(57)【要約】【課題】短時間で簡便に候補化合物を選別することができる、ＤＮＡ損傷剤のスクリーニング方法及びＤＮＡ損傷剤のスクリーニング用キットを提供すること。【解決手段】本発明に係るスクリーニング方法は、一本鎖ＤＮＡと、該一本鎖ＤＮＡと同じ塩基長である一本鎖ＤＮＡとから構成される二本鎖ＤＮＡを有し、複数の該二本鎖ＤＮＡが表面から伸びるように形成されたナノ粒子が分散した分散液中で、前記ナノ粒子と、被検物質とを接触させる工程と、前記被検物質の非存在下において前記ナノ粒子が凝集する量の塩を、前記被検物質を含む前記分散液に混合する工程と、前記塩を混合した分散液中での前記ナノ粒子の分散状態を評価し、前記被検物質を接触させない場合と比較して前記ナノ粒子の凝集が抑制された場合に、前記被検物質をＤＮＡ損傷剤として選別する工程と、を含む。【選択図】図１
2020031549.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ損傷剤のスクリーニング方法であって、
一本鎖ＤＮＡと、該一本鎖ＤＮＡと同じ塩基長である一本鎖ＤＮＡとから構成される二本鎖ＤＮＡを有し、複数の該二本鎖ＤＮＡが表面から伸びるように形成されたナノ粒子が分散した分散液中で、前記ナノ粒子と、被検物質とを接触させる工程と、
前記被検物質の非存在下において前記ナノ粒子が凝集する量の塩を、前記被検物質を含む前記分散液に混合する工程と、
前記塩を混合した分散液中での前記ナノ粒子の分散状態を評価し、前記被検物質を接触させない場合と比較して前記ナノ粒子の凝集が抑制された場合に、前記被検物質をＤＮＡ損傷剤として選別する工程と、を含むスクリーニング方法。
【請求項２】
前記ナノ粒子が、金属ナノ粒子である請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記金属ナノ粒子が、金ナノ粒子である請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡ損傷剤がＤＮＡ切断活性を有する化合物である請求項１〜３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記ナノ粒子の分散状態を、色調変化を確認することにより評価する請求項１〜４のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
ＤＮＡ損傷剤のスクリーニング用キットであって、
複数の一本鎖又は二本鎖ＤＮＡが表面から伸びるように形成されたナノ粒子の分散液を含み、
前記二本鎖ＤＮＡが、一本鎖ＤＮＡと該一本鎖ＤＮＡと同じ塩基長である一本鎖ＤＮＡとから構成されるスクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ損傷剤のスクリーニング方法及びＤＮＡ損傷剤のスクリーニング用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ損傷剤には、ＤＮＡの切断、アルキル化等のＤＮＡ損傷作用を有する様々なタイプの薬剤が存在する。ＤＮＡの切断作用を有するＤＮＡ損傷剤として、例えば、ブレオマイシンが挙げられる。ブレオマイシンは、鉄等の金属と錯体を形成することにより、そのＤＮＡ切断作用が活性化されることが知られている。
【０００３】
ブレオマイシンのＤＮＡ切断活性の評価方法として、例えば、非特許文献１には、放射性同位元素である３２Ｐで標識化した基質ＤＮＡにブレオマイシンを接触させた後、ゲル電気泳動法を用いてＤＮＡを解析する方法が記載されている。また、非特許文献２には、ＤＮＡにブレオマイシンを接触させた後に、高速液体クロマトグラフを用いてＤＮＡ断片を分離して解析する方法が記載されている。これらの評価方法は、ＤＮＡ損傷剤のスクリーニングにも応用することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｑ．Ｍａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００９，１３１，ｐｐ．２０１３−２０２２
【非特許文献２】Ｈ．Ｓｕｇｉｙａｍａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８５，１０７，４１０４−４１０５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、非特許文献１、２に記載の方法では、前処理を含めた煩雑な工程や測定に手間と時間を要する。これらの方法をＤＮＡ損傷剤のスクリーニングに用いた場合、より多くの時間及び労力が必要となる。
【０００６】
本発明は上記に鑑みてなされたものであり、短時間で簡便に候補化合物を選別することができる、ＤＮＡ損傷剤のスクリーニング方法及びＤＮＡ損傷剤のスクリーニング用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するための具体的な手段には、以下の実施態様が含まれる。
＜１＞  ＤＮＡ損傷剤のスクリーニング方法であって、一本鎖ＤＮＡと、該一本鎖ＤＮＡと同じ塩基長である一本鎖ＤＮＡとから構成される二本鎖ＤＮＡを有し、複数の該二本鎖ＤＮＡが表面から伸びるように形成されたナノ粒子が分散した分散液中で、前記ナノ粒子と、被検物質とを接触させる工程と、前記被検物質の非存在下において前記ナノ粒子が凝集する量の塩を、前記被検物質を含む前記分散液に混合する工程と、前記塩を混合した分散液中での前記ナノ粒子の分散状態を評価し、前記被検物質を接触させない場合と比較して前記ナノ粒子の凝集が抑制された場合に、前記被検物質をＤＮＡ損傷剤として選別する工程と、を含むスクリーニング方法。
【０００８】
＜２＞  前記ナノ粒子が、金属ナノ粒子である＜１＞に記載のスクリーニング方法。
【０００９】
＜３＞  前記金属ナノ粒子が、金ナノ粒子である＜２＞に記載のスクリーニング方法。
【００１０】
＜４＞  前記ＤＮＡ損傷剤がＤＮＡ切断活性を有する化合物である＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【００１１】
＜５＞  前記ナノ粒子の分散状態を、色調変化を確認することにより評価する＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【００１２】
＜６＞  ＤＮＡ損傷剤のスクリーニング用キットであって、複数の一本鎖又は二本鎖ＤＮＡが表面から伸びるように形成されたナノ粒子の分散液を含み、前記二本鎖ＤＮＡが、一本鎖ＤＮＡと該一本鎖ＤＮＡと同じ塩基長である一本鎖ＤＮＡとから構成されるスクリーニング用キット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、短時間で簡便に候補化合物を選別することができる、ＤＮＡ損傷剤のスクリーニング方法及びＤＮＡ損傷剤のスクリーニング用キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】複数の二本鎖ＤＮＡが表面から伸びるように形成されたナノ粒子の分散、凝集の原理を説明するための概略図である。
【図２】試験例１のＢＬＭによるＤＮＡ切断活性評価試験において目視により評価した分散液の色調を示す図である。
【図３】試験例１のＢＬＭによるＤＮＡ切断活性評価結果を示す吸収スペクトルである。
【図４】試験例２のＢＬＭによるＤＮＡ切断活性評価試験において目視により評価した分散液の色調を示す図である。
【図５】試験例３のＤＮＡ損傷剤によるＤＮＡ損傷作用評価試験において目視により評価した分散液の色調を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施形態について説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１６】
＜ＤＮＡ損傷剤のスクリーニング方法＞
本実施形態に係るＤＮＡ損傷剤のスクリーニング方法は、一本鎖ＤＮＡと、該一本鎖ＤＮＡと同じ塩基長である一本鎖ＤＮＡとから構成される二本鎖ＤＮＡを有し、複数の該二本鎖ＤＮＡが表面から伸びるように形成されたナノ粒子（以下、「ｄｓＤＮＡナノ粒子」という）が分散した分散液中で、ｄｓＤＮＡナノ粒子と被検物質とを接触させる工程（以下、「接触工程」という）と、被検物質の非存在下においてｄｓＤＮＡナノ粒子が凝集する量の塩を、被検物質を含む分散液に混合する工程（以下、「塩混合工程」という）と、塩を混合した分散液中でのｄｓＤＮＡナノ粒子の分散状態を評価し、被検物質を接触させない場合と比較してｄｓＤＮＡナノ粒子の凝集が抑制された場合に、被検物質をＤＮＡ損傷剤として選別する工程（以下、「選別工程」という）と、を含む。
【００１７】
「ＤＮＡ損傷剤」とは、ＤＮＡの切断、アルキル化等のＤＮＡ損傷作用を有する薬剤を意味する。公知の薬剤を例に挙げると、ブレオマイシン（ＢＬＭ）、メトロニダゾール（ＭＴＺ）、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、シクロホスファミド（ＣＰＡ）等の薬剤が挙げられる。
【００１８】
ここで、図１を参照しながら、本実施形態に係るスクリーニング方法の原理について説明する。通常、分散液中のｄｓＤＮＡナノ粒子は、表面が電荷で覆われているため、お互いに反発して分散した状態を維持している。所定の量の塩を添加すると、ｄｓＤＮＡナノ粒子の表面の電荷が中和されて凝集するようになる。しかし、特定の塩基配列が切断されて一本鎖ＤＮＡが突出した構造又はＤＮＡの一部がアルキル化等された構造の二本鎖ＤＮＡを有するｄｓＤＮＡナノ粒子は、高塩濃度下においても分散した状態を維持する。この現象を利用して、被検物質を接触させたｄｓＤＮＡナノ粒子の凝集が被検物質を接触させない場合と比較して抑制された場合に、該被検物質をｄｓＤＮＡナノ粒子に形成されたＤＮＡに損傷を与えることができる有望なＤＮＡ損傷剤として選別することができる。
【００１９】
（接触工程）
まず、接触工程では、ｄｓＤＮＡナノ粒子が分散した分散液中で、ｄｓＤＮＡナノ粒子と被検物質とを接触させる。
【００２０】
ｄｓＤＮＡナノ粒子と被検物質とを接触させる方法としては特に制限されず、例えば、ｄｓＤＮＡナノ粒子が分散した分散液に被検物質を添加する方法が挙げられる。
【００２１】
ｄｓＤＮＡナノ粒子が分散した分散液とは、ｄｓＤＮＡナノ粒子が液中に分散しているコロイド溶液である。
分散液中のｄｓＤＮＡナノ粒子の濃度は特に限定されないが、例えば、０．５〜５００ｎｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。ナノ粒子の濃度が０．５ｎｍｏｌ／Ｌ以上であれば、上記分散液の分散状態をより容易に判別することができ、５００ｎｍｏｌ／Ｌ以下であれば、該ナノ粒子の液中の分散安定性が向上するためである。
【００２２】
ｄｓＤＮＡナノ粒子と接触させる被検物質としては、特に限定されるものではなく、天然由来の物質であっても、合成化合物であってもよい。天然由来の被検物質としては、例えば、アミノ酸、ペプチド、核酸、糖類等が挙げられる。合成化合物としては、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術等を用いて作成される無機及び有機化合物等が挙げられる。
【００２３】
接触工程におけるｄｓＤＮＡナノ粒子の二本鎖ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡと、該一本鎖ＤＮＡと同じ塩基長である相補鎖とから構成される。二本鎖ＤＮＡは、ＤＮＡ損傷剤が作用することを期待する特定の塩基配列を含んでもよい。ＤＮＡ上の該特定の塩基配列の位置については特に制限されていないが、被検物質との接触が容易になるように、ｄｓＤＮＡナノ粒子の最表層に位置することが好ましい。
【００２４】
ｄｓＤＮＡナノ粒子に形成されるＤＮＡの塩基長は、１０ｂｐ〜５０ｂｐであることが好ましい。ＤＮＡの塩基長を１０ｂｐ以上とすることにより、ｄｓＤＮＡナノ粒子の分散安定性がより向上する。また、ＤＮＡの塩基長を５０ｂｐ以下とすることにより、二本鎖ＤＮＡの運動性が下がり、ｄｓＤＮＡナノ粒子間のそれぞれの二本鎖ＤＮＡ同士で形成されるπ−π相互作用が強められるため、塩を添加した際に粒子がより凝集し易くなる。
【００２５】
ｄｓＤＮＡナノ粒子に形成される二本鎖ＤＮＡの密度は、０．３×１０１３本／ｃｍ２〜３．５×１０１３本／ｃｍ２程度であることが好ましい。
【００２６】
ｄｓＤＮＡナノ粒子の種類については特に制限されず、例えば、表面に二本鎖ＤＮＡが担持された金属の担体であっても、表面に二本鎖ＤＮＡが担持された高分子の担体であってもよい。
【００２７】
上記担体の形状については特に制限されず、球状、プレート状、ロッド状等であってもよい。
【００２８】
金属の担体である金属ナノ粒子としては、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、カドミウムナノ粒子等が挙げられる。この中では、長期保存という観点から、酸化安定性が高い金ナノ粒子が好ましい。
【００２９】
金属ナノ粒子のサイズは、５ｎｍ〜５００ｎｍであることが好ましい。特に、金ナノ粒子の場合、５ｎｍ〜２５０ｎｍであることがより好ましい。金ナノ粒子の直径が５ｎｍ以上では分散液がより赤みを帯び、直径が２５０ｎｍ以下では粒子自体の分散安定性が向上し沈殿しにくくなり、金ナノ粒子の分散状態を色調により評価することがより容易になるためである。
【００３０】
金属ナノ粒子へ二本鎖ＤＮＡを担持する方法としては特に制限されず、例えば、以下の方法が挙げられる。
まず、一本鎖ＤＮＡの末端をチオール化してナノ粒子に担持する。次いで、一本鎖ＤＮＡが担持されたナノ粒子を含む分散液に、該一本鎖ＤＮＡの相補鎖を混合してアニールする。これにより、二本鎖ＤＮＡを有する金属ナノ粒子の分散液を調製できる。この方法以外にも、従来公知の方法を適宜選択できる。
【００３１】
高分子の担体である高分子ナノ粒子としては、ラテックス粒子等が挙げられる。ラテックス粒子を構成する高分子としては特に限定されないが、例えば、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、スチレン−アクリル酸共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、等が挙げられる。ラテックス粒子のサイズは、１０〜５００ｎｍであることが好ましい。ラテックス粒子のサイズを１０ｎｍ以上にすると、分散液に塩を添加した場合、ラテックス粒子が凝集し易くなり、５００ｎｍ以下にすると、粒子の液中の分散安定性が向上するためである。
【００３２】
ラテックス粒子へ二本鎖ＤＮＡを担持する方法としては特に制限されず、例えば、以下の方法が挙げられる。
まず、ラテックス粒子表面に存在するカルボキシ基、エポキシ基等の官能基と一本鎖ＤＮＡのアミノ基等を反応させ結合させる。次いで、一本鎖ＤＮＡが担持されたラテックス粒子を含む分散液に、該一本鎖ＤＮＡの相補鎖を混合してアニールする。これにより、二本鎖ＤＮＡを有するラテックス粒子の分散液を調製できる。この方法以外にも、従来公知の方法を適宜選択できる。
【００３３】
ナノ粒子に担持された一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡにする方法としては、上述した方法以外に、一本鎖ＤＮＡが担持されたナノ粒子の分散液に、一端側が一本鎖であり、他端側が二本鎖であるＤＮＡ鎖を混合してアニールする方法が挙げられる。該ＤＮＡ鎖の一端側の一本鎖ＤＮＡは、ナノ粒子に担持された一本鎖ＤＮＡの相補鎖である。これにより、ナノ粒子に担持された一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡにすることができる。
【００３４】
ナノ粒子へ二本鎖ＤＮＡを担持する方法としては、上述した方法以外に、既報（Ｎ．Ｋａｎａｙａｍａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２０１６，３２，１３２９６−１３３０４）に記載のステム−ループ構造を有するヘアピン型ＤＮＡを用いる方法も挙げられる。具体的には、ステム−ループ構造を有するヘアピン型ＤＮＡのループ部位に存在するＤＮＡ塩基にアルキレン基等のスペーサーを介してカルボキシ基やチオール基を導入し、ナノ粒子に担持させる方法である。この方法によれば、一本鎖ＤＮＡが混在することなく、二本鎖ＤＮＡをナノ粒子上に担持することができる。
【００３５】
（塩混合工程）
次いで、塩混合工程では、ｄｓＤＮＡナノ粒子と被検物質とを含む分散液に塩を混合する。塩の混合は、被検物質とＤＮＡとの反応時間を考慮して、被検物質とｄｓＤＮＡナノ粒子との接触後、５分以上経過後とすることが好ましい。塩の種類は特に限定されないが、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２等の金属塩が好ましい。
【００３６】
混合する塩の量は、被検物質の非存在下においてｄｓＤＮＡナノ粒子が凝集する量である。つまり、被検物質によるＤＮＡ損傷作用を受けておらず、突出末端やアルキル化した二本鎖ＤＮＡを有さないｄｓＤＮＡナノ粒子が凝集する塩濃度となるように混合する。金属塩の場合は、金属カチオンの価数によって、分散液中でｄｓＤＮＡナノ粒子が凝集する塩濃度が異なる。具体的には、一価の金属カチオンの場合、分散液中の金属カチオンの最終濃度が、０．５〜２ｍｏｌ／Ｌになるように混合することが好ましい。分散液中のナノ粒子の濃度にもよるが、金属カチオンの濃度が０．５ｍｏｌ／Ｌ以上であれば、突出末端やアルキル化した二本鎖ＤＮＡを有さないｄｓＤＮＡナノ粒子が凝集しやすくなる。二価の金属カチオンの場合は、分散液中の金属カチオンの最終濃度が、０．０５〜０．２ｍｏｌ／Ｌになるように混合することが好ましい。
【００３７】
（選別工程）
選択工程では、後述する評価方法により、塩を混合した分散液中でのｄｓＤＮＡナノ粒子の分散状態を評価し、被検物質を接触させない場合と比較してｄｓＤＮＡナノ粒子の凝集が抑制された場合に、被検物質をＤＮＡ損傷剤として選択する。
【００３８】
評価方法としては、ｄｓＤＮＡナノ粒子の分散及び凝集状態を確認できる方法であれば特に制限されず、例えば、目視により分散液の色調、濁り、沈殿等を確認する方法、紫外可視分光光度計を用いてスペクトルを確認する方法、濁度計を用いて濁度を確認する方法等が挙げられる。この中でもより迅速かつ簡便に評価できるという点で、目視により分散液の色調を確認する方法が好ましい。また、使用するナノ粒子の種類によって、適宜評価方法を選択することが好ましい。
【００３９】
例えば、金属ナノ粒子の場合、より迅速かつ簡便に評価するという観点から、目視により分散液の色調を確認する方法が好ましい。
ラテックス粒子の場合は、目視により分散液の濁りを確認する方法又は濁度計を用いて濁度を確認する方法が好ましい。
【００４０】
ここで、金属ナノ粒子の分散液の色調の変化について、金ナノ粒子の分散液を例に挙げて説明する。
金ナノ粒子は、液中に分散した状態では表面プラズモン共鳴により赤みを帯びた色に発色するが、この共鳴エネルギーは粒子径に依存し、液中で凝集して粒子径が大きくなると、吸収バンドが長波長側へシフトする。このため、液中で分散した状態の金ナノ粒子の凝集が進むと、分散液の色調は赤みを帯びた色から青みを帯びた色に変化する。しかし、二本鎖ＤＮＡの切断、アルキル化等が起こると、高塩濃度下においてもｄｓＤＮＡナノ粒子が分散した状態を維持するため、色調変化は抑制される。この現象を利用することにより、ｄｓＤＮＡナノ粒子のＤＮＡの損傷の有無を迅速かつ簡便に見分けることができる。
【００４１】
本実施形態に係るＤＮＡ損傷剤のスクリーニング方法によれば、上記のように、被検物質と接触させたｄｓＤＮＡナノ粒子の分散状態を評価することにより、被検物質によるＤＮＡ損傷作用の有無を確認することができる。これにより、短時間で簡便にＤＮＡ損傷剤を選別することができる。
【００４２】
以上、本発明の実施形態に係るＤＮＡ損傷剤のスクリーニング方法について説明したが、本発明は上述の実施形態に制限されるものではなく、適宜変更が可能である。
例えば、ｄｓＤＮＡナノ粒子は、ＤＮＡと高分子との複合体から構成されるナノミセルであってもよい。ＤＮＡと高分子との複合体としては、ナノミセルを形成するものであれば特に制限されず、例えば、ＤＮＡとポリチオフェン等の導電性高分子との複合体等が挙げられる。該複合体のナノミセルのサイズは、特に制限されないが、５〜５００ｎｍであることが好ましい。
【００４３】
ＤＮＡと高分子との複合体から構成されるナノミセルの分散液の調製方法としては、例えば、ＤＮＡと高分子との複合体を水等の液体に投入して、液中で高分子が内側、ＤＮＡが外側に向いたナノミセルを形成させる方法等が挙げられる。
【００４４】
＜ＤＮＡ損傷剤のスクリーニング用キット＞
本実施形態に係るＤＮＡ損傷剤のスクリーニング用キットは、ＤＮＡ損傷剤のスクリーニングに使用するものであり、上述した複数の一本鎖又は二本鎖ＤＮＡが表面から伸びるように形成されたナノ粒子の分散液を含む。
【００４５】
本実施形態に係るスクリーニング用キットによれば、予めナノ粒子にＤＮＡが形成されているため、ナノ粒子上へＤＮＡを担持する工程又はＤＮＡと高分子との複合体からナノミセルを形成させる工程が不要であり、より迅速かつ簡便にスクリーニングすることができる。
【００４６】
上記分散液は、複数の一本鎖ＤＮＡが形成されたナノ粒子の分散液であっても、複数の二本鎖ＤＮＡが形成されたナノ粒子の分散液であってもよい。
【００４７】
複数の一本鎖ＤＮＡが形成されたナノ粒子の分散液を含むスクリーニング用キットによれば、スクリーニングにより得ようとするＤＮＡ損傷剤に合わせて、ナノ粒子の表層部に形成される二本鎖ＤＮＡの塩基配列を適宜選択することができる。
所望の塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡを形成させる具体的な方法としては、一端側が一本鎖であって上記一本鎖ＤＮＡの相補鎖であり、他端側が二本鎖であるＤＮＡ鎖を上記分散液に混合してアニールする方法が挙げられる。このとき、該ＤＮＡ鎖の他端側の二本鎖ＤＮＡにＤＮＡ損傷剤の標的となる塩基配列を含ませる。この方法により、ナノ粒子の表層部に標的となる塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡを形成させることができる。
【００４８】
また、上記分散液は、鉄イオン、コバルトイオン等の金属イオンを含んでいてもよい。
これにより、例えば、ＢＬＭのような活性化に金属イオンを必要とするＤＮＡ損傷剤のスクリーニングをより簡便に実施することができる。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５０】
＜調製例１：二本鎖ＤＮＡが担持された金ナノ粒子の分散液の調製＞
二本鎖ＤＮＡが担持された金ナノ粒子（以下、「ｄｓＤＮＡ−ＧＮＰ」という）の分散液は、既報を参照して以下のように調製した（Ｋ．Ｓａｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００３，１２５，８１０２−８１０３）。
まず、直径１５ｎｍの金ナノ粒子を１．４×１０１２個／ｍＬ含む分散液（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｂｉｏｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）に、３’末端に−（ＣＨ２）６−ＳＨ基を有する後述する一本鎖ＤＮＡを３ｎｍｏｌ加えて、５０℃で２４時間インキュベートした。次いで、上記分散液に０．１ＭのＮａＣｌと、１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）とを添加して、５０℃で４８時間静置した。未反応の一本鎖ＤＮＡを取り除くため、１０℃、１４０００ｒｐｍの条件で２０分間遠心し、上澄を除去し、１ｍＬの上記リン酸緩衝液を添加して、再び上記の条件で遠心した後、得られた沈殿物に上記リン酸緩衝液を添加して、２０ｎＭの一本鎖ＤＮＡが担持された金ナノ粒子を含むストック分散液を調製した。そして、上記ストック分散液に、一本鎖ＤＮＡの相補鎖（最終濃度５００ｎｍｏｌ／Ｌ）と、１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０とを添加し、室温で１０分静置することにより、５ｎｍｏｌ／ＬのｄｓＤＮＡ−ＧＮＰの分散液を調製した。上記の一本鎖ＤＮＡが担持された金ナノ粒子には、粒子１個あたり１００本程度の一本鎖ＤＮＡが担持された。そして、相補鎖を添加後は、一本鎖ＤＮＡのうち約４０％に二本鎖ＤＮＡが形成された。つまり、ｄｓＤＮＡ−ＧＮＰには、約６０本の一本鎖ＤＮＡと約４０本の二本鎖ＤＮＡとが混在する。
金ナノ粒子の表面に結合させる一本鎖ＤＮＡ及び該一本鎖ＤＮＡの相補鎖の塩基配列は以下の通りである。
一本鎖ＤＮＡ：５’−ＣＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号１）
相補鎖：５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＧ−３’（配列番号２）
ここで、後述する試験例１〜３におけるＢＬＭは、塩基配列５’−ＧＣ−３’のＧとＣとの間で特異的にＤＮＡを切断する。このＢＬＭの切断活性を評価するため、ｄｓＤＮＡ−ＧＮＰのＤＮＡの末端付近が５’−ＧＣ−３’である上記塩基配列の一本鎖ＤＮＡを用いた。
【００５１】
＜試験例１：ＢＬＭによるＤＮＡ切断活性評価＞
試験例１では、調製例１で調製したｄｓＤＮＡ−ＧＮＰの分散液を用いて、ＢＬＭによるＤＮＡ切断活性を評価した。
まず、ｄｓＤＮＡ−ＧＮＰの分散液に、ＢＬＭ及びＦｅ（ＮＨ４）２（ＳＯ４）２をそれぞれの最終濃度が６２．５μｍｏｌ／Ｌとなるように添加して、室温で３０分間静置し、全量２０μＬのサンプルＡを調製した。
【００５２】
次いで、対照サンプルとして、以下のサンプルＢ〜Ｄを調製した。
サンプルＢ：ＢＬＭ及びＦｅ（ＮＨ４）２（ＳＯ４）２の代わりに水を添加した以外はサンプルＡと同様の方法でサンプルを調製した。
サンプルＣ：ＢＬＭを添加しない以外はサンプルＡと同様の方法でサンプルを調製した。
サンプルＤ：Ｆｅ（ＮＨ４）２（ＳＯ４）２を添加しない以外はサンプルＡと同様の方法でサンプルを調製した。
【００５３】
上記のサンプルＡ〜Ｄに、最終濃度が０．５ｍｏｌ／ＬとなるようにＮａＣｌを添加し、室温で１０分間静置した後、目視により各サンプルの色調の変化を評価した。また、目視による評価とともに、紫外可視分光光度計を使用して、各サンプルの吸収スペクトルを測定した。目視による評価時の各サンプルの分散液を図２に、各サンプルの吸収スペクトルを図３に示す。
【００５４】
図２に示すとおり、ＢＬＭ又はＦｅ（ＮＨ４）２（ＳＯ４）２の一方のみを含むか、どちらも含まないサンプルＢ〜Ｄの場合は、塩の添加により、分散液中のｄｓＤＮＡ−ＧＮＰが凝集し、分散液の色調が赤色から紫色に変化した。一方、ＢＬＭ及びＦｅ（ＮＨ４）２（ＳＯ４）２の両方が含まれるサンプルＡは、塩を添加した後も、分散液の色調が赤色のままであった。これは、ｄｓＤＮＡ−ＧＮＰの末端塩基（５’−ＧＣ−３’）がＧとＣの間で切断された結果、粒子表層部に突出構造が形成され、高塩濃度下における粒子の凝集が抑制されたためであると考えられる。これにより、ＢＬＭのようなＤＮＡ損傷剤のＤＮＡ切断活性を目視により評価できることが分かった。
【００５５】
ＢＬＭのＤＮＡ切断活性は、図３に示す各サンプルの吸収スペクトルからも確認することができる。図３に示すように、サンプルＢ〜Ｄは、金ナノ粒子が凝集し粒子径が大きくなることにより、吸収バンドが長波長側へシフトしたが、サンプルＡの吸収バンドは長波長側へシフトしなかった。この結果から、サンプルＡのｄｓＤＮＡ−ＧＮＰの末端塩基が切断され、金ナノ粒子の凝集が抑制されたことが確認された。
【００５６】
＜試験例２：目視によるＤＮＡ切断活性評価結果に対するＢＬＭの濃度依存性の評価＞
試験例２では、目視によるＤＮＡ切断活性評価結果に対するｄｓＤＮＡ−ＧＮＰ分散液中のＢＬＭ濃度の影響について確認した。
【００５７】
評価用サンプルとして、以下のサンプルを調製した。
サンプルＥ〜Ｋ：ＢＬＭ及びＦｅ（ＮＨ４）２（ＳＯ４）２をそれぞれの最終濃度が、０．５μｍｏｌ／Ｌ、２．０μｍｏｌ／Ｌ、３．９μｍｏｌ／Ｌ、７．８μｍｏｌ／Ｌ、１６μｍｏｌ／Ｌ、３１μｍｏｌ／Ｌ、６２μｍｏｌ／Ｌとなるように添加した以外は、サンプルＡと同様の方法でサンプルを調製した。
サンプルＬ〜Ｒ：Ｆｅ（ＮＨ４）２（ＳＯ４）２を添加せず、ＢＬＭの最終濃度を、０．５μｍｏｌ／Ｌ、２．０μｍｏｌ／Ｌ、３．９μｍｏｌ／Ｌ、７．８μｍｏｌ／Ｌ、１６μｍｏｌ／Ｌ、３１μｍｏｌ／Ｌ、６２μｍｏｌ／Ｌとした以外は、サンプルＡと同様の方法でサンプルを調製した。
【００５８】
次いで、サンプルＥ〜Ｒに、最終濃度が０．５ｍｏｌ／ＬとなるようにＮａＣｌを添加して、室温で１０分間静置した後、目視により各サンプルの色調の変化を評価した。目視による評価時の各サンプルの分散液を図４に示す。
【００５９】
図４に示すように、ＢＬＭの最終濃度が７．８μｍｏｌ／Ｌ以上であるサンプルＨ〜Ｋの場合、高塩濃度下においてもｄｓＤＮＡ−ＧＮＰの分散状態に由来する赤色を保持した。しかし、ＢＬＭの最終濃度が３．９μｍｏｌ／Ｌ以下であるサンプルＥ〜Ｇは、Ｆｅ（ＮＨ４）２（ＳＯ４）２を含まないサンプルＬ〜Ｒと同様に、塩を添加した後、分散液の色調が赤色から紫色に変化した。これにより、ＢＬＭの濃度が３．９μｍｏｌ／Ｌ以下では、ｄｓＤＮＡ−ＧＮＰの凝集の抑制が目視により評価できる程度まで、ＤＮＡが切断されていないことが示唆される。
【００６０】
＜試験例３：ＢＬＭ及びその他のＤＮＡ損傷剤によるＤＮＡ損傷作用の評価＞
試験例３では、ＢＬＭ及びその他のＤＮＡ損傷剤によるＤＮＡ損傷作用を目視により評価した。
【００６１】
評価用サンプルとして、サンプルＨと、以下のサンプルを調製した。
サンプルＳ：ＢＬＭ及びＦｅ（ＮＨ４）２（ＳＯ４）２の代わりに、最終濃度が７．８μｍｏｌ／ＬとなるようにＭＴＺを添加した以外は、サンプルＡと同様の方法でサンプルを調製した。
サンプルＴ：ＢＬＭ及びＦｅ（ＮＨ４）２（ＳＯ４）２の代わりに、最終濃度が７．８μｍｏｌ／ＬとなるようにＣＤＤＰを添加した以外は、サンプルＡと同様の方法でサンプルを調製した。
サンプルＵ：ＢＬＭ及びＦｅ（ＮＨ４）２（ＳＯ４）２の代わりに、最終濃度が７．８μｍｏｌ／ＬとなるようにＣＰＡを添加した以外は、サンプルＡと同様の方法でサンプルを調製した。
【００６２】
次いで、サンプルＨ、Ｓ〜Ｕに、最終濃度が０．５ｍｏｌ／ＬとなるようにＮａＣｌを添加して、室温で１０分間静置した後、目視により各サンプルの色調の変化を評価した。目視による評価時の各サンプルの分散液を図５に示す。
【００６３】
図５に示すように、ＢＬＭ以外のＤＮＡ損傷剤を添加したサンプルＳ〜Ｕにおいては、溶液の色調が赤色から紫色に変化し、ｄｓＤＮＡ−ＧＮＰの凝集を抑制することができなかった。この理由として、ＭＴＺについては、ＢＬＭと異なり不活性な状態であり、ＤＮＡ損傷作用を発揮しなかったためであると考えられる。
また、ＣＤＤＰ及びＣＰＡについては、濃度が低いため、二本鎖ＤＮＡのアルキル化が効率的に進行せず、ｄｓＤＮＡ−ＧＮＰの凝集を抑制するまでの効果が発揮されなかったことが理由であると考えられる。
【図１】
2020031549.tif 000003
【図２】
2020031549.tif 000004
【図３】
2020031549.tif 000005
【図４】
2020031549.tif 000006
【図５】
2020031549.tif 000007
【配列表】
2020031549000001.app