(57)【要約】【課題】新たな誘導性タンパク質発現システムを提供することを目的とする。【解決手段】  第一の発現カセット及び第二の発現カセットを含む第一の２本鎖ＤＮＡ断片と、第三の発現カセットを含む第二の２本鎖ＤＮＡ断片と、を含む、発現システムであって、第一の発現カセットは、第一のプロモーターと、第一のプロモーターの制御下にあり第一のリプレッサータンパク質をコードする核酸と、を含み、第二の発現カセットは、第二のプロモーターと、１つ以上の第一のオペレーターと、第二のプロモーターの制御下にありＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸と、を含み、第三の発現カセットは、第三のプロモーターと、第三のプロモーターの制御下にあり目的タンパク質をコードする核酸と、を含む、発現システム。【選択図】図１
2020031550.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の発現カセット及び第二の発現カセットを含む第一の２本鎖ＤＮＡ断片と、第三の発現カセットを含む第二の２本鎖ＤＮＡ断片と、を含む、発現システムであって、
前記第一の発現カセットは、第一のプロモーターと、第一のプロモーターの制御下にあり第一のリプレッサータンパク質をコードする核酸と、を含み、
前記第二の発現カセットは、第二のプロモーターと、１つ以上の第一のオペレーターと、第二のプロモーターの制御下にありＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸と、を含み、
前記第三の発現カセットは、第三のプロモーターと、第三のプロモーターの制御下にあり目的タンパク質をコードする核酸と、を含み、前記第三のプロモーターは前記ＲＮＡポリメラーゼにより認識され、
前記第一のリプレッサータンパク質は、マルトースの非存在下で前記１つ以上の第一のオペレーターに結合して、前記ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸の転写を抑制するが、マルトースの存在下で前記１つ以上の第一のオペレーターに結合しない、発現システム。
【請求項２】
前記第一のリプレッサータンパク質がＭａｌＲタンパク質である、請求項１に記載の発現システム。
【請求項３】
前記第一のリプレッサータンパク質をコードする核酸が、配列番号１で示される塩基配列を有する、請求項１又は２に記載の発現システム。
【請求項４】
前記１つ以上の第一のオペレーターが、配列番号２で示される塩基配列を有するオペレーターである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の発現システム。
【請求項５】
前記第一の発現カセットが、前記第一のオペレーターを２つ以上含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の発現システム。
【請求項６】
前記ＲＮＡポリメラーゼがＴ７ＲＮＡポリメラーゼであり、前記第三のプロモーターがＴ７プロモーターである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の発現システム。
【請求項７】
前記第二の２本鎖ＤＮＡ断片が、第四のプロモーターと、第四のプロモーターの制御下にあり第二のリプレッサータンパク質をコードする核酸と、を含む第四の発現カセットをさらに含み、
前記第三の発現カセットが、１つ以上の第二のオペレーターをさらに含み、
前記第二のリプレッサータンパク質は、マルトースの非存在下で前記１つ以上の第二のオペレーターに結合して、前記目的タンパク質をコードする核酸の転写を抑制するが、マルトースの存在下で前記１つ以上の第二のオペレーターに結合しない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の発現システム。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の発現システムを備え、
前記ＲＮＡポリメラーゼが外来性である、組換え細胞。
【請求項９】
前記組換え細胞が大腸菌である、請求項８に記載の組換え細胞。
【請求項１０】
前記組換え細胞がマルトースを資化できない、請求項８又は９に記載の組換え細胞。
【請求項１１】
前記第一の２本鎖ＤＮＡ断片を染色体ＤＮＡに含み、前記第二の２本鎖ＤＮＡ断片を染色体外ＤＮＡとして含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項１２】
前記染色体外ＤＮＡのコピー数が１〜７００である、請求項１１に記載の組換え細胞。
【請求項１３】
請求項８〜１２のいずれか一項に記載の組換え細胞をマルトース存在下で培養する工程を含む、目的タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は目的タンパク質を発現させるための発現システム及び組換え細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
人為的に異種タンパク質を大量発現させると、宿主の生育能は著しく損なわれることがある。したがって、培養液あたりのタンパク質生産性を最大化するためには、目的タンパク質を発現させずに細胞を増殖させ、一定の細胞数に達した後に発現のスイッチをオンにする、いわゆる「発現誘導システム」が有効である。
【０００３】
転写速度等において優れた特徴を有する、Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼ（以下、「Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ」という）が実装された発現誘導システムにより、近代のタンパク質関連研究は大きな発展を遂げてきた。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた発現誘導システムには、環境中のラクトースに応答してタンパク質の生産を制御するｌａｃＩ遺伝子が利用されている。つまり、培養液にラクトース又はラクトースアナログであるイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（以下ＩＰＴＧ）を加えることにより、宿主細胞を増殖フェイズから生産フェイズに切り替えることが可能である（非特許文献１、非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｆ．Ｗ．Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｂ．Ａ．Ｍｏｆｆａｔｔ，  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｔｏ  ｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９（１９８６）１１３−１３０．
【非特許文献２】Ｆ．Ｗ．Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ａ．Ｈ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｊ．Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ｗ．Ｄｕｂｅｎｄｏｒｆｆ，Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｔｏ  ｄｉｒｅｃｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５（１９９０）６０−８９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＩＰＴＧは非常に高価であり大量調達の難しい化合物である。そのため、ＩＰＴＧを別の安価な物質に置き換えることが出来れば、培養を大規模化するにあたり、コスト的に大きな利点がある。したがって、本発明は、新たな誘導性タンパク質発現システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一形態に係る発現システムは、第一の発現カセット及び第二の発現カセットを含む第一の２本鎖ＤＮＡ断片と、第三の発現カセットを含む第二の２本鎖ＤＮＡ断片と、を含む。第一の発現カセットは、第一のプロモーターと、第一のプロモーターの制御下にあり第一のリプレッサータンパク質をコードする核酸と、を含む。第二の発現カセットは、第二のプロモーターと、１つ以上の第一のオペレーターと、第二のプロモーターの制御下にありＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸と、を含む。第三の発現カセットは、第三のプロモーターと、第三のプロモーターの制御下にあり目的タンパク質をコードする核酸と、を含む。第三のプロモーターは上記ＲＮＡポリメラーゼにより認識される。第一のリプレッサータンパク質は、マルトースの非存在下で上記１つ以上の第一のオペレーターに結合して、上記ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸の転写を抑制するが、マルトースの存在下で上記１つ以上の第一のオペレーターに結合しない。
【０００７】
第一のリプレッサータンパク質は、ＭａｌＲタンパク質であってもよい。
【０００８】
第一のリプレッサータンパク質をコードする核酸は、配列番号１で示される塩基配列を有してもよい。
【０００９】
上記１つ以上の第一のオペレーターは、配列番号２で示される塩基配列を有するオペレーターであってもよい。
【００１０】
第一の発現カセットは、第一のオペレーターを２つ以上含んでもよい。
【００１１】
ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼであってもよく、第三のプロモーターはＴ７プロモーターであってもよい。
【００１２】
第二の２本鎖ＤＮＡ断片は、第四のプロモーターと、第四のプロモーターの制御下にあり第二のリプレッサータンパク質をコードする核酸と、を含む第四の発現カセットをさらに含んでもよい。第三の発現カセットは、１つ以上の第二のオペレーターをさらに含んでもよい。第二のリプレッサータンパク質は、マルトースの非存在下で上記１つ以上の第二のオペレーターに結合して、目的タンパク質をコードする核酸の転写を抑制するが、マルトースの存在下で上記１つ以上の第二のオペレーターに結合しない。
【００１３】
本発明の一形態に係る組換え細胞は、上記タンパク質発現システムを備え、上記ＲＮＡポリメラーゼが外来性である。
【００１４】
組換え細胞は大腸菌であってもよい。
【００１５】
組換え細胞は、マルトースを資化できなくもてよい。
【００１６】
組換え細胞は、第一の２本鎖ＤＮＡ断片を染色体ＤＮＡに含み、第二の２本鎖ＤＮＡ断片を染色体外ＤＮＡとして含んでもよい。
【００１７】
染色体外ＤＮＡのコピー数は、１〜７００であってもよい。
【００１８】
本発明の一形態に係る目的タンパク質の製造方法は、マルトース存在下で上記組換え細胞を培養する工程を含む。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、発現誘導にＩＰＴＧを必要としない、新たな誘導性タンパク質発現システム及び該発現システムを備える組換え細胞が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の一実施形態に係る発現システムの概要を示す模式図である。
【図２】ＳＳＰ発現ベクターのベクターマップを示す模式図である。
【図３】ＳＳＰ発現ベクターのベクターマップを示す模式図である。
【図４】ＳＳＰ発現ベクターのベクターマップを示す模式図である。
【図５】ＣＲＩＭプラスミドをバックボーンとする、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを含むプラスミドのベクターマップを示す模式図である。
【図６】Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの発現ベクターのベクターマップを示す模式図である。
【図７】ｍａｌＱ破壊株におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動写真である。
【図８】ｍａｌＱを有する株におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
［１．発現システム］
本発明の一実施形態に係る発現システムは、マルトースによる誘導下において目的タンパク質を発現させるためのマルトース誘導性タンパク質発現システムである。本発明の一実施形態に係る発現システムの概要を図１に示す。図１に示す発現システムは、第一の発現カセット及び第二の発現カセットを含む第一の２本鎖ＤＮＡ断片と、第三の発現カセットを含む第二の２本鎖ＤＮＡ断片と、を含む。第一の発現カセットは、リプレッサータンパク質を発現させるための発現カセットであり、第二の発現カセットはＲＮＡポリメラーゼを発現させるための発現カセットであり、第三の発現カセットは、目的タンパク質を発現させるための発現カセットである。第二の２本鎖ＤＮＡ断片は、リプレッサータンパク質を発現させるための第四の発現カセットを任意で含む。
【００２２】
本明細書において、発現カセットとは、単一のプロモーターと、そのプロモーターの制御下にあり、タンパク質をコードする核酸と、を含み、ＲＮＡポリメラーゼによって連続的に転写される２本鎖ＤＮＡを意味する。本明細書において、２本鎖ＤＮＡ断片とは、１つ以上の発現カセットを含む、連続的な線状又は環状の２本鎖ＤＮＡ断片を意味する。該２本鎖ＤＮＡ断片は、宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれる線状ＤＮＡ断片であってもよく、また、染色体外ＤＮＡとして宿主細胞に導入される環状ＤＮＡ断片であってもよい。本明細書において、核酸は特に明記しない限り２本鎖ＤＮＡを意味し、タンパク質をコードする核酸は、タンパク質をコードする遺伝子又はｃＤＮＡであってよい。
【００２３】
本発現システムでは、第二の発現カセットから発現されるＲＮＡポリメラーゼが、第三の発現カセットに含まれる第三のプロモーターを認識し、それによって第三のプロモーターの制御下にあり目的タンパク質をコードする核酸が発現される。第二の発現カセットにおいて、第二のプロモーターの制御下にあるＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸の発現は、マルトースの非存在下では、第一の発現カセットから発現される第一のリプレッサータンパク質が１つ以上の第一のオペレーターに結合することによって抑制される。一方、マルトースの存在下では、第一のリプレッサータンパク質が上記１つ以上の第一のオペレーターに結合しないため、ＲＮＡポリメラーゼによって目的タンパク質が発現される。すなわち、目的タンパク質の発現はマルトースの添加により誘導される。したがって、マルトースの存在下で本発現システムを備える組換え細胞を培養することで、目的タンパク質を生産することができる。
【００２４】
本実施形態に係る発現システムを宿主細胞において機能させるためには、第二の発現カセットにおけるＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸から発現されるＲＮＡポリメラーゼは、宿主細胞にとって外来性のＲＮＡポリメラーゼ（以下、「外来性ＲＮＡポリメラーゼ」という。）である必要があり、かつ、第三のプロモーターは上記外来性ＲＮＡポリメラーゼにより認識され、内在性ＲＮＡポリメラーゼにより認識されないプロモーターである必要がある。仮に、第三のプロモーターが内在性ＲＮＡポリメラーゼによっても認識されるプロモーターであると、内在性ＲＮＡポリメラーゼによって第三のプロモーターが認識され、第三のプロモーターの制御下にある目的タンパク質をコードする核酸が、マルトースの有無に関わらず発現されてしまうからである。
【００２５】
＜第一の２本鎖ＤＮＡ断片＞
第一の２本鎖ＤＮＡ断片は、リプレッサータンパク質を発現させるための第一の発現カセットと、ＲＮＡポリメラーゼを発現させるための第二の発現カセットとを含む。第一の発現カセットは、第一のプロモーターと、第一のリプレッサータンパク質をコードする核酸と、を含む。第二の発現カセットは、第二のプロモーターと、１つ以上の第一のオペレーターと、ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸と、を含む。
【００２６】
第一のプロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであれば限定されず、例えば、ｌａｃＩプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、λＰＲプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｂｉｏＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｓｔｒプロモーター、ｒｐｏＡプロモーター、ｐＢＲｔｅｔプロモーター、ｍａｌＴプロモーター、ｌｅｕプロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター、ｏｍｐＦプロモーター、ｔｙｒＴプロモーター、ｉｌｖＭプロモーター、ｃｓｐＡプロモーター、ｐＴＥＦ１プロモーター、ｐＡＤＨ１プロモーター、ｐＴＰＩ１プロモーター、ｐＨＸＴ７プロモーター、ｐＴＤＨ３プロモーター、ｐＰＧＫ１プロモーター、ｐＰＹＫ１プロモーター、ＣＭＶプロモーター、及びｌｐｐプロモーターが挙げられる。第一のプロモーターとしては、宿主細胞中で恒常的に機能するプロモーターが好ましい。宿主細胞が大腸菌の場合、恒常的に機能するプロモーターとしては、ｌａｃＩプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、及びｌｐｐプロモーターが挙げられる。第一のプロモーターは、第二のプロモーターを制御するリプレッサータンパク質を供給する観点から、発現が過度に強くなく、かつ恒常的に機能するプロモーターであることがより好ましい。通常、微生物が有する、リプレッサータンパク質のプロモーターは、上記の特徴を有しているため、ｌａｃＩプロモーター等、リプレッサータンパク質を転写するプロモーターがより好ましい。
【００２７】
第一のリプレッサータンパク質（以下、リプレッサータンパク質を「リプレッサー」ともいう。）は、マルトースオペロンにおける転写調節因子であり、第一のリプレッサーとしては、例えば、ＭａｌＲタンパク質が挙げられる。第一のリプレッサーは、マルトースの非存在下では、後述する１つ以上の第一のオペレーターに結合しており、マルトースの存在下では、第一のオペレーターから解離する。第一のリプレッサーが第一のオペレーターに結合することにより、第一のオペレーターと機能的に連結した第二のプロモーターへのＲＮＡポリメラーゼの結合が妨げられ、該プロモーターの制御下にある核酸の転写が抑制される。第一のリプレッサーをコードする核酸は、配列番号１で示される塩基配列を有するストレプトコッカス・ニューモニエのｍａｌＲ遺伝子であってよく、該ｍａｌＲ遺伝子と８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有する塩基配列を有する核酸であってよい。
【００２８】
第一の発現カセットにおける第一のリプレッサーをコードする核酸は、第一のプロモーターの制御下にあり、宿主細胞中に恒常的に存在するＲＮＡポリメラーゼ（以下、内在性ＲＮＡポリメラーゼという。）により構成的に転写される。本明細書において、プロモーターの制御下にある核酸とは、プロモーターの下流にあり、内在性または外来性ＲＮＡポリメラーゼが該プロモーターに結合することによりその核酸の転写が開始される、核酸をいう。
【００２９】
第二のプロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであれば限定されず、第一のプロモーターとして上記に列挙したプロモーターのうち、いずれを使用してもよい。第二のプロモーターの具体例としては、例えば、ｌａｃＵＶ５プロモーターが挙げられる。
【００３０】
オペレーターは、リプレッサーが結合する配列である。第一のオペレーターは、マルトースオペロンにおけるオペレーターであることが好ましく、例えば、配列番号２で示される塩基配列を有するオペレーターであってよい。第二の発現カセットは、１つ以上の第一のオペレーターを含み、第一のリプレッサーによる第一のオペレーターへの結合を容易にするために、好ましくは２つ以上のオペレーター、より好ましくは３つのオペレーターを含む。
【００３１】
第一のオペレーターは、第二のプロモーターと機能的に連結している。プロモーターと機能的に連結しているオペレーターとは、特定の位置であって、オペレーターにリプレッサーが結合したときに、該プロモーターへの内在性又は外来性ＲＮＡポリメラーゼの結合が妨げられるような位置に、配置されたオペレーターをいう。第一のオペレーターは、転写開始点から、例えば、１５０ｂｐ上流〜４５０ｂｐ下流に一番目の塩基が位置するように配置されてよく、転写開始点から、例えば、１０６〜１１９ｂｐ上流、１〜１４ｂｐ下流、又は３９４〜４０８ｂｐ下流に一番目の塩基が位置するように配置されてよい。各オペレーター間は、約１０．５ｂｐの倍数離れていることが好ましい。
【００３２】
ＲＮＡポリメラーゼは、所望の宿主細胞にとって外来性ＲＮＡポリメラーゼであれば、任意のＲＮＡポリメラーゼであり得る。例えば、宿主細胞が大腸菌の場合、外来性ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７様ＲＮＡポリメラーゼ、等のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、及びバクテリオファージＮ４ビリオンＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。ＲＮＡポリメラーゼは、好ましくはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり、より好ましくはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ又はＴ７様ＲＮＡポリメラーゼであり、さらに好ましくはＴ７ＲＮＡポリメラーゼである。
【００３３】
Ｔ７様ＲＮＡポリメラーゼとは、配列番号３で示されるアミノ酸配列と、４０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＲＮＡポリメラーゼをいう。Ｔ７様ＲＮＡポリメラーゼは、後述するＴ７様プロモーターを特異的に認識する。Ｔ７様ＲＮＡポリメラーゼの具体例は、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ及びその他のＴ７様ＲＮＡポリメラーゼである。その他のＴ７様ＲＮＡポリメラーゼの具体例は、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するＲＮＡポリメラーゼである。
【００３４】
ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸は、第二のプロモーターの制御下にあり、マルトースの存在下で、内在性ＲＮＡポリメラーゼにより転写される。マルトースの非存在下では、第一のオペレーターに第一のリプレッサーが結合しており、第二のプロモーターに内在性ＲＮＡポリメラーゼが結合できないため、ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸の転写は抑制される。
【００３５】
第一の発現カセット及び第二の発現カセットは、必要に応じてターミネーター、リボソーム結合部位等、遺伝子発現に関与する配列をさらに含むことができる。また、第一の２本鎖ＤＮＡ断片は、第一の発現カセット及び第二の発現カセットの機能を妨げない限り、抗生物質耐性遺伝子を有する発現カセットなど、他のタンパク質を発現するための発現カセットをさらに含んでいてもよい。
【００３６】
第一の２本鎖ＤＮＡ断片において、第一の発現カセットと第二の発現カセットとは、それぞれのカセットの転写方向が同一となる向きで連結されていてもよく、逆となる向きで連結されていてもよい。すなわち、第一のリプレッサーをコードする核酸のセンス鎖と、外来性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸のセンス鎖とが、第一の２本鎖ＤＮＡ断片の２本鎖のうち、同一鎖上にあってもよいし、異なる鎖上にあってもよい。
【００３７】
＜第二の２本鎖ＤＮＡ断片＞
第二の２本鎖ＤＮＡ断片は、目的タンパク質を発現させるための第三の発現カセットを含み、リプレッサーを発現させるための第四の発現カセットを任意で含む。第三の発現カセットは、第三のプロモーターと、目的タンパク質をコードする核酸と、任意で１つ以上の第二のオペレーターと、を含むことができる。第四の発現カセットは、第四のプロモーターと、第二のリプレッサーをコードする核酸と、を含む。第四の発現カセットは、第二の発現カセットと同一であってもよい。
【００３８】
第三のプロモーターは、本発現システムを宿主細胞において機能させる観点から、上記外来性ＲＮＡポリメラーゼにより認識され、内在性ＲＮＡポリメラーゼにより認識されないプロモーターであれば限定されない。例えば、宿主細胞が大腸菌の場合、第三のプロモーターとしては、Ｔ７プロモーター及びＴ７様プロモーターが挙げられる。第三のプロモーターは、好ましくはＴ７プロモーター又はＴ７様プロモーターであり、より好ましくはＴ７プロモーターである。第三のプロモーターが外来性ＲＮＡポリメラーゼによって認識されると、外来性ＲＮＡポリメラーゼが第三のプロモーターに結合し、第三のプロモーターの制御下にある目的タンパク質をコードする核酸が発現される。
【００３９】
Ｔ７様プロモーターとは、配列番号４で示されるＴ７プロモーター配列と、５０％以上、５０％〜９５％、５０％〜９０％、５０％〜８５％、又は５５％〜８０％の配列同一性を有する塩基配列を含むプロモーターをいう。また、Ｔ７様プロモーターは、配列番号５で示される塩基配列と、６０％以上、６５％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、又は９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むプロモーターであってよい。Ｔ７様プロモーターは、Ｔ７様ＲＮＡポリメラーゼにより認識される。Ｔ７様プロモーターの具体例は、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、及び配列番号５で示される塩基配列を含むプロモーターである。
【００４０】
目的タンパク質は、特に限定されないが、好ましくは工業規模での製造を目的とするタンパク質である。目的タンパク質としては、例えば、工業に利用できるタンパク質、医療に利用できるタンパク質、及び構造タンパク質を挙げることができる。工業又は医療に利用できるタンパク質の具体例としては、酵素、制御タンパク質、受容体、ペプチドホルモン、サイトカイン、膜タンパク質、輸送タンパク質、予防接種に使用される抗原、ワクチン、抗原結合タンパク質、免疫刺激タンパク質、アレルゲン、完全長抗体又は抗体フラグメント若しくは抗体の誘導体を挙げることができる。構造タンパク質の具体例としては、スパイダーシルク、カイコシルク、ケラチン、コラ−ゲン、エラスチン及びレシリン、並びにこれらに由来するタンパク質を挙げることができる。
【００４１】
フィブロイン様タンパク質であるスパイダーシルク又はカイコシルク由来のタンパク質として、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質を挙げることができる。式１中、（Ａ）ｎモチーフは４〜２０アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が８０％以上である。ＲＥＰは１０〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは８〜３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。スパイダーシルク又はカイコシルク由来のタンパク質の具体的として、配列番号６（ＰＲＴ４１０）又は配列番号７（ＰＲＴ９１８）で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。
【００４２】
コラーゲン由来のタンパク質として、例えば、式２：［ＲＥＰ２］ｏで表されるドメイン配列を含むタンパク質を挙げることができる。式２中、ｏは５〜３００の整数を示す。ＲＥＰ２は、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘ及びＹはＧｌｙ以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するＲＥＰ２は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。コラーゲン由来のタンパク質の具体例として、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号８で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したヒトのコラーゲンタイプ４の部分的な配列（ＮＣＢｌのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＣＡＡ５６３３５．１、ＧＩ：３７０２４５２）のリピート部分及びモチーフに該当する３０１残基目から５４０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号９で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【００４３】
レシリン由来のタンパク質として、例えば、式３：［ＲＥＰ３］ｐで表されるドメイン配列を含むタンパク質を挙げることができる。式３中、ｐは４〜３００の整数を示す。ＲＥＰ３はＳｅｒ−Ｊ−Ｊ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｕ−Ｐｒｏから構成されるアミノ酸配列を示す。Ｊは任意のアミノ酸残基を示し、特にＡｓｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。Ｕは任意のアミノ酸残基を示し、特にＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。複数存在するＲＥＰ３は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。レシリン由来のタンパク質の具体例として、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号１０で示されるアミノ酸配列は、レシリン（ＮＣＢｌのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ  ６１１１５７、Ｇｌ：２４６５４２４３）のアミノ酸配列において、８７残基目のＴｈｒをＳｅｒに置換し、かつ９５残基目のＡｓｎをＡｓｐに置換した配列の１９残基目から３２１残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号９で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【００４４】
エラスチン由来のタンパク質として、例えば、ＮＣＢｌのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５（ヒト）、Ｉ４７０７６（ヒツジ）、ＮＰ７８６９６６（ウシ）等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。具体的には、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号１１で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢｌのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５のアミノ酸配列の１２１残基目から３９０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号９で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【００４５】
ケラチン由来のタンパク質として、例えば、カプラ・ヒルクス（Ｃａｐｒａ  ｈｉｒｃｕｓ）のタイプＩケラチン等を挙げることができる。具体的には、配列番号１２で示されるアミノ酸配列（ＮＣＢｌのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号ＡＣＹ３０４６６のアミノ酸配列）を含むタンパク質を挙げることができる。
【００４６】
目的タンパク質をコードする核酸は、第三のプロモーターの制御下にあり、マルトースの存在下で、第二の発現カセットから発現した外来性ＲＮＡポリメラーゼによりに転写される。マルトースの非存在下では、上述したように、外来性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸の転写が抑制されている。したがって、マルトースの非存在下では、外来性ＲＮＡポリメラーゼが生産されず、それによって第三のプロモーターが機能せず、目的タンパク質をコードする核酸が転写されない。
【００４７】
第三の発現カセットにおいて含まれてもよい上記１つ以上の第二のオペレーターは、マルトースオペロンにおけるオペレーターであることが好ましく、例えば、配列番号２で示される塩基配列を有するオペレーターであってよい。第三の発現カセットは、リプレッサーによるオペレーターへの結合を容易にするために、２つ以上のオペレーター含んでよく３つのオペレーターを含んでよい。上記１つ以上の第二のオペレーターは、第三のプロモーターと機能的に連結していてよい。各オペレーターの転写開始点からの位置、及び各オペレーター間の距離は、上述のとおりである。
【００４８】
第三の発現カセットに上記１つ以上の第二のオペレーターが含まれる場合、後述の第二のリプレッサーは、マルトースの非存在下で第二のオペレーターに結合する。また、第一のリプレッサーが第二のリプレッサーと同じである場合、第一のリプレッサーも、マルトースの非存在下で第二のオペレーターに結合し得る。第二のオペレーターに第一のリプレッサー又は第二のリプレッサーが結合すると、該オペレーターと機能的に連結した第三のプロモーターへの外来性ＲＮＡポリメラーゼの結合が妨げられ、第三のプロモーターの制御下にある目的タンパク質をコードする核酸の転写が抑制される。すなわち、第二の発現カセットに加えて第三の発現カセットにもオペレーターを配置することにより、目的タンパク質をコードする核酸の転写、すなわち目的タンパク質の発現を、より厳密に制御することができる。
【００４９】
第二の２本鎖ＤＮＡ断片は、第四のプロモーターと、第四のプロモーターの制御下にあり第二のリプレッサータンパク質をコードする核酸と、を含む第四の発現カセットをさらに含んでもよい。第四のプロモーターは、宿主細胞中で機能するものであれば限定されず、第一のプロモーターとして上記に列挙したプロモーターのうち、いずれを使用してもよい。第四のプロモーターは、第一のプロモーターと同一であってもよい。
【００５０】
第二のリプレッサーをコードする核酸としては、第一のリプレッサーをコードする核酸として上記に列挙した核酸のうち、いずれを使用してもよい。第二のリプレッサーをコードする核酸は、第一のリプレッサーをコードする核酸と同一であってもよい。
【００５１】
第三の発現カセット及び第四の発現カセットは、必要に応じてターミネーター、リボソーム結合部位等、遺伝子発現に関与する配列をさらに含むことができる。また、第二の２本鎖ＤＮＡ断片は、第三の発現カセット及び第四の発現カセットの機能を妨げない限り、抗生物質耐性遺伝子を有する発現カセットなど、他のタンパク質を発現するための発現カセットをさらに含んでいてもよい。
【００５２】
第三の発現カセットと第四の発現カセットとは、それぞれのカセットの転写方向が同一となる向きで連結されていてもよく、逆となる向きで連結されていてもよい。すなわち、目的タンパク質をコードする核酸のセンス鎖と、第二のリプレッサーをコードする核酸のセンス鎖とが、第二の２本鎖ＤＮＡ断片の２本鎖のうち、同一鎖上にあってもよいし、異なる鎖上にあってもよい。第二の２本鎖ＤＮＡ断片をプラスミド等の環状の染色体外ＤＮＡとして宿主細胞に保持させる場合、第三の発現カセットと第四の発現カセットとは、好ましくは、それぞれのカセットの転写方向が逆となる向きで連結される。第三の発現カセットと第四の発現カセットとの転写の向きが同じであると、例えば、上流にある第三の発現カセットにおけるターミネーターがリードスルーされることにより、第四の発現カセット中の第二のリプレッサーをコードする核酸の過剰な転写が起こる場合がある。第三の発現カセットと第四の発現カセットとの転写の向きが逆であれば、このような、第二のリプレッサーをコードする核酸の過剰転写を防ぐことができる。
【００５３】
第一の２本鎖ＤＮＡ断片及び第二の２本鎖ＤＮＡ断片は、それぞれ発現ベクターであってよい。発現ベクターは、宿主細胞において自立複製が可能であるか、又は、宿主細胞の染色体ＤＮＡへの組込みが可能なものであれば限定されず、宿主細胞に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、及び人工染色体ベクターが挙げられる。発現ベクターとして機能する第一の２本鎖ＤＮＡ断片は、例えば、第一の発現カセットと第二の発現カセットとを公知のベクターに挿入することにより得ることができる。発現ベクターとして機能する第二の２本鎖ＤＮＡ断片は、例えば、第三の発現カセットと、任意で第四の発現カセットと、を公知のベクターに挿入することにより得ることができる。ただし、これらの公知のベクターにおけるｌａｃＩ遺伝子及びｌａｃオペレーターは、適宜除去されるか、上述のリプレッサー及びオペレーターで置換される。
【００５４】
公知のベクターとしては、例えば、ｐＵＣ１９（タカラバイオ株式会社）、ｐＴＷＶ２２８（タカラバイオ株式会社）、ｐＭＷ１１９（ニッポン・ジーン社）、ＣＲＩＭプラスミドベクター、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、ｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒｓ３０〔エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒｓ３２〔エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＧＨＡ２〔エシェリヒア・コリ  ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  Ｂ−４００）より調製、特開昭６０−２２１０９１号公報〕、ｐＧＫＡ２〔エシェリヒア・コリ  ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９８）より調製、特開昭６０−２２１０９１号公報〕、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＡＣＹＣ１８４（株式会社ニッポンジーン製、製品番号３１３−０２２０１）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ＹＩｐ、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５、ｐＡ０８０４、ｐＨＩＬ３Ｏｌ、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣＺα、ｐＧＡＰＺα、ｐＰＩＣＺ  Ｂ、及び、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等のバキュロウイルス発現ベクター〔Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）〕を挙げることができる。
【００５５】
発現ベクターのコピー数は特に限定されないが、マルトース資化能を欠いた細胞を宿主として使用する場合、第二の２本鎖ＤＮＡ断片を含むベクターのコピー数は、好ましくは１〜７００であり、より好ましくは１〜２０であり、さらに好ましくは１〜５である。
【００５６】
［２．組換え細胞］
本発明の一実施形態に係る組換え細胞は、上記実施形態に係る発現システムを備える組換え細胞である。組換え細胞は、例えば、上記第一の２本鎖ＤＮＡ断片及び上記第二の２本鎖ＤＮＡ断片を宿主細胞に導入することにより得ることができる。
【００５７】
宿主細胞としては、細菌等の原核生物の細胞、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物の細胞のいずれも好適に用いることができる。
【００５８】
原核生物としては、例えば、エシェリヒア属、ビブリオ属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する微生物を挙げることができる。
【００５９】
エシェリヒア属に属する微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリ  ＢＬ２１（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（ライフテクノロジーズ社）、エシェリヒア・コリ  ＢＬ２１（メルクミリポア社）、エシェリヒア・コリ  ＢＬＲ（ＤＥ３）（メルクミリポア社）、エシェリヒア・コリ  ＤＨ１、エシェリヒア・コリ  ＧＩ６９８、エシェリヒア・コリ  ＨＢ１０１、エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ  Ｋ５（ＡＴＣＣ  ２３５０６）、エシェリヒア・コリ  ＫＹ３２７６、エシェリヒア・コリ  ＭＣ１０００、エシェリヒア・コリ  ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ  ４７０７６）、エシェリヒア・コリ  Ｎｏ．４９、エシェリヒア・コリ  Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ  ＴＢ１、エシェリヒア・コリ  Ｔｕｎｅｒ（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ  Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ  Ｗ１４８５、エシェリヒア・コリ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７３２５）、エシェリヒア・コリ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ等を挙げることができる。
【００６０】
酵母としては、例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、シワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ヤロウィア属及びハンゼヌラ属等に属する酵母を挙げることができる。より具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クリベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、シワニオマイセス・アルビウス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ａｌｌｕｖｉｕｓ）、シワニオマイセス・オシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・ポリモルファ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピキア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）等を挙げることができる。
【００６１】
酵母としては、例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、シワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ヤロウィア属及びハンゼヌラ属等に属する酵母を挙げることができる。
【００６２】
糸状真菌としては、例えば、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ウスチラーゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ）属、ボトリティス（Ｂｏｔｒｙｔｓ）属、マグナポルサ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）属、ムコア（Ｍｕｃｏｒ）属、メタリチウム（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）属、モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、及びリゾムコア属に属する菌等を挙げることができる。
【００６３】
宿主細胞としては、大腸菌（エシェリヒア・コリ）、バチルス・ズブチリス、シュードモナス、コリネバクテリウム、及びラクトコッカス等の原核生物が好ましく、大腸菌がより好ましい。
【００６４】
組換え細胞は、目的タンパク質の発現誘導の持続性の観点から、マルトースを資化できない細胞であることが好ましい。マルトースを資化できない細胞は、マルトース資化遺伝子を有さないか、変異のあるマルトース資化遺伝子を有する。マルトース資化遺伝子としては、例えば、ｍａｌＱ、ｍａｌＰ、ｍａｌＺ、及びｍａｌＳが挙げられる。組換え細胞は、ｍａｌＱを有さないことが好ましい。
【００６５】
組換え細胞において、第一の２本鎖ＤＮＡ断片及び第二の２本鎖ＤＮＡ断片は、それぞれ独立に、染色体ＤＮＡに組み込まれていてもよく、プラスミド等の染色体外ＤＮＡとして保持されていてもよい。組換え細胞は、例えば、染色体ＤＮＡに組み込まれた第一の２本鎖ＤＮＡ断片と、プラスミドとして保持された第二の２本鎖ＤＮＡ断片と、を有してもよい。
【００６６】
宿主細胞への第一の２本鎖ＤＮＡ断片又は第二の２本鎖ＤＮＡ断片の導入は、公知の方法により行うことができる。例えば、第一の２本鎖ＤＮＡ断片又は第二の２本鎖ＤＮＡ断片を含む発現ベクターを宿主細胞に導入することができる。
【００６７】
第一の２本鎖ＤＮＡ断片又は第二の２本鎖ＤＮＡ断片を宿主細胞の染色体に組み込む方法としては、公知の方法を使用することができる。公知の方法としては、例えば、λファージの２重鎖切断修復における組換え機構を応用したλｒｅｄ法、Ｒｅｄ／ＥＴ相同組換え法、及び、ｐＵＴ−ｍｉｎｉ  Ｔｎ５を用いたトランスポゾン活性を利用した転移法が挙げられる。
【００６８】
［３．目的タンパク質の製造方法］
本発明の一実施形態に係る目的タンパク質の製造方法は、マルトース存在下で上記組換え細胞を培養する工程を含む。マルトース存在下で上記組換え細胞を培養することにより、組換え細胞において目的タンパク質の発現を誘導することができる。組換え細胞は、例えば、マルトースを添加した培地中で培養することができる。培地は特に限定されず、組換え細胞の種類に応じて、公知の天然培地又は合成培地から選択することができる。培地は、好ましくは、組換え細胞が資化し得る、無機塩類、窒素源、及びマルトース以外の炭素源を含む。培地中のマルトースの濃度は、例えば、０．１〜４ｗ／ｖ％、１〜３ｗ／ｖ％、又は１．５〜２ｗ／ｖ％であってよい。培地のｐＨは、例えば、３．０〜９．０であってよい。培養温度は、例えば、１５〜４０℃である。培養時間は、例えば、１〜３０時間であってよい。
【００６９】
実施形態に係る目的タンパク質の製造方法には、マルトース存在下で組換え細胞を培養する工程の前に、マルトースの非存在下で組換え細胞を培養する工程が含まれてもよい。目的タンパク質の発現を誘導する前に組換え細胞を所定の量まで増殖させておくことで、目的タンパク質をより効率的に生産することができる。培養に用いる培地は、マルトースを含まないという点以外は、上記の培地と同じであってよい。培養温度は、例えば、１５〜４０℃である。培養時間は、例えば、３時間以上であってよく、５〜１５時間であってよい。
【実施例】
【００７０】
［スパイダーシルクタンパク質発現ベクターの作製］
まず、ストレプトコッカス・ニューモニエのｍａｌＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片を以下のとおり合成した。表１に示すプライマーの水溶液（１００ｐｍｏｌ／μＬ）を２μＬずつ混合した。この混合水溶液１μＬを、２５μＬのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ株式会社）と混合した。最終容量が５０μＬとなるように超純水を添加し、反応混合液を得た。上記反応混合液を９８℃で１分加温した後、９８℃で１０秒間、５５℃で５秒間、７２℃で５秒間のＰＣＲプロフィールを１５サイクル繰り返し、反応混合液をさらに７２℃で２分間反応させた。得られたＰＣＲ産物１０μに、表１に示すプライマーの水溶液（１０ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬずつと、２５μＬのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｐｒｅｍｉｘとを加えた。最終容量が５０μＬとなるように超純水を添加し、反応混合液を得た。上記反応混合液を、９８℃で１分加温した後、９８℃で１０秒間、５５℃で５秒間、７２℃で５秒間のＰＣＲプロフィールを２５サイクル繰り返し、反応混合液をさらに７２℃で１０秒間反応させた。得られたＰＣＲ産物を精製した。なお、本実施例におけるＤＮＡの精製には、ｉｎｎｕＰＲＥＰ  ＰＣＲｐｕｒｅ  Ｋｉｔ  ｜  ｉｎｎｕＰＲＥＰ  ＰＣＲｐｕｒｅ  ９６  Ｋｉｔ（アナリティクイエナ社）を使用した。精製したＰＣＲ産物に、配列番号３７及び配列番号３８で示される塩基配列を有するプライマーの水溶液（１０ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬずつと、２２μＬの超純水と、２５μＬのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｐｒｅｍｉｘとを加えて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は次のとおりである：９８℃で１分加温した後、９８℃で１０秒間、５５℃で５秒間、７２℃で７秒間のＰＣＲプロフィールを、３０サイクル繰り返し、反応混合液をさらに７２℃で１０秒間反応させた。これ以降のＰＣＲも同様の条件で行った。得られたＰＣＲ産物を精製し、ｌａｃＩプロモーター、ｍａｌＲ遺伝子、及びｒｒｎＢ  Ｔ１ターミネーターをこの順に含むＤＮＡ断片１を得た。
【表１】
2020031550.tif 000003
【００７１】
次に、鋳型としてベクターを、プライマーとして配列番号３９及び配列番号４０で示される塩基配列を有するプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ベクターとしては、ｐＵＣ１９（タカラバイオ株式会社）、ｐＴＷＶ２２８（タカラバイオ株式会社）、又はｐＭＷ１１９（ニッポン・ジーン社）を用いた。得られたＰＣＲ産物を精製し、ベクター配列を含む３種類のＤＮＡ断片２を得た。
【００７２】
ＤＮＡ断片１とベクター配列を含むＤＮＡ断片２とをＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社）を用いて融合した。得られたプラスミドでＥ．  ｃｏｌｉ  ＨＳＴ０２（タカラバイオ株式会社）を形質転換した。翌日、形質転換体のコロニーからプラスミドを回収し、シーケンス解析により、正しい配列のプラスミドを選択した。このプラスミドに対してＰＣＲを行い、ｌａｃＩプロモーター、ｍａｌＲ遺伝子、ｒｒｎＢ  Ｔ１ターミネーターをこの順に含むベクターである、ＤＮＡ断片３を得た。ＤＮＡ断片３には、上記ベクター配列のほぼ全長が含まれる。ｐＵＣ１９又はｐＭＷ１１９を含むＤＮＡ断片３の合成には、配列番号４１及び配列番号４２で示される塩基配列を有するプライマーを用いた。ｐＴＷＶ２２８を含むＤＮＡ断片３の合成には、配列番号４３及び配列番号４４で示される塩基配列を有するプライマーを用いた。
【００７３】
また、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペレーター、スパイダーシルクタンパク質（以下、ＳＳＰともいう。）をコードする核酸、Ｔ７ターミネーター、及びｒｒｎＢターミネーターをこの順に含むＤＮＡ断片４を作製した。上記ＳＳＰをコードする核酸としては、配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するＳＳＰをコードする核酸を用いた。
【００７４】
ＤＮＡ断片３と、ＤＮＡ断片４とを、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘによって融合した。得られた３種類のプラスミドでＥ．  ｃｏｌｉ  ＨＳＴ０２を形質転換した。翌日、形質転換体のコロニーからプラスミドを回収し、シーケンス解析により、正しい配列のプラスミドを選択した。
【００７５】
次に、上記プラスミド内のｌａｃオペレーターを以下の方法で、配列番号２で示される塩基配列を有するオペレーター（Ｓｔｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）に置き換えた。鋳型としてプラスミドを、プライマーとして配列番号４５及び配列番号４６で示される塩基配列を有するプライマー用いて、ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＤｐｎＩで処理をした。得られた３種類のプラスミドでＥ．  ｃｏｌｉ  ＨＳＴ０２を形質転換した。翌日、形質転換体のコロニーからプラスミドを回収し、シーケンス解析により、正しい配列のプラスミドを選択した。得られたＳＳＰ発現ベクターのベクターマップを図２〜図４に示す。
【００７６】
［Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現ベクターの作製］
表２に示すプライマーを用いて、ＤＮＡ断片１の合成と同様にＰＣＲを繰り返し、ＤＮＡ断片５を得た。ＤＮＡ断片５は、ｌａｃＵＶ５プロモーターと、それぞれ配列番号２で示される塩基配列を有する３つのオペレーター（Ｓｔｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）と、を含む。
【００７７】
【表２】
2020031550.tif 000004
【００７８】
また、ＤＮＡ断片１を鋳型として、配列番号５９及び配列番号６０で示される塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片６を得た。ＤＮＡ断片６は、ｌａｃＩプロモーター及びｍａｌＲ遺伝子を含む。
【００７９】
さらに、図５に示すベクター（attlambda-Cm2-Tsp-lac-T7P）を鋳型として、配列番号６１及び配列番号６２で示される塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片７を得た。図５に示すベクターは、ＣＲＩＭプラスミド（Haldimann and Wanner (“Conditional-replication, integration,excision, and retrieval plasmid-host systems for gene structure-functionstudies of bacteria,” J Bacteriology, 183:6384-6393 (2001))）をバックボーンとしたプラスミドである。ＤＮＡ断片７は、attlambda-Cm2-Tsp-lac-T7Pから一部配列を除去した断片であり、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を含む。
【００８０】
ＤＮＡ断片５、６、及び７をＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘによって融合し、図６に示すＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現ベクターを得た。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現ベクターは、クロラムフェニコール（Ｃｍ）耐性遺伝子も含む。
【００８１】
［形質転換］
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現ベクターを、ヘルパープラスミドｐＡＨ６９（米国特許出願公開第２００４／００３３６０８号明細書参照）を用いて、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００１  Ｎｏｖ；１８３（２１）：６３８４−６３９３に記載される方法により、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＨＳＴ０２のａｔｔＨＫ０２２部位に挿入した。単一のプラスミドが組み込まれた形質転換体を、クロラムフェニコールを含むプレート上で選択した。
【００８２】
上記形質転換体のｍａｌＱ遺伝子を、ＰＮＡＳ  Ｊｕｎｅ６，２０００．９７（１２）６６４０−６６４５に記載される方法により破壊した。その後、得られたｍａｌＱ破壊株をＳＳＰ発現ベクターで形質転換し、ｍａｌＱ遺伝子を有さない１９株、２２８株、及び１１９株を得た。１９株、２２８株、及び１１９株は、それぞれをｐＵＣ１９（コピー数：５００〜７００）、ｐＴＷＶ２２８（コピー数：１５〜２０）、及びｐＭＷ１１９（コピー数：５以下）、に由来するＳＳＰ発現ベクターを有する。
【００８３】
［発現誘導］
アンピシリンを含む１０ｍＬのＬＢ培地を用いて、ｍａｌＱ遺伝子を有さない１９株、２２８株、１１９株をコロニーから培養した。ＯＤが１を超えた段階で培養液を５ｍＬずつ２本のチューブに分け、終濃度が１．５％（ｗ／ｖ）になるようにグルコース又はマルトースを培養液に加えた。上記糖を添加する前と上記糖を添加してから２時間後の培養液のＯＤ６００ｎｍの値を表３に示す。糖を添加してから２時間後に集菌してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動写真を図７に示す。図７において、「Ｇ」、「Ｍ」は、それぞれグルコース、マルトースを表す。
【００８４】
【表３】
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【００８５】
上記と同様の実験を、ｍａｌＱ遺伝子を有する１９株、２２８株、及び１１９株を用いて行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動写真を図８に示す。図８において、「Ｇ」、「Ｍ」は、それぞれグルコース、マルトースを表す。
【００８６】
表３に示されるとおり、ｍａｌＱ破壊株は正常な増殖能を有していた。また、図７及び図８に示されるとおり、ｍａｌＱ遺伝子の有無に関わらず、マルトース添加により、ＳＳＰ遺伝子の発現が顕著に誘導されていた。一方、ｍａｌＱ破壊株では、コピー数の低いプラスミドを有する株でより強い発現誘導が認められたのに対し（図７）、ｍａｌＱを有する株では、コピー数の高いプラスミドを有する株でより強い発現誘導が認められた（図８）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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