(57)【要約】【課題】酸性環境下で活性が高く、中性付近で活性が低いβ−ラクタマーゼを提供する。【解決手段】ｐＨ５．５〜６．５のいずれかにおけるβ−ラクタマーゼ活性がｐＨ７．０におけるβ−ラクタマーゼ活性よりも１．４倍以上高い、β−ラクタマーゼ変異体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ５．５〜６．５のいずれかにおけるβ−ラクタマーゼ活性がｐＨ７．０におけるβ−ラクタマーゼ活性よりも１．４倍以上高い、β−ラクタマーゼ変異体。
【請求項２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列において、第１５８番目のスレオニンに相当するアミノ酸が、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、アスパラギン、グルタミン又はチロシンに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
配列番号１に記載のアミノ酸配列において、第１６０番目のロイシンに相当するアミノ酸がグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
配列番号１に記載のアミノ酸配列において、第１５８番目のスレオニンに相当するアミノ酸が、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、アスパラギン、グルタミン又はチロシンに置換され、第１５８番目に相当するアミノ酸を除く１又は複数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ５．５〜６．５のいずれかにおけるβ−ラクタマーゼ活性がｐＨ７．０におけるβ−ラクタマーゼ活性よりも１．４倍以上高いタンパク質、又は
配列番号１に記載のアミノ酸配列において、第１６０番目のロイシンに相当するアミノ酸がグルタミン酸に置換され、第１６０番目に相当するアミノ酸を除く１又は複数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ５．５〜６．５のいずれかにおけるβ−ラクタマーゼ活性がｐＨ７．０におけるβ−ラクタマーゼ活性よりも１．４倍以上高いタンパク質である、請求項１に記載のβ−ラクタマーゼ変異体。
【請求項３】
配列番号１に記載のアミノ酸配列において、第７７番目のアラニンに相当するアミノ酸のバリンへの置換、第８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸のリジンへの置換、第４７番目のロイシンに相当するアミノ酸のバリンへの置換、第１４９番目のフェニルアラニンに相当するアミノ酸のチロシンへの置換、第１５１番目のヒスチジンに相当するアミノ酸のチロシンへの置換、第２２５番目のアラニンに相当するアミノ酸のバリンへの置換、第２６５番目のグルタミンに相当するアミノ酸のヒスチジンへの置換、第２７４番目のグルタミンに相当するアミノ酸のグルタミン酸への置換からなる群より選択される１又は複数個のアミノ酸置換を更に含む、請求項１又は２に記載のβ−ラクタマーゼ変異体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のβ−ラクタマーゼ変異体と、β−ラクタム環が結合した抗癌剤とを含む、癌治療用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−ラクタマーゼ変異体に関する。本発明は、より詳細には、β−ラクタマーゼ変異体及び癌治療用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
β−ラクタマーゼは、β−ラクタム系抗生物質を加水分解する酵素である。近年、β−ラクタマーゼをプロドラッグ療法に適用する検討が行われている。例えば、非特許文献１には、β−ラクタマーゼを結合した癌抗原特異的抗体により、β−ラクタム環が結合した無毒性のプロドラッグを毒性のある抗癌剤に変換し、癌細胞の成長を阻害したことが報告されている。
【０００３】
このようなプロドラッグ療法において、β−ラクタマーゼによるプロドラッグの変換は、血液中や正常組織中では生じないことが求められる。また、β−ラクタマーゼを結合した癌抗原特異的抗体は、癌組織以外の領域ではすばやく除去される必要がある。しかしながら、従来、これらの要求を十分に満たすことは困難であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】D. L. Meyer, et al., Site-specific Prodrug Activation by Antibody-β-Lactamase Conjugates: Regression and Long-Term Growth Inhibition of Human Colon Carcinoma Xenograft Models, CANCERRESEARCH 53, 3956-3963, 1993.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
血液中や正常組織のｐＨは中性付近であり、癌組織の細胞外環境はｐＨ６．０程度の酸性であることが知られている。発明者らは、酸性環境下で活性が高く、中性付近で活性が低いβ−ラクタマーゼを作出することができれば、このｐＨ依存性により、血液中や正常組織中ではβ−ラクタマーゼの作用を抑制することができ、β−ラクタマーゼを利用したプロドラッグ療法の安全性を高めることができると着想した。
【０００６】
従来、数多くのβ−ラクタマーゼ変異体が報告されているものの、酸性環境下で活性が高く、中性付近で活性が低いβ−ラクタマーゼは知られていない。そこで、本発明は、酸性環境下で活性が高く、中性付近で活性が低いβ−ラクタマーゼを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の態様を含む。
［１］ｐＨ５．５〜６．５のいずれかにおけるβ−ラクタマーゼ活性がｐＨ７．０におけるβ−ラクタマーゼ活性よりも１．４倍以上高い、β−ラクタマーゼ変異体。
［２］配列番号１に記載のアミノ酸配列において、第１５８番目のスレオニンに相当するアミノ酸が、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、アスパラギン、グルタミン又はチロシンに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
配列番号１に記載のアミノ酸配列において、第１６０番目のロイシンに相当するアミノ酸がグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
配列番号１に記載のアミノ酸配列において、第１５８番目のスレオニンに相当するアミノ酸が、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、アスパラギン、グルタミン又はチロシンに置換され、第１５８番目に相当するアミノ酸を除く１又は複数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ５．５〜６．５のいずれかにおけるβ−ラクタマーゼ活性がｐＨ７．０におけるβ−ラクタマーゼ活性よりも１．４倍以上高いタンパク質、又は
配列番号１に記載のアミノ酸配列において、第１６０番目のロイシンに相当するアミノ酸がグルタミン酸に置換され、第１６０番目に相当するアミノ酸を除く１又は複数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ５．５〜６．５のいずれかにおけるβ−ラクタマーゼ活性がｐＨ７．０におけるβ−ラクタマーゼ活性よりも１．４倍以上高いタンパク質である、［１］に記載のβ−ラクタマーゼ変異体。
［３］配列番号１に記載のアミノ酸配列において、第７７番目のアラニンに相当するアミノ酸のバリンへの置換、第８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸のリジンへの置換、第４７番目のロイシンに相当するアミノ酸のバリンへの置換、第１４９番目のフェニルアラニンに相当するアミノ酸のチロシンへの置換、第１５１番目のヒスチジンに相当するアミノ酸のチロシンへの置換、第２２５番目のアラニンに相当するアミノ酸のバリンへの置換、第２６５番目のグルタミンに相当するアミノ酸のヒスチジンへの置換、第２７４番目のグルタミンに相当するアミノ酸のグルタミン酸への置換からなる群より選択される１又は複数個のアミノ酸置換を更に含む、［１］又は［２］に記載のβ−ラクタマーゼ変異体。
［４］［１］〜［３］のいずれかに記載のβ−ラクタマーゼ変異体と、β−ラクタム環が結合した抗癌剤とを含む、癌治療用キット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、酸性環境下で活性が高く、中性付近で活性が低いβ−ラクタマーゼを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】（ａ）及び（ｂ）は、実験例１におけるインビボアッセイの代表的な結果を示す写真である。
【図２】（ａ）及び（ｂ）は、実験例２におけるインビトロアッセイの結果を示すグラフである。
【図３】（ａ）〜（ｆ）は、実験例３におけるインビトロアッセイの結果を示すグラフである。
【図４】（ａ）〜（ｆ）は、実験例３におけるインビトロアッセイの結果を示すグラフである。
【図５】（ａ）〜（ｆ）は、実験例３におけるインビトロアッセイの結果を示すグラフである。
【図６】実験例４におけるインビトロアッセイの結果を示すグラフである。
【図７】実験例４におけるインビボアッセイの代表的な結果を示す写真である。
【図８】（ａ）〜（ｉ）は、実験例６におけるインビトロアッセイの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［β−ラクタマーゼ変異体］
１実施形態において、本発明は、ｐＨ５．５〜６．５のいずれかにおけるβ−ラクタマーゼ活性がｐＨ７．０におけるβ−ラクタマーゼ活性よりも１．４倍以上高い、β−ラクタマーゼ変異体を提供する。
【００１１】
実施例において後述するように、発明者らは、酸性環境下で活性が高く、中性付近で活性が低いβ−ラクタマーゼを提供することができる、β−ラクタマーゼ変異体を作出することに成功した。本実施形態のβ−ラクタマーゼ変異体によれば、血液中や正常組織中ではβ−ラクタマーゼの作用を抑制することができるため、例えば、β−ラクタマーゼを利用した癌のプロドラッグ療法の安全性を高めることができる。
【００１２】
本実施形態のβ−ラクタマーゼ変異体は、野生型のβ−ラクタマーゼに対してアミノ酸変異を有している。ここで、野生型のβ−ラクタマーゼとしては、例えば、大腸菌由来のＴＥＭ−１遺伝子（ＮＣＢＩ  アクセッション番号：ＮＣ＿００５３２７）にコードされるβ−ラクタマーゼが挙げられる。配列番号１に、野生型のＴＥＭ−１タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００１３】
実施例において後述するように、具体的なβ−ラクタマーゼ変異体としては、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、第１５８番目のスレオニンに相当するアミノ酸が、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、アスパラギン、グルタミン又はチロシンに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。あるいは、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、第１６０番目のロイシンに相当するアミノ酸がグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
【００１４】
以下、第１５８番目のスレオニンに相当するアミノ酸がイソロイシンに置換されたＴＥＭ−１タンパク質を、「ＴＥＭ−１（Ｔ１５８Ｉ）変異体タンパク質」という場合がある。同様に、第１５８番目のスレオニンに相当するアミノ酸がアスパラギン酸に置換されたＴＥＭ−１タンパク質を、「ＴＥＭ−１（Ｔ１５８Ｄ）変異体タンパク質」という場合がある。同様に、第１６０番目のロイシンに相当するアミノ酸がグルタミン酸に置換されたＴＥＭ−１タンパク質を、「ＴＥＭ−１（Ｌ１６０Ｅ）変異体タンパク質」という場合がある。以下、他の変異体についても同様である。
【００１５】
野生型のβ−ラクタマーゼは大腸菌由来のＴＥＭ−１タンパク質に限られない。本実施形態のβ−ラクタマーゼ変異体において、「配列番号１に記載のアミノ酸配列において、第１５８番目のスレオニンに相当するアミノ酸」とは、野生型のＴＥＭ−１タンパク質の第１５８番目のスレオニンと、その機能の発揮に同等の貢献をしているアミノ酸を意味する。
【００１６】
例えば、基準のアミノ酸配列、すなわち、配列番号１のアミノ酸配列と、比較対象のβ−ラクタマーゼのアミノ酸配列を、一次構造（アミノ酸配列）の部分的な相同性を考慮しつつ、最適な比較ができるように並べた場合に（ここで、必要に応じてギャップを導入し、アライメントを最適化してもよい。）、基準のアミノ酸配列中の特定のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸を「相当するアミノ酸」として特定することができる。
【００１７】
また、一次構造同士の比較に代えて、又はこれに加えて、立体構造（三次元構造）同士の比較によって「相当するアミノ酸」を特定することもできる。立体構造情報を利用することによって信頼性の高い比較結果が得られる。この場合は、複数のタンパク質の立体構造の原子座標を比較しながらアライメントを行っていく手法を採用できる。タンパク質の立体構造情報は例えばＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  Ｊａｐａｎ（https://pdbj.org/）より取得することができる。
【００１８】
また、上述した、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、第１５８番目のスレオニンに相当するアミノ酸が、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、アスパラギン、グルタミン又はチロシンに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であるβ−ラクタマーゼ変異体、及び、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、第１６０番目のロイシンに相当するアミノ酸がグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であるβ−ラクタマーゼ変異体は、ｐＨ５．５〜６．５のいずれかにおけるβ−ラクタマーゼ活性がｐＨ７．０におけるβ−ラクタマーゼ活性よりも１．４倍以上高いタンパク質である限り、更に変異を有していてもよい。
【００１９】
例えば、本実施形態のβ−ラクタマーゼ変異体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、第１５８番目のスレオニンに相当するアミノ酸が、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、アスパラギン、グルタミン又はチロシンに置換され、第１５８番目に相当するアミノ酸を除く１又は複数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ５．５〜６．５のいずれかにおけるβ−ラクタマーゼ活性がｐＨ７．０におけるβ−ラクタマーゼ活性よりも１．４倍以上高いタンパク質であってもよい。
【００２０】
あるいは、本実施形態のβ−ラクタマーゼ変異体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、第１６０番目のロイシンに相当するアミノ酸がグルタミン酸に置換され、第１６０番目に相当するアミノ酸を除く１又は複数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ５．５〜６．５のいずれかにおけるβ−ラクタマーゼ活性がｐＨ７．０におけるβ−ラクタマーゼ活性よりも１．４倍以上高いタンパク質であってもよい。
【００２１】
ここで、１又は複数個とは、例えば１〜２０個であってもよく、例えば１〜１５個であってもよく、例えば１〜１０個であってもよく、例えば１〜８個であってもよく、例えば１〜５個であってもよく、例えば１〜３個であってもよい。
【００２２】
実施例において後述するように、本実施形態のβ−ラクタマーゼ変異体は、ｐＨ５．５〜６．５のいずれかにおけるβ−ラクタマーゼ活性がｐＨ７．０におけるβ−ラクタマーゼ活性よりも１．４倍以上高いタンパク質である限り、上述したアミノ酸変異に加えて、更なるアミノ酸置換を含んでいてもよい。
【００２３】
具体的には、本実施形態のβ−ラクタマーゼ変異体は、上述したアミノ酸変異に加えて、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、第７７番目のアラニンに相当するアミノ酸のバリンへの置換、第８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸のリジンへの置換、第４７番目のロイシンに相当するアミノ酸のバリンへの置換、第１４９番目のフェニルアラニンに相当するアミノ酸のチロシンへの置換、第１５１番目のヒスチジンに相当するアミノ酸のチロシンへの置換、第２２５番目のアラニンに相当するアミノ酸のバリンへの置換、第２６５番目のグルタミンに相当するアミノ酸のヒスチジンへの置換、第２７４番目のグルタミンに相当するアミノ酸のグルタミン酸への置換からなる群より選択される１又は複数個のアミノ酸置換を更に含んでいてもよい。
【００２４】
［癌治療用キット］
１実施形態において、本発明は、上述したβ−ラクタマーゼ変異体と、β−ラクタム環が結合した抗癌剤とを含む、癌治療用キットを提供する。
【００２５】
本実施形態の癌治療用キットは、β−ラクタム環が結合した無毒性のプロドラッグを毒性のある抗癌剤に変換し、癌細胞の成長を特異的に阻害するプロドラッグ療法に好適である。本実施形態の癌治療用キットによれば、ｐＨが中性である血液中や正常組織中では、β−ラクタマーゼの作用を抑制することができるため、β−ラクタマーゼを利用したプロドラッグ療法の安全性を高めることができる。
【００２６】
本実施形態の癌治療用キットにおいて、β−ラクタマーゼ変異体は癌抗原特異的結合物質に結合されていてもよい。ここで、特異的結合物質としては、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。
【００２７】
β−ラクタマーゼ変異体に癌抗原特異的結合物質が結合することにより、β−ラクタマーゼ変異体を癌細胞特異的に送達することが可能となる。また、β−ラクタマーゼ変異体に癌抗原特異的結合物質が結合することにより、生体に投与した場合の抗原性を低減することができる。
【００２８】
β−ラクタマーゼ変異体には、生体適合性ポリマーが結合していてもよい。生体適合性ポリマーが結合することにより、生体に投与した場合の抗原性を低減することができ、また、体内動態を調節することができる。生体適合性ポリマーとしては、例えば、ポリエチレングリコール等のポリエーテル、ポリアミノ酸、多糖類等が挙げられる。
【００２９】
β−ラクタム環が結合した抗癌剤としては、β−ラクタム環が結合することにより無毒性化されたプロドラッグが挙げられる。このようなプロドラッグにβ−ラクタマーゼを作用させてβ−ラクタム環を開裂させることにより、毒性のある抗癌剤に変換することができる。
【００３０】
β−ラクタム環が結合した具体的な抗癌剤としては、例えば、下記化学式（１）に示す、ビンブラスチン誘導体であるＤＡＶＬＢＨＹＤとセファロスポリンとの結合体（ＬＹ２６６０７０（ＣＡＳ番号：１３７８４８−３６−３）、例えば、上記非特許文献１を参照）、下記化学式（２）に示す、ドキソルビシンとセファロスポリンとの結合体（ＬＹ３００６６３、例えば、D. L. Meyer et al., Site-specific Prodrug Activation by Antibody-β-Lactamase Conjugates: Preclinical Investigation of the Efficacy and Toxicity of Doxorubicin Delivered by Antibody Directed Catalysis, Bioconjugate Chemistry 6, 440-446, 1995. を参照。）、下記化学式（３）〜（７）に示す、ナイトロジェンマスタードとセファロスポリンとの結合体（例えば、R. P. Alexander et al., CEPHALOSPORIN NITROGEN MUSTARD CARBAMATE PRODRUGS FOR "ADEPT", Tetrahedron Letters 32, 3269-3272, 1991. を参照。）、下記化学式（８）に示す、メルファランとセファロスポリンとの結合体（例えば、D. E. Kerr et al., Development and Activities of a New Melphalan Prodrug Designed for Tumor-Selective Activation, Bioconjugate Chemistry 9, 255-259, 1998. を参照。）、下記化学式（９）に示す、タキソールとセファロスポリンとの結合体（例えば、M. L. Rodrigues et al., Synthesis and beta-lactamase-mediated activation of a cephalosporin-taxol prodrug, Chemistry & Biology 2, 223-227, 1995. を参照。）、下記化学式（１０）に示す、マイトマイシンＣとセファロスポリンとの結合体（例えば、V. M. Vrudhula et al., Immunologically Specific Activation of a Cephalosporin Derivative of Mitomycin C by Monoclonal Actibody beta-Lactamase Conjugates, Journal of Medicinal Chemistry 40, 2788-2792, 1997. を参照。）等が挙げられる。
【００３１】
【化１】
2020036543.tif 000002
【００３２】
【化２】
2020036543.tif 000003
【００３３】
【化３】
2020036543.tif 000004
【００３４】
【化４】
2020036543.tif 000005
【００３５】
【化５】
2020036543.tif 000006
【００３６】
【化６】
2020036543.tif 000007
【００３７】
【化７】
2020036543.tif 000008
【００３８】
【化８】
2020036543.tif 000009
【００３９】
【化９】
2020036543.tif 000010
【００４０】
【化１０】
2020036543.tif 000011
【実施例】
【００４１】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４２】
［材料及び方法］
（ＴＥＭ−１変異体の作製及びプラスミド）
β−ラクタマーゼ遺伝子として、大腸菌由来のＴＥＭ−１遺伝子（ＮＣＢＩ  アクセッション番号：ＮＣ＿００５３２７）を使用した。ＴＥＭ−１タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に示し、ＴＥＭ−１遺伝子の塩基配列を配列番号２に示す。ＴＥＭ−１遺伝子へのランダム変異の導入は、市販のキット（名称「ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＩＩ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ」、アジレントテクノロジーズ）を用いて行った。変異を導入したＴＥＭ−１遺伝子を、大腸菌（名称「ＭｅｇａＸ  ＤＨ１０Ｂ  Ｔ１」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に導入して変異体ライブラリを作製した。部位特異的変異導入は、市販のキット（名称「ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ」、タカラバイオ社）を用いて行った。
【００４３】
ＴＥＭ−１遺伝子は、ｐＥＴ２６ｂ（＋）ベクター（ノバジェン社）を改変して得られた、カナマイシン耐性遺伝子の代わりにクロラムフェニコール耐性遺伝子を有する発現ベクターを用いて、Ｔ７プロモーターの制御下で発現させた。この発現ベクターを、β−ラクタマーゼ変異体のスクリーニング及びβ−ラクタマーゼ変異体の調製に使用した。発現したＴＥＭ−１タンパク質は、２３アミノ酸からなるシグナルペプチドを有しており、Ｃ末端に７アミノ酸からなるリンカー（ＧＳＳＳＧＳＳ、配列番号３）、ＴＥＶプロテアーゼ認識配列、６×ヒスチジンタグをこの順に有していた。
【００４４】
（ＴＥＭ−１遺伝子変異体ライブラリのスクリーニング）
ＴＥＭ−１遺伝子変異体ライブラリを、ｐＣＤＦ−ＩＹＮ３プラスミドを有する大腸菌Ｂ−９５．ΔＡ株に導入した。ｐＣＤＦ−ＩＹＮ３プラスミドはカナマイシン耐性遺伝子を発現可能に保持する。
【００４５】
ｐＨ５．８の増殖培地は、ＬＢブロス、終濃度０．１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、終濃度１ｍＭの３−ニトロ−Ｌ−チロシン（渡辺化学工業）、終濃度１００μｇ／ｍＬのカルベニシリン、終濃度３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含んでおり、終濃度１００ｍＭのＭＥＳによりｐＨ５．８に調製した。ｐＨ７．０の増殖培地は、ＭＥＳを添加しなかった点以外はｐＨ５．８の培地と同様にして調製した。３−ニトロ−Ｌ−チロシンは、上記の条件では、ＴＥＭ−１変異体のＵＡＧコドンに取り込まれる。しかしながら、結局、インフレームにＵＡＧコドンを有する変異体は取得されなかった。
【００４６】
（インビボアッセイ）
第１５８番目のアミノ酸に近接した位置にアミノ酸変異を有するＴＥＭ−１タンパク質変異体のインビボにおける活性は、当該変異体の遺伝子を、ｐＣＤＦ−ＩＹＮ３プラスミドを有しない大腸菌Ｂ−９５．ΔＡ株に導入して試験した。
【００４７】
インビボにおける活性の検討に用いたＬＢプレートは、カナマイシン及び３−ニトロ−Ｌ−チロシンを含まない点以外は、ＴＥＭ−１遺伝子変異体ライブラリのスクリーニングに用いたものと同様にして調製した。
【００４８】
野生型のＴＥＭ−１タンパク質、ＴＥＭ−１（Ｔ１５８Ｉ）変異体タンパク質及びＴＥＭ（Ｌ１６０Ｅ）変異体タンパク質のインビボにおける活性の比較は、これらをコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した大腸菌ＤＨ５α株を、後述する終濃度のカルベニシリンを含み、ｐＨの異なるＬＢプレート上で培養することにより行った。大腸菌の培養は３７℃で行った。
【００４９】
（ＴＥＭ−１変異体タンパク質の精製）
ｐＥＴベクターからＴＥＭ−１タンパク質を発現する大腸菌Ｂ−９５．ΔＡを、１００ｍＬの２×ＹＴ培地で２５℃で２４時間培養した。続いて、大腸菌を、終濃度２０ｍＭのイミダゾールを含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ、タカラバイオ社）中で破砕し、得られた上清をカラム（名称「Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ」、ＧＥヘルスケア社）に供し、終濃度２５０ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳで溶出した。
【００５０】
続いて、ＴＥＭ−１タンパク質をＰＢＳに対して一晩透析し、この間にＴＥＶプロテアーゼで分解した。その後、再度カラム（名称「Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ」、ＧＥヘルスケア社）に供し、フロースルー画分を回収した。
【００５１】
続いて、ＴＥＭ−１タンパク質を更に精製するために、ＡＫＴＡクロマトグラフィーシステム（ＧＥヘルスケア社）を用いて、カラム（名称「ＨｉＬｏａｄ  １６／６０  ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５」、ＧＥヘルスケア社）を用いたクロマトグラフィーを行った。溶離液にはＰＢＳを使用した。精製した試料は５０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含むＰＢＳ中で−２５℃で保存した。
【００５２】
（インビトロアッセイ）
ＴＥＭ−１タンパク質のインビトロにおける活性は、市販のキット（名称「Ｂｅｔａ  Ｌａｃｔａｍａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ」、アブカム社）及びニトロセフィンを用いて解析した。反応液として、終濃度５０ｍＭのリン酸バッファーを用い、ｐＨを５．８又は７．０に調整した。
【００５３】
ＴＥＭ−１タンパク質は、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む５０ｍＭリン酸バッファーで希釈した。この結果、各反応液中のＢＳＡの濃度は０．０２％となった。波長４９０ｎｍにおける吸光度はスペクトルメーター（名称「ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３ｘ」、モレキュラーデバイス社）を用いて測定した。
【００５４】
反応のタイムコースを取得する場合には、終濃度４０μＭのニトロセフィンの存在下で、ＴＥＭ−１タンパク質を終濃度６００ｐＭ含む反応液を使用した。反応速度論的パラメータを測定する場合には、野生型のＴＥＭ−１タンパク質を１５０ｐＭ含む反応液、又はＴＥＭ−１タンパク質変異体を６００ｐＭ含む反応液を使用した。基質であるニトロセフィンの濃度は１０〜４０μＭで変化させた。ニトロセフィンはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈した。反応液中のＤＭＳＯの濃度は２％であった。すべての反応は３７℃で行った。
【００５５】
［実験例１］
（ＴＥＭ−１遺伝子変異体ライブラリのスクリーニング）
大腸菌由来のβ−ラクタマーゼであるＴＥＭ−１タンパク質は、２３アミノ酸からなるシグナルペプチドを含めて２８６アミノ酸からなる。発明者らは、ＴＥＭ−１遺伝子のランダムな位置に変異を導入したＴＥＭ−１遺伝子変異体ライブラリを作製した。変異の導入率は１遺伝子あたり１塩基置換程度であった。
【００５６】
作製したＴＥＭ−１遺伝子変異体ライブラリで大腸菌を形質転換し、非選択性の増殖培地プレートで１０６〜１０７個の独立したコロニーを得た。続いて、これらの大腸菌を、ｐＨ５．８に調製した、カルベニシリン含有培地プレート上に播種した結果、１，０５６個のコロニーが得られた。続いて、これらのコロニーをｐＨ７．０の同様の培地プレートに播種した結果、３２クローンがｐＨ７．０の培地プレート上では生育できないことが明らかとなった。
【００５７】
ｐＨ７．０の培地プレート上で生育できなかった３２クローンのうち、８クローンにおけるＴＥＭ−１タンパク質のそれぞれが１アミノ酸置換を有していた。そして、Ｔ１５８Ｉ変異のみが１クローン以上（４クローン）に見出された。
【００５８】
図１（ａ）及び（ｂ）は、ＴＥＭ−１タンパク質を発現する大腸菌を、１０、２５、５０、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む、ｐＨ５．８及びｐＨ７．０の培地プレートにそれぞれ播種した代表的な結果を示す写真である。大腸菌は、それぞれ独立した３クローンを１０倍ずつ希釈して写真の右側から左側に向かって播種した。図１（ａ）は、ＴＥＭ−１（Ｔ１５８Ｉ）変異体タンパク質を発現する大腸菌の結果であり、図１（ｂ）は、野生型のＴＥＭ−１タンパク質を発現する大腸菌の結果である。図１（ａ）及び（ｂ）中、「Ｃｂ」はカルベニシリンを示す。
【００５９】
図１（ａ）に示すように、ＴＥＭ−１（Ｔ１５８Ｉ）変異体タンパク質を発現する大腸菌は、ｐＨ５．８では生育できるが、ｐＨ７．０では生育できなかった。これに対し、図１（ｂ）に示すように、野生型のＴＥＭ−１タンパク質を発現する大腸菌は、ｐＨ５．８でもｐＨ７．０でも同程度のカルベニシリン耐性を示すことが明らかとなった。また、ＴＥＭ−１（Ｔ１５８Ｉ）変異体タンパク質のインビボにおける活性は、野生型のＴＥＭ−１タンパク質の活性よりも低いことが明らかとなった。
【００６０】
［実験例２］
（インビトロアッセイ）
続いて、野生型のＴＥＭ−１タンパク質及びＴＥＭ−１（Ｔ１５８Ｉ）変異体タンパク質をそれぞれ精製し、それらの活性をインビトロで解析した。具体的には、各ＴＥＭ−１タンパク質のβ−ラクタム環を分解する活性を、ニトロセフィンを基質に用いて検討した。なお、ニトロセフィンは、発色性のセファロスポリンである。
【００６１】
図２（ａ）及び（ｂ）は、ｐＨ５．８及びｐＨ７．０において、各ＴＥＭ−１タンパク質でニトロセフィンを分解し、波長４９０ｎｍにおける吸光を継時的に測定した結果を示すグラフである。図２（ａ）は、野生型のＴＥＭ−１タンパク質の結果であり、図１（ｂ）は、ＴＥＭ−１（Ｔ１５８Ｉ）変異体タンパク質の結果である。
【００６２】
その結果、野生型のＴＥＭ−１タンパク質は、ｐＨ５．８及びｐＨ７．０の双方において、同様の反応速度を示した。一方、ＴＥＭ−１（Ｔ１５８Ｉ）変異体タンパク質は、ｐＨ７．０では、ｐＨ５．８よりも顕著に低い反応速度を示した。
【００６３】
また、ＴＥＭ−１（Ｔ１５８Ｉ）変異体タンパク質の初期反応速度は、野生型のＴＥＭ−１タンパク質の初期反応速度よりも顕著に低いことが明らかとなった。これらの結果は、実験例１において上述したインビボにおける結果と基本的に一致した。
【００６４】
［実験例３］
（ＴＥＭ−１変異体タンパク質の作製１）
ＴＥＭ−１タンパク質の第１５８番目のアミノ酸を様々なアミノ酸で置換した１８種類の変異体タンパク質を作製し、実験例２と同様のインビトロアッセイをそれぞれ行った。
【００６５】
図３（ａ）〜（ｆ）、図４（ａ）〜（ｆ）、図５（ａ）〜（ｆ）は、ｐＨ５．８及びｐＨ７．０において、各ＴＥＭ−１変異体タンパク質でニトロセフィンを分解し、波長４９０ｎｍにおける吸光を経時的に測定した結果を示すグラフである。
【００６６】
その結果、ＴＥＭ−１タンパク質の第１５８番目のアミノ酸が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、セリン（Ｓ）、メチオニン（Ｍ）及びフェニルアラニン（Ｆ）である変異体タンパク質は、ｐＨ５．８及びｐＨ７．０において、ほとんど同程度の活性を有することが明らかとなった。一方、ＴＥＭ−１タンパク質の第１５８番目のアミノ酸が、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）及びグルタミン（Ｑ）である変異体タンパク質は、ｐＨ５．８において、ｐＨ７．０よりも高い活性を示すことが明らかとなった。また、その他の変異体タンパク質では、ｐＨによらずβ−ラクタマーゼ活性の障害が認められた。
【００６７】
以上の結果から、ＴＥＭ−１（Ｔ１５８Ｉ）変異体タンパク質以外にも、ｐＨ７．０で活性の低下を示すＴＥＭ−１変異体タンパク質が存在することが明らかとなった。
【００６８】
［実験例４］
（ＴＥＭ−１変異体タンパク質の作製２）
発明者らは、ＴＥＭ−１タンパク質のβ−ラクタマーゼ活性に影響を与える可能性があるアミノ酸残基として、ＴＥＭ−１タンパク質の立体構造に基づいて、第６６番目のメチオニン、第６９番目のスレオニン、第７０番目のフェニルアラニン、第７３番目のロイシン、第１４６番目のロイシン、第１５０番目のロイシン、第１５９番目のアルギニン、第１６０番目のロイシン、第１８４番目のメチオニンを選択し、これらをそれぞれ別のアミノ酸に置換した１７１種類の変異体タンパク質をそれぞれ作製した。
【００６９】
続いて、作製した各変異体タンパク質を発現する大腸菌を、ｐＨ５．８及びｐＨ７．０の培地プレートにそれぞれ播種するインビボアッセイを行い、カルベニシリンに対する耐性を検討した。
【００７０】
下記表１にインビボアッセイの結果を示す。表１中、「ＮＡ」はその位置の本来のアミノ酸であることを示し、「◎」はｐＨ５．８で活性が高くｐＨ７．０で活性が低かったことを示し、「○」は野生型ＴＥＭ−１タンパク質と同様の活性であったことを示し、「×」はβ−ラクタマーゼ活性が消失したことを示す。
【００７１】
【表１】
2020036543.tif 000012
【００７２】
その結果、ＴＥＭ−１タンパク質の第１６０番目のロイシン以外の位置におけるアミノ酸置換のほとんどは、ＴＥＭ−１タンパク質のβ−ラクタマーゼ活性を失わせることが明らかとなった。
【００７３】
しかしながら、第１６０番目のロイシンにおいては、１９個のあり得るアミノ酸置換のうちの９個でｐＨ５．８におけるカルベニシリンに対する耐性が維持された。
【００７４】
続いて、ｐＨ５．８でβ−ラクタマーゼ活性を示したＴＥＭ−１変異体タンパク質について、実験例２と同様のインビトロアッセイにより、詳細な検討を行った。その結果、ＴＥＭ−１（Ｌ１６０Ｅ）変異体タンパク質が、ｐＨ５．８でｐＨ７．０よりも高いβ−ラクタマーゼ活性を示すことが明らかとなった。
【００７５】
図６は、ｐＨ５．８及びｐＨ７．０において、ＴＥＭ−１（Ｌ１６０Ｅ）変異体タンパク質でニトロセフィンを分解し、波長４９０ｎｍにおける吸光を継時的に測定した結果を示すグラフである。
【００７６】
また、図７は、ＴＥＭ−１（Ｌ１６０Ｅ）変異体タンパク質を発現する大腸菌を、１０、２５、５０、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む、ｐＨ５．８及びｐＨ７．０の培地プレートにそれぞれ播種した代表的な結果を示す写真である。大腸菌は、それぞれ独立した３クローンを１０倍ずつ希釈して写真の右側から左側に向かって播種した。図７中、「Ｃｂ」はカルベニシリンを示す。
【００７７】
その結果、インビトロアッセイの結果と一致して、ＴＥＭ−１（Ｌ１６０Ｅ）変異体タンパク質を発現する大腸菌は、ｐＨ５．８の培地プレートでは生育し、ｐＨ７．０の培地プレートでは生育しないことが明らかとなった。また、実験例１、図１（ａ）及び（ｂ）との比較から、ＴＥＭ−１（Ｌ１６０Ｅ）変異体タンパク質のインビボにおける活性は、野生型のＴＥＭ−１タンパク質の活性と同等であり、ＴＥＭ−１（Ｔ１５８Ｉ）変異体タンパク質よりも顕著に高いことが明らかとなった。
【００７８】
［実験例５］
（ＴＥＭ−１変異体タンパク質の反応速度論的解析）
ニトロセフィンを基質として、異なるｐＨにおいて、野生型のＴＥＭ−１タンパク質、ＴＥＭ−１（Ｔ１５８Ｉ）変異体タンパク質、ＴＥＭ−１（Ｌ１６０Ｅ）変異体タンパク質の反応速度論的パラメータをそれぞれ測定した。下記表２〜４に、各ＴＥＭ−１タンパク質の反応速度論的パラメータの測定結果を示す。
【００７９】
【表２】
2020036543.tif 000013
【００８０】
【表３】
2020036543.tif 000014
【００８１】
【表４】
2020036543.tif 000015
【００８２】
その結果、野生型ＴＥＭ−１タンパク質のｋｃａｔ及びＫｍはｐＨにより大きく変化したが、ｋｃａｔ／Ｋｍで表される反応効率は、ｐＨ７．０からｐＨ５．８の間でほとんど変化しないことが明らかとなった。
【００８３】
また、ＴＥＭ−１（Ｔ１５８Ｉ）変異体タンパク質及びＴＥＭ−１（Ｌ１６０Ｅ）変異体タンパク質についても、ｋｃａｔ及びＫｍがｐＨにより大きく変化する傾向が認められた。しかしながら、ＴＥＭ−１（Ｔ１５８Ｉ）変異体タンパク質及びＴＥＭ−１（Ｌ１６０Ｅ）変異体タンパク質のｋｃａｔ／Ｋｍは、ｐＨ７．０からｐＨ５．８に向かって増加していく傾向が認められた。
【００８４】
ＴＥＭ−１（Ｔ１５８Ｉ）変異体タンパク質のｐＨ６．２におけるｋｃａｔ／Ｋｍは、ｐＨ７．０におけるｋｃａｔ／Ｋｍの１．４倍以上であった。また、ＴＥＭ−１（Ｌ１６０Ｅ）変異体タンパク質のｐＨ５．８におけるｋｃａｔ／Ｋｍは、ｐＨ７．０におけるｋｃａｔ／Ｋｍの３倍以上であった。
【００８５】
上述したように、インビボでは、ＴＥＭ−１（Ｌ１６０Ｅ）変異体タンパク質の活性はＴＥＭ−１（Ｔ１５８Ｉ）変異体タンパク質の活性よりも高かった。しかしながら、インビトロで測定した、ＴＥＭ−１（Ｔ１５８Ｉ）変異体タンパク質及びＴＥＭ−１（Ｌ１６０Ｅ）変異体タンパク質の反応速度論的パラメータはあまり変わらなかった。この結果は、これらの変異体タンパク質の細胞における安定性又は細胞外における安定性の違いによるものと考えられた。
【００８６】
［実験例６］
（ＴＥＭ−１変異体タンパク質の作製３）
ＴＥＭ−１（Ｔ１５８Ｉ）変異体タンパク質に、他の変異を更に加えたＴＥＭ−１変異体タンパク質を作製した。続いて、作製したＴＥＭ−１変異体タンパク質について、実験例２と同様のインビトロアッセイにより、詳細な検討を行った。
【００８７】
図８（ａ）〜（ｉ）は、ｐＨ５．８及びｐＨ７．０において、各ＴＥＭ−１変異体タンパク質でニトロセフィンを分解し、波長４９０ｎｍにおける吸光を継時的に測定した代表的な結果を示すグラフである。
【００８８】
図８（ａ）はＴＥＭ−１（Ｔ１５８Ｉ，Ａ７７Ｖ）変異体タンパク質の結果を示し、図８（ｂ）はＴＥＭ−１（Ｔ１５８Ｉ，Ｑ８６Ｋ）変異体タンパク質の結果を示し、図８（ｃ）はＴＥＭ−１（Ｔ１５８Ｉ，Ｈ１５１Ｙ）変異体タンパク質の結果を示し、図８（ｄ）はＴＥＭ−１（Ｔ１５８Ｉ，Ｆ１４９Ｙ）変異体タンパク質の結果を示し、図８（ｅ）はＴＥＭ−１（Ｔ１５８Ｉ，Ａ２２５Ｖ）変異体タンパク質の結果を示し、図８（ｆ）はＴＥＭ−１（Ｔ１５８Ｉ，Ｑ２６５Ｈ）変異体タンパク質の結果を示し、図８（ｇ）はＴＥＭ−１（Ｔ１５８Ｉ，Ｑ２７４Ｅ）変異体タンパク質の結果を示し、図８（ｈ）はＴＥＭ−１（Ｔ１５８Ｉ，Ｌ４７Ｖ，Ｑ２７４Ｅ）変異体タンパク質の結果を示し、図８（ｉ）はＴＥＭ−１（Ｔ１５８Ｉ，Ｑ２６５Ｈ，Ｑ２７４Ｅ）変異体タンパク質の結果を示す。
【００８９】
その結果、これらのＴＥＭ−１変異体タンパク質は、ｐＨ５．８でｐＨ７．０よりも高いβ−ラクタマーゼ活性を示すことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明によれば、酸性環境下で活性が高く、中性付近で活性が低いβ−ラクタマーゼを提供することができる。
【図１】
2020036543.tif 000016
【図２】
2020036543.tif 000017
【図３】
2020036543.tif 000018
【図４】
2020036543.tif 000019
【図５】
2020036543.tif 000020
【図６】
2020036543.tif 000021
【図７】
2020036543.tif 000022
【図８】
2020036543.tif 000023
【配列表】
2020036543000001.app