(57)【要約】      （修正有）【課題】CoAやアセチルCoAによるフィードバック阻害を受けず、なおかつ熱安定性に優れたパントテン酸キナーゼの提供。【解決手段】以下の（ａ）または（ｂ）のパントテン酸からコエンザイムＡを合成するためのパントテン酸キナーゼであって、コエンザイムＡのフィードバック阻害を受けないパントテン酸キナーゼ：（ａ）好熱性細菌であるGeobacillus sp.またはThermus thermophilusから単離したパントテン酸キナーゼ；（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつパントテン酸からホスホパントテン酸の反応を触媒する活性を有するパントテン酸キナーゼ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)または(b)のパントテン酸からコエンザイムＡを合成するためのパントテン酸キナーゼであって、コエンザイムＡのフィードバック阻害を受けないパントテン酸キナーゼ：
(a)  配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるパントテン酸キナーゼ；
(b)  配列番号２で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつパントテン酸からホスホパントテン酸の反応を触媒する活性を有するパントテン酸キナーゼ。
【請求項２】
Geobacillus sp.（ゲオバシラス・エスピー）30株由来であり熱安定性に優れている、請求項１記載のパントテン酸キナーゼ。
【請求項３】
以下の(a)または(b)のパントテン酸からコエンザイムＡを合成するためのパントテン酸キナーゼであって、コエンザイムＡのフィードバック阻害を受けないパントテン酸キナーゼをコードするDNA：
(a)  配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるパントテン酸キナーゼ；
(b)  配列番号２で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつパントテン酸からホスホパントテン酸の反応を触媒する活性を有するパントテン酸キナーゼ。
【請求項４】
パントテン酸からコエンザイムＡを合成するためのパントテン酸キナーゼであって、コエンザイムＡのフィードバック阻害を受けないパントテン酸キナーゼをコードする以下の(c)または(d)のDNA：
(c)  配列番号１で表される塩基配列を含むDNA
(d)  配列番号１で表される塩基配列を含むDNAと少なくとも90％以上の配列同一性を有し、かつパントテン酸からホスホパントテン酸の反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項５】
Geobacillus sp.（ゲオバシラス・エスピー）30株由来であり熱安定性に優れている、請求項３または４に記載のパントテン酸キナーゼをコードするDNA。
【請求項６】
以下の(e)または(f)のパントテン酸からコエンザイムＡを合成するためのパントテン酸キナーゼであって、コエンザイムＡのフィードバック阻害を受けないパントテン酸キナーゼ：
(e)  配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるパントテン酸キナーゼ；
(f)  配列番号４で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつパントテン酸からホスホパントテン酸の反応を触媒する活性を有するパントテン酸キナーゼ。
【請求項７】
Thermus thermophilus（サーマス・サーモフィルス）HB8株由来であり熱安定性に優れている、請求項６記載のパントテン酸キナーゼ。
【請求項８】
以下の(e)または(f)のパントテン酸からコエンザイムＡを合成するためのパントテン酸キナーゼであって、コエンザイムＡのフィードバック阻害を受けないパントテン酸キナーゼをコードするDNA：
(e)  配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるパントテン酸キナーゼ；
(f)  配列番号４で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつパントテン酸からホスホパントテン酸の反応を触媒する活性を有するパントテン酸キナーゼ。
【請求項９】
パントテン酸からコエンザイムＡを合成するためのパントテン酸キナーゼであって、コエンザイムＡのフィードバック阻害を受けないパントテン酸キナーゼをコードする以下の(g)または(h)のDNA：
(g)  配列番号３で表される塩基配列を含むDNA
(h)  配列番号３で表される塩基配列を含むDNAと少なくとも90％以上の配列同一性を有し、かつパントテン酸からホスホパントテン酸の反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項１０】
Thermos thermophilus（サーマス・サーモフィルス）HB8株由来であり熱安定性に優れている、請求項８または９に記載のパントテン酸キナーゼをコードするDNA。
【請求項１１】
請求項３〜５のいずれか１項に記載のDNAを含む発現ベクターを宿主細胞に導入し、該宿主細胞を培養することを含む、請求項１または２に記載のパントテン酸キナーゼを作製する方法。
【請求項１２】
請求項８〜１０のいずれか１項に記載のDNAを含む発現ベクターを宿主細胞に導入し、該宿主細胞を培養することを含む、請求項６または７に記載のパントテン酸キナーゼを作製する方法。
【請求項１３】
請求項１、２、６または７に記載のパントテン酸キナーゼを用いて、パントテン酸からコエンザイムＡを生産する方法。
【請求項１４】
さらに、ホスホパントテン酸-システインリガーゼ（CoaB)、ホスホパントテノイルシステインデカルボキシラーゼ（CoaC）、パンテテインリン酸アデニリルトランスフェラーゼ（PA)及びデホスホCoAキナーゼ（DCK)を用いる、請求項１３記載の方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好熱性細菌由来のコエンザイムＡ（CoA）の生成に関与するパントテン酸キナーゼおよび該酵素をコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
コエンザイムＡ（補酵素Ａ、CoA）は全ての生物に存在しており、生体内の多くの反応において補酵素として作用する。
【０００３】
コエンザイムＡは、例えば酵母等の微生物から抽出、精製することにより製造することができるが、大量生産には適さず、製造コストも大きかった。
【０００４】
CoA合成経路は、数段階の酵素反応からなり、パントテン酸を基質としてパントテン酸をリン酸化しホスホパントテン酸を生成する初発反応は、パントテン酸キナーゼ（PanK）が触媒し、CoA合成経路に関与する他の酵素と共役させることでパントテン酸からCoAを生産することも可能である。しかしながらほとんどのパントテン酸キナーゼは、CoAやアセチルCoAによるフィードバック阻害を受けるだけでなく（非特許文献１を参照）、高温では活性が低下してしまうためこのようなパントテン酸キナーゼを用いてCoAを効率的に生産することは困難であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Shimosaka et al., (2016) J Bacteriol 198:1993-2000
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、CoAやアセチルCoAによるフィードバック阻害を受けず、なおかつ熱安定性に優れたパントテン酸キナーゼの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、多くのパントテン酸キナーゼがCoAによるフィードバック阻害を受けることに鑑み、CoAによるフィードバック阻害を受けないパントテン酸キナーゼの開発を鋭意検討した。
【０００８】
その結果、好熱性細菌であるGeobacillus sp.およびThermus thermophilusから単離したパントテン酸キナーゼがCoAおよびアセチルCoAによるフィードバック阻害を受けないことを見出した。さらに、これらのパントテン酸キナーゼが熱安定性に優れていることも見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  以下の(a)または(b)のパントテン酸からコエンザイムＡを合成するためのパントテン酸キナーゼであって、コエンザイムＡのフィードバック阻害を受けないパントテン酸キナーゼ：
(a)  配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるパントテン酸キナーゼ；
(b)  配列番号２で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつパントテン酸からホスホパントテン酸の反応を触媒する活性を有するパントテン酸キナーゼ。
[２]  Geobacillus sp.（ゲオバシラス・エスピー）30株由来であり熱安定性に優れている、[１]のパントテン酸キナーゼ。
[３]  以下の(a)または(b)のパントテン酸からコエンザイムＡを合成するためのパントテン酸キナーゼであって、コエンザイムＡのフィードバック阻害を受けないパントテン酸キナーゼをコードするDNA：
(a)  配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるパントテン酸キナーゼ；
(b)  配列番号２で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつパントテン酸からホスホパントテン酸の反応を触媒する活性を有するパントテン酸キナーゼ。
[４]  パントテン酸からコエンザイムＡを合成するためのパントテン酸キナーゼであって、コエンザイムＡのフィードバック阻害を受けないパントテン酸キナーゼをコードする以下の(c)または(d)のDNA：
(c)  配列番号１で表される塩基配列を含むDNA
(d)  配列番号１で表される塩基配列を含むDNAと少なくとも90％以上の配列同一性を有し、かつパントテン酸からホスホパントテン酸の反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
[５]  Geobacillus sp.（ゲオバシラス・エスピー）30由来であり熱安定性に優れている、[３]または[４]のパントテン酸キナーゼをコードするDNA。
[６]  以下の(e)または(f)のパントテン酸からコエンザイムＡを合成するためのパントテン酸キナーゼであって、コエンザイムＡのフィードバック阻害を受けないパントテン酸キナーゼ：
(e)  配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるパントテン酸キナーゼ；
(f)  配列番号４で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつパントテン酸からホスホパントテン酸の反応を触媒する活性を有するパントテン酸キナーゼ。
[７]  Thermus thermophilus（サーマス・サーモフィルス）HB8株由来であり熱安定性に優れている、[６]のパントテン酸キナーゼ。
[８]  以下の(e)または(f)のパントテン酸からコエンザイムＡを合成するためのパントテン酸キナーゼであって、コエンザイムＡのフィードバック阻害を受けないパントテン酸キナーゼをコードするDNA：
(e)  配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるパントテン酸キナーゼ；
(f)  配列番号４で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつパントテン酸からホスホパントテン酸の反応を触媒する活性を有するパントテン酸キナーゼ。
[９]  パントテン酸からコエンザイムＡを合成するためのパントテン酸キナーゼであって、コエンザイムＡのフィードバック阻害を受けないパントテン酸キナーゼをコードする以下の(g)または(h)のDNA：
(g)  配列番号３で表される塩基配列を含むDNA
(h)  配列番号３で表される塩基配列を含むDNAと少なくとも90％以上の配列同一性を有し、かつパントテン酸からホスホパントテン酸の反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
[１０]  Thermus thermophilus（サーマス・サーモフィルス）HB8株由来であり熱安定性に優れている、[８]または[９]のパントテン酸キナーゼをコードするDNA。
[１１]  [３]〜[５]のいずれかのDNAを含む発現ベクターを宿主細胞に導入し、該宿主細胞を培養することを含む、[１]または[２]のパントテン酸キナーゼを作製する方法。
[１２]  [８]〜[１０]のいずれかのDNAを含む発現ベクターを宿主細胞に導入し、該宿主細胞を培養することを含む、[６]または[７]に記載のパントテン酸キナーゼを作製する方法。
[１３]  [１]、[２]、[６]または[７]のパントテン酸キナーゼを用いて、パントテン酸からコエンザイムＡを生産する方法。
[１４]  さらに、ホスホパントテン酸-システインリガーゼ（CoaB)、ホスホパントテノイルシステインデカルボキシラーゼ（CoaC）、パンテテインリン酸アデニリルトランスフェラーゼ（PA)及びデホスホCoAキナーゼ（DCK)を用いる、[１３]の方法。
【発明の効果】
【００１０】
好熱性細菌であるGeobacillus sp.およびThermus thermophilus由来のパントテン酸キナーゼは、CoAやアセチルCoAによりフィードバック阻害を受けない。また、好熱性細菌由来の酵素であるため熱安定性が高い。よって、本発明のパントテン酸キナーゼは、コエンザイムAの有用中間体製造の生体触媒として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】一般的なCoA合成経路を示す図である。
【図２】反応温度がGbPanK（A)およびTtPanK（B)の活性に及ぼす影響を示す図である。
【図３】pHがGbPanK（A)およびTtPanK（B)の活性に及ぼす影響を示す図である。
【図４】GbPanK(A)およびTtPanK(B)の熱安定性を示す図である。
【図５】CoAがGbPanK(A)およびTtPanK(B)の活性に及ぼす影響を示す図である。
【図６】アセチルCoAがGbPanK(A)およびTtPanK(B)の活性に及ぼす影響を示す図である。
【図７】実施例３で構築したD-パントテン酸を初発物質とするCoA生産経路を示す図である。
【図８】各温度におけるデホスホCoA及びCoA生産量を示す図である。Ａは、耐熱性酵素を含まないコントロールを示し、Ｂは耐熱性酵素存在下でのデホスホCoA及びCoA生産量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、新規なパントテン酸キナーゼ（PanK)である。
本発明のパントテン酸キナーゼは、好熱性細菌から単離することができる。好ましくはGeobacillus sp.（ゲオバシラス・エスピー）30株またはThermus thermophilus (サーマス・サーモフィルス）HB8株から単離することができる。Geobacillus sp.はゲオバシラス属に属するグラム陽性の好熱菌である。T. thermophilusはサーマス属に属するグラム陰性の好気性真正細菌であり、約75℃に至適生育温度を有する高度好熱菌である。
【００１３】
Geobacillus sp.（ゲオバシラス・エスピー）30株から単離されたパントテン酸キナーゼをGbPanKと呼び、T. thermophilus（サーマス・サーモフィルス）HB8株から単離されたパントテン酸キナーゼをTtPanKと呼ぶ。GbPanKをコードするDNAの塩基配列を配列番号１にアミノ酸配列を配列番号２に示す。また、TtPanKをコードするDNAの塩基配列を配列番号３にアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００１４】
本発明のパントテン酸キナーゼは、そのアミノ酸配列からなるタンパク質がパントテン酸キナーゼ活性を有する限り、当該アミノ酸配列において少なくとも１個、好ましくは１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異を有していてもよい。
【００１５】
例えば、配列番号２または４で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１または数個（例えば１〜10個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１若しくは２個）のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２または４で表わされるアミノ酸配列に少なくとも１個、好ましくは１または数個（例えば１〜10個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１若しくは２個）のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２または４で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１または数個（例えば１〜10個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１若しくは２個）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。また、配列番号２および４のアミノ酸配列において、１番目のMetはなくてもよい。
【００１６】
このような配列番号２または４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列として、配列番号２または４のアミノ酸配列と、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、少なくとも85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、さらに好ましくは97％以上、さらに好ましくは98％以上、特に好ましくは98％以上の配列同一性を有しているものが挙げられる。
【００１７】
このような配列番号２または４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質は配列番号２または４のアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同一である。
【００１８】
また、配列番号１または３に表される塩基配列からなるDNAと相補的な配列からなるDNAと下記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるDNAであってパントテン酸キナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAも本発明のDNAに含まれる。すなわち、DNAを固定したフィルターを用いて、0.7〜1.0 MのNaCl存在下、68℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のSSC溶液（1倍濃度のSSCとは150 mM NaCl、15 mM クエン酸ナトリウムからなる）を用い、68℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。あるいは、サザンブロッティング法によりニトロセルロース膜上にDNAを転写、固定後、ハイブリダイゼーション緩衝液〔50％ フォルムアミド、４×SSC、50 mM HEPES(pH7.0)、10×デンハルツ（Denhardt's）溶液、100μg/mlサケ精子DNA〕中で42℃で一晩反応させることによりハイブリッドを形成することができるDNAである。
【００１９】
また、配列番号１または３に表される塩基配列からなるDNAとBLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、少なくとも85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、さらに好ましくは97％以上、さらに好ましくは98％以上、特に好ましくは98％以上の配列同一性を有しているDNAであって、パントテン酸キナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAも本発明のパントテン酸キナーゼをコードするDNAに包含される。
【００２０】
さらに、上記DNAに対するRNA、または該RNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるRNAであってパントテン酸キナーゼ活性を有するタンパク質をコードするRNAも本発明に含まれる。
【００２１】
本発明のパントテン酸キナーゼは、上記のGeobacillus sp.（ゲオバチルス・エスピー）30株またはT. thermophilus（サーマス・サーモフィルス）HB8株を培養し、該株に産生させ公知の方法で精製することにより得ることができる。本発明において、遺伝子の導入は、遺伝子の機能を有するポリヌクレオチドを組換え核酸として宿主に導入する全ての場合を含む。ポリヌクレオチドは、核酸、および１本鎖、２本鎖または３本鎖のDNAまたはRNAを包含する。遺伝子の導入には、組換えベクターによって導入する場合や、PCR等で合成した核酸を用いて相同組換えによって導入する場合が含まれる。
【００２２】
遺伝子を導入する宿主の種類は限定されず、細菌、真菌、各種の酵母などの単細胞真核生物、または動物もしくは植物の生細胞を任意に選択できるが、本発明においては、微生物が好ましく、特に大腸菌が好ましい。宿主大腸菌は通常遺伝子工学に用いられる大腸菌K-12株の中から適切なものを選択する。代表的なものとしてJM105やJM109が挙げられるが、DH5あるいは誘導型の発現系に用いられるBL21やBL21(DE3)などを使用してもよい。
【００２３】
遺伝子は、より好ましくは、遺伝子の発現を強化する発現ベクターによって導入される。発現ベクターは、導入しようとする遺伝子を、その発現を強化する種々のDNA断片またはRNA断片と融合させたものである。好ましくは、発現ベクターは、遺伝子を恒常的または誘導的に発現させるための転写プロモーター、転写ターミネーター、選択マーカーを含み得る。所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、オペレーター、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００２４】
ベクターとしては、限定はされないが、大腸菌を宿主とする場合によく利用されるプラスミド、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pSC101、pBR322、pHSG298、pVC18、pVC19、pTrc99A、pMal-c2、pGEX2T、pTV118N、pTV119N、pTRP等を好ましく使用でき、その他にもS.cerevisiaeを宿主とする場合によく利用されるYep13、Yep24、YCp50、pRS414、pRS415、pRS404、pAUR101、pKG1等も利用でき、枯草菌を宿主とする場合によく利用されるプラスミドpUB110、pC194等も利用できる。更に、pBI122、pBI1101その他の各種のものも限定なく使用できる。
【００２５】
大腸菌での発現用の転写プロモーターとして、例えばトリプトファン合成酵素(trp)、ラクトースオペロン(lac)、あるいはこれらを融合したtacおよびtrcプロモーター、λファージPLおよびPRプロモーター、T7ファージのプロモーター等が例として挙げられる。しかし、プロモーターが強力すぎると目的タンパク質の大腸菌内における発現が過多となり、その結果、目的タンパク質が封入体を形成しやすくなり、その後の分離および精製工程が困難となる。ゆえに可溶性画分への発現あるいは培養上清中へのタンパク質の分泌を可能にすべく最適なプロモーターを選択する必要があり、このような点を考慮するとトリプトファンプロモーター(trp)が望ましい。トリプトファンプロモーター(trp)を有する発現ベクターとしては、pTRP(Clinica Chimica Acta 237,43-58(1995))等が挙げられる。
【００２６】
選択マーカーの例としては、ホルムアルデヒド耐性マーカー、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコールなどの薬剤耐性マーカー、ロイシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、アルギニン、トリプトファン、ウラシルなどの栄養要求性マーカーが挙げられるがこれに限定されない。
【００２７】
一般的な組換えベクターの構築方法としては、例えば、PCR法等で調製した遺伝子断片を、適当な制限酵素とリガーゼを用いて組換えベクターに組み込む方法が挙げられる。好ましくは市販のライゲーションキット、例えばLigation high（東洋紡社製）を用いて、規定の条件にてライゲーション反応を行うことにより組換えベクターを得ることができる。また、これらのベクターを、必要であればボイル法、アルカリSDS法、磁性ビーズ法およびそれらの原理を使用した市販されているキット等により精製し、さらにエタノール沈殿法、ポリエチレングリコール沈殿法などの濃縮手段により濃縮することができる。
【００２８】
遺伝子の導入方法としては、特に制限されないが、例えば、電気パルス法、コンピテントセル法、塩化カルシウム法、プロトプラスト法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法等を挙げることができる。具体的には、大腸菌への遺伝子の導入には、ハナハンの方法等を利用でき、酵母への遺伝子の導入には、リチウムイオン法等を利用できる。
【００２９】
相同組換えによってゲノム上の任意の位置に目的の遺伝子を挿入する方法は、ゲノム上の配列と相同な配列に目的遺伝子をプロモーターとともに挿入し、このDNA断片をエレクトロポレーションによって細胞内に導入して相同組換えを起こさせることにより実施できる。ゲノムへの導入の際には目的遺伝子と選択マーカー遺伝子を連結したDNA断片を用いると容易に相同組換えが起こった株を選抜することができる。また、薬剤耐性遺伝子と特定の条件下で致死的になる遺伝子を連結した遺伝子をゲノム上に上記の方法で相同組換えによって挿入し、その後、薬剤耐性遺伝子と特定の条件下で致死的になる遺伝子を置き換える形で目的遺伝子を相同組換えを利用して導入することもできる。
【００３０】
一般的に形質転換体を利用する目的物の生産方法において認められることであるが、本発明のパントテン酸キナーゼにおいても、導入遺伝子の選択、導入すべき宿主の選択、発現ベクターの導入手段とそれに適したDNAまたはRNAの構築方法の選択、培地もしくはこれに対する添加物の種類や濃度の選択、形質転換体の培養条件または生育条件の選択等の要因が、パントテン酸キナーゼの生産量に影響する場合がある。
【００３１】
上記形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００３２】
炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グリセリンなどのポリオール類、またはピルビン酸、コハク酸もしくはクエン酸等の有機酸類を使用することができる。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物、またはアンモニアもしくはその塩などを使用することができる。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミン、消泡剤なども必要に応じて使用してもよい。また、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドなどのタンパク質発現誘導剤を必要に応じて培地に添加してもよい。
【００３３】
培養は、通常、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下、好ましくは0〜40℃、より好ましくは10〜37℃、特に好ましくは15〜37℃で培養を行う。培養期間中、培地のpHは宿主の発育が可能で、生産されたパントテン酸キナーゼの活性が損なわれない範囲で適宜変更することができるが、好ましくはpH 4〜8程度の範囲である。pHの調整は、無機または有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３４】
続いて、形質転換体の培養により可溶化発現したパントテン酸キナーゼを、培養物から採取する。培養物には、培養液、培養上清、培養細胞、培養菌体、細胞または菌体の破砕物が包含される。採取方法は、通常行われる細胞または菌体の破砕物からの抽出だけでなく、場合によっては、適当な抽出溶媒を用いて培養液からも直接抽出できる。利用する宿主の種類によっては、パントテン酸キナーゼの少なくとも一部が宿主細胞内または細胞表面に止まる場合があるが、細胞膜または細胞壁の破壊や、適宜な抽出溶媒による抽出等の公知の各種操作を経て、採取することができる。
【００３５】
宿主の対数増殖期を過ぎたときに上記温度範囲に設定することでパントテン酸キナーゼ遺伝子が発現し、宿主内に非常に高い比活性を示すパントテン酸キナーゼを製造することができる。培養後、目的のパントテン酸キナーゼが宿主内に生産されるため菌体または細胞を破砕し、粗酵素懸濁液を調製する。この粗酵素懸濁液には、非常に多くのパントテン酸キナーゼが含まれる。したがって、得られた粗酵素懸濁液をそのまま利用してもよい。なお、得られた粗酵素懸濁液から熱処理によってパントテン酸キナーゼを簡易精製することもできる。また、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせても単離精製することができる。単離精製されたパントテン酸キナーゼは、所定のpHの緩衝液等に懸濁された状態で利用することができる。
【００３６】
本発明のパントテン酸キナーゼ(GbPanKおよびTtPanK)は、パントテン酸(pantothenate)をホスホパントテン酸(phosphopantothenate)に変換する反応を触媒する。パントテン酸からCoAに至る反応経路の他の反応を触媒する酵素と組合せて用いることにより、本発明のパントテン酸キナーゼを用いてCoA等のパントテン酸誘導体を生産することができる。パントテン酸からCoAに至る反応経路を図１に示す。パントテン酸誘導体として、ホスホパントテン酸（phosphopantothenate）、ホスホパントテノイルシステイン（phosphopantothenoyl-cysteine)、ホスホパンテテイン（phosphopantetheine）、デホスホCoA（dephospho CoA）、コエンザイムＡが挙げられる。ホスホパントテン酸をホスホパントテノイルシステインに変換する酵素として、ホスホパントテン酸-システインリガーゼ（phosphopantothenate-cysteine ligase：CoaB）が挙げられ、ホスホパントテノイルシステインをホスホパンテテインに変換する酵素として、ホスホパントテノイルシステインデカルボキシラーゼ（phosphopantothenoylcysteine decarboxylase：CoaC）が挙げられ、ホスホパンテテインをデホスホCoAに変換する酵素として、パンテテインリン酸アデニリルトランスフェラーゼ（pantetheine-phosphate adenylyltransferase）(PA)が挙げられ、デホスホCoAをCoAに変換する酵素として、デホスホCoAキナーゼ（dephospho-CoA kinase） (DCK)が挙げられる。すなわち、本発明のパントテン酸キナーゼGbPanKまたはTtPanKとこれらの酵素を組合せて用いることにより、CoA等のパントテン酸誘導体を生産することができる。すなわち、図７に示すように、D-パントテン酸をPanKによりD-ホスホパントテン酸に変換し、次いでホスホパントテン酸-システインリガーゼ（CoaB)によりD-ホスホパントテノイル-L-システインに変換し、次いでホスホパントテノイルシステインデカルボキシラーゼ（CoaC）により、D-ホスホパンテテインに変換し、次いでパンテテインリン酸アデニリルトランスフェラーゼ（PA)によりデホスホCoAに変換し、次いでデホスホCoAキナーゼ（DCK)によりCoAに変換する。
【００３７】
この際、ホスホパントテン酸-システインリガーゼ（CoaB)及びホスホパントテノイルシステインデカルボキシラーゼ（CoaC）として、Methanocaldococcus jannaschii（メタノカルドコックス・ヤンナスキイ）由来のものを用いることができる。また、パンテテインリン酸アデニリルトランスフェラーゼ（PA)及びデホスホCoAキナーゼ（DCK)として、T. thermophilus（サーマス・サーモフィルス）HB8株由来のものを用いることができる。
【００３８】
用いる酵素は、上記の微生物から精製して用いてもよいし、大腸菌や動物細胞により作製したリコンビナント酵素を用いてもよい。M. jannaschiiは本来、CoaB、CoaCの2つの機能ドメインがひとつのポリペプチド鎖としてコードされた融合遺伝子を有するが、CoaB（C末側）及びCoaC（N末側）として、それぞれのドメインのリコンビナントタンパク質を用いることができる。また、大腸菌を用いてリコンビナント酵素を作製する場合、コドンを大腸菌用に最適化することが好ましい。
【００３９】
配列番号９にCoaB、CoaCの2つの機能ドメインがひとつのポリペプチド鎖としてコードされた融合遺伝子の発現産物のアミノ酸配列を、配列番号１０にCoaCドメイン（N末端）のアミノ酸配列を、配列番号１１にCoaBドメイン（C末端）のアミノ酸配列を示す。また、配列番号１２に本来、CoaB、CoaCの2つの機能ドメインをひとつのポリペプチド鎖としてコードするM. jannaschiiのゲノムDNAの配列を示し、配列番号１３にCoaCドメインをコードするゲノムDNAの配列を示し、配列番号１４にCoaBドメインをコードするゲノムDNAの配列を示す。さらに、配列番号１５にCoaB、CoaCの2つの機能ドメインをひとつのポリペプチド鎖としてコードするDNAを大腸菌用にコドンを最適化した配列を示し、配列番号１６にCoaCドメインをコードするDNAを大腸菌用にコドンを最適化した配列を示し、配列番号１７にCoaBドメインをコードするDNAを大腸菌用にコドンを最適化した配列を示す。さらに、配列番号１８及び１９に、それぞれパンテテインリン酸アデニリルトランスフェラーゼ（PA)のDNA配列及びアミノ酸配列を示し、配列番号２０及び２１に、それぞれデホスホCoAキナーゼ（DCK)のDNA配列及びアミノ酸配列を示す。
【００４０】
本発明のパントテン酸キナーゼは、熱安定性に優れている。例えば、本発明のパントテン酸キナーゼを60℃で２時間インキュベートした場合であっても、インキュベート前の活性に対して、80％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは93％以上、特に好ましくは95％以上の活性を有している。また、70℃で２時間インキュベートした場合であっても、インキュベート前の活性に対して、85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは93％以上、特に好ましくは95％以上の活性を有している。さらに、80℃で２時間インキュベートした場合であっても、インキュベート前の活性に対して、85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは93％以上、特に好ましくは95％以上の活性を有している。
【００４１】
なお、パントテン酸キナーゼの活性は、例えば、D-パントテン酸のリン酸化に伴うATP消費量とADP蓄積量をHPLCにて定量することにより測定することができる。
【００４２】
通常、パントテン酸キナーゼの活性は、上記経路の最終生産物であるCoAによりフィードバック阻害されるが、本発明のGbPanKおよびTtPanKは、CoAのフィードバック阻害を受けない。従って、PanKおよびCoA生産に関わる他の酵素を混合して用いてCoAを生産する場合であっても、CoAによるフィードバック阻害を受けないので、CoAを高率的に生産することができる。また、本発明のGbPanKおよびTtPanKは、アセチルCoAによってもフィードバック阻害を受けない。
【００４３】
本発明は、本発明のパントテン酸キナーゼを用いて、パントテン酸誘導体を生産する方法を包含する。さらに、CoA合成経路に関与する他の酵素と組合せてCoAを生産する方法を包含する。
【００４４】
この際、好熱性細菌から単離したGbPanKまたはTtPanKを基質と混合して酵素反応を起こさせてもよい。また、GbPanKまたはTtPanKをコードするDNAを発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを宿主細胞に導入し、該宿主細胞を基質と混合し、GbPanKまたはTtPanKを発現させて、酵素反応を起こさせてもよい。この際、基質としては、パントテン酸の他、ATPやL-システインも適宜混合する。
【００４５】
さらに、CoAの生産に関与する他の酵素をコードするDNAを宿主細胞に導入し、それらの酵素を共発現させ、図１に示す一連の反応を起こさせ、CoAを生産することもできる。
生産したCoAは、公知のクロマトグラフィー等の手法により精製することができる。
【実施例】
【００４６】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００４７】
実施例１  好熱性細菌からのPanKの単離
［方法］
（使用微生物とプラスミド)
H. pylori、P. aeruginosa (Brand and Strauss, J Biol Chem 280:20185-20188頁, 2005年)およびT. maritima (Shimosaka等, J Bacteriol 198:1993-2000頁, 2016年)由来の既知のtype III PanKのアミノ酸配列をクエリとしたBLAST検索により、本発明者等が保有する好熱菌のうち、Geobacillus sp. 30株(Tsuji等, Appl Microbiol Biotechnol 98:5925-5935頁, 2014年)およびThermus thermophilus HB8株(Oshima等, Microbiol. 76:18-27頁, 1974年)よりtype III PanKと推定されるホモログ酵素（それぞれGbPanK、TtPanKとする）遺伝子を見出した。
【００４８】
GbPanK遺伝子は、Geobacillus sp. 30株のゲノムDNAをテンプレートとし、AGTCTACATATGATTTTTGTGTTAGATGTT（配列番号５）(下線はNdeI認識配列）およびACGGTCCTCGAGTCATTGTTTTTTATCTACATT（配列番号６）（下線はXhoI認識配列）に示すプライマーを用いたPCRにより取得した。これらのプライマーの５’末端には制限酵素NdeI、XhoIの認識配列が付加されている。得られたPCR産物をNdeI、XhoI消化し、pET21aの同サイトに連結した。
【００４９】
TtPanK発現ベクターは、T. thermophilus HB8株のゲノムDNAをテンプレートとし、AGTCTACATATGCTCCTCGCGGTGGACATC（配列番号７）（下線はNdeI認識配列）およびACGGGATCCTCACCCTCGCCCCAGGTG（配列番号８）（下線はBamHI認識配列）に示すプライマーを用いたPCRにより取得した。これらのプライマーの５’末端には制限酵素NdeI、BamHIの認識配列が付加されている。得られたPCR産物をNdeI、BamHI消化し、pET21aの同サイトに連結した。
【００５０】
以上のとおり作製されたTtPanK、GbPanK発現用プラスミドをそれぞれpET-TtPanK、pET-GbPanKとした。
【００５１】
次いで、GbPanK、TtPanKのそれぞれのN末端にヘキサヒスチジン(His6)タグを付した融合タンパク質の発現ベクターを作製した。具体的には、GbPanKについては配列番号５および６のプライマー（GbPanK-F、GbPanK-R）を、およびTtPanKについては配列番号７および配列番号８のプライマー（TtPanK-F、TtPanK-R)を用いたPCRによりGbPanK遺伝子およびTtPanK遺伝子を増幅した。GbPanK遺伝子は、NdeI、XhoIで、TtPanK遺伝子はNdeI、BamHIで消化し、pET19bの該当するサイトに連結した。得られたプラスミドをそれぞれpET-His6-GbPanK、pET-His6-TtPanKとする。
【００５２】
構築した各プラスミドは、Escherichia coli Rosetta 2 (DE3)に導入し、発現株を作製した。組換え大腸菌の培養は、100μg mL-1アンピシリン、30μg mL-1クロラムフェニコールを含むLuria Bertani (LB) 培地を使用し、37℃で好気的に行った。対数増殖後期の培養液に終濃度0.2 mMのisopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)を添加することで目的遺伝子の発現を誘導し、さらに3時間の培養を行った。
【００５３】
（酵素調製)
培養後の組換え大腸菌を8,000 rpm、2分間の遠心分離にて回収した。得られた湿菌体を200 mg wet cells mL-1程度になるように50 mM Tris-HCl (pH7.5)に再懸濁し、超音波破砕を行った。破砕後、15,000 rpm、4℃、5分間の遠心分離を行い、得られた上清を70℃、30分間の熱処理に供した。再度、15,000 rpm、4℃、5分間の遠心分離を行い、変性タンパク質を取り除き、得られた上清を熱処理粗酵素液として得た。
【００５４】
His6タグを付加したPanKはAKTA purifierを用いたニッケル（Ni）アフィニティカラムクロマトグラフィーによる精製に供した。HisTrap HP (1 mL)カラムを2 mLの500 mM NaCl、30 mMイミダゾールを含む50 mM Tris-HCl (pH7.5)で平衡化し、熱処理を行った酵素液をマウントした。上記の溶離液5 CV(カラム体積）で非吸着タンパク質を洗い流した後、20 CVの溶離液中でイミダゾール濃度を30 mMから500 mMまで直線的にあげるグラジエント溶出で目的タンパク質を回収した。
【００５５】
[結果と考察]
GbPanK、TtPanK遺伝子のそれぞれをpETベクターのT7プロモーター制御下に組み込み、大腸菌内で発現させた。この際、IPTGによる発現誘導後の培養温度を20℃、37℃の2通りで行い、SDS-PAGEにて可溶性画分中の目的酵素生産量の比較を行った。His6タグ付加のないPanKの場合、由来と培養温度の別によらず目的酵素の推定分子量（約28 kDa）付近に目立ったバンドは見られず酵素の発現を確認することができなかった。これに対し、N 末端にHis6タグを付した場合、いずれのケースにおいても28 kDa付近に空ベクター保持株（Null）には見られないバンドが確認できた。以上の結果から、GbPanK、TtPanKの大腸菌内での発現にはN末端へのHis6タグの付加が有効であることが示された。
【００５６】
実施例２  PanKの酵素学的性能評価
［方法］
酵素活性測定は、50 mM Tris-HCl (pH7.5)、5 mM ATP、10 mM MgCl2、60 mM NH4Cl、60 mM KCl、10 mM pantothenate calcium、および酵素液からなる反応液（100μL）を用いて行った。酵素液を含まない反応液を60℃で約2分間プレインキュベートした後、適量の酵素液を加え反応を開始した。酵素液添加後、60℃で30分間のインキュベートを行い、1 M HCl (Wako Pure Chemical) 20μLを加えることで反応を停止させた。反応液を15,000 rpm、4℃、5分間の遠心分離に供し、上清中のATPおよびADPをHPLCにて分析した。HPLC分析には5C18-AR-II (Nacalai Tesque, φ4.6 × 150 mm)カラムを使用し、溶出にはA溶液；20 mM tert-butyl amine (pH6.8)、B溶液; 10% (v/v) methanol in 20 mM tert-butyl amine (pH6.8)を用いた。カラム温度40℃、溶離液流速1.0 mL min-1で、B溶液の濃度を10分間で20% (v/v)から100% (v/v)に直線的に増加させるグラジエント溶出を行った。検出は溶離液の254 nmの吸収を測定することで行った。
【００５７】
[結果と考察]
（比活性)
PanK活性測定は、パントテン酸を基質とした際のADP生成量（およびATP消費量）をHPLCで定量することにより行った。アッセイには、カラム精製後のGbPanK、TtPanKを使用した。反応に供する酵素量を適宜調整し、ADP生成速度に直線性が見られる範囲で反応の初速度を求めた。また精製酵素標品中のタンパク質濃度をBradford法で定量し、各酵素の比活性を算出した。この結果、60℃、pH7.5におけるGbPanK、TtPanKの比活性はそれぞれ3.97、2.78μmol min-1 mg-1 enzymeと求められた。
【００５８】
（基礎性能評価)
（１）反応温度、pHが及ぼす影響の検証
反応温度とpHがGbPanKおよびTtPanKの活性に及ぼす影響を検証した。図２に示す各温度で30分間の反応を行いADP生成量より活性を求めた。相対活性は90℃で反応を行ったときの活性値を100%として算出した。また、図３のpH活性については、反応液のpH調整には50 mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH 5〜8、四角シンボル）、もしくは50 mM 炭酸ナトリウム緩衝液（pH 9〜10、丸シンボル）を用いた。GbPanKはpH 6、TtPanKはpH 7で反応させたときの酵素活性を100%として相対活性を算出した。図２に温度の影響を示し、図３にpHの影響を示す。図２に示すとおり、GbPanKおよびTtPanKともに60〜90℃の範囲で優れた活性を示した。また、図３に示すとおり、pHに関しては中性付近が好適であることが認められた。
【００５９】
（２）熱安定性の評価
図４Ａおよび図４Ｂは、それぞれ、GbPanKおよびTtPanKの熱安定性を示す。His-tag付加した各酵素をニッケルアフィニティカラムにて精製後、図４に示した温度で50 mM Tris-HCl (pH7.5)中で2時間インキュベートし、その残存活性を評価した。活性測定はD-パントテン酸のリン酸化に伴うATP消費量とADP蓄積量をHPLCにて定量することで行った。残存活性は、氷上（4℃）で同時間インキュベートした酵素の残存活性を100%とした相対残存活性で表した。図４Ａおよび図４Ｂに示すように、いずれの酵素も優れた熱安定性を有し、GbPanKでは60℃、TtPanKでは80℃までの範囲で90%以上の活性を保持できることがわかった。これはGeobacillus sp. 30が50〜60℃の範囲で最もよく生育できることに対し、Thermus thermophilus HB8は70〜75℃付近に最適生育温度を有する事実ともよく合致する。
【００６０】
（３）CoAおよびアセチルCoAが酵素活性に及ぼす影響の評価
図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれ、CoAがGbPanKおよびTtPanKの活性に及ぼす影響を示し、図６Ａおよび図６Ｂは、それぞれ、アセチルCoAがGbPanKおよびTtPanKの活性に及ぼす影響を示す。His-tag付加した各酵素をニッケルアフィニティカラムにて精製後、図５および図６に示した濃度のCoA、アセチルCoA存在下での活性を評価した。相対活性はCoA、アセチルCoAをともに含まない反応液中での活性に対するパーセンテージで表した。図５および図６に示すように、GbPanKおよびTtPanKともに活性はCoAおよびアセチルCoAにより影響を受けなかった。このことは、CoAおよびアセチルCoAによるフィードバック阻害を受けなかったことを示す。
【００６１】
実施例３  コエンザイムA(CoA)のin vitro合成
１．酵素の調製
（１）CoAのin vitro合成に用いた酵素を表１に示す。
【００６２】
【表１】
2020036576.tif 000002
【００６３】
（２）PanKの取得
PanK発現株は実施例１と同様に、pET19bを用いてN末端にHisタグを付加したベクターを作製し、E. coli Rosetta 2 (DE3)を宿主とした。
【００６４】
（３）Phosphopantothenate-cysteine ligase（ホスホパントテン酸-システインリガーゼ） (CoaB), phosphopantothenoylcysteine decarboxylase（ホスホパントテン酸-システインデカルボキシラーゼ）(CoaC)の取得方法
Thomas K., Wolfgang S., J Biol Chem (2006) 281: 5435-5444を参考にMethanocaldococcus jannaschii由来のCoaBCを、CoaB及びCoaCの各ドメインごとに別々にクローニングし、大腸菌内で発現させた。遺伝子は両端に制限酵素NdeIとBamHI認識配列を付加した合成DNA（大腸菌用にコドン最適化）を用いた。ベクターはpET21aを用い、宿主としてはE. coli BL21 (DE3)を用いた。
【００６５】
（前培養)
5 mLのLB培地（100μg/mLアンピシリン、PanK発現株にはさらに30μg/mLクロラムフェニコールを添加）を含む試験管内に、それぞれの組換え株のコロニーを植菌し、37℃で一晩振とう培養した。
【００６６】
（本培養)
500 mLフラスコ内に100 mL LB培地（100μg/mLアンピシリン、PanK発現株にはさらに30 g/mLクロラムフェニコールを添加）。上述の前培養液を5 mL添加し、3時間、37℃で振とう培養した。その後100 mM IPTGを100μL加え、再度37℃で3時間インキュベートした。集菌は8,000 rpm、5分間の遠心分離により行った。
【００６７】
(超音波破砕・熱処理)
得られた湿菌体を200 mg wet cells/mLとなるように50 mM Tris-HCl (pH8)に懸濁し、超音波破砕を行った。15,000 rpmで8分間遠心分離した後の上清を70℃、30分熱処理した。再度遠心分離により変性したタンパク質を取り除き、上清を熱処理酵素液として用いた。調製した酵素液は1 mLずつエッペンドルフチューブに分注し、-20℃で保管した。
【００６８】
（４）パンテテインリン酸アデニリルトランスフェラーゼ(PA)及びデホスホCoAキナーゼ(DCK)の取得
（発現系構築と培養)
Thermus thermophilus由来のパンテテインリン酸アデニリルトランスフェラーゼ(PA)遺伝子を化学合成し、EcoRIおよびSalIで切断後、pTRP発現ベクターに導入した。E. coli JM101を形質転換して得られたコロニーをLB培地 (2 mL)で種培養したのち、25 mL LB/ 100 mLフラスコに0.5 mLを接種し、30℃で培養した。その後、得られた菌体を20 mM Tris-HCl (pH 8.0)バッファーに懸濁したのち、超音波破砕を行なった。次いで、遠心分離により破砕液を清澄化したのち、SDS-PAGEにより目的蛋白質の発現を確認した。尚、デホスホCoAキナーゼ(DCK)もPAと同様の方法で目的蛋白質の発現を確認した。
【００６９】
（熱処理による簡易精製)
本酵素は好熱菌由来であるため、熱処理により目的蛋白質を簡易的に精製することができる。そこで、60-80℃で熱処理を行なうことで、CoA合成能評価のための粗精製品を調製した。コロニーを20 mL LB/ 100 mLフラスコに接種し、30℃で一晩培養した。次いで、1 L LB培地/ 2 Lフラスコに種培養(全量)を接種し、30℃で培養を行なった。遠心分離により菌体を回収したのち、20 mM Tris-HCl (pH 8.0)に懸濁した。その後、超音波破砕を行ない、遠心分離により清澄化した。それぞれの酵素において熱処理条件を検討した結果、70℃で30 minの熱処理を行なうことで、SDS-PAGEにおいてほぼ単一のバンドに精製することができた。
【００７０】
２．酵素反応
反応液を100μlずつ分注し、サーマルサイクラーのグラジエント機能を用いて、30, 50, 70℃の各温度で、24時間インキュベートした。インキュベート終了後、各サンプルに1M HCl 20μlを加えてクエンチングを行った。15,000 rpm, 5分間遠心分離し、上清をHPLC分析に供した。
酵素反応サンプル液組成は、表２に示すとおりである。
【００７１】
【表２】
2020036576.tif 000003
【００７２】
３．HPLC分析条件
カラム：5C18-AR-II (ナカライテスク社製, φ4.6 × 250mm)
溶離液：A. 50 mM リン酸Na緩衝液 pH 5.0
B. 50 mM リン酸Na緩衝液 pH 5.0 + 20% アセトニトリル
検出：UV210 nm
インジェクションボリューム：2 μl
なお、HPLC分析は表３に示すプログラムで実施した。
【００７３】
【表３】
2020036576.tif 000004
【００７４】
４．結果
構築したCoA生産経路を図７に示す。上記スキームに則り、CoAおよび同HPLC分析条件で検出が可能なdephospho CoAについて反応液中の濃度を定量した。実験は2回実施し、得られたデータの平均値を結果とした。CoA生合成に関わる耐熱性酵素を発現させた大腸菌の熱処理粗酵素液のほか、コントロールとして、耐熱性酵素遺伝子を含まない空ベクター(pET19b)を形質転換した大腸菌より調製した熱処理粗酵素液を用いた試験を行った。結果は図８に示す。コントロール（Ａ）では、極めて微量のdephospho CoA、CoAが検出されたが、これらは大腸菌の細胞に由来するものと考えられる。一方、耐熱性酵素を加えたサンプル（Ｂ）では、反応温度が高くなるほどCoAの蓄積量は増加していき、70℃において、0.96 mMに達した。今回の試験では、5 mMのパントテン酸を基質とし、補酵素として15 mM ATP、5 mM CTPを用いて行っているため、本試験で得られた生産物収率は19.3% (mol/mol)と求められる。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明のパントテン酸キナーゼは、コエンザイムAの有用中間体製造の生体触媒として利用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００７６】
配列番号５：プライマー（GbPanK-F)
配列番号６：プライマー（GbPanK-R)
配列番号７：プライマー（TtPanK-F)
配列番号８：プライマー（TtPanK-R)
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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