(57)【要約】【課題】リポ多糖およびリピドＡの阻害のためのミエロペルオキシダーゼ組成物および方法の提供。【解決手段】ミエロペルオキシダーゼおよび過酸化物産生オキシダーゼの組合せを含む組成物ならびにグラム陰性細菌リポ多糖およびリピドＡ内毒素を不活性化するために組成物を使用する方法が提供される。本発明は、例えば、グラム陰性細菌感染を有するヒトまたは動物対象を処置する方法であって、前記対象におけるグラム陰性細菌感染部位にミエロペルオキシダーゼおよびハロゲン化物を含む組成物を投与するステップを含み、前記組成物が、グラム陰性細菌のリポ多糖内毒素活性を阻害する、方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１６年５月２７日に出願された米国仮出願第６２／３４２３８２号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
背景
細菌性毒素は、宿主組織を直接損傷することによって、および免疫系を無効にすることによって感染および疾患を促進する。２種類の細菌性毒素：外毒素および内毒素がある。外毒素は、細菌によって分泌され、細菌に応じて種々の症状を生じる。例えば細菌性外毒素は、ジフテリア、破傷風、ボツリヌス症、コレラ、下痢、猩紅熱、毒素ショック症候群および髄膜炎の原因になる。内毒素は、リポ多糖（「ＬＰＳ」）であり、リポ多糖分子の普遍的な毒性脂質構成成分は、リピドＡである。内毒素は、グラム陰性細菌の細胞壁の不可欠な部分であり、細胞死で遊離される。血液中の内毒素の存在は、発熱、下痢、敗血症性ショックならびに腎臓、肝臓、副腎および肺などの内臓の機能喪失を生じる場合がある。
【０００３】
グラム陰性細菌感染は、細菌の殺滅が内毒素の放出をもたらすことから処置が困難である。例えば、ヤーリッシュ・ヘルクスハイマー反応、細菌性敗血症に似ている徴候および症状を有する状態は、抗菌薬処置の際にＴｒｅｐｏｎｅｍａ（梅毒の原因病原体）およびＢｏｒｅｌｌｉａ（ライム病の原因病原体）などのグラム陰性細菌スピロヘーターから内毒素が放出される場合に生じる。したがって、細菌を死滅させるだけでなく、細菌の死滅により放出される内毒素も不活性化する、グラム陰性細菌に対する殺菌剤に対する必要性がある。下でさらに記述するとおり、本開示は上述および他の必要性に対処する。
【０００４】
ミエロペルオキシダーゼ／過酸化水素／ハロゲン化物系が、グラム陰性細菌を含む細菌性感染病原体を死滅させることは当技術分野において公知である。米国特許第５，８８８，５０５号、第６，２９４，１６８号および第８，９４５，５４０号に開示されるとおり、濃度が制限されている場合、ミエロペルオキシダーゼは、標的微生物に選択的に結合し、過酸化物およびハロゲン化物の存在下で、宿主細胞および常在菌叢などの媒体の他の構成成分を顕著に損傷することなく死滅させる。ミエロペルオキシダーゼの選択的結合特性により、病原性微生物などの標的微生物が、常在菌叢の乳酸菌のメンバーなどの望ましい微生物のものより大きな結合能力をミエロペルオキシダーゼに対して有する場合、標的微生物は、望ましいマイクローブによるミエロペルオキシダーゼの結合をわずかに伴って、または伴わずにミエロペルオキシダーゼに選択的に結合する。これに関して、ミエロペルオキシダーゼは、検査したすべてのグラム陰性細菌の高度の選択的結合および選択的殺滅を実証している。
【０００５】
標的結合ミエロペルオキシダーゼは、過酸化物およびハロゲン化物の存在下で、ハロゲン化物の酸化を触媒し、標的微生物表面での一重項酸素分子（ｓｉｎｇｌｅｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｏｘｙｇｅｎ）（１Ｏ２）への過酸化物の不均化を促進する。一重項酸素分子は、マイクロ秒の寿命および約０．２マイクロメートルの反応半径を有する。このように燃焼性殺菌作用（ｃｏｍｂｕｓｔｉｖｅ  ｍｉｃｒｏｂｉｃｉｄａｌ  ａｃｔｉｏｎ）は、望ましいマイクローブまたは宿主細胞への付随する損傷を最小限伴って、ミエロペルオキシダーゼ結合マイクローブに限定される。このように米国特許第５，８８８，５０５号、第６，２９４，１６８号および第８，９４５，５４０号に開示されるとおり、宿主細胞および宿主の常在菌叢への付随する損傷を最小限伴って病原性微生物に選択的に結合し、死滅させるための、ヒトまたは動物対象の治療用または予防的処置における消毒剤としてミエロペルオキシダーゼを用いることができる。
【０００６】
ミエロペルオキシダーゼ／過酸化水素／ハロゲン化物系が外毒素を解毒することに有効であることも当技術分野において公知である。例えば、Agner,  K.、（１９５０年）、「Studies  On  Peroxidative  Detoxification  of  Purified  Diptheria  Toxin」、JEM、９２巻（４号）３３７〜３４７頁；Agner,  K.、（１９５５年）、「Peroxidative  Detoxification  of  Diptheria  Toxin  Studied  by  Using  I131,  Recueil」、７４巻：３７３〜３７６頁；Agner,  K.、（１９４７年）、「Detoxicating  Effect  of  Verdoperoxidase  on  Toxins」、Nat.４０３４巻：２７１〜２７２頁（破傷風毒素）およびOolら（１９９４年）、「Inactivation  of  Clostridium  difficile  Cytotoxin  by  the  Neutrophil  Myeloperoxidase  System」、J.  Infect.  Dis.１４９巻（２号）：２１５〜２１９頁を参照されたい。
すべての前述の参考文献は、過酸化水素が抗毒素活性のために必要であることを教示している。先行技術は、ミエロペルオキシダーゼが単独で、ハロペルオキシダーゼ活性の非存在下で、内毒素を解毒することに有効であることを教示していない、またはわずかに示唆している。
本開示の発明者は、ミエロペルオキシダーゼがグラム陰性細菌に結合するだけでなく、グラム陰性細菌内毒素（リポ多糖）におよびリピドＡ（毒性の原因となる内毒素の構成成分）にも結合し、そのような結合がリポ多糖およびリピドＡの毒性活性を阻害することを発見した。さらに本開示の発明者は、内毒素リポ多糖／リピドＡのミエロペルオキシダーゼ阻害が次亜塩素酸塩または一重項酸素分子のハロペルオキシダーゼ酵素生成を必要としないことを驚くべきことに発見した。先行技術に、ミエロペルオキシダーゼがハロペルオキシダーゼ活性の非存在下で抗リポ多糖（抗内毒素）および抗リピドＡ剤として有効であることを開示しているものはない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，８８８，５０５号明細書
【特許文献２】米国特許第６，２９４，１６８号明細書
【特許文献３】米国特許第８，９４５，５４０号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Agner,  K.、（１９５０年）、「Studies  On  Peroxidative  Detoxification  of  Purified  Diptheria  Toxin」、JEM、９２巻（４号）３３７〜３４７頁
【非特許文献２】Agner,  K.、（１９５５年）、「Peroxidative  Detoxification  of  Diptheria  Toxin  Studied  by  Using  I131,  Recueil」、７４巻：３７３〜３７６頁
【非特許文献３】Agner,  K.、（１９４７年）、「Detoxicating  Effect  of  Verdoperoxidase  on  Toxins」、Nat.４０３４巻：２７１〜２７２頁
【非特許文献４】Oolら（１９９４年）、「Inactivation  of  Clostridium  difficile  Cytotoxin  by  the  Neutrophil  Myeloperoxidase  System」、J.  Infect.  Dis.１４９巻（２号）：２１５〜２１９頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示は、細菌感染を処置するために使用されるミエロペルオキシダーゼ組成物が、グラム陰性細菌病原体のリポ多糖およびリピドＡ内毒素活性を阻害する（解毒する）追加的有利点を有することを実証している。したがって本開示は、細菌を死滅させ、細菌の死滅で放出される内毒素を阻害する両方で、グラム陰性細菌感染に対する有効な処置を提供する必要性に合致している。
【００１０】
概要
本概要は、発明を実施するための形態において下にさらに記載される概念の選択を簡潔な形式で紹介するために提供される。本概要は、特許請求される主題の重要な特性を特定することを意図せず、特許請求される主題の範囲を決定する補助として使用されることを意図しない。
【００１１】
本開示は、リポ多糖（内毒素）およびグラム陰性細菌の毒性の原因となる内毒素の脂質構成成分、リピドＡに結合し、不活性化するミエロペルオキシダーゼを含む組成物を使用するグラム陰性微生物感染の処置のための方法に関する。本開示は、グラム陰性細菌感染を有するヒトまたは動物対象を処置する方法であって、上記対象におけるグラム陰性細菌感染部位にミエロペルオキシダーゼを含む組成物を投与するステップを含み、上記組成物が、感染部位に存在するリポ多糖およびリピドＡを解毒するように作用する、方法を提供する。
【００１２】
一部の実施形態では、ミエロペルオキシダーゼ組成物は、過酸化物産生オキシダーゼをさらに含む。過酸化物産生オキシダーゼの例として、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼおよびガラクトースオキシダーゼが挙げられる。一部の実施形態では、過酸化物産生オキシダーゼはグルコースオキシダーゼである。一部の実施形態では、ミエロペルオキシダーゼ／オキシダーゼ組成物は、ハロゲン化物をさらに含む。
【００１３】
一部の実施形態では、方法は、オキシダーゼの基質の存在下で感染部位をミエロペルオキシダーゼ／オキシダーゼ組成物に接触させるステップをさらに含む。しかし、ミエロペルオキシダーゼの抗毒素活性は、過酸化水素の産生に依存しない。
【００１４】
一部の実施形態では、ミエロペルオキシダーゼ／オキシダーゼ組成物は、少なくとも２種のアミノ酸をさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも２種のアミノ酸は、グリシン、ｌ−アラニン、ｄ−アラニン、ｌ−アラニン無水物、ｌ−グルタミン、ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、ｌ−ヒスチジン、ｌ−ロイシン、ｄ−ロイシン、ｌ−イソロイシン、ｄ−イソロイシン、ｌ−リシン、ｌ−オルニチン、ｄ−フェニルアラニン、ｌ−フェニルアラニン、ｌ−プロリン、ｌ−ヒドロキシプロリン、ｌ−セリン、タウリン、ｌ−スレオニン、ｄ−スレオニン、ｌ−チロシン、ｌ−バリン、ｄ−バリン、ベータアラニン、ｌ−ベータホモロイシン、ｄ−ベータホモロイシンなどのベータアミノ酸、３−アミノブタン酸、ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、ｄ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、ｌ−３−アミノイソ酪酸、ｄ−３−アミノイソ酪酸、エチル３−アミノブチレート、サルコシンメチルエステル塩酸塩およびニペコ酸、またはそのアルキルエステルもしくは薬学的に許容される塩からなる群から選択される。
【００１５】
他の実施形態では、少なくとも２種のアミノ酸は、グリシン、ｌ−アラニン、ｄ−アラニン、ｌ−アラニン無水物、ｌ−グルタミン、ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、ｌ−ヒスチジン、ｌ−ロイシン、ｄ−ロイシン、ｌ−イソロイシン、ｄ−イソロイシン、ｌ−リシン、ｌ−オルニチン、ｄ−フェニルアラニン、ｌ−フェニルアラニン、ｌ−プロリン、ｌ−ヒドロキシプロリン、ｌ−セリン、タウリン、ｌ−スレオニン、ｄ−スレオニン、ｌ−チロシン、ｌ−バリンおよびｄ−バリンまたはそのアルキルエステルもしくは薬学的に許容される塩からなる群から選択される。
【００１６】
一部の実施形態では、ミエロペルオキシダーゼ／オキシダーゼ組成物は、少なくとも３種のアミノ酸をさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも３種のアミノ酸は、グリシン、ｌ−アラニン、ｄ−アラニン、ｌ−アラニン無水物、ｌ−グルタミン、ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、ｌ−ヒスチジン、ｌ−ロイシン、ｄ−ロイシン、ｌ−イソロイシン、ｄ−イソロイシン、ｌ−リシン、ｌ−オルニチン、ｄ−フェニルアラニン、ｌ−フェニルアラニン、ｌ−プロリン、ｌ−ヒドロキシプロリン、ｌ−セリン、タウリン、ｌ−スレオニン、ｄ−スレオニン、ｌ−チロシン、ｌ−バリン、ｄ−バリン、ベータアラニン、ｌ−ベータホモロイシン、ｄ−ベータホモロイシンなどのベータアミノ酸、３−アミノブタン酸、ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、ｄ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、ｌ−３−アミノイソ酪酸、ｄ−３−アミノイソ酪酸、エチル３−アミノブチレート、サルコシンメチルエステル塩酸塩およびニペコ酸、またはそのアルキルエステルもしくは薬学的に許容される塩からなる群から選択される。
【００１７】
他の態様では、少なくとも３種のアミノ酸は、グリシン、ｌ−アラニン、ｄ−アラニン、ｌ−アラニン無水物、ｌ−グルタミン、ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、ｌ−ヒスチジン、ｌ−ロイシン、ｄ−ロイシン、ｌ−イソロイシン、ｄ−イソロイシン、ｌ−リシン、ｌ−オルニチン、ｄ−フェニルアラニン、ｌ−フェニルアラニン、ｌ−プロリン、ｌ−ヒドロキシプロリン、ｌ−セリン、タウリン、ｌ−スレオニン、ｄ−スレオニン、ｌ−チロシン、ｌ−バリンおよびｄ−バリン、またはそのアルキルエステルもしくは薬学的に許容される塩からなる群から選択される。
【００１８】
一部の実施形態では、３種のアミノ酸は、グリシン、アラニンおよびプロリンである。
【００１９】
一実施形態では、本開示の組成物は、１から５０，０００μｇ／ｍｌのミエロペルオキシダーゼを含む。他の実施形態では、本開示の組成物は、少なくとも２種のアミノ酸をそれぞれ０．１から約５００ｍＭ含む。代表的な一実施形態では、本開示の組成物は、１０から５，０００μｇ／ｍｌのミエロペルオキシダーゼ、０．３から５０ｍＭのグリシン、０．３から５０ｍＭのｌ−アラニン、０．３から５０ｍＭのｌ−プロリンおよび１から５００Ｕ／ｍｌのグルコースオキシダーゼを含む。
【００２０】
本開示の一部の態様では、処置されるヒトまたは動物対象は、歯肉、眼、耳、皮膚、軟部組織、創傷、膣領域、鼠径部領域、褥瘡または熱傷領域のグラム陰性細菌感染に罹患している。一部の実施形態では、感染は、多微生物性感染である。他の実施形態では、感染は、少なくとも部分的に、多剤耐性グラム陰性細菌によって生じている。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
グラム陰性細菌感染を有するヒトまたは動物対象を処置する方法であって、前記対象におけるグラム陰性細菌感染部位にミエロペルオキシダーゼおよびハロゲン化物を含む組成物を投与するステップを含み、前記組成物が、グラム陰性細菌のリポ多糖内毒素活性を阻害する、方法。
（項目２）
前記組成物が、リポ多糖の毒性構成成分であるリピドＡの内毒素活性を阻害する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記組成物が、過酸化物産生オキシダーゼをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記オキシダーゼの基質の存在下で前記組成物を投与するステップをさらに含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記過酸化物産生オキシダーゼが、グルコースオキシダーゼであり、前記基質が、グルコースである、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記組成物が、少なくとも２種のアミノ酸をさらに含む、項目３に記載の方法。
（項目７）
前記少なくとも２種のアミノ酸が、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−スレオニン、Ｄ−スレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｄ−バリン、ベータアラニン、Ｌ−ベータホモロイシン、Ｄ−ベータホモロイシンなどのベータアミノ酸、３−アミノブタン酸、Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｄ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｌ−３−アミノイソ酪酸、Ｄ−３−アミノイソ酪酸、エチル３−アミノブチレート、サルコシンメチルエステル塩酸塩およびニペコ酸、またはそのアルキルエステルもしくは薬学的に許容される塩からなる群から選択される、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記少なくとも２種のアミノ酸が、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−スレオニン、Ｄ−スレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリンおよびＤ−バリン、またはそのアルキルエステルもしくは薬学的に許容される塩からなる群から選択される、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記組成物が、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−スレオニン、Ｄ−スレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｄ−バリン、ベータアラニン、Ｌ−ベータホモロイシン、Ｄ−ベータホモロイシンなどのベータアミノ酸、３−アミノブタン酸、Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｄ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｌ−３−アミノイソ酪酸、Ｄ−３−アミノイソ酪酸、エチル３−アミノブチレート、サルコシンメチルエステル塩酸塩およびニペコ酸、またはそのアルキルエステルもしくは薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも３種のアミノ酸を含む、項目３に記載の方法。
（項目１０）
前記少なくとも３種のアミノ酸が、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−スレオニン、Ｄ−スレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリンおよびＤ−バリン、またはそのアルキルエステルもしくは薬学的に許容される塩からなる群から選択される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記３種のアミノ酸が、グリシン、Ｌ−アラニンおよびＬ−プロリンである、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記組成物が、前記オキシダーゼの基質の存在下にある場合、１分間に１ｍｌあたり１００ｐｍｏｌから５０μｍｏｌのペルオシドを生成するために有効な過酸化物産生オキシダーゼを含む、項目３に記載の方法。
（項目１３）
前記組成物が、１から５０，０００μｇ／ｍｌのミエロペルオキシダーゼを含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記組成物が、前記少なくとも２種のアミノ酸をそれぞれ０．１から約５００ｍＭ含む、項目６に記載の方法。
（項目１５）
前記組成物が、１０から５，０００μｇ／ｍｌのミエロペルオキシダーゼ、０．３から５０ｍＭのグリシン、０．３から５０ｍＭのＬ−アラニン、０．３から５０ｍＭのＬ−プロリンおよび１から５００Ｕ／ｍｌのグルコースオキシダーゼを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１６）
前記ヒトまたは動物対象が、歯肉、眼、耳、皮膚、軟部組織、創傷、膣領域、鼠径部領域、褥瘡または熱傷領域の細菌感染に罹患している、項目１に記載の方法。
（項目１７）
細菌感染を有するヒトまたは動物対象を処置する方法であって、ミエロペルオキシダーゼ、過酸化物産生オキシダーゼおよび少なくとも３種のアミノ酸を含む第１の組成物を前記対象の細菌感染部位に投与するステップ；ならびに前記オキシダーゼの基質を含む第２の組成物を前記対象における前記細菌感染部位に投与するステップを含む、前記第１の組成物が、前記第２の組成物との組合せで作用して、グラム陰性細菌によって産生されたリポ多糖内毒素を不活性化する、方法。
（項目１８）
前記第１の組成物および前記第２の組成物が、前記感染部位への投与前に混合される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記第１の組成物および前記第２の組成物が、前記感染部位に同時に投与される、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
前記第１の組成物および前記第２の組成物が、前記感染部位に順次投与される、項目１７に記載の方法。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
詳細な説明
本開示は、グラム陰性細菌感染を有するヒトまたは動物対象を処置する方法であって、上記対象におけるグラム陰性細菌感染部位にミエロペルオキシダーゼを含む組成物を投与するステップを含み、上記組成物が、感染部位に存在するリポ多糖およびリピドＡを解毒するように作用する、方法を広範に指向する。ミエロペルオキシダーゼ組成物は、リポ多糖（内毒素）およびリピドＡ（毒性の原因となる内毒素の純化された構成成分）に結合し、解毒できる。
【００２２】
一部の実施形態では、ミエロペルオキシダーゼ組成物は、過酸化物産生オキシダーゼをさらに含む。ミエロペルオキシダーゼ組成物が過酸化物産生オキシダーゼを含む実施形態では、ミエロペルオキシダーゼおよび過酸化物産生オキシダーゼは、ミエロペルオキシダーゼの解毒活性を増加させるように相乗的に作用する。
【００２３】
ミエロペルオキシダーゼ／オキシダーゼ組成物は、アミノ酸を含んでまたは含まずにリポ多糖およびリピドＡを解毒することに有効である。アミノ酸が存在する実施形態では、ミエロペルオキシダーゼ／オキシダーゼ組成物は、少なくとも２種のアミノ酸をさらに含む。一部の実施形態では、ミエロペルオキシダーゼ／オキシダーゼ組成物は、３種のアミノ酸をさらに含む。一部の実施形態では、ミエロペルオキシダーゼ組成物は、ハロゲン化物、例えば塩化物、臭化物またはヨウ化物をさらに含む。
【００２４】
一態様では、本開示の方法は、例えば皮膚、眼、耳、口腔、鼻および副鼻腔経路（ｓｉｎｕｓ  ｐａｓｓａｇｅ）、外傷性傷害部位、手術部位などのグラム陰性細菌感染など、微生物感染と本開示のミエロペルオキシダーゼ組成物との直接接触が可能である部位において、ヒトまたは非ヒト哺乳動物対象における易感染性感染（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）の局所処置のために非常に好適である。宿主組織と接触すると、本開示のミエロペルオキシダーゼ組成物は、関連する宿主組織の破壊または常在菌叢の崩壊を伴わずにリピドＡおよびリポ多糖を不活性化できる。
【００２５】
本開示において有用なミエロペルオキシダーゼは、ハロゲン化物：過酸化水素酸化還元酵素（例えばＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙの下のＥＣ  Ｎｏ．１．１１．１．７およびＥＣ  Ｎｏ．１．１１．１．１０）であり、ハロゲン化物、すなわち塩化物、臭化物またはヨウ化物は電子供与体または還元剤であり、過酸化物は電子受容体（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｒｅｃｅｉｖｅｒ）または酸化剤である。ハロペルオキシダーゼ活性が殺菌活性のために必要である一方で、ミエロペルオキシダーゼは、ハロペルオキシダーゼ酵素作用とは非依存的な直接結合を通じてリポ多糖およびリピドＡの両方を阻害する。
【００２６】
大部分の目的のために、本開示の組成物は、一般に少なくとも約０．０５μｇ／ｍｌのミエロペルオキシダーゼを含む。一部の実施形態では、本開示の組成物は、約１から約５０，０００μｇ／ｍｌのミエロペルオキシダーゼ、より好ましくは約５から約１０，０００μｇ／ｍｌのミエロペルオキシダーゼ、さらにより好ましくは約１０から約５，０００μｇ／ｍｌのミエロペルオキシダーゼを含む。
【００２７】
本開示において有用な過酸化物産生オキシダーゼとして、例えばグルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼおよびガラクトースオキシダーゼなどのオキシダーゼが挙げられる。代表的な例として、オキシダーゼがグルコースオキシダーゼであり、その基質がグルコースである場合、本開示の組成物は、約０．０５から約３，０００Ｕ／ｍｌ、より好ましくは約０．１から約１，０００Ｕ／ｍｌ、さらにより好ましくは約１から約５００Ｕ／ｍｌのグルコースオキシダーゼ、および約０．１から約１００ｍＭ、より好ましくは約０．５から約８０ｍＭ、さらにより好ましくは約１から約５０ｍＭグルコースを含み得る。
【００２８】
ミエロペルオキシダーゼは、ハロペルオキシダーゼ酵素作用とは非依存的な直接結合を通じてリポ多糖およびリピドＡ内毒素活性の両方を阻害する。ハロペルオキシダーゼ酵素の実施形態では、方法は、ハロゲン化物およびオキシダーゼの基質の存在下で感染部位を組成物と接触させるステップをさらに含む。
【００２９】
一部の実施形態では、本開示の組成物は、グリシン、ｌ−アラニン、ｄ−アラニン、ｌ−アラニン無水物、ｌ−グルタミン、ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、ｌ−ヒスチジン、ｌ−ロイシン、ｄ−ロイシン、ｌ−イソロイシン、ｄ−イソロイシン、ｌ−リシン、ｌ−オルニチン、ｄ−フェニルアラニン、ｌ−フェニルアラニン、ｌ−プロリン、ｌ−ヒドロキシプロリン、ｌ−セリン、タウリン、ｌ−スレオニン、ｄ−スレオニン、ｌ−チロシン、ｌ−バリン、ｄ−バリン、ベータアラニン、ｌ−ベータホモロイシン、ｄ−ベータホモロイシンなどのベータアミノ酸、３−アミノブタン酸、ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、ｄ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、ｌ−３−アミノイソ酪酸、ｄ−３−アミノイソ酪酸およびエチル３−アミノブチレート、ならびに例えばｌ−アラニンメチルエステル、ｄ−アラニンメチルエステル、ｌ−リシンメチルエステル二塩酸塩、グリシンメチルエステル塩酸塩、ｌ−プロリンメチルエステル塩酸塩、ｌ−バリンエチルエステル塩酸塩およびエチル２−アミノプロパノエートなどのそのアルキルエステル、ならびにサルコシンメチルエステル塩酸塩およびニペコ酸などのＮ−置換アミノ酸からなる群から選択される少なくとも２種のアミノ酸を含む。
【００３０】
他の実施形態では、本開示の組成物は、グリシン、ｌ−アラニン、ｄ−アラニン、ｌ−アラニン無水物、ｌ−グルタミン、ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、ｌ−ヒスチジン、ｌ−ロイシン、ｄ−ロイシン、ｌ−イソロイシン、ｄ−イソロイシン、ｌ−リシン、ｌ−オルニチン、ｄ−フェニルアラニン、ｌ−フェニルアラニン、ｌ−プロリン、ｌ−ヒドロキシプロリン、ｌ−セリン、タウリン、ｌ−スレオニン、ｄ−スレオニン、ｌ−チロシン、ｌ−バリンおよびｄ−バリン、ならびにそのアルキルエステルからなる群から選択される少なくとも２種のアミノ酸を含む。
【００３１】
一部の実施形態では、ミエロペルオキシダーゼ／オキシダーゼ組成物は、少なくとも３種のアミノ酸をさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも３種のアミノ酸は、グリシン、ｌ−アラニン、ｄ−アラニン、ｌ−アラニン無水物、ｌ−グルタミン、ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、ｌ−ヒスチジン、ｌ−ロイシン、ｄ−ロイシン、ｌ−イソロイシン、ｄ−イソロイシン、ｌ−リシン、ｌ−オルニチン、ｄ−フェニルアラニン、ｌ−フェニルアラニン、ｌ−プロリン、ｌ−ヒドロキシプロリン、ｌ−セリン、タウリン、ｌ−スレオニン、ｄ−スレオニン、ｌ−チロシン、ｌ−バリン、ｄ−バリン、ベータアラニン、ｌ−ベータホモロイシン、ｄ−ベータホモロイシンなどのベータアミノ酸、３−アミノブタン酸、ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、ｄ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、ｌ−３−アミノイソ酪酸、ｄ−３−アミノイソ酪酸、エチル３−アミノブチレート、サルコシンメチルエステル塩酸塩およびニペコ酸、またはそのアルキルエステルもしくは薬学的に許容される塩からなる群から選択される。
【００３２】
他の態様では、少なくとも３種のアミノ酸は、グリシン、ｌ−アラニン、ｄ−アラニン、ｌ−アラニン無水物、ｌ−グルタミン、ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、ｌ−ヒスチジン、ｌ−ロイシン、ｄ−ロイシン、ｌ−イソロイシン、ｄ−イソロイシン、ｌ−リシン、ｌ−オルニチン、ｄ−フェニルアラニン、ｌ−フェニルアラニン、ｌ−プロリン、ｌ−ヒドロキシプロリン、ｌ−セリン、タウリン、ｌ−スレオニン、ｄ−スレオニン、ｌ−チロシン、ｌ−バリンおよびｄ−バリン、またはそのアルキルエステルもしくは薬学的に許容される塩からなる群から選択される。
【００３３】
一部の実施形態では、３種のアミノ酸は、グリシン、アラニンおよびプロリンである。
【００３４】
本開示の組成物において用いられるアミノ酸の有用な量は、組成物中のミエロペルオキシダーゼの量および使用環境において存在する条件に依存して変化する。大部分の目的のために、本開示の組成物は、一般にそれぞれのアミノ酸を約０．１から約５００ｍＭ、より好ましくは約０．２から約１００ｍＭ、さらにより好ましくは約０．３から約５０ｍＭ含む。
【００３５】
ミエロペルオキシダーゼ、過酸化物産生オキシダーゼをアミノ酸を伴ってまたは伴わずに含む本開示の組成物は、基質の非存在下、したがってハロペルオキシダーゼ酵素活性の非存在下で内毒素を阻害する。しかし本開示の組成物は、過酸化物産生オキシダーゼの基質との組合せで、過酸化物産生オキシダーゼの基質の非存在下での組成物と比較して、同等のまたはいくらか大きな、拡大したリポ多糖（内毒素）およびリピドＡ阻害（すなわち、ハロペルオキシダーゼ作用）をもたらすことができる。
【００３６】
過酸化物産生オキシダーゼの基質を含む実施形態では、本開示のミエロペルオキシダーゼ組成物の活性は、過酸化物と塩化物または臭化物とが反応し、ハイポハライト（ｈｙｐｏｈａｌｉｔｅ）を形成すること、および過酸化物とハイポハライトとが反応し、一重項酸素分子を形成することによる殺菌である。過酸化物を産生する目的のために特に有用な薬剤として、例えばグルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼおよびガラクトースオキシダーゼなどのオキシダーゼが挙げられる。
【００３７】
例示としての一例では、抗毒素製剤としての使用のために好適な組成物は、約１０から５，０００μｇ／ｍｌのミエロペルオキシダーゼ、０．３から５０ｍＭのグリシン、０．３から５０ｍＭのｌ−アラニン、０．３から５０ｍＭのｌ−プロリンおよび１から５００単位／ｍｌのグルコースオキシダーゼを含み得る。
【００３８】
本開示の組成物は、ハロゲン化物も含み得る。ハロゲン化物が塩化物である場合、本開示の組成物において使用される塩化物の量は、好ましくは塩化物溶液１ｍｌあたり塩化物約１０μｍｏｌから約２００μｍｏｌの範囲内（すなわち、１０から２００ｍＥｑ塩化物／Ｌ）である。血漿中の塩化物の生理学的濃度は、約１０５ｍＥｑ／Ｌである。含まれる場合に本開示の組成物は、液体組成物１ｍｌあたり臭化物約０．５μｍｏｌから臭化物約２０μｍｏｌ（すなわち、０．５から２０ｍＥｑ臭化物／Ｌ）、より好ましくは液体組成物１ｍｌあたり臭化物約１μｍｏｌから臭化物約１０μｍｏｌ（すなわち、１から１０ｍＥｑ臭化物／Ｌ）、最も好ましくは液体組成物１ｍｌあたり臭化物約１００ｎｍｏｌから臭化物約１μｍｏｌを含み得る。
【００３９】
組成物は、薬学的に許容される担体を追加的に含み得る。一部の実施形態では、組成物は、液体担体中に好都合に提供される場合がある。担体がミエロペルオキシダーゼの選択的結合能力または酵素活性（殺菌作用が望ましい場合）を顕著に干渉しない限り、任意の液体担体をこの目的のために一般に使用することができる。代替的に組成物は、液体中への溶解で活性化される固形形態で提供されてもよい。
【００４０】
過酸化物産生オキシダーゼの基質を含む実施形態では、ミエロペルオキシダーゼ／オキシダーゼ系は、組成物の活性剤が使用時に統合される２個の別々の部分に製剤化されるバイナリー製剤としての構築に適している。例えばバイナリー製剤の第１の組成物は、ミエロペルオキシダーゼおよびオキシダーゼを含有する溶液を含み得る。一部の実施形態では、第１の組成物は、２種または３種のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、３種のアミノ酸は、グリシン、ｌ−アラニンおよびｌ−プロリンである。バイナリー製剤の第２の組成物は、オキシダーゼの基質、例えばグルコースオキシダーゼの場合はグルコース（すなわち、デキストロース）を含み得る。基質は、例えば固形ウエハの形態で提供される得る。一部の実施形態では、ミエロペルオキシダーゼ組成物は、オキシダーゼ基質可溶化およびオキシダーゼによる利用を促進するためにアルコールを追加的に含み得る。
【００４１】
一実施形態では、本開示の方法は、ミエロペルオキシダーゼ、過酸化物産生オキシダーゼおよび少なくとも２種のアミノ酸を含む第１の組成物を感染部位に投与するステップ；ならびにオキシダーゼの基質を含む第２の組成物を感染部位に投与するステップを含む。一部の実施形態では、第１の組成物および第２の組成物は、感染部位への投与の前に混合される。一部の実施形態では、第１の組成物および第２の組成物は、感染部位に同時に投与される。一部の実施形態では、第１の組成物および第２の組成物は、感染部位に順次投与される。第１の組成物および第２の組成物は、任意の順序で投与されてよい。
【００４２】
上に記載されるバイナリー製剤は、殺菌作用を発揮するために使用されてよく、内毒素の阻害を増加させるために使用されてよいが、ミエロペルオキシダーゼまたはミエロペルオキシダーゼ−オキシダーゼ複合体によるリポ多糖およびリピドＡの阻害のために必要ではない。
【００４３】
局所適用のために解毒組成物は、局所、バッカル、経鼻スプレー、吸入のためのエアロゾルまたは活性ミエロペルオキシダーゼを細菌感染部位に送達するために有効な任意の他のやり方として、例えば局所、洗浄、経口、経膣または直腸内座薬投与形態でヒトおよび動物対象を含む温血動物に、任意の有効な薬学的に許容される形態で投与されてよい。投与の経路は、感染細菌によって産生されたまたはそれに関連している毒素と組成物との直接接触を得るように好ましくは設計される。本開示の一態様では、本開示の組成物は、例えば歯肉、眼、耳、皮膚、創傷、膣領域、鼠径部領域、褥瘡、熱傷、湿っている可能性が高い包帯、おむつまたは他の被覆材下の領域などの感染したまたは感染し易いヒトまたは動物対象の領域に局所的に送達または投与される。
【００４４】
局所適用のために、薬学的に許容される担体は、液体、クリーム、フォーム、ローション、軟膏、懸濁液、座薬またはゲルの形態をとることができ、追加的に水性または有機溶媒、緩衝剤、乳化剤、ゲル化剤、保湿剤、安定化剤、界面活性剤、湿潤剤、保存剤、徐放性薬剤ならびに少量の、保水剤、封鎖剤、色素、香料および局所投与のための医薬組成物において一般に用いられる他の構成成分を含むことができる。付加的に、本開示の組成物は、対象への適用のための包帯または被覆材に浸透される場合がある。
【００４５】
前述のものは、限定の目的ではなく例示の目的のために示される、次の代表的実施例に関連してより良好に理解される。
【実施例】
【００４６】
種々の薬剤による細菌性内毒素、リポ多糖およびリピドＡの阻害をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ、Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ、Ｓｏｕｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａから入手できるＬｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）Ｅｎｄｏｃｈｒｏｍｅ−Ｋ（商標）キット（「ＬＡＬ」）を使用して研究した。ＬＡＬアッセイは、試料中の細菌性内毒素活性を検出および測定する手段である。次の実施例において使用したＬＡＬアッセイは、発色を検出および測定する動力学的比色分析アッセイである。発色の時間は、試料中の内毒素の量に反比例する。未知試料中の内毒素レベルは、標準曲線との比較によって決定する。試料中に存在する内毒素の量は、内毒素単位（「ＥＵ」）によって示される。Ｅｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）ＬＡＬアッセイは、１００〜０．００１ＥＵ／ｍｌを検出できる。
（実施例１）
【００４７】
本実施例は、ミエロペルオキシダーゼを含む組成物によるリポ多糖内毒素の阻害を実証する。次の４種の薬剤または薬剤の組合せを検査した：（１）ミエロペルオキシダーゼ；（２）グルコースオキシダーゼ；（３）ミエロペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼおよびアミノ酸；ならびに（４）ミエロペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースおよびアミノ酸。
【００４８】
本実施例において使用するミエロペルオキシダーゼ（「ＭＰＯ」）は、ブタミエロペルオキシダーゼ（Ｅｘｏｘｅｍｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｒｏｃｋ、Ａｒｋ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）であった。グルコースオキシダーゼ（「ＧＯ」）は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来であり、Ｂｉｏｚｙｍｅ，Ｉｎｃ．、ＵＫから購入した。ミエロペルオキシダーゼおよびグルコースオキシダーゼを、ＭＰＯまたはＧＯを２回ポリミキシンｂカラムに通し、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔから入手できるＴｏｘｉｎ  Ｅｒａｓｅｒ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｋｉｔ、カタログ番号Ｌ００３３８を使用して検査添加物中に存在するＬＰＳを除去することによってさらに精製した。
【００４９】
手順。保存溶液を次の検査添加物から作製した：ミエロペルオキシダーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）、グルコースオキシダーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）、Ｅ−１０１（酵素）（１ｍｇ／ｍｌ  ＭＰＯ、０．２５ｍｇ／ｍｌ  ＧＯ）、Ｅ−１０１（基質）（最終２７ｍｇ／ｍｌグルコース）、Ｅ−１０１（完全）（１ｍｇ／ｍｌ  ＭＰＯ、０．２５ｍｇ／ｍｌ  ＧＯ、５４ｍｇ／ｍｌグルコース）。
【００５０】
本明細書において使用する用語「Ｅ−１０１（酵素）」は、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５中に１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび０．０２％ｗ／ｖポリソルベート８０を含む水性ビヒクル中の、ミエロペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼならびにアミノ酸グリシン、アラニンおよびプロリンからなる溶液を指す。
【００５１】
本明細書において使用する用語「Ｅ−１０１（基質）」は、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５中に１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび０．０２％ｗ／ｖポリソルベート８０を含む水性ビヒクル中の２７ｍｇ／ｍｌグルコースの溶液を指す。
【００５２】
本明細書において使用する用語「Ｅ−１０１（完全）」は、１パートのＥ−１０１（酵素）と２パートのＥ−１０１（基質）とを組み合わせることによって作製した製剤を指す。
【００５３】
検査を１ウエルあたり１００μＬの最終体積を使用して９６ウエルマイクロタイタープレート上で実施した。試薬を最終所望濃度の２倍に調製し、１ウエルあたり体積５０μＬで加えた。１ウエルあたり５０μＬのＬＰＳ内毒素を加えた。試薬を除くウエルでは、その体積は、Ｅｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）アッセイキットと共に供給された同体積の低内毒素試薬水（「ＬＲＷ」）を用いて置き換えた。
【００５４】
リポ多糖を阻害するミエロペルオキシダーゼ組成物の能力を、検査溶液中の内毒素の量を増加させ、ミエロペルオキシダーゼの量を減少させて、すなわち広範な内毒素：ミエロペルオキシダーゼ比にわたって内毒素阻害を測定することによって決定した。このアプローチは、内毒素利用能が限定されている場合の１ミリグラムのミエロペルオキシダーゼの最大阻害活性の推定を可能にし、グルコースオキシダーゼに対するミエロペルオキシダーゼの、ならびに基質を伴うおよび伴わないグルコースオキシダーゼとの組合せでの阻害活性の比較も可能にした。
【００５５】
ＬＰＳの８種の活性（濃度）を検査した：検査溶液あたり４０ＥＵ、８０ＥＵ、１２０ＥＵ、３００ＥＵ、６００ＥＵ、１００００ＥＵ、２００００ＥＵおよび４００００ＥＵ。ミエロペルオキシダーゼの濃度は、検査溶液１ｍｌあたり１ｍｇから０．０３ｍｇに変化させた。単独で検査する場合グルコースオキシダーゼの濃度は、１ｍｇ／ｍｌから０．０３ｍｇ／ｍｌに変化させた。ミエロペルオキシダーゼとの組合せで検査したグルコースオキシダーゼの濃度は、０．２５ｍｇ／ｍｌから０．００７５ｍｇ／ｍｌに変化させた（Ｅ１０１酵素およびＥ１０１完全でＭＰＯのＧＯに対する比は４：１であった）。系列希釈を、Ｅｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）アッセイキットと共に供給された低内毒素試薬水（ＬＲＷ）を使用して行った。
【００５６】
検査試料中に存在する内毒素活性の量を決定するためにＬＡＬアッセイを実行する前に、リポ多糖を種々の検査添加物と３０分間、予備インキュベートした。予備インキュベーション期間後、１００μＬの発色性Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）溶液（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｋｉｔ  Ｒ１７０８Ｋ）を加え、吸光度における変化をＴｅｃａｎ  Ｓｕｎｒｉｓｅマイクロプレート分光光度計を波長４０５ｎｍで使用して測定した。種々の濃度の検査剤で阻害された内毒素の量を決定し、次に１ミリグラムのミエロペルオキシダーゼあたりで阻害された内毒素単位の数を決定するために値を外挿した。例えば４０ＥＵ  ＬＰＳおよび０．５ｍｇ／ｍｌのＭＰＯを含有する試料が４０ＥＵの完全阻害を生じた場合、次に１ｍｇのＭＰＯによって阻害されたＥＵの数を８０ＥＵと算出した。
【００５７】
結果を下の表１に示す。表１中のデータは、１ｍｇ  ＭＰＯによって阻害された内毒素単位の量を報告している。
【表１】
2020111620.tif 000002
*0.25mg/ml  MPOにより40EUの内35が阻害されたことを、1mg  MPOあたり140EU阻害に外挿する
**0.5mg/ml  GOにより40EUの内35が阻害されたことを、1mg  GOあたり70EU阻害に外挿す
る
***E101(酵素)およびE101(完全)は、MPOおよびGOを4:1の比で含む。阻害活性をMPO  1mg
あたりで算出する。
【００５８】
上のデータは、ミエロペルオキシダーゼがリポ多糖内毒素の強力な阻害剤であることを例示している。データは、１ミリグラムのミエロペルオキシダーゼが１０，０００ＥＵ／ｍＬを超えるＬＰＳを阻害できることを例示している。グルコースオキシダーゼは、ＬＰＳを低濃度で検査した場合にミエロペルオキシダーゼの約半分の阻害効果を示すが、より高いＬＰＳ用量（例えば、４，０００ＥＵ／ｍＬ）では、ＧＯも１０，０００ＥＵ／ｍＬを超えて阻害する。
【００５９】
個々のＭＰＯおよびＧＯとは際だって対照的に、１ミリグラムのミエロペルオキシダーゼと０．２５ミリグラムのグルコースオキシダーゼとの組合せは、グルコースオキシダーゼを伴わずにミエロペルオキシダーゼを用いて達成される効果より数倍大きな阻害効果を示す。同様の結果がグルコースオキシダーゼおよびグルコース（グルコースオキシダーゼの基質）との組合せでのミエロペルオキシダーゼについて見出された。
（実施例２）
【００６０】
本実施例は、ミエロペルオキシダーゼを含む組成物によるリポ多糖の毒性構成成分であるリピドＡの阻害を実証している。本実施例では、リピドＡを阻害するミエロペルオキシダーゼ組成物の能力は、検査溶液中のリピドＡの量を増加させ、ミエロペルオキシダーゼの量を減少させて、すなわち広範な内毒素：ミエロペルオキシダーゼの比にわたって内毒素阻害を測定することによって決定した。検査溶液は、実施例１と同じ構成成分および濃度を有し、手順は同じであった。リピドＡの９種の活性（濃度）を検査した：検査溶液あたり１０ＥＵ、２０ＥＵ、４０ＥＵ、８０ＥＵ、３００ＥＵ、６００ＥＵ、１０００ＥＵ、２０００ＥＵおよび４０００ＥＵ。計算をミエロペルオキシダーゼ１ミリグラムあたりで阻害されたリピドＡ内毒素単位の数を決定するために実施例１と同様に実施した。結果を下の表２に報告する。
【表２】
2020111620.tif 000003
【００６１】
表２中のデータは、リピドＡ活性へのミエロペルオキシダーゼ単独、およびグルコースオキシダーゼとの組合せでのミエロペルオキシダーゼの阻害効果が、リポ多糖活性へのミエロペルオキシダーゼの阻害効果を例示している表１中のデータよりもさらにより劇的であることを例示している。表２中のデータは、グルコースオキシダーゼ単独はリピドＡへの阻害効果をほとんど有さないが、リピドＡへのミエロペルオキシダーゼ単独の阻害効果はＭＰＯ  １ｍｇあたり８，０００ＥＵを超える（リピドＡの４，０００ＥＵの阻害から外挿）ことを示している。同じ４，０００ＥＵリピドＡ濃度で、ＭＰＯとＧＯとの組合せは、ミエロペルオキシダーゼ１ｍｇあたり９２，０００ＥＵを超えるリピドＡへの阻害効果を示す。
【００６２】
これらのデータは、グルコースオキシダーゼおよびミエロペルオキシダーゼが組合せでグラム陰性細菌リピドＡ内毒素活性の強力な阻害剤として相乗的に作用することを示している。さらに実施例１のとおりデータは、内毒素阻害作用がハロペルオキシダーゼ殺菌活性に非依存的であることを示している。リピドＡに関連する阻害作用が、酵素的に活性な調製物において穏やかに減少すると考えられることは注目すべきである。
（実施例３）
【００６３】
表１および２のデータは、内毒素のミエロペルオキシダーゼ、およびミエロペルオキシダーゼ：グルコースオキシダーゼ阻害が検査した内毒素（ＬＰＳまたはリピドＡ）の濃度に比例する、すなわち反応が、検査した内毒素の範囲にわたって内毒素の増加に関して本質的に一次であることを例示している。
【００６４】
内毒素のミエロペルオキシダーゼ阻害の限界を検査するために、高濃度のＬＰＳおよびリピドＡを、１ｍｇ／ｍＬ  ＭＰＯに相当する一定濃度のＭＰＯ、Ｅ１０１酵素（ＭＰＯ：ＧＯ）またはＥ１０１完全（ＭＰＯ：ＧＯ：グルコース）を使用し、１０，０００，０００ＥＵ／ｍＬ（３．３ｍｇ／ｍＬのＬＰＳ、および３．０ｍｇ／ｍＬリピドＡ）から３１２，５００ＥＵ／ｍＬへの２ｎ希釈によってＬＰＳおよびリピドＡの濃度を変化させて検査した。結果を下の表３および４に示す。
【表３−１】
2020111620.tif 000004
【表３−２】
2020111620.tif 000005
【表４】
2020111620.tif 000006
【００６５】
表３および４中のデータは、最も高い濃度（１０，０００，０００ＥＵ／ｍＬ）ではＬＰＳおよびリピドＡは、ＧＯとの組合せでの１ｍｇ／ｍＬ  ＭＰＯ、すなわちＥ１０１酵素（ＭＰＯ：ＧＯ）またはＥ１０１完全（ＭＰＯ：ＧＯ：グルコース）によって完全に阻害され、ＭＰＯ単独は部分的な阻害（遅延ＥＵ動態（ｄｅｌａｙｅｄ  ＥＵ  ｋｉｎｅｔｉｃ））を示したが、これ以上定量することはできなかったことを例示している。
【００６６】
これらのデータは、ミエロペルオキシダーゼおよびグルコースオキシダーゼが相乗的に作用して、グラム陰性細菌のリポ多糖（内毒素）およびリピドＡを阻害することを明らかに示している。さらに、ＭＰＯ／ＧＯの阻害効果がＭＰＯ／ＧＯに加えてグルコースでの阻害効果とほとんど同じであることから、データは内毒素阻害作用がハロペルオキシダーゼ殺菌活性に非依存的であることを示している。
【００６７】
例示的実施形態が例示され、記載されたが、種々の変更を本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく行うことができることが理解される。
【外国語明細書】
2020111620000001.pdf