(57)【要約】      （修正有）【課題】脂肪酸及びある濃度のＥＰＡを有する微生物バイオマス、微生物油を作製する方法の提供。【解決手段】脂肪酸及びある濃度のＥＰＡを有する微生物のバイオマスを作製する方法であって、微生物を、ビタミンＢ１２を含有しない培養培地中で増殖させてバイオマスを生成するステップを含み、前記微生物がヤブレツボカビである、方法。前記培養培地は、脂質不含バイオマス５０ｇ当たり１ｇ未満の酵母エキスをさらに含み、前記微生物は、前記脂肪酸の総重量の少なくとも３％のＥＰＡを生成する、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪酸およびある濃度のＥＰＡを有する微生物のバイオマスを作製する方法であって：
（ａ）前記微生物を発酵容器中で発酵させてバイオマスを生成するステップであって、前記微生物は、前記脂肪酸の総重量の少なくとも３％のＥＰＡを有するバイオマスを生成するヤブレツボカビを含むステップと、
（ｂ）前記容器中の前記バイオマスの量を、前記バイオマス中の所望のＥＰＡレベルを保持するように調整するステップと
を含む方法。
【請求項２】
脂肪酸およびある濃度のＥＰＡを有する微生物のバイオマスを作製する方法であって：
（ａ）前記微生物を発酵容器中で発酵させてバイオマスを生成するステップであって、前記微生物は、前記脂肪酸の総重量の少なくとも３％のＥＰＡを有するバイオマスを生成するヤブレツボカビを含むステップと、
（ｂ）前記バイオマスに対する圧力を、前記バイオマス中の所望のＥＰＡレベルを保持するように調整するステップと
を含む方法。
【請求項３】
脂肪酸およびある濃度のＥＰＡを有する微生物のバイオマスを作製する方法であって：
（ａ）前記微生物を発酵容器中で発酵させて発酵ブロスおよびバイオマスを生成するステップであって、前記微生物は、前記脂肪酸の総重量の少なくとも３％のＥＰＡを有するバイオマスを生成するヤブレツボカビを含むステップと、
（ｂ）前記ブロス中の温度を、前記バイオマス中の所望のＥＰＡレベルを保持するように調整するステップと
を含む方法。
【請求項４】
脂肪酸およびある濃度のＥＰＡを有する微生物のバイオマスを作製する方法であって：
（ａ）前記微生物を、ガスを含む発酵容器中で発酵させてバイオマスを生成するステップであって、前記微生物は、前記脂肪酸の総重量の少なくとも３％のＥＰＡを有するバイオマスを生成するヤブレツボカビを含むステップと、
（ｂ）前記ガス中のＣＯ２レベルを、前記バイオマス中の所望のＥＰＡレベルを保持するように調整するステップと
を含む方法。
【請求項５】
脂肪酸およびある濃度のＥＰＡを有する微生物のバイオマスを作製する方法であって：
（ａ）前記微生物を発酵容器中で発酵させて水相を有する発酵ブロスおよびバイオマスを生成するステップであって、前記水相は、溶解ガスを有し、前記微生物は、前記脂肪酸の総重量の少なくとも３％のＥＰＡを有するバイオマスを生成するヤブレツボカビを含むステップと、
（ｂ）前記溶解ＣＯ２を前記溶解ガスの＞２％に調整するステップと
を含む方法。
【請求項６】
前記バイオマスに対する圧力を、前記バイオマス中の所望のＥＰＡレベルを保持するように調整するステップをさらに含む、請求項１、および３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ブロス中の温度を、前記バイオマス中の所望のＥＰＡレベルを保持するように調整するステップをさらに含む、請求項１、２、および４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
脂肪酸およびある濃度のＥＰＡを有する微生物のバイオマス中のＥＰＡの濃度を増加させる方法であって：
（ａ）前記微生物を、ガスを含む発酵容器中で発酵させてバイオマスを生成するステップであって、前記微生物は、前記脂肪酸の総重量の少なくとも３％のＥＰＡを有するバイオマスを生成するヤブレツボカビを含むステップと、
（ｂ）前記ガスに、前記バイオマス中の前記ＥＰＡの濃度を増加させるために十分なＣＯ２を補給するステップと
を含む方法。
【請求項９】
ＣＯ２の量は、チャンバ中の前記ガスの２％（モル）以上であり、前記バイオマス中の前記ＥＰＡの濃度を、前記脂肪酸の総重量の約４重量％超に増加させる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＯ２の量は、前記チャンバ中の前記ガスの約５％以上から最大２０％（モル）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＣＯ２の量は、前記容器中の前記ガスの約５％以上から最大１５％（モル）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＥＰＡの濃度を、前記脂肪酸の総重量の約４重量％超から最大約４５重量％に増加させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ＥＰＡの濃度を、前記脂肪酸の総重量の約４重量％超から最大約４０重量％に増加させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＥＰＡの濃度を、前記脂肪酸の総重量の約４重量％から、前記脂肪酸の総重量の約６重量％から約３０重量％の範囲に増加させる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ＥＰＡの濃度を、前記総脂肪酸の約１５重量％から前記総脂肪酸の最大約４０重量％に増加させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＥＰＡの濃度を、前記脂肪酸の総重量の２０重量％超に増加させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＥＰＡの濃度を、前記脂肪酸の総重量の約２０重量％から最大約２５重量％に増加させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
脂肪酸およびある濃度のＥＰＡを有する微生物のバイオマス中のＥＰＡの濃度を増加させる方法であって：
（ａ）前記微生物を発酵容器中で発酵させてバイオマスを生成するステップと、
（ｂ）大気圧よりも０．５ｐｓｉ以上高い前記バイオマスに対する圧力を、前記バイオマス中のＥＰＡの濃度を増加させるために十分な時間提供すること
を含む方法。
【請求項１９】
前記容器は、約０．４ｐｓｉから最大約３０ｐｓｉの頭部圧力を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記容器は、約１から最大約３０ｐｓｉの頭部圧力を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記容器は、約１から最大約２０ｐｓｉの頭部圧力を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記圧力を、最大約１２０時間提供する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記バイオマスは、１０ｇ／ｌ以上の密度を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
前記バイオマスは、約１０ｇ／ｌから最大約２５０ｇ／ｌの密度を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記温度を、約３０℃未満に調整する、請求項３に記載の方法。
【請求項２６】
前記温度は、約２２℃未満である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記温度は、約２１℃である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法により作製されたバイオマス。
【請求項２９】
前記バイオマスは、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２０８で寄託された単離された微生物から生成され、脂肪酸を含むことを含み、前記脂肪酸は、ω−３多価不飽和脂肪酸をさらに含み、前記ω−３多価不飽和脂肪酸は、ＤＨＡおよびＥＰＡを、ω−３多価不飽和脂肪酸の総量の約≧９０重量％の量で含み、ＥＰＡの量は、ＥＰＡおよびＤＨＡの総量の約６重量％から最大約６５重量％である、請求項２８に記載のバイオマスから抽出された油。
【請求項３０】
前記ＥＰＡの量は、ＥＰＡおよびＤＨＡの総量の約６重量％から最大２８重量％である、請求項２９に記載の油。
【請求項３１】
前記ＥＰＡの量は、ＥＰＡおよびＤＨＡの総量の約３６重量％から最大約６５重量である、請求項２９に記載の油。
【請求項３２】
前記ＥＰＡの量は、ＥＰＡおよびＤＨＡの総量の約２８重量％から約３６重量％である、請求項２９に記載の油。
【請求項３３】
前記バイオマスは、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２１２で寄託された単離された微生物から生成され、脂肪酸を含み、前記脂肪酸は、ＤＨＡおよびＥＰＡをさらに含み、ＥＰＡの量は、ＥＰＡおよびＤＨＡの総重量の約１５重量％から最大約７０重量％である、請求項２８に記載のバイオマスから抽出された油。
【請求項３４】
前記バイオマスは、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−９６９５で寄託された単離された微生物から生成され、脂肪酸を含み、前記脂肪酸は、ω−３多価不飽和脂肪酸をさらに含み、前記ω−３多価不飽和脂肪酸は、ＤＨＡおよびＥＰＡを、ω−３多価不飽和脂肪酸の総量の約５０重量％から約７０重量％の量で含み、ＥＰＡの量は、ＥＰＡおよびＤＨＡの総重量の総量の約５重量％から最大約６０重量％である、請求項２８に記載のバイオマスから抽出された油。
【請求項３５】
前記ＤＨＡおよびＥＰＡは、前記ω−３脂肪酸の総量の約６０％の量である、請求項３４に記載の油。
【請求項３６】
脂肪酸およびある濃度のＥＰＡを有する微生物のバイオマスを作製する方法であって：
（ａ）前記微生物を、ガスを含む発酵容器中で発酵させてバイオマスを生成するステップであって、前記微生物は、前記脂肪酸の総重量の少なくとも３％のＥＰＡを有するバイオマスを生成するヤブレツボカビを含み、前記微生物は、前記脂肪酸の総重量の少なくとも３％のＥＰＡを有するバイオマスを生成するヤブレツボカビを含むステップと、
（ｂ）前記ガスにＣＯ２を補給するステップと
を含む方法。
【請求項３７】
前記バイオマス、ＥＰＡまたはＤＨＡの量を、前記バイオマスに対する前記圧力を調整する前に計測する、請求項２に記載の方法。
【請求項３８】
前記バイオマス、ＥＰＡまたはＤＨＡの量を、前記ブロス中の前記温度を調整する前に計測する、請求項３に記載の方法。
【請求項３９】
前記バイオマス、ＥＰＡまたはＤＨＡの量を、前記容器中の前記ＣＯ２を調整する前に計測する、請求項４に記載の方法。
【請求項４０】
前記バイオマス、ＥＰＡまたはＤＨＡの量を、溶解ＣＯ２を調整する前に計測する、請求項５に記載の方法。
【請求項４１】
油を生成する方法であって、請求項１〜２７および３６〜４０のいずれか一項に記載の方法によりバイオマスを作製するステップと、前記バイオマスから油を得るステップとを含む方法。
【請求項４２】
前記油を、前記バイオマスから抽出する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
増加濃度のＥＰＡを有する微生物のバイオマスを作製する方法であって、前記微生物を、０．１ｍｇ／Ｌ未満のビタミンＢ１２を含む培養培地中で増殖させてバイオマスを生成するステップを含む方法。
【請求項４４】
前記培養培地は、０．０１ｍｇ／Ｌ未満のビタミンＢ１２を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記培養培地は、０．００１ｍｇ／Ｌ未満のビタミンＢ１２を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記培養培地は、０．０００１ｍｇ／Ｌ未満のビタミンＢ１２を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記培養培地は、ビタミンＢ１２を含有しない、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記培養培地は、脂質不含バイオマス５０ｇ当たり１ｇ未満の酵母エキスをさらに含む、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記培養培地は、脂質不含バイオマス５０ｇ当たり０．５ｇ未満の酵母エキスをさらに含む、請求項４３〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記培養培地は、脂質不含バイオマス５０ｇ当たり０．１ｇ未満の酵母エキスをさらに含む、請求項４３〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＥＰＡ濃度を、０．１ｍｇ／Ｌ超のビタミンＢ１２を含む培養培地中で増殖させた微生物から得られたバイオマス中のＥＰＡ濃度と比較して少なくとも４００％だけ増加させる、請求項４３〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＥＰＡ濃度を、０．０１ｍｇ／Ｌ超のビタミンＢ１２を含む培養培地中で増殖させた微生物からのバイオマス中のＥＰＡ濃度と比較して少なくとも３００％だけ増加させる、請求項４４〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＥＰＡ濃度を、０．００１ｍｇ／Ｌ超のビタミンＢ１２を含む培養培地中で増殖させた微生物からのバイオマス中のＥＰＡ濃度と比較して少なくとも２００％だけ増加させる、請求項４５〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＥＰＡ濃度を、０．０００１ｍｇ／Ｌ超のビタミンＢ１２を含む培養培地中で増殖させた微生物からのバイオマス中のＥＰＡ濃度と比較して少なくとも１００％だけ増加させる、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
増加濃度のＥＰＡを有する微生物のバイオマスを作製する方法であって、前記微生物を、０．１ｍｇ／Ｌ未満のコバルトを含む培養培地中で増殖させてバイオマスを生成するステップを含む方法。
【請求項５６】
前記培養培地は、０．０１ｍｇ／Ｌ未満のコバルトを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記培養培地は、０．００１ｍｇ／Ｌ未満のコバルトを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記培養培地は、０．０００１ｍｇ／Ｌ未満のコバルトを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記培養培地は、コバルトを含有しない、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記微生物は、ヤブレツボカビである、請求項４３〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記微生物は、前記脂肪酸の総重量の少なくとも３％のＥＰＡを生成する、請求項４３〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記培養培地は、少なくとも５％の溶解ＣＯ２レベルを有する、請求項４３〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記培養培地は、少なくとも１０％の溶解ＣＯ２レベルを有する、請求項４３〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記培養培地は、少なくとも１５％の溶解ＣＯ２レベルを有する、請求項４３〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
請求項４３〜６４のいずれか一項に記載の単離されたバイオマス。
【請求項６６】
請求項４３〜６５のいずれか一項に記載のバイオマスから抽出された微生物油。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
[0001]本発明は、単離された微生物ならびにそれらの株および突然変異体、バイオマス、微生物油、組成物、および培養物；微生物油、バイオマス、および突然変異体を生成する方法；ならびに単離された微生物、バイオマス、および微生物油を使用する方法を対象とする。
【０００２】
［背景技術］
[0002]脂肪酸は、炭素鎖の長さおよび飽和特徴に基づいて分類される。脂肪酸は、鎖中に存在する炭素の数に基づいて短鎖脂肪酸、中鎖脂肪酸、または長鎖脂肪酸と呼ばれ、炭素原子間に二重結合が存在しない場合は飽和脂肪酸と呼ばれ、二重結合が存在する場合は不飽和脂肪酸と呼ばれる。不飽和長鎖脂肪酸は、二重結合が１つのみ存在する場合は一不飽和であり、２つ以上の二重結合が存在する場合は多価不飽和である。
【０００３】
[0003]多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は、脂肪酸メチル末端から最初の二重結合の位置に基づいて分類され；ω−３（ｎ−３）脂肪酸は３番目の炭素において最初の二重結合を含有する一方、ω−６（ｎ−６）脂肪酸は６番目の炭素において最初の二重結合を含有する。例えば、ドコサヘキサエン酸（「ＤＨＡ」）は、２２個の炭素からなる鎖長および６個の二重結合を有するω−３長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡ）であり、「２２：６ｎ−３」と呼ばれることが多い。他のω−３ＬＣ−ＰＵＦＡには、「２０：５ｎ−３」と呼ばれるエイコサペンタエン酸（「ＥＰＡ」）および「２２：５ｎ−３」と呼ばれるω−３ドコサペンタエン酸（「ＤＰＡｎ−３」）が含まれる。ＤＨＡおよびＥＰＡは「必須」脂肪酸と呼ばれている。ω−６ＬＣ−ＰＵＦＡには、「２０：４ｎ−６」と呼ばれるアラキドン酸（「ＡＲＡ」）および「２２：５ｎ−６」と呼ばれるω−６ドコサペンタエン酸（「ＤＰＡｎ−６」）が含まれる。
【０００４】
[0004]ω−３脂肪酸は、細胞膜中での存在に起因して細胞生理機能に影響を及ぼし、生物学的に活性な化合物の生成および遺伝子発現を調節し、生合成基質として役立つ生物学的に重要な分子である。Ｒｏｃｈｅ，Ｈ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎｕｔｒ．Ｓｏｃ．５８：３９７−４０１（１９９９）。例えば、ＤＨＡはヒト大脳皮質中の脂質の約１５％〜２０％、網膜中の脂質の３０％〜６０％を占め、精巣および精子中で濃縮され、母乳の重要な構成成分である。Ｂｅｒｇｅ，Ｊ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｂａｒｎａｔｈａｎ，Ｇ．．Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９６：４９−１２５（２００５）。ＤＨＡは脳中のω−３脂肪酸の最大９７％を占め、網膜中のω−３脂肪酸の最大９３％を占める。さらに、ＤＨＡは、胎児および乳児の発達ならびに成人における認知機能の維持に必須である。同上。ω−３脂肪酸はヒト体内でデノボ合成されないため、これらの脂肪酸は栄養源から得なければならない。
【０００５】
[0005]アマニ油および魚油は、良好な食事性ω−３脂肪酸源と考えられている。アマニ油はＥＰＡ、ＤＨＡ、ＤＰＡ、ＡＲＡを含有しないが、身体がＥＰＡを製造するのを可能にするビルディングブロックであるリノレン酸（Ｃ１８：３ｎ−３）を含有する。しかしながら、特に、非健常者間では代謝変換速度は緩慢および変動し得る証拠が存在する。魚油は、特定の種およびそれらの飼料に応じて脂肪酸組成物のタイプおよびレベルの点で大きく変動する。例えば、水産養殖魚は天然魚よりも低レベルのω−３脂肪酸を有する傾向がある。さらに、魚油は環境汚染物質を含有するリスクを有し、安定性の問題および魚臭または魚味を伴い得る。
【０００６】
[0006]ヤブレツボカビは、ヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）の微生物である。ヤブレツボカビには、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）およびヤブレツボカビ属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）のメンバーが含まれ、ＤＨＡおよびＥＰＡを含むω−３脂肪酸の代替源として認識されてきた。米国特許第５，１３０，２４２号明細書参照。これらの海洋従属栄養微生物から生成された油は、対応する魚油または微細藻類油よりも単純な多価不飽和脂肪酸プロファイルを有することが多い。Ｌｅｗｉｓ，Ｔ．Ｅ．，Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１：５８０−５８７（１９９９）。ヤブレツボカビ種の株は、その生物により生成される高い割合の総脂肪酸としてω−３脂肪酸を生成すると報告されている。米国特許第５，１３０，２４２号明細書；Ｈｕａｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７８：６０５−６１０（２００１）；Ｈｕａｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：４５０−４５７（２００３）。しかしながら、単離されたヤブレツボカビは、上記株の中には不所望なレベルのω−６脂肪酸を有し得るものもあり、および／または培養において低い生産性を示すものもあるように、生成されるＬＣ−ＰＵＦＡの同一性および量の点で変動する。したがって、高い生産性および所望のＬＣ−ＰＵＦＡプロファイルを示す微生物の単離が引き続き必要とされている。
【０００７】
［発明の概要］
[0007]本出願人らは、少なくとも３％のＥＰＡを有するバイオマスを生成するヤブレツボカビにより生成されるＥＰＡおよびＤＨＡの量を、微生物の発酵の間の発酵ブロスの水相中の溶解二酸化炭素（ＣＯ２）の量を変動させることによりモジュレートすることができることを見出した。本明細書において、脂肪酸およびある濃度のＥＰＡを有する微生物のバイオマスを作製する方法であって、微生物を、発酵ブロス中の溶解ガスを有する発酵容器中で発酵させてバイオマスを生成するステップであって、微生物は、脂肪酸の総重量の少なくとも３％のＥＰＡを有するバイオマスを生成するヤブレツボカビを含むステップと、溶解ガス中の溶解ＣＯ２レベルを調整することを含む方法が提供される。一実施形態において、溶解ＣＯ２レベルは、バイオマス中の所望のＥＰＡおよび／またはＤＨＡレベルを保持するように調整することができる。さらなる実施形態において、発酵ブロスの水相中の溶解ＣＯ２の量は、総溶解ガスの約３８から約６００ｐｐｍ、特に、総溶解ガスの約３８から約１３５ｐｐｍの範囲である。
【０００８】
[0008]本明細書において、脂肪酸およびある濃度のＥＰＡを有する微生物のバイオマスを作製する方法であって、微生物を、ガスを含む発酵容器中で発酵させてバイオマスを生成するステップであって、微生物は、脂肪酸の総重量の少なくとも３％のＥＰＡを有するバイオマスを生成するヤブレツボカビを含むステップと、ガスにＣＯ２を補給するステップとを含む方法がさらに提供される。補給は、容器にＣＯ２を細胞の発酵により生成される量または周囲条件における量に加えた量で添加することまたは入れることを意味する。一実施形態において、ＣＯ２は、バイオマス中の所望のＥＰＡおよび／またはＤＨＡ量を保持するように容器に補給する。
【０００９】
[0009]本明細書において、脂肪酸およびある濃度のＥＰＡを有する微生物のバイオマスを作製する方法であって、微生物を発酵容器中で発酵させてバイオマスを生成するステップであって、微生物は、脂肪酸の総重量の少なくとも３％のＥＰＡを有するバイオマスを生成するヤブレツボカビを含むステップと、容器中の前記バイオマスの量を調整するステップとを含む方法も提供される。本発明の実施形態において、バイオマスは、バイオマス中の所望のＥＰＡまたはＤＨＡレベルを保持するように調整する。
【００１０】
[0010]脂肪酸およびある濃度のＥＰＡを有する微生物を作製する方法であって、前記微生物を発酵容器中で発酵させてバイオマスを生成するステップであって、微生物は、脂肪酸の総重量の少なくとも３％のＥＰＡを有するバイオマスを生成するヤブレツボカビを含むステップと、前記バイオマスに対する圧力を調整するステップ、例えば、限定されるものではないが、前記容器の背圧を制御するステップとを含む方法。一実施形態において、圧力は、バイオマス中の所望のＥＰＡまたはＤＨＡレベルを保持するように調整する。
【００１１】
[0011]本明細書で提供される別の実施形態において、脂肪酸およびある濃度のＥＰＡを有する微生物を作製する方法であって、微生物を発酵容器中で発酵させて発酵ブロスおよびバイオマスを生成するステップであって、微生物は、脂肪酸の総重量の少なくとも３％のＥＰＡを有するバイオマスを生成するヤブレツボカビを含むステップと、前記ブロス中の温度を調整するステップとを含む方法が提供される。一実施形態において、温度は、バイオマス中の所望のＥＰＡおよび／またはＤＨＡレベルを保持するように調整する。
【００１２】
[0012]種々の実施形態において、ＥＰＡおよびＤＨＡの量を、容器中のＣＯ２の量を増加または減少させることにより、容器の水相または発酵ブロス中の溶解ＣＯ２の量を調整することによりモジュレートすることもできる。溶解ＣＯ２の量は、発酵されるバイオマスの量をさらに調整することにより調整することができる。例えば、細胞をフラスコおよびより大きい発酵容器中で発酵させることによる。ＥＰＡおよびＤＨＡは、温度を変動させることにより、本明細書において提供される実施形態に従って変動させることもできる。溶解ＣＯ２の量は、例えば、容器中の温度を調整することにより、さらに調整することができる。例えば、より低い容器温度は、より高濃度のＥＰＡおよびより低濃度のＤＨＡを生成する。溶解ＣＯ２の量は、容器中の圧力を調整することにより、さらに調整することができる。例えば、圧力の増加は、溶解ＣＯ２を増加させる可能性が高く、このことはバイオマス中のＥＰＡの量を増加させ、ＤＨＡの量を減少させる。上記調整のそれぞれ、例えば、ＣＯ２の補給、バイオマスの増加もしくは減少、温度の増加もしくは減少、または圧力の増加もしくは減少は、バイオマスおよびバイオマスから抽出された任意の油中の所望のＥＰＡおよびＤＨＡレベルを保持するための他の調整のいずれかとそれぞれ組み合わせることができる。溶解ＣＯ２は、ｐＨの変化により調整することもできる。
【００１３】
[0013]一部の実施形態において、ＥＰＡおよびＤＨＡの総量は、脂肪酸およびω−３脂肪酸の総重量の重量基準量と比較して比較的一定のままである。
【００１４】
[0014]さらなる実施形態において、バイオマスのＥＰＡまたはＤＨＡの含有率は、補給ＣＯ２の量、圧力、温度、またはバイオマスを調整する前に計測する。
【００１５】
[0015]任意の理論に拘束されるものではないが、ＥＰＡまたはＤＨＡの量の増加および減少は、発酵ブロスの水相中の溶解ＣＯ２の量に直接関連することならびにＣＯ２、圧力、および温度の上記調整はバイオマス中の溶解ＣＯ２の量を変動させることが仮定される。
【００１６】
[0016]一部の実施形態において、本発明は、増加濃度のＥＰＡを有する微生物のバイオマスを作製する方法であって、微生物を、０．１ｍｇ／Ｌ未満のビタミンＢ１２を含む培養培地中で増殖させてバイオマスを生成するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態において、培養培地は、０．０１ｍｇ／Ｌ未満のビタミンＢ１２を含む。一部の実施形態において、培養培地は、０．００１ｍｇ／Ｌ未満のビタミンＢ１２を含む。さらなる実施形態において、培養培地は、０．０００１ｍｇ／Ｌ未満のビタミンＢ１２を含む。一部の実施形態において、培養培地は、ビタミンＢ１２を含有しない。
【００１７】
[0017]一部の実施形態において、培養培地は、脂質不含バイオマス５０ｇ当たり１ｇ未満の酵母エキスをさらに含む。一部の実施形態において、培養培地は、脂質不含バイオマス５０ｇ当たり０．５ｇ未満の酵母エキスをさらに含む。さらなる実施形態において、培養培地は、脂質不含バイオマス５０ｇ当たり０．１ｇ未満の酵母エキスをさらに含む。
【００１８】
[0018]一部の実施形態において、ＥＰＡ濃度を、０．１ｍｇ／Ｌ超のビタミンＢ１２を含む培養培地中で増殖させた微生物から得られるバイオマス中のＥＰＡ濃度と比較して少なくとも４００％だけ増加させる。一部の実施形態において、ＥＰＡ濃度を、０．０１ｍｇ／Ｌ超のビタミンＢ１２を含む培養培地中で増殖させた微生物からのバイオマス中のＥＰＡ濃度と比較して少なくとも３００％だけ増加させる。さらなる実施形態において、ＥＰＡ濃度を、０．００１ｍｇ／Ｌ超のビタミンＢ１２を含む培養培地中で増殖させた微生物からのバイオマス中のＥＰＡ濃度と比較して少なくとも２００％だけ増加させる。一部の実施形態において、ＥＰＡ濃度を、０．０００１ｍｇ／Ｌ超のビタミンＢ１２を含む培養培地中で増殖させた微生物からのバイオマス中のＥＰＡ濃度と比較して少なくとも１００％だけ増加させる。
【００１９】
[0019]一部の実施形態において、本発明は、増加濃度のＥＰＡを有する微生物のバイオマスを作製する方法であって、微生物を、０．１ｍｇ／Ｌ未満のコバルトを含む培養培地中で増殖させてバイオマスを生成するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態において、培養培地は、０．０１ｍｇ／Ｌ未満のコバルトを含む。一部の実施形態において、培養培地は、０．００１ｍｇ／Ｌ未満のコバルトを含む。さらなる実施形態において、培養培地は、０．０００１ｍｇ／Ｌ未満のコバルトを含む。一部の実施形態において、培養培地は、コバルトを含有しない。
【００２０】
[0020]一部の実施形態において、微生物は、ヤブレツボカビである。一部の実施形態において、微生物は、脂肪酸の総重量の少なくとも３％のＥＰＡを生成する。
【００２１】
[0021]一部の実施形態において、培養培地は、少なくとも５％の溶解ＣＯ２レベルを有する。さらなる実施形態において、培養培地は、少なくとも１０％の溶解ＣＯ２レベルを有する。一部の実施形態において、培養培地は、少なくとも１５％の溶解ＣＯ２レベルを有する。
【００２２】
[0022]本発明は、単離されたバイオマス、および本明細書における方法のいずれかのバイオマスから抽出された微生物油も提供する。
【００２３】
［図面の簡単な説明］
[0023]本発明の種々の実施形態は、本出願の一部を形成する以下の詳細な説明、図面、および添付の配列の説明からより十分に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、チアミン勾配中のＰＴＡ−９６９５の性能を示す。
【図２】図２は、ビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−９６９５の性能を示す。
【図３】図３は、ビオチン勾配中のＰＴＡ−９６９５の性能を示す。
【図４】図４は、パントテン酸Ｃａ勾配中のＰＴＡ−９６９５の性能を示す。
【図５】図５は、ＴＳＦＭ標準液中のＰＴＡ−９６９５の性能を示す。
【図６】図６〜１９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−９６９５の性能を示す。
【図７】図６〜１９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−９６９５の性能を示す。
【図８】図６〜１９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−９６９５の性能を示す。
【図９】図６〜１９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−９６９５の性能を示す。
【図１０】図６〜１９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−９６９５の性能を示す。
【図１１】図６〜１９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−９６９５の性能を示す。
【図１２】図６〜１９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−９６９５の性能を示す。
【図１３】図６〜１９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−９６９５の性能を示す。
【図１４】図６〜１９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−９６９５の性能を示す。
【図１５】図６〜１９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−９６９５の性能を示す。
【図１６】図６〜１９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−９６９５の性能を示す。
【図１７】図６〜１９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−９６９５の性能を示す。
【図１８】図６〜１９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−９６９５の性能を示す。
【図１９】図６〜１９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−９６９５の性能を示す。
【図２０】図２０〜４９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−１０２０８の性能を示す。
【図２１】図２０〜４９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−１０２０８の性能を示す。
【図２２】図２０〜４９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−１０２０８の性能を示す。
【図２３】図２０〜４９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−１０２０８の性能を示す。
【図２４】図２０〜４９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−１０２０８の性能を示す。
【図２５】図２０〜４９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−１０２０８の性能を示す。
【図２６】図２０〜４９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−１０２０８の性能を示す。
【図２７】図２０〜４９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−１０２０８の性能を示す。
【図２８】図２０〜４９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−１０２０８の性能を示す。
【図２９】図２０〜４９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−１０２０８の性能を示す。
【図３０】図２０〜４９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−１０２０８の性能を示す。
【図３１】図２０〜４９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−１０２０８の性能を示す。
【図３２】図２０〜４９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−１０２０８の性能を示す。
【図３３】図２０〜４９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−１０２０８の性能を示す。
【図３４】図２０〜４９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−１０２０８の性能を示す。
【図３５】図２０〜４９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−１０２０８の性能を示す。
【図３６】図２０〜４９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−１０２０８の性能を示す。
【図３７】図２０〜４９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−１０２０８の性能を示す。
【図３８】図２０〜４９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−１０２０８の性能を示す。
【図３９】図２０〜４９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−１０２０８の性能を示す。
【図４０】図２０〜４９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−１０２０８の性能を示す。
【図４１】図２０〜４９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−１０２０８の性能を示す。
【図４２】図２０〜４９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−１０２０８の性能を示す。
【図４３】図２０〜４９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−１０２０８の性能を示す。
【図４４】図２０〜４９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−１０２０８の性能を示す。
【図４５】図２０〜４９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−１０２０８の性能を示す。
【図４６】図２０〜４９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−１０２０８の性能を示す。
【図４７】図２０〜４９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−１０２０８の性能を示す。
【図４８】図２０〜４９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−１０２０８の性能を示す。
【図４９】図２０〜４９は、１０％のＣＯ２におけるビタミンＢ１２勾配中のＰＴＡ−１０２０８の性能を示す。
【００２５】
［発明を実施するための形態］
[0031]本明細書において提供される方法および組成物は、生成する脂肪酸の総重量の少なくとも３％のＥＰＡを有するバイオマスを生成するヤブレツボカビに特に適用可能である。本明細書において提供される少なくとも３％のＥＰＡを有するバイオマスを生成する特定のヤブレツボカビは、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２１２で寄託された種の単離された微生物である。ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２１２に関連する単離された微生物は、ブダペスト条約の下、２００９年７月１４日に、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ），Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９に寄託された。
【００２６】
[0032]少なくとも３％のＥＰＡを有するバイオマスを生成する特定のヤブレツボカビは、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２１２、ＰＴＡ−１０２１３、ＰＴＡ−１０２１４、ＰＴＡ−１０２１５、ＰＴＡ−１０２０８、ＰＴＡ−１０２０９、ＰＴＡ−１０２１０、またはＰＴＡ−１０２１１で寄託された、単離された微生物から選択される。
【００２７】
[0033]本明細書において提供される特定の実施形態は、配列番号１のポリヌクレオチド配列または配列番号１と少なくとも９４％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む１８ｓｒＲＮＡを含む単離された微生物を対象とする。
【００２８】
[0034]本明細書において提供される特定の実施形態は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２１２で寄託された微生物の１８ｓｒＲＮＡポリヌクレオチド配列と少なくとも９４％の同一性を有する１８ｓｒＲＮＡポリヌクレオチド配列を含む単離された微生物を対象とする。
【００２９】
[0035]本明細書において提供される少なくとも３％のＥＰＡを有するバイオマスを生成する特定のヤブレツボカビは、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２０８で寄託された種の単離された微生物を対象とする。
【００３０】
[0036]本明細書において提供される特定の実施形態は、微生物により生成される総脂肪酸が１０重量％超のエイコサペンタエン酸を含む、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２０８で寄託された種の単離された微生物を対象とする。
【００３１】
[0037]本発明の少なくとも３％のＥＰＡを有するバイオマスを生成する特定のヤブレツボカビは、微生物により生成される総脂肪酸が約１０重量％超のエイコサペンタエン酸を含む、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２０８で寄託された種の特徴を有する単離された微生物を対象とする。本明細書において提供される少なくとも３％のＥＰＡを有するバイオマスを生成する特定のヤブレツボカビは、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２０９、ＰＴＡ−１０２１０、またはＰＴＡ−１０２１１で寄託された突然変異株から選択される単離された微生物から選択される。ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２０９、ＰＴＡ−１０２１０、およびＰＴＡ−１０２１１に関連する微生物は、ブダペスト条約の下、２００９年９月２５日に、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ），Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９に寄託された。
【００３２】
[0038]明細書において提供される実施形態は、上記微生物、それらの突然変異株および参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／７２９，０１３号明細書に同定される微生物を対象とする。
【００３３】
[0039]本明細書において提供される実施形態は、トリアシルグリセロール画分のエイコサペンタエン酸含有率が少なくとも約１２重量％である、トリアシルグリセロール画分を生成する単離された微生物を対象とする。
【００３４】
[0040]本明細書において提供される実施形態は、バイオマスの乾燥細胞重量の少なくとも約２０重量％が脂肪酸であり、脂肪酸の約１０重量％超がエイコサペンタエン酸であり、脂肪酸が約５重量％未満のアラキドン酸およびドコサペンタエン酸ｎ−６のそれぞれを含む単離されたバイオマスを対象とする。一部の実施形態において、脂肪酸の少なくとも約２５重量％は、ドコサヘキサエン酸である。
【００３５】
[0041]一部の実施形態において、本発明は、トリアシルグリセロールの少なくとも約１２重量％がエイコサペンタエン酸である、トリアシルグリセロールを含む単離されたバイオマスを対象とする。
【００３６】
[0042]一部の実施形態において、本発明は、脂肪酸が約５重量％未満のオレイン酸、リノール酸、リノレン酸、エイコセン酸、およびエルカ酸のそれぞれをさらに含む、本発明の単離されたバイオマスのいずれかを対象とする。
【００３７】
[0043]本発明は、微生物またはそれに由来する株により生成される総脂肪酸が約１０重量％以下のエイコサペンタエン酸を含む、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−９６９５で寄託されたヤブレツボカビ種の単離されたヤブレツボカビ微生物またはそれに由来する株を対象とする。本明細書において提供される実施形態は、上記微生物またはそれからの株を対象とし、他の関連微生物は参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０２３９５３３号明細書に記載する。
【００３８】
[0044]本明細書において、脂肪酸およびある濃度のＥＰＡを有する微生物のバイオマス中のＥＰＡの濃度を増加させる方法であって、微生物を、ガスを含む発酵容器中で発酵させてバイオマスを生成するステップであって、微生物は、脂肪酸の総重量の少なくとも３％のＥＰＡを有するバイオマスを生成するヤブレツボカビを含むステップと、ガスにＣＯ２を、バイオマス中のＥＰＡの濃度を増加させるために十分な量で補給するステップとを含む方法も提供される。ＥＰＡの濃度の増加は、例えば、ＣＯ２を補給しない同様に発酵させた微生物のＥＰＡの濃度と比較することができ、または周囲条件において同様に発酵させた微生物と比較した場合である。
【００３９】
[0045]別の実施形態において、ＥＰＡの濃度を増加させるために十分なＣＯ２の量は、容器中の総ガスの２％以上である。別の実施形態において、容器中のＣＯ２の量は、容器中の総ガスの約５％以上から最大約２０％である。別の実施形態において、容器中のＣＯ２の量は、容器中の総ガスの約５％以上から最大約１５％である。
【００４０】
[0046]さらなる実施形態において、補給されるＣＯ２の量は、バイオマス中のＥＰＡの濃度を脂肪酸の総重量の約４重量％超、より特定すると、脂肪酸の総重量の約４重量％超から最大約４５重量％、より特定すると、脂肪酸の総重量の約４％超から最大約４０％に増加させるために容器中の総ガスの２％以上である。
【００４１】
[0047]さらなる実施形態において、補給されるＣＯ２の量は、ＥＰＡレベルを脂肪酸の総重量の約４重量％から、約６から３０重量％の範囲に増加させるために十分なものである。別の実施形態において、提供されるＣＯ２の量は、ＥＰＡの濃度を脂肪酸の総重量の約１５重量％から最大約４０重量％に増加させるために十分なものである。別の実施形態において、提供されるＣＯ２の量は、ＥＰＡの濃度を脂肪酸の総重量の２０重量％超に増加させるために十分なものである。別の実施形態において、ＣＯ２は、ＥＰＡの濃度を約２０％から最大約２５％に増加させるために十分な量で提供する。
【００４２】
[0048]別の実施形態において、本明細書において、脂肪酸およびある濃度のＥＰＡを有する微生物のバイオマス中のＥＰＡの濃度を増加させる方法であって、微生物を発酵容器中で発酵させてバイオマスを生成するステップと；バイオマス中のＥＰＡの濃度を増加させるために十分なバイオマスに対する圧力を提供するステップとを含む方法が提供される。ＥＰＡの濃度の増加は、例えば、圧力を提供しない同様に発酵させた微生物のＥＰＡの濃度に比較することができ、または周囲条件において同様に発酵させた微生物と比較した場合である。さらなる実施形態において、バイオマスに対して提供される圧力は、大気圧よりも約０．５ｐｓｉ高い。別の実施形態において、容器は、約０．４ｐｓｉ以上、より特定すると、約０．４ｐｓｉから最大約３０ｐｓｉ、さらにより特定すると、約１から最大約３０ｐｓｉの頭部圧力（または背圧）を有する。別の実施形態において、容器は、約１から最大約２０ｐｓｉの頭部圧力を有する。別の実施形態において、提供される圧力は、バイオマス中のＥＰＡの量を調整するために十分な時間、特に最大１２０時間の時間提供される。
【００４３】
[0049]本明細書において提供される別の実施形態において、脂肪酸およびある濃度のＥＰＡを生成する微生物のバイオマスを作製する方法であって、微生物を発酵容器中で発酵させてバイオマスを生成するステップを含み、微生物は、バイオマス中のＥＰＡの濃度を増加させるために十分な温度において脂肪酸の総重量の少なくとも３％のＥＰＡを有するバイオマスを生成するヤブレツボカビを含む方法が提供される。一部の実施形態において、ＥＰＡレベルを増加させるために十分な温度は、約３０℃未満であり、より特定すると、約２２℃以下であり、より特定すると、温度は、約２１℃以下である。ＥＰＡの濃度の増加は、例えば、温度を調整せずに同様に発酵させた微生物中のＥＰＡの濃度と比較することができ、または周囲条件において同様に発酵させた微生物と比較した場合である。
【００４４】
[0050]さらなる実施形態において、本明細書において提供される方法は、バイオマスおよび抽出油を生成するために発酵の間に生成されるＥＰＡの量を変動させ、提供されるＥＰＡの量は、脂肪酸の総重量の４重量％超、特に約４重量％超から最大約４５重量％、より特定すると、約４重量％超から最大約４０重量％である。さらなる実施形態において、本明細書において提供される方法により生成されるＥＰＡの量は、脂肪酸の総重量の約６重量％から最大約３０重量％の量である。さらなる実施形態において、本明細書において提供される方法により生成されるＥＰＡの量は、脂肪酸の総重量の約１５重量％から最大約４０重量％の量である。さらなる実施形態において、本明細書において提供される方法により生成されるＥＰＡの量は、脂肪酸の総重量の約２０重量％超、より特定すると、約２０重量％から最大約２５重量％の量である。
【００４５】
[0051]さらなる実施形態において、提供される所望のＥＰＡレベルは、脂肪酸の総重量の４重量％超、特に約４重量超から最大約４５重量％、より特定すると、約４重量％超から最大約４０重量％である。別の実施形態において、本明細書において提供される方法により生成される所望のＥＰＡレベルは、脂肪酸の総重量の約６重量％から最大約３０重量％の量である。さらなる実施形態において、本明細書において提供される方法により生成される所望のＥＰＡレベルは、脂肪酸の総重量の約１５重量％から最大約４０重量％の量である。さらなる実施形態において、本明細書において提供される方法により生成される所望のＥＰＡレベルは、脂肪酸の総重量の約２０重量％超、より特定すると、約２０重量％から最大約２５重量％の量である。
【００４６】
[0052]脂肪酸およびある濃度のＥＰＡを有する微生物のバイオマス中のＥＰＡの濃度を増加させる方法であって、微生物を発酵容器中でバイオマスを生成するステップであって、微生物は、脂肪酸の総重量の少なくとも３％のＥＰＡを有するバイオマスを生成するヤブレツボカビを含むステップと、バイオマスをバイオマス中のＥＰＡの濃度を増加させるために十分な量で増加させるステップとを含む方法。一部の実施形態において、ＥＰＡの濃度を増加させるために十分なバイオマスの量は、１０ｇ／ｌ以上の密度を有する。一部の実施形態において、ＥＰＡの濃度を増加させるために十分なバイオマスの量は、約１０ｇ／ｌから最大約２５０ｇ／ｌの密度を有する。ＥＰＡの濃度の増加は、例えば、バイオマスを増加させずに同様に発酵させた微生物中のＥＰＡの濃度と比較することができる。
【００４７】
[0053]一部の実施形態において、より高いＣＯ２レベル（例えば、容器中の総ガスの２％以上、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、５％から２０％、または５から１５％の量のＣＯ２を含む容器中）を含む培養培地中で増殖させたバイオマスのＥＰＡ濃度は、より低いＣＯ２レベル（例えば、それぞれ、容器中の総ガスの２％未満、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、０％から４％、または１％から３％の量のＣＯ２を含む容器中）を含む培養培地中で増殖させた微生物から得られるバイオマス中のＥＰＡ濃度よりも、少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２５０％、少なくとも５００％、少なくとも７５０％、少なくとも１０００％、少なくとも１１００％、少なくとも１２００％、少なくとも１３００％、少なくとも１４００％、少なくとも１５００％、少なくとも１６００％、少なくとも１７００％、少なくとも１８００％、少なくとも１９００％、または少なくとも２０００％高い。例えば、より高いＣＯ２レベル（例えば、容器中の総ガスの２％以上、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、５％から２０％、または５％から１５％の量のＣＯ２を含む容器中）を含む培養培地中で増殖させたバイオマスのＥＰＡ濃度は、周囲ＣＯ２レベルにおける容器中で増殖させた微生物から得られるバイオマス中のＥＰＡ濃度よりも、少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２５０％、少なくとも５００％、少なくとも７５０％、少なくとも１０００％、少なくとも１１００％、少なくとも１２００％、少なくとも１３００％、少なくとも１４００％、少なくとも１５００％、少なくとも１６００％、少なくとも１７００％、少なくとも１８００％、少なくとも１９００％、または少なくとも２０００％高い。
【００４８】
［培養培地中のビタミンＢ１２］
[0054]本明細書において使用される用語「ビタミンＢ１２」は、天然および合成形態の両方における化学的に関連する化合物のクラス、例として、限定されるものではないが、ビタミンＢ１２、コバラミン、シアノコバラミン、およびヒドロキソコバラミンを指す。一部の実施形態において、本発明は、微生物を、低レベルのビタミンＢ１２を有する培養培地中でまたはビタミンＢ１２を有さない培養培地中で増殖させることによりＥＰＡを生成する微生物のバイオマス中のＥＰＡ濃度を増加させる方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、増加濃度のＥＰＡを有する微生物のバイオマスを作製する方法であって、微生物を、０．１ｍｇ／Ｌ未満のビタミンＢ１２を含む培養培地中で増殖させてバイオマス生成するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態において、培養培地は、０．０５ｍｇ／Ｌ未満、０．０１ｍｇ／Ｌ未満、０．００５ｍｇ／Ｌ未満、０．００１ｍｇ／Ｌ未満、０．０００５ｍｇ／Ｌ未満、０．０００１ｍｇ／Ｌ未満のビタミンＢ１２を含み、またはビタミンＢ１２を含まない。
【００４９】
[0055]一部の実施形態において、培養培地は、脂質不含バイオマス５０ｇ当たり１ｇ未満のビタミンＢ１２の源（例えば、酵母エキス、コーンスティープ固体、ダイズ粉、および他の複合窒素源）を含む。一部の実施形態において、培養培地は、脂質不含バイオマス５０ｇ当たり０．８ｇ未満、０．５ｇ未満、０．３ｇ未満、０．１ｇ未満、０．０５ｇ未満、または０．０１ｇ未満のビタミンＢ１２のそのような源を含む。一部の実施形態において、培養培地は、脂質不含バイオマス５０ｇ当たり１ｇ未満の酵母エキス、脂質不含バイオマス５０ｇ当たり０．８ｇ未満の酵母エキス、脂質不含バイオマス５０ｇ当たり０．５ｇ未満の酵母エキス、脂質不含バイオマス５０ｇ当たり０．３ｇ未満の酵母エキス、脂質不含バイオマス５０ｇ当たり０．１ｇ未満の酵母エキス、脂質不含バイオマス５０ｇ当たり０．０５ｇ未満の酵母エキス、または脂質不含バイオマス５０ｇ当たり０．０１ｇ未満の酵母エキスをさらに含む。本明細書において使用される用語「脂質不含バイオマス」は、培養後の微生物の標的脂肪不含乾燥細胞重量を指す。
【００５０】
[0056]一部の実施形態において、より低いビタミンＢ１２レベル（例えば、０．１ｍｇ／Ｌ未満、０．０５ｍｇ／Ｌ未満、０．０１ｍｇ／Ｌ未満、０．００５ｍｇ／Ｌ未満、０．００１ｍｇ／Ｌ未満、０．０００５ｍｇ／Ｌ未満、０．０００１ｍｇ／Ｌ未満のビタミンＢ１２を含み、またはビタミンＢ１２を含まない培養培地中）を含む培養培地中で増殖させたバイオマスのＥＰＡ濃度は、より高いビタミンＢ１２（例えば、少なくとも０．１ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０５ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０１ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．００５ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．００１ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０００５ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０００１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも０．００００５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２をそれぞれ含む培養培地中）を含む培養培地中で増殖させた微生物から得られるバイオマス中のＥＰＡ濃度よりも、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、少なくとも５００％、少なくとも５５０％、少なくとも６００％、少なくとも６５０％、または少なくとも７００％高い。例えば、ビタミンＢ１２を含有しない培養培地中で増殖させたバイオマス中のＥＰＡ濃度は、ビタミンＢ１２（例えば、少なくとも０．０００１ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２）を含む培養培地中で増殖させた微生物から得られるバイオマス中のＥＰＡ濃度よりも、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、少なくとも５００％、少なくとも５５０％、少なくとも６００％、少なくとも６５０％、または少なくとも７００％高い。
【００５１】
[0057]一部の実施形態において、周囲ＣＯ２レベル下でより低いビタミンＢ１２レベル（例えば、０．１ｍｇ／Ｌ未満、０．０５ｍｇ／Ｌ未満、０．０１ｍｇ／Ｌ未満、０．００５ｍｇ／Ｌ未満、０．００１ｍｇ／Ｌ未満、０．０００５ｍｇ／Ｌ未満、０．０００１ｍｇ／Ｌ未満のビタミンＢ１２を含み、またはビタミンＢ１２を含まない培養培地中）を含む培養培地中で増殖させたバイオマスのＥＰＡ濃度は、周囲ＣＯ２レベル下でより高いビタミンＢ１２レベル（例えば、少なくとも０．１ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０５ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０１ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．００５ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．００１ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０００５ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０００１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも０．００００５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２をそれぞれ含む培養培地中）を含む培養培地中で増殖させた微生物から得られるバイオマス中のＥＰＡ濃度よりも、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％高い。一部の実施形態において、周囲ＣＯ２レベル下でより低いビタミンＢ１２レベルを含む培養培地中で増殖させたバイオマスのＥＰＡ濃度は、周囲ＣＯ２レベル下でより高いビタミンＢ１２レベルを含む培養培地中で増殖させた微生物から得られるバイオマス中のＥＰＡ濃度よりも、１００％から７００％、１５０％から６５０％、２００％から６００％、２５０％から５５０％、または３００％から５００％高い。一部の実施形態において、高ＣＯ２レベル（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％の溶解ＣＯ２レベル）下でより低いビタミンＢ１２レベルを含む培養培地中で増殖させたバイオマスのＥＰＡ濃度は、高ＣＯ２レベル下でより高いビタミンＢ１２レベルを含む培養培地中で増殖させた微生物から得られるバイオマス中のＥＰＡ濃度よりも、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％高い。一部の実施形態において、高ＣＯ２レベル（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％の溶解ＣＯ２レベル）下でより低いビタミンＢ１２レベルを含む培養培地中で増殖させたバイオマスのＥＰＡ濃度は、高ＣＯ２レベル下でより高いビタミンＢ１２レベルを含む培養培地中で増殖させた微生物から得られるバイオマス中のＥＰＡ濃度よりも、５％から２００％、１０％から１７５％、１５％から１５０％、２０％から１２５％、または２５％から１００％高い。例えば、周囲ＣＯ２レベル下でビタミンＢ１２を含まない培養培地中で増殖させたバイオマスのＥＰＡ濃度は、周囲ＣＯ２レベル下でビタミンＢ１２（例えば、少なくとも０．０００１ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２）を含む培養培地中で増殖させた微生物から得られるバイオマス中のＥＰＡ濃度よりも、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％高い。別の例において、少なくとも１０％の溶解ＣＯ２レベル下でビタミンＢ１２を含まない培養培地中で増殖させたバイオマスのＥＰＡ濃度は、少なくとも１０％の溶解ＣＯ２レベル下でビタミンＢ１２（例えば、少なくとも０．０００１ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２）を含む培養培地中で増殖させた微生物から得られるバイオマス中のＥＰＡ濃度よりも、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％高い。
【００５２】
[0058]一部の実施形態において、ＥＰＡ濃度は、０．１ｍｇ／Ｌ超のビタミンＢ１２を有する培養培地中で増殖させた同一微生物と比較して、０．１ｍｇ／Ｌ未満のビタミンＢ１２を有する培養培地中で増殖させた微生物のバイオマス中で少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％だけ増加させる。一部の実施形態において、ＥＰＡ濃度は、０．０１ｍｇ／Ｌ超のビタミンＢ１２を有する培養培地中で増殖させた同一微生物と比較して、０．０１ｍｇ／Ｌ未満のビタミンＢ１２を有する培養培地中で増殖させた微生物のバイオマス中で少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％だけ増加させる。一部の実施形態において、ＥＰＡ濃度は、０．００１ｍｇ／Ｌ超のビタミンＢ１２を有する培養培地中で増殖させた同一微生物と比較して、０．００１ｍｇ／Ｌ未満のビタミンＢ１２を有する培養培地中で増殖させた微生物のバイオマス中で少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％だけ増加させる。さらなる実施形態において、ＥＰＡ濃度は、０．０００１ｍｇ／Ｌ超のビタミンＢ１２を有する培養培地中で増殖させた同一微生物と比較して、０．０００１ｍｇ／Ｌ未満のビタミンＢ１２を有する培養培地中で増殖させた微生物のバイオマス中で少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％だけ増加させる。一部の実施形態において、ＥＰＡ濃度は、ある量のビタミンＢ１２を含有する培養培地中で増殖させた同一微生物と比較して、ビタミンＢ１２を有さない培養培地中で増殖させた微生物のバイオマス中で少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％だけ増加させる。バイオマス中のＥＰＡ濃度の増加の測定は、より多量のビタミンＢ１２を有する培養培地中で微生物を増殖させること、より少量のビタミンＢ１２を有する培養培地中で同一微生物を増殖させること、およびそれぞれの培養物から得られたバイオマス中のＥＰＡ濃度を比較することにより行うことができる。この測定において、より少量またはより多量のビタミンＢ１２を有する培養培地の含有物は、それらのビタミンＢ１２のレベルを除き同一である。
【００５３】
[0059]一部の実施形態において、少なくとも０．１ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０５ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０１ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．００５ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．００１ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０００５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも０．０００１ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を含む培養培地中で増殖させた微生物のバイオマスのＥＰＡ濃度は、総脂肪酸の少なくとも１重量％、少なくとも２重量％、少なくとも３重量％、少なくとも４重量％、または少なくとも５重量％のＥＰＡである。一部の実施形態において、少なくとも０．１ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０５ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０１ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．００５ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．００１ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０００５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも０．０００１ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を含む培養培地中で増殖させた微生物のバイオマスのＥＰＡ濃度は、総脂肪酸の１重量％から５０重量％、１重量％から４０重量％、１重量％から３０重量％、１重量％から２０重量％、２重量％から５０重量％、２重量％から４０重量％、２重量％から３０重量％、または２重量％から２０重量％のＥＰＡである。
【００５４】
［培養培地中のコバルト］
[0060]一部の実施形態において、本発明は、増加濃度のＥＰＡを有する微生物のバイオマスを作製する方法であって、微生物を、０．１ｍｇ／Ｌ未満のコバルトを含む培養培地中で増殖させてバイオマスを生成するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態において、培養培地は、０．０５ｍｇ／Ｌ未満、０．０１ｍｇ／Ｌ未満、０．００５ｍｇ／Ｌ未満、０．００１ｍｇ／Ｌ未満、０．０００５ｍｇ／Ｌ未満、０．０００１ｍｇ／Ｌ未満のコバルトを含み、またはコバルトを含まない。
【００５５】
[0061]一部の実施形態において、培養培地は、脂質不含バイオマス５０ｇ当たり１ｇ未満の酵母エキス、脂質不含バイオマス５０ｇ当たり０．８ｇ未満の酵母エキス、脂質不含バイオマス５０ｇ当たり０．５ｇ未満の酵母エキス、脂質不含バイオマス５０ｇ当たり０．３ｇ未満の酵母エキス、脂質不含バイオマス５０ｇ当たり０．１ｇ未満の酵母エキス、脂質不含バイオマス５０ｇ当たり０．０５ｇ未満の酵母エキス、または脂質不含バイオマス５０ｇ当たり０．０１ｇ未満の酵母エキスをさらに含む。
【００５６】
[0062]一部の実施形態において、より低いコバルトレベル（例えば、０．１ｍｇ／Ｌ未満、０．０５ｍｇ／Ｌ未満、０．０１ｍｇ／Ｌ未満、０．００５ｍｇ／Ｌ未満、０．００１ｍｇ／Ｌ未満、０．０００５ｍｇ／Ｌ未満、０．０００１ｍｇ／Ｌ未満のコバルトを含み、またはコバルトを含まない培養培地中）を含む培養培地中で増殖させたバイオマスのＥＰＡ濃度は、より高いコバルトレベル（例えば、少なくとも０．１ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０５ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０１ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．００５ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．００１ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０００５ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０００１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも０．００００５ｍｇ／Ｌのコバルトをそれぞれ含む培養培地中）を含む培養培地中で増殖させた微生物から得られるバイオマス中のＥＰＡ濃度よりも、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、少なくとも５００％、少なくとも５５０％、少なくとも６００％、少なくとも６５０％、または少なくとも７００％高い。例えば、コバルトを含有しない培養培地中で増殖させたバイオマスのＥＰＡ濃度は、コバルト（例えば、少なくとも０．０００１ｍｇ／Ｌのコバルト）を含む培養培地中で増殖させた微生物から得られるバイオマス中のＥＰＡ濃度よりも、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、少なくとも５００％、少なくとも５５０％、少なくとも６００％、少なくとも６５０％、または少なくとも７００％高い。
【００５７】
[0063]一部の実施形態において、周囲ＣＯ２レベル下でより低いコバルトレベル（例えば、０．１ｍｇ／Ｌ未満、０．０５ｍｇ／Ｌ未満、０．０１ｍｇ／Ｌ未満、０．００５ｍｇ／Ｌ未満、０．００１ｍｇ／Ｌ未満、０．０００５ｍｇ／Ｌ未満、０．０００１ｍｇ／Ｌ未満のコバルトを含み、またはコバルトを含まない培養培地中）を含む培養培地中で増殖させたバイオマスのＥＰＡ濃度は、周囲ＣＯ２レベル下でより高いコバルトレベル（例えば、少なくとも０．１ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０５ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０１ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．００５ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．００１ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０００５ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０００１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも０．００００５ｍｇ／Ｌのコバルトをそれぞれ含む培養培地中）を含む培養培地中で増殖させた微生物から得られるバイオマス中のＥＰＡ濃度よりも、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％高い。一部の実施形態において、周囲ＣＯ２レベル下でより低いコバルトレベルを含む培養培地中で増殖させたバイオマスのＥＰＡ濃度は、周囲ＣＯ２レベル下でより高いコバルトレベルを含む培養培地中で増殖させた微生物から得られるバイオマス中のＥＰＡ濃度よりも、１００％から７００％、１５０％から６５０％、２００％から６００％、２５０％から５５０％、または３００％から５００％高い。一部の実施形態において、高ＣＯ２レベル下でより低いコバルトレベル（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％の溶解ＣＯ２レベル）を含む培養培地中で増殖させたバイオマスのＥＰＡ濃度は、高ＣＯ２レベル下でより高いコバルトレベルを含む培養培地中で増殖させた微生物から得られるバイオマス中のＥＰＡ濃度よりも、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％高い。一部の実施形態において、高ＣＯ２レベル（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％の溶解ＣＯ２レベル）下でより低いコバルトレベルを含む培養培地中で増殖させたバイオマスのＥＰＡ濃度は、高ＣＯ２レベル下でより高いコバルトレベルを含む培養培地中で増殖させた微生物から得られるバイオマス中のＥＰＡ濃度よりも、５％から２００％、１０％から１７５％、１５％から１５０％、２０％から１２５％、または２５％から１００％高い。例えば、周囲ＣＯ２レベル下でコバルトを含まない培養培地中で増殖させたバイオマスのＥＰＡ濃度は、周囲ＣＯ２レベル下でコバルト（例えば、少なくとも０．０００１ｍｇ／Ｌのコバルト）を含む培養培地中で増殖させた微生物から得られるバイオマス中のＥＰＡ濃度よりも、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％高い。別の例として、少なくとも１０％の溶解ＣＯ２レベル下でコバルトを含まない培養培地中で増殖させたバイオマスのＥＰＡ濃度は、少なくとも１０％の溶解ＣＯ２レベル下でコバルト（例えば、少なくとも０．０００１ｍｇ／Ｌのコバルト）を含む培養培地中で増殖させた微生物から得られるバイオマス中のＥＰＡ濃度よりも、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％高い。
【００５８】
[0064]一部の実施形態において、ＥＰＡ濃度は、０．１ｍｇ／Ｌ超のコバルトを有する培養培地中で増殖させた同一微生物と比較して０．１ｍｇ／Ｌ未満のコバルトを有する培養培地中で増殖させた微生物のバイオマス中で少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％だけ増加させる。一部の実施形態において、ＥＰＡ濃度は、０．０１ｍｇ／Ｌ超のコバルトを有する培養培地中で増殖させた同一微生物と比較して０．０１ｍｇ／Ｌ未満のコバルトを有する培養培地中で増殖させた微生物のバイオマス中で少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％だけ増加させる。一部の実施形態において、ＥＰＡ濃度は、０．００１ｍｇ／Ｌ超のコバルトを有する培養培地中で増殖させた同一微生物と比較して０．００１ｍｇ／Ｌ未満のコバルトを有する培養培地中で増殖させた微生物のバイオマス中で少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％だけ増加させる。さらなる実施形態において、ＥＰＡ濃度は、０．０００１ｍｇ／Ｌ超のコバルトを有する培養培地中で増殖させた同一微生物と比較して０．０００１ｍｇ／Ｌ未満のコバルトを有する培養培地中で増殖させた微生物のバイオマス中で少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％だけ増加させる。一部の実施形態において、ＥＰＡ濃度は、ある量のコバルトを含有する培養培地中で増殖させた同一微生物と比較してコバルトを有さない培養培地中で増殖させた微生物のバイオマス中で少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％だけ増加させる。バイオマス中のＥＰＡ濃度の増加の測定は、より多量のコバルトを有する培養培地中で微生物を増殖させること、より少量のコバルトを有する培養培地中で同一微生物を増殖させること、およびそれぞれの培養物から得られたバイオマス中のＥＰＡ濃度を比較することにより行うことができる。この測定において、より少量またはより多量のコバルトを有する培養培地の含有物は、それらのコバルトのレベルを除き同一である。
【００５９】
[0065]一部の実施形態において、少なくとも０．１ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０５ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０１ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．００５ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．００１ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０００５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも０．０００１ｍｇ／Ｌのコバルトを含む培養培地中で増殖させた微生物のバイオマスのＥＰＡ濃度は、総脂肪酸の少なくとも１重量％、少なくとも２重量％、少なくとも３重量％、少なくとも４重量％、または少なくとも５重量％のＥＰＡである。一部の実施形態において、少なくとも０．１ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０５ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０１ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．００５ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．００１ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０００５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも０．０００１ｍｇ／Ｌのコバルトを含む培養培地中で増殖させた微生物のバイオマスのＥＰＡ濃度は、総脂肪酸の１重量％から５０重量％、１重量％から４０重量％、１重量％から３０重量％、１重量％から２０重量％、２重量％から５０重量％、２重量％から４０重量％、２重量％から３０重量％、または２重量％から２０重量％のＥＰＡである。
【００６０】
[0066]少量のビタミンＢ１２、酵母エキス、および／またはコバルトを含有する培養培地は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％の溶解ＣＯ２レベルをさらに含み得る。本発明は、本明細書において開示される方法の単離されたバイオマス、および本方法のバイオマスから抽出された微生物油を対象とする。
【００６１】
[0067]本発明は、本発明の微生物のいずれかまたはそれらの混合物を含む単離された培養物を対象とする。
【００６２】
[0068]本発明は、本発明の微生物もしくはバイオマスのいずれかまたはそれらの混合物を含む、非ヒト動物またはヒト用の食品、化粧品、または医薬組成物を対象とする。
【００６３】
[0069]本発明は、少なくとも約２０重量％のエイコサペンタエン酸および約５重量％未満のアラキドン酸、ドコサペンタエン酸ｎ−６、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、エイコセン酸、エルカ酸、およびステアリドン酸のそれぞれを含む微生物油を対象とする。一部の実施形態において、微生物油は、少なくとも約２５重量％のドコサヘキサエン酸をさらに含む。
【００６４】
[0070]本発明は、トリアシルグリセロール画分中の脂肪酸の少なくとも約１２重量％がエイコサペンタエン酸であり、トリアシルグリセロール画分中の脂肪酸の少なくとも約２５重量％未満がドコサヘキサエン酸であり、トリアシルグリセロール画分中の脂肪酸の約５重量％がアラキドン酸である、少なくとも約１０重量％のトリアシルグリセロール画分を含む微生物油を対象とする。
【００６５】
[0071]本発明は、本発明の微生物油のいずれかを含む、非ヒト動物またはヒト用の食品、化粧品、または医薬組成物である。一部の実施形態において、食品は、調製粉乳である。一部の実施形態において、調製粉乳は未熟児に好適である。一部の実施形態において、食品は、乳、飲料、治療用飲料、栄養飲料、またはそれらの組合せである。一部の実施形態において、食品は、非ヒト動物用食物またはヒト用食物のための添加物である。一部の実施形態において、食品は栄養サプリメントである。一部の実施形態において、食品は動物用飼料である。一部の実施形態において、動物用飼料は水産養殖飼料である。一部の実施形態において、動物用飼料は、家畜用飼料、動物園動物用飼料、使役動物用飼料、畜類用飼料、またはそれらの組合せである。
【００６６】
[0072]本発明は、ω−３脂肪酸を含む微生物油を生成する方法であって、本発明の単離された微生物のいずれかまたはそれらの混合物を培養物中で増殖させてω−３脂肪酸を含む油を生成するステップを含む方法を対象とする。一部の実施形態において、本方法は、油を抽出することをさらに含む。
【００６７】
[0073]本発明は、ω−３脂肪酸を含む微生物油を生成する方法であって、本発明のバイオマスのいずれかから、ω−３脂肪酸を含む油を抽出するステップを含む方法を対象とする。一部の実施形態において、微生物油は、有機溶媒抽出プロセス、例えばヘキサン抽出を使用して抽出する。一部の実施形態において、微生物油は、無溶媒抽出プロセスを使用して抽出する。
【００６８】
[0074]本発明は、本発明の方法により生成された微生物油を対象とする。
【００６９】
[0075]本発明は、本発明のバイオマスを生成する方法であって、本発明の単離された微生物のいずれかまたはそれらの混合物を培養物中で増殖させてバイオマスを生成するステップを含む方法を対象とする。
【００７０】
[0076]本発明は、本発明の方法により生成されたバイオマスを対象とする。
【００７１】
[0077]本発明は、本発明の突然変異株を生成する方法であって、本発明の微生物のいずれかを突然変異誘発させるステップと、突然変異株を単離するステップとを含む方法を対象とする。
【００７２】
[0078]本発明は、炎症または炎症に関連する病態の治療用の医薬品の製造のための、本発明の単離された微生物、バイオマス、もしくは微生物油のいずれか、またはそれらの混合物の使用を対象とする。
【００７３】
[0079]本発明は、炎症または炎症に関連する病態の治療のための、本発明の単離された微生物、バイオマス、もしくは微生物油のいずれか、またはそれらの混合物の使用を対象とする。
【００７４】
[0080]本発明は、炎症または炎症に関連する病態の治療において使用される、本発明の単離された微生物、バイオマス、もしくは微生物油のいずれか、またはそれらの混合物を対象とする。
【００７５】
[0081]本発明は、炎症または炎症に関連する病態の治療を必要とする対象において炎症または炎症に関連する病態を治療する方法であって、本発明の単離された微生物、バイオマス、もしくは微生物油のいずれか、またはそれらの混合物、および薬学的に許容可能な担体を対象に投与するステップを含む方法を対象とする。
【００７６】
[0082]本発明は、本発明の微生物から微生物油、およびバイオマスを生成する方法、ならびに微生物、バイオマス、および微生物油を使用する方法を対象とする。
【００７７】
［微生物］
[0083]一部の実施形態において、本発明で使用される微生物細胞は、ラビリンチュラ菌門（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｏｔａ）の微生物である。一部の実施形態において、ラビリンチュラ菌門（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｏｔａ）の微生物細胞は、ヤブレツボカビ、例えば、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）またはトラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）である。本発明によれば、用語「ヤブレツボカビ」は、ヤブレツボカビ科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｃｅａｅ）を含むヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）の任意のメンバーを指し、用語「ラビリンチュラ」は、ラビリンチュラ科（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａｃｅａｅ）を含むラビリンチュラ目（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａｌｅｓ）の任意のメンバーを指す。
【００７８】
[0084]ラビリンチュラ科（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａｃｅａｅ）のメンバーは、以前はヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）のメンバーであると考えられていたが、近年、このような生物の分類学上の分類が見直され、現在は、ラビリンチュラ科（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａｃｅａｅ）はラビリンチュラ目（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａｌｅｓ）のメンバーであると考えられている。ラビリンチュラ目（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａｌｅｓ）およびヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）の双方とも、ラビリンチュラ菌門（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｏｔａ）のメンバーであると考えられている。分類学の理論家は、現在、概してこれらの微生物群の双方をストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅ）系統の藻類または藻類様原生生物とともに位置付けている。ヤブレツボカビおよびラビリンチュラの現行の分類学上の位置付けは以下のとおり要約することができる：
界：ストラメノパイラ（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌａ）（クロミスタ（Ｃｈｒｏｍｉｓｔａ））
門：ラビリンチュラ菌門（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｏｔａ）（不等毛藻類（Ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔａ））
綱：ラビリンチュラ綱（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｅｔｅｓ）（ラビリンチュラ類（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａｅ））
目：ラビリンチュラ目（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａｌｅｓ）
科：ラビリンチュラ科（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａｃｅａｅ）
目：ヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）
科：ヤブレツボカビ科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｃｅａｅ）
【００７９】
[0085]本発明の目的上、ヤブレツボカビとして記載される微生物細胞株には、以下の生物が含まれる：目：ヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）；科：ヤブレツボカビ科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｃｅａｅ）；属：トラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）（種：エスピー（ｓｐ．）、アルジメンタレ（ａｒｕｄｉｍｅｎｔａｌｅ）、アウレウム（ａｕｒｅｕｍ）、ベンチコラ（ｂｅｎｔｈｉｃｏｌａ）、グロボスム（ｇｌｏｂｏｓｕｍ）、キンネイ（ｋｉｎｎｅｉ）、モチブム（ｍｏｔｉｖｕｍ）、ムルチルジメンタレ（ｍｕｌｔｉｒｕｄｉｍｅｎｔａｌｅ）、パキデルマム（ｐａｃｈｙｄｅｒｍｕｍ）、プロリフェルム（ｐｒｏｌｉｆｅｒｕｍ）、ロセウム（ｒｏｓｅｕｍ）、およびストリアツム（ｓｔｒｉａｔｕｍ））、ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属（種：エスピー（ｓｐ．）、アモエボイデア（ａｍｏｅｂｏｉｄｅａ）、ケルグエレンシス（ｋｅｒｇｕｅｌｅｎｓｉｓ）、ミヌタ（ｍｉｎｕｔａ）、プロフンダ（ｐｒｏｆｕｎｄａ）、ラジアタ（ｒａｄｉａｔａ）、サイレンス（ｓａｉｌｅｎｓ）、サルカリアナ（ｓａｒｋａｒｉａｎａ）、シゾキトロプス（ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｏｐｓ）、ウィスルゲンシス（ｖｉｓｕｒｇｅｎｓｉｓ）、ヨルケンシス（ｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）、およびエスピー（ｓｐ．）ＢＰ−５６０１）、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）（種：エスピー（ｓｐ．）、アグレガツム（ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）、リムナセウム（ｌｉｍｎａｃｅｕｍ）、マングロベイ（ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）、ミヌツム（ｍｉｎｕｔｕｍ）、およびオクトスポルム（ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｍ））、ヤポノキトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属（種：エスピー（ｓｐ．）、マリヌム（ｍａｒｉｎｕｍ））、アプラノキトリウム属（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）（種：エスピー（ｓｐ．）、ハリオチジス（ｈａｌｉｏｔｉｄｉｓ）、ケルグエレンシス（ｋｅｒｇｕｅｌｅｎｓｉｓ）、プロフンダ（ｐｒｏｆｕｎｄａ）、およびストッキノイ（ｓｔｏｃｃｈｉｎｏｉ））、アルトルニア（Ａｌｔｈｏｒｎｉａ）属（種：エスピー（ｓｐ．）、クロウチイ（ｃｒｏｕｃｈｉｉ））、またはエリナ（Ｅｌｉｎａ）属（種：エスピー（ｓｐ．）、マリサルバ（ｍａｒｉｓａｌｂａ）、およびシノリフィカ（ｓｉｎｏｒｉｆｉｃａ））。本発明の目的上、ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属の範囲内に記載される種は、トラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）のメンバーであると考えられ得る。アウランチアコキトリウム属（Ａｕｒａｎｔｉａｃｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）およびオブロゴスポラ属（Ｏｂｌｏｇｏｓｐｏｒａ）は、本発明においてラビリンチュラ菌門（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｏｔａ）により包含される２つの追加の属である。一部の実施形態において、微生物細胞はトラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｓｔｒｉｕｍ）、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、およびそれらの混合物である。
【００８０】
[0086]本発明は、単離された微生物およびそれに由来する株を対象とする。本発明の単離された微生物に「由来する」株は天然または人工誘導体、例えば、変異株、変種株、または組換え株などであり得る。本明細書において使用される「単離された」という用語は、必ずしも、単離物が精製されている程度を反映するとは限らず、天然形態または天然環境からの単離または分離を示す。単離物には、限定されるものではないが、単離された微生物、単離されたバイオマス、単離された培養物、単離された微生物油、および単離された配列（例えば、本明細書に開示の単離されたポリヌクレオチド配列）が含まれ得る。本明細書において使用される「微生物」という用語には、限定されるものではないが、「微細藻類」、「ヤブレツボカビ」という用語および本明細書に記載の寄託された微生物のいずれかに関連する分類学上の分類が含まれる。本明細書に記載の寄託された微生物を含む本発明の微生物のいずれかに関連して使用される「ヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）」、「ヤブレツボカビ」、「シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）」、および「ヤブレツボカビ属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）」という用語は、利用可能な系統情報を含む現在の分類学上の分類に基づいており、本願の出願日の後に、万一この分類学上の分類が改訂された場合には限定的であることが意図されない。
【００８１】
[0087]一部の実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２１２で寄託された種の単離された微生物を対象とする。ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２１２に関連する単離された微生物は、本明細書において、ヤブレツボカビ属エスピー（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１０２１２としても公知である。ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２１２に関連する単離された微生物は、ブダペスト条約の下、２００９年７月１４日に、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ），Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１１０−２２０９に寄託された。一部の実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２１２で寄託された単離された株を対象とする。一部の実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２１２、ＰＴＡ−１０２１３、ＰＴＡ−１０２１４、ＰＴＡ−１０２１５、ＰＴＡ−１０２０８、ＰＴＡ−１０２０９、ＰＴＡ−１０２１０、またはＰＴＡ−１０２１１で寄託された単離された微生物を対象とする。
【００８２】
[0088]一部の実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２１２で寄託された種の特徴を有する単離された微生物またはそれに由来する株を対象とする。ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２１２で寄託された種の特徴には、その増殖特性および表現型特性（表現型特性の例には、形態特性および生殖特性が含まれる）、その物理的特性および化学的特性（例えば、乾燥重量および脂質プロファイル）、その遺伝子配列、ならびにそれらの組合せが含まれ得、これらの特徴により、前記の種と、以前に特定された種が区別される。一部の実施形態において、本発明は、配列番号１のポリヌクレオチド配列、または配列番号１と少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む１８ｓｒＲＮＡ、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２１２で寄託された種の形態特性および生殖特性、ならびにＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２１２で寄託された種の脂肪酸プロファイルを含む、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２１２で寄託された種の特徴を有する単離された微生物を対象とする。一部の実施形態において、本発明の単離された微生物は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２１２で寄託された微生物の表現型特性と実質的に同一の表現型特性を有する。一部の実施形態において、本発明の単離された微生物は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２１２で寄託された微生物の増殖特性と実質的に同一の増殖特性を有する。一部の実施形態において、本発明は、配列番号１のポリヌクレオチド配列または配列番号１と少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む１８ｓｒＲＮＡを含む、単離された微生物を対象とする。一部の実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２１２で寄託された微生物の１８ｓｒＲＮＡポリヌクレオチド配列と少なくとも９４％の同一性を有する１８ｓｒＲＮＡポリヌクレオチド配列を含む、単離された微生物を対象とする。
【００８３】
[0089]一部の実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２１２で寄託された微生物の突然変異株を対象とする。さらなる実施形態において、突然変異株は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２１３、ＰＴＡ−１０２１４、またはＰＴＡ−１０２１５で寄託された株である。ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２１３、ＰＴＡ−１０２１４、およびＰＴＡ−１０２１５に関連する微生物は、ブダペスト条約の下、２００９年７月１４日に、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ），Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９に寄託された。
【００８４】
[0090]一部の実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２０８で寄託された種の単離された微生物を対象とする。ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２０８に関連する単離された微生物はまた、本明細書において、シゾキトリウム属エスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１０２０８とも知られる。ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２０８に関連する微生物は、ブダペスト条約の下、２００９年７月１４日に、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ），Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１１０−２２０９に寄託された。一部の実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２０８で寄託された単離された株を対象とする。
【００８５】
[0091]一部の実施形態において、本発明は、微生物より生成される総脂肪酸が約１０重量％超、約１１重量％超、約１２重量％超、約１３重量％超、約１４重量％超、約１５重量％超、約１６重量％超、約１７重量％超、約１８重量％超、約１９重量％超、または約２０重量％超のＥＰＡを含む、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２０８で寄託された種の単離された微生物に関する。一部の実施形態において、本発明は、微生物により生成される総脂肪酸が約１０重量％から約５５重量％、約１０重量％から約５０重量％、約１０重量％から約４５重量％、約１０重量％から約４０重量％、約１０重量％から約３５重量％、約１０重量％から約３０重量％、約１５重量％から約５５重量％、約１５重量％から約５０重量％、約１５重量％から約４５重量％、約１５重量％から約４０重量％、約１５重量％から約３５重量％、約１５重量％から約３０重量％、約２０重量％から約５５重量％、約２０重量％から約５０重量％、約２０重量％から約４５重量％、約２０重量％から約４０重量％、約２０重量％から約３５重量％、または約２０重量％から約３０重量％のＥＰＡを含む、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２０８で寄託された種の単離された微生物を対象とする。
【００８６】
[0092]一部の実施形態において、本発明は、微生物により生成される総脂肪酸が約１０重量％超のエイコサペンタエン酸を含む、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２０８で寄託された種の特徴を有する単離された微生物を対象とする。ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２０８で寄託された微生物の特徴には、その増殖特性および表現型特性（表現型特性の例には、形態特性および生殖特性が含まれる）、その物理的特性および化学的特性（例えば、乾燥重量および脂質プロファイル）、その遺伝子配列、ならびにそれらの組合せが含まれ、これらの特徴により、前記の種と、以前に特定された種が区別される。一部の実施形態において、本発明は、特徴が配列番号２のポリヌクレオチド配列を含む１８ｓｒＲＮＡ、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２０８で寄託された種の形態特性および生殖特性、ならびにＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２０８で寄託された種の脂肪酸プロファイルを含む、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２１２で寄託された種の特徴を有する単離された微生物を対象とする。一部の実施形態において、本発明の単離された微生物は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２０８で寄託された微生物の物理的特性および化学的特性と実質的に同一の物理的特性および化学的特性を有する。
【００８７】
[0093]一部の実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２０８で寄託された微生物の突然変異株を対象とする。さらなる実施形態において、突然変異株は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２０９、ＰＴＡ−１０２１０、またはＰＴＡ−１０２１１で寄託された株である。ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２０９、ＰＴＡ−１０２１０、およびＰＴＡ−１０２１１に関連する微生物は、ブダペスト条約の下、２００９年９月２５日に、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ），  Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１１０−２２０９に寄託された。
【００８８】
[0094]一部の実施形態において、本発明は、トリアシルグリセロール画分のＥＰＡ含有率が少なくとも約１２重量％、少なくとも約１３重量％、少なくとも約１４重量％、少なくとも約１５重量％、少なくとも約１６重量％、少なくとも約１７重量％、少なくとも約１８重量％、少なくとも約１９重量％、または少なくとも約２０重量％であるトリアシルグリセロール画分を生成する、本発明の単離された微生物を対象とする。一部の実施形態において、本発明は、トリアシルグリセロール画分のＥＰＡ含有率が約１２重量％から約５５重量％、約１２重量％から約５０重量％、約１２重量％から約４５重量％、約１２重量％から約４０重量％、約１２重量％から約３５重量％、約１２重量％から約３０重量％、約１５重量％から約４５重量％、約１５重量％から約４０重量％、約１５重量％から約３５重量％、約１５重量％から約３０重量％、または約２０重量％から約３０重量％であるトリアシルグリセロール画分を生成する、単離された微生物を対象とする。
【００８９】
[0095]一部の実施形態において、本発明は、トリアシルグリセロール画分のＥＰＡ含有率が少なくとも約１０重量％、少なくとも約１１重量％、少なくとも約１２重量％、少なくとも約１３重量％、少なくとも約１４重量％、少なくとも約１５重量％、少なくとも約１６重量％、少なくとも約１７重量％、少なくとも約１８重量％、少なくとも約１９重量％、または少なくとも約２０重量％であるトリアシルグリセロール画分を生成する、本発明の単離された微生物の突然変異体、変種、または組換え体を対象とする。一部の実施形態において、本発明は、トリアシルグリセロール画分のＥＰＡ含有率が約１２重量％から約５５重量％、約１２重量％から約５０重量％、約１２重量％から約４５重量％、約１２重量％から約４０重量％、約１２重量％から約３５重量％、約１２重量％から約３０重量％、約１５重量％から約５５重量％、約１５重量％から約５０重量％、約１５重量％から約４５重量％、約１５重量％から約４０重量％、約１５重量％から約３５重量％、約１５重量％から約３０重量％、約２０重量％から約５５重量％、約２０重量％から約５０重量％、約２０重量％から約４５重量％、約２０重量％から約４０重量％、約２０重量％から約３５重量％、または約２０重量％から約３０重量％であるトリアシルグリセロール画分を生成する、本発明の単離された微生物の突然変異体、変種、または組換え体に関する。突然変異株は、周知の手順により生成することができる。一般的な手順には、放射線照射、高温処理、および突然変異原による処理が含まれる。変種株は、本明細書に記載の種の他の天然の単離物および／または下位単離物（ｓｕｂ−ｉｓｏｌａｔｅ）であり得る。組換え株は、外因性遺伝子を発現させるための、または内因性遺伝子の機能もしくは発現を変えるための分子生物学における任意の周知の方法により生成することができる。一部の実施形態において、突然変異株、変種株、または組換え株は、野生型株よりも多量のω−３脂肪酸、特にＥＰＡを生成する。一部の実施形態において、突然変異株、変種株、または組換え株は、より少ない量の１つ以上の脂肪酸、例えば、より少ない量のＤＨＡ、ＡＲＡ、ＤＰＡｎ−６、またはそれらの組合せを生成する。一部の実施形態において、突然変異株、変種株、または組換え株は、培養物１リットル当たり、野生型株よりも多い乾燥細胞重量を生成する。このような突然変異株、変種株、または組換え株は、本発明の単離された微生物に由来する株の例である。
【００９０】
[0096]本発明はまた、微生物またはそれに由来する株により生成される総脂肪酸が約１０重量％以下のエイコサペンタエン酸を含む、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−９６９５で寄託されたヤブレツボカビ種の特徴を有する単離されたヤブレツボカビ微生物を対象とする。
【００９１】
[0097]本発明はまた、トリグリセリド画分のドコサヘキサエン酸含有率が少なくとも約４０重量％であり、トリグリセリド画分のドコサペンタエン酸ｎ−６含有率が少なくとも約０．５重量％から約６重量％であり、微生物またはそれに由来する株により生成される総脂肪酸が約１０重量％以下のエイコサペンタエン酸を含むトリグリセリド画分を含む、単離されたヤブレツボカビ微生物、またはそれに由来する株を対象とする。
【００９２】
[0098]本発明はまた、微生物またはそれに由来する株により生成される総脂肪酸が約１０重量％以下のエイコサペンタエン酸を含む、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−９６９５で寄託されたヤブレツボカビと同一種の単離されたヤブレツボカビ微生物、またはそれに由来する株を対象とする。
【００９３】
[0099]一部の実施形態において、本発明の単離されたヤブレツボカビ微生物に由来する株は、突然変異株である。
【００９４】
[0100]本発明はまた、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−９６９５、ＰＴＡ−９６９６、ＰＴＡ−９６９７、またはＰＴＡ−９６９８で寄託された、単離された微生物を対象とする。
【００９５】
[0101]本発明はまた、本発明のヤブレツボカビ微生物のいずれか１つまたはそれらの混合物を含むヤブレツボカビバイオマスを対象とする。
【００９６】
[0102]本発明はまた、バイオマスの乾燥細胞重量の少なくとも約５０重量％が脂肪酸であり、脂肪酸の少なくとも約５０重量％がω−３脂肪酸である、単離されたヤブレツボカビバイオマスを対象とする。一部の実施形態において、脂肪酸の少なくとも約５０重量％は、ドコサヘキサエン酸である。本発明はまた、バイオマスの乾燥細胞重量の少なくとも約２５重量％がドコサヘキサエン酸である、単離されたヤブレツボカビバイオマスを対象とする。
【００９７】
[0103]一部の実施形態において、本発明はまた、脂肪酸の約１０重量％以下がエイコサペンタエン酸であり、ドコサヘキサエン酸とエイコサペンタエン酸との重量比が少なくとも約５：１である、単離されたヤブレツボカビバイオマスを対象とする。
【００９８】
[0104]一部の実施形態において、本発明はまた、脂肪酸の約１．５重量％以下がアラキドン酸であり、ドコサヘキサエン酸とアラキドン酸との重量比が少なくとも約２０：１である、単離されたヤブレツボカビバイオマスを対象とする。
【００９９】
[0105]一部の実施形態において、本発明はまた、ドコサヘキサエン酸およびドコサペンタエン酸ｎ−６を少なくとも約１０：１の重量比で含む、単離されたヤブレツボカビバイオマスを対象とする。一部の実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−９６９５で寄託された種のヤブレツボカビを対象とする。単離されたヤブレツボカビは、本明細書においてシゾキトリウム属エスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−９６９５としても公知である。ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−９６９５に関連するヤブレツボカビは、ブダペスト条約の下、２００９年１月７日に、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ），  Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９に寄託された。
【０１００】
[0106]一部の実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−９６９５で寄託された、単離されたヤブレツボカビ株を対象とする。一部の実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−９６９５で寄託されたヤブレツボカビと同一種の単離されたヤブレツボカビ微生物を対象とする。
【０１０１】
[0107]一部の実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−９６９５寄託された種の特徴を有する単離されたヤブレツボカビまたはそれに由来する株を対象とする。ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−９６９５で寄託されたヤブレツボカビ種の特徴には、その増殖特性および表現型特性（表現型特性の例には、形態特性および生殖特性が含まれる）、その物理的特性および化学的特性（例えば、乾燥重量および脂質プロファイル）、ならびにその遺伝子配列が含まれる。一部の実施形態において、本発明の単離されたヤブレツボカビは、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−９６９５で寄託されたヤブレツボカビの実質的に同一の表現型特性を有する。一部の実施形態において、本発明の単離されたヤブレツボカビは、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−９６９５で寄託されたヤブレツボカビの実質的に同一の増殖特性を有する。
【０１０２】
[0108]一部の実施形態において、本発明は、突然変異体、変種、または組換え体により生成される総脂肪酸が約１０重量％以下のエイコサペンタエン酸を含む、本発明の単離されたヤブレツボカビの突然変異体、変種、または組換え体を対象とする。突然変異株は、周知の手順により生成することができる。一般的な手順には、放射線照射；高温処理；および突然変異原による処理が含まれる。変種株は、本明細書に記載の種の他の天然の単離物および／または下位単離物であり得る。組換え株は、外因性遺伝子を発現させるための、または内因性遺伝子の機能もしくは発現を変えるための分子生物学における任意の周知の方法により生成することができる。一部の実施形態において、突然変異株、変種株、または組換え株は、野生型株よりも多量のω−３脂肪酸、例としてＤＨＡおよび／またはＥＰＡを生成する。一部の実施形態において、突然変異株、変種株、または組換え株は、より少量の１つ以上の脂肪酸、例えば、より少量のＤＨＡ、ＡＲＡ、ＤＰＡｎ−６、またはそれらの組合せを生成する。一部の実施形態において、突然変異株、変種株、または組換え株は、培養物１リットル当たり、野生型株よりも多い乾燥細胞重量を生成する。このような突然変異株、変種株、または組換え株は、本発明の単離されたヤブレツボカビに由来する株の例である。
【０１０３】
[0109]一部の実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−９６９５で寄託されたヤブレツボカビの突然変異株を対象とする。さらなる実施形態において、突然変異株は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−９６９６、ＰＴＡ−９６９７、またはＰＴＡ−９６９８で寄託された株である。ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−９６９６、ＰＴＡ−９６９７、およびＰＴＡ−９６９８に関連するヤブレツボカビ株は、ブダペスト条約の下、２００９年１月７日に、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ），Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１１０−２２０９に寄託された。これらの寄託された突然変異株は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−９６９５で寄託されたヤブレツボカビの誘導体である。
【０１０４】
[0110]一部の実施形態において、本発明の単離されたヤブレツボカビは、その突然変異体、変種、または組換え体を含め、ヤブレツボカビから単離された１つ以上の画分中に脂肪酸プロファイルを含む。ヤブレツボカビから単離された１つ以上の画分には、総脂肪酸画分、ステロールエステル画分、トリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、極性画分（リン脂質画分を含む）、およびそれらの組合せが含まれる。
【０１０５】
[0111]本発明はまた、本発明のヤブレツボカビ微生物のいずれか１つまたはそれらの混合物を含む、単離されたヤブレツボカビ培養物を対象とする。一部の実施形態において、培養物は、少なくとも約５％の溶解酸素を含む。
【０１０６】
[0112]本発明はまた、本発明のヤブレツボカビ微生物もしくはバイオマスのいずれか１つまたはそれらの混合物を含む、動物またはヒト用の食品、化粧品、または医薬組成物を対象とする。
【０１０７】
[0113]本発明はまた、少なくとも約７０重量％のトリグリセリド画分を含み、トリグリセリド画分のドコサヘキサエン酸含有率が少なくとも約５０重量％であり、トリグリセリド画分のドコサペンタエン酸ｎ−６含有率が約０．５重量％から約６重量％である微生物油を対象とする。一部の実施形態において、微生物油は、約１．５重量％以下のトリグリセリド画分のアラキドン酸含有率をさらに含む。
【０１０８】
[0114]本発明はまた、少なくとも約７０重量％のトリグリセリド画分を含み、トリグリセリド画分のドコサヘキサエン酸含有率が少なくとも約４０重量％であり、トリグリセリド画分のドコサペンタエン酸ｎ−６含有率が少なくとも約０．５重量％から約６重量％であり、ドコサヘキサエン酸とドコサペンタエン酸ｎ−６との比が約６：１超である微生物油を対象とする。
【０１０９】
[0115]本発明はまた、少なくとも約７０重量％のトリグリセリド画分を含み、トリグリセリド画分のドコサヘキサエン酸含有率が少なくとも約６０重量％である微生物油を対象とする。
【０１１０】
[0116]一部の実施形態において、微生物油のトリグリセリド画分中のトリグリセリドの少なくとも約２０％は、ｓｎ−１、ｓｎ−２、およびｓｎ−３位のいずれか２つから選択されるトリグリセリド中の２つの位置においてドコサヘキサエン酸を含有する。一部の実施形態において、微生物油のトリグリセリド画分中のトリグリセリドの少なくとも約５％は、トリグリセリド中のｓｎ−１、ｓｎ−２、およびｓｎ−３位の３つ全てにおいてドコサヘキサエン酸を含有する。
【０１１１】
[0117]一部の実施形態において、本発明の単離された微生物は、その突然変異体、変種、および組換え体を含め、微生物から単離された１つ以上の画分中に脂肪酸プロファイルを含む。微生物から単離された１つ以上の画分は、総脂肪酸画分、ステロールエステル画分、トリアシルグリセロール画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジアシルグリセロール画分、極性画分（リン脂質画分を含む）、およびそれらの組合せが含まれる。特定の画分の脂肪酸プロファイルは、本明細書に開示の特定の画分に関連する脂肪酸プロファイルのいずれかを含み得る。
【０１１２】
[0118]本発明は、突然変異体を生成する方法であって、本発明の微生物のいずれかを突然変異誘発させるステップと、突然変異株を単離するステップとを含む方法を対象とする。
【０１１３】
［培養物および単離されたバイオマス］
[0119]本発明は、本発明の１つ以上の単離された微生物を含む培養物を対象とする。ミクロフロラ、例えば、微細藻類およびヤブレツボカビを接種、増殖、および回収するための種々の発酵パラメータが当分野において公知である。例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第５，１３０，２４２号明細書参照。液体培地または固体培地は、天然海水または人工海水を含有し得る。従属栄養増殖のための炭素源には、限定されるものではないが、グルコース、フルクトース、キシロース、サッカロース、マルトース、可溶性デンプン、糖蜜、フコース、グルコサミン、デキストラン、脂肪、油、グリセロール、酢酸ナトリウム、およびマンニトールが含まれる。窒素源には、限定されるものではないが、ペプトン、酵母エキス、ポリペプトン、麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸、コーンスティープリカー、有機窒素源、グルタミン酸ナトリウム、尿素、無機窒素源、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、および硝酸アンモニウムが含まれる。
【０１１４】
[0120]ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２１２で寄託された微生物を増殖させるための典型的な培地を表１に示す。
【０１１５】
【表１】
2020036602.tif 000002
【０１１６】
[0121]一部の実施形態において、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２１２で寄託された微生物、またはその突然変異体、変種、もしくは組換え体は、炭素源としてのグリセロール上で従属栄養的に増殖するが、炭素源としてのグルコース上では増殖しない。
【０１１７】
[0122]ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２０８で寄託された微生物を増殖させるための典型的な培地を表２に示す。
【０１１８】
【表２】
2020036602.tif 000003
【０１１９】
[0123]一部の実施形態において、発酵体積（培養物の体積）は、少なくとも約２リットル、少なくとも約１０リットル、少なくとも約５０リットル、少なくとも約１００リットル、少なくとも約２００リットル、少なくとも約５００リットル、少なくとも約１０００リットル、少なくとも約１０，０００リットル、少なくとも約２０，０００リットル、少なくとも約５０，０００リットル、少なくとも約１００，０００リットル、少なくとも約１５０，０００リットル、少なくとも約２００，０００リットル、または少なくとも約２５０，０００リットルである。一部の実施形態において、発酵体積は、約２リットルから約３００，０００リットル、約２リットル、約１０リットル、約５０リットル、約１００リットル、約２００リットル、約５００リットル、約１０００リットル、約１０，０００リットル、約２０，０００リットル、約５０，０００リットル、約１００，０００リットル、約１５０，０００リットル、約２００，０００リットル、約２５０，０００リットル、または約３００，０００リットルである。
【０１２０】
[0124]一部の実施形態において、本発明は、本発明の脂肪酸プロファイルを含む単離されたバイオマスを対象とする。一部の実施形態において、バイオマスの乾燥細胞重量の少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％は脂肪酸である。一部の実施形態において、バイオマスの乾燥細胞重量の約２０％超、約２５％超、約３０％超、約３５％超、約４０％超、約４５％超、約５０％超、約５５％超、または約６０％超は脂肪酸である。一部の実施形態において、バイオマスの乾燥細胞重量の約２０重量％から約５５重量％、約２０重量％から約６０重量％、約２０重量％から約７０重量％、約２０重量％から約８０重量％、約３０重量％から約５５重量％、約３０重量％から約７０重量％、約３０重量％から約８０重量％、約４０重量％から約６０重量％、約４０重量％から約７０重量％、約４０重量％から約８０重量％、約５０重量％から約６０重量％、約５０重量％から約７０重量％、約５０重量％から約８０重量％、約５５重量％から約７０重量％、約５５重量％から約８０重量％、約６０重量％から約７０重量％、または約６０重量％から約８０重量％は脂肪酸である。一部の実施形態において、バイオマスは、ＥＰＡとして、約１０重量％超、少なくとも約１２重量％、少なくとも約１５重量％、少なくとも約２０重量％、少なくとも約２５重量％、少なくとも約３０重量％、少なくとも約３５重量％、少なくとも約４０重量％、または少なくとも約４５重量％の脂肪酸を含む。一部の実施形態において、バイオマスは、ＥＰＡとして、約１０重量％から約５５重量％、約１２重量％から約５５重量％、約１５重量％から約５５重量％、約２０重量％から約５５重量％、約２０重量％から約４０重量％、または約２０重量％から約３０重量％の脂肪酸を含む。一部の実施形態において、バイオマスは、トリアシルグリセロール画分の少なくとも約１２重量％、少なくとも約１３重量％、少なくとも約１４重量％、少なくとも約１５重量％、少なくとも約１６重量％、少なくとも約１７重量％、少なくとも約１８重量％、少なくとも約１９重量％、または少なくとも約２０重量％がＥＰＡであるトリアシルグリセロール画分を含む。一部の実施形態において、バイオマスは、トリアシルグリセロール画分のＥＰＡ含有率が少なくとも約１２重量％から約５５重量％、約１２重量％から約５０重量％、約１２重量％から約４５重量％、少なくとも約１２重量％から約４０重量％、少なくとも約１２重量％から約３５重量％、または少なくとも約１２重量％から約３０重量％、約１５重量％から約５５重量％、約１５重量％から約５０重量％、約１５重量％から約４５重量％、約１５重量％から約４０重量％、約１５重量％から約３５重量％、約１５重量％から約３０重量％、約２０重量％から約５５重量％、約２０重量％から約５０重量％、約２０重量％から約４５重量％、少なくとも約２０重量％から約４０重量％、少なくとも約２０重量％から約３５重量％、または約２０重量％から約３０重量％であるトリアシルグリセロール画分を含む。一部の実施形態において、バイオマスの乾燥細胞重量の少なくとも約２０重量％、少なくとも約２５重量％、少なくとも約３０重量％、少なくとも約３５重量％、少なくとも約４０重量％、少なくとも約５０重量％、または少なくとも約６０重量％がＤＨＡである。一部の実施形態において、バイオマスの乾燥細胞重量の約２０重量％から約６０重量％、約２５重量％から約６０重量％、約２５重量％から約５０重量％、約２５重量％から約４５重量％、約３０重量％から約５０重量％、または約３５重量％から約５０重量％はＤＨＡである。一部の実施形態において、バイオマスは、ＤＨＡとして、約１０重量％以下、約９重量％以下、約８重量％以下、約７重量％以下、約６重量％以下、約５重量％以下、約４重量％以下、約３重量％以下、約２重量％以下、または約１重量％以下の脂肪酸を含む。一部の実施形態において、バイオマスは、ＤＨＡとして、約１重量％から約１０重量％、約１重量％から約５重量％、約２重量％から約５重量％、約３重量％から約５重量％、または約３重量％から約１０重量％の脂肪酸を含む。一部の実施形態において、バイオマスは、ＤＨＡを実質的に含まない。一部の実施形態において、バイオマスは、ＡＲＡとして、約０．１重量％から約５重量％未満、約０．１重量％から約４重量％、約０．１重量％から約３重量％、約０．１重量％から約２重量％、約０．２重量％から約５重量％未満、約０．２重量％から約４重量％、約０．２重量％から約３重量％、約０．２重量％から約２重量％、約０．３重量％から約２重量％、約０．１重量％から約０．５重量％、約０．２重量％から約０．５重量％、約０．１重量％から約０．４重量％、約０．２重量％から約０．４重量％、約０．５重量％から約２重量％、約１重量％から約２重量％、約０．５重量％から約１．５重量％、または約１重量％から約１．５重量％の脂肪酸を含む。一部の実施形態において、バイオマスは、ＡＲＡとして、約５重量％未満、約４重量％以下、約３重量％以下、約２重量％以下、約１．５重量％以下、約１重量％以下、約０．５重量％以下、約０．４重量％以下、約０．３重量％以下、約０．２重量％以下、または約０．１重量％以下の脂肪酸を含む。一部の実施形態において、バイオマスは、ＡＲＡを実質的に含まない。一部の実施形態において、バイオマスは、ＤＰＡｎ−６として、約０．４重量％から約２重量％、約０．４重量％から約３重量％、約０．４重量％から約４重量％、約０．４重量％から約５重量％、約０．４重量％から約５重量％未満、約０．５重量％から約１重量％、約０．５重量％から約２重量％、約０．５重量％から約３重量％、約０．５重量％から約４重量％、約０．５重量％から約５重量％、約０．５重量％から約５重量％未満、約１重量％から約２重量％、約１重量％から約３重量％、約１重量％から約４重量％、約１重量％から約５重量％、または約１重量％から約５重量％未満の脂肪酸を含む。一部の実施形態において、バイオマスは、ＤＰＡｎ−６として、約５重量％以下、約５重量％未満、約４重量％以下、約３重量％以下、約２重量％以下、約１重量％以下、約０．７５重量％以下、約０．６重量％以下、または約０．５重量％以下の脂肪酸を含む。一部の実施形態において、バイオマスは、ＤＰＡｎ−６を実質的に含まない。一部の実施形態において、バイオマスは、約５重量％以下、約５重量％未満、約４重量％以下、約３重量％以下、または約２重量％以下のオレイン酸（１８：１ｎ−９）、リノール酸（１８：２ｎ−６）、リノレン酸（１８：３ｎ−３）、エイコセン酸（２０：１ｎ−９）、エルカ酸（２２：１ｎ−９）、またはそれらの組合せを有する脂肪酸を含む。
【０１２１】
[0125]本発明の単離されたバイオマスの特徴は、外因的に導入された材料ではなく、単離されたバイオマスの内因的なまたは固有の特性に関連する。一部の実施形態において、単離されたバイオマスはポリビニルピロリドンを含有せず、ポリビニルピロリドンを含有する培養物から単離されない。
【０１２２】
[0126]本発明は、バイオマスを生成する方法を対象とする。一部の実施形態において、本発明のバイオマスを生成する方法は、本発明の単離された微生物のいずれかまたはそれらの混合物を培養物中で増殖させてバイオマスを生成することを含む。本発明は、本方法により生成されたバイオマスを対象とする。
【０１２３】
[0127]一部の実施形態において、バイオマスは脂肪酸を含み、脂肪酸は、ω−３多価不飽和脂肪酸をさらに含み、ω−３多価脂肪酸は、ＤＨＡおよびＥＰＡを、ω−３多価不飽和脂肪酸の総量の約≧９０重量％の量で含み、ＥＰＡの量は、ＥＰＡおよびＤＨＡの総量の約６重量％から最大約６５重量％である。特に、ＥＰＡの量がＥＰＡおよびＤＨＡの総量の約６重量％から最大約２８重量％であるバイオマスが提供される。さらに、本明細書において、ＥＰＡの量がＥＰＡおよびＤＨＡの総量の約３６重量％から最大約６５重量であるバイオマスが提供される。より特定すると、ＥＰＡの量がＥＰＡおよびＤＨＡの総量の約２８重量％から約３６重量％であるバイオマスが提供される。
【０１２４】
[0128]本明細書において提供される一部の実施形態は、脂肪酸を含み、脂肪酸がＤＨＡおよびＥＰＡをさらに含み、ＥＰＡの量がＥＰＡおよびＤＨＡの総量の約１５から最大約６０重量％であるバイオマスを含む。
【０１２５】
[0129]本発明の一部の実施形態は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−９６９５で寄託されたヤブレツボカビ、または突然変異株を含む培養物をさらに対象とする。ミクロフロラを接種、増殖、および回収するための種々の発酵パラメータが当分野において公知であり、例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第５，１３０，２４２号明細書に記載されている。ヤブレツボカビの増殖のための任意の慣用培地を使用することができる。液体培地または固体培地は、天然海水または人工海水を含有し得る。炭素源には、限定されるものではないが、グルコース、フルクトース、キシロース、サッカロース、マルトース、可溶性デンプン、糖蜜、フコース、グルコサミン、デキストラン、脂肪、油、グリセロール、酢酸ナトリウム、およびマンニトールが含まれる。窒素源には、限定されるものではないが、ペプトン、酵母エキス、ポリペプトン、麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸、コーンスティープリカー、有機窒素源、グルタミン酸ナトリウム、尿素、無機窒素源、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、および硫酸ナトリウムが含まれる。典型な培地を表３に示す。
【０１２６】
【表３】
2020036602.tif 000004
【０１２７】
[0130]一部の実施形態において、培養培地は、飽和レベルの割合として、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の溶解酸素を含む。一部の実施形態において、培養培地は、飽和レベルの割合として、約５％から約２０％、約５％から約５０％、約５％から約１００％、約１０％から約２０％、約１０％から約５０％、約１０％から約１００％、約２０％から約５０％、または約２０％から約１００％の溶解酸素を含む。
【０１２８】
[0131]本発明は、本発明のヤブレツボカビの単離されたバイオマスをさらに対象とする。本発明の単離されたヤブレツボカビバイオマスは、ヤブレツボカビバイオマスを単離する任意の慣用法、例えば、米国特許第５，１３０，２４２号明細書および米国特許出願公開第２００２／０００１８３３号明細書に記載の慣用法により得られた、回収された細胞バイオマスである。
【０１２９】
[0132]一部の実施形態において、炭素源、窒素源、および栄養源、ならびに約９５０ｐｐｍから約８５００ｐｐｍの塩化物イオンを含む、約ｐＨ６．５から約８．５の培養培地中で約７日間、約１７℃から約３０℃において増殖させた後、培養物１リットルから単離されるバイオマスの乾燥細胞重量は、少なくとも約５０ｇ、少なくとも約６０ｇ、少なくとも約７０ｇ、少なくとも約８０ｇ、少なくとも約１００ｇ、少なくとも約１２０ｇ、少なくとも約１４０ｇ、少なくとも約１６０ｇ、少なくとも約１８０ｇ、または少なくとも約２００ｇである。一部の実施形態において、炭素源、窒素源、および栄養源、ならびに約９５０ｐｐｍから約８５００ｐｐｍの塩化物イオンを含む、約ｐＨ６．５、約ｐＨ７、約ｐＨ７．５、約ｐＨ８．０、または約ｐＨ８．５の培養培地中で、約７日間、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、または約３０℃において増殖させた後、培養物１リットルから単離されるバイオマスの乾燥細胞重量は、少なくとも約５０ｇ、少なくとも約６０ｇ、少なくとも約７０ｇ、少なくとも約８０ｇ、少なくとも約１００ｇ、少なくとも約１２０ｇ、少なくとも約１４０ｇ、少なくとも約１６０ｇ、少なくとも約１８０ｇ、または少なくとも約２００ｇである。一部の実施形態において、炭素源、窒素源、および栄養源、ならびに約９５０ｐｐｍから約８５００ｐｐｍの塩化物イオンを含む、約ｐＨ６．５から約ｐＨ８．５の培養培地中で、約７日間、約１７℃から約３０℃において増殖させた後、培養物１リットルから単離されるバイオマスの乾燥細胞重量は約５０ｇから約２００ｇである。一部の実施形態において、炭素源、窒素源、および栄養源、ならびに約９５０ｐｐｍから約８５００ｐｐｍの塩化物イオンを含む、約ｐＨ６．５、約ｐＨ７、約ｐＨ７．５、約ｐＨ８．０、または約ｐＨ８．５の培養培地中で、約７日間、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、または約３０℃において増殖させた後、培養物１リットルから単離されるバイオマスの乾燥細胞重量は、約５０ｇから約２００ｇである。
【０１３０】
[0133]一部の実施形態において、炭素源、窒素源、および栄養源、ならびに約９５０ｐｐｍ〜約８５００ｐｐｍの塩化物イオンを含む、約ｐＨ６．５〜約ｐＨ８．５の培地中で、約７日間、約１７℃〜約３０℃で増殖させた後、単離されたヤブレツボカビ培養物は、少なくとも約２ｇ／Ｌ／日、少なくとも約４ｇ／Ｌ／日、または少なくとも約８ｇ／Ｌ／日のω−３脂肪酸生産性を有する。一部の実施形態において、炭素源、窒素源、および栄養源、ならびに約９５０ｐｐｍから約８５００ｐｐｍの塩化物イオンを含む、約ｐＨ６．５から約ｐＨ８．５の培養培地中で、約７日間、約１７℃から約３０℃において増殖させた後、単離されたヤブレツボカビ培養物は、約１ｇ／Ｌ／日から約２０ｇ／Ｌ／日、約２ｇ／Ｌ／日から約１５ｇ／Ｌ／日、約２ｇ／Ｌ／日から約１０ｇ／Ｌ／日、約３ｇ／Ｌ／日から約１０ｇ／Ｌ／日、または約４ｇ／Ｌ／日から約９ｇ／Ｌ／日のω−３脂肪酸生産性を有する。
【０１３１】
[0134]一部の実施形態において、発酵体積（培養物の体積）は、少なくとも約２リットル、少なくとも約１０リットル、少なくとも約５０リットル、少なくとも約１００リットル、少なくとも約２００リットル、少なくとも約５００リットル、少なくとも約１０００リットル、少なくとも約１０，０００リットル、少なくとも約２０，０００リットル、少なくとも約５０，０００リットル、少なくとも約１００，０００リットル、少なくとも約１５０，０００リットル、少なくとも約２００，０００リットル、または少なくとも約２５０，０００リットルである。一部の実施形態において、発酵体積は、約２リットルから約３００，０００リットル、約２リットル、約１０リットル、約５０リットル、約１００リットル、約２００リットル、約５００リットル、約１０００リットル、約１０，０００リットル、約２０，０００リットル、約５０，０００リットル、約１００，０００リットル、約１５０，０００リットル、約２００，０００リットル、約２５０，０００リットル、または約３００，０００リットルである。
【０１３２】
[0135]一部の実施形態において、本発明は、本発明の脂肪酸プロファイルを含む単離されたヤブレツボカビバイオマスを対象とする。一部の実施形態において、バイオマスの乾燥細胞重量の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％は脂肪酸である。一部の実施形態において、バイオマスの乾燥細胞重量の約５０％超、約５５％超、または約６０％超は脂肪酸である。一部の実施形態において、バイオマスの乾燥細胞重量の約５０重量％から約６０重量％、約５０重量％から約７０重量％、約５０重量％から約８０重量％、約５５重量％から約７０重量％、約５５重量％から約８０重量％、約６０重量％から約７０重量％、または約６０重量％から８０重量％は脂肪酸である。一部の実施形態において、バイオマスは、ω−３脂肪酸として、少なくとも約５０重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、または少なくとも約８０重量％の脂肪酸を含む。一部の実施形態において、バイオマスは、ω−３脂肪酸として、約５０重量％から約６０重量％、約５０重量％から約７０重量％、約５０重量％から約８０重量％の脂肪酸を含む。一部の実施形態において、バイオマスは、ＤＨＡとして、少なくとも約５０重量％、少なくとも約５５重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約６５重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約７５重量％、または少なくとも約８０重量％の脂肪酸を含む。一部の実施形態において、バイオマスは、ＤＨＡとして、約５０重量％から約６０重量％、約５０重量％から約７０重量％、または約５０重量％から約８０重量％の脂肪酸を含む。一部の実施形態において、バイオマスの乾燥細胞重量の少なくとも約２５重量％、少なくとも約３０重量％、少なくとも約４０重量％、少なくとも約５０重量％、または少なくとも約６０重量％は、ドコサヘキサエン酸である。一部の実施形態において、バイオマスの乾燥細胞重量の約２５重量％から約６５重量％、約２５重量％から約５０重量％、約３０重量％から約４０重量％、または約２５重量％から約３５重量％は、ドコサヘキサエン酸である。一部の実施形態において、バイオマスは、ＥＰＡとして、約１０重量％以下、約９重量％以下、約８重量％以下、約７重量％以下、約６重量％以下、約５重量％以下、約４重量％以下、約３重量％以下、約２重量％以下、または約１重量％以下の脂肪酸を含む。一部の実施形態において、バイオマスは、ＥＰＡとして、約１重量％から約１０重量％、約１重量％から約５重量％、約２重量％から約５重量％、約３重量％から約５重量％、または約３重量％から約１０重量％の脂肪酸を含む。一部の実施形態において、バイオマスは、ＥＰＡを実質的に含まない。一部の実施形態において、バイオマスは、少なくとも約５：１、少なくとも約７：１、少なくとも約１０：１、少なくとも約１１：１、少なくとも約１４：１、少なくとも約１５：１、少なくとも約１７：１、少なくとも約２０：１、少なくとも約２５：１、少なくとも約５０：１、または少なくとも約１００：１のＤＨＡとＥＰＡとの重量比を含み、バイオマスは、ＥＰＡとして、約１０重量％以下の脂肪酸を含む。一部の実施形態において、バイオマスは、ＡＲＡとして、��０．１重量％から０．２重量％、約０．１重量％から約０．３重量％、約０．１重量％から約０．４重量％、約０．１重量％から約０．５重量％、または約０．１重量％から約１．５重量％の脂肪酸を含む。一部の実施形態において、バイオマスは、ＡＲＡとして、約１．５重量％以下、約１重量％以下、約０．５重量％以下、約０．４重量％以下、約０．３重量％以下、約０．２重量％以下、または約０．１重量％以下の脂肪酸を含む。一部の実施形態において、バイオマスは、ＡＲＡを実質的に含まない。一部の実施形態において、バイオマスは、少なくとも約２０：１、少なくとも約４０：１、少なくとも約６０：１、少なくとも約８０：１、少なくとも約１００：１、少なくとも約１５０：１、少なくとも約２００：１、少なくとも約２５０：１、または少なくとも約３００：１のＤＨＡとＡＲＡとの重量比を含む。一部の実施形態において、バイオマスは、ＤＰＡｎ−６として、約０．５重量％から約１重量％、約０．５重量％から約２重量％、約０．５重量％から約５重量％、約０．５重量％から約６重量％、約１重量％から約５重量％、約１重量％から約６重量％、約２重量％から約５重量％、または約２重量％から約６重量％の脂肪酸を含む。一部の実施形態において、バイオマスは、ＤＰＡｎ−６として、約６重量％以下、約５重量％以下、約２重量％以下、約１重量％以下、または約０．５重量％以下の脂肪酸を含む。一部の実施形態において、バイオマスは、ＤＰＡｎ−６を実質的に含まない。一部の実施形態において、バイオマスは、約６：１超、少なくとも約８：１、少なくとも約１０：１、少なくとも約１５：１、少なくとも約２０：１、少なくとも約２５：１、少なくとも約５０：１、または少なくとも約１００：１のＤＨＡとＤＰＡｎ−６との重量比を含む。一部の実施形態において、バイオマスは、約５重量％以下、約４重量％以下、約３重量％以下、または約２重量％以下のリノール酸（１８：２ｎ−６）、リノレン酸（１８：３ｎ−３）、エイコセン酸（２０：１ｎ−９）、およびエルカ酸（２２：１ｎ−９）のそれぞれ、またはそれらの組合せを有する脂肪酸を含む。
【０１３３】
[0136]別の実施形態において、本明細書において、脂肪酸がω−３多価不飽和脂肪酸をさらに含み、ω−３多価不飽和脂肪酸が、ＤＨＡおよびＥＰＡをω−３多価不飽和脂肪酸の総量の約５８〜６８重量％以上、特に約６０重量％の量で含み、ＥＰＡの量が、ＥＰＡおよびＤＨＡの総重量の総量の約５重量％から最大約６０重量％である、脂肪酸を含むバイオマスが提供される。
【０１３４】
[0137]本発明の単離されたバイオマスの特徴は、外因的に導入された材料ではなく、単離されたバイオマスの内因的なまたは固有の特性に関連する。
【０１３５】
［微生物油］
[0138]本明細書において、上記方法により作製された油、特に微生物油が提供される。
【０１３６】
[0139]一部の実施形態において、微生物油は脂肪酸を含み、脂肪酸は、ω−３多価不飽和脂肪酸をさらに含み、ω−３多価不飽和脂肪酸は、ＤＨＡおよびＥＰＡをω−３多価不飽和脂肪酸の総量の約≧９０重量％の量で含み、ＥＰＡの量は、ＥＰＡおよびＤＨＡの総量の約６重量％から最大約６５重量％である。特に、ＥＰＡの量がＥＰＡおよびＤＨＡの総量の約６重量％から最大約２８重量％である微生物油が提供される。本明細書において、ＥＰＡの量がＥＰＡおよびＤＨＡの総量の約３６重量％から最大約６５重量である微生物油がさらに提供される。より特定すると、ＥＰＡの量がＥＰＡおよびＤＨＡの総量の約２８重量％から約３６重量％である微生物油が提供される。
【０１３７】
[0140]本明細書におけるさらなる実施形態において、脂肪酸がＤＨＡおよびＥＰＡをさらに含み、ＥＰＡの量がＥＰＡおよびＤＨＡの総重量の約１５から最大約６０重量％である、脂肪酸を含む微生物油が提供される。
【０１３８】
[0141]本明細書で提供される別の実施形態において、脂肪酸がω−３多価不飽和脂肪酸をさらに含み、ω−３多価不飽和脂肪酸がＤＨＡおよびＥＰＡをω−３多価不飽和脂肪酸の総量のおおよそ約５８〜６８重量％以上、特に約６０重量％の量で含み、ＥＰＡの量がＥＰＡおよびＤＨＡの総重量の総量の約５重量％から最大約６０重量％である、脂肪酸を含む微生物油が提供される。
【０１３９】
[0142]本発明は、本発明の脂肪酸プロファイルを含む微生物油を対象とする。本発明の微生物油は、少なくとも約３５重量％のトリアシルグリセロール画分を含む「粗製油」または「精製油」である。「粗製油」は、微生物のバイオマスから抽出され、さらに加工されない油である。「精製油」は、粗製油を標準的な精製、脱色、および／または脱臭の加工により処理することにより得られる油である。例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第５，１３０，２４２号明細書参照。微生物油は、植物油により希釈された精製油である本明細書に記載の「最終油」も含む。一部の実施形態において、最終油は、高オレイン酸のヒマワリ油により希釈された精製油である。本明細書において使用される「微生物の」という用語には、限定されるものではないが、「微細藻類の」、「ヤブレツボカビ」という用語、および本明細書に記載の寄託された微生物のいずれかに関連する分類学上の分類が含まれる。本明細書に記載の寄託された微生物の微生物油のいずれかに関して使用される「ヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）」、「ヤブレツボカビ」、「シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）」、および「ヤブレツボカビ属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）」という用語は、利用可能な系統情報を含む現在の分類学上の分類に基づいており、本願の出願日の後に、万一、この分類学上の分類が改訂された場合には限定的であることが意図されない。
【０１４０】
[0143]一部の実施形態において、本明細書に記載の脂肪酸は脂肪酸エステルであり得る。一部の実施形態において、脂肪酸エステルには、ω−３脂肪酸エステル、ω−６脂肪酸エステル、およびそれらの組合せが含まれる。一部の実施形態において、脂肪酸エステルは、ＤＨＡエステル、ＥＰＡエステル、またはそれらの組合せである。一部の実施形態において、本明細書に記載の油またはその画分をエステル化して脂肪酸エステルを含む油またはその画分を生成する。「エステル」という用語は、脂肪酸分子のカルボン酸基の中の水素と別の置換基との置換を指す。典型的なエステルは当業者に公知であり、この議論は、Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｔ．ａｎｄ  Ｖ．Ｓｔｅｌｌａ  ｉｎ  Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｖｏｌ．１４，Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｅｄ．Ｅｄｗａｒｄ  Ｂ．Ｒｏｃｈｅ，アメリカ薬剤協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ），Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７、およびＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＭｃＯｍｉｅ  ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７３により提供されている。エステルの例には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ｔ−ブチル、ベンジル、ニトロベンジル、メトキシベンジル、ベンズヒドリル、およびトリクロロエチルが含まれる。一部の実施形態において、エステルは、カルボン酸保護エステル基、アラルキル（例えば、ベンジル、フェネチル）を有するエステル、低級アルケニル（例えば、アリル、２−ブテニル）を有するエステル、低級アルコキシ−低級アルキル（例えば、メトキシメチル、２−メトキシエチル、２−エトキシエチル）を有するエステル、低級アルカノイルオキシ−低級アルキル（例えば、アセトキシメチル、ピバロイルオキシメチル、１−ピバロイルオキシエチル）を有するエステル、低級アルコキシカルボニル−低級アルキル（例えば、メトキシカルボニルメチル、イソプロポキシカルボニルメチル）を有するエステル、カルボキシ−低級アルキル（例えば、カルボキシメチル）を有するエステル、低級アルコキシカルボニルオキシ−低級アルキル（例えば、１−（エトキシカルボニルオキシ）エチル、１−（シクロヘキシルオキシカルボニルオキシ）エチル）を有するエステル、カルバモイルオキシ−低級アルキル（例えば、カルバモイルオキシメチル）を有するエステルなどである。一部の実施形態において、付加される置換基は、直鎖または環式炭化水素基、例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、またはＣ１〜Ｃ６アリールエステルである。一部の実施形態において、エステルは、アルキルエステル、例えば、メチルエステル、エチルエステル、またはプロピルエステルである。一部の実施形態において、脂肪酸が精製状態または半精製状態である場合、エステル置換基は遊離脂肪酸分子に付加される。あるいは、トリアシルグリセロールがエステルに変換されると、脂肪酸エステルは形成される。
【０１４１】
[0144]本発明は、微生物油を生成する方法を対象とする。一部の実施形態において、本方法は、本発明の単離された微生物のいずれかまたはそれらの混合物を培養物中で増殖させてω−３脂肪酸を含む微生物油を生成することを含む。一部の実施形態において、本方法は、微生物油を抽出することをさらに含む。一部の実施形態において、本方法は、本発明のバイオマスのいずれかまたはそれらの混合物から、ω−３脂肪酸を含む微生物油を抽出することを含む。一部の実施形態において、本方法は、単離された微生物を従属栄養的に増殖させることを含み、培養物は、本明細書に記載の炭素源を含む。微生物油は、新たに回収されたバイオマスから抽出することができ、または腐敗を防ぐ条件下で保管されていた以前に回収されたバイオマスから抽出することができる。本発明の微生物を培養するため、培養物からバイオマスを単離するため、バイオマスから微生物油を抽出するため、およびバイオマスから抽出された油の脂肪酸プロファイルを分析するため、公知の方法を使用することができる。例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第５，１３０，２４２号明細書参照。本発明は、本発明の方法のいずれかにより生成された微生物油を対象とする。
【０１４２】
[0145]一部の実施形態において、微生物油は酵素抽出法により抽出される。一部の実施形態において、微生物油は機械的抽出法により抽出される。一部の実施形態において、機械的抽出法は、（１）殺菌した発酵ブロスをホモジナイザーに通して加工して細胞溶解および細胞からの油の放出を支援すること；（２）ホモジナイゼーション後に、イソプロピルアルコールを発酵ブロスに添加して油および水エマルションを破壊すること；（３）混合物を遠心分離して油相を回収すること；ならびに（４）酸化防止剤を添加して真空下で乾燥させることの１つ以上を含む。一部の実施形態において、粗製油は精製される。一部の実施形態において、粗製油の精製は、（１）粗製油を精製タンク中にポンプ導入し、油を加熱し、次いで酸溶液を混合しながら添加すること；（２）酸処理後に、苛性アルカリ溶液を油に添加する工程；（３）粗製油を再加熱し、次いで遠心分離して精製油から重相を分離すること；（４）例えば、酸、ＴｒｉＳｙｌ（登録商標）、クレー、および／または濾過を使用することにより残留極性化合物、微量金属、および酸化生成物を精製油から除去する工程；（５）脱色油を冷却濾過して油から高融点構成成分をさらに除去して所望レベルの透明性を達成すること；（６）油を加熱し、この後に次いで油を冷却し、ある一定の期間保持し、高融点トリグリセリドおよびろうの結晶化をもたらすこと；（７）濾過助剤を冷却された油に添加し、次いで濾過により結晶化固体を除去すること；（８）高温および真空下で操作された冷却濾過の後に脱臭剤を使用し、例えば、汚臭および香りを惹起し得る過酸化物および任意の残留低分子量化合物を除去すること；（９）油を脱臭剤供給タンクに移し、脱気し、脱臭する、例えば、充填カラム脱臭剤の中で脱臭すること；ならびに（１０）脱臭サイクルの終了時に冷却し、例えば、窒素ブランケット下で冷却し、好適な酸化防止剤を脱臭油に添加して酸化安定性を提供することの１つ以上を含む。
【０１４３】
[0146]一部の実施形態において、微生物油は、約０重量％、少なくとも約０．１重量％、少なくとも約０．２重量％、少なくとも約０．５重量％、少なくとも約１重量％、少なくとも約１．５重量％、少なくとも約２重量％、または少なくとも約５重量％のステロールエステル画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、約０重量％から約１．５重量％、約０重量％から約２重量％、約０重量％から約５重量％、約１重量％から約１．５重量％、約０．２重量％から約１．５重量％、約０．２重量％から約２重量％、または約０．２重量％から約５重量％のステロールエステル画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、約５重量％以下、約４重量％以下、約３重量％以下、約２重量％以下、約１重量％以下、約０．５重量％以下、約０．３重量％以下、約０．２重量％以下、約０．５重量％以下、約０．４重量％以下、約０．３重量％以下、または約０．２重量％以下のステロールエステル画分を含む。
【０１４４】
[0147]一部の実施形態において、微生物油は、少なくとも約３５重量％、少なくとも約４０重量％、少なくとも約４５重量％、少なくとも約５０重量％、少なくとも約５５重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約６５重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約７５重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約８５重量％、または少なくとも約９０重量％のトリアシルグリセロール画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、約３５重量％から約９８重量％、約３５重量％から約９０重量％、約３５重量％から約８０重量％、約３５重量％から約７０重量％、約３５重量％から約７０重量％、約３５重量％から約６５重量％、約４０重量％から約７０重量％、約４０重量％から約６５重量％、約４０重量％から約５５重量％、約４０重量％から約５０重量％、約６５重量％から約９５重量％、約７５重量％から約９５重量％、約７５重量％から約９８重量％、約８０重量％から約９５重量％、約８０重量％から約９８重量％、約９０重量％から約９６重量％、約９０重量％から約９７重量％、約９０重量％から約９８重量％、約９０重量％、約９５重量％、約９７重量％、または約９８重量％のトリアシルグリセロール画分を含む。
【０１４５】
[0148]一部の実施形態において、微生物油は、少なくとも約１０重量％、少なくとも約１１重量％、少なくとも約１２重量％、少なくとも約１３重量％、少なくとも約１４重量％、少なくとも約１５重量％、少なくとも約１６重量％、少なくとも約１７重量％、少なくとも約１８重量％、少なくとも約１９重量％、または少なくとも約２０重量％のジアシルグリセロール画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、約１０重量％から約４５重量％、約１０重量％から約４０重量％、約１０重量％から約３５重量％、約１０重量％から約３０重量％、約１５重量％から約４０重量％、約１５重量％から約３５重量％、または約１５重量％から約３０重量％のジアシルグリセロール画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、少なくとも約０．２重量％、少なくとも約０．３重量％、少なくとも約０．４重量％、少なくとも約０．５重量％、少なくとも約１重量％、少なくとも約５重量％、少なくとも約１０重量％、少なくとも約１１重量％、少なくとも約１２重量％、少なくとも約１３重量％、少なくとも約１４重量％、少なくとも約１５重量％、少なくとも約１６重量％、少なくとも約１７重量％、少なくとも約１８重量％、少なくとも約１９重量％、または少なくとも約２０重量％の１，２−ジアシルグリセロール画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、約０．２重量％から約４５重量％、約０．２重量％から約３０重量％、約０．２重量％から約２０重量％、約０．２重量％から約１０重量％、約０．２重量％から約５重量％、約０．２重量％から約１重量％、約０．２重量％から約０．８重量％、約０．４重量％から約４５重量％、約０．４重量％から約３０重量％、約０．４重量％から約２０重量％、約０．４重量％から約１０重量％、約０．４重量％から約５重量％、約０．４重量％から約１重量％、約０．４重量％から約０．８重量％、約０．５重量％から約１重量％、約０．５重量％から約０．８重量％、約１０重量％から約４５重量％、約１０重量％から約４０重量％、約１０重量％から約３５重量％、約１０重量％から約３０重量％、約１５重量％から約４０重量％、約１５重量％から約３５重量％、約１５重量％から約３０重量％、または約１５重量％から約２５重量％のジアシルグリセロール画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、少なくとも約０．１重量％、少なくとも約０．２重量％、少なくとも約０．５重量％、少なくとも約１重量％、少なくとも約２重量％、少なくとも約２．５重量％、または少なくとも約３重量％の１，３−ジアシルグリセロール画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、少なくとも約０．３重量％、少なくとも約０．４重量％、少なくとも約０．５重量％、少なくとも約１重量％、少なくとも約１．５重量％、少なくとも約２重量％、または少なくとも約５重量％のステロール画分を含む。
【０１４６】
[0149]一部の実施形態において、微生物油は、約０．３重量％から約５重量％、約０．３％から約２重量％、約０．３重量％から約１．５重量％、約０．５重量％から約１．５重量％、約１重量％から約１．５重量％、約０．５重量％から約２重量％、約０．５重量％から約５重量％、約１重量％から約２重量％、または約１重量％から約５重量％のステロール画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、約５重量％以下、約４重量％以下、約３重量％以下、約２重量％以下、約１．５重量％以下、または約１重量％以下のステロール画分を含む。
【０１４７】
[0150]一部の実施形態において、微生物油は、少なくとも約２重量％、少なくとも約５重量％、または少なくとも約８重量％のリン脂質画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、約２重量％から約２５重量％、約２重量％から約２０重量％、約２重量％から約１５重量％、約２重量％から約１０重量％、約５重量％から約２５重量％、約５重量％から約２０重量％、約５重量％から約２０重量％、約５重量％から約１０重量％、または約７重量％から約９重量％のリン脂質画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、約２０重量％未満、約１５重量％未満、約１０重量％未満、約９重量％未満、または約８重量％未満のリン脂質画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、リン脂質を実質的に含まない。一部の実施形態において、微生物油は、油の約２重量％未満、約１．５重量％未満、約１重量％未満、または約０．５重量％未満の不鹸化物を含む。微生物油中に存在する脂質クラス、例えば、トリアシルグリセロール画分は、フラッシュクロマトグラフィーにより分離することができ、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により分析することができ、または当分野において公知の他の方法により分離および分析することができる。
【０１４８】
[0151]一部の実施形態において、微生物油、ならびに／またはトリアシルグリセロール画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジアシルグリセロール画分、およびそれらの組合せから選択されるその１つ以上の画分は、少なくとも約５重量％、少なくとも約１０重量％、約１０重量％超、少なくとも約１２重量％、少なくとも約１３重量％、少なくとも約１４重量％、少なくとも約１５重量％、少なくとも約１６重量％、少なくとも約１７重量％、少なくとも約１８重量％、少なくとも約１９重量％、少なくとも約２０重量％、少なくとも約２５重量％、少なくとも約３０重量％、少なくとも約３５重量％、少なくとも約４０重量％、または少なくとも約４５重量％のＥＰＡを含む。一部の実施形態において、微生物油、ならびに／またはトリアシルグリセロール画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジアシルグリセロール画分、およびそれらの組合せから選択されるその１つ以上の画分は、約５重量％から約５５重量％、約５重量％から約５０重量％、約５重量％から約４５重量％、約５重量％から約４０重量％、約５重量％から約３５重量％、約５重量％から約３０重量％、約１０重量％から約５５重量％、約１０重量％から約５０重量％、約１０重量％から約４５重量％、約１０重量％から約４０重量％、約１０重量％から約３５重量％、約１０重量％から約３０重量％、少なくとも約１２重量％から約５５重量％、少なくとも約１２重量％から約５０重量％、少なくとも約１２重量％から約４５重量％、少なくとも約１２重量％から約４０重量％、少なくとも約１２重量％から約３５重量％、または少なくとも約１２重量％から約３０重量％、約１５重量％から約５５重量％、約１５重量％から約５０重量％、約１５重量％から約４５重量％、約１５重量％から約４０重量％、約１５重量％から約３５重量％、約１５重量％から約３０重量％、約１５重量％から約２５重量％、約１５重量％から約２０重量％、約２０重量％から約５５重量％、約２０重量％から約５０重量％、約２０重量％から約４５重量％、約２０重量％から約４０重量％、または約２０重量％から約３０重量％のＥＰＡを含む。一部の実施形態において、微生物油、ならびに／またはトリアシルグリセロール画分、ジアシルグリセロール画分、ステロール画分、ステロールエステル画分、遊離脂肪酸画分、リン脂質画分、およびそれらの組合せから選択されるその１つ以上の画分は、少なくとも約５重量％、少なくとも約１０重量％、少なくとも約１５重量％、少なくとも約２０重量％、少なくとも約２５重量％、少なくとも約３０重量％、少なくとも約３５重量％、少なくとも約４０重量％、少なくとも約５０重量％、または少なくとも約６０重量％のＤＨＡを含む。一部の実施形態において、微生物油、ならびに／またはトリアシルグリセロール画分、ジアシルグリセロール画分、ステロール画分、ステロールエステル画分、遊離脂肪酸画分、リン脂質画分、およびそれらの組合せから選択される１つ以上の画分は、約５重量％から約６０重量％、約５重量％から約５５重量％、約５重量％から約５０重量％、約５重量％から約４０重量％、約１０重量％から約６０重量％、約１０重量％から約５０重量％、約１０重量％から約４０重量％、約２０重量％から約６０重量％、約２５重量％から約６０重量％、約２５重量％から約５０重量％、約２５重量％から約４５重量％、約３０重量％から約５０重量％、約３５重量％から約５０重量％、または約３０重量％から約４０重量％のＤＨＡを含む。一部の実施形態において、微生物油、ならびに／またはトリアシルグリセロール画分、ジアシルグリセロール画分、ステロール画分、ステロールエステル画分、遊離脂肪酸画分、リン脂質画分、およびそれらの組合せから選択されるその１つ以上の画分は、約１０重量％以下、約９重量％以下、約８重量％以下、約７重量％以下、約６重量％以下、約５重量％以下、約４重量％以下、約３重量％以下、約２重量％以下、または約１重量％以下のＤＨＡを含む。一部の実施形態において、微生物油、ならびに／またはトリアシルグリセロール画分、ジアシルグリセロール画分、ステロール画分、ステロールエステル画分、遊離脂肪酸画分、リン脂質画分、およびそれらの組合せから選択されるその１つ以上の画分は、ＤＨＡとして、約１重量％から約１０重量％、約１重量％から約５重量％、約２重量％から約５重量％、約３重量％から約５重量％、または約３重量％から約１０重量％の脂肪酸を含む。一部の実施形態において、微生物油、ならびに／またはトリアシルグリセロール画分、ジアシルグリセロール画分、ステロール画分、ステロールエステル画分、遊離脂肪酸画分、リン脂質画分、およびそれらの組合せから選択されるその１つ以上の画分はＤＨＡを実質的に含まない。一部の実施形態において、微生物油、ならびに／またはトリアシルグリセロール画分、ジアシルグリセロール画分、ステロール画分、ステロールエステル画分、遊離脂肪酸画分、リン脂質画分、およびそれらの組合せから選択されるその１つ以上の画分は、約０．１重量％から約５重量％、約０．１重量％から約５重量％未満、約０．１重量％から約４重量％、約０．１重量％から約３重量％、約０．１重量％から約２重量％、約０．２重量％から約５重量％、約０．２重量％から約５重量％未満、約０．２重量％から約４重量％、約０．２重量％から約３重量％、約０．２重量％から約２重量％、約０．３重量％から約２重量％、約０．１重量％から約０．５重量％、約０．２重量％から約０．５重量％、約０．１重量％から約０．４重量％、約０．２重量％から約０．４重量％、約０．５重量％から約２重量％、約１重量％から約２重量％、約０．５重量％から約１．５重量％、または約１重量％から約１．５重量％のＡＲＡを含む。一部の実施形態において、微生物油、ならびに／またはトリアシルグリセロール画分、ジアシルグリセロール画分、ステロール画分、ステロールエステル画分、遊離脂肪酸画分、リン脂質画分、およびそれらの組合せから選択されるその１つ以上の画分は、約５重量％以下、約５重量％未満、約４重量％以下、約３重量％以下、約２重量％以下、約１．５重量％以下、約１重量％以下、約０．５重量％以下、約０．４重量％以下、約０．３重量％以下、約０．２重量％以下、または約０．１重量％以下のＡＲＡを含む。一部の実施形態において、微生物油、ならびに／またはトリアシルグリセロール画分、ジアシルグリセロール画分、ステロール画分、ステロールエステル画分、遊離脂肪酸画分、リン脂質画分、およびそれらの組合せから選択されるその１つ以上の画分はＡＲＡを実質的に含まない。一部の実施形態において、微生物油、ならびに／またはトリアシルグリセロール画分、ジアシルグリセロール画分、ステロール画分、ステロールエステル画分、遊離脂肪酸画分、リン脂質画分、およびそれらの組合せから選択されるその１つ以上の画分は、約０．４重量％から約２重量％、約０．４重量％から約３重量％、約０．４重量％から約４重量％、約０．４重量％から約５重量％、約０．４重量％から約５重量％未満、約０．５重量％から約１重量％、約０．５重量％から約２重量％、約０．５重量％から約３重量％、約０．５重量％から約４重量％、約０．５重量％から約５重量％、約０．５重量％から約５重量％未満、約１重量％から約２重量％、約１重量％から約３重量％、約１重量％から約４重量％、約１重量％から約５重量％、または約１重量％から約５重量％未満のＤＰＡｎ−６を含む。一部の実施形態において、微生物油、ならびに／またはトリアシルグリセロール画分、ジアシルグリセロール画分、ステロール画分、ステロールエステル画分、遊離脂肪酸画分、リン脂質画分、およびそれらの組合せから選択されるその１つ以上の画分は、約５重量％、約５重量％未満、約４重量％以下、約３重量％以下、約２重量％以下、約１重量％以下、約０．７５重量％以下、約０．６重量％以下、または約０．５重量％以下のＤＰＡｎ−６を含む。一部の実施形態において、微生物油、ならびに／またはトリアシルグリセロール画分、ジアシルグリセロール画分、ステロール画分、ステロールエステル画分、遊離脂肪酸画分、リン脂質画分、およびそれらの組合せから選択されるその１つ以上の画分はＤＰＡｎ−６を実質的に含まない。一部の実施形態において、微生物油、ならびに／またはトリアシルグリセロール画分、ジアシルグリセロール画分、ステロール画分、ステロールエステル画分、遊離脂肪酸画分、リン脂質画分、およびそれらの組合せから選択されるその１つ以上の画分は、約５重量％以下、約５重量％未満、約４重量％以下、約３重量％以下、または約２重量％以下のオレイン酸（１８：１ｎ−９）、リノール酸（１８：２ｎ−６）、リノレン酸（１８：３ｎ−３）、エイコセン酸（２０：１ｎ−９）、エルカ酸（２２：１ｎ−９）、ステアリドン酸（１８：４ｎ−３）、またはそれらの組合せを有する脂肪酸を含む。
【０１４９】
[0152]トリアシルグリセロール分子は、異なる位置異性体の形成を可能にする、３つの中心炭素原子（Ｃ（ｓｎ−１）Ｈ２Ｒ１−（ｓｎ−２）Ｈ２Ｒ２−Ｃ（ｓｎ−３）Ｈ２Ｒ３）を含有する。一部の実施形態において、微生物油は、トリアシルグリセロール画分中の少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、または少なくとも約４０％のトリアシルグリセロールが、ＨＰＬＣクロマトグラフ上のピークの相対面積パーセントに基づいてｓｎ−１、ｓｎ−２、およびｓｎ−３位のいずれか２つから選択されるトリアシルグリセロール中の２つの位置にＤＨＡを含有する（二置換ＤＨＡ）、トリアシルグリセロール画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、トリアシルグリセロール画分中の約２％から約５５％、約２％から約５０％、約２％から約４５％、約２％から約４０％、約２％から約３５％、約２％から約３０％、約２％から約２５％、約５％から約５５％、約５％から約５０％、約５％から約４５％、約５％から約４０％、約５％から約３５％、約５％から約３０％、約５％から約２５％、約１０％から約５５％、約１０％から約５０％、約１０％から約４５％、約１０％から約４０％、約１０％から約３５％、約１０％から約３０％、約１０％から約２５％、約１０％から約２０％、約２０％から約４０％、約２０％から約３５％、または約２０％から約２５％のトリアシルグリセロールが、ＨＰＬＣクロマトグラフ上のピークの相対面積パーセントに基づいてｓｎ−１、ｓｎ−２、およびｓｎ−３位のいずれか２つから選択されるトリアシルグリセロール中の２つの位置にＥＰＡを含有する、トリアシルグリセロール画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、トリアシルグリセロール画分中の少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、少なくとも約１．５％、または少なくとも約２％のトリアシルグリセロールが、ＨＰＬＣクロマトグラフ上のピークの相対面積パーセントに基づいてｓｎ−１、ｓｎ−２、およびｓｎ−３位の全てにＤＨＡを含有する（三置換ＤＨＡ）、トリアシルグリセロール画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、トリアシルグリセロール画分中の約０．５％から約５％、約０．５％から約３％、約０．５％から約２．５％、約０．５％から約２％、約１％から約５％、約１％から約３％、または約１％から約２％のトリアシルグリセロールが、ＨＰＬＣクロマトグラフ上のピークの相対面積パーセントに基づいてｓｎ−１、ｓｎ−２、およびｓｎ−３位の全てにＤＨＡを含有する、トリアシルグリセロール画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、トリアシルグリセロール画分中の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、または少なくとも約６０％のトリアシルグリセロールが、ＨＰＬＣクロマトグラフ上のピークの相対面積パーセントに基づいてｓｎ−１、ｓｎ−２、およびｓｎ−３位のいずれか１つから選択されるトリアシルグリセロール中の１つの位置にＤＨＡを有する、トリアシルグリセロール画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、トリアシルグリセロール画分中の約１０％から約８０％、約１０％から約７０％、約１０％から約６０％、約１５％から約８０％、約１５％から約７５％、約１５％から約７０％、約１５％から約６５％、約１５％から約６０％、約３５％から約８０％、約３５％から約７５％、約３５％から約６５％、約３５％から約６０％、約４０％から約８０％、約４０％から約７５％、約４０％から約７０％、約４０％から約６５％、約４０％から約６０％、または約４０％から約５５％のトリアシルグリセロールが、ＨＰＬＣクロマトグラフ上のピークの相対面積パーセントに基づいてｓｎ−１、ｓｎ−２、およびｓｎ−３位のいずれか１つから選択されるトリアシルグリセロール中の１つの位置にＤＨＡを含む、トリアシルグリセロール画分を含む。
【０１５０】
[0153]本発明はさらに、微生物油を生成する方法を対象とする。一部の実施形態において、本方法は、本発明のヤブレツボカビを培養物中で増殖させてバイオマスを生成し、バイオマスからω−３脂肪酸を含む油を抽出することを含む。油は、新たに回収されたバイオマスから抽出することができ、または腐敗を防ぐ条件下で保管されていた以前に回収されたバイオマスから抽出することができる。本発明のヤブレツボカビを培養するため、培養物からバイオマスを単離するため、バイオマスから微生物油を抽出するため、およびバイオマスから抽出された油の脂肪酸プロファイルを分析するため、公知の方法を使用することができる。例えば、米国特許第５，１３０，２４２号明細書参照。
【０１５１】
[0154]本発明はさらに、本発明の脂肪酸プロファイルを含む微生物油を対象とする。本発明の微生物油は、微生物に由来する任意の油であり得、例として、例えば：微生物のバイオマスから抽出され、さらに加工されない粗製油；粗製微生物油をさらなる加工工程、例えば、精製、脱色、および／または脱臭により処理することにより得られる精製油；粗製または精製微生物油を希釈することにより得られる希釈微生物油；または例えば、粗製もしくは精製微生物油を、油中の脂肪酸（例えば、ＤＨＡ）の濃度を増加させるために精製するさらなる方法により処理することにより得られる濃縮油であり得る。
【０１５２】
[0155]一部の実施形態において、微生物油は、約０重量％、少なくとも約０．１重量％、少なくとも約０．２重量％、少なくとも約０．５重量％、少なくとも約１重量％、少なくとも約１．５重量％、少なくとも約２重量％、または少なくとも約５重量％のステロールエステル画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、約０重量％から約１．５重量％、約０重量％から約２重量％、約０重量％から約５重量％、約１重量％から約１．５重量％、約０．２重量％から約１．５重量％、約０．２重量％から約２重量％、または約０．２重量％から約５重量％のステロールエステル画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、約５重量％未満、約４重量％未満、約３重量％未満、または約２重量％未満のステロールエステル画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、少なくとも約６５重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約７５重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約８５重量％、または少なくとも約９０重量％のトリグリセリド画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、約６５重量％から約９５重量％、約７５重量％から約９５重量％、または約８０重量％から約９５重量％、または約９７重量％、または約９８重量％のトリグリセリド画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、少なくとも約０．５重量％、少なくとも約１重量％、少なくとも約１．５重量％、少なくとも約２重量％、少なくとも約２．５重量％、または少なくとも約５重量％の遊離脂肪酸画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、約０．５重量％から約５重量％、約０．５重量％から約２．５重量％、約０．５重量％から約２重量％、約０．５重量％から約１．５重量％、約０．５重量％から約１重量％、約１重量％から約２．５重量％、約１重量％から約５重量％、約１．５重量％から約２．５重量％、約２重量％から約２．５重量％、または約２重量％から約５重量％の遊離脂肪酸画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、約５重量％未満、約４重量％未満、約３重量％未満、約２重量％未満、または約１重量％未満の遊離脂肪酸画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、少なくとも約０．５重量％、少なくとも約１重量％、少なくとも約１．５重量％、少なくとも約２重量％、または少なくとも約５重量％のステロール画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、約０．５重量％から約１．５重量％、約１重量％から約１．５重量％、約０．５重量％から約２重量％、約０．５重量％から約５重量％、約１重量％から約２重量％、または約１重量％から約５重量％のステロール画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、約５重量％未満、約４重量％、約３重量％未満、約２重量％未満、または約１重量％未満のステロール画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、少なくとも約１．５重量％、少なくとも約２重量％、少なくとも約２．５重量％、少なくとも約３重量％、少なくとも約３．５重量％、または少なくとも約５重量％のジグリセリド画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、約１．５重量％から約３重量％、約２重量％から約３重量％、約１．５重量％から約３．５重量％、約１．５重量％から約５重量％、約２．５重量％から約３重量％、約２．５重量％から約３．５重量％、または約２．５重量％から約５重量％のジグリセリド画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、油の約２重量％未満、約１．５重量％未満、約１重量％未満、または約０．５重量％未満の不鹸化物を含む。微生物油中に存在する脂質クラス、例えば、トリグリセリド画分は、フラッシュクロマトグラフィーにより分離することができ、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により分析することができ、または当分野において公知の他の方法により分離および分析することができる。
【０１５３】
[0156]一部の実施形態において、微生物油ならびに／またはトリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、およびそれらの組合せから選択されるその１つ以上の画分は、少なくとも約４０重量％、少なくとも約４５重量％、少なくとも約５０重量％、少なくとも約５５重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約６５重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約７５重量％、または少なくとも約８０重量％のＤＨＡを含む。一部の実施形態において、微生物油ならびに／またはトリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、およびそれらの組合せから選択されるその１つ以上の画分は、約４０重量％から約４５重量％、約４０重量％から約５０重量％、約４０重量％から約６０重量％、約５０重量％から約６０重量％、約５５重量％から約６０重量％、約４０重量％から約６５重量％、約５０重量％から約６５重量％、約５５重量％から約６５重量％、約４０重量％から約７０重量％、約４０重量％から約８０重量％、約５０重量％から約８０重量％、約５５重量％から約８０重量％、約６０重量％から約８０重量％、または約７０重量％から約８０重量％のＤＨＡを含む。一部の実施形態において、微生物油は、約４５重量％以下、約４０重量％以下、約３５重量％以下、約３０重量％以下、約２５重量％以下、約２０重量％以下、約１５重量％以下、または約１３重量％以下のＤＨＡを含むステロールエステル画分を含む。一部の実施形態において、微生物油ならびに／またはトリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、およびそれらの組合せから選択されるその１つ以上の画分は、約１０重量％以下、約９重量％以下、約８重量％以下、約７重量％以下、約６重量％以下、約５重量％以下、約４重量％以下、約３重量％以下、約２重量％以下、または約１重量％以下のＥＰＡを含む。一部の実施形態において、微生物油ならびに／またはトリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、およびそれらの組合せから選択されるその１つ以上の画分は、約２重量％から約３重量％、約２重量％から約３．５重量％、約２．５重量％から約３．５重量％、約２重量％から約６重量％、約２．５重量％から約６重量％、約３．０重量％から約６重量％、約３．５重量％から約６重量％、約５重量％から約６重量％、または約２重量％から約１０重量％のＥＰＡを含む。一部の実施形態において、微生物油ならびに／またはステロールエステル画分、トリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、極性画分（リン脂質画分を含む）、およびそれらの組合せから選択されるその１つ以上の画分は、ＥＰＡを実質的に含まない。一部の実施形態において、微生物油ならびに／またはステロールエステル画分、トリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、極性画分（リン脂質画分を含む）およびそれらの組合せから選択されるその１つ以上の画分は、少なくとも約５：１、少なくとも約７：１、少なくとも約９：１、少なくとも約１０：１、少なくとも約１５：１、少なくとも約２０：１、少なくとも約２５：１、少なくとも約３０：１、または少なくとも約５０：１のＤＨＡとＥＰＡとの重量比を含み、微生物油および／またはその１つ以上の画分は、１０重量％以下のＥＰＡを含む。一部の実施形態において、微生物油ならびに／またはステロールエステル画分、トリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、極性画分（リン脂質画分を含む）およびそれらの組合せから選択されるその１つ以上の画分は、少なくとも約５：１であるが、約２０：１未満のＤＨＡとＥＰＡとの重量比を含む。一部の実施形態において、ＤＨＡとＥＰＡとの重量比は、約５：１から約１８：１、約７：１から約１６：１、または約１０：１から約１５：１である。一部の実施形態において、微生物油ならびに／またはステロールエステル画分、トリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、極性画分（リン脂質画分を含む）およびそれらの組合せから選択されるその１つ以上の画分は、約０．１重量％から約０．２５重量％、約０．２重量％から約０．２５重量％、約０．１重量％から約０．５重量％、または約０．１重量％から約１．５重量％のＡＲＡを含む。一部の実施形態において、微生物油ならびに／またはステロールエステル画分、トリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、極性画分（リン脂質画分を含む）およびそれらの組合せから選択されるその１つ以上の画分は、約１．５重量％以下、約１重量％以下、約０．５重量％以下、約０．２重量％以下、または約０．１重量％以下のＡＲＡを含む。一部の実施形態において、微生物油ならびに／またはステロールエステル画分、トリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、極性画分（リン脂質画分を含む）およびそれらの組合せから選択されるその１つ以上の画分は、ＡＲＡを実質的に含まない。一部の実施形態において、微生物油ならびに／またはステロールエステル画分、トリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ジグリセリド画分、極性画分（リン脂質画分を含む）およびそれらの組合せから選択されるその１つ以上の画分は、少なくとも約２０：１、少なくとも約３０：１、少なくとも約３５：１、少なくとも約４０：１、少なくとも約６０：１、少なくとも約８０：１、少なくとも約１００：１、少なくとも約１５０：１、少なくとも約２００：１、少なくとも約２５０：１、または少なくとも約３００：１のＤＨＡとＡＲＡとの重量比を含む。一部の実施形態において、微生物油ならびに／またはステロールエステル画分、トリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、極性画分（リン脂質画分を含む）およびそれらの組合せから選択されるその１つ以上の画分は、約０．５重量％から約１重量％、約０．５重量％から約２重量％、約０．５重量％から約２．５重量％、約０．５重量％から約３重量％、約０．５重量％から約３．５重量％、約０．５重量％から約５重量％、約０．５重量％から約６重量％、約１重量％から約２重量％、約２重量％から約３重量％、約２重量％から約３．５重量％、約１重量％から約２．５重量％、約１重量％から約３重量％、約１重量％から約３．５重量％、約１重量％から約５重量％、または約１重量％から約６重量％のＤＰＡｎ−６を含む。一部の実施形態において、微生物油ならびに／またはステロールエステル画分、トリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、極性画分（リン脂質画分を含む）およびそれらの組合せから選択されるその１つ以上の画分は、約６重量％以下、約５重量％以下、約３重量％以下、約２．５重量％以下、約２重量％以下、約１重量％以下、または約０．５重量％以下のＤＰＡｎ−６を含む。一部の実施形態において、微生物油ならびに／またはステロールエステル画分、トリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、極性画分（リン脂質画分を含む）およびそれらの組合せから選択されるその１つ以上の画分は、ＤＰＡｎ−６を実質的に含まない。一部の実施形態において、微生物油ならびに／またはステロールエステル画分、トリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、極性画分（リン脂質画分を含む）およびそれらの組合せから選択されるその１つ以上の画分は、約６：１超、少なくとも約８：１、少なくとも約１０：１、少なくとも約１５：１、少なくとも約２０：１、少なくとも約２５：１、少なくとも約５０：１、または少なくとも約１００：１のＤＨＡとＤＰＡｎ−６との重量比を含む。一部の実施形態において、微生物油ならびに／またはステロールエステル画分、トリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、極性画分（リン脂質画分を含む）およびそれらの組合せから選択されるその１つ以上の画分は、約５重量％以下、約４重量％以下、約３重量％以下、約２重量％以下、約１．５重量％以下、約１重量％以下、または約０．５重量％以下のリノール酸（１８：２ｎ−６）、リノレン酸（１８：３ｎ−３）、エイコセン酸（２０：１ｎ−９）、およびエルカ酸（２２：１ｎ−９）のそれぞれを含む。一部の実施形態において、微生物油ならびに／またはステロールエステル画分、トリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、極性画分（リン脂質画分を含む）およびそれらの組合せから選択されるその１つ以上の画分は、約５重量％以下、約４重量％以下、約３重量％以下、約２重量％以下、約１．５重量％以下、または約１重量％以下のヘプタデカン酸（１７：０）を含む。一部の実施形態において、微生物油および／またはその１つ以上の画分は、約０．０１重量％から約５重量％、約０．０５重量％から約３重量％、または約０．１重量％から約１重量％のヘプタデカン酸を含む。
【０１５４】
[0157]トリグリセリド分子は、異なる位置異性体の形成を可能にする、３つの中心炭素原子（Ｃｓｎ−１Ｈ２Ｒ１−Ｃｓｎ−２Ｈ２Ｒ２−Ｃｓｎ−３Ｈ２Ｒ３）を含有する。一部の実施形態において、微生物油は、トリグリセリド画分中の少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、または少なくとも約４０％のトリグリセリドが、ＨＰＬＣクロマトグラフ上のピークの相対面積パーセントに基づいてｓｎ−１、ｓｎ−２、およびｓｎ−３位のいずれか２つから選択されるトリグリセリドの２つの位置にＤＨＡを含有する（二置換ＤＨＡ）、トリグリセリド画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、トリグリセリド画分中の約２０％から約４０％、約２０％から約３５％、約３０％から約４０％、または約３０％から約３５％のトリグリセリドが、ＨＰＬＣクロマトグラフ上のピークの相対面積パーセントに基づいてｓｎ−１、ｓｎ−２、およびｓｎ−３位のいずれか２つから選択されるトリグリセリド中の２つの位置にＤＨＡを含有する、トリグリセリド画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、トリグリセリド画分中の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％のトリグリセリドが、ＨＰＬＣクロマトグラフ上のピークの相対面積パーセントに基づいてｓｎ−１、ｓｎ−２、およびｓｎ−３位の全てにＤＨＡを含有する（三置換ＤＨＡ）、トリグリセリド画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、トリグリセリド画分中の約５％から約２０％、約５％から約１５％、約１０％から約２０％；または約１０％から約１５％のトリグリセリドが、ＨＰＬＣクロマトグラフ上のピークの相対面積パーセントに基づいてｓｎ−１、ｓｎ−２、およびｓｎ−３位の全てにＤＨＡを含有する、トリグリセリド画分を含む。対照的に、米国特許第６，５８２，９４１号明細書に報告されているＴＡＧ種は、３つ全ての位置にＤＨＡを含有しない。一部の実施形態において、微生物油は、トリグリセリド画分中の少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％のトリグリセリドが、ＨＰＬＣクロマトグラフ上のピークの相対面積パーセントに基づいてｓｎ−１、ｓｎ−２、およびｓｎ−３位のいずれか１つから選択されるトリグリセリド中の１つの位置にＤＨＡを含有する、トリグリセリド画分を含む。一部の実施形態において、微生物油は、トリグリセリド画分中の約５０％から約７５％、約５０％から約７０％、約５０％から約６５％、約６０％から約７５％、約６０％から約７０％、または約６０％から約６５％のトリグリセリドが、ＨＰＬＣクロマトグラフ上のピークの相対面積パーセントに基づいてｓｎ−１、ｓｎ−２、およびｓｎ−３位のいずれか１つから選択されるトリグリセリド中の１つの位置にＤＨＡを含有する、トリグリセリド画分を含む。
【０１５５】
［組成物］
[0158]本発明は、本発明の微生物を含む組成物、本発明の単離されたバイオマス、本発明の微生物油、またはそれらの組合せを対象とする。
【０１５６】
[0159]本発明の微生物、バイオマス、または微生物油は、組成物の要件に基づいて、任意の公知の技術により化学的または物理的にさらに改変または加工することができる。
【０１５７】
[0160]微生物細胞またはバイオマスは、組成物中での使用前に、限定されるものではないが、フリーズドライ、風乾、噴霧乾燥、トンネル乾燥、真空乾燥（凍結乾燥）、および類似のプロセスを含む方法により乾燥させることができる。あるいは、回収および洗浄されたバイオマスを、乾燥なしで組成物中で直接使用することができる。例えば、それぞれ参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第５，１３０，２４２号明細書および米国特許第６，８１２，００９号明細書参照。
【０１５８】
[0161]本発明の微生物油は、脂肪酸、例えば、ＥＰＡに富む生成物をより効率的に生成するための出発材料として使用することができる。例えば、本発明の微生物油は、より高いＥＰＡまたは別の脂肪酸の濃度を有するより強力な生成物を生成するために当分野において公知の種々の精製技術、例えば、蒸留または尿素アダクト法に供することができる。本発明の微生物油は、油中の脂肪酸に由来する化合物、例えば、ＥＰＡまたは別の脂肪酸のエステルおよび塩を生成する化学反応において使用することもできる。
【０１５９】
[0162]本発明の組成物は１つ以上の賦形剤を含み得る。本明細書において使用される「賦形剤」は、食物ならびに医薬組成物、化粧組成物、および工業組成物を含む組成物に所望の特徴を与えるために本発明の組成物において使用される構成成分または構成成分の混合物を指す。本発明の賦形剤は、医薬組成物に添加される場合、「薬学的に許容可能な」賦形剤と記載することができ、「薬学的に許容可能な」は、この賦形剤が、合理的なベネフィット／リスク比に対応する所望の接触期間にわたり過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題のある合併症なくヒトおよび非ヒト動物の組織との接触に好適な、妥当な医学的判断の範囲内の化合物、材料、組成物、塩、および／または剤形であることを意味する。一部の実施形態において、「薬学的に許容可能な」という用語は、連邦政府または州政府の規制当局により承認されているかまたは米国薬局方、もしくは動物、より特定すると、ヒトにおける使用のための一般に認められている他の国際薬局方に列挙されていることを意味する。種々の賦形剤を使用することができる。一部の実施形態において、賦形剤は、限定されるものではないが、アルカリ剤、安定剤、酸化防止剤、接着剤、分離剤、コーティング剤、外相構成成分、徐放構成成分、溶媒、界面活性剤、保湿剤、緩衝剤、増量剤、エモリネント剤、またはそれらの組合せであり得る。本明細書において議論される賦形剤に加えて、賦形剤には、限定されるものではないが、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  ｅｄ．（２００５）に列挙される賦形剤が含まれ得る。本明細書の特定の分類における賦形剤（例えば、「溶媒」）の包含は、賦形剤の役割を限定するのではなく説明することを目的とする。特定の賦形剤は、複数の分類内に存在し得る。
【０１６０】
[0163]本発明の組成物には、限定されるものではないが、食品、医薬組成物、化粧品、および工業組成物が含まれる。
【０１６１】
[0164]一部の実施形態において、組成物は食品である。食品は、非ヒト動物またはヒト消費のための任意の食物であり、固体組成物および液体組成物の両方を含む。食品は、動物またはヒトの食物への添加物であり得る。食物には、限定されるものではないが、一般食物；乳、飲料、治療用飲料、および栄養飲料を含む液体製品；機能性食品；サプリメント；栄養補助食品；未熟児用調製粉乳を含む調製粉乳；妊婦または授乳婦のための食物；成人用食物；高齢者用食物；ならびに動物用食物が含まれる。
【０１６２】
[0165]一部の実施形態において、本発明の微生物、バイオマス、または微生物油は、油、ショートニング、スプレッド、他の脂肪成分、飲料、ソース、乳ベースの食物またはダイズベースの食物（例えば、乳、ヨーグルト、チーズ、およびアイスクリーム）、焼成食物、栄養製品、例えば、（カプセルまたは錠剤の形態の）栄養サプリメントとしての栄養製品、ビタミンサプリメント、食事サプリメント、粉末飲料、ならびに完成品または半完成品の粉末食品の１つ以上として直接使用することができ、またはその中で添加物として含めることができる。一部の実施形態において、栄養サプリメントは、動物源からのいかなる成分からも形成されず、そのいかなる成分も含有しないベジタリアンカプセルの形態である。
【０１６３】
[0166]本発明の微生物油を含み得る食物組成物の部分的なリストには、限定されるものではないが、ダイズベースの製品（乳、アイスクリーム、ヨーグルト、飲料、クリーム、スプレッド、増白剤）；スープおよびスープミックス；ドー、衣用生地、ならびに、焼成食品、例として、例えば、ファインベーカリー製品、朝食用シリアル、ケーキ、チーズケーキ、パイ、カップケーキ、クッキー、バー、パン、ロールケーキ、ビスケット、マフィン、ペストリー、スコーン、クルトン、クラッカー、甘味品、スナックケーキ、パイ、グラノーラ／スナックバー、およびトースターペストリー；キャンディー；堅菓子；チョコレートおよび他の菓子；チューインガム；液体食品、例えば、乳、エネルギー飲料、調製粉乳、炭酸飲料、茶、流動食、果物ジュース、果物ベースの飲料、野菜ベースの飲料；マルチビタミンシロップ、食事代用品、メディカルフード、およびシロップ；粉末飲料ミックス；パスタ；加工魚製品；加工肉製品；加工鳥肉製品；グレイビーおよびソース；調味料（ケチャップ、マヨネーズなど）；植物油ベースのスプレッド；乳製品；ヨーグルト；バター；冷凍乳製品；アイスクリーム；フローズンデザート；フローズンヨーグルト；半固体食品、例えば、ベビーフード；プディングおよびゼラチンデザート；加工および未加工チーズ；パンケーキミックス；フードバー、例として、エネルギーバー；ワッフルミックス；サラダドレッシング；代用卵液（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｅｇｇ  ｍｉｘ）；ナッツおよびナッツベースのスプレッド；塩味スナック、例えば、ポテトチップおよび他のチップまたはクリスプ、コーンチップ、トルティーヤチップ、膨化状スナック、ポップコーン、プレッツェル、ポテトクリスプ、ならびにナッツ；ならびに特殊スナック、例えば、ディップ、ドライフルーツスナック、ミートスナック、ポークラインズ、ヘルスフードバー、およびライス／コーンケーキが含まれる。
【０１６４】
[0167]一部の実施形態において、本発明の微生物油は調製粉乳に補給するために使用することができる。調製粉乳に、本発明の微生物油を単独で、または本発明の微生物油を、アラキドン酸（ＡＲＡ）生成微生物に由来する物理的に精製された油との組合せで補給することができる。ＡＲＡ生成微生物は、例えば、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）またはモルティエレラ属シュムケリ節（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｓｅｃｔ．ｓｃｈｍｕｃｋｅｒｉ）である。あるいは、調製粉乳に、本発明の微生物油をＡＲＡが豊富にある油、例として、ＡＲＡＳＣＯ（登録商標）（Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）との組合せで補給することができる。
【０１６５】
[0168]一部の実施形態において、組成物は動物用飼料である。「動物」には、動物界に属する非ヒト生物が含まれ、限定されるものではないが、水生動物および陸生動物が含まれる。「動物用飼料」または「動物の食物」という用語は、魚；商用魚；観賞魚；稚魚；二枚貝；軟体動物；甲殻類；貝；エビ；エビの幼生；アルテミア；ワムシ；ブラインシュリンプ；フィルターフィーダー；両生類；爬虫類；哺乳動物；家畜；農場の動物；動物園の動物；競技用動物；繁殖用動物；競走用動物；展覧用動物；在来動物（ｈｅｉｒｌｏｏｍ  ａｎｉｍａｌ）；希少動物もしくは絶滅危惧動物；伴侶動物；愛玩動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、またはウマ；霊長類、例えば、サル（例えば、オマキザル、アカゲザル、アフリカミドリザル、パタスモンキー、カニクイザル、およびオナガザル）、類人猿、オランウータン、ヒヒ、テナガザル、およびチンパンジー；イヌ科、例えば、イヌおよびオオカミ；ネコ科、例えば、ネコ、ライオン、およびトラ；ウマ科、例えば、ウマ、ロバ、およびシマウマ；食用動物、例えば、乳牛、ウシ、ブタ、およびヒツジ；有蹄類、例えば、シカおよびキリン；またはげっ歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットにかかわらず非ヒト動物用の任意の食物を指す。動物用飼料には、限定されるものではないが、水産養殖飼料、家畜用飼料、例として、愛玩動物用飼料、動物園動物用飼料、使役動物用飼料、畜類用飼料を含む、およびそれらの組合せが含まれる。
【０１６６】
[0169]一部の実施形態において、組成物は、食肉または製品がヒトにより消費される任意の動物、例えば、ヒト消費のための食肉、卵、または乳が由来する任意の動物のための飼料または飼料サプリメントである。栄養分、例えば、ＬＣ−ＰＵＦＡは、このような動物に供給される場合、このような動物の肉、乳、卵、または他の製品中に取り込まれてこれらの栄養分の含有率が増加され得る。
【０１６７】
[0170]一部の実施形態において、組成物は、粉々に崩れて動物プランクトン、アルテミア、ワムシ、およびフィルターフィーダーによる消費に適切なサイズの粒子を形成することができる噴霧乾燥された材料である。一部の実施形態において、組成物を供給された動物プランクトン、アルテミア、またはワムシは、次に、稚魚、魚、貝、二枚貝、または甲殻類に供給される。
【０１６８】
[0171]一部の実施形態において、組成物は医薬組成物である。好適な医薬組成物には、限定されるものではないが、抗炎症性組成物、冠状動脈性心疾患を治療するための薬物、動脈硬化症を治療するための薬物、化学療法剤、活性賦形剤、骨粗鬆症薬、抗うつ薬、抗痙攣薬、抗ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）薬、神経変性疾患を治療するための薬物、変性性肝臓疾患を治療するための薬物、抗生物質、コレステロール低下組成物、およびトリアシルグリセロール低下組成物が含まれる。一部の実施形態において、組成物はメディカルフードである。メディカルフードには、医師の監督下で外部から消費または投与される組成物の中にあり、認められた科学原理に基づく独特の栄養所要量が医学的評価により確立されている病態の特定の食事による管理を目的とする食物が含まれる。
【０１６９】
[0172]一部の実施形態において、微生物油は剤形に配合することができる。剤形には、限定されるものではないが、有効量の微生物油を含む、錠剤、カプセル、カシェ剤、ペレット、丸剤、散剤および顆粒剤、ならびに非経口剤形、例として、限定されるものではないが、液剤、懸濁液、エマルション、および乾燥粉末が含まれ得る。このような配合物は、薬学的に許容可能な希釈剤、増量剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、界面活性剤、疎水性ビヒクル、水溶性ビヒクル、乳化剤、緩衝剤、保湿剤、湿潤剤、可溶化剤、保存剤なども含有し得ることも当分野において公知である。投与形態には、限定されるものではないが、微生物油および１つ以上の好適な薬学的に許容可能な担体を含有する、錠剤、糖衣錠、カプセル、カプレット、および丸剤が含まれ得る。
【０１７０】
[0173]経口投与のために、微生物油は、当分野において周知の薬学的に許容可能な担体と組み合わせることができる。このような担体により、治療すべき対象による経口摂取の錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして本発明の微生物油を配合することが可能になる。一部の実施形態において、剤形は、錠剤、丸剤、またはカプレットである。経口使用のための医薬調製物は、固体賦形剤を添加することにより、場合により、好適な補助剤を添加した後、得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を加工して所望により錠剤または糖衣錠コアを得ることにより得ることができる。好適な賦形剤には、限定されるものではないが、増量剤、例えば、糖、例として、限定されるものではないが、ラクトース、スクロース、マンニトール、およびソルビトール；セルロース調製物、例えば、限定されるものではないが、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が含まれる。所望により、崩壊剤、例えば、限定されるものではないが、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩、例えば、アルギン酸ナトリウムを添加することができる。経口使用することができる薬学的調製物には、限定されるものではないが、ゼラチン製のプッシュフィット（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤、例えば、グリセロールまたはソルビトール製の軟密封カプセルが含まれる。一部の実施形態において、剤形は、動物源からのいかなる成分からも形成されず、そのいかなる成分も含有しないベジタリアン用の剤形である。一部の実施形態において、ベジタリアン用の剤形はベジタリアンカプセルである。
【０１７１】
[0174]一部の実施形態において、組成物は化粧品である。化粧品には、限定されるものではないが、エマルション、クリーム、ローション、マスク、石鹸、シャンプー、洗浄液、フェイシャルクリーム、コンディショナー、メーキャップ、入浴剤、およびディスパージョン液が含まれる。化粧剤は薬用でも非薬用でもよい。
【０１７２】
[0175]一部の実施形態において、組成物は工業組成物である。一部の実施形態において、組成物は、１つ以上の製品のための出発材料である。製品には、限定されるものではないが、ポリマー；写真感光材；界面活性剤；工業油；または工業界面活性剤が含まれる。例えば、米国特許第７，２５９，００６号明細書は、ベヘン酸を生成するための、およびベヘン酸を使用して写真感光材を生成するためのＤＨＡ含有脂肪および油の使用を記載している。
【０１７３】
［組成物を使用する方法］
[0176]一部の実施形態において、組成物は、ヒトまたは非ヒト動物における病態の治療において使用することができる。一部の実施形態において、組成物は、ヒトまたは非ヒト動物における栄養摂取に使用することができる。
【０１７４】
[0177]「治療する」または「治療」という用語は、療法的治療および予防的措置もしくは防止的措置の両方を指し、その目的は、不所望な生理学的病態、疾患、もしくは障害を阻止し、もしくは遅延させる（弱める）こと、または有益なもしくは所望の臨床結果を得ることである。本発明の目的上、有益なもしくは所望の臨床結果には、限定されるものではないが、病態、疾患、もしくは障害に伴う症状もしくは徴候の軽減もしくは排除；病態、疾患、もしくは障害の程度の縮小；病態、疾患、もしくは障害の安定化（すなわち、病態、疾患、もしくは障害が悪化していない）；病態、疾患、もしくは障害の発症もしくは進行の遅延；病態、疾患、もしくは障害の回復；病態、疾患、もしくは障害の寛解（部分的か完全かは問わず、検出可能か検出不能かも問わない）；または病態、疾患、もしくは障害の向上もしくは改善が含まれる。治療は、過度の副作用なく、臨床的に有意な応答を誘発することを含む。治療は、治療を受けない場合に予測される生存期間と比較して生存期間を延長することも含む。
【０１７５】
[0178]一部の実施形態において、組成物は、病態、疾患、または障害、例えば、ざ瘡、急性炎症、加齢性黄斑変性症、アレルギー、アルツハイマー、関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫疾患、血中脂質障害、乳房嚢胞、悪液質、癌、心臓再狭窄、心血管疾患、慢性炎症、冠状動脈性心疾患、嚢胞性線維症、肝臓の変性障害、糖尿病、湿疹、胃腸障害、心臓病、高トリアシルグリセロールレベル、高血圧、過敏症、免疫疾患、腫瘍増殖の阻害、炎症病態、腸障害、腎機能不全、白血病、大うつ病、多発性硬化症、神経変性障害、変形性関節症、骨粗鬆症、ペルオキシソーム病、子癇前症、早産、乾癬、肺障害、関節リウマチ、心臓病リスク、または血栓症を治療するために使用される。
【０１７６】
[0179]一部の実施形態において、組成物は、第三期の胎児の妊娠期間の長さを増加させるために使用される。
【０１７７】
[0180]一部の実施形態において、組成物は血圧を管理するために使用される。
【０１７８】
[0181]一部の実施形態において、組成物は認知機能を改善または維持するために使用される。
【０１７９】
[0182]一部の実施形態において、組成物は記憶を改善または維持するために使用される。
【０１８０】
[0183]組成物または剤形は、組成物または剤形と適合する任意の経路により対象の体内に投与することができる。物質は、対象により対象の体内に導入される場合、または別の者、機械、もしくは装置が物質を対象の体内に導入する場合、「投与された」とみなされる。したがって、「投与する」には、例えば、自己投与、他者による投与、および間接的な投与が含まれる。「投与」に関して本明細書において使用される「継続的」または「連続的」という用語は、投与頻度が少なくとも１日１回であることを意味する。しかしながら、投与頻度は１日１回よりも多くてよく、本明細書において特定される投与量レベルを超過しない限り、例えば、１日２回、さらには３回でも依然として「継続的」または「連続的」であることに留意のこと。投与のための手段および方法は当分野において公知であり、当業者は指針のために種々の薬理学参考文献を参照することができる。例えば、“Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ”，Ｂａｎｋｅｒ  ＆  Ｒｈｏｄｅｓ，Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＳＡ，４ｔｈ  ｅｄ．（２００２）；および“Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１０ｔｈ  ｅｄ．（２００１）を閲覧することができる。
【０１８１】
[0184]「対象」、「個体」、または「患者」は、診断、予後診断、治療、または組成物もしくは剤形の投与が望まれるヒトまたは非ヒトの任意の対象を意味する。哺乳動物対象には、限定されるものではないが、ヒト；家畜；農場の動物；動物園の動物；競技用動物；愛玩動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、もしくはウマ；霊長類、例えば、サル（例えば、オマキザル、アカゲザル、アフリカミドリザル、パタスモンキー、カニクイザル、およびオナガザル）、類人猿、オランウータン、ヒヒ、テナガザル、ならびにチンパンジー；イヌ科、例えば、イヌおよびオオカミ；ネコ科、例えば、ネコ、ライオン、およびトラ；ウマ科、例えば、ウマ、ロバ、およびシマウマ；食用動物、例えば、乳牛、ウシ、ブタ、およびヒツジ；有蹄類、例えば、シカおよびキリン；げっ歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットなどが含まれる。対象という用語は、モデル動物、例えば、疾患モデル動物も包含する。一部の実施形態において、対象という用語には、経済的にまたは他の点で有用な動物、例えば、経済的に重要な繁殖用動物、競走用動物、展覧用動物、在来動物、希少動物もしくは絶滅危惧動物、または伴侶動物が含まれる。ある実施形態において、対象はヒト対象である。ある実施形態において、対象は非ヒト対象である。
【０１８２】
[0185]組成物は、「栄養量」、「治療有効量」、「予防有効量」、「治療用量」、または「予防用量」として投与することができる。「栄養量」は、必要な投与量および期間において所望の栄養結果を達成するために有効な量を指す。栄養結果は、例えば、対象における所望の脂肪酸構成成分レベル増加であり得る。「治療有効量」または「治療用量」は、必要な投与量および期間において所望の治療結果を達成するために有効な量を指す。治療結果は、例えば、症状の減弱、生存期間の延長、モビリティーの改善などであり得る。治療結果は「治癒」である必要はない。「予防有効量」または「予防用量」は、必要な投与量および期間において所望の予防結果を達成するために有効な量を指す。典型的には、疾患の前または疾患の初期段階の対象において予防用量が使用されるため、予防有効量は、進行期の疾患を治療するための治療有効量よりも少ない。
【０１８３】
[0186]対象に投与すべき微生物、バイオマス、または微生物油のＥＰＡまたは他の脂肪酸構成成分の量に基づき、種々の投与量の組成物、剤形、または医薬組成物を対象に投与することができる。「１日投与量（ｄａｉｌｙ  ｄｏｓａｇｅ）」、「１日投与量レベル」、および「１日投与量（ｄａｉｌｙ  ｄｏｓａｇｅ  ａｍｏｕｎｔ）」という用語は、本明細書において、１日当たり（２４時間の期間当たり）投与されるＥＰＡまたは他の脂肪酸成分の総量を指す。したがって、例えば、２ｍｇの１日投与量のＥＰＡを対象に投与することは、対象が１日基準で合計２ｍｇのＥＰＡを受容することを意味し、ＥＰＡは、２ｍｇのＥＰＡを含む単一剤形として投与されても、それぞれ０．５ｍｇのＥＰＡを含む４つの剤形（合計２ｍｇのＥＰＡ）として投与されてもよい。一部の実施形態において、１日量のＥＰＡは単一剤形で投与されるか、または２つの剤形で投与される。本発明の剤形は単回適用または複数回適用で服用することができる。例えば、毎日、４つの錠剤が服用され、それぞれの錠剤が０．５ｍｇのＥＰＡを含む場合、４つ全ての錠剤を１日１回服用することができ、または２つの錠剤を１日２回服用することができ、または１つの錠剤を６時間毎に服用することができる。一部の実施形態において、１日投与量は、約１００ｍｇから約１５ｇのＥＰＡである。一部の実施形態において、１日投与量は、約０．５ｍｇから約２５０ｍｇ、約１００ｍｇから約２５０ｍｇ、約１００ｍｇから約５００ｍｇ、約１００ｍｇから約１ｇ、約１ｇから約２．５ｇ、約１ｇから約５ｇ、約１ｇから約１０ｇ、約１ｇから約１５ｇ、約５ｇから約１０ｇ、約５ｇから約１５ｇ、約１０ｇから約１５ｇ、約１００ｍｇから約１０ｇ、約１００ｍｇから約５ｇ、または約１００ｍｇから約２．５ｇのＥＰＡ、ＤＨＡ、またはそれらの組合せである。一部の実施形態において、組成物は、剤形１つ当たり約０．５ｍｇから約２５０ｍｇ、１００ｍｇから約２５０ｍｇ、約０．５ｍｇから約５００ｍｇ、約１００ｍｇから約５００ｍｇ、約０．５ｍｇから約１ｇ、または約１００ｍｇから約１ｇのＥＰＡ、ＤＨＡ、またはそれらの組合せを含む剤形である。
【０１８４】
[0187]本発明の組成物または剤形の投与は、種々のレジメンを使用して達成することができる。例えば、一部の実施形態において、投与は、連日、毎日行われるか、または隔日（１日おきに）行われる。投与は１日以上で行うことができる。
【０１８５】
[0188]組成物および剤形の投与は、病態を治療するために使用される他のレジメンと組み合わせることができる。例えば、本発明の方法は、食事レジメン（例えば、低炭水化物食、高タンパク質食、高繊維食など）、運動レジメン、減量レジメン、禁煙レジメン、またはそれらの組合せと組み合わせることができる。本発明の方法は、病態の治療において他の医薬製品との組合せで使用することもできる。本発明の組成物または剤形は、他のレジメンまたは医薬製品の前またはその後に投与することができる。
【０１８６】
［組成物を含むキット］
[0189]本発明は、本発明の組成物の１つ以上の単位を含有するキットまたは包装容器を対象とする。キットまたは包装容器は、本発明の微生物、バイオマス、もしくは微生物油、またはそれらの組合せを含む食品、医薬組成物、化粧品、または工業組成物の単位を含み得る。キットまたは包装容器は、食物、化粧品、医薬組成物、または工業用組成物を調製するための、本発明の微生物、バイオマス、もしくは微生物油、またはそれらの組合せを含む添加物も含み得る。
【０１８７】
[0190]一部の実施形態において、キットまたは包装容器は、本発明の方法により投与すべき医薬組成物の１つ以上の単位を含有する。キットまたは包装容器は１つの投与量単位、または２つ以上の投与量単位（すなわち、複数の投与量単位）を含有し得る。キットまたは包装容器中に複数の投与量単位が存在する場合、複数の投与量単位は、場合により、連続投与するように並べることができる。
【０１８８】
[0191]本発明のキットは、場合により、キットの単位または剤形に関連する説明書を含有し得る。このような説明書は、医薬製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関により定められた形態であり得、その通知は製品の機関による承認、病態または障害を治療するためのヒト投与のための使用または販売を反映する。説明書は、本発明の方法により、キット中の単位または剤形の使用に関する情報を伝達する任意の形態であり得る。例えば、説明書は印刷物の形態であり得、または事前記録媒体装置の形態であり得る。
【０１８９】
[0192]患者の試験過程において、医療従事者は、本発明の方法の１つの実施が患者に適切であることを決定することができ、または、医師は、本発明の方法の１つの実施により患者の病態を改善することができることを決定することができる。いずれかのレジメンを処方する前、医師は、例えば、レジメンに関連する種々のリスクおよびベネフィットについて患者に助言することができる。患者には、レジメンに関連する全ての公知のおよび疑われるリスクの完全な開示を提供することができる。このような助言は口頭ならびに書面で提供することができる。一部の実施形態において、医師は、患者に、レジメンに関する資料、例えば、製品情報、教材を提供することができる。
【０１９０】
[0193]本発明は、治療方法について消費者を教育する方法であって、販売時点において消費者情報とともに剤形を配布するステップを含む方法を対象とする。一部の実施形態において、配布は、販売時点において薬剤師または医療提供者が関与して行われる。
【０１９１】
[0194]「消費者情報」という用語には、限定されるものではないが、英語の文章、非英語の文章、画像、チャート、電話録音、ウェブサイト、およびライブ顧客サービス担当者へのアクセスが含まれ得る。一部の実施形態において、消費者情報は、本発明の方法による剤形の使用、適切な年齢での使用、適応症、禁忌症、適切な投薬、警告、電話番号またはウェブサイトアドレスについての説明を提供する。一部の実施形態において、本方法は、本発明の方法による開示されたレジメンの使用に関する消費者の質問に答える地位にある関係者に専門情報を提供することをさらに含む。「専門情報」という用語には、限定されるものではないが、医療従事者が消費者の質問に答えることができるように設計された、本発明の方法により投与された時のレジメンに関係する情報が含まれる。「医療従事者」には、例えば、医師、医師助手、看護師、ナースプラクティショナー、薬剤師、および顧客サービス担当者が含まれる。
【０１９２】
[0195]本発明を一般に記載したが、本明細書において提供される実施例を参照することにより、さらなる理解を得ることができる。これらの実施例は例示の目的にすぎず、限定することは意図されない。
【０１９３】
［実施例１］
[0196]本実施例において、シゾキトリウム属エスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）を、５０ｍｌの培養培地を含有する２５０ｍｌのエルレンマイヤー（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ）振とうフラスコ中で培養した。接種材料を、約９００ｍｌの蒸留水中で溶解させた０．６２５ｇのＮａＣｌ、１．０ｇのＫＣｌ、５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２９ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１．０ｇのグルタミン酸一ナトリウム一水和物、１．０ｇの酵母エキス、および２３．８ｇのＨＥＰＥＳ緩衝液からなる同一培地中で調製した。ＮａＯＨを使用して培地をｐＨ７にした。培地の最終体積を８９６ｍｌにし、培地をオートクレーブ処理により滅菌した。オートクレーブ処理後、以下の構成成分を培地に無菌的に添加した：０．８９ｍｌの５６．５ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、１００ｍｌの５００ｇ／ｌのグルコース、２ｍｌの微量金属原液、および１ｍｌのビタミン原液。微量金属原液は、以下のものを含有した：１リットルの蒸留水中で溶解させた９０ｇのクエン酸、５．１５ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．５５ｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．９６５ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０２ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０２ｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１．０３５ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１．０３５ｇのＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、ｐＨをＨＣｌにより２．５にした。ビタミン原液は、以下のものを含有した：１リットルの蒸留水中で溶解させた０．１６ｇのビタミンＢ１２、９．７５ｇのチアミン、および３．３３ｇのパントテン酸カルシウム。振とうフラスコに１ｍｌの接種材料を接種した。トリプリケートフラスコを、空気中５、１０、または１５％のＣＯ２のいずれかの雰囲気を維持するように設定したＣＯ２インキュベーター中に置いた。別の組のトリプリケートフラスコは、周囲ＣＯ２レベルにおけるインキュベーター中に置いた。全ての組のフラスコを２００ｒｐｍにおいて振とうし、全てのインキュベーターを２２．５Ｃに設定した。７日間の増殖後、バイオマスを振とうフラスコから遠心分離により回収し、バイオマスをフリーズドライし、標準メチルエステル化手順を使用してバイオマスの脂肪酸プロファイルを決定した。ＣＯ２レベルの上昇は、バイオマス、％脂肪および脂肪酸プロファイルの顕著な変化を生成した。ＣＯ２条件および周囲条件間の％ＥＰＡおよび％ＤＨＡ値で生成された変化が顕著であった。さらに、これらの脂肪酸の変化は、ＣＯ２レベルの増加につれてより顕著になった。結果を表４に示す。
【０１９４】
【表４】
2020036602.tif 000005
【０１９５】
［実施例２］
[0197]本実施例において、シゾキトリウム属エスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）を、５０ｍｌの培養培地を含有する２５０ｍｌのエルレンマイヤー振とうフラスコ中で培養した。接種材料を、約９００ｍｌの蒸留水中で溶解させた０．６２５ｇのＮａＣｌ、１．０ｇのＫＣｌ、５ｇのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．１ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２９ｇのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、１．０ｇのグルタミン酸一ナトリウム一水和物、１．０ｇの酵母エキス、および２３．８ｇのＨＥＰＥＳ緩衝液からなる同一培地中で調製した。ＮａＯＨを使用して培地をｐＨ７にした。培地の最終体積を８９６ｍｌにし、培地をオートクレーブ処理により滅菌した。オートクレーブ処理後、以下の構成成分を培地に無菌的に添加した：０．８９ｍｌの５６．５ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、１００ｍｌの５００ｇ／ｌのグルコース、２ｍｌの微量金属原液、および１ｍｌのビタミン原液。微量金属原液は、以下のものを含有した：１リットルの蒸留水中で溶解させた９０ｇのクエン酸、５．１５ｇのＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、１．５５ｇのＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、０．９６５ｇのＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．０２ｇのＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、０．０２ｇのＮａ２ＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏ、１．０３５ｇのＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ、１．０３５ｇのＮｉＳＯ４．６Ｈ２Ｏ、ｐＨをＨＣｌにより２．５にした。ビタミン原液は、以下のものを含有した：１リットルの蒸留水中で溶解させた０．１６ｇのビタミンＢ１２、９．７５ｇのチアミン、および３．３３ｇのパントテン酸カルシウム。振とうフラスコに１ｍｌの接種材料を接種した。デュプリケートフラスコを、空気中５、１０、または１５％のＣＯ２のいずれかの雰囲気を維持するように設定したＣＯ２インキュベーター中に置いた。別の組のデュプリケートフラスコは、周囲ＣＯ２レベルにおけるインキュベーター中に置いた。全ての組のフラスコを２００ｒｐｍにおいて振とうし、全てのインキュベーターを２２．５Ｃに設定した。７日間の増殖後、バイオマスを振とうフラスコから遠心分離により回収し、バイオマスをフリーズドライし、標準メチルエステル化手順を使用してバイオマスの脂肪酸プロファイルを決定した。ＣＯ２レベルの上昇は、バイオマス、％脂肪および脂肪酸プロファイルの顕著な変化を生成した。ＣＯ２条件および周囲条件間の％ＥＰＡおよび％ＤＨＡ値で生成された変化が顕著であった。さらに、これらの脂肪酸の変化は、ＣＯ２レベルの増加につれてより顕著になった。結果を以下の表５に示す。
【０１９６】
【表５】
2020036602.tif 000006
【０１９７】
［実施例３］
[0198]本実施例において、ヤブレツボカビ属エスピー（Ｔｈｒａｓｕｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）を、５０ｍｌの培養培地を含有する２５０ｍｌのエルレンマイヤー振とうフラスコ中で培養した。接種材料を、約９００ｍｌの蒸留水中で溶解させた４２ｇのＮａ２ＳＯ４、０．６２５ｇのＮａＣｌ、１．０ｇのＫＣｌ、５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２９ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１．０ｇのグルタミン酸一ナトリウム一水和物、１．０ｇの酵母エキス、および２３．８ｇのＨＥＰＥＳ緩衝液からなる同一培地中で調製した。ＮａＯＨを使用して培地をｐＨ７にした。培地の最終体積を９６１ｍｌにし、培地をオートクレーブ処理により滅菌した。オートクレーブ処理後、以下の構成成分を培地に無菌的に添加した：０．８９ｍｌの５６．５ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、３５ｍｌの５００ｇ／ｌのグリセロール、２ｍｌの微量金属原液、および１ｍｌのビタミン原液。微量金属原液は、以下のものを含有した：１リットルの蒸留水中で溶解させた９ｇのクエン酸、５．１５ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．５５ｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．９６５ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０２ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０２ｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１．０３５ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１．０３５ｇのＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、ｐＨをＨＣｌにより２．５にした。ビタミン原液は、以下のものを含有した：１リットルの蒸留水中で溶解させた０．１６ｇのビタミンＢ１２、９．７５ｇのチアミン、および３．３３ｇのパントテン酸カルシウム。振とうフラスコに１ｍｌの接種材料を接種した。トリプリケートフラスコを、空気中１５％のＣＯ２の雰囲気を維持するように設定したＣＯ２インキュベーター中に置いた。別の組のトリプリケートフラスコは、周囲ＣＯ２レベルにおけるインキュベーター中に置いた。両方の組のフラスコを２００ｒｐｍにおいて振とうし、両方のインキュベーターを２２．５Ｃに設定した。７日間の増殖後、バイオマスを振とうフラスコから遠心分離により回収し、バイオマスをフリーズドライし、標準メチルエステル化手順を使用してバイオマスの脂肪酸プロファイルを決定した。空気中１５％のＣＯ２の雰囲気は、ヤブレツボカビ属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）培養物の多大な変化を生成した。高いＣＯ２において、バイオマスおよび％脂肪は、周囲条件下よりも低かった。％１６：０および％ＤＨＡは周囲条件下よりも低く、％ＥＰＡは周囲条件下よりも顕著に高かった。結果を以下の表６に示す。
【０１９８】
【表６】
2020036602.tif 000007
【０１９９】
［実施例４］
[0199]本実施例［ＮＢｘ０６１４ｅｔ１０］において、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１０２０８）を、４つの１００リットルのＮｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＢｉｏＦｌｏ  ６０００発酵槽中で、８０リットルの標的最終（レシピ）体積において炭素（グルコース）および窒素（水酸化アンモニウム）フェドバッチプロセスにより種々の過圧条件において培養して溶解二酸化炭素の増加に対する培養物の感受性を評価した。発酵物に８リットルの培養物をそれぞれ接種した。接種材料繁殖のため、８０リットルのＮｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＢｉｏＦｌｏ  ５０００発酵槽を利用した。接種材料培地は、６つの別個の群で調製された６５リットルの培地からなるものであった。第１群は、５８５ｇのＭＳＧ＊１Ｈ２Ｏ、６５ｇのＫＣｌ、３２５ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２４．０５ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４、４０．６２５ｇのＮａＣｌ、３９０ｇのＴ１５４（酵母エキス）、および１３ｍＬのＤｏｗ１５２０ＵＳ（消泡剤）からなるものであった。第１群を、約６０リットルの体積において接種材料発酵槽中で１２１度においてバッチ滅菌した。第２群は、１８．８５ｇのＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏからなるものであった。第３群は、３３．８ｇのＨ２Ｐ０４からなるものであった。第２および第３群をそれぞれ、別個の溶液中で約４５〜６０分間オートクレーブ処理し、滅菌後に第１群に無菌的に添加した。第４群は、２０１．５ｍｇのＭｎＣｌ２＊４Ｈ２Ｏ、２０１．５ｍｇのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２．６ｍｇのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、２．６ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ、１３４．６ｍｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、１３４．６ｍｇのＮｉＳＯ４＊６Ｈ２Ｏ、６６９．４ｍｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏおよび１．５２２ｇのクエン酸からなるものであった。第４群を、第２および第３群と同一の様式でオートクレーブ処理した。第５群は、６３３．７５ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、１０．４ｍｇのビタミンＢ１２、および２１６．５ｍｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩からなるものであった。第５群をＲＯ水中で溶解させ、次いでフィルター滅菌した。第６群は、３０００ｍＬのＲＯ水の体積中で溶解させた３２５０ｇのグルコースからなるものであった。接種材料発酵槽を摂氏２２．５度に冷却した後、第２、第３、第４、第５および第６群を発酵槽に添加した。水酸化ナトリウムおよび硫酸を使用して、発酵槽のｐＨを７に調整し、接種前に溶解酸素を１００％に拡張した。接種材料発酵槽に１３００ｍＬのより小さい発酵培養物（より小さい発酵培養物は、６５リットルの接種材料培養物と同一の様式で調製および培養した）を接種し、摂氏２２．５度、ｐＨ７、１８０ｒｐｍの撹拌、および３２．５ｌｐｍの空気において３７時間の時間培養し、この時点において８リットルの接種材料ブロスをそれぞれの１００リットルの発酵槽に植継ぎした。それぞれの１００リットルの発酵槽は、８０リットルの発酵培地を含有した。発酵培地は、接種材料発酵槽と同様の様式で調製した。それぞれの１００リットルの発酵槽について、発酵培地は６つのバッチ培地群からなるものであった。容器ＮＢ５、ＮＢ６、およびＮＢ７のため、第１群は、７０４ｇのＮａ２ＳＯ４、５０ｇのＮａＣｌ、８０ｇのＫＣｌ、４００ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、３３．６ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、８０ｇのＴ１５４酵母エキス、および８ｍＬのＤｏｗ１５２０−ＵＳ消泡剤を含有した。第１群を約３５リットルの体積において１００リットルの発酵槽中で摂氏１２２度において６０分間蒸気滅菌した。第２群は、約３００ｍＬの体積中で２３．２ｇのＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏを含有した。第３群は、ＲＯ水中で溶解させた１４１．２ｇのＫＨ２ＰＯ４を含有した。第４群は、全てＲＯ水中に溶解させた２４８ｍｇのＭｎＣｌ２＊４Ｈ２Ｏ、７４４ｍｇのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、３．２ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ、１６５．６ｍｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、および１６５．６ｍｇのＮｉＳＯ４＊６Ｈ２Ｏ、８２４ｍｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏおよび８０ｇのクエン酸を含有した。第５群は、全てＲＯ水中で溶解させ、フィルター滅菌した７８０ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、２６６．４ｍｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩、および２８６．４ｕｇのビオチンを含有した。第６群は、約３リットルのＲＯ水中で２４００ｇのグルコースを含有した。第２、第３、第４、第５、および第６群を合わせ、発酵槽が摂氏２２．５度の運転温度に達した後に発酵槽に添加した。容器ＮＢ８については、全ての群がクエン酸を除き他の３つの条件と同一であった。ＮＢ８において、第４群は約３．７５ｇのクエン酸のみを含有した。接種前のそれぞれの発酵槽体積は、約５２〜５３リットルであった。それぞれの発酵槽に、上記の接種材料発酵物からの８リットルのブロスを接種した。４Ｎ水酸化アンモニウムの７．３リットル溶液を利用して発酵物を７のｐＨにおいて窒素排出までｐＨ制御し、その時点において４Ｎ水酸化ナトリウムおよび４Ｎ硫酸をｐＨ制御に利用した。１８０から４８０ｒｐｍの撹拌および４０ＬＰＭから８０ＬＰＭの空気流を使用して溶解酸素を発酵物全体にわたり２０％の標的に維持するように制御した。これらの容器のそれぞれを異なる頭部圧力（Ｂ５＝２、ＮＢ６＝１５、ＮＢ７＝２０ＰＳＩ）において制御して溶解二酸化炭素の増加に対する生物の感受性を評価した。発酵物全体にわたり、９５％デキストローズ（コーンシロップ）の８５０ｇ／Ｌ溶液を、５０ｇ／Ｌ未満のグルコース濃度を維持するように供給した。８日後、それぞれの８０リットルの発酵槽の乾燥細胞重量およびω−３力価は同様であり、ＮＢ５は、１１０．１ｇ／ＬのＤＣＷおよび４４．３７ｇ／Ｌのω−３におけるものであり；ＮＢ６は、１１７．７ｇ／ＬのＤＣＷおよび４５．７８ｇ／Ｌのω−３におけるものであり；ＮＢ７は、１１４．１ｇ／ＬのＤＣＷおよび４８．４３ｇ／Ｌのω−３におけるものであり；ＮＢ８は、１１９．５ｇ／ＬのＤＣＷおよび４３．５５ｇ／Ｌのω−３におけるものであった。圧力を増加させるにつれ、％ＤＨＡ／ＦＡＭＥは減少し、％ＥＰＡ／ＦＡＭＥは増加し、ＤＨＡとＥＰＡとの比は減少した。２ＰＳＩから２０ＰＳＩの最終脂肪酸含有率を比較した場合、％ＤＨＡ／ＦＡＭＥは５０．４８％から４１．２６％に減少し、％ＥＰＡ／ＦＡＭＥは１８．９５％から２３．２８％に増加した。結果を表７に示す。
【０２００】
【表７】
2020036602.tif 000008
【０２０１】
［実施例５］
[0200]本実施例［Ｎｘ０７１９ｅｔ１０］において、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１０２０８）を、４つの１４リットルのＮｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＢｉｏＦｌｏ  ３１０発酵槽中で、１０リットルの標的最終（レシピ）体積において、炭素（グルコース）および窒素（水酸化アンモニウム）フェドバッチプロセスにより培養した。４つの発酵槽のうち３つに二酸化炭素を発酵の間の異なる時点において補給して溶解二酸化炭素の増加に対する培養物の感受性を評価した。ＮＢＳ１、ＮＢＳ２、およびＮＢＳ３に、二酸化炭素を１２、２４、および４８時間の対数において開始してそれぞれ補給した。発酵物にそれぞれ１リットルの培養物をそれぞれ接種した。接種材料繁殖のため、１４リットルのＶｉｒｔｉｓ発酵槽を利用した。接種材料培地は、４つの別個の群で調製された１０リットルの培地からなるものであった。第１群は、９０ｇのＭＳＧ＊１Ｈ２Ｏ、１０ｇのＫＣｌ、５０ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、３．３ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６．２５ｇのＮａＣｌ、６０ｇのＴ１５４（酵母エキス）、４．９７ｇのＫＨ２ＰＯ４、２．９ｇのＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ、および２ｍＬのＤｏｗ１５２０ＵＳ（消泡剤）からなるものであった。第１群を約９．８リットルの体積において１２１度において１２０分間オートクレーブ処理した。第２群は、８００ｍＬの体積のＲＯ水中で溶解させた５００ｇのグルコースからなるものであった。第３群は、３１ｍｇのＭｎＣｌ２＊４Ｈ２Ｏ、３１ｍｇのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ、２０．７ｍｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、２０．７ｍｇのＮｉＳＯ４＊６Ｈ２Ｏ、１０３ｍｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏおよび２３４．１ｍｇのクエン酸からなるものであった。第２および第３群をそれぞれ、６０分間オートクレーブ処理した。第４群は、９７．５ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、１．６ｍｇのビタミンＢ１２、および３３．３ｍｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩からなるものであった。第４群をＲＯ水中で溶解させ、次いでフィルター滅菌した。発酵槽を摂氏２２．５度に冷却した後、第２、第３、第４、および第５群を発酵槽に添加した。水酸化ナトリウムおよび硫酸を使用して、発酵槽のｐＨを７に調整し、接種前に溶解酸素を１００％に拡張した。接種材料発酵槽に１５０ｍＬのより小さい発酵培養物（より小さい発酵培養物は、１０リットルの接種材料培養物と同一の様式で調製および培養した）を接種し、摂氏２２．５度、ｐＨ７、４３３ｒｐｍの撹拌、および５ｌｐｍの空気において４４．５時間の時間培養し、この時点において１リットルの接種材料ブロスをそれぞれの１４リットルの発酵槽に植継ぎした。それぞれの１４リットルの発酵槽は、１０リットルの発酵培地を含有した。発酵培地は、接種材料発酵槽と同様の様式で調製した。それぞれの１４リットルの発酵槽について、発酵培地は６つのバッチ培地群からなるものであった。全ての容器について、第１群は、６０ｇのＮａ２ＳＯ４、６．２５ｇのＮａＣｌ、１０ｇのＫＣｌ、５０ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、０．４３ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｇのＴ１５４酵母エキ��、および１ｍＬのＤｏｗ１５２０−ＵＳ消泡剤を含有した。第１群を約６．５リットルの体積において１４リットルの発酵槽中で摂氏１２１度において１２０分間オートクレーブ処理した。第２群は、約２０ｍＬの体積のＲＯ水中で２．９ｇのＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏを含有した。第３群は、１００ｍＬのＲＯ水中で溶解させた１７．６１ｇのＫＨ２ＰＯ４を含有した。第４群は、全て５０ｍＬのＲＯ水中で溶解させた３１ｍｇのＭｎＣｌ２＊４Ｈ２Ｏ、９３ｍｇのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ、２０．７ｍｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、２０．７ｍｇのＮｉＳＯ４＊６Ｈ２Ｏ、１０３ｍｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏおよび１０ｇのクエン酸を含有した。第５群は、全て１０ｍＬのＲＯ水中で溶解させ、フィルター滅菌した９７．５ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、３３．３ｍｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩、および３６．３ｕｇのビオチンを含有した。第６群は、約０．５リットルのＲＯ水中で３００ｇのグルコースを含有した。第２、第３、第４、第５、および第６群を合わせ、発酵槽が摂氏２２．５度の運転温度に達した後に発酵槽に添加した。接種前のそれぞれの発酵槽体積は、約６．５リットルであった。それぞれの発酵槽に、上記の接種材料発酵物からの１リットルのブロスを接種した。４Ｎ水酸化アンモニウムの０．８５リットル溶液を利用して発酵物を７のｐＨにおいて窒素排出までｐＨ制御し、その時点において４Ｎ水酸化ナトリウムおよび３Ｎ硫酸を７．５の設定点におけるｐＨ制御に利用した。３５７から８３３ｒｐｍの撹拌および７ＬＰＭから７ＬＰＭの空気流を使用して溶解酸素を発酵物全体にわたり２０％の標的に維持するように制御した。容器ＮＢＳ１、ＮＢＳ２、ＮＢＳ３に、二酸化炭素を異なる時間枠でそれぞれ補給して溶解二酸化炭素の増加に対する生物の感受性を評価した。発酵物全体にわたり、９５％のデキストローズ（コーンシロップ）の８５０ｇ／Ｌ溶液を、５０ｇ／Ｌ未満のグルコース濃度を維持するように供給した。８日後、それぞれの１０リットルの発酵槽の乾燥細胞重量およびω−３力価は二酸化炭素補給条件に応じて変動した。１８３時間において、ＮＢＳ１は、１０９．１ｇ／ＬのＤＣＷおよび４５．８７ｇ／Ｌのω−３におけるものであり；ＮＢＳ１は、１０８．９ｇ／ＬのＤＣＷおよび４５．４１ｇ／Ｌのω−３におけるものであり；ＮＢＳ３は、１１６．４ｇ／ＬのＤＣＷおよび５０．６ｇ／Ｌのω−３におけるものであり；ＮＢＳ４は、９５．７ｇ／ＬのＤＣＷおよび４０．３６ｇ／Ｌのω−３におけるものであった。二酸化炭素補給を開始した直後、％ＤＨＡ／ＦＡＭＥは減少し、％ＥＰＡ／ＦＡＭＥは増加し、ＤＨＡとＥＰＡとの比は減少した。二酸化炭素補給条件および周囲条件の最大％ＥＰＡ／ＦＡＭＥ含有率を比較した場合、ＣＯ２補給条件下での最大ＥＰＡ含有率が６５％増加した。結果を表８に示す。
【０２０２】
【表８】
2020036602.tif 000009
【０２０３】
［実施例６］
[0201]本実施例［Ｎｘ０１０６ｅｔ１０］において、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１０２０８）を、４つの１４リットルのＮｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＢｉｏＦｌｏ  ３１０発酵槽中で、１０リットルの標的最終（レシピ）体積において、炭素（グルコース）および窒素（水酸化アンモニウム）フェドバッチプロセスにより培養した。温度を、ＮＢＳｌ、ＮＢＳ２、ＮＢＳ３、およびＮＢＳ４についてそれぞれ２１．０℃、２２．５℃、２４．０℃、および２５．５℃の標的を維持するように発酵の実行全体にわたり制御した。発酵物に、それぞれ１リットルの培養物をそれぞれ接種した。接種材料繁殖のため、１４リットルのＶｉｒｔｉｓ発酵槽を利用した。接種材料培地は、４つの別個の群で調製された１０リットルの培地からなるものであった。第１群は、９０ｇのＭＳＧ＊１Ｈ２Ｏ、１０ｇのＫＣｌ、５０ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、３．７ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６．２５ｇのＮａＣｌ、６０ｇのＴ１５４（酵母エキス）、５．２ｇのＫＨ２ＰＯ４、２．９ｇのＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ、および２ｍＬのＤｏｗ１５２０ＵＳ（消泡剤）からなるものであった。第１群を約９．８リットルの体積において１２１度において１２０分間オートクレーブ処理した。第２群は、８００ｍＬの体積のＲＯ水中で溶解させた５００ｇのグルコースからなるものであった。第３群は、３１ｍｇのＭｎＣｌ２＊４Ｈ２Ｏ、３１ｍｇのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ、２０．７ｍｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、２０．７ｍｇのＮｉＳＯ４＊６Ｈ２Ｏ、１０３ｍｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏおよび２３４．１ｍｇのクエン酸からなるものであった。第２および第３群をそれぞれ、６０分間オートクレーブ処理した。第４群は、９７．５ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、１．６ｍｇのビタミンＢ１２、および３３．３ｍｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩からなるものであった。第４群をＲＯ水中に溶解させ、次いでフィルター滅菌した。発酵槽を摂氏２２．５度に冷却した後、第２、第３、第４、および第５群を発酵槽に添加した。水酸化ナトリウムおよび硫酸を使用して、発酵槽のｐＨを７に調整し、接種前に溶解酸素を１００％に拡張した。接種材料発酵槽に２００ｍＬのより小さい発酵培養物（より小さい発酵培養物は、１０リットルの接種材料培養物と同一の様式で調製および培養した）を接種し、摂氏２２．５度、ｐＨ７、４３３ｒｐｍの撹拌、および５ｌｐｍの空気において４２時間の時間培養し、この時点において１リットルの接種材料ブロスをそれぞれの１４リットルの発酵槽に植継ぎした。それぞれの１４リットルの発酵槽は、１０リットルの発酵培地を含有した。発酵培地を接種材料発酵槽と同様の様式で調製した。それぞれの１４リットルの発酵槽について、発酵培地は４つのバッチ培地群からなるものであった。全ての容器について、第１群は、８８ｇのＮａ２ＳＯ４、６．２５ｇのＮａＣｌ、１０ｇのＫＣｌ、５０ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、４．２ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２．９ｇのＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ、１７．６５ｇのＫＨ２ＰＯ４、１０ｇのＴ１５４酵母エキス、および１ｍＬ��Ｄｏｗ１５２０−ＵＳ消泡剤を含有した。第１群を約７．０リットルの体積において１４リットルの発酵槽中で摂氏１２１度において１２０分間オートクレーブ処理した。第２群は、５０ｍＬのＲＯ水中で溶解させた３１ｍｇのＭｎＣｌ２＊４Ｈ２Ｏ、９３ｍｇのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ、２０．７ｍｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、２０．７ｍｇのＮｉＳＯ４＊６Ｈ２Ｏ、１０３ｍｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏおよび４６８ｍｇのクエン酸を含有した。第２群を６０分間オートクレーブ処理した。第３群は、全て１０ｍＬのＲＯ水中で溶解させ、フィルター滅菌した９７．５ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、３３．３ｍｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩、および３５．８ｕｇのビオチンを含有した。第４群は、約０．５リットルのＲＯ水中で３００ｇのグルコースを含有し、６０分間オートクレーブ処理した。第２、第３、および第４群を合わせ、発酵槽が摂氏２２．５度の運転温度に達した後に発酵槽に添加した。接種前のそれぞれの発酵槽体積は、約６．５リットルであった。それぞれの発酵槽に、上記の接種材料発酵物からの１リットルのブロスを接種した。４Ｎ水酸化アンモニウムの０．８５リットル溶液を利用して発酵物全体にわたり発酵物を７．０のｐＨにおいて窒素排出までｐＨ制御し、その時点において４Ｎ水酸化ナトリウムおよび３Ｎ硫酸を設定点におけるｐＨ制御に利用した。窒素排出まで２０％の標的を維持するように溶解酸素を制御した。窒素排出後、３５７から７１４ｒｐｍの撹拌および８ＬＰＭの空気流を使用して溶解酸素を発酵終了時まで１０％の標的を維持するように制御した。発酵物全体にわたり、９５％のデキストローズ（コーンシロップ）の８５０ｇ／Ｌ溶液を、５０ｇ／Ｌ未満のグルコース濃度を維持するように供給した。８日後、乾燥細胞重量またはω−３力価は、評価した異なる温度でわずかに変動し；しかしながら、より低い発酵温度は、より高い％ＥＰＡ／ＦＡＭＥをもたらした。１８４時間において、ＮＢＳ１は、８５．２ｇ／ＬのＤＣＷおよび２９．９ｇ／Ｌのω−３におけるものであり；ＮＢＳ２は、９２．０ｇ／ＬのＤＣＷおよび３５．０ｇ／Ｌのω−３におけるものであり；ＮＢＳ３は、８６．８ｇ／ＬのＤＣＷおよび３１．７ｇ／Ｌのω−３におけるものであり；ＮＢＳ４は、８４．２ｇ／ＬのＤＣＷおよび２９．４ｇ／Ｌのω−３におけるものであった。
【０２０４】
[0202]ＮＢＳ１について、％ＥＰＡ／ＦＡＭＥは発酵実行の開始から終了まで１２．３６％から１９．０２％の範囲であり、最大２１．５７％であった。ＮＢＳ２について、％ＥＰＡ／ＦＡＭＥは発酵実行の開始から終了まで１１．７２％から１８．１１％の範囲であり、最大２０．２１％であった。ＮＢＳ３について、％ＥＰＡ／ＦＡＭＥは、発酵実行の開始から終了まで１１．４９％から１５．４３％の範囲であり、最大１８．０９％であった。ＮＢＳ４について、％ＥＰＡ／ＦＡＭＥは、発酵実行の開始から終了まで１１．６５％から１３．６５％の範囲であり、最大１５．７０％であった。最大％ＥＰＡ／ＦＡＭＥを比較した場合、最低発酵温度は、評価した最大発酵温度と比べて最大ＥＰＡ含有率の３７％の増加をもたらした。結果を以下の表９に提供する。
【０２０５】
【表９】
2020036602.tif 000010
【０２０６】
［実施例７］
[0203]本実施例［Ｎｘ０６１４ｅｔ１０］において、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１０２０８）を、２つの１４リットルのＮｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＢｉｏＦｌｏ  ３１０発酵槽中で、１０リットルの標的最終（レシピ）体積において、炭素（グルコース）および窒素（水酸化アンモニウム）フェドバッチプロセスにより培養した。一方の発酵槽（ＮＢＳ１５）を、発酵実行の開始から終了まで１５％の二酸化炭素を補給した空気によりスパージし、他方の発酵槽（ＮＢＳ１７）を空気のみによりスパージして溶解二酸化炭素の増加に対する培養物の感受性を評価した。発酵物に、それぞれ１リットルの培養物をそれぞれ接種した。接種材料繁殖のため、１４リットルのＶｉｒｔｉｓ発酵槽を利用した。接種材料培地は、４つの別個の群で調製された１０リットルの培地からなるものであった。第１群は、９０ｇのＭＳＧ＊１Ｈ２Ｏ、１０ｇのＫＣｌ、５０ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、３．３ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４、６．２５ｇのＮａＣｌ、６０ｇのＴ１５４（酵母エキス）、４．９７ｇのＫＨ２ＰＯ４、２．９ｇのＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ、および２ｍＬのＤｏｗ１５２０ＵＳ（消泡剤）からなるものであった。第１群を約９．８リットルの体積において１２１度において１２０分間オートクレーブ処理した。第２群は、８００ｍＬの体積のＲＯ水中で溶解させた５００ｇのグルコースからなるものであった。第３群は、３１ｍｇのＭｎＣｌ２＊４Ｈ２Ｏ、３１ｍｇのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ、２０．７ｍｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、２０．７ｍｇのＮｉＳＯ４＊６Ｈ２Ｏ、１０３ｍｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏおよび２３４．１ｍｇのクエン酸からなるものであった。第２および第３群をそれぞれ、６０分間オートクレーブ処理した。第４群は、９７．５ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、１．６ｍｇのビタミンＢ１２、および３３．３ｍｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩からなるものであった。第４群をＲＯ水中に溶解させ、次いでフィルター滅菌した。発酵槽を摂氏２２．５度に冷却した後、第２、第３、第４、および第５群を発酵槽に添加した。水酸化ナトリウムおよび硫酸を使用して、発酵槽のｐＨを７に調整し、接種前に溶解酸素を１００％に拡張した。接種材料発酵槽に２００ｍＬのより小さい発酵培養物（より小さい発酵培養物は、１０リットルの接種材料培養物と同一の様式で調製および培養した）を接種し、摂氏２２．５度、ｐＨ７、４３３ｒｐｍの撹拌、および５ｌｐｍの空気において４０時間の時間培養し、この時点において１リットルの接種材料ブロスをそれぞれの１４リットルの発酵槽に植継ぎした。それぞれの１４リットルの発酵槽は、１０リットルの発酵培地を含有した。発酵培地を接種材料発酵槽と同様の様式で調製した。それぞれの１４リットルの発酵槽について、発酵培地は６つのバッチ培地群からなるものであった。全ての容器について、第１群は、８８ｇのＮａ２ＳＯ４、６．２５ｇのＮａＣｌ、１０ｇのＫＣｌ、５０ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、４．２ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｇのＴ１５４酵母エキス、および１ｍＬのＤｏｗ１５２０−��Ｓ消泡剤からなるものであった。第１群を約６．５リットルの体積において１４リットルの発酵槽中で摂氏１２１度において１２０分間オートクレーブ処理した。第２群は、約２０ｍＬの体積のＲＯ水中で２．９ｇのＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏを含有した。第３群は、１００ｍＬのＲＯ水中で溶解させた１７．６５ｇのＫＨ２ＰＯ４を含有した。第４群は、５０ｍＬのＲＯ水中で溶解させた３１ｍｇのＭｎＣｌ２＊４Ｈ２Ｏ、９３ｍｇのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ、２０．７ｍｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、２０．７ｍｇのＮｉＳＯ４＊６Ｈ２Ｏ、１０３ｍｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏおよび４６８ｍｇのクエン酸を含有した。第２、第３、および第４群をそれぞれ、６０分間オートクレーブ処理した。第５群は、全て１０ｍＬのＲＯ水中で溶解させ、フィルター滅菌した９７．５ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、３３．３ｍｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩、および３６．３ｕｇのビオチンを含有した。第６群は、約０．５リットルのＲＯ水中で３００ｇのグルコースを含有し、６０分間オートクレーブ処理した。第２、第３、第４、第５、および第６群を合わせ、発酵槽が摂氏２２．５度の運転温度に達した後に発酵槽に添加した。接種前のそれぞれの発酵槽体積は、約６．５リットルであった。それぞれの発酵槽に、上記の接種材料発酵物からの１リットルのブロスを接種した。４Ｎ水酸化アンモニウムの０．８５リットル溶液を利用して発酵物全体にわたり発酵物を７．０のｐＨにおいて窒素排出までｐＨ制御し、その時点において４Ｎ水酸化ナトリウムおよび３Ｎ硫酸を設定点におけるｐＨ制御に利用した。窒素排出まで２０％の標的を維持するように溶解酸素を制御した。窒素排出後、３５７から８３３ｒｐｍの撹拌および８ＬＰＭの空気流を使用して溶解酸素を発酵終了時まで１０％の標的を維持するように制御した。発酵物全体にわたり、９５％のデキストローズ（コーンシロップ）の８５０ｇ／Ｌ溶液を、５０ｇ／Ｌ未満のグルコース濃度を維持するように供給した。８日後、それぞれの１０リットル発酵槽の乾燥細胞重量およびω−３力価は、二酸化炭素補給条件に応じて変動した。１８８時間において、ＮＢＳ１５は、５４．５ｇ／ＬのＤＣＷおよび１３．７ｇ／Ｌのω−３におけるものであり；ＮＢＳ１７は、９６．１ｇ／ＬのＤＣＷおよび３７．５ｇ／Ｌのω−３におけるものであった。ＮＢＳ１５（実行全体にわたるＣＯ２補給条件）における％ＥＰＡ／ＦＡＭＥは、ＮＢＳ１７（ＣＯ２未補給）よりも高かった。ＮＢＳ１５について、％ＥＰＡ／ＦＡＭＥは発酵実行の開始から終了まで２５．５０％から３５．４８％の範囲であり、最大３８．３４％であった。ＮＢＳ１７について、％ＥＰＡ／ＦＡＭＥは発酵実行の開始から終了まで１２．３１％から１９．８０％の範囲であり、最大２２．２９％であった。二酸化炭素補給条件および周囲条件の最大％ＥＰＡ／ＦＡＭＥ含有率を比較した場合、ＣＯ２補給条件下での最大ＥＰＡ含有率が７３％増加する。
【０２０７】
[0204]％ＤＨＡ／ＦＡＭＥは、発酵実行全体にわたりＣＯ２補給条件のものについて、周囲条についてのものよりも低かった。結果を以下の表１０に提供する。
【０２０８】
【表１０】
2020036602.tif 000011
【０２０９】
［実施例８］
[0205]本実施例［Ｋ０１９］において、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１０２０８）を、１５７，０００リットルの撹拌発酵槽中で、１００，０００ｋｇの標的最終（レシピ）重量において、炭素（グルコース）および窒素（無水アンモニアガス）フェドバッチプロセスにより培養した。発酵物に４５００ｋｇの培養物を接種した。接種材料繁殖のため、７５００リットルの撹拌シード発酵槽を利用した。接種材料培地は、４つの別個の群で調製された４５００ｋｇの培地からなるものであった。第１群は、２３００ｋｇの総重量を有するプロセス水中で溶解させた４０．５ｋｇのＭＳＧ＊１Ｈ２Ｏ、４．５ｋｇのＫＣｌ、２２．５ｋｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１．７ｋｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２．８１ｋｇのＮａＣｌ、２７ｋｇのＴ１５４（酵母エキス）、２ｋｇのＫＨ２ＰＯ４、９８５ｇのＣａＣｌ２、および０．９ｋｇのＤｏｗ１５２０ＵＳ（消泡剤）からなるものであった。第２群は、１５００ｋｇの総重量を有するプロセス水中で溶解させた２４７．５ｋｇのグルコース．１Ｈ２Ｏからなるものであった。摂氏１２２〜１２３度における３０分間の定置蒸気滅菌により第１群をシード発酵槽中で滅菌し、第２群を別個の容器中で滅菌した。第３群は、５Ｌの蒸留水中で溶解させた１４ｇのＭｎＣｌ２＊４Ｈ２Ｏ、１４ｇのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１８０ｍｇのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、１８０ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ、９．３ｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、９．３ｇのＮｉＳＯ４＊６Ｈ２Ｏ、４６．４ｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏおよび１０５．３ｇのクエン酸からなるものであった。第３群を摂氏１２１度において６０分間オートクレーブ処理した。第４群は、５Ｌの蒸留水中で溶解させ、次いでフィルター滅菌した４３．９ｇのチアミン−ＨＣｌ、７２０ｍｇのビタミンＢ１２、および１５ｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩からなるものであり、次いでフィルター滅菌した。シード発酵槽を摂氏２２．５度に冷却した後、第２、第３、第４群を発酵槽に添加した。水酸化ナトリウムおよび硫酸を使用して、発酵槽のｐＨを７に調整し、接種前に溶解酸素を１００％に拡張した。シード発酵槽に１２Ｌのより小さい発酵培養物（より小さい発酵培養物は、シード培養物と同一の様式で調製および培養した）を接種し、摂氏２２．５度、ｐＨ７、９０ｒｐｍの撹拌、および１３０〜１７０Ｎｍ３／ｈｒの空気において４〜５日間の時間培養して約１５ｇ／Ｌの乾燥細胞重量を得た。発酵培地を接種材料発酵槽と同様の様式で調製した。発酵培地は５つの群からなるものであった。第１群は、９，０００ｋｇの溶液中で１７７ｋｇのＫＨ２ＰＯ４、８８０ｋｇのＮａ２ＳＯ４、５００ｋｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、４２ｋｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１００ｋｇのＴ１５４酵母エキス、および１０ｋｇのＤｏｗ１５２０−ＵＳ消泡剤を含有した。第２群は、９，０００ｋｇの溶液中で２１．９ｋｇのＣａＣｌ２、６２．５ｋｇのＮａＣｌ、１００ｋｇのＫＣｌを含有した。第１および第２群を発酵槽中に熱交換器を介してポンプ導入し、次いで水をポンプ導入して発酵槽の６７，０００ｋｇの重量を得た。第３群は、１５００ｋｇのプロセス水中で溶解させた３１０ｇのＭｎ���ｌ２＊４Ｈ２Ｏ、９３０ｇのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、４ｇのＮａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ、２０７ｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、２０７ｇのＮｉＳＯ４＊６Ｈ２Ｏ、１．０３ｋｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏおよび４．６８ｋｇのクエン酸を含有した。第４群は、４３００ｋｇのコーンシロップ（ＤＥ−９５、７０．５％）を含有した。摂氏１２２〜１２３度における３０分間の定置蒸気滅菌により第３および第４群を異なる容器中で滅菌した。第５群は、５Ｌの蒸留水中で溶解させ、フィルター滅菌した９７５ｇのチアミン−ＨＣｌ、３３３ｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩、および３５８ｍｇのビオチンを含有した。発酵槽を摂氏２２．５度に冷却した後、第３、第４、および第５群を発酵槽に添加した。接種前の発酵槽体積の重量は、約７３，５００ｋｇであった。開始発酵条件を設定した後（温度：２２．５℃、圧力：０．３４ｂａｒ、空気流：３０００Ｎｍ３／ｈｒ、撹拌、４０ｒｐｍ）、発酵物ｐＨを７に調整し、溶解酸素を１００％に拡張した。接種後の重量は約７８，０００ｋｇであった。開始時、無水アンモニアを利用して５５０ｋｇのアンモニアを添加するまでｐＨを７に制御し、次いで３０％の水酸化ナトリウム溶液を７．５の設定点におけるｐＨ制御に利用した。溶解酸素を、４０から１００ｒｐｍの撹拌および２０００から８０００Ｎｍ３／ｈｒの空気流を使用してアンモニア供給の間２０％およびその後の１０％の標的を維持するように制御した。発酵物全体にわたり、６５％のＤＥ−９５コーンシロップ溶液を、約３５ｇ／Ｌのグルコース濃度を維持するように供給した。別の実施例［Ｋ０２０］において、実施例Ｋ０１９から３つの変化を施した：１）圧力を０．１５ｂａｒに低減させ、２）接種後の重量を６８，０００ｋｇに低減させ、３）空気流を接種６０時間後において５０００Ｎｍ３／ｈｒ超に増加させ、溶解酸素濃度にかかわらず実行全体にわたり高く維持した。上記３つの変化により、ブロス中の溶解二酸化炭素濃度が低減した。結果は、ＣＯ２の低減により、％ＤＨＡ／ＦＡＭＥが３８．３８％から４３．８％に増加し、％ＥＰＡ／ＦＡＭＥが２４．４２％から２０．６８％に低減したことを示した。ＤＨＡ：ＥＰＡ比は、１．５７から２．１２に増加した。結果を以下の表１１に示す。
【０２１０】
【表１１】
2020036602.tif 000012
【０２１１】
【表１２】
2020036602.tif 000013
【０２１２】
［実施例９］
[0206]以下の表中、最大溶解ＣＯ２は、ヘンリー定数を使用して実施例のいくつかについて計算する。第１の条件「０ＰＳＩの背圧および４５．５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間のＣＥＲにおける１０Ｌ（ＮＢＳ４  ０７１９ｅｔｌ０）」は、４５．５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間の二酸化炭素発生速度、１０リットルの発酵体積、０．８ｖｖｍの通気速度、および０ＰＳＩの背圧において表８中のＮＢＳ４について計算された溶解ＣＯ２である。第２の条件「インレットガス中６％のＣＯ２での０ＰＳＩの背圧および５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間のＣＥＲにおける１０Ｌ（ＮＢＳ２  ０７１９ｅｔｌ０）」は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間の二酸化炭素発生速度、１０リットルの発酵体積、０．８ｖｖｍの通気速度、０ＰＳｉの背圧において、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐｒｉｍａ  ｄＢ質量分析計を使用する質量分析により計測される総ガスの６％におけるインレット流で補給されるＣＯ２を用いてＮＢＳ２について表８中で計算された溶解ＣＯ２である。第３の条件「２ＰＳＩの背圧および５５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間のＣＥＲにおける８０リットル（ＮＢ５  ０６１４ｅｔｌ０）」は、５５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間の二酸化炭素発生速度、８０リットルの発酵体積、１．０ｗｍの通気速度、および２ＰＳＩの背圧において、表７中のＮＢ５について計算された溶解ＣＯ２である。第４の条件「１５ＰＳＩの背圧および５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間のＣＥＲにおける８０リットル（ＮＢ６  ０６１４ｅｔｌ０）」は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間の二酸化炭素発生速度、８０リットルの発酵体積、１．０ｖｖｍの通気速度、および１５ＰＳＩの背圧において、表７中のＮＢ６について計算された溶解ＣＯ２である。第５の条件「２０ＰＳＩの背圧および５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間のＣＥＲにおける８０リットル（ＮＢ７＆ＮＢ８  ０６１４ｅｔ１０）」は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間の二酸化炭素発生速度、８０リットルの発酵体積、１．０ｖｖｍの通気速度および２０ＰＳＩの背圧において、表７中のＮＢ７及びＮＢ８について計算された溶解ＣＯ２である。全てのＣＥＲ値を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐｒｉｍａ  ｄＢ質量分析計により回収されたオフガスＣＯ２データを使用して計算した。計算の結果を以下の表１３および表１４に提供する。
【０２１３】
【表１３】
2020036602.tif 000014
【０２１４】
【表１４】
2020036602.tif 000015
【０２１５】
【表１５】
2020036602.tif 000016
【０２１６】
［実施例１０］
[0207]実験を、周囲ＣＯ２レベル下でヤブレツボカビ属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）振とうフラスコ培地（Ｓｈａｋｅ  Ｆｌａｓｋ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＴＳＦＭ）中のＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−９６９５を使用して性能（バイオマスの乾燥細胞重量（ＤＷ）、％ＤＨＡ、％脂肪、および％ＥＰＡ）に対するビタミン勾配の効果を決定するために実施した。
【０２１７】
[0208]材料および方法：４つのビタミン（チアミン．ＨＣｌ、Ｂ１２、ビオチン、およびパントテン酸Ｃａ）を、０．２５ｇ／Ｌのｔａｓｔｏｎｅおよび０．６２５ｇ／ＬのＮａＣｌを有するＴＳＦＭ培地中で使用した（表１６参照）。追加のＭＳＧおよびＫＨ２ＰＯ４を、それらの総窒素およびリン含有率を維持するように培地に添加した。培地中の全ビタミン濃度は、試験されるビタミンに応じて標準量の０、０．５ｘ、１ｘ、５ｘ、１０ｘ、２０ｘ、または３０ｘであった（表１７参照）。勾配試験を、それぞれのビタミンに対して別個に実施した。しかしながら、ビオチンおよびパントテン酸Ｃａの場合、標準量のチアミン．ＨＣｌおよびＢ１２も培地中に取り込んだ。それというのも、後者２つの濃度は、標準ＴＳＦＭ中で極めて低かったためである。３つのＴＳＦＭ対照も、比較のために実験に含めた。これらの対照は、２ｇ／Ｌのｔａｓｔｏｎｅ（表１５参照）、１ｘチアミン．ＨＣｌおよび１ｘＢ１２（ＣＩ）を有する標準ＴＳＦＭ；いかなるビタミンも有さないｔａｓｔｏｎｅ不含ＴＳＦＭ（Ａ）；ならびに１ｘチアミン．ＨＣｌおよび１ｘＢ１２を有するｔａｓｔｏｎｅ不含ＴＳＦＭ（Ｂ）であった。全ての対照は、０．６２５ｇ／ＬのＮａＣｌを含有した。ＰＴＡ−９６９５の３日間培養物を使用して０．１ｇのＤＷ／Ｌにおいてデュプリケート２５０ｍｌ振とうフラスコに接種した。全てのフラスコ（平底、合計５０ｍｌの培地）を、ロータリーシェーカー（２００ＲＰＭ）上で２２．５＋／−１Ｃにおいて好気的にインキュベートした。全ての培養物を７日後に回収し、ＦＡＭＥ分析を最終フリーズドライバイオマス試料に対して実施した。
【０２１８】
【表１６】
2020036602.tif 000017
【０２１９】
【表１７】
2020036602.tif 000018
【０２２０】
【表１８】
2020036602.tif 000019
【０２２１】
[0209]結果：チアミン勾配についての最大ＤＷおよび％脂肪（それぞれ、６．７ｇ／Ｌおよび３８．５％）は、培地へのこのビタミンの添加量が標準レベルの５倍である場合に達成された（図１）。このレベルのチアミンにおける％ＤＨＡは４４．１％であった。５ｘ未満および５ｘ超のチアミンにおいて、ＤＷおよび％脂肪は両方とも降下し始めた。５ｘ未満のチアミンを有する培地中で％ＤＨＡも降下し、それは５ｘ超のチアミンにおいてわずかに変動し、顕著な改善はなかった。チアミン勾配培養物中の％ＥＰＡは、８．６から１１．５の範囲であった。ｔａｓｔｏｎｅもビタミンも培地に添加しなかった場合（図５、培地Ａ）、％ＤＨＡを除き全てが顕著に降下した。しかしながら、％ＤＨＡの増加は人為的であると思われた。それというのも、この条件についてＤＷおよび％脂肪が両方とも極端に低かったためである。Ｂ１２の１ｘ濃度は、ＤＷ、％ＤＨＡ、％脂肪、および％ＥＰＡに最適であると思われた（図２）。このレベルのビタミンＢ１２において、以下のことが達成された：７．１ｇ／ＬのＤＷ、５０．６％のＤＨＡ、４２．７％の脂肪，および２．１％のＥＰＡ。Ｂ１２を培地に添加しなかった場合、最大％ＥＰＡ（１１．５）が得られた。ビタミンを添加しなかったｔａｓｔｏｎｅ不含培地は、生物の性能をさらに改善せず、上記のとおり最大ＤＨＡ％は人為的であると思われた（図５、培地Ａ）。
【０２２２】
[0210]同様に、ビオチンの１ｘ濃度は、ＤＷ、％ＤＨＡ、および％脂肪に最適であった（図３）。これらのパラメータについての対応する値は：それぞれ６．８ｇ／Ｌ、４７．７％、および３７．９％であった。この点におけるＥＰＡパーセントは１．９であった。１ｘチアミンおよび１ｘＢ１２を有するｔａｓｔｏｎｅ不含培地（図５、培地Ｂ）は、ＰＴＡ−９６９５の全性能を顕著に減弱させた。
【０２２３】
[0211]パントテン酸Ｃａは、このビタミンを標準量の１０ｘにおいて培地に添加した場合、最大のＤＷ、％ＤＨＡ、および％脂肪を生成した（図４）。これらのパラメータの最適濃度は、それに応じて７．０ｇ／Ｌ、４７．３％、および３９．１％であった。パントテン酸Ｃａ勾配実験全体のＥＰＡ含有率は２％未満であった。ＰＴＡ−９６９５の全性能の顕著な低減は、１ｘチアミンおよび１ｘＢ１２のみを有するｔａｓｔｏｎｅ不含培地（図５、培地Ｂ）中で生物を増殖させた場合に顕著であった。
【０２２４】
[0212]結果を以下のデータ表にも示す。
【０２２５】
【表１９】
2020036602.tif 000020
【０２２６】
【表２０】
2020036602.tif 000021
【０２２７】
【表２１】
2020036602.tif 000022
【０２２８】
【表２２】
2020036602.tif 000023
【０２２９】
【表２３】
2020036602.tif 000024
【０２３０】
【表２４】
2020036602.tif 000025
【０２３１】
【表２５】
2020036602.tif 000026
【０２３２】
［実施例１１］
[0213]実験を、１０％のＣＯ２における最大性能を達成するためのビタミンＢ１２についてのＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−９６９５の最小所要量、例として、１０％のＣＯ２条件下での最大乾燥重量およびＤＨＡ収率を生成するためにＰＴＡ−９６９５培養物に要求されるビタミンＢ１２の最小量を決定するために実施した。
【０２３３】
[0214]温度：２２．５＋／−１Ｃ（１０％のＣＯ２における）
【０２３４】
[0215]シェーカー速度：２００ｒｐｍ
【０２３５】
[0216]基礎培地：既知組成スケールダウン発酵槽培地（Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｓｃａｌｅｄ−Ｄｏｗｎ  Ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＳＤＦＭ−Ｂ）（表２０）。
【０２３６】
[0217]接種材料：異なる濃度のビタミンＢ１２を有するＤＳＤＦＭ−Ｂ中で増殖させたＰＴＡ−９６９５の３日間培養物。
【０２３７】
[0218]ＰＴＡ−９６９５の新たなクライオバイアルをＳＤＦＭ−Ｂ（表１９）中で最初に解凍し、続いて増殖させ、１０％のＣＯ２下で既知組成ＳＤＦＭ−Ｂ中で数回植継ぎした。ＤＳＤＦＭ−Ｂ中のＰＴＡ−９６９５の３日間培養物を（４％において）使用し、種々の濃度のビタミンＢ１２（すなわち、処理ＡからＩについて、それに応じて７．６８ｍｇ／Ｌから０ｍｇ／ＬのＢ１２；表１８参照）を有するＤＳＤＦＭ−Ｂを含有する初期接種材料フラスコを調製した。それぞれの濃度のビタミンＢ１２についての接種材料フラスコを、１０％のＣＯ２下で、培養物をそれらのそれぞれの新たな培地中に７日間ごと植継ぎすることにより維持した。このビタミンについての最小所要量をより正確に決定することができるように、培養物の毎週の植継ぎが細胞内部に蓄積され得るあらゆる過剰なビタミンＢ１２のウォッシュアウトに不可欠であった。デュプリケート振とうフラスコに、６００ｎｍにおける光学密度を使用してそれらのそれぞれの３日間接種材料を０．１ｇ／Ｌの理論ＤＷにおいて接種した。培養物を１０％ＣＯ２下で９日間増殖させてから回収し、ＦＡＭＥアッセイによりさらに分析した。
【０２３８】
[0219]結果：
[0220]注：本試験において第３週目についてのデータ点を無視する。それというのも、実験室修復の間の６時間、インキュベーターへのＣＯ２の補給を中断し、フラスコをインキュベーターから取り出さなければならなかったためである。
【０２３９】
[0221]高濃度のビタミンＢ１２（３．８４ｍｇ／Ｌ超）へのＰＴＡ−９６９５の曝露延長（最大４週間）は、乾燥重量、％脂肪、およびＤＨＡ収率に悪影響を与え得る一方、１．５から７６８ｕｇ／ＬのビタミンＢ１２の濃度はＰＴＡ−９６９５のＤＷ、％脂肪、％ＥＰＡ、およびＤＨＡ収率に対する顕著な効果を有さない。
【０２４０】
[0222]単一細胞の数の増加（３〜４に対して最大１５）は、７６８ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２（処理Ａ）の存在下で増殖させた培養物中で見られた。
【０２４１】
[0223]培地レシピからビタミンＢ１２の排除は、％ＥＰＡを約１０％だけ顕著に増加させた一方、％ＤＨＡおよび％１６：０を両方ともわずかに減少させた。以下の図６〜１９および表２１は、実験の結果を示す。
【０２４２】
[0224]結論：
[0225]最小の約１．５ｕｇ／ＬのビタミンＢ１２（ＳＤＦＭ−Ｂ中の標準濃度の５００分の１）は、最大ＤＷ、％ＤＨＡ、％脂肪、およびＤＨＡ収率を得るために不可欠である。極めて高濃度のビタミンＢ１２（３．８４ｍｇ／Ｌ超）がＤＷ、％脂肪、およびＤＨＡ収率を顕著に低減させ得る一方、このビタミンからのＰＴＡ−９６９５の完全な喪失は、その％ＥＰＡを顕著に（約１０％）増加させ得る。極めて高レベルのビタミンＢ１２も、「塊状」培養物の「単一細胞」への形質転換の促進の役割を担う。
【０２４３】
【表２６】
2020036602.tif 000027
【０２４４】
【表２７】
2020036602.tif 000028
【０２４５】
【表２８】
2020036602.tif 000029
【０２４６】
【表２９】
2020036602.tif 000030
【０２４７】
【表３０】
2020036602.tif 000031
【０２４８】
【表３１】
2020036602.tif 000032
【０２４９】
【表３２】
2020036602.tif 000033
【０２５０】
【表３３】
2020036602.tif 000034
【０２５１】
【表３４】
2020036602.tif 000035
【０２５２】
【表３５】
2020036602.tif 000036
【０２５３】
【表３６】
2020036602.tif 000037
【０２５４】
【表３７】
2020036602.tif 000038
【０２５５】
【表３８】
2020036602.tif 000039
【０２５６】
【表３９】
2020036602.tif 000040
【０２５７】
【表４０】
2020036602.tif 000041
【０２５８】
［実施例１２］
［１０％のＣＯ２におけるＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２０８ビタミンＢ１２勾配］
[0226]最適なＰＴＡ−１０２０８増殖およびＥＰＡ生産性を提供するビタミンＢ１２の濃度を決定するための実験を実施した。
【０２５９】
[0227]温度：２３℃
【０２６０】
[0228]シェーカー速度：２００ｒｐｍ
【０２６１】
[0229]基礎培地：既知組成（Ｄｅｆｉｎｅｄ）ＳＤＦＭ−Ｏ（ＤＳＤＦＭ−Ｏ）
【０２６２】
[0230]接種材料：ＰＴＡ−１０２０８のバイアルを周囲条件においてＳＤＦＭ−Ｏ中に解凍した。２ｍＬの培養物を４８ｍＬのＤＳＤＦＭ−Ｏ中に１０％のＣＯ２において植継ぎした。培養物を新たなＤＳＤＦＭ−Ｏ（１０％のＣＯ２）中に植継ぎした（表２２参照）。培養物を新たなＤＳＤＦＭ−Ｏ（１０％のＣＯ２）中に植継ぎした。培養物を使用してビタミンＢ１２勾配実験第１週（２ｍＬ／フラスコ）（１０％のＣＯ２）に接種した。
【０２６３】
[0231]実験設定：
[0232]全ての培養物を５０ｍＬの振とうフラスコ中で増殖させ、デュプリケートフラスコをそれぞれの条件について増殖させた。ＰＴＡ−１０２０８を、ＤＳＤＦＭ−Ｏ（ｔａｓｔｏｎｅなし）中の９日間ビタミンＢ１２勾配中に７日間ごとに接種した。それぞれの濃度のビタミンＢ１２についての接種材料を実験の過程全体にわたり維持した。ＰＴＡ−１０２０８を低減濃度のビタミンＢ１２中で植継ぎし続けることにより、過剰のビタミンＢ１２を細胞から効率的にウォッシュアウトした。それぞれの濃度のビタミンＢ１２についての接種材料を７日間ごとに移した。４日間接種材料を使用してそれぞれの９日間ビタミンＢ１２勾配を開始した。それぞれの９日間勾配を、実験設定Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、ＪおよびＫとして、以下の表２３中で連続的に標識する。それぞれの勾配接種前、光学密度をそれぞれの濃度のビタミンＢ１２について計測してほぼ同一量の細胞を植継ぎした。９日間の増殖後、全ての培養物を回収してｐＨ、乾燥重量、および脂肪酸プロファイルを計測した。それぞれの濃度のビタミンＢ１２の濃度における乾燥重量が少なくとも３つの連続した９日間勾配について安定化したことが見出されたら実験を終了させた。
【０２６４】
【表４１】
2020036602.tif 000042
【０２６５】
【表４２】
2020036602.tif 000043
【０２６６】
【表４３】
2020036602.tif 000044
【０２６７】
[0233]７つの連続する５ｘから１／５００ｘのビタミンＢ１２勾配を実施した。最後の実験の終了時、１／５００ｘ（０．００１５ｍｇ／Ｌ）および０ｘ（０ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２）におけるＰＴＡ−１０２０８増殖およびＥＰＡ生成を比較する新たな実験を開始した。４つの連続する１／５００ｘ対０ｘのビタミンＢ１２実験を実施した。
【０２６８】
[0234]結果：
[0235]（５ｘ−−＞１／５００ｘビタミンＢ１２について）：７つの連続する９日間実験について、ＰＡＴ−１０２０８の乾燥重量、％ＥＰＡ、％ＤＨＡ、％脂肪、およびＥＰＡ収率は、５ｘ（３．８４ｍｇ／Ｌ）から１／５００ｘ（０．００１５ｍｇ／Ｌ）の範囲のビタミンＢ１２濃度において変化しなかった。
【０２６９】
[0236]（１／５００ｘおよび０ｘビタミンＢ１２について）：４つの連続する９日間実験の過程にわたる結果は、０ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を含有するＤＳＤＦＭ−Ｏ中で増殖させたＰＴＡ−１０２０８が単に１／５００ｘ（０．００１５ｍｇ／Ｌ）のビタミンＢ１２を用いて増殖させた場合よりもかなり高いＥＰＡ％を有することを示す。％ＥＰＡが１／５００ｘ（０．００１５ｍｇ／Ｌ）ビタミンＢ１２を用いて約１８％からいかなるビタミンＢ１２もなしで約２７％に増加する一方、％ＤＨＡは１／５００ｘ（０．００１５ｍｇ／Ｌ）ビタミンＢ１２を用いて約４５％からいかなるビタミンＢ１２もなしで約３６％に減少する。ＰＴＡ−１０２０８の乾燥重量および％脂肪は、ビタミンＢ１２をＤＳＤＦＭ−Ｏから完全に除去した場合にわずかに増加する。％ＥＰＡの増加ならびに乾燥重量および％脂肪のわずかな増加の結果として、ＰＴＡ−１０２０８のＥＰＡ収率は、ビタミンＢ１２をＤＳＤＦＭ−Ｏから除去した場合に約６０％だけ増加する。
【０２７０】
[0237]結果を図２０〜４９および以下の表にも示す。
【０２７１】
【表４４】
2020036602.tif 000045
【０２７２】
【表４５】
2020036602.tif 000046
【０２７３】
【表４６】
2020036602.tif 000047
【０２７４】
【表４７】
2020036602.tif 000048
【０２７５】
【表４８】
2020036602.tif 000049
【０２７６】
【表４９】
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【０２７７】
【表５０】
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【０２７８】
【表５１】
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【０２７９】
【表５２】
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【０２８０】
【表５３】
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【０２８１】
[0238]結論：ＰＴＡ−１０２０８増殖およびＥＰＡ生産性は、１０％のＣＯ２におけるＤＳＤＦＭ−Ｏ中の５ｘ（３．８４ｍｇ／Ｌ）および１／５００ｘ（０．００１５ｍｇ／Ｌ）の範囲のビタミンＢ１２濃度においては変化しなかった。しかしながら、ビタミンＢ１２をＤＳＤＦＭ−Ｏから完全に除去した場合、％ＥＰＡは約５０％だけ増加する一方、乾燥重量および％脂肪もわずかに増加し、ＥＰＡ生産性の６０％の増加をもたらす。
【０２８２】
[0239]本明細書に記載の種々の態様、実施形態、および任意選択の全ては、任意のおよび全てのバリエーションで組み合わせることができる。
【０２８３】
[0240]本明細書において挙げられる全ての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許、および特許出願が参照により組み込まれるように個別具体的に示されるのと同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年11月8日(2019.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪酸およびＥＰＡを有する微生物のバイオマスを作製する方法であって、前記微生物を、ビタミンＢ１２を含有しない培養培地中で増殖させてバイオマスを生成するステップを含み、
前記微生物がヤブレツボカビである、方法。
【請求項２】
前記培養培地は、脂質不含バイオマス５０ｇ当たり１ｇ未満の酵母エキスをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培養培地は、脂質不含バイオマス５０ｇ当たり０．５ｇ未満の酵母エキスをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記培養培地は、脂質不含バイオマス５０ｇ当たり０．１ｇ未満の酵母エキスをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物は、前記脂肪酸の総重量の少なくとも３％のＥＰＡを生成する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記培養培地は、少なくとも５％の溶解ＣＯ２レベルを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記培養培地は、少なくとも１０％の溶解ＣＯ２レベルを有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記培養培地は、少なくとも１５％の溶解ＣＯ２レベルを有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【外国語明細書】
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