可能性がある化合物を指す。類似体は、天然のカンナビノイドの化学的、生物学的又は半合成変換により天然のカンナビノイドから誘導された化合物も指す。
【００８３】
カンナビノイド化合物としては、限定されるものではないが、カンナビノール、カンナビジオール、Δ９−テトラヒドロカンナビノール、Δ８−テトラヒドロカンナビノール、１１−ヒドロキシ−テトラヒドロカンナビノール、１１−ヒドロキシ−Δ９−テトラヒドロカンナビノール、レボナントラド−ル、Δ１１−テトラヒドロカンナビノール、テトラヒドロカンナビバリン、ドロナビノール、アマンダミド（amandamide）及びナビロン、並びに基本的なカンナビノイド構造を有し、合成的に修飾されてカンナビノイド類似体をもたらす天然又は合成分子が挙げられる。
【００８４】
本発明は、カンナビノイドの生合成において役割を果たす酵素の大規模クローニング及び発現、並びにカンナビノイド及びカンナビノイド類似体の製造に使用することができる生合成酵素を産生する真核生物発現系の使用のための方法も提供する。酵母並びに真核細胞及び原核細胞はカンナビノイド酸合成酵素のクローニング及び発現に好適であり、限定されるものではないが、大腸菌（E coli）、酵母及びバキュロウイルス宿主を含む。このため、本発明は、ｐｉｎｋピキア酵母発現系を用いたテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）合成酵素及びカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）合成酵素を含むが、これらに限定されない幾つかのカンナビノイド酸合成酵素の大規模作製のための方法を開示する。したがって、これらの酵素の大規模作製は、カンナビノイド合成酵素の遺伝子を含むＤＮＡ構築物で酵母を形質転換し、カンナビノイド酸合成酵素遺伝子の１つ又は複数のコピーを生成し、カンナビノイド酸合成酵素遺伝子によってコードされるタンパク質を過剰発現させることによって行うことができる。
【００８５】
ＴＨＣＡ合成酵素遺伝子の核酸配列は配列番号１によって表され、配列番号２に記載のポリペプチド配列をコードする。ピキア・パストリス発現のためのＴＨＣＡ合成酵素遺伝子のコドン最適化核酸配列は配列番号３によって表され、ピキア・パストリスのα分泌配列を含むＴＨＣＡ合成酵素アミノ酸配列である配列番号４に記載のポリペプチド配列をコードする。「ＴＨＣＡ合成酵素発現」は配列番号１若しくは配列番号３、又は配列番号１若しくは配列番号３の変異体、フラグメント若しくは一部によってコードされる遺伝子産物の生合成を指す。「ＴＨＣＡ合成酵素発現」は配列番号２若しくは配列番号４を含むポリペプチド、又は配列番号２若しくは配列番号４を含むポリペプチドの変異体、フラグメント若しくは一部の生合成も指す。「ＴＨＣＡ合成酵素過剰発現」はＴＨＣＡ合成酵素発現の増大を意味する。ＴＨＣＡ過剰発現は、過剰発現が生じる植物又は細胞についてのＴＨＣＡ又はＣＢＣＡ含量の増大に影響を与える。ＴＨＣＡ過剰発現は配列番号１若しくは配列番号３、又は配列番号１若しくは配列番号３の任意の変異体、フラグメント若しくは一部によってコードされる遺伝子産物の生合成の上方調節を指す。
【００８６】
ＣＢＤＡ合成酵素遺伝子の核酸配列（ピキア・パストリス発現についてコドン最適化した）は配列番号５によって表され、配列番号６に記載のポリペプチド配列をコードする。ピキア・パストリス発現のためのＣＢＤＡ合成酵素遺伝子のコドン最適化核酸配列は配列番号７によって表され、ピキア・パストリスのα分泌配列を含むＣＢＤＡ合成酵素アミノ酸配列である配列番号８に記載のポリペプチド配列をコードする。「ＣＢＤＡ合成酵素発現」は配列番号５若しくは配列番号７、又は配列番号５若しくは配列番号７の変異体、フラグメント若しくは一部によってコードされる遺伝子産物の生合成を指す。「ＣＢＤＡ合成酵素発現」は配列番号６若しくは配列番号８を含むポリペプチド、又は配列番号６若しくは配列番号８を含むポリペプチドの変異体、フラグメント若しくは一部の生合成も指す。「ＣＢＤＡ合成酵素過剰発現」はＣＢＤＡ合成酵素発現の増大を意味する。ＣＢＤＡ過剰発現は、過剰発現が生じる植物又は細胞についてのＣＢＤＡ又はＣＢＣＡ含量の増大に影響を与える。ＣＢＤＡ過剰発現は配列番号５若しくは配列番号７、又は配列番号５若しくは配列番号７の任意の変異体、フラグメント若しくは一部によってコードされる遺伝子産物の生合成の上方調節を指す。
【００８７】
本発明は、カンナビノイド又はカンナビノイド類似体の生合成を増大する、植物種のゲノムから単離された又は合成的に作製された任意の核酸、遺伝子、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ分子を包含する。付加的に、かかるカンナビノイド酸合成酵素配列の発現により、酵母、原核（prokaryotic）細胞及び真核（eukaryotic）細胞を含む非カンナビノイド産生細胞、例えば非カンナビノイド産生植物細胞、細菌細胞、昆虫細胞又は酵母細胞においてカンナビノイド又はカンナビノイド類似体が産生される。ＤＮＡ又はＲＮＡは二本鎖又は一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡはセンス鎖としても知られるコード鎖であっても、又はアンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖であってもよい。
【００８８】
ＴＨＣＡ合成酵素及びＣＢＤＡ合成酵素が配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号７にそれぞれ記載の配列、並びに１つ又は複数の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号７の変異体、フラグメント又は一部を含む核酸分子を含み、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号７のいずれか１つの変異体がカンナビノイド又はカンナビノイド類似体生合成活性を有するポリペプチドをコードすることを理解されたい。したがって、「１つ又は複数の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列」を有する配列は、コードされるアミノ酸配列が置換、欠失、挿入又は付加された１つ又は複数のアミノ酸を有する場合であっても生理学的活性を保持する。コードされるアミノ酸配列の生理学的活性は、当該技術分野で既知の従来の酵素アッセイを用いて試験することができる。付加的に、複数の形態のＴＨＣＡ合成酵素及びＣＢＤＡ合成酵素が存在していてもよく、これは遺伝子産物の翻訳後修飾又はそれぞれのＴＨＣＡ合成酵素及びＣＢＤＡ合成酵素の複数の形態に起因し得る。かかる修飾を有し、カンナビノイド又はカンナビノイド類似体生合成酵素をコードするヌクレオチド配列は本発明の範囲内に含まれる。
【００８９】
例えば、ポリＡテール又は５’若しくは３’末端、非翻訳領域は欠失していてもよく、アミノ酸が欠失する範囲内で塩基が欠失していてもよい。塩基はフレームシフトが生じない限りにおいて置換されていてもよい。塩基はアミノ酸が付加される範囲内で「付加されて」いてもよい。しかしながら、任意のかかる修飾によりカンナビノイド酸又はカンナビノイド酸類似体生合成酵素活性の喪失が生じないことが不可欠である。この状況で、修飾ＤＮＡは、特定の部位のアミノ酸が例えば部位特異的突然変異誘発によって置換、欠失、挿入又は付加されるが、カンナビノイド酸又はカンナビノイド酸類似体生合成酵素活性が依然として保持されるように本発明のＤＮＡ塩基配列を修飾することによって得ることができる。コードされるアミノ酸配列のカンナビノイド酸又はカンナビノイド酸類似体生合成酵素活性は上記のようにアッセイすることができる。
【００９０】
カンナビノイド又はカンナビノイド類似体生合成配列は、例えば本明細書で開示される適切なタンパク質配列を、自然のＤＮＡ配列とは異なるが、同じ又は同様のアミノ酸配列を有するタンパク質の産生をもたらすＤＮＡ分子を作り出すガイドとして用いることによって適切な塩基より最初から合成することができる。このタイプの合成ＤＮＡ分子は、異なる（非植物）コドン使用頻度を反映し、修飾せずに用いる場合に、宿主細胞による非効率的な翻訳をもたらす可能性がある異種タンパク質をコードする非植物細胞にＤＮＡ配列を導入する場合に有用である。
【００９１】
「単離」核酸分子（複数の場合もある）とは、その自然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意図する。例えば、ＤＮＡ構築物中に含有される組み換えＤＮＡ分子は本発明の目的上、単離されているとみなされる。単離ＤＮＡ分子の更なる例としては、異種宿主細胞中に維持される組み換えＤＮＡ分子、又は溶液中で部分的若しくは実質的に精製されるＤＮＡ分子が挙げられる。単離ＲＮＡ分子は本発明のＤＮＡ分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ転写産物を含む。本発明による単離核酸分子は合成的に作製された分子を更に含む。
【００９２】
「外因性核酸」は細胞に人為的に導入された核酸、ＤＮＡ又はＲＮＡを指す。かかる外因性核酸は、核酸が導入された細胞中に天然に見られる配列又はそのフラグメントのコピーであってもよい。
【００９３】
対照的に、「内因性核酸」は遺伝子操作される植物又は生物のゲノム内に存在する核酸、遺伝子、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ分子を指す。内因性配列は、遺伝子操作される植物又は生物に対して「自然（native）」、すなわち固有である。
【００９４】
「異種核酸」は、核酸が導入される細胞中に天然に見られる配列のコピーではない、細胞に導入された核酸、ＤＮＡ又はＲＮＡを指す。かかる異種核酸は、核酸が導入された細胞中に天然に見られる配列又はそのフラグメントのコピーであるセグメントを含んでいてもよい。
【００９５】
「キメラ核酸」は、コード配列が天然に生じる細胞内で会合する転写開始領域とは異なる転写開始領域に連結したコード配列又はそのフラグメントを含む。
【００９６】
本願は配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号７のいずれかに記載の核酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の核酸分子に関する。配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号７のいずれかに示される核酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の核酸分子が好ましい。２つの核酸配列間の差は参照ヌクレオチド配列の５’若しくは３’末端位置、又は参照配列中のヌクレオチド間に個別に若しくは参照配列内の１つ若しくは複数の隣接基に散在した、これらの末端位置間の任意の場所に生じ得る。
【００９７】
実際に、任意の特定の核酸分子が参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるか否かは、当該技術分野で既知の標準的なアルゴリズムを用いて２つの分子間で行われる比較を指し、ＢＬＡＳＴアルゴリズム等の公表されているコンピュータプログラムを用いて常法により決定することができる。
【００９８】
本発明は、活性カンナビノイド又はカンナビノイド類似体生合成酵素をコードする配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号７のそれぞれのヌクレオチド配列を含む核酸分子を更に提供し、ここで酵素は配列番号２、配列番号４、配列番号６及び配列番号８のそれぞれ、又は配列番号２、配列番号４、配列番号６及び配列番号８のいずれか１つの変異体、フラグメント若しくは一部に対応するアミノ酸配列を有し、本発明のタンパク質は、カンナビノイド又はカンナビノイド類似体生合成酵素の機能を変えないアミノ酸の置換、付加及び欠失を包含する。
【００９９】
「変異体」は、特定の遺伝子又はタンパク質の標準又は所与のヌクレオチド若しくはアミノ酸配列から逸脱したヌクレオチド又はアミノ酸配列である。「アイソフォーム」、「アイソタイプ」及び「類似体」という用語は、「変異体」形態のヌクレオチド又はアミノ酸配列も指す。１つ若しくは複数のアミノ酸の付加、除去若しくは置換、又はヌクレオチド配列の変化によって変えられるアミノ酸配列は「変異体」配列とみなすことができる。変異体は、置換されたアミノ酸が同様の構造的又は化学的特性を有する「保存的」変化、例えばイソロイシンによるロイシンの置き換えを有していてもよい。変異体は「非保存的」変化、例えばトリプトファンによるグリシンの置き換えを有していてもよい。類似の僅かな変異にはアミノ酸の欠失若しくは挿入又はその両方も含まれ得る。どのアミノ酸残基が置換、挿入又は欠失し得るかを決定する際の指針は、当該技術分野で既知のコンピュータプログラムを用いて見つけることができる。
【０１００】
本発明は、カンナビノイド又はカンナビノイド類似体の産生に関与する酵素をコードする核酸配列で「非カンナビノイド又はカンナビノイド類似体産生細胞」を遺伝子操作することを企図する。非カンナビノイド又はカンナビノイド類似体産生細胞は、カンナビノイド又はカンナビノイド類似体を産生しない任意の生物に由来する細胞を指す。例示的な細胞としては、植物細胞及び昆虫、哺乳動物、酵母、真菌、藻類又は細菌の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
「真菌細胞」は、カンナビノイド又はカンナビノイド類似体生合成酵素をコードする遺伝子で形質転換することができ、酵素又はその産物を回収可能な量で発現することが可能な任意の真菌細胞を指す。例示的な真菌細胞としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）及びピキア・パストリス等の酵母細胞が挙げられる。アスペルギルス属及びトリコデルマ属等の糸状菌の細胞を使用することもできる。
【０１０２】
カンナビノイド酸合成酵素遺伝子配列は、公表されているデータベースから得ることができる。本発明の好ましい態様では、カンナビノイド酸合成酵素遺伝子の１つ又は複数のコピーをｉｎ  ｖｉｖｏで生成し、上記方法はカンナビノイド酸合成酵素遺伝子の１つ又は複数のコピーをピキア・パストリス等の真核生物宿主のゲノムに組み込み、タンパク質発現をスケールアップすることを含む。好ましくは、カンナビノイド酸合成酵素遺伝子はタンパク質分泌を標的とするようにα分泌配列でコドン最適化されるか、又は精製を促進するために３’末端に６個のタンデムヒスチジン残基がタグ付けされる。このプロセスは、カンナビノイド酸合成酵素遺伝子を１つ又は複数の制限酵素での消化によって線状化することと、カンナビノイド酸合成酵素遺伝子をゲル抽出によって抽出することと、カンナビノイド酸合成酵素遺伝子をピキア・パストリスプラスミドにライゲートすることと、プラスミドを細菌細胞に電気穿孔して、１つ又は複数のカンナビノイド酸合成酵素遺伝子コピーのコロニーを生成することとを含む。
【０１０３】
このため、一実施形態では、α−ＣＢＤＡ合成酵素及びα−ＴＨＣＡ合成酵素配列の１つ又は複数のコピーを例えば上記のような修飾、ｐＰｉｎｋ−ＨＣベクター（Invitrogen（商標））への挿入、及び大腸菌細胞への形質転換によって生成する。形質転換細胞は今後の使用のために寒天スタブとして保管することができる。酵母細胞の形質転換の前にカンナビノイド酸合成酵素の対象の遺伝子（ＧＯＩ）を含有するベクターを、形質転換大腸菌細胞を含有する寒天スタブから単離し、ＰｍｅＩ又はＳｐｅＩ制限酵素を用いて線状化し、それにより得られる線状化プラスミドを、ＰｉｃｈｉａＰｉｎｋ（商標）酵母発現系（Invitrogen（商標））     を用いてピキア・パストリスｐｅｐＢ欠失突然変異細胞に電気穿孔する。制限酵素ＰｍｅＩを用いた線状化では挿入断片がピキアゲノムのＡＯＸ１プロモーター領域に指向され、制限酵素ＳｐｅＩを用いた線状化では挿入断片がＴＲＰ遺伝子に指向される。
【０１０４】
形質転換酵母細胞をアデニン欠乏選択的プレートで増殖させ、それにより形成されるコロニーをスクリーニングして、陽性形質転換体を特定することができる。スクリーニング法としては、カラースクリーニング法が挙げられるが、これに限定されない。通例、多量の組み換えタンパク質、例えば培養物１リットル当たり約１．０ｇ〜約２．０ｇのタンパク質を得るためには、６コピー〜１０コピーの対象の遺伝子を有する細胞が所望される。
【０１０５】
一実施形態では、ＴＨＣＡ合成酵素遺伝子又はＣＢＤＡ合成酵素遺伝子を保有する酵母細胞の個々の白色コロニーを、例えばＢＭＧＹ培地を用いてフラスコ内で別個に培養し、続いてＢＭＭＹ培地中での増殖により誘導し、下記に更に記載されるようにＴＨＣＡ合成酵素又はＣＢＤＡ合成酵素の発現を誘導する。簡潔に述べると、各々の培養物中の酵素を含有する培地を細胞から分離し、既知の量の基質と反応させ、生成物を分析する。２０％超の変換を示す形質転換体の培養物を、本発明の方法に従うカンナビノイド又はカンナビノイド類似体の商業的合成に用いる。
【０１０６】
上記のＰｉｃｈｉａＰｉｎｋ（商標）酵母発現系を用いて得られるカンナビノイド酸合成酵素、ＴＨＣＡ合成酵素及びＣＢＤＡ合成酵素を、カンナビノイド又はカンナビノイド類似体の製造に使用することができる。そのように得られるカンナビノイド又はカンナビノイド類似体は治療薬として単離、精製及び使用される。更なる実施形態では、そのように得られるカンナビノイド又はカンナビノイド類似体を脱炭酸工程に供する。
【０１０７】
本発明によるカンナビノイド合成酵素としては、カンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）合成酵素及びテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）合成酵素が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０８】
一実施形態では、本発明は式Ｉの化合物及びカンナビノイド酸合成酵素を、式Ｉの化合物をカンナビノイド又はカンナビノイド類似体へと変換する触媒として選択することによってカンナビノイド又はカンナビノイド類似体を作製する方法を提供する。
【化１３】
2020036617.tif 000019
【０１０９】
式Ｉにおいて、Ｒはヒドロキシル（−ＯＨ）、ハロゲン、チオール（−ＳＨ）又は−ＮＲａＲｂ基から選択することができる。置換基Ｒ１及びＲ２は各々独立して−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＲａ、任意に置換されたＣ１〜Ｃ１０直鎖又は分岐アルキレン、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０直鎖又は分岐アルケニレン、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０直鎖又は分岐アルキニレン、任意に置換されたＣ３〜Ｃ１０アリール、任意に置換されたＣ３〜Ｃ１０シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン及び（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニレンからなる群から選択される。代替的には、Ｒ１及びＲ２はそれらが結合する炭素原子とともにＣ５〜Ｃ１０環式環を形成する。式Ｉによる化合物については、Ｒ３はＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ及びＣ１〜Ｃ１０直鎖又は分岐アルキルからなる群から選択され、Ｒａ及びＲｂは各々独立して−Ｈ、−ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１０）直鎖若しくは分岐アルキル、−ＳＨ、−ＮＨ２又はＣ３〜Ｃ１０シクロアルキルである。
【０１１０】
Ｒ２は直鎖アルキレン又は分岐アルキレンであり得る。直鎖アルキレンの例としては、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、Ｃ３Ｈ７、Ｃ４Ｈ９、Ｃ５Ｈ１１、Ｃ６Ｈ１３、Ｃ７Ｈ１５及びＣ８Ｈ１７が挙げられるが、これらに限定されない。分岐アルキレンの例は、イソプロピル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ネオペンチル基、２−メチルヘキシル基、又は２，３−ジメチルヘキシル基から選択される基である。幾つかの実施形態では、Ｒ２は任意に置換された直鎖又は分岐アルキレンとすることができ、ここで１つ又は複数の水素原子が、限定されるものではないが塩素、フッ素、臭素、ニトロ、アミノ、ヒドロキシル、フェニル、又はベンジル基から選択される基で置き換えられている。
【０１１１】
一実施形態では、Ｒ１及びＲ２はそれらが結合する環炭素原子とともにＣ５〜Ｃ１０環式環を形成する。かかる式Ｉの化合物については、環の１つ又は複数の炭素原子が酸素、硫黄又は窒素から選択されるヘテロ原子で置換されていてもよい。
【０１１２】
別の実施形態では、Ｒ２はＣ２〜Ｃ１０アルケニレンであり、
【化１４】
2020036617.tif 000020
からなる群から選択され、Ｒ４は上記の直鎖又は分岐アルキレンである。Ｒ２がＣ２〜Ｃ１０直鎖又は分岐アルキニレンである場合、Ｒ２は、
【化１５】
2020036617.tif 000021
であり得る。代替的には、式Ｉ中のＲ２は、
【化１６】
2020036617.tif 000022
であり、置換基Ｘは−ＯＨ、−ＳＨ又は−ＮＲａＲｂから選択される基であり、基Ｒａ及びＲｂは上記で規定される通りである。
【０１１３】
一実施形態では、本発明によって合成されるカンナビノイド及び／又はカンナビノイド類似体はＲ１置換基としてカルボン酸（−ＣＯＯＨ）基を有し、それらを医薬品又は栄養剤として使用する前に任意の脱炭酸工程に供してもよい。カルボン酸基を有するカンナビノイド又はカンナビノイド類似体の例としては、Ｒが−ＯＨであり、Ｒ１が−ＣＯＯＨであり、Ｒ２がＣ５Ｈ１１であり、Ｒ３が−Ｈである式Ｉの化合物と上記のように得られるカンナビノイド酸合成酵素とを反応させることによって得られる化合物が挙げられるが、これに限定されない。
【０１１４】
カンナビノイド又はカンナビノイド類似体の合成、単離及び精製は、カンナビノイド酸合成酵素を固体支持体に固定化すること、又は合成酵素をリポソームに封入することで改善することができる。一態様では、酵素を固体支持体に固定化する。いかなる理論にも束縛されるものではないが、本願の発明者らは、固定化が酵素触媒の使用及び回収、所望の生成物の精製、並びに最終生成物のエナンチオマー過剰率（ｅｅ）の維持を促進し、生成物の収率の全体的な改善をもたらすことを予期せず発見した。さらに、固定化は固定化酵素のリサイクル及び再利用を可能にし、医薬品グレードのカンナビノイド又はカンナビノイド類似体の製造と関連するコストを顕著に低減する。通例、本発明により作製されるカンナビノイド又はカンナビノイド類似体のエナンチオマー純度は約９０％ｅｅ〜約１００％ｅｅであり、例えば本発明の手法を用いて作製されるカンナビノイド又はカンナビノイド類似体は約９１％ｅｅ、約９２％ｅｅ、約９３％ｅｅ、約９４％ｅｅ、約９５％ｅｅ、約９６％ｅｅ、約９７％ｅｅ、約９８％ｅｅ及び約９９％ｅｅのエナンチオマー純度を有し得る。
【０１１５】
通例、固定化される酵素は固体支持体に吸収させる、支持体に吸着させる、支持体に共有結合する、又はイオン相互作用により固体支持体に固定化することができる。一実施形態では、カンナビノイド酸合成酵素を固体支持体に共有結合させる。酵素を固体支持体に連結するのに好適な戦略は生化学分野で既知であり、適切に官能化された支持体とアミノ酸基の側鎖との共有結合、又は支持体を酵素から分離するための適切に官能化されたリンカー若しくはスペーサーを用いた共有結合によるものが含まれる。「リンカー」という用語は、支持体を酵素から分離する任意の基を指す。したがって、リンカーは共有結合により支持体の表面上の基の一端に繋がれ、もう一端の酵素に付着する基である。例示的なリンカーとしては、エチレングリコールの（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレンリンカーポリマー、例えば−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−Ｏ−基（ここで、ｎは０〜１０の整数である）、−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン−ＮＨ−、−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレンシロキシ、又は−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン−Ｃ（Ｏ）−が挙げられる。
【０１１６】
酵素の固定化に好適な支持体としては、限定されるものではないが、アンバーライト樹脂、デュオライト樹脂、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ（商標）Ｃ、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ等のアクリル樹脂、及びポリビニルアルコールを用いて作製されるゲルが挙げられる。
【０１１７】
カンナビノイドは種々の生理学的特性を示し、痛みを軽減し、食欲を刺激することが知られており、アレルギー、炎症、感染、癲癇、鬱病、片頭痛、双極性障害、不安障害及び緑内障等の様々な疾患状態を治療する候補治療薬として試験されている。カンナビノイドが示す生理的効果はカンナビノイド受容体、例えばＣＢ１、ＣＢ２及びＣＢ３受容体を刺激又は不活性化するその能力に影響を受ける。したがって、本発明は、本発明によって作製されるカンナビノイド及び／又はカンナビノイド類似体に付着した置換基の性質及び配向を決定することで、カンナビノイド及び／又はカンナビノイド類似体結合相互作用並びにカンナビノイド受容体活性部位内のリガンドの配向を変更することによって、カンナビノイド受容体活性及びそれらの薬学的特性を変調する手段を提供する。
【０１１８】
このため、一実施形態では、本発明は中央コアに付着した構造的に異なる多様な置換基を有し、したがって種々の薬学的に有益な特性を示すカンナビノイド及びカンナビノイド類似体を製造する方法を提供する。構造多様性は、適切に置換された式ＩＩＩの化合物と式ＩＶの化合物とを、ＧＰＰオリベトレートゲラニルトランスフェラーゼ（ポリケチド合成酵素）等の酵素の存在下で接触させ、式ＩＩの化合物を得ることによって達成される。下記スキーム１に、本実施形態に従う式ＩＩの化合物を合成するプロトコルを構造的に示す。
【化１７】
2020036617.tif 000023
【０１１９】
本発明によるカンナビノイド及び／又はカンナビノイド類似体の製造のための基質として働く種々の式ＩＩの化合物は、式ＩＩＩ及び式ＩＶの化合物中のＲ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ５の置換基の性質及びタイプを変えることによって得ることができる。したがって、本実施形態によると、種々のカンナビノイド及び／又はカンナビノイド類似体は、式ＩＩの化合物と上記のように得られるカンナビノイド酸合成酵素、例えばＴＨＣＡ合成酵素又はＣＢＤＡ合成酵素とを反応させ、続いてカンナビノイド又はカンナビノイド類似体を得るために得られる生成物を単離及び脱炭酸することによって得ることができる。
【０１２０】
式ＩＩＩにおいて、Ｒはヒドロキシル（−ＯＨ）、ハロゲン、チオール（−ＳＨ）又は−ＮＲａＲｂ基から選択することができる。置換基Ｒ１及びＲ２は各々独立して−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＲａ、任意に置換された直鎖又は分岐（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、任意に置換された直鎖又は分岐（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン、任意に置換された直鎖又は分岐（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキニレン、任意に置換されたＣ３〜Ｃ１０アリール、任意に置換されたＣ３〜Ｃ１０シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン及び（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニレンからなる群から選択される。
【０１２１】
或る特定の実施形態では、Ｒ１及びＲ２はそれらが結合する炭素原子とともにＣ５〜Ｃ１０環式環を形成し、Ｒ３はＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ及びＣ１〜Ｃ１０直鎖又は分岐アルキルからなる群から選択される。
【０１２２】
式ＩＶ中のＲ５は直鎖又は分岐（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、直鎖又は分岐（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン、直鎖又は分岐（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキニレン、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン及び−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキニレンとすることができる。式ＩＩ、式ＩＩＩ及び式ＩＶの化合物については、任意のアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリール、アリールアルキレン又はシクロアルキル基が−ＯＨ、ハロゲン、−ＮＲｂＲｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、−ＣＮ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ４）ハロアルキル及び（Ｃ１〜Ｃ４）ヒドロキシアルキルからなる群から選択される１つ又は複数の基で更に置換されていてもよく、Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは各々独立して−Ｈ、−ＯＨ、又は（Ｃ１〜Ｃ１０）直鎖若しくは分岐アルキル、−ＳＨ、−ＮＨ２、又はＣ３〜Ｃ１０シクロアルキルから選択される。
【０１２３】
一実施形態によると、式ＩＶ中のＲ５は、
【化１８】
2020036617.tif 000024
から選択される（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレンであってもよく、Ｒ４はＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、Ｃ３Ｈ７、Ｃ４Ｈ９、Ｃ５Ｈ１１、Ｃ６Ｈ１３、Ｃ７Ｈ１５及びＣ８Ｈ１７からなる群から選択される直鎖アルキレンである。或る特定の式ＩＶの化合物については、Ｒ５は、
【化１９】
2020036617.tif 000025
であり、Ｒ６基は（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン、−ＯＨ、−ＳＨ、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、−ＮＨ２又は−ＮＨＲａから選択され、Ｒａは上記で規定される通りである。
【０１２４】
上記のような組み換えカンナビノイド酸合成酵素遺伝子によってコードされるタンパク質を過剰発現させることによって得られる組み換えカンナビノイド酸合成酵素を、上記のような式Ｉによる基質又は式ＩＩによる基質と、溶媒及び両親媒性化合物を含む反応混合物中で反応させ、１つ又は複数のカンナビノイド又はカンナビノイド類似体を作製する。それにより形成されるカンナビノイド又はカンナビノイド類似体を反応混合物から単離し、任意に脱炭酸する。好ましくは、組み換えカンナビノイド酸合成酵素は上記の方法によって得られる組み換えＣＢＤＡ合成酵素又は組み換えＴＨＣＡ合成酵素である。本発明の好ましい態様では、反応混合物中の溶媒はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）又はイソプロピルアルコール等の非水溶媒である。反応混合物における溶媒の濃度は１０％〜３０％（ｖ／ｖ）で変えることができる。本願の発明者らは、反応混合物における非水溶媒の濃度が反応速度及び異なるカンナビノイド生成物の比率に影響を与えることを予期せず発見した。このため、下記表はＴＨＣＡ合成酵素によって誘導される反応において、反応混合物における２０％（ｖ／ｖ）濃度でのＤＭＳＯの存在が反応速度を２．５倍増大し、ＴＨＣＡ及びＣＢＣＡを５：１の比率で生じる反応を引き起こすが、反応混合物における１０％（ｖ／ｖ）濃度でのＤＭＳＯの存在によりＴＨＣＡ及びＣＢＣＡが１０：１の比率で生じることを示す。したがって、本発明の好ましい態様では、反応混合物中の非水溶媒はＤＭＳＯであり、反応混合物におけるＤＭＳＯの濃度は最も好ましくは２０％（ｖ／ｖ）である。
【０１２５】
【表５】
2020036617.tif 000026
【０１２６】
本発明の付加的な好ましい実施形態では、反応混合物は両親媒性化合物も含む。好ましくは、両親媒性化合物は界面活性剤又はシクロデキストリンである。界面活性剤としては、陽イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤及び陰イオン性界面活性剤を挙げることができるが、これらに限定されない。最も好ましくは、反応混合物はシクロデキストリンを含有する。
【０１２７】
シクロデキストリンは６個以上の１−４結合α−無水グルコース部分からなる天然の環状オリゴ糖であり、デンプンから酵素反応によって作製することができる。シクロデキストリンは、グルコース単位の数によってα−シクロデキストリン（６単位）、β−シクロデキストリン（７単位）及びγ−シクロデキストリン（８単位）に分類される。シクロデキストリンの構造を下記に示す：
【化２０】
2020036617.tif 000027
【０１２８】
シクロデキストリン分子の外側の第二級ヒドロキシル基は親水性であり、第一級ヒドロキシル基は疎水性中心空洞を形成する。いかなる理論にも束縛されるものではないが、シクロデキストリン中の疎水性中心空洞は反応混合物中の基質をゲスト分子として組み込み、それにより形成される複合体は、共有又はイオン結合が形成されないにもかかわらず基質を保護及び安定化すると考えられる。
【０１２９】
本願の発明者らは、下記表に示されるように、反応混合物におけるシクロデキストリンの濃度が基質から生成物への変換率及び反応の異なる生成物の比率に影響を与えることを予期せず発見した。下記表はｐＨ４．８５でのＣＢＤＡ合成酵素反応に対する反応混合物におけるシクロデキストリン濃度の影響を示す。
【０１３０】
下記表に示されるように、ＣＢＤＡ合成酵素反応におけるシクロデキストリンの濃度を０ｍｇ／ｍｌから２８ｍｇ／ｍｌまで増大することによって、ＣＢＧＡからＣＢＤＡ及びＣＢＣＡへの変換率が増大し、最高の変換率はシクロデキストリン濃度が８ｍｇ／ｍｌ及び１２ｍｇ／ｍｌである場合に見られた（シクロデキストリンを反応に添加しない場合と比較して２０％高い変換率）。
【０１３１】
シクロデキストリンの添加により、ｐＨ５でのＣＢＤＡ：ＣＢＣＡの比率が僅かに変化する。最も高いＣＢＤＡ：ＣＢＣＡ比（ＣＢＤＡ：ＣＢＣＡ  １．４１：１）はシクロデキストリン濃度が２０ｍｇ／ｍｌである場合に観察され、最も低いＣＢＤＡ：ＣＢＣＡ比（ＣＢＤＡ：ＣＢＣＡ  １．０４：１）はシクロデキストリン濃度が１６ｍｇ／ｍｌである場合に観察された。
【０１３２】
【表６】
2020036617.tif 000028
【０１３３】
シクロデキストリンはα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン又はγ−シクロデキストリンであり得る。幾つかの実施形態では、シクロデキストリンはスルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム塩又は無作為メチル化β−シクロデキストリンである。反応混合物中に存在する場合、シクロデキストリンは約０．００１ｍｇ／ｍｌ〜約３０ｍｇ／ｍｌの濃度である。好ましくは、反応混合物におけるシクロデキストリンの濃度は２ｍｇ／ｍｌ〜２８ｍｇ／ｍｌである。最も好ましい実施形態では、反応混合物におけるシクロデキストリンの濃度は８ｍｇ／ｍｌである。
【０１３４】
下記表及び図１１〜図１７に示されるように、シクロデキストリンを用いない場合、ＤＭＳＯの量を１０％から２０％まで増大することによって、ＣＢＧＡの変換が一晩で１３．５％から４５．８％まで増大し、ＴＨＣＡ：ＣＢＣＡの比率が３．３３：１から２．２４：１まで変化した。シクロデキストリンを１０％ＤＭＳＯとともに反応に加えることで、ＣＢＧＡの変換が８９．７％まで増大し、４．２：１というＴＨＣＡ：ＣＢＣＡの比率が得られた。シクロデキストリンの濃度を４０％又は６０％まで増大することによっても同じ結果が得られた。
【０１３５】
【表７】
2020036617.tif 000029
【０１３６】
本発明の方法によって作製されるカンナビノイド又はカンナビノイド類似体は、エナンチオマー純度が少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の単一エナンチオマーであり得る。
【０１３７】
本願の発明者らは、反応混合物のｐＨが得られる異なるカンナビノイド生成物の比率に影響を与えることも予期せず発見した。したがって、好ましい実施形態では、カンナビノイド生成物及び／又はカンナビノイド類似体生成物を所望の比率で得るために反応混合物のｐＨを変更する。このため、本発明による式Ｉの化合物と反応させた場合、ＴＨＣＡ合成酵素はテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）、ＴＨＣＡ及びＣＢＣＡ又はそれらの類似体を反応のｐＨに応じて異なる比率で生じ得る。好ましくは、反応を３．８〜７．２の範囲のｐＨで行い、上記方法により各々の指定したｐＨでＴＨＣＡ、ＣＢＣＡ又はＴＨＣＡ及びＣＢＣＡを以下の表に示される比率で作製する。
【０１３８】
【表８】
2020036617.tif 000030
【０１３９】
要約すると、ＴＨＣＡ合成酵素反応のｐＨの変化は生成物に影響を与える。ｐＨ４ではＴＨＣＡのみが生成物である。ｐＨ５ではＴＨＣＡ：ＣＢＣＡの比率は２．３３：１である。ｐＨ６で比率は逆転し、生成物ミックスはＴＨＣＡ：ＣＢＣＡ  １：５．６７である。ｐＨ７ではＣＢＣＡのみが生成物である。これらの条件下で、式Ｉの化合物の９８％が２時間以内に１つ又は複数のカンナビノイド又はカンナビノイド類似体に変換される。
【０１４０】
同様に、式Ｉの化合物と反応させた場合、ＣＢＤＡ合成酵素はカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）、ＣＢＤＡ及びＣＢＣＡ又はそれらの類似体を反応のｐＨに応じて異なる比率で生じ得る。好ましくは、反応を３．８〜７．２の範囲のｐＨで行い、上記方法により各々の指定したｐＨでＣＢＤＡ、ＣＢＣＡ又はＣＢＤＡ及びＣＢＣＡを以下の表に示される比率で作製する。
【０１４１】
【表９】
2020036617.tif 000031
【０１４２】
要約すると、ＣＢＤＡ合成酵素反応のｐＨの変化は生成物に影響を与える。ｐＨ４．２ではＣＢＤＡ：ＣＢＣＡ比は２．５：１である。ｐＨ５ではＣＢＤＡ：ＣＢＣＡの比率は１．１３：１である。ｐＨ６．８ではＣＢＤＡ合成酵素反応による生成物は形成されない。これらの条件下で、式Ｉの化合物の７０％が２時間以内に１つ又は複数のカンナビノイド又はカンナビノイド類似体に変換される。
【０１４３】
本発明は、式ＩＩによる１つ又は複数のカンナビノイド又はカンナビノイド類似体：
【化２１】
2020036617.tif 000032
を作製する方法であって、（ａ）式ＩＩＩによる化合物と式ＩＶによる化合物とを：
【化２２】
2020036617.tif 000033
式ＩＩＩ及び式ＩＶの化合物の反応を触媒する酵素の存在下で反応させ、式ＩＩの化合物を形成する工程と、（ｂ）式ＩＩの化合物とカンナビノイド酸合成酵素とを上記のような溶媒及び両親媒性化合物を含む反応混合物中で反応させ、１つ又は複数のカンナビノイド又はカンナビノイド類似体を作製する工程と、（ｃ）工程（ｂ）において作製された１つ又は複数のカンナビノイド又はカンナビノイド類似体を反応混合物から単離する工程と、（ｅ）任意に、工程（ｃ）において単離された１つ又は複数のカンナビノイド又はカンナビノイド類似体を脱炭酸する工程とを含む、方法も提供する。式ＩＩＩ中のＲは−ＯＨ、ハロゲン、−ＳＨ又は−ＮＲａＲｂ基から選択することができ、Ｒ１及びＲ２は各々独立して−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＲａ、任意に置換された直鎖若しくは分岐（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、任意に置換された直鎖若しくは分岐（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン、任意に置換された直鎖若しくは分岐（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキニレン、任意に置換されたＣ３〜Ｃ１０アリール、任意に置換されたＣ３〜Ｃ１０シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン及び（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニレンからなる群から選択されるか、又はＲ１及びＲ２はそれらが結合する炭素原子とともにＣ５〜Ｃ１０環式環を形成し、Ｒ３はＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ及びＣ１〜Ｃ１０直鎖又は分岐アルキルからなる群から選択される。式ＩＶ中のＲ５は直鎖又は分岐（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、直鎖又は分岐（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン、直鎖又は分岐（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキニレン、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン及び−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキニレンからなる群から選択することができ、ここで任意のアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリール、アリールアルキレン又はシクロアルキル基は−ＯＨ、ハロゲン、−ＮＲｂＲｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、−ＣＮ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ４）ハロアルキル及び（Ｃ１〜Ｃ４）ヒドロキシアルキルからなる群から選択される１つ又は複数の基で更に置換され、Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは各々独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ１０）直鎖若しくは分岐アルキル又はＣ３〜Ｃ１０シクロアルキルである。
【０１４４】
一実施形態では、Ｒ５は、
【化２３】
2020036617.tif 000034
からなる群から選択される（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレンであり、Ｒ４はＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、Ｃ３Ｈ７、Ｃ４Ｈ９、Ｃ５Ｈ１１、Ｃ６Ｈ１３、Ｃ７Ｈ１５及びＣ８Ｈ１７からなる群から選択される直鎖アルキレンである。本発明の好ましい態様では、Ｒ５は、
【化２４】
2020036617.tif 000035
であり、Ｒ６は（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン、−ＯＨ、−ＳＨ、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、−ＮＨ２又は−ＮＨＲａから選択される。
【０１４５】
また別の実施形態では、本発明はテトラヒドロカンナビノール、カンナビクロメン、若しくはテトラヒドロカンナビノール及びカンナビクロメンの両方、又はそれらの類似体を作製する方法であって、（ａ）式Ｉによる化合物：
【化２５】
2020036617.tif 000036
を選択する工程と、（ｂ）式Ｉの化合物とテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）合成酵素とを上記のような溶媒及び両親媒性化合物を含む反応混合物中で反応させる工程と、（ｃ）反応混合物の少なくとも１つの特性、例えば反応のｐＨ、非水溶媒の性質及び／又は濃度、及び／又はシクロデキストリン等の両親媒性化合物の濃度を変更して、テトラヒドロカンナビノール、カンナビクロメン、若しくはテトラヒドロカンナビノール及びカンナビクロメンの両方、又はそれらの類似体を上記のような生成物として得る工程と、（ｄ）テトラヒドロカンナビノール、カンナビクロメン、若しくはテトラヒドロカンナビノール及びカンナビクロメンの両方、又はそれらの類似体を反応混合物から単離する工程と、（ｅ）テトラヒドロカンナビノール、カンナビクロメン、若しくはテトラヒドロカンナビノール及びカンナビクロメンの両方、又はそれらの類似体を脱炭酸する工程とを含む、方法を提供する。式Ｉ中のＲは−ＯＨ、ハロゲン、−ＳＨ又は−ＮＲａＲｂ基から選択することができ、Ｒ１及びＲ２は各々独立して−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＲａ、任意に置換されたＣ１〜Ｃ１０直鎖若しくは分岐アルキレン、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０直鎖若しくは分岐アルケニレン、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０直鎖若しくは分岐アルキニレン、任意に置換されたＣ３〜Ｃ１０アリール、任意に置換されたＣ３〜Ｃ１０シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン及び（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニレンからなる群から選択されるか、又はＲ１及びＲ２はそれらが結合する炭素原子とともにＣ５〜Ｃ１０環式環を形成し、Ｒ３はＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ及びＣ１〜Ｃ１０直鎖又は分岐アルキルからなる群から選択され、Ｒａ及びＲｂは各々独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ１０）直鎖若しくは分岐アルキル又はＣ３〜Ｃ１０シクロアルキルである。
【０１４６】
異なる実施形態では、本発明はカンナビジオール、カンナビクロメン若しくはカンナビジオール及びカンナビクロメンの両方、又はそれらの類似体を作製する方法であって、（ａ）式Ｉによる化合物：
【化２６】
2020036617.tif 000037
を選択する工程と、（ｂ）式Ｉの化合物とカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）合成酵素とを上記のような溶媒及び両親媒性化合物を含む反応混合物中で反応させる工程と、（ｃ）反応混合物の少なくとも１つの特性、例えば反応のｐＨ、非水溶媒の性質及び／又は濃度、及び／又はシクロデキストリン等の両親媒性化合物の濃度を変更して、カンナビジオール、カンナビクロメン若しくはカンナビジオール及びカンナビクロメンの両方、又はそれらの類似体を生成物として得る工程と、（ｄ）カンナビジオール、カンナビクロメン若しくはカンナビジオール及びカンナビクロメンの両方、又はそれらの類似体を反応混合物から単離する工程と、（ｅ）カンナビジオール、カンナビクロメン若しくはカンナビジオール及びカンナビクロメンの両方、又はそれらの類似体を脱炭酸する工程とを含む、方法も提供する。式Ｉ中のＲは−ＯＨ、ハロゲン、−ＳＨ又は−ＮＲａＲｂ基から選択することができ、Ｒ１及びＲ２は各々独立して−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＲａ、任意に置換されたＣ１〜Ｃ１０直鎖若しくは分岐アルキレン、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０直鎖若しくは分岐アルケニレン、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０直鎖若しくは分岐アルキニレン、任意に置換されたＣ３〜Ｃ１０アリール、任意に置換されたＣ３〜Ｃ１０シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン及び（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニレンからなる群から選択されるか、又はＲ１及びＲ２はそれらが結合する炭素原子とともにＣ５〜Ｃ１０環式環を形成し、Ｒ３はＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ及びＣ１〜Ｃ１０直鎖又は分岐アルキルからなる群から選択され、Ｒａ及びＲｂは各々独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ１０）直鎖若しくは分岐アルキル又はＣ３〜Ｃ１０シクロアルキルである。
【０１４７】
このように、本発明者らは、異なるカンナビノイド及び／又はカンナビノイド類似体を、反応のｐＨ、非水溶媒の性質及び／又は濃度、及び／又は反応混合物におけるシクロデキストリン等の両親媒性化合物の濃度を変更することによって所望の比率で制御して作製する方法を考案した。
【０１４８】
カンナビノイド又はカンナビノイド類似体を作製する装置及び方法
本発明の方法により１つ又は複数のカンナビノイド又はカンナビノイド類似体を作製する装置又はシステムが提供される。装置は発酵装置、フィルター、バイオリアクター及び制御機構を備えることができる。図７は、実施形態による少なくとも１つのカンナビノイド及び／又は少なくとも１つのカンナビノイド類似体を作製するように構成される装置１００を示す。図７に示されるように、装置１００は発酵装置１０、フィルター２０、バイオリアクター３０及び制御機構（制御装置）４０を備える。発酵装置１０は細胞培養培地１２及び複数の細胞１４を収容する。細胞１４はカンナビノイド酸合成酵素を産生及び分泌する。カンナビノイド酸合成酵素の製造のために発酵装置１０内で増殖させる細胞１４は、カンナビノイド酸合成酵素タンパク質をコードする核酸配列又は遺伝子を含むように遺伝子操作した酵母、原核細胞又は真核細胞であり得る。或る特定の実施形態では、カンナビノイド酸合成酵素タンパク質をコードする核酸配列は、酵母α分泌配列をその５’末端に含み、６残基ヒスチジンタグをその３’末端に組み込むように修飾される。酵母α分泌配列の付加は、真核細胞増殖に使用される培地１２へのカンナビノイド合成酵素タンパク質の分泌を可能にする。発酵装置１０におけるカンナビノイド合成酵素の産生に続いて、培地１２及び細胞１４（及びカンナビノイド合成酵素）を含む上清を経路に沿ってフィルター２０へと輸送する。
【０１４９】
フィルター２０は上清を濾過し、発現された酵素を含有する培地１２から細胞１４を少なくとも部分的に分離することができる。通例、フィルター２０は全細胞１４の少なくとも８０％を培地から分離する。幾つかの実施形態では、フィルター２０は全細胞１４の少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％を、培地１２から分離する。濾過の後、細胞１４は発酵装置１０へと再び輸送される。一実施形態では、フィルター２０は、カンナビノイド合成酵素を精製するための複数のフィルター及びリザーバを備える濾過及び精製システムであり得る。
【０１５０】
フィルター２０を通過した後、カンナビノイド酸合成酵素はバイオリアクター３０に流入し、入口３２を介してバイオリアクター３０に入る。バイオリアクター３０は、基質ＣＢＧＡ又は上記の式Ｉの化合物に従う他の基質等の反応物の入口３４も備える。
【０１５１】
幾つかの実施形態では、バイオリアクター３０は支持体３６を有するカラムバイオリアクターであり得る。支持体３６は二価金属イオンを含浸させた固体支持体又は表面を二価金属イオンで官能化した支持体であり得る。通例、セファロース、アガロース又は他の生体高分子をニッケル、コバルト、マグネシウム及びマンガン等の二価金属イオンを結合する支持体として使用する。かかる支持体は、発現されたカンナビノイド酸合成酵素上に存在するヒスチジンタグに対して強い親和性を有し、合成酵素を隔離し、カンナビノイド合成を阻害又は妨害し得る他の不必要なタンパク質及び残屑から分離するために使用することができる。
【０１５２】
カンナビノイドの合成に使用されるバイオリアクター３０は、薬学的に有用なカンナビノイドの商業的製造を可能にするバッチ及び連続合成プロセス用に構成される。一実施形態では、バイオリアクター３０は培地の組成、酵素及び基質の濃度がプロセスの開始時に固定され、触媒反応中に変化しないバッチ合成用に構成される。合成は、バイオリアクター３０の培地中の所望の生成物の濃度が所定の値に達した又は基質の濃度が、例えば基質から生成物への検出可能な触媒変換が存在しないレベルまで所定のレベルを下回った時点で終了する。
【０１５３】
したがって、一実施形態では、Ｈｉｓタグ付きカンナビノイド酸合成酵素は既知の量の基質、例えばカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）又は式Ｉ若しくは式ＩＩの化合物をバイオリアクター３０に導入する前にバイオリアクター３０内のニッケル含有樹脂支持体に隔離される。代替的な実施形態では、ＣＢＧＡ又は式Ｉ若しくは式ＩＩの化合物は、カンナビノイド酸合成酵素を含有する培地をバイオリアクター３０に導入する前にニッケル樹脂支持体を有するバイオリアクター３０内に存在し得る。
【０１５４】
バイオリアクター３０内の反応の進行は定期的又は連続的にモニタリングすることができる。例えば、光学モニタリングシステム５０を利用して、時間に応じたバイオリアクター内の培地中の生成物の濃度を検出してもよい。代替的には、基質の濃度の低下をモニタリングして合成の終了を知らせることができる。このようにして作製されたカンナビノイド生成物は、標準的な溶媒抽出又はクロマトグラフィー精製法を用いて培地から容易に回収することができる。モニタリングシステム５０は、下記に更に説明されるように制御機構４０（制御装置）の一部であっても又はそれと対話するものであってもよい。
【０１５５】
バッチプロセスモードの代替手段は、規定量の基質及び培地を連続的にバイオリアクター３０に添加し、カンナビノイド生成物を含有する等量の培地を同時にバイオリアクター３０から取り出すことで、一定の生成物形成速度を維持する連続プロセスモードである。培地は入口３２を介してバイオリアクター３０に入り、出口３８を介してバイオリアクターから出ることができる。
【０１５６】
バイオリアクターの条件は制御機構４０を用いて制御することができる。制御機構４０はバイオリアクター３０に連結させてもよく、又は代替的にはバイオリアクター３０とワイヤレス又は遠隔で相互作用するものであってもよい。制御機構４０は酸素レベル、撹拌、ｐＨ及び供給速度等の発酵装置１０の条件を制御するために使用することもできる。制御機構４０は発酵装置１０、フィルター２０及びバイオリアクター３０への材料の（例えば少なくとも１つのポンプを制御することによる）出入りを制御することもできる。幾つかの実施形態では、制御機構４０は発酵装置１０、フィルター２０及びバイオリアクター３０の少なくとも１つの条件を、光学モニタリングシステム５０から得られる情報に基づいて制御するように構成される。
【０１５７】
制御機構４０はプロセッサ及び記憶装置を有する処理回路を備えていてもよい。プロセッサ及び記憶装置は本願に記載の様々なプロセス及び機能を完成させる又は容易にする、例えばバイオリアクター３０のｐＨ、温度及び圧力を制御する、又はバイオリアクター３０に出入りする培地の流量を変更するように構成される。幾つかの実施形態では、ｐＨ、温度、圧力及び流量の制御を容易にするために、制御機構４０をセンサースイート６０の少なくとも１つのセンサーと通信するように構成してもよい。センサースイート６０はｐＨセンサー６２、温度センサー６４及び圧力センサー６６を含むことができる。制御機構４０はフィードバックベースの制御のために比例積分微分（ＰＩＤ）制御装置を備えていてもよい。制御機構４０は発酵装置１０、フィルター２０及びバイオリアクター３０に出入りする材料の流量をパルス幅変調（ＰＷＭ）法によって調節するように更に構成されていてもよい。
【０１５８】
図１０は制御機構４０を示す。制御機構４０は通信バス４８に連結したプロセッサ４３を備える。制御機構４０は、情報を格納するためにバス４８に連結し、プロセッサ４３によって実行される命令を格納するように構成されるランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）又は他の動的ストレージ装置等のメインメモリ４２を更に備える。メインメモリ４２は、プロセッサ４３による命令の実行中にテンポラリ変数及び中間情報を格納するように更に構成される。制御機構４０は、情報及び命令を格納するためにバス４８に接続したリードオンリーメモリ（ＲＯＭ）４４又は他の静的ストレージ装置を付加的に備えていてもよい。付加的に、情報及び命令を恒久的に格納するためにソリッドステート装置、磁気ディスク又は光学ディスク等のストレージ装置４６がバス４８に連結していてもよい。
【０１５９】
さらに、制御機構４０は情報をユーザーに表示するための液晶ディスプレー又はアクティブマトリクスディスプレー等のディスプレー７７に（バス４８を介して）連結していてもよい。幾つかの実施形態では、キーボード等の入力装置１１が情報を通信し、指令をプロセッサ４３に伝えるためにバス４８に連結していてもよい。幾つかの実施形態では、入力装置１１はタッチスクリーンディスプレーを有する。
【０１６０】
幾つかの実施形態では、バイオリアクター３０はカラムリアクターではない。代わりに、図８に示されるように、バイオリアクター３０は複数のマイクロタイタープレートを備え、システム２００内に設けられる。システム２００は、システム１００のようにバイオリアクター３０を制御するように構成される制御装置４０を備える。制御装置４０は、バイオリアクター３０の環境条件及びバイオリアクター３０への材料の供給を制御することができ、複数のマイクロタイタープレート上で行われる操作を制御することもできる。
【０１６１】
幾つかの実施形態では、システム２００のマイクロタイタープレートは各々９６ウェルを有する。他の実施形態では、少なくとも１つのマイクロタイタープレートは３８４ウェル、１５３６ウェル、３４５６ウェル又は９６００ウェルを有する。９６ウェルマイクロタイタープレートを用いる実施形態では、酵素反応は９６ウェルの各々において行うことができる。各ウェルにおける反応は、０．５ｍｌの容量又は０．５ｍＬを超える容量で行うことができる。上記の装置は、図９を参照して下記の技法を実行することによってカンナビノイド酸又はカンナビノイド酸類似体、具体的にはＴＨＣＡ及びＣＢＣＡ又はＣＢＤＡ及びＣＢＣＡを作製するように構成される。図９は実施形態によるカンナビノイド又はカンナビノイド類似体を作製する自動化方法（９００）を示す。上記方法はカンナビノイドＣＢＧ、ＤＭＳＯ及びカンナビノイド生合成酵素をウェルの各々に準備することを含む（９０１）。カンナビノイド生合成酵素は、例えばＴＨＣＡ合成酵素であり得る。カンナビノイド生合成酵素は、上記のようなＴＨＣＡ合成酵素をコードする遺伝子で形質転換した酵母を増殖させることによって発酵装置１０により作製される。一方で、カンナビノイドＣＢＧは化学合成される。カンナビノイドＣＢＧ、ＤＭＳＯ及びカンナビノイド生合成酵素は、バイオリアクターに導入され、少なくとも１つのカンナビノイド又はカンナビノイド類似体を最終的に生じる「出発物質」とみなすことができる。カンナビノイドＣＢＧ、ＤＭＳＯ及びカンナビノイド生合成酵素は自動ピペッティングによってウェルの各々に準備することができる。言い換えると、システム１００、２００等の装置は適切な量のカンナビノイドＣＢＧ、ＤＭＳＯ及びカンナビノイド生合成酵素の少なくとも１つをマイクロタイタープレートの各ウェルに送達するように、例えば制御機構４０によって制御され得る機械化された構成部品を備えることができる。幾つかの実施態様では、かかる自動化のために図９に示される操作を繰り返し行うことができる。例えば、自動分注システム又は自動送達システムが供給機構として構成され、ＣＢＧ、ＤＭＳＯ及びＴＨＣＡ合成酵素、並びに溶媒の少なくとも１つを送達するために使用することができる。幾つかの実施態様では、システム１００、２００はサンプルの調製及び移動を自動化するように構成されるプログラマブルサンプル交換装置を用いて構成することができる。プログラマブルサンプル交換装置は、例えばGilson, Inc.（Middleton，Wisconsin，USA）製のＧｉｌｓｏｎ  ２２３サンプル交換装置であり、蠕動ポンプ及び／又はシリンジポンプを用いて操作可能であり得る。
【０１６２】
上記方法は、カンナビノイドＣＢＧとＴＨＣＡ合成酵素等のカンナビノイド生合成酵素とを、これらの材料をウェルに分配した（９０２）後にＤＭＳＯ中で反応させることを更に含む。上記方法は、幾つかの実施態様では、反応（９０３）によって作製されるＴＨＣＡとＣＢＣＡとの比率又はＣＢＤＡとＣＢＣＡとの比率を決定することを更に含む。幾つかの実施態様では、作製されるＴＨＣＡの量及びＣＢＣＡの量又は作製されるＣＢＤＡの量及びＣＢＣＡの量が制御機構４０により決定される。次に、上記方法は所定のＴＨＣＡとＣＢＣＡとの比率又は所定のＣＢＤＡとＣＢＣＡとの比率を得るために、反応混合物のｐＨを調整する必要があるか否かを決定することを含む（９０４）。具体的には、ｐＨは所望のＴＨＣＡ：ＣＢＣＡの比率又は所望のＣＢＤＡ：ＣＢＣＡの比率が得られるように反応混合物の組成を変えることによって調整することができる。反応はＴＨＣＡ及びＣＢＣＡ又はＣＢＤＡ及びＣＢＣＡの作製で終わる（９０５）。
【０１６３】
上記方法は、溶媒をマイクロタイタープレートの各ウェルに自動的にピペッティングすることを更に含む（９０６）。溶媒の添加により反応の停止がもたらされる。上記方法は、ウェルへの溶媒の導入及び反応の停止に続いて、溶媒層中のカンナビノイド又はカンナビノイド類似体を回収することを付加的に含む。
【０１６４】
反応が止まった後、得られる溶媒層を除去することで（９０７）、カンナビノイド又はカンナビノイド類似体が回収可能である。より具体的には、カンナビノイド又はカンナビノイド類似体はウェルの各々に存在する溶媒画分から真空蒸発又はエタノール抽出によって回収可能である（９０８）。幾つかの実施形態では、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去する。ロータリーエバポレーターは、Genser Scientific Instruments（Rothenburg ob der Tauber，Germany）製の完全自動ＰＯＷＥＲＶＡＰ（商標）ロータリーエバポレーター等の自動ロータリーエバポレーターであり得る。溶媒の除去の後、カンナビノイド又はカンナビノイド類似体はウェルの底に残る。上記方法は、カンナビノイド又はカンナビノイド類似体を再懸濁することを更に含む（９０９）。カンナビノイド又はカンナビノイド類似体はエタノール、リポソーム又は脂質ミセルに再懸濁することができる。
【０１６５】
図９に示されるプロセスによりカンナビノイド又はカンナビノイド類似体の回収が可能となり、カンナビノイド又はカンナビノイド類似体を医薬品並びに幾つかある例の中でも特に飲料、菓子及び化粧品を含むマリファナ注入製品に容易に配合することができる。カンナビノイド又はカンナビノイド類似体は薬学的用途のためにＨＰＬＣにより容易に精製することができる。
【０１６６】
少なくとも１つの実施態様では、安定剤を含む又は含まない０．５ｍｇの緩衝ＣＢＧ、緩衝ＴＨＣＡ合成酵素又は緩衝ＣＢＤＡ合成酵素及びＤＭＳＯが、マイクロタイタープレートの複数のウェルの各々に自動的にピペッティングされる。添加されるＤＭＳＯは、幾つかの実施態様では２０％の最終濃度を有し得る。複数のウェルの各々におけるその後の反応は概して２時間、４時間、１２時間及び２４時間インキュベートした場合におよそ０．５ｍｇのカンナビノイドを生じる。このため、９６ウェルを含むマイクロタイタープレートについては、システム１００により約４８ｍｇのカンナビノイドが作製される。結果として、複数のマイクロタイタープレートを使用する場合、作製されるカンナビノイドの量が「スケールアップする」こととなる。例えば、各々９６ウェルを有する２１個のマイクロタイタープレートを使用する場合、１００８ｍｇ（約１グラムのカンナビノイド）が上記の技法によって作製され得る。３１５個のマイクロタイタープレートを使用することで、およそ１５０グラムのカンナビノイドが作製される。幾つかの実施態様では、０．５ｍｇを超える容量を反応混合物に使用することができる。
【０１６７】
幾つかの実施形態では、制御装置のプロセッサは汎用プロセッサ、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、１つ又は複数のフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、処理要素群、又は他の好適な電子処理要素として実装され得る。記憶装置（例えばメモリ、メモリユニット、ストレージ装置等）は、上記の様々なプロセス及び機能を完成させる又は容易にするためのデータ及び／又はコンピュータコードを保存する１つ又は複数の装置（例えばＲＡＭ、ＲＯＭ、フラッシュメモリ、ハードディスクストレージ等）である。記憶装置は揮発性メモリ又は不揮発性メモリであっても又はそれを含んでいてもよい。記憶装置はデータベース要素、オブジェクトコード要素、スクリプト要素、又は本願に記載の様々な動作及び情報構造を支持する任意の他のタイプの情報構造を含み得る。一実施形態によると、記憶装置はプロセッサに処理回路を介した通信によって接続し、本明細書に記載の１つ又は複数のプロセスを（例えば処理回路及び／又はプロセッサによって）実行するコンピュータコードを含む。
【０１６８】
本開示は様々な操作を達成する、例えばバイオリアクターの条件を制御するための任意の機械可読媒体上の方法、装置及びプログラム製品を企図する。本開示の実施形態は、この又は別の目的で組み込まれる既存のコンピュータプロセッサ又は適切なシステムの専用コンピュータプロセッサを用いて、又はハードワイヤードシステムによって実行することができる。本開示の範囲内の実施形態としては、機械可読媒体に保存されている機械により実行可能な指示又はデータ構造を実行する又は有する機械可読媒体を含むプログラム製品が挙げられる。かかる機械可読媒体は、汎用若しくは専用コンピュータ又はプロセッサを有する他の機械がアクセスすることができる任意の利用可能な媒体であり得る。例としては、かかる機械可読媒体はＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ又は他の光ディスクストレージ、磁気ディスクストレージ、他の磁気ストレージ装置、ソリッドステートストレージ装置、又は所望のプログラムコードを機械により実行可能な指示若しくはデータ構造の形態で実行若しくは保存するのに使用することができ、汎用若しくは専用コンピュータ若しくはプロセッサを有する他の機械がアクセスすることができる任意の他の媒体を含み得る。情報がネットワーク又は別の通信接続（ハードワイヤード、ワイヤレス、又はハードワイヤード若しくはワイヤレスの組合せ）を通じて機械に転送又は提供された場合、機械は機械可読媒体の接続を適切に表示する。このため、任意のかかる接続は機械可読媒体と適切に称される。上記の組合せも機械可読媒体の範囲に含まれる。機械により実行可能な指示としては、例えば汎用コンピュータ、専用コンピュータ又は専用処理機械に或る特定の機能又は機能群を実行させる指示及びデータが挙げられる。
【０１６９】
制御機構は、バイオリアクターの条件を制御するためにユーザーと制御機構との対話を可能にするキーボード及びディスプレー等の付加的な装置を更に備えていてもよい。例えば、ディスプレーはユーザーがバイオリアクターのｐＨ、温度、圧力及び流量の変化をモニタリングする、又はカンナビノイド若しくはカンナビノイド類似体を作製するシステムの任意の他の条件をモニタリングするのを可能にするスクリーンを備えていてもよい。本発明を以下の実施例によって更に説明するが、これらの実施例は特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１７０】
Ａ．  高収率酵母形質転換体からのタンパク質の分子クローニング、スクリーニング及び発現
１．  制限消化
ＴＨＣＡαプラスミドＤＮＡ及びＣＢＤＡαプラスミドＤＮＡを、各プラスミドをＰｍｅ  Ｉ又はＳｐｅ  Ｉ制限酵素により３７℃で２時間消化することによって線状化した。線状化プラスミドを０．８％アガロースゲル上で電気泳動によって検証した。Qiagenのゲル抽出キットを使用して線状化プラスミドをアガロースゲルから抽出し、プラスミドを−２０℃で使用時まで凍結した。
【０１７１】
２．  エレクトロコンピテント酵母細胞の調製
エレクトロコンピテントＰｉｃｈｉａＰｉｎｋ（ｐＰｉｎｋ）細胞を、１０ｍＬのＹＰＤ培地に遺伝子組み換えＡｄｅ２、ｐｅｐ４ノックアウトｐＰｉｎｋ酵母株２のグリセロールストックを接種することによって作製した。これらの細胞を、２７０ｒｐｍで回転する振盪機(shaker spinning)を用いて培養物のＯＤ６００が対数期増殖を示す１．３単位の値に達するまで１２５ｍｌ容のバッフル底フラスコにおいて２８℃で一晩増殖させた。次いで、この培養物を１００ｍｌのＹＰＤ培地に添加し、同じ条件下で一晩インキュベートした。ＯＤ６００を１時間毎に確認し、１２時間のインキュベーション期間後に１．３単位の値に達した。
【０１７２】
対数期増殖に達した後、細胞を５００ｍｌ容の遠心分離管に移し、４℃及び２５００ｒｐｍで５分間遠沈した。ＹＰＤブロスをデカント(decant)し、２５０ｍｌの滅菌氷冷水を添加して、細胞を再懸濁した。次いで、細胞を４℃、２５００ｒｐｍで更に５分間遠心分離し、更に２５０ｍｌの水で再懸濁して全てのＹＰＤ培地の除去を確実にし、同じ条件下で再度遠心分離した。次いで、水をデカントし、５０ｍｌの滅菌氷冷水を添加し、細胞を再懸濁し、同じ条件下で遠心分離した。次いで、水をデカントし、１０ｍｌの滅菌氷冷１Ｍソルビトールを添加して、細胞を再懸濁した。次いで、懸濁液を１５ｍｌ容の滅菌円錐管に移し、先と同じ条件下で遠心分離した。次いで、１Ｍソルビトールをデカントし、３００μｌの滅菌氷冷１Ｍソルビトールを添加し、細胞を再懸濁し、使用のために氷上に置いた。
【０１７３】
３．  エレクトロポレーション
予め凍結しておいた線状化プラスミドＤＮＡを氷上で解凍し、８０μｌのエレクトロコンピテントｐＰｉｎｋ細胞を管に添加した。次いで、この容量を０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベットに移し、氷上で５分間インキュベートした。次いで、キュベットに１６４０Ｖ、２００Ω及び２５μＦ、総パルス時間およそ４分でパルスした。パルスの直後に、１ｍｌのＹＰＤＳ培地をキュベットに添加し、ピペッティングにより混合した。次いで、キュベットを振盪することなく２８℃のインキュベーターに２時間入れ、続いて３００μｌを新鮮ＰＡＤプレートに塗布した。次いで、ＰＡＤプレートを２８℃のインキュベーターにおよそ７日〜１０日間入れ、細胞増殖について毎日検査した。
【０１７４】
４．  スクリーニング
白色コロニーは対象の遺伝子の陽性発現の指標であり、赤色コロニーは発現を示さない。全ての白色コロニーを選択し、新鮮ＰＡＤプレートに再び画線培養して、個々のコロニーが現れるまで３日〜５日間増殖させた。次いで、単一コロニーを使用して１２５ｍｌ容のバッフル底フラスコに入った１０ｍｌのＢＭＧＹに播種し、２８℃及び２７０ｒｐｍで振盪しながら一晩インキュベーターに入れた。ＯＤ６００が１．２〜１．５に達した時点で（水で１０倍希釈した後）、接種材料を５０ｍｌ容の円錐管に移し、２５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＢＭＧＹをデカントし、１ｍｌのＢＭＭＹを添加した。次いで、滅菌空気交換を可能にする空気孔テープで管を覆い、２８℃及び２７０ｒｐｍの振盪インキュベーターに入れた。
【０１７５】
２４時間後に１００μｌのサンプルを取り出し、１００μｌの４０％メタノールを添加した。次いで、取り出した部分を１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清及びペレットをＴ＝１（１日目）サンプルとして保存した。次いで、この手順を４８時間（Ｔ＝２）後に繰り返した。７２時間（Ｔ＝３）後に、残りのサンプルを最終時点として採取した。次いで、Ｔ＝３上清をＡｍｉｃｏｎ  ３０ｋＤタンパク質フィルターを通して回転させ、タンパク質の可視化のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。
【０１７６】
５．  酵素変換
次いで、４時間〜２４時間にわたって２０％を超えるＣＢＧＡからＣＢＤＡへの変換を有するサンプルをスケールアップした。簡潔に述べると、酵素変換反応を以下のように行った。２５μｌのＴ＝３サンプルに由来する無細胞上清を、２００μｌの１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）中で、ＤＭＳＯ中２５μｌの１ｍｇ／ｍｌ  ＣＢＧＡストックとともに３０℃で２時間インキュベートした。反応によりｐＨ５．０で０．１ｍｇ／ｍｌのＣＢＧＡの最終濃度がもたらされた。
【０１７７】
スケールアップのために、単一コロニーを使用して１２５ｍｌ容のバッフル底フラスコに入った１０ｍｌのＢＭＧＹに播種し、これを２８℃及び２７０ｒｐｍで一晩インキュベートした。ＯＤ６００を２４時間後に測定した後、ＯＤ６００が１．２に達した時点で、１０ｍｌの懸濁液を使用して１Ｌ容のバッフル底フラスコに入った９０ｍｌのＢＭＧＹに播種した。次いで、懸濁液を２８℃及び２７０ｒｐｍで一晩インキュベートした。次いで、ＯＤ６００が１．２〜１．５に達した後、接種材料を５００ｍｌ容の遠心分離ボトルに移し、２５００ｒｐｍで５分間ペレット化した。
【０１７８】
ＢＭＧＹをデカントし、細胞ペレットを１０ｍｌのＢＭＭＹで洗浄した。２回洗浄した後、ペレットを１０ｍｌのＢＭＭＹに再懸濁し、５００ｍｌ容のバッフル底フラスコに移し、２８℃及び２７０ｒｐｍで一晩インキュベートした。２４時間後に、１ｍｌのサンプルを取り出し（Ｔ＝１）、１ｍｌの４０％メタノールを添加した。これを４８時間及び７２時間後に繰り返し、全サンプル容量を採取し、分離し、分析した。
【０１７９】
下記表５に、スケールアップに選択した、２０％を超えるＣＢＧＡからＴＨＣＡへの変換を有する小規模スクリーニングサンプルの結果を示す。
【０１８０】
【表１０】
2020036617.tif 000038
【０１８１】
６．  多コピーＧＯＩ挿入断片をｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成するクローニング戦略
代替的な酵母発現系を使用して、対象の遺伝子の１つ又は複数のコピーを有する形質転換細胞を得た。Invitrogenの多コピーピキア発現キットを使用して、多コピー遺伝子挿入断片をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで生成することができる新たなプラスミドを構築した。
【０１８２】
多コピー挿入断片のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成
多コピーＧＯＩ挿入断片をｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成するために、ｐＡＯ８１５ベクターを使用して対象の遺伝子をクローニングした。α−ＣＢＤＡ合成酵素及びα−ＴＨＣＡ合成酵素を、α−ＣＢＤＡ合成酵素遺伝子又はα−ＴＨＣＡ合成酵素遺伝子を含有する１００ｎｇのｐＰｉｎｋ−ＨＣベクターを１μｌのＥｃｏＲ  Ｉ緩衝液、１μｌの各制限酵素（１０単位／μｌ）及び１μｌのＢＳＡとともに２０μｌの総反応容量、３７℃で２時間インキュベートすることによって、ＥｃｏＲ  Ｉ及びＢａｍ  ＨＩを用いてｐＰｉｎｋ−ＨＣプラスミドから切り取った。１００ｎｇのｐＡＯ８１５ベクターを同様に同じプロトコルに従ってＥｃｏ  Ｒ  Ｉ及びＢａｍ  ＨＩ酵素で消化した。
【０１８３】
消化の後、ＧＯＩ及びベクター混合物を０．８％アガロースゲル上、９５Ｖで１時間泳動した。正確なサイズのバンドを切り出し、Invitrogenのゲル抽出キットを用いてゲルから抽出した。線状化ベクター及び遺伝子挿入断片を、NEB（商標）のＴ４  ＤＮＡリガーゼプロトコルを用いてライゲートした。ライゲーション後に、対象の遺伝子を含有する環状ベクターを大腸菌Ｔｏｐ  １０  Ｆ−細胞に形質転換し、プラスミドを１５００Ｖ、２００Ω及び２５μＦで４ミリ秒のエレクトロポレーションによって採取した。次いで、形質転換細胞を２５０μｌのＳＯＣ培地（InvitrogenのＯｎｅ  Ｓｈｏｔ（商標）  Ｔｏｐ  １０  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐ（商標）大腸菌を添加した）と混合し、ＬＢ−Ａｍｐ１００プレートに３７℃で一晩プレーティングした。翌朝、陽性コロニーを５’ＡＯＸ１及び３’ＡＯＸ１プライマーによるコロニーＰＣＲプロトコルを用いて特定した。対象の遺伝子を含有する陽性コロニーを液体ＬＢ−Ａｍｐ１００培地中、３７℃で一晩増殖させた。翌日、Invitrogenのｆａｓｔ  ｐｒｅｐキットを用いてプラスミドミニプレップを行い、更なる増幅の前にプラスミドの濃度を０．８％アガロースゲルで分析した。
【０１８４】
α−ＴＨＣＡ合成酵素及びα−ＣＢＤＡ合成酵素遺伝子を含有する組み換えｐＡＯ８１５プラスミドを２つのバッチに分け、一方のバッチを対象の遺伝子の第２のコピーが挿入されるベクターとして使用し、一方のバッチをα−ＴＨＣＡ合成酵素又はα−ＣＢＤＡ合成酵素遺伝子の抽出に使用した。ベクターバッチを初めにＢａｍ  ＨＩでNEBの単一消化プロトコルに従って消化した。第２のバッチをＢｇｌ  ＩＩ及びＢａｍ  ＨＩ制限酵素で消化した。線状化ベクター及び遺伝子を０．８％アガロースゲルで精製し、抽出した。次いで、ベクター及び遺伝子をNEBのＴ４  ＤＮＡリガーゼプロトコルに従ってライゲートした後、上記のようなエレクトロポレーションにより大腸菌Ｔｏｐ１０  Ｆ−細胞に形質転換した。細胞を３７℃で一晩インキュベートした後、正確な遺伝子挿入断片についてＰＣＲによってスクリーニングした。遺伝子配列をシークエンシングによって確認した。多コピープラスミドをＨｉｓ４配列領域で制限酵素消化により線状化し、コンピテントピキア・パストリス株Ｇ１１５（ｈｉｓ４、Ｍｕｔ＋）細胞に形質転換した。形質転換細胞をスクリーニングのためにＨｉｓ−プレート上で増殖させた。スクリーニングをＨｉｓ−プレートで行い、ピキア・パストリスゲノムのＨｉｓ部位でのプラスミドの組込みを確認した。陽性コロニーをタンパク質のメタノール誘導、タンパク質ＳＤＳ−ゲルの時点及び酵素アッセイのために選んだ。
【０１８５】
多コピー挿入断片のｉｎ  ｖｉｖｏ生成
多コピーＧＯＩ挿入断片をｉｎ  ｖｉｖｏで生成するために、ｐＰＩＣ−３．５Ｋベクターをα−ＣＢＤＡ合成酵素遺伝子又はα−ＴＨＣＡ合成酵素遺伝子の１つ又は複数のコピーを保有し、ピキア・パストリスＧＳ１１５株ゲノムに挿入する骨格として使用した。α−ＣＢＤＡ合成酵素及びα−ＴＨＣＡ合成酵素遺伝子をＰｍｅ  Ｉ及びＢａｍ  ＨＩを用いてｐＰｉｎｋ−ＨＣプラスミドから切り出し、０．８％アガロースゲル上、９５Ｖで１時間かけてｐＰｉｎｋ−ＨＣ骨格から分離し、Qiagen又はInvitrogenのゲル抽出キットを用いてゲルから抽出した。ｐＰＩＣ−３．５ＫプラスミドをNEBのＰｍｅＩ及びＢａｍＨｉによって消化し、０．８％アガロースゲル上で泳動し、Qiagen又はInvitrogenのゲル抽出キットを用いてゲルから抽出した。
【０１８６】
線状化ベクター及び遺伝子挿入断片を、NEB（商標）のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼプロトコルを用いてライゲートした。ライゲートされた環状組み換えプラスミドを大腸菌Ｔｏｐ  １０  Ｆ−株に電気穿孔し、細胞をＬＢ−Ａｍｐ−１００プレートにプレーティングした。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、コロニーを形成した。コロニーＰＣＲを用いて形質転換の成功を検証し、更なるプラスミドを生成するためにｐＰＩＣ−３．５Ｋ−α−ＴＨＣＡ合成酵素又はｐＰＩＣ−３．５Ｋ−α−ＣＢＤＡ合成酵素を有するコロニーを新たなＬＢ−Ａｍｐ−１００プレートに再び画線培養した。
【０１８７】
ｐＰＩＣ−３．５Ｋ−α−ＴＨＣＡ合成酵素及びｐＰＩＣ−３．５Ｋ−α−ＣＢＤＡ合成酵素を上記のようなエレクトロポレーションによってＧＳ１１５株に挿入した。次いで、形質転換ＧＳ１１５細胞を０．２５ｍｇ／ｍｌ〜３ｍｇ／ｍｌジェネティシンを含むＹＰＤ−ジェネティシンプレートにプレーティングし、１つ又は複数のＴＨＣＡ合成酵素遺伝子及びＣＢＤＡ合成酵素遺伝子コピーのコロニーを選択した。３ｍｇ／ｍｌ  ＹＰＤ−ジェネティシンプレートで増殖させたコロニーを、ＴＨＣＡ合成酵素及びＣＢＤＡ合成酵素作製のスクリーニングに選択した。
【０１８８】
結果
粗発酵上清を用いたＣＢＧＡからＴＨＣＡ及びＣＢＣＡへの変換率は２時間で９０％を超えていた（図３及び図５）。
【０１８９】
粗発酵上清を用いたＣＢＧＡからＣＢＤＡ及びＣＢＣＡへの変換率は一晩で７０％を超えていた（図６）。
【０１９０】
７．  酵素精製
このようにして得られるカンナビノイド酸合成酵素を、カラム容量と粗酵素上清との比率が２０：１の２．２ｃｍ内径カラム及び５ｍｌの上清を用いるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。簡潔に述べると、１０ｇの乾燥ｓｅｐｈａｄｅｘビーズを測定し、Ｐｙｒｅｘガラス容器に添加した。１００ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を過剰量のＢｉｏ−ＧＥＬ  Ｐ−１００ビーズに添加し、１２時間超にわたって静置した（Ｐ−１００ビーズは完全に水和すると１２倍膨張した）。真空ポンプを用いて、水和したＰ−１００ビーズ及び更に１Ｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を脱気し、ビーズを過剰な緩衝液中で沈降させた。緩衝液を捨て、１００ｍＬの脱気リン酸緩衝液をビーズに注ぎ入れ、ビーズを再度沈降させた。これらの工程を更に２回繰り返した。次いで、水和したＰ−１００を２ｃｍ〜５ｃｍのゲル床が形成されるまでガラスカラムに注ぎ入れた後、更なるゲルを所望の高さまで注ぎ入れ、沈降させた。それにより形成されたカラムを４℃で保管した。５ｍＬのＴＨＣＡ又はＣＢＤＡ合成酵素のいずれかの粗上清を４℃でカラムに通し、１画分当たり５ｍＬで２５画分について画分を収集した。全ての画分を保存し、４℃で保管し、酵素活性についてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分析し、精製効率及び分解能を検査した。
【０１９１】
Ｂ．  カンナビノイド及びカンナビノイド類似体の酵素作製
１．  酵素アッセイ条件
標準的なＣＢＤＡ合成酵素／ＴＨＣＡ合成酵素反応アッセイ条件は以下のようにした。酵素反応を１．５ｍｌ容のエッペンドルフスナップキャップ管内で行った。２００μｌの１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８５）中の２５μｌの基質、例えばＣＢＧＡ（ＤＭＳＯに１．０ｍｇ／ｍｌで溶解した）を、２５μｌの酵素溶液とともに３０℃で２時間インキュベートした。反応を２５０μｌのＭｅＯＨの添加によって終了し、ＨＰＬＣによって分析した。
【０１９２】
酵素活性を様々な条件下で以下のように試験した：
１．  ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＩＰＡ、シクロデキストリン（ＣＤ）、ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むが、これらに限定されない種々の溶媒及び条件を基質の溶解性及び送達の増強について試験した。
２．  アッセイをｐＨ４、５、６、７及び８で行った。
３．  酵素アッセイを、ＳＤＳ又はＴｒｉｔｏｎ−Ｘを含む又は含まないリン酸ナトリウム緩衝液又はクエン酸緩衝液のいずれかにおいて行った。
４．  酵素アッセイを様々なイオン強度下で行った。
５．  ２時間〜４日間のインキュベーション時間の結果を比較した。
【０１９３】
結果
下記表６にＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＩＰＡ及びシクロデキストリンがカンナビノイドの可溶化を促進したことが示される。シクロデキストリンは２０ｇ／Ｌ〜２５ｇ／ＬのＣＢＧＡが変換されるまで可溶化した。酵素変換率は、２０％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）を反応混合物に添加した場合に増強され、ＴＨＣＡ合成酵素により反応中にＴＨＣＡ及びＣＢＣＡの両方が作製された（表７）。
【０１９４】
【表１１】
2020036617.tif 000039
【０１９５】
【表１２】
2020036617.tif 000040
【０１９６】
ＴＨＣＡ合成酵素活性に対するｐＨの影響を下記表８及び表９に示す。
【０１９７】
【表１３】
2020036617.tif 000041
【０１９８】
要約すると、ＴＨＣＡ合成酵素反応のｐＨの変化は生成物に影響を与える。ｐＨ４ではＴＨＣＡのみが生成物である。ｐＨ５ではＴＨＣＡ：ＣＢＣＡの比率は２．３３：１である。ｐＨ６で比率は逆転し、生成物ミックスはＴＨＣＡ：ＣＢＣＡ  １：５．６７となる。ｐＨ７ではＣＢＣＡのみが生成物である。
【０１９９】
【表１４】
2020036617.tif 000042
【０２００】
ＣＢＤＡ合成酵素活性に対するｐＨの影響を下記表１０に示す。
【０２０１】
【表１５】
2020036617.tif 000043
【０２０２】
要約すると、ＣＢＤＡ合成酵素反応のｐＨの変化は生成物に影響を与える。ｐＨ４．２ではＣＢＤＡ：ＣＢＣＡ比は２．５：１である。ｐＨ５ではＣＢＤＡ：ＣＢＣＡ比は１．１３：１である。ｐＨ６．８ではＣＢＤＡ合成酵素反応による生成物は形成されない。
【０２０３】
これらの結果から、酵素反応のｐＨを制御することによって、ＴＨＣＡ合成酵素により作製されるＴＨＣＡ：ＣＢＣＡの比率を制御することが可能であることが明らかに示される。酵素アッセイを、ＳＤＳ又はＴｒｉｔｏｎ−Ｘを含む又は含まないリン酸ナトリウム緩衝液又はクエン酸緩衝液のいずれかにおいて行った。
【０２０４】
カンナビノイド酸合成酵素活性に対する異なる濃度のシクロデキストリンの影響を評価した。ｐＨ４．８５でのＣＢＤＡ合成酵素の結果を下記表１１に示す。
【０２０５】
【表１６】
2020036617.tif 000044
【０２０６】
これらの結果から、反応混合物におけるシクロデキストリンの濃度が基質から生成物への酵素変換率及び反応の異なる生成物の比率に影響を与えることが明らかに示される。
【０２０７】
これらの実験から、ＣＢＤＡ合成酵素についての酵素反応ミックスにおける最適なシクロデキストリン（ＣＤ）：ＣＢＧＡ比が１１：１（質量対質量）又は４：１（モル比）であり、ＴＨＣＡ合成酵素ＣＤ：ＣＢＧＡについての酵素反応ミックスにおける最適なシクロデキストリン（ＣＤ）：ＣＢＧＡ比が２８：１（質量対質量）又は７．３：１（モル比）であることも示された。反応ミックスにおけるかかる濃度のシクロデキストリンの存在は２時間で９８％の変換をもたらした（データは示さない）。
【０２０８】
Ｂ．  カンナビノイドの抽出及び精製
上記のようなカンナビノイド酸合成酵素を用いた酵素反応によって得られるカンナビノイド及びカンナビノイド類似体を、以下のように溶媒抽出によって抽出した。
【０２０９】
溶媒を１：３（ｖ／ｖ）の比率で反応ミックスに添加し、混合物を室温で２分間激しくボルテックスし、３２００ｇで１０分間遠心分離した。溶媒画分を分離し、ガラスバイアル内に保管した。これらの工程を繰り返し、全ての抽出物を合わせてＨＰＬＣによって分析した。
【０２１０】
Ｃ．  発酵によるカンナビノイド酸合成酵素の作製
カンナビノイド酸合成酵素を、Invitrogenの「ピキア発酵プロセスガイドライン（Pichia Fermentation Process Guidelines）」に従う発酵によって作製した。幾つかの変更を以下のように加えた。
【０２１１】
Ａ．  接種材料のフラスコ調製
ピキア株ＧＳ１１５（Ｍｕｔ＋、Ａｒｇ＋、Ｈｉｓ−）の凍結グリセロールストックをＹＰＤプレートに接種した。４８時間後に、ＹＰＤ上の単一コロニーを使用して２Ｌ容のバッフル底フラスコに入った３００ｍｌのＢＭＧＹに播種した。培養物を２８℃、２７０ｒｐｍでＯＤ６００が２〜６に達するまで（およそ１５時間）増殖させた。
【０２１２】
Ｂ．  発酵装置調製／バッチグリセロール
ＢｉｏＦｌｏ  ３０００発酵装置のガラス容器内の３．５Ｌの基礎塩培地の滅菌及び冷却の後、温度を２７℃以上、３０℃以下に設定した。通気及び撹拌はＰＩＤモード（溶存酸素依存性）に設定した。ｐＨは３０％ＮＨ４ＯＨにより常に６．５に調整した。発酵装置に上記で生成した３００ｍｌの培養物を接種した。滅菌１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中で調製した２００ｍｌの２０％カザミノ酸を添加した。溶存酸素は２０％超に維持されるように調整した。ＢＭＧＹ培地のグリセロールが完全に消費された後（およそ２４時間）、この最初の発酵段階の終了時に１０ｍｌのサンプルを取り、細胞増殖（ＯＤ６００）及び細胞湿重量について分析した。ペレットを後のタンパク質の分析のために−８０℃で凍結した。サンプリングを各段階の終了時に繰り返した。
【０２１３】
Ｃ．  グリセロール供給バッチ期
グリセロール溶液１リットル当たり１２ｍｌのＰＴＭ微量塩を含む５０％（ｗ／ｖ）グリセロールを添加して、細胞バイオマスを増大させた。供給速度は１８．１５ｍｌ／時間／リットル（初期発酵容量）に設定した。グリセロール供給を細胞湿重量が１８０ｇ／リットル〜２２０ｇ／リットルに達するまで継続し、ＤＯスパイクを用いてグリセロール供給バッチ期のエンドポイントをモニタリングした。
【０２１４】
Ｄ．  メタノール供給バッチ期
全てのグリセロールがＡＯＸ１プロモーターの誘導及びカンナビノイド合成酵素の発現に消費された後にメタノール誘導を開始した。メタノール１リットル当たり１２ｍｌのＰＴＭ微量塩を含む１００％メタノールを添加した。供給速度は始めに３．６ｍｌ／時間／リットル（初期発酵容量）に設定した。撹拌、通気及び酸素供給はその後２時間にわたってＤＯを２０％超に維持するように調整した。一定のＤＯ読取りによりメタノールへの完全な適応が推測され、その時点でメタノール供給を７．３ｍｌ／時間／リットルに倍増させた。２時間後、メタノール供給を１０．９ｍｌ／時間／リットル（初期発酵容量）まで更に増大した。約２時間後又は発泡の最初の兆候時に、２０μｌ〜５０μｌの滅菌純粋Ａｎｔｉ−Ｆｏａｍ  ２０４（Sigma）を添加して、発酵装置のヘッドスペースを透明に維持し、気泡により撹拌及び様々な供給が干渉されないようにした。付加的な２０μｌ〜５０μｌのアリコートを、必要に応じて発酵の実行時間全体にわたっておよそ１日１回又は１日おきに添加した。１０．９ｍｌ／時間／リットルが確立された後、酵素活性を測定し、その後８時間おきにモニタリングした。初期接種の５日後又はタンパク質濃度がプラトーに達した時点で発酵を停止した。
【０２１５】
Ｅ．  細胞及び上清の採取
採取の時点で、最終発酵容量は初期容量のほぼ２倍であった。細胞密度は約４００ｇ／リットル（細胞湿重量）まで増大した。７リットルの培養物を５００ｍｌ容の遠心分離ボトルに収集し、１００００ＲＰＭで１５分間遠心分離し、細胞を上清から分離した。タンジェント流濾過を用いて上清を１０倍濃縮した。上清のサンプルをタンパク質分析のためにポリアクリルアミドゲルにロードした。ＴＨＣＡ合成酵素はおよそ８０ＫＤａであった。３０ＫｄａのＴＦＦフィルターを用いて発酵上清を１０倍濃縮した。ＴＦＦ濃縮上清の一部を酵素の精製のためにニッケルカラムにロードした。元の発酵上清の一部を硫酸アンモニウム沈殿（４５％〜７５％）によって分画した。
【０２１６】
Ｆ．  標準的な酵素活性アッセイ
２００μｌの１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）に、ＤＭＳＯに１ｍｇ／ｍＬ濃度で溶解した２５μｌの基質（ＣＢＧＡ）及び２５μｌの酵素（上清）を１．５ｍＬ容のエッペンドルフスナップキャップ管において添加した。管を３０℃で２時間インキュベートし、２５０μｌのＭｅＯＨを添加することによって反応を終了した。酵素の活性をＨＰＬＣによって分析した。
【０２１７】
Ｅ．  発酵からのカンナビノイド酸合成酵素の濃縮／精製
発酵後に、細胞を１００００ＲＰＭ×１５分での遠心分離によって上清から分離した。次いで、酵素を以下のように濃縮及び精製した。タンジェント流濾過を用いて上清を１０倍濃縮した後、硫酸アンモニウム沈殿を用いて分画した。４５％〜７５％（ＮＨ４）２ＳＯ４で塩析するタンパク質画分が合成酵素を含有していた。ＴＦＦ濾過上清を酵素の精製のためにニッケルカラムにロードした。
【０２１８】
Ｆ．  カンナビノイド基質の化学合成
Ａ．  ゲラニオール（３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエン−１−オール）の合成
【化２７】
2020036617.tif 000045
ゲラニオールをパルマローザ油の蒸留によって得た。パルマローザ油（New Directions Aromatics）を減圧下で蒸留し、１３９℃〜１４５℃、２５ｍｍ  Ｈｇの減圧下で蒸留される画分をプールして純粋なゲラニオールを得た。
【０２１９】
Ｂ．  オリベトールの合成
【化２８】
2020036617.tif 000046
オリベトールを公表されている手法（Focella, A, et al., J. Org. Chem., Vol. 42, No. 21, (1977), p. 3456-3457）を用いて合成した。
【０２２０】
１．  メチル６−Ｎ−ペンチル−２−ヒドロキシ−４−オキソ−シクロヘキサ−２−エン−１−カルボキシレート
【化２９】
2020036617.tif 000047
ナトリウムメトキシド（３２．４ｇ、０．６０ｍｏｌ）及びマロン酸ジメチル（９０ｇ、０．６８ｍｏｌ）の無水メタノール撹拌溶液２３０ｍＬに、７５ｇ（０．４８ｍｏｌ）の９０％３−ノネン−２−オンを少量ずつ添加した。次いで、反応混合物をＮ２下で３時間還流させ、室温まで冷却した。溶媒を減圧下で蒸留し、残渣を３５０ｍＬの水に溶解した。白色結晶とほぼ透明な溶液とのスラリーを８０ｍＬのクロロホルムで３回抽出した。水層を濃ＨＣｌでｐＨ４まで酸性化し、形成される白色沈殿物を一晩静置した後、濾過した。結晶を高真空下、５０℃で５時間乾燥させ、１０６．５ｇ（０．４４１６ｍｏｌ）（９２％）のメチル６−ｎ−ペンチル−２−ヒドロキシ−４−オキソ−シクロヘキサ−２−エン−１−カルボキシレート（融点９６℃〜９８℃）を得た。生成物を、石油エーテル：酢酸エチル（９：１）の混合物を用いて再結晶化し、９４ｇの純粋なメチル６−ｎ−ペンチル−２−ヒドロキシ−４−オキソ−シクロヘキサ−２−エン−１−カルボキシレート（融点９８℃〜１００℃）を得た。
【０２２１】
２．  １−Ｎ−ペンチル−３，５−ジヒドロキシベンゼン（オリベトール）
【化３０】
2020036617.tif 000048
１１５ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解したメチル６−Ｎ−ペンチル−２−ヒドロキシ−４−オキソ−シクロヘキサ−２−エン−１−カルボキシレート（５８．４ｇ、０．２４ｍｏｌ）の撹拌氷冷溶液に、６０ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解した３７．９ｇ（０．２３ｍｏｌ）の臭素を滴加した。添加（およそ９０分）の終了後に反応混合物を８０℃までゆっくりと加熱すると、二酸化炭素の発生が非常に激しくなった。
【０２２２】
反応をガス発生が止まるまでこの温度に維持し、続いて反応物を１６０℃まで更に加熱し、この温度におよそ１０時間保持した。加熱後に反応物を冷却し、溶媒ＤＭＦを減圧下で除去した。これにより得られた残渣を水（８０ｍＬ）で処理し、２５０ｍＬのエーテルで２回抽出した。合わせたエーテル層を水で洗浄した後、２×８０ｍＬの亜硫酸水素ナトリウムの１０％溶液、２×８０ｍＬの酢酸の１０％溶液、続いて水で再び洗浄した。
【０２２３】
無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧下で除去し、４６．８ｇの粘性の油を得た。油を減圧下で蒸留し、３０．３ｇ（０．１６８ｍｏｌ）（６９．３％）のオリベトールを生成物として得た。ＨＰＬＣ分析により９７．５％の純度が示された。
【０２２４】
Ｃ．  ＣＢＧの合成
ＣＢＧをTaura et al., (1996), The Journal of Biological Chemistry, Vol. 271, No. 21, p. 17411-17416に開示のプロトコルに従って合成した。
【０２２５】
１．  ２−［（２Ｅ）−３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニル］−５−ペンチル−ベンゼン−１，３−ジオール（カンナビゲロール（ＣＢＧ））の合成
【化３１】
2020036617.tif 000049
ゲラニオール（３ｇ、０．０１９４ｍｏｌ）及びオリベトール（２ｇ、０．０１１１ｍｏｌ）を、８０ｍｇのｐ−トルエンスルホン酸を触媒として含有する４００ｍＬのクロロホルムに溶解し、反応混合物を暗所、室温で１２時間撹拌した。１２時間後に反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム（４００ｍＬ）、続いてＨ２Ｏ（４００ｍＬ）で洗浄した。クロロホルム層を減圧下、４０℃で濃縮し、得られた残渣を、ベンゼン（１０００ｍＬ）を溶離液として用いた２．０ｃｍ×２５ｃｍシリカゲルカラムでのクロマトグラフにかけ、１．４ｇ（０．００４４２ｍｏｌ）（３９．９％）のＣＢＧを生成物として得た。
【０２２６】
代替的には、粗ＣＢＧを以下のようにして精製した。２５０ｍＬ容のビーカーに７．２５ｇの粗ＣＢＧ及び５０ｍＬのベンゼンを添加した。フラスコをかき混ぜてＣＢＧを溶解し、５０ｇのシリカゲルを撹拌子とともに添加した。溶液を一晩撹拌した後、４４ｃｍ×２．７５ｃｍカラムに注ぎ入れた。カラムを３００ｍＬのベンゼンで溶出した。溶離液のおよそ７０ｍＬの画分をＣＢＧについてアッセイした。ＣＢＧを含有する画分１、２及び３（約２３０ｍＬ）を合わせ、溶媒を加圧下で除去し、次の合成工程での使用に好適な純度を有する８０％超のＣＢＧを含む残渣を６．４６４ｇ得た。
【０２２７】
一実施形態では、７．２５ｇの粗ＣＢＧ残渣とシリカゲル（５０ｍＬ）のスラリーとを２５０ｍｌ容のビーカー内で混合することによって粗ＣＢＧを精製した。この混合物を１時間ゆっくりとかき混ぜた後、細目濾紙を用いて真空濾過した。濾過ケ−キを２５０ｍｌのベンゼンで透明な濾液が得られるまで洗浄した。濾液から溶媒を減圧下で除去し、８０％超のＣＢＧを含む残渣を６．５６７ｇ得た。
【０２２８】
Ａ．  炭酸メチルマグネシウム（ＭＭＣ）の合成
炭酸メチルマグネシウム（ＭＭＣ）をBalasubrahmanyam et al., (1973), Organic Synthesis, Collective Volume V, John Wiley & Sons, Inc., p. 439-444に開示のプロトコルに従って合成した。
【０２２９】
乾燥した２リットル容の三つ口フラスコに機械的撹拌器、凝縮器及び１リットル容の均圧添加漏斗を取り付け、その最上部にガス導入管を取り付けた。清浄な乾燥マグネシウムリボン（４０．０ｇ、１．６５ｍｏｌ）をフラスコに入れ、システムを窒素でフラッシングした後、無水メタノール（６００ｍＬ）を添加した。反応混合物を外部から冷却することによって水素ガスの発生を制御した。水素の発生が止まった後、緩徐な窒素流をシステムに通過させ、凝縮器を全縮−分取蒸留ヘッドに交換した。窒素フローを停止し、メタノールの大部分を減圧下で溶液から蒸留した。マグネシウムメトキシドのペースト状の懸濁液の撹拌が実際的でなくなった時点で蒸留を停止した。システムを、窒素を用いて再度フラッシングし、蒸留ヘッドの出口を、鉱油を含有する小トラップに取り付け、それにより反応システムから流出するガスの容量を推定することができた。
【０２３０】
無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（７００ｍＬ）を反応フラスコに添加し、得られる懸濁液を激しく撹拌しながら、無水二酸化炭素流を添加漏斗に接続したガス導入管により反応容器に通した。二酸化炭素の溶解は懸濁マグネシウムメトキシドの発熱反応を伴っていた。ＣＯ２が吸収されなくなった時点で、無色の溶液を蒸留される液体の温度が１４０℃に達するまで緩徐なＣＯ２ガス流下で加熱し、残留メタノールが反応混合物から除去されたことが示された。反応混合物を、不活性雰囲気下で混合物を室温まで冷却するのを助ける緩徐な窒素流を用いてフラッシングした。これにより５３６ｍｇ  ＭＭＣ／ｍＬのＤＭＦを含む溶液が得られた。８
【０２３１】
Ｂ．  ＣＢＧＡの形成
６−カルボン酸−２−［（２Ｅ）−３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニル］−５−ペンチル−ベンゼン−１，３−ジオール、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）を以下のようにして調製した。１０ｍＬ容の三角フラスコに１ｍＬのＭＭＣのＤＭＦ溶液を添加した。この溶液に２−［（２Ｅ）−３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニル］−５−ペンチル−ベンゼン−１，３−ジオール（１２０ｍｇ、０．３７９ｍｍｏｌ）を添加した。フラスコを１２０℃で１時間加熱した後、反応混合物を１００ｍＬのクロロホルム：メタノール（２：１）溶液に溶解した。この溶液のｐＨを希ＨＣｌでｐＨ２．０に調整した後、５０ｍＬのＨ２Ｏを用いて分配した。
【０２３２】
有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を蒸発により除去した。粗反応物のＨＰＬＣ分析によりＣＢＧからＣＢＧＡへの約４０％の変換が示された。
【０２３３】
代替的には、３．１６ｇ（１０ｍｍｏｌ）のＣＢＧ（又は任意の他の中性カンナビノイド）、８．６３ｇ（１００ｍｍｏｌ）のマグネシウムメチレート及び４４ｇ（１ｍｏｌ）のドライアイスを圧力適合容器に密封した。容器を５０℃に加熱し、温度をその値に３時間保持した。加熱の後、容器を室温まで冷却し、ゆっくりと通気した。反応混合物を１００ｍＬのクロロホルム：メタノール（２：１）溶媒に溶解した。この溶液のｐＨを希ＨＣｌによりｐＨ２．０に調整した後、この溶液を５０ｍＬのＨ２Ｏを用いて分配した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を蒸発により除去した。粗反応混合物のＨＰＬＣ分析により、このプロトコルを用いたＣＢＧからＣＢＧＡへの約８５％の変換が示された。
【０２３４】
粗ＣＢＧＡを、２．０ｃｍ×２５ｃｍシリカゲルカラムを用いたクロマトグラフィーにより精製した。生成物をｎ−ヘキサン：酢酸エチル（２：１）（１０００ｍＬ）の混合物を用いて溶出し、４５ｍｇ（０．１２５ｍｍｏｌ）（３７．５％）の所望の生成物を得た。
【０２３５】
代替的には、超高純度ＣＢＧＡを、媒体としてＬＨ−２０親油性樹脂を用いて粗生成物をクロマトグラフにかけることによって得た。４００ｇのＬＨ−２０  Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂を、初めに２ＬのＤＣＭ：クロロホルム（４：１）溶媒を用いて膨潤させた。膨潤させた樹脂を４４×２．７５ｃｍカラムに重力充填した。最小量のＤＣＭ：クロロホルム（４：１）溶媒に溶解した２．１ｇの粗ＣＢＧＡをカラムにロードし、１．７Ｌの同じ溶媒で溶出した。１００ｍＬの画分を回収した。未反応のＣＢＧを、この溶媒系を用いて黄色／橙色溶液として溶出した。約１．７Ｌのこの溶媒を通過させると黄色／橙色画分は観察されなくなり、溶出溶媒を結合したＣＢＧＡを溶出する１００％アセトンに変更した。
【０２３６】
ＣＢＧＡを含有する画分をプールし、溶媒を除去して０．５２ｇのＣＢＧＡを得た（約９０％の回収率）。アセトンで溶出する前にカラムに通すＤＣＭ：クロロホルム（４：１）溶媒の容量を増大させることで、９９．５％超の純度を有するＣＢＧＡを得た。
【０２３７】
Ｃ．  ＣＢＧＶの合成
ＣＢＧＶを以下のようにして合成した。
【０２３８】
Ａ．  メチル６−Ｎ−プロピル−２−ヒドロキシ−４−オキソ−シクロヘキサ−２−エン−１−カルボキシレート：
【化３２】
2020036617.tif 000050
簡潔に述べると、３−ヘプテン−２−オン（３０．１ｇ、０．２５ｍｏｌ）を、マロン酸ジエチル（５２．０１６ｇ、０．３２３ｍｏｌ）及びナトリウムメトキシド（１６．２０６ｇ、０．３ｍｏｌ）の乾燥メタノール（１２５ｍＬの乾燥ＭｅＯＨ）溶液に滴加した。真空オーブン内、４５℃で一晩乾燥させると、粗生成物は４６．３１５ｇと秤量された。粗生成物を石油エーテル（３００ｍＬ）に溶解した。撹拌後に任意の非溶解材料を溶液から濾過し、その後酢酸エチル（３０ｍＬ）を添加し、ＣＢＧＶを沈殿させた。沈殿物を濾過し、真空オーブン内、４４℃で一晩乾燥させた。合計３３．５６９ｇ（０．１５７ｍｏｌ）（５２．３％）の所望の生成物が回収された。
【０２３９】
Ｂ．  １−Ｎ−プロピル−３，５−ジヒドロキシベンゼン
【化３３】
2020036617.tif 000051
メチル６−Ｎ−プロピル−２−ヒドロキシ−４−オキソ−シクロヘキサ−２−エン−１−カルボキシレートを出発物質として使用した以外は、オリベトールの合成のための上記と同様の手法を用いて表題の化合物を製造した。簡潔に述べると、メチル６−Ｎ−プロピル−２−ヒドロキシ−４−オキソ−シクロヘキサ−２−エン−１−カルボキシレートの撹拌氷冷ＤＭＦ溶液に臭素のＤＭＦ溶液を添加した。臭素の添加の後、反応混合物を８０℃に加熱した。加熱に伴って二酸化炭素ガスの生成及び放出が起こった。ガス発生が止まった後、反応物の温度を１６０℃まで増大させ、加熱を１０時間継続した。次いで、反応物を冷却し、ＤＭＦを減圧下で除去した。粗混合物を水で希釈し、ジエチルエーテルを用いた溶媒抽出に供した。エーテルを除去し、残留する油を蒸留することによって表題の化合物を得た。
【０２４０】
Ｃ．  ２−［（２Ｅ）−３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニル］−５−プロピル−ベンゼン−１，３−ジオール（ＣＢＧＶ）
ＣＢＧＶの合成は、ｐ−トルエンスルホン酸をゲラニオール及び１−Ｎ−プロピル−３，５−ジヒドロキシベンゼンのクロロホルム溶液に添加することによって進行した。反応物を暗所、室温で１２時間撹拌した後、水を添加して粗生成物をクロロホルム層に分配した。次いで、クロロホルム層を飽和重炭酸ナトリウムで洗浄し、乾燥させ、有機溶媒を除去した後、ＣＢＧの合成について上記したように精製した。
【０２４１】
Ｄ．  ６−カルボン酸−２−［（２Ｅ）−３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニル］−５−プロピル−ベンゼン−１，３−ジオール（ＣＢＧＶＡ）
６−カルボン酸−２−［（２Ｅ）−３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニル］−５−プロピル−ベンゼン−１，３−ジオール、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＶＡ）を以下のようにして調製した。炭酸メチルマグネシウム（ＭＭＣ）を上記のようにして調製した。フラスコ内のＭＭＣのＤＭＦ溶液に、２−［（２Ｅ）−３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニル］−５−プロピル−ベンゼン−１，３−ジオールを添加した。フラスコを１２０℃で１時間加熱した後、反応混合物をクロロホルム：メタノールの２：１混合物に溶解した。この溶液のｐＨを希ＨＣｌでｐＨ２．０に調整し、反応混合物を、Ｈ２Ｏを用いて抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を蒸発により除去した。
【０２４２】
Ｇ．  カンナビノイドの大規模酵素生成
１００ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を、酸素ガススパージャー及び撹拌器を備えるガラス反応容器に入れた。この溶液に３５ｇ／ｌの２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰβＣＤ；Ｋｌｅｐｔｏｓｅ（商標）  ＨＰＢ）、スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム塩（ＳＢＥβＣＤ；Ｃａｐｔｉｓｏｌ（商標））、又は無作為にメチル化したβ−シクロデキストリン（ＲＭβＣＤ）を添加した。ＣＤを５ｇと少量で添加し、完全に溶解させた。
【０２４３】
２．５ｇのカンナビノイド酸合成酵素基質、例えばＣＢＧＡ若しくはＣＢＧＶ−Ａ、又は式Ｉ、式ＩＩ若しくは式Ｖの化合物を緩衝シクロデキストリン溶液に添加した。ＣＤと基質とのモル比は約４：１であった。６０ｍｇの精製合成酵素を溶液に添加し、反応混合物を３０℃で８時間インキュベートした。反応の進行をＨＰＬＣによって定期的にモニタリングし、酵素アッセイを用いて過酸化水素の発生を検出及び定量化した。
【０２４４】
８時間後に、９０％超のＣＢＧＡ基質がＴＨＣＡ及びＣＢＣＡに変換された。ＴＨＣＡとＣＢＣＡとの比率は５．０の酸性ｐＨでおよそ１０：１であった。ＣＢＣ異性体の比率は５：１であった。
【０２４５】
水溶液を９５％ＥｔＯＨで１０倍に希釈した。これによりシクロデキストリンが沈殿し、カンナビノイドが溶液中に残る。シクロデキストリンを真空濾過し、１Ｌの９０％ＥｔＯＨで洗浄し、乾燥させて今後の反応における再利用を可能にする。カンナビノイドを含有するエタノール溶液の濃縮、その後のＤＣＭ：クロロホルム（４：１）溶媒への残渣の懸濁により、約２５ｇの橙黄色の粗残渣が得られた。
【０２４６】
Ｈ．  カンナビノイドの大規模精製
本技術の方法を用いて合成したカンナビノイドの精製は、ＬＨ−２０親油性樹脂を用いたクロマトグラフィーにより達成された。簡潔に述べると、４０００ｇの樹脂を、２０ＬのＤＣＭ：クロロホルム（４：１）を用いて膨潤させた。膨潤させた樹脂を４４×２７．５ｃｍカラムに重力充填した。膨潤させた樹脂の容量は約１３５０ｍＬであった。カラムに最小量の溶媒に溶解した２５ｇの粗残渣をロードした後、４ＬのＤＣＭ：クロロホルム（４：１）溶媒で洗浄してＣＢＧを溶出させた。カンナビノイド酸はこの溶出中にカラムから溶出しなかった。
【０２４７】
１：１→０：１のＤＣＭ：アセトン溶媒による勾配溶出を用いてカンナビノイド酸を溶出した。各勾配工程に１カラム容量（４Ｌ）の溶媒を用いた。ＣＢＣＡが初めに溶出し、続いてＣＢＧＡ、その後ＴＨＣＡが溶出した。各々のカンナビノイドの純度は９９．５％超であった。
【０２４８】
純粋なカンナビノイドを、酸形態を真空下、９０℃で加熱することによってそれらの中性又は「活性」形態へと更に加工することができる。脱炭酸により中性カンナビノイドが定量的に得られた。必要に応じて再結晶化を行い、医薬品グレードのカンナビノイドを得ることができる。
【０２４９】
多数の変更及び変化を本明細書に記載の例示的な設計及び実施形態に加えることができ、本発明がかかる実施形態に限定されないことが当業者には認識される。
【図１】
2020036617.tif 000052
【図２】
2020036617.tif 000053
【図３】
2020036617.tif 000054
【図４】
2020036617.tif 000055
【図５】
2020036617.tif 000056
【図６】
2020036617.tif 000057
【図７】
2020036617.tif 000058
【図８】
2020036617.tif 000059
【図９】
2020036617.tif 000060
【図１０】
2020036617.tif 000061
【図１１】
2020036617.tif 000062
【図１２】
2020036617.tif 000063
【図１３】
2020036617.tif 000064
【図１４】
2020036617.tif 000065
【図１５】
2020036617.tif 000066
【図１６】
2020036617.tif 000067
【図１７】
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【配列表】
2020036617000001.xml
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月28日(2019.11.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カンナビノイド生成物を作製するシステムであって、（ｉ）少なくとも一つ以上のカンナビノイド合成酵素遺伝子で安定的に変換された細胞を含むバイオリアクターと、（ｉｉ）式Ｉにしたがう化合物を含む反応混合物と、（ｉｉｉ）少なくとも１つの反応条件を修飾することによって、カンナビノイド生成物の比率を修飾する制御機構と、を備え、    前記式Ｉは次の化学式は：【化１】
2020036617.tif 000072
（式中、Ｒは−ＯＨ、ハロゲン、−ＳＨ、又は−ＮＲａＲｂ基；        Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、−Ｈ又はＣ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＲａ、任意に置換されたＣ１−Ｃ１０直鎖又は分岐アルキレン、任意に置換されたＣ２−Ｃ１０直鎖又は分岐アルケニレン、任意に置換されたＣ２−Ｃ１０直鎖又は分岐アルキニレン、任意に置換されたＣ３−Ｃ１０アリール、任意に置換されたＣ３−Ｃ１０シクロアルキル、（Ｃ３−Ｃ１０）アリール−（Ｃ１−Ｃ１０）アルケニレン、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン及び（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニレンからなる群から選択されるか、又は、Ｒ１及びＲ２はそれらが結合する炭素原子とともにＣ５−Ｃ１０環式環を形成し、  Ｒ３はＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ又はＣ１〜Ｃ１０直鎖若しくは分岐アルキルからなる群から選択され、  Ｒａ及びＲｂは各々独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ１０）直鎖若しくは分岐アルキル又はＣ３〜Ｃ１０シクロアルキルからなる群から選択されている）。  前記修飾する条件はｐＨ又は溶媒であるシステム。
【請求項２】
前記細胞は真菌細胞、動物細胞、藻細胞、及び細菌細胞から成る群から選択される請求項１のシステム。
【請求項３】
前記真菌細胞は酵母菌細胞である請求項２のシステム。
【請求項４】
前記カンナビノイド合成酵素遺伝子はテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）合成酵素遺伝子である請求項１のシステム。
【請求項５】
前記カンナビノイド合成酵素遺伝子はカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）合成酵素遺伝子である請求項１のシステム。
【請求項６】
式Ｉに係る化合物はカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）である請求項１のシステム。
【請求項７】
Ｒは−ＯＨであり、Ｒ１  は‐Ｈ又は−ＣＯＯＨである請求項１のシステム。
【請求項８】
Ｒ２はＣ１−Ｃ１０直鎖若しくは分岐アルキルであり、前記Ｃ１−Ｃ１０直鎖若しくは分岐アルキルはＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、Ｃ３Ｈ７、Ｃ４Ｈ９、Ｃ５Ｈ１１、Ｃ６Ｈ１３、Ｃ７Ｈ１５、Ｃ８Ｈ１７の群、及びイソプロピル、セクブチル（ｓｅｃ−ｂｕｔｙｌ）、イソブチル（ｉｓｏ−ｂｕｔｙｌ）、ネオペンチル１  （ｎｅｏｐｅｎｔｙｌ１）、２‐メチル  ヘキシル（２−ｍｅｔｈｙｌ  ｈｅｘｙｌ）、及び２，３−ジメチル  ヘキシル（２，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｈｅｘｙｌ）からなる群から選択されている請求項１のシステム。
【請求項９】
Ｒ２はＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、Ｃ３Ｈ７、Ｃ４Ｈ９、Ｃ５Ｈ１１、Ｃ６Ｈ１３、Ｃ７Ｈ１５、及びＣ８Ｈ１７からなる群から選択されている請求項１のシステム。
【請求項１０】
前記Ｒ２はＣ３Ｈ７である請求項１のシステム。
【請求項１１】
前記Ｒ２はＣ５Ｈ１０である請求項１のシステム。
【請求項１２】
Ｒは−ＯＨ；Ｒ１は−Ｈ又は−ＣＯＯＨ；Ｒ２はＣ１−Ｃ１０の直鎖又は分岐アルキルであり、前記Ｃ１−Ｃ１０の直鎖又は分岐アルキルはＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、Ｃ３Ｈ７、Ｃ４Ｈ９、Ｃ５Ｈ１１、Ｃ６Ｈ１３、Ｃ７Ｈ１５、Ｃ８Ｈ１７の群、及びイソプロピル、セクブチル（ｓｅｃ−ｂｕｔｙｌ）、イソブチル（ｉｓｏ−ｂｕｔｙｌ）、ネオペンチル１  （ｎｅｏｐｅｎｔｙｌ１）、２‐メチル  ヘキシル（２−ｍｅｔｈｙｌ  ｈｅｘｙｌ）、及び２，３−ジメチル  ヘキシル（２，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｈｅｘｙｌ）からなる群から選択されている請求項１のシステム。
【請求項１３】
カンナビノイドを生成するシステムであって、前記システムは、（ｉ）少なくとも１つのカンナビノイド合成酵素を含むバイオリアクターと、（ｉｉ）下記の式Ｉに従う化合物を含む反応混合物と、（ｉｉｉ）少なくとも１つの反応条件を修飾することによって、カンナビノイド生成物の比率を修飾する制御機構と、を備え、前記式Ｉは次の化学式は：【化２】
2020036617.tif 000073
（式中、Ｒは−ＯＨ、ハロゲン、−ＳＨ、又は−ＮＲａＲｂ基；        Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、−Ｈ又はＣ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＲａ、任意に置換されたＣ１−Ｃ１０直鎖又は分岐アルキレン、任意に置換されたＣ２−Ｃ１０直鎖又は分岐アルケニレン、任意に置換されたＣ２−Ｃ１０直鎖又は分岐アルキニレン、任意に置換されたＣ３−Ｃ１０アリール、任意に置換されたＣ３−Ｃ１０シクロアルキル、（Ｃ３−Ｃ１０）アリール−（Ｃ１−Ｃ１０）アルケニレン、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン及び（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニレンからなる群から選択されるか、又は、Ｒ１及びＲ２はそれらが結合する炭素原子とともにＣ５−Ｃ１０環式環を形成し、  Ｒ３はＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ又はＣ１〜Ｃ１０直鎖若しくは分岐アルキルからなる群から選択され、  Ｒａ及びＲｂは各々独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ１０）直鎖若しくは分岐アルキル又はＣ３〜Ｃ１０シクロアルキルからなる群から選択されている）。  前記修飾される条件はｐＨ又は溶媒であるシステム。
【請求項１４】
前記カンナビノイド合成酵素はＴＨＣＡ合成酵素を含んでいる請求項１３のシステム。
【請求項１５】
前記カンナビノイド合成酵素はＣＢＤＡ合成酵素を含んでいる請求項１３のシステム。
【請求項１６】
前記カンナビノイド合成酵素は遺伝子組み換えされた酵素である請求項１３記載のシステム。
【請求項１７】
カンナビノイドを生成するシステムであって、前記システムは：（ｉ）少なくとも１つのカンナビノイド生合成遺伝子で安定に転換される細胞と、試薬（ｒｅａｇｅｎｔ）としてカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）を含む反応混合物を含むバイオリアクターと、（ｉｉ）前記反応混合物のｐＨを修正することによって、前記カンナビノイド生成物の比率を修正するように構成された制御機構と、を有するシステム。
【請求項１８】
前記細胞は真菌細胞、動物細胞、藻細胞、及び細菌細胞からなる群から選択されている請求項１７のシステム。
【請求項１９】
前記真菌細胞は酵母細胞である請求項１８のシステム。
【請求項２０】
前記カンナビノイド生合成遺伝子はテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）合成遺伝子である請求項１７のシステム。
【請求項２１】
前記カンナビノイド生合成遺伝子はカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）合成遺伝子である請求項１７のシステム。
【請求項２２】
カンナビノイド生成物を生成する方法であって、前記方法は、（１）反応混合物中でＣＢＤＡ合成酵素を下式ＩＩに従う化合物と反応させ、（２）少なくとも１つの反応条件を修正して前記カンナビノイド生成物の比率を修正し、（３）前記カンナビノイド生成物を回収する方法であり、且つ、前記修正される条件はｐＨ又は溶媒であり、  前記式ＩＩは、【化３】
2020036617.tif 000074
であり、式ＩＩ中、  Ｒ１  は−Ｈ  又は  −ＣＯＯＨ；  Ｒ２  はＣ１−Ｃ１０の直鎖又は分岐されたＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、Ｃ３Ｈ７、Ｃ４Ｈ９、Ｃ５Ｈ１１、Ｃ６Ｈ１３、Ｃ７Ｈ１５、Ｃ８Ｈ１７基から選択されている方法。
【請求項２３】
ＣＢＤＡ合成酵素を生成することを含む請求項２２の方法。
【請求項２４】
前記ＣＢＤＡ合成酵素は遺伝子組み換えされた合成酵素である請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記ＣＢＤＡ合成酵素はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の核酸配列又はその異性体（ｖａｒｉａｎｔ）又は断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）である請求項２３の方法。
【請求項２６】
前記ＣＢＤＡ合成酵素はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のポリぺプチド又はその異性体（ｖａｒｉａｎｔ）又は断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）を含む請求項２３の方法。
【請求項２７】
前記ＣＢＤＡ合成酵素はα分泌配列（ａｌｐｈａ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）でコドン最適化されたカンナビノイド酸合成遺伝子でコード化されている請求項２３の方法。
【請求項２８】
前記反応混合物のｐＨは４．２から６．２の範囲にある請求項２２の方法。
【請求項２９】
前記反応混合物はジメチルスルホオキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、イソプロピルアルコール、又はその組み合わせを含む溶媒を含んでいる請求項２２の方法。
【請求項３０】
前記溶媒はＤＭＳＯである請求項２９の方法。
【請求項３１】
前記反応混合物中の前記溶媒の濃度は５％と３０％（ｖ／ｖ）の範囲にある請求項２９の方法。
【請求項３２】
前記ＣＢＤＡ合成酵素はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のポリぺプチド又はその異性体（ｖａｒｉａｎｔ）又は断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）を含む請求項２２の方法。
【請求項３３】
前記ＣＢＤＡ合成酵素は６  タンデムヒスチジン残基（ｔａｎｄｅｍ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）でタグ付けされているカンナビノイド合成遺伝子によってコード化されている請求項２３の方法。
【請求項３４】
カンナビノイド生成物を生成する方法であって、前記方法は、（１）反応混合物中でＴＨＣＡ合成酵素を下式ＩＩに従う組成物と反応させ、（２）  少なくとも一つの反応条件を修正することによって、前記カンノビノイド生成物の比率を修正し、（３）  前記カンノビノイド生成物を回収する方法であり、前記修正する条件はｐＨ又は溶媒であって、前記式ＩＩは【化４】
2020036617.tif 000075
（式中、Ｒ１  は−Ｈ  又は  −ＣＯＯＨ；  Ｒ２  はＣ１−Ｃ１０の直鎖又は分岐されたＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、Ｃ３Ｈ７、Ｃ４Ｈ９、Ｃ５Ｈ１１、Ｃ６Ｈ１３、Ｃ７Ｈ１５、Ｃ８Ｈ１７）である方法。
【請求項３５】
前記ＴＨＣＡ合成酵素を生成することを含む請求項３４の方法。
【請求項３６】
前記ＴＨＣＡ合成酵素は遺伝子組み換えされた合成酵素である請求項３５の方法。
【請求項３７】
前記ＴＨＣＡ合成酵素はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の核酸配列又はその異性体（ｖａｒｉａｎｔ）又はフラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）のポリぺプチドを含んでいる請求項３５の方法。
【請求項３８】
前記ＴＨＣＡ合成酵素はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のポリペプチド又はその異性体（ｖａｒｉａｎｔ）又はフラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）である請求項３５の方法。
【請求項３９】
前記ＴＨＣＡ合成酵素はα分泌配列（ａｌｐｈａ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）でコドン最適化されたカンナビノイド酸合成遺伝子によってコード化されている請求項３５の方法。
【請求項４０】
前記反応混合物中のｐＨは３．８〜７．２の範囲にある請求項３４の方法。
【請求項４１】
前記反応混合物はジメチルスルホオキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、イソプロピルアルコール、又はその組み合わせを含む溶媒を含んでいる請求項３４の方法。
【請求項４２】
前記溶媒はＤＭＳＯである請求項４１の方法。
【請求項４３】
前記反応混合物中の前記溶媒の濃度は５％から３０％（ｖ／ｖ）の範囲にある請求項４１の方法。
【請求項４４】
前記ＴＨＣＡ合成酵素はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のポリペプチド又はその異性体（ｖａｒｉａｎｔ）又はフラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）である請求項３４の方法。
【請求項４５】
前記ＴＨＣＡ合成酵素は６タンデムヒスチジン残基（ｔａｎｄｅｍ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）でタグ付けされているカンナビノイド合成遺伝子によってコード化されている請求項３５の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３０】  無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（７００ｍＬ）を反応フラスコに添加し、得られる懸濁液を激しく撹拌しながら、無水二酸化炭素流を添加漏斗に接続したガス導入管により反応容器に通した。二酸化炭素の溶解は懸濁マグネシウムメトキシドの発熱反応を伴っていた。ＣＯ２が吸収されなくなった時点で、無色の溶液を蒸留される液体の温度が１４０℃に達するまで緩徐なＣＯ２ガス流下で加熱し、残留メタノールが反応混合物から除去されたことが示された。反応混合物を、不活性雰囲気下で混合物を室温まで冷却するのを助ける緩徐な窒素流を用いてフラッシングした。これにより５３６ｍｇ  ＭＭＣ／ｍＬのＤＭＦを含む溶液が得られた。