(57)【要約】【課題】移植片対宿主病の患者の治療又は予防に用いることができる新規な移植片対宿主病の治療剤又は予防剤を提供する。【解決手段】移植片対宿主病の治療剤又は予防剤は、老化細胞除去剤を有効成分として含有する。前記老化細胞除去剤は、下記式（Ｉ）で表されるＡＢＴ−２６３が好ましい。［化１］2020111548.tif 000005【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
老化細胞除去剤を有効成分として含有する、移植片対宿主病の治療剤又は予防剤。
【請求項２】
前記老化細胞除去剤が、下記式（Ｉ）で表されるＡＢＴ−２６３である、請求項１に記載の治療剤又は予防剤。
【化１】
2020111548.tif 000004
【請求項３】
前記移植片対宿主病は、骨髄移植後の移植片対宿主病である、請求項１又は２に記載の治療剤又は予防剤。
【請求項４】
前記移植片対宿主病が、眼における移植片宿主病である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の治療剤又は予防剤。
【請求項５】
前記移植片対宿主病が、ドライアイである、請求項４に記載の治療剤又は予防剤。
【請求項６】
前記移植片対宿主病が、炎症と病的線維化を伴うものである請求項１〜５のいずれか一項に記載の治療剤又は予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移植片対宿主病の治療剤又は予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
造血幹細胞移植は、造血幹細胞の異常に起因する血液悪性疾患に対して、他者の健康な造血幹細胞を移植して、白血病を根治させる治療法として行われている。他方、近年、ドナーから提供された骨髄細胞、末梢血又は臍帯血の移植片が、免疫応答によってレシピエントの標的臓器を攻撃することによって発症する移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ：以下、ＧＶＨＤと称することもある）が問題となっている。
【０００３】
これまでにヒト慢性ＧＶＨＤに酷似した病態を示すマウスモデルを用いて、新鮮ドナー骨髄間葉系幹細胞には免疫原性があり、ＧＶＨＤの外分泌腺、粘膜に生着し疾病の発症に関与することが報告されている（非特許文献１）。また、骨髄移植された造血幹細胞は移植後にテロメアの短縮が生じ、幹細胞老化を来すことが報告されている（非特許文献２）。間葉系幹細胞も同様に幹細胞老化を生じるとの報告もある（非特許文献３）。
【０００４】
また、ＧＶＨＤモデルマウスの発症初期涙腺に老化マクロファージの浸潤が認められることが知られている（非特許文献４）。また、ＧＶＨＤ涙腺および他の標的臓器の免疫性線維化には局所組織レニンアンギオテンシン系システム（ＲＡＳ）が関与し、その阻害剤で病態が軽減することが示されている（非特許文献５）。ＲＡＳは老化の進展に係るミトコンドリアの機能不全を惹起するとされ、ＧＶＨＤの病態に加齢性変化の側面が関与していることが示唆されている。さらに、老化にかかわる小胞体ストレスが慢性ＧＶＨＤ標的各臓器で過剰に亢進していることが見出され、小胞体ストレス抑制剤フェニル酪酸の投与により炎症と線維化が標的臓器で抑制されることが報告されている（非特許文献６）。これらの報告はＧＶＨＤの病態に加齢性変化が関与していることを示唆している。
【０００５】
造血幹細胞移植後は放射線照射等、過度のストレスや免疫機能低下により老化細胞が蓄積する（非特許文献７）。
近年、老化細胞が液性因子を持続的に放出し、隣接している細胞の活性化を促して慢性炎症を導く機構が、老化関連分泌形質（Senescence associated secretory phenotype；ＳＡＳＰ）として報告されている（非特許文献８、９）。そして、老化細胞が黄斑変性のような加齢性疾患の病態形成に積極的に関わることが報告されている（非特許文献１０）。
【０００６】
慢性ＧＶＨＤに対する治療薬としては、免疫抑制剤が知られているが、免疫抑制剤は部分的な効果があるものの、難治症例が多く存在する。
【０００７】
ＧＶＨＤの治療剤としては、例えば、眼表面の治療としてレバミピドやジクアホソルが知られており、レバミピドとジクアホソルとを併用することで、ＧＶＨＤの症状の一つであるドライアイを改善することが開示されている。しかしながら、上記レバミピドやジクアホソルは、軽度、中度のＧＶＨＤの患者の治療には用いることができるものの、重度のＧＶＨＤの患者の治療には用いることができない。
また、全身的には、シクロスポリンやタクロリムスのような免疫抑制剤およびステロイドによる治療が行われている。しかし、上記の薬剤による治療の効果は未だ不十分であり、ＧＶＨＤに対する有効な治療薬が存在しないのが実情である。
【０００８】
老化細胞除去剤の一つである、ＡＢＴ−２６３は、アポトーシスBcl-2ファミリーを標的とする薬剤であり、マウス体内で老化した造血幹細胞を除去することにより、老化した造血幹細胞を正常化し、活性化することが報告されている（非特許文献１１）が、ＧＶＨＤに効果があることについては知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ogawa Y, et al. eLife, 2016 Jan 26;5:e09394. doi: 10.7554/eLife.09394.
【非特許文献２】Seligman SJ, Lancet,1998 Apr 25;351(9111):1287-8.
【非特許文献３】Sethe S, Aging Res Rev, 2006 Feb;5(1):91-116. Epub 2005 Nov 28.
【非特許文献４】Kawai M, Ogawa Y, et al. Sci Rep, 2013;3:2455. doi: 10.1038/srep02455.
【非特許文献５】Yaguchi S, Ogawa Y, et al. PLoS One, 2013 Jun 6;8(6):e64724. doi: 10.1371/journal.pone.0064724. Print 2013.
【非特許文献６】Mukai S, Ogawa Y, et al. Sci Rep 2017, Royal Society Open Science, 2018 Oct 17;5(10):181067. doi: 10.1098/rsos.181067. eCollection 2018 Oct.
【非特許文献７】Munoz-Espin D, Nat Rev Mol Cell Biol, 2014 Jul;15(7):482-96. doi: 10.1038/nrm3823.
【非特許文献８】Rodier F, J Cell Biol. 2011 Feb 21;192(4):547-56. doi: 10.1083/jcb.201009094. Epub 2011 Feb 14.
【非特許文献９】Ohtani N, Nature 2013 Jul 4;499(7456):97-101. doi: 10.1038/nature12347. Epub 2013 Jun 26.
【非特許文献１０】Apte RS, Cell Metab. 2013 Apr 2;17(4):549-61. doi: 10.1016/j.cmet.2013.03.009.
【非特許文献１１】Chang J, et al. Nat Med 2016 Jan;22(1):78-83. doi: 10.1038/nm.4010. Epub 2015 Dec 14.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、ＧＶＨＤの患者の治療に用いることができる新規なＧＶＨＤの治療剤又は予防剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は以下の態様を含む。
［１］老化細胞除去剤を有効成分として含有する、移植片対宿主病の治療剤又は予防剤。
［２］前記老化細胞除去剤が、下記式（Ｉ）で表されるＡＢＴ−２６３である、［１］に記載の治療剤又は予防剤。
【００１２】
【化１】
2020111548.tif 000002
【００１３】
［３］前記移植片対宿主病は、骨髄移植後の移植片対宿主病である、［１］又は［２］に記載の治療剤又は予防剤。
［４］前記移植片対宿主病が、眼における移植片宿主病である、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の治療剤又は予防剤。
［５］前記移植片対宿主病が、ドライアイである、［４］に記載の治療剤又は予防剤。
［６］前記移植片対宿主病が、炎症と病的線維化を伴うものである［１］〜［５］のいずれか一項に記載の治療剤又は予防剤。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ＧＶＨＤの患者の治療又は予防に用いることができる新規なＧＶＨＤの治療剤又は予防剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】慢性ＧＶＨＤ（以下、ｃＧＶＨＤとも称する）マウスとコントロールマウスにおける全身のイメージングを示した図である。
【図１Ｂ】ｃＧＶＨＤモデルマウスとコントロールマウスの涙腺におけるヘマトキシン・エオジン染色（ＨＥ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）とマロニー染色（Ｍａｌｌｏｒｙ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）の画像を示した図である。
【図１Ｃ】ｃＧＶＨＤモデルマウスとコントロールマウスの涙腺を電子顕微鏡で観察した画像を示した図である。
【図１Ｄ】ｃＧＶＨＤモデルマウスとコントロールマウスの血清中でのＩＬ−６の骨髄移植後の濃度を示したグラフである。
【図２】ｃＧＶＨＤモデルマウスとコントロールマウスの涙腺のホルマリン固定パラフィン包埋組織切片での、ＤＮＡ損傷マーカーであるγ−Ｈ２Ａｘと５３ＢＰ１、及び老化関連マーカーであるｐ１６の各陽性細胞の免疫染色の画像と、各陽性細胞の数を示したグラフである。
【図３】ｃＧＶＨＤモデルマウスとコントロールマウスの涙腺のホルマリン固定パラフィン包埋組織切片での、マクロファージマーカーであるＣＤ６８、ＳＡＳＰ主要因子であるＩＬ−６、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ９の各陽性細胞の免疫染色の画像と、各陽性細胞の数を示したグラフである。
【図４】ｃＧＶＨＤモデルマウスの涙腺のホルマリン固定パラフィン包埋組織切片での、老化関連マーカーであるｐ１６、細胞増殖マーカーであるＫｉ−６７、マクロファージのマーカーであるＣＤ６８の各陽性細胞の免疫染色の画像である。
【図５】ｃＧＶＨＤモデルマウスとコントロールマウスの涙腺のホルマリン固定パラフィン包埋組織切片での、線維化マーカーであるＨＳＰ４７陽性細胞の免疫染色の画像と、各陽性細胞の数を示したグラフである。
【図６】老化細胞除去剤ＡＢＴ−２６３投与マウスとコントロールマウスの眼の外観とフルオレセイン染色の画像と、各マウスでの骨髄移植４週後の涙液量を示したグラフである。図中、Ｖｅｈｉｃｌｅはコントロールマウスの結果を示し、ＡＢＴ−２６３はＡＢＴ−２６３投与マウスの結果を示す。
【図７】老化細胞除去剤ＡＢＴ−２６３投与マウスとコントロールマウスの涙腺の免疫染色での観察像と、単位面積当たりの線維化面積を示したグラフである。図中、Ｖｅｈｉｃｌｅはコントロールマウスの結果を示し、ＡＢＴ−２６３はＡＢＴ−２６３投与マウスの結果を示す。
【図８】老化細胞除去剤ＡＢＴ−２６３投与マウスとコントロールマウスの涙腺の電子顕微鏡写真と、単位面積当たりの炎症性細胞（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌ）数を示したグラフである。図中、Ｖｅｈｉｃｌｅはコントロールマウスの結果を示し、ＡＢＴ−２６３はＡＢＴ−２６３投与マウスの結果を示す。
【図９】老化細胞除去剤ＡＢＴ−２６３投与マウスとコントロールマウスの涙腺のｐ１６遺伝子と、ＣＸＣＬ９遺伝子の発現を示したグラフである。図中、Ｖｅｈｉｃｌｅはコントロールマウスの結果を示し、ＡＢＴ−２６３はＡＢＴ−２６３投与マウスの結果を示す。
【図１０】老化細胞除去剤ＡＢＴ−２６３投与マウスとコントロールマウスの涙腺のマクロファージマーカーＣＤ６８、ＤＮＡ損傷マーカー５３ＢＰ１、老化関連マーカーｐ１６、ｐ２１の各陽性細胞の免疫染色の画像と、各陽性細胞の単位面積当たりの数を示したグラフである。図中、Ｖｅｈｉｃｌｅはコントロールマウスの結果を示し、ＡＢＴ−２６３はＡＢＴ−２６３投与マウスの結果を示す。
【図１１】老化細胞除去剤ＡＢＴ−２６３投与マウスとコントロールマウスの涙腺のＳＡＳＰ主要因子であるＣＸＣＬ９陽性細胞の免疫染色の画像と、単位面積当たりのＣＸＣＬ９陽性細胞の数を示したグラフである。図中、Ｖｅｈｉｃｌｅはコントロールマウスの結果を示し、ＡＢＴ−２６３はＡＢＴ−２６３投与マウスの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
［老化細胞除去剤］
本発明において、老化細胞除去剤としては、老化細胞を特異的に除去できる物質であれば特に制限はなく、例えば、老化細胞特異的に細胞死を誘導する物質等が挙げられる。具体的な老化細胞除去剤としては、例えば、ＡＢＴ−２６３、ＦＯＸＯ４−ＤＲＩ、Ｐｉｐｅｌｏｎｇｕｍｉｎｅ、Ａ１３３１８５２、Ａ１１５５４３６、Ｆｉｓｅｔｉｎ、ダサチニブとケルセチンの併用剤等が挙げられるが、ＡＢＴ−２６３が好ましい。ＡＢＴ−２６３は下記（Ｉ）式で表される化合物である。これらの老化細胞除去剤は、単独で用いても、組み合わせて用いてもよい。
【００１７】
【化２】
2020111548.tif 000003
【００１８】
老化細胞除去剤が、老化細胞を除去できることについては、例えば、老化マーカーｐ１６、ｐ５３、ｐ２１、ＤＮＡ損傷マーカーＢＰ５３、ＳＡＳＰ関連分子であるＩＬ−６、ＣＸＣＬ９等のマーカーの発現が減少すること、ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ陽性細胞および前記マーカーとの二重陽性となるＣＤ６８陽性老化マクロファージ、老化マーカーＣＤ１５３陽性Ｔ細胞が減少すること等により確認することができる。
【００１９】
老化細胞はＤＮＡ損傷、老化関連マーカーの発現、細胞増殖の不可逆的停止、ＳＡＳＰ関連分子の発現の上昇等により特定することができる。ＤＮＡ損傷は、ＤＮＡ損傷マーカーγ−Ｈ２Ａｘ、５３ＢＰ１等の発現により確認することができる。老化関連マーカーとしては、ｐ１６、ｐ２１等が挙げられる。細胞増殖の不可逆的停止は、細胞増殖マーカーＫｉ−６７等の発現により確認することができる。ＳＡＳＰ関連分子としては、インフラマゾーム因子Ｃａｓｐａｓｅ−１、ＳＡＳＰ誘導上流因子ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＳＡＳＰ主要因子ＣＸＣＬ１、ＩＬ−６、ＣＸＣＬ９等が挙げられる。
【００２０】
（ＧＶＨＤ）
本発明におけるＧＶＨＤの種類は、特に限定されず、例えば、その症状が眼、口腔、肝臓、消化管、皮膚、肺等の外分泌腺を備える器官において発現するものが挙げられる。また、本発明におけるＧＶＨＤは、炎症や病的線維化を伴っているものが挙げられる。
これらのうち、本発明の治療剤又は予防剤は、眼におけるＧＶＨＤに用いることが好ましい。
【００２１】
眼におけるＧＶＨＤとしては、特に限定されないが、例えば、ドライアイ、乾性結膜炎、角膜損傷等、ドライアイに伴う結膜線維化が挙げられる。これらのうち、特に治療又は予防効果に優れることから、治療又は予防対象である眼におけるＧＶＨＤの疾患は、ドライアイであることが好ましい。
【００２２】
口腔におけるＧＶＨＤとしては、特に限定されないが、例えば、口腔乾燥症、皮膚硬化による開口障害等が挙げられる。
【００２３】
肝臓におけるＧＶＨＤとしては、特に限定されないが、例えば、急性肝炎、肝硬変等が挙げられる。
【００２４】
消化管におけるＧＶＨＤとしては、特に限定されないが、例えば、下痢、食欲不振、嘔吐、上部消化管狭窄や拘束等が挙げられる。
【００２５】
皮膚におけるＧＶＨＤとしては、特に限定されないが、例えば、皮膚乾燥症、強皮症等が挙げられる。
【００２６】
肺におけるＧＶＨＤとしては、特に限定されないが、例えば、間質性肺炎、閉塞性肺炎等が挙げられる。
【００２７】
ＧＶＨＤの原因となる移植される臓器としては、特に限定されず、例えば、骨髄、血液（輸血）等が挙げられる。ＧＶＨＤは、特に、骨髄移植後に、骨髄由来の造血幹細胞が、ＧＶＨＤの原因である線維芽細胞に分化して、血中を経由して、外分泌腺の組織に浸潤する可能性が指摘されている。しかしながら、本発明の治療剤又は予防剤は、線維芽細胞浸潤の抑制効果に優れることから、このような骨髄移植後のＧＶＨＤに対して、特に優れた治療又は予防効果を発揮する。このことから、本発明の治療剤又は予防剤の対象のＧＶＨＤは、骨髄移植後のＧＶＨＤであることが好ましい。
【００２８】
ＧＶＨＤは、慢性ＧＶＨＤであってもよく、急性ＧＶＨＤであってもよい。なお、通常、慢性ＧＶＨＤとは、移植後、一定期間経過後に発症するＧＶＨＤのことを指し、例えば、古典的な分類では移植後、１００日以降に発症するＧＶＨＤを指す。急性ＧＶＨＤとは、移植後、一定期間内（慢性ＧＶＨＤが発症するまでの期間より短い期間内）に発症するＧＶＨＤを指し、例えば、移植後、古典的には１００日以内に発症するＧＶＨＤを指す。現在の分類では時期による分類はなされておらず急性、慢性に典型的で特徴的所見により両者の区別がなされている。本発明のＧＶＨＤの治療剤又は予防剤は、特に、慢性ＧＶＨＤに好適に用いることができる。その理由は、線維化抑制に有効であるためであると推測される。
【００２９】
本発明の治療剤又は予防剤は、軽度、中度、又は重度のいずれのＧＶＨＤにも適用可能であるが、特に、重度のＧＶＨＤの治療又は予防に好適に用いることができる。その理由は、重症例のドライアイでは線維化が著明であるからである。なお、重度のＧＶＨＤとは、通常、涙液分泌の細胞源となる涙腺上皮細胞、角結膜ムチンの分泌上皮細胞、マイボーム腺上皮細胞が重度の障害された眼ＧＶＨＤのことを指す。
【００３０】
［ＧＶＨＤの治療又は予防効果の評価］
ＧＶＨＤの治療又は予防効果は、ＧＶＨＤモデル動物を用いて評価することができる。ＧＶＨＤモデル動物の作製方法は公知であり、Ｓｃｉ  Ｒｅｐ，  ２０１３；３：２４５５．ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｓｒｅｐ０２４５５．等に記載の方法により作製することができる。例えば、マウスのＧＶＨＤモデル動物を作製する場合、雄のＢ１０．Ｄ２（Ｈ−２ｄ）マウスの骨髄を、雌のＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスに移植することにより、作製することができる。
ＧＶＨＤの治療又は予防効果は、例えば、前記ＧＶＨＤモデルマウスを用い、骨髄移植後、被験薬を投与した群が、被験薬非投与群と比較して、ＧＶＨＤの病態が抑制されたかを確認することにより評価することができる。
ＧＶＨＤの病態の抑制は、例えば、ＧＶＨＤモデルマウスの涙腺におけるリンパ球等の炎症細胞の浸潤の抑制、コラーゲン線維が占める面積の単位面積当たりの減少、炎症マーカーとしてのｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＮＦ−ｋＢ、線維化の指標としての一型コラーゲン、三型コラーゲン、ｃｏｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４７の遺伝子発現の減少、血清中のＩＬ−６、ＩＬ−１７の減少等により評価することができる。
【００３１】
また、ＧＶＨＤの治療又は予防効果は、各種組織において老化関連分子の発現が抑制されたかを確認することによっても評価することができる。
例えば、ｐ１６、ｐ２１、ｐ５３、ＢＰ５３、ＩＬ−６、ＣＸＣＬ９、ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎの蛋白質発現または遺伝子発現が抑制されたかを、標的臓器組織について免疫組織染色および定量ＰＣＲを用いて確認することにより評価することできる。
【００３２】
［医薬組成物］
上述したＧＶＨＤの治療剤又は予防剤は、それ自体を投与してもよいし、薬学的に許容される担体と混合した医薬組成物として製剤化したものを投与してもよい。
【００３３】
医薬組成物は、例えば錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等の経口的に使用される剤型に製剤化されていてもよく、例えば注射剤、軟膏、貼付剤等の非経口的に使用される剤型に製剤化されていてもよい。
【００３４】
薬学的に許容される担体としては、例えば、滅菌水、生理食塩水等の溶媒；ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤、結晶性セルロース等の賦形剤；コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等の膨化剤等が挙げられる。
【００３５】
医薬組成物は添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノールの安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤；界面活性剤；乳化剤等が挙げられる。
【００３６】
医薬組成物は、上記の担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
【００３７】
医薬組成物が注射剤である場合、注射剤用の溶媒としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等の補助薬を含む等張液が挙げられる。注射剤用の溶媒は、エタノール等のアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール；ポリソルベート８０（商標）、ＨＣＯ−５０等の非イオン性界面活性剤等を含有していてもよい。
【００３８】
ＧＶＨＤの治療剤又は予防剤の患者への投与は、特に限定はされず、目的とする、症状が発現する器官に応じて適宜選択することができるが、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等のほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。また、目的とする、症状が発現する器官が眼である場合、結膜下注射、点眼により投与してもよい。
【００３９】
ＧＶＨＤの治療剤又は予防剤の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり、例えば０．１〜１００ｍｇ、例えば１〜５０ｍｇ、例えば１〜２０ｍｇ等が挙げられる。
【００４０】
非経口的に投与する場合は、その１回の投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり、例えば０．０１〜３０ｍｇ、例えば０．１〜２０ｍｇ、例えば０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射又は局所注射により投与することが挙げられる。
【実施例】
【００４１】
次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【００４２】
［実験例１］
ｃＧＶＨＤモデルマウスモデルを用いて、慢性移植片宿主病（ｃＧＶＨＤ）免疫反応がＳＡＳＰに関係するかを以下のようにして確認した。
ｃＧＶＨＤモデルマウス作成のために、同種異系の造血幹細胞移植を７−９週齢、雄のＢ１０／Ｄ２マウスをドナーに雌のＢＡＬＢ／ｃマウスをレシピエントに行なった。本移植はＭＨＣが一致し、minor histocompatibility antigen（ＭｉＨＣ）ミスマッチの造血幹細胞移植である。コントロールとして、非ｃＧＶＨＤモデルも作成し、こちらは同種同系の造血幹細胞移植を行なった（ドナーもレシピエントもＢＡＬＢ／ｃマウス）。移植方法として、レシピエントは７Ｇｙの放射線照射を行なったのちに、１×１０６の骨髄細胞と２×１０６の脾臓細胞とを０．１ｍＬのＲＰＭＩ溶液に溶解し、合計０．２ｍＬを経尾静脈的に投与した。これら移植はＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｆｒｅｅ）環境で行われ、実験動物は全て滅菌済みの水と餌を同様に与えられた。ｃＧＶＨＤモデルマウスと非ｃＧＶＨＤモデルマウスはそれぞれ、移植後３、４、８週後に解析を行った。
【００４３】
ｃＧＶＨＤモデルマウス（同種異系の造血幹細胞移植）はＡＢＴ−２６３投与群とコントロール溶液［１０％エタノール、３０％ポリエチレン９９４グリコール４００（ＨＲ２−６０３、Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）、６０％Ｐｈｏｓａｌ５０ＰＧ９９５（Ｈ．Ｈｏｌｓｔｅｉｎ社製）］投与群の２群に分けた。ＡＢＴ−２６３は５０ｍｇ／ｋｇの濃度に調整し、造血幹細胞移植の１０日後より７日間続けて経口的に投与し、移植後２８日目に解析を行った。
【００４４】
活性化食細胞のミエロペルオキシダーゼ活性すなわち、生体内のマクロファージ検出のため、electron multiplying CCD camera (浜松フォトニクス社製)を用いた生体内イメージングを行った。マウスは、経腹腔内注射的に200 mg/kgのXenoLight Rediject Inflammation Probe (パーキンエルマー社製)をphoton recording開始１０分前に投与して暗室内でイメージングを行った。なお、イメージングは、骨髄移植後の３５日後に行った。
【００４５】
次に、ＧＶＨＤモデルマウスの涙腺の組織の切片を、ホルマリン４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンワックスで包埋した。このパラフィン包埋組織の切片を、ヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）及びマロリー染色（Ｍａｌｌｏｒｙ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）により染色した。ヘマトキシリン・エオジン染色、マロリー染色を受ける涙腺の切片を、顕微鏡により観察した。染色パターンは標識化の強度及び区分に従って半定量的に等級分けされた。
【００４６】
具体的には、顕微鏡としてＮｉｋｏｎ  Ｃｏｏｌｓｃｏｐｅ  ＩＩ（ニコン社製）を用い、各切片について２００Ｘの倍率で４つ以上のランダムに選択したフィールドをキャプチャーし、コンピュータ化されたイメージ分析システムであるＩｍａｇｅ  Ｊ［ＮＩＨ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）製］に取り込んだ。なお、染色による観察は、骨髄移植後の２８日後に採取した組織から組織切片を作成し、マロリー染色をした組織像を解析することにより行った。
【００４７】
その結果、ＧＶＨＤモデルマウスではコントロールマウスと比較して、マウスの標的臓器に相当する部位に炎症細胞が浸潤していた（図１Ａ）。また、ヒトＧＶＨＤ涙腺に酷似した炎症細胞浸潤と高度の線維化が形成されていた（図１Ｂ）。電子顕微鏡では間質に浸潤するマクロファージと活性化線維芽細胞の相互作用像が認められた（図１Ｃ）。なお、図１Ｂ中、「Ｄｕ」は導管、「Ｉ」は炎症細胞、「Ｆ」は線維化をそれぞれ示し、図１Ｃ中、「Ａｃ」は腺房、「ｍｔ」はミトコンドリア、「Ｍａｃ」はマクロファージ、「ｆ」は線維芽細胞をそれぞれ示す。
【００４８】
それに対し、コントロールマウスでは活性化に乏しい所見の線維芽細胞が認められた（図１Ｃ）。また、老化関連分泌形質（ＳＡＳＰ）の主要分子であるＩＬ−６はｃＧＶＨＤモデルマウスにおいて、経時的にコントロールマウスと比較して血清中で有意に上昇していることが確認された（図１Ｄ）。これらの所見はヒトＧＶＨＤをよく反映している。
【００４９】
［実験例２］
老化細胞はＤＮＡ損傷、老化関連マーカーの発現、細胞増殖の不可逆的停止、ＳＡＳＰ主要因子の発現の上昇が特徴であるとされる。そこで、ｃＧＶＨＤモデルマウスとコントロールマウスそれぞれの涙腺のホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を、一次抗体として、ＤＮＡ損傷マーカーであるγ−Ｈ２Ａｘ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、５３ＢＰ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、老化関連マーカーｐ１６（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、細胞増殖マーカーＫｉ−６７（Ａｂｃａｍ社製）、ＳＡＳＰ主要因子ＣＸＣＬ１（Ａｂｃａｍ社製）、ＩＬ−６（Ａｂｃａｍ社製）、ＣＸＣＬ９（Ａｂｃａｍ社製）、マクロファージマーカーＣＤ６８（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、線維化マーカーＨＳＰ４７（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）をそれぞれ用いて免疫染色を行った。
その結果を図２〜５に示す。図２〜５に示すように、ＧＶＨＤ涙腺ではコントロールマウスと比較して、ＤＮＡ損傷マーカーγ−Ｈ２Ａｘ、５３ＢＰ１、老化関連マーカーｐ１６、細胞増殖マーカーＫｉ−６７、ＳＡＳＰ主要因子ＣＸＣＬ１、ＩＬ−６、ＣＸＣＬ９の発現の上昇が認められた。
炎症細胞の指標としてマクロファージマーカーＣＤ６８、線維化マーカーＨＳＰ４７の発現上昇がコントロールマウスと比較してＧＶＨＤ涙腺に認められた。
以上の所見はＧＶＨＤ標的臓器である涙腺において、老化関連分子の発現が上昇しており、ＳＡＳＰ主要因子の一つをマクロファージが産生していることを示唆している。
【００５０】
［実験例３］
同種骨髄移植レシピエントマウスを２群に分け、１群には老化細胞除去剤であるＡＢＴ−２６３（Ｎａｖｉｏｃｌａｘ社製）を投与し、もう１群には、コントロール溶液のみを投与した。ＡＢＴ−２６３は骨髄移植（以下、ＢＭＴと略記する）後１０日から１６日の７日間、一日一回経口投与した。２群の間で体重に相違はなかった。
【００５１】
ｃＧＶＨＤにおける涙腺の機能を評価するため、涙液量を測定した。涙液量の測定は、フェノールレッド糸を、１５秒間、下眼瞼縁に一時的に配置し、糸の端から湿る糸の長さを測定することにより行った。涙液量は、それぞれのマウスの両眼において測定し、それぞれの平均値を測定値とした。
【００５２】
その結果、ＡＢＴ−２６３投与マウスでは、ＢＭＴ４週間後、コントロールマウスと比較して、涙液分泌が有意に増加した（図６右図）。
【００５３】
次に、移植後４週時にレシピエントマウスの眼表面に、０．５％  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  （Ｆｌｕｏｒｅｓｃｉｔｅ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ社製）を１μｌ、無麻酔でマウス結膜嚢に添加した。マウスの眼表面はコバルトブルーライトを搭載した顕微鏡（ＳＺ６１、オリンパス社製）にて観察した。その結果を、図６左図に示す。コントロールマウスと比較して、ＡＢＴ−２６３投与マウスは、眼瞼炎とびまん性角膜上皮炎が少なかった。
【００５４】
また、図７左図に示すように、ｃＧＶＨＤの涙腺と皮膚では炎症細胞浸潤のような病的変化が、ＡＢＴ−２６３投与マウスではコントロールマウスと比較して少なかった。単位面積当たりの涙腺組織切片での線維化面積は、図７右図に示すように、ＡＢＴ−２６３投与マウスでは、コントロールマウスと比較して、有意に少なかった。
【００５５】
透過型電子顕微鏡像は、図８に示すように、ＡＢＴ−２６３投与マウスの涙腺では、炎症細胞浸潤とコラーゲン線維束が間質において減少している所見（図中の矢印部分）を示し、腺房上皮のミトコンドリアは、コントロールマウスでは破壊されている（図中の星印部分）のに対して、構造を保っていた。この結果から、老化細胞除去剤であるＡＢＴ−２６３がｃＧＶＨＤの涙腺において病的抑制に効果的であることが示唆された。
【００５６】
［実験例４］
眼窩外涙腺の全ＲＮＡをｍｉＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてプロトコールに従って抽出した。相補的ＤＮＡはＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｋｉｔ（ＦＳＱ−１０１、東洋紡社製）を用いて合成された。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてリアルタイムｑＰＣＲを行った。ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ＧＡＰＤＨを内因性コントロールとして使用しサンプルのｍＲＮＡの発現を検討した。
その結果、ＡＢＴ−２６３投与マウスの涙腺において、Ｃｄｋｎ２ａ（ｐ１６）遺伝子とＣｘｃｌ９遺伝子の発現が、コントロールマウスと比較して、有意に抑制されていた（図９）。
【００５７】
また、図１０に示すように、単位面積当たりの涙腺間質における、ＤＮＡ損傷マーカーである５３ＢＰ１、老化関連マーカーであるｐ１６、ｐ２１、マクロファージマーカーであるＣＤ６８の各陽性細胞の数が、ＡＢＴ−２６３投与マウスでは、コントロールマウスと比較して、有意に減少していた。これらの結果は、老化細胞除去剤による老化細胞の除去が、ｃＧＶＨＤの涙腺の病態を抑制することを示唆している。
【００５８】
また、ＧＶＨＤ涙腺の血管内腔におけるＣＸＣＬ９陽性部位が、ＡＢＴ−２６３投与マウスでは、コントロールマウスと比較して、有意に抑制されていた（図１１左図）。これは、ＣＸＣＬ９が、マクロファージやＴ細胞をｃＧＶＨＤの病変部位に引き寄せているためと思われる。
さらに、イメージJ解析ソフトを使用した解析した涙腺の単位面積当たりの血管内腔におけるＣＸＣＬ９の面積は、ＡＢＴ−２６３投与マウスでは、コントロールマウスと比較して、有意に減少していた（図１１右図）。
以上のことから、老化マクロファージがＩＬ−６とＣＸＣＬ９を産生し、ＣＸＣＬ９が隣接するＴ細胞を標的臓器の微小環境に呼び寄せ、ＩＬ−６とＣＸＣＬ９がそれぞれ、又は協調して、様々なストレスにより障害された病的線維芽細胞の増殖を促すと考えられる。老化細胞除去剤は、前記老化マクロファージおよび老化Ｔ細胞を除去することにより、病的線維芽細胞を除去し、ＧＶＨＤの病態を抑制すると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明によれば、ＧＶＨＤの患者の治療又は予防に用いることができる新規な移植片対宿主病の治療剤又は予防剤を提供することができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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