(57)【要約】【課題】ＩＬ−３３発現抑制剤の製造方法を提供する。【解決手段】ＩＬ−３３発現抑制剤の製造方法は、竹チップを準備する工程と、準備された竹チップを５０〜８９℃で焙煎する工程と、焙煎された竹チップを乾燥する工程と、乾燥された竹チップを５〜３９℃の抽出溶媒に浸漬することにより竹チップから有効成分を抽出する工程とを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
竹チップを準備する工程と、
前記準備された竹チップを５０〜８９℃で焙煎する工程と、
前記焙煎された竹チップを乾燥する工程と、
前記乾燥された竹チップを５〜３９℃の抽出溶媒に浸漬することにより前記竹チップから有効成分を抽出する工程とを含む、ＩＬ−３３発現抑制剤の製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の製造方法であって、
前記抽出溶媒はブチレングリコール水溶液又は水を含む、ＩＬ−３３発現抑制剤の製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の製造方法であって、
前記乾燥する工程は前記竹チップを天日干しする、ＩＬ−３３発現抑制剤の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法であって、
前記ＩＬ−３３発現抑制剤はアトピー性皮膚炎に用いられる、ＩＬ−３３発現抑制剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＬ−３３（インターロイキン３３）発現抑制剤の製造方法に関し、特に、アトピー性皮膚炎に用いられるＩＬ−３３発現抑制剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特開２００５−２００３９３号公報（特許文献１）は、竹酢液を含有するクリーム状組成物を開示する。特許文献１には、「竹酢液は、抗菌・抗酸化機能、アトピー性皮膚炎・水虫に対する治療効果、血糖値を下げる効果および肝機能の向上・骨粗しょう症の改善・歯周病や口内炎に対する効果、消臭効果等々の特異な効能から従来より期待されてきた材料であり、竹酢液そのままに水やアルコールを配合して使用されてきた。しかしながら、竹酢液に独特の強い臭気があり、皮膚に塗布すると不快感があり、また液状であるために皮膚に塗布しづらく携帯にも不便であるという欠点があった。」（段落０００２）、「竹酢液は、竹の乾留による公知の方法で得ることができる。また、オートクレーブ中に竹を入れ、高温の蒸気で加圧と圧力開放を繰り返す方法により竹を繊維状に粉砕するとき、オートクレーブ底部に溜まる液体としても得ることができる。」と記載されている（段落０００９参照）。
【０００３】
特開２００３−２１２７８６号公報（特許文献２）は、竹の抽出成分を有効成分とする皮膚外用薬を開示する。特許文献２には、「これらの竹が切り取られたものを、チップ状にした粉砕物を、本発明の原料物質とする。粉砕物は、抽出操作を考慮して粉状としたものを用いる。」（段落０００６）、「本発明では、竹の粉砕物を水、又は有機溶剤で処理して抽出物を用いる。」（段落０００７）と記載されている。
【０００４】
特表２０１０−５０５９４４号公報（特許文献３）は、竹抽出物とコガネバナ抽出物とを含有するアトピー性皮膚炎治療用組成物を開示する。特許文献３には、竹抽出物の製造として、「乾燥された竹２０ｋｇに、２５％のエタノール２００Ｌを加え、混合物を８０℃で６時間加熱することによって抽出した。抽出液をろ過し、抽出液の体積が約５Ｌになるまで濃縮してエタノールを除去した。その後、濃縮された抽出液を室温に冷却した。沈澱物を回収し、乾燥して竹抽出物３９０ｇを得た。」（段落００３１）、「乾燥された竹２０ｋｇに、重量対比１０倍の水を加え、混合物を１００℃で４時間加熱することによって抽出した。抽出液をろ過し、減圧下で濃縮した。濃縮された抽出液にエタノール１０Ｌを加え、７０℃で２時間撹拌した後、室温に冷却した。沈澱物をろ過し、減圧下で濃縮して竹抽出物３５０ｇを得た。」（段落００３２）と記載されている。
【０００５】
特開２０１０−１１６３７７号公報（特許文献４）は、抗菌組成物を開示する。抗菌組成物は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）に対する抗菌剤であり、竹抽出物を含有する。特許文献４には、「竹抽出物は、・・・粉末状にしたモウソウチク竹茹部分をエタノール等の水系溶媒中で攪拌し、遠心分離によって得られた上清を濾過して得られてもよい。・・・また、竹抽出物は、・・・竹植物を水蒸気の存在下にて１２０〜１８０℃で水蒸気処理し、これを冷却した後、エタノール等を含む抽出溶剤で抽出されてもよい。」（段落００２１）と記載されている。
【０００６】
特開２０１１−４６６３６号公報（特許文献５）は、抗ウイルス組成物を開示する。特許文献５には、「抗ウイルス組成物は竹抽出物を含有するものである。そして、当該竹抽出物は、（ａ）竹植物を水系溶剤によって抽出することによって抽出液を得る工程と、（ｂ）上記抽出液から上記水系溶剤を除去して乾固物を得る工程と、（ｃ）上記乾固物を水に溶解させて水溶性画分を得る工程と、を含む方法によって得られる。」（段落００３３）と記載されている。
【０００７】
一方、アトピー性皮膚炎の発症には、サイトカインの一種であるＩＬ−３３（インターロイキン３３）の関与が指摘されている（例えばＷＯ２０１４／１７８３９２Ａ１公報（特許文献６）、ＷＯ２０１５／０９９１７５Ａ１公報（特許文献７）、特開２０１８−１１８９６５号公報（特許文献８）参照）。すなわち、皮膚の角化細胞がＩＬ−３３を産生し、その結果、アトピー性皮膚炎のほか、花粉症、喘息、アレルギー性鼻炎、炎症性腸疾患などの炎症性疾患を引き起こすと考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００５−２００３９３号公報
【特許文献２】特開２００３−２１２７８６号公報
【特許文献３】特表２０１０−５０５９４４号公報
【特許文献４】特開２０１０−１１６３７７号公報
【特許文献５】特開２０１１−４６６３６号公報
【特許文献６】ＷＯ２０１４／１７８３９２Ａ１公報
【特許文献７】ＷＯ２０１５／０９９１７５Ａ１公報
【特許文献８】特開２０１８−１１８９６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述した通り、アトピー性皮膚炎の外用剤に用いられる竹酢液は、独特の燻製臭を有するため、人によってはその臭いが不快であると感じることがある。そこで、本発明者は、燻製臭を有する竹酢液の代わりに、竹抽出液を用い、アトピー性皮膚炎の改善効果を検討した。その結果、本発明者は、特定の製造条件下で、ＩＬ−３３の発現を抑制する有効成分を竹から抽出できるという新たな知見を得た。
【００１０】
本発明の目的は、ＩＬ−３３発現抑制剤の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係るＩＬ−３３発現抑制剤の製造方法は、竹チップを準備する工程と、準備された竹チップを５０〜８９℃で焙煎する工程と、焙煎された竹チップを乾燥する工程と、乾燥された竹チップを５〜３９℃の抽出溶媒に浸漬することにより竹チップから有効成分を抽出する工程とを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、表１に示される各サンプルのＩＬ−３３発現抑制効果を検証した試験結果を示したグラフである。
【図２】図２は、表２に示される各サンプルのＩＬ−３３発現抑制効果を検証した試験結果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
【００１４】
本実施の形態に係るＩＬ−３３発現抑制剤の製造方法は、（１）竹チップを準備する工程と、（２）準備された竹チップを５０〜８９℃で焙煎する工程と、（３）焙煎された竹チップを乾燥する工程と、（４）乾燥された竹チップを５〜３９℃の抽出溶媒に浸漬することにより竹チップから有効成分を抽出する工程とを含む。
【００１５】
［竹チップ］
竹を適当な大きさに粉砕することにより竹チップを準備する。用いられる竹の種類は、特に限定されないが、例えば、モウソウチク属、マダケ属、ハチク属、ホウソウチク属、シホウチク属、シュドササ属、ササモルフア属、ナリヒラダケ属、トウチク属、オカメザサ属、ササ属、アズマザサ属、ヤダケ属、メダケ属、カンチク属、ホウライチク属などに属する竹を用いることができる。用いられる竹の部位は、特に限定されないが、表皮や竹如などを用いることができる。
【００１６】
なお、竹チップを後述する焙煎前に発酵させてもよい。
【００１７】
［焙煎］
焙煎温度が５０〜８９℃（一般的な焙煎温度よりも低い）であれば、後述する実施例で示される通り、ＩＬ−３３発現抑制効果に優れる有効成分を抽出できる。焙煎温度は９０℃よりも低ければよく、好ましい上限は８９℃であり、さらに好ましい上限は８５℃、８０℃、７５℃、７０℃である。また、焙煎温度の好ましい下限は５０℃であり、さらに好ましい下限は５５℃、６０℃である。焙煎時間は、特に限定されないが、例えば５〜６０分、好ましくは２５〜３５分である。
【００１８】
［乾燥］
乾燥は、特に限定されないが、天日干しであれば、後述する実施例で示される通り、ＩＬ−３３発現抑制効果に優れる有効成分を抽出できる。
【００１９】
天日干し時の天候は、特に制限されず、太陽光が竹チップに到達すればよい。また、竹チップがそれを収容している容器の陰になっていてもよい。天日干しの時間は、特に限定されないが、例えば半日〜１０日、好ましくは１〜５日である。１日当たりの平均日照時間は約１２時間である。また、天日干しの代わりに、紫外線を竹チップに照射してもよい。
【００２０】
［抽出］
抽出溶媒は、特に限定されないが、例えば有機溶媒、好ましくは、エチルアルコール、多価アルコールなどのアルコールであり、さらに好ましくは、ブチレングリコール（ＢＧ）、ヘキシレングリコール（ＨＧ）である。抽出溶媒は水でもよい。
【００２１】
抽出温度（有効成分を抽出する時の抽出溶媒の温度）が５〜３９℃であれば、後述する実施例で示される通り、ＩＬ−３３発現抑制効果に優れる有効成分を抽出できる。抽出温度は４０℃よりも低ければよく、好ましい上限は３９℃であり、さらに好ましい上限は３８℃、３６℃、３４℃、３２℃、３０℃である。また、抽出温度の好ましい下限は５℃であり、さらに好ましい下限は１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃である。
【００２２】
抽出時間（有効成分を抽出する時間）は、特に限定されないが、たとえば１〜２５日、好ましくは５〜１５日である。
【００２３】
抽出圧力（有効成分を抽出する時に抽出溶媒にかかる圧力）は、特に限定されないが、好ましくは常圧（１０１３ｈＰａ）である。
【００２４】
［濾過］
抽出後、有効成分を含有する竹抽出液を濾過することにより竹チップを除去するのが好ましい。
【００２５】
［竹チップの大きさ］
上記において、準備された竹チップの大きさは区々であるため、抽出前に、竹チップを大きさで選別するのが好ましい。竹チップの選別は、抽出前であれば、焙煎後若しくは乾燥後でもよく、又は焙煎前でもよい。竹チップの大きさは、特に限定されないが、好ましい上限は、約１０ｍｍ、約８ｍｍ、約６ｍｍ、約４ｍｍである。特に、竹チップの大きさが４ｍｍ以下であれば、ＩＬ−３３発現抑制効果に優れる有効成分を抽出しやすくなると考えられる。一方、竹チップが大き過ぎると、有効成分を抽出しにくくなると考えられる。竹チップの大きさの下限は、特に限定されないが、竹チップが小さ過ぎると（例えば２ｍｍ未満であると）、竹チップ（又は竹紛）が抽出溶媒を吸収して膨張してしまうため、有効成分を抽出しにくくなると考えられる。
【００２６】
例えば、２ｍｍ未満の竹チップは、２ｍｍの目開きを有するふるいを通過した竹チップである。４ｍｍ未満の竹チップは、４ｍｍの目開きを有するふるいを通過した竹チップである。１０ｍｍ未満の竹チップは、１０ｍｍの目開きを有するふるいを通過した竹チップである。１０ｍｍ以上の竹チップは、１０ｍｍの目開きを有するふるいを通過しなかった竹チップである。ただし、竹チップがほぼ直立してふるいを通過することもあるため、２ｍｍ以上の竹チップが２ｍｍの目開きを有するふるいを通過したり、４ｍｍ以上の竹チップが４ｍｍの目開きを有するふるいを通過したり、１０ｍｍ以上の竹チップが１０ｍｍの目開きを有するふるいを通過したりする場合がある。また、２ｍｍ未満の竹チップが２ｍｍの目開きを有するふるいを通過しなかったり、４ｍｍ未満の竹チップが４ｍｍの目開きを有するふるいを通過しなかったり、１０ｍｍ未満の竹チップが１０ｍｍの目開きを有するふるいを通過しなかったりする場合がある。したがって、竹チップの大きさに関し、「未満」、「以上」、「以下」などに厳密な意味はなく、概ねそのような大きさという意味しかない。
【００２７】
また、２〜４ｍｍの竹チップは、４ｍｍの目開きを有するふるいを通過したが、２ｍｍの目開きを有するふるいを通過しなかった竹チップである。２〜１０ｍｍの竹チップは、１０ｍｍの目開きを有するふるいを通過したが、２ｍｍの目開きを有するふるいを通過しなかった竹チップである。４〜１０ｍｍの竹チップは、１０ｍｍの目開きを有するふるいを通過したが、４ｍｍの目開きを有するふるいを通過しなかった竹チップである。このように、１又は２種以上のふるいを使い分けることにより、所望の大きさの竹チップを選別できる。
【００２８】
［濃度調整］
最後に、得られた竹抽出液に対し、水等を添加し、竹抽出液の濃度を調整してもよい。
【００２９】
［用途］
上記製造方法により得られたＩＬ−３３発現抑制剤（ＩＬ−３３発現抑制効果を有する有効成分を含有する竹抽出液）は、好ましくは、アトピー性皮膚炎に用いられる。
【００３０】
アトピー性皮膚炎用の剤は、アトピー性皮膚炎に起因する皮膚掻痒症等の症状を緩和する外用剤、内用剤（内服剤）、注射剤などである。アトピー性皮膚炎の外用剤は、例えば、クリーム状、ローション状、粉末状に製造される。
【００３１】
上記製造方法により得られたＩＬ−３３発現抑制剤はまた、花粉症、喘息、アレルギー性鼻炎、炎症性腸疾患などの炎症性疾患を緩和する製剤にも用いられる。
【００３２】
以上、上述した実施の形態は本発明を実施するための例示に過ぎない。よって、本発明は上述した実施の形態に限定されることなく、その趣旨を逸脱しない範囲内で上述した実施の形態を適宜変形して実施することが可能である。
【実施例】
【００３３】
［実施例１］
次の表１に示される通り、竹抽出液である試験サンプル１〜７と、これらのＩＬ−３３発現量を相対的に比較するための基準サンプル１〜３とを作製した。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
［評価］
ヒト表皮角化細胞を用い、試験サンプル１〜７によるＩＬ−３３発現抑制効果を検証した。
【００３６】
＜使用細胞＞
成人由来正常ヒト表皮角化細胞（クラボウ、ＫＫ‐４１０９）
【００３７】
＜培地＞
５００ｍＬの培地（クラボウ、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２ に、増殖添加剤（１０μｇ／ｍのインスリン、０．６７μｇ／ｍのハイドロコーチゾン）及び抗菌剤（５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、５０ｎｇ／ｍＬのアンフオテリシン）を添加して調製した。
【００３８】
＜試験方法＞
細胞前培養
成人由来正常ヒト表皮細胞は、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２（培地）を用いてＴ−７５フラスコに起眠し、ＣＯ２インキュベータ（５％ＣＯ２、３７℃、湿潤）内で培養した。培地交換は１日おきに行い、８０％コンフルエントに到達した時点で細胞を回収し、試験に用いた。
【００３９】
ＩＬ−３３発現誘導試験
細胞を、２×１０４ｃｅｌｌｓ／０．ｌｍＬ／ウェルとなるよう培地で調製し、９６ウェルプレートに播種し、ＣＯ２インキュベータ内（５％ＣＯ２、３７℃）で培養した。その後、ＴＮＦα 及びＩＦＮγを培地に対して終濃度１０ｎｇ／ｍＬとなるよう添加し（基準サンプル２）、６時間後にＲＮＡを抽出し、ＩＬ−３３の発現を測定した。ＲＮＡの抽出及びリアルタイムＰＣＲについては公知の方法で行った。実験はｎ＝２ で行った。
【００４０】
本試験
細胞を、２×１０４ｃｅｌｌｓ／０．１ｍＬ／ウェルとなるよう培地で調製し、９６ウェルプレートに播種した。ＣＯ２インキュベータ内（５％ＣＯ２、３７℃）で培養した。その後、ＴＮＦα及びＩＦＮγを培地に対して終濃度１０ｎｇ／ｍＬとなるよう調整し、サンプル１〜８を終濃度０．０１％となるよう添加した培地で６時間培養し、ＲＮＡを抽出した。試験はｎ＝３で行った。細胞からのトータルＲＮＡの回収及びリアルタイムＰＣＲ による遺伝子発現解析を行った。
【００４１】
＜基準サンプル＞
基準サンプル１：培地に何も添加しなかった。
基準サンプル２：ＴＮＦα 及びＩＦＮγを終濃度１０ｎｇ／ｍＬとなるよう培地に添加した。
基準サンプル３：ＴＮＦα 及びＩＦＮγを終濃度１０ｎｇ／ｍＬとなるよう培地に添加し、かつ、濃度５０％のブチレングリコール水溶液を培地に添加した。
【００４２】
＜試験サンプル＞
表１に記載の製造条件で作成した試験サンプル１〜７を、終濃度０．１％となるように培地に添加した。抽出溶媒には、濃度５０％のブチレングリコール水溶液を用いた。ブチレングリコール水溶液は、５０ｇの水と５０ｇのブチレングリコールとを混合して作成した。そして、作成した１００ｇのブチレングリコール水溶液に２５ｇの竹チップを添加した。
【００４３】
相対定量の算出法
各遺伝子の増幅曲線と閥値線との交点より、Ｃｔ値（ＰＣＲサイクル数）を算出する。目的遺伝子のＣｔ値より内部標準ＧＡＰＤＨ遺伝子のＣｔ値を引いたＣｔ（目的遺伝子）−Ｃｔ（ＧＡＰＤＨ）＝ΔＣｔ値である。さらにΔＣｔ値よりブランクの平均ΔＣｔ値を引いたΔＣｔ（サンプル処理区）−ΔＣｔ（ブランク区）＝ΔΔＣｔ値とする。ΔΔＣｔ値を乗数項に代入した２−ΔΔＣｔ値が相対発現量となる。
【００４４】
＜試験結果＞
本試験の結果を図１に示した。基準サンプル２（ＴＮＦα十ＩＦＮγのみを培地に添加したもの）は、ＩＬ−３３の発現量を基準サンプル１（培地に何も添加していないもの）の約６倍に上昇させた。基準サンプル３（ブチレングリコール水溶液のみを添加したもの）は、ＴＮＦα十ＩＦＮγによるＩＬ−３３の発現上昇を約２分の１に抑制する効果が認められた。
【００４５】
特に、試験サンプル１、５及び７においてＩＬ−３３の発現が基準サンプル３を下回ったことから、試験サンプル１、５及び７にはＴＮＦα十ＩＦＮγ によるＩＬ−３３の発現上昇を抑制する効果があると考えられた。無添加区及びＴＮＦα十ＩＦＮγのみ添加区においてＩＬ−３３の発現が大幅に上昇したことから細胞応答は正常であり、本試験は問題なく行われたと考えられた。
【００４６】
ただし、試験サンプル２、３、４及び６においては十分なＩＬ−３３発現抑制効果が認められなかった。試験サンプル２のように竹チップを焙煎しなければ、ＩＬ−３３の発現を抑制する有効成分を十分に抽出できないと考えられる。また、試験サンプル３のように焙煎温度が高過ぎると（例えば９０℃以上であると）、竹のタンパク質が変性し始め、その結果、ＩＬ−３３の発現を抑制する有効成分を十分に抽出できないと考えられる。したがって、焙煎温度は９０℃よりも低い方が好ましいことがわかった。
【００４７】
焙煎温度は、赤外線放射温度計を用い、焙煎中の竹チップの温度を非接触で測定した。試験サンプル１、４〜７では、焙煎温度が６０℃よりも少し高くなるように、しかし７０℃を超えることはないように調整した。試験サンプル３では、焙煎温度が９０℃よりも少し高くなるように、しかし１００℃を超えることはないように調整した。
【００４８】
また、試験サンプル４のように竹チップを乾燥しなければ、ＩＬ−３３の発現を抑制する有効成分を十分に抽出できないと考えられる。また、試験サンプル６のように抽出温度が高過ぎると（例えば４０℃以上であると）、ＩＬ−３３発現抑制効果を妨げる成分も抽出してしまうと考えられる。したがって、抽出温度は４０℃よりも低い方が好ましいことがわかった。
【００４９】
［実施例２］
上記実施例１は、竹チップをブチレングリコール水溶液に浸漬することにより竹チップから有効成分を抽出するアルコール抽出法を用いたが、これに代えて、竹チップを水に浸漬することにより竹チップから有効成分を抽出する水抽出法を用いてもよい。
【００５０】
次の表２に示される通り、竹抽出液である試験サンプル８と、このＩＬ−３３発現量を相対的に比較するための基準サンプル４〜６とを作製した。
【００５１】
【表２】
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【００５２】
ヒト表皮角化細胞を用い、試験サンプル８によるＩＬ−３３発現抑制効果を検証した。基準サンプル４は、ＴＮＦα 及びＩＦＮγを培地に添加したものであり、上記実施例１の基準サンプル２に相当する。基準サンプル５は、ＴＮＦα 及びＩＦＮγ並びに水を培地に添加したものであり、水を培地に添加した点を除き、上記実施例１の基準サンプル３に相当する。基準サンプル６は、上記実施例１の基準サンプル３に相当する。試験サンプル８は、水抽出法で得られた竹抽出液である点及び水を培地に添加した点を除き、上記実施例１の試験サンプル１と同じである。
【００５３】
ただし、実施例２では、ＴＮＦα 及びＩＦＮγを終濃度１０ｎｇ／ｍＬとなるよう培地に添加した。また、試験サンプル８の抽出圧力は１００ＭＰａであった。また、試験サンプル８を終濃度０．１％となるように培地に添加した。
【００５４】
本試験の結果を図２に示した。基準サンプル５（水のみを添加したもの）は、ＴＮＦα十ＩＦＮγによるＩＬ−３３の発現上昇を約３分の１に抑制する効果が認められた。基準サンプル６（ブチレングリコール水溶液のみを添加したもの）は、ＴＮＦα十ＩＦＮγによるＩＬ−３３の発現上昇を約５分の３に抑制する効果が認められた。これらに対し、試験サンプル８においてＩＬ−３３の発現が基準サンプル５を大幅に下回ったことから、試験サンプル８にはＴＮＦα十ＩＦＮγ によるＩＬ−３３の発現上昇を大幅に抑制する効果があると考えられた。
【図１】
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【図２】
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