(57)【要約】      （修正有）【課題】前立腺癌患者の遺伝子発現プロフィールを使用して患者の予後情報を特定する、分子診断検査法の提供。【解決手段】前立腺癌患者から採取された生物学的試料からの予後バイオマーカー又は共発現バイオマーカーの発現量を測定する工程を含み、測定された発現量を分析して、患者に関して起こり得る予後の情報、及び患者が前立腺癌の再発を有する尤度を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺癌患者における癌の再発尤度を定量化する方法であって、
前記患者から採取された前立腺組織を含む生物学的試料中の少なくとも１つの遺伝子の発現量を測定する工程であって、前記少なくとも１つの遺伝子が表３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、６Ａ、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、８Ａ、８Ｂ、１０Ａもしくは１０Ｂの遺伝子を含むか、または前記少なくとも１つの遺伝子と共発現する遺伝子を含む工程と、
前記患者の癌の再発尤度を予測する工程であって、
表３Ａ、４Ａ、５Ａ、６Ａ、７Ａ、８Ａ、および１０Ａ中の任意の遺伝子の発現量が再発リスクの増加と正の関連を示し、かつ
表３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ、６Ｂ、７Ｂ、８Ｂ、および１０Ｂ中の任意の遺伝子の発現量が再発リスクの増加と負の関連を示す工程と、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許仮出願第６１／３６８，２１７号（２０１０年７月２７日出願）、米国特許仮出願第６１／４１４，３１０号（２０１０年１１月１６日出願）、および米国特許仮出願第６１／４８５，５３６，号（２０１１年５月１２日出願）に対する優先権を主張するものであり、それらの仮出願はいずれも本明細書に参照として援用されている。
【０００２】
本開示は、遺伝子発現プロフィールを使用して患者の予後情報を特定する方法を関する情報を提供する、分子診断検査法に関する。本開示は詳細には、前立腺癌患者が癌の局所再発または遠隔再発を経験する尤度を定量化する際に発現量を用いる対象の遺伝子およびｍｉｃｒｏＲＮＡを提供する。
【背景技術】
【０００３】
前立腺癌は、男性に最もよく起こる固形悪性腫瘍であり、北アメリカおよび欧州連合（ＥＵ）における男性の癌関連死の２番目によくある死因でもある。２００８年には、前立腺癌と診断される患者は米国内だけでも１８万例を突破しており、この疾患による死者は３万例近くに及ぶであろう。前立腺癌の進行にとって最も重大な危険因子の１つは年齢であり、これは調査された全ての人種グループに当てはまる。米国人口の高齢化に伴い、前立腺癌の年間発病率は２０２５年までに倍増し、１年に４０万例近くに及ぶことが予測される。
【０００４】
１９９０年代に前立腺特異抗原（ＰＳＡ）スクリーニングが導入されて以来、臨床的に明らかな疾患を呈する患者の比率が激減し、今日新たに診断を受けた患者の半分は「低リスク」に分類される患者で占められるようになった。ＰＳＡは前立腺癌の有無を判定する腫瘍マーカーとして用いられ、ＰＳＡレベルが高い場合は前立腺癌を有するものと判定される。病期初期（Ｔ１）疾患等の低リスクな特徴を呈する限局性前立腺癌患者の比率が増えつつあるにもかかわらず、米国内の患者の９０％超は依然として、前立腺切除もしくは放射線などの根治療法を受けている。根治療法を受けていない場合でも、転移性疾患を発症し前立腺癌で死亡する患者は、これらの患者のうちの約１５％にすぎない。Ａ．Ｂｉｌｌ−Ａｘｅｌｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎａｔ’ｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１００（１６）：１１４４−１１５４（２００８）。したがって、前立腺癌患者の大多数は過度な治療を受けている。
【０００５】
前立腺癌の再発危険率および治療法の決定に関する評価は現在、主にＰＳＡレベルおよび／または腫瘍病期に基づいて行われている。腫瘍病期と転帰との関連性は病理学的レポートに記載するのに充分な有意なものであることが実証されてきた一方、米国病理学者協会（Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ）コンセンサスステートメントは、この情報の入手、解釈、リポーティング、および解析の手法にはバリエーションがあることに注目している。Ｃ．Ｃｏｍｐｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  １２４：９７９−９９２（２０００）。結果的に、既存の病理学的な病期分類方法は再現性に欠くとして批判されてきており、それ故、個々の患者について不正確なリスク評価がなされ得る。
【発明の概要】
【０００６】
本出願は、前立腺癌患者から採取された生物学的サンプルからの遺伝子、遺伝子サブセット、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、または１つ以上のｍｉｃｒｏＲＮＡと１種以上の遺伝子もしくは遺伝子サブセットとの組み合わせの発現量の測定、および測定された発現量の解析を含み、それらに基づき癌の再発尤度に関する情報を提供する、分子アッセイを開示するものである。例えば、癌の再発尤度は、臨床的または生化学的無再発期間に基づくスコアに換算して記述し得る。
【０００７】
また、本出願は、前立腺癌患者から採取された生物学的サンプルからの遺伝子、遺伝子サブセット、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、または１つ以上のｍｉｃｒｏＲＮＡと１種以上の遺伝子もしくは遺伝子サブセットとの組み合わせの発現量の測定を含む、分子アッセイを開示している。例えば、患者は癌の再発もしくは癌による死、または予後因子に対して正または負の関連性を示す関連する１種以上の遺伝子またはｍｉｃｒｏＲＮＡの発現量を使用して層別化し得る。例示的な実施例において、予後因子はグリソン（Ｇｌｅａｓｏｎ）パターンである。
【０００８】
生物学的サンプルは、手術、生検、もしくは体液を含む標準法で採取することが可能であり、腫瘍組織または癌細胞、および場合によっては組織学的に正常な組織（例えば、腫瘍組織に隣接する組織学的に正常な組織）を含み得る。例示的な実施態様においては、生物学的サンプルはＴＭＰＲＳＳ２融合に対して陽性または陰性である。
【０００９】
例示的な実施例では、前立腺癌における特定の臨床転帰に対して正または負の関連性を示す関連する１種以上の遺伝子および／またはｍｉｃｒｏＲＮＡの発現量を使用して、予後および適切な療法を判定する。本明細書中に開示された遺伝子は、単独で使用してもよいし、細胞接着／遊走、即初期ストレス反応、および関連する細胞外基質などの機能的な遺伝子サブセット内に配列することもできる。各遺伝子サブセットは、本明細書に開示される遺伝子のほか、１種以上の開示された遺伝子と共発現する遺伝子も包含する。遺伝子発現解析を行うようにプログラムされた計算を、コンピュータ上で実行することもできる。本明細書中に開示されたｍｉｃｒｏＲＮＡはまた、単独使用してもよいし、開示された１種以上のｍｉｃｒｏＲＮＡおよび／または遺伝子のいずれかと組み合わせて使用することもできる。
【００１０】
例示的な実施態様において、分子アッセイには少なくとも２つの遺伝子の発現量が関与し得る。遺伝子または遺伝子サブセットは、予後または腫瘍ミクロ環境との関連の強度に従ってウェイトを与え得る。別の例示的な実施例において、分子アッセイには少なくとも１つの遺伝子および少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡの発現量が関与し得る。遺伝子とｍｉｃｒｏＲＮＡとの組み合わせは、遺伝子とｍｉｃｒｏＲＮＡとの組み合わせが機能的に相互作用する尤度に基づいて選択し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】生検グリソンスコア、ベースラインＰＳＡレベル、および臨床病期Ｔ期の臨床評価および病理学的評価の分布を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
定義
別途定義がない限り、本願明細書に用いられている技術用語および科学用語は、本発明の帰する当業者に一般的に理解されているのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９４），ａｎｄ  Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４ｔｈ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９２）は、当業者にとって、本出願に用いられている多くの用語に対する一般的指針となる。
【００１３】
当業者であれば、本明細書に記述されている方法および材料と類似もしくは等価で、かつ本発明の実施に使用し得る多くの方法および材料を識別するであろう。事実上、本発明はいかなる場合も、本明細書に記述されている方法および材料に限定されない。以下、本発明の目的に合わせて、以下の用語を定義する。
【００１４】
本明細書で用いられている「腫瘍」および「病変」という用語は、悪性であるか良性であるかに関係なく、全ての腫瘍細胞の成長および増殖、ならびに全ての前癌性／癌性の細胞および組織を意味する。当業者であれば、１種以上の癌細胞、部分的または断片化した細胞、様々な病期の腫瘍、組織学的に正常な外観の周囲組織、および／またはマクロもしくはミクロ解剖された組織等の複数の生物学的要素を、腫瘍組織標本に含み得ることを理解するであろう。
【００１５】
「癌」および「癌性」という用語は、典型的には無秩序な細胞増殖によって特徴づけられる、哺乳類の生理的条件を指し、これを説明するものである。本開示における癌の実施例は、前立腺癌等の尿生殖路癌を包含している。
【００１６】
癌の「病理」とは患者の健康を損なうあらゆる現象を包含し、限定はされないが、異常もしくは制御不能な細胞増殖、転移、隣接する細胞の正常な機能の妨害、サイトカインもしくは他の分泌生成物の異常なレベルでの放出、炎症性もしくは免疫学的反応の抑制もしくは悪化、周囲または遠隔の組織のもしくは器官（例えばリンパ節、その他）の腫瘍形成、前悪性腫瘍、悪性腫瘍、浸潤が挙げられる。
【００１７】
本明細書において「前立腺癌」という用語は、交換可能に用いられ、最も広義には、前立腺の組織から生じる全ての病期の癌および全ての形態の癌を指す。
【００１８】
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ（ＡＪＣＣ）のＡＪＣＣ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｇｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ（７ｔｈ  Ｅｄ．，２０１０）の腫瘍（ｔｕｍｏｒ）、リンパ節（ｎｏｄｅ）、転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）（ＴＮＭ）病期分類システムによれば、前立腺癌の様々な病期は、腫瘍（Ｔ１：臨床的に不顕性な腫瘍であり、かつ画像診断を介しても触知できないかまたは不可視である。Ｔ１ａ：組織学的に偶然検出された腫瘍で切除組織の５％以下、Ｔ１ｂ：組織学的に偶然検出された腫瘍で切除組織の５％を超える、Ｔ１ｃ：針生検で腫瘍が同定される；Ｔ２：腫瘍が前立腺内に限局している、Ｔ２ａ：腫瘍が１葉の半分以下に及んでいる、Ｔ２ｂ：腫瘍が１葉の半分を越えた域にまで及んでいるが、両葉には及んでいない、Ｔ２ｃ：腫瘍が両葉に及んでいる；Ｔ３：腫瘍が前立腺被膜を通過して進展している、Ｔ３ａ：被膜の外へ拡大（片側であるか両側であるかを問わない）、Ｔ３ｂ：腫瘍が精嚢に浸潤する；Ｔ４：腫瘍が定着しているか、または精嚢以外の隣接する構造（膀胱頚部、外括約筋、直腸、挙筋、もしくは骨盤壁）に侵入する）。リンパ節（Ｎ０：局部リンパ節の転移が存在しない；Ｎｌ：局部リンパ節における転移）。転移（Ｍ０：遠隔転移が存在しない；Ｍｌ：遠隔転移が存在する）のように定義されている。
【００１９】
グリソン悪性度分類システム（Ｇｌｅａｓｏｎ  Ｇｒａｄｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用することで、前立腺癌を有する男性の予後の評価に役立つ。他のパラメーターと共に、前立腺癌の病期分類ストラテジーに組み込まれ、予後を予測し、療法を指導する助けになる。前立腺癌は、その顕微鏡的な外観に基づいてグリソン「スコア」または「グレード」が与えられる。グリソンスコアが低い腫瘍は典型的には、その生涯にわたって患者に有意な脅威を引き起こし得ないほど充分に緩徐に生育する。これらの患者は、経時的な監視（「注意深い経過観察（ｗａｔｃｈｆｕｌ  ｗａｉｔｉｎｇ）」もしくは「積極的サーベイランス（Ａｃｔｉｖｅ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）」を受ける。グリソンスコアが高い癌は、攻撃性が強く予後が悪化する。これらの患者は一般に手術（例えば、根治的前立腺切除）、および場合によっては療法（例えば、放射線、ホルモン、超音波、化学療法）で治療される。グリソンスコア（もしくは総計）は、２つの最も一般的な腫瘍パターンのグレードを含む。これらのパターンはグリソンパターン１〜５と呼ばれる。パターン１は最も高分化型である。大部分はパターンが混在されている。グリソンスコアまたはグレードを得るには、優性パターンをその次に優性なパターンに加算する。これにより、２〜１０の数値が得られる。グリソングレードとしては、以下が挙げられる。Ｇ１：高分化（軽度異型性）（グリソン（Ｇｌｅａｓｏｎ）２〜４）
Ｇ２：中分化（中等度異型性）（グリソン（Ｇｌｅａｓｏｎ）５〜６）
Ｇ３〜４：低分化または未分化（高度異型性）（グリソン（Ｇｌｅａｓｏｎ）７〜１０）
【００２０】
病期分類：Ｉ期：Ｔｌａ  Ｎ０  Ｍ０  Ｇ１。ＩＩ期：（Ｔ１ａ、Ｎ０、Ｍ０、Ｇ２〜４）または（Ｔ１ｂ、ｃ、Ｔ１、Ｔ２、Ｎ０、Ｍ０、全てのＧ）；ＩＩＩ期：Ｔ３、Ｎ０、Ｍ０、全てのＧ；ＩＶ期：（Ｔ４、Ｎ０、Ｍ０、全てのＧ）または（全てのＴ、Ｎ１、Ｍ０、全てのＧ）または（全てのＴ、全てのＮ、Ｍ１、全てのＧ）。
【００２１】
本明細書において「腫瘍組織」という用語は、１つ以上の癌細胞を含有する生物学的サンプル、または１つ以上の癌細胞の一部分を指す。そのような生物学的サンプルが、腫瘍組織を取得する際に使用される方法（例えば、外科的切除、生検、もしくは体液）に応じた他の生物学的構成要素、例えば、組織学的に（腫瘍に隣接するなどの）正常な外観の細胞を付加的に含み得ることは、当業者に認識されるであろう。
【００２２】
本明細書において「ＡＵＡリスクグループ」という用語とは、臨床的限局性前立腺癌の処置に関する、２００７年度にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＵＡ）が更新した、臨床的限局性前立腺癌の処置に関するガイドラインを指し、局所療法後の患者の生化学的（ＰＳＡ）再発リスク状態（低、中、または高）を判定する場合に臨床医によって用いられる。
【００２３】
本明細書において「隣接組織（ＡＴ）」という用語は、腫瘍に隣接した組織学的に「正常な」細胞を指す。例えば、ＡＴ発現プロフィールは、疾患の再発および存続と関連し得る。
【００２４】
本明細書において「非腫瘍性前立腺組織」とは、前立腺腫瘍に隣接している組織学的に正常な外観の組織を意味する。
【００２５】
予後因子は、癌の自然な経過に関連した変数であり、癌をいったん発症した後の患者の再発速度および転帰に影響を及ぼす。予後の悪化と関連する臨床パラメーターとしては、例えば、腫瘍病期の増分、提示されるＰＳＡレベル、およびグリソングレードまたはグリソンパターンが挙げられる。予後因子は多くの場合、様々なベースライン再発リスクを基準に患者をサブグループに分類する場合に使用される。
【００２６】
本明細書中で使用されている「予後」という用語は、癌患者が癌に起因し得る死または進行（前立腺癌等の腫瘍性疾患の再発、転移進展、および薬剤抵抗を含む）を有する尤度を指す。例えば、「予後良好」とは再発を伴わない長期生存を包含し、「予後不良」とは癌の再発を包含する。
【００２７】
本明細書において、「発現量」という用語は、遺伝子に適用された場合、遺伝子産物の正規化レベル（例えば、遺伝子のＲＮＡ発現量、または遺伝子のポリペプチド発現量に対して定量化された正規化値）を指す。
【００２８】
「遺伝子産物」または「発現生成物」という用語は、ｍＲＮＡを含む遺伝子のＲＮＡ（リボ核酸）転写産物（転写物）、およびそのようなＲＮＡ転写物のポリペプチド翻訳生物を指すために、本明細書中に使用されている。遺伝子産物は、例えば、非スプライスＲＮＡ、ｍＲＮＡ、スプライスバリアントｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、断片化ＲＮＡ、ポリペチド、翻訳後修飾ポリペチド、スプライスバリアントポリペチドなどであり得る。
【００２９】
本明細書において「ＲＮＡ転写物」という用語は、遺伝子のＲＮＡ転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、非スプライスＲＮＡ、スプライスバリアントｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、および断片化ＲＮＡを含む）を指す。
【００３０】
「ｍｉｃｒｏＲＮＡ」という用語は、遺伝子発現を調節し得る１８〜２５のヌクレオチドを含んだ短い一本鎖非コードＲＮＡを指す目的で本明細書に使用されている。例えば、複合体はＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に関連している場合、特定のｍＲＮＡ標的に結合してこれらのｍＲＮＡの配列を翻訳阻止または開裂させる。
【００３１】
特に明記しない限り、本明細書中に使用されている各遺伝子名は、遺伝子に割り当てられた公式シンボルと一致し、これらのシンボルは本出願の出願日時点でＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ（ＵＲＬ：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ）によって提供されている。
【００３２】
「相関」および「関連」という用語は、本明細書中で交換可能に用いられており、２つの測定値の関連（または測定されたエンティティ）を指す。本開示は、遺伝子、遺伝子サブセット、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、またはｍｉｃｒｏＲＮＡと遺伝子もしくは遺伝子サブセットとの組み合わせが提供されており、それらの発現量は腫瘍病期と関連している。例えば、遺伝子またはｍｉｃｒｏＲＮＡの発現量の増加は、予後良好あるいは肯定的な予後に対して正の相関（正の関連性）を示し得る。そのような正の相関は、様々な方法で（例えば、１未満の癌の再発ハザード比により）統計学的に実証し得る。別の例では、遺伝子またはｍｉｃｒｏＲＮＡの発現量の増加は、予後良好あるいは肯定的な予後に対して負の相関（負の関連性）を示し得る。その場合、例えば、患者は癌の再発を経験する可能性がある。
【００３３】
本明細書において「予後良好」あるいは「肯定的な予後」という用語は、再発を伴わない長期生存等の有益な臨床転帰を指す。本明細書において「予後不良」あるいは「否定的な予後」という用語は、癌の再発等の否定的な臨床転帰を指す。
【００３４】
「リスク分類」という用語は、被験者が特定の臨床転帰を経験するリスクのレベル（あるいは尤度）を基準に、被験者をグループ化することを意味する。本開示の方法（例えば、高、中間、低リスク）に基づいて、被験者をリスクグループに分類するかリスクのレベルで分類し得る。「リスクグループ」は、特定の臨床転帰に関して同程度のリスクレベルを有する被験者、または個々のグループである。
【００３５】
「長期」生存という用語は、特定期間（例えば、少なくとも５年、または少なくとも１０年）の生存を指すために本明細書中に使用されている。
【００３６】
「再発」という用語は、癌の局所再発もしくは遠隔再発（即ち、転移）を指すために、本明細書中に使用されている。例えば、前立腺癌は、前立腺の隣の組織内でまたは精嚢内で局所的に再発する可能性がある。癌はまた、骨盤内の周囲リンパ節またはこの領域の外側のリンパ節に影響を及ぼし得る。前立腺癌は、前立腺の隣の組織（例えば、骨盤筋、骨、もしくは他の器官）に広がり得る。再発は、例えば画像診断検査もしくは生検で検出される臨床的再発を基準に判別するか、あるいは、例えば持続的な経過観察による前立腺特異抗原（ＰＳＡ）レベル≧０．４ｎｇ／ｍＬ、またはＰＳＡレベル上昇の結果としてサルベージ療法の初発変化で検出される生化学的再発を基準に判別することができる。
【００３７】
「臨床的無再発期間（ｃＲＦＩ）」という用語は、手術から初めての臨床的再発まで、または前立腺癌の臨床的再発による死亡までの期間（月数）として、本明細書中に使用されている。不完全な経過観察による喪失、他の原発性癌、または臨床的再発に先立った死亡は、検閲事象と見なされるため、これらが起きた場合、検閲時間に達するまでこの被験者に臨床的再発が起こらなかったという情報くらいしか判らない。ｃＲＦＩを計算する目的上、生化学的再発は無視される。
【００３８】
「生化学的無再発期間（ｂＲＦＩ）」という用語は、手術から前立腺癌の初回の生化学的再発までの期間（月数）として、本明細書中に使用されている。臨床的再発、不完全な経過観察による喪失、他の原発性癌、または生化学的再発に先立った死亡は、検閲事象と見なされる。
【００３９】
「全体的な生存率（ＯＳ）」という用語は、手術から何らかの原因による死亡までの期間（月数）を指すために、本明細書中に使用されている。不完全な経過観察による喪失は、検閲事象と見なされる。ＯＳを計算する目的上、生化学的再発および臨床的再発は無視される。
【００４０】
「前立腺癌特異的生存率（ＰＣＳＳ）」という用語は、手術から前立腺癌による死亡までの期間（月数）を指すために、本明細書中に使用されている。不完全な経過観察による喪失または他の原因による死亡は、検閲事象と見なされる。ＰＣＳＳを計算する目的上、臨床的再発および生化学的再発は無視される。
【００４１】
本明細書において「悪性度進行」または「病期進行」という用語は、グリソングレードが生検の時点での３＋３から、根治的前立腺摘除術（ｒａｄｉｃａｌ  ｐｒｏｓｔａｔｅｃｔｏｍｙ）（ＲＰ）の時点での３＋４以上になるまでの変化、またはグリソングレードが生検の時点での３＋４から、ＲＰの時点での４＋３以上になるまでの変化、またはＲＰの時点での精嚢浸潤（ＳＶＩ）もしくは被膜外浸潤（ＥＣＥ）を指す。
【００４２】
実際問題として、上記測定の計算は、検閲対象と見なされる事象の定義に応じて、スタディごとに変化し得る。
【００４３】
「マイクロアレイ」という用語は、ハイブリダイゼーション可能なアレイ要素（例えば、基質上のオリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドプローブ）の秩序立った配列を指す。
【００４４】
「ポリヌクレオチド」という用語は、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを一般に指し、それらは無修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。したがって、例えば、本明細書中に定義されているポリヌクレオチドは、限定はされないが、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域とを含むＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖領域と二本鎖領域とを含むＲＮＡ、ならびにＤＮＡとＲＮＡ（一本鎖であり得るかより典型的には二本鎖であり得、かつ一本鎖領域と二本鎖領域とを含む）とを含んでなるハイブリッド分子を包含する。加えて、本明細書において「ポリヌクレオチド」という用語は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。そのような領域内の鎖は、同じ分子からの鎖であるか、異なる分子からの鎖であり得る。領域は１つ以上の分子を全て含んだ領域を包含し得るが、より典型的には分子をいくつか含んだ領域のみを包含する。三重螺旋領域の分子の１つは、多くの場合オリゴヌクレオチドである。「ポリヌクレオチド」という用語は、特異的にｃＤＮＡを包含する。この用語は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、および１つ以上の修飾塩基を含有するＲＮＡを包含する。したがって、安定化または他の理由で主鎖が修正されたＤＮＡまたはＲＮＡは、その用語が本明細書中で意図された「ポリヌクレオチド」である。本明細書で定義されている用語「ポリヌクレオチド」内には更に、イノシン等の異例の塩基を有するＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはトリチウム化された塩基等の修飾塩基が含有されている。一般に、「ポリヌクレオチド」という用語は、化学的に、酵素によって、かつ／または代謝的に修飾された無修飾ポリヌクレオチドの全ての形態と、ウイルスおよび細胞（単純型および複雑型細胞を含む）に特有のＤＮＡおよびＲＮＡの化学形態とを包含する。
【００４５】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、比較的短いポリヌクレオチドを指し、限定はされないが、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖または二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡｒＤＮＡハイブリッド、および二本鎖ＤＮＡを包含する。一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチドは多くの場合、例えば市販のオートメーション化されたオリゴヌクレオチドシンセサイザーを使用して化学法で合成される。ただし、オリゴヌクレオチドは、細胞および有機体内でのＤＮＡの発現によるインビトロ組み換えＤＮＡ媒介技術を含む他の様々な方法で作製し得る。
【００４６】
本明細書において「ＣＴ」という用語は閾値サイクル（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ）を指す。つまり、或る反応中に発生した蛍光が、定義済みの閾値を優に超える時点（例えば、反応中に充分な数の単位複製配列が累積して定義済み閾値と一致した時点）での定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）のサイクル数である。
【００４７】
本明細書において「Ｃｐ」という用語は、「クロッシングポイント（ｃｒｏｓｓｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）」を指す。Ｃｐ値は、ｑＰＣＲ増幅曲線全体の二次導関数およびその最大値を定量化することによって計算される。Ｃｐ値は、蛍光の増加が最高に達し、ＰＣＲの対数期が開始する時点でのサイクルを表す。
【００４８】
「閾値」あるいは「閾値処理（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｉｎｇ）」という用語は、遺伝子発現測定値と臨床反応の非線形関係を考慮すると共に、レポートされた患者スコアにおける変動を更に軽減するために使用される手順を指す。閾値処理（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｉｎｇ）を適用した場合、閾値未満または閾値を超える測定値はいずれも、その閾値に設定される。遺伝子発現と転帰の非線形関係は、スムーザーまたは三次スプラインを使用し、無再発期間に対するＣｏｘ  ＰＨ回帰、または再発状態に対するロジスティック回帰における遺伝子発現をモデリングして、調査し得る。Ｄ．Ｃｏｘ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ  ３４：１８７−２２０（１９７２）。レポートされた患者スコアの変動は、特定の遺伝子の定量化および／または検出の限界点における遺伝子発現の変動性の関数として調査し得る。
【００４９】
本明細書において「単位複製配列」という用語は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応等の増幅技術を使用して合成されたＤＮＡの断片を指す。
【００５０】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」は当業者であれば容易に判別でき、一般的にプローブ長さ、洗浄温度、および塩濃度に応じて経験則に基づき算定される。一般に、プローブが長いほど適切なアニーリングを得るための所要温度は高く、一方、プローブが短いほど所要温度は低い。ハイブリダイゼーションは一般に、相補鎖がその融解温度未満の環境に存在する場合に、変性ＤＮＡが相補鎖をリアニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション可能配列との間の所望の相同性の程度が高いほど、使用可能な相対温度が高い。結果として、相対温度が高いほど反応条件のストリンジェンシーが強まる傾向があり、一方、温度が低いほどその傾向が弱まる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細および説明については、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）を参照されたい。
【００５１】
本明細書中に定義されている「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェントな条件」は典型的に（１）洗浄に低イオン強度および高温、例えば、５０℃にて０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを使用し；（２）ハイブリダイゼーション時に４２℃にて７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含有する０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／ｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液と共に、ホルムアミド、例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドなどの変性剤を使用するか、または（３）４２℃にて５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを使用し、４２℃にて０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５０％ホルムアミド中で洗浄した後、５５℃にてＥＤＴＡ含有の０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェントな洗浄を行う。
【００５２】
「中程度にストリンジェントな条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９の説明に従って確認でき、上記のハイブリダイゼーション条件に比べて低ストリンジェントな洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度および％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度にストリンジェントな条件の一例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｍｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で３７℃にて一晩インキュベートした後、約３７〜５０℃にて１×ＳＳＣ中でフィルタを洗浄する。プローブ長およびこれに類するもの等の因子に適合させるための所要温度、イオン強度等の調整方法は、当業者によって認識されるであろう。
【００５３】
「スプライシング」および「ＲＮＡスプライシング」という用語は、交換可能に用いられており、真核細胞の細胞質内に移動する連続したコード配列を有する成熟ｍＲＮＡを生成するため、イントロンを除去してエクソン同士を連結するＲＮＡプロセッシングを指す。
【００５４】
本明細書において「共発現する」および「共発現した」という用語は、様々な患者からなる集団全体におけるそれぞれの転写物配列の量の統計的な相関を指す。ペアワイズ共発現（Ｐａｉｒｗｉｓｅ  ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、当該技術分野で公知の様々な方法で、例えば、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）相関係数またはスピアマン（Ｓｐｅａｒｍａｎ）相関係数を算出することによって計算できる。共発現遺伝子クリークは、グラフ理論を用いて同定し得る。共発現の解析は、正規化された発現データを使用して算定できる。或る遺伝子が、開示された特定の遺伝子と共発現すると言われるのは、遺伝子の発現量が、０．６に等しいかそれより大きいピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）相関係数を呈する場合である。
【００５５】
「コンピュータベースのシステム」は、情報解析に使用されるハードウェア、ソフトウェアおよびデータ記憶媒体のシステムを指す。患者のコンピュータベースシステムの最小ハードウェアは、中央演算処理装置（ＣＰＵ）、データ入力／データ出力用ハードウェア（例えば、ディスプレイ装置）、およびデータ記憶装置を備える。現在利用可能な任意のコンピュータベースのシステムおよび／またはそのコンポーネントが、本開示の方法に関連した使用に好適であることは、当業者であれば容易に認めることができる。データ記憶媒体は、上に記載した本情報を記録する装置を備える製造品、またはそのような製造品にアクセスできる記憶アクセス装置を備える任意の製造品を含み得る。
【００５６】
データ、プログラミング、または他の情報をコンピュータ可読媒体に「記録する」とは、当該技術分野で公知られている任意の方法を使用して情報を保存する工程を指す。保存された情報へのアクセスに用いる手段に応じて、何らかの便利なデータ記憶構造を選択できる。保存に使用できるデータプロセッサプログラムおよびフォーマットには、例えば、文書処理テキストファイル、データベースフォーマット等、様々なものがある。
【００５７】
「プロセッサ」あるいは「コンピューティング手段」とは、それに必要とされる機能を実行する任意のハードウェアおよび／またはソフトウェアの組み合わせを指す。例えば、好適なプロセッサは、電子コントローラ、メインフレーム、サーバ、またはパーソナルコンピュータ（デスクトップ型または携帯型）等の型式で利用可能なプログラム可能なデジタルマイクロプロセッサであり得る。プロセッサがプログラム可能である限り、好適なプログラミングが遠隔位置からプロセッサに伝達できるか、またはコンピュータプログラム製品（携帯型または固定型コンピュータ読み取り可能記憶媒体等、基盤のデバイスが磁気、光学、または固体かを問わない）に予め保存される。磁気媒体または光ディスクは、プログラミングを実行でき、対応する端末で各プロセッサとやり取りする好適な読み取り装置を介して読み取ることが可能である。
【００５８】
本明細書において、「積極的サーベイランス（Ａｃｔｉｖｅ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）」および「注意深い経過観察（ｗａｔｃｈｆｕｌ  ｗａｉｔｉｎｇ）」という用語は、症候が現れるかまたは変化するまで一切の治療なしに患者の症状を綿密に監視することを意味する。例えば、前立腺癌において注意深い経過観察（ｗａｔｃｈｆｕｌ  ｗａｉｔｉｎｇ）は通常、他の医療問題および初期疾患を有する高齢の男性に使用される。
【００５９】
本明細書において、「手術」という用語は、癌組織を除去するために行われる外科手術上の方法（骨盤のリンパ節切除、根治的前立腺摘除術（ｒａｄｉｃａｌ  ｐｒｏｓｔａｔｅｃｔｏｍｙ）、経尿道的前立腺切除術（ＴＵＲＰ）、摘出、切開、および腫瘍生検／除去を含む）に適用される。遺伝子発現解析に使用される腫瘍組織または切片は、これらの方法のいずれかによって採取し得る。
【００６０】
本明細書において「療法」という用語は、放射線、ホルモン療法、冷凍外科療法、化学療法、生物学的療法を含む、および高密度焦点式超音波療法を含む。
【００６１】
本明細書において「ＴＭＰＲＳＳ融合」および「ＴＭＰＲＳＳ２融合」は交換可能に使用される用語であり、アンドロゲン駆動ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子と、前立腺癌と有意な関連性があることが実証されたＥＲＧオンコジーンとの融合を指す。Ｓ．Ｐｅｒｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｕｒｏｌｏｇｅ  Ａ．４６（７）：７５４−７６０（２００７）；Ｓ．Ａ．Ｎａｒｏｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９９（６）：８４７−８５１（２００８）。本明細書において、陽性ＴＭＰＲＳＳ融合状態はＴＭＰＲＳＳ融合が組織標本内に存在することを示し、一方、陰性ＴＭＰＲＳＳ融合状態はＴＭＰＲＳＳ融合が組織標本内に存在しないことを示す。当業者であれば、ＴＭＰＲＳＳ融合状態の判定方法には、リアルタイム、計量的ＰＣＲ、または高スループットシークエンシング等、多くの方法があることを認識するであろう。例えば、Ｋ．Ｍｅｒｔｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｏｐｌａｓｉｓ  ９（３）：２００−２０６（２００７）；Ｃ．Ｍａｈｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ４５８（７２３４）：９７−１０１（２００９）を参照のこと。
【００６２】
遺伝子、遺伝子サブセット、およびｍｉｃｒｏＲＮＡを使用した遺伝子発現方法
本開示は、１つ以上の遺伝子、遺伝子サブセット、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、または１つ以上のｍｉｃｒｏＲＮＡと、前立腺癌患者から採取される生物学的サンプルからの１つ以上の遺伝子または遺伝子サブセットとの組み合わせの発現量の測定を含む分子アッセイを提供すると共に、測定された発現量の解析も提供し、これにより癌の再発尤度に関する情報を提供する。
【００６３】
本開示は、１つ以上の遺伝子および／またはｍｉｃｒｏＲＮＡの発現量に基づいて前立腺腫瘍を分類する方法を更に提供する。本開示は、特定の予後の転帰に対して正または負の関連性を示す遺伝子および／またはｍｉｃｒｏＲＮＡを更に提供する。例示的な実施態様において、臨床転帰はｃＲＦＩ、およびｂＲＦＩを含む。別の実施形態において、予後因子に対して正または負の関連性を示す関連する１つ以上の遺伝子および／またはｍｉｃｒｏＲＮＡの発現量に基づいてリスクグループ内の患者を分類し得る。例示的な実施例において、予後因子はグリソン（Ｇｌｅａｓｏｎ）パターンである。
【００６４】
開示された遺伝子およびｍｉｃｒｏＲＮＡの発現量を定量化するための技術的手法は、様々なものが本明細書に記載されており、限定はされないが、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、高スループットシークエンシング、遺伝子発現の連続解析（ＳＡＧＥ）、およびデジタル遺伝子発現（ＤＧＥ）を含む。それらの手法については、以下で詳細に述べる。特定の態様において、各遺伝子またはｍｉｃｒｏＲＮＡの発現量は、遺伝子の発現産物の様々な特徴（エキソン、イントロン、蛋白質エピトープ、および蛋白質活性を含む）に関連して定量化し得る。
【００６５】
１つ以上の遺伝子および／またはｍｉｃｒｏＲＮＡの発現量は、腫瘍組織において測定し得る。例えば、腫瘍組織は、腫瘍の外科的除去または摘除、または腫瘍生検によって採取し得る。腫瘍組織は、組織学的に「正常な」組織（例えば、腫瘍に隣接した組織学的に「正常な」組織）であり得るか、またはそのような組織を含み得る。遺伝子および／またはｍｉｃｒｏＲＮＡの発現量はまた、腫瘍から遠く離れた部位から回収される腫瘍細胞、例えば、循環腫瘍細胞、体液（例えば、尿、血液、血液分画等）においても測定し得る。
【００６６】
検定される発現生成物は、例えば、ＲＮＡまたはポリペチドであり得る。発現産物は、断片化し得る。例えば、アッセイでは、発現産物の標的配列と相補的なプライマーを使用でき、したがって、完全な転写物だけでなく、標的配列を含む断片化された発現産物も測定できる。更なる情報は、表Ａ（特許請求の範囲よりも上部の明細書中に挿入されている）に掲載されているとおりである。
【００６７】
ＲＮＡ発現産物は、直接検定してもよいし、またはＰＣＲベースの増幅方法、例えば、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）で生じたｃＤＮＡ産物の検出によって検定することもできる（例えば、米国特許第７，５８７，２７９号明細書を参照）。ポリペチド発現産物は、免疫組織化学（ＩＨＣ）を使用して検定し得る。更に、ＲＮＡおよびポリペチド発現産物の両方はまた、マイクロアレイを使用して検定し得る。
【００６８】
臨床的有用性
前立腺癌は現在、デジタル直腸診（ＤＲＥ）および前立腺特異抗原（ＰＳＡ）試験を使用して診断されている。ＰＳＡ結果が高い場合、患者は一般的に前立腺組織生検を受ける。病理学者は、生検サンプルの確認および癌細胞の検査によってグリソンスコアを判定する。内科医はグリソンスコア、ＰＳＡ、臨床病期、および他の因子に基づいて、患者を監視するか、それとも患者を手術および療法で治療するか決定をする必要がある。
【００６９】
現在、初期前立腺癌における臨床上の意思決定を左右するのは、特定の組織病理学的因子および臨床因子である。これら因子のとしては、以下のものが挙げられる。（１）臨床病期（例えばＴ１、Ｔ２）、提示されたＰＳＡレベル、およびグリソングレードなど、転帰の定量化において極めて強力な予後因子である腫瘍因子；ならびに（２）診断時の年齢および同時罹患率等の宿主因子。これらの因子が存在するため、限局性疾患の患者を予後によって層別化する臨床的に最も有用な手段は、臨床病期、血清ＰＳＡレベル、および腫瘍悪性度（グリソングレード）を併用し、多因子による病期分類を介してなされている。２００７年度にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＵＡ）が更新した、臨床的限局性前立腺癌の処置に関するガイドラインでは、これらのパラメーターをグループ化することによって、局所療法後の患者の生化学的（ＰＳＡ）再発リスク状態（低、中、または高）を判定できるようにしている。Ｉ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ，Ｊ  Ｕｒｏｌ．１７７（６）：２１０６−３１（２００７）。
【００７０】
そのような分類を行った場合、手術／放射線を受けた後に補助療法を必要とし得る限局性疾患の患者を識別する上では役立つであることが証明されてきたが、反面、局所療法による処置を必要としない緩慢性の癌と局所療法を要する攻撃的な腫瘍との区別は付き難い。事実上、ＰＳＡスクリーニングで診断される前立腺癌の大多数は現在、臨床病期がＴ１ｃでかつＰＳＡ≦１０ｎｇ／ｍＬであるため、これらのアルゴリズムは、次第に、保存療法（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ）と原因療法（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）との判別に使用するには限界が生じてきた。
【００７１】
Ｔ１期の前立腺癌患者は、臨床的に明らかでない疾患を有するが、ＰＳＡが高いため（＞４ｎｇ／ｍＬ、Ｔ１ｃ）、前立腺経尿道を摘除したとき（ＴＵＲＰ、Ｔ１ａ、Ｔ１ｂ）または実施された生検において発見される。２００７年度に存在する症例の約８０％は、診断時に臨床Ｔ１期にある。スカンジナビア試験によれば、根治的前立腺摘除術（ｒａｄｉｃａｌ  ｐｒｏｓｔａｔｅｃｔｏｍｙ）後に初期前立腺癌（Ｔ１／Ｔ２）およびグリソンスコア≦７の患者における１０年を経た時点での全体的な生存率（ＯＳ）は８５％であった。
【００７２】
Ｔ２前立腺癌を有する患者は、臨床的に明らかでかつ器官に限局した疾患に罹患しており、Ｔ３腫瘍を有する患者の疾患は、前立腺被膜に侵入しかつ／または精嚢を浸潤している疾患に罹患している。臨床病期分類が病理病期を過小評価しており、臨床的にＴ２期にある患者の約２０％は前立腺切除後にｐＴ３期に進むことが、外科的シリーズから判明している。Ｔ２またはＴ３前立腺癌患者のほとんどは、前立腺切除または放射線のいずれか一方の局所療法で処置されている。スカンジナビア試験からのデータによれば、グリソングレード≦７であるＴ２患者においては、前立腺切除が生存に及ぼす効果は１０年経た時点で最高でも５％にすぎない。つまり、患者の大多数は、診断の時点で外科的療法による利益が得られていない。グリソンが７より大きいＴ２患者の場合、またはＴ３患者の場合、前立腺切除の療法効果は有意であると見なされるが、その有意性はランダム化試験では定量化されなかった。公知のとおり、これらの患者は局所療法後１０年を経た時点で有意な再発リスク（１０〜３０％）を有する。ただし、診断の時点において最適な局所療法（根治的前立腺摘除術（ｒａｄｉｃａｌ  ｐｒｏｓｔａｔｅｃｔｏｍｙ）、放射線）、どの患者がネオアジュバント／アジュバントアンドロゲン遮断療法からメリットが得られる可能性が高いか、またどの療法（アンドロゲン遮断、化学療法）が生化学的に衰弱した（ＰＳＡの上昇）の時点で何らかの臨床的利益をもたらすかを定義するプロスペクティブランダム化試験（ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｔｒｉａｌ）は存在していない。
【００７３】
ニードル生検からグリソンスコアを正確に定量化するにあたって、技術上の課題がいくつか存在する。第一に、グリソンパターン間の「ボーダーライン」である組織構造を解釈することは、泌尿器学的病理学者にとってさえ非常に主観的である。第二に、生検に関して「予測された」グリソンスコアが、腺自体における前立腺癌の実際の「観測された」グリソンスコアと必ずしも相関しない理由としては、上記のほかに、生検サンプリングが不完全であることも挙げられる。このため、グリソンスコアリングの精度は、スライドを解読する病理学者の専門知識によってだけでなく、前立腺の生検サンプリングストラテジーの完全性および妥当性によっても左右される。Ｔ．Ｓｔａｍｅｙ，Ｕｒｏｌｏｇｙ  ４５：２−１２（１９９５）。遺伝子／ｍｉｃｒｏＲＮＡの発現アッセイ、および本明細書中に開示されている方法の実施によって提供される関連情報は、初期前立腺癌における最適な処置についての意思決定を容易にする分子アッセイ方法を提供する。例示的な実施態様では、発現量が前立腺癌の再発に対して（正または負の）関連性を示す遺伝子およびｍｉｃｒｏＲＮＡが提供されている。例えば、そのような臨床ツールがあれば、原因療法（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）後に再発する可能性が高くかつ補助療法を必要とするＴ２／Ｔ３期の患者を、内科医が同定することも可能になる。
【００７４】
加えて、内科医であれば本明細書中に開示されている方法を使用することにより、グリソンパターンおよびＴＭＰＲＳＳ融合状態等の予後因子と有意に関連する１つ以上の遺伝子および／またはｍｉｃｒｏＲＮＡの発現量に基づいて、腫瘍を分子レベルで分類することが可能になる。これらの方法は、患者同士（ｉｎｔｒａ−ｐａｔｉｅｎｔ）の変動性、生検サンプルにおけるグリソンパターンの組織学的な定量化、または腫瘍組織に隣接する組織学的に正常な外観の組織の封入といった技術的問題の影響を受けない。複数の検体遺伝子／ｍｉｃｒｏＲＮＡの発現試験を使用して、いくつかの適切な生理学的プロセスまたは構成要素の細胞特性の各々に関与する１つ以上の遺伝子および／またはｍｉｃｒｏＲＮＡの発現量を測定し得る。本明細書に開示されている方法は、遺伝子、および／またはｍｉｃｒｏＲＮＡをグループ化し得る。遺伝子およびｍｉｃｒｏＲＮＡのグループ化は、それらの遺伝子および／またはｍｉｃｒｏＲＮＡの貢献の知識に少なくとも部分的に基づき、例えば上に述べたグループにおける生理学的機能または構成要素の細胞特性に従って実行できる。更にまた、１つ以上のｍｉｃｒｏＲＮＡは、１つ以上の遺伝子と結合し得る。遺伝子とｍｉｃｒｏＲＮＡとの組み合わせは、遺伝子とｍｉｃｒｏＲＮＡとの組み合わせが機能的に相互作用する尤度に基づいて選択できる。加えて、グループ（または遺伝子サブセット）を形成することによって、癌再発に対する様々な発現量の寄与の数学的重み付けを容易化できる。生理的プロセスまたは構成要素の細胞特性を表す遺伝子／ｍｉｃｒｏＲＮＡグループの重み付けは、そのプロセスの貢献を反映し得るか、または癌および臨床転帰の病理の特性を示している。
【００７５】
任意選択的に、開示されている方法を用い、リスク（例えば、再発リスク）を基準に患者を分類し得る。患者は、サブグループ（三分位値または四分位値など）に区分化できる。患者のサブグループに対する各リスクの大／小は、選択された値によって定義される。
【００７６】
予後を予測する上で開示されている遺伝子マーカーの有用性は、そのマーカーに特有のものでない場合がある。開示されている遺伝子の発現パターンと類似の発現パターンを有する代替マーカーは、その共発現遺伝子またはｍｉｃｒｏＲＮＡで置換し得るか、または加えて使用し得る。そのような遺伝子またはｍｉｃｒｏＲＮＡが共発現するので、発現量値の置換は試験の全体的有用性にほとんど影響してはならない。２つの遺伝子またはｍｉｃｒｏＲＮＡのかなり類似する発現パターンは、同じプロセスにおいて遺伝子またはｍｉｃｒｏＲＮＡの両方の関与によって生じる場合があり、かつ／または前立腺腫瘍細胞内で一般的な制御調節下に置かれる場合がある。したがって、本開示は、そのような共発現遺伝子、遺伝子、サブセットもしくはｍｉｃｒｏＲＮＡを、本開示の遺伝子の代替として、または本開示の遺伝子に付加して使用することを企図している。
【００７７】
遺伝子産物の発現量アッセイ方法
本開示の方法および組成物には、特に明記しない限り、当該分野の技術の範囲内にある分子生物学の従来技術（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、および生化学が利用されている。例示的な技術は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ＆  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．，１９８７）、“Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）、および“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）等の文献中で詳細に説明されている。
【００７８】
遺伝子発現プロファイリングの方法としては、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション解析に基づく方法、ポリヌクレオチドの配列決定に基づく方法、およびプロテオミクスに基づく方法が挙げられる。サンプル中のＲＮＡの発現を定量化するための例示的方法としては、当該技術分野で公知のノーザンブロット法およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｐａｒｋｅｒ  ＆  Ｂａｒｎｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０６：２４７−２８３（１９９９））、リボヌクレアーゼ（ＲＮＡｓｅ）プロテクションアッセイ（Ｈｏｄ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：８５２−８５４（１９９２））、およびＰＣＲに基づく方法、例えば、逆転写ＰＣＴ（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｗｅｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８：２６３−２６４（１９９２））が挙げられる。配列特異的な二重鎖を認識できる抗体（例えば、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ‐ＲＮＡハイブリッド二重鎖、またはＤＮＡ−蛋白質二重鎖など）を用いてもよい。配列決定に基づく遺伝子発現解析方法の代表例としては、遺伝子発現の連続解析（ＳＡＧＥ）、および大量並行シグネチャー配列決定（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現解析が挙げられる。
【００７９】
逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
典型的には、ｍＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）は、試験サンプルから単離される。出発原料は、典型的には、ヒト腫瘍（通常、原発性腫瘍）から単離される総ＲＮＡである。任意選択的に、同じ患者からの正常な組織を内部対照として使用できる。そのような正常な組織は、腫瘍に隣接した組織学的に正常な外観の組織であり得る。ｍＲＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡは、組織標本から（例えば、新鮮で冷凍された（例えば新鮮凍結）、またはパラフィン包埋（例えばホルマリン固定）サンプルから）抽出されたものであってよい。
【００８０】
ｍＲＮＡおよびｍｉｃｒｏＲＮＡ抽出の一般的な方法は当該技術で周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９７）等の分子生物学の標準教科書で開示されている。パラフィン包埋組織からＲＮＡを抽出する方法は、例えば、Ｒｕｐｐ  ａｎｄ  Ｌｏｃｋｅｒ，Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．５６：Ａ６７（１９８７）、およびＤｅ  Ａｎｄｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８：４２０４４（１９９５）で開示されている。特に、ＲＮＡの単離は、精製キット、緩衝液セット、およびＱｉａｇｅｎ等の商業的な製造業者からのプロテアーゼを使用して、そのメーカーの指示に従い実施できる。例えば、培養物内の細胞からの総ＲＮＡはＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニカラムを使用して単離し得る。他の市販ＲＮＡ単離キットとしては、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、およびＰａｒａｆｆｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）が挙げられる。組織標本からの総ＲＮＡは、ＲＮＡ  Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）を使用して単離し得る。腫瘍から調製されたＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心分離によって単離し得る。
【００８１】
次いで、ＲＮＡ含有のサンプルを逆転写にかけ、ＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを生成した後、ＰＣＲ反応において指数関数的増幅を行う。最も一般的に使用されている逆転写酵素としては、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）、およびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）の２つがある。逆転写工程は、典型的には、状況および発現プロファイリングの目標に応じて特定のプライマー、ランダムヘキサマー（ｒａｎｄｏｍ  ｈｅｘａｍｅｒ）、またはオリゴｄＴプライマーを使用してプライムされる。例えば、抽出されたＲＮＡは、メーカーの指示に従い、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して逆転写できる。続いて、誘導されたｃＤＮＡは以降のＰＣＲ反応で鋳型として使用できる。
【００８２】
ＰＣＲベースの方法では、耐熱ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）を使用する。例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲは典型的には、ＴａｑポリメラーゼまたはＴｔｈポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を利用し、そのアンプリコンに結合されているハイブリダイゼーションプローブを加水分解するが、等価な５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素であれば、どのような酵素でも使用できる。２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＰＣＲ反応生成物に典型的なアンプリコンを生成する。第３のオリゴヌクレオチドまたはプローブは、２つのＰＣＲプライマーのハイブリダイゼーション部位間に位置するアンプリコンのヌクレオチド配列の検出を容易にするように設計し得る。プローブは、レポーター色素等で検出可能に標識でき、更に蛍光染料および失活剤蛍光染料の両方で標識してＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブ構成として提供できる。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）を使用した場合、増幅反応中にＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、鋳型に依存した方法でプローブを開裂する。結果として得られたプローブ断片は溶液中で分離し、放出されたレポーター色素からのシグナルは、第２の蛍光体の消光効果を免れる。新しい分子が合成されるたびに、レポーター色素の１分子が遊離される。消光されていないレポーター色素の検出は、データの定量的解釈の基礎となる。
【００８３】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲは、市販の機器（例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）、またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）等の高スループットのプラットフォーム）を使用して実施できる。好適な実施形態では、手順をマイクロウェルプレートベースのサイクラープラットフォームであるＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）リアルタイムＰＣＲシステム上で実行する。
【００８４】
５’ヌクレアーゼアッセイデータは一般的に、初めに閾値サイクル（「ＣＴ」）として表される。蛍光値は全てのサイクルで記録され、増幅反応においてその位置に増幅される生成物の分量を表す。閾値サイクル（ＣＴ）は、蛍光シグナルが統計的に有意として初めて記録される時点である、と一般的に説明される。代わりに、データをクロッシングポイント（ｃｒｏｓｓｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）（「Ｃｐ」）として表すこともできる。Ｃｐ値は、ｑＰＣＲ増幅曲線全体の二次導関数、およびその最大値を定量化することによって計算される。Ｃｐ値は、蛍光の増加が最高に達してＰＣＲの対数期が開始するサイクルを表す。
【００８５】
誤差およびサンプル間の変動の効果を最小限に抑えるため、ＲＴ−ＰＣＲは通常、内部標準を使用して実施される。理想的な内部標準遺伝子（リファレンス遺伝子も呼ばれる）は、同じ起源（即ち、正常組織および癌組織間で有意な相異のないレベル）の癌組織および非癌組織の間で極めて一定のレベルにて表され、実験的処置による有意な影響を受けず（即ち、化学療法に露出された結果として、関連する組織内での発現量における有意差を呈さず）、別々の患者から採取された同じ組織同士の間で極めて一定のレベルで表される。例えば、本明細書中に開示されている方法において有用なリファレンス遺伝子は、癌性前立腺内で、正常前立腺組織と比較して有意に相異する発現量を呈してはならない。遺伝子発現のパターンを正規化する際によく用いられるＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびβ−アクチンのｍＲＮＡである。正規化に使用される例示的なリファレンス遺伝子は、遺伝子ＡＡＭＰ、ＡＲＦ１、ＡＴＰ５Ｅ、ＣＬＴＣ、ＧＰＳ１、およびＰＧＫ１のうちの１つ以上を含んで構成される。遺伝子発現の測定値は、１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上）のリファレンス遺伝子の平均を基準に正規化できる。基準により正規化された（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ−ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）発現測定値は２から１５までの範囲に及ぶ可能性があり、ここで、１単位の増加は一般に、ＲＮＡ量における２倍の増加を反映する。
【００８６】
リアルタイムＰＣＲは、標的配列ごとの内部競合核酸（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）を正規化に使用する定量的比較ＰＣＲと、サンプル中に含有する正規化遺伝子またはＲＴ−ＰＣＲ用ハウスキーピング遺伝子を使用する定量的比較ＰＣＲの両方と互換性を持つ。詳細については、例えば、Ｈｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９８６−９９４（１９９６）を参照のこと。
【００８７】
本開示の方法に用いられる代表的なプロトコールのステップでは、固定パラフィン包埋組織をＲＮＡ供給源として使用する。例えば、ｍＲＮＡの単離、精製、プライマー伸張および増幅は当該技術分野で利用可能な方法を用いて実施できる（例えば、Ｇｏｄｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ２：８４−９１（２０００）；Ｓｐｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５８：４１９−２９（２００１））を参照のこと。簡潔に言うと、典型的なプロセスでは、初めに、パラフィン包埋腫瘍組織標本の約１０μｍ厚の切片を切断する。その後、ＲＮＡを抽出し、蛋白質およびＤＮＡをＲＮＡ含有のサンプルから除去する。ＲＮＡ濃度を解析した後、遺伝子特異的プライマーを使用してＲＮＡを逆転写し、続いてｃＤＮＡ増幅産物に対してＲＴ−ＰＣＲを行う。
【００８８】
イントロンベースのＰＣＲプライマーおよびプローブの設計
ＰＣＲプライマーおよびプローブは、対象遺伝子のｍＲＮＡ転写物中に存在するエクソンまたはイントロン配列に基づいて設計できる。プライマー／プローブの設計を行う際は、ＤＮＡ  ＢＬＡＴソフトウェア（開発元：Ｋｅｎｔ，Ｗ．Ｊ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１２（４）：６５６−６４（２００２））等の一般公開されているソフトウェア、またはＢＬＡＳＴソフトウェア（そのバリエーションを含む）を使用できる。
【００８９】
必要であるか望ましい場合、標的配列の反復塩基配列は、非特異的シグナルが緩和されるようにマスクし得る。これを遂行するための例示的なツールとしては、反復因子のライブラリに対してＤＮＡ配列をスクリーニングし、内部で反復因子がマスクされる問い合わせ配列を返すためのＲｅｐｅａｔ  Ｍａｓｋｅｒプログラム（Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅを介してオンラインで利用可能な）が挙げられる。その後、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＭＧＢ  ａｓｓａｙ−ｂｙ−ｄｅｓｉｇｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｐｒｉｍｅｒ３（Ｓｔｅｖｅ  Ｒｏｚｅｎ  ａｎｄ  Ｈｅｌｅｎ  Ｊ．Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ（２０００）Ｐｒｉｍｅｒ３  ｏｎ  ｔｈｅ  ＷＷＷ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｕｓｅｒｓ  ａｎｄ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒｓ）等の市販またはそれ以外の一般公開されているプライマー／プローブ設計パッケージいずれかを使用して、マスクしたイントロン配列を使用してプライマーおよびプローブ配列を設計することができる。Ｓ．Ｒｒａｗｅｔｚ，Ｓ．Ｍｉｓｅｎｅｒ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．３６５−３８６（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）を参照のこと。
【００９０】
ＰＣＲプライマー設計に影響する可能性のある他の因子としては、プライマーの長さ、融解温度（Ｔｍ）およびＧ／Ｃ含量、特異性、相補プライマー配列、ならびに３’末端配列が挙げられる。一般に、ＰＣＲプライマーは概ね１７〜３０塩基の長さで、約２０〜８０％の含有率（例えば、約５０〜６０％のＧ＋Ｃ塩基）であり、５０〜８０℃の間（例えば、約５０〜７０℃）の融解温度を呈するものが、最適である。
【００９１】
ＰＣＲプライマーおよびプローブの設計に関するガイドラインの詳細については、例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，ＣＷ．ｅｔ  ａｌ，“Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｆｏｒ  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ”ｉｎ：ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５，ｐｐ．１３３−１５５、Ｉｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，“Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣＲｓ”ｉｎ：ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９４，ｐｐ．５−１１、およびＰｌａｓｔｅｒｅｒ，Ｔ．Ｎ．Ｐｒｉｍｅｒｓｅｌｅｃｔ：Ｐｒｉｍｅｒ  ａｎｄ  ｐｒｏｂｅ  ｄｅｓｉｇｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．７０：５２０−５２７（１９９７）を参照のこと。それらの開示全体は、本明細書中で引用により明示的に援用されている。
【００９２】
本明細書に開示されている実施例と関連するプライマー、プローブ、およびアンプリコン配列に関する詳細は、表Ａに記載のとおりである。
【００９３】
ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）システム
ＭａｓｓＡＲＲＡＹベースの方法、例えば、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ、Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）が策定した例示的な方法では、ＲＮＡの単離および逆転写の後、採取されたｃＤＮＡを競合核酸（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）である合成ＤＮＡ分子でスパイクし、単一塩基を除く全ての位置にある標的ｃＤＮＡ領域と照合して、内部標準として作用する。ｃＤＮＡ／競合核酸（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）の混合物は、増幅されたＰＣＲであり、ＰＣＲ後のシュリンプ由来アルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）酵素処理を施すことによって、残存ヌクレオチドが脱リン酸化される。アルカリホスファターゼの失活後、競合核酸（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）およびｃＤＮＡからのＰＣＲ産物にプライマー伸張法を行い、それによって、競合核酸（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）およびｃＤＮＡで誘導されたＰＣＲ産物に対して明白なマスシグナルを生成する。精製後、これらの生成物をチップアレイ上に分取し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法飛行時間型質量解析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）解析での解析に必要とされる成分を予め装填する。その後、反応において存在するｃＤＮＡは、生成されたマススペクトルにおけるピーク領域の比率を解析することによって定量化される。詳細については、例えば、Ｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃａｎｔｏｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：３０５９−３０６４（２００３）を参照のこと。
【００９４】
他のＰＣＲベースの方法
本明細書中に開示されている方法に使用できるＰＣＲベースの技術としては、上述のもの以外に、例えば、ＢｅａｄＡｒｒａｙ（登録商標）技術（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｏｌｉｐｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），Ｊｕｎｅ  ２００２、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７２：５６１８（２０００））、遺伝子発現の迅速アッセイ法において市販のＬｕｍｉｎｅｘ１００  ＬａｂＭＡＰ（登録商標）システムおよび複数カラーコードミクロスフィア（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いた遺伝子発現検出用ビーズアレイ法（ＢｅａｄｓＡｒｒａｙ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＢＡＤＧＥ)）（登録商標））（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１１：１８８８−１８９８（２００１））、ならびに高カバー率遺伝子発現プロフィール（ｈｉｇｈ  ｃｏｖｅｒａｇｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ（ＨｉＣＥＰ））解析法（Ｆｕｋｕｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３１（１６）ｅ９４（２００３））が挙げられる。
【００９５】
マイクロアレイ
関心のある遺伝子またはマイクロアレイの発現量の評価には、マイクロアレイ技術を利用することもできる。この方法では、関心のあるポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む）は、基質上に配列される。その後、アレイ配列（ａｒｒａｙｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、特定のハイブリダイゼーションに好適な条件下で、試験サンプルのＲＮＡから生成された検出可能に標識されたｃＤＮＡと接触される。ＲＴ−ＰＣＲ方法の場合と同様にＲＮＡ供給源は、典型的には、腫瘍サンプルから単離された総ＲＮＡであり、任意選択的には、同じ患者の正常組織から内部標準または細胞系として単離された総ＲＮＡである。ＲＮＡは、例えば、凍結またはアーカイブされたパラフィン包埋、および固定（例えばホルマリン固定）組織標本から抽出できる。
【００９６】
例えば、アッセイ対象となる遺伝子のｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅済みインサートは、高密度の配列内の基質に適用される。通常、少なくとも１万のヌクレオチド配列が基質に適用される。例えば、マイクロチップ上に１万要素ごとに不動化されたマイクロアレイ遺伝子は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに好適である。蛍光標識ｃＤＮＡプローブは、関心のある組織から抽出されたＲＮＡの逆転写によって蛍光ヌクレオチドを組み込むことで生成し得る。チップに適用された標識ｃＤＮＡプローブは、アレイ上のＤＮＡの各スポットと特異的にハイブリダイズする。ストリンジェントな条件下で洗浄して、非特異的に結合しているプローブを取り除いた後、共焦レーザー顕微鏡、または別の検出方法（ＣＣＤカメラ等）でチップをスキャンする。各アレイ済み要素のハイブリダイゼーションを定量化することにより、対応するＲＮＡの存在量の評価が可能になる。
【００９７】
二色蛍光により、２つのＲＮＡ供給源から生成された別個の標識ｃＤＮＡプローブを、ペアでアレイにハイブリダイズさせる。したがって、各特異的遺伝子に対応する２つの供給源からの転写物の相対存在量が、同時に定量される。ハイブリダイゼーションを小規模化すると、大量の遺伝子の発現パターンを簡便かつ迅速に評価できる。そのような方法は、１細胞あたり２〜３のコピー数で発現される稀少な転写物を検出するだけでなく、発現量において少なくとも約２倍の差を再現的に検出するのにも必要な感度を有することが証明されてきた（Ｓｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ  ９３（２）：１０６−１４９（１９９６））。マイクロアレイ解析は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎＣｈｉｐ（登録商標）技術またはＩｎｃｙｔｅのマイクロアレイ技術等の製造業者のプロトコールに従い、市販の機器で実施できる。
【００９８】
遺伝子発現の連続解析（ＳＡＧＥ）
遺伝子発現の連続解析（ＳＡＧＥ）は、転写産物ごとに個々のハイブリダイゼーションプローブを提供する必要なしに多数の遺伝子転写物を同時かつ定量的に解析するための方法である。最初に、転写物を一意に同定するのに充分な情報を含む短配列タグ（約１０〜１４ｂｐ）を生成する。ただし、そのタグは、各転写物内の一意の位置から採取されることを条件とする。その後、配列できる多数の転写物を一括に連結し、長い連続分子を形成して、同時に複数のタグの同一性を暴露する。転写物の任意の母集団の発現パターンは、個々のタグの存在量を定量化し、各タグに対応する遺伝子を同定することによって、定量的に評価し得る。詳細については、例えば、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４８４−４８７（１９９５）、およびＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８８：２４３−５１（１９９７）を参照のこと。
【００９９】
核酸配列決定による遺伝子発現解析
核酸配列決定技術は、遺伝子発現解析に好適な方法である。これらの方法の基礎をなすのは、サンプル中にｃＤＮＡ配列が検出される回数が、その配列に対応するＲＮＡの相対的な発現に直接に関連するという原理である。これらの方法は時折、結果として得られたデータの離散的な数値特性を反映する、デジタル遺伝子発現（ＤＧＥ）という用語で呼ばれることもある。この原理が適用されている初期の方法は、遺伝子発現の連続解析（ＳＡＧＥ）および大量並行シグネチャー配列決定（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＭＰＳＳ）であった。例えば、Ｓ．Ｂｒｅｎｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８（６）：６３０−６３４（２０００）を参照のこと。最近では、「次世代の」配列決定技術の出現によって、ＤＧＥが単純化され、スループットが向上し、しかも入手しやすくなった。その結果、ＤＧＥを利用することによって、これまでよりも多くの個々の患者サンプルにおいて従来可能であったよりも多くの遺伝子の発現をスクリーニングできるようになったラボが増加つつある。例えば、Ｊ．Ｍａｒｉｏｎｉ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８（９）：１５０９−１５１７（２００８）；Ｒ．Ｍｏｒｉｎ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８（４）：６１０−６２１（２００８）；Ａ．Ｍｏｒｔａｚａｖｉ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５（７）：６２１−６２８（２００８）；Ｎ．Ｃｌｏｏｎａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５（７）：６１３−６１９（２００８）を参照のこと。
【０１００】
体液からのＲＮＡの単離
発現解析用にＲＮＡを血液、血漿および血清から（例えば、Ｋ．Ｅｎｄｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４８，１６４７−５３（２００２）および同書中の引用文献を参照）、更には尿から（例えば、Ｒ．Ｂｏｏｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８，４９５−５０３（１９９０）および同書中の引用文献を参照）単離する方法が記載されている。
【０１０１】
免疫組織化学
免疫組織化学方法はまた、遺伝子の発現量の検出に好適であり、本明細書中に開示されている方法に対する適用されている。そのような方法においては、関心のある遺伝子の遺伝子産物と特異的に結合する抗体（例えば、モノクローナル抗体）を使用できる。例えば、放射性ラベル、蛍光ラベル、ビオチン等のハプテンのラベル、またはワサビ由来ペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ等の酵素で抗体自体を直接標識することによって、抗体を検出し得る。あるいは、未標識の一次抗体を、一次抗体に特異的な標識二次抗体と共に使用することもできる。免疫組織化学プロトコールおよびキットは当該技術分野において周知であり、市販されている。
【０１０２】
プロテオミクス
「プロテオーム」という用語は、或る時点でサンプル（例えば組織、有機体または細胞培養液）中に存在する蛋白質の総量として定義される。プロテオミクスは、とりわけ、サンプルの蛋白質発現の全体的な変更の研究を包含する（「発現プロテオミクス」とも呼ばれる）。プロテオミクスは典型的には、（１）二次元ゲル電気泳動（２−Ｄ  ＰＡＧＥ）でサンプル中の個々の蛋白質を分離する工程と、（２）ゲルから回収された個々の蛋白質を同定する工程（例えばマイマススペクトロメトリーまたはＮ末端配列決定）と、（３）バイオインフォマティクスを使用してデータを解析する工程を含む。
【０１０３】
ｍＲＮＡ／ｍｉｃｒｏＲＮＡの単離、精製および増幅の概説
固定パラフィン包埋組織をＲＮＡ供給源として使用した遺伝子発現プロファイリングの代表的プロトコールの工程（ｍＲＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡの単離、精製、プライマー伸長および増幅を含む）は、様々な発行ジャーナル記事に提供されている（例えば、Ｔ．Ｅ．Ｇｏｄｆｒｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ２：８４−９１（２０００）；Ｋ．Ｓｐｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５８：４１９−２９（２００１），Ｍ．Ｃｒｏｎｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １６４：３５−４２（２００４）を参照）。代表的な方法では、まず組織標本部（例えば、パラフィン包埋腫瘍組織標本の約１０μｍ厚の断片）を切断する。次いで、ＲＮＡを抽出し、蛋白質およびＤＮＡを除去する。ＲＮＡ濃度の解析の後、必要に応じてＲＮＡ修復を実行する。続いて、例えば、遺伝子特異的プロモーターを使用した逆転写によってサンプルを解析にかけた後、ＲＴ−ＰＣＲを行うことができる。
【０１０４】
遺伝子およびｍｉｃｒｏＲＮＡの発現量の同定における統計解析
本明細書中に記述されているように、関心のあるパラメーター（例えば、再発）とマーカー遺伝子／ｍｉｃｒｏＲＮＡの発現量との間に有意な関係があるかどうかの判定に使用できる統計的方法が数多くあることは、当業者に認識されるであろう。例示的な実施例において、本発明は、前立腺癌患者からの組織およびデータを使用して、層化されたコホートサンプリングデザイン（ケースコントロールサンプリングの形態）を提供する。標本の選択範囲は、病期Ｔ期（Ｔ１、Ｔ２）、年度コホート（＜１９９３、＝１９９３）、および前立腺切除グリソンスコア（低／中、高）を基準に層化した。臨床的再発を伴った全ての患者を選択し、臨床的再発を経験しなかった患者サンプルを選択した。患者ごとに、最高２つの濃縮された腫瘍標本、および１つの正常な外観の組織標本を検定した。
【０１０５】
全ての仮説試験が、両側ｐ値を使用してレポートされた。転帰（臨床的無再発期間（ｃＲＦＩ）、生化学無再発期間（ｂＲＦＩ）、前立腺癌特異的生存率（ＰＣＳＳ）および全生存率（ＯＳ））と、個々の遺伝子および／またはｍｉｃｒｏＲＮＡとの間に有意な関係があるかどうかを調査する目的から、重み付き擬似最偏尤推定量（ｍａｘｉｍｕｍ  ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｐｓｅｕｄｏ  ｐａｒｔｉａｌ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｅｓｔｉｍａｔｏｒ）を使用した人口統計学的または臨床的共変量Ｃｏｘ比例ハザード（ＰＨ）モデルを使用した。危険率（ＨＲ）が１であるという帰無仮説のウォールド試験から得られたｐ値をレポートする。個々の遺伝子および／またはｍｉｃｒｏＲＮＡと特定のサンプルのグリソンパターンとの間に有意な関係があるかどうかを調査する目的から、重み付き最尤法（ｍａｘｉｍｕｍ  ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用した序数ロジスティック回帰（ｏｒｄｉｎａｌ  ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）モデルを使用した。オッズ比（ＯＲ）が１であるという帰無仮説のウォールド試験から得られたｐ値をレポートする。
【０１０６】
同時発現解析
本開示は、ステージング遺伝子、または特定のステージング遺伝子と共発現する遺伝子の発現に基づいて腫瘍の病期を判定する方法を提供する。特定の生物学的プロセスを実行するために、遺伝子同士は多くの場合、協調して連携（即ち、共発現）する。癌などの疾病経過において同定された共発現遺伝子群は、腫瘍状態および疾患進行のバイオマーカーの役目を果たし得る。そのような共発現遺伝子は、共発現した相手のステージング遺伝子をアッセイする代わりに、またはそのようなアッセイに付加してアッセイできる。
【０１０７】
例示的な実施例において、調査対象となった前立腺癌標本の間での遺伝子発現量の共同相関を評価することもできる。この目的のために、遺伝子および標本の間の相関構造を、階層的クラスター方法を介して調査することもできる。この情報を用いることによって、前立腺癌標本内で高度な相関を示すことが公知である遺伝子同士が、予期したように群生することを確認し得る。一変量Ｃｏｘ  ＰＨ回帰分析におけるｃＲＦＩと名目上有意な（未調整のｐ＜０．０５）関係を示す遺伝子だけが、これらの解析の対象として含まれる。
【０１０８】
現在公知であるかまたは以後に策定される共発現解析方法の多くは、本発明の範囲および趣旨の範囲内に入るであろう。これらの方法は、例えば、相関係数、共発現ネットワーク分析、クリーク分析等を含むものであってもよいし、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、塩基配列決定、および他の類似技術から得られる発現データに基づくものであってもよい。例えば、遺伝子発現クラスターは、相関のペアワイズ解析を使用し、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）相関係数またはスピアマン（Ｓｐｅａｒｍａｎ）相関係数に基づいて同定し得る（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｋ．ａｎｄ  Ｌｅｅ  Ａ．，Ｂｉｏｍｅｔｒｉｋａ  ２，３５７（１９０２）；Ｃ．Ｓｐｅａｒｍａｎ，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐｓｙｃｈｏｌ  １５：７２−１０１（１９０４）；Ｊ．Ｍｙｅｒｓ，Ａ．Ｗｅｌｌ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，ｐ．５０８（２ｎｄ  Ｅｄ．，２００３）を参照）。
【０１０９】
発現量の正規化
本明細書中に開示されている方法に用いられる発現データは、正規化することが可能である。正規化とは、例えば、アッセイされたＲＮＡの量の差、および使用されるＲＮＡの質の変動性を修正（変動性を排除して正規化）して、ＣＴまたはＣｐ測定値、およびこれらに類するものにおける系統的バリエーションの不要ソースを除去する工程を指す。アーカイブされた固定パラフィン包埋組織標本を含むＲＴ−ＰＣＲ実験に関して、系統的バリエーションのソースは、患者サンプルの時間経過、およびサンプルの貯蔵に使用される定着剤の種類を基準としたＲＮＡ分解の程度を包含したものであることは公知である。系統的バリエーションの他のソースは、ラボの処理条件に起因する。
【０１１０】
関連する条件の下で発現量に有意差のない特定の正規化遺伝子の発現は、アッセイ対象に含めることによって、アッセイにて正規化することができる。本明細書中に開示されている例示的な正規化遺伝子としては、ハウスキーピング遺伝子が挙げられる（例えば、Ｅ．Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９（７）：３６２−３６５（２００３）を参照）。正規化は、アッセイされた全ての遺伝子の平均値もしくはメジアンシグナル（ＣＴまたはＣｐ）、またはその大規模サブセット（全体的な正規化手法）に基づくことができる。一般に、リファレンス遺伝子とも呼ばれる正規化する遺伝子は、癌性前立腺内で、非癌性前立腺組織と比較して有意に相異する発現量を呈さないことが公知で、かつ様々なサンプルおよび処理条件による有意な影響を受けない遺伝子であるべきであり、それゆえ外的影響を排除して正規化に対応できる。
【０１１１】
例示的な実施態様において、ｍＲＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡの発現データを正規化するための基準として使用される１つ以上の遺伝子は、ＡＡＭＰ、ＡＲＦ１、ＡＴＰ５Ｅ、ＣＬＴＣ、ＧＰＳ１およびＰＧＫ１である。別の例示的な実施態様において、ｍｉｃｒｏＲＮＡの発現データを正規化するための基準として使用される１つ以上のｍｉｃｒｏＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ；およびｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａである。予後遺伝子および予測的遺伝子またはｍｉｃｒｏＲＮＡごとの較正済み加重平均ＣＴまたはＣｐ測定値は、５つ以上のリファレンス遺伝子またはｍｉｃｒｏＲＮＡ平均値を基準にして正規化し得る。
【０１１２】
正規化を実行できる手段は数多くある。上述の技術は網羅的なものではなく、単なる例示を意図したものであることは、当業者に認識されるであろう。
【０１１３】
発現量の標準化
本明細書中に開示されている方法に用いられる発現データは、標準化することが可能である。標準化は、全ての遺伝子またはｍｉｃｒｏＲＮＡを事実上比較できる尺度に変換する工程を指す。この標準化を行う理由は、一部の遺伝子またはｍｉｃｒｏＲＮＡが他に比べて多くのバリエーションを示す（発現がより広範である）ためである。標準化は、その遺伝子またはｍｉｃｒｏＲＮＡの全てのサンプルにおける各発現値をその標準偏差で除算することによって行う。その場合、ハザード比は、発現における１標準偏差増分あたりの相対再発リスクとして解釈される。
【０１１４】
本発明のキット
本発明の方法に使用される材料は、周知の手順に従って製作されたキットの調製に好適である。したがって、本開示は、開示されている遺伝子またはｍｉｃｒｏＲＮＡの発現を定量化し、予後の転帰または治療に対する反応を予測するために、遺伝子（もしくはｍｉｃｒｏＲＮＡ）特異的プローブ、遺伝子（もしくはｍｉｃｒｏＲＮＡ）選択プローブおよび／またはプライマーを含有し得る薬剤を含むキットを提供する。そのようなキットは、任意選択的に、腫瘍サンプルからＲＮＡを抽出するための試薬（特に、固定パラフィン包埋組織標本および／またはＲＮＡ増幅用試薬）を含んでもよい。加えて、本キットは、任意選択的に、識別用の記載もしくはラベル付きの試薬、または本発明の方法における使用に関する指示を含んでもよい。キットは容器（本方法の自動化実装での使用に好適なマイクロリットルプレートを含む）を備えてもよく、本方法で利用される各種材料または試薬（典型的には、濃縮形態）のうちの１種以上、例えば、クロマトグラフィーカラム、事前作製済み（ｐｒｅ−ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ）マイクロアレイ、緩衝液、適当なヌクレオチド三リン酸塩（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ；またはｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰおよびＵＴＰ）、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ならびに本発明のプローブおよびプライマー（例えば、適当な長さのポリ（Ｔ）、またはＲＮＡポリメラーゼと反応するプロモーターに連結されているランダムプライマー）のうちの１つ以上が、各容器に付属する。予後情報または予測的情報の推定または定量化に使用される数学的アルゴリズムもまた、適切にキットの構成要素となり得る。
【０１１５】
レポート
商業的な診断目的に実施された場合は通常、レポート、即ち、本明細書に記載されている方法で得られる情報のサマリーを生成する。例えば、レポートは、１つ以上の遺伝子の発現量に関する情報、および／またはｍｉｃｒｏＲＮＡ、腫瘍もしくは患者の再発リスクの分類、患者に起こり得る予後またはリスク分類、臨床因子および病理学的因子、および／または他の情報を含み得る。本発明の方法およびレポートは、レポートをデータベースに保管する工程を更に含み得る。本方法は、被験者のデータベースに記録を作成し、その記録にデータを取り込むことができる。レポートは、紙レポート、聴覚レポート、または電子記録であり得る。レポートは表示および／またはコンピュータ（例えば、ハンドヘルドデバイス、デスクトップコンピュータ、スマートデバイス、ウェブサイトなど）への保存が可能である。レポートを医師および／または患者に提供するように企図されている。レポートの受信は、データおよびレポートを含むサーバコンピュータへのネットワーク接続を確立する工程と、サーバコンピュータからデータおよびレポートを要求する工程と、を更に含み得る。
【０１１６】
コンピュータプログラム
上述の分析で得られた値（例えば、発現データ）は計算して手動で保存することができる。代わりに上記のステップは、コンピュータプログラム製品で完全にまたは部分的に実行できる。したがって、本発明は、コンピュータプログラムを保管した記憶媒体（コンピュータによる読み取りが可能）を備えるコンピュータプログラム製品を提供する。プログラムは、コンピュータでの読み取り時に、個体から採取された１つ以上の生体サンプルの分析により得られた値に基づいて、関連する計算を実行できる（例えば、遺伝子の発現量、正規化、標準化、閾値処理（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｉｎｇ）および分析で得られた値からスコアへの変換、および／または腫瘍病期および関連情報のテキストもしくはグラフィック描写への変換）。コンピュータプログラム製品の内部には、計算を実行するためのコンピュータプログラムが保存されている。
【０１１７】
本開示は、上述のプログラムを実行するためのシステムを提供する。本システムは通常、ａ）中央コンピューティング環境と、ｂ）患者データを受信するコンピューティング環境に作動可能に接続されている入力装置（ここで、患者データが、例えば、発現量、もしくは患者から採取された生物学的サンプルを使用した分析から得られた他の値、または上に詳述されているマイクロアレイデータを含み得る）と、ｃ）情報をユーザー（例えば、医療関係者）に提供するコンピューティング環境に作動可能に接続されている出力装置と、ｄ）中央コンピューティング環境（例えば、プロセッサ）を介して実行されるアルゴリズム（ここで、アルゴリズムは入力装置で受信されるデータに基づいて実行され、かつアルゴリズムは発現スコア、閾値処理（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｉｎｇ）または本明細書に記載されている他の関数の計算を行う）と、を備える。本発明により提供される方法は、全面的または部分的に自動化し得る。
【０１１８】
本発明の全ての態様は、開示されている遺伝子と共発現するか機能的に関連する限られた数の付加的な遺伝子および／またはｍｉｃｒｏＲＮＡ（例えば、統計学的に有意なピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）および／またはスピアマン（Ｓｐｅａｒｍａｎ）相関係数によって立証されているもの）を、開示されている遺伝子に付加してかつ／または置き換えて試験の対象に含めるように実施し得る。
【０１１９】
本発明について記述したのと同じ内容に関しては、下記の実施例を参照することによって理解が容易になるであろう。下記の実施例は、いかなる形であれ発明を限定することを意図するものでなく、例示として提供されている。
【実施例】
【０１２０】
実施例１：前立腺癌生検コアにおけるＲＮＡ収率および遺伝子発現プロフィール
限局性前立腺癌の男性に対して診断の治療計画を指導するには、前立腺ニードルコア生検ベースの臨床ツールが必要である。ニードルコア生検標本において組織を制限することは、分子診断検査法の開発に向けての重大な課題である。この研究では、ＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用してＲＮＡの摘出収量および遺伝子発現プロフィールを調査し、手動で顕微解剖された固定パラフィン包埋（ＦＰＥ）前立腺癌ニードル生検コアからのＲＮＡを特徴づけた。また、ＲＮＡ収量および遺伝子発現プロフィールとこれらの標本におけるグリソンスコアとの関連も調査した。
【０１２１】
患者およびサンプル
この研究では、固定パラフィン包埋（ＦＰＥ）前立腺癌ニードルコア生検標本から抽出されたＲＮＡの量と質を評価して、前立腺癌ニードルコア生検における遺伝子発現プロフィール分析の実現可能性を定量化した。この研究では、前立腺ニードルコア生検標本からのホルマリン固定塊４８個が使用された。グリソンスコアの解釈（２００５  Ｉｎｔ’ｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ）、および病理学者によって評価された腫瘍併発率（＜３３％、３３〜６６％、＞６６％）に基づいて、標本が分類された。
【０１２２】
【表１】
2020031642.tif 000002
【０１２３】
アッセイ方法
各ＦＰＥ組織塊からの連続した５μｍ未染色断片１４個を、研究の対象に含めた。症例ごとに最初および最後の断片をＨ＆Ｅで染色し、手動の顕微手術によって組織学的にチェックして、腫瘍の存在および腫瘍富化を確認した。
【０１２４】
手動のＲＮＡ摘出方法を使用して、富化された腫瘍サンプルからのＲＮＡを抽出した。ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）アッセイを使用してＲＮＡを定量化し、ゲノムＤＮＡ汚染が存在するかどうかを試験した。定量ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＲＮＡ収量が充分でかつゲノムＤＮＡを含まないサンプルに対して試験を行い、リファレンス遺伝子および癌関連遺伝子に関して２４の遺伝子パネルの遺伝子発現量を確認した。その発現は、６種類のリファレンス遺伝子（ＡＡＭＰ、ＡＲＦ１、ＡＴＰ５Ｅ、ＣＬＴＣ、ＥＥＦ１Ａ１、およびＧＰＸ１）の平均に対して正規化された。
【０１２５】
統計的方法
記述統計および図示を使用して、標準病理学メトリクスおよび遺伝子発現を要約すると共に、グリソンスコアのカテゴリおよび腫瘍併発率カテゴリを層化した。序数ロジスティック回帰を使用して、遺伝子発現とグリソンスコアのカテゴリとの間の関係を評価した。
【０１２６】
結果
単位表面積当たりのＲＮＡ収量は、１６〜２４０６ｎｇ／ｍｍ２の範囲に及んだ。腫瘍併発率（ｐ＝０．０２）およびグリソンスコア（ｐ＝０．０１）が高いサンプルにおいては、ＲＮＡ収率の上昇が観測された。７１％の症例は９６ウェルＲＴ−ＰＣＲを実施する上でＲＮＡ収率が充分（＞２００ｎｇ）であった。８７％の症例はＲＮＡ収量が１００ｎｇ超であった。ｑＲＴ−ＰＣＲで測定されたように、前立腺生検からの遺伝子発現は、市販の乳癌用分子アッセイに使用されたＦＰＥＴサンプルと同等であることが、研究によって確認された。加えて、観測により、グリソンスコア上昇および腫瘍併発率上昇に伴って、生検ＲＮＡ収量が増大することも確認された。グリソンスコアと有意に（ｐ＜０．０５）関連している９種類の遺伝子が同定されたと共に、多くの試験遺伝子に関しては大きいダイナミックレンジの存在が観測された。
【０１２７】
実施例２：前立腺癌における予後関連の遺伝子に対する遺伝子発現分析
患者およびサンプル
１９８７〜２００４年の間にＣｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃで根治的前立腺切除（ＲＰ）の治療を受けた前立腺癌患者約２６００例は、臨床病期Ｔ１／Ｔ２にあることが同定された。前外科的ＰＳＡ値が失われた場合、または初期診断からの腫瘍塊が使えない場合、ネオアジュバントおよび／またはアジュバント治療を受けた患者は、研究デザインから除外された。根治的前立腺切除の後に臨床的再発があった１２７例の患者、および臨床的再発がなかった３７４例の患者が、コホートサンプリングデザインを使用して無作為に選択された。標本は、病期Ｔ期（Ｔ１、Ｔ２）、年度コホート（＜１９９３、≧１９９３）、および前立腺切除グリソンスコア（低／中、高）によって層化された。サンプルを採取された患者５０１例のうち、５１例は腫瘍が不充分なため除外され、７例は臨床的不適格のため除外され、２例は遺伝子発現データ不良のため除外され、１０例は一次グリソンパターンが利用できないため除外された。したがって、この遺伝子発現研究では、１９８７〜２００４年に初期（Ｔ１、Ｔ２）前立腺癌の処置に対する根治的前立腺切除を実施された後に臨床的再発があった患者１１１例、ならびに臨床的再発がなかった患者３３０例からの組織およびデータを含めた。
【０１２８】
各患者における前立腺腫瘍標本から、２つの固定パラフィン包埋（ＦＰＥ）組織標本が採取された。サンプリング方法（サンプリング方法ＡまたはＢ）は、最高グリソンパターンが一次グリソンパターンであるかどうかに依存する。２．２ｍｍが容認されたパターン５の例を除き、選択された各標本の浸潤癌細胞は寸法が少なくとも５．０ｍｍであった。可能な場合、標本同士が空間的に異なっていた。
【０１２９】
【表２】
2020031642.tif 000003
【０１３０】
腫瘍標本に隣接した組織学的に正常な外観の組織（ＮＡＴ）（これらの実施例においては「非腫瘍性組織」とも呼ばれる）も評価された。腫瘍から３ｍｍ、ＦＰＥＴ塊の端から３ｍｍの範囲の隣接組織が採取された。一次グリソンパターンに隣接するＮＡＴは、優先的にサンプル採取された。一次グリソンパターンに隣接するＮＡＴが不充分な場合は、表２に記載の方法に従って、二次または最高グリソンパターン（Ａ２またはＢ１）に隣接するＮＡＴがサンプル採取された。Ｈ＆Ｅ染色が５μｍで開始し未染色標本（ｕｎｓｔａｉｎｅｄ  ｓｌｉｄｅ）が５μｍで終端する１０μｍ断片６個を、研究に含めた各固定パラフィン包埋腫瘍（ＦＰＥＴ）塊から調製した。全ての症例を、組織学的にチェックし、手動で顕微解剖して、富化された腫瘍サンプル２つ（可能な場合は、腫瘍標本に隣接する正常組織の標本１つ）を産生する。
【０１３１】
アッセイ方法
この研究では、ＲＴ−ＰＣＲ解析を使用して、根治的前立腺切除の治療を受けた初期前立腺癌患者の前立腺癌組織、ならびに周囲ＮＡＴにおける７３８個の遺伝子および染色体の配列換え（例えば、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ融合または他のＥＴＳ族遺伝子）のＲＮＡの発現量を定量化した。
【０１３２】
ＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイを使用してサンプルを定量化し、サブセットを試験してゲノムＤＮＡ汚染の有無を確認した。サンプルを逆方向転写（ＲＴ）および定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）に使用した。６種類のリファレンス遺伝子（ＡＡＭＰ、ＡＲＦ１、ＡＴＰ５Ｅ、ＣＬＴＣ、ＧＰＳ１、ＰＧＫ１）に対して再現性の高いクロッシングポイント（ｃｒｏｓｓｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）（ＣＰ）値の平均を使用して、基準により正規化された（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ−ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）遺伝子発現量に対して全ての解析を実施した。
【０１３３】
統計解析および結果
一次統計解析では、病期初期の前立腺癌に対して根治的前立腺切除を実施された後に臨床的再発があった患者１１１例、ならびに臨床的再発がなかった患者３３０例を含め、それらの患者を病期Ｔ期（Ｔ１、Ｔ２）、年度コホート（＜１９９３、≧１９９３）、および前立腺切除グリソンスコア（低／中、高）によって層化した。グリソンスコアのカテゴリは、低（グリソンスコア≦６）、中（グリソンスコア＝７）、および高（グリソンスコア≧８）のように定義されている。対象の患者に対して少なくとも１つのサンプルが評価可能な場合、患者を指定された解析に含めた。特に明記しない限り、全ての仮説試験を、両側ｐ値を使用してレポートした。結果として得られた一連のｐ値にＳｔｏｒｅｙの方法を適用し、偽発見率（ＦＤＲ）を２０％にて制御するＪ．Ｓｔｏｒｅｙ，Ｒ．Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ，Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ  Ｕｎｄｅｒ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ，ｗｉｔｈ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ，Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．（２００１）。
【０１３４】
遺伝子リスト内の評価可能な遺伝子（７２７個の試験遺伝子、および５個のリファレンス遺伝子）ごとに、重み付き擬似最偏尤推定量（ｍａｘｉｍｕｍ  ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｐｓｅｕｄｏ−ｐａｒｔｉａｌ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｅｓｔｉｍａｔｏｒ）を使用して、遺伝子発現および無再発間隔の解析を、一変量のＣｏｘ比例ハザード（ＰＨ）モデルに基づいて行った。ハザード比（ＨＲ）が１であるという帰無仮説のウォールド試験を使用して、ｐ値を生成した。未調整のｐ値およびｑ値の両方（当該の仮説試験が拒絶される最小ＦＤＲ）がレポートされた。未調整のｐ値（＜０．０５）は、統計的に有意であると見なされた。患者ごとに２つの腫瘍標本を選択したため、この解析は各患者からの２つの標本を使用して、（１）各患者からの一次グリソンパターンの標本（表２に記載されている標本Ａ１およびＢ２）を使用した解析；（２）各患者からの最高グリソンパターンの標本（表２に記載されている標本Ａ１およびＢ１）を使用した解析にて実施された。
【０１３５】
遺伝子リスト内の遺伝子（７２７個の試験遺伝子、および５個のリファレンス遺伝子）ごとに、重み付き最偏尤推定量（ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｅｓｔｉｍａｔｏｒ）を使用して、遺伝子発現およびグリソンパターン（３、４、５）の解析を、一変量の序数ロジスティック回帰（ｏｒｄｉｎａｌ  ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）モデルに基づいて行った。オッズ比（ＯＲ）が１であるという帰無仮説のウォールド試験を使用して、ｐ値を生成した。未調整のｐ値およびｑ値の両方（当該の仮説試験が拒絶される最小ＦＤＲ）がレポートされた。未調整のｐ値（＜０．０５）は、統計的に有意であると見なされた。患者ごとに２つの腫瘍標本を選択したため、この解析は各患者からの２つの標本を使用して、（１）各患者からの一次グリソンパターンの標本（表２に記載されている標本Ａ１およびＢ２）を使用した解析；（２）各患者からの最高グリソンパターンの標本（表２に記載されている標本Ａ１およびＢ１）を使用した解析にて実施された。
【０１３６】
選択された人口統計学的変数、臨床的変数、および病理学変数（年齢、人種、臨床的腫瘍の病期、病理学的腫瘍の病期、前立腺（辺縁帯対移行帯）内部において選択された腫瘍の標本の部位、手術時点のＰＳＡ、根治的前立腺摘除術（ｒａｄｉｃａｌ  ｐｒｏｓｔａｔｅｃｔｏｍｙ）、手術年度、および標本グリソンパターンからの全体的なグリソンスコアを含む）とｃＲＦＩとの間に有意な関係があるかどうかが確認された。人口統計学的変数または臨床的変数ごとに別個に、重み付き擬似最偏尤推定量（ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｐｓｅｕｄｏ  ｐａｒｔｉａｌ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｅｓｔｉｍａｔｏｒ）を使用した一変量Ｃｏｘ  ＰＨ回帰分析にて臨床的共変量とｃＲＦＩとの間の関係をモデル化し、ハザード比（ＨＲ）が１であるという帰無仮説のウォールド試験を使用して、ｐ値を生成した。未調整のｐ値＜０．２である共変量を、共変量調整解析に含め得る。
【０１３７】
重要な人口統計学的および臨床的共変量を制御した後に、各々の個体癌関連遺伝子とｃＲＦＩとの間に有意な関係があるかどうかを特定した。遺伝子ごとに別個に、重要な人口統計学的変数および臨床的変数を共変量として含む重み付き擬似最偏尤推定量（ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｐｓｅｕｄｏ  ｐａｒｔｉａｌ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｅｓｔｉｍａｔｏｒ）を使用した一変量Ｃｏｘ  ＰＨ回帰分析にて遺伝子発現とｃＲＦＩとの間の関係をモデル化した。ｃＲＦＩ予測に対する遺伝子発現の独自の貢献は、ノジュール（表２に定義されている標本）ごとの臨床共変量を含めたモデルを使用してウォールド試験からｐ値を生成することによって試験された。未調整のｐ値＜０．０５は、統計的に有意であると見なされた。
【０１３８】
一次および／または最高グリソンパターンにおけるグリソンパターンに対して有意に（ｐ＜０．０５）正または負の関連を示す遺伝子は、表３Ａおよび表３Ｂに掲載されているとおりである。表３Ａにおける遺伝子の発現増加はグリソンスコア上昇と正の関連を示すのに対し、表３Ｂにおける遺伝子の発現増加はグリソンスコア上昇と負の関連を示す。
【０１３９】
【表３】
2020031642.tif 000004
【０１４０】
【表４】
2020031642.tif 000005
【０１４１】
【表５】
2020031642.tif 000006
【０１４２】
【表６】
2020031642.tif 000007
【０１４３】
【表７】
2020031642.tif 000008
【０１４４】
【表８】
2020031642.tif 000009
【０１４５】
【表９】
2020031642.tif 000010
【０１４６】
【表１０】
2020031642.tif 000011
【０１４７】
【表１１】
2020031642.tif 000012
【０１４８】
【表１２】
2020031642.tif 000013
【０１４９】
一次および最高グリソンパターンにおける再発（ｃＲＦＩ、ｂＲＦＩ）と関連した遺伝子を同定するために、標本Ａ１およびＢ２を使用して、一変量のモデルにおける７２７個の遺伝子の各々を解析した（上掲の表２を参照）。一次および／または最高グリソンパターンにおけるｃＲＦＩおよび／またはｂＲＦＩに対して正または負の関連を示す遺伝子は、表４Ａおよび表４Ｂに掲載されているとおりである。表４Ａにおける遺伝子の発現増加は予後良好と負の関連を示すのに対し、表４Ｂにおける遺伝子の発現増加は予後良好と正の関連を示す。
【０１５０】
【表１３】
2020031642.tif 000014
【０１５１】
【表１４】
2020031642.tif 000015
【０１５２】
【表１５】
2020031642.tif 000016
【０１５３】
【表１６】
2020031642.tif 000017
【０１５４】
【表１７】
2020031642.tif 000018
【０１５５】
【表１８】
2020031642.tif 000019
【０１５６】
【表１９】
2020031642.tif 000020
【０１５７】
【表２０】
2020031642.tif 000021
【０１５８】
【表２１】
2020031642.tif 000022
【０１５９】
【表２２】
2020031642.tif 000023
【０１６０】
【表２３】
2020031642.tif 000024
【０１６１】
【表２４】
2020031642.tif 000025
【０１６２】
一次および／または最高グリソンパターンにおけるＡＵＡリスク群に対する調整後の再発（ｃＲＦＩ、ｂＲＦＩ）に対して有意に（ｐ＜０．０５）正または負の関連を示す遺伝子は、表５Ａおよび表５Ｂに掲載されているとおりである。表５Ａにおける遺伝子の発現増加は予後良好と負の関連を示すのに対し、表５Ｂにおける遺伝子の発現増加は予後良好と正の関連を示す。
【０１６３】
【表２５】
2020031642.tif 000026
【０１６４】
【表２６】
2020031642.tif 000027
【０１６５】
【表２７】
2020031642.tif 000028
【０１６６】
【表２８】
2020031642.tif 000029
【０１６７】
【表２９】
2020031642.tif 000030
【０１６８】
【表３０】
2020031642.tif 000031
【０１６９】
【表３１】
2020031642.tif 000032
【０１７０】
【表３２】
2020031642.tif 000033
【０１７１】
【表３３】
2020031642.tif 000034
【０１７２】
【表３４】
2020031642.tif 000035
【０１７３】
【表３５】
2020031642.tif 000036
【０１７４】
【表３６】
2020031642.tif 000037
【０１７５】
一次および／または最高グリソンパターンにおけるグリソンパターンに対する調整後の再発（ｃＲＦＩ、ｂＲＦＩ）に対して有意に（ｐ＜０．０５）正または負の関連を示す遺伝子は、表６Ａおよび表６Ｂに掲載されているとおりである。表６Ａにおける遺伝子の発現増加は予後良好と負の関連を示すのに対し、表６Ｂにおける遺伝子の発現増加は予後良好と正の関連を示す。
【０１７６】
【表３７】
2020031642.tif 000038
【０１７７】
【表３８】
2020031642.tif 000039
【０１７８】
【表３９】
2020031642.tif 000040
【０１７９】
【表４０】
2020031642.tif 000041
【０１８０】
【表４１】
2020031642.tif 000042
【０１８１】
【表４２】
2020031642.tif 000043
【０１８２】
【表４３】
2020031642.tif 000044
【０１８３】
【表４４】
2020031642.tif 000045
【０１８４】
【表４５】
2020031642.tif 000046
【０１８５】
一次または最高グリソンパターンの標本の陰性ＴＭＰＲＳＳ融合標本において臨床的再発（ｃＲＦＩ）に対して有意に（ｐ＜０．０５）正または負の関連を示す遺伝子は、表７Ａおよび表７Ｂに掲載されているとおりである。表７Ａにおける遺伝子の発現増加は予後良好と負の関連を示すのに対し、表７Ｂにおける遺伝子の発現増加は予後良好と正の関連を示す。
【０１８６】
【表４６】
2020031642.tif 000047
【０１８７】
【表４７】
2020031642.tif 000048
【０１８８】
【表４８】
2020031642.tif 000049
【０１８９】
【表４９】
2020031642.tif 000050
【０１９０】
【表５０】
2020031642.tif 000051
【０１９１】
【表５１】
2020031642.tif 000052
【０１９２】
【表５２】
2020031642.tif 000053
【０１９３】
【表５３】
2020031642.tif 000054
【０１９４】
【表５４】
2020031642.tif 000055
【０１９５】
一次または最高グリソンパターンの標本の陽性ＴＭＰＲＳＳ融合標本において臨床的再発（ｃＲＦＩ）に対して有意に（ｐ＜０．０５）正または負の関連を示す遺伝子は、表８Ａおよび表８Ｂに掲載されているとおりである。表８Ａにおける遺伝子の発現増加は予後良好と負の関連を示すのに対し、表８Ｂにおける遺伝子の発現増加は予後良好と正の関連を示す。
【０１９６】
【表５５】
2020031642.tif 000056
【０１９７】
【表５６】
2020031642.tif 000057
【０１９８】
【表５７】
2020031642.tif 000058
【０１９９】
【表５８】
2020031642.tif 000059
【０２００】
【表５９】
2020031642.tif 000060
【０２０１】
【表６０】
2020031642.tif 000061
【０２０２】
【表６１】
2020031642.tif 000062
【０２０３】
一次グリソンパターンにおけるＴＭＰＲＳＳ融合状態に対して有意に（ｐ＜０．０５）正または負の関連を示す遺伝子は、表９Ａおよび表９Ｂに掲載されているとおりである。表９Ａにおける遺伝子の発現増加はＴＭＰＲＳＳ融合陰性と正の関連を示すのに対し、表１０Ａにおける遺伝子の発現増加はＴＭＰＲＳＳ融合陽性と負の関連を示す。
【０２０４】
【表６２】
2020031642.tif 000063
【０２０５】
【表６３】
2020031642.tif 000064
【０２０６】
【表６４】
2020031642.tif 000065
【０２０７】
【表６５】
2020031642.tif 000066
【０２０８】
【表６６】
2020031642.tif 000067
【０２０９】
【表６７】
2020031642.tif 000068
【０２１０】
【表６８】
2020031642.tif 000069
【０２１１】
分子電界効果を調査して、腫瘍に隣接する組織学的に正常な外観の細胞の発現量が、前立腺癌の分子署名を呈していると判定した。非腫瘍サンプルにおけるｃＲＦＩまたはｂＲＦＩに対して有意に（ｐ＜０．０５）正または負の関連を示す遺伝子は、表１０Ａおよび表１０Ｂに掲載されているとおりである。表１０Ａは予後良好と負の関連を示すのに対し、表１０Ｂにおける遺伝子の発現増加は予後良好と正の関連を示す。
【０２１２】
【表６９】
2020031642.tif 000070
【０２１３】
【表７０】
2020031642.tif 000071
【０２１４】
【表７１】
2020031642.tif 000072
【０２１５】
【表７２】
2020031642.tif 000073
【０２１６】
【表７３】
2020031642.tif 000074
【０２１７】
【表７４】
2020031642.tif 000075
【０２１８】
グリソンパターンまたは最高グリソンパターンに対する調整の後、ｃＲＦＩまたはｂＲＦＩと有意に（ｐ＜０．０５）関連した遺伝子は、表１１に掲載されているとおりである。
【０２１９】
【表７５】
2020031642.tif 000076
【０２２０】
一次グリソンパターンにおける前立腺癌特異的生存率（ＰＣＳＳ）と有意に（ｐ＜０．０５）関連した遺伝子は、表１２Ａおよび表１２Ｂに掲載されているとおりである。表１２Ａにおける遺伝子の発現増加は予後良好と負の関連を示すのに対し、表１２Ｂにおける遺伝子の発現増加は予後良好と正の関連を示す。
【０２２１】
【表７６】
2020031642.tif 000077
【０２２２】
【表７７】
2020031642.tif 000078
【０２２３】
【表７８】
2020031642.tif 000079
【０２２４】
遺伝子リスト内の遺伝子（７２７個の試験遺伝子、および５個のリファレンス遺伝子）ごとに、重み付き最偏尤推定量（ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｅｓｔｉｍａｔｏｒ）を使用して、遺伝子発現および悪性度進行／病期進行の解析を、一変量の序数ロジスティック回帰（ｏｒｄｉｎａｌ  ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）モデルに基づいて行った。オッズ比（ＯＲ）が１であるという帰無仮説のウォールド試験を使用して、ｐ値を生成した。未調整のｐ値およびｑ値の両方（当該の仮説試験が拒絶される最小ＦＤＲ）がレポートされた。未調整のｐ値＜０．０５は、統計的に有意であると見なされた。患者ごとに２つの腫瘍標本を選択したため、この解析は各患者からの２つの標本を使用して、（１）各患者からの一次グリソンパターンの標本（表２に記載されている標本Ａ１およびＢ２）を使用した解析；および（２）各患者からの最高グリソンパターンの標本（表２に記載されている標本Ａ１およびＢ１）を使用した解析にて実施された。２００個の遺伝子が一次グリソンパターンサンプル（ＰＧＰ）における悪性度進行／病期進行と有意に（ｐ＜０．０５）関連していることが見出されると共に、２０３個の遺伝子が最高グリソンパターンサンプル（ＨＧＰ）における悪性度進行／病期進行と有意に（ｐ＜０．０５）関連していることも見出された。
【０２２５】
一次および／または最高グリソンパターンにおける悪性度進行／病期進行に対して有意に（ｐ＜０．０５）正または負の関連を示す遺伝子は、表１３Ａおよび表１３Ｂに掲載されているとおりである。表１３Ａにおける遺伝子の発現増加は悪性度進行／病期進行のリスク上昇と正の関連を示す（予後不良）のに対し、表１３Ｂにおける遺伝子の発現増加は悪性度進行／病期進行のリスクと負の関連を示す（予後良好）。
【０２２６】
【表７９】
2020031642.tif 000080
【０２２７】
【表８０】
2020031642.tif 000081
【０２２８】
【表８１】
2020031642.tif 000082
【０２２９】
【表８２】
2020031642.tif 000083
【０２３０】
【表８３】
2020031642.tif 000084
【０２３１】
【表８４】
2020031642.tif 000085
【０２３２】
【表８５】
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【０２３３】
【表８６】
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【０２３４】
【表８７】
2020031642.tif 000088
【０２３５】
実施例３：臨床的再発および前立腺癌による死亡に関連するｍｉｃｒｏＲＮＡの同定
ｍｉｃｒｏＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の一部と結合し、ｍＲＮＡが蛋白質に変換される頻度を変更する変えることによって機能する。また、ｍＲＮＡのターンオーバー、および細胞内でｍＲＮＡが無傷の状態に維持される期間に対しても影響を及ぼし得る。ｍＲＮＡは主にｍｉｃｒｏＲＮＡの補助として作用するため、この研究ではｍｉｃｒｏＲＮＡの発現と遺伝子（ｍＲＮＡ）発現との合同の予後値を評価した。特定のｍｉｃｒｏＲＮＡの発現は、評価されたパネル内にない遺伝子の発現の代理になり得るため、我々はｍｉｃｒｏＲＮＡの発現自体の予後値も評価した。
【０２３６】
患者およびサンプル
根治的前立腺切除の後に臨床的再発があった１２７例の患者、および臨床的再発がなかった３７４例の患者から採取されたサンプル（実施例２に記載）が、この研究に使用された。最終的な解析セットは、遺伝子発現およびｍｉｃｒｏＲＮＡの発現が両方とも正しく測定された患者からの４１６個のサンプルを含む。これらの患者のうちの１０６例は臨床的再発を呈したのに対し、３１０例は臨床的再発がなかった。各前立腺サンプルから組織標本は採取され、（１）サンプル中の一次グリソンパターン、および（２）サンプル中の最高グリソンパターンを表す。加えて、腫瘍に隣接する組織学的に正常な外観の組織（ＮＡＴ）のサンプルが採取された。各組織型の解析セットに含まれる患者の数、および臨床的再発を経験した患者の数、または前立腺癌で死亡した患者の数は、表１４に示すとおりである。
【０２３７】
【表８８】
2020031642.tif 000089
【０２３８】
アッセイ方法
固定パラフィン包埋（ＦＰＥ）組織から抽出されたＲＮＡから、７６個の試験ｍｉｃｒｏＲＮＡおよび５個のリファレンスｍｉｃｒｏＲＮＡの発現を定量化した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡアッセイキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手されたクロッシングポイント（ｃｒｏｓｓｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）（Ｃｐ）を使用して、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を介して、３通りの全ての組織型におけるｍｉｃｒｏＲＮＡの発現を定量化した。
【０２３９】
統計解析
一変量の比例ハザード回帰（Ｃｏｘ  ＤＲ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ  ３４：１８７−２２０，１９７２）を使用し、コホートサンプリングデザインからのサンプリング重量を適用し、かつＬｉｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉの方法（Ｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ８４：１０７４−１０７８，１９８９）に基づく分散評価を使用することによって、５つのリファレンスｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂおよびｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ）の平均的発現により正規化されたｍｉｃｒｏＲＮＡの発現、および上述の７３３個の遺伝子（リファレンス遺伝子を含む）の基準により正規化された（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ−ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）遺伝子発現を、臨床的再発および前立腺癌による死亡との関連について評価した。標準化されたハザード比（共変動値における１つの標準偏差の変化と関連性のあるハザードの比例的変化）を計算した。
【０２４０】
この分析に含めた予測因子のクラスは、下掲のとおりである。
１．ｍｉｃｒｏＲＮＡのみ
２．ｍｉｃｒｏＲＮＡ−遺伝子ペア層１
３．ｍｉｃｒｏＲＮＡ−遺伝子ペア層２
４．ｍｉｃｒｏＲＮＡ−遺伝子ペア層３
５．他の全てのｍｉｃｒｏＲＮＡ−遺伝子ペア層４
【０２４１】
文献および既存のマイクロアレイデータセットをレビューすることによって、遺伝子−ｍｉｃｒｏＲＮＡペアが機能的に相互作用する尤度、またはｍｉｃｒｏＲＮＡが前立腺癌に関する尤度に基づき、４つの層を予め特定した（層１は最高の尤度を表す）。
【０２４２】
偽発見率（ＦＤＲ）（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ  ａｎｄ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ  ５７：２８９−３００，１９９５）は、Ｅｆｒｏｎの別個のクラス方法論（Ｅｆｒｏｎ，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ２：１９７−２２３．，２００８）を使用して評価された。偽発見率は、誤って拒絶された（したがって偽発見である）帰無仮説の期待割合である。Ｅｆｒｏｎの方法論は、全てのクラスからデータを利用して計算の精度を改善しながら、各クラス内で別個のＦＤＲ評価（ｑ値）（Ｓｔｏｒｅｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ  ６４：４７９−４９８，２００２）を可能にする。この解析では、ｍｉｃｒｏＲＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡ−遺伝子ペアのｑ値を、経験的ベイズ尤度と解釈できる。所与のデータによると、臨床転帰に関連していると同定されたｍｉｃｒｏＲＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡ−遺伝子ペアは事実上、偽発見である。別個のクラスアプローチを真の発見率関連度（ＴＤＲＤＡ）解析（Ｃｒａｇｅｒ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２９：３３−４５，２０１０）に適用して、ＦＤＲを１０％にて制御しながら、臨床的再発または前立腺癌特異的死亡に対する標準ハザード比が少なくとも指定量である一連のｍｉｃｒｏＲＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡ−遺伝子ペアを特定した。各ｍｉｃｒｏＲＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡ−遺伝子ペアについて、１０％ＦＤＲで設定されたＴＤＲＤＡにｍｉｃｒｏＲＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡ−遺伝子ペアが含まれる、最高の下限を示す最大下限（ＭＬＢ）の標準化ハザード比を計算した。また、最善の予測因子を長いリストから選択する場合に、以後の研究で発生する平均値への回帰（ＲＭ）で修正された、真の標準化ハザード比の推定値も計算した（上述のＣｒａｇｅｒ，２０１０）。選択されたｍｉｃｒｏＲＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡ−遺伝子ペアを別々の以降の研究で調査した場合、ＲＭで修正された標準化ハザード比の推定値は、予想し得る内容の合理的な推定値である。
【０２４３】
これらの解析は、患者生検時に利用できる臨床病理学的共変量（生検グリソンスコア、ベースラインＰＳＡ値、および臨床病期Ｔ期（Ｔ１＝Ｔ２Ａ対Ｔ２ＢまたはＴ２Ｃ））に関しては調整を繰り返し、ｍｉｃｒｏＲＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡ−遺伝子ペアが、これらの臨床病理学的共変量に依存しない予測値を有するかどうかこと評価した。
【０２４４】
結果
解析の際、偽発見率１０％を許容して、根治的前立腺切除後の前立腺癌の臨床的再発に関連する一次グリソンパターン腫瘍組織から検定されたｍｉｃｒｏＲＮＡ２１個を同定した（表１５）。結果は、最高グリソンパターン腫瘍組織から評価されたｍｉｃｒｏＲＮＡの場合と同様（表１６）、ｍｉｃｒｏＲＮＡの発現と臨床的再発との関連は、腫瘍組織サンプル内の部位に応じた顕著な変化がないことを示唆している。偽発見率１０％では、正常な隣接組織から測定されたｍｉｃｒｏＲＮＡはいずれも、臨床的再発のリスクに関連していなかった。表１５〜表２１に掲載されているｍｉｃｒｏＲＮＡの配列は、表Ｂに示すとおりである。
【０２４５】
【表８９】
2020031642.tif 000090
【０２４６】
【表９０】
2020031642.tif 000091
【０２４７】
一次グリソンパターン組織から検定されたｍｉｃｒｏＲＮＡは、表１７に示すとおりである。偽発見率１０％では、これらのｍｉｃｒｏＲＮＡが前立腺癌特異的死亡のリスクに関連するものとして同定された。最高グリソンパターン組織から検定されたｍｉｃｒｏＲＮＡのための対応する解析は、表１８に示すとおりである。正常な隣接組織から測定されたｍｉｃｒｏＲＮＡはいずれも、偽発見率１０％では前立腺癌特異的死亡のリスクに関連していなかった。
【０２４８】
【表９１】
2020031642.tif 000092
【０２４９】
【表９２】
2020031642.tif 000093
【０２５０】
臨床的再発のリスクに関連するものとして同定できるｍｉｃｒｏＲＮＡは、表１９および表２０に示すとおりである。臨床病理学的共変量（生検グリソンスコア、ベースラインＰＳＡレベル、および臨床病期Ｔ期）に関しては調整が施された。これらの共変量の分布は、図１に示すとおりである。表１５に同定されている１５個のｍｉｃｒｏＲＮＡは、それは表１９に示したものと同じである。これらのｍｉｃｒｏＲＮＡは、グリソンスコア、ベースラインＰＳＡおよび臨床病期Ｔ期に依存しない臨床的再発に関する予測値を有することを示している。
【０２５１】
一次グリソンパターンの腫瘍組織から検定された２つのｍｉｃｒｏＲＮＡは、グリソンスコア、ベースラインＰＳＡ、および臨床病期Ｔ期に依存しない前立腺癌による死亡に関する予測値を有することが明らかにされた（表２１）。
【０２５２】
【表９３】
2020031642.tif 000094
【０２５３】
【表９４】
2020031642.tif 000095
【０２５４】
【表９５】
2020031642.tif 000096
【０２５５】
したがって、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３；ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２１；ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２；ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１；ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２；ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３１；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１；ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５；およびｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃの正規化された発現量は再発リスクの増加と正の関連を示す一方、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２；ｈｓａ−ｍｉＲ−１；ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５；ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５；ｈｓａ−ｍｉＲ−３１；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５；ｈｓａ−ｍｉＲ−２０６；ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａ；およびｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐの正規化された発現量は再発リスクの増加と負の関連を示す。
【０２５６】
更に、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２１；ｈｓａ−ｍｉＲ−９３；ｈｓａ−ｍｉＲ−３３１；ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０；ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ；およびｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａの正規化された発現量は前立腺癌特異的死亡のリスク増加と正の関連を示す一方、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ；ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２；ｈｓａ−ｍｉＲ−１；ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ；およびｈｓａ−ｍｉＲ−１５２の正規化された発現量は前立腺癌特異的死亡のリスク増加と負の関連を示す。
【０２５７】
各層（層１〜４）に分類されたｍｉｃｒｏＲＮＡ−遺伝子ペアの数、ならびに偽発見率１０％にて臨床的再発が予測されたｍｉｃｒｏＲＮＡ−遺伝子ペアの数およびパーセントは、表２２に示すとおりである。
【０２５８】
【表９６】
2020031642.tif 000097
【０２５９】
【表９７】
2020031642.tif 000098
【０２６０】
【表９８】
2020031642.tif 000099
【０２６１】
【表９９】
2020031642.tif 000100
【０２６２】
【表１００】
2020031642.tif 000101
【０２６３】
【表１０１】
2020031642.tif 000102
【０２６４】
【表１０２】
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【０２６５】
【表１０３】
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【０２６６】
【表１０４】
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【０２６７】
【表１０５】
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【０２６８】
【表１０６】
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【０２６９】
【表１０７】
2020031642.tif 000108
【０２７０】
【表１０８】
2020031642.tif 000109
【０２７１】
【表１０９】
2020031642.tif 000110
【０２７２】
【表１１０】
2020031642.tif 000111
【０２７３】
【表１１１】
2020031642.tif 000112
【０２７４】
【表１１２】
2020031642.tif 000113
【０２７５】
【表１１３】
2020031642.tif 000114
【０２７６】
【表１１４】
2020031642.tif 000115
【０２７７】
【表１１５】
2020031642.tif 000116
【図１】
2020031642.tif 000117
【配列表】
2020031642000001.app
【外国語明細書】
2020031642000001.pdf
2020031642000002.pdf
2020031642000003.pdf
2020031642000004.pdf