(57)【要約】      （修正有）【課題】脊髄損傷及び中枢神経系（ＣＮＳ）の関連疾患の治療における全身的に使用できるキメラ若しくは融合タンパク質の提供。【解決手段】タンパク質形質導入ドメイン、及びプロテオグリカン分解ドメインを有する融合ペプチド、好ましくは、タンパク質形質導入ドメインは、ＴＡＴドメインであり、タンパク質形質導入ドメインおよびプロテオグリカン分解ドメインの間にリンカーポリペプチドを有する、融合ペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドをコードする配列を有する単離された核酸を有する組成物であって、
前記ポリペプチドが、タンパク質形質導入ドメイン、プロテオグリカン分解ドメイン、或いはニューロン再生を促進するドメインの少なくとも２つを有するものである、組成物。
【請求項２】
請求項１記載の組成物において、
前記核酸は、タンパク質形質導入ドメインであるＴＡＴドメインをコードするものである、組成物。
【請求項３】
請求項１記載の組成物において、
前記ポリペプチドの任意の２つのドメインは、リンカーポリペプチドドメインに一緒に連結されるものである、組成物。
【請求項４】
請求項１記載の組成物において、
前記核酸は、コンドロイチナーゼＡＢＣＩの欠損変異体であるプロテオグリカン分解ドメインをコードするものである、組成物。
【請求項５】
請求項１記載の組成物において、
前記ニューロン再生を促進するドメインは、Ｌ１、少なくとも８０％のＬ１である変異体、又はＬ１の欠損変異体である、組成物。
【請求項６】
請求項１記載の組成物において、
前記ニューロン再生を促進するドメインは、ＧＧＦ２、少なくとも８０％のＧＧＦ２である機能的変異体、又はＧＧＦ２の機能的欠損変異体である、組成物。
【請求項７】
請求項１記載の組成物において、
前記ニューロン再生を促進するドメインは、ＮｇＲ２７−３１１、ＮｇＲ２７−３１１と少なくとも８０％の相同性を有する機能的変異体、又はＮｇＲ２７−３１１の機能的欠損変異体である、組成物。
【請求項８】
遺伝的に修飾された細胞から発現された請求項１記載の組成物。
【請求項９】
請求項１記載の組成物、及びＣＮＳからの細胞。
【請求項１０】
組成物であって、
タンパク質形質導入ドメイン、プロテオグリカン分解ドメイン、或いはニューロン再生を促進するドメインの少なくとも２つを有するポリペプチドを有する組成物。
【請求項１１】
請求項１０記載の組成物において、
前記タンパク質形質導入ドメインは、ＴＡＴドメインである、組成物。
【請求項１２】
請求項１０記載の組成物において、
前記ポリペプチドの２つのドメインは、リンカーポリペプチドドメインによって一緒に連結されるものである、組成物。
【請求項１３】
請求項１０記載の組成物において、
前記プロテオグリカン分解ドメインは、コンドロイチナーゼＡＢＣＩの欠損変異である、組成物。
【請求項１４】
請求項１０記載の組成物において、
前記ニューロン再生を促進するドメインは、Ｌ１、少なくとも８０％のＬ１である変異体、或いはＬ１の欠損変異体である、組成物。
【請求項１５】
請求項１０記載の組成物において、
前記ニューロン再生を促進するドメインは、ＧＧＦ２、少なくとも８０％のＧＧＦ２である機能的変異体、或いはＧＧＦ２の機能的欠損変異体である、組成物。
【請求項１６】
請求項１０記載の組成物において、
前記ニューロン再生を促進するドメインは、ＮｇＲ２７−３１１、ＮｇＲ２７−３１１と少なくとも８０％の相同性を有する機能的変異体、或いはＮｇＲ２７−３１１の機能的欠損変異体である、組成物。
【請求項１７】
コンドロイチナーゼを有する請求項１０記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１０記載の組成物、及び薬学的に許容可能な賦形剤。
【請求項１９】
請求項１０記載の組成物、及びＣＮＳからの細胞。
【請求項２０】
神経機能の回復を促進する方法であって、
ＳＣＩ損傷によって特徴付けられる構成された神経機能を有する疾患を同定する工程と、
タンパク質形質導入ポリペプチド、プロテオグリカン分解ポリペプチド、或いはニューロン再生を促進するポリペプチドの少なくとも２つを有する組成物を、その治療を必要とする患者へ投与する工程と
を有する方法。
【請求項２１】
請求項２０記載の方法において、
前記組成物は、ＣＮＳ損傷の部位の近くに移植された、遺伝的に修飾された細胞によって分泌されるものである、方法。
【請求項２２】
請求項２０記載の組成物において、
前記プロテオグリカン分解タンパク質は、コンドロイチナーゼＡＢＣＩ、コンドロイチナーゼＡＢＣＩＩ、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＢ、ヒアルロニダーゼ１、ヒアルロニダーゼ２、ヒアルロニダーゼ３、ヒアルロニダーゼ４、ＰＨ２０、若しくはこれらの混合物である、方法。
【請求項２３】
請求項２０記載の組成物において、
前記ポリペプチドは、一緒に連結されているものである、組成物。
【請求項２４】
中枢神経系における薬剤の拡散を促進する方法であって、
中枢神経系へ前記薬剤を投与する工程と、
細胞外マトリックスへの前記薬剤の通過を可能にするように、中枢神経系における細胞外マトリックスを修飾する工程と
を有する方法。
【請求項２５】
請求項２４記載の方法であって、
さらに、前記細胞外マトリックスにおけるプロテオグリカンを切断できる少なくとも１つの酵素を利用する工程を有するものである、方法。
【請求項２６】
請求項２４記載の方法において、
前記プロテオグリカンは、コンドロイチナーゼ硫酸プロテオグリカンである、方法。
【請求項２７】
請求項２４記載の方法において、
前記少なくとも１つの酵素は、コンドロイチナーゼＡＢＣタイプＩ、コンドロイチナーゼＡＢＣタイプＩＩ、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＢ、ヒアルロニダーゼ１、ヒアルロニダーゼ２、ヒアルロニダーゼ３、ヒアルロニダーゼ４、カテプシン、ＡＤＡＭＴ'ｓ、ＰＨ２０、及びそれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択されるものである、方法。
【請求項２８】
請求項２４記載の方法において、
前記少なくとも１つの酵素は、１若しくはそれ以上の薬学的担体と共に投与されるものである、方法。
【請求項２９】
請求項２４記載の方法において、
前記薬剤は、生物学的複合体、小分子、及び移植された細胞から成る群から選択されるものである、方法。
【請求項３０】
請求項２４記載の方法において、
前記薬剤を投与する工程は、局所性に、局在性に、若しくは全身性に達成されるものである、方法。
【請求項３１】
請求項２４記載の方法において、
前記薬剤を投与する工程は、大量瞬時投与注射、静脈内運搬、連続注入、移植片からの除放、若しくは除放性医薬品によるものである、方法。
【請求項３２】
細胞外マトリックスを通って薬剤を通過させる方法であって、
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを切断できる少なくとも１つの酵素を投与する工程を有する方法。
【請求項３３】
請求項３２記載の方法において、
前記少なくとも１つの酵素は、コンドロイチナーゼＡＢＣタイプＩ、コンドロイチナーゼＡＢＣタイプＩＩ、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＢ、ヒアルロニダーゼ１、ヒアルロニダーゼ２、ヒアルロニダーゼ３、ヒアルロニダーゼ４、カテプシン、ＡＤＡＭＴ'ｓ、ＰＨ２０、及びそれらの組み合わせから成る群から選択されるものである、方法。
【請求項３４】
請求項３２記載の方法において、
前記少なくとも１つの酵素は、有効な量で投与されるものである、方法。
【請求項３５】
請求項３２記載の方法において、
前記薬剤は、生物学的複合体、小分子、及び移植された細胞から成る群から選択されるものである、方法。
【請求項３６】
請求項３２記載の方法であって、
さらに、前記薬剤を局所性に、局在性に、及び全身性に投与する工程を有する方法。
【請求項３７】
請求項３２記載の方法であって、
さらに、大量瞬時投与注射、静脈内運搬、連続注入、移植片からの除放、若しくは除放性医薬品によって前記薬剤を投与する工程を有する方法。
【請求項３８】
中枢神経系への薬剤の取り込みを増強する方法であって、
前記薬剤、及びコンドロイチナーゼ硫酸プロテオグリカンを切断できる少なくとも１つの酵素を投与する工程を有する方法。
【請求項３９】
請求項３８記載の方法において、
前記少なくとも１つの酵素は、コンドロイチナーゼＡＢＣタイプＩ、コンドロイチナーゼＡＢＣタイプＩＩ、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＢ、ヒアルロニダーゼ１、ヒアルロニダーゼ２、ヒアルロニダーゼ３、ヒアルロニダーゼ４、カテプシン、ＡＤＡＭＴ'ｓ、ＰＨ２０、及びそれらの組み合わせから成る群から選択されるものである、方法。
【請求項４０】
請求項３８記載の方法において、
前記少なくとも１つの酵素は、有効な量で投与されるものである、方法。
【請求項４１】
請求項３８記載の方法において、
前記少なくとも１つの酵素は、１若しくはそれ以上の薬学的担体と共に投与されるものである、方法。
【請求項４２】
請求項３８記載の方法において、
前記薬学的担体は、希釈剤、結合剤、潤滑剤、発色剤、分解剤、緩衝剤、等張剤、ポリオール、及び麻酔薬から成る群から選択されるものである、方法。
【請求項４３】
請求項３８記載の方法において、
前記薬剤は、生物学的な複合体、小分子、及び移植された細胞から成る群から選択されるものである、方法。
【請求項４４】
請求項３８記載の方法において、
前記薬剤を投与する工程は、局所性に、局在性に、若しくは全身性に達成されるものである、方法。
【請求項４５】
請求項３８記載の方法において、
前記薬剤を投与する工程は、ボーラス注入法、静脈内運搬、連続注入、移植片からの除放、若しくは除放性医薬品によるものである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本明細書は、２００３年５月１６日に提出された米国仮出願番号第６０／４７１，２３９号（代理人整理番号１２７３０４．０１２００）、２００３年５月１６日に提出された米国仮出願番号第６０／４７１，３００号（代理人整理番号１２７３０４．０１４００）、２００３年５月１６日に提出された米国仮出願番号第６０／４７４，３７２号（代理人整理番号１２７３０４．０１７００）、２００３年５月１６日に提出された米国仮出願番号第６０／４７１，２４０号（代理人整理番号１２７３０４．０１３００）、及び２００４年５月１７日に本明細書と同時に提出された表題「ＣＮＳ治療に対するプロテオグリカン分解変異体」の米国特許出願明細書（米国特許出願番号［未定］、代理人整理番号１２７３０４．０１３０１）の利益と優先権を主張するものであり、これらの各引用文献の全体の内容は、この参考によって本明細書に組み込まれるものである。
【背景技術】
【０００２】
脊髄損傷（ＳＣＩ）は、細胞及び中枢神経系（ＣＮＳ）に対してトラウマを与え、個人を重症で衰弱した状態にする。ＳＣＩに続き、傷害ニューロンの限られた再生は、感覚の損失、麻痺、及び自律神経機能障害によって特徴付けられる永久的な障害を生じる。ニューロンが再生することができない１つの理由は、ＳＣＩに続いて発達するグリア性瘢痕を越える能力がないからである。このグリア性瘢痕は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧｓ）を含む細胞外マトリックス分子を含む。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究によって、ニューロンはＣＳＰＧコーティング表面を越えて伸長できないことが示され、ｉｎ  ｖｉｖｏデータも相関してＣＳＰＧ発現の領域での再生の失敗を示していた。成体中枢神経系（ＣＮＳ）ミエリン内で、ミエリン結合糖タンパク質（ＭＡＧ）、ＯＭｇｐ、及びニューロンの成長に対して阻害性を示すＲｅｔｉｃｕｌｏｎ４或いはＮｏｇｏのような軸索成長阻害化合物もいくつか同定された。
【０００３】
プロテオグリカン分解酵素コンドロイチナーゼＡＢＣタイプＩ（配列ＩＤ番号：Ｘ）は、脊髄損傷の脊柱破壊モデルにおいてニューロン成長を増強するために用いられている。また、ＮＯＧＯ受容体アンタゴニストで脊髄損傷を治療することによって、特定の限られた程度のニューロン再生が促進されるとも報告された。さらに、ＮＯＧＯノックアウトマウスを作成した結果、脊髄の背側片側切断に続き、特定の限られた不定の程度のニューロン再生が生じると報告された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
コンドロイチナーゼは細胞外マトリックスにおけるＣＳＰＧを消化し、細胞内貯蔵を切断しなかったけれども、ＣＮＳの傷害に対する実験的治療は、コンドロイチナーゼを細胞外スペースに対して適用するために利用した。さらに、柔組織内（器官の重要で特有な組織、或いはその支持フレームワークと区別される異常成長）、若しくは解剖学的コンパートメントの間のコンドロイチナーゼの拡散は、限られている。標的細胞及び／若しくは中枢神経系（ＣＮＳ）の組織への薬剤、造影試薬、及び麻酔薬などの限られたアクセスは、これらの物質のあらゆる有用性或いは有効性を減少する可能性がある。
【０００５】
治療用及び診断用分子の細胞及び組織への運搬は、部分的には、細胞膜に結合している炭水化物及びタンパク質、及び細胞外マトリックスに依存している。細胞外マトリックスは、プロテオグリカンの一部から構成されており、それらはコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧｓ）である。ＣＳＰＧｓは、コアタンパク質からなるプロテオグリカンのファミリーであり、硫酸グリコサミノグリカンに共有結合的に結合している。各プロテオグリカンは、グリコサミノグリカン側鎖によって決定される。ＣＳＰＧｓのこれら側鎖は、コンドロイチン４、６及びデルマタン硫酸塩から構成される約４０〜１００硫酸二糖類から成るものである。ＣＳＰＧのタンパク質構成成分は、リボソーム性に合成され、グリコシル化は、小胞体及びゴルジ体において起こる。次に糖鎖は、いくつかのグリコサミノグリカンスルホ基転移酵素によって、４或いは６位で硫酸化される。
【０００６】
形質導入タンパク質は、解剖学的バリアを横切って細胞内へ、ポリペプチド及びポリヌクレオチドカーゴを輸送するために使用される。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）からのＴＡＴタンパク質は、細胞内へのＨＩＶの形質導入に関与するタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を含む。ＰＴＤは、ＰＴＤの活性に関与する１１アミノ酸ドメイン（ＴＡＴペプチド）を含む。ＴＡＴペプチドは、タンパク質に結合でき、タンパク質の細胞への形質導入を促進する。形質導入のメカニズムは、ＴＡＴペプチドに結合されるタンパク質の分子量或いは化学特性には依存していない。Ｉｎ  ｖｉｖｏ研究によって、１２０ｋｄ酵素であるベータ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）に結合したＴＡＴペプチドから成る融合タンパク質がマウスに注入された場合、次に広範囲な細胞へのβ−Ｇａｌの頑強な運搬が観察されることが示された。ＴＡＴ形質導入ペプチドへ結合された場合、β−Ｇａｌ活性が脳において観察されたが、ＴＡＴペプチドがない場合は、β−Ｇａｌは脳において観察されなかった。血液脳関門を越える輸送は、通常、特定の疎水性小分子及び特定の低分子量親油性ペプチドに制限される。β−Ｇａｌ位の大きさのタンパク質の脳への輸送は、血液脳関門の実質的な破壊がない限り通常不可能であるが、ＴＡＴペプチドは、血液脳関門が無傷のまま輸送することを促進する。
【０００７】
キメラタンパク質（融合タンパク質とも呼ばれる）は、２若しくはそれ以上の前駆タンパク質或いはポリペプチドの少なくとも一部を組合わせたハイブリッドタンパク質である。キメラタンパク質は、組換え技術、すなわち、少なくとも一部の１つの遺伝子のコード配列を別の遺伝子のコード配列と融合することによって作成される。次に融合遺伝子は、その融合タンパク質を発現する適切な生物へ形質転換するために用いられる。
【０００８】
Ｔａｔペプチド複合体に関して、Ｆｒａｎｋｅｌら（米国特許番号第５，８０４，６０４号、第５，７４７，６４１号、第５，６７４，９８０号、第５，６７０，６１７号、及び第５，６５２，１２２号）は、共有結合的に結合した生物学的に活性なカーゴ分子を細胞の細胞質及び核へ輸送するためのＴａｔペプチドの使用を開示している。Ｆｒａｎｋｅｌは、（治療用、診断用、或いは予防用）である、共有結合的に結合したカーゴ部位を開示しているのみであり、拡散、可塑性、神経突起成長、及び軸索再生を促進する分子の接着を教示或いは示唆してはない。これらの分子は、限定されるものではないが、神経突起伸長阻害を克服する分子、若しくは、ＮｇＲ２７−３１１のような可溶性ＮＯＧＯアンタゴニスト、Ｌ１のような神経細胞接着分子、神経栄養因子、成長因子、ホスホジエステラーゼ阻害因子、及びＭＡＧ或いはＭＯＧの阻害因子などの神経成長を促進する分子を含む。さらに、欠損変異体は、ニューレグリン（ＧＧＦ２）などの再ミエリン化を促進する他の化合物、および再ミエリン化を促進する抗体、またはＴａｔペプチドに対するプロテオグリカン分解分子と組み合わされる。
【０００９】
ＳＣＩに続く再生は、グリア性瘢痕におけるＣＳＰＧの堆積、軸索の脱髄、栄養性支持の欠乏、及び軸索誘導の欠如を含む様々な障壁のため、限定される。ＳＣＩの１観点に対する１つの方法は、組み合わせアプローチと同じ程は効果的ではない。コンドロイチナーゼを有する融合タンパク質は、１つのタンパク質での組み合わせ治療を可能にする。この提案において構成されるコンドロイチナーゼの融合パートナーは、ＳＣＩにおいて有効であると証明されたタンパク質から選択された。
【００１０】
細胞外マトリックス糖タンパク質を分解する能力と、ミエリン構成成分の阻害特性を阻害する或いは克服する能力との両方を有する分子の使用は、治療のみの場合と比較して、損傷ニューロンが成長或いは再生する能力を改善するために用いられる。プロテオグリカン分解分子は、プロテオグリカンを切断でき、好ましくはコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）を分解できる少なくとも１つの酵素の使用を介して、細胞或いは組織へのアクセス及び物質の拡散を容易する方法を提供するためにも有利に使用される。  
【発明の効果】
【００１１】
本発明の実施形態は、プロテオグリカンを切断するポリペプチド、ニューロン成長阻害分子の活性を阻害する及び／若しくは克服するポリペプチド、若しくはそれらの組み合わせを有する組成物を含む。プロテオグリカン分解分子、或いはニューロン成長阻害分子を含む組成物は、細胞膜及び血液脳関門を越えるポリペプチドの形質導入のための分子も含む。前記組成物は、脊髄損傷、及び中枢神経系（ＣＮＳ）の関連疾患の治療に使用される。前記組成物は、損傷神経組織の再生に使用され、ニューロン成長阻害分子の活性を阻害する及び／若しくは克服することができる治療用分子の損傷或いは疾患組織への拡散及び形質導入を促進する。
【００１２】
本発明の実施形態は、治療用或いは診断用薬剤、好ましくは神経及び軸索の再生を促進する薬剤を、細胞或いは組織へ運搬及び拡散を促進するためにそれらを使用する組成物及び方法を含む。好ましくは、前記組成物は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）を切断可能でき、中枢神経系の細胞或いは組織へのこれら薬剤の拡散を増加する酵素の使用を含む。
【００１３】
本発明の組成物は、脊髄損傷及び中枢神経系（ＣＮＳ）の関連疾患の治療における全身的に使用できるキメラ若しくは融合タンパク質、特に、血液脳関門を通過できる融合タンパク質を含む。前記融合タンパク質は、ポリペプチド形質導入ドメイン、プロテオグリカンを分解できるポリペプチドドメイン、好ましくはコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）を切断するドメイン、ニューロン成長阻害分子の活性を阻害する及び／若しくは克服するポリペプチドドメイン、若しくは脊髄損傷及び中枢神経系（ＣＮＳ）の関連疾患の治療において使用されるこれらのポリペプチドドメインの組み合わせを含む。様々なポリペプチドドメインは、ポリペプチドリンカーによって連結される或いは化学的に結合される。
【００１４】
本発明の組成物は、脊髄損傷及び中枢神経形（ＣＮＳ）の関連疾患の治療において全身的に使用できるキメラ或いは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び、特に血管脳関門を通過できる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。これらのキメラ或いは融合タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドは、ポリペプチド形質導入ドメインをコードするポリヌクレオチドドメイン、プロテオグリカン、好ましくはコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）を分解できるポリペプチドドメインをコードするポリヌクレオチドドメイン、ニューロン成長阻害分子の活性を阻害する及び／若しくは克服するポリペプチドドメインをコードするポリヌクレオチドドメイン、及び脊髄損傷及び中枢神経系（ＣＮＳ）の関連疾患の治療において使用されるこれらのドメインの組み合わせを含む。前記ポリヌクレオチドは、ポリペプチドのドメインに連結し、融合タンパク質を形成するポリペプチドをコードする１若しくはそれ以上のポリヌクレオチドドメインも含む。
【００１５】
本発明の１実施形態は、プロテオグリカンを切断できる少なくとも１つの酵素を含む組成物の使用による、膜を通って細胞内へ或いは組織内への前記組成物内の治療用及び診断用薬剤のアクセス及び拡散を促進する組成物とその使用であり、好ましくは、前記組成物は、ＣＳＰＧを切断できる酵素を有する融合タンパク質を含むものである。前記組成物中の分子或いは薬剤は、脳由来神経栄養因子、インスリン様成長因子、繊維芽細胞成長因子、繊毛様神経栄養因子、グリア細胞由来神経栄養因子、形質転換増殖因子、グリア性細胞成長因子２、Ｌ１、ＧＭ１、血管内皮増殖因子、神経成長因子、イムノフィリンを含む１若しくはそれ以上の成長因子を含む。前記組成物中の分子は、画像化するための蛍光若しくは造影剤を含むことができる。前記薬剤は、例えば幹細胞、ニューロン、他の細胞などの移植用の細胞、運搬因子としての細胞、化学療法因子、抗生物質、抗体医薬、Ｎｏｇｏ受容体アンタゴニスト、他のコンドロイチナーゼ酵素を含む。前記組成物は、形質導入ドメイン、プロテオグリカンを切断できる酵素、若しくはその両方を含む。好ましくは、前記組成物は、形質導入ドメインを有する融合タンパク質、プロテオグリカンを切断できる酵素ドメイン、若しくはその両方を含む。前記融合タンパク質は、輸送を促進できる、若しくは細胞、組織及び／若しくは他のアクセス不可能な位置へのそのような薬剤の輸送を修飾する、及び／若しくは通過率や通過する距離を増強する、若しくは一定濃度の拡散を提供する。好ましくは、前記修飾された輸送は、ＣＳＰＧｓを切断できる少なくとも１つの酵素の使用を介して起こるものである。前記組成物は、ＣＮＳ傷害を治療するために使用され、好ましくは、前記組成物は挫傷による神経損傷の治療に使用されるものである。
【００１６】
本発明の実施形態は、これに限定されるものではないが、例えばＮｏｇｏ−受容体アンタゴニスト（ＮｇＲ２７−３１１）ドメインなどの、ニューロン成長阻害因子の活性を阻害するポリペプチドに連結したプロテオグリカン分解ドメインのキメラタンパク質、若しくはコンドロイチナーゼＡＢＣＩなどのコンドロイチナーゼに連結した変異体、或いは１若しくはそれ以上のＮ末端アミノ酸欠損を有するコンドロイチナーゼの変異体などの、神経成長阻害作用を阻害するポリペプチドに連結したプロテオグリカン分解ドメインのキメラタンパク質を含む。前記組成物は、Ｌ１神経細胞プロモータードメインなどの神経細胞接着プロモーターであるポリペプチドに連結したプロテオグリカン分解ドメインのキメラタンパク質、もしくはコンドロイチナーゼＡＢＣＩに連結した変異体、或いは１若しくはそれ以上のＮ末端アミノ酸欠損を有するコンドロイチナーゼの変異体を含む。前記キメラタンパク質は、これに限定されるものではないが、例えばＧＧＦ２グリア細胞刺激因子などのグリア細胞刺激因子であるポリペプチドに連結したプロテオグリカン分解ドメインのキメラタンパク質、若しくはコンドロイチナーゼＡＢＣＩに連結した変異体、或いは１若しくはそれ以上のＮ末端アミノ酸欠損を有するコンドロイチナーゼの変異体を含む。
【００１７】
Ｅ．Ｃｏｌｉ（大腸菌）組換え発現システム及び精製工程は、本質的に純粋で、触媒的に活性なコンドロイチナーゼＡＢＣＩを産生するために使用され得る。これらの方法は、プロテオグリカン分解分子及び他の薬剤のキメラの産生に対して修飾される。
【００１８】
前記キメラは、コンドロイチナーゼ酵素活性、および各融合パートナーの特異的生物活性をアッセイされる。前記キメラの活性を測定するための方法は、分光光度計、ザイモグラフィー、二糖類消化産物ＣＳＰＧを検出するためのＨＰＬＣアッセイ、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経突起成長アッセイを含む、コンドロイチナーゼ活性を測定するために用いられた方法に対して修飾される。ニューロン成長錐体破壊アッセイは、ＮＯＧＯ受容体アンタゴニストを評価するために使用され、神経突起成長アッセイは、ＬＩ活性を測定するために使用され得る。ＧＧＦ２活性は、Ｓｃｈｗａｎｎ細胞増殖アッセイを用いて測定される。
【００１９】
本発明の組成物及び方法は、脊髄損傷の治療、及び軸索の再生の促進において使用され得る。本発明の組成物は、アルツハイマー病やパーキンソン病を含む退行性疾患などの疾患の結果として損傷を受けたＣＮＳにおける不機能ニューロンの可塑性、再成長、修復、及び／若しくは再生を促進するために使用される。有利に、本発明の組成物におけるプロテオグリカン分解ポリペプチド或いは膜形質導入ポリペプチドの使用は、損傷或いは疾患組織へのニューロンの再生を促進する他の治療用薬剤の拡散及びアクセスも促進する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
本発明のファイルには、少なくとも１つのカラーで作成された図面／写真を含む。カラー図面／写真を含む本発明のコピーは、特許庁にリクエストし必要経費を支払えば提供されるものである。
【００２１】
本発明の実施形態の他の観点、特徴、利益、及び利点は、以下の説明、添付された請求項、及び添付された図面によって理解されるであろう。
【図１】図１は、ＴＡＴ−コンドロイチナーゼＡＢＣＩコンストラクトの実例である。完全遺伝子断片に対するＤＮＡ配列は、５−グリシンリンカーに続きＴａｔ配列と融合されるものである；５'−ｔａｔｇｔａｔｇｇｔｃｇｔａａａａａｇｃｇｔｃ  ｇｔｃａａｃｇｔｃｇｔｃｇｔｇｇ  ｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｃａ−３'及び５'−ｔａｔｇａｃｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃｇａｃ  ｇａｃｇｔｔｇａｃｇａｃｇｃｔｔｔｔｔ  ａｃｇａｃｃａｔａｃａ−３'という配列を有するセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アニーリングされ、ＮｄｅＩ部位で連結され、これはＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ部位でのｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）内にクローニングされたＡＢＣＩ遺伝子に対する５'末端である。Ｔａｔ４８−５７ペプチド配列（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲ）は、ペンタグリシンリンカーによってＡＢＣＩ配列に連結されているものである。
【図２】図２は、脳切片画像である。（Ｉ）は、β−ガラクトシダーゼのみで（Ｂ&Ｄ）、或いはコンドロイチナーゼＡＢＣＩ（Ａ、０．５Ｕ／ｍｌ或いはＣ、０．００５Ｕ／ｍｌ）を添加して、インキュベートした成体ラットの葉（ｌｏｂｅｓ）を説明したものである。（ＩＩ）コンドロイチナーゼ処理した脳半球の皮質のエオシンＹ通過、及びほぼ同様の通過を示した対照を示したものである。エオシンＹは双性イオンであり、それが使用された低ｐＨで全体的に負電荷を有するものであり、６９２ｋＤａである。（ＩＩＩ）コンゴレッドの飽和溶液は、未処理の脳と比較して、コンドロイチナーゼ処理された脳半球の皮質をよく通過した。コンゴレッドは、負に電荷した６９７ｋＤａの色素である。
【図３】図３において、（Ａ）は、完全長ＧＧＦタンパク質（ＧＧＦ２−Ｍ１−Ｅ４２２）を表した図であり、３つのＧＧＦ２断片は、Ｉｇ及びＥＦＧドメイン単独、及びその組み合わせを有するものである。（Ｂ）は、コンドロイチナーゼＡＢＣＩ及びニューレグリン１遺伝子アイソフォームＧＧＦ２などのプロテオグリカン分解分子のキメラタンパク質の模式図である。
【図４】図４は、（Ａ）ペプチドスペーサー或いはリンキング基を持つ／持たないＮｇＲ２７−３１１−Ｎ末端コンドロイチナーゼＡＢＣＩキメラタンパク質、（Ｂ）ペプチドスペーサー或いはリンキング基を持つ／持たないＮｇＲ２７−３１１−Ｃ末端コンドロイチナーゼＡＢＣＩキメラタンパク質、（ｃ）スペーサー或いはリンキングペプチドを持つ／持たない細胞外ドメインＬ１  Ｎ末端コンドロイチナーゼＡＢＣＩキメラタンパク質、（Ｄ）スペーサー或いはリンキングペプチドを持つ／持たない細胞外ドメインＬ１  Ｃ末端コンドロイチナーゼＡＢＣＩキメラタンパク質の構造を示したものである。
【図５】図５において、（Ａ）コンドロイチナーゼ（コンドロイチナーゼＡＢＣＩ）、ペニシリナーゼ、あるいは人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）で処理した脊髄損傷動物のＢＢＢスコアを示しており、（Ｂ）コンドロイチナーゼ（左列）或いはペニシリナーゼ（右列）で処理した動物の脊髄の傍矢状（Ｐａｒａｓａｇｉｔｔａ）切片を示している。切片は、３０ミクロンで切られた。各セットの画像は、吻側索（ｒｏｓｔｒａｌ  ｃｏｒｄ）を左側に、尾側索（ｃａｕｄａｌ  ｃｏｒｄ）を右側になるように再調整された４つの傍矢状切片を含む。各セットの最も中心の切片は除去され、視覚化を補助するために下に置換されている。画像のペアは、抗−ＧＦＡＰ及びニューロン変性のアミノ第二銅染色によるＷｅｉｌ染色である（上から下）。（Ｃ）と（Ｄ）は、処理群に従ったそれぞれのＢＢＢスコアの分布を示している。スコアは、手術１０週間後のＢＢＢスコアである。群平均地は、データ点の下に記載されている。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の組成物及び方法を記載する前に、本発明は、記載された特定の分子、組成物、方法論、若しくは手順に限定されるものではなく、変更されるものであることが理解される。さらに、本記載において用いられた専門用語は、特定のバージョン或いは実施例のみを説明することを目的としており、添付された請求項によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００２３】
本明細書や請求項で用いられたように、単数形"ａ"、"ａｎ"、及び"ｔｈｅ"は、文脈が明らかに指示しない限り、複数形も含むことに留意されるものである。従って、例えば、"細胞（ｃｅｌｌ）"という言及は、１若しくはそれ以上の細胞、及び当業者に理解されるそれらの同等物を意味することになる。他に定義しない限り、本明細書で用いられた全ての技術用語及び特有な用語は、当業者に共通して理解されているものと同じ意味を有する。あらゆる方法及び材料或いは本明細書に記載されたそれらの同等物は、本明細書の実施例の実行及び試行に使用され得るが、好ましい方法、装置、及び材料は、これから記載されるものである。本明細書で引用される全ての刊行物は、この参照によって組み込まれるものである。本明細書は、本明細書が先行発明の長所によってそのような開示を先行する権利がないということを許可するものとは考えられない。
【００２４】
"任意の"或いは"任意で"とは、その後に記載されたイベント或いは状況が生じる若しくは生じないこと、及びその記載がそのイベントが起こる場合及びそれが起こらない場合を含むことを意味している。
【００２５】
ＣＳＰＧｓを切断する適切な酵素は、コンドロイチナーゼＡＢＣタイプＩ、コンドロイチナーゼＡＢＣタイプＩＩ、コンドロイチナーゼＡＣ及びコンドロイチナーゼＢ、若しくは、ヒアルロニダーゼ１、ヒアルロニダーゼ２、ヒアルロニダーゼ３、ヒアルロニダーゼ４、カテプシン、ＡＤＡＭＴｓ及びＰＨ−２０などのコンドロイチナーゼ様活性を有する哺乳類酵素、若しくはそれらの混合物を含む。
【００２６】
ＣＳＰＧｓは、コアタンパク質のプロテオグリカンのファミリーであり、硫酸グリコサミノグリカンと共有結合的に連結している。多糖鎖は、コンドロイチナーゼのファミリーを含むいくつかの酵素によって切断される。現在まで、この酵素ファミリーは、少なくとも４つのメンバー、コンドロイチナーゼＡＢＣＩ、ＡＢＣＩＩ、ＡＣ及びＢを含む。コンドロイチナーゼＡＢＣＩは、コンドロイチン及びデルマタン硫酸の両者を切断するエキソ−リアーゼである。これは、ＣＳＰＧを多く含む基質を越えるｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経再生の研究において、さらに最近ではＣＮＳ傷害後のｉｎ  ｖｉｖｏ研究大規模に使用されていた。
【００２７】
本発明の組成物及び融合タンパク質において使用されたタンパク質及びポリペプチドは、傷害或いは疾患ニューロン及び軸索の再生、及び可塑性を促進するものである。これらの再生タンパク質及びポリペプチドは、細胞接着タンパク質、グリア細胞を刺激するタンパク質及びポリペプチド、及び軸索成長阻害因子として作用するタンパク質の阻害作用を阻害するポリペプチドを含む。
【００２８】
神経系の可塑性とは、あらゆるタイプの機能的再組織化を意味している。この再組織化は、発生、学習と記憶、及び脳修復によって生じる。可塑性によって生じる構造変化は、シナプス形成、シナプス除去、神経突起発芽を含み、存在するシナプスの伸長或いは減退も含む。再生は、再生の特徴である破壊された神経束における軸索の長期成長によって、可塑性とは一般的に区別される。
【００２９】
神経成長阻害分子の活性を阻害することができるタンパク質及びポリペプチドは、これに限定されるものではないが、Ｎｏｇｏ、ＭＡＧ、ＯＭｇｐなどのペプチドの阻害特性を阻害するペプチド及びポリペプチドを含む。神経成長阻害分子の活性を克服する適切な組成物は、これに限定されるものではないが、プロテインキナーゼＣファミリー阻害剤、Ｒｈｏキナーゼファミリー阻害剤、及び細胞内環状ＡＭＰを増加するホスホジエステラーゼ阻害剤などの薬剤、及びＬ１を含む。（ＮｇＲ２７−３１１）ペプチドは、膜結合性ＮｏｇｏＲへのＮｏｇｏ６６、ＯＭｇｐ、ＭＡＧ、及びＭＯＧの結合を阻害し、神経プロセスの再生に対するＮｏｇｏｎｏ阻害作用を克服する。
【００３０】
細胞接着に影響を及ぼし、細胞を刺激するタンパク質及びポリペプチドは、これに限定されるものではないが、Ｌ１及びＧＧＦ２などのポリペプチドを含む。Ｌ１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経突起成長の強力な刺激因子である神経細胞接着タンパク質であり、これによってＬ１の可溶性形態を用いたげっ歯類における急性ＳＣＩの治療は、神経性機能の回復の増加を導くことが発見された。ＧＧＦ２は、グリア細胞を刺激し、再ミエリン化を促進するためのオリゴデンドロサイトの刺激の結果とおおよそ同様に、実験性アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）のマウスモデルにおいて測定された臨床成果を改良すると示された。
【００３１】
本発明を実行するのに有用な細胞膜−浸透ペプチド配列は、これに限定されるものではないが、ＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ−５１（ＨＩＶ−１  Ｒｅｖタンパク質塩基性モチーフ；配列ＩＤ番号：５１）、ＭＰＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＫＲＰＰＴＰ−１１９（ＨＴＬＶ−１  Ｒｅｘタンパク質塩基性モチーフ；配列ＩＤ番号：５２）（Ｋｕｂｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．１９８９）、アンテナペディア（Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）のホメオドメイン第３へリックス（Ｄｅｒｏｓｓｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１８１８８〜９３）（４３−ＲＱＩＬＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＬＬ−５８；配列ＩＤ番号：５３）、抗ＤＮＡモノクローナル抗体の重鎖可変部由来のペプチド（Ａｖｒａｍｅａｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｓ．Ｓｃｉ．９５：５６０１〜０６，１９９８）（ＶＡＹＩＳＲＧＧＶＳＴＹＹＳＤＴＶＫＧＲＦＴＲＱＫＹＮＫＲＡ；配列ＩＤ番号：５４）、及び単純ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質（Ｅｌｌｉｏｔ  ａｎｄ  Ｏ'Ｈａｒａ，Ｃｅｌｌ，８８：２２３〜３３，１９９７）（１−ＭＴＳＲＲＳＶＫＳＧＰＲＥＶＰＲＤＥＹＥＤＬＹＹＴＰＳＳＧＭＡＳＰＤＳＰＰＤＴＳＲＲＧＡＬＱＴＲＳＲＱＲＧＥＶＲＦＶＱＹＤＥＳＤＹＡＬＹＧＧＳＳＳＥＤＤＥＨＰＥＶＰＲＴＲＲＰＶＳＧＡＶＬＳＧＰＧＰＡＲＡＰＰＰＰＡＧＳＧＧＡＧＲＴＰＴＴＡＰＲＡＰＲＴＱＲＶＡＴＫＡＰＡＡＰＡＡＥＴＴＲＧＲＫＳＡＱＰＥＳＡＡＬＰＤＡＰＡＳＲＡＰＴＶＱＬＷＱＭＳＲＰＲＴＤＥＤＬＮＥＬＬＧＩＴＨＲＶＴＶＣＥＧＫＮＬＬＱＲＡＮＥＬＶＮＰＤＶＶＱＤＶＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＥ−２４６；配列ＩＤ番号：５５）を含む。好ましい実施例において、前記塩基性ペプチドは、ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）Ｔａｔタンパク質（Ｆａｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９１：６６４〜６８，１９９４）から派生することができる。特に、Ｔａｔペプチドは、前記Ｔａｔタンパク質塩基性ペプチドモチーフ３７〜７２のあらゆる配列残基から成ることができる（Ｖｉｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）（３７−ＣＦＩＴＫＡＬＧＩＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＳＱＴＨＱＶＳＬＳＫＱ−７２；配列ＩＤ番号：５６）。アミノ酸残基の最小値は、約３から約６、好ましくは約３から約５、最も好ましくは約４、すなわち１つのアルファへリックスターンにとって最小限必須である範囲であり得る。好ましい実施形態は、Ｔａｔタンパク質残基４８〜５７（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；配列ＩＤ番号：５７）を有している。
【００３２】
最適なＰＴＤドメインは、ＴＡＴタンパク質から由来したドメインを含む。ＴＡＴタンパク質及びペプチドＴａｔは、ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）の複製に関連する８６−アミノ酸タンパク質である。前記ＨＩＶ−１Ｔａｔトランス活性化タンパク質は、細胞によって効率的に取り込まれ（Ｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｋｅｌ  １９９１；Ｖｉｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９４）、低濃度（ｎＭ）でＨＩＶ−１プロモーターから発現されるレポーター遺伝子をトランス活性化するのに十分である（Ｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｋｅｌ  １９９１）。外因性Ｔａｔタンパク質は、形質膜を通って転位（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅ）可能であり、核に到達し、ウイルスゲノムをトランス活性化する。
【００３３】
塩基性アミノ酸のクラスターの中心に位置するＴａｔタンパク質の領域は、この転位活性の原因であると考えられる（Ｖｉｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）。Ｔａｔペプチド仲介細胞性取り込み、及び核転移は、いくつかのシステムにおいて示されていた（Ｖｉｖｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：１６０１０〜１６０１７，１９９７；Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １１：２５９３〜２５９９，１９９７）。いくつかのタンパク質と化学的にカップリングしたＴａｔ−由来ペプチド（残基３７〜７２）は、いくつかの細胞株或いは組織におけるそれらの内部移行を生じる（Ｆａｗｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：６６４〜６６８，１９９４；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９４：８７６〜８８８４，１９９３；Ｆａｈｒａｅｕｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  ６：８４〜９１，１９９６；Ｎａｇａｈａｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ４：１４４９〜１４５２，１９９８）。Ｔａｔ塩基性アミノ酸４８〜６０から成り、蛍光マレイミドと連結したＣ末端にシステイン残基を有する合成ペプチドは、蛍光顕微鏡によって決定されたように、細胞核に転位置させる（Ｖｉｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）。さらに、Ｔａｔアミノ酸４８〜５９から成り、それらのアミノ末端がベータ−ガラクトシダーゼアミノ酸９〜１０２３と融合している融合タンパク質（Ｔａｔ−ＮＬＳ−ベータ−Ｇａｌ）は、ＡＴＰ依存性でサイトゾル因子非依存性の様式で細胞核へ転位置させる（Ｅｆｔｈｙｍｉａｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。
【００３４】
キメラタンパク質（本分野では融合タンパク質とも言及される）は、２若しくはそれ以上の前駆体タンパク質或いはペプチドの少なくとも部分を組合わせるハイブリッドタンパク質である。キメラタンパク質は、組換え技術によって、すなわち１遺伝子のコード配列の少なくとも一部を別の遺伝子のコード配列の少なくとも一部と融合することによって産生させる。望ましくは、リンカーペプチドに対して１若しくはそれ以上の遺伝子は、前記融合タンパク質における他のポリペプチドドメインに対する遺伝子のコード配列と融合されるものである。次に、前記融合された遺伝子は、これに限定されるものではないが、例えばＥ．Ｃｏｌｉ（大腸菌）或いはＣＨＯ細胞などの安定な生物を形質転換するために使用され、この生物は次に前記融合タンパク質を発現する。
【００３５】
融合タンパク質のポリペプチドドメインのＮ或いはＣ末端欠損変異をコードする遺伝子は、前記融合タンパク質の発現のためのコンストラクトにおいて使用される。好ましくは、産生された欠損変異体は、その触媒性プロテオグリカン分解活性、阻害活性、成長活性、或いは形質導入活性を維持している。前記変異体がＮ及び／若しくはＣ末端から一定数のアミノ酸を欠損している、コンドロイチナーゼＡＢＣＩ酵素のようなプロテオグリカン分解分子の産生欠損変異体は、いくつかのプロテオグリカン分解活性を保持するものである。コンドロイチナーゼＡＢＣＩのようなコンドロイチナーゼのＮ末端欠損は、Ｎ末端へ連結されるヒスチジン−タグを維持する。ＴＡＴ−欠損変異体コンドロイチナーゼＡＢＣＩ融合ＤＮＡコンストラクトは、発現の間、ＴＡＴポリペプチドの除去なしに発現され得る。例えば、ＡＢＣＩ−ＮΔ２０或いはＡＢＣＩ−ＮΔ６０欠損変異のＮ末端の融合ＴＡＴペプチドなどである。図３に示されたような、ＧＧＦ２に対するポリペプチドの断片は、キメラ融合タンパク質のコンストラクトにおいて使用される。
【００３６】
コンドロイチナーゼＡＢＣＩの触媒的に活性な欠損変異体は、例えば、これに限定されるものではないが、成熟ＡＢＣＩタンパク質のＮ末端からそれぞれ２０、４０及び６０アミノ酸を欠損するように調整される。Ｎ末端からの６０アミノ酸の欠損、及びＣ末端からの８０アミノ酸の欠損も、プロテオグリカン分解コンドロイチナーゼＡＢＣＩの欠損変異体を作成するために用いられる。これらの欠損変異体、及び他のプロテオグリカン分解分子のそれらは、Ｎ末端融合キメラタンパク質のコンストラクションに使用される。詳細な比較生化学研究は、組成物中の成熟コンドロイチナーゼＡＢＣＩ対様々な欠損変異体、及び基質特異性、基質結合及び組織通過に関する融合タンパク質の効率を決定するために行われた。
【００３７】
未変性なタンパク質構造を有しているが、触媒活性を欠いているコンドロイチナーゼＡＢＣＩの変異体は、生物検定及びＳＣＩ研究のためにヌル或いはネガティブ対照として調整される。コンドロイチナーゼＡＢＣＩの結晶構造に基づいて、推定上の活性部位において触媒活性をノックアウトするような、Ｈ５０１ａ及びＹ５０８ａと命名された部位特異的変異体が調整された。そのような変異体は、触媒活性の不活性化及びＳＥＣに対してテストされ、野生型酵素と比較した。ヌル活性変異体がうまく作成された場合、それは生物検定及に、最終的にはＳＣＩ動物研究において使用するための様々な融合タンパク質に対するネガティブ対照を提供する。
【００３８】
Ｅ．Ｃｏｌｉ（大腸菌）発現システムは、ＰＥＴ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いてコンドロイチナーゼを作成する。ＧＧＦ２−コンドロイチナーゼ融合タンパク質は、Ｅ．Ｃｏｌｉにおいて発現される。Ｔａｔ−コンドロイチナーゼ欠損変異体融合タンパク質、Ｔａｔ−ＧＧＦ２融合タンパク質、或いはＴａｔ−コンドロイチナーゼ−ＧＧＦ２融合タンパク質に対するコンストラクトは、Ｅ．Ｃｏｌｉから発現される。他の融合タンパク質は、ＣＨＯ細胞株において発現され得る。
【００３９】
表１は、様々な制限されない構成成分を説明したものであり、混合物として、好ましくは融合或いはキメラ分子としての本発明の組成物において使用されるものである。記載された前記組成物若しくはキメラ分子は、表１の分子の１若しくはそれ以上を含む。キメラ分子の場合、１若しくはそれ以上のリンカーセグメント、好ましくはポリペプチドが使用される。
【００４０】
【表１】
2020111578.tif 000002
【００４１】
本発明のキメラ融合タンパク質の限定されないバージョンの模式図は、図４Ａ及び図４Ｂに説明されている。
【００４２】
表１のあらゆるコラムからのペプチド構成成分は、例えばＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−などの、グリシンリッチペプチドとして当業者には既知であるオリゴペプチドリンカーによって連結され得る、若しくは天然由来アミノ酸、４−アミノブチル酸或いは６−アミノカプロン酸のような置換若しくはベータ或いはガンマアミノ酸を含む調整リンカーが用いられ得る。これに限定されるものではないがアルキルジアミン、アミノ或いはアルキルジオールを含む他のリンカーも使用される。好ましくは、前記融合タンパク質の形質導入構成成分は、前記キメラタンパク質の末端部分に存在する。共通リンカーの他の例は、これに限定されるものではないが、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリッチリンカー（例えばＧｌｙ４Ｓｅｒ３）、若しくはＧｌｙ／Ａｌａリッチリンカーを含む。さらに、リンカーは、任意の長さであり、前記融合タンパク質における構成成分の移動性を促進する或いは制限するように設計される。
【００４３】
合成非天然アミノ酸を含む非天然アミノ酸の取り込み、若しくは本発明の１若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸のペプチド（或いは前記複合体の他の構成成分）（本明細書において"Ｄ−ペプチド"としてその後言及される）への取り込みは、多くの異なる方法において有利である。Ｄ−アミノ酸含有ペプチドは、Ｌ−アミノ酸含有対応物と比較して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ或いはｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性を増加すると示した。従って、、Ｄ−アミノ酸を取り込んだペプチドの構成は、より優れた細胞内安定性が必要或いは要求されている場合、特に有用である。より特異的には、Ｄ−ペプチドは内在性ペプチダーゼ及びプロテアーゼに対して耐性であり、それによって連結薬剤或いは共役物のより優れた経口経上皮運搬及び経皮性運搬を提供し、膜透過性複合体の生物学的利用能を改善し、そのようなペプチドが望ましい場合、血管内及び間質性寿命を延長する。Ｄ−ペプチドの使用は、連結薬剤及び他のカーゴ分子の経皮性及び経口経上皮運搬も増強できる。
【００４４】
脊髄損傷において、上行性感覚ニューロン及び下行性運動ニューロンの軸索は破壊され、感覚の欠損及び運動麻痺を生じる。これらの軸索は、再生に失敗し、永久の身体障害を導くものである。もろい組織の領域を囲むと考えられている損傷の部位である瘢痕包膜は、血液脳関門を安定化し、制御できない組織損傷の不可抗力のカスケードを防ぐ。この瘢痕は、肥大性グリア細胞及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）から構成されている。コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧｓ）は、前記瘢痕の１つの重要な構成成分である。それらは、グリア細胞から発現され、血液脳関門崩壊の領域のＥＣＭに堆積される。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結果によって、これらのＣＳＰＧｓは軸索の成長に対して潜在的に阻害性であり、理論に縛られることを望まないで、脊髄軸索が機能的シナプスを再生及び再編成できない一因となると考えられる。Ｉｎ  ｖｉｖｏ研究によって、再生している軸索は、瘢痕へ及び上で成長できることが示された。
【００４５】
ＣＳＰＧｓ及び白質構成成分は、傷害後、機能的連結を再生及び再設立するためにニューロンが克服しなくてはならない分子関門として一般的に受け入れられている。形成瘢痕の末梢側に位置付けられた移植成体感覚ニューロンは、白質経路が変性している間でさえ頑強に再生できるが、再生は軸索がプロテオグリカン含有グリア性瘢痕へ入った時突然終わる。ＣＮＳ白質経路をコンドロイチナーゼで処理すると、これらの基質へ成長するためのニューロンの能力を増強する。
【００４６】
中枢神経系組織は、細胞できつく詰められており、限られた細胞外スペースを有している。前記細胞外マトリックスのタンパク質と糖鎖は、電化と浸透力を提供し、さらに治療薬剤の通過を阻止する特異的結合部位及び非特異的結合部位を提供する。これらマトリックス及び細胞性構成成分の酵素的切断は、化合物或いは細胞の組織を通るアクセスを促進する。コンドロイチナーゼＡＢＣＩのようなプロテオグリカン分解分子は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを消化する酵素であり、治療用分子のＣＮＳへの拡散を促進するために使用され得る。共有結合的に結合した生物学的に活性なカーゴ分子を原形質及び細胞の核へ輸送するためのＴａｔペプチドである。ＨＩＶ  ｔａｔタンパク質のようなタンパク質形質導入ポリペプチドドメインを有する融合タンパク質の場合において、軸索再生のための治療用分子は、血管脳関門を越えて運搬される。
【００４７】
ＳＣＩモデル傷害、好ましくは挫傷モデル傷害の治療は、本発明の組成物及び方法によって達成される再生及び機能回復の程度を決定するために使用され得る。機能回復の程度は、改善された皮質脊髄路伝導、改善されたテープ除去、ビーム移動、グリッド移動、及び脊柱破壊のコンドロイチナーゼ処理に続く足交換によって説明され得る。運動スキル改善及び自律神経性機能（腸、膀胱、感覚及び性機能）も、機能改善の基準として使用され、本発明の組成物における分子構造及び構成成分に関連する。
【００４８】
コンドロイチナーゼの再生を増強する能力に加えて、コンドロイチナーゼはニューロン周囲ネットワーク（ＰＮＮ）の構成成分を消化する。ＰＮＮの密度は、ＣＮＳ内で可変的であり、体性感覚、聴覚、視覚皮質、および海馬において特に高密度である。ＰＮＮは、脊髄運動ニューロンの周りでも高密度であると示されていた。本発明者らは、索の後角内の高密度ＰＮＮを発見した。ＰＮＮの消化は、海馬及び視覚皮質内の可塑性を増強できる。不完全ＳＣＩにおける、特に中心パターン発生器の領域における或いは網状コアにおける無傷システム内の可塑性は、損傷或いは破壊されたシステムの機能を補助する。これらのシステムにおける可塑性の促進は、コンドロイチナーゼがＣＮＳ損傷に続く機能を改善できることによる再生以外の、或いはそれに加えての１つのメカニズムである。さらに、再生及び可塑性は、損傷に続く回復に一致協力して影響を及ぼし、実は、皮質脊髄路は脊髄可塑性を調節するために重要であることが示された。
【００４９】
ＣＮＳにおける挫傷損傷、或いは病態に続く神経性機能の回復は、前記融合タンパク質若しくは１若しくはそれ以上の表１の構成成分を含む混合物を、細胞、組織、或いは損傷或いは病気のニューロンを有する（前記損傷及び病気は、即時若しくは長年にわたるものである）対象へ投与することによって促進される。
【００５０】
本明細書の前記融合タンパク質は、ＣＳＰＧｓを分解するのに有効な量で投与され、それによって神経性機能の回復を促進する。一度、前記組成物中のタンパク質或いはポリペプチドが望ましい程度まで精製されたら、それらは、ＳＣＩ治療のために適切な生理学的担体或いは賦形剤に懸濁される、若しくは希釈される。ＳＣＩのモデルにおいて、ラットにおける効果的なくも膜下腔内用量は、１日おきに１４日間、約０．０６ユニットであった。７９キログラムヒトに対する用量は、約１７ユニットである。約１００ユニット／ミリグラムで、これは約１７０マイクログラムと同じである。２０ユニットまでの用量は、ラットにおいて安全であった。混合物における若しくは担体或いは薬学的に許容可能な賦形剤内に希釈された融合タンパク質の部分としてのプロテオグリカン分解分子を含む組成物は、一般的に１μｇ〜５００ｍｇ／ｋｇの宿主の範囲の濃度で注射され得る。前記薬剤の投与は、大量瞬時投与注射、静脈内運搬、連続注入、移植片からの除放、或いは除放性医薬品によって行われる。投与は、筋肉内、腹膜、皮下、静脈内などの注射によって行われる。経口投与は、錠剤或いはカプセルを含み、好ましくは、前記経口用量は、１日に１若しくは２回投与に対して除放性処方である。経皮的投与は１日１回であり、好ましくは１日１回以下の投与である。ヒト患者或いは他のほ乳類対象への投与は、患者において自律性或いは運動における機能測定可能な改善が達成されるまで継続される。
【００５１】
コンドロイチナーゼＰＴＤ融合タンパク質は、適切な薬学的担体と共に投与され得る。混合物或いはキメラタンパク質としての本発明の前記組成物の投与は、局所性（ｔｏｐｉｃａｌ）、局在性（ｌｏｃａｌ）或いは全身性であり得る。前記キメラ融合タンパク質は、遺伝的な細胞によって分泌され、好ましくは、コンドロイチナーゼのようなプロテオグリカン分解部分、及びＴＡＴのような形質導入ポリペプチド部分を有するキメラ融合タンパク質は、遊離して或いはカプセル内において、ＣＮＳ損傷の部位で或いはその周辺に移植される遺伝子改変細胞によって分泌され得る。混合物或いは融合タンパク質としての前記組成物が一度投与されると、ＣＳＰＧｓの分解は、神経突起成長を阻害する阻害性分子を除去し、患部への神経突起の再生を可能にする。例えば、コンドロイチナーゼＡＣ及びコンドロイチナーゼＢは、それぞれＣＳ及びＤＳを分解し、不飽和硫酸二糖類を生じる。コンドロイチナーゼＡＣは、ＣＳの多糖バックボーンにおけるＮ−アセチルガラクトサミンとグルコロン酸との間の１，４グルコシド結合でＣＳを切断する。切断は、ランダム内部溶解性（ｅｎｄｏｌｙｔｉｃ）作用パターンにおけるベータ−除去を介して生じる。コンドロイチナーゼＢは、ＤＳの多糖バックボーンにおける１，４ガラクトサミンイズロン酸結合を切断する。ＣＳ及びＤＳ両者の切断は、これらの酵素メカニズムは哺乳類ＧＡＧ分解酵素とは異なっているベータ−除去プロセスを介して生じる。コンドロイチナーゼＡＢＣＩ、コンドロイチナーゼＡＢＣＩＩは、ＣＳ及びＤＳ両者を切断するエクソ（外部）及びエンド（内部）溶解性である。グリア性瘢痕からのＣＳ及びＤＳの除去は、患部への神経突起成長の再生を可能にする。
【００５２】
これらの融合ポリペプチドの任意の混合物は、これに限定されるものではないが、挫傷傷害、外傷性脳損傷、脳損傷、脳卒中、多発性硬化症、腕神経叢損傷、ａｍｂｌｉｏｐｈｉａ、脊椎損傷を含むＣＮＳ損傷及び疾患に対する治療を提供するために使用される。脊椎損傷は、交通事故、墜落、挫傷、或いは銃創、及び他の傷害によってもたらされたニューロンの挫滅などの疾患及び外傷性損傷を含む。本発明の方法の実行は、対象の運動性強調機能及び感覚認識の少なくとも１つにおいて臨床的に関連性のある改善を提供し、治療される動物に対して臨床的利点をもたらすことができる。臨床的に関連性のある改善は、ＣＮＳの障害した機能或いは欠如した機能の検出可能な改善から完全な修復までの範囲である。
【００５３】
患部ＣＮＳ領域への神経細胞の再生は、運動及び感覚機能の回復を可能にする。臨床的に関連性のある改善は、障害した或いは欠如した神経機能の検出可能な改善から完全な修復までの範囲であり、個々の患者及び損傷によって変わる。
【００５４】
タンパク質及びそれらの断片の変異体は、完全タンパク質或いは断片と実質的に類似で、完全なタンパク質或いは断片の生物活性と実質的に類似な生物活性を有している分子を言及する。分子は、両分子が実質的に類似な構造を有する、若しくは両分子が同様な生物活性を有する場合、別の分子と実質的に類似である。
【００５５】
補体タンパク質或いはそれらの断片の変異体は、化学的或いは組換え手段によって賛成される。融合タンパク質を発現するように構成された前記ポリペプチドの変異体も作成される。前記変異体は、例えば、欠損型、若しくはアミノ酸配列内へのアミノ酸残基の挿入体或いは置換体、若しくは特定の融合タンパク質或いは前記融合タンパク質内のポリペプチドドメインをコードしている配列核酸の欠損、置換或いは挿入を含む。例えば、いくつかのケースにおいて、コンドロイチナーゼポリペプチドからの１若しくはそれ以上のアミノ酸残基の除去は、そのＣＳＰＧ分解活性の著しい変化なしになされ得る。プロテオグリカン分解或いは軸索成長阻害因子に対する阻害活性のような機能的特性における実質的な変化は、保存されていない、すなわち構造維持、電荷、或いは置換領域のペプチドバックボーンの疎水性に対する影響が著しく異なる、置換を選択することによってなされる。
【００５６】
多くの欠損、挿入、及び置換は、前記タンパク質分子の特性においてラジカル変化を産生するとは考えられないが、置換、欠損、或いは挿入の正確な影響をそうなる前に予想することは難しく、当業者は、この影響は日常的なスクリーニングアッセイによって評価されることを理解するであろう。例えば、前記ポリペプチド分子の軸索再生特性における変化は、おおよそプロテオグリカン分解を介して、機能的回復テスト、及びＣＳＰＧ二糖消化産物を検出するためのＨＰＬＳアッセイを用いて測定され得る。
【００５７】
本発明は、ＣＮＳ或いは神経組織損傷が疾患或いは外傷によって生じているＣＮＳの部位へ目的の分子を運搬するために、プロテオグリカン分解分子であるＨＩＶ  ｔａｔタンパク質或いはｔａｔ−由来ポリペプチド、若しくは混合物或いは融合タンパク質としてのそれらの組み合わせの使用に関するものである。特に、前記ＣＮＳにおける損傷部位は、挫傷損傷の結果として瘢痕が生じた部位である。目的の分子（任意に薬剤或いはカーゴ分子として言及する）は、可塑性、軸索成長を促進する治療用分子、診断用分子、或いはプロテオグリカン分解分子である。ＨＩＶ  ｔａｔタンパク質のようなタンパク質形質導入ポリペプチドドメインを有する融合タンパク質の場合、軸索再生に対する治療用分子は、血液脳関門を越えて運搬され、プロテオグリカン分解分子は、細胞内へ運搬され、プロテオグリカンの細胞貯蔵を分解し、軸索再生を促進する。
【００５８】
本発明のポリペプチドの輸送は、化学的クロスリンクによって、或いは遺伝的融合によってカーゴ分子へ有利に接着される。独特の末端システイン残基は、化学的クロスリンクの好ましい手段である。本発明の同様な好ましい実施形態によると、輸送部位のカルボキシ末端は、前記カーゴ部位のアミノ末端に一般的に融合される。本発明の実施形態は、ｔａｔ残基４７〜５８に続き、コンドロイチナーゼポリペプチドに続くアミノ末端メチオニンから成る。
【００５９】
ｔａｔタンパク質を作る完全８６アミノ酸は、ｔａｔの取り込み活性に必要ではない。例えば、８６アミノ酸より小さいが、細胞への取り込みが見られる或いは血液脳関門を通過できるタンパク質断片或いはペプチドは、使用され得る（機能的に有効なｔａｔの断片部分）。例えば、残基１〜７２から成るｔａｔタンパク質は、取り込み活性に対しては十分であり、ｔａｔ残基１〜６２は、異種性タンパク質の細胞への侵入を仲介できる。ｔａｔ残基１〜５８から成る合成ペプチドは、取り込み活性を有することができる。
【００６０】
前記ｔａｔタンパク質は、ｔａｔタンパク質中に存在する単一（すなわち連続性）アミノ酸配列であり得る、若しくは、ｔａｔタンパク質中に存在するが、天然由来タンパク質中では他のアミノ酸配列によって分離されている、２若しくはそれ以上のアミノ酸配列であり得る。ここで用いられたように、ｔａｔタンパク質は、天然由来ｔａｔタンパク質、その機能的同等物、或いは機能的に同等なそれらの断片（ペプチド）の配列と同じ天然由来アミノ酸配列を含む。そのような機能的同等物或いは機能的に同等な断片は、細胞への取り込み活性を有しており、血液脳関門を通過することができ、天然由来ｔａｔタンパク質と実質的に類似である。Ｔａｔタンパク質は、天然由来ソースから得られる、或いは遺伝子工学技術或いは化学合成を使用して産生され得る。
【００６１】
天然由来ＨＩＶ  ｔａｔタンパク質のアミノ酸配列は、天然由来ｔａｔタンパク質に存在するとも１つのアミノ酸の付加、欠損及び／若しくは置換によって修飾され得、修飾ｔａｔタンパク質を産生する（ここにおいては、ｔａｔタンパク質或いはポリペプチドとして言及される）。従って、増加した安定性を有する修飾ｔａｔタンパク質或いはｔａｔペプチド類似体は、既知技術を用いて産生される。従って、ｔａｔタンパク質或いはペプチドは、天然由来ｔａｔタンパク質或いはそれらの部分と同一ではないが、実質的に類似なアミノ酸配列を有している。さらに、コレステロール或いは他の脂質誘導体は、ｔａｔタンパク質に付加され、膜溶解度の増加した修飾ｔａｔを産生する。
【００６２】
天然由来ＨＩＶ−１  ｔａｔタンパク質は、１６アミノ酸中７つがシステインである領域（アミノ酸２２〜３７）を有している。これらのシステイン残基は、お互いに、他のｔａｔタンパク質分子のシステインリッチ領域におけるシステイン残基と、及びカーゴタンパク質或いは共役カーゴ部位のシステイン残基と、ジスルフィド結合形成することができる。そのようなジスルフィド結合形成は、カーゴの生物活性の欠損を引き起こすことができる。さらに、カーゴ部位へのジスルフィド結合の可能性がない場合（例えば、カーゴタンパク質がシステイン残基を持たない場合）でさえ、輸送ポリペプチド間のジスルフィド結合は、輸送ポリペプチド、輸送ポリペプチド−カーゴ共役、或いはその両方の凝集及び不溶性を導くことができる。ｔａｔシステインリッチ領域は、ジスルフィド結合形成を回避する、及び輸送ポリペプチド、輸送ポリペプチド−カーゴ共役、或いはその両方の凝集及び可溶性を阻害するように除去される。
【００６３】
コンドロイチナーゼも、皮質、海馬、及び脊髄を含む、著しい高密度ＰＮＮを有するＣＮＳの領域の可塑性を促進することができる。再生、出芽、及び可塑性を含むいくつかの効果の組み合わせは、ＳＣＩの後にコンドロイチナーゼ治療による、若しくはコンドロイチナーゼ或いは他のプロテオグリカン分解分子を含む融合タンパク質での治療による機能の改善に関与するということは、適切である。
【００６４】
ＮｂＲ２７−３１１：Ｎｏｇｏは、高分子量ミエリン構成成分であり、神経突起成長を阻害する。アミノ末端領域（Ｎｏｇｏ６６）は、神経突起成長の阻害に特に関連する分子の一部である。発現クローニング方法によって、Ｎｏｇｏ６６（ＮｇＲ）に対する受容体は、ニューロンに主に発現したＧＰＩアンカー糖タンパク質であることが明らかになった。ＮｇＲは、Ｎｏｇｏだけでなく、ＭＡＧ及びＭＯＧなどの他のミエリン関連阻害因子とも相互作用する。ニューロン上のミエリンの阻害特性におけるその主要な役割に起因して、ＮｇＲは、そのリガンドとのその相互作用を拮抗するためのアプローチとしての標的であった。ＮｇＲの可溶性断片は、Ｎｏｇｏ６６、ＭＡＧ、及びＭＯＧと相互作用する。その領域は、残基２７〜３１１にわたり、従ってこのＮｇＲ断片は、ニューロンのミエリン関連性阻害を干渉するデコイ受容体として作用する。ＮｇＲ２７−３１１が、コンドロイチナーゼＡＢＣＩのようなプロテオグリカン分解分子と連結しキメラ融合タンパク質を形成する場合、前記融合タンパク質のＮｇＲ２７−３１１ペプチドドメインは、神経突起成長のミエリン−関連性阻害を制限し、脊髄損傷のコンドロイチナーゼ分解領域における軸索再生を促進すると予想される。
【００６５】
クローン（ＮｇＲ２７−３１１）のために、目的物の正確な領域或いは断片は、最初のクローンから派生された。ＮｇＲ２７−３１１、その断片、及びＮｇＲ２７−３１１を含む融合ポリペプチドの生物学的活性は、ニューロンにおける成長錐体の破壊に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いて確認される。成長錐体破壊アッセイは確立され、ＭＡＧ或いはＮｏｇｏ６６の付加は、用量依存的に成長の破壊を引き起こす。ＮｇＲ２７−３１１、その断片、及びＮｇＲ２７−３１１を含む融合ポリペプチドの生物活性が活性である場合、それらはＭＡＧ及びＮｏｇｏ６６仲介性成長錐体破壊が見られる。成長錐体破壊データは、Ｎｏｇｏ６６及びＭＡＧに反応したＤＲＧニューロンの顕微鏡写真の検討によって収集される。
【００６６】
Ｌ１ポリペプチドは、細胞接着分子の免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、成長中の軸索、グリア前駆体細胞、及びシュワン細胞に一生の間発現されるが、ＣＮＳにおける発現は限定されている。Ｌ１は、それ自体、ＦＧＦ受容体などの他の細胞外分子を相互作用し、神経突起線維束形成及び成長を促進する。Ｌ１の発現は、軸索再生が許容的な環境に一般的に関連しており、目的Ｌ１の正確な領域或いはＬ１の断片は、最初のクローンから派生される。例えば、Ｌ１を発現するシュワン細胞は、末端神経再生を補助し、軸索成長は、アストロサイトにおいてＬ１を発現するトランスジェニックマウスからの視神経において観察される（野生型視神経においては観察されない）。Ｌ１を発現するように設計された線維芽細胞は、脊髄へ移植された場合、軸索成長を補助する。最終的に、Ｆｃに連結されたＬ１の可溶形態は、急性ＳＣＩ後の機能的回復を促進した。Ｌ１が、融合タンパク質中のコンドロイチナーゼＡＢＣＩのようなプロテオグリカン分解分子に連結される場合、前記融合タンパク質が、脊椎損傷のコンドロイチナーゼ消化領域における軸索成長を促進すると予想することは適切である。
【００６７】
ニューレグリン及びそれらの受容体は、多様な成長因子、及びＣＮＳ、筋肉上皮及び他の組織の器官形成に重要であると示されている受容体チロシンキナーゼシステムを有している。ＧＧＦ２は、ニューレグリン１遺伝子の可溶性アイソフォームである。これは最初、シュワン細胞分裂促進因子３２として特徴付けられたが、配列研究によって、オリゴデンドロサイト、ニューロン、及び他の細胞タイプにおいて直接作用することが示された。ＧＧＦ２は、脱髄及び炎症を減少し、多発性硬化症のマウスモデルにおける再ミエリン化を増強する。これらの結果に基づいて、組換えヒトＧＧＦ２は、ＳＣＩに関連した脱髄に対する潜在的な治療であると予想することは適切である。ＧＧＦ２は、コンドロイチナーゼＡＢＣＩのようなプロテオグリカン分解分子に連結されているため、ＳＣＩのコンドロイチナーゼ消化領域における軸索の再ミエリン化を促進すると予想することは適切である。
【００６８】
【表２】
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【００６９】
プロテオグリカン分解分子、及び軸索成長阻害因子の活性を阻害する分子などの、混合物或いは融合タンパク質としての本発明の組成物の有効性は、確証ラットＳＣＩモデルを用いてＳＣＩ重症度の３つの異なるレベルで評価され得る。
【００７０】
コンドロイチナーゼＡＢＣＩのようなプロテオグリカン分解分子は、天然由来酵素として少量で商業的に利用可能であり（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、プロテウス・ブルガリスから精製された酵素として本質的に同じ活性を有するように、組換え産物システムによって作成され得る。ゲノムＤＮＡは、ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプロテウス・ブルガリスから単離され得る。ＰＣＲプライマーは、５'末端のＮｄｅＩ制限部位（５'−ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＧＣ  ＭＴ  ＣＣＴ  ＧＣＡ  ＴＴＴ  Ｇ−３'（Ｆ２）の配列を有する）と３'末端のＢａｍＨＩ部位（５'−ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＡＧＧ  ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＣＧＡ  ＧＡＧ−３'（Ｒ）の配列を有する）で合成され、成熟タンパク質を合成する。３．０ｋｂのＰＣＲ産物は、ｐＣＲ２．１ベクター（ＴＯＰＯクローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ連結され、ＤＨ５ａコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ形質転換される。プラスミドＤＮＡは、ＥｃｏＲＩ制限酵素で消化することによってスクリーンされた多くのクローンから単離される。この方法で調整された遺伝子の統合性は、反復ＤＮＡ配列決定によって確認された。
【００７１】
コンドロイチナーゼＡＢＣＩ配列は、Ｅ．Ｃｏｌｉ（大腸菌）における発現のためにＰＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）へクローン化される。ＩＰＴＧによる遺伝子発現の導入後、細菌は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４／ＰＢＳによるコンドロイチナーゼＡＢＣＩの同時抽出を有する超音波処理によって溶解した。本発明者らは、組換えコンドロイチナーゼＡＢＣＩの大部分は、細菌細胞溶解液の細胞基質画分に見出され、これは、高収率で高活性の酵素を産生するコンドロイチナーゼＡＢＣＩ精製プロトコールの開発を可能にするものである。前記プロトコールは、捕獲工程として陽イオン交換クロマトグラフィー、及び研磨工程としてゲル濾過を含む。これらの工程の後、コンドロイチナーゼＡＢＣＩは〜９５％の純度に達する。陰イオン交換膜濾過（Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ  Ｑ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）は、内毒素及び宿主ＤＮＡ除去のために使用され得る。この工程は、約７５％のない毒素を除去すると予想される。濾過に続いて、コンドロイチナーゼＡＢＣＩは、揮発性バッファー（ｐＨ８．０）へ透析され、乾燥するまで凍結乾燥され得る。最終産物は、−７０℃で長期貯蔵に対して安定である。精製されたｃＡＢＣＩは、未精製細胞溶解液からのサンプルのＩＥＦ−ＰＡＧＥ解析によって決定されたように、ｐＩ〜９．５を有する高度に塩基性なタンパク質である。
【００７２】
多くの解析方法は、コンドロイチナーゼの組換えバージョンの酵素活性を、プロテウス・ブルガリスから精製されたその酵素の商業用に利用可能な形態（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の酵素活性と比較するために使用され得る。前記方法は、コンドロイチナーゼのようなプロテオグリカン分解ポリペプチドを含む融合タンパク質の活性を評価するために適用され得る。特異的活性測定値は、プロテオグリカンの分解からの反応産物の産生に起因した吸光度の変化を測定する一般分光光度法アッセイを用いて得られた。コンドロイチナーゼＡＢＣＩの組換え形態は、ＳｅｉｋａｇａｋｕコンドロイチナーゼＡＢＣＩに比べて、約２５％高い特異的活性を有していた。サイズ溶出クロマトグラフィーは、前記酵素の水力学的特性を比較するために使用され得る。組換え酵素の溶出特性は、天然由来の酵素の特性と同一である。
【００７３】
ザイモグラフィーの形態は、酵素をさらに特徴付けるために使用され、前記融合タンパク質の特徴付けに対して適用される。ポリアクリルアミドゲルは、コンドロイチナーゼＡＢＣＩの基質であるアグリカンの存在下で重合された。酵素サンプルは、アグリカン−浸透性ゲル上で、ＳＤＳの存在下での電気泳動によって分解される。前記ゲルは次に、ＳＤＳが抽出され、酵素が再折り畳みすることが可能となる再生工程へ曝される。次に、酵素再折り畳み及び回復活性は、前記ゲル内のアグリカンを消化し、結果生じるゲルのその領域における糖鎖の欠如は、糖鎖特異的染色によって可視化され得る。ゲルにおける糖鎖の類似の欠如は、プロテオグリカン分解ポリペプチド部分を含む融合タンパク質の活性型であると予想された。組換えコンドロイチナーゼＡＢＣＩの場合において、その活性は、ザイモグラムにおける明白なスポットとして可視化された。ザイモグラフィーの結果は、分光光度法解析と一致しており、コンドロイチナーゼＡＢＣＩの組換え形態が天然由来形態と同等若しくはそれ以上の特異的活性を有していることを示していた。
【００７４】
ＨＰＬＣ法は、ＣＳＰＧのコンドロイチナーゼＡＢＣＩ消化の結果として遊離された４及び６硫酸化二糖類（それぞれΔ４ＤＳ及びΔ６ＤＳ）を検出するために使用される。２つの二糖類は、陰イオン交換クロマトグラフィーによって効果的に分離され得る。ＨＰＬＣアッセイは、クロマトグラムからのΔ４ＤＳ及びΔ６ＤＳの定量化が、ＨＰＬＣに注入された量に対して比例関係をもたらすことを示すことによって確認された。ＣＳＰＧ消化からのΔ４ＤＳ及びΔ６ＤＳの産生は、上述した分光光度アッセイによって決定されたように、コンドロイチナーゼ特異的活性の量と直接的に関連している。このアッセイは、様々な基質のコンドロイチナーゼ消化によって放出されたΔ４ＤＳ及びΔ６ＤＳを、独立して定量化するための敏感で正確な手段として使用され、融合タンパク質におけるコンドロイチナーゼポリペプチドの活性を決定するためにも使用される。
【００７５】
プロテオグリカンポリペプチド活性を特徴付けるために実行され得る別の機能的アッセイは、後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンが、アグリカン、若しくはコンドロイチナーゼＡＢＣＩのようなプロテオグリカンで処理されたアグリカン上に配置されるものである。アグリカン上に配置されたニューロンは、プレートに接着し、軸索を伸長することができないであろうと予想される。対照的に、比較のために、或いは融合タンパク質の一部として、コンドロイチナーゼＡＢＣＩのようなプロテオグリカン分解ポリペプチドで処理されたアグリカン上に配置されたニューロンは、表面に接着し、軸索を伸長すると予想される。コンドロイチナーゼＡＢＣＩが観察される、広範な軸索成長は、軸索成長に対してより許容的な基質を作成するアグリカンコアタンパク質上の糖鎖の消化に起因するものであると考えられる。
【００７６】
ＳＣＩのラット挫傷モデルは、臨床的に関連性のあるモデルであり、軸索再生の促進に対する、本発明の融合タンパク質及び他の組成物の有効性を評価するために使用される。挫傷ＳＣＩにおいて、細胞は破壊され、出血が後に続き、炎症が開始する。破壊された細胞は、マクロファージによって除去され、反応性グリオーシスが開始する。嚢胞性腔が形成され、グリオーシスはグリア性瘢痕へ成熟する。この領域におけるミエリンは破壊され、破壊されなかった多くの局所性ニューロンは、脱髄状態で残される。
【００７７】
ＳＣＩの鉗子圧迫モデルは、開発され特徴付けられた挫傷モデルである。このモデルは確認され、より広く使用されているインパクタモデルと非常に類似した損傷を生じる。このモデルは、椎骨レベルＴ９／Ｔ１０での鉗子圧迫を含む。鉗子は１５秒間に０．９、１．３、或いは１．７の幅に索を圧迫する。圧迫のこれら３つのレベルは、重症、穏和、或いは中程度の損傷を可能にする。このモデルは、オープンフィールド歩行運動テスト及びＢａｓｓｏ，Ｂｒｅｓｎａｈａｎ  ａｎｄ  Ｂｅａｔｔｉｅ（ＢＢＢ）スコアリングシステムを用いて確認された。これは、組織学的にも特徴付けられた。行動性テスト及びＢＢＢスコアリングによって、鉗子は、インパクタモデルでみられるのと類似の回復を有した、高度に再現性のある損傷を産生することが示された。これらのテスト及びスコアリングデータによって、鉗子圧迫モデルは他の挫傷モデルに匹敵し、ＳＣＩの実験モデルとして使用するのに十分な再現性があり、本発明の組成物を評価するために使用されることが示された。
【００７８】
鉗子圧迫損傷動物からの組織は、白質回避（ｓｐａｒｉｎｇ）、グリア性瘢痕、及び嚢胞形成を検討するために組織学的に処理される。他の挫傷ＳＣＩモデルと同様に、中心嚢胞は損傷後に形成され、損傷重症度が増加するにつれてサイズが増加する（鉗子ギャップは減少する）。この嚢胞の周辺で、アストログリア（ＧＦＡＰ）、マクロファージ活性化、及びミエリン萎縮によって特徴付けられるグリア性瘢痕が形成する。
【００７９】
本発明の様々な観点は以下の限定されない実施例を参照にすることで説明されるであろう。  
【実施例１】
【００８０】
この実施例は、プロテオグリカン分解分子がどのように投与され、研究され、モデル挫傷損傷を有する動物における機能的改善を示すと示されたかを説明している。
【００８１】
ＳＣＩの鉗子圧迫モデルは、開発され特徴付けられた挫傷モデルである。このモデルは確認され、より広く使用されているインパクタモデルと非常に類似した損傷を生じる。このモデルは、椎骨レベルＴ９／Ｔ１０での鉗子圧迫を含む。鉗子は１５秒間に０．９、１．３、或いは１．７の幅に索を圧迫する。圧迫のこれら３つのレベルは、重症、穏和、或いは中程度の損傷を可能にする。
【００８２】
ラットは、椎骨レベルＴ９／Ｔ１０での鉗子圧迫モデルによって損傷された。手術時に、コンドロイチナーゼの運搬のためにくも膜下腔内カテーテルを配置した。動物を毎日、１週間処理し、次に２日に１回で１週間、０．０６Ｕ／１用量のコンドロイチナーゼＡＢＣＩ（Ｓｅｉｋａａｋｕ）、ペニシリナーゼ、或いは人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）で処理した。用量及び対照は、Ｂｒａｄｂｕｒｙら（２００２）による文献から派生させた。行動は、オープンフィールド歩行運動テスト及びＢＢＢスコアリングシステムを用いて、２日目、次に損傷後週１回で１０週間、評価した。
【００８３】
図５Ａは、コンドロイチナーゼＡＢＣＩ、ペニシリナーゼ、及びａＣＳＦで処理された動物の平均ＢＢＢスコアを示したものである。ａＣＳＦ或いはペニシリナーゼで処理されたラットは、平均ＢＢＢスコアの約４まで回復した。コンドロイチナーゼで処理したラットは、平均ＢＢＢスコアの約８まで回復した。複数の動物は、１０以上のスコアまで回復し、これは上−脊髄インプットを意味している。コンドロイチナーゼスコアは、ＡＮＯＶＡ及びポスト  ｈｏｃ  Ｔｕｋｅｙにより、両方の対照とは著しく異なった。
【００８４】
これらの動物からの組織は、一般的なグリア構造を評価するためにグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に対して免疫組織化学的に処理された。組織は、Ｗｅｉｌ染色と銀変性染色で染色され、それぞれミエリン及びニューロン変性を評価した。興味深いことに、これらのパラメーターにおける明らかな違いは、実験的及び対照処理組織の間では見出されなかった。
【００８５】
図５Ｂにおいて、いくつかのセグメントを含む大きな破壊及び腹側索における回避（ｓｐａｒｉｎｇ）が見られる。Ｗｅｉｌ染色によって、処理及び未処理動物の両者において広範の脱髄が観察された。ＧＦＡＰイメージ（真ん中のセット）によって、鉗子損傷に続いて形成された瘢痕の範囲が示された。下のアミノ酸化第銅（ｃｕｐｒｉｃ）銀変性染色によって、損傷後、吻側及び尾側の両方へ伸長した巨大な神経変性が観察された。コンドロイチナーゼ処理及び対照組織の間に明らかな違いは再び観察されなかった。
【００８６】
付加的な予備実験は、中程度損傷レベルで実行され、オープンフィールド歩行活動における著しい改善はコンドロイチナーゼ処理によって観察された。コンドロイチナーゼＡＢＣＩを受けた動物は、損傷後１０週間で平均ＢＢＢスコアの９．１まで回復し、それに比べて、ペニシリナーゼ対照は７．１であった。データの一貫性（それぞれ０．６と０．３のＳＥＭ'ｓ）、及びＢＢＢスコアにおけるスコアの区分により、この２ポイントで統計学的に有意であるだけでなく、臨床的にも意味のある変化をもたらした。スコアの９は、体重サポートを有する足底配置、或いは背側足踏みしながらの体重サポートと一致する足底配置を意味しているが、一方、７のスコアは、体重サポートもなく、一致する脚の延び（ｓｗｅｅｐｉｎｇ）もない、後脚における各関節の動きを意味している。１０週目での個々の動物スコアの検討は、コンドロイチナーゼ群における１２個体のうち６個体の動物は、スコアの９若しくはそれ以上まで回復したが、ペニシリナーゼ群における１２個体のうち１個体の動物のみがスコアの９まで回復した。各群からの１個体の動物は、そのスコアが２．５以上まで上昇しなかったため、解析から除去され、これはモデル標準の外側の損傷重症度を示していた。図５Ｃ及び図５Ｄは、中程度損傷に対するペニシリナーゼ及びコンドロイチナーゼ処理群における各動物の、１０週間目のスコアの散乱プロットを含む。群平均は、以下に示した。
【００８７】
結果は、このよく調節された研究において、コンドロイチナーゼは、椎骨レベルＴ９／Ｔ１０での鉗子圧迫モデルで損傷されたラットにおけるオープンフィールド歩行機能を改善することを示していた。動物は、ペニシリナーゼ及びコンドロイチナーゼ群に対してそれぞれ平均ＢＢＢスコアの９．７及び９．９まで回復した。この研究によって、穏和な損傷レベルではなかったが、重症および中程度レベルでの著しい影響を示された。穏和な損傷レベル（１．３ｍｍ鉗子）のあらゆる群の間では著しい違いは観察されなかった。コンドロイチナーゼが穏和な損傷に有効でないか、さらに、コンドロイチナーゼは、オープンフィールド歩行テストによって適切にアッセイされなかった変化、例えば歩幅の長さ、足配置、感覚、或いは自律神経性機能などに影響したかどうかは不確かである。本研究の動物からの組織学の予備的解析によって、カテーテル、及び各動物における損傷の配置を確認した。損傷後の時点で、コンドロイチナーゼ処理あり／なしの動物を殺戮するという進行中の実験は、瘢痕におけるＣＳＰＧ含有量、及びコンドロイチナーゼ消化のスタブ−高原発現に対する影響を特徴付けるであろう。将来の研究は、行動テストの集団（ｂａｔｔｅｒｙ）まで拡大し、腔追跡による再生の証拠として索を検討するであろう。
【００８８】
２つの急性毒性研究は、ラットで実行された。第１は、静脈内（ＩＶ）研究であり、ラットは０、０．２、０．７７５、或いは７．７７５ｍｇ・ｋｇのコンドロイチナーゼＡＢＣＩを注射された。第２の研究において、くも膜下腔内（ＩＴ）カテーテルは、ＳＣＩ動物実験で用いられた同じ方法を用いて脊髄を越えては位置され、０．０６、０．６、及び６．０ユニットのコンドロイチナーゼＡＢＣＩをＩＴカテーテルを通じて運搬した。これらの用量は、ＳＣＩ実験においてＩＴカテーテルで達成されたコンドロイチナーゼＡＢＣＩの予想された局所的濃度の１、１０、及び１００倍以上である。動物の痛みや苦痛を観察し、体重は毎日測定した。明白な反応は、コンドロイチナーゼＡＢＣＩ投与の間、或いは直後には観察されなかった。延び（ｓｗｅｅｐｉｎｇ）、炎症、挫傷或いはネクローシス（壊死）は、ＩＶ実験の注射部位においては観察されなかった。ＩＴ経路を介して処理された動物における体温の変化も観察されなかった。摂食、毛づくろい、或いは発声における変化も観察されなかった。動物は、オープンプールにおける運動行動を評価された。動物ケアスタッフ或いは行動専門家によると、異常性は見られなかった。動物は、関節圧痛或いは膨張のシグナルは示さなかった。処理群の間で体重変化の著しい違いはなかった。この結果は、コンドロイチナーゼＡＢＣＩ処理は、効果的なＩＴ用量よりも実質的に多い、ＩＶ及びＩＴ用量を用いた急性毒性には関連していないことを示している。  
【実施例２】
【００８９】
この実施例は、Ｎｏｇｏ−受容体アンタゴニスト、Ｌ１神経細胞接着タンパク質、及びＧＧＦ２ポリペプチドドメインの調整を説明しており、これらは本発明の組成物及び融合タンパク質に使用され得る。
【００９０】
ヒトＮｏｇｏ受容体貫通（ｓｐａｎｎｉｎｇ）アミノ酸２７〜３１１の可溶性部分（ＮｇＲ２７−３１１）は、膜結合ＮｇＲへのＮｏｇｏ６６、ＭＡＧ、及びＭＯＧの結合を阻害すると示されたので選択された。プライマーは、この領域に隣接するように設計され、ＲＴ−ＰＣＲを、ヒト海馬ＲＮＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて実行した。１．０５ｋｂ領域を無事に増幅し、精製した。
【００９１】
Ｌ１は、Ｄｒ．Ｍｅｌｉｔｔａ  Ｓｃｈａｃｈｎｅｒから寄贈されたＣＨＯ細胞株を用いて調整し、この細胞は、ヒトＦｃを有する融合タンパク質（Ｌ１−Ｆｃ）としてヒトＬ１を分泌するものである。前記細胞は、回転ボトル内で増殖させ、Ｌ１−Ｆｃを、タンパク質Ａ親和性カラムクロマトグライフィーを用いて条件培地から精製した。Ｌ１−Ｆｃの精製物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価し、適切な分子量の１本のバンドが観察された。Ｌ１−Ｆｃの生物活性は、神経突起成長アッセイを用いて確認した。組織培養プレートは、ポリＬ−リシン或いはＬ１−Ｆｃでコーティングし、次に出生後１０日目のラットから小脳顆粒細胞を単離し、基質上の培養へ播種した。Ｌａ−Ｆｃ基質上に播種されたニューロンは、ポリリシン基質対照と比較して、かなりの数の長い神経突起が見られると観察された。これらの結果より、産生されたＬ１−Ｆｃは、神経突起成長を促進する生物活性を有していることが示された。この神経突起成長アッセイは、コンドロイチナーゼＡＢＣＩ融合タンパク質のＬ１部分生物活性を評価するために使用される。
【００９２】
完全長ＧＧＦ２糖タンパク質の可溶形態を分泌するＣＨＯ細胞株は、ＣｅＮｅｓより入手した。培地及び精製方法の広範な最適化は、本質的に純粋で生物学的に活性なＧＧＦ２を得るために達成された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、ペプチドマッピング、及び糖鎖解析を含む多くの解析方法は、ＧＧＦ２を特徴付けるために開発された。例えば、還元型及び非還元型ＧＧＦ２のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいては、その単離物は本質的にコンタミ（混入した）タンパク質はなく、予想分子量及び単量体構造を示す。ＧＧＦ２の生物活性は、プライマリラットシュワン細胞増殖方法を用いてアッセイされ、予想された影響は、ＧＧＦ２の４つの異なるバッチから再生可能な方法で得られた。ｅｒｂＢ受容体経路の下流細胞シグナル構成成分である、Ａｋｔキナーゼのリン酸化を測定する別の機能的アッセイが開発された。Ａｋｔキナーゼの用量依存性リン酸化が存在すると観察された。  
【実施例３】
【００９３】
この実施例は、キメラ構成のためのコンドロイチナーゼＡＢＣＩの操作を説明している。
【００９４】
コンドロイチナーゼＡＢＣＩは、Ｐ．ｖｕｌｇａｎｓからクローニングされ、Ｅ．Ｃｏｌｉ．（大腸菌）で発現された。驚くことに、Ｎ末端融合タンパク質を作成するために繰り替えされた試みは、Ｎ末端融合タンパク質が合成の間にコンドロイチナーゼＡＢＣＩから切断されたため、失敗した。しかしながら、ＡＢＣＩ−ＮΔ２０、ＡＢＣＩ−ＮΔ４０、及びＡＢＣＩ−ＮΔ６０と名付けられた、触媒的に活性なＮ末端Ｈｉｓ融合タグを有する欠損変異体は、それぞれ、成熟ＡＢＣＩタンパク質のＮ末端から２０、４０、及び６０アミノ酸の欠損によって調整された。完全長コンドロイチナーゼＡＢＣＩとは異なって、Ｎ末端欠損変異体は、Ｎ末端融合タンパク質として、６ｘＨｉｓタグを合成することが可能である。Ｃ末端からの８０アミノ酸欠損は、ザイモグラフィーアッセイでテストされたように、コンドロイチナーゼＡＢＣＩのプロテオグリカン分解活性の変異を形成したことも観察された。
【００９５】
ＮｇＲ２７−３１１或いは、コンドロイチナーゼＡＢＣＩなどのプロテオグリカン分解分子を有するＬ１との融合タンパク質は、哺乳類発現で利用し、ＣＨＯ細胞において実行され得る。コンドロイチナーゼＡＢＣＩのｃＤＮＡは、ｐＳＥＣＴａｇベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の適切なリーディングフレーム中にクローニングされた。コンドロイチナーゼＡＢＣＩを分泌するＣＨＯ細胞株が開発され、条件培地は、ザイモグラフィーアッセイによって触媒活性をテストされ、哺乳類細胞中に発現したコンドロイチナーゼＡＢＣＩが機能することを確認した。コンドロイチナーゼＡＢＣＩの哺乳類細胞コドン最適化バージョンは、ＣＨＯ細胞発現に対して使用される本分野で既知である方法によって合成され得る。
【００９６】
ＧＧＦ２は、成人の脳及び脊髄に発現したＮＲＧ１遺伝子のスプライス変異体である。これは、６６〜９０ｋＤａの間の分子質量のグリコシル化タンパク質である。本発明者らは、ＣＨＯ細胞中に発現された組換えＧＧＦ２は、高度にグリコシル化されていて、シュワン細胞の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで促進することを発見し、さらに、大腸菌内に発現されたＮＲＧ１のＥＧＦ様ドメインは、筋細胞の増殖と生存を促進する機能を十分に有していることも発見した。
【００９７】
本発明者らは、予備的データの項で説明されたように、大腸菌内にＧＧＦ２の断片を発現した。シュワン細胞増殖に関与し、その結果再ミエリン化にも関与する特異的ＧＧＦ２ドメインが決定された。Ｉｇ及びＥＧＦドメインは、共に或いは別々にｉｎ  ｖｉｔｒｏで生物活性を示した場合、次にそれらはキメラ融合タンパク質を形成するために使用され得る。
【００９８】
ＣＨＯ細胞におけるＮｇＲ２７−３１１のクローニング及び発現：残基１〜３５９に一致するＮｇＲ断片は、ＲＴ−ＰＣＲによって、ヒト海馬ポリＫ  ＲＮＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）から単離させ、その構造は、ＤＮＡ配列決定によって確認され得る。残基２７〜３１１に一致する遺伝子断片は、より大きい断片からクローニングされ、次に、ＣＨＯ細胞において分泌タンパク質として前記断片を発現するための、ｐＳＥＣＴａｇベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の適切なリーディングフレームにおいてサブクローニングされた。ＮｇＲ２７−３１１遺伝子を含むプラスミドＤＮＡは、ＣＨＯ細胞へ形質移入され、ＮｇＲ２７−３１１を産生する前記細胞株は、ハイグロマイシンＢの淘汰圧下で選択された。ＮｇＲ２７−３１１−ＡＢＣＩキメラ発現プラスミドは、本分野では既知である方法を用いて、ＣＨＯ細胞発現システムにおける発現に対して構成され得る。  
【実施例４】
【００９９】
この実施例は、発現されたコンドロイチナーゼＡＢＣＩ、及び大腸菌内で発現されたＧＧＦ２ドメインを精製及び単離するために使用される方法を説明するものである。これらの方法は、本発明のキメラ融合タンパク質の精製に適用される。
【０１００】
コンドロイチナーゼＡＢＣＩに対する効率的な大腸菌組換え発現システム、及び精製工程は、本発明者らによって開発され、コンドロイチナーゼＡＢＣＩキメラ誘導体の精製に適用され得る。
【０１０１】
例えば、コンドロイチナーゼＡＢＣＩ発現宿主である大腸菌における様々なＧＧＦ２ドメインの発現は、予備生成され、以下のペプチド、ａａ２５０〜４０２、ａａ２５０〜４２２、及びａａ３５０〜４０２がテストされた。これらの発現されたペプチドは、大腸菌溶解液の可溶性画分において見出された。大腸菌におけるコンドロイチナーゼＡＢＣＩを有するこれらペプチドの最終キメラ産物も、可溶性であると予想することは適切である。加えて、前記キメラ産物の電荷特性は、組換えコンドロイチナーゼＡＢＣＩを比較した場合、類似するであろうと予想された。従って、ＧＧＦ２ペプチドに対する理論上等電点（ｐ１）値は、ａａ２５０〜４０２で９．３、ａａ２５０〜４２２で９．１８、及びａａ３５０〜４０２で７．５５である。最初の２つのペプチドをコンドロイチナーゼＡＢＣＩと融合することは、約９のｐ１値を有するキメラタンパク質を生じると予想される。この場合において、ＳＰクロマトグラフィーは、捕獲工程としてよく実施すると予想される。最小ＧＧＦ２ペプチドであるａａ３５０〜４０２は、最終コンドロイチナーゼＡＢＣキメラのｐ１を約８．４まで減少おする。この変化は、捕獲工程条件の最適化を必要とする。
【０１０２】
ＮｇＲ２７−３１１、及びＬ１ペプチドを有するコンドロイチナーゼＡＢＣＩのキメラ産物は、ＣＨＯ細胞システムにおいて発現され得る。発現したキメラタンパク質の精製の前に、ＮｇＲ２７−３１１或いはＬ１キメラタンパク質を産生する細胞株に対する増殖条件は、無血清培地において最適化される。詳細な培地最適化研究は、最も高い産生条件を決定するために実行された。スケールアップ量は、キメラタンパク質の産生率（ｐｇ／細胞／１日）に基づいて決定された。様々なキメラ産生細胞株からの条件培地を回収し、接線流動濾過に曝した。イオン交換性クロマトグラフィーは、条件培地からの分泌タンパク質を捕獲するために使用され、ゲル濾過クロマトグラフィーは研磨精製工程として使用され、次に陰イオン交換膜濾過は、内毒素及びＤＮＡ除去に対して使用され得る。各工程で、精製の効率はＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びタンパク質濃度の分光光度的定量化によって解析される。  
【実施例５】
【０１０３】
この机上の実施例は、キメラ生物活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価を説明するものであり、各キメラは、コンドロイチナーゼ酵素活性、及び各融合パートナーの特異的生物活性を評価される。
【０１０４】
解析の第１工程は、従来のタンパク質生化学的方法論を用い、遺伝子発現の忠実度を確認する。これらは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＩＥＥ、質量分析法、及びサイズ除去クロマトグラフィーを含む。
【０１０５】
コンドロイチナーゼキメラ特異的活性は、標準的で一様に受け入れられている分光光度アッセイを用いて決定され得る。コンドロイチナーゼキメラポリペプチドの触媒活性からの反応産物の産生は、波長２３２ｎｍでの前記産生の吸光度の測定によって決定され得る。１２０マイクロリットルの反応混合物（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、４０ｎＭ  Ｎａアセテート、０．００２％カゼイン）から成る典型的な反応混合物は、基質（５マイクロリットルの５０ｍＭコンドロイチンＣ）、及び１．５マイクロリットルのコンドロイチナーゼＡＢＣＩキメラ融合ポリペプチド或いはテストサンプルと組み合わせた。吸光度ユニットにおける変化は、ユニット活性測定に変換され得る初速度（ｉｎｉｔｉａｌ  ｒａｔｅ）である。
【０１０６】
二糖ＨＰＬＣアッセイ：ＣＳＰＧ基質上のコンドロイチナーゼキメラポリペプチドの触媒活性は、α−Δ  ＡＵＡ−［１→３］−ＧａｌＮａｃ−４Ｓ（Δ４ＤＳ）及びα−Δ  ＡＵＡ−［１→３］−ＧａｌＮａｃ−６Ｓ（Δ６ＤＳ）を含む、２種類の硫酸化二糖を放出すると予想される。これらの種は、ＨＰＬＣによって分解され、結果生じるクロマトグラムからの定量化は、コンドロイチナーゼ活性に対して感受性があり、正確な測定である。このアッセイを実行するために、野生型コンドロイチナーゼ、及びコンドロイチナーゼ融合タンパク質で実行されたコンドロイチナーゼ消化反応からのサンプルは、遠心分離によって精製され、次に、以下の有効な陰イオン交換ＨＰＬＣ方法に曝された。Ｄｉｏｎｅｘ  ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ−１０（４ｘ５０ｍｍ）ガードカラムに装着したＤｉｏｎｅｘ  ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ−１０分析用カラム（４ｘ２５０ｍｍ）は、ｐＨ３．５の水（バッファーＡ）及び２Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ３．５）（バッファーＢ）の勾配から成る移動相で使用され得る。検出は、波長２３２ｎｍで設定される。１ｍＬ／分の流速、及び１００％のＡ〜１００％のＢまでの４５分連続勾配は、Δ４ＤＳ及びΔ６ＤＳの許容可能な分解度を提供した。基準曲線は、既知量のΔ４ＤＳ及びΔ６ＤＳを用いて作られ得る。
【０１０７】
ザイモグラフィーによって、コンドロイチナーゼ活性の付随評価と共に、分子量によるタンパク質の分離が可能になる。１０％ポリアクリルアミドゲルは、８５ｐｇ／ｍｌのアグリカンの存在下で重合される、サンプルは、ＳＤＳ−添加バッファーにおいて煮沸され、次に分析物は電気泳動によって分離され得る。分離後、ゲルは、２．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００において１時間、室温でインキュベートされ、次に新しい２．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００において１６時間、３７℃でインキュベートされる。このインキュベーションの間、ＳＯＳはゲルから抽出され、コンドロイチナーゼはそのすぐ近傍においてアグリカンを再び折り畳み、消化する。再折り畳み工程の後、ゲルは糖鎖を染色した：ゲルはまず０．２％セチルピリジニウムにおいて、９０分間、室温でインキュベートされ、次にＨ２Ｏ：エタノール：酢酸＝４９：５０：１である溶液中の０．２％トルイジン（Ｔｏｌｕｄｉｎｅ）ブルーで３０分間インキュベートした。次にゲルは、完全に脱色された。脱色に続いて、ゲルは、５０％エタノール中の５０マイクログラム／ｍｌのＳｔａｉｎｓ−Ａｌｌ（Ｓｉｇｍａ）の溶液において一晩インキュベートされた。コンドロイチナーゼ活性は、ゲルにおいて明白なスポットとして検出され得る。空いたスポット（ｃｌｅａｒｉｎｇ）のサイズは、ユニット活性とほぼ比例した関係を示した。
【０１０８】
ＮｇＲ２７−３１１−コンドロイチナーゼキメラは、デコイＮｏｇｏ受容体の活性のために評価された。このアッセイは、成長錐体の破壊を測定するために使用され得る：後根神経節（ＤＲＧ）は、出産後１日目（Ｐ１）Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット仔から解剖され、２００Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）及び２．５Ｕ／ｍｌジスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ／Ｒｏｃｈｅ）において２回、３０分間解離された。酵素は除去され、ＤＮＡｓｅ（０．５ｍｇ／ｍｌ）を神経節に添加した。１０００μｌピペットマンに付けられたピペットチップを用いて倍散を行った。結果生じる細胞懸濁液は、４０ミクロン細胞フィルターを通して濾過され、７０ｘｇで５分間、遠心分離した。細胞は、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳに再懸濁され、非コーティング組織培養プレート（１００ｍｍ直径）に２時間前播種した。非接着性ニューロンは除去され、５０ｎｇ／ｍｌＮＧＦ含有の無血清Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７において、１０，０００細胞／ウェルで、ポリ−リシン／ラミニン−コーティング２４ウェルプレートに播種した。２０〜２４時間後、増殖錐体破壊を誘導するために、ＭＡＧ或いはＮｏｇｏ６６を１時間、３７℃、様々な濃度で添加された。ＮｇＲ２７−３１１−コンドロイチナーゼキメラは、ＭＡＧ及びＭｏｇｏ６６と競合させるために様々な濃度で添加され、従って、ニューロンを成長錐体破壊から保護する。培養は、等量の事前に温めた８％パラホルムアルデヒド／０．６Ｍスクロースを前記培地に２０分間添加することによって固定される。一方、細胞は３７℃ホットプレート上に置かれている。成長錐体は、ＡｌｅｘａＳ６８ファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で標識化される。簡潔には、細胞は、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００で５分間、ＲＴで透過処理され、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡにおいて２０分間ブロックされ、ファロイジンにおいてインキュベートされ、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡにおいて、２０分間、ＲＴで１：４０に希釈された。細胞はＰＢＳで洗浄され、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＡＫＯ）上に載せた。破壊された成長錐体のパーセンテージを、４０ｘ対物レンズにおいて、１００成長錐体／ウェルの最小値を解析することによって決定した。
【０１０９】
Ｌ１融合タンパク質の生物活性は、標準化神経突起成長アッセイを用いて決定される。組織培養−処理された３５ｍｍディッシュの中心に２５ｍｍサークルをエッチングした後、１ｍｌの１０μｇ／ｍｌ  ポリ−リシンを各エッチングサークルに添加し、３７℃で６０分間インキュベートした。ポリ−リシンは、神経突起成長に対するネガティブ対照を提供する。エッチングサークルは、最後のすすぎの後にハンクス平衡塩類溶液＋カルシウム及びマグネシウム（ＨＢＳＳ＋＋）で２回洗浄され；１．２μｌのＬ１−Ｆｃ（０．６μＭ、０．３μＭ、０．１５μＭ、０．０７５μＭ）を、ポジティブ対照として作用するように、ペトリ皿上にスポットし、様々な濃度のＬ１−コンドロイチナーゼ融合タンパク質を、テストサンプルとして前記プレート上に適用した。前記プレートは、１時間室温でインキュベートした。前記スポットは、それらが乾燥しないように素早く吸引し、即座に１ｍｌ  ＨＢＳＳ＋＋で２回洗浄し、次にＰＢＳ中の１ｍｌの１％ＢＳＡを各エッチングサークルに添加した。室温で１５分後、前記エッチングサークルをＨＢＳＳ＋＋で２回洗浄し、バイオアッセイ培地（ＮｅｕｒａｌＢａｓａｌ（Ｇｉｂｃｏ）＋Ｂ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）＋Ｌ−グルタミン＋Ｌ−グルタミン酸、ペニシリン及びストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）＋１％ウシ胎児血清）（これはアッセイ時までペトリ皿に残る）で１回洗浄した。基質上に置かれたニューロンを提供するために、出産後日数（ＰＮＤ）９或いは１０からの小脳顆粒細胞を播種した。脳を１仔の頭蓋から除去し、小脳を組織の残りから分離した。髄膜を除去し、小脳を氷で冷やしたＨＢＳＳ＋＋に置いた。組織を刻み、０．２５％トリプシンを用いて、３７℃で１５分間、トリプシン処理した。トリプシン作用を、０．５ｍｇ／ｍｌのダイズトリプシン阻害剤（Ｇｉｂｃｏ）を添加することにより阻害した。前記組織を、ＨＢＳＳ＋＋ですすぎ、ＥＢＳでコーティングしたフレーム縮小パスツールピペットを用いて倍散した。解離された細胞は、５００ｘｇで３分間、ペレット状にし、その上清をデカントし、細胞を２ｍｌの増殖培地に再懸濁した。軽く倍散した後、細胞懸濁液を、３．５％ＢＳＡ（ＰＢＳ中）クッションの上に注意深く重層し、５００ｘｇで３分間スピンした。上清を吸引し、ペレットを２ｍｌの増殖培地に再懸濁した。細胞カウントを実行し、その細胞を最終作業濃度の１．５ｘ１０５細胞／ｍｌに希釈した。３００μｌの一定分量希釈細胞を各プレートの中心に添加し、この結果、エッチングサークルの全表面領域を越えて６ｘ１０４細胞の分配を生じることになった。この細胞を、５％ＣＯ２を含む湿気のある環境において１６時間、３７℃で増殖させた。翌日、プレートは３７℃インキュベーターから取り出し、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、神経突起の成長を顕微鏡写真によって記録した。
【０１１０】
ＧＧＦ２に対する生物活性アッセイは、シュワン細胞増殖を用いて実行した。坐骨神経は、３日齢Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット仔から解剖し、０．２５％トリプシン及び０．０３％コラゲナーゼタイプＩ（ＳＩＧＭＡ）を含むＬ−１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に１５分間、３７℃で解離した。神経は４００ｘｇで５分間、遠心分離し、解離培地をＤＥＭＥ／１０％ＦＢＳに取り替えた。神経は、２１ｇ針のついた１０ｍｌシリンジで、次に２３ｇ針のついたシリンジを用いて倍散した。細胞懸濁液は、５０ｍｌ子にカルチューブの口を覆うように置かれた４０μｍメッシュを通して濾過した。細胞を、４００ｘｇで５分間遠心分離し、１５ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／ＰｅｎＳｔｒｅｐにおいて約５百万細胞の密度で、ポリ−Ｄ−リシン（ＰＤＬ）コーティングＴ−７５フラスコに播種し、１０％ＣＯ２に調節された３７℃インキュベーター内でインキュベートした。２４時間インキュベーション後、細胞をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳで２回洗浄し、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ及び１０μｌ／ｍｌの１ｍＭシトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）から成る線維芽細胞阻害培地で再培養した。２〜３日のインキュベーションの後、前記線維芽細胞阻害培地を、シュワン細胞増殖培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／１５０ｎｇ／ｍｌのＧＧＦ２／５μＭフォルスコリン）に取り替えた。細胞を展開させ、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ、５４％ＦＢＳ中で、一定分量の２ｘ１０６細胞／ｍｌを、液体窒素において冷凍した。使用する際、シュワン細胞を解凍し、ＤＭＥＭ／５％ＦＢＳ中で約１６，０００細胞／ウェルの密度で、ＰＤＬ−コーティング９６ウェル培養プレートに播種した。約２４時間後、ＧＧＦ２を、５μＭフォルスコリンを含む約１００ｎｇ／ｍｌ〜０．７８ｎｇ／ｍｌの範囲の一連の希釈倍率で添加し、規準曲線を得た。ＧＧＦ２融合タンパク質のサンプルは、５μＭフォルスコリンと共に一連の希釈倍率で添加した。ＢｒｄＵを１０μＭで添加した。細胞を４８時間、１０％ＣＯ２インキュベーターにおいてインキュベートした。ＢｒｄＵ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；カタログ番号１６４７２２９）は、シュワン細胞増殖を検出するために使用した。培地をプレートから注ぎ出し、プレートをティッシュペーパーの上で軽くたたいた。２００μｌ／ウェル一定分量のＦｉｘ／Ｄｅｎａｔを添加し、１５〜２５℃で３０分間インキュベートした。１００μｌ／ウェル一定分量の抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ作業溶液（凍結乾燥抗体は、１．１ｍｌ二倍蒸留水に溶解し、抗体希釈溶液で１：１００に希釈した。）を添加し、室温で９０分間インキュベートした。ウェルを３回、２００〜３００μｌ／ウェルの洗浄溶液で洗浄した。１００μｌ一定分量の基質溶液を添加し、１５分間、若しくは測光検出に十分な着色となるまでインキュベートした。プレートを、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーで４５０ｎｍにおいて、３７０ｎｍにおいて停止溶液の添加前、或いは５０ｍｌの１Ｎ硫酸を各ウェルへ添加した後、測定した。
【０１１１】
Ａｌｔ［ｐＳ４７３］ＥＬＩＳＡ：ＡＴＣＣから入手したＣ６グリア細胞腫細胞を、Ｔ−７５フラスコにおいてＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中でコンフルエンスになるまで増殖した。トリプシン処理の後、細胞を、２４ウェルプレートに、０．５ｍｌの培地中に５００，０００細胞／ウェルの密度で播種した。播種１日後、細胞を、０．７８〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲の一連の希釈倍率でＧＧＦ２で、３７℃において処理し（バッチ：Ｌｏｎｚａ  ＢｉｏｌｏｇｉｃｓからＧｌｕ）、基準曲線を得た。ネガティブ対照として、ＧＧＦ２の添加前に、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤であるワートマニンを１０ｎｎＭで３０分間、細胞へ添加した。ＧＧＦ融合タンパク質のサンプルも、一連の希釈倍率で添加した。細胞をＰＢＳで洗浄し、次に１００μｌの細胞抽出バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＮａＦ、２０ｍＭ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、２ｍＭＮａ３ＶＯ４、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％グリセロール、０．１％  ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐｉｅｒｃｅ））で抽出した。細胞抽出物はさらに使用するまで−８０℃で保存した。ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ；カタログ＃ＫＨＯＯ１ＩＩ）は、リン酸化Ａｋｔキナーゼレベルを測定するために使用した。簡潔には、１００μｌの１：５０希釈サンプル及び一連の希釈倍率のＡｋｔ［ｐＳ４７３］標準を、抗−Ａｋｔ抗体で事前にコーティングしたウェルに、２時間室温（ＲＴ）で、或いは４℃で一晩、添加した。ウェルを洗浄し、抗−Ａｋｔ［ｐＳ４７３］抗体を添加し、１時間インキュベートした。洗浄後、ＨＲＰ−共役抗−ウサギ抗血清をウェルに添加し、３０分間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ色素原をウェルに添加し、停止溶液で反応を停止する前に、ＲＴで３０分間インキュベートした。プレートは、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーにおいて４５０ｎｍで測定した。光学密度を、Ａｋｔ［ｐＳ４７３］標準に対してプロットし、Ｃ６サンプルにおけるｐＡｋｔの濃度を基準曲線より推定した。  
【実施例６】
【０１１２】
この実施例は、コンドロイチナーゼポリペプチド及びＴＡＴ細胞性形質導入ペプチドの融合タンパク質の構成を説明するものである。
【０１１３】
コンドロイチナーゼ酵素をコードする遺伝子配列は、ＴＡＴペプチドと呼ばれるＨＩＶからのタンパク質形質導入ドメインへ機能的に連結されている。得られたキメラ遺伝子ＴＡＴ−コンドロイチナーゼＡＢＣＩ融合ＤＮＡコンストラクトは、図１に示されている。このコンストラクトを細菌が発現している間、ＴＡＴペプチドは、細菌が増殖する間のいくつかのプロセッシング点でコンドロイチナーゼ酵素から除去されたことが観察された。Ｎ末端連結ペプチドの除去も、Ｎ末端ヒスチジン−タグ化コンドロイチナーゼＡＢＣＩ酵素の発現の間に観察された。
【０１１４】
コンドロイチナーゼＡＢＣＩ酵素の欠損変異体は、変異が前記ポリペプチドのＮ末端部分からの特定数のアミノ酸を欠くが、そのプロテオグリカン分解活性は維持しているように産生された。これらのＮ末端欠損は、Ｎ末端に連結されたヒスチジン−タグを維持したことが観察された。様々なＴＡＴ−欠損変異コンドロイチナーゼＡＢＣＩ融合ＤＮＡコンストラクトは、発現している間、ＴＡＴポリペプチドの除去なしで発現されると予想される。例えば、ＴＡＴペプチドは、ＡＢＣＩ−ＮΔ２０或いはＡＢＣＩ−ＮΔ６０欠損変異体のような欠損変異体のＮ末端で融合される。理論に束縛されることを望まないで、本発明者らは、未変性プロテオグリカン分解酵素は、Ｎ末端に連結したシグナル配列を有していると考える。このシグナル配列は、細菌における天然産生の間に、及び大腸菌におけるクローン酵素の産生の間に除去される。Ｎ末端アミノ酸なしのいくつかのシグナルは、細菌にこの末端に連結した全てを除去するように指示すると考えられた。
【０１１５】
コンドロイチナーゼ欠損変異体の１つのＮ末端に連結したＴＡＴ−ペプチドを有するＤＮＡコンストラクトが作成され、ウエスタンブロット及びタンパク質ゲルによって、この発現されたタンパク質と活性が示された。  
【実施例７】
【０１１６】
この実施例は、プロテオグリカン分解組成物を用いて、細胞及び組織内への分子の拡散を説明するものである。
【０１１７】
成体Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットからの脳を頭蓋骨から除去し、右前部、左前ぶ、右後部、左後部セクションに４分割し、これはおおよそ前頭部（前部）及び後頭−頭頂（後部）葉に一致している。（Ａ）右前頭の１／４部分を、ベータ−ガラクトシダーゼ酵素（カタログ＃Ｇ５１６０；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）及びコンドロイチナーゼＡＢＣＩを０．５Ｕ／ｍｌ（カタログ＃Ｃ３６６７；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）を含む人工脳脊髄液（カタログ＃５９−７３１６；Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、マサチューセッツ州）に、３７℃で２時間置いた。脳１／４部分は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で数回すすぎ、次に、ベータ−Ｇａｌ染色キット（カタログ＃Ｇａｌ−Ｓ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）で処理した。基質−酵素反応（青色産物）を１時間行い、脳をＰＢＳで数回洗浄し、各脳ブロックの中央からのスラブを平衡直線剃刀を用いて切った。（Ｂ）左前頭の１／４部分を、ベータ−ガラクトシダーゼ酵素（カタログ＃Ｇ５１６０；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）を含む人工脳脊髄液（カタログ＃５９−７３１６；Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、マサチューセッツ州）に、３７℃で２時間置いた。脳１／４部分は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で数回すすぎ、次に、ベータ−Ｇａｌ染色キット（カタログ＃Ｇａｌ−Ｓ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）で処理した。基質−酵素反応（青色産物）を１時間行い、脳をＰＢＳで数回洗浄し、各脳ブロックの中央からのスラブを平衡直線剃刀を用いて切った。（Ｃ）右後頭の１／４部分を、ベータ−ガラクトシダーゼ酵素（カタログ＃Ｇ５１６０；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）及びコンドロイチナーゼＡＢＣＩを０．５Ｕ／ｍｌ（カタログ＃Ｃ３６６７；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）を含む人工脳脊髄液（カタログ＃５９−７３１６；Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、マサチューセッツ州）に、３７℃で２時間置いた。脳１／４部分は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で数回すすぎ、次に、ベータ−Ｇａｌ染色キット（カタログ＃Ｇａｌ−Ｓ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）で処理した。基質−酵素反応（青色産物）を１時間行い、脳をＰＢＳで数回洗浄し、各脳ブロックの中央からのスラブを平衡直線剃刀を用いて切った。（Ｄ）左後頭の１／４部分を、ベータ−ガラクトシダーゼ酵素（カタログ＃Ｇ５１６０；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）を含む人工脳脊髄液（カタログ＃５９−７３１６；Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、マサチューセッツ州）に、３７℃で２時間置いた。脳１／４部分は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で数回すすぎ、次に、ベータ−Ｇａｌ染色キット（カタログ＃Ｇａｌ−Ｓ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）で処理した。基質−酵素反応（青色産物）を１時間行い、脳をＰＢＳで数回洗浄し、各脳ブロックの中央からのスラブを平衡直線剃刀を用いて切った。脳の画像は、スキャナーで入手し、図２（Ｉ）（Ａ〜Ｄ）に示した。
【０１１８】
成体ラット脳半球は、バッファーのみ、或いは３３Ｕ／ｍｌコンドロイチナーゼＡＢＣＩ（Ａｃｏｒｄａ）を含むバッファーで、２時間、３７℃で浸漬した。半球をすすぎ、すぐさまエオシンＹ（Ｓｉｇｍａ）、或いは７０％エタノール中のコンゴレッドの飽和溶液（Ｓｉｇｍａ）に置いた。組織のスラブを切り、画像はスキャナーで入手した。図２（ＩＩ）はエオシン、及び図２（ＩＩＩ）はコンゴレッドの場合であるので、参照のこと。
【０１１９】
図２（ＩＩＩ）において、コンゴレッド飽和溶液は、未処理の脳と比較して、コンドロイチナーゼ処理した脳半球の皮質を通ってよく通過したことを示していた。コンゴレッドは、６９７ｋＤａの負に帯電した色素である。図２（ＩＩ）において、コンドロイチナーゼ処理した脳半球を通るエオシンＹの通過は、わずかに拡散したように見られたが、通過は未処理の脳と比較して深くはなかった。エオシンＹは、それが使用された低ｐＨで、全体的に負に帯電した双生イオンであり、６９２ｋＤａである。図２（Ｉ）において、成体ラットからの葉は、ベータ−ガラクトシダーゼのみ（Ｂ&Ｄ）で、或いはコンドロイチナーゼＡＢＣＩ（Ａ、０．５Ｕ／ｍｌ或いはＣ、０．００５Ｕ／ｍｌ）が添加されてインキュベートされた。
【０１２０】
結果より、コンドロイチナーゼ処理された組織は、ベータ−ガラクトシダーゼのＣＮＳ組織への通過に影響を受けたことが示された。コンドロイチナーゼは、コンゴレッド色素追加の速度に劇的に影響を及ぼしたが、エオシンに対しては明らかに影響を及ぼさなかった。  
【実施例８】
【０１２１】
この実施例は、本発明のコンドロイチナーゼＡＢＣＩ欠損変異−融合タンパク質の活性、若しくは他のプロテオグリカン分解ペプチド−融合タンパク質の活性を測定するために修飾されたコンドロイチナーゼＡＢＣＩアッセイプロトコールを説明するものである。
【０１２２】
プロテオグリカン分解分子或いは融合タンパク質の触媒活性からの反応産物の産生は、波長２３２ｎｍで産物の吸光度を測定することによって決定された。１２０μｌの反応混合物（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、４０ｎＭ  Ｎａアセテート、０．００２％カゼイン）から成る典型的な反応混合物は、基質（５μｌの５０ｍＭコンドロイチンＣ）、及び１．５μｌのコンドロイチナーゼＡＢＣＩ、若しくはコンドロイチナーゼＡＢＣＩ−ＴＡＴの欠損変異体の融合タンパク質と組合わせた。Ｓｅｉｋａｇａｋｕ'ｓ  ｃＡＢＣＩ参照：５ｍｌ一定分量において−２０℃で凍結し、１ｍｌ／反応（水において５０ｍＭコンドロイチンＣ（ＭＷ５２１）で使用した；１００ｍｌ一定分量においてー２０℃で凍結した。約１２０μｌの一定分量の反応混合物は、３７℃、３分或いはそれ以上で調整した。波長２３２ｎｍは分光計で使用した。
【０１２３】
反応産物に対する吸光係数を知り、２３２ｎｍでの前記反応産物の吸光度における変化を測定し、０．００２％カゼイン及び添加されたコンドロイチン基質を有する１２０μｌ反応混合物への、既知量のコンドロイチナーゼＡＢＣＩ或いは他のプロテオグリカン分解ポリペプチド−融合タンパク質の付加の結果を長期にわたり測定することによって、プロテオグリカン分解性融合他の悪質のμｍｏｌ／分／ｍｇにおける特異的な活性が決定された。ＳｅｉｋａｇａｋｕコンドロイチナーゼＡＢＣＩは、約４５０μｍｏｌ／分／ｍｇのこれらのアッセイ条件下で特異的な活性を有している。
【０１２４】
本発明は、特定の好ましい実施形態を参照にしながらかなり詳細に説明されたが、他のバージョンも可能である。従って、添付された請求項の要旨と範囲は、その記載に限定されるものではなく、好ましいバージョンはこの明細書内に含まれるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年3月18日(2020.3.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質形質導入ドメインおよびプロテオグリカン分解ドメインを有する融合ペプチドであって、前記プロテオグリカン分解ドメインは配列ＩＤ番号６８、配列ＩＤ番号６９、配列ＩＤ番号７０、配列ＩＤ番号７１、および配列ＩＤ番号７２から選択されるアミノ酸配列を含む、融合ペプチド。
【請求項２】
請求項１記載の融合ペプチドにおいて、前記タンパク質形質導入ドメインは、ＴＡＴドメインである、融合ペプチド。
【請求項３】
請求項１記載の融合ペプチドであって、さらに、前記タンパク質形質導入ドメインおよび前記プロテオグリカン分解ドメインの間にリンカーポリペプチドを有する、融合ペプチド。
【請求項４】
請求項３記載の融合ペプチドにおいて、前記リンカーポリペプチドは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリッチリンカー、又はＧｌｙ／Ａｌａリッチリンカーからなる群から選択される配列を含む、融合ペプチド。
【請求項５】
請求項３記載の融合ペプチドにおいて、前記リンカーポリペプチドは、非天然型アミノ酸、置換アミノ酸、ベータアミノ酸、又はガンマアミノ酸を含む、融合ペプチド。
【請求項６】
請求項１記載の融合ペプチドであって、さらに、ニューロン再生を促進するドメインを有する、融合ペプチド。
【請求項７】
請求項６記載の融合ペプチドにおいて、前記ニューロン再生を促進するドメインは、Ｌ１、ＧＧＦ２、ＮｇＲ２７−３１１、およびそれらの組み合わせから選択される、融合ペプチド。
【請求項８】
請求項６記載の融合ペプチドであって、さらに、前記ニューロン再生を促進するドメインを前記プロテオグリカン分解ドメインに連結する１またはそれ以上のリンカーポリペプチドを含む、融合ペプチド。
【請求項９】
タンパク質形質導入ドメインおよびプロテオグリカン分解ドメインを有する融合ペプチドを有する組成物であって、前記プロテオグリカン分解ドメインは配列ＩＤ番号６８、配列ＩＤ番号６９、配列ＩＤ番号７０、配列ＩＤ番号７１、および配列ＩＤ番号７２から選択されるアミノ酸配列を含む、組成物。
【請求項１０】
請求項９記載の組成物において、前記タンパク質形質導入ドメインは、ＴＡＴドメインである、組成物。
【請求項１１】
請求項９記載の組成物であって、さらに、前記タンパク質形質導入ドメインおよび前記プロテオグリカン分解ドメインの間にリンカーポリペプチドを有する、組成物。
【請求項１２】
請求項１１記載の組成物において、前記リンカーポリペプチドは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリッチリンカー、又はＧｌｙ／Ａｌａリッチリンカーからなる群から選択される配列を含む、組成物。
【請求項１３】
請求項１２記載の組成物において、前記リンカーポリペプチドは、非天然型アミノ酸、置換アミノ酸、ベータアミノ酸、又はガンマアミノ酸を含む、組成物。
【請求項１４】
請求項９記載の組成物であって、さらに、ニューロン再生を促進するドメインを有する、組成物。
【請求項１５】
請求項１４記載の組成物において、前記ニューロン再生を促進するドメインは、Ｌ１、ＧＧＦ２、ＮｇＲ２７−３１１、およびそれらの組み合わせから選択される、組成物。
【請求項１６】
請求項１４記載の組成物であって、さらに、前記ニューロン再生を促進するドメインを前記プロテオグリカン分解ドメインに連結する１またはそれ以上のリンカーポリペプチドを含む、組成物。
【外国語明細書】
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