(57)【要約】      （修正有）【課題】グリコール酸オキシダーゼ（ＨＡＯ１）遺伝子の発現および／または活性の調節に応答する特性、疾患および状態の研究、診断および処置のための化合物、組成物、および方法の提供。【解決手段】１５〜８０の長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖を含む核酸であって、前記核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１標的ｍＲＮＡの発現を低減するように、前記オリゴヌクレオチド鎖が前記オリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って特定の配列から選択される標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列に十分に相補的である、核酸。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１５〜８０の長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖を含む核酸であって、前記核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１標的ｍＲＮＡの発現を低減するように、前記オリゴヌクレオチド鎖が前記オリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４から選択される標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列に十分に相補的である、核酸。
【請求項２】
１９〜８０の長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖を含む核酸であって、前記核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１標的ｍＲＮＡの発現を低減するように、前記オリゴヌクレオチド鎖が前記オリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１９の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４から選択される標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列に十分に相補的である、核酸。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチド鎖が１９〜３５の長さのヌクレオチドである、請求項１または請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
ＲＮＡを含む第１の核酸鎖および第２の核酸鎖を含む二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）であって、前記ｄｓＮＡの前記第１の鎖が１５〜６６の長さのヌクレオチドであり、前記第２の鎖が１９〜６６の長さのヌクレオチドであり、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１標的ｍＲＮＡの発現を低減するように、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖が前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４から選択される標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列に十分に相補的である、二本鎖核酸。
【請求項５】
第１の核酸鎖および第２の核酸鎖を含む二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）であって、前記ｄｓＮＡの前記第１の鎖が１５〜６６の長さのヌクレオチドであり、前記第２の鎖が１９〜６６の長さのヌクレオチドであり、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１標的ｍＲＮＡの発現を低減するように、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖が前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１９の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４から選択される標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列に十分に相補的である、二本鎖核酸。
【請求項６】
第１の核酸鎖および第２の核酸鎖を含む二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）であって、前記ｄｓＮＡの前記第１の鎖が１５〜６６の長さのヌクレオチドであり、前記第２の鎖が１９〜６６の長さのヌクレオチドであり、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に、ＨＡＯ１標的ｍＲＮＡの発現を低減するように、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖が前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１９の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４から選択される標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列に十分に相補的であり、かつ配列番号１９２１〜２３０４から選択される該ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列の該５’末端（位置１）から開始して、哺乳類のＡｇｏ２が前記配列の位置９および１０の間の部位で前記ｍＲＮＡを切断する、二本鎖核酸。
【請求項７】
（ａ）センス領域およびアンチセンス領域であって、前記センス領域および前記アンチセンス領域が２５〜６６塩基対からなる二本鎖領域を共に形成し、前記アンチセンス領域が配列番号１９２１〜２３０４から選択される配列に相補的である配列を含む、センス領域およびアンチセンス領域；ならびに（ｂ）０〜２つの３’オーバーハング領域であって、各オーバーハング領域が６以下の長さのヌクレオチドである３’オーバーハング領域からなるｄｓＮＡ分子であって、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に、配列番号１９２１〜２３０４から選択される該ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列の該５’末端（位置１）から開始して、哺乳類のＡｇｏ２が前記配列の位置９および１０の間の部位で前記ｍＲＮＡを切断する、ｄｓＮＡ分子。
【請求項８】
第１の核酸鎖および第２の核酸鎖ならびに少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を含む二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）であって、前記ｄｓＮＡの前記第１の鎖が２５〜６５の長さのヌクレオチドであり、前記第２の鎖が２６〜６６の長さのヌクレオチドであり、かつその３’末端に１〜５の一本鎖ヌクレオチドを含み、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１標的遺伝子発現を低減するように、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖が前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１９の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４から選択される標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列に十分に相補的である、二本鎖核酸。
【請求項９】
第１の核酸鎖および第２の核酸鎖ならびに少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を含む二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）であって、前記ｄｓＮＡの前記第１の鎖が２５〜６５の長さのヌクレオチドであり、前記第２の鎖が２６〜６６の長さのヌクレオチドであり、かつその３’末端に１〜５の一本鎖ヌクレオチドを含み、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖の該３’末端および前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の該５’末端が平滑末端を形成し、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖が、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１ｍＲＮＡ発現を低減するように、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１９の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４からなる群から選択される標的ＨＡＯ１配列と十分に相補的である、二本鎖核酸。
【請求項１０】
前記第１の鎖が１５〜３５の長さのヌクレオチドである、請求項４〜９または５６のいずれか１項に記載のｄｓＮＡ。
【請求項１１】
前記第２の鎖が１９〜３５の長さのヌクレオチドである、請求項４〜１０または５６のいずれか１項に記載のｄｓＮＡ。
【請求項１２】
少なくとも２５の塩基対；１９〜２１の塩基対および２１〜２５の塩基対からなる群から選択される二本鎖領域を含む、請求項４〜７または５６のいずれか１項に記載のｄｓＮＡ。
【請求項１３】
前記第２のオリゴヌクレオチド鎖が、その３’末端に１〜５の一本鎖ヌクレオチドを含む、請求項４〜１２または５６のいずれか１項に記載のｄｓＮＡ。
【請求項１４】
前記第２のオリゴヌクレオチド鎖が、その３’末端に５〜３５の一本鎖ヌクレオチドを含む、請求項４〜１２または５６のいずれか１項に記載のｄｓＮＡ。
【請求項１５】
前記一本鎖ヌクレオチドが改変ヌクレオチドを含む、請求項１４に記載のｄｓＮＡ。
【請求項１６】
前記一本鎖ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡ、２’−アミノおよび２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバマート）からなる群から選択される改変ヌクレオチドを含む、請求項１４に記載のｄｓＮＡ。
【請求項１７】
前記一本鎖ヌクレオチドがリボヌクレオチドを含む、請求項１４に記載のｄｓＮＡ。
【請求項１８】
前記一本鎖ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項１４に記載のｄｓＮＡ。
【請求項１９】
該第１の鎖の該３’末端および該第２の鎖の該５’末端が、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはその両方を含むポリヌクレオチド配列により結合され、任意に該ポリヌクレオチド配列がテトラループ配列を含む、請求項１〜１８または請求項５６のいずれか１項に記載の核酸またはｄｓＮＡ。
【請求項２０】
前記第１の鎖が２５〜３５の長さのヌクレオチドである、請求項４〜１９または５６のいずれか１項に記載のｄｓＮＡ。
【請求項２１】
前記第２の鎖が２５〜３５の長さのヌクレオチドである、請求項４〜１９または５６のいずれか１項に記載のｄｓＮＡ。
【請求項２２】
前記第２のオリゴヌクレオチド鎖が、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の最大２７の長さのヌクレオチドに沿って標的ＨＡＯ１ｃＤＮＡ配列のＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第ＮＭ＿０１７５４５．２号に相補的である、請求項４〜２１または５６のいずれか１項に記載のｄｓＮＡ。
【請求項２３】
該第１のオリゴヌクレオチド鎖の該３’末端での該第１のヌクレオチド（位置１）から開始して、位置１、２および／または３が改変ヌクレオチドで置換される、請求項４〜２２または５６のいずれか１項に記載のｄｓＮＡ。
【請求項２４】
前記第１の鎖の前記３’末端および前記第２の鎖の前記５’末端が平滑末端を形成する、請求項４〜２３または５６のいずれか１項に記載のｄｓＮＡ。
【請求項２５】
前記第１の鎖が２５の長さのヌクレオチドであり、前記第２の鎖が２７の長さのヌクレオチドである、請求項４〜２４または５６のいずれか１項に記載のｄｓＮＡ。
【請求項２６】
配列番号１９２１〜２３０４から選択されるＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列の該５’末端（位置１）から開始して、哺乳類のＡｇｏ２が前記配列の位置９および１０の間の部位で前記ｍＲＮＡを切断し、それによって前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１標的ｍＲＮＡ発現を低減する、請求項４〜５、７〜２５または５６のいずれか１項に記載のｄｓＮＡ。
【請求項２７】
前記第２の鎖が、配列番号３８５〜７６８からなる群から選択される配列を含む、請求項４〜２６または５６のいずれか１項に記載のｄｓＮＡ。
【請求項２８】
前記第１の鎖が、配列番号１〜３８４からなる群から選択される配列を含む、請求項４〜２７または５６のいずれか１項に記載のｄｓＮＡ。
【請求項２９】
表２から選択される一対の第１の鎖／第２の鎖配列を含む、請求項４〜２８または５６のいずれか１項に記載のｄｓＮＡ。
【請求項３０】
前記第１の鎖の前記３’末端の前記改変ヌクレオチド残基が、デオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド（ａｃｙｃｌｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）および蛍光分子からなる群から選択される、請求項１５に記載のｄｓＮＡ。
【請求項３１】
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖の前記３’末端の位置１がデオキシリボヌクレオチドである、請求項３０に記載のｄｓＮＡ。
【請求項３２】
前記第２の鎖の前記３’末端の前記１〜５または５〜３５の一本鎖ヌクレオチドの前記ヌクレオチドが、改変ヌクレオチドを含む、請求項７、８または１３〜３１のいずれか１項に記載のｄｓＮＡ。
【請求項３３】
前記第２の鎖の前記３’末端の前記１〜５または５〜３５の一本鎖ヌクレオチドの前記改変ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである、請求項３２に記載のｄｓＮＡ。
【請求項３４】
前記第２の鎖の前記３’末端の前記１〜５または５〜３５の一本鎖ヌクレオチドの全てのヌクレオチドが、改変ヌクレオチドである、請求項３２または３３に記載のｄｓＮＡ。
【請求項３５】
前記ｄｓＮＡが改変ヌクレオチドを含む、請求項４〜３４のいずれか１項に記載のｄｓＮＡ。
【請求項３６】
前記改変ヌクレオチド残基が、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡ、２’−アミノおよび２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバマート（ｍｅｔｈｌｙｃａｒｂａｍａｔｅ））からなる群から選択される、請求項３５に記載のｄｓＮＡ。
【請求項３７】
前記第２の鎖の前記３’末端の前記１〜５または５〜３５の一本鎖ヌクレオチドが、１〜３の長さのヌクレオチドである、請求項７、８または１３〜３６のいずれか１項に記載のｄｓＮＡ。
【請求項３８】
前記第２の鎖の前記３’末端の前記１〜５または５〜３５の一本鎖ヌクレオチドが、１〜２の長さのヌクレオチドである、請求項７、８または１３〜３７のいずれか１項に記載のｄｓＮＡ。
【請求項３９】
前記第２の鎖の前記３’末端の前記１〜５または５〜３５の一本鎖ヌクレオチドが、２の長さのヌクレオチドであり、かつ２’−Ｏ−メチル改変リボヌクレオチドを含む、請求項７、８または１３〜３８のいずれか１項に記載のｄｓＮＡ。
【請求項４０】
前記第２のオリゴヌクレオチド鎖が、ＡＳ−Ｍ１〜ＡＳ−Ｍ９６、ＡＳ−Ｍ２１０、ＡＳ−Ｍ１＊〜ＡＳ−Ｍ９６＊およびＡＳ−Ｍ２１０＊からなる群から選択される改変パターンを含む、請求項４〜３９または５６のいずれか１項に記載のｄｓＮＡ。
【請求項４１】
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖が、ＳＭ１〜ＳＭ１１９およびＳＭ２５０からなる群から選択される改変パターンを含む、請求項４〜４０または５６のいずれか１項に記載のｄｓＮＡ。
【請求項４２】
前記第１の鎖および前記第２の鎖のそれぞれが、少なくとも２６かつ最大３０の長さのヌクレオチドを有する、請求項４〜４１または５６のいずれか１項に記載のｄｓＮＡ。
【請求項４３】
前記ｄｓＮＡがＤｉｃｅｒにより前記細胞中で内因的に切断される、請求項４〜４２または５６のいずれか１項に記載のｄｓＮＡ。
【請求項４４】
前記標的遺伝子の発現を低減するために十分な前記単離核酸の量が、前記細胞の前記環境中で１ナノモル濃度以下、２００ピコモル濃度以下、１００ピコモル濃度以下、５０ピコモル濃度以下、２０ピコモル濃度以下、１０ピコモル濃度以下、５ピコモル濃度以下、２ピコモル濃度以下および１ピコモル濃度以下からなる群から選択される、請求項１〜４３または請求項５６のいずれか１項に記載の核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体。
【請求項４５】
前記ｄｓＮＡが、１ナノモル濃度以下の細胞の該環境中での有効濃度においてｉｎ  ｖｉｔｒｏの哺乳類細胞中でアッセイされる際に、標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡの発現の低減において同一の前記標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡの少なくとも１９の該ヌクレオチドを対象とする２１マーｓｉＲＮＡよりも大きな効力を有する、請求項７〜４４または５６のいずれか１項に記載のｄｓＮＡ。
【請求項４６】
前記ｄｓＮＡが、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０〜９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％からなる群から選択される量（％により表される）でＨＡＯ１標的ｍＲＮＡ発現を低減するように、該標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列に十分に相補的である、請求項１〜４５または請求項５６のいずれか１項に記載の核酸またはｄｓＮＡ。
【請求項４７】
該第１の鎖および第２の鎖が化学的なリンカーにより結合される、請求項４〜４６または５６のいずれか１項に記載のｄｓＮＡ。
【請求項４８】
前記第１の鎖の前記３’末端および前記第２の鎖の前記５’末端が化学的なリンカーにより結合される、請求項４〜４７または５６のいずれか１項に記載の二本鎖核酸。
【請求項４９】
前記第２の鎖または第１の鎖のヌクレオチドが、Ｄｉｃｅｒ開裂の配向を方向付ける改変ヌクレオチドで置換される、請求項４〜４８または５６のいずれか１項に記載の二本鎖核酸。
【請求項５０】
デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）のヌクレオチド一リン酸塩と２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）のヌクレオチド一リン酸塩、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、５−（３−アミノアリル）−ウラシル、２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−アミノリボヌクレオチド、２’−フルオロリボヌクレオチド、およびロックド核酸からなる群から選択される改変ヌクレオチドを含む、請求項１〜４９または請求項５６のいずれか１項に記載の核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体。
【請求項５１】
ホスホン酸塩、ホスホロチオエートおよびホスホトリエステルからなる群から選択されるリン酸塩骨格改変を含む、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の単離核酸。
【請求項５２】
モルフォリノ核酸およびペプチド核酸（ＰＮＡ）からなる群から選択される改変を含む、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の単離核酸。
【請求項５３】
前記ｄｓＮＡ、核酸またはハイブリッド形成複合体が、ダイナミックなポリコンジュゲート（ＤＰＣ）に付着する、請求項１〜５２または５６のいずれか１項に記載の核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体。
【請求項５４】
前記ｄｓＮＡ、核酸またはハイブリッド形成複合体が、ＤＰＣと共に投与され、該ｄｓＮＡおよびＤＰＣが任意に付着していない、請求項１〜５３または５６のいずれか１項に記載の核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体。
【請求項５５】
前記ｄｓＮＡ、核酸またはハイブリッド形成複合体が、ＧａｌＮＡｃ部分、コレステロールおよびコレステロール標的化リガンドからなる群から選択される部分に付着する、請求項１〜５４または５６のいずれか１項に記載の核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体。
【請求項５６】
組成物であって、
第１の核酸鎖および第２の核酸鎖を含むｄｓＮＡであって、前記ｄｓＮＡの前記第１の鎖が１５〜３５の長さのヌクレオチドであり、前記第２の鎖が１９〜３５の長さのヌクレオチドであり、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１標的ｍＲＮＡの発現を低減するように、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖が前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１９の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４から選択される標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列に十分に相補的である、ｄｓＮＡ；
第１の核酸鎖および第２の核酸鎖を含むｄｓＮＡであって、前記ｄｓＮＡの前記第１の鎖が１５〜３５の長さのヌクレオチドであり、前記第２の鎖が１９〜３５の長さのヌクレオチドであり、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に、ＨＡＯ１標的ｍＲＮＡの発現を低減するように、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖が前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１９の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４から選択される標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列に十分に相補的であり、かつ配列番号１９２１〜２３０４から選択される該ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列の該５’末端（位置１）から開始して、哺乳類のＡｇｏ２が前記配列の位置９および１０の間の部位で前記ｍＲＮＡを切断する、ｄｓＮＡ；
（ａ）センス領域およびアンチセンス領域であって、前記センス領域および前記アンチセンス領域が２５〜３５塩基対からなる二本鎖領域を共に形成し、前記アンチセンス領域が配列番号１９２１〜２３０４から選択される配列に相補的である配列を含む、センス領域およびアンチセンス領域；ならびに（ｂ）０〜２つの３’オーバーハング領域であって、各オーバーハング領域が６以下の長さのヌクレオチドである３’オーバーハング領域からなるｄｓＮＡ分子であって、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に、配列番号１９２１〜２３０４から選択される該ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列の該５’末端（位置１）から開始して、哺乳類のＡｇｏ２が前記配列の位置９および１０の間の部位で前記ｍＲＮＡを切断する、ｄｓＮＡ分子；
第１の核酸鎖および第２の核酸鎖ならびに少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を含むｄｓＮＡであって、前記ｄｓＮＡの前記第１の鎖が２５〜３４の長さのヌクレオチドであり、前記第２の鎖が２６〜３５の長さのヌクレオチドであり、かつその３’末端に１〜５の一本鎖ヌクレオチドを含み、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１標的遺伝子発現を低減するように、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖が前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１９の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４から選択される標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列に十分に相補的である、ｄｓＮＡ；
第１の核酸鎖および第２の核酸鎖ならびに少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を含むｄｓＮＡであって、前記ｄｓＮＡの前記第１の鎖が２５〜３４の長さのヌクレオチドであり、前記第２の鎖が２６〜３５の長さのヌクレオチドであり、かつその３’末端に１〜５の一本鎖ヌクレオチドを含み、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖の該３’末端および前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の該５’末端が平滑末端を形成し、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖が、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１ｍＲＮＡ発現を低減するように、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１９の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４からなる群から選択される標的ＨＡＯ１配列と十分に相補的である、ｄｓＮＡ；
１９〜３５の長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖を含む核酸であって、前記核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１標的ｍＲＮＡの発現を低減するように、前記オリゴヌクレオチド鎖が前記オリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１９の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４から選択される標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列に十分に相補的である、核酸；
１５〜３５の長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖を含む核酸であって、前記オリゴヌクレオチド鎖が、前記オリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って、配列番号１９２１〜２３０４からなる群から選択される標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列とハイブリッド形成可能である、核酸；
ＲＮＡを含む第１の核酸鎖および第２の核酸鎖を含むｄｓＮＡであって、前記ｄｓＮＡの前記第１の鎖が１５〜３５の長さのヌクレオチドであり、前記第２の鎖が１９〜３５の長さのヌクレオチドであり、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖が、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って、配列番号１９２１〜２３０４からなる群から選択される標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列とハイブリッド形成可能である、ｄｓＮＡ；
ＲＮＡを含む第１の核酸鎖および第２の核酸鎖を含むｄｓＮＡであって、前記ｄｓＮＡの前記第１の鎖が１５〜３５の長さのヌクレオチドであり、前記第２の鎖が少なくとも３５の長さのヌクレオチドであり、任意に配列番号３８５〜７６８の少なくとも２５の長さのヌクレオチドの配列を含み、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１標的ｍＲＮＡの発現を低減するように、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖が前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４から選択される標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列に十分に相補的である、ｄｓＮＡ；
５’末端および３’末端を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖ならびに５’末端および３’末端を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖を含むｄｓＮＡであって、前記第１の鎖が２５〜５３の長さのヌクレオチド残基であり、該第１の鎖の該５’末端での該第１のヌクレオチド（位置１）から開始して、前記第１の鎖の位置１〜２３が、リボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドであり；前記第２の鎖が２７〜５３の長さのヌクレオチド残基であり、かつ二本鎖を形成するために該リボヌクレオチドまたは前記第１の鎖の位置１〜２３のリボヌクレオチドと塩基対を形成する、２３の連続したリボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドを含み；該第１の鎖の該５’末端および該第２の鎖の該３’末端が、平滑末端、１〜６ヌクレオチドの５’オーバーハングおよび１〜６ヌクレオチドの３’オーバーハングからなる群から選択される構造を形成し；前記第１の鎖の該３’末端および前記第２の鎖の該５’末端が、平滑末端、１〜６ヌクレオチドの５’オーバーハングおよび１〜６ヌクレオチドの３’オーバーハングからなる群から選択される構造を形成し；前記第１の鎖の該３’末端ヌクレオチド残基の位置２４のうち少なくとも１つが、該第２の鎖のデオキシリボヌクレオチドと任意に塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドであり；該第２の鎖が、該二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１標的ｍＲＮＡ発現を低減するように、該第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４から選択される標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と十分に相補的である、ｄｓＮＡ；
５’末端および３’末端を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖ならびに５’末端および３’末端を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖を含むｄｓＮＡであって、該第２の鎖が２７〜５３の長さのヌクレオチド残基であり、該第２の鎖の該５’末端での該第１のヌクレオチド（位置１）から開始して、該第２の鎖の位置１〜２３が、リボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドであり；該第１の鎖が２５〜５３の長さのヌクレオチド残基であり、かつ二本鎖を形成するために該第２の鎖の位置１〜２３の該リボヌクレオチドと十分に塩基対を形成する、２３の連続したリボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドを含み；該第２の鎖の該３’末端ヌクレオチド残基の位置２４のうち少なくとも１つが、該第１の鎖のデオキシリボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドと任意に塩基対を形成する、デオキシリボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドであり；該第２の鎖が、該二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１標的ｍＲＮＡ発現を低減するように、該第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４から選択される標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と十分に相補的である、ｄｓＮＡ；
５’末端および３’末端を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖ならびに５’末端および３’末端を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖を含むｄｓＮＡであって、該５’末端の各々が５’末端ヌクレオチドを有し、該３’末端の各々が３’末端ヌクレオチドを有し、該第１の鎖（または該第２の鎖）が２５〜３０の長さのヌクレオチド残基であり、該５’末端ヌクレオチド（位置１）から開始して、該第１の鎖（または該第２の鎖）の位置１〜２３が、少なくとも８のリボヌクレオチドを含み；該第２の鎖（または該第１の鎖）が３６〜６６の長さのヌクレオチド残基であり、該３’末端ヌクレオチドから開始して、二本鎖を形成するために該第１の鎖の位置１〜２３と対を形成する該位置に少なくとも８のリボヌクレオチドを含み；該第２の鎖（または該第１の鎖）の少なくとも該３’末端ヌクレオチドが該第１の鎖（または該第２の鎖）と対になっておらず、最大６の連続した３’末端ヌクレオチドが該第１の鎖（または該第２の鎖）と対になっておらず、それによって１〜６ヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングを形成し；該第２の鎖（または該第１の鎖）の該５’末端が、該第１の鎖（または該第２の鎖）と対になっていない１０〜３０の連続したヌクレオチドを含み、それによって１０〜３０ヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングを形成し；該第１の鎖および第２の鎖が最大の相補性でアライメントされる場合、少なくとも該第１の鎖（または該第２の鎖）の５’末端および３’末端ヌクレオチドが、該第２の鎖（または該第１の鎖）のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって該第１の鎖と第２の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し；該第２の鎖が、該二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に標的遺伝子発現を低減するように、該第２の鎖の少なくとも１９の長さのリボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡと十分に相補的である、ｄｓＮＡ；
５’末端および３’末端を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖ならびに５’末端および３’末端を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖を含むｄｓＮＡであって、該５’末端の各々が５’末端ヌクレオチドを有し、該３’末端の各々が３’末端ヌクレオチドを有し、該第１の鎖が２５〜３５の長さのヌクレオチド残基であり、該５’末端ヌクレオチド（位置１）から開始して、該第２の鎖の位置１〜２５が少なくとも８のリボヌクレオチドを含み；該第２の鎖が３０〜６６の長さのヌクレオチド残基であり、該３’末端ヌクレオチドから開始して、二本鎖を形成するために該第１の鎖の位置１〜２５と対を形成する該位置に少なくとも８のリボヌクレオチドを含み；該第２の鎖の該５’末端が、該第１の鎖と対になっていない５〜３５の連続したヌクレオチドを含み、それによって５〜３５ヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングを形成し；該第１の鎖および第２の鎖が最大の相補性でアライメントされる場合、少なくとも該第１の鎖の５’末端および３’末端ヌクレオチドが、該第２の鎖のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって該第１の鎖と第２の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し；該第２の鎖が、該二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１標的ｍＲＮＡ発現を低減するように、該第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４から選択される標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と十分に相補的である、ｄｓＮＡ；
５’末端および３’末端を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖ならびに５’末端および３’末端を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖を含むｄｓＮＡであって、該５’末端の各々が５’末端ヌクレオチドを有し、該３’末端の各々が３’末端ヌクレオチドを有し、該第２の鎖が１９〜３０の長さのヌクレオチド残基であり、任意に２５〜３０の長さのヌクレオチド残基であり、該５’末端ヌクレオチド（位置１）から開始して、該第２の鎖の位置１〜１７（任意に位置１〜２３）が、少なくとも８のリボヌクレオチドを含み；該第１の鎖が２４〜６６の長さのヌクレオチド残基（任意に３０〜６６の長さのヌクレオチド残基）であり、該３’末端ヌクレオチドから開始して、二本鎖を形成するために該第２の鎖の位置１〜１７（任意に位置１〜２３）と対を形成する該位置に少なくとも８のリボヌクレオチドを含み；該第１の鎖の該３’末端および該第２の鎖の該５’末端が、平滑末端、３’オーバーハングおよび５’オーバーハングからなる群から選択される構造を含み、任意に該オーバーハングは１〜６の長さのヌクレオチドであり；該第１の鎖の該５’末端が、該第２の鎖と対になっていない５〜３５の連続したヌクレオチドを含み、それによって５〜３５ヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングを形成し；該第１の鎖および第２の鎖が最大の相補性でアライメントされる場合、少なくとも該第２の鎖の５’末端および３’末端ヌクレオチドが、該第１の鎖のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって該第１の鎖と第２の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し；該第２の鎖が、該二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１標的ｍＲＮＡ発現を低減するように、該第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４から選択される標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と十分に相補的である、ｄｓＮＡ；
第１の鎖および第２の鎖を含むｄｓＮＡであって、該第１の鎖および該第２の鎖が１９〜２５の長さのヌクレオチドの二本鎖領域を形成し、該第１の鎖が、該第１の鎖−第２の鎖の二本鎖領域を超えて伸長し、かつテトラループを含む３’領域を含み、該ｄｓＮＡが該第１の鎖の該３’末端と該第２の鎖の該５’末端との間に不連続性をさらに含み、該第１の鎖または第２の鎖が、該ｄｓＮＡが哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１標的ｍＲＮＡ発現を低減するように、該第１の鎖または第２の鎖の少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って、配列番号１９２１〜２３０４から選択される標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と十分に相補的である、ｄｓＮＡ；
５’末端および３’末端を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖ならびに５’末端および３’末端を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖を含むｄｓＮＡであって、該５’末端の各々が５’末端ヌクレオチドを有し、該３’末端の各々が３’末端ヌクレオチドを有し、該第１のオリゴヌクレオチド鎖が２５〜５３の長さのヌクレオチドであり、該第２のオリゴヌクレオチド鎖が２５〜５３の長さのヌクレオチドであり、該ｄｓＮＡが、該ｄｓＮＡのｄｉｃｅｒ開裂を実質的に防止するのに十分なほど多く改変され、任意に該ｄｓＮＡが、哺乳類細胞中でＬＤＨｍＲＮＡ発現を低減できる１つ以上の１９〜２３の長さのヌクレオチド鎖ｄｓＮＡを得るために、非ｄｉｃｅｒヌクレアーゼによって切断される、ｄｓＮＡ；
外来核酸配列および配列番号１９２１〜２３０４からなる群から選択される標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列を持つ細胞内のｉｎ  ｖｉｖｏハイブリッド形成複合体；ならびに
外来核酸配列および配列番号１９２１〜２３０４からなる群から選択される標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列を持つ細胞内のｉｎ  ｖｉｔｒｏハイブリッド形成複合体
からなる群から選択される組成物。
【請求項５７】
少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を有し、前記ｄｓＮＡが、１ナノモル濃度以下の細胞の該環境中での有効濃度においてｉｎ  ｖｉｔｒｏの哺乳類細胞中でアッセイされる際に、標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡの発現の低減において同一の前記標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡの少なくとも１９の該ヌクレオチドを対象とする２１マーｓｉＲＮＡよりも大きな効力を有する、請求項５６に記載のｄｓＮＡ。
【請求項５８】
少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を有し、前記ｄｓＮＡが、１ナノモル濃度、２００ピコモル濃度、１００ピコモル濃度、５０ピコモル濃度、２０ピコモル濃度、１０ピコモル濃度、５ピコモル濃度、２ピコモル濃度および１ピコモル濃度からなる群から選択される濃度でｉｎ  ｖｉｔｒｏの哺乳類細胞中でアッセイされる際に、標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡの発現の低減において同一の前記標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡの少なくとも１９の該ヌクレオチドを対象とする２１マーｓｉＲＮＡよりも大きな効力を有する、請求項５６または５７に記載のｄｓＮＡ。
【請求項５９】
前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１５または１９のヌクレオチドの１５または１９の連続したヌクレオチドに沿って該標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列に対して、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記１５または１９の連続したヌクレオチドが、前記標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と最大の相補性でアライメントされる場合、４以下のミスマッチ核酸残基を有する、請求項４〜５８のいずれか１項に記載のｄｓＮＡ。
【請求項６０】
前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１５または１９のヌクレオチドの１５または１９の連続したヌクレオチドに沿って該標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列に対して、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記１５または１９の連続したヌクレオチドが、前記標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と最大の相補性でアライメントされる場合、３以下のミスマッチ核酸残基を有する、請求項４〜５９のいずれか１項に記載のｄｓＮＡ。
【請求項６１】
前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１５または１９のヌクレオチドの１５または１９の連続したヌクレオチドに沿って該標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列に対して、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記１５または１９の連続したヌクレオチドが、前記標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と最大の相補性でアライメントされる場合、２以下のミスマッチ核酸残基を有する、請求項４〜６０のいずれか１項に記載のｄｓＮＡ。
【請求項６２】
前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１５または１９のヌクレオチドの１５または１９の連続したヌクレオチドに沿って該標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列に対して、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記１５または１９の連続したヌクレオチドが、前記標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と最大の相補性でアライメントされる場合、１つのミスマッチ核酸残基を有する、請求項４〜６１のいずれか１項に記載のｄｓＮＡ。
【請求項６３】
前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１５または１９のヌクレオチドの１５または１９の連続したヌクレオチドが、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記１５または１９の連続したヌクレオチドが、前記標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と最大の相補性でアライメントされる場合、該標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と完全に相補的である、請求項４〜６２のいずれか１項に記載のｄｓＮＡ。
【請求項６４】
哺乳類細胞中で標的ＨＡＯ１遺伝子の発現を低減する方法であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで哺乳類細胞を、前記細胞中で標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡの発現を低減するのに十分な量の請求項１〜６３のいずれか１項に記載の核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体と接触させることを含む、方法。
【請求項６５】
標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ発現が、少なくとも１０％、少なくとも５０％および少なくとも８０〜９０％からなる群から選択される量（％により表される）で減少する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
ＨＡＯ１ｍＲＮＡレベルが、前記細胞を前記ｄｓＮＡと接触させてから少なくとも８日後において、少なくとも９０％の量（％により表される）で減少する、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６７】
ＨＡＯ１ｍＲＮＡレベルが、前記細胞を前記ｄｓＮＡと接触させてから少なくとも１０日後において、少なくとも７０％の量（％により表される）で減少する、請求項６４〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
哺乳類中で標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡの発現を低減する方法であって、該哺乳類中で標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡの発現を低減するために十分な量の請求項１〜６３のいずれか１項に記載の核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体を哺乳類に投与することを含む、方法。
【請求項６９】
前記単離核酸が脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中で製剤化される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記単離核酸が、１マイクログラム〜５ミリグラム／ｋｇ前記哺乳類／日、１００マイクログラム〜０．５ミリグラム／ｋｇ、０．００１〜０．２５ミリグラム／ｋｇ、０．０１〜２０マイクログラム／ｋｇ、０．０１〜１０マイクログラム／ｋｇ、０．１０〜５マイクログラム／ｋｇ、および０．１〜２．５マイクログラム／ｋｇからなる群から選択される用量で投与される、請求項６８〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体が、１ナノモル濃度以下の細胞の該環境中での有効濃度においてｉｎ  ｖｉｔｒｏの哺乳類細胞中でアッセイされる際に、標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡの発現の低減において同一の前記標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡの少なくとも１９の該ヌクレオチドを対象とする２１マーｓｉＲＮＡよりも大きな効力を有する、請求項６８〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
ＨＡＯ１ｍＲＮＡレベルが、前記単離ｄｓＮＡを前記哺乳類に投与してから少なくとも３日後において、少なくとも７０％の量（％により表される）で前記哺乳類の組織中で減少する、請求項６８〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記組織が肝臓組織である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記投与するステップが、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、点滴、皮下注射、経皮注射、エアロゾル、直腸送達、膣送達、局所送達、経口送達および吸入送達からなる群から選択される様式を含む、請求項６８〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
対象の疾患または障害を治療または予防する方法であって、前記対象の前記疾患または障害を治療または予防するのに十分な量の請求項１〜６３のいずれか１項に記載の核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項７６】
前記疾患または障害が原発性高シュウ酸尿症１型（ＰＨ１）である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記対象がヒトである、請求項７５または７６に記載の方法。
【請求項７８】
請求項１〜６３のいずれか１項に記載の該核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体を含む製剤であって、前記核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体が、少なくとも１０％、少なくとも５０％および少なくとも８０〜９０％からなる群から選択される量（％により表される）で哺乳類細胞内にｉｎ  ｖｉｔｒｏで導入される際に、前記核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体が、標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡレベルを低減するために有効な量で存在する、製剤。
【請求項７９】
前記有効量が、前記細胞の該環境中で１ナノモル濃度以下、２００ピコモル濃度以下、１００ピコモル濃度以下、５０ピコモル濃度以下、２０ピコモル濃度以下、１０ピコモル濃度以下、５ピコモル濃度以下、２ピコモル濃度以下および１ピコモル濃度以下からなる群から選択される、請求項７８に記載の製剤。
【請求項８０】
請求項１〜６３のいずれか１項に記載の該核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体を含む製剤であって、前記核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体が、少なくとも１０％、少なくとも５０％および少なくとも８０〜９０％からなる群から選択される量（％により表される）で哺乳類対象の細胞内に導入される際に、前記核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体が、標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡレベルを低減するために有効な量で存在する、製剤。
【請求項８１】
前記有効量が、１マイクログラム〜５ミリグラム／ｋｇ前記対象／日、１００マイクログラム〜０．５ミリグラム／ｋｇ、０．００１〜０．２５ミリグラム／ｋｇ、０．０１〜２０マイクログラム／ｋｇ、０．０１〜１０マイクログラム／ｋｇ、０．１０〜５マイクログラム／ｋｇ、および０．１〜２．５マイクログラム／ｋｇからなる群から選択される用量である、請求項８０に記載の製剤。
【請求項８２】
前記核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体が、１ナノモル濃度以下の細胞の該環境中での有効濃度においてｉｎ  ｖｉｔｒｏの哺乳類細胞中でアッセイされる際に、標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡレベルの低減において同一の前記標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡの少なくとも１９の該ヌクレオチドを対象とする２１マーｓｉＲＮＡよりも大きな効力を有する、請求項７８〜８１のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項８３】
請求項１〜６３のいずれか１項に記載の該核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体を含む哺乳類細胞。
【請求項８４】
請求項１〜６３のいずれか１項に記載の該核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項８５】
請求項１〜６３のいずれか１項に記載の該核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体およびその使用のための説明書を含むキット。
【請求項８６】
請求項１〜６３のいずれか１項に記載の核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体から本質的になるＨＡＯ１阻害活性を有する組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１３年１２月２７日に出願の「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｌａｔｅ  Ｏｘｉｄａｓｅ  （ＨＡＯ  １）  ｂｙ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ」（二本鎖ＲＮＡによるグリコール酸オキシダーゼ（ＨＡＯ１）の特異的阻害に関する方法および組成物）という表題の米国特許仮出願番号第６１／９２１，１８１号、および２０１４年２月１０日に出願の「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｌａｔｅ  Ｏｘｉｄａｓｅ  （ＨＡＯ  １）  ｂｙ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ」（二本鎖ＲＮＡによるグリコール酸オキシダーゼ（ＨＡＯ１）の特異的阻害に関する方法および組成物）という表題の米国特許仮出願番号第６１／９３７，８３８号に対する優先権、および利益を主張する。上述の特許出願全体は、この参照により本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、グリコール酸オキシダーゼ（ＨＡＯ１）遺伝子の発現および／または活性の調節に応答する特性、疾患および状態の研究、診断および処置のための化合物、組成物、および方法に関する。
【０００３】
配列の提出
本願は、電子形式の配列表と共に出願されている。配列表は、「３０１９３７＿９４０１５ＷＯ＿ｓｅｑ＿ｌｉｓｔｉｎｇ」という表題であり、２０１４年１２月２３日に作成されたもので、サイズは２．８７ＭＢである。配列表の電子形式における情報は本願の一部であり、その全体が参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００４】
原発性高シュウ酸尿症１型（「ＰＨ１」）は、肝臓に特異的な酵素のアラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼの欠損により引き起こされる、希な常染色体劣性遺伝の先天性グリオキシル酸代謝異常である。この障害は、シュウ酸塩の過剰産生および尿中への過剰排出の原因となり、再発性尿路結石症および腎石灰化症を引き起こす。進行性腎病変に起因して糸球体濾過量が低下するので、シュウ酸塩が蓄積し、全身性シュウ酸症を引き起こす。診断は、臨床および超音波所見、尿中シュウ酸塩評価、酵素学ならびに／またはＤＮＡ分析に基づく。初期の保守的な治療は腎機能の維持を目標としていたが、慢性腎疾患のステージ４および５において、肝臓−腎臓移植を併用し、これまでに最良の結果が得られている（Ｃｏｃｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２７：１７２９−３６）。
【０００５】
ＰＨ１は、原発性高シュウ酸尿症の最も一般的な形態であり、欧州では人口１００万人あたり１〜３症例の推定有病率、および年間の出生児数１２０，０００人あたりおよそ１症例の罹患率を有する（Ｃｏｃｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １０（Ｓｕｐｐｌ  ８）：３−７；ｖａｎ  Ｗｏｅｒｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １８：２７３−９）。それは、欧州、米国、および日本からの登録数によれば、小児末期腎疾患（ＥＳＲＤ）症例の１〜２％を占める（Ｈａｒａｍｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ７：４５８−６５）が、近親婚が一般的な国では、より有病率が高くなるようである（一部の北アフリカおよび中東諸国では、１０％以上の有病率を有する；Ｋａｍｏｕｎ  ａｎｄ  Ｌａｋｈｏｕａ  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １０：４７９−８２；Ｃｏｃｈａｔ  ａｎｄ  Ｒｕｍｓｂｙ  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６９（７）：６４９−５８を参照のこと）。
【０００６】
グリコール酸オキシダーゼ（ＨＡＯ１、すなわち「ヒドロキシ酸オキシダーゼ１」遺伝子の産物）は、肝臓および膵臓のミトコンドリア／ペルオキシソームグリシン代謝経路において、グリコール酸塩をグリオキシル酸塩に変換させることに関与する酵素である。グリコール酸塩は、グリシン代謝経路の無害な中間体であるが、グリオキシル酸塩の蓄積（例えば、ＡＧＴ１変異による）はシュウ酸塩の蓄積を亢進させ、最終的にＰＨ１疾患をもたらす。
【０００７】
２５〜３５の長さのヌクレオチド鎖を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤が、哺乳類細胞での標的遺伝子発現の効果的な阻害剤として記述されている（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第８，０８４，５９９号および米国特許公開公報第２００５／０２７７６１０号）。このような長さのｄｓＲＮＡ剤は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路のＤｉｃｅｒ酵素によって処理されると考えられており、このような薬剤は「Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡ」（「ＤｓｉＲＮＡ」）剤と呼ばれている。ＤｓｉＲＮＡ剤のさらなる改変構造は従来より記述されている（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許公開公報第２００７／０２６５２２０号）。効果的なＤｉｃｅｒ基質の伸長形態についても、近年記述されている（Ｂｒｏｗｎ，米国特許第８，３４９，８０９号および米国特許第８，５１３，２０７号）。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、ｄｓＲＮＡに基づくノックダウン療法の魅力的な標的としてのＨＡＯ１の同定に、少なくとも部分的に基づく。特に、ＨＡＯ１標的として、その発現を低減させる核酸剤が、本明細書で提供される。このような組成物は、二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）などの核酸、およびそれらを調製する方法を含む。本発明の核酸は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは哺乳類の対象中のいずれかで、細胞内の標的グリコール酸オキシダーゼ遺伝子の発現を低減できる。
【０００９】
１つの態様では、本発明は、１５〜８０の長さのヌクレオチドであるオリゴヌクレオチド鎖を有する核酸であって、オリゴヌクレオチド鎖が、核酸が哺乳類細胞の中に導入される際に、ＨＡＯ１標的ｍＲＮＡ発現を低減させるために、オリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って、配列番号１９２１〜２３０４の標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と十分に相補的である、核酸を提供する。
【００１０】
本発明の別の態様は、１９〜８０の長さのヌクレオチドであるオリゴヌクレオチド鎖を有する核酸であって、オリゴヌクレオチド鎖が、核酸が哺乳類細胞の中に導入される際に、ＨＡＯ１標的ｍＲＮＡ発現を低減させるために、オリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも１９の長さのヌクレオチドに沿って、配列番号１９２１〜２３０４の標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と十分に相補的である、核酸を提供する。
【００１１】
１つの実施形態では、オリゴヌクレオチド鎖は、１９〜３５の長さのヌクレオチドである。
【００１２】
本発明の追加的な態様は、ＲＮＡを含む第１の核酸鎖および第２の核酸鎖を有する二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）であって、ｄｓＮＡの第１の鎖が１５〜６６の長さのヌクレオチドであり、第２の鎖が１９〜６６の長さのヌクレオチドであり、第２のオリゴヌクレオチド鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１標的ｍＲＮＡ発現を低減するため、第２のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４の標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と十分に相補的である、核酸を提供する。
【００１３】
本発明の別の態様は、第１の核酸鎖および第２の核酸鎖を有する二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）であって、ｄｓＮＡの第１の鎖が１５〜６６の長さのヌクレオチドであり、第２の鎖が１９〜６６の長さのヌクレオチドであり、第２のオリゴヌクレオチド鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１標的ｍＲＮＡ発現を低減するため、第２のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも１９の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４の標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と十分に相補的である、核酸を提供する。
【００１４】
本発明のさらなる態様は、第１の核酸鎖および第２の核酸鎖を有する二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）であって、ｄｓＮＡの第１の鎖が１５〜６６の長さのヌクレオチドであり、第２の鎖が１９〜６６の長さのヌクレオチドであり、第２のオリゴヌクレオチド鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１標的ｍＲＮＡ発現を低減するため、第２のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも１９の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４の標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と十分に相補的であり、かつ配列番号１９２１〜２３０４のＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列の５’末端（位置１）から開始して、哺乳類のＡｇｏ２が配列の位置９および１０の間の部位でｍＲＮＡを切断する、核酸を提供する。
【００１５】
本発明の別の態様は、（ａ）センス領域およびアンチセンス領域であって、センス領域およびアンチセンス領域が２５〜６６塩基対からなる二本鎖領域を共に形成し、アンチセンス領域が配列番号１９２１〜２３０４の配列に相補的である配列を含む、センス領域およびアンチセンス領域；ならびに（ｂ）０〜２つの３’オーバーハング領域であって、各オーバーハング領域が６以下の長さのヌクレオチドである、３’オーバーハング領域からなるｄｓＮＡ分子であって、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に、配列番号１９２１〜２３０４のＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列の５’末端（位置１）から開始して、哺乳類のＡｇｏ２が配列の位置９および１０の間の部位でｍＲＮＡを切断する、ｄｓＮＡ分子を提供する。
【００１６】
本発明の追加的な態様は、第１の核酸鎖および第２の核酸鎖、ならびに少なくとも２５の塩基対の二本鎖領域を有する二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）であって、ｄｓＮＡの第１の鎖が２５〜６５の長さのヌクレオチドであり、第２の鎖が２６〜６６の長さのヌクレオチドであり、かつその３’末端に１〜５の一本鎖ヌクレオチドを含み、第２のオリゴヌクレオチド鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１標的遺伝子発現を低減するため、第２のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも１９の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４の標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と十分に相補的である、ｄｓＮＡを提供する。
【００１７】
本発明の別の態様は、第１の核酸鎖および第２の核酸鎖、ならびに少なくとも２５の塩基対の二本鎖領域を有する二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）であって、ｄｓＮＡの第１の鎖が２５〜６５の長さのヌクレオチドであり、第２の鎖が２６〜６６の長さのヌクレオチドであり、かつその３’末端に１〜５の一本鎖ヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端および第２のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端が平滑末端を形成し、第２のオリゴヌクレオチド鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１ｍＲＮＡ発現を低減するため、第２のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも１９の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４の標的ＨＡＯ１配列と十分に相補的である、ｄｓＮＡを提供する。
【００１８】
１つの実施形態では、第１の鎖は、１５〜３５の長さのヌクレオチドである。
【００１９】
別の実施形態では、第２の鎖は、１９〜３５の長さのヌクレオチドである。
【００２０】
追加的な実施形態では、ｄｓＮＡは、少なくとも２５の塩基対；１９〜２１の塩基対または２１〜２５の塩基対の二本鎖領域を有する。
【００２１】
任意に、第２のオリゴヌクレオチド鎖は、その３’末端に１〜５の一本鎖ヌクレオチドを含む。
【００２２】
１つの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチド鎖は、その３’末端に５〜３５の一本鎖ヌクレオチドを含む。
【００２３】
別の実施形態では、一本鎖ヌクレオチドは、改変ヌクレオチドを含む。任意に、一本鎖ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡ、２’−アミノおよび／または２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバマート）改変ヌクレオチドを含む。
【００２４】
ある特定の実施形態では、一本鎖ヌクレオチドは、リボヌクレオチドを含む。任意に、一本鎖ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドを含む。
【００２５】
ある特定の実施形態では、本発明のｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体の第１の鎖の３’末端および第２の鎖の５’末端は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはその両方を含むポリヌクレオチド配列により結合され、任意にポリヌクレオチド配列は、テトラループ配列を含む。
【００２６】
１つの実施形態では、第１の鎖は、２５〜３５の長さのヌクレオチドである。任意に、第２の鎖は、２５〜３５の長さのヌクレオチドである。
【００２７】
１つの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチド鎖は、第２のオリゴヌクレオチド鎖の最大２７の長さのヌクレオチドに沿って標的ＨＡＯ１ｃＤＮＡ配列のＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第ＮＭ＿０１７５４５．２号に相補的である。
【００２８】
別の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端での第１のヌクレオチド（位置１）から開始して、位置１、２および／または３が、改変ヌクレオチドに置換される。
【００２９】
任意に、第１の鎖および第２の鎖の５’末端は、平滑末端を形成する。
【００３０】
１つの実施形態では、第１の鎖は２５の長さのヌクレオチドであり、第２の鎖は２７の長さのヌクレオチドである。
【００３１】
別の実施形態では、配列番号１９２１〜２３０４のＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列の５’末端（位置１）から開始して、哺乳類のＡｇｏ２が配列の位置９および１０の間の部位でｍＲＮＡを切断し、それによって二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１標的ｍＲＮＡ発現を低減する。
【００３２】
１つの実施形態では、第２の鎖は、配列番号３８５〜７６８の配列を含む。追加的な実施形態では、第１の鎖は、配列番号１〜３８４の配列を含む。
【００３３】
別の実施形態では、本発明のｄｓＮＡは、表２の一対の第１の鎖／第２の鎖配列を有する。
【００３４】
任意に、第１の鎖の３’末端の改変ヌクレオチド残基は、デオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドまたは蛍光分子である。
【００３５】
１つの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の位置１は、デオキシリボヌクレオチドである。
【００３６】
別の実施形態では、第２の鎖の３’末端の１〜５または５〜３５の一本鎖ヌクレオチドのヌクレオチドは、改変ヌクレオチドを含む。
【００３７】
１つの実施形態では、第２の鎖の３’末端の１〜５または５〜３５の一本鎖ヌクレオチドの改変ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである。
【００３８】
追加的な実施形態では、第２の鎖の３’末端の１〜５または５〜３５の一本鎖ヌクレオチドの全てのヌクレオチドは、改変ヌクレオチドである。
【００３９】
別の実施形態では、ｄｓＮＡは、改変ヌクレオチドを含む。任意に、改変ヌクレオチド残基は、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡ、２’−アミノまたは２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバマート）である。
【００４０】
１つの実施形態では、第２の鎖の３’末端の１〜５または５〜３５の一本鎖ヌクレオチドは、１〜３の長さのヌクレオチドであり、任意に１〜２の長さのヌクレオチドである。
【００４１】
別の実施形態では、第２の鎖の３’末端の１〜５または５〜３５の一本鎖ヌクレオチドは、２つの長さのヌクレオチドであり、２’−Ｏ−メチル改変リボヌクレオチドを含む。
【００４２】
１つの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチド鎖は、ＡＳ−Ｍ１〜ＡＳ−Ｍ９６およびＡＳ−Ｍ１＊〜ＡＳ−Ｍ９６＊の改変パターンを含む。
【００４３】
別の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチド鎖は、ＳＭ１〜ＳＭ１１９の改変パターンを含む。
【００４４】
追加的な実施形態では、第１の鎖および第２の鎖のそれぞれは、少なくとも２６かつ最大３０の長さのヌクレオチドを有する。
【００４５】
１つの実施形態では、ｄｓＮＡは、Ｄｉｃｅｒにより細胞中で内因的に切断される。
【００４６】
別の実施形態では、標的遺伝子の発現を低減するために十分な核酸の量は、細胞環境において１ナノモル濃度以下、２００ピコモル濃度以下、１００ピコモル濃度以下、５０ピコモル濃度以下、２０ピコモル濃度以下、１０ピコモル濃度以下、５ピコモル濃度以下、２ピコモル濃度以下および１ピコモル濃度以下である。
【００４７】
１つの実施形態では、ｄｓＮＡは、１ナノモル濃度以下の細胞の環境中での有効濃度においてｉｎ  ｖｉｔｒｏの哺乳類細胞中でアッセイされる際に、標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡの発現の低減において同一の標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡの少なくとも１９のヌクレオチドを対象とする２１マーｓｉＲＮＡよりも大きな効力を有する。
【００４８】
追加的な実施形態では、核酸またはｄｓＮＡは、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に、少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０〜９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の量（％により表される）でＨＡＯ１標的ｍＲＮＡ発現を低減するため、標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列に十分に相補的である。
【００４９】
１つの実施形態では、第１の鎖および第２の鎖は、化学的なリンカーにより結合される。
【００５０】
別の実施形態では、第１の鎖の３’末端および第２の鎖の５’末端は、化学的なリンカーにより結合される。
【００５１】
追加的な実施形態では、第２の鎖または第１の鎖のヌクレオチドは、Ｄｉｃｅｒ開裂の方向を指示する改変ヌクレオチドで置換される。
【００５２】
１つの実施形態では、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体は、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）のヌクレオチド一リン酸塩と２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）のヌクレオチド一リン酸塩、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、５−（３−アミノアリル）−ウラシル、２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−アミノリボヌクレオチド、２’−フルオロリボヌクレオチド、またはロックド核酸改変ヌクレオチドを有する。
【００５３】
別の実施形態では、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体は、ホスホン酸塩、ホスホロチオエートまたはホスホトリエステルリン酸塩骨格改変を含む。
【００５４】
１つの実施形態では、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体は、モルフォリノ核酸またはペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。
【００５５】
追加的な実施形態では、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体は、ｄｙｎａｍｉｃ  ｐｏｌｙｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＤＰＣ）に付着する。
【００５６】
１つの実施形態では、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体はＤＰＣと共に投与され、ｄｓＮＡおよびＤＰＣは、任意に付着していない。
【００５７】
別の実施形態では、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体は、ＧａｌＮＡｃ部分、コレステロールおよび／またはコレステロール標的化リガンドに付着する。
【００５８】
本発明の別の態様は、以下の組成物を提供する：
第１の核酸鎖および第２の核酸鎖を有するｄｓＮＡであって、ｄｓＮＡの第１の鎖が１５〜３５の長さのヌクレオチドであり、第２の鎖が１９〜３５の長さのヌクレオチドであり、第２のオリゴヌクレオチド鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１標的ｍＲＮＡ発現を低減するため、第２のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも１９の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４の標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と十分に相補的である、ｄｓＮＡ；
第１の核酸鎖および第２の核酸鎖を有するｄｓＮＡであって、ｄｓＮＡの第１の鎖が１５〜３５の長さのヌクレオチドであり、第２の鎖が１９〜３５の長さのヌクレオチドであり、第２のオリゴヌクレオチド鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１標的ｍＲＮＡ発現を低減するため、第２のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも１９の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４の標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と十分に相補的であり、かつ配列番号１９２１〜２３０４のＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列の５’末端（位置１）から開始して、哺乳類のＡｇｏ２が配列の位置９および１０の間の部位でｍＲＮＡを切断する、ｄｓＮＡ；
（ａ）センス領域およびアンチセンス領域であって、センス領域およびアンチセンス領域が２５〜３５塩基対からなる二本鎖領域を共に形成し、アンチセンス領域が配列番号１９２１〜２３０４の配列に相補的である配列を含む、センス領域およびアンチセンス領域；ならびに（ｂ）０〜２つの３’オーバーハング領域であって、各オーバーハング領域が６以下の長さのヌクレオチドである、３’オーバーハング領域からなるｄｓＮＡ分子であって、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に、配列番号１９２１〜２３０４のＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列の５’末端（位置１）から開始して、哺乳類のＡｇｏ２が配列の位置９および１０の間の部位でｍＲＮＡを切断する、ｄｓＮＡ分子；
第１の核酸鎖および第２の核酸鎖、ならびに少なくとも２５の塩基対の二本鎖領域を有するｄｓＮＡであって、ｄｓＮＡの第１の鎖が２５〜３４の長さのヌクレオチドであり、第２の鎖が２６〜３５の長さのヌクレオチドであり、かつその３’末端に１〜５の一本鎖ヌクレオチドを含み、第２のオリゴヌクレオチド鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１標的遺伝子発現を低減するため、第２のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも１９の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４の標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と十分に相補的である、ｄｓＮＡ；
第１の核酸鎖および第２の核酸鎖、ならびに少なくとも２５の塩基対の二本鎖領域を有するｄｓＮＡであって、ｄｓＮＡの第１の鎖が２５〜３４の長さのヌクレオチドであり、第２の鎖が２６〜３５の長さのヌクレオチドであり、かつその３’末端に１〜５の一本鎖ヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端および第２のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端が平滑末端を形成し、第２のオリゴヌクレオチド鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１ｍＲＮＡ発現を低減するため、第２のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも１９の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４の標的ＨＡＯ１配列と十分に相補的である、ｄｓＮＡ；
１９〜３５の長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖を有する核酸であって、オリゴヌクレオチド鎖が、核酸が哺乳類細胞の中に導入される際に、ＨＡＯ１標的ｍＲＮＡ発現を低減させるために、オリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも１９の長さのヌクレオチドに沿って、配列番号１９２１〜２３０４の標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と十分に相補的である、核酸；
１５〜３５の長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖を有する核酸であって、オリゴヌクレオチド鎖が、オリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って、配列番号１９２１〜２３０４の標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列とハイブリッド形成可能である、核酸；
ＲＮＡを有する第１の核酸鎖および第２の核酸鎖を有するｄｓＮＡであって、ｄｓＮＡの第１の鎖が１５〜３５の長さのヌクレオチドであり、第２の鎖が１９〜３５の長さのヌクレオチドであり、第２のオリゴヌクレオチド鎖が、第２のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４の標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列とハイブリッド形成可能である、ｄｓＮＡ；
ＲＮＡを有する第１の核酸鎖および第２の核酸鎖を有するｄｓＮＡであって、ｄｓＮＡの第１の鎖が１５〜３５の長さのヌクレオチドであり、第２の鎖が少なくとも３５の長さのヌクレオチドであり、任意に配列番号３８５〜７６８の少なくとも２５の長さのヌクレオチドの配列を含み、第２のオリゴヌクレオチド鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１標的ｍＲＮＡ発現を低減するため、第２のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４の標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と十分に相補的である、ｄｓＮＡ；
５’末端および３’末端を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖ならびに５’末端および３’末端を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖を有するｄｓＮＡであって、第１の鎖が２５〜５３の長さのヌクレオチド残基であり、第１の鎖の５’末端での第１のヌクレオチド（位置１）から開始して、第１の鎖の位置１〜２３が、リボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドであり；第２の鎖が２７〜５３の長さのヌクレオチド残基であり、かつ二本鎖を形成するためにリボヌクレオチドまたは第１の鎖の位置１〜２３のリボヌクレオチドと塩基対を形成する、２３の連続したリボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドを含み；第１の鎖の５’末端および第２の鎖の３’末端が、平滑末端、１〜６ヌクレオチドの５’オーバーハングおよび１〜６ヌクレオチドの３’オーバーハングの構造を形成し；第１の鎖の３’末端および第２の鎖の５’末端が、平滑末端、１〜６ヌクレオチドの５’オーバーハングおよび１〜６ヌクレオチドの３’オーバーハングの構造を形成し；第１の鎖の３’末端ヌクレオチド残基の位置２４のうち少なくとも１つが、第２の鎖のデオキシリボヌクレオチドと任意に塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドであり；第２の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１標的ｍＲＮＡ発現を低減するため、第２のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４の標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と十分に相補的である、ｄｓＮＡ；
５’末端および３’末端を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖ならびに５’末端および３’末端を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖を有するｄｓＮＡであって、第２の鎖が２７〜５３の長さのヌクレオチド残基であり、第２の鎖の５’末端での第１のヌクレオチド（位置１）から開始して、第２の鎖の位置１〜２３が、リボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドであり；第１の鎖が２５〜５３の長さのヌクレオチド残基であり、かつ二本鎖を形成するために第２の鎖の位置１〜２３のリボヌクレオチドと十分に塩基対を形成する、２３の連続したリボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドを含み；第２の鎖の３’末端ヌクレオチド残基の位置２４のうち少なくとも１つが、第１の鎖のデオキシリボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドと任意に塩基対を形成する、デオキシリボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドであり；第２の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１標的ｍＲＮＡ発現を低減するため、第２のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４の標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と十分に相補的である、ｄｓＮＡ；
５’末端および３’末端を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖ならびに５’末端および３’末端を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖を有するｄｓＮＡであって、５’末端の各々が５’末端ヌクレオチドを有し、３’末端の各々が３’末端ヌクレオチドを有し、第１の鎖（または第２の鎖）が２５〜３０の長さのヌクレオチド残基であり、５’末端ヌクレオチド（位置１）から開始して、第１の鎖（または第２の鎖）の位置１〜２３が、少なくとも８のリボヌクレオチドを含み；第２の鎖（または第１の鎖）が３６〜６６の長さのヌクレオチド残基であり、３’末端ヌクレオチドから開始して、二本鎖を形成するために第１の鎖の位置１〜２３と対を形成する位置に少なくとも８のリボヌクレオチドを含み；第２の鎖（または第１の鎖）の少なくとも３’末端ヌクレオチドが第１の鎖（または第２の鎖）と対になっておらず、最大６の連続した３’末端ヌクレオチドが第１の鎖（または第２の鎖）と対になっておらず、それによって１〜６ヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングを形成し；第２の鎖（または第１の鎖）の５’末端が、第１の鎖（または第２の鎖）と対になっていない１０〜３０の連続したヌクレオチドを含み、それによって１０〜３０ヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングを形成し；第１の鎖および第２の鎖が最大の相補性でアライメントされる場合、少なくとも第１の鎖（または第２の鎖）の５’末端および３’末端ヌクレオチドが、第２の鎖（または第１の鎖）のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって第１の鎖と第２の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し；第２の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に標的遺伝子発現を低減するため、第２の鎖のうち少なくとも１９の長さのリボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡと十分に相補的である、ｄｓＮＡ；
５’末端および３’末端を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖ならびに５’末端および３’末端を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖を有するｄｓＮＡであって、５’末端の各々が５’末端ヌクレオチドを有し、３’末端の各々が３’末端ヌクレオチドを有し、第１の鎖が２５〜３５の長さのヌクレオチド残基であり、５’末端ヌクレオチド（位置１）から開始して、第２の鎖の位置１〜２５が少なくとも８のリボヌクレオチドを含み；第２の鎖が３０〜６６の長さのヌクレオチド残基であり、３’末端ヌクレオチドから開始して、二本鎖を形成するために第１の鎖の位置１〜２５と対を形成する位置に少なくとも８のリボヌクレオチドを含み；第２の鎖の５’末端が、第１の鎖と対になっていない５〜３５の連続したヌクレオチドを含み、それによって５〜３５ヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングを形成し；第１の鎖および第２の鎖が最大の相補性でアライメントされる場合、少なくとも第１の鎖の５’末端および３’末端ヌクレオチドが、第２の鎖のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって第１の鎖と第２の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し；第２の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１標的ｍＲＮＡ発現を低減するため、第２のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４の標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と十分に相補的である、ｄｓＮＡ；
５’末端および３’末端を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖ならびに５’末端および３’末端を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖を有するｄｓＮＡであって、５’末端の各々が５’末端ヌクレオチドを有し、３’末端の各々が３’末端ヌクレオチドを有し、第２の鎖が１９〜３０の長さのヌクレオチド残基であり、任意に２５〜３０の長さのヌクレオチド残基であり、５’末端ヌクレオチド（位置１）から開始して、第２の鎖の位置１〜１７（任意に位置１〜２３）が、少なくとも８のリボヌクレオチドを含み；第１の鎖が２４〜６６の長さのヌクレオチド残基（任意に３０〜６６の長さのヌクレオチド残基）であり、３’末端ヌクレオチドから開始して、二本鎖を形成するために第２の鎖の位置１〜１７（任意に位置１〜２３）と対を形成する位置に少なくとも８のリボヌクレオチドを含み；第１の鎖の３’末端および第２の鎖の５’末端が、平滑末端、３’オーバーハングおよび５’オーバーハングの構造を含み、任意にオーバーハングは１〜６の長さのヌクレオチドであり；第１の鎖の５’末端が、第２の鎖と対になっていない５〜３５の連続したヌクレオチドを含み、それによって５〜３５ヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングを形成し；第１の鎖および第２の鎖が最大の相補性でアライメントされる場合、少なくとも第２の鎖の５’末端および３’末端ヌクレオチドが、第１の鎖のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって第１の鎖と第２の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し；第２の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にＨＡＯ１標的ｍＲＮＡ発現を低減するため、第２のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って配列番号１９２１〜２３０４の標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と十分に相補的である、ｄｓＮＡ；
第１の鎖および第２の鎖を有するｄｓＮＡであって、第１の鎖および第２の鎖が１９〜２５の長さのヌクレオチドの二本鎖領域を形成し、第１の鎖が、第１の鎖−第２の鎖の二本鎖領域を超えて伸長し、かつテトラループを含む３’領域を含み、ｄｓＮＡが第１の鎖の３’末端と第２の鎖の５’末端との間に不連続性をさらに含み、第１の鎖または第２の鎖が、ｄｓＮＡが哺乳類細胞の中に導入される際に、ＨＡＯ１標的ｍＲＮＡ発現を低減させるために、第１の鎖または第２の鎖のうち少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って、配列番号１９２１〜２３０４の標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と十分に相補的である、ｄｓＮＡ；
５’末端および３’末端を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖ならびに５’末端および３’末端を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖を有するｄｓＮＡであって、５’末端の各々が５’末端ヌクレオチドを有し、３’末端の各々が３’末端ヌクレオチドを有し、第１のオリゴヌクレオチド鎖が２５〜５３の長さのヌクレオチドであり、第２のオリゴヌクレオチド鎖が２５〜５３の長さのヌクレオチドであり、ｄｓＮＡが、ｄｓＮＡのｄｉｃｅｒ開裂を実質的に防止するのに十分なほど多く改変され、任意にｄｓＮＡが、哺乳類細胞中でＬＤＨｍＲＮＡ発現を低減できる１つ以上の１９〜２３の長さのヌクレオチド鎖ｄｓＮＡを得るために、非ｄｉｃｅｒヌクレアーゼによって切断される、ｄｓＮＡ；
外来核酸配列および配列番号１９２１〜２３０４の標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列を持つ細胞内のｉｎ  ｖｉｖｏハイブリッド形成複合体；ならびに
外来核酸配列および配列番号１９２１〜２３０４の標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列を持つ細胞内のｉｎ  ｖｉｔｒｏハイブリッド形成複合体。
【００５９】
１つの実施形態では、本発明のｄｓＮＡは、少なくとも２５の塩基対の二本鎖領域を有し、ｄｓＮＡが、１ナノモル濃度以下の細胞の環境中での有効濃度においてｉｎ  ｖｉｔｒｏの哺乳類細胞中でアッセイされる際に、標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡの発現の低減において同一の標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡの少なくとも１９のヌクレオチドを対象とする２１マーｓｉＲＮＡよりも大きな効力を有する。
【００６０】
別の実施形態では、本発明のｄｓＮＡは、少なくとも２５の塩基対の二本鎖領域を有し、ｄｓＮＡが、１ナノモル濃度、２００ピコモル濃度、１００ピコモル濃度、５０ピコモル濃度、２０ピコモル濃度、１０ピコモル濃度、５ピコモル濃度、２ピコモル濃度および１ピコモル濃度でｉｎ  ｖｉｔｒｏの哺乳類細胞中でアッセイされる際に、標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡの発現の低減において同一の標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡの少なくとも１９のヌクレオチドを対象とする２１マーｓｉＲＮＡよりも大きな効力を有する。
【００６１】
追加的な実施形態では、本発明のｄｓＮＡは、第２のオリゴヌクレオチドの１５または１９の連続したヌクレオチドが、標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と最大の相補性でアライメントされる場合、第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１５または１９ヌクレオチドの１５または１９の連続したヌクレオチドに沿って、標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列に対して４以下のミスマッチ核酸残基を有する。
【００６２】
別の実施形態では、本発明のｄｓＮＡは、第２のオリゴヌクレオチドの１５または１９の連続したヌクレオチドが、標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と最大の相補性でアライメントされる場合、第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１５または１９ヌクレオチドの１５または１９の連続したヌクレオチドに沿って、標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列に対して３以下のミスマッチ核酸残基を有する。
【００６３】
任意に、本発明のｄｓＮＡは、第２のオリゴヌクレオチドの１５または１９の連続したヌクレオチドが、標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と最大の相補性でアライメントされる場合、第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１５または１９ヌクレオチドの１５または１９の連続したヌクレオチドに沿って、標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列に対して２以下のミスマッチ核酸残基を有する。
【００６４】
ある特定の実施形態では、本発明のｄｓＮＡは、第２のオリゴヌクレオチドの１５または１９の連続したヌクレオチドが、標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と最大の相補性でアライメントされる場合、第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１５または１９ヌクレオチドの１５または１９の連続したヌクレオチドに沿って、標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列に対して１つのミスマッチ核酸残基を有する。
【００６５】
１つの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１５または１９ヌクレオチドの１５または１９の連続したヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドの１５または１９の連続したヌクレオチドが、標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と最大の相補性でアライメントされる場合、標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列と完全に相補的である。
【００６６】
任意に、本発明の核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体は単離される。
【００６７】
本発明の別の態様は、哺乳類細胞中で標的ＨＡＯ１遺伝子の発現を低減する方法であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで哺乳類細胞を、細胞中で標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡの発現を低減するのに十分な量の本発明の核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体と接触させることを含む方法を提供する。
【００６８】
任意に、標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ発現は、少なくとも１０％、少なくとも５０％および少なくとも８０〜９０％の量（％により表される）で減少する。
【００６９】
１つの実施形態では、ＨＡＯ１ｍＲＮＡレベルは、細胞がｄｓＮＡと接触してから少なくとも８日後において、少なくとも９０％の量（％により表される）で減少する。
【００７０】
別の実施形態では、ＨＡＯ１ｍＲＮＡレベルは、細胞がｄｓＮＡと接触してから少なくとも１０日後において、少なくとも７０％の量（％により表される）で減少する。
【００７１】
本発明のさらなる態様は、哺乳類中の標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡの発現を低減する方法であって、哺乳類において標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡの発現を低減するのに十分な量で本発明の核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体を哺乳類に投与することを有する方法を提供する。
【００７２】
１つの実施形態では、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中で製剤化される。
【００７３】
別の実施形態では、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体は、１マイクログラム〜５ミリグラム／哺乳類キログラム／日、１００マイクログラム〜０．５ミリグラム／キログラム、０．００１〜０．２５ミリグラム／キログラム、０．０１〜２０マイクログラム／キログラム、０．０１〜１０マイクログラム／キログラム、０．１０〜５マイクログラム／キログラム、および０．１〜２．５マイクログラム／キログラムの投与量で投与される。
【００７４】
ある特定の実施形態では、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体は、１ナノモル濃度以下の細胞の環境中での有効濃度においてｉｎ  ｖｉｔｒｏの哺乳類細胞中でアッセイされる際に、標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡの発現の低減において同一の標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡの少なくとも１９のヌクレオチドを対象とする２１マーｓｉＲＮＡよりも大きな効力を有する。
【００７５】
１つの実施形態では、ＨＡＯ１ｍＲＮＡレベルは、ｄｓＮＡが哺乳類に投与されてから少なくとも３日後において、少なくとも７０％の量（％により表される）で哺乳類の組織中において減少する。
【００７６】
任意に、組織は肝臓組織である。
【００７７】
ある特定の実施形態では、投与ステップには、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、点滴、皮下注射、経皮、エアロゾル、腸、膣、局所、経口または吸入送達が含まれる。
【００７８】
本発明の別の態様は、対象の疾患または障害を治療または予防する方法であって、対象の疾患または障害を治療または予防するのに十分な量で、本発明の核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体のある量を対象に投与することを含む方法を提供する。
【００７９】
１つの実施形態では、疾患または障害は、原発性高シュウ酸尿症１型（ＰＨ１）である。
【００８０】
任意に、対象はヒトである。
【００８１】
本発明のさらなる態様は、本発明の核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体を含む製剤であって、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体が、少なくとも１０％、少なくとも５０％および少なくとも８０〜９０％の量（％により表される）で哺乳類細胞内にｉｎ  ｖｉｔｒｏで導入される際に、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体が、標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡレベルを低減するために有効な量で存在する、製剤を提供する。
【００８２】
１つの実施形態では、有効量は、細胞の環境中で１ナノモル濃度以下、２００ピコモル濃度以下、１００ピコモル濃度以下、５０ピコモル濃度以下、２０ピコモル濃度以下、１０ピコモル濃度以下、５ピコモル濃度以下、２ピコモル濃度以下および１ピコモル濃度以下である。
【００８３】
別の実施形態では、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体が、哺乳類対象の細胞に導入される際に、少なくとも１０％、少なくとも５０％および少なくとも８０〜９０％の量（％により表される）で核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体が、標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡレベルを低減するために有効な量で存在する。
【００８４】
任意に、有効量は、１マイクログラム〜５ミリグラム／キログラム対象／日、１００マイクログラム〜０．５ミリグラム／キログラム、０．００１〜０．２５ミリグラム／キログラム、０．０１〜２０マイクログラム／キログラム、０．０１〜１０マイクログラム／キログラム、０．１０〜５マイクログラム／キログラム、または０．１〜２．５マイクログラム／キログラムの投与量である。
【００８５】
別の実施形態では、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体は、１ナノモル濃度以下の細胞の環境中での有効濃度においてｉｎ  ｖｉｔｒｏの哺乳類細胞中でアッセイされる際に、標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡレベルの低減において同一の標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡの少なくとも１９のヌクレオチドを対象とする２１マーｓｉＲＮＡよりも大きな効力を有する。
【００８６】
本発明のさらなる態様は、本発明の核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体を含む哺乳類細胞を提供する。
【００８７】
本発明の別の態様は、本発明の核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
【００８８】
本発明の追加的な態様は、本発明の核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体およびその使用のための説明書を含むキットを提供する。
【００８９】
本発明のさらなる態様は、本発明の核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリッド形成複合体から本質的になる、ＨＡＯ１阻害活性を有する組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】本明細書中で「ＨＡＯ１−１１７１」標的部位を指す、グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ中の部位を標的とする本発明の例示的なＤｓｉＲＮＡ剤の構造を示す。大文字＝非改変ＲＮＡ、小文字＝ＤＮＡ、太字＝ミスマッチ塩基対ヌクレオチド；矢頭は予想されるＤｉｃｅｒ酵素開裂部位を示し；破線は標的化グリコール酸オキシダーゼ配列内の予想されるＡｒｇｏｎａｕｔｅ２（Ａｇｏ２）開裂部位に相当するセンス鎖（上鎖）配列を示す。
【図２Ａ−２Ｆ】ヒト（ＨｅＬａ）およびマウス（Ｈｅｐａ１−６）細胞中の、それぞれヒトグリコール酸オキシダーゼ（図２Ａおよび２Ｂは、ヒト−マウス共通ＤｓｉＲＮＡの結果を示す一方、図２Ｃおよび２Ｄは、ヒト特有ＤｓｉＲＮＡの結果を示す）およびマウスグリコール酸オキシダーゼ（図２Ｃおよび２Ｄ）のＤｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンを示す、第１次スクリーニングデータを提示している。ヒトＨｅＬａ細胞中の活性を、Ｐｓｉ−Ｃｈｅｃｋ−ＨｓＨＡＯ１プラスミドレポーターアッセイを使用し、ウミシイタケルシフェラーゼ産生のノックダウンをモニタリングして評価した。マウス細胞で試験した各ＤｓｉＲＮＡについては、２つの独立したｑＰＣＲアンプリコンをアッセイした（アンプリコン「４７６−６１１」および「１７７５−１８８８」）。
【図３Ａ−３Ｆ】示したＤｓｉＲＮＡについて観察されたヒトおよびマウスのグリコール酸オキシダーゼ阻害効果のヒストグラムを示す。「Ｐ１」はフェーズ１（第１次スクリーニング）を示し、「Ｐ２」はフェーズ２を示す。フェーズ１において、ＤｓｉＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞（ヒト細胞アッセイ；図３Ａおよび３Ｂ）またはマウス細胞（Ｈｅｐａ１−６細胞アッセイ；図３Ｃ〜３Ｆ）の環境中１ｎＭで試験した。フェーズ２において、ＤｓｉＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞またはマウスのＨｅｐａ１−６細胞の環境中、１ｎＭおよび０．１ｎＭにて試験した（二重アッセイ）。個々のバーは、三重に観察されたヒト（図３Ａおよび３Ｂ）またはマウス（図３Ｃ〜３Ｆ）の平均のグリコール酸オキシダーゼレベルを表し、標準誤差とともに示している。マウスグリコール酸オキシダーゼレベルをＨＰＲＴおよびＲｐｌ２３レベルに対して正規化した。
【図４】最初のｉｎ  ｖｉｖｏマウス実験のフローチャートを示し、グリコール酸塩負荷を含めた。
【図５】ＬＮＰ（ここではＬＮＰ  ＥｎＣｏｒｅ  ２３４５）中で製剤化した０．１ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇの示されたＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡを投与した動物の、マウスの肝臓におけるＨＡＯ１ノックダウンを示す。
【図６】１ｍｇ／ｋｇ量のおよびさらに０．１ｍｇ／ｋｇ量においてもＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡであるＨＡＯ１−１１７１で処理したマウスの肝臓組織において、ＨＡＯ１ｍＲＮＡノックダウンの強力なレベルを観察し、強力な有効性の持続時間を観察した（１ｍｇ／ｋｇおよび０．１ｍｇ／ｋｇ動物の両方で、投与後１２０時間において９０％以上のレベルのノックダウンを観察した）ことを示す。
【図７Ａ−７Ｅ】０．１ｎＭ（二重アッセイ）および１ｎＭで試験したヒトＨｅＬａ細胞（図７Ｂおよび７Ｃ）ならびに０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ（二重アッセイ）および１ｎＭで試験した８つの二本鎖サブセットのマウスＨｅｐａ１−６細胞（図７Ｄおよび７Ｅ）における、４つの異なるガイド（アンチセンス）鎖の２’−Ｏ−メチル改変パターン（図７Ａで示すように、それぞれ「Ｍ１７」、「Ｍ３５」、「Ｍ４８」および「Ｍ８」、ならびに図７Ｂ〜７Ｅについては、パッセンジャー鎖の改変パターン（ここでは「Ｍ１０７」）−ガイド鎖の改変パターン、例えば「Ｍ１０７−Ｍ１７」、「Ｍ１０７−Ｍ３５」、「Ｍ１０７−Ｍ４８」または「Ｍ１０７−Ｍ８」として改変パターンを列挙していることに留意する）に対する２４の独立したＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡ配列の有効性データを示す改変パターンの略図およびヒストグラムを提示している。
【図８Ａ−８Ｅ】０．１ｎＭ（二重アッセイ）および１ｎＭで試験したヒトＨｅＬａ細胞（図８Ｂおよび８Ｃ）ならびに０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ（二重アッセイ）および１ｎＭで試験した８つの二本鎖サブセットのマウスＨｅｐａ１−６細胞（図８Ｄおよび８Ｅ）における、４つの異なるパッセンジャー（センス）鎖の２’−Ｏ−メチル改変パターン（図８Ａで示すように、それぞれ「Ｍ１０７」、「Ｍ１４」、「Ｍ２４」および「Ｍ２５０」、ならびに図８Ｂ〜８Ｅについては、パッセンジャー鎖の改変パターン−ガイド鎖の改変パターン（ここでは「Ｍ４８」）、例えば「Ｍ１０７−Ｍ４８」、「Ｍ１４−Ｍ４８」、「Ｍ２４−Ｍ４８」または「Ｍ２５０−Ｍ４８」として改変パターンを列挙していることに留意する）に対する２４の独立したＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡ配列の有効性データを示す改変パターンの略図およびヒストグラムを提示している。
【図９Ａ−９Ｌ】０．１ｎＭ（二重アッセイ）および１ｎＭで試験したヒトＨｅＬａ細胞（図９Ｅ〜９Ｈ）またはＨＥＫ２９３−ｐｃＤＮＡ  ＨＡＯ１細胞（図９Ｉ〜９Ｌ）において、ウミシイタケルシフェラーゼ産生のノックダウンをモニタリングするＰｓｉ−Ｃｈｅｃｋ−ＨｓＨＡＯ１プラスミドレポーターアッセイ（図９Ｅ〜９Ｈ）、またはＨＡＯ１で安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３−ｐｃＤＮＡ  ＨＡＯ１細胞；図９Ｉ〜９Ｌ）のいずれかを用いて、示されたパッセンジャー（センス）鎖およびガイド（アンチセンス）鎖の２’−Ｏ−メチル改変パターン（パッセンジャー鎖の改変パターン−ガイド鎖の改変パターンとして改変パターンを列挙していることに留意する）に対する２４の独立したＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡ配列の有効性データを示す改変パターンの略図およびヒストグラムを提示している。
【図１０Ａ−１０Ｏ】０．１ｎＭ（二重アッセイ）および１ｎＭでアッセイした、ＨＡＯ１で安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３−ｐｃＤＮＡ  ＨＡＯ１細胞）において、示されたパッセンジャー（センス）鎖およびガイド（アンチセンス）鎖の２’−Ｏ−メチル改変パターン（上記のように、パッセンジャー鎖の改変パターン−ガイド鎖の改変パターンとして改変パターンを列挙していることに留意する）に対する４つの独立したＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡ配列の有効性データを示す改変パターンの略図およびヒストグラムを提示している。
【図１１Ａ−１１Ｆ】ＨＡＯ１−１１７１、ＨＡＯ１−１３１５、ＨＡＯ１−１３７８およびＨＡＯ１−１５０１ＤｓｉＲＮＡの改変パターンおよび配列、ならびに０．１ｎＭ、０．０１ｎＭおよび０．００１ｎＭのＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡ濃度で、ＨＡＯ１で安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３−ｐｃＤＮＡ  ＨＡＯ１細胞）においてアッセイした場合の、関連する阻害有効性の結果（ヒストグラムおよびＩＣ５０曲線）を提示している。
【図１２Ａ−１２Ｆ】示すとおりの、広範囲に改変したＨＡＯ１−１１７１およびＨＡＯ１−１３７６ＤｓｉＲＮＡの改変パターンおよび配列（図１２Ａ〜１２Ｄ）、ならびに０．１ｎＭ、０．０１ｎＭおよび０．００１ｎＭのＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡ濃度で、ＨＡＯ１で安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３−ｐｃＤＮＡ  ＨＡＯ１細胞）においてアッセイした場合の、関連する阻害有効性の結果（図１２Ｅおよび１２Ｆのヒストグラム）を提示している。
【図１３Ａ−１３Ｌ】マウス（図１３Ａ〜１３Ｋ）および非ヒト霊長類（図１３Ｌ）の両方における、ＬＮＰで製剤化したＨＡＯ１標的化二本鎖の広範囲な改変形態のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性（阻害の動態および持続時間を含む）を実証する。
【発明を実施するための形態】
【００９１】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにてグリコール酸オキシダーゼ（ＨＡＯ１）遺伝子のレベルおよび／または発現を低減することが可能な、核酸、例えば二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を含む組成物、ならびにそれらを調製する方法を目的とする。ｄｓＲＮＡの鎖の１つは、標的とするＨＡＯ１転写産物の破壊および／または翻訳阻害を対象とし得る１９〜３５ヌクレオチドの範囲の長さを持つヌクレオチド配列の領域を含む。
【００９２】
定義
他に定義しない限り、本明細書で使用するところの全ての技術的かつ科学的語句は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を持つ。以下の参照は、本発明で使用される多くの語句の一般的な定義を当業者に提供する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  （１９９１）；  ａｎｄ  Ｈａｌｅ  ＆  Ｍａｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用するように、以下の語句は、他で特定しない限り、以下のそれらに帰する意味を持つ。
【００９３】
本発明は、グリコール酸オキシダーゼ発現を調節（例えば阻害）可能な１つ以上のＤｓｉＲＮＡ分子を特徴とする。本発明のＤｓｉＲＮＡは任意に、グリコール酸オキシダーゼ誤調節に関連した疾患または障害（例えば、原発性高シュウ酸尿症１型（ＰＨ１）または肝臓、腎臓などの他の疾患もしくは障害）の維持または発展に関連した他の遺伝子および／または遺伝子産物のモジュレータと組み合わせて使用可能である。本発明のＤｓｉＲＮＡ剤は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第ＮＭ＿０１７５４５．２号（ヒトＨＡＯ１）および第ＮＭ＿０１０４０３．２号（マウスＨＡＯ１）によって表されるｃＤＮＡ配列に対応するもののようなグリコール酸オキシダーゼ（ヒドロキシ酸オキシダーゼ１、すなわちＨＡＯ１）ＲＮＡを調節し、それらは本明細書で一般的に「グリコール酸オキシダーゼ」または「ヒドロキシ酸オキシダーゼ１」と呼ばれる。
【００９４】
本発明の種々の態様および実施形態の以下の記述が、本明細書中で一般的にグリコール酸オキシダーゼと呼ばれる例示的なグリコール酸オキシダーゼＲＮＡに関して提供される。しかしながら、このような記載は単なる例示を意味するのみであり、本発明の種々の態様および実施形態はまた、変異体グリコール酸オキシダーゼＲＮＡまたはさらなるグリコール酸オキシダーゼスプライスバリアントのような、代替的なグリコール酸オキシダーゼＲＮＡも対象とする。また、特定の態様および実施形態はグリコール酸オキシダーゼ経路に関与する他の遺伝子をも対象とし、その誤調節がグリコール酸オキシダーゼの誤調節に関連して作用する（例えばグリコール酸オキシダーゼの調節に影響されるか、またはグリコール酸オキシダーゼの調節に影響を与える）ことにより治療のために標的化され得る表現型効果（例えば、グリオキシル酸塩および／またはシュウ酸塩の過剰産生）を産出する遺伝子を含む。ＤＡＯおよびＡＧＴは、グリコール酸オキシダーゼと相互作用する遺伝子の例である。グリコール酸オキシダーゼと共に作用する経路のそれらを含む、このような追加の遺伝子は、グリコール酸オキシダーゼ−標的化ｄｓＲＮＡの利用に関して本明細書で記述されたｄｓＲＮＡおよび方法を用いて標的とされ得る。したがって、他の遺伝子の阻害もしくはおよびこのような阻害の効果、または上方制御およびこのような上方制御の効果を、本明細書で記述したように実施できる。
【００９５】
語句「グリコール酸オキシダーゼ」は、グリコール酸オキシダーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドをコードする核酸配列を意味する（例えば、グリコール酸オキシダーゼ（ＨＡＯ１）Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号第ＮＭ＿０１７５４５．２号および第ＮＭ＿０１０４０３．２号の配列のような、グリコール酸オキシダーゼ転写産物）。ある特定の実施形態では、語句「グリコール酸オキシダーゼ」はまた、他のグリコール酸オキシダーゼアイソフォーム、変異体グリコール酸オキシダーゼ遺伝子、グリコール酸オキシダーゼ遺伝子のスプライスバリアント、およびグリコール酸オキシダーゼ遺伝子多型などの、他のグリコール酸オキシダーゼコード配列を含むことも意味する。語句「グリコール酸オキシダーゼ」は、グリコール酸オキシダーゼ遺伝子／転写産物のポリペプチド遺伝子産物、例えば、グリコール酸オキシダーゼ（ＨＡＯ１）Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号第ＮＰ＿０６００１５．１号および第ＮＰ＿０３４５３３．１号によってコードされたものなどの、グリコール酸オキシダーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチド指すためにも使用される。
【００９６】
本明細書で使用するところの、「グリコール酸オキシダーゼ関連疾患または障害」は、変化したグリコール酸オキシダーゼ発現、レベルおよび／または活性に関連すると当業者に知られている疾患または障害を意味する。とりわけ、「グリコール酸オキシダーゼ−関連疾患または障害」または「ＨＡＯ１−関連疾患または障害」は、限定されないが原発性高シュウ酸尿症（ＰＨ１）を含む、腎臓、肝臓、皮膚、骨、目および他の臓器の疾患または障害を含む。
【００９７】
ある特定の実施形態では、グリコール酸オキシダーゼ標的配列のｄｓＲＮＡ−媒介阻害を評価する。このような実施形態では、グリコール酸オキシダーゼＲＮＡレベルは、任意に、このような抗−グリコール酸オキシダーゼｄｓＲＮＡが存在しないものに対する本発明の抗−グリコール酸オキシダーゼｄｓＲＮＡの存在下でのグリコール酸オキシダーゼレベルの比較を介して、本技術分野で認識された方法（例えばＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロット、発現アレイなど）によって評価可能である。ある特定の実施形態では、抗−グリコール酸オキシダーゼｄｓＲＮＡの存在下でのグリコール酸オキシダーゼレベルを、ビヒクルのみの存在下、関連のない標的ＲＮＡを対象とするｄｓＲＮＡの存在下、または処置を全く行っていない状態で、観察したものと比較する。
【００９８】
また、グリコール酸オキシダーゼタンパク質のレベルを評価可能であること、ならびにグリコール酸オキシダーゼタンパク質のレベルが、異なる条件下で、グリコール酸オキシダーゼＲＮＡレベルおよび／またはｄｓＲＮＡが、グリコール酸オキシダーゼ発現を阻害する程度まで直接的もしくは間接的に関連することが認識されており、したがってグリコール酸オキシダーゼタンパク質レベルを評価する本技術分野で認識されている方法（例えばウェスタンブロット、免疫沈降、他の抗体に基づく方法など）もまた、本発明のｄｓＲＮＡの阻害効果を試験するために使用できる。
【００９９】
選択された対照と比較して、本発明の抗グリコール酸オキシダーゼｄｓＲＮＡがある系（例えば、無細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ系）、細胞、組織または生命体に投与された時にグリコール酸オキシダーゼＲＮＡ（またはグリコール酸オキシダーゼタンパク質が評価される場合、グリコール酸オキシダーゼタンパク質レベル）における統計学的に有意な減少が見られた場合に、本発明の抗グリコール酸オキシダーゼｄｓＲＮＡが「グリコール酸オキシダーゼ阻害活性」を有すると見なされる。実験値の分布と実施された再現アッセイ数が、どのレベルのグリコール酸オキシダーゼＲＮＡの減少（％または絶対値のいずれかとして）が（本技術分野で公知の統計学的有意差を決定する標準の方法によって評価されるように）統計学的に有意と判断されるかのパラメータを決定づける傾向にある。しかしながら、ある特定の実施形態では、「グリコール酸オキシダーゼ阻害活性」は、系、細胞、組織もしくは生命体におけるグリコール酸オキシダーゼのレベルの減少の％または絶対レベルに基づいて定義される。例えば、ある特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡの存在下で、好適な対照に対して見られるグリコール酸オキシダーゼレベルと比較して、グリコール酸オキシダーゼＲＮＡの少なくとも５％の減少または少なくとも１０％の減少が観察される場合に、本発明のｄｓＲＮＡは、グリコール酸オキシダーゼ阻害活性を有すると見なされる。（例えば、ある特定の実施形態では、対照と比較して、グリコール酸オキシダーゼレベルの５％または１０％の減少が観察される場合に、組織および／または対象のｉｎ  ｖｉｖｏでのグリコール酸オキシダーゼレベルが、本発明のｄｓＲＮＡ剤によって阻害されると見なすことができる。）特定の他の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、グリコール酸オキシダーゼＲＮＡレベルが、選択された対照と比較して少なくとも１５％、選択された対照と比較して少なくとも２０％、選択された対照と比較して少なくとも２５％、選択された対照と比較して少なくとも３０％、選択された対照と比較して少なくとも３５％、選択された対照と比較して少なくとも４０％、選択された対照と比較して少なくとも４５％、選択された対照と比較して少なくとも５０％、選択された対照と比較して少なくとも５５％、選択された対照と比較して少なくとも６０％、選択された対照と比較して少なくとも６５％、選択された対照と比較して少なくとも７０％、選択された対照と比較して少なくとも７５％、選択された対照と比較して少なくとも８０％、選択された対照と比較して少なくとも８５％、選択された対照と比較して少なくとも９０％、選択された対照と比較して少なくとも９５％、選択された対照と比較して少なくとも９６％、選択された対照と比較して少なくとも９７％、選択された対照と比較して少なくとも９８％、または選択された対照と比較して少なくとも９９％減少することが観察される場合に、グリコール酸オキシダーゼ阻害活性を持つと見なされる。いくつかの実施形態では、グリコール酸オキシダーゼの完全阻害が、ｄｓＲＮＡがグリコール酸オキシダーゼ阻害活性をもつと見なされるために必要とされる。特定のモデル（例えば細胞培養液）において、ｄｓＲＮＡは、好適��対照と比較してグリコール酸オキシダーゼレベルの少なくとも５０％減少が観察される場合に、グリコール酸オキシダーゼ阻害活性を有すると見なされる。特定の他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、好適な対照と比較してグリコール酸オキシダーゼレベルの少なくとも８０％減少が観察される場合に、グリコール酸オキシダーゼ阻害活性を有すると見なされる。
【０１００】
特定の例として、以下の実施例２において、一連のＤｓｉＲＮＡ標的化グリコール酸オキシダーゼをｉｎ  ｖｉｔｒｏにてヒトＨｅＬａまたはマウスＨｅｐａ１−６細胞中のグリコール酸オキシダーゼｍＲＮＡレベルを減少させる能力に関して、このような細胞の環境下およびトランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で１ｎＭ濃度にて、試験した。以下の実施例２では、アッセイした条件下でグリコール酸オキシダーゼｍＲＮＡレベルの少なくとも５０％の減少に効果があると観察されたＤｓｉＲＮＡに対してグリコール酸オキシダーゼ阻害活性があると見なした。またグリコール酸オキシダーゼ阻害活性は、以下の実施例２に対して使用したものと比較して、より厳しいか、より厳しくないいずれかの条件下の、すなわち同一または同様のアッセイおよび条件が使用された場合のｄｓＲＮＡにも起因し得ると考えられる。例えば、ある特定の実施形態では、試験した本発明のｄｓＲＮＡは、好適な対照と比較したグリコール酸オキシダーゼｍＲＮＡレベルの、少なくとも１０％の減少、少なくとも２０％の減少、少なくとも３０％の減少、少なくとも４０％の減少、少なくとも５０％の減少、少なくとも６０％の減少、少なくとも７０％の減少、少なくとも７５％の減少、少なくとも８０％の減少、少なくとも８５％の減少、少なくとも９０％の減少、または少なくとも９５％の減少がｉｎ  ｖｉｔｒｏにて哺乳類細胞内で、細胞環境下で１ｎＭ以下のｄｓＲＮＡ濃度で観察された場合に、グリコール酸オキシダーゼ阻害活性を有すると見なされる。
【０１０１】
本発明の二本鎖ＲＮＡがグリコール酸オキシダーゼ阻害活性を有するかどうかを決定するための他の評価項目の利用も考慮される。特に、１つの実施形態では、グリコール酸オキシダーゼｍＲＮＡレベルを評価することに加えて、またはこの評価に代えて、試験したｄｓＲＮＡのグリコール酸オキシダーゼタンパク質レベルを減少させる能力を（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにて、哺乳類細胞を接触させてから４８時間後に）評価し、好適な対照と比較して、グリコール酸オキシダーゼタンパク質レベルの少なくとも１０％の減少、少なくとも２０％の減少、少なくとも３０％の減少、少なくとも４０％の減少、少なくとも５０％の減少、少なくとも６０％の減少、少なくとも７０％の減少、少なくとも７５％の減少、少なくとも８０％の減少、少なくとも８５％の減少、少なくとも９０％の減少、または少なくとも９５％の減少がｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにて、アッセイした二本鎖ＲＮＡに接触させた哺乳類細胞内で観察される場合に、試験したｄｓＲＮＡがグリコール酸オキシダーゼ阻害活性を有すると見なされる。さらに考慮される評価項目には、例えばグリコール酸オキシダーゼレベルの減少に関する表現型の評価−例えば、全身でのグリオキシル酸塩誘導沈着（例えば、シュウ酸カルシウムの沈着）レベルの上昇に関する表現型の減少が含まれる。
【０１０２】
また、投与される濃度および投与後の持続時間にしたがって調整したグリコール酸オキシダーゼ阻害活性を有するｄｓＲＮＡを構成するものの評価により、グリコール酸オキシダーゼ阻害活性を時間（持続時間）および、濃度範囲（効力）に関して評価することもできる。したがって、ある特定の実施形態では、グリコール酸オキシダーゼ活性の少なくとも５０％の減少が、ｄｓＲＮＡの細胞または臓器への投与後２時間、５時間、１０時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日以上の持続期間で観察／持続される場合に、本発明のｄｓＲＮＡをグリコール酸オキシダーゼ阻害活性を有すると見なす。さらなる実施形態では、グリコール酸オキシダーゼ阻害活性（例えばある特定の実施形態では、少なくとも５０％のグリコール酸オキシダーゼ阻害）が、１ｎＭ以下、５００ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、１００ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、２０ｐＭ以下、１０ｐＭ以下、５ｐＭ以下、２ｐＭ以下、または１ｐＭ以下の濃度にて細胞の環境中で、例えば、本明細書で記述したようなグリコール酸オキシダーゼ阻害活性に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ内で観察された場合、本発明のｄｓＲＮＡを強力なグリコール酸オキシダーゼ阻害剤であると見なす。ある特定の実施形態では、本発明の強力なグリコール酸オキシダーゼ阻害ｄｓＲＮＡは、有効な送達ビヒクル（例えば有効な脂質ナノ粒子製剤）で対象に投与する場合１０ｍｇ／ｋｇ以下の製剤化濃度でグリコール酸オキシダーゼ阻害活性（ある特定の実施形態では、少なくとも２０％グリコール酸オキシダーゼレベルを減少させる）を有し得るｄｓＲＮＡであると定義される。好ましくは、本発明の強力なグリコール酸オキシダーゼ阻害ｄｓＲＮＡは、効果的な伝達ビヒクルで対象に投与された場合５ｍｇ／ｋｇ以下の製剤化濃度でグリコール酸オキシダーゼ阻害活性（例えばある特定の実施形態では、少なくとも５０％のグリコール酸オキシダーゼレベルの減少）を有し得るものとして定義される。より好ましくは、本発明の強力なグリコール酸オキシダーゼ阻害ｄｓＲＮＡは、効果的な伝達ビヒクルで対象に投与された場合５ｍｇ／ｋｇ以下の製剤化濃度にてグリコール酸オキシダーゼ阻害活性（例えばある特定の実施形態では、少なくとも５０％のグリコール酸オキシダーゼレベルの減少）を有し得るものとして定義される。任意に、本発明の強力なグリコール酸オキシダーゼ阻害ｄｓＲＮＡは、効果的な伝達ビヒクルで対象に投与された場合２ｍｇ／ｋｇ以下、またはさらには１ｍｇ／ｋｇ以下の製剤化濃度にてグリコール酸オキシダーゼ阻害活性（例えばある特定の実施形態では、少なくとも５０％のグリコール酸オキシダーゼレベルの減少）を有し得るものとして定義される。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡの効力を、特定のレベルの標的遺伝子ノックダウンを達成するために必要な、標的細胞の細胞質内に存在するｄｓＲＮＡのコピー数を参照して決定する。例えば、ある特定の実施形態では、強力なｄｓＲＮＡは、細胞あたり１０００以下のＲＩＳＣ−ロードアンチセンス鎖コピー数にて標的細胞の細胞質内に存在した場合に、標的ｍＲＮＡの５０％以上のノックダウンを引き起こし得るｄｓＲＮＡである。より好ましくは、強力なｄｓＲＮＡは、細胞あたり５００以下のＲＩＳＣ−ロードアンチセンス鎖コピー数にて標的細胞の細胞質内に存在した場合に、標的ｍＲＮＡの５０％以上のノックダウンを引き起こし得るｄｓＲＮＡである。任意に、強力なｄｓＲＮＡは、細胞あたり３００以下のＲＩＳＣ−ロードアンチセンス鎖のコピー数にて標的細胞の細胞質内に存在した場合に、標的ｍＲＮＡの５０％以上のノックダウンを引き起こし得るｄｓＲＮＡである。
【０１０４】
さらなる実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡの効力は、同一の標的遺伝子内の同一の標的配列を対象とした１９〜２３マーｄｓＲＮＡを参照して定義可能である。例えば、対応する１９〜２３マーｄｓＲＮＡに対して増強した効力を有する本発明のＤｓｉＲＮＡは、効力差の検出を許容するのに十分低い濃度（例えば、本明細書で記述したようなｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ中、細胞の環境中１ｎＭ以下の、細胞の環境中１００ｐＭ以下、細胞の環境中１０ｐＭ以下、細胞の環境中１ｎＭ以下のトランスフェクション濃度；とりわけ効力差は、用量応答曲線を作成してＤｓｉＲＮＡ／ｄｓＲＮＡに関連したＩＣ５０値を同定する目的のための濃度範囲−例えば０．１ｐＭ〜１０ｎＭ−にわたり、このようなアッセイを実施することを介して最もよく検出可能であると認識されている）にて本明細書で記述したｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでアッセイした場合に、対応する１９〜２３マーｄｓＲＮＡと比較して、さらに５％以上、さらに１０％以上、さらに２０％以上、さらに３０％以上、さらに４０％以上、またはさらに５０％以上標的遺伝子を減少させるＤｓｉＲＮＡであり得る。
【０１０５】
グリコール酸オキシダーゼ阻害レベルおよび／またはグリコール酸オキシダーゼレベルはまた間接的に評価してもよく、例えば、対象中の原発性高シュウ酸尿症１型表現型の低減の測定を、グリコール酸オキシダーゼレベルおよび／または本発明の二本鎖核酸のグリコール酸オキシダーゼ阻害効果を評価するために使用してよい。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、語句「から本質的になる」は、本発明の抗−グリコール酸オキシダーゼｄｓＲＮＡに関連して使用される。いくつかのこのような実施形態では、「から本質的になる」は、グリコール酸オキシダーゼ阻害活性の少なくとも特定のレベル（例えば、少なくとも５０％のグリコール酸オキシダーゼ阻害活性）を有する本発明のｄｓＲＮＡを含み、かつ、ｄｓＲＮＡのグリコール酸オキシダーゼ阻害活性に有意に影響を与えない１つ以上のさらなる構成要素および／または改変をも含む、組成物を意味する。例えば、ある特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡの改変および／または組成物中のｄｓＲＮＡ−関連構成要素が、本発明のｄｓＲＮＡ単独と比較して３％超、５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、または５０％超まで（任意にグリコール酸オキシダーゼ阻害活性の効力または持続期間を含む）グリコール酸オキシダーゼ阻害活性を変えない場合、組成物は、本発明のｄｓＲＮＡ「から本質的になる」。ある特定の実施形態では、グリコール酸オキシダーゼ阻害活性のより劇的な減少（例えば、効果、持続期間および／または効力において８０％減少、９０％減少など）がさらなる構成要素または改変の存在下で発生したとしても、まだグリコール酸オキシダーゼ阻害活性がさらなる構成要素および／または改変の存在下で有意に上昇しない（例えば観察されるグリコール酸オキシダーゼ阻害活性のレベルが、本発明の単離されたｄｓＲＮＡに対して観察されるレベルの１０％以内である）場合、組成物は本発明のｄｓＲＮＡから本質的になると見なされる。
【０１０７】
本明細書で使用するところの語句「核酸」は、一本鎖または二本鎖形状のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、または改変ヌクレオチド、およびそれらのポリマーを意味する。本語句は公知のヌクレオチド類似体または改変された骨格残基あるいは結合を含む核酸を網羅し、それらは合成の、天然に存在する、また天然に存在しない核酸であり、参照核酸と同様の結合特性を持ち、かつ参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される。このような類似体の例には、限定するものではないが、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホン酸塩、キラル−メチルホスホン酸塩、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）およびアンロックド核酸（ＵＮＡ、例えばＪｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５２：  １３３−４参照）、ならびにそれらの誘導体が含まれる。
【０１０８】
本明細書で使用するところの「ヌクレオチド」は、本技術分野で認識されているように天然塩基（標準）、および本技術分野でよく知られている改変塩基を持つヌクレオチドを含んで使用される。このような塩基は一般的に、ヌクレオチド糖部分の１’位に位置している。ヌクレオチドは一般的に、塩基、糖およびリン酸基を含む。ヌクレオチドは非改変であるか、糖、リン酸および／または塩基部分にて改変され得る（またヌクレオチド類似体、改変ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチドおよびその他としても互換的に指す；例えば、Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ、上記；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，国際特許公開公報第９２／０７０６５号；Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，国際特許公開公報第ＷＯ  ９３／１５１８７号；Ｕｈｌｍａｎ  ＆  Ｐｅｙｍａｎ参照、これら全ては参照により本明細書に援用される）。Ｌｉｍｂａｃｈ，ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２１８３，１９９４によって要約されたような、本技術分野で公知の改変核酸塩基の種々の例が存在する。核酸分子内に導入可能な塩基改変の非限定例のいくつかとして、ヒポキサンチン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン類（例えば５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン類（例えばリボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば５−ブロモウリジン）または６−アザピリミジン類または６−アルキルピリミジン類（例えば６−メチルウリジン）、プロピン、およびその他（Ｂｕｒｇｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１４０９０，１９９６；Ｕｈｌｍａｎ  ＆  Ｐｅｙｍａｎ，上記）が挙げられる。本態様において、「改変塩基」は、１’位でのアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルまたはそれらの等価物以外のヌクレオチド塩基を意味する。
【０１０９】
本明細書で使用するところの「改変ヌクレオチド」は、ヌクレオシド、ヌクレオ塩基、ペントース環、またはリン酸基への１つ以上の改変を持つヌクレオチドを意味する。例えば、改変ヌクレオチドはアデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン酸、およびシチジン一リン酸を含むリボヌクレオチド類ならびにデオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸、およびデオキシシチジン一リン酸を含むデオキシリボヌクレオチド類を除外する。改変には、メチルトランスフェラーゼのようなヌクレオチドを改変する酵素による改変に由来する天然に発生するものが含まれる。改変ヌクレオチドにはまた、合成または天然に発生しないヌクレオチドが含まれる。ヌクレオチドにおける合成のまたは天然に存在しない改変には、２’改変、例えば２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡまたは他の二環もしくは「架橋型」ヌクレオシド類似体、および２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）または塩基類似体を含むものが含まれる。本開示のために記述されたような２’−改変ヌクレオチドに関しては、「アミノ」によっては２’−ＮＨ２または２’−Ｏ−ＮＨ２が意味され、これらは改変されてよく、または改変されなくてよい。このような改変基は、例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許公開公報第５，６７２，６９５号およびＭａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，２４８，８７８号にて記述されている。本発明の「改変ヌクレオチド」はまた、上述のヌクレオチド類似体を含むことができる。
【０１１０】
本明細書の核酸分子に関して、改変は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の１つまたは両方の鎖上のパターンで、これらの薬剤上に存在してもよい。本明細書で使用するところの「交互位置」は、全ての他のヌクレオチドが改変ヌクレオチドであるか、または定義された長さのｄｓＲＮＡの鎖にわたる各改変ヌクレオチド間で改変されていないヌクレオチド（例えば、改変されていないリボヌクレオチド）が存在する（例えば５’−ＭＮＭＮＭＮ−３’、３’−ＭＮＭＮＭＮ−５’、式中Ｍは改変ヌクレオチドであり、Ｎは改変されていないヌクレオチドである）パターンを意味する。改変パターンは、例えば本明細書で記述したような、位置ナンバリングの慣例にしたがって、５’または３’末端のいずれかの第１のヌクレオチド位置から開始する（ある特定の実施形態では、位置１は、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤の推定されるＤｉｃｅｒ開裂事象の後の鎖の終末残基に関して指定される。したがって位置１は毎回本発明の前処理剤の３’末端または５’末端残基を構成するものではない）。交互位置での改変ヌクレオチドのパターンは、鎖の全長を移動してよいが、ある特定の実施形態では、それぞれ、少なくとも２、３、４、５、６または７つの改変ヌクレオチドを含む、少なくとも４、６、８、１０、１２、１４のヌクレオチドが含まれる。本明細書で使用するところの、「位置の交互対」は、２つの連続した改変ヌクレオチドが、ｄｓＲＮＡの鎖の定義された長さにわたり、２つの連続した改変されていないヌクレオチドによって分離されるパターンを意味する（例えば、５’−ＭＭＮＮＭＭＮＮＭＭＮＮ−３’、３’−ＭＭＮＮＭＭＮＮＭＭＮＮ−５’、式中Ｍは改変ヌクレオチドであり、Ｎは改変されていないヌクレオチドである）。改変パターンは、本明細書で記述したもののような、位置ナンバリングの慣例にしたがって、５’または３’末端いずれかでの、第１のヌクレオチド位置から開始する。交互位置における改変ヌクレオチドのパターンは、鎖の全長を移動してよいが、好ましくは、それぞれ、少なくとも４、６、８、１０、１２または１４の改変ヌクレオチドを含む、少なくとも８、１２、１６、２０、２４、２８のヌクレオチドが含まれる。上記改変パターンは例示であり、本発明の範囲における限定は意図されないことが強調される。
【０１１１】
本明細書で使用するところの「塩基類似体」は、核酸二本鎖に組み込むことが可能な改変ヌクレオチド中のヌクレオチド糖部位の１’位（または核酸二本鎖内に組み込むことが可能なヌクレオチド糖部位置換中の等価の位置）に位置するヘテロ環状部位を意味する。本発明のｄｓＲＮＡにおいて、塩基類似体は一般的に、塩基グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）を除く、プリンまたはピリミジン塩基のいずれかである。塩基類似体は、ｄｓＲＮＡ中他の塩基または塩基類似体と二本鎖となり得る。塩基類似体には、本発明の化合物および方法にて有用なもの、例えば、参考文献によって本明細書に組み込まれている、Ｂｅｎｎｅｒに付与された米国特許第５，４３２，２７２号および第６，００１，９８３号、およびＭａｎｏｈＡＲａｎに付与された米国特許公開公報第２００８０２１３８９１号に開示されたものが含まれる。塩基の非限定例には、ハイポキサンチン（Ｉ）、キサンチン（Ｘ）、３β−Ｄ−リボフラノシル−（２，６−ジアミノピリミジン）（Ｋ）、３−β−Ｄ−リボフラノシル−（１−メチル−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５，７（４Ｈ，６Ｈ）−ジオン）（Ｐ）、イソ−シトシン（ｉｓｏ−Ｃ）、イソ−グアニン（ｉｓｏ−Ｇ）、１−β−Ｄ−リボフラノシル−（５−ニトロインドール）、１−β−Ｄ−リボフラノシル−（３−ニトロピロール）、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、４−チオ−ｄＴ、７−（２−チエニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）およびピロール−２−カルボアルデヒド（Ｐａ）、２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン（Ｓ）、２−オキソピリジン（Ｙ）、ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベンズイミダゾール、４−メチルベンゾイミダゾール、３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリルおよび３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリル、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピリジニル、ピローロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボシチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベンジル、テトラセニル、ペンタセニルおよびそれらの構造誘導体（Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５９：７２３８−７２４２（１９９４）；Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２８（１５）：２９１１−２９１４（２０００）；Ｍｏｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１９：２０５６−２０５７（１９９７）；Ｍｏｒａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：２３２３−２３２４（１９９９）；Ｇｕｃｋｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８：８１８２−８１８３（１９９６）；Ｍｏｒａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２（６）：１００１−１００７（２０００）；ＭｃＭｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓ��ｃ．，１２１：１１５８５−１１５８６（１９９９）；Ｇｕｃｋｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６３：９６５２−９６５６（１９９８）；Ｍｏｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４：１０５０６−１０５１１（１９９７）；Ｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．，１：１９７−２０６（２００２）；Ｓｈｉｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．，１：１６０５−１６１１（２００１）；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２（３２）：７６２１−７６３２（２０００）；Ｏ’Ｎｅｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６７：５８６９−５８７５（２００２）；Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１７：１０４３４−１０４４２（１９９５）；および米国特許第６，２１８，１０８号）が含まれる。塩基類似体はまたユニバーサル塩基であってよい。
【０１１２】
本明細書で使用するところの「ユニバーサル塩基」は、核酸二本鎖中に存在する場合に、二本鎖ヘリックス構造（例えばリン酸塩骨格の構造）を変化させずに、１超の型の塩基と反対に位置可能な、改変ヌクレオチド中のヌクレオチド糖部位の１’位、またはヌクレオチド糖部位置換基中の等価位置に位置するヘテロ環状部位を意味する。さらに、ユニバーサル塩基は、標的核酸に対する二本鎖に属する、一本鎖の核酸の能力を破壊しない。標的核酸である二本鎖にユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸の能力を、当業者に理解される方法（例えば、ＵＶ吸収、円偏光二色性、ゲルシフト、一本鎖ヌクレアーゼ感受性など）によってアッセイ可能である。さらに、二本鎖形成が観察された条件は、二本鎖安定性または形成を決定するために変化してよく、例えば融解温度（Ｔｍ）は、核酸二本鎖の安定性と相関するので、温度を変化させてもよい。標的核酸と正確に相補的である参照一本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、相補的核酸で形成された核酸二本鎖よりも低いＴｍを有する標的核酸と共に二本鎖を形成する。しかしながら、ユニバーサル塩基が単一ミスマッチを産生するために塩基で置換された参照一本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、ミスマッチした塩基を持つ核酸で形成された二本鎖よりも、高いＴｍを有する標的核酸を備える二本鎖を形成する。
【０１１３】
いくつかのユニバーサル塩基は、塩基対形成条件下、ユニバーサル塩基と、全ての塩基グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）との間で水素結合を形成することによって塩基対化可能である。ユニバーサル塩基は、単一相補塩基とのみ塩基対を形成する塩基ではない。二本鎖内で、ユニバーサル塩基は、水素結合を形成しなくてよく、また二本鎖の反対の鎖上の塩基と反対の各Ｇ、Ｃ、Ａ、ＴおよびＵと１つの水素結合または１つ超の水素結合を形成してよい。好ましくは、ユニバーサル塩基は、二本鎖の反対の鎖上の塩基と反対の塩基と相互作用しない。二本鎖において、ユニバーサル塩基間の塩基対化は、リン酸骨格の二本ヘリックス構造を変えずに発生する。ユニバーサル塩基はまた、スタッキング相互作用によって、同一の核酸鎖上の隣接ヌクレオチド中の塩基と相互作用してもよい。このようなスタッキング相互作用は、とりわけ、ユニバーサル塩基が、二本鎖の反対の鎖上の塩基と反対に位置する塩基と任意の水素結合を形成しない条件下で、二本鎖を安定化させる。ユニバーサル−結合ヌクレオチドの非限定例には、イノシン、１−β−Ｄ−リボフラノシル−５−ニトロインドール、および／または１−β−Ｄ−リボフラノシル−３−ニトロピロールが含まれる（Ｑｕａｙらに付与された米国特許出願番号第２００７０２５４３６２号、Ｖａｎ  Ａｅｒｓｃｈｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎ  ａｃｙｃｌｉｃ  ５−ｎｉｔｒｏｉｎｄａｚｏｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ａｓ  ａｍｂｉｇｕｏｕｓ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９５  Ｎｏｖ  １１；２３（２１）：４３６３−７０；Ｌｏａｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，３−Ｎｉｔｒｏｐｙｒｒｏｌｅ  ａｎｄ  ５−ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ  ａｓ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ＰＣＲ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９５  Ｊｕｌ  １１；２３（１３）：２３６１−６；Ｌｏａｋｅｓ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ，５−Ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ  ａｓ  ａｎ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９４  Ｏｃｔ  １１；２２（２０）：４０３９−４３）。
【０１１４】
本明細書で使用するところの「ループ」は、特定の一本鎖ヌクレオチド領域に隣接する相補領域が、相補領域間の一本鎖ヌクレオチド領域が、二本鎖形成またはワトソン−クリック塩基対化から除外される方法でハイブリッド形成する、核酸の一本鎖によって形成される構造を意味する。ループは、任意の長さの一本鎖ヌクレオチド領域である。ループの例には、ヘパリン、ステムループまたは伸長ループのような構造中に存在する、対になっていないヌクレオチドが含まれる。
【０１１５】
本明細書で使用するところの、ｄｓＲＮＡの文脈中の「伸長ループ」は、一本鎖ループ、および加えて、１、２、３、４、５、６または最大２０の塩基対またはループに隣接する二本鎖を意味する。伸長ループ中、５’側上のループに隣接するヌクレオチドは、３’側上でループに隣接するヌクレオチドと二本鎖を形成する。伸長ループはヘアピンまたはステムループを形成してよい。
【０１１６】
本明細書で使用するところの、ｄｓＲＮＡの文脈中の「テトラループ」は、隣接するワトソン−クリックハイブリッド形成ヌクレオチドの安定性に寄与する、安定二次構造を形成する４つのヌクレオチドからなるループ（一本鎖領域）を意味する。理論に限定されるものではないが、テトラループは、スタッキング相互作用によって、隣接するワトソン−クリック塩基対を安定化させてよい。加えて、テトラループ中の４つのヌクレオチド間の相互作用には、非ワトソン−クリック塩基対化、スタッキング相互作用、水素結合、および接触相互作用が含まれるが、これらに限定されるものではない（Ｃｈｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９０  Ａｕｇ  １６；３４６（６２８５）：６８０−２；Ｈｅｕｓ  ａｎｄ  ＰＡＲｄｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１  Ｊｕｌ  １２；２５３（５０１６）：１９１−４）。テトラループは、４つの無作為塩基からなる単一モデルループ配列から推測されるものよりも高い隣接二本鎖融解温度（Ｔｍ）における増加をもたらす。例えば、テトラループは、長さにして少なくとも２塩基対の二本鎖を含むヘアピンに、１０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４中、少なくとも５５℃の融解温度をもたらし得る。テトラループには、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、改変ヌクレオチドおよびそれらの混合物が含まれてよい。ＲＮＡテトラループの例には、テトラループのＵＮＣＧファミリー（例えばＵＵＣＧ）、テトラループのＧＮＲＡファミリー（例えばＧＡＡＡ）、およびＣＵＵＧテトラループが含まれる（Ｗｏｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９０  Ｎｏｖ；８７（２１）：８４６７−７１；Ａｎｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９１  Ｎｏｖ  １１；１９（２１）：５９０１−５）。ＤＮＡテトラループの例には、テトラフープのｄ（ＧＮＮＡ）ファミリー（例えば、ｄ（ＧＴＴＡ）、テトラループのｄ（ＧＮＲＡ））ファミリー、テトラループのｄ（ＧＮＡＢ）ファミリー、テトラループのｄ（ＣＮＮＧ）ファミリー、テトラフープのｄ（ＴＮＣＧ）ファミリー（例えばｄ（ＴＴＣＧ））が含まれる。（Ｎａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（４８），１４２８１−１４２９２，２００２．；ＳＨＩＮＪＩ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｉｐｐｏｎ  Ｋａｇａｋｋａｉ  Ｋｏｅｎ  Ｙｏｋｏｓｈｕ  ＶＯＬ．７８ｔｈ；ＮＯ．２；ＰＡＧＥ．７３１（２０００）．）。
【０１１７】
本明細書で使用するところの語句「ｓｉＲＮＡ」は、各鎖が、ＲＮＡ、ＲＮＡ類似体（類）またはＲＮＡおよびＤＮＡを含む二本鎖核酸を意味する。ｓｉＲＮＡは、１９〜２３ヌクレオチドを含み、または２１ヌクレオチドを含む。ｓｉＲＮＡは、概して、ｓｉＲＮＡ中の二本鎖領域が１７〜２１ヌクレオチド、または１９ヌクレオチドを含むように、各鎖の３’末端上に２ｂｐオーバーハングを有する。概して、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、グリコール酸オキシダーゼ遺伝子／ＲＮＡの標的配列と十分に相補的である。
【０１１８】
ある特定の実施形態では、本発明の抗−グリコール酸オキシダーゼＤｉＲＮＡは、少なくとも２５ヌクレオチドの鎖長を有する。したがって、ある特定の実施形態では、抗−グリコール酸オキシダーゼＤｓｉＲＮＡは、１つのオリゴヌクレオチド配列、長さにして少なくとも２５ヌクレオチドであり、長くても３５、または最大５０以上のヌクレオチドである、第１の配列を含む。このＲＮＡ配列は、長さにして２６〜３５、２６〜３４、２６〜３３、２６〜３２、２６〜３１、２６〜３０、２６〜２９ヌクレオチドであり得る。本配列は、長さにして２７または２８ヌクレオチドであり得、長さにして２７ヌクレオチドであり得る。ＤｓｉＲＮＡ剤の第２の配列は、真核細胞の細胞質内のような生物学的条件下で第１の配列にアニールする配列であり得る。一般的に、第２のオリゴヌクレオチド配列は、第１のオリゴヌクレオチドと少なくとも１９の相補塩基対を持ち、より典型的には、第２のオリゴヌクレオチド配列は、第１のオリゴヌクレオチド配列と、２１以上の相補塩基対を持ち、または２５以上の相補塩基対を持つ。１つの実施形態では、第２の配列は、第１の配列と同一の長さであり、ＤｓｉＲＮＡ剤は平滑末端である。別の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡ剤の末端は１つ以上のオーバーハングを有する。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡ剤の第１および第２のオリゴヌクレオチド配列は、化学的に合成可能で、典型的に化学的に合成される別のオリゴヌクレオチド鎖上に存在する。いくつかの実施形態では、両方の鎖は、長さにして２６〜３５ヌクレオチドである。他の実施形態では、両方の鎖は、長さにして、２５〜３０または２６〜３０である。１つの実施形態では、両方の鎖は、長さにして２７ヌクレオチドであり、完全に相補的であり、平滑末端を有する。本発明のある特定の実施形態では、抗−グリコール酸オキシダーゼＤｓｉＲＮＡの第１および第２の配列は、別のＲＮＡオリゴヌクレオチド（鎖）上に存在する。１つの実施形態では、１つまたは両方のオリゴヌクレオチド鎖は、Ｄｉｃｅｒに対する基質として働くことが可能である。他の実施形態では、少なくとも１つの改変が、遺伝子発現を阻害することにおいて、二本鎖ＲＮＡ構造の有効性を最大化する方向で、Ｄｉｃｅｒが二本鎖ＲＮＡ構造に結合することを促進して存在する。本発明のある特定の実施形態では、抗−グリコール酸オキシダーゼＤｓｉＲＮＡ剤は、第１の鎖（センス鎖）の３’末端で平滑末端を有し、第２の鎖（アンチセンス鎖）の３’末端で３’オーバーハングを有する抗−グリコール酸オキシダーゼＤｓｉＲＮＡと、異なる長さの２つのオリゴヌクレオチド鎖からなる。ＤｓｉＲＮＡはまた、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）塩基置換基を含んでもよい。
【０１２０】
２つの別のオリゴヌクレオチドを含む好適なＤｓｉＲＮＡ組成物は、化学結合基によって、それらのアニーリング領域外で化学的に連結可能である。多くの好適な化学連結基が、本技術分野で公知であり、使用可能である。好適な基は、ＤｓｉＲＮＡにおけるＤｉｃｅｒ活性を妨げず、標的遺伝子から転写されたＲＮＡの指向性破壊と干渉しない。あるいは、２つの別のオリゴヌクレオチドは、ヘアピン構造が、ＤｓｉＲＮＡ組成物を作製している２つのオリゴヌクレオチドのアニーリングに際して産生されるように、第３のオリゴヌクレオチドによって連結可能である。ヘアピン構造は、ＤｓｉＲＮＡ上のＤｉｃｅｒ活性を妨げず、標的ＲＮＡの指向性破壊と干渉しない。
【０１２１】
ｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の全ての残基が、標的分子内の残基に相補的であるようにデザイン可能である。あるいは、置換を、分子の安定性を増大させ、かつ／または処理活性を増強するために、分子内で実施可能である。置換は、鎖内にて実施可能であり、または鎖の末端での残基にて実施可能である。ある特定の実施形態では、置換および／または改変は、ＤｓｉＲＮＡ剤内の特定の残基にて実施される。このような置換および／または改変には、例えばＤｓｉＲＮＡ剤のセンス鎖の３’末端位置からナンバリングした場合、位置１、２および３の残基の１つ以上でのデオキシ−改変、ならびにＤｓｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の３’末端残基での、２’−Ｏ−アルキル（例えば２’−Ｏ−メチル）改変の導入が含まれ、このような改変はまた、アンチセンス鎖の３’末端のオーバーハング位置、および活性ｓｉＲＮＡ剤を形成するために処理されるＤｓｉＲＮＡ剤の領域内に含まれるＤｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の交互残基にて実施される。以上の改変は、例示的なものとして提供され、任意の様式にて限定されるよう意図するものではない。本発明の抗−グリコール酸オキシダーゼＤｓｉＲＮＡ剤において実施可能な改変および置換のさらなる記述を含む、好ましいＤｓｉＲＮＡ剤の構造のさらなる考慮を以下で見ることが可能である。
【０１２２】
第１の配列が、本明細書の第２の配列に関して「実質的に相補的である」配列を指す場合、２つの配列は完全に相補的であってよく、またはそれらの最終的な適用に最も関連する条件下でハイブリッド形成する能力を維持したまま、それら２つの配列は、ハイブリッド形成に際して、１つ以上、しかしながら一般的に４、３または２以下のミスマッチ塩基を形成してよい。しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリッド形成に際して、１つ以上の一本鎖オーバーハングを形成するようにデザインされる場合、このようなオーバーハングは、相補性の決定に関して、ミスマッチとして見なされるものではない。例えば、１つの２１の長さのオリゴヌクレオチドおよび別の２３の長さのオリゴヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡであって、長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドと完全に相補的な２１のオリゴヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡが、本発明の目的となる「完全に相補的である」ことをさらに意味してもよい。
【０１２３】
本明細書で使用する、語句「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」は、上記で定義したような、２つの逆平行および実質的に相補的な核酸鎖を含む二本鎖構造を持つ、リボ核酸分子の複合体を意味する。二本鎖構造を形成する２つの鎖は、１つの大きなＲＮＡ分子の異なる部分であってよく、または別々のＲＮＡ分子であってよい。別々のＲＮＡ分子の場合、このようなｄｓＲＮＡは、多くの場合ｓｉＲＮＡ（「短い干渉ＲＮＡ」）またはＤｓｉＲＮＡ（「Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡ」）を指す。２つの鎖が１つの大きな分子の一部分であり、したがって二本鎖構造を形成する１つの鎖の３’末端と、別の他の鎖の５’末端間のヌクレオチドの連鎖によって連結される場合、連結しているＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」、「短ヘアピンＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」を指す。２つの鎖が、二本鎖構造を形成する１つの鎖の３’末端と、別の他の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連鎖以外の方法によって共有的に連結する場合、連結している構造は、「リンカー」を指す。ＲＮＡ鎖は、同一または異なる数のヌクレオチドを有していてもよい。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最も短い鎖中のヌクレオチドの数マイナス二本鎖中に存在する任意のオーバーハングである。二本鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは、１つ以上のヌクレオチドオーバーハングを含んでよい。加えて、本明細書で使用するところの「ｄｓＲＮＡ」は、多重ヌクレオチドにおける実質的改変を含み、かつ本明細書で開示されたか、本技術分野で公知の全ての型の改変を含む、リボヌクレオチド、ヌクレオシド間結合、末端基、キャップおよび共役部位への化学的改変が含まれ得る。ｓｉＲＮＡ−またはＤｓｉＲＮＡ−型分子内で使用されるような、任意のこのような改変は、本明細書および特許請求の範囲のための「ｄｓＲＮＡ」によって包含される。
【０１２４】
語句「二本鎖領域」は、ワトソン−クリック塩基対化、もしくは相補的であるか、もしくは実質的に相補的であるオリゴヌクレオチド鎖間の二本鎖を許容する他の様式のいずれかによって、互いに塩基対を形成する２つの相補的であるか、または本質的に相補的なオリゴヌクレオチド中の領域を意味する。例えば、２１ヌクレオチドユニットを有するオリゴヌクレオチド鎖は、別の２１ヌクレオチドユニットのオリゴヌクレオチドと塩基対化可能であり、さらには、「二本鎖領域」が１９塩基対からなるように、各鎖上の１９塩基のみが、相補的であるか、または実質的に相補的である。残りの塩基対は、例えば、５’および３’オーバーハングとして存在してもよい。さらに、二本鎖領域内で、１００％相補性は必要ではなく、実質的な相補性が二本鎖領域内で許容可能である。実質的な相補性は、生物学的条件下でアニーリング可能であるような、鎖間の相補性を意味する。２つの鎖が、生物学的条件下でアニーリング可能であるかどうかを実験的に決定するための技術は、当業者によく知られている。あるいは、２つの鎖を、互いにアニールするかどうかを決定するために、合成でき、かつ生物学的条件下で共に添加できる。
【０１２５】
多数の塩基にわたり塩基対を形成する一本鎖核酸が、「ハイブリッドする」と呼ばれる。ハイブリッド形成は、概して、生理学的または生物学的に関連のある条件（例えば、細胞内：ｐＨ７．２、１４０ｍＭカリウムイオン、細胞外ｐＨ７．４、１４５ｍＭナトリウムイオン）下で決定される。ハイブリッド形成条件は一般的に、一価カチオンと生物学的に許容可能な緩衝液とを含み、二価カチオン、複合体アニオン、例えばグルタミン酸カリウム由来のグルタミン酸、スクロースのような非荷電種、および試料中の水の活性を減少させるための不活性ポリマー、例えばＰＥＧを含んでよく、または含まなくてよい。このような条件には、塩基対が形成される条件が含まれる。
【０１２６】
ハイブリッド形成は、二本鎖を形成している一本鎖核酸を乖離させるために必要な温度、すなわち（融解温度；Ｔｍ）によって測定される。ハイブリッド形成条件はまた、塩基対が形成され得る条件下であり得る。種々の厳密性条件を使用して、ハイブリッド形成を決定可能である（例えばＷａｈｌ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９；Ｋｉｍｍｅｌ．Ａ．Ｒ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照のこと）。厳密性温度条件は通常、少なくとも約３０℃の、より好ましくは少なくとも約３７℃、最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度を含む。長さにして５０塩基対未満であると予想されるハイブリッドに対するハイブリッド形成温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）よりも５〜１０℃低くあるべきであり、ここでＴｍは、以下の等式にしたがって決定される。長さにして１８塩基対以下のハイブリッドでは、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の＃）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の＃）。長さにして１８〜４９塩基対のハイブリッドにでは、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、式中Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、［Ｎａ＋］はハイブリッド形成緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣ＝０．１６５Ｍでの［Ｎａ＋］）。例えば、ハイブリッド形成決定緩衝液を表１に示す。
【表１−１】
2020036603.tif 000003
【表１−２】
2020036603.tif 000004
【０１２７】
ハイブリッド形成条件における有用な変化が、当業者に簡単に理解されるであろう。ハイブリッド形成技術は、当業者によく知られており、例えば、Ｂｅｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：１８０，１９７７）；Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｈｏｇｎｅｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ７２：３９６１，１９７５）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２００１）；Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋにて記述されている。
【０１２８】
本明細書で使用するところの、「オリゴヌクレオチド鎖」は、一本鎖核酸分子である。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、改変ヌクレオチド（例えば２’改変、合成塩基類似体などを持つヌクレオチド）またはそれらの混合物を含んでよい。このような改変オリゴヌクレオチドは、例えば細胞取込の増強、およびヌクレアーゼの存在下での安定性の増大のような特性のために、天然の形態に対して好ましい。
【０１２９】
本明細書で使用するところの語句「リボヌクレオチド」は、天然および合成の、非改変および改変リボヌクレオチドを包含する。改変には、オリゴヌクレオチド中の糖部分に対する、塩基部分に対する、および／またはリボヌクレオチド間の結合に対する変化が含まれる。本明細書で使用するところの語句「リボヌクレオチド」はとりわけ、２’リボース環位置にて、単一プロトン基を有するヌクレオチドである、デオキシリボヌクレオチドを除外する。
【０１３０】
本明細書で使用するところの語句「デオキシリボヌクレオチド」は、天然および合成の、非改変および改変デオキシリボヌクレオチドを包含する。改変には、オリゴヌクレオチド中の、糖部分に対する、塩基部分に対する、および／またはデオキシリボヌクレオチド間の結合に対する変化が含まれる。本明細書で使用するところの語句「デオキシリボヌクレオチド」にはまた、ｄｓＲＮＡ剤のＤｉｃｅｒ開裂を許容しない改変リボヌクレオチド、例えば、このような残基の結合においてＤｉｃｅｒ開裂が発生することを許容しない、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオエート−改変リボヌクレオチド残基なども含まれる。
【０１３１】
本明細書で使用するところの語句「ＰＳ−ＮＡ」は、ホスホロチオエート−改変ヌクレオチド残基を意味する。語句「ＰＳ−ＮＡ」はしたがって、ホスホロチオエート−改変リボヌクレオチド（「ＰＳ−ＲＮＡ」」）およびホスホロチオエート−改変デオキシリボヌクレオチド（「ＰＳ−ＤＮＡ」）の両方を包含する。
【０１３２】
本明細書で使用するところの「Ｄｉｃｅｒ」は、ｄｓＲＮＡもしくはｄｓＲＮＡ−含有分子、例えば二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはプレ−ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を、通常３’末端に２塩基オーバーハングを持つ、二本鎖核酸断片１９〜２５ヌクレオチド長に開裂する、ＲＮａｓｅＩＩＩファミリーのエンドリボヌクレアーゼを意味する。本発明の特定のｄｓＲＮＡ（例えば「ＤｓｉＲＮＡ」）に関して、本発明の薬剤のｄｓＲＮＡ領域によって形成される二本鎖は、Ｄｉｃｅｒによって認識され、二本鎖の少なくとも１つの鎖上Ｄｉｃｅｒ基質である。Ｄｉｃｅｒは、ＲＮＡ干渉経路中の第一段階を触媒し、結果として、標的ＲＮＡの分解をもたらす。ヒトＤｉｃｅｒのタンパク質配列が、参考文献によって本明細書で組み込まれた寄託番号第ＮＰ＿０８５１２４号の下、ＮＣＢＩデータベースにて提供される。
【０１３３】
Ｄｉｃｅｒ「開裂」は、以下のように決定できる（例えば、Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １８：１８７-２００（２００８）を参照のこと）。Ｄｉｃｅｒ開裂アッセイにおいて、ＲＮＡ二本鎖（１００ｐｍｏｌ）を、１ユニットの組換え体ヒトＤｉｃｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）あり、またはなしで、２０μＬの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２中、３７℃にて１８〜２４時間インキュベートする。試料を、Ｐｅｒｆｏｒｍａ  ＳＲ９６−ウェルプレート（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓメリーランド州ゲイザースバーグ）を用いて脱塩する。Ｄｉｃｅｒでの二本鎖ＲＮＡの処理前および処理後の電子噴霧イオン化液体クロマトグラフィー質量分析（ＥＳＩ−ＬＣＭＳ）を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ  ＴＳＱ７０００、Ｘｃａｌｉｂｕｒデータシステム、ＰｒｏＭａｓｓデータ処理ソフトウェアおよびＰａｒａｄｉｇｍ  ＭＳ４  ＨＰＬＣ（Ｍｉｃｈｒｏｍ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ，カリフォルニア州オーバーン）からなるＯｌｉｇｏ  ＨＴＣＳシステム（Ｎａｖａｔｉａ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ：Ｈａｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）を用いて実施する。本アッセイにおいて、Ｄｉｃｅｒ開裂が、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％のＤｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡ（すなわち２５〜３０ｂｐ、ｄｓＲＮＡ、好ましくは２６〜３０ｂｐ  ｄｓＲＮＡ）が、より短いｄｓＲＮＡ（例えば、１９〜２３ｂｐ  ｄｓＲＮＡ、好ましくは２１〜２３ｂｐ  ｄｓＲＮＡ）に開裂される場で発生する。
【０１３４】
本明細書で使用するところの「Ｄｉｃｅｒ開裂部位」は、ＤｉｃｅｒがｄｓＲＮＡ（例えば、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤のｄｓＲＮＡ領域）を開裂する部位を意味する。Ｄｉｃｅｒは、概してｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を開裂する、２つのＲＮａｓｅＩＩＩドメインを含む。ＲＮａｓｅＩＩＩドメインとＰＡＺドメインとの間の平均距離が、産出する短い二本鎖核酸断片の長さを決定し、この距離は変動可能である（Ｍａｃｒａｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１１：１９５−８）。図１で示すように、Ｄｉｃｅｒは、アンチセンス鎖の３’末端から除去された２１番目と２２番目とのヌクレオチド間の部位にて、およびセンス鎖の５’末端より除去された２１番目と２２番目とのヌクレオチド間の対応する部位で、２ヌクレオチド３’オーバーハングを持つアンチセンス鎖を有する、本発明の特定の二本鎖リボ核酸を開裂すると考えられる。図１にて描写したものと異なる、ｄｓＲＮＡ分子に対する、考えられる、かつ／または一般的なＤｉｃｅｒ開裂部位は、Ｍａｃｒａｅらにて記述されたものを含む、本技術分野で認識される方法を介して同様に同定されてもよい。図１で描写したＤｉｃｅｒ開裂事象が、２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡを産出する一方で、ｄｓＲＮＡ（例えばＤｓｉＲＮＡ）のＤｉｃｅｒ開裂が結果として、長さにして１９〜２３ヌクレオチドのＤｉｃｅｒ−処理したｓｉＲＮＡ長の産出となり得ることが留意される。実際、ある特定の実施形態では、二本鎖ＤＮＡ領域は、２１マーではなく、概して好ましくない１９マーまたは２０マーｓｉＲＮＡの一般的なＤｉｃｅｒ切除を指向するために、ｄｓＲＮＡ内に含まれてよい。
【０１３５】
本明細書で使用するところの、「オーバーハング」は、ｄｓＲＮＡの５’末端または３’末端にて１つ以上の遊離末端を有する二本鎖の文脈において、対になっていないヌクレオチドを意味する。ある特定の実施形態では、オーバーハングは、アンチセンス鎖またはセンス鎖上の３’または５’オーバーハングである。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、１〜６ヌクレオチド、任意に１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜６、３〜５、３〜４、４〜６、４〜５、５〜６ヌクレオチド、または１、２、３、４、５または６ヌクレオチドの長さを持つ３’オーバーハングである。「平滑末端化」または「平滑末端」は、ｄｓＲＮＡの末端に対でないヌクレオチドがない、すなわちヌクレオチドのオーバーハングがないことを意味する。明確にすると、ｓｉＲＮＡの３’末端または５’末端に結合した化学的キャップまたは非ヌクレオチド化学的部分は、ｓｉＲＮＡがオーバーハングを有しているかまたは平滑末端化されているかどうかを判定する際に考慮されるものではない。ある特定の実施形態では、本発明は、細胞または哺乳類中のグリコール酸オキシダーゼ標的遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子であって、ｄｓＲＮＡがグリコール酸オキシダーゼ標的遺伝子の発現において形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である相補領域を含むアンチセンス鎖を含み、かつ上記相補領域が３５未満の長さのヌクレオチド、任意に１９〜２４の長さのヌクレオチドまたは２５〜３０の長さのヌクレオチドであり、かつｄｓＲＮＡが、グリコール酸オキシダーゼ標的遺伝子を発現する細胞と接触すると、グリコール酸オキシダーゼ標的遺伝子の発現を少なくとも１０％、２５％、または４０％阻害する、ｄｓＲＮＡ分子を提供する。
【０１３６】
本発明のｄｓＲＮＡは、二本鎖構造を形成するためにハイブリッド形成するのに十分に相補的である２つのＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの１つの鎖（アンチセンス鎖）は、グリコール酸オキシダーゼ標的遺伝子の発現の間に形成されたｍＲＮＡの配列から誘導された、標的配列に実質的に相補的な、一般的には完全に相補的な相補性の領域を含み、他の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖に相補的な領域を含み、それによって２つの鎖は、好適な条件下で混合した時に、ハイブリッド形成し、二本鎖構造を形成する。一般的に、二本鎖構造は、長さにして１５〜８０、または１５〜５３、または１５〜３５、任意に２５〜３０、２６〜３０、１８〜２５、１９〜２４または１９〜２１塩基対である。同様に、標的配列に相補的な領域は、長さにして、１５〜３５、任意に１８〜３０、２５〜３０、１９〜２４または１９〜２１ヌクレオチドである。本発明のｄｓＲＮＡはさらに、１つ以上の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含んでよい。（一般的に長さにして少なくとも２５塩基対の）ＤｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ（ある特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡの二本鎖構造は、２０〜２３、任意に特に２１塩基対）を含む、長さにして１５〜３５塩基対の二本鎖構造を含むｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を誘導することにおいて効果的であり得ることが同定されてきた（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  ２０：６８７７−６８８８）。また、２０塩基対より短い（例えば１５、１６、１７、１８または１９塩基対二本鎖）を有するｄｓＲＮＡも同様に効果的であり得ることが同定されてきた。ある特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、１９以上の長さのヌクレオチドのうち少なくとも１つの鎖を含み得る。ある特定の実施形態では、以下の表４、６、８または１０の配列の１つに相補的な配列マイナス１つまたは両方の末端上の数個のヌクレオチドを含む、より短いｄｓＲＮＡが、上記および表２、３、５、７および９にて記述したｄｓＲＮＡと比較して同様に効果的であり得ることが合理的に予測できる。したがって、表４、６、８または１０の配列の１つに十分に相補的な、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の隣接ヌクレオチドの部分配列を含み、完全配列を含むｄｓＲＮＡから最高５、１０、１５、２０、２５または３０％阻害まで、本発明で記述したアッセイにて、グリコール酸オキシダーゼ標的遺伝子の発現を阻害するそれらの能力において異なるｄｓＲＮＡが、本発明によって考慮される。１つの実施形態では、ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの末端が、１〜５、任意に１〜４、ある特定の実施形態では、１または２ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを有する。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有する特定のｄｓＲＮＡ構造は、ｄｓＲＮＡ分子の両方の間端にて、塩基対形成平滑末端を有する同等のものと比較して、優れた阻害特性を有する。
【０１３７】
本明細書で使用するところの語句「ＲＮＡ処理」は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはＲＮａｓｅ  Ｈ経路の構成要素（例えばＤｒｏｓｈａ、Ｄｉｃｅｒ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２または他のＲＩＳＣエンドリボヌクレアーゼおよびＲＮａｓｅＨ）によって実施される処理活性を意味し、以下でより詳細に記述されている（以下「ＲＮＡ処理」項目を参照のこと）。本語句は、ＲＮＡの５’キャッピングの転写後工程と、非−ＲＩＳＣまたは非−ＲＮａｓｅ  Ｈ−媒介工程を介したＲＮＡの分解とから明確に区別される。このようなＲＮＡの「分解」は、種々の形態、例えば脱アデニル化（３’ポリ（Ａ）テールの除去）、および／または１つ以上の種々のエンド−もしくはエキソ−ヌクレアーゼ（例えばＲＮａｓｅＩＩＩ、ＲＮａｓｅＰ、ＲＮａｓｅＴ１、ＲＮａｓｅＡ（１、２、３、４／５）、オリゴヌクレオチダーゼなど）によるＲＮＡの本体の一部または全てのヌクレアーゼ消化、を取り得る。
【０１３８】
「相同配列」は、遺伝子、遺伝子転写産物および／または非コードポリヌクレオチドのような、１つ以上のポリヌクレオチド配列によって共有されるヌクレオチド配列を意味する。例えば、相同配列は、サイトカインおよびそれと対応する受容体のような、遺伝子ファミリーの異なるメンバー、異なるタンパク質エピトープ、異なるタンパク質アイソフォームまたは完全に相違する遺伝子のような、関連するが異なるタンパク質をコードしている２つ以上の遺伝子によって共有されるヌクレオチド配列であり得る。相同配列は、非コードＤＮＡまたはＲＮＡ、制御配列、イントロン、および転写制御または調節の部位のような、２つ以上の非コードポリヌクレオチドによって共有されるヌクレオチド配列であり得る。相同配列はまた、１つ超のポリヌクレオチド配列によって共有される保存配列領域を含み得る。相同性は、部分相同配列（例えば９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％など）もまた本発明で考慮されるので、完全相同性（例えば１００％）である必要はない。実際、本発明のｄｓＲＮＡ剤のデザインおよび利用は、本明細書で記述したｄｓＲＮＡ剤と完全な相補性を有するグリコール酸オキシダーゼの標的ＲＮＡに対してのみでなく、上記ｄｓＲＮＡ剤に対して例えば９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％などのみ相補的である配列を有するグリコール酸オキシダーゼＲＮＡに対しての、このようなｄｓＲＮＡ剤を利用する可能性も考慮する。同様に、本明細書で記述された本発明のｄｓＲＮＡ剤は、上記ｄｓＲＮＡ剤と標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ例えばグリコール酸オキシダーゼの特定の対立バリアント（例えば増強された治療的対象の対立遺伝子）との間の相補性の程度増強するために、当業者によって簡単に変更され得る。実際、標的グリコール酸オキシダーゼ配列に関する挿入、欠損および単一点変異を持つｄｓＲＮＡ剤配列がまた、阻害に対して効果的であり得る。あるいは、ヌクレオチド類似体置換または挿入を持つｄｓＲＮＡ剤配列が阻害に対して効果的であり得る。
【０１３９】
配列同一性は、本技術分野で公知の配列比較およびアライメントアルゴリズムによって決定してよい。２つの核酸配列の（または２つのアミノ酸配列の）パーセント同一性を決定するために、配列を比較の目的でアライメントさせる（例えばギャップを、最適配列のために、第１の配列または第２の配列中に導入可能である）。次に、対応するヌクレオチド（またはアミノ酸）位置でのヌクレオチド（またはアミノ酸残基）を比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同一の残基によって占有される場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、配列によって共有された同一の位置の数の関数であり（すなわち％相同性＝同一位置の＃／位置×１００の合計＃）、任意に、導入されたギャップの数および／または導入されたギャップの長さに対するスコアにペナルティーを課す。
【０１４０】
配列の比較と、２つの配列間の配列パーセント同一性の決定とを、数学的アルゴリズムを用いて実施可能である。１つの実施形態では、アライメントは、十分な同一性をもってアライメントさせたアライメントの特定の部分にわたり、しかし低度の同一性を持つ部分にはわたらず（すなわち局所アライメント）産出された。配列の比較のために使用した局所アライメントアルゴリズムの好ましい、非限定例は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−７７にてのように改変された、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−６８のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）内に組み込まれる。
【０１４１】
別の実施形態では、適切なギャップを導入することによってアライメントが最適化されるギャップアライメントは、パーセント同一性が、アライメントした配列（すなわちギャップアライメント）の長さにわたり決定される。比較の目的のためギャップアライメントを得るために、ギャップＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２にて記述したように使用可能である。別の実施形態では、適切なギャップを導入することによってアライメントが最適化されるグローバルアライメントが、パーセント同一性が、アライメントした配列の全長（すなわちグローバルアライメント）にわたり決定される。配列のグローバル比較のために利用される数学的アルゴリズムの好ましい、非限定例は、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部である、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）内に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する時に、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用可能である。
【０１４２】
ｄｓＲＮＡアンチセンス鎖およびグリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列の一部の間の８０％超の配列同一性、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性が好ましい。あるいは、ｄｓＲＮＡは、グリコール酸オキシダーゼＲＮＡの一部とハイブリッド形成可能なヌクレオチド配列（またはオリゴヌクレオチド配列）として機能的に定義してよい（例えば、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１２〜１６時間の５０℃または７０℃ハイブリッド形成と続く洗浄）。さらなる好ましいハイブリッド形成条件には、１×ＳＳＣ中７０℃、または１×ＳＳＣ中５０℃、５０％ホルムアミドでのハイブリッド形成と、続く０．３×ＳＳＣ中７０℃での洗浄、または４×ＳＳＣ中７０℃もしくは４×ＳＳＣ中５０℃、５０％ホルムアミドでのハイブリッド形成と、続く１×ＳＳＣ中６７℃での洗浄が含まれる。長さにして５０塩基対未満であると予測されるハイブリッドでのハイブリッド形成温度は、当該ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５〜１０℃低いべきであり、Ｔｍは以下の等式にしたがって決定される。長さにして１８塩基対より少ないハイブリッドでは、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の＃）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の＃）。長さにして１８〜４９塩基対のハイブリッドでは、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、式中Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、［Ｎａ＋］はハイブリッド形成緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣ＝０．１６５Ｍでの［Ｎａ＋］）。ポリヌクレオチドハイブリッド形成に対する厳密性条件のさらなる例が、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，９および１１章、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，項目２．１０および６．３〜６．４にて提供される。等しいヌクレオチド配列の長さは、少なくとも１０、１２、１５、１７、２０、２２、２５、２７または３０塩基であってよい。
【０１４３】
「保存配列領域」は、世代間で、または１つの生物系、対象もしくは生命体から別の生物系、対象もしくは生命体までで有意に変化しないポリヌクレオチドの１つ以上の領域のヌクレオチド配列を意味する。ポリヌクレオチドは、コードおよび非コードのＤＮＡおよびＲＮＡ両方を含み得る。
【０１４４】
「センス領域」は、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス領域に相補性を持つｄｓＲＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに、ｄｓＲＮＡ分子のセンス領域は、標的核酸配列と相同性を持つ核酸配列を含み得る。
【０１４５】
「アンチセンス領域」は、標的核酸配列に相補性を持つｄｓＲＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス領域は、ｄｓＲＮＡ分子のセンス領域に相補性を持つ核酸配列を含む。
【０１４６】
本明細書で使用するところの「アンチセンス鎖」は、標的ＲＮＡの配列に相補的な配列を持つ一本鎖核酸分子を意味する。アンチセンス鎖が、塩基類似体を有する改変ヌクレオチドを含む場合、その全長にわたり相同的である必要はないが、少なくとも標的ＲＮＡにハイブリッドしなければならない。
【０１４７】
本明細書で使用するところの「センス鎖」は、アンチセンス鎖の配列に相補的な配列を持つ一本鎖核酸分子を意味する。アンチセンス鎖が、塩基類似体を有する改変ヌクレオチドを含む場合、センス鎖は、アンチセンス鎖の全長にわたり相補的である必要はないが、アンチセンス鎖と少なくとも二本鎖を形成しなければならない。
【０１４８】
本明細書で使用するところの「ガイド鎖」は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ−含有分子の一本鎖核酸分子を意味し、結果としてＲＮＡ干渉をもたらす標的ＲＮＡの配列と十分に相補的である配列を持つ。ＤｉｃｅｒによるｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ−含有分子の開裂後、ガイド鎖の断片が、ＲＩＳＣに結合したままとなり、ＲＩＳＣ複合体の一成分として標的ＲＮＡに結合し、ＲＩＳＣによって標的ＲＮＡの開裂を促進する。本明細書で使用するように、ガイド鎖は、連続一本鎖核酸を意味する必要はなく、好ましくはＤｉｃｅｒによる開裂の部位で、不連続性を含んでよい。ガイド鎖はアンチセンス鎖である。
【０１４９】
本明細書で使用するところの「パッセンジャー鎖」は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ−含有分子のオリゴヌクレオチド鎖を意味し、ガイド鎖の配列と相補的である配列を持つ。本明細書で使用するように、パッセンジャー鎖は、連続一本鎖核酸を意味する必要はなく、好ましくはＤｉｃｅｒにより開裂する部位で、不連続性を含んでよい。パッセンジャー鎖はセンス鎖である。
【０１５０】
「標的核酸」は、その発現、レベルまたは活性が調整されるべきである核酸配列を意味する。標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。グリコール酸オキシダーゼを標的とする薬剤に関して、ある特定の実施形態では、標的核酸はグリコール酸オキシダーゼ（ＨＡＯ１）ＲＮＡ、例えばある特定の実施形態ではグリコール酸オキシダーゼ（ＨＡＯ１）ｍＲＮＡである。グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ標的部位はまた、対応するｃＤＮＡ配列によって互換的に参照され得る。グリコール酸オキシダーゼのレベルはまた、グリコール酸オキシダーゼの上流エフェクターの標的化を介して標的化されてよく、または調整されたもしくは誤調節されたグリコール酸オキシダーゼの効果がまた、グリコール酸オキシダーゼシグナル伝達経路中のグリコール酸オキシダーゼの下流の分子の標的化によって調整されてもよい。
【０１５１】
「相同性」は、核酸が、従来のワトソン−クリック、または他の従来にはない型のいずれかによって、他の核酸配列と水素結合を形成可能であることを意味する。本発明の核酸分子に関して、その相補的な配列を備える核酸分子に対する結合自由エネルギーは、核酸の関連ある機能、例えばＲＮＡｉ活性を進行できるために十分なエネルギーである。核酸分子に対する結合自由エネルギーの決定が、本技術分野でよく知られている（例えば、Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，ＣＳＨ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩ  ｐｐ．１２３−１３３；Ｆｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：９３７３−９３７７；Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−３７８５を参照のこと）。パーセント相補性は、第２の核酸配列と水素結合（例えばワトソン−クリック塩基対化）を形成可能な核酸分子中の近接残基の割合を示唆する（例えば１０ヌクレオチドを持つ第２の核酸配列に対して塩基対形成する第１のオリゴヌクレオチド中の合計１０ヌクレオチドのうち５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドが、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および１００％相同性を表す）。「完全に相補的」は、核酸配列の近接残基の全てが、第２の核酸配列中の同一の数の近接残基と水素結合することを意味する。１つの実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、１つ以上の標的核酸分子またはそれらの一部に対して相補的である、１９〜３０（例えば１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０以上）のヌクレオチドを含む。
【０１５２】
本明細書で使用するように、標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列（例えばグリコール酸オキシダーゼ（ＨＡＯ１）ｍＲＮＡ）に「十分に相補的な」配列を有するｄｓＮＡ、例えばＤｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、ｄｓＮＡが、ＲＮＡｉ機構（例えばＲＩＳＣ複合体）または工程によって、標的ＲＮＡ（ｃＤＮＡ配列が列挙される場合、列挙されたｃＤＮＡ配列に相当するＲＮＡ配列）の破壊を引き起こすのに十分な配列を持つことを意味する。例えば、ＲＮＡｉ機構または工程によって、標的ＲＮＡの破壊を引き起こすための、標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列に「十分に相補的な」ｄｓＮＡは、ｄｓＮＡ活性の適切なアッセイ（例えば、以下実施例２にて記述したようなｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ）中の、標的ＲＮＡのレベルにおいて検出可能な減少を引き起こすｄｓＮＡとして同定可能であり、またはさらなる実施例において、ＲＮＡｉ機構または工程によって、標的ＲＮＡの破壊を引き起こすための標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列に十分に相補的なｄｓＮＡを、ｄｓＮＡ活性の適切なアッセイ中の標的ＲＮＡのレベルにおいて、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の減少を産出するｄｓＮＡとして同定可能である。追加の実施例において、ＲＮＡｉ機構または工程によって標的ＲＮＡの破壊を引き起こすための、標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列に十分に相補的なｄｓＮＡは、細胞または生命体における標的ＲＮＡまたはタンパク質レベルに関する特定レベルの阻害活性持続時間の評価に基づいて同定可能である。例えば、ＲＮＡｉ機構または工程によって標的ＲＮＡの破壊を引き起こすための、標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列に十分に相補的なｄｓＮＡは、細胞または生命体へのｄｓＮＡの投与から少なくとも４８時間後において少なくとも２０％まで、標的ｍＲＮＡレベルを減少可能なｄｓＮＡとして同定可能である。好ましくは、ＲＮＡｉ機構または工程によって標的ＲＮＡの破壊を引き起こすための、標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列に十分に相補的なｄｓＮＡは、細胞または生命体へのｄｓＮＡの投与から少なくとも７２時間後において少なくとも４０％まで、細胞または生命体へのｄｓＮＡの投与から少なくとも４、５または７日後において少なくとも４０％まで、細胞または生命体へのｄｓＮＡの投与から少なくとも４８時間後において少なくとも５０％まで、細胞または生命体へのｄｓＮＡの投与から少なくとも７２時間後において少なくとも５０％まで、細胞または生命体へのｄｓＮＡの投与から少なくとも４、５または７日後において少なくとも５０％まで、細胞または生命体へのｄｓＮＡの投与から少なくとも４８時間後において少なくとも８０％まで、細胞または生命体へのｄｓＮＡの投与から少なくとも７２時間後において少なくとも８０％まで、または細胞または生命体へのｄｓＮＡの投与から少なくとも４、５または���日後において少なくとも８０％まで、標的ｍＲＮＡレベルを減少可能なｄｓＮＡとして同定可能である。
【０１５３】
ある特定の実施形態では、本発明の核酸（例えば、ＤｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）は、標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列に対して「ハイブリッド形成するのに十分に相補的な」配列を有し、それによって標的ＲＮＡに対する阻害効果を得る。ハイブリッド形成、および２つの配列のハイブリッド形成を可能にするために、１つの核酸が別の核酸に十分に相補的であるか否かを決定するのに使用可能な条件を、以下でより詳細に記載する。
【０１５４】
当業者には明らかであるように、「十分に相補的な」（例えば「１００％相補的な」と対比される）は、ｄｓＮＡがＲＮＡｉ機構（例えば、ＲＩＳＣ複合体）または工程により標的ＲＮＡの破壊を起こすのに十分な相補性を有することを条件として、本発明のｄｓＮＡと標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列（例えばグリコール酸オキシダーゼ（ＨＡＯ１）ｍＲＮＡ）との間に１つ以上のミスマッチが存在することを許容する。ある特定の実施形態では、「十分に相補的な」本発明のｄｓＮＡは、ｄｓＮＡ配列および標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列の間に１、２、３または４つ以上ものミスマッチを有することができる（例えば、このようなある特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、最大の相補性で標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列とアライメントされる際、１、２、３、４、５または６つ以上ものミスマッチを有する）。さらに、本発明の特定のｄｓＲＮＡ内のこのようなミスマッチの好ましい位置は、以下により詳細に考慮されている。
【０１５５】
１つの実施形態では、グリコール酸オキシダーゼ遺伝子発現を下方制御または低減させる本発明のｄｓＲＮＡ分子を、対象または生命体内のグリコール酸オキシダーゼ−関連疾患または障害（例えば、ＰＨ１）を治療、予防または減少させるために使用する。
【０１５６】
本発明の１つの実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子の各配列は、独立して、長さにして２５〜３５ヌクレオチド、特定の実施形態では、長さにして２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５ヌクレオチドである。別の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡ二本鎖は独立して、２５〜３０塩基対（例えば２５、２６、２７、２８、２９または３０）を含む。別の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子の１つ以上の鎖は、標的（グリコール酸オキシダーゼ）核酸分子に相補的である、１９〜３５ヌクレオチド（例えば、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５）を独立して含む。ある特定の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子は、長さにして２５〜６６ヌクレオチド、任意に２５〜４９ヌクレオチド（例えば長さにして２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６ヌクレオチド、任意に全てのこのようなヌクレオチドは、反対の鎖の同種ヌクレオチドと塩基対を形成する）の長さの二本鎖ヌクレオチドを有する。関連する実施形態では、本発明のｄｓＮＡは、独立して１９〜６６の長さのヌクレオチド、任意に２５〜５３の長さのヌクレオチド、例えば、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６の長さのヌクレオチドである鎖の長さを有する。ある特定の実施形態では、１つの鎖の長さは、１９〜３５の長さのヌクレオチドであるが、もう一方の鎖の長さは、３０〜６６の長さのヌクレオチドであり、少なくとも１つの鎖が、もう一方の鎖に対して少なくとも５の長さのヌクレオチドを持つ５’オーバーハングを有する。特定の関連する実施形態では、第１の鎖の３’末端および第２の鎖の５’末端は、平滑末端または１〜６ヌクレオチドの３’オーバーハングである構造を形成するが、第１の鎖の５’末端は、第２の鎖の３’末端に対して５〜３５ヌクレオチドのオーバーハングを形成する。任意に、５〜３５ヌクレオチドのオーバーハングのうち１〜全てのヌクレオチドが、改変ヌクレオチド（任意に、デオキシリボヌクレオチドおよび／または改変リボヌクレオチド）である。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、本発明のｄｓＮＡは、少なくとも８の隣接リボヌクレオチドを有する第１の鎖または第２の鎖を有する。ある特定の実施形態では、本発明のｄｓＮＡは、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３以上（例えば、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、２６以上、最大で鎖の全長）リボヌクレオチドを有し、任意に改変リボヌクレオチド（２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオエート結合など）を含む。ある特定の実施形態では、リボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドは隣接している。
【０１５８】
本発明のある特定の実施形態では、例えば、米国特許公開公報第２０１１／０２８８１４７号に記載されているような、テトラループおよび改変ヌクレオチド含有ｄｓＮＡを企図する。そのようなある実施形態では、本発明のｄｓＮＡは、第１の鎖および第２の鎖を有し、第１の鎖および第２の鎖が１９〜２５の長さのヌクレオチドの二本鎖領域を形成し、第１の鎖が、第１の鎖−第２の鎖の二本鎖領域を超えて伸長し、かつテトラループを含む３’領域を含み、ｄｓＮＡが第１の鎖の３’末端と第２の鎖の５’末端との間に不連続性を含む。任意に、不連続性は、テトラループ含有ｄｓＮＡの予想されるｄｉｃｅｒ開裂部位に位置する。本発明の他の二本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかに関して、本発明のテトラループ含有二本鎖は、本明細書で開示される、またはさもなければ本技術分野で既知の改変、例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、逆塩基、ＧａｌＮＡｃ部分などを含む任意の範囲を有することができることが企図される。
【０１５９】
ある特定の実施形態では、ｄｓＮＡは第１の鎖および第２の鎖を有し、各鎖が独立して５’末端および３’末端を有し、独立して２５〜５３の長さのヌクレオチドを持つそれぞれの鎖の長さを有して、十分なほど多く改変され、例えば、１つおよび／または両方の鎖の少なくとも１０％以上、少なくとも２０％以上、少なくとも３０％以上、少なくとも４０％以上、少なくとも５０％以上、少なくとも６０％以上、少なくとも７０％以上、少なくとも８０％以上、少なくとも９０％以上、少なくとも９５％以上の残基が改変されて、ｄｓＮＡのｄｉｃｅｒ開裂を防止するようにする（任意に、改変残基は、ｄｓＮＡの１つまたは全ての予測されるｄｉｃｅｒ開裂部位に、および／またはその部位に隣接して生成される）。このような非ｄｉｃｅｒ開裂ｄｓＮＡは、グリコール酸オキシダーゼ（ＨＡＯ１）阻害活性を保持し、任意に非ｄｉｃｅｒヌクレアーゼにより切断されて、哺乳類細胞中でグリコール酸オキシダーゼ（ＨＡＯ１）を阻害できる、例えば１５〜３０の長さ、またはある特定の実施形態では１９〜２３の長さのヌクレオチド鎖ｄｓＮＡを得る。特定の関連する実施形態では、このようなｄｓＮＡのｄｉｃｅｒ開裂をブロックするために十分に広範囲な改変を有するｄｓＮＡは、非ＤｉｃｅｒヌクレアーゼによるこのようなｄｓＮＡの開裂を可能にする、および／または促進させる非改変ヌクレオチド残基（例えば、改変パターン中に「ギャップ」または「ウィンドウ」を形成する１または２以上の連続したヌクレオチド）の領域を任意に有する。他の実施形態では、本発明のＤｉｃｅｒ開裂ｄｓＮＡは、改変中にこのような「ウィンドウ」または「ギャップ」を有する広範囲な改変パターンを含み、Ｄｉｃｅｒ開裂がこのような部位で（このようなｄｓＮＡ内の大幅に改変された領域と比較して）選択的に生成されるようにすることができる。
【０１６０】
本発明のある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド（任意に、遊離アンチセンスオリゴヌクレオチドとして、または二本鎖もしくは他の多重鎖構造のオリゴヌクレオチドとして）が提供され、このオリゴヌクレオチドは、本明細書内の他の箇所に記載されているようにＨＡＯ１標的と相補的な配列を含み、１５〜８０の長さのヌクレオチド、例えば、ある特定の実施形態では、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９または８０の長さのヌクレオチドである。
【０１６１】
本発明のある特定の追加的な実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子の各オリゴヌクレオチドは、独立して２５〜５３の長さのヌクレオチド、特定の実施形態では、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２または５３の長さのヌクレオチドである。３０の長さのヌクレオチドを超える鎖を有するＤｓｉＲＮＡに関して、使用可能な構造としては、１つの鎖のみが３０の長さのヌクレオチドを超えるようなもの（例えば、米国特許第８，３４９，８０９号を参照のこと）、または両方の鎖が３０の長さのヌクレオチドを超えるようなもの（例えば、国際公開第２０１０／０８０１２９号を参照のこと）が挙げられる。安定化改変（例えば、ｄＮＴＰ塩基対、２’−Ｆなどを含む、２’−Ｏ−メチル、ホスホロチオエート、デオキシリボヌクレオチド）を本発明の任意の二本鎖核酸内に組み込むことができ、特に、３０の長さのヌクレオチドを超える１つまたは両方の鎖を有するＤｓｉＲＮＡ内で特に、任意には大量に使用することができる。本発明の二本鎖核酸のガイド鎖は、標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）に相補的な、例えば１５、１６、１７、１８または１９ヌクレオチドの配列を有していなければならないが、ガイド鎖の追加の配列は標的ＲＮＡに相補的である必要はない。３０ヌクレオチドを超える少なくとも１つの鎖の長さを有する二本鎖核酸の末端構造はまた、変動可能でありながら機能的ｄｓＮＡを生成し続け、このｄｓＮＡでは例えば、ガイド鎖の５’末端およびパッセンジャー鎖の３’末端が、５’オーバーハング、平滑末端または３’オーバーハングを形成し得（ある特定のｄｓＮＡ、例えば「一本鎖伸長」ｄｓＮＡについては、このような５’または３’オーバーハングの長さは、１〜４、１〜５、１〜６、１〜１０、１〜１５、１〜２０あるいは１〜２５以上のヌクレオチドであり得る）；同様に、ガイド鎖の３’末端およびパッセンジャー鎖の５’末端が、５’オーバーハング、平滑末端または３’オーバーハングを形成し得る（ある特定のｄｓＮＡ、例えば「一本鎖伸長」ｄｓＮＡについては、このような５’または３’オーバーハングの長さは、１〜４、１〜５、１〜６、１〜１０、１〜１５、１〜２０あるいは１〜２５以上のヌクレオチドであり得る）。ある特定の実施形態では、パッセンジャー鎖の５’末端は、ガイド鎖の３’末端に対して５’オーバーハングを含み、その結果、１〜１５以上のヌクレオチド一本鎖の伸長が存在する。任意に、本発明のｄｓＮＡのこのような一本鎖伸長は（パッセンジャー鎖上またはガイド鎖上に存在しようとも）、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、２’−Ｆ、２’−Ｏ−メチルおよび／または本明細書で企図される、もしくは本技術分野において既知の、例えばＧａｌＮＡｃ部分、逆脱塩基残基などとの複合体化を含む、他の改変形態で改変され得る。いくつかの実施形態では、本発明の一本鎖伸長二本鎖のガイド鎖は、３５〜５０の長さのヌクレオチドであるが、二本鎖は、７〜２０の長さのヌクレオチドである一本鎖伸長を提示する。ある特定の実施形態では、二本鎖のガイド鎖は、３７〜４２の長さのヌクレオチドであり、二本鎖は、およそ５〜１５の長さの一本鎖ヌクレオチド（任意に、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４の長さのヌクレオチド）であるパッセンジャー鎖の５’一本鎖オーバーハングを有する。関連する実施形態では、二本鎖のパッセンジャー鎖は、約２５〜約３０の長さのヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、二本鎖の伸長領域は、例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、ＧａｌＮＡｃ部分、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、逆脱塩基残基などのうちの１つ以上で、任意に広範囲に改変され得る。ある特定の実施形態では、パッセンジャー鎖の長さが３１〜４９ヌクレオチドである一方で、ガイド鎖の長さは３１〜５３ヌクレオチドであって、任意にガイド鎖の５’末端が、パッセンジャー鎖の３’末端と平滑末端（任意に、塩基対平滑末端）を形成する一方で、任意にガイド鎖の３’末端およびパッセンジャー鎖の５’末端が、１〜４の長さのヌクレオチドを持つ３’オーバーハングを形成する。例示的な「伸長」Ｄｉｃｅｒ基質構造は、例えば米国特許公開公報第２０１０／０１７３９７４号、米国特許第８，５１３，２０７号および米国特許第８，３４９，８０９号に記載され、その両方が参照により本明細書に援用される。ある特定の実施形態では、本発明のｄｓＮＡ分子の１つ以上の鎖は、独立して標的（グリコール酸オキシダーゼ）核酸分子に相補的な１９〜３５ヌクレオチド（例えば、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５）を含む。ある特定の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子は、２５〜４９の長さのヌクレオチド（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９の長さのヌクレオチド；任意に、全てのこのようなヌクレオチドは、反対の鎖の同種ヌクレオチドと塩基対を形成する）の二本鎖ヌクレオチドの長さを有する。
【０１６２】
本発明のさらなる実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子の各オリゴヌクレオチドは、独立して１９〜６６の長さのヌクレオチド、特定の実施形態では、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５または６６の長さのヌクレオチドである。３０の長さのヌクレオチドを超える鎖を有するｄｓＮＡに関して、使用可能な構造としては、１つの鎖のみが３０の長さのヌクレオチドを超えるようなもの（例えば、米国特許第８，３４９，８０９号を参照のこと、ここで、例示的な二本鎖核酸は、５’末端および３’末端を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖ならびに５’末端および３’末端を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖を有し、５’末端の各々が５’末端ヌクレオチドを有し、３’末端の各々が３’末端ヌクレオチドを有し、第１の鎖（または第２の鎖）が２５〜３０の長さのヌクレオチド残基であり、５’末端ヌクレオチド（位置１）から開始して、第１の鎖（または第２の鎖）の位置１〜２３が、少なくとも８のリボヌクレオチドを含み；第２の鎖（または第１の鎖）が３６〜６６の長さのヌクレオチド残基であり、３’末端ヌクレオチドから開始して、二本鎖を形成するために第１の鎖の位置１〜２３と対を形成する位置に少なくとも８のリボヌクレオチドを含み；第２の鎖（または第１の鎖）の少なくとも３’末端ヌクレオチドが第１の鎖（または第２の鎖）と対になっておらず、最大６の連続した３’末端ヌクレオチドが第１の鎖（または第２の鎖）と対になっておらず、それによって１〜６ヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングを形成し；第２の鎖（または第１の鎖）の５’末端が、第１の鎖（または第２の鎖）と対になっていない１０〜３０の連続したヌクレオチドを含み、それによって１０〜３０ヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングを形成し；第１の鎖および第２の鎖が最大の相補性でアライメントされる場合、少なくとも第１の鎖（または第２の鎖）の５’末端および３’末端ヌクレオチドが、第２の鎖（または第１の鎖）のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって第１の鎖と第２の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し；第２の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に標的遺伝子発現を低減するため、第２の鎖のうち少なくとも１９の長さのリボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡと十分に相補的である）、または両方の鎖が３０の長さのヌクレオチドを超えるようなもの（例えば、米国特許第８，５１３，２０７号を参照のこと、ここで、例示的な二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）は、５’末端および３’末端を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖ならびに５’末端および３’末端を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖を有し、第１の鎖が３１〜４９の長さのヌクレオチド残基であり、第１の鎖の５’末端での第１のヌクレオチド（位置１）から開始して、第１の鎖の位置１〜２３がリボヌクレオチドであり；第２の鎖が３１〜５３の長さのヌクレオチド残基であり、かつ二本鎖を形成するために第１の鎖の位置１〜２３のリボヌクレオチドと塩基対を形成する、２３の連続したリボヌクレオチドを含み；第１の鎖の５’末端および第２の鎖の３’末端が、平滑末端または１〜４ヌクレオチドの３’オーバーハングを形成し；第１の鎖の３’末端および第２の鎖の５’末端が、二本鎖平滑末端、５’オーバーハングまたは３’オーバーハングを形成し；任意に第１の鎖の３’末端ヌクレオチド残基の位置２４のうち少なくとも１つが、任意に第２の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；第２の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に標的遺伝子発現を低減するため、第２の鎖のうち少なくとも１９の長さのリボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡと十分に相補的である）が挙げられる。
【０１６３】
ある特定の実施形態では、本発明の活性ｄｓＮＡは、２〜５０（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０）以上の長さのヌクレオチドを持つ第２の鎖（任意に、ガイド鎖）に対して、第１の鎖（任意に、パッセンジャー鎖）の５’オーバーハングを有し得る。関連する実施形態では、このようなｄｓＮＡの第１の鎖および第２の鎖により形成された二本鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５以上の長さの塩基対である。第１の鎖の５’オーバーハング「伸長」領域は、１つ以上の残基にて（任意に、交互残基、全ての残基、または任意の他の種類の残基にて）任意に改変される。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、本発明の活性ｄｓＮＡは、２〜５０（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０）以上の長さのヌクレオチドを持つ第２の鎖（任意に、ガイド鎖）に対して、第１の鎖（任意に、パッセンジャー鎖）の３’オーバーハングを有し得る。関連する実施形態では、このようなｄｓＮＡの第１の鎖および第２の鎖により形成された二本鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５以上の長さの塩基対である。第１の鎖の３’オーバーハング「伸長」領域は、１つ以上の残基にて（任意に、交互残基、全ての残基、または任意の他の種類の残基にて）任意に改変される。
【０１６５】
追加的な実施形態では、本発明の活性ｄｓＮＡは、２〜５０（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０）以上の長さのヌクレオチドを持つ第１の鎖（任意に、パッセンジャー鎖）に対して、第２の鎖（任意に、ガイド鎖）の５’オーバーハングを有し得る。関連する実施形態では、このようなｄｓＮＡの第１の鎖および第２の鎖により形成された二本鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５以上の長さの塩基対である。第２の鎖の５’オーバーハング「伸長」領域は、１つ以上の残基にて（任意に、交互残基、全ての残基、または任意の他の種類の残基にて）任意に改変される。
【０１６６】
さらなる実施形態では、本発明の活性ｄｓＮＡは、２〜５０（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０）以上の長さのヌクレオチドを持つ第１の鎖（任意に、パッセンジャー鎖）に対して、第２の鎖（任意に、ガイド鎖）の３’オーバーハングを有し得る。関連する実施形態では、このようなｄｓＮＡの第１の鎖および第２の鎖により形成された二本鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５以上の長さの塩基対である。第２の鎖の３’オーバーハング「伸長」領域は、１つ以上の残基にて（任意に、交互残基、全ての残基、または任意の他の種類の残基にて）任意に改変される。
【０１６７】
本発明の別の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子の各配列は、独立して２５〜３５の長さのヌクレオチド、特定の実施形態では、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５の長さのヌクレオチドである。別の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡ二本鎖は、独立して２５〜３０の塩基対（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）を含む。別の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子の１つ以上の鎖は、独立して標的（ＨＡＯ１）核酸分子に相補的な１９〜３５ヌクレオチド（例えば、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５）を含む。ある特定の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子は、２５〜３４の長さのヌクレオチド（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４の長さのヌクレオチド；任意に、全てのこのようなヌクレオチドは、反対の鎖の同種ヌクレオチドと塩基対を形成する）の二本鎖ヌクレオチドの長さを有する。（本発明の例示的なＤｓｉＲＮＡ分子は、図１および以下に示す）。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、本発明の核酸のヌクレオチド残基の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上が、改変残基である。本発明のｄｓＮＡについては、第１の鎖のヌクレオチド残基の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上が、改変残基である。さらに、および／またはあるいは、本発明のｄｓＮＡについて、第２の鎖のヌクレオチド残基の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上が、改変残基である。本発明のｄｓＮＡについては、二本の鎖（二本鎖）領域およびオーバーハング（一本鎖）領域の両方の改変が企図される。したがって、ある特定の実施形態では、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上（例えば、全て）の二本鎖ヌクレオチド残基が、改変残基である。さらに、および／またはあるいは、１つまたは両方の鎖の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上（例えば、全て）のオーバーハングヌクレオチド残基が、改変残基である。任意に、本発明のｄｓＮＡの改変は、逆脱塩基（例えば、逆デオキシ脱塩基）または逆ｄＴ末端保護基を含まない。あるいは、本発明のｄｓＮＡは、末端キャップ部分（例えば、逆デオキシ脱塩基および／または逆ｄＴ末端保護基）を含む。任意に、このような末端キャップ部分は、第１の鎖の、第２の鎖の、または第１の鎖および第２の鎖の両方の５’末端に、３’末端に、または５’末端および３’末端の両方に位置する。
【０１６９】
本明細書で使用するところの「細胞」は、その通常の生物学的意味において使用され、全多細胞生物を意味せず、例えば特にヒトを意味するものではない。細胞は、生命体、例えば鳥類、植物ならびにヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌおよびネコのような哺乳類中に存在し得る。細胞は、原核生物（例えば細菌細胞）または真核生物（例えば哺乳類細胞または植物細胞）であり得る。細胞は、体細胞または生殖細胞由来、全能細胞または多能性細胞、分裂細胞または非分裂細胞であり得る。細胞はまた、配偶子または胚、幹細胞または完全に分化した細胞から分化してよく、または含んでよい。特定の態様内で、語句「細胞」は、本開示の１つ以上の単離ｄｓＲＮＡ分子を含むヒト細胞のような哺乳類細胞を特に意味する。特定の態様において、細胞は、結果として標的核酸のＲＮＡ干渉をもたらす、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ−含有分子を有し、ＲＮＡｉに対して必要とされるタンパク質およびタンパク質複合体、例えばＤｉｃｅｒおよびＲＩＳＣを含む。
【０１７０】
ある特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡ（「ＤｓｉＲＮＡ」）である。ＤｓｉＲＮＡは、ｄｉｃｅｒ基質ではない阻害核酸（「非ＤｓｉＲＮＡ」）と比較して、特定の利点を有し得る。このような利点には、限定するものではないが、非ＤｓｉＲＮＡに対して、ＤｓｉＲＮＡの効果の持続期間の増強、ならびに各阻害核酸が好適に処方され、同一の濃度で、哺乳類細胞内の阻害活性に関して評価される時、非ＤｓｉＲＮＡ（例えば１９〜２３マーｓｉＲＮＡ）と比較したＤｓｉＲＮＡの阻害活性の増強が含まれる（後者のシナリオの場合、ＤｓｉＲＮＡは、非−ＤｓｉＲＮＡよりも強力なものとして同定され得る）。非−ＤｓｉＲＮＡに対するＤｓｉＲＮＡの効力の増大の検出はしばしば、結果としてＤｉｓＲＮＡが、標的ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）におけるおよそ３０〜７０％のノックダウン活性を誘発することとなる、製剤化濃度（例えばｄｓＲＮＡのトランスフェクション濃度）でほとんど容易に達成される。活性ＤｓｉＲＮＡに関して、このようなノックダウン活性のレベルは、ほとんどの場合、１ｎＭ以下の好適に処方されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ哺乳類細胞ＤｓｉＲＮＡトランスフェクション濃度で達成され、特定の例においては、２００ｐＭ以下、１００ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、２０ｐＭ以下、１０ｐＭ以下、５ｐＭ以下、または１ｐＭ以下のＤｓｉＲＮＡトランスフェクション濃度で観察される。実際、標的ＲＮＡの３０〜７０％ノックダウンが観察される正確な濃度のＤｓｉＲＮＡ間の変動に起因して、効果的な濃度の範囲にわたる、ＤｓｉＲＮＡおよび非ＤｓｉＲＮＡの阻害活性の評価を介したＩＣ５０曲線の構築が、非ＤｓｉＲＮＡ阻害剤に対するＤｓｉＲＮＡの効力の増強を検出する好ましい方法である。
【０１７１】
ある特定の実施形態では、（Ｄｉｃｅｒ開裂前、最初に形成されたような状態での）ＤｓｉＲＮＡは、その中に含まれる１９、２０、２１、２２または２３の塩基対配列よりも、哺乳類細胞中のグリコール酸オキシダーゼ標的遺伝子発現を低減させる際により効力がある。特定のこのような実施形態では、ｄｉｃｅｒ開裂前のＤｓｉＲＮＡは、その中に含まれる１９〜２１マーよりもより強力である。任意に、ｄｉｃｅｒ開裂前のＤｓｉＲＮＡは、（それによって、ｄＴｄＴオーバーハングを持つ２１ヌクレオチド鎖長を有するｓｉＲＮＡを形成する）対称ｄＴｄＴオーバーハングで合成される配列中に含まれた１９塩基対二本鎖よりも強力である。ある特定の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、本発明のＤｓｉＲＮＡで列挙される２１ヌクレオチド標的配列の少なくとも１９ヌクレオチドを標的とする、１９〜２３マーｓｉＲＮＡ（例えばｄＴｄＴオーバーハングを持つ１９塩基対二本鎖）よりも強力である（いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、このようなＤｓｉＲＮＡに対する標的部位の同一性は、ＤｓｉＲＮＡに対するＡｇｏ２開裂部位の同定を介して同定される。いったんＤｓｉＲＮＡのＡｇｏ２開裂部位がＤｓｉＲＮＡに対して決定されたならば、任意の他の阻害ｄｓＲＮＡに対するＡｇｏ２開裂部位の同定が実施され、これらのＡｇｏ２開裂部位をアライメント可能であり、それによって多数のｄｓＲＮＡに対して考えられる標的ヌクレオチド配列のアライメントが決定される）。特定の関連した実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、本発明のＤｓｉＲＮＡに関して記載される２１ヌクレオチド標的配列のうち少なくとも２０ヌクレオチドを標的とする、１９〜２３マーｓｉＲＮＡよりも強力である。任意に、ＤｓｉＲＮＡは、本発明のＤｓｉＲＮＡに関して記載される同一の２１ヌクレオチド標的配列を標的とする、１９〜２３マーｓｉＲＮＡよりも強力である。ある特定の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、本発明のＤｓｉＲＮＡに関して記載される同一の２１ヌクレオチド標的配列を標的とする、任意の２１マーｓｉＲＮＡよりも強力である。任意に、ＤｓｉＲＮＡは、本発明のＤｓｉＲＮＡに関して記載される同一の２１ヌクレオチド標的配列を標的とする、任意の２１または２２マーｓｉＲＮＡよりも強力である。ある特定の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、本発明のＤｓｉＲＮＡに関して記載される同一の２１ヌクレオチド標的配列を標的とする任意の２１、２２または２３マーｓｉＲＮＡより強力である。上述のように、このような効力の評価は、１ｎＭ以下の濃度で、好適に製剤化（例えば適切なトランスフェクト試薬で製剤化された）ｄｓＲＮＡにおいて最も効果的に実施される。任意に、ＩＣ５０評価を、効果的な阻害濃度の範囲にわたる活性を評価するために実施し、それによって、アッセイされたｄｓＲＮＡの相対効力の確固とした比較が可能となる。
【０１７２】
本発明のｄｓＲＮＡ分子は、直接加えられ、または脂質（例えばカチオン性脂質）と複合体化、リポソーム内にパッケージでき、または標的細胞もしくは組織に伝達可能である。核酸または核酸複合体を、バイポリマー内への組み込みを用い、またはこの組み込みを用いることなく、直接的な皮膚適用、経皮適用、または注射を介して、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、関連する組織に局所投与できる。特定の実施形態では、本発明の核酸分子は、図１で示す配列と、以下の例示的構造を含む。このような核酸分子の例は、これらの図面および例示的構造にて定義した配列から本質的になる。さらに、このような薬剤を、ＤｓｉＲＮＡ剤の改変パターン化の以下の記述にしたがって改変する場合、図１にて記述された構造物の化学的に改変された形態、および以下の例示的構造を、図１および以下の例示的構造のＤｓｉＲＮＡ剤に対して記述した全ての使用において利用可能である。
【０１７３】
別の態様において、本発明は、本発明の１つ以上のｄｓＲＮＡを含む哺乳類細胞を提供する。１つ以上のｄｓＲＮＡ分子は独立して、同一または異なる部位を標的とすることが可能である。
【０１７４】
「ＲＮＡ」は、少なくとも１つの、好ましくは少なくとも４、８および１２のリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。少なくとも４、８または１２のＲＮＡ残基は近接してよい。「リボヌクレオチド」は、β−Ｄ−リボフラノース部位の２’位でヒドロキシル基を持つヌクレオチドを意味する。本語句には、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製したＲＮＡのような単離ＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え体産出ＲＮＡ、ならびに１つ以上のヌクレオチドの添加、欠損、置換および／または変質によって天然に存在するＲＮＡとは異なる変質ＲＮＡが含まれる。このような変質には、例えばＲＮＡのうち１つ以上のヌクレオチドでの、ｄｓＲＮＡの末端または内部などへの非ヌクレオチド物質の添加が含まれる。本発明のＲＮＡ分子中のヌクレオチドはまた、天然に存在しないヌクレオチドまたは化学的に合成されたヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのような、非標準ヌクレオチドも含み得る。これらの変質ＲＮＡは、類似体または天然に存在するＲＮＡの類似体を指すことができる。
【０１７５】
「対象」は、外植された細胞のドナーもしくはレシピエントまたはこれらの細胞自体である、生命体を意味する。「対象」はまた、本発明のｄｓＲＮＡ剤を投与可能な生命体を意味する。対象は、ヒトまたはヒト細胞を含む、哺乳類または哺乳類細胞であり得る。
【０１７６】
語句「薬学的に許容可能な担体」は、治療薬剤の投与のための担体を意味する。例示的な担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびこれらの混合物が含まれる。経口で投与される薬物に関する薬学的に許容可能な担体には、限定するものではないが、不活性希釈液、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味剤、香味料、着色料および保存料などのような、薬理学的に許容可能な賦形剤が含まれる。好適な不活性希釈液には、炭酸ナトリウムおよびカルシウム、リン酸ナトリウムおよびカルシウムならびにラクトースが含まれ、トウモロコシデンプンおよびアルギン酸が好適な崩壊剤である。結合剤には、デンプンおよびゼラチンが含まれてよく、潤滑剤は存在するのであれば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクが一般的である。望ましい場合、胃腸管での吸収を遅延させるために、錠剤を一ステアリン酸グリセリルまたは二ステアリン酸グリセリルのような物質で被覆してよい。開示されたｄｓＲＮＡの薬学的に許容可能な担体は、リポソーム、カプシド、カプソイド、ポリマー性ナノカプセルまたはポリマー性ミクロカプセルのようなミセル構造であってよい。
【０１７７】
ポリマー性ナノカプセルまたはマイクロカプセルは、カプセル封入または結合したｄｓＲＮＡの細胞内への伝達および放出を促進する。これらには、特にポリブチルシアノアクリレートを含む、ポリマー性および単量体物質が含まれる。物質および製造法の要約が公開されている（Ｋｒｅｕｔｅｒ，１９９１を参照のこと）。ポリマー化／ナノ粒子産出段階で単量体および／またはオリゴマー前駆体から形成されるポリマー性物質は、ナノ粒子を製造する領域の当業者が通常の技術にしたがって好適に選択してよいポリマー性物質の分子量および分子量分布であるため、先行技術からそれ自体が公知である。
【０１７８】
本発明の種々の方法には、本明細書で「適切な対照（ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）」を互換的に意味する、「適切な対照（ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）」に対して、値、レベル、特徴、特性、性質などを比較することを含む段階が含まれる。「適切な対照」または「適切な対照」は、比較の目的のために有用な、当業者によく知られた対照または標準である。１つの実施形態では、「適切な対照」または「適切な対照」は、本明細書で記述したような、ＲＮＡｉ法を実施する前に決定される、値、レベル、特徴、特性、性質などである。例えば、転写率、ｍＲＮＡレベル、翻訳率、タンパク質レベル、生物学的活性、細胞特徴または性質、遺伝子型、表現型などを、本発明のＲＮＡサイレンシング剤（例えばＤｓｉＲＮＡ）を細胞または生命体内に導入する前に決定可能である。別の実施形態では、「適切な対照」または「適切な対照」は、細胞または生物内で決定される値、レベル、特徴、特性、性質などであり、例えば正常な特質を示している対照または正常細胞または生命体である。さらなる別の実施形態では、「適切な対照」または「適切な対照」は、あらかじめ定義された値、レベル、特徴、特性、性質などである。
【０１７９】
語句「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、その業界で認識された意味を持ち、例えば、精製された試薬または抽出物、例えば細胞抽出物を含む。語句「ｉｎ  ｖｉｖｏ」はまた、その業界で認識された意味を持ち、例えば生細胞を含み、例えば不死化細胞、初代細胞、細胞株および／または生命体内の細胞を含む。
【０１８０】
本明細書で使用するところの「治療」または「治療すること」は、治療薬剤（例えばｄｓＲＮＡ剤またはそれをコードしているベクターもしくはトランスジーン）を、疾患もしくは障害、または疾患もしくは障害の症状を治癒、治す、緩和、軽減、変化、治療、改善、改良または影響する目的で、障害を有する患者への適用もしくは投与、または治療薬剤の患者由来の単離した組織または細胞株への適用もしくは投与として定義される。語句「治療」または「治療する」はまた、予防的に薬剤を投与する文脈でも使用される。語句「有効用量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ）」または「有効用量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓａｇｅ）」は、望ましい効果を達成するか、または少なくとも部分的に達成するための十分な量として定義される。語句「治療上有効量」は、疾患をすでに患っている患者における疾患またはその合併症を治癒する、または少なくとも部分的に停止させるのに十分な量として定義される。語句「患者」には、予防的治療または治療的治療のいずれかを受けるヒトおよび他の哺乳類対象が含まれる。
【０１８１】
抗−グリコール酸オキシダーゼＤｓｉＲＮＡ剤の構造
ある特定の実施形態では、本発明の抗−グリコール酸オキシダーゼＤｓｉＲＮＡ剤は以下の構造を持つことができる。
【０１８２】
１つのこのような実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
2020036603.tif 000005
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡであり、かつ「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインである。関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
2020036603.tif 000006
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡであり、かつ「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
【０１８３】
本発明のＤｓｉＲＮＡは、広範囲の改変パターン（例えば、２’−Ｏ−メチルＲＮＡパターン、例えば伸長ＤｓｉＲＮＡ剤内）を持ち得る。本発明のＤｓｉＲＮＡの第２の鎖の特定の改変パターンを以下に示す。
【０１８４】
１つの実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは
2020036603.tif 000007
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは
【化１】
2020036603.tif 000008
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０１８５】
別のこのような実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２】
2020036603.tif 000009
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは
【化３】
2020036603.tif 000010
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０１８６】
別のこのような実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは
【化４】
2020036603.tif 000011
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは
【化５】
2020036603.tif 000012
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０１８７】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化６】
2020036603.tif 000013
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは
【化７】
2020036603.tif 000014
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化８】
2020036603.tif 000015
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは
【化９】
2020036603.tif 000016
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡおよび「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ７」または「Ｍ７」改変パターンと称される。
【０１８８】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１０】
2020036603.tif 000017
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは
【化１１】
2020036603.tif 000018
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１２】
2020036603.tif 000019
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは
【化１３】
2020036603.tif 000020
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡおよび「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ７」または「Ｍ７」改変パターンと称される。
【０１８９】
他の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは
【化１４】
2020036603.tif 000021
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは
【化１５】
2020036603.tif 000022
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１６】
2020036603.tif 000023
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１７】
2020036603.tif 000024
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ５」または「Ｍ５」改変パターンと称される。
【０１９０】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１８】
2020036603.tif 000025
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１９】
2020036603.tif 000026
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２０】
2020036603.tif 000027
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２１】
2020036603.tif 000028
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書では「ＡＳ−Ｍ４」または「Ｍ４」改変パターンと称される。
【０１９１】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２２】
2020036603.tif 000029
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２３】
2020036603.tif 000030
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２４】
2020036603.tif 000031
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２５】
2020036603.tif 000032
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、および「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ８」または「Ｍ８」改変パターンと称される。
【０１９２】
他の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２６】
2020036603.tif 000033
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２７】
2020036603.tif 000034
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２８】
2020036603.tif 000035
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２９】
2020036603.tif 000036
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ３」または「Ｍ３」改変パターンと称される。
【０１９３】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３０】
2020036603.tif 000037
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３１】
2020036603.tif 000038
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３２】
2020036603.tif 000039
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３３】
2020036603.tif 000040
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、および「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２」または「Ｍ２」改変パターンと称される。
【０１９４】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３４】
2020036603.tif 000041
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３５】
2020036603.tif 000042
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３６】
2020036603.tif 000043
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３７】
2020036603.tif 000044
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１」または「Ｍ１」改変パターンと称される。
【０１９５】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３８】
2020036603.tif 000045
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３９】
2020036603.tif 000046
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４０】
2020036603.tif 000047
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４１】
2020036603.tif 000048
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ９」または「Ｍ９」改変パターンと称される。
【０１９６】
他の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４２】
2020036603.tif 000049
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４３】
2020036603.tif 000050
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４４】
2020036603.tif 000051
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４５】
2020036603.tif 000052
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、および「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１０」または「Ｍ１０」改変パターンと称される。
【０１９７】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４６】
2020036603.tif 000053
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４７】
2020036603.tif 000054
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４８】
2020036603.tif 000055
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４９】
2020036603.tif 000056
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、および「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１１」または「Ｍ１１」改変パターンと称される。
【０１９８】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化５０】
2020036603.tif 000057
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化５１】
2020036603.tif 000058
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化５２】
2020036603.tif 000059
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化５３】
2020036603.tif 000060
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１２」または「Ｍ１２」改変パターンと称される。
【０１９９】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化５４】
2020036603.tif 000061
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化５５】
2020036603.tif 000062
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化５６】
2020036603.tif 000063
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化５７】
2020036603.tif 000064
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１３」または「Ｍ１３」改変パターンと称される。
【０２００】
他の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化５８】
2020036603.tif 000065
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化５９】
2020036603.tif 000066
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化６０】
2020036603.tif 000067
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化６１】
2020036603.tif 000068
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２１」または「Ｍ２１」改変パターンと称される。
【０２０１】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化６２】
2020036603.tif 000069
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化６３】
2020036603.tif 000070
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化６４】
2020036603.tif 000071
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化６５】
2020036603.tif 000072
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１４」または「Ｍ１４」改変パターンと称される。
【０２０２】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化６６】
2020036603.tif 000073
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化６７】
2020036603.tif 000074
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化６８】
2020036603.tif 000075
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化６９】
2020036603.tif 000076
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、および「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１５」または「Ｍ１５」改変パターンと称される。
【０２０３】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化７０】
2020036603.tif 000077
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化７１】
2020036603.tif 000078
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化７２】
2020036603.tif 000079
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化７３】
2020036603.tif 000080
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、および「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１６」または「Ｍ１６」改変パターンと称される。
【０２０４】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化７４】
2020036603.tif 000081
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化７５】
2020036603.tif 000082
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化７６】
2020036603.tif 000083
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化７７】
2020036603.tif 000084
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、および「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１７」または「Ｍ１７」改変パターンと称される。
【０２０５】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化７８】
2020036603.tif 000085
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化７９】
2020036603.tif 000086
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化８０】
2020036603.tif 000087
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化８１】
2020036603.tif 000088
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１８」または「Ｍ１８」改変パターンと称される。
【０２０６】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化８２】
2020036603.tif 000089
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化８３】
2020036603.tif 000090
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化８４】
2020036603.tif 000091
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化８５】
2020036603.tif 000092
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１９」または「Ｍ１９」改変パターンと称される。
【０２０７】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化８６】
2020036603.tif 000093
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化８７】
2020036603.tif 000094
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化８８】
2020036603.tif 000095
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化８９】
2020036603.tif 000096
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２０」または「Ｍ２０」改変パターンと称される。
【０２０８】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化９０】
2020036603.tif 000097
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化９１】
2020036603.tif 000098
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化９２】
2020036603.tif 000099
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化９３】
2020036603.tif 000100
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２２」または「Ｍ２２」改変パターンと称される。
【０２０９】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化９４】
2020036603.tif 000101
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化９５】
2020036603.tif 000102
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化９６】
2020036603.tif 000103
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化９７】
2020036603.tif 000104
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２４」または「Ｍ２４」改変パターンと称される。
【０２１０】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化９８】
2020036603.tif 000105
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化９９】
2020036603.tif 000106
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１００】
2020036603.tif 000107
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１０１】
2020036603.tif 000108
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２５」または「Ｍ２５」改変パターンと称される。
【０２１１】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１０２】
2020036603.tif 000109
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１０３】
2020036603.tif 000110
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１０４】
2020036603.tif 000111
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１０５】
2020036603.tif 000112
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２６」または「Ｍ２６」改変パターンと称される。
【０２１２】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１０６】
2020036603.tif 000113
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１０７】
2020036603.tif 000114
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１０８】
2020036603.tif 000115
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１０９】
2020036603.tif 000116
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２７」または「Ｍ２７」改変パターンと称される。
【０２１３】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１１０】
2020036603.tif 000117
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１１１】
2020036603.tif 000118
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１１２】
2020036603.tif 000119
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１１３】
2020036603.tif 000120
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２８」または「Ｍ２８」改変パターンと称される。
【０２１４】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１１４】
2020036603.tif 000121
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１１５】
2020036603.tif 000122
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１１６】
2020036603.tif 000123
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１１７】
2020036603.tif 000124
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２９」または「Ｍ２９」改変パターンと称される。
【０２１５】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１１８】
2020036603.tif 000125
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１１９】
2020036603.tif 000126
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ３０」または「Ｍ３０」改変パターンと称される。
【０２１６】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１２０】
2020036603.tif 000127
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１２１】
2020036603.tif 000128
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ３１」または「Ｍ３１」改変パターンと称される。
【０２１７】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１２２】
2020036603.tif 000129
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１２３】
2020036603.tif 000130
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ３２」または「Ｍ３２」改変パターンと称される。
【０２１８】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１２４】
2020036603.tif 000131
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１２５】
2020036603.tif 000132
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１２６】
2020036603.tif 000133
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１２７】
2020036603.tif 000134
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ３４」または「Ｍ３４」改変パターンと称される。
【０２１９】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１２８】
2020036603.tif 000135
2020036603.tif 000136
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１２９】
2020036603.tif 000137
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１３０】
2020036603.tif 000138
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１３１】
2020036603.tif 000139
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ３５」または「Ｍ３５」改変パターンと称される。
【０２２０】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１３２】
2020036603.tif 000140
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１３３】
2020036603.tif 000141
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１３４】
2020036603.tif 000142
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１３５】
2020036603.tif 000143
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ３７」または「Ｍ３７」改変パターンと称される。
【０２２１】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１３６】
2020036603.tif 000144
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１３７】
2020036603.tif 000145
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１３８】
2020036603.tif 000146
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１３９】
2020036603.tif 000147
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ３８」または「Ｍ３８」改変パターンと称される。
【０２２２】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１４０】
2020036603.tif 000148
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１４１】
2020036603.tif 000149
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１４２】
2020036603.tif 000150
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１４３】
2020036603.tif 000151
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４０」または「Ｍ４０」改変パターンと称される。
【０２２３】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１４４】
2020036603.tif 000152
2020036603.tif 000153
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１４５】
2020036603.tif 000154
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１４６】
2020036603.tif 000155
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１４７】
2020036603.tif 000156
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４１」または「Ｍ４１」改変パターンと称される。
【０２２４】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１４８】
2020036603.tif 000157
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１４９】
2020036603.tif 000158
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１５０】
2020036603.tif 000159
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１５１】
2020036603.tif 000160
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ３６」または「Ｍ３６」改変パターンと称される。
【０２２５】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１５２】
2020036603.tif 000161
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１５３】
2020036603.tif 000162
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１５４】
2020036603.tif 000163
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１５５】
2020036603.tif 000164
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４２」または「Ｍ４２」改変パターンと称される。
【０２２６】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１５６】
2020036603.tif 000165
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１５７】
2020036603.tif 000166
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１５８】
2020036603.tif 000167
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１５９】
2020036603.tif 000168
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４３」または「Ｍ４３」改変パターンと称される。
【０２２７】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１６０】
2020036603.tif 000169
2020036603.tif 000170
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１６１】
2020036603.tif 000171
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１６２】
2020036603.tif 000172
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１６３】
2020036603.tif 000173
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４４」または「Ｍ４４」改変パターンと称される。
【０２２８】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１６４】
2020036603.tif 000174
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１６５】
2020036603.tif 000175
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１６６】
2020036603.tif 000176
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１６７】
2020036603.tif 000177
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４５」または「Ｍ４５」改変パターンと称される。
【０２２９】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１６８】
2020036603.tif 000178
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１６９】
2020036603.tif 000179
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１７０】
2020036603.tif 000180
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１７１】
2020036603.tif 000181
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４６」または「Ｍ４６」改変パターンと称される。
【０２３０】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１７２】
2020036603.tif 000182
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１７３】
2020036603.tif 000183
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１７４】
2020036603.tif 000184
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１７５】
2020036603.tif 000185
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４７」または「Ｍ４７」改変パターンと称される。
【０２３１】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１７６】
2020036603.tif 000186
2020036603.tif 000187
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１７７】
2020036603.tif 000188
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１７８】
2020036603.tif 000189
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１７９】
2020036603.tif 000190
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４８」または「Ｍ４８」改変パターンと称される。
【０２３２】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１８０】
2020036603.tif 000191
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１８１】
2020036603.tif 000192
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１８２】
2020036603.tif 000193
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１８３】
2020036603.tif 000194
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ５２」または「Ｍ５２」改変パターンと称される。
【０２３３】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１８４】
2020036603.tif 000195
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１８５】
2020036603.tif 000196
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１８６】
2020036603.tif 000197
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１８７】
2020036603.tif 000198
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンはまた、「ＡＳ−Ｍ５４」または「Ｍ５４」改変パターンと称される。
【０２３４】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１８８】
2020036603.tif 000199
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１８９】
2020036603.tif 000200
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１９０】
2020036603.tif 000201
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１９１】
2020036603.tif 000202
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンはまた、「ＡＳ−Ｍ５５」または「Ｍ５５」改変パターンと称される。
【０２３５】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１９２】
2020036603.tif 000203
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１９３】
2020036603.tif 000204
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１９４】
2020036603.tif 000205
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１９５】
2020036603.tif 000206
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンはまた、「ＡＳ−Ｍ５６」または「Ｍ５６」改変パターンと称される。
【０２３６】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１９６】
2020036603.tif 000207
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１９７】
2020036603.tif 000208
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１９８】
2020036603.tif 000209
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１９９】
2020036603.tif 000210
2020036603.tif 000211
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンはまた、「ＡＳ−Ｍ５７」または「Ｍ５７」改変パターンと称される。
【０２３７】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２００】
2020036603.tif 000212
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２０１】
2020036603.tif 000213
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２０２】
2020036603.tif 000214
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２０３】
2020036603.tif 000215
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンはまた、「ＡＳ−Ｍ５８」または「Ｍ５８」改変パターンと称される。
【０２３８】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２０４】
2020036603.tif 000216
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２０５】
2020036603.tif 000217
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２０６】
2020036603.tif 000218
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２０７】
2020036603.tif 000219
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンはまた、「ＡＳ−Ｍ５９」または「Ｍ５９」改変パターンと称される。
【０２３９】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２０８】
2020036603.tif 000220
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
2020036603.tif 000221
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２０９】
2020036603.tif 000222
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２１０】
2020036603.tif 000223
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンはまた、「ＡＳ−Ｍ６０」または「Ｍ６０」改変パターンと称される。
【０２４０】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２１１】
2020036603.tif 000224
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２１２】
2020036603.tif 000225
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２１３】
2020036603.tif 000226
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２１４】
2020036603.tif 000227
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンはまた、「ＡＳ−Ｍ６１」または「Ｍ６１」改変パターンと称される。
【０２４１】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２１５】
2020036603.tif 000228
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２１６】
2020036603.tif 000229
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２１７】
2020036603.tif 000230
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２１８】
2020036603.tif 000231
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンはまた、「ＡＳ−Ｍ６２」または「Ｍ６２」改変パターンと称される。
【０２４２】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２１９】
2020036603.tif 000232
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２２０】
2020036603.tif 000233
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２２１】
2020036603.tif 000234
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２２２】
2020036603.tif 000235
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンはまた、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６３」または「Ｍ６３」改変パターンと称される。
【０２４３】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２２３】
2020036603.tif 000236
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２２４】
2020036603.tif 000237
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２２５】
2020036603.tif 000238
2020036603.tif 000239
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２２６】
2020036603.tif 000240
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンはまた、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６４」または「Ｍ６４」改変パターンと称される。
【０２４４】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２２７】
2020036603.tif 000241
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２２８】
2020036603.tif 000242
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２２９】
2020036603.tif 000243
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２３０】
2020036603.tif 000244
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンはまた、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６５」または「Ｍ６５」改変パターンと称される。
【０２４５】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２３１】
2020036603.tif 000245
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２３２】
2020036603.tif 000246
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２３３】
2020036603.tif 000247
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２３４】
2020036603.tif 000248
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンはまた、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６６」または「Ｍ６６」改変パターンと称される。
【０２４６】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２３５】
2020036603.tif 000249
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２３６】
2020036603.tif 000250
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２３７】
2020036603.tif 000251
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２３８】
2020036603.tif 000252
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンはまた、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６７」または「Ｍ６７」改変パターンと称される。
【０２４７】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２３９】
2020036603.tif 000253
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２４０】
2020036603.tif 000254
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２４１】
2020036603.tif 000255
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２４２】
2020036603.tif 000256
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンはまた、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６８」または「Ｍ６８」改変パターンと称される。
【０２４８】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２４３】
2020036603.tif 000257
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２４４】
2020036603.tif 000258
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２４５】
2020036603.tif 000259
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２４６】
2020036603.tif 000260
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンはまた、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６９」または「Ｍ６９」改変パターンと称される。
【０２４９】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２４７】
2020036603.tif 000261
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２４８】
2020036603.tif 000262
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２４９】
2020036603.tif 000263
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２５０】
2020036603.tif 000264
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンはまた、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ７０」または「Ｍ７０」改変パターンと称される。
【０２５０】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２５１】
2020036603.tif 000265
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２５２】
2020036603.tif 000266
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２５３】
2020036603.tif 000267
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２５４】
2020036603.tif 000268
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンはまた、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ７１」または「Ｍ７１」改変パターンと称される。
【０２５１】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２５５】
2020036603.tif 000269
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２５６】
2020036603.tif 000270
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２５７】
2020036603.tif 000271
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２５８】
2020036603.tif 000272
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンはまた、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ７２」または「Ｍ７２」改変パターンと称される。
【０２５２】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２５９】
2020036603.tif 000273
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２６０】
2020036603.tif 000274
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２６１】
2020036603.tif 000275
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２６２】
2020036603.tif 000276
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンはまた、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ７３」または「Ｍ７３」改変パターンと称される。
【０２５３】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２６３】
2020036603.tif 000277
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２６４】
2020036603.tif 000278
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ７*」または「Ｍ７*」改変パターンと称される。
【０２５４】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２６５】
2020036603.tif 000279
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２６６】
2020036603.tif 000280
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６*」または「Ｍ６*」改変パターンと称される。
【０２５５】
他の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２６７】
2020036603.tif 000281
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２６８】
2020036603.tif 000282
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ５*」または「Ｍ５*」改変パターンと称される。
【０２５６】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２６９】
2020036603.tif 000283
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２７０】
2020036603.tif 000284
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４*」または「Ｍ４*」改変パターンと称される。
【０２５７】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２７１】
2020036603.tif 000285
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２７２】
2020036603.tif 000286
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ８*」または「Ｍ８*」改変パターンと称される。
【０２５８】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２７３】
2020036603.tif 000287
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２７４】
2020036603.tif 000288
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２*」または「Ｍ２*」改変パターンと称される。
【０２５９】
他の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２７５】
2020036603.tif 000289
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２７６】
2020036603.tif 000290
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１０*」または「Ｍ１０*」改変パターンと称される。
【０２６０】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２７７】
2020036603.tif 000291
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２７８】
2020036603.tif 000292
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１１*」または「Ｍ１１*」改変パターンと称される。
【０２６１】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２７９】
2020036603.tif 000293
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２８０】
2020036603.tif 000294
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１３*」または「Ｍ１３*」改変パターンと称される。
【０２６２】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２８１】
2020036603.tif 000295
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２８２】
2020036603.tif 000296
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１４*」または「Ｍ１４*」改変パターンと称される。
【０２６３】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２８３】
2020036603.tif 000297
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２８４】
2020036603.tif 000298
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１５*」または「Ｍ１５*」改変パターンと称される。
【０２６４】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２８５】
2020036603.tif 000299
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２８６】
2020036603.tif 000300
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１６*」または「Ｍ１６*」改変パターンと称される。
【０２６５】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２８７】
2020036603.tif 000301
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２８８】
2020036603.tif 000302
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１７*」または「Ｍ１７*」改変パターンと称される。
【０２６６】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２８９】
2020036603.tif 000303
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２９０】
2020036603.tif 000304
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１８*」または「Ｍ１８*」改変パターンと称される。
【０２６７】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２９１】
2020036603.tif 000305
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２９２】
2020036603.tif 000306
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１９*」または「Ｍ１９*」改変パターンと称される。
【０２６８】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２９３】
2020036603.tif 000307
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１−４ＲＮＡモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２９４】
2020036603.tif 000308
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２９５】
2020036603.tif 000309
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２０*」または「Ｍ２０*」改変パターンと称される。
【０２６９】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２９６】
2020036603.tif 000310
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２９７】
2020036603.tif 000311
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２２*」または「Ｍ２２*」改変パターンと称される。
【０２７０】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２９８】
2020036603.tif 000312
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２９９】
2020036603.tif 000313
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２４*」または「Ｍ２４*」改変パターンと称される。
【０２７１】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３００】
2020036603.tif 000314
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３０１】
2020036603.tif 000315
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２５*」または「Ｍ２５*」改変パターンと称される。
【０２７２】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３０２】
2020036603.tif 000316
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３０３】
2020036603.tif 000317
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２６*」または「Ｍ２６*」改変パターンと称される。
【０２７３】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３０４】
2020036603.tif 000318
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３０５】
2020036603.tif 000319
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２７*」または「Ｍ２７*」改変パターンと称される。
【０２７４】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３０６】
2020036603.tif 000320
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３０７】
2020036603.tif 000321
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２８*」または「Ｍ２８*」改変パターンと称される。
【０２７５】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３０８】
2020036603.tif 000322
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡを含む。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３０９】
2020036603.tif 000323
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２９*」または「Ｍ２９*」改変パターンと称される。
【０２７６】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３１０】
2020036603.tif 000324
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３１１】
2020036603.tif 000325
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ３４*」または「Ｍ３４*」改変パターンと称される。
【０２７７】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３１２】
2020036603.tif 000326
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３１３】
2020036603.tif 000327
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ３５*」または「Ｍ３５*」改変パターンと称される。
【０２７８】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３１４】
2020036603.tif 000328
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３１５】
2020036603.tif 000329
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ３７*」または「Ｍ３７*」改変パターンと称される。
【０２７９】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３１６】
2020036603.tif 000330
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３１７】
2020036603.tif 000331
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ３８*」または「Ｍ３８*」改変パターンと称される。
【０２８０】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３１８】
2020036603.tif 000332
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３１９】
2020036603.tif 000333
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４０*」または「Ｍ４０*」改変パターンと称される。
【０２８１】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３２０】
2020036603.tif 000334
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３２１】
2020036603.tif 000335
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４１*」または「Ｍ４１*」改変パターンと称される。
【０２８２】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３２２】
2020036603.tif 000336
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３２３】
2020036603.tif 000337
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ３６*」または「Ｍ３６*」改変パターンと称される。
【０２８３】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３２４】
2020036603.tif 000338
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３２５】
2020036603.tif 000339
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４２*」または「Ｍ４２*」改変パターンと称される。
【０２８４】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３２６】
2020036603.tif 000340
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３２７】
2020036603.tif 000341
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４３*」または「Ｍ４３*」改変パターンと称される。
【０２８５】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３２８】
2020036603.tif 000342
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３２９】
2020036603.tif 000343
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４４*」または「Ｍ４４*」改変パターンと称される。
【０２８６】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３３０】
2020036603.tif 000344
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３３１】
2020036603.tif 000345
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４６*」または「Ｍ４６*」改変パターンと称される。
【０２８７】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３３２】
2020036603.tif 000346
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３３３】
2020036603.tif 000347
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４７*」または「Ｍ４７*」改変パターンと称される。
【０２８８】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３３４】
2020036603.tif 000348
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３３５】
2020036603.tif 000349
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４８*」または「Ｍ４８*」改変パターンと称される。
【０２８９】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３３６】
2020036603.tif 000350
2020036603.tif 000351
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３３７】
2020036603.tif 000352
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ５２*」または「Ｍ５２*」改変パターンと称される。
【０２９０】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３３８】
2020036603.tif 000353
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３３９】
2020036603.tif 000354
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ５４*」または「Ｍ５４*」改変パターンと称される。
【０２９１】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３４０】
2020036603.tif 000355
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３４１】
2020036603.tif 000356
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ５５*」または「Ｍ５５*」改変パターンと称される。
【０２９２】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３４２】
2020036603.tif 000357
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３４３】
2020036603.tif 000358
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ５６*」または「Ｍ５６*」改変パターンと称される。
【０２９３】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３４４】
2020036603.tif 000359
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３４５】
2020036603.tif 000360
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ５７*」または「Ｍ５７*」改変パターンと称される。
【０２９４】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３４６】
2020036603.tif 000361
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３４７】
2020036603.tif 000362
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ５８*」または「Ｍ５８*」改変パターンと称される。
【０２９５】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３４８】
2020036603.tif 000363
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３４９】
2020036603.tif 000364
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ５９*」または「Ｍ５９*」改変パターンと称される。
【０２９６】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３５０】
2020036603.tif 000365
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３５１】
2020036603.tif 000366
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６０*」または「Ｍ６０*」改変パターンと称される。
【０２９７】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３５２】
2020036603.tif 000367
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３５３】
2020036603.tif 000368
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６１*」または「Ｍ６１*」改変パターンと称される。
【０２９８】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３５４】
2020036603.tif 000369
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３５５】
2020036603.tif 000370
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６２*」または「Ｍ６２*」改変パターンと称される。
【０２９９】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３５６】
2020036603.tif 000371
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３５７】
2020036603.tif 000372
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンはまた、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６３＊」または「Ｍ６３＊」改変パターンと称される。
【０３００】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３５８】
2020036603.tif 000373
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３５９】
2020036603.tif 000374
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンはまた、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６４＊」または「Ｍ６４＊」改変パターンと称される。
【０３０１】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３６０】
2020036603.tif 000375
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３６１】
2020036603.tif 000376
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンはまた、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６５＊」または「Ｍ６５＊」改変パターンと称される。
【０３０２】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３６２】
2020036603.tif 000377
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３６３】
2020036603.tif 000378
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンはまた、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６６＊」または「Ｍ６６＊」改変パターンと称される。
【０３０３】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３６４】
2020036603.tif 000379
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３６５】
2020036603.tif 000380
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンはまた、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６７＊」または「Ｍ６７＊」改変パターンと称される。
【０３０４】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３６６】
2020036603.tif 000381
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３６７】
2020036603.tif 000382
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンはまた、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６８＊」または「Ｍ６８＊」改変パターンと称される。
【０３０５】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３６８】
2020036603.tif 000383
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３６９】
2020036603.tif 000384
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンはまた、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６９＊」または「Ｍ６９＊」改変パターンと称される。
【０３０６】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３７０】
2020036603.tif 000385
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３７１】
2020036603.tif 000386
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンはまた、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ７０＊」または「Ｍ７０＊」改変パターンと称される。
【０３０７】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３７２】
2020036603.tif 000387
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３７３】
2020036603.tif 000388
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンはまた、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ７１＊」または「Ｍ７１＊」改変パターンと称される。
【０３０８】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３７４】
2020036603.tif 000389
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３７５】
2020036603.tif 000390
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンはまた、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ７２＊」または「Ｍ７２＊」改変パターンと称される。
【０３０９】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３７６】
2020036603.tif 000391
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３７７】
2020036603.tif 000392
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンはまた、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ７３＊」または「Ｍ７３＊」改変パターンと称される。
【０３１０】
追加の例示的アンチセンス鎖の改変としては、以下を含む：
【化３７８】
2020036603.tif 000393
【化３７９】
2020036603.tif 000394
【化３８０】
2020036603.tif 000395
【化３８１】
2020036603.tif 000396
【化３８２】
2020036603.tif 000397
【化３８３】
2020036603.tif 000398
式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｆ」＝２’−フルオロＮＡおよび「ｐ」＝ホスホロチオエート結合である。
【０３１１】
ある特定の追加的な実施形態では、本発明の選択されたｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、任意に５’末端で伸長され、塩基「ＡＳ−Ｍ８」、「ＡＳ−Ｍ１７」および「ＡＳ−Ｍ４８」改変パターンの例示的な５’伸長を、それぞれ以下に示す：
【化３８４】
2020036603.tif 000399
【０３１２】
ある特定の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡのセンス鎖は改変されており、−センス鎖改変の具体的かつ例示的な形態を以下に示す。このような改変センス鎖は上記に示すＤｓｉＲＮＡのいずれかのセンス鎖に代わって上述のアンチセンス鎖とアニールする以下に記載のセンス鎖を含むＤｓｉＲＮＡを作製することが考えられる。例示的なセンス鎖改変パターンは以下：
【化３８５】
2020036603.tif 000400
【化３８６】
2020036603.tif 000401
【化３８７】
2020036603.tif 000402
【化３８８】
2020036603.tif 000403
【化３８９】
2020036603.tif 000404
【化３９０】
2020036603.tif 000405
【化３９１】
2020036603.tif 000406
【化３９２】
2020036603.tif 000407
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｆ」＝２’−フルオロＮＡおよび「ｐ」＝ホスホロチオエート結合である。
【０３１３】
本発明のある特定の実施形態では、本明細書に開示される全ての２’−Ｏ−メチル改変パターンについて、２’−Ｏ−メチル改変のいずれかまたはその全ての部位を、任意に２’−フルオロ改変により置換することができることが企図される。上記の改変パターンをまた、例えば、以下に記述した伸長ＤｓｉＲＮＡ構造およびミスマッチならびに／またはほころびたＤｓｉＲＮＡ構造内に組み込むことも可能である。
【０３１４】
別の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ開裂を正しい方向にするように働く、１〜３ミスマッチ残基を有する等しい長さを持つ鎖を含む（とりわけ、３’−末端残基からナンバリングした時に、ＤｓｉＲＮＡの第１の鎖上の位置１、２または３のうちの１つ以上が、第１の鎖および第２の鎖が互いにアニールする時に、第２の鎖上の５’末端領域の対応する残基とミスマッチする）。２つの末端ミスマッチ残基を持つ例示的２７マーＤｓｉＲＮＡ剤を
【化３９３】
2020036603.tif 000408
に示し、
式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｍ」＝鎖がアニールする時、他の相補的鎖の対応する「Ｍ」残基と塩基対を形成しない（水素結合しない）核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは非天然または改変核酸）である。このような薬剤の任意の残基は任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり得、上記非対称薬剤に関して示したように、下（第２の）鎖の３’−末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの交互位置が上記「平滑／ほつれ」ＤｓｉＲＮＡ剤中でも使用可能である。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
【０３１５】
ある特定のさらなる実施形態では、本発明は、推定されるセンス鎖Ｄｉｃｅｒ開裂部位の３’と、推定されるアンチセンス鎖Ｄｉｃｅｒ開裂部位の対応する５’とに位置する、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の領域内に１つ以上の塩基対化デオキシリボヌクレオチドを有するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に関する組成物を提供する。本発明の組成物は、前駆体分子であるｄｓＲＮＡを含み、すなわち本発明のｄｓＲＮＡが、活性小干渉核酸（ｓｉＲＮＡ）を産生するようにｉｎ  ｖｉｖｏで処理される。ｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒによって、ＲＩＳＣ内に組み込まれる活性ｓｉＲＮＡに処理される。
【０３１６】
ある特定の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤は、以下の例示的構造を持ち得る（任意の以下の例示的構造は、例えば、上述の構造の下鎖改変パターンと組み合わせ可能であることに留意のこと−１つの特定の例において、任意の上記構造中で示した下鎖改変パターンが、任意の以下の構造の下鎖の２７のほとんどの３’残基に適用される。別の特定の例にて、下鎖の２３のほとんどの３’残基における、任意の上記構造にて示した下鎖改変パターンが、任意の以下の構造の下鎖の２３のほとんどの３’残基に適用される）。
【０３１７】
１つのこのような実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、以下の（例示的「右伸長」、「ＤＮＡ伸長」ＤｓｉＲＮＡ）、
【化３９４】
2020036603.tif 000409
を含み、
式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態では「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、および「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
【０３１８】
関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、以下を含み、
【化３９５】
2020036603.tif 000410
式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態では「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、および「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
【０３１９】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、以下を含み、
【化３９６】
2020036603.tif 000411
式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態では「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡ、かつＮ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖に沿って交互残基に局在する。
【０３２０】
別のこのような実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、以下を含み、
【化３９７】
2020036603.tif 000412
式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態では「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡ、かつ「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖に沿って交互残基に局在する。
【０３２１】
別のこのような実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、以下を含み、
【化３９８】
2020036603.tif 000413
式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態では「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡ、かつ「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖に沿って交互残基に局在する。
【０３２２】
別の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、以下を含み、
【化３９９】
2020036603.tif 000414
式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態では「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡ、かつ「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８または１〜１０であり、少なくとも１つのＤ１Ｎが上鎖中に存在し、下鎖中の対応するＤ２Ｎと塩基対を形成する。任意にＤ１ＮとＤ１Ｎ＋１は、対応するＤ２ＮとＤ２Ｎ＋１と塩基対を形成し、Ｄ１Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１、およびＤ１Ｎ＋２は、対応するＤ２Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１およびＤ１Ｎ＋２などと塩基対を形成する。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖に沿って交互残基に局在する。
【０３２３】
本明細書で描写した構造において、センス鎖またはアンチセンス鎖いずれかの５’末端が任意にリン酸基を含む。
【０３２４】
別の実施形態では、ＤＮＡ：ＤＮＡ−伸長ＤｓｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ開裂を正しい方向にするように働く、１〜３ミスマッチ残基を有する等しい長さを持つ鎖を含む（とりわけ、３’−末端残基からナンバリングした時に、ＤｓｉＲＮＡの第１の鎖上の位置１、２または３のうちの１つ以上が、第１の鎖および第２の鎖が互いにアニールする時に、第２の鎖上の５’末端領域の対応する残基とミスマッチする）。２つの末端ミスマッチ残基を持つ例示的ＤＮＡ：ＤＮＡ−伸長ＤｓｉＲＮＡ剤が
【化４００】
2020036603.tif 000415
に示され、
式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｍ」＝鎖がアニールする時、他の相補的鎖の対応する「Ｍ」残基と塩基対を形成しない（水素結合しない）核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは非天然または改変核酸）、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜１５、または任意１〜８であり、「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。このような薬剤の任意の残基は任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり得、上記非対称薬剤に関して示したように、下（第２の）鎖の３’−末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの交互位置が、上記「平滑／ほつれ」ＤｓｉＲＮＡ剤中でも使用可能である。１つの実施形態では、上鎖（第１の鎖）はセンス鎖であり、下鎖（第２の鎖）はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。非対称／オーバーハング薬剤に関して上述のものと並行する改変パターンおよびＤＮＡ：ＤＮＡ伸長パターンもまた、このような「平滑／ほつれ」薬剤内に組み込むことが可能である。
【０３２５】
１つの実施形態では、伸長したＤｓｉＲＮＡ剤が、ｄｓＲＮＡ構造中の塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドの存在を必要としない、Ｄｉｃｅｒ開裂の特定の方向を介して機能するようにモデル化された部位に位置するデオキシリボヌクレオチドを含むように提供される。このような分子の例示的な構造を、
【化４０１】
2020036603.tif 000416
に示し、
式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態では「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。上記の構造は、Ｄｉｃｅｒがその第一処理後形態として、最小２１マーの二本鎖を開裂するようにさせるようにモデル化されている。上記構造の下鎖がアンチセンス鎖である実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端の最後および最後から２番目の残基で２つのデオキシリボヌクレオチド残基が存在することが、的外れの効果の低減を支援する（先行研究では、的外れの効果を低減させるために、アンチセンス鎖の５’末端から少なくとも最後から２番目の２’−Ｏ−メチル改変が示される。例えば、米国特許公開公報第２００７／０２２３４２７号を参照のこと）。
【０３２６】
１つの実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、以下を含み（例示的「左伸長」、「ＤＮＡ伸長」ＤｓｉＲＮＡ）、
【化４０２】
2020036603.tif 000417
2020036603.tif 000418
式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態では「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、および「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
【０３２７】
関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４０３】
2020036603.tif 000419
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマー、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
【０３２８】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４０４】
2020036603.tif 000420
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマー、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡである。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖に沿って交互残基に局在する。
【０３２９】
別のこのような実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４０５】
2020036603.tif 000421
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマー、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡである。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖に沿って交互残基に局在する。
【０３３０】
別のこのような実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４０６】
2020036603.tif 000422
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡ、および「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖に沿って交互残基に局在する。
【０３３１】
別のこのような実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４０７】
2020036603.tif 000423
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡ、および「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態では「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインである。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖に沿って交互残基に局在する。
【０３３２】
別の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４０８】
2020036603.tif 000424
2020036603.tif 000425
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡ、および「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８または１〜１０であり、ここで少なくとも１つのＤ１Ｎが上鎖中に存在し、下鎖中の対応するＤ２Ｎと塩基対を形成する。任意にＤ１ＮとＤ１Ｎ＋１は、対応するＤ２ＮとＤ２Ｎ＋１と塩基対を形成し、Ｄ１Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１、Ｄ１Ｎ＋２は、対応するＤ２Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１およびＤ１Ｎ＋２などと塩基対を形成する。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖に沿って交互残基に局在する。
【０３３３】
関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４０９】
2020036603.tif 000426
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態では「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８または１〜１０であり、ここで少なくとも１つのＤ１Ｎが上鎖中に存在し、下鎖中の対応するＤ２Ｎと塩基対を形成する。任意にＤ１ＮとＤ１Ｎ＋１は、対応するＤ２ＮとＤ２Ｎ＋１と塩基対を形成し、Ｄ１Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１、Ｄ１Ｎ＋２は、対応するＤ２Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１およびＤ１Ｎ＋２などと塩基対を形成する。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖に沿って交互残基に局在する。
【０３３４】
別の実施形態では、ＤＮＡ：ＤＮＡ−伸長ＤｓｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ開裂を正しい方向にするように働く、１〜３ミスマッチ残基を有する等しい長さを持つ鎖を含む（とりわけ、３’−末端残基からナンバリングした時に、ＤｓｉＲＮＡの第１の鎖上の位置１、２または３のうちの１つ以上が、第１の鎖および第２の鎖が互いにアニールする時に、第２の鎖上の５’末端領域の対応する残基とミスマッチする）。２つの末端ミスマッチ残基を持つ例示的ＤＮＡ：ＤＮＡ−伸長ＤｓｉＲＮＡ剤が、
【化４１０】
2020036603.tif 000427
に示され、
式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｍ」＝鎖がアニールする時、他の相補的鎖の対応する「Ｍ」残基と塩基対を形成しない（水素結合しない）核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは非天然または改変核酸）、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８、または任意１〜１０であり、「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。このような薬剤の任意の残基は任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり得、上記非対称薬剤に関して示したように、下（第２の）鎖の３’−末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの交互位置が、上記「平滑／ほつれ」ＤｓｉＲＮＡ剤中でも使用可能である。１つの実施形態では、上鎖（第１の鎖）はセンス鎖であり、下鎖（第２の鎖）はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。非対称／オーバーハング薬剤に関して上で示したものと並行する改変パターンおよびＤＮＡ：ＤＮＡ伸長パターンもまた、このような「平滑／ほつれ」薬剤内に組み込むことが可能である。
【０３３５】
別の実施形態では、伸長したＤｓｉＲＮＡ剤が、ｄｓＲＮＡ構造中の塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドの存在を必要としない、Ｄｉｃｅｒ開裂の特定の方向を介して機能するようにモデル化された部位に位置するデオキシリボヌクレオチドを含むように提供される。このような分子の例示的な構造が
【化４１１】
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または
【化４１２】
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に示され、
式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態では「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
【０３３６】
上記構造の下鎖がアンチセンス鎖である上記のいずれかの実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端の最後および最後から二番目の残基での２つのデオキシリボヌクレオチド残基の位置が、的外れの効果の低減を支援する（先行研究では、的外れの効果を低減させるために、アンチセンス鎖の５’末端から少なくとも最後から二番目の２’−Ｏ−メチル改変が示される。例えば、米国特許公開公報第２００７／０２２３４２７号を参照のこと）。
【０３３７】
ある特定の実施形態では、上記構造の「Ｄ」残基には、少なくとも１つのＰＳ−ＤＮＡまたはＰＳ−ＲＮＡが含まれる。任意に、上記構造の「Ｄ」残基には、Ｄｉｃｅｒ開裂を阻害する少なくとも１つの改変ヌクレオチドが含まれる。
【０３３８】
上記「ＤＮＡ−伸長」ＤｓｉＲＮＡ剤は、「左伸長」または「右伸長」のいずれかとして分類される一方で、単剤内で左および右の両方の伸長ＤＮＡ−含有配列を含むＤｓｉＲＮＡ剤（例えば、コアｄｓＲＮＡ構造を取り囲むフランキングがｄｓＤＮＡ伸長である）をまた、「右伸長」および「左伸長」剤に関して本明細書で記述したものと同様の様式で、作製し、かつ使用できる。
【０３３９】
いくつかの実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡはさらに、ＤＮＡ：ＤＮＡ−伸長ＤｓｉＲＮＡ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖を連結する結合部位またはドメインを含む。任意に、このような結合部位ドメインは、センス鎖の３’末端と、アンチセンス鎖の５’末端とを連結する。結合部位は、オリゴメチレンジオールリンカー、オリゴエチレングリコールリンカー、または他の本技術分野で認識されるリンカー部位のような、化学的（非ヌクレオチド）リンカーであってもよい。あるいは、リンカーは、任意に伸長ループおよび／またはテトラループを含む、ヌクレオチドリンカーであり得る。
【０３４０】
１つの実施形態では、ＤｓｉＲＮＡ剤は、２５塩基対長を持つセンス鎖と、１〜４塩基３’−オーバーハング（例えば１塩基３’オーバーハング、２塩基３’−オーバーハング、３塩基３’−オーバーハングまたは４塩基３’−オーバーハング）を持つ２７塩基対長を持つアンチセンス鎖を持つ、非対称構造を有する。別の実施形態では、本ＤｓｉＲＮＡ剤は、センス鎖の３’末端にて、２つのデオキシヌクレオチドをさらに含む、非対称構造を有する。
【０３４１】
別の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡ剤は、２５塩基対長を持つアンチセンス鎖と、１〜４塩基３’−オーバーハング（例えば１塩基３’オーバーハング、２塩基３’−オーバーハング、３塩基３’−オーバーハングまたは４塩基３’−オーバーハング）を持つ２７塩基対長を持つセンス鎖を持つ、非対称構造を有する。別の実施形態では、本ＤｓｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端にて、２つのデオキシヌクレオチドをさらに含む、非対称構造を有する。
【０３４２】
本発明の例示的なグリコール酸オキシダーゼ標的化ＤｓｉＲＮＡ剤、およびそれらの関連するグリコール酸オキシダーゼ標的配列は、下の一連の表に示される以下のものを含む：
表番号：
（２）選択したヒト抗グリコール酸オキシダーゼＤｓｉＲＮＡ剤（非対称）；
（３）選択したヒト抗グリコール酸オキシダーゼＤｓｉＲＮＡ、非改変の二本鎖（非対称）；
（４）グリコール酸オキシダーゼｍＲＮＡ中のＤｓｉＲＮＡ標的配列（２１マー）；
（５）選択したヒト抗グリコール酸オキシダーゼ「平滑／平滑」ＤｓｉＲＮＡ；および
（６）グリコール酸オキシダーゼｍＲＮＡ中のＤｓｉＲＮＡ成分である１９のヌクレオチド標的配列；
（７）＞５０％のノックダウン有効性を有すると予測されるヒト抗グリコール酸オキシダーゼＤｓｉＲＮＡ（非対称）；
（８）＞５０％のノックダウン有効性を有すると予測されるヒト抗グリコール酸オキシダーゼＤｓｉＲＮＡのＤｓｉＲＮＡ標的配列（２１マー）；
（９）＞５０％のノックダウン有効性を有すると予測されるヒト抗グリコール酸オキシダーゼＤｓｉＲＮＡに対応する「平滑／平滑」ＤｓｉＲＮＡ；および
（１０）＞５０％のノックダウン有効性を有すると予測されるヒト抗グリコール酸オキシダーゼＤｓｉＲＮＡのＤｓｉＲＮＡ成分である１９のヌクレオチド標的配列；
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【表２−１０】
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【表２−１１】
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【表２−１２】
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【表２−１３】
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【表２−１４】
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【表２−１５】
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【表２−１６】
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【表２−１７】
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【表２−１８】
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【表２−１９】
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【表２−２０】
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【表２−２１】
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【表２−２２】
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【表２−２３】
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【表２−２４】
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【表２−２５】
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【表２−２６】
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【表２−２７】
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【表２−２８】
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【表２−２９】
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【表２−３０】
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【表２−３１】
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【表２−３２】
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【表２−３３】
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【表２−３４】
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【表２−３５】
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【表２−３６】
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【表２−３７】
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【表２−３８】
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【表２−３９】
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【表２−４０】
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【表２−４１】
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【表２−４２】
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【表２−４３】
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【表２−４４】
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【表２−４５】
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【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表３−１０】
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【表３−１１】
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【表３−１２】
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【表３−１３】
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【表３−１４】
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【表３−１５】
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【表３−１６】
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【表３−１７】
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【表３−１８】
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【表３−１９】
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【表３−２０】
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【表３−２１】
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【表３−２２】
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【表３−２３】
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【表３−２４】
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【表３−２５】
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【表３−２６】
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【表３−２７】
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【表３−２８】
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【表３−２９】
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【表３−３０】
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【表３−３１】
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【表３−３２】
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【表３−３３】
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【表３−３４】
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【表３−３５】
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【表３−３６】
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【表３−３７】
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【表３−３８】
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【表３−３９】
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【表３−４０】
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【表３−４１】
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【表３−４２】
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【表３−４３】
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【表３−４４】
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【表３−４５】
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【表３−４６】
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【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表４−７】
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【表４−８】
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【表４−９】
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【表４−１０】
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【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【表５−５】
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【表５−６】
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【表５−７】
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【表５−８】
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【表５−９】
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【表５−１０】
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【表５−１１】
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【表５−１２】
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【表５−１３】
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【表５−１４】
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【表５−１５】
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【表５−１６】
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【表５−１７】
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【表５−１８】
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【表５−１９】
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【表５−２０】
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【表５−２１】
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【表５−２２】
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【表５−２３】
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【表５−２４】
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【表５−２５】
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【表５−２６】
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【表５−２７】
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【表５−２８】
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【表５−２９】
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【表５−３０】
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【表５−３１】
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【表５−３２】
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【表５−３３】
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【表５−３４】
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【表５−３５】
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【表５−３６】
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【表５−３７】
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【表５−３８】
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【表５−３９】
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【表５−４０】
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【表５−４１】
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【表５−４２】
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【表５−４３】
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【表５−４４】
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【表５−４５】
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【表５−４６】
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【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
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【表６−６】
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【表６−７】
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【表６−８】
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【表６−９】
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【表６−１０】
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【表６−１１】
2020036603.tif 000587
【表６−１２】
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【表６−１３】
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【表６−１４】
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【表６−１５】
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【表６−１６】
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【表６−１７】
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【表６−１８】
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【表６−１９】
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【表６−２０】
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【表６−２１】
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【表６−２２】
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【表６−２３】
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【表６−２４】
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【表６−２５】
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【表６−２６】
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【表６−２７】
2020036603.tif 000603
【表６−２８】
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【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【表７−５】
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【表７−６】
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【表７−７】
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【表７−８】
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【表７−９】
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【表７−１０】
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【表７−１１】
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【表７−１２】
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【表７−１３】
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【表７−１４】
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【表７−１５】
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【表７−１６】
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【表７−１７】
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【表７−１８】
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【表７−１９】
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【表７−２０】
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【表７−２１】
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【表７−２２】
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【表１０−１４６】
2020036603.tif 001150
【表１０−１４７】
2020036603.tif 001151
【表１０−１４８】
2020036603.tif 001152
【表１０−１４９】
2020036603.tif 001153
【表１０−１５０】
2020036603.tif 001154
【０３４３】
上記の表２、３、５、７および９内で、下線残基は、２’−Ｏ−メチル残基を示し、大文字はリボヌクレオチド類を示し、小文字はデオキシリボヌクレオチド類を意味する。上記の表２、３および７のＤｓｉＲＮＡ剤は、平滑末端を有する２５／２７マーの薬剤である。上記の表２、３および７の薬剤の構造および／または改変パターンを、上記の遺伝的配列構造に対して容易に適合でき、例えば、第２の鎖の３’オーバーハングを伸長させるか、または短縮させることが可能であり、第２の鎖の２’−Ｏ−メチル化を第２の鎖の５’末端に向かって、任意に交互部位にて拡大させることが可能である。このような改変をもつ２５／２７マーＤｓｉＲＮＡをまた、上記ＤｓｉＲＮＡ剤から簡単にデザイン可能であり、グリコール酸オキシダーゼ発現の機能的阻害剤としても予測されるため、このようなさらなる改変は任意である。同様に、上記の表５および９の薬剤の、２７マー「平滑／平滑」ＤｓｉＲＮＡ構造および／または改変パターンを、例えばこのような構造に対するアンチセンス鎖の改変パターンの適用、および／またはこのような配列の上記遺伝的構造への適用のために、上記遺伝的配列構造に容易に適用できる。
【０３４４】
ある特定の実施形態では、各２７ヌクレオチドの独立した鎖長を有する２７マーＤｓｉＲＮＡを、本明細書の表２、３および７にて示した、非対称「２５／２７」構造と同一のグリコール酸オキシダーゼ転写物内の部位の標的化のために、デザインし、合成する。例示的「２７／２７」ＤｓｉＲＮＡは、上記表５および９のＤｓｉＲＮＡに関して示したような「平滑／平滑」構造で、任意にデザインされる。
【０３４５】
ある特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、第１の鎖の、例えば少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、または少なくとも２６の残基が、第２の鎖の対応する残基に相補的であることを必要とする。特定の関連実施形態では、第２の鎖の対応する残基に相補的なこれらの第１の鎖残基は任意に連続残基である。
【０３４６】
本明細書で使用するところの「ＤｓｉＲＮＡｍｍ」は、ＤｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖によって形成された二本鎖の１、２、３または４つのミスマッチ塩基対を含む、「ミスマッチ耐性領域」を持つＤｓｉＲＮＡを意味し、ここでこのようなミスマッチは、ＤｓｉＲＮＡのいずれかの末端の２つの末端塩基対間で横たわっている（したがって末端塩基対を含まない）場所で、ＤｓｉＲＮＡ内に位置する。ミスマッチ塩基対は、対応する標的核酸の推定されるＡｇｏ２切断部位の局所に関して本明細書で定義した、「ミスマッチ−耐性領域」内に局在する。ミスマッチ耐性領域は、標的鎖の推定Ａｇｏ２切断部位「の上流」に局在する。本文脈中の「上流」は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ二本鎖の５’−の大部分の部位として理解され、５’はＤｓｉＲＮＡ二本鎖のセンス鎖の方向を意味する。したがって、ミスマッチ耐性領域は、標的核酸の推定Ａｇｏ２切断部位に対応するセンス（パッセンジャー）鎖上の塩基の上流であり（図１）、あるいは、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス（ガイド）鎖を指す場合、ミスマッチ耐性領域は、標的核酸の推定Ａｇｏ２切断部位に相補的な塩基の下流に位置すると記述することも可能であり、すなわち、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖の３’の大部分と記述可能である（アンチセンス鎖の位置１は、アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドである、図１を参照のこと）。
【０３４７】
１つの実施形態では、例えば図１にて描写したようなナンバリングで、ミスマッチ耐性領域は、二本鎖のセンス鎖の５’末端で開始したヌクレオチドからナンバリングした場合、塩基対３〜９の間、または塩基対３〜９を含んで位置する。したがって、本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍは、右手伸長ＤｓｉＲＮＡのセンス鎖の位置３、４、５、６、７、８または９のいずれか１つにおいて、単一のミスマッチ塩基対を有する（位置１は、センス鎖の５’末端ヌクレオチドであり、位置９は、センス鎖配列に対応する標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列の推定Ａｇｏ２切断部位の５’に接したセンス鎖のヌクレオチド残基である）。ある特定の実施形態では、センス鎖の位置３、４、５、６、７、８または９の任意の位置でミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍでは、アンチセンス鎖の対応するミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、ＤｓｉＲＮＡｍｍ標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列ともミスマッチ塩基対を形成する（したがって、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基対にて中断され、相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列との間で同様に中断される）。代替的なの実施形態では、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖配列の対応するヌクレオチドとミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、その対応する標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列ヌクレオチドとも塩基対を形成する（したがって、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基対にて中断され、また相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列との間で維持される）。
【０３４８】
上述のように、ミスマッチ耐性領域（ミスマッチ領域）内で単一のミスマッチ塩基対を有する本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍ（例えば、センス鎖の位置３、４、５、６、７、８または９のいずれか１つにてミスマッチヌクレオチド残基をもつＤｓｉＲＮＡｍｍ）はさらに、１、２または３つのさらなるミスマッチ塩基対を含み得る。好ましい実施形態では、これらＤｓｉＲＮＡｍｍの１、２または３つのさらなるミスマッチ塩基対は、センス鎖の位置３、４、５、６、７、８および／または９にて（そしてアンチセンス鎖の対応する残基にて）発生する。１つのさらなるミスマッチ塩基対が、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内に存在する１つの実施形態では、センス鎖の２つのミスマッチ塩基対が、例えば（アンチセンス鎖の対応するヌクレオチド残基にて発生もするミスマッチとともに）センス鎖の位置４および位置６両方のヌクレオチドで発生し得る。
【０３４９】
２つのミスマッチ塩基対を有するＤｓｉＲＮＡｍｍ剤において、ミスマッチは、連続して（例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿った連続位置にて）発生可能である。あるいは、アンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖のヌクレオチドが、アンチセンス鎖配列と塩基対を形成するヌクレオチドによって散在可能である（例えば、位置４および５ではなく、位置３および６にてミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍに関して、センス鎖位置３および６のミスマッチ残基は、アンチセンス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する２つのヌクレオチドによって散在される）。例えば、対応するアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（センス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する）センス鎖の２つの残基が、これらのミスマッチ塩基対間に局在する、０、１、２、３、４または５のマッチした塩基対で発生可能である。
【０３５０】
３つのミスマッチ塩基対を有するある特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤において、ミスマッチは、連続して発生可能である（例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿って三重に発生可能である）。あるいは、アンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖のヌクレオチドが、アンチセンス鎖配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在可能である（例えば、位置５、６および７ではなく、位置３、４および８にてミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍに関して、センス鎖位置３および４のミスマッチ残基は、互いに隣接し、センス鎖位置４および８のミスマッチ残基は、アンチセンス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する３つの残基によって散在される）。例えば、対応するアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（センス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する）センス鎖の３つの残基が、これらのミスマッチ塩基対の任意の２つの間に局在する、０、１、２、３または４つのマッチした塩基対で発生可能である。
【０３５１】
４つのミスマッチ塩基対を有するある特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤に関して、ミスマッチは、連続して発生可能である（例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿って四重に発生可能である）。あるいは、アンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖のヌクレオチドが、アンチセンス鎖配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在可能である（例えば、位置４および６ではなく、位置３、５、７および８にてミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍに関して、センス鎖位置７および８のミスマッチ残基は、互いに隣接し、センス鎖位置３および５のミスマッチ残基は、アンチセンス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する１つの残基によって散在される。同様に、センス鎖位置５および７のミスマッチ残基がまた、アンチセンス鎖の対応する残基と、マッチした塩基対を形成する１つのヌクレオチドによっても散在される）。例えば、対応するアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（センス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する）センス鎖の４つの残基が、これらのミスマッチ塩基対の任意の２つの間に局在する、０、１、２または３つのマッチした塩基対で発生可能である。
【０３５２】
例えば図１でまた描写したようなナンバリングで、別の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍは、ＤｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の位置１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３のいずれか１つにて、単一のミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するミスマッチ耐性領域を含む（位置１はアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドであり、位置１７は、アンチセンス鎖配列に十分に相補的な標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列の推定Ａｇｏ２切断部位のアンチセンス鎖中の３’（下流）隣接であるアンチセンス鎖のヌクレオチド残基である）。ある特定の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖に関して、アンチセンス鎖の位置１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３のいずれかにミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍでは、アンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、ＤｓｉＲＮＡｍｍ標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列ともミスマッチ塩基対を形成する（したがって、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基対にて中断され、相補性は同様に、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列との間で中断される）。代替的な実施形態では、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖配列の対応するヌクレオチドとミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、その対応する標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列ヌクレオチドと塩基対を形成する（したがって、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基で中断され、また相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列との間で維持される）。
【０３５３】
上述のように、ミスマッチ耐性領域内で単一ミスマッチ塩基対を有する本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍ（例えば、アンチセンス鎖の位置１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３にてミスマッチヌクレオチド残基を持つＤｓｉＲＮＡｍｍ）はさらに、１、２または３つのさらなるミスマッチ塩基対を含み得る。好ましい実施形態では、これらＤｓｉＲＮＡｍｍのさらなる１、２または３つのミスマッチ塩基対が、アンチセンス鎖の位置１７、１８、１９、２０、２１、２２および／または２３で（そしてセンス鎖の対応する残基にて）発生する。１つのさらなるミスマッチ塩基対がＤｓｉＲＮＡｍｍ内に存在する１つの実施形態では、アンチセンス鎖の２つのミスマッチ塩基対が、（センス鎖の対応するヌクレオチド残基にて同様に発生しているミスマッチと共に）アンチセンス鎖の位置１８および位置２０の両方のヌクレオチドで発生し得る。
【０３５４】
２つのミスマッチ塩基対を有するＤｓｉＲＮＡｍｍ剤において、ミスマッチは連続して（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿った連続位置にて）発生し得る。あるいは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列と塩基対形成するヌクレオチドによって散在され得る（例えば位置１８および１９ではなく、位置１７および２０でミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍでは、アンチセンス鎖位置１７および２０のミスマッチ残基が、センス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する２つのヌクレオチドによって散在する）。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（センス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する）アンチセンス鎖の２つの残基は、これらのミスマッチ塩基対間に局在する０、１、２、３、４、５、６または７マッチ塩基対で発生可能である。
【０３５５】
３つのミスマッチ塩基対を有するある特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤に関して、ミスマッチは連続して起こり得る（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿って三重に起こり得る）。あるいは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドが、センス鎖配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在可能である（例えば、位置１９、２０および２１ではなく、位置１７、１８および２２にてミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍでは、アンチセンス鎖位置１７および１８のミスマッチ残基は、互いに隣接し、一方アンチセンス鎖位置１８および１２２のミスマッチ残基は、センス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する３つの残基によって散在される）。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する）アンチセンス鎖の３つの残基が、これらのミスマッチ塩基対の任意の２つの間に局在する、０、１、２、３、４、５または６のマッチした塩基対で発生可能である。
【０３５６】
４つのミスマッチ塩基対を有するある特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤では、ミスマッチは、連続して発生可能である（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿って四重に発生可能である）。あるいは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドが、センス鎖配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在可能である（例えば、位置１９および２１ではなく、位置１８、２０、２２および２３にてミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍでは、アンチセンス鎖位置２２および２３のミスマッチ残基は、互いに隣接し、一方アンチセンス鎖位置１８および２０のミスマッチ残基は、センス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する１つの残基によって散在される−同様に、アンチセンス鎖位置２０および２２のミスマッチ残基がまた、センス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する１つのヌクレオチドによって散在される）。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する）アンチセンス鎖の４つの残基が、これらのミスマッチ塩基対の任意の２つの間に局在する、０、１、２、３、４または５のマッチ塩基対で発生可能である。
【０３５７】
明確化の理由のために、上記ＤｓｉＲＮＡｍｍ剤内のミスマッチヌクレオチド残基の配置を、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの５’末端残基に関してナンバリングする。アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域（ミスマッチ領域）内に配置される位置のナンバリングが、推定Ａｇｏ２開裂部位に対するセンス鎖またはアンチセンス鎖の５’末端の近位での変動を伴ってシフト可能である。したがって、アンチセンス鎖またはセンス鎖いずれかの好ましいミスマッチ部位の配置をまた、推定Ａｇｏ２切断部位に対して、このようなミスマッチの許容される近位にあると同定可能でもある。したがって、１つの好ましい実施形態では、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖のミスマッチヌクレオチドの位置は、対応する標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列の推定Ａｇｏ２開裂部位の５’（上流）直近に配置されるセンス鎖のヌクレオチド残基である。他の好ましい実施形態では、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖のミスマッチヌクレオチドは、推定Ａｇｏ２開裂部位の２ヌクレオチド５’（上流）、推定Ａｇｏ２開裂部位の３ヌクレオチド５’（上流）、推定Ａｇｏ２開裂部位の４ヌクレオチド５’（上流）、推定Ａｇｏ２開裂部位の５ヌクレオチド５’（上流）、推定Ａｇｏ２開裂部位の６ヌクレオチド５’（上流）、推定Ａｇｏ２開裂部位の７ヌクレオチド５’（上流）、推定Ａｇｏ２開裂部位の８ヌクレオチド５’（上流）または推定Ａｇｏ２開裂部位の９ヌクレオチド５’（上流）に局在するセンス鎖のヌクレオチド残基に位置する。
【０３５８】
例示的単一ミスマッチ−含有２５／２７マーＤｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡｍｍ）は、以下の構造を含む（このようなミスマッチ−含有構造はまた、本明細書で示した他の例示的ＤｓｉＲＮＡ構造内に組み込んでもよい）。
【化４１３】
2020036603.tif 001155
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡおよび「Ｍ」＝鎖がアニールする時に、他の相補的鎖の対応する「Ｍ」残基と塩基対（水素結合）を形成しない核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは天然に存在しないまたは改変核酸）である。このような薬剤の任意の残基は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり得、−上記示したように、下（第２の）鎖の３’−末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡの交互配置を、上記のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤中で使用可能でもある。上記ミスマッチ構造では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０３５９】
ある特定の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡは、ＤｓｉＲＮＡの２つの鎖内のミスマッチ塩基対として必ずしも存在せず、標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列に関して存在するミスマッチを含み得る−したがって、ＤｓｉＲＮＡは、ＤｓｉＲＮＡの第１の鎖および第２の鎖間で完全な相補性を有してよく、また（ある特定の実施形態では、有効性および／または効力および／または効果の持続期間を促進することにおいて有益であり得る）標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡに関してミスマッチ残基を有し得る。ミスマッチが、アンチセンス鎖と標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列との間で発生するある特定の実施形態では、ミスマッチの位置が、標的領域の推定Ａｇｏ２切断部位の５’に局在したセンス鎖の配列に対応する位置で、−例えば標的配列の推定Ａｇｏ２切断部位に相補的であるアンチセンス残基の３’に対して、アンチセンス鎖内に位置するアンチセンス鎖残基で、アンチセンス内に配置される。
【０３６０】
標的配列に関する単一ミスマッチ残基を持つ例示的２５／２７マーＤｓｉＲＮＡは以下の構造を含む。
【化４１４】
2020036603.tif 001156
【化４１５】
2020036603.tif 001157
【化４１６】
2020036603.tif 001158
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡおよび「Ｅ」＝鎖がアニールする時に、他の相補的（標的）鎖の対応する「Ａ」ＲＮＡ残基と塩基対（水素結合）を形成せず、また任意に対応する「Ｂ」残基と塩基対形成する（「Ｂ」残基はまた、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは天然に存在しないまたは改変核酸）核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは天然に存在しないまたは改変核酸）である。このような薬剤の任意の残基は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり得、−上記示したように、下（第２の）鎖の３’−末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡの交互配置をまた、上記のＤｓｉＲＮＡ剤中で使用可能でもある。
【０３６１】
ある特定の実施形態では、標的遺伝子発現を低減するよう標的遺伝子配列の少なくとも１９のヌクレオチドに沿った標的ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）に十分に相補的である、本発明のｄｓＲＮＡのガイド鎖は、少なくとも１９のヌクレオチドである長い標的遺伝子配列に完全に相補的ではない。むしろ、標的遺伝子発現を低減するよう標的遺伝子配列の少なくとも１９のヌクレオチドに沿った標的ｍＲＮＡに十分に相補的である本発明のｄｓＲＮＡのガイド鎖が、１９以上の長さのヌクレオチドである標的鎖配列とミスマッチを形成する１、２、３、または４つ以上ものヌクレオチドを有することができる。したがって、１９のヌクレオチドの標的ＲＮＡ配列に対し、本発明のｄｓＲＮＡのガイド鎖は、標的遺伝子レベルを低減するよう標的ＲＮＡ配列に十分に相補的であり、その一方で例えば、ガイド鎖および標的ＲＮＡ配列の間に１５／１９、１６／１９、１７／１９、または１８／１９のみがマッチしたヌクレオチド残基を有する。
【０３６２】
上記で例示した構造に加えて、本発明のｄｓＲＮＡはまた、標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列とさらなるミスマッチを形成する、１、２または３つのさらなる残基を有し得る。このようなミスマッチは連続であってよく、または標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在し得る。マッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在される場合、ミスマッチ残基は、このようなミスマッチ形成残基間の１、２、３、４、５、６、７または８つの塩基対形成ヌクレオチドの間隔にて一本鎖内で互いに離れて隔たり得る。
【０３６３】
上記ＤｓｉＲＮＡｍｍ剤に関しては、（また対応するセンス鎖ヌクレオチドとミスマッチを形成してよく、または形成しなくてよい）標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖ヌクレオチドに関して、ｄｓＲＮＡ（例えばＤｓｉＲＮＡ）内の好ましい配置が、ＤｓｉＲＮＡの推定Ａｇｏ２切断部位に相補的なアンチセンス鎖配列の３’（下流）に局在するアンチセンス鎖領域内である（例えば、図１において、推定Ａｇｏ２切断部位の３’であるアンチセンス鎖の領域が、ミスマッチ形成残基に関して好ましく、図１にて示した２５／２７マー薬剤に対するアンチセンス鎖の位置１７〜２３に局在する）。したがって、１つの実施形態では、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖の（標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列に関する）ミスマッチヌクレオチドの位置が、対応する標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列の推定Ａｇｏ２開裂部位のアンチセンス鎖配列内の３’（下流）直近に局在するアンチセンス鎖のヌクレオチド残基である。他の好ましい実施形態では、（標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列に関する）ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖のミスマッチヌクレオチドは、対応する推定Ａｇｏ２開裂部位の２ヌクレオチド３’（下流）、対応する推定Ａｇｏ２開裂部位の３ヌクレオチド３’（下流）、対応する推定Ａｇｏ２開裂部位の４ヌクレオチド３’（下流）、対応する推定Ａｇｏ２開裂部位の５ヌクレオチド３’（下流）、対応する推定Ａｇｏ２開裂部位の６ヌクレオチド３’（下流）、対応する推定Ａｇｏ２開裂部位の７ヌクレオチド３’（下流）、対応する推定Ａｇｏ２開裂部位の８ヌクレオチド３’（下流）または対応する推定Ａｇｏ２開裂部位の９ヌクレオチド３’（下流）に局在するアンチセンス鎖のヌクレオチド残基に位置する。
【０３６４】
アンチセンス鎖の２つのミスマッチ形成ヌクレオチドを有するｄｓＲＮＡ剤において（ミスマッチ形成ヌクレオチドは、標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列に関してミスマッチ形成している）、ミスマッチは連続して発生し得る（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿って連続した位置で発生し得る）。あるいは、標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列と塩基対形成するヌクレオチドによって散在され得る（例えば、図１で示した２５／２７マー薬剤のアンチセンス鎖の５’末端（位置１）から開始して）位置１８および１９ではなく、位置１７および２０でミスマッチ形成ヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡでは、センス鎖位置１７および２０のミスマッチ残基が、標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列の対応する残基とマッチした塩基対を形成する２つのヌクレオチドによって散在する）。例えば、対応する標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成する（アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に位置する）アンチセンス鎖の２つの残基は、これらのミスマッチ形成塩基対間に局在する（標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列に関する）０、１、２、３、４または５つのマッチした塩基対で発生し得る。
【０３６５】
（標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列に関してミスマッチを形成している）３つのミスマッチ形成塩基対を有する特定のｄｓＲＮＡでは、ミスマッチ形成ヌクレオチドは、連続して発生し得る（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿って三重に発生し得る）。あるいは、標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドが、標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在可能である（例えば、位置１９、２０および２１ではなく、位置１７、１８および２２にてミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡでは、アンチセンス鎖位置１７および１８のミスマッチ形成残基は、互いに隣接し、一方アンチセンス鎖位置１８および２２のミスマッチ形成残基は、標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列の対応する残基とマッチした塩基対を形成する３つの残基によって散在される）。例えば、対応する標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成する（アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する）アンチセンス鎖の３つの残基が、これらのミスマッチ塩基対の任意の２つの間に局在する、０、１、２、３または４つのマッチ塩基対で発生可能である。
【０３６６】
（標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列に関してミスマッチを形成している）４つのミスマッチ形成塩基対を有する特定のｄｓＲＮＡでは、ミスマッチ形成ヌクレオチドは、連続して発生し得る（例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿って四重に発生し得る）。あるいは、標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドが、標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在可能である（例えば、位置１８および２０ではなく、位置１７、１９、２１および２２にてミスマッチ形成ヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡでは、アンチセンス鎖位置２１および２２のミスマッチ形成残基は、互いに隣接し、一方アンチセンス鎖位置１７および１９のミスマッチ形成残基は、標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列の対応する残基とマッチした塩基対を形成する１つのヌクレオチドによって散在される−同様に、アンチセンス鎖位置１９および２１のミスマッチ形成残基はまた、標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡの対応する残基とマッチした塩基対を形成する１つのヌクレオチドによって散在される）。例えば、対応する標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成する（アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する）アンチセンス鎖の４つの残基が、これらのミスマッチ形成塩基対の任意の２つの間に局在する、０、１、２または３つのマッチした塩基対で発生可能である。
【０３６７】
上記ＤｓｉＲＮＡｍｍと他のｄｓＲＮＡ構造を、ＤｓｉＲＮＡｍｍとｄｓＲＮＡ剤との特定の構造を例示するために記述する。上記ＤｓｉＲＮＡｍｍとｄｓＲＮＡ構造とのデザインを、例えば以下に示した他のＤｓｉＲＮＡ構造のＤｓｉＲＮＡｍｍ形態を産出するために適合可能である。上記で例示したように、ｄｓＲＮＡはまた、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間の単一ミスマッチ（または２、３または４つのミスマッチ）を有するようにデザイン可能であり、また任意に、ｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖配列間の完全な相補性を維持可能である。
【０３６８】
なお、以下で例示するｄｓＲＮＡ剤はまた、それらの二本鎖および／または標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ−整列構造内に、挿入／欠損（ｉｎ／ｄｅｌ）構造を有し得る。したがって、本発明のｄｓＲＮＡは、例えば、ミスマッチおよび／またはミスマッチ形成塩基対の位置に関して上述のそれらの局所に対応する、このようなｉｎ／ｄｅｌヌクレオチドの配置に対して好ましい局所で、標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列と比較したアンチセンス配列、および／またはセンス鎖配列と比較したアンチセンス配列中、ｉｎ／ｄｅｌ変化を有するようにデザイン可能である。
【０３６９】
なお、本発明のＤｓｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒによって処理され、ＲＩＳＣへ積み込むガイド鎖配列から自由であるようにモデル化されるので、センス鎖の３’−末端領域／アンチセンス鎖の５’−末端領域内でもミスマッチを許容可能である。このようなミスマッチを持つ本発明の例示的ＤｓｉＲＮＡ構造には、以下が含まれ、
【化４１７】
2020036603.tif 001159
式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡおよび「Ｉ」および「Ｊ」＝互いに塩基対（水素結合）を形成しない核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは天然に存在しない核酸もしくは改変核酸）で、また任意に「Ｊ」は、標的ＲＮＡ配列ヌクレオチド「Ｈ」に相補的である。このような薬剤の任意の残基は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり得、−上記で示したように、下（第２の）鎖の３’−末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡの交互配置−または上述のいずれかのメチル化パターン−をまた、以上のＤｓｉＲＮＡ剤中で使用可能でもある。上記ミスマッチはまた、本発明のＤｓｉＲＮＡ内で組み合わせ可能である。
【０３７０】
以下の構造において、このようなミスマッチは、非対称ＨＡＯ１−１１７１ＤｓｉＲＮＡ（新規に導入されたミスマッチ残基はイタリック体である）内に導入される。
ＨＡＯ１−１１７１  ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の１９（５’末端より）
【化４１８】
2020036603.tif 001160
任意に、センス鎖の位置１９のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
【０３７１】
ＨＡＯ１−１１７１  ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２０（５’末端より）
【化４１９】
2020036603.tif 001161
任意に、センス鎖の位置２０のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
【０３７２】
ＨＡＯ１−１１７１  ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２１（５’末端より）
【化４２０】
2020036603.tif 001162
任意に、センス鎖の位置２１のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
【０３７３】
ＨＡＯ１−１１７１  ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２２（５’末端より）
【化４２１】
2020036603.tif 001163
【化４２２】
2020036603.tif 001164
任意に、センス鎖の位置２２のミスマッチ「Ｇ」残基は、あるいは「Ａ」または「Ｃ」である。
【０３７４】
ＨＡＯ１−１１７１  ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２３（５’末端より）
【化４２３】
2020036603.tif 001165
任意に、センス鎖の位置２３のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
【０３７５】
ＨＡＯ１−１１７１  ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２４（５’末端より）
【化４２４】
2020036603.tif 001166
任意に、センス鎖の位置２４のミスマッチ「ｇ」残基は、あるいは「ａ」または「ｃ」である。
【０３７６】
ＨＡＯ１−１１７１  ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２５（５’末端より）
【化４２５】
2020036603.tif 001167
任意に、センス鎖の位置２５のミスマッチ「ａ」残基は、あるいは「ｃ」または「ｇ」である。
【０３７７】
ＨＡＯ１−１１７１  ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の１（５’末端より）
【化４２６】
2020036603.tif 001168
任意に、アンチセンス鎖の位置１のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ｇ」または「Ｃ」である。
【０３７８】
ＨＡＯ１−１１７１  ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の２（５’末端より）
【化４２７】
2020036603.tif 001169
任意に、アンチセンス鎖の位置２のミスマッチ「Ｃ」残基は、あるいは「Ｕ」または「Ｇ」である。
【０３７９】
ＨＡＯ１−１１７１  ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の３（５’末端より）
【化４２８】
2020036603.tif 001170
任意に、アンチセンス鎖の位置３のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
【０３８０】
ＨＡＯ１−１１７１  ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の４（５’末端より）
【化４２９】
2020036603.tif 001171
任意に、アンチセンス鎖の位置４のミスマッチ「Ｃ」残基は、あるいは「Ｕ」または「Ｇ」である。
【０３８１】
ＨＡＯ１−１１７１  ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の５（５’末端より）
【化４３０】
2020036603.tif 001172
任意に、アンチセンス鎖の位置５のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
【０３８２】
ＨＡＯ１−１１７１  ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の６（５’末端より）
【化４３１】
2020036603.tif 001173
任意に、アンチセンス鎖の位置６のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
【０３８３】
ＨＡＯ１−１１７１  ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の７（５’末端より）
【化４３２】
2020036603.tif 001174
任意に、アンチセンス鎖の位置７のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
【０３８４】
別の例として、以下の構造では、このようなミスマッチは、非対称ＨＡＯ１−１３７８ＤｓｉＲＮＡ（新規に導入されたミスマッチ残基はイタリック体である）内に導入される。
ＨＡＯ１−１３７８  ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の１９（５’末端より）
【化４３３】
2020036603.tif 001175
【化４３４】
2020036603.tif 001176
任意に、センス鎖の位置１９のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
【０３８５】
ＨＡＯ１−１３７８  ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２０（５’末端より）
【化４３５】
2020036603.tif 001177
任意に、センス鎖の位置２０のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
【０３８６】
ＨＡＯ１−１３７８  ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２１（５’末端より）
【化４３６】
2020036603.tif 001178
任意に、センス鎖の位置２１のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ｇ」または「Ｃ」である。
【０３８７】
ＨＡＯ１−１３７８  ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２２（５’末端より）
【化４３７】
2020036603.tif 001179
任意に、センス鎖の位置２２のミスマッチ「Ｇ」残基は、あるいは「Ｕ」または「Ｃ」である。
【０３８８】
ＨＡＯ１−１３７８  ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２３（５’末端より）
【化４３８】
2020036603.tif 001180
任意に、センス鎖の位置２３のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
【０３８９】
ＨＡＯ１−１３７８  ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２４（５’末端より）
【化４３９】
2020036603.tif 001181
任意に、センス鎖の位置２４のミスマッチ「ｇ」残基は、あるいは「ｔ」または「ｃ」である。
【０３９０】
ＨＡＯ１−１３７８  ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２５（５’末端より）
【化４４０】
2020036603.tif 001182
任意に、センス鎖の位置２５のミスマッチ「ａ」残基は、あるいは「ｔ」または「ｃ」である。
【０３９１】
ＨＡＯ１−１３７８  ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の１（５’末端より）
【化４４１】
2020036603.tif 001183
任意に、アンチセンス鎖の位置１のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ａ」または「Ｇ」である。
【０３９２】
ＨＡＯ１−１３７８  ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の２（５’末端より）
【化４４２】
2020036603.tif 001184
任意に、アンチセンス鎖の位置２のミスマッチ「Ｃ」残基は、あるいは「Ａ」または「Ｇ」である。
【０３９３】
ＨＡＯ１−１３７８  ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の３（５’末端より）
【化４４３】
2020036603.tif 001185
任意に、アンチセンス鎖の位置３のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
【０３９４】
ＨＡＯ１−１３７８  ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の４（５’末端より）
【化４４４】
2020036603.tif 001186
任意に、アンチセンス鎖の位置４のミスマッチ「Ｃ」残基は、あるいは「Ａ」または「Ｇ」である。
【０３９５】
ＨＡＯ１−１３７８  ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の５（５’末端より）
【化４４５】
2020036603.tif 001187
任意に、アンチセンス鎖の位置５のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
【０３９６】
ＨＡＯ１−１３７８  ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の６（５’末端より）
【化４４６】
2020036603.tif 001188
任意に、アンチセンス鎖の位置６のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
【０３９７】
ＨＡＯ１−１３７８  ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の７（５’末端より）
【化４４７】
2020036603.tif 001189
任意に、アンチセンス鎖の位置７のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
【０３９８】
上記のオリゴヌクレオチド鎖配列では、描写される１つの二本鎖のセンス鎖配列を描写される別の二本鎖のアンチセンス鎖と組み合わせることができ、これにより異なる二本鎖を形成でき、特定の例ではこのような二本鎖は、グリコール酸オキシダーゼ標的転写配列に関するミスマッチ残基を含み、その一方でこのようなセンス鎖およびアンチセンス鎖は、お互いに関してこの残基でのミスマッチを示さないことが考慮される（例えば、配列番号３４６６および３４６７；配列番号３４６５および３４６８；配列番号３４６４および３４６９などを含む二本鎖が、このような二本鎖の例として考慮される）。
【０３９９】
上述のように、このようなミスマッチの導入は本明細書で記述した任意のＤｓｉＲＮＡ上で実施可能である。
【０４００】
このようなＤｓｉＲＮＡ構造のミスマッチを組み合わせて、例えばセンス鎖の３’末端の４〜７のヌクレオチド／アンチセンス鎖の５’末端の４〜７のヌクレオチド内に２、３または４つものミスマッチを有するＤｓｉＲＮＡを産出してもよい。
【０４０１】
実際、センス鎖の３’末端残基／アンチセンス鎖の５’末端残基にてＤｓｉＲＮＡ内に組み込み可能な配列の柔軟性に関して、ある特定の実施形態では、本発明の非対称ＤｓｉＲＮＡの配列の必要条件を以下の（例示的なＨＡＯ１−１１７１ＤｓｉＲＮＡ配列に関して示した）（ミニマリスト）構造で表すことが出来る。
【化４４８】
2020036603.tif 001190
式中、ｎ＝１〜５、１〜１０、１〜２０、１〜３０、１〜５０、または１〜８０以上である。
ＨＡＯ１−１１７１ｍＲＮＡ標的：
【化４４９】
2020036603.tif 001191
【０４０２】
グリコール酸オキシダーゼ標的部位はまた、その相補的標的部位が、規定された標的部位と重なる、１つ以上の種々のオリゴヌクレオチドによって標的とされる部位であり得る。例えば、例示的ＨＡＯ１−１３１５ＤｓｉＲＮＡに関して、グリコール酸オキシダーゼ配列に重なり、わずかばかり補正されたグリコール酸オキシダーゼ配列を標的としている特定のＤｓｉＲＮＡが、ＨＡＯ１−１３１５のものと同様の活性レベルを示し得る（例えば、上記表２のＨＡＯ１−１３１４〜ＨＡＯ１−１３１７）ことに留意する。したがって、ある特定の実施形態では、デザインされた標的配列領域は、広く重なっている配列を有する一連のＤｓｉＲＮＡによって効果的に標的とされる場合がある（例えば、ＨＡＯ１−１３１４〜ＨＡＯ１−１３１７標的部位周辺のＤｓｉＲＮＡを考慮する場合、より包括的なグリコール酸オキシダーゼ転写産物標的配列が、例えば５’−ＴＴＴＣＡＴＴＧＣＴＴＴＴＧＡＣＴＴＴＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＴ−３’（配列番号３４９１）を指してもよく、ここで所定のいずれかのＤｓｉＲＮＡ（例えば、ＨＡＯ１−１３１４〜ＨＡＯ１−１３１７から選択されるＤｓｉＲＮＡ）のみが、このような配列領域内のサブ配列を標的とし、また全配列は、このような一連のＤｓｉＲＮＡに対する実行可能な標的と考慮可能である）。
【０４０３】
さらに、かつ／またはあるいは、センス鎖の３’末端の７ヌクレオチド／アンチセンス鎖の５’末端の７ヌクレオチド内のミスマッチを、上述のように、他のミスマッチ耐性位置にて配置されるミスマッチと組み合わせることができる。
【０４０４】
特定のグリコール酸オキシダーゼ配列の標的化を介して、グリコール酸オキシダーゼレベルの阻害剤として、上記Ｄｉｃｅｒ基質剤（ＤｓｉＲＮＡ）の本同定を考慮して、本明細書で記述したものと同様の構造を持つｄｓＲＮＡがまた、ＮＭ＿０１７５４５．２のグリコール酸オキシダーゼ配列内、またはそれらの変異体（例えば、ＮＭ＿０１７５４５．２の配列に対して、８０％同一性、９０％同一性、９５％同一性、９６％同一性、９７％同一性、９８％同一性、９９％同一性またはそれ以上の同一性を有する標的配列）内の他の配列を標的とするように合成可能である。
【０４０５】
抗−グリコール酸オキシダーゼＤｓｉＲＮＡデザイン／合成
２５〜３５ヌクレオチド、とりわけ２５〜３０ヌクレオチドのより長いｄｓＲＮＡ種（ＤｓｉＲＮＡ）が、１９〜２３マーｓｉＲＮＡ剤と比較して、活性の効力および持続期間に関して、予期せぬ効果的な結果を与えることが、実験的にわかってきた。ｄｓＲＮＡ処理機構の根本的な理論に拘束されることを望むものではないが、より長いｄｓＲＮＡ種が細胞の細胞質中のＤｉｃｅｒ酵素に対する基質として働くことが考えられる。本発明のｄｓＲＮＡをより短いセグメントに分割することに加えて、Ｄｉｃｅｒは、分割されたｄｓＲＮＡ由来の一本鎖分割産物の、標的遺伝子グリコール酸オキシダーゼ（またはグリコール酸オキシダーゼ−関連疾患もしくは障害と関連する他の遺伝子）由来の細胞質ＲＮＡ（例えばグリコール酸オキシダーゼＲＮＡ）の崩壊に関与するＲＩＳＣ複合体内への組み込みを促進すると考えられる。先行する研究（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許公開公報第２００７／０２６５２２０号）は、ＤｉｃｅｒによるｄｓＲＮＡ種（特にＤｓｉＲＮＡ剤）の開裂性が、ｄｓＲＮＡ種の活性の効力および持続期間の増大と一致することを示した。
【０４０６】
ある特定の抗−グリコール酸オキシダーゼＤｓｉＲＮＡ剤を、プレスクリーニングした集合から選択した。ＤｓｉＲＮＡのデザインは任意に、配列の領域に広がっている可能性のある多数のＤｓｉＲＮＡ剤の推定有効性／効果のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ評価にて実施する予測スコアリングアルゴリズムの利用を含み得る。より最近の「ｖ４．３」アルゴリズムは、本技術分野ですでに利用可能なｓｉＲＮＡスコアリングアルゴリズムに対して理論的に改善されたアルゴリズムを表すが、このようなスコアリングアルゴリズムのデザインに関する情報は、例えば、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００６，７：５１６）で見ることができる。（例えば「ｖ３」および「ｖ４」スコアリングアルゴリズムは、ヒト配列中の任意のバイアスに依存していない機械学習アルゴリズムである。さらに、「ｖ３」および「ｖ４」アルゴリズムは、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．にて記述されたデバイスのような、より古い「ｖ２」アルゴリズムからのものよりも、複数倍大きいデータ組に由来する。）
【０４０７】
本発明のＤｓｉＲＮＡ剤の第１および第２のオリゴヌクレオチドは、完全に相補的であることを必要としない。実際、１つの実施形態では、センス鎖の３’−末端は、１つ以上のミスマッチを含む。１つの態様において、２つのミスマッチが、センス鎖の３’末端に組み込まれる。別の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡは、それぞれが長さにおいて２７ヌクレオチドであり、互いにアニールした時に、センス鎖の３’末端（アンチセンス鎖の５’末端）上に平滑末端と２つのヌクレオチド末端とを持つ、２つのＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ分子である。（特に３’−センス／５’−アンチセンス位置での）ミスマッチまたは減少した熱力学的安定性の利用が、おそらくｓｉＲＮＡのＲＩＳＣへの進入とともに発生する速度が限定された巻き戻し段階に影響を与えることによって、アンチセンス鎖のＲＩＳＣへの進入を促進するまたは有利に働かせることが提案されてきた（Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｅｌｌ  １１５：１９９−２０８；Ｋｈｖｏｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｅｌｌ  １１５：２０９−２１６）。したがって、末端塩基組成物は、活性２１マーｓｉＲＮＡ二本鎖を選択するためのデザインアルゴリズムに含まれてきた（Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２：９３６−９４８；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：３２６−３３０）。本実施形態のｄｓＲＮＡのＤｉｃｅｒ開裂で、ミスマッチを含む小さな最終末端配列は、アンチセンス鎖と対を形成しないままである（３’−オーバーハングの一部となる）か、または最終２１−マーｓｉＲＮＡを完全に開裂して除去される。これらの「ミスマッチ」はしたがって、ＲＩＳＣの最終ＲＮＡ成分中のミスマッチとして持続しない。Ｄｉｃｅｒ基質のセンス鎖の３’−末端での塩基ミスマッチまたはセグメントの不安定化が、おそらくＤｉｃｅｒによる処理を促進することによって、ＲＮＡｉ中の合成二本鎖の効力を改善したという発見は、２５〜３０マーｄｓＲＮＡ（また本明細書で「ＤｓｉＲＮＡ」と呼ぶ；米国特許公開公報第２００５／０２７７６１０号、第２００５／０２４４８５８号および第２００７／０２６５２２０号）のデザインと利用を記述している過去の研究の驚くべき発見であった。
【０４０８】
抗−グリコール酸オキシダーゼｄｓＲＮＡの改変
二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）の効果を阻害する１つの主要な因子は、ヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡおよびＤｓｉＲＮＡ）の分解である。３’−エキソヌクレアーゼは、血清中に存在する第一ヌクレアーゼ活性であり、アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドの３’−末端の改変が、分解を防止するために重要である（Ｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ  Ｄｅｖ，１：１４１−１５１）。ＲＮａｓｅ−Ｔファミリーヌクレアーゼは同定され、ｓｉＲＮＡの制御および分解に関与する３’から５’エキソヌクレアーゼ活性を持つＥＲＩ−１と呼ばれている（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎａｔｕｒｅ  ４２７：６４５−６４９；Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３９０：６７５−６７９）。この遺伝子はまた、マウスのＴｈｅｘ１（ＮＭ＿０２６０６７）またはヒトのＴＨＥＸ１（ＮＭ＿１５３３３２）として知られ、ヒストンｍＲＮＡの分解に関与し、またｓｉＲＮＡ中の３’−オーバーハングの分解を媒介するが、二本鎖ＲＮＡを分解しない（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２８１：３０４４７−３０４５４）。したがって、本発明のＤｓｉＲＮＡを含む、ｄｓＲＮＡの３’−末端−安定化が安定性を改善すると予測することが合理的である。
【０４０９】
ＸＲＮ１（ＮＭ＿０１９００１）は、Ｐ−体中に存在し、ｍｉＲＮＡによって標的化されたｍＲＮＡの分解に関与してきた５’から３’エキソヌクレアーゼであり（Ｒｅｈｗｉｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，ＲＮＡ  １１：１６４０−１６４７）、またｓｉＲＮＡによって指向されるような内部開裂によって開始される分解を完了するのに関与し得る。ＸＲＮ２（ＮＭ＿０１２２５５）は、核ＲＮＡ処理に関与する異なる５’から３’エキソヌクレアーゼである。
【０４１０】
ＲＮａｓｅ  Ａは、ＲＮＡを分解する哺乳類における主要なエンドヌクレアーゼ活性である。ｓｓＲＮＡに対して特異的であり、ピリミジン塩基の３’−末端で開裂する。ＲＮａｓｅ  Ａ開裂と一致するｓｉＲＮＡ分解産物は、血清中でのインキュベーション後、質量分析によって検出可能である（Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｓｙｓｔ  ３：４３〜５０）。３’−オーバーハングは、ＲＮａｓｅ分解に対するｓｉＲＮＡの感受性を増強する。血清からのＲＮａｓｅ  Ａの枯渇が、ｓｉＲＮＡの分解を減少させ、この分解が配列優先傾向を見せ、末端上でポリＡ／Ｕ配列を持つ配列に対してより悪い（Ｈａｕｐｅｎｔｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６  Ｂｉｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７１：７０２−７１０）。このことは、二本鎖のより安定性の低い領域が、「呼吸をし」てもよく、ＲＮａｓｅ  Ａによる分解に対して利用可能な一時的な一本鎖種を提供することを示唆している。ＲＮａｓｅ  Ａ阻害剤を血清に加え、ｓｉＲＮＡ寿命および効力を改善することができる（Ｈａｕｐｅｎｔｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｉｎｔ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １２１：２０６−２１０）。
【０４１１】
２１マー中、ホスホロチオエートまたはボラノホスフェート改変が、ヌクレオチド内リン酸結合を直接安定化させる。ボラノホスフェート改変ＲＮＡは、ヌクレアーゼ耐性が高く、サイレンシング剤として強力であり、比較的無毒性である。ボラノホスフェート改変ＲＮＡは、標準的な化学合成方法を用いて製造できず、代わりにｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）によって作製される（Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２：５９９１−６０００；Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３４：２７７３−２７８１）。ホスホロチオエート（ＰＳ）改変は、任意の所望の位置で、ＲＮＡ二本鎖中容易に配置可能であり、標準的な化学合成方法を用いて作製可能である。ＰＳ改変は、用量依存毒性を示し、それにより、ほとんどの研究者は、ｓｉＲＮＡ内への限定した組み込みを推奨し、ここでヌクレアーゼからの保護が最も重要な３’−末端が好まれる（Ｈａｒｂｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  １３：８３−１０５；Ｃｈｉｕ  ａｎｄ  Ｒａｎａ，２００３，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  １０：５４９−５６１；  Ｂｒａａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：７９６７−７９７５；  Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：５８９−５９５）。より広範囲のＰＳ改変が、強力なＲＮＡｉ活性と互換可能であるが、しかし（２’−Ｏ−メチルＲＮＡのような）糖改変の利用がよりすぐれている可能性がある（Ｃｈｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３４２：９１９−９２７）。
【０４１２】
種々の置換基を、一般的に二本鎖安定性（Ｔｍ）を増大させ、ヌクレアーゼ耐性を大きく改善できるリボースの２’−位置に配置可能である。２’−Ｏ−メチルＲＮＡは、哺乳類リボソームＲＮＡおよび転写ＲＮＡにて見られる、天然に存在する改変である。ｓｉＲＮＡ中の２’−Ｏ−メチル改変は公知であるが、二本鎖内の改変塩基の精確な位置が、効力を保つために重要であり、ＲＮＡに対する２’−Ｏ−メチルＲＮＡの完全な置換は、ｓｉＲＮＡを不活性化する。例えば、交互２’−Ｏ−メチル塩基を使用するパターンは、改変されていないＲＮＡと等価の効力を有することができ、血清中極めて安定である（Ｃｈｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３４２：９１９−９２７；Ｃｚａｕｄｅｒｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：２７０５−２７１６）。
【０４１３】
２’−フルオロ（２’−Ｆ）改変はまた、ｄｓＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡおよびＤｓｉＲＮＡ）機能と互換可能であり、（試薬コストおよび利用可能性のため）最も一般的にはピリジン部位に位置し、プリン位置にて２’−Ｏ−メチル改変と組み合わせ可能であり、２’−Ｆプリンが利用でき、使用可能である。この種類の非常に改変された二本鎖は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて、ＲＮＡｉの強力なトリガーであり得（Ａｌｌｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４８：９０１−９０４；Ｐｒａｋａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４８：４２４７−４２５３；Ｋｒａｙｎａｃｋ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，２００６，ＲＮＡ  １２：１６３−１７６）、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用した時に、活性の性能を改善し、持続期間を延長できる（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４１：１３４９−１３５６；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：１００２−１００７）。非常に強力で、ヌクレアーゼ安定である、交互２’−Ｆおよび２’−Ｏ−Ｍｅ塩基を含む平滑１９マーの二本鎖が、Ａｌｌｅｒｏｎによって教示された。このデザインにおいて、交互２’−Ｏ−Ｍｅ残基は、Ｃｚａｕｄｅｒｎａによって使用されたものと同一のパターンで配置されるが、残りのＲＮＡ残基は２’−Ｆ改変塩基に変換される。Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙによって使用された、非常に強力な、ヌクレアーゼ耐性のｓｉＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、非常に強力な、ヌクレアーゼ耐性ｓｉＲＮＡを使用した。２’−Ｏ−Ｍｅ  ＲＮＡおよび２’−Ｆ  ＲＮＡに加えて、この二本鎖は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、逆脱塩基残基、および３’−末端ＰＳヌクレオシド内結合を含む。広範囲の改変は、特定の利点を持つ一方で、より限定される二本鎖の改変もまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで性能を改善し、製造がより単純で、よりコストがかからなくすることができる。Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋら（２００４，  Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１７３−１７８）は、ｉｎ  ｖｉｖｏで二本鎖を使用し、主に２つの２’−Ｏ−Ｍｅ  ＲＮＡ塩基および限定された３’−末端ＰＳヌクレオシド内結合を持つＲＮＡであった。
【０４１４】
ロック核酸（ＬＮＡ）は、ｄｓＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡおよびＤｓｉＲＮＡ）を安定させるために使用可能な異なる種類の２’−改変である。効力を維持するＬＮＡ組み込みのパターンは、２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｆ−塩基よりも制限され、このように限定された改変が好ましい（Ｂｒａａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：７９６７−７９７５；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１：３１８５−３１９３；Ｅｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３：４３９−４４７）。限定された組み込みでさえ、ＬＮＡ改変の利用は、ｉｎ  ｖｉｖｏにてｄｓＲＮＡの性能を改善可能であり、標的効果特性を変えるか、または改善し得る（Ｍｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ６：８３３−８４３）。
【０４１５】
細胞内または生動物内に導入された合成核酸は、「外来」として認識され、免疫応答を引き起こし得る。免疫刺激は、劇的に実験結果を変化させ、細胞死を導きさえする的外れな効果の主な種類を構成する。生来の免疫システムには、これらの応答を媒介するＤＮＡおよびＲＮＡと特異的に相互作用する受容体分子の集合が含まれ、その幾つかは、細胞質内に局在し、その幾つかはエンドソーム内に存在する（Ｍａｒｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，２００５，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：１３９９−１４０５；Ｓｃｈｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １４：４６３−４７０）。カチオン性脂質またはリポソームによるｓｉＲＮＡの伝達は、ｓｉＲＮＡを、細胞質およびエンドソームセグメントの両方へ曝露させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ両方で、１型インターフェロン（ＩＦＮ）応答を引き起こすリスクを最大化する（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：１００２−１００７；Ｓｉｏｕｄ  ａｎｄ  Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３１２：１２２０−１２２５；Ｓｉｏｕｄ，２００５，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３４８：１０７９−１０９０；Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３３０：  ７５５−７５９）。細胞内に転写されたＲＮＡは免疫原性が少なく（Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｌ  ２４：５６６−５７１）、脂質に基づく方法を用いて伝達した時に免疫原性である合成ＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏでさえ、機械的方法によって細胞内に導入された時の免疫刺激を回避する可能性がある（Ｈｅｉｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：  １５７９−１５８２）。しかしながら、脂質に基づく伝達方法は一般的でかつ効果的であり、広く使用される。とりわけ、全ての細胞型が存在し、免疫応答が産出されるリスクが最も高いｉｎ  ｖｉｖｏ適用に対して、免疫応答を防止するためのいくつかの一般的な戦略が必要である。化学的に改変したＲＮＡの利用が、これらの問題のほとんどまたは全てを解決し得る。
【０４１６】
ある特定の実施形態では、改変がグリコール酸オキシダーゼ阻害活性を有することからｄｓＲＮＡ剤を阻害しない限り、改変を本発明の抗グリコール酸オキシダーゼｄｓＲＮＡ剤中に含めることができる。１つの実施形態では、１つ以上の改変が、ＤｓｉＲＮＡ剤のＤｉｃｅｒ処理を増強するように実施される（ＤｓｉＲＮＡのＤｉｃｅｒ処理を判定するためのアッセイが本明細書中他の部分に記されている）。第２の実施形態では、１つ以上の改変が、より効果的なグリコール酸オキシダーゼ阻害をもたらすように作製される（本明細書で記述したように、ｄｓＲＮＡのグリコール酸オキシダーゼ阻害／グリコール酸オキシダーゼ阻害活性は、ＲＮＡレベルを判定、またはグリコール酸オキシダーゼポリペプチドレベルを判定するための本技術分野で認識されている方法を介してアッセイ可能であり、このようなレベルは、例えばグリコール酸オキシダーゼｍＲＮＡレベルの評価の代わりに、またはこの評価に加えて評価されるべきである）。第３の実施形態では、１以上の改変が、より大きなグリコール酸オキシダーゼ阻害活性を支持するように作製される（グリコール酸オキシダーゼ阻害活性を判定する方法は上記されている）。第４の実施形態では、１つ以上の改変が、細胞に伝達されるべき各ｄｓＲＮＡ剤分子あたりのグリコール酸オキシダーゼ阻害活性のより強力な効力をもたらすように作製される（グリコール酸オキシダーゼ阻害活性の効力は上記されている）。改変は、配列内の３’−末端領域、５’−末端領域にて、３’−末端領域と５’−末端領域両方にて、または例えば種々の位置に組み込むことができる。上述の限定を考慮して、改変の数および組み合わせをｄｓＲＮＡ剤内に組み込むことが可能である。多数の改変が存在する場合、それらは同一であるか、または異なってもよい。塩基、糖部位、リン酸骨格およびそれらの組み合わせに対する改変が考慮される。いずれかの５’−末端がリン酸化可能である。
【０４１７】
リン酸骨格に関して考慮される改変の例には、メチルホスホネート、ホスホロチオエートを含むホスホン酸塩、およびアルキルホスホトリエステルのようなホスホトリエステル改変などを含むリン酸塩が含まれる。糖部位に関して考慮される改変の例には、２’−Ｏ−メチルのような２’−アルキルピリミジン、２’−フルオロ、アミノおよびデオキシ改変などが含まれる（例えば、Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：５８９−５９５を参照のこと）。塩基に関して考慮される改変の例には、脱塩基糖、２−Ｏ−アルキル改変ピリミジン類、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシルおよび５−（３−アミノアリル）−ウラシルなどが含まれる。ロック核酸またはＬＮＡ’ｓも組み込むことが可能である。多くの他の改変が公知であり、上記の基準を満たす限り使用可能である。改変の例はまた、米国特許題５，６８４，１４３号、第５，８５８，９８８号および第６，２９１，４３８号、および米国特許公開公報第２００４／０２０３１４５  Ａ１号に開示されている。他の改変は、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ  （２０００，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  １０：２９７−３１０），Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（２０００，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  １０：１１７−２１）、Ｒｕｓｃｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  １０：３３３−３４５）、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  １１：３１７−２５）、Ｖｏｒｏｂｊｅｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００１，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  １１：７７−８５）にて開示されている。
【０４１８】
考慮される１つ以上の改変をいずれかの鎖の中に組み込むことが可能である。ｄｓＲＮＡ剤中の改変の位置は、より強力な効力および安定性の授与、毒性の低減、Ｄｉｃｅｒ処理の増強および免疫応答の最小化を含む、ｄｓＲＮＡ剤の特徴に大きく影響を与えることができる。１つの実施形態では、アンチセンス鎖もしくはセンス鎖、または両方の鎖が、１つ以上の２’−Ｏ−メチル改変ヌクレオチドを有する。別の実施形態では、アンチセンス鎖は、２’−Ｏ−メチル改変ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、アンチセンス鎖は、２’−Ｏ−メチル改変ヌクレオチドからなる３’オーバーハングを含む。アンチセンス鎖はまた、さらなる２’−Ｏ−メチル改変ヌクレオチドを含むことができる。
【０４１９】
ある特定の実施形態では、本発明の抗−グリコール酸オキシダーゼＤｓｉＲＮＡ剤は、Ｄｉｃｅｒによるその処理を増強する種々の特徴を持つ。このような実施形態にしたがって、ＤｓｉＲＮＡ剤は、ｓｉＲＮＡを産出するためにＤｉｃｅｒにより処理され、以下の特徴の少なくとも１つを有すように十分な長さを持つ。（ｉ）ＤｓｉＲＮＡ剤は非対称であり、例えばセンス鎖上に３’オーバーハングを持つ、および（ｉｉ）ＤｓｉＲＮＡ剤は、活性ｓｉＲＮＡへのｄｓＲＮＡのＤｉｃｅｒ結合と処理の方向を指向するために、アンチセンス鎖上に改変３’末端を持つ。これらの実施形態にしたがって、ＤｓｉＲＮＡ剤において最も長い鎖は、２５〜３５ヌクレオチドを含む。１つの実施形態では、センス鎖は２５〜３０ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は２５〜２８ヌクレオチドを含む。したがって、得られるｄｓＲＮＡは、センス鎖の３’末端上にオーバーハングを持つ。オーバーハングは、２ヌクレオチドのような、１〜４ヌクレオチドである。アンチセンス鎖は、５’リン酸を有していてもよい。
【０４２０】
ある特定の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡ剤のセンス鎖を、センス鎖の３’末端に位置する好適な修飾因子によるＤｉｃｅｒ処理のために改変し、すなわちＤｓｉＲＮＡ剤が、Ｄｉｃｅｒ結合および処理の方向を指向するようにデザインされる。好適な修飾因子には、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドなどのヌクレオチド類、および蛍光分子などのような立体的に込み入った分子が含まれる。アシクロヌクレオチドは、ｄＮＭＰ中に通常存在する２’−デオキシリボフラノシル糖の代わりに、２−ヒドロキシエトキシメチル基を用いる。他のヌクレオチド修飾因子には、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−  ジデヒドロ−２’，３−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、ならびに３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）および２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチドが含まれ得る。１つの実施形態では、デオキシヌクレオチドを修飾因子として使用する。ヌクレオチド修飾因子を使用する時に、１〜３ヌクレオチド修飾因子、または２ヌクレオチド修飾因子を、センス鎖の３’末端上のリボヌクレオチドの代わりに使用する。立体的に込み入った分子を使用する場合、それらは、アンチセンス鎖の３’末端にてリボヌクレオチドに付着する。したがって、鎖の長さは、修飾因子の組み込みに伴って変化するものではない。別の実施形態では、本発明は、Ｄｉｃｅｒ処理の方向を指向するために、ｄｓＲＮＡ剤中の２つのＤＮＡ塩基を置換することを考慮する。さらなる本発明において、アンチセンス鎖の５’末端およびセンス鎖の３’末端上の二本鎖の平滑末端を形成する２つのリボヌクレオチドの代わりに、２つの末端のＤＮＡ塩基を、センス鎖の３’末端上に配置し、２ヌクレオチドＲＮＡオーバーハングをアンチセンス鎖の３’末端上に配置する。これは、平滑末端上にＤＮＡ、オーバーハング末端上にＲＮＡ塩基を持つ、非対称組成物である。
【０４２１】
ある特定の他の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖を、アンチセンス鎖の３’末端に位置する好適な修飾因子によりＤｉｃｅｒ処理のために改変し、すなわちＤｓｉＲＮＡ剤が、Ｄｉｃｅｒ結合および処理の方向を指向するようにデザインされる。好適な修飾因子には、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドなどのヌクレオチド類、および蛍光分子などのような立体的に込み入った分子が含まれる。アシクロヌクレオチドは、ｄＮＭＰ中に通常存在する２’−デオキシリボフラノシル糖の代わりに、２−ヒドロキシエトキシメチル基を使用する。他のヌクレオチド修飾因子には、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−デヒドロ２’，３−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、ならびに３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）および２’、３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチドが含まれ得る。１つの実施形態では、デオキシヌクレオチドを修飾因子として使用する。ヌクレオチド修飾因子を使用する時に、１〜３ヌクレオチド修飾因子、または２ヌクレオチド修飾因子を、アンチセンス鎖の３’末端上のリボヌクレオチドの代わりに使用する。立体的に込み入った分子を使用する場合、それらは、アンチセンス鎖の３’末端にてリボヌクレオチドに付着する。したがって、鎖の長さは、修飾因子の組み込みに伴い変化するものではない。別の実施形態では、本発明は、Ｄｉｃｅｒ処理の方向を指向するために、ｄｓＲＮＡ剤中の２つのＤＮＡ塩基を置換することを考慮する。さらなる発明において、２つの末端ＤＮＡ塩基を、センス鎖の５’末端とアンチセンス鎖の３’末端上で、二本鎖の平滑末端を形成している２つのリボヌクレオチドの代わりにアンチセンス鎖の３’−末端上に配置し、２ヌクレオチドＲＮＡオーバーハングをセンス鎖の３’末端上に配置する。これはまた、平滑末端上にＤＮＡ、オーバーハング末端上にＲＮＡ塩基を持つ、非対称組成物である。
【０４２２】
センス鎖およびアンチセンス鎖は、細胞の細胞質中で見られる条件のような、生物学的条件下でアニールする。さらに、ｄｓＲＮＡ剤の、とりわけアンチセンス鎖の、１つの配列の一領域が、少なくとも１９ヌクレオチドの配列長を持ち、ここでこれらのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端に隣接し、標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡのヌクレオチド配列に十分に相補的である。
【０４２３】
さらに、ＤｓｉＲＮＡ剤の構造は、Ｄｉｃｅｒの開裂から産出されるオリゴヌクレオチドセグメントが、遺伝子発現を阻害することにおいて最も効果的であるオリゴヌクレオチドの一部であることを確かにするために最適化することができる。例えば、本発明の１つの実施形態では、ＤｓｉＲＮＡ剤構造の２７−ｂｐオリゴヌクレオチドが合成され、ここで遺伝子発現を阻害する２１〜２２−ｂｐセグメントが、アンチセンス鎖の３’末端上に局在することが予想される。アンチセンス鎖の５’−末端上に局在する残りの塩基は、Ｄｉｃｅｒによって開裂され、廃棄される。この開裂された部分は均一であるか（すなわち標的配列の配列に基づく）、または不均一であり、核酸鎖を伸長するために添加される。
【０４２４】
米国特許出願公開第２００７／０２６５２２０号は、２７マーＤｓｉＲＮＡが、化学改変がない場合でさえ、対応する２１マーｓｉＲＮＡ組成物に対して、血清中での改善された安定性を示したことを開示している。５’リン酸塩の添加と組み合わせた時に、上述のようなパターンで、アンチセンス鎖中の２’−Ｏ−メチルＲＮＡの包含のような、ＤｓｉＲＮＡの改変が、ＤｓｉＲＮＡ剤の安定性を改善できる。合成ＲＮＡ二本鎖中の全ての鎖への５’−リン酸塩の添加が、ある程度限定したヌクレアーゼ安定性を与えるための、高額でない、生理学的方法であってもよい。
【０４２５】
本発明のｄｓＲＮＡ剤の化学改変パターンは、このような薬剤の有効性を増強するためにデザインする。したがってこのような改変は、ｄｓＲＮＡ剤の効力の低下を避けるため、ＤｓｉＲＮＡ剤のＤｉｃｅｒ処理との干渉を避けるため、ｄｓＲＮＡ剤の生物学的流体中の安定性を改善するため（ヌクレアーゼ感受性を低減させるため）、または自然免疫系による検出を阻害もしくは回避するためにデザインされる。このような改変はまた、毒性であることを避けるため、かつ本発明の即時ｄｓＲＮＡ剤の製造コストの上昇を避けるため、またはその簡便さに影響を与えるためにもデザインされる。
【０４２６】
本発明のある特定の実施形態では、抗−グリコール酸オキシダーゼＤｓｉＲＮＡ剤は、以下のうち１つ以上の特徴を持つ。（ｉ）ＤｓｉＲＮＡ剤は非対称であり、例えばアンチセンス鎖上に３’オーバーハングを持つ、および（ｉｉ）ＤｓｉＲＮＡ剤は、活性ｓｉＲＮＡへのｄｓＲＮＡのＤｉｃｅｒ結合と処理の方向を指向するために、センス鎖上に改変３’末端を持つ。本実施形態にしたがって、ｄｓＲＮＡにおける最も長い鎖は、２５〜３５ヌクレオチド（例えば２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５ヌクレオチド）を含む。特定のこのような実施形態では、ＤｓｉＲＮＡ剤は、センス鎖が２５〜３４ヌクレオチドを含み、センス鎖の３’末端が、アンチセンス鎖の５’末端と平滑末端を形成し、一方アンチセンス鎖が２６〜３５ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖の３’末端上にオーバーハングを形成するように非対称である。１つの実施形態では、ＤｓｉＲＮＡ剤は、センス鎖が２５〜２８ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が２５〜３０ヌクレオチドを含むように非対称である。したがって、得られたｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端上にオーバーハングを持つ。オーバーハングは、１〜４ヌクレオチド、例えば２ヌクレオチドである。センス鎖はまた５’リン酸塩を有してもよい。
【０４２７】
ＤｓｉＲＮＡ剤はまた、以下のうち１つ以上の特徴をさらに持つことができる。（ａ）アンチセンス鎖は、典型的２１マーから右シフトを持つ（例えば、ＤｓｉＲＮＡは、ＤｓｉＲＮＡ内の推定Ｄｉｃｅｒ開裂部位の５’まで伸長するアンチセンス鎖ヌクレオチド長を含み、このようなアンチセンス鎖ヌクレオチドは、センス鎖中の推定Ｄｉｃｅｒ開裂の３’を伸長しているセンス鎖の対応するヌクレオチドと塩基対を形成する）、（ｂ）鎖は、完全に相補的でなくてよく、すなわちこの鎖は、単一のミスマッチ塩基対を含んでよい（ミスマッチ塩基対を有するＤｓｉＲＮＡのグリコール酸オキシダーゼ阻害活性が、十分なレベルで維持される（例えばミスマッチ塩基対を有しない対応するＤｓｉＲＮＡと比較して、少なくとも５０％以上のグリコール酸オキシダーゼ阻害活性、少なくとも６０％以上のグリコール酸オキシダーゼ阻害活性、少なくとも７０％以上のグリコール酸オキシダーゼ阻害活性、少なくとも８０％以上のグリコール酸オキシダーゼ阻害活性、少なくとも９０％以上のグリコール酸オキシダーゼ阻害活性または少なくとも９５％以上のグリコール酸オキシダーゼ阻害活性を維持する）という条件で、ある特定の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡは、１、２、３、４または５以上のミスマッチ塩基対を有する。ある特定の実施形態では、ミスマッチ塩基対は、ＤｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖とセンス鎖との間に存在する。いくつかの実施形態では、ミスマッチ塩基対は、アンチセンス鎖と標的ＲＮＡとの間に存在する（または存在すると予想される）。ある特定の実施形態では、アンチセンス鎖残基と、想定Ａｇｏ２開裂部位の標的ＲＮＡ配列中３’に局在する標的ＲＮＡ内の対応する残基との間でのミスマッチ塩基対の存在が維持され、本発明のＤｓｉＲＮＡのグリコール酸オキシダーゼ阻害活性を増強さえしてもよい）、（ｃ）ロック核酸のような塩基改変が、センス鎖の５’末端に含まれてよい。「典型的」２１マーｓｉＲＮＡは、従来の技術を用いてデザインされる。１つの技術において、種々の部位が、並行して、または試薬の１つが効果的であるという希望とともに、同一の標的に特異的な種々の異なるｓｉＲＮＡ二本鎖を含むプール中で一般に試験される（Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５５２：２４７−２５２）。他の技術は、活性ＲＮＡｉエフェクター分子を得る可能性を上げるためのデザインルールおよびアルゴリズムを使用する（Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｅｌｌ  １１５：１９９−２０８；Ｋｈｖｏｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｅｌｌ  １１５：  ２０９−２１６；Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２：９３６−９４８；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：３２６−３３０；Ｋｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：４２２３０−４２２３９；Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２（ウェブ発行）：Ｗ１３０−１３４；Ｂｏｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３９２：７３−９６）。ｓｉＲＮＡのハイスループット選別もまた開発されてきた（米���特許公開公報第２００５．００４２６４１  Ａ１号）。潜在的標的部位をまた、二次構造予測によって解析できる（Ｈｅａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３（３）：  ｅ３０）。ついで、この２１マーを使用して右シフトをデザインし、２１マーの５’末端上に３〜９のさらなるヌクレオチドを含める。これらのさらなるヌクレオチドの配列は制限されない。１つの実施形態では、追加したリボヌクレオチドは、標的遺伝子の配列に基づく。本実施形態においてさえ、標的配列とアンチセンスｓｉＲＮＡとの間の完全な相補性は必要とされるものではない。
【０４２８】
本発明のＤｓｉＲＮＡ剤の第１および第２のオリゴヌクレオチドは、完全な相補性を必要とするものではない。これらは、生物学的条件下でアニールすし、かつ標的配列に対して十分に相補的なｓｉＲＮＡを産出するＤｉｃｅｒに対する基質を提供するために十分に相補的であることのみが必要である。ロック核酸またはＬＮＡ’ｓは当業者によく公知である（Ｅｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３：４３９−４４７；Ｋｕｒｒｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：１９１１−１９１８；Ｃｒｉｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：２４３５−２４４３；Ｂｒａａｓｃｈ  ａｎｄ  Ｃｏｒｅｙ，  ２００１，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ８：１−７；Ｂｏｎｄｅｎｓｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６：２６８７−２６９５；Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：５６３３−５６３８）。１つの実施形態では、ＬＮＡをセンス鎖の５’末端に組み込む。別の実施形態では、ＬＮＡを、アンチセンス鎖上に３’オーバーハングを含むようにデザインされた二本鎖中のセンス鎖の５’末端に組み込む。
【０４２９】
ある特定の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤は、２５−塩基対長を持つセンス鎖と、２塩基３’−オーバーハングを持つ２７−塩基対長を持つアンチセンス鎖の非対称構造を持つ。他の実施形態では、非対称構造を持つこのＤｓｉＲＮＡ剤はさらに、２つのリボヌクレオチドの代わりに、センス鎖の３’末端にて２−デオキシヌクレオチドを含む。
【０４３０】
２つの別々のオリゴヌクレオチドを含む、ある特定のＤｓｉＲＮＡ剤組成物は、三次構造によって連結可能である。三次構造は、ＤｓｉＲＮＡ剤上のＤｉｃｅｒ活性を阻害せず、標的遺伝子から転写されたＲＮＡの指向された崩壊と干渉するものではない。１つの実施形態では、三次構造は、化学結合基であってよい。多くの好適な化学結合基が本技術分野で公知であり、使用可能である。あるいは、三次構造は、ヘアピン構造が、ｄｓＲＮＡ組成物を作製している２つのオリゴヌクレオチドのアニーリングに際して産出されるような様式で、ＤｓｉＲＮＡ剤の２つのオリゴヌクレオチドを結合させるオリゴヌクレオチドであってよい。ヘアピン構造は、ＤｓｉＲＮＡ剤上のＤｉｃｅｒ活性を阻害せず、グリコール酸オキシダーゼＲＮＡの指向された崩壊と干渉しない。
【０４３１】
グリコール酸オキシダーゼｃＤＮＡおよびポリペプチド配列
知られているヒトおよびマウスのグリコール酸オキシダーゼ（ＨＡＯ１）ｃＤＮＡおよびポリペプチド配列は、以下の：ヒトヒドロキシ酸オキシダーゼ１（ＨＡＯ１）第ＮＭ＿０１７５４５．２号および対応するヒトＨＡＯ１ポリペプチド配列ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第ＮＰ＿０６００１５．１号；ならびにマウス野生型ＨＡＯ１配列ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第ＮＭ＿０１０４０３．２号（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  Ｃ５７ＢＬ／６  ＨＡＯ１）および対応するマウスＨＡＯ１配列ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第ＮＰ＿０３４５３３．１号を含む。
【０４３２】
ｄｓＲＮＡグリコール酸オキシダーゼ阻害活性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
無細胞系でのＲＮＡｉを繰り返すｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列（類）を標的化しているｄｓＲＮＡ構築物を評価し、したがって、ｄｓＲＮＡのグリコール酸オキシダーゼ特異的遺伝子阻害活性（また本明細書中でグリコール酸オキシダーゼ阻害活性を指す）を評価できる。このアッセイには、グリコール酸オキシダーゼＲＮＡに対して指向したｄｓＲＮＡ（例えばＤｓｉＲＮＡ）剤との利用に適合した、Ｔｕｓｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３，３１９１−３１９７およびＺａｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３によって記述されたシステムが含まれる。合胞体胚盤葉由来のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ抽出物を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにてＲＮＡｉ活性を再構築するために使用する。標的ＲＮＡは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いる選択されたグリコール酸オキシダーゼ発現プラスミドからのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を介して、または化学合成を介して産出される。センスおよびアンチセンスのｄｓＲＮＡ鎖（例えば各２０uＭ）を、９０℃で１分間、ついで３７℃で１時間（１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウムのような）緩衝液中でのインキュベーションによってアニールし、ついで溶解緩衝液（例えば１００ｍＭ  酢酸カリウム、ｐＨ７．４での３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、２ｍＭ酢酸マグネシウム）中で希釈する。アニーリングをＴＢＥ緩衝液中アガロースゲル上のゲル電気泳動によってモニタし、臭化エチジウムで染色できる。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ溶解物を、脱塩素化し、溶解した酵母糖蜜寒天上で回収したＯｒｅｇｏｎ  Ｒハエ由来の０〜２時間齢胚を用いて調製する。溶解物を遠心し、上清を単離する。本アッセイには、５０％溶解物［ｖｏｌ／ｖｏｌ］、ＲＮＡ（１０〜５０ｐＭ最終濃度）、およびｄｓＲＮＡ（１０ｎＭ最終濃度）を含む１０％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］溶解緩衝液を含む反応混合物が含まれる。反応混合液はまた、１０ｍＭ  リン酸クレアチン、１０ｕｇ／ｍｌクレアチンホスホキナーゼ、１００ｕｍ  ＧＴＰ、１００ｕＭ  ＵＴＰ、１００ｕＭ  ＣＴＰ、５００ｕＭ  ＡＴＰ、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．１Ｕ／uＬ  ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）および１００ｕＭの各アミノ酸を含む。酢酸カリウムの最終濃度を１００ｍＭに調節する。反応を氷上でプレアセンブルし、ＲＮＡ添加する前に１０分間、２５℃にてプレインキュベートし、２５℃にてさらに６０分間インキュベートする。反応を４容量の１．２５×Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で反応停止する。標的ＲＮＡ開裂をＲＴ−ＰＣＲ解析または本技術分野で公知の他の方法によってアッセイし、ｄｓＲＮＡが反応より除外された対照反応と比較する。
【０４３３】
あるいは、アッセイのために内部標識した標的ＲＮＡを、［α−３２Ｐ］ＣＴＰの存在下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって調製し、スピンクロマトグラフィーによるＧ５０Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムを通し、さらに精製することなく標的ＲＮＡとして使用する。任意に、標的ＲＮＡを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて、５’−３２Ｐ−末端標識する。アッセイを、上記のように実施し、標的ＲＮＡとＲＮＡｉによって産出される特定のＲＮＡ開裂産物を、ゲルのオートラジオグラフィー上で可視化する。開裂の割合を、未処置の対照ＲＮＡまたはｄｓＲＮＡなしの対照反応由来のＲＮＡ、およびアッセイによって産出された開裂産物を表すバンドのＰＨＯＳＰＨＯＲ  ＩＭＡＧＥＲ（登録商標）（オートラジオグラフィー）定量によって決定する。
【０４３４】
１つの実施形態において、本アッセイを、ｄｓＲＮＡ媒介ＲＮＡｉ開裂に対するグリコール酸オキシダーゼＲＮＡ標的中の標的部位を決定するために使用し、ここで複数のｄｓＲＮＡ構築物を、例えば標識化標的ＲＮＡの電気泳動またはノザンブロットによって、ならびに本技術分野でよく知られている他の方法論によってアッセイ反応を解析することで、グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ標的のＲＮＡｉ媒介開裂に関してスクリーニングする。
【０４３５】
ある特定の実施形態では、好適な対照に対して、例えばグリコール酸オキシダーゼレベルにおける５０％減少が系、細胞、組織または生命体にて観察された場合、本発明のｄｓＲＮＡはグリコール酸オキシダーゼＲＮＡ阻害活性を持つと見なされる。本発明のｄｓＲＮＡのグリコール酸オキシダーゼ阻害活性の決定に対するさらなる境界（ｍｅｔｅｓ  ａｎｄ  ｂｏｕｎｄｓ）は上に記載されている。
【０４３６】
抗−グリコール酸オキシダーゼｄｓＲＮＡ剤の共役と伝達
ある特定の実施形態では、本発明は、グリコール酸オキシダーゼの阻害が、治療効果を有すると予測される、または治療効果を有すると実証されている疾患または障害（例えば、原発性高シュウ酸尿症１型（ＰＨ１）などの肝疾患）を有する、またはそれらを発症させるリスクを持つ対象を治療する方法に関する。このような実施形態では、ｄｓＲＮＡは、グリコール酸オキシダーゼの阻害が、治療効果を有すると予測される、または治療効果を有すると実証されている疾患または障害を制御するための新規治療薬剤として働き得る。本方法は、本発明の医薬組成物を患者（例えばヒト）に投与し、それによって、グリコール酸オキシダーゼ（ＨＡＯ１）ＲＮＡの発現、レベルおよび／または活性が低減することを含む。グリコール酸オキシダーゼ（ＨＡＯ１）ＲＮＡによってコードされたポリペプチドの発現、レベルおよび／または活性はまた、ｄｓＲＮＡがグリコール酸オキシダーゼ転写産物の非コード領域に対して指向する場合（例えば標的化５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ配列）でさえ、本発明のｄｓＲＮＡによって低減してもよい。これらの高い特異性のために、本発明のｄｓＲＮＡは、任意に多型対立遺伝子が個々および／または集団内で存在する対立遺伝子特異的様式であっても、細胞および組織のグリコール酸オキシダーゼ（ＨＡＯ１）配列を特に標的化できる。
【０４３７】
グリコール酸オキシダーゼの阻害が、治療効果を有すると予測される、または治療効果を有すると実証されている疾患または障害の治療において、ｄｓＲＮＡを、対象の細胞または組織、例えば、グリコール酸オキシダーゼの脱制御を示し、かつ／またはグリコール酸オキシダーゼレベルの低減のために標的化された対象の細胞または組織との接触に持ち込むことが可能である。例えば、グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列の全てまたは一部と実質的に同一のｄｓＲＮＡを、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏいずれかで、このような細胞との接触に持ち込むか、またはこのような細胞内へ導入してよい。同様に、グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列の全てまたは一部と実質的に同一のｄｓＲＮＡを、グリコール酸オキシダーゼの阻害が、治療効果を有すると予測される、または治療効果を有すると実証されている疾患または障害を持つ、または発症させるリスクのある対象に直接投与してよい。
【０４３８】
本発明のｄｓＲＮＡ剤の治療的利用は、多数の異なるｄｓＲＮＡ剤配列を含むｄｓＲＮＡ剤の製剤の利用を含み得る。例えば、２以上、３以上、４以上、５以上などの本明細書で記述した薬剤を、例えばグリコール酸オキシダーゼＲＮＡの多数の異なる領域を標的とする、または標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡだけでなく、例えばグリコール酸オキシダーゼの阻害が、治療効果を有すると予測される、または治療効果を有すると実証されている疾患または障害と関連した細胞性標的遺伝子といった標的をも標的とする製剤を産出するように組み合わせることができる。本発明のｄｓＲＮＡ剤をまた、ｄｓＲＮＡ剤のいずれかの鎖が、２以上のグリコール酸オキシダーゼＲＮＡの領域を独立して標的するように、またはｄｓＲＮＡ剤の鎖の１つが、本技術分野で公知のグリコール酸オキシダーゼの細胞性標的遺伝子を標的とするように構築してもよい。
【０４３９】
標的核酸分子の１超の領域を標的とする多機能ｄｓＲＮＡ分子の利用がまた、グリコール酸オキシダーゼＲＮＡレベルおよび発現の強力な阻害を提供できる。例えば、本発明の単一多機能ｄｓＲＮＡ構築物が、ＨＡＯ１−１１７１とＨＡＯ１−１３７８の部位両方を同時に標的とすることができ、さらにおよび／またはあるいは、本発明の単一または多機能薬剤を、グリコール酸オキシダーゼの１つのスプライスバリアントを他よりも選択的に標的とするようにデザインできる。
【０４４０】
したがって、本発明のｄｓＲＮＡ剤は個々に、または他の薬剤との組み合わせまたは併せて、グリコール酸オキシダーゼの阻害が治療効果を有すると予測される、または治療効果を有すると実証されている疾患または障害を治療、阻害、低減または予防するために使用できる。例えば、ｄｓＲＮＡ分子を、治療に好適な条件下、単独で、または１つ以上の薬剤との組み合わせで、対象に投与可能であり、当業者にとって明白な他の適切な細胞に投与可能である。
【０４４１】
ｄｓＲＮＡ分子をまた、対象または生体中のグリコール酸オキシダーゼの阻害が治療効果を有すると予測される、または治療効果を有すると実証されている疾患または障害を治療する、阻害、低減または予防するための他の公知の治療との組み合わせで使用できる。例えば、記述した分子を、本技術分野で公知のように、対象または生体内のグリコール酸オキシダーゼの阻害が治療効果を有すると予測される、または治療効果を有すると実証されている疾患または障害を治療、阻害、低減または予防するために、１つ以上の公知の化合物、治療または手順と組み合わせて使用できる。
【０４４２】
本発明のｄｓＲＮＡ剤は、他の部位（例えばペプチドのような非核酸部位）、有機化合物（例えば染料、コレステロールなど）と（例えばそのセンス鎖またはアンチセンス鎖のその５’または３’末端で）共役可能であり、または共役していなくてよい。この方法でｄｓＲＮＡ剤を改変することは、対応する非共役ｄｓＲＮＡ剤と比較して細胞取込を改善し、得られるｄｓＲＮＡ剤誘導体の細胞標的化活性を増強してよく、細胞内のｄｓＲＮＡ剤誘導体をトレースするために有用であり、または対応する非共役ｄｓＲＮＡ剤と比較してｄｓＲＮＡ剤誘導体の安定性を改善する。
【０４４３】
ある特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ複合体の具体的な例示的形態が企図される。とりわけ、ＲＮＡｉ療法、例えば本明細書で具体的に例示されるｄｓＲＮＡなどは、ｉｎ  ｖｉｖｏで肝臓細胞への特に良好な送達能を実証している（例えば、脂質ナノ粒子および／またはダイナミックなポリコンジュゲートもしくはＧａｌＮＡｃ複合体などの複合体により、ある特定の例示的実施形態では、１つ以上のＧａｌＮＡｃ部分を、ｄｓＮＡの３’オーバーハング領域および／もしくは５’オーバーハング領域に、任意にｄｓＮＡの「伸長」オーバーハング領域に（例えば、このようなオーバーハングの５以上のヌクレオチド、８以上のヌクレオチドの例などに）共役させることができる；さらにならびに／またはあるいは、１つ以上のＧａｌＮＡｃ部分を、ｄｓＮＡのｄｓ伸長領域に、例えばｄｓＮＡのガイド／アンチセンス鎖の５’末端領域およびｄｓＮＡのパッセンジャー／センス鎖の対応する３’末端領域により形成される二本鎖領域に、ならびに／もしくはｄｓＮＡのガイド／アンチセンス鎖の３’末端領域およびｄｓＮＡのパッセンジャー／センス鎖の対応する５’末端領域により形成される二本鎖領域に共役させることができる）。したがって、本明細書に記載されるものなどの製剤化ＲＮＡｉ療法は、肝臓中に存在する、肝臓に由来する、またはさもなければ肝臓を含む疾患または障害を治療または予防するための魅力的な様式である。
【０４４４】
核酸、ベクターおよび宿主細胞を導入する方法
本発明のｄｓＲＮＡ剤を、直接細胞に（すなわち細胞内に）導入してよく、または空洞、間質腔内、生命体の循環中に細胞外で導入してよく、経口で導入してよく、または核酸を含む溶液で細胞または生命体を浴させることによって導入してよい。血管または血管外の循環、血液またはリンパ系、および脳脊髄液が、核酸を導入してよい部位である。
【０４４５】
本発明のｄｓＲＮＡ剤を、核酸を含む溶液の注射、核酸によって覆われた粒子の照射、核酸溶液中の細胞または生命体の浸漬、または核酸の存在下での細胞膜のエレクトロポレーションを含む、本技術分野で公知の核酸伝達方法を用いて導入可能である。脂質媒介担体伝達、化学媒介伝達、リン酸カルシウムのようなカチオン性リポソームトランスフェクションなどのような核酸を細胞に導入するための本技術分野で公知の他の方法を使用してよい。核酸を、以下の、細胞による核酸取込を増強する、または標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡの阻害を増加させる、といった活性の１つ以上を実施する他の成分と一緒に導入してよい。
【０４４６】
標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡを持つ細胞は、生殖系または体性、分化全能性または多能性、分裂または非分裂、柔組織または上皮、不死化または形質導入した系などが由来であってよい。細胞は、幹細胞または分化細胞であってよい。分化した細胞型には、脂肪細胞、繊維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、ニューロン、グリア細胞、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球、ケラチノサイト、コンドロサイト、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞、内分泌または外分泌腺の細胞が含まれる。
【０４４７】
特定の標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列と、伝達されたｄｓＲＮＡ剤物質の用量に依存して、本工程は、グリコール酸オキシダーゼＲＮＡに対しての部分的または完全な機能の欠損を提供し得る。標的細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％以上でのＲＮＡレベルまたは発現（グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ発現またはコードされたポリペプチド発現のいずれか）の減少または欠損が例として挙げられる。グリコール酸オキシダーゼＲＮＡレベルまたは発現の阻害は、グリコール酸オキシダーゼＲＮＡまたはグリコール酸オキシダーゼＲＮＡ−コードタンパク質のレベルの欠如（または観察可能な減少）を意味する。特異性は、細胞の他の遺伝子における明らかな効果なしに、グリコール酸オキシダーゼＲＮＡを阻害する能力を意味する。この阻害の結果は、細胞または生命体の外部特性の試験によって、またはＲＮＡ溶液ハイブリッド形成、ヌクレアーゼ保護、ノザンハイブリッド形成、逆転写、マイクロアレイでの遺伝子発現モニタリング、抗体結合、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロッティング、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、他の免疫アッセイ、および蛍光活性化細胞解析（ＦＡＣＳ）のような生化学的技術によって確認可能である。本発明のｄｓＲＮＡ剤による標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列の阻害は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかで、グリコール酸オキシダーゼの阻害が治療効果を有すると予測される、または治療効果を有すると実証されている疾患または障害、例えば原発性高シュウ酸尿症１型（ＰＨ１）または他の希な肝疾患の発症／進行における、このようなｄｓＲＮＡ剤の投与の効果に基づいて測定可能でもある。ＰＨ１および／または他の希な肝疾患の治療および／または減少には、ＰＨ１または他の希な肝疾患に関連する臓器障害（例えば、腎障害および／または肝障害）の停止または減少を含み得る（例えば、腎障害、肝障害、シュウ酸カルシウム沈着、全身性シュウ酸症、溶骨性病変、骨端線離開（例えば、対象の骨において）、腎臓石灰化を含む腎性骨症、および／または皮膚、目もしくは他の臓器の石灰化／シュウ酸カルシウム沈着の、例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％以上の減少、かつ対数の観点で測定可能であり、細胞、組織、または対象への本発明のｄｓＲＮＡ剤の投与を介して、腎障害、肝障害、シュウ酸カルシウム沈着、全身性シュウ酸症、溶骨性病変、骨端線離開（例えば、対象の骨において）、腎臓石灰化を含む腎性骨症および皮膚、目または他の臓器の石灰化／シュウ酸カルシウム沈着の、例えば１０倍、１００倍、１０００倍、１０５倍、１０６倍、１０７倍減少を達成できる）。
【０４４８】
細胞株または全生命体でのＲＮＡ媒介阻害では、そのタンパク質産物が容易にアッセイされる、レポーターまたは薬物耐性遺伝子の発現を測定できる。このようなレポーター遺伝子には、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、ベータグルコロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトパインシンターゼ（ＯＣＳ）およびそれらの誘導体が含まれる。多数の選別可能なマーカーが利用可能であり、アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ヒグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキセート、ホスフィノリシン、プロマイシンおよびテトラサイクリンに対する耐性を供与する。アッセイに応じて、遺伝子発現の量の定量化により、本発明にしたがって処理されない細胞と比較して、１０％、３３％、５０％、９０％、９５％または９９％超程度阻害を判定できる。
【０４４９】
注射物質の用量が少なくなり、およびＲＮＡサイレンシング薬剤の投与後の時間が長くなると、より小さな細胞画分における阻害がもたらされ得る（例えば少なくとも標的細胞の１０％、２０％、５０％、７５％、９０％または９５％）。細胞内での遺伝子発現の定量化は、標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡの蓄積または標的タンパク質の翻訳のレベルにて同様の量の阻害を示してもよい。例として、阻害の効果を、細胞内の遺伝子産物の量を評価することによって判定してもよく、ＲＮＡは、阻害ｄｓＲＮＡのために使用した領域の外側にヌクレオチド配列を持つハイブリッド形成プローブで検出してよく、または翻訳されたポリペプチドは、その領域のポリペプチド配列に対して作製された抗体で検出してよい。
【０４５０】
ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つのコピー／細胞の伝達を許容する量で導入してよい。物質のより大きな用量（例えば少なくとも５、１０、１００、５００または１０００コピー／細胞）が、より効果的な阻害を産出してもよく、より低い用量がまた、特定の適用のために有用であってもよい。
【０４５１】
グリコール酸オキシダーゼ生物学
グリコール酸オキシダーゼ（ＨＡＯ１遺伝子の産物）は、ミトコンドリア／ペルオキシソームグリシン代謝経路において、グリコール酸塩をグリオキシル酸塩に変換させる要因となる酵素である。グリコール酸塩は、グリシン代謝経路の無害な中間体であるが、グリオキシル酸塩の蓄積（例えば、ＡＧＴ１変異による）は、（カルシウムが最初に腎臓中に、最終的には他の臓器中に沈着して）シュウ酸塩の蓄積を亢進させ、最終的にＰＨ１疾患をもたらす。
【０４５２】
医薬組成物
ある特定の実施形態では、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡ剤を含む医薬組成物を提供する。ｄｓＲＮＡ剤試料は、好適に製剤化され、それが存在する場合に、十分な試料の一部が、遺伝子サイレンシングを誘導するために細胞内に入ることを許容する任意の方法によって細胞の環境内に導入可能である。ｄｓＲＮＡに関する多くの製剤は、本技術分野で公知であり、ｄｓＲＮＡが標的細胞内に入り、働くことができる限り使用可能である。例えば、米国特許出願公開第２００４／０２０３１４５Ａ１号および第２００５／００５４５９８  Ａ１号を参照のこと。例えば、本発明のｄｓＲＮＡ剤を、リン酸緩衝食塩水溶液、リポソーム、ミセル構造およびカプシドのような緩衝溶液中に製剤化できる。カチオン性脂質を備えたｄｓＲＮＡ剤の製剤を、ｄｓＲＮＡ剤の細胞内へのトランスフェクションを促進するために使用可能である。例えば、リポフェクチン（米国特許第５，７０５，１８８号）のようなカチオン性脂質、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリシン（ＰＣＴ国際特許公開第９７／３０７３１号）のようなポリカチオン性分子を使用できる。好適な脂質には、オリゴフェクタミン、リポフェクタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＮＣ３８８（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  ＰｈＡＲｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏ．）、またはＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）が含まれ、これら全ては製造業者の取扱説明書にしたがって使用できる。
【０４５３】
このような組成物には、概して核酸分子と薬学的に許容可能な担体が含まれる。本明細書で使用するところの語句「薬学的に許容可能な担体」には、薬学的投与に適合可能な食塩水、溶媒、分散培地、コーティング剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。補助的な活性化合物もまた組成物内に組み込むことができる。
【０４５４】
医薬組成物を、その意図する投与経路に適合するように製剤化する。投与経路の例には、非経口、例えば静脈内、皮膚内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（局所）、経粘膜および腸投与が含まれる。非経口、皮膚内または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液には、以下の、注射用の水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような無菌希釈液、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン類のような抗菌剤、アスコルビン酸または二硫化ナトリウムのような抗酸化剤、エチレンジアミンテトラ酢酸のようなキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝液および塩化ナトリウム、デキストロースのような浸透圧の調節のための薬剤といった成分を含むことができる。ｐＨを、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調節可能である。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックからなるアンプル、使い捨てシリンジまたは多重用量バイアル内に同封可能である。
【０４５５】
注射可能な用途に好適な医薬組成物には、無菌水溶液（水溶性である場合）または分散液、および無菌注射可能な溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末が含まれる。静脈内投与のために、好適な担体には、生理学的食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ．ＴＭ．（ＢＡＳＦ、ＰＡＲｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全ての場合で、本組成物は無菌でなければならず、簡単にシリンジ注入可能な程度まで流動的であるべきである。製造および保存の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌のような微生物の汚染作用にが防止されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレンングリコールなど）、ならびにこれらの好適な混合液を含む、溶媒または分散培地とすることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの利用によって、分散液の場合、要求される粒子の大きさの維持によって、かつ界面活性剤の利用によって、維持可能である。微生物の活性の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成可能である。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコール類、塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能組成物の長期間の吸収を、組成物内に、吸収を遅延させる薬剤、例えばアルミニウム一ステアリン酸およびゼラチンを加えることによって達成可能である。
【０４５６】
無菌注射可能溶液は、必要に応じて、上記に列挙した成分のうち１つ以上の組み合わせと、選択した溶媒中の必要量の活性化合物を組み込み、続いて濾過滅菌することにより調製できる。一般的に、分散液は、基礎分散培地と上記に列挙した必要な他の成分とを含む、無菌ビヒクル内に活性化合物を組み込むことによって調製する。無菌注射可能溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、前もって濾過滅菌したその溶液から活性成分＋任意の所望な成分を回収する吸引乾燥および凍結乾燥である。
【０４５７】
経口組成物は一般的に、不活性希釈液または食用担体を含む。経口治療投与の目的のために、活性化合物を、賦形剤と組み込み、錠剤、トローチまたは例えばゼラチンカプセルのようなカプセルの形態で使用可能である。経口組成物はまた、マウスウォッシュとしての利用のために流体の担体を用いて調製可能である。薬学的に適合可能な結合剤、および／またはアジュバント物質を、組成物の一部として含めることが可能である。錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、以下の、結晶セルロース、ガムトラガカントもしくはゼラチンのような結合剤、デンプンもしくはラクトースのような賦形剤、アルギン酸、プリモゲルもしくはトウモロコシデンプンのような崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓのような潤滑油、二酸化コロイドシリコーンのような流動促進剤、スクロースもしくはサッカリンのような甘味剤、またはペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香味料のような香味料、といった成分または同様の性質の化合物のいずれかを含んでよい。
【０４５８】
吸入による投与のために、化合物を、例えば二酸化炭素のような気体といった高圧ガスを含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザー由来のエアゾルスプレーの形状で伝達する。このような方法には、米国特許第６，４６８，７９８号に記述されたものが含まれる。
【０４５９】
全身投与がまた、経粘膜または経皮的手段によって可能でもある。経粘膜投与または経皮投与では、浸潤されるべきバリアに対して適切な浸透剤が製剤で使用される。このような浸透剤は一般的に本技術分野で公知であり、例えば、経粘膜投与では、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、経鼻スプレーまたは座薬の使用を介して実施可能である。経皮投与では、活性化合物を、本技術分野で一般的に公知の軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔｓ）、軟膏（ｓａｌｖｅｓ）、ジェルまたはクリームに製剤化する。
【０４６０】
本化合物をまた、（例えばココアバターおよび他のグリセリド類のような従来の座薬基体を備えた）座薬、または腸伝達のための停留かん腸の形態で調製可能である。
【０４６１】
本化合物はまた、限定するものではないが、ＭｃＣａｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ，４１８（６８９３），３８−９（流体力学トランスフェクション）；Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０（１０），１００６−１０（ウイルス媒介伝達）；またはＰｕｔｎａｍ  （１９９６），Ａｍ．Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｙｓｔ．ＰｈＡＲｍ．５３（２），１５１−１６０，ｅｒｒａｔｕｍ  ａｔ  Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｙｓｔ．Ｐｈａｒｍ．５３（３），３２５（１９９６）にて記述された方法を含む、本技術分野で公知の方法を用いてトランスフェクションまたは感染によって投与可能である。
【０４６２】
また、本化合物を、ＤＮＡワクチンのような核酸剤の投与に好適な方法によって投与可能である。これらの方法には、遺伝子銃、生物注入器、および皮膚パッチならびに米国特許第６，１９４，３８９号にて開示されたマイクロ粒子ＤＮＡワクチン技術のようなニードルフリー方法、および米国特許第６，１６８，５８７号にて開示されたような粉末形状ワクチンによる哺乳類経皮ニードルフリーワクチン化が含まれる。さらに、とりわけＨａｍａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，８８（２），２０５−１０．Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓに記載されるように（例えば、米国特許第６，４７２，３７５号にて記述されたような）、経鼻伝達が可能であり、マイクロカプセル化も利用可能である。（例えば、米国特許第６，４７１，９９６号にて記述されたような）生物分解性、標的化可能マイクロ粒子伝達システムもまた使用可能である。
【０４６３】
１つの実施形態では、活性化合物を、インプラントおよびマイクロカプセル化伝達系を含む、徐放製剤のような、体からの急速な消失に対して化合物を保護する担体で調製する。酢酸エチレンビニル、ポリアンヒドリド類、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル類およびポリ酢酸のような生物分解性、生物適合性ポリマーを使用可能である。このような製剤は、標準技術を用いて調製可能である。物質はまた、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手可能である。（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染した細胞に標的化したリポソームを含む）リポソーム懸濁液を、薬学的に許容可能な担体として使用可能でもある。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号にて記述されたような、当業者に公知の方法にしたがって調製可能である。
【０４６４】
このような化合物の毒性および治療効果を、例えばＬＤ５０（集団の５０％が致死する用量）およびＥＤ５０（集団の５０％の治療上有効量）を決定するために、細胞培養液または実験動物における標準薬学的手順によって決定できる。毒性および治療効果の間の用量比が治療指数であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０で表すことが可能である。高い治療指数を表す化合物が好ましい。毒性副作用を表す化合物を使用してよい一方で、感染していない細胞への損傷の可能性を最小限にし、それによって副作用を低減させるために、罹患組織の部位へ、このような化合物を標的化する伝達系をデザインすることに注意が払われるべきである。
【０４６５】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータを、ヒトにおける使用のための用量の範囲を定式化する際に使用可能である。このような化合物の用量は、好ましくは毒性がほとんどないか、全くないＥＤ５０を含む循環濃度範囲内にある。用量は、使用する用量形態および利用した投与経路に応じてこの範囲内で変化してよい。本発明の方法にて使用される化合物では、治療上有効量は、細胞培養アッセイからまず推定可能である。用量を、細胞培養液中で測定したようなＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む、循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにて定式化してよい。このような情報を使用して、ヒトに有用な用量をより正確に決定するできる。血漿中のレベルを、例えば高性能液体クロマトグラフィーによって測定してよい。
【０４６６】
本明細書で定義したように、治療的有効量の核酸分子（すなわち有効用量）は、選択した核酸に依存する。例えば、ｄｓＲＮＡ（または、例えばこのようなｄｓＲＮＡをコードする構築物）を、およそ１ｐｇ〜１０００ｍｇの範囲の単一投与用量で投与してよく、いくつかの実施形態では、１０、３０、１００、もしくは１０００ｐｇ、または１０、３０、１００、もしくは１０００ｎｇ、または１０、３０、１００、もしくは１０００μｇ、または１０、３０、１００、もしくは１０００ｍｇを投与してよい。いくつかの実施形態では、１〜５ｇの組成物を投与可能である。本組成物は、２日に１回を含む、１以上の回数／日〜１以上の回数／週投与可能である。当業者は、限定するものではないが、疾患または障害の重症度、先行治療、対象の一般的健康および／または年齢、他の疾患の存在を含む特定の要因が、対象を効果的に処置するために要求される用量およびタイミングに影響を与え得ることを理解するであろう。さらに、治療的有効量の核酸（例えばｄｓＲＮＡ）、タンパク質、ポリペプチド、または抗体での対象の治療には、単一治療が含まれてよく、または好ましくは一連の治療が含まれてよい。
【０４６７】
本発明の核酸分子は、限定するものではないが、例えば、Ｘｉａらにより（２００２）上記にて記述されたものを含む、本技術分野で公知の方法を用いて、発現構築物、例えばウイルスベクター、レトロウイルスベクター、発現カセット、またはプラスミドウイルスベクター内に挿入可能である。発現構築物は、例えば、吸入、経口、静脈注射、局所投与によって（米国特許第５，３２８，４７０号明細書を参照のこと）、または定位注射によって（例えばＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，３０５４−３０５７）対象に伝達可能である。伝達ベクターの薬学的調製物には、適切な希釈液中のベクターが含まれてよく、または伝達ビヒクルが埋め込まれる徐放マトリックスを含むことができる。あるいは、完全な伝達ベクター、例えばレトロウイルスベクターを、組換え細胞から完全なまま産出可能である場合、薬学的調製物は、遺伝子伝達系を産出する１つ以上の細胞を含むことができる。
【０４６８】
発現構築物は、適切な発現系での使用に好適な構築物であってよく、限定するものではないが、本技術分野で公知のような、レトロウイルスベクター、直線発現カセット、プラスミドおよびウイルスまたはウイルス由来ベクターを含んでもよい。このような発現構築物には、１つ以上の誘導可能なプロモーター、Ｕ６  ｓｎＲＮＡプロモーターまたはＨ１  ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターのような、ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター系、または本技術分野で公知の他のプロモーターを含んでよい。本構築物は、ｓｉＲＮＡの１つまたは両方の鎖を含み得る。両方の鎖を発現している発現構築物にはまた、両方の鎖を連結しているループ構造が含むことができ、または各鎖は、同一の構築物内の別々のプロモーターから別々に転写され得る。各鎖はまた、別々の発現構築物、例えばＴｕｓｃｈｌ（２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０：５００５−５０５）から転写可能でもある。
【０４６９】
細胞の環境内にｄｓＲＮＡ剤を導入する方法が、細胞の型、およびその環境の構成に依存し得ることが理解できる。例えば、細胞が液体内で見られる時に、１つの好ましい製剤は、リポフェクタミン中でのような脂質製剤によるものであり、ｄｓＲＮＡ剤を細胞の液体環境に直接添加できる。脂質製剤をまた、静脈内、筋肉内または腹腔内注射によって、または経口で、または吸入または本技術分野で公知のような他の方法によって動物に投与できる。本製剤が、哺乳類、とりわけヒトのような動物内への投与に好適である場合、本製剤はまた薬学的に許容可能である。オリゴヌクレオチドを投与するための薬学的に許容可能な製剤が公知であり、利用可能である。いくつかの例において、ｄｓＲＮＡ剤を緩衝液または生理食塩水溶液中で製剤化し、製剤化したｄｓＲＮＡ剤を、卵母細胞での研究でのように、直接細胞内に注入することが好ましい場合がある。ｄｓＲＮＡ剤二本鎖の直接注射もまた実施され得る。ｄｓＲＮＡ（例えばＤｓｉＲＮＡ剤）を導入する好適な方法に関して、米国特許公開公報第２００４／０２０３１４５  Ａ１号を参照のこと。
【０４７０】
好適な量のｄｓＲＮＡ剤を導入しなければならず、これらの量は、標準の方法を用いて実験的に決定できる。概して、細胞の環境中の個々のｄｓＲＮＡ剤種の効果的な濃度は、５０ナノモル濃度以下、１０ナノモル濃度以下であり、または１ナノモル濃度以下で濃度での組成物を使用できる。別の実施形態では、２００ピコモル濃度以下、１００ピコモル濃度以下、５０ピコモル濃度以下、２０ピコモル濃度以下、および１０ピコモル濃度以下、５ピコモル濃度以下、２ピコモル濃度以下、または１ピコモル濃度以下の濃度を用いる方法を、多くの環境で使用できる。
【０４７１】
十分な量のｄｓＲＮＡ剤が細胞に入りその効果を発揮するようにｄｓＲＮＡ剤組成物が製剤化される場合、本方法は、細胞が生存可能な細胞外マトリックスにｄｓＲＮＡ剤組成物を添加することにより実行できる。例えば、本方法は、液体培養液または細胞増殖培地のような液体中、組織外植片中、または哺乳類、とりわけヒトのような動物を含む全生命体中に存在する細胞を用いて使用できる。
【０４７２】
グリコール酸オキシダーゼＲＮＡのレベルまたは活性は、本技術分野で公知の、または後に開発される好適な方法によって決定できる。標的ＲＮＡおよび／または標的ＲＮＡの発現を測定するために使用する方法が、標的ＲＮＡの性質に依存し得ることが理解できる。例えば、標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ配列がタンパク質をコードする場合、語句「発現」は、グリコール酸オキシダーゼ遺伝子（ゲノムまたは外来源由来のいずれか）から由来する、タンパク質またはグリコール酸オキシダーゼＲＮＡ／転写産物を意味することができる。このような例において、標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡの発現を、グリコール酸オキシダーゼＲＮＡ／転写産物の量を直接測定することによって、またはグリコール酸オキシダーゼタンパク質の量を測定することによって決定可能である。タンパク質を、染色または免疫ブロッティングによって、またはタンパク質が測定可能な反応を触媒する場合、反応速度を測定することによってなどのタンパク質アッセイにて測定可能である。全てのこのような方法が、本技術分野で公知であり、使用可能である。標的グリコール酸オキシダーゼＲＮＡレベルが測定されるべきである場合、ＲＮＡレベルを検出するための本技術分野で認識された方法を使用可能である（例えばＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロッディングなど）。本発明のｄｓＲＮＡ剤でのグリコール酸オキシダーゼＲＮＡの標的化で、対象、組織中、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏいずれかでの、細胞中の、または細胞抽出物中の、グリコール酸オキシダーゼＲＮＡまたはタンパク質のレベルを減少させる際の、ｄｓＲＮＡ剤の有効性の測定をまた、グリコール酸オキシダーゼ−関連表現型（例えば、ＰＨ１、ＰＨ１−関連バイオマーカーおよび／または表現型、他の希な肝疾患および関連バイオマーカーおよび／または表現型などのような、例えば疾患または障害）の低減の程度を決定するために使用可能でもある。上記測定は、細胞、細胞抽出物、組織、組織抽出物または他の好適な供給源物質で実施できる。
【０４７３】
グリコール酸オキシダーゼＲＮＡの発現が低減したかどうかの決定は、ＲＮＡレベルにおける変化を正確に検出可能な好適な方法とすることができる。概して、この決定は、ｄｓＲＮＡ剤の少なくとも一部が細胞質に入るように未消化のｄｓＲＮＡを細胞環境に導入し、その後標的ＲＮＡのレベルを測定することによって実施される。同様の測定を、同一の未処理細胞上で行い、それぞれの測定から得られた結果を比較する。
【０４７４】
ｄｓＲＮＡ剤は、薬理学的に有効量のｄｓＲＮＡ剤と、薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物として製剤化できる。薬学的、または治療的に有効な量は、意図する薬理学的、治療上または予防上の結果を産出するのに効果的なｄｓＲＮＡ剤の量を意味する。語句「薬理学的有効量」および「治療上有効量」または単に「有効量」は、意図する薬理学的、治療上または予防上の結果を産出するのに効果的なＲＮＡの量を意味する。例えば、当該臨床治療が、疾患または疾病に関連した測定可能なパラメータにおいて、少なくとも２０％の減少が見られた時に有効とされる場合、当該疾患または障害の治療に対する薬物の治療上有効量は、当該パラメータにおける少なくとも２０％減少に影響を与えるのに必要な量である。
【０４７５】
本発明の好適な製剤化された医薬組成物を、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、空路（エアゾル）、腸、膣および（バッカルおよびサブリンガルを含む）局所投与を含む、非経口経路などによるような、本技術分野で公知の方法によって投与可能である。いくつかの実施形態では、本医薬組成物は、静脈または非経口内点滴または注射によって投与される。
【０４７６】
一般に、ｄｓＲＮＡの好適な用量ユニットは、０．００１〜０．２５ミリグラム／レシピエントのキログラム体重／日の範囲、または０．０１〜２０マイクログラム／キログラム体重／日の範囲、または０．００１〜５マイクログラム／キログラム体重／日の範囲、または１〜５００ナノグラム／キログラム体重／日の範囲、または０．０１〜１０マイクログラム／レシピエントのキログラム体重／日の範囲、または０．１０〜５マイクログラム／レシピエントのキログラム体重／日の範囲、または０．１〜２．５マイクログラム／キログラム体重／日の範囲である。ｄｓＲＮＡを含む医薬組成物は、１日１回投与可能である。しかしながら、治療薬剤はまた、１日を通して適切な間隔で投与される、２、３、４、５、６またはそれ以上のサブ用量を含む用量ユニットで投与されてもよい。この場合、各サブ用量に含まれるｄｓＲＮＡは、総合一日用量ユニットを達成するために相応により小さくなければいけない。用量ユニットはまた、例えば数日の間隔にわたり、ｄｓＲＮＡの持続しかつ一定した放出を提供する従来の徐放製剤を用いて、数日にわたる単一用量のために合成可能である。徐放製剤は本技術分野でよく知られている。本実施形態では、用量ユニットは、対応する複数の一日用量を含む。製剤に関係なく、医薬組成物は、処置される動物またはヒトの標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量で、ｄｓＲＮＡを含まなければいけない。本組成物は、ｄｓＲＮＡの複数ユニットの合計が、まとめて十分な用量を含む方法で合成可能である。
【０４７７】
ヒトに好適な用量範囲を製剤化するために、データを細胞培養アッセイと動物研究から得ることができる。本発明の組成物の用量は、毒性がほとんどまたは全くない、（公知の方法によって決定したような）ＥＤ５０を含む、循環濃度の範囲内である。用量は、使用した剤形および利用した投与経路に応じて、この範囲内で変化してよい。本発明の方法にて使用する化合物では、治療上有効用量は、まず細胞培養アッセイより推定できる。細胞培養中で決定したような、ＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む化合物の循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルにて用量を定式化してよい。このような情報は、ヒトに有用な用量をより正確に決定するために使用できる。血漿中のｄｓＲＮＡのレベルを、標準方法によって、例えば高性能液体クロマトグラフィーによって測定してよい。
【０４７８】
医薬組成物は、投与のための取扱説明書とともに、キット、容器、パックまたはディスペンサー内に含まれることができる。
【０４７９】
治療方法
本発明は、グリコール酸オキシダーゼ（例えばＨＡＯ１転写産物および／もしくはグリコール酸オキシダーゼタンパク質レベルの正常機能および／もしくは誤調節および／もしくは上昇）によって、全体としてもしくは部分的に引き起こされる、もしくはグリコール酸オキシダーゼの選択的標的化介して処置可能な疾患または障害のリスクのある（または受けやすい）対象を治療する予防的および治療的方法の両方を提供する。
【０４８０】
本明細書で使用するところの「治療」または「治療すること」は、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、もしくは疾患に向かう傾向を治癒させる、治す、緩和する、軽減する、変化させる、治療する、改善する、好転させるまたは影響を与える目的で、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、もしくは疾患もしくは障害に向かう傾向を持つ患者への治療的薬剤（例えばｄｓＲＮＡ剤またはそれをコードしているベクターまたはトランスジーン）の適用もしくは投与、またはこのような患者から単離した組織もしくは細胞株への治療薬剤の適用もしくは投与として定義される。
【０４８１】
１つの態様において、本発明は、対象に治療薬剤（例えばｄｓＲＮＡ剤またはそれをコードしているベクターもしくはトランスジーン）を投与することによって、対象中で、（例えばグリコール酸オキシダーゼ発現の阻害を介して対象内での、例えばＰＨ１形成事象の開始を防止することを含む）上述の疾患または障害を予防する方法を提供する。疾患に対してリスクを有する対象を、例えば、本明細書で記述したような診断または予後アッセイの１つまたは組み合わせによって同定できる。予防的薬剤の投与は、例えば対象中のＰＨ１の検出、または疾患もしくは障害の症状特徴の顕在化の前に実施可能であり、それによって疾患または障害が予防され、あるいはその進行が遅延する。
【０４８２】
本発明の別の態様は、対象を治療的に治療する方法、すなわち疾患または障害の症状の開始を変更する方法に関する。これらの方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、ｄｓＲＮＡ剤とともに細胞を培養することによって）、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば対象にｄｓＲＮＡ剤を投与することによって）で実施可能である。
【０４８３】
治療の予防的および治療的方法の両方に関して、このような治療はとりわけ、ファーマコジェノミクスの領域から得られた知識に基づいてあつらえ、または改変してよい。本明細書で使用するところの「ファーマコジェノミクス」は、遺伝子シークエンシング、統計学的遺伝学、および臨床試験および市場における薬物に対する遺伝子発現解析のような、ゲノミクス技術の適用を意味する。より具体的には、本語句は、どのようにして患者の遺伝子が、彼または彼女の薬物に対する応答を決定するか（例えば、患者の「薬物応答表現型」または「薬物応答遺伝子型」）の研究を意味する。したがって、本発明の別の態様は、個々の薬物応答遺伝子型にしたがって、本発明の標的ＨＡＯ１ＲＮＡ分子または標的ＨＡＯ１ＲＮＡモジュレータいずれかでの個々の予防的または治療的治療をあつらえるための方法を提供する。ファーマコジェノミクスは、臨床医または医師が、治療より最も利益を得る患者へ、予防的または治療的処置を標的化し、毒性薬物関連副作用を経験する患者の治療を避けることを可能にする。
【０４８４】
治療薬剤を、選択した動物モデルで試験可能である。例えば、本明細書で記述したようなｄｓＲＮＡ剤（またはそれをコードしている発現ベクターもしくはトランスジーン）は、上記薬剤での治療の有効性、毒性または副作用を決定するために、動物モデルにて使用可能である。あるいは、薬剤（例えば治療薬剤）を、このような薬剤の作用機序を決定するために、動物モデルにて使用可能である。
【０４８５】
ＨＡＯ１ｍＲＮＡレベルおよび発現の下方調節を評価するために有用なモデル
細胞培養
本発明のｄｓＲＮＡ剤を、ｉｎ  ｖｉｖｏにて、例えば以下の手順を用いて、開裂活性に対して試験可能である。本発明のｄｓＲＮＡ剤によって標的化されたＨＡＯ１ｃＤＮＡ内のヌクレオド配列を、上記のＨＡＯ１配列中に示す。
【０４８６】
本発明のｄｓＲＮＡ試薬を、ＨＡＯ１ＲＮＡおよび／またはグリコール酸オキシダーゼタンパク質阻害の程度を決定するために、ＨｅＬａまたは他の哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞株Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、ＤＵ１４５、Ｃａｌｕ３、ＳＷ４８０、Ｔ８４、ＰＬ４５など、およびマウス細胞株Ｈｅｐａ１−６、ＡＭＬ１２、Ｎｅｕｒｏ２ａなど）を用いて、細胞培養液中で試験できる。ある特定の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡ試薬（例えば図１および上述構造を参照のこと）を、本明細書で記述したように、ＨＡＯ１標的に対して選択する。ＨＡＯ１ＲＮＡ阻害は、例えば、培養ＨｅＬａ細胞、または培養液中の他の形質転換されたか、形質転換されていない哺乳類細胞への、好適なトランスフェクション薬剤によるこれらの試薬の送達後に測定する。標的ＨＡＯ１ＲＮＡの相対量を、レポーターアッセイ（例えば、以下に例示されるような）によって、および／または増幅のリアルタイムＰＣＲモニタリング（例えばＡＢＩ７７００ＴＡＱＭＡＮ（登録商標））を用いて、ＨＰＲＴ１、アクチンもしくは他の適切な対照に対して測定する。比較を、関係しない標的、または同一の総長および化学式を持つ無作為化ＤｓｉＲＮＡ対照、または単に適切なビヒクル処理もしくは未処理の対照に対して実施したオリゴヌクレオチド配列の活性に対して実施する。第一および第二リード試薬を、標的に対して選択し、最適化を実施した。
【０４８７】
ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（増幅のリアルタイムＰＣＲモニタリング）およびｍＲＮＡのライトサイクラー定量化
ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイについて、総ＲＮＡを、例えば大規模抽出用のＡｍｂｉｏｎ  Ｒｎａｑｕｅｏｕｓ  ４−ＰＣＲ精製キット、または９６−ウェルプレート用のＰｒｏｍｅｇａ  ＳＶ９６を用いて、ＤｓｉＲＮＡ伝達後の細胞から調製する。Ｔａｑｍａｎ解析のために、二重標識化プローブを、例えば５’末端にて共有結合したレポーター色素ＦＡＭまたはＶＩＣと３’末端に共役したクエンサー色素ＴＡＭＲＡで合成した。ＰＣＲ増幅を、例えば１０uＬ総ＲＮＡ、１００ｎＭフォワードプライマー、１００ｍＭリバースプライマー、１００nＭ  プローブ、１×ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ反応緩衝液（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、５．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００uＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、０．２Ｕ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．０２５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および０．２Ｕ  Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）からなる５０uＬ反応液を用いて、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００配列検出器上で実施する。温度サイクル条件は、４８℃にて３０分間、９５℃にて１０分間、続いて９５℃にて１５秒間と６０℃の４０サイクル、および、および６０℃で１分間からなることができる。標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡレベルの定量を、段階希釈した総細胞ＲＮＡ（３００、１００、３０、１０ｎｇ／ｒｘｎ）から産出した標準物質に対して決定し、例えば、平行または同一のいずれかのチューブＴａｑＭａｎ反応におけるＨＰＲＴ１  ｍＲＮＡに対して正規化する。
【０４８８】
ウェスタンブロッディング
細胞タンパク質抽出物を、標準マイクロ調製技術を用いて（例えばＲＩＰＡ緩衝液を使用して）調製可能である。細胞タンパク質抽出物を、Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅポリアクリルアミドゲル上で泳動し、膜上に移す。非特異的結合を、例えば５％不脂肪ミルクとの１時間のインキュベーションにて阻害し、続いて４℃にて１６時間一次抗体でインキュベーションできる。洗浄後、二次抗体を、例えば室温にて１時間（１：１０，０００希釈）適用し、シグナルを、ＶｅｒｓａＤｏｃイメージングシステム上で検出する。
【０４８９】
いくつかの細胞培養系において、カチオン性脂質が、培養液中の細胞に対するオリゴヌクレオチドのバイオアベイラビリティを増強することが示されてきた（Ｂｅｎｎｅｔ，  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，４１，１０２３−１０３３）。１つの実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子を、細胞培養実験のために、カチオン性脂質と複合体化する。ｄｓＲＮＡとカチオン性脂質との混合物を、細胞への添加の直前に、血清を含まないＯｐｔｉｍＭＥＭ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）中で調製する。ＯｐｔｉＭＥＭを室温（約２０〜２５℃）まで温め、カチオン性脂質を最終の所望濃度まで加える。ｄｓＲＮＡ分子をＯｐｔｉＭＥＭに、所望の濃度まで加え、溶液を希釈したｄｓＲＮＡに加え、１５分間室温にてインキュベートする。用量応答実験において、ＲＮＡ複合体を、カチオン性脂質の添加前に、ＯｐｔｉＭＥＭで段階希釈する。
【０４９０】
動物モデル
抗−ＨＡＯ１ｄｓＲＮＡ剤の有効性を、動物モデルにおいて評価してよい。本技術分野で公知のようなＰＨ１の動物モデルを、抗−ＨＡＯ１ｄｓＲＮＡの有効性、効力、毒性などの評価のために使用可能である。抗−ＨＡＯ１ｄｓＲＮＡの評価に有用な例示的動物モデルとしては、グリコール酸塩負荷のマウスモデルおよびＰＨ１疾患の遺伝子組換えマウスモデルが挙げられる。このような動物モデルは、本発明の組成物のアッセイのための、供給源細胞または組織としても使用できる。このようなモデルはまた、治療的利用に向けてＨＡＯ１遺伝子発現の調節における、本発明のｄｓＲＮＡ組成物の有効性の前臨床評価のために使用できるか、または使用のために適合できる。
【０４９１】
このようなモデルおよび／または野生型マウスを、ＨＡＯ１レベル、発現、ＨＡＯ１−関連表現型、疾患または障害の発症などを阻害する本発明のｄｓＲＮＡ分子の有効性の評価において使用できる。これらのモデル、野生型マウスおよび／または他のモデルを同様に、前臨床設定にて、本発明のｄｓＲＮＡ分子の安全性／毒性および有効性を評価するために使用できる。
【０４９２】
本発明のＨＡＯ１標的化ｄｓＲＮＡの評価に有用な動物モデル系の特異的な例には、野生型マウスおよび遺伝子組換えアラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ欠損モデルマウスが含まれる（Ｓａｌｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３（４８）：１８２４９−５４を参照のこと）。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験における例において、本発明のｄｓＲＮＡを、このようなマウスモデルに、０．０１〜０．１〜１ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で尾静脈注射するか、または繰り返し用量を、単一用量のＩＣ５０レベルで投与し、臓器試料（例えば、肝臓、ただし前立腺、腎臓、肺、膵臓、結腸、皮膚、脾臓、骨髄、リンパ節、乳腺脂肪体なども含み得る）を、最終用量を投与してから２４時間後に回収する。ついでこのような臓器を、使用するモデルに応じてマウスおよび／もしくはヒトＨＡＯ１レベルに関して、ならびに／またはＰＨ１−関連表現型に対する影響に関して評価する。活性期間も最終ｄｓＲＮＡ投与から、例えば１、４、７、１４、２１日以上で試験できる。
【０４９３】
本発明の実施は、他に指摘がない限り、当業者の技術内である、化学、分子生物学、微生物学、組換え体ＤＮＡ、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養およびトランスジェニック生物学の従来の技術を使用する。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｕｐｄａｔｅｓ）；Ｇｌｏｖｅｒ，１９８５，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）；Ａｎａｎｄ，１９９２；Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｆｉｎｋ，１９９１；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ｊａｋｏｂｙ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ，１９７９；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；Ｒｉｏｔｔ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８８；Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）；Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｍ．，Ｔｈｅ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｂｏｏｋ．Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔＨｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ），（４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｏｒｅｇｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，２０００）を参照のこと。
【０４９４】
他に定義しない限り、本明細書で使用した全ての技術的かつ化学的語句は、本発明の属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を持つ。本明細書で記述したものと同様または等価の方法および物質を、本発明の実施または試験で使用できるが、好適な方法および物質が以下で記述されている。全ての発行物、特許明細書、特許、および本明細書で言及された他の参考文献が、参考文献として援用される。矛盾がある場合、定義を含む本明細書が制御する。さらに、物質、方法および実施例は単なる例示であり、限定する意図はない。
【実施例】
【０４９５】
本発明は、以下の実施例を参照して記述され、これらは例示するために提供されるものであり、任意の方法で本発明の限定を意図するものではない。本技術分野でよく知られている標準技術、または以下で特に記述される技術を使用した。
【０４９６】
実施例１：二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチド合成および精製
ＤｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡメッセージ中の種々の部位、例えば本明細書で記述したＲＮＡ配列内の標的配列と相互作用するようにデザインした。本例示の薬剤において、３８４のヒト標的ＨＡＯ１配列を評価のために選択した（選択した３８４のヒト標的ＨＡＯ１部位が、マウスＨＡＯ１転写配列中の対応する部位と共に保存されていることが予測された）。ＤｓｉＲＮＡ分子の１つの鎖の配列は、上述の標的ＨＡＯ１部位配列と相補的であった。ＤｓｉＲＮＡ分子は、本明細書で記述した方法を用いて化学的に合成した。一般に、ＤｓｉＲＮＡ構築物を、１９〜２３マーｓｉＲＮＡに対して記述したような固相オリゴヌクレオチド合成法を用いて合成した（例えば、Ｕｓｍａｎらの米国特許第５，８０４，６８３号；第５，８３１，０７１号；第５，９９８，２０３号；第６，１１７，６５７号；第６，３５３，０９８号；第６，３６２，３２３号；第６，４３７，１１７号；第６，４６９，１５８号；Ｓｃａｒｉｎｇｅらの米国特許第６，１１１，０８６号；第６，００８，４００号；第６，１１１，０８６号を参照のこと）。
【０４９７】
個々のＲＮＡ鎖を合成し、標準の方法にしたがってＨＰＬＣ精製した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，アイオワ州コーラルビル）。例えば、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを、標準技術（Ｄａｍｈａ  ａｎｄ  Ｏｌｇｉｖｉｅ，  １９９３，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２０：  ８１−１１４；  Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２３：  ２６７７−８４）を用いて、固相ホスホロアミダイト化学反応を用いて合成し、脱保護し、ＮＡＰ−５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）上で脱塩した。オリゴマーを、１５分間段階直線勾配を用いて、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｑカラム（１．０ｃｍ×２５ｃｍ；  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）上のイオン交換高性能液体クロマトグラフィー（ＩＥ−ＨＰＬＣ）を用いて精製した。勾配は、９０：１０  緩衝液Ａ：Ｂ〜５２：４８  緩衝液Ａ：Ｂで変化し、ここで緩衝液Ａは１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５であり、緩衝液Ｂは１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５、１Ｍ  ＮａＣｌであった。試料を２６０ｎｍでモニタし、全長オリゴヌクレオチド種に対応するピークを回収し、プールし、ＮＡＰ−５カラム上で脱塩し、凍結乾燥した。
【０４９８】
各オリゴマーの純度を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＰＡＣＥ  ５０００（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州フラートン）上でのキャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって決定した。ＣＥキャピラリーは、１００μｍ内径を持ち、ｓｓＤＮＡ  １００Ｒ  Ｇｅｌ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を含有した。概して、約０．６ｎｍｏｌのオリゴヌクレオチドをキャピラリー内に注入し、４４４Ｖ／ｃｍの電場中で走らせ、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度によって検出した。変性Ｔｒｉｓ−ホウ酸塩−７Ｍ−尿素ランニング緩衝液をＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒから購入した。オリゴリボヌクレオチドを、以下に記述する実験での使用のために、ＣＥによって評価したように、少なくとも９０％純度で得た。化合物同一性を、製造業者の推奨プロトコールにしたがって、Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ．ＴＭ．Ｂｉｏｓｐｅｃｔｏｍｅｔｒｙ  Ｗｏｒｋ  Ｓｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州フォスターシティ）上での、マトリックス補助レーザー吸収イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析によって確認した。しばしば０．２％の予測分子量内で、全てのオリゴマーの相対分子量を得た。
【０４９９】
二本鎖の調製
一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）オリゴマーを、例えば１００ｍＭ  酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５からなる二本鎖緩衝液中１００μＭ濃度で、再懸濁した。相補的センス鎖およびアンチセンス鎖を等モル量で混合し、例えば５０μＭ二本鎖の最終溶液を得た。試料をＲＮＡ緩衝液（ＩＤＴ）中５’間１００℃まで熱し、使用の前に室温まで冷却した。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）オリゴマーを−２０℃で保存した。一本鎖ＲＮＡオリゴマーを、凍結乾燥または−８０℃にてヌクレアーゼフリーの水中で保存した。
【０５００】
命名法
一貫性のために、以下の命名法を本明細書で使用した。二本鎖に与えた名前は、オリゴマーの長さと、オーバーハングの有無とを示唆する。「２５／２７」は、２−塩基３’−オーバーハングを含む、２５塩基センス鎖と、２７塩基アンチセンス鎖とを持つ非対称二本鎖である。「２７／２５」は、２７塩基センス鎖と２５塩基アンチセンス鎖とを持つ非対称二本鎖である。
【０５０１】
細胞培養およびＲＮＡトランスフェクション
ＨｅＬａ細胞を得て、５％ＣＯ２下、３７℃にて、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）を含むＤＭＥＭ（ＨｙＣｌｏｎｅ）中で維持した。ＲＮＡトランスフェクションのために、細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造業者の取り扱い説明書にしたがって、１ｎＭまたは０．１ｎＭの最終濃度でＤｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。簡単に記すと、例えば以下の実施例３の０．１ｎＭのトランスフェクションでは、各ＤｓｉＲＮＡのストック溶液の一定分量を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸと、１５０μＬ（０．３ｎＭ  ＤｓｉＲＮＡを備える）の容量に達するまで混合した。得られた１５０μＬ混合液を、室温にて２０分間インキュベートして、ＤｓｉＲＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ複合体を形成させた。一方、標的細胞をトリプシン処理し、培地中に再懸濁させた。２０分間の複合体形成の終わりに、ウェルあたり５０uＬのＤｓｉＲＮＡ：ＲＮＡｉＭＡＸ混合物を、９６ウェルプレート中の３組のウェルに添加した。最後に、細胞懸濁液１００μＬを各ウェルに加え（最終容量１５０μＬ）、プレートを２４時間インキュベーター内に配置した。
【０５０２】
グリコール酸オキシダーゼ阻害の評価
ヒトＨｅＬａ細胞中のＨＡＯ１標的遺伝子ノックダウンをレポーターアッセイによって決定した（ＨｅＬａ細胞を、Ｐｓｉ−Ｃｈｅｃｋ−ＨｓＨＡＯ１プラスミドで形質転換し、ついでウミシイタケルシフェラーゼレベルを、ルミノメーターを使用して検出した）一方で、ＨＰＲＴおよびＲＰＬ２３ハウスキーピング遺伝子に対して、ならびに対照ＤｓｉＲＮＡおよび／またはモックトランスフェクション対照でのトランスフェクションに対して正規化した値を用いて、マウスＨｅｐａ１−６細胞中のＨＡＯ１標的遺伝子ノックダウンをｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。
【０５０３】
ＲＮＡ単離および解析
培地を吸引し、総ＲＮＡをＳＶ９６キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて抽出した。総ＲＮＡを、製造業者の取扱説明書にしたがって、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴおよびランダムヘキサマーを用いて逆転写した。概して、得られたｃＤＮＡを、ＨＡＯ１遺伝子ならびにマウス遺伝子ＨＰＲＴ−１およびＲＰＬ２３の両方に特異的なプライマーとプローブとを用いて、ｑＰＣＲによって解析した。ＡＢＩ７７００を、増幅反応のために使用した。各試料を三重で試験した。相対グリコール酸オキシダーゼＲＮＡレベルを、ＨＰＲＴ１およびＲＰＬ２３ＲＮＡレベルに対して正規化し、トランスフェクション対照試料中で得たＲＮＡレベルと比較した。
【０５０４】
実施例２：グリコール酸オキシダーゼのＤｓｉＲＮＡ阻害
グリコール酸オキシダーゼを標的としているＤｓｉＲＮＡ分子を、上述のようにデザインして合成し、阻害有効性に関してヒトＨｅＬａ細胞（あるいは、ＨｅｐＧ２または他のヒト細胞を使用できただろう）中で試験した。トランスフェクションのために、アニールしたＤｓｉＲＮＡを、トランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、室温にて２０分間インキュベートした。ＨｅＬａ（ヒト）またはＨｅｐａ１−６（マウス）細胞（あるいは、マウスＡＭＬ１２または他のマウス細胞を使用できただろう）をトリプシン処理し、培地中で再懸濁し、ウェルに加え（１００μＬ／ウェル）、１５０μｌの容量で、１ｎＭの最終ＤｓｉＲＮＡ濃度を得た。各ＤｓｉＲＮＡトランスフェクション混合液を、三重ＤｓｉＲＮＡ処理のために３つのウェルに加えた。細胞を３７℃にて２４時間、ＤｓｉＲＮＡトランスフェクション混合液の継続存在下、インキュベートした。２４時間の時点で、ウミシイタケルシフェラーゼレベルの検出のために、ヒト細胞でルミノメーターアッセイを実施した、またはＲＮＡを、処理したマウス細胞の各ウェルから調製した。このようなマウス細胞については、トランスフェクション混合液を含む上清をまず除去して廃棄し、ついで細胞を溶解し、各ウェルからＲＮＡを調製した。処理後の標的レポータールシフェラーゼレベル（ヒト）またはＨＡＯ１ＲＮＡレベル（マウス）を、対照から得られた値に対して正規化した値を用いて、ＨＡＯ１標的遺伝子に対してルミノメーター（ヒト）またはｑＲＴ−ＰＣＲ（マウス）によって評価した。三重のデータを平均し、％エラーを各処置に対して決定した。正規化データを表にしてグラフ化し、対照との比較で、活性ＤｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの減少を決定した（以下の表１１および図２Ａ〜２Ｆを参照のこと）。
【表１１−１】
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【表１１−２】
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【表１１−３】
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【表１１−４】
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【表１１−５】
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【表１１−６】
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【表１１−７】
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【表１１−８】
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【表１１−９】
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【表１１−１０】
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【表１１−１１】
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【表１１−１２】
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【表１１−１３】
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【表１１−１４】
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【表１１−１５】
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【表１１−１６】
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【表１１−１７】
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【表１１−１８】
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【表１１−１９】
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【表１１−２０】
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【０５０５】
実施例３：グリコール酸オキシダーゼのＤｓｉＲＮＡ阻害−二次スクリーニング
上記実験の９６の非対称ＤｓｉＲＮＡ（Ｈｓ  ＨＡＯ１を標的とする９６のうち、２６はＭｍ  ＨＡＯ１も標的とした）を、ついで二次アッセイで試験し（「フェーズ２」）、このようなアッセイの結果を図３Ａ〜３Ｆにてヒストグラムの形態で提示した。特に、上記で試験したものから選択した９６の非対称ＤｓｉＲＮＡを、ヒトＨｅＬａ細胞の環境中１ｎＭまたは０．１ｎＭにて（二重アッセイで）ヒトＨＡＯ１の阻害に関して評価した（図３Ａおよび３Ｂ）。これらの９６非対称ＤｓｉＲＮＡをまた、マウスＨｅｐａ１−６細胞の環境中１ｎＭまたは０．１ｎＭにて、マウスＨＡＯ１の阻害に関して（二重に）評価した（図３Ｃ〜３Ｆ）。図３Ａおよび３Ｂにて示すように、多くの非対称ＤｓｉＲＮＡが、ＨｅＬａ細胞の環境中でアッセイした場合、サブナノモル濃度にて有意なヒトＨＡＯ１阻害有効性を再現的に示した。
【０５０６】
理論に束縛されるものではないが、ＤｓｉＲＮＡ媒介ｍＲＮＡノックダウン後のｍＲＮＡ残存量を測定するためにＲＴ−ｑＰＣＲ法を使用する場合、ｍＲＮＡ内におけるｑＰＣＲアッセイの位置が、ノックダウンの検出に影響を与え得ることに留意する。ＤｓｉＲＮＡ指向性ｍＲＮＡ開裂点により近いｑＰＣＲアッセイは通常、より信頼性の高いｍＲＮＡレベルの測定値を生成する。例えば、ｑＰＣＲアッセイを開裂点から離れるように位置付ける場合、ＤｓｉＲＮＡ指向性開裂から得られるｍＲＮＡ断片の緩やかな分解は、不自然に高いｑＰＣＲシグナル（ノックダウンの「偽陰性」）を生成し得る。この兆候は、ＤｓｉＲＮＡ部位近傍に位置するｑＰＣＲアッセイを使用すると高ノックダウンとして検出され、ＤｓｉＲＮＡ部位から離れて位置するｑＰＣＲアッセイを用いると不自然な「低」ノックダウンとして検出される。この状況では、ＤｓｉＲＮＡ部位近傍でのｑＰＣＲアッセイを定量化に使用する。
【０５０７】
図３Ｃ〜３Ｆにて示すように、いくつかの非対称ＤｓｉＲＮＡも、マウスＨｅｐａ１−６細胞の環境中でアッセイした場合、サブナノモル濃度で有意なマウスＨＡＯ１阻害有効性を有すると同定した。
【０５０８】
実施例４：グリコール酸オキシダーゼ標的化ＤｓｉＲＮＡのＩｎ  Ｖｉｖｏ有効性の評価
ある特定の活性ＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡの、マウスの肝臓内でＨＡＯ１レベルを減少させる能力を試験した。本研究で用いたＤｓｉＲＮＡは、ＨＡＯ１−１１０５、ＨＡＯ１−１１７１、ＨＡＯ１−１２２１、ＨＡＯ１−１２７２、ＨＡＯ１−１２７３、ＨＡＯ１−１３１６、ＨＡＯ１−１３７８およびＨＡＯ１−１３７９であり、その各々をパッセンジャー（センス）鎖改変パターン「ＳＭ１０７」およびガイド（アンチセンス）鎖改変パターン「Ｍ４８」（パターンは上に記載）で合成した。本研究を実施するために、原発性高シュウ酸尿症モデルを、０．２５ｍＬの０．５Ｍグリコール酸塩の経口強制投与により、メスのＣ５７ＢＬ／６マウス中で尿中シュウ酸塩の蓄積を引き起こして生成した。動物を無作為化し、体重に基づいて群に割り当てた。１ｍｇ／ｋｇまたは０．１ｍｇ／ｋｇのＤｓｉＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ；ここではＥｎＣｏｒｅ−２３４５という名称のＬＮＰ製剤を用いた）での動物の静脈内投薬を、０日目に開始した。投薬を続けて１週間に２回行い、グリコール酸塩負荷前にマウスに合計で３用量投与した。シュウ酸塩／クレアチニンレベルの評価のために、グリコール酸塩負荷の４時間後および２４時間後に尿試料を収集した（実験フローチャートの図４を参照のこと）。ついで、グリコール酸塩負荷の２４時間後に動物を犠牲死させた。肝臓を解剖して計量し、ＨＡＯ１レベルを、ＲＴ−ｑＰＣＲ、ＶｉｅｗＲＮＡ、グリコール酸オキシダーゼのウェスタンブロットおよび／またはグリコール酸オキシダーゼ免疫組織化学を使用して評価した（ＶｉｅｗＲＮＡ、グリコール酸オキシダーゼのウェスタンブロットおよびグリコール酸オキシダーゼ免疫組織化学のデータは示さず）。血清試料でも、グリコール酸オキシダーゼの検出のためにＥＬＩＳＡを実施した（データは示さず）。特に、１ｍｇ／ｋｇで投与した場合、８つ全てのＤｓｉＲＮＡがＨＡＯ１の強力なノックダウンを示した（図５）。ｉｎ  ｖｉｖｏで試験した８つのＤｓｉＲＮＡのうち少なくとも２つ（ＨＡＯ１−１１７１およびＨＡＯ１−１３７８）はまた、０．１ｍｇ／ｋｇで投与した場合に、全ての処理動物でＨＡＯ１の強力なノックダウンも示した。図５に示すように、０．１ｍｇ／ｋｇでのＨＡＯ１−１１７１−Ｍ１０７／Ｍ４８ＤｓｉＲＮＡの投与が、処理マウスの肝臓組織で平均７０％のノックダウンを引き起こした一方で、１ｍｇ／ｋｇでの投与は、処理マウスの肝臓組織で平均９７％のノックダウンをもたらした。同様に、０．１ｍｇ／ｋｇでのＨＡＯ１−１３７８−Ｍ１０７／Ｍ４８ＤｓｉＲＮＡの投与が、処理マウスの肝臓組織で平均５３％のノックダウンを引き起こした一方で、１ｍｇ／ｋｇでの投与は、処理マウスの肝臓組織で平均９７％のノックダウンをもたらした。０．１ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇの両方でのＨＡＯ−１１７１誘導ノックダウンを、ＶｉｅｗＲＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイによってさらに確認した。
【０５０９】
１ｍｇ／ｋｇ量のＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡであるＨＡＯ１−１１７１およびＨＡＯ１−１３７８（図６およびデータは示さず）で処理したマウスの肝臓組織で、ＨＡＯ１ｍＲＮＡノックダウンの強力なレベルを観察し、０．１ｍｇ／ｋｇ量のこれらのＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡであっても、強力なＨＡＯ１ノックダウンをもたらした。図６に示すように、単回用量のＨＡＯ１−１１７１ＤｓｉＲＮＡ処理は、処理動物の肝臓において投与後少なくとも１２０時間、耐久的なＨＡＯ１ｍＲＮＡ標的ノックダウンを達成した。強力なＨＡＯ１ノックダウンを肝臓で達成したが、最初のグリコール酸塩負荷実験では、決定的な表現型結果を得られなかった（データは示さず）。
【０５１０】
追加のｉｎ  ｖｉｖｏ実験では、ＨＡＯ１およびシュウ酸塩レベルの両方を、対照およびＤｓｉＲＮＡ処理した遺伝子組換えＰＨ１モデルマウスの両方で評価した。
【０５１１】
実施例５：Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏでのグリコール酸オキシダーゼ標的化ＤｓｉＲＮＡの改変形態の評価
上記の実施例３から選択した２４のＤｓｉＲＮＡを、「Ｍ１０７」パッセンジャー鎖の改変と対を形成する２’−Ｏ−メチルガイド鎖改変パターン（上に示されるように、「Ｍ１７」、「Ｍ３５」、「Ｍ４８」および「Ｍ８」）で調製した。これらのＤｓｉＲＮＡ配列の各々に関して、「Ｍ１０７」パッセンジャー鎖改変パターンと一体となった４つのガイド鎖改変パターンのＭ１７、Ｍ３５、Ｍ４８およびＭ８の各々を有するＤｓｉＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞の環境において１．０ｎＭおよび０．１ｎＭ（二重アッセイ）濃度での、ヒトＨｅＬａ細胞中のＨＡＯ１阻害についてアッセイした。図７Ａが、このような二本鎖の特定の改変パターンを示す（斜線の残基は、２’−Ｏ−メチル改変を有するこれらを示す）一方で、図７Ｂおよび７Ｃは、試験した２４の二本鎖配列（ＨＡＯ１−６５、７５、７７、８０、８３、９６、１１９８、１４８０、１４９０、１４９１、１４９９、１５０１、１１７１、１２７９、１５０４、１５４９、１５５２、１６９６、１３１５、１３１６、１３７５、１３７８、１３７９および１３９３）に対応する４つの改変二本鎖の各々に対するヒトＨＡＯ１ノックダウン有効性データを示す。図７Ｂおよび７Ｃで実証されるように、試験した多くの二本鎖が、試験した高度に改変した形態の全てにわたり０．１ｎＭ濃度であっても、強力なＨＡＯ１ノックダウン有効性を有すると実証した。
【０５１２】
８つの二本鎖配列（ＨＡＯ１−ｍ１１６７、ｍ１２７６、ｍ１３１２、ｍ１３１３、ｍ１３７２、ｍ１３７５、ｍ１３７６およびｍ１３９０、これらはヒト二本鎖のＨＡＯ１−１１７１、１２７９、１３１５、１３１６、１３７５、１３７８、１３７９および１３９３にそれぞれ対応する）を、４つの二本鎖改変パターンの同じ範囲にわたって、マウスＨｅｐａ１−６細胞中のノックダウン有効性についても試験した。図７Ｄおよび７Ｅに示すように、これらの二本鎖の大部分が、０．０３ｎＭほどの低濃度であっても、二本鎖改変パターンの範囲にわたり、マウス細胞中で強力なＨＡＯ１ノックダウン有効性を示した。
【０５１３】
実施例６：Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏでのグリコール酸オキシダーゼ標的化ＤｓｉＲＮＡの追加的改変形態の評価
実施例５で上述した２４のＨＡＯ１標的化二本鎖配列の同じセットを、固定の「Ｍ４８」ガイド鎖改変パターンと一体となった４つの２’−Ｏ−メチルパッセンジャー鎖改変パターン（「Ｍ１０７」、「Ｍ１４」、「Ｍ２４」および「Ｍ２５０」）の範囲を有するように調製した。これらのＤｓｉＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞の環境において１．０ｎＭおよび０．１ｎＭ（二重アッセイ）濃度でＨＡＯ１阻害についてアッセイした。図８Ａが、このような二本鎖の特定の改変パターンを示す（斜線の残基は、２’−Ｏ−メチル改変を有するこれらを示す）一方で、図８Ｂおよび８Ｃは、試験した２４の二本鎖配列（ＨＡＯ１−６５、７５、７７、８０、８３、９６、１１９８、１４８０、１４９０、１４９１、１４９９、１５０１、１１７１、１２７９、１５０４、１５４９、１５５２、１６９６、１３１５、１３１６、１３７５、１３７８、１３７９および１３９３）に対応する４つの改変二本鎖の各々に対するヒトＨＡＯ１ノックダウン有効性データを示す。図８Ｂおよび８Ｃで実証されるように、試験した追加の二本鎖の多くが、試験した高度に改変したパッセンジャー鎖（固定のガイド鎖改変パターンを有する）形態の全てにわたり０．１ｎＭ濃度であっても、強力なＨＡＯ１ノックダウン有効性を有すると実証した。
【０５１４】
８つの二本鎖配列（ＨＡＯ１−ｍ１１６７、ｍ１２７６、ｍ１３１２、ｍ１３１３、ｍ１３７２、ｍ１３７５、ｍ１３７６およびｍ１３９０、これらはヒト二本鎖のＨＡＯ１−１１７１、１２７９、１３１５、１３１６、１３７５、１３７８、１３７９および１３９３にそれぞれ対応する）を、４つの二本鎖改変パターンの同じ範囲にわたり、マウスＨｅｐａ１−６細胞中のノックダウン有効性についても試験した（上記実施例５の二本鎖と対照的に、パッセンジャー鎖改変パターンを変更し、ガイド鎖改変パターンを固定した）。図８Ｄおよび８Ｅに示すように、これらの二本鎖の大部分が、０．０３ｎＭほどの低濃度であっても、二本鎖改変パターンの範囲にわたり、マウス細胞中で強力なＨＡＯ１ノックダウン有効性を示した。
【０５１５】
実施例７：Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏでのグリコール酸オキシダーゼ標的化ＤｓｉＲＮＡの改変形態のさらなる評価
上記２４のＨＡＯ１標的化二本鎖配列（ＨＡＯ１−６５、７５、７７、８０、８３、９６、１１７１、１１９８、１２７９、１３１５、１３１６、１３７５、１３７８、１３７９、１３９３、１４８０、１４９０、１４９１、１４９９、１５０１、１５０４、１５４９、１５５２および１６９６）のパッセンジャー（センス）鎖およびガイド（アンチセンス）鎖の両方のさらなる改変パターンを、図９Ａ〜９Ｄに示すように、２’−Ｏ−メチル改変パターンを有するように調製した。これらの大幅に改変したＤｓｉＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞（ルシフェラーゼレポーター系、すなわちＰｓｉ−Ｃｈｅｃｋ−ＨｓＨＡＯ１プラスミドを使用して；図９Ｅ〜９Ｈ）またはＨＡＯ１で安定にトランスフェクトしたヒトＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３−ｐｃＤＮＡ＿ＨＡＯ１細胞；図９Ｉ〜９Ｌ）のいずれかの環境において、１．０ｎＭおよび０．１ｎＭ（二重アッセイ）濃度でＨＡＯ１阻害についてアッセイした。図９Ｄ〜９Ｌで実証されるように、試験した追加の二本鎖の多くが、試験した広範囲に改変した形態の全てにわたり０．１ｎＭ濃度であっても、強力なＨＡＯ１ノックダウン有効性を有すると同定した。事実、全ての標的配列に関して、両方の鎖上に広範囲な２’−Ｏ−メチル改変を有する１つ以上の二本鎖を、ＨＡＯ１発現の強力な阻害剤であると同定した。さらに、これらの結果は、上記実施例の多くで用いたルシフェラーゼ系（Ｐｓｉ−Ｃｈｅｃｋ−ＨｓＨＡＯ１プラスミド）とＨＥＫ２９３−ｐｃＤＮＡ＿ＨＡＯ１細胞の安定なトランスフェクタント系との間の一致を裏付けた。
【０５１６】
実施例８：グリコール酸オキシダーゼ標的化ＤｓｉＲＮＡの追加の広範囲な改変形態は、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏで活性であった
上記２４のＨＡＯ１標的化二本鎖配列のうち４つ、すなわちＨＡＯ１−１１７１、ＨＡＯ１−１３１５、ＨＡＯ１−１３７８およびＨＡＯ１−１５０１を、図１０Ａ〜１０Ｋに示すように、２’−Ｏ−メチル改変パターン中に広範囲な変化を有するように調製した。これらの大幅に改変したＤｓｉＲＮＡを、安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３−ｐｃＤＮＡ＿ＨＡＯ１細胞；図１０Ｌ〜１０Ｏ）の環境において、１．０ｎＭおよび０．１ｎＭ（二重アッセイ）濃度でＨＡＯ１阻害についてアッセイした。図１０Ｌ〜１０Ｏで実証されるように、ＨＡＯ１−１１７１、ＨＡＯ１−１３１５、およびＨＡＯ１−１５０１二本鎖の改変形態が、試験した広範囲に改変した形態の全てにわたり０．１ｎＭ濃度であっても、強力なＨＡＯ１ノックダウン有効性を有すると同定した。一方で、ＨＡＯ１−１３７８二本鎖配列に関して、高度に改変した形態のいくつかは、他の大幅に改変した形態と比較した場合に（ＨＡＯ１−１３７８二本鎖の、強力に活性した多数の大幅な２’−Ｏ−メチル改変形態を同定したが）、０．１ｎＭで阻害活性の減少を示した。
【０５１７】
ＨＡＯ１−１１７１、ＨＡＯ１−１３１５、ＨＡＯ１−１３７８およびＨＡＯ１−１５０１二本鎖の改変を、図１１Ａ〜１１Ｄに示すように、様々な２’−Ｏ−メチル改変二本鎖のガイド鎖およびパッセンジャー鎖両方の５’末端および３’末端両方の最後のヌクレオチド間結合にホスホロチオエート結合を含むように、拡大した。４つの二本鎖各々の５つの形態を小規模に合成し、対照と共に、１００ｐＭ、１０ｐＭおよび１ｐＭの用量で、安定した細胞株（ＨＡＯ１−６−９）中で試験した。図１１Ｅに示すように、二本鎖の大多数に関して、１００ｐＭで、および１０ｐＭであっても、試験した全ての二本鎖で有意なノックダウンを観察した。試験した２０の形態のうち９つをＩＣ５０用量曲線評価のために選択し、１０分の１単位で減らした１０ｎＭ〜１０ｆＭの範囲の濃度で、結果を図１１Ｆに示す。
【０５１８】
図１２Ａ〜１２Ｄに示すように、ＨＡＯ１−１１７１およびＨＡＯ−１３７６の改変形態を２’−フルオロおよび逆塩基でさらに改変し、追加でおよび／または代わりに「親」改変パターン上に重ねてホスホロチオエート（ＰＳ）改変を配置した。図１２Ｅおよび１２Ｆに示すように、各「親」改変パターンを提示する二本鎖の高活性なさらに改変した（「誘導体改変パターン」）形態を同定し、１０ｐＭ濃度であっても有意な有効性を観察した。
【０５１９】
実施例９：グリコール酸オキシダーゼ標的化ＤｓｉＲＮＡは、Ｉｎ  Ｖｉｖｏで高活性であった
Ｍ１０７／Ｍ４８の２’−Ｏ−メチル改変パターンを有する８つのＨＡＯ１標的化二本鎖配列、すなわちＨＡＯ１−１１０５、ＨＡＯ１−１１７１、ＨＡＯ１−１２２１、ＨＡＯ１−１２７２、ＨＡＯ１−１２７３、ＨＡＯ１−１３１６、ＨＡＯ１−１３７８およびＨＡＯ１−１３７９を、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤（ＥｎＣｏｒｅ  ２３４５）中でｉｎ  ｖｉｖｏ送達のために製剤化した。０．１または１．０ｍｇ／ｋｇでの単回静脈内用量をマウス（ｎ＝５／群）に投与し、処理動物の肝臓を投与後２４時間で採取した。処理マウスの肝臓におけるＨＡＯ１ｍＲＮＡノックダウンの程度を、ｑＰＣＲにより評価した。図１３Ａに示すように、ｉｎ  ｖｉｖｏノックダウン有効性について試験した８つ全てのＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡが、１．０ｍｇ／ｋｇ用量で活性であった。特に、ＨＡＯ１−１１７１−Ｍ１０７／Ｍ４８およびＨＡＯ１−１３７８−Ｍ１０７／Ｍ４８二本鎖が、０．１ｍｇ／ｋｇ用量であっても、処理マウスの肝臓中でＨＡＯ１の強力なノックダウンを示した（それぞれ、およそ７０％およびおよそ５３％のノックダウンレベルを示した）。
【０５２０】
上記のｑＰＣＲ結果を裏付けるため、またグリコール酸オキシダーゼタンパク質ノックダウンを検証するために、ＶｉｅｗＲＮＡアッセイおよび免疫組織化学を、処理マウスの肝臓試料で実施した。図１３Ｂに示すように、ＨＡＯ１−１１７１処理マウスは、ＶｉｅｗＲＮＡ（上パネル）および免疫組織化学の両方で有意なＨＡＯ１ノックダウンを示した。
【０５２１】
次に、ＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡを、ＰＨ１遺伝子組換えモデルマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ治療有効性について試験した。ＡＧＸＴ−／−ＰＨ１モデルマウスにおいて、ＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡを、最初に０．３ｍｇ／ｋｇでマウスに静脈内投与した。３２日目および３９日目に、ＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡの連続的な追加の静脈内注射を０．３ｍｇ／ｋｇで投与し、この投薬レジメンの効果を、シュウ酸塩／クレアチニン比およびグリコール酸塩／クレアチニン比の両方に対する効果について試験した。図１３Ｃに示すように、ＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡの各投与により、処置マウスのシュウ酸塩／クレアチニン比が顕著に減少したが、同じマウスのグリコール酸塩／クレアチニン比は、各ＤｓｉＲＮＡ投与後に上昇した。したがって、製剤化ＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡは、原発性高シュウ酸尿症１型を引き起こす上昇したシュウ酸塩レベルを減少させるのに効果的であった。
【０５２２】
処置マウスのシュウ酸塩／クレアチニン比およびグリコール酸塩／クレアチニン比に対するＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡの効果を証明したので、ついで、ＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡがまた、処理ＰＨ１モデルマウスにおいて尿中グリコール酸オキシダーゼレベルも減少させることができるかを試験した。図１３Ｄに示すように、製剤化ＤｓｉＲＮＡを、１、４、６、１０および１４日目に合計５用量でＡＧＸＴ−／−ＰＨ１モデルマウスに注射した場合、１６日目に採取した肝臓においてグリコール酸オキシダーゼタンパク質レベルの有意な減少を観察した。
【０５２３】
ＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡ投与の上記で観察した効果と一致して、ＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡを用いたＡＧＸＴ−／−ＰＨ１モデルマウスの処理が、エチレングリコールで処置した時のこのようなマウスの腎障害を防止することを観察した。図１３Ｅに示すように、エチレングリコール投与中に３時点でＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡを投与したマウスは、シュウ酸塩／クレアチニン比の上昇から効果的に保護されたが、この上昇はエチレングリコール投与の全体を通してＰＢＳのみを投与した対照マウスでは観察された。最後の投与時点でのＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡの単回用量であっても、野生型レベルに、またはその近傍までシュウ酸塩／クレアチニン比を劇的に低下させることに成功した。したがって、本発明のＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡで腎障害を効果的に防止する、または積極的に処置することができた。
【０５２４】
組織学は、ＡＧＸＴ−／−ＰＨ１マウスモデルにおけるＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡの保護効果を裏付けた。図１３Ｆは、ＡＧＸＴ−／−ＰＨ１モデルマウスに０．７％エチレングリコール食を給餌することにより誘発した腎障害を示す。図１３Ｇおよび１３Ｈに示すように、ＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡ処置は、エチレングリコール投与の全体を通して処置動物の腎臓を効果的に維持したが、レジメンの最終用量のみとしてのＨＡＯ１の注射も腎障害を劇的に減少させた（エチレングリコール投与の全体を通してＨＡＯ１ＤｓｉＲＮＡ処置を受けなかったマウスと比較して）。このような効果が、拡大した断面（図１３Ｇ）で、および腎臓全体のレベル（図１３Ｈ）での両方で観察された。
【０５２５】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＨＡＯ１ｍＲＮＡおよびタンパク質（グリコール酸オキシダーゼ）阻害の動態および持続時間も試験した。図１３Ｉに示すように、ＬＮＰ製剤化ＨＡＯ標的化ＤｓｉＲＮＡを、０．３ｍｇ／ｋｇまたは１．０ｍｇ／ｋｇ投与量のいずれかで０日目にＣ５７ＢＬ／６マウスに注射した場合、ＨＡＯ１ｍＲＮＡレベルの劇的な減少がすぐに観察された（図１３Ｉ、上パネル）。ｉｎ  ｖｉｖｏで短い半減期（急速な回転率）を有するグリコール酸オキシダーゼタンパク質と一致して、ＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡの投与後に観察したＨＡＯ１ｍＲＮＡの劇的な阻害は、投与後の１〜５日間にわたってグリコール酸オキシダーゼタンパク質レベルの劇的な減少をもたらした（図１３Ｉ、下パネル、および図１３Ｊ）。事実、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＨＡＯ１タンパク質の半減期は、３１時間未満であると推定した（図１３Ｊで評価した２セットの動物からのデータに基づいて）。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＨＡＯ１ｍＲＮＡおよびグリコール酸オキシダーゼタンパク質レベルの両方に対するＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡの効果もまた高度に耐久性があり、単回投与後２９日目であっても、ｍＲＮＡレベルは有意に減少し、グリコール酸オキシダーゼはウェスタン分析で検出されなかった。したがって、ＨＡＯ１ＤｓｉＲＮＡは、ＨＡＯ１ｍＲＮＡおよびタンパク質の産生の両方に対する急速かつ高度に耐久的なｉｎ  ｖｉｖｏサイレンシング効果を達成した。
【０５２６】
製剤化ＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡの投与時に観察したサイレンシング効果はまた、低用量レベルで蓄積することを観察した。図１３Ｋに示すように、ＨＡＯ１ｍＲＮＡ阻害は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡに高応答性であることを記録した。ＨＡＯ１タンパク質レベルでの処理マウスのＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡに対する応答性は、ｍＲＮＡレベルで観察した応答性と比較して鈍いと予想したが、タンパク質レベルでの応答性を低用量レベルでも依然として観察し、ＬＮＰ製剤化ＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡをマウスに投与することの強力なｉｎ  ｖｉｖｏ影響力をさらに裏付けた。
【０５２７】
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における、ＬＮＰ製剤化ＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性も評価した。図１３Ｌに示すように、ＬＮＰ製剤化ＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡ（ＨＡＯ１−１１７１）を０．３ｍｇ／ｋｇで投与した非ヒト霊長類において、肝臓でのＨＡＯ１ｍＲＮＡおよびタンパク質の両方の劇的なノックダウンを観察した。上述したマウス実験と一致して、ＬＮＰ製剤化ＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡの阻害有効性は、処理非ヒト霊長類において急速かつ強力であり、持続時間が長いことを観察した。事実、投与後の２９日目に、非ヒト霊長類におけるｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方で、有意な阻害有効性が持続した。
【０５２８】
したがって、ＨＡＯ１ＤｓｉＲＮＡは、マウスおよび非ヒト霊長類の両方で、ＨＡＯ１ｍＲＮＡおよびタンパク質の産生の両方に対する急速かつ高度に耐久的なｉｎ  ｖｉｖｏサイレンシング効果を達成した。
【０５２９】
実施例１０：適応
ＨＡＯ１研究における本知識体系は、ＨＡＯ１活性をアッセイする方法ならびに研究、診断、および治療的使用のためにＨＡＯ１発現を制御できる化合物の必要性を示す。本明細書に記載されるように、本発明の核酸分子をアッセイで使用し、ＨＡＯ１レベルに関連する疾患状態を診断することができる。加えて、核酸分子を使用し、ＨＡＯ１機能性、誤調節、レベルなどに関連する疾患状態を治療することができる。
【０５３０】
ＨＡＯ１発現調節と関連し得る特定の障害および疾患状態としては、原発性高シュウ酸尿症１型（ＰＨ１）であって、臓器、例えば腎臓、目、皮膚、肝臓などにおけるこのような疾患の表現型を含むものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５３１】
他の治療薬剤を、本発明の核酸分子（例えば、ＤｓｉＲＮＡ分子）と組み合わせて、またはそれらと併用して使用することができる。当業者は、本明細書に記載される疾患および状態を治療するために使用される他の化合物および療法を、本発明の核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ分子、例えば２−ヒドロキシ酸オキシダーゼ活性を有する他の酵素を対象とするものなど）と組み合わせることができ、それゆえ、これらは本発明の範囲内であると理解するだろう。例えば、併用療法に関して、本発明の核酸を少なくとも２つの方法のうち１つで調製することができる。第１に、薬剤を、核酸および他の薬剤の調製において物理的に混合させ（例えば、静脈内投与用に、リポソーム内にカプセル化された本発明の核酸と他の薬剤との溶液中での混合物など）、ここで両方の薬剤は、治療上有効な濃度で存在する（例えば、溶液中の他の薬剤を１０００〜１２５０ｍｇ／ｍ２／日で送達し、同じ溶液中の本発明のリポソーム付随核酸を０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日で送達する）。あるいは、薬剤を、別々ではあるが同時にまたは順次それら各々の有効量（例えば、１０００〜１２５０ｍｇ／ｍ２／日での他の薬剤および０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日での本発明の核酸）で投与する。
【０５３２】
実施例１１：ＤｓｉＲＮＡの血清安定性
ＤｓｉＲＮＡ剤の血清安定性を、３７℃での様々な時間（最大で２４時間）の５０％ウシ胎児血清中におけるＤｓｉＲＮＡ剤のインキュベーションにより評価する。血清を抽出し、核酸を２０％非変性ＰＡＧＥ上で分離して、Ｇｅｌｓｔａｒ染色で視覚化できる。ヌクレアーゼ分解からの保護の相対レベルを、ＤｓｉＲＮＡ（任意に改変し、および改変することなく）について評価する。
【０５３３】
実施例１２：診断的使用
本発明のＤｓｉＲＮＡ分子を、多様な診断用途、例えば多様な用途における、例えば臨床、工業、環境、農業および／または研究設定における分子標的（例えば、ＲＮＡ）の同定などで使用することができる。このようなＤｓｉＲＮＡ分子の診断的使用は、例えば、細胞溶解物または部分的に精製した細胞溶解物を使用する再構成ＲＮＡｉ系を利用することを含む。本発明のＤｓｉＲＮＡ分子は、異常細胞内の遺伝的浮動および変異を試験するための診断ツールとして使用することができる。ＤｓｉＲＮＡ活性と標的ＨＡＯ１ＲＮＡの構造との間の密接な関係によって、標的ＨＡＯ１ＲＮＡの塩基対形成および３次元構造を変化させる、ＨＡＯ１分子領域内での変異の検出が可能となる。本発明に記載される複数のＤｓｉＲＮＡ分子を使用することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの、加えて細胞および組織中のＲＮＡ構造および機能に重要なヌクレオチド変化をマッピングすることができる。ＤｓｉＲＮＡ分子による標的ＨＡＯ１ＲＮＡの開裂を使用して、遺伝子発現を阻害し、ＨＡＯ１関連疾患または障害の進行における特定の遺伝子産物の役割を定義することができる。このようにして、他の遺伝子標的を疾患の重要なメディエーターとして定義することができる。これらの実験は、併用療法（例えば、異なる遺伝子を標的とする複数のＤｓｉＲＮＡ分子、既知の小分子阻害剤と一体になったＤｓｉＲＮＡ分子、またはＤｓｉＲＮＡ分子および／もしくは他の化学分子もしくは生体分子の組み合わせによる間欠的治療）の可能性を提供することにより、疾患進行の良好な治療をもたらすだろう。本発明のＤｓｉＲＮＡ分子の他のｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用は本技術分野において周知であり、疾患または関連状態に関連するＲＮＡの存在の検出を含む。このようなＲＮＡを、標準的手法、例えば蛍光共鳴発光移動（ＦＲＥＴ）を使用して、ＤｓｉＲＮＡによる処理後の開裂産物の存在を決定することにより検出する。
【０５３４】
特定の実施例では、標的ＨＡＯ１ＲＮＡの野生型または変異体もしくは多形形態のみを切断するＤｓｉＲＮＡ分子をアッセイに使用する。第１のＤｓｉＲＮＡ分子（すなわち、標的ＨＡＯ１ＲＮＡの野生型形態のみを切断するもの）を使用して、試料中に存在する野生型ＨＡＯ１ＲＮＡを同定し、第２のＤｓｉＲＮＡ分子（すなわち、標的ＲＮＡの変異体または多形形態のみを切断するもの）を使用して、試料中の変異体または多形ＨＡＯ１ＲＮＡを同定する。反応対照として、野生型および変異体または多形ＨＡＯ１ＲＮＡの両方の合成基質を、両方のＤｓｉＲＮＡ分子によって切断し、反応における相対ＤｓｉＲＮＡ効率、および「非標的」ＨＡＯ１ＲＮＡ種の開裂が存在しないことを実証する。合成基質からの開裂産物はまた、試料集団中の野生型および変異体ＨＡＯ１ＲＮＡの分析用のサイズマーカーを作製するのに役立つ。したがって、各分析には２つのＤｓｉＲＮＡ分子、２つの基質および１つの未知試料が必要であり、これを組み合わせて６つの反応物にする。各ＨＡＯ１ＲＮＡの全長および開裂断片をポリアクリルアミドゲルの１レーンで分析できるように、開裂産物の存在を、ＲＮａｓｅ保護アッセイを使用して決定する。標的細胞における変異体または多形ＨＡＯ１ＲＮＡの発現、およびＨＡＯ１関連表現型変化の推定リスクを洞察するために、結果を定量化することが絶対に必要という訳ではない。タンパク質産物が表現型（すなわち、疾患に関係／関連する）の発生に関与しているＨＡＯ１ｍＲＮＡの発現は、リスクを立証するのに適切である。同等の比活性のプローブを両方の転写産物に使用する場合には、ＨＡＯ１ＲＮＡレベルの定性的比較が適切であり、初期診断のコストを削減する。ＨＡＯ１ＲＮＡレベルを定性的または定量的に比較しても、変異体または多形形態対野生型の比がより高いほど、より高いリスクと相関する。
【０５３５】
本明細書で言及された全ての特許および公開公報は、本発明が属する技術分野の当業者のレベルの指標である。本明細書で引用した全ての参考文献は、各参考文献が、個々に全体にわたり援用されたものと同様の程度まで、参考文献により援用される。
【０５３６】
当業者は、本発明が目的を実行し、かつ、言及した結果および利点ならびにその中の固有のものを得るために適合されていることを容易に認識するものである。好ましい実施形態の代表例として本明細書に記載の方法および組成物は例示的なものであり、本発明の範囲を限定よう意図するものではないい。上記方法および組成物の変化および他の利用が当業者に対して起こるものであり、これらは本発明の趣旨の範囲内に含まれ、かつ特許請求の範囲により定義される。
【０５３７】
種々の置換および改変が、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく本明細書で開示された本発明に対して実施可能であることが、当業者に簡単に理解されるであろう。したがって、このような追加的な実施形態は、本発明および以下の特許請求の範囲内である。本発明は、ＲＮＡｉ活性を媒介するために、改善された活性をもつ核酸構築物を産出することを目的とする、本明細書で記述した化学的改変の種々の組み合わせおよび／または置換を試験することを当業者に教示する。このような改善された活性は、改善された安定性、改善されたバイオアベイラビリティ、および／またはＲＮＡｉを媒介する細胞応答の改善された活性を含み得る。したがって、本明細書で記述したある特定の実施形態は、限定ではなく、かつ本明細書で記述した改変の特定の組み合わせが改善されたＲＮＡｉ活性を持つＤｓｉＲＮＡ分子を同定するために、過度に実験を行うことなく試験できることを当業者は容易に理解するものである。
【０５３８】
本明細書で例示的に記述された発明は、本明細書で特に開示されていない、任意の要素または要素類、制限または制限類なしに好適に実施可能である。したがって、例えば、本明細書中の各例において、任意の語句「含む」、「から本質的になる」および「からなる」は、他の２つの語句いずれかと置き換えても良い。使用された語句および表現は、記述のために使用される語句であり、限定を意味するものではなく、かつ、示し、記述した特徴の任意の等価物またはそれらの一部を除外するこのような語句および表現の利用において意図しておらず、種々の改変が、請求された本発明の目的の範囲内である可能性が認識される。したがって、本発明が、好ましい実施形態によって特に開示されているが、本明細書で開示された概念の任意の特徴、改変およびバリエーションが、当業者によって変更されてもよく、このような改変およびバリエーションが、記述ならびに付随する特許請求の範囲によって定義されたように、本発明の範囲内であると考慮されることが理解されるべきである。
【０５３９】
さらに、本発明の特徴または態様が、Ｍａｒｋｕｓｈグループまたは他の代替グルーピングの観点で記述される場合、当業者は、それにより本発明がＭａｒｋｕｓｈグループまたは他のグループの任意の個々のメンバー、またはメンバーのサブグループに関して記述もされることを理解するものである。
【０５４０】
本発明を記述する文脈中（特に以下の特許請求の範囲の文脈中）語句「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびに同様の指示対象の使用は、本明細書で他の指摘がある、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数および複数両方をカバーすると理解されるべきである。語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「持つ（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、他に言及しない限り、無制限語句として構築されるべきである（すなわち、「含むが、限定されない」と意味する）。本明細書の値の範囲の記載は、本明細書で他の指摘がない限り、その範囲内にあるそれぞれ別々の値を個々に指す単なる省略表現方法を意図するものであり、それぞれ別々の値は、本明細書で個々に記載されるものとして、本明細書内に組み込まれる。本明細書で記述された全ての方法を、本明細書中他の指摘がない限り、または文脈において明確に他に矛盾しない限り、好適な順番で実施できる。本明細書で定義される任意かつ全ての例、または例示的言語（「例えば「のような」）の利用は、単に本発明をよりよく例示することを意図するものであり、他に請求しない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。明細書中言及がないものは、本発明の実施に必須であるような、任意の非請求要素を表すとして構成されるべきである。
【０５４１】
本発明の実施形態が本明細書で記述されており、本発明を実行するために本発明者等に公知の最適な様式が含まれる。これらの実施形態のバリエーションが、上記の記述を読むことにより当業者に明確になり得る。
【０５４２】
本発明者らは、当業者が、適切にこのようなバリエーションを利用することを予測しており、本発明に関して、本明細書で特に記述したもの以外で実施されるべきと意図している。したがって、本発明は、適用可能な法律によって許可されるように、本明細書に付随する特許請求の範囲にて記載される対象の全ての改変および等価物を含む。さらに、全ての可能性あるそれらのバリエーションにおける上記要素の任意の組み合わせが、本発明で他に指摘されない限り、または文脈によって明確に矛盾しない限り、本発明に含まれる。当業者は、単なる通常の実験を使用して、本明細書で記述される本発明のある特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または究明することが出来る。このような等価物は、以下の特許請求の範囲に含まれると意図される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図９Ｊ】
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【図９Ｋ】
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【図９Ｌ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１０Ｉ】
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【図１０Ｊ】
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【図１０Ｋ】
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【図１０Ｌ】
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【図１０Ｍ】
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【図１０Ｎ】
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【図１０Ｏ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
2020036603.tif 001278
【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
2020036603.tif 001280
【図１３Ｅ】
2020036603.tif 001281
【図１３Ｆ】
2020036603.tif 001282
【図１３Ｇ】
2020036603.tif 001283
【図１３Ｈ】
2020036603.tif 001284
【図１３Ｉ】
2020036603.tif 001285
【図１３Ｊ】
2020036603.tif 001286
【図１３Ｋ】
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【図１３Ｌ】
2020036603.tif 001288
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月8日(2019.12.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖核酸を含む、原発性高シュウ酸尿症１型（ＰＨ１）を有する対象の治療のための薬剤であって、
前記二本鎖核酸が、二本鎖領域を形成する第１のオリゴヌクレオチド鎖および第２のオリゴヌクレオチド鎖を含み、
前記二本鎖核酸の有効量が前記対象に投与される際にＨＡＯ１標的ｍＲＮＡの発現を低減するように、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖が前記オリゴヌクレオチド鎖の長さの少なくとも１５ヌクレオチドに沿って標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列に十分に相補的である、薬剤。
【請求項２】
前記薬剤の前記対象への投与が、前記対象におけるシュウ酸塩蓄積を阻害する、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記薬剤の前記対象への投与が、前記対象の尿におけるグリコール酸塩／クレアチニン比を増加させ、および前記対象の尿におけるシュウ酸塩／クレアチニン比を減少させる、請求項１に記載の薬剤。
【請求項４】
前記薬剤の前記対象への投与が、前記対象の腎臓におけるカルシウム沈着の蓄積を阻害する、請求項１に記載の薬剤。
【請求項５】
前記薬剤の前記対象への投与が、皮下に適用される、請求項１に記載の薬剤。
【請求項６】
前記薬剤の前記対象への投与が、前記対象におけるＨＡＯ１ｍＲＮＡレベルを少なくとも５０％減少させる、請求項１に記載の薬剤。
【請求項７】
前記薬剤の前記対象への投与が、前記対象におけるＨＡＯ１ｍＲＮＡレベルを少なくとも８０〜９０％減少させる、請求項１に記載の薬剤。
【請求項８】
前記対象がヒト患者である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項９】
前記対象が小児のヒト患者である、請求項８に記載の薬剤。
【請求項１０】
前記対象が、シュウ酸塩の蓄積を引き起こすＡＧＴ１変異を有している、請求項１に記載の薬剤。
【請求項１１】
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖および／または前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の１つまたは複数のヌクレオチドに１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ部分が付着した、請求項１に記載の薬剤。
【請求項１２】
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端ヌクレオチドに、１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ部分が付着した、請求項１に記載の薬剤。
【請求項１３】
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖が１５〜６６ヌクレオチドの長さであり、
前記第２のオリゴヌクレオチド鎖が１９〜６６ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載の薬剤。
【請求項１４】
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖が２１ヌクレオチドの長さであり、
前記第２のオリゴヌクレオチド鎖が２３ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載の薬剤。
【請求項１５】
前記第２のオリゴヌクレオチド鎖が２ヌクレオチドの長さの３’オーバーハングを形成する、請求項１４に記載の薬剤。
【請求項１６】
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖および／または前記第２のオリゴヌクレオチド鎖が、１つまたは複数の改変ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の薬剤。
【請求項１７】
前記１つまたは複数の改変ヌクレオチドのそれぞれが、独立して２’−Ｏ−メチル改変ヌクレオチドまたは２’−フルオロ改変ヌクレオチドである、請求項１６に記載の薬剤。
【請求項１８】
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖が、第２のオリゴヌクレオチド鎖とともに形成された二本鎖領域を超えて伸長した３’領域を含み、
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖がテトラループを含む、請求項１７に記載の薬剤。
【請求項１９】
二本鎖核酸を含む、原発性高シュウ酸尿症１型（ＰＨ１）を有する対象における腎障害の減少または予防のための薬剤であって、
前記二本鎖核酸が、二本鎖領域を形成する第１のオリゴヌクレオチド鎖および第２のオリゴヌクレオチド鎖を含み、
前記二本鎖核酸の有効量が前記対象に投与される際に干渉によってＨＡＯ１標的ｍＲＮＡの発現を低減するように、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖が前記オリゴヌクレオチド鎖の長さの少なくとも１５ヌクレオチドに沿って標的ＨＡＯ１ｍＲＮＡ配列に十分に相補的であり、
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖および／または前記第２のオリゴヌクレオチド鎖が、２’−Ｏ−メチル改変ヌクレオチドおよび２’−フルオロ改変ヌクレオチドから独立して選択される１つまたは複数の改変ヌクレオチドを含み、
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖および／または前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の１つまたは複数のヌクレオチドに１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ部分が付着した、薬剤。
【請求項２０】
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖が２１ヌクレオチドの長さであり、
前記第２のオリゴヌクレオチド鎖が２３ヌクレオチドの長さであり、
前記第２のオリゴヌクレオチド鎖が２ヌクレオチドの長さの３’オーバーハングを形成する、請求項１９に記載の薬剤。