(57)【要約】【課題】がんおよび病原体に向けた免疫応答を増強するための方法および組成物を提供すること。【解決手段】ヒトメソセリンを特異的に標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびこのようなＣＡＲを含む免疫応答性細胞に関する。ここで開示されるメソセリン標的化ＣＡＲは、抗腫瘍活性を含めた免疫活性化特性を増強した。本発明は、例えば、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外抗原結合性ドメインが、ヒトメソセリンと約１ｎＭ〜約２５ｎＭの結合アフィニティー（Ｋｄ）で特異的に結合する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。【選択図】図１
2020036606.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１４年６月６日に出願した米国仮特許出願第６２／００８，８５１号に対する優先権を主張する。この出願はそれぞれ、その全体が、本明細書中に参考として援用され、そしてそのそれぞれに対して優先権を主張する。
【０００２】
助成金情報
本発明は、米国国防総省からの助成金番号Ｗ８１ＸＷＨ−１１−１−０７８３およびＷ８１ＸＷＨ−１２−１−０２３０の下、政府の支援を受けて行った。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
導入
ここで開示される主題は、がんおよび病原体に対する免疫応答を増強するための方法および組成物を提供する。それは、ヒトメソセリンを特異的に標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびこのようなＣＡＲを含む免疫応答性細胞に関する。ここで開示されるメソセリン標的化ＣＡＲは、ＣＡＲ誘発性毒性および免疫原性を最小化する特徴を有しながら、抗腫瘍活性を含めた免疫活性化特性を増強した。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
細胞ベースの免疫療法は、がんの治療のための治癒可能性を有する療法である。Ｔ細胞および他の免疫細胞は、選択された抗原に対して特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と呼ばれる抗原の人工または合成受容体をコードする遺伝物質の導入によって、腫瘍抗原を標的とするよう修飾され得る。ＣＡＲを使用する標的化Ｔ細胞療法は、いくつかの血液悪性腫瘍の治療において、最近、臨床上の成功を示した。しかし、ＣＡＲ発現性Ｔ細胞療法を固形腫瘍にトランスレーションすると、臨床上の利益を達成するためには克服しなければならないいくつかの障害を生じる。悪性細胞は、自身を免疫認識および排除から保護するために、免疫抑制性微小環境を生成するよう適応する。この腫瘍微小環境は、標的化Ｔ細胞療法などの免疫応答の刺激を含む治療方法に対して課題をもたらす。固形腫瘍はまた、効率的なＴ細胞輸送を妨げ、アゴニスト共刺激リガンドの発現を欠き、および／またはＴ細胞機能の負の制御因子を発現する解剖学的コンパートメント内に制限され得る。したがって、固形腫瘍の排除の成功は、効率的な腫瘍浸潤および腫瘍誘発性免疫抑制を克服することを必要とする。さらに、固形腫瘍は、その標的化が、非腫瘍組織に対する最小のまたは許容できる毒性を伴って、強力なＴ細胞による腫瘍根絶を可能にするであろう、最適な免疫標的−抗原を選択するための課題をもたらす。したがって、がん、特に固形腫瘍を治療するためのＣＡＲを設計する新規治療戦略が必要であり、この戦略は、最小の毒性および免疫原性を伴って、強力な腫瘍根絶を誘導可能である（ＣＡＲ免疫原性は、最適以下のＣＡＲに対するアナフィラキシー反応の状況において例示される、低減された有効性または急性毒性をもたらし得る）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ここで開示される主題は、概して、ヒトメソセリンを特異的に標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、このようなＣＡＲを含む免疫応答性細胞、ならびにがん、病原体感染などを治療するためのこれらのＣＡＲおよび免疫応答性細胞の使用を提供する。
【０００６】
ここで開示される主題は、ＣＡＲを提供する。ある一つの限定されない例では、前記ＣＡＲは、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、ここで、前記細胞外抗原結合性ドメインは、ヒトメソセリンと約１ｎＭ〜約２５ｎＭの結合アフィニティーで特異的に結合する。ある特定の実施形態では、前記ＣＡＲは、約１，０００またはそれ超のメソセリン結合部位／細胞のメソセリン発現レベルのヒトメソセリンを認識する。
【０００７】
一部の実施形態では、前記細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号１のアミノ酸１〜１１９を含む重鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、前記細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号５のアミノ酸１〜１０７を含む軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、前記細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号３のアミノ酸１〜１０７を含む軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、前記細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号１１に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１２に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号１３に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、前記細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号１４に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１５に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号１６に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。ある特定の限定されない実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、前記重鎖および軽鎖の両方を含み、必要に応じて、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間に、リンカー配列、例えば、リンカーペプチドを有する。例えば、ある特定の限定されない実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸１〜１１９を含む重鎖可変領域および（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸１〜１０７を含む軽鎖可変領域を含み、必要に応じて、（ｉｉｉ）重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間にリンカー配列、例えば、リンカーペプチドを有する。一部の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸１〜１１９を含む重鎖可変領域および（ｉｉ）配列番号３のアミノ酸１〜１０７を含む軽鎖可変領域を含み、必要に応じて、（ｉｉｉ）重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間にリンカー配列、例えば、リンカーペプチドを有する。例えば、ある特定の限定されない実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、（ｉ）配列番号１１に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１２に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号１３に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３ならびに（ｉｉ）配列番号１４に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１５に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号１６に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含み、必要に応じて、（ｉｉｉ）重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間にリンカー配列、例えば、リンカーペプチドを有する。特定の限定されない実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖである。特定の限定されない実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、Ｆａｂであり、これは必要に応じて架橋されている。特定の限定されない実施形態では、細胞外結合性ドメインは、Ｆ（ａｂ）２である。特定の限定されない実施形態では、前述の分子のいずれかは、細胞外抗原結合性ドメインを形成するように異種配列との融合タンパク質中に含まれ得る。
【０００８】
ここで開示される主題と一致して、細胞外抗原結合性ドメインは、膜貫通ドメインと共有結合によって連結している。前記ＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、前記細胞外抗原結合性ドメインの重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間にリンカーを含み得る。前記細胞外抗原結合性ドメインは、前記細胞外抗原結合性ドメインの５’末端と共有結合によって連結しているリーダーを含み得る。一つの実施形態では、前記リーダーは、ＣＤ８ポリペプチドを含み得る。一部の実施形態では、前記ＣＡＲの前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８ポリペプチド、ＣＤ２８ポリペプチド、ＣＤ３ζポリペプチド、ＣＤ４ポリペプチド、４−１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、ＣＴＬＡ−４ポリペプチド、ＰＤ−１ポリペプチド、ＬＡＧ−３ポリペプチド、２Ｂ４ポリペプチド、ＢＴＬＡポリペプチド、合成ペプチド（免疫応答と関連しているタンパク質をベースとしない）またはそれらの組合せを含み得る。一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８ポリペプチドを含む。一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８ポリペプチドを含む。
【０００９】
ここで開示される主題と一致して、前記細胞内ドメインは、ＣＤ３ζポリペプチドを含む。一部の実施形態では、前記細胞内ドメインは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２８ポリペプチド、４−１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、ＰＤ−１ポリペプチド、ＣＴＬＡ−４ポリペプチド、ＬＡＧ−３ポリペプチド、２Ｂ４ポリペプチド、ＢＴＬＡポリペプチド、合成ペプチド（免疫応答と関連しているタンパク質をベースとしない）またはそれらの組合せを含む。一実施形態では、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８ポリペプチドを含み、前記細胞内ドメインは、ＣＤ３ζポリペプチドを含む。別の実施形態では、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ２８ポリペプチドを含み、前記細胞内ドメインは、ＣＤ３ζポリペプチドと、ＣＤ２８ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。さらに別の実施形態では、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８ポリペプチドを含み、前記細胞内ドメインは、ＣＤ３ζポリペプチドと、４−１ＢＢポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。
【００１０】
一実施形態では、前記ＣＡＲはＭｚである。Ｍｚは、ＣＤ８ポリペプチドを含む膜貫通ドメインと、ＣＤ３ζポリペプチドを含む細胞内ドメインとを含む。一実施形態では、前記ＣＡＲはＭ２８ｚである。Ｍ２８ｚは、ＣＤ２８ポリペプチドを含む膜貫通ドメインと、および、ＣＤ３ζポリペプチドと、ＣＤ２８ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む細胞内ドメインとを含む。一実施形態では、前記ＣＡＲはＭＢＢｚである。ＭＢＢｚは、ＣＤ８ポリペプチドを含む膜貫通ドメインと、およびＣＤ３ζポリペプチドと、４−１ＢＢポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域とを含む細胞内ドメインを含む。
【００１１】
ある特定の実施形態では、前記ＣＡＲは組換え発現される。前記ＣＡＲは、ベクターから発現され得る。一実施形態では、前記ベクターは、γ−レトロウイルスレクター（γ−retroviral  rector）である。
【００１２】
ここで開示される主題はまた、上記のＣＡＲを含む、単離された免疫応答性細胞を提供する。ある特定の実施形態では、前記単離された免疫応答性細胞は、少なくとも１種の外因性共刺激リガンドをさらに含む。一部の実施形態では、前記少なくとも１種の共刺激リガンドは、４−１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＴＮＦＲＳＦ１４およびそれらの組合せからなる群から選択される。一実施形態では、前記共刺激リガンドは、４−１ＢＢＬである。ある特定の実施形態では、前記単離された免疫応答性細胞は、少なくとも１種の外因性のサイトカインをさらに含む。一部の実施形態では、前記少なくとも１種のサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１およびそれらの組合せからなる群から選択される。一実施形態では、前記サイトカインは、ＩＬ−１２である。一部の実施形態では、前記単離された免疫応答性細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、ヒト胚幹細胞およびリンパ球系細胞に分化し得る多能性幹細胞からなる群から選択される。一実施形態では、前記細胞はＴ細胞である。ある特定の実施形態では、前記免疫応答性細胞は、細胞あたり約１〜約４ベクターコピー数の前記ＣＡＲを発現する。ある特定の実施形態では、前記単離された免疫応答性細胞は、ヒトメソセリンとは異なる抗原と結合する抗原認識受容体をさらに含む。前記抗原は、腫瘍または病原体抗原である。一部の実施形態では、前記腫瘍抗原は、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原（例えば、細胞表面抗原）、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質−４０（ＥＧＰ−４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、受容体チロシンプロテインキナーゼｅｒｂ−Ｂ２、３、４、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体−ａ、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ−２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、インターロイキン−１３受容体サブユニットアルファ−２（ＩＬ−１３Ｒα２）、κ−軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、黒色腫抗原ファミリーＡ，１（ＭＡＧＥ−ＡＩ）、ムチン１６（Ｍｕｃ−１６）、ムチン１（Ｍｕｃ−１）、ＮＫＧ２Ｄリガンド、がん精巣抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１、癌胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ−７２）、血管内皮成長因子Ｒ２（ＶＥＧＦ−Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ−１）、１型チロシン−プロテインキナーゼ膜貫通型受容体（ＲＯＲ１）およびそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、前��免疫応答性細胞は、１種または複数種の接着分子を発現する。前記接着分子は、前記ＣＡＲのアビディティーを高め得る。一部の実施形態では、前記接着分子は、ＣＤ２、ＶＬＡ−４およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００１３】
さらに、ここで開示される主題は、上記の免疫応答性細胞を使用する種々の方法を提供する。例えば、ここで開示される主題は、被験体における腫瘍量を低減する方法であって、被験体に、有効量の、ここで開示される免疫応答性細胞を投与し、それによって、被験体において腫瘍細胞死を誘導することを含む方法を提供する。一実施形態では、前記方法は、腫瘍細胞の数を低減する。別の実施形態では、前記方法は、腫瘍の大きさを低減する。さらに別の実施形態では、前記方法は、前記被験体において前記腫瘍を根絶する。一部の実施形態では、前記腫瘍は固形腫瘍である。一部の実施形態では、前記固形腫瘍は、中皮腫、肺がん、膵臓がん、卵巣がん、乳がん、結腸がん、胸膜腫瘍、神経膠芽腫、食道がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、滑膜肉腫、胸腺癌、子宮内膜癌、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、胆管癌およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００１４】
ここで開示される主題はまた、新生物を有する被験体の生存を増大または延長する方法を提供し、ここで、前記方法は、前記被験体に、有効量の、ここで開示される免疫応答性細胞を投与し、それによって、前記被験体の生存を増大または延長することを含む。ある特定の実施形態では、前記新生物は、中皮腫、肺がん、膵臓がん、卵巣がん、乳がん、結腸がん、胸膜がん、神経膠芽腫、食道がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、滑膜肉腫、胸腺癌、子宮内膜癌、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、胆管癌およびそれらの組合せからなる群から選択される。本方法は、被験体における腫瘍量を低減または根絶し得る。
【００１５】
さらに、ここで開示される主題はまた、被験体におけるがん細胞または病原体に応じた免疫活性化サイトカイン産生を増大する方法を提供し、ここで、この方法は、前記被験体に、ここで開示された免疫応答性細胞を投与することを含む。ある特定の実施形態では、前記免疫活性化サイトカインは、（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、インターフェロン制御因子７（ＩＲＦ７）およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００１６】
ここで開示される主題と一致して、上記の種々の方法は、少なくとも１種の免疫調節因子を投与することをさらに含み得る。ある特定の実施形態では、前記少なくとも１種の免疫調節因子は、免疫賦活因子、チェックポイント免疫遮断剤、放射線療法因子、化学療法剤およびそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、前記免疫賦活因子は、ＩＬ−１２、アゴニスト共刺激モノクローナル抗体およびそれらの組合せからなる群から選択される。一実施形態では、前記免疫賦活剤は、ＩＬ−１２である。一部の実施形態では、前記アゴニスト共刺激モノクローナル抗体は、抗４−１ＢＢ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＩＣＯＳ抗体およびそれらの組合せからなる群から選択される。一実施形態では、前記アゴニスト共刺激モノクローナル抗体は、抗４−１ＢＢ抗体である。一部の実施形態では、前記チェックポイント免疫遮断剤が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗Ｂ７−Ｈ３抗体、抗ＴＩＭ３抗体およびそれらの組合せからなる群から選択される。一実施形態では、チェックポイント免疫遮断剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。ある特定の実施形態では、被験体はヒトである。ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞は、被験体に胸膜投与される。
【００１７】
ここで開示される主題はまた、ヒトメソセリンと結合する免疫応答性細胞を製造するための方法を提供する。ある一つの限定されない例では、この方法は、前記免疫応答性細胞に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コードする核酸配列を導入することを含み、このＣＡＲは、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、ここで、前記細胞外抗原結合性ドメインは、ヒトメソセリンと、約１ｎＭ〜約２５ｎＭの結合アフィニティーで特異的に結合する。特定の限定されない実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖである。特定の限定されない実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、Ｆａｂであり、これは必要に応じて架橋されている。特定の限定されない実施形態では、細胞外結合性ドメインは、Ｆ（ａｂ）２である。特定の限定されない実施形態では、前述の分子のいずれかが、細胞外抗原結合性ドメインを形成するように、異種配列との融合タンパク質中に含まれ得る。
【００１８】
ここで開示される主題は、ここで開示されるＣＡＲをコードする核酸、および前記核酸を含むベクターをさらに提供する。一実施形態では、前記ベクターはγ−レトロウイルスベクターである。
【００１９】
ここで開示される主題は、有効量の、個々で開示される免疫応答性細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物をさらに提供する。新生物を治療するための医薬組成物であって、有効量の、ここで開示される免疫応答性細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物もまた提供される。一部の実施形態では、前記新生物は、中皮腫、肺がん、膵臓がん、卵巣がん、乳がん、結腸がん、胸膜がん、神経膠芽腫、食道がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、滑膜肉腫、胸腺癌、子宮内膜癌、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、胆管癌およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００２０】
ここで開示される主題は、新生物、病原体感染、自己免疫障害、炎症性疾患、同種異系移植または移植片拒絶を治療または予防するためのキットであって、ここで開示される免疫応答性細胞を含むキットをさらに提供する。新生物、病原体感染、自己免疫障害、炎症性疾患、同種異系移植または移植片拒絶を治療または予防するためのキットであって、ここで開示されるＣＡＲを含む核酸を含むキットもまた提供される。一部の実施形態では、前記キットは、新生物、病原体感染、自己免疫障害、炎症性疾患、同種異系移植または移植片拒絶を有する被験体を治療するために前記免疫応答性細胞を使用するための指示書をさらに含む。
【００２１】
ここで開示される主題は、被験体において炎症性疾患を予防または治療する方法をさらに提供する。ある一つの限定されない例では、この方法は、前記被験体に、ここで開示される免疫応答性細胞を投与することを含む。一実施形態では、前記免疫応答性細胞は、免疫阻害細胞である。一つの限定されない実施形態では、前記免疫阻害細胞は、制御性Ｔ細胞である。一実施形態では、前記炎症性疾患は膵炎である。一実施形態では、前記被験体はヒトである。一実施形態では、前記被験体は、臓器移植のレシピエントである。一つの特定の実施形態では、前記被験体は、膵臓移植のレシピエントである。
【００２２】
ここで開示される主題は、臓器移植のレシピエントである被験体において移植片拒絶を予防する方法をさらに提供する。ある一つの限定されない例では、この方法は、前記被験体に、ここで開示される免疫応答性細胞を投与することを含む。一実施形態では、前記免疫応答性細胞は、免疫阻害細胞である。ある一つの限定されない例では、前記免疫阻害細胞は、制御性Ｔ細胞である。一実施形態では、前記被験体はヒトである。一実施形態では、前記被験体は、膵臓移植のレシピエントである。
【００２３】
以下の詳細な説明は、例として示しているが、記載された特定の実施形態に対して本発明を限定する意図ではなく、添付の図面と組み合わせて理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、「第２世代」のＣＡＲを指す。
【図２Ａ】図２Ａ〜図２Ｆは、メソセリン特異的構築物のｉｎ  ｖｉｔｒｏのエフェクター機能を示す。（Ａ）メソセリン特異的構築物の生成。抗メソセリン構築物は、ＣＤ３ζエンドドメインを単独で（Ｍｚ）またはＣＤ２８共刺激ドメインと組み合わせて（Ｍ２８ｚ）のいずれかで含有する。ＣＤ２８共刺激によるＰＳＭＡ指向性のＣＡＲ（Ｐ２８ｚ）が、実験中に陰性対照として含まれた。（Ｂ）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの両方をＣＡＲで効率的に形質導入する。形質導入のパーセンテージは、フローサイトメトリーで測定したレポーター遺伝子発現に相当する。Ｍ２８ｚおよびＭｚ  ＣＡＲは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子発現を介して検出された。Ｐ２８ｚ  ＣＡＲを発現するＴ細胞を、低アフィニティー神経成長因子（ＬＮＧＦＲ）レポーター遺伝子発現によって検出した。形質導入されていない細胞を用いて、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染色によって生きていない細胞を除外した後に陽性ゲートをセットした。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋のパーセンテージは、ＣＡＲ＋細胞についてゲートした後に報告される。（Ｃ）メソセリン特異的Ｔ細胞は、抗原特異的溶解を実証する。Ｔ細胞を、メソセリン過剰発現するように形質導入された５１Ｃｒ−ロードのＭＳＴＯ−２１１Ｈ標的細胞（ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋）とともに、示したエフェクター／標的比でインキュベートして、標的細胞溶解（クロム放出）を測定した。エラーバーは、３回の反復の平均のｓ．ｅ．ｍ．である。（Ｄ）ＣＤ２８共刺激は、抗原特異的サイトカイン分泌を増強する。対照の形質導入のＴ細胞またはＭｚもしくはＭ２８ｚで形質導入されたＴ細胞を、形質導入されていないＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞（ＭＳＴＯ  Ｅｍｐｔｙ）またはＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋細胞のいずれかで刺激し、サイトカインを、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズアレイを用いて測定した。（Ｅ）ＣＤ２８共刺激は、反復性の抗原刺激の際に堅調なＴ細胞蓄積を促進する。Ｔ細胞は、ＭＳＴＯ  ＥｍｐｔｙまたはＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞とともに共存培養した（矢印は、新鮮に照射された腫瘍細胞での再刺激を示す）。左側、外因性のＩＬ−２の添加なしの抗原刺激。右側、外因性のＩＬ−２添加（２０ＩＵ／ｍＬ）。ＣＡＲ＋Ｔ細胞絶対数は、フローサイトメトリーで決定したＧＦＰ＋のパーセンテージで補正した手技による血球計算器カウントを用いて示した時点で算出した。エラーバーは、３回の反復の平均のｓ．ｅ．ｍ．に相当する。（Ｆ）メソセリン特異的ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞は、連続抗原刺激の際に６２Ｌエフェクター表現型を獲得する。各抗原刺激後のＣＡＲ＋Ｔ細胞の連続多色フローサイトメトリー解析。
【図２Ｂ】図２Ａ〜図２Ｆは、メソセリン特異的構築物のｉｎ  ｖｉｔｒｏのエフェクター機能を示す。（Ａ）メソセリン特異的構築物の生成。抗メソセリン構築物は、ＣＤ３ζエンドドメインを単独で（Ｍｚ）またはＣＤ２８共刺激ドメインと組み合わせて（Ｍ２８ｚ）のいずれかで含有する。ＣＤ２８共刺激によるＰＳＭＡ指向性のＣＡＲ（Ｐ２８ｚ）が、実験中に陰性対照として含まれた。（Ｂ）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの両方をＣＡＲで効率的に形質導入する。形質導入のパーセンテージは、フローサイトメトリーで測定したレポーター遺伝子発現に相当する。Ｍ２８ｚおよびＭｚ  ＣＡＲは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子発現を介して検出された。Ｐ２８ｚ  ＣＡＲを発現するＴ細胞を、低アフィニティー神経成長因子（ＬＮＧＦＲ）レポーター遺伝子発現によって検出した。形質導入されていない細胞を用いて、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染色によって生きていない細胞を除外した後に陽性ゲートをセットした。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋のパーセンテージは、ＣＡＲ＋細胞についてゲートした後に報告される。（Ｃ）メソセリン特異的Ｔ細胞は、抗原特異的溶解を実証する。Ｔ細胞を、メソセリン過剰発現するように形質導入された５１Ｃｒ−ロードのＭＳＴＯ−２１１Ｈ標的細胞（ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋）とともに、示したエフェクター／標的比でインキュベートして、標的細胞溶解（クロム放出）を測定した。エラーバーは、３回の反復の平均のｓ．ｅ．ｍ．である。（Ｄ）ＣＤ２８共刺激は、抗原特異的サイトカイン分泌を増強する。対照の形質導入のＴ細胞またはＭｚもしくはＭ２８ｚで形質導入されたＴ細胞を、形質導入されていないＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞（ＭＳＴＯ  Ｅｍｐｔｙ）またはＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋細胞のいずれかで刺激し、サイトカインを、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズアレイを用いて測定した。（Ｅ）ＣＤ２８共刺激は、反復性の抗原刺激の際に堅調なＴ細胞蓄積を促進する。Ｔ細胞は、ＭＳＴＯ  ＥｍｐｔｙまたはＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞とともに共存培養した（矢印は、新鮮に照射された腫瘍細胞での再刺激を示す）。左側、外因性のＩＬ−２の添加なしの抗原刺激。右側、外因性のＩＬ−２添加（２０ＩＵ／ｍＬ）。ＣＡＲ＋Ｔ細胞絶対数は、フローサイトメトリーで決定したＧＦＰ＋のパーセンテージで補正した手技による血球計算器カウントを用いて示した時点で算出した。エラーバーは、３回の反復の平均のｓ．ｅ．ｍ．に相当する。（Ｆ）メソセリン特異的ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞は、連続抗原刺激の際に６２Ｌエフェクター表現型を獲得する。各抗原刺激後のＣＡＲ＋Ｔ細胞の連続多色フローサイトメトリー解析。
【図２Ｃ−Ｄ】図２Ａ〜図２Ｆは、メソセリン特異的構築物のｉｎ  ｖｉｔｒｏのエフェクター機能を示す。（Ａ）メソセリン特異的構築物の生成。抗メソセリン構築物は、ＣＤ３ζエンドドメインを単独で（Ｍｚ）またはＣＤ２８共刺激ドメインと組み合わせて（Ｍ２８ｚ）のいずれかで含有する。ＣＤ２８共刺激によるＰＳＭＡ指向性のＣＡＲ（Ｐ２８ｚ）が、実験中に陰性対照として含まれた。（Ｂ）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの両方をＣＡＲで効率的に形質導入する。形質導入のパーセンテージは、フローサイトメトリーで測定したレポーター遺伝子発現に相当する。Ｍ２８ｚおよびＭｚ  ＣＡＲは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子発現を介して検出された。Ｐ２８ｚ  ＣＡＲを発現するＴ細胞を、低アフィニティー神経成長因子（ＬＮＧＦＲ）レポーター遺伝子発現によって検出した。形質導入されていない細胞を用いて、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染色によって生きていない細胞を除外した後に陽性ゲートをセットした。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋のパーセンテージは、ＣＡＲ＋細胞についてゲートした後に報告される。（Ｃ）メソセリン特異的Ｔ細胞は、抗原特異的溶解を実証する。Ｔ細胞を、メソセリン過剰発現するように形質導入された５１Ｃｒ−ロードのＭＳＴＯ−２１１Ｈ標的細胞（ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋）とともに、示したエフェクター／標的比でインキュベートして、標的細胞溶解（クロム放出）を測定した。エラーバーは、３回の反復の平均のｓ．ｅ．ｍ．である。（Ｄ）ＣＤ２８共刺激は、抗原特異的サイトカイン分泌を増強する。対照の形質導入のＴ細胞またはＭｚもしくはＭ２８ｚで形質導入されたＴ細胞を、形質導入されていないＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞（ＭＳＴＯ  Ｅｍｐｔｙ）またはＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋細胞のいずれかで刺激し、サイトカインを、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズアレイを用いて測定した。（Ｅ）ＣＤ２８共刺激は、反復性の抗原刺激の際に堅調なＴ細胞蓄積を促進する。Ｔ細胞は、ＭＳＴＯ  ＥｍｐｔｙまたはＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞とともに共存培養した（矢印は、新鮮に照射された腫瘍細胞での再刺激を示す）。左側、外因性のＩＬ−２の添加なしの抗原刺激。右側、外因性のＩＬ−２添加（２０ＩＵ／ｍＬ）。ＣＡＲ＋Ｔ細胞絶対数は、フローサイトメトリーで決定したＧＦＰ＋のパーセンテージで補正した手技による血球計算器カウントを用いて示した時点で算出した。エラーバーは、３回の反復の平均のｓ．ｅ．ｍ．に相当する。（Ｆ）メソセリン特異的ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞は、連続抗原刺激の際に６２Ｌエフェクター表現型を獲得する。各抗原刺激後のＣＡＲ＋Ｔ細胞の連続多色フローサイトメトリー解析。
【図２Ｅ−Ｆ】図２Ａ〜図２Ｆは、メソセリン特異的構築物のｉｎ  ｖｉｔｒｏのエフェクター機能を示す。（Ａ）メソセリン特異的構築物の生成。抗メソセリン構築物は、ＣＤ３ζエンドドメインを単独で（Ｍｚ）またはＣＤ２８共刺激ドメインと組み合わせて（Ｍ２８ｚ）のいずれかで含有する。ＣＤ２８共刺激によるＰＳＭＡ指向性のＣＡＲ（Ｐ２８ｚ）が、実験中に陰性対照として含まれた。（Ｂ）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの両方をＣＡＲで効率的に形質導入する。形質導入のパーセンテージは、フローサイトメトリーで測定したレポーター遺伝子発現に相当する。Ｍ２８ｚおよびＭｚ  ＣＡＲは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子発現を介して検出された。Ｐ２８ｚ  ＣＡＲを発現するＴ細胞を、低アフィニティー神経成長因子（ＬＮＧＦＲ）レポーター遺伝子発現によって検出した。形質導入されていない細胞を用いて、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染色によって生きていない細胞を除外した後に陽性ゲートをセットした。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋のパーセンテージは、ＣＡＲ＋細胞についてゲートした後に報告される。（Ｃ）メソセリン特異的Ｔ細胞は、抗原特異的溶解を実証する。Ｔ細胞を、メソセリン過剰発現するように形質導入された５１Ｃｒ−ロードのＭＳＴＯ−２１１Ｈ標的細胞（ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋）とともに、示したエフェクター／標的比でインキュベートして、標的細胞溶解（クロム放出）を測定した。エラーバーは、３回の反復の平均のｓ．ｅ．ｍ．である。（Ｄ）ＣＤ２８共刺激は、抗原特異的サイトカイン分泌を増強する。対照の形質導入のＴ細胞またはＭｚもしくはＭ２８ｚで形質導入されたＴ細胞を、形質導入されていないＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞（ＭＳＴＯ  Ｅｍｐｔｙ）またはＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋細胞のいずれかで刺激し、サイトカインを、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズアレイを用いて測定した。（Ｅ）ＣＤ２８共刺激は、反復性の抗原刺激の際に堅調なＴ細胞蓄積を促進する。Ｔ細胞は、ＭＳＴＯ  ＥｍｐｔｙまたはＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞とともに共存培養した（矢印は、新鮮に照射された腫瘍細胞での再刺激を示す）。左側、外因性のＩＬ−２の添加なしの抗原刺激。右側、外因性のＩＬ−２添加（２０ＩＵ／ｍＬ）。ＣＡＲ＋Ｔ細胞絶対数は、フローサイトメトリーで決定したＧＦＰ＋のパーセンテージで補正した手技による血球計算器カウントを用いて示した時点で算出した。エラーバーは、３回の反復の平均のｓ．ｅ．ｍ．に相当する。（Ｆ）メソセリン特異的ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞は、連続抗原刺激の際に６２Ｌエフェクター表現型を獲得する。各抗原刺激後のＣＡＲ＋Ｔ細胞の連続多色フローサイトメトリー解析。
【図３Ａ−Ｂ】図３Ａ〜図３Ｅは、Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞の胸膜内投与後の樹立されたＭＳＬＮ＋胸膜腫瘍の根絶を示す。（Ａ）同所性の悪性の胸膜の中皮腫のマウスモデルは、ヒト疾患を再現する。腫瘍接種５週後に１×１０５個のＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞を注射されたマウスにおける顕微鏡的病変の核磁気画像および写真（それぞれ、上の左側および右側の画像）。全てのマウスが、胸膜および横隔膜の表面に沿って増殖し、かつ縦隔の構造を包み込む腫瘍を有する。底部、胸壁切片の代表的なヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色であって、腫瘍による早期の胸壁浸潤（下の左側）、および持続したメソセリン発現（下の右側）が実証される。（Ｂ）胸膜腫瘍を保有するＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃヌルマウス（ＮＳＧ）マウスの連続的なｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍生物発光イメージング（ＢＬＩ）。ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞は、緑色蛍光タンパク質／ホタルルシフェラーゼ融合タンパク質（ＧＦＰ／Ｌｕｃ）を共発現して、イメージングを可能にする。胸膜内腫瘍の樹立後、マウスを、静脈内の３×１０６個のＭ２８ｚ  Ｔリンパ球、または胸膜内の３×１０５個のＭ２８ｚ  Ｔリンパ球（１０分の１の用量）のいずれかの養子免疫移入で処置して、ヒトＰＳＭＡ標的化キメラ抗原受容体Ｐ２８ｚを保有する３×１０５個のＴ細胞を、陰性対照として胸膜に注射した。各々の群に由来する４つの代表的なマウスを示す。マウスを腹側および背側の両方でイメージングした。ＢＬＩシグナル強度は、光子／秒で示す。（Ｃ）１００日間の期間にまたがって毎週、動物１匹あたりで定量したＢＬＩ腫瘍シグナル。各々のラインは、１匹の動物に相当し、各々のドットは、所定の時点での動物１匹あたりの腹側および背側の獲得の平均光子カウントに相当する。（Ｄ）静脈内に投与されたＭ２８ｚ  Ｔ細胞（ｎ＝４、青い破線）を比較するカプラン・マイヤー生存解析は、胸膜内に投与されたＭ２８ｚ＋  Ｔ細胞と比較して生存が低下していた（ｎ＝７，青線）（９２日対ｎｄ，ｐ＝０．０２）。結果は、反復実験で確認した。（Ｅ）腫瘍接種後の動物の処置。
【図３Ｃ】図３Ａ〜図３Ｅは、Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞の胸膜内投与後の樹立されたＭＳＬＮ＋胸膜腫瘍の根絶を示す。（Ａ）同所性の悪性の胸膜の中皮腫のマウスモデルは、ヒト疾患を再現する。腫瘍接種５週後に１×１０５個のＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞を注射されたマウスにおける顕微鏡的病変の核磁気画像および写真（それぞれ、上の左側および右側の画像）。全てのマウスが、胸膜および横隔膜の表面に沿って増殖し、かつ縦隔の構造を包み込む腫瘍を有する。底部、胸壁切片の代表的なヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色であって、腫瘍による早期の胸壁浸潤（下の左側）、および持続したメソセリン発現（下の右側）が実証される。（Ｂ）胸膜腫瘍を保有するＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃヌルマウス（ＮＳＧ）マウスの連続的なｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍生物発光イメージング（ＢＬＩ）。ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞は、緑色蛍光タンパク質／ホタルルシフェラーゼ融合タンパク質（ＧＦＰ／Ｌｕｃ）を共発現して、イメージングを可能にする。胸膜内腫瘍の樹立後、マウスを、静脈内の３×１０６個のＭ２８ｚ  Ｔリンパ球、または胸膜内の３×１０５個のＭ２８ｚ  Ｔリンパ球（１０分の１の用量）のいずれかの養子免疫移入で処置して、ヒトＰＳＭＡ標的化キメラ抗原受容体Ｐ２８ｚを保有する３×１０５個のＴ細胞を、陰性対照として胸膜に注射した。各々の群に由来する４つの代表的なマウスを示す。マウスを腹側および背側の両方でイメージングした。ＢＬＩシグナル強度は、光子／秒で示す。（Ｃ）１００日間の期間にまたがって毎週、動物１匹あたりで定量したＢＬＩ腫瘍シグナル。各々のラインは、１匹の動物に相当し、各々のドットは、所定の時点での動物１匹あたりの腹側および背側の獲得の平均光子カウントに相当する。（Ｄ）静脈内に投与されたＭ２８ｚ  Ｔ細胞（ｎ＝４、青い破線）を比較するカプラン・マイヤー生存解析は、胸膜内に投与されたＭ２８ｚ＋  Ｔ細胞と比較して生存が低下していた（ｎ＝７，青線）（９２日対ｎｄ，ｐ＝０．０２）。結果は、反復実験で確認した。（Ｅ）腫瘍接種後の動物の処置。
【図３Ｄ−Ｅ】図３Ａ〜図３Ｅは、Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞の胸膜内投与後の樹立されたＭＳＬＮ＋胸膜腫瘍の根絶を示す。（Ａ）同所性の悪性の胸膜の中皮腫のマウスモデルは、ヒト疾患を再現する。腫瘍接種５週後に１×１０５個のＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞を注射されたマウスにおける顕微鏡的病変の核磁気画像および写真（それぞれ、上の左側および右側の画像）。全てのマウスが、胸膜および横隔膜の表面に沿って増殖し、かつ縦隔の構造を包み込む腫瘍を有する。底部、胸壁切片の代表的なヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色であって、腫瘍による早期の胸壁浸潤（下の左側）、および持続したメソセリン発現（下の右側）が実証される。（Ｂ）胸膜腫瘍を保有するＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃヌルマウス（ＮＳＧ）マウスの連続的なｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍生物発光イメージング（ＢＬＩ）。ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞は、緑色蛍光タンパク質／ホタルルシフェラーゼ融合タンパク質（ＧＦＰ／Ｌｕｃ）を共発現して、イメージングを可能にする。胸膜内腫瘍の樹立後、マウスを、静脈内の３×１０６個のＭ２８ｚ  Ｔリンパ球、または胸膜内の３×１０５個のＭ２８ｚ  Ｔリンパ球（１０分の１の用量）のいずれかの養子免疫移入で処置して、ヒトＰＳＭＡ標的化キメラ抗原受容体Ｐ２８ｚを保有する３×１０５個のＴ細胞を、陰性対照として胸膜に注射した。各々の群に由来する４つの代表的なマウスを示す。マウスを腹側および背側の両方でイメージングした。ＢＬＩシグナル強度は、光子／秒で示す。（Ｃ）１００日間の期間にまたがって毎週、動物１匹あたりで定量したＢＬＩ腫瘍シグナル。各々のラインは、１匹の動物に相当し、各々のドットは、所定の時点での動物１匹あたりの腹側および背側の獲得の平均光子カウントに相当する。（Ｄ）静脈内に投与されたＭ２８ｚ  Ｔ細胞（ｎ＝４、青い破線）を比較するカプラン・マイヤー生存解析は、胸膜内に投与されたＭ２８ｚ＋  Ｔ細胞と比較して生存が低下していた（ｎ＝７，青線）（９２日対ｎｄ，ｐ＝０．０２）。結果は、反復実験で確認した。（Ｅ）腫瘍接種後の動物の処置。
【図４Ａ−Ｂ】図４Ａ〜図４Ｆは、堅調な、腫瘍抗原依存性の、胸膜に投与されたＭ２８ｚ＋Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏの蓄積を示す。（Ａ）強化されたホタルルシフェラーゼ（ｅｆｆＬｕｃ）（上部に示されるベクター）およびＭ２８ｚ  ＣＡＲを用いて共形質導入された１×１０６個のＴ細胞の胸膜のまたは静脈内投与後、０〜１０日目にＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腫瘍保有ＮＳＧマウスにおける養子免疫移入されたＴ細胞の比較のｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴ細胞ＢＬＩの比較。Ｔ細胞は、１×１０６個のＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞の胸膜内注射１週後に投与した。１群（ｎ＝３〜４）あたり１匹の代表的なマウスを示す。（Ｂ）１０日間の期間の間のＴ細胞移入後の連続的ＢＬＩからのＥｆｆＬｕｃ−ルシフェラーゼシグナル強度。各々のラインは、３〜４匹のマウスの平均シグナルに相当し、各々のドットは、所定の時点での１群あたり動物１匹あたりの腹側および背側の獲得の平均光子カウントを示している。特に、胸膜に投与されたｅｆｆＬｕｃ＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞は、静脈内に投与されたｅｆｆＬｕｃ＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞（これは、胸膜腔の腫瘍内で最初の肺内滞留および遅延したシグナル発光を示す）と比較して増大および持続した蛍光を示す。（Ｃ）胸膜または静脈内のいずれかのＭ２８ｚ  Ｔ細胞投与の３日後、代表的な動物から調製した腫瘍単一細胞懸濁物の多色フローサイトメトリー解析。細胞を、ヒトＣＤ３の抗体で染色し、およびＣＡＲ陽性は、ＧＦＰレポーター発現によって決定し、さらなる分析は、ＣＤ４／ＣＤ８／ＣＤ６２Ｌ／ＣＤ４５ＲＡを含んだ。（Ｄ）Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞の免疫組織化学。（Ｅ）腫瘍浸潤性Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞絶対数（ｃｏｕｎｔｂｒｉｇｈｔビーズを用いる総細胞カウント）。示される棒グラフは、１群あたり３匹のマウスの平均±ｓ．ｅ．ｍ．に相当し、胸膜投与７日後の堅調なＭ２８ｚ  Ｔ細胞の蓄積を示す。同じ用量の静脈内Ｔ細胞で処置されたマウスは、胸膜腫瘍内の蓄積が少ないことが実証される。（Ｆ）胸膜投与３日および７日後、脾臓中の腫瘍浸潤性Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞絶対数。
【図４Ｃ】図４Ａ〜図４Ｆは、堅調な、腫瘍抗原依存性の、胸膜に投与されたＭ２８ｚ＋Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏの蓄積を示す。（Ａ）強化されたホタルルシフェラーゼ（ｅｆｆＬｕｃ）（上部に示されるベクター）およびＭ２８ｚ  ＣＡＲを用いて共形質導入された１×１０６個のＴ細胞の胸膜のまたは静脈内投与後、０〜１０日目にＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腫瘍保有ＮＳＧマウスにおける養子免疫移入されたＴ細胞の比較のｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴ細胞ＢＬＩの比較。Ｔ細胞は、１×１０６個のＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞の胸膜内注射１週後に投与した。１群（ｎ＝３〜４）あたり１匹の代表的なマウスを示す。（Ｂ）１０日間の期間の間のＴ細胞移入後の連続的ＢＬＩからのＥｆｆＬｕｃ−ルシフェラーゼシグナル強度。各々のラインは、３〜４匹のマウスの平均シグナルに相当し、各々のドットは、所定の時点での１群あたり動物１匹あたりの腹側および背側の獲得の平均光子カウントを示している。特に、胸膜に投与されたｅｆｆＬｕｃ＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞は、静脈内に投与されたｅｆｆＬｕｃ＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞（これは、胸膜腔の腫瘍内で最初の肺内滞留および遅延したシグナル発光を示す）と比較して増大および持続した蛍光を示す。（Ｃ）胸膜または静脈内のいずれかのＭ２８ｚ  Ｔ細胞投与の３日後、代表的な動物から調製した腫瘍単一細胞懸濁物の多色フローサイトメトリー解析。細胞を、ヒトＣＤ３の抗体で染色し、およびＣＡＲ陽性は、ＧＦＰレポーター発現によって決定し、さらなる分析は、ＣＤ４／ＣＤ８／ＣＤ６２Ｌ／ＣＤ４５ＲＡを含んだ。（Ｄ）Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞の免疫組織化学。（Ｅ）腫瘍浸潤性Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞絶対数（ｃｏｕｎｔｂｒｉｇｈｔビーズを用いる総細胞カウント）。示される棒グラフは、１群あたり３匹のマウスの平均±ｓ．ｅ．ｍ．に相当し、胸膜投与７日後の堅調なＭ２８ｚ  Ｔ細胞の蓄積を示す。同じ用量の静脈内Ｔ細胞で処置されたマウスは、胸膜腫瘍内の蓄積が少ないことが実証される。（Ｆ）胸膜投与３日および７日後、脾臓中の腫瘍浸潤性Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞絶対数。
【図４Ｄ−Ｆ】図４Ａ〜図４Ｆは、堅調な、腫瘍抗原依存性の、胸膜に投与されたＭ２８ｚ＋Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏの蓄積を示す。（Ａ）強化されたホタルルシフェラーゼ（ｅｆｆＬｕｃ）（上部に示されるベクター）およびＭ２８ｚ  ＣＡＲを用いて共形質導入された１×１０６個のＴ細胞の胸膜のまたは静脈内投与後、０〜１０日目にＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腫瘍保有ＮＳＧマウスにおける養子免疫移入されたＴ細胞の比較のｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴ細胞ＢＬＩの比較。Ｔ細胞は、１×１０６個のＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞の胸膜内注射１週後に投与した。１群（ｎ＝３〜４）あたり１匹の代表的なマウスを示す。（Ｂ）１０日間の期間の間のＴ細胞移入後の連続的ＢＬＩからのＥｆｆＬｕｃ−ルシフェラーゼシグナル強度。各々のラインは、３〜４匹のマウスの平均シグナルに相当し、各々のドットは、所定の時点での１群あたり動物１匹あたりの腹側および背側の獲得の平均光子カウントを示している。特に、胸膜に投与されたｅｆｆＬｕｃ＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞は、静脈内に投与されたｅｆｆＬｕｃ＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞（これは、胸膜腔の腫瘍内で最初の肺内滞留および遅延したシグナル発光を示す）と比較して増大および持続した蛍光を示す。（Ｃ）胸膜または静脈内のいずれかのＭ２８ｚ  Ｔ細胞投与の３日後、代表的な動物から調製した腫瘍単一細胞懸濁物の多色フローサイトメトリー解析。細胞を、ヒトＣＤ３の抗体で染色し、およびＣＡＲ陽性は、ＧＦＰレポーター発現によって決定し、さらなる分析は、ＣＤ４／ＣＤ８／ＣＤ６２Ｌ／ＣＤ４５ＲＡを含んだ。（Ｄ）Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞の免疫組織化学。（Ｅ）腫瘍浸潤性Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞絶対数（ｃｏｕｎｔｂｒｉｇｈｔビーズを用いる総細胞カウント）。示される棒グラフは、１群あたり３匹のマウスの平均±ｓ．ｅ．ｍ．に相当し、胸膜投与７日後の堅調なＭ２８ｚ  Ｔ細胞の蓄積を示す。同じ用量の静脈内Ｔ細胞で処置されたマウスは、胸膜腫瘍内の蓄積が少ないことが実証される。（Ｆ）胸膜投与３日および７日後、脾臓中の腫瘍浸潤性Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞絶対数。
【図５Ａ】図５Ａ〜図５Ｃは、ＣＤ２８共刺激が、ＣＡＲ＋Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｖｏの永続性および有効性で増強することを示す。（Ａ）ＣＤ２８共刺激は、中央生存によって測定されるＣＡＲ＋Ｔ細胞有効性を増強し、かつ単回Ｔ細胞投与後の腫瘍根絶を容易にする。１×１０５個のＣＡＲ＋Ｍｚ、Ｍ２８ｚ、またはＰ２８ｚ（陰性対照）Ｔ細胞を、樹立された胸膜のＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋ＧＦＰ／Ｌｕｃ＋腫瘍を保有するマウスに対して胸膜に投与した。腫瘍負荷は、ＢＬＩで毎週測定した。左側、カプラン・マイヤー生存曲線。ＭｚおよびＭ２８ｚ群の中央生存を比較する統計学的有意差（１群あたり少なくとも９匹のマウス）を、ログランク検定を用いて決定した。右側、腫瘍負荷であって、１秒あたりの光子という単位を用いて各々の個々のマウスについてＢＬＩで定量。（Ｂ）ＣＤ２８共刺激は、ＣＡＲ＋Ｔ細胞持続性を増強する。１ｍＬの末梢血あたりのＣＡＲ＋Ｔ細胞絶対数は、３×１０６個のＣＡＲ＋Ｔ細胞の胸膜投与４０日および５０日後に示される。示される棒グラフは、３匹のマウスの平均±ｓ．ｅ．ｍ．に相当する。ｔ検定を行い、かつ統計学的有意差は、多重補正のためのボンフェローニ補正を用いて決定した。＊ｐ＜０．０５。（Ｃ）持続するＣＡＲ＋Ｔ細胞は主にＣＤ４＋である。左側、ＭｚまたはＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のいずれかで処置したマウスの末梢血の代表的な多色フローサイトメトリー解析。ゲーティングストラテジーは、リンパ球ゲートおよびＣＤ３＋ＣＤ４５＋Ｔ細胞ゲートを、死んだ細胞の除去後に示す。各々のマウスについて、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋表現型解析は、生きている細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４５＋Ｔ細胞、およびＧＦＰ＋（ＣＡＲ＋）Ｔ細胞についてゲーティング後に行った。右側、Ｔ細胞投与後の連続する時点で引いた末梢血の連続フローサイトメトリー解析を用いて決定したＣＤ４：ＣＤ８比を示す棒グラフ。注入前のＣＤ４：ＣＤ８比は、全てのｉｎ  ｖｉｖｏの実験において約０．５であった。示される結果は、ある範囲のＴ細胞用量（３×１０６、１×１０６、および３×１０５個のＣＡＲ＋）にまたがって同様である。平均のＣＤ４＋対ＣＤ８＋比を比較するｔ検定（各時点でｎ＝３）によって、Ｍｚ処置マウスにおいてＴ細胞注入の３０、４０および５０日後の、ならびにＭ２８ｚ処置マウスについては３０および４０日での統計学的有意差（多重比較のためのボンフェローニ補正後）が実証された。
【図５Ｂ】図５Ａ〜図５Ｃは、ＣＤ２８共刺激が、ＣＡＲ＋Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｖｏの永続性および有効性で増強することを示す。（Ａ）ＣＤ２８共刺激は、中央生存によって測定されるＣＡＲ＋Ｔ細胞有効性を増強し、かつ単回Ｔ細胞投与後の腫瘍根絶を容易にする。１×１０５個のＣＡＲ＋Ｍｚ、Ｍ２８ｚ、またはＰ２８ｚ（陰性対照）Ｔ細胞を、樹立された胸膜のＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋ＧＦＰ／Ｌｕｃ＋腫瘍を保有するマウスに対して胸膜に投与した。腫瘍負荷は、ＢＬＩで毎週測定した。左側、カプラン・マイヤー生存曲線。ＭｚおよびＭ２８ｚ群の中央生存を比較する統計学的有意差（１群あたり少なくとも９匹のマウス）を、ログランク検定を用いて決定した。右側、腫瘍負荷であって、１秒あたりの光子という単位を用いて各々の個々のマウスについてＢＬＩで定量。（Ｂ）ＣＤ２８共刺激は、ＣＡＲ＋Ｔ細胞持続性を増強する。１ｍＬの末梢血あたりのＣＡＲ＋Ｔ細胞絶対数は、３×１０６個のＣＡＲ＋Ｔ細胞の胸膜投与４０日および５０日後に示される。示される棒グラフは、３匹のマウスの平均±ｓ．ｅ．ｍ．に相当する。ｔ検定を行い、かつ統計学的有意差は、多重補正のためのボンフェローニ補正を用いて決定した。＊ｐ＜０．０５。（Ｃ）持続するＣＡＲ＋Ｔ細胞は主にＣＤ４＋である。左側、ＭｚまたはＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のいずれかで処置したマウスの末梢血の代表的な多色フローサイトメトリー解析。ゲーティングストラテジーは、リンパ球ゲートおよびＣＤ３＋ＣＤ４５＋Ｔ細胞ゲートを、死んだ細胞の除去後に示す。各々のマウスについて、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋表現型解析は、生きている細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４５＋Ｔ細胞、およびＧＦＰ＋（ＣＡＲ＋）Ｔ細胞についてゲーティング後に行った。右側、Ｔ細胞投与後の連続する時点で引いた末梢血の連続フローサイトメトリー解析を用いて決定したＣＤ４：ＣＤ８比を示す棒グラフ。注入前のＣＤ４：ＣＤ８比は、全てのｉｎ  ｖｉｖｏの実験において約０．５であった。示される結果は、ある範囲のＴ細胞用量（３×１０６、１×１０６、および３×１０５個のＣＡＲ＋）にまたがって同様である。平均のＣＤ４＋対ＣＤ８＋比を比較するｔ検定（各時点でｎ＝３）によって、Ｍｚ処置マウスにおいてＴ細胞注入の３０、４０および５０日後の、ならびにＭ２８ｚ処置マウスについては３０および４０日での統計学的有意差（多重比較のためのボンフェローニ補正後）が実証された。
【図５Ｃ】図５Ａ〜図５Ｃは、ＣＤ２８共刺激が、ＣＡＲ＋Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｖｏの永続性および有効性で増強することを示す。（Ａ）ＣＤ２８共刺激は、中央生存によって測定されるＣＡＲ＋Ｔ細胞有効性を増強し、かつ単回Ｔ細胞投与後の腫瘍根絶を容易にする。１×１０５個のＣＡＲ＋Ｍｚ、Ｍ２８ｚ、またはＰ２８ｚ（陰性対照）Ｔ細胞を、樹立された胸膜のＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋ＧＦＰ／Ｌｕｃ＋腫瘍を保有するマウスに対して胸膜に投与した。腫瘍負荷は、ＢＬＩで毎週測定した。左側、カプラン・マイヤー生存曲線。ＭｚおよびＭ２８ｚ群の中央生存を比較する統計学的有意差（１群あたり少なくとも９匹のマウス）を、ログランク検定を用いて決定した。右側、腫瘍負荷であって、１秒あたりの光子という単位を用いて各々の個々のマウスについてＢＬＩで定量。（Ｂ）ＣＤ２８共刺激は、ＣＡＲ＋Ｔ細胞持続性を増強する。１ｍＬの末梢血あたりのＣＡＲ＋Ｔ細胞絶対数は、３×１０６個のＣＡＲ＋Ｔ細胞の胸膜投与４０日および５０日後に示される。示される棒グラフは、３匹のマウスの平均±ｓ．ｅ．ｍ．に相当する。ｔ検定を行い、かつ統計学的有意差は、多重補正のためのボンフェローニ補正を用いて決定した。＊ｐ＜０．０５。（Ｃ）持続するＣＡＲ＋Ｔ細胞は主にＣＤ４＋である。左側、ＭｚまたはＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のいずれかで処置したマウスの末梢血の代表的な多色フローサイトメトリー解析。ゲーティングストラテジーは、リンパ球ゲートおよびＣＤ３＋ＣＤ４５＋Ｔ細胞ゲートを、死んだ細胞の除去後に示す。各々のマウスについて、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋表現型解析は、生きている細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４５＋Ｔ細胞、およびＧＦＰ＋（ＣＡＲ＋）Ｔ細胞についてゲーティング後に行った。右側、Ｔ細胞投与後の連続する時点で引いた末梢血の連続フローサイトメトリー解析を用いて決定したＣＤ４：ＣＤ８比を示す棒グラフ。注入前のＣＤ４：ＣＤ８比は、全てのｉｎ  ｖｉｖｏの実験において約０．５であった。示される結果は、ある範囲のＴ細胞用量（３×１０６、１×１０６、および３×１０５個のＣＡＲ＋）にまたがって同様である。平均のＣＤ４＋対ＣＤ８＋比を比較するｔ検定（各時点でｎ＝３）によって、Ｍｚ処置マウスにおいてＴ細胞注入の３０、４０および５０日後の、ならびにＭ２８ｚ処置マウスについては３０および４０日での統計学的有意差（多重比較のためのボンフェローニ補正後）が実証された。
【図６Ａ】図６Ａ〜図６Ｅは、ＣＤ４＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞が、ＣＤ２８共刺激を用いて、遅れたが効率的な細胞傷害性を実証することを示す。（Ａ）陰性選択ビーズソーティングによって、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団を分析する実験について９８％を超える純度が達成された。（Ｂ）ＣＤ４＋  Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞は、ＣＤ８＋  Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞と比較して、遅れたが同様の抗腫瘍細胞傷害性を示す。メソセリン特異的または対照の形質導入されたＣＡＲ＋Ｔ細胞を、示したエフェクター／標的比で、メソセリンを過剰発現するように形質導入された５１ＣｒロードのＭＳＴＯ２１１Ｈ標的細胞（ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋）とともに、インキュベートして、標的細胞溶解（クロム放出）を測定した。エラーバーは、３回の反復の平均のｓ．ｅ．ｍ．である。＊ｐ＜０．０５は、ＣＤ８  Ｍ２８ｚとＣＤ４  Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞を比較する。（Ｃ）ＣＤ２８共刺激は、最適のＣＤ４＋媒介性の細胞傷害性に必須である。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋のＴ細胞サブセットのビーズ精製後、メソセリン特異的または対照の形質導入されたＣＡＲ＋Ｔ細胞を、示したエフェクター／標的比で、メソセリンを過剰発現するように形質導入された５１ＣｒロードされたＭＳＴＯ２１１Ｈ標的細胞（ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋）とともにインキュベートして、標的細胞溶解（クロム放出）を測定した。＊ｐ＜０．０５は、ＣＤ４  Ｍ２８ｚとＣＤ４  Ｍｚ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞とを比較している。（Ｄ）サイトカインリッチな上清は、腫瘍細胞溶解を直接生じない。ＣＤ４＋  Ｍ２８ｚまたはＣＤ４＋  Ｐ２８ｚ（陰性対照として）とＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋またはＭＳＴＯ  ｅｍｐｔｙ標的細胞との１８時間の共インキュベーション後に得られた上清を、新鮮にプレートした５１Ｃｒ標識の標的とともに混合して、標的細胞溶解を、示した時点で測定した。ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、抗原特異的溶解を実証した（陽性対照）。（Ｅ）ＣＡＲ＋Ｔ細胞分泌サイトカインは、ＣＡＲ＋媒介性の細胞傷害性を強化する。ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞のメソセリン特異的刺激後に得られた上清は、ＣＤ８Ｍ２８ｚおよびＣＤ４Ｍ２８ｚの両方とＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋標的細胞との１８時間共存培養において細胞傷害性を増強する。エラーバーは、３回の反復の平均のｓ．ｅ．ｍ．に相当する。＊ｐ＜０．０５は、ＣＡＲ＋Ｔ細胞と添加された上清の有無とを比較している。
【図６Ｂ−Ｃ】図６Ａ〜図６Ｅは、ＣＤ４＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞が、ＣＤ２８共刺激を用いて、遅れたが効率的な細胞傷害性を実証することを示す。（Ａ）陰性選択ビーズソーティングによって、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団を分析する実験について９８％を超える純度が達成された。（Ｂ）ＣＤ４＋  Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞は、ＣＤ８＋  Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞と比較して、遅れたが同様の抗腫瘍細胞傷害性を示す。メソセリン特異的または対照の形質導入されたＣＡＲ＋Ｔ細胞を、示したエフェクター／標的比で、メソセリンを過剰発現するように形質導入された５１ＣｒロードのＭＳＴＯ２１１Ｈ標的細胞（ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋）とともに、インキュベートして、標的細胞溶解（クロム放出）を測定した。エラーバーは、３回の反復の平均のｓ．ｅ．ｍ．である。＊ｐ＜０．０５は、ＣＤ８  Ｍ２８ｚとＣＤ４  Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞を比較する。（Ｃ）ＣＤ２８共刺激は、最適のＣＤ４＋媒介性の細胞傷害性に必須である。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋のＴ細胞サブセットのビーズ精製後、メソセリン特異的または対照の形質導入されたＣＡＲ＋Ｔ細胞を、示したエフェクター／標的比で、メソセリンを過剰発現するように形質導入された５１ＣｒロードされたＭＳＴＯ２１１Ｈ標的細胞（ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋）とともにインキュベートして、標的細胞溶解（クロム放出）を測定した。＊ｐ＜０．０５は、ＣＤ４  Ｍ２８ｚとＣＤ４  Ｍｚ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞とを比較している。（Ｄ）サイトカインリッチな上清は、腫瘍細胞溶解を直接生じない。ＣＤ４＋  Ｍ２８ｚまたはＣＤ４＋  Ｐ２８ｚ（陰性対照として）とＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋またはＭＳＴＯ  ｅｍｐｔｙ標的細胞との１８時間の共インキュベーション後に得られた上清を、新鮮にプレートした５１Ｃｒ標識の標的とともに混合して、標的細胞溶解を、示した時点で測定した。ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、抗原特異的溶解を実証した（陽性対照）。（Ｅ）ＣＡＲ＋Ｔ細胞分泌サイトカインは、ＣＡＲ＋媒介性の細胞傷害性を強化する。ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞のメソセリン特異的刺激後に得られた上清は、ＣＤ８Ｍ２８ｚおよびＣＤ４Ｍ２８ｚの両方とＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋標的細胞との１８時間共存培養において細胞傷害性を増強する。エラーバーは、３回の反復の平均のｓ．ｅ．ｍ．に相当する。＊ｐ＜０．０５は、ＣＡＲ＋Ｔ細胞と添加された上清の有無とを比較している。
【図６Ｄ−Ｅ】図６Ａ〜図６Ｅは、ＣＤ４＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞が、ＣＤ２８共刺激を用いて、遅れたが効率的な細胞傷害性を実証することを示す。（Ａ）陰性選択ビーズソーティングによって、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団を分析する実験について９８％を超える純度が達成された。（Ｂ）ＣＤ４＋  Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞は、ＣＤ８＋  Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞と比較して、遅れたが同様の抗腫瘍細胞傷害性を示す。メソセリン特異的または対照の形質導入されたＣＡＲ＋Ｔ細胞を、示したエフェクター／標的比で、メソセリンを過剰発現するように形質導入された５１ＣｒロードのＭＳＴＯ２１１Ｈ標的細胞（ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋）とともに、インキュベートして、標的細胞溶解（クロム放出）を測定した。エラーバーは、３回の反復の平均のｓ．ｅ．ｍ．である。＊ｐ＜０．０５は、ＣＤ８  Ｍ２８ｚとＣＤ４  Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞を比較する。（Ｃ）ＣＤ２８共刺激は、最適のＣＤ４＋媒介性の細胞傷害性に必須である。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋のＴ細胞サブセットのビーズ精製後、メソセリン特異的または対照の形質導入されたＣＡＲ＋Ｔ細胞を、示したエフェクター／標的比で、メソセリンを過剰発現するように形質導入された５１ＣｒロードされたＭＳＴＯ２１１Ｈ標的細胞（ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋）とともにインキュベートして、標的細胞溶解（クロム放出）を測定した。＊ｐ＜０．０５は、ＣＤ４  Ｍ２８ｚとＣＤ４  Ｍｚ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞とを比較している。（Ｄ）サイトカインリッチな上清は、腫瘍細胞溶解を直接生じない。ＣＤ４＋  Ｍ２８ｚまたはＣＤ４＋  Ｐ２８ｚ（陰性対照として）とＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋またはＭＳＴＯ  ｅｍｐｔｙ標的細胞との１８時間の共インキュベーション後に得られた上清を、新鮮にプレートした５１Ｃｒ標識の標的とともに混合して、標的細胞溶解を、示した時点で測定した。ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、抗原特異的溶解を実証した（陽性対照）。（Ｅ）ＣＡＲ＋Ｔ細胞分泌サイトカインは、ＣＡＲ＋媒介性の細胞傷害性を強化する。ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞のメソセリン特異的刺激後に得られた上清は、ＣＤ８Ｍ２８ｚおよびＣＤ４Ｍ２８ｚの両方とＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋標的細胞との１８時間共存培養において細胞傷害性を増強する。エラーバーは、３回の反復の平均のｓ．ｅ．ｍ．に相当する。＊ｐ＜０．０５は、ＣＡＲ＋Ｔ細胞と添加された上清の有無とを比較している。
【図７Ａ】図７Ａ〜図７Ｄは、メソセリン特異的ＣＡＲ＋Ｔ細胞の細胞傷害性が、パーフォリン／グランザイムによって主に媒介されることを示す。（Ａ）左側および中央では、Ｆａｓリガンドブロックの際のＭ２８ｚ形質導入Ｔ細胞に対して細胞傷害性の影響がないことが実証される。ソートされたＣＤ４、ＣＤ８およびソートされていないＣＤ４／８Ｍ２８ｚ＋Ｔ細胞を、抗Ｆａｓ−Ｌ  ｍＡｂ  ＮＯＫ−１またはＩｇＧ１アイソタイプ対照ｍＡｂ（各々１０ｕｇ／ｍｌ）およびＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋の存在下で、１８時間の５１Ｃｒ放出アッセイ中で共存培養した。右側の図は、ＦａｓＬ媒介性の細胞死についての標的細胞の感受性を示す（詳細に関しては、方法のセクションを参照のこと）。＊ｐ＜０．０５。（Ｂ）腫瘍標的のＴ細胞溶解物を形質導入されたメソセリン特異的なＣＡＲは、細胞傷害性顆粒の放出に依存する。Ｍ２８ｚまたはＭｚ形質導入Ｔ細胞のソートされたＣＤ４＋、ＣＤ８＋亜集団およびソートされていないバルク集団の１８時間の５１Ｃｒ放出アッセイを、キレート剤エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）の有無のもとで、ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞とともに、９６ウェル組織培養プレート中で１８時間共存培養した。＊ｐ＜０．０５。（Ｃ）ＣＤ４＋ＣＡＲ  Ｔ細胞は、刺激の際にグランザイムＢを発現し、ただしＣＤ８＋ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較した場合、動態が遅延していた。グランザイムＡおよびＢに関する細胞内フローサイトメトリーは、休止期のＰＢＭＣ、ＰＨＡ刺激のブラスト、およびＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋刺激の（２：１のエフェクター対標的の比）ＣＡＲ形質導入の（Ｍ２８ｚ、Ｍｚ、およびＰ２８ｚを陰性対照として）Ｔ細胞で行った。細胞を、４時間または１８時間刺激して、クロム放出を細胞傷害性アッセイで評価した２つの時点と比較した。ＣＤ３＋およびＧＦＰ＋事象のためのゲーティングの後、グランザイム陽性の事象を、蛍光マイナスワン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｎｕｓ  ｏｎｅ）染色細胞を用いて決定した。抗体アイソタイプ対照は、全ての染色について陰性であった。左側、代表的なＦＡＣＳドットは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方のＴ細胞サブセットについてプロットする。右側、行った全部で３つの総実験の１つの代表的な実験の棒グラフ。（Ｄ）Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｍｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞よりも大量のグランザイムＢを発現する。細胞を、（ｃ）のように染色して、代表的なヒストグラムを、ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋刺激による刺激の１８時間後に示す。
【図７Ｂ】図７Ａ〜図７Ｄは、メソセリン特異的ＣＡＲ＋Ｔ細胞の細胞傷害性が、パーフォリン／グランザイムによって主に媒介されることを示す。（Ａ）左側および中央では、Ｆａｓリガンドブロックの際のＭ２８ｚ形質導入Ｔ細胞に対して細胞傷害性の影響がないことが実証される。ソートされたＣＤ４、ＣＤ８およびソートされていないＣＤ４／８Ｍ２８ｚ＋Ｔ細胞を、抗Ｆａｓ−Ｌ  ｍＡｂ  ＮＯＫ−１またはＩｇＧ１アイソタイプ対照ｍＡｂ（各々１０ｕｇ／ｍｌ）およびＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋の存在下で、１８時間の５１Ｃｒ放出アッセイ中で共存培養した。右側の図は、ＦａｓＬ媒介性の細胞死についての標的細胞の感受性を示す（詳細に関しては、方法のセクションを参照のこと）。＊ｐ＜０．０５。（Ｂ）腫瘍標的のＴ細胞溶解物を形質導入されたメソセリン特異的なＣＡＲは、細胞傷害性顆粒の放出に依存する。Ｍ２８ｚまたはＭｚ形質導入Ｔ細胞のソートされたＣＤ４＋、ＣＤ８＋亜集団およびソートされていないバルク集団の１８時間の５１Ｃｒ放出アッセイを、キレート剤エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）の有無のもとで、ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞とともに、９６ウェル組織培養プレート中で１８時間共存培養した。＊ｐ＜０．０５。（Ｃ）ＣＤ４＋ＣＡＲ  Ｔ細胞は、刺激の際にグランザイムＢを発現し、ただしＣＤ８＋ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較した場合、動態が遅延していた。グランザイムＡおよびＢに関する細胞内フローサイトメトリーは、休止期のＰＢＭＣ、ＰＨＡ刺激のブラスト、およびＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋刺激の（２：１のエフェクター対標的の比）ＣＡＲ形質導入の（Ｍ２８ｚ、Ｍｚ、およびＰ２８ｚを陰性対照として）Ｔ細胞で行った。細胞を、４時間または１８時間刺激して、クロム放出を細胞傷害性アッセイで評価した２つの時点と比較した。ＣＤ３＋およびＧＦＰ＋事象のためのゲーティングの後、グランザイム陽性の事象を、蛍光マイナスワン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｎｕｓ  ｏｎｅ）染色細胞を用いて決定した。抗体アイソタイプ対照は、全ての染色について陰性であった。左側、代表的なＦＡＣＳドットは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方のＴ細胞サブセットについてプロットする。右側、行った全部で３つの総実験の１つの代表的な実験の棒グラフ。（Ｄ）Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｍｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞よりも大量のグランザイムＢを発現する。細胞を、（ｃ）のように染色して、代表的なヒストグラムを、ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋刺激による刺激の１８時間後に示す。
【図７Ｃ−１】図７Ａ〜図７Ｄは、メソセリン特異的ＣＡＲ＋Ｔ細胞の細胞傷害性が、パーフォリン／グランザイムによって主に媒介されることを示す。（Ａ）左側および中央では、Ｆａｓリガンドブロックの際のＭ２８ｚ形質導入Ｔ細胞に対して細胞傷害性の影響がないことが実証される。ソートされたＣＤ４、ＣＤ８およびソートされていないＣＤ４／８Ｍ２８ｚ＋Ｔ細胞を、抗Ｆａｓ−Ｌ  ｍＡｂ  ＮＯＫ−１またはＩｇＧ１アイソタイプ対照ｍＡｂ（各々１０ｕｇ／ｍｌ）およびＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋の存在下で、１８時間の５１Ｃｒ放出アッセイ中で共存培養した。右側の図は、ＦａｓＬ媒介性の細胞死についての標的細胞の感受性を示す（詳細に関しては、方法のセクションを参照のこと）。＊ｐ＜０．０５。（Ｂ）腫瘍標的のＴ細胞溶解物を形質導入されたメソセリン特異的なＣＡＲは、細胞傷害性顆粒の放出に依存する。Ｍ２８ｚまたはＭｚ形質導入Ｔ細胞のソートされたＣＤ４＋、ＣＤ８＋亜集団およびソートされていないバルク集団の１８時間の５１Ｃｒ放出アッセイを、キレート剤エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）の有無のもとで、ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞とともに、９６ウェル組織培養プレート中で１８時間共存培養した。＊ｐ＜０．０５。（Ｃ）ＣＤ４＋ＣＡＲ  Ｔ細胞は、刺激の際にグランザイムＢを発現し、ただしＣＤ８＋ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較した場合、動態が遅延していた。グランザイムＡおよびＢに関する細胞内フローサイトメトリーは、休止期のＰＢＭＣ、ＰＨＡ刺激のブラスト、およびＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋刺激の（２：１のエフェクター対標的の比）ＣＡＲ形質導入の（Ｍ２８ｚ、Ｍｚ、およびＰ２８ｚを陰性対照として）Ｔ細胞で行った。細胞を、４時間または１８時間刺激して、クロム放出を細胞傷害性アッセイで評価した２つの時点と比較した。ＣＤ３＋およびＧＦＰ＋事象のためのゲーティングの後、グランザイム陽性の事象を、蛍光マイナスワン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｎｕｓ  ｏｎｅ）染色細胞を用いて決定した。抗体アイソタイプ対照は、全ての染色について陰性であった。左側、代表的なＦＡＣＳドットは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方のＴ細胞サブセットについてプロットする。右側、行った全部で３つの総実験の１つの代表的な実験の棒グラフ。（Ｄ）Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｍｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞よりも大量のグランザイムＢを発現する。細胞を、（ｃ）のように染色して、代表的なヒストグラムを、ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋刺激による刺激の１８時間後に示す。
【図７Ｃ−２】図７Ａ〜図７Ｄは、メソセリン特異的ＣＡＲ＋Ｔ細胞の細胞傷害性が、パーフォリン／グランザイムによって主に媒介されることを示す。（Ａ）左側および中央では、Ｆａｓリガンドブロックの際のＭ２８ｚ形質導入Ｔ細胞に対して細胞傷害性の影響がないことが実証される。ソートされたＣＤ４、ＣＤ８およびソートされていないＣＤ４／８Ｍ２８ｚ＋Ｔ細胞を、抗Ｆａｓ−Ｌ  ｍＡｂ  ＮＯＫ−１またはＩｇＧ１アイソタイプ対照ｍＡｂ（各々１０ｕｇ／ｍｌ）およびＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋の存在下で、１８時間の５１Ｃｒ放出アッセイ中で共存培養した。右側の図は、ＦａｓＬ媒介性の細胞死についての標的細胞の感受性を示す（詳細に関しては、方法のセクションを参照のこと）。＊ｐ＜０．０５。（Ｂ）腫瘍標的のＴ細胞溶解物を形質導入されたメソセリン特異的なＣＡＲは、細胞傷害性顆粒の放出に依存する。Ｍ２８ｚまたはＭｚ形質導入Ｔ細胞のソートされたＣＤ４＋、ＣＤ８＋亜集団およびソートされていないバルク集団の１８時間の５１Ｃｒ放出アッセイを、キレート剤エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）の有無のもとで、ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞とともに、９６ウェル組織培養プレート中で１８時間共存培養した。＊ｐ＜０．０５。（Ｃ）ＣＤ４＋ＣＡＲ  Ｔ細胞は、刺激の際にグランザイムＢを発現し、ただしＣＤ８＋ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較した場合、動態が遅延していた。グランザイムＡおよびＢに関する細胞内フローサイトメトリーは、休止期のＰＢＭＣ、ＰＨＡ刺激のブラスト、およびＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋刺激の（２：１のエフェクター対標的の比）ＣＡＲ形質導入の（Ｍ２８ｚ、Ｍｚ、およびＰ２８ｚを陰性対照として）Ｔ細胞で行った。細胞を、４時間または１８時間刺激して、クロム放出を細胞傷害性アッセイで評価した２つの時点と比較した。ＣＤ３＋およびＧＦＰ＋事象のためのゲーティングの後、グランザイム陽性の事象を、蛍光マイナスワン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｎｕｓ  ｏｎｅ）染色細胞を用いて決定した。抗体アイソタイプ対照は、全ての染色について陰性であった。左側、代表的なＦＡＣＳドットは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方のＴ細胞サブセットについてプロットする。右側、行った全部で３つの総実験の１つの代表的な実験の棒グラフ。（Ｄ）Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｍｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞よりも大量のグランザイムＢを発現する。細胞を、（ｃ）のように染色して、代表的なヒストグラムを、ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋刺激による刺激の１８時間後に示す。
【図７Ｄ】図７Ａ〜図７Ｄは、メソセリン特異的ＣＡＲ＋Ｔ細胞の細胞傷害性が、パーフォリン／グランザイムによって主に媒介されることを示す。（Ａ）左側および中央では、Ｆａｓリガンドブロックの際のＭ２８ｚ形質導入Ｔ細胞に対して細胞傷害性の影響がないことが実証される。ソートされたＣＤ４、ＣＤ８およびソートされていないＣＤ４／８Ｍ２８ｚ＋Ｔ細胞を、抗Ｆａｓ−Ｌ  ｍＡｂ  ＮＯＫ−１またはＩｇＧ１アイソタイプ対照ｍＡｂ（各々１０ｕｇ／ｍｌ）およびＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋の存在下で、１８時間の５１Ｃｒ放出アッセイ中で共存培養した。右側の図は、ＦａｓＬ媒介性の細胞死についての標的細胞の感受性を示す（詳細に関しては、方法のセクションを参照のこと）。＊ｐ＜０．０５。（Ｂ）腫瘍標的のＴ細胞溶解物を形質導入されたメソセリン特異的なＣＡＲは、細胞傷害性顆粒の放出に依存する。Ｍ２８ｚまたはＭｚ形質導入Ｔ細胞のソートされたＣＤ４＋、ＣＤ８＋亜集団およびソートされていないバルク集団の１８時間の５１Ｃｒ放出アッセイを、キレート剤エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）の有無のもとで、ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞とともに、９６ウェル組織培養プレート中で１８時間共存培養した。＊ｐ＜０．０５。（Ｃ）ＣＤ４＋ＣＡＲ  Ｔ細胞は、刺激の際にグランザイムＢを発現し、ただしＣＤ８＋ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較した場合、動態が遅延していた。グランザイムＡおよびＢに関する細胞内フローサイトメトリーは、休止期のＰＢＭＣ、ＰＨＡ刺激のブラスト、およびＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋刺激の（２：１のエフェクター対標的の比）ＣＡＲ形質導入の（Ｍ２８ｚ、Ｍｚ、およびＰ２８ｚを陰性対照として）Ｔ細胞で行った。細胞を、４時間または１８時間刺激して、クロム放出を細胞傷害性アッセイで評価した２つの時点と比較した。ＣＤ３＋およびＧＦＰ＋事象のためのゲーティングの後、グランザイム陽性の事象を、蛍光マイナスワン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｎｕｓ  ｏｎｅ）染色細胞を用いて決定した。抗体アイソタイプ対照は、全ての染色について陰性であった。左側、代表的なＦＡＣＳドットは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方のＴ細胞サブセットについてプロットする。右側、行った全部で３つの総実験の１つの代表的な実験の棒グラフ。（Ｄ）Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｍｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞よりも大量のグランザイムＢを発現する。細胞を、（ｃ）のように染色して、代表的なヒストグラムを、ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋刺激による刺激の１８時間後に示す。
【図８Ａ】図８Ａおよび図８Ｂは、メソセリン特異的なＣＡＲ＋Ｔ細胞のＣＤ２８共刺激効果は、大部分がＣＤ４＋媒介性であることを示す。（Ａ）Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞における強化されたサイトカイン分泌は、主にＣＤ４＋媒介性である。サイトカイン放出アッセイは、ＣＤ４＋、ＣＤ８亜集団（以前に記載のとおり）またはソートされていないバルク集団について、ソートされたＭ２８ｚおよびＭｚ  Ｔ細胞で行なった。５×１０４個のＣＡＲ＋Ｔ細胞を、１ウェルあたり５×１０３標的細胞とともに、１ウェルあたり２００μｌの最終容積で、９６ウェル丸底プレート中で、三連で、共存培養した。２０時間後、共存培養上清を採集して、サイトカインアッセイを、多重ヒトサイトカイン検出アッセイを用いて行い、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、および、ＩＦＮ−γ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）を検出した。データは、１サイトカンあたり３つのウェル中の平均±ｓ．ｅ．ｍ．のサイトカインレベルに相当する。（Ｂ）外因性のＩＬ−２なしのＭ２８ｚ  ＣＤ４＋Ｔ細胞の顕著なＴ細胞増殖能力。ＭＳＬＮ＋またはＭＳＬＮ−腫瘍単層を用いて４日ごとに共存培養されたＴ細胞のＭ２８ｚまたはＭｚ形質導入ＣＤ４＋、ＣＤ８＋亜集団またはソートされていないバルク集団のＴ細胞増殖。ＣＡＲ＋Ｔ細胞絶対数は、フローサイトメトリーで決定したＧＦＰ＋のパーセンテージで補正した手技による血球計算器カウントを用いて示した時点で算出した。各々のドットは、３つのウェルにおける平均±ｓ．ｅ．ｍ．に相当する。
【図８Ｂ】図８Ａおよび図８Ｂは、メソセリン特異的なＣＡＲ＋Ｔ細胞のＣＤ２８共刺激効果は、大部分がＣＤ４＋媒介性であることを示す。（Ａ）Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞における強化されたサイトカイン分泌は、主にＣＤ４＋媒介性である。サイトカイン放出アッセイは、ＣＤ４＋、ＣＤ８亜集団（以前に記載のとおり）またはソートされていないバルク集団について、ソートされたＭ２８ｚおよびＭｚ  Ｔ細胞で行なった。５×１０４個のＣＡＲ＋Ｔ細胞を、１ウェルあたり５×１０３標的細胞とともに、１ウェルあたり２００μｌの最終容積で、９６ウェル丸底プレート中で、三連で、共存培養した。２０時間後、共存培養上清を採集して、サイトカインアッセイを、多重ヒトサイトカイン検出アッセイを用いて行い、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、および、ＩＦＮ−γ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）を検出した。データは、１サイトカンあたり３つのウェル中の平均±ｓ．ｅ．ｍ．のサイトカインレベルに相当する。（Ｂ）外因性のＩＬ−２なしのＭ２８ｚ  ＣＤ４＋Ｔ細胞の顕著なＴ細胞増殖能力。ＭＳＬＮ＋またはＭＳＬＮ−腫瘍単層を用いて４日ごとに共存培養されたＴ細胞のＭ２８ｚまたはＭｚ形質導入ＣＤ４＋、ＣＤ８＋亜集団またはソートされていないバルク集団のＴ細胞増殖。ＣＡＲ＋Ｔ細胞絶対数は、フローサイトメトリーで決定したＧＦＰ＋のパーセンテージで補正した手技による血球計算器カウントを用いて示した時点で算出した。各々のドットは、３つのウェルにおける平均±ｓ．ｅ．ｍ．に相当する。
【図９Ａ】図９Ａおよび図９Ｂは、ＣＤ４＋  Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ＣＤ８＋  Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞に比較した場合、単独でｉｎ  ｖｉｖｏで投与され、有効性の増強を媒介するときに、有効であることを示す。（Ａ）ＮＳＧマウスの胸膜腔に接種された（０日目の接種時間）ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋  ＧＦＰ／Ｌｕｃ＋腫瘍の腫瘍負荷を追跡する、毎週行われるｉｎ  ｖｉｖｏの生物発光イメージング。腫瘍注入の１８日後、マウスは、３×１０５、１×１０５、または３×１０４個のＣＡＲ＋Ｔ細胞のバルクのＭ２８ｚ（ｎ＝５）、ソートされたＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｍ２８ｚ（ｎ＝７）のいずれかを投与された。ＣＡＲ  Ｐ２８ｚを標的化するヒトＰＳＭＡを発現する同数のＴ細胞を、対照群（ｎ＝４）に注射した。ＢＬＩシグナル強度は、光子／秒として示され、平均の腹側および背側のシグナルの平均に相当する。（Ｂ）（ａ）に記載されるＴ細胞処置マウスのカプラン・マイヤー生存曲線。示されるＰ値は、ログランク統計学的検定を用いて示した。全ての用量で、ＣＤ４＋  Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ＣＤ８＋  ＣＡＲ＋Ｔ細胞と比較して有効である。ＣＤ４＋  ＣＡＲ＋Ｔ細胞抗腫瘍有効性は、ソートされていないＣＡＲ＋Ｔ細胞に匹敵する。
【図９Ｂ】図９Ａおよび図９Ｂは、ＣＤ４＋  Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ＣＤ８＋  Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞に比較した場合、単独でｉｎ  ｖｉｖｏで投与され、有効性の増強を媒介するときに、有効であることを示す。（Ａ）ＮＳＧマウスの胸膜腔に接種された（０日目の接種時間）ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋  ＧＦＰ／Ｌｕｃ＋腫瘍の腫瘍負荷を追跡する、毎週行われるｉｎ  ｖｉｖｏの生物発光イメージング。腫瘍注入の１８日後、マウスは、３×１０５、１×１０５、または３×１０４個のＣＡＲ＋Ｔ細胞のバルクのＭ２８ｚ（ｎ＝５）、ソートされたＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｍ２８ｚ（ｎ＝７）のいずれかを投与された。ＣＡＲ  Ｐ２８ｚを標的化するヒトＰＳＭＡを発現する同数のＴ細胞を、対照群（ｎ＝４）に注射した。ＢＬＩシグナル強度は、光子／秒として示され、平均の腹側および背側のシグナルの平均に相当する。（Ｂ）（ａ）に記載されるＴ細胞処置マウスのカプラン・マイヤー生存曲線。示されるＰ値は、ログランク統計学的検定を用いて示した。全ての用量で、ＣＤ４＋  Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ＣＤ８＋  ＣＡＲ＋Ｔ細胞と比較して有効である。ＣＤ４＋  ＣＡＲ＋Ｔ細胞抗腫瘍有効性は、ソートされていないＣＡＲ＋Ｔ細胞に匹敵する。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜図１０Ｅは、養子免疫移入された、メソセリン指向性Ｔ細胞の機能的な持続性が、主にＣＤ４＋媒介性であり、かつＣＤ２８共刺激によって強められることを示す。（Ａ）Ｔ細胞を胸膜内に投与した２０２日後に屠殺した１匹の代表的なＮＳＧマウス（ｎ＝３）から調製した脾臓単一細胞懸濁物の多色フローサイトメトリー解析。３×１０５個のＭ２８ｚ  Ｔ細胞（データ示さず）の注入によって、樹立されたＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋胸膜内腫瘍の根絶の１８４日後。ＣＡＲ＋（ＣＤ３＋ＧＦＰ＋）事象についてゲートした後のＭ２８ｚ  Ｔ細胞亜集団では、ＣＤ４＋Ｔ細胞優勢が示される。（Ｂ）ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋およびＭＳＴＯ−２１１Ｈ−ＭＳＬＮ−腫瘍再チャレンジのＮＳＧマウスのｉｎ  ｖｉｖｏのＢＬＩ。１×１０５個のＭ２８ｚまたはＭｚ形質導入されたＴ細胞；１×１０６個のＭＳＬＮ＋またはＭＳＬＮ−  ＭＳＴＯ腫瘍細胞（マウスの腹腔に注射する場合）のいずれかの投与の後、胸膜腫瘍根絶８７日後。示した時点で、ｌｕｃ＋腫瘍細胞を生物発光イメージングによってモニターした。３匹のＮＳＧマウスを、１つの処置群あたりにイメージングした。各々のラインは、各群のマウスの平均±ｓ．ｅ．ｍ．に相当し、各々のドットは、腹側および背側の両方でマウス全体にまたがって測定した平均光子カウントを示している。ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腹膜腫瘍を注射されたマウスで腫瘍再チャレンジの２週後、８７日前に注射されたＭｚおよびＭ２８ｚ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞の両方とも、抗腫瘍有効性を実証した。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、Ｍｚ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞と比較して腫瘍容積の低下にさらに有効であった。（ＣおよびＤ）。Ｍ２８ｚまたはＭｚＴ細胞絶対数は、腫瘍再チャレンジ後に脾臓で蓄積した。示される棒グラフは、ＭＳＬＮ＋（ｎ＝６）またはＭＳＬＮ−（ｎ＝６）腫瘍のいずれかで再チャレンジされ、腫瘍再チャレンジの１６日後に屠殺されたＮＳＧマウスの脾臓からの形質導入されたＴ細胞の平均±ｓ．ｅ．ｍ．に相当する。ＭＳＴＯ−２１１Ｈ−ＭＳＬＮ＋で再チャレンジされたＭ２８ｚ  Ｔ細胞処置マウスのみが、脾臓中でＣＡＲ＋Ｔ細胞の堅調な蓄積を示した。Ｔ細胞亜集団はまた、フローサイトメトリー（詳細については、方法のセクションを参照のこと）によって定量し、Ｍ２８ｚ群に示されるＴ細胞のほとんどがＣＤ４＋Ｔ細胞であることが示された。（Ｅ）腫瘍接種後の動物の処置。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜図１０Ｅは、養子免疫移入された、メソセリン指向性Ｔ細胞の機能的な持続性が、主にＣＤ４＋媒介性であり、かつＣＤ２８共刺激によって強められることを示す。（Ａ）Ｔ細胞を胸膜内に投与した２０２日後に屠殺した１匹の代表的なＮＳＧマウス（ｎ＝３）から調製した脾臓単一細胞懸濁物の多色フローサイトメトリー解析。３×１０５個のＭ２８ｚ  Ｔ細胞（データ示さず）の注入によって、樹立されたＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋胸膜内腫瘍の根絶の１８４日後。ＣＡＲ＋（ＣＤ３＋ＧＦＰ＋）事象についてゲートした後のＭ２８ｚ  Ｔ細胞亜集団では、ＣＤ４＋Ｔ細胞優勢が示される。（Ｂ）ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋およびＭＳＴＯ−２１１Ｈ−ＭＳＬＮ−腫瘍再チャレンジのＮＳＧマウスのｉｎ  ｖｉｖｏのＢＬＩ。１×１０５個のＭ２８ｚまたはＭｚ形質導入されたＴ細胞；１×１０６個のＭＳＬＮ＋またはＭＳＬＮ−  ＭＳＴＯ腫瘍細胞（マウスの腹腔に注射する場合）のいずれかの投与の後、胸膜腫瘍根絶８７日後。示した時点で、ｌｕｃ＋腫瘍細胞を生物発光イメージングによってモニターした。３匹のＮＳＧマウスを、１つの処置群あたりにイメージングした。各々のラインは、各群のマウスの平均±ｓ．ｅ．ｍ．に相当し、各々のドットは、腹側および背側の両方でマウス全体にまたがって測定した平均光子カウントを示している。ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腹膜腫瘍を注射されたマウスで腫瘍再チャレンジの２週後、８７日前に注射されたＭｚおよびＭ２８ｚ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞の両方とも、抗腫瘍有効性を実証した。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、Ｍｚ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞と比較して腫瘍容積の低下にさらに有効であった。（ＣおよびＤ）。Ｍ２８ｚまたはＭｚＴ細胞絶対数は、腫瘍再チャレンジ後に脾臓で蓄積した。示される棒グラフは、ＭＳＬＮ＋（ｎ＝６）またはＭＳＬＮ−（ｎ＝６）腫瘍のいずれかで再チャレンジされ、腫瘍再チャレンジの１６日後に屠殺されたＮＳＧマウスの脾臓からの形質導入されたＴ細胞の平均±ｓ．ｅ．ｍ．に相当する。ＭＳＴＯ−２１１Ｈ−ＭＳＬＮ＋で再チャレンジされたＭ２８ｚ  Ｔ細胞処置マウスのみが、脾臓中でＣＡＲ＋Ｔ細胞の堅調な蓄積を示した。Ｔ細胞亜集団はまた、フローサイトメトリー（詳細については、方法のセクションを参照のこと）によって定量し、Ｍ２８ｚ群に示されるＴ細胞のほとんどがＣＤ４＋Ｔ細胞であることが示された。（Ｅ）腫瘍接種後の動物の処置。
【図１０Ｃ−Ｅ】図１０Ａ〜図１０Ｅは、養子免疫移入された、メソセリン指向性Ｔ細胞の機能的な持続性が、主にＣＤ４＋媒介性であり、かつＣＤ２８共刺激によって強められることを示す。（Ａ）Ｔ細胞を胸膜内に投与した２０２日後に屠殺した１匹の代表的なＮＳＧマウス（ｎ＝３）から調製した脾臓単一細胞懸濁物の多色フローサイトメトリー解析。３×１０５個のＭ２８ｚ  Ｔ細胞（データ示さず）の注入によって、樹立されたＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋胸膜内腫瘍の根絶の１８４日後。ＣＡＲ＋（ＣＤ３＋ＧＦＰ＋）事象についてゲートした後のＭ２８ｚ  Ｔ細胞亜集団では、ＣＤ４＋Ｔ細胞優勢が示される。（Ｂ）ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋およびＭＳＴＯ−２１１Ｈ−ＭＳＬＮ−腫瘍再チャレンジのＮＳＧマウスのｉｎ  ｖｉｖｏのＢＬＩ。１×１０５個のＭ２８ｚまたはＭｚ形質導入されたＴ細胞；１×１０６個のＭＳＬＮ＋またはＭＳＬＮ−  ＭＳＴＯ腫瘍細胞（マウスの腹腔に注射する場合）のいずれかの投与の後、胸膜腫瘍根絶８７日後。示した時点で、ｌｕｃ＋腫瘍細胞を生物発光イメージングによってモニターした。３匹のＮＳＧマウスを、１つの処置群あたりにイメージングした。各々のラインは、各群のマウスの平均±ｓ．ｅ．ｍ．に相当し、各々のドットは、腹側および背側の両方でマウス全体にまたがって測定した平均光子カウントを示している。ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腹膜腫瘍を注射されたマウスで腫瘍再チャレンジの２週後、８７日前に注射されたＭｚおよびＭ２８ｚ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞の両方とも、抗腫瘍有効性を実証した。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、Ｍｚ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞と比較して腫瘍容積の低下にさらに有効であった。（ＣおよびＤ）。Ｍ２８ｚまたはＭｚＴ細胞絶対数は、腫瘍再チャレンジ後に脾臓で蓄積した。示される棒グラフは、ＭＳＬＮ＋（ｎ＝６）またはＭＳＬＮ−（ｎ＝６）腫瘍のいずれかで再チャレンジされ、腫瘍再チャレンジの１６日後に屠殺されたＮＳＧマウスの脾臓からの形質導入されたＴ細胞の平均±ｓ．ｅ．ｍ．に相当する。ＭＳＴＯ−２１１Ｈ−ＭＳＬＮ＋で再チャレンジされたＭ２８ｚ  Ｔ細胞処置マウスのみが、脾臓中でＣＡＲ＋Ｔ細胞の堅調な蓄積を示した。Ｔ細胞亜集団はまた、フローサイトメトリー（詳細については、方法のセクションを参照のこと）によって定量し、Ｍ２８ｚ群に示されるＴ細胞のほとんどがＣＤ４＋Ｔ細胞であることが示された。（Ｅ）腫瘍接種後の動物の処置。
【図１１Ａ】図１１Ａおよび図１１Ｂは、ＦｏｘＰ３リッチな腫瘍微小環境におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋腫瘍／間質性浸潤が、長期生存を伴っていることを示す。（Ａ）高ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍浸潤は、ＦｏｘＰ３の存在下でさえ長期生存を伴う。１９８９〜２００９年の間にメモリアルスローン・ケタリングがんセンター（Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）で類上皮ＭＰＭと診断された患者が含まれた。利用可能な標品がある１６２例の患者の各々に関して、全てのＨ＆Ｅスライド（中央値９、範囲１〜４３）を再見した。代表的なブロックは、各々の患者腫瘍ブロックから９つの代表的なコア（０．６ｍｍ）を取ること、および少なくとも６つの完全な腫瘍コアを確立することによって、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を構築するように選択した。５マイクロメートルの切片を、ＴＭＡから切断して、特異的な抗体（ＣＤ８：マウスモノクローナル、Ｄａｋｏ、１：２００希釈、ＦｏｘＰ３：マウスモノクローナル、Ａｂｃａｍ、１：２，０００希釈）によって染色した。ＣＤ８およびＦｏｘＰ３強度の等級付けは、以下のように臨床データに盲検であった病理学者によって別々の機会で行った：各々の患者について、免疫細胞浸潤は、１（平均、１〜１．６７）、２（平均、１．６７〜２．３３）、または３（平均、＞２．３３）というスコアで定義した。統計学的解析のために、１というスコアは、低いとみなし、ならびに２および３は高いとみなした。（Ｂ）高いＣＤ４＋Ｔ細胞の間質性浸潤は、ＦｏｘＰ３の存在下では長期生存を伴う。ａ．に記載のとおり、ヤギポリクローナル（Ｇｏａｔ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓを、１：１００希釈で用いてＣＤ４＋細胞を染色する。
【図１１Ｂ】図１１Ａおよび図１１Ｂは、ＦｏｘＰ３リッチな腫瘍微小環境におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋腫瘍／間質性浸潤が、長期生存を伴っていることを示す。（Ａ）高ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍浸潤は、ＦｏｘＰ３の存在下でさえ長期生存を伴う。１９８９〜２００９年の間にメモリアルスローン・ケタリングがんセンター（Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）で類上皮ＭＰＭと診断された患者が含まれた。利用可能な標品がある１６２例の患者の各々に関して、全てのＨ＆Ｅスライド（中央値９、範囲１〜４３）を再見した。代表的なブロックは、各々の患者腫瘍ブロックから９つの代表的なコア（０．６ｍｍ）を取ること、および少なくとも６つの完全な腫瘍コアを確立することによって、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を構築するように選択した。５マイクロメートルの切片を、ＴＭＡから切断して、特異的な抗体（ＣＤ８：マウスモノクローナル、Ｄａｋｏ、１：２００希釈、ＦｏｘＰ３：マウスモノクローナル、Ａｂｃａｍ、１：２，０００希釈）によって染色した。ＣＤ８およびＦｏｘＰ３強度の等級付けは、以下のように臨床データに盲検であった病理学者によって別々の機会で行った：各々の患者について、免疫細胞浸潤は、１（平均、１〜１．６７）、２（平均、１．６７〜２．３３）、または３（平均、＞２．３３）というスコアで定義した。統計学的解析のために、１というスコアは、低いとみなし、ならびに２および３は高いとみなした。（Ｂ）高いＣＤ４＋Ｔ細胞の間質性浸潤は、ＦｏｘＰ３の存在下では長期生存を伴う。ａ．に記載のとおり、ヤギポリクローナル（Ｇｏａｔ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓを、１：１００希釈で用いてＣＤ４＋細胞を染色する。
【図１２】図１２は、ＭＳＬＮスコアの分布：三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）対非ＴＮＢＣを示す。
【図１３Ａ−Ｄ】図１３Ａ〜図１３Ｆは、生存プロファイルを示す：ＭＳＬＮ＋  ＴＮＢＣ対ＮＳＬＮ−ＴＮＢＣ。
【図１３Ｅ−Ｆ】図１３Ａ〜図１３Ｆは、生存プロファイルを示す：ＭＳＬＮ＋  ＴＮＢＣ対ＮＳＬＮ−ＴＮＢＣ。
【図１４】図１４は、ステージＩの肺ＡＤＣ患者の血清における術前の可溶性ＭＳＬＮ関連性のペプチド（ＳＭＲＰ）レベルの測定を示す。
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｃは、マウスモデルの開発を示す。
【図１６】図１６は、肺転移性マウスモデルにおいて腫瘍負荷を低減するためのＭ２８ｚの有効性を示す。
【図１７】図１７Ａ〜図１７Ｄは、高ＭＳＬＮ発現標的と比較して低ＭＳＬＮ発現標的の抗原特異的バイスタンダー殺傷に対するＭ２８ｚ  Ｔ細胞を示す。
【図１８】図１８は、ＰＤ−Ｌ１発現性ＭＳＴＯ−２１１Ｈ（ヒト胸膜の中皮腫）細胞を示す。
【図１９】図１９は、ＭＢＢｚの構造を示す。
【図２０】図２０Ａ〜図２０Ｃは、ＭＳＬＮ標的化ＣＤ２８および４−１ＢＢ共刺激が、腫瘍分泌性の免疫抑制タンパク質の存在下においてＣＡＲ  Ｔ細胞機能を強化したことを示す。
【図２１】図２１Ａ〜図２１Ｃは、ＭＳＬＮ標的化ＣＤ２８および４−１ＢＢ共刺激が、腫瘍分泌性の免疫抑制タンパク質の存在下においてＣＡＲ  Ｔ細胞機能を強化したことを示す。
【図２２】図２２は、ＭＳＬＮ＋がん細胞に対するＭ２８−ＩＬ１２およびＭ２８ｚの細胞傷害性を示す。
【図２３】図２３は、Ｍ２８ｚ誘発性のサイトカイン発現に対するＩＬ−１２の影響を示す。
【図２４】図２４Ａ〜図２４Ｅは、ここで開示される本発明の主題によるＣＡＲを示す。（Ａ）ＳＦＧ−Ｍ２８ｚの構造を示す。（ＳＦＧ−ＭＢＢｚのＢＢ構造を示す）。（Ｃ）ＳＦＧ−Ｍ２８ｚ−４−１ＢＢＬの構造を示す。（Ｄ）ＳＦＧ−４−１ＢＢＬ−Ｍ２８ｚの構造を示す。（Ｅ）ＳＦＧ−Ｍ２８ｚ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｅｘｉ−ＩＬ−１２の構造を示す（ここでＩＲＥＳは、ＮＦＡＴまたはインターフェロン応答性エレメントの制御下で代替的に発現され得る）。
【図２５】図２５は、ＳＦＧ−Ｍ２８ｚ−ＥＧＦＲｔの構造を示す。
【図２６】図２６は、ＳＦＧ−ｉＣ９−Ｍ２８ｚの制限マップを示す。
【図２７】図２７Ａ〜図２７Ｃは、種々のレベルのＭ２８ｚを発現するヒトＴ細胞を示す。
【図２８】図２８は、種々のレベルのヒトメソセリンを発現する標的細胞株を示す。
【図２９Ａ】図２９Ａおよび図２９Ｂは、種々のレベルのヒトメソセリンを発現する標的細胞に対するＭ２８ｚ＋Ｔ細胞のサイトカイン産生を示す。
【図２９Ｂ】図２９Ａおよび図２９Ｂは、種々のレベルのヒトメソセリンを発現する標的細胞に対するＭ２８ｚ＋Ｔ細胞のサイトカイン産生を示す。
【図３０】図３０は、種々のレベルのヒトメソセリンを発現する標的細胞に対するＭ２８ｚ＋Ｔ細胞の細胞傷害性を示す。
【図３１】図３１Ａ〜図３１Ｃは、種々のレベルのヒトメソセリン（ＭＳＬＮ）を発現する標的細胞に対するＭ２８ｚ＋Ｔ細胞のサイトカイン産生および細胞傷害性を示す。（Ａ）種々のレベルのＭＳＬＮを発現するＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞。（Ｂ）種々のレベルのＭＳＬＮを発現するＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞に対するＣＴＬ解析。（Ｃ）種々のレベルのＭＳＬＮを発現するＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞に対するサイトカイン産生。
【図３２−１】図３２は、シスプラチン前処置が、本発明の開示のＭＳＬＮ特異的ＣＡＲ発現Ｔ細胞の有効性を促進したことを示す。
【図３２−２】図３２は、シスプラチン前処置が、本発明の開示のＭＳＬＮ特異的ＣＡＲ発現Ｔ細胞の有効性を促進したことを示す。
【図３３】図３３は、放射線療法が、本発明の開示のＭＳＬＮ特異的ＣＡＲ発現Ｔ細胞の有効性を促進したことを示す。胸部腫瘍を有するマウスにおける半胸郭放射線療法（ＨＴＲＴ）に対する曝露後７２時間のｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Ａ）およびｉｎ  ｖｉｖｏ（Ｂ）におけるケモカインおよびサイトカイン分泌。
【図３４】図３４は、放射線療法が、本発明の全体的な開示のＭＳＬＮ特異的ＣＡＲ発現Ｔ細胞の有効性を促進したことを示す。ＣＡＲ＋Ｔ細胞投与前の半胸郭放射線療法は、Ｔ細胞ＢＬＩによってモニターした場合Ｔ細胞蓄積を増大し、収集された脾臓（Ｔ細胞５６日）の分析では、Ｔ細胞単独を投与されたマウスと比較して、持続するＴ細胞の割合が高いことが示された。
【図３４Ａ−Ｂ】図３４は、放射線療法が、本発明の全体的な開示のＭＳＬＮ特異的ＣＡＲ発現Ｔ細胞の有効性を促進したことを示す。ＣＡＲ＋Ｔ細胞投与前の半胸郭放射線療法は、Ｔ細胞ＢＬＩによってモニターした場合Ｔ細胞蓄積を増大し、収集された脾臓（Ｔ細胞５６日）の分析では、Ｔ細胞単独を投与されたマウスと比較して、持続するＴ細胞の割合が高いことが示された。
【図３５Ａ−Ｃ】図３５Ａ〜図３５Ｅは、ＭＳＬＮ  ＣＡＲ形質導入のＴ細胞の局所投与が、優れた腫瘍有効性を生じることを示す。（Ａ）クロム放出アッセイで測定される、ＭＳＬＮ発現（ただしＰＳＭＡ発現ではない）標的細胞の溶解によって示されるＭＳＬＮ−ＣＡＲ形質導入のＴ細胞の抗原特異的エフェクター機能。（ＢおよびＤ）胸膜腫瘍を保有するＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃヌルマウスの腫瘍ＢＬＩ。腫瘍保有マウスを、１×１０５（１×）または３×１０５（３×）個のＭ２８ｚ  Ｔ細胞を胸膜内に（Ｅ：Ｔ、それぞれ１：３０００または１０００）と比較して、１×１０５（１×）または３×１０６（３０×）個のＭ２８ｚ  Ｔ細胞のいずれかを静脈内に（それぞれＥ：Ｔが１：３０００または１００）で用いて処置した。死亡は、アスタリスク（＊）で示す。（ＣおよびＥ）カプラン・マイヤー生存解析で、静脈内投与（青い破線）と比較して、胸膜内投与での優れた有効性が実証される（青い実線）。中央生存は、Ｍ２８ｚの胸膜内投与については達しなかった；静脈内投与の中央生存は、２７日（１×）および８６日（３０×）であった。胸膜のＰ２８ｚで処置した対照のマウス（黒い線）は、２７〜４２日の中央生存を有した（１群あたりｎ＝４〜１０）。生存曲線は、ログランク検定で分析した。＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図３５Ｄ−Ｅ】図３５Ａ〜図３５Ｅは、ＭＳＬＮ  ＣＡＲ形質導入のＴ細胞の局所投与が、優れた腫瘍有効性を生じることを示す。（Ａ）クロム放出アッセイで測定される、ＭＳＬＮ発現（ただしＰＳＭＡ発現ではない）標的細胞の溶解によって示されるＭＳＬＮ−ＣＡＲ形質導入のＴ細胞の抗原特異的エフェクター機能。（ＢおよびＤ）胸膜腫瘍を保有するＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃヌルマウスの腫瘍ＢＬＩ。腫瘍保有マウスを、１×１０５（１×）または３×１０５（３×）個のＭ２８ｚ  Ｔ細胞を胸膜内に（Ｅ：Ｔ、それぞれ１：３０００または１０００）と比較して、１×１０５（１×）または３×１０６（３０×）個のＭ２８ｚ  Ｔ細胞のいずれかを静脈内に（それぞれＥ：Ｔが１：３０００または１００）で用いて処置した。死亡は、アスタリスク（＊）で示す。（ＣおよびＥ）カプラン・マイヤー生存解析で、静脈内投与（青い破線）と比較して、胸膜内投与での優れた有効性が実証される（青い実線）。中央生存は、Ｍ２８ｚの胸膜内投与については達しなかった；静脈内投与の中央生存は、２７日（１×）および８６日（３０×）であった。胸膜のＰ２８ｚで処置した対照のマウス（黒い線）は、２７〜４２日の中央生存を有した（１群あたりｎ＝４〜１０）。生存曲線は、ログランク検定で分析した。＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図３６Ａ−Ｃ】図３６Ａ〜図３６Ｅは、胸膜内に投与されたＭ２８ｚ＋Ｔ細胞が、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋サブセットの両方の早期の堅調な増殖を示すことを示す。（Ａ）腫瘍保有マウスにおける連続的なＴ細胞ＢＬＩ。静脈内に投与されたＭ２８ｚ＋Ｔ細胞は、進行性の胸膜腫瘍において遅れたが等価の蓄積を示す。（Ｂ）連続的なＴ細胞  ＢＬＩからの平均のｅｆｆＬｕｃ−ルシフェラーゼシグナル強度。胸膜内に投与されたＴ細胞（青線）は、早期かつ持続した蓄積を示し、最大のＴ細胞シグナルは５日である。静脈内に投与されたＴ細胞は、蓄積の遅延を示し、最大のシグナルは７日目である。（Ｃ）Ｅ：Ｔ比は、６時間ならびに１、３および７日の腫瘍負荷と並行したＭ２８ｚ  Ｔ細胞蓄積を反映し、これによってＴ細胞ＢＬＩの知見が確認される。静脈内投与は、Ｔ細胞蓄積の遅延、低いＥ：Ｔ比、およびＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤の低下を示す。（Ｄ）７日目のＦＡＣＳ分析によって、静脈内投与後の脾臓における、低下したＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍蓄積、ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の等しい分布と比較して、胸膜内投与後の腫瘍および脾臓内のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの等しい蓄積が示される。（Ｅ）ＣＤ６２Ｌ発現の低下が、胸膜内投与後のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方で観察された。エラーバーは、±ＳＥＭを示す。スチューデントｔ検定によって、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図３６Ｄ−Ｅ】図３６Ａ〜図３６Ｅは、胸膜内に投与されたＭ２８ｚ＋Ｔ細胞が、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋サブセットの両方の早期の堅調な増殖を示すことを示す。（Ａ）腫瘍保有マウスにおける連続的なＴ細胞ＢＬＩ。静脈内に投与されたＭ２８ｚ＋Ｔ細胞は、進行性の胸膜腫瘍において遅れたが等価の蓄積を示す。（Ｂ）連続的なＴ細胞  ＢＬＩからの平均のｅｆｆＬｕｃ−ルシフェラーゼシグナル強度。胸膜内に投与されたＴ細胞（青線）は、早期かつ持続した蓄積を示し、最大のＴ細胞シグナルは５日である。静脈内に投与されたＴ細胞は、蓄積の遅延を示し、最大のシグナルは７日目である。（Ｃ）Ｅ：Ｔ比は、６時間ならびに１、３および７日の腫瘍負荷と並行したＭ２８ｚ  Ｔ細胞蓄積を反映し、これによってＴ細胞ＢＬＩの知見が確認される。静脈内投与は、Ｔ細胞蓄積の遅延、低いＥ：Ｔ比、およびＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤の低下を示す。（Ｄ）７日目のＦＡＣＳ分析によって、静脈内投与後の脾臓における、低下したＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍蓄積、ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の等しい分布と比較して、胸膜内投与後の腫瘍および脾臓内のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの等しい蓄積が示される。（Ｅ）ＣＤ６２Ｌ発現の低下が、胸膜内投与後のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方で観察された。エラーバーは、±ＳＥＭを示す。スチューデントｔ検定によって、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図３７Ａ−Ｂ】図３７Ａ〜図３７Ｃは、胸膜内に投与されたＭ２８ｚ＋Ｔ細胞が、胸膜外腫瘍において、抗原特異的な方式で効果的な全身性の輸送および蓄積を示すことを示す。（Ａ）二重ルシフェラーゼイメージングによる連続的な腫瘍およびＴ細胞ＢＬＩであって、全身性の輸送および胸膜外腫瘍蓄積を実証している。右わき腹および胸膜腔にｆｆｌｕｃ＋ＭＳＬＮ＋腫瘍ならびに左わき腹にＭＳＬＮ−腫瘍を樹立されたマウスに、ガウス−ルシフェラーゼ＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞を胸膜内に投与した。Ｔ細胞投与前にわき腹および胸膜腔に腫瘍を有する代表的なマウス（左側）。Ｔ細胞投与１５日後のＴ細胞ＢＬＩ（中央）は、胸膜腔における残留Ｔ細胞およびＭＳＬＮ＋右わき腹腫瘍（中央）における蓄積を示す。１日後、腫瘍ＢＬＩは、ＭＳＬＮ−左わき腹腫瘍（右側）と比較して、ＭＳＬＮ＋右わき腹腫瘍では負荷の低下を示す。（ＢおよびＣ）胸膜内に投与されたＭ２８ｚ＋Ｔ細胞は、静脈内に投与されたＴ細胞と比較して、ＭＳＬＮ＋腹膜内腫瘍において早期かつ堅調な蓄積を示す。（Ｃ）腫瘍保有マウスにおける腹腔のシグナル強度の倍数増大の定量は、静脈内投与と比較して、胸膜内投与でのＴ細胞蓄積の増強を示す（１群あたりｎ＝３、エラーバーは±ＳＥＭに相当する）。
【図３７Ｃ】図３７Ａ〜図３７Ｃは、胸膜内に投与されたＭ２８ｚ＋Ｔ細胞が、胸膜外腫瘍において、抗原特異的な方式で効果的な全身性の輸送および蓄積を示すことを示す。（Ａ）二重ルシフェラーゼイメージングによる連続的な腫瘍およびＴ細胞ＢＬＩであって、全身性の輸送および胸膜外腫瘍蓄積を実証している。右わき腹および胸膜腔にｆｆｌｕｃ＋ＭＳＬＮ＋腫瘍ならびに左わき腹にＭＳＬＮ−腫瘍を樹立されたマウスに、ガウス−ルシフェラーゼ＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞を胸膜内に投与した。Ｔ細胞投与前にわき腹および胸膜腔に腫瘍を有する代表的なマウス（左側）。Ｔ細胞投与１５日後のＴ細胞ＢＬＩ（中央）は、胸膜腔における残留Ｔ細胞およびＭＳＬＮ＋右わき腹腫瘍（中央）における蓄積を示す。１日後、腫瘍ＢＬＩは、ＭＳＬＮ−左わき腹腫瘍（右側）と比較して、ＭＳＬＮ＋右わき腹腫瘍では負荷の低下を示す。（ＢおよびＣ）胸膜内に投与されたＭ２８ｚ＋Ｔ細胞は、静脈内に投与されたＴ細胞と比較して、ＭＳＬＮ＋腹膜内腫瘍において早期かつ堅調な蓄積を示す。（Ｃ）腫瘍保有マウスにおける腹腔のシグナル強度の倍数増大の定量は、静脈内投与と比較して、胸膜内投与でのＴ細胞蓄積の増強を示す（１群あたりｎ＝３、エラーバーは±ＳＥＭに相当する）。
【図３８】図３８Ａおよび図３８Ｂは、胸膜内に投与されたＭ２８ｚ  Ｔ細胞が、胸膜腫瘍を根絶し、かつ長期のＣＤ４＋優勢な持続性を確立することを示す。（Ａ）ＣＤ２８共刺激が、Ｔ細胞の単回投与後、腫瘍根絶を促進する。全部で、１×１０５個のＣＡＲ＋Ｍｚ、Ｍ２８ｚ、またはＰ２８ｚ（陰性対照）Ｔ細胞を、樹立された腫瘍を保有するマウスに、胸膜内に投与した。（左側）腫瘍負荷。（右側）カプラン・マイヤー生存曲線。ＭｚおよびＭ２８ｚ群（１群あたり少なくとも９匹のマウス）の中央生存は、６３日であって、それぞれ、中央生存は達しなかった。生存曲線は、ログランク検定によって分析した。＊＊Ｐ＜０．０１。（Ｂ）ＣＤ２８共刺激は、ＣＡＲ＋Ｔ細胞持続性を増強する。３×１０６個のＣＡＲ＋Ｔ細胞の胸膜内投与５０日後のＣＡＲ＋Ｔ細胞カウント絶対数（末梢血の１ｍＬあたり）。エラーバーは、±ＳＥＭに相当し、スチューデントｔ検定によって＊Ｐ＜０．０５。
【図３９】図３９は、ＭＳＬＮ＋およびＭＳＬＮ−腫瘍で再チャレンジしたマウスの腫瘍ＢＬＩに相当する。単回投与の３×１０５個のＭ２８ｚまたはＭｚ  Ｔ細胞の投与後、胸膜腫瘍根絶の８７日後、１×１０６個のＭＳＬＮ＋またはＭＳＬＮ−腫瘍細胞を、腹腔に注射した。腫瘍再チャレンジ後、Ｍｚ  Ｔ細胞は、腫瘍増殖を妨げ、一方で、Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞は、腫瘍退縮を促進する。
【図４０Ａ−Ｃ】図４０Ａ〜図４０Ｆは、ＣＤ４＋  Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞が、予備活性化（ｐｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）で強められるＣＤ８＋蓄積を増強することを示す。（Ａ〜Ｃ）ソートされていないＭ２８ｚおよびＭｚまたはビーズでソートしたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞をアッセイした。Ｍ２８ｚ  ＣＤ４＋Ｔ細胞は、（Ａ）より高度なサイトカイン分泌（４〜１４倍；スチューデントｔ検定によって＊＊＊Ｐ＜０．００１）および（Ｂ）外因性のＩＬ−２のない顕著なＴ細胞増殖を示す。（Ｃ）ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ活性化は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの反復性の抗原刺激の際に堅調なＣＤ８＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞蓄積を容易にする。（Ｄ）抗原活性化されたＣＤ４＋  Ｍ２８ｚ活性化は、ｉｎ  ｖｉｖｏで堅調なＣＤ８＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞蓄積を容易にする。単離されたＣＤ８＋ｅｆｆＬｕｃ  Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞を、ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ（ｎ＝６）またはＣＤ４＋対照形質導入のＴ細胞（ｎ＝６）のいずれかとともにＭＳＬＮ＋胸膜腫瘍保有マウスに対して胸膜内に投与して、連続的にイメージングした。１匹の代表的なマウス（１群あたりｎ＝６；左側）は、ＣＤ４＋Ｍ２８ｚの存在下で、増大したＣＤ８＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞蓄積を示す。（Ｅ）ＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞の平均蓄積を、示した間隔で計算した（Ｐ値は示したとおり、１６〜７２時間の倍数増大を算出、１群あたりｎ＝６）。（Ｆ）Ｍ２８ｚ  ＣＤ４＋の予備活性化は、ＣＤ８＋増殖を、ＣＤ４＋の同時の活性化と比較して増強する。ビーズソートしたＣＤ８＋ＭｚまたはＭ２８ｚ  Ｔ細胞を、対応するＭｚもしくはＭ２８ｚ  ＣＤ４＋または予備活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞（アッセイ２４時間前にＭＳＬＮ＋腫瘍細胞上で活性化される）のいずれかとともに共存培養した。Ｍ２８ｚ  ＣＤ４＋の予備活性化は、ＣＤ８＋の蓄積を、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋共刺激が増強するよりも大きい程度まで増強する。
【図４０Ｄ−Ｆ】図４０Ａ〜図４０Ｆは、ＣＤ４＋  Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞が、予備活性化（ｐｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）で強められるＣＤ８＋蓄積を増強することを示す。（Ａ〜Ｃ）ソートされていないＭ２８ｚおよびＭｚまたはビーズでソートしたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞をアッセイした。Ｍ２８ｚ  ＣＤ４＋Ｔ細胞は、（Ａ）より高度なサイトカイン分泌（４〜１４倍；スチューデントｔ検定によって＊＊＊Ｐ＜０．００１）および（Ｂ）外因性のＩＬ−２のない顕著なＴ細胞増殖を示す。（Ｃ）ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ活性化は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの反復性の抗原刺激の際に堅調なＣＤ８＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞蓄積を容易にする。（Ｄ）抗原活性化されたＣＤ４＋  Ｍ２８ｚ活性化は、ｉｎ  ｖｉｖｏで堅調なＣＤ８＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞蓄積を容易にする。単離されたＣＤ８＋ｅｆｆＬｕｃ  Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞を、ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ（ｎ＝６）またはＣＤ４＋対照形質導入のＴ細胞（ｎ＝６）のいずれかとともにＭＳＬＮ＋胸膜腫瘍保有マウスに対して胸膜内に投与して、連続的にイメージングした。１匹の代表的なマウス（１群あたりｎ＝６；左側）は、ＣＤ４＋Ｍ２８ｚの存在下で、増大したＣＤ８＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞蓄積を示す。（Ｅ）ＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞の平均蓄積を、示した間隔で計算した（Ｐ値は示したとおり、１６〜７２時間の倍数増大を算出、１群あたりｎ＝６）。（Ｆ）Ｍ２８ｚ  ＣＤ４＋の予備活性化は、ＣＤ８＋増殖を、ＣＤ４＋の同時の活性化と比較して増強する。ビーズソートしたＣＤ８＋ＭｚまたはＭ２８ｚ  Ｔ細胞を、対応するＭｚもしくはＭ２８ｚ  ＣＤ４＋または予備活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞（アッセイ２４時間前にＭＳＬＮ＋腫瘍細胞上で活性化される）のいずれかとともに共存培養した。Ｍ２８ｚ  ＣＤ４＋の予備活性化は、ＣＤ８＋の蓄積を、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋共刺激が増強するよりも大きい程度まで増強する。
【図４１Ａ−Ｃ】図４１Ａ〜図４１Ｅは、ＣＤ４＋ＭＳＬＮ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞が、グランザイム／パーフォリン依存性である効率的な細胞溶解機能を実証することを示す。（Ａ）ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞は、遅いがＣＤ８＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞と同様の細胞傷害性を示す。（Ｂ）ＣＤ２８共刺激は、ＣＤ４＋媒介性の細胞傷害性を増強する。（Ｃ）刺激されたＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞から得られたサイトカインリッチな上清は、ＣＤ８Ｍ２８ｚおよびＣＤ４Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞の両方の細胞傷害性を増強する。（Ｄ）ＣＡＲ  Ｔ細胞溶解性機能は、細胞傷害性顆粒の放出に依存する。バルク、ＣＤ４、またはＣＤ８  Ｍ２８ｚおよびＭｚ  Ｔ細胞を、１８時間、キレート剤エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）の有無のもとで共存培養した。（Ａ〜Ｄ）ビーズ精製されたＣＤ４＋またはＣＤ８＋ＭｚおよびＭ２８ｚ  Ｔ細胞の細胞傷害性。（Ｅ、左側）ＣＤ４＋ＣＡＲ  Ｔ細胞は、グランザイムＢを発現するが、ＣＤ８＋ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、反応速度は遅延している。グランザイムＢの細胞内ＦＡＣＳ分析は、休止期のＰＢＭＣ、ＰＨＡ刺激のブラスト、ならびにＭ２８ｚ、ＭｚおよびＰ２８ｚ  Ｔ細胞（ＭＳＬＮ＋で４時間または１８時間刺激された）で行った。（Ｅ、右側）ＣＤ２８共刺激は、グランザイムＢ発現を増強する。ヒストグラムは、ＭＳＬＮ＋刺激１８時間後の発現を示す。エラーバーは、±ＳＥＭに相当し、スチューデントｔ検定によって＊Ｐ＜０．０５である。
【図４１Ｄ−Ｆ】図４１Ａ〜図４１Ｅは、ＣＤ４＋ＭＳＬＮ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞が、グランザイム／パーフォリン依存性である効率的な細胞溶解機能を実証することを示す。（Ａ）ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞は、遅いがＣＤ８＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞と同様の細胞傷害性を示す。（Ｂ）ＣＤ２８共刺激は、ＣＤ４＋媒介性の細胞傷害性を増強する。（Ｃ）刺激されたＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞から得られたサイトカインリッチな上清は、ＣＤ８Ｍ２８ｚおよびＣＤ４Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞の両方の細胞傷害性を増強する。（Ｄ）ＣＡＲ  Ｔ細胞溶解性機能は、細胞傷害性顆粒の放出に依存する。バルク、ＣＤ４、またはＣＤ８  Ｍ２８ｚおよびＭｚ  Ｔ細胞を、１８時間、キレート剤エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）の有無のもとで共存培養した。（Ａ〜Ｄ）ビーズ精製されたＣＤ４＋またはＣＤ８＋ＭｚおよびＭ２８ｚ  Ｔ細胞の細胞傷害性。（Ｅ、左側）ＣＤ４＋ＣＡＲ  Ｔ細胞は、グランザイムＢを発現するが、ＣＤ８＋ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、反応速度は遅延している。グランザイムＢの細胞内ＦＡＣＳ分析は、休止期のＰＢＭＣ、ＰＨＡ刺激のブラスト、ならびにＭ２８ｚ、ＭｚおよびＰ２８ｚ  Ｔ細胞（ＭＳＬＮ＋で４時間または１８時間刺激された）で行った。（Ｅ、右側）ＣＤ２８共刺激は、グランザイムＢ発現を増強する。ヒストグラムは、ＭＳＬＮ＋刺激１８時間後の発現を示す。エラーバーは、±ＳＥＭに相当し、スチューデントｔ検定によって＊Ｐ＜０．０５である。
【図４２Ａ】図４２Ａ〜図４２Ｃは、胸膜内に投与されたＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏで単独で投与されたとき有効であり；ＣＤ８＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞と比較して有効性の増強を媒介し；および長期の機能的な持続性を確立することを示す。（Ａ）腫瘍負荷の進行を追跡するＢＬＩ。腫瘍注射の１８日後、マウスには、３×１０５（３×）、１×１０５（１×）、または３×１０４（０．３×）個のＣＡＲ＋Ｔ細胞のバルクのＭ２８ｚ（ｎ＝５）、ビーズでソートしたＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｍ２８ｚ（ｎ＝７）、またはＰ２８ｚ（ｎ＝４）のいずれかを投与した。（Ｂ）カプラン・マイヤー生存曲線。全ての用量で、ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞と比較して有効であった。ＣＤ４＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞の抗腫瘍有効性は、ソートされていないＣＡＲ＋Ｔ細胞のものと匹敵した。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントｔ検定による）。生のデータおよびＰ値は、補充的な物質で提供される。（Ｃ）腫瘍を再チャレンジされたマウスの腫瘍ＢＬＩ。単回投与の３×１０５（３×）ソートされていない（バルク）Ｍ２８ｚまたはＣＤ４＋ソートのＭ２８ｚ  Ｔ細胞の胸膜内投与の１９６日後、１×１０６個のＭＳＬＮ＋腫瘍細胞を、腹腔に注射した。持続するＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞は、腫瘍増殖を妨げた。
【図４２Ｂ−Ｃ】図４２Ａ〜図４２Ｃは、胸膜内に投与されたＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏで単独で投与されたとき有効であり；ＣＤ８＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞と比較して有効性の増強を媒介し；および長期の機能的な持続性を確立することを示す。（Ａ）腫瘍負荷の進行を追跡するＢＬＩ。腫瘍注射の１８日後、マウスには、３×１０５（３×）、１×１０５（１×）、または３×１０４（０．３×）個のＣＡＲ＋Ｔ細胞のバルクのＭ２８ｚ（ｎ＝５）、ビーズでソートしたＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｍ２８ｚ（ｎ＝７）、またはＰ２８ｚ（ｎ＝４）のいずれかを投与した。（Ｂ）カプラン・マイヤー生存曲線。全ての用量で、ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞と比較して有効であった。ＣＤ４＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞の抗腫瘍有効性は、ソートされていないＣＡＲ＋Ｔ細胞のものと匹敵した。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントｔ検定による）。生のデータおよびＰ値は、補充的な物質で提供される。（Ｃ）腫瘍を再チャレンジされたマウスの腫瘍ＢＬＩ。単回投与の３×１０５（３×）ソートされていない（バルク）Ｍ２８ｚまたはＣＤ４＋ソートのＭ２８ｚ  Ｔ細胞の胸膜内投与の１９６日後、１×１０６個のＭＳＬＮ＋腫瘍細胞を、腹腔に注射した。持続するＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞は、腫瘍増殖を妨げた。
【図４３】図４３Ａおよび図４３Ｂは、メソセリン標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞が、抗原特異的エフェクター機能を実証することを示す。（Ｂ）ＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクター機能のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける解析のために用いられる腫瘍細胞株のＦＡＣＳ分析。（Ｃ）Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、２〜５倍多い量のＴｈ１サイトカインを分泌した。
【図４４】図４４は、ここでは共存培養の１８時間後に示される、休止期のＰＢＭＣ、ＰＨＡ刺激のブラスト、およびＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＭＳＬＮ＋で刺激された）で行われた、グランザイムＡおよびＢの細胞内ＦＡＣＳ分析を示す。
【図４５Ａ】図４５Ａおよび図４５Ｂは、ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞溶解性機能が、標的抗原発現のレベルに比例することを示す。（Ａ）低（灰色）または高（黒）レベルのいずれかのメソセリンを用いて形質導入されたＭＳＴＯ−２１１Ｈ中皮腫の腫瘍細胞による表面メソセリン発現。アイソタイプの染色を参照のために含む。（Ｂ）Ｔ細胞およびメソセリン低または高標的のいずれかの、示したエフェクター対標的比での１８時間共存培養後、クロム放出によって測定されたＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞溶解性機能。
【図４５Ｂ】図４５Ａおよび図４５Ｂは、ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞溶解性機能が、標的抗原発現のレベルに比例することを示す。（Ａ）低（灰色）または高（黒）レベルのいずれかのメソセリンを用いて形質導入されたＭＳＴＯ−２１１Ｈ中皮腫の腫瘍細胞による表面メソセリン発現。アイソタイプの染色を参照のために含む。（Ｂ）Ｔ細胞およびメソセリン低または高標的のいずれかの、示したエフェクター対標的比での１８時間共存培養後、クロム放出によって測定されたＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞溶解性機能。
【図４６】図４６Ａおよび図４６Ｂは、フローサイトメトリーのゲーティングストラテジーを示す。（Ａ）ソートされたＣＤ４およびＣＤ８  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの分析に関しては、全ての試料を、純度が９５％を超えるまでソートした。（Ｂ）Ｔ細胞表現型解析は、適切な非形質導入対照を用いて（ＣＡＲ陽性のゲートを決定するため）、ならびにＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡについてゲートを設定するためのアイソタイプ対照を用いて行った。
【図４７Ａ−Ｂ】図４７Ａ〜図４７Ｅは、ＣＤ２８または４−１ＢＢ共刺激によるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、等価なエフェクターサイトカイン分泌および最初の抗原刺激の際のｉｎ  ｖｉｔｒｏの増殖を呈することが示す。（Ａ）第１および第２世代のＣＡＲ。（Ｂ）メソセリン（ＭＳＬＮ）標的化ＣＡＲは、ＣＤ３ζエンドドメインを、単独で（Ｍｚ、第１世代ＣＡＲ）またはＣＤ２８（Ｍ２８ｚ）もしくは４−１ＢＢ（ＭＢＢｚ）共刺激ドメインと組み合わせて（第２世代ＣＡＲ）含有する。前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）指向性ＣＡＲ（ＣＤ２８共刺激（Ｐ２８ｚ）による）およびＰＳＭＡ発現標的（ＰＳＭＡ＋）は、実験中に陰性対照として含まれる。ＣＹＴ、細胞質ドメイン；ＬＳ、リーダー配列；ＬＴＲ、長末端反復；ＳＡ、スプライスアクセプター；ＳＤ、スプライスドナー；ＴＭ、膜貫通。（Ｃ〜Ｅ）ＣＡＲ形質導入のＴ細胞の抗原特異的エフェクター機能。（Ｃ）クロム放出アッセイで測定した、ＭＳＬＮ発現標的（ＭＳＬＮ＋）（ただしＰＳＭＡ＋標的ではない）の溶解。（Ｄ）４−１ＢＢおよびＣＤ２８共刺激は、ＭＳＬＮ＋細胞とのＣＡＲ  Ｔ細胞の共存培養後、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイによって評価されるように、サイトカイン分泌を増強する。（Ｅ）Ｍ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲは、ＭＳＬＮ＋細胞での刺激後、堅調なＴ細胞蓄積を促進する。データは、３つの反復の平均±ＳＥＭ（Ｃ、Ｅ）に相当するか、または個々のポイントとしてプロットされる（Ｄ）。＊＊＊Ｐ＜０．００１、共刺激されたＣＡＲ  Ｔ細胞（Ｍ２８ｚまたはＭＢＢｚ）と第１世代の受容体（Ｍｚ）とを、スチューデントｔ検定によって比較して；有意差は、多重比較のためのボンフェローニ補正を用いて決定した。
【図４７Ｃ】図４７Ａ〜図４７Ｅは、ＣＤ２８または４−１ＢＢ共刺激によるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、等価なエフェクターサイトカイン分泌および最初の抗原刺激の際のｉｎ  ｖｉｔｒｏの増殖を呈することが示す。（Ａ）第１および第２世代のＣＡＲ。（Ｂ）メソセリン（ＭＳＬＮ）標的化ＣＡＲは、ＣＤ３ζエンドドメインを、単独で（Ｍｚ、第１世代ＣＡＲ）またはＣＤ２８（Ｍ２８ｚ）もしくは４−１ＢＢ（ＭＢＢｚ）共刺激ドメインと組み合わせて（第２世代ＣＡＲ）含有する。前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）指向性ＣＡＲ（ＣＤ２８共刺激（Ｐ２８ｚ）による）およびＰＳＭＡ発現標的（ＰＳＭＡ＋）は、実験中に陰性対照として含まれる。ＣＹＴ、細胞質ドメイン；ＬＳ、リーダー配列；ＬＴＲ、長末端反復；ＳＡ、スプライスアクセプター；ＳＤ、スプライスドナー；ＴＭ、膜貫通。（Ｃ〜Ｅ）ＣＡＲ形質導入のＴ細胞の抗原特異的エフェクター機能。（Ｃ）クロム放出アッセイで測定した、ＭＳＬＮ発現標的（ＭＳＬＮ＋）（ただしＰＳＭＡ＋標的ではない）の溶解。（Ｄ）４−１ＢＢおよびＣＤ２８共刺激は、ＭＳＬＮ＋細胞とのＣＡＲ  Ｔ細胞の共存培養後、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイによって評価されるように、サイトカイン分泌を増強する。（Ｅ）Ｍ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲは、ＭＳＬＮ＋細胞での刺激後、堅調なＴ細胞蓄積を促進する。データは、３つの反復の平均±ＳＥＭ（Ｃ、Ｅ）に相当するか、または個々のポイントとしてプロットされる（Ｄ）。＊＊＊Ｐ＜０．００１、共刺激されたＣＡＲ  Ｔ細胞（Ｍ２８ｚまたはＭＢＢｚ）と第１世代の受容体（Ｍｚ）とを、スチューデントｔ検定によって比較して；有意差は、多重比較のためのボンフェローニ補正を用いて決定した。
【図４７Ｄ−Ｅ】図４７Ａ〜図４７Ｅは、ＣＤ２８または４−１ＢＢ共刺激によるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、等価なエフェクターサイトカイン分泌および最初の抗原刺激の際のｉｎ  ｖｉｔｒｏの増殖を呈することが示す。（Ａ）第１および第２世代のＣＡＲ。（Ｂ）メソセリン（ＭＳＬＮ）標的化ＣＡＲは、ＣＤ３ζエンドドメインを、単独で（Ｍｚ、第１世代ＣＡＲ）またはＣＤ２８（Ｍ２８ｚ）もしくは４−１ＢＢ（ＭＢＢｚ）共刺激ドメインと組み合わせて（第２世代ＣＡＲ）含有する。前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）指向性ＣＡＲ（ＣＤ２８共刺激（Ｐ２８ｚ）による）およびＰＳＭＡ発現標的（ＰＳＭＡ＋）は、実験中に陰性対照として含まれる。ＣＹＴ、細胞質ドメイン；ＬＳ、リーダー配列；ＬＴＲ、長末端反復；ＳＡ、スプライスアクセプター；ＳＤ、スプライスドナー；ＴＭ、膜貫通。（Ｃ〜Ｅ）ＣＡＲ形質導入のＴ細胞の抗原特異的エフェクター機能。（Ｃ）クロム放出アッセイで測定した、ＭＳＬＮ発現標的（ＭＳＬＮ＋）（ただしＰＳＭＡ＋標的ではない）の溶解。（Ｄ）４−１ＢＢおよびＣＤ２８共刺激は、ＭＳＬＮ＋細胞とのＣＡＲ  Ｔ細胞の共存培養後、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイによって評価されるように、サイトカイン分泌を増強する。（Ｅ）Ｍ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲは、ＭＳＬＮ＋細胞での刺激後、堅調なＴ細胞蓄積を促進する。データは、３つの反復の平均±ＳＥＭ（Ｃ、Ｅ）に相当するか、または個々のポイントとしてプロットされる（Ｄ）。＊＊＊Ｐ＜０．００１、共刺激されたＣＡＲ  Ｔ細胞（Ｍ２８ｚまたはＭＢＢｚ）と第１世代の受容体（Ｍｚ）とを、スチューデントｔ検定によって比較して；有意差は、多重比較のためのボンフェローニ補正を用いて決定した。
【図４８Ａ】図４８Ａ〜図４８Ｃは、Ｍ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置されたマウスが、高用量では腫瘍根絶を示すが、低用量の処置では、Ｍ２８ｚで高率の腫瘍再発を生じることが示す。（Ａ）ｉｎ  ｖｉｖｏの生物発光イメージング（ＢＬＩ）を用いて、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃヌルマウスにおいて腫瘍負荷（ホタルルシフェラーゼ＋ＭＳＬＮ＋）をモニターした。胸膜腫瘍が樹立されたマウスを、単回投与の１ｅ５（Ｅ：Ｔ  １：３，０００）、８ｅ４（Ｅ：Ｔ１：３，７５０）、または５ｅ４（Ｅ：Ｔ  １：６，０００）Ｍ２８ｚまたはＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて処置した。（†）という記号は、マウスの死亡を示す。同じドナーを用いる２つの同様の実験を、例示のために組み合わせる。（Ｂ）マウスを、４ｅ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞（Ｅ：Ｔ  １：７，５００）で処理した。第１世代のＭｚ  ＣＡＲおよび陰性対照のＰ２８ｚが含まれる。（Ｃ）カプラン・マイヤー生存解析であって、４ｅ４  Ｍｚ（ｎ＝１３、赤）、Ｍ２８ｚ（ｎ＝１５、青）、ＭＢＢｚ（ｎ＝８、緑）、およびＰ２８ｚ（ｎ＝３、黒）ＣＡＲ  Ｔ細胞の胸膜内投与のｉｎ  ｖｉｖｏの有効性を比較する。Ｔ細胞投与後の中央生存の日数。生存曲線を、ログランク検定を用いて解析した。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。
【図４８Ｂ−Ｃ】図４８Ａ〜図４８Ｃは、Ｍ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置されたマウスが、高用量では腫瘍根絶を示すが、低用量の処置では、Ｍ２８ｚで高率の腫瘍再発を生じることが示す。（Ａ）ｉｎ  ｖｉｖｏの生物発光イメージング（ＢＬＩ）を用いて、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃヌルマウスにおいて腫瘍負荷（ホタルルシフェラーゼ＋ＭＳＬＮ＋）をモニターした。胸膜腫瘍が樹立されたマウスを、単回投与の１ｅ５（Ｅ：Ｔ  １：３，０００）、８ｅ４（Ｅ：Ｔ１：３，７５０）、または５ｅ４（Ｅ：Ｔ  １：６，０００）Ｍ２８ｚまたはＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて処置した。（†）という記号は、マウスの死亡を示す。同じドナーを用いる２つの同様の実験を、例示のために組み合わせる。（Ｂ）マウスを、４ｅ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞（Ｅ：Ｔ  １：７，５００）で処理した。第１世代のＭｚ  ＣＡＲおよび陰性対照のＰ２８ｚが含まれる。（Ｃ）カプラン・マイヤー生存解析であって、４ｅ４  Ｍｚ（ｎ＝１３、赤）、Ｍ２８ｚ（ｎ＝１５、青）、ＭＢＢｚ（ｎ＝８、緑）、およびＰ２８ｚ（ｎ＝３、黒）ＣＡＲ  Ｔ細胞の胸膜内投与のｉｎ  ｖｉｖｏの有効性を比較する。Ｔ細胞投与後の中央生存の日数。生存曲線を、ログランク検定を用いて解析した。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。
【図４９Ａ−Ｂ】図４９Ａ〜図４９Ｃは、Ｍ２８ｚおよびＭＢＢｚ処置のマウスが、同様の早期かつ長期のＣＡＲ  Ｔ細胞蓄積を示し、かつ腫瘍が進行しているＭ２８ｚ処置のマウスが、持続性のＣＡＲ  Ｔ細胞を含有することが示す。（Ａ）ＣＤ２８および４−１ＢＢ共刺激は、腫瘍内のＣＡＲ  Ｔ細胞蓄積を等しい程度まで増強する。左側のパネルは、単回投与の８ｅ４ＣＡＲ  Ｔ細胞の投与後の腫瘍ＢＬＩの結果を示す。６日後、Ｔ細胞を腫瘍から収集した；ｘは、Ｔ細胞カウントがデータポイントとして示されるマウスを示す。右側のパネルは、腫瘍組織１グラムあたりのＣＡＲ  Ｔ細胞絶対数を示す（＊Ｐ＜０．０５）。スチューデントｔ検定を行い、統計学的有意差は、多重比較のためにボンフェローニ補正を用いて決定した。（Ｂ）ＣＤ２８および４−１ＢＢ共刺激は、脾臓で測定した場合、ＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性を等しい程度まで増強する。脾臓細胞あたりのＣＡＲ  Ｔ細胞絶対数は、胸膜内投与のＣＡＲ  Ｔ細胞（８ｅ４）の７３日後に示される。左側のパネルは、腫瘍ＢＬＩの結果を示す；ｘは、Ｔ細胞カウントがデータポイントとして示されるマウスを示す（＊Ｐ＜０．０５）。スチューデントｔ検定を行い、統計学的有意差は、多重比較のためにボンフェローニ補正を用いて決定した。（Ｃ）低用量のＭ２８ｚ  Ｔ細胞（４ｅ４）で処置したマウスは、脾臓および腫瘍中の持続性のＣＡＲ  Ｔ細胞を伴う腫瘍再発を示す。左側のパネルは、腫瘍ＢＬＩの結果を示す。ｘで示されるマウス由来の脾臓および腫瘍を、収集して、ＦＡＣｓ解析（中央パネル）およびＴ細胞定量化（右側パネル）のために用いた。
【図４９Ｃ】図４９Ａ〜図４９Ｃは、Ｍ２８ｚおよびＭＢＢｚ処置のマウスが、同様の早期かつ長期のＣＡＲ  Ｔ細胞蓄積を示し、かつ腫瘍が進行しているＭ２８ｚ処置のマウスが、持続性のＣＡＲ  Ｔ細胞を含有することが示す。（Ａ）ＣＤ２８および４−１ＢＢ共刺激は、腫瘍内のＣＡＲ  Ｔ細胞蓄積を等しい程度まで増強する。左側のパネルは、単回投与の８ｅ４ＣＡＲ  Ｔ細胞の投与後の腫瘍ＢＬＩの結果を示す。６日後、Ｔ細胞を腫瘍から収集した；ｘは、Ｔ細胞カウントがデータポイントとして示されるマウスを示す。右側のパネルは、腫瘍組織１グラムあたりのＣＡＲ  Ｔ細胞絶対数を示す（＊Ｐ＜０．０５）。スチューデントｔ検定を行い、統計学的有意差は、多重比較のためにボンフェローニ補正を用いて決定した。（Ｂ）ＣＤ２８および４−１ＢＢ共刺激は、脾臓で測定した場合、ＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性を等しい程度まで増強する。脾臓細胞あたりのＣＡＲ  Ｔ細胞絶対数は、胸膜内投与のＣＡＲ  Ｔ細胞（８ｅ４）の７３日後に示される。左側のパネルは、腫瘍ＢＬＩの結果を示す；ｘは、Ｔ細胞カウントがデータポイントとして示されるマウスを示す（＊Ｐ＜０．０５）。スチューデントｔ検定を行い、統計学的有意差は、多重比較のためにボンフェローニ補正を用いて決定した。（Ｃ）低用量のＭ２８ｚ  Ｔ細胞（４ｅ４）で処置したマウスは、脾臓および腫瘍中の持続性のＣＡＲ  Ｔ細胞を伴う腫瘍再発を示す。左側のパネルは、腫瘍ＢＬＩの結果を示す。ｘで示されるマウス由来の脾臓および腫瘍を、収集して、ＦＡＣｓ解析（中央パネル）およびＴ細胞定量化（右側パネル）のために用いた。
【図５０Ａ−Ｂ】図５０Ａ〜図５０Ｄは、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏの抗原曝露後に消耗されるが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、優先的に、エフェクターサイトカイン分泌および細胞傷害性を保持することを示す。（Ａ）ＣＡＲ  Ｔ細胞の胸膜内投与の６日後、Ｍ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、腫瘍および脾臓から単離して、ｅｘ  ｖｉｖｏの抗原刺激に供した。（Ｂ）ｅｘ  ｖｉｖｏ刺激の際のクロム放出アッセイによって、Ｍ２８ｚにおける減少、ただし持続的なＭＢＢｚ細胞溶解性機能が実証される（Ｅ：Ｔ比  １：５）（Ｃ）サイトカイン分泌測定は、ＣＡＲ  Ｔ細胞によるエフェクターサイトカイン分泌の低下を示すが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、分泌をさらによく保持できる。（Ｄ）収集されたＣＡＲ  Ｔ細胞によるＧｚＢ、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−２発現のＲＴ−ＰＣＲ測定は、パネル（Ａ）および（Ｂ）におけるタンパク質レベル測定とよく相関する。データは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの未刺激のＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のｍＲＮＡ発現に対する倍数変化を示す。データは１条件あたり３つの個々のウェルの平均±ＳＥＭに相当する。スチューデントｔ検定を行って、統計学的有意差を、多重比較についてボンフェローニ補正を用いて決定した（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。結果を、２つの実験の各々に関して用いられるマウスの２つの別のコホートで再現する。
【図５０Ｃ】図５０Ａ〜図５０Ｄは、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏの抗原曝露後に消耗されるが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、優先的に、エフェクターサイトカイン分泌および細胞傷害性を保持することを示す。（Ａ）ＣＡＲ  Ｔ細胞の胸膜内投与の６日後、Ｍ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、腫瘍および脾臓から単離して、ｅｘ  ｖｉｖｏの抗原刺激に供した。（Ｂ）ｅｘ  ｖｉｖｏ刺激の際のクロム放出アッセイによって、Ｍ２８ｚにおける減少、ただし持続的なＭＢＢｚ細胞溶解性機能が実証される（Ｅ：Ｔ比  １：５）（Ｃ）サイトカイン分泌測定は、ＣＡＲ  Ｔ細胞によるエフェクターサイトカイン分泌の低下を示すが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、分泌をさらによく保持できる。（Ｄ）収集されたＣＡＲ  Ｔ細胞によるＧｚＢ、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−２発現のＲＴ−ＰＣＲ測定は、パネル（Ａ）および（Ｂ）におけるタンパク質レベル測定とよく相関する。データは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの未刺激のＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のｍＲＮＡ発現に対する倍数変化を示す。データは１条件あたり３つの個々のウェルの平均±ＳＥＭに相当する。スチューデントｔ検定を行って、統計学的有意差を、多重比較についてボンフェローニ補正を用いて決定した（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。結果を、２つの実験の各々に関して用いられるマウスの２つの別のコホートで再現する。
【図５０Ｄ】図５０Ａ〜図５０Ｄは、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏの抗原曝露後に消耗されるが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、優先的に、エフェクターサイトカイン分泌および細胞傷害性を保持することを示す。（Ａ）ＣＡＲ  Ｔ細胞の胸膜内投与の６日後、Ｍ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、腫瘍および脾臓から単離して、ｅｘ  ｖｉｖｏの抗原刺激に供した。（Ｂ）ｅｘ  ｖｉｖｏ刺激の際のクロム放出アッセイによって、Ｍ２８ｚにおける減少、ただし持続的なＭＢＢｚ細胞溶解性機能が実証される（Ｅ：Ｔ比  １：５）（Ｃ）サイトカイン分泌測定は、ＣＡＲ  Ｔ細胞によるエフェクターサイトカイン分泌の低下を示すが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、分泌をさらによく保持できる。（Ｄ）収集されたＣＡＲ  Ｔ細胞によるＧｚＢ、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−２発現のＲＴ−ＰＣＲ測定は、パネル（Ａ）および（Ｂ）におけるタンパク質レベル測定とよく相関する。データは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの未刺激のＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のｍＲＮＡ発現に対する倍数変化を示す。データは１条件あたり３つの個々のウェルの平均±ＳＥＭに相当する。スチューデントｔ検定を行って、統計学的有意差を、多重比較についてボンフェローニ補正を用いて決定した（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。結果を、２つの実験の各々に関して用いられるマウスの２つの別のコホートで再現する。
【図５１Ａ−Ｃ】図５１Ａ〜図５１Ｅは、ＣＡＲ  Ｔ細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏでの反復性の抗原刺激の際に消耗されるが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、優先的に、エフェクターサイトカイン分泌および細胞傷害性を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでかつｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍再チャレンジの際に保持することを示す。（Ａ）Ｍ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の両方とも、反復性の抗原刺激の際にｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖能力を保持している。Ｔ細胞をまた、細胞傷害性について、クロム放出アッセイによって、およびサイトカイン分泌について、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイによって試験した（Ｂ〜Ｄ）。（Ｂ）（左側）ＣＡＲ  Ｔ細胞は、第１刺激で等しい殺傷を、および反復性の抗原刺激の際に細胞溶解性機能の喪失を示したが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、クロム放出アッセイによって測定した場合、細胞溶解性機能をさらによく保持できる。（Ｃ）ＣＤ１０７ａ発現によって測定される細胞傷害性顆粒放出（第３刺激で示される）は、クロム放出アッセイと関連する（Ｂ）。データは、未刺激のＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＤ１０７ａ  ＭＦＩに対する倍数変化の平均±ＳＤ（三連）を示す。（Ｄ）サイトカイン分泌測定は、同様に、反復性の抗原遭遇の際にＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクター機能の喪失を示す；ここでも、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、それらの機能をさらによく保存できる。（Ｅ）等しく持続するが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、優れた機能的な持続性を示す。胸膜腫瘍根絶（単回投与の１ｅ５  ＣＡＲ  Ｔ細胞の後）の２８日後、１ｅ６  ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞を、胸膜腔に注射した（腫瘍再チャレンジ）。ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、全てのマウスで腫瘍増殖を妨げたが、腫瘍増殖および死亡が、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で最初に処置した４匹のマウスのうち２匹で観察された。スチューデントｔ検定を行い、統計学的有意差は、ボンフェローニ補正を用いて決定した（＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。データは、３つの反復の平均±ＳＥＭを示すか、または個々のポイントとしてプロットする。
【図５１Ｄ】図５１Ａ〜図５１Ｅは、ＣＡＲ  Ｔ細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏでの反復性の抗原刺激の際に消耗されるが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、優先的に、エフェクターサイトカイン分泌および細胞傷害性を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでかつｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍再チャレンジの際に保持することを示す。（Ａ）Ｍ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の両方とも、反復性の抗原刺激の際にｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖能力を保持している。Ｔ細胞をまた、細胞傷害性について、クロム放出アッセイによって、およびサイトカイン分泌について、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイによって試験した（Ｂ〜Ｄ）。（Ｂ）（左側）ＣＡＲ  Ｔ細胞は、第１刺激で等しい殺傷を、および反復性の抗原刺激の際に細胞溶解性機能の喪失を示したが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、クロム放出アッセイによって測定した場合、細胞溶解性機能をさらによく保持できる。（Ｃ）ＣＤ１０７ａ発現によって測定される細胞傷害性顆粒放出（第３刺激で示される）は、クロム放出アッセイと関連する（Ｂ）。データは、未刺激のＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＤ１０７ａ  ＭＦＩに対する倍数変化の平均±ＳＤ（三連）を示す。（Ｄ）サイトカイン分泌測定は、同様に、反復性の抗原遭遇の際にＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクター機能の喪失を示す；ここでも、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、それらの機能をさらによく保存できる。（Ｅ）等しく持続するが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、優れた機能的な持続性を示す。胸膜腫瘍根絶（単回投与の１ｅ５  ＣＡＲ  Ｔ細胞の後）の２８日後、１ｅ６  ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞を、胸膜腔に注射した（腫瘍再チャレンジ）。ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、全てのマウスで腫瘍増殖を妨げたが、腫瘍増殖および死亡が、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で最初に処置した４匹のマウスのうち２匹で観察された。スチューデントｔ検定を行い、統計学的有意差は、ボンフェローニ補正を用いて決定した（＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。データは、３つの反復の平均±ＳＥＭを示すか、または個々のポイントとしてプロットする。
【図５１Ｅ】図５１Ａ〜図５１Ｅは、ＣＡＲ  Ｔ細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏでの反復性の抗原刺激の際に消耗されるが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、優先的に、エフェクターサイトカイン分泌および細胞傷害性を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでかつｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍再チャレンジの際に保持することを示す。（Ａ）Ｍ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の両方とも、反復性の抗原刺激の際にｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖能力を保持している。Ｔ細胞をまた、細胞傷害性について、クロム放出アッセイによって、およびサイトカイン分泌について、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイによって試験した（Ｂ〜Ｄ）。（Ｂ）（左側）ＣＡＲ  Ｔ細胞は、第１刺激で等しい殺傷を、および反復性の抗原刺激の際に細胞溶解性機能の喪失を示したが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、クロム放出アッセイによって測定した場合、細胞溶解性機能をさらによく保持できる。（Ｃ）ＣＤ１０７ａ発現によって測定される細胞傷害性顆粒放出（第３刺激で示される）は、クロム放出アッセイと関連する（Ｂ）。データは、未刺激のＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＤ１０７ａ  ＭＦＩに対する倍数変化の平均±ＳＤ（三連）を示す。（Ｄ）サイトカイン分泌測定は、同様に、反復性の抗原遭遇の際にＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクター機能の喪失を示す；ここでも、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、それらの機能をさらによく保存できる。（Ｅ）等しく持続するが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、優れた機能的な持続性を示す。胸膜腫瘍根絶（単回投与の１ｅ５  ＣＡＲ  Ｔ細胞の後）の２８日後、１ｅ６  ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞を、胸膜腔に注射した（腫瘍再チャレンジ）。ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、全てのマウスで腫瘍増殖を妨げたが、腫瘍増殖および死亡が、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で最初に処置した４匹のマウスのうち２匹で観察された。スチューデントｔ検定を行い、統計学的有意差は、ボンフェローニ補正を用いて決定した（＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。データは、３つの反復の平均±ＳＥＭを示すか、または個々のポイントとしてプロットする。
【図５２Ａ−Ｂ】図５２Ａ〜図５２Ｆは、ＰＤ−１受容体を示し、そのリガンドはｉｎ  ｖｉｖｏで上方制御される。（Ａ）腫瘍浸潤性のＭ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、それらの投与６日後に阻害性受容体を発現するが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、低レベルのＰＤ−１を発現する。（Ｂ）胸膜内投与６日後の腫瘍浸潤性ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＴＩＬ）のＰＤ−１受容体発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）。（Ｃ）胸膜内投与６日後の腫瘍浸潤性ＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＤ４およびＣＤ８サブセットにおけるＰＤ−１のｍＲＮＡの相対的発現。データは、未刺激のＭ２８ｚ  Ｔ細胞のＰＤ−１のｍＲＮＡ発現に対する倍数変化で示す。（Ｄ）進行性腫瘍から単離された腫瘍浸潤性Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、阻害性受容体ＰＤ−１、Ｔｉｍ−３、およびＬａｇ−３を発現する。（Ｅ）Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置されたマウスから収集した単独細胞の腫瘍懸濁物は、高レベルのＰＤ−１結合性リガンドを発現する。（Ｆ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の中皮腫の腫瘍細胞は、ＰＤ−１受容体に関するリガンド（ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２）を発現し、発現はさらに、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αとともに２４時間インキュベーションした後に上方制御される。
【図５２Ｃ−Ｄ】図５２Ａ〜図５２Ｆは、ＰＤ−１受容体を示し、そのリガンドはｉｎ  ｖｉｖｏで上方制御される。（Ａ）腫瘍浸潤性のＭ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、それらの投与６日後に阻害性受容体を発現するが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、低レベルのＰＤ−１を発現する。（Ｂ）胸膜内投与６日後の腫瘍浸潤性ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＴＩＬ）のＰＤ−１受容体発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）。（Ｃ）胸膜内投与６日後の腫瘍浸潤性ＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＤ４およびＣＤ８サブセットにおけるＰＤ−１のｍＲＮＡの相対的発現。データは、未刺激のＭ２８ｚ  Ｔ細胞のＰＤ−１のｍＲＮＡ発現に対する倍数変化で示す。（Ｄ）進行性腫瘍から単離された腫瘍浸潤性Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、阻害性受容体ＰＤ−１、Ｔｉｍ−３、およびＬａｇ−３を発現する。（Ｅ）Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置されたマウスから収集した単独細胞の腫瘍懸濁物は、高レベルのＰＤ−１結合性リガンドを発現する。（Ｆ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の中皮腫の腫瘍細胞は、ＰＤ−１受容体に関するリガンド（ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２）を発現し、発現はさらに、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αとともに２４時間インキュベーションした後に上方制御される。
【図５２Ｅ−Ｆ】図５２Ａ〜図５２Ｆは、ＰＤ−１受容体を示し、そのリガンドはｉｎ  ｖｉｖｏで上方制御される。（Ａ）腫瘍浸潤性のＭ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、それらの投与６日後に阻害性受容体を発現するが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、低レベルのＰＤ−１を発現する。（Ｂ）胸膜内投与６日後の腫瘍浸潤性ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＴＩＬ）のＰＤ−１受容体発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）。（Ｃ）胸膜内投与６日後の腫瘍浸潤性ＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＤ４およびＣＤ８サブセットにおけるＰＤ−１のｍＲＮＡの相対的発現。データは、未刺激のＭ２８ｚ  Ｔ細胞のＰＤ−１のｍＲＮＡ発現に対する倍数変化で示す。（Ｄ）進行性腫瘍から単離された腫瘍浸潤性Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、阻害性受容体ＰＤ−１、Ｔｉｍ−３、およびＬａｇ−３を発現する。（Ｅ）Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置されたマウスから収集した単独細胞の腫瘍懸濁物は、高レベルのＰＤ−１結合性リガンドを発現する。（Ｆ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の中皮腫の腫瘍細胞は、ＰＤ−１受容体に関するリガンド（ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２）を発現し、発現はさらに、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αとともに２４時間インキュベーションした後に上方制御される。
【図５３Ａ−Ｃ】図５３Ａ〜図５３Ｄは、ＰＤ−Ｌ１がＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクター機能を阻害することを示す。（Ａ）３Ｔ３線維芽細胞を形質導入して、メソセリン単独を発現するか（ＭＳＬＮ＋、左側）またはＰＤ−Ｌ１に加えてＭＳＬＮを共発現する（ＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋、右側）。（Ｂ〜Ｄ）Ｍ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクター機能を、３Ｔ３  ＭＳＬＮ＋またはＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋標的で刺激した後に評価した。ＰＤ−Ｌ１は、反復性の抗原刺激の際にＭ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞蓄積（Ｂ）、ＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋腫瘍細胞での２回の刺激後の細胞溶解性機能（Ｃ）、ならびに第１刺激の際のＴｈ１エフェクターサイトカイン分泌（Ｄ）を阻害する。データは、３回の反復の平均±ＳＥＭを示すか、または個々のポイントとしてプロットする。
【図５３Ｄ】図５３Ａ〜図５３Ｄは、ＰＤ−Ｌ１がＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクター機能を阻害することを示す。（Ａ）３Ｔ３線維芽細胞を形質導入して、メソセリン単独を発現するか（ＭＳＬＮ＋、左側）またはＰＤ−Ｌ１に加えてＭＳＬＮを共発現する（ＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋、右側）。（Ｂ〜Ｄ）Ｍ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクター機能を、３Ｔ３  ＭＳＬＮ＋またはＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋標的で刺激した後に評価した。ＰＤ−Ｌ１は、反復性の抗原刺激の際にＭ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞蓄積（Ｂ）、ＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋腫瘍細胞での２回の刺激後の細胞溶解性機能（Ｃ）、ならびに第１刺激の際のＴｈ１エフェクターサイトカイン分泌（Ｄ）を阻害する。データは、３回の反復の平均±ＳＥＭを示すか、または個々のポイントとしてプロットする。
【図５４】図５４は、Ｍｚ、Ｍ２８ｚ、およびＭＢＢｚ  ＣＡＲを発現するためのヒトＴ細胞の効率的なレトロウイルス形質導入を示す。（上部）示されるのは、遺伝子導入４日後の代表的なＦＡＣＳ分析である。蛍光マイナスワン染色を用いて、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染色によって生きていない細胞を除外した後に陽性ゲートをセットした。全ての実験では、５０％〜７０％のＣＡＲ形質導入効率を有するＴ細胞を用い；Ｔ細胞群の間の形質導入パーセンテージは、お互いの５％内であった。（下側）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方のＴ細胞サブセットを効率的に形質導入した。ＣＡＲ  Ｔ細胞のゲーティング後のＣＤ４＋およびＣＤ８＋のパーセンテージを示す。
【図５５】図５５は、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較してより消耗された、より強力な表現型を発現することを示す。４−１ＢＢおよびＣＤ２８共刺激Ｔ細胞を、反復性の抗原刺激で増殖させ、ｍＲＮＡを抽出して第３刺激２０時間後ＲＴ−ＰＣＲ解析に供した。データは、ＣＤ４＋未形質導入のＴ細胞のｍＲＮＡ発現に対する倍数変化で示される。ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、より高レベルのＥＯＭＥＳ（Ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ）およびＴＢＸ２１（Ｔ−ｂｅｔ）、ならびに低レベルのＰＤＣＤ１（ＰＤ−１）およびＦＯＸＰ３（Ｆｏｘｐ３）を発現する。全ての比較はＰ＜０．００１で有意であった。結果は、異なるドナーを用いる３つの別の実験で同様であった。
【図５６−１】図５６は、Ｍ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、他の阻害性受容体とともにＰＤ−１を共発現することを示す。腫瘍浸潤性のＭ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、胸膜腫瘍保有マウスに対する胸膜内投与６日後に収集した。細胞を、ＰＤ−１の抗体およびＬａｇ−３（左側）またはＴｉｍ−３（右側）のいずれかを用いて同時染色して、フローサイトメトリーによって分析した。アイソタイプ染色対照（上部）を用いて陽性のゲートを確立した。
【図５６−２】図５６は、Ｍ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、他の阻害性受容体とともにＰＤ−１を共発現することを示す。腫瘍浸潤性のＭ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、胸膜腫瘍保有マウスに対する胸膜内投与６日後に収集した。細胞を、ＰＤ−１の抗体およびＬａｇ−３（左側）またはＴｉｍ−３（右側）のいずれかを用いて同時染色して、フローサイトメトリーによって分析した。アイソタイプ染色対照（上部）を用いて陽性のゲートを確立した。
【図５７−１】図５７は、種々のがんおよび正常細胞でのＭＳＬＮ発現を示す。
【図５７−２】図５７は、種々のがんおよび正常細胞でのＭＳＬＮ発現を示す。
【図５８】図５８は、種々のがんおよび正常細胞での１細胞あたりのＭＳＬＮ分子の定量を示す。
【図５９】図５９は、種々のがんおよび正常細胞でのｍＲＮＡ  ＭＳＬＮ発現レベルを示す。
【図６０】図６０は、種々のがんおよび正常細胞でのＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性を示す。
【図６１】図６１は、外因性のＩＬ−２の存在下での反復性の抗原刺激後のＣＡＲ  Ｔ細胞蓄積を示す。
【図６２】図６２は、外因性のＩＬ−２の非存在下での反復性の抗原刺激後のＣＡＲ  Ｔ細胞蓄積を示す。
【図６３Ａ−Ｂ】図６３Ａ〜図６３Ｃは、肺がんモデルにおけるＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏの有効性を示す。（Ａ）試験設計。（Ｂ）生物発光による腫瘍増殖解析（ＢＬＩ）。（Ｃ）生存解析。
【図６３Ｃ】図６３Ａ〜図６３Ｃは、肺がんモデルにおけるＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏの有効性を示す。（Ａ）試験設計。（Ｂ）生物発光による腫瘍増殖解析（ＢＬＩ）。（Ｃ）生存解析。
【図６４Ａ−Ｂ】図６４Ａ〜図６４Ｄは、肺がんモデルにおけるＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏの蓄積を示す。（Ａ）試験設計。（Ｂ〜Ｄ）ＢＬＩによるＴ細胞蓄積解析。
【図６４Ｃ−Ｄ】図６４Ａ〜図６４Ｄは、肺がんモデルにおけるＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏの蓄積を示す。（Ａ）試験設計。（Ｂ〜Ｄ）ＢＬＩによるＴ細胞蓄積解析。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
ここで開示される主題は、概して、メソセリン標的化キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。１つの限定されない例では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、細胞外抗原結合性ドメインは、ヒトメソセリンと、約１ｎＭ〜約２５ｎＭの結合アフィニティー（Ｋｄ）で特異的に結合する。ここで開示される主題はまた、メソセリン標的化ＣＡＲを発現する免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、ヒト胚幹細胞およびリンパ球系細胞に分化し得る多能性幹細胞）ならびに新生物および他の病理を治療するためのこのような免疫応答性細胞を使用する方法を提供する。悪性細胞は、免疫認識および排除から自身を保護する一連の機序を発達させる。本アプローチは、腫瘍根絶のために腫瘍微小環境内に免疫原性を提供し、従来の養子Ｔ細胞療法を上回る大幅な進歩に相当する。
【００２６】
Ｉ．定義
特に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明において使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する：Singleton  et  al.,  Dictionary  of  Microbiology  and  Molecular  Biology  (2nd  ed.  1994)；The  Cambridge  Dictionary  of  Science  and  Technology  (Walker  ed.,  1988)；The  Glossary  of  Genetics,  5th  Ed.,  R.  Rieger  et  al.  (eds.),  Springer  Verlag  (1991)；およびHale  &  Marham,  The  Harper  Collins  Dictionary  of  Biology  (1991)。本明細書において、以下の用語は、特に別に明記されない限り、以下のそれらに帰する意味を有する。
【００２７】
本明細書において、用語「約」または「およそ」は、当業者によって決定されるような特定の値の許容される誤差範囲内を意味し、これは、幾分かは、値が測定されるか、または決定される方法、すなわち、測定系の制限に応じて変わる。例えば、「約」は、当技術分野における実施あたり、３または３を超える標準偏差内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、好ましくは最大１０％、より好ましくは最大５％、より好ましくはさらに最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に、生物学的系またはプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。
【００２８】
本明細書において、用語「細胞集団」は、同様のまたは異なる表現型を発現する少なくとも２つの細胞の群を指す。限定されない例では、細胞集団は、同様のまたは異なる表現型を発現する、少なくとも約１０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００個の細胞を含み得る。
【００２９】
本明細書において、用語「抗体」は、インタクトな抗体分子だけでなく、免疫原結合能力を保持する抗体分子の断片も意味する。このような断片はまた、当技術分野で周知であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で常用されている。したがって、本明細書において、用語「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン分子だけでなく、周知の活性断片Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂも意味する。インタクトな抗体のＦｅ断片を欠くＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片は、循環からより迅速に消え、より少ない、インタクトな抗体の非特異的組織結合を有し得る（Wahl  et  al.,  J.  Nucl.  Med.  24:316-325  (1983)）。本発明の抗体は、全天然抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、一本鎖Ｖ領域断片（ｓｃＦｖ）、融合ポリペプチドおよび非従来型抗体を含む。
【００３０】
本明細書において、用語「一本鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ」は、ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を形成するように共有結合によって連結している免疫グロブリン（例えば、マウスまたはヒト）の重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）は、直接連結しているか、またはＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端、もしくはＶＨのＣ末端とＶＬのＮ末端をつなぐペプチドをコードするリンカー（例えば、１０、１５、２０、２５個のアミノ酸）によって連結されている。リンカーは、普通、可動性のためにグリシン、ならびに溶解度のためにセリンまたはトレオニンに富んでいる。リンカーは、細胞外抗原結合性ドメインの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を連結し得る。１つの限定されない例では、リンカーは、以下に提供されるような配列番号１７に示される配列を有するアミノ酸を含む。
GGGGSGGGGSGGGGS[配列番号17]。
【００３１】
一実施形態では、配列番号１７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、以下に提供される配列番号１８に示されている：
GGAGGTGGAGGCTCAGGAGGAGGAGGCAGTGGAGGTGGTGGGTCA[配列番号18]。
【００３２】
別の実施形態では、配列番号１７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、以下に提供される配列番号１９に示されている。
GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCA[配列番号19]。
【００３３】
定常領域の除去およびリンカーの導入にもかかわらず、ｓｃＦｖタンパク質は、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。一本鎖Ｆｖポリペプチド抗体は、Huston,  et  al.（Proc.  Nat.  Acad.  Sci.  USA,  85:5879-5883,  1988）によって記載されるようなＶＨおよびＶＬをコードする配列を含む核酸から発現され得る。米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，１３２，４０５号および同第４，９５６，７７８号ならびに米国特許公開第２００５０１９６７５４号および同第２００５０１９６７５４号も参照のこと。阻害活性を有するアンタゴニストｓｃＦｖが記載されている（例えば、Zhao  et  al.,  Hyrbidoma  (Larchmt)  2008  27(6):455-51；Peter  et  al.,  J  Cachexia  Sarcopenia  Muscle  2012  August  12；Shieh  et  al.,  J  Imunol  2009  183(4):2277-85；Giomarelli  et  al.,  Thromb  Haemost  2007  97(6):955-63；Fife  eta.,  J  Clin  Invst  2006  116(8):2252-61；Brocks  et  al.,  Immunotechnology  1997  3(3):173-84；Moosmayer  et  al.,  Ther  Immunol  1995  2(10:31-40)を参照のこと。刺激活性を有するアゴニストｓｃＦｖが記載されている（例えば、Peter  et  al.,  J  Bioi  Chern  2003  25278(38):36740-7；Xie  et  al.,  Nat  Biotech  1997  15(8):768-71；Ledbetter  et  al.,  Crit  Rev  Immunol  1997  17(5-6):427-55；Ho  et  al.,  BioChim  Biophys  Acta  2003  1638(3):257-66を参照のこと）。
【００３４】
本明細書において、「Ｆ（ａｂ）」は、抗原と結合するが、一価であり、Ｆｃ部分を有さない抗体構造の断片を指し、例えば、酵素パパインによって消化された抗体は、２つのＦ（ａｂ）断片およびＦｃ断片（例えば、重（Ｈ）鎖定常領域；抗原と結合しないＦｃ領域）をもたらす。
【００３５】
本明細書において、「Ｆ（ａｂ’）２」は、全ＩｇＧ抗体のペプシン消化によって生じた抗体断片を指し、この断片は、２つの抗原結合（ａｂ’）（二価）領域を有し、各（ａｂ’）領域は、２つの別個のアミノ酸鎖を含み、Ｈ鎖および軽（Ｌ）鎖の一部は、抗原を結合するためにＳ−Ｓ結合によって連結しており、残りのＨ鎖部分が一緒に連結している。「Ｆ（ａｂ’）２」断片は、２つの個別のＦａｂ’断片に分けることができる。
【００３６】
本明細書において、用語「ベクター」は、適切な制御エレメントと会合すると複製可能であり、遺伝子配列を細胞中に導入できる、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどの任意の遺伝要素を指す。したがって、この用語は、クローニングおよび発現媒体ならびにウイルスベクターおよびプラスミドベクターを含む。
【００３７】
本明細書において、用語「発現ベクター」は、特定の宿主生物中に、所望のコード配列および作動可能に連結されたコード配列の発現のために必要な適当な核酸配列を含有する組換え核酸配列、すなわち、組換えＤＮＡ分子を指す。原核生物における発現のために必要な核酸配列は、普通、プロモーター、オペレーター（必要に応じて）およびリボソーム結合部位を含み、他の配列と一緒であることが多い。真核細胞は、プロモーター、エンハンサーならびに終結およびポリアデニル化シグナルを利用することがわかっている。
【００３８】
本明細書において、用語「アフィニティー」は、結合力の尺度を意味する。理論に捉われるものではないが、アフィニティーは、抗体結合部位および抗原決定基の間の立体化学的かみ合いの親密性、それらの間の接触面積の大きさならびに荷電基および疎水基の分布に応じて変わる。アフィニティーは、用語「アビディティー」も含み、これは、可逆性複合体の形成後の抗原−抗体結合の力を指す。アフィニティーを算出するための結合実験の使用を含む、抗体の抗原に対するアフィニティーを算出するための方法は、当技術分野で公知である。機能アッセイ（例えば、フローサイトメトリーアッセイ）における抗体活性もまた、抗体アフィニティーを反映する。抗体およびアフィニティーは、表現型によって特徴付けられ、機能アッセイ（例えば、フローサイトメトリーアッセイ）を使用して比較され得る。
【００３９】
本発明の方法において有用な核酸分子として、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子が挙げられる。このような核酸分子は、内因性核酸配列と１００％同一であることを必要としないが、通常、実質的な同一性を示す。内因性配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、通常、二本鎖核酸分子の少なくとも一方の鎖とハイブリダイズ可能である。「ハイブリダイズする」は、ストリンジェンシーの種々の条件下で、相補的ポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書において記載される遺伝子）またはその一部の間で、対を形成して、二本鎖分子を形成することを意味する（例えば、Wahl,  G.  M.  and  S.  L.  Berger  (1987)  Methods  Enzymol.  152:399；Kimmel,  A.  R.  (1987)  Methods  Enzymol.  152:507を参照のこと）。
【００４０】
例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約７５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび７５ｍＭクエン酸三ナトリウム未満、好ましくは約５００ｍＭ  ＮａＣｌおよび５０ｍＭクエン酸三ナトリウム未満、より好ましくは約２５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２５ｍＭクエン酸三ナトリウム未満となる。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えば、ホルムアミドの不在下で得ることができ、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約３５％のホルムアミド、より好ましくは少なくとも約５０％のホルムアミドの存在下で得ることができる。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約３０℃、より好ましくは少なくとも約３７℃、最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度を含む。ハイブリダイゼーション時間、界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の濃度などのさらなるパラメータを変えることならびにキャリアーＤＮＡを含めることまたは排除することは、当業者に周知である。必要に応じて、これらの種々の条件を組み合わせることによって種々のレベルのストリンジェンシーが達成される。好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび１％ＳＤＳ中、３０℃で起こる。より好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、３５％ホルムアミドおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中、３７℃で起こる。最も好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミドおよび２００μｇ／ｍｌ  ｓｓＤＮＡ中、４２℃で起こる。これらの条件に対する有用な変動は、当業者にとって容易に明らかであろう。
【００４１】
ほとんどの適用について、ハイブリダイゼーションに続く洗浄ステップもまた、ストリンジェンシーを変える。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度によって、および温度によって規定され得る。上記のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を低下させることによって、または温度を増大することによって増大することができる。例えば、洗浄ステップのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約３０ｍＭ  ＮａＣｌおよび３ｍＭクエン酸三ナトリウム未満、最も好ましくは約１５ｍＭ  ＮａＣｌおよび１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム未満となる。洗浄ステップのストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約２５℃、より好ましくは少なくとも約４２℃、さらにより好ましくは少なくとも約６８℃の温度を含むであろう。好ましい実施形態では、洗浄ステップは、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳ中、２５℃で起こる。より好ましい実施形態では、洗浄ステップは、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳ中、４２℃で起こる。より好ましい実施形態では、洗浄ステップは、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳ中、６８℃で起こる。これらの条件に対するさらなる変動は、当業者には容易に明らかであろう。ハイブリダイゼーション技術は、当業者に周知であり、例えば、Benton  and  Davis  (Science  196:180,  1977)；Grunstein  and  Rogness  (Proc.  Natl.  Acad.  Sci.,  USA  72:3961,  1975)；Ausubel  et  al.  (Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Wiley  Interscience,  New  York,  2001)；Berger  and  Kimmel  (Guide  to  Molecular  Cloning  Techniques,  1987,  Academic  Press,  New  York)；およびSambrook  et  al.,  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  New  Yorkに記載されている。
【００４２】
「実質的に同一の」は、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれか１種）または核酸配列（例えば、本明細書において記載される核酸配列のいずれか１種）に対して少なくとも５０％の同一性を示す、ポリペプチドまたは核酸分子を意味する。好ましくは、このような配列は、比較のために使用される配列に対してアミノ酸レベルまたは核酸で、少なくとも６０％、より好ましくは８０％または８５％、より好ましくは９０％、９５％またはさらには９９％同一である。
【００４３】
配列同一性は、通常、配列解析ソフトウェア（例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ、１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．５３７０５の配列解析ソフトウェアパッケージ、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰまたはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を使用して測定される。このようなソフトウェアは、種々の置換、欠失および／または他の修飾に相同性の程度を割り当てることによって同一または同様の配列をマッチさせる。同一性の程度を決定する例示的アプローチでは、ＢＬＡＳＴプログラムが使用され得、密接に関連する配列を示すｅ−３からｅ−１００の間の確率スコアを有する。
【００４４】
本明細書において、用語「類似体」は、参照ポリペプチドまたは核酸分子の機能を有する構造的に関連するポリペプチドまたは核酸分子を指す。
【００４５】
本明細書において、用語「リガンド」は、受容体と結合する分子を指す。特に、リガンドは、別の細胞上の受容体と結合し、細胞対細胞認識および／または相互作用を可能にする。
【００４６】
本明細書において、用語「疾患」は、細胞、組織または臓器の正常な機能に損傷を与える、またはそれに干渉する任意の状態または障害を指す。疾患の例として、細胞の新生物または病原体感染が挙げられる。
【００４７】
本明細書において、用語「有効量」は、治療効果を有するのに十分な量を指す。一実施形態では、「有効量」は、新生物の継続した増殖、成長または転移（例えば、浸潤または遊走）を停止、寛解または阻害するのに十分な量である。
【００４８】
本明細書において、用語「内因性」は、細胞または組織において通常発現される核酸分子またはポリペプチドを指す。
【００４９】
本明細書において、用語「外因性」は、細胞中に内因的に存在しないか、または過剰発現された場合に得られる機能効果を達成するのに十分なレベルで存在しない核酸分子またはポリペプチドを指す。したがって、用語「外因性」は、外来、異種および過剰発現された核酸分子およびポリペプチドなどの、細胞において発現される任意の組換え核酸分子またはポリペプチドを包含する。
【００５０】
本明細書において、用語「異種核酸分子またはポリペプチド」は、細胞または細胞から得られた試料中に通常は存在しない核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子）またはポリペプチドを指す。この核酸は、別の生物に由来するものであり得るか、または例えば、細胞もしくは試料において通常は発現されないｍＲＮＡ分子であり得る。
【００５１】
本明細書において、用語「免疫応答性細胞」は、免疫応答において機能する細胞またはその前駆体もしくは後代を指す。
【００５２】
本明細書において、用語「調節する」は、正または負に変更することを指す。例示的調節として、約１％、約２％、約５％、約１０％、約２５％、約５０％、約７５％または約１００％の変化が挙げられる。
【００５３】
本明細書において、用語「増大する」は、これらに限定されないが、約５％、約１０％、約２５％、約３０％、約５０％、約７５％または約１００％正に変更することを含め、少なくとも約５％正に変更することを指す。
【００５４】
本明細書において、用語「低減する」は、これらに限定されないが、約５％、約１０％、約２５％、約３０％、約５０％、約７５％または約１００％負に変更することを含め、少なくとも約５％負に変更することを指す。
【００５５】
本明細書において、用語「単離された細胞」は、細胞に天然に付随する分子成分および／または細胞成分から分離されている細胞を指す。
【００５６】
本明細書において、用語「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」は、その天然状態において見られるような、それに通常付随する成分を、変動する程度に含まない材料を指す。「単離する」は、元の供給源または周囲からの分離の程度を示す。「精製する」は、単離よりも高い分離の程度を示す。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、任意の不純物が、タンパク質の生物学的特性に実質的に影響を及ぼさず、他の有害な結果を引き起こさないよう、他の材料を十分に含まない。すなわち、本発明の核酸またはペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって製造された場合には、細胞性材料、ウイルス材料もしくは培養培地、または化学的に合成された場合には、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない場合に精製されている。純度および均一性は、通常、分析的化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高性能液体クロマトグラフィーを使用して決定される。用語「精製された」は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲルにおいて本質的に１つのバンドを生じさせることを示し得る。修飾、例えば、リン酸化またはグリコシル化に付され得るタンパク質については、種々の修飾が種々の単離されたタンパク質を生じさせ得、これは、別個に精製され得る。
【００５７】
本明細書において、用語「病原体」は、疾患を引き起こすことが可能なウイルス、細菌、真菌、寄生生物または原虫を指す。
【００５８】
例示的ウイルスとして、これらに限定されないが、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ＨＩＶ−１（ＨＤＴＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶＥもしくはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶとも称される、またはＨＩＶ−ＩＩＩ、およびＨＩＶ−ＬＰなどの他の分離菌などのヒト免疫不全ウイルス；Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ（例えば、胃腸炎を引きおこす株）；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、コロナウイルス）；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、水泡性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、エボラウイルス）；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、インフルエンザウイルス）；Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ハンタンウイルス、ブンガ（bunga）ウイルス、フレボウイルスおよびナイラ（Naira）ウイルス）；Ａｒｅｎａ  ｖｉｒｉｄａｅ（出血熱ウイルス）；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、レオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ（Ｂ型肝炎ウイルス）；Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ（パルボウイルス）；Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ（ほとんどのアデノウイルス）；Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス；Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびＩｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、アフリカブタ熱ウイルス）；および未分類ウイルス（例えば、デルタ肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損型サテライトであると考えられる）、非Ａ、非Ｂ型肝炎の病原体（クラス１＝内部伝染した；クラス２＝非経口的に伝染した（すなわち、Ｃ型肝炎）；ノーウォークおよび関連ウイルスならびにアストロウイルス）が挙げられる。
【００５９】
例示的細菌として、これらに限定されないが、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの種およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａの種が挙げられる。感染性細菌の具体例として、これらに限定されないが、Helicobacter  pyloris、Borelia  burgdorferi、Legionella  pneumophilia、Mycobacteria  sps(例えば、M.  tuberculosis、M.  avium、M.  intracellulare、M.  kansaii、M.  gordonae)、Staphylococcus  aureus、Neisseria  gonorrhoeae、Neisseria  meningitidis、Listeria  monocytogenes、Streptococcus  pyogenes（Ａ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Streptococcus  agalactiae  (Ｂ群Streptococcus)、Streptococcus（緑色群）、Streptococcus  faecalis、Streptococcus  bovis、Streptococcus（嫌気性種）、Streptococcus  pneumoniae、病原性  Campylobacter  sp.、Enterococcus  sp.、Haemophilus  influenzae、Bacillus  antracis、corynebacterium  diphtheriae、corynebacterium  sp.、Erysipelothrix  rhusiopathiae、Clostridium  perfringers、Clostridium  tetani、Enterobacter  aerogenes、Klebsiella  pneumoniae、Pasturella  multocida、Bacteroides  sp.、Fusobacterium  nucleatum、Streptobacillus  moniliformis、Treponema  pallidium、Treponema  pertenue、Leptospira、RickettsiaおよびActinomyces  israelliが挙げられる。
【００６０】
本明細書において、用語「受容体」は、１種または複数種のリガンドと選択的に結合する細胞膜上に存在するポリペプチドまたはその一部を指すものとする。
【００６１】
本明細書において、用語「認識する」は、標的と選択的に結合することを意味する。ウイルスを認識するＴ細胞は、通常、ウイルスによって発現された抗原と結合する受容体を発現する。
【００６２】
本明細書において、用語「参照」または「対照」は、比較の標準を意味する。例えば、ＣＡＲおよびｓｃＦｖを発現する細胞によるｓｃＦｖ抗原結合のレベルが、ＣＡＲのみを発現する対応する細胞におけるｓｃＦｖ抗原結合のレベルと比較され得る。
【００６３】
本明細書において、用語「分泌された」は、小胞体、ゴルジ体による分泌経路によって、および細胞の細胞膜で一過性に融合し、細胞の外側にタンパク質を放出する小胞として細胞から放出されるポリペプチドを意味する。
【００６４】
本明細書において、用語「特異的に結合する」または「と特異的に結合する」または「特異的に標的とする」は、目的の生体分子（例えば、ポリペプチド）を認識し、結合するが、本発明のポリペプチドを天然に含む試料、例えば、生体試料中の他の分子を実質的に認識および結合しないポリペプチドまたはその断片を意味する。
【００６５】
本明細書において、用語「治療すること」または「治療」は、治療されている個体または細胞の疾患経過を変更しようとする臨床的介入を指し、予防または臨床病理の経過の間のいずれかのために実施され得る。治療の治療効果として、限定するものではないが、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的病理学的帰結の減少、転移の予防、疾患進行速度の低減、疾患状態の寛解または緩和および緩解または予後の改善が挙げられる。疾患または障害の進行を予防することによって、治療は、罹患した、もしくは診断を受けた被験体または障害を有すると疑われる被験体において、障害による増悪を予防することができるが、また、治療は、障害のリスクにあるか、または障害を有すると疑われる被験体において、障害または障害の症状の発生を予防し得る。
【００６６】
本明細書において、用語「被験体」は、これらに限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類など（例えば、特定の治療のレシピエントであるべき、または細胞が回収される）を含めた、任意の動物（例えば、哺乳動物）を指す。
【００６７】
ＩＩ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
【００６８】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、免疫エフェクター細胞に目的の特異性を移植または付与する操作された受容体である。ＣＡＲは、Ｔ細胞にモノクローナル抗体の特異性を移植するために使用され得、それらのコード配列の導入は、レトロウイルスベクターによって促進される。
【００６９】
３世代のＣＡＲがある。「第１世代」ＣＡＲは、通常、膜貫通ドメインと融合している、Ｔ細胞受容体鎖の細胞質／細胞内ドメインと融合している細胞外抗原結合性ドメイン（例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ））からなる。「第１世代」ＣＡＲは、通常、内因性ＴＣＲからのシグナルの主な伝達物質であるＣＤ３ξ鎖由来の細胞内ドメインを有する。「第１世代」ＣＡＲは、ｄｅ  ｎｏｖｏ抗原認識を提供し、ＨＬＡ媒介性抗原提示とは独立した、単一融合分子におけるそれらのＣＤ３ζ鎖シグナル伝達ドメインによるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞両方の活性化を引き起こし得る。「第２世代」ＣＡＲは、種々の共刺激分子（例えば、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０）に由来する細胞内ドメインを、ＣＡＲの細胞質テールに付加して、Ｔ細胞に対するさらなるシグナルを提供する。「第２世代」ＣＡＲは、共刺激（例えば、ＣＤ２８または４−１ＢＢ）および活性化（ＣＤ３ζ）の両方を提供するものを含む。前臨床研究によって、「第２世代」ＣＡＲは、Ｔ細胞の抗腫瘍活性を改善し得ることが示された。例えば、慢性リンパ芽球性白血病（ＣＬＬ）および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を有する患者におけるＣＤ１９分子を標的とする臨床治験において、「第２世代」ＣＡＲによって修飾されたＴ細胞の頑強な有効性が実証された。「第３世代」ＣＡＲは、複数の共刺激（例えば、ＣＤ２８および４−１ＢＢ）および活性化（ＣＤ３ζ）を提供するものを含む。
【００７０】
ここで開示される主題に一致して、ＣＡＲは、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、細胞外抗原結合性ドメインは、ヒトメソセリンと、約１ｎＭ〜約２５ｎＭの解離定数（Ｋｄ）で結合する。特定の限定されない実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖである。特定の限定されない実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、Ｆａｂであり、これは必要に応じて架橋されている。特定の限定されない実施形態では、細胞外結合性ドメインは、Ｆ（ａｂ）２である。特定の限定されない実施形態では、前述の分子のいずれかが、細胞外抗原結合性ドメインを形成するように異種配列との融合タンパク質中に含まれ得る。
【００７１】
メソセリン（ＭＳＬＮ）は、固形がんにおいて高度に発現される２８〜３３免疫原性細胞表面抗原２７、２８である。ＭＳＬＮは、細胞増殖３４、接着３５、３６、浸潤３７〜３９、細胞シグナル伝達３５および転移４０に関与している。研究によって、ＭＳＬＮ発現性腫瘍によって分泌された血清可溶性ＭＳＬＮ関連ペプチド（ＳＭＲＰ）は、ヒト３２、３３、４１〜４７およびマウスの両方において測定され得ることが実証され、療法応答および予後と相関すると示されている。正常組織では、ＭＳＬＮは、胸膜、心膜および腹膜においてのみ、低レベルで発現される２８、４８。患者では、抗ＭＳＬＮ組換え免疫毒素ＳＳ１Ｐは、ｉｎ  ｖｉｖｏ特異性および相当な抗腫瘍活性を示した４９、５０。膵臓がんワクチン治験では、生存優位性を有する患者は、ワクチン誘導性遅延型過敏症応答を伴う、ＭＳＬＮに対する一貫したＣＤ８＋Ｔ細胞応答を有していた５１。ＭＳＬＮ由来の特異的Ｔ細胞エピトープは、ヒトＴ細胞を活性化して、ＭＳＬＮを発現するヒト腫瘍を効率的に溶解すると示された５２。したがって、ＭＳＬＮを標的とする養子免疫療法は、ＭＳＬＮ発現腫瘍を標的とし得るという強力な裏付けとなる証拠がある。
【００７２】
ある特定の限定されない実施形態では、ＭＳＬＮは、ＮＣＢＩ参照番号：ＡＡＶ８７５３０．１（配列番号４３）を有する配列を有するヒトメソセリンまたはその断片である。
【００７３】
配列番号４３は、以下に提供される：
【化１】
2020036606.tif 000003
【００７４】
ある特定の限定されない実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、ヒトＭＳＬＮに対して高結合特異性ならびに高結合アフィニティーを有する。例えば、このような実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメイン（例えば、ｓｃＦｖまたはその類似体において具体化される）は、ヒトＭＳＬＮと約２５ｎＭまたはそれ未満の解離定数（Ｋｄ）で結合する。一部の実施形態では、Ｋｄは、約２４ｎＭ、約２３ｎＭ、約２２ｎＭ、約２１ｎＭまたは約２０ｎＭもしくはそれ未満である。他の実施形態では、Ｋｄは、約１５ｎＭまたはそれ未満、例えば、約１４ｎＭ、約１３ｎＭ、約１２ｎＭまたは約１１ｎＭなどである。他の実施形態では、Ｋｄは、約１０ｎＭまたはそれ未満、例えば、約９ｎＭ、約８ｎＭ、約７ｎＭまたは約６ｎＭなどである。他の実施形態では、Ｋｄは、約５ｎＭまたはそれ未満、例えば、約４ｎＭ、約３ｎＭ、約２．５ｎＭ、約２ｎＭまたは約１ｎＭもしくはそれ未満などである。一部の実施形態では、Ｋｄは、約１〜約２０ｎＭ、例えば、約２．５〜約１５ｎＭまたは約５〜約１０ｎＭなどである。一部の実施形態では、Ｋｄは、約１ｎＭ〜約２５ｎＭ、約１ｎＭ〜約２０ｎＭ、約１ｎＭ〜約１５ｎＭ、約１ｎＭ〜約１０ｎＭ、約５ｎＭ〜約１０ｎＭ、約１ｎＭ〜約５ｎＭまたは約１ｎＭ〜約２ｎＭである。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる米国特許第８，３５７，７８３号に記載される、ヒト抗メソセリン抗体またはその抗原結合部分を含む。一部の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、ヒトメソセリン、例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるFeng  (2009)に開示されるような抗体ｍ９１２と結合する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域に由来する。抗体ｍ９１２は、組換えメソセリンに対するパニングによってヒトＦａｂライブラリーから単離された。他の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、Ｆａｂ（例えば、ヒトまたはマウスＦａｂライブラリー）に由来する。
【００７５】
ここで開示されるＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメイン（例えば、ｓｃＦｖまたはその類似体における実施形態）の、ヒトＭＳＬＮとの結合は、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、生物検定法（例えば、成長阻害）またはウエスタンブロットアッセイによって確認できる。これらのアッセイの各々は、一般に、目的の複合体に特異的な標識された試薬（例えば、抗体またはｓｃＦｖ）を使用することによって特に目的とするタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。例えば、ｓｃＦｖは、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）において放射活性標識され、使用され得る（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Weintraub,  B.,  Principles  of  Radioimmunoassays,  Seventh  Training  Course  on  Radioligand  Assay  Techniques,  The  Endocrine  Society,  March,  1986を参照のこと）。放射活性同位元素は、γカウンターもしくはシンチレーションカウンターの使用またはオートラジオグラフィーによってなどの手段によって検出できる。ある特定の実施形態では、ＭＳＬＮ標的化細胞外抗原結合性ドメインは、蛍光マーカーを用いて標識される。蛍光マーカーの限定されない例として、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、ＡｚｕｒｉｔｅおよびｍＫａｌａｍａ１）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、ＣｅｒｕｌｅａｎおよびＣｙＰｅｔ）および黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ＶｅｎｕｓおよびＹＰｅｔ）が挙げられる。一実施形態では、ＭＳＬＮ標的化ヒトｓｃＦｖは、ＧＦＰを用いて標識される。
【００７６】
ある特定の限定されない実施形態では、ここで開示されるＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、約１，０００またはそれ超のＭＳＬＮ結合部位／細胞のＭＳＬＮレベルのヒトＭＳＬＮを認識するか、またはそれと結合する。ある特定の実施形態では、ここで開示されるＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、約１，０００〜約５０，０００のＭＳＬＮ結合部位／細胞のＭＳＬＮレベルのヒトＭＳＬＮを認識するか、またはそれと結合する。一部の実施形態では、ここで開示されるＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、１，０００未満のＭＳＬＮ結合部位／細胞のＭＳＬＮ発現レベルのヒトＭＳＬＮ、例えば、正常組織、例えば、正常胸膜、心膜および腹膜組織において発現されたヒトＭＳＬＮを認識せず、それと結合しない。ある特定の実施形態では、ここで開示されるＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、５０，０００超のＭＳＬＮ結合部位／細胞のＭＳＬＮ発現レベルのヒトＭＳＬＮを認識せず、それと結合しない。一実施形態では、ここで開示されるＣＡＲ中に含まれるヒトｓｃＦＶは、約１，０００〜約５０，０００のＭＳＬＮ結合部位／細胞のＭＳＬＮ発現レベルのヒトＭＳＬＮを認識するか、またはそれと結合する。一実施形態では、ここで開示されるＣＡＲ中に含まれるヒトｓｃＦＶは、５０，０００超または１，０００未満のＭＳＬＮ結合部位／細胞のＭＳＬＮ発現レベルのヒトＭＳＬＮを認識せず、それと結合しない。
【００７７】
ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、以下に提供されるような配列番号１に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域を含む。
【化２】
2020036606.tif 000004
【００７８】
配列番号１のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、以下に提供されるような配列番号２に示される。
【化３】
2020036606.tif 000005
【００７９】
一部の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、以下に提供されるような配列番号３に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域を含む。
【化４】
2020036606.tif 000006
【００８０】
配列番号３のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、以下に提供されるような配列番号４に示されている。
【化５】
2020036606.tif 000007
【００８１】
一部の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、以下に提供されるような配列番号５に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域を含む。
【化６】
2020036606.tif 000008
【００８２】
ある特定の実施形態では、ここで開示されるＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。１つの特定の実施形態では、ここで開示されるＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、ヒトｓｃＦＶを含む。一実施形態では、ヒトｓｃＦＶは、配列番号１のアミノ酸１〜１１９を含む重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、ヒトｓｃＦＶは、以下に提供されるような配列番号６に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域を含む。
【化７】
2020036606.tif 000009
【００８３】
一実施形態では、ヒトｓｃＦＶは、配列番号３のアミノ酸１〜１０７を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒトｓｃＦＶは、配列番号５のアミノ酸１〜１０７を含む軽鎖可変領域を含む。
【００８４】
ある特定の実施形態では、ヒトｓｃＦＶは、以下に提供されるような配列番号７に示される配列を有するアミノ酸を含む。
【化８】
2020036606.tif 000010
【００８５】
一実施形態では、配列番号７のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、以下に提供されるような配列番号８に示されている。
【化９】
2020036606.tif 000011
【００８６】
別の実施形態では、配列番号７のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、以下に提供されるような配列番号９に示されている。配列番号９に示されるような核酸配列は、コドン使用について合成的に最適化され、これは、ＣＡＲの発現を増大し得る。
【化１０】
2020036606.tif 000012
【００８７】
さらに別の実施形態では、配列番号７のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、以下に提供されるような配列番号１０に示されている。配列番号１０に示されるような核酸配列は、コドン使用について合成的に最適化され、これは、ＣＡＲの発現を増大し得る。
【化１１】
2020036606.tif 000013
【００８８】
ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号１１に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１２に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号１３に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号１４に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１５に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号１６に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。１つの限定されない例示的実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、参照により本明細書に組み込まれるFeng  et  al.,  Mol.  Cancer  Therapy  (2009);8(5):1113-1118に開示されるような、完全ヒト抗ＭＳＬＮ抗体ｍ９１２に由来するヒトｓｃＦｖである。
【００８９】
配列番号１１〜１６は、以下に提供されている：
【化１２】
2020036606.tif 000014
【００９０】
本明細書において、用語「保存的配列修飾」は、アミノ酸配列を含むここで開示されるＣＡＲ（例えば、細胞外抗原結合性ドメイン）の結合特徴に大幅に影響を及ぼさず、変更しないアミノ酸修飾を指す。このような保存的修飾物として、アミノ酸置換、付加および欠失が挙げられる。修飾は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの当技術分野で公知の標準技術によって、ここで開示される主題のヒトｓｃＦｖ中に導入され得る。アミノ酸は、電荷および極性などのそれらの物理化学的特性に従って、群に分類され得る。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が同一群内のアミノ酸と置き換えられているものである。例えば、アミノ酸は、電荷によって分類され得、正荷電を有するアミノ酸として、リシン、アルギニン、ヒスチジンが挙げられ、負電荷を有するアミノ酸として、アスパラギン酸、グルタミン酸が挙げられ、中性電荷アミノ酸として、アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンが挙げられる。さらに、アミノ酸は、極性によって分類され得る：極性アミノ酸として、アルギニン（塩基性極性）、アスパラギン、アスパラギン酸（酸性極性）、グルタミン酸（酸性極性）、グルタミン、ヒスチジン（塩基性極性）、リシン（塩基性極性）、セリン、トレオニンおよびチロシンが挙げられ；非極性アミノ酸として、アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよびバリンが挙げられる。したがって、ＣＤＲ領域内の１個または複数のアミノ酸残基が同一群に由来する他のアミノ酸残基で置き換えられ得、変更された抗体は、本明細書に記載される機能アッセイを使用して、保持された機能（すなわち、上記の（ｃ）から（ｌ）に示される機能）について試験され得る。ある特定の実施形態では、特定の配列またはＣＤＲ領域内の１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下の残基が変更される。
【００９１】
ある特定の限定されない実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、細胞外抗原結合性ドメインの重鎖可変領域と軽鎖可変領域をつなげるリンカーを含み得る。本明細書において、用語「リンカー」は、互いにつなげられるように２つまたはそれ超のポリペプチドまたは核酸を共有結合する官能基（例えば、化学物質またはポリペプチド）を指す。本明細書において、「ペプチドリンカー」は、２つのタンパク質を一緒にカップリングするために（例えば、ＶＨおよびＶＬドメインをカップリングするために）使用される１個または複数のアミノ酸を指す。１つの限定されない例では、リンカーは、以下に提供されるような配列番号１７に示される配列を有するアミノ酸を含む。
GGGGSGGGGSGGGGS[配列番号17]
【００９２】
一実施形態では、配列番号１７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、以下に提供される配列番号１８に示されている。
GGAGGTGGAGGCTCAGGAGGAGGAGGCAGTGGAGGTGGTGGGTCA[配列番号18]
【００９３】
別の実施形態では、配列番号１７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、以下に提供される配列番号１９に示されている。
GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCA[配列番号19]
【００９４】
さらに、細胞外抗原結合性ドメインは、新生タンパク質を小胞体に向けるリーダーまたはシグナルペプチドを含み得る。ＣＡＲが、グリコシル化され、細胞膜に固定されるべきである場合には、シグナルペプチドまたはリーダーが必須であり得る。シグナル配列またはリーダーは、その移行を分泌経路に向ける、新規に合成されたタンパク質のＮ末端に存在するペプチド配列（約５、約１０、約１５、約２０、約２５または約３０個のアミノ酸長）であり得る。限定されない例では、リーダーは、細胞外抗原結合性ドメインの５’末端に共有結合によって連結される。一実施形態では、リーダーは、以下に提供されるような配列番号２０に示される配列を有するアミノ酸を含むＣＤ８ポリペプチドを含む。
MALPVTALLLPLALLLHAARP[配列番号20]
【００９５】
配列番号２０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、以下に提供される配列番号２１に示されている：
ATGGCCCTGCCAGTAACGGCTCTGCTGCTGCCACTTGCTCTGCTCCTCCATGCAGCCAGGCC  [配列番号21]
【００９６】
ある特定の限定されない実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、膜の少なくとも一部に広がる疎水性アルファヘリックスを含む。種々の膜貫通ドメインが、種々の受容体安定性をもたらす。抗原認識後、受容体はクラスター形成し、シグナルが細胞に伝達される。ここで開示される主題に一致して、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８ポリペプチド、ＣＤ２８ポリペプチド、ＣＤ３ζポリペプチド、ＣＤ４ポリペプチド、４−１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、ＣＴＬＡ−４ポリペプチド、ＰＤ−１ポリペプチド、ＬＡＧ−３ポリペプチド、２Ｂ４ポリペプチド、ＢＴＬＡポリペプチド、合成ペプチド（免疫応答と関連しているタンパク質をベースとしない）またはそれらの組合せを含み得る。
【００９７】
一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８ポリペプチドを含む。ＣＤ８ポリペプチドは、以下に提供されるようなＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００１１３９３４５．１（配列番号２２）を有する配列に対して、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同である（本明細書において相同性は、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどの標準ソフトウェアを使用して決定され得る）アミノ酸配列もしくはその断片を有し得る、および／または必要に応じて、最大１つもしくは最大２つもしくは最大３つの保存的アミノ酸置換を含み得る。限定されない実施形態では、ＣＤ８ポリペプチドは、少なくとも２０個、または少なくとも３０個、または少なくとも４０個、または少なくとも５０個および最大２３５個のアミノ酸長である配列番号２２の連続部分であるアミノ酸配列を有し得る。あるいは、またはさらに、限定されない種々の実施形態では、ＣＤ８ポリペプチドは、配列番号２２のアミノ酸１〜２３５、１〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００または２００〜２３５のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、ここで開示される主題のＣＡＲは、Ｍｚであり、その膜貫通ドメインは、ＣＤ８ポリペプチドを含む。別の実施形態では、ここで開示される主題のＣＡＲは、ＭＢＢｚであり、その膜貫通ドメインは、ＣＤ８ポリペプチドを含む。限定されない一実施形態では、ここで開示されるＣＡＲは、配列番号２２のアミノ酸１３７〜２０９を有するＣＤ８ポリペプチドを含む膜貫通ドメインを含む。
【化１３】
2020036606.tif 000015
【００９８】
ここで開示される主題に一致して、「ＣＤ８核酸分子」は、ＣＤ８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
【００９９】
一実施形態では、ここで開示されるＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ２８ポリペプチドを含む。ＣＤ２８ポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号：Ｐ１０７４７またはＮＰ＿００６１３０（配列番号２３）を有する配列に対して、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは１００％相同であるアミノ酸配列もしくはその断片を有し得る、および／または必要に応じて、最大１つもしくは最大２つもしくは最大３つの保存的アミノ酸置換を含み得る。限定されない実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、少なくとも２０個、または少なくとも３０個、または少なくとも４０個、または少なくとも５０個、および最大２２０個のアミノ酸長である配列番号２３の連続部分であるアミノ酸配列を有し得る。あるいは、またはさらに、限定されない種々の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号２３のアミノ酸１〜２２０、１〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００または２００〜２２０のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、ここで開示される主題のＣＡＲは、Ｍ２８ｚであり、これは、ＣＤ２８ポリペプチドを含む膜貫通ドメインおよびＣＤ２８ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む細胞内ドメインを含む。一実施形態では、Ｍ２８ｚの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン中に含まれるＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号２３のアミノ酸１１７〜２２０のアミノ酸配列を有する。
【０１００】
配列番号２３は、以下に提供されている：
【化１４】
2020036606.tif 000016
【０１０１】
ここで開示される主題に一致して、「ＣＤ２８核酸分子」は、ＣＤ２８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。一実施形態では、Ｍ２８ｚの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン（例えば、共刺激シグナル伝達領域）中に含まれるＣＤ２８ポリペプチドをコードするＣＤ２８核酸分子は、以下に提供されるような配列番号２４に示されるようなヌクレオチド配列を含む。
【化１５】
2020036606.tif 000017
【０１０２】
ある特定の限定されない実施形態では、ＣＡＲはまた、抗原結合性ドメインを膜貫通ドメインと連結するスペーサー領域を含み得る。スペーサー領域は、抗原結合性ドメインが抗原認識を容易にするために種々の方向に向くことを可能にするのに十分可動性であり得る。スペーサー領域は、ＩｇＧ１由来のヒンジ領域または免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３領域およびＣＤ３の部分であり得る。
【０１０３】
ある特定の限定されない実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、細胞（例えば、リンパ球系系統の細胞、例えば、Ｔ細胞）を活性化または刺激し得るＣＤ３ζポリペプチドを含み得る。ＣＤ３ζは、３つのＩＴＡＭを含み、抗原が結合した後、活性化シグナルを細胞（例えば、リンパ球系系統の細胞、例えば、Ｔ細胞）に伝達する。ＣＤ３ζポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿９３２１７０を有する配列（配列番号２５）に対して、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同であるアミノ酸配列もしくはその断片を有し得る、および／または必要に応じて、最大１つもしくは最大２つもしくは最大３つの保存的アミノ酸置換を含み得る。限定されない実施形態では、ＣＤ３ζポリペプチドは、少なくとも２０個、または少なくとも３０個、または少なくとも４０個、または少なくとも５０個、および最大１６４個のアミノ酸長である配列番号２５の連続部分であるアミノ酸配列を有し得る。あるいは、またはさらに、限定されない種々の実施形態では、ＣＤ３ζポリペプチドは、配列番号２５のアミノ酸１〜１６４、１〜５０、５０〜１００、１００〜１５０または１５０〜１６４のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、ＣＤ３ζポリペプチドは、配列番号２５のアミノ酸５２〜１６４のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、ここで開示される主題のＣＡＲは、Ｍｚであり、その細胞内ドメインは、配列番号２５のアミノ酸５２〜１６４のアミノ酸配列を有するＣＤ３ζポリペプチドを含む。一実施形態では、ここで開示される主題のＣＡＲは、Ｍ２８ｚであり、その細胞内ドメインは、配列番号２５のアミノ酸５２〜１６４のアミノ酸配列を有するＣＤ３ζポリペプチドを含む。一実施形態では、ここで開示される主題のＣＡＲは、ＭＢＢｚであり、その細胞内ドメインは、配列番号２５のアミノ酸５２〜１６４のアミノ酸配列を有するＣＤ３ζポリペプチドを含む。
【０１０４】
配列番号２５は、以下に提供されている：
【化１６】
2020036606.tif 000018
【０１０５】
ここで開示される主題に一致して、「ＣＤ３ζ核酸分子」は、ＣＤ３ζポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。一実施形態では、ここで開示されるＣＡＲ（例えば、Ｍｚ、Ｍ２８ｚまたはＭＢＢｚ）の細胞内ドメイン中に含まれるＣＤ３ζポリペプチドをコードするＣＤ３ζ核酸分子は、以下に提供されるような配列番号２６に示されるようなヌクレオチド配列を含む。
【化１７】
2020036606.tif 000019
【０１０６】
ある特定の限定されない実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、少なくとも１つの共刺激分子を含む少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域をさらに含み、これは、最適なリンパ球活性化を提供し得る。本明細書において、「共刺激分子」は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要である抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子を指す。少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２８ポリペプチド、４−１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、ＰＤ−１ポリペプチド、ＣＴＬＡ−４ポリペプチド、ＬＡＧ−３ポリペプチド、２Ｂ４ポリペプチド、ＢＴＬＡポリペプチド、合成ペプチド（免疫応答と関連しているタンパク質をベースとしない）またはそれらの組合せを含み得る。共刺激分子は、共刺激リガンドと結合し得、これは、その受容体との結合の際に、抗原がそのＣＡＲ分子と結合するときに提供される刺激を生じさせる共刺激応答、すなわち、細胞内応答をもたらす、細胞表面に発現されるタンパク質である。共刺激リガンドとして、これらに限定されないが、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ４８、ＴＮＦＲＳＦ１４およびＰＤ−Ｌ１が挙げられる。一例として、４−１ＢＢリガンド（すなわち、４−１ＢＢＬ）は、ＣＡＲシグナルと組み合わせて、ＣＡＲ＋Ｔ細胞のエフェクター細胞機能を誘導する細胞内シグナルを提供するために、４−１ＢＢ（「ＣＤ１３７」としても知られる）と結合し得る。４−１ＢＢ、ＩＣＯＳまたはＤＡＰ−１０を含む共刺激シグナル伝達領域を含む細胞内ドメインを含むＣＡＲは、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Ｕ．Ｓ．７，４４６，１９０に開示されている（例えば、４−１ＢＢをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５に示されており、ＩＣＯＳをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１６に示されており、ＤＡＰ−１０をコードするヌクレオチド配列は、Ｕ．Ｓ．７，４４６，１９０において配列番号１７に示されている）。一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、２種の共刺激分子：ＣＤ２８および４−１ＢＢ（Sadelain,  et  al.,  Cancer  Discovery,  OF1-11,  (2013)を参照のこと）またはＣＤ２８およびＯＸ４０を含む共刺激シグナル伝達領域を含む。
【０１０７】
４−１ＢＢは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドとして作用し得、刺激活性を有し得る。４−１ＢＢポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号：Ｐ４１２７３もしくはＮＰ＿００１５５２（配列番号２７）を有する配列に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは１００％相同であるアミノ酸配列もしくはその断片を有し得る、および／または必要に応じて、最大１つもしくは最大２つもしくは最大３つの保存的アミノ酸置換を含み得る。限定されない実施形態では、４−１ＢＢポリペプチドは、少なくとも２０個、または少なくとも３０個、または少なくとも４０個、または少なくとも５０個、および最大２５５個のアミノ酸長である配列番号２７の連続部分であるアミノ酸配列を有し得る。あるいは、またはさらに、限定されない種々の実施形態では、４−１ＢＢポリペプチドは、配列番号２７のアミノ酸１〜２５５、１〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００または２００〜２５５のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、ここで開示される主題のＣＡＲは、ＭＢＢｚであり、その細胞内ドメインは、４−１ＢＢポリペプチドを含む。
【０１０８】
配列番号２７は、以下に提供されている：
【化１８】
2020036606.tif 000020
【０１０９】
ここで開示される主題に一致して、「４−１ＢＢ核酸分子」は、４−１ＢＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
【０１１０】
ＯＸ４０ポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号：Ｐ４３４８９もしくはＮＰ＿００３３１８（配列番号２８）を有する配列に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは１００％相同であるアミノ酸配列もしくはその断片を有し得る、および／または必要に応じて、最大１つもしくは最大２つもしくは最大３つの保存的アミノ酸置換を含み得る。
【０１１１】
配列番号２８は、以下に提供されている：
【化１９】
2020036606.tif 000021
【０１１２】
ここで開示される主題に一致して、「ＯＸ４０核酸分子」は、ＯＸ４０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
【０１１３】
ＩＣＯＳポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿０３６２２４（配列番号２９）を有する配列に対して、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは１００％相同であるアミノ酸配列もしくはその断片を有し得る、および／または必要に応じて、最大１つもしくは最大２つもしくは最大３つの保存的アミノ酸置換を含み得る。
【０１１４】
配列番号２９は、以下に提供されている：
【化２０】
2020036606.tif 000022
【０１１５】
ここで開示される主題に一致して、「ＩＣＯＳ核酸分子」は、ＩＣＯＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
【０１１６】
ＣＴＬＡ−４は、その対応するリガンドによって（それぞれ、ＣＤ８０およびＣＤ８６；Ｂ７−１およびＢ７−２）会合される場合に、活性化Ｔ細胞阻害またはアネルギーを媒介する、活性化Ｔ細胞によって発現される阻害性受容体である。前臨床および臨床研究の両方において、全身抗体注入によるＣＴＬＡ−４遮断は、内因性抗腫瘍応答を増強したが、臨床状況では、相当な予期せぬ毒性を有していた。
【０１１７】
ＣＴＬＡ−４は、細胞外Ｖドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質テールを含有する。種々のアイソフォームをコードする代替のスプライス変異体が特徴付けられている。膜結合アイソフォームは、ジスルフィド結合によって相互接続されたホモ二量体として機能するが、可溶性アイソフォームは、単量体として機能する。細胞内ドメインは、内因性触媒活性を有さず、ＰＩ３Ｋ、ＰＰ２ＡおよびＳＨＰ−２と結合できる１つのＹＶＫＭモチーフならびにＳＨ３含有タンパク質と結合できる１つのプロリンリッチモチーフを含有する点で、ＣＤ２８のものと同様である。Ｔ細胞応答の阻害におけるＣＴＬＡ−４の１つの役割は、直接的に、ＣＤ３およびＬＡＴなどのＴＣＲ−近位シグナル伝達タンパク質のＳＨＰ−２およびＰＰ２Ａ脱リン酸化によると思われる。ＣＴＬＡ−４はまた、ＣＤ８０／８６結合についてＣＤ２８と競合することによってシグナル伝達に間接的に影響を及ぼし得る。ＣＴＬＡ−４は、ＰＩ３Ｋ、ＣＤ８０、ＡＰ２Ｍ１およびＰＰＰ２Ｒ５Ａと結合および／または相互作用することが示されている。
【０１１８】
ここで開示される主題に一致して、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、配列番号３０に対して、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同である（本明細書において相同性は、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどの標準ソフトウェアを使用して決定され得る）アミノ酸配列もしくはその断片を有し得る、および／または必要に応じて、最大１つもしくは最大２つもしくは最大３つの保存的アミノ酸置換を含み得る。限定されない実施形態では、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、少なくとも２０個、または少なくとも３０個、または少なくとも４０個、または少なくとも５０個、および最大２２３個のアミノ酸長である配列番号３０の連続部分であるアミノ酸配列を有し得る。あるいは、またはさらに、限定されない種々の実施形態では、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、配列番号３０のアミノ酸１〜２２３、１〜５０、５０〜１００、１００〜１４０、１４１〜１６１、１６２〜１８２、１８３〜２２３、１４１〜２２３、１６２〜２２３または１８３〜２２３のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、配列番号３０のアミノ酸１８３〜２２３のアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、配列番号３０のアミノ酸１８３〜２２３のアミノ酸配列を有するＣＴＬＡ−４ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、配列番号３０のアミノ酸１６２〜１８２のアミノ酸配列を有するＣＴＬＡ−４ポリペプチドを含む。
【０１１９】
配列番号３０は、以下に提供されている：
【化２１】
2020036606.tif 000023
【０１２０】
ここで開示される主題に一致して、「ＣＴＬＡ−４核酸分子」は、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
【０１２１】
ＰＤ−１は、内因性マクロファージおよび樹状細胞上に発現されるその対応するリガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２との会合の際の活性化Ｔ細胞の負の免疫制御因子である。ＰＤ−１は、２６８個のアミノ酸のＩ型膜タンパク質である。ＰＤ−１は、２種のリガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を有し、それらは、Ｂ７ファミリーのメンバーである。タンパク質の構造は、細胞外ＩｇＶドメインと、それに続く、膜貫通領域および細胞内テールを含む。細胞内テールは、ＰＤ−１が、ＴＣＲシグナルを負に制御する、免疫受容体チロシンベースの阻害性モチーフおよび免疫受容体チロシンベースのスイッチモチーフ中に位置する２つのリン酸化部位を含有する。ＳＨＰ−ＩおよびＳＨＰ−２脱リン酸化酵素は、リガンド結合の際にＰＤ−１の細胞質テールと結合する。ＰＤ−Ｌ１の上方制御は、腫瘍細胞が宿主免疫系を逃れ得る１つの機序である。前臨床および臨床治験では、アンタゴニスト抗体によるＰＤ−１遮断が、宿主内因性免疫系によって媒介される抗腫瘍応答を誘導した。
【０１２２】
ここで開示される主題に一致して、ＰＤ−１ポリペプチドは、配列番号３１に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同であるアミノ酸配列もしくはその断片を有し得る、および／または必要に応じて、最大１つもしくは最大２つもしくは最大３つの保存的アミノ酸置換を含み得る。限定されない実施形態では、ＰＤ−１ポリペプチドは、少なくとも２０個、または少なくとも３０個、または少なくとも４０個、または少なくとも５０個、および最大２８８個のアミノ酸長である配列番号３１の連続部分であるアミノ酸配列を有し得る。あるいは、またはさらに、限定されない種々の実施形態では、ＰＤ−１ポリペプチドは、配列番号３１のアミノ酸１〜２８８、１〜５０、５０〜１００、１００〜１４４、１４５〜１７０、１７１〜１９１、１９２〜２８８、１４５〜２８８、１７１〜２８８または１９２〜２８８のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、ＰＤ−１ポリペプチドは、配列番号３１のアミノ酸１９２〜２８８のアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、配列番号３１のアミノ酸１９２〜２８８のアミノ酸配列を有するＰＤ−１ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、配列番号３１のアミノ酸１７１〜１９１のアミノ酸配列を有するＰＤ−１ポリペプチドを含む。
【０１２３】
配列番号３１は、以下に提供されている：
【化２２】
2020036606.tif 000024
【０１２４】
ここで開示される主題に一致して、「ＰＤ−１核酸分子」は、ＰＤ−１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
【０１２５】
リンパ球−活性化タンパク質３（ＬＡＧ−３）は、免疫細胞の負の免疫制御因子である。ＬＡＧ−３は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属し、４つの細胞外Ｉｇ様ドメインを含有する。ＬＡＧ３遺伝子は、８つのエキソンを含有する。配列データ、エキソン／イントロン組織化および染色体局在性はすべて、ＬＡＧ３のＣＤ４に対する密接な関係を示す。ＬＡＧ３は、ＣＤ２２３（分化２２３のクラスター）とも呼ばれている。
【０１２６】
ここで開示される主題に一致して、ＬＡＧ−３ポリペプチドは、配列番号３２に対して、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同であるアミノ酸配列もしくはその断片を有し得る、および／または必要に応じて、最大１つもしくは最大２つもしくは最大３つの保存的アミノ酸置換を含み得る。限定されない実施形態では、ＬＡＧ−３ポリペプチドは、少なくとも２０個、または少なくとも３０個、または少なくとも４０個、または少なくとも５０個、および最大５２５個のアミノ酸長である配列番号３２の連続部分であるアミノ酸配列を有し得る。あるいは、またはさらに、限定されない種々の実施形態では、ＬＡＧ−３ポリペプチドは、配列番号３２のアミノ酸１〜５２５、１〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４２０、４２１〜４５０、４５１〜４７１、４７２〜５２５、４２１〜５２５、４５１〜５２５または４７２〜５２５のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、ＬＡＧ−３ポリペプチドは、配列番号３２のアミノ酸４７２〜５２５のアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、配列番号３２のアミノ酸４７２〜５２５のアミノ酸配列を有するＬＡＧ−３ポリペプチドを含む共刺激領域を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、配列番号３２のアミノ酸４５１〜４７１のアミノ酸配列を有するＬＡＧ−３ポリペプチドを含む。
【０１２７】
配列番号３２は、以下に提供されている：
【化２３】
2020036606.tif 000025
【０１２８】
ここで開示される主題に一致して、「ＬＡＧ−３核酸分子」は、ＬＡＧ−３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
【０１２９】
ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４（２Ｂ４）は、ＮＫ細胞およびＴ細胞のサブセットで非ＭＨＣ拘束性細胞死滅を媒介する。今日まで、２Ｂ４の機能は、依然として研究中であり、２Ｂ４−Ｓアイソフォームは、活性化受容体であると考えられ、２Ｂ４−Ｌアイソフォームは、免疫細胞の負の免疫制御因子であると考えられる。２Ｂ４は、結合の際に、その高アフィニティーリガンド、ＣＤ４８を会合するようになる。２Ｂ４は、チロシンベースのスイッチモチーフ、タンパク質が種々の脱リン酸化酵素と会合することを可能にする分子スイッチを含有する。２Ｂ４は、ＣＤ２４４（分化２４４のクラスター）とも呼ばれている。
【０１３０】
ここで開示される主題に一致して、２Ｂ４ポリペプチドは、配列番号３３に対して、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同であるアミノ酸配列もしくはその断片を有し得る、および／または必要に応じて、最大１つもしくは最大２つもしくは最大３つの保存的アミノ酸置換を含み得る。限定されない実施形態では、２Ｂ４ポリペプチドは、少なくとも２０個、または少なくとも３０個、または少なくとも４０個、または少なくとも５０個、および最大３７０個のアミノ酸長である配列番号３３の連続部分であるアミノ酸配列を有し得る。あるいは、またはさらに、限定されない種々の実施形態では、２Ｂ４ポリペプチドは、配列番号３３のアミノ酸１〜３７０、１〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２１５、２１６〜２２９、２３０〜２５０、２５１〜３７０、２１６〜３７０、２３０〜３７０または２５１〜３７０のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、２Ｂ４ポリペプチドは、配列番号３３のアミノ酸２５１〜３７０のアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、配列番号３３のアミノ酸２５１〜３７０のアミノ酸配列を有する２Ｂ４ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、配列番号３３のアミノ酸２３０〜２５０のアミノ酸配列を有する２Ｂ４ポリペプチドを含む。
【０１３１】
配列番号３３は、以下に提供されている：
【化２４】
2020036606.tif 000026
【０１３２】
ここで開示される主題に一致して、「２Ｂ４核酸分子」は、２Ｂ４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
【０１３３】
ＢおよびＴリンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）発現は、Ｔ細胞の活性化の際に誘導され、ＢＴＬＡは、Ｔｈ１細胞では発現されたままであるが、Ｔｈ２細胞では発現されない。ＰＤ１およびＣＴＬＡ４同様、ＢＴＬＡは、Ｂ７相同体、Ｂ７Ｈ４と相互作用する。しかし、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４とは異なり、ＢＴＬＡは、細胞表面受容体のＢ７ファミリーだけではなく腫瘍壊死ファミリー受容体（ＴＮＦ−Ｒ）との相互作用によるＴ細胞阻害を示す。ＢＴＬＡは、ヘルペスウイルスエントリーメディエーター（ＨＶＥＭ）としても知られている、腫瘍壊死因子（受容体）スーパーファミリー、メンバー１４（ＴＮＦＲＳＦ１４）のリガンドである。ＢＴＬＡ−ＨＶＥＭ複合体は、Ｔ細胞免疫応答を負に制御する。ＢＴＬＡ活性化は、ヒトＣＤ８＋がん特異的Ｔ細胞の機能を阻害することが示されている。ＢＴＬＡは、ＣＤ２７２（分化２７２のクラスター）とも呼ばれている。
【０１３４】
ここで開示される主題に一致して、ＢＴＬＡポリペプチドは、配列番号３４に対して、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同であるアミノ酸配列もしくはその断片を有し得る、および／または必要に応じて、最大１つもしくは最大２つもしくは最大３つの保存的アミノ酸置換を含み得る。限定されない実施形態では、ＢＴＬＡポリペプチドは、少なくとも２０個、または少なくとも３０個、または少なくとも４０個、または少なくとも５０個、および最大２８９個のアミノ酸長である配列番号３４の連続部分であるアミノ酸配列を有し得る。あるいは、またはさらに、限定されない種々の実施形態では、ＢＴＬＡポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸１〜２８９、１〜５０、５０〜１００、１００〜１３４、１３５〜１５７、１５８〜１７８、１７９〜２８９、１３５〜２８９、１５８〜２８９または１７９〜２８９のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、ＢＴＬＡポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸１７９〜２８９のアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、配列番号３４のアミノ酸１７９〜２８９のアミノ酸配列を有するＢＴＬＡポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、配列番号３４のアミノ酸１５８〜１７８のアミノ酸配列を有するＢＴＬＡポリペプチドを含む。
【０１３５】
配列番号３４は、以下に提供されている：
【化２５】
2020036606.tif 000027
【０１３６】
ここで開示される主題に一致して、「ＢＴＬＡ核酸分子」は、ＢＴＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
【０１３７】
一実施形態では、ＣＡＲは、Ｍｚであり、これは、ヒトメソセリンと特異的に結合する細胞外抗原結合性ドメインを含む細胞外抗原結合領域、ＣＤ８ポリペプチドを含む膜貫通ドメインおよびＣＤ３ζポリペプチドを含む細胞内ドメインを含む（例えば、図２を参照のこと）。Ｍｚはまた、細胞外抗原結合性ドメインの５’末端と共有結合によって連結しているリーダーを含む。リーダーは、配列番号２０に示される配列を有するアミノ酸を含むＣＤ８ポリペプチドを含む。
【０１３８】
一実施形態では、ＣＡＲは、Ｍ２８ｚであり、これはヒトメソセリンと特異的に結合する細胞外抗原結合領域、ＣＤ２８ポリペプチドを含む膜貫通ドメインおよびＣＤ３ζポリペプチドを含む細胞内ドメインおよびＣＤ２８ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む（例えば、図２を参照のこと）。Ｍ２８ｚはまた、細胞外抗原結合性ドメインの５’末端と共有結合によって連結しているリーダーを含む。リーダーは、配列番号２０に示される配列を有するアミノ酸を含むＣＤ８ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、Ｍ２８ｚおよびＩＬ−１２である共刺激リガンド、例えば、図２４Ｅに示されるようなＭ２８ｚ＋ＩＬ−１２を含む。ＩＬ−１２は、Ｍ２８ｚの細胞内ドメインの３’末端に共有結合によって連結され得る。一部の実施形態では、ＣＡＲは、Ｍ２８ｚおよび４−１ＢＢＬである共刺激リガンド、例えば、図２４Ｃおよび２４Ｄに示されるようなＭ２８ｚ＋４−１ＢＢＬを含む。４−１ＢＢＬは、図２４Ｄに示されるように、Ｍ２８ｚの細胞外抗原結合性ドメインの５’末端に共有結合によって連結され得る。あるいは、４−１ＢＢＬは、図２４Ｃに示されるように、Ｍ２８ｚの細胞内ドメインの３’末端に共有結合によって連結され得る。
【０１３９】
一実施形態では、ＣＡＲは、ＭＢＢｚであり、これは、ヒトメソセリンと特異的に結合する細胞外抗原結合領域、ＣＤ８ポリペプチドを含む膜貫通ドメインおよびＣＤ３ζポリペプチドを含む細胞内ドメインおよび４−１ＢＢポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む（例えば、図１９および２４Ｂを参照のこと）。ＭＢＢｚはまた、細胞外抗原結合性ドメインの５’末端に共有結合によって連結しているリーダーを含む。リーダーは、配列番号２０に示される配列を有するアミノ酸を含むＣＤ８ポリペプチドを含む。
【０１４０】
一部の実施形態では、ここで開示される主題のＣＡＲは、ヒト細胞において核酸配列を発現させるために誘導プロモーターをさらに含み得る。ＣＡＲ遺伝子の発現において使用するためのプロモーターは、ユビキチンＣ（ＵｂｉＣ）プロモーターなどの構成プロモーターであり得る。
【０１４１】
ＭＳＬＮ特異的ＣＡＲは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ状況の両方で、卵巣がん、悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）および三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）に対する有効性を示している５４〜５８。２つの第Ｉ相臨床治験は、抗ＭＳＬＮ  ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞を使用した。ＮＣＩ第Ｉ相臨床治験（ＮＣＴ０１５８３６８６）は、ＭＳＬＮを発現する転移性または切除不能がんを、骨髄破壊的化学療法および／またはアルデスロイキン（ＩＬ−２類似体）と組み合わせてＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて治療して、ＣＡＲ  Ｔ細胞持続を増強する。ペンシルベニア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）第Ｉ相臨床治験（ＮＣＴ０１３５５９６５）は、中皮腫患者に、１〜３用量のＲＮＡがトランスフェクトされたＭＳＬＮ標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞を与える。後者の研究では、３回目の治療された患者においてヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答が観察された（Cancer  Immunol  Res  Apr  7,  2013）。ＮＣＩおよびＵ  Ｐｅｎｎ臨床治験におけるＭＳＬＮ  ＣＡＲとは異なり、一実施形態では、ここで開示されるＭＳＬＮ標的化ＣＡＲは、ヒトＦａｂ５３に由来し、したがって、マウス抗体に由来するＣＡＲと比較して、かなり低下した免疫原性のリスクをもたらす（マウス抗体に由来するＣＡＲの潜在的免疫原性は、ｍＲＮＡ  ＣＡＲの安全性の問題であり得ると報告する（Maus  et  al.,  Cancer  Immunol  Res  (2003);1(1):26-31を参照のこと）を参照のこと）。ここで開示されるＭＳＬＮ標的化ＣＡＲは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞両方を形質導入し得、したがって、ＣＡＲを用いる患者のＴ細胞の形質導入は、ヘルパーおよびＣＴＬ応答の両方を生じさせ、その結果、持続した抗腫瘍応答をもたらす。
【０１４２】
ＩＩＩ．免疫応答性細胞
【０１４３】
ここで開示される主題は、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含むＣＡＲを発現する免疫応答性細胞を提供し、細胞外抗原結合性ドメインは、上記のように、ヒトメソセリンと特異的に結合する。ここで開示される主題はまた、例えば、免疫応答の増強を必要とする疾患の治療のためにこのような細胞を使用する方法を提供する。ここで開示される主題の免疫応答性細胞は、リンパ球系系統の細胞であり得る。Ｂ、Ｔおよびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含めたリンパ球系系統は、抗体の製造、細胞免疫系の制御、血液中の外来病原体の検出、宿主に対して外来の細胞の検出などを提供する。リンパ球系系統の細胞の限定されない例として、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、胚幹細胞および多能性幹細胞が挙げられる（例えば、リンパ球系細胞に分化し得るもの）が挙げられる。Ｔ細胞は、胸腺において成熟し、細胞性免疫に主に責任を負うリンパ球であり得る。Ｔ細胞は、適応免疫系に関与している。ここで開示される主題のＴ細胞は、これらに限定されないが、Ｔヘルパー細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞（セントラルメモリーＴ細胞、幹細胞様メモリーＴ細胞（または幹様メモリーＴ細胞）および２種類のエフェクターメモリーＴ細胞：例えば、ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞を含む）、制御性Ｔ細胞（サプレッサーＴ細胞としても知られる）、ナチュラルキラーＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ細胞およびγδ  Ｔ細胞を含めた、任意の種類のＴ細胞であり得る。一部の実施形態では、ＣＡＲを発現するＴ細胞は、Ｆｏｘｐ３を発現して、Ｔ制御性表現型を達成および維持する。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、細胞性免疫の一部であり、自然免疫応答中に作用するリンパ球であり得る。ＮＫ細胞は、標的細胞に対するそれらの細胞傷害性効果を発揮するために、事前の活性化を必要としない。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬまたはキラーＴ細胞）は、感染した体細胞または腫瘍細胞の死を誘導可能なＴリンパ球のサブセットである。
【０１４４】
ここで開示される主題の免疫応答性細胞は、新生物を治療または予防するための、ヒトメソセリンと特異的に結合する、細胞外抗原結合性ドメイン（例えば、ヒトｓｃＦＶ、必要に応じて架橋されている、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）２）を発現し得る。このような免疫応答性細胞は、固形腫瘍（例えば、中皮腫、肺がん、膵臓がん、卵巣がん、乳がん、結腸がん、胸膜腫瘍、神経膠芽腫、食道がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、滑膜肉腫、胸腺癌、子宮内膜癌、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）および／または胆管癌）を治療または予防するために、それを必要とする被験体（例えば、ヒト被験体）に投与され得る。一実施形態では、免疫応答性細胞は、Ｔ細胞である。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る。一実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。
【０１４５】
ここで開示される免疫応答性細胞は、免疫応答性細胞が、メソセリン特異的ＣＡＲおよび少なくとも１種の外因性共刺激リガンドを外因性に共発現するように、または共発現するように誘導されるように、少なくとも１種の外因性共刺激リガンドをさらに含み得る。メソセリン特異的ＣＡＲおよび少なくとも１種の共刺激リガンド間の相互作用は、免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）の完全活性化にとって重要な非抗原特異的シグナルを提供する。共刺激リガンドとして、限定するものではないが、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのメンバーおよび免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーリガンドが挙げられる。ＴＮＦは、全身性炎症に関与しているサイトカインであり、急性期反応を刺激する。その主な役割は、免疫細胞の制御にある。ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーは、いくつかの共通の特徴を共有する。ＴＮＦスーパーファミリーメンバーの大部分は、短い細胞質セグメントおよび比較的長い細胞外領域を含有するＩＩ型膜貫通タンパク質（細胞外Ｃ末端）として合成される。ＴＮＦスーパーファミリーメンバーとして、限定するものではないが、神経成長因子（ＮＧＦ）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０Ｌ）／ＣＤ１５４、ＣＤ１３７Ｌ／４−１ＢＢＬ、ＴＮＦ−α、ＣＤ１３４Ｌ／ＯＸ４０Ｌ／ＣＤ２５２、ＣＤ２７Ｌ／ＣＤ７０、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＣＤ３０Ｌ／ＣＤ１５３、腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦβ）／リンホトキシン−アルファ（ＬＴα）、リンホトキシン−ベータ（ＬＴβ）、ＣＤ２５７／Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）／Ｂｌｙｓ／ＴＨＡＮＫ／Ｔａｌｌ−１、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体リガンド（ＧＩＴＲＬ）およびＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４）が挙げられる。免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーは、細胞の認識、結合または接着プロセスに関与している、細胞表面の可溶性タンパク質の大きな群である。これらのタンパク質は、免疫グロブリンと構造的特徴を共有する−それらは免疫グロブリンドメイン（フォールディング）を有する。免疫グロブリンスーパーファミリーリガンドとして、限定するものではないが、ＣＤ８０およびＣＤ８６、ＣＤ２８の両リガンド、ＰＤ−１とリガンド結合するＰＤ−Ｌ１／（Ｂ７−Ｈ１）が挙げられる。
【０１４６】
一部の実施形態では、少なくとも１つの共刺激リガンドは、４−１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＰＤ−Ｌ１およびそれらの組合せからなる群から選択される。一実施形態では、共刺激リガンドは、４−１ＢＢＬである。限定されない一実施形態では、免疫応答性細胞は、Ｍ２８ｚおよび４−１ＢＢＬを共発現する、例えば、図２４Ｃおよび２４Ｄに示されるようなＭ２８ｚ＋４−１ＢＢＬ。４−１ＢＢＬは、図２４Ｄに示されるように、Ｍ２８ｚの細胞外抗原結合性ドメインの５’末端に共有結合によって連結され得る。あるいは、４−１ＢＢＬは、図２４Ｃに示されるように、Ｍ２８ｚの細胞内ドメインの３’末端に共有結合によって連結され得る。
【０１４７】
ＯＸ４０Ｌポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号：ＢＡＢ１８３０４もしくはＮＰ＿００３３１７（配列番号３５）を有する配列に対して、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは１００％相同であるアミノ酸配列もしくはその断片を有し得る、および／または必要に応じて、最大１つもしくは最大２つもしくは最大３つの保存的アミノ酸置換を含み得る。
【０１４８】
配列番号３５は、以下に提供されている：
【化２６】
2020036606.tif 000028
【０１４９】
ここで開示される主題に一致して、「ＯＸ４０Ｌ核酸分子」は、ＯＸ４０Ｌポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
【０１５０】
さらに、ここで開示される免疫応答性細胞は、免疫応答性細胞が、メソセリン特異的ＣＡＲおよび少なくとも１種のサイトカインを外因性に共発現するように、または共発現するように誘導されるように、少なくとも１種の外因性サイトカインをさらに含み得る。一部の実施形態では、少なくとも１種のサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７およびＩＬ−２１からなる群から選択される。一実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−１２である。限定されない一実施形態では、免疫応答性細胞は、Ｍ２８ｚおよびＩＬ−１２を共発現する、例えば、図２４Ｅに示されるようなＭ２８ｚ＋ＩＬ−１２。ＩＬ−１２は、Ｍ２８ｚの細胞内ドメインの３’末端に共有結合によって連結され得る。
【０１５１】
さらに、免疫応答性細胞は、ヒトメソセリンとは異なる抗原と結合する第２のＣＡＲを発現し得る。ここで開示される主題においてメソセリン特異的ＣＡＲと組み合わせて第２のＣＡＲとして使用できるＣＡＲとして、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Sadelain,  et  al.,  "The  Basic  Principles  of  Chimeric  Antigen  Receptor  Design."  Cancer  Discovery,  OF1-11,  (2013)、Chicaybam,  et  al.,  (2011),  Brentjens  et  al.  Nature  Medicine  9:279-286  (2003)およびＵ．Ｓ．７，４４６，１９０に記載されるもの、例えば、ＣＤ１９標的化ＣＡＲ（Ｕ．Ｓ．７，４４６，１９０；Ｕ．Ｓ．２０１３／００７１４１４を参照のこと）、ＨＥＲ２標的化ＣＡＲ（Ahmed,  et  al.,  Clin  Cancer  Res.,  2010を参照のこと）、ＭＵＣ１６標的化ＣＡＲ（Chekmasova,  et  al.,  2011を参照のこと）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）標的化ＣＡＲ（例えば、Zhong,  et  al.,  Molecular  Therapy,  18(2):413-420  (2010)）が挙げられ、それらのすべては、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。２種またはそれ超の抗原認識性受容体（例えば、ＣＡＲ）を発現する免疫応答性細胞は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０５５６６８に記載されている。
【０１５２】
抗原は、腫瘍または病原体抗原であり得る。任意の適した腫瘍抗原（抗原ペプチド）は、本明細書において記載される腫瘍関連実施形態において使用するのに適している。腫瘍抗原の供給源として、これに限定されないが、がんタンパク質が挙げられる。抗原は、ペプチドとして、またはインタクトなタンパク質もしくはその一部として発現され得る。インタクトなタンパク質またはその一部は、天然である場合も、突然変異されている場合もある。適した抗原として、これらに限定されないが、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）および前立腺幹細胞抗原（ＰＣＳＡ）が挙げられる。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原（例えば、細胞表面抗原）、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質−４０（ＥＧＰ−４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、受容体チロシンプロテインキナーゼｅｒｂ−Ｂ２、３、４、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体−ａ、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ−２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、インターロイキン−１３受容体サブユニットアルファ−２（ＩＬ−１３Ｒα２）、κ−軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、黒色腫抗原ファミリーＡ，１（ＭＡＧＥ−ＡＩ）、ムチン１６（Ｍｕｃ−１６）、ムチン１（Ｍｕｃ−１）、ＮＫＧ２Ｄリガンド、がん精巣抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１、癌胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ−７２）、血管内皮成長因子Ｒ２（ＶＥＧＦ−Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ−１）、１型チロシン−プロテインキナーゼ膜貫通型受容体（ＲＯＲ１）およびそれらの組合せであり得る。
【０１５３】
例えば、免疫低下被験体において病原体感染または他の感染性疾患の治療に使用するための適した病原体抗原として、限定するものではないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびインフルエンザウイルス中に存在するウイルス抗原が挙げられる。ウイルス疾患を治療するために、ウイルス抗原を標的化する第２のＣＡＲを含む免疫応答性細胞を使用できる。限定されない一実施形態では、免疫応答性細胞（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球）において、ここで開示されるメソセリン標的化ＣＡＲおよびＣＭＶ抗原と結合する第２のＣＡＲが共発現され、ＣＭＶを治療するために使用できる。
【０１５４】
ここで開示される主題の方法において使用され得る、メソセリン特異的またはメソセリン標的化ヒトリンパ球として、限定するものではないが、末梢のドナーリンパ球、例えば、Sadelain,  M.,  et  al.  2003  Nat  Rev  Cancer  3:35-45（ＣＡＲを発現するように遺伝子修飾された末梢のドナーリンパ球を開示する）に、Morgan,  R.A.,  et  al.  2006  Science  314:126-129（αおよびβヘテロ二量体を含む、全長腫瘍抗原が認識するＴ細胞受容体複合体を発現するように遺伝子修飾された末梢のドナーリンパ球を開示する）に、Panelli,  M.C.,  et  al.  2000  J  Immunol  164:495-504；Panelli,  M.C.,  et  al.  2000  J  Immunol  164:4382-4392（腫瘍生検における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に由来するリンパ球培養物を開示する）に、およびDupont,  J.,  et  al.  2005  Cancer  Res  65:5417-5427；Papanicolaou,  G.A.,  et  al.  2003  Blood  102:2498-2505（人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）またはパルス樹状細胞を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大された抗原特異的末梢血白血球の選択性を開示する）に開示されるものが挙げられる。免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）は、自己、非自己（例えば、同種異系）であり得るか、または操作された前駆体もしくは幹細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで導かれ得る。
【０１５５】
反復された（毎週の）抗原刺激の際のＭＳＬＮ  ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞の増殖、エフェクター機能および蓄積の増強に対する共刺激シグナル伝達の影響を比較するために、アッセイが使用され得る。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）が、ＩＲＢによって承認されたプロトコールの下で健常なボランティアから採取され、形質導入され得る。遺伝子導入効率は、ＧＦＰ＋（形質導入された）Ｔ細胞の画分を定量化するためのＦＡＣＳ分析によって、および／または定量的ＰＣＲによってモニタリングされ得る。十分に確立された共培養系１６、２５、９８を使用して、ＭＳＬＮを発現する（ＭＳＬＮ−対照に対する）線維芽細胞ＡＡＰＣが、形質導入されたＴ細胞からのサイトカイン放出（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦについての細胞上清ＬＵＭＩＮＥＸアッセイ）、Ｔ細胞増殖（ＣＦＳＥ標識による）およびＴ細胞生存（アネキシンＶ染色による）を指示するか否かが決定され得る。Ｔ細胞生存、増殖および有効性に対するＣＤ８０および／または４−１ＢＢＬの影響が評価され得る。Ｔ細胞が、ＭＳＬＮ＋標的細胞による反復刺激に曝露され得、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン応答が同様のままであるか、または反復刺激に応じて減少されるか否かを決定する。Ｍｚ、Ｍ２８ｚ、ＭＢＢｚ、Ｍ２８ｚ＋４−１ＢＢＬおよびＭ２８ｚ−ＩＬ−１２  ＣＡＲ構築物は、厳密に同等の条件下で並べて比較され得る。クロム放出アッセイを使用して、複数のＥ：Ｔ比を用いる細胞毒性アッセイが実施され得る。２元配置ＡＮＮＯＶＡとそれに続く、ペアワイズ多重比較手順を用いて、統計分析が必要に応じて実施され得、データは、平均±ＳＥＭとして表され得る。どの条件が、セントラルメモリー表現型の維持または拡大に好都合であるかを決定するために、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞サブタイプ（活性化されたエフェクター、セントラルメモリー、エフェクターメモリー）が同定され得る。
【０１５６】
１つの限定されない例では、同一細胞株に由来する、各々、ＭＳＬＮ発現ＴＮＢＣ腫瘍を有するか有さない２匹またはそれ超のマウスにおいて、形質導入された（Ｍｚ／Ｍ２８ｚ／ＭＢＢｚ／Ｍ２８ｚ＋４−１ＢＢＬ）および形質導入されていないＴ細胞が、尾静脈注射によって全身注射され得る。投与の前に、Ｔ細胞は、ＣＦＳＥ標識され、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼを用いて形質導入され、それらの発光について定量化され得る。２４時間ならびに７、４０および７０日後、Ｔ細胞のＢＬＩおよび安楽死マウス（各時点で４匹のマウス）から回収した腫瘍のフローサイトメトリーによって、ＴＭＥにおけるＴ細胞輸送および持続が評価され得、ＩＨＣ分析によってさらに確認され得る。Ｔ細胞輸送に対するＭＳＬＮ発現の特異的影響を決定するために、マウスは右乳房脂肪体（mammary  pad）に同数のＭＳＬＮ発現腫瘍細胞および左乳房脂肪体にＭＳＬＮ陰性腫瘍細胞を用いて注射され得、Ｔ細胞が全身に投与され得る。イメージング陽性ＴＮＢＣを有するマウスは、形質導入されていない、および標的化Ｔ細胞の１：１混合物を用いて全身に注射され得る。形質導入されていないＴ細胞は、コメツキムシルシフェラーゼを用いて標識され得、標的化Ｔ細胞は、Ｇａｕｓｓｉａ−ルシフェラーゼ、続いて、ＢＬＩを用いて標識され得、ＭＳＬＮ＋  ＴＮＢＣ細胞に関してそれらの薬動力学が特徴付けられ得る。Ｔ細胞持続および増殖が、Ｔ細胞のＣＦＳＥ標識によって区別され、マウスを安楽死させた後にフローサイトメトリーによって決定され得る。
【０１５７】
１つの限定されない例では、標的化Ｔ細胞の特異性および有効性を研究するために、転移性ＴＮＢＣ（胸膜転移性疾患または全身転移性疾患のいずれか）を有するＳＭＲＰおよびイメージング陽性マウスが、各３６匹のマウスの４群に分けられ得る。マウスは、全身に（群１）もしくは胸膜内に（群２）送達される対照Ｔ細胞を用いて、または全身に（群３）もしくは胸膜内に（群４）送達されるＭＳＬＮ標的化Ｔ細胞を用いて治療され得る。対照Ｔ細胞は、ｈｒＧＦＰベクターを用いて形質導入され得る。１００万個の細胞〜５００万個の細胞の用量のＴ細胞が送達され得る。腫瘍量は、体重減少および悪液質のモニタリングに加えて、連続ＢＬＩによって、およびＳＭＲＰを測定することによってモニタリングされ得る。組織学的検査およびＩＨＣ分析のために、Ｔ細胞投与の７、２１、４０および７０日後に各群から３匹のマウスが屠殺され得る。回収された組織は、標的化Ｔ細胞の持続について、および表現型についてフローサイトメトリーによって分析され得る。Ｔ細胞療法有効性評価パラメータは、腫瘍小結節の数および分布（胸膜腔中＝疾患の平均胸壁重量／治療されたマウス−対照マウスの平均胸壁重量）、リンパ節における転移の数および負荷量、血清ＳＭＲＰレベル、フローサイトメトリーによって検出されるような固形臓器中の微小転移性腫瘍量によって評価され得る腫瘍量ならびにマウスの長期生存である。各群のマウスの平均生存期間および生存曲線は、群あたり１２匹のマウスの並行実験においてモニタリングおよび測定され得る。
【０１５８】
ある特定の実施形態では、ここで開示される免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）は、約１〜約４、約２〜約４、約３〜約４、約１〜約２、約１〜約３または約２〜約３のベクターコピー数／細胞のここで開示されるメソセリン特異的ＣＡＲを発現する。例えば、ここで開示される免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）は、約１、約２、約３または約４のベクターコピー数／細胞のメソセリン特異的ＣＡＲを発現する。限定されない一実施形態では、ここで開示される免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）は、約３〜約４のベクターコピー数／細胞のここで開示されるメソセリン特異的ＣＡＲを発現する。ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）の細胞毒性およびサイトカイン製造は、細胞におけるメソセリン特異的ＣＡＲの発現レベルと比例する。例えば、免疫応答性細胞におけるＣＡＲ発現レベルが高いほど、免疫応答性細胞は、より大きな細胞毒性およびサイトカイン製造を示す。高いメソセリン−ＣＡＲ発現レベルを有する免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）は、抗原特異的サイトカイン製造もしくは分泌を誘導し、および／または低レベルのメソセリン発現、例えば、約２，０００もしくはそれ未満、約１，０００もしくはそれ未満、約９００もしくはそれ未満、約８００もしくはそれ未満、約７００もしくはそれ未満、約６００もしくはそれ未満、約５００もしくはそれ未満、約４００もしくはそれ未満、約３００もしくはそれ未満、約２００もしくはそれ未満、約１００もしくはそれ未満のメソセリン結合部位／細胞を有する組織または細胞に対して細胞毒性を示し得る。例えば、実施例４および５を参照のこと。さらに、またはあるいは、ここで開示される免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）の細胞毒性およびサイトカイン製造は、標的組織または標的細胞におけるヒトメソセリンの発現レベルに比例する。例えば、標的におけるヒトメソセリンの発現レベルが高いほど、免疫応答性細胞は、より大きな細胞毒性およびサイトカイン製造を示す。例えば、実施例５を参照のこと。
【０１５９】
ある特定の実施形態では、標的細胞は、低ＭＳＬＮ発現細胞および高ＭＳＬＮ発現細胞を含む細胞の集団である不均一なＭＳＬＮ発現細胞である。ここで開示される免疫応答性細胞は、高ＭＳＬＮ発現細胞の存在下での低ＭＳＬＮ発現細胞（例えば、約２，０００もしくはそれ未満、約１，０００もしくはそれ未満、約９００もしくはそれ未満、約８００もしくはそれ未満、約７００もしくはそれ未満、約６００もしくはそれ未満、約５００もしくはそれ未満、約４００もしくはそれ未満、約３００もしくはそれ未満、約２００もしくはそれ未満、または約１００もしくはそれ未満のＭＳＬＮ結合部位／細胞）に対する細胞毒性および抗腫瘍活性の増大を示し得る。例えば、実施例２を参照のこと。ある特定の実施形態では、高ＭＳＬＮ発現細胞の存在下でさえ、免疫応答性細胞は、ＭＳＬＮ陰性細胞に対して増大した細胞毒性も非特異的死滅も示さない。したがって、免疫応答性細胞は、ＭＳＬＮ陰性細胞に対して安全性を保持しながら、高ＭＳＬＮ発現細胞の存在下で低ＭＳＬＮ発現細胞に対して細胞毒性および抗腫瘍活性の増大を示し得る。
【０１６０】
ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞は、１種または複数種の接着分子を発現し得、これは、特に、ＣＡＲが低アフィニティーＣＡＲである場合には、ＭＳＬＮ特異的ＣＡＲのアビディティーを増大し得る。接着分子の限定されない例として、ＣＤ２およびＶＬＡ−４が挙げられる。免疫応答性細胞上に発現されるＣＤ２は、標的細胞（例えば、がん性細胞）上に発現されるＣＤ５８と結合し得る。免疫応答性細胞上に発現されるＶＬＡ−４は、標的細胞（例えば、がん性細胞）上のＶＣＡＭ−１と結合し得る。
【０１６１】
ＣＴＬの未精製供給源は、骨髄、胎児、新生児または成人または他の造血細胞供給源、例えば、胎児肝臓、末梢血または臍帯血などの当技術分野で公知の任意のものであり得る。細胞を分離するために種々の技術が使用され得る。例えば、陰性選択方法は、最初に非ＣＴＬを除去し得る。ｍＡｂは、陽性および陰性選択の両方について特定の細胞系統および／または分化の段階と関連するマーカーを同定するために特に有用である。
【０１６２】
比較的粗い分離によって、最終分化した細胞の大きな割合が最初に除去され得る。例えば、多数の無関係の細胞を除去するために、磁性ビーズ分離が最初に使用され得る。好ましくは、細胞単離に先立って、総造血細胞の少なくとも約８０％、普通、少なくとも７０％が除去される。
【０１６３】
分離の手順として、これらに限定されないが、密度勾配遠心分離、再設定、細胞密度を修飾する粒子とのカップリング、抗体によってコーティングされた磁性ビーズを用いる磁性分離、アフィニティークロマトグラフィー、ｍＡｂと連結されるか、またはそれとともに使用される、これらに限定されないが、補体および細胞毒を含めた細胞傷害性薬剤ならびに固体マトリックス、例えば、プレート、チップと結合している抗体を用いるパニング、水簸または任意の他の好都合な技術が挙げられる。
【０１６４】
分離および分析するための技術として、これらに限定されないが、変動する程度の精巧さ、例えば、複数の色チャネル、低角度および鈍角光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルを有し得るフローサイトメトリーが挙げられる。
【０１６５】
ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）などの死細胞と関連する色素を使用することによって、死細胞に対して細胞が選択され得る。好ましくは、細胞は、２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）もしくは０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む培地または任意の他の適した、好ましくは、無菌の等張性培地中に集められる。
【０１６６】
ＩＶ．ベクター
【０１６７】
免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞、ＣＴＬ細胞、ＮＫ細胞）の遺伝子修飾は、実質的に均一な細胞組成物を、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物を用いて形質導入することによって達成され得る。一実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター（例えば、ガンマレトロウイルスまたはレンチウイルスの）であり、宿主細胞ゲノムへのＤＮＡまたはＲＮＡ構築物の導入のために使用される。例えば、メソセリン特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、レトロウイルスベクター中にクローニングされ得、発現は、その内因性プロモーターから、レトロウイルスの長い反復配列から、または代替内部プロモーターから駆動され得る。
【０１６８】
非ウイルスベクターまたはＲＮＡも同様に使用され得る。ランダム染色体組込みまたは標的化された組込み（例えば、ヌクレアーゼ、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および／またはクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（clustered  regularly  interspaced  short  palindromic  repeats）（ＣＲＩＳＰＲ）または導入遺伝子発現（例えば、天然ＲＮＡまたは化学修飾されたＲＮＡを使用する）を使用する）が使用され得る。
【０１６９】
メソセリン特異的細胞を提供するための細胞の最初の遺伝子修飾のためには、一般に、レトロウイルスベクターが形質導入のために使用されるが、任意の他の適したウイルスベクターまたは非ウイルス送達系が使用され得る。少なくとも２種の共刺激リガンドを含む抗原提示複合体を含む細胞を提供するための細胞のその後の遺伝子修飾のために、レトロウイルス遺伝子導入（形質導入）は同様に有効であるとわかる。レトロウイルスベクターおよび適当なパッケージング系統の組合せも適しており、キャプシドタンパク質は、ヒト細胞に感染するのに機能的となる。これらに限定されないが、ＰＡ１２（Miller,  et  al.  (1985)  Mol.  Cell.  Biol.  5:431-437）、ＰＡ３１７（Miller,  et  al.  (1986)  Mol.  Cell.  Biol.  6:2895-2902）およびＣＲＩＰ（Danos,  et  al.  (1988)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  85:6460-6464）を含めた、種々の両栄養性ウイルス製造細胞株が公知である。非両栄養性の粒子、例えば、ＶＳＶＧ、ＲＤ１１４またはＧＡＬＶエンベロープおよび当技術分野で公知の任意の他のものを用いてシュードタイプされた粒子も適している。
【０１７０】
形質導入の可能性ある方法としてまた、例えば、Bregni,  et  al.  (1992)  Blood  80:1418-1422の方法によるプロデューサー細胞との細胞の直接共存培養、または例えば、Xu  et  al.  (1994)  Exp.  Hemat.  22:223-230およびHughes  et  al.  (1992)  J.  Clin.  Invest.  89:1817の方法による、適当な成長因子およびポリカチオンとともに、もしくはそれらを伴わずに、ウイルス上清単独もしくは濃縮ベクターストックとともに培養することが挙げられる。
【０１７１】
免疫応答性細胞において、共刺激リガンド（例えば、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１２）を発現させるために、形質導入ウイルスベクターが使用され得る。好ましくは、選択されたベクターは、高い感染効率および安定な組込みおよび発現を示す（例えば、Cayouette  et  al.,  Human  Gene  Therapy  8:423-430,  1997；Kido  et  al.,  Current  Eye  Research  15:833-844,  1996；Bloomer  et  al.,  Journal  of  Virology  71:6641-6649,  1997；Naldini  et  al.,  Science  272:263  267,  1996およびMiyoshi  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  94:10319,  1997を参照のこと）。使用され得る他のウイルスベクターとして、例えば、アデノウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルス、ウシパピローマウイルスまたはエプスタイン−バーウイルスなどのヘルペスウイルスが挙げられる（例えば、the  vectors  of  Miller,  Human  Gene  Therapy  15-14,  1990；Friedman,  Science  244:1275-1281,  1989、Eglitis  et  al.,  BioTechniques  6:608-614,  1988、Tolstoshev  et  al.,  Current  Opinion  in  Biotechnology  1:55-61,  1990、Sharp,  The  Lancet  337:1277-1278,  1991、Cornetta  et  al.,  Nucleic  Acid  Research  and  Molecular  Biology  36:311-322,  1987、Anderson,  Science  226:401-409,  1984、Moen,  Blood  Cells  17:407-416,  1991、Miller  et  al.,  Biotechnology  7:980-990,  1989、Le  Gal  La  Salle  et  al.,  Science  259:988-990,  1993およびJohnson,  Chest  107:77S-83S,  1995も参照のこと）。レトロウイルスベクターは特によく開発されており、臨床状況において使用されている（Rosenberg  et  al.,  N.  Engl.  J.  Med  323:370,  1990；Anderson  et  al.、米国特許第５，３９９，３４６号）。
【０１７２】
１つの限定されない例では、ここで開示されるＭＳＬＮ標的化ＣＡＲをコードするベクターは、レトロウイルスベクター、例えば、図２４Ａおよび２６に示されるような、Ｍ２８ｚをコードするＳＧＦ  γ−レトロウイルスベクターなどのモロニーマウス白血病ベースのレトロウイルスベクターである、ＳＧＦ  γ−レトロウイルスベクターである。ＳＦＧ−ＩＣＡＳ９−Ｐ２Ａ−Ｍ２８ｚ  プラスミドＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号３６に示されており、これは以下に提供されている：
【化２７−１】
2020036606.tif 000029
【化２７−２】
2020036606.tif 000030
【化２７−３】
2020036606.tif 000031
【０１７３】
Ｍ２８ｚをコードするＳＦＧ  γ−レトロウイルスベクターは、ＳＦＧ骨格の６．７ｋｂのＮｏｔＩ／ＢｇｌＩＩ中に２種のＤＮＡ断片を挿入することによって構築され得る。この骨格は、以下：（１）ｍＲＮＡをコードするＭｏ−ＭＬＶ  ｅｎｖのＳＡおよび５’ＵＴＲを包含する領域を除く全ＳＦＧ  γ−レトロウイルスベクター、（２）ヒトＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと融合しているヒトＣＤ２８シグナル伝達ドメインのＣＤＳをコードする。
【０１７４】
ＤＮＡ断片１は、プラスミド構築物ＳＦＧ−ｉＣＡＳ９−４１ＢＢＬ−ＮＹ２８ｚに由来する１．５ｋｂのＢｇｌＩＩ／ＢｓｐＥＩ断片であり得る。この断片は、Ｃ末端の８個のアミノ酸および停止コドンを欠くｉＣＡＳＰ９のＣＤＳと融合している、ｍＲＮＡをコードするＭｏ−ＭＬＶ  ｅｎｖのＳＡおよび５’ＵＴＲを包含する領域をコードする。ｉＣＡＳＰ９  ＣＤＳは、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏからｄｅ  ｎｏｖｏ合成によって導かれ得る。
【０１７５】
ＤＮＡ断片２は、０．９７９ｋｂのＰＣＲ産物に由来する０．８９ｋｂのＢｓｐＥＩ／ＮｏｔＩ断片であり得る。この断片は、ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＣＤ８ａリーダー＿ｍ９１２  ｓｃＦｖと融合している、ｉＣＡＳＰ９のＣ末端ＣＤＳ（停止コドンを含まない）をコードする。このＰＣＲ産物は、以下のプライマーを使用して鋳型としてのＳＦＧ−ＴＫ−２Ａ−Ｍ２８ｚから合成され得る：
（１．）ｉＣＡＳＰ９−２Ａ左プライマー：gcgctccggaaaaaacttttctttaaaacatc  aggatctggagcaacaaacttc  [配列番号37]。
（２．）ＣＤ２８右プライマー：ggtgtttccctttcacatgg[配列番号38].
【０１７６】
Ｐ２Ａのアミノ酸配列は、配列番号３９に示されており、これは以下に提供されている：
ATNFSLLKQAGDVEENPGP[配列番号39]。
配列番号３９のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４０に示されており、これは、以下に提供されている：
GCAACAAACTTCTCACTACTCAAACAAGCAGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCC[配列番号40]。
【０１７７】
ＳＦＧ−ＴＫ＿２Ａ＿Ｍ２８ｚ鋳型は、オーバーラップ−エクステンションＰＣＲによって、ＳＦＧ−Ｈｓｖｔｋ＿Ｐ２Ａ＿Ｐ２８ｚ骨格およびＳＦＧ−Ｍ２８ｚ＿ｉｒｅｓ＿ｈｒＧＦＰ中のＣＤ８ａリーダー＿ｍ９１２  ｓｃＦｖ配列を使用して導かれ得る。ＳＦＧ−Ｍ２８ｚ＿ｉｒｅｓ＿ｈｒＧＦＰ中のＣＤ８ａリーダー＿ｍ９１２  ｓｃＦｖ配列は、発現最適化されたコドン表を使用してＢｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏからのｄｅ  ｎｏｖｏ合成によって導かれ得る。
【０１７８】
ＳＦＧ／ＴＫ＿２Ａ＿Ｐ２８ｚは、３要素連結−
（１）ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子と融合している、スプライスアクセプター部位を含有するＭｏ−ＭＬＶベクターの領域をコードするＳＦＧ−ＴＰ２８ｚ．３に由来する１４６２ｂｐのＢｇｌＩＩ／ＢｓｓＨＩＩ断片、
（２）停止コドン＿ＧＳＧ＿２Ａ＿ＣＤ８ａシグナルペプチド＿Ｊ５９１  ＳｃＦｖを含まないＨＳＶ−ＴＫ遺伝子の３’末端をコードするＰＣＲ産物に由来する、８８０ｂｐのＢｓｓＨＩＩ／ＮｏｔＩ断片、ならびに
（３）キメラ抗原受容体の膜貫通＿ＣＤ２８＿ゼータ鎖の残りをコードするＳＦＧ−ＴＰ２８ｚ．３およびレトロウイルスベクター骨格の残部に由来する、６６５２ｂｐのＮｏｔＩ／ＢｓｓＨＩＩ断片
を使用してＳＦＧ−ＴＰ２８ｚ．３から導かれ得る。
【０１７９】
ＰＣＲ産物は、鋳型としてＧＳＧ＿Ｐ２Ａ＿＿ＣＤ２８ｚをコードするこれまでに構築されたプラスミドＤＮＡを使用して増幅され得る。以下のプライマーが利用され得る：
（１）フォワードＨＳＶＴＫ＿リンカー＿ＧＳＧ＿Ｐ２Ａ：
GCGCGCGCGCACGTTTGCCCGGGAGATGGGGGAGGCTAACGGATCTGGAGCAACAAACTTC[配列番号41]および
（２）リバース−Ｐ２８ｚ  Ｒ：ggtgtttccctttcacatgg[配列番号42]。
【０１８０】
ＳＦＧ−ｉＣ９−４１ＢＢＬ−ＮＹ２８ｚは、ＳＦＧ−Ｈｓｖｔｋ＿２Ａ＿Ｐ２８ｚに由来する６．８ｋｂのＡｇｅＩ／ＮｏｔＩ骨格中に２種の断片を挿入することによって作製され得る：（１）ｉＣＡＳＰ９の全ＣＤＳおよびｇｓｇ＿Ｐ２Ａ切断ペプチドとインフレームで融合しているＮ末端４−１ＢＢＬと融合している、ｅｎｖ  ｍＲＮＡのＭｏ−ＭＬＶ  ＳＤおよび５’ＵＴＲをコードするｐＵＣ（−ｍｃｓ）−ＣＢＮＩに由来する１．７ｋｂのＡｇｅＩ／ＳａｃＩＩ断片ならびに（２）別のＧＳＧ＿Ｐ２Ａ切断ペプチドを介してＮＹＥＳＯ−１抗原を標的化するｓｃＦｖと融合している、残りのＣ末端４−１ＢＢＬ  ＣＤＳをコードするｐＵＣ（−ｍｃｓ）−ＣＢＮＩＩに由来する１．５ｋｂのＳａｃＩＩ／ＡｇｅＩ断片。
【０１８１】
ｐＵＣ（−ｍｃｓ）−ＣＢＮＩおよびｐＵＣ（−ｍｃｓ）−ＣＢＮＩＩの両方とも、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏから得ることができ、挿入部分は、ｄｅ  ｎｏｖｏ遺伝子合成によって作製され得る。
【０１８２】
細胞におけるタンパク質の発現のために非ウイルスアプローチも使用され得る。例えば、核酸分子は、リポフェクションの存在下で核酸を投与すること（Feigner  et  al.,  Proc.  Nat!.  Acad.  Sci.  U.S.A.  84:7413,  1987；Ono  et  al.,  Neuroscience  Letters  17:259,  1990；Brigham  et  al.,  Am.  J.  Med.  Sci.  298:278,  1989；Staubinger  et  al.,  Methods  in  Enzymology  101:512,  1983）、アシアロオロソムコイド−ポリリジンコンジュゲーション（Wu  et  al.,  Journal  of  Biological  Chemistry  263:14621,  1988；Wu  et  al.,  Journal  of  Biological  Chemistry  264:16985,  1989）によって、または外科的条件下でのマイクロインジェクションによって（Wolff  et  al.,  Science  247:1465,  1990）細胞中に導入され得る。遺伝子導入のための他の非ウイルス手段として、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーションおよびプロトプラスト融合を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏでのトランスフェクションが挙げられる。リポソームはまた、細胞へのＤＮＡの送達にとって有益である可能性があり得る。被験体の罹患組織への正常な遺伝子の移植はまた、正常な核酸を、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養可能な細胞種（例えば、自己または異種初代細胞またはその後代）に導入し、その後、細胞（またはその子孫）が標的化された組織中に注射されるか、または全身に注射されることによって達成され得る。組換え受容体は、トランスポサーゼまたは標的化されたヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼまたはＴＡＬＥヌクレアーゼ）を使用して導くまたは得ることもできる。ＲＮＡエレクトロポレーションによって、一過性の発現を得ることができる。
【０１８３】
ポリヌクレオチド療法の方法において使用するためのｃＤＮＡ発現は、任意の適したプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）またはメタロチオネインプロモーター）から指示され、任意の適当な哺乳動物制御エレメントまたはイントロン（例えば、延長因子１αエンハンサー／プロモーター／イントロン構造）によって制御され得る。例えば、必要に応じて、特定の細胞種において遺伝子発現を選択的に指示すると知られているエンハンサーが、核酸の発現を指示するために使用され得る。使用されるエンハンサーとして、限定するものではないが、組織または細胞特異的エンハンサーとして特徴付けられているものを挙げることができる。あるいは、治療用構築物としてゲノムクローンが使用される場合には、制御は、同族制御配列によって、または必要に応じて、上記のプロモーターまたは制御エレメントのいずれかを含めた異種供給源に由来する制御配列によって媒介され得る。
【０１８４】
得られた細胞は、非修飾細胞のためのものと同様の条件下で成長され得、それによって、修飾された細胞は、拡大され、種々の目的のために使用され得る。
【０１８５】
Ｖ．ポリペプチドおよび類似体およびポリヌクレオチド
【０１８６】
ヒトメソセリンに特異的に結合する細胞外抗原結合性ドメイン（例えば、抗体ｍ９１２に由来するｓｃＦｖなどのｓｃＦｖ、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２）と、ＣＤ３ζ、ＣＤ８、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−１２、Ｍｚ、Ｍ２８ｚ、ＭＢＢｚのポリペプチドまたはその断片と、免疫応答性細胞において発現された場合にそれらの抗新生物活性を増強する方法で修飾されているそれらをコードするポリヌクレオチドとが、ここで開示される主題に含まれる。ここで開示される主題は、配列に変更をもたらすことによってアミノ酸配列または核酸配列を最適化するための方法を提供する。このような変更は、ある特定の突然変異、欠失、挿入または翻訳後修飾を含み得る。ここで開示される主題は、ここで開示される主題の任意の天然に存在するポリペプチドの類似体をさらに含む。類似体は、ここで開示される主題の天然に存在するポリペプチドとは、アミノ酸配列相違によって、翻訳後修飾によって、または両方によって異なり得る。ここで開示される主題の類似体は、全般的に、ここで開示される主題の天然に存在するアミノ酸配列のすべてまたは一部と、少なくとも約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれを超える同一性を示し得る。配列比較の長さは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００個またはそれを超えるアミノ酸残基である。やはり、同一性の程度を決定するための例示的アプローチでは、ＢＬＡＳＴプログラムが使用され得、密接に関連する配列を示すｅ−３からｅ−１００の間の確率スコアを有する。修飾は、ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ化学誘導体化、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化またはグリコシル化を含み、このような修飾は、ポリペプチド合成またはプロセシングまたは単離された修飾酵素を用いるその後の処理の間に起こり得る。類似体はまた、一次配列の変更によって、ここで開示される主題の天然に存在するポリペプチドとは異なり得る。これらは、天然および誘導された（例えば、Sambrook,  Fritsch  and  Maniatis,  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual  (2d  ed.),  CSH  Press,  1989またはAusubel  et  al.前掲に記載されるような、エタンメチルスルフェートに対する照射もしくは曝露によるランダム突然変異誘発に起因する、または部位特異的突然変異誘発による）両方の遺伝的変異体を含む。Ｌ−アミノ酸以外の残基、例えば、Ｄ−アミノ酸または天然に存在しないアミノ酸または合成アミノ酸、例えば、ベータ（β）またはガンマ（γ）アミノ酸を含有する環化ペプチド、分子および類似体も含まれる。
【０１８７】
全長ポリペプチドに加えて、ここで開示される主題はまた、ここで開示される主題のポリペプチドまたはペプチドドメインのいずれか１種の断片も提供する。断片は、少なくとも５、１０、１３または１５個のアミノ酸であり得る。一部の実施形態では、断片は、少なくとも２０個の連続するアミノ酸、少なくとも３０個の連続するアミノ酸または少なくとも５０個の連続するアミノ酸である。一部の実施形態では、断片は、少なくとも６０〜８０、１００、２００、３００またはそれ超の連続するアミノ酸である。ここで開示される主題の断片は、当業者に公知の方法によって作製され得るか、または正常なタンパク質プロセシング（例えば、生物活性に必要ではない新生ポリペプチドからのアミノ酸の除去または代替ｍＲＮＡスプライシングもしくは代替タンパク質プロセシング事象によるアミノ酸の除去）に起因し得る。
【０１８８】
非タンパク質類似体は、本発明のタンパク質の機能活性を模倣するように設計された化学構造を有する。このような類似体は、ここで開示される主題の方法に従って投与される。このような類似体は、元のポリペプチドの生理活性を超える場合がある。類似体設計の方法は、当技術分野で周知であり、類似体の合成は、免疫応答性細胞において発現された場合に、得られた類似体が、元のポリペプチドの抗新生物活性を増大するように化学構造を修飾することによって、このような方法に従って実施され得る。これらの化学修飾として、これらに限定されないが、代替Ｒ基を置換することおよび参照ポリペプチドの特定の炭素原子の飽和度を変えることが挙げられる。タンパク質類似体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ分解に対して相対的に耐性であり、その結果、投与の際に、より長期の治療効果をもたらし得る。機能活性を測定するためのアッセイとして、これらに限定されないが、以下の実施例に記載されるものが挙げられる。
【０１８９】
ここで開示される主題に一致して、ヒトメソセリンと特異的に結合する細胞外抗原結合性ドメイン（例えば、ｓｃＦＶ（例えば、抗体ｍ９１２に由来するｓｃＦｖ）、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２）、ＣＤ３ζ、ＣＤ８、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−１２、Ｍｚ、Ｍ２８ｚ、およびＭＢＢｚをコードするポリヌクレオチドは、コドン最適化によって修飾され得る。コドン最適化は、任意の所与の発現系において最高の可能性あるレベルの生産性を達成するように天然に存在するおよび組換え遺伝子配列の両方を変更し得る。タンパク質発現の種々の段階に関与している因子として、転写および翻訳における、コドン適応性、ｍＲＮＡ構造および種々のシスエレメントが挙げられる。ここで開示される主題のポリヌクレオチドを修飾するために、これらに限定されないが、ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）、Ｅｎｃｏｒ最適化およびＢｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎを含めた、任意の適したコドン最適化方法または当業者に公知の技術が使用され得る。
【０１９０】
ある特定の実施形態では、ここで開示されるＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、ｍ９１２抗体に由来するｓｃＦｖである。ｍ９１２抗体のコドン最適化は、４種の異なるアルゴリズム（例えば、Ｂｌｕｅ  ＨｅｒｏｎおよびＥｎｃｏｒｅアルゴリズム）に基づいて実施される。最適クローニングのために、４種すべてのアルゴリズムから得られたコドン最適化配列が混ぜられ、すべてのＣＰＧおよびＢＡＭ−Ｈ１が除去される。コドン最適化されたヌクレオチド配列は、元のｍ９１２  ｓｃＦｖに対して約７０％相同である。免疫応答性細胞（例えば、ヒト初代Ｔ細胞）における効率的な発現を得るために、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ８リーダー、例えば、配列番号２０をコードするポリヌクレオチドにライゲートされる。ＣＤ８リーダーは、ＳｃＦｖ重鎖（ＱＶＱＬ）に先行する最適シグナル切断を提供する。コドン最適化は、免疫応答性細胞、例えば、複数のヒトドナー初代Ｔ細胞においてメソセリンＣＡＲ発現を最適化し、良好な形質導入効率を有する。変動するメソセリン発現を有する複数の血液がん細胞および固形がん細胞に対する、機能的効率、特異性および感受性について、複数のドナーＴ細胞における複数のＣＡＲベクターコピー数が試験される。１〜４のベクターコピー数（より具体的には、約３〜４）を有する、コドン最適化されたｍ９１２ベースのメソセリンＣＡＲは、高メソセリン発現標的に対する高効率細胞毒性を提供するが、低メソセリン発現標的、すなわち、正常組織に対して最小の反応性を提供し、これは、効率を損なうことなくベクター安全性のために達成される重要な特徴である。高メソセリンを発現するがん細胞に対して反応性であるが、低メソセリンを発現する正常組織を残す、特異的メソセリンＣＡＲの作製における上記の革新的な遺伝子工学は、安全性を保障しながらがん療法のために臨床ベクターとして使用するのに最適である。
【０１９１】
ＶＩ．投与
【０１９２】
ここで開示される主題のメソセリン特異的ＣＡＲおよびそれを発現する免疫応答性細胞は、新生物、病原体感染、感染性疾患、炎症性疾患または移植片拒絶を治療または予防するために、被験体に全身にまたは直接的に提供され得る。一実施形態では、ＭＳＬＮ特異的ＣＡＲおよびそれを発現する免疫応答性細胞は、目的の臓器（例えば、新生物に罹患した臓器）中に直接的に注射される。あるいは、ＭＳＬＮ特異的ＣＡＲおよびそれを発現する免疫応答性細胞は、目的の臓器に間接的に、例えば、循環系（例えば、腫瘍脈管構造）への投与によって提供される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのＴ細胞の製造を増大するために、拡大および分化剤（expansion  and  differentiation  agent）が、細胞および組成物の投与に先立って、その間またはその後に提供され得る。
【０１９３】
ここで開示される主題のＭＳＬＮ特異的ＣＡＲおよびそれを発現する免疫応答性細胞は、任意の生理学的に許容される媒体中で、普通、血管内に投与され得るが、それらはまた、骨または、細胞が再生および分化にとって適当な部位を見出し得る他の好都合な部位（例えば、胸腺）中に導入されてもよい。普通、少なくとも１×１０５個の細胞が投与され、最終的に、１×１０１０個またはそれ超に達する。ＭＳＬＮ特異的ＣＡＲを発現する免疫応答性細胞を含む細胞集団は、精製された細胞の集団を含み得る。当業者ならば、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）などの種々の周知の方法を使用して、細胞集団中の免疫応答性細胞のパーセンテージを容易に決定できる。ＭＳＬＮ特異的ＣＡＲを発現する遺伝子修飾された免疫応答性細胞を含む細胞集団における純度の範囲は、約５０％〜約５５％、約５５％〜約６０％、約６５％〜約７０％、約７０％〜約７５％、約７５％〜約８０％、約８０％〜約８５％、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％または約９５〜約１００％であり得る。投与量は、当業者によって容易に調整され得る（例えば、純度の低下は、投与量の増大を必要とし得る）。免疫応答性細胞は、注射、カテーテルなどによって導入され得る。必要に応じて、これらに限定されないが、インターロイキン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ  ６、ＩＬ−１１、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１ならびに他のインターロイキン、Ｇ−、Ｍ−およびＧＭ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、インターフェロン、例えば、ガンマ−インターフェロンを含めた因子も含まれ得る。
【０１９４】
ここで開示される主題の組成物は、ＭＳＬＮ特異的ＣＡＲを発現する免疫応答性細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を含む。投与は、自家である場合も、または非自家である場合もある。例えば、ＭＳＬＮ特異的ＣＡＲを発現する免疫応答性細胞およびそれを含む組成物は、ある被験体から得られ、同一被験体または異なる適合する被験体に投与され得る。ここで開示される主題の末梢血由来Ｔ細胞またはそれらの後代（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ由来の）が、カテーテル投与を含めた局在型注射、全身注射、局在型注射、静脈内注射または非経口投与によって投与され得る。ここで開示される主題の医薬組成物（例えば、ＭＳＬＮ特異的ＣＡＲを発現する免疫応答性細胞を含む医薬組成物）を投与する場合には、それは一般に、単位投与量注射用形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）に製剤化される。
【０１９５】
ＶＩＩ．製剤
【０１９６】
ここで開示される主題のＭＳＬＮ特異的ＣＡＲを発現する免疫応答性細胞およびそれを含む組成物は、滅菌液体調製物、例えば、選択されたｐＨに緩衝され得る、等張性水溶液、懸濁液、エマルジョン、分散物または粘性組成物として提供され得ることが好都合である。液体調製物は、普通、ゲル、他の粘性組成物および固体組成物よりも調製することが容易である。さらに、液体組成物は、特に注射によって投与するのに幾分かより好都合である。他方、粘性組成物は、特定の組織とのより長い接触期間を提供するために適当な粘度範囲内で製剤化され得る。液体または粘性組成物は、担体を含み得、これは、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適した混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。
【０１９７】
滅菌注射用溶液は、ここで開示される主題のＭＳＬＮ特異的ＣＡＲを発現する免疫応答性細胞を含む組成物を、必要に応じて種々の量の他の成分とともに必要な量の適当な溶媒中に組み込むことによって調製され得る。このような組成物は、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどの、適した担体、希釈剤または賦形剤との混合物中にあり得る。組成物はまた、凍結乾燥され得る。組成物は、望まれる投与経路および調製に応じて、湿潤剤、分散剤または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化もしく粘性増強添加物、保存料、矯味剤、色などの補助物質を含有し得る。過度の実験法なしに適した調製物を調製するために、参照により本明細書に組み込まれる"REMINGTON'S  PHARMACEUTICAL  SCIENCE",  17th  edition,  1985などの標準教本が参考にされ得る。
【０１９８】
抗微生物保存料、抗酸化物質、キレート化剤およびバッファーを含めた、組成物の安定性および無菌性を増強する種々の添加物が添加され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって確実にされ得る。注射用医薬品形態の長期吸収は、吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によって引き起こされ得る。しかし、本発明によれば、使用される任意の媒体、希釈剤または添加物は、ここで開示される主題のＭＳＬＮ特異的ＣＡＲを発現する免疫応答性細胞と適合しなければならないであろう。
【０１９９】
組成物は、等張性であり得る、すなわち、それらは、血液および涙液と同じ浸透圧を有し得る。ここで開示される主題の組成物の所望の等張性は、塩化ナトリウムまたはデキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコールもしくは他の無機もしくは有機溶質などの他の薬学的に許容される因子（agent）を使用して達成され得る。塩化ナトリウムは、ナトリウムイオンを含有するバッファーにとって特に好ましい。
【０２００】
必要に応じて、組成物の粘度は、薬学的に許容される増粘剤を使用して選択されたレベルで維持され得る。メチルセルロースは、それが容易に、経済的に入手可能であり、それを用いて作業することが容易であるので使用され得る。他の適した増粘剤として、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマーなどが挙げられる。増粘剤の濃度は、選択される薬剤に応じて変わり得る。重要な点は、選択された粘度を達成する量を使用することである。適した担体および他の添加物の選択は、正確な投与経路および特定の投与形、例えば、液体投与形（例えば、組成物が、溶液、懸濁液、ゲルまたは持続放出形態もしくは液体充填形態などの別の液体形態に製剤化されようと）の性質に応じて変わることは明らかである。
【０２０１】
当業者ならば、組成物の成分は、化学的に不活性であるように選択されるべきであり、ここで開示される主題において記載されるような免疫応答性細胞の生存力にも有効性にも影響を及ぼさないことを認識するであろう。これは、化学および医薬の原理の当業者には問題を提示しないか、または問題は、標準教本を参照することによって、もしくは本開示および本明細書に引用される文書からの簡単な実験（過度の実験法を含まない）によって容易に避けられ得る。
【０２０２】
ここで開示される主題の免疫応答性細胞の治療的使用に関する１つの考慮は、最適な効果を達成するのに必要な細胞の量である。投与されるべき細胞の量は、治療されている被験体について変わる。ある特定の実施形態では、約１０４〜約１０１０、例えば、約１０４〜約１０５、約１０４〜約１０６、約１０５〜約１０６、約１０６〜約１０７、約１０７〜約１０８、約１０８〜約１０９、約１０９〜約１０１０、約１０５〜約１０９または約１０６〜約１０８個のここで開示される免疫応答性細胞が、被験体に投与される。より有効な細胞は、さらに小さい数で投与され得る。ある特定の実施形態では、少なくとも約１×１０４、少なくとも約１×１０５、約１×１０４〜約１×１０５（例えば、約１×１０４、２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４、６×１０４、７×１０４、８×１０４、９×１０４または１×１０５）、約１×１０５〜約１×１０６（例えば、１×１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５または１×１０６）または約１×１０６〜約１×１０７（例えば、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６または１×１０７）個のここで開示される免疫応答性細胞が被験体に投与される。
【０２０３】
ある特定の実施形態では、少なくとも約１×１０８、約２×１０８、約３×１０８、約４×１０８および約５×１０８個のここで開示される主題の免疫応答性細胞が、ヒト被験体に投与される。有効な用量とみなされるものの正確な決定は、特定の被験体のそれらの大きさ、年齢、性別、体重および状態を含めた、各被験体に個々の因子に基づくものであり得る。投与量は、この開示および当技術分野における知識から当業者により容易に確認され得る。
【０２０４】
当業者ならば、組成物中の、ここで開示される主題の方法において投与されるべき、細胞および任意選択の添加物、媒体および／または担体の量を容易に決定できる。通常、任意の添加物（活性細胞（単数または複数）および／または因子／薬剤（単数または複数）に加えて）は、リン酸緩衝生理食塩水中、重量で、約０．００１％〜約５０％溶液の量で存在し、有効成分は、約０．０００１重量％〜約５重量％、約０．０００１重量％〜約１重量％、約０．０００１重量％〜約０．０５重量％、約０．００１重量％〜約２０重量％、約０．０１重量％〜約１０重量％、または約０．０５重量％〜約５重量％などのマイクログラム〜ミリグラムのオーダーで存在する。動物またはヒトに投与されるべき任意の組成物について、および任意の特定の投与方法について、毒性は、適した動物モデル、例えば、マウスなどのげっ歯類における致死用量（ＬＤ）およびＬＤ５０ならびに適した応答を誘発する、組成物（単数または複数）の投与量、その中の成分の濃度および組成物（単数または複数）を投与するタイミングを決定することなどによって決定されるべきである。このような決定は、当業者の知識、この開示および本明細書において引用される文書からの過度の実験法を必要としない。また、逐次投与の時間は、過度の実験法なしに確認され得る。
【０２０５】
ＶＩＩＩ．治療の方法
【０２０６】
腫瘍微小環境。腫瘍は、免疫認識および排除から自身を保護するための、悪性細胞による一連の機序を含む、宿主免疫応答に適さない微小環境を有する。この「適さない腫瘍微小環境」は、浸潤性制御性ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βを含めた免疫抑制サイトカインならびに活性化Ｔ細胞（ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１）によって発現される免疫抑制受容体に標的化されるリガンドの発現を含め、種々の免疫抑制因子を含む。免疫抑制のこれらの機序は、寛容の維持および不適当な免疫応答の抑制において役割を果たすが、腫瘍微小環境内では、これらの機序は、有効な抗腫瘍免疫応答を防止する。これらの免疫抑制因子は、集団的に、標的化された腫瘍細胞との遭遇の際に養子導入されたＣＡＲによって修飾されたＴ細胞の著しいアネルギーまたはアポトーシスのいずれかを誘導し得る。
【０２０７】
腫瘍免疫学における課題。有効な腫瘍免疫は、免疫エフェクター細胞による腫瘍抗原の認識および反対のない腫瘍排除を必要とする。腫瘍抗原は、腫瘍によって提示され、特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識され得るペプチドエピトープを含有しなくてはならない。初回刺激されたＣＴＬは、十分な数に拡大し、腫瘍部位に遊走しなくてはならず、そこで、エフェクターに成熟して、それらの機能を発揮し、これらは、ヘルパーＴ細胞によって増強され、Ｔｒｅｇおよび阻害性マクロファージによって弱められる。
【０２０８】
操作されたＴリンパ球を用いる標的化Ｔ細胞療法。Ｔ細胞操作は、初期の免疫療法アプローチの多数のこれまでに観察された欠点を解決する可能性がある草分け的戦略である。過去１年以内に、研究者は、規定の抗原（それぞれ、ＣＤ１９およびＮＹ−ＥＳＯ−１）に対して標的化された自家末梢血Ｔ細胞を用いて得られた、再発性１０、１１、化学療法抵抗性白血病および転移性黒色腫１２〜１４における劇的な完全緩解を報告している。
【０２０９】
遺伝子アプローチの理論的根拠：細胞操作は、Ｔ細胞を腫瘍抗原に再度向けるために、またＴ細胞機能を増強するために使用され得る。遺伝的Ｔ細胞修飾の１つの起動力は、Ｔ細胞生存および拡大を増強し、Ｔ細胞死、アネルギーおよび免疫抑制を埋め合わせる可能性である。Ｔ細胞の遺伝的標的化はまた、正常組織の望ましくない破壊を防止するために精緻化され得る。
【０２１０】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）：腫瘍特異的Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードする遺伝子の導入によって作製され得る１５〜２０。第２世代ＣＡＲは、Ｔ細胞を活性化可能である細胞内シグナル伝達ドメインならびにＴ細胞効力および持続を増強するように設計された共刺激ドメインと融合している腫瘍抗原結合性ドメインを含む２１（図１を参照のこと）。したがって、ＣＡＲ設計は、抗原認識とシグナル伝達、すなわち２種の別個の複合体、ＴＣＲヘテロ二量体およびＣＤ３複合体に生理学的に由来する２つの機能を一致させることができる。ＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、普通、マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に、または受容体もしくはそれらのリガンドに由来する。したがって、抗原認識は、ＭＨＣ拘束性ではなく２２、２３、したがって、同一ＣＡＲを使用して、標的抗原を発現する任意の患者に適用可能である。ＣＡＲによる抗原結合は、細胞内ドメイン中の免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）のリン酸化の引き金を引き、細胞溶解誘導、サイトカイン分泌および増殖に必要なシグナル伝達カスケードを開始する。抗原認識のＭＨＣ拘束は、迂回されるので、ＣＡＲ標的化Ｔ細胞の機能は、ＨＬＡ下方制御または抗原プロセシング機構の欠陥によって影響を受けない。
【０２１１】
拡大および生存のためのＴ細胞必要条件：腫瘍特異的Ｔ細胞の増殖は、ｅｘ  ｖｉｖｏで必要とされ、ｉｎ  ｖｉｖｏでもほぼ間違いなく望ましい。Ｔ細胞増殖は、絶対的Ｔ細胞拡大および持続を可能にするためにＴ細胞生存によって達成されなければならない。抗原に応じて増殖するために、Ｔ細胞は、２種のシグナルを受け取らなければならない。一方は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面にディスプレイされる抗原ペプチド／ＭＨＣ複合体のＴＣＲ認識によって提供される１９。もう一方は、ＣＤ２８または４−１ＢＢ受容体などのＴ細胞共刺激受容体によって提供される。Ｔ細胞の細胞溶解活性は、同時に起こる共刺激を必要としないが、これまでに実証されたように１７、２１、２４〜２６、養子導入されたＴ細胞の抗腫瘍機能を持続するには共刺激シグナルの提供が非常に必要である。
【０２１２】
免疫モニタリング：リンパ球は、注入後に動的に発展する作用を示す多機能性「薬物」である。抗原遭遇の際、腫瘍特異的Ｔ細胞は、腫瘍死滅、Ｔ細胞増殖および他の免疫細胞の補充または免疫調節を引き起こし得る種々のタンパク質を活性化および／または放出する。したがって、どの細胞から、どの量で、どの時点でどのタンパク質が分泌されるかを測定することが、特定の患者が応答しているまたは応答していない理由に深い洞察をもたらし、より有効な治験を設計するための重要なフィードバックを提供する。これらのアッセイ系は、臨床アプローチの直接的な意味のある比較を可能にし、したがって、設計原理、次世代治療戦略に役立つ。
【０２１３】
治療のために、投与される量は、所望の効果をもたらすのに有効な量である。有効量は、１回のまたは一連の投与で提供され得る。有効量は、ボーラスで、または連続灌流によって提供され得る。
【０２１４】
「有効量」（または「治療有効量」）は、治療の際に有益なまたは所望の臨床結果に影響を及ぼすのに十分な量である。有効量は、被験体に１回または複数回用量で投与され得る。治療の点では、有効量は、疾患の進行を緩和、寛解、安定化、逆転または減速するか、そうでなければ、疾患の病理学的帰結を低減するのに十分である量である。有効量は、一般に、個々の場合に応じて医師によって決定され、当業者の技術の範囲内である。有効量を達成するのに適当な投与量を決定する場合には、通常、いくつかの因子が考慮される。これらの因子として、被験体の年齢、性別および体重、治療されている状態、状態および形態の重症度ならびに投与される免疫応答性細胞の有効濃度が挙げられる。
【０２１５】
抗原特異的Ｔ細胞を使用する養子免疫療法のためには、約１０６〜約１０１０個の範囲（例えば、約１０９個）の細胞用量が通常注入される。被験体への免疫応答性細胞の投与およびその後の分化の際に、１種の特異的抗原（例えば、ヒトメソセリン）に特異的に向けられる免疫応答性細胞が誘導される。Ｔ細胞の「誘導」は、欠失またはアネルギーなどによる抗原特異的Ｔ細胞の不活性化を含み得る。不活性化は、自己免疫障害などにおいて寛容を確立または再確立するために特に有用である。ここで開示される主題の免疫応答性細胞は、これらに限定されないが、胸膜投与、静脈内投与、皮下投与、リンパ節内投与、腫瘍内投与、くも膜下腔内投与、胸膜内投与、腹膜内投与および胸腺への直接投与を含めた、当技術分野で公知の任意の方法によって投与され得る。一実施形態では、免疫応答性細胞およびそれを含む組成物は、必要とする被験体に胸膜投与される。
【０２１６】
ここで開示される主題は、メソセリン特異的ＣＡＲを発現する免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）を使用する種々の方法を提供する。例えば、ここで開示される主題は、被験体における腫瘍量を低減する方法を提供する。１つの限定されない例では、腫瘍量を低減する方法は、被験体に、有効量のここで開示される免疫応答性細胞を投与し、それによって、被験体において腫瘍細胞死を誘導することを含む。ここで開示される免疫応答性細胞は、被験体において腫瘍細胞の数を低減し、腫瘍の大きさを低減し、および／または腫瘍を根絶し得る。腫瘍は、固形腫瘍であり得る。固形腫瘍の限定されない例として、中皮腫、肺がん、膵臓がん、卵巣がん、乳がん、結腸がん、胸膜腫瘍、神経膠芽腫、食道がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、滑膜肉腫、胸腺癌、子宮内膜癌、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）および胆管癌が挙げられる。
【０２１７】
ここで開示される主題はまた、新生物を有する被験体の生存を増大または延長する方法を提供する。１つの限定されない例では、新生物を有する被験体の生存を増大または延長する方法は、被験体に有効量のここで開示される免疫応答性細胞を投与し、それによって、被験体の生存を増大または延長することを含む。本方法は、被験体における腫瘍量を低減または根絶し得る。さらに、ここで開示される主題は、被験体に、ここで開示される免疫応答性細胞を投与することを含む、被験体において免疫応答を増大するための方法を提供する。ここで開示される主題は、被験体に、ここで開示される免疫応答性細胞を投与することを含む、被験体において新生物を治療または予防するための方法をさらに提供する。
【０２１８】
本明細書において、用語「新生物」は、細胞または組織の病的増殖および他の組織または臓器へのそのその後の遊走または浸潤を特徴とする疾患を指す。新生物の成長は、通常、制御されず、進行性であり、正常細胞の増殖を誘発しない、またはその休止を引き起こす条件下で起こる。新生物は、これらに限定されないが、膀胱、結腸、骨、脳、乳房、軟骨、グリア、食道、卵管、胆嚢、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、神経組織、卵巣、胸膜、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）、精巣、胸腺、甲状腺、気管、泌尿生殖器管、尿管、尿道、子宮および膣からなる群から選択される臓器またはその組織もしくは細胞種を含めた、種々の細胞種、組織または臓器に影響を及ぼし得る。新生物として、肉腫、癌腫または形質細胞腫（形質細胞の悪性腫瘍）などのがんが挙げられる。一実施形態では、新生物は、固形腫瘍である。新生物は、原発腫瘍または原発がんであり得る。さらに、新生物は、転移性状態であり得る。
【０２１９】
ここで開示される主題の免疫応答性細胞を使用して成長が阻害され得るがんは、通常、免疫療法に応答性のがんを含む。治療のためのがんの限定されない例として、中皮腫、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、膵臓がん、卵巣がん、乳がん（例えば、転移性乳がん、転移性三重陰性乳がん）、結腸がん、胸膜腫瘍、神経膠芽腫、食道がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、滑膜肉腫、胸腺癌、子宮内膜癌、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）および胆管癌が挙げられる。さらに、ここで開示される主題は、ここで開示される主題の免疫応答性細胞を使用して成長が阻害され得る、不応性または再発性悪性腫瘍を含む。
【０２２０】
ここで開示される主題の方法を使用して治療され得る他の新生物またはがんの例として、骨がん、腸がん、肝臓がん、皮膚がん、頭頸部のがん、黒色腫（皮膚のまたは眼球内悪性黒色腫）、腎がん（例えば、明細胞癌）、咽頭がん、前立腺がん（例えば、ホルモン不応性前立腺腺癌）、血液がん（例えば、白血病、リンパ腫および骨髄腫）、子宮がん、直腸がん、肛門領域のがん、膀胱がん、脳がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、精巣がん、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟部組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、小児の固形腫瘍、リンパ性リンパ腫、膀胱のがん、腎臓または尿管のがん、腎盂の癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによって誘発されるものを含めた環境誘発性がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病ならびに肉腫および癌腫などの固形腫瘍（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（endotheliosarcoma）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、肝細胞腫、胆管（nile  duct）癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、子宮がん、精巣がん、膀胱癌、上皮性癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、シュワン腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫）が挙げられる。
【０２２１】
さらに、ここで開示される主題は、被験体においてがん細胞または病原体に応じて免疫活性化サイトカイン製造を増大する方法を提供する。１つの限定されない例では、本方法は、被験体に、ここで開示された免疫応答性細胞を投与することを含む。免疫活性化サイトカインは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、インターフェロン制御因子７（ＩＲＦ７）およびそれらの組合せであり得る。ある特定の実施形態では、ここで開示される主題のメソセリン特異的ＣＡＲを含む免疫応答性細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、および／またはＴＮＦ−αの製造を増大する。
【０２２２】
ここで開示される主題は、固形腫瘍（例えば、中皮腫、肺がん、膵臓がん、卵巣がん、乳がん、結腸がん、胸膜腫瘍、神経膠芽腫、食道がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、滑膜肉腫、胸腺癌、子宮内膜癌、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）および胆管癌）を治療するのに特に有用である療法を提供する。固形腫瘍は、原発腫瘍または転移性状態の腫瘍であり得る。ある特定の固形腫瘍は、不均一なＭＳＬＮを発現する腫瘍、例えば、乳がん（例えば、ＴＮＢＣ）、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、食道がん、結腸がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）および悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）である。不均一なＭＳＬＮ発現細胞（例えば、腫瘍細胞）は、低ＭＳＬＮ発現細胞および高ＭＳＬＮ発現細胞を含む細胞の集団である。ここで開示される免疫応答性細胞は、高ＭＳＬＮ発現細胞の存在下で、低ＭＳＬＮ発現細胞（例えば、約２，０００もしくはそれ未満、約１，０００もしくはそれ未満、約９００もしくはそれ未満、約８００もしくはそれ未満、約７００もしくはそれ未満、約６００もしくはそれ未満、約５００もしくはそれ未満、約４００もしくはそれ未満、約３００もしくはそれ未満、約２００もしくはそれ未満、約１００もしくはそれ未満のＭＳＬＮ結合部位／細胞）に対する、細胞毒性および抗腫瘍活性の増大を示し得る。例えば、実施例２を参照のこと。ある特定の実施形態では、高ＭＳＬＮ発現細胞の存在下でさえ、免疫応答性細胞は、ＭＳＬＮ陰性細胞に対して細胞毒性または非特異的死滅の増大を示さない。したがって、免疫応答性細胞は、ＭＳＬＮ陰性細胞に対して安全性を保持しながら、高ＭＳＬＮ発現細胞の存在下で低ＭＳＬＮ発現細胞に対して細胞毒性および抗腫瘍活性の増大を示し得る。
【０２２３】
療法のための適したヒト被験体は、通常、臨床判定基準によって区別され得る２つの治療群を含む。「進行した疾患」または「高腫瘍量」を有する被験体は、臨床上測定可能な腫瘍を有する被験体である。臨床上測定可能な腫瘍は、腫瘍量に基づいて検出され得るものである（例えば、触診、ＣＡＴスキャン、超音波画像、マンモグラムまたはＸ線によって；陽性生化学マーカーまたは病理組織学的マーカーは、そのままではこの集団を同定するのに不十分である）。ここで開示される主題に包含される医薬組成物は、それらの状態を緩和する目的で抗腫瘍応答を誘発するためにこれらの被験体に投与される。結果として腫瘍量の低減が起こることが理想的であるが、任意の臨床改善が利益を構成する。臨床改善は、進行のリスクもしくは速度の低減または腫瘍の病理学的帰結の低減を含む。
【０２２４】
適した被験体の第２の群は、「アジュバント群」として当技術分野で公知である。これらは、新生物の病歴を有していたが、別の様式の療法に応答性であった個体である。先行療法は、外科的切除、放射線療法および伝統的な化学療法を含んでいた可能性があるが、それらに制限されない。結果として、これらの個体は、臨床的に測定可能な腫瘍を有さない。しかし、彼らは、元の腫瘍部位の付近または転移による疾患の進行のリスクにあると疑われる。この群は、ハイリスクおよびローリスク個体にさらに細分され得る。細分割は、最初の治療の前または後に観察される特徴に基づいて行われる。これらの特徴は、臨床の技術分野では公知であり、種々の新生物各々について適宜規定されている。ハイリスク亜群に特有の特徴は、腫瘍が浸潤された隣接組織を有するものまたはリンパ節の関与を示すものである。
【０２２５】
もう１つの群は、新生物に対する遺伝的素因を有するが、まだ新生物の明らかな臨床徴候を有さない。例えば、乳がんと関連する遺伝子突然変異について検査陽性であるが、まだ出産可能年齢である女性は、予防的手術を実施するのに適するまで、新生物の発生を防ぐために予防的に治療において本明細書に記載される抗原結合断片の１種または複数種を受けることを望む場合がある。
【０２２６】
被験体は、進行した形態の疾患を有することがあり、この場合には、治療目的は、疾患進行の軽減もしくは逆転、および／または副作用の寛解を含み得る。被験体は、すでに治療されている状態の病歴を有することがあり、この場合には、治療目的は、通常、再発のリスクの低減または遅延を含む。
【０２２７】
さらに、ここで開示される主題は、病原体感染（例えば、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、寄生生物感染または原虫感染）を有する被験体を治療するための方法を提供する。ここで開示される主題は、免疫低下被験体において免疫応答を増強するために特に有用である。本発明の方法を使用する治療に対して感受性である例示的ウイルス感染として、これらに限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびインフルエンザウイルス感染が挙げられる。したがって、ここで開示される主題は、被験体において病原体感染を治療または予防する方法であって、有効量の、ここで開示される主題のメソセリン特異的ＣＡＲを発現する免疫応答性細胞を投与することを含む方法を提供する。
【０２２８】
ここで開示される主題に一致して、上記の種々の方法は、少なくとも１種の免疫調節因子（immunomodulatory  agent）を投与することを含み得る。免疫調節因子の限定されない例として、免疫賦活剤（immunostimulatory  agent）、チェックポイント免疫遮断剤（checkpoint  immune  blockade  agent）、放射線療法因子（radiation  therapy  agent）および化学療法剤（chemotherapy  agent）が挙げられる。ある特定の実施形態では、免疫調節因子は、免疫賦活剤である。免疫賦活剤の限定されない例として、ＩＬ−１２およびアゴニスト共刺激モノクローナル抗体が挙げられる。一実施形態では、免疫賦活剤は、ＩＬ−１２である。ある特定の実施形態では、乳がん（ＢＣ）、例えば、転移性三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）を治療するために、抗ＩＬ−１２抗体と組み合わせたここで開示される主題の免疫応答性細胞が使用され得る。アゴニスト共刺激モノクローナル抗体の限定されない例として、抗４−１ＢＢ抗体、抗ＯＸ４０抗体および抗ＩＣＯＳ抗体が挙げられる。一実施形態では、アゴニスト共刺激モノクローナル抗体は、抗４−１ＢＢ抗体である。
【０２２９】
ここで開示される主題の本質的な態様は、養子療法のために、腫瘍標的化（例えば、メソセリン特異的）Ｔ細胞を単に作製することではなく、改善された抗原受容体の設計によって、またＩＬ−１２を使用する免疫調節による宿主微小環境における介入によって、Ｔ細胞機能を増強することである。すべての免疫療法アプローチの中で、ＩＬ−１２、多機能サイトカインは、ＢＣを治療するために最も有望なアプローチの１つであると考えられてきた５９〜６１。ＩＬ−１２は、適応１型細胞性免疫、すなわち、抗腫瘍応答に関与する重要な経路の主要制御因子と考えられている６２。ＩＬ−１２は、Ｔｈ１表現型に向けたＣＤ４Ｔ細胞の分極化６３、Ｔ細胞およびＮＫエフェクター機能のブースティング６４、自然免疫応答のリモデリング６５ならびに腫瘍血管新生の制御６６を含め、抗腫瘍応答を種々のレベルで調節する。ＩＬ−１２の免疫調節および抗血管新生機能は、がん、例えば、ＢＣ（例えば、ＴＮＢＣ）を治療するために、ここで開示される主題の免疫応答性細胞と組み合わせてこのサイトカインを使用するための理論的根拠を提供した。がんを有する患者へのＩＬ−１２の投与を含む１４８種の臨床治験（うち、３６種は最近報告された）の中で、腹腔内６７、６８または皮下６９、７０ＩＬ−１２を用いる成功した第ＩＩ相研究は、遺伝子導入によって生じたＩＬ−１２のパラ分泌が、腫瘍に対する免疫性を局所的に、および遠位部位で誘導し得ることを示した。いくつかの研究が、乳がん（ＢＣ）の前臨床モデルにおけるＩＬ−１２の抗がん有効性を実証してきたが５９、６１、７１、進行がんにおけるいくつかの臨床治験において観察された組換えヒトＩＬ−１２の投与に起因する相当な毒性が、その臨床使用を妨げている。この制限を克服するために、いくつかのグループは、アデノウイルスベクターを使用するＩＬ−１２の腫瘍内送達が、ＢＣの前臨床モデルにおいて腫瘍退縮およびＴ細胞活性化を誘導することを実証した７２、７３。より最近、Sabel  et  al.は、ＩＬ−１２を腫瘍中に放出するためにポリ乳酸ミクロスフェアを使用し、抗腫瘍応答は、主にＮＫ細胞によって媒介されることを見出した７４。その他は、ＩＬ−１２をマウスＢＣに局所的に送達するために間葉系間質細胞を使用した７５。ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する悪性腫瘍を有する患者における、ＩＬ−１２と組み合わせた、パクリタキセルおよびトラスツズマブの第Ｉ相治験は、ＮＫ細胞サイトカイン分泌の刺激のためのＩＬ−１２およびトラスツズマブの間の印象的な相乗作用を示した７６。したがって、ＩＬ−１２は、抗がん剤としてかなりの見込みを有し得、養子Ｔ細胞療法アプローチにおける共刺激物質としてのその使用は、十分に正当化される。
【０２３０】
ある特定の実施形態では、免疫調節因子は、チェックポイント免疫遮断剤である。チェックポイント免疫遮断剤の限定されない例として、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗Ｂ７−Ｈ３抗体および抗ＴＩＭ３抗体が挙げられる。一実施形態では、チェックポイント免疫遮断剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせた、ここで開示される主題の免疫応答性細胞は、乳がん（ＢＣ）、例えば、ＴＮＢＣを治療するために使用され得る。
【０２３１】
プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１／Ｂ７−Ｈ４／ＣＤ２７４）は、通常、活発な炎症組織において発現される阻害シグナルであり、Ｔ細胞活性化を制限するためのネガティブフィードバックループとして働く。ＰＤ−Ｌ１発現は、通常、非炎症正常組織（乳房を含む７７）にはなく、代わりに、がん組織、特に、炎症性浸潤物を有するものでは、最も広く行き渡っている７８。この炎症との関連は、Ｔ細胞活性化の際に生じたＴ細胞によって分泌されたサイトカインに対する腫瘍細胞曝露の際のＰＤ−Ｌ１上方制御によるものである可能性が高い。このパターンの発現は、ＢＣによって示され、ＢＣ検体の５０％〜７５％がＰＤ−Ｌ１について染色陽性であり７９〜８１、その発現は、重症リンパ性浸潤物と強く関連している８０。ＢＣ浸潤性Ｔ細胞も、患者の５４％においてＰＤ−Ｌ１を発現した８１。ＢＣはまた、発癌シグナル伝達に続いてＰＤ−Ｌ１を生得的に発現し得る。ＰＩ（３）Ｋ経路の活性化は、ＢＣ細胞においてＰＤ−Ｌ１タンパク質の上方制御をもたらし、患者腫瘍におけるＰＩ（３）Ｋ活性化は、ＰＤ−Ｌ１発現と有意に相関する８２。活性化Ｔ細胞によるＰＤ−１の発現は、免疫抑制ＴＭＥ内のリガンドと受容体発現を空間的および時間的に関連付ける。ＢＣ組織におけるＰＤ−Ｌ１の発現は、これらの患者のための免疫療法標的としてのそれを示唆する。複数の前臨床がんモデル（乳房を含む８３）におけるＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１遮断の有効性は、進行がんを有する患者のためのＰＤ−Ｌ１−またはＰＤ−１−標的化抗体を使用する第Ｉ相治験への道を開いた。第Ｉ相研究（ＰＤ−１抗体を使用する）は、ＰＤ−Ｌ１＋患者においてのみ有効性を実証した８４。遺伝子操作されたＴ細胞は、共阻害チェックポイントを克服するための独特な利点を提供し、ＴＭＥ内には共刺激が通常ないとわかった。ＣＡＲを発現するＴ細胞を実際に操作して、それらの共刺激必要条件を最適化し、Ｔ細胞拡大、生存および機能を支援する。
【０２３２】
一部の実施形態では、免疫調節因子は、放射線療法剤である。局在化した放射線によって誘導された免疫学的環境は、腫瘍における標的化されたＴ細胞の生着を増強するためのプレコンディションを提供し得る（それによって、全身のリンパ球枯渇（lymphodepleting）レジメンの必要性を排除する）だけでなく、放射線療法および養子Ｔ細胞療法の組合せに起因する免疫学的応答もまた、未照射部位への抗腫瘍有効性を増強する。放射線耐性腫瘍では、ＣＡＲ  Ｔ細胞における４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達が、免疫阻害を克服し得る。一部の実施形態では、免疫調節因子は、これに限定されないが、シスプラチンを含めた化学療法剤である。ケモカインおよびサイトカインのシスプラチン誘導性分泌は、ＭＳＬＮ標的化および内因性Ｔ細胞応答を促進し得る。
【０２３３】
研究によって、高レベルの細胞傷害性腫瘍浸潤性リンパ球（ｃＴＩＬ）および低レベルの制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を示す、肺腺癌（ＬＡＣ）および悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）を有する患者は、より良好な予後およびより長い無増悪生存期間を有することが示された（Servais,  et  al.,  Clin  Cancer  Res  (May  1,  2012);18:2478-2489；Kachala  et  al.,  Clin  Cancer  Res  (2013);20(4);  1020-8）。ＭＳＬＮ標的化ＣＡＲを使用する養子Ｔ細胞療法は、ＬＡＣおよびＭＰＭにおいてｃＴＩＬを促進するために使用され得る。Servais(2012)およびKachala(2013)は、ＭＳＬＮは、ＬＡＣおよびＭＰＭにおいて過剰発現され、攻撃性を促進すると報告しており、これは、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の標的としてのＭＳＬＮの選択を正当化する。シスプラチンおよび放射線療法後のより高い割合のＴＩＬは、マウスモデルおよび患者の両方における結果の改善と関連している（図３２、３３および３４）。
【０２３４】
腫瘍放射線照射−およびシスプラチン療法誘導性腫瘍および未照射部位免疫調節は、養子導入されたＴ細胞のより良好な生着に必要なプレコンディショニングを提供し得、腫瘍および間質免疫調節を使用するＴ細胞共刺激戦略は、内因性および養子導入された両方のＴ細胞の抗腫瘍有効性を増強し得る。
【０２３５】
さらに、例えば、被験体においてがんを治療するための、または被験体において腫瘍量を低減するための、メソセリン特異的ＣＡＲを発現する免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）を使用する上記の種々の方法は、がん細胞抗原調節と組み合わせてもよい。メソセリン特異的ＣＡＲを発現する免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）は、細胞質ＭＳＬＮではなく、腫瘍またはがん性細胞の膜上に発現されたＭＳＬＮ（「細胞膜ＭＳＬＮ」と称される）を標的とし、死滅させ得る。ある特定の腫瘍またはがん（例えば、肺がんおよび中皮腫）は、低細胞膜ＭＳＬＮを有するが、高細胞質ＭＳＬＮを有する。がん細胞抗原調節は、腫瘍またはがん性細胞における細胞膜ＭＳＬＮの発現を増大し得、これは、腫瘍またはがん性細胞をＣＡＲ発現免疫応答性細胞によって標的化される可能性をより高いものにし、したがって、免疫応答性細胞による死滅に対してより感受性にし得る。一実施形態では、がん細胞抗原調節は、放射線照射である。
【０２３６】
免疫学的合併症（「悪性Ｔ細胞形質転換」として知られる）、例えば、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のリスクを防ぐもしくは最小化するために、またはＧｖＨＤと同様の結果につながる、健常組織が腫瘍細胞と同じ標的抗原を発現する場合には、メソセリン特異的ＣＡＲ発現性免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）にさらなる改変が導入され得る。この問題に対する可能性ある解決策は、ＣＡＲを発現するＴ細胞に自殺遺伝子を操作して入れることである。適した自殺遺伝子として、これらに限定されないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｈｓｖ−ｔｋ）、誘導可能カスパーゼ９自殺遺伝子（ｉＣａｓｐ−９）および末端切断型ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）ポリペプチドが挙げられる。一実施形態では、自殺遺伝子は、ＥＧＦＲｔポリペプチドである。ＥＧＦＲｔポリペプチドは、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（例えば、セツキシマブ）を投与することによってＴ細胞排除を可能にし得る。ＥＧＦＲｔは、図２５に示されるように、ＭＳＬＮ特異的ＣＡＲ（例えば、Ｍｚ、Ｍ２８ｚ、ＭＢＢｚ）の細胞内ドメインの３’末端に共有結合によって連結され得る。自殺遺伝子は、ここで開示されるメソセリン特異的ＣＡＲをコードする核酸を含むベクター内に含まれ得る。このようにして、悪性Ｔ細胞形質転換（例えば、ＧＶＨＤ）中の自殺遺伝子を活性化するように設計されたプロドラッグ（例えば、プロドラッグ（例えば、ｉＣａｓｐ−９を活性化し得るＡＰ１９０３）の投与は、自殺遺伝子活性化ＣＡＲを発現するＴ細胞においてアポトーシスを引き起こす。
【０２３７】
さらに、ここで開示される主題は、被験体において炎症性疾患を予防または治療する方法を提供する。１つの限定されない例では、本方法は、被験体に、ここで開示された免疫応答性細胞を投与することを含む。一実施形態では、免疫応答性細胞は、免疫阻害細胞である。１つの限定されない例では、免疫阻害細胞は、制御性Ｔ細胞である。一実施形態では、炎症性疾患は、膵炎である。一実施形態では、被験体は、ヒトである。１つの特定の実施形態では、被験体は、臓器移植のレシピエント、例えば、膵臓移植のレシピエントである。
【０２３８】
さらに、ここで開示される主題は、臓器移植のレシピエントである被験体において移植片拒絶を予防する方法を提供する。１つの限定されない例では、本方法は、被験体にここで開示される免疫応答性細胞を投与することを含む。一実施形態では、免疫応答性細胞は、免疫阻害細胞である。１つの限定されない例では、免疫阻害細胞は、制御性Ｔ細胞である。一実施形態では、被験体はヒトである。さらなる実施形態では、被験体は、膵臓移植のレシピエントである。
【０２３９】
ここで開示されるメソセリン特異的ＣＡＲは、免疫阻害細胞、例えば、制御性Ｔ細胞中に形質導入され得る。形質導入された免疫阻害細胞は、炎症状態または炎症性疾患を有する被験体（例えば、ヒト）に投与され得る。一部の実施形態では、炎症部位または炎症性疾患の部位は、高発現レベルのメソセリンを有し、これは、ここで開示されるＭＳＬＮ−ＣＡＲによって認識される。炎症状態は、極度、例えば、重症膵炎であり得る。さらに、形質導入された免疫阻害細胞は、臓器移植のレシピエントである被験体に投与され得る。
【０２４０】
さらに、ここで開示されるＭＳＬＮ特異的ＣＡＲならびにＭＨＣ抗原を標的化する第２のＣＡＲは、免疫阻害細胞が、移植された膵臓の部位で特異的に集まり得るように免疫阻害細胞（例えば、制御性Ｔ細胞）中に共形質導入され得る。一例では、ＭＨＣクラスＩ被験体は、ＭＨＣクラスＩＩドナーから膵臓移植を受け、レシピエントの制御性Ｔ細胞は、ここで開示されるＭＳＬＮ特異的ＣＡＲおよびＭＨＣクラスＩＩ抗原を標的化する第２のＣＡＲとともに形質導入され、したがって、レシピエントの形質導入された制御性Ｔ細胞は、移植された膵臓の部位に集まる／プールされ、移植片または臓器拒絶を避ける。
【０２４１】
ＩＸ．キット
【０２４２】
ここで開示される主題は、新生物、病原体感染、免疫障害または同種異系移植を治療または予防するためのキットを提供する。一実施形態では、キットは、単位投与形に、メソセリン特異的ＣＡＲを含む有効量の免疫応答性細胞を含有する治療用または予防用組成物を含む。特定の実施形態では、細胞は、共刺激リガンドをさらに含む。一部の実施形態では、キットは、治療用または予防用ワクチンを含有する滅菌容器を含み、このような容器は、箱、アンプル、瓶、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、ブリスターパックまたは当技術分野で公知の他の適した容器形態であり得る。このような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔または医薬を保持するのに適した他の材料製であり得る。
【０２４３】
必要に応じて、免疫応答性細胞は、新生物、病原体感染、免疫障害または同種異系移植を有するか、またはそれを発生するリスクにある被験体に、細胞を投与するための指示書と一緒に提供される。指示書は、一般に、新生物、病原体感染、免疫障害または同種異系移植の治療または予防のための組成物の使用に関する情報を含む。他の実施形態では、指示書は、以下のうちの少なくとも１つを含む：治療剤の説明、新生物、病原体感染、免疫障害もしくは同種異系移植またはそれらの症状の治療または予防のための投与スケジュールおよび投与、使用上の注意、警告、適応症、禁忌、過量投与情報、副作用、動物薬理作用、臨床研究および／または参考文献。指示書は、容器（存在する場合には）上に直接、または容器に張り付けられたラベルとして、または容器中にもしくは容器とともに供給された別個のシート、パンフレット、カードもしくはフォルダーとして印刷される場合もある。
【実施例】
【０２４４】
本発明の実行は、他に示さない限り、十分に当業者の範囲内である、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は、"Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual",  second  edition  (Sambrook,  1989);  "Oligonucleotide  Synthesis"  (Gait,  1984)  ;  "Animal  Cell  Culture"  (Freshney,  1987);  "Methods  in  Enzymology"  "Handbook  of  Experimental  Immunology"  (Weir,  1996);  "Gene  Transfer  Vectors  for  Mammalian  Cells"  (Miller  and  Calos,  1987);  "Current  Protocols  in  Molecular  Biology"  (Ausubel,  1987);  "PCR:  The  Polymerase  Chain  Reaction",  (Mullis,  1994)  ;  "Current  Protocols  in  Immunology"  (Coligan,  1991)などの文献に詳細に説明される。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に適用可能であり、したがって、本発明を作製し、かつ行うのに考慮され得る。特定の実施形態について特に有用な技術は、下のセクションで考察される。
【０２４５】
以下の実施例は、当業者に対して、本発明のアッセイ、スクリーニングおよび治療方法を作製し、かつ用いるための方法を完全に開示および説明するために示しているものであって、本発明者らがその発明であるとみなす範囲を限定することは意図していない。
【０２４６】
（実施例１）
１．序
【０２４７】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を使用するがん抗原標的化Ｔ細胞療法は、血液悪性腫瘍の治療において、最近、臨床上の成功を収めた。ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を固形腫瘍にトランスレーションすると、臨床上の利益を達成するために克服しなければならないいくつかの障害を生じる。固形腫瘍は、効率的なＴ細胞輸送を妨げる解剖学的コンパートメント内に制限され、通常は、共刺激リガンドの発現を欠き、かつＴ細胞機能の負の制御因子を発現する。したがって、固形腫瘍の排除は、腫瘍媒介性免疫抑制に打ち勝つことができるＴ細胞の浸潤の成功に依拠する。
【０２４８】
抗原特異的キメラ受容体への活性化共刺激シグナル伝達を操作することは、免疫抑制性の腫瘍微小環境と対抗して、Ｔ細胞の増殖および生存を保証し得る。共刺激シグナル伝達が抗腫瘍有効性を増強する能力は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋のＴ細胞サブセットの間の協調的な労力に起因する。伝統的に、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、がん細胞を排除するのに一次的な役割を果たすと考えられるが、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ８＋エフェクター形成およびＣＤ８＋Ｔ細胞消耗の防止に必要なヘルパーサイトカインを提供する。さらに近年では、ＣＤ４＋Ｔ細胞がそれ自体、強力な抗腫瘍有効性を媒介するという評価によって、腫瘍免疫療法におけるこのサブセットに関する進化する役割が強調される。キメラ抗原受容体は、抗腫瘍応答の全局面へのＣＤ４＋Ｔ細胞の有効な動員に対して固有的に適合され得る。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、細胞表面腫瘍抗原を認識し、ほとんどの腫瘍を欠いているＭＨＣクラスＩＩ発現の必要性を迂回する。さらに、それらの抗体由来抗原認識ドメインは、ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性の溶解に必須の高い結合アフィニティーを提供する。
【０２４９】
胸膜の中皮腫の同所性モデルにおいて腫瘍への効率的なＴ細胞送達を促進するために、Ｔ細胞を胸膜腔へ直接投与した。胸膜に投与されたＣＤ４＋ＣＡＲ  Ｔ細胞は、腫瘍を直接溶解可能であり、かつＣＤ２８共刺激で損なわれる増強された増殖性能と呼応して、それ自体が、ｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍排除に必要な全ての機能を媒介すべきであるという仮説がなされた。本実施例によって、ＣＤ８＋ＣＡＲ  Ｔ細胞と大きさの等しい効率的なＣＤ４＋媒介性の腫瘍細胞溶解、ならびにＣＤ４＋ＣＡＲ  Ｔ細胞がＩＬ−２を分泌して、反復性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗原刺激の際に増殖する固有の能力が実証される。メソセリンに対して遺伝的に標的化された、胸膜に投与されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、堅調な増殖を受け、およびこれらの細胞の唯一の移入は、大きい樹立された胸膜腫瘍の拒絶を生じる。さらに、ＣＤ４＋ＣＡＲ  Ｔ細胞は、胸膜腔の外側に遊走して、長期の腫瘍免疫を、それらが胸膜外腫瘍再チャレンジに対する応答を生じる能力によって実証されるように確立する。まとめると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方の研究によって、固形腫瘍によって生じる障害を克服するための局所的なＣＡＲ  Ｔ細胞投与の使用が支持される。この実施例によって、多機能性のＣＤ４＋Ｔ細胞の生成がＴ細胞を補助し得、細胞傷害性が、固形腫瘍の処置のためにＣＡＲ＋Ｔ細胞療法の使用に対して特定の利点を提供することが実証される。
【０２５０】
２．材料および方法
【０２５１】
細胞株
【０２５２】
ＭＳＴＯ−２１１Ｈ（ヒト胸膜の中皮腫）およびＥＬ４（マウス胸腺腫）は両方とも、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣから入手した。ＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞を、レトロウイルスによって形質導入して、緑色蛍光タンパク質／ホタルルシフェラーゼ融合タンパク質（ＭＳＴＯ  ＧＦＰ−ｆｆＬｕｃ＋）を発現して、非侵襲性ｉｎ  ｖｉｖｏ生物発光イメージングを容易にする。次いで、これらの細胞を、ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋ＧＦＰ−ｆｆＬｕｃ＋を生成するようにＳＦＧレトロウイルスベクター中にサブクリーニングされた、ヒトＭＳＬＮ変異体１（ヒト卵巣がん細胞株（ＯＶＣＡＲ−３）から単離された）を用いて形質導入した。
【０２５３】
ガンマレトロウイルスベクター構築およびウイルス産生
【０２５４】
メソセリン特異的キメラ抗原受容体を生成するために、そのＮ末端でヒトＣＤ８リーダーペプチドにライゲーションされた、完全ヒトｓｃＦｖをコードする融合タンパク質であるｍ９１２を操作した。ガンマレトロウイルスベクターを骨格構築物として用いて、このｓｃＦｖを交換して、第１世代（ＳＦＧ−Ｍｚ）および第２世代（ＳＦＧ−Ｍ２８ｚ）のメソセリン特異的構築物を、ｓｃＦｖの５’に位置するＮｃｏＩ部位およびｓｃＦｖの３’に位置するＮｏｔＩ部位を用いる指向性クローニングによって生成した。内部リボソーム進入部位を挿入して、ヒト化組換え緑色蛍光タンパク質（ｈｒＧＦＰ）レポーター遺伝子を有するＣＡＲの２シストロン性発現を容易にした。次いで、ＳＦＧ−Ｍｚ、ＳＦＧ−Ｍ２８ｚ、およびＳＦＧ−Ｐ２８ｚを、２９３Ｔ  Ｈ２９パッケージング細胞株中にトランスフェクトして、このウイルス上清を用いて、安定な２９３Ｔ  ＲＤ１１４細胞株を形質導入して生成した。
【０２５５】
Ｔ細胞単離、遺伝子導入、およびＣＤ４／ＣＤ８単離
【０２５６】
末梢血白血球は、治験審査委員会が承認したプロトコールのもとで健常なボランティアのドナーの血液から単離した。ＰＨＡ活性化された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＮＹ）での低密度遠心分離によって単離した。単離の２日後、ＰＢＭＣを、２日間、毎日、１５μｇ／ｍｌのレトロネクチン（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｏｔｓｕ、Ｊａｐａｎ）でコーティングしたプレート上で１時間、Ｍｚ、Ｍ２８ｚ、またはＰ２８ｚベクターを含有する、２９３Ｔ産生上清で形質導入した。３日間ベクター発現させた後、形質導入されたＰＢＭＣを、２０単位／ｍｌのＩＬ−２中で維持した。形質導入の有効性は、フローサイトメトリーによって決定した。
【０２５７】
ＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞の純粋な集団は、製造業者の指示（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）に従って、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ（商標）Ｈｕｍａｎ  ＣＤ４  ＆  ＣＤ８  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ単離キットを用いて陰性選択プロトコールによって得た。単離された細胞は、実験で直ちに用いるか、または１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０中で培養した。ｉｎ  ｖｉｖｏの実験のために、培地にはまた、２０単位／ｍＬのＩＬ−２を補充した。
【０２５８】
細胞傷害性アッセイ
【０２５９】
キメラ抗原受容体またはベクター対照で形質導入されたＴ細胞の細胞傷害性を、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイによって決定した。９６ウェル丸底プレートの中で、１×１０６個の総Ｔ細胞（１０％のＦＣＳ、１００単位／ｍＬのペニシリン、および１００ｕｇ／ｍＬのストレプトマイシンを有する２００ｕｌのＲＰＭＩの中）を１００ｕｌの培地中で１：２で連続希釈した。標的細胞を、２時間、１×１０６個の細胞あたり１００μＣｉの５１Ｃｒとともにインキュベートして、５×１０３細胞／１００μｌの最終濃度に再懸濁した。培地で３回洗浄した後、１００μｌの標的細胞を、Ｔ細胞に添加し、３７℃で、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中で４〜２４時間インキュベートした。ＭＳＬＮ刺激のＣＤ４細胞を用いる実験のために、ＣＤ４エフェクターおよび標的を、１００ｕｌの総容積中で４時間インキュベートして、２００ｕｌの総容積のために１００ｕｌに懸濁したエフェクターおよび標的とともに上記のように細胞傷害性アッセイに添加した。外因性のＩＬ−２を加える実験では、細胞を、１０〜４０単位／ｍＬの最終濃度で、最終培地中でインキュベートした。上清を採集し、９６ウェルのＬｕｍｉｎａプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＣＡ）上にプレートして、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＴｏｐＣｏｕｎｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＣＡ）で測定した。自然な５１Ｃｒ放出を、培地単独とともにインキュベートした標的細胞中で評価して、最大の５１Ｃｒ放出を、１００ｕｌの０．２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００中でインキュベートした標的細胞で決定した。特異的溶解パーセントは以下のように算出した：［（実験的放出のｃｐｍ−自然な放出のｃｐｍ）／（最大放出のｃｐｍ−自然な放出のｃｐｍ）］×１００。データは、三連の測定の平均＋／−ＳＥＭとして報告し、かつＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐ．、ＷＡ）またはＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、ＣＡ）を用いて分析した。
【０２６０】
Ｔ細胞の単離、遺伝子導入、およびＣＤ４／ＣＤ８単離
【０２６１】
ヒト初代Ｔリンパ球は、治験審査委員会が承認したプロトコールのもとで健常なボランティアのドナーの血液から単離した。ＰＨＡ活性化された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＮＹ）での低密度遠心分離によって単離した。単離の２日後、ＰＢＭＣを、３０００ｒｐｍで、２４℃で１時間のウイルス接種によって、２日間、毎日、ウイルス上清を用いて、製造業者の指示に従って、１５μｇ／ｍｌのレトロネクチン（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｏｔｓｕ、Ｊａｐａｎ）でコーティングした６ウェル非組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＮＪ）中で、Ｍ２８ｚＧ、Ｍ２ｚＧ、またはヒト組換え緑色蛍光タンパク質（ｈｒＧＦＰ）をコードするレトロウイルスベクターを用いて形質導入した。形質導入されたＰＢＭＣを、１０％のＦＢＳ、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および２０単位／ｍｌのＩＬ−２を補充したＲＰＭＩ−１６４０中で維持した。ＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞の純粋な集団は、製造業者の指示（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）に従って、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ（商標）Ｈｕｍａｎ  ＣＤ４  ＆  ＣＤ８  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ単離キットを用いて陰性選択プロトコールによって得た。単離された細胞は、実験で直ちに用いるか、または１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。ｉｎ  ｖｉｖｏの実験のために、培地にはまた、２０単位／ｍＬのＩＬ−２を補充した。
【０２６２】
同所性の胸膜の中皮腫動物モデルおよび養子Ｔ細胞療法
【０２６３】
胸膜の中皮腫の同所性マウスモデルを開発するために、６〜１０週齢の雌性ＮＯＤ／ＳＣＩＤガンマ（Ｔａｃｏｎｉｃ，ＮＹ）を利用した。全ての手順は、承認された動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）のプロトコールのもとで行った。マウスは、吸入イソフルランおよび酸素を用いて麻酔し、かつ鎮痛のためにブピバカインを投与した。右胸部切開を介して、２００μＬの無血清培地中の１×１０５〜１×１０６個の腫瘍細胞の直接胸膜内注射を行って、同所性ＭＰＭ腫瘍を以前に記載のとおり３５、３７、３９、４０樹立した。３×１０４〜３×１０６個の形質導入されたＴ細胞を、直接胸膜注射によってマウスの胸腔に、または尾静脈注射によって全身に、２００μＬの無血清培地の注射によって、腫瘍保有マウス中に養子免疫移入した。外因性のＩＬ−２の投与による実験のために、マウスを処置して、養子免疫移入されたＴ細胞投与後の日に開始して、毎日１００，０００単位のＩＬ−２の３回の腹膜内投与を投与した。
【０２６４】
サイトカイン検出アッセイ
【０２６５】
サイトカイン放出アッセイは、Ｍ２８ｚＧ、Ｍ２ｚＧ、または対照ベクターを形質導入された５×１０５〜５×１０３個のＴ細胞と、５×１０３個の標的細胞とを、２００ｕｌの培地中で、９６ウェル丸底プレート中で、三連で、共存培養することによって行った。共存培養の６〜２４時間後、上清を採集した。サイトカインレベルは、多重ビーズヒトサイトカイン検出キット（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．、ＭＡ）を用いて、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γについて、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ＩＳ１００システムで決定した。値は、三連のウェルの平均に相当し、かつおよびエラーバーは、測定の標準誤差（ＳＥＭ）に相当する。得られたデータを、ＩＳ２．３のソフトウェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ、ＴＸ）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐ．、ＷＡ）、およびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、ＣＡ）を用いて分析した。
【０２６６】
Ｔ細胞増殖アッセイ
【０２６７】
Ｍ２８ｚＧ、Ｍ２ｚＧ、またはｈｒＧＦＰを形質導入された１×１０６〜３×１０６個のＴ細胞を、ＭＳＬＮ発現の有無で、照射されたＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞上で刺激して、それを１×１０５〜３×１０５細胞／３ｍＬ／ウェルの密度で６ウェルの組織培養プレート中にプレートした。新鮮ＲＰＭＩ−１６４０培地に、１０％のＦＢＳ、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００ｕｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および２０〜４０単位／ｍｌのＩＬ−２を補充した。細胞を７日ごとにカウントし、次いでＭＳＬＮ発現の有無で、照射したＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞上に積層した。細胞数対時間を、各々のＴ細胞群にプロットして、表現型を、フローサイトメトリーによって決定した。
【０２６８】
組織学および免疫染色
【０２６９】
腫瘍の組織病理学的評価は、パラフィン包埋した、４％パラホルムルデヒド固定の組織試料のヘマトキシリンおよびエオシン染色後に行った。血管形成のために、ＣＤ３４ラットモノクローナル抗体（５ｕｇ／ｍｌ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、７時間、続いて１６分、（１：２００の）ビオチン化ウサギ抗ラットＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、カタログ番号ＢＡ−４０００）とともにインキュベートした。ラットＩｇＧ２ａ（５ｕｇ／ｍｌ）を、適切なアイソタイプ陰性対照として用いた。リンパ管形成のために、ヤギポリクローナルＬＹＶＥ−１抗体（１μｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、３時間、続いて、６０分、ビオチン化ウサギ抗ヤギＩｇＧ（ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ）とともにインキュベートした。それぞれ、ＣＤ３４およびＬＹＶＥ−１のために、Ｔｙｒａｍｉｄｅ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＴｙｒａｍｉｄｅ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いる免疫蛍光検出のためのプロトコールを、確立して、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴ自動プロセッサー（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＭＳＫＣＣ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで行った。ヒトＭＳＬＮの免疫組織化学は、Ｖｅｎｔａｎａプラットフォームを用いて、マウス抗ヒトＭＳＬＮ  ＩｇＧ（１：１００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、ＣＡ）で行った。
【０２７０】
定量的およびＴ細胞生物発光イメージング
【０２７１】
腫瘍保有マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏのＢＬＩは、１５０ｍｇ／ｋｇのＤ−ルシフェリンで単回腹膜内投与を用いて行った。マウスは、Ｄ−ルシフェリン注射２０分後、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  １００  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＭＡ）でイメージングした。画像は、シグナル強度次第で５〜３０秒間撮った。ＢＬＩデータは、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ２．６０ソフトウェアを用いて分析して、ＢＬＩシグナルは、総流入（光子／ｓ）として報告した。次いで、ＢＬＩ流入（光子／ｓ）を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐ．、ＷＡ）を用いて腹側および背側の画像の平均として決定し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、ＣＡ）で分析した。
【０２７２】
Ｍ２８ｚＧおよび強化されたホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を形質導入されたＴ細胞を、単回の胸膜内注射によってマウスに養子免疫移入した。移入後、Ｔ細胞を単回の静脈内の、単回腹膜内用量の１５０ｍｇ／ｋｇのＤ−ルシフェリンを用いてイメージングし、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  １００イメージングシステムの注射２０分後に１２０秒間イメージングした。
【０２７３】
３．結果
【０２７４】
メソセリン標的化ＣＤ２８共刺激は、ＣＡＲ  Ｔ細胞機能を増強する
【０２７５】
中皮腫反応性Ｔ細胞を生成するために、末梢血ヒトＴ細胞を、メソセリン特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を用いてレトロウイルスによって形質導入した。メソセリン特異的抗原認識は、下流のＴ細胞シグナル伝達ドメインに融合されたｍ９１２  ｓｃＦｖによって提供され、このドメインは、ＣＤ３ｚシグナル伝達を単独で（Ｍｚ）またはＣＤ２８共刺激シグナル伝達（Ｍ２８ｚ）と並行して提供する（図２Ａ）。ＭｚおよびＭ２８ｚの形質導入効率は、ＩＲＥＳエレメントによりＣＡＲ発現に連結されたＧＦＰレポーター導入遺伝子を通じてモニターした。ＧＦＰシグナルは、ＣＡＲのヒトｓｃＦｖに対するタンパク質−Ｌ結合と高度に相関し、これによってそのレポーターとしての信頼性が実証される。無関係の抗原に特異性を付与する陰性対照は、全ての実験に含まれた。初代ヒトＴ細胞のＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方のサブセットは、実験について６０〜７０％の等価な頻度までキメラ受容体で効率的に形質導入された（図２Ｂ）。
【０２７６】
ＭｚおよびＭ２８ｚ  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞のメソセリン特異的エフェクター機能を評価するために、３つの標準的なアッセイにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏのＴ細胞応答を検討した。標的細胞株として、メソセリンを過剰発現するように形質導入されたＭＳＴＯ−２１１Ｈ中皮腫がん細胞株（内因性のＣＤ８０／８６共刺激リガンドの発現を欠く）（ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋）を用いた。細胞傷害性を測定するためのクロム放出アッセイでは、ＭｚおよびＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞との１８時間の共存培養の際に、等価なメソセリン特異的溶解を実証した（図２Ｃ）。第１世代および第２世代の受容体を比較した場合、等しい溶解の観察は、他のキメラ受容体に利用可能なデータを再現する。
【０２７７】
共刺激の有益な効果は、典型的には、モデルシステムで確認される知見である、サイトカイン分泌および増殖を測定する時に見られた。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｍｚ  Ｔ細胞と比較した場合、ほぼ２倍の大きさの量のＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αを分泌する。Ｔ細胞生存および増殖に重要なサイトカインであるＩＬ−２の分泌は、Ｍ２８ｚ受容体によって独自に提供された（図２Ｄ）。陰性対照受容体で形質導入されたＴ細胞、およびメソセリン陰性の腫瘍細胞によって刺激されるメソセリン特異的細胞は、細胞傷害性を示すこともなく、サイトカインを分泌することもなく、全ての抗腫瘍エフェクター機能について抗原特異性の必要性が実証される。
【０２７８】
抗原認識に対してｉｎ  ｃｉｓで提供されたＣＤ２８共刺激が、腫瘍細胞共刺激リガンド発現の非存在下でＴ細胞蓄積を提供し得るか否かを評価するために、ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞での反復性の抗原刺激の際のＭｚおよびＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖を定量した。外因性のＩＬ−２の存在下では、メソセリン特異的受容体を形質導入されたＴ細胞は、増殖して、ＣＤ２８共刺激細胞は、毎週の抗原刺激で培養中で４週後、１８０倍の増殖を達成した。この堅調な増殖性の応答は、Ｍｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞によって達成された応答よりも３倍大きかった（図２Ｅ、左側）。さらに、Ｔ細胞が生存および増殖する能力のさらに積極的な試験を提供するモデルシステムである、外因性のＩＬ−２の非存在下では、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のみが蓄積できた。共刺激されたＴ細胞は、第３刺激後に見られるＴ細胞数の細胞死誘発性の低下を受ける前に、２つの連続する抗原刺激の際に、生存および増殖できた（図２Ｅ、右側）。ＭｚおよびＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、連続刺激の際にＧＦＰ陽性について富化され、連続刺激の際にエフェクター／分化したＬ−セレクチン陰性Ｔ細胞表現型を獲得した（図２Ｆ）。
【０２７９】
胸膜投与されたＭ２８ｚ形質導入のＴ細胞は、胸膜腫瘍を根絶する
【０２８０】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＭ２８ｚ  Ｔ細胞の力価を検討するため、前に記載のとおり、ＭＳＴＯ−２１１Ｈ腫瘍細胞を用いて、悪性胸膜の中皮腫の同所性モデルを開発した。腫瘍細胞は、胸膜腔に直接接種して、治療の開始前に大きい腫瘍負荷が確立されるのに十分な時間（＞１０日）を与えた。腫瘍は、局在的に胸膜の表面に沿って伝播し（ＭＲＩ、図３Ａ、上の左側）、縦隔の構造を圧迫し（図３Ａ、上の右側）、かつ胸壁を侵害した（図３Ａ、底部）。このパターンは、ヒト疾患を再現していた。連続的なＢＬＩを用いて、養子Ｔ細胞療法を開始する前に腫瘍の樹立を確認して、治療に対する応答を測定するために引き続き用いた。この実験では、動物を、メソセリン標的化Ｔ細胞の３×１０６個の単回静脈内注入、または３×１０５個の単回胸膜投与のいずれかを用いて腫瘍接種１２日後に処置した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＭＳＬＮ＋腫瘍標的を溶解しなかった３×１０５個のＰＳＭＡ標的化Ｔ細胞で処置した対照のマウスでは（図２Ｂ）、腫瘍負荷は、マウスが死ぬまで着実に進行した（図３Ｂおよび図３Ｃ）。静脈内Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞での処置は、腫瘍負荷において遅延した短期の減少、続いて末端の腫瘍進行を生じ（図３Ｂ）、軽度の４４日の生存の利点を生じた（Ｐ＝０．００５１、図３Ｄ）。胸膜に投与されたＭ２８ｚ  Ｔ細胞は、大きい応答を誘発した。腫瘍負荷は、７日目までおよびベースラインではＴ細胞で１１日目まで有意に低かった（図３Ｂ）。中央生存は、この群では達しなかった（ＩＶに比較して、ｐ＝０．００１３）。７匹の処置動物のうち２匹が、Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞の胸膜投与２００日後腫瘍がなかったが、他の処置または対照群のいずれでも、完全な腫瘍クリアランスを達成した動物はいなかった（図３Ｃ）。最初に処置された他の４匹のマウスは、Ｔ細胞療法１００日後、抗原陰性の腫瘍細胞での再発の前に顕著な腫瘍退縮を示した（図３Ｂ）。
【０２８１】
胸膜に投与されたＴ細胞増殖は、堅調かつ抗原特異的である
【０２８２】
これらの観察は、胸膜内投与と静脈内投与との間のＴ細胞増殖および腫瘍局在化に相違があるか否かについての検討につながった。この目的を達成するために、腫瘍が胸膜の空間に制限されている、前に記載の動物モデルを用いた。全てのマウスを、Ｍ２８ｚ＋および強化されたホタルルシフェラーゼ（ｅｆｆＬｕｃ）の両方を共発現して、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏイメージングを可能にするように形質導入されたＴ細胞で処置した（図４Ａ）。Ｍ２８ｚ  ｅｆｆＬｕｃ＋リンパ球の組織分布および生物発光シグナルにおける大きな相違が、両方の処置群で１×１０６個のＭ２８ｚ＋ｅｆｆＬｕｃ＋Ｔ細胞の養子移入４時間後に観察された（図４Ｂ）。両群を比較する４時間の生物発光のシグナルによって、静脈内と比較した場合、局在的な投与での胸膜のＴ−蓄積の顕著な１０倍の増大が示された。静脈内に投与されたＴ細胞は、最初の肺内滞留、および投与８〜１０日後に予想される軽度のＴ細胞蓄積を示した。逆に、胸膜に投与されたＴ細胞は、ｅｆｆＬｕｃ形質導入のＴ細胞単独と比較した場合、最大２週まで、顕著でかつ持続性の抗原特異的蓄積を示した（データ示さず）。フローサイトメトリー解析のため、Ｔ細胞カウントおよび免疫組織化学によって、Ｔ細胞数が、生物発光のシグナル強度と極めて調和していたことが確認された（図４Ｃ〜図４Ｅ）。さらに、胸膜に投与されたＴ細胞は、注入後７日までに胸膜腔から退出し、脾臓（図４Ｆ）および肺（データ示さず）を含む胸膜外部位に循環した。
【０２８３】
Ｍ２８ｚ共刺激のＣＡＲ  Ｔ細胞は、強力な抗腫瘍有効性およびＴ細胞持続性を示す
【０２８４】
ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＤ２８共刺激によって提供される増殖能を検討するため、胸膜腫瘍保有マウスを、Ｍｚ、Ｍ２８ｚ、または対照の形質導入されたＴ細胞を用いて、３×１０５個のＣＡＲ＋Ｔ細胞という低用量で処置した。前と同様、Ｔ細胞は、腫瘍増殖１８日後、胸膜腔に直接注射した。３×１０４個のＰＳＭＡ標的化Ｔ細胞で処置した対照のマウスでは、腫瘍負荷は、死亡するまで（中央生存３６日）一貫して進行した。等しい用量のＭｚ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞での処置は、生存を６３日まで延長し（図４ａ）、かつマウスのうち２０％では腫瘍を根絶した。腫瘍生物発光によって、腫瘍負荷における混合された応答が示される。Ｍ２８ｚ受容体形質導入のＴ細胞での処置は、腫瘍生物発光においてバックグラウンドの発光までのほぼ均一な低下を誘発し、これによって、Ｍ２８ｚ処置マウスのほとんどにおける根絶が示唆される。中央生存は、この群では達しなかった（対Ｍｚでｐ＝０．０１）。Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞で処置したマウスの６０％が、肉眼検査で確認したとおり、Ｔ細胞注入後２００日を超えて腫瘍がなかった。他のマウスは最初に、再発の前に顕著な腫瘍の退縮、および平均１２５日間の生存を示した。Ｔ細胞用量がさらに高ければ、両群で完全な腫瘍の根絶が観察され、これは、両方の受容体の等しい細胞溶解性を反映しており、かつ最初の低いＴ細胞エフェクター対腫瘍細胞比でのＣＤ２８共刺激誘発性のＴ細胞増殖の重要性を証明している。
【０２８５】
処置したマウスの末梢血におけるＣＡＲ＋Ｔ細胞カウントの連続的評価によって、抗腫瘍有効性と増強されたＴ細胞生存との間の強力な相関が実証された。Ｍ２８ｚ処置マウスは、Ｔ細胞注入４０日および５０日後、遅い時点を含む、全ての毎週の測定で増強されたＴ細胞持続性を実証した（図６Ｂ）。同様の結果が、３つの別々のＴ細胞用量（３×１０６、１×１０６、および３×１０５個の投与されたＣＡＲ＋Ｔ細胞）で、ならびにＴ細胞注入の１４日および５５日後の脾臓におけるＣＡＲ＋Ｔ細胞絶対数定量の際に、得られた。
【０２８６】
持続性のＴ細胞の表現型アセスメントによって、ＣＤ４＋Ｔ細胞における進行性の富化が実証され、これは、ＭｚおよびＭ２８ｚ処置マウスの両方でＴ細胞注入の３０日後に統計学的に有意であった。この知見は、Ｔ細胞の用量にも分析した組織（脾臓または血液）にもかかわらず一貫して観察された。この富化は、Ｍｚ処置マウスについてさらに顕著であって、これによって、ＣＡＲの有効性におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋のＴ細胞サブセットの示差的な役割について２つの別の説明が示唆される。優勢なＣＤ４＋Ｔ細胞の絶対量が多いことは、Ｍ２８ｚ有効性の増強を担うか、またはこれは、ＣＤ２８共刺激が有意な割合のＣＤ８＋Ｔ細胞を維持する能力であって、これが最終的には抗腫瘍有効性を担うかのいずれかである。これらの２つの可能性に取り組むために、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＣＡＲ形質導入のＴ細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでそれらの抗腫瘍有効性に関して直接対決で比較した。
【０２８７】
ＣＤ４＋ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達に依存する強力な細胞傷害性を実証する
【０２８８】
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＣＡＲ  Ｔ細胞のエフェクター機能を比較するために、Ｔ細胞サブセットの両方を、＞９８％の純度まで精製した（図６Ａ）。４時間の共存培養後、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞傷害性を示す唯一のサブセットであったが（図６Ｂ、左側）；１８時間の共存培養後、ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞と比較して等価な細胞傷害性を媒介した。
【０２８９】
ＣＤ２８共刺激は、ＩＬ−２誘発性のＴ細胞の細胞傷害性の相乗作用またはＴＮＦ−α分泌（腫瘍細胞アポトーシスを直接誘発できるサイトカイン）のいずれかを通じて細胞溶解を増強し得るので、ＣＡＲ媒介性の細胞傷害性におけるＣＤ２８共刺激の役割を評価した。ＣＤ２８共刺激シグナル伝達は、１３〜１６％の多重エフェクター対標的比までＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞による溶解を増強した（ｐ＜０．０００１）が、ＣＤ８＋ＣＡＲ  Ｔ細胞による溶解を一貫して増強することはなかった（ｐ＝０．０７）。
【０２９０】
ＣＤ２８シグナル伝達が、ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性を強化する機構を決定するために、ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞とメソセリン発現腫瘍細胞を、刺激して、上清の移入細胞傷害性アッセイを行った。上清のみの移入、または対照の形質導入されたＴ細胞に加えて上清の移入は、検出可能な溶解は生じなかった（図６Ｄ）。陽性対照として、ＣＤ４＋Ｍ２８ｚは、メソセリン陽性の標的を溶解した。対照的に、刺激されたＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞から得られたサイトカインリッチな上清（Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイによって確認したサイトカイン濃度）の移入は、ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ（５〜２３％の増強、ｐ＜０．０００１）およびＣＤ８＋Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（５〜３０％の増強、ｐ＜０．００１）の両方で細胞傷害性を増強した。共刺激が、反応速度に遅延を伴いＣＤ４＋ＣＡＲ  Ｔ細胞溶解を向上する観察と並列して、上清は、短期の４時間の共存培養後、溶解をより小さい程度まで向上した（ＣＤ４＋については、２．５〜４％、ＣＤ８＋については１．０〜４．４％、データ示さず）。
【０２９１】
したがって、抗原認識に対してｉｎ  ｃｉｓで提供されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達は、細胞傷害性ＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクターの生成を促進し、これは反応速度に遅延を伴い、かつＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットにおいて最も顕著である。
【０２９２】
ＣＡＲ＋Ｔ細胞媒介性の細胞傷害性は、グランザイム／パーフォリン経路依存性である
【０２９３】
サイトカインリッチ上清による腫瘍標的の直接溶解を除外して、２つの細胞接触依存性（Ｆａｓ／ＦａｓＬまたはグランザイム／パーフォリン経路）溶解性機構のどちらが、ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性を担うかを研究した。Ｆａｓリガンド／Ｆａｓ受容体相互作用の抗体遮断は、標的細胞溶解を、ＭｚまたはＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のいずれによっても低下しなかった（ｐ＞０．０５、図７Ａ、底部）。フローサイトメトリーで、ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＦａｓリガンド発現、およびＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腫瘍でのＦａｓ受容体発現を確認した（図７Ａ、上側）。ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋細胞は、ＦａｓＬ媒介性の細胞傷害性を受け易く、かつこの実験で用いたαＦａｓＬ  Ａｂは、この効果を遮断した（図７Ａ、下の右側）。
【０２９４】
Ｔ細胞／腫瘍細胞共存培養物に対するカルシウムキレーターＥＧＴＡの添加によるグランザイム放出の遮断は、試験した全ての群でＣＡＲ媒介性の溶解を低減し（ｐ＜０．０００１、図７Ｂ）、これによって、ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性がパーフォリン／グランザイム経路依存性であることが実証される。等濃度のＥＧＴＡ（４ｍＭ）を用いて細胞傷害性で観察された低下は、群間で変化した。溶解で最も顕著な低下は、Ｍｚ（Ｍ２８ｚについて平均の減少２７．６％対１７．６％）およびＣＤ８＋（ＣＤ８＋Ｍｚの２９．４％対ＣＤ４＋Ｍｚの１５．３％；ＣＤ８＋Ｍ２８ｚについて２４．２％、対ＣＤ４＋Ｍ２８ｚについて１１．１％）のＴ細胞群で見られた。
【０２９５】
細胞内フローサイトメトリーを行って、細胞傷害性アッセイの結果と、パーフォリン−グランザイム誘発性溶解の２つの主なメディエーターであるグランザイムＡおよびＢの発現とは相関していた。休止期のＰＢＭＣ中のグランザイムＡおよびＢの発現は主に、前の試験と一致してＣＤ８＋Ｔ細胞に限定された（図７Ｃ）。グランザイムＡ発現は、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞のＰＨＡ刺激およびメソセリン特異的刺激後に有意に変更されなかった。対照的に、グランザイムＢは、誘導性発現によって特徴付けられた。ＰＨＡ刺激後、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の約７５％が、陽性に染色し、メソセリン発現腫瘍細胞での刺激１８時間後、グランザイムＢは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の９５％超で発現された。グランザイムＢ発現の反応速度に関してＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を比較するために、細胞を、４時間または１８時間のいずれかを刺激して、グランザイムＢ  ＭＦＩを定量した。ＣＤ８＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞は、４時間培養後ＭＦＩの１．８倍の増大を示し、かつさらに、最終１２時間にわたってさらに０．８倍グランザイムＢ発現を上方制御した。しかし、ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞は、グランザイムＢ発現を、培養の最後の１２時間にわたってかなり大きい程度まで上方制御した（４時間にわたって１．５倍、最終１２時間にわたってさらに２．２倍、同様の結果が２つの他の独立した実験で得られた）。これらの知見は、図６Ｂに実証されるようにＣＤ４＋ＣＡＲ  Ｔ細胞で観察された細胞傷害性の反応速度の遅延を反映し得る。さらに、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋のＴ細胞サブセットの両方でグランザイムＢ発現を増強し（図７Ｄ、１８時間培養後の発現）、おそらく、ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞で見られた細胞傷害性の増強（ＣＤ４＋Ｍｚ  Ｔ細胞と比較した場合、図６Ｃ）およびグランザイム放出遮断に対するＭ２８ｚ  Ｔ細胞の相対的耐性を反映している（図７Ｂ）。
【０２９６】
ＣＤ２８共刺激は、ＣＤ４＋Ｔ細胞において優れたサイトカイン分泌および増殖を提供する。
【０２９７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＴ細胞サイトカインに対するＣＤ２８共刺激、およびＴ細胞亜集団に対する抗原活性化に対する増殖性の応答の相対的な寄与を評価するため、メソセリン発現性腫瘍細胞とともにＭｚまたはＭ２８ｚのいずれかで形質導入されたＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびバルクＴ細胞を活性化して、Ｔｈ１サイトカイン分泌、および抗原特異的な増殖を定量した。ＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して、Ｍｚで形質導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｔｈ１サイトカイン分泌のレベルの増大を示し、この相違は、Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞で見られるＣＤ２８共刺激で強められた（図２Ａ）。予想どおり、共刺激リガンドの非存在下における再発性刺激は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｍｚ  Ｔ細胞集団のいずれにおいてもＴ細胞増殖を誘発せず、外因性のＩＬ−２の非存在下で第１刺激後にＴ細胞数の減少を急速に誘発した（図２Ｂ）。対照的に、共刺激されたＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞の２倍の増大と比較して第３刺激によって２０倍大きい平均増殖を誘発した。
【０２９８】
ＣＤ４  Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで単独で有効であって、かつＣＤ８  Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較した場合有効性の増強を媒介する
【０２９９】
ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞の強力なｉｎ  ｖｉｔｒｏのエフェクター機能の観察によって、ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞の非存在下で投与された場合でさえ、ｉｎ  ｖｉｖｏの有効性を示すという仮説がもたらされた。腫瘍保有マウスを、ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ、ＣＤ８＋Ｍ２８ｚ、またはバルクのソートされていないＭ２８ｚ  Ｔ細胞（腫瘍増殖の１８日後に、３つの異なる用量で胸膜腔に投与された）で処置した。最高用量の３×１０５個のＣＡＲ＋Ｔ細胞で処置した対照のマウスでは、腫瘍負荷は、マウスを屠殺しなければならないときまで（中央生存２８日）、一貫して進行した。ＣＤ４＋Ｍ２８ｚおよびバルクのＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞での処置は、マウスの１００％で腫瘍の根絶をもたらし、ここでマウスは、追跡の２００日まで腫瘍がないままであった。ＣＤ８＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞は、８３日まで対照の形質導入の細胞を上回って生存を延長し（１１１日対２８日、ｐ＝０．００３）、ただし、３／７のマウスでのみ腫瘍根絶を生じた。ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞での処置は、ＣＤ８＋Ｍ２８ｚ処置マウスと比較した場合生存を有意に延長した（ｍｓは達せず対１１１日、ｐ＝０．０２）。より低い用量では、結果は、ＣＤ８＋Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ療法に対してＣＤ４＋の有効性を比較した場合、同様であった（用量１×１０５で、１１２対６７日、ｐ＝０．０４および用量３×１０４で、１６０対３７、ｐ＝０．００１）。これらの結果、ＣＤ４＋ＣＡＲ  Ｔ細胞は（サイトカイン産生および増殖というそれらの、伝統的な方の機能に加えて、溶解を媒介できる）は、ＣＤ８＋ＣＡＲ  Ｔ細胞療法よりも優れていることが例示される。さらに、ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞の増殖能によって、最初のＥ：Ｔ比が１：１０，０００である用量でさえ有効なＥ：Ｔ比に達する能力が付与される。
【０３００】
養子免疫移入の機能的な持続性は、主にＣＤ４＋であり、ＣＤ２８共刺激によって媒介されかつ強められる
【０３０１】
腫瘍再チャレンジ実験を行うことによる連続的な腫瘍制御において、持続性Ｔ細胞の重要性を評価した。マウスには、最初に胸膜のＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋を接種し、両群で腫瘍をほぼ均一に根絶する用量である１×１０５個のＭｚまたはＭ２８ｚの胸膜のＴ細胞のいずれかを投与した（図４）。最初のＴ細胞注射の８７日後、１×１０６個のＭＳＬＮ＋またはＭＳＬＮ−  ＭＳＴＯの腫瘍細胞のいずれかを、腹腔に投与し、そして腫瘍負荷は、ＢＬＩで追跡した。全てのマウスにおける腫瘍負荷の最初の増大後、腫瘍負荷の抗原特異的な制御が、ＭｚおよびＭ２８ｚの両方のＴ細胞で処置したマウスで見られ、Ｍ２８ｚマウスにおいて見られる低下が大きかった（図１０）。マウスにおけるＴ細胞増殖性応答を検査した。全ての群のマウスを再チャレンジ後１６日で屠殺して、脾臓を前に記載のとおり収集した。抗原を再チャレンジされたＭ２８ｚ  Ｔ細胞は、抗原陰性の腫瘍再チャレンジと比較してＴ細胞数の４倍の増殖を示した（図１０Ｃ）。この脾臓内のＴ細胞蓄積の顕著な相違は、主にＣＤ４＋亜集団に起因した（図１０Ｄ）。
【０３０２】
４．考察
【０３０３】
がん免疫療法の主な目標は、強力な一次免疫応答を生じ、かつＴ細胞持続性を確立することである。固形腫瘍は、もしそれらが、Ｔ細胞輸送を妨げ、かつ通常は共刺激リガンドの発現を欠く解剖学的コンパートメント内に位置するならば、これらの目標に重大な課題を課す。胸膜の中皮腫の確立されたマウスモデルを用いて、この実施例では、がん抗原を標的化し、共刺激シグナル伝達を提供するように遺伝子操作されたＴ細胞が、ほとんどのマウスにおいて樹立された胸膜の中皮腫を根絶することが示される（図５）。この実施例は、共刺激シグナル伝達の特性を強化することが、ＣＤ８＋Ｔ細胞と比較した場合、それらの優れたサイトカイン分泌および増殖によって証明されるとおり、ＣＤ４サブセットによって特に増幅されることを実証する（図８）。さらに、共刺激されたキメラ抗原受容体を有する形質導入のＣＤ４＋Ｔ細胞は、このサブセットを、一次細胞傷害性応答に動員する（図６）。Ｔｈ１ヘルパーサイトカイン分泌を保持する能力と組み合わせた細胞傷害性能力の獲得によって、独立して胸膜の中皮腫異種移植片を排除できる強力なＣＤ４＋免疫エフェクターが形成される（図１０）。この抗腫瘍有効性は、Ｔ細胞が胸膜腔中に直接投与されるとき、特に顕著であり、静脈内投与と比較した場合、劇的に低いＴ細胞用量で完全な腫瘍制御を生じる。肺分画症は、静脈内に投与されたＴ細胞による、効果的な腫瘍浸潤に対する重要な障害として特定される（図４）。対照的に、胸膜のＴ細胞投与は、抗原との遭遇後に、早期の腫瘍浸潤および堅調な増殖を生じる。著しいことに、局所的に投与されたＴ細胞は、胸膜腔から全身の循環に遊走し（図４）、かつ共刺激シグナル伝達と組み合わせて、最初のＴ細胞注入の１００日後に腫瘍再チャレンジの際に長期の機能的な持続性を示す（図１０）。これらの知見によって、ＣＡＲ療法は、抗腫瘍有効性の主なメディエーターとしてＣＤ４＋Ｔ細胞の首尾よい動員によって、ならびに強力な一次免疫および二次免疫を達成するために局所投与を用いることによって固形腫瘍で生じる障害を克服するのに特に有用であり得ることが証明される。
【０３０４】
この実施例では、肺分画症は、固形腫瘍に対して有効なＴ細胞輸送を制限する重要な障害として特定された。ルシフェラーゼ標識Ｔ細胞の生物発光イメージングによって、静脈内に投与されたＴ細胞の長期の肺分画症が、胸膜腫瘍蓄積の遅延を生じることが実証される（図４）。ＩＶ  Ｔ細胞による腫瘍浸潤の遅延は、腫瘍負荷における退縮の遅延と一致していた（図３）。これらの結果は、以前の研究を裏付けており、末梢の腫瘍の効率的な輸送および浸潤が、固形がんにおける抗腫瘍有効性と相関していることを示し、かつ静脈内に投与されたＴ細胞の腫瘍蓄積が劣る主な理由として肺分画症を示唆する。肺分画症は一部は、効率的なレトロウイルス形質導入のために活性化を必要とするＣＡＲ＋形質導入のＴ細胞の活性化状態に起因する場合がある。活性化の機能的な結果は、肺血管系によって構成的に発現されるリガンドに結合する接着インテグリンのアフィニティーの増大である。ＩＶ投与で見られる輸送の遅延に加えて、胸膜投与と比較して胸膜腫瘍内のＴ細胞蓄積における絶対的な低下も観察された（図４）。低レベルの腫瘍蓄積は、通常は、Ｌ−セレクチンの下方制御、ならびにケモカイン受容体および接着分子の上方制御などの追加的なシグナルを要する、末梢組織へのＣＡＲ  Ｔ細胞の非効率的な輸送に起因し得る。これらの研究と一致して、投与の際のＣＡＲ形質導入Ｔ細胞のほとんどが、Ｌ−セレクチン陽性であり、かつ胸膜腫瘍に効率的に移動できない場合があり、これは将来の研究で取り組む必要がある問題である。他のストラテジーは、腫瘍蓄積を向上するためにケモカイン受容体を過剰発現した固形腫瘍に対してＴ細胞送達を最適化することを目的とした。輸送の要件は、腫瘍保有胸膜へＴ細胞を局所的に、直接投与するという臨床的に関連するアプローチによって回避され得る。胸膜投与では、肺分画症およびＴ細胞表現型に内在するなんらかの輸送のバイアスの両方を迂回する。得られたＴ細胞活性化および強力な増殖性の応答は、抗腫瘍有効性の増大を生じる。重要なことに、胸膜内に投与されたＴ細胞は、胸膜腔から出ることが可能で、かつそれらの最初の注入後に、末梢全体に循環し、最大２００日まで長期間持続し、かつ１００日を超える全身的な腫瘍の調査を確立することを可能にする（図１０）。
【０３０５】
ＣＤ２８共刺激したＴ細胞が、優れたサイトカイン分泌を示し、かつ外因性のＩＬ−２の非存在下で反復性の抗原曝露後に増殖するという知見（図１）、これは、他のキメラ受容体−がん抗原モデルと一致している。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、低いＴ細胞用量でさえ、胸膜腫瘍を排除し、これは、有効なＴ細胞対腫瘍比をｉｎ  ｖｉｖｏで達成するのに必要な増殖能を提供するのにおける共刺激の重要性を例示する。さらに、ＣＤ２８共刺激は、Ｔ細胞持続性を増強し（図５）、かつそれらの投与後１００日を超えて二次的な再チャレンジの際に優れた腫瘍制御を提供した。顕著なことに、Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞は、抗原再チャレンジ後の堅調な増殖を受けて、これは、共刺激シグナル伝達の持続的な機能を示している（図１０）。これは、大きい腫瘍負荷の完全な制御のための共刺激の重要性を強調しており、かつ共刺激されたＴ細胞が慢性の抗原刺激の存在下で消耗を受ける可能性が少ないことを示唆している。ＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏの増殖および持続性を強化するために共刺激シグナル伝達を含むことは、近年、造血性の悪性腫瘍のトライアルで長期のがんの寛解にトランスレーションされた。最初の腫瘍退縮後にいくつかのマウスで示された抗原陽性腫瘍の後期の再発によって、低いＴ細胞用量で投与されたＣＡＲ  Ｔ細胞が腫瘍媒介性の免疫抑制によって負に制御され得ることが示唆される。進行中の前臨床試験では、共刺激ＣＡＲ移入および同じ細胞でのこれらの阻害性経路の標的化された逆転を組み合わせることが、抗腫瘍有効性をさらに改善するか否かに取り組む。
【０３０６】
以前の研究では、最適の抗腫瘍免疫のためのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の要件が強化された。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、伝統的に、がん細胞を排除するのに主な役割を果たすが、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞に最適機能に必要なＩＬ−２のような増殖因子を提供すると考えられている。この実施例で示される結果は、最適のＣＤ８＋エフェクター形成をプライミングすること、および持続的なウイルスまたは腫瘍に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を維持することにおける、ＣＤ４＋Ｔ細胞ヘルプの重要性を支持する大規模な研究と一致するが、それらはまた、ＣＤ４＋Ｔ細胞が、抗腫瘍有効性の主なメディエーターとして機能し得るという評価の高まりを強調する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＣＤ２８共刺激されたＣＤ４＋ＣＡＲ  Ｔ細胞は、大量のサイトカインを分泌し（図８）、外因性のＩＬ−２の補充なしで反復性の抗原刺激の際に固有的に増殖可能であり（図８）、かつＣＤ８＋Ｔ細胞と比較した場合、等価な細胞傷害性を示した（図６）。Ｔｈ１ヘルパーサイトカイン分泌を保持する能力と組み合わせた細胞傷害能の獲得によって、局所投与後に、胸膜の中皮腫異種移植片を排除できる強力なＣＤ４＋免疫エフェクターが形成される。この観察は、ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いる以前の研究とは対照的である。これらの研究におけるＣＤ４＋ＣＡＲ  Ｔ細胞有効性の欠失は、低レベルのＣＡＲ発現および共刺激シグナル伝達において欠いている第１世代の受容体の使用によって説明され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞と比較した場合、エフェクター機能を媒介するのに高いアビディティーの相互作用を要するので、そして機能的なアビディティーは部分的には、発現の受容体レベルによって決定されるので、この実施例で得られる高レベルの受容体発現は、ＣＤ４＋力価を説明し得る。さらに、キメラ抗原受容体は、アビディティーをさらに増大する、抗原認識のための高いアフィニティーのｓｃＦｖを実行するので、ＣＡＲ療法は、Ｔ細胞を補助し得る多機能のＣＤ４＋Ｔ細胞および細胞傷害性を生成するのに固有的に適しているかもしれない。Ｔ細胞アビディティーを上昇する他のストラテジーは、抗腫瘍ＴＣＲトランスジェニック療法で細胞傷害性ＣＤ４＋Ｔ細胞を生成するために首尾よく用いられている。この実施例で示される研究は、Ｔ細胞応答を制御する環境的な指図に加えて機能的なアビディティーを支配する因子が、抗腫瘍免疫においてＣＤ４＋対ＣＤ８＋Ｔ細胞の相対的な役割を指示することを理解する情報を補助する。
【０３０７】
ＣＡＲ形質導入のＣＤ４＋Ｔ細胞による細胞傷害性活性の獲得は、特に顕著である。抗腫瘍免疫のＴＣＲトランスジェニックモデルを用いて行われた近年公開された研究ではまた、ＣＤ４＋Ｔ細胞が細胞傷害性エフェクターに分化する能力も実証されている。これらの報告では、ＣＤ４＋Ｔ細胞が独立して腫瘍を排除する能力は、レシピエントマウスにおいてリンパ球減少症を獲得することに依存していた。リンパ球枯渇のレジメンを用いて、遺伝子改変Ｔ細胞療法の有効性を改善し、これはＴ細胞増殖を刺激し、かつ細胞傷害性の分化をプログラムできるγ鎖サイトカインの利用性を増大することによって一部は作用する。サイトカインの利用性を増大するための他の臨床的なストラテジーとしては、全身性のＩＬ−２投与が挙げられるが、ＩＶ投与を用いる有効性は、腫瘍への不十分な送達によって制限される。Ｔ細胞の遺伝子的改変は、腫瘍微小環境内でＴ細胞活性化の部位へＩＬ−２を効率的に送達する方法で、リンパ球枯渇の使用なしで腫瘍反応性のＣＡＲ＋Ｔ細胞の完全な活性化を達成するという見込みを保持する。この実施例では、抗原認識の下流にＣＤ２８共刺激シグナル伝達を組み込むことは、パーフォリン／グランザイム依存性経路による（図７）ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞傷害性を増強し（図６）、これは、共刺激されたＣＤ４＋ＣＡＲ  Ｔ細胞が抗原刺激の際に高レベルのグランザイムＢを発現する能力と相関している。この効果は、ＣＤ２８シグナル伝達によってますます利用可能にされた分泌されたサイトカインによって強化されるが；サイトカインは、直接の腫瘍溶解を媒介できず、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するサイトカインリッチな上清の添加は、強化された細胞傷害性をもたらした（図６）。これらの知見は、他の研究によって支持され、ここでは、共刺激が細胞傷害性ＣＤ４＋細胞を産生する能力におけるＩＬ−２依存性の役割が実証される。それらの堅調なＩＬ−２産生を考慮すると、共刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、特に腫瘍抗原との高いアビディティーの相互作用を提供するＣＡＲ受容体に取り付けられた場合、強力な免疫エフェクターとして作用するのに特有の位置にある。
【０３０８】
結論として、この実施例では、固形腫瘍によって生じる障害を克服するための局所のＣＡＲ  Ｔ細胞投与の使用を支持する証拠を提供する。抗腫瘍免疫の全局面に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の動員の成功は、固形腫瘍の処置のためのＣＡＲ＋Ｔ細胞療法の使用に対して特定の利点を提供する。
【０３０９】
（実施例２）
転移性乳がんのための標的化Ｔ細胞療法
【０３１０】
１．ＴＮＢＣ中のＭＳＬＮ発現は、攻撃性と相関する：２２６個のＴＮＢＣおよび８８個の非ＴＮＢＣの組織マイクロアレイ中のＭＳＬＮの発現を評価した。この解析によって、ＭＳＬＮ過剰発現は、非ＴＮＢＣにおいてよりもＴＮＢＣにおいて有意に高頻度であることが明らかになった（それぞれ、３６％対１６％；ｐ＝０．０００６；図１２）。ＭＳＬＮ陽性のＴＮＢＣを有する患者は、より短い間隔でより遠位の転移を発症し（表１を参照のこと）、かつＭＳＬＮ陰性のＴＮＢＣを有する患者よりも有意に全生存および無病生存が低く、これによってＭＳＬＮ発現は、攻撃性のマーカーであることが示された。この結果、ＭＳＬＮ＋ＴＮＢＣを有する患者は、ＭＳＬＮ標的化療法のトライアルのための潜在的な集団である。５．３年の中央追跡期間（範囲０．７〜８．２）で、５年のカプラン・マイヤー生存推定によって、ＴＮＢＣは、非ＴＮＢＣについての０．９５９（９５％ＣＩ：０．８９５〜０．９８４）と比較して、０．８２（９５％ＣＩ：０．７５〜０．８７）で、生存の有意に短い全体的確率を有することが示された（図１３Ａ）。ＴＮＢＣを有する患者の中では、ＭＳＬＮ陽性は、有意に短い全生存（ＯＳ）と相関しており（０．６５９［９５％ＣＩ：０．５１５〜０．７７０］対０．９１３［９５％ＣＩ：  ０．８３８〜０．９５４］）（図１３Ｂ）、同様に有意に短い無病生存と相関していた（ＤＦＳ）（０．６６５［９５％ＣＩ：０．５３６〜０．７６６］対０．８６５［９５％ＣＩ：０．７８５〜０．９１６］）（図１３Ｃ）。ＭＳＬＮの陰性の生存の影響は、リンパ節の状態とは独立している（ログランク検定、ｐ＝０．０００３）。リンパ節陽性／ＭＳＬＮ＋ＴＮＢＣの症例は、リンパ節陽性の／ＭＳＬＮ−ＴＮＢＣ症例（０．８６５［９５％ＣＩ：０．６９９〜０．９４３］）と比較して、悪かった（５年ＯＳ可能性、０．５６４［９５％ＣＩ：０．３４８〜０．７３３］）（図１３Ｄ）。ＴＮＢＣ患者内では、メソセリン陽性の患者は、図１３Ｅおよび図１４Ｆに示されるとおり、全生存が低下し（ｐ＝０．００１）；疾患特異的生存が低下し（ｐ＝０．０８）；遠位の転移の頻度が増大し（ＯＲ２．９、ｐ＝０．０１１）；遠位の転移に対する平均の間隔が低下し（１９対３５か月、ｐ＝０．００６）；平均生存が低下した（２４対５３か月、ｐ＝０．００１）。
【０３１１】
【表１】
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【０３１２】
腫瘍負荷進行のマーカーとしての血清ＳＭＲＰ：確立されたデータによって、血清ＳＭＲＰの連続測定（中皮腫患者の標準的な臨床試験）の役割が、腫瘍負荷の進行のマーカーとして、例えば、食道および肺腺癌を有する患者における進行のマーカーとして確立された（図１４）。したがって、血清ＳＭＲＰ測定は、ＴＮＢＣ患者集団に容易に適応できる標準的な臨床検査室試験である。
【０３１３】
ＭＳＬＮ特異的ＣＡＲ：ＩＲＥＳリンカー（Ｍｚ）によって分けられたヒトＭＳＬＮ抗体（ｓｃＦｖ）およびｅＧＦＰレポーター遺伝子に由来するＭＳＬＮ標的化ＣＡＲを、実施例１に記載のとおり創出した。実施例１に記載のとおり、ＣＤ２８受容体の細胞質ドメインを組み込んで、第２世代Ｍ２８ｚ  ＣＡＲを構築して、Ｔ細胞増殖、サイトカイン分泌、および生存を増強した。このベクター構築物を、ｅＧＦＰレポーター遺伝子で検出されるとおり、ヒトＴ細胞のＣＤ４およびＣＤ８の両方のサブセットに首尾よく形質導入した。ＭＳＬＮ標的化または対照Ｔ細胞をＭＳＬＮ＋がん細胞とともにインキュベートした、標準的なクロム放出アッセイを用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞傷害性によって、Ｍｚ−およびＭ２８ｚ形質導入のＴ細胞の両方によるＭＳＬＮ＋細胞の有効かつ特異的な殺傷が示された。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｍｚ  Ｔ細胞と比較して、約２倍の量のＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αを分泌した。Ｔ細胞生存および増殖に重要なサイトカインであるＩＬ−２の分泌は、Ｍ２８ｚによって固有的に提供される。外因性のＩＬ−２の存在下で、ＭＳＬＮ特異的受容体で形質導入されたＴ細胞は増殖して、ＣＤ２８共刺激細胞は、Ｍｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞によって達成されたよりも３倍大きい増殖性の応答を達成した。さらに、外因性のＩＬ−２の非存在下では、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のみが、反復性の抗原刺激の際に蓄積できた。
【０３１４】
ＣＡＲ＋Ｔ細胞媒介性の細胞傷害性は、グランザイム／パーフォリン経路依存性である：実施例１に記載のとおり、２つの細胞接触依存性の（Ｆａｓ／ＦａｓＬまたはグランザイム／パーフォリン経路）溶解性機構のどちらが、ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性を担うかを決定した。Ｆａｓリガンド／Ｆａｓ受容体相互作用の抗体遮断は、ＭｚまたはＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のいずれによっても標的細胞溶解を低減しなかった（ｐ＞０．０５）。フローサイトメトリーは、ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＦａｓリガンド発現、およびＭＳＬＮ＋腫瘍上でのＦａｓ受容体発現を確認した。ＭＳＬＮ＋細胞は、ＦａｓＬ媒介性の細胞傷害性を受け易く、実験で用いたＦａｓＬ抗体がこの効果をブロックした。対照的に、Ｔ細胞／腫瘍共存培養に対するカルシウムキレーターエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）の添加によるグランザイム放出の遮断は、ＣＡＲ媒介性の溶解を、ＭｚおよびＭ２８ｚの両方において低下し、同様に、ＣＤ４およびＣＤ８、サブセット（ｐ＜０．０００１）によって、ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性がパーフォリン／グランザイム依存性であることが実証される。
【０３１５】
マウスモデルの開発：ＭＳＬＮ発現ＴＮＢＣのための胸膜および全身性の標的化療法の検討を容易にするため、３つの異なる動物モデルを開発して、研究者らが確認した８５〜９０。得られた腫瘍は、ヒトの疾患を、同所性または転移性のいずれかの胸膜の肺病変について解剖学的に模倣している（それぞれ、図１５Ａ、図１５Ｂ＆Ｃ）。これらの動物モデルを、ｅＧＦＰ＋、ＭＳＬＮ＋、およびホタルルシフェラーゼ＋細胞株を用いることにより腫瘍の進行を追跡するために、非侵襲性生物発光イメージング（ＢＬＩ）８５〜８９、９１〜９３の使用について確認した。これらの腫瘍は、疾患の後期段階でさえ、ＭＳＬＮの発現を保持した（データ示さず）。重要なことに、腫瘍を接種され、かつ、ＢＬＩについて最適化されたプロトコールで毎週イメージングされたマウスは、信頼できる血清バイオマーカーである血清ＳＭＲＰを分泌し、かつ腫瘍負荷測定および進行と相関した（図１５Ａ、図１５Ｂ＆Ｃ、底部）。インセットで示されるのは、ＢＬＩまたはＭＲＩで実証される転移を有するマウスである。
【０３１６】
ＭＳＬＮ発現性肺転移マウスモデルにおける単回低用量Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞の抗腫瘍有効性：転移性の腫瘍増殖の２２日後、静脈内Ｍ２８ｚ形質導入のＴ細胞の単回投与は、対照のマウスと比較して（対照に対してｐ＜０．０５）、中央生存の延長でわかるように、腫瘍負荷を効率的に低下した（図１６）−したがって、全身投与されたＭ２８ｚ  Ｔ細胞が、肺転移モデルで複数の腫瘍病変を根絶する能力が実証された。
【０３１７】
局所的に投与されたＭ２８ｚ形質導入のＴ細胞は、胸膜腫瘍を根絶する：実施例１に記載のとおり、大きい転移性胸膜腫瘍負荷の確立の後、動物を腫瘍接種の１８日後（図３Ｅ）、単回静脈内注入または単回胸膜内投与のいずれかのＭＳＬＮ標的化Ｔ細胞を用いて処置した。胸膜に投与された対照の形質導入されたＴ細胞で処置したマウスでは、腫瘍負荷は、マウスが死ぬまで（図３Ｃ）一貫して進行した（図１７Ｂ）。低用量の静脈内Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞を用いた処置では、腫瘍負荷の低下の遅延が生じ（図３Ｂおよび図３Ｃ）、生存の利点が得られる（ｐ＝０．００５；図３Ｄ）。胸膜に投与されたＭ２８ｚ  Ｔ細胞は、主要な応答を誘発した。腫瘍負荷は、７日目まで有意に低く、１１日のＴまでベースラインであった（図３Ｂ）。中央生存は、腫瘍根絶を達成するほとんどのマウスで達しなかった（図１７Ｄ）。
【０３１８】
Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、強力な抗腫瘍有効性を実証し、かつＴ細胞の機能的な持続性は、ＣＤ２８共刺激によって強められる：実施例１に記載のとおり、ＭｚまたはＭ２８ｚ胸膜のいずれかのＴ細胞を投与された樹立された胸膜のＭＳＬＮ＋腫瘍を有するマウスでは、腫瘍根絶後、両群とも、ＣＤ４およびＣＤ８の両方のサブセットのＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性を呈した（図１０Ａ）。最初のＴ細胞注射の８７日後、ＭＳＬＮ＋またはＭＳＬＮ−腫瘍細胞のいずれかを、腹腔に投与し、腫瘍負荷はＢＬＩで追跡した（図１０Ｅ、上側）。腫瘍負荷の抗原特異的対照が、Ｍｚ−およびＭ２８ｚの両方のＴ細胞処置のマウスで見られ、Ｍ２８ｚ処置のマウスで見られる低下はさらに大きかった（図１０Ｃおよび図１０Ｅ）。マウスを、再チャレンジの１６日後に屠殺して、それらの脾臓を収集した。抗原陽性の腫瘍を再チャレンジしたＭ２８ｚ  Ｔ細胞は、抗原陰性の腫瘍と比較して、Ｔ細胞の４倍の増殖を示した（図１０Ｄ）。これによって、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、末梢で持続可能であり、かつ腫瘍を再チャレンジされたとき、増殖を示す（ＣＤ２８共刺激によって強められる効果）ことが実証される。
【０３１９】
Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞は、低−ＭＳＬＮ発現標的の抗原特異的バイスタンダー殺傷を媒介する：ＴＮＢＣ中を含む、特定の固形腫瘍中のＭＳＬＮ発現の異種性を考慮して、異種ＭＳＬＮ発現標的に対するＭ２８ｚ  Ｔ細胞の細胞傷害性を評価した。ＭＲＣ−５肺線維芽細胞（ＭＳＬＮ−）との共存培養の１６時間後、Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞は、溶解を示さなかった（図１７Ａ）。低レベルのＭＳＬＮを自然に発現する細胞株（低ＭＳＬＮ）および高レベルのＭＳＬＮを発現するように形質導入された細胞株（高ＭＳＬＮ）の１：１混合物から構成される、ＭＳＬＮ発現標的に対するＭ２８ｚ  Ｔ細胞の細胞傷害性を評価した。特異的溶解を検査するために、低ＭＳＬＮ細胞株のみを、５１クロムで標識して、未標識の高ＭＳＬＮ細胞と混合し、引き続いてＭ２８ｚまたは対照Ｔ細胞のいずれかと共存培養した。共存培養１６時間後、高ＭＳＬＮ標的の存在下における、Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞による低ＭＳＬＮ細胞の特定の細胞溶解（図１７Ｂ）を観察したところ、標的比に対して各々のエフェクターで約５％〜１５％まで低ＭＳＬＮ細胞株単独の溶解を超えている（ｐ＜０．０５）。重要なことに、不活性化されたＭ２８ｚ  Ｔ細胞と比較して、抗原予備活性化のＭ２８ｚ  Ｔ細胞は、低ＭＳＬＮ細胞またはＭＳＬＮ陰性の腫瘍に対してなんら増大した細胞傷害性も非特異的殺傷も示さなかった（図１７Ｃおよび図１７Ｄ）。したがって、Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞は、高ＭＳＬＮ腫瘍の存在下で、低ＭＳＬＮ細胞に対する強められた抗原特異的細胞溶解を示す。
【０３２０】
Ｔ細胞ＢＬＩによって実証されたＭＳＬＮ標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ輸送：実施例１に記載のとおり、Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ輸送および増殖を決定するために、ヒトＴ細胞のＭ２８ｚ  ＣＡＲおよび強化されたホタルルシフェラーゼ（ｅｆｆＬｕｃ）を用いた二重形質導入を最適化した。胸膜に投与されたＴ細胞は、非腫瘍保有マウスと比較して、腫瘍保有マウスにおいてのみ強度の増大を示し、これはＭＳＬＮ特異的Ｔ細胞増殖を意味している（図４Ａ、背側＆腹側）。比較的に、全身に投与されたＭ２８ｚＧ−ｅｆｆｌｕｃ＋Ｔ細胞は、投与直後に肺内滞留を示し、２〜３日後、胸膜のシグナル発光は増大していた（図４Ｂ）。非侵襲性イメージングの使用によるＴ細胞応答のモニタリングを最適化し、輸送の可視化、および抗原に応答したＴ細胞増殖の定量を可能にした。
【０３２１】
Ｔ細胞機能のインヒビターを発現するがん細胞に対する有効性を検討するための４−１ＢＢ共刺激ドメインを有するＭＳＬＮ特異的ＣＡＲ：免疫系を回避するための阻害性タンパク質を通常発現する、がんの影響を検討するために、ＰＤ−Ｌ１を発現し（図１８の黒、アイソタイプ対照との比較、赤）、かつＴＧＦ−βのような阻害性サイトカインを分泌する細胞をＥＬＩＳＡによって特徴付けて、確認した。したがって、これらの細胞によって、阻害性ＴＭＥ内のＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏの抗腫瘍有効性とモデリングすることが可能になる。ＣＡＲ  Ｔ細胞が腫瘍媒介性の阻害を克服する能力を研究するために、抗原認識の際、４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達を提供する（ＭＢＢｚ；図１９）受容体を提供した。初代ヒトＴ細胞を、６０％〜７０％の頻度まで、ＭＳＬＮ特異的なＣＡＲを用いて効率的に形質導入した。
【０３２２】
ＭＳＬＮ標的化ＣＤ２８および４−１ＢＢ共刺激は、腫瘍分泌の免疫抑制性タンパク質の存在下でＣＡＲ  Ｔ細胞機能を増強する：ＭＳＬＮ（３Ｔ３  ＭＳＬＮ＋；図２０Ａ、上側）またはＭＳＬＮおよびＰＤ−Ｌ１の両方（３Ｔ３  ＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋；図２０Ａ、下側）の両方のいずれかを発現する３Ｔ３マウス線維芽細胞を操作して、外因性のＴＧＦ−βを、Ｔ細胞／３Ｔ３  ＭＳＬＮ＋共存培養物（図２１Ａ）に、有害なＴＭＥの代わりとして添加した。３Ｔ３  ＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋（空白の形；３Ｔ３  ＭＳＬＮ＋、塗りつぶしの形）での刺激の際、共刺激のＣＡＲ＋Ｔ細胞は、３Ｔ３  ＭＳＬＮ＋での刺激と比較して、低い量のサイトカインを分泌した。しかし、共刺激されたＴ細胞は、ＰＤ−Ｌ１の存在下でさえ、Ｍｚ  Ｔ細胞より大量のサイトカインを分泌し続けた（ｐ＜０．００５）。さらに、１０ｕｇ／ｍＬのＰＤ−Ｌ１ブロッキング抗体でのＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１ライゲーションの遮断は、全てのＴ細胞群に関してサイトカイン分泌を救済し（救済は青い塗りつぶしの形で示す；ｐ＜０．０２、Ｍｚと、遮断なしのＭｚに対するＰＤ−Ｌ１遮断とを比較；ＭＢＢｚについてＩＦＮ−γについてｐ＝０．０２；Ｍ２８ｚについてｐ＜０．０２、対応のないｔ検定）、さらにＰＤ−Ｌ１媒介性の阻害の特異性を示し、かつＣＡＲ  Ｔ細胞療法を増強するのにおけるＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１軸遮断の役割を示唆していた。増殖に関して、Ｍ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のみが、ＰＤ−Ｌ１過剰発現の存在下で増殖できた（ｐ＜０．０５、７日および１４日で）。ＰＤ−Ｌ１媒介性の阻害と同様に、ＴＧＦ−βの添加はまた、全てのＣＡＲ  Ｔ細胞群のサイトカイン分泌を低下したが、もう一度共刺激したＣＡＲ＋Ｔ細胞は、Ｍｚ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞と比較してより大量のサイトカインを分泌し続けた（ｐ＜０．００３；図２１Ｂ）。ＴＧＦ−βの存在下でのＭＳＬＮ特異的刺激に応答して、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、２回の連続刺激の際にやはり増殖できた（ｐ＜０．００２；図２１Ｃ）。共刺激シグナル伝達は、顕著な腫瘍発現の阻害性タンパク質の存在下でさえ、ＣＡＲ  Ｔ細胞機能を増強することが実証された。
【０３２３】
養子Ｔ細胞療法における共刺激因子としてのＩＬ−１２：Ｍ２８ｚＩＬ１２  ＣＡＲ構築物は、Ｔ細胞中に形質導入されたとき、ＩＬ−１２を分泌することが特徴付けられた。Ｍ２８ｚおよびＭ２８ｚＩＬ１２細胞は両方とも、ただし非形質導入の細胞は違うが、ほぼ同じ効果で、ＭＳＬＮ＋がん細胞の特異的溶解を媒介した（図２２）。ＥＬＩＳＡ／ＬＵＭＩＮＥＸアッセイを用いて、抗原発現性腫瘍細胞との共存培養の際、ＩＬ−１２  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、Ｔｈ１サイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、およびＧＭ−ＣＳＦ）の分泌を増強し（図２３）、かつＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−１３、ＩＬ−４、およびＩＬ−５）の産生を阻害したことを示した。
【０３２４】
（実施例３）
レトロウイルスベクターＳＦＧ−ｉＣＡＳＰ９−２Ａ−Ｍ２８ｚの生成
【０３２５】
ＳＦＧベクターは、ｉＣＡＳＰ９−２Ａ−Ｍ２８ｚ  ＣＡＲの発現のために、Ｍｏ−ＭｕＬＶの５’および３’の両方の長末端反復（ＬＴＲ）を使用した。ｉＣＡＳＰ９−２Ａ−Ｍ２８ｚ  ＣＡＲの転写は、５’ＬＴＲのＵ３領域に存在するエンハンサーおよびプロモーター配列、ならびに３’ＬＴＲのＲ領域中に存在するポリアデニル化部位の制御下であった。さらに、このベクターは、ウイルス粒子中への組換えレトロウイルスゲノムの効率的なキャプシド形成に必須のψ＋配列、ならびにｅｎｖタンパク質をコードするサブゲノムのレトロウイルスＲＮＡの生成のために用いられるレトロウイルススプライスドナーおよびアクセプター配列をＭｏ−ＭＬＶ内に保持した。ｉＣＡＳＰ９−２Ａ−Ｍ２８ｚ配列を挿入して、そのためその開始コドンは、サブゲノムのウイルス転写におけるウイルスｅｎｖ  ＡＴＧによって正常には占有される位置であった。このクローニングストラテジーは、１ベクターコピーあたりスプライシングされてないベクターＲＮＡに対するスプライスングされたベクターの比を、従来のガンマレトロウイルスベクターに対して４倍まで、増大したことがノーザンブロット分析によって示された（Krall  and  Kohn,  1996,  Expression  levels  by  retroviral  vectors  based  upon  the  N2  and  the  MFG  backbones.  Gene  Ther  3,  365）。
【０３２６】
ＳＦＧ−ｉＣＡＳＰ９−２Ａ−Ｍ２８ｚ（図３１および図３２に示される）は、２つのＤＮＡ断片を、ＳＦＧ骨格の６．７ｋｂのＮｏｔＩ／ＢｇｌＩＩの中に挿入することによって構築した。この骨格は、以下をコードする：（１）ｍＲＮＡをコードするＭｏ−ＭＬＶ  ｅｎｖのＳＡおよび５’ＵＴＲを包含する領域を除く全体的なＳＦＧ  γ−レトロウイルスベクター；ならびに（２）ヒトＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに融合されたヒトＣＤ２８シグナル伝達ドメインのＣＤＳ。
【０３２７】
ＤＮＡ断片１は、プラスミド構築物ＳＦＧ−ｉＣ９−４１ＢＢＬ−ＮＹ２８ｚ由来の１．５ｋｂのＢｇｌＩＩ／ＢｓｐＥＩ断片であった。この断片は、Ｃ末端の８つのアミノ酸および停止コドンを欠いているｉＣＡＳＰ９のＣＤＳに融合されたｍＲＮＡをコードするＭ０−ＭＬＶ  ｅｎｖのＳＡおよび５’ＵＴＲを包含する領域をコードした。ｉＣＡＳＰ９  ＣＤＳは、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏからの新規な合成に由来した。
【０３２８】
ＤＮＡ断片２は、０．９７９ｋｂのＰＣＲ生成物由来の０．８９ｋｂのＢｓｐＥＩ／ＮｏｔＩ断片であった。この断片は、ＧＳＧ−Ｐ２Ａ−ＣＤ８ａリーダー＿ｍ９１２  ｓｃＦｖに融合されたｉＣＡＳＰ９のＣ末端ＣＤＳをコードした（停止コドンなし）。このＰＣＲ生成物は、以下のプライマーを鋳型として用いて、ＳＦＧ−ＴＫ−２Ａ−Ｍ２８ｚから合成した：
（１）ｉＣＡＳＰ９−２Ａ  Ｌｅｆｔプライマー：gcgctccggaaaaaacttttctttaaaacatc
aggatctggagcaacaaacttc  [配列番号37]
（２）ＣＤ２８  Ｒｉｇｈｔプライマー：ggtgtttccctttcacatgg  [配列番号38]。
Ｐ２Ａのアミノ酸配列は、下に示す配列番号３９に示される：
ATNFSLLKQAGDVEENPGP[配列番号39]。
配列番号３９のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、下に示される、配列番号４０に示す：
GCAACAAACTTCTCACTACTCAAACAAGCAGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCC[配列番号40]。
【０３２９】
ＳＦＧ−ＴＫ＿２Ａ＿Ｍ２８ｚ鋳型は、オーバーラップエクステンションＰＣＲによって、ＳＦＧ−Ｈｓｖｔｋ＿Ｐ２Ａ＿Ｐ２８ｚ骨格およびＣＤ８ａリーダー＿ｍ９１２  ｓｃＦｖ配列をＳＦＧ−Ｍ２８ｚ＿ｉｒｅｓ＿ｈｒＧＦＰ中で用いて誘導した。ＳＦＧ−Ｍ２８ｚ＿ｉｒｅｓ＿ｈｒＧＦＰ中のＣＤ８ａリーダー＿ｍ９１２  ｓｃＦｖ配列は、発現最適化コドン表１を用いて、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏから新規合成によって誘導した。ＳＦＧ−Ｈｓｖｔｋ＿Ｐ２Ａ＿Ｐ２８ｚレトロウイルスベクターＳＦＧ／ＴＫ＿２Ａ＿Ｐ２８ｚの生成は、３ピースのライゲーションを用いてＳＦＧ／ＴＰ２８ｚ．３から誘導した（（１）ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子に融合されたスプライスアクセプター部位を含有するＭｏ−ＭＬＶベクターの領域をコードするＳＦＧ−ＴＰ２８ｚ．３由来の１４６２ｂｐのＢｇｌＩＩ／ＢｓｓＨＩＩ断片；（２）停止コドン＿ＧＳＧ＿２Ａ＿ＣＤ８ａシグナルペプチド＿Ｊ５９１  ＳｃＦｖなしのＨＳＶ−ＴＫ遺伝子の３’末端をコードするＰＣＲ産物由来の８８０ｂｐのＢｓｓＨＩＩ／ＮｏｔＩ断片；および（３）キメラ抗原受容体の膜貫通＿ＣＤ２８＿ゼータ鎖の残り、プラス、レトロウイルスベクター骨格の残りをコードするＳＦＧ−ＴＰ２８ｚ．３由来の６６５２ｂｐのＮｏｔＩ／ＢｓｓＨＩＩ断片）。ＰＣＲ生成物は、鋳型としてＧＳＧ＿Ｐ２Ａ＿＿ＣＤ２８ｚをコードする前に構築されたプラスミドＤＮＡを用いて増幅した。以下のプライマーを利用した：（１）フォワードＨＳＶＴＫ＿リンカー＿ＧＳＧ＿Ｐ２Ａ：GCGCGCGCGCACGTTTGCCCGGGAGATGGGGGAGGCTAACGGATCTGGAGCAACAAACTTC  [配列番号41]（２）リバース−Ｐ２８ｚ  Ｒ：ggtgtttccctttcacatgg  [配列番号42]。
【０３３０】
２．レトロウイルスベクターＳＦＧ−ｉＣ９−４１ＢＢＬ−ＮＹ２８ｚＳＦＧ−ｉＣ９−４１ＢＢＬ−ＮＹ２８ｚの生成は、２つの断片を、ＳＦＧ−Ｈｓｖｔｋ＿２Ａ＿Ｐ２８ｚ由来の６．８ｋｂのＡｇｅＩ／ＮｏｔＩ骨格中に挿入することによって生成した：（１）Ｍｏ−ＭＬＶ  ＳＤおよびｉＣＡＳＰ９の全ＣＤＳに融合されたｅｎｖ  ｍＲＮＡの５’ＵＴＲおよびｇｓｇ＿Ｐ２Ａ切断ペプチドとインフレームで融合されたＮ末端４−１ＢＢＬをコードするｐＵＣ（−ｍｃｓ）−ＣＢＮＩ由来の１．７ｋｂのＡｇｅＩ／ＳａｃＩＩ断片；ならびに（２．）ＮＹＥＳＯ−１抗原を標的化するｓｃＦｖに対して別のＧＳＧ＿Ｐ２Ａ切断ペプチドを介して融合された残りのＣ末端４−１ＢＢＬ  ＣＤＳをコードするｐＵＣ（−ｍｃｓ）−ＣＢＮＩＩ由来の１．５ｋｂのＳａｃＩＩ／ＡｇｅＩ断片。
【０３３１】
ｐＵＣ（−ｍｃｓ）−ＣＢＮＩおよびｐＵＣ（−ｍｃｓ）−ＣＢＮＩＩの両方を、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏおよび新規な遺伝子合成によって生成したインサートから得た。
【０３３２】
（実施例４）
ＣＡＲ発現レベルは、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の有効性と関連する
【０３３３】
２９３Ｔパッケージング細胞株のサブクローンを用いるＭ２８ｚ  ＣＡＲの発現レベルが種々であるＴ細胞集団を生成した。ＣＤマーカーを標的化する第２世代のＣＡＲを、陰性対照（対照ＣＡＲ）として用いた。Ｍ２８ｚをコードするレトロウイルス構築物を図２７Ａに示す。図２７Ａに示されるとおり、この構築物は、レポーター、ＧＦＰを含む。ＣＤ３＋ヒトＴ細胞を、Ｍ２８ｚおよび対照のＣＡＲで形質導入した。Ｔ細胞は、図２７Ｂに示されるように、異なるレベルのＭ２８ｚを発現した。１細胞あたり約４またはそれ超のベクターコピー数というＭ２８ｚ発現レベルを有するＴ細胞を、「高Ｍ２８ｚ」として分類した。１細胞あたり約１〜約４のベクターコピー数というＭ２８ｚ発現レベルを有するＴ細胞を、「中Ｍ２８ｚＴ」として、１細胞あたり約１未満のベクターコピー数というＭ２８ｚ発現レベルを有する細胞を、「低Ｍ２８ｚ」として分類した。非形質導入および形質導入されたＴ細胞のベクターコピー数を、定量的ＰＣＲによって、図２７Ｃに示されるとおり測定した。種々のレベルの表面メソセリンを発現する４つの標的細胞株を生成したＭｅｔ５ａ、ＥＫＶＸ、ＭＳＴＯ  ＭおよびＯＶＣＡＲ−３。Ｍｅｔ５ａは、ＳＶ４０大型Ｔ抗原で不死化されたヒト中皮細胞株であった。ＥＫＶＸは、メソセリンを天然に発現する肺がん細胞株であった。ＭＳＴＯ  Ｍは、ヒトメソセリンを過剰発現するように形質導入されたＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞株であった。ＯＶＣＡＲ−３は、メソセリンを天然に発現する卵巣がん株であった。図２８に示されるとおり、これらの４つの標的細胞株の中でＭＳＴＯ  Ｍは、最高発現レベルのヒトメソセリンを有し、Ｍｅｔ５ａは、ヒトメソセリンの発現レベルが最低であった。４つの標的細胞株を、Ｍ２８ｚ＋Ｔ細胞または対照のＣＡＲ＋Ｔ細胞のいずれかとともに共存培養した。４つの標的細胞株中のサイトカイン産生またはＭ２８ｚ＋Ｔ細胞の分泌を評価した。図２９Ａおよび図２９Ｂに示されるとおり、最高発現レベルのＭ２８ｚを有するＴ細胞のみが、Ｍｅｔ５ａ標的細胞（４つの試験した細胞株の中で最低発現レベルのヒトメソセリンを有した）に対して抗原特異的サイトカイン分泌を提示した。漸増発現レベルのＭ２８ｚ  ＣＡＲは、ＭＳＴＯ標的細胞（４つの標的化細胞株の中で最高発現レベルのヒトメソセリンを有した）に対して用量依存性のサイトカイン分泌を生じた。ボンフェローニ補正を用いるペアワイズ比較で、サイトカイン分泌は、（１）Ｔ細胞のみおよびＭｅｔ５ａ標的の両方に関して３つ全ての他のエフェクターに対してＭ２８ｚが高い発現レベルで；ならびに（２）ＭＳＴＯ  Ｍ標的細胞の場合は群比較の間で全て、有意に高かった（ｐ＜０．０５）。
【０３３４】
さらに、４つの標的細胞株に対するＭ２８ｚ＋Ｔ細胞の細胞傷害性を、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイによって評価した。種々の密度のＭ２８ｚ  ＣＡＲ、Ｍｅｔ５ａ標的細胞、ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋標的細胞、およびＥＬ４ＰＳＭＡ＋ＭＳＬＮ−標的細胞を発現するＴ細胞を、異なるＥ：Ｔ比で１８時間インキュベートした。ＥＬ４ＰＳＭＡ＋ＭＳＬＮ−標的細胞を、陰性対照として用いた。図３０に示されるとおり、Ｍ２８ｚの発現レベルが高いＴ細胞のみが、Ｍｅｔ５ａ標的細胞（４つの試験した細胞株の中で最低発現レベルのヒトメソセリンを有した）に対して細胞傷害性を示した。さらに、図３０に示されるとおり、ＣＡＲの発現レベルが、ＭＳＴＯ標的細胞（４つの試験した細胞株の中で最高発現レベルのヒトメソセリンを有した）に対する細胞傷害性の程度を決定した。
【０３３５】
（実施例５）
メソセリン発現レベルは、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の有効性と関連する
【０３３６】
単一の中皮腫細胞株（ＭＳＴＯ  ２１１−Ｈ）を用いて、図３１Ａに示すように、低レベルまたは高レベルのヒトＭＳＬＮで形質導入した。Ｍ２８ｚ＋Ｔ細胞の細胞傷害性は、上記のような標準的な５１Ｃｒ放出アッセイによって決定し、その結果を図３１Ｂに示す。サイトカイン産生は、サイトカイン分泌アッセイによって決定し、その結果を図３１Ｃに示す。図３１Ｂおよび３１Ｃに示されるとおり、Ｍ２８ｚ＋Ｔ細胞の細胞傷害性およびサイトカイン産生は、ヒトＭＳＬＮの発現レベルと比例していた。例えば、ヒトＭＳＬＮの発現レベルが高いほど、Ｔ細胞の細胞傷害性およびサイトカイン産生は大きい。
【０３３７】
（実施例６）
最適発現レベルのＭＳＬＮ特異的ＣＡＲの生成
【０３３８】
ｍ９１２抗体由来のｓｃＦｖを得た。ｍ９１２抗体のコドン最適化は、４つの異なるアルゴリズム（例えば、Ｂｌｕｅ  ＨｅｒｏｎおよびＥｎｃｏｒｅアルゴリズム）に基づいて行った。全ての４つのアルゴリズムから得たコドン最適化配列を混ぜて、全てのＣＰＧおよびＢＡＭ−Ｈ１を、最適クローニングのために取り出した。コドン最適化ヌクレオチド配列は、もとのｍ９１２  ｓｃＦｖに対して約７０％相同であった。免疫抑制細胞（例えば、ヒト初代Ｔ細胞）中で効率的な発現を得るために、コドン最適化ヌクレオチド配列を、ヒトＣＤ８リーダー、例えば、配列番号２０をコードするポリヌクレオチドに対してライゲーションした。ＣＤ８リーダーによって、ＳｃＦｖ重鎖（ＱＶＱＬ）の前に最適のシグナル切断を提供した。コドン最適化は、免疫抑制細胞、例えば、複数のヒトドナー初代Ｔ細胞中で、良好な形質導入効率で、メソセリンＣＡＲ発現を最適化した。複数のドナーＴ細胞中の複数のＣＡＲベクターコピー数を、複数の血液および固形がん細胞（種々のメソセリン発現を有する）に対する機能的な効率、特異性および選択性ついて試験した。１〜４というベクターコピー数を有するコドン最適化のｍ９１２ベースのメソセリンＣＡＲは、高いメソセリン発現性標的に対して高度に効率的な細胞傷害性を、ただし、低いメソセリン発現性標的、すなわち正常組織に対しては最小限の反応性を提供し、これは、有効性を損なうことのない、ベクター安全性について達成された重要な特徴である。正常組織発現性低メソセリンを節約しながら高いメソセリンを発現するがん細胞に対して反応性である特定のメソセリンＣＡＲを生成するのにおける、上記の革新的な遺伝子操作は、安全性を保証しながらがん治療のための臨床的なベクターとしての使用に最適である。
【０３３９】
（実施例７）
メソセリン標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の局所送達は、強力かつ長期持続性のＣＤ４依存性の腫瘍免疫を生じる−実施例１の更新
【０３４０】
１．要約
固形腫瘍に対する血液悪性腫瘍のためのＣＡＲ  Ｔ細胞療法の最近の成功を言い換えれば、不十分なＴ細胞の腫瘍浸潤および不十分な機能的な持続性を含むいくつかの障害を克服する必要がある。ヒト胸膜の悪性腫瘍を忠実に模倣する同所性モデルを利用して、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲを用いるメソセリン標的化Ｔ細胞の２つの投与経路を評価した。胸膜内に投与されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、全身的に注入されたＴ細胞よりもかなり機能が優れており、長期の完全な寛解を誘発するのに必要なＭ２８ｚ  Ｔ細胞が３０分の１であることが見出された。胸膜内Ｔ細胞投与後、適切なｉｎ  ｖｉｖｏの抗原誘発性のＴ細胞活性化が、堅調なＣＡＲ  Ｔ細胞増殖およびエフェクター分化を可能にし、強化された抗腫瘍有効性および機能的なＴ細胞持続性を２００日間生じた。局所的なＴ細胞投与はまた、胸郭外腫瘍部位の効率的な排除を促進した。この治療的有効性は、より高い腫瘍内ＣＤ４／ＣＤ８細胞比を伴う早期のＣＤ４＋Ｔ細胞活性化、およびＣＤ２８依存性のＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性の細胞傷害性に依存した。対照的に、静脈内に送達されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、胸膜腫瘍で等価な数で蓄積した場合でさえ、匹敵する活性化も、腫瘍根絶も、持続性も達成しなかった。胸膜内に投与されたＴ細胞が循環して持続する能力によって、「局所的な分布中心」を通じて最適のＣＡＲ  Ｔ細胞療法を送達するという概念が支持される。これらの結果に基づいて、原発性または二次的な胸膜悪性腫瘍を有する患者において、メソセリン標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞の胸膜内投与の安全性を評価するための第１相臨床治験が進行中である。
【０３４１】
１．序
【０３４２】
胸膜の悪性腫瘍であって、原発性の（悪性胸膜の中皮腫、ＭＰＭ）および転移性（肺がんおよび乳がん由来）悪性腫瘍は、米国だけで１年あたり１５０，０００例を超える患者に罹患している１０８。ＭＰＭは、処置の選択肢が限られた局所で攻撃性の疾患である１０９。研究は、ＭＰＭにおいてより高レベルの腫瘍浸潤性のリンパ球を有するという良好な予後を報告しており１１０〜１１３、これによって、Ｔ細胞ベースの免疫療法は、ＭＰＭを有する患者に有益であり得ることが示唆された１１４。
【０３４３】
患者のＴ細胞を再指向して、再プログラムするためにＣＡＲを利用する標的化免疫療法は、近年、いくつかのＢ細胞悪性腫瘍、特に急性リンパ芽球性白血病および非ホジキンリンパ腫において有望な結果を示している１１、１１５、１１６、１１７。ＣＡＲは、腫瘍表面抗原に対してＴ細胞を再標的化する合成の受容体である２１、１１８。活性化および共刺激シグナル伝達ドメインを組み合わせる第２世代のＣＡＲの出現によって、化学療法不応性ＣＤ１９＋悪性腫瘍を有する患者で完全な応答を媒介し得る強力なＴ細胞の設計が可能になった１１、１１５、１１６、１１７。固形がんに対するＣＡＲ療法の治療能力は未知のままである。任意の固形腫瘍についてＣＡＲ療法を工夫する１つの重要な態様は、妥当な標的抗原の特定である。メソセリン（ＭＳＬＮ）は、類上皮細胞ＭＰＭの９０％超で過剰発現されるＭＰＭの特徴である、局所の浸潤に関連する細胞表面分子である３７。ＭＳＬＮの発現および強度を系統的に評価する研究者らの臨床病理学的研究では、強度から中間程度のＭＳＬＮ発現が、肺腺癌のうち６９％で（ｎ＝１２０９）１１９、三重陰性乳がんのうち３６％で（ｎ＝３５５）および食道腺癌のうち４６％で（ｎ＝１２５）４７見出された。ＭＳＬＮ発現は、一貫して、腫瘍攻撃性および生存の低下と関連していた３７、４７、１１９。まとめると、これらの観察によって、ＭＰＭおよび他の固形がんにおいてＭＳＬＮを標的化することが支持される１１４、１２０〜１２２。
【０３４４】
メソセリン標的化ＣＡＲは、中皮腫の皮下モデルで以前に活性を示した５５、５６、１２３。しかし、標的化Ｔ細胞療法は、同所性モデルで研究されていない。この目的を達成するために、ヒトの疾患に特徴的な特徴を再現する臨床的に関連するＭＰＭマウスモデル３７、８５、８６を樹立した。樹立された胸膜腫瘍は、局所の浸潤を有する肺および縦隔の構造を囲み、広範なリンパ管形成を示し、かつ縦隔リンパ節転移を発症する。このモデルは、ＣＡＲ  Ｔ細胞が腫瘍を根絶し得るか否かに取り組むだけでなく、Ｔ細胞投与の２つの可能性のある経路（従来の全身性の静脈内および局所の胸膜内投与）も研究した。全身性送達は、本発明者らがモデリングし得る、びまん性胸膜疾患、縦隔リンパ節および偶発的転移部位の良好な浸潤に起因して優れている場合があると仮説した。驚くべきことに、局所の、すなわち、胸膜内のＴ細胞投与は、胸膜の疾患に対してだけではなく、散在性の腫瘍部位に対しても大いに優れていることが見出された。この観察によって、このような治療的有効性の基礎を検討することが促された。
【０３４５】
この実施例では、固形腫瘍のための局所のＣＡＲ  Ｔ細胞療法の治療的能力を報告しており、抗腫瘍有効性の増強を達成するためのＣＤ４＋ＣＡＲ  Ｔ細胞の早期の抗原活性化の重要性が強調された。さらに、臨床的に関連する疾患モデルにおける局所療法の明確な利点を実証するこの知見は、ＭＰＭおよび転移性の胸膜腫瘍の処置に直ちにトランスレーション可能である。
【０３４６】
３．材料および方法
【０３４７】
試験の設計
この研究の目的は、固形の悪性腫瘍のための最適のＴ細胞免疫療法を創出することであった。ヒトＴ細胞に形質導入された場合、腫瘍抗原認識および抗原特異的エフェクター機能を提供するメソセリン標的化キメラ抗原受容体を設計した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、（ｉ）細胞傷害性、（ｉｉ）サイトカイン分泌、および（ｉｉｉ）Ｔ細胞増殖を解析した。ｉｎ  ｖｉｖｏの実験では、Ｔ細胞および腫瘍の両方の生きたままのイメージングを用いてＴ細胞療法を最適化するためのストラテジーを解析した。ヒトがん細胞およびヒトＴ細胞を有する免疫不全マウスを用いて、ＣＤ１９（Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ、ＮＭ、２００３）およびＰＳＭＡ（Ｇａｄｅ、ＣＲ、２００５）について以前行ったように、本発明者らのＭ２８ｚ  ＣＡＲの臨床へのトランスレーションを確証して容易にした。ＣＡＲ  Ｔ細胞と内因性の免疫系との間の機械的な相互作用の研究は、免疫適格性のマウスモデルで最もよく研究されるであろうが、ここでは、その臨床的に関連する対応物とは異なるマウスＣＡＲを利用する必要があろう。この実験手順は、メモリアルスローン・ケタリングがんセンター（Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ：ＭＳＫＣＣ）の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。各々の実験は、異なるドナーＴ細胞を用いて何度も行った（Ｔ細胞は決してプールしなかった）。示したデータは、代表的な実験（３つ超の試料複製を有する）を用いて、形質導入の効率に起因する相違、ドナー関連の変動およびＥ：Ｔ比などの交絡変数を回避した。
【０３４８】
細胞株
【０３４９】
ＭＳＴＯ−２１１Ｈ（ヒト胸膜の中皮腫）およびＥＬ４（マウス胸腺腫）細胞を、レトロウイルスによって形質導入して、ＧＦＰ／ホタルルシフェラーゼ融合タンパク質（ＭＳＴＯ  ＧＦＰ−ｆｆＬｕｃ＋）を発現させた。次いで、これらの細胞を、ＳＦＧレトロウイルスベクター中にサブクローニングされたヒトＭＳＬＮ変異体１を用いて形質導入して、ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋ＧＦＰ−ｆｆＬｕｃ＋を生成した。
【０３５０】
ガンマ−レトロウイルスベクター構築およびウイルス産生
【０３５１】
ＭＳＬＮ特異的ＣＡＲ（完全ヒトｓｃＦｖをコードする融合タンパク質）を生成するために、以前に記載のようにヒトＣＤ８リーダーペプチドおよびＣＤ８／ＣＤ３ζまたはＣＤ２８／ＣＤ３ζ配列に連結したｍ９１２（Ｄ．Ｄｉｍｉｔｒｏｖ、ＮＣＩ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋより贈呈）５３を操作した１７。ＳＦＧガンマ−レトロウイルスベクター骨格（Ｉ  Ｒｉｖｉｅｒｅ、ＭＳＫＣＣより贈呈）内で、内部リボソーム進入部位を挿入して、ヒト化された組換えＧＦＰレポーター遺伝子を有するＣＡＲの２シストロン性発現を容易にした。次いで、Ｍｚ、Ｍ２８ｚ、およびＰ２８ｚコードプラスミドを、以前に記載のとおり２０、２９３Ｔ  Ｈ２９パッケージング細胞株中にトランスフェクトした。
【０３５２】
Ｔ細胞単離、遺伝子導入、およびＣＤ４／ＣＤ８単離
【０３５３】
末梢血白血球を、治験審査委員会の承認したプロトコールのもとで健常なボランティアのドナーの血液から単離した。ＰＨＡ活性化されたＰＢＭＣは、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐでの低密度遠心分離によって単離した。単離の２日後、２日間毎日、ＰＢＭＣを、１５μｇ／ｍｌのレトロネクチンでコーティングしたプレート上で、Ｍｚ、Ｍ２８ｚ、またはＰ２８ｚベクターを含有する２９３Ｔ  ＲＤ１１４産生上清で１時間形質導入した。３日ベクター発現させた後、形質導入されたＰＢＭＣを、２０単位／ｍＬのＩＬ−２中で維持した。形質導入の有効性は、フローサイトメトリー解析によって決定した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の純粋な集団を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞単離キットを用いて、陰性選択プロトコールを通じて得た。
【０３５４】
細胞傷害性アッセイ
【０３５５】
ＣＡＲまたはベクター対照で形質導入されたＴ細胞の細胞傷害性を、以前に記載のとおり１５３、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイによって決定した。
【０３５６】
同所性の胸膜の中皮腫動物モデルおよびｉｎ  ｖｉｖｏのアセスメント
【０３５７】
胸膜の中皮腫の同所性マウスモデルを開発するために、雌性ＮＯＤ／ＳＣＩＤガンママウスを、６〜１０週齢で用いた。全ての手順は、承認された動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）のプロトコールのもとで行った。マウスは吸入および酸素を用いて麻酔し、鎮痛用にブピバカインを投与した。２００μＬの無血清培地中の１×１０５〜１×１０６個の腫瘍細胞の直接胸膜内注射を、右胸部切開を介して行って、以前に記載のとおり８５、８６、９２、１５４、同所性ＭＰＭ腫瘍を樹立した。全部で、３×１０４〜３×１０６個の形質導入されたＴ細胞を、２００μＬの無血清培地とともに腫瘍保有マウス中に、直接胸膜内注射によってマウスの胸腔中に、または尾静脈注射によって全身的に、養子免疫移入した。末梢血は、後眼窩採血によって得た。
【０３５８】
サイトカイン検出アッセイ
【０３５９】
サイトカイン放出アッセイは、Ｍ２８ｚ、Ｍｚ、または対照ベクターを形質導入された５×１０５〜５×１０３個のＴ細胞と、５×１０３個の標的細胞とを２００ｕＬの培地中で、９６ウェル丸底プレート中で、三連で、共存培養することによって行った。６〜２４時間の共存培養後、上清を採集した。サイトカインレベルを、多重ビーズヒトサイトカイン検出キットを用いて決定した。
【０３６０】
Ｔ細胞増殖アッセイ
【０３６１】
Ｍ２８ｚ、Ｍｚ、またはＰ２８ｚを形質導入された全部で１×１０６〜３×１０６個のＴ細胞を、ＭＳＬＮ発現の有無において、照射されたＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞上で刺激して、６または２４ウェルの組織培養プレート中で、１×１０５〜３×１０５細胞／ウェルの密度でプレートした。増殖アッセイを、注記したように、２０Ｕ／ｍＬの外因性のＩＬ−２の有無のもとで行った。細胞を、４または７日ごとにカウントし、次いでＭＳＬＮ発現の有無のもとで照射されたＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞上に積層した。各々のＴ細胞群について細胞数を時間に対してプロットして、表現型をフローサイトメトリー解析によって決定した。
【０３６２】
組織学的解析および免疫染色
【０３６３】
腫瘍の組織病理学的評価は、パラフィン包埋した、４％パラホルムルデヒド固定の組織試料のヘマトキシリンおよびエオシン染色後に行った。ヒトＭＳＬＮの免疫組織化学分析は、マウス抗ヒトＭＳＬＮ  ＩｇＧを用いて行った。ヒト抗ＣＤ３染色は、マウス抗ヒトＣＤ３  ＩｇＧで行った。
【０３６４】
フローサイトメトリー
【０３６５】
ヒトＭＳＬＮ発現を、ＰＥコンジュゲートのまたはＡＰＣコンジュゲートの抗ヒトＭＳＬＮラットＩｇＧ２ａを用いて検出した。Ｔ細胞表現型は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２５、ＣＤ２７およびＣＤ４５ＲＡのモノクローナル抗体で決定した。引き続き、フローサイトメトリーをＧＦＰ、ＭＳＬＮ発現、およびＴ細胞表現型解析のために、ＬＳＲＩＩサイトメーターで行い、およびＦｌｏｗＪｏ解析ソフトウェアを用いて分析した。マウス組織は、以下のとおり処理した：組織を秤量して、氷冷ＲＰＭＩ−１６４０中に収集した。組織を、外科用メスを用いて手技的に切り分け、次いで、４０〜１００ｕｍのフィルターを通して機械的にバラバラにした。試料を再懸濁して、２×１０６個の事象をＦＡＣＳで記録した。
【０３６６】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの定量的およびＴ細胞のＢＬＩ
【０３６７】
マウスにおけるＢＬＩは、単回腹膜内用量の１５０ｍｇ／ｋｇのホタルのｄ−ルシフェリンまたはｅｆｆＬｕｃレポーター遺伝子（Ｐａｔｒｉｃｋ  Ｈｗｕ博士、Ｔｅｘａｓより贈呈）を用いて行った８６、１５５。Ｍ２８ｚおよびＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼレポーター遺伝子で形質導入した細胞は、１５０ｕｌのプロピレングリコール：ＰＢＳ（１：１）中に再懸濁した１５ｕｇの天然のセレンテラジンの単回静脈内投与でイメージングした１５６。ＢＬＩのデータは、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ２．６０ソフトウェアを用いて分析し、ＢＬＩシグナルを、総流量として報告した（光子／秒）。次いで、ＢＬＩ流量（光子／秒）を、腹側および背側の画像の平均としてＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐ．、ＷＡ）を用いて決定し、かつＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、ＣＡ）を用いて分析した。
【０３６８】
統計学的方法
【０３６９】
データは、図の凡例に説明したとおり、平均＋／−ＳＤまたはＳＥＭとして示す。結果を、適用できる場合、多重比較のためのボンフェローニ補正を用いて対応のないスチューデントｔ検定（両側）で分析した。生存曲線は、ログランク検定で分析した。統計学的有意差は、Ｐ＜０．０５として定義した。全ての統計学的解析は、Ｐｒｉｓｍソフトウェアのバージョン６．０（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて行った。
【０３７０】
４．結果
ＭｚおよびＭ２８ｚ形質導入のＴ細胞は、ＭＳＬＮ＋標的細胞と特異的に応答する
【０３７１】
ヒトＭＳＬＮ特異的ｓｃＦｖ５３およびＣＤ３ζまたはＣＤ２８／ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインのいずれかを組み込む２つのＣＡＲ（ＭｚおよびＭ２８ｚ、図２Ａ）を構築した。前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）１７に特異的であるＰ２８ｚ  ＣＡＲは、同種反応性および異種反応性の陰性対照として機能した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方のヒト末梢血のＴリンパ球は、ＳＦＧガンマ−レトロウイルスベクターを用いて効率的に形質導入された（６０〜７５％形質導入、図２Ｂ）。ＭＳＬＮ形質導入のＭＳＴＯ−２１１Ｈ（ＭＳＬＮ＋）およびＰＳＭＡ形質導入のＥＬ−４マウスリンパ腫細胞（ＭＳＬＮ−）細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験に用いられるＭＳＬＮ陽性および陰性の標的を提供した（図４３Ａ）。ＭｚおよびＭ２８ｚ形質導入のＴ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで同様のＭＳＬＮ特異的溶解を示した（図３５Ａ）。Ｐ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋を溶解せず、メソセリン標的化ＣＡＲは、ＥＬ４  ＰＳＭＡ＋を溶解しなかった。第２世代のＣＡＲについて予想されるとおり１５、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、２倍〜５倍多い量のＴｈ１サイトカインを分泌し（図４３Ｂ）、かつ外因性のＩＬ−２の有無においてＭＳＬＮ＋細胞に対する反復曝露の際に、より大きいＴ細胞蓄積を生じた（図２Ｅ）。これらの知見に基づいて、本発明者らは、樹立された胸膜腫瘍を保有するマウスでＭ２８ｚの治療能力を評価することを開始した。
【０３７２】
Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞の局所的な送達は、全身経路よりもさらに強力である。
【０３７３】
本発明者らの実験室３７、８５、８６、９３によって以前に確立されたＭＰＭの同所性モデルでは、ホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）形質導入のＭＳＴＯ−２１１Ｈを用いて連続的な生物発光イメージング（ＢＬＩ）を用いて、腫瘍の樹立を確認し、Ｔ細胞療法の開始前に介入群にまたがって腫瘍負荷を平等にし、治療に対する応答を測定する。胸膜腫瘍が樹立されたマウスを、腫瘍接種１２日後、単回の静脈内または胸膜内投与の１×１０５個のＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のいずれかを用いた処置した（以前に記載のとおり、腫瘍負荷の定量から推定した、１：３０００というエフェクター対標的［Ｅ：Ｔ］比）８５、８６。Ｐ２８ｚ  ＣＡＲまたは非形質導入のＴ細胞を、同じ用量で投与して、抗原特異性ならびに同種反応性および異種反応性の対照を実証した。この用量での静脈内Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞を用いた処置は、辺縁性の抗腫瘍有効性を生じ（図３５Ｂ）、Ｐ２８ｚ対照Ｔ細胞をほとんど超えない（図３５Ｃ、青い破線対黒い実線、それぞれ、ＭＳ．２７対２５日）。対照的に、胸膜内に投与されたＭ２８ｚ  Ｔ細胞は、主要な応答を誘発した。腫瘍負荷は７日目まで有意に低く、１１日までに検出不能になった（図３５Ｂ）。中央生存は、１００日まで達しなかった（図３５Ｃ）。高用量の静脈内Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞での処置（３×１０６、３０倍増大、Ｅ：Ｔが１：１００）は、腫瘍負荷を低下したが、最終的な腫瘍の進行は回避せず（図２Ｂおよび図３５Ｄ）、軽度の４４日の生存の利点を生じた（図３５Ｅ、青い破線）。対照的に、胸膜内に投与された１０分の１低い用量のＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（３×１０５、Ｅ：Ｔが１：１０００）は、投与１０日内に腫瘍負荷を急速に低下し（図２Ｂおよび図３５Ｄ）、２００日までの中央生存に達しなかった（青い実線、図３５Ｅ）。実験結果は、３つの異なるドナー由来のＴ細胞と同様であって、もしあれば、同種反応性の有意な影響に対して主張した。
【０３７４】
全身の送達とは異なり、胸膜内Ｔ細胞投与は、即時的なＭ２８ｚ  Ｔ細胞増殖および分化を促進する。
【０３７５】
局所的なＣＡＲ  Ｔ細胞療法で観察される長期の無腫瘍生存によって、静脈内に用いられるよりも３０分の１の用量でさえ、胸膜内投与対静脈内投与後にＴ細胞の腫瘍浸潤、増殖および持続性を検討するように本発明者らは促された。この目的を達成するために、本発明者らは最初に、腫瘍およびＴ細胞非侵襲性の定量的ＢＬＩを行った。全てのマウスを、単回投与のＴ細胞（１×１０６）共発現Ｍ２８ｚおよび増強されたホタルルシフェラーゼ（ｅｆｆＬｕｃ）で処置した。投与の２４時間内に、胸膜内送達は、静脈内送達よりも１０倍大きい、胸膜のＭ２８ｚ  Ｔ細胞蓄積の急速な増大を生じた（図３６Ａ）。この急速かつ持続した蓄積は、Ｍ２８ｚで生じたが（図３６Ｂ、青線）、Ｐ２８ｚ  Ｔ細胞では生じなかった。静脈内に投与されたＭ２８ｚ  Ｔ細胞は、５〜７日後、胸膜内に送達されたＴ細胞に対して適合性のシグナルを生じた。休止期のＴ細胞  ＢＬＩシグナルは、併存する腫瘍ＢＬＩの低下によって記録された腫瘍負荷退縮と並行していた。連続的な免疫組織化学分析によって、Ｔ細胞蓄積の反応速度を確認した（図４Ｄ）。Ｔ細胞対腫瘍細胞比のさらなるフローサイトメトリー解析によって、２つの投与経路を比較した場合、最初の時点（３〜５日）でのＣＡＲ  Ｔ細胞の同様の蓄積が明らかになったが、ただし、これは、その後分かれて、胸膜内に送達されたＴ細胞の場合には一貫して増大するが、全身的に処置されたマウスでは低下する（図３６Ｃ）。エフェクター機能の異なる獲得と一致して、本発明者らは、胸膜のＣＤ４／ＣＤ８比およびＣＤ６２Ｌ発現のパターン（Ｌ−セレクチン）における顕著な相違、Ｔ細胞活性化の際のマーカーの下方制御およびエフェクター記憶形成を観察した１２４。胸膜内投与は、平衡のとれたＣＤ４／ＣＤ８比を維持したが、静脈内投与は、有意に少ないＣＤ８＋蓄積を生じた（図３６Ｃおよび図３６Ｄ）。これらのマウスの脾臓内で見られるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の分布が等しいことで、腫瘍内のＣＤ８＋蓄積の低下は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の全身的な欠失に起因するのではないことが示される。さらに、ほとんどの静脈内に投与されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、投与１週後に活性化されていない（ＣＤ６２Ｌ＋）Ｔ細胞表現型を示した。対照的に、胸膜内に投与されたＣＤ４＋Ｔ細胞の大きい割合が、活性化されたＣＤ６２Ｌ−表現型を示した（図３６Ｆ）。ＣＤ８＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞は、いずれの場合にもＣＤ６２Ｌ発現の同様の低下を示し（図３６Ｆ）、これによって、種々の活性化が主に、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化およびＣＤ８＋Ｔ細胞の併存する蓄積に影響したことが確認された。
【０３７６】
局所的にプライミングされたＭ２８ｚ  Ｔ細胞は、強力な全身的な、腫瘍特異的な応答を支持する。
【０３７７】
胸膜内に投与されたＴ細胞が、全身性の腫瘍防御を提供するか否かを評価するために、本発明者らは、ホタルルシフェラーゼを発現するＭＳＬＮ＋胸膜腫瘍を保有するマウス、同様に、ＭＳＬＮ＋およびＭＳＬＮ−わき腹腫瘍（右ＭＳＬＮ＋および左ＭＳＬＮ−、図３７Ａ、左側）を保有するマウスを、ガウシアルシフェラーゼを発現する胸膜内Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞を用いて処置した。Ｔ細胞投与１５日後、セレンテラジンを用いるＢＬＩは、胸膜腔中の残留Ｔ細胞およびＭＳＬＮ＋右わき腹腫瘍におけるＴ細胞蓄積を示したが（図３７Ａ、中央）、ＭＳＬＮ−左わき腹腫瘍では示さなかった。翌日、Ｄ−ルシフェリンによる腫瘍イメージングによって、胸膜腫瘍の根絶、ＭＳＬＮ＋右わき腹腫瘍の退縮およびＭＳＬＮ−左わき腹腫瘍の進行が示された（図３７Ａ、右側）。さらに、胸膜内に投与されたＣＡＲ  Ｔ細胞が、中皮腫播種の可能性のある部位である腹腔へ移動し得るか否かを検討した。二重の胸膜／腹膜疾患モデルでは、胸膜内に投与されたＭ２８ｚ  Ｔ細胞は、急速に蓄積し（１〜２日）、静脈内に投与されたＴ細胞よりも多数であった（図３７Ｂおよび図３７Ｃ）。
【０３７８】
胸膜内に投与されたＭ２８ｚ  Ｔ細胞は、少なくとも１００日間機能を保持する。
【０３７９】
局所的に分注されたＭ２８ｚ  Ｔ細胞の急速な活性化、およびそれらの効率的な胸郭外再分布を用いて、それらの持続性および機能をさらに検査した。１８日にわたって大きい胸膜腫瘍負荷を確立した後、Ｍｚ、Ｍ２８ｚまたはＰ２８ｚのＴ細胞を、胸膜腔中に、低用量の３×１０５個のＣＡＲ＋Ｔ細胞で投与した（Ｅ：Ｔが１：１０００）。Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞での処置は、バックグラウンドの発光レベルに対する腫瘍生物発光の均一な低下および長期の無腫瘍生存を誘発した（中央生存は、達せず、対Ｍｚにおける６３日、対Ｐ２８ｚにおける３６日、Ｐ＝０．０１、図３８）。処置したマウスの末梢血におけるＣＡＲ＋Ｔ細胞カウントの連続アセスメントは、Ｍｚ処置マウスと比較して、Ｍ２８ｚ処置マウスでのＴ細胞の持続性の増大を実証した（Ｔ細胞注入５０日後；図３８Ｂ）。Ｔ細胞持続性の同様の結果は、３つの別々のＴ細胞用量（３×１０６、１×１０６、および３×１０５個の投与されたＣＡＲ＋Ｔ細胞）を用いて得られた。持続性のＴ細胞の表現型アセスメントによって、ＭｚおよびＭ２８ｚの両方の処置のマウスにおけるＴ細胞注入３０日後、ＣＤ４＋Ｔ細胞の進行性かつ優勢な富化が実証された（図５Ｃ）。この漸進的なＣＤ４＋富化が、脾臓および血液の両方において全ての３Ｔ細胞用量で観察された。
【０３８０】
次に、持続性のＴ細胞の機能的な状況を、腫瘍再チャレンジ実験を行うことによって評価した。樹立されたＭＳＬＮ＋胸膜腫瘍を有するマウスは、胸膜内に、３×１０５個のＭｚまたはＭ２８ｚ  Ｔ細胞のいずれかを投与して、胸膜腫瘍を根絶して、長期生存を促進した。最初のＴ細胞注射８７日後、ＭＳＬＮ＋またはＭＳＬＮ−腫瘍細胞（１×１０６）のいずれかを、長期生存のために腹腔に投与して、腫瘍負荷を、ＢＬＩを用いてモニターした。再チャレンジの時点で、持続性のＴ細胞を、代表的なマウスにおけるＦＡＣＳ分析によって証明されるように、主にエフェクター記憶（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ−）細胞であった（図１０Ａ）。全てのマウスにおける腫瘍負荷での最初の増大後、腫瘍負荷の抗原特異的対照は、ＭｚおよびＭ２８ｚ  Ｔ細胞処置マウスの両方で、最も顕著には、Ｍ２８ｚ処置のマウスで見られた（図３９）。次いで、腫瘍チャレンジに対するＴ細胞増殖性応答を検査した。全ての群由来のマウスを、再チャレンジ１６日後に屠殺し、脾臓を、ＦＡＣＳ分析のために収集した。Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞を用いて最初に処置し、かつＭＳＬＮ＋腫瘍で再チャレンジしたマウスは、ＭＳＬＮ−腫瘍で再チャレンジされたマウスよりも４倍高いＴ細胞増殖を示した（図１０Ｃ）。Ｔ細胞蓄積が大きいことは、Ｍ２８ｚ群におけるＣＤ４＋亜集団に優先的に帰せられた（図１０Ｄ）。
【０３８１】
ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞の早期の抗原活性化は、ＣＡＲ  Ｔ細胞有効性を向上するのに必須である。
【０３８２】
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋サイトカインならびに増殖性応答に対するＣＤ２８共刺激の相対的な寄与を評価するため、ＭｚまたはＭ２８ｚのいずれかで形質導入されたＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびバルクＴ細胞を、ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞で刺激して、Ｔｈ１サイトカイン分泌および増殖を定量した。ＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して、Ｍｚで形質導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｔｈ１サイトカイン分泌のレベルを増大した（図４０Ａ）。ＣＤ２８共刺激のＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞よりも１１倍〜５０倍高いレベルのサイトカインを分泌し、これは、サイトカイン分泌が、ＣＤ２８共刺激のＴ細胞、特にＣＤ４＋Ｔ細胞で強力に増強されることを示す。予想されるとおり、ＭＳＬＮ＋標的での反復性の刺激は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ＭｚのいずれのＴ細胞集団でもＴ細胞増殖を誘発せず、むしろ、外因性のＩＬ−２の非存在下で抗原刺激の際にＴ細胞数の低下を急速に誘発した（図４０Ｂ）。対照的に、ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞における２倍の増大と比較して、第３刺激によって２０倍を超える平均増殖を増幅させた（Ｐ＜０．００１）。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞機能を支持するのにおけるＣＤ４＋ＣＡＲ  Ｔ細胞の重要性は、ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞と共存培養され、かつＭＳＬＮ＋標的によって刺激された場合、ＣＤ８＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞の堅調な蓄積によってさらに実証された（３倍大きい蓄積；Ｐ＜０．００１；図４０Ｃ）。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の増強する機能をさらに確認するために、ＣＤ８＋Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ｅｆｆＬｕｃを用いて形質導入した（胸膜腫瘍保有マウスにおけるＴ細胞蓄積をモニターするため）。ＣＤ８＋Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＢＬＩによるＴ細胞シグナル発光の追跡によって決定されるように、ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞とともに投与された場合、ｉｎ  ｖｉｖｏの蓄積を有意に増強した（７２時間のＴ細胞生物発光のシグナルにおいて、２．３倍、対１．２倍の増大；図４０Ｄ〜Ｅ）。
【０３８３】
胸膜に投与されたＭ２８ｚ  Ｔ細胞の強化された抗腫瘍有効性は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＣＡＲの両方のＴ細胞サブセットの増殖を持続するために最適のサイトカイン分泌につながり得る、ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞の早期の抗原活性化によって説明され得る。早期の抗原活性化の影響を実証するために、本発明者らは、予備活性化したＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞（２４時間前にＭＳＬＮ＋腫瘍細胞で一回予備活性化された）を利用する上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏ蓄積実験を行った。ＣＤ４＋ＣＡＲ  Ｔ細胞予備活性化は、ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞と同時に抗原曝露される実験条件と比較して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方の蓄積において増強を生じた（図４０Ｆ）。
【０３８４】
ＣＤ４＋ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ２８依存性のグランザイム／パーフォリン媒介性の細胞傷害性を実証する
【０３８５】
Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性能力を検討した。精製されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、４時間にわたって迅速な細胞傷害性を示した（図４１Ａ、左側）。ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ＋Ｔ細胞は、迅速ではない細胞傷害性能力を有し、１８時間までにＣＤ８＋Ｍ２８ｚ＋Ｔ細胞に対して等価なレベルに達した。ＣＤ２８共刺激シグナル伝達は、多重Ｅ：Ｔ比で１３〜１６％までＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞による溶解を増強したが（Ｐ＜０．００１；図４１Ｂ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性の細胞溶解は一貫して増強しなかった（Ｐ＝０．０７）。５１Ｃｒ放出アッセイの時点で添加された刺激されたＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞から得られたサイトカインリッチな上清の移動によって、ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞（５％〜２３％の増強；Ｐ＜０．０００１；図４１Ｃ）およびＣＤ８＋Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（５％〜３０％の増強；Ｐ＜０．００１）の両方の細胞傷害性が増強された。上清の移動単独、またはＰ２８ｚ対照Ｔ細胞への上清の添加は、溶解を生じなかった（図４１Ｃ）。したがって、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲは、細胞傷害性ＣＤ４＋Ｔ細胞エフェクターの形成を支持し、かつＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性をＣＤ４依存性の方式で補助すると結論された。
【０３８６】
排除されたサイトカインリッチな上清による腫瘍標的の直接溶解を考慮して、２つの細胞接触依存性溶解機構のどちらが（Ｆａｓ受容体／Ｆａｓリガンドまたはグランザイム／パーフォリン経路）ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性を担うかを決定した。Ｆａｓリガンド／Ｆａｓ受容体（ＦａｓＬ／ＦａｓＲ）相互作用の抗体遮断は、標的細胞溶解を、ＭｚまたはＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のいずれによっても低下しなかった（Ｐ＞０．０５；図７Ａ、左側および中央）。フローサイトメトリー解析によって、ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＦａｓＬ発現、およびＭＳＬＮ＋腫瘍上のＦａｓＲ発現を確認した（図７Ａ）。ＭＳＬＮ＋細胞は実際に、ＦａｓＬ媒介性の細胞傷害性を受けやすく、およびこれらの実験で用いられるαＦａｓＬ抗体は、この効果をブロックした（図４５Ａ、右側）。Ｔ細胞／腫瘍細胞共存培養に対するカルシウムキレーターＥＧＴＡの添加によるグランザイム放出の遮断は、試験された全ての群でＣＡＲ媒介性の溶解を低下し（図４１Ｄ）、これによって、ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性がパーフォリン／グランザイム経路に依存することが、実証される。溶解における最も顕著な低下は、Ｍｚ（平均低下、Ｍ２８ｚについて２７．６％対１７．６％）およびＣＤ８＋（ＣＤ８＋Ｍｚについて２９．４％、対ＣＤ４＋Ｍｚについて１５．３％；ＣＤ８＋Ｍ２８ｚについて２４．２％、対ＣＤ４＋Ｍ２８ｚについて１１．１％）Ｔ細胞群において見られた。休止期の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるグランザイムＡおよびＢの発現は、前の研究の結果に従って、主にＣＤ８＋Ｔ細胞に制限された（図４１Ｅおよび図４４Ｃ）。グランザイムＡ発現は、ＣＡＲ形質導入されたＴ細胞のＰＨＡ刺激およびＭＳＬＮ特異的刺激後に有意に変更されなかった（図４４）。グランザイムＢは、ＭＳＬＮ発現腫瘍細胞での刺激後１８時間内にＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の９５％超で発現された。ＣＤ８＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞は、４時間の共存培養後、ＭＦＩ中で１．８倍増大し、かつグランザイムＢ発現はさらに、最後の１２時間の間に２．６倍まで上方制御された。しかし、ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞では、グランザイムＢ発現は、培養の最後の１２時間の間、かなり大きい程度まで上方制御された（最初の４時間の間の１．５倍〜最後の１２時間の間の３．７倍）。これらの知見は、ＣＤ４＋ＣＡＲ  Ｔ細胞によって示された溶解の反応速度の遅延を説明し得る。さらに、Ｍ２８ｚは、グランザイムＢ発現を、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方のＴ細胞サブセット中で強化し（図４１Ｅ、共存培養の１８時間後の発現）、これによっておそらく、ＣＤ４＋Ｍｚ  Ｔ細胞と比較してＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞で見られた細胞傷害性の増強が説明される（図４１Ｂ）。
【０３８７】
局所的に投与されたＣＤ４＋ＣＡＲ  Ｔ細胞は、単独で有効であり、かつ機能的な持続性を媒介する
【０３８８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのエフェクター機能における強力なＣＤ４＋Ｍ２８ｚ、およびＣＤ４＋優勢の長期免疫の観察によって、ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞の非存在下でｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性を示すという仮説がなされた。腫瘍保有マウスは、ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ、ＣＤ８＋Ｍ２８ｚ、またはバルクのソートされていないＭ２８ｚ  Ｔ細胞（腫瘍増殖の１８日後に３つの異なる用量で胸膜腔に投与された）で処置した（図４２Ａおよび図４２Ｂ）。Ｐ２８ｚ処置したマウスでは、腫瘍負荷は、マウスを屠殺する必要がくるまで一貫して進行した（中央生存、２８日）。ＣＤ４＋Ｍ２８ｚおよびバルクＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いた処置（３×１０５；Ｅ：Ｔが１：１０００）は、マウスの１００％で腫瘍根絶を生じ、マウスは２００日の追跡を通じて腫瘍なしで維持された。ＣＤ８＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞での処置は、８３日までだけ生存を伸ばした（１１１対２８日；Ｐ＝０．００３；図４２Ｂ）、７匹のマウスのうち３匹でのみ腫瘍根絶を達成した。低用量でさえ、ＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ８＋ＣＡＲ  Ｔ細胞よりも高い有効性を有した（１×１０５：Ｅ：Ｔが１：３０００、１１２対６７日［Ｐ＝０．０４］；３×１０４：Ｅ：Ｔが１：１００００、１６０対３７日［Ｐ＝０．００１］）。これらの結果、ＣＤ４＋ＣＡＲ  Ｔ細胞単独では、ＣＤ８＋ＣＡＲ  Ｔ細胞単独よりも優れているが、それらは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を組み合わせたほど有効ではないことが例示される。
【０３８９】
最終的に、ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞なしで投与された場合、長期の機能的な持続性を確立し得るか否かに取り組むために、本発明者らは、ＣＤ４＋ソートされたまたはバルクＭ２８ｚ  Ｔ細胞の最初の胸膜内投与１９６日後、マウスで腹膜腫瘍再チャレンジを行った。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方を含有するバルク集団に比べて、持続性のＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞を有する腫瘍負荷では最初の増大があったが、次いで腫瘍は退縮し、引き続く腫瘍増殖は、４週を超えて制御された（図４２Ｃ）。
【０３９０】
５．考察
【０３９１】
ヒト疾患を忠実に模倣する同所性ＭＰＭモデル３７、８５、８６、９３を用いて、ＭＳＬＮ標的化Ｔ細胞で悪性胸膜の疾患を処置するための２つの投与経路を評価した。胸膜内に投与されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、全身に注入されたＴ細胞よりも極めて機能が優れており、長期の完全な寛解を誘発し、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の３０分の１未満であることが見出された。局所的に投与されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、迅速かつ堅調なＴ細胞増殖を呈し、有効なＴ細胞分化および全身性の腫瘍免疫を生じた。この優れた有効性は、早期のＣＤ４＋Ｔ細胞活性化に依存し、かつ高い腫瘍内ＣＤ４／ＣＤ８細胞比および長期記憶を伴っていた。対照的に、静脈内に送達されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、胸膜腫瘍中で等しい数で蓄積された場合でさえ、匹敵する活性化も、腫瘍根絶も、持続性も達成しなかった。これらの知見のトランスレーション可能な関連性は、ヒトＴ細胞およびＣＡＲの使用によってさらに大きくなる。なぜなら、これらは、本明細書に報告される結果に基づいて臨床研究で利用されるからである。
【０３９２】
この研究では、ＭＳＬＮ標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞を、樹立された胸膜腫瘍を保有するマウスに対して胸膜内に投与した（接種後１２〜１８日、対照のマウスは２５〜３６日までに死ぬ）。腫瘍およびＴ細胞非侵襲性イメージングを用いて、本発明者らは、胸膜内に投与されたＣＡＲ  Ｔ細胞が（１）胸部の腫瘍を通じて効率的に浸潤し、（２）静脈内治療で用いる用量よりも３０分の１の低い用量で胸膜腫瘍を根絶する強力なエフェクター細胞になり、かつ（３）胸膜腔の外側に遊走し、循環し、胸郭外腫瘍部位に蓄積する、ことを実証した。局所的に投与された細胞の直ぐの位置は、静脈内に投与されたＴ細胞の偏った循環および一過性の肺分画症を明らかに回避し迂回するが、胸膜内に投与されたＴ細胞は、全身に動員されたＴ細胞とは、１）ＣＤ８Ｔ細胞蓄積のレベル、および２）エフェクター分化の反応速度の迅速性（ＣＤ６２Ｌ下方制御によって反映される）という点で異なった。胸膜のＣＤ８＋Ｔ細胞蓄積の最初の欠失は、全体的なＣＤ８＋Ｔ細胞消失によって生じるのではない。なぜなら、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、静脈内投与後７日を超えてマウスの脾臓で持続したからである。それらの動員が乏しいことは部分的には、それらの輸送に必要なケモカイン受容体または接着分子の発現が最適に及ばないせいであり得る。しかし、胸膜の蓄積が、ＣＡＲ  Ｔ細胞中の形質導入されたＣＣＲ−２の強制的な発現によって増強され得るにもかかわらず５５、ＣＡＲ  Ｔ細胞による局所療法は、輸送の制限を、もし存在しても迂回し、Ｔ細胞の操作を追加することなく、静脈内に投与されるＴ細胞よりも大きい効率性で他の腫瘍位置へ高度に効率的に再分布することを可能にする。さらに、単回投与の局所のＣＡＲ  Ｔ細胞療法は、長期の腫瘍免疫（Ｔ細胞投与後最大２００日まで）を樹立し、腫瘍再チャレンジに対する有効な防御を提供する。
【０３９３】
局所のＣＡＲ  Ｔ細胞療法のこの全身的な有益性は、局所領域の放射線療法１２５、１２６の未照射部位効果および固形悪性腫瘍のための腫瘍内がん溶解性ウイルス療法１２７を連想させる（ここでは、局在的な炎症性応答が、特定の免疫を生じ、かつ遠位の腫瘍部位に効果的に影響し得る）。胸膜内に投与されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、胸膜腔の外へ遊走し、かつ投与後２４〜７２時間ほどの早期に胸膜外腫瘍部位を直接可視化する。このように早期のＴ細胞活性化は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の生体分布に有益な影響を有する。ＣＤ６２Ｌ−表現型の迅速な獲得は、転移性部位へのそれらの効率的な輸送を説明し得る１２４。本発明者らの同所性モデルにおける胸膜の中皮腫の過度のリンパ管分布８６は、増殖の際に通常は中央の壊死があるわき腹の腫瘍のものとは対照的に、このような効果的なＴ細胞活性化および再分布に寄与し得る。
【０３９４】
胸膜内に投与されたＴ細胞が循環して、末梢で持続する顕著な能力によって、アクセスできる腫瘍部位を有する転移性がんの処置の新しい手段が切り開かれ、これは、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法のための「局所の充電および分布の中心」として役立ち得る。これらには、胸膜腔に転移するがん、例えば、肺がんおよび乳がん、ならびに腹腔に転移するがん、例えば、膵臓がんおよび卵巣がんが挙げられる。胸膜内または腹膜内の投与に加えて、本発明者らの知見は、他の局所の養子Ｔ細胞療法アプローチ、例えば、肝動脈注入、局所の手足のかん流または頭蓋内投与など１２８〜１３０が優れた有効性を提供し得るという見込みを示す。さらに控えめに言っても、これらの局所のおよび／または腫瘍内の送達アプローチは、他のＭＳＬＮ発現固形がんには高度に適用可能であり、これには、卵巣がん、膵臓がん、結腸直腸がん、肺がん、三重陰性乳がん、食道がん、胃がん、胆管がんおよび胸腺がんが挙げられる３７、４７、１１９、５８、１３１〜１３５。このアプローチは、Ｔ細胞用量の必要性を最低限でも低下し得、（低収率のアフェレーシス、ｅｘ  ｖｉｖｏ増殖が劣っていること、または低い形質導入のせいで）多数のＣＡＲ  Ｔ細胞が獲得できない場合には利点を示し、体系的なアフェレーシスの必要性を取り除きさえし得る。
【０３９５】
ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットの早期の浸潤および活性化は、局所投与の観察された利点には必須である。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、多機能性であって、強力なＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞傷害性、ならびにＴ細胞のエフェクター形成、生存および増殖を支持するヘルパー機能を示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞の二重機能性は、ＣＤ４＋エフェクターが、局所投与後に胸膜の中皮腫異種移植片を独立して排除する能力によって最も明確に実証される。ヘルパー機能におけるそれらの重要な役割はさらに、静脈内投与と比較して胸膜投与後に観察された強化されたＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット、およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖性バーストを達成するための早期の抗原活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の重要性によって支持される。静脈内に投与されたＴ細胞が、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方のサブセットの強力な蓄積を達成する能力が低いことで、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、腫瘍部位でのそれらの到着の遅延によって負に影響されることが示唆される。
【０３９６】
ＣＡＲを通じて提供されるＣＤ２８共刺激の重要な役割は、いくつかの方法で明らかになる。Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞は、低いＴ細胞用量でさえ大きい胸膜腫瘍を排除した。本発明者らが用いた胸膜内Ｔ細胞用量（ほとんどの実験では３×１０５個のＭ２８ｚ  Ｔ細胞）は、他の中皮腫異種移植片研究５５、５６、１２３に用いられるよりも顕著に低用量であり、かつ血液悪性腫瘍１１、１１６および固形腫瘍１３６、１３７についての現在の臨床治験で用いられる用量に匹敵する（表２を参照のこと）。
【０３９７】
【表２】
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【０３９８】
Ｍｚ  Ｔ細胞と比較して、Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞は、胸膜内投与後１００日を超えて、腫瘍再チャレンジの際に、優れた腫瘍制御および堅調な増殖を提供した。ＣＤ２８シグナル伝達の特性の増強は特に、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対して、それらの優れたサイトカイン分泌および増殖によって実証されるように、ＣＤ４＋サブセットで特に顕著である。興味深いことに、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲは、パーフォリン／グランザイム依存性の経路によって効率的なＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性の細胞傷害性を誘発するのに必須であった。ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞と比較してエフェクター機能を媒介するために高アビディティーの相互作用を必要とすることがよく確立された１３８、１３９。したがって、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ操作は、Ｔ細胞ヘルプおよび細胞傷害性を可能にする多機能的なＣＤ４＋Ｔ細胞を生成するために特に適している場合がある１４０。
【０３９９】
低レベルのメソセリンを発現する正常組織の近傍におけるメソセリン標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞の局在化および活性化の増強は、胸膜炎および心膜炎などの「オンターゲット・オフ腫瘍（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ  ｏｆｆ−ｔｕｍｏｒ）」毒性の仮説的なリスクを増大し得る。しかし、メソセリン発現は、以前報告されたとおり、正常組織と比較して、腫瘍組織中で顕著に高い４７、９１、１１９。ＣＡＲ  Ｔ細胞活性化は、存在する抗原密度が高いほど高いので、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、正常組織に対してよりも腫瘍に対してさらに強力に応答すると期待される。これは、同質遺伝子的な標的（図４６Ａおよび図４６Ｂ）などを用いる本発明者らのｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究によって支持される５４、１４０。メソセリン標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置したマウスでの組織病理学的試験では、胸膜または心膜における炎症性変化は明らかにならなかったことにも注目すべきである。さらに、免疫毒素を用いてメソセリンを標的化する臨床試験は、１００例を超える患者で正常組織に対する毒性を示さなかった１２２、１４１、１４２。メソセリン標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置された患者で観察された報告された毒性（アナフィラキシーショック）は、マウスｓｃＦｖを含むＣＡＲに対する抗体応答に起因した１４３。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲは、ヒトの配列のみから構成される５３。それにもかかわらず、正常組織に対する反応性を制限または防止するためには、追加のストラテジーが必要であると考えられた。リンパ球毒性コルチコステロイドは、時に、ＣＡＲ  Ｔ細胞を排除し得るが１１７、本発明者らは、自殺遺伝子を利用する臨床に向かう９４。ｉＣａｓｐａｓｅ−９９４、ＥＧＦＲ変異１４４および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ１４５のような自殺遺伝子は、プロドラッグまたは抗体の投与後、急速なＴ細胞排除を媒介する。本発明者らはまた、コンビナトリアル抗原認識または阻害性受容体を利用する正常組織に対する反応性を妨げるように設計された別のストラテジーを必要に応じて追求し得る１４６〜１４８。ＣＡＲ  Ｔ細胞毒性を制限する別のストラテジーは、ＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性の費用、および有効性を得るために複数回のＴ細胞投与を必要とすることにかかわらず、ｍＲＮＡエレクトロポレーションを用いてＣＡＲを一過性に発現することである５６、１４９。
【０４００】
この試験では、ヒトがん細胞およびヒトＴ細胞を有する免疫不全のマウスを用いて、ＣＤ１９およびＰＳＭＡ標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞療法について以前に行ったように１５、１６、１１７、臨床治験への本発明者らの知見およびヒトベースのＣＡＲベクターの直接的な臨床トランスレーションを容易にした。免疫適格性のマウスモデルで検討した、養子免疫移入された細胞と、内因性の免疫系との間の相互作用によって、本発明者らの観察の重要性が拡張される。
【０４０１】
本明細書に示されるデータに基づいて、第Ｉ相臨床治験は、ＭＳＬＮ標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞の胸膜内投与の安全性を評価するように設計した。本発明者らが、さらに攻撃性の疾患を有することを示した９１、１１９、ＭＳＬＮを過剰発現する肺がんおよび乳がん由来の原発性の胸膜の悪性腫瘍または二次的な胸膜の悪性腫瘍を有する患者を、この治験に登録する。ＭＳＬＮ標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞は、悪性の胸膜の滲出がある患者を管理するのにおける標準のケアとなるように開発されたアプローチである、胸膜内カテーテルを通じて送達される１５０。サイトカイン１５１およびがん溶解性ウイルス１５２のような生物学的因子の局所投与は、以前に臨床へのトランスレーションに成功している。この試験は、ＭＰＭを有する被験体に対する局所的なＣＡＲ  Ｔ細胞投与が、低下したＴ細胞用量によって、部分的には、早期のＣＤ４＋Ｔ細胞活性化および続けて生じる全身性の利点に起因して、より大きいＴ細胞抗腫瘍力価を生じることを強力に支持する。
【０４０２】
（実施例８）
ＣＡＲ  Ｔ細胞は、腫瘍媒介性の阻害に抵抗する
１．要約
【０４０３】
臨床的に関連する、胸膜の中皮腫の同所性マウスモデルを用いて、本発明者らは、ＣＤ２８または４−１ＢＢベースの第２世代ＣＡＲを発現するＴ細胞は持続するが、腫瘍微小環境内で機能的に阻害されることを実証する。ＣＤ２８および４−１ＢＢ  ＣＡＲは、ＣＡＲ  Ｔ細胞の同様の増殖および持続性をもたらしたが；持続は、より永続的にそれらの細胞傷害性およびサイトカイン分泌機能を保持し、低いＴ細胞用量を与えられたマウスで生存の改善を生じた。
【０４０４】
２．序
【０４０５】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、腫瘍表面抗原に対してＴ細胞を再標的化する合成の受容体である１５７、１５８。第１世代受容体は、抗原認識を担う抗体由来の腫瘍結合エレメントを、Ｔ細胞活性化を誘発する、ＣＤ３ゼータまたはＦｃ受容体シグナル伝達ドメインのいずれかに対して連結する。活性化および共刺激のシグナル伝達ドメインを組み合わせる。第２世代ＣＡＲの出現は、化学療法剤難治性のＢ細胞悪性腫瘍を有する患者で有望な結果をもたらした１５９〜１６３。この臨床的成功を固形腫瘍にトランスレーションすることは、まだ達成されておらず、腫瘍への十分なＴ細胞浸潤および腫瘍免疫逃避に抵抗することを達成することを含めて、追加の障害を克服することを必要とする。腫瘍浸潤の限界および全身性のＴ細胞投与で観察された活性化の遅延を克服するために、本発明者らは、近年、胸膜の中皮腫の臨床的に関連するモデルでメソセリン特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の局所投与のメリットを実証した１６４。メソセリン（ＭＳＬＮ）は、腫瘍関連性の細胞表面抗原であり、これは、いくつかのがんの過剰発現および本発明者らの腫瘍攻撃性との関連の観察、ならびに中皮腫、肺がんおよび乳がん患者の生存の低下に基づいて選択された１６５〜１７２。ＭＳＬＮ標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞の局所投与では、原発性の腫瘍を根絶し、かつ静脈内投与よりも３０分の１濃度で長期の全身性の免疫学的監視を確立する１６４。これらの結果によって、固形悪性腫瘍の処置について促進され、かつ本発明者らは、メソセリン標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞の胸膜内投与の第Ｉ相臨床治験を開始するように促された（ＮＣＴ０２４１４２６９）。本発明者らは、低レベルの腫瘍浸潤をモデリングしたので、彼らは、ここで、ＣＡＲ  Ｔ細胞が、腫瘍細胞媒介性の免疫阻害を受けやすい場合があり、Ｔ細胞機能の障害および腫瘍拒絶の低下を生じたことを見出して、報告する。
【０４０６】
この報告では、本発明者らは、ＣＡＲ  Ｔ細胞の腫瘍媒介性の阻害の存在および反応速度を確立した。Ｔ細胞エフェクター機能の包括的な連続解析を行うことによって、本発明者らは、現在臨床治験で共刺激されたＣＡＲ  Ｔ細胞でさえ、ｉｎ  ｖｉｖｏで反復性の抗原遭遇の際に、それらの細胞溶解性およびサイトカイン分泌機能の阻害を受けることを確認した。別の共刺激ストラテジー（４−１ＢＢ対ＣＤ２８）が免疫阻害に抵抗する種々の能力が、さらに強調された。
【０４０７】
３．材料および方法
一般的目的
【０４０８】
本試験の目的は、固形悪性腫瘍のＴ細胞免疫療法の有効性を増強するために腫瘍媒介性のＴ細胞阻害の機構を特徴付けることであった。本発明者らは、ヒトＴ細胞に形質導入された場合、腫瘍抗原認識および抗原特異的エフェクター機能活性化を提供するＭＳＬＮ標的化ＣＡＲを設計した。本発明者らはまた、共刺激シグナル伝達および／または共刺激遮断を提供する、シグナル伝達ドメインを設計した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、細胞傷害性、サイトカイン分泌、およびＴ細胞増殖を分析した。ｉｎ  ｖｉｖｏの実験で、同所性ＭＰＭおよび転移性肺がんの臨床的に関連するマウスモデルの使用によって、Ｔ細胞療法を最適化するためのストラテジーを分析した。ヒトがん細胞およびヒトＴ細胞を用いて、ＣＤ１９２１４およびＰＳＭＡ２１５  ＣＡＲ  Ｔ細胞について前に実証されたとおり、本発明者らのＭ２８ｚ  ＣＡＲを臨床にトランスレーションすることを確認し、かつ容易にした。実験的な手順は、メモリアルスローン・ケタリングがんセンター（Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ：ＭＳＫＣＣ）の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。各々の実験は、異なるドナーＴ細胞を用いて何度も行った。形質導入の効率に起因する相違、ドナー関連の変動およびＥ：Ｔ比などの交絡変数（３つより多くの試料複製を有する、代表的な実験を用いる、本明細書に示されるデータ）を回避する。
【０４０９】
細胞株
【０４１０】
ＭＳＴＯ−２１１Ｈヒト胸膜の中皮腫細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、レトロウイルスによって形質導入して、ＧＦＰおよびホタルルシフェラーゼ融合タンパク質（ＭＳＴＯ  ＧＦＰ−ｆｆＬｕｃ＋）を発現した。次いで、これらの細胞を、ＳＦＧレトロウイルスベクター中にサブクローニングされたヒトＭＳＬＮ変異体１を用いて形質導入して、ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋ＧＦＰ−ｆｆＬｕｃ＋を生成した。同様に、Ａ５４９細胞および３Ｔ３マウス線維芽細胞を、ヒトＭＳＬＮ変異体１単独を用いて形質導入して、Ａ５４９  ＭＳＬＮ＋および３Ｔ３  ＭＳＬＮ＋細胞株を生成した。３Ｔ３細胞をまた、ＰＤ−Ｌ１（ＳＦＧベクター中にサブクローニングされたＯｒｉｇｅｎｅ  ｃＤＮＡ）とともに共形質導入して、３Ｔ３  ＭＳＬＮ＋ＰＤＬ１＋細胞を生成した。
【０４１１】
γ−レトロウイルスベクター構築およびウイルス産生
【０４１２】
ＭＳＬＮ特異的ＣＡＲを生成するために、本発明者らは、ＭＳＬＮに特異的な完全ヒトｓｃＦｖ  ｍ９１２をコードするｃＤＮＡを操作して（Ｄ．Ｄｉｍｉｔｒｏｖによって、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋの国立がん研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）で提供される）１８６、ヒトＣＤ８リーダードメインおよびＣＤ８／ＣＤ３ζ、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ、またはＣＤ８／４−１ＢＢ／ＣＤ３ζドメインに対して、以前に記載のとおり２１６連結した。対照のＰＳＭＡ特異的ＣＡＲを、以前に特徴付けられたＰＳＭＡ標的化ｓｃＦｖ２１５を用いて同様に生成した。ＣＡＲ配列は、ＳＦＧ  γ−レトロウイルスベクター（Ｉ．Ｒｉｖｉｅｒｅ、ＭＳＫＣＣによって提供される）中に挿入して、Ｐ２Ａ配列に連結して、ＬＮＧＦＲレポーターの共発現を誘発した（短縮された低アフィニティー神経成長因子受容体）。次いで、ＣＡＲコードプラスミドを、２９３Ｔ  Ｈ２９パッケージング細胞株中にトランスフェクトして、以前に記載のとおり２１９、レトロウイルスを生成した。
【０４１３】
Ｔ細胞単離、遺伝子導入、およびＣＤ４／ＣＤ８単離
【０４１４】
末梢血白血球を、健常なボランティアのドナーの血液から、治験審査委員会の承認したプロトコールのもとで単離した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）で低密度遠心分離によって単離して、フィトヘマグルチニン（２ｕｇ／ｍＬ；Ｒｅｍｅｌ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）で活性化した。単離２日後、ＰＢＭＣを、ＣＡＲをコードする２９３Ｔ  ＲＤ１１４産生レトロウイルス粒子を用いて形質導入して、レトロネクチン（１５μｇ／ｍＬ；ｒ−フィブロネクチン、Ｔａｋａｒａ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いてコーティングしたプレートで、３０００ｒｐｍで１時間ウイルス接種した。１日後、形質導入されたＰＢＭＣを、ＩＬ−２中で維持した（２０ＵＩ／ｍＬ；Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。形質導入効率は、フローサイトメトリー解析によって決定した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞の純粋な集団を、フローサイトメトリーベースのソートによって得た（ＢＤ  Ａｒｉａ  Ｓｏｒｔｅｒ）。
【０４１５】
フローサイトメトリー
【０４１６】
ヒトＭＳＬＮ発現は、フィコエリトリンまたはアロフィコシアニンコンジュゲートの抗ヒトＭＳＬＮラットＩｇＧ２ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を用いて検出した。腫瘍細胞上での共刺激または阻害性タンパク質の発現は、以下の抗体を用いて分析した：４−１ＢＢＬ（ＰＥ、クローン５Ｆ４；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＭＨＣ  ＨＬＡ−ＤＲ（ＰＥ、クローンＬ２０３；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＰＤ−Ｌ１（ＡＰＣ、クローンＭＩＨ１；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＰＤ−Ｌ２（ＡＰＣ、クローンＭＩＨ１８；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、およびガレクチン−９（ＡＰＣ、クローン９Ｍ１３；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。Ｔ細胞表現型および形質導入効率を、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ６９ｍ  ＬＮＧＦＲについてのモノクローナル抗体を用いて決定した。Ｔ細胞阻害性受容体の発現を、ＰＤ１（ＡＰＣ、ｅＢｉｏＪＩＵ５；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＴＩＭ−３（ＰＥ、クローン３４４８２３；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、およびＬａｇ−３（ＰＥ、クローンＣ９Ｂ７Ｗ；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて分析した。細胞染色は、ＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）およびＦｌｏｗＪｏ解析ソフトウェアを用いて解析した。
【０４１７】
Ｔ細胞機能的なアッセイ
【０４１８】
ＣＡＲまたはベクター対照で形質導入されたＴ細胞の細胞傷害性を、前に記載のとおり２２０、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイによって決定した。ルシフェラーゼ活性アッセイを行うために、ＣＡＲ＋Ｔ細胞およびＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞（ＭＳＬＮおよびホタルルシフェラーゼを発現する）を、異なるＥ：Ｔ比で１８時間インキュベートした。腫瘍細胞量を、ＩＶＩＳの１００／ｌｕｍｉｎａＩＩを用いてＢＬＩによって、１ウェルあたり１００ｕＬのＤ−ルシフェリン（１５ｍｇ／ｍＬ）の添加後、決定して、腫瘍細胞単独で放射されたシグナルと比較した。ＣＤ１０７ａおよび細胞内染色を、エフェクター細胞のインキュベーション後に行い、ＭＳＴＯ−２１１Ｈ  ＭＳＬＮ腫瘍細胞を、１８時間、２４ウェルプレート中で、５：１の比で照射した。ＣＤ１０７ａアッセイのために、５ｕＬのＣＤ１０７ａ−ＰｅＣｙ７抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）およびＧｏｌｇｉ  ＳＴＯＰ（４ｕＬ／６ｍＬ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、刺激時に添加した。細胞内染色のために、Ｇｏｌｇｉ  Ｐｌｕｇ（１ｕＬ／１ｍＬ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を刺激の時点で添加した。インキュベーション後、エフェクター細胞を、ＣＤ４、ＣＤ８、ＬＮＧＦＲ、およびＣＤ３マーカーについて染色し、次いで、固定して、製造業者（Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ  Ｋｉｔ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の指示に従って透過させた。細胞内サイトカインの染色は、グランザイムＢ−ＡＰＣ、パーフォリン−ＰＥ、およびＩＦＮ−γ−ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。
【０４１９】
サイトカイン放出アッセイは、１：１〜５：１の比で、３×１０４〜５×１０３個のＴ細胞と標的細胞とを、２００μＬの培地中で、９６ウェル丸底プレート中で、三連で、共存培養することによって行った。６〜２４時間の共存培養後、上清を採集した。サイトカインレベルは、製造業者の指示（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って、多重ビーズヒトサイトカイン検出キットを用いて決定した。
【０４２０】
Ｔ細胞の増殖能力を分析するために、１×１０６個のＣＡＲ＋Ｔ細胞を、ＭＳＬＮ発現の有無のもとで（および３Ｔ３の場合は、ＰＤ−Ｌ１の有無のもとで）、照射されたＭＳＴＯ−２１１Ｈまたは３Ｔ３細胞上で刺激した。増殖アッセイは、外因性のＩＬ−２の非存在下で行った。細胞は、７日ごとにカウントし、次いで、反復刺激のために照射された標的細胞上に積層した。時間に対するＣＡＲ＋Ｔ細胞数を、各々のＴ細胞群についてプロットした。
【０４２１】
同所性の胸膜の中皮腫動物モデルおよびｅｘ  ｖｉｖｏ実験
【０４２２】
胸膜の中皮腫の同所性マウスモデルを開発するために、４〜６週齢の雌性ＮＯＤ／ＳＣＩＤγマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）を用いた。全ての手順は、動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認のもとで行った。マウスは、吸入イソフルランおよび酸素を、鎮痛に投与されたブピバカインとともに用いて麻酔した。右胸部切開を介して２００μＬの無血清培地中で、１×１０５〜１×１０６個の腫瘍細胞の直接胸膜内注射を行って、同所性ＭＰＭ腫瘍を、以前に記載のとおり１６４、１７１、１８８樹立した。全部で、３×１０４〜１×１０５個の形質導入されたＴ細胞（２００μＬの無血清培地）を、腫瘍保有マウス中に、胸腔中に直接胸膜内注射によって、または全身に尾静脈注射によって、そのいずれかで、養子免疫移入した。腫瘍増殖は、単回の腹膜内投与のＤ−ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）の２０分後に行ったＢＬＩによってｉｎ  ｖｉｖｏでモニターして、定量した。ＢＬＩのデータを、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ２．６０）を用いて分析し；ＢＬＩシグナルは、腹側および背側の流量の平均に相当する総流量（１秒あたりの光子）として報告した。ｅｘ  ｖｉｖｏでＣＡＲ  Ｔ細胞の機能的能力を分析するために、腫瘍組織およびマウス脾臓を、以下のとおり処理した：組織を秤量して、氷冷のＲＰＭＩ  １６４０中に収集した。組織は外科用メスを用いて手技的に切り分け、次いで、４０〜１００μｍのフィルターを通して機械的にバラバラにした。次に、試料を、表現型決定のためにＦＡＣＳによって分析するか、またはＣＡＲ＋ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａソーターを用いてソートし、次いで、ＩＬ−２（６０ＵＩ／ｍＬ）を用いてＲＰＭＩ中で２４時間休息させ、そして５１Ｃｒ放出アッセイおよびサイトカイン放出アッセイを上記のとおり行った。
【０４２３】
組織学的解析および免疫染色
【０４２４】
腫瘍の組織病理学的評価は、パラフィン包埋した、４％パラホルムルデヒド固定の組織試料のＨ＆Ｅ染色後に行った。ヒトＭＳＬＮの免疫組織化学分析は、以前に記載のとおり１６８、１７０、１７２マウス抗ヒトＭＳＬＮ免疫グロブリンＧを用いて行った。
【０４２５】
定量的なリアルタイムＰＣＲ
【０４２６】
ＣＤ４＋ＬＮＧＦＲ＋またはＣＤ８＋ＬＮＧＦＲ＋ソートされたＴ細胞由来のｍＲＮＡを、抽出して、μＭＡＣＳ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ｃＤＮＡキット（ＭＡＣＳ分子、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＵＳＡ）を用いてｃＤＮＡ中に逆転写した。定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）７５００システム（Ｆｏｓｔｅｒ、ＣＡ、ＵＳＡ）、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒｍｉｘおよびＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブ（６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ−ＭＢＧ）で標識し、かつｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって設計した）：Ｔｂｅｔ（Ｈｓ００２０３４３６＿ｍ１）；Ｅｏｍｅｓ（Ｈｓ００１７２８７２＿ｍ１）；Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ（Ｈｓ０１５５４３５５＿ｍ１）；ＩＦＮγ（Ｈｓ００９８９２９１＿ｍ１）；ＩＬ−２（Ｈｓ００１７４１１４＿ｍ１）；ＰＤ−１（Ｈｓ０１５５００８８＿ｍ１）を用いて、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）法で行った。目的の遺伝子の比較閾値サイクル（ＣＴ）を用いて、以下の式を用いてβ２ｍハウスキーピング遺伝子に対して正規化したΔＣｔ（試料）＝Ｃｔ（目的の遺伝子）−Ｃｔ（β２ｍ）。次いで、２−ΔΔＣｔ法を用いて、対照条件と比較して相対的な発現の倍数変化を分析し、以下のとおり算出した：２−ΔΔＣｔ＝２＾−（ΔＣｔ（試料）−ΔＣｔ（対照））。
【０４２７】
統計学的方法
【０４２８】
データは、Ｐｒｉｓｍ（バージョン６．０；ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）ソフトウェアを用いて分析し、図の凡例に示されるとおり、平均±ＳＥＭとして示す。結果は、対応のないスチューデントｔ検定（両側）を用いて分析し、適用可能な場合、多重比較のためにボンフェローニ補正を用いた。生存曲線は、ログランク検定を用いて分析した。統計学的有意差は、Ｐ＜０．０５として定義した。全ての統計学的解析は、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて行った。
【０４２９】
４．結果
ＣＤ２８または４−１ＢＢ共刺激のＣＡＲは、最初の抗原刺激の際にｉｎ  ｖｉｔｒｏで等価なエフェクターサイトカイン分泌および増殖を示す
【０４３０】
ヒトＭＳＬＮ特異的ｓｃＦｖ１８６およびＣＤ３ξ、ＣＤ２８／ＣＤ３ξまたは４−１ＢＢ／ＣＤ３ξシグナル伝達ドメイン（Ｍｚ、Ｍ２８ｚ、ＭＢＢｚ）のいずれかを組み込む３つのＣＡＲを構築した（図４７Ａおよび図４７Ｂ）。前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異的であるＰ２８ｚ  ＣＡＲは、陰性エフェクターとして機能して、同種反応性および異種反応性について制御した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ヒト末梢血Ｔリンパ球の両方を、ＳＦＧ−レトロウイルスベクターを用いて効率的に形質導入した（５０％〜７０％の形質導入）（図５４）。ＭＳＬＮ形質導入のＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞（ＭＳＬＮ＋）およびＰＳＭＡ形質導入のＥＬ−４マウスリンパ腫細胞（ＭＳＬＮ−）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験では、ＭＳＬＮ陽性および陰性の標的として機能した。Ｍｚ−、Ｍ２８ｚ−、およびＭＢＢｚ形質導入のＴ細胞は、同様のＭＳＬＮ特異的溶解をｉｎ  ｖｉｔｒｏで示した（図４７Ｃ）。Ｐ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋細胞を溶解せず、かつＭＳＬＮ標的化ＣＡＲは、ＥＬ４  ＰＳＭＡ＋細胞を溶解せず、これによって、溶解は抗原特異的であることが実証される。共刺激シグナル伝達の機能性を確証することは１８７、Ｍ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、２〜１５倍の高いレベルのＴｈ１サイトカインを分泌し（図４７Ｄ）かつ、外因性のＩＬ−２の非存在下でＭｚに比較した場合、ＭＳＬＮ＋細胞に対する反復曝露の際に１４倍大きいＴ細胞蓄積を達成した（図４７Ｅ）。抗原特異性を樹立しかつ共刺激シグナル伝達ドメインの機能性を確証することで、本発明者らは、樹立された胸膜腫瘍を保有するマウスにおけるＭＳＬＮ標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞の治療的能力の評価を進めた。
【０４３１】
Ｍ２８ｚは、ＭＢＢｚよりも腫瘍再発を可能にすることがさらに容易である
【０４３２】
以前に本発明者らの実験で確立された悪性胸膜の中皮腫（ＭＰＭ）の同所性モデルでは１７１、１８８〜１９０、ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）形質導入のＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞による連続的生物発光イメージング（ＢＬＩ）を用いて、腫瘍の樹立を確認し、Ｔ細胞治療の開始前に介入群にまたがって腫瘍負荷を平等にし、かつ治療に対する応答を測定した。単回投与の１×１０５で胸膜内投与されたＭ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲの両方のＴ細胞（腫瘍負荷の定量で推定して、１：３０００というエフェクター対標的［Ｅ：Ｔ］比）１８９は、ほとんどのマウスで樹立された胸膜腫瘍を根絶できた（図４８Ａ、頂部）。この研究の目的は、Ｔ細胞消耗に対する腫瘍誘発性の免疫阻害の影響を検討することであったので、ＣＡＲ  Ｔ細胞を、首尾よい低用量で樹立された胸膜腫瘍を保有するマウスに投与した。これらのより低い用量では、Ｔ細胞は特に、それらが、腫瘍を排除するために、阻害性環境内で反復性の抗原遭遇の際に、機能を保持しなければならないので、消耗を受けやすいと仮説した。これらの低用量では、本発明者らは、特にＭ２８ｚコホート内では、腫瘍再発を見始めた（図４８Ａ、中央および底部）。４×１０４という試験した最低用量では（Ｅ：Ｔが１：７，５００）、胸膜内Ｍｚで処置されたマウス（第１世代ＣＡＲ、共刺激シグナル伝達は含まれなかった）ＣＡＲ  Ｔ細胞は、腫瘍負荷に関して持続不能な応答を示した（図４８Ｂ）、および中央生存は、Ｐ２８ｚ処置の対照においてよりも２９日長かった（中央生存、４５対１６日、Ｐ２８ｚは、ＰＳＭＡ抗原を標的化する異種反応性および同種反応性対照標的化に相当する）（図４８Ｂ）。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置したマウスは、腫瘍負荷がより均一に低下し、かつ第１世代のＣＡＲ  Ｔ細胞で処置されたマウスよりも長く生存した（中央生存、６４日）；しかし、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した全てのマウスは、腫瘍の進行で偶発的に死んだ。腫瘍の副産物は、腫瘍抗原逃避によって生じなかったことが確認された（全ての試験されたマウスにおける再発性の腫瘍は、フローサイトメトリーおよび組織学的解析によってＭＳＬＮ＋であることが見出された；データ示さず）。対照的に、胸膜内に投与されたＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、処置の２０日内に腫瘍根絶を誘発し、マウスのほとんど（８匹のうち７匹）が、１００日を超えて腫瘍なしで保持された（中央生存は、１００日には達しなかった）。
【０４３３】
ＭＢＢｚは、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を低いＴ細胞用量で上回る
【０４３４】
共刺激シグナル伝達によって得られるＣＡＲ  Ｔ細胞有効性の改善は、ＣＡＲ  Ｔ細胞増殖および／または持続性における改善に通常は起因する１５８。期待どおり、Ｍ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｍｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、強化された腫瘍内のＴ細胞蓄積を達成した（Ｍ２８ｚについて９倍大きく、ＭＢＢｚについて１２倍大きい）（図４９Ａ）。驚くべきことに、Ｍ２８ｚとＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞との間の有効性における相違にかかわらず、同様の数の腫瘍浸潤性Ｔ細胞が、２つの群の間で観察された（図４９Ａ）。さらに、Ｍ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、長期の時点で等しく持続していた（図４９Ｂ）。最初に処置応答を有したが、次に進行性の腫瘍で死んだＭ２８ｚ処置のマウス由来の腫瘍組織および脾臓は、循環性のＴ細胞および腫瘍浸潤性Ｔ細胞を含有し、これには、ＣＡＲ陽性の細胞を含む（図４９Ｃ）。この知見によって、腫瘍に対して効率的に移動できるＴ細胞のまれな永続性が、腫瘍を排除するのに十分ではないこと、ならびに腫瘍微小環境内のＴ細胞の機能的状況が、臨床転帰のさらに重要な決定因子であり得ることが示される。したがって、共刺激されたＴ細胞でさえ、特に、低いエフェクター：標的比に相当する低いＴ細胞用量では、腫瘍内で消耗し得るという仮説がなされた。さらに、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞程度に持続性のＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、さらに消耗に耐えて、Ｔ細胞エフェクター機能を保持して、大きい腫瘍負荷を排除することが可能であり得る。
【０４３５】
メソセリンＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗原曝露後に消耗する
【０４３６】
ＣＡＲ  Ｔ細胞の進行性の免疫阻害が存在するか否かを評価するために、ならびにＭ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が腫瘍媒介性の免疫阻害を克服する相対的な能力を比較するために、１×１０６個のＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腫瘍保有マウスの胸膜腔に注射して、反復性の抗原遭遇およびＴ細胞活性化に十分な時間を可能にし（活性化マーカーＣＤ６９の前方および側方散乱および上方制御によって確認した）、次いで、収集されたＣＤ４もしくはＣＤ８  ＣＡＲ腫瘍浸潤性のｅｘ  ｖｉｖｏ刺激、またはＭＳＬＮ＋標的を有する脾臓Ｔ細胞（図５０Ａに示される概略図）を行った。未注射のｉｎ  ｖｉｔｒｏの休止期のＴ細胞（「前注入細胞」）を用いて、機能のベースラインレベル（抗原曝露前）を確立した。休止期のＭ２８ｚ  ＣＤ８＋ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、ｉｎ  ｖｉｖｏでＭＳＬＮ抗原に曝露したＴ細胞は、低レベルの細胞溶解性機能を有した（図５０Ａ）（注入前細胞溶解、２０．５％；腫瘍浸潤性Ｔ細胞溶解、１３．１％；脾臓Ｔ細胞溶解、８．７％）。対照的に、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、細胞溶解性機能を保持した（注入前細胞溶解、１８．３％；腫瘍浸潤性Ｔ細胞溶解、３７．２％；脾臓Ｔ細胞溶解、２２．２％）。ソートされたＣＤ４＋ＣＡＲ  Ｔ細胞は、同様のパターンの結果を実証した。腫瘍浸潤性および脾臓のＣＡＲ  Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ刺激の際のサイトカインレベルも測定して、ＭＳＬＮ＋抗原に対してｉｎ  ｖｉｖｏで曝露されたＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のＴｈ１サイトカイン分泌における低下も観察した。ＣＤ４＋ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞はまた、Ｔｈ１サイトカイン分泌の低下を示すが、これらの細胞は、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較した場合、サイトカイン分泌を良好に保持できた（図５０Ｂ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞上清は、ＣＤ４＋Ｔ細胞上清（本発明者らのモデルで以前に観察された知見１６４）と比較して、含有するサイトカインのレベルが有意に低かった。ＣＤ８＋Ｔ細胞はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗原曝露の際にサイトカインを分泌する能力が低下していた；ＣＤ８＋ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は優先的に、それらがＩＦＮ−γを分泌する能力を保持していた。次に、投与３日後に腫瘍および脾臓から収集されたＴ細胞のｍＲＮＡレベルを評価し、ＧｚＢ、ＩＬ−２、およびＩＦＮ−γのｉｎ  ｖｉｖｏの発現レベルが、ＣＤ８＋サブセットにおけるＩＬ−２発現を除いて、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞についてよりもＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞について最も大きかったことを見出した（図５０Ｃ）。
【０４３７】
ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて消耗の遅延を示す
【０４３８】
ｉｎ  ｖｉｖｏで抗原に曝露された共刺激されたＣＡＲ  Ｔ細胞での細胞溶解性機能およびエフェクターサイトカイン分泌の両方の阻害が実証され、本発明者らは、反復性の抗原刺激が、慢性感染のモデルに対して同様に、Ｔ細胞阻害においてある役割を果たすということ、および反復性の抗原遭遇の際に機能を保持する異なる能力が、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性の増強を説明し得るということを判断した。したがって、Ｍｚ、Ｍ２８ｚ、およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、それらがｉｎ  ｖｉｔｒｏのモデルシステムにおいて反復性の抗原遭遇に抵抗する能力について試験し、ここでは、細胞を、７日ごとにＭＳＬＮ＋抗原刺激の際の増殖、細胞溶解性機能、およびサイトカイン分泌について評価した。Ｍ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、連続的ＭＳＬＮ＋刺激の際に増殖する同様の能力を有し、Ｍｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖よりも１４倍大きいレベルまで増殖する；それらの細胞は、第３刺激後に増殖する能力を失った（図５１）。ＭＢＢｚおよびＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の両方とも、反復性の抗原刺激の際の細胞溶解性機能を失ったが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、溶解性機能をよく保持できていた。溶解は、第３刺激によって、第１刺激で、３つのＴ細胞群の間で等しかったが、Ｍ２８ｚ溶解性機能は、さらに顕著なレベルまで阻害され、その結果、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、多数のＥ：Ｔ比で強化された腫瘍溶解を有した（図５１Ｂ、右側）。溶解性機能（ＣＤ１０７ａ発現を測定する脱顆粒アッセイで評価した場合）は、第３刺激で、クロム放出アッセイの結果と相関した（図５１Ｃ）。次に、Ｔｈ１サイトカイン分泌を測定し、ここでも、Ｍ２８ｚとＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞との間の、第１刺激での同様のレベル、および各々の刺激での連続的な低下が注目された。細胞傷害性と同様、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、サイトカイン分泌を優先的に保持し；サイトカイン濃度は、第１および第２刺激でレベルを比較した場合、Ｍ２８ｚについて３０倍を超えて低下し、かつＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞についてはわずかに約２倍の低下であった（図５１Ｄ）。次いで、第２刺激でサイトカインの細胞内レベルを測定することによって、サイトカイン産生の相違を確認した（データ示さず）。抗原刺激の時点でのＣＡＲ  Ｔ細胞の逆転写酵素ＰＣＲ解析によって、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、低レベルの消耗および阻害と相関するマーカーを発現したことが明らかになった：ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、高レベルのＴｂｅｔおよびＥｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ、ならびに低レベルのＰＤ１およびＦｏｘＰ３を発現した（図５５）。次いで、本発明者らは、腫瘍抗原に既に曝露されている持続性のＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏの機能を試験することを追求し、定量的な持続性は、Ｍ２８ｚとＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞との間で等しいが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、腫瘍再チャレンジの際に機能の増強を示したと仮説した。ＭＳＬＮ＋胸膜腫瘍を樹立されたマウスに、胸膜内のＭ２８ｚまたはＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を（１×１０５個の用量で、Ｅ：Ｔ比が１：３０００で）投与して、胸膜腫瘍を根絶した（図５１Ｅ）。最初のＴ細胞注射の２０日後、腫瘍再チャレンジを、ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞（１×１０６）を、生残している胸膜腔に注射することによって行った；腫瘍負荷は、ＢＬＩを用いてモニターした。持続性のＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、腫瘍負荷をより良好に制御できた（４匹のＭＢＢｚ処置マウスのうち４匹とも、４匹のＭ２８ｚ処置マウスでの２匹に対して、ベースラインレベルのＢＬＩシグナルを有した）（図５１Ｅ）。
【０４３９】
腫瘍細胞ＰＤ−Ｌ１は、メソセリンＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクター機能を阻害する
【０４４０】
ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍環境によって阻害されたこと、およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、この阻害をよりよく克服できたこと（少なくとも一部は、反復性の抗原遭遇の際にその機能を保持する能力のおかげである）を確認して、本発明者らは、次に、阻害性受容体およびリガンド経路がこのモデルで果たす役割を評価しようと試みた。本発明者らは、阻害の周知の経路の発現について、腫瘍進行を有するＭ２８ｚ処置のマウスにおいて、腫瘍浸潤性のＴ細胞を染色することによって開始した。本発明者らは、ＰＤ−１、Ｔｉｍ−３、およびＬＡＧ−３の高レベルの発現を見出した（図５２Ａ）。投与６日後に収集した腫瘍浸潤性ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、阻害性受容体の上方制御を同様に実証したが、それらは、タンパク質レベルでも、ｍＲＮＡレベルでも両方とも、有意に低いレベルのＰＤ−１受容体を発現した（図５２Ｂ〜図５２Ｄ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して、高レベルのＰＤ−１を発現した。Ｍ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲの両方のＴ細胞の有意な画分が、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３またはＰＤ−１およびＴｉｍ−３を共発現することが観察され、これによって、複数の阻害性経路が、同時に機能し得ることが示唆される（図５６）。次に、腫瘍発現のリガンド：ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２（ＰＤ−１のリガンド）、ガレクチン−９（Ｔｉｍ−３のリガンド）、およびＭＨＣクラスＩＩ（ＬＡＧ−３のリガンド）を評価した。ＰＤ−１リガンドのみが、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の胸膜内投与後に収集した胸膜腫瘍で発現された（図５２Ｅ）。他のいずれかに報告されるとおり１７３、１７４、腫瘍細胞とＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α（図４７および図５１でＴ細胞によって分泌されるのと同様の濃度で）との共存培養は、腫瘍細胞に対してＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２発現の同様のレベルの上方制御を生じ（図５２Ｆ）、これは、免疫の攻撃に抵抗する腫瘍細胞の適応を反映している（「適応的免疫抵抗（ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）」）。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＰＤ−１受容体およびリガンドの両方の発現の固有の存在によって、この経路は、有意な阻害性の役割を果たし得ることが示唆される。いくつかの研究では、共刺激は、ＰＤ−１による阻害を克服するのに十分であり得ることが示唆されているので１９１〜１９３、本発明者らは次に、過剰発現されたＰＤ−Ｌ１が、ＰＤ−Ｌ１媒介性の免疫阻害のｉｎ
ｖｉｔｒｏモデルにおいて、ＣＡＲ  Ｔ細胞機能を阻害し得るか否かを評価した（ＭＳＬＮ単独［ＭＳＬＮ＋］またはＭＳＬＮおよびＰＤ−Ｌ１［ＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋］の両方のいずれかで形質導入された３Ｔ３マウス線維芽細胞を用いて）（図５３Ａ）。Ｍ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の両方において、ＰＤ−Ｌ１過剰発現は、蓄積の低下を、連続刺激（図５３Ｂ）およびＴｈ１エフェクターサイトカイン分泌（図５３Ｄ）の際に生じた。腫瘍細胞溶解は、最初の刺激の際に阻害されなかったが（データ示さず）、ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞に対する２回の刺激後に標的として３Ｔ３で行ったクロム放出アッセイでは、Ｍ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲの両方のＴ細胞における溶解性機能の低下が、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞ではより高い程度の低下が示される（図５３Ｃ）。この結果は、ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞に対する曝露後のＭ２８ｚおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞に対するＰＤ−１の種々の上方制御に起因し得る。
【０４４１】
５．考察
【０４４２】
本明細書に示される研究では、第２世代ＣＡＲを発現するＴ細胞でさえ、腫瘍微小環境内でｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗原曝露の際に阻害されことが実証される。そのいくつかの他の試験では、共刺激単独で、腫瘍発現された阻害性シグナル伝達を克服し得ると報告しており、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの研究でのそれらの確実性、免疫鋭敏なｉｎ  ｖｉｖｏモデルのそれらの使用、および患者で見られる樹立された固形腫瘍の負荷を反映しない高いＴ細胞用量のそれらの投与によって説明され得る１９１〜１９３。実験では、Ｔ細胞用量が高ければ、ＣＤ２８または４−１ＢＢ共刺激ドメインにかかわらず、腫瘍根絶を生じる。Ｔ細胞用量が低ければ（結果として、エフェクター：標的比が低ければ）、消耗の影響が明らかになる。これらの知見によって、臨床的に関連するｉｎ  ｖｉｖｏモデルおよび患者の治験で用いられる用量と同様のＴ細胞用量を用いることの重要性が例示される。用いた胸膜内Ｔ細胞用量（ヒトにおける１．２×１０５〜３×１０６／Ｋｇに対して等価なマウス１匹あたり４×１０４〜１×１０５個）は、他の中皮腫異種移植片研究で用いられるよりも顕著に低用量であり１９４、１９５、かつ血液悪性腫瘍１５９、１６２および固形腫瘍１９６、１９７についての現在の臨床治験で用いられる用量に匹敵する。したがって、本明細書に提示される実験的なストラテジーは、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法における消耗の役割を特徴付けるために特に適切である。
【０４４３】
この報告では、４−１ＢＢおよびＣＤ２８共刺激シグナル伝達の両方とも、Ｔ細胞持続性を、同様の程度まで強化したが（より低いＥ：Ｔ比で、４−１ＢＢでの処置のみ）共刺激したＴ細胞は腫瘍を根絶した。４−１ＢＢ共刺激されたＴ細胞は、腫瘍媒介性の阻害に対してやはり鋭敏であるが、ｉｎ  ｖｉｖｏの抗原曝露後、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける反復性の抗原刺激の際の両方で、Ｔ細胞の細胞溶解性機能およびサイトカイン分泌における低下に対して比較的耐性であった。免疫阻害に対する４−１ＢＢシグナル伝達の抵抗性は、より強力な表現型（ＰＤ−１ｌｏＴｂｅｔｈｉ、Ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎｈｉ）１９８〜２０２と関連しており、これは、他の腫瘍モデルおよび慢性ウイルス感染の類似のモデルにおいて、消耗の少なさおよびより堅調な細胞傷害性エフェクター応答と関連していた。これによって、利用可能な選択肢（すなわち、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ２７など）の中で特定の共刺激シグナル伝達ストラテジーを選択するための基準は、「機能的な持続性」へ向けてＴ細胞持続性を超えて拡張しなければならないことが示唆され、これは、腫瘍微小環境内で最初に、または原発性腫瘍負荷の制御後に抗原再チャレンジの際に生じ得るような反復性の抗原刺激の際にＴ細胞が機能する能力として定義される。局所のＣＡＲ  Ｔ細胞療法を支持する本発明者らの既に公開した研究と同様に１６４、高い機能的な持続性を伴うＴ細胞の投与によって、低いＴ細胞用量の単回の投与が可能になり、これは、原発性腫瘍を根絶しながらもサイトカイン放出症候群を制限するように機能し得る。これらの実験から、４−１ＢＢが事実上、患者の治療に用いられるべき共刺激因子であるということを結論すべきではないことに注目することが重要である。優れたシグナル伝達経路は、腫瘍による共刺激および共阻害リガンド発現の固有のパターン、抗原発現レベルまたは密度、腫瘍抗原についてのｓｃＦｖのアフィニティー、膜からの腫瘍エピトープの距離、および構築設計（例えば、スペーサーおよび膜貫通ドメイン）におけるバリエーションに依存する１５８、２０３〜２０７。これらの変数（およびシグナル伝達における定性的ではない相違）は最終的に、前臨床治験で見られる変動性を説明し得、これによって、代わって、４−１ＢＢまたはＣＤ２８が、文脈次第で、優れていると結論される。実際は、この報告で用いられる４−１ＢＢおよびＣＤ２８構築物は、それらの膜貫通ドメインにおいて十分に異なり、その結論によって、最適の共刺激ドメインを、行うべきでないとこの試験から決定された。
【０４４４】
（実施例９）
可変ＭＳＬＮ発現を有する細胞に対するＭ２８ｚ  ＣＡＴ  Ｔ細胞の有効性
【０４４５】
がん細胞（例えば、Ａ５４９、Ｈ１２９９およびＥＫＶＸ肺がん細胞、ＭＳＴＯ中皮腫細胞およびＨｅｌａ細胞）および正常細胞（例えば、ＭＲＣ５細胞）上のＭＳＬＮ発現を、ＦＡＣＳによって評価した。その結果を、図５７に示す。１細胞あたりのＭＳＬＮ分子の数を、ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズＦＡＣＳ分析によって定量した。結果を図５８に示す。図５７および図５８に示されるとおり、ＭＳＬＮ形質導入のＡ５４９ＭｍｃおよびＨ１２９９Ｍｍｃ細胞は、最高のＭＳＬＮ発現を有し、それに続くのが、ＭＳＬＮ形質導入のＥＫＶＸＭおよびＭＳＴＯＧＭ（または「ＭＧＭ」）細胞であった。次に、ＭＳＬＮ
ｍＲＮＡ発現分析を、これらの肺および中皮腫の細胞で行った。このｍＲＮＡを、培養した腫瘍細胞から抽出し、ｃＤＮＡ中に合成した。Ｔａｑｍａｎアッセイを、ＭＳＬＮについて行って、Ｂ２−ミクログロブリンを、内部対照として用いた。その結果は、図５９に示されるように、ＭＲＣ−５細胞内のＭＳＬＮ  ｍＲＮＡ発現に対する倍数変化で示す。図５７および５８に示されるＭＳＬＮ発現レベルと一致して、ＭＳＬＮ形質導入のＡ５４９ＭｍｃおよびＨ１２９９Ｍｍｃ細胞は、最高のＭＳＬＮ  ｍＲＮＡレベルを有し、それに続くのが、ＭＳＬＮ形質導入のＥＫＶＸＭおよびＭＧＭ細胞であった。
【０４４６】
Ｍ２８ｚ  ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞の細胞傷害性は、以前に記載のとおり２２０、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイで決定した。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ形質導入のＴ細胞および可変性のＭＳＬＮ発現レベルを有する細胞を、異なるＥ：Ｔ比で１８時間インキュベートした。Ｐ２８ｚ標的化ＰＳＭＡ抗原を、陰性対照として用いた。その結果を、図６０に示す。図６０に示されるとおり、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性は、ＭＬＳＮ抗原依存性であって、かつＭＳＬＮ発現レベルに比例していた。例えば、最高のＭＳＬＮ発現レベルを有したＡ５４９Ｍｍｃ細胞に対するＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性は、試験した全ての細胞の間で最高であった。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性は、この細胞傷害性が、いくつかの他の要因、例えば、細胞内ＭＳＬＮの量、がん細胞上の共刺激または共阻害リガンドの発現、細胞の大きさ、培養中のがん細胞／Ｔ細胞インキュベーションの期間（これが次に、共刺激リガンド発現に影響する）およびプレートされたがん細胞のコンフルエンシーによって影響され得るので、細胞表面上のＭＳＬＮ抗原強度に対して正確に比例するのではなかったことも注目された。
【０４４７】
（実施例１０）
Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖能
【０４４８】
外因性のＩＬ−２の存在下、およびＩＬ−２の非存在下における反復性の抗原刺激後のＣＡＲ  Ｔ細胞蓄積を決定した。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＩＬ−２の存在下で、種々のレベルのＭＳＬＮ（ＭＲＣ５、ＥＫＶＸ、Ａ５４９Ｇ、およびＡ５４９ＧＭ）を発現する種々の細胞株を用いて複数回刺激した。１０：１の比を用いて、Ｔ細胞を、刺激７日後にカウントした。結果を、図６１および６２に示す。図６１Ａおよび６１Ｂに示すとおり、ＣＡＲ  Ｔ細胞蓄積は、腫瘍細胞上のＭＳＬＮのレベルと比例した。
【０４４９】
（実施例１１）
肺がんモデルにおけるＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性
【０４５０】
同所性肺がんモデルにおいて低または高のＭＳＬＮ抗原発現を発現する肺がん細胞に対するＭ２８ｚ  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の有効性を評価するために、免疫不全のＮＳＧマウスを、ＧＦＰ−ホタルルシフェラーゼ、および低または高のＭＳＬＮ発現（それぞれ、Ａ５４９ＧまたはＡ５４９ＧＭ）のいずれかを発現する１ｅ６  Ａ５４９細胞を静脈内に注射した。腫瘍確立の２２日後、単回投与の５ｅ４または５ｅ５  Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いてマウスを静脈内で処置した（図６３Ａ）。抗腫瘍有効性を、腫瘍生物発光イメージング（ＢＬＩ）（図６３Ｂ）およびカプラン・メイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）生存解析（図６３Ｃ）により、腫瘍負荷の連続的アセスメントによってモニターした。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、両方の用量で高ＭＳＬＮ発現性がん細胞（Ａ５４９ＧＭ）に対して有効であった。Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞は、腫瘍負荷進行を遅らせることにおいて、および低ＭＳＬＮ発現性Ａ５４９Ｇ細胞に対して生存を延長するのにおいて、試験した２つの用量のうち高い方の用量でのみ、有効であった。用いた両方の用量とも、公開された従来のＣＡＲ  Ｔ細胞実験と比較してかなり低い用量である。結論として、Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞は、低ＭＳＬＮ発現性細胞（Ａ５４９Ｇ）を有するマウスで腫瘍負荷を制御するのに有効であり、かつ高い抗原発現性細胞（Ａ５４９ＧＭ）を有するマウスで腫瘍を根絶する。
【０４５１】
免疫不全のＮＳＧマウスに、１ｅ６  Ａ５４９ＥまたはＡ５４９  Ｍ細胞（それぞれ、低および高ＭＳＬＮ発現、ＧＦＰ−ルシフェラーゼなし）を静脈内に注射して、肺がんを樹立した（図６４Ａ）。腫瘍樹立の２２日後、マウスを、強化されたホタルルシフェラーゼ（Ｅｆｆｌｕｃ）を用いて共形質導入した２ｅ６  Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の単回投与を用いて静脈内に処置して、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴ細胞蓄積をモニターした。Ｔ細胞のＢＬＩは、Ｔ細胞注射の１、３、５、７および１２日後に行った（図６４Ａ）。図６４Ｂ〜６４Ｄに示されるとおり、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、高ＭＳＬＮ発現を有するマウスで迅速な方式で蓄積して（Ａ５４９Ｍ）、５日（腫瘍が排除される時点）までにそれらのピークに達し、次いで、減少した蓄積を示した。ＣＡＲ  Ｔ細胞蓄積は、低ＭＳＬＮ発現性腫瘍を有するマウス（Ａ５４９Ｅ）で相対的に低いペースで進行し、７日目にそれらのピークに達した。したがって、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞蓄積は、肺がん腫瘍における抗原発現レベルに依存した。
【０４５２】
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【０４５３】
前述の説明から、変更および改変を、本明細書に記載の本発明に対して行って、それを種々の用途および条件に対して適合させてもよいことが明らかである。このような実施形態はまた、添付の特許請求の範囲内である。
【０４５４】
本明細書に言及される、受託番号または参照番号で挙げた、全ての特許および刊行物および配列は、あたかも各々の独立した特許および刊行物および配列が、参照によって援用されるように具体的にかつ個々に示されるのと同じ程度まで参照によって本明細書に援用される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外抗原結合性ドメインが、ヒトメソセリンと約１ｎＭ〜約２５ｎＭの結合アフィニティー（Ｋｄ）で特異的に結合する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
（項目２）
前記細胞外抗原結合性ドメインが、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目３）
前記細胞外抗原結合性ドメインが、ヒトｓｃＦｖを含む、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目４）
前記細胞外抗原結合性ドメインが、Ｆａｂを含み、これは必要に応じて架橋されている、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目５）
前記細胞外抗原結合性ドメインが、Ｆ（ａｂ）２を含む、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目６）
前記ｓｃＦＶ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２のうちの１つまたは複数が、前記細胞外抗原結合性ドメインを形成するように異種配列を有する融合タンパク質中に含まれる、項目２から５のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目７）
前記ＣＡＲの前記細胞外抗原結合性ドメインが、約１，０００またはそれ超のメソセリン結合部位／細胞のメソセリン発現レベルのヒトメソセリンを認識する、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目８）
前記細胞外抗原結合性ドメインが、配列番号１のアミノ酸１〜１１９を含む重鎖可変領域を含む、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目９）
前記細胞外抗原結合性ドメインが、配列番号５のアミノ酸１〜１０７を含む軽鎖可変領域を含む、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目１０）
前記細胞外抗原結合性ドメインが、配列番号３のアミノ酸１〜１０７を含む軽鎖可変領域を含む、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目１１）
前記細胞外抗原結合性ドメインが、配列番号１のアミノ酸１〜１１９を含む重鎖可変領域および配列番号５のアミノ酸１〜１０７を含む軽鎖可変領域を含む、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目１２）
前記細胞外抗原結合性ドメインが、配列番号１のアミノ酸１〜１１９を含む重鎖可変領域および配列番号３のアミノ酸１〜１０７を含む軽鎖可変領域を含む、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目１３）
前記細胞外抗原結合性ドメインが、配列番号１１に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１２に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号１３に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目１４）
前記細胞外抗原結合性ドメインが、配列番号１４に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１５に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号１６に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目１５）
前記細胞外抗原結合性ドメインが、配列番号１１に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１２に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１３に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号１４に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１５に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号１６に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目１６）
前記細胞外抗原結合性ドメインが、前記細胞外抗原結合性ドメインの重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間にリンカーを含む、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目１７）
前記細胞外抗原結合性ドメインが、前記細胞外抗原結合性ドメインの５’末端と共有結合によって連結しているリーダーを含む、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目１８）
前記リーダーが、ＣＤ８ポリペプチドを含む、項目１７に記載のＣＡＲ。
（項目１９）
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８ポリペプチド、ＣＤ２８ポリペプチド、ＣＤ３ζポリペプチド、ＣＤ４ポリペプチド、４−１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、ＣＴＬＡ−４ポリペプチド、ＰＤ−１ポリペプチド、ＬＡＧ−３ポリペプチド、２Ｂ４ポリペプチド、ＢＴＬＡポリペプチド、合成ペプチド（免疫応答と関連しているタンパク質をベースとしない）またはそれらの組合せを含む、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目２０）
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８ポリペプチドを含む、項目１９に記載のＣＡＲ。
（項目２１）
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８ポリペプチドを含む、項目１９に記載のＣＡＲ。
（項目２２）
前記細胞内ドメインが、ＣＤ３ζポリペプチドを含む、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目２３）
前記細胞内ドメインが、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域をさらに含む、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目２４）
前記少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域が、ＣＤ２８ポリペプチド、４−１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、ＰＤ−１ポリペプチド、ＣＴＬＡ−４ポリペプチド、ＬＡＧ−３ポリペプチド、２Ｂ４ポリペプチド、ＢＴＬＡポリペプチド、合成ペプチド（免疫応答と関連しているタンパク質をベースとしない）またはそれらの組合せを含む、項目２３に記載のＣＡＲ。
（項目２５）
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８ポリペプチドを含み、前記細胞内ドメインが、ＣＤ３ζポリペプチドを含む、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目２６）
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８ポリペプチドを含み、前記細胞内ドメインが、ＣＤ３ζポリペプチドと、ＣＤ２８ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達ドメインとを含む、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目２７）
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８ポリペプチドを含み、前記細胞内ドメインが、ＣＤ３ζポリペプチドと、４−１ＢＢポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達ドメインとを含む、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目２８）
前記ＣＡＲがＭｚである、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目２９）
Ｍｚの膜貫通ドメインが、ＣＤ８ポリペプチドを含み、Ｍｚの細胞内ドメインが、ＣＤ３ζポリペプチドを含む、項目２８に記載のＣＡＲ。
（項目３０）
前記ＣＡＲがＭ２８ｚである、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目３１）
膜貫通ドメインＭ２８ｚが、ＣＤ２８ポリペプチドを含み、Ｍ２８ｚの細胞内ドメインが、ＣＤ３ζポリペプチドと、ＣＤ２８ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域とを含む、項目３０に記載のＣＡＲ。
（項目３２）
前記ＣＡＲがＭＢＢｚである、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目３３）
ＭＢＢｚの前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８ポリペプチドを含み、ＭＢＢｚの細胞内ドメインが、ＣＤ３ζポリペプチドと、４−１ＢＢポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域とを含む、項目３２に記載のＣＡＲ。
（項目３４）
前記ＣＡＲが組換え発現される、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目３５）
前記ＣＡＲがベクターから発現される、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目３６）
前記ベクターが、γ−レトロウイルスベクターである、項目３５に記載のＣＡＲ。
（項目３７）
前記項目のうちのいずれか一項に記載のＣＡＲを含む、単離された免疫応答性細胞。
（項目３８）
少なくとも１種の外因性共刺激リガンドをさらに含む、項目３７に記載の単離された免疫応答性細胞。
（項目３９）
前記少なくとも１種の共刺激リガンドが、４−１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＴＮＦＲＳＦ１４およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目３８に記載の単離された免疫応答性細胞。
（項目４０）
前記共刺激リガンドが、４−１ＢＢＬである、項目３９に記載の単離された免疫応答性細胞。
（項目４１）
少なくとも１種の外因性サイトカインをさらに含む、項目３７に記載の単離された免疫応答性細胞。
（項目４２）
前記少なくとも１種のサイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目４１に記載の単離された免疫応答性細胞。
（項目４３）
前記少なくとも１種のサイトカインが、ＩＬ−１２である、項目４２に記載の単離された免疫応答性細胞。
（項目４４）
前記細胞がＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、ヒト胚幹細胞およびリンパ球系細胞に分化し得る多能性幹細胞からなる群から選択される、項目３７から４３のいずれか一項に記載の単離された免疫応答性細胞。
（項目４５）
前記細胞がＴ細胞である、項目３７に記載の単離された免疫応答性細胞。
（項目４６）
前記単離された免疫応答性細胞が細胞あたり約１〜約４ベクターコピー数の前記ＣＡＲを発現する、項目３７から４５のいずれか一項に記載の単離された免疫応答性細胞。
（項目４７）
ヒトメソセリンとは異なる抗原と結合する抗原認識受容体をさらに含む、項目３７から４６のいずれか一項に記載の単離された免疫応答性細胞。
（項目４８）
前記抗原が、腫瘍または病原体抗原である、項目４７に記載の単離された免疫応答性細胞。
（項目４９）
前記腫瘍抗原が、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原（例えば、細胞表面抗原）、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質−４０（ＥＧＰ−４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、受容体チロシンプロテインキナーゼｅｒｂ−Ｂ２、３、４、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体−ａ、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ−２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、インターロイキン−１３受容体サブユニットアルファ−２（ＩＬ−１３Ｒα２）、κ−軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、黒色腫抗原ファミリーＡ，１（ＭＡＧＥ−ＡＩ）、ムチン１６（Ｍｕｃ−１６）、ムチン１（Ｍｕｃ−１）、ＮＫＧ２Ｄリガンド、がん精巣抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１、癌胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ−７２）、血管内皮成長因子Ｒ２（ＶＥＧＦ−Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ−１）、１型チロシン−プロテインキナーゼ膜貫通型受容体（ＲＯＲ１）およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目４８に記載の単離された免疫応答性細胞。
（項目５０）
前記単離された免疫応答性細胞が１種または複数種の接着分子を発現する、項目３７から４９のいずれか一項に記載の単離された免疫応答性細胞。
（項目５１）
前記接着分子が、前記ＣＡＲのアビディティーを高める、項目５０に記載の単離された免疫応答性細胞。
（項目５２）
前記接着分子が、ＣＤ２、ＶＬＡ−４およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目５０または５１に記載の単離された免疫応答性細胞。
（項目５３）
被験体における腫瘍量を低減する方法であって、前記被験体に、有効量の、項目３７から５２のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞を投与し、それによって、前記被験体において腫瘍細胞死を誘導することを含む方法。
（項目５４）
前記方法が腫瘍細胞の数を低減する、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記方法が腫瘍の大きさを低減する、項目５３に記載の方法。
（項目５６）
前記方法が前記被験体において前記腫瘍を根絶する、項目５３に記載の方法。
（項目５７）
前記腫瘍が固形腫瘍である、項目５３に記載の方法。
（項目５８）
前記固形腫瘍が、中皮腫、肺がん、膵臓がん、卵巣がん、乳がん、結腸がん、胸膜腫瘍、神経膠芽腫、食道がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、滑膜肉腫、胸腺癌、子宮内膜癌、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、胆管癌およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
新生物を有する被験体の生存を増大または延長する方法であって、前記被験体に、有効量の、項目３７から５２のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞を投与し、それによって、前記被験体の生存を増大または延長することを含む方法。
（項目６０）
前記新生物が、中皮腫、肺がん、膵臓がん、卵巣がん、乳がん、結腸がん、胸膜がん、神経膠芽腫、食道がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、滑膜肉腫、胸腺癌、子宮内膜癌、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、胆管癌およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記方法が前記被験体における腫瘍量を低減または根絶する、項目５９に記載の方法。
（項目６２）
被験体におけるがん細胞または病原体に応じた免疫活性化サイトカイン産生を増大する方法であって、前記被験体に、項目３７から５２のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞を投与することを含む方法。
（項目６３）
前記免疫活性化サイトカインが、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、インターフェロン制御因子７（ＩＲＦ７）およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
前記免疫活性化サイトカインが、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびそれらの組合せからなる群から選択される、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
少なくとも１種の免疫調節因子を投与することをさらに含む、項目５３から６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
前記少なくとも１種の免疫調節因子が、免疫賦活剤、チェックポイント免疫遮断剤、放射線療法因子、化学療法剤およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記免疫賦活剤が、ＩＬ−１２、アゴニスト共刺激モノクローナル抗体およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記免疫賦活剤が、ＩＬ−１２である、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
前記アゴニスト共刺激モノクローナル抗体が、抗４−１ＢＢ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＩＣＯＳ抗体およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目６６に記載の方法。
（項目７０）
前記アゴニスト共刺激モノクローナル抗体が、抗４−１ＢＢ抗体である、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記チェックポイント免疫遮断剤が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗Ｂ７−Ｈ３抗体、抗ＴＩＭ３抗体およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目６６に記載の方法。
（項目７２）
前記チェックポイント免疫遮断剤が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体である、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記被験体がヒトである、項目５３から７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目７４）
前記免疫応答性細胞が、前記被験体に胸膜投与される、項目５３から７３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７５）
ヒトメソセリンと結合する免疫応答性細胞を製造するための方法であって、前記免疫応答性細胞に、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コードする核酸配列を導入することを含み、前記細胞外抗原結合性ドメインが、ヒトメソセリンと、約１ｎＭ〜約２５ｎＭの結合アフィニティー（Ｋｄ）で特異的に結合する、方法。
（項目７６）
項目１から３６のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする核酸。
（項目７７）
項目７６に記載の核酸を含むベクター。
（項目７８）
前記ベクターがγ−レトロウイルスベクターである、項目７７に記載のベクター。
（項目７９）
医薬組成物であって、有効量の、項目３７から５２のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
（項目８０）
新生物を治療するための医薬組成物であって、有効量の、項目３７から５２のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
（項目８１）
前記新生物が、中皮腫、肺がん、膵臓がん、卵巣がん、乳がん、結腸がん、胸膜がん、神経膠芽腫、食道がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、滑膜肉腫、胸腺癌、子宮内膜癌、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、胆管癌およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目８０に記載の医薬組成物。
（項目８２）
新生物、病原体感染、自己免疫障害、炎症性疾患、同種異系移植または移植片拒絶を治療または予防するためのキットであって、項目３７から５２のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞を含むキット。
（項目８３）
新生物、病原体感染、自己免疫障害、炎症性疾患、同種異系移植または移植片拒絶を治療または予防するためのキットであって、項目７６に記載の核酸を含むキット。
（項目８４）
前記キットが、新生物、病原体感染、自己免疫障害、炎症性疾患、同種異系移植または移植片拒絶を有する被験体を治療するために前記免疫応答性細胞を使用するための指示書をさらに含む、項目８２または８３に記載のキット。
（項目８５）
前記新生物が、中皮腫、肺がん、膵臓がん、卵巣がん、乳がん、結腸がん、胸膜がん、神経膠芽腫、食道がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、滑膜肉腫、胸腺癌、子宮内膜癌、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、胆管癌およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目８２から８４のいずれか一項に記載のキット。
（項目８６）
被験体において炎症性疾患を予防または治療する方法であって、前記被験体に項目３７から５２のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞を投与することを含む方法。
（項目８７）
前記免疫応答性細胞が、免疫阻害細胞である、項目８６に記載の方法。
（項目８８）
前記免疫阻害細胞が、制御性Ｔ細胞である、項目８７に記載の方法。
（項目８９）
前記炎症性疾患が膵炎である、項目８６から８８のいずれか一項に記載の方法。
（項目９０）
前記被験体がヒトである、項目８６から８９のいずれか一項に記載の方法。
（項目９１）
前記被験体が、臓器移植のレシピエントである、項目８６から９０のいずれか一項に記載の方法。
（項目９２）
前記被験体が、膵臓移植のレシピエントである、項目９１に記載の方法。
（項目９３）
臓器移植のレシピエントである被験体において移植片拒絶を予防する方法であって、前記被験体に、項目３７から５２のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞を投与することを含む方法。
（項目９４）
前記免疫応答性細胞が、免疫阻害細胞である、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
前記免疫阻害細胞が、制御性Ｔ細胞である、項目９４に記載の方法。
（項目９６）
前記被験体がヒトである、項目９３から９５のいずれか一項に記載の方法。
（項目９７）
前記被験体が、膵臓移植のレシピエントである、項目９３から９６のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
2020036606.tif 000034
【図２Ａ】
2020036606.tif 000035
【図２Ｂ】
2020036606.tif 000036
【図２Ｃ−Ｄ】
2020036606.tif 000037
【図２Ｅ−Ｆ】
2020036606.tif 000038
【図３Ａ−Ｂ】
2020036606.tif 000039
【図３Ｃ】
2020036606.tif 000040
【図３Ｄ−Ｅ】
2020036606.tif 000041
【図４Ａ−Ｂ】
2020036606.tif 000042
【図４Ｃ】
2020036606.tif 000043
【図４Ｄ−Ｆ】
2020036606.tif 000044
【図５Ａ】
2020036606.tif 000045
【図５Ｂ】
2020036606.tif 000046
【図５Ｃ】
2020036606.tif 000047
【図６Ａ】
2020036606.tif 000048
【図６Ｂ−Ｃ】
2020036606.tif 000049
【図６Ｄ−Ｅ】
2020036606.tif 000050
【図７Ａ】
2020036606.tif 000051
【図７Ｂ】
2020036606.tif 000052
【図７Ｃ−１】
2020036606.tif 000053
【図７Ｃ−２】
2020036606.tif 000054
【図７Ｄ】
2020036606.tif 000055
【図８Ａ】
2020036606.tif 000056
【図８Ｂ】
2020036606.tif 000057
【図９Ａ】
2020036606.tif 000058
【図９Ｂ】
2020036606.tif 000059
【図１０Ａ】
2020036606.tif 000060
【図１０Ｂ】
2020036606.tif 000061
【図１０Ｃ−Ｅ】
2020036606.tif 000062
【図１１Ａ】
2020036606.tif 000063
【図１１Ｂ】
2020036606.tif 000064
【図１２】
2020036606.tif 000065
【図１３Ａ−Ｄ】
2020036606.tif 000066
【図１３Ｅ−Ｆ】
2020036606.tif 000067
【図１４】
2020036606.tif 000068
【図１５】
2020036606.tif 000069
【図１６】
2020036606.tif 000070
【図１７】
2020036606.tif 000071
【図１８】
2020036606.tif 000072
【図１９】
2020036606.tif 000073
【図２０】
2020036606.tif 000074
【図２１】
2020036606.tif 000075
【図２２】
2020036606.tif 000076
【図２３】
2020036606.tif 000077
【図２４】
2020036606.tif 000078
【図２５】
2020036606.tif 000079
【図２６】
2020036606.tif 000080
【図２７】
2020036606.tif 000081
【図２８】
2020036606.tif 000082
【図２９Ａ】
2020036606.tif 000083
【図２９Ｂ】
2020036606.tif 000084
【図３０】
2020036606.tif 000085
【図３１】
2020036606.tif 000086
【図３２−１】
2020036606.tif 000087
【図３２−２】
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【図３３】
2020036606.tif 000089
【図３４】
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【図３４Ａ−Ｂ】
2020036606.tif 000091
【図３５Ａ−Ｃ】
2020036606.tif 000092
【図３５Ｄ−Ｅ】
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【図３６Ａ−Ｃ】
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【図３６Ｄ−Ｅ】
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【図３７Ａ−Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３８】
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【図３９】
2020036606.tif 000099
【図４０Ａ−Ｃ】
2020036606.tif 000100
【図４０Ｄ−Ｆ】
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【図４１Ａ−Ｃ】
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【図４１Ｄ−Ｆ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ−Ｃ】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４６】
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【図４７Ａ−Ｂ】
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【図４７Ｃ】
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【図４７Ｄ−Ｅ】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ−Ｃ】
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【図４９Ａ−Ｂ】
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【図４９Ｃ】
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【図５０Ａ−Ｂ】
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【図５０Ｃ】
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【図５０Ｄ】
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【図５１Ａ−Ｃ】
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【図５１Ｄ】
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【図５１Ｅ】
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【図５２Ａ−Ｂ】
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【図５２Ｃ−Ｄ】
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【図５２Ｅ−Ｆ】
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【図５３Ａ−Ｃ】
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【図５３Ｄ】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６−１】
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【図５６−２】
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【図５７−１】
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【図５７−２】
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【図５８】
2020036606.tif 000135
【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
2020036606.tif 000139
【図６３Ａ−Ｂ】
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【図６３Ｃ】
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【図６４Ａ−Ｂ】
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【図６４Ｃ−Ｄ】
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【配列表】
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【外国語明細書】
2020036606000001.pdf