(57)【要約】【課題】  本発明は脂肪減少効果を有するマイタケ抽出物及びその製造方法を得ることにある。【解決手段】  その成分にはβ−グルカン（β−Ｇｌｕｃａｎ）及びラッカーゼ（Ｌａｃｃａｓｅｓ）が含まれ、真菌固有の分解能を有するアポ酵素を利用することにより、５０℃以下の加熱温度下で、低エネルギー消費という利点を有するだけでなく、アポ酵素に活性能を発揮させることもでき、先に細胞破砕を行い、それから水／エタノール混合液を添加して活性代謝物を抽出するという２段階式の抽出物調製方法により、得られたマイタケ抽出物のリパーゼ阻害効果を向上させることができる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
成分にβ−グルカン及びラッカーゼを含む、膵リパーゼ阻害効果を有するマイタケ抽出物。
【請求項２】
高血糖抑制薬の製造に用いられる、請求項１に記載のマイタケ抽出物の用途。
【請求項３】
血中コレステロール低下剤の製造に用いられる、請求項１に記載のマイタケ抽出物の用途。
【請求項４】
マイタケを５０℃以下の水とエタノールの混合液中で抽出することで抽出液を得て、次に前記抽出液に対して精製・濃縮処理を行い、凍結乾燥処理を経た後に前記マイタケ抽出物を得ることが可能な、請求項１に記載のマイタケ抽出物の製造方法。
【請求項５】
前記マイタケは、先に空気乾燥させてから粉砕し、次に粉砕後のマイタケを５０℃の加熱温度下に置き、マイタケ中のアポ酵素に活性能を発揮させた後に、水とエタノールの混合液を添加して抽出を行う、請求項４に記載のマイタケ抽出物の製造方法。
【請求項６】
前記水とエタノールの混合液において、水とエタノールは体積比で１：１の割合に混合する、請求項５に記載のマイタケ抽出物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はマイタケの抽出工程に関し、特に脂肪減少効果を有するマイタケ抽出物及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，ＷＨＯ）は、２１世紀の公共衛生上最も重要な問題として肥満を挙げている。肥満から派生する関連疾患は、人体の健康に対する重大な脅威となる。多くの研究が天然化合物の抗肥満作用における顕著な効果を指摘する中で、近年では国際的に医学研究者の間でマイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｆｒｏｎｄｏｓａ）が注目されており、マイタケは良好な保健食・食事療法効果を有するため、将来性が広く見込まれている。
【０００３】
マイタケ水性抽出物中に含まれている特殊な多糖体は、グリセロール−３−リン酸脱水素酵素（ｇｌｙｃｅｒｏｌ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＧＰＤＨ）の活性を低減したり、トリグリセリドの形成を低減したり、ラット血清中のコレステロールを低減したりすることができる。しかし、周知のキノコ類の抽出はいずれも水温≧１００℃の条件下で行われるか、又は酢酸エチルなどの有機溶剤を用いて行われており、そのリパーゼ阻害効果は良くない上に、抽出方法が過度にエネルギーを消費するという問題も存在している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、低エネルギー消費という要件を満たすと同時に、脂肪細胞の増殖及び分化を阻害し、脂肪の蓄積を減少させ、脂肪の消化吸収を低減させるのに極めて良好な効果をマイタケ抽出物に確実に備えさせることが可能な、脂肪減少効果を有するマイタケ抽出物及びその製造方法を提供することを主な目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明は、脂肪減少効果を有するマイタケ抽出物を提供し、その成分にはβ−グルカン（β−Ｇｌｕｃａｎ）及びラッカーゼ（Ｌａｃｃａｓｅｓ）が含まれる。
【０００６】
さらに、マイタケ抽出物はリパーゼ阻害薬の製造用途に用いることができる。
【０００７】
さらに、マイタケ抽出物は高血糖抑制薬の製造用途に用いることができる。
【０００８】
さらに、マイタケ抽出物は血中コレステロール低下剤の製造用途に用いることができる。
【０００９】
また本発明は、マイタケを５０℃以下の水とエタノールの混合液中で抽出することで抽出液を得て、次に抽出液に対して精製・濃縮操作を行い、凍結乾燥を経た後にマイタケ抽出物を得ることが可能な、マイタケ抽出物の製造方法をさらに提供する。
【００１０】
マイタケは、先に空気乾燥させた後で粉砕し、次に粉砕後のマイタケを５０℃の加熱温度下に置き、マイタケ中のアポ酵素に活性能を発揮させた後に、水とエタノールの混合液を添加して抽出を行うのが好ましい。
【００１１】
水とエタノールの混合液において、水とエタノールは体積比で１：１の割合に混合するのが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の製造フローチャートである。
【図２】本発明が異なる抽出温度下で得たマイタケ抽出物の波長条件が３３０ｎｍにおけるラッカーゼの吸収スペクトル図である。
【図３】本発明が異なる抽出温度下で得たマイタケ抽出物とＡＢＴＳを反応させて生成したＡＢＴＳラジカルの波長条件が４２０ｎｍにおける吸収スペクトル図である。
【図４】本発明で行われたマウスを用いた試験の写真概略図。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
[実施例]
図１が示す通り、本発明は脂肪減少効果を有するマイタケ抽出物の製造方法を提供するが、最初にマイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｆｒｏｎｄｏｓａ）を空気乾燥させた後に粉砕し、次に粉砕後のマイタケを５０℃の加熱温度下に置き、マイタケ中のアポ酵素に活性能を発揮させて、先に細胞破砕を行った後に、水とエタノールの混合液を添加してその活性代謝物を抽出することで抽出液を取得し、その後に抽出液に対して分離精製・濃縮処理を行い、次に凍結乾燥処理を行うことで本発明のマイタケ抽出物を得ることができる。また、マイタケ抽出物の成分にはβ−グルカン（β−Ｇｌｕｃａｎ）及びラッカーゼ（Ｌａｃｃａｓｅｓ）が含まれる。
【００１４】
水とエタノールの混合液において、水とエタノールは体積比で１：１の割合に混合する。
【００１５】
次に実験例とテスト結果とを組み合わせて本発明が達成可能な効果を検証する。
マイタケを４℃、２７℃、５０℃、１００℃の温度が異なる水でそれぞれ抽出し、また異なる割合（１：１及び１：２）の水とエタノールの混合液で抽出し、表１が示す通り、それぞれから６グループ（Ａ１〜Ａ６）の抽出物を得た。次に各グループの抽出物それぞれに対してリパーゼ活性分析を行い、また分化後の３Ｔ３−Ｌ１細胞と培養した。処理後の３Ｔ３−Ｌ１細胞の細胞増殖状況及びオイルレッドＯ染色試験を分析した。
[表１]  マイタケを水抽出及び水とエタノールの混合液で抽出したβ−ｇｌｕｃａｎ含有量の分析表
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【００１６】
表１の試験結果から分かるように、水を溶媒とした場合、５０℃以下で高い抽出率を得ることができており、エタノールを添加して抽出した場合には抽出物のβ−グルカン（β−Ｇｌｕｃａｎ）含有量を向上させることができた。
【００１７】
ラッカーゼ（Ｌａｃｃａｓｅｓ）は銅を含むポリフェノールオキシダーゼであり、酸化還元反応の触媒作用を有し、ラッカーゼの酸化還元触媒性能を利用して化学触媒反応を行うことができる。真菌ラッカーゼの多くは最適反応温度が低く、通常は２５〜５０℃の間であり、ラッカーゼ酵素生産菌種及びラッカーゼ製品の優劣評価ではその酵素活性の大きさが直接的な基準となるため、通常は分光光度度法で測定が行われる。分光光度によるラッカーゼ酵素活性測定の基本原理は、特定の光波の波長下に存在する最大の吸光係数を選定し、基質ラジカル濃度が増加するにつれて吸光度の値が増大するので、吸光度（ＯＤ）の時間変化関係に基づいて酵素活性を算出することができる。ＡＢＴＳは、ラッカーゼ酵素活性を測定するのに良く用いられる基質であり、ＡＢＴＳはラッカーゼ作用を経た後にＡＢＴＳラジカルを形成し、ＡＢＴＳラジカル濃度が増加するにつれて４２０ｎｍの吸光度値が大きくなる。従って、異なる抽出温度で得たマイタケ抽出物の酵素活性を分光光度法により波長条件が３３０ｎｍ及び形成されたＡＢＴＳラジカルの波長４２０ｎｍで測定することができ、その結果は図２及び図３が示す通りである。図２及び図３から分かるように、マイタケの抽出温度が高いほどその吸収は低く形成されており、抽出物中のラッカーゼ酵素活性がより低いことを表している。
【００１８】
（１）本発明のマイタケ抽出物が３Ｔ３−Ｌ１  前駆脂肪細胞増殖に与える影響の試験：
次に各グループのマイタケ抽出物が３Ｔ３−Ｌ１  前駆脂肪細胞増殖に与える影響を分析した。表１に記載された各グループの抽出物５０μｇ／ｍｌを分化の第一段階にある前駆脂肪細胞中で４８時間培養した後に、ＭＴＴａｓｓａｙで細胞生存率を分析したが、試験結果は表２が示す通り、１００℃で水抽出したＡ４グループと、水とエタノールの混合液で抽出したＡ５グループは、どちらも前駆脂肪細胞増殖に対する良好な阻害効果を有しており、阻害率はそれぞれ４８％と３７％であった。
[表２]
マイタケ抽出物が３Ｔ３−Ｌ１  脂肪細胞増殖に与える影響の分析表
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＊各グループ間に同じアルファベットがないことは顕著な差異があることを指す（Ｐ＜０．０５）
【００１９】
（２）本発明のマイタケ抽出物が３Ｔ３−Ｌ１  前駆脂肪細胞の脂質生成に与える影響の試験：
Ａ１〜Ａ６グループのマイタケ抽出物５０μｇ／ｍｌを分化の第一段階にある前駆脂肪細胞中で１０日間培養し、染色した後に４９０ｎｍで吸光値を測定して、３Ｔ３−Ｌ１  前駆脂肪細胞の脂質生成に与える影響を分析したが、その試験結果は表３が示す通りである。
[表３]
マイタケ抽出物が３Ｔ３−Ｌ１  前駆脂肪細胞の脂質生成に与える影響の分析表
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＊各グループ間に同じアルファベットがないことは顕著な差異があることを指す（Ｐ＜０．０５）
次にＡ５グループのマイタケ抽出物を異なる用量（０〜５０μｇ／ｍｌ）で分化の第一段階にある前駆脂肪細胞中で１０日間培養し、染色した後に４９０ｎｍで吸光値を測定して、３Ｔ３−Ｌ１  前駆脂肪細胞の脂質生成に与える影響を分析したが、その試験結果は表４が示す通りである。
[表４]
Ａ５グループで異なる用量（０〜５０μｇ／ｍｌ）で得たマイタケ抽出物が３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞の脂質生成に与える影響の分析表
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＊各グループ間に同じアルファベットがないことは顕著な差異があることを指す（Ｐ＜０．０５）
上記の３Ｔ３−Ｌ１  前駆脂肪細胞の増殖影響試験の試験結果から分かるように、水とエタノールを採用して体積比が１：１の割合の混合液を５０℃の加熱温度下で抽出したマイタケ抽出物（Ａ５グループ）は、脂肪細胞の増殖率を２０％以下に効果的に抑制することができ、極めて良好な脂肪細胞増殖阻害効果を有することが示されており、また表４から分かるように、Ａ５グループのマイタケ抽出物の脂質蓄積の阻害作用は、その容量と正比例の関係を呈している。この結果により、マイタケ抽出物には３Ｔ３−Ｌ１  前駆脂肪細胞が脂肪細胞に分化するのを阻害する作用があることが実証できる。
【００２０】
（３）本発明のマイタケ抽出物が膵リパーゼ活性に与える影響の試験：
Ａ１〜Ａ６グループのマイタケ抽出物５０μｇ／ｍｌを膵リパーゼと培養し、且つそれがｎ−ＰＮＰＢの分解作用に与える影響を分析したが、その試験結果は表５が示す通りである。
[表５]
マイタケ抽出物が膵リパーゼ活性に与える影響の分析表
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＊各グループ間に同じアルファベットがないことは顕著な差異があることを指す（Ｐ＜０．０５）
【００２１】
次にＡ５グループのマイタケ抽出物を異なる用量（０〜６０μｇ／ｍｌ）で膵リパーゼと培養し、且つそれがｎ−ＰＮＰＢの分解作用に与える影響を分析したが、その試験結果は表６が示す通りである。
[表６]
Ａ５グループで異なる用量（０〜６０μｇ／ｍｌ）で得たマイタケ抽出物が膵リパーゼ活性に与える影響の分析表
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＊各グループ間に同じアルファベットがないことは顕著な差異があることを指す（Ｐ＜０．０５）
上記の膵リパーゼ活性影響試験の試験結果から分かるように、水とエタノールを採用して体積比が１：１の割合の混合液を５０℃の加熱温度下で抽出したマイタケ抽出物（Ａ５グループ）は、膵リパーゼの活性を１０％以下に効果的に阻害することができ、極めて良好な膵リパーゼ活性阻害効果を有し、且つ脂肪の消化吸収を阻害する作用を有することが示されており、また表６から分かるように、Ａ５グループのマイタケ抽出物の膵リパーゼ活性の阻害作用についても容量反応関係を呈している。
【００２２】
（４）高脂肪食誘導性肥満マウス試験：
高脂肪食誘導性肥満マウス試験中、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆの計６グループに分け、そのうちＡグループはコントロールグループであり、正常飼料を摂取させ、Ｂ〜Ｆグループにはいずれもラード、コーンオイル、コレステロールが添加された高脂肪食（ＨＦ）を摂取させ、そのうちＣ、Ｄ、Ｅグループにはそれぞれ０．１％、１％及び２％のマイタケ抽出物（Ａ５グループ）を与え、Ｆグループには０．５％のβ−ｇｌｕｃａｎを与えた。試験は計１６週であり、その試験結果は図４が示す通りである。
本発明の水とエタノールを採用して体積比が１：１の割合の混合液を５０℃の加熱温度下で抽出したマイタケ抽出物（Ａ５グループ）が、マウスの体重増加及び肝臓重量の増加傾向に与える影響については、後に添付した表７が示す通りである。
また、本発明の水とエタノールを採用して体積比が１：１の割合の混合液を５０℃の加熱温度下で抽出したマイタケ抽出物（Ａ５グループ）が、マウスの血中コレステロール濃度（ＣＨＯ）、ＬＤＬ／ＨＤＬ数値及び血糖値（ＧＬＵＣ）に与える影響については、後に添付する表８が示す通りである。
上記の高脂肪食誘導性肥満マウス試験からはっきりと分かるように、本発明の水とエタノールを採用して体積比が１：１の割合の混合液を５０℃の加熱温度下で抽出したマイタケ抽出物（Ａ５グループ）は、マウスの体重増加及び肝臓重量の増加傾向を効果的に軽減させることができるだけでなく、容量反応関係も呈しており（表７が示す通り）、且つマウスの血中コレステロール濃度（ＣＨＯ）を効果的に減少させ、ＬＤＬ／ＨＤＬ数値を低減させ、さらに高脂肪食により誘導された高血糖の症状を効果的に減少させることができる（表８が示す通り）。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
上記の各試験を通して、本発明が提供する脂肪減少効果を有するマイタケ抽出物が３Ｔ３−Ｌ１の脂肪蓄積を阻害し、脂肪細胞の増殖及び分化を減少させることができ、さらには膵リパーゼ活性を効果的に阻害することができ、脂肪の消化吸収を阻害する作用を確かに有しており、リパーゼ阻害薬、高血糖抑制剤及び血中コレステロール低下剤の製造用途に広く適用可能であることが実証できる。また、本発明が提供する脂肪減少効果を有するマイタケ抽出物の製造方法は、真菌固有の分解能を有するアポ酵素を利用することにより、低い加熱温度下で、低エネルギー消費という利点を有するだけでなく、アポ酵素に活性能を発揮させることもでき、先に細胞破砕を行い、それから水／エタノール混合液を添加して活性代謝物を抽出するという２段階式の抽出物調製方法により、得られたマイタケ抽出物のリパーゼ阻害効果を向上させることができる。
[表７]
マイタケ抽出物（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｆｒｏｎｄｏｓａ  ｅｘｔｒａｃｔｓ）がマウスの体重増加及び肝臓重量の増加傾向に与える影響の分析表
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[表８]
マイタケ抽出物（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｆｒｏｎｄｏｓａ  ｅｘｔｒａｃｔｓ）がマウスの血中コレステロール濃度、ＬＤＬ／ＨＤＬ数値及び血糖値に与える影響の分析表
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年5月7日(2020.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
成分にβ−グルカン及びラッカーゼを含む、膵リパーゼ阻害効果を有するマイタケ抽出物の製造方法であって、
マイタケを５０℃以下の水とエタノールの混合液中で抽出することで抽出液を得て、次に前記抽出液に対して精製・濃縮処理を行い、凍結乾燥処理を経た後に前記マイタケ抽出物を得ることが可能な、マイタケ抽出物の製造方法。
【請求項２】
前記マイタケは、先に空気乾燥させてから粉砕し、次に粉砕後のマイタケを５０℃の加熱温度下に置き、マイタケ中のアポ酵素に活性能を発揮させた後に、水とエタノールの混合液を添加して抽出を行う、請求項１に記載のマイタケ抽出物の製造方法。
【請求項３】
前記水とエタノールの混合液において、水とエタノールは体積比で１：１の割合に混合する、請求項２に記載のマイタケ抽出物の製造方法。