(57)【要約】【課題】ジペプチドリピート（ＤＰＲ）伸長に伴う疾患及び／又は障害のための処置、例えば、疾患の進行を遅らせる薬物を提供する。【解決手段】本発明は、ＤＰＲタンパク質及びその凝集型形態に伴う疾患及び状態の予防的処置又は治療的処置において特に有用である、ＤＰＲ及びＤＰＲ含有タンパク質（ＤＰＲタンパク質）と結合することができるヒト由来モノクローナル抗体、並びに、同等なＤＰＲタンパク質結合分子を提供する。より具体的には、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ；ＧＡ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ；ＧＰ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ；ＧＲ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ；ＰＲ）又はポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ；ＰＡ）リピートからなるＤＰＲ及びそのようなＤＰＲを含むタンパク質を認識する治療的に有用なヒト由来抗体及び同等なＤＰＲタンパク質結合分子が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般には、抗体に基づく治療法及び診断方法に関連する。詳細には、本発明は、ジペプチドリピート（ＤＰＲ）を形成する非通常的な非ＡＴＧ翻訳部（具体的にはヘキサヌクレオチドリピート）、及びそのようなＤＰＲを含む抗原に特異的に結合する新規な分子であって、凝集したＤＰＲ及びＤＰＲ含有タンパク質によってそれぞれ誘発される疾患及び状態の診断において有用であるそのような新規な分子に関連する。１つの実施形態において、本発明は、第９染色体のオープンリーディングフレーム７２（Ｃ９ＯＲＦ７２）において見出されるようなＤＰＲ（例えば、ポリ−グリシン−アラニンリピート、ポリ−グリシン−プロリンリピート、ポリ−グリシン−アルギニンリピート、ポリ−プロリン−アラニンリピート又はポリ−プロリン−アルギニンリピートなど）を認識し、かつ、凝集型Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲによって誘発される疾患及び状態の処置及び診断において有用であるヒト由来抗体、並びに、そのフラグメント、誘導体及び生物工学変異体を提供する。加えて、本発明は、ＤＰＲ又はその凝集物に伴う疾患を特定するための診断ツールとして、また、そのような疾患（例えば、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ＦＴＬＤ−ＡＬＳ及び脊髄小脳失調症３６型など）を処置するための受動的ワクチン接種戦略として、両方で有益であるそのような結合性分子、抗体及びそれらの模倣体を含む医薬組成物及び診断組成物に関連する。
【背景技術】
【０００２】
前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）は、脳の前頭葉及び側頭葉における萎縮に伴う臨床的、病理学的及び遺伝学的に不均一な障害の一群に属する。これは、認知症の早期発症の二番目に多い一般的な原因である。様々な認知症状が定まっておらず、これらには、前頭皮質及び側頭皮質の変性を伴う、また、前頭皮質及び側頭皮質の変性に起因する認知症、人格並びに行動の変化、言語機能障害及び／又は精神病が含まれる。その症状のために、ＦＴＬＤは下記の３つの群に分けることができる：（ｉ）行動型前頭側頭型認知症（ｂｖＦＴＬＤ）、（ｉｉ）意味性認知症（ＳＤ）又は（ｉｉｉ）進行性非流暢性失語（ＰＮＦＡ）。ＦＴＬＤの患者は、好適な治療法が何ら得られないので、症状発症後５年〜１０年で死亡する。しかしながら、ＦＴＬＤ患者の５０％は、陽性の家族歴を有することが示され、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）と比較すると、根本の病理発生が共通する連続的な疾患状態を表すようである。両方の常染色体優性障害は遺伝学的及び病理学的に不均一であることが示されたにもかかわらず（例えば、非特許文献１を参照のこと）、遺伝子分析では、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の非コードエクソン１ａと非コードエクソン１ｂとの間に位置するヘテロ接合性の伸長したヘキサヌクレオチドリピート（ＧＧＧＧＣＣ）が、ＦＴＬＤ及びＡＬＳの最も一般的な遺伝子的原因として特定された；例えば、非特許文献２、及び、非特許文献３を参照のこと。具体的には、３つの代替的な読み枠でのセンス転写物の非通常的な非ＡＴＧ翻訳、すなわち、伸長したヘキサヌクレオチドリピートの３つの代替的な読み枠でのセンス転写物の非通常的な非ＡＴＧ翻訳により、２アミノ酸の繰り返し単位（ジペプチドリピート、ＤＰＲ）からそれぞれが構成される３つの異なるポリペプチド、すなわち、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ；ＧＡ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ；ＧＰ）及びポリ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ；ＧＲ）の産生、生成及び凝集が生じていたことが示された。そのうえ、対応するアンチセンス転写物の翻訳により、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ；ＰＲ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ；ＰＡ）及びポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ；ＧＰ）の生成が生じている。これらのＣ９ＯＲＦ７２−ジペプチドリピート（ＤＰＲ）伸長が、ＦＴＬＤ患者の３０％に至るまで、ＡＬＳ患者の５０％に至るまで、そして、ＦＴＬＤ−ＡＬＳ患者の８０％に至るまでを占め、最大変異頻度が米国及び欧州の白人集団において認められることが示された。加えて、リピートが１９回を超えるＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲ伸長を有する患者は、ＦＴＬＤ及び／又はＡＬＳの他の形態を有する患者と比較して、発症年齢がより低く、神経学的障害の発生率が増大し、かつ、精神病又は幻覚に至る傾向を有した；例えば、非特許文献４を参照のこと。
【０００３】
しかしながら、ヘキサヌクレオチドリピート伸長に伴うと思われる他の疾患及び／又は障害もまた報告されている（例えば、脊髄小脳失調症３６型）。実際、そのようなタンデムリピートは（マイクロサテライトト又はミニサテライトのどちらとしてであっても）、真核生物及び原核生物の両方における変異しやすいＤＮＡである。例えば、細菌の細胞表面のアドヘシンは多くの場合、１８ヌクレオチドの反復が並ぶセリン−アスパラギン酸のアミノ酸対をコードするミニサテライトＳＤリピートを含有しており、この場合、１８ヌクレオチドの反復の各要素は、とりわけブドウ球菌株ではコンセンサスなＧＡＹＴＣＮＧＡＹＴＣＮＧＡＹＡＧＹ（式中、Ｎは任意の塩基であり、ＹはＴ又はＣである）に従っている。セリン−アスパラギン酸リピート（ＳＤＲ）が、これらのアドヘジンの変化しやすい反復領域（例えば、クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）のＲドメインなど）に存在することが見出されている；例えば、非特許文献５を参照のこと。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｖａｎｃｅ他、Ｂｒａｉｎ  １２９（２００６）、８６８〜８７６
【非特許文献２】ＤｅＪｅｓｕｓ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ他、Ｎｅｕｒｏｎ  ７２（２０１１）、２４５〜２５６
【非特許文献３】Ｒｅｎｔｏｎ他、Ｎｅｕｒｏｎ  ７２（２０１１）、２５７〜２６８
【非特許文献４】Ｈａｒｍｓ他、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ  ３４（２０１３）、ｅ１３〜ｅ１９
【非特許文献５】Ｈａｚｅｎｂｏｓ他、ＰＬＯＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ９（２０１３）、ｅ１００３６５３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ジペプチドリピート（ＤＰＲ）伸長に伴う疾患及び／又は障害のための処置、例えば、疾患の進行を遅らせる薬物は現在、見当たらない。医学的ケアの主要な目標は今までのところ、多くの場合に非常にストレスの多い随伴症状を処置するための医薬品を提供することにある。しかしながら、今までのところ、効果的な処置のための証拠は何もない。
【０００６】
この技術的課題が、請求項において特徴づけられ、また、以下でさらに記載され、また、実施例及び図面において例示される実施形態によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＤＰＲタンパク質及びその凝集型形態に伴う疾患及び状態の予防的処置又は治療的処置において特に有用である、ジペプチドリピート（ＤＰＲ）及びＤＰＲ含有タンパク質（ＤＰＲタンパク質）と結合することができるヒト由来モノクローナル抗体、並びに、同等なＤＰＲタンパク質結合分子（例えば、本明細書中に例示される抗体のＤＰＲ結合フラグメント、合成変異体及び生物工学誘導体など）を提供する。より具体的には、ポリ−グリシン−アラニン（Ｇｌｙ−Ａｌａ；ＧＡ）リピート、ポリ−グリシン−プロリン（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ；ＧＰ）リピート、ポリ−グリシン−アルギニン（Ｇｌｙ−Ａｒｇ；ＧＲ）リピート、ポリ−プロリン−アルギニン（Ｐｒｏ−Ａｒｇ；ＰＲ）リピート又はポリ−プロリン−アラニン（Ｐｒｏ−Ａｌａ；ＰＡ）リピートからなるＤＰＲ及びそのようなＤＰＲを含むタンパク質を認識する治療的に有用なヒト由来抗体及び同等なＤＰＲタンパク質結合分子が提供される。
【０００８】
本発明に従って行われた様々な実験では、ヒト身体において成熟した抗体で、非凝集型及び凝集型のＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲタンパク質種並びにそれらのフラグメントを特異的に認識することができるヒト由来のモノクローナル抗ＤＰＲ特異的抗体を単離することに成功した。このようなヒト由来のモノクローナル抗ＤＰＲタンパク質抗体と、その可変ドメインをコードするｃＤＮＡとがそれぞれ単離されたＢ細胞の供給源であるヒト対象は、神経学的状態及び神経変性状態の症状を有していなかった。しかしながら、本発明の別の実施形態において、そのようなヒト由来のモノクローナル抗ＤＰＲ抗体と、その可変ドメインをコードするｃＤＮＡとがそれぞれ単離されることがあるかもしれないＢ細胞の供給源は、ＤＰＲタンパク質に伴う疾患及び／又は障害の症状を示す患者である。本発明の抗体はヒト身体から単離されており、また、実施例において明らかにされるように、ＦＴＬＤ患者におけるＤＰＲタンパク質に特異的に結合することが示されたので、本発明のヒトモノクローナル抗ＤＰＲタンパク質抗体、及びその誘導体はまた、非免疫原性であることのほかに、治療的に有益な影響をヒトにおいて示すことを予想することは無理のないことである。
【０００９】
前頭側頭型認知症（ＦＴＬＤ）（これはまた、ピック病として知られている）は、脳の前頭葉及び／又は側頭葉における進行性の神経細胞変性に伴う一群の障害である。細胞損傷及び組織収縮に起因する脳の低下した機能に伴う諸症状が前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）と名付けられた。背景の節（その開示内容は本明細書中に組み込まれる）で既に説明されたように、Ｃ９ＯＲＦ７２（ＮＣ＿０００００９．１２、２７５４６５４５−２７５７３８６６、相補体；ＮＧ＿０３１９７７．１、５００１−３２３２２  ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ）の非コードエクソン１ａと非コードエクソン１ｂとの間に位置するヘテロ接合性の伸長したヘキサヌクレオチドリピート（ＧＧＧＧＣＣ）、すなわち、ジペプチドリピート（ＤＰＲ）が、ＦＴＬＤ及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の最も一般的な原因として特定された。この伸長したヘキサヌクレオチドリピートにより、２アミノ酸の繰り返し単位（ジペプチドリピート、ＤＰＲ）からなる種々のポリペプチド、具体的には、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ；ＧＡ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ；ＧＰ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ；ＰＲ）又はポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ；ＰＡ）並びに／或いはポリ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ；ＧＲ）の産生、生成及び／又は凝集が生じる。
【００１０】
本発明は一般には、ＤＰＲタンパク質を特異的に認識することができる、具体的には、ＤＰＲが、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ；ＧＡ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ；ＧＰ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ；ＰＲ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ；ＰＡ）及び／又はポリ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ；ＧＲ）からなるＤＰＲタンパク質を特異的に認識することができるヒト由来抗体、その抗原結合フラグメント、合成変異体及び生物工学変異体、並びに、同等な抗原結合分子に関する。したがって、本発明は、１つの特定のジペプチドリピート（例えば、ポリＧＡ）を選択的に認識する抗体、並びに、２つ以上のジペプチドリピート（例えば、ポリＧＡ及びポリＧＰ、又は、ポリＧＲ、ポリＧＡ及びポリＰＲ）を実質的に同じ親和性又は異なる親和性でのどちらでも、しかし、依然としてバックグラウンドを有意に上回って認識することができる抗体の両方に関する。別途示されないならば、「ＤＰＲを特異的に認識すること」によって、「ＤＰＲに対して／ついて特異的な抗体」及び「抗ＤＰＲ抗体」は、本明細書中では交換可能に使用される「ＤＰＲタンパク質」、「ジペプチドリピート」、「ＤＰＲ」の生来型形態又は凝集型形態に特異的に結合する抗体、あまねく結合する抗体、及び、集団で結合する抗体が意味される。ＤＰＲは、伸長したヘキサヌクレオチドリピートの結果であり、２アミノ酸の繰り返し単位を含む。繰り返し単位は、どのようなアミノ酸であっても含むことができる。しかしながら、本発明の好ましい実施形態において、ＤＰＲは、グリシン及びアラニン（Ｇｌｙ−Ａｌａ；ＧＡ）、グリシン及びプロリン（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ；ＧＰ）、グリシン及びアルギニン（Ｇｌｙ−Ａｒｇ；ＧＲ）、プロリン及びアルギニン（Ｐｒｏ−Ａｒｇ；ＰＲ）、又は、プロリン及びアラニン（Ｐｒｏ−Ａｌａ；ＰＡ）を含む。したがって、本明細書中には、ＧＡ、ＧＰ、ＧＲ、ＰＲ又はＰＡからなるＤＰＲタンパク質について選択的であるヒト由来抗体、そのタンパク質結合フラグメント、合成変異体及び生物工学変異体が提供される。好ましい実施形態において、本発明のＤＰＲ結合分子は、より多数のリピートを含有するＤＰＲタンパク質、すなわち、（ＧＡ）Ｘ、（ＧＰ）Ｘ、（ＧＲ）Ｘ、（ＰＲ）Ｘ又は（ＰＡ）ＸからなるＤＰＲに結合する。具体的には、Ｘはリピートの数を示し、例えば、１５回のリピートを有するＤＰＲタンパク質が（ＧＡ）１５として示されることになり、これはまた、例えば、ヘキサヌクレオチド伸長Ｇ４Ｃ２が１５回繰り返されることを意味する。本発明の１つの実施形態において、抗体は好ましくは、（ＧＡ）１５のＤＰＲタンパク質を認識する。
【００１１】
典型的には、抗体のＤＰＲタンパク質結合能が、キャリアタンパク質（例えば、ＢＳＡ又はＧＳＴなど）に結合させたＤＰＲペプチドを使用して評価される；例えば、Ｍｏｒｉ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９（２０１３）、１３３５〜１３３８、及び、Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ他、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１２６（２０１３）、８５９〜８７９を参照のこと。これらは、マウスモノクローナル抗ＧＡ抗体の作製及び特徴づけにおける組換えＧＳＴ−ＧＡ１５タンパク質の使用をとりわけ記載する。しかしながら、本発明に従って行われた実験では驚くべきことに、ＢＳＡとカップリングされたＤＰＲペプチドに対する有意な結合を有しなかった、又は、もっぱらかなり低い親和性を示したいくつかの抗ＤＰＲ抗体が、ＢＳＡとカップリングされたＤＰＲペプチドよりも実質的に大きい親和性により、非カップリング型のＤＰＲペプチドと結合することが明らかにされた；例えば、抗ポリＧＡ抗体ＮＩ−３０８．４５Ｃ２、抗ポリＰＲ抗体ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１について図３ＡにまとめられるＥＣ５０値と、特に、ＢＳＡとカップリングされた（ＧＲ）１５ペプチドにはまったく結合しなかった、したがって、マウスモノクローナル抗ＤＰＲ抗体を作製するために先行技術で使用されるＥＬＩＳＡ方法では見逃されていたであろうとおそらくは思われる抗ポリＧＲ抗体のＮＩ−３０８．６Ｂ１１及びＮＩ−３０８．４６Ｆ８のＥＣ５０値とを比較のこと。
【００１２】
例えば、国際特許出願公開ＷＯ２０１４／１１４３０３（Ａ１）及び同ＷＯ２０１４／１１４６６０（Ａ１）には、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）に融合されるポリ（ＧＡ）（ＧＡ）１５及びポリ（ＧＰ）（ＧＰ）１５に対してウサギにおいて惹起されるポリクローナル抗体、そして、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に連結される凝集型ポリＧＡ（ＧＡ）１０に対して惹起され、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合されるポリＧＡ（ＧＡ）１５を認識するマウスモノクローナル抗体がそれぞれ記載される。しかしながら、無関係なアミロイド原性タンパク質に対する結合特異性と、ヒトＣ９ｏｒｆ７２−ＦＴＬＤ脳組織における病理学的なＤＰＲ凝集物に対する結合とに関するデータは何ら開示されていない。したがって、そのような抗体の診断有用性及び治療有用性は実証されておらず、今後の課題である。
【００１３】
国際特許出願公開ＷＯ２０１４／１１６８６５（Ａ１）には、それぞれがアミノヘキサン酸（Ａｈｘ）にカップリングされ、かつ、免疫キャリアとしてのｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）にコンジュゲート化されるポリＧＡ（ＧＡ）８、ポリＧＰ（ＧＰ）８及びポリＧＲ（ＧＲ）８の混合物に対してウサギにおいて惹起されるポリクローナル抗体の作製が記載される。ＭＣ−００１と称される１つのポリクローナルなウサギ抗体がポリＧＰ（ＧＰ）８に結合し、それ以外のＤＰＲには結合しないことが記載される。このポリクローナルなＭＣ−００１抗体により、免疫反応性がＣ９＋ＡＬＳ患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）において検出されること、そして、ポリＧＰポリペプチドの不溶性封入体が、Ｃ９ＯＲＦ７２の遺伝子伸長を有する患者の脳において検出されることが記載される。さらには、ポリクローナルな抗ポリＧＡ抗体、抗ポリＧＰ抗体、抗ポリＧＲ抗体及び抗ポリＰＡ抗体を、リピート数及び免疫キャリアが異なる個々のＤＰＲペプチドを使用してウサギ及びヤギにおいてそれぞれ作製するための試みが、ポリクローナルなＭＣ−００１抗体の作製のために使用される取り組みを用いてマウスモノクローナル抗ポリＧＰ抗体を製造する１つの実験と同様に記載される。しかしながら、ポリＧＰ（ＧＰ）８のみと結合する３つのモノクローナル抗体クローン（Ｇ２、Ｇ３及びＧ４）が得られたことが記載されるにもかかわらず、無関係なアミロイド原性タンパク質に対する結合特異性と、ヒトＣ９ｏｒｆ７２−ＦＴＬＤ脳組織における病理学的なＤＰＲ凝集物に対する結合とに関するデータは何ら開示されていない。そのうえ、モノクローナル抗体を製造するプロトコルの曖昧な記載のほかには、抗体の可変領域に関する配列情報もその寄託も何ら提供されていない。したがって、この場合もまた、ＷＯ２０１４／１１６８６５（Ａ１）において教示される免疫化プロトコルによって得ることができるかもしれないモノクローナル抗体の診断有用性及び治療有用性は今後、検討されなければならない。
【００１４】
国際特許出願公開ＷＯ２０１４／１５９２４７（Ａ１）には、リピート数が異なり、かつ、Ｎ末端修飾及び／又はＣ末端修飾（例えば、アセチル及びアミド化）を有する合成ＤＰＲペプチドに対して惹起されたポリクローナルなウサギ抗体及びマウス抗体が記載される。しかしながら、モノクローナルな抗ＤＰＲ抗体の作製は記載されていない。さらには、ＷＯ２０１４／１５９２４７（Ａ１）にはとりわけ、Ｃ９ＯＲＦ７２  ＡＬＳの遺伝子組換えマウスモデルが、センス転写物及びアンチセンス転写物の両方がＡＬＳ／ＦＴＤに寄与するという仮説を検証するために記載される。本発明に従って、このマウスモデルは、本発明の抗体の治療有用性を検証するために使用されるかもしれない。
【００１５】
まとめると、先行技術は、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子の異なる読み枠に由来するＤＰＲのうちの１つ又はそれ以上と選択的に結合する抗ＤＰＲ抗体で、ヒトのＣ９ｏｒｆ７２−ＦＴＬＤ脳組織における病理学的なＤＰＲ凝集物と結合することができ、かつ、ＤＰＲタンパク質、例えば、ＡＬＳ／ＦＴＤなどにおけるＤＰＲタンパク質の蓄積及び凝集に伴う障害の診断及び治療の両方において有用性を有する抗ＤＰＲ抗体を提供するどころか、そのような抗ＤＰＲ抗体を教示も、示唆もしていない。対照的に、本発明は、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子からそのセンス方向及び／又はアンチセンス方向で翻訳されるような１つ又はそれ以上のＤＰＲを特異的に認識する、ヒトメモリーＢ細胞から得られる一連のモノクローナルヒト由来の抗ＤＰＲ抗体を初めて提供する。実施例において明らかにされるように、本発明のモノクローナルヒト由来の抗ＤＰＲ抗体は大きい親和性を有しており、無関係なアミロイド原性タンパク質を実質的に認識せず、かつ、ヒトのＣ９ｏｒｆ７２−ＦＴＬＤ脳組織における病理学的なＤＰＲ凝集物に結合することができる。
【００１６】
したがって、本発明の抗ＤＰＲ抗体はヒトの自己抗体に由来しており、それ故に、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であることが推測されるという事実を考慮すると、実施例において例示されるその診断的価値のほかに、本発明の抗ＤＰＲ抗体は治療有用性もまた有することを予想することは、無理のないことである。これに関連して、先行技術は、ＤＰＲタンパク質に対するヒト自己抗体の存在可能性に関して何ら言及しておらず、しかし、合成された修飾ＤＰＲペプチドのみによる研究室動物の免疫化を適用することを教示することには留意しなければならず、また、一般的な免疫化方法では失敗し、ＰＥＧとコンジュゲート化されたポリＧＡ（ＧＡ）１０ペプチドを用いた免疫化のみが、安定な抗体クローンをもたらしたので、マウスモノクローナル抗ＤＰＲ抗体の作製はかなり困難であることには留意しなければならない；例えば、国際特許出願公開ＷＯ２０１４／１１４６６０（Ａ１）、実施例１０、８０頁５行〜１５行を参照のこと。したがって、このことは、本発明の知見、すなわち、ヒト由来の抗ＤＰＲ抗体が提供されることを一層驚くべきものにしている。これは、当然のこととして、本発明の抗体の供給源を提供するメモリーＢ細胞が、免疫化されていないヒト患者／志願者から得られたからである。
【００１７】
したがって、本発明は一般には、下記の実施形態に関連する：
［１］第９染色体のオープンリーディングフレーム７２（Ｃ９ｏｒｆ７２）遺伝子からそのセンス方向及び／又はアンチセンス方向で翻訳されるような少なくとも１つのＤＰＲを認識する、ジペプチド（ＸＸ’）リピート（ＤＰＲ）と結合することができるヒト由来モノクローナル抗体或いはそのＤＰＲ結合フラグメント、合成変異体又は生物工学誘導体。この場合、好ましくは、前記抗体の可変軽鎖及び可変重鎖の一方又は好ましくは両方の少なくとも１つのＣＤＲ、好ましくは２つのＣＤＲ、最も好ましくは３つすべてのＣＤＲが、ヒトメモリーＢ細胞によって発現されるようなヒト抗体（ヒト自己抗体）に由来する。好ましくは、前記抗体は、少なくとも２つの異なるＤＰＲを認識し、好ましくは、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子からそのセンス方向で翻訳されるような少なくとも１つのＤＰＲと、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子からそのアンチセンス方向で翻訳されるような少なくとも１つのＤＰＲとを認識する；例えば、実施例及び図２Ａにおける表において例示されるような主題抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１を参照のこと。明確化のために、別途示される場合を除き、下記の項における抗体のみに対する言及は、簡潔さのためになされており、当然のことながら、前記抗体の言及されたＤＰＲ結合フラグメント、合成変異体及び生物工学誘導体を包含することを理解しなければならない。
［２］前記ＤＰＲがタンパク質に含有され、又はタンパク質にコンジュゲート化され（ＤＰＲ−タンパク質）、好ましくは、前記タンパク質がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であり、前記ＤＰＲにコンジュゲート化される、［１］に記載の抗体。
［３］前記ＤＰＲが、ポリ−グリシン−アラニン（Ｇｌｙ−Ａｌａ；ＧＡ）リピート、ポリ−グリシン−プロリン（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ；ＧＰ）リピート、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ；ＧＲ）リピート、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ；ＰＲ）リピート及び／又はポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ；ＰＡ）リピートからなり、好ましくは、リピート数が（ＸＸ’）１５である、［１］又は［２］に記載の抗体。
［４］ＤＰＲタンパク質の組合せを認識し、好ましくは、前記ＤＰＲタンパク質が、ポリ（ＧＡ）又はポリ（ＰＡ）、ポリ（ＧＰ）又はポリ（ＰＡ）、或いは、ポリ（ＧＲ）又はポリ（ＰＲ）からなる、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の抗体。この場合、好ましくは、前記抗体はポリ（ＧＡ）及びポリ（ＧＰ）を認識する；ポリ（ＧＡ）及びポリ（ＧＲ）を認識する；ポリ（ＰＡ）及びポリ（ＧＡ）を認識する；ポリ（ＧＡ）、ポリ（ＧＲ）及び場合によりポリ（ＰＲ）を認識する；ポリ（ＰＡ）、ポリ（ＰＲ）及び場合によりポリ（ＧＲ）を認識する；或いは、ポリ（ＰＡ）、ポリ（ＧＲ）、ポリ（ＰＲ）及び場合によりポリ（ＧＡ）を認識する。
［５］（ＸＸ’）１５からなるＤＰＲペプチドと結合することができ、場合により、ＢＳＡ又は別のキャリアタンパク質（例えば、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）など）にカップリングされるペプチドには結合しない、又は少なくともより小さい大きさで結合する、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の抗体。
［６］前記ＤＰＲ及びＤＰＲタンパク質の凝集型形態とそれぞれ結合することができる、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の抗体。
［７］前記ＤＰＲ−タンパク質がＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲである、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の抗体。
［８］ＧＡリピートを含むＤＰＲを認識し、下記のものをその可変領域において含む、［１］〜［７］のいずれか一項に記載される抗体：
（ａ）抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１及び抗体ＮＩ−３０８．４５Ｃ２のいずれか１つのＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、ただし、前記ＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列は図１Ａ〜図１Ｄのいずれか１つに示され、かつ、下記の（ｉ）ＶＨ配列及び（ｉｉ）ＶＬ配列においてそれぞれ示される：
（ｉ）ＶＨ配列（配列番号２、配列番号８、配列番号２２、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３４）、及び
（ｉｉ）ＶＬ配列（配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３２、配列番号３６）；
（ｂ）図１Ａ〜図１Ｄのいずれか１つに示されるようなＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）の前記アミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；
（ｄ）（ｂ）の前記アミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域、並びに／或いは
（ｅ）前記ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域或いは前記少なくとも１つのＣＤＲに対して異種であるポリペプチド配列を場合によりさらに含む前記抗体又はその抗原結合フラグメントであって、好ましくは、ポリペプチド配列がヒト定常ドメインを含み、好ましくはＩｇＧタイプのヒト定常ドメインを含み、最も好ましくはＩｇＧ１クラス又はＩｇＧ１アイソタイプのヒト定常ドメインを含む、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
［９］ＧＰリピートを含むＤＰＲを認識し、下記のものをその可変領域において含む、［１］〜［７］のいずれか一項に記載される抗体：
（ａ）抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２、抗体ＮＩ−３０８．４６Ｅ９及び抗体ＮＩ−３０８．１２Ａ３のいずれか１つのＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、ただし、前記ＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列は、図１Ｆ、図１Ｇ及び図１Ｋに示され、かつ、下記の（ｉ）ＶＨ配列及び（ｉｉ）ＶＬ配列においてそれぞれ示される：
（ｉ）ＶＨ配列（配列番号１４、配列番号１８、配列番号４４、配列番号４８、配列番号７２、配列番号７６）、及び
（ｉｉ）ＶＬ配列（配列番号１６、配列番号２０、配列番号４６、配列番号５０、配列番号７４、配列番号７８）；
（ｂ）図１Ｆ、図１Ｇ又は図１Ｋに示されるようなＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）の前記アミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；
（ｄ）（ｂ）の前記アミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域、並びに／或いは
（ｅ）前記ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域或いは前記少なくとも１つのＣＤＲに対して異種であるポリペプチド配列を場合によりさらに含む前記抗体又はその抗原結合フラグメントであって、好ましくは、ポリペプチド配列がヒト定常ドメインを含み、好ましくはＩｇＧタイプのヒト定常ドメインを含み、最も好ましくはＩｇＧ１クラス又はＩｇＧ１アイソタイプのヒト定常ドメインを含む、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
［１０］ＧＲリピートを含むＤＰＲを認識し、下記のものをその可変領域において含む、［１］〜［７］のいずれか一項に記載される抗体：
（ａ）抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１又は抗体ＮＩ−３０８．４６Ｆ８のＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、ただし、前記ＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列は図１Ｈ及び図１Ｉに示され、かつ、下記の（ｉ）ＶＨ配列及び（ｉｉ）ＶＬ配列においてそれぞれ示される：
（ｉ）ＶＨ配列（配列番号５２、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６２）、及び
（ｉｉ）ＶＬ配列（配列番号５４、配列番号６０）；
（ｂ）図１Ｈ又は図１Ｉに示されるようなＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）の前記アミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；
（ｄ）（ｂ）の前記アミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域、並びに／或いは
（ｅ）前記ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域或いは前記少なくとも１つのＣＤＲに対して異種であるポリペプチド配列を場合によりさらに含む前記抗体又はその抗原結合フラグメントであって、好ましくは、ポリペプチド配列がヒト定常ドメインを含み、好ましくはＩｇＧタイプのヒト定常ドメインを含み、最も好ましくはＩｇＧ１クラス又はＩｇＧ１アイソタイプのヒト定常ドメインを含む、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
［１１］ＰＲリピートを含むＤＰＲを認識し、下記のものをその可変領域において含む、［１］〜［７］のいずれか一項に記載される抗体：
（ａ）抗体ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１のＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、ただし、前記ＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列は図１Ｅに示され、かつ、下記の（ｉ）ＶＨ配列及び（ｉｉ）ＶＬ配列においてそれぞれ示される：
（ｉ）ＶＨ配列（配列番号３８）、及び
（ｉｉ）ＶＬ配列（配列番号４０、配列番号４２）；
（ｂ）図１Ｅに示されるようなＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）の前記アミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；
（ｄ）（ｂ）の前記アミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域、並びに／或いは
（ｅ）前記ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域或いは前記少なくとも１つのＣＤＲに対して異種であるポリペプチド配列を場合によりさらに含む前記抗体又はその抗原結合フラグメントであって、好ましくは、ポリペプチド配列がヒト定常ドメインを含み、好ましくはＩｇＧタイプのヒト定常ドメインを含み、最も好ましくはＩｇＧ１クラス又はＩｇＧ１アイソタイプのヒト定常ドメインを含む、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
［１２］ＰＡリピートを含むＤＰＲを認識し、下記のものをその可変領域において含む、［１］〜［７］のいずれか一項に記載される抗体：
（ａ）抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１のＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、ただし、前記ＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列は図１Ｊに示され、かつ、下記の（ｉ）ＶＨ配列及び（ｉｉ）ＶＬ配列においてそれぞれ示される：
（ｉ）ＶＨ配列（配列番号６４、配列番号６８）、及び
（ｉｉ）ＶＬ配列（配列番号６６、配列番号７０）；
（ｂ）図１Ｊに示されるようなＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）の前記アミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；
（ｄ）（ｂ）の前記アミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域、並びに／或いは
（ｅ）前記ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域或いは前記少なくとも１つのＣＤＲに対して異種であるポリペプチド配列を場合によりさらに含む前記抗体又はその抗原結合フラグメントであって、好ましくは、ポリペプチド配列がヒト定常ドメインを含み、好ましくはＩｇＧタイプのヒト定常ドメインを含み、最も好ましくはＩｇＧ１クラス又はＩｇＧ１アイソタイプのヒト定常ドメインを含む、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
［１３］ＰＲリピートを含むＤＰＲを認識し、下記のものをその可変領域において含む、［１］〜［７］のいずれか一項に記載される抗体：
（ａ）抗体ＮＩ−３０８．１６Ｃ１０のＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、ただし、前記ＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列は図１Ｌに示され、かつ、下記の（ｉ）ＶＨ配列及び（ｉｉ）ＶＬ配列においてそれぞれ示される：
（ｉ）ＶＨ配列（配列番号８０、配列番号８４）、及び
（ｉｉ）ＶＬ配列（配列番号８２、配列番号８６）；
（ｂ）図１Ｌに示されるようなＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）の前記アミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；
（ｄ）（ｂ）の前記アミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域、並びに／或いは
（ｅ）前記ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域或いは前記少なくとも１つのＣＤＲに対して異種であるポリペプチド配列を場合によりさらに含む前記抗体又はその抗原結合フラグメントであって、好ましくは、ポリペプチド配列がヒト定常ドメインを含み、好ましくはＩｇＧタイプのヒト定常ドメインを含み、最も好ましくはＩｇＧ１クラス又はＩｇＧ１アイソタイプのヒト定常ドメインを含む、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
［１４］ポリＧＡリピートともまた結合することができ、好ましくは、抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２である、又は抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２に由来する、［９］に記載の抗体。
［１５］ポリＧＡリピートともまた結合することができ、好ましくは、抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１である、又は抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１に由来する、［１０］に記載の抗体。
［１６］ポリＰＲリピートともまた結合することができ、好ましくは、抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１である、又は抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１に由来する、［１０］又は［１４］に記載の抗体。
［１７］ポリＧＡリピートともまた結合することができ、好ましくは、抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１である、又は抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１に由来する、［１２］に記載の抗体。
［１８］ポリＧＡリピートともまた結合することができ、好ましくは、抗体ＮＩ−３０８．１６Ｃ１０である、又は抗体ＮＩ−３０８．１６Ｃ１０に由来する、［１３］に記載の抗体。
［１９］非カップリング型のＤＰＲペプチドと選択的又は優先的に結合する、［１］〜［１８］のいずれか一項に記載の抗体。
［２０］リピート数ｎが６以上（好ましくは１０以上、より好ましくは１５以上）である場合においてのみ前記ＤＰＲに結合する、［１］〜［１９］のいずれか一項に記載の抗体。
［２１］非カップリング型のＤＰＲ及びＢＳＡカップリング型のＤＰＲと、実質的に等しい親和性で、又は、ほぼ同じ程度の大きさで結合することができ、好ましくは、前記非カップリング型ＤＰＲ及び前記ＢＳＡカップリング型ＤＰＲと結合することについてのＥＣ５０（最大半量有効濃度）が、間接的ＥＬＩＳＡによって求められる場合（リピート数ｎは１５である）、最大でも２０倍以下（好ましくは最大でも１５倍以下、より好ましくは最大でも１０倍以下、一層より好ましくは最大でも５倍以下、最も好ましくは最大でも約２倍以下又は３倍）異なる、［１］〜［２０］のいずれか一項に記載の抗体。
［２２］２つ以上の異なるＤＰＲと、実質的に等しい親和性で、又は、ほぼ同じ程度の大きさで結合することができ、好ましくは、前記ＤＰＲのいずれか１つと結合することについてのＥＣ５０が、間接的ＥＬＩＳＡによって求められる場合、ＤＰＲｎ又はＤＰＲｎタンパク質（リピート数ｎは１５である）と結合することについては少なくとも２００ｎＭ以下であり、好ましくは１５０ｎＭ以下であり、より好ましくは１００ｎＭ以下であり、一層より好ましくは５０ｎＭ以下であり、最も好ましくは２５ｎＭ以下である、［１］〜
［２２］のいずれか一項に記載の抗体。例えば、抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２は（ＧＡ）１５とは約１５．３のＥＣ５０で、（ＧＰ）１５とは約０．８８のＥＣ５０で結合し、抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１は（ＧＡ）１５とは約３８．４のＥＣ５０で、（ＧＲ）１５とは約０．９４のＥＣ５０で、（ＰＲ）１５とは約１１９のＥＣ５０で結合する；実施例３及び図２を参照のこと。
［２３］間接的ＥＬＩＳＡによって求められる場合、２５ｎＭ以下の、好ましくは２ｎＭ以下の、より好ましくは１ｎＭ以下の、最も好ましくは０．５ｎＭ以下のＥＣ５０（最大半量有効濃度）値に対応する、少なくとも１つのＤＰＲｎ又はＤＰＲｎタンパク質（リピート数ｎは１５である）に対する結合親和性を有する、［１］〜［２２］のいずれか一項に記載の抗体。
［２４］キメラなマウス−ヒト抗体又はマウス化抗体である、［１］〜［２３］のいずれか一項に記載の抗体。
［２５］［１］〜［２４］のいずれか一項で定義されるようなＤＰＲ又はＤＰＲ−タンパク質に対する特異的な結合について、［１］〜［２４］のいずれか一項に記載される抗体と競合する抗体又は抗原結合分子。
［２６］単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメント及びＦ（ａｂ’）２フラグメントからなる群から選択される、［１］〜［２５］のいずれか一項に記載の抗体。
［２７］［１］〜［２６］のいずれか一項に記載される抗体の免疫グロブリン鎖の結合ドメイン又は可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチドであって、好ましくはｃＤＮＡであるポリヌクレオチド。
［２８］［７］に記載される前記ポリヌクレオチドを、必要な場合には前記結合性分子の他方の免疫グロブリン鎖の可変領域をコードする［２７］に記載されるポリヌクレオチドとの組合せで含むベクター。
［２９］［２７］に記載されるポリヌクレオチド又は［２８］に記載されるベクターを含む宿主細胞。
［３０］抗ＤＰＲ抗体を製造するための、［２７］に記載されるｃＤＮＡ、［２８］に記載されるベクター又は［２９］に記載される宿主細胞の使用。
［３１］抗ＤＰＲ抗体或いはその生物工学誘導体又は免疫グロブリン鎖を調製するための方法であって、
（ａ）［３０］に記載される細胞を培養すること、及び
（ｂ）前記抗体又はその免疫グロブリン鎖を前記培養物から単離することを含む方法。
［３２］［２７］に記載されるポリヌクレオチドによってコードされる、又は、［３１］に記載される方法によって得ることができる抗体又はその免疫グロブリン鎖。
［３３］検出可能に標識される、［１］〜［２６］又は［３２］のいずれか一項に記載の抗体。
［３４］前記検出可能な標識が、酵素、放射性同位体、蛍光団及び重金属からなる群から選択される、［３３］に記載の抗体。
［３５］薬物に結合させられる、［１］〜［２６］又は［３２］のいずれか一項に記載の抗体。
［３６］［１］〜［２６］又は［３２］〜［３４］のいずれか一項に記載される抗体、［２７］に記載されるポリヌクレオチド、［２８］に記載されるベクター、或いは、［２９］に記載される細胞を含む組成物。
［３７］医薬組成物であり、かつ、医薬的に許容され得る担体をさらに含む、［３６］に記載の組成物。
［３８］ワクチンである、［３７］に記載の組成物。
［３９］ＤＰＲ凝集物及びＤＰＲ−タンパク質凝集物に伴う、又は、ＤＰＲ凝集物及びＤＰＲ−タンパク質凝集物によって引き起こされる障害の処置において使用されるための医薬組成物を調製する方法であって、
（ａ）［２９］に記載される細胞を培養すること、
（ｂ）前記抗体、その生物工学誘導体又は免疫グロブリン鎖を前記培養物から医薬品グレードにまで精製すること；及び
（ｃ）前記抗体又はその生物工学誘導体を医薬的に許容され得る担体と混合すること
を含む方法。
［４０］凝集型ＤＰＲタンパク質（例えば、Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲ）に伴う疾患及び／又は症状を処置するために有用であるさらなる薬剤をさらに含む、［３６］又は［３７］に記載の医薬組成物。
［４１］診断組成物である、［４０］に記載の組成物。
［４２］免疫又は核酸に基づく診断方法において従来から使用される試薬を含む、［４１］に記載の診断組成物。
［４３］ＤＰＲタンパク質及びその凝集型形態に伴う疾患の予防的処置及び治療的処置のための医薬組成物又は診断組成物を調製することにおいて使用されるための、［１］〜［２６］又は［３２］〜［３４］のいずれか一項に記載の抗体、又は、前記抗体のいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有するＤＰＲタンパク質結合分子、［２７］に記載のポリヌクレオチド、［２８］に記載のベクター、或いは［２９］に記載の細胞。
［４４］前記疾患が、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及びＦＴＬＤ−ＡＬＳからなる群から選択される、予防的処置及び治療的処置のための医薬組成物又は診断組成物を調製することにおいて使用されるための［４３］に記載の抗体。
［４５］ヒト又は動物の身体における凝集物のインビボ検出において、或いは、治療剤及び／又は診断剤をヒト又は動物の身体における凝集物に対して標的化することにおいて使用されるための、［１］〜［２６］又は［３２］〜［３５］のいずれか一項に記載される抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含むＤＰＲタンパク質結合分子。
［４６］前記インビボ画像化が、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射型断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、近赤外（ＮＩＲ）光学的画像法又は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を含む、［４５］に記載のＤＰＲタンパク質結合分子。
［４７］ＤＰＲタンパク質に伴う障害を診断するための方法であって、［１］〜［２６］又は［３２］〜［３５］のいずれか一項に記載される抗体の存在を前記対象の生物学的サンプルにおいて明らかにする工程を含む方法。
［４９］ＤＰＲタンパク質に伴う障害の診断又はモニタリングにおいて有用なキットであって、［１］〜［２７］若しくは［３２］〜［３５］のいずれか一項に記載される少なくとも１つの抗体、又は、前記抗体のいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有するＤＰＲタンパク質結合分子、［２７］に記載されるポリヌクレオチド、［２８］に記載されるベクター、或いは、［２９］に記載される細胞を、必要な場合には使用のための試薬及び／又は説明書と一緒に含むキット。
【００１８】
反復伸長の毒性的性質が、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ＦＴＬＤ−ＡＬＳ及び脊髄小脳失調症３６型（これらに限定されない）を含むいくつかの疾患において示された。したがって、本発明の１つの実施形態において、本発明の抗体は、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ＦＴＬＤ−ＡＬＳ及び／又は脊髄小脳失調症３６型からなる群から選択される疾患及び／又は障害のいずれか１つにおいてＤＰＲと結合することができる。Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲはＦＴＬＤに伴うことが示されたので（上記参照）、好ましい実施形態において、本発明の抗体はＣ９ＯＲＦ７２ジペプチドリピート（ＤＰＲ）に結合する。
【００１９】
実施例及び図において明らかにされるように、本発明に従って得られる抗体はヒトＣ９ＯＲＦ７２−ＦＴＬＤ患者においてＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲの凝集型形態と結合する；例えば、実施例１０及び実施例１２、並びに、図９〜図１２及び図１４を参照のこと。したがって、１つの実施形態において、本発明の抗体はＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲの凝集型形態と結合することができる。興味深いことに、本発明に従って得られる抗体はまた、ヒトＣ９ＯＲＦ７２−ＦＴＬＤ患者においてＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲの共凝集型形態と結合する；実施例１３及び図１５を参照のこと。したがって、別の実施形態において、本発明の抗体はＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲの共凝集型形態と結合することができる。
【００２０】
本発明の１つの実施形態において、抗体或いはその結合フラグメント、合成誘導体又は生物工学誘導体により、図１に示されるような可変領域ＶＨ及び／又は可変領域ＶＬのいずれか１つによって特徴づけられる抗体の免疫学的な結合特性が明らかにされる。好ましい実施形態において、本発明の抗体は、その可変領域において、下記の（ｉ）及び（ｉｉ）において示されるＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つ相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む：（ｉ）ＶＨ配列（配列番号２、配列番号８、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３８、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５２、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２、配列番号７６、配列番号８０、配列番号８４）、及び、（ｉｉ）ＶＬ配列（配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３２、配列番号３６、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４６、配列番号５０、配列番号５４、配列番号６０、配列番号６６、配列番号７０、配列番号７４、配列番号８２、配列番号８６、配列番号８８）。
【００２１】
加えて、又は代替において、本発明の１つの実施形態において、抗体は、図１Ａ〜図１Ｊのいずれか１つに示されるようなＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のアミノ酸配列を含む。
【００２２】
１つの実施形態において、本発明の抗体は、加えて、又は代替において、ＶＨ配列（配列番号２、配列番号８、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３８、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５２、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２、配列番号７６、配列番号８０、配列番号８４）及び（ｉｉ）ＶＬ配列（配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３２、配列番号３６、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４６、配列番号５０、配列番号５４、配列番号６０、配列番号６６、配列番号７０、配列番号７４、配列番号８２、配列番号８６、配列番号８８）のアミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、抗体は、上記で記載されるアミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む。
【００２３】
本発明のさらなる実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、加えて、又は代替において、ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域或いは少なくとも１つのＣＤＲに対して異種であるポリペプチド配列を場合によりさらに含み、好ましくは、この場合、ポリペプチド配列はヒト定常ドメインを含む。
【００２４】
好ましい実施形態（下記）において、抗体又はその生物工学誘導体はヒトＩｇＧアイソタイプ抗体であり、好ましくはＩｇＧ１クラス又はＩｇＧ１アイソタイプのものである。
【００２５】
実施例及び図において例示されるように、抗ＤＰＲタンパク質抗体は、（ＧＡ）１５リピート又は（ＧＰ）１５リピート又は（ＧＲ）１５リピート又は（ＰＡ）１５リピート又は（ＰＲ）１５リピートを有するＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲに特異的に結合することが示された。したがって、本発明の１つの実施形態において、本発明の抗体又はその生物工学誘導体は、（ＸＸ’）１５からなるＤＰＲと結合することについては２ｎＭ以下の、好ましくは１ｎＭ以下の、最も好ましくは０．５ｎＭ以下のＥＣ５０（最大半量有効濃度）値に対応する結合親和性を有しており、好ましくは、この場合、前記ＤＰＲは、ＤＰＲタンパク質（ＧＡ）１５又はＤＰＲタンパク質（ＧＰ）１５、ＤＰＲタンパク質（ＧＲ）１５又はＤＰＲタンパク質（ＰＡ）１５又はＤＰＲタンパク質（ＰＲ）１５である。
【００２６】
個々のジペプチドリピートに対する大きい親和性及び特異性を有する抗ＤＰＲ抗体が一般には興味深く、また、実施例において例示される主題抗体により、同等な抗体及び同様なＤＰＲ結合分子に達するための手段が提供されるので、本発明はまた、ＤＰＲタンパク質に対する特異的な結合について抗体（上記）と競合する抗体又は抗原結合分子に関連する。
【００２７】
抗体の抗原結合フラグメントは、単鎖Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメント及びＦ（ａｂ’）２フラグメント、又はどのような他の抗原結合フラグメントでもあることが可能である。代替において、抗体は、ヒト−齧歯類のキメラ抗体又は齧歯類化された抗体、例えば、マウス−ヒト抗体、マウス抗体又はマウス化抗体、ラット抗体又はラット化抗体などであり、齧歯類型が診断方法及び動物における研究のために特に有用である。
【００２８】
さらには、本発明は、本発明の抗体或いはその抗原結合フラグメント、合成誘導体又は生物工学誘導体を含む組成物に関連し、また、ＤＰＲタンパク質及び／又は凝集型Ｃ９ＯＲＦ７２に伴う疾患及び／又は障害の防止、診断又は処置においてそのような組成物を使用する免疫治療方法及び免疫診断方法であって、組成物の有効量がその必要性のある患者に投与される方法に関連する。
【００２９】
本発明はまた、本発明の抗体の免疫グロブリン鎖の可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチドに関連する。好ましくは、前記可変領域は、図１Ａ〜図１Ｌのいずれか１つに示されるような可変領域のＶＨ及び／又はＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００３０】
したがって、本発明はまた、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、及び、該ベクターにより形質転換される宿主細胞、並びに、ＤＰＲに対して特異的であり、かつ、好ましくはＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲタンパク質又はそのフラグメントと結合することができる抗体及び同等な結合性分子を製造するためのそれらの使用を包含する。抗体及びその模倣体の組換え産生のための様々な手段及び方法、並びに、競合する結合性分子（これは抗体であっても、又は抗体でなくてもよい）についてスクリーニングする様々な方法がこの技術分野において知られている。しかしながら、特にヒトにおける治療的適用に関して本明細書中に記載されるように、本発明の抗体は、前記抗体の適用が、キメラ抗体について、また、それどころかヒト化抗体について他の場合には認められるそのような抗体に対する免疫応答を実質的に有していないという意味で、ヒト由来抗体である。
【００３１】
さらに、本明細書中には、ＤＰＲ（具体的にはＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲ又はフラグメント）をインビトロにおいて、例えば、サンプルにおいて、及び／又はインビボにおいて特定するために使用することができる組成物及び方法が開示される。開示された抗ＤＰＲタンパク質抗体及びその結合フラグメントは、ヒトの血液、血漿、血清、唾液、腹腔液、脳脊髄液（「ＣＳＦ」）及び尿を、例えば、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイ又は表面適合化アッセイを使用することによって、サンプルにおけるＤＰＲ種及び／又はＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲ種或いはそれらのフラグメントの存在についてスクリーニングするために使用することができる。１つの実施形態において、本発明は、ＤＰＲタンパク質種又はそのフラグメントに関連づけられる疾患及び／又は障害を対象において診断する、或いはその進行をモニターする方法であって、診断される対象から得られるサンプルにおけるＤＰＲタンパク質種又はフラグメントの存在を、本発明の少なくとも１つの抗体又は同等なＤＰＲ結合分子を用いて明らかにすることを含み、ただし、ＤＰＲタンパク質種又はフラグメントの存在により、当該障害が示される方法に関連する。さらには、本発明の１つの実施形態において、本発明の抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含む開示された抗ＤＰＲ抗体及びＤＰＲ結合分子が、ヒト又は動物の身体におけるＤＰＲ（具体的にはＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲ種）のインビボ検出（これはまた、インビボ画像化と呼ばれる）のための、或いは、治療剤及び／又は診断剤をヒト又は動物の身体においてＤＰＲ（具体的にはＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲ種）に対して標的化するための組成物を調製するために提供される。本明細書中に開示される方法及び組成物は、ＤＰＲタンパク質に伴う疾患及び／又は障害で、例えば、ＤＰＲの凝集型形態の出現によって特徴づけられる疾患及び／又は障害において助けとなることができ、また、疾患の進行と、対象に施される治療の治療効力とを、例えば、インビボ画像化に関連づけられる診断方法でモニターするために使用することができる。１つの実施形態において、インビボ検出（画像化）は、シンチグラフィー、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射型断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、近赤外（ＮＩＲ）光学的画像法又は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を含む。
【００３２】
したがって、ＤＰＲタンパク質に伴う、好ましくはＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲに伴う疾患及び／又は障害を処置するための方法、診断するための方法、又は防止するための方法を提供することが、本発明の具体的な目的の１つである。これらの方法は、好ましくはヒト由来抗体又は生物工学抗体誘導体の効果的な濃度を対象に投与することを含み、ただし、この場合、抗体はＤＰＲ及びＤＰＲタンパク質を標的とし、好ましくはＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲタンパク質種又はそのフラグメントを標的とする。
【００３３】
本発明のさらなる実施形態が下記の説明及び実施例から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１−１】下記ヒト抗体の可変領域のアミノ酸配列：ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、ＮＩ−３０８．４５Ｃ２、ＮＩ．３０８．２４Ｅ１１、ＮＩ−３０８．５Ｇ２、ＮＩ−３０８．４６Ｅ９、ＮＩ３０８−６Ｂ１１、ＮＩ−３０８．４６Ｆ８、ＮＩ−３０８．４Ｍ１、ＮＩ−３０８．１２Ａ３及びＮＩ−３０８．１６Ｃ１０。フレームワーク領域（ＦＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）が示され、ＣＤＲには下線が引かれている。Ｋａｂａｔ番号表記スキームが使用された（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／を参照のこと）。四角で囲った部分は、言及されたウエブ参照で示され、表１（下記）において与えられる、Ｋａｂａｔ他（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３））によって定義されるようなＶＨのＣＤＲ１を示す。
【図１−２】下記ヒト抗体の可変領域のアミノ酸配列：ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、ＮＩ−３０８．４５Ｃ２、ＮＩ．３０８．２４Ｅ１１、ＮＩ−３０８．５Ｇ２、ＮＩ−３０８．４６Ｅ９、ＮＩ３０８−６Ｂ１１、ＮＩ−３０８．４６Ｆ８、ＮＩ−３０８．４Ｍ１、ＮＩ−３０８．１２Ａ３及びＮＩ−３０８．１６Ｃ１０。フレームワーク領域（ＦＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）が示され、ＣＤＲには下線が引かれている。Ｋａｂａｔ番号表記スキームが使用された（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／を参照のこと）。四角で囲った部分は、言及されたウエブ参照で示され、表１（下記）において与えられる、Ｋａｂａｔ他（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３））によって定義されるようなＶＨのＣＤＲ１を示す。
【図１−３】下記ヒト抗体の可変領域のアミノ酸配列：ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、ＮＩ−３０８．４５Ｃ２、ＮＩ．３０８．２４Ｅ１１、ＮＩ−３０８．５Ｇ２、ＮＩ−３０８．４６Ｅ９、ＮＩ３０８−６Ｂ１１、ＮＩ−３０８．４６Ｆ８、ＮＩ−３０８．４Ｍ１、ＮＩ−３０８．１２Ａ３及びＮＩ−３０８．１６Ｃ１０。フレームワーク領域（ＦＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）が示され、ＣＤＲには下線が引かれている。Ｋａｂａｔ番号表記スキームが使用された（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／を参照のこと）。四角で囲った部分は、言及されたウエブ参照で示され、表１（下記）において与えられる、Ｋａｂａｔ他（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３））によって定義されるようなＶＨのＣＤＲ１を示す。
【図１−４】下記ヒト抗体の可変領域のアミノ酸配列：ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、ＮＩ−３０８．４５Ｃ２、ＮＩ．３０８．２４Ｅ１１、ＮＩ−３０８．５Ｇ２、ＮＩ−３０８．４６Ｅ９、ＮＩ３０８−６Ｂ１１、ＮＩ−３０８．４６Ｆ８、ＮＩ−３０８．４Ｍ１、ＮＩ−３０８．１２Ａ３及びＮＩ−３０８．１６Ｃ１０。フレームワーク領域（ＦＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）が示され、ＣＤＲには下線が引かれている。Ｋａｂａｔ番号表記スキームが使用された（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／を参照のこと）。四角で囲った部分は、言及されたウエブ参照で示され、表１（下記）において与えられる、Ｋａｂａｔ他（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３））によって定義されるようなＶＨのＣＤＲ１を示す。
【図１−５】下記ヒト抗体の可変領域のアミノ酸配列：ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、ＮＩ−３０８．４５Ｃ２、ＮＩ．３０８．２４Ｅ１１、ＮＩ−３０８．５Ｇ２、ＮＩ−３０８．４６Ｅ９、ＮＩ３０８−６Ｂ１１、ＮＩ−３０８．４６Ｆ８、ＮＩ−３０８．４Ｍ１、ＮＩ−３０８．１２Ａ３及びＮＩ−３０８．１６Ｃ１０。フレームワーク領域（ＦＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）が示され、ＣＤＲには下線が引かれている。Ｋａｂａｔ番号表記スキームが使用された（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／を参照のこと）。四角で囲った部分は、言及されたウエブ参照で示され、表１（下記）において与えられる、Ｋａｂａｔ他（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３））によって定義されるようなＶＨのＣＤＲ１を示す。
【図１−６】下記ヒト抗体の可変領域のアミノ酸配列：ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、ＮＩ−３０８．４５Ｃ２、ＮＩ．３０８．２４Ｅ１１、ＮＩ−３０８．５Ｇ２、ＮＩ−３０８．４６Ｅ９、ＮＩ３０８−６Ｂ１１、ＮＩ−３０８．４６Ｆ８、ＮＩ−３０８．４Ｍ１、ＮＩ−３０８．１２Ａ３及びＮＩ−３０８．１６Ｃ１０。フレームワーク領域（ＦＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）が示され、ＣＤＲには下線が引かれている。Ｋａｂａｔ番号表記スキームが使用された（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／を参照のこと）。四角で囲った部分は、言及されたウエブ参照で示され、表１（下記）において与えられる、Ｋａｂａｔ他（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３））によって定義されるようなＶＨのＣＤＲ１を示す。
【図１−７】下記ヒト抗体の可変領域のアミノ酸配列：ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、ＮＩ−３０８．４５Ｃ２、ＮＩ．３０８．２４Ｅ１１、ＮＩ−３０８．５Ｇ２、ＮＩ−３０８．４６Ｅ９、ＮＩ３０８−６Ｂ１１、ＮＩ−３０８．４６Ｆ８、ＮＩ−３０８．４Ｍ１、ＮＩ−３０８．１２Ａ３及びＮＩ−３０８．１６Ｃ１０。フレームワーク領域（ＦＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）が示され、ＣＤＲには下線が引かれている。Ｋａｂａｔ番号表記スキームが使用された（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／を参照のこと）。四角で囲った部分は、言及されたウエブ参照で示され、表１（下記）において与えられる、Ｋａｂａｔ他（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３））によって定義されるようなＶＨのＣＤＲ１を示す。
【図２−１】Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質についての結合特異性及びＥＣ５０決定。（Ａ）Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質についての、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、ＮＩ３０８．４５Ｃ２、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１、ＮＩ−３０８．５Ｇ２、ＮＩ−３０８．４６Ｅ９、ＮＩ−３０８−６Ｂ１１、ＮＩ−３０８．４６Ｆ８、ＮＩ−３０８．４Ｍ１の結合特異性及び結合親和性のまとめ。Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５（■）、（ＧＰ）１５（▲）、（ＧＲ）１５（▼）、（ＰＡ）１５（◆）、（ＰＲ）１５（●）と、ＢＳＡコントロール（△）とについてのヒト由来ＮＩ−３０８抗体のＥＣ５０を間接的ＥＬＩＳＡによって求めた。抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７（Ｂ）、抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１（Ｃ）、抗体ＮＩ−３０８．４５Ｃ２（Ｄ）及び抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７（Ｄ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５を特異的に認識し、結合親和性がそれぞれ、０．４８ｎＭ、１．１ｎＭ、１．１ｎＭ及び１．５ｎＭであった。抗体ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１（Ｆ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＰＲ）１５を特異的に標的とし、ＥＣ５０が１２．８ｎＭであり、これに対して、抗体ＮＩ−３０８．１６Ｃ１０（Ｍ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＰＲ）１５への優先的な結合を示し、結合親和性が３．５ｎＭであり、しかし、この抗体はまた、より低い結合親和性により、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５を認識した。抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２（Ｇ）、抗体ＮＩ−３０８．１２Ａ３（Ｌ）及び抗体ＮＩ−３０８．４６Ｅ９（Ｈ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＰ）１５への優先的な結合を示し、結合親和性がそれぞれ、０．８８ｎＭ、２．２ｎＭ及び１３．９ｎＭであり、しかし、これらの抗体はまた、より低い結合親和性により、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５を認識した。抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１（Ｉ）及び抗体ＮＩ−３０８．４６Ｆ８（Ｊ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＲ）１５を優先的に標的とし、結合親和性がそれぞれ、０．９４ｎＭ及び４０．６ｎＭであり、しかし、これらの抗体はまた、より低い結合親和性により、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５及び（ＰＲ）１５を認識した。抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１（Ｋ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＰＡ）１５への優先的な結合を示し、結合親和性が０．１０ｎＭであり、しかし、この抗体はまた、より低い結合親和性により、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５を認識した。
【図２−２】Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質についての結合特異性及びＥＣ５０決定。（Ａ）Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質についての、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、ＮＩ３０８．４５Ｃ２、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１、ＮＩ−３０８．５Ｇ２、ＮＩ−３０８．４６Ｅ９、ＮＩ−３０８−６Ｂ１１、ＮＩ−３０８．４６Ｆ８、ＮＩ−３０８．４Ｍ１の結合特異性及び結合親和性のまとめ。Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５（■）、（ＧＰ）１５（▲）、（ＧＲ）１５（▼）、（ＰＡ）１５（◆）、（ＰＲ）１５（●）と、ＢＳＡコントロール（△）とについてのヒト由来ＮＩ−３０８抗体のＥＣ５０を間接的ＥＬＩＳＡによって求めた。抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７（Ｂ）、抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１（Ｃ）、抗体ＮＩ−３０８．４５Ｃ２（Ｄ）及び抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７（Ｄ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５を特異的に認識し、結合親和性がそれぞれ、０．４８ｎＭ、１．１ｎＭ、１．１ｎＭ及び１．５ｎＭであった。抗体ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１（Ｆ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＰＲ）１５を特異的に標的とし、ＥＣ５０が１２．８ｎＭであり、これに対して、抗体ＮＩ−３０８．１６Ｃ１０（Ｍ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＰＲ）１５への優先的な結合を示し、結合親和性が３．５ｎＭであり、しかし、この抗体はまた、より低い結合親和性により、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５を認識した。抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２（Ｇ）、抗体ＮＩ−３０８．１２Ａ３（Ｌ）及び抗体ＮＩ−３０８．４６Ｅ９（Ｈ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＰ）１５への優先的な結合を示し、結合親和性がそれぞれ、０．８８ｎＭ、２．２ｎＭ及び１３．９ｎＭであり、しかし、これらの抗体はまた、より低い結合親和性により、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５を認識した。抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１（Ｉ）及び抗体ＮＩ−３０８．４６Ｆ８（Ｊ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＲ）１５を優先的に標的とし、結合親和性がそれぞれ、０．９４ｎＭ及び４０．６ｎＭであり、しかし、これらの抗体はまた、より低い結合親和性により、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５及び（ＰＲ）１５を認識した。抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１（Ｋ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＰＡ）１５への優先的な結合を示し、結合親和性が０．１０ｎＭであり、しかし、この抗体はまた、より低い結合親和性により、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５を認識した。
【図２−３】Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質についての結合特異性及びＥＣ５０決定。（Ａ）Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質についての、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、ＮＩ３０８．４５Ｃ２、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１、ＮＩ−３０８．５Ｇ２、ＮＩ−３０８．４６Ｅ９、ＮＩ−３０８−６Ｂ１１、ＮＩ−３０８．４６Ｆ８、ＮＩ−３０８．４Ｍ１の結合特異性及び結合親和性のまとめ。Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５（■）、（ＧＰ）１５（▲）、（ＧＲ）１５（▼）、（ＰＡ）１５（◆）、（ＰＲ）１５（●）と、ＢＳＡコントロール（△）とについてのヒト由来ＮＩ−３０８抗体のＥＣ５０を間接的ＥＬＩＳＡによって求めた。抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７（Ｂ）、抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１（Ｃ）、抗体ＮＩ−３０８．４５Ｃ２（Ｄ）及び抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７（Ｄ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５を特異的に認識し、結合親和性がそれぞれ、０．４８ｎＭ、１．１ｎＭ、１．１ｎＭ及び１．５ｎＭであった。抗体ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１（Ｆ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＰＲ）１５を特異的に標的とし、ＥＣ５０が１２．８ｎＭであり、これに対して、抗体ＮＩ−３０８．１６Ｃ１０（Ｍ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＰＲ）１５への優先的な結合を示し、結合親和性が３．５ｎＭであり、しかし、この抗体はまた、より低い結合親和性により、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５を認識した。抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２（Ｇ）、抗体ＮＩ−３０８．１２Ａ３（Ｌ）及び抗体ＮＩ−３０８．４６Ｅ９（Ｈ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＰ）１５への優先的な結合を示し、結合親和性がそれぞれ、０．８８ｎＭ、２．２ｎＭ及び１３．９ｎＭであり、しかし、これらの抗体はまた、より低い結合親和性により、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５を認識した。抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１（Ｉ）及び抗体ＮＩ−３０８．４６Ｆ８（Ｊ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＲ）１５を優先的に標的とし、結合親和性がそれぞれ、０．９４ｎＭ及び４０．６ｎＭであり、しかし、これらの抗体はまた、より低い結合親和性により、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５及び（ＰＲ）１５を認識した。抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１（Ｋ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＰＡ）１５への優先的な結合を示し、結合親和性が０．１０ｎＭであり、しかし、この抗体はまた、より低い結合親和性により、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５を認識した。
【図２−４】Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質についての結合特異性及びＥＣ５０決定。（Ａ）Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質についての、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、ＮＩ３０８．４５Ｃ２、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１、ＮＩ−３０８．５Ｇ２、ＮＩ−３０８．４６Ｅ９、ＮＩ−３０８−６Ｂ１１、ＮＩ−３０８．４６Ｆ８、ＮＩ−３０８．４Ｍ１の結合特異性及び結合親和性のまとめ。Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５（■）、（ＧＰ）１５（▲）、（ＧＲ）１５（▼）、（ＰＡ）１５（◆）、（ＰＲ）１５（●）と、ＢＳＡコントロール（△）とについてのヒト由来ＮＩ−３０８抗体のＥＣ５０を間接的ＥＬＩＳＡによって求めた。抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７（Ｂ）、抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１（Ｃ）、抗体ＮＩ−３０８．４５Ｃ２（Ｄ）及び抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７（Ｄ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５を特異的に認識し、結合親和性がそれぞれ、０．４８ｎＭ、１．１ｎＭ、１．１ｎＭ及び１．５ｎＭであった。抗体ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１（Ｆ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＰＲ）１５を特異的に標的とし、ＥＣ５０が１２．８ｎＭであり、これに対して、抗体ＮＩ−３０８．１６Ｃ１０（Ｍ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＰＲ）１５への優先的な結合を示し、結合親和性が３．５ｎＭであり、しかし、この抗体はまた、より低い結合親和性により、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５を認識した。抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２（Ｇ）、抗体ＮＩ−３０８．１２Ａ３（Ｌ）及び抗体ＮＩ−３０８．４６Ｅ９（Ｈ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＰ）１５への優先的な結合を示し、結合親和性がそれぞれ、０．８８ｎＭ、２．２ｎＭ及び１３．９ｎＭであり、しかし、これらの抗体はまた、より低い結合親和性により、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５を認識した。抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１（Ｉ）及び抗体ＮＩ−３０８．４６Ｆ８（Ｊ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＲ）１５を優先的に標的とし、結合親和性がそれぞれ、０．９４ｎＭ及び４０．６ｎＭであり、しかし、これらの抗体はまた、より低い結合親和性により、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５及び（ＰＲ）１５を認識した。抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１（Ｋ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＰＡ）１５への優先的な結合を示し、結合親和性が０．１０ｎＭであり、しかし、この抗体はまた、より低い結合親和性により、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５を認識した。
【図２−５】Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質についての結合特異性及びＥＣ５０決定。（Ａ）Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質についての、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、ＮＩ３０８．４５Ｃ２、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１、ＮＩ−３０８．５Ｇ２、ＮＩ−３０８．４６Ｅ９、ＮＩ−３０８−６Ｂ１１、ＮＩ−３０８．４６Ｆ８、ＮＩ−３０８．４Ｍ１の結合特異性及び結合親和性のまとめ。Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５（■）、（ＧＰ）１５（▲）、（ＧＲ）１５（▼）、（ＰＡ）１５（◆）、（ＰＲ）１５（●）と、ＢＳＡコントロール（△）とについてのヒト由来ＮＩ−３０８抗体のＥＣ５０を間接的ＥＬＩＳＡによって求めた。抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７（Ｂ）、抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１（Ｃ）、抗体ＮＩ−３０８．４５Ｃ２（Ｄ）及び抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７（Ｄ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５を特異的に認識し、結合親和性がそれぞれ、０．４８ｎＭ、１．１ｎＭ、１．１ｎＭ及び１．５ｎＭであった。抗体ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１（Ｆ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＰＲ）１５を特異的に標的とし、ＥＣ５０が１２．８ｎＭであり、これに対して、抗体ＮＩ−３０８．１６Ｃ１０（Ｍ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＰＲ）１５への優先的な結合を示し、結合親和性が３．５ｎＭであり、しかし、この抗体はまた、より低い結合親和性により、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５を認識した。抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２（Ｇ）、抗体ＮＩ−３０８．１２Ａ３（Ｌ）及び抗体ＮＩ−３０８．４６Ｅ９（Ｈ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＰ）１５への優先的な結合を示し、結合親和性がそれぞれ、０．８８ｎＭ、２．２ｎＭ及び１３．９ｎＭであり、しかし、これらの抗体はまた、より低い結合親和性により、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５を認識した。抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１（Ｉ）及び抗体ＮＩ−３０８．４６Ｆ８（Ｊ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＲ）１５を優先的に標的とし、結合親和性がそれぞれ、０．９４ｎＭ及び４０．６ｎＭであり、しかし、これらの抗体はまた、より低い結合親和性により、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５及び（ＰＲ）１５を認識した。抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１（Ｋ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＰＡ）１５への優先的な結合を示し、結合親和性が０．１０ｎＭであり、しかし、この抗体はまた、より低い結合親和性により、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５を認識した。
【図３−１】ＢＳＡカップリング型Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質ペプチド及び非カップリング型Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質ペプチドについてのＥＣ５０決定。（Ａ）ＢＳＡカップリング型及び非カップリング型のＣ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲペプチドに対する、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、ＮＩ３０８．４５Ｃ２、ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１、ＮＩ−３０８．５Ｇ２、ＮＩ−３０８．４６Ｅ９、ＮＩ−３０８−６Ｂ１１、ＮＩ−３０８．４６Ｆ８、ＮＩ−３０８．４Ｍ１、ＮＩ−３０８．１２Ａ３及びＮＩ−３０８．１６Ｃ１０の結合親和性のまとめ。間接的ＥＬＩＳＡを使用する、ＢＳＡカップリング型（▲）及び非カップリング型（■）のＣ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５、（ＧＰ）１５、（ＧＲ）１５、（ＰＲ）１５、（ＰＡ）１５、又はＢＳＡコントロール（△）についてのヒト由来ＮＩ−３０８抗体の最大半量有効濃度（ＥＣ５０）の決定。抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７（Ｂ）、抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７（Ｃ）、抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１（Ｄ）、抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２（Ｇ）、抗体ＮＩ−３０８．４６Ｅ９（Ｈ）、抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１（Ｋ）及び抗体ＮＩ−３０８．１２Ａ３（Ｌ）では、類似する結合親和性により、ＢＳＡカップリング型及び非カップリング型のＣ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドが認識された。抗体ＮＩ−３０８．４５Ｃ２（Ｅ）、抗体ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１（Ｆ）及び抗体ＮＩ−３０８．１６Ｃ１０（Ｍ）は、非カップリング型ペプチドと比較して、ＢＳＡカップリング型ＤＰＲタンパク質ペプチドをより低いＥＣ５０で標的とした。ＢＳＡカップリング型のＤＰＲタンパク質ペプチド（ＧＲ）１５への結合が、抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１（Ｉ）及び抗体ＮＩ−３０８．４６Ｆ８（Ｊ）については検出されなかった。
【図３−２】ＢＳＡカップリング型Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質ペプチド及び非カップリング型Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質ペプチドについてのＥＣ５０決定。（Ａ）ＢＳＡカップリング型及び非カップリング型のＣ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲペプチドに対する、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、ＮＩ３０８．４５Ｃ２、ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１、ＮＩ−３０８．５Ｇ２、ＮＩ−３０８．４６Ｅ９、ＮＩ−３０８−６Ｂ１１、ＮＩ−３０８．４６Ｆ８、ＮＩ−３０８．４Ｍ１、ＮＩ−３０８．１２Ａ３及びＮＩ−３０８．１６Ｃ１０の結合親和性のまとめ。間接的ＥＬＩＳＡを使用する、ＢＳＡカップリング型（▲）及び非カップリング型（■）のＣ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５、（ＧＰ）１５、（ＧＲ）１５、（ＰＲ）１５、（ＰＡ）１５、又はＢＳＡコントロール（△）についてのヒト由来ＮＩ−３０８抗体の最大半量有効濃度（ＥＣ５０）の決定。抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７（Ｂ）、抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７（Ｃ）、抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１（Ｄ）、抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２（Ｇ）、抗体ＮＩ−３０８．４６Ｅ９（Ｈ）、抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１（Ｋ）及び抗体ＮＩ−３０８．１２Ａ３（Ｌ）では、類似する結合親和性により、ＢＳＡカップリング型及び非カップリング型のＣ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドが認識された。抗体ＮＩ−３０８．４５Ｃ２（Ｅ）、抗体ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１（Ｆ）及び抗体ＮＩ−３０８．１６Ｃ１０（Ｍ）は、非カップリング型ペプチドと比較して、ＢＳＡカップリング型ＤＰＲタンパク質ペプチドをより低いＥＣ５０で標的とした。ＢＳＡカップリング型のＤＰＲタンパク質ペプチド（ＧＲ）１５への結合が、抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１（Ｉ）及び抗体ＮＩ−３０８．４６Ｆ８（Ｊ）については検出されなかった。
【図３−３】ＢＳＡカップリング型Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質ペプチド及び非カップリング型Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質ペプチドについてのＥＣ５０決定。（Ａ）ＢＳＡカップリング型及び非カップリング型のＣ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲペプチドに対する、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、ＮＩ３０８．４５Ｃ２、ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１、ＮＩ−３０８．５Ｇ２、ＮＩ−３０８．４６Ｅ９、ＮＩ−３０８−６Ｂ１１、ＮＩ−３０８．４６Ｆ８、ＮＩ−３０８．４Ｍ１、ＮＩ−３０８．１２Ａ３及びＮＩ−３０８．１６Ｃ１０の結合親和性のまとめ。間接的ＥＬＩＳＡを使用する、ＢＳＡカップリング型（▲）及び非カップリング型（■）のＣ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５、（ＧＰ）１５、（ＧＲ）１５、（ＰＲ）１５、（ＰＡ）１５、又はＢＳＡコントロール（△）についてのヒト由来ＮＩ−３０８抗体の最大半量有効濃度（ＥＣ５０）の決定。抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７（Ｂ）、抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７（Ｃ）、抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１（Ｄ）、抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２（Ｇ）、抗体ＮＩ−３０８．４６Ｅ９（Ｈ）、抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１（Ｋ）及び抗体ＮＩ−３０８．１２Ａ３（Ｌ）では、類似する結合親和性により、ＢＳＡカップリング型及び非カップリング型のＣ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドが認識された。抗体ＮＩ−３０８．４５Ｃ２（Ｅ）、抗体ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１（Ｆ）及び抗体ＮＩ−３０８．１６Ｃ１０（Ｍ）は、非カップリング型ペプチドと比較して、ＢＳＡカップリング型ＤＰＲタンパク質ペプチドをより低いＥＣ５０で標的とした。ＢＳＡカップリング型のＤＰＲタンパク質ペプチド（ＧＲ）１５への結合が、抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１（Ｉ）及び抗体ＮＩ−３０８．４６Ｆ８（Ｊ）については検出されなかった。
【図３−４】ＢＳＡカップリング型Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質ペプチド及び非カップリング型Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質ペプチドについてのＥＣ５０決定。（Ａ）ＢＳＡカップリング型及び非カップリング型のＣ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲペプチドに対する、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、ＮＩ３０８．４５Ｃ２、ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１、ＮＩ−３０８．５Ｇ２、ＮＩ−３０８．４６Ｅ９、ＮＩ−３０８−６Ｂ１１、ＮＩ−３０８．４６Ｆ８、ＮＩ−３０８．４Ｍ１、ＮＩ−３０８．１２Ａ３及びＮＩ−３０８．１６Ｃ１０の結合親和性のまとめ。間接的ＥＬＩＳＡを使用する、ＢＳＡカップリング型（▲）及び非カップリング型（■）のＣ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５、（ＧＰ）１５、（ＧＲ）１５、（ＰＲ）１５、（ＰＡ）１５、又はＢＳＡコントロール（△）についてのヒト由来ＮＩ−３０８抗体の最大半量有効濃度（ＥＣ５０）の決定。抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７（Ｂ）、抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７（Ｃ）、抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１（Ｄ）、抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２（Ｇ）、抗体ＮＩ−３０８．４６Ｅ９（Ｈ）、抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１（Ｋ）及び抗体ＮＩ−３０８．１２Ａ３（Ｌ）では、類似する結合親和性により、ＢＳＡカップリング型及び非カップリング型のＣ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドが認識された。抗体ＮＩ−３０８．４５Ｃ２（Ｅ）、抗体ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１（Ｆ）及び抗体ＮＩ−３０８．１６Ｃ１０（Ｍ）は、非カップリング型ペプチドと比較して、ＢＳＡカップリング型ＤＰＲタンパク質ペプチドをより低いＥＣ５０で標的とした。ＢＳＡカップリング型のＤＰＲタンパク質ペプチド（ＧＲ）１５への結合が、抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１（Ｉ）及び抗体ＮＩ−３０８．４６Ｆ８（Ｊ）については検出されなかった。
【図３−５】ＢＳＡカップリング型Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質ペプチド及び非カップリング型Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質ペプチドについてのＥＣ５０決定。（Ａ）ＢＳＡカップリング型及び非カップリング型のＣ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲペプチドに対する、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、ＮＩ３０８．４５Ｃ２、ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１、ＮＩ−３０８．５Ｇ２、ＮＩ−３０８．４６Ｅ９、ＮＩ−３０８−６Ｂ１１、ＮＩ−３０８．４６Ｆ８、ＮＩ−３０８．４Ｍ１、ＮＩ−３０８．１２Ａ３及びＮＩ−３０８．１６Ｃ１０の結合親和性のまとめ。間接的ＥＬＩＳＡを使用する、ＢＳＡカップリング型（▲）及び非カップリング型（■）のＣ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５、（ＧＰ）１５、（ＧＲ）１５、（ＰＲ）１５、（ＰＡ）１５、又はＢＳＡコントロール（△）についてのヒト由来ＮＩ−３０８抗体の最大半量有効濃度（ＥＣ５０）の決定。抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７（Ｂ）、抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７（Ｃ）、抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１（Ｄ）、抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２（Ｇ）、抗体ＮＩ−３０８．４６Ｅ９（Ｈ）、抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１（Ｋ）及び抗体ＮＩ−３０８．１２Ａ３（Ｌ）では、類似する結合親和性により、ＢＳＡカップリング型及び非カップリング型のＣ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドが認識された。抗体ＮＩ−３０８．４５Ｃ２（Ｅ）、抗体ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１（Ｆ）及び抗体ＮＩ−３０８．１６Ｃ１０（Ｍ）は、非カップリング型ペプチドと比較して、ＢＳＡカップリング型ＤＰＲタンパク質ペプチドをより低いＥＣ５０で標的とした。ＢＳＡカップリング型のＤＰＲタンパク質ペプチド（ＧＲ）１５への結合が、抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１（Ｉ）及び抗体ＮＩ−３０８．４６Ｆ８（Ｊ）については検出されなかった。
【図４−１】無関係な凝集性タンパク質に対するヒト由来ＤＰＲ抗体の結合特異性分析。センス型（（ＧＡ）１５、（ＧＰ）１５及び（ＧＲ）１５）のＤＰＲタンパク質ペプチド混合物及びアンチセンス型（（ＰＡ）１５及び（ＰＲ）１５）のＤＰＲタンパク質ペプチド混合物並びに６個の無関係なアミロイド原性タンパク質に対する抗体結合を間接的ＥＬＩＳＡによって求めた。抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７（Ａ）、抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７（Ｂ）、抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１（Ｃ）、抗体ＮＩ−３０８．４５Ｃ２（Ｄ）、抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２（Ｆ）及び抗体ＮＩ−３０８．４６Ｆ８（Ｉ）は、無関係な分析物に対する有意な標的外結合を伴うことなく、センス型ＤＰＲタンパク質ペプチド混合物への結合を示した。抗体ＮＩ−３０８．４６Ｅ９（Ｅ）はまた、センス型ＤＰＲタンパク質ペプチド混合物を標的とし、加えて、無関係な分析物に対する穏やかな標的外結合を示した。抗体ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１（Ｅ）はアンチセンス型ＤＰＲタンパク質ペプチド混合物への特異的な結合を示し、これに対して、抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１（Ｈ）はセンス型及びアンチセンス型の両方のＤＰＲペプチド混合物を標的とした。両方の抗体について、無関係なアミロイド原性タンパク質に対する有意な標的外結合は明らかにされなかった。ＮＩ−３０８抗体を２０ｎＭの濃度で試験した。
【図４−２】無関係な凝集性タンパク質に対するヒト由来ＤＰＲ抗体の結合特異性分析。センス型（（ＧＡ）１５、（ＧＰ）１５及び（ＧＲ）１５）のＤＰＲタンパク質ペプチド混合物及びアンチセンス型（（ＰＡ）１５及び（ＰＲ）１５）のＤＰＲタンパク質ペプチド混合物並びに６個の無関係なアミロイド原性タンパク質に対する抗体結合を間接的ＥＬＩＳＡによって求めた。抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７（Ａ）、抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７（Ｂ）、抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１（Ｃ）、抗体ＮＩ−３０８．４５Ｃ２（Ｄ）、抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２（Ｆ）及び抗体ＮＩ−３０８．４６Ｆ８（Ｉ）は、無関係な分析物に対する有意な標的外結合を伴うことなく、センス型ＤＰＲタンパク質ペプチド混合物への結合を示した。抗体ＮＩ−３０８．４６Ｅ９（Ｅ）はまた、センス型ＤＰＲタンパク質ペプチド混合物を標的とし、加えて、無関係な分析物に対する穏やかな標的外結合を示した。抗体ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１（Ｅ）はアンチセンス型ＤＰＲタンパク質ペプチド混合物への特異的な結合を示し、これに対して、抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１（Ｈ）はセンス型及びアンチセンス型の両方のＤＰＲペプチド混合物を標的とした。両方の抗体について、無関係なアミロイド原性タンパク質に対する有意な標的外結合は明らかにされなかった。ＮＩ−３０８抗体を２０ｎＭの濃度で試験した。
【図４−３】無関係な凝集性タンパク質に対するヒト由来ＤＰＲ抗体の結合特異性分析。センス型（（ＧＡ）１５、（ＧＰ）１５及び（ＧＲ）１５）のＤＰＲタンパク質ペプチド混合物及びアンチセンス型（（ＰＡ）１５及び（ＰＲ）１５）のＤＰＲタンパク質ペプチド混合物並びに６個の無関係なアミロイド原性タンパク質に対する抗体結合を間接的ＥＬＩＳＡによって求めた。抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７（Ａ）、抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７（Ｂ）、抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１（Ｃ）、抗体ＮＩ−３０８．４５Ｃ２（Ｄ）、抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２（Ｆ）及び抗体ＮＩ−３０８．４６Ｆ８（Ｉ）は、無関係な分析物に対する有意な標的外結合を伴うことなく、センス型ＤＰＲタンパク質ペプチド混合物への結合を示した。抗体ＮＩ−３０８．４６Ｅ９（Ｅ）はまた、センス型ＤＰＲタンパク質ペプチド混合物を標的とし、加えて、無関係な分析物に対する穏やかな標的外結合を示した。抗体ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１（Ｅ）はアンチセンス型ＤＰＲタンパク質ペプチド混合物への特異的な結合を示し、これに対して、抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１（Ｈ）はセンス型及びアンチセンス型の両方のＤＰＲペプチド混合物を標的とした。両方の抗体について、無関係なアミロイド原性タンパク質に対する有意な標的外結合は明らかにされなかった。ＮＩ−３０８抗体を２０ｎＭの濃度で試験した。
【図５−１】Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質についてのＮＩ−３０８抗体結合選択性。ＢＳＡカップリング型のＣ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５、（ＧＰ）１５、（ＧＲ）１５、（ＰＡ）１５及び（ＰＲ）１５についての、ヒト由来Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲ抗体結合選択性の、ウエスタンブロット分析による決定。Ｃ９ｏｒｆ７２ポリＧＡ  ＤＰＲタンパク質が、抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７（Ａ）、抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７（Ｂ）、抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１（Ｃ）及び抗体ＮＩ−３０８．４５Ｃ２（Ｄ）によって認識された。ポリＰＲ  ＤＰＲタンパク質が抗体ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１（Ｅ）及び抗体ＮＩ−３０８．１６Ｃ１０（Ｊ）によって特異的に認識され、抗体ＮＩ−３０８．１６Ｃ１０は、ポリＧＡ  ＤＰＲタンパク質に対してもまた、より弱い結合を示した。抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２（Ｆ）、抗体ＮＩ−３０８．４６Ｅ９（Ｇ）及び抗体ＮＩ−３０８．１２Ａ３（Ｉ）は、ポリＧＰ  ＤＰＲタンパク質を標的とし、ＮＩ−３０８．５Ｇ２は、ポリＧＡ  ＤＰＲタンパク質に対してもまた、より弱い結合を示した。抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１（Ｈ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２ポリＰＡ  ＤＰＲタンパク質を特異的に認識した。
【図５−２】Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質についてのＮＩ−３０８抗体結合選択性。ＢＳＡカップリング型のＣ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５、（ＧＰ）１５、（ＧＲ）１５、（ＰＡ）１５及び（ＰＲ）１５についての、ヒト由来Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲ抗体結合選択性の、ウエスタンブロット分析による決定。Ｃ９ｏｒｆ７２ポリＧＡ  ＤＰＲタンパク質が、抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７（Ａ）、抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７（Ｂ）、抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１（Ｃ）及び抗体ＮＩ−３０８．４５Ｃ２（Ｄ）によって認識された。ポリＰＲ  ＤＰＲタンパク質が抗体ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１（Ｅ）及び抗体ＮＩ−３０８．１６Ｃ１０（Ｊ）によって特異的に認識され、抗体ＮＩ−３０８．１６Ｃ１０は、ポリＧＡ  ＤＰＲタンパク質に対してもまた、より弱い結合を示した。抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２（Ｆ）、抗体ＮＩ−３０８．４６Ｅ９（Ｇ）及び抗体ＮＩ−３０８．１２Ａ３（Ｉ）は、ポリＧＰ  ＤＰＲタンパク質を標的とし、ＮＩ−３０８．５Ｇ２は、ポリＧＡ  ＤＰＲタンパク質に対してもまた、より弱い結合を示した。抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１（Ｈ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２ポリＰＡ  ＤＰＲタンパク質を特異的に認識した。
【図５−３】Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質についてのＮＩ−３０８抗体結合選択性。ＢＳＡカップリング型のＣ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５、（ＧＰ）１５、（ＧＲ）１５、（ＰＡ）１５及び（ＰＲ）１５についての、ヒト由来Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲ抗体結合選択性の、ウエスタンブロット分析による決定。Ｃ９ｏｒｆ７２ポリＧＡ  ＤＰＲタンパク質が、抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７（Ａ）、抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７（Ｂ）、抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１（Ｃ）及び抗体ＮＩ−３０８．４５Ｃ２（Ｄ）によって認識された。ポリＰＲ  ＤＰＲタンパク質が抗体ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１（Ｅ）及び抗体ＮＩ−３０８．１６Ｃ１０（Ｊ）によって特異的に認識され、抗体ＮＩ−３０８．１６Ｃ１０は、ポリＧＡ  ＤＰＲタンパク質に対してもまた、より弱い結合を示した。抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２（Ｆ）、抗体ＮＩ−３０８．４６Ｅ９（Ｇ）及び抗体ＮＩ−３０８．１２Ａ３（Ｉ）は、ポリＧＰ  ＤＰＲタンパク質を標的とし、ＮＩ−３０８．５Ｇ２は、ポリＧＡ  ＤＰＲタンパク質に対してもまた、より弱い結合を示した。抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１（Ｈ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２ポリＰＡ  ＤＰＲタンパク質を特異的に認識した。
【図６】Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質に対する溶液中での結合。ペプチド（ＧＡ）１５、ペプチド（ＰＲ）１５及びペプチド（ＧＲ）１５に対する、ヒト由来Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲ抗体の溶液中での結合の、免疫沈降分析による決定。Ｃ９ｏｒｆ７２ポリＧＡ  ＤＰＲタンパク質が、抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、抗体ＮＩ−３０８．４５Ｃ２及び抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１によって溶液中で捕獲された（Ａ）。ポリＰＲ  ＤＰＲタンパク質が、抗体ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１によって沈殿させられ（Ｂ）、これに対して、抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１により、ポリＧＲ  ＤＰＲタンパク質が捕獲された。アイソタイプコントロール抗体ＮＩ−４３Ａ１１では、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質のどれもが沈殿しなかった（Ａ〜Ｃ）。
【図７−１】選択されたＮＩ−３０８抗体の、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質リピート長さ依存的な結合。（Ａ）選択されたＮＩ−３０８抗体のＣ９ｏｒｆ７２ポリＧＡリピート長さ依存的な結合のまとめ。（Ｂ）選択されたＮＩ−３０８抗体のＣ９ｏｒｆ７２ポリＧＰリピート長さ依存的な結合のまとめ。（Ｃ）選択されたＮＩ−３０８抗体のＣ９ｏｒｆ７２ポリＧＲリピート長さ依存的な結合のまとめ。（Ｄ）選択されたＮＩ−３０８抗体のＣ９ｏｒｆ７２ポリＰＲリピート長さ依存的な結合のまとめ。（Ｅ）選択されたＮＩ−３０８抗体のＣ９ｏｒｆ７２ポリＰＡリピート長さ依存的な結合のまとめ。Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質ペプチドについてのヒト由来ＮＩ−３０８抗体のジペプチドリピート長さ依存的結合特異性及び最大半量有効濃度（ＥＣ５０）の、間接的ＥＬＩＳＡによる決定。抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７（Ｆ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）５、（ＧＡ）６、（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０に、１５０ｎＭ超、７．９ｎＭ、０．３７ｎＭ及び０．５４ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ結合した。抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７（Ｇ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）６、（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０を、２００ｎＭ超、０．７８ｎＭ及び０．８３ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ認識した。抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１（Ｈ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）５、（ＧＡ）６、（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０を、２００ｎＭ超、６．３ｎＭ、０．９ｎＭ及び１．１ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ標的とした。抗体ＮＩ−３０８．４５Ｃ２（Ｉ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）６、（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０に、２００ｎＭ超、７．６ｎＭ及び９．６ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ結合した。抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２（Ｊ及びＫ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＰ）５、（ＧＰ）６、（ＧＰ）１０及び（ＧＰ）２０を、２００ｎＭ超、２６．８ｎＭ、０．９４ｎＭ及び０．４７ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ認識し、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）６、（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０を、２００ｎＭ超、５．７ｎＭ及び１８．２ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ認識した。抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１（Ｌ及びＭ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＲ）３、（ＧＲ）４、（ＧＲ）５、（ＧＲ）６、（ＧＲ）１０及び（ＧＲ）２０に、１４．３ｎＭ、１３．２ｎＭ、０．４７ｎＭ、０．３３ｎＭ、１．３ｎＭ及び０．２５ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ結合し、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）６、（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０に、２００ｎＭ超、２７．７ｎＭ及び３３．６ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ結合した。抗体ＮＩ−３０８．４６Ｅ９（Ｎ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＰ）１０及び（ＧＰ）２０を、６３．３ｎＭ及び１５．５ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ標的とした。抗体ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１（Ｏ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＰＲ）６、（ＰＲ）１０及び（ＰＲ）２０を、２００ｎＭ超、３１．７ｎＭ及び１１．３ｎＭのＥＣ５０での結合親和性に���りそれぞれ認識した。抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１（Ｐ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＰＡ）５、（ＰＡ）６、（ＰＡ）１０及び（ＰＡ）２０に、２６．９ｎＭ、４．３ｎＭ、０．０６ｎＭ及び０．０６ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ結合した。
【図７−２】選択されたＮＩ−３０８抗体の、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質リピート長さ依存的な結合。（Ａ）選択されたＮＩ−３０８抗体のＣ９ｏｒｆ７２ポリＧＡリピート長さ依存的な結合のまとめ。（Ｂ）選択されたＮＩ−３０８抗体のＣ９ｏｒｆ７２ポリＧＰリピート長さ依存的な結合のまとめ。（Ｃ）選択されたＮＩ−３０８抗体のＣ９ｏｒｆ７２ポリＧＲリピート長さ依存的な結合のまとめ。（Ｄ）選択されたＮＩ−３０８抗体のＣ９ｏｒｆ７２ポリＰＲリピート長さ依存的な結合のまとめ。（Ｅ）選択されたＮＩ−３０８抗体のＣ９ｏｒｆ７２ポリＰＡリピート長さ依存的な結合のまとめ。Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質ペプチドについてのヒト由来ＮＩ−３０８抗体のジペプチドリピート長さ依存的結合特異性及び最大半量有効濃度（ＥＣ５０）の、間接的ＥＬＩＳＡによる決定。抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７（Ｆ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）５、（ＧＡ）６、（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０に、１５０ｎＭ超、７．９ｎＭ、０．３７ｎＭ及び０．５４ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ結合した。抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７（Ｇ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）６、（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０を、２００ｎＭ超、０．７８ｎＭ及び０．８３ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ認識した。抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１（Ｈ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）５、（ＧＡ）６、（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０を、２００ｎＭ超、６．３ｎＭ、０．９ｎＭ及び１．１ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ標的とした。抗体ＮＩ−３０８．４５Ｃ２（Ｉ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）６、（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０に、２００ｎＭ超、７．６ｎＭ及び９．６ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ結合した。抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２（Ｊ及びＫ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＰ）５、（ＧＰ）６、（ＧＰ）１０及び（ＧＰ）２０を、２００ｎＭ超、２６．８ｎＭ、０．９４ｎＭ及び０．４７ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ認識し、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）６、（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０を、２００ｎＭ超、５．７ｎＭ及び１８．２ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ認識した。抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１（Ｌ及びＭ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＲ）３、（ＧＲ）４、（ＧＲ）５、（ＧＲ）６、（ＧＲ）１０及び（ＧＲ）２０に、１４．３ｎＭ、１３．２ｎＭ、０．４７ｎＭ、０．３３ｎＭ、１．３ｎＭ及び０．２５ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ結合し、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）６、（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０に、２００ｎＭ超、２７．７ｎＭ及び３３．６ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ結合した。抗体ＮＩ−３０８．４６Ｅ９（Ｎ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＰ）１０及び（ＧＰ）２０を、６３．３ｎＭ及び１５．５ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ標的とした。抗体ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１（Ｏ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＰＲ）６、（ＰＲ）１０及び（ＰＲ）２０を、２００ｎＭ超、３１．７ｎＭ及び１１．３ｎＭのＥＣ５０での結合親和性に���りそれぞれ認識した。抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１（Ｐ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＰＡ）５、（ＰＡ）６、（ＰＡ）１０及び（ＰＡ）２０に、２６．９ｎＭ、４．３ｎＭ、０．０６ｎＭ及び０．０６ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ結合した。
【図７−３】選択されたＮＩ−３０８抗体の、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質リピート長さ依存的な結合。（Ａ）選択されたＮＩ−３０８抗体のＣ９ｏｒｆ７２ポリＧＡリピート長さ依存的な結合のまとめ。（Ｂ）選択されたＮＩ−３０８抗体のＣ９ｏｒｆ７２ポリＧＰリピート長さ依存的な結合のまとめ。（Ｃ）選択されたＮＩ−３０８抗体のＣ９ｏｒｆ７２ポリＧＲリピート長さ依存的な結合のまとめ。（Ｄ）選択されたＮＩ−３０８抗体のＣ９ｏｒｆ７２ポリＰＲリピート長さ依存的な結合のまとめ。（Ｅ）選択されたＮＩ−３０８抗体のＣ９ｏｒｆ７２ポリＰＡリピート長さ依存的な結合のまとめ。Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質ペプチドについてのヒト由来ＮＩ−３０８抗体のジペプチドリピート長さ依存的結合特異性及び最大半量有効濃度（ＥＣ５０）の、間接的ＥＬＩＳＡによる決定。抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７（Ｆ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）５、（ＧＡ）６、（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０に、１５０ｎＭ超、７．９ｎＭ、０．３７ｎＭ及び０．５４ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ結合した。抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７（Ｇ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）６、（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０を、２００ｎＭ超、０．７８ｎＭ及び０．８３ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ認識した。抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１（Ｈ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）５、（ＧＡ）６、（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０を、２００ｎＭ超、６．３ｎＭ、０．９ｎＭ及び１．１ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ標的とした。抗体ＮＩ−３０８．４５Ｃ２（Ｉ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）６、（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０に、２００ｎＭ超、７．６ｎＭ及び９．６ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ結合した。抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２（Ｊ及びＫ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＰ）５、（ＧＰ）６、（ＧＰ）１０及び（ＧＰ）２０を、２００ｎＭ超、２６．８ｎＭ、０．９４ｎＭ及び０．４７ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ認識し、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）６、（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０を、２００ｎＭ超、５．７ｎＭ及び１８．２ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ認識した。抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１（Ｌ及びＭ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＲ）３、（ＧＲ）４、（ＧＲ）５、（ＧＲ）６、（ＧＲ）１０及び（ＧＲ）２０に、１４．３ｎＭ、１３．２ｎＭ、０．４７ｎＭ、０．３３ｎＭ、１．３ｎＭ及び０．２５ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ結合し、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）６、（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０に、２００ｎＭ超、２７．７ｎＭ及び３３．６ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ結合した。抗体ＮＩ−３０８．４６Ｅ９（Ｎ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＰ）１０及び（ＧＰ）２０を、６３．３ｎＭ及び１５．５ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ標的とした。抗体ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１（Ｏ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＰＲ）６、（ＰＲ）１０及び（ＰＲ）２０を、２００ｎＭ超、３１．７ｎＭ及び１１．３ｎＭのＥＣ５０での結合親和性に���りそれぞれ認識した。抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１（Ｐ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＰＡ）５、（ＰＡ）６、（ＰＡ）１０及び（ＰＡ）２０に、２６．９ｎＭ、４．３ｎＭ、０．０６ｎＭ及び０．０６ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ結合した。
【図７−４】選択されたＮＩ−３０８抗体の、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質リピート長さ依存的な結合。（Ａ）選択されたＮＩ−３０８抗体のＣ９ｏｒｆ７２ポリＧＡリピート長さ依存的な結合のまとめ。（Ｂ）選択されたＮＩ−３０８抗体のＣ９ｏｒｆ７２ポリＧＰリピート長さ依存的な結合のまとめ。（Ｃ）選択されたＮＩ−３０８抗体のＣ９ｏｒｆ７２ポリＧＲリピート長さ依存的な結合のまとめ。（Ｄ）選択されたＮＩ−３０８抗体のＣ９ｏｒｆ７２ポリＰＲリピート長さ依存的な結合のまとめ。（Ｅ）選択されたＮＩ−３０８抗体のＣ９ｏｒｆ７２ポリＰＡリピート長さ依存的な結合のまとめ。Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質ペプチドについてのヒト由来ＮＩ−３０８抗体のジペプチドリピート長さ依存的結合特異性及び最大半量有効濃度（ＥＣ５０）の、間接的ＥＬＩＳＡによる決定。抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７（Ｆ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）５、（ＧＡ）６、（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０に、１５０ｎＭ超、７．９ｎＭ、０．３７ｎＭ及び０．５４ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ結合した。抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７（Ｇ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）６、（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０を、２００ｎＭ超、０．７８ｎＭ及び０．８３ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ認識した。抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１（Ｈ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）５、（ＧＡ）６、（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０を、２００ｎＭ超、６．３ｎＭ、０．９ｎＭ及び１．１ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ標的とした。抗体ＮＩ−３０８．４５Ｃ２（Ｉ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）６、（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０に、２００ｎＭ超、７．６ｎＭ及び９．６ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ結合した。抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２（Ｊ及びＫ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＰ）５、（ＧＰ）６、（ＧＰ）１０及び（ＧＰ）２０を、２００ｎＭ超、２６．８ｎＭ、０．９４ｎＭ及び０．４７ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ認識し、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）６、（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０を、２００ｎＭ超、５．７ｎＭ及び１８．２ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ認識した。抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１（Ｌ及びＭ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＲ）３、（ＧＲ）４、（ＧＲ）５、（ＧＲ）６、（ＧＲ）１０及び（ＧＲ）２０に、１４．３ｎＭ、１３．２ｎＭ、０．４７ｎＭ、０．３３ｎＭ、１．３ｎＭ及び０．２５ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ結合し、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）６、（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０に、２００ｎＭ超、２７．７ｎＭ及び３３．６ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ結合した。抗体ＮＩ−３０８．４６Ｅ９（Ｎ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＰ）１０及び（ＧＰ）２０を、６３．３ｎＭ及び１５．５ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ標的とした。抗体ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１（Ｏ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＰＲ）６、（ＰＲ）１０及び（ＰＲ）２０を、２００ｎＭ超、３１．７ｎＭ及び１１．３ｎＭのＥＣ５０での結合親和性に���りそれぞれ認識した。抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１（Ｐ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＰＡ）５、（ＰＡ）６、（ＰＡ）１０及び（ＰＡ）２０に、２６．９ｎＭ、４．３ｎＭ、０．０６ｎＭ及び０．０６ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ結合した。
【図７−５】選択されたＮＩ−３０８抗体の、Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質リピート長さ依存的な結合。（Ａ）選択されたＮＩ−３０８抗体のＣ９ｏｒｆ７２ポリＧＡリピート長さ依存的な結合のまとめ。（Ｂ）選択されたＮＩ−３０８抗体のＣ９ｏｒｆ７２ポリＧＰリピート長さ依存的な結合のまとめ。（Ｃ）選択されたＮＩ−３０８抗体のＣ９ｏｒｆ７２ポリＧＲリピート長さ依存的な結合のまとめ。（Ｄ）選択されたＮＩ−３０８抗体のＣ９ｏｒｆ７２ポリＰＲリピート長さ依存的な結合のまとめ。（Ｅ）選択されたＮＩ−３０８抗体のＣ９ｏｒｆ７２ポリＰＡリピート長さ依存的な結合のまとめ。Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質ペプチドについてのヒト由来ＮＩ−３０８抗体のジペプチドリピート長さ依存的結合特異性及び最大半量有効濃度（ＥＣ５０）の、間接的ＥＬＩＳＡによる決定。抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７（Ｆ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）５、（ＧＡ）６、（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０に、１５０ｎＭ超、７．９ｎＭ、０．３７ｎＭ及び０．５４ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ結合した。抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７（Ｇ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）６、（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０を、２００ｎＭ超、０．７８ｎＭ及び０．８３ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ認識した。抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１（Ｈ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）５、（ＧＡ）６、（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０を、２００ｎＭ超、６．３ｎＭ、０．９ｎＭ及び１．１ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ標的とした。抗体ＮＩ−３０８．４５Ｃ２（Ｉ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）６、（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０に、２００ｎＭ超、７．６ｎＭ及び９．６ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ結合した。抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２（Ｊ及びＫ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＰ）５、（ＧＰ）６、（ＧＰ）１０及び（ＧＰ）２０を、２００ｎＭ超、２６．８ｎＭ、０．９４ｎＭ及び０．４７ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ認識し、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）６、（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０を、２００ｎＭ超、５．７ｎＭ及び１８．２ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ認識した。抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１（Ｌ及びＭ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＲ）３、（ＧＲ）４、（ＧＲ）５、（ＧＲ）６、（ＧＲ）１０及び（ＧＲ）２０に、１４．３ｎＭ、１３．２ｎＭ、０．４７ｎＭ、０．３３ｎＭ、１．３ｎＭ及び０．２５ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ結合し、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）６、（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０に、２００ｎＭ超、２７．７ｎＭ及び３３．６ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ結合した。抗体ＮＩ−３０８．４６Ｅ９（Ｎ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＰ）１０及び（ＧＰ）２０を、６３．３ｎＭ及び１５．５ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ標的とした。抗体ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１（Ｏ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＰＲ）６、（ＰＲ）１０及び（ＰＲ）２０を、２００ｎＭ超、３１．７ｎＭ及び１１．３ｎＭのＥＣ５０での結合親和性に���りそれぞれ認識した。抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１（Ｐ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＰＡ）５、（ＰＡ）６、（ＰＡ）１０及び（ＰＡ）２０に、２６．９ｎＭ、４．３ｎＭ、０．０６ｎＭ及び０．０６ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ結合した。
【図８−１】選択されたＮＩ−３０８抗体の、Ｃ９ｏｒｆ７２ポリＧＡ  ＤＰＲタンパク質リピート長さ依存的な結合及びＣ９ｏｒｆ７２ポリＧＰ  ＤＰＲタンパク質リピート長さ依存的な結合。（Ａ）選択されたＮＩ−３０８抗体のＣ９ｏｒｆ７２ポリＧＡリピート長さ依存的な結合のまとめ。（Ｂ）選択されたＮＩ−３０８抗体のＣ９ｏｒｆ７２ポリＧＰリピート長さ依存的な結合のまとめ。Ｃ９ｏｒｆ７２ポリＧＡジペプチドリピートタンパク質ペプチド又はＣ９ｏｒｆ７２ポリＧＰジペプチドリピートタンパク質ペプチについてのヒト由来ＮＩ−３０８抗体のジペプチドリピート長さ依存的結合特異性及び最大半量有効濃度（ＥＣ５０）の、サンドイッチＥＬＩＳＡによる決定。抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７（Ｃ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０に、４００ｎＭ超及び９．０ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ溶液中で結合した。抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７（Ｄ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０を、０．３４ｎＭ及び０．４５ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ溶液中で認識した。抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１（Ｅ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０を、０．４６ｎＭ及び０．４０ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ溶液中で標的とした。抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２（Ｆ）は、ただ１つのＤＰＲタンパク質ペプチド（ＧＰ）２０のみを３８．２ｎＭのＥＣ５０での結合親和性により溶液中で認識した。
【図８−２】選択されたＮＩ−３０８抗体の、Ｃ９ｏｒｆ７２ポリＧＡ  ＤＰＲタンパク質リピート長さ依存的な結合及びＣ９ｏｒｆ７２ポリＧＰ  ＤＰＲタンパク質リピート長さ依存的な結合。（Ａ）選択されたＮＩ−３０８抗体のＣ９ｏｒｆ７２ポリＧＡリピート長さ依存的な結合のまとめ。（Ｂ）選択されたＮＩ−３０８抗体のＣ９ｏｒｆ７２ポリＧＰリピート長さ依存的な結合のまとめ。Ｃ９ｏｒｆ７２ポリＧＡジペプチドリピートタンパク質ペプチド又はＣ９ｏｒｆ７２ポリＧＰジペプチドリピートタンパク質ペプチについてのヒト由来ＮＩ−３０８抗体のジペプチドリピート長さ依存的結合特異性及び最大半量有効濃度（ＥＣ５０）の、サンドイッチＥＬＩＳＡによる決定。抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７（Ｃ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０に、４００ｎＭ超及び９．０ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ溶液中で結合した。抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７（Ｄ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０を、０．３４ｎＭ及び０．４５ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ溶液中で認識した。抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１（Ｅ）は、ＤＰＲタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１０及び（ＧＡ）２０を、０．４６ｎＭ及び０．４０ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ溶液中で標的とした。抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２（Ｆ）は、ただ１つのＤＰＲタンパク質ペプチド（ＧＰ）２０のみを３８．２ｎＭのＥＣ５０での結合親和性により溶液中で認識した。
【図９】Ｃ９ｏｒｆ７２（ＧＡ）２０ジペプチドリピートタンパク質ペプチドのモノマー調製物及び凝集型調製物についての、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７抗体及びＮＩ−３０８．１５Ｏ７抗体の結合特異性及び結合親和性。
【図１０】透過電子顕微鏡法によるインビトロＣ９ｏｒｆ７２（ＧＡ）２０ＤＰＲタンパク質ペプチド調製物の特徴づけ。非凝集型（モノマー型、Ａ）及びアミロイド原線維様凝集型（凝集型、Ｂ）の（ＧＡ）２０ＤＰＲタンパク質ペプチド調製物の代表的な画像。倍率：６６ｋ。スケールバー：０．５μｍ。
【図１１】間接的ＥＬＩＳＡ結合アッセイによる、モノマー型及び凝集型のＣ９ｏｒｆ７２（ＧＡ）２０ＤＰＲタンパク質ペプチド調製物についての、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７及びＮＩ−３０８．１５Ｏ７の結合特異性及びＥＣ５０決定。間接的ＥＬＩＳＡを使用する、モノマー型（●）及び凝集型（■）のＣ９ｏｒｆ７２（ＧＡ）２０ＤＰＲタンパク質ペプチド調製物についての、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７抗体及びＮＩ−３０８．１５Ｏ７抗体の結合特異性及びＥＣ５０決定。抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７（Ａ）は、モノマー型及び凝集型の（ＧＡ）２０調製物を、０．８７ｎＭ及び０．８９ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ認識した。抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７（Ｂ）は、モノマー型及び凝集型の（ＧＡ）２０調製物に、０．５３ｎＭ及び０．７８ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ結合した。
【図１２−１】サンドイッチＥＬＩＳＡ結合アッセイによる、モノマー型及び凝集型のＣ９ｏｒｆ７２（ＧＡ）２０ＤＰＲタンパク質ペプチド調製物についての、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７及びＮＩ−３０８．１５Ｏ７の結合特異性及びＥＣ５０決定。サンドイッチＥＬＩＳＡを使用する、モノマー型（●）及び凝集型（■）のＣ９ｏｒｆ７２（ＧＡ）２０ＤＰＲタンパク質ペプチド調製物についての、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７抗体及びＮＩ−３０８．１５Ｏ７抗体の結合特異性及びＥＣ５０決定。抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７（Ａ）は、モノマー型及び凝集型の（ＧＡ）２０調製物を、０．６４ｎＭ及び２．９ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ認識した。抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７（Ｂ）は、モノマー型及び凝集型の（ＧＡ）２０調製物に、６．３ｎＭ及び８．１ｎＭのＥＣ５０によりそれぞれ結合した。抗体結合がｈｉｓタグ型（ＧＡ）２０調製物の非存在下では検出されなかった（白三角）。結合特異性及び結合親和性が図９の表にまとめられている。
【図１２−２】サンドイッチＥＬＩＳＡ結合アッセイによる、モノマー型及び凝集型のＣ９ｏｒｆ７２（ＧＡ）２０ＤＰＲタンパク質ペプチド調製物についての、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７及びＮＩ−３０８．１５Ｏ７の結合特異性及びＥＣ５０決定。サンドイッチＥＬＩＳＡを使用する、モノマー型（●）及び凝集型（■）のＣ９ｏｒｆ７２（ＧＡ）２０ＤＰＲタンパク質ペプチド調製物についての、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７抗体及びＮＩ−３０８．１５Ｏ７抗体の結合特異性及びＥＣ５０決定。抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７（Ａ）は、モノマー型及び凝集型の（ＧＡ）２０調製物を、０．６４ｎＭ及び２．９ｎＭのＥＣ５０での結合親和性によりそれぞれ認識した。抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７（Ｂ）は、モノマー型及び凝集型の（ＧＡ）２０調製物に、６．３ｎＭ及び８．１ｎＭのＥＣ５０によりそれぞれ結合した。抗体結合がｈｉｓタグ型（ＧＡ）２０調製物の非存在下では検出されなかった（白三角）。結合特異性及び結合親和性が図９の表にまとめられている。
【図１３】ＮＩ−３０８抗体完全性分析。５μｇの組換えヒト由来ＮＩ−３０８抗Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲ抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、その後のクーマシーブルー染色。予想されたサイズにおける抗体の重鎖及び軽鎖に対応する２つの主要なバンドが検出された。
【図１４−１】ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．５Ｇ２及びＮＩ−３０８．４Ｍ１により、病理学的なＣ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質凝集物がＦＴＬＤ患者において検出される。（Ａ）ヒト由来のＮＩ−３０８．１８Ｆ７抗体、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７抗体及びＮＩ−３０８．５Ｇ２抗体により、病理学的なニューロン細胞質封入体、ニューロン核内封入体及び異栄養性神経突起が３名すべての試験されたＣ９ｏｒｆ７２−ＦＴＬＤ症例の小脳の顆粒細胞層において明らかにされた。対照的に、非神経学的なコントロール小脳は、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７染色、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７染色及びＮＩ−３０８．５Ｇ２染色について陰性であった。市販抗体Ｃ９ＲＡＮＴをコントロール抗体として使用した。代表的な画像が示される。（Ｂ）抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７及び抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２によって検出される、選択されたＣ９ｏｒｆ７２−ＦＴＬＤ症例の小脳の顆粒細胞層におけるニューロンのＣ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲ封入体の代表的な高倍率画像。（Ｃ）抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１によって検出される、選択されたＣ９ｏｒｆ７２−ＦＴＬＤ症例の小脳の顆粒細胞層におけるニューロンの細胞質及び核内のＣ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲ封入体の代表的な高倍率画像。対照的に、非神経学的なコントロール小脳はＮＩ−３０８．４Ｍ１染色について陰性であった。
【図１４−２】ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．５Ｇ２及びＮＩ−３０８．４Ｍ１により、病理学的なＣ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質凝集物がＦＴＬＤ患者において検出される。（Ａ）ヒト由来のＮＩ−３０８．１８Ｆ７抗体、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７抗体及びＮＩ−３０８．５Ｇ２抗体により、病理学的なニューロン細胞質封入体、ニューロン核内封入体及び異栄養性神経突起が３名すべての試験されたＣ９ｏｒｆ７２−ＦＴＬＤ症例の小脳の顆粒細胞層において明らかにされた。対照的に、非神経学的なコントロール小脳は、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７染色、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７染色及びＮＩ−３０８．５Ｇ２染色について陰性であった。市販抗体Ｃ９ＲＡＮＴをコントロール抗体として使用した。代表的な画像が示される。（Ｂ）抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７及び抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２によって検出される、選択されたＣ９ｏｒｆ７２−ＦＴＬＤ症例の小脳の顆粒細胞層におけるニューロンのＣ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲ封入体の代表的な高倍率画像。（Ｃ）抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１によって検出される、選択されたＣ９ｏｒｆ７２−ＦＴＬＤ症例の小脳の顆粒細胞層におけるニューロンの細胞質及び核内のＣ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲ封入体の代表的な高倍率画像。対照的に、非神経学的なコントロール小脳はＮＩ−３０８．４Ｍ１染色について陰性であった。
【図１５】Ｃ９ｏｒｆ７２ポリＧＡ  ＤＰＲタンパク質と、Ｃ９ｏｒｆ７２ポリＧＰ  ＤＰＲタンパク質とは共凝集物を形成する。病理学的なＣ９ｏｒｆ７２ポリＧＡ  ＤＰＲタンパク質及びＣ９ｏｒｆ７２ポリＧＰ  ＤＰＲタンパク質の存在は、Ｃ９ｏｒｆ７２ヘキサヌクレオチドリピート伸長を有するヒトＦＴＬＤ患者の小脳の顆粒層において共凝集を生じさせる。ＮＩ−３０８．１８Ｆ７により、Ｃ９ｏｒｆ７２ポリＧＡが認識され、これに対して、抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２により、Ｃ９ｏｒｆ７２ポリＧＰの細胞質封入体及び核内封入体が特異的に検出された。ポリＧＰ  ＤＰＲタンパク質凝集物の大多数が、ポリＧＡ凝集物と共局在化した。代表的な画像が示される。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は一般には、ジペプチドリピート（ＤＰＲ）タンパク質の存在に伴う、特にその凝集型形態の存在に伴う疾患及び状態を検出するための免疫療法方法及び非侵襲的方法に関連する。より具体的には、本発明は、選択されたヒトドナー集団から得られる配列情報に基づいて作製された組換えヒト由来モノクローナル抗体及びその抗原結合フラグメントで、そのようなＤＰＲ（具体的にはポリ−グリシン−アラニン（Ｇｌｙ−Ａｌａ；ＧＡ）−ＤＰＲ、ポリ−グリシン−プロリン（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ；ＧＰ）−ＤＰＲ、ポリ−グリシン−アルギニン（Ｇｌｙ−Ａｒｇ；ＧＲ）−ＤＰＲ、ポリ−プロリン−アルギニン（Ｐｒｏ−Ａｒｇ；ＰＲ）−ＤＰＲ及び／又はポリ−プロリン−アラニン（Ｐｒｏ−Ａｌａ；ＰＡ）−ＤＰＲ）及びそれらの抗原に結合することができる組換えヒト由来モノクローナル抗体及びその抗原結合フラグメントに関連する。本発明の組換えヒト由来モノクローナル抗体、並びに、その合成誘導体及び生物工学誘導体は好都合には、Ｃ９ＯＲＦ７２−ジペプチドリピート（ＤＰＲ）を形成する、伸長したヘキサヌクレオチドリピートを有する変化したＣ９ＯＲＦ７２に特異的に結合することによって特徴づけられる。実施例において示されるように、本発明の組換え抗体は、ＤＰＲ及び／又は病理学的Ｃ９ＯＲＦ７２を、偽陽性を与えることなく検出するための診断試薬として非常に特異的であり、また、可変領域及びＣＤＲを少なくともコードする配列がそれぞれヒト起源であることのために、そして、ヒト身体における元の抗体の成熟のために、治療剤として有効かつ安全であると予想され得ることは無理のないことである。
【００３６】
加えて、本発明は、患者の処置において単独で、或いは、ＤＰＲに伴う疾患、障害及び／又は症状のために利用される他の薬剤との組合せでのどちらでも使用されるための本明細書中に記載されるようなヒト由来モノクローナル抗体（そのどのような生物工学誘導体であっても含む）に関連し、好ましくは、本発明の抗体は、さらなる副作用を抑制する薬剤と同時に投与されるために、或いは、副作用を抑制する薬剤の投与前又は投与後において連続して投与されるために設計される。これに関連して、本発明の抗ＤＰＲ抗体は好ましくは、ヒトにおいて実質的に非免疫原性である。本発明の１つの実施形態において、本発明のヒト由来モノクローナル抗体と、ＤＰＲに伴う疾患、障害及び／又は症状のために利用される１つ又は複数の薬物との両方を含む医薬組成物が提供される。
【００３７】
Ｉ．定義
別途言及されない限り、本明細書中で使用されるような用語には、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７年、２０００年改訂及び２００３年再版、ＩＳＢＮ  ０  １９  ８５０６７３  ２）において提供されるような定義が与えられる。
【００３８】
用語「ａ」又は「ａｎ」を伴う実体はそのような実体の１つ又は複数を示すことに留意しなければならない；例えば、「ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ」（抗体）は１つ又は複数の抗体を表すことが理解される。そのようなものとして、用語「ａ」（又は「ａｎ」）、  「ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ」（１つ又は複数）及び  「ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ」（少なくとも１つ）は、本明細書中では交換可能に使用され得る。
【００３９】
具体的に別途示されないならば、用語「ＤＰＲ」、すなわち、「ジペプチドリピート」タンパク質は、２アミノ酸の繰り返し単位、具体的には、遺伝子における伸長したヘキサヌクレオチドリピートに起因する２アミノ酸の繰り返し単位を特に示すために本明細書中では使用される。用語「ＤＰＲ」及び「ＤＰＲｓ」はまた、ＤＰＲのすべてのタイプ及び形態、例えば、ＧＡ、ＧＲ、ＧＰ、ＰＡ、ＰＲなどを総称的に示すために使用される。下記では、本発明は主に、ＦＬＴＤ又はＡＬＳに罹患する患者の脳組織に見出されるＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲタンパク質において一般に認められるＧＡ、好ましくは１５回のリピートを有するＧＡ（ＧＡ１５）、ＧＰ、好ましくは１５回のリピートを有するＧＰ（ＧＰ１５）、ＧＲ、好ましくは１５回のリピートを有するＧＲ（ＧＲ１５）、又は、ＰＲ、好ましくは１５回のリピートを有するＰＲ（ＰＲ１５）、又は、ＰＡ、好ましくは１５回のリピートを有するＰＡ（ＰＡ１５）のいずれかを含むＤＰＲ、或いは、それらのいずれかからなるＤＰＲを特異的に認識する抗体に関して記載される。しかしながら、抗Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲ抗体により、好ましい実施形態が表されるにもかかわらず、本発明は一般に、抗ＤＰＲタンパク質抗体及び対応する実施形態を提供する。したがって、原理的には、本明細書中に開示され、また、実施例及び図において例示される実施形態及び対応する特徴はどれも、抗Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲのみに対して明確に適用可能でない場合を除き、一般にはどのような抗ＤＰＲタンパク質抗体にも当てはまることもまた意味されることが強調される。
【００４０】
ＤＰＲ関連疾患についての別の一例が脊髄小脳失調症３６型であり、これは、成人発症の歩行運動失調及び四肢運動失調、下肢痙縮、構音障害、筋攣縮、舌萎縮並びに反射亢進によって特徴づけられる緩徐進行性の神経変性障害で、常染色体優性小脳失調症１型（ＡＤＣＡ１型）のサブタイプの１つである。一部の罹患者はまた、難聴を発症することがあり得る；例えば、Ｇａｒｃｉａ−Ｍｕｒｉａｓ他、Ｂｒａｉｎ  １３５（２０１２）、１４２３〜１４３５を参照のこと。脊髄小脳失調症３６型は、染色体２０ｐ１３上のＮＯＰ５６遺伝子におけるイントロンのＧＧＣＣＴＧヘキサヌクレオチドリピートのヘテロ接合性伸長によって引き起こされることが示された；例えば、下記を参照のこと：Ｇａｒｃｉａ−Ｍｕｒｉａｓ他、Ｂｒａｉｎ  １３５（２０１２）、１４２３〜１４３５；Ｉｋｅｄａ他、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ７９（２０１２）、３３３〜３４１；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ他、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．８９（２０１１）、１２１〜１３０。
【００４１】
用語「Ｃ９ＯＲＦ７２」は、具体的に別途示さないならば、第９染色体のオープンリーディングフレーム７２（Ｃ９ＯＲＦ７２）の変化した様々な形態を示す。用語「Ｃ９ＯＲＦ７２」はまた、Ｃ９ＯＲＦ７２−ジペプチドリピート（ＤＰＲ）をもたらすＣ９ＯＲＦ７２ヘキサヌクレオチド伸長を一般に特定するために使用される。したがって、この用語はまた、Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲを示すために使用される。用語「Ｃ９ＯＲＦ７２」はまた、Ｃ９ＯＲＦ７２のすべてのタイプ及び形態（例えば、変異したＣ９ＯＲＦ７２など）を総称的に示すために使用される。用語Ｃ９ＯＲＦ７２の前における加えられた文字は、その特定のオルソログが由来する生物を示すために使用され、例えば、ｈＣ９ＯＲＦ７２がヒトＣ９ＯＲＦ７２について使用され、又は、ｍＣ９ＯＲＦ７２がマウス起源について使用される。
【００４２】
本明細書中に開示される抗ＤＰＲ抗体は好ましくは、Ｃ９ＯＲＦ７２−ジペプチドリピート（ＤＰＲ）及びそのエピトープと結合する。例えば、本明細書中には、病理学的に変化したＣ９ＯＲＦ７２種又はそのフラグメント、すなわち、イントロンの伸長したＣ９ＯＲＦ７２ヘキサヌクレオチドリピートのＣ９ＯＲＦ７２転写物から非通常的に翻訳されるジペプチドリピート、並びに、Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲ又はそのフラグメントの凝集型形態と特異的に結合する抗体が開示される。Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲの（病理学的に）凝集した／凝集物という用語は、上述の形態を特に示すために本明細書中では使用される。（病理学的な）「凝集型形態」又は「凝集物」という用語は、本明細書中で使用される場合、イントロンの伸長したＣ９ＯＲＦ７２ヘキサヌクレオチドリピートのＣ９ＯＲＦ７２転写物から生じるＣ９ＯＲＦ７２の誤った翻訳／病理学的な翻訳に起因する蓄積又はクラスター形成の産物を記述する。これらの凝集物、蓄積物又はクラスター形態は、Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲタンパク質及び／又はそのフラグメントの両方である場合があり、Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲタンパク質及び／又はそのフラグメントの両方から実質的になる場合があり、或いは、Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲタンパク質及び／又はそのフラグメントの両方からなる場合がある。本明細書中で使用される場合、Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲと「特異的に結合する」、「選択的に結合する」、又は「優先的に結合する」抗体に対する言及は、他の無関係なタンパク質とは結合しない抗体を示す；例えば、図４を参照のこと。図４及び実施例５において示されるように、本発明の抗体は、対らせん状細線維（ＰＨＦ）−タウ、ＴＡＵ、トランス活性応答ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ−４３）、トランスチレチン（ＴＴＲ）、全長アミロイド前駆体タンパク質（ｆｌＡＰＰ）及び／又はハンチンチン（ＨＴＴ）からなる群から選択される無関係なアミロイド形成タンパク質を実質的に認識しない。
【００４３】
一例において、本明細書中に開示されるＣ９ＯＲＦ７２抗体はＤＰＲ及び／又はＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲ或いはそれらのエピトープと結合することができ、かつ、他のタンパク質についてはバックグランドの約２倍を超える結合を示さない。ＤＰＲ及び／又はＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲタンパク質変異体と「特異的に結合する」、又は「選択的に結合する」抗体は、Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲタンパク質のすべての変異体とは結合しない抗体、すなわち、少なくとも１つの他のＣ９ＯＲＦ７２配座異性体とは結合しない抗体を示す。例えば、本明細書中には、ＤＰＲを形成する伸長したヘキサヌクレオチドリピートを示すＣ９ＯＲＦ７２の様々な形態にインビトロにおいて、また、Ｃ９ＯＲＦ７２に伴う疾患を有する患者、又は、Ｃ９ＯＲＦ７２に伴う疾患を発症する危険性がある患者から得られる組織において両方で優先的に結合することができる抗体が開示される；例えば、実施例８及び図７を参照のこと。
【００４４】
本発明の抗ＤＰＲ抗体はヒト対象から単離されているので、本発明のＤＰＲ抗体はまた、そのような抗体が実際にヒト対象によって最初に発現されたものであり、例えば、ヒト免疫グロブリンを発現するファージライブラリーによって生じる合成構築物でないこと、また、ヒト免疫グロブリンレパートリーの一部を発現する遺伝子導入動物において生じる異種抗体でないことを強調するために（なお、それらはこれまで、ヒト様抗体を提供するために試みるための１つの一般的な方法を表していた）、「ヒト自己抗体」又は「ヒト由来抗体」と呼ばれる場合がある。他方で、本発明のヒト由来抗体は、プロテインＡカラム又は親和性カラムによって精製されることがあるヒト血清抗体そのものから区別するために、合成（的）、組換え（型）及び／又は生物工学（的）であると示される場合がある。
【００４５】
本発明の治療的取り組みの具体的な利点の１つが、本発明の抗体は、ＤＰＲタンパク質及びその凝集型形態の出現を示す疾患、又は、ＤＰＲタンパク質及びその凝集型形態に関連づけられる疾患の徴候を何ら有しない健康なヒト対象から得られるＢ細胞又はＢメモリー細胞に由来し、したがって、ある程度の確率で、凝集型のＤＰＲタンパク質（例えば、Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲなど）に関連づけられる臨床的に明白な疾患を防止することができる、或いは、そのような臨床的に明白な疾患の出現の危険性を減らすことができる、或いは、そのような臨床的に明白な疾患の発症又は進行を遅らせることができるという事実にある。
【００４６】
典型的には、本発明の抗体はまた、体細胞変異、すなわち、抗体の可変領域の体細胞変化による標的ＤＰＲ分子に対する高親和性結合における選択性及び有効性に関しての最適化を既に首尾良く経ている。そのような細胞は生体内において、例えば、ヒト体内において、自己免疫学的反応又はアレルギー反応の意味で、関連した又は他の生理学的なタンパク質又は細胞構造によって活性化されていないという認識はまた、臨床試験段階を首尾よく生き残るという相当に増大した可能性がこれにより意味されるので、非常に医学的に重要である。いわば、効率、許容性及び耐容性が、少なくとも１名のヒト対象において予防用抗体又は治療用抗体の前臨床開発及び臨床開発の前に既に実証されている。したがって、本発明のヒト由来の抗ＤＰＲ抗体は、治療剤としてのその標的構造特異的な効率と、副作用のその低下した可能性との両方により、成功のその臨床的可能性を著しく増大させることが予想され得る。
【００４７】
対照的に、ｃＤＮＡライブラリー又はファージディスプレーに由来する抗体は、人為的な分子であり、例えば、依然としてマウス起源であり、したがって、ヒト身体に対しては外来であるヒト化抗体などである。したがって、治療用抗体の臨床上の有用性及び効力が、抗体の効力及び薬物動態学に影響を及ぼし得る、また、ときには重大な副作用を引き起こし得る抗薬物抗体（ＡＤＡ）の産生によって制限される可能性がある；例えば、Ｉｇａｗａ他、ＭＡｂｓ．３（２０１１）、２４３〜２５２を参照のこと。具体的には、ヒト化抗体、すなわち、近年のヒト抗体作製技術により作製される抗体は、ヒト由来抗体（例えば、本発明のヒト由来抗体など）とは対照的に、抗体応答を誘発しやすく、これらの抗体は、例えば、ファージディスプレーに由来するこれらのヒト様抗体、例えば、アダリムマブなどは、ＡＤＡ産生を誘発することが報告されている；例えば、Ｍａｎｓｏｕｒ、Ｂｒ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  ９１（２００７）、２７４〜２７６、及び、Ｉｇａｗａ他、ＭＡｂｓ．３（２０１１）、２４３〜２５２を参照のこと。したがって、望まれない免疫応答を生じさせる傾向がないヒト由来抗体は、患者のためには、ライブラリー又はディスプレイに由来する人為的な分子よりも有益である。
【００４８】
用語「ペプチド」は、その意味の範囲内において、（時には本明細書中では交換可能に使用されることがある）用語「ポリペプチド」及び用語「タンパク質」を包含することが理解される。同様に、タンパク質及びポリペプチドのフラグメントもまた包含され、タンパク質及びポリペプチドのフラグメントは本明細書中では「ペプチド」と称される場合がある。それにもかかわらず、用語「ペプチド」は好ましくは、少なくとも５個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸ポリマーを意味し、好ましくは少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸ポリマーを意味し、より好ましくは少なくとも１５個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸ポリマーを意味し、さらにより好ましくは少なくとも２０個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸ポリマーを意味し、特に好ましくは少なくとも２５個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸ポリマーを意味する。加えて、本発明によるペプチドは典型的には、最大でも１００個の連続するアミノ酸、好ましくは８０個未満の連続するアミノ酸、より好ましくは５０個未満の連続するアミノ酸を有する。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、１つだけの「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を包含することが意図され、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）によって直鎖状に連結されるモノマー（アミノ酸）から構成される分子を示す。用語「ポリペプチド」は、２個以上のアミノ酸の任意の鎖（１つ又は複数）を示し、生成物の特定の長さを示さない。したがって、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「オリゴペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は、２個以上のアミノ酸の鎖（１つ又は複数）を示すために使用される任意の他の用語が、「ポリペプチド」の定義の範囲に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりに、又は、これらの用語のどれとも交換可能に使用される場合がある。
【００５０】
用語「ポリペプチド」はまた、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、及び、知られている保護基／ブロック基、タンパク質分解的切断による誘導体化、又は、天然に存在しないアミノ酸による修飾を含めて、当該ポリペプチドの発現後修飾の産物を示すことが意図される。ポリペプチドは天然の生物学的供給源に由来してもよく、又は、組換え技術によって産生されてもよいが、指定された核酸配列から必ずしも翻訳されない。ポリペプチドは、化学合成による様式を含めて、どのような様式において作製されてもよい。
【００５１】
本発明のポリペプチドは、約３個以上のアミノ酸のサイズ、５個以上のアミノ酸のサイズ、１０個以上のアミノ酸のサイズ、２０個以上のアミノ酸のサイズ、２５個以上のアミノ酸のサイズ、５０個以上のアミノ酸のサイズ、７５個以上のアミノ酸のサイズ、１００個以上のアミノ酸のサイズ、２００個以上のアミノ酸のサイズ、５００個以上のアミノ酸のサイズ、１，０００個以上のアミノ酸、又は、２，０００個以上のアミノ酸のサイズである場合がある。ポリペプチドは、規定された三次元構造を有する場合があるが、ポリペプチドはそのような構造を必ずしも有さない。規定された三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれたとして示される。規定された三次元構造を有するのではなく、むしろ、非常に多数の異なる立体配座を取ることができるポリペプチドは、折り畳まれていないとして示される。本明細書中で使用される場合、糖タンパク質という用語は、アミノ酸残基（例えば、セリン残基又はアスパラギン残基）の酸素含有側鎖又は窒素含有側鎖を介して当該タンパク質に結合する少なくとも１つの炭水化物成分に連結されるタンパク質を示す。
【００５２】
「単離された」ポリペプチドあるいはそのフラグメント、変異体又は誘導体によって、その天然の環境に存在していないポリペプチドが意図される。特定の精製レベルは何ら要求されない。例えば、単離されたポリペプチドはそのネイティブ環境又は天然の環境から取り出され得る。宿主細胞において発現される組換え産生されたポリペプチド及びタンパク質は、任意の好適な技術によって分離されているか、分画されているか、あるいは、部分的又は実質的に精製されているネイティブポリペプチド又は組換えポリペプチドのように、本発明の様々な目的のために単離されていると見なされる。
【００５３】
「組換え（の）ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質」は、組換えＤＮＡ技術によって産生される、すなわち、所望されるペプチドを含む融合タンパク質をコードする外因性の組換えＤＮＡ発現構築物によって形質転換される細胞（微生物細胞又は哺乳動物細胞）から産生される、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を示す。ほとんどの細菌培養物において発現されるタンパク質又はペプチドは典型的にはグリカンを含まないであろう。酵母において発現されるタンパク質又はペプチドは、哺乳動物細胞において発現されるものとは異なるグリコシル化パターンを有する場合がある。
【００５４】
本発明のポリペプチドとして、前記ポリペプチドのフラグメント、誘導体、アナログ又は変異体、及びそれらの合成または生物学的変異体、並びに、それらの任意の組合せも含まれる。用語「フラグメント」、「変異体」、「誘導体」及び「アナログ」には、天然ペプチドのアミノ酸配列に十分に類似するアミノ酸配列を有するペプチド及びポリペプチドが含まれる。用語「十分に類似する」は、第１のアミノ酸配列及び第２のアミノ酸配列が共通の構造的ドメイン及び／又は共通の機能的活性を有するように、第２のアミノ酸配列に対する十分な数又は最小数の同一アミノ酸残基又は等価なアミノ酸残基を含有する第１のアミノ酸配列を意味する。例えば、共通の構造的ドメインを含むアミノ酸配列で、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は少なくとも約１００％が同一であるアミノ酸配列は、十分に類似するとして本明細書中では定義される。好ましくは、変異体は、本発明の好ましいペプチドのアミノ酸配列に、特に、変化したＣ９ＯＲＦ７２タンパク質（病理学的Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲｓやＤＰＲ単独など）、あるいは、それらのどちらかの変異体、誘導体又はアナログのアミノ酸配列に十分に類似しているであろう。そのような変異体は一般に、本発明のペプチドの機能的活性を保持する。変異体には、１つ又は複数のアミノ酸欠失、アミノ酸付加及び／又はアミノ酸置換によって生来型ペプチド及びｗｔ型ペプチドとはアミノ酸配列においてそれぞれ異なるペプチドが含まれる。これらは、天然に存在する変異体、ならびに、人為的に設計された変異体である場合がある。
【００５５】
さらに、用語「フラグメント」、「変異体」、「誘導体」及び「アナログ」は、本発明の抗体又は抗体ポリペプチドに言及するときには、対応する生来型の結合性分子、抗体又はポリペプチドの抗原結合特性の少なくとも一部を保持するどのようなポリペプチドも含まれる。本発明のポリペプチドのフラグメントには、本明細書中の他のところで議論される具体的な抗体フラグメントに加えて、タンパク質分解的フラグメント、ならびに、欠失フラグメントが含まれる。本発明の抗体及び抗体ポリペプチドの変異体には、上記で記載されるようなフラグメント、及び、アミノ酸の置換、欠失又は挿入に起因する変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドも含まれる。変異体は天然に存在している場合があり、又は、天然に存在していない場合がある。天然に存在していない変異体は、この技術分野において知られている変異誘発技術を使用して作製される場合がある。変異体ポリペプチドは、保存的又は非保存的なアミノ酸置換、アミノ酸欠失又はアミノ酸付加を含む場合がある。ＤＰＲタンパク質特異的な結合性分子の誘導体、例えば、本発明の抗体及び抗体ポリペプチドの誘導体は、生来型ポリペプチドに対して見出されないさらなる特徴を示すように変化させられているポリペプチドである。例には、融合タンパク質が挙げられる。変異体ポリペプチドは、本明細書中では「ポリペプチドアナログ」として示される場合もある。本明細書中で使用される場合、結合性分子もしくはそのフラグメント、抗体又は抗体ポリペプチドの「誘導体」は、官能側鎖基の反応によって化学的に誘導体化される１つ又は複数の残基を有する当該ポリペプチドを示す。また、「誘導体」として、２０個の標準的アミノ酸の１つ又は複数の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するそのようなペプチドも含まれる。例えば、４−ヒドロキシｐｒｏリンがｐｒｏリンの代わりに使用されてもよい；５−ヒドロキシリシンがリシンの代わりに使用されてもよい；３−メチルヒスチジンがヒスチジンの代わりに使用されてもよい；ホモセリンがセリンの代わりに使用されてもよい；また、オルニチンがリシンの代わりに使用されてもよい。
【００５６】
分子の類似性及び／又は同一性の決定：
２つのペプチドの間における「類似性」が、一方のペプチドのアミノ酸配列を第２のペプチドの配列に対して比較することによって求められる。一方のペプチドのアミノ酸が同一であるか、又は、保存的なアミノ酸置換であるならば、一方のペプチドのアミノ酸は第２のペプチドの対応するアミノ酸と類似している。保存的な置換には、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．編、Ｔｈｅ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９７８））に記載される置換、及び、Ａｒｇｏｓ、ＥＭＢＯ  Ｊ．８（１９８９）、７７９〜７８５に記載される置換が含まれる。例えば、下記の群の１つに属するアミノ酸は、保存的な変化又は置換を表す：−Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；−Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ；及び、−Ａｓｐ、Ｇｌｕ。
【００５７】
２つのポリヌクレオチドの間における「類似性」が、一方のポリヌクレオチドの核酸配列を所与のポリヌクレオチドの配列に対して比較することによって求められる。一方の核酸が同一であるならば、又は、核酸がコード配列の一部である場合、当該核酸を含むそれぞれのトリプレットが、同じアミノ酸又は保存的なアミノ酸置換をコードするならば、一方のポリヌクレオチドの核酸は第２のポリヌクレオチドの対応する核酸と類似している。
【００５８】
２つの配列の間におけるパーセント同一性又はパーセント類似性の決定が好ましくは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５８７７）の数学的アルゴリズムを使用して達成される。そのようなアルゴリズムが、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）において利用可能なＡｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９０）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０）のＢＬＡＳＴｎプログラム及びＢＬＡＳＴｐプログラムに組み込まれる。
【００５９】
パーセント同一性又はパーセント類似性の決定が、ＮＣＢＩのウエブページで推奨されるような、また、特定の長さ及び組成の配列に関しての「ＢＬＡＳＴ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ」に記載されるような、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索についてはＢＬＡＳＴｎプログラムの標準的なパラメーター、ＢＬＡＳＴタンパク質検索についてはＢＬＡＳＴｐプログラムの標準的なパラメーターを用いて行われる。
【００６０】
ＢＬＡＳＴポリヌクレオチド検索が、ＢＬＡＳＴｎプログラムを用いて行われる。
一般的なパラメーターについては、「Ｍａｘ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ボックスが１００に設定される場合があり、「Ｓｈｏｒｔ  ｑｕｅｒｉｅｓ」ボックスにチェックが入れられる場合があり、「Ｅｘｐｅｃｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」ボックスが１０００に設定される場合があり、「Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ」ボックスが７に設定される場合があり、これらはＮＣＢＩのウエブページにおいて短い配列（２０塩基未満）について推奨される通りである。より長い配列については、「Ｅｘｐｅｃｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」ボックスが１０に設定される場合があり、「Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ」ボックスが１１に設定される場合がある。スコア化パラメーターについては、「Ｍａｔｃｈ／ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｓｃｏｒｅｓ」が、１、−２に設定される場合があり、「Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ」ボックスが直線に設定される場合がある。フィルター及びマスキングパラメーターについては、「Ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｒｅｇｉｏｎｓ」ボックスにチェックが入れられない場合があり、「Ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ」ボックスにチェックが入れられない場合があり、「Ｍａｓｋ  ｆｏｒ  ｌｏｏｋｕｐ  ｔａｂｌｅ  ｏｎｌｙ」ボックスにチェックが入れられる場合があり、「ＤＵＳＴ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｓｅｔｔｉｎｇｓ」にチェックが入れられる場合があり、「Ｍａｓｋ  ｌｏｗｅｒ  ｃａｓｅ  ｌｅｔｔｅｒｓ」ボックスにチェックが入れられない場合がある。一般に、「Ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｈｏｒｔ  ｎｅａｒｌｙ  ｅｘａｃｔ  ｍａｔｃｈｅｓ」がこの点に関して使用される場合があり、これにより、上記で示された設定のほとんどが提供される。この点に関してのさらなる情報は、ＮＣＢＩのウエブページで公開される「ＢＬＡＳＴ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ」に見出される場合がある。
【００６１】
ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴｐプログラムを用いて行われる。一般的なパラメーターについては、「Ｍａｘ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ボックスが１００に設定される場合があり、「Ｓｈｏｒｔ  ｑｕｅｒｉｅｓ」ボックスにチェックが入れられる場合があり、「Ｅｘｐｅｃｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」ボックスが１０に設定される場合があり、「Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ」ボックスが「３」に設定される場合がある。スコア化パラメーターについては、「Ｍａｔｒｉｘ」ボックスが「ＢＬＯＳＵＭ６２」に設定される場合があり、「Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ」ボックスが「Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１」に設定される場合があり、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ”ボックスが“Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｓｃｏｒｅ  ｍａｔｒｉｘ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ”に設定される場合がある。フィルター及びマスキングパラメーターについては、“Ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｒｅｇｉｏｎｓ」ボックスにチェックが入れられない場合があり、「Ｍａｓｋ  ｆｏｒ  ｌｏｏｋｕｐ  ｔａｂｌｅ  ｏｎｌｙ」ボックスにチェックが入れられない場合があり、「Ｍａｓｋ  ｌｏｗｅｒ  ｃａｓｅ  ｌｅｔｔｅｒｓ」ボックスにチェックが入れられない場合がある。
【００６２】
両方のプログラムの改変、例えば、検索された配列の長さに関しての改変は、ＮＣＢＩのウエブページにおいてＨＴＭＬ版及びＰＤＦ版で公開される「ＢＬＡＳＴ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ」における推奨に従って行われる。
【００６３】
ポリヌクレオチド：
用語「ポリヌクレオチド」は、１つだけの核酸ならびに複数の核酸を包含することが意図され、単離された核酸分子又は核酸構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を示す。ポリヌクレオチドは、従来型のホスホジエステル結合又は非従来型の結合（例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見出されるアミド結合など）を含む場合がある。用語「核酸」は、ポリヌクレオチドに存在するいずれかの１つ又は複数の核酸セグメント（例えば、ＤＮＡフラグメント又はＲＮＡフラグメント）を示す。「単離された」核酸又はポリヌクレオチドによって、そのネイティブ環境から取り出されている核酸分子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）が意図される。例えば、ベクターに含有される、抗体をコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の様々な目的のために単離されていると見なされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種の宿主細胞において維持される組換えポリヌクレオチド、又は、溶液における（部分的又は実質的に）精製されたポリペプチドが含まれる。単離されたＲＮＡ分子には、本発明のポリヌクレオチドのインビボＲＮＡ転写物又はインビトロＲＮＡ転写物が含まれる。本発明による単離されたポリヌクレオチド又は核酸にはさらに、合成的に作製されるそのような分子が含まれる。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、調節エレメント、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位又は転写ターミネーターなどである場合があり、あるいは、調節エレメント、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位又は転写ターミネーターなどを包含する場合がある。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないにもかかわらず、コード領域の一部であると見なされる場合があるが、近接配列はどれも、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどはコード領域の一部ではない。本発明の２つ以上のコード領域を、１つのポリヌクレオチド構築物において、例えば、１つのベクターに存在させることができ、又は、別個のポリヌクレオチド構築物において、例えば、別個の（異なる）ベクターに存在させることができる。さらには、ベクターはどれも、１つだけのコード領域を含有する場合があり、又は、２つ以上のコード領域を含む場合があり、例えば、１つのベクターが免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を別々にコードする場合がある。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、結合性分子、抗体、あるいは、そのフラグメント、変異体又は誘導体をコードする核酸に融合されて、又は融合されずに、異種のコード領域をコードする場合がある。異種のコード領域には、限定されないが、特殊化されたエレメント又はモチーフ、例えば、分泌シグナルペプチド又は異種の機能的ドメインなどが含まれる。
【００６５】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは通常、１つ又は複数のコード領域と操作可能に連係させられるプロモーターならびに／あるいは他の転写制御エレメント又は翻訳制御エレメントを含む場合がある。操作可能連係は、遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）のためのコード領域が、当該遺伝子産物の発現を当該調節配列の影響下又は制御下に置くような様式で１つ又は複数の調節配列と連係させられるときにおいてである。２つのＤＮＡフラグメント（例えば、ポリペプチドコード領域及びそれと連係させられるプロモーターなど）は、プロモーター機能の誘導により、所望される遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写が生じるならば、また、これら２つのＤＮＡフラグメントの間における連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現調節配列の能力を妨げないか、又は、転写されるＤＮＡテンプレートの能力を妨げないならば、「操作可能に連係させられる」又は「操作可能に連結される」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写を達成することができたならば、ポリペプチドをコードする核酸と操作可能に連係させられているであろう。プロモーターは、ＤＮＡの実質的な転写を所定の細胞においてのみ導く細胞特異的なプロモーターである場合がある。プロモーターのほかに、他の転写制御エレメントを、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写終結シグナルを、細胞特異的な転写を導くためにポリヌクレオチドと操作可能に連係させることができる。好適なプロモーター及び他の転写制御領域が本明細書中に開示される。
【００６６】
様々な転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、サイトメガロウイルス由来のプロモーターセグメント及びエンハンサーセグメント（前初期プロモーター、イントロンＡとの併用で）、シミアンウイルス４０由来のプロモーターセグメント及びエンハンサーセグメント（初期プロモーター）、ならびに、レトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）由来のプロモーターセグメント及びエンハンサーセグメントなど（これらに限定されない）が含まれる。他の転写制御領域には、脊椎動物の遺伝子（例えば、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβ−グロビンなど）に由来する転写制御領域ならびに遺伝子発現を真核生物細胞において制御することができる他の配列が含まれる。さらなる好適な転写制御領域には、組織特異的なプロモーター及びエンハンサー、ならびに、リンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロン又はインターロイキンによって誘導可能であるプロモーター）が含まれる。
【００６７】
同様に、様々な翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、リボソーム結合部位、翻訳開始コドン及び翻訳終結コドン、ならびに、ピコルナウイルスに由来するエレメント（特に、配列内リボソーム進入部位、すなわち、ＩＲＥＳ、これはまたＣＩＴＥ配列とも称する）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６８】
他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡであり、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態である。
【００６９】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードし、これにより、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を導くさらなるコード領域と連係させられる場合がある。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、粗面小胞体を横断する成長途中のタンパク質鎖の移行が開始されると、成熟型タンパク質から切断されるシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドは一般に、当該ポリペプチドのＮ末端に融合されるシグナルペプチドで、当該ポリペプチドの分泌型形態又は「成熟型」形態をもたらすために、完全なポリペプチド又は「全長」のポリペプチドから切断されるシグナルペプチドを有することを承知している。特定の実施形態において、生来型のシグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖又は免疫グロブリン軽鎖のシグナルペプチドが使用されるか、又は、操作可能に連係させられるポリペプチドの分泌を導く能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。代替では、異種の哺乳動物シグナルペプチド又はその機能的誘導体が使用されてもよい。例えば、野生型のリーダー配列がヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列により置き換えられる場合がある。
【００７０】
「結合性分子」は、本発明に関連して使用される場合、主として抗体及びそのフラグメントに関し、しかし、ジペプチドリピート（ＤＰＲ）タンパク質（好ましくは、変化したＣ９ＯＲＦ７２、特に好ましくは（病理学的に変化したＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲｓ）に結合する他の非抗体分子を示す場合もあり、これらには、ホルモン、受容体、リガンド、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子、シャペロン（例えば、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）など）、ならびに、細胞・細胞接着分子（例えば、カドヘリンスーパーファミリー、インテグリンスーパーファミリー、Ｃ型レクチンスーパーファミリー及び免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーなど）が含まれるが、これらに限定されない。したがって、明瞭性だけのために、また、本発明の範囲を限定することなく、下記の実施形態のほとんどが、治療剤及び診断剤を開発するための好ましい結合性分子を代表する抗体及び抗体様分子に関して議論される。
【００７１】
抗体：
用語「抗体」及び用語「免疫グロブリン」は本明細書中では交換可能に使用される。抗体又は免疫グロブリンは、重鎖の可変ドメインを少なくとも含み、かつ、通常の場合には重鎖及び軽鎖の可変ドメインを少なくとも含む結合性分子である。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造は比較的よく理解されている（例えば、Ｈａｒｌｏｗ他、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８）を参照のこと）。
【００７２】
より詳しく下記で議論されるように、用語「免疫グロブリン」は、生化学的に識別することができる様々な幅広いクラスのポリペプチドを含む。当業者は、重鎖が、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ又はイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として、それらの中のいくつかのサブクラス（例えば、γ１〜γ４）を伴って分類されることを理解するであろう。抗体の「クラス」を、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ又はＩｇＥとしてそれぞれ決定するのが、この鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１などが十分に特徴づけられており、また、機能的な特殊化を与えることが知られている。これらのクラス及びアイソタイプのそれぞれの改変された型が、本開示を考慮して当業者には容易に認識可能であり、従って、本発明の範囲内である。すべての免疫グロブリンクラスが明らかに本発明の範囲内であり、下記の議論は一般に、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに関する。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量がおよそ２３，０００ダルトンである２つの同一の軽鎖ポリペプチドと、分子量が５３，０００〜７０，０００である２つの同一の重鎖ポリペプチドとを含む。これら４つの鎖は典型的には、軽鎖が、「Ｙ」字型の口部から始まり、可変領域の終わりまで続く腕木として重鎖を支える「Ｙ」字型の立体配置でジスルフィド結合によって結合される。
【００７３】
軽鎖はカッパ又はラムダ（κ、λ）のどちらかとして分類される。それぞれの重鎖クラスがカッパ軽鎖又はラムダ軽鎖のどちらかと結合し得る。一般には、免疫グロブリンが、ハイブリドーマ、Ｂ細胞、又は、遺伝子操作された宿主細胞のどれかによって生じるとき、軽鎖及び重鎖は互いに共有結合により結合し、２つの重鎖の「テール」部分が共有結合性のジスルフィド連結又は非共有結合性の連結によって互いに結合する。重鎖において、アミノ酸配列が、Ｙ字型の立体配置の二叉末端におけるＮ末端から、それぞれの鎖の底部におけるＣ末端にまで延びる。
【００７４】
軽鎖及び重鎖はともに、構造的及び機能的に相同的である領域に分けられる。用語「定常」及び「可変」が機能的に使用される。これに関連して、軽鎖部分及び重鎖部分の両方の可変ドメイン（ＶＬ及びＶＨ）により、抗原認識及び特異性が決定されることが理解されるであろう。逆に、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３）により、様々な重要な生物学的性質、例えば、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合及び補体結合などが与えられる。慣例によって、定常領域ドメインの番号づけは、これらのドメインが抗体の抗原結合部位又はアミノ末端からより遠位になるにつれて大きくなる。Ｎ末端部分が可変領域であり、Ｃ末端部分が定常領域である；ＣＨ３ドメイン及びＣＬドメインが実際に、重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端をそれぞれ含む。
【００７５】
上記で示されるように、可変領域により、抗体は抗原上のエピトープを選択的に認識し、かつ、このエピトープと特異的に結合することができる。すなわち、抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメイン、又は、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットが組み合わさって、三次元の抗原結合部位を規定する可変領域を形成する。この四元抗体構造が、Ｙ字型のそれぞれのアームの端部に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位がＶＨ鎖及びＶＬ鎖のそれぞれにおける３つのＣＤＲによって規定される。ＤＰＲｓに特異的に結合するための十分な構造を含有する抗体又は免疫グロブリンフラグメントはどれも、本明細書中では交換可能に、「結合フラグメント」又は「免疫特異性フラグメント」として示される。
【００７６】
実施例１１において記載されるように、また、図１３に示されるように、本発明の抗体は、ＩｇＧ（好ましくはＩｇＧ１）として哺乳動物細胞（特にＣＨＯ−Ｓ細胞）で発現させられたとき、大きい完全性を軽鎖（ＶＬ）部分及び重鎖（ＶＨ）部分の両方に関して明らかにし、これに対して、有意な混入物又はタンパク質分解産物が何ら検出され得なかった。
【００７７】
天然に存在する抗体において、抗体は、抗体がその三次元立体配置を水性環境において取るような抗原結合ドメインを形成するために特異的に配置されるアミノ酸の短い不連続な配列である６つの超可変領域（これらは時には、それぞれの抗原結合ドメインに存在する「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と呼ばれる）を含む。「ＣＤＲ」には、分子間の変動性をそれほど示さない４つの比較的保存された「フレームワーク」領域又は「ＦＲ」が近接する。これらのフレームワーク領域は主としてβ−シートの立体配座を取り、ＣＤＲにより、このβ−シート構造をつなぐ、また、時にはこのβ−シート構造の一部を形成するループが形成される。したがって、フレームワーク領域は、ＣＤＲを鎖間の非共有結合性の相互作用によって正しい配向で配置することを提供する足場を形成するように作用する。配置されたＣＤＲによって形成される抗原結合ドメインにより、免疫反応性抗原におけるエピトープに対して相補的な表面が規定される。この相補的な表面は、抗体がその同種エピトープに非共有結合的に結合することを促進させる。ＣＤＲ及びフレームワーク領域を構成するアミノ酸が、それらは正確に規定されているので、当業者によっていずれかの所与の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域についてそれぞれ容易に特定され得る；「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｋａｂａｔ，Ｅ．他編、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９８３）、及び、Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７）、９０１〜９１７を参照のこと。これらの全体が参照によって本願明細書に組み込まれる。
【００７８】
この技術分野において使用される、及び／又は受け入れられる用語の２つ以上の定義が存在する場合には、本明細書中で使用されるような当該用語の定義は、反するようなことが明示的に言及される場合を除き、すべてのそのような意味を包含することが意図される。具体的な一例が、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域の中に見出される不連続な抗原結合部位を記述するための用語「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）の使用である。この特定の領域が、Ｋａｂａｔ他、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって、また、Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７）、９０１〜９１７によって記載されており（これらは参照によって本明細書中に組み込まれる）、この場合、それらの定義は、互いに比較されたときにはアミノ酸残基の重複又はサブセットを包含する。それにもかかわらず、抗体又はその変異体のＣＤＲを示すためのどちらかの定義の適用は、本明細書中で定義され、かつ使用されるようなこの用語の範囲内であることが意図される。上記で引用された参考文献のそれぞれによって定義されるようなＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基が、比較として下記において表Ｉに示される。特定のＣＤＲを包含する正確な残基番号は、ＣＤＲの配列及びサイズに依存して変わる。当業者は、どの残基が、抗体の可変領域アミノ酸配列が与えられる抗体のヒトＩｇＧサブタイプの特定の超可変領域又はＣＤＲを含むかを常法により決定することができる。
表Ｉ：ＣＤＲの定義１
【表１】
2020031660.tif 000002
１表ＩにおけるすべてのＣＤＲ定義の番号表記は、Ｋａｂａｔ他によって示される番号表記慣例に従う（下記を参照のこと）。
【００７９】
Ｋａｂａｔ他はまた、どのような抗体に対しても適用可能である可変ドメイン配列のための番号表記システムを定義した。当業者は、「Ｋａｂａｔ番号表記」のこのシステムを、配列そのものを超える実験的データに何ら頼ることなく、どのような可変ドメイン配列に対してでも一義的に割り当てることができる。本明細書中で使用される場合、「Ｋａｂａｔ番号表記」は、Ｋａｂａｔ他、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって示される番号表記システムを示す。別途指定される場合を除き、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体における具体的なアミノ酸残基位置の番号表記に対する言及は、Ｋａｂａｔ番号表記システムに従っており、しかしながら、Ｋａｂａｔ番号表記システムは理論的であり、本発明のどの抗体にも等しく適用されない場合がある。例えば、最初のＣＤＲの位置に依存して、その後のＣＤＲはどちらかの方向でずれる場合がある。
【００８０】
本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、免疫特異性フラグメント、変異体又は誘導体には、ポリクローナル性、モノクローナル性、多特異性、ヒト型、ヒト化型、霊長類化型、マウス化型又はキメラ型の抗体、単鎖抗体、エピトープ結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２）、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬドメイン又はＶＨドメインのどちらかを含むフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって作製されるフラグメント、ならびに、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書中に開示される抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）が含まれるが、これらに限定されない。ｓｃＦＶ分子がこの技術分野では知られており、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載される。本発明の免疫グロブリン分子又は抗体分子は、免疫グロブリン分子のどのようなタイプのものも（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、どのようなクラスのものも（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はどのようなサブクラスのものも可能である。
【００８１】
１つの実施形態において、本発明の抗体は、五価構造を有するＩｇＭ又はその誘導体ではない。特に、本発明の具体的な適用において、とりわけ治療的使用において、ＩｇＭはＩｇＧ及び他の二価抗体又は対応する結合性分子よりも有用でない。これは、ＩｇＭは、その五価構造のために、また、親和性成熟化の欠如のために、非特異的な交差反応性及び非常に低い親和性を示すことが多いからである。特に好ましい実施形態において、本発明の抗体はポリクローナル抗体でない。すなわち、本発明の抗体は、血漿の免疫グロブリンサンプルから得られる混合物ではなく、むしろ、１つの特定の抗体種から実質的になる。
【００８２】
単鎖抗体を含めて、抗体フラグメントは、可変領域（１つ又は複数）を単独で、あるいは、下記の全体又は一部分との組合せで含む場合がある：ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン。また、本発明には、可変領域（１つ又は複数）と、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインとのどのような組合せをも含むＤＰＲ結合フラグメントが含まれる。本発明の抗体又はその免疫特異性フラグメントは、鳥類及び哺乳動物を含めて、どのような動物起源に由来してもよい。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ又はニワトリの抗体である。別の実施形態において、可変領域が起源において（例えば、サメからの）コンドリクトイド（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）である場合がある。
【００８３】
１つの実施形態において、本発明の抗体は、ヒトから単離されるヒトモノクローナル抗体である。場合により、ヒト抗体のフレームワーク領域がデータベースにおける該当するヒト生殖系列可変領域配列に従ってアライメントされ、それらと一致させられる；例えば、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）によって提供されるＶｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を参照のこと。例えば、真の生殖系列配列から潜在的に逸脱すると見なされるアミノ酸は、クローニング過程の期間中に組み込まれるＰＣＲプライマー配列に起因し得ると思われる。人為的に作製されたヒト様抗体、例えば、ファージディスプレーされた抗体ライブラリー又は異種マウスに由来する単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦＶ）などと比較した場合、本発明のヒトモノクローナル抗体は、（ｉ）代理動物の免疫応答ではなく、ヒトの免疫応答を使用して得られること、すなわち、抗体が、ヒト体内におけるその関連する立体配座における天然のＤＰＲｓ及びＤＰＲタンパク質（好ましくはＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲｓ）に対する応答で作製されていること、（ｉｉ）個体を保護しているか、あるいは、ＤＰＲｓ（好ましくはＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲｓ）の存在について少なくとも有意であること、そして、（ｉｉｉ）抗体がヒト起源であるので、自己抗原に対する交差反応性の危険性が最小限に抑えられることによって特徴づけられる。したがって、本発明によれば、用語「ヒトモノクローナル抗体」、「ヒトモノクローナル自己抗体」及び「ヒト抗体」などは、ヒト起源である、すなわち、ヒト細胞（例えば、Ｂ細胞又はそのハイブリドーマなど）から単離されているか、あるいは、ｃＤＮＡがヒト細胞（例えば、ヒトメモリーＢ細胞）のｍＲＮＡから直接クローン化されているＤＰＲ結合性分子を示すために使用される。ヒト抗体は、アミノ酸置換が、例えば、結合特性を改善するために、当該抗体においてたとえ行われるにしても、依然として「ヒト」である。この点において、ヒト化抗体あるいはヒト様抗体と異なり（上記の説明も参照のこと）、本発明のヒト由来抗体はヒト体内でみられるＣＤＲ（ｓ）を含むことによって特徴付けられ、それ故に免疫原性であるリスクを実質的に有しない。従って、本発明の抗体は、可変軽鎖及び重鎖の片方又は両方の少なくとも１つ、好ましくは２つ、最も好ましくは３つ全てのＣＤＲが、ここで説明されるヒト抗体由来であれば、依然としてヒト由来であるとされる。
【００８４】
１つの実施形態において、本発明のヒト由来抗体は、天然の存在する抗体と比較して異種の領域を含み、例えば、フレームワーク領域におけるアミノ酸置換、可変領域に外因的に融合される定常領域、及び、Ｃ末端又はＮ末端における異なるアミノ酸などを含む。
【００８５】
ヒト免疫グロブリンライブラリーに由来する抗体、あるいは、１つ又は複数のヒト免疫グロブリンについて遺伝子組換えであり、かつ、内因性免疫グロブリンを発現しない動物に由来する抗体（下記において、また、例えば、米国特許第５，９３９，５９８号（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ他）に記載されるような抗体）は、本発明の真のヒト抗体から区別するためにヒト様抗体として示される。例えば、ヒト様抗体の重鎖及び軽鎖の対形成、例えば、ファージディスプレーから典型的には単離される合成抗体及び半合成抗体などは、その対形成が元々のヒトＢ細胞において生じていたような元の対形成を必ずしも反映していない。したがって、先行技術において一般に使用されるような組換え発現ライブラリーから得られるＦａｂフラグメント及びｓｃＦｖフラグメントは、免疫原性及び安定性に対するすべての可能な関連した影響に関して人為的であると見なされる。対照的には、本発明は、その治療的有用性及びヒトにおけるその寛容性によって特徴づけられる、選択されたヒト対象から得られる単離された親和性成熟している抗体を提供する。
【００８６】
本明細書中で使用される場合、用語「齧歯類化（された）抗体」又は「齧歯類化（された）免疫グロブリン」は、本発明のヒト抗体に由来する１つ又は複数のＣＤＲと、齧歯類抗体配列に基づくアミノ酸の置換及び／又は欠失及び／又は挿入を含有するヒトフレームワーク領域とを含む抗体を示す。齧歯類を示すとき、好ましくは、マウス及びラットに起源を有する配列が使用され、この場合、そのような配列を含む抗体は、「マウス化された」又は「ラット化された」としてそれぞれ示される。ＣＤＲを提供するヒト免疫グロブリンは「親」又は「アクセプター」と呼ばれ、フレームワークの変化を提供する齧歯類抗体は「ドナー」と呼ばれる。定常領域は存在している必要はないが、定常領域が存在するならば、定常領域は通常、齧歯類抗体の定常領域と実質的に同一であり、すなわち、少なくとも約８５％〜９０％が同一であり、好ましくは約９５％以上が同一である。したがって、いくつかの実施形態において、全長のマウス化されたヒト重鎖免疫グロブリン又は軽鎖免疫グロブリンは、マウスの定常領域、ヒトのＣＤＲ、及び、いくつかの「マウス化する」アミノ酸置換を有する実質的にはヒトのフレームワークを含有する。典型的には、「マウス化抗体」は、マウス化された可変軽鎖及び／又はマウス化された可変重鎖を含む抗体である。例えば、マウス化抗体は、例えば、キメラ抗体の可変領域全体が非マウス性であるので、典型的なキメラ抗体を包含しないであろう。「マウス化」のプロセスによって「マウス化」されている改変された抗体は、ＣＤＲを提供する親抗体と同じ抗原に結合し、かつ、通常の場合、マウスにおける免疫原性が、親抗体と比較してより低い。「マウス化」抗体に関しての上記説明は、他の「齧歯類化」抗体について、例えば、ラットの配列がマウスの代わりに使用される「ラット化抗体」などについて同様に当てはまる。
【００８７】
本明細書中で使用される場合、用語「重鎖部分」には、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列が含まれる。重鎖部分を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中央及び／又は下部のヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインあるいはそれらの変異体又はフラグメントのうちの少なくとも１つを含む。例えば、本発明において使用されるための結合性ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、及び、ＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、及び、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；又は、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む場合がある。別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本発明において使用されるための結合性ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部分（例えば、ＣＨ２ドメインのすべて又は一部）を欠く場合がある。上記で示されるように、これらのドメイン（例えば、重鎖部分）は、天然に存在する免疫グロブリン分子からアミノ酸配列において異なるように改変され得ることが、当業者によって理解されるであろう。
【００８８】
本明細書中に開示されるある特定の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体において、マルチマーの１つのポリペプチド鎖の重鎖部分が、当該マルチマーの第２のポリペプチド鎖における重鎖部分と同一である。代替では、本発明の重鎖部分を含有するモノマーは同一でない。例えば、それぞれのモノマーが、異なる標的結合部位を含む場合があり、これにより、例えば、二重特異性抗体又はディアボディを形成する。
【００８９】
別の実施形態において、本明細書中に開示される抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は、ただ１つのポリペプチド鎖から構成され（例えば、ｓｃＦｖ）、潜在的なインビボ治療適用及び診断適用のために細胞内で発現させられることになる（細胞内抗体）。
【００９０】
本明細書中に開示される診断方法及び処置方法において使用されるための結合性ポリペプチドの重鎖部分が、異なる免疫グロブリン分子に由来してもよい。例えば、ポリペプチドの重鎖部分が、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１ドメインと、ＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域とを含む場合がある。別の例において、重鎖部分は、一部がＩｇＧ１分子に由来し、かつ、一部がＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含むことができる。別の例において、重鎖部分は、一部がＩｇＧ１分子に由来し、かつ、一部がＩｇＧ４分子に由来するキメラなヒンジを含むことができる。
【００９１】
本明細書中で使用される場合、用語「軽鎖部分」には、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列が含まれる。好ましくは、軽鎖部分はＶＬドメイン又はＣＬドメインの少なくとも一方を含む。
【００９２】
抗体のためのペプチドエピトープ又はポリペプチドエピトープの最小サイズは約４個〜５個のアミノ酸であると考えられる。ペプチドエピトープ又はポリペプチドエピトープは好ましくは、少なくとも７個のアミノ酸を含有し、より好ましくは少なくとも９個のアミノ酸を含有し、最も好ましくは少なくとも約１５個〜約３０個の間のアミノ酸を含有する。ＣＤＲは抗原性のペプチド又はポリペプチドをその三次形態で認識することができるので、エピトープを含むアミノ酸は連続している必要はなく、場合により、同じペプチド鎖に存在していないことさえある。本発明において、本発明の抗体によって認識されるペプチドエピトープ又はポリペプチドエピトープは、ＤＰＲ（例えば、Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲに見出されるようなＧＡ１５など）の少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、より好ましくは少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、又は、約１５個〜約３０個の間の連続するアミノ酸又は非連続なアミノ酸の配列を含有する。言い換えれば、本発明の抗体又はその生物工学誘導体は好ましくは、２つの異なるアミノ酸（Ｘ及びＸ’）からなるジペプチド（ＸＸＸ及びＸＸＸ’；ＸａａＸａａ’）のリピート数が、例えば、３〜５０であるＤＰＲを、好ましくは１０〜４０であるＤＰＲを、より好ましくは１５〜３０であるＤＰＲを、最も好ましくは１５であるＤＰＲを認識する。したがって、本発明の抗体又はその生物工学誘導体によって認識されるエピトープ又は抗原は、リピート数が１５であるＤＰＲからなるならば、一般には（ＸＸ’）１５と称される場合がある。
【００９３】
「特異的に結合する」又は「特異的に認識する」によって、これらは本明細書中では交換可能に使用されており、結合性分子、例えば、抗体が、その抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、及び、この結合は、抗原結合ドメインとエピトープとの間における何らかの相補性を伴うことが一般に意味される。この定義によれば、抗体は、抗体がランダムな無関係なエピトープに結合するであろうよりも容易にその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合するとき、そのエピトープに「特異的に結合する」と言われる。用語「特異性」は、ある特定の抗体がある特定のエピトープに結合する相対的な親和性を限定するために本明細書中では使用される。例えば、抗体「Ａ」は、所与のエピトープについて、抗体「Ｂ」よりも大きい親和性を有すると見なされる場合があり、又は、抗体「Ａ」は、関連したエピトープ「Ｄ」について有するよりも大きい特異性によりエピトープ「Ｃ」に結合すると言われる場合がある。
【００９４】
存在する場合、抗原との抗体の用語「免疫学的結合特性」又は他の結合特性はその文法的形態のすべてで、抗体の特異性、親和性、交差反応性及び他の結合特性を示す。
【００９５】
「優先的に結合する」によって、結合性分子、例えば、抗体が、関連したエピトープ、類似したエピトープ、相同的なエピトープ又は類似的なエピトープに結合するであろうよりも容易にエピトープに特異的に結合することが意味される。したがって、所与のエピトープに「優先的に結合する」抗体は、そのような抗体が関連のエピトープと交差反応することがあるとしても、関連のエピトープよりもそのエピトープに結合する可能性が大きいであろう。
【００９６】
非限定的な例として、結合性分子、例えば、抗体は、この抗体が第２のエピトープについての抗体のＫＤよりも小さい解離定数（ＫＤ）により第１のエピトープと結合するならば、この第１のエピトープと優先的に結合すると見なされる場合がある。別の非限定的な例において、抗体は、この抗体が第２のエピトープについての抗体のＫＤよりも少なくとも１桁小さい親和性により第１のエピトープと結合するならば、この第１の抗原と優先的に結合すると見なされる場合がある。別の非限定的な例において、抗体は、この抗体が第２のエピトープについての抗体のＫＤよりも少なくとも２桁小さい親和性により第１のエピトープと結合するならば、この第１のエピトープと優先的に結合すると見なされる場合がある。
【００９７】
別の非限定的な例として、結合性分子、例えば、抗体は、この抗体が第２のエピトープについての抗体のｋ（ｏｆｆ）よりも小さいオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））により第１のエピトープと結合するならば、この第１のエピトープと優先的に結合すると見なされる場合がある。別の非限定的な例において、抗体は、この抗体が第２のエピトープについての抗体のｋ（ｏｆｆ）よりも少なくとも１桁小さい親和性により第１のエピトープと結合するならば、この第１のエピトープと優先的に結合すると見なされる場合がある。別の非限定的な例において、抗体は、この抗体が第２のエピトープについての抗体のｋ（ｏｆｆ）よりも少なくとも２桁小さい親和性により第１のエピトープと結合するならば、この第１のエピトープと優先的に結合すると見なされる場合がある。
【００９８】
結合性分子、例えば、本明細書中に開示される抗体あるいは抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は、５×１０−２ｓｅｃ−１以下、１０−２ｓｅｃ−１以下、５×１０−３ｓｅｃ−１以下又は１０−３ｓｅｃ−１以下であるオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））によりＤＰＲｓあるいはそのフラグメント、変異体又は特異的な立体配座と結合すると言われる場合がある。より好ましくは、本発明の抗体は、５×１０−４ｓｅｃ−１以下、１０−４ｓｅｃ−１以下、５×１０−５ｓｅｃ−１以下又は１０−５ｓｅｃ−１以下、５×１０−６ｓｅｃ−１以下、１０−６ｓｅｃ−１以下、５×１０−７ｓｅｃ−１以下又は１０−７ｓｅｃ−１以下であるオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））によりＤＰＲタンパク質あるいはそのフラグメント、変異体又は特異的な立体配座と結合すると言われる場合がある。特に好ましい態様では、ＤＰＲは、Ｃ９ＯＲＦ７２（即ち、Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲ）に関連したＤＰＲである。
【００９９】
結合性分子、例えば、本明細書中に開示される抗体あるいは抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は、１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１以上、５×１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１以上、１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１以上又は５×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１以上であるオン速度（ｋ（ｏｎ））によりＤＰＲあるいはそのフラグメント、変異体又は特異的な立体配座と結合すると言われる場合がある。より好ましくは、本発明の抗体は、１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１以上、５×１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１以上、１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１以上又は５ｘ１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１以上又は１０７Ｍ−１ｓｅｃ−１以上であるオン速度（ｋ（ｏｎ））によりＤＰＲあるいはそのフラグメント、変異体又は特異的な立体配座と結合すると言われる場合がある。１つの実施形態において、結合性分子は、１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１以上、５×１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１以上、１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１以上又は５×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１以上であるオン速度（ｋ（ｏｎ））によりＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲあるいはそのフラグメント、変異体又は特異的な立体配座と結合すると言われる場合がある。より好ましくは、本発明の抗体は、１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１以上、５×１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１以上、１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１以上又は５ｘ１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１以上又は１０７Ｍ−１ｓｅｃ−１以上であるオン速度（ｋ（ｏｎ））によりＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲあるいはそのフラグメント、変異体又は特異的な立体配座と結合すると言われる場合がある。
【０１００】
結合性分子、例えば、抗体は、所与のエピトープに対する参照抗体の結合をある程度阻止する程度にそのエピトープに優先的に結合するならば、そのエピトープに対する参照抗体の結合を競合的に阻害すると言われる。競合的阻害が、この技術分野において知られているいずれかの方法によって、例えば、競合的ＥＬＩＳＡアッセイによって求められてもよい。抗体は、所与のエピトープに対する参照抗体の結合を、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％又は少なくとも５０％競合的に阻害すると言われる場合がある。
【０１０１】
本明細書中で使用される場合、用語「親和性」は、結合性分子（例えば、免疫グロブリン分子）のＣＤＲとの個々のエピトープの結合の強さの尺度を示す（例えば、Ｈａｒｌｏｗ他、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版（１９８８）、２７頁〜２８頁を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「アビディティー」は、免疫グロブリンの集合と抗原との複合体の全般的な安定性、すなわち、抗原との免疫グロブリン混合物の機能的結合強度を示す（例えば、Ｈａｒｌｏｗ、２９頁〜３４頁を参照のこと）。アビディティーは、特異的なエピトープとの集団内の個々の免疫グロブリン分子の親和性に、及びまた、免疫グロブリン及び抗原の結合価の両方に関連づけられる。例えば、二価のモノクローナル抗体と、高度に反復するエピトープ構造を有する抗原（例えば、ポリマーなど）との間における相互作用が、高いアビディティーの１つであろう。抗原についての抗体の親和性又はアビディティーを、いずれかの好適な方法（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ他、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９２）を参照のこと）及び本明細書中に記載される方法を使用して実験的に求めることができる。抗原についての抗体の親和性を測定するための一般的な技術には、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ及び表面プラズモン共鳴が含まれる。特定の抗体−抗原相互作用の測定された親和性は、異なる条件（例えば、塩濃度、ｐＨ）のもとで測定されるならば異なる可能性がある。したがって、親和性及び他の抗原結合パラメーター（例えば、ＫＤ、ＩＣ５０）の測定は好ましくは、抗体及び抗原の標準化された溶液ならびに標準化された緩衝液を用いて行われる。
【０１０２】
結合性分子、例えば、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体はまた、それらの交差反応性に関して記載又は指定される場合がある。本明細書中で使用される場合、用語「交差反応性」は、抗体（これは１つの抗原について特異的である）が第２の抗原と反応する能力、すなわち、２つの異なる抗原性物質の間における関連度の度合いを示す。したがって、抗体は、その形成を誘導したエピトープとは異なるエピトープに結合するならば、交差反応性である。交差反応性エピトープは一般に、誘導用エピトープと同じ相補的な構造的特徴の多くを含有しており、また、場合により、実際には元のエピトープよりも良好にはまる場合がある。
【０１０３】
例えば、ある種の抗体は、関連しているが、同一でないエピトープと結合するという点で、例えば、参照エピトープに対して（この技術分野で知られている方法及び本明細書中に記載される方法を使用して計算されるように）少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％及び少なくとも５０％の同一性を有するエピトープと結合するという点で、ある程度の交差反応性を有する。抗体は、参照エピトープに対して（この技術分野で知られている方法及び本明細書中に記載される方法を使用して計算されるように）９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満及び５０％未満の同一性を有するエピトープと結合しないならば、交差反応性をほとんど有していないか、又は全く有していないと言われる場合がある。抗体は、ある特定のエピトープのどのような他のアナログ、オルソログ又はホモログとも結合しないならば、そのエピトープについて「非常に特異的」であると見なされる場合がある。
【０１０４】
結合性分子、例えば、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体はまた、ＤＰＲ及び／又は、変異したＣ９ＯＲＦ７２種（Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲｓを示す）及び／又はそのフラグメントに対するそれらの結合親和性に関して記載又は指定される場合がある。好ましい結合親和性には、解離定数つまりＫｄが５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１５Ｍ未満又は１０−１５Ｍ未満である結合親和性が含まれる。
【０１０５】
上記で示されたように、様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造及び三次元立体配置が広く知られている。本明細書中で使用される場合、用語「ＶＨドメイン」には、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインが含まれ、用語「ＣＨ１ドメイン」には、免疫グロブリン重鎖の第１の（最もアミノ末端側の）定常領域ドメインが含まれる。ＣＨ１ドメインはＶＨドメインに隣接しており、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域のアミノ末端側である。
【０１０６】
本明細書中で使用される場合、用語「ＣＨ２ドメイン」には、従来の番号表記スキームを使用して、例えば、抗体のおよそ残基２４４から残基３６０にまで広がる重鎖分子の一部分が含まれる（残基２４４〜残基３６０、Ｋａｂａｔ番号表記システム；残基２３１〜残基３４０、ＥＵ番号表記システム；Ｋａｂａｔ  ＥＡ他（前掲書中）を参照のこと）。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密に対形成しないという点で独特である。むしろ、２つのＮ−連結している分岐した炭水化物鎖が、無傷の生来型ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に置かれる。ＣＨ３ドメインがＩｇＧ分子のＣＨ２ドメインからＣ末端にまで広がり、およそ１０８残基を含むこともまた広く記録されている。
【０１０７】
本明細書中で使用される場合、用語「ヒンジ領域」には、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインにつなぐ重鎖分子の一部分が含まれる。このヒンジ領域はおよそ２５残基を含み、かつ、柔軟であり、したがって、２つのＮ末端の抗原結合領域が独立して動くことを可能にする。ヒンジ領域は３つの異なったドメイン（上部、中央及び下部のヒンジドメイン）に細分化することができる（Ｒｏｕｘ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（１９９８）、４０８３〜４０９０を参照のこと）。
【０１０８】
本明細書中で使用される場合、用語「ジスルフィド結合」には、２つのイオウ原子の間に形成される共有結合性の結合が含まれる。アミノ酸のシステインは、ジスルフィド結合を形成することができるか、又は、第２のチオール基と架橋することができるチオール基を含む。ほとんどの天然に存在するＩｇＧ分子において、ＣＨ１領域及びＣＬ領域がジスルフィド結合によって連結され、２つの重鎖が、Ｋａｂａｔ番号表記システムを使用して２３９位及び２４２位（２２６位又は２２９位、ＥＵ番号表記システム）に対応する位置での２つのスルフィド結合によって連結される。
【０１０９】
本明細書中で使用される場合、用語「連結される」、「融合される」又は「融合」は交換可能に使用される。これらの用語は、化学的コンジュゲート化又は組換え手段を含むどのような手段によってでも、２つ以上の要素又は成分を一緒につなぐことを示す。「インフレーム融合」は、２つ以上のポリヌクレオチド・オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、これらの元々のＯＲＦの正しい翻訳読み枠を維持する様式で、連続したより長いＯＲＦを形成するためにつなぐことを示す。したがって、組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する２つ以上のセグメントを含有する単一タンパク質である（そのようなセグメントは通常、自然界ではそのようにつながれない）。したがって、読み枠が、融合されたセグメントの全体にわたって連続にされるにもかかわらず、これらのセグメントは、例えば、インフレームリンカー配列によって物理的又は空間的に隔てられる場合がある。例えば、免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドが、インフレーム融合される場合があり、しかし、「融合された」ＣＤＲが、連続したポリペプチドの一部として共翻訳される限り、少なくとも１つの免疫グロブリンフレームワーク領域又はさらなるＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドによって隔てられる場合がある。
【０１１０】
用語「発現」は、本明細書中で使用される場合、遺伝子が生化学物質（例えば、ＲＮＡ又はポリペプチド）をもたらすプロセスを示す。このプロセスには、限定されないが、遺伝子ノックダウンならびに一過性発現及び安定的発現の両方を含めて、細胞内における遺伝子の機能的な存在のどのような顕在化も含まれる。このプロセスには、限定されないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小さいヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、小さい干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は何らかの他のＲＮＡ産物への遺伝子の転写、及び、ポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳が含まれる。最終的な所望される産物が生化学物質であるならば、発現には、そのような生化学物質及び何らかの前駆体を生じさせることが含まれる。遺伝子の発現により、「遺伝子産物」がもたらされる。本明細書中で使用される場合、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって産生されるメッセンジャーＲＮＡ、又は、転写物から翻訳されるポリペプチドのどちらもが可能である。本明細書中に記載される遺伝子産物にはさらに、転写後修飾（例えば、ポリアデニル化）を伴う核酸、又は、翻訳後修飾（例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、及び、タンパク質分解的切断など）を伴うポリペプチドが含まれる。
【０１１１】
本明細書中で使用される場合、用語「サンプル」は、対象又は患者から得られる任意の生物学的材料を示す。１つの態様において、サンプルは、血液、腹腔液、ＣＳＦ、唾液又は尿を含むことができる。別の態様において、サンプルは、全血、血漿、血清、血液サンプルから富化されるＢ細胞、及び、培養された細胞（例えば、対象からのＢ細胞）を含むことができる。サンプルにはまた、神経組織を含む生検サンプル又は組織サンプルが含まれ得る。さらに他の態様において、サンプルは、細胞全体及び／又は細胞の溶解物を含むことができる。血液サンプルをこの技術分野において知られている方法によって集めることができる。
【０１１２】
疾患：
別途言及される場合を除き、用語「障害」及び「疾患」は本明細書中では交換可能に使用され、対象、動物、単離された器官、組織又は細胞／細胞培養物における望まれない任意の生理学的変化を含む。
【０１１３】
前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）は、脳の前頭葉及び側頭葉における萎縮に伴う病理発生である。加えて、ＦＴＬＤ患者の５０％がまた、陽性の家族歴を有することが示され、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）と比較された。既に上記で記載されたように、病理発生の共通した根本的な原因は、ＦＴＬＤ患者及びＡＬＳ患者のＣ９ＯＲＦ７２に位置するヘテロ接合性の伸長したヘキサヌクレオチドリピートであるようである。具体的には、２アミノ酸の生じる繰り返し単位（ジペプチドリピート、ＤＰＲ）が示された。
【０１１４】
しかしながら、２アミノ酸の繰り返し（ＤＰＲ）を生じさせる伸長したヘキサヌクレオチドリピートがまた、いくつかの他の疾患及び／又は障害でも報告されている。これらの疾患には、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ＦＴＬＤ−ＡＬＳ及び／又は脊髄小脳失調症３６型、並びに、それらにおいて伴う症状が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１５】
本発明の抗体はＤＰＲに結合することができること、具体的には、ＦＴＬＤ患者の組織切片におけるＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲに結合することができることが示されているので（例えば、実施例１２及び図１４を参照のこと）、ヒト由来抗体及びその生物工学誘導体は、ＦＴＬＤ、また、ＤＰＲに伴う他の疾患及び／又は障害、並びに、それらの症状の処置及び診断の両方において有用である。具体的には、疾患の進行を調節することにおける本発明の抗体のインビトロ及びインビボでの治療可能性が、細胞に基づくモデルにおいて、又は、選択されたＣ９ｏｒｆ７２ヘキサヌクレオチドリピート伸長マウスモデルにおいてそのどちらでもそれぞれ評価される；例えば、実施例１４及び実施例１５を参照のこと。
【０１１６】
したがって、本発明の１つの実施形態において、本発明の様々な抗体、これらの抗体のいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有する結合性分子、本発明のポリヌクレオチド、ベクター又は細胞は、ＤＰＲに伴う疾患の予防的処置及び／又は治療的処置のための医薬組成物又は診断組成物を調製することのために、疾患進行及び／又は処置応答をモニターすることのために、また、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ＦＴＬＤ−ＡＬＳ及び／又は脊髄小脳失調症３６型を含む、ＤＰＲアミロイドーシスに伴う疾患を診断することのために使用される。
【０１１７】
実施例１２及び実施例１３、並びに、図１４及び図１５において示されるように、本発明の抗体はＦＴＬＤ患者における病原性のＣ９ＯＲＦ７２−ジペプチドリピートタンパク質凝集物に結合する。したがって、本発明の１つの実施形態において、本発明の様々な抗体、これらの抗体のいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有する結合性分子、本発明のポリヌクレオチド、ベクター又は細胞は、Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲに伴う疾患の予防的処置及び／又は治療的処置のための医薬組成物又は診断組成物を調製することのために、疾患進行及び／又は処置応答をモニターすることのために、また、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及び／又はＦＴＬＤ−ＡＬＳ、並びにそれらに伴う症状を含む、Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲ凝集物に伴う疾患を診断することのために使用される。
【０１１８】
処置：
本明細書中で使用される場合、用語「処置する」又は「処置」は治療的処置及び予防的又は防止的な対策の両方を示し、この場合、その目的が、望まれない生理学的変化又は障害（例えば、糖尿病の発症など）を防止すること又は抑制すること（緩和すること）である。有益な臨床結果又は所望される臨床結果には、検出可能であるか、又は検出不能であるかにかかわりなく、症状の緩和、疾患の程度の減弱、疾患の安定化された（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行の遅延又は緩速化、疾患状態の改善又は緩和、及び、寛解（部分的又は全体的を問わず）が含まれるが、これに限定されない。「処置」はまた、処置を受けない場合の予想された生存と比較して、生存を延ばすことを意味することができる。処置を必要としている人々には、状態又は障害を既に有する人々ならびに状態又は障害を有する傾向がある人々、あるいは、状態又は障害の発現が防止されなければならない人々が含まれる。
【０１１９】
別途言及される場合を除き、用語「薬物」、「医薬」又は「医薬品」は本明細書中では交換可能に使用され、下記のすべてを包含するものとするが、それに限定されない：（Ａ）体内使用又は体外使用のための物品、医薬及び調製物、ならびに、ヒト又は他の動物のどちらかの疾患の診断、治療、緩和、処置又は防止のために使用されることが意図されるあらゆる物質又は物質の混合物；ならびに、（Ｂ）ヒト又は他の動物の身体の構造又はどのような機能に対してでも影響を及ぼすことが意図される（食物以外）の物品、医薬及び調製物；ならびに（Ｃ）条項（Ａ）及び条項（Ｂ）において指定されるあらゆる物品の成分としての使用のために意図される物品。用語「薬物」、「医薬」又は「医薬品」は、１つ又は複数の「薬剤」、「化合物」、「物質」又は「（化学的）組成物」をフィラー、崩壊剤、滑剤、流動促進剤、バインダーとして、また、何らかの他の関連では、他の医薬的に不活性な賦形剤もまた、フィラー、崩壊剤、滑剤、流動促進剤、バインダーとして含有するか、あるいは、「薬物」、「医薬」又は「医薬品」の容易な輸送、崩壊、解離、溶解及び生物学的利用性を、ヒト又は他の動物の体内の意図された標的場所（例えば、皮膚、胃内又は腸内）において保証する、ヒト又は他の動物のどちらかでの使用のために意図される調製物の完全な処方を包含するものとする。用語「薬剤」、「化合物」又は「物質」は本明細書中では交換可能に使用され、より具体的な関連では、すべての薬理学的に活性な薬剤、すなわち、本発明の方法によって所望の生物学的又は薬理学的な効果を誘発するか、あるいは、そのような可能な薬理学的効果を誘発することができることについて研究又は試験される薬剤を包含するものとするが、これらに限定されない。
【０１２０】
「対象」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳動物」によって、診断、予後、防止又は治療が望まれるあらゆる対象、特に哺乳動物対象、例えば、ヒト患者が意味される。
【０１２１】
医薬用キャリア：
医薬的に許容されるキャリア及び投与経路を、当業者に知られている対応する文献から選ぶことができる。本発明の医薬組成物は、この技術分野において広く知られている方法に従って配合することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０００）（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＩＳＢＮ０−６８３−３０６４７２）；Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第２版（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ他、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、米国、２００３）；Ｂａｎｇａ、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第２版（Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓ（２００６）、ＩＳＢＮ：０−８４９３−１６３０−８）を参照のこと）。好適な医薬用キャリアの例がこの技術分野では広く知られており、これらには、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルション（例えば、油／水エマルションなど）、様々なタイプの湿潤化剤、無菌溶液などが含まれる。そのようなキャリアを含む組成物を、広く知られている従来の方法によって配合することができる。これらの医薬組成物は好適な用量で対象に投与することができる。好適な組成物の投与を種々の方式によって行うことができる。例には、医薬的に許容されるキャリアを含有する組成物を、経口方法、鼻腔内方法、直腸方法、局所的方法、腹腔内方法、静脈内方法、筋肉内方法、皮下方法、真皮下方法、経皮的方法、クモ膜下腔内方法及び頭蓋内方法を介して投与することが含まれる。エアロゾル配合物、例えば、鼻腔噴霧配合物などには、保存剤及び等張剤を伴う活性な薬剤の精製された水性溶液又は他の溶液が含まれる。そのような配合物は好ましくは、鼻腔粘膜と適合し得るｐＨ及び等張性状態に調節される。経口投与用の医薬組成物、例えば、単一ドメイン抗体分子（例えば、「ナノボディー（商標）」）などもまた、本発明において想定される。そのような経口配合物は、錠剤、カプセル、粉末、液体又は半固体の形態である場合がある。錠剤は、固体のキャリア、例えば、ゼラチン又はアジュバントなどを含む場合がある。直腸投与又は膣投与のための配合物が、好適なキャリアを伴う坐薬として提示される場合がある（Ｏ’Ｈａｇａｎ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２（９）（２００３）、７２７〜７３５もまた参照のこと）。様々なタイプの投与のために好適である配合物に関するさらなる指針を、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、第１７版（１９８５）及び対応する更新版）において見出すことができる。薬物送達のための方法の簡単な総説については、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９（１９９０）、１５２７〜１５３３を参照のこと。
【０１２２】
ＩＩ．本発明の抗体
本発明は一般には、ヒト由来抗ＤＰＲ抗体（好ましくは抗Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲ抗体）及び抗原結合フラグメント、並びに生物工学的誘導体に関連し、この場合、これらは好ましくは、実施例において例示される抗体について概略されるような免疫学的結合特性及び／又は生物学的性質を明らかにする。本発明によれば、ＤＰＲについて特異的であるヒトモノクローナル抗体が、健康なヒト対象のプールからクローン化された。しかしながら、本発明の別の態様では、ヒト抗ＤＰＲモノクローナル抗体はＤＰＲ凝集に伴う疾患及び／又は障害の症状を示す患者からもクローン化され得る。
【０１２３】
本発明に従って行われた実験の過程において、ＤＰＲ結合に対して当初スクリーニングされた培養ヒトメモリーＢ細胞の馴化培地に存在する組換えＩｇＧ抗体が、ＤＰＲｓに対する、また、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む、他のタンパク質に対するそれらの結合能について評価された。実施例３〜７及び図２〜６を参照のこと。このスクリーニングにおいてＤＰＲタンパク質に結合することができ、しかし、他のタンパク質のどれにも結合することができないＢ細胞上清のみが、抗体クラス及び軽鎖サブクラスの決定を含めて、さらなる分析のために選択された。選択されたＢ細胞はその後、抗体クローニングのために処理された。実施例１及び１２並びに図１４を参照のこと。
【０１２４】
簡単に記載すると、クローニング方法は、選択されたＢ細胞からのメッセンジャーＲＮＡの抽出、ＲＴ−ＰＣＲによる逆転写、ＰＣＲによる抗体コード領域の増幅、プラスミドベクターへのクローニング及び配列決定を行うことにある。選択されたヒト抗体がその後、ＨＥＫ２９３細胞又はＣＨＯ細胞における組換え発現及び精製によって産生され、続いて、ヒトＤＰＲタンパク質と結合するそれらの能力について特徴づけられた。様々な試験の組合せにより、例えば、ＨＥＫ２９３細胞又はＣＨＯ細胞における抗体の組換え発現、そして、ヒトＤＰＲタンパク質に対するそれらの結合特異性の引き続いた特徴づけ、ならびに、その病理学的に変異した形態、及び／又は凝集した形態に対するそれらの弁別的な結合により、ＤＰＲについて非常に特異的であり、かつ、ＤＰＲタンパク質、例えばＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲｓの病理学的に凝集した形態を弁別的に認識し、それらと選択的に結合するヒト抗体が今回初めてクローン化されたことが確認された。場合により、マウスキメラ抗体もまた、本発明のヒト抗体の可変ドメインに基づいて作製された。
【０１２５】
したがって、本発明は一般には、組換えのヒト由来モノクローナル抗ＤＰＲ抗体ならびにＤＰＲ結合フラグメント、合成及び生物工学的誘導体及び変異体に関連する。本発明の１つの実施形態において、抗体はヒトＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲｓと結合することができる。
【０１２６】
本発明の１つの実施形態において、抗体は、Ｃ９ＯＲＦ７２のＧＡリピート、ＧＰリピート、ＧＲリピート、ＰＲリピート及びＰＡリピートについては実施例において使用されるようなＤＰＲタンパク質又はＤＰＲペプチド（リピート数が約１０〜２０であり、好ましくは１５である）と結合する；例えば、実施例８及び実施例９、並びに、図７及び図８を参照のこと。ＤＰＲタンパク質はＤＰＲのみから本質的になる場合があり、或いは、ＤＰＲをより大きいポリペプチドの内部に、例えば、Ｃ９ＯＲＦ７２での第１エクソンにおけるＧＡリピート又はＧＰリピートのようにＮ末端、Ｃ末端又は間に含む場合がある。
【０１２７】
さらには、実施例１２及び実施例１３において明らかにされるように、また、図１４及び図１５に示されるように、本発明のヒト由来のモノクローナルＮＩ−３０８．１８Ｆ７抗ＤＰＲ抗体、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７抗ＤＰＲ抗体、ＮＩ−３０８．５Ｇ２抗ＤＰＲ抗体及びＮＩ−３０８．４Ｍ１抗ＤＰＲ抗体は好ましくは、病理学的な変異型及び／又は凝集型のＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲに特異的に結合し、かつ、生理学的形態でのＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲを実質的に認識しないことにおいて特徴づけられる；例えば、図１４及び図１５を参照のこと。したがって、本発明は、診断目的及び治療目的のために特に有用である結合特性を有する一連のヒト抗ＤＰＲ抗体を提供する。したがって、１つの実施形態において、本発明は、ＤＰＲタンパク質（例えば、Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＲＰ）の病理学的な凝集型形態と特異的に結合することができる抗体を提供する。
【０１２８】
１つの実施形態において、本発明の抗体は、実施例において記載されるような例示的なＮＩ−３０８．１８Ｆ７抗体、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７抗体、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１抗体、ＮＩ−３０８．４５Ｃ２抗体、ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１抗体、ＮＩ−３０８．５Ｇ２抗体、ＮＩ−３０８．４６Ｅ９抗体、ＮＩ−３０８．６Ｂ１１抗体、ＮＩ−３０８．４６Ｆ８抗体、ＮＩ−３０８．４Ｍ１抗体、ＮＩ−３０８．１２Ａ３抗体及びＮＩ−３０８．１６Ｃ１０抗体のいずれか１つの結合特性を示す。本発明の抗ＤＰＲ抗体は、生理学的なＣ９ＯＲＦ７２ではなく、むしろ、病理学的に変化したＣ９ＯＲＦ７２（例えば、Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲ種及びそのフラグメントなど）を優先的に認識する。したがって、１つの実施形態において、本発明の抗体は、生理学的なＣ９ＯＲＦ７２種を実質的に認識しない。
【０１２９】
用語「実質的に認識しない」は、抗体、そのフラグメント、あるいは、特定の標的分子、特定の抗原、ならびに／又は、前記標的分子及び／もしくは抗原の特定の立体配座についての結合性分子を含む一群の分子の結合親和性を記述するために本出願において使用されるときには、前述の群の分子が、別の分子、抗原及び／又は立体配座と結合することについての前述の群の分子の結合親和性の２分の１未満である、３分の１未満である、４分の１未満である、５分の１未満である、６分の１未満である、７分の１未満である、８分の１未満である、又は９分の１未満である結合親和性により、前記の分子、抗原及び／又は立体配座と結合することを意味する。非常に多くの場合、解離定数（ＫＤ）が、結合親和性の尺度として使用される。ときには、結合親和性の尺度として使用されるのが、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイのような特異的アッセイでのＥＣ５０である。好ましくは、用語「実質的に認識しない」は、本出願において使用されるときには、前述の群の分子が、別の分子、抗原及び／又は立体配座に対する結合についての前述の群の前記分子の結合親和性の１０分の１未満である、２０分の１未満である、５０分の１未満である、１００分の１未満である、１０００分の１未満である、又は１００００分の１未満である結合親和性により、前記の分子、抗原及び／又は立体配座と結合することを意味する。
【０１３０】
上記で記載されるように、ＦＴＬＤ及びＡＬＳにおけるＣ９ＯＲＦ７２の凝集の最も一般的な原因が、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の非コードエクソン１ａと非コードエクソン１ｂとの間に位置するヘテロ接合性の伸長したヘキサヌクレオチドリピート（ＧＧＧＧＣＣ）に起因することが示された。具体的には、３つの代替的な読み枠でのセンス転写物の非通常的な非ＡＴＧ翻訳、すなわち、伸長したヘキサヌクレオチドリピートの３つの代替的な読み枠でのセンス転写物の非通常的な非ＡＴＧ翻訳により、２アミノ酸の繰り返し単位（ジペプチドリピート、ＤＰＲ）をそれぞれが含む異なるポリペプチド、すなわち、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ；ＧＡ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ；ＧＰ）及び／又はポリ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ；ＧＲ）の産生、生成及び凝集が生じることが示された。したがって、本発明の１つの実施形態において、ＤＰＲは、ポリ−グリシン−アラニン（Ｇｌｙ−Ａｌａ；ＧＡ）リピート、ポリ−グリシン−プロリン（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ；ＧＰ）リピート又はポリ−グリシン−アルギニン（Ｇｌｙ−Ａｒｇ；ＧＲ）リピートを含む。好ましい実施形態において、ＤＰＲは、ポリ−グリシン−アラニン（Ｇｌｙ−Ａｌａ；ＧＡ）リピート又はポリ−グリシン−プロリン（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ；ＧＰ）リピートからなる。
【０１３１】
伸長したヘキサヌクレオチドリピートがＣ９ＯＲＦ７２の非コードエクソン１ａと非コードエクソン１ｂとの間に位置するという事実、及び、変異したＣ９ＯＲＦ７２は開始コドンを欠いているという事実にもかかわらず、すべての読み枠が、ジペプチドリピート（ＤＰＲ）タンパク質に、すなわち、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ；ＧＡ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ；ＧＰ）及び／又はポリ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ；ＧＲ）に翻訳される。予備的研究ではまた、様々な抗体が、本発明に従って行われた実験において特定され、クローン化され、これらの抗体は、ニューロン細胞質封入体、ニューロン核内封入体及び異栄養性神経突起を、実施例１２及び実施例１３並びに図１４及び図１５に示されるように、ＧＡ、ＧＰ又はＧＰタイプのＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲに伴う、すなわち、センス鎖方向で翻訳されるＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲに伴う小脳の顆粒細胞層において染色するだけでなく、両方向で翻訳されたＤＰＲ、すなわち、そのアンチセンス方向で翻訳されるジペプチドリピートタンパク質、すなわち、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ；ＰＲ）及び／又はポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ；ＰＡ）を認識することができる抗体もまた、それらを染色することが示される。したがって、両方の鎖に由来するＣ９ＯＲＦ７２タンパク質産物、すなわち、Ｃ９ＯＲＦ７２のエクソン１ａとエクソン１ｂとの間の非コード領域の伸長したヘキサヌクレオチドリピートからセンス方向及びアンチセンス方向で翻訳されて生じるＤＰＲの凝集を特定することができ、かつ、これと結合することができる抗体が提供される。したがって、１つの実施形態において、抗ＤＰＲ抗体、そのＤＰＲ結合分子若しくはフラグメント、合成変異体又は生物工学変異体は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子からそのセンス方向及び／又はアンチセンス方向で翻訳されるようなＤＰＲを認識する。好ましい実施形態において、ＤＰＲ抗体は、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ；ＧＡ）タイプ、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ；ＧＰ）タイプ、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ；ＧＲ）タイプ、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ；ＰＲ）タイプ及び／又はポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ；ＰＡ）タイプのＤＰＲを認識する。
【０１３２】
加えて、予備実験では、ＤＰＲの異なる配列体、すなわち、ＤＰＲタンパク質の異なるアミノ酸組成体に結合することができるＤＰＲ抗体が特定された。具体的には、（ＰＡ）ｎ及び（ＧＡ）ｎの両方、（ＧＰ）ｎ及び（ＧＡ）ｎの両方、（ＰＲ）ｎ及び（ＧＡ）ｎの両方、又は、（ＧＲ）ｎ及び（ＧＡ）ｎ及び（ＰＲ）ｎからなるＤＰＲタンパク質を認識するＤＰＲ抗体が認められた。したがって、本発明の１つの実施形態において、ＤＰＲ抗体は、異なるアミノ酸組成を示すＤＰＲタンパク質の組合せからなるＤＰＲタンパク質を認識することができる。したがって、実施例において明らかにされるように、また、図２Ａ〜図２Ｍ及び図７Ａ〜図７Ｐに示されるように、２つ又はそれどころか３つの異なるジペプチドリピートを同じ程度の大きさでの特異性で認識するヒト由来抗体が得られる。好ましい実施形態において、抗ＤＰＲ抗体は、（ＰＡ）ｎ又は（ＧＡ）ｎ、（ＧＰ）ｎ又は（ＧＡ）ｎ、（ＰＲ）ｎ又は（ＧＡ）ｎ、或いは、（ＧＲ）ｎ又は（ＧＡ）ｎ又は（ＰＲ）ｎであるＤＰＲタンパク質の組合せからなるＤＰＲタンパク質を認識することができる。すなわち、本発明の抗ＤＰＲ抗体はＤＰＲのどのような組合せでも認識する場合があり、好ましくは、抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２について示されるように（ＧＰ）ｎ及び（ＧＡ）ｎを認識する場合があり（図２Ａ及び図２Ｇ並びに図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｊ及び図７Ｋを参照のこと）、又は、抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１について示されるように、（ＧＲ）ｎ、（ＧＡ）ｎ及び（ＰＲ）ｎを認識する場合があり（図２Ａ及び図２Ｉ並びに図７Ａ、図７Ｃ、図７Ｌ及び図７Ｍを参照のこと）、又は、抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１について示されるように、（ＰＡ）ｎ及び（ＧＡ）ｎを認識する場合があり（図２Ａ及び図２Ｋ並びに図７Ｅ及び図７Ｐを参照のこと）、又は、抗体ＮＩ−３０８．１６Ｃ１０について示されるように、（ＰＲ）ｎ及び（ＧＡ）ｎを認識する場合がある（図２Ａ及び図２Ｍを参照のこと）。
【０１３３】
代替において、又は加えて、本発明の抗体は、少なくとも第１及び第２の抗原結合部位、すなわち、異なったエピトープを有する本発明の２つの異なる抗体に由来する可変ドメインを含むように操作される場合があり、好ましくは、この場合、一方又は両方の可変領域が、添付された実施例及び図において例示される主題抗体のいずれか１つに由来し、さらには本明細書中に記載される通りである。例えば、抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１及び抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１の可変領域を組み合わせれば、（ＧＡ）ｎ、（ＧＲ）ｎ、（ＰＲ）ｎ及び（ＰＡ）ｎからなるＤＰＲの組合せと結合することができる抗体が生じるであろう。したがって、主題抗体により、ＤＰＲのどのような組合せでも認識することができる抗体を提供することが可能となる。二重特異性抗体及び多重特異性抗体をこの技術分野ではよく知られている方法によって作製することができ、例えば、モノクローナルな免疫グロブリンＧ１フラグメントの化学的組換えを、例えば、Ｂｒｅｎｎａｎ他（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９（１９８５）、８１〜８３）によって記載されるように行うことによって、又は、適切な重鎖及び軽鎖を組換えにより同時共発現し、対応する対を形成させることによって作製することができる；例えば、Ｌｅｗｉｓ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３２（２０１４）、１９１〜１９８を参照のこと；総説については、例えば、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ、ｍＡｂｓ．４（２０１２）、１８２〜１９７を、そして、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ及びＢｒｉｎｋｍａｎｎ、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ２０（２０１５）、８３８〜８４７を参照のこと。
【０１３４】
いくつかの研究では、患者におけるＤＰＲの凝集が、より多数のジペプチドリピートを有する患者において主に生じることが明らかにされている。したがって、本発明の１つの実施形態において、ＤＰＲ結合性分子は、より多数の数のリピートを含有するＤＰＲタンパク質、すなわち、（ＧＡ）ｎ、（ＧＰ）ｎ、（ＧＲ）ｎ、（ＰＲ）ｎ又は（ＰＡ）ｎからなるＤＰＲに結合する。この場合、ｎはリピートの数を示し、例えば、１５回のリピートを有するＤＰＲタンパク質が（ＸＸ）１５として示されることになり、これはまた、例えば、ヘキサヌクレオチド伸長Ｇ４Ｃ２が１５回繰り返されることを意味する。好ましい実施形態において、リピート数は１０〜３０であり、すなわち、（ＸＸ’）１０〜３０である。特に好ましい実施形態において、リピート数は（ＸＸ’）１５である。
【０１３５】
しかしながら、理論にとらわれることはないが、より小さいリピートサイズ（すなわち、１５回未満のリピート、好ましくは１０回未満のリピート、より好ましくは５回未満のリピート）が、表面における高密度コーティングのときにはより大きいペプチドを模倣する場合がある。したがって、本発明の１つの実施形態において、ＤＰＲ抗体は、（ＧＡ）ｎ、（ＧＰ）ｎ、（ＧＲ）ｎ、（ＰＲ）ｎ又は（ＰＡ）ｎからなるＤＰＲに結合する（この場合、リピートの数（ｎ）は１５回未満のリピートである）。好ましい実施形態において、ＤＰＲ抗体は、（ＧＡ）ｎ、（ＧＰ）ｎ、（ＧＲ）ｎ、（ＰＲ）ｎ又は（ＰＡ）ｎからなるＤＰＲに結合する（この場合、リピートの数（ｎ）は１０回未満のリピートである）。特に好ましい実施形態において、ＤＰＲ抗体は、（ＧＡ）ｎ、（ＧＰ）ｎ、（ＧＲ）ｎ、（ＰＲ）ｎ又は（ＰＡ）ｎからなるＤＰＲに結合する（この場合、リピートの数（ｎ）は５回未満のリピートである）。予備実験では、本発明のＤＰＲ抗体の結合がまた、ちょうど３回〜４回のリピートを示すＤＰＲタンパク質において可能であることが示される；例えば、図７を参照のこと。したがって、本発明の１つの実施形態において、３回〜４回のリピートが、ＤＰＲ抗体の結合のためには十分である。１つの実施形態において、本発明の抗体は、上記で記載されたジペプチドリピートのいずれかの１つの３回未満（ｎ＜３）を有するエピトープには実質的に結合しないか、又は、有意により小さい程度にしか結合しない；例えば、実施例８及び実施例９、同様にまた、図７及び図８を参照のこと。
【０１３６】
実施例において、具体的には実施例３及び実施例４において示されるように、より多数のジペプチドリピートを示す種々のＤＰＲ構築物が設計された。具体的には、１５回のリピート、すなわち、（ＧＡ）１５、（ＧＰ）１５、（ＧＲ）１５、（ＰＡ）１５及び（ＰＲ）１５を示すＤＰＲ構築物が構築された。これらの構築物を利用して、本発明に従って特定された抗体の特徴づけ研究が行われた；例えば、実施例３及び実施例４を参照のこと。結果から、抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１及び抗体ＮＩ−３０８．４５Ｃ２は、Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲの（ＧＡ）１５に大きい親和性で特異的に結合し、しかし、（ＧＰ）１５、（ＧＲ）１５、（ＰＡ）１５又は（ＰＲ）１５からなるＤＰＲには結合しないことが明らかにされた；例えば、図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ及び図２Ｅ、並びに、図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ及び図３Ｅを参照のこと。対照的に、抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２、抗体ＮＩ−３０８．１２Ａ３及び抗体ＮＩ−３０８．４６Ｅ９は、Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲの（ＧＡ）１５及び（ＧＰ）１５を大きい親和性で特異的に認識し、しかし、（ＧＲ）１５、（ＰＡ）１５又は（ＰＲ）１５からなるＤＰＲを認識しない；例えば、図２Ａ、図２Ｇ、図２Ｈ及び図２Ｌ、並びに、図３Ａ、図３Ｇ、図３Ｈ及び図３Ｌを参照のこと。抗体ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１はＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲの（ＰＲ）１５のみを認識し、しかし、（ＧＰ）１５、（ＧＲ）１５、（ＰＡ）１５又は（ＰＲ）１５からなるＤＰＲを認識しない；例えば、図２Ａ及び図２Ｆ、同様にまた、図３Ａ及び図３Ｆを参照のこと。対照的に、抗体ＮＩ−３０８．１６Ｃ１０はＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲの（ＰＲ）１５を優先的に認識し、（ＧＡ）１５にもまた結合し、しかし、（ＧＰ）１５、（ＧＲ）１５又は（ＰＲ）１５からなるＤＰＲを認識しなかった；例えば、図２Ａ及び図２Ｍ、並びに、図３Ａ及び図３Ｍを参照のこと。驚くべきことに、抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１及び抗体ＮＩ−３０８．４６Ｆ８は大きい親和性を、（ＧＲ）１５、（ＧＡ）１５及び（ＰＲ）１５に対して示し、しかし、（ＧＰ）１５又は（ＰＡ）１５からなるＤＰＲには示さなかった；例えば、図２Ａ、図２Ｉ及び図２Ｊ、並びに、図３Ａ、図３Ｉ及び図３Ｊを参照のこと。抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１はＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲの（ＰＡ）１５及び（ＧＡ）１５を認識し、しかし、（ＧＰ）１５、（ＧＲ）１５又は（ＰＲ）１５からなるＤＰＲを認識しない；例えば、図２Ａ及び図２Ｋ、並びに、図３Ａ及び図３Ｋを参照のこと。したがって、１つの実施形態において、本発明の抗体は好ましくは、（ＧＡ）１５からなるＤＰＲタンパク質を認識する。別の実施形態において、（ＧＡ）１５からなるＤＰＲタンパク質を認識する本発明の抗体は、（ＧＰ）１５又は（ＧＲ）１５又は（ＰＡ）１５又は（ＰＲ）１５からなるＤＰＲタンパク質を実質的に認識しない。さらなる実施形態において、本発明の抗体は好ましくは、（ＧＰ）１５又は（ＧＡ）１５からなるＤＰＲタンパク質を認識し、好ましくは、（ＧＰ）１５又は（ＧＡ）１５からなるＤＰＲタンパク質を認識する抗体は、（ＧＲ）１５又は（ＰＲ）１５又は（ＰＡ）１５からなるＤＰＲタンパク質を実質的に認識しない。さらなる実施形態において、（ＰＲ）１５からなるＤＰＲタンパク質を認識する本発明の抗体は、（ＧＡ）１５、（ＧＰ）１５又は（ＧＲ）１５又は（ＰＡ）１５からなるＤＰＲタンパク質を実質的に認識しない。なおさらなる実施形態において、（ＧＡ）１５、（ＧＲ）１５又は（ＰＲ）１５からなるＤＰＲタンパク質を認識する本発明の抗体は、（ＧＰ）１５又は（ＰＡ）１５からなるＤＰＲタンパク質を実質的に認識しない。さらなる実施形態において、本発明の抗体は好ましくは、（ＰＡ）１５又は（ＧＡ）１５からなるＤＰＲタンパク質を認識し、好ましくは、（ＰＡ）１５又は（ＧＡ）１５からなるＤＰＲタンパク質を認識する抗体は、（ＧＰ）１５又は（ＧＲ）１５又は（ＰＲ）１５からなるＤＰＲタンパク質を実質的に認識しない。さらにさらなる実施形態において、本発明の抗体は好ましくは、（ＰＲ）１５又は（ＧＡ）１５からなるＤＰＲタンパク質を認識し、好ましくは、（ＧＡ）１５又は（ＰＲ）１５からなるＤＰＲタンパク質を認識する抗体は、（ＧＰ）１５又は（ＧＲ）１５又は（ＲＡ）１５からなるＤＰＲタンパク質を実質的に認識しない。別の言い方をすれば、それらの実施形態における抗体は、ただ１つのＤＰＲタンパク質又は少なくとも２つの異なるＤＰＲタンパク質のどちらとでも結合することができる；例えば、実施例３及び実施例４、並びに、図２及び図３において例示されるような例示的抗体のＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、ＮＩ−３０８．４５Ｃ２、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１、ＮＩ−３０８．５Ｇ２、ＮＩ−３０８．４６Ｅ９、ＮＩ−３０８．６Ｂ１１、ＮＩ−３０８．４６Ｆ８、ＮＩ−３０８．４Ｍ１、ＮＩ−３０８．１２Ａ３及びＮＩ−３０８．１６Ｃ１０を参照のこと。
【０１３７】
実施例において記載されるような構築物を利用すれば、本発明の抗ＤＰＲ抗体がヒトＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲの（ＧＡ）１５若しくは（ＧＰ）１５又は（ＧＲ）１５又は（ＰＲ）１５又は（ＰＡ）１５に結合することが示され得るかもしれない。これに関連して、本発明の抗ＤＰＲ抗体のいずれか１つ又はその生物工学誘導体の結合親和性が、図２における例示的なＮＩ−３０８．１５Ｏ７抗体、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１抗体、ＮＩ−３０８．４５Ｃ２抗体、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７抗体、ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１抗体、ＮＩ−３０８．５Ｇ２抗体、ＮＩ−３０８．４６Ｅ９抗体、ＮＩ−３０８．６Ｂ１１抗体、ＮＩ−３０８．４６Ｆ８抗体、ＮＩ−３０８．４Ｍ１抗体、ＮＩ−３０８．１２Ａ３抗体及びＮＩ−３０８．１６Ｃ１０抗体について示されるような範囲にある場合があり、すなわち、最大半量有効濃度（ＥＣ５０）が約０．１ｎＭ〜約２００ｎＭであり、好ましくは１ｐＭ〜１００ｎＭであり、より好ましくは、ＥＣ５０が約５０ｐＭ〜５０ｎＭであり、最も好ましくは、ＥＣ５０が、ＢＳＡ−（ＧＡ）１５構築物、ＢＳＡ−（ＧＰ）１５構築物又はＢＳＡ−（ＰＡ）１５構築物については約０．１ｎＭ〜０．５ｎＭであり、最も好ましくは、ＥＣ５０が、ＢＳＡ−（ＰＲ）１５構築物については約１０ｎＭ〜２００ｎＭである；例えば、図３Ａ〜図３Ｍを参照のこと。
【０１３８】
好ましくは、抗ＤＰＲ抗体、そのＤＰＲ結合フラグメント又は生物工学誘導体は、２００ｎＭ超、好ましくは１００ｎＭ以下、より好ましくは５０ｎＭ以下、一層より好ましくは１０ｎＭ以下、最も好ましくは０．５ｎＭ以下であるＥＣ５０（最大半量有効濃度）値に対応する結合親和性を、ＤＰＲタンパク質の（ＧＡ）１５、（ＧＲ）１５又は（ＰＲ）１５と結合することについて有し、又は、１０ｎＭ以下、好ましくは２ｎＭ以下、一層より好ましくは１ｎＭ以下、最も好ましくは０．５ｎＭ以下であるＥＣ５０（最大半量有効濃度）値に対応する結合親和性を、ＤＰＲタンパク質の（ＧＰ）１５又は（ＰＡ）１５と結合することについて有する；例えば、図２Ａ〜図２Ｍを参照のこと。
【０１３９】
いくつかの抗体は広範囲の数々の生体分子（例えば、タンパク質）に結合することができる。当業者は理解するであろうように、特異的（な）という用語は、ＤＰＲでない他の生体分子が抗原結合性分子（例えば、本発明の抗体の１つ）に有意に結合しないことを示すために本明細書中では使用される。好ましくは、ＤＰＲ以外の生体分子に対する結合のレベルにより、ＤＰＲに対する親和性の最大でもほんの２０％以下、１０％以下、ほんの５％以下、ほんの２％以下、又はほんの１％以下（すなわち、少なくとも５分の１未満、１０分の１未満、２０分の１未満、５０分の１未満又は１００分の１未満、或いはそれよりも小さいどのような程度でも）である結合親和性がそれぞれもたらされる；例えば、実施例３〜実施例５、並びに、図２〜図４を参照のこと。
【０１４０】
１つの実施形態において、本発明の抗ＤＰＲ抗体は、ＤＰＲ（例えば、Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲ）並びに／或いはそのフラグメント、誘導体、原線維及び／又はオリゴマーの凝集型形態に優先的に結合する。別の実施形態において、本発明の抗ＤＰＲ抗体は、疾患及び／又は障害に関連しないＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲと、Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲの病理学的な凝集型形態との両方に優先的に結合する；例えば、実施例１０並びに、図９〜図１２を参照のこと。なお別の実施形態において、本発明の抗ＤＰＲ抗体は、ＤＰＲ（例えば、Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲ）並びに／或いはそのフラグメント、誘導体、原線維及び／又はオリゴマーの様々な形態に溶液中で結合することができる；実施例７、並びに、図６を参照のこと。これに関連して、本発明の抗ＤＰＲ抗体のいずれか１つ又はその生物工学誘導体は、例示的抗体のＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．４５Ｃ２及びＮＩ−３０８．２８Ｇ１について示されるように、ポリＧＡ  ＤＰＲタンパク質ペプチドを溶液中で捕捉することができる場合があり、或いは、本発明の抗ＤＰＲ抗体のいずれか１つ又はその生物工学誘導体は、例示的抗体のＮＩ−３０８．２４Ｅ１１及びＮＩ−３０８．６Ｂ１１について示されるように、ポリＰＲ及びポリＧＲを沈殿させることができる場合がある；例えば、図６（Ａ）〜図６（Ｃ）を参照のこと。
【０１４１】
図１４及び図１５、並びに、実施例１２及び実施例１３において、本発明の抗体は、ＤＰＲの凝集物、具体的にはＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲタンパク質の凝集物に伴うＦＴＬＤ患者における小脳の顆粒細胞層での病理学的なニューロン細胞質封入体、ニューロン核内封入体及び異栄養性神経突起を染色することができることが示された。したがって、１つの実施形態において、本発明の抗体はヒト組織における凝集型Ｃ９ＯＲＦ７２と結合することができる。特に好ましい実施形態において、抗体はヒトＦＴＬＤ組織における凝集型Ｃ９ＯＲＦ７２と結合することができる。述べられたように、凝集型Ｃ９ＯＲＦ７２は、上記で記載されるように、伸長したヘキサヌクレオチドリピートをその非コード領域において示す変異したＣ９ＯＲＦ７２を意味する。このリピートにより、ＡＴＧ開始側（ｓｔａｒｔ  ｓｉｄｅ）の喪失と、上記で記載されるようなＤＰＲへのリピート部の翻訳とが引き起こされる。
【０１４２】
前述の通り、脳の前頭葉及び側頭葉におけるＤＰＲタンパク質凝集物の蓄積が神経変性障害ＦＴＬＤの顕著な特徴である。ニューロン細胞質封入体、ニューロン核内封入体及び異栄養性神経突起におけるＤＰＲ凝集物を、本発明の図１４及び図１５、並びに、実施例１２及び実施例１３に示されるように小脳の顆粒細胞層に有する患者は多くの場合、変化した認知機能を示す。具体的には、ＦＴＬＤの患者は、上記で記載されるように、前頭皮質及び側頭皮質の変性に起因する認知症、人格並びに行動の変化、言語機能障害及び／又は精神病を示す。したがって、１つの実施形態において、本発明の抗体は、ＤＰＲに伴う疾患及び／又は障害を処置するために有用である。好ましい実施形態において、本発明の抗体は、ＦＴＬＤ及びその症状の処置において有用である。
【０１４３】
本発明はまた、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、ＮＩ−３０８．４５Ｃ２、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１、ＮＩ−３０８．５Ｇ２、ＮＩ−３０８．４６Ｅ９、ＮＩ−３０８．６Ｂ１１、ＮＩ−３０８．４６Ｆ８、ＮＩ−３０８．４Ｍ１、ＮＩ−３０８．１２Ａ３及びＮＩ−３０８．１６Ｃ１０からなる群から選択される抗体の抗原結合ドメインと、或いは、ＤＰＲと結合することについて、例えば、（ＧＡ）１５又は（ＧＰ）１５又は（ＧＲ）１５又は（ＰＲ）１５又は（ＰＡ）１５と結合することについていずれかの抗体又はすべての抗体と競合することができる抗体の抗原結合ドメインと同一の抗原結合ドメインを含む抗体、その抗原結合フラグメント、生物工学変異体及び生物工学誘導体に向けられる。
【０１４４】
本発明ではさらに、その可変領域において、例えば、結合ドメインにおいて、図１Ａ〜図１Ｌのいずれか１つに示されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むＶＨ可変領域及び／又はＶＬ可変領域の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことによって特徴づけられることがある、ＤＰＲを認識するいくつかの結合性分子（例えば、抗体及びその結合性フラグメント）が例示される。
【０１４５】
上記の可変領域をコードする対応するヌクレオチド配列が下記の表ＩＩに示される。ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域の上記アミノ酸配列のＣＤＲの例示的なセットが図１Ａ〜図１Ｌのいずれか１つに示される。しかしながら、下記で議論されるように、当業者は、加えて、又は代替において、様々なＣＤＲが使用されることがあり、ただし、この場合、これらのＣＤＲが、それらのアミノ酸配列において、図１Ａ〜図１Ｌのいずれか１つに示されるアミノ酸配列から、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の場合には１つ、２つ、３つ、又はそれどころかそれ以上のアミノ酸によって異なるという事実を十分に承知している。したがって、１つの実施形態において、図１Ａ〜図１Ｌのいずれか１つに示されるような少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びに／或いは、１つ又は複数のアミノ酸置換を含むその１つ又は複数のＣＤＲをその可変領域に含む本発明の抗体、その生物工学誘導体又はＤＰＲ結合フラグメンが提供される。
【０１４６】
１つの実施形態において、本発明の抗体は、図１Ａ−Ｌのいずれかに示される又はそのＶＨ領域及び／又はＶＬ領域、あるいは、１つ又は複数のアミノ酸置換を含むそのＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のアミノ酸配列を含む抗体のいずれか１つである。好ましくは、本発明の抗体は、ヒトＢ細胞に存在したような重鎖及び軽鎖の同族性の対形成の保存によって特徴づけられる。
【０１４７】
本発明のさらなる実施形態において、抗ＤＰＲ抗体、ＤＰＲ結合フラグメント、それらの合成変異体又は生物工学変異体は、標的に対する適切な結合親和性、及び、適切な薬物動態学的特性を有するように最適化することができる。したがって、グリコシル化、酸化、脱アミノ化、ペプチド結合切断、イソアスパラギン酸形成及び／又は不対システインからなる群から選択される修飾を受けやすいＣＤＲ領域内又は可変領域内の少なくとも１つのアミノ酸が、そのような変化を欠く変異アミノ酸によって置換され、あるいは、少なくとも１つの炭水化物成分が化学的又は酵素的に除かれ、又は抗体に付加される。例えば、Ｌｉｕ他、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９７（７）（２００８），２４２６−２４４７、Ｂｅｃｋ他Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０（２０１０），３４５−３５２、Ｈａｂｅｒｇｅｒ他ＭＡｂｓ．６（２０１４），３２７−３３９．を参照のこと。
【０１４８】
代替では、本発明の抗体は、ＤＰＲｓに対する結合について、図１Ａ−Ｌのいずれか１つに示されるようなＶＨ領域及び／又はＶＬ領域を有する抗体の少なくとも１つと競合する抗体あるいはその抗原結合フラグメント、生物工学的誘導体又は変異体である。
【０１４９】
図４及び実施例５において提供される実験結果からは、本発明の抗ＤＰＲ抗体のいくつかが、疾患を引き起こす凝集型形態のＤＰＲ（例えば、Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲなど）に他のアミロイド形成タンパク質よりも優先的に結合することが示唆される。したがって、１つの実施形態において、本発明の抗体はＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲをアミロイド形成タンパク質よりも優先的に認識する。
【０１５０】
本発明の１つの実施形態において、抗ＤＰＲ抗体、そのＤＰＲ結合フラグメント、合成誘導体又は生物工学誘導体は本当に、Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲの変異型形態及び／又は凝集型形態を生理学的なＣ９ＯＲＦ７２よりも優先的に認識する。
【０１５１】
本発明の抗体は、治療適用のためには特に、ヒト由来の抗体である場合がある。代替では、本発明の抗体は、動物における診断方法及び研究のために特に有用である齧歯類抗体、齧歯類化抗体又は齧歯類−ヒトのキメラ抗体、好ましくは、マウス抗体、マウス化抗体又はマウス−ヒトのキメラ抗体、あるいは、ラット抗体、ラット化抗体又はラット−ヒトのキメラ抗体である。１つの実施形態において、本発明の抗体は齧歯類−ヒトのキメラ抗体又は齧歯類化抗体である。
【０１５２】
さらには、１つの実施形態において、本発明のキメラ抗体、すなわち、ヒト抗体の可変ドメインと、マウスの一般的な軽鎖定常ドメイン及び重鎖定常ドメインとを含むキメラ抗体はヒトＤＰＲｓに大きい親和性で結合する。好ましくは、キメラ抗体の結合親和性はそれらのヒト対応物と類似している。
【０１５３】
１つの実施形態において、本発明の抗体は、培養される単一のＢ細胞又はオリゴクローナルなＢ細胞の培養物、及び、前記Ｂ細胞によって産生される抗体を含有する培養物の上清によって提供され、それらにおける抗ＤＰＲ抗体の存在及び親和性についてスクリーニングされる。スクリーニングプロセスは、合成された全長型ｈＤＰＲペプチドに由来する、或いは例えばヒト血漿又は組換え発現から精製されたｈＤＰＲのオリゴマーのような生来型モノマー凝集物、原線維性凝集物又は非原線維性凝集物に対する結合についてのスクリーニングを含む。各ｈＤＰＲペプチドは、そのままの形態で、或いは代替として、ＢＳＡなどの適当な担体に連結又は結合した状態で使用され得る。
【０１５４】
好ましい実施形態において、本発明はまた一般には、変異型Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲ種及び／又は凝集型Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲ種或いはそれらのフラグメントに対する特異的な結合について本発明のヒトモノクローナル抗体と競合する抗ＤＰＲ抗体及びＤＰＲ結合性分子にまで及ぶ。
【０１５５】
抗体間の競合が、試験下にある免疫グロブリンが共通の抗原（ＤＰＲｓなど）に対する参照抗体の特異的な結合を阻害するアッセイによって求められる。数多くのタイプの競合的結合アッセイが知られている：例えば、固相での直接的又は間接的な放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、固相での直接的又は間接的な酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９（１９８３）、２４２〜２５３を参照のこと）、固相での直接的なビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７（１９８６）、３６１４〜３６１９、及び、Ｃｈｅｕｎｇ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６（１９９０）、５４６〜５５２を参照のこと）、固相での直接的な標識化アッセイ、固相での直接的な標識化サンドイッチアッセイ（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）を参照のこと）、Ｉ１２５標識を使用する固相での直接的な標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌ他、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（１９８８）、７〜１５、及び、Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ他、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２（１９９０）、７７〜８２を参照のこと）。典型的には、そのようなアッセイは、精製されたＤＰＲ又は変異した及び／又は凝集したＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲｓ（例えば、固体表面、又は、これらのどちらかを有する細胞に結合させたオリゴマー及び／又はその原線維など）と、標識されていない試験用免疫グロブリン及び標識された参照用免疫グロブリン（すなわち、本発明のヒトモノクローナル抗体）とを使用することを伴う。競合的阻害が、試験用免疫グロブリンの存在下において固体表面又は細胞に結合する標識の量を求めることによって測定される。通常、試験用免疫グロブリンは過剰に存在する。好ましくは、競合的結合アッセイが、添付された実施例においてＥＬＩＳＡアッセイについて記載されるような条件のもとで行われる。競合アッセイによって特定される抗体（競合抗体）には、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体、及び、立体的障害が生じるために、参照抗体が結合するエピトープに十分に近い隣接エピトープに結合する抗体が含まれる。通常の場合、競合抗体が過剰に存在するときには、競合抗体により、共通の抗原に対する参照抗体の特異的な結合が少なくとも５０％又は７５％阻害されるであろう。したがって、本発明はさらに、抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体に関しており、この場合、当該抗体は、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７，  ＮＩ−３０８．２８Ｇ１，  ＮＩ−３０８．４５Ｃ２，  ＮＩ−３０８．１８Ｆ７，  ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１，  ＮＩ−３０８．５Ｇ２，  ＮＩ−３０８．４６Ｅ９，  ＮＩ−３０８．６Ｂ１１，  ＮＩ−３０８．４６Ｆ８，  ＮＩ−３０８．４Ｍ１，  ＮＩ−３０８．１２Ａ３及びＮＩ−３０８．１６Ｃ１０からなる群から選択される参照抗体がＤＰＲｓに結合することを競合的に阻害する。
【０１５６】
本発明はさらに、抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体に関しており、この場合、当該抗体は、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７，  ＮＩ−３０８．２８Ｇ１，  ＮＩ−３０８．４５Ｃ２，  ＮＩ−３０８．１８Ｆ７，  ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１，  ＮＩ−３０８．５Ｇ２，  ＮＩ−３０８．４６Ｅ９，  ＮＩ−３０８．６Ｂ１１，  ＮＩ−３０８．４６Ｆ８，  ＮＩ−３０８．４Ｍ１，  ＮＩ−３０８．１２Ａ３及びＮＩ−３０８．１６Ｃ１０からなる群から選択される参照抗体が、変異した、及び／又は凝集したＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲ種又はそのフラグメントに結合することを競合的に阻害する。
【０１５７】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む単離されたポリペプチド、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）から本質的になる単離されたポリペプチド、又は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）からなる単離されたポリペプチドであって、重鎖可変領域のＶＨ−ＣＤＲの少なくとも１つ、又は、重鎖可変領域のＶＨ−ＣＤＲの少なくとも２つが、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用重鎖のＶＨ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＨ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列又はＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である、そのような単離されたポリペプチドを提供する。代替において、ＶＨのＶＨ−ＣＤＲ１領域、ＶＨ−ＣＤＲ２領域及びＶＨ−ＣＤＲ３領域は、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用重鎖のＶＨ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＨ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列又はＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。したがって、この実施形態によれば、本発明の重鎖可変領域は、図１Ａ−Ｌのいずれか１つにそれぞれ示される群に関連づけられるＶＨ−ＣＤＲ１ポリペプチド配列、ＶＨ−ＣＤＲ２ポリペプチド配列及びＶＨ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。図１Ａ−Ｌは、Ｋａｂａｔシステムによって定義されるＶＨ−ＣＤＲを示すが、他のＣＤＲ定義、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａシステムによって定義されるＶＨ−ＣＤＲもまた本発明に含まれ、これらは、図１Ａ−Ｌに示されるデータを使用して当業者によって容易に特定され得る。
【０１５８】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む単離されたポリペプチド、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）から本質的になる単離されたポリペプチド、又は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）からなる単離されたポリペプチドであって、ＶＨ−ＣＤＲ１領域、ＶＨ−ＣＤＲ２領域及びＶＨ−ＣＤＲ３領域が、図１Ａ−Ｌのいずれか１つにそれぞれ示されるＶＨ−ＣＤＲ１群、ＶＨ−ＣＤＲ２群及びＶＨ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する、そのような単離されたポリペプチドを提供する。
【０１５９】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む単離されたポリペプチド、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）から本質的になる単離されたポリペプチド、又は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）からなる単離されたポリペプチドであって、ＶＨ−ＣＤＲ１領域、ＶＨ−ＣＤＲ２領域及びＶＨ−ＣＤＲ３領域が、いずれか１つのＶＨ−ＣＤＲにおける１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのアミノ酸置換を除いて、図１Ａ−Ｌのいずれか１つにそれぞれ示されるＶＨ−ＣＤＲ１群、ＶＨ−ＣＤＲ２群及びＶＨ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する、そのような単離されたポリペプチドを提供する。特定の実施形態において、アミノ酸置換は保存的である。
【０１６０】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離されたポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）から本質的になる単離されたポリペプチド、又は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）からなる単離されたポリペプチドであって、軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲの少なくとも１つ、又は、軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲの少なくとも２つが、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＬ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列又はＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である、そのような単離されたポリペプチドを提供する。代替において、ＶＬのＶＬ−ＣＤＲ１領域、ＶＬ−ＣＤＲ２領域及びＶＬ−ＣＤＲ３領域は、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＬ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列又はＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。したがって、この実施形態によれば、本発明の軽鎖可変領域は、図１（Ａ）〜１（Ｊ）のいずれか１つにそれぞれ示されるポリペプチドに関連づけられるＶＬ−ＣＤＲ１ポリペプチド配列、ＶＬ−ＣＤＲ２ポリペプチド配列及びＶＬ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。図１（Ａ）〜１（Ｌ）は、Ｋａｂａｔシステムによって定義されるＶＬ−ＣＤＲを示すが、他のＣＤＲ定義、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａシステムによって定義されるＶＬ−ＣＤＲもまた本発明に含まれる。
【０１６１】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離されたポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）から本質的になる単離されたポリペプチド、又は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）からなる単離されたポリペプチドであって、ＶＬ−ＣＤＲ１領域、ＶＬ−ＣＤＲ２領域及びＶＬ−ＣＤＲ３領域が、図１（Ａ）〜１（Ｌ）にそれぞれ示されるＶＬ−ＣＤＲ１群、ＶＬ−ＣＤＲ２群及びＶＬ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する、そのような単離されたポリペプチドを提供する。
【０１６２】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離されたポリペプチド、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＬ）から本質的になる単離されたポリペプチド、又は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＬ）からなる単離されたポリペプチドであって、ＶＬ−ＣＤＲ１領域、ＶＬ−ＣＤＲ２領域及びＶＬ−ＣＤＲ３領域が、いずれか１つのＶＬ−ＣＤＲにおける１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのアミノ酸置換を除いて、図１（Ａ）〜１（Ｌ）にそれぞれ示されるＶＬ−ＣＤＲ１群、ＶＬ−ＣＤＲ２群及びＶＬ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する、単離されたポリペプチドを提供する。特定の実施形態において、アミノ酸置換は保存的である。
【０１６３】
免疫グロブリン又はそのコードｃＤＮＡがさらに改変される場合がある。したがって、さらなる実施形態において、本発明の方法は、キメラ抗体、マウス化抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、二重特異性抗体、融合抗体、標識化抗体、又は、それらのいずれか１つのアナログを製造する工程のいずれか１つを含む。対応する様々な方法が当業者には知られており、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８８）に記載される。前記抗体の誘導体がファージディスプレー技術によって得られるとき、ＢＩＡｃｏｒｅシステムにおいて用いられるような表面プラズモン共鳴を、本明細書中に記載される抗体のいずれか１つのエピトープと同じエピトープに結合するファージ抗体の効率を増大させるために使用することができる（Ｓｃｈｉｅｒ、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ７（１９９６）、９７〜１０５；Ｍａｌｍｂｏｒｇ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３（１９９５）、７〜１３）。キメラ抗体の製造が、例えば、国際特許出願公開ＷＯ８９／０９６２２に記載される。ヒト化抗体を製造するための方法が、例えば、欧州特許出願ＥＰ−Ａ１０２３９４００及び国際特許出願公開ＷＯ９０／０７８６１に記載される。本発明に従って利用されるための抗体のさらなる供給源は、いわゆる異種抗体である。異種抗体（例えば、ヒト様抗体）をマウスにおいて製造するための一般的原理が、例えば、国際特許出願公開ＷＯ９１／１０７４１、ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９６／３４０９６及びＷＯ９６／３３７３５に記載される。上記で議論されたように、本発明の抗体は、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）２を含めて、完全な抗体のほかに様々な形態で、ならびに、単鎖で存在する場合がある（例えば、国際特許出願公開ＷＯ８８／０９３４４を参照のこと）。したがって、１つの実施形態において、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメント及びＦ（ａｂ’）２フラグメントからなる群から選択される本発明の抗体が提供される。
【０１６４】
本発明の様々な抗体又はそれらの対応する免疫グロブリン鎖はさらに、この技術分野において知られている従来からの技術を使用して、例えば、この技術分野において知られているアミノ酸欠失、アミノ酸挿入、アミノ酸置換、アミノ酸付加及び／又は組換えならびに／あるいはいずれかの他の改変を単独又は組合せでのどちらかで使用することによって改変することができる。そのような改変を免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列の根底にあるＤＮＡ配列に導入するための方法が、当業者には広く知られている；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）、Ｎ．Ｙ．、及び、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９９４）を参照のこと。本発明の抗体の修飾には、アセチル化、ヒドロキシル化、メチル化、アミド化、及び、炭水化物成分又は脂質成分及び補因子などの連結を含む側鎖修飾、骨格修飾、ならびに、Ｎ末端修飾及びＣ末端修飾を含めて、１つ又は複数の構成アミノ酸における化学的及び／又は酵素的な誘導体化が含まれる。同様に、本発明は、記載された抗体又はその何らかのフラグメントを異種分子（例えば、カルボキシル末端での免疫刺激リガンドなど）に融合されてアミノ末端において含むキメラなタンパク質の製造を包含する；対応する技術的詳細については、例えば、国際特許出願公開ＷＯ００／３０６８０を参照のこと。
【０１６５】
本発明の抗体はまた、その治療的可能性を最適化するさらなる改変を含む場合がある。これらの改変には、抗体（例えば、可変領域）のアミノ酸配列に対する改変、及び、翻訳後修飾が含まれるが、これらに限定されない。翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、これにより、活性、局在化、及び、他の細胞分子（例えば、タンパク質、核酸、脂質及び補因子など）との相互作用が調節されるので、重要な役割を機能的プロテオミクスにおいて果たす化学的修飾である。したがって、抗体を最適化することにより、いくつかの利点がもたらされる場合があり、例えば、Ｉｇａｗａ他、ＭＡｂｓ  ３（２０１１）、２４３〜５２に示されるように、例えば、貯蔵期間中の改善された安定性、並びに、薬物動態学及び／又は薬力学での改善されたプロファイル、例えば、抗体のインビボ又はインビトロでの循環時間、増大した溶解性、安定性、標的に対する増大した親和性、低下したオフ速度、抗体の定常領域（Ｆｃ領域）の改善されたエフェクター機能及び改善された安全性プロファイル（例えば、低下した免疫原性など）など、或いは、翻訳後修飾に対する低下した感受性がもたらされる場合がある。したがって、本発明の１つの実施形態において、抗ＤＰＲ抗体、そのＤＰＲ結合フラグメント、合成変異体又は生物工学変異体を最適化することができ、ただし、この場合、ＣＤＲ領域又は可変領域におけるアミノ酸で、下記の修飾に限定されないが、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、脱アミノ化、フラビンの共有結合、ヘム成分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、異性化、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、加水分解、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アミノ酸のタンパク質への転移ＲＮＡ媒介付加（例えば、アルギニル化など）及びユビキチン化を含む様々な修飾を受けやすい少なくとも１つのアミノ酸（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、“Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”、第２版、Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．、１９９２；“Ｐｏｓｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”、Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８３；Ｓｅｉｆｔｅｒ他、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２（１９９０）、６２６〜６４６；Ｒａｔｔａｎ他、Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．６６３（１９９２）、４８〜６２を参照のこと）が、そのような変化を欠く変異型アミノ酸によって置換され、或いは、少なくとも１つの炭水化物成分が化学的若しくは酵素的に欠失され、又は、抗体に化学的若しくは酵素的に付加される。好ましい実施形態において、修飾が、グリコシル化、酸化、脱アミノ化、ペプチド結合切断、イソアスパラギン酸塩形成及び／又は不対システイ���からなる群から選択される。治療剤としての抗ＤＰＲ抗体又は同等な結合性分子の有用性を最適化するさらなる改変がこの技術分野では広く知られており、例えば、Ｉｇａｗａ他、ＭＡｂｓ  ３（２０１１）、２４３〜５２に記載される（その開示内容は本明細書中に組み込まれる）。炭水化物成分を付加する手段又は欠失する手段を化学的又は酵素的に達成することができ、これらの手段が、例えば、下記において詳しく記載される：Ｂｅｒｇ他、“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、第５版、Ｗ  Ｈ  Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２００２；国際公開ＷＯ８７／０５３３０；Ａｐｌｉｎ他、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２（１９８１）、２５９〜３０６；Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ他、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９（１９８７）、１０〜５２；Ｅｄｇｅ他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８（１９８１）、１３１；Ｔｈｏｔａｋｕｒａ他、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８（１９８７）、３５０。
【０１６６】
加えて、重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）は、より大きい度合いの可変性と、抗原−抗体相互作用における支配的な関与とを有する領域であることがしばしば認められているので、本発明は、上記で記載されるような結合性分子を含有するペプチド、例えば、述べられた抗体のいずれか１つの可変領域のＣＤＲ３領域（特に、重鎖のＣＤＲ３）を含有するペプチドを含むペプチドを包含する。そのようなペプチドが、本発明に従って有用である結合剤を製造するために容易に合成される場合があり、又は、組換え手段によって製造される場合がある。そのような方法は当業者にはよく知られている。ペプチドを、例えば、市販されている自動化されたペプチド合成機を使用して合成することができる。ペプチドはまた、ペプチドを発現するＤＮＡを発現ベクターに組み込むこと、及び、細胞を、ペプチドを産生させるために発現ベクターにより形質転換することによる組換え技術によって製造することができる。
【０１６７】
したがって、本発明は、本発明の抗ＤＰＲ抗体に向けられ、かつ、他の場合には正常なタンパク質に存在するかもしれない凝集型ＤＰＲ（例えば、Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲ種及び／又はそのフラグメント）と結合することができるどのような結合性分子（例えば、抗体又はその結合フラグメント）にも関連する。そのような抗体及び結合性分子は、本明細書中に記載されるようなＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫組織化学によってそれらの結合特異性及び結合親和性について試験することができる（例えば、実施例３〜実施例１３を参照のこと）。抗体及び結合性分子のこれらの特徴をウエスタンブロットによって同様に試験することができる；特に実施例６及び図５を参照のこと。
【０１６８】
免疫グロブリンをＢ細胞又はＢメモリー細胞の培養から直接に得ることの代替として、これらの細胞を、その後の発現及び／又は遺伝子操作のための、再編成された重鎖遺伝子座及び軽鎖遺伝子座の供給源として使用することができる。再編成された抗体遺伝子を、ｃＤＮＡを作製するために、適切なｍＲＮＡから逆転写することができる。所望されるならば、重鎖定常領域を異なるアイソタイプの重鎖定常領域に交換することができ、又は、完全に除くことができる。可変領域を、単鎖のＦｖ領域をコードするために連結することができる。多数のＦｖ領域を、２つ以上の標的に対する結合能を与えるために連結することができ、又は、重鎖及び軽鎖のキメラな組合せを用いることができる。遺伝物質が入手可能であると、所望の標的と結合するそれらの能力をともに保持する上記で記載されるようなアナログの設計は簡単である。抗体可変領域のクローニング及び組換え抗体の作製のための方法が当業者には知られており、例えば、Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ他、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ４７（１９９６）、１〜２０；Ｄｏｅｎｅｃｋｅ他、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １１（１９９７）、１７８７〜１７９２に記載される。
【０１６９】
適切な遺伝物質が得られ、かつ、所望されるならば、アナログをコードするために改変されると、コード配列（これは、最低でも重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする配列を含む）を、標準的な組換え宿主細胞にトランスフェクションされ得るベクターにおいて含有される発現系に挿入することができる。様々なそのような宿主細胞が使用してよい；しかしながら、効率的なプロセシングのためには、哺乳動物細胞が好ましい。この目的のために有用である典型的な哺乳動物細胞株には、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞又はＮＳＯ細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７０】
抗体又はアナログの製造はその後、改変された組換え宿主を、宿主細胞の成長及びコード配列の発現のために適切である培養条件のもとで培養することによって着手される。その後、抗体が、抗体を培養物から単離することによって回収される。発現系は好ましくは、シグナルペプチドを含み、その結果、生じた抗体が培地中に分泌されるように設計される。しかしながら、細胞内産生もまた可能である。
【０１７１】
上記によれば、本発明はまた、本発明の抗体又は同等な結合性分子をコードするポリヌクレオチドに関連し、抗体の場合には、好ましくは、上で記載される抗体の免疫グロブリン鎖の可変ドメインを少なくともコードするポリヌクレオチドに関連する。典型的には、ポリヌクレオチドによってコードされる前記可変領域は、前記抗体の可変領域のＶＨ及び／又はＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【０１７２】
当業者は、上記の可変ドメインを有する抗体の可変ドメインが、所望される特異性及び生物学的機能の他のポリペプチド又は抗体を構築するために使用され得ることを容易に理解するであろう。したがって、本発明はまた、上で記載された可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲを含み、かつ、添付された実施例において記載される抗体と実質的に同じ又は類似する結合性質を好都合には有するポリペプチド及び抗体を包含する。当業者は、結合親和性が、アミノ酸置換をＣＤＲ内において、又は、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲと部分的に重なる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７）、９０１〜９１７）の内部において行うことによって強化され得ることを理解している（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２（１９８８）、３２３〜３２７を参照のこと）。したがって、本発明はまた、述べられたＣＤＲの１つ又は複数が１つ又は複数の、好ましくは２つ以下のアミノ酸置換を含む抗体に関連する。好ましくは、本発明の抗体は、その免疫グロブリン鎖の一方又は両方において、図１（Ａ）〜１（Ｌ）のいずれか１つに示されるような可変領域の２つのＣＤＲ又は３つすべてのＣＤＲを含む。
【０１７３】
結合性分子、例えば、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は、当業者によって知られているように、１つ又は複数のエフェクター機能を媒介する定常領域を含むことができる。例えば、補体のＣ１成分が抗体の定常領域に結合することにより、補体系が活性化される場合がある。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン化及び溶解において重要である。補体の活性化は炎症応答をも刺激し、自己免疫の過敏性に関与することもある。さらに、抗体は、Ｆｃ領域を介して、すなわち、抗体のＦｃ領域におけるＦｃ受容体結合部位が細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合することにより様々な細胞における受容体に結合する。ＩｇＧ（ガンマ受容体）、ＩｇＥ（イプシロン受容体）、ＩｇＡ（アルファ受容体）及びＩｇＭ（ミュー受容体）を含めて、異なるクラスの抗体について特異的であるいくつかのＦｃ受容体が存在する。抗体が細胞表面のＦｃ受容体に結合することにより、抗体被覆粒子の貪食及び破壊、免疫複合体の排除、キラー細胞による抗体被覆された標的細胞の溶解（これは抗体依存性細胞媒介性細胞傷害又はＡＤＣＣと呼ばれる）、炎症性媒介因子の放出、胎盤移行及び免疫グロブリン産生の制御を含む多数の重要かつ多様な生物学的応答が誘発される。
【０１７４】
したがって、本発明の特定の実施形態には、少なくとも定常領域ドメインの１つ又は複数の一部が欠失されているか、さもなければ変化させられており、その結果、所望される生化学的特性を提供するように、例えば、およそ同じ免疫原性の完全な未変化抗体と比較したとき、低下したエフェクター機能、ダイマーを非共有結合により形成することができること、ＤＰＲタンパク質の凝集及び沈着の部位に局在化する増大した能力、低下した血清中半減期、あるいは、増大した血清中半減期などを提供するようにされている抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体が含まれる。例えば、本明細書中に記載される診断方法及び処置方法において使用されるためのある種の抗体は、免疫グロブリン重鎖に類似するポリペプチド鎖を含むが、１つ又は複数の重鎖ドメインの少なくとも一部を欠くドメイン欠失抗体である。例えば、ある種の抗体では、改変された抗体の定常領域の１つのドメイン全体が欠失されるであろう。例えば、ＣＨ２ドメインのすべて又は一部が欠失されるであろう。他の実施形態において、本明細書中に記載される診断方法及び処置方法において使用されるためのある種の抗体は、グリコシル化を排除するために変化させられる定常領域（例えば、ＩｇＧ重鎖定常領域）を有しており、これは、本明細書中の他のところでは、非グルコシル化抗体又は「ａｇｌｙ」抗体として示される。そのような「ａｇｌｙ」抗体は、酵素学的に、ならびに、定常領域におけるコンセンサスなグリコシル化部位を操作することによって調製されてもよい。理論によって拘束されることはないが、「ａｇｌｙ」抗体は生体内での安全性及び安定性の改善されたｐｒｏフィルを有する場合があると考えられる。所望されるエフェクター機能を有する非グリコシル化抗体を製造する方法が、例えば、国際特許出願公開ＷＯ２００５／０１８５７２に見出される（その全体が参照によって組み込まれる）。
【０１７５】
本明細書中に記載されるある種の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体において、Ｆｃ部分が、この技術分野において知られている技術を使用して、エフェクター機能を低下させるために変異させられる場合がある。例えば、定常領域ドメインの（点変異又は他の手段による）欠失又は不活性化は、循環する改変された抗体のＦｃ受容体結合を低下させ、それにより、ＤＰＲタンパク質の局在化を増大させる場合がある。他の場合には、本発明と一致する定常領域改変が補体結合を和らげ、したがって、抱合された細胞毒素の血清半減期及び非特異的会合を低下させることがあるかもしれない。定常領域のさらに他の改変が、増大した抗原特異性又は抗体柔軟性に起因する高まった局在化を可能にするジスルフィド連結又はオリゴ糖成分を改変するために使用される場合がある。そのような改変の得られた生理学的プロファイル、生物学的利用能及び他の生化学的影響、例えば、ＤＰＲタンパク質の局在化、生体分布及び血清半減期などが、過度な実験を行うことなく、広く知られている免疫学的技術を使用して容易に測定及び定量化され得る。
【０１７６】
本明細書中に記載されるある種の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体において、Ｆｃ部分が、例として、Ｆｃγ受容体、ＬＲＰ又はＴｈｙ１受容体を介する抗体の受容体媒介性エンドサイトーシスを高めることによって、あるいは、「ＳｕｐｅｒＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（これは、抗体が、生細胞を傷つけることなく生細胞内に往復させられることを可能にすると言われる）（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００５）、２３７〜２４１）によって抗体の細胞取り込みを増大させるために変異させられる場合があり、又は、代わりのタンパク質配列に交換される場合がある。例えば、抗体結合領域と、細胞表面受容体の同族タンパク質リガンドとの融合タンパク質、あるいは、ＤＰＲｓならびに細胞表面受容体に結合する特異的な配列を有する二重特異性抗体又は多特異性抗体の作製が、この技術分野において知られている技術を使用して設計される場合がある。
【０１７７】
本明細書中に記載されるある種の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体において、Ｆｃ部分が、その血液脳関門透過を増大させるために変異させられる場合があり、又は、代わりのタンパク質配列に交換される場合があり、あるいは、抗体が化学的に改変される場合がある。
【０１７８】
本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体の改変された形態を、この技術分野において知られている技術を使用して完全な前駆体又は親抗体から作製することができる。例示的な技術が本明細書中により詳しく議論される。本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は、この技術分野において知られている技術を使用して作製又は製造することができる。特定の実施形態において、抗体分子又はそのフラグメントが「組換え製造され」、すなわち、組換えＤＮＡ技術を使用して製造される。抗体分子又はそのフラグメントを作製するための例示的な技術が本明細書中の他のところでより詳しく議論される。
【０１７９】
本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、生物工学的変異体又は誘導体にはまた、例えば、共有結合による結合により、抗体がその同族エピトープに特異的に結合することが妨げられないように、どのようなタイプの分子でも抗体に共有結合により結合させることによって改変される誘導体が含まれる。例えば、しかし、限定としてではなく、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、知られている保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンド又は他のタンパク質への連結などによって改変されている抗体が含まれる。数多くの化学的修飾のどれもが、知られている技術によって行われる場合があり、これらには、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などが含まれるが、これらに限定されない。加えて、誘導体は１つ又は複数の非古典的アミノ酸を含有する場合がある。
【０１８０】
特に好ましい実施形態において、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は、有害な免疫応答を処置されるべき動物において、例えば、ヒトにおいて誘発しないであろう。特定の実施形態において、結合性分子、例えば、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは患者、例えば、ヒト患者に由来し、続いて、抗体又はその抗原結合フラグメントが由来する同じ種、例えば、ヒトにおいて使用され、これにより、有害な免疫応答の出現を緩和するか、又は最小限に抑える。
【０１８１】
脱免疫化もまた、抗体の免疫原性を低下させるために使用することができる。本明細書中で使用される場合、用語「脱免疫化」は、Ｔ細胞エピトープを改変するための抗体の変化を包含する（例えば、国際特許出願公開ＷＯ９８／５２９７６及び同ＷＯ００／３４３１７を参照のこと）。例えば、出発抗体からのＶＨ配列及びＶＬ配列が分析され、そして、相補性決定領域（ＣＤＲ）との関連でのエピトープの所在位置、及び、配列内の他の重要な残基を示すそれぞれのＶ領域からのヒトＴ細胞エピトープ「マップ」が分析される。Ｔ細胞エピトープマップからの個々のＴ細胞エピトープが、最終的な抗体の活性を変化させる危険性が低い代わりのアミノ酸置換を特定するために分析される。アミノ酸置換の組合せを含む様々な代替的なＶＨ配列及びＶＬ配列が設計され、これらの配列が続いて、本明細書中に開示される診断方法及び処置方法における使用のために様々な結合性ポリペプチド（例えば、ＤＰＲ特異的抗体又はその免疫特異性フラグメント）に組み込まれ、その後、これらは機能について試験される。典型的には、１２個〜２４個の間の変化型抗体が作製され、試験される。改変されたＶ領域及びヒトＣ領域を含む完全な重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子がその後、発現ベクターにクローン化され、それに続くプラスミドが、完全な抗体の産生のために細胞株に導入される。その後、抗体が、適切な生化学的アッセイ及び生物学的アッセイにおいて比較され、最適な変異体が特定される。
【０１８２】
モノクローナル抗体を、ハイブリドーマ技術、組換え技術及びファージディスプレー技術又はそれらの組合せの使用を含むこの技術分野において知られている広範囲の様々な技術を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体を、この技術分野において知られているハイブリドーマ技術、及び、例えば、Ｈａｒｌｏｗ他、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版（１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ他、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、５６３〜６８１（１９８１）に教示されるハイブリドーマ技術を含む様々なハイブリドーマ技術を使用して製造することができる（前記参考文献はそれらの全体が参照によって組み込まれる）。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書中で使用される場合、ハイブリドーマ技術により製造される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、真核生物クローン、原核生物クローン又はファージクローンのどのようなものも含めて、ただ１つのクローンに由来する抗体を示し、モノクローナル抗体が製造される方法に由来する抗体を示さない。したがって、用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術により製造される抗体に限定されない。特定の実施形態において、本発明の抗体は、本明細書中に記載されるように、エプスタイン・バールウイルスによる形質転換により抗体産生が誘導されているヒトＢ細胞に由来する。
【０１８３】
広く知られているハイブリドーマプロセス（Ｋｏｈｌｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６（１９７５）、４９５）では、哺乳動物から得られる比較的短命の、すなわち、いつかは死滅するリンパ球、例えば、本明細書中に記載されるようなヒト対象に由来するＢ細胞が、不死性の腫瘍細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）と融合され、このようにして、不死性であり、かつ、Ｂ細胞の遺伝子コードされた抗体を産生することができるハイブリッド細胞、すなわち、「ハイブリドーマ」がもたらされる。得られたハイブリッドは、選抜、希釈及び再成長によって単一の遺伝的形質に分離され、それぞれの個々の株が単一抗体の形成のための特定の遺伝子を含む。それらにより、所望の抗原に対して均質であり、そして、それらの純粋な遺伝的起源に関連して、「モノクローナル」と呼ばれる抗体が産生される。
【０１８４】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞は、融合されていない元の骨髄腫細胞の成長又は生存を阻害する１つ又は複数の物質を好ましくは含有する好適な培養培地において播種され、成長させられる。当業者は、ハイブリドーマの形成、選抜及び成長のための試薬、細胞株及び培地がいくつかの供給源から市販されており、また、標準化されたプロトコルが十分に確立されていることを理解するであろう。一般に、ハイブリドーマ細胞が成長している培養培地が、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性が、インビトロアッセイによって、例えば、本明細書中に記載されるような免疫沈殿、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などによって求められる。所望される特異性、親和性及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が特定された後、当該クローンは限界希釈手法によってサブクローン化され、標準的な方法によって成長させられる場合がある（例えば、Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、５９頁〜１０３頁（１９８６）を参照のこと）。サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体が、従来からの精製手段によって、例えば、プロテインＡ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーなどによって、培養培地、腹水又は血清から分離され得ることがさらに理解されるであろう。
【０１８５】
別の実施形態において、リンパ球を顕微操作によって選択することができ、可変性遺伝子を単離することができる。例えば、末梢血単核細胞を、免疫化された哺乳動物又は生まれつき免疫性の哺乳動物（例えば、ヒト）から単離し、約７日間にわたってインビトロ培養することができる。培養物を、スクリーニング基準を満たす特異的なＩｇＧについてスクリーニングすることができる。陽性のウェルからの細胞を単離することができる。個々のＩｇ産生Ｂ細胞を、ＦＡＣＳによって、又は、Ｉｇ産生Ｂ細胞を補体媒介溶血プラークアッセイで特定することによって単離することができる。Ｉｇ産生Ｂ細胞をチューブの中に顕微操作することができ、ＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子を、例えば、ＲＴ−ＰＣＲを使用して増幅することができる。ＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子を抗体発現ベクターにクローン化し、発現のための細胞（例えば、真核生物細胞又は原核生物細胞）にトランスフェクションすることができる。
【０１８６】
代替では、抗体産生の細胞株が、当業者に広く知られている技術を使用して選択及び培養される場合がある。そのような技術が様々な実験室マニュアル及び一次刊行物に記載されている。これに関連して、下で記載されるような本発明における使用のために好適である技術が、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｉｇａｎ他編、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載される（これは、増刊を含めて、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０１８７】
特異的なエピトープを認識する抗体フラグメントが、知られている技術によって作製され得る。例えば、Ｆａｂフラグメント及びＦ（ａｂ’）２フラグメントが、組換えによって、あるいは、例えば、パパイン（Ｆａｂフラグメントを製造するために）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを製造するために）などの酵素を使用する免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によって製造され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可変領域、軽鎖定常領域及び重鎖のＣＨ１ドメインを含有する。そのようなフラグメントは、例えば、免疫グロブリンの免疫特異性部分を検出用試薬（例えば、放射性同位体など）に連結することを伴う免疫診断手順における使用のために十分である。
【０１８８】
１つの実施形態において、本発明の抗体は抗体分子の少なくとも１つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗体は１つ又は複数の抗体分子からの少なくとも２つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗体は１つ又は複数の抗体分子からの少なくとも３つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗体は１つ又は複数の抗体分子からの少なくとも４つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗体は１つ又は複数の抗体分子からの少なくとも５つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗体は１つ又は複数の抗体分子からの少なくとも６つのＣＤＲを含む。主題となるこれらの抗体に含まれ得る少なくとも１つのＣＤＲを含む例示的な抗体分子が本明細書中に記載される。
【０１８９】
本発明の抗体は、抗体を合成するためにこの技術分野において知られているいずれかの方法によって、特に、化学合成によって、又は、好ましくは、本明細書中に記載されるような組換え発現技術によって製造することができる。
【０１９０】
１つの実施形態において、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は、１つ又は複数のドメインが部分的又は完全に欠失される合成された定常領域を含む（「ドメイン欠失抗体」）。特定の実施形態において、適合し得る改変された抗体は、ＣＨ２ドメイン全体が除かれているドメイン欠失の構築物又は変異体（ΔＣＨ２構築物）を含むであろう。他の実施形態については、短い連結ペプチドが、動きの柔軟性及び自由を可変領域に与えるために欠失ドメインの代わりに使用される場合がある。当業者は、そのような構築物が抗体の異化速度に対するＣＨ２ドメインの調節的特性のために特に好ましいことを理解するであろう。ドメイン欠失された構築物を、ＩｇＧ１ヒト定常ドメインをコードするベクターを使用して得ることができる（例えば、国際特許出願公開ＷＯ０２／０６０９５５及び同ＷＯ０２／０９６９４８Ａ２を参照のこと）。このベクターは、ＣＨ２ドメインを欠失し、かつ、ドメイン欠失されたＩｇＧ１定常領域を発現する合成ベクターを提供するために操作される。
【０１９１】
特定の実施形態において、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体はミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）である。ミニボディを、この技術分野において記載される方法を使用して作製することができる（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号又は国際特許出願公開ＷＯ９４／０９８１７を参照のこと）。
【０１９２】
１つの実施形態において、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は、モノマーサブユニット間の会合を可能にする限り、数個のアミノ酸の欠失もしくは置換、又は、１個だけのアミノ酸の欠失もしくは置換を有する免疫グロブリン重鎖を含む。例えば、ＣＨ２ドメインの選択された領域における１個だけのアミノ酸の変異が、Ｆｃ結合を実質的に低下させるために、そして、それにより、ＤＰＲタンパク質の局在化を増大させるために十分である場合がある。同様に、調節されるべきエフェクター機能（例えば、補体結合）を制御する１つ又は複数の定常領域ドメインのその部分を単に欠失することが望ましい場合がある。定常領域のそのような部分的欠失は抗体の選択された特性（血清半減期）を改善し、一方で、当該定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能を損なわないままにし得る。そのうえ、上記において暗に示されるように、開示された抗体の定常領域は、生じた構築物のプロファイルを高める１つ又は複数のアミノ酸の変異又は置換により合成物である場合がある。これに関連して、改変された抗体の立体配置及び免疫原性プロファイルを実質的に維持しながら、保存されている結合部位（例えば、Ｆｃ結合）によって提供される活性を妨げることが可能である場合がある。さらに他の実施形態は、１つ又は複数のアミノ酸を、望ましい特性（例えば、エフェクター機能など）を高めるために、あるいは、細胞毒素又は炭水化物のより多くの結合を提供するために定常領域に付加することを含む。そのような実施形態では、選択された定常領域ドメインに由来する特異的な配列を挿入すること、又は複製することが望ましい場合がある。
【０１９３】
本発明はまた、本明細書中に記載される抗体分子（例えば、ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域）の変異体（誘導体を含む）を含む抗体、本明細書中に記載される抗体分子（例えば、ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域）の変異体（誘導体を含む）から本質的になる抗体、あるいは、本明細書中に記載される抗体分子（例えば、ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域）の変異体（誘導体を含む）からなる抗体を提供し、そのような抗体又はそのフラグメントはＤＰＲｓに免疫特異的に結合する。当業者に知られている様々な標準的技術を、抗体をコードするヌクレオチド配列に変異を導入するために使用することができ、そのような技術には、アミノ酸置換をもたらす部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介変異誘発が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、変異体（誘導体を含む）は、基準となるＶＨ領域、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、ＶＬ領域、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２又はＶＬ−ＣＤＲ３に対して５０未満のアミノ酸置換、４０未満のアミノ酸置換、３０未満のアミノ酸置換、２５未満のアミノ酸置換、２０未満のアミノ酸置換、１５未満のアミノ酸置換、１０未満のアミノ酸置換、５未満のアミノ酸置換、４未満のアミノ酸置換、３未満のアミノ酸置換又は２未満のアミノ酸置換をコードする。「保存的（な）アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似する電荷を伴う側鎖を有するアミノ酸残基により置き換えられるアミノ酸置換である。類似する電荷を伴う側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーがこの技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電の極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分岐した側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。代替において、変異を、例えば、飽和変異誘発などによってコード配列の全体又は一部に沿ってランダムに導入することができ、得られた変異体を、活性（例えば、ＤＰＲｓ、及び／又は、変異した及び／又は凝集したＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲ種及び／又はそのフラグメントと結合する能力）を保持する変異体を特定するために生物学的活性についてスクリーニングすることができる。
【０１９４】
例えば、変異を抗体分子のフレームワーク領域においてのみに、又は、抗体分子のＣＤＲ領域においてのみに導入することが可能である。導入された変異はサイレント変異又は中立のミスセンス変異である場合があり、例えば、抗体の抗原結合能に対する影響を全く有しないか、又はほとんど有しない場合があり、実際、いくつかのそのような変異はアミノ酸配列を全く変化させない。これらのタイプの変異は、コドン使用を最適化するために、又は、ハイブリドーマの抗体産生を改善するために有用である場合がある。本発明の抗体をコードするコドン最適化コード領域が本明細書中の他のところで開示される。代替において、非中立的なミスセンス変異により、抗体の抗原結合能が変化する場合がある。ほとんどのサイレント変異及び中立的ミスセンス変異の位置はフレームワーク領域内である可能性が高く、一方、ほとんどの非中立的ミスセンス変異の位置はＣＤＲ内である可能性が高く、だが、このことは絶対的要件でない。当業者であれば、所望される性質、例えば、抗原結合活性における変化がないこと又は結合活性における変化（例えば、抗原結合活性における改善又は抗体特異性における変化）などを有する変異体分子を設計し、試験することができるであろう。変異誘発後、コードされたタンパク質が常法により発現させられる場合があり、そして、コードされたタンパク質の機能的活性及び／又は生物学的活性（例えば、ＤＰＲｓ、及び／又は、変異した及び／又は凝集したＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲ種及び／又はそのフラグメントと免疫特異的に結合する能力）を、本明細書中に記載される技術を使用して、又は、この技術分野において知られている技術を常法により改変することによって求めることができる。
【０１９５】
ＩＩＩ．抗体をコードするポリヌクレオチド
抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体をコードするポリヌクレオチドは、どのようなポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチド（これらは非修飾のＲＮＡ又はＤＮＡあるいは修飾されたＲＮＡ又はＤＮＡである場合がある）からでも構成され得る。例えば、抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体をコードするポリヌクレオチドは、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡ、一本鎖領域及び二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖のＲＮＡ、ならびに、一本鎖領域及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖である場合がある、あるいは、より典型的には、二本鎖である場合があるか、又は、一本鎖領域及び二本鎖領域の混合物である場合があるＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成され得る。加えて、抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体をコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡ、あるいは、ＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域から構成され得る。抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体をコードするポリヌクレオチドはまた、安定性又は他の理由のために改変される１つ又は複数の修飾された塩基あるいはＤＮＡ骨格又はＲＮＡ骨格を含有してもよい。「修飾（改変）（された）」塩基には、例えば、トリチル化塩基及び非通常的塩基（例えば、イノシンなど）が含まれる。様々な修飾をＤＮＡ及びＲＮＡに対して行うことができる；したがって、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的又は代謝的に改変された形態を包含する。
【０１９６】
免疫グロブリン（例えば、免疫グロブリンの重鎖部分又は軽鎖部分）に由来するポリペプチドの非天然型変異体をコードする単離されたポリヌクレオチドを、１つ又は複数のアミノ酸置換、アミノ酸付加又はアミノ酸欠失が、コードされたタンパク質に導入されるように、１つ又は複数のヌクレオチド置換、ヌクレオチド付加又はヌクレオチド欠失を免疫グロブリンのヌクレオチド配列に導入することによって作出することができる。変異は、標準的な技術によって、例えば、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介変異誘発などによって導入される場合がある。好ましくは、保存的なアミノ酸置換が１つ又は複数の非必須アミノ酸残基において行われる。
【０１９７】
よく知られているように、ＲＮＡが、標準的な技術、例えば、イソチオシアン酸グアニジウム抽出及び沈殿化、その後、遠心分離又はクロマトグラフィーなどによって、元のＢ細胞、ハイブリドーマ細胞又は他の形質転換細胞から単離される場合がある。望ましい場合、ｍＲＮＡが、標準的な技術、例えば、オリゴｄＴセルロースでのクロマトグラフィーなどによって総ＲＮＡから単離される場合がある。好適な技術がこの技術分野では熟知されている。１つの実施形態において、抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡが、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼをよく知られている方法に従って使用して、同時又は別個に作製される場合がある。ＰＣＲが、コンセンサスな定常領域プライマーによって、又は、公開された重鎖及び軽鎖のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列に基づくより特異的なプライマーによって開始される場合がある。上記で議論されるように、ＰＣＲはまた、抗体の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離するために使用される場合がある。この場合、ライブラリーが、コンセンサスなプライマー又はより大きい相同的プローブ（例えば、ヒト定常領域プローブなど）によってスクリーニングされる場合がある。
【０１９８】
ＤＮＡ、典型的にはプラスミドＤＮＡが、この技術分野において知られている技術を使用して細胞から単離され、そして、例えば、組換えＤＮＡ技術に関連する前記の参考文献に詳しく示される標準的なよく知られている技術に従って制限酵素マッピング及び配列決定に供される場合がある。当然のことながら、ＤＮＡは、単離プロセス又はその後の分析の期間中のどの時点であっても、本発明に従う合成物である場合がある
【０１９９】
この関連において、本発明はまた、本発明の抗体の免疫グロブリン鎖の結合ドメイン又は可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチドに関連する。１つの実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチド、そのような核酸から本質的になる単離されたポリヌクレオチド、又は、そのような核酸からなる単離されたポリヌクレオチドであって、重鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも１つ、又は、重鎖可変領域のＶＨ−ＣＤＲの少なくとも２つが、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用重鎖のＶＨ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＨ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列又はＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である、そのような単離されたポリヌクレオチドを提供する。代替において、ＶＨのＶＨ−ＣＤＲ１領域、ＶＨ−ＣＤＲ２領域又はＶＨ−ＣＤＲ３領域は、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用重鎖のＶＨ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＨ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列又はＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。したがって、この実施形態によれば、本発明の重鎖可変領域は、図１に示されるポリペプチド配列に関連づけられるＶＨ−ＣＤＲ１ポリペプチド配列、ＶＨ−ＣＤＲ２ポリペプチド配列又はＶＨ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。
【０２００】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチド、そのような核酸から本質的になる単離されたポリヌクレオチド、又は、そのような核酸からなる単離されたポリヌクレオチドであって、軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲの少なくとも１つ、又は、軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲの少なくとも２つが、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＬ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列又はＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である、そのような単離されたポリヌクレオチドを提供する。代替において、ＶＬのＶＬ−ＣＤＲ１領域、ＶＬ−ＣＤＲ２領域又はＶＬ−ＣＤＲ３領域は、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＬ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列又はＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。したがって、この実施形態によれば、本発明の軽鎖可変領域は、図１Ａ−Ｌのいずれか１つに示されるポリペプチド配列に関連づけられるＶＬ−ＣＤＲ１ポリペプチド配列、ＶＬ−ＣＤＲ２ポリペプチド配列又はＶＬ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。
【０２０１】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチド、そのような核酸から本質的になる単離されたポリヌクレオチド、又は、そのような核酸からなる単離されたポリヌクレオチドであって、ＶＨ−ＣＤＲ１領域、ＶＨ−ＣＤＲ２領域及びＶＨ−ＣＤＲ３領域が、図１Ａ−Ｌのいずれか１つに示されるＶＨ−ＣＤＲ１群、ＶＨ−ＣＤＲ２群及びＶＨ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する、そのような単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０２０２】
この技術分野において知られているように、２つのポリペプチド又は２つのポリヌクレオチドの間における「配列同一性」が、一方のポリペプチド又はポリヌクレオチドのアミノ酸配列又は核酸配列を第２のポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列に対して比較することによって求められる。本明細書中で議論されるとき、任意の特定のポリペプチドが別のポリペプチドと少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％同一であるかどうかを、この技術分野において知られている方法及びコンピュータープログラム／ソフトウエア（例えば、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、５３７１１）（これに限定されない）など）を使用して決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴでは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２（１９８１）、４８２〜４８９）の局所的相同性アルゴリズムを、２つの配列の間における相同性の最も良いセグメントを見出すために使用する。ＢＥＳＴＦＩＴ又はいずれかの他の配列アライメントプログラムを使用して、特定の配列が、例えば、本発明による参照配列と９５％同一であるかどうかを決定するときには、当然のことながら、同一性の百分率が参照ポリペプチド配列の全長にわたって計算され、かつ、参照配列におけるアミノ酸の総数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように、パラメーターが設定される。
【０２０３】
本発明の好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、表ＩＩに示されるような、抗ＤＰＲ抗体のＶＨ領域又はＶＬ領域のポリヌクレオチド配列を有する核酸を含むか、あるいは、そのような核酸から本質的になるか、あるいは、そのような核酸からなる。これに関連して、当業者は、軽鎖及び／又は重鎖の可変ドメインを少なくともコードするポリヌクレオチドが両方の免疫グロブリン鎖又は一方の免疫グロブリン鎖のみの可変ドメインをコードし得ることを容易に理解するであろう。したがって、１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、表ＩＩに示されるような、抗ＤＰＲ抗体及び／又はそのフラグメントのＶＨ領域及びＶＬ領域のポリヌクレオチド配列を有する核酸を含むか、あるいは、そのような核酸から本質的になるか、あるいは、そのような核酸からなる。
表ＩＩ：ＤＰＲｓ、好ましくはＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲｓを認識する抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域のヌクレオチド配列
【表２−１】
2020031660.tif 000003
【表２−２】
2020031660.tif 000004
【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
2020031660.tif 000009
【表２−８】
2020031660.tif 000010
【０２０４】
本発明にはまた、他のところで記載されるように、本発明のポリヌクレオチドのフラグメントが含まれる。加えて、本明細書中に記載されるように、融合ポリヌクレオチド、Ｆａｂフラグメント及び他の生物光学的誘導体をコードするポリヌクレオチドも本発明によって包含される。
【０２０５】
ポリヌクレオチドは、この技術分野において知られているいずれかの方法によって作製又は製造される場合がある。例えば、抗体のヌクレオチド配列が知られているならば、当該抗体をコードするポリヌクレオチドが、例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ他、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７（１９９４）、２４２に記載されるように、化学合成されたオリゴヌクレオチドから組み立てられる場合があり、これには、簡単に記載すると、抗体をコードする配列の一部分を含有する重複するオリゴヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリング及び連結、ならびに、連結されたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅を伴う。
【０２０６】
代替において、抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体をコードするポリヌクレオチドが、好適な供給源から得られる核酸から作製される場合がある。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンが入手できず、しかし、抗体分子の配列が知られているならば、当該抗体をコードする核酸が化学合成される場合があるか、あるいは、好適な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、あるいは、ＤＰＲ特異的抗体を発現するいずれかの組織もしくは細胞（例えば、抗体を発現させるために選択されるハイブリドーマ細胞など）から作製されるｃＤＮＡライブラリー、又は、そのようなものから単離される核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）から、配列の３’末端及び５’末端にハイブリダイゼーション可能である合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって得られる場合があり、又は、例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡクローンを特定するために特定の遺伝子配列について特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得られる場合がある。ＰＣＲによって生じる増幅された核酸がその後、この技術分野において広く知られているいずれかの方法を使用して、複製可能なクローニングベクターにクローン化される場合がある。
【０２０７】
抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列が決定されると、そのヌクレオチド配列が、異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製するために、例えば、アミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入をもたらすために、ヌクレオチド配列の操作についてこの技術分野においてよく知られている方法、例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなどを使用して操作される場合がある（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９０）、及び、Ａｕｓｕｂｅｌ他編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９８）に記載される技術を参照のこと。これらはともに、それらの全体において参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０２０８】
ＩＶ．抗体ポリペプチドの発現
単離された遺伝物質が、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体を提供するために操作された後、抗体をコードするポリヌクレオチドは典型的には、所望される量の抗体を産生させるために使用されることがある宿主細胞への導入のために発現ベクターに挿入される。抗体あるいはそのフラグメント、誘導体又はアナログ（例えば、標的分子に結合する抗体の重鎖又は軽鎖）の組換え発現が本明細書中に記載される。本発明の抗体分子又は抗体の重鎖もしくは軽鎖あるいはその一部分（好ましくは重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインを含有するその一部分）をコードするポリヌクレオチドが得られると、抗体分子を産生させるためのベクターが、この技術分野においてよく知られている技術を使用する組換えＤＮＡ技術によって作製される場合がある。したがって、抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現させることによってタンパク質を調製するための方法が本明細書中に記載される。当業者によく知られている方法を、抗体コード配列ならびに適切な転写制御シグナル及び翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法には、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボ遺伝子組換えが含まれる。したがって、本発明は、本発明の抗体分子あるいはその重鎖又は軽鎖あるいは重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列をｐｒｏモーターに機能的に連結されて含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含む場合があり（例えば、国際特許出願公開ＷＯ８６／０５８０７及びＷＯ８９／０１０３６、ならびに、米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと）、また、抗体の可変ドメインが、重鎖全体又は軽鎖全体を発現させるためにそのようなベクターにクローン化される場合がある。
【０２０９】
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、所望される遺伝子を宿主細胞に導入し、その遺伝子をその宿主細胞において発現させるためのビヒクルとして本発明に従って使用されるベクターを意味するために本明細書中では使用される。当業者には知られているように、そのようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス及びレトロウイルスからなる群から容易に選択される場合がある。一般に、本発明と適合し得るベクターは、選択マーカー、所望される遺伝子のクローニングを容易にするための適切な制限部位、ならびに、真核生物細胞又は原核生物細胞における進入能及び／又は複製能を含む。本発明の目的のために、数多くの発現ベクター系が用いられる場合がある。例えば、１つのクラスのベクターでは、動物ウイルス、例えば、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ又はＭＯＭＬＶ）又はＳＶ４０ウイルスなどに由来するＤＮＡエレメントが利用される。他では、内部リボソーム結合部位を伴う多シストロン系の使用を伴う。加えて、ＤＮＡをその染色体に組み込んでいる細胞が、トランスフェクションされた宿主細胞の選択を可能にする１つ又は複数のマーカーを導入することによって選択される場合がある。マーカーにより、栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺生物剤抵抗性（例えば、抗生物質）、又は、重金属（例えば、銅など）に対する抵抗性が与えられる場合がある。選択マーカー遺伝子は、発現させられるＤＮＡ配列に直接に連結することができるか、又は、共形質転換によって同じ細胞に導入することができる。さらなるエレメントがまた、ｍＲＮＡの最適な合成のために必要となる場合がある。これらのエレメントには、シグナル配列、スプライス信号ならびに転写プロモーター、エンハンサー及び終結シグナルが含まれる場合がある。
【０２１０】
特に好ましい実施形態において、クローン化された可変領域遺伝子が、上記で議論されるような重鎖定常領域遺伝子及び軽鎖定常領域遺伝子（好ましくはヒトの遺伝子）と一緒に発現ベクターに挿入される。1つの実施形態では、これは、Ｂｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ社所有の発現ベクターＮＥＯＳＰＬＡ（米国特許Ｎｏ．６，１５９，７３０に開示される）によって達成される。このベクターは、サイトメガロウイルスのプロモーター／エンハンサー、マウスのベータグロビン主要プロモーター、ＳＶ４０の複製起点、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのエクソン１及びエクソン２、ジヒドロ葉酸レダクターゼの遺伝子及びリーダー配列を含有する。このベクターは、可変領域遺伝子及び定常領域遺伝子の取り込み、ＣＨＯ細胞におけるトランスフェクション、それに続く、Ｇ４１８含有培地における選択、及び、メトトレキサート増幅を行ったとき、抗体の非常に高いレベルの発現をもたらすことが見出されている。当然のことながら、発現を真核生物細胞において誘発することができる発現ベクターはどれも、本発明において使用される場合がある。好適なベクターの例には、プラスミドのｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１及びｐＺｅｏＳＶ２（これらはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手可能である）、ならびに、プラスミドのｐＣＩ（これはＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から入手可能である）が含まれるが、これらに限定されない。一般に、非常に多数の形質転換細胞を、好適に高レベルの免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖を発現する形質転換細胞についてスクリーニングすることは、例えば、ロボットシステムによって行うことができる日常的な実験である。ベクター系はまた、米国特許第５，７３６，１３７号及び第５，６５８，５７０号に教示される（これらのそれぞれがその全体において参照によって本明細書中に組み込まれる）。この系は、例えば、３０ｐｇ／細胞／日を超える高い発現レベルを提供する。他の例示的なベクター系が、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号に開示される。
【０２１１】
他の好ましい実施形態において、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体が、多シストロン構築物、例えば、米国特許出願公開第２００３−０１５７６４１号Ａ１（その全体が本明細書中に組み込まれる）に開示される多シストロン構築物などを使用して発現させられる場合がある。これらの発現系において、目的とする多数の遺伝子産物（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖など）がただ１つの多シストロン構築物からもたらされる場合がある。これらの系では、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）が、比較的高いレベルの抗体を提供するために都合よく使用される。適合し得るＩＲＥＳ配列が米国特許第６，１９３，９８０号（これもまた本明細書中に組み込まれる）に開示される。当業者は、そのような発現系が、本出願において開示される抗体の完全な範囲を効果的に産生するために使用されることがあることを理解するであろう。したがって、１つの実施形態において、本発明は、抗体の免疫グロブリン鎖の結合ドメイン又は可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチドを、場合により、前記結合性分子の他の免疫グロブリン鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチドとの組合せで含むベクターを提供する。
【０２１２】
より一般的には、抗体のモノマーサブユニットをコードするベクター又はＤＮＡ配列が調製されると、発現ベクターが、適切な宿主細胞に導入される場合がある。宿主細胞へのプラスミドの導入を、当業者にはよく知られている様々な技術によって達成することができる。これらには、例えば、Ｆｕｇｅｎｅ（登録商標）又はリポフェクタミンを使用するリポトランスフェクションを含むトランスフェクション、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、包まれたＤＮＡを用いた細胞融合、顕微注入、及び、無傷のウイルスによる感染が含まれるが、これらに限定されない。典型的には、宿主へのプラスミド導入が、標準的なリン酸カルシウム共沈殿法により行われる。発現構築物を有する宿主細胞が、軽鎖及び重鎖を産生させるために適切である条件のもとで成長させられ、重鎖及び／又は軽鎖のタンパク質合成についてアッセイされる。例示的なアッセイ技術には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）又は蛍光活性化細胞分取器分析（ＦＡＣＳ）及び免疫組織化学などが含まれる。
【０２１３】
発現ベクターが従来からの技術によって宿主細胞に移され、トランスフェクションされた細胞がその後、抗体を本明細書中に記載される方法における使用のために産生させるため従来からの技術によって培養される。したがって、本発明には、好ましくは異種プロモーターに機能的に連結される、本発明の抗体又はその重鎖もしくは軽鎖、あるいは、少なくともその免疫グロブリンの結合ドメイン又は可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞が含まれる。加えて、又は、代替において、本発明にはまた、抗体の免疫グロブリン鎖の結合ドメイン又は可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチドを、場合により、前記結合性分子の他の免疫グロブリン鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチドとの組合せで含む本明細書中上記で定義されるようなベクターを含む宿主細胞が含まれる。二重鎖抗体を発現させるための好ましい実施形態において、重鎖及び軽鎖の両方をコードする単一のベクター又は複数のベクターが、下記で詳述されるように、完全な免疫グロブリン分子の発現のために宿主細胞において共発現させられる場合がある。
【０２１４】
宿主細胞が本発明の２つの発現ベクターにより共トランスフェクションされる場合があり、この場合、第１のベクターが重鎖由来のポリペプチドをコードし、第２のベクターが軽鎖由来のポリペプチドをコードする。これら２つのベクターは、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選択マーカーを含有する場合がある。代替では、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの両方をコードするただ１つのベクターが使用される場合がある。そのような状況では、軽鎖が好都合には、毒性のない重鎖の過剰を避けるために重鎖の前に置かれる（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ  ３２２（１９８６）、５２；Ｋｏｈｌｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７（１９８０）、２１９７を参照のこと）。重鎖及び軽鎖のためのコード配列がｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含む場合がある。
【０２１５】
本明細書中で使用される場合、「宿主細胞」は、組換えＤＮＡ技術を使用して構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターを有する細胞を示す。抗体を組換え宿主から単離するためのプロセスの記載において、用語「細胞」及び「細胞培養（物）」が、別途明確に指定される場合を除き、抗体の供給源を示すために交換可能に使用される。別の言い方をすれば、「細胞」からのポリペプチドの回収は、遠心分離された細胞全体から、又は、培地及び懸濁された細胞の両方を含有する細胞培養物からのどちらをも意味する場合がある。
【０２１６】
様々な宿主−発現ベクター系が、本明細書中に記載される方法において使用されるための抗体分子を発現させるために利用される場合がある。そのような宿主−発現系は、目的とするコード配列が産生され、続いて精製されることがあるビヒクルを表し、しかし、適切なヌクレオチドコード配列により形質転換又はトランスフェクションされたとき、本発明の抗体分子をその場で発現する細胞もまた表す。これらには、微生物、例えば、抗体コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、プラスミドＤＮＡ発現ベクター又はコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換される細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターにより形質転換される酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）が感染させられる昆虫細胞系；抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ；タバコモザイクウイルスＴＭＶ）が感染させられるか、又は、抗体コード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）により形質転換される植物細胞系；あるいは、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）又は哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＢＬＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞）が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、完全な組換え抗体分子の発現のためにはとりわけ、細菌細胞（例えば、大腸菌など）、より好ましくは真核生物細胞が、組換え抗体分子の発現のために使用される。例えば、ベクター（例えば、ヒトサイトメガロウイルスからの主要前初期遺伝子プロモーターエレメントなど）と併せての哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などが、抗体のための効果的な発現系である（例えば、Ｆｏｅｃｋｉｎｇ他、Ｇｅｎｅ  ４５（１９８６）、１０１；Ｃｏｃｋｅｔｔ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８（１９９０）、２を参照のこと）。
【０２１７】
タンパク質発現のために使用される宿主細胞株は多くの場合、哺乳動物起源である；当業者には、宿主細胞株において発現させられる所望の遺伝子産物のために最もよく適する特定の宿主細胞株を優先的に決定する能力があると思われる。例示的な宿主細胞株には、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＤＧ４４及びＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲ欠損）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸ガン）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０のＴ抗原を有するＣＶＩの誘導体）、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）及び２９３（ヒト腎臓）が含まれるが、これらに限定されない。ＣＨＯ細胞及び２９３細胞が特に好ましい。宿主細胞株は典型的には、商用サービスから、すなわち、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能であり、又は、発表された文献から入手可能である。
【０２１８】
加えて、挿入された配列の発現を調節するか、あるいは、遺伝子産物を所望される特定の様式で修飾し、また、プロセシングする宿主細胞系統が選ばれる場合がある。タンパク質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）及びプロセシング（例えば、切断）が当該タンパク質の機能のために重要である場合がある。種々の宿主細胞が、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後のプロセシング及び修飾のための特徴的かつ特異的な機構を有する。適切な細胞株又は宿主系を、発現される外来タンパク質の正しい修飾及びプロセシングを保証するために選ぶことができる。この目的を達成するために、一次転写物の適正なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞が使用される場合がある。
【０２１９】
組換えタンパク質の長期間にわたる高収量の産生のためには、安定的発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定的に発現する細胞株が操作される場合がある。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、むしろ、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）及び選択マーカーによって制御されるＤＮＡにより形質転換することができる。外来ＤＮＡを導入した後、操作された細胞は富化培地において１日間〜２日間にわたって成長させられる場合があり、その後、選択培地に切り換えられる。組換えプラスミドにおける選択マーカーは選択に対する抵抗性を与え、また、細胞がプラスミドをその染色体に安定的に組み込み、成長して、結果としてクローン化され、かつ、細胞株に拡大することができる増殖巣を形成することを可能にする。この方法は、抗体分子を安定的に発現する細胞株を操作するために都合よく使用される場合がある。
【０２２０】
数多くの選択システムが使用される場合があり、これらには、下記のものが含まれるが、それらに限定されない：単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒ他、Ｃｅｌｌ  １１（１９７７）、２２３）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８（１９９２）、２０２）及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙ他、Ｃｅｌｌ  ２２（１９８０）、８１７）をｔｋ−細胞、ｈｇｐｒｔ−細胞又はａｐｒｔ−細胞においてそれぞれ用いることができる。また、代謝拮抗物質抵抗性を下記の遺伝子のための選択の基礎として使用することができる：ｄｈｆｒ、これはメトトレキサートに対する抵抗性を与える（Ｗｉｇｌｅｒ他、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７（１９８０）、３５７；Ｏ’Ｈａｒｅ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８（１９８１）、１５２７）；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸に対する抵抗性を与える（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８（１９８１）、２０７２）；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−４１８に対する抵抗性を与える（Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ他、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２（１９９３）、４８８〜５０５；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３（１９９１）、８７〜９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２（１９９３）、５７３〜５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０（１９９３）、９２６〜９３２；ならびに、Ｍｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２（１９９３）、１９１〜２１７；ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（１９９３）、１５５〜２１５）；及び、ｈｙｇｒｏ、これはヒグロマイシンに対する抵抗性を与える（Ｓａｎｔｅｒｒｅ他、Ｇｅｎｅ  ３０（１９８４）、１４７）。使用することができる、組換えＤＮＡ技術の技術分野において一般に知られている様々な方法が、Ａｕｓｕｂｅｌ他（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９０）に記載さされ、また、第１２章及び第１３章、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ他（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載される（これらはその全体において参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０２２１】
抗体分子の発現レベルをベクター増幅によって増大させることができる（総説については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第３巻（１９８７）を参照のこと）。抗体を発現させるベクター系におけるマーカーが増幅可能であるときには、宿主細胞の培養において存在する阻害剤のレベルにおける増大はマーカー遺伝子のコピー数を増大させるであろう。増幅された領域は抗体遺伝子に付随するので、抗体の産生もまた増大するであろう（Ｃｒｏｕｓｅ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３（１９８３）、２５７を参照のこと）。
【０２２２】
インビトロ産生では、スケールアップにより、多量の所望されるポリペプチドを与えることが可能である。組織培養条件のもとでの哺乳動物細胞培養のための様々な技術がこの技術分野において知られており、これらには、均一懸濁培養、例えば、エアーリフト型リアクター又は連続撹拌槽リアクターにおける培養、あるいは、固定化細胞又は包括化細胞の培養、例えば、中空繊維、マイクロカプセル、アガロースマイクロビーズ又はセラミックカートリッジにおける培養が含まれる。必要及び／又は所望されるならば、ポリペプチドの溶液を、例えば、合成ヒンジ領域ポリペプチドの優先的な生合成の後で、あるいは、本明細書中に記載されるＨＩＣクロマトグラフィー工程の前又は後で、慣例的なクロマトグラフィー方法、例えば、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロースでのクロマトグラフィー、又は、（免疫）アフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。
【０２２３】
本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体をコードする遺伝子はまた、哺乳動物以外の細胞、例えば、細菌細胞又は昆虫細胞又は酵母細胞又は植物細胞において発現させることができる。核酸を容易に取り込む細菌には、腸内細菌科のメンバー、例えば、大腸菌又はサルモネラ属の菌株など；バチルス科、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など；肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）；連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）が含まれる。細菌において発現させられるとき、異種ポリペプチドは典型的には封入体の一部となることがさらに理解されるであろう。異種ポリペプチドは単離され、精製され、その後、機能的な分子に組み立てられなければならない。四価形態の抗体が所望される場合、そのサブユニットは四価抗体に自己集合するであろう（例えば、国際特許出願公開ＷＯ０２／０９６９４８を参照のこと）。
【０２２４】
細菌系において、多数の発現ベクターが、抗体分子が発現されるための意図される使用に依存して、都合よく選択される場合がある。例えば、多量のそのようなタンパク質が抗体分子の医薬組成物の作製のために産生させられることになるときには、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を導くベクターが望ましい場合がある。そのようなベクターには、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．２（１９８３）、１７９１）（この場合、抗体コード配列がｌａｃＺコード領域とインフレームでベクターに個々に連結され、その結果、融合タンパク質が産生されるようにされる場合がある）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３（１９８５）、３１０１〜３１０９；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４（１９８９）、５５０３〜５５０９）などが含まれるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクターもまた、外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるために使用される場合がある。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズのマトリックスへの吸着及び結合、その後の遊離したグルタチオンの存在下での溶出によって溶解細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、トロンビン又は第Ｘａ因子のプロテアーゼ切断部位を含み、その結果、クローン化された標的遺伝子産物がＧＳＴ成分から放出され得るように設計される。
【０２２５】
原核生物に加えて、真核生物の微生物もまた使用される場合がある。サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、すなわち、普通のパン酵母が、真核生物の微生物の中で最も一般に使用されるが、多くの他の菌株が一般に利用可能である（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））。サッカロミセス属における発現のために、例えば、プラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ他、Ｎａｔｕｒｅ  ２８２（１９７９）、３９；Ｋｉｎｇｓｍａｎ他、Ｇｅｎｅ  ７（１９７９）、１４１；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ他、Ｇｅｎｅ  １０（１９８０）、１５７）が一般に使用される。このプラスミドは、トリプトファン中で成長する能力を欠く酵母の変異菌株（例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号又はＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８５（１９７７）、１２））のための選択マーカーを提供するＴＲＰ１遺伝子を既に含有する。その場合、酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐ１損傷の存在により、形質転換をトリプトファンの不在下での成長によって検出するための効果的な環境が提供される。
【０２２６】
昆虫系において、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が典型的には、外来タンパク質を発現させるためのベクターとして使用される。このウイルスはヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞において成長する。抗体コード配列がウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）の中に個々にクローン化され、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれる場合がある。
【０２２７】
本発明の抗体分子が組換え発現させられると、本発明の完全な抗体、それらのダイマー、個々の軽鎖及び重鎖又は他の免疫グロブリン形態を、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、特に、プロテインＡの後での特異的抗原についてのアフィニティー、及び、サイズ分画カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差的溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈澱）、又は、タンパク質の精製のためのいずれかの他の標準的な技術によることを含めて、この技術分野の標準的な手順に従って精製することができる（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照のこと）。代替では、本発明の抗体の親和性を増大させるための好ましい方法が米国特許出願公開第２００２−０１２３０５７号Ａ１に開示される。したがって、１つの実施形態において、本発明はまた、抗ＤＰＲ抗体、又は変異した、及び／又は凝集したＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲ種及び／又はそのフラグメントを認識する抗体、或いはその免疫グロブリン鎖を調製するための方法であって、
（ａ）本明細書中上記で定義されるようなポリヌクレオチド又はベクターを含む本明細書中上記で定義されるような宿主細胞を培養すること、及び
（ｂ）前記抗体又はその免疫グロブリン鎖を培養物から単離すること
を含む方法を提供する。
【０２２８】
さらには、本発明はまた、本明細書中上記で定義されるようなポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその免疫グロブリン鎖、あるいは、抗ＤＰＲ抗体、又は変異した及び／又は凝集したＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲ種及び／又はそのフラグメント又はその免疫グロブリン鎖を調製するための前記方法によって得ることができる抗体又はその免疫グロブリン鎖に関連する。
【０２２９】
Ｖ．融合タンパク質及びコンジュゲート
特定の実施形態において、抗体ポリペプチドは、通常の場合には抗体に付随しないアミノ酸配列あるいは１つ又は複数の成分を含む。例示的な改変が下記においてより詳細に記載される。例えば、本発明の単鎖Ｆｖ抗体フラグメントは柔軟なリンカー配列を含む場合があり、又は、機能的成分（例えば、ＰＥＧ、薬物、毒素又は標識（例えば、蛍光性、放射性、酵素、核磁気性及び重金属など））を付加するために改変される場合がある。
【０２３０】
本発明の抗体ポリペプチドは融合タンパク質を含む場合があり、融合タンパク質から本質的になる場合があり、又は、融合タンパク質からなる場合がある。融合タンパク質は、例えば、少なくとも１つの標的結合部位を伴う免疫グロブリンのＤＰＲ結合ドメインと、少なくとも１つの異種部分、すなわち、自然界では生来的に連結されない部分とを含むキメラ分子である。これらのアミノ酸配列は、融合ポリペプチドにおいて一緒にされる別個のタンパク質において正常に存在する場合があり、又は、同じタンパク質において正常に存在する場合があるが、融合ポリペプチドにおいては新しい配置で置かれる。融合タンパク質が、例えば、化学合成によって、又は、ペプチド領域が所望の関係でコードされるポリヌクレオチドを作出し、翻訳することによって作出される場合がある。
【０２３１】
用語「異種（の）」は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドに適用される場合、当該ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、比較されている実体の残部のものとは異なる実体に由来することを意味する。例えば、本明細書中で使用されるように、抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又はアナログに融合されるための“異種ポリペプチド”は、同じ種の非免疫グロブリンポリペプチド、あるいは、異なる種の免疫グロブリンポリペプチド又は非免疫グロブリンポリペプチドに由来する。
【０２３２】
本明細書中の他のところでより詳細に議論されるように、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体はさらに、Ｎ末端又はＣ末端において異種ポリペプチドに組換え融合される場合があり、あるいは、ポリペプチド又は他の組成物に化学的にコンジュゲート化される場合がある（共有結合によるコンジュゲート化及び非共有結合によるコンジュゲート化を含む）。例えば、抗体が、検出アッセイにおいて標識として有用である分子に、また、エフェクター分子（例えば、異種ポリペプチド、薬物、放射性核種又は毒素など）に組換え融合されるか、又はコンジュゲート化される場合がある（例えば、国際特許出願公開ＷＯ９２／０８４９５、ＷＯ９１／１４４３８、ＷＯ８９／１２６２４、米国特許第５，３１４，９９５号及び欧州特許出願ＥＰ０３９６３８７を参照のこと）。
【０２３３】
本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は、ペプチド結合又は修飾型ペプチド結合（すなわち、ペプチドアイソスター）によって互いにつながれるアミノ酸から構成されることが可能であり、また、遺伝子によりコードされる２０個のアミノ酸とは異なるアミノ酸を含有する場合がある。抗体は、天然のプロセス（例えば、翻訳後プロセシングなど）によって、又は、この技術分野ではよく知られている化学的修飾技術によって改変される場合がある。そのような修飾が、基礎的な教本において、また、より詳しいモノグラフにおいて、ならびに、膨大な数の研究文献において十分に記載されている。修飾を、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びアミノ末端又はカルボキシル末端を含めて、抗体においてどこにでも、あるいは、炭水化物などの成分に対して行うことができる。同じタイプの修飾が、所与の抗体において、いくつかの部位において同じ程度又は種々の程度で存在する場合があることが理解されるであろう。また、所与の抗体が多くのタイプの修飾を含有する場合がある。抗体は、例えば、ユビキチン化の結果として分岐する場合があり、また、分岐を伴って、又は伴うことなく、環状である場合がある。環状の抗体、分岐した抗体、及び、分岐した環状の抗体が、翻訳後の天然のプロセスから生じる場合があり、又は、合成的方法によって作製される場合がある。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合連結、ヘム成分の共有結合連結、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合連結、脂質又は脂質誘導体の共有結合連結、ホスファチジルイノシトールの共有結合連結、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解的プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加（例えば、アルギニル化など）、及び、ユビキチン化が含まれる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第２版（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１頁〜１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ他、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２（１９９０）、６２６〜６４６；Ｒａｔｔａｎ他、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３（１９９２）、４８〜６２を参照のこと）。
【０２３４】
本発明はまた、抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体と、異種ポリペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。１つの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、本発明の抗体のＶＨ領域のいずれか１つ又は複数のアミノ酸配列、あるいは、本発明の抗体のＶＬ領域又はそのフラグメントもしくは変異体のいずれか１つ又は複数のアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含むか、あるいは、そのようなポリペプチドから本質的になるか、あるいは、そのようなポリペプチドからなる。別の実施形態において、本明細書中に開示される診断方法及び処置方法において使用されるための融合タンパク質は、抗体のＶＨ−ＣＤＲ又はそのフラグメント、変異体もしくは誘導体のいずれか１つ、２つ、３つのアミノ酸配列、あるいは、抗体のＶＬ−ＣＤＲ又はそのフラグメント、変異体もしくは誘導体のいずれか１つ、２つ、３つのアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含むか、あるいは、そのようなポリペプチドから本質的になるか、あるいは、そのようなポリペプチドからなる。１つの実施形態において、融合タンパク質は、本発明の抗体のＶＨ−ＣＤＲ３又はそのフラグメント、誘導体もしくは変異体のアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含み、そのような融合タンパク質はＤＰＲタンパク質又はペプチドに特異的に結合する。別の実施形態において、融合タンパク質は、本発明の抗体の少なくとも１つのＶＨ領域のアミノ酸配列と、本発明の抗体の少なくとも１つのＶＬ領域又はそのフラグメント、誘導体もしくは変異体のアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含む。好ましくは、融合タンパク質のＶＨ領域及びＶＬ領域は、ＤＰＲｓと特異的に結合する単一供給源の抗体（あるいはｓｃＦｖフラグメント又はＦａｂフラグメント）に対応する。さらに別の実施形態において、本明細書中に開示される診断方法及び処置方法において使用されるための融合タンパク質は、抗体のＶＨＣＤＲのいずれか１つ、２つ、３つ又はそれ以上のアミノ酸配列と、抗体のＶＬＣＤＲ又はそのフラグメントもしくは変異体のいずれか１つ、２つ、３つまたそれ以上のアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含む。好ましくは、ＶＨ−ＣＤＲ又はＶＬ−ＣＤＲの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又はそれ以上が、本発明の単一供給源の抗体（あるいはｓｃＦｖフラグメント又はＦａｂフラグメント）に対応する。これらの融合タンパク質をコードする核酸分子もまた本発明によって包含される。
【０２３５】
文献に報告される例示的な融合タンパク質には、下記の融合物が含まれる：Ｔ細胞受容体（Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４（１９８７）、２９３６〜２９４０）；ＣＤ４（Ｃａｐｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３３７（１９８９）、５２５〜５３１；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３３９（１９８９）、６８〜７０；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌ他、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ  ９（１９９０）、３４７〜３５３；及びＢｙｒｎ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３４４（１９９０）、６６７〜６７０）；Ｌ−セレクチン（ホーミング受容体）（Ｗａｔｓｏｎ他、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０（１９９０）、２２２１〜２２２９；及びＷａｔｓｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９（１９９１）、１６４〜１６７）；ＣＤ４４（Ａｒｕｆｆｏ他、Ｃｅｌｌ  ６１（１９９０）、１３０３〜１３１３）；ＣＤ２８及びＢ７（Ｌｉｎｓｌｅｙ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３（１９９１）、７２１〜７３０）；ＣＴＬＡ−４（Ｌｉｓｌｅｙ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４（１９９１）、５６１〜５６９）；ＣＤ２２（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ他、Ｃｅｌｌ  ６６（１９９１）、１１３３〜１１４４）；ＴＮＦ受容体（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８（１９９１）、１０５３５〜１０５３９；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１９９１）、２８８３〜２８８６；及びＰｅｐｐｅｌ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４（１９９１）、１４８３〜１４８９（１９９１））；ならびにＩｇＥ受容体ａ（Ｒｉｄｇｗａｙ  ａｎｄ  Ｇｏｒｍａｎ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１５（１９９１）、アブストラクト番号：１４４８）。
【０２３６】
本明細書中の他のところで議論されるように、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は、ポリペプチドのインビボ半減期を増大させるために、又は、この技術分野において知られている方法を使用する免疫アッセイにおける使用のために異種ポリペプチドに融合される場合がある。例えば、１つの実施形態において、ＰＥＧを、本発明の抗体に、その半減期をインビボにおいて増大させるためにコンジュゲート化することができる（例えば、Ｌｅｏｎｇ他、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、１６（２００１）、１０６〜１１９；Ａｄｖ．ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４（２００２）、５３１；又はＷｅｉｒ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ３０（２００２）、５１２を参照のこと）。
【０２３７】
そのうえ、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、合成変異体又は生物工学的誘導体は、マーカー配列（例えば、それらの精製又は検出を容易にするためのペプチドなど）に融合することができる。好ましい実施形態において、マーカーのアミノ酸配列は、多くのものが市販されているが、とりわけ、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（ＨＩＳ）であり、例えば、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、Ｃａｌｉｆ．、９１３１１）において提供されるタグなどである。例えば、Ｇｅｎｔｚ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６（１９８９）、８２１〜８２４に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは融合タンパク質の便利な精製をもたらす。精製のために有用である他のペプチドタグには、「ＨＡ」タグ（これは、インフルエンザの赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する）（Ｗｉｌｓｏｎ他、Ｃｅｌｌ  ３７（１９８４）、７６７）、ＧＳＴ、ｃ−ｍｙｃ及び「ｆｌａｇ」タグが含まれるが、これらに限定されない（例えば、エピトープタグ化技術の総説については、Ｂｉｌｌ  Ｂｒｉｚｚａｒｄ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４４（２００８）、６９３〜６９５を、また本発明において使用可能である最も一般的なエピトープタグを列挙するその６９４頁における表１を参照のこと。これらの主題は、本明細書により明示的に、参照によって組み込まれる）。
【０２３８】
融合タンパク質を、この技術分野においてよく知られている方法を使用して調製することができる（例えば、米国特許第５，１１６，９６４号及び第５，２２５，５３８号を参照のこと）。融合が行われるまさにその部位が、融合タンパク質の分泌又は結合特性を最適化するために経験的に選択される場合がある。融合タンパク質をコードするＤＮＡがその後、本明細書中上で記載されるように行われる発現のために宿主細胞にトランスフェクションされる。
【０２３９】
本発明の抗体は非コンンジュゲート化形態で使用される場合があり、あるいは、例えば、分子の治療的性質を改善するために、標的検出を容易にするために、又は、患者の画像化もしくは治療のために様々な分子の少なくとも１つにコンジュゲート化される場合がある。本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は、精製が行われるときには精製前又は精製後のどちらでも標識化又はコンジュゲート化することができる。特に、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答調節物質、医薬剤又はＰＥＧにコンジュゲート化される場合がある。
【０２４０】
従来の抗体を含む免疫毒素であるコンジュゲートがこの技術分野において幅広く記載されている。毒素が従来からのカップリング技術によって抗体にカップリングされる場合があり、又は、タンパク質毒素部分を含有する免疫毒素を融合タンパク質として作製することができる。本発明の抗体は、そのような免疫毒素を得るための対応する方法で使用することができる。そのような免疫毒素を例示するものが、Ｂｙｅｒｓ、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（１９９１）、５９〜７０、及び、Ｆａｎｇｅｒ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １２（１９９１）、５１〜５４によって記載される免疫毒素である。
【０２４１】
当業者は、コンジュゲートがまた、コンジュゲート化されるための選択された薬剤に依存して様々な技術を使用して組み立てられ得ることを理解するであろう。例えば、ビオチンとのコンジュゲートが、例えば、ＤＰＲ結合ポリペプチドをビオチンの活性化エステル（例えば、ビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなど）と反応することによって調製される。同様に、蛍光性マーカーとのコンジュゲートがカップリング剤（例えば、本明細書中に列挙されるカップリング剤）の存在下で調製される場合があり、又は、イソチオシアン酸塩との反応によって、好ましくはイソチオシアン酸フルオレセインとの反応によって調製される場合がある。本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体のコンジュゲートが同様な様式で調製される。
【０２４２】
本発明はさらに、診断剤又は治療剤にコンジュゲート化される本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体を包含する。抗体を、例えば、ＤＰＲｓの存在を明らかにして、ＤＰＲｓ（好ましくは、ＤＰＲｓ形成変異Ｃ９ＯＲＦ７２、即ちＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲｓ）に関連付づけられる疾患に罹る危険性を示すために、そのような疾患（すなわち、凝集したＤＰＲｓの出現を示す、あるいは、それらに関連づけられる疾患）の発症又は進行をモニターして、又は臨床検査手順の一部として、例えば、所与の処置療法及び／又は防止療法の効力を明らかにするために、診断的に使用することができる。したがって、１つの実施形態において、本発明は、検出可能に標識される抗体に関連する。さらには、１つの実施形態において、本発明は、薬物に結合させられる抗体に関連する。検出を、抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体を検出可能な物質にカップリングすることによって容易にすることができる。検出可能な物質又は標識は一般に、酵素、重金属（好ましくは金）、色素（好ましくは蛍光性色素又は発光性色素）又は放射性標識である場合がある。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光性物質、発光性物質、生物発光性物質、放射性物質、様々な陽電子放出断層撮影法を使用する陽電子放出金属、及び、非放射性常磁性金属イオンが含まれる（本発明に従って診断剤として使用されるために抗体にコンジュゲート化することができる金属イオンについては、例えば、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと）。好適な酵素の例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；好適な補欠分子族複合体の例として、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられる；好適な蛍光性物質の例として、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリトリンが挙げられる；発光性物質の一例として、ルミノールが挙げられる；生物発光性物質の例として、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが挙げられる；好適な放射性物質の例として、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ又は９９Ｔｃが挙げられる。したがって、１つの実施形態において、本発明は、検出可能な標識が、酵素、放射性同位体、蛍光団及び重金属からなる群から選択される検出可能に標識された抗体を提供する。
【０２４３】
抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体はまた、化学発光化合物にカップリングすることによって検出可能に標識することができる。化学発光標識された抗体の存在がその後、化学反応の経過の期間中に生じる発光の存在を検出することによって求められる。特に有用な化学発光性の標識用化合物の例が、ルミノール、イソルミノール、テロマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルである。
【０２４４】
抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体が検出可能に標識され得る方法の１つは、抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体を酵素に連結し、連結された生成物を酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）において使用することによってである（Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．、「Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）」、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ２（１９７８）、１〜７）；Ｖｏｌｌｅｒ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１（１９７８）、５０７〜５２０；Ｂｕｔｌｅｒ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３（１９８１）、４８２〜５２３；Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（編）、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．（１９８０）；Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｅ．他（編）、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｋｇａｋｕ  Ｓｈｏｉｎ、Ｔｏｋｙｏ（１９８１））。酵素は、抗体に結合しているので、例えば、分光光度法的手段、蛍光定量法的手段又は目視的手段によって検出することができる化学的成分を生成するような様式で、適切な基質（好ましくは発色性基質）と反応するであろう。抗体を検出可能に標識するために使用することができる酵素には、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼが含まれるが、これらに限定されない。加えて、検出を、酵素のための発色性基質を用いる比色法によって達成することができる。検出はまた、類似して調製された標準物との比較における基質の酵素反応の程度の目視比較によって達成される場合がある。
【０２４５】
検出はまた、様々な他の免疫アッセイのいずれかを使用して達成される場合がある。例えば、抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体を放射能標識することによって、抗体を放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）の使用により検出することが可能である（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（Ｍａｒｃｈ、１９８６）を参照のこと。これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。放射性同位体を、ガンマカウンター、シンチレーションカウンター又はオートラジオグラフィー（これらに限定されない）を含む手段によって検出することができる。
【０２４６】
抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体はまた、蛍光放射金属（例えば、ランタニド系列の１５２Ｅｕなど）を使用して検出可能に標識することができる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート化基を使用して抗体に結合させることができる。
【０２４７】
様々な成分を抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体にコンジュゲート化するための技術がよく知られている；例えば、Ａｒｎｏｎ他、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄ他（編）、２４３頁〜５６頁、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ他、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ他（編）、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、６２３頁〜５３頁（１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ‘８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａ他（編）、４７５頁〜５０６頁（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎ他（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、３０３頁〜１６頁（１９８５）、及び、Ｔｈｏｒｐｅ他、「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、６２（１９８２）、１１９〜１５８を参照のこと。
【０２４８】
述べられたように、特定の実施形態において、結合性分子、例えば、結合性ポリペプチド、例えば、抗体又はその免疫特異性フラグメントの安定性又は効力を高める成分をコンジュゲート化することができる。例えば、１つの実施形態において、ＰＥＧを、本発明の結合性分子に、その半減期をインビボにおいて増大させるためにコンジュゲート化することができる。Ｌｅｏｎｇ他、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、１６（２００１）、１０６；Ａｄｖ．ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４（２００２）、５３１；又は、Ｗｅｉｒ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ３０（２００２）、５１２。
【０２４９】
ＶＩ．組成物及び使用方法
本発明は、本明細書中前記で定義されるように、上記で述べられた本発明のＤＰＲ結合性分子（例えば、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント、それらの変異体又は生物工学的誘導体）、あるいは、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、又は細胞を含む組成物に関連する。１つの実施形態において、本発明の組成物は医薬組成物であり、かつ、医薬的に許容される担体をさらに含む。さらには、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の意図された使用に依存して、さらなる薬剤（例えば、インターロイキン又はインターフェロンなど）を含む場合がある。変異した及び／又は凝集したＤＰＲｓ、特にＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲｓの出現を示すか、あるいは、関連づけられる疾患又は障害（例えば、ＦＴＬＤなど）を処置することにおける使用のために、さらなる薬剤が、小さい有機分子、抗ＤＰＲ抗体及びそれらの組合せからなる群から選択される場合がある。したがって、特定の好ましい実施形態において、本発明は、ＤＰＲタンパク質に伴う疾患又は障害の予防的処置及び治療的処置、ＤＰＲタンパク質及び／又は凝集Ｃ９ＯＲＦ７２に伴う疾患又は障害の進行又はＤＰＲの処置に対する応答を対象においてモニターすること、あるいは、ＤＰＲタンパク質及び／又は凝集Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲｓに伴う疾患又は障害を発症することについての対象の危険性を明らかにすることのための医薬組成物又は診断組成物を調製するための、ＤＰＲ結合性分子の使用、例えば、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント、あるいは、それらのいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有する結合性分子、本発明のポリヌクレオチド、ベクター又は細胞の使用に関連する。
【０２５０】
したがって、１つの実施形態において、本発明は、ＤＰＲｓ、及びＤＰＲタンパク質（例えばＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲｓに起因する凝集Ｃ９ＯＲＦ７２）の、罹患した系及び器官における異常な蓄積及び／又は沈着によって特徴づけられる疾患又は障害を処置する方法であって、その必要性のある対象に、本発明の上記で記載されたＤＰＲ結合性分子、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞のいずれか１つの治療有効量を投与することを含む方法に関連する。
【０２５１】
本発明の治療的取り組みの特定の利点が、本発明の組換え抗体は、例えば、無症候性の変異を有する、凝集したＤＰＲｓの出現を示す、又は、凝集したＤＰＲｓに関連づけられる疾患の徴候又は症状を何ら有しない健康なヒト対象から得られるＢ細胞又はメモリーＢ細胞に由来しており、したがって、ＤＰＲｓ、例えば、伸長したヘキサヌクレオチドリピートを有する変異Ｃ９ＯＲＦ７２（Ｃ９ＯＲＦ７２にジペプチドリピートを形成し、Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲｓに起因する凝集Ｃ９ＯＲＦ７２をもたらすことになる）に関連づけられる臨床的に明白な疾患を防止することが、あるいは、そのような臨床的に明白な疾患又は障害の出現の危険性を減らすことが、あるいは、そのような臨床的に明白な疾患又は障害の発症又は進行を遅らせることが、ある程度の確率で可能であるという事実にある。典型的には、本発明の抗体はまた、体細胞変異、すなわち、抗体の可変領域の体細胞変化による標的ＤＰＲ分子に対する高親和性結合における選択性及び有効性に関しての最適化を既に首尾良く経ている。
【０２５２】
そのような細胞は生体内において、例えば、ヒト体内において、自己免疫学的反応又はアレルギー反応の意味で、関連した、又は他の生理学的なタンパク質又は細胞構造によって活性化されていないという認識はまた、臨床試験段階を首尾よく生き残るという相当に増大した可能性がこれにより意味されるので、非常に医学的に重要である。いわば、効率、許容性及び耐容性が、少なくとも１名のヒト対象において予防的抗体又は治療的抗体の前臨床開発及び臨床開発の前に既に実証されている。したがって、本発明のヒト由来抗ＤＰＲ抗体は、治療剤としてのその標的構造特異的効率と、副作用のその低下した可能性との両方により、成功のその臨床的可能性を著しく増大させることが予想され得る。
【０２５３】
本発明はまた、上記で記載された成分（例えば、本発明の抗ＤＰＲ抗体、その結合フラグメント、生物工学的誘導体もしくは変異体、ポリヌクレオチド、ベクター、又は細胞）の１つ又は複数により満たされる１つ又は複数の容器を含む医薬用及び診断用のパック又はキットをそれぞれ提供する。そのような容器には、医薬品又は生物学的製造物の製造、使用又は販売を規制する政府当局によって定められる形式での通知が伴い得る（ただし、そのような通知は、製造、使用又は販売の当局によるヒト投与のための承認を反映する）。加えて、又は、代替において、キットは、適切な診断アッセイにおいて使用されるための試薬及び／又は説明書を含む。本発明の組成物、例えば、キットは、当然のことながら、ＤＰＲの存在が付随する疾患又は障害のリスク評価、診断、防止及び処置のために特に適しており、具体的には、ＤＰＲｓの存在によって一般には特徴づけられる障害を処置するために適用可能である。特に、前記組成物は、ＤＰＲの凝集（例えば、伸長したヘキサヌクレオチドリピートを有する変異Ｃ９ＯＲＦ７２（Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲｓに起因する凝集Ｃ９ＯＲＦ７２をもたらすことになる）に関連した疾患の処置に有用である。ＤＰＲｓに伴う疾患及び／又は障害には、これらに限定されるわけではないが、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及び／又は脊髄小脳失調症３６型が含まれる。
【０２５４】
本発明の医薬組成物はこの技術分野においてよく知られている方法に従って配合することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０００）（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＩＳＢＮ０−６８３−３０６４７２）を参照のこと）。好適な医薬用キャリアの例がこの技術分野ではよく知られており、これらには、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルション（例えば、油／水エマルションなど）、様々なタイプの湿潤化剤、無菌溶液などが含まれる。そのようなキャリアを含む組成物を、よく知られている従来の方法によって配合することができる。これらの医薬組成物は好適な用量で対象に投与することができる。好適な組成物の投与が、種々の方法によって、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、局所的投与又は皮内投与あるいは脊髄送達又は脳送達によって行われる場合がある。エアロゾル配合物、例えば、鼻腔噴霧配合物などには、保存剤及び等張剤を伴う活性な薬剤の精製された水性溶液又は他の溶液が含まれる。そのような配合物は好ましくは、鼻腔粘膜と適合し得るｐＨ及び等張性状態に調節される。直腸投与又は膣投与のための配合物が、好適なキャリアを伴う坐薬として提示される場合がある。
【０２５５】
投薬計画が主治医及び臨床上の要因によって決定されるであろう。医療技術分野ではよく知られているように、どのような患者であれ、患者のための投薬量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与されるべき具体的な化合物、性別、投与時間及び投与経路、全身の健康状態、ならびに、同時に投与されている他の薬物を含めて、多くの要因に依存する。典型的な用量が、例えば、０．００１μｇ〜１０００μｇの範囲（あるいは、この範囲における発現又は発現阻害のための核酸の範囲）であり得る；しかしながら、この例示的な範囲よりも少ない用量又は大きい用量が、とりわけ上述の要因を考慮して想定される。一般に、投薬量は、例えば、宿主体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲が可能であり、より通常的には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇなど）が可能である。例えば、投薬量は、１ｍｇ／ｋｇ体重又は１０ｍｇ／ｋｇ体重、あるいは、１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇであり得る。上記範囲において中間的である用量もまた、本発明の範囲内で意図される。対象には、そのような用量を毎日、１日おきに、毎週、又は、経験的分析によって決定されるいずれかの他のスケジュールに従って投与することができる。例示的な処置は、例えば、少なくとも６ヶ月の長期間にわたる多数回の投薬での投与を伴う。さらなる例示的な処置計画は、２週間毎に１回、又は、１ヶ月に１回、又は、３ヶ月毎〜６ヶ月毎に１回での投与を伴う。例示的な投薬スケジュールには、連続した毎日での１〜１０ｍｇ／ｋｇ又は１５ｍｇ／ｋｇ、１日おきでの３０ｍｇ／ｋｇ、あるいは、毎週での６０ｍｇ／ｋｇが含まれる。一部の方法では、異なる結合特異性を有する２つ以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、そのような場合、投与されるそれぞれの抗体の投薬量が、示される範囲内である。進行を定期的な評価によってモニターすることができる。非経口投与のための調製物には、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁物及びエマルションが含まれる。非水性溶媒の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油など）、及び、注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）が挙げられる。水性キャリアには、生理的食塩水及び緩衝媒体を含めて、水、アルコール性溶液／水溶液、エマルション又は懸濁物が含まれる。非経口用ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル又は固定油が含まれる。静脈内用ビヒクルには、流体及び栄養補充液及び電解質補充液（例えば、リンゲルブドウ糖に基づくものなど）などが含まれる。保存剤及び他の添加剤もまた存在する場合がある（例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤及び不活性ガスなど）。さらには、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の意図された使用に依存して、さらなる薬剤（例えば、ドーパミン又は精神薬理学的薬物など）を含む場合がある。
【０２５６】
さらには、本発明の好ましい実施形態において、例えば、本発明の医薬組成物が抗ＤＰＲ抗体あるいはＤＰＲ結合フラグメント、又はそれらの合成若しくは生物工学的変異体又は誘導体を受動免疫化のために含むならば、医薬組成物はワクチンとして配合される場合がある。背景の節で述べられたように、凝集したＤＰＲ種がＦＬＴＤやＡＬＳなどの疾患及び／又は障害の主要な誘因である。したがって、本発明のヒト抗ＤＰＲ抗体及び同等なＤＰＲ結合性分子による受動免疫化は、能動免疫化療法概念のいくつかの有害な影響を回避すること、そして、ＤＰＲｓの軽減された凝集をもたらすことを助けるであろうと予想することは賢明なことである。したがって、本発明の抗ＤＰＲ抗体及びその同等物は、凝集したＤＰＲｓ、特にＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲｓの存在を示すか、又は、凝集したＤＰＲｓ、特にＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲｓによって引き起こされる疾患又は障害、例えばＦＴＬＤの防止又は緩和のためのワクチンとして特に有用であろう。
【０２５７】
１つの実施形態において、本発明の抗体の組換えＦａｂフラグメント（ｒＦａｂ）及び単鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）を使用することが有益である場合がある。これは、それらがより容易に細胞膜に浸透するかもしれないからである。例えば、Ｒｏｂｅｒｔ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．（２００８）（Ｏｃｔ  １６）；Ｓ１７４１−０１３４（これはオンライで事前に発表された）は、ＡβのＮ末端領域におけるエピトープを認識するモノクローナル抗体ＷＯ−２のキメラな組換えＦａｂフラグメント（ｒＦａｂ）及び単鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）の使用を記載する。操作されたフラグメントは、（ｉ）アミロイド原線維化を防止することができ、（ｉｉ）事前に形成されたＡβ１−４２原線維を解凝集することができ、かつ、（ｉｉｉ）Ａβ１−４２オリゴマー媒介の神経毒性を完全なＩｇＧ分子と同じくらい効率的にインビトロで阻害することができた。エフェクター機能を欠く小さいＦａｂ及びｓｃＦｖの操作された抗体様式を使用することの認識された利点には、血液脳関門をより効率的に通過すること、及び、炎症性の副反応を誘発する危険性を最小限に抑えることが含まれる。さらには、ｓｃＦＶ及び単鎖ドメイン抗体は全長抗体の結合特異性を保持することのほかに、それらは単一遺伝子として発現させることができ、また、折り畳み、相互作用、修飾、又は、それらの標的の細胞内局在化の変化についての潜在的可能性が伴うが、細胞内抗体として哺乳動物細胞において細胞内に発現させることができる（総説については、例えば、Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｓｓｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１２（２００５）、３９４〜４０１を参照のこと）。
【０２５８】
異なる取り組みにおいて、Ｍｕｌｌｅｒ他、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００５）、２３７〜２４１は、抗体が、生細胞を傷づけることなく生細胞内に往復させられることを可能にすると言われる技術基盤（いわゆる「ＳｕｐｅｒＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」）を記載する。そのような細胞浸透抗体により、新しい診断範囲及び治療範囲が開拓される。用語「ＴｒａｎｓＭａｂｓ」がこれらの抗体のために案出されている。
【０２５９】
さらなる実施形態において、ＤＰＲｓ、特に、凝集したＤＰＲｓ（Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲｓなど）の出現に関連づけられる疾患、障害又は症状を処置するために有用である他の抗体の共投与又は逐次投与が望ましい場合がある。１つの実施形態において、そのようなさらなる抗体が本発明の医薬組成物において含まれる。対象を処置するために使用することができる抗体の例には、ＣＤ３３、ＳＧＬＴ２、ＩＬ−６及びＩＬ−１を標的化する抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【０２６０】
さらなる実施形態において、ＤＰＲに関連づけられる、具体的には凝集型ＤＰＲ（例えば、変異型Ｃ９ＯＲＦ７２など）、すなわち、Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲに関連づけられる疾患、障害又は症状を処置するために有用である他の薬剤の共投与又は逐次投与が望ましい場合がある。１つの実施形態において、そのようなさらなる薬剤が本発明の医薬組成物において含まれる。対象を処置するために使用することができる薬剤の例には、下記の薬剤が含まれるが、それらに限定されない：不随意筋運動を標的とするＶＭＡＴ２阻害剤、例えば、抗炎症剤など、例えば、ジフルシナール（ｄｉｆｌｕｓｉｎａｌ）、コルチコステロイド類、２−（２，６−ジクロルアニリノ）フェニル酢酸（ジクロフェナク）、イソ−ブチルプロパノイックフェノール酸（ｉｓｏ−ｂｕｔｙｌ−ｐｒｏｐａｎｏｉｃ−ｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（イブプロフェン）など；利尿剤、没食子酸エピガロカテキン、メルファラン塩酸塩、デキサメタゾン、ボルテゾミブ、ボルテゾミブ−メルファラン、ボルテゾミブ−デキサメタゾン、メルファラン−デキサメタゾン、ボルテゾミブ−メルファラン−デキサメタゾン；抗うつ剤、抗精神病薬、神経遮断剤、抗痴呆剤（例えば、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストのメマンチン）、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤（例えば、ドネペジルＨＣｌ、リバスチグミン、ガランタミン）、グルタミン酸アンタゴニスト及び他の向知性剤血圧薬剤（例えば、ジヒドララジン、メチルドパ）、細胞増殖抑制剤、グルココルチコイド類、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤；抗炎症剤、又は、どのような組合せであれ、それらの組合せ。
【０２６１】
治療効果的な用量又は量は、症状又は状態を改善するために十分である有効成分のそのような量を示す。そのような化合物の治療効力及び毒性を、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学手順によって、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％において治療効果的な用量）及びＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）によって求めることができる。治療効果と毒性影響との間における用量比が治療指数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表すことができる。
【０２６２】
前記から、本発明は、上記抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含むＤＰＲ結合性分子のどのような使用をも包含し、具体的には、上記で述べられるような、ＤＰＲｓ、特に、凝集したＤＰＲｓ（Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲｓなど）に関連づけられる疾患又は障害（例えばＦＴＬＤなど）の診断及び／又は処置のためのそのような分子のどのような使用をも包含することが明らかである。好ましくは、前記結合性分子は本発明の抗体又は生物学的誘導体である。加えて、本発明は、本明細書中前記で記載される述べられた抗体のいずれかの１つの様々な抗イディオタイプ抗体に関連する。これらは、抗原結合部位の近くにおいて抗体の可変領域に位置する特有の抗原性ペプチド配列に結合する抗体又は他の結合性分子であり、例えば、対象から得られるサンプルにおける抗ＤＰＲ抗体を検出するために有用である。１つの実施形態において、本発明は、ＤＰＲｓに関連づけられる疾患又は障害の予防的処置、治療的処置、ならびに／あるいは、ＤＰＲｓに関連づけられる疾患又は障害の進行又は処置に対する応答をモニターすることにおいて使用されるための、本明細書中上記において、また下記で定義されるような抗体、又は、前記抗体のいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有するＤＰＲ結合性分子、本明細書中で定義されるようなポリヌクレオチド、ベクター又は細胞、あるいは、それらのいずれか１つを含む医薬組成物又は診断組成物を提供する。好ましい実施形態では、疾患及び／又は障害は、凝集したＤＰＲｓを伴う。特に好ましい実施形態では、疾患及び／又は障害は、Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲｓを伴う（例えばＦＴＬＤやＡＬＳなど）。
【０２６３】
別の実施形態において、本発明は、本発明の上記で記載されたＤＰＲ結合性分子、抗体、抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクターあるいは細胞のいずれか１つと、場合により、検出のための好適な手段（例えば、免疫又は核酸に基づく診断方法において従来から使用される試薬など）とを含む診断組成物に関連する。本発明の抗体は、例えば、抗体を液相において利用することができるか、又は、固相キャリアに結合させることができる免疫アッセイにおける使用のために適している。本発明の抗体を利用することができる免疫アッセイの例が、直接的様式又は間接的様式でのどちらであれ、競合的免疫アッセイ及び非競合的免疫アッセイである。そのような免疫アッセイの例が、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチアッセイ（イムノメトリックアッセイ）、フローサイトメトリーアッセイ及びウエスタンブロットアッセイである。本発明の抗原及び抗体は多くの異なるキャリアに結合させることができ、また、それらに特異的に結合する細胞を単離するために使用することができる。よく知られているキャリアの例には、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然セルロース及び修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース及びマグネタイトが含まれる。キャリアの性質は本発明の目的のために可溶性又は不溶性のどちらでも可能である。多くの異なる標識及び標識化方法が当業者には知られている。本発明において使用することができる標識のタイプの例には、酵素、放射性同位体、コロイド状金属、蛍光性化合物、化学発光化合物及び生物発光化合物が含まれる（本明細書中上記で議論された実施形態もまた参照のこと）。
【０２６４】
さらなる実施形態によって、ＤＰＲ結合性分子はまた、特に、本発明の抗体はまた、血液サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、リンパサンプル又はいずれかの他の体液サンプル（例えば、唾液サンプル又は尿サンプルなど）である場合がある体液サンプルを検査された個体から得ること、及び、体液サンプルを、抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件のもとで本発明の抗体と接触させることによって、障害を個体において診断するための方法において使用される場合がある。そのような複合体のレベルがその後、この技術分野において知られている方法によって求められ、コントロールサンプルにおいて形成されるレベルよりも有意に大きいレベルにより、疾患が、検査された個体において示される。同じ様式で、本発明の抗体が結合する特異的抗原もまた使用される場合がある。したがって、本発明は、結合性分子、例えば、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを含むインビトロ免疫アッセイに関連する。
【０２６５】
本発明のさらなる実施形態において、本発明のＤＰＲ結合性分子（具体的には抗体）はまた、個体における疾患又は障害の診断を、生検物を試験された個体から得ることによって行うための方法において使用される場合がある。
【０２６６】
この関連において、本発明はまた、この目的のために具体的に設計される手段に関連する。例えば、抗体に基づくアレイが使用される場合があり、アレイには、例えば、ＤＰＲを特異的に認識する本発明の抗体又はその同等な抗原結合性分子が負荷される。マイクロアレイでの免疫アッセイの設計が、Ｋｕｓｎｅｚｏｗ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ５（２００６）、１６８１〜１６９６において要約される。したがって、本発明はまた、本発明に従って特定されるＤＰＲ結合性分子が負荷されるマイクロアレイに関連する。
【０２６７】
１つの実施形態において、本発明は、ＤＰＲｓ、特に、凝集したＤＰＲｓ（Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲｓなど）に関連づけられる疾患又は障害を対象において診断する方法であって、診断される対象から得られるサンプルにおけるＤＰＲｓ及び凝集したＤＰＲｓの各々の存在を、本発明の少なくとも１つの抗体、ＤＰＲ結合フラグメント、又は、それらのいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有するＤＰＲ結合性分子を用いて明らかにすることを含み、この場合、病理学的に凝集したＤＰＲｓ（好ましくはＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲｓ）の存在が、ＦＴＬＤ及び／又はＡＬＳについて示すものであり、また、生理学的Ｃ９ＯＲＦ７２（即ち、ＤＰＲタンパク質内にリピート領域が翻訳されない）のレベルとの比較において、病理学的に凝集したＤＰＲｓ、特にＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲｓのレベルの増大が、前記対象のＦＴＬＤ及び／又はＡＬＳの進行について示すものである方法に関連する。
【０２６８】
診断されるべき対象は疾患について無症候性又は病状発現前である場合がある。好ましくは、コントロール対象は、上記で記載されるように、ＤＰＲ、凝集型ＤＰＲ及び／好ましくはＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲに伴う疾患、例えば、ＦＴＬＤ、ＡＬＳ及びＦＴＬＤ−ＡＬＳなどを有しており、ただし、この場合、ＤＰＲのレベル、例えば、凝集型Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲのレベルと、参照標準との間における類似性により、診断されるべき対象が、ＦＴＬＤ、ＡＬＳ及び／又はＦＴＬＤ−ＡＬＳを有すること、或いは、ＤＰＲ凝集に伴う疾患及び／又は障害を発症する危険性があることが示される。代替において、又は加えて、第２のコントロールとして、コントロール対象はＤＰＲ凝集を有しておらず、ただし、この場合、変異型Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子のようにその遺伝子における変異のために挿入されるＤＰＲを有しやすい生理学的Ｃ９ＯＲＦ７２若しくは他のタンパク質、及び／又は凝集型Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲのレベルと、参照標準との間における違いにより、診断されるべき対象が、ＤＰＲに伴う疾患及び／又は障害（例えば、ＦＴＬＤ、ＡＬＳ及び／又はＦＴＬＤ−ＡＬＳなど）を有すること、或いは、ＤＰＲに伴う疾患及び／又は障害を発症する危険性があることが示される。好ましくは、診断されるべき対象と、コントロール対象とは、年齢が一致している。分析されるべきサンプルは、病理学的にＤＰＲタンパク質を含有することが疑われる、例えば、凝集型Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲなどを含有することが疑われるどのような体液であってもよく、例えば、血液、血漿、血清、尿、腹腔液、唾液又は脳脊髄液（ＣＳＦ）である場合がある。
【０２６９】
生理学的Ｃ９ＯＲＦ７２又は同様なタンパク質並びに／或いは凝集型ＤＰＲ（例えば、Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲなど）のレベルが、例えば、ＤＰＲ及び／又はＤＰＲを取り込むタンパク質（例えば、Ｃ９ＯＲＦ７２など）を、ウエスタンブロット、免疫沈降、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）、二次元ゲル電気泳動、質量分析法（ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化−飛行時間型ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、表面増強レーザー脱離イオン化−飛行時間（ＳＥＬＤＩーＴＯＦ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、多次元液体クロマトグラフィー（ＬＣ）それに続くタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）、及び、レーザーデンシトメトリーから選ばれる１つ又は複数の技術によって分析することを含む、この技術分野で知られている好適な方法のどれによって評価されてもよい。好ましくは、ＤＰＲの前記インビボ画像化は、シンチグラフィー、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射型断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、近赤外（ＮＩＲ）光学的画像法又は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を含む。
【０２７０】
したがって、１つの実施形態において、本発明の抗体又は前記抗体のいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有するＤＰＲ結合性分子、本明細書中上記で定義されるようなポリヌクレオチド、ベクター又は細胞、或いは、それらのいずれか１つを含む医薬組成物又は診断組成物が、凝集型ＤＰＲタンパク質に関連づけられる疾患又は障害の予防的処置、治療的処置、並びに／或いは、そのような疾患又は障害の進行又は処置に対する応答をモニターすることにおける使用のために提供される。したがって、本発明はまた、対象におけるＤＰＲタンパク質に関連づけられる疾患又は障害（例えば、ＦＴＬＤ及びＡＬＳなど）を診断する、又はその進行をモニターする方法であって、診断される対象からのサンプルにおけるＤＰＲタンパク質の存在を、本発明の少なくとも１つの抗体又はそれらの抗体のいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有するＤＰＲ結合性分子を用いて明らかにすることを含み、ただし、この場合、変異型Ｃ９ＯＲＦ７２種及び凝集型Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲ種などにおけるＤＰＲの存在が前記疾患又は障害についての暗示である方法に関連する。１つの実施形態において、対象におけるＤＰＲ関連の疾患及び／又は障害を診断する、或いはその進行をモニターする前記方法であって、診断される対象からのサンプルにおける変異型Ｃ９ＯＲＦ７２及びその凝集型形態などにおけるＤＰＲの存在を、本発明の少なくとも１つの抗体又はそれらの抗体のいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有するＤＰＲ結合性分子を用いて明らかにすることを含み、ただし、この場合、ＤＰＲ（例えば、変異型Ｃ９ＯＲＦ７２及び／又は凝集型Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲなど）の存在が、前駆症状的、前駆的又は臨床的なＤＰＲ関連の疾患及び／障害についての暗示であり、また、ＤＰＲを有しない生理学的Ｃ９ＯＲＦ７２のレベルと比較した場合、或いは、健康なコントロール対象に由来する参照サンプル、又は、同じ対象からのコントロールサンプルと比較した場合、ＤＰＲ凝集物（具体的にはＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲ）のレベルの増大が、症状発現前、前駆的又は立証されたＤＰＲ関連の疾患及び／又は障害（例えば、ＦＴＬＤ及びＡＬＳなど）の進行についての暗示である方法が提供される。１つの実施形態において、前記方法は、本明細書中上記で定義されるように、ＤＰＲ及びＤＰＲを含有するタンパク質にそれぞれ関連づけられる障害の一群からのいずれか他の疾患又は障害を診断するために、或いはその進行をモニターするために同様に使用されることが、当業者によって理解されるであろう。
【０２７１】
上記で示されるように、本発明の抗体、及び、本発明の抗体と同じ結合特異性の分子は、インビトロだけでなく、インビボにおいても同様に使用される場合があり、ただし、この場合、診断的適用のほかに、治療的適用が同様に実行される場合がある。したがって、１つの実施形態において、本発明はまた、ヒト又は動物の身体におけるＤＰＲ（好ましくはＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲ）のインビボ検出のための組成物、或いは、治療剤及び／又は診断剤をヒト又は動物の身体においてＤＰＲ（好ましくはＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲ）に対して標的化するための組成物を調製するための、本発明の抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含むＤＰＲ結合性分子に関連する。潜在的可能性のある治療剤及び／又は診断剤が、本明細書中上記で示されるような、ＤＰＲに伴う疾患及び／又は障害の処置において有用である治療剤、並びに、潜在的可能性のある標識の非網羅的な列挙から選ばれる場合がある。インビボ画像化に関して、１つの好ましい実施形態において、本発明は、本発明の抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含む前記ＤＰＲ結合性分子を提供し、ただし、この場合、前記インビボ画像化が、シンチグラフィー、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射型断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、近赤外（ＮＩＲ）光学的画像法又は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を含む。さらなる実施形態において、本発明はまた、本発明の抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含む前記ＤＰＲ結合性分子、又は、上記で指定されるインビボ画像化方法のための組成物を調製するための前記分子を、本明細書中上記で定義されるような、対象におけるＤＰＲタンパク質に関連づけられる疾患又は障害を診断する、或いはその進行をモニターする方法における使用のために提供する。
【０２７２】
この関連において、本発明はまた、ＤＰＲ及びＤＰＲ含有タンパク質に伴う疾患及び／又は障害を診断すること、或いはその進行をモニターすることにおいて有用なキットであって、本発明の少なくとも１つの抗体、又はそれらの抗体のいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有するＤＰＲ結合性分子、本明細書中上記でそれぞれ定義されるようなポリヌクレオチド、ベクター又は細胞及び／又はペプチドを、必要な場合には使用のための試薬及び／又は説明書と一緒に含むキットに関連する。
【０２７３】
上記開示は本発明を概して記載する。別途言及されない限り、本明細書中で使用されるような用語には、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７年、２０００年改訂及び２００３年再版、ＩＳＢＮ  ０  １９  ８５０６７３  ２）において提供されるような定義が与えられる。いくつかの文書が本明細書の本文を通して引用される。完全な書誌的引用が請求項の直前において明細書の最後に見出される場合がある。すべての引用された参考文献（本出願明細書を通して引用されるような文献参照物、発行された特許、公開された特許出願、及び、製造者の仕様書、説明書などを含む）の内容が、本明細書により明示的に、参照によって組み込まれる；しかしながら、どのような文書であれ、引用される文書は実際に本発明に関して先行技術であることを何ら認めるものではない。
【０２７４】
より完全な理解を、例示のみの目的のために本明細書中に提供され、かつ、本発明の範囲を限定するために意図されない下記の具体的な実施例を参照することによって得ることができる。
【実施例】
【０２７５】
実施例１：抗ジペプチドリピート（ＤＰＲ）タンパク質抗体の単離及び特定
ジペプチドリピート（ＤＰＲ）タンパク質、そのフラグメント、Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲ及び／又はそのフラグメントを標的とする様々なヒト由来抗体を、国際特許出願公開ＷＯ２００８／０８１００８（その開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載される方法を改変とともに利用して特定した。具体的には、様々なジペプチドリピートタンパク質がＳｃｈａｆｅｒ−Ｎ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、デンマーク）によって合成され、精製された：ＧＡ１５：Ｈ−ＣＨＨＨＨＨＨ（ＧＡ）１５−ＯＨ；ＧＰ１５：Ｈ−Ｃ（ＧＰ）１５−ＯＨ；ＧＲ１５：Ｈ−Ｃ（ＧＲ）１５−ＯＨ；（ＰＡ）１５：Ｈ−（Ｃ（ＰＡ）１５−ＯＨ；（ＰＲ）１５：Ｈ−Ｃ（ＰＲ）１５−ＯＨ。その後、ジペプチドリピートタンパク質を、二官能性リンカー（ＳＭＣＣ）を介してウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にコンジュゲート化した。続いて、直接的ＥＬＩＳＡを、非コンジュゲート化ジペプチドリピートタンパク質又はＢＳＡコンジュゲート化ジペプチドリピートタンパク質のどちらかにより、或いはＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）により被覆緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．４２）において５μｇ／ｍｌの濃度で被覆される９６ウエルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用して行った。非特異的結合部位を室温で１時間、２％のＢＳＡを含有するＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）によりブロッキング処理した。Ｂ細胞馴化培地をメモリーＢ細胞培養プレートからＥＬＩＳＡプレートに移し、ＲＴで１時間インキュベーションし、その後、ＨＲＰとコンジュゲート化されたロバ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、米国）、及び、ＨＲＰとコンジュゲート化されたヤギ抗ヒトＩｇＡ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、米国）とインキュベーションした。結合を標準的な比色アッセイでのＨＲＰ活性の測定によって求めた。培地に含有される抗体の結合が、ＢＳＡに対してではなく、ＤＰＲに対して示されたＢ細胞培養物のみを、抗体クローニングに供した。
【０２７６】
実施例２：抗体配列の決定
上記で特定された抗ＤＰＲ抗体の可変領域のアミノ酸配列をそれらのｍＲＮＡ配列に基づいて決定した（図１Ａ〜図１Ｊを参照のこと）。簡単に記載すると、選択された非不死化メモリーＢ細胞培養物の生存Ｂ細胞を集めた。続いて、選択された抗ＤＰＲ抗体を産生する細胞からのｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに転換し、抗体の可変領域をコードする配列をＰＣＲによって増幅し、プラスミドベクターにクローン化し、配列決定した。簡単に記載すると、ヒト免疫グロブリン生殖系列レパートリーのすべての配列ファミリーを表すプライマーの組合せを、リーダーペプチド、Ｖセグメント及びＪセグメントの増幅のために使用した。１回目の増幅を、５’末端におけるリーダーペプチド特異的プライマーと、３’末端における定常領域特異的プライマーとを使用して行った（Ｓｍｉｔｈ他、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．４（２００９）、３７２〜３８４）。重鎖及びカッパ軽鎖のために、２回目の増幅を、５’末端におけるＶセグメント特異的プライマーと、３’末端におけるＪセグメント特異的プライマーとを使用して行った。ラムダ軽鎖のために、２回目の増幅を、５’末端におけるＶセグメント特異的プライマーと、３’末端におけるＣ領域特異的プライマーとを使用して行った（Ｍａｒｋｓ他、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２（１９９１）、５８１〜５９７；ｄｅ  Ｈａａｒｄ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６（１９９９）、１８２１８〜１８２３０）。
【０２７７】
所望の特異性を有する抗体クローンの特定を、完全な抗体を組換え発現させたときにＥＬＩＳＡでの再スクリーニングによって行った。完全なヒトＩｇＧ１抗体の組換え発現が、可変重鎖配列及び可変軽鎖配列を、可変領域配列を５’末端において、リーダーペプチドをコードする配列により補い、かつ、３’末端において、適切な定常ドメインをコードする配列により補う発現ベクターに「正しい読み枠で」挿入したときに達成された。その目的を達成するために、プライマーは、抗体発現ベクターへの可変重鎖配列及び可変軽鎖配列のクローニングを容易にするために設計される制限部位を含有した。重鎖免疫グロブリンを、免疫グロブリン重鎖のＲＴ−ＰＣＲ産物を、シグナルペプチドとヒト又はマウスの免疫グロブリンガンマ１の定常ドメインとを有する重鎖発現ベクターに読み枠を合わせて挿入することによって発現させた。カッパ軽鎖免疫グロブリンを、カッパ軽鎖のＲＴ−ＰＣＲ産物を、シグナルペプチドとヒトカッパ軽鎖免疫グロブリンの定常ドメインとを提供する軽鎖発現ベクターに読み枠を合わせて挿入することによって発現させた。ラムダ軽鎖免疫グロブリンを、ラムダ軽鎖のＲＴ−ＰＣＲ産物を、シグナルペプチドとヒト又はマウスのラムダ軽鎖免疫グロブリンの定常ドメインとを提供するラムダ軽鎖発現ベクターに読み枠を合わせて挿入することによって発現させた。
【０２７８】
機能的な組換えモノクローナル抗体を、Ｉｇ重鎖発現ベクターと、カッパＩｇ軽鎖発現ベクター又はラムダＩｇ軽鎖発現ベクターとをＨＥＫ２９３細胞又はＣＨＯ細胞（或いは、どのようなレシピエント細胞株であれ、ヒト起源又はマウス起源の他の適切なレシピエント細胞株）に共トランスフェクションしたときに得た。組換えヒトモノクローナル抗体を続いて、標準的なプロテインＡカラム精製を使用して馴化培地から精製した。組換えヒトモノクローナル抗体を、一過性トランスフェクション細胞又は安定的トランスフェクション細胞のどちらかを使用して無限の量で製造することができる。組換えヒトモノクローナル抗体を産生する細胞株を、Ｉｇ発現ベクターをそのまま使用することによって、又は、Ｉｇ可変領域を異なる発現ベクターに再クローニングすることによってそのどちらでも樹立することができる。誘導体、例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２およびｓｃＦｖなどもまた、これらのＩｇ可変領域から作製することができる。
【０２７９】
フレームワーク領域及び相補性決定領域をデータベース（例えば、Ａｂｙｓｉｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｙｓｉｓ／）など）において利用可能な参照抗体配列との比較によって決定し、これらの領域に、Ｋａｂａｔ番号表記スキーム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／）を使用して注釈を付けた。
【０２８０】
実施例３：Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質のＥＬＩＳＡでのＥＣ５０分析
組換えヒト由来Ｃ９ｏｒｆ７２抗体のＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、ＮＩ−３０８．４５Ｃ２、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１、ＮＩ−３０８．５Ｇ２、ＮＩ−３０８．４６Ｅ９、ＮＩ−３０８．６Ｂ１１、ＮＩ−３０８．４６Ｆ８、ＮＩ−３０８．４Ｍ１、ＮＩ−３０８．１２Ａ３及びＮＩ−３０８．１６Ｃ１０の、Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質についての結合特異性及び最大半量有効濃度（ＥＣ５０）を求めるために、ＥＬＩＳＡでのＥＣ５０分析を行った。簡単に記載すると、様々なジペプチドリピートタンパク質がＳｃｈａｆｅｒ−Ｎ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、デンマーク）によって合成され、精製された：（ＧＡ）１５：Ｈ−ＣＨＨＨＨＨＨ（ＧＡ）１５−ＯＨ；（ＧＰ）１５：Ｈ−Ｃ（ＧＰ）１５−ＯＨ；（ＧＲ）１５：Ｈ−Ｃ（ＧＲ）１５−ＯＨ；（ＰＡ）１５：Ｈ−Ｃ（ＰＡ）１５−ＯＨ；（ＰＲ）１５：Ｈ−Ｃ（ＰＲ）１５−ＯＨ。９６ウエルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）をジペプチドリピートタンパク質ペプチドにより被覆緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．４２）において５μｇ／ｍｌ又は２０μｇ／ｍｌのどちらかの濃度で被覆した。非特異的結合部位を室温で１時間、２％のＢＳＡを含有するＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）によりブロッキング処理した。一次抗体を示された濃度に希釈し、室温で１時間インキュベーションし、その後、ＨＲＰとコンジュゲート化されたロバ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、米国）とインキュベーションした。結合を標準的な比色アッセイでのＨＲＰ活性の測定によって求めた。ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエア（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、米国）を使用する非線形回帰によって推定した。Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質ペプチドの（ＧＡ）１５、（ＧＰ）１５、（ＧＲ）１５、（ＰＡ）１５及び（ＰＲ）１５についてのヒト由来抗体の結合特異性及びＥＣ５０を間接的ＥＬＩＳＡによって求めた。抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、抗体ＮＩ−３０８．４５Ｃ２及び抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７は、ポリＧＡ  ＤＰＲタンパク質をもっぱら認識し、結合親和性がサブナノモル濃度又は低ナノモル濃度の範囲であった（図２Ａ〜図２Ｅ）。抗体ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１は、ポリＰＲ  ＤＰＲタンパク質に、低ナノモル濃度のＥＣ５０により特異的に結合し（図２Ａ及び図２Ｆ）、これに対して、抗体ＮＩ−３０８．１６Ｃ１０は、ＤＰＲタンパク質のポリＰＲを低ナノモル濃度のＥＣ５０により優先的に認識し、この抗体はまた、より低い親和性により、ポリＧＡ  ＤＰＲタンパク質にも結合した（図２Ａ及び図２Ｍ）。抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２、抗体ＮＩ−３０８．１２Ａ３及び抗体ＮＩ−３０８．４６Ｅ９は、ＤＰＲタンパク質のポリＧＰを、サブナノモル濃度及び低ナノモル濃度のＥＣ５０によりそれぞれ優先的に認識し、これらの抗体はまた、より低い親和性により、ポリＧＡ  ＤＰＲに結合した（図２Ａ、図２Ｇ、図２Ｌ及び図２Ｈ）。抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１は多数のＤＰＲタンパク質に対する結合を示し、ポリＧＲ、ポリＧＡ及びポリＰＲを標的とし、最も大きい親和性が、ポリＧＲ  ＤＰＲタンパク質についてであった（図２Ａ及び図２Ｉ）。類似する結合パターンが、より低い親和性ではあるが、ＮＩ−３０８．４６Ｆ８について認められた（図２Ａ及び図２Ｊ）。抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１はＤＰＲタンパク質のポリＰＡをサブナノモル濃度のＥＣ５０により優先的に認識し、この抗体はまた、より低い親和性により、ポリＧＡ  ＤＰＲタンパク質に結合した（図２Ａ及び図２Ｋ）。結論として、ＲＴＭ（商標）スクリーニングによる健康な高齢ヒトドナー集団のハイスループット免疫レパートリー分析により、Ｃ９ｏｒｆ７２ヘキサヌクレオチド伸長に伴うＤＰＲを大きい親和性で標的とするヒトモノクローナル抗体の成功したクローニング及び組換え産生がもたらされる。これらの組換えヒト抗体は、ただ１つのＤＰＲについて選択的であるか、又は、多数のＤＰＲ種を標的とするかのどちらかであり、これはもしかすると、リピート部における普通の共通したアミノ酸のためであるかもしれない。
【０２８１】
実施例４：ＢＳＡとカップリングされたＤＰＲペプチドに対する結合親和性
組換えヒト由来Ｃ９ｏｒｆ７２抗体のＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、ＮＩ−３０８．４５Ｃ２、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１、ＮＩ−３０８．５Ｇ２、ＮＩ−３０８．４６Ｅ９、ＮＩ−３０８．６Ｂ１１、ＮＩ−３０８．４６Ｆ８、ＮＩ−３０８．４Ｍ１、ＮＩ−３０８．１２Ａ３及びＮＩ−３０８．１６Ｃ１０の、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にカップリングされたＣ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質についての結合特異性及び最大半量有効濃度（ＥＣ５０）を求めるために、ＥＬＩＳＡでのＥＣ５０分析を行った。簡単に記載すると、様々なジペプチドリピートタンパク質がＳｃｈａｆｅｒ−Ｎ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、デンマーク）によって合成され、精製された：（ＧＡ）１５：Ｈ−ＣＨＨＨＨＨＨ（ＧＡ）１５−ＯＨ；（ＧＰ）１５：Ｈ−Ｃ（ＧＰ）１５−ＯＨ；（ＧＲ）１５：Ｈ−Ｃ（ＧＲ）１５−ＯＨ；（ＰＡ）１５：Ｈ−Ｃ（ＰＡ）１５−ＯＨ；（ＰＲ）１５：Ｈ−Ｃ（ＰＲ）１５−ＯＨ。その後、ＤＰＲタンパク質ペプチドを、二官能性リンカー（ＳＭＣＣ）を介してウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にコンジュゲート化した。９６ウエルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）をＢＳＡカップリング型又はＢＳＡ非カップリング型のジペプチドリピートタンパク質ペプチドにより被覆緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．４２）において５μｇ／ｍｌ又は２０μｇ／ｍｌのどちらかの濃度で被覆した。非特異的結合部位を室温で１時間、２％のＢＳＡを含有するＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）によりブロッキング処理した。一次抗体を示された濃度に希釈し、室温で１時間インキュベーションし、その後、ＨＲＰとコンジュゲート化されたロバ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、米国）とインキュベーションした。結合を標準的な比色アッセイでのＨＲＰ活性の測定によって求めた。ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエア（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、米国）を使用する非線形回帰によって推定した。同程度の結合親和性が、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、ＮＩ−３０８．５Ｇ２、ＮＩ−３０８．４６Ｅ９、ＮＩ−３０８．４Ｍ１及びＮＩ−３０８．１２Ａ３の各抗体についてはＢＳＡカップリング型ＤＰＲ及び非カップリング型ＤＰＲについて明らかにされた（図３Ａ〜図３Ｄ、図３Ｇ、図３Ｈ、図３Ｋ、図３Ｌ）。抗体ＮＩ−３０８．４５Ｃ２、抗体ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１及び抗体ＮＩ−３０８．１６Ｃ１０は、低下した親和性をそれぞれのＢＳＡカップリング型ＤＰＲペプチドについて示し（図３Ａ、図３Ｅ、図３Ｆ及び図３Ｍ）、一方で、抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１及び抗体ＮＩ−３０８．４６Ｆ８はこれらの実験条件のもとではＢＳＡカップリング型ＤＰＲには結合しなかった（図３Ａ、図３Ｉ及び図３Ｊ）。結論として、上記ヒトＤＰＲ抗体のほとんどが、ＢＳＡキャリアタンパク質にカップリングされたＤＰＲペプチドを、疎水性被覆されたペプチドに対する同程度の親和性で認識することができる。個々の候補物について認められる結合親和性がより低いことは、ＢＳＡに対する個々のＤＰＲペプチドの不良なカップリング効率、ＢＳＡとカップリングしたときの異なる立体配座、又は、キャリアに対する部位特異的な化学的カップリングの後ではエピトープが立体的に接近できないことのためであり得るかもしれない。
【０２８２】
実施例５：無関係なアミロイド原性タンパク質に対する結合特異性分析
ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、ＮＩ−３０８．４５Ｃ２、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１、ＮＩ−３０８．５Ｇ２、ＮＩ−３０８．４６Ｅ９、ＮＩ−３０８．６Ｂ１１及びＮＩ−３０８．４６Ｆ８の各組換え抗体の標的特異性を明らかにするために、間接的ＥＬＩＳＡを下記のように行った。９６ウエルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を異なる標的タンパク質により被覆緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．４２）において１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの濃度で被覆した。非特異的結合部位をＲＴで１時間、２％のＢＳＡを含有するＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）によりブロッキング処理した。ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、ＮＩ−３０８．４５Ｃ２、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１、ＮＩ−３０８．５Ｇ２、ＮＩ−３０８．４６Ｅ９、ＮＩ−３０８．６Ｂ１１及びＮＩ−３０８．４６Ｆ８の各抗体を２０ｎＭの濃度で希釈し、ＲＴで１時間インキュベーションした。結合を、ＨＲＰとコンジュゲート化されるロバ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、米国）を使用して明らかにし、その後、ＨＲＰ活性の測定を標準的な比色アッセイで行った。標的タンパク質についてのシグナルを、メジアンを超える増加倍数で計算した。ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、ＮＩ−３０８．４５Ｃ２、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１、ＮＩ−３０８．５Ｇ２、ＮＩ−３０８．４６Ｅ９、ＮＩ−３０８．６Ｂ１１及びＮＩ−３０８．４６Ｆ８の各ヒト由来抗体の標的特異性を間接的ＥＬＩＳＡによって明らかにすることにより、Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質及び６つの無関係なアミロイド形成タンパク質（ＰＨＦタウ、タウ、ＴＤＰ−４３、ＴＴＲ、ｆｌＡＰＰ及びＨＴＴ）に対する抗体結合を評価した。図４に示されるように、ヒト由来抗体のＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、ＮＩ−３０８．４５Ｃ２、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１、ＮＩ−３０８．５Ｇ２、ＮＩ−３０８．６Ｂ１１及びＮＩ−３０８．４６Ｆ８により、ＤＰＲペプチドに対するそれらの大きい結合特異性が、無関係なアミロイド原性タンパク質に対する交差反応性をほとんどの候補体については伴うことなく、又は最小限に伴って明らかにされた（図４Ａ〜図４Ｆ、図４Ｈ及び図４Ｉ）。抗体ＮＩ−３０８．４６Ｅ９については、上昇した標的外シグナルがいくつかの分析物について検出された（図４Ｇ）。
【０２８３】
実施例６：Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質のウエスタンブロット分析
組換えヒト由来Ｃ９ｏｒｆ７２抗体のＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、ＮＩ−３０８．４５Ｃ２、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１、ＮＩ−３０８．５Ｇ２、ＮＩ−３０８．４６Ｅ９、ＮＩ−３０８．６Ｂ１１、ＮＩ−３０８．４６Ｆ８、ＮＩ−３０８．４Ｍ１、ＮＩ−３０８．１２Ａ３及びＮＩ−３０８．１６Ｃ１０の、Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質についての結合特異性を明らかにするために、免疫ブロット分析を行った。様々なジペプチドリピートタンパク質ペプチドがＳｃｈａｆｅｒ−Ｎ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、デンマーク）によって合成され、精製された：（ＧＡ）１５：Ｈ−ＣＨＨＨＨＨＨ（ＧＡ）１５−ＯＨ；（ＧＰ）１５：Ｈ−Ｃ（ＧＰ）１５−ＯＨ；（ＧＲ）１５：Ｈ−Ｃ（ＧＲ）１５−ＯＨ；（ＰＡ）１５：Ｈ−Ｃ（ＰＡ）１５−ＯＨ；（ＰＲ）１５：Ｈ−Ｃ（ＰＲ）１５−ＯＨ。その後、ＤＰＲタンパク質ペプチドを、二官能性リンカー（ＳＭＣＣ）を介してウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にコンジュゲート化した。簡単に記載すると、ＢＳＡとコンジュゲート化されたジペプチドリピートタンパク質ペプチド（０．５μｇ）を、酸化防止剤が補われるＮｏｖｅｘ（登録商標）ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ  ＳＤＳ泳動緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｂ．Ｖ．、Ｚｕｇ、スイス）を使用するグラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４−１２％；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｂ．Ｖ．、Ｚｕｇ、スイス）によって分離した。その後、分離されたタンパク質をＮｏｖｅｘ（登録商標）ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）転写緩衝液２ｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｂ．Ｖ．、Ｚｕｇ、スイス）の使用によってメタノール活性化ＰＶＤＦメンブラン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（登録商標）−Ｐ転写メンブラン、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｉｅ、Ｓｃｈａｆｆｈａｕｓｅｎ、スイス）にエレクトロブロットした（Ｎｏｖｅｘ（登録商標）セミドライブロッター、１ｈ、２５Ｖ）。非特異的結合部位を４℃で一晩（又は代替において室温で１時間）、２％のＢＳＡを含有するＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０（ＰＢＳＴ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）によりブロッキング処理した。ＮＩ−３０８抗体を１０ｎＭ又は１００ｎＭのどちらかの濃度で希釈し、室温で１時間（又は代替において４℃で１晩）インキュベーションした。メンブランをＰＢＳＴにおいて３回、ＲＴで１５分間洗浄し、その後、ＨＲＰとコンジュゲート化されたロバ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的抗体（１：２００００又は１：１００００の希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、米国）と室温で１時間インキュベーションした。抗体結合を、ＥＣＬ及びＩｍａｇｅＱｕａｎｔ３５０検出（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｏｔｅｌｆｉｎｇｅｎ、スイス）を使用してメンブラン発色によって明らかにした。
【０２８４】
ＢＳＡとカップリングされたＣ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質（（ＧＡ）１５、（ＧＰ）１５、（ＧＲ）１５、（ＰＡ）１５及び（ＰＲ）１５）に対するヒト由来抗体の結合特異性をウエスタンブロット分析によって明らかにした。抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１及び抗体ＮＩ−３０８．４５Ｃ２はＤＰＲタンパク質のポリＧＡをもっぱら認識した（図５Ａ〜図５Ｄ）。抗体ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１及び抗体ＮＩ−３０８．１６Ｃ１０は、ただ１つのＤＰＲタンパク質のポリＰＲに特異的に結合し（図５Ｅ及び図５Ｊ）、抗体ＮＩ−３０８．１６Ｃ１０はさらに、ポリＧＡ  ＤＰＲを認識した（図５Ｊ）。抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２、抗体ＮＩ−３０８．１２Ａ３及び抗体ＮＩ−３０８．４６Ｅ９は、ポリＧＰを特異的に標的とし（図５Ｆ、図５Ｇ及び図５Ｉ）、抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２はさらに、ポリＧＡ  ＤＰＲを認識した（図５Ｆ）。抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１はＤＰＲタンパク質のポリＰＡをもっぱら認識した（図５Ｈ）。抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１及び抗体ＮＩ−３０８．４６Ｆ８については、結合が、選択された実験条件のもとではウエスタンブロットによってＢＳＡカップリング型ＤＰＲに対して検出されなかった（データは示されず）。結論として、ほとんどのヒト由来Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲ抗体が、ＢＳＡとカップリングされたＤＰＲペプチドを、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングの後で認識することができる。認められた結合パターンは、ＥＬＩＳＡ分析によって得られる結果と一致している。
【０２８５】
実施例７：免疫沈降によるＣ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲの溶液中での結合分析
組換えヒト由来Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲ抗体のＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、ＮＩ−３０８．４５Ｃ２、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１及びＮＩ−３０８．６Ｂ１１の溶液中での結合を免疫沈降によって評価すること。簡単に記載すると、様々なジペプチドリピートタンパク質がＳｃｈａｆｅｒ−Ｎ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、デンマーク）によって合成され、精製された：（ＧＡ）１５：Ｈ−ＣＨＨＨＨＨＨ（ＧＡ）１５−ＯＨ；（ＧＰ）１５：Ｈ−Ｃ（ＧＰ）１５−ＯＨ；（ＧＲ）１５：Ｈ−Ｃ（ＧＲ）１５−ＯＨ；（ＰＡ）１５：Ｈ−Ｃ（ＰＡ）１５−ＯＨ；（ＰＲ）１５：Ｈ−Ｃ（ＰＲ）１５−ＯＨ。５マイクログラムのＢＳＡ非カップリング型ジペプチドリピートタンパク質ペプチドを５００μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４；Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｂ．Ｖ．、Ｚｕｇ、スイス）において１０μｇ／ｍｌの最終濃度に希釈した。ＤＰＲタンパク質ペプチドのサンプルを、回転プラットフォームでの４℃における３０分間のインキュベーションによって２５μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）プロテインＡ（Ｎｏｖｅｘ（登録商標）；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｂ．Ｖ．、Ｚｕｇ、スイス）による事前の吸着に供した。１μｇ又は１０μｇの選択された抗体を事前吸着サンプルに加え、回転プラットフォームにおいて４℃で一晩インキュベーションした。免疫複合体を、２５μｌのプロテインＡ−Ｄｙｎａｂｅａｄｓの添加及び回転プラットフォームでの４℃における２時間のインキュベーションによって捕獲した。ビーズを製造者の説明書に従って洗浄し、サンプル緩衝液に懸濁し、９５℃で３分間加熱した。ウエスタンブロット分析のために、免疫複合体及び非カップリング型ＤＰＲタンパク質ペプチド（５００ｎｇ）を、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ  ＳＤＳ泳動緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｂ．Ｖ．、Ｚｕｇ、スイス）を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）１２％；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｂ．Ｖ．、Ｚｕｇ、スイス）によって非還元条件下で分離した。分離されたタンパク質を、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）転写緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｂ．Ｖ．、Ｚｕｇ、スイス）においてメタノール活性化ＰＶＤＦメンブラン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（登録商標）−Ｐ転写メンブラン、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｉｅ、Ｓｃｈａｆｆｈａｕｓｅｎ、スイス）にエレクトロブロットした（Ｎｏｖｅｘ（登録商標）セミドライブロッター、１ｈ、２５Ｖ）。非特異的結合部位を４℃で一晩、２％のＢＳＡを含有するＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０（ＰＢＳＴ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）によりブロッキング処理した。ＤＰＲタンパク質が下記の検出抗体との室温での１時間のインキュベーションによって明らかにされた：（ＧＡ）１５：ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、１０ｎＭ；（ＰＲ）１５：ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１、１００ｎＭ；（ＧＲ）１５：抗Ｃ９ＯＲＦ７２／Ｃ９ＲＡＮＴクローン５Ａ５、１：５０００の希釈（ＭＡＢＮ７７８、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｉｅ、Ｓｃｈａｆｆｈａｕｓｅｎ、スイス）。メンブランをＰＢＳＴで３回、ＲＴで１５分間洗浄し、ＨＲＰとコンジュゲート化されたロバ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的抗体（１：１００００の希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、米国）、又は、ＨＲＰとコンジュゲート化されたマウス抗ラットカッパ抗体（１：１００００の希釈、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、米国）のどちらかと室温で１時間インキュベーションした。メンブランを、ＥＣＬ及びＩｍａｇｅＱｕａｎｔ３５０検出（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｏｔｅｌｆｉｎｇｅｎ、スイス）を使用して発色させた。抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、抗体ＮＩ−３０８．４５Ｃ２及び抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１により、ポリＧＡ  ＤＰＲタンパク質ペプチドが溶液中で捕獲され（図６Ａ）、これに対して、抗体ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１及び抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１により、ポリＰＲ及びポリＧＲがそれぞれ沈殿させられた（図６Ｂ及び図６Ｃ）。ＮＩ−４３Ａ１１アイソタイプコントロール抗体は、試験されたＤＰＲタンパク質ペプチドのどれも沈殿させなかった（図６Ａ〜図６Ｃ）。結論として、上記ヒト由来Ｃ９ｏｒｆ７２抗体は溶液中においてＤＰＲタンパク質ペプチドと結合し、これらを沈殿させることができる。
【０２８６】
実施例８：リピート長さ依存的な結合の間接的ＥＬＩＳＡによる特徴づけ
組換えヒト由来抗体のＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、ＮＩ−３０８．４５Ｃ２、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１、ＮＩ−３０８．５Ｇ２、ＮＩ−３０８．４６Ｅ９、ＮＩ−３０８．６Ｂ１１及びＮＩ−３０２．４Ｍ１の、異なるリピートサイズのＣ９ｏｒｆ７２  ＤＲＰに対する結合親和性を明らかにするために、ＥＬＩＳＡでのＥＣ５０分析を行った。簡単に記載すると、様々なジペプチドリピートタンパク質がＳｃｈａｆｅｒ−Ｎ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、デンマーク）によって合成され、精製された：ＧＡ２０：Ｈ−（ＧＡ）２０ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＡ１０：Ｈ−（ＧＡ）１０ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＡ６：Ｈ−（ＧＡ）６ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＡ５：Ｈ−（ＧＡ）５ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＡ４：Ｈ−（ＧＡ）４ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＡ３：Ｈ−（ＧＡ）３ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＡ２：Ｈ−（ＧＡ）２ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＰ２０：Ｈ−（ＧＰ）２０ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＰ１０：Ｈ−（ＧＰ）１０ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＰ６：Ｈ−（ＧＰ）６ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＰ５：Ｈ−（ＧＰ）５ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＰ４：Ｈ−（ＧＰ）４ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＰ３：Ｈ−（ＧＰ）３ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＰ２：Ｈ−（ＧＰ）２ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２。ＧＲ２０：Ｈ−（ＧＲ）２０ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＲ１０：Ｈ−（ＧＲ）１０ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＲ６：Ｈ−（ＧＲ）６ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＲ５：Ｈ−（ＧＲ）５ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＲ４：Ｈ−（ＧＲ）４ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＲ３：Ｈ−（ＧＲ）３ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＲ２：Ｈ−（ＧＲ）２ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＰＡ２０：Ｈ−（ＰＡ）２０ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＰＡ１０：Ｈ−（ＰＡ）１０ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＰＡ６：Ｈ−（ＰＡ）６ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＰＡ５：Ｈ−（ＰＡ）５ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＰＡ４：Ｈ−（ＰＡ）４ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＰＡ３：Ｈ−（ＰＡ）３ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＰＡ２：Ｈ−（ＰＡ）２ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＰＲ２０：Ｈ−（ＰＲ）２０ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＰＲ１０：Ｈ−（ＰＲ）１０ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＰＲ６：Ｈ−（ＰＲ）６ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＰＲ５：Ｈ−（ＰＲ）５ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＰＲ４：Ｈ−（ＰＲ）４ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＰＲ３：Ｈ−（ＰＲ）３ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＰＲ２：Ｈ−（ＰＲ）２ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２。９６ウエルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）をジペプチドリピートタンパク質ペプチドにより被覆緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．４２）において５０μｇ／ｍｌの濃度で被覆した。非特異的結合部位を室温で１時間、２％のＢＳＡを含有するＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）によりブロッキング処理した。一次抗体を示された濃度に希釈し、室温で１時間インキュベーションし、その後、ＨＲＰとコンジュゲート化されたロバ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ  Ｇ���ｏｖｅ、米国）とインキュベーションした。結合を標準的な比色アッセイでのＨＲＰ活性の測定によって求めた。ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエア（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、米国）を使用する非線形回帰によって推定した。
【０２８７】
リピート長さが異なるＣ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質についての選択されたＮＩ−３０８抗体の結合親和性を、疎水性ペプチド被覆の後、間接的ＥＬＩＳＡによって明らかにした。抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７及び抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１は、１００ｎＭ超のＥＣ５０での最初の検出可能な低親和性結合のためには最低でも５回のＧＡジペプチドリピートを必要とし、これに対して、抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７及び抗体ＮＩ−３０８．４５Ｃ２は、少なくとも６回のＧＡリピートを必要とした（図７Ａ、図７Ｆ〜図７Ｉ）。高親和性結合が、１０回又は２０回の（ＧＡ）リピートを有するポリＧＡ  ＤＰＲについて検出され、このことがサブナノモル濃度又は低ナノモル濃度の範囲でのＥＣ５０において反映された（図７Ａ、図７Ｃ〜図７Ｉ）。抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２及び抗体ＮＩ−３０８．４６Ｅ９は、最低でも５回及び１０回のＧＰリピートをそれぞれ必要とした（図７Ｂ、図７Ｊ及び図７Ｎ）。後者の２つの抗体についての高親和性結合が、１０回及び２０回のリピートを有するポリＧＰ  ＤＰＲタンパク質ペプチドについては伸長したリピート長さにおいてのみ検出された。さらには、抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２は、１００ｎＭ超のＥＣ５０での最初の検出可能な低親和性結合のためには最低でも６回のＧＡジペプチドリピートを必要とした（図７Ａ及び図７Ｋ）。高親和性結合が、１０回又は２０回の（ＧＡ）リピートを有するポリＧＡ  ＤＰＲについて検出され、このことが低ナノモル濃度の範囲でのＥＣ５０において反映された（図７Ａ及び図７Ｋ）。抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１は、最低でも３回のＧＲリピートを必要とした（図７Ｃ及び図７Ｌ）。この抗体についての高親和性結合が、少なくとも５回のＧＲジペプチドリピートを有するポリＧＲ  ＤＰＲタンパク質ペプチドについて検出された（図７Ｃ及び図７Ｌ）。加えて、抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１は、１００ｎＭ超のＥＣ５０での最初の検出可能な低親和性結合のためには最低でも６回のＧＡジペプチドリピートを必要とした（図７Ａ及び図７Ｍ）。高親和性結合が、１０回又は２０回の（ＧＡ）リピートを有するポリＧＡ  ＤＰＲについて検出され、このことが低ナノモル濃度の範囲でのＥＣ５０において反映された（図７Ａ及び図７Ｍ）。抗体ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１は、１００ｎＭ超のＥＣ５０での最初の検出可能な低親和性結合のためには、又は、２桁のナノモル濃度での結合親和性においてそれぞれ、最低でも６回のＰＲジペプチドリピートを必要とし（図７Ｄ及び図７Ｏ）、これに対して、抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１は、少なくとも５回のＰＡリピートを必要とした（図７Ｅ及び図７Ｐ）。後者の２つの抗体についての高親和性結合が、１０回又は２０回のリピートを有するポリＰＲ  ＤＰＲ及びポリＰＡ  ＤＰＲについては伸長したリピート長さについてのみそれぞれ検出され、このことが低ナノモル濃度又はサブナノモル濃度の範囲でのＥＣ５０において反映された（図７Ｄ、図７Ｅ、図７Ｏ及び図７Ｐ）。結論として、ヒト由来Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲ抗体は、短いリピートサイズに対する結合を伴うことなく、かつ、伸長したジペプチドリピートに対する優先的な高親和性結合を伴って、ＤＰＲに対するリピート長さ依存的な結合を示す。
【０２８８】
実施例９：リピート長さ依存的な結合のサンドイッチＥＬＩＳＡによる特徴づけ
組換えヒト由来抗体のＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．２８Ｇ１、ＮＩ−３０８．１８Ｆ７及びＮＩ−３０８．５Ｇ２の、異なるリピートサイズのＣ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質に対する結合親和性を明らかにすること。簡単に記載すると、様々なＨｉｓタグ型ジペプチドリピートタンパク質ペプチドがＳｃｈａｆｅｒ−Ｎ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、デンマーク）によって合成され、精製された：ＧＡ２０：Ｈ−（ＧＡ）２０ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＡ１０：Ｈ−（ＧＡ）１０ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＡ６：Ｈ−（ＧＡ）６ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＡ５：Ｈ−（ＧＡ）５ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＡ４：Ｈ−（ＧＡ）４ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＡ３：Ｈ−（ＧＡ）３ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＡ２：Ｈ−（ＧＡ）２ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＰ２０：Ｈ−（ＧＰ）２０ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＰ１０：Ｈ−（ＧＰ）１０ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＰ６：Ｈ−（ＧＰ）６ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＰ５：Ｈ−（ＧＰ）５ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＰ４：Ｈ−（ＧＰ）４ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＰ３：Ｈ−（ＧＰ）３ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２；ＧＰ２：Ｈ−（ＧＰ）２ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２。９６ウエルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）を、モノクローナルマウス抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｅｕｒｏｐｅ／Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｓａｉｎｔ−Ｇｅｒｍａｉｎ−ｅｎ−Ｌａｙｅ、フランス）により被覆緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．４２）において１０μｇ／ｍｌの濃度で、４℃で一晩被覆した。非特異的結合部位を室温で１時間、２％のＢＳＡを含有するＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）によりブロッキング処理した。洗浄工程の後、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）における１μＭ又は５μＭのどちらかの等しい濃度でのＨｉｓタグ化Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質ペプチドを、室温での１時間にわたる抗Ｈｉｓタグ抗体による標的捕獲のために加えた。さらなる洗浄工程の後、ＮＩ−３０８抗体を示された濃度に、２％のＢＳＡを含有するＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）において希釈し、室温で１時間インキュベーションした。ＤＰＲタンパク質ペプチドに対する抗体結合を、ＨＲＰとコンジュゲート化されたロバ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的抗体（１：５０００の希釈；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、米国）によってＲＴで１時間、検出した。結合を標準的な比色アッセイでのＨＲＰ活性の測定によって求めた。ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエア（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、米国）を使用する非線形回帰によって推定した。リピート長さが異なるＣ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質についての選択されたＮＩ−３０８抗体の結合親和性を、ＤＰＲタンパク質のＨｉｓタグ捕捉の後、サンドイッチＥＬＩＳＡによって明らかにした。抗体ＮＩ−３０８．１５０７、抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１は、ポリＧＡ  ＤＰＲタンパク質ペプチドに対する溶液中での結合のためには最低でも１０回のＧＡリピートを必要とした（図８Ａ、図８Ｃ〜図８Ｅ）。抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７及び抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１についての結合親和性がサブナノモル濃度の範囲であり、（ＧＡ）１０ＤＰＲタンパク質ペプチド及び（ＧＡ）２０ＤＰＲタンパク質ペプチドの両方については同等であった（図８Ａ、図８Ｄ及び図８Ｅ）。抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７は、伸長した（ＧＡ）２０ＤＰＲタンパク質ペプチドについてのみ高親和性結合を示した（図８Ａ及び図８Ｃ）。抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２は、類似する結合依存性を、伸長したポリＧＰ  ＤＰＲリピート長さに対して示し、有意な結合が２０回のＧＰリピートからでのみ始まった（図８Ｂ及び図８Ｆ）。結論として、ヒト由来Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲ抗体は、短いリピートに対する結合を伴うことなく、かつ、伸長したジペプチドリピートに対する優先的な高親和性結合を伴って、ＤＰＲに対する顕著なリピート長さ依存的な結合を示す。伸長したＤＰＲについての認められた選択性が、疎水性被覆されたペプチド（実施例９）と比較して、抗原捕獲の後では一層より顕著であった。
【０２８９】
実施例１０：モノマー型及び凝集型のＣ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲに対する結合分析
組換えヒト由来のＮＩ−３０８．１８Ｆ７抗体及びＮＩ−３０８．１５Ｏ７抗体の、モノマー型及び凝集型のＧＡ  Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質に対する結合特異性及び最大半量有効濃度（ＥＣ５０）を明らかにすること。
【０２９０】
方法
Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質ペプチド
ジペプチドリピートタンパク質（ＧＡ）２０（Ｈ−（ＧＡ）２０ＨＨＨＨＨＨ−ＮＨ２）がＳｃｈａｆｅｒ−Ｎ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、デンマーク）によって合成され、精製された。凍結乾燥ペプチドをＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。
【０２９１】
（ＧＡ）２０ＤＰＲタンパク質ペプチドのモノマー型調製物及び原線維性凝集型調製物の作製
モノマー型ＤＰＲタンパク質調製物を得るために、（ＧＡ）２０ペプチドを炭酸塩緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．４２）に２００μｇ／ｍｌの濃度で溶解し、直ちに−８０℃で凍結した。ＤＰＲ凝集物を得るために、（ＧＡ）２０ペプチドを酢酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ  Ｃ２Ｈ３Ｏ２Ｎａ、１００ｍＭ  ＫＣｌ及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ３．０）に２００μｇ／ｍｌの濃度で溶解し、振とう（６００ｒｐｍ）を行いながら室温で７２時間インキュベーションした。ペプチド調製物を、使用されるまで−８０℃で貯蔵した。
【０２９２】
走査型電子顕微鏡法
サンプルをグロー放電により炭素被覆された銅グリッドに吸着させた。過剰なサンプルをろ紙でのブロッティングによって除いた。グリッドを２％（ｗ／ｖ）酢酸ウラニルにより１分間染色し、過剰な酢酸ウラニルを蒸留脱イオン水により洗浄した。グリッドを風乾し、１００ｋＶの加速電圧を用いるＰｈｉｌｉｐｓ社のＣＭ１００透過型電子顕微鏡を使用して画像化した。
【０２９３】
間接的ＥＬＩＳＡ
９６ウエルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）をモノマー型及び凝集型の（ＧＡ）２０ＤＰＲタンパク質ペプチド調製物により被覆緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．４２）において５μｇ／ｍｌの濃度で被覆した。非特異的結合部位を室温で１時間、２％のＢＳＡを含有するＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）によりブロッキング処理した。一次抗体を示された濃度に希釈し、室温で１時間インキュベーションし、その後、ＨＲＰとコンジュゲート化されたロバ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、米国）とインキュベーションした。結合を標準的な比色アッセイでのＨＲＰ活性の測定によって求めた。ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエア（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、米国）を使用する非線形回帰によって推定した。
【０２９４】
サンドイッチＥＬＩＳＡ
９６ウエルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）を、モノクローナルマウス抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｅｕｒｏｐｅ／Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｓａｉｎｔ−Ｇｅｒｍａｉｎ−ｅｎ−Ｌａｙｅ、フランス）により被覆緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．４２）において１０μｇ／ｍｌの濃度で、４℃で一晩被覆した。非特異的結合部位を室温で１時間、２％のＢＳＡを含有するＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）によりブロッキング処理した。洗浄工程の後、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）における５μＭの等しい濃度でのｈｉｓタグ化（ＧＡ）２０ＤＰＲタンパク質ペプチド調製物を、室温での１時間にわたる抗Ｈｉｓタグ抗体による標的捕獲のために加えた。さらなる洗浄工程の後、ＮＩ−３０８抗体を示された濃度に、２％のＢＳＡを含有するＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）において希釈し、ＲＴで１時間インキュベーションした。ＤＰＲタンパク質ペプチドに対する抗体結合を、ＨＲＰとコンジュゲート化されたロバ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的抗体（１：５０００の希釈；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、米国）によってＲＴで１時間、検出した。結合を標準的な比色アッセイでのＨＲＰ活性の測定によって求めた。ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエア（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、米国）を使用する非線形回帰によって推定した。
【０２９５】
結果として、Ｃ９ｏｒｆ７２（ＧＡ）２０ジペプチドリピートタンパク質は、透過電子顕微鏡法分析によって明らかにされるように、酸性条件下で放置したとき、アミロイド原線維に似る構造に容易に凝集した（図１０Ｂ）。対照的に、塩基性条件下では、（ＧＡ）２０ＤＰＲタンパク質ペプチドは原線維凝集物を形成せず、おそらくはモノマー状態で留まっていた（図１０Ａ）。ヒト由来抗体のＮＩ−３０８．１８Ｆ７及びＮＩ−３０８．１５Ｏ７の、モノマー型及び凝集型のＣ９ｏｒｆ７２（ＧＡ）２０ＤＰＲタンパク質ペプチド調製物についての結合特異性及び結合親和性（ＥＣ５０）を、間接的ＥＬＩＳＡ結合アッセイ及びサンドイッチＥＬＩＳＡ結合アッセイによって求めた。両方の抗体が、同程度の結合親和性により、凝集型と同様にモノマー型の（ＧＡ）２０ＤＰＲタンパク質ペプチド調製物を認識した（図９、図１１及び図１２）。ポリＧＡジペプチドリピートタンパク質は、Ｃ９ｏｒｆ７２−ＦＴＬＤにおける最も優勢なペプチド種であることが報告された（Ｍｏｒｉ他、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．２０１３）。（ＧＡ）２０ジペプチドリピートタンパク質は、塩基性条件下ではなく、酸性条件下で放置したとき、アミロイド様の原線維構造に容易に凝集した。ヒト由来抗体のＮＩ−３０８．１８Ｆ７及びＮＩ−３０８．１５Ｏ７は、２つの独立した結合アッセイにおいて、同程度の結合親和性により、凝集型と同様にモノマー型のＧＡ）２０−ＤＰＲ調製物を認識した。したがって、これらの抗体は、病理学的なＧＡ  ＤＰＲタンパク質を不溶性の立体配座と同様に可溶性の立体配座において標的化するための好適な候補物である。
【０２９６】
実施例１１：ＳＤＳ  ＰＡＧＥによる抗体完全性分析
組換えヒトＮＩ−３０８抗体の純度及び完全性を評価すること。簡単に記載すると、ヒトＮＩ−３０８抗体をＣＨＯ−Ｓ細胞の一過性トランスフェクションによって発現させ、ＦＰＬＣシステム（ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのプロテインＡ親和性精製によって精製した。ＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）での脱塩の後、抗体をＰＢＳにおいて配合した。５μｇの精製された組換えヒトＮＩ−３０８抗体を、酸化防止剤が補われるＮｏｖｅｘ（登録商標）ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ  ＳＤＳ泳動緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｂ．Ｖ．、Ｚｕｇ、スイス）を使用するグラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４−１２％；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｂ．Ｖ．、Ｚｕｇ、スイス）によって還元条件下で分離し、その後、クーマシーブルー染色（Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）  ＳａｆｅＳｔａｉｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｂ．Ｖ．、Ｚｕｇ、スイス）を行った。結果として、組換えヒトＮＩ−３０８抗体の還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、抗体の重鎖及び軽鎖に対応する２つの主要なバンドが、予想されたサイズにおいて明らかにされた。有意な混入物又はタンパク質分解生成物は検出できなかった（図１３）。
【０２９７】
実施例１２：死後のヒトＣ９ｏｒｆ７２−ＦＴＬＤ脳組織及び非神経学的コントロール脳組織におけるＤＰＲ凝集物病理に対する結合分析
ヒトＣ９ｏｒｆ７２−ＦＴＬＤ患者及び非神経学的コントールに由来する死後小脳組織におけるＣ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質に対する、抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２及び抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１の結合を評価すること。簡単に記載すると、Ｃ９ｏｒｆ７２ヘキサヌクレオチドリピート伸長を有する３名のＦＴＬＤ患者と、１名の非神経学的コントロール対象とから得られる小脳のホルマリン固定されたパラフィン包埋の５μｍ切片（ＢｉＯＢＡＮＣ  ＨＣＢ−ＩＤＩＢＡＰＳ、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、スペイン）を、１ｍＭのＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．３）における加熱処理及び１２分間のマイクロ波照射（６００Ｗ）によって抗原回復のために前処理した。内因性ペルオキシダーゼ活性の消去をメタノールにおける３％Ｈ２Ｏ２によるＲＴでの１０分間の処理によって達成した。非特異的結合部位を、ＰＢＳ／５％血清（ウマ／ヤギ）／４％ＢＳＡを用いてＲＴで１時間ブロッキング処理した。ブロッキング処理工程の後、切片を、５ｎＭの濃度でのヒト由来のＮＩ−３０８．１８Ｆ７抗体、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７抗体、ＮＩ−３０８．５Ｇ２抗体及びＮＩ−３０８．４Ｍ１抗体と、又は、１：５０００希釈でのＣ９ＲＮＡＴコントロール抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、米国）と４℃で一晩インキュベーションした。検出を、ビオチン化ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１：３５０の希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、米国）又は抗ウサギ二次抗体（１：２５０の希釈、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、米国）を用いて行い、抗体シグナルを、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、米国）により増幅し、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、米国）により検出した。スライドを、Ｅｕｋｉｔｔ（登録商標）封入剤（Ｏ．Ｋｉｎｄｌｅｒ  ＧｍｂＨ；Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）を使用して封入した。明視野画像化を、Ｄｏｔｓｌｉｄｅ  ＶＳ１２０スライドスキャナー（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｓｃｈｗｅｉｚ  ＡＧ、スイス）を使用して行った。ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．５Ｇ２及びＮＩ−３０８．４Ｍ１の病理学的なＣ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質に対する結合を、ＦＴＬＤ患者及び非神経学的コントロール対象から得られる小脳切片の免疫組織化学的分析によって評価した。図１４Ａ及び図１４Ｂに示されるように、ヒト由来のＮＩ−３０８．１８Ｆ７抗体、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７抗体及びＮＩ−３０８．５Ｇ２抗体により、ニューロン細胞質封入体、ニューロン核内封入体及び異栄養性神経突起が、試験された３名すべてのＣ９ｏｒｆ７２−ＦＴＬＤ症例の小脳の顆粒細胞層において明らかにされた。対照的に、非神経学的なコントロール小脳は、試験されたすべての抗体について陰性であった（図１４Ａ）。図１４Ｃに示されるように、抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１により、ニューロン細胞質封入体及びニューロン核内封入体が、非神経学的コントロール症例ではなく、Ｃ９ｏｒｆ７２−ＦＴＬＤ症例の小脳の顆粒細胞層において明らかにされた。結論として、ヒト由来抗体のＮＩ−３０８．１８Ｆ７、ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、ＮＩ−３０８．５Ｇ２及びＮＩ−３０８．４Ｍ１により、Ｃ９ｏｒｆ７２ジペプチドリピートタンパク質凝集物がＣ９ｏｒｆ７２−ＦＴＬＤ症例の小脳の顆粒細胞層において特異的に検出され、その一方で、染色がコントロール小脳では認められず、このことはこれらの抗体の大きい標的特異性を明らかにする。
【０２９８】
実施例１３：ＦＴＬＤにおける共凝集型ＤＰＲ種に対するヒト抗体結合
Ｃ９ｏｒｆ７２ヘキサヌクレオチドリピート伸長を有するヒトＦＴＬＤ患者から得られる死後小脳組織におけるＣ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質の異なった種の局在化を評価すること。簡単に記載すると、抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７を、Ａｔｔｏ４８８タンパク質標識キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）を製造者の説明書に従って使用することによって蛍光色素Ａｔｔｏ４８８に直接にコンジュゲート化した。抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２を、Ａｔｔｏ５５０タンパク質標識キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）を製造者の説明書に従って使用することによってＡｔｔｏ５５０に直接にコンジュゲート化した。免疫蛍光組織化学実験のために、Ｃ９ｏｒｆ７２ヘキサヌクレオチドリピート伸長を有するＦＴＬＤ患者から得られる小脳のホルマリン固定されたパラフィン包埋の５μｍ切片（ＢｉＯＢＡＮＣ  ＨＣＢ−ＩＤＩＢＡＰＳ、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、スペイン）を、１ｍＭのＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．３）における加熱処理及び１２分間のマイクロ波照射（６００Ｗ）によって抗原回復のために前処理した。非特異的結合部位を、ＰＢＳ／５％血清（ウマ／ヤギ）／４％ＢＳＡを用いて室温で１時間ブロッキング処理した。ブロッキング処理工程の後、切片をヒト抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７−Ａｔｔｏ４８８及びヒト抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２−Ａｔｔｏ５５０と５ｎＭで、室温で２時間インキュベーションした。免疫染色の後、組織切片を、組織の自己蛍光を低下させるために０．１％ズダンブラックＢ溶液と室温で１０分間インキュベーションした。核の対比染色をＤＡＰＩ核酸染料（５ｍｇ／ｍｌストック溶液の１：１０００希釈物、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｂ．Ｖ．、Ｚｕｇ、スイス）の使用によって行った。スライドを、Ｈｙｄｒｏｍｏｕｎｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ａｔｌａｎｔａ、米国）封入剤を使用して封入した。蛍光画像化を、Ｄｏｔｓｌｉｄｅ  ＶＳ１２０スライドスキャナー（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｓｃｈｗｅｉｚ  ＡＧ、スイス）を使用して行った。
【０２９９】
Ｃ９ｏｒｆ７２ヘキサヌクレオチドリピート伸長を有するヒトＦＴＬＤ患者の小脳の顆粒層における、Ｃ９ｏｒｆ７２ポリＧＡ  ＤＰＲタンパク質及びＣ９ｏｒｆ７２ポリＧＰ  ＤＰＲタンパク質の局在化を、蛍光顕微鏡法によって評価した。図１５に示されるように、抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７により、広範囲に及ぶニューロンの細胞質及び核内のＣ９ｏｒｆ７２ポリＧＡ封入体が認識された（左側パネル、緑色染色シグナル）。実験条件下において、選ばれたＮＩ−３０８．５Ｇ２により、細胞質及び核内のポリＧＰ封入体のよりまばらな病理が検出された（中央パネル、赤色染色シグナル）。ポリＧＰ  ＤＰＲタンパク質凝集物の相当な割合が、ポリＧＡ  ＤＰＲタンパク質凝集物と共局在化していた（左側パネル、黄色染色シグナル）。このことから、両方のＤＰＲタンパク質が病理学的な封入体で共凝集し得ることが示唆される。
【０３００】
実施例１４：Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質の病原性機構を研究するための細胞型モデル
次々と現れる細胞培養モデル及び動物モデルでの近年の報告により、異常なＣ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質の毒性についての証拠が提供された。例えば、ハエ及びいくつかの細胞培養モデルにおいて、特にアルギニンに富むＤＰＲタンパク質（ポリＧＲ及びポリＰＲ）が、核封入体及び核小体ストレスを誘導することによって、毒性であることが見出され（Ｋｗｏｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４５（２０１４）、１１３９〜１１４５；Ｍｉｚｉｅｌｉｎｓｋａ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４５（２０１４）、１１９２〜１１９４；Ｔａｏ他、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２４（２０１５）、２４２６〜２４４１；Ｗｅｎ他、Ｎｅｕｒｏｎ  ８４（２０１４）、１２１３〜１２２５；Ｙａｎｇ他、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１３０（２０１５）、５２５〜５３５）、一方で、他のモデルにより、毒性が細胞培養系における細胞質ポリＧＡ凝集物について報告された（Ｍａｙ他、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１２８（２０１４）、４８５〜５０３；Ｚａｎｇ他、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１２８（２０１４）、５０５〜５２４）。
【０３０１】
タウ（Ｙａｎａｍａｎｄｒａ他、Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｎｅｕｒｏｌ．２（２０１３）、２７８〜２８８）及びα−シヌクレイン（Ｔｒａｎ他、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．７（２０１４）、２０５４〜２０６５）について示されるように、ＤＰＲ病理の拡大が本発明の抗体による処置によって防止され得るかを明らかにするために、インビトロＣ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲ毒性アッセイが、本質的には同様に使用される。具体的には、合成ＤＮＡ配列を、１５０回のジペプチドリピートを有する個々のＤＰＲタンパク質のＡＴＧ依存的翻訳での発現を生じさせるために作製した。ランダム化コドン戦略を用いて、選択された個々のＤＰＲタンパク質配列のみの発現を確実にした。ニューロン細胞（例えば、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＮＳＣ−３４、Ｎｅｕｒｏ−２ａ、ｉＰＳＣ由来ニューロン及び初代ニューロンなど）におけるＤＰＲタンパク質の発現を生じさせるために、合成ＤＮＡ配列を、ニューロン特異的なＴｈｙ１．２プロモーターによって調節される発現ベクターにクローン化した。広範囲の真核生物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｕ−２ＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞及びＣｏｓ細胞など）における高レベル発現のために、合成ＤＮＡ配列を、ＣＭＶプロモーターによって調節される発現ベクターにクローン化した。ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンと、Ｃ９ｏｒｆ７２患者の線維芽細胞に由来する分化転換させたニューロン（ｉニューロン）とは、さらなるＣ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質細胞培養モデルを表す。
【０３０２】
これらの細胞モデルは、本発明の抗体の治療有用性を調べるために使用することができる。本発明の抗体の治療効果の評価及び確認を、細胞生存性をミトコンドリア活性アッセイ及び／又はカスパーゼ活性アッセイによりモニターすることによって、細胞毒性を細胞溶解アッセイ及び／又は膜漏出アッセイによりモニターすることによって、また、細胞ＤＰＲタンパク質拡大の阻害を免疫組織化学的アッセイによりモニターすることによって行うことができる。
【０３０３】
実施例１５：Ｃ９ｏｒｆ７２  ＤＰＲタンパク質の病原性機構を研究するための遺伝子組換えマウスモデル
凝集しやすいタンパク質及び／又は誤って折り畳まれたタンパク質に対して開発された免疫療法取り組みは、有望な結果をいくつかの神経変性疾患の前臨床研究及び臨床研究においてもたらしている。Ｃ９ｏｒｆ７２ヘキサヌクレオチドリピート伸長により媒介されるＡＬＳ／ＦＴＬＤの病理学的特徴を再現する遺伝子組換えマウスモデルが近年、開発されている（Ｃｈｅｗ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４８（２０１５）、１１５１〜１１５４；及び国際特許出願公開ＷＯ２０１４／１５９２４７（Ａ１））。これらのマウスモデルの作製のために、全長型又は短縮型のどちらかのヘキサヌクレオチドリピートが伸長したＣ９ｏｒｆ７２遺伝子（約４５０回〜５００回の間のヘキサヌクレオチドリピート）を有する細菌人工染色体構築物、又は、６６回のＣ９ｏｒｆ７２ヘキサヌクレオチドリピートの配列を有するアデノ関連ウイルスベクターが使用された。これらのマウスモデルにおいて、Ｃ９ｏｒｆ７２ヘキサヌクレオチドリピート伸長により媒介される核ＲＮＡ巣及びＤＰＲタンパク質の蓄積が中枢神経系において検出されている。さらには、Ｃ９ｏｒｆ７２疾患の顕著な病理学的特徴（例えば、ニューロン喪失、行動異常、運動障害及び生存低下など）が、異なる遺伝子組換えマウスモデルにおいて認められている。これらのマウスモデルは、本発明の抗体の治療有用性を調べるために使用することができる。具体的には、スクリーニングされる抗体が、多様な可能な経路（例えば、腹腔内の抗体注射、頭蓋内注射、脳室内脳注入など）で動物に適用され、治療効果について調べられる場合がある。
【０３０４】
ヒト免疫系における進化的最適化及び親和性成熟のために、本発明の抗体は、健康なヒト対象から単離されたことに起因する有益な治療ツールを、優れた安全性プロファイル及び免疫原性の喪失のための大きい可能性を伴って提供する。これらの予想された治療効果の確認が、マウス抗体の代わりにヒト抗体を用いて、上述の刊行物に記載されるような試験方法によってもたらされ得る。
本発明の特定の実施形態においては、例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
第９染色体のオープンリーディングフレーム７２（Ｃ９ｏｒｆ７２）遺伝子からそのアンチセンス方向で翻訳されるような少なくとも１つのＤＰＲ（ポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ；ＰＲ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ；ＰＡ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ；ＧＰ））、及び／又は、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子からそのセンス方向で翻訳されるような少なくとも１つのＤＰＲ（ポリ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ；ＧＲ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ；ＧＡ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ；ＧＰ））を認識するヒト由来のモノクローナル抗ジペプチド（ＸＸ’）リピート（ＤＰＲ）抗体（好ましくは、リピート数は（ＸＸ’）１５である）或いはそのＤＰＲ結合フラグメント、合成変異体又は生物工学誘導体。
（項目２）
Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子からそのアンチセンス方向で翻訳されるような少なくとも１つのＤＰＲと、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子からそのセンス方向で翻訳されるような少なくとも１つのＤＰＲとを認識する、項目１に記載の抗体。
（項目３）
前記ＤＰＲがタンパク質に含有され、又はタンパク質にコンジュゲート化され（ＤＰＲ−タンパク質）、好ましくは、前記タンパク質がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であり、前記ＤＰＲにコンジュゲート化される、項目１又は２に記載の抗体。
（項目４）
ＤＰＲタンパク質の組合せを認識し、好ましくは、ポリ（ＧＲ）、ポリ（ＰＲ）及び場合によりポリ（ＧＡ）を認識し、又は、ポリ（ＧＡ）及びポリ（ＧＰ）を認識し、又は、ポリ（ＧＡ）及びポリ（ＧＲ）を認識し、又は、ポリ（ＧＲ）及びポリ（ＰＲ）を認識し、又は、ポリ（ＧＡ）、ポリ（ＧＲ）及び場合によりポリ（ＰＲ）を認識し、又は、ポリ（ＰＡ）、ポリ（ＰＲ）及び場合によりポリ（ＧＲ）を認識し、又は、ポリ（ＰＡ）及びポリ（ＧＡ）を認識する、項目１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
（項目５）
（ＸＸ’）１５からなるＤＰＲペプチドと結合することができ、場合により、ＢＳＡにカップリングされる前記ペプチドには結合しない、又は少なくともより小さい大きさで結合する、項目１〜４のいずれか一項に記載の抗体。
（項目６）
前記ＤＰＲ及びＤＰＲタンパク質の凝集型形態とそれぞれ結合することができる、項目１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
（項目７）
前記ＤＰＲ−タンパク質がＣ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲである、項目１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
（項目８）
ＧＡリピートを含むＤＰＲを認識し、下記のものをその可変領域において含む、項目１〜７のいずれか一項に記載の抗体：
（ａ）抗体ＮＩ−３０８．１８Ｆ７、抗体ＮＩ−３０８．１５Ｏ７、抗体ＮＩ−３０８．２８Ｇ１及び抗体ＮＩ−３０８．４５Ｃ２のいずれか１つのＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、ただし、前記ＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列は図１Ａ〜図１Ｄのいずれか１つに示され、かつ、下記の（ｉ）ＶＨ配列及び（ｉｉ）ＶＬ配列においてそれぞれ示される：
（ｉ）ＶＨ配列（配列番号２、配列番号８、配列番号２２、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３４）、及び
（ｉｉ）ＶＬ配列（配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３２、配列番号３６）；
（ｂ）図１Ａ〜図１Ｄのいずれか１つに示されるようなＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）の前記アミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；
（ｄ）（ｂ）の前記アミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域、並びに／或いは
（ｅ）前記ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域或いは前記少なくとも１つのＣＤＲに対して異種であるポリペプチド配列を場合によりさらに含む前記抗体又はその抗原結合フラグメントであって、好ましくは、ポリペプチド配列がヒト定常ドメインを含み、好ましくはＩｇＧタイプのヒト定常ドメインを含み、最も好ましくはＩｇＧ１クラス又はＩｇＧ１アイソタイプのヒト定常ドメインを含む、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目９）
ＧＰリピートを含むＤＰＲを認識し、下記のものをその可変領域において含む、項目１〜７のいずれか一項に記載の抗体：
（ａ）抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２、抗体ＮＩ−３０８．４６Ｅ９及び抗体ＮＩ−３０８．１２Ａ３のいずれか１つのＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、ただし、前記ＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列は、図１Ｆ、図１Ｇ及び図１Ｌに示され、かつ、下記の（ｉ）ＶＨ配列及び（ｉｉ）ＶＬ配列においてそれぞれ示される：
（ｉ）ＶＨ配列（配列番号１４、配列番号１８、配列番号４４、配列番号４８、配列番号７２、配列番号７６）、及び
（ｉｉ）ＶＬ配列（配列番号１６、配列番号２０、配列番号４６、配列番号５０、配列番号７４、配列番号７８）；
（ｂ）図１Ｆ、図１Ｇ又は図１Ｌに示されるようなＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）の前記アミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；
（ｄ）（ｂ）の前記アミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域、並びに／或いは
（ｅ）前記ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域或いは前記少なくとも１つのＣＤＲに対して異種であるポリペプチド配列を場合によりさらに含む前記抗体又はその抗原結合フラグメントであって、好ましくは、ポリペプチド配列がヒト定常ドメインを含み、好ましくはＩｇＧタイプのヒト定常ドメインを含み、最も好ましくはＩｇＧ１クラス又はＩｇＧ１アイソタイプのヒト定常ドメインを含む、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目１０）
ＧＲリピートを含むＤＰＲを認識し、下記のものをその可変領域において含む、項目１〜７のいずれか一項に記載の抗体：
（ａ）抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１又は抗体ＮＩ−３０８．４６Ｆ８のＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、ただし、前記ＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列は図１Ｈ及び図１Ｉに示され、かつ、下記の（ｉ）ＶＨ配列及び（ｉｉ）ＶＬ配列においてそれぞれ示される：
（ｉ）ＶＨ配列（配列番号５２、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６２）、及び
（ｉｉ）ＶＬ配列（配列番号５４、配列番号６０）；
（ｂ）図１Ｈ又は図１Ｉに示されるようなＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）の前記アミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；
（ｄ）（ｂ）の前記アミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域、並びに／或いは
（ｅ）前記ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域或いは前記少なくとも１つのＣＤＲに対して異種であるポリペプチド配列を場合によりさらに含む前記抗体又はその抗原結合フラグメントであって、好ましくは、ポリペプチド配列がヒト定常ドメインを含み、好ましくはＩｇＧタイプのヒト定常ドメインを含み、最も好ましくはＩｇＧ１クラス又はＩｇＧ１アイソタイプのヒト定常ドメインを含む、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目１１）
ＰＲリピートを含むＤＰＲを認識し、下記のものをその可変領域において含む、項目１〜７のいずれか一項に記載の抗体：
（ａ）抗体ＮＩ−３０８．２４Ｅ１１のＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、ただし、前記ＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列は図１Ｅに示され、かつ、下記の
（ｉ）ＶＨ配列及び（ｉｉ）ＶＬ配列においてそれぞれ示される：
（ｉ）ＶＨ配列（配列番号３８）、及び
（ｉｉ）ＶＬ配列（配列番号４０、配列番号４２）；
（ｂ）図１Ｅに示されるようなＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）の前記アミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列
からなる少なくとも１つのＣＤＲ；
（ｄ）（ｂ）の前記アミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域、並びに／或いは
（ｅ）前記ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域或いは前記少なくとも１つのＣＤＲに対して異種であるポリペプチド配列を場合によりさらに含む前記抗体又はその抗原結合フラグメントであって、好ましくは、ポリペプチド配列がヒト定常ドメインを含み、好ましくはＩｇＧタイプのヒト定常ドメインを含み、最も好ましくはＩｇＧ１クラス又はＩｇＧ１アイソタイプのヒト定常ドメインを含む、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目１２）
ＰＡリピートを含むＤＰＲを認識し、下記のものをその可変領域において含む、項目１〜７のいずれか一項に記載の抗体：
（ａ）抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１のＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、ただし、前記ＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列は図１Ｊに示され、かつ、下記の（ｉ）ＶＨ配列及び（ｉｉ）ＶＬ配列においてそれぞれ示される：
（ｉ）ＶＨ配列（配列番号６４、配列番号６８）、及び
（ｉｉ）ＶＬ配列（配列番号６６、配列番号７０）；
（ｂ）図１Ｊに示されるようなＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）の前記アミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；
（ｄ）（ｂ）の前記アミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域、並びに／或いは
（ｅ）前記ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域或いは前記少なくとも１つのＣＤＲに対して異種であるポリペプチド配列を場合によりさらに含む前記抗体又はその抗原結合フラグメントであって、好ましくは、ポリペプチド配列がヒト定常ドメインを含み、好ましくはＩｇＧタイプのヒト定常ドメインを含み、最も好ましくはＩｇＧ１クラス又はＩｇＧ１アイソタイプのヒト定常ドメインを含む、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目１３）
ＰＲリピートを含むＤＰＲを認識し、下記のものをその可変領域において含む、項目１〜７のいずれか一項に記載の抗体：
（ａ）抗体ＮＩ−３０８．１６Ｃ１０のＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、ただし、前記ＶＨ可変領域アミノ酸配列及び／又はＶＬ可変領域アミノ酸配列は図１Ｍに示され、かつ、下記の
（ｉ）ＶＨ配列及び（ｉｉ）ＶＬ配列においてそれぞれ示される：
（ｉ）ＶＨ配列（配列番号８０、配列番号８４）、及び
（ｉｉ）ＶＬ配列（配列番号８２、配列番号８６）；
（ｂ）図１Ｍに示されるようなＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）の前記アミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；
（ｄ）（ｂ）の前記アミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域、並びに／或いは
（ｅ）前記ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域或いは前記少なくとも１つのＣＤＲに対して異種であるポリペプチド配列を場合によりさらに含む前記抗体又はその抗原結合フラグメントであって、好ましくは、ポリペプチド配列がヒト定常ドメインを含み、好ましくはＩｇＧタイプのヒト定常ドメインを含み、最も好ましくはＩｇＧ１クラス又はＩｇＧ１アイソタイプのヒト定常ドメインを含む、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目１４）
ポリＧＡリピートともまた結合することができ、好ましくは、抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２である、又は抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２に由来する、項目９に記載の抗体。
（項目１５）
ポリＧＡリピートともまた結合することができ、好ましくは、抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１である、又は抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１に由来する、項目１０に記載の抗体。
（項目１６）
ポリＰＲリピートともまた結合することができ、好ましくは、抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１である、又は抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１に由来する、項目１０又は１４に記載の抗体。
（項目１７）
ポリＧＡリピートともまた結合することができ、好ましくは、抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１である、又は抗体ＮＩ−３０８．４Ｍ１に由来する、項目１２に記載の抗体。
（項目１８）
ポリＧＡリピートともまた結合することができ、好ましくは、抗体ＮＩ−３０８．１６Ｃ１０である、又は抗体ＮＩ−３０８．１６Ｃ１０に由来する、項目１３に記載の抗体。
（項目１９）
非カップリング型のＤＰＲペプチドと選択的又は優先的に結合する、項目１〜１６のいずれか一項に記載の抗体。
（項目２０）
リピート数ｎが６以上（好ましくは１０以上、より好ましくは１５以上）である場合においてのみ前記ＤＰＲに結合する、項目１〜１９のいずれか一項に記載の抗体。
（項目２１）
非カップリング型のＤＰＲ及びＢＳＡカップリング型のＤＰＲと、実質的に等しい親和性で、又は、ほぼ同じ程度の大きさで結合することができ、好ましくは、前記非カップリング型ＤＰＲ及び前記ＢＳＡカップリング型ＤＰＲと結合することについてのＥＣ５０（最大半量有効濃度）が、間接的ＥＬＩＳＡによって求められる場合（リピート数ｎは１５である）、最大でも２０倍以下（好ましくは最大でも１５倍以下、より好ましくは最大でも１０倍以下、一層より好ましくは最大でも５倍以下、最も好ましくは最大でも約２倍以下又は３倍）異なる、項目１〜２０のいずれか一項に記載の抗体。
（項目２２）
２つ以上の異なるＤＰＲと、実質的に等しい親和性で、又は、ほぼ同じ程度の大きさで結合することができ、好ましくは、前記ＤＰＲのいずれか１つと結合することについてのＥＣ５０が、間接的ＥＬＩＳＡによって求められる場合、ＤＰＲｎ又はＤＰＲｎタンパク質（リピート数ｎは１５である）と結合することについては少なくとも２００ｎＭ以下であり、好ましくは１５０ｎＭ以下であり、より好ましくは１００ｎＭ以下であり、一層より好ましくは５０ｎＭ以下であり、最も好ましくは２５ｎＭ以下である、項目１〜２１のいずれか一項に記載の抗体。例えば、抗体ＮＩ−３０８．５Ｇ２は（ＧＡ）１５とは約１５．３のＥＣ５０で、（ＧＰ）１５とは約０．８８のＥＣ５０で結合し、抗体ＮＩ−３０８．６Ｂ１１は（ＧＡ）１５とは約３８．４のＥＣ５０で、（ＧＲ）１５とは約０．９４のＥＣ５０で、（ＰＲ）１５とは約１１９のＥＣ５０で結合する；実施例３及び図２を参照のこと。
（項目２３）
間接的ＥＬＩＳＡによって求められる場合、２５ｎＭ以下の、好ましくは２ｎＭ以下の、より好ましくは１ｎＭ以下の、最も好ましくは０．５ｎＭ以下のＥＣ５０（最大半量有効濃度）値に対応する、少なくとも１つのＤＰＲｎ又はＤＰＲｎタンパク質（リピート数ｎは１５である）に対する結合親和性を有する、項目１〜２２のいずれか一項に記載の抗体。
（項目２４）
キメラなマウス−ヒト抗体又はマウス化抗体である、項目１〜２３のいずれか一項に記載の抗体。
（項目２５）
項目１〜２４のいずれか一項で定義されるようＤＰＲ又はＤＰＲ−タンパク質に対する特異的な結合について、項目１〜２４のいずれか一項に記載される抗体と競合する抗体又は抗原結合分子。
（項目２６）
単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメント及びＦ（ａｂ’）２フラグメントからなる群から選択される、項目１〜２５のいずれか一項に記載の抗体。
（項目２７）
項目１〜２６のいずれか一項に記載される抗体の免疫グロブリン鎖の結合ドメイン又は可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチドであって、好ましくはｃＤＮＡであるポリヌクレオチド。
（項目２８）
項目２７に記載される前記ポリヌクレオチドを、必要な場合には前記結合性分子の他方の免疫グロブリン鎖の可変領域をコードする項目２７に記載されるポリヌクレオチドとの組合せで含むベクター。
（項目２９）
項目２７に記載されるポリヌクレオチド又は項目２８に記載されるベクターを含む宿主細胞。
（項目３０）
抗ＤＰＲ抗体を製造するための、項目２７に記載されるｃＤＮＡ、項目２８に記載されるベクター、又は項目３０に記載される宿主細胞の使用。
（項目３１）
抗ＤＰＲ抗体或いはその生物工学誘導体又は免疫グロブリン鎖を調製するための方法であって、
（ａ）項目２９に記載される細胞を培養すること、及び
（ｂ）前記抗体又はその免疫グロブリン鎖を前記培養物から単離すること
を含む方法。
（項目３２）
項目２７に記載されるポリヌクレオチドによってコードされる、又は、項目３１に記載される方法によって得ることができる抗体又はその免疫グロブリン鎖。
（項目３３）
検出可能に標識される、項目１〜２６又は３２のいずれか一項に記載の抗体。
（項目３４）
前記検出可能な標識が、酵素、放射性同位体、蛍光団及び重金属からなる群から選択される、項目３４に記載の抗体。
（項目３５）
薬物に結合させられる、項目１〜２６又は３２のいずれか一項に記載の抗体。
（項目３６）
項目１〜２６又は３２〜３５のいずれか一項に記載される抗体、項目２７に記載されるポリヌクレオチド、項目２８に記載されるベクター、或いは項目２９に記載される細胞を含む組成物。
（項目３７）
医薬組成物であり、かつ、医薬的に許容され得る担体をさらに含む、項目３６に記載の組成物。
（項目３８）
ワクチンである、項目３７に記載の組成物。
（項目３９）
ＤＰＲ凝集物及びＤＰＲ−タンパク質凝集物に伴う、又は、ＤＰＲ凝集物及びＤＰＲ−タンパク質凝集物によって引き起こされる障害の処置において使用されるための医薬組成物を調製する方法であって、
（ａ）項目２９に記載される細胞を培養すること；
（ｂ）前記抗体、その生物工学誘導体又は免疫グロブリン鎖を前記培養物から医薬品グレードにまで精製すること；及び
（ｃ）前記抗体又はその生物工学誘導体を医薬的に許容され得る担体と混合すること
を含む方法。
（項目４０）
凝集型ＤＰＲタンパク質（例えば、Ｃ９ＯＲＦ７２−ＤＰＲ）に伴う疾患及び／又は症状を処置するために有用であるさらなる薬剤をさらに含む、項目３６又は３７に記載の医薬組成物。
（項目４１）
診断組成物である、項目４０に記載の組成物。
（項目４２）
免疫又は核酸に基づく診断方法において従来から使用される試薬を含む、項目４１に記載の診断組成物。
（項目４３）
ＤＰＲタンパク質及びその凝集型形態に伴う疾患の予防的処置及び治療的処置のための医薬組成物又は診断組成物を調製することにおいて使用されるための、項目１〜２６若しくは３２〜３５のいずれか一項に記載の抗体、又は、前記抗体のいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有するＤＰＲタンパク質結合分子、項目２７に記載のポリヌクレオチド、項目２８に記載のベクター、或いは、項目２９に記載の細胞。
（項目４４）
前記疾患が、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及びＦＴＬＤ−ＡＬＳからなる群から選択される、予防的処置及び治療的処置のための医薬組成物又は診断組成物を調製することにおいて使用されるための項目４３に記載の抗体。
（項目４５）
ヒト又は動物の身体における凝集物のインビボ検出において、或いは、治療剤及び／又は診断剤をヒト又は動物の身体における凝集物に対して標的化することにおいて使用されるための、項目１〜２６又は３２〜３５のいずれか一項に記載される抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含むＤＰＲタンパク質結合分子。
（項目４６）
前記インビボ画像化が、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射型断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、近赤外（ＮＩＲ）光学的画像法又は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を含む、項目４５に記載のＤＰＲタンパク質結合分子。
（項目４７）
ＤＰＲタンパク質に伴う障害を診断するための方法であって、項目１〜２６又は３２〜３５のいずれか一項に記載される抗体の存在を前記対象の生物学的サンプルにおいて明らかにする工程を含む方法。
（項目４８）
ＤＰＲタンパク質に伴う障害の診断又はモニタリングにおいて有用なキットであって、項目１〜２６若しくは３２〜３５のいずれか一項に記載される少なくとも１つの抗体、又は、前記抗体のいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有するＤＰＲタンパク質結合分子、項目２７に記載されるポリヌクレオチド、項目２８に記載されるベクター、或いは、項目２９に記載される細胞を、必要な場合には使用のための試薬及び／又は説明書と一緒に含むキット。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４−１】
2020031660.tif 000048
【図１４−２】
2020031660.tif 000049
【図１５】
2020031660.tif 000050
【配列表】
2020031660000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月26日(2019.11.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１−１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１−１】
2020031660.tif 000051
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１−２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１−２】
2020031660.tif 000052
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１−４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１−４】
2020031660.tif 000053
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１−５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１−５】
2020031660.tif 000054
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１−６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１−６】
2020031660.tif 000055
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１−７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１−７】
2020031660.tif 000056
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2020031660000001.app
【外国語明細書】
2020031660000001.pdf