(57)【要約】【課題】鎖長が伸長又は短縮されたワックスエステルを含有するユーグレナ及びワックスエステルの製造方法を提供する。【解決手段】アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とするユーグレナ、及び、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子の発現が抑制されたＡＣＤノックダウンユーグレナを培養する培養工程と、前記ＡＣＤノックダウンユーグレナからワックスエステルを抽出する抽出工程と、を行うことを特徴とするワックスエステルの製造方法である。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とするユーグレナ。
【請求項２】
前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子が、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）１遺伝子（配列番号１）又はアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）２遺伝子（配列番号３）であることを特徴とする請求項１に記載のユーグレナ。
【請求項３】
前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子が、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）１遺伝子（配列番号１）であり、
前記ユーグレナは、ワックスエステルを含有し、
該ワックスエステルは、前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）１遺伝子（配列番号１）の発現が抑制されていないユーグレナが生産するワックスエステルと比較して、炭素原子数２９〜３２の鎖長のワックスエステル化合物が多く、炭素原子数２２〜２７の鎖長のワックスエステル化合物が少ないことを特徴とする請求項１に記載のユーグレナ。
【請求項４】
前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子が、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）２遺伝子（配列番号３）であり、
前記ユーグレナは、ワックスエステルを含有し、
該ワックスエステルは、前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）２遺伝子（配列番号３）の発現が抑制されていないユーグレナが生産するワックスエステルと比較して、炭素原子数２９〜３２の鎖長のワックスエステル化合物が少なく、炭素原子数２２〜２７の鎖長のワックスエステル化合物が多いことを特徴とする請求項１に記載のユーグレナ。
【請求項５】
さらに、３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ＫＡＴ）１遺伝子（配列番号５）の発現が抑制されていることを特徴とする請求項４に記載のユーグレナ。
【請求項６】
前記ワックスエステルは、炭素原子数２４〜２６のうちいずれかの鎖長のワックスエステル化合物を主成分とすることを特徴とする請求項５に記載のユーグレナ。
【請求項７】
アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子の発現が抑制されたＡＣＤノックダウンユーグレナを培養する培養工程と、
前記ＡＣＤノックダウンユーグレナからワックスエステルを抽出する抽出工程と、を行うことを特徴とするワックスエステルの製造方法。
【請求項８】
前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子が、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）１遺伝子（配列番号１）又はアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）２遺伝子（配列番号３）であることを特徴とする請求項７に記載のワックスエステルの製造方法。
【請求項９】
前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子が、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）１遺伝子（配列番号１）であり、
前記抽出工程では、炭素原子数２８〜３０のうちいずれかの鎖長のワックスエステル化合物を主成分とする前記ワックスエステルを抽出することを特徴とする請求項７に記載のワックスエステルの製造方法。
【請求項１０】
前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子が、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）２遺伝子（配列番号３）であり、
前記抽出工程では、炭素原子数２２〜２７のうちいずれかの鎖長のワックスエステル化合物を主成分とする前記ワックスエステルを抽出することを特徴とする請求項７に記載のワックスエステルの製造方法。
【請求項１１】
さらに、３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ＫＡＴ）１遺伝子（配列番号５）の発現が抑制されており、
前記抽出工程では、炭素原子数２４〜２６のうちいずれかの鎖長のワックスエステル化合物を主成分とする前記ワックスエステルを抽出することを特徴とする請求項１０に記載のワックスエステルの製造方法。
【請求項１２】
ユーグレナ由来であって、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）１遺伝子（配列番号１）の発現が抑制されていないユーグレナが生産するワックスエステルと比較して、炭素原子数２９〜３２の鎖長のワックスエステル化合物が多く、炭素原子数２２〜２７の鎖長のワックスエステル化合物が少ないことを特徴とするワックスエステル組成物。
【請求項１３】
ユーグレナ由来であって、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）２遺伝子（配列番号３）の発現が抑制されていないユーグレナが生産するワックスエステルと比較して、炭素原子数２９〜３２の鎖長のワックスエステル化合物が少なく、炭素原子数２２〜２７の鎖長のワックスエステル化合物が多いことを特徴とするワックスエステル組成物。
【請求項１４】
ユーグレナのアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥｇＡＣＤ）発現量を抑制するＥｇＡＣＤ発現量制御工程を行うことを特徴とするユーグレナにおける炭素原子数２９〜３２の長鎖ワックスエステル含有量を増加させる方法。
【請求項１５】
ユーグレナのアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥｇＡＣＤ）発現量を抑制するＥｇＡＣＤ発現量制御工程を行うことを特徴とするユーグレナにおける炭素原子数２２〜２７の短鎖ワックスエステル含有量を増加させる方法。
【請求項１６】
ユーグレナにおける下記（ａ）又は（ｂ）の何れかのアミノ酸配列からなるアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥｇＡＣＤ）の発現量を抑制するＥｇＡＣＤ発現量制御工程を行うことを特徴とするユーグレナにおける炭素原子数２９〜３２の長鎖ワックスエステルを増加させる方法。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であって、アシル−ＣｏＡに対する脱水素活性を有するアミノ酸配列
【請求項１７】
ユーグレナにおける下記（ｃ）又は（ｄ）の何れかのアミノ酸配列からなるアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥｇＡＣＤ）の発現量を抑制するＥｇＡＣＤ発現量制御工程を行うことを特徴とするユーグレナにおける炭素原子数２２〜２７の短鎖ワックスエステルを増加させる方法。
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であって、アシル−ＣｏＡに対する脱水素活性を有するアミノ酸配列
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワックスエステルを含有するユーグレナ、ワックスエステルの製造方法及びワックスエステル組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
微細藻類の一種であるユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）は、高濃度のＣＯ２が存在する環境でも光合成によって良好に生育する生物である。ユーグレナは好気状態において、光合成や培地成分から獲得した余剰の炭素を、貯蔵多糖パラミロンとして細胞内に蓄積する。パラミロンを蓄積したユーグレナ細胞を、低酸素状態もしくは嫌気状態にさらすと、ユーグレナは、細胞内に貯めたパラミロンを分解して、脂肪酸脂肪アルコールエステルであるワックスエステルを発酵生産する（図１）。
【０００３】
ワックスエステルの利用法として、現在は主に燃料用途が想定されており、水素化や異性化の後ジェット燃料として使用することや、バイオディーゼル燃料に変換して使用することが期待されている。実用化に向けた研究開発が進められる中で、ワックスエステル生産能力の増強や、用途に合った性質を持つワックスエステルの生産が重要な課題となっている。
【０００４】
図１の低酸素状態でのユーグレナワックスエステル生産経路において生産されるワックスエステルの構成脂肪酸・脂肪アルコールの主成分は、Ｃ１４のミリスチン酸−ミリスチルアルコール（Ｃ１４：０−Ｃ１４：０）であり（非特許文献１）、Ｃ１０−Ｃ１６程度の構成成分が含まれている。また、炭素数が奇数のワックスエステルも多く存在する。
【０００５】
ワックスエステルを構成する脂質の組成を、自在に変化させることができれば、従来想定されてきた燃料用途のみならず、化成品や化粧品等、新たな用途を創出できる可能性がある。しかし、ユーグレナがワックスエステルを作るメカニズムには未だ不明な点が多く、全体像は知られているものの、具体的に機能する酵素の分子情報はほとんど明らかになっていない。
【０００６】
特許文献１及び非特許文献２には、脂肪酸を伸長する反応を触媒する３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ＫＡＴ）のうち、中・長鎖脂肪酸を伸長するＫＡＴ（ＥｇＫＡＴ１、ＥｇＫＡＴ２）の発現を抑制することで、細胞内のワックスエステル量をほとんど変化させずに、構成炭素長の短いワックスエステルを生産するユーグレナを作りだすことができたことが記載されている。ワックスエステルを構成する脂肪酸の主成分が、通常のユーグレナで炭素長１４のミリスチン酸であるのに対して、ＥｇＫＡＴ１の発現を抑制したユーグレナでは炭素長１２のラウリン酸および１３のトリデカン酸であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１７−１４８００５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Inui Het al., “Production and composition of wax esters byfermentation of Euglena gracilis”, Agric Biol Chem,vol.47, pp.2669-2671 (1983).
【非特許文献２】M. Nakazawa et al., “Alteration of WaxEster Content and Composition in Euglena graciliswith Gene Silencing of 3-ketoacyl-CoA ThiolaseIsozymes” Lipids, vol.50, no.5, pp.483-92 (2015).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従来の方法では、脂質の炭素数の偶数・奇数の制御や、脂質の短鎖化についての検討が行われてきたが、ワックスエステルの長鎖化は困難であった。燃料用途のみならず、化成品や化粧品等、新たな用途を創出のためにも、ユーグレナが生産するワックスエステルを構成する脂質の組成を効果的、且つ、自在に変化させることが望まれる。
【００１０】
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、鎖長が伸長又は短縮されたワックスエステルを含有するユーグレナ、ワックスエステルの製造方法及びワックスエステル組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題は、本発明のユーグレナによれば、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子の発現が抑制されていること、により解決される。
このように、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子の発現を抑制することで、ユーグレナが含有するワックスエステルの鎖長を伸長又は短縮することが可能となる。
【００１２】
このとき、前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子が、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）１遺伝子（配列番号１）又はアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）２遺伝子（配列番号３）であるとよい。
また、前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子が、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）１遺伝子（配列番号１）であり、前記ユーグレナは、ワックスエステルを含有し、該ワックスエステルは、前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）１遺伝子（配列番号１）の発現が抑制されていないユーグレナが生産するワックスエステルと比較して、炭素原子数２９〜３２の鎖長のワックスエステル化合物が多く、炭素原子数２２〜２７の鎖長のワックスエステル化合物が少ないとよい。
このように、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）１遺伝子の発現が抑制されているため、ユーグレナのワックスエステルの合成において、より長鎖のワックスエステルを得ることが可能となる。
【００１３】
また、前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子が、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）２遺伝子（配列番号３）であり、前記ユーグレナは、ワックスエステルを含有し、該ワックスエステルは、前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）２遺伝子（配列番号３）の発現が抑制されていないユーグレナが生産するワックスエステルと比較して、２９〜３２の鎖長のワックスエステル化合物が少なく、炭素原子数２２〜２７の鎖長のワックスエステル化合物が多いとよい。
このように、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）２遺伝子の発現が抑制されているため、ユーグレナのワックスエステルの合成において、より短鎖長のワックスエステルを得ることが可能となる。
【００１４】
また、さらに、３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ＫＡＴ）１遺伝子（配列番号５）の発現が抑制されているとよい。
また、前記ワックスエステルは、炭素原子数２４〜２６のうちいずれかの鎖長のワックスエステル化合物を主成分とするとよい。
このように、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）２遺伝子及び３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ＫＡＴ）１遺伝子の発現が抑制されているため、ユーグレナのワックスエステルの合成において、より短鎖長のワックスエステルを得ることが可能となる。
【００１５】
前記課題は、本発明のワックスエステルの製造方法によれば、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子の発現が抑制されたＡＣＤノックダウンユーグレナを培養する培養工程と、前記ＡＣＤノックダウンユーグレナからワックスエステルを抽出する抽出工程と、を行うことにより解決される。
このように、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子の発現を抑制して、ユーグレナが含有するワックスエステルの鎖長を伸長又は短縮することで、燃料用途のみならず、化成品や化粧品等に利用できるワックスエステルを製造することが可能となる。
【００１６】
このとき、前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子が、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）１遺伝子（配列番号１）又はアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）２遺伝子（配列番号３）であるとよい。
また、前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子が、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）１遺伝子（配列番号１）であり、前記抽出工程では、炭素原子数２８〜３０のうちいずれかの鎖長のワックスエステル化合物を主成分とする前記ワックスエステルを抽出するとよい。
【００１７】
また、前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子が、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）２遺伝子（配列番号３）であり、前記抽出工程では、炭素原子数２２〜２７のうちいずれかの鎖長のワックスエステル化合物を主成分とする前記ワックスエステルを抽出するとよい。
また、さらに、３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ＫＡＴ）１遺伝子（配列番号５）の発現が抑制されており、前記抽出工程では、炭素原子数２４〜２６のうちいずれかの鎖長のワックスエステル化合物を主成分とする前記ワックスエステルを抽出するとよい。
【００１８】
前記課題は、本発明のワックスエステル組成物によれば、ユーグレナ由来であって、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）１遺伝子（配列番号１）の発現が抑制されていないユーグレナが生産するワックスエステルと比較して、炭素原子数２９〜３２の鎖長のワックスエステル化合物が多く、炭素原子数２２〜２７の鎖長のワックスエステル化合物が少ないこと、により解決される。
前記課題は、本発明のワックスエステル組成物によれば、ユーグレナ由来であって、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）２遺伝子（配列番号３）の発現が抑制されていないユーグレナが生産するワックスエステルと比較して、炭素原子数２９〜３２の鎖長のワックスエステル化合物が少なく、炭素原子数２２〜２７の鎖長のワックスエステル化合物が多いこと、により解決される。
【００１９】
前記課題は、本発明のユーグレナにおける炭素原子数２９〜３２の長鎖ワックスエステル含有量を増加させる方法によれば、ユーグレナのアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥｇＡＣＤ）発現量を抑制するＥｇＡＣＤ発現量制御工程を行うこと、により解決される。
【００２０】
前記課題は、本発明のユーグレナにおける炭素原子数２２〜２７の短鎖ワックスエステル含有量を増加させる方法によれば、ユーグレナのアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥｇＡＣＤ）発現量を抑制するＥｇＡＣＤ発現量制御工程を行うこと、により解決される。
【００２１】
前記課題は、本発明のユーグレナにおける炭素原子数２９〜３２の長鎖ワックスエステルを増加させる方法によれば、ユーグレナにおける下記（ａ）又は（ｂ）の何れかのアミノ酸配列からなるアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥｇＡＣＤ）の発現量を抑制するＥｇＡＣＤ発現量制御工程を行うこと、により解決される。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であって、アシル−ＣｏＡに対する脱水素活性を有するアミノ酸配列
【００２２】
前記課題は、本発明のユーグレナにおける炭素原子数２２〜２７の短鎖ワックスエステルを増加させる方法によれば、ユーグレナにおける下記（ｃ）又は（ｄ）の何れかのアミノ酸配列からなるアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥｇＡＣＤ）の発現量を抑制するＥｇＡＣＤ発現量制御工程を行うこと、により解決される。
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であって、アシル−ＣｏＡに対する脱水素活性を有するアミノ酸配列
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、ユーグレナのアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子の発現を抑制することで、ユーグレナが含有するワックスエステルの鎖長を伸長又は短縮することができるため、ワックスエステルの組成を効果的、且つ、自在に変化させることが可能となる。その結果、燃料用途のみならず、化成品や化粧品等に利用できるワックスエステルを製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】低酸素状態でのユーグレナワックスエステル生産経路を示す図である。
【図２】従来考えられてきたユーグレナミトコンドリアにおける予想脂肪酸合成・分解経路を示す図である。
【図３】半定量ＲＴ−ＰＣＲによるＥｇＡＣＤ  ｍＲＮＡ発現抑制効果の確認結果を示す図である。
【図４】ＥｇＡＣＤ１ノックダウンによる炭素鎖長別ワックスエステル量の変動を示すグラフである。
【図５】ＥｇＡＣＤ２ノックダウンによる炭素鎖長別ワックスエステル量の変動を示すグラフである。
【図６】ＥｇＡＣＤ２−ＥｇＫＡＴ１ノックダウンによる炭素鎖長別ワックスエステル量の変動を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）、ワックスエステルの製造方法及びワックスエステル組成物に関する。以下、本発明に係るユーグレナ、ワックスエステルの製造方法及びワックスエステル組成物について、詳細に説明する。
文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同様の意味を有する。本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。
【００２６】
本明細書において、ワックスエステルとは、脂肪酸と脂肪アルコールがエステル結合した化合物の総称をいう。
また、本明細書において、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）とは、二本鎖ＲＮＡにより配列特異的に遺伝子発現が抑制される現象をいう。
【００２７】
＜ユーグレナ＞
本実施形態において、「ユーグレナ」とは、分類学上、ユーグレナ属（Euglena）に分類される微生物、その変種、その変異種及びユーグレナ科（Euglenaceae）の近縁種を含む。
ここで、ユーグレナ属（Euglena）とは、真核生物のうち、エクスカバータ、ユーグレノゾア門、ユーグレナ藻綱、ユーグレナ目、ユーグレナ科に属する生物の一群である。
【００２８】
ユーグレナ属に含まれる種として、具体的には、Euglena chadefaudii、Euglena deses、Euglena gracilis、Euglena granulata、Euglena mutabilis、Euglena proxima、Euglena spirogyra、Euglena viridisなどが挙げられる。
ユーグレナとして、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis），特に、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）Ｚ株を用いることができるが、そのほか、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）Ｚ株の変異株ＳＭ−ＺＫ株（葉緑体欠損株）や変種のE. gracilis
var. bacillaris、これらの種の葉緑体の変異株等の遺伝子変異株、Astasia longa等のその他のユーグレナ類であってもよい。
【００２９】
ユーグレナ属は、池や沼などの淡水中に広く分布しており、これらから分離して使用しても良く、また、既に単離されている任意のユーグレナ属を使用してもよい。
ユーグレナ属は、その全ての変異株を包含する。また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組換え、形質導入、形質転換等により得られたものも含有される。
【００３０】
＜ユーグレナの低酸素状態におけるワックスエステル生産経路＞
ユーグレナは、図１に示すように、低酸素状態では蓄積したパラミロンを出発物質として、ワックスエステルを発酵生産する。微生物は嫌気状態に曝されると、解糖系から生じる還元力を消費するため発酵を行う。低酸素状態のユーグレナにおいては、ワックスエステル発酵が還元力を消費する役割を担っている。
【００３１】
図１に示すように、低酸素状態に曝露されたユーグレナは、パラミロンを分解し、グルコース単位に分解する。その後、解糖を経て生産したピルビン酸はミトコンドリアでアセチルＣｏＡに変換された後ＡＴＰを消費しない図２のｄｅ  ｎｏｖｏ脂肪酸合成系を経て、アシルＣｏＡを合成する。アシルＣｏＡはミクロソームに輸送されワックスエステルへと合成されると考えられている。
【００３２】
ワックスエステル発酵はユーグレナの持つ独特な代謝系の一つであり、脂肪酸β酸化の逆行反応によるアセチル−ＣｏＡからのｄｅ  ｎｏｖｏ脂肪酸合成が含まれている（Inui
et al.,,FEBS LETERS , vol.150, no.1, pp.89-93 (1982)）。この経路はＡＴＰ消費を伴わない反応により構成されており、解糖より生じた還元力を消費することができる。これにより、ユーグレナは低酸素状態においても、ワックスエステル発酵によりＡＴＰを獲得しながら酸化還元バランスを維持し生存する。
【００３３】
＜ユーグレナのｄｅ  ｎｏｖｏ脂肪酸伸長酵素＞
ユーグレナのミトコンドリアには、低酸素下で機能する脂肪酸合成系が存在する。本合成系は３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ＥｇＫＡＴ）によるアセチルＣｏＡ２分子の縮合から開始するため、ＡＴＰの消費を伴わずにアシル鎖伸長反応を進行する。
【００３４】
従来ユーグレナのワックスエステル発酵における予想ワックスエステル合成経路では、解糖系を通じてアセチル−ＣｏＡを合成し、アセチル−ＣｏＡ（および、プロピオニル−ＣｏＡ）をミトコンドリアの脂肪酸β酸化の逆行経路を経てアシル−ＣｏＡを合成すると考えられてきた。図２に示すように、この経路はエノイルＣｏＡレダクターゼ（ＴＥＲ）、エノイルＣｏＡヒドラターゼ、ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ＫＡＴ）という４つの酵素から成り立っている。
【００３５】
β酸化とは、アシル−ＣｏＡを原料としてアセチル−ＣｏＡを遊離する代謝経路のことであり、β酸化反応は以下の４ステップの反応の繰り返しからなる（図２）。
【００３６】
１ステップ目の反応ではアシル−ＣｏＡ（Ｃｎ＋２）からエノイル−ＣｏＡ（Ｃｎ＋２）が生成される。１ステップ目の反応では、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＡＣＤ）が関与する。
ＡＣＤは、ＦＡＤを補因子として、アシル−ＣｏＡをエノイル−ＣｏＡに変換する反応を触媒する酵素である。ＡＣＤによる反応は一般的に不可逆であると考えられている。
【００３７】
２ステップ目の反応では、１ステップ目の反応で生成したエノイル−ＣｏＡ（Ｃｎ＋２）から、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ（Ｃｎ＋２）が生成される。この２ステップ目の反応では、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ  ｈｙｄｒａｔａｓｅ）が関与する。
エノイルＣｏＡヒドラターゼは、エノイル−ＣｏＡ（ｔｒａｎｓ−２，３−デヒドロアシルＣｏＡ）にＨ２Ｏを付加し、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ（β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ）に変換する反応を触媒する酵素である。
【００３８】
３ステップ目の反応では、２ステップ目の反応で生成した３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ（Ｃｎ＋２）から、３−ケトアシル−ＣｏＡ（Ｃｎ＋２）が生成される。この３ステップ目の反応では、３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（３−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）などが関与する。
３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤ＋を補因子として、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡを酸化し、３−ケトアシル−ＣｏＡ（β−ケトアシル−ＣｏＡ）に変換する反応を触媒する酵素である。
【００３９】
４ステップ目の反応では、３ステップ目の反応で生成した３−ケトアシル−ＣｏＡ（Ｃｎ＋２）から、炭素原子が２個分短くなったアシル−ＣｏＡ（Ｃｎ）と、アセチル−ＣｏＡ（Ｃ２）が生成される。この４ステップ目の反応では、３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ＫＡＴ）が関与する。
３−ケトアシルＣｏＡ−チオラーゼ（ＫＡＴ）は、ＣｏＡとともにチオール開裂を起こし、３−ケトアシル−ＣｏＡから炭素原子が２個分短くなったアシル−ＣｏＡと、アセチルＣｏＡを産生する反応を触媒する酵素である。
【００４０】
一般的に脂肪酸の分解過程であるβ酸化において、アシル−ＣｏＡからトランスエノイル−ＣｏＡへの脱水素反応はアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）による不可逆反応であり、生体内での脂質合成には寄与していないと考えられてきた。さらにユーグレナは、トランスエノイル−ＣｏＡからアシル−ＣｏＡへの変換を触媒する酵素としてトランスエノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＴＥＲ）を有しており、ＴＥＲがワックスエステル合成において機能すると考えられてきた。
【００４１】
本発明では、以下に詳述するように、遺伝子発現抑制の手法を用いて、各ＡＣＤ遺伝子の発現抑制がワックスエステル合成に及ぼす影響を詳細に検討したところ、ＡＣＤ１遺伝子及びＡＣＤ２遺伝子の発現抑制が、予想外に、ワックスエステルの組成に大きく変化を及ぼすことを見出した。
【００４２】
＜ＥｇＡＣＤ遺伝子の発現が抑制されたＥｇＡＣＤノックダウンユーグレナ＞
本発明のユーグレナは、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子（ＥｇＡＣＤ遺伝子）の発現が抑制されたユーグレナである。
ここで、「ＥｇＡＣＤ遺伝子の発現が抑制された」とは、通常のユーグレナと比較してＥｇＡＣＤ遺伝子の発現が抑制されている状態を意味する。より詳細には、ユーグレナにおいて、ＥｇＡＣＤ遺伝子の発現を抑制した場合であっても発現量が変化しない特定の遺伝子（例えば、ハウスキーピング遺伝子）を基準として、ＥｇＡＣＤ遺伝子の発現量が１／２以下、好ましくは１／３以下、１／４以下、より好ましくは、１／５以下、１／６以下、１／７以下、１／８以下、１／９以下、１／１０以下、更により好ましくは、１／２０以下、１／３０以下、１／４０以下、１／５０以下、特に好ましくは、１／６０以下、１／７０以下、１／８０以下、１／９０以下、１／１００以下となっている状態を意味する。
【００４３】
（ＥｇＡＣＤ遺伝子）
本実施形態のＥｇＡＣＤ遺伝子の例としては、配列番号１のヌクレオチド番号１から１８６０に示されるヌクレオチド配列であり、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）をコードするＤＮＡ（ＥｇＡＣＤ１遺伝子）、配列番号３のヌクレオチド番号１から１８５４に示されるヌクレオチド配列であり、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）をコードするＤＮＡ（ＥｇＡＣＤ２遺伝子）が挙げられる。
【００４４】
本実施形態のＥｇＡＣＤ遺伝子の別の例としては、配列番号１のヌクレオチド番号１から１８６０に示されるヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド番号１から１８５４に示されるヌクレオチド配列と、それぞれ、４０％以上、より好ましくは５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、特に好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上のヌクレオチド配列相同性、同一性又は類似性を有し、且つ、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）をコードするＤＮＡが挙げられる。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見される変異型ＤＮＡ、人為的に改変した変異型ＤＮＡ、異種生物由来の相同ＤＮＡ、同一ＤＮＡ又は類似ＤＮＡなどが含まれる。
【００４５】
本実施形態のＥｇＡＣＤ遺伝子の別の例としては、配列番号１のヌクレオチド番号１から１８６０に示されるヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド番号１から１８５４に示されるヌクレオチド配列と、それぞれ、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）をコードするＤＮＡが挙げられる。
また、配列番号１のヌクレオチド番号１から１８６０に示されるヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド番号１から１８５４に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドも、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）をコードする領域を含む限り、本実施形態のＥｇＡＣＤ遺伝子に含まれるものである。
【００４６】
（アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）
本実施形態のアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥｇＡＣＤ）としては、配列表の配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
配列番号２で表されるアミノ酸配列は、本明細書においてＥｇＡＣＤ１と命名したものである。配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を含むヌクレオチド配列は、配列番号１（ＥｇＡＣＤ１遺伝子）の通りである。
配列番号４で表されるアミノ酸配列は、本明細書においてＥｇＡＣＤ２と命名したものである。配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を含むヌクレオチド配列は、配列番号３（ＥｇＡＣＤ２遺伝子）の通りである。
【００４７】
また、配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において、１個または数個の部位に、１個または数個のアミノ酸残基が、置換、欠失、挿入および／または付加したタンパク質も、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼとしての活性を有する限り、本実施形態のタンパク質に含まれる。数個とは６０個を超えない個数を意味し、好適には３０個、さらに好適には１５個、さらに好適には１０個を超えない個数（１個以上９個以下）をいう。
【００４８】
タンパク質の別の例としては、配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と４０％以上、より好ましくは５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、特に好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上のヌクレオチド配列相同性、同一性又は類似性を有するタンパク質も、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼとしての活性を有する限り、本実施形態のタンパク質に含まれる。
【００４９】
（ＥｇＡＣＤ遺伝子の発現抑制とワックスエステルの炭素鎖長）
通常、ユーグレナは、ワックスエステルの構成脂肪酸・脂肪アルコールの主成分は、Ｃ１４のミリスチン酸−ミリスチルアルコール（Ｃ１４：０−Ｃ１４：０）であり、炭素原子数２８の鎖長のワックスエステル化合物が主成分である。
【００５０】
（ＥｇＡＣＤ１遺伝子の発現抑制）
実施例にて示すように、ＥｇＡＣＤ１遺伝子（配列番号１）の発現を抑制すると、同一の培養条件で培養した場合、ユーグレナは、ＥｇＡＣＤ１遺伝子を抑制していないものと比較して炭素原子数２９〜３２の鎖長のワックスエステル化合物が多く、炭素原子数２２〜２７の鎖長のワックスエステル化合物が少ない組成のワックスエステルを含有するようになる。つまり、ＥｇＡＣＤ１遺伝子（配列番号１）の発現を抑制することで、ユーグレナが含有するワックスエステルを長鎖化することができる。
【００５１】
（ＥｇＡＣＤ２遺伝子の発現抑制）
実施例にて示すように、ＥｇＡＣＤ２遺伝子（配列番号３）の発現を抑制すると、同一の培養条件で培養した場合、ユーグレナは、ＥｇＡＣＤ２遺伝子を抑制していないものと比較して炭素原子数２２〜２７の鎖長のワックスエステル化合物が多く、炭素原子数２９〜３２の鎖長のワックスエステル化合物が少ないワックスエステルを含有するようになる。つまり、ＥｇＡＣＤ２遺伝子（配列番号３）の発現を抑制することで、ユーグレナが含有するワックスエステルを短鎖化することができる。
【００５２】
（ＥｇＡＣＤ２遺伝子及びＥｇＫＡＴ遺伝子の発現抑制）
ここで、ユーグレナにおいて、３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ＫＡＴ）１遺伝子（配列番号５）の発現を抑制することで、ユーグレナが含有するワックスエステルを短鎖化できることが報告されている（特許文献１及び非特許文献２）。なお、ＥｇＫＡＴ１遺伝子（配列番号５）は、ＥｇＫＡＴ１酵素（配列番号６）をコードする遺伝子である。
【００５３】
ＥｇＡＣＤ２遺伝子（配列番号３）を、３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ＫＡＴ）１遺伝子（配列番号５）とともに発現を抑制すると、ユーグレナは、炭素原子数２４〜２６のうちいずれかの鎖長のワックスエステル化合物を主成分とするワックスエステルを含有するようになる。つまり、ＥｇＡＣＤ２遺伝子（配列番号３）及びＥｇＫＡＴ１遺伝子（配列番号５）の発現を同時に抑制することで、ユーグレナが含有するワックスエステルをより一層短鎖化することができる。
【００５４】
＜ワックスエステルの製造方法＞
本発明のワックスエステルの製造方法は、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子の発現が抑制されたＡＣＤノックダウンユーグレナを培養する培養工程と、前記ＡＣＤノックダウンユーグレナからワックスエステルを抽出する抽出工程と、を行うことを特徴とするワックスエステルの製造方法である。
【００５５】
（培養工程）
本発明のワックスエステルの製造方法では、まず、ＡＣＤ遺伝子の発現が抑制されたＡＣＤノックダウンユーグレナを、該ユーグレナが増殖可能な増殖至適温度で培養する培養工程を行う。
ＡＣＤノックダウンユーグレナとしては、ＥｇＡＣＤ１遺伝子（配列番号１）の発現が抑制されたＥｇＡＣＤ１ノックダウンユーグレナ、ＥｇＡＣＤ２遺伝子（配列番号３）の発現が抑制されたＥｇＡＣＤ２ノックダウンユーグレナ、ＥｇＡＣＤ２遺伝子（配列番号３）及びＥｇＫＡＴ１遺伝子（配列番号５）の両方の発現が抑制されたＥｇＡＣＤ２−ＥｇＫＡＴ１ノックダウンユーグレナが例として挙げられる。
【００５６】
培養工程では、ユーグレナの増殖至適温度である２５〜２８℃の範囲内の温度で培養を行う。
培地中には、酸素を含む気体、例えば、空気の通気を行う。
また、培地中に酸素を含む気体の通気をしていたものを、停止させ、ユーグレナを沈降させることにより、培地を低酸素又は酸素欠乏状態とする。このとき、酸素を含まない気体（例えば、アルゴンガスや窒素ガス）の通気を行っても良い。
【００５７】
（抽出工程）
その後、公知の方法により、ＡＣＤノックダウンユーグレナからワックスエステルを抽出し、回収する。
ＥｇＡＣＤ１ノックダウンユーグレナを用いた場合、抽出工程では、炭素原子数２８〜３０のうちいずれかの鎖長のワックスエステル化合物を主成分とするワックスエステルを抽出すると好適である。
また、ＥｇＡＣＤ２ノックダウンユーグレナを用いた場合、抽出工程では、炭素原子数２２〜２７のうちいずれかの鎖長のワックスエステル化合物を主成分とするワックスエステルを抽出すると好適である。
さらに、ＥｇＡＣＤ２−ＥｇＫＡＴ１ノックダウンユーグレナを用いた場合、抽出工程では、炭素原子数２４〜２６のうちいずれかの鎖長のワックスエステル化合物を主成分とするワックスエステルを抽出すると好適である。
【００５８】
アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子（ＥｇＡＣＤ１遺伝子又はＥｇＡＣＤ２遺伝子）の発現を抑制することで、ユーグレナが含有するワックスエステルの鎖長を伸長したり、短縮したりすることで、バイオ燃料用途のみならず、化成品や化粧品等に利用できるワックスエステルを製造することが可能となる。
【００５９】
（ワックスエステル組成物）
回収したワックスエステルは、バイオ燃料、化成品、化粧品等として用いることのできるワックスエステル組成物である。ワックスエステル組成物は、バイオ燃料組成物として用いる場合、単独でバイオ燃料として用いてもよいし、他の燃料に混合して用いてもよい。また、ワックスエステル組成物は、単独で化成品、化粧品等として用いてもよいし、他の成分と混合して用いてもよい。
【００６０】
（長鎖ワックスエステル含有量を増加させる方法）
本発明の長鎖ワックスエステル含有量を増加させる方法は、ユーグレナのアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥｇＡＣＤ）発現量を抑制するＥｇＡＣＤ発現量制御工程を行うことを特徴とする方法である。
【００６１】
具体的には、ユーグレナにおける下記（ａ）又は（ｂ）の何れかのアミノ酸配列からなるアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥｇＡＣＤ）の発現量を抑制するＥｇＡＣＤ発現量制御工程を行うことを特徴とするユーグレナにおける炭素原子数２９〜３２の長鎖ワックスエステルを増加させる方法である。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列（ＥｇＡＣＤ１）；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であって、アシル−ＣｏＡに対する脱水素活性を有するアミノ酸配列
【００６２】
（短鎖ワックスエステル含有量を増加させる方法）
本発明の短鎖ワックスエステル含有量を増加させる方法は、ユーグレナのアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥｇＡＣＤ）発現量を抑制するＥｇＡＣＤ発現量制御工程を行うことを特徴とする方法である。
【００６３】
具体的には、ユーグレナにおける下記（ｃ）又は（ｄ）の何れかのアミノ酸配列からなるアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥｇＡＣＤ）の発現量を抑制するＥｇＡＣＤ発現量制御工程を行うことを特徴とするユーグレナにおける炭素原子数２２〜２７の短鎖ワックスエステルを増加させる方法である。
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列（ＥｇＡＣＤ２）；
（ｄ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であって、アシル−ＣｏＡに対する脱水素活性を有するアミノ酸配列
【実施例】
【００６４】
以下、具体的実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
各実験において、試薬は特に記載の無い限り、市販の特級試薬を用い、その他の材料及び装置は、文中に記載した。
【００６５】
＜実験１  ＥｇＡＣＤ遺伝子のノックダウンがワックスエステル発酵に及ぼす影響＞
本実験では、ＥｇＡＣＤ１遺伝子又はＥｇＡＣＤ２遺伝子のノックダウンを行い、ユーグレナのワックスエステル合成におよぼす影響について調べた。
【００６６】
（（実験１の方法））
（材料及び試薬）
本実験では、葉緑体を有するEuglena gracilis Z株(以下ユーグレナ野生株)をstreptomycin処理で人工的に葉緑体を永久欠損させた変異体Euglena gracilis SM-ZK株(以下ユーグレナ葉緑体欠損株)(Oda Y. et. al., (1982) : J Gen Microbiol, 128, 853-858.)を使用した。
【００６７】
（ユーグレナの培養方法）
従属栄養培地として表１のＫｏｒｅｎ−Ｈｕｔｎｅｒ培地（ＫＨ培地）を用いた。
【００６８】
【表１】
2020036547.tif 000003
【００６９】
５００ｍｌ容坂口フラスコに、ｐＨを５．０に調整した１５０ｍｌの表１のＫＨ培地を分注し、１２１℃、１５分のオートクレーブにより滅菌した。この培地に、４〜５日間程度の培養で定常期に達したユーグレナ（１５〜２０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を１ｍｌ接種し、２４時間の連続光照射条件下、２７℃で振盪培養した。
【００７０】
細胞数計測には、粒子計数分析装置（ＣＤＡ−１０００）を用いた。１０倍ルゴール液を、ヨウ素１ｇ，ヨウ化カリウム２ｇにＨ２Ｏを全量が３００ｍｌになるよう添加して調製した。
ユーグレナの培養液とルゴール液を１：１の割合で混合することで細胞を固定し、この細胞液を適宜希釈して使用した。
【００７１】
（ユーグレナ低酸素曝露方法）
本実験で原料ユーグレナ細胞として用いたユーグレナ葉緑体欠損株は、静置すると培養容器の底へ沈む性質があった。静置して沈降した条件では、通気が悪く、さらに溶存酸素は自らの呼吸によって消費されることから、細胞は低酸素状態にあると考えられる。そこで、本実験では、低酸素状態とは、ユーグレナ細胞を静置した状態と規定した。
【００７２】
好気状態で対数増殖期後期まで生育させたユーグレナ細胞１．５ｍｌを１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移し、温度を２７℃（通常時の培養温度）に設定したインキュベーター内で静置することにより低酸素処理を行った。
【００７３】
（ワックスエステル抽出分析法）
１．５ｍｌエッペンドルフチューブにユーグレナ培養液１．５ｍｌを移し、２４ｈ静置して低酸素処理を行った。その後遠心分離（１７４００×ｇ，１分，４℃）し上清を除去した後、蒸留水で洗浄し、完全に上清を除去した。ワックスエステル抽出及び定量は、Ｉｎｕｉらの方法（Inui, H et.al.,(1982)）に従って行った。ガスクロマトグラフィーはＧＣ−２０１４を用い、２．５％  Ｔｈｅｒｍｏｎ−３０００カラムで、２４０℃の恒温分析により測定した。スタンダードには、既知濃度のＣ１４：０−Ｃ１４：０Ａｌｃを用いた。
【００７４】
アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）は脂肪酸β酸化で機能する酵素であり、図２の１ステップ目の反応において、アシル−ＣｏＡ（Ｃｎ＋２）とＦＡＤの反応を触媒し、トランスエノイル−ＣｏＡ（Ｃｎ＋２）が生成される。
【００７５】
本発明では、従来、ワックスエステル合成には寄与しないと考えられてきた、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）に着目した。アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）は、広い生物種においてアシル−ＣｏＡからトランスエノイル−ＣｏＡへの不可逆反応を触媒することが知られている。さらに、各生物内に多種のアイソザイムが存在しており、基質特異性や局在の違いを通じて機能分担をしていると考えられているが、各酵素の詳細が明らかになっている例は少なく、また相同性のみでは機能を推定することが困難である。
【００７６】
本発明者らは、調査を行ったところ、ユーグレナＥＳＴデータ上で７種のＥｇＡＣＤアイソザイム（ＥｇＡＣＤ１〜７）の存在を見出し、さらに少なくともＥｇＡＣＤ１とＥｇＡＣＤ２がワックスエステル生産において機能することをＲＮＡｉによる遺伝子ノックダウン実験により見出した。
【００７７】
（（ＥｇＡＣＤ１遺伝子およびＥｇＡＣＤ２遺伝子のノックダウン））
（半定量ＲＴ−ＰＣＲ）
好気状態で３日間培養したユーグレナからｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、逆転写によりｃＤＮＡを獲得した。半定量ＲＴ−ＰＣＲによって各遺伝子の発現量を調べた。
以下、半定量ＲＴ−ＰＣＲについて説明する。
−ユーグレナ細胞からのｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出
ＲＮＡの抽出にはＩＳＯＧＥＮ  ＩＩ（ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ）を用いた。試薬は、原則としてＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅのものを用い、水はＤＥＰＣ処理したものを使用した。
５００μｌのユーグレナ培養液から遠心によりユーグレナ細胞ペレットを回収し、５００μｌのＩＳＯＧＥＮ  ＩＩを加えて完全に懸濁した。２００μｌのＤＥＰＣ水を加え、１５秒間激しく攪拌し、室温で１５分静置した。遠心分離（１７４００×ｇ、１５℃、１５分）を行った後、沈殿付近を取らないように上清画分から５００μｌ回収した。これに２．５μｌのｐ−ブロモアニソールを加え、１５秒間激しく撹拌し、室温で５分静置した。遠心分離（１７４００×ｇ、１５℃、１０分）を行った後、沈殿付近を取らないように上清画分から３００μｌ回収した。回収した液量と同量のイソプロパノールを添加し、転倒混和後、室温で１０分静置した。遠心分離（１７４００×ｇ、１５℃、１０分）後、上清を捨て、沈殿に対して５００μｌの７５％エタノールを加え、遠心分離した（７７００×ｇ，１５℃，３分）。７５％エタノールで再度沈殿を洗浄し、遠心分離した（７７００×ｇ，１５℃，３分）。上清を完全に取り除き、１２μｌのＤＥＰＣ水で溶解した。ＲＮＡ濃度は分光光度計によって、Ａ２６０値を測定することで求めた。
【００７８】
−逆転写反応
ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型として、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ｇＤＮＡ  Ｅｒａｓｅｒ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）により逆転写反応を行った。
表２の反応液（１）を４２℃で２分インキュベートし、氷上で急冷した。
【００７９】
【表２】
2020036547.tif 000004
【００８０】
反応液（１）に、表３の反応液（２）を加え混合後、３７℃で１５分、８５℃で５秒インキュベートすることで、ｃＤＮＡを得た。
【００８１】
【表３】
2020036547.tif 000005
【００８２】
−半定量ＰＣＲ
合成したｃＤＮＡを鋳型として、表４〜表６の条件で半定量ＰＣＲを行った。半定量用ＰＣＲプライマーとして、表６に示すプライマー（上の行から順に配列番号７〜１０）を用いた。また、反応後の確認は１％ゲルを用いたアガロースゲル電気泳動により行った。
【００８３】
【表４】
2020036547.tif 000006
【００８４】
【表５】
2020036547.tif 000007
【００８５】
【表６】
2020036547.tif 000008
【００８６】
また、ハウスキーピング遺伝子としてα−チューブリンを採用した。α−チューブリンｃＤＮＡ断片の増幅には表７のプライマー（上の行から順に配列番号１１，１２）を用い、１８サイクルの反応により行った。
【００８７】
【表７】
2020036547.tif 000009
【００８８】
−二本鎖ＲＮＡ（以下ｄｓＲＮＡ）の作製
逆転写により獲得したｃＤＮＡを用い、両端にＴ７配列を付加したＥｇＡＣＤ  ｃＤＮＡ部分断片をＰＣＲにより増幅、精製した。精製後のｃＤＮＡ断片５００ｎｇもしくは１μｇをＴ７転写反応に用いた。Ｔ７転写反応以降はＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＮＡｉ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用いて各ＥｇＫＡＴに対応するｄｓＲＮＡを作製した。
ｄｓＲＮＡ用プライマー（上の行から順に配列番号１３〜１６）を、表８に示す。
【００８９】
【表８】
2020036547.tif 000010
【００９０】
−エレクトロポレーション法を用いたＲＮＡｉ
ＰＢＳ（＋）で二度洗浄した１０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌのユーグレナ細胞４００μｌ、１５μｇ分の二本鎖ＲＮＡをキュベットに入れ、軽くピペッティングした。ＰＢＳ（＋）の組成は、表９の通りである。
【００９１】
【表９】
2020036547.tif 000011
【００９２】
その後、装置にＢＴＸ−ＥＣＭ６３０を用い、二本鎖ＲＮＡ３０μｇについて、電圧０．５ｋＶ、抵抗５０Ω、電気容量２００μＦの条件で、エレクトロポレーションを行った。この際、ネガティブコントロールにはｄｓＲＮＡの代わりにＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））を１５μｌ使用した。
【００９３】
キュベットはＧａｐ長が２ｍｍのものを用いた。パルス後の細胞を回収し、ＫＨ培地１ｍｌが入った５ｍｌプラスチックチューブに移した後、蓋をパラフィルムで固定し、ローテーターで旋回培養した。２７℃で、３ｈ旋回培養した後、ＫＨ培地３ｍｌが入った試験管に４００μｌ移すことで継代し、２７℃で振盪培養した。
【００９４】
（（結果））
（ＲＮＡｉによるＥｇＡＣＤ  ｍＲＮＡ発現抑制効果の確認）
（（方法））の「二本鎖ＲＮＡ（以下ｄｓＲＮＡ）の作製」「エレクトロポレーション法を用いたＲＮＡｉ」により、ＥｇＡＣＤ  ＲＮＡｉを行った細胞およびコントロール細胞を対数増殖期後期まで振盪培養した。（（方法））の「ユーグレナ細胞からのｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出」により、培養後の細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、「逆転写反応」により逆転写を行った後、半定量ＲＴ−ＰＣＲによってＥｇＡＣＤ  ｍＲＮＡ発現量を調べた。
結果を、図３に示す。図３のように、ＥｇＡＣＤノックダウン細胞が得られていた。
【００９５】
（ＥｇＡＣＤ遺伝子のノックダウンがワックスエステル総量におよぼす影響）
ＥｇＡＣＤ１  ＲＮＡｉ又はＥｇＡＣＤ２  ＲＮＡｉを行った細胞およびコントロール細胞を好気状態で４日間生育させた細胞を２７℃で低酸素処理し、２４時間後の細胞内に存在するワックスエステルを上述の「ワックスエステル抽出分析法」に従い抽出し、分析した。
図４（ＥｇＡＣＤ１ノックダウン）及び図５（ＥｇＡＣＤ２ノックダウン）に炭素鎖長別のワックスエステル量を示す。
【００９６】
（ＥｇＡＣＤ１ノックダウン）
図４に示すように、ワックスエステル組成ピークはコントロール細胞（対比例１：Ｃｏｎｔｒｏｌ）及びＥｇＡＣＤ１ノックダウン細胞（実施例１：ＡＣＤ１  ＲＮＡｉ）の両方でＣ２８であった。
ＥｇＡＣＤ１ノックダウン細胞（実施例１）において、Ｃ２９〜Ｃ３２の割合が高くなり、Ｃ２９〜Ｃ３２の絶対量もコントロール細胞（対比例１）と比べて高くなった。
また、ＥｇＡＣＤ１ノックダウン細胞（実施例１）において、Ｃ２２〜Ｃ２７の割合が低くなり、Ｃ２２〜Ｃ２７の絶対量もコントロール細胞（対比例１）と比べて低くなった。
【００９７】
（ＥｇＡＣＤ２ノックダウン）
図５に示すように、ＥｇＡＣＤ２ノックダウン細胞（実施例２：ＡＣＤ２  ＲＮＡｉ）でワックスエステル組成ピークはＣ２７であった。
ＥｇＡＣＤ２ノックダウン細胞（実施例２）において、Ｃ２２〜Ｃ２７の割合が高くなり、Ｃ２２〜Ｃ２７の絶対量もコントロール細胞（対比例１）と比べて高くなった。
また、ＥｇＡＣＤ２ノックダウン細胞（実施例２）において、Ｃ２８〜Ｃ３２の割合が低くなり、Ｃ２８〜Ｃ３２の絶対量もコントロール細胞（対比例１）と比べて低くなった。
【００９８】
（実験１まとめ）
ユーグレナのワックスエステル合成経路においてトランスエノイルＣｏＡからアシルＣｏＡへの変換はトランスエノイルＣｏＡレダクターゼ（ＴＥＲ）により触媒されると考えられてきた。ユーグレナのＡＣＤに関し、ワックスエステル合成経路における寄与は全く不明であった。本発明者らは、ワックスエステル合成系でＡＣＤが機能する可能性を明らかにするために研究を進めた。さらにＲＮＡｉを用いたノックダウンによりワックスエステルの組成制御を行い、ユーグレナが生産するワックスエステルを改変することを目指した。
その結果、ユーグレナＥＳＴデータ上で見出した７種のＡＣＤアイソザイム（ＥｇＡＣＤ１〜７）のうち、２種がワックスエステル合成系で機能していることを見出した。
【００９９】
ＥｇＡＣＤ１の発現抑制は、ワックスエステルの長鎖化に寄与した。ワックスエステルの長鎖化は、従来の技術では達成されなかった結果である。
ＥｇＡＣＤ２の発現抑制はワックスエステルの短鎖化に寄与した。ワックスエステルの短鎖化は、従来の技術におけるＥｇＫＡＴ１およびＥｇＫＡＴ２の発現抑制と同様の傾向であった。
【０１００】
このことから、ＥｇＡＣＤ１が短鎖アシルＣｏＡ合成に関与し、ＥｇＡＣＤ２が中鎖から長鎖のアシルＣｏＡ合成に関与することが分かった。
脂質代謝酵素の代謝制御によるワックスエステル組成の改変というアプローチから、実験１ではＥｇＡＣＤ１の発現抑制がワックスエステルの高分子化（長鎖化）に有効であり、ＥｇＡＣＤ２の発現抑制がワックスエステルの低分子化（短鎖化）に有効であることを明らかとした。
【０１０１】
＜実験２  ＥｇＡＣＤ２−ＥｇＫＡＴ１ノックダウンの検討＞
実験１にて、ＥｇＡＣＤ２遺伝子の発現を抑制すると、低分子化したワックスエステルが得られた。そこで、本実験では、ＥｇＡＣＤ２ノックダウンと、ＥｇＫＡＴ１ノックダウン（特許文献１及び非特許文献２）の組み合わせがワックスエステル発酵に及ぼす影響を解析した。
【０１０２】
ＥｇＫＡＴ１遺伝子のノックダウンは、特許文献１及び非特許文献２に記載の方法を採用し、実験１と同様の手順で、ＥｇＡＣＤ２遺伝子と同時にノックダウンを行った。
実験１と同様の手順で、培養を行った後に、ワックスエステルを抽出した。
図６にＥｇＡＣＤ２−ＥｇＫＡＴ１ノックダウンを行った場合の、炭素鎖長別のワックスエステル量を示す。
【０１０３】
図６に示すようにＥｇＡＣＤ２−ＥｇＫＡＴ１ノックダウン細胞（実施例３：ＡＣＤ２  ａｎｄ  ＫＡＴ１  ＲＮＡｉ）でワックスエステル組成ピークはＣ２６であり、主成分はＣ２４〜２６であった。
ＥｇＡＣＤ２−ＥｇＫＡＴ１ノックダウン細胞（実施例３）において、Ｃ２１〜Ｃ２６の割合が高くなり、Ｃ２１〜Ｃ２６の絶対量もコントロール細胞（対比例１）と比べて高くなった。
また、ＥｇＡＣＤ２−ＥｇＫＡＴ１ノックダウン細胞（実施例３）において、Ｃ２７〜Ｃ３２の割合が低くなり、Ｃ２７〜Ｃ３２の絶対量もコントロール細胞（対比例１）と比べて低くなった。
【０１０４】
（実験２まとめ）
ＥｇＡＣＤ２とＥｇＫＡＴ１を同時に発現抑制すると、それぞれを単独で発現抑制した場合と比較して、さらにワックスエステルの短鎖化が顕著になった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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