(57)【要約】【課題】本発明は、レナラーゼに結合し阻害する組成物および方法を提供する。【解決手段】一態様では、レナラーゼ結合性分子がレナラーゼ活性を阻害する。したがって、レナラーゼ活性の低減が有益な疾患や状態において、このような阻害性をもつレナラーゼ結合性分子は治療薬として作用する。【選択図】図１Ａ
2020138972.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、レナラーゼ受容体、レナラーゼ受容体断片、抗体、抗体断片、抗体模倣物、リボザイム、小分子化合物、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、アンチセンス核酸分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス核酸分子をコードする核酸、タンパク質をコードする核酸配列からなる群より選択される少なくとも１種のレナラーゼ阻害剤を含む組成物。
【請求項２】
前記レナラーゼ阻害剤はレナラーゼ結合性分子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記レナラーゼ結合性分子は抗体またはその結合性部分である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
少なくとも１０-6Ｍの親和性でレナラーゼに特異的に結合する抗体またはその結合性部分を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗体は配列番号１〜７からなる群より選択されるペプチド配列に特異的に結合する、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記レナラーゼはヒトレナラーゼである、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
前記抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、免疫複合体、脱フコシル化抗体、二重特異性抗体からなる群より選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
前記免疫複合体は治療薬または検出用成分を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記抗体はヒト化抗体、キメラ抗体、完全ヒト抗体、抗体模倣物からなる群より選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗体は、以下のａ）〜ｆ）からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含む、請求項３に記載の組成物：ａ）配列番号１１および配列番号１９からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ１配列；ｂ）配列番号１２および配列番号２０からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ２配列；ｃ）配列番号１３および配列番号２１からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ３配列；ｄ）配列番号１４および配列番号２２からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ１配列；ｅ）配列番号１５および配列番号２３からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ２配列；ならびにｆ）配列番号１６および配列番号２４からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ３配列。
【請求項１１】
前記抗体は配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する、請求項４に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗体は以下のａ）〜ｆ）からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含む、請求項３に記載の組成物：ａ）配列番号２７および配列番号３５からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ１配列；ｂ）配列番号２８および配列番号３６からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ２配列；ｃ）配列番号２９および配列番号３７からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ３配列；ｄ）配列番号３０および配列番号３８からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ１配列；ｅ）配列番号３１および配列番号３９からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ２配列；ならびにｆ）配列番号３２および配列番号４０からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ３配列。
【請求項１３】
前記抗体は配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する、請求項６に記載の組成物。
【請求項１４】
前記抗体はａ）配列番号４３の重鎖ＣＤＲ１配列；ｂ）配列番号４４の重鎖ＣＤＲ２配列；ｃ）配列番号４５の重鎖ＣＤＲ３配列；ｄ）配列番号４６の軽鎖ＣＤＲ１配列；ｅ）配列番号４７の軽鎖ＣＤＲ２配列；およびｆ）配列番号４８の軽鎖ＣＤＲ３配列からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記抗体は配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する、請求項７に記載の組成物。
【請求項１６】
前記抗体は配列番号９、１７、２５、３３、および４１からなる群より選択される重鎖配列を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項１７】
前記抗体は配列番号１０、１８、２６、３４、および４２からなる群より選択される軽鎖配列を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項１８】
レナラーゼに結合し請求項３の抗体のレナラーゼに対する結合と競合する抗体を含む、組成物。
【請求項１９】
対象のレナラーゼ関連疾患または障害を処置または予防する方法であって、該対象に請求項１の組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項２０】
前記請求項１の組成物は第二の治療薬と併用して前記対象に投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記レナラーゼ関連疾患または障害は、腎疾患、心血管系疾患、がん、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記疾患または障害はがんであり、該がんは膵臓がんまたは黒色腫である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項２に記載のレナラーゼ結合性分子をコードする単離核酸分子。
【請求項２４】
請求項２３に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項２５】
請求項２３に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項２６】
診断を必要とする対象の疾患または障害を診断する方法であって、
ａ．該対象の生体試料のレナラーゼ値を決定することと、
ｂ．該対象の該生体試料のレナラーゼ値を比較対照と比較することと、
ｃ．該対象の該生体試料のレナラーゼ値が該比較対照のレナラーゼ値に比べて高い場合に該対象が疾患または障害を有すると診断することと
を含む、方法。
【請求項２７】
疾患または障害を有すると診断された前記対象に処置を施す工程をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記生体試料のレナラーゼ値を該生体試料のレナラーゼｍＲＮＡ値の測定によって決定する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記生体試料のレナラーゼ値を該生体試料のレナラーゼポリペプチド値の測定によって決定する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記生体試料のレナラーゼポリペプチド値をレナラーゼ結合性分子を用いて決定する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記生体試料のレナラーゼ値を該生体試料でのレナラーゼポリペプチドの酵素活性を測定することによって決定する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
レナラーゼ値が比較対照に比べて少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも９００％、少なくとも１０００％増加している場合に前記生体試料のレナラーゼ値が高いと決定する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記比較対照は陽性対照、陰性対照、歴史的対照、歴史的標準、該生体試料中の基準分子の値からなる群より選択される少なくとも１つである、前記請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記疾患または障害は、腎疾患、心血管系疾患、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
前記疾患または障害はがんであり該がんは膵臓がんまたは黒色腫である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記対象はヒトである、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府資金による研究開発の記載
本発明は、政府の支援により、アメリカ国立衛生研究所（National Institutes of Health）によって与えられた助成金第ＲＣ１ＤＫ０８６４６５号、第ＲＣ１ＤＫ０８６４０２号、第ＤＫ５４０２１号、および第Ｒ０１ＤＫ０８１０３７号を受けてなされた。
【背景技術】
【０００２】
レナラーゼ（ＲＮＬＳ）は腎臓、心臓、骨格筋、精巣で主に産生され、程度は劣るがその他の組織でも産生されるタンパク質である（Xuら、2005 J Clin Invest. 115 (5):1275-80およびWangら、2008 Mol Biol Rep. 35(4):613-20）。レナラーゼの２種類のイソ型多様体、すなわちレナラーゼ１およびレナラーゼ２が記載されている。この２つの形態のレナラーゼは最終エキソンの選択的スプライシングによって違いがある。レナラーゼはカテコールアミン類であるエピネフリン、ノルエピネフリン、およびドーパミンを選択的に脱アミノ化する活性を有する新規なフラビンアデニンジヌクレオチド含有モノアミン酸化酵素であると記載されている。末期腎疾患の患者の血漿では健常な個体に比べてレナラーゼが欠乏していることが記載されている。カテコールアミン類は、疾患の場合も含め、心拍出量と血管抵抗に作用することにより血圧の維持と調節に主要な役割を果たす。レナラーゼの組換え型をラットに注入すると、心収縮性、心拍数、および血圧が低下した。腎不全患者は循環カテコールアミン類の値が高いことが特徴で、これは高血圧と関連し、さらには心血管系合併症による死亡率増加とも関連する。したがって、タンパク質レナラーゼはカテコールアミン類が誘発する血圧変化の制御と維持に関与する可能性があり、腎疾患患者に見られるレナラーゼの欠乏は予後にとって有害となる可能性がある。
【０００３】
末期腎疾患の患者の血漿では健常な個体と比べてレナラーゼが欠乏しているとの記述がある。腎不全患者は循環カテコールアミン類の値が高いことが特徴で、これは高血圧と関連し、さらには心血管系合併症による死亡率増加とも関連する。したがって、タンパク質レナラーゼはカテコールアミン類が誘発する血圧変化の制御と維持に関与する可能性があり、腎疾患患者に見られるレナラーゼの欠乏は予後にとって有害となる可能性がある。しかし、がんでのレナラーゼの役割についてはほとんど知られていない。
【０００４】
がんの本質的な特徴は細胞老化および細胞死の調節不全である。レナラーゼ（ＲＮＬＳ）は、細胞膜カルシウムＡＴＰアーゼであるＰＭＣＡ４ｂを介してＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路およびＭＡＰＫ経路を活性化するようシグナル伝達することにより虚血性・中毒性の細胞傷害を防ぐ分泌型フラボタンパク質である。
【０００５】
皮膚がんは一般的なヒト悪性腫瘍であり、その発生率は先進国で増加している（Gray-Schopferら、2007 Nature. 445:851-7；Loweら、2014 Mayo Clinic Proceedings. 89:52-9；Lesinskiら、2013 Future oncology. 9:925-7）。黒色腫は皮膚がんの最も致死性の高い形態であり、切除不能になると生存率が低い（Loweら、2014 Mayo Clinic Proceedings. 89:52-9）。黒色腫は分子的に異質性の疾患であり、疾患の発症および進行に関与するシグナル伝達経路の重要な変化がいくつか特定されている。Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路およびＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路は黒色腫の病態形成に重要な役割を果たす（Gray-Schopferら、2007 Nature. 445:851-7；Lesinskiら、2013 Future oncology. 9:925-7；Yajimaら、2012 Dermatology research and practice（皮膚科学の研究と実践）2012:354191）。Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＰＩ３Ｋ、またはＰＴＥＮ（ＰＩ３Ｋ阻害剤）の変異によってＥＲＫおよびＡＫＴが持続的に活性化される場合があり、これによって細胞の生存と増殖が促進される。Ｄａｎｋｏｒｔらは、マウスでメラニン細胞特異的にＢＲａｆV600Eを条件付き発現させることによりこのことを十分に実証した。マウスはいずれも黒色腫を発症しなかったが、Ｐｔｅｎ腫瘍抑制遺伝子の発現抑制と組み合わせた場合、黒色腫の発症の浸透率が１００％であることが明らかになった（Dankortら、2009 Nature genetics. 41:544-52）。これらの病原経路の解明により、高活性化したキナーゼを標的とする特異的な阻害剤の開発が促進された。このような薬剤は転移性黒色腫の選択患者群の処置で有効だとわかったが、薬剤の有益な作用は一時的である場合が多いため、別の治療標的を早急に特定する必要がある。
【０００６】
ＲＮＬＳの発現は黒色腫の腫瘍で、特にＣＤ１６３陽性腫瘍関連マクロファージ（tumor associated macrophage; TAM）で顕著に増加する。原発性黒色腫患者のコホートでは、疾患特異的生存率は腫瘍塊でのＲＮＬＳ発現と逆相関し、ＲＮＬＳが病態形成に関与することが示唆された。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、抗ＲＮＬＳ抗体、またはＲＮＬＳ由来の阻害性ペプチドを用いてＲＮＬＳシグナル伝達を阻害することにより、生体外では黒色腫細胞の生存率が有意に低下する。モノクローナル抗体による抗ＲＮＬＳ療法では、異種移植マウスモデルの黒色腫の腫瘍増殖が著しく阻害される。ｍ２８−ＲＮＬＳ（１Ｄ−２８−４ともいう）による処置では、内因性ＲＮＬＳ発現とＣＤ１６３陽性ＴＡＭにおける総ＳＴＡＴ３およびリン酸化ＳＴＡＴ３が著しく減少した。腫瘍細胞におけるアポトーシスの増加は、Ｂ細胞リンパ腫２に関連するタンパク質Ｂａｘのｐ３８ＭＡＰＫによる活性化と時間的に関連していた。細胞周期阻害因子ｐ２１の発現は増加し、細胞周期停止が実証された。これらの結果は、ＣＤ１６３陽性ＴＡＭによるＲＮＬＳ産生量の増加によってＳＴＡＴ３の活性化により黒色腫の増殖が促進されることと、黒色腫の管理においてＲＮＬＳシグナル伝達の阻害を治療に応用できる可能性があることを示す。
【０００７】
体液や組織に含まれるレナラーゼを検出する改良法は、腎疾患、心血管系疾患、および／またはがんの診断と予後に役立つ可能性がある。しかし、レナラーゼを関連バイオマーカーとして検証するには、選択性の高いレナラーゼ検出用試薬が必要である。バイオマーカーの検出には抗体に基づく方法が広く利用されているが、現在まで、レナラーゼに対する試薬抗体はごくわずかしか作製されておらず、最低限の特性決定に至ってはいなかった。
【０００８】
膵臓がんは最も致死性の高い腫瘍の１つであり、世界で約３３万人、米国では約４万人が死亡している（World Cancer Report 2014. WHO Press; 2014）。膵臓がんは検出が困難であり、ほとんどの症例は後期に診断される（Nolenら、2014 PLoS ONE. 9(4):e94928）。このがんの化学療法の使用はいくらか進歩したが、この疾患は依然としてあらゆる薬物療法に対して非常に耐性が高い（Hidalgoら、2010 New England Journal of Medicine. 362(17):1605-17）。膵臓がん患者全体の５年生存率は５％未満であり（Hidalgoら、2010 New England Journal of Medicine. 362(17):1605-17）、さらに治療標的が必要である。
【０００９】
膵臓がんの発症は遺伝子変異の段階的蓄積に依存し（Jonesら、2008 Science. 321(5897):1801-6）、この遺伝子変異の一部によってＭＡＰＫ、ＰＩ３ＫおよびＪＡＫ−ＳＴＡＴの異常なシグナル伝達が起こる。ごく軽度の上皮異形成から浸潤がんとなる異形成までの進行は、がん遺伝子（たとえばＫＲＡＳ２遺伝子）を活性化するか腫瘍抑制遺伝子（９、たとえばＣＤＫＮ２ａ／ＩＮＫ４ａ遺伝子、ＴＰ５３遺伝子、およびＤＰＣ４／ＳＭａＤ４遺伝子）を不活性化する遺伝子変異の段階的蓄積を反映する（Hidalgoら、2012 Annals of Oncology. 23(suppl 10):x135-x8）。膵臓腫瘍の９５％がＫＲＡＳ２遺伝子、９０％がＣＤＫＮ２ａ遺伝子、７５％がＴＰ５３遺伝子に変異を有する。これらの変異の結果、がんの増殖を示す持続的かつ調節不能な増殖が起こる。膵管腺がん（pancreatic ductal adenocarcinoma; PDAC）での変異の状況と中心的なシグナル伝達経路が２４件の進行ＰＤＡＣの総合的な遺伝解析によって定義された（Jonesら、2008 Science. 321(5897):1801-6）。これらのデータは、ほとんどのＰＤＡＣが多くの遺伝子変化（主に点変異である）を有し、それが約１２の細胞シグナル伝達経路に影響を及ぼすことを示している。
【００１０】
この研究ではさらに、腫瘍の９０％で少なくとも１０倍の発現を示した、ＰＤＡＣで過剰発現した５４１個の遺伝子を特定した。その中には、近年特性が明らかになったタンパク質、レナラーゼ（ＲＮＬＳ）が腫瘍または腫瘍由来の細胞株で２倍〜４倍に増加したことも含まれていた。ＲＮＬＳは新規な分泌型フラボタンパク質であり（Xuら、2005 J Clin Invest. 115(5):1275-80；Desirら、2012 J Am Heart Assoc. 1: e002634；Desirら、2012 J Am Soc Hypertens. 6(6):417-26；Liら、2008 Circulation. 117(10):1277-82）、ＮＡＤＨ酸化酵素活性を有し（Farzaneh-Farら、2010 PLoS One. 5(10):e13496；Beaupreら、2015 Biochemistry. 54(3):795-806）、内因的な酵素活性とは無関係な、受容体による処理（Wangら、2014 Journal of the American Society of Nephrology. DOI:10.1681/asn.2013060665）を介して細胞と臓器の生存を促進する（Leeら、2013 J Am Soc Nephrol. 24(3):445-55）。ＲＮＬＳは、タンパク質キナーゼＢ（ＡＫＴ）、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）、および分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ｐ３８）を迅速に活性化する。ＥＲＫまたはＡＫＴを化学的に阻害すると、ＲＮＬＳの保護効果は抑制された（Wangら、2014 Journal of the American Society of Nephrology（米国腎臓学会誌）DOI:10.1681/asn.2013060665）。
【００１１】
したがって、腎疾患、心血管系疾患、がんなどの疾患または障害の検出、診断、予防、治療のための改善された方法とレナラーゼ結合性組成物（抗体など）が必要である。本発明はこの必要性を満たす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明はレナラーゼ阻害剤を含む組成物を包含する。レナラーゼ阻害剤は、化合物、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、レナラーゼ受容体、レナラーゼ受容体断片、抗体、抗体断片、抗体模倣物、リボザイム、小分子化合物、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、アンチセンス核酸分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス核酸分子をコードする核酸、タンパク質をコードする核酸配列であってよい。一部の態様では、レナラーゼ阻害剤はレナラーゼ結合性分子である。一部の態様では、レナラーゼ結合性分子は抗体またはその結合性部分である。一部の態様では、レナラーゼ結合性分子は少なくとも１０-6Ｍの親和性でレナラーゼに特異的に結合する。一部の態様では、レナラーゼ結合性分子は配列番号１〜７からなる群より選択されるペプチド配列に特異的に結合する。一部の態様では、レナラーゼはヒトのレナラーゼである。様々な態様では、抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、免疫複合体、脱フコシル化抗体、二重特異性抗体であってよい。一部の態様では、免疫複合体は治療薬または検出用成分を含む。様々な態様では、抗体はヒト化抗体、キメラ抗体、完全ヒト抗体、抗体模倣物であってよい。一態様では、抗体は、以下のａ）〜ｆ）からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含む：ａ）配列番号１１および配列番号１９からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ１配列；ｂ）配列番号１２および配列番号２０からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ２配列；ｃ）配列番号１３および配列番号２１からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ３配列；ｄ）配列番号１４および配列番号２２からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ１配列；ｅ）配列番号１５および配列番号２３からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ２配列；ならびにｆ）配列番号１６および配列番号２４からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ３配列。一部の態様では、抗体は配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する。一部の態様では、抗体は以下のａ）〜ｆ）からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含む：ａ）配列番号２７および配列番号３５からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ１配列；ｂ）配列番号２８および配列番号３６からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ２配列；ｃ）配列番号２９および配列番号３７からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ３配列；ｄ）配列番号３０および配列番号３８からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ１配列；ｅ）配列番号３１および配列番号３９からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ２配列；ならびにｆ）配列番号３２および配列番号４０からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ３配列。一部の態様では、抗体は配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する。一部の態様では、抗体はａ）配列番号４３の重鎖ＣＤＲ１配列；ｂ）配列番号４４の重鎖ＣＤＲ２配列；ｃ）配列番号４５の重鎖ＣＤＲ３配列；ｄ）配列番号４６の軽鎖ＣＤＲ１配列；ｅ）配列番号４７の軽鎖ＣＤＲ２配列；およびｆ）配列番号４８の軽鎖ＣＤＲ３配列からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含む。一部の態様では、抗体は配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する。一部の態様では、抗体���配列番号９、１７、２５、３３、および４１からなる群より選択される重鎖配列を含む。一部の態様では、抗体は配列番号１０、１８、２６、３４、および４２からなる群より選択される軽鎖配列を含む。ある態様では、本発明はレナラーゼに結合し請求項３の抗体のレナラーゼに対する結合と競合する抗体を含む、組成物である。
【００１３】
別の態様では、本発明は対象のレナラーゼ関連疾患または障害を治療または予防する方法であって、対象に少なくとも１種のレナラーゼ阻害剤を投与する工程を含む。一部の態様では、レナラーゼ阻害剤は第二の治療薬と併用して対象に投与される。一部の態様では、レナラーゼ関連疾患または障害は、腎疾患、心血管系疾患、がん、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。前記疾患または障害ががんである一部の態様では、がんは膵臓がんまたは黒色腫である。
【００１４】
別の態様では、本発明はレナラーゼ結合性分子（たとえば抗体であるが、これに限定するものではない）をコードする単離核酸分子である。別の態様では、本発明はレナラーゼ結合性分子（たとえば抗体であるが、これに限定するものではない）をコードする核酸分子を含む発現ベクターである。別の態様では、本発明はレナラーゼ結合性分子（たとえば抗体であるが、これに限定するものではない）をコードする核酸分子を含む宿主細胞である。
【００１５】
別の態様では、本発明は診断を必要とする対象の疾患または障害を診断する方法であり、対象の生体試料のレナラーゼ値を決定する工程と、対象の生体試料のレナラーゼ値を比較対照と比較する工程と、対象の生体試料のレナラーゼ値が比較対照のレナラーゼ値に比べて高い場合に対象が疾患または障害を有すると診断する工程とを含む。一態様では、この方法は疾患または障害を有すると診断された対象に処置を施す工程をさらに含む。一態様では、生体試料のレナラーゼ値を生体試料のレナラーゼｍＲＮＡ値の測定によって決定する。一態様では、生体試料のレナラーゼ値を生体試料のレナラーゼポリペプチド値の測定によって決定する。一態様では、生体試料のレナラーゼポリペプチド値を、レナラーゼ結合性分子を用いて決定する。一態様では、生体試料のレナラーゼ値を生体試料でのレナラーゼポリペプチドの活性（たとえば、酵素活性、基質結合活性、受容体結合活性など）の測定によって決定する。一態様では、レナラーゼ値が比較対照に比べて少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも９００％、少なくとも１０００％増加している場合に生体試料のレナラーゼ値が高いと決定する。様々な態様では、比較対照は陽性対照、陰性対照、歴史的対照、歴史的標準、生体試料中の基準分子の値からなる群より選択される少なくとも１つである。一態様では、疾患または障害は、腎疾患、心血管系疾患、がん、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つである。疾患または障害ががんである一態様では、このがんは膵臓がんまたは黒色腫である。一態様では、対象はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
以上の概要と以下の本発明の好ましい態様の詳細な説明は、添付の図面と併せて読めばより理解が深まる。本発明を例示するため、図面には現在好ましい態様を示すが、当然ながら、本発明は図面に示す態様の厳密な配置や手段に限定されない。
【図１Ａ】図１は図１Ａと図１Ｂを含み、レナラーゼ依存性シグナル伝達の経時変化を示す一連の画像である。図１Ａは、ヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＫ−２）をレナラーゼと共にインキュベートし、タンパク質キナーゼＢ（ＡＫＴ）および細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）の活性化をウェスタンブロット分析で決定した結果を示す。代表的なブロットを示す（ｎ＝３）。グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（負荷対照）に対して正規化したシグナルを示す（ｎ＝３）。ＥＲＫおよびＡＫＴ（Ｔ３０８）の場合は１分後〜６０分後に、ＡＫＴ（Ｓ４７３）の場合のみ３０分後に、基準値から見た変化が統計的に有意である。
【図１Ｂ】図１は図１Ａと図１Ｂを含み、レナラーゼ依存性シグナル伝達の経時変化を示す一連の画像である。図１Ｂは、レナラーゼがＨＫ−２細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞（human umbilical vein endothelial cells; HUVEC）で抗アポトーシス分子Ｂｃｌ−２を上方制御することを示す。
【図２】図２は、レナラーゼのイソ型であるＲｅｎ１〜７を示す画像である。エキソンに１〜１０と番号を付けた。ＲＰ−２２４はＲｅｎ１またはＲｅｎ２のレナラーゼペプチドのアミノ酸２２４〜２３３、ＲＰ−２２０はアミノ酸２２０〜２３９、ＲＰ−Ｈ２２０はヒスチジンタグを付けたＲＰ−２２０、ＲＰ−Ｓｃｒ２２０は組換えＲＰ−２２０を示す。
【図３】図３は、ＥＲＫまたはＡＫＴを阻害するとレナラーゼペプチドの保護効果が抑制されることを示す図である。野生型（ＷＴ）マウスに偽手術または３０分間の腎虚血と再灌流を行った。ＲＰ−Ｈ２２０または溶媒（生理食塩水）を腎虚血の１０分前に注射した。ＥＲＫ阻害剤ＰＤ９８０５９またはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ阻害剤ワートマニンによりＲＰ−Ｈ２２０の保護効果が抑制された。
【図４】図４は表１のペプチドの配列比較結果を示す画像であり、これらのペプチドはレナラーゼ１または２の配列に対応する。
【図５Ａ】図５は図５Ａ〜図５Ｊを含み、レナラーゼに結合する抗体の配列を示す一連の画像である。相補性決定領域（complementarity determining region; CDR）に下線を施した。図５Ａおよび図５Ｂは、１Ｄ−２８−４の重鎖コード配列および軽鎖コード配列をそれぞれ示す。
【図５Ｂ】図５は図５Ａ〜図５Ｊを含み、レナラーゼに結合する抗体の配列を示す一連の画像である。相補性決定領域（complementarity determining region; CDR）に下線を施した。図５Ａおよび図５Ｂは、１Ｄ−２８−４の重鎖コード配列および軽鎖コード配列をそれぞれ示す。
【図５Ｃ−ｉ】図５は図５Ａ〜図５Ｊを含み、レナラーゼに結合する抗体の配列を示す一連の画像である。相補性決定領域（complementarity determining region; CDR）に下線を施した。図５Ｃおよび図５Ｄは１Ｄ−３７−１０の重鎖コード配列および軽鎖コード配列をそれぞれ示す。
【図５Ｃ−ｉｉ】図５は図５Ａ〜図５Ｊを含み、レナラーゼに結合する抗体の配列を示す一連の画像である。相補性決定領域（complementarity determining region; CDR）に下線を施した。図５Ｃおよび図５Ｄは１Ｄ−３７−１０の重鎖コード配列および軽鎖コード配列をそれぞれ示す。
【図５Ｄ】図５は図５Ａ〜図５Ｊを含み、レナラーゼに結合する抗体の配列を示す一連の画像である。相補性決定領域（complementarity determining region; CDR）に下線を施した。図５Ｃおよび図５Ｄは１Ｄ−３７−１０の重鎖コード配列および軽鎖コード配列をそれぞれ示す。
【図５Ｅ−ｉ】図５は図５Ａ〜図５Ｊを含み、レナラーゼに結合する抗体の配列を示す一連の画像である。相補性決定領域（complementarity determining region; CDR）に下線を施した。図５Ｅおよび図５Ｆは１Ｆ−２６−１の重鎖コード配列および軽鎖コード配列をそれぞれ示す。
【図５Ｅ−ｉｉ】図５は図５Ａ〜図５Ｊを含み、レナラーゼに結合する抗体の配列を示す一連の画像である。相補性決定領域（complementarity determining region; CDR）に下線を施した。図５Ｅおよび図５Ｆは１Ｆ−２６−１の重鎖コード配列および軽鎖コード配列をそれぞれ示す。
【図５Ｆ】図５は図５Ａ〜図５Ｊを含み、レナラーゼに結合する抗体の配列を示す一連の画像である。相補性決定領域（complementarity determining region; CDR）に下線を施した。図５Ｅおよび図５Ｆは１Ｆ−２６−１の重鎖コード配列および軽鎖コード配列をそれぞれ示す。
【図５Ｇ−ｉ】図５は図５Ａ〜図５Ｊを含み、レナラーゼに結合する抗体の配列を示す一連の画像である。相補性決定領域（complementarity determining region; CDR）に下線を施した。図５Ｇおよび図５Ｈは１Ｆ−４２−７の重鎖コード配列および軽鎖コード配列をそれぞれ示す。
【図５Ｇ−ｉｉ】図５は図５Ａ〜図５Ｊを含み、レナラーゼに結合する抗体の配列を示す一連の画像である。相補性決定領域（complementarity determining region; CDR）に下線を施した。図５Ｇおよび図５Ｈは１Ｆ−４２−７の重鎖コード配列および軽鎖コード配列をそれぞれ示す。
【図５Ｈ】図５は図５Ａ〜図５Ｊを含み、レナラーゼに結合する抗体の配列を示す一連の画像である。相補性決定領域（complementarity determining region; CDR）に下線を施した。図５Ｇおよび図５Ｈは１Ｆ−４２−７の重鎖コード配列および軽鎖コード配列をそれぞれ示す。
【図５Ｉ−ｉ】図５は図５Ａ〜図５Ｊを含み、レナラーゼに結合する抗体の配列を示す一連の画像である。相補性決定領域（complementarity determining region; CDR）に下線を施した。図５Ｉおよび図５Ｊは３Ａ−５−２の重鎖コード配列および軽鎖コード配列をそれぞれ示す。
【図５Ｉ−ｉｉ】図５は図５Ａ〜図５Ｊを含み、レナラーゼに結合する抗体の配列を示す一連の画像である。相補性決定領域（complementarity determining region; CDR）に下線を施した。図５Ｉおよび図５Ｊは３Ａ−５−２の重鎖コード配列および軽鎖コード配列をそれぞれ示す。
【図５Ｊ】図５は図５Ａ〜図５Ｊを含み、レナラーゼに結合する抗体の配列を示す一連の画像である。相補性決定領域（complementarity determining region; CDR）に下線を施した。図５Ｉおよび図５Ｊは３Ａ−５−２の重鎖コード配列および軽鎖コード配列をそれぞれ示す。
【図６】図６はがん細胞株でのレナラーゼ発現値を示す図である。発現値を定量ＰＣＲで測定し、アクチン発現値に対して正規化した。
【図７】図７はメラニン細胞でのレナラーゼ発現値を示す図である。正常な皮膚と比べて、母斑および黒色腫ではレナラーゼ発現値が著しく増加している。
【図８】図８は、抗レナラーゼモノクローナル抗体が培養下のＡ３７５．Ｓ２黒色腫細胞を阻害しテモゾロミドと相乗作用を示すことを表す図である。処理の７２時間後、ＷＳＴ−１法で細胞生存率を測定した。ＲｅｎＡｂ−１０はレナラーゼモノクローナル抗体１０μ／ｍｌ、ＴＭＺはテモゾロミド１００μｇ／ｍｌまたは１５０μｇ／ｍｌを指す。
【図９】図９は、抗レナラーゼモノクローナル抗体が培養下のＡ３７５．Ｓ２黒色腫細胞を阻害し、ダカルバジンと相乗作用を示すことを表す図である。処理の７２時間後、ＷＳＴ−１法で細胞生存率を測定した。ＲＮＬＳＭｏｎｏはレナラーゼモノクローナル抗体を指す。
【図１０】図１０は、抗レナラーゼモノクローナル抗体が培養下のＳｋ−Ｍｅｌ−２８黒色腫細胞を阻害し、テモゾロミドと相乗作用を示すことを表す図である。処理の７２時間後、ＷＳＴ−１法で細胞生存率を測定した。ＲｅｎＡｂ−１０はレナラーゼモノクローナル抗体１０μ／ｍｌ、ＴＭＺ１００はテモゾロミド１００μｇ／ｍｌを指す。
【図１１】図１１は、抗レナラーゼモノクローナル抗体が培養下の白血病細胞を阻害することを示す図である。培養下のＣＣＬ−１１９細胞を抗レナラーゼモノクローナル抗体で２４時間処理し、ＷＳＴ−１法で細胞生存率を測定した（ｎ＝３、＊＝Ｐ、０．０５）。
【図１２】図１２は抗レナラーゼポリクローナル抗体が膵臓がん細胞株ＭｉａＰａｃを阻害することを示す図である。
【図１３】図１３は抗レナラーゼモノクローナル抗体が膵臓がん細胞株Ｐａｎｃ１を阻害することを示す図である。
【図１４】図１４はレナラーゼ抗体を用いた場合と用いなかった場合の培養下の黒色腫細胞を比較した顕微鏡写真である。レナラーゼ抗体によって生存細胞数は顕著に減少した。
【図１５】図１５はレナラーゼモノクローナル抗体１Ｃ−２２−１および１Ｄ−３７−１０が培養下の黒色腫細胞を阻害することを示す図である。
【図１６】図１６はレナラーゼ発現値の高い黒色腫の患者の死亡率が上昇することを示す一連の画像である。黒色腫患者２６３人の生検標本で、自動定量分析（ＡＱＵＡ）によりレナラーゼ発現量を測定した。Ｓ−１００およびｇｐ１００に対する抗体を用いて腫瘍マスクを得た。Ｘ軸に追跡調査期間（月）、Ｙ軸に累積生存率（％）を示す。
【図１７Ａ】図１７は図１７Ａ〜図１７Ｄを含み、黒色腫でＲＮＬＳが過剰発現すること、および患者の予後不良との関連を示す一連の画像と図である。図１７Ａは、ＲＮＬＳ−ｍ２８抗体を用いて正常ヒト皮膚（ｎ＝１５）、良性母斑（ｎ＝２９５）、および悪性黒色腫（ｎ＝２６４）の組織マイクロアレイを免疫蛍光染色することで検出したＲＮＬＳ発現を示す画像である。それぞれについて代表的な結果を示す。青色は核、緑色はメラニン細胞、赤色はＲＮＬＳを示す。
【図１７Ｂ】図１７は図１７Ａ〜図１７Ｄを含み、黒色腫でＲＮＬＳが過剰発現すること、および患者の予後不良との関連を示す一連の画像と図である。図１７Ｂは、ＡＱＵＡｎａｌｙｓｉｓ（商標）ソフトウェアを用いて定量したＹａｌｅの組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）、すなわち正常ヒト皮膚（ｎ＝１５）、良性母斑（ｎ＝２９５）、および悪性黒色腫（ｎ＝２６４）の蛍光強度を示す図である。
【図１７Ｃ】図１７は図１７Ａ〜図１７Ｄを含み、黒色腫でＲＮＬＳが過剰発現すること、および患者の予後不良との関連を示す一連の画像と図である。図１７Ｃは、ＡＱＵＡｎａｌｙｓｉｓ（商標）ソフトウェアを用いて定量したUS Biomax社のＴＭＡ、すなわち正常ヒト皮膚（ｎ＝１４）、良性母斑（ｎ＝１４）、原発性黒色腫（ｎ＝３５）、および転移性黒色腫（ｎ＝１１）の蛍光強度を示す図である。＊はｐ＝０．００９、＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【図１７Ｄ】図１７は図１７Ａ〜図１７Ｄを含み、黒色腫でＲＮＬＳが過剰発現すること、および患者の予後不良との関連を示す一連の画像と図である。図１７Ｄは、黒色腫特異的死亡に関するカプラン・マイヤー生存曲線を示す。１９９７年〜２００４年に採取した１１９件の一連の原発性黒色腫について、ＡＱＵＡスコアの中央値（＝７５，７６４．４５）で腫瘍をＲＮＬＳ発現量の低いものと高いものに層別化した。＊はｐ＝０．００８を示す。
【図１８Ａ】図１８は図１８Ａと図１８Ｂを含み、ＲＮＬＳの過剰発現ががん細胞の生存に有利であることを示す２つの図である。図１８Ａは、Ａ３７５．Ｓ２細胞、ＭｅＷｏ細胞、Ｓｋｍｅｌ５細胞、およびＳｋｍｅｌ２８細胞を血清飢餓状態にした後にＢＳＡ（３０μｇ／ｍｌ）またはｒＲＮＬＳ（３０μｇ／ｍｌ）で処理し、７２時間後にＷＳＴ−１試験法で細胞生存率を測定した結果を示す図である。ｎ＝６であり、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．００５を示す。
【図１８Ｂ】図１８は図１８Ａと図１８Ｂを含み、ＲＮＬＳの過剰発現ががん細胞の生存に有利であることを示す２つの図である。図１８Ｂは、Ａ３７５．Ｓ２細胞を２４時間血清飢餓状態にした後、処理を行わないか、３０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはｒＲＮＬＳと共に３日間インキュベートした結果を示す図である。全細胞数と生存細胞数を、トリパンブルーおよび自動細胞計数器を用いて測定した。ｎ＝６であり、＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【図１９Ａ】図１９は図１９Ａ〜図１９Ｄを含み、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害が生体外で黒色腫細胞に対し細胞傷害性であることを示す一連の画像と図である。図１９Ａは、黒色腫細胞Ａ３７５．Ｓ２およびＳＫ−Ｍｅｌ−２８にＲＮＬＳ特異的なｓｉＲＮＡまたは非特異的な対照ｓｉＲＮＡを一過性形質移入した後の相対細胞生存率を示す図であり、細胞生存率は７２時間後にＷＳＴ−１試験法で評価した。ｎ＝６であり、＊はｐ＝０．０３、＊＊はｐ＝０．００３を示す。
【図１９Ｂ】図１９は図１９Ａ〜図１９Ｄを含み、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害が生体外で黒色腫細胞に対し細胞傷害性であることを示す一連の画像と図である。図１９Ｂは相対細胞生存率を示す２つの図を含む。左：表示した抗体で細胞を７２時間処理し、ＷＳＴ−１法で細胞生存率を測定した。ｍ２８−ＲＮＬＳ（１Ｄ−２８−４ともいう）とｍ３７−ＲＮＬＳ（１Ｄ−３７−１０ともいう）は、ＲＮＬＳペプチドＲＰ２２０に対して生成されたモノクローナル抗体である。右：ｍ２８−ＲＮＬＳの用量を増やしてＡ３７５．Ｓ２細胞を７２時間処理し、細胞生存率をＷＳＴ−１試験法で測定した。ｎ＝６であり、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．００５を示す。
【図１９Ｃ】図１９は図１９Ａ〜図１９Ｄを含み、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害が生体外で黒色腫細胞に対し細胞傷害性であることを示す一連の画像と図である。図１９Ｃは、ウサギＩｇＧ（対照）またはｍ２８−ＲＮＬＳと共に７２時間インキュベートした後のＡ３７５．Ｓ２、ＳｋＭｅｌ２８、およびＳｋＭｅｌ５の代表的な写真を含む。
【図１９Ｄ】図１９は図１９Ａ〜図１９Ｄを含み、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害が生体外で黒色腫細胞に対し細胞傷害性であることを示す一連の画像と図である。図１９Ｄは、ＲＮＬＳペプチド拮抗薬（ＲＰ２２０Ａ）のアミノ酸（ＡＡ）配列を含む、相対細胞生存率を示す図である。Ａ３７５．Ｓ２細胞を、表示した濃度のＢＳＡまたはＲＰ２２０Ａで処理し、７２時間後にＷＳＴ−１試験法で細胞生存率を測定した。ｎ＝６であり、＊＊はｐ＜０．００５を示す。
【図２０Ａ】図２０は図２０Ａと図２０Ｂを含み、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害が生体内で黒色腫の増殖を阻止することを示す図と２つの画像を含む。図２０Ａは、Ａ３７５．Ｓ２細胞を異種移植した無胸腺ヌードマウスの腫瘍体積の増加を示す図である。２ｍｇ／ｋｇのウサギＩｇＧ（陰性対照）またはＲＮＬＳモノクローナル抗体ｍ２８−ＲＮＬＳで３日毎に処理を行い、処理前に腫瘍サイズを測定した。各群、ｎ＝１４である。前の測定値からみた腫瘍サイズの変化として１日の腫瘍増殖率を計算する。＊はｐ＜０．０５を示す。
【図２０Ｂ】図２０は図２０Ａと図２０Ｂを含み、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害が生体内で黒色腫の増殖を阻止することを示す図と２つの画像を含む。図２０Ｂは、ｍ２８−ＲＮＬＳまたはウサギＩｇＧ（対照）で処理したＡ３７５．Ｓ２異種移植腫瘍（それぞれｎ＝１４）の切片を細胞増殖マーカーＫｉ６７についてＩＨＣ（免疫組織化学）染色した結果の代表的な画像を含む。茶色はＫｉ６７陽性細胞である。
【図２１Ａ】図２１は、図２１Ａ〜図２１Ｆを含み、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害がＲＮＬＳ発現およびＳＴＡＴ３活性化を阻止し、アポトーシスおよび細胞周期停止を誘導することを示す、一連の画像と図である。図２１Ａは、異種移植腫瘍をウサギＩｇＧ（陰性対照）またはＲＮＬＳモノクローナル抗体で処理し、ＲＮＬＳ、リン酸化ＳＴＡＴ３、および総ＳＴＡＴ３について免疫蛍光法で調査した結果を示す一連の画像を含む（リン酸化ＳＴＡＴ３＝ｐ−Ｙ705−ＳＴＡＴ３）。それぞれについて代表的な結果を示す。青色は核、緑色はＲＮＬＳ、赤色はリン酸化ＳＴＡＴ３（左）または総ＳＴＡＴ３（右）を示す。
【図２１Ｂ】図２１は、図２１Ａ〜図２１Ｆを含み、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害がＲＮＬＳ発現およびＳＴＡＴ３活性化を阻止し、アポトーシスおよび細胞周期停止を誘導することを示す、一連の画像と図である。図２１Ｂは、異種移植腫瘍をウサギＩｇＧ（陰性対照）またはＲＮＬＳモノクローナル抗体で処理し、腫瘍細胞可溶化物をＲＮＬＳ、リン酸化ＳＴＡＴ３、総ＳＴＡＴ３、およびｐ２１についてウェスタンブロットにより調査した結果を示す画像（ｐ−Ｙ705−ＳＴＡＴ３は７０５位のチロシンのリン酸化を示す）であり、代表的な試験結果を示す。
【図２１Ｃ】図２１は、図２１Ａ〜図２１Ｆを含み、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害がＲＮＬＳ発現およびＳＴＡＴ３活性化を阻止し、アポトーシスおよび細胞周期停止を誘導することを示す、一連の画像と図である。図２１Ｃは、図２１Ｂに示す試料のＳＴＡＴ３タンパク質発現量の定量結果を示す図である。ｐ−Ｙ705−ＳＴＡＴ３シグナルを総ＳＴＡＴ３に対して正規化し、総ＳＴＡＴ３シグナルをタンパク質負荷測定値に対して正規化した。ｎ＝３であり、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．００５を示す。
【図２１Ｄ】図２１は、図２１Ａ〜図２１Ｆを含み、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害がＲＮＬＳ発現およびＳＴＡＴ３活性化を阻止し、アポトーシスおよび細胞周期停止を誘導することを示す、一連の画像と図である。図２１Ｄは、異種移植腫瘍をウサギＩｇＧ（陰性対照）またはＲＮＬＳモノクローナル抗体で処理し、ｑＰＣＲでヒトＲＮＬＳおよびマウスＲＮＬＳの発現について調査した結果を示す図である（それぞれｎ＝１４）。＊はｐ＜０．０５を示す。
【図２１Ｅ】図２１は、図２１Ａ〜図２１Ｆを含み、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害がＲＮＬＳ発現およびＳＴＡＴ３活性化を阻止し、アポトーシスおよび細胞周期停止を誘導することを示す、一連の画像と図である。図２１Ｅは、ｍ２８−ＲＮＬＳまたはウサギＩｇＧ（対照）で処理したＡ３７５．Ｓ２異種移植腫瘍（それぞれｎ＝１４）の切片を、アポトーシスを起こした細胞を標識するＴＵＮＥＬ試験に関して、または細胞周期阻害因子ｐ２１に関してＩＨＣ染色した結果の代表的な画像を含む。茶色はそれぞれＴＵＮＥＬ陽性細胞またはｐ２１陽性細胞を示す。
【図２１Ｆ】図２１は、図２１Ａ〜図２１Ｆを含み、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害がＲＮＬＳ発現およびＳＴＡＴ３活性化を阻止し、アポトーシスおよび細胞周期停止を誘導することを示す、一連の画像と図である。図２１Ｆは、抗ＲＮＬＳ抗体またはヤギＩｇＧ（対照）で処理したＡ３７５．Ｓ２細胞を示す画像である。ウェスタンブロットによって評価したｐ３８リン酸化とＢａｘ発現の経時変化を示す。ｐ−ｐ３８はリン酸化ｐ３８、Ｂａｘはｂｃｌ−２様タンパク質４を示す。
【図２２Ａ】図２２は図２２Ａ〜図２２Ｃを含み、ＲＮＬＳが黒色腫のＣＤ１６３陽性ＴＡＭで発現されることを示す一連の画像と図である。図２２Ａは以下を示す画像を含む。上：ＲＮＬＳと汎マクロファージマーカーＣＤ６８の共発現をＩＦ（免疫蛍光法）で試験したヒト黒色腫試料の組織マイクロアレイを示す。青色は核、緑色はＲＮＬＳ、赤色はすべてのマクロファージを示す。ＤＡＰＩは核染色を示し、ＲＮＬＳ−ＣＤ６８はＲＮＬＳ染色とＣＤ６８染色を合わせた図を示す。中央：ＲＮＬＳと代替活性化マクロファージ（Ｍ２）マーカーＣＤ１６３の共発現についてＩＦで試験した黒色腫試料を示す。青色は核、緑色はＲＮＬＳ、赤色はＭ２マクロファージを示す。ＤＡＰＩは核染色を示し、ＲＮＬＳ−ＣＤ１６３はＲＮＬＳ染色とＣＤ１６３染色を合わせた図を示す。ＲＮＬＳとＣＤ１６３の有意な共発現が認められる。下：ＲＮＬＳと古典的活性化マクロファージ（Ｍ１）マーカーＣＤ８６の共発現についてＩＦで試験した黒色腫試料を示す。青色は核、緑色はＲＮＬＳ、赤色はＭ１マクロファージを示す。ＤＡＰＩは核染色を示し、ＲＮＬＳ−ＣＤ１６３はＲＮＬＳ染色とＣＤ８６染色を合わせた図を示す。ＲＮＬＳとＣＤ１８６の有意な共発現は認められない。
【図２２Ｂ】図２２は図２２Ａ〜図２２Ｃを含み、ＲＮＬＳが黒色腫のＣＤ１６３陽性ＴＡＭで発現されることを示す一連の画像と図である。図２２Ｂは、異種移植腫瘍をウサギＩｇＧ（陰性対照）またはｍ２８−ＲＮＬＳで処理し、免疫蛍光法でＲＮＬＳおよびＭ２型ＴＡＭ（ＣＤ１６３陽性細胞）について調査した結果を示す２つの画像を含む。それぞれ代表的な結果を示し、緑色はＭ２マクロファージ、赤色はＲＮＬＳを示す。ｍ２８−ＲＮＬＳ処理によってＣＤ１６３陽性ＴＡＭとＲＮＬＳの発現は低減する。
【図２２Ｃ】図２２は図２２Ａ〜図２２Ｃを含み、ＲＮＬＳが黒色腫のＣＤ１６３陽性ＴＡＭで発現されることを示す一連の画像と図である。図２２Ｃは、提案されるｍ２８−ＲＮＬＳの作用機序を示す。ＴＡＭは腫瘍関連マクロファージ、ＣＤ１６３は代替活性化マクロファージ（Ｍ２）マーカー、ＣＤ８６は古典的活性化マクロファージ（Ｍ１）マーカー、ＲＮＬＳはレナラーゼ、ｍ２８−ＲＮＬＳは抗レナラーゼモノクローナル抗体、ｔ−ＳＴＡＴ３は総ＳＴＡＴ３、ｐ−ＳＴＡＴ３はリン酸化ＳＴＡＴ３を示す。
【図２３Ａ】図２３は図２３Ａ〜図２３Ｅを含み、一部のがんでのＲＮＬＳ発現、およびＰＤＡＣでの患者の予後不良との関連を示す一連の画像と図を示す。図２３Ａは、１５種類の異なる腫瘍型の１８２件のヒト腫瘍試料（OriGene Technologies）を含むｃＤＮＡアレイでｑＰＣＲにより測定したＲＮＬＳのｍＲＮＡ値を示す図である。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＝０．０００１を示す。
【図２３Ｂ】図２３は図２３Ａ〜図２３Ｅを含み、一部のがんでのＲＮＬＳ発現、およびＰＤＡＣでの患者の予後不良との関連を示す一連の画像と図を示す。図２３Ｂは、正常膵（ｎ＝６）、膵管腺がん（ｎ＝１１）、および膵神経内分泌腫瘍（ｎ＝２３）でｑＰＣＲにより測定したＲＮＬＳのｍＲＮＡ量を示す図である。＊はｐ＝０．０５、＊＊はｐ＝０．０００１７を示す。
【図２３Ｃ】図２３は図２３Ａ〜図２３Ｅを含み、一部のがんでのＲＮＬＳ発現、およびＰＤＡＣでの患者の予後不良との関連を示す一連の画像と図を示す。図２３Ｃは、正常ヒト膵臓組織（左、ｎ＝９０）、膵管腺がん（悪性度１〜４、それぞれｎ＝２０）でｍ２８−ＲＮＬＳを用いた免疫組織化学的検査で検出したＲＮＬＳタンパク質発現を示す画像である。それぞれについて代表的な結果を示す。ＲＮＬＳタンパク質は茶色に染色する。
【図２３Ｄ】図２３は図２３Ａ〜図２３Ｅを含み、一部のがんでのＲＮＬＳ発現、およびＰＤＡＣでの患者の予後不良との関連を示す一連の画像と図を示す。図２３Ｄは、正常ヒト膵臓組織（左、ｎ＝９０）、膵管腺がん（中央、ｎ＝９０）の組織マイクロアレイをＲＮＬＳ−ｍ２８抗体で免疫蛍光染色することで検出したＲＮＬＳ発現を示す。それぞれ代表的な結果を示す。青色は核、緑色はサイトケラチン、赤色はＲＮＬＳを示す。右はＡＱＵＡｎａｌｙｓｉｓ（商標）ソフトウェアで定量した正常ヒト膵臓組織（ｎ＝９０）と腺管がん（ｎ＝９０）の蛍光強度を示す。＊＊＊はｐ＝０．０００１３を示す。
【図２３Ｅ】図２３は図２３Ａ〜図２３Ｅを含み、一部のがんでのＲＮＬＳ発現、およびＰＤＡＣでの患者の予後不良との関連を示す一連の画像と図を示す。図２３Ｅは生存率に関するカプラン・マイヤー生存曲線を示す。Ｂｉｏｍａｘ社の６９件のＰＤＡＣのコホートを、ＲＮＬＳ発現値が低いもの（ｎ＝３５、ＲＮＬＳのＡＱＵＡスコア＜中央値）と高いもの（ｎ＝３４、ＲＮＬＳのＡＱＵＡスコア＞中央値）に層別化した。＊はｐ＝０．０００１を示す。
【図２４Ａ】図２４は図２４Ａ〜図２４Ｄを含み、ＲＮＬＳの過剰発現ががん細胞の生存に有利であることを示す一連の図である。図２４Ａは、ＰＤＡＣＣ株ＢｘＰＣ３、Ｐａｎｃ１、およびＭｉａＰａＣａ２を４８時間血清飢餓状態にし、３０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはｒＲＮＬＳと共に３日間インキュベートした結果を示す。全細胞数および生存細胞数をトリパンブルーと自動細胞計数器で決定した。ｎ＝４であり、＊＊はｐ＜０．０００１を示す。
【図２４Ｂ】図２４は図２４Ａ〜図２４Ｄを含み、ＲＮＬＳの過剰発現ががん細胞の生存に有利であることを示す一連の図である。図２４Ｂは、対照に対する相対細胞生存率を示す図である。ＭｉａＰａＣａ２細胞を血清飢餓状態にした後、ＭＥＫ１阻害剤Ｕ０１２６で前処理した場合としない場合でＢＳＡ（３０μｇ／ｍｌ）またはｒＲＮＬＳ（３０μｇ／ｍｌ）で処理し、７２時間後にＷＳＴ−１試験法で細胞生存率を測定した。ｎ＝６であり、＊はｐ＜０．００５を示す。
【図２４Ｃ】図２４は図２４Ａ〜図２４Ｄを含み、ＲＮＬＳの過剰発現ががん細胞の生存に有利であることを示す一連の図である。図２４Ｃは、ＰＭＣＡ４ｂ発現をｓｉＲＮＡによって阻害するとＲＮＬＳを介するＭＡＰＫシグナル伝達が阻止されることを示す画像と図を含む。左および中央：ＭｉａＰａＣａ２細胞に非標的ｓｉＲＮＡまたはＰＭＣＡ４ｂのｓｉＲＮＡを形質移入し、無血清培地で３日間維持し、２５μｇのＢＳＡまたは２５μｇのＲＮＬＳペプチドＲＰ−２２０で、表示した時間かけて処理した結果を示す。ＲＰ−２２０によるＥＲＫおよびＳＴＡＴ３の活性化をウェスタンブロットと代表的な免疫ブロットで評価した結果を示す。ｐ−ＥＲＫはリン酸化ＥＲＫ、ｐ−Ｙ705−ＳＴＡＴ３はリン酸化ＳＴＡＴ３、ｐ−Ｓ727−ＳＴＡＴ３はリン酸化ＳＴＡＴ３、ＢＳＡはウシ血清アルブミン、ＲＰ−２２０はＲＮＬＳペプチドアゴニストを示す。右：リン酸化ＥＲＫ（ｐ−ＥＲＫ）の定量結果を示す。グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）（負荷対照）に対して正規化したシグナルを示す。ｎ＝３であり、＊はＰ＜０．０５を示す。
【図２４Ｄ】図２４は図２４Ａ〜図２４Ｄを含み、ＲＮＬＳの過剰発現ががん細胞の生存に有利であることを示す一連の図である。図２４Ｄは、ＢＳＡ（３０μｇ／ｍｌ）またはｒＲＮＬＳ（３０μｇ／ｍｌ）で処理したＭｉａＰａＣａ２細胞の蛍光活性化細胞選別（fluorescence activated cell sorting; FACS）分析結果を示すグラフである（ｎ＝３）。
【図２５Ａ】図２５は図２５Ａ〜図２５Ｅを含み、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害が生体内外でがん細胞に対して細胞傷害性であることを示す一連の図と画像である。図２５Ａは、Ｐａｎｃ１細胞にＲＮＬＳ特異的なｓｉＲＮＡまたは非特異的な対照ｓｉＲＮＡを一過性形質移入した後の相対細胞生存率を示す図である。細胞生存率は９６時間後にＷＳＴ−１試薬で評価した。ｎ＝６であり、＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【図２５Ｂ】図２５は図２５Ａ〜図２５Ｅを含み、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害が生体内外でがん細胞に対して細胞傷害性であることを示す一連の図と画像である。図２５Ｂは、表示した抗体で細胞を７２時間処理し、細胞生存率をＷＳＴ−１法で測定した場合の相対細胞生存率を示す図である。ｍ２８−ＲＮＬＳおよびｍ３７−ＲＮＬＳはＲＮＬＳペプチドＲＰ２２０に対して生成されたモノクローナル抗体であり、ａｂ３１２９１はＲＰ−２２０の部分配列に対して生成されたＡｂｃａｍ社のポリクローナル抗体である。ｎ＝６であり、＊はｐ＜０．００５を示す。
【図２５Ｃ】図２５は図２５Ａ〜図２５Ｅを含み、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害が生体内外でがん細胞に対して細胞傷害性であることを示す一連の図と画像である。図２５Ｃは、ＭｉａＰａＣａ２細胞をｍ２８−ＲＮＬＳと共に３日間インキュベートした後の代表的な写真を示す（ｎ＝１０）。
【図２５Ｄ】図２５は図２５Ａ〜図２５Ｅを含み、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害が生体内外でがん細胞に対して細胞傷害性であることを示す一連の図と画像である。図２５Ｄは、ＲＮＬＳのｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピン型ＲＮＡ）（ｓｈ−ＲＮＬＳ）または対照（ｓｈ−対照）を形質導入したＰａｎｃ１細胞を無胸腺ヌードマウスに皮下注射した後の腫瘍体積の増加を示す図である。最大３０日後まで、２３日毎に腫瘍体積を測定した。それぞれｎ＝６であり、＊はｐ＜０．０５を示す。
【図２５Ｅ】図２５は図２５Ａ〜図２５Ｅを含み、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害が生体内外でがん細胞に対して細胞傷害性であることを示す一連の図と画像である。図２５Ｅは、ヌードマウスにＢｘＰＣ３を異種移植した後の腫瘍体積の増加を示す図である。２ｍｇ／ｋｇのウサギＩｇＧ（陰性対照）またはｍ２８−ＲＮＬＳで３〜４日毎に処理を行い、処理前に腫瘍サイズを測定した。ｎ＝１０であり、＊はｐ＜０．０５を示す。
【図２６Ａ】図２６は図２６Ａ〜図２６Ｅを含み、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害がアポトーシスおよび細胞周期停止を誘導することを示す一連の画像と図である。図２６Ａは、ｍ２８−ＲＮＬＳ抗体またはウサギＩｇＧ（対照）で処理したＢｘＰＣ３異種移植腫瘍の切片をＴＵＮＥＬ染色した結果の代表的な画像を示す（それぞれｎ＝１４）。矢印はＴＵＮＥＬ陽性細胞を示す。
【図２６Ｂ】図２６は図２６Ａ〜図２６Ｅを含み、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害がアポトーシスおよび細胞周期停止を誘導することを示す一連の画像と図である。図２６Ｂは、培養下のＰａｎｃ１細胞をｍ２８−ＲＮＬＳ（３０μｇ／ｍｌ）または１００μＭのエトポシド（陽性対照）で４日間処理しＦＡＣＳ分析した結果を示す図である。ｎ＝３であり、＊はｐ＜０．０５を示す。
【図２６Ｃ】図２６は図２６Ａ〜図２６Ｅを含み、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害がアポトーシスおよび細胞周期停止を誘導することを示す一連の画像と図である。図２６Ｃは、Ｐａｎｃ１細胞をポリクローナル抗体ａｂ３１２９１またはヤギＩｇＧ（陰性対照）で処理し、ウェスタンブロットでｐ３８およびＢａｘの活性化について細胞可溶化物を調査した結果を示す図である。
【図２６Ｄ】図２６は図２６Ａ〜図２６Ｅを含み、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害がアポトーシスおよび細胞周期停止を誘導することを示す一連の画像と図である。図２６Ｄは、ｍ２８−ＲＮＬＳ抗体またはウサギＩｇＧ（対照）で処理したＢｘＰＣ３異種移植腫瘍（それぞれｎ＝１４）の切片を細胞増殖マーカーＫｉ６７および細胞周期阻害因子ｐ２１についてＩＨＣ染色した結果の代表的な画像を示す。
【図２６Ｅ】図２６は図２６Ａ〜図２６Ｅを含み、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害がアポトーシスおよび細胞周期停止を誘導することを示す一連の画像と図である。図２６Ｅは、ＦＡＣＳ分析によって決定した、ｍ２８−ＲＮＬＳがＰａｎｃ１細胞の細胞周期に及ぼす効果を示す図である。緑色の曲線は未処理の場合、紫色の曲線はウサギＩｇＧ、赤色の曲線はｍ２８−ＲＮＬＳ（３０μｇ／ｍｌ）で処理した場合を示す。
【図２７Ａ】図２７は図２７Ａ〜図２７Ｅを含み、ＲＮＬＳとＳＴＡＴ３との相互作用、およびｍ２８−ＲＮＬＳによる阻害機構のモデルを示す一連の画像と図である。図２７Ａは、Ｐａｎｃ１細胞でのＲＮＬＳによるＳＴＡＴ３活性化を示す画像である。培養下のＰａｎｃ１細胞をＢＳＡまたはＲＮＬＳで処理し、ＳＴＡＴ３のリン酸化をウェスタンブロットにより評価した。ｐ−Ｓｅｒ727−ＳＴＡＴ３は７２７位のセリンのリン酸化、ｐ−Ｙ705−ＳＴＡＴ３は７０５位のチロシンのリン酸化を示す。代表的な試験結果を示す。
【図２７Ｂ】図２７は図２７Ａ〜図２７Ｅを含み、ＲＮＬＳとＳＴＡＴ３との相互作用、およびｍ２８−ＲＮＬＳによる阻害機構のモデルを示す一連の画像と図である。図２７ＢはＲＮＬＳによるＳＴＡＴ３のリン酸化の定量結果を示す図である。総ＳＴＡＴ３に対し正規化したシグナルを示す。ｎ＝３であり、＊はＰ＜０．０５を示す。
【図２７Ｃ】図２７は図２７Ａ〜図２７Ｅを含み、ＲＮＬＳとＳＴＡＴ３との相互作用、およびｍ２８−ＲＮＬＳによる阻害機構のモデルを示す一連の画像と図である。図２７Ｃは、ｍ２８−ＲＮＬＳがＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害することを示す画像である。培養下のＰａｎｃ１細胞をウサギＩｇＧまたは抗ＲＮＬＳモノクローナル抗体ｍ２８−ＲＮＬＳで最大４日間処理し、ＳＴＡＴ３のリン酸化をウェスタンブロットにより評価した。ｐ−Ｓｅｒ727−ＳＴＡＴ３は７２７位のセリンのリン酸化、ｐ−Ｙ705−ＳＴＡＴ３は７０５位のチロシンのリン酸化を示す。ＧＡＰＤＨを負荷対照とした。代表的な試験結果を示す。
【図２７Ｄ】図２７は図２７Ａ〜図２７Ｅを含み、ＲＮＬＳとＳＴＡＴ３との相互作用、およびｍ２８−ＲＮＬＳによる阻害機構のモデルを示す一連の画像と図である。図２７Ｄは、ｍ２８−ＲＮＬＳによるＳＴＡＴ３のリン酸化の定量結果を示す図である。ＧＡＰＤＨ（負荷対照）に対して正規化したシグナルを示す。ｎ＝３であり、＊はＰ＜０．０５を示す。
【図２７Ｅ】図２７は図２７Ａ〜図２７Ｅを含み、ＲＮＬＳとＳＴＡＴ３との相互作用、およびｍ２８−ＲＮＬＳによる阻害機構のモデルを示す一連の画像と図である。図２７Ｅは、ｍ２８−ＲＮＬＳの抗腫瘍活性について提案される機構モデルを示す。
【図２８】図２８は、ＲＮＬＳ発現が悪性度１〜４のＰＤＡＣに存在し、主にがん細胞に局在化していたことを示す画像を含む。
【図２９】図２９は膵神経内分泌腫瘍でのＲＮＬＳ発現を示す画像を含み、ＲＮＬＳが腫瘍全体の細胞で発現されたことを示す。
【図３０】図３０は、βアクチンに対して正規化した相対的なＲＮＬＳのｍＲＮＡ値を示す図であり、ＫＲＡＳ変異を有する膵管腺がん細胞（ＰＤＡＣＣ）株（ＭｉａＰａＣａ２およびＰａｎｃ１）では野生型ＫＲＡＳを有するＰＤＡＣＣ株（ＢｘＰＣ３など）に比べてＲＮＬＳ遺伝子発現値が高かったことを示す。
【図３１】図３１は、βアクチンに対して正規化した相対的なＲＮＬＳのｍＲＮＡ値を示す図であり、ｓｉＲＮＡでＲＮＬＳをノックダウンすることによって評価した、ＲＮＬＳ発現量減少が生体外で細胞生存率に及ぼす効果を示す。この処理により、ＰＤＡＣＣ株Ｐａｎｃ１とＭｉａＰａＣａ２の生存率は著しく低下した。
【図３２】図３２は、ＲＮＬＳを標的とするｓｈＲＮＡによるＲＮＬＳ発現の阻害によってＲＮＬＳ受容体ＰＭＣＡ４ｂの発現が顕著に減少したことを示す図であり、ＲＮＬＳとＰＭＣＡ４ｂの発現が同時制御されていると示唆される。
【図３３】図３３は培養下のＰａｎｃ１細胞のＦＡＣＳ分析結果を示す一連の図であり、ｍ２８−ＲＮＬＳがアポトーシスを引き起こしたことが確認された。
【図３４】図３４は、ＲＮＬＳで処理したＨＫ−２細胞で７２７位のセリンのリン酸化（ｐ−Ｓｅｒ727−ＳＴＡＴ３）と７０５位のチロシンのリン酸化（ｐ−Ｙ705−ＳＴＡＴ３）がそれぞれ２倍と４倍に増加したがＳＴＡＴ１には影響がなかったという所見により、正のＲＮＬＳ−ＳＴＡＴ３フィードバックループが示唆されることを示す、画像と図を含む。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明はレナラーゼ阻害剤を用いたレナラーゼの阻害に関する。様々な態様では、本発明は、レナラーゼ阻害剤の投与が必要な対象にレナラーゼ阻害剤を投与することによって、個体のレナラーゼに関連する症状または状態を処置するための組成物および方法に関する。様々な態様では、本発明の組成物および方法によって診断、予防、治療が可能な疾患および障害としては、急性腎不全（すなわち腎臓の虚血性状態である急性尿細管壊死（acute tubular necrosis; ATN））、心血管系疾患、およびがんが挙げられる。
【００１８】
一態様では、本発明は、がんの治療、予防、および診断に広く関する。一態様では、本発明はがんの診断、治療、阻害、予防、または軽減のための方法および組成物に関する。一態様では、本発明はレナラーゼの量、産生、活性のうち１つ以上を調節するための組成物および方法を提供する。がんならびに関連疾患および障害に関して、本発明はレナラーゼの量、産生、活性のうち１つ以上を低減するための組成物および方法を提供する。本発明の一部の側面では、がん転移の治療、予防、診断、または予後のための方法および組成物を提供する。
（定義）
【００１９】
別に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本発明の実施または試験には本明細書に記載したものと類似または同等の任意の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法および材料を記載する。
【００２０】
一般的に、本明細書で用いる用語、ならびに細胞培養、分子遺伝学、有機化学、核酸化学の実験手順およびハイブリダイゼーションの実験手順は、当技術分野で一般に使用される周知のものである。
【００２１】
核酸およびペプチドの合成には標準の技術を用いる。このような技術や手順は一般に、当技術分野の従来の方法と、本明細書全体に記載する様々な一般参照文献（たとえばSambrook and Russell, 2012, Molecular Cloning, A Laboratory Approach（分子クローニング、実験手法）, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NYおよびAusubelら、2012, Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学の最新プロトコール）, John Wiley & Sons, NY）に従い実施される。
【００２２】
本明細書で用いる用語ならびに以下に記載する分析化学および有機合成に用いる実験手順は当技術分野で一般に使用される周知のものである。化学合成および化学分析には標準の技術またはその改良技術を用いる。
【００２３】
本明細書では、冠詞「ａ」および「ａｎ」を、冠詞の文法上の対象が１つまたは２つ以上（すなわち少なくとも１つ）あることを指すために用いる。例として、「要素（an element）」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
【００２４】
量、持続時間などの測定可能な値を指す場合に本明細書で用いる「約」は、指定の値から±２０％、±１０％、±５％、±１％、または±０．１％の変動を包含するものとする、というのもこのような変動は開示した方法を実施するのに適切であるためである。
【００２５】
「異常な」という用語は、生物、組織、細胞、またはそれらの構成成分に関して用いる場合、少なくとも１つの観察可能または検出可能な特性（たとえば年齢、処置、時間帯など）が「正常な」（期待される／恒常的な）各特性を示す生物、組織、細胞、またはそれらの構成成分と異なる生物、組織、細胞、またはそれらの構成成分を指す。ある細胞または組織の種類にとって正常である、ないしは期待される特性が別の細胞または組織の種類にとって異常である場合がある。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「類似体」という用語は一般に、類似体の元の化合物、すなわち「親」化合物と全体的に構造が似ている化合物を指す。一般に、類似体は親化合物の特定の特性（たとえば生物学的活性または薬理学的活性）を保持するが、さほど望ましくない他の特性（たとえば抗原性、タンパク質分解不安定性、毒性など）は有さなくてよい。類似体には、親の特定の生物学的活性は低下し、１つ以上の特徴的な生物学的活性はその「類似体」では影響を受けていない化合物が含まれる。ポリペプチドに用いる場合、「類似体」という用語は、親化合物に対し様々な範囲のアミノ酸配列同一性（たとえば親化合物の所定のアミノ酸配列あるいは親化合物の選択された部分またはドメインのアミノ酸のうち少なくとも約７０％であり、少なくとも約８０％〜８５％または約８６％〜８９％がより好ましく、少なくとも約９０％、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％、または約９９％がさらに好ましい）を有してよい。ポリペプチドに用いる場合、「類似体」という用語は一般に、少なくともアミノ酸約３個からなり結合ドメイン融合タンパク質の少なくとも一部分と実質的に同一なセグメントで構成されるポリペプチドを指す。類似体は一般的には少なくとも５アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも５０アミノ酸長、少なくとも１００アミノ酸長、少なくとも１５０アミノ酸長、少なくとも２００アミノ酸長であり、より一般的には少なくとも２５０アミノ酸長である。一部の類似体は実質的な生物学的活性を有さない場合があるが、様々な用途（たとえば所定のエピトープに対する抗体を産生させるため；親和性クロマトグラフィーで反応性抗体を検出かつ／／または精製するための免疫学的試薬として；あるいは結合ドメイン融合タンパク質機能の競合的または非競合的な作用薬、拮抗薬、または部分的作用薬として）に使用できる。
【００２７】
本明細書で用いる場合、「抗体」という用語は、結合パートナー分子の特定のエピトープに特異的に結合できる免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然供給源または組換え供給源に由来する完全型免疫グロブリンであってもよいし、完全型免疫グロブリンの免疫反応部分であってもよい。本発明における抗体は、たとえば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、細胞内抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、およびＦ（ａｂ’）２、ならびに単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ラクダ科動物抗体などの重鎖抗体、ヒト化抗体などの多様な形態で存在してよい（Harlowら、1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual（抗体の使用：実験の手引き）, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlowら、1989, Antibodies: A Laboratory Manual（抗体の使用：実験の手引き）, Cold Spring Harbor, New York; Houstonら、1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Birdら、1988, Science 242:423-426）。
【００２８】
「抗体断片」という用語は完全型抗体の少なくとも一部分を指し、完全型抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、直鎖状抗体、ｓｄＡｂ（ＶLまたはＶH）、ラクダ科動物のＶHHドメイン、ｓｃＦｖ抗体、抗体断片で形成された多重特異性抗体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。「ｓｃＦｖ」という用語は、軽鎖可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片と重鎖可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片とを含む融合タンパク質である。ここで、軽鎖可変領域と重鎖可変領域は短い柔軟なポリペプチドリンカーを介して隣接して連結され、一本鎖ポリペプチドとして発現でき、ｓｃＦｖは、元の完全型抗体の特異性を保持する。特定しない限り、本明細書で使用する場合、ｓｃＦｖはＶL可変領域とＶH可変領域を含む（いずれの順序でもよい）。たとえば、ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に対し、ｓｃＦｖはＶL−リンカー−ＶHを含んでもよいし、ＶH−リンカー−ＶLを含んでもよい。
【００２９】
本明細書で用いる場合、「抗体重鎖」は、抗体分子がその天然の立体構造のときに有する２種類のポリペプチド鎖のうち大きい方を指す。通常、抗体重鎖によって抗体の属するクラスが決まる。
【００３０】
本明細書で用いる場合、「抗体軽鎖」は、抗体分子がその天然の立体構造のときに有する２種類のポリペプチド鎖のうち小さい方を指す。カッパ（κ）軽鎖およびラムダ（λ）軽鎖は、抗体軽鎖の２つの主なアイソタイプを指す。
【００３１】
本明細書で用いる場合、「合成抗体」という用語は、たとえば本明細書に記載のバクテリオファージが発現する抗体など、組換えＤＮＡ技術を用いて生成される抗体を意味する。この用語は、抗体をコードし抗体タンパク質を発現するＤＮＡ分子の合成、あるいはその抗体を特定するアミノ酸配列の合成によって生成された抗体を意味するとも解釈すべきである。ここで、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は当技術分野で利用可能な周知のＤＮＡ合成技術またはアミノ酸配列合成技術によって得たものである。
【００３２】
「キメラ抗体」は、ドナー抗体由来の天然の可変領域（軽鎖および重鎖）がアクセプター抗体由来の軽鎖定常領域および重鎖定常領域と結合した改変抗体の型を指す。
【００３３】
「ヒト化抗体」は、ＣＤＲはヒト以外のドナーの免疫グロブリンに由来し、分子のうちＣＤＲ以外の免疫グロブリン由来部分は１種（またはそれ以上）のヒト免疫グロブリンに由来する改変抗体の型を指す。また、結合親和性を保持するようにフレームワークの支持残基を変更してもよい（たとえば、1989, Queenら、Proc. Natl. Acad Sci USA, 86:10029-10032；1991, Hodgsonら、Bio/Technology, 9:421を参照）。適切なヒトアクセプター抗体は、ドナー抗体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列との相同性によって従来のデータベース（たとえばＫＡＢＡＴデータベース、Los AlamosデータベースおよびSwiss Proteinデータベース）から選択した１つの抗体であってよい。ドナー抗体のフレームワーク領域との相同性（アミノ酸基準）を特徴とするヒト抗体は、ドナーＣＤＲを挿入するための重鎖定常領域および／または重鎖可変フレームワーク領域を得るのに適切な場合がある。軽鎖の定常領域または可変フレームワーク領域を提供できる適切なアクセプター抗体を似た方法で選択してもよい。なお、アクセプター抗体の重鎖と軽鎖は同じアクセプター抗体に由来する必要はない。このようなヒト化抗体を作製する一部の方法は先行技術文献に記載されている（たとえば、欧州特許第０２３９４００号明細書および欧州特許第０５４９５１号明細書を参照）。
【００３４】
「ドナー抗体」という用語は、その可変領域、ＣＤＲ、あるいは他の機能的断片またはその類似体のアミノ酸配列を第一の免疫グロブリンパートナーに改変免疫グロブリンコード領域を提供し、その結果発現されるドナー抗体特有の結合特異性と中和活性を有する改変抗体を提供する抗体（モノクローナル抗体および／または組換え抗体）を指す。
【００３５】
「アクセプター抗体」という用語は、その重鎖および／または軽鎖のフレームワーク領域ならびに／あるいはその重鎖および／または軽鎖の定常領域をコードするアミノ酸配列全体（または任意の部分（一部の態様では全体）を第一の免疫グロブリンパートナーに与える、ドナー抗体にとって異種の抗体（モノクローナル抗体および／または組換え抗体）を指す。特定の態様では、ヒト抗体はアクセプター抗体である。
【００３６】
「ＣＤＲ」は免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域である、抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列と定義される。たとえば、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th（免疫学的に有益なタンパク質の配列（第４版））Ed., U.S. Department of Health and Human Services（米国保健福祉省）、National Institutes of Health（国立衛生研究所）（1987）を参照のこと。免疫グロブリンの可変部分には３個の重鎖ＣＤＲと３個の軽鎖ＣＤＲ（すなわちＣＤＲ）がある。したがって、本明細書で用いる場合、「ＣＤＲ」は３個すべての重鎖ＣＤＲ、または３個すべての軽鎖ＣＤＲ（あるいは、適切な場合はすべての重鎖ＣＤＲとすべての軽鎖ＣＤＲ）を指す。抗体の構造やタンパク質折り畳みは、他の残基が結合領域の一部と考えられ、そのように当業者に理解されることを意味する可能性がある。たとえばChothiaら、(1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions（免疫グロブリンの超可変領域の立体構造）; Nature 342, p 877-883を参照のこと。
【００３７】
「フレームワーク」または「フレームワーク配列」という用語は、可変領域からＣＤＲを除いた残りの配列を指す。ＣＤＲ配列の正確な定義は様々な体系によって決定できるため、フレームワーク配列の意味もそれに応じて様々に解釈される。６個のＣＤＲ（軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３と重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３）はさらに、軽鎖および重鎖の各鎖のフレームワーク領域を４個の小領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）に分割する。ＦＲ１とＦＲ２の間にＣＤＲ１、ＦＲ２とＦＲ３の間にＣＤＲ２、ＦＲ３とＦＲ４の間にＣＤＲ３が位置する。特定の小領域をＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ４と指定せず、フレームワーク領域は、他の当業者がいう場合と同様に、１つの天然免疫グロブリン鎖の可変領域に存在するＦＲ全体を表す。ＦＲは４個の小領域のうちの１個を表し、複数のＦＲはフレームワーク領域を構成する４個の小領域のうち２個以上を表す。
【００３８】
本明細書で用いる場合、「免疫検定」は、標的分子に特異的に結合して標的分子を検出かつ定量できる抗体を用いる任意の結合試験を指す。
【００３９】
抗体に関して本明細書で用いる「特異的に結合する」という用語は、試料中の特定の結合パートナー分子を認識するが他の分子に対しては実質的に認識も結合もしない抗体を意味する。たとえば、１つの種に由来する結合パートナー分子に特異的に結合する抗体は１つ以上の種に由来するその結合パートナー分子にも結合する可能性がある。しかし、抗体が特異的だという分類はこのような異種間反応性自体によって変わるわけではない。別の例では、ある結合パートナー分子に特異的に結合する抗体はその結合パートナー分子の様々なアレル型にも結合する可能性がある。しかし、抗体が特異的だという分類はこのような交差反応性自体によって変わるわけではない。
【００４０】
一部の例では、「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語は、抗体、タンパク質、またはペプチドと第二の結合パートナー分子との相互作用について使用でき、その相互作用が結合パートナー分子上の特定の構造（たとえば抗原決定基、すなわちエピトープ）の存在に依存することを意味する。たとえば、抗体は一般にタンパク質というよりも特定のタンパク質構造に対して認識・結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識付きの「Ａ」と抗体を含む反応にエピトープＡ含有分子（または標識のない遊離状態のＡ）が存在すると、抗体が結合する標識付きのＡの量は減少する。一部の例では、「特異的結合」および「特異的に結合する」という用語は、抗体が結合パートナー分子に対する結合親和性を高めるのに重要な配列エピトープまたは立体構造エピトープを認識するような選択的結合を指す。
【００４１】
本明細書で用いる場合、「中和する」という用語は、結合性タンパク質がレナラーゼに特異的に結合した際のレナラーゼの生物学的活性の中和を指す。中和結合タンパク質は、レナラーゼと結合することによりレナラーゼの生物学的活性を阻害する中和抗体であることが好ましく、レナラーゼに結合してレナラーゼの生物学的活性を少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、または８５％低下させることが好ましい。一部の態様ではレナラーゼはヒトのレナラーゼである。
【００４２】
「エピトープ」という用語は、抗体またはその結合性部分あるいは他の結合分子（たとえばｓｃＦｖなど）が認識する結合パートナー分子上の部位というこの用語の通常の意味を有する。エピトープはアミノ酸の分子またはセグメント（タンパク質またはポリペプチド全体のうちの小さな部分を表すセグメントを含む）であってよい。エピトープは立体構造（すなわち不連続）であってもよい。すなわち、エピトープは、一次配列では不連続であるがタンパク質折り畳みによって隣接するようになった部分がコードするアミノ酸で構成されてもよい。
【００４３】
本明細書で用いる「生体試料」という用語は、核酸またはポリペプチドの発現が検出できる細胞、組織、または体液を含有する任意の試料を含むものとする。このような生体試料の例としては、血液、リンパ液、骨髄、生検、塗抹標本などが挙げられるが、これらに限定するものではない。本来は液体である試料を本明細書では「体液」という。生体試料は、たとえばある範囲を擦過するか拭き取る、あるいは針を用いて体液を採取するなどの様々な方法で患者から入手できる。様々な生体試料を採取する方法は当技術分野で周知である。
【００４４】
本明細書で用いる場合、「がん」という用語は異常細胞の異常増殖を特徴とする疾患と定義される。がん細胞は局所的に広がる場合もあるし、血流やリンパ系を通じて体内の他の部分に広がる場合もある。様々ながんの例としては、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頚がん、皮膚がん（たとえば黒色腫）、膵臓がん、大腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がん、肉腫などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４５】
本明細書で用いる場合、「複合」は１つの分子が第二の分子に共有結合していることを指す。
【００４６】
遺伝子の「コード領域」は、その遺伝子の転写によって得られるｍＲＮＡ分子のコード領域に相同な、遺伝子のコード鎖のヌクレオチド残基と、同コード領域と相補的な、遺伝子の非コード鎖のヌクレオチドとで構成される。
【００４７】
ｍＲＮＡ分子の「コード領域」はさらに、そのｍＲＮＡ分子のうち、ｍＲＮＡ分子の翻訳時に転移ＲＮＡ分子の逆コドン領域と対合するヌクレオチド残基または停止コドンをコードするヌクレオチド残基で構成される。したがって、このコード領域は、ｍＲＮＡ分子がコードする成熟タンパク質には存在しないアミノ酸残基に関するコドンを含むヌクレオチド残基（たとえば、タンパク質輸送シグナル配列に含まれるアミノ酸残基）を含んでもよい。
【００４８】
核酸を指すために本明細書で用いる「相補的」は、２本の核酸鎖の領域間または同じ核酸鎖の２つの領域間の配列相補性という広い概念を指す。第一の核酸領域のアデニン残基は、第一の領域と逆平行である第二の核酸領域の残基がチミンまたはウラシルである場合、その残基と特異的な水素結合を形成できること（「塩基対形成」）が知られている。同様に、第一の核酸鎖のシトシン残基は、第一の鎖と逆平行な第二の核酸鎖の残基がグアニンである場合、その残基と塩基対形成できることが知られている。核酸の第一の領域と同じ核酸または別の核酸の第二の領域とが逆平行に配置されているときに第一の領域の少なくとも１個のヌクレオチド残基が第二の領域の残基と塩基対形成できる場合、第一の領域は第二の領域と相補的である。第一の領域は第一の部分を含み、第二の領域は第二の部分を含み、第一の部分と第二の部分が逆平行に配置されている場合、第一の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％（少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％であることが好ましい）は第二の部分のヌクレオチド残基と塩基対形成できることが好ましい。第一の部分のすべてのヌクレオチド残基が第二の部分のヌクレオチド残基と塩基対形成できることがより好ましい。
【００４９】
本明細書で用いる場合、「誘導体」という用語は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはその他の分子の化学修飾物を含む。本発明に関して、「誘導体ポリペプチド」（たとえば、グリコシル化、ペグ化、または同様の任意の処理によって修飾したもの）は結合活性を保持する。たとえば、結合ドメインの「誘導体」という用語は、野生型の結合ドメイン融合タンパク質には本来は結合していない、たとえば１つ以上のポリエチレングリコール分子、糖、リン酸塩、および／または他のこのような分子を付加することで化学修飾した結合ドメイン融合タンパク質、多様体、または断片を包含する。ポリペプチドの「誘導体」は、基準ポリペプチドに対してたとえばアミノ酸の置換、欠失、または挿入を有することによって基準ポリペプチドから「誘導」されるポリペプチドをさらに含む。したがって、ポリペプチドは、野生型ポリペプチドまたはその他の任意のポリペプチドから「誘導された」ポリペプチドであってよい。本明細書で用いる場合、ポリペプチドを含む化合物はさらに、特定の供給源（たとえば特定の生物、組織型、あるいは特定の生物や組織型に存在する特定のポリペプチド、核酸、または他の化合物）から「誘導された」ものであってもよい。
【００５０】
本明細書で用いる場合、「ＤＮＡ」という用語はデオキシリボ核酸と定義される。
【００５１】
「コードする」は、ヌクレオチド（すなわちｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｍＲＮＡ）の所定配列またはアミノ酸の所定配列とその配列により得られる生物学的特性を有する別の重合体や高分子を生物学的処理で合成するための鋳型として機能するポリヌクレオチド（例えば、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）に含まれる特定のヌクレオチド配列に固有の特性を指す。したがって、ある遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写と翻訳によって細胞またはその他の生体系でタンパク質が産生される場合、その遺伝子はタンパク質をコードする。ｍＲＮＡ配列と同一で配列表に通常記載されるヌクレオチド配列を有するコード鎖も、遺伝子やｃＤＮＡの転写のための鋳型として用いられる非コード鎖も、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質やその他の産物をコードするということができる。
【００５２】
別に特定しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重型であり同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。また、「タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列」という表現は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が一部の型でイントロンを含み得る場合、イントロンを含んでもよい。
【００５３】
「疾患」は、動物が恒常性を維持できず、改善されなければその動物の健康は悪化し続ける、動物の健康状態である。
【００５４】
一方、動物の「障害」は、その動物は恒常性を維持できるが、障害がない場合の健康状態に劣るような健康状態である。治療を受けずに放置した場合、障害は必ずしもその動物の健康状態をさらに悪化させるとは限らない。
【００５５】
疾患または障害の徴候または症状の重症度、患者がその徴候または症状を経験する頻度、あるいは重症度と頻度の両方が低減される場合、疾患または障害は「軽減される」。
【００５６】
化合物の「有効量」または「治療有効量」は、その化合物の投与対象に有益な治療上または予防上の効果をもたらすのに十分な化合物量である。
【００５７】
本明細書に記載の結合ドメインポリペプチドに関する「高親和性」という用語は、解離定数（Ｋｄ）が約１０-6Ｍ以下であることを指し、約１０-7Ｍ以下であることが好ましく、約１０-8Ｍ以下であることがより好ましく、約１０-9Ｍ以下であることがより好ましく、約１０-10Ｍ以下であることがより好ましく、たとえば最大でも１０-12Ｍである。しかし、「高親和性」結合は、別の結合ドメインポリペプチドの場合には異なる場合がある。
【００５８】
本明細書で用いる場合、「阻害する」という用語は、たとえば活性または機能を対照値の約１０パーセント抑制または阻止することを意味する。活性を対照値に比べて５０％抑制または阻止することが好ましく、７５％の抑制または阻止がより好ましく、９５％の抑制または阻止がさらに好ましい。本明細書で用いる場合、「阻害する」は、分子、反応、相互作用、遺伝子、ｍＲＮＡ、および／またはタンパク質の発現、安定性、機能、または活性の値を測定可能な量だけ低下させること、あるいは完全に防止することも意味する。阻害剤は、たとえば結合によって、部分的または完全に活性を阻止したり、減少させたり、防止したり、活性化を遅らせたり、不活性化させたり、脱感作させたり、あるいはタンパク質、遺伝子、ｍＲＮＡの安定性、発現、機能、および活性を下方制御させる化合物（たとえば拮抗剤）である。
【００５９】
本明細書において様々な形で用いる、目的の分子の「調節剤」および「調節」という用語は、目的のタンパク質分解酵素に関連する活性の拮抗、刺激、部分的拮抗、および／または部分的刺激を包含するものとする。様々な態様では、「調節剤」は、タンパク質分解酵素の発現または活性を阻害または刺激できる。このような調節剤としては、タンパク質分解酵素分子、アンチセンス分子、リボザイム、三重鎖分子、ＲＮＡｉポリヌクレオチドなどに対する低分子の刺激剤および拮抗剤が挙げられる。
【００６０】
本明細書で用いる場合、「説明資料」は、本明細書に記載の多様な疾患または障害を軽減するためのキットに含まれ本発明の化合物、組成物、ベクター、または送達系の有用性を伝えるために用いることのできる発行物、記録、図表、またはその他の任意の表現媒体を含む。それとは別に、あるいはその代わりに、説明資料に哺乳類の細胞または組織の疾患または障害を軽減する１つ以上の方法を記載してもよい。本発明のキットの説明資料は、たとえば、本発明の化合物、組成物、ベクター、または送達系を識別して入れた容器に貼ってもよいし、容器と一緒に輸送してもよい。あるいは、受取人が説明資料を見ながら化合物を使用する目的で、説明資料と容器を分けた状態で輸送してもよい。
【００６１】
「単離された」は、天然の状態から変更されるか取り出されたことを意味する。たとえば、本来の状況で動物生体に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離されて」いないが、その本来の状況で共存する物質から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離されて」いる。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することもできるし、たとえば宿主細胞などの非天然の環境に存在することもできる。
【００６２】
「単離核酸」は、天然の状態では近接していた配列から分離された核酸分節または核酸断片、すなわち、通常であれば近接している配列（その断片が天然に存在するゲノムではその断片に近接している配列）から取り出されたＤＮＡ断片を指す。この用語は、核酸に本来付随する他の成分（すなわち、細胞ではその核酸に本来付随しているＲＮＡまたはＤＮＡあるいはタンパク質）を実質的に取り除いた核酸にも用いる。したがって、この用語には、たとえば、ベクター、自己複製するプラスミドもしくはウイルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた組換えＤＮＡ、あるいは他の配列から独立した別個の分子として存在する組換えＤＮＡ（すなわち、ＰＣＲまたは制限酵素消化によって得られたｃＤＮＡあるいはゲノム断片またはｃＤＮＡ断片）も含まれる。また、この用語には、別のポリペプチド配列もコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含まれる。
【００６３】
本発明に関して、通常存在する核酸塩基について以下の略語を用いる。「Ａ」はアデノシン、「Ｃ」はシトシン、「Ｇ」はグアノシン、「Ｔ」はチミジン、「Ｕ」はウリジンを指す。
【００６４】
本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド鎖と定義される。核酸はヌクレオチドの重合体である。したがって、本明細書で用いる場合、核酸とポリヌクレオチドは互換可能である。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり単量体「ヌクレオチド」に加水分解できるという一般知識を有する。この単量体ヌクレオチドはヌクレオシドに加水分解できる。本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチドとしては、当技術分野で利用可能な任意の手段（たとえば組換え技術、すなわち組換えライブラリーまたは細胞ゲノムから核酸配列を通常のクローニング技術とＰＣＲによってクローニングすることなどが挙げられるが、これらに限定するものではない）と合成手段によって得られたすべての核酸配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６５】
本明細書で用いる場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」という用語は互換可能に用いられ、ペプチド結合で共有結合したアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは少なくとも２個のアミノ酸を含有しなければならないが、タンパク質またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数には制限はない。ポリペプチドにはペプチド結合で互いに連結した２個以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書で用いる場合、この用語は当技術分野で一般的にたとえばペプチド、オリゴペプチド、オリゴマーとも呼ばれる短い鎖と、それよりも長く当技術分野で一般的にタンパク質と呼ばれる鎖の両方を指し、多くの種類が存在する。「ポリペプチド」には特に、たとえば生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの多様体、ポリペプチドの改変体、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドとしては、天然のペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００６６】
ポリペプチドについて説明する場合の「保存的置換」という用語は、そのポリペプチドの活性を実質的に変化させないポリペプチドのアミノ酸組成の変化（すなわちアミノ酸を特性の似た他のアミノ酸と置換すること）を指す。機能の似たアミノ酸を示す保存的置換表は当技術分野で周知である。以下の６つの群はそれぞれ、互いに保存的置換となると一般に理解されているアミノ酸を含む：（１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；（４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）（Creighton, 1984, Proteins（タンパク質）、W.H. Freeman and Companyも参照のこと）。以上に定義した保存的置換の他、他のアミノ酸残基改変によっても「保存的に改変された多様体」が得られる場合がある。たとえば、荷電したアミノ酸はすべて、正電荷でも負電荷でも互いの置換体とみなすことができる。コードされた配列のうち１個のアミノ酸またはわずかな割合（たとえば５％未満であることが多い）のアミノ酸を変更、付加、または削除する個々の置換、欠失または付加によって保存的に改変された多様体を得ることもできる。組換えポリペプチドを基に、天然または野生型の遺伝子が利用するアミノ酸のコドンを同じアミノ酸の別のコドンで置換することによって保存的に改変された多様体を作製することもできる。
【００６７】
本明細書で用いる場合、「ＲＮＡ」という用語はリボ核酸と定義される。
【００６８】
本明細書で用いる場合、「組換えＤＮＡ」という用語は、異なる供給源に由来するＤＮＡ片を連結することで作製されるＤＮＡと定義される。
【００６９】
本明細書で用いる場合、「組換えポリペプチド」という用語は、組換えＤＮＡ法で作製されるポリペプチドと定義される。
【００７０】
「医薬的に許容される」は、たとえば、製剤に含まれる他の成分と適合性があり、その製剤の対象に投与しても一般的に安全な担体、希釈剤または賦形剤を意味する。本明細書で用いる場合、「医薬的に許容される担体」は、複合体と組み合わせた場合もその複合体の活性を保持し、かつ個体の免疫系と反応しない任意の物質を含む。例としては、リン酸緩衝食塩水、水、油／水乳剤などの乳剤、および様々な種類の湿潤剤などの任意の標準の医薬担体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。その他の担体としては、滅菌溶液、被覆錠剤などの錠剤、カプセルなども挙げられる。一般的に、このような担体は、デンプン、乳、糖、ある種の粘土、ゼラチン、ステアリン酸またはその塩、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウム、タルク、植物性油脂、ゴム、グリコール、あるいはその他の既知の賦形剤などの賦形剤を含有する。このような担体としては、香味添加剤や着色添加剤またはその他の成分も挙げることができる。このような担体を含む組成物を周知の従来方法で製剤する。
【００７１】
「患者」、「対象」、「個体」などの用語は本明細書で互換可能に用いられ、補体系を有する任意の動物（状態またはその後遺症の治療を必要とするか、その状態またはその後遺症になりやすいヒトを含む）を指す。動物は哺乳類であることが好ましく、ヒトが最も好ましい。したがって、個体としては、たとえばイヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、サル、マウス、ヒトを挙げることができる。
【００７２】
「パーセント（％）同一性」という用語は、２つ以上のアミノ酸配列を比較したときにわかる配列類似性の割合を指す。パーセント同一性は任意の適切なソフトウェアを用いて電子的に決定できる。同様に、１つのポリペプチドのアミノ酸配列を第二のポリペプチドのアミノ酸配列と比較することによって、２つのポリペプチド（あるいは、一方または両方のポリペプチドの１つ以上の部分）の「類似性」を決定する。このような比較に有用な任意の適切なアルゴリズムを本発明に関する用途に適合させることができる。
【００７３】
「治療」処置は、病気の徴候を示す対象に対してその徴候を軽減するか取り除く目的で実施する処置である。
【００７４】
「治療有効量」という用語は、患者に投与した際に疾患の症状を改善するような本発明の化合物量である。「治療有効量」となる本発明の化合物量は、化合物、疾患の状態や重症度、処置を受ける患者の年齢などに応じて変動する。治療有効量は通常、当業者が自身の知識と本開示を考慮して決定できる。
【００７５】
「処置（する）」という用語は本明細書に記載の治療手段または予防手段を指す。この「処置」方法では、その処置を必要とする対象（たとえば、疾患または障害にかかった対象、あるいは最終的にその疾患または障害にかかるかもしれない対象）に対し、障害または再発性障害の１つ以上の症状を予防するため、治癒させるため、遅らせるため、重症度を下げるため、もしくは改善するため、あるいはその処置を行わない場合に期待されるよりも対象の生存期間を長くするため、本発明の組成物の投与を用いる。
【００７６】
本明細書で用いる場合、「多様体」という用語は、それぞれ基準の核酸配列またはペプチド配列と配列は異なるが基準分子の本質的な生物学的特性を保持している核酸配列またはペプチド配列を指す。核酸多様体の配列の変化によって、基準核酸がコードするペプチドのアミノ酸配列は変化しない場合もあればアミノ酸の置換、付加、欠失、融合、および切断が起こる場合もある。ペプチド多様体の配列の変化は一般的には限定的または保存的であり、結果として基準ペプチドと多様体の配列は全体的に非常に似ており、多くの領域で同一である。多様体と基準ペプチドは、任意の組み合わせで１つ以上の置換、付加、欠失が起こることでアミノ酸配列が異なってもよい。核酸またはペプチドの多様体は、アレル多様体などの天然に存在する多様体であってもよく、天然に存在するとわかっていない多様体であってもよい。天然に存在しない核酸多様体およびペプチド多様体は、変異誘発技術または直接合成によって作製できる。
【００７７】
範囲：本開示全体で、範囲を示す書式で本発明の様々な側面を記載する場合がある。当然ながら、範囲を示す書式による記載は単なる簡便が目的で、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきではない。したがって、範囲の記載は、考えられるすべての部分的範囲と、その範囲に含まれる個々の数値とを具体的に開示しているものとする。たとえば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの部分的範囲と、その範囲に含まれるたとえば１、２、２．７、３、４、５、５．３、６などの個々の数とを具体的に開示しているものとする。これを範囲の幅に関係なく適用する。
（説明）
【００７８】
本発明はレナラーゼ阻害剤を用いたレナラーゼの阻害に関する。様々な態様では、本発明は、レナラーゼ阻害剤の投与が必要な対象にレナラーゼ阻害剤を投与することによって個体のレナラーゼ関連疾患または障害を処置するための組成物および方法に関する。一部の態様では、レナラーゼ阻害剤はレナラーゼ結合性分子である。一部の態様では、レナラーゼ結合性分子は抗体である。様々な態様では、本発明の組成物および方法によって診断、予防、治療が可能な疾患および障害としては、急性腎不全（すなわち腎臓の虚血性状態である急性尿細管壊死（ＡＴＮ））、心血管系疾患、およびがんが挙げられる。
【００７９】
一態様では、本発明は、がんの治療、予防、および診断に広く関する。一態様では、本発明は、がんの診断、病期決定、治療、阻害、予防、または軽減のための方法および組成物に関する。一態様では、本発明はレナラーゼの量、産生、活性のうち１つ以上を調節するための組成物および方法を提供する。がんならびに関連疾患および障害に関して、本発明はレナラーゼの量、産生、活性のうち１つ以上を低減するための組成物および方法を提供する。本発明の一部の側面では、がん転移の治療、予防、診断、または予後のための方法および組成物を提供する。
（治療用の阻害剤組成物と使用法）
【００８０】
様々な態様では、本発明はレナラーゼの量または活性の低下が望まれる疾患または障害を治療または予防するためのレナラーゼ阻害剤組成物および方法を包含する。本発明の組成物および方法で治療または予防できる、レナラーゼの量または活性の低下が望まれる疾患または障害の例としてはがんが挙げられるが、これに限定されるものではない。様々な態様では、本発明のレナラーゼ阻害剤組成物と治療または予防の方法は、レナラーゼポリペプチドの量、レナラーゼペプチド断片の量、レナラーゼｍＲＮＡの量、レナラーゼ酵素活性の量、レナラーゼ基質結合活性の量、レナラーゼ受容体結合活性の量、またはそれらの組み合わせを低減する。
【００８１】
当業者であれば本明細書の開示に基づき理解することであるが、レナラーゼ値の低減にはレナラーゼの発現（転写、翻訳、またはその両方）の低減が包含され、レナラーゼの分解（ＲＮＡレベルの分解（たとえばＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡなど）とタンパク質レベルの分解（たとえばユビキチン化など）を含む）の促進も包含される。また、当業者であれば本発明の教示を得れば理解することであるが、レナラーゼ値の低減には、レナラーゼの活性（たとえば酵素活性、基質結合活性、受容体結合活性など）の低減も包含される。したがって、レナラーゼの量または活性の低減としては、レナラーゼをコードする核酸の転写、翻訳、またはその両方を低減することが挙げられるが、これに限定されるものではない。また、レナラーゼポリペプチドまたはそのペプチド断片の任意の活性を低減することも包含される。本発明のレナラーゼ阻害剤組成物および方法は、レナラーゼを選択的に阻害することもできるし、レナラーゼおよび別の分子を阻害することもできる。
【００８２】
レナラーゼの阻害は、本明細書に開示する方法と当技術分野で公知の方法または将来開発される方法を含む多様な方法で評価できる。すなわち、当業者であれば本明細書の開示に基づき理解できることであるが、レナラーゼの量または活性の低減は、生体試料に含まれる、レナラーゼをコードする核酸（たとえばｍＲＮＡ）の値、レナラーゼポリペプチドまたはそのペプチド断片の値、レナラーゼ活性（たとえば酵素活性、基質結合活性、受容体結合活性など）の値、あるいはそれらの組み合わせを評価する方法を用いて容易に評価できる。
【００８３】
当業者であれば本明細書の開示に基づき理解することであるが、本発明は、対象が別の薬物療法または治療を受けているかどうかに関係なく、治療または予防を必要とする対象の治療または予防に有用である。さらに、当業者であれば本明細書の教示に基づき理解できることであるが、本明細書に記載の組成物および方法で処置できる疾患または障害としては、レナラーゼが関与しレナラーゼの量または活性を低減することで治療の予後が良くなるような任意の疾患または障害が包含される。様々な態様では、本発明の組成物および方法によって治療または予防できる疾患または障害としては、急性腎不全（すなわち腎臓の虚血性状態である急性尿細管壊死（ＡＴＮ））、心血管疾患または心血管障害（たとえば、高血圧症、肺高血圧症、収縮期高血圧症、糖尿病性高血圧症、無症候性左室機能不全、慢性うっ血性心不全、心筋梗塞、心調律障害、アテローム動脈硬化症など）、がん、心疾患または心障害、腎疾患または腎障害、胃腸疾患または胃腸障害、肝疾患または肝障害、肺疾患または肺障害、膵疾患または膵障害（たとえば膵炎）、精神疾患または精神障害（たとえばうつ状態、不安など）、あるいは神経疾患または神経障害が挙げられる。
【００８４】
別の態様では、本発明のレナラーゼ阻害剤は、外因性レナラーゼ、組換えレナラーゼ、レナラーゼ断片、および／またはレナラーゼ活性化因子による治療を受けている患者に対し、患者の内因性レナラーゼおよび／または外因性レナラーゼの量または活性を制御、量設定、低減、または安定化するために投与できる。
【００８５】
レナラーゼまたはレナラーゼ断片の量または活性（たとえば酵素活性、基質結合活性、受容体結合活性など）を低減する本発明のレナラーゼ阻害剤組成物および方法は、化合物、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、抗体、抗体断片、抗体模倣物、リボザイム、小分子化合物、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、ＲＮＡｉ、アンチセンス核酸分子（たとえばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）、アンチセンス核酸分子をコードする核酸、タンパク質をコードする核酸配列、レナラーゼ受容体、レナラーゼ受容体断片、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されると解釈すべきではない。一部の態様では、阻害剤はアロステリック（構造変化によって活性を調節する）阻害剤である。当業者であれば本明細書の開示に基づき容易に理解できることであるが、レナラーゼ阻害剤組成物としては、レナラーゼまたはレナラーゼ断片の量または活性を低減する任意の化合物が包含される。また、化学分野の当業者には周知であるが、レナラーゼ阻害剤組成物としては化学修飾を施した化合物および誘導体が包含される。
【００８６】
レナラーゼまたはレナラーゼ断片の量または活性（たとえば酵素活性、基質結合活性、受容体結合活性など）を低減する本発明のレナラーゼ阻害剤組成物および方法には抗体と抗体断片が包含される。本発明の抗体としては、たとえばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、細胞内抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、重鎖抗体（ラクダ科動物の抗体など）、合成抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの多様な形態の抗体が含まれる。一態様では、本発明の抗体はレナラーゼに特異的に結合する抗体である。一部の態様では、本発明の抗体は二重特異性抗体であり、ここで、第一の特異性はレナラーゼに対する特異性であり、第二の特異性は、細胞または組織に存在し前記二重特異性抗体を標的化分子が存在する解剖学的位置およびレナラーゼ結合が望まれる解剖学的位置へと導く標的化分子に対する特異性である。一部の態様では、本発明の抗体は二重特異性抗体であり、ここで、第一の特異性はレナラーゼに対する特異性であり、第二の特異性は、抗体の第二の特異性によって輸送されてレナラーゼ結合が望まれる解剖学的位置に配置される第二の結合パートナー分子（すなわち薬剤（ｐａｙｌｏａｄ））に対する特異性である。
【００８７】
一部の態様では、がんを処置するために対象に本発明のレナラーゼ阻害剤（たとえばレナラーゼ結合性分子）を投与することは、がんに対する個体の免疫系による免疫応答を開始かつ／または補足するのに役立つ。がんに対する個体の免疫応答は、自然免疫応答、液性免疫応答、細胞性免疫応答、またはそれらの組み合わせなどの任意の宿主防御または宿主応答であってよい。
【００８８】
また、当業者であれば本開示と本明細書に例示の方法を得れば認識できることであるが、レナラーゼ阻害剤組成物には、薬理学の技術分野で周知の基準（本明細書に詳細に記載され、かつ／または当技術分野で公知である、レナラーゼ阻害による生理学的成果など）により特定できるような、将来発見される阻害剤が包含される。したがって、本発明は、本明細書に例示または開示したいずれの特定のレナラーゼ阻害剤組成物にも全く限定されず、本発明は、有用であると当業者が理解するような当該技術分野で公知の阻害剤組成物および将来発見される阻害剤組成物を包含する。
【００８９】
レナラーゼ阻害剤組成物を特定し産生するさらなる方法は当業者に周知であり、天然供給源（たとえばストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、プセウドモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、スティロテラ・アウランティウム（Stylotella aurantium）など）から阻害剤を得ることが挙げられるが、これに限定されない。あるいは、レナラーゼ阻害剤を化学的に合成してもよい。また、当業者であれば本明細書の教示に基づいて認識できることであるが、レナラーゼ阻害剤組成物を組換え生物から得てもよい。レナラーゼ阻害剤を化学合成するため、また、天然供給源からレナラーゼ阻害剤を得るための組成物および方法は、当技術分野で周知であり、当技術分野で記述がみられる。
【００９０】
当業者には分かっていることであるが、阻害剤は、化合物、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、抗体、抗体断片、抗体模倣物、リボザイム、小分子化合物、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、ＲＮＡｉ、アンチセンス核酸分子（たとえばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）、アンチセンス核酸分子をコードする核酸、タンパク質をコードする核酸配列、レナラーゼ受容体、レナラーゼ受容体断片、またはそれらの組み合わせとして投与できる。タンパク質またはタンパク質をコードする核酸構築物を細胞または組織に投与するための周知のベクターや他の組成物および方法は多数ある。したがって、本発明は、レナラーゼ阻害剤であるタンパク質またはタンパク質をコードする核酸の投与方法を含む（Sambrookら、2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual（分子クローニング：実験の手引き）, Cold Spring Harbor Laboratory, New York; Ausubelら、1997, Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学の最新プロトコール）、John Wiley & Sons, New York）。
【００９１】
当業者には分かっていることであるが、レナラーゼの量または活性を増加する分子の量または活性を低減することは、レナラーゼの量または活性を低減するための本発明の組成物および方法に役立つことができる。
【００９２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはＲＮＡ分子の一部に相補的なＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。細胞内に存在する場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは既存のＲＮＡ分子にハイブリダイズして遺伝子産物への翻訳を阻害する。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子の発現を阻害することは当技術分野で周知であり（Marcus-Sekura, 1988, Anal. Biochem. 172:289）、細胞内でアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現させる方法も当技術分野で周知である（Ｉｎｏｕｅ、米国特許第５，１９０，９３１号明細書）。本発明の方法は、レナラーゼの量を低減するため、あるいはレナラーゼの量または活性を増加させる分子の量を低減することによってレナラーゼの量または活性を低減するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を包含する。
【００９３】
本発明では、当業者に周知の方法で合成し細胞に提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを考慮する。一例として、アンチセンスオリゴヌクレオチドは約１０〜約１００ヌクレオチド長になるよう合成でき、約１５〜約５０ヌクレオチド長がより好ましい。核酸分子の合成は、非修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドに比べて生物学的活性を改善する修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成（Ｔｕｌｌｉｓ、１９９１年、米国特許第５，０２３，２４３号明細書）のように当技術分野で周知である。
【００９４】
同様に、アンチセンス分子を遺伝子のプロモーターまたは他の制御配列にハイブリダイズして遺伝子の発現を阻害することによって遺伝子の転写に影響を与えてもよい。目的の遺伝子と相互作用するプロモーターまたは他の制御配列を特定する方法は当技術分野で周知であり、酵母二重ハイブリッド系などの方法が挙げられる（BartelおよびFields, eds., In: The Yeast Two Hybrid System（酵母二重ハイブリッド系）、Oxford University Press, Cary, N.C.）。
【００９５】
あるいは、レナラーゼを発現する遺伝子もしくはレナラーゼの量または活性を増加するタンパク質を発現する遺伝子の阻害は、リボザイムを用いて達成できる。遺伝子発現を阻害するためにリボザイムを使用することは当業者に周知である（たとえば、Cechら、1992, J. Biol. Chem. 267:17479；Hampelら、1989, Biochemistry 28: 4929；Altmanら、米国特許第５，１６８，０５３号明細書）。リボザイムは他の一本鎖ＲＮＡ分子を切断する能力を有する触媒性ＲＮＡ分子である。リボザイムは配列特異性を有することが知られ、したがって特定のヌクレオチド配列を認識するように改変し、特定のｍＲＮＡ分子を選択的に切断させることができる（Cech, 1988, J. Amer. Med. Assn. 260:3030）。分子のヌクレオチド配列があれば、当業者は本開示と本明細書に援用した参考文献を読めば過度の実験をしなくてもアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを合成できるであろう。
【００９６】
あるいは、レナラーゼを発現する遺伝子もしくはレナラーゼの量または活性を増加するタンパク質を発現する遺伝子の阻害は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉなどの低分子ヘアピン型ＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを用いて達成できる。分子のヌクレオチド配列があれば、当業者は本明細書に援用した開示と参考文献を読めば過度の実験をしなくても低分子ヘアピン型ＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを合成できるであろう。
【００９７】
当業者には分かっていることであるが、レナラーゼまたはレナラーゼ断片の阻害剤は、急性投与（たとえば１日、１週間、または１ヶ月などの短期間）してもよいし、慢性投与（たとえば数か月または１年以上などの長期間）してもよい。当業者には分かっていることであるが、レナラーゼの阻害剤は単独でも投与でき、他の薬剤と任意に組み合わせても投与できる。さらに、レナラーゼ阻害剤は、同時に投与しても互いに前後して投与してもよいという点で、時間的な意味で単独でも任意の組み合わせでも投与できる。当業者は本明細書の開示に基づき、レナラーゼ阻害剤組成物を用いて疾患または障害の治療または予防を必要とする個体の疾患または障害を治療または予防することができ、阻害剤組成物は単独使用しても別の阻害剤と任意に組み合わせて使用しても治療成果をもたらすことができることをよく理解している。
【００９８】
様々な態様では、本明細書に記載の本発明のレナラーゼ阻害剤またはレナラーゼ断片阻害剤はいずれも単独で投与してもよいし、他のがん関連分子に対する他の阻害剤と組み合わせて投与してもよい。
【００９９】
当業者であれば本明細書に詳述する方法を含む本開示を読めば分かることであるが、本発明は既に確立されている疾患または障害（がんなど）の処置に限定されるものではない。特に、疾患または障害は対象にとって有害な程度まで発症していなくてもよい。実際には、疾患または障害は処置を行う以前に対象で検出されなくてもよい。すなわち、本発明が利益をもたらす前に重大な疾患または障害が発生していなくてもよい。したがって、本発明は、本明細書中の他の箇所で既に説明したように、レナラーゼ阻害剤組成物を疾患または障害の発症前に対象に投与することによってその疾患または障害の発症を予防する方法を包含する。本明細書に記載の予防方法は、寛解期の個体に対する疾患または障害の再発予防のための処置も包含する。
【０１００】
当業者であれば本明細書の開示を得れば認識できることであるが、疾患または障害の予防には、レナラーゼ阻害剤組成物をその疾患または障害（がんなど）に対する予防手段として対象に投与することが包含される。本明細書中の他の箇所でさらに十分に説明するが、レナラーゼの量または活性を低減する方法には、レナラーゼ活性を低減するため、また、レナラーゼをコードする核酸の発現を低減する（転写の低減または翻訳の低減、あるいはその両方を含む）ための幅広い技術が包含される。
【０１０１】
また、本明細書中の他の箇所でも開示するとおり、当業者であれば本明細書の教示を得れば理解できることであるが、本発明は、レナラーゼの発現および／または活性の低減によって治療または予防をもたらす、多様な疾患、障害、または症状に対する予防方法を包含する。疾患がレナラーゼの量または活性に関連するかどうかを評価する方法は当技術分野で公知である。また、本発明は将来発見されるこのような疾患の治療または予防も包含する。
【０１０２】
本発明は、本発明の方法を実施するためのレナラーゼ阻害剤の投与を包含する。当業者であれば、本明細書の開示に基づき対象に適切なレナラーゼ阻害剤を製剤・投与する方法を理解できる。しかし、本発明は何らかの特定の投与方法または治療計画に限定されるものではない。
【０１０３】
本発明はレナラーゼに結合する組成物を提供する。一態様では、レナラーゼ結合剤はレナラーゼの量または活性を阻害する。したがって、レナラーゼ活性の低減が有益となるような疾患および状態では、このような阻害性をもつレナラーゼ結合剤が治療薬として有効に作用するであろう。
【０１０４】
一部の例では、レナラーゼは有効な治療的役割を有することに加え、疾患または障害の診断用マーカーとしても使用できる。疾患または障害の例としては、急性腎不全（すなわち腎臓の虚血性状態である急性尿細管壊死（ＡＴＮ））、心疾患、がんなどが挙げられるがこれらに限定されるものではない。腎臓が適切に機能しない患者はレナラーゼの値が低い。したがって、本発明は本発明のレナラーゼ結合剤によるレナラーゼの検出および／または定量に基づいて心血管、心臓、腎臓、胃腸、肝臓、肺、膵臓、精神、および神経に関連する状態、障害、および疾患（がんを含む）に対する感受性を診断する方法も包含する。レナラーゼの値（たとえばレナラーゼタンパク質の値）を決定することにより、たとえば心血管の状態、障害、および疾患（高血圧症、無症候性左室機能不全、慢性うっ血性心不全、心筋梗塞、心調律障害、アテローム動脈硬化症など）；精神の状態、障害、および疾患（うつ状態、不安など）；心臓の状態、障害、および疾患（肺高血圧症など）をすべて診断、評価、監視することができる。たとえば、レナラーゼタンパク質の値の減少は交感神経による産生量の増加に関連する障害の診断マーカーとなる。本発明の組成物および方法は、収縮期高血圧症、孤立性収縮期高血圧症、糖尿病性高血圧症などの高血圧症を治療、予防、軽減、または改善するために使用できる。より珍しい高血圧性障害である肺高血圧症や膵炎についても同様の利点が期待される。肺高血圧症は肺動脈（心臓から肺に至る血管）の血圧が正常値を超える珍しい肺血管障害であり、致命的になる場合がある。糖尿病性高血圧と孤立性収縮期高血圧症では肺血管床（pulmonary bed）の血圧上昇と全身の血圧上昇の発症が似ていることから、同様の機構が関与していると示唆される。
【０１０５】
レナラーゼの量または活性（たとえば酵素活性、基質結合活性、受容体結合活性など）を低減する本発明のレナラーゼ阻害剤組成物は、化合物、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、抗体、抗体断片、抗体模倣物、リボザイム、小分子化合物、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、ＲＮＡｉ、アンチセンス核酸分子（たとえばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）、アンチセンス核酸分子をコードする核酸、タンパク質をコードする核酸配列、レナラーゼ受容体、レナラーゼ受容体断片、またはそれらの組み合わせを包含するが、これらに限定されると解釈すべきではない。一部の態様では、阻害剤はアロステリック阻害剤である。当業者であれば本明細書の開示に基づき容易に理解できることであるが、レナラーゼ阻害剤組成物にはレナラーゼの量または活性を低減する化合物が包含される。また、化学分野の当業者はレナラーゼ阻害剤組成物としては化学修飾を施した化合物および誘導体が包含されることをよく理解している。
【０１０６】
レナラーゼの量または活性（たとえば酵素活性、基質結合活性、受容体結合活性など）を低減する本発明のレナラーゼ阻害剤組成物には抗体と抗体断片が包含される。本発明の抗体としては、たとえばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、細胞内抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、重鎖抗体（ラクダ科動物の抗体など）、合成抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの多様な形態の抗体が含まれる。一態様では、本発明の抗体はレナラーゼに特異的に結合する抗体である。一部の態様では、本発明の抗体は二重特異性抗体であり、ここで、第一の特異性はレナラーゼに対する特異性であり、第二の特異性は、前記二重特異性抗体をレナラーゼ結合が望まれる解剖学的位置へと導く標的化分子に対する特異性である。一部の態様では、本発明の抗体は二重特異性抗体であり、ここで、第一の特異性はレナラーゼに対する特異性であり、第二の特異性は、レナラーゼ結合が望まれる解剖学的位置へ輸送かつ配置される第二の結合パートナー分子に対する特異性である。
【０１０７】
本発明の抗体（抗体のレナラーゼ結合性断片を含む）は、特定の態様では、任意の適切なポリヌクレオチドによってコードされる本明細書に開示の抗体アミノ酸配列、または任意の単離抗体または製剤抗体を包含する。また、本開示の抗体は、本明細書に記載の抗レナラーゼ抗体の構造的特徴および／または機能的特徴を有する抗体を包含する。一態様では、抗レナラーゼ抗体はレナラーゼに結合することにより、レナラーゼの少なくとも１つの生物学的活性（たとえば酵素活性、基質結合活性、受容体結合活性など）を部分的または実質的に変化させる。一部の態様では、レナラーゼはヒトのレナラーゼである。
【０１０８】
一態様では、本発明の抗レナラーゼ抗体は、レナラーゼタンパク質、そのペプチド、構成亜単位（ｓｕｂｕｎｉｔ）、断片、部分、またはそれらの任意の組み合わせに特異的な少なくとも１つの特定のエピトープに免疫特異的に結合するが、他のポリペプチド（他の種に由来するレナラーゼを除く）には特異的に結合しない。この少なくとも１つのエピトープは、レナラーゼタンパク質の少なくとも１つの部分を含む少なくとも１つの抗体結合領域を含んでよい。本明細書で用いる場合、「エピトープ」という用語は抗体に結合できるタンパク質決定基を指す。エピトープは通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基で構成され、通常、特異的な三次元構造特性と特異的な電荷特性を有する。立体構造エピトープと非立体構造エピトープは、変性溶媒の存在下では前者に対する結合は失われるが後者に対する結合は失われないことによって区別される。
【０１０９】
一部の態様では、本発明はレナラーゼに特異的に結合する抗体（たとえば抗体の結合性部分）を含有する組成物を包含する。一態様では抗レナラーゼ抗体はポリクローナル抗体である。別の態様では抗レナラーゼ抗体はモノクローナル抗体である。一部の態様では抗レナラーゼ抗体はキメラ抗体である。さらなる態様では抗レナラーゼ抗体はヒト化抗体である。一部の態様ではレナラーゼはヒトのレナラーゼである。一部の態様では、本発明の抗体は、配列番号１〜７、８、５０、９２、９４、およびその断片のうちの少なくとも１つに特異的に結合する。
【０１１０】
抗体の結合性部分は、結合パートナー分子（たとえばレナラーゼ）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を含む。抗体の結合機能は全長抗体の断片によって達成できることがわかっている。抗体の「結合性部分」という用語に包含される結合性断片の例としては、以下が挙げられる：（ｉ）Ｆａｂ断片（ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインで構成される一価の断片）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（２個のＦａｂ断片がヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結している二価の断片）；（ｉｉｉ）Ｆｄ断片（ＶＨドメインとＣＨ１ドメインで構成される）；（ｉｖ）Ｆｖ断片（抗体の１つのアームのＶＬドメインとＶＨドメインで構成される）；（ｖ）ｄＡｂ断片（Wardら、(1989) Nature 341:544-546）（ＶＨドメインで構成される）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）。Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬとＶＨは別々の遺伝子にコードされるが、これらをＶＬ領域とＶＨ領域とが対をなし一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖にすることができる合成リンカーで組換え方法によって連結することができる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；たとえばBirdら、(1988) Science 242:423-426；およびHustonら(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照のこと）。このような単鎖抗体も抗体の「結合性部分」という用語に包含されるものとする。これらの抗体断片を当業者に公知の従来技術によって作製し、完全型抗体と同じ方法で有用性について選別する。結合性部分は、組換えＤＮＡ技術、あるいは完全型免疫グロブリンの酵素切断または化学切断によって作製できる。
【０１１１】
本発明のレナラーゼ結合性抗体は、少なくとも１つのレナラーゼ活性（たとえば、酵素活性、基質結合活性、受容体結合活性など）を生体外および／または生体内原位置、および／または生体内で阻害、阻止、または干渉する抗体である。必要に応じて、適切な抗レナラーゼ抗体、特定の部分、または多様体もレナラーゼの少なくとも１つの活性または機能に影響を与えることができる。レナラーゼの活性または機能としては、ＲＮＡ合成、ＤＮＡ合成、タンパク質合成、タンパク質放出、レナラーゼシグナル伝達、レナラーゼ切断、レナラーゼ活性、レナラーゼ受容体結合、レナラーゼ産生、および／またはレナラーゼ合成などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１１２】
一態様では、本発明の抗体はレナラーゼに特異的に結合する。一態様では、抗体はレナラーゼ−１に特異的に結合する。別の態様では、抗体はレナラーゼ−２に特異的に結合する。さらに別の態様では、抗体はレナラーゼ−１とレナラーゼ−２の両方に特異的に結合する。さらに、エピトープに特異的な抗体を生成した。本発明の好ましい抗体としては、モノクローナル抗体１Ｃ−２２−１、１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ−４２−７、および３Ａ−５−２が挙げられる。二重特異性抗体（たとえば、レナラーゼ−１とレナラーゼ−２を認識する抗体）の例としては、抗体１Ｃ−２２−１、１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、および表１に記載のポリクローナル抗体が挙げられる。型特異性のレナラーゼ抗体の例としては、レナラーゼ−１に特異的な１Ｆ−２６−１、１Ｆ−４２−７が挙げられる。３Ａ−５−２はレナラーゼ−２に特異的である。抗レナラーゼモノクローナル抗体をコードする配列を図５に示す。
【０１１３】
モノクローナル抗体１Ｄ−２８−４の重鎖コード配列の核酸配列（配列番号５２）とアミノ酸配列（配列番号９）、軽鎖コード配列の核酸配列（配列番号５３）とアミノ酸配列（配列番号１０）を図５に示す。
【０１１４】
モノクローナル抗体１Ｄ−３７−１０の重鎖コード配列の核酸配列（配列番号６０）とアミノ酸配列（配列番号１７）、軽鎖コード配列の核酸配列（配列番号６１）とアミノ酸配列（配列番号１８）を図５に示す。
【０１１５】
モノクローナル抗体１Ｆ−２６−１の重鎖コード配列の核酸配列（配列番号６８）とアミノ酸配列（配列番号２５）、軽鎖コード配列の核酸配列（配列番号６９）とアミノ酸配列（配列番号２６）を図５に示す。
【０１１６】
モノクローナル抗体１Ｆ−４２−７の重鎖コード配列の核酸配列（配列番号７６）とアミノ酸配列（配列番号３３）、軽鎖コード配列の核酸配列（配列番号７７）とアミノ酸配列（配列番号３４）を図５に示す。
【０１１７】
モノクローナル抗体３Ａ−５−２の重鎖コード配列の核酸配列（配列番号８４）とアミノ酸配列（配列番号４１）、軽鎖コード配列の核酸配列（配列番号８５）とアミノ酸配列（配列番号４２）を図５に示す。
【０１１８】
各配列の下線を施した配列は、重鎖と軽鎖それぞれのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列を含む。
【０１１９】
特定のモノクローナル抗体はレナラーゼタンパク質に結合できることから、ＶＨ配列およびＶＬ配列を「適切に組み合わせ」て本開示の別の抗レナラーゼ結合性分子を作製してもよい。このような「適切に組み合わせた」抗体のレナラーゼ結合は、上述しかつ実施例にも記載する結合試験法（たとえば免疫ブロット、Ｂｉａ−Ｃｏｒｅ（登録商標）など）により試験できる。ＶＨ鎖とＶＬ鎖を適切に組み合わせるときは特定のＶＨ／ＶＬ対のうちＶＨ配列を構造の似たＶＨ配列で置き換えるのが好ましい。同様に、特定のＶＨ／ＶＬ対のうちＶＬ配列を構造の似たＶＬ配列で置き換えるのが好ましい。
【０１２０】
したがって、一側面では、本開示は（ａ）配列番号９、１７、２５、３３、および４１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と（ｂ）配列番号１０、１８、２６、３４、および４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、レナラーゼタンパク質に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその結合性部分を提供する。
【０１２１】
重鎖と軽鎖の好ましい組み合わせとしては、以下が挙げられる：（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ｄ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；および（ｅ）配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【０１２２】
別の側面では、本開示は、１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ−４２−７、または３Ａ−５−２の重鎖と軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、あるいはその組み合わせを含む抗体を提供する。１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ−４２−７、および３Ａ−５−２のＶＨのＣＤＲ１のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１１、１９、２７、３５、４３に示す配列を含む。１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ−４２−７、および３Ａ−５−２のＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１２、２０、２８、３６、４４に示す配列を含む。１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ−４２−７、および３Ａ−５−２のＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１３、２１、２９、３７、４５に示す配列を含む。１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ−４２−７、および３Ａ−５−２のＶκのＣＤＲ１のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１４、２２、３０、３８、４６に示す配列を含む。１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ−４２−７、および３Ａ−５−２のＶκのＣＤＲ２のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１５、２３、３１、３９、４７に示す配列を含む。１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ−４２−７、および３Ａ−５−２のＶκのＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１６、２４、３２、４０、４８に示す配列を含む。これらのＣＤＲ領域を、Ｋａｂａｔシステム（Kabat, E. A.ら(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition（免疫学的に有益なタンパク質の配列（第５版））, U.S. Department of Health and Human Services（米国保健福祉省）, NIH Publication No. 91-3242）を用いて記載する。
【０１２３】
これらの抗体のそれぞれがレナラーゼファミリーメンバーに結合できることや、結合特異性は主にＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域によってもたらされることを考えれば、ＶＨのＣＤＲｌ配列、ＣＤＲ２配列、ＣＤＲ３配列とＶＬのＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、ＣＤＲ３配列を「適切に組み合わせる」（すなわち、各抗体はＶＨのＣＤＲｌ、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３とＶＬのＣＤＲｌ、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含まなければならないが、異なる抗体のＣＤＲを適切に組み合わせることができる）ことによって本開示の別の抗レナラーゼ結合分子を作製できる。このような「適切に組み合わせた」抗体のレナラーゼ結合は、上述し実施例に記載する結合試験法（たとえば免疫ブロット、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）分析など）で試験できる。ＶＨのＣＤＲ配列を適切に組み合わせるときは、特定のＶＨ配列のに由来するＣＤＲｌ配列、ＣＤＲ２配列および／またはＣＤＲ３配列を構造の似たＣＤＲ配列で置き換えるのが好ましい。同様に、ＶＬのＣＤＲ配列を適切に組み合わせるときは、特定のＶＬ配列に由来するＣＤＲｌ配列、ＣＤＲ２配列および／またはＣＤＲ３配列を構造の似たＣＤＲ配列で置き換えるのが好ましい。当業者にはすぐに分かることであるが、ＶＨおよび／またはＶＬの１つ以上のＣＤＲ領域配列を、本明細書に開示したモノクローナル抗体１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ−４２−７、または３Ａ−５−２のＣＤＲ配列に由来する似た構造の配列で置き換えることにより、新規なＶＨ配列およびＶＬ配列を作製できる。
【０１２４】
したがって、別の側面では、本発明は、以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含む、レナラーゼに特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその結合性部分を提供する：（ａ）配列番号１１、１９、２７、３５、および４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号１２、２０、２８、３６、および４４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号１３、２１、２９、３７、および４５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号１４、２２、３０、３８、および４６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１５、２３、３１、３９、および４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；ならびに（ｆ）配列番号１６、２４、３２、４０、および４８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３。
【０１２５】
別の態様では、抗体は（ａ）配列番号１１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号１２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号１３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号１４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号１６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３から選択されるＣＤＲのうち少なくとも１つの配列を含む。
【０１２６】
別の態様では、抗体は（ａ）配列番号１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号２０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号２１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号２２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号２３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号２４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３から選択されるＣＤＲのうち少なくとも１つの配列を含む。
【０１２７】
別の態様では、抗体は（ａ）配列番号２７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号２８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号２９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号３０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号３１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号３２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３から選択されるＣＤＲのうち少なくとも１つの配列を含む。
【０１２８】
別の態様では、抗体は（ａ）配列番号３５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号３６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号３７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号３８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号３９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号４０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３から選択されるＣＤＲのうち少なくとも１つの配列を含む。
【０１２９】
別の態様では、抗体は（ａ）配列番号４３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号４４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号４５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号４６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号４７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号４８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３から選択されるＣＤＲのうち少なくとも１つの配列を含む。
【０１３０】
上記の単離抗レナラーゼ抗体のＣＤＲ配列は、本発明に従って単離され、かつ列挙したＣＤＲ配列を有するポリペプチドを含む新規なレナラーゼ結合タンパク質のファミリーを確立する。レナラーゼ結合活性および／またはレナラーゼ検出活性および／またはレナラーゼ中和活性を有する本発明のＣＤＲを生成し選択するには、本発明の結合性タンパク質を生成するため、また、それらの結合性タンパク質のレナラーゼ結合特性および／またはレナラーゼ検出特性および／またはレナラーゼ中和特性を評価するための当技術分野で公知の標準の方法（本明細書に具体的に記載した方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない）を用いることができる。
【０１３１】
本発明のレナラーゼ結合性分子（たとえば抗体など）は、たとえば当技術分野で公知の生体内外での試験法のいずれかで試験した場合に、塩の混合物、化合物、および他のポリペプチドに含まれるレナラーゼに対して高い検出能力と結合能力を示すことが好ましい。当業者には分かることであるが、疾患の診断方法、治療方法、予防方法に有用な本明細書に記載のレナラーゼ結合性分子（たとえば抗体など）は、以下を含む（ただし、これらに限定されるものではない）本発明の手順と方法でも有用である：免疫クロマトグラフィー試験、免疫ドット試験、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）試験、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）試験、タンパク質マイクロアレイ試験、ウェスタンブロット試験、質量分光光度測定試験、放射免疫測定試験（ＲＩＡ）、放射免疫拡散試験、液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法、オークタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）免疫拡散試験、逆相タンパク質マイクロアレイ、ロケット免疫電気泳動試験、免疫組織染色試験、免疫沈降試験、補体結合試験、ＦＡＣＳ、タンパク質チップ試験、分離・精製処理、および親和性クロマトグラフィー（以下も参照のこと：2007, Van Emon, Immunoassay and Other Bioanalytical Techniques（免疫検定法および他の生化学分析技術）, CRC Press; 2005, Wild, Immunoassay Handbook（免疫検定法ハンドブック）, Gulf Professional Publishing; 1996, Diamandis and Christopoulos, Immunoassay（免疫検定法）, Academic Press; 2005, Joos, Microarrays in Clinical Diagnosis（臨床診断におけるマイクロアレイ）, Humana Press; 2005, Hamdan and Righetti, Proteomics Today（今日のプロテオミクス）, John Wiley and Sons; 2007）。
【０１３２】
本発明のレナラーゼ結合性分子（たとえば抗体など）は、当技術分野で公知の生体内外の試験法のいずれかで評価したときにレナラーゼ活性（たとえば、酵素活性、基質結合活性、受容体結合活性など）を低減または中和する高い能力を示すことがより好ましい。たとえば、これらのレナラーゼ結合性分子（たとえば抗体など）は、レナラーゼが関連または媒介する疾患または障害を中和する。本発明のレナラーゼ結合性分子（たとえば抗体など）はまた、レナラーゼ活性を低減または中和する高い能力を示すことが好ましい。一部の態様では、レナラーゼはヒトのレナラーゼである。
【０１３３】
本明細書で用いる場合、「レナラーゼタンパク質に特異的に結合する」レナラーゼ結合性分子（たとえば抗体など）は、任意の動物のレナラーゼタンパク質に結合するレナラーゼ結合性分子（たとえば抗体など）を指すものとする。一部の態様では、そのような抗体はヒトのレナラーゼに結合する。レナラーゼ結合性分子（たとえば抗体など）は、１×１０-6Ｍ以下のＫＤでレナラーゼタンパク質に結合することが好ましく、ＫＤは１×１０-7Ｍ以下であることがより好ましく、１×１０-8Ｍ以下であることがより好ましく、５×１０-9Ｍ以下であることがより好ましく、１×１０-9Ｍ以下であることがより好ましく、あるいは３×１０-10Ｍ以下であることがさらに好ましい。本明細書で用いる場合、タンパク質または細胞に「実質的に結合しない」という用語は、そのタンパク質または細胞に結合しないか、高親和性では結合しない、すなわち１×１０6Ｍ超（１×１０5Ｍ以上であることがより好ましく、１×１０4Ｍ以上であることがより好ましく、１×１０3Ｍ以上であることがより好ましく、１×１０2Ｍ以上であることがさらに好ましい）のＫＤで結合することを指す。本明細書で用いる場合、「ＫＤ」という用語は、ＫｄのＫａに対する比（すなわちＫｄ／Ｋａ）から求められモル濃度（Ｍ）として表される解離定数を指すものとする。レナラーゼ結合性分子（たとえば抗体など）のＫＤ値は当技術分野で十分に確立された方法で求めることができる。結合性分子（たとえば抗体など）のＫＤ値を求めるための好ましい方法は表面プラズモン共鳴を用いる方法であり、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを用いる方法が好ましい。
【０１３４】
本明細書で用いる場合、ＩｇＧ抗体に関する「高親和性」という用語は、抗体の標的結合パートナー分子に対するＫＤ値が１×１０-7Ｍ以下であることを指し、ＫＤ値は５×１０-8Ｍ以下であることがより好ましく、１×１０-8Ｍ以下であることがさらに好ましく、５×１０-9Ｍ以下であることがさらに好ましく、１×１０-9Ｍ以下であることがさらに好ましい。しかし、「高親和性」結合は、別の抗体アイソタイプに対しては異なってもよい。たとえば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高親和性」結合は、抗体が１０-6Ｍ以下のＫＤ値を有することを指し、ＫＤ値は１０-7Ｍ以下であることがより好ましく、１０-8Ｍ以下であることがさらに好ましい。
【０１３５】
特定の態様では、抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはＩｇＤの定常領域などの重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域はＩｇＧ１の重鎖定常領域またはＩｇＧ４の重鎖定常領域であることが好ましい。抗体はκ軽鎖定常領域またはλ軽鎖定常領域のいずれかの軽鎖定常領域を含んでよいが、κ軽鎖定常領域を含むことが好ましい。あるいは、抗体部分はたとえばＦａｂ断片または単鎖Ｆｖ断片であってもよい。
（抗レナラーゼ抗体の生成）
【０１３６】
本発明はレナラーゼに結合する組成物を提供する。本明細書に開示するレナラーゼ分子は、本明細書に開示する他のポリペプチドと有意なかつ／または高い配列同一性を有する分子を含む分子群である。より具体的には、推定上のレナラーゼは配列番号４９または５１の配列を有する核酸と少なくとも約４０％の配列同一性を有する。レナラーゼをコードする核酸は、本明細書に開示する配列番号４９または５１の配列と少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８%、または少なくとも約９９％の配列同一性を有することがより好ましい。上記の核酸は配列番号４９、５１、９３、または９５を有することがより好ましい。「レナラーゼ」という用語はレナラーゼのイソ型を包含する。レナラーゼ遺伝子はヒトゲノムの１０番染色体に３１０１８８ｂｐに及ぶ９個のエキソンを有する。本明細書に開示するレナラーゼクローン（配列番号４９、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＢＣ００５３６４）はエキソン１、エキソン２、エキソン３、エキソン４、エキソン５、エキソン６、エキソン８を含む遺伝子である。ヒトゲノムのデータベースに示されるように、さらに少なくとも２種類、選択的スプライシングにより得られる型のレナラーゼタンパク質が存在する。その１つはヒトゲノムのデータベースにあるクローンで同定されたエキソン１、エキソン２、エキソン３、エキソン４、エキソン５、エキソン６、エキソン９を含む（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＫ００２０８０およびＮＭＪ）１８３６３；これらの配列は参照により明示的に本明細書に組み込まれる）。選択スプライシングにより得られるもう一方の型はヒトゲノムデータベースにあるクローンで同定されたエキソン５、エキソン６、エキソン７、エキソン８を含む（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＸ６４８１５４；この配列は参照により明示的に本明細書に組み込まれる）。特に示さない限り、「レナラーゼ」は本明細書に開示するレナラーゼの特性および／または物理的特徴を有する既知のレナラーゼ（たとえばラットのレナラーゼ、ヒトのレナラーゼ）および未発見のレナラーゼすべてを包含し、たとえばヒトのレナラーゼおよびチンパンジーのレナラーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１３７】
また、推定上のレナラーゼは、配列番号８または５０の配列を有するポリペプチドと少なくとも約６０％の配列同一性を有する。レナラーゼは、本明細書に開示する配列番号８または５０と少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％の同一性、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有することがより好ましい。レナラーゼポリペプチドは、配列番号８または５０あるいは配列番号９２または９４のアミノ酸配列を有することがさらに好ましい。
【０１３８】
一態様では、本発明の抗体は、レナラーゼの配列に由来するペプチドを用いて動物を免疫することにより、その動物が免疫原に対する抗体を産生することで生成できる。例示の免疫原としてはレナラーゼ由来のペプチドが挙げられる。すなわち、本発明ではレナラーゼ配列の断片を有するペプチドを使用できる。ペプチドは、組換えペプチドとして発現させる、より大きなポリペプチドとして発現させて酵素切断または化学切断するなど、様々な方法で作製できる。あるいは、当技術分野で公知のとおり合成によって作製してもよい。本発明の親和性試薬の生成に用いる好ましいペプチドを表１（配列番号１〜７）に示す。
【０１３９】
本発明の抗レナラーゼ抗体は、KohlerおよびMilstein、(1975)Nature 256:495の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション法（ハイブリドーマ法）などの様々な方法で任意に作製できる。ハイブリドーマ法では、マウスまたはその他の適切な宿主動物（ハムスターまたはマカクザルなど）を本明細書に記載の方法で免疫化することにより、免疫化に用いたタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する、または産生できるリンパ球を誘導する。あるいは、生体外でリンパ球を免疫化してもよい。次にこのリンパ球をポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成させる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice（モノクローナル抗体：原理と実践）、pp.59-103 (Academic Press, 1986)）。
【０１４０】
ハイブリドーマ技術で特異的抗体を作製し選別する方法は通常の手順であり当技術分野で周知である。一態様では、本発明はモノクローナル抗体を生成する方法と、この方法で作製した抗体を提供する。この方法は、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマを培養することと；次いでこの融合で得たハイブリドーマを選別して本発明のポリペプチドに結合できる抗体を分泌するハイブリドーマのクローンを得ることを含み、ここで、ハイブリドーマは本発明のポリペプチドまたはペプチドで免疫化したマウスもしくはウサギまたは他の種から単離した脾細胞を骨髄腫細胞と融合することによって生成されることが好ましい。要するに、マウスをレナラーゼポリペプチドまたはそのペプチドで免疫化できる。好ましい態様では、レナラーゼポリペプチドまたはそのペプチドを免疫賦活剤と共に投与して免疫応答を刺激する。このような免疫賦活剤としては、完全フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ）免疫賦活剤または不完全フロイント免疫賦活剤、ＲＩＢＩ（商標）（ムラミルジペプチド）またはＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）が挙げられる。このような免疫賦活剤は、局所沈着物中でポリペプチドを捕捉してそのポリペプチドの急速な分散を予防できるか、宿主を刺激してマクロファージ走化因子および他の免疫系成分に対する走化因子を分泌させる物質を含むことができる。ポリペプチドを投与する場合、ポリペプチドは数週間かかって拡散するため、２回以上の投与を免疫化の計画に含むことが望ましい。
【０１４１】
あるいは、ウサギをレナラーゼポリペプチドまたはそのペプチドで免疫化してもよい。この態様では、全長レナラーゼタンパク質とレナラーゼ由来ペプチドのいずれも免疫原として使用できる。
【０１４２】
本発明で用いるレナラーゼは様々な形態を取ることができる。たとえば精製レナラーゼタンパク質またはその断片、組換えにより得られたレナラーゼまたはその断片を挙げることができる。一部の態様ではレナラーゼはヒトのレナラーゼである。組換えレナラーゼを用いる場合、当技術分野で公知のとおり、真核細胞または原核細胞でこれを産生できる。別の免疫原としてはレナラーゼ由来のペプチドが挙げられる。すなわち、本発明ではレナラーゼ配列の断片を有するペプチドを使用できる。ペプチドは、組換えペプチドとして発現させる、より大きなポリペプチドとして発現させて酵素切断または化学切断するなど、様々な方法で作製できる。あるいは、当技術分野で公知のとおり合成によって作製してもよい。本発明の親和性試薬の生成に用いる好ましいペプチドを表１（配列番号１〜７）に示す。ヒトレナラーゼの全長アミノ酸配列を配列番号８に記載する。そこに示すとおり既知の多型が起こる可能性がある（配列番号９２と比較のこと）。レナラーゼ−２のアミノ酸配列を配列番号５０に示す。同じく、そこに示すとおり既知の多型が起こる可能性がある（配列番号９４と比較のこと）。他にも多型が存在することがわかっており、それらもレナラーゼの定義に含む。一部の態様では、本発明のレナラーゼ結合性分子は配列番号１〜７、８、５０、９２、９４およびその断片のうち、少なくとも１つに特異的に結合する。
【０１４３】
本明細書に記載し、また当技術分野でも公知のとおり、必要に応じて、様々なヒト抗体の産生能をもつ遺伝子導入動物（たとえばマウス、ラット、ハムスター、ヒト以外の霊長類など）を免疫化することによって抗レナラーゼ抗体を生成してもよい。本明細書に記載の方法などの適切な方法でこのような動物からヒト抗レナラーゼ抗体を産生する細胞を単離し、不死化することができる。あるいは、本明細書に教示する方法および当技術分野で公知の方法で、抗体コード配列をクローニングし、適切なベクターに導入し、これを用いて宿主細胞を形質移入して抗体を発現させ、単離してもよい。
【０１４４】
生殖系列構造にヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）座を有する遺伝子導入マウスを用いて、ヒト自己抗原（正常なヒト免疫系はこの抗原に対し耐性をもつ）を含む様々な標的に対する高親和性の完全型ヒトモノクローナル抗体を単離できる（Lonberg, N.ら、米国特許第５，５６９，８２５号明細書、米国特許第６，３００，１２９号、および1994, Nature 368:856-9；Green, L.ら、1994, Nature Genet. 7:13-21；Green, L. & Jakobovits, 1998, Exp. Med. 188:483-95；Lonberg, N.およびHuszar, D., 1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93；Kucherlapatiら、米国特許第６，７１３，６１０号明細書；Bruggemann, M.ら、1991, Eur. J. Immunol. 21:1323-1326；Fishwild, D.ら、1996, Nat. Biotechnol. 14:845-851；Mendez, M.ら、1997, Nat. Genet. 15:146-156；Green, L., 1999, J. Immunol. Methods 231:11-23；Yang, X.ら、1999, Cancer Res. 59:1236-1243；Bruggemann, M.およびTaussig, M J., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-458, 1997；Tomizukaら、国際公開第０２／０４３４７８号パンフレット）。上記のマウスに内在する免疫グロブリン座を破壊するか欠失させ、この動物による内因性遺伝子がコードする抗体の産生能を消失させることができる。また、Abgenix,Inc.(Freemont,Calif.)やMedarex(San Jose, Calif.)などの企業が関与して、本明細書で他の箇所に記載した技術を利用し、選択した標的結合性パートナー分子（たとえば抗原など）に対するヒト抗体を提供してもよい。
【０１４５】
別の態様ではヒト抗体をファージライブラリーから選択する。ここで、このファージはヒト免疫グロブリン遺伝子を含み、ライブラリーはヒト抗体の結合ドメインをたとえば単鎖抗体（ｓｃＦｖ）として、Ｆａｂとして、あるいは対合した抗体可変領域または対合していない抗体可変領域を提示する他の何らかの構築物として発現する（Vaughan et lo al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996): Sheetsら、PITAS (USA) 95:6157-6162 (1998))；Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marksら、J. Mol. Biol., 222:581 (1991)）。本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーを選別するためのファージ提示法でも作製できる。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージ提示法は当技術分野で確立されている。たとえば以下を参照のこと：米国特許第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、および第５，５７１，６９８号明細書（以上Ｌａｄｎｅｒら）；米国特許第５，４２７，９０８号および第５，５８０，７１７号明細書（以上Ｄｏｗｅｒら）；米国特許第５，９６９，１０８号および第６，１７２，１９７号明細書（以上ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら）；ならびに米国特許第５，８８５，７９３号、第６，５２１，４０４号、第６，５４４，７３１号、第６，５５５，３１３号、第６，５８２，９１５号、および第６，５９３，０８１号明細書（以上Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら）。
【０１４６】
免疫原性抗原の調製とモノクローナル抗体の作製は、組換えタンパク質産生などの任意の適切な技術を用いて行うことができる。このような免疫原性抗原を精製タンパク質；または全細胞、細胞抽出物、もしくは組織抽出物を含むタンパク質混合物の形で動物に投与することもできるし、この抗原またはその一部分をコードする核酸を基に動物の体内で新たに形成することもできる。
【０１４７】
本発明の単離核酸は、当技術分野で周知のように、（ａ）組換え法、（ｂ）合成技術、（ｃ）精製技術、またはそれらの組み合わせによって作製できる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは当技術分野で公知の方法（たとえば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブの利用など）で容易に単離・配列決定される。ハイブリドーマを作製する場合、上記の細胞はこのようなＤＮＡの供給源として機能することができる。あるいは、コード配列と翻訳産物を連結する提示技術（ファージ提示ライブラリーまたはリボソーム提示ライブラリーなど）を用いることで結合剤および核酸の選択が単純になる。ファージ選択の後、ファージから抗体コード領域を単離し、これを用いてヒト抗体などの完全抗体または他の任意の所望の結合性断片を生成し、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌などの任意の所望の宿主で発現させることができる。
（ヒト化抗体）
【０１４８】
本発明はさらに、ヒトレナラーゼに結合するヒト化免疫グロブリン（すなわち抗体）を提供する。ヒト化形態の免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリン（アクセプター免疫グロブリンという）に実質的に由来する可変フレームワーク領域と、レナラーゼに特異的に結合する非ヒトｍＡｂに実質的に由来するＣＤＲとを有する。定常領域（存在する場合）は実質的にヒト免疫グロブリン由来である。このヒト化抗体はレナラーゼに対し少なくとも約１０-6Ｍ（１μＭ）、約１０-7Ｍ（１００ｎＭ）、またはそれ以下のＫD値を示す。ヒト化抗体の結合親和性は、そのヒト化抗体が由来するマウス抗体の結合親和性より高くても低くてもよい。ヒト化抗体のレナラーゼに対する親和性の変化に影響を及ぼす（すなわち親和性を改善する）ため、ＣＤＲ残基またはヒト残基に置換を施してもよい。
【０１４９】
レナラーゼに結合するヒト化抗体を作製するための原料はマウス抗体１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ４２−７、または３Ａ−５−２が好ましい。これらのマウス抗体の生成、単離、特性決定については本明細書の実施例に記載する。しかし、レナラーゼとの結合についてマウス抗体１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ４２−７、または３Ａ−５−２と競合する他のマウス抗体も使用できる。配列表に示す同定されたＣＤＲを出発点としてヒト化加工を行ってよい。たとえば、以下のアミノ酸配列（およびそれに対応する核酸配列）のいずれか１つ以上を出発点としてヒト化加工を行ってよい：（ａ）配列番号１１、１９、２７、３５、および４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１：（ｂ）配列番号１２、２０、２８、３６、および４４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号１３、２１、２９、３７、および４５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号１４、２２、３０、３８、および４６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１５、２３、３１、３９、および４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｆ）配列番号１６、２４、３２、４０、および４８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３。
【０１５０】
マウスのＣＤＲをヒトの可変ドメインフレームワークに置き換えても、ヒトの可変ドメインフレームワークがＣＤＲの由来するマウスの可変フレームワークと同じか似た立体配座をとれば、マウスのＣＤＲの適切な空間的配位は保持される可能性が非常に高い。これは、フレームワーク配列がＣＤＲの由来するマウスの可変フレームワークドメインと高い配列同一性を示すヒト抗体からヒト可変ドメインを得ることで達成される。重鎖および軽鎖の可変フレームワーク領域は、同じヒト抗体配列に由来しても異なるヒト抗体配列に由来してもよい。ヒト抗体配列は、天然に存在するヒト抗体の配列であってもよく、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来してもよく、一部のヒト抗体および／またはヒト生殖系列配列に共通の配列であってもよい。
【０１５１】
マウスの可変領域のアミノ酸配列を既知のヒト抗体の配列とコンピューターで比較することによって適切なヒト抗体配列を同定する。比較は重鎖の場合と軽鎖の場合を別に行うが、原理はそれぞれ同様である。
【０１５２】
一例では、抗レナラーゼｍＡｂのアミノ酸配列を用いて、公共の抗体配列データベースから収集したヒト抗体データベースを照会する。重鎖可変領域を用いて最も配列同一性の高いヒト可変領域を見つけることができる。軽鎖可変領域も同様に最も配列同一性の高いヒト可変領域を見つけるのに用いることができる。選択したヒト重鎖可変領域配列にマウスｍＡｂドナー由来の重鎖可変領域の１つのＣＤＲをコードする領域を導入してヒトの可変領域のＣＤＲを置き換えたＤＮＡ構築物を、マウスの各可変領域について作製した。
【０１５３】
マウスのＣＤＲ領域を無理にヒト可変フレームワーク領域と並列させると立体配座に無理な制限が起こる可能性があり、特定のアミノ酸残基を置換することでこれを修正しない限り、結合親和性が失われる。上記のとおり、本発明のヒト化抗体は、実質的にヒト免疫グロブリンに由来する可変フレームワーク領域と実質的にマウス免疫グロブリンに由来するＣＤＲとを含む。マウス抗体および適切なヒトアクセプター免疫グロブリン配列のＣＤＲを特定し終えると、次の工程は、得られるヒト抗体の特性を最適化するためにこれらの成分のどの残基を置換するか（置換する場合）を決定することである。一般に、ヒトのアミノ酸残基をマウスのもので置換するのは最少にすべきである、というのもマウスの残基を導入すると抗体がヒトにヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を誘発するリスクが増加するためである。アミノ酸がＣＤＲの立体配座および／または標的結合パートナー分子との結合性に対して及ぼす可能性のある影響に基づき、置換するアミノ酸を選択する。このような可能性のある影響の調査は、モデリング、特定位置のアミノ酸の特性の試験、あるいは特定のアミノ酸の置換または変異誘発による影響の実験による観察によって行うことができる。実験による方法に関しては、所望の活性、結合親和性、または特異性について選別できる多様体配列ライブラリーの作製が特に好都合であることがわかっている。このような多様体のライブラリーを作製するための１つの形式はファージ提示ベクターである。あるいは、可変ドメイン内の標的残基をコードする核酸配列を多様化するその他の方法で作製することもできる。
【０１５４】
さらに置換が必要かどうかの決定や置換するアミノ酸残基の選択をする別の方法は、コンピュータモデリングを用いて実行できる。免疫グロブリン分子の三次元画像を作成するコンピュータハードウェアやソフトウェアを広く利用できる。一般に、免疫グロブリン鎖またはそのドメインを解析した構造から出発して分子モデルを作成する。モデリングする鎖を、解析した三次元構造の鎖またはドメインとのアミノ酸配列の類似性について比較し、最も高い配列類似性を示す鎖またはドメインを分子モデル構築の出発点として選択する。モデリングする免疫グロブリン鎖またはドメインの実際のアミノ酸と開始構造のアミノ酸との違いを考慮に入れるため、解析した出発構造を修正する。次に修正後の構造を組み立てて複合体免疫グロブリンを得る。最後に、エネルギー最小化と、すべての原子が互いに適切な距離にあって結合の距離や角度が化学的に許容範囲内であることを確認することにより、モデルを精密にする。
【０１５５】
ヒト化抗体のＣＤＲ領域は、それらの由来するマウス抗体の対応ＣＤＲ領域と実質的に同一である場合が多く、同一である場合がさらに多い。通常は望ましいというわけではないが、得られるヒト化免疫グロブリンの結合親和性に認識できるほどの影響を与えずにＣＤＲ残基の１個以上のアミノ酸の保存的置換を行うことが可能な場合もある。場合によってはＣＤＲ領域の置換によって結合親和性を高めることができる。
【０１５６】
上記の特定のアミノ酸置換の場合以外でも、ヒト化免疫グロブリンのフレームワーク領域は、それらの由来するヒト抗体のフレームワーク領域と実質的に同一である場合が多く、同一である場合がさらに多い。当然ながら、フレームワーク領域内のアミノ酸の多くは抗体の特異性または親和性への直接的な関与がほとんどないか、まったくない。したがって、フレームワーク領域の残基の個々の保存的置換の多くは、得られるヒト化免疫グロブリンの特異性または親和性に認識できるほどの変化をもたらさず、許容できる。
【０１５７】
コードの縮重により、様々な核酸配列が各免疫グロブリンアミノ酸配列をコードすると考えられる。所望の核酸配列は、固相ＤＮＡ新規合成または先に調製した所望ポリヌクレオチド多様体のＰＣＲ変異誘発によって作製できる。本願に記載の抗体をコードするすべての核酸を明示的に本発明に包含する。
【０１５８】
上記の方法で作製したヒト化抗体の可変分節は、一般的にはヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部に連結している。この抗体は軽鎖定常領域と重鎖定常領域の両方を含む。重鎖定常領域は通常、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、および場合によってＣＨ４ドメインを含む。
【０１５９】
ヒト化抗体は、任意のクラス（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥなど）および任意のサブクラス（アイソタイプ）（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４など）の抗体に由来する任意の型の定常ドメインを含んでよい。ヒト化抗体が細胞傷害活性を示すことを望む場合、通常、定常ドメインは補体結合定常ドメインであり、一般的にクラスはＩｇＧ１である。このような細胞傷害活性を望まない場合、定常ドメインはＩｇＧ２クラスのものである可能性がある。ヒト化抗体は、２つ以上のクラスまたはアイソタイプに由来する配列を含んでもよい。
【０１６０】
ヒト化軽鎖可変領域およびヒト化重鎖可変領域をそれぞれコードする核酸を必要に応じて定常領域と連結し、発現ベクターに挿入する。軽鎖と重鎖を同一の発現ベクターにクローニングしてもよいし、別の発現ベクターにクローニングしてもよい。免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡ分節を、免疫グロブリンポリペプチドを確実に発現する発現ベクターに含まれる制御配列と、作動可能に連結する。このような制御配列としては、シグナル配列、プロモーター、エンハンサー、および転写終結配列が挙げられる（Queenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029 (1989)；国際公開第９０／０７８６１号パンフレット；Coら、J. Immunol. 148, 1149 (1992)を参照のこと）。
（レナラーゼ結合性分子の使用法）
【０１６１】
本発明のレナラーゼ結合性分子（たとえば抗体など）の特性を考慮すれば、このレナラーゼ結合性分子は、ヒトおよび動物のレナラーゼ関連の状態を診断、治療または予防するための診断薬、治療薬および予防薬として適切である。
【０１６２】
一般に、用途には本発明の１つ以上のモノクローナル抗体または結合性断片の治療上または予防上の有効量を、感受性のある対象、またはレナラーゼ活性が腫瘍の増殖や転移などの病理学的後遺症を含むと知られている状態を示す個体に投与することが含まれる。抗体のＦａｂ断片およびＦ（ａｂ’）２断片などを含む任意の活性型レナラーゼ結合性分子を投与することができる。
【０１６３】
使用するレナラーゼ結合性分子は、レナラーゼ結合性分子に対する免疫応答によって循環半減期が許容できないほど短くなったり個体のレナラーゼ結合性分子に対する免疫応答が誘導されたりしないように、個体の種と適合性を有することが好ましい。投与されたレナラーゼ結合性分子は、個体のＦｃ受容体との結合、ＡＤＣＣ機構の活性化などの何らかの二次機能を示すことが好ましい。
【０１６４】
個体の治療は、治療有効量の本発明のレナラーゼ結合性分子を投与することを含んでよい。後述するように、レナラーゼ結合性分子をキットで提供してもよい。レナラーゼ結合性分子は、混合物（たとえば等量で混合したもの）としても単独でも使用または投与でき、順に提供しても一度にすべて投与してもよい。患者にレナラーゼ結合性分子を提供する際、投与する薬剤の用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全般的な医学的状態、既往歴などの要因によって変わる。
【０１６５】
一般に、全身投与量のレナラーゼ結合性分子を投与する場合、約１ｎｇ／ｋｇ〜１００ｎｇ／ｋｇ、１００ｎｇ／ｋｇ〜５００ｎｇ／ｋｇ、５００ｎｇ／ｋｇ〜１μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜５００μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ（個体の体重に対して）の範囲の投与量のレナラーゼ結合性分子を患者に与えるのが望ましいが、これよりも低用量または高用量で投与してもよい。わずか１．０ｍｇ／ｋｇの用量でも何らかの効能を示すと期待できる。約５ｍｇ／ｋｇを許容可能な用量とすることが好ましいが、最大約５０ｍｇ／ｋｇの投与量も特に治療用途には好ましい。あるいは、患者の体重に基づかない特定量のレナラーゼ結合性分子を投与してもよい。このような量は、たとえば１μｇ〜１００μｇ、１ｍｇ〜１００ｍｇ、または１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲である。たとえば、部位特異的投与は、体内区画または体腔への投与であってよく、関節内投与、気管支内投与、腹腔内投与、関節包内（ｉｎｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ）投与、軟骨内投与、腔内投与、腹腔内投与、小脳内投与、脳室内投与、結腸内投与、子宮頸管内投与、胃内投与、肝内投与、心筋内投与、骨内投与、骨盤内投与、心膜内投与、腹腔内投与、胸膜内投与、前立腺内投与、肺内投与、直腸内、腎内投与、網膜内投与、髄腔内投与、滑液嚢内投与、胸内投与、子宮内投与、膀胱内投与、病巣内投与、膣内投与、直腸投与、頬側投与、舌下投与、鼻腔内投与、眼内投与、または経皮投与などが挙げられる。
【０１６６】
レナラーゼ結合性分子組成物は、非経口投与（皮下投与、筋肉内投与または静脈内投与）または他の任意の投与のため、特に液剤または懸濁剤の形で調製してもよく；膣投与または直腸投与のため、特にクリーム剤および坐剤（これらに限定するものではない）などの半固形状の形で調製してもよく；頬側投与または舌下投与のため、特に錠剤またはカプセル剤など（これらに限定するものではない）として調製してもよく；鼻腔内投与のため、散剤、点鼻剤、鼻用噴霧剤（これらに限定するものではない）または何らかの薬剤の形で調製してもよく；眼内投与のために点眼剤（これに限定するものではない）などとして調製してもよく；歯科疾患の処置のために調製してもよく；あるいは、経皮投与のため、ゲル剤、軟膏剤、ローション剤、懸濁剤、またはパッチ（これらに限定するものではない）などの送達系として調節してもよく、これらの送達系では、ジメチルスルホキシドなどの化学促進剤を用いて皮膚構造を変更するか経皮パッチ中の薬物濃度を増加させてもよく、タンパク質やペプチドを含む製剤を皮膚に塗布できるようにする酸化剤を用いてもよく（国際公開第９８／５３８４７号パンフレット）、電界を印加することで、一時的な経路を作る（電気穿孔など）か荷電薬物の経皮的移動性を高めてもよく（イオン導入など）、あるいは超音波を用いてもよい（超音波導入など）（米国特許第４，３０９，９８９号および第４，７６７，４０２号明細書）。
【０１６７】
同様の方法で、本発明のレナラーゼ結合性分子の別の治療用途は、本モノクローナル抗体の１つに対して作製した抗イディオタイプ抗体による患者の能動免疫である。エピトープの構造を模倣した抗イディオタイプ抗体で免疫化することにより、能動的な抗レナラーゼ応答を誘発できるだろう（Linthicum, D. S.およびFarid, N. R., Anti-Idiotypes, Receptors, and Molecular Mimicry（抗イディオタイプ抗体、受容体、および分子模倣） (1988), pp 1-5 and 285-300）。
【０１６８】
本発明のレナラーゼ結合性分子は薬学的に有用な組成物を調製するための既知の方法に従って製剤でき、このような方法により、これらの物質またはその機能性誘導体を医薬的に許容される担体溶媒と組み合わせて混合する。他のヒトタンパク質（たとえばヒト血清アルブミン）を含む適切な溶媒とその設計については、たとえばRemington's Pharmaceutical Sciences（レミントン薬学）第１６版、Osol, A. ed., Mack Easton Pa (1980)）に記述がある。有効な投与に適した医薬的に許容される組成物を作製するため、このような組成物は有効量の上記化合物と適量の担体溶媒を含有する。作用の持続時間を制御するため追加の薬学的方法を用いてもよい。重合体を用いて化合物を複合または吸収させることによって徐放性製剤を得てもよい。徐放性製剤により作用持続時間を制御するために可能な別の方法は、本発明の化合物をポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチレンビニルアセテート共重合体などの重合体材料の粒子に組み込むことである。あるいは、これらの薬剤を重合体粒子に組み込む代わりに、これらの物質を、たとえば界面重合などにより調製したマイクロカプセル（たとえば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル）；あるいはコロイド薬物送達系（たとえば、リポソーム、アルブミン微粒子、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）；あるいはマクロエマルションに封入することができる。
【０１６９】
処置は単回投与計画で行ってもよく、あるいは、複数回投与計画で行うのが好ましい。複数回投与では、最初の処置過程を１〜１０回の個別の投与によって行ってよく、その後、応答を維持かつ／または強化するのに必要な時間間隔を空けてさらに投与を行ってよい（たとえば、１〜４ヶ月後に二回目の投与を行い、必要に応じて数か月後に次の投与を行う）。適切な処置計画の例としては、以下が挙げられる：（ｉ）０ヶ月、１ヶ月後、および６ヶ月後に投与、（ｉｉ）０日、７日後、および１ヶ月後に投与、（ｉｉｉ）０ヶ月および１ヶ月後に投与、（ｉｖ）０ヶ月および６ヶ月後に投与、または疾患の症状を低減するか疾患の重症度を下げると期待される所望の応答を誘発するのに十分なその他の計画が挙げられる。
【０１７０】
本発明はさらに、本発明を実施するのに有用なキットを提供する。本発明のキットは、上記の抗体が入った、または抗体と一緒に包装された、第一の容器を含む。本発明のキットはさらに、本発明を実施するのに必要または便利な溶液が入った、またはそれらと一緒に包装された、別の容器を含んでもよい。容器は、ガラス製、プラスチック製、または箔製であってよく、バイアル、瓶、パウチ、チューブ、袋などであってよい。本発明のキットはさらに、本発明を実施するための手順または分析情報などの情報（第一の容器に入っている試薬の量など）を記載した書類を含んでもよい。この情報書と共に容器を別の容器（たとえば箱または袋）に入れてもよい。
【０１７１】
本発明のさらに別の側面は、生体試料中のレナラーゼを検出するためのキットである。このキットは、レナラーゼのエピトープに結合する１種以上のレナラーゼ結合性分子を保持する容器と；このレナラーゼ結合性分子をレナラーゼに結合させ、複合体を形成させて、その複合体（その有無が試料中にレナラーゼが存在するかどうかに関連する）の形成を検出する目的で用いるための説明書とを含む。容器の例としては、複数の試料でレナラーゼを同時に検出できるマルチウェルプレートが挙げられる。
（併用療法）
【０１７２】
本発明のレナラーゼ結合性分子組成物を別の治療処置または治療薬と併用して疾患または障害を処置することができる。たとえば、本発明のレナラーゼ結合性分子を単独で投与してもよいし、１種以上の治療上有効な薬剤または処置と組み合わせて投与してもよい。このような別の治療上有効な薬剤を本発明のレナラーゼ結合性分子に結合してもよく、本発明のレナラーゼ結合性分子と同じ組成物に含ませてもよく、別の組成物として投与してもよい。このような別の治療薬または処置は、本発明の抗体または関連化合物の投与前、投与中および／または投与後に投与できる。
【０１７３】
特定の態様では、本発明のレナラーゼ結合性分子を別の１種以上の治療薬または治療処置と同時投与する。他の態様では、本発明のレナラーゼ結合性分子を別の１種以上の治療薬の投与または処置の実施とは独立して投与する。たとえば、本発明のレナラーゼ結合性分子を最初に投与し、その後に別の１種以上の治療薬の投与または処置を行う。あるいは、別の１種以上の治療薬を最初に投与し、その後に本発明のレナラーゼ結合性分子を投与する。別の例として、ある処置（たとえば手術、放射線照射など）を最初に実施し、その後に本発明のレナラーゼ結合性分子を投与する。
【０１７４】
他の治療上有効な薬剤／処置としては、手術、抗腫瘍剤（化学療法剤および放射線照射を含む）、抗血管新生剤、他の標的に対する抗体、小分子、光線力学療法、免疫療法、免疫増強療法、細胞傷害性剤、サイトカイン、ケモカイン、増殖阻害剤、抗ホルモン剤、キナーゼ阻害剤、心保護剤、免疫賦活剤、免疫抑制剤、および血液細胞の増殖を促進する薬剤が挙げられる。
【０１７５】
一態様では、本明細書で用いる「別の治療剤」は、別の第二の治療剤または抗がん剤、すなわち本発明のレナラーゼ結合性分子「以外」の治療剤または抗がん剤である。任意の第二の治療剤を本発明の併用療法に使用できる。また、第二の治療剤または「第二の抗がん剤」は、以下の指針にしたがって、相加効果（相加効果を超えて相乗効果である可能性もある）を得るために選択できる。
【０１７６】
腫瘍に対する併用療法を実施するため、本発明のレナラーゼ結合性分子を別の（すなわち第二の）異なる抗がん剤と併用で、それらを併せた抗腫瘍作用を動物または患者の体内でもたらすのに有効な方式で動物または患者に投与するであろう。したがって、薬剤が共に（すなわち同時に）腫瘍または腫瘍脈管構造に存在し、かつ腫瘍環境で共に作用するのに有効な量および期間で提供するであろう。この目的を達成するために、本発明のレナラーゼ結合分子および別の第二の抗がん剤を、単一の組成物または異なる投与経路を使う２つの異なる組成物として実質的に同時に動物に投与してもよい。
【０１７７】
あるいは、本発明のレナラーゼ結合性分子を、異なる第二の抗がん剤投与の前後いずれかにたとえば数分から数週間の間隔で投与してもよい。本発明のレナラーゼ結合性分子と第二の別の抗がん剤とを別に動物に投与する特定の態様では、使用者は各薬剤が腫瘍に対して有利に併用効果を発揮し続けるように各薬剤の送達の間の有意な期間を決して過ぎないようにするであろう。このような場合、互いに約５分〜約１週間以内の間隔で両方の薬剤に腫瘍を接触させると考えられる。互いに約１２時間〜７２時間以内の間隔がより好ましく、わずか約１２時間〜４８時間の遅延時間が最も好ましい。
【０１７８】
別個にタイミングを設定した併用療法のための第二の治療剤は、本明細書で他の箇所に記載するものを含む特定の基準に基づいて選択できる。先または後に投与するために１種以上の第二の異なる抗がん剤を選択することを好んでも、それらを必要に応じて実質的に同時投与で使用することを排除するものではない。第二の異なる抗がん剤を本発明の第一の治療剤の「前に」投与するために選択し、相乗効果となる可能性のある高い効果を得るように設計してもよい。
【０１７９】
本発明の第一の治療剤の「後に」投与するために選択し、相乗効果となる可能性のある高い効果を得るように設計される第二の異なる抗がん剤としては、第一の薬剤の効果を活かす薬剤が挙げられる。したがって、後に投与する有効な第二の異なる抗がん剤としては、転移を阻害する抗血管新生剤；壊死させる腫瘍細胞を標的化する薬剤（生体内で悪性細胞が接触できるようになる、細胞内結合パートナー分子に特異的な抗体（米国特許第５，０１９，３６８号、第４，８６１，５８１号、および第５，８８２，６２６号明細書；各文献の内容は参照により本明細書に具体的に組み込まれる）など）；化学療法剤；および任意の腫瘍細胞を攻撃する抗腫瘍細胞免疫複合体が挙げられる。
【０１８０】
本発明のレナラーゼ結合分子は、がん免疫療法と併用で投与することもできる。がん免疫療法は、個体のがん細胞に対する液性免疫応答または個体のがん細胞に対する細胞性免疫応答、あるいは個体のがん細胞に対する液性応答と細胞性応答の組合せを誘発するように設計されたものであってよい。本発明のレナラーゼ結合性分子との併用で有用ながん免疫療法の例としては、がんワクチン、ＤＮＡがんワクチン、養子細胞療法、養子免疫療法、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法、抗体、免疫増強化合物、サイトカイン、インターロイキン（たとえばＩＬ−２など）、インターフェロン（ＩＦＮ−αなど）、およびチェックポイント阻害剤（たとえば、ＰＤ−１阻害剤、ＣＴＬＡ−４阻害剤など）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１８１】
状況により、それぞれの投与の間に数日間（２日、３日、４日、５日、６日、または７日）、数週間（１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、または８週間）、あるいは数ヶ月間（１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、または８ヶ月間）が経過するよう処置期間を有意に延長することが望ましい場合がある。これは、１つの処置（本発明の第一の治療剤など）には実質的に腫瘍の破壊を意図し、もう１つの処置（抗血管新生剤の投与など）には微小転移または腫瘍再増殖の予防を意図する状況では有利になるだろう。しかし、抗血管新生剤は、効果的な創傷治癒を得るために術後の慎重な期間に投与すべきである。その後、抗血管新生剤を患者の生存期間にわたり投与してもよい。
【０１８２】
本発明のレナラーゼ結合性分子または異なる第二の抗がん剤を２回以上投与することも想定する。本発明のレナラーゼ結合性分子および異なる第二の抗がん剤は、隔日または隔週で交互に投与してもよいし、一方の薬剤で連続して処置を行った後にもう一方の薬剤で連続して治療を行ってもよい。いずれの場合も、併用療法で腫瘍の縮小を達成するには、投与回数には関係なく、抗腫瘍効果を発揮するのに有効な合計量で両方の薬剤を送達するだけでよい。
【０１８３】
化学療法剤は本発明のレナラーゼ阻害剤と併用できる。化学療法剤によって増殖中の腫瘍細胞が死滅し、処置全体によって得られる壊死範囲が増える。
【０１８４】
本発明の一側面は、本発明のレナラーゼ阻害剤を用いてがんを治療または予防する方法を提供する。当業者は、患者のがんの治療または予防ががん細胞の死滅および破壊とがん細胞の増殖または細胞分裂速度の低減（この例に限定されるものではない）を含むことを理解している。当業者は、非限定的な例としてがん細胞は原発性がん細胞、がん幹細胞、転移性がん細胞でであってよいことも理解している。以下は本開示の方法および組成物で処置できるがんの例であるが、これらに限定されるものではない：急性リンパ性白血病；急性骨髄性白血病；副腎皮質がん；小児副腎皮質がん；虫垂がん；基底細胞がん；肝外胆管がん；膀胱がん；骨がん；骨肉腫および悪性線維性組織球腫；小児脳幹神経膠腫；成人脳腫瘍；小児脳腫瘍、小児脳幹神経膠腫；脳腫瘍、中枢神経系の小児異型奇形腫瘍／ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；小脳星細胞腫；大脳星細胞腫／悪性神経膠腫；頭蓋咽頭腫；上衣芽腫；上衣腫；髄芽腫；髄様上皮腫；中間型松果体実質腫瘍；テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽腫；視経路および視床下部神経膠腫（visual pathway and hypothalamic glioma）；乳がん；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；カルチノイド腫瘍；消化管カルチノイド腫瘍；中枢神経系の異型奇形腫瘍／ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；中枢神経系リンパ腫；小児小脳星細胞腫、小児小脳悪性神経膠腫；子宮頚がん；小児脊索腫；慢性リンパ性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性疾患；直腸がん；大腸がん；頭蓋咽頭腫；皮膚Ｔ細胞性リンパ腫；食道がん；ユーイング腫瘍ファミリーの腫瘍；性腺外生殖細胞腫瘍；肝外胆管がん；眼がん、眼球内黒色腫；眼がん、網膜芽細胞腫；胆嚢がん；胃がん；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外生殖細胞腫瘍；卵巣胚細胞腫瘍；妊娠性絨毛性疾患腫瘍；神経膠腫；小児脳幹神経膠腫；神経膠腫、小児大脳星細胞腫；小児視経路および視床下部神経膠腫；有毛細胞白血病；頭頚部がん；肝細胞（肝臓）がん；ランゲルハンス細胞組織球症；ホジキンリンパ腫；下咽頭がん；視床下部および視経路神経膠腫；眼球内黒色腫；島細胞腫瘍；腎（腎細胞）がん；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭がん；急性リンパ性白血病；急性骨髄性白血病；慢性リンパ性白血病；慢性骨髄性白血病；有毛細胞白血病；口唇がんまたは口腔がん；肝臓がん；非小細胞肺がん；小細胞肺がん；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；バーキットリンパ腫；皮膚Ｔ細胞性リンパ腫；ホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫；原発性中枢神経系リンパ腫；ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症；骨悪性線維性組織球腫および骨肉腫；髄芽腫；黒色腫；眼球内黒色腫（眼）；メルケル細胞がん；中皮腫；原発不明の転移性頚部扁平上皮がん；口腔がん；多発性内分泌腫瘍症候群（小児）；多発性骨髄腫および形質細胞腫瘍；菌状息肉症；骨髄異形成症候群；骨髄異形成／骨髄増殖性疾患；慢性骨髄性白血病；成人急性骨髄性白血病；小児急性骨髄性白血病；多発性骨髄腫；慢性骨髄増殖性疾患；鼻腔がんおよび副鼻腔がん；鼻咽腔がん；神経芽腫；非小細胞肺がん；口腔がん；中咽頭がん；骨肉腫および骨悪性線維性組織球腫；卵巣がん；卵巣上皮がん；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣���悪性度腫瘍；膵臓がん；膵臓がん、膵島細胞がん；乳頭腫；副甲状腺がん；陰茎がん；咽頭がん；褐色細胞腫；傍神経節腫；中間型松果体実質腫瘍；松果体芽腫またはテント上原始神経外胚葉性腫瘍；下垂体腺腫；形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；原発性中枢神経系リンパ腫；前立腺がん；、直腸がん；腎細胞（腎）がん；腎盂移行上皮がんおよび尿管移行上皮がん；１５番染色体にあるＮＵＴ遺伝子に関連する気道がん；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺がん；肉腫（ユーイング腫瘍ファミリーの肉腫）；カポジ肉腫；軟部肉腫；子宮肉腫；セザリー症候群、皮膚がん（非黒色腫）；皮膚がん（黒色腫）；メルケル細胞皮膚がん；小細胞肺がん；小腸がん；軟部肉腫；原発不明の転移性頚部扁平上皮がん；胃がん；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；皮膚Ｔ細胞リンパ腫；精巣がん；咽頭がん；胸腺腫および胸腺がん；甲状腺がん；腎盂移行上皮がんおよび尿管移行上皮がん；妊娠性絨毛性腫瘍；尿道がん；子宮内膜がん；子宮肉腫；腟がん；外陰がん；ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症；ウィルムス腫瘍。
【０１８５】
一態様では、本発明は、本発明のレナラーゼ結合性分子の投与前、投与時、または投与後に、がんの補完治療（たとえば、手術、化学療法、化学療法薬、放射線療法またはホルモン療法、あるいはそれらの組み合わせ）で対象のがんを処置することを含むがんの処置方法を提供する。
【０１８６】
化学療法剤としては、細胞傷害性の薬剤（たとえば５−フルオロウラシル、シスプラチン、カルボプラチン、メトトレキサート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、オキソルビシン（ｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シタラビン（米国薬局方（ＵＳＰ））、シクロホスファミド、エストラムスチンリン酸エステルナトリウム、アルトレタミン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、プロカルバジン、マイトマイシン、ブスルファン、シクロホスファミド、ミトキサントロン、カルボプラチン、シスプラチン、組換えインターフェロンα−２ａ、パクリタキセル、テニポシド、ストレプトゾシン）；細胞障害性のアルキル化剤（たとえば、ブスルファン、クロランブシル、シクロホスファミド、メルファラン、またはエチルスルホン酸）；アルキル化剤（たとえば、アサレー（ａｓａｌｅｙ）、ＡＺＱ、ＢＣＮＵ、ブスルファン、ビスルファン（ｂｉｓｕｌｐｈａｎ）、カルボキシフタラト−白金（ｃａｒｂｏｘｙｐｈｔｈａｌａｔｏｐｌａｔｉｎｕｍ）、ＣＢＤＣＡ、ＣＣＮＵ、ＣＨＩＰ、クロランブシル、クロロゾトシン、シス−プラチン、クロメソン、シアノモルホリノドキソルビシン、シクロジソン、シクロホスファミド、ジアンヒドロガラクチトール、フルオロドーパン、ヘプスルファム、ヒカントン、イホスファミド、メルファラン、メチルＣＣＮＵ、マイトマイシンＣ、ミトゾラミド（ｍｉｔｏｚｏｌａｍｉｄｅ）、ナイトロジェンマスタード、ＰＣＮＵ、ピペラジン、ピペラジンジオン、ピポブロマン、ポルフィロマイシン、スピロヒダントインマスタード、ストレプトゾトシン、テロキシロン、テトラプラチン、チオテパ、トリエチレンメラミン、ウラシルナイトロジェンマスタード、Ｙｏｓｈｉ−８６４）；有糸分裂阻害剤（たとえば、アロコルヒチン、ハリコンドリンＭ、コルヒチン、コルヒチン誘導体、ドラスタチン１０、メイタンシン、リゾキシン、パクリタキセル誘導体、パクリタキセル、チオコルヒチン、トリチルシステイン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン）；植物性アルカロイド（たとえば、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、Ｌ−アスパラギナーゼ、イダルビシン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ダウノルビシン、ＶＰ−１６−２１３、ＶＭ−２６、ナベルビン（登録商標）、およびタキソテール（登録商標））；生物学的薬剤（たとえば、αインターフェロン、ＢＣＧ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびインターロイキン−２）；トポイソメラーゼＩ阻害剤（たとえば、カンプトテシン、カンプトテシン誘導体、モルホリノドキソルビシン）；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（たとえば、ミトキサントロン、アモナフィド、ｍ−ＡＭＳＡ、アントラピラゾール誘導体、ピラゾロアクリジン、ビサントレンＨＣＬ、ダウノルビシン、デオキシドキソルビシン、メノガリル、Ｎ，Ｎ−ジベンジルダウノマイシン、オキサントラゾール（ｏｘａｎｔｈｒａｚｏｌｅ）、ルビダゾン、ＶＭ−２６、およびＶＰ−１６）；ならびに合成薬剤（たとえば、ヒドロキシ尿素、プロカルバジン、ｏ，ｐ’−ＤＤＤ、ダカルバジン、ＣＣＮＵ、ＢＣＮＵ、シス−ジアミ��ジクロロ白金、ミトキサントロン、ＣＢＤＣＡ、レバミゾール、ヘキサメチルメラミン、全トランス型レチノイン酸、ギリアデル（登録商標）、およびポルフィマーナトリウム）が挙げられる。
【０１８７】
抗増殖剤は細胞増殖を低減する化合物である。抗増殖剤としては、アルキル化剤；代謝拮抗剤；酵素；生体応答修飾物質；多様な薬剤、ホルモン、および拮抗剤；アンドロゲン阻害剤（たとえばフルタミドおよびリュープロレリン酢酸塩）；抗エストロゲン剤（たとえば、クエン酸タモキシフェンとその類似体、トレミフェン、ドロロキシフェン、およびラロキシフェン）が挙げられる。具体的な抗増殖剤の例をさらに挙げると、レバミゾール、硝酸ガリウム、グラニセトロン、サルグラモスチム、塩化ストロンチウム−８９、フィルグラスチム、ピロカルピン、デキスラゾキサン、およびオンダンセトロンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１８８】
本発明のレナラーゼ結合性分子は、単独で投与することもできるし、細胞傷害性／抗悪性腫瘍薬剤および抗血管新生剤などの別の抗腫瘍剤と併用で投与することもできる。細胞傷害性／抗悪性腫瘍薬剤は、がん細胞を攻撃し死滅させる薬剤として定義される。一部の細胞傷害性／抗悪性腫瘍薬剤は腫瘍細胞内の遺伝物質をアルキル化するアルキル化剤であり、たとえば、シスプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、トリメチレンチオホスホラミド、カルムスチン、ブスルファン、クロランブシル、ベルスチン（登録商標）、ウラシルマスタード、クロマファジン（ｃｈｌｏｍａｐｈａｚｉｎ）、およびダカルバジンが挙げられる。他の細胞傷害性／抗悪性腫瘍薬剤は腫瘍細胞に対する代謝拮抗剤であり、たとえば、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、アザチオプリン、およびプロカルバジンが挙げられる。他の細胞障害性／抗悪性腫瘍薬剤は抗生物質であり、たとえば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシンＣ、およびダウノマイシンが挙げられる。このような化合物については多数のリポソーム製剤がある。さらに他の細胞障害性／抗悪性腫瘍薬剤は細胞分裂阻害剤（ビンカアルカロイド）であり、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびエトポシドが挙げられる。様々な細胞傷害性／抗悪性腫瘍薬剤としては、タキソール（登録商標）とその誘導体、Ｌ−アスパラギナーゼ、抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファラン、ＶＭ−２６、イホスファミド、ミトキサントロン、ビンデシンが挙げられる。
【０１８９】
抗血管新生剤は当業者に周知である。本開示の方法および組成物に適切な抗血管新生剤 としては、抗ＶＥＧＦ抗体（ヒト化抗体およびキメラ抗体を含む）、抗ＶＥＧＦアプタマー、ならびにアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。その他の既知の血管新生阻害剤としては、アンジオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、インターロイキン−１（αとβがある）、インターロイキン−１２、レチノイン酸、組織メタロプロテアーゼ阻害物質１および組織メタロプロテアーゼ阻害物質２（ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２）が挙げられる。トポイソメラーゼを含む小分子（抗血管新生活性を有するトポイソメラーゼＩＩ阻害剤であるラゾキサンなど）も使用できる。
【０１９０】
本開示の化合物と併用できる他の抗がん剤としては以下が挙げられるが、これらに限定されるものではない：アシビシン；アクラルビシン；塩酸アコダゾール；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン； アンボマイシン；酢酸アメタントロン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；ビサントレン塩酸塩；メシル酸ビスナフィド；ビゼレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；カルビシン塩酸塩；カルゼレシン；セデフィンゴール；クロランブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；メシル酸クリスナトール；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；塩酸ダウノルビシン；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；メシル酸デザグアニン；ジアジコン；ドセタキセル；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン；エダトレキサート；塩酸エフロルニチン；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロマート；エピプロピジン；塩酸エピルビシン；エルブロゾール；エソルビシン塩酸塩；エストラムスチン；リン酸エストラムスチンナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン；塩酸ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；フルダラビンリン酸エステル；フルオロウラシル；フルオロシタビン（ｆｌｕｏｒｏｃｉｔａｂｉｎｅ）；ホスキドン；ホストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；ゲムシタビン塩酸塩；ヒドロキシ尿素；塩酸イダルビシン；イホスファミド；イルモホシン；インターロイキンＩＩ（組換えインターロイキンＩＩ（ｒＩＬ２）など）；インターフェロンアルファ−２ａ；インターフェロンアルファ−２ｂ；インターフェロンアルファ−ｎ１；インターフェロンアルファ−ｎ３；インターフェロンベータ−Ｉａ；インターフェロンガンマ−Ｉｂ；イプロプラチン；塩酸イリノテカン；ランレオチド酢酸塩；レトロゾール；リュープロレリン酢酸塩；リアロゾール塩酸塩；ロメトレキソールナトリウムナトリウム；ロムスチン；ロソキサントロン塩酸塩；マソプロコール；メイタンシン；塩酸メクロレタミン； 酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトギリン；ミトマルシン；マイトマイシン；ミトスペル；ミトタン；ミトキサントロン塩酸塩；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；アルブミン結合パクリタキセル；ペグアスパラガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；ペプロマイシン硫酸塩；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピロキサントロン塩酸塩；プリカマイシン；プロメスタン；ポル���ィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；塩酸プロカルバジン；ピューロマイシン；ピューロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；サフィンゴール塩酸塩；セムスチン；シムトラゼン；スパルホサートナトリウム；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム塩酸塩；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；タリソマイシン；テコガランナトリウム；テガフール；テロキサントロン塩酸塩；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン； チラパザミン；トレミフェンクエン酸塩；トレストロンアセタート；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；ツブロゾール塩酸塩；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；ビネピジンスルファート；ビングリシナートスルファート；硫酸ビンロイロシン；ビノレルビン；ビノレルビン酒石酸塩；ビンロシジンスルファート；ビンゾリジンスルファート；ボロゾール；ゼニプラチン； ジノスタチン；ゾルビシン塩酸塩。他の抗がん剤としては以下が挙げられるが、これらに限定されるものではない：２０−エピ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５−エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール（ａｄｅｃｙｐｅｎｏｌ）；アドゼレシン；アルデスロイキン；ＡＬＬ−ＴＫ拮抗剤類；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドックス（ａｍｉｄｏｘ）；アミホスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラホリド；血管新生阻害剤類；アンタゴニストＤ（Antagonist D）；アンタゴニストＧ（Antagonist G）；アンタレリクス（ａｎｔａｒｅｌｉｘ）；抗背側形成タンパク質−１（anti-dorsalizing morphogenetic protein-1）；抗アンドロゲン剤（前立腺がん）；抗エストロゲン剤；アンチネオプラストン；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィジコリングリシナート；アポトーシス遺伝子調節物質；アポトーシス制御因子；アプリン酸；ａｒａ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン１；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬ拮抗剤；ベンゾクロリン（ｂｅｎｚｏｃｈｌｏｒｉｎ）類；ベンゾイルスタウロスポリン；βラクタム誘導体；βアレチン（ｂｅｔａ−ａｌｅｔｈｉｎｅ）；ベタクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦ阻害剤；ビカルタミド；ビサントレン；ビサジリジニルスペルミン（ｂｉｓａｚｉｒｉｄｉｎｙｌｓｐｅｒｍｉｎｅ）；ビスナフィド；ビストラテン（ｂｉｓｔｒａｔｅｎｅ）Ａ；ビゼレシン；ブレフラート（ｂｒｅｆｌａｔｅ）；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カナリアポックス（ｃａｎａｒｙｐｏｘ）ＩＬ−２；カペシタビン；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；CaRest M3；CARN 700；軟骨由来阻害剤；カルゼレシン；カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリクス；クロリン類；クロロキノキサリンスルホンアミド（chloroquinoxaline sulfonamide）；シカプロスト；シス−ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェン類似体；クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチン類似体；コナゲニン；クランベシジン８１６；クリスナトール；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；クラシンＡ；シクロペンタアントラキノン（ｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅ）類；シクロプラタム（ｃｙｃｌｏｐｌａｔａｍ）；シペマイシン（ｃｙｐｅｍｙｃｉｎ）；シタラビンオクホスファート；細胞溶解因子；シトスタチン（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｎ）；ダクリズマブ；デシタビン；デヒドロジデムニンＢ；デスロレリン；デキサメタゾン；デキシホスファミド（ｄｅｘｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）；デキスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジコン；ジデムニンＢ；ジドックス（ｄｉｄｏｘ）；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ−５−アザシチジン；９−ジヒドロタキソール；ジオキサマイシン（ｄｉｏｘａｍｙｃｉｎ）；ジフェニルスピロムスチン（diphenyl spiromustine）；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスチン；エデルホシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフル；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチン類似体；エストロゲン作用剤；エストロゲン拮抗剤；エタニダゾール；リン酸エトポシド；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン（ｆｌｕａｓｔｅｒｏｎｅ）；フルダラビン；塩酸フルオロダウノルニシン（fluorodaunorunicin hydrochloride）；ホルフェニメックス；ホルメスタン；ホストリエシン；ホテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリクス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン；グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム；ヘレグリン； ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモホシン；イロマスタット；イミダゾアクリドン（ｉｍｉｄａｚｏａｃｒｉｄｏｎｅ）類；イミキモド；免疫賦活ペプチド類；インスリン様増殖因子−１受容体阻害剤；インターフェロン作用剤；インターフェロン；インターロイキン；ヨーベングアン；ヨードドキソルビシン；４−イポメアノール；イロプラクト（ｉｒｏｐｌａｃｔ）；イルソグラジン；イソベンガゾール（ｉｓｏｂｅｎｇａｚｏｌｅ）；イソホモハリコンドリンＢ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリドＦ；三酢酸ラメラリンＮ（lamellarin−N triacetate）；ランレオチド；レイナマイシン（ｌｅｉｎａｍｙｃｉｎ）；レノグラスチム；硫酸レンチナン（lentinan sulfate）；レプトルスタチン；レトロゾール；白血病阻止因子；白血球αインターフェロン；リュ���プロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；リュープロレリン；レバミゾール；リアロゾール；直鎖ポリアミン類似体；親油性二糖ペプチド；親油性白金化合物類；リッソクリナミド７；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロバスタチン；ロキソリビン；ルルトテカン； ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン（ｌｙｓｏｆｙｌｌｉｎｅ）；溶解性ペプチド類；マイタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリライシン阻害剤；細胞外基質分解酵素阻害剤；メノガリル；メルバロン；メテレリン（ｍｅｔｅｒｅｌｉｎ）；メチオニナーゼ（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ）（登録商標）；メトクロプラミド；遊走阻害因子（ＭＩＦ）阻害剤；ミフェプリストン；ミルテホシン；ミリモスチム；二重鎖の塩基が対応しないＲＮＡ；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシン類似体；ミトナフィド；線維芽細胞増殖因子とサポリンを結合したミトトキシン（ｍｉｔｏｔｏｘｉｎ）（＝分裂促進因子に由来する毒素）；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；ヒト絨毛性ゴナドトロピンモノクローナル抗体；モノホスホリルリピドＡ＋ミコバクテリア細胞壁ｓｋ；モピダモール；多剤耐性遺伝子阻害薬；ＭＴＳ１（multiple tumor suppressor 1）に基づく治療；マスタード系抗がん剤；ミカペルオキシドＢ（mycaperoxide B）；ミコバクテリアの細胞壁抽出物；ミリアポロン（ｍｙｒｉａｐｏｒｏｎｅ）；Ｎ−アセチルジナリン；Ｎ−置換ベンズアミド；ナファレリン；ナグレスチップ（Ｎａｇｒｅｓｔｉｐ）（登録商標）；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン（ｎａｐａｖｉｎ）；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン（ｎｅｍｏｒｕｂｉｃｉｎ）；ネリドロン酸；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド；ニサマイシン（ｎｉｓａｍｙｃｉｎ）；一酸化窒素調節剤；窒素酸化物系抗酸化剤；ニトルリン（ｎｉｔｒｕｌｌｙｎ）；Ｏ６−ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド類；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン（ｏｒａｃｉｎ）；経口サイトカイン誘導剤；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オキサウノマイシン；パクリタキセル；パクリタキセル類似体；パクリタキセル誘導体；
パラウアミン；パルミトイルリゾキシン（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｒｈｉｚｏｘｉｎ）；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ペガスパルガーゼ；ペルデシン；ペントサン多硫酸ナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール（ｐｅｎｔｒｏｚｏｌｅ）；ペルフルブロン；ペルホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；フェニルアセタート；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニール（登録商標）；ピロカルピン塩酸塩；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチンＡ（placetin A）；プラセチンＢ（placetin B）；プラスミノーゲン活性化因子阻害因子；白金錯体；白金化合物；白金−トリアミン錯体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルビスアクリドン（propyl bis−acridone）；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害剤；タンパク質Ａに基づく免疫調節剤；プロテインキナーゼＣ阻害剤；微細藻類のプロテインキナーゼＣ阻害剤；タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン類；ピラゾロアクリジン； ピリドキシル化ヘモグロビン−ポリオキシエチレン複合体；Ｒａｆ拮抗剤；ラルチトレキセド；ラモセトロン；Ｒａｓタンパク質ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤；Ｒａｓ阻害剤；Ｒａｓ−ＧＡＰ阻害剤；脱メチル化レテリプチン；エチドロン酸レニウム（Ｒｅ；原子量１８６）；リゾキシン；リボザイム類；ＲＩＩレチンアミド；ログレチミド；ロヒツキン；ロムルチド；ロキニメクス；ルビギノンＢ１；ルボキシル；サフィンゴール；サイントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ１模倣物；セムスチン；老化由来阻害剤１（senescence derived inhibitor 1）；センスオリゴヌクレオチド類；シグナル伝達阻害剤；シグナル伝達調節剤；単鎖抗原結合性タンパク質；シゾフィラン；ソブゾキサン；ボロカプテイトナトリウム；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール（ｓｏｌｖｅｒｏｌ）；ソマトメジン結合性タンパク質；ソネルミン；スパルホス酸；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンギスタチン１（spongistatin 1）；スクアラミン；幹細胞阻害剤；幹細胞分裂阻害剤；スチピアミド；ストロメライシン阻害剤；スルフィノシン；過活性（ｓｕｐｅｒａｃｔｉｖｅ）血管作用性腸ペプチド拮抗剤；スラジスタ（ｓｕｒａｄｉｓｔａ）；スラミン；スウェインソニン；合成グリコサミノグリカン類；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリリウム（ｔｅｌｌｕｒａｐｙｒｙｌｉｕｍ）；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｄｅｃａｏｘｉｄｅ）；テトラゾミン；タリブラスチン；チオコラリン；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣物；サイマルファシン；サイモポエチン受容体作用剤；チモトリナン；甲状腺刺激ホルモン；エチルエチオプルプリンスズ（tin ethyl etiopurpurin）；チラパザミン；二塩化チタノセン；トプセンチン；トレミフェン；全能性幹細胞因子；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼ阻害剤；チルホスチン類；ＵＢＣ阻害剤；ウベニメックス；泌尿生殖洞由来増殖阻害因子；ウロキナーゼ受容体拮抗剤；バプレオチド；バリオリンＢ；ベクター系、赤血球遺伝子治療；ベラレソール；べラミン（ｖｅｒａｍｉｎｅ）；ベルジン（ｖｅｒｄｉｎ）類；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン（ｖｉｎｘａｌｔｉｎｅ）；ビタキシン（ｖｉｔａｘｉｎ）；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；イミリムマブ（ｉｍｉｌｉｍｕｍａｂ）；ミルタザピン；BrUOG 278；BrUOG 292；ＲＡＤ０００１；ＣＴ−０１１； ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ；ティピファルニブ；Ｒ１１５７７７；ＬＤＥ２２５；カルシトリオール；ＡＺＤ６２４４；ＡＭＧ６５５；ＡＭＧ４７９；ＢＫＭ１２０；ｍＦＯＬＦＯＸ６；ＮＣ−６００４；セツキシマブ；ＩＭ−Ｃ２２５；ＬＧＸ８１８；ＭＥＫ１６２；ＢＢＩ６０８；ＭＥＤＩ４７３６；ベムラフェニブ；イピリムマブ；イボルマブ（ｉｖｏｌｕｍａｂ）；二ボルマブ；パノビノスタット；レフルノミド；ＣＥＰ−３２４９６；アレムツズマブ；ベバシズマブ；オファツムマブ；パニツムマブ；ペムブロリズマブ；リツキシマブ；トラスツズマブ；ＳＴＡＴ３阻害剤（たとえばＳＴＡ−２１、ＬＬＬ−３、ＬＬＬ１２、ＸＺＨ−５、Ｓ３１−２０１、ＳＦ−１０６６、ＳＦ−１０８７、ＳＴＸ−０１１９、クリプトタンシノン、クルクミン、ジフェルロイルメタン、ＦＬＬＬ１１、ＦＬＬＬ１２、ＦＬＬＬ３２、ＦＬＬＬ６２、Ｃ３、Ｃ３０、Ｃ１８８、Ｃ１８８−９、ＬＹ５、ＯＰＢ−３１１２１、ピリメタミン、ＯＰＢ−５１６０２、ＡＺＤ９１５０など）；低酸素誘導因子１（hypoxia inducing factor 1；HIF−1）阻害剤（たとえば、ＬＷ６、ジゴキシン、ラウレンジテルペノール（ｌａｕｒｅｎｄｉｔｅｒｐｅｎｏｌ）、ＰＸ−４７８、ＲＸ−００４７、ビテキシン、ＫＣ７Ｆ２、ＹＣ−１など）；ならびにジノスタチンスチマラマー。一態様では、抗がん剤は５−フルオロウラシル、タキソール（登録商標）、またはロイコボリンである。
（診断方法）
【０１９１】
一部の態様では、個体の細胞、組織、または体液に含まれるレナラーゼまたはレナラーゼ断片の値が比較対照に比べて高いことを指標として疾患または障害を診断する本発明の方法に使用し、その重症度を評価し、その疾患または障害に対する処置の効果または有効性を監視する。様々な態様では、このような疾患または障害は、急性腎不全（すなわち腎臓の虚血性状態である急性尿細管壊死（ＡＴＮ））、心血管疾患または心血管障害（たとえば、高血圧症、肺高血圧症、収縮期高血圧症、糖尿病性高血圧症、無症候性左室機能不全、慢性うっ血性心不全、心筋梗塞、心調律障害、アテローム動脈硬化症など）、がん、心疾患または心障害、腎疾患または腎障害、胃腸疾患または胃腸障害、肝疾患または肝障害、肺疾患または肺障害、膵疾患または膵障害（たとえば膵炎）、精神疾患または精神障害（たとえばうつ状態、不安など）、あるいは神経疾患または神経障害が挙げられる。
【０１９２】
一態様では、本発明は個体の生体試料に含まれるレナラーゼまたはレナラーゼ断片の値を評価することにより個体の疾患または障害を診断する方法である。一態様では、個体の生体試料は細胞、組織、または体液である。レナラーゼまたはレナラーゼ断片の値を評価できる体液の例としては、血液、血清、血漿、および尿が挙げられるが、これらに限定されるものではない。様々な態様では、個体の生体試料に含まれるレナラーゼまたはレナラーゼ断片の値を、比較対照のレナラーゼまたはレナラーゼ断片の値と比較する。比較対照の例としては、陰性対照、陽性対照、個体に期待される正常基準値、個体の歴史的な正常基準値、個体が属する母集団に期待される正常基準値、個体が属する母集団の歴史的な正常基準値が挙げられるが、これらに限定されるものではない。様々な態様では、このような疾患または障害は、急性腎不全（すなわち腎臓の虚血性状態である急性尿細管壊死（ＡＴＮ））、心血管疾患または心血管障害（たとえば、高血圧症、肺高血圧症、収縮期高血圧症、糖尿病性高血圧症、無症候性左室機能不全、慢性うっ血性心不全、心筋梗塞、心調律障害、アテローム動脈硬化症など）、がん、心疾患または心障害、腎疾患または腎障害、胃腸疾患または胃腸障害、肝疾患または肝障害、肺疾患または肺障害、膵疾患または膵障害（たとえば膵炎）、精神疾患または精神障害（たとえばうつ状態、不安など）、あるいは神経疾患または神経障害が挙げられる。一部の態様では、この診断方法は診断した疾患または障害について患者を処置する工程をさらに含む。
【０１９３】
別の態様では、本発明は個体の生体試料に含まれるレナラーゼまたはレナラーゼ断片の値を評価することにより個体の疾患または障害の重症度を評価する方法である。一態様では、個体の生体試料は細胞、組織、または体液である。レナラーゼまたはレナラーゼ断片の値を評価できる体液の例としては、血液、血清、血漿、および尿が挙げられるが、これらに限定されるものではない。様々な態様では、個体の生体試料に含まれるレナラーゼまたはレナラーゼ断片の値を、比較対照のレナラーゼまたはレナラーゼ断片の値と比較する。比較対照の例としては、陰性対照、陽性対照、個体に期待される正常基準値、個体の歴史的な正常基準値、個体が属する母集団に期待される正常基準値、個体が属する母集団の歴史的な正常基準値が挙げられるが、これらに限定されるものではない。様々な態様では、このような疾患または障害は、急性腎不全（すなわち腎臓の虚血性状態である急性尿細管壊死（ＡＴＮ））、心血管疾患または心血管障害（たとえば、高血圧症、肺高血圧症、収縮期高血圧症、糖尿病性高血圧症、無症候性左室機能不全、慢性うっ血性心不全、心筋梗塞、心調律障害、アテローム動脈硬化症など）、がん、心疾患または心障害、腎疾患または腎障害、胃腸疾患または胃腸障害、肝疾患または肝障害、肺疾患または肺障害、膵疾患または膵障害（たとえば膵炎）、精神疾患または精神障害（たとえばうつ状態、不安など）、あるいは神経疾患または神経障害が挙げられる。一部の態様では、この重症度評価方法は疾患または障害について患者を処置する工程をさらに含む。
【０１９４】
一態様では、本発明は個体の生体試料に含まれるレナラーゼまたはレナラーゼ断片の値を評価することにより個体の疾患または障害に対する処置の効果を監視する方法である。一態様では、個体の生体試料は細胞、組織、または体液である。レナラーゼまたはレナラーゼ断片の値を評価できる体液の例としては、血液、血清、血漿、および尿が挙げられるが、これらに限定されるものではない。様々な態様では、個体の生体試料に含まれるレナラーゼまたはレナラーゼ断片の値を、比較対照のレナラーゼまたはレナラーゼ断片の値と比較する。比較対照の例としては、陰性対照、陽性対照、個体に期待される正常基準値、個体の歴史的な正常基準値、個体が属する母集団に期待される正常基準値、個体が属する母集団の歴史的な正常基準値が挙げられるが、これらに限定されるものではない。様々な態様では、このような疾患または障害は、急性腎不全（すなわち腎臓の虚血性状態である急性尿細管壊死（ＡＴＮ））、心血管疾患または心血管障害（たとえば、高血圧症、肺高血圧症、収縮期高血圧症、糖尿病性高血圧症、無症候性左室機能不全、慢性うっ血性心不全、心筋梗塞、心調律障害、アテローム動脈硬化症など）、がん、心疾患または心障害、腎疾患または腎障害、胃腸疾患または胃腸障害、肝疾患または肝障害、肺疾患または肺障害、膵疾患または膵障害（たとえば膵炎）、精神疾患または精神障害（たとえばうつ状態、不安など）、あるいは神経疾患または神経障害が挙げられる。一部の態様では、この処置の効果の監視方法は疾患または障害について患者を処置する工程をさらに含む。
【０１９５】
様々な態様では、対象はヒトであり、任意の人種、性別、年齢であってよい。代表的な対象としては、疾患または障害にかかっている疑いのある対象、疾患または障害にかかっていると診断された対象、疾患または障害を有すると診断された対象、疾患または障害を発症するリスクのある対象が挙げられる。
【０１９６】
本明細書に記載の本発明の方法で得た情報は単独でも利用できるし、対象または対象から採取した生体試料から得られるその他の情報（たとえば病状、病歴、生命徴候、血液化学など）と組み合わせても利用できる。
【０１９７】
本発明の診断方法では、対象から採取する生体試料を、含有するレナラーゼまたはレナラーゼ断片の値について評価する。一態様では、生体試料は、本明細書に記載の方法に有用なレナラーゼポリペプチドの断片を少なくとも含有する試料である。
【０１９８】
本発明の方法の様々な他の態様では、レナラーゼ値が比較対照に比べて少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも９００％、少なくとも１０００％増加している場合に生体試料のレナラーゼ値が高いと決定する。様々な態様では、レナラーゼまたはレナラーゼ断片の値が高いことは疾患又は障害の指標となる。様々な態様では、疾患または障害は急性腎不全（すなわち腎臓の虚血性状態である急性尿細管壊死（ＡＴＮ））、心血管疾患またはがんである。
【０１９９】
本発明の方法では、対象から採取した生体試料の含有するレナラーゼまたはレナラーゼ断片の値を評価する。生体試料中のレナラーゼまたはレナラーゼ断片の値は、生体試料に含まれる、レナラーゼポリペプチドまたはそのペプチド断片の量、レナラーゼｍＲＮＡまたはその断片の量、レナラーゼ活性（たとえば酵素活性、基質結合活性、受容体結合活性など）の量、あるいはそれらの組み合わせを評価することによって評価できる。一部の態様では、本明細書で他の箇所に記載する本発明の少なくとも１種のレナラーゼ結合性分子を用いて生体試料中のレナラーゼの値を決定する。
【０２００】
本発明の方法の様々な態様では、患者から採取した生体試料に含まれるレナラーゼの値を測定する方法としては以下が挙げられるが、これらに限定されるものではない：免疫クロマトグラフィー試験、免疫ドット試験、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）試験、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）試験、タンパク質マイクロアレイ試験、ウェスタンブロット試験、質量分光光度測定試験、放射免疫測定試験（ＲＩＡ）、放射免疫拡散試験、液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法、オークタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）免疫拡散試験、逆相タンパク質マイクロアレイ、ロケット免疫電気泳動試験、免疫組織染色試験、免疫沈降試験、補体結合試験、ＦＡＣＳ、酵素−基質結合試験、酵素試験、検出可能な分子（発色団、蛍光色素、または放射性基質など）を用いた酵素試験、このような基質を用いた基質結合試験や基質置換試験、ならびにタンパク質チップ試験（以下も参照のこと：2007, Van Emon, Immunoassay and Other Bioanalytical Techniques（免疫検定法および他の生化学分析技術）, CRC Press; 2005, Wild, Immunoassay Handbook（免疫検定法ハンドブック）, Gulf Professional Publishing; 1996, Diamandis and Christopoulos, Immunoassay（免疫検定法）, Academic Press; 2005, Joos, Microarrays in Clinical Diagnosis（臨床診断におけるマイクロアレイ）, Humana Press; 2005, Hamdan and Righetti, Proteomics Today（今日のプロテオミクス）, John Wiley and Sons; 2007）。一部の態様では、本明細書で他の箇所に記載する本発明の少なくとも１種のレナラーゼ結合性分子を用いた試験で生体試料中のレナラーゼの値を決定する。
（キット）
【０２０１】
本発明には、本発明のレナラーゼ結合性分子（たとえば抗体など）またはその組み合わせと、たとえば、レナラーゼ結合性分子またはその組み合わせを本明細書で他の箇所に記載する治療処置または治療以外の処置として個体に投与することなどを記載した説明資料とを含むキットも包含される。一態様では、本発明のキットは、たとえば本発明のレナラーゼ結合性分子を個体に投与する前に本発明のレナラーゼ結合性分子またはその組み合わせを含有する治療組成物を溶解または懸濁するのに適した医薬的に許容される担体（無菌であることが好ましい）をさらに含む。必要に応じて、本発明のキットはレナラーゼ結合性分子を投与するためのアプリケーターをさらに含んでもよい。
【実施例】
【０２０２】
以下、実施例を参照しながら本発明を説明する。これらの実施例は例示のみを目的として記載するものであり、本発明は決してこれらの実施例に限定されるものではなく、本明細書に記載の教示によって明らかとなるあらゆる変更をすべて包含するものと解釈すべきである。
【０２０３】
別に説明がなければ、当業者は上記の説明と下記の実施例によって本発明の化合物を作製・利用でき、特許請求の範囲に記載の方法を実施できるだろう。したがって、以下の実施例は本発明の好ましい態様を具体的に示すものであり、決してそれ以外の本開示の内容を限定すると解釈すべきではない。
（実施例１：レナラーゼ抗体の開発）
【０２０４】
ペプチドを免疫源として用いた。生成したペプチドはアミノ酸９個〜２１個の範囲であり、レナラーゼ−１タンパク質およびレナラーゼ−２タンパク質の領域に対応していた。これらのペプチドはすべてＮ末端またはＣ末端にシステイン残基を有していた。ペプチドの配列を表１に示し、これらのペプチドがレナラーゼ−１またはレナラーゼ−２の配列に対応する箇所を図４の配列比較結果に示す。図のとおり、レナラーゼ−１に特異的なペプチドを１Ａ〜１Ｆ、レナラーゼ−２に特異的なペプチドを３Ａ５とする。各ペプチドを、システインを介して免疫賦活剤ＫＬＨと結合し、これを用いて６匹のウサギを免疫した。各個体から採取した抗血清を、関連ペプチド（ＢＳＡ複合体）と全長のレナラーゼ−１またはレナラーゼ−２の両方を用いたＥＬＩＳＡで抗レナラーゼ抗体価について選別した。さらに、組織可溶化液に含まれる内因性レナラーゼを検出する能力について、ウェスタンブロットで抗血清を試験した。これらの選別基準を用いて、好ましい特性を有する抗体を産生する個体を選択した。一部のペプチドについて、必要な特異性を有する抗体を産生する個体が複数存在する例があった。そのような場合、１体から最終抗血清を採取してポリクローナル抗体を作製し、別の１体（一部の例では２体）から脾臓リンパ球を採取した。他の例では１体から致死採血（terminal bleed）と脾臓摘出を行った。これらのペプチドすべてに対して得たポリクローナル抗体は、致死採血から得た全ＩｇＧをＧタンパク質クロマトグラフィーで精製した後にペプチド親和性クロマトグラフィーでさらに精製することによって作製した。さらに、標準の方法で、選択した個体の脾臓から採取したリンパ球を骨髄腫細胞に融合させてハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの上清を、そのハイブリドーマが対象とするペプチドとの結合性について選別し、次に全長レナラーゼタンパク質に対する結合性についても選別した。選択したハイブリドーマをサブクローニングし抗体を精製するため増殖させた。条件を調節したハイブリドーマからプロテインＡ親和性クロマトグラフィーによってモノクローナル抗体を精製した。
【０２０５】
【表１】
2020138972.tif 000003
【０２０６】
（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）で測定した抗体親和性）
Biacore T100（登録商標）で結合試験を実施した。泳動用緩衝液として２５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８；ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）、グリセロール（１０％）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（０．００５％）、ＢＳＡ（０．１ｍｇ／ｍＬ））を用いて２５℃で結合試験を行った。ビオチン化抗体を以下のように個々のストレプトアビジンセンサーチップフローセル上に固定化した。本試験では２個のセンサーチップを用いたため、別のセンサーチップでもｍＡｂのうち２個を分析し、これを繰り返すことでより多くのデータを収集した。レナラーゼ−１は、５０ｎＭを最高濃度として３倍希釈系列で試験した。５種類の濃度で２回ずつ試験を行った。結合した複合体を、リン酸濃度を１／１０００にして短いパルスを用いて再生した。データセットを全体に適合し、結合定数の推定値を抽出した。概要を表２に示す。
【０２０７】
【表２】
2020138972.tif 000004
【０２０８】
１Ｄ２８−４が最も親和性が高く、これを阻害試験に用いた。
（抗レナラーゼ抗体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列）
【０２０９】
レナラーゼ結合特異性と高親和性を有することから、モノクローナル抗体１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ−４２−７、および３Ａ−５−２を選択した。これらの抗体の抗体重鎖と軽鎖の可変領域のｃＤＮＡを、標準のポリメラーゼ連鎖反応方法と縮重プライマーセットを用いて、上記のサブクローニングしたハイブリドーマから増幅した。１Ｄ−２８−４（ＲＰ−２２０）の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図５に示す。このように、好ましい特性を有する抗体の組成を例示する。
（抗体がレナラーゼのシグナル伝達を阻害することによってがん細胞生存率が低下する）
【０２１０】
一部のがん細胞株ではレナラーゼの発現が上方調節された（図６）ため、レナラーゼががん細胞の生存に有利となったかどうかを確認するための実験を実施した。レナラーゼの発現は母斑および転移性黒色腫では正常皮膚に比べて顕著に増加する（図７）ことがわかり、レナラーゼがメラニン細胞の生存に有利であったことが示唆された。また、ＲｅｎＭｏｎｏＡｂ１（ＲＰ−２２０に対して生成されたモノクローナル抗体）は、Ａ３７５．Ｓ２（変異Ｂ−Ｒａｆ（Ｖ６００Ｅ）を有する黒色腫細胞株）の生存率の低減に非常に有効であり、黒色腫に有効な２種類のアルキル化剤、テモゾロミド（図８）およびダカルバジン（図９）と相乗作用を示した。ＲｅｎＭｏｎｏＡｂ１は黒色腫細胞株Ｓｋ−Ｍｅｌ−２８（変異Ｂ−Ｒａｆ（Ｖ６００Ｅ）および野生型Ｎ−Ｒａｓを発現する）の生存率の低減にも有効であり、テモゾロミドとの相乗作用を示した（図１０）。
【０２１１】
次に、ＲｅｎＭｏｎｏＡｂ１の阻害作用が黒色腫に特異的であるか、より広範な腫瘍細胞に影響するかを決定するために実験を行った。ＣＣＬ−１１９細胞（ＣＣＦ−ＭＥＣ、急性リンパ性白血病細胞株；American Type Culture Collection）は急速に分裂し、高レベルのレナラーゼ発現（ＮＣＩ−６０パネルを構成する細胞の平均値の約３．８倍）を示した（ＢｉｏＧＰＳ．ｏｒｇのマイクロアレイデータ）。ＲｅｎＭｏｎｏＡｂ１は培養下のＣＣＬ−１１９細胞の生存率を有意に低下させた（図１１）。同様に、ＲｅｎＭｏｎｏＡｂ１は２つの膵臓がん細胞株ＭｉａＰａｃおよびＰａｎｃ１の増殖も阻害した（図１２〜図１３）。図１４は黒色腫細胞の数と形態に対するレナラーゼモノクローナル抗体の効果を示す顕微鏡写真である。レナラーゼモノクローナル抗体（たとえば１Ｄ−２８−４）が培養下の黒色腫細胞を阻害することを確認した。図１５は、別の２種類のレナラーゼモノクローナル抗体１Ｃ−２２−１と１Ｄ−３７−１０も黒色腫細胞の増殖を阻害することを示す。これらのデータはレナラーゼ阻害が一部のがんで有用な治療選択肢となり得ることを示している。
（黒色腫患者の予後不良に関連するレナラーゼ過剰発現）
【０２１２】
Ｙａｌｅによる開示とMetastatic Series（患者２６３名を最大３０年間追跡調査したもの）から得た原発性腫瘍および転移性腫瘍の試料でレナラーゼの発現を調べた。自動定量分析（ＡＱＵＡ）技術を用いて、蛍光発光に基づく免疫組織染色を行った（Gouldら、2009 Journal of Clinical Oncology, 27:5772-5780）。これは、抗Ｓ−１００抗体と抗ｇｐ１００で標識して定義した領域での標的抗原の発現を測定する方法である。黒色腫組織でのレナラーゼ発現の増加は疾患特異的死亡率の有意な増加と関連することがわかり（図１６）、レナラーゼ作用の阻害はこの疾患では有用な治療選択肢となり得ることが示唆された。
（実施例２：代替活性化した腫瘍関連マクロファージによるレナラーゼ発現はＳＴＡＴ３が媒介する機構を介して黒色腫の増殖を促進する）
【０２１３】
ＲＮＬＳはＭＡＰＫ経路およびＰＩ３Ｋ経路に関与する生存因子として機能すること、また、ＳＴＡＴ３によって発現を制御される（Sonawaneら、2014 Biochemistry. 53(44):6878-6892）ことから、問題はＲＮＬＳ発現とシグナル伝達ががん細胞の生存に有利であるかどうかである。黒色腫に着目する。黒色腫は、ＭＡＰＫ経路、ＰＩ３Ｋ経路、およびＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の調節異常が起こり、さらなる治療標的が望まれる障害である。
【０２１４】
ＲＮＬＳの発現は黒色腫細胞株と腫瘍試料で顕著に増加する。転移性黒色腫の患者では、ＲＮＬＳ発現は疾患特異的生存率と逆相関する。黒色腫でのＲＮＬＳ発現パターンの試験は、腫瘍に関連する間質の細胞内成分、特にＣＤ１６３陽性マクロファージでは上方制御が主に起こることを示唆している。腫瘍に集まった代替活性化マクロファージ（Ｍ２様、ＣＤ１６３陽性）によって腫瘍への免疫応答が抑制され、血管新生が増大し、腫瘍細胞の移動、浸潤、および転移が促進されるとの実験データがある（Ruhrbergら、2010 Nat Med. 16:861-2; Pollardら、2004 Nat Rev Cancer. 4:71-8; Haoら、2012 Clinical and Developmental Immunology. 2012:11）。ＴＡＭはヒト黒色腫の腫瘍塊の相当の割合を占め、本試験で記載する異種移植モデルでも同様である。
【０２１５】
ＲＮＬＳはＣＤ１６２陽性ＴＡＭで優先的に発現し、このことからＭ２様ＴＡＭがＲＮＬＳの分泌によって腫瘍の進行を促進する可能性があると示唆される。図２２Ｃは、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害で見られる抗腫瘍効果の根本である重要な機構を含む研究モデルを示す。抗ＲＮＬＳモノクローナル抗体ｍ２８−ＲＮＬＳがＲＮＬＳシグナル伝達を阻害することにより、ＣＤ８６陽性ＴＡＭのＣＤ１６３陽性ＴＡＭに対する比は増加し、ＣＤ１６２陽性ＴＡＭによるＲＮＬＳ分泌は減少する。さらに、ｍ２８−ＲＮＬＳは黒色腫細胞でＲＮＬＳシグナル伝達を阻害する。最終的には総ＳＴＡＴ３値とリン酸化ＳＴＡＴ３値が劇的に減少し、アポトーシスが起こる。
【０２１６】
近年、ＲＮＬＳ遺伝子発現を調節する調節プロモーター配列や転写因子が研究されており（Sonawaneら、2014 Biochemistry. 53(44):6878-6892）、そのデータはＳＴＡＴ３の重要な役割を示している。研究結果から、ＳＴＡＴ３を上方制御するシグナルがＲＮＬＳ遺伝子発現を増大し、ＲＮＬＳはＳＴＡＴ３活性を増大する正のフィードバックループがＲＮＬＳとＳＴＡＴ３との間に存在すると示唆される。ＲＮＬＳとＳＴＡＴ３との間にこのような相互作用が存在することは、がんの病態形成におけるＲＮＬＳシグナル伝達の役割に関して重要な意味を有する。実際、ＳＴＡＴファミリータンパク質（特にＳＴＡＴ３）について、悪性形質転換とがん進行を促進する炎症微小環境の誘導・維持での重要な役割を示すデータは多く存在する（Yuら、2009 Nat Rev Cancer. 9:798-809）。悪性細胞ではＳＴＡＴ３シグナル伝達が持続的に活性化されることが多く、この活性化により、腫瘍細胞の増殖が誘発され、さらには、腫瘍微小環境の炎症を維持する多数の遺伝子の産生が増加する。がん細胞および非形質転換と間質細胞との間に正のＳＴＡＴ３フィードバックループがあることは、がんで証明されている（Catlett-Falconeら、1999 Immunity. 10:105-15；Yuら、2007 Nat Rev Immunol. 7:41-51；Araら、2009 Cancer Res. 69:329-37）。たとえば、ＳＴＡＴ３は多発性骨髄腫患者では恒常的に活性化される。ＩＬ−６依存性ヒト骨髄腫細胞株Ｕ２６６では、ＩＬ−６はヤヌスキナーゼを介してＳＴＡＴ３を活性化し、それによって抗アポトーシス因子が上方制御され、腫瘍細胞の生存が促進される（Catlett-Falconeら、1999 Immunity. 10:105-15）。様々な機構を通じて、ＳＴＡＴ３は黒色腫の大部分で恒常的に活性化されて腫瘍細胞の生存、増殖、転移、血管新生を増大し、かつ腫瘍免疫応答を低減することもわかっている（Lesinskiら、2013 Future oncology. 9:925-7；Kortylewskiら、2005 Cancer metastasis reviews. 24:315-27；Emeagiら、2013 Gene therapy. 20:1085-92；Yangら、2010 International journal of interferon, cytokine and mediator research: IJIM. 2010:1-7）。
【０２１７】
ＲＮＬＳは、抗アポトーシス因子Ｂｃｌ２を増加させ実行型カスパーゼの活性化を防止することによって細胞保護を媒介する（Wangら、2014 Journal of the American Society of Nephrology DOI:10.1681/asn.2013060665）。Ａ３７５．Ｓ２細胞でのＲＮＬＳシグナル伝達の阻害は、ｐ３８ＭＡＰＫの持続的活性化、その後に続くアポトーシス因子Ｂａｘの活性化、およびアポトーシスに関連する。ｐ３８ＭＡＰＫは、炎症、細胞分化、細胞周期の制御、およびアポトーシスに関与するストレス活性化タンパク質キナーゼである（Onoら、2000 Cellular Signaling 12：1-13）。たとえば、神経成長因子を除去すると、ＪＮＫおよびｐ３８の持続的活性化とＥＲＫの下方制御の後、アポトーシスが起こることがわかった（Xiaら、1995 Science. 270:1326-31）。しかし、ある条件ではｐ３８を阻害することでアポトーシスを阻止できる（Onoら、2000 Cellular Signalling. 12:1-130）ため、アポトーシスでのｐ３８の役割は明らかに状況に依存する。これらのデータから、Ａ３７５．Ｓ２細胞ではＲＮＬＳに依存するｐ３８の活性化によってアポトーシスが起こると示唆される。
【０２１８】
黒色腫の異種移植では、ＲＮＬＳシグナル伝達を阻害するとＫｉ−６７の発現が顕著に低減する。Ｋｉ−６７は詳細がよくわかっている腫瘍増殖マーカーで、腫瘍の増殖能力の評価に広く利用されるため、このデータはＲＮＬＳシグナル伝達が腫瘍増殖に重要な要素であること、さらにはＲＮＬＳの阻害によって腫瘍の増殖率が低下することを示すものと解釈される。細胞周期進行を決定する重要な因子の多くは同定されており、これにはサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）と２種類のＣＤＫ阻害剤因子（すなわち、サイクリン依存性キナーゼ４阻害因子（ＩＮＫ４）とＣＤＫ相互作用タンパク質／キナーゼ阻害タンパク質（ＣＩＰ／ＫＩＰ）ファミリー）のセットが含まれる（Jungら、2010 Cellular Signalling（細胞シグナル伝達）22:1003-12)。ＣＩＰ／ＫＩＰファミリーに属するＣＤＫ阻害因子であるｐ２１の発現は、ＲＮＬＳシグナル伝達により制御される。ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害はｐ２１発現の顕著な増加と関連がある。ｐ２１は細胞をＧ０期に維持し、Ｇ１期からＳ期への移行を阻止し、Ｇ１期、またはＳ期への移行期で停止させる負の制御因子である（Jungら、2010 Cellular Signalling（細胞シグナル伝達）22:1003-12）。したがって、ｐ２１発現の増加は抗ＲＮＬＳ抗体で処置した腫瘍に見られる細胞増殖の減少によるものだったと考えられる。また、ｐ３８が細胞周期進行に影響を及ぼすこともわかっており（Onoら、2000 Cellular Signalling（細胞シグナル伝達）12:1-13）、抗ＲＮＬＳ抗体での処置によるｐ３８細胞の活性化はも細胞周期進行に関与したと考えられる。
【０２１９】
これらの知見によってＲＮＬＳをがん細胞の生存と増殖を促進する分泌型タンパク質と認識し、悪性黒色腫の処置に抗ＲＮＬＳ治療を単独使用あるいは他のＴＡＭ阻害薬（ＣＳＦ−１Ｒ阻害因子など）または黒色腫阻害薬（ＭＡＰＫ経路阻害因子）と併用することについてさらに調査するための構想を得た。ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３を制御する機構は複数あり、経路間のクロストークが存在するため、細胞運命は複数のシグナルの動的バランスと統合に依存し、上記データからＲＮＬＳの阻害によってこのバランスはがん細胞死に傾くと示唆される。
【０２２０】
以下、本実施例に使用した物質と方法を記載する。
（試薬）
【０２２１】
ヒトの黒色腫細胞株Ａ３７５．Ｓ２、ＳｋＭｅｌ２８、ＳｋＭｅｌ５、ＭｅＷｏ、およびＷＭ２６６−４をAmerican Type Culture Collectionから入手し、推奨のとおりに維持した。文献に記述されているように、組み換えヒトＲＮＬＳを発現させ、精製し、濃縮し、ＰＢＳで透析を行った（Desirら、Journal of the American Heart Association. 2012;1:e002634)。ＲＮＬＳペプチドＲＰ２２０と変異ペプチドＲＰ２２０ＡはUnited Peptide社で合成したものである。ウサギ抗ＲＮＬＳモノクローナル抗体（ＡＢ１７８７００）、ヤギ抗ＲＮＬＳポリクローナル抗体（ＡＢ３１２９１）、ヤギＩｇＧ、およびウサギＩｇＧはＡｂｃａｍ社から購入した。
（抗ＲＮＬＳモノクローナル抗体ｍ２８−ＲＮＬＳ（１Ｄ−２８−４ともいう）とｍ３７−ＲＮＬＳ（１Ｄ−３７−１０ともいう）の合成）
【０２２２】
ＲＮＬＳペプチドＲＰ−２２０をＫＬＨと結合させ、これを用いて６体のウサギを免疫化し、選択した個体の脾臓から採取したリンパ球を骨髄腫細胞に融合させ、ハイブリドーマを生成した。ハイブリドーマの上清を、ｒＲＮＬＳで選別し、選択したハイブリドーマをクローニングし、増殖させて抗体を精製した。条件を調節したハイブリドーマからプロテインＡ親和性クロマトグラフィーによってモノクローナル抗体を精製した。
【０２２３】
Biacore T100（登録商標）システムで測定した結合親和性が高かったことに基づき、２つのクローンｍ２８−ＲＮＬＳ（１Ｄ−２８−４ともいう）（ＫＤ値＝０．３１６ｎＭ）とｍ３７−ＲＮＬＳ（１Ｄ−３７−１０ともいう）（ＫＤ値＝２．６７ｎＭ）を選択した。ｍ２８−ＲＮＬＳのヌクレオチド配列をＰＣＲで決定し、合成し、哺乳類の発現ベクターにクローニングした。２９３−Ｆ細胞に一過性発現させることで合成したｍ２８−ＲＮＬＳを、プロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。
（組織標本）
【０２２４】
ヒト黒色腫のｃＤＮＡアレイＩおよびＩＩをOriGene Technologies, Inc.（Rockville, MD, USA）から入手した。関連する症状の報告はオンラインで入手できる（http://www.origene.com/assets/documents/TissueScan）。US Biomax (Rockville, MD, USA)から入手したヒトの黒色腫組織と正常皮膚組織の試料を免疫組織化学的試験または免疫蛍光試験に用いた。
（定量ＲＴ−ＰＣＲ）
【０２２５】
先に記載した方法で様々な遺伝子の相対発現値をｑＲＴ−ＰＣＲで評価した（Leeら、2013 J Am Soc Nephrol. 24:445-55）。ＲＮＬＳのｍＲＮＡ値、２’−５’−オリゴアデニル酸合成酵素１（ＯＡＳ１）、β−アクチン、および１８ＳリボソームＲＮＡをTaqMan（登録商標）Gene Expression Assay（Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA）を用いたリアルタイムＰＣＲ試験で評価した。結果を閾値サイクル（Ｃｔ）値で表した。標的転写産物の定量結果を内在対照である１８ＳリボソームＲＮＡまたはβアクチンの値に対して正規化した相対値を比較Ｃｔ法（ΔＣｔ）で求め、試験細胞株の間に見られる遺伝子発現の相対的変化を２−ΔΔＣｔ法で製造者のプロトコールに従い分析した（User Bulletin No. 2, Applied Biosystems）。
（免疫組織化学染色分析とウェスタンブロット分析）
【０２２６】
過去に文献に記載された方法で免疫組織化学分析を実施した（Guoら、2012 Cancer science（がん科学）103:1474-80）。要約すると、腫瘍組織をホルマリン固定し、パラフィン包埋して、５μｍの小片に切断してスライドガラスに置いた。スライドガラスの脱パラフィンと水和を行った後、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ：６）を入れた圧力釜で抗原を賦活化した。切片を３％過酸化水素で３０分間、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０に溶解した２．５％正常ウマ血清で１時間、ブロッキングした後、一次抗体およびアイソタイプ対照ＩｇＧと共に４℃で一晩インキュベートした。本試験に用いた抗体は以下のとおりである：ｍ２８−ＲＮＬＳ（５００ｎｇ／ｍｌ）；ヤギ抗ＲＮＬＳポリクローナル抗体（２５０ｎｇ／ｍｌ）（Ａｂｃａｍ、ａｂ３１２９１）；ウサギ抗ＣＤ６８モノクローナル抗体（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１：１００）；ウサギ抗ＣＤ１６３モノクローナル抗体（AbD Serotec、１：１００）；ウサギ抗ＣＤ８６モノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、１：１００）；ウサギ抗Ｋｉ６７モノクローナル抗体（Vector Lab、ＶＰ−ＲＭ０４、１：１００）；ウサギ抗ｐ２１モノクローナル抗体、リン酸化Ｔｙｒ705−ＳＴＡＴ３および総Ｓｔａｔ３（以上Cell Signaling Technologies、それぞれ♯２９４７、１：１００；♯９１４５、１：４００；♯４９０４、１：４００）。ＩｍｍＰＲＥＳＳペルオキシダーゼ−抗ウサギＩｇＧ（Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)を用いて一次抗体を検出した。Vector DAB Substrate Kitを用いて発色させ、ヘマトキシリンでカウンター染色した（Vector Laboratories）。カメラ付き顕微鏡Olympus BX41（Olympus America Inc, Center Valley, PA, USA）でスライドを観察し、撮影した。
【０２２７】
上記の方法でウェスタンブロット分析を実施した（Wangら、2014 Journal of the American Society of Nephrology DOI:10.1681/asn.2013060665）。
（組織マイクロアレイ）
【０２２８】
黒色腫組織マイクロアレイをUS BioMax, Inc.およびYale Tissue Pathology Servicesから購入した。本試験は、イェール大学医学部（Yale University School of Medicine）のHuman Investigation Committeeによる承認を受けている（ＨＩＣ治験実施計画書番号１００３００６４７９）。イェール大学の黒色腫組織マイクロアレイは過去に記載された方法で構築した（Bergerら、2003 Cancer research（がん研究）63:8103-7；Rimmら、2001 Cancer journal（がんジャーナル）7:24-31）。全５４２件の黒色腫の症例を表す合計５７０個の組織コアを一連の対照小片（０．６ｍｍ）と０．８ｍｍ間隔でそれぞれスライドガラスに配置した。イェール大学医学部のDepartment of Pathologyから入手したホルマリン固定化パラフィン包埋組織ブロックを基にコホートを作成した。各例を病理学者が検査し、組織マイクロアレイに含むべき範囲を選択した。試料から得たコア生検をTissue Microarrayer（Beecher Instruments, Sun Prairie, WI)で組織マイクロアレイに置いた。次にこの組織マイクロアレイを切断して５μｍの切片にし、接着テープによる移動システム(Instumedics, Inc., Hackensack, NJ)でスライドガラスに置き、ＵＶ架橋した。標本はすべて１９５９年〜１９９４年に切除されて保管されていた腫瘍から得たもので、２ヶ月〜３８年の範囲で追跡調査が行われた（追跡調査期間の中央値は６０ヶ月である）。コホートの特性は既に記載したとおりである（Bergerら、2004 Cancer research（がん研究）64:8767-72）。
【０２２９】
組織マイクロアレイスライドを上記のとおり染色した（Bergerら、2004 Cancer research（がん研究）64:8767-72；Nicholsonら、2014 Journal of the American College of Surgeons（アメリカ外科学会誌）219:977-87）。免疫組織化学試験について上述したのと同様の手順でスライドを脱パラフィン処理し、再水和し、抗原を賦活化し（ｕｎｍａｓｋｅｄ）、ブロッキングを行った。ｍ２８−ＲＮＬＳと抗Ｓ１００マウスモノクローナル抗体（1:100, Millipore, Temecula, CA, USA）と抗ＨＭＢ４５マウスモノクローナル抗体（1:100, Thermo Scientific, Fremont, CA, USA）とをＢＳＡ／ＴＢＳで希釈したカクテルを用いて、４℃で一晩かけて黒色腫組織アレイを染色した。ＢＳＡ／ＴＢＳで希釈した二次抗体Alexa 488結合ヤギ抗マウス抗体（1：100、Molecular Probes、Eugene、OR）とEnvision抗ウサギ抗体（DAKO）を用いて室温で１時間染色した。スライドをＴＢＳＴ（それぞれ５分間×３回）で洗浄した後、Ｃｙ５−チラミド（Perkin-Elmer Life Science Products, Boston, MA）と共にインキュベートし、セイヨウワサビペルオキシダーゼで活性化することにより、セイヨウワサビペルオキシダーゼと結合した二次抗体のごく付近に、共有結合したＣｙ５色素の沈着が多数みられる。Ｃｙ５は発光ピーク（赤色）が組織の自己蛍光のスペクトル（緑色〜橙色）の範囲から十分に離れているため、Ｃｙ５を用いた。４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールを含有するProlong Gold褪色防止剤を添加してカバーガラスでスライドを密封し、核を可視化した。
（細胞生存率試験）
【０２３０】
全細胞数と生存細胞の割合をトリパンブルーで選別して評価し、細胞数をBioRad TC10（商標）自動細胞計数器で数えることにより評価した。さらに研究するため、細胞生存率をＷＳＴ−１試薬（Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA）を用いて製造者の指示に従い決定した。マイクロプレートリーダーで吸光度を測定した（Power Waves XS, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA）。
（ＲＮＡ干渉）
【０２３１】
ＲＮＬＳを標的とする４種の個別のｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡのＳＭＡＲＴプールをDharmacon（Lafayette, CO, USA）から購入した。製造者の指示に従い、DharmaFECT 4試薬（Dharmacon）を用いてＲＮＬＳのｓｉＲＮＡまたは汎用的な陰性対照低分子干渉ＲＮＡ（Control siRNA, Dharmacon）を細胞に形質移入した。ノックダウン効率をｑＰＣＲで確認した。
（マウス腫瘍モデル）
【０２３２】
１８〜２０ｇの雌の無胸腺ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）をCharles River（Willimantic, CT）から購入し、特定の無菌施設でオートクレーブ滅菌済みの敷藁を使用し、１２時間の明暗周期でＭｉｃｒｏｉｓｏｌａｔｏｒ（登録商標）ケージ内で飼育した。VACHS IACUCの承認を受けた研究プロトコールに従い、マウスには水と食餌を自由に摂らせ、腫瘍の増殖、活性、摂食、疼痛の徴候を観察した。
【０２３３】
Ａ３７５．Ｓ２細胞（ＰＢＳ（ｐＨ７．６）溶液、１００μｌ中２×１０6個）を皮下注射し、異種移植腫瘍を確立した。腫瘍体積が５０〜１００ｍｍ3に達すると、マウスを対照群（ウサギＩｇＧ処置群（ｎ＝１４）、週に１回４０μｇを腹腔内注射（ＩＰ）し、３日毎に腫瘍周辺に４０μｇを皮下注射（ＳＱ））と、ｍ２８−ＲＮＬＳを投与する実験群（ｎ＝１４）（週に１回４０μｇ（ＩＰ）、３日毎に４０μｇ（ＳＱ））とに分けた。腫瘍サイズをデジタルノギスで測定し、体積を公式（縦×横2）×π／２に従って計算した。
【０２３４】
実験終了時にマウスを屠殺し、腫瘍を切除して直ちに液体窒素で瞬間冷凍し、−８０℃で保存した。製造者の指示に従い、ＴＵＮＥＬ試験でアポトーシスを検査した（Roche in situ Apotosis Detection System)。切片を光学顕微鏡で検査し、１０例を無作為に選んで高倍率視野（拡大率：２００倍）で１０００個以上の細胞を計測し、アポトーシス指数を決定した。
（統計分析）
【０２３５】
ウィルコクソン順位和検定およびマンホイットニーのＵ検定を対応データと独立データにそれぞれ用いた。ノンパラメトリックな反復測定に適切である場合、ＡＮＯＶＡ（フリードマン検定）を使用して統計的有意性を評価した。フリードマン検定が統計的有意性を示した場合、ダン検定を用いて対比較を行った。さらにカプラン・マイヤー生存分析と多変量コックス回帰分析を行った。データはすべて平均値±標準誤差（平均値±ＳＥＭ）であり、Ｐ値＜０．０５を統計的有意差と認めた。組織アレイのデータの統計分析は、ＳＰＳＳ（登録商標）ソフトウェアのバージョン２１．０（SPSS Inc., Chicago, IL, USA）で行った。
【０２３６】
以下、本実施例の結果について説明する。
（黒色腫でのＲＮＬＳ過剰発現）
【０２３７】
ＲＮＬＳ発現がヒトの正常な皮膚と悪性黒色腫とで異なるかどうかを判断するため、正常皮膚から良性母斑へ、さらには原発性黒色腫や転移性黒色腫への進行を対象範囲とする組織マイクロアレイ（ＴＭＡ；Yale Tissue Microarray FacilityおよびUS Biomax, Inc.）を検査した。ＹａｌｅのＴＭＡには、１９５９年〜１９９４年に採取した１９２例の原発性黒色腫のコホートから得たホルマリン固定パラフィン包埋標本、１９９７年〜２００４年に採取した２４６例の一連の原発性黒色腫および転移性黒色腫のコホート、良性母斑患者２９５人のコホート、ならびに１５人の患者の対応正常皮膚の標本が含まれた。これらの組織マイクロアレイの人口統計学的特性と臨床的特性については前述のとおりである（Gould Rothbergら、2009 Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology. 27:5772-80）。US Biomaxのアレイには７４例の標本が含まれ、そのうち３５例は原発性黒色腫、１１例は転移病巣、１４例は良性母斑、１４例は正常試料であった。自動免疫蛍光（ＩＦ）定量・顕微鏡検査システム（ＡＱＵＡ）を用いて、約６００個の組織スポットでＲＮＬＳタンパク質の発現を検査した結果、正常皮膚から良性母斑へ、さらに原発性悪性黒色腫、転移性黒色腫への進行には、ＲＮＬＳ発現の有意な増加が伴うことが明らかになった（それぞれ、ｐ＝０．００９、ｐ＝０．０００３、ｐ＜０．００１（図１７Ａ〜図１７Ｃ）。
【０２３８】
問題はＲＮＬＳ発現やシグナル伝達の調節不全が黒色腫の増殖を促す可能性があって予後マーカーとして有用であるかどうかである。１９９７年〜２００４年に採取した２４６例の一連の原発性黒色腫試料および転移性黒色腫試料のコホートの各原発性黒色腫を検査した。１１９人の患者がＡＱＵＡ技術による評価に適した組織スポットを有していた。このグループでは、腫瘍のＲＮＬＳ発現値が高い（ＲＮＬＳのＡＱＵＡスコア＞中央値７５，７６４．４５）患者の予後を、ＲＮＬＳ発現値の低い（ＲＮＬＳのＡＱＵＡスコア＜中央値）患者の予後と比較した。ＲＮＬＳ発現値が高いことは黒色腫特異的死亡の増加と関連していた。すなわち、疾患特異的な５年生存率は５５％対６９％、１０年生存率は３９．７％対５８．５％であり、ｐ値は０．００８であった（図１７Ｄ）。このコホートの多変量解析を行ったところ、黒色腫ではＲＮＬＳ値が独立して生存期間を予測するとわかった（ｐ＝０．００４、ＨＲ＝３．１３０）。診断時の病期（ｐ＝０．０５、ＨＲ＝３．９４０）、Ｃｌａｒｋレベル（ｐ＝０．０１５、ＨＲ＝１．６８７）、および原発性腫瘍の潰瘍形成（ｐ＝０．００１、ＨＲ＝２．５４）も独立して黒色腫における生存期間を予測するとわかった。これらの知見から、ＲＮＬＳの発現は黒色腫の有用な予後マーカーとなる可能性があり、さらに悪性度の高い表現型を有する患者の部分集合を特定するのに役立つ可能性があると示唆される。
（ＲＮＬＳの過剰発現はがん細胞の生存に有利である）
【０２３９】
ＲＮＬＳを媒介するシグナル伝達はアポトーシス抵抗性であり、毒性ストレスにさらされた正常細胞をアポトーシス死から防御する。（Wangら、2014 J Am Soc Nephrol.；Leeら、2013 J Am Soc Nephrol. 24:445-55）。ＲＮＬＳシグナル伝達ががん細胞の生存に有利であるかどうかを調べるため、血清飢餓状態にした培養下の黒色腫細胞（Ａ３７５．Ｓ２、ＭｅＷｏ、ＳｋＭｅｌ５およびＳｋＭｅｌ２８）に組換えＲＮＬＳ（ｒＲＮＬＳ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加し、細胞生存率を測定した。ＢＳＡに比べてＲＮＬＳは顕著に血清飢餓細胞の生存率を増大し、ＷＳＴ−１試験で測定した増殖速度も明らかに増加した（ｎ＝６、ｐ＜０．０５、図１８Ａ）。ＲＮＬＳで処置した患者の全細胞数と生存細胞率を計測し、増殖速度の明らかな増加が細胞増殖の増加によるものか、アポトーシス速度の低減によるものかを決定した。図１８Ｂに示すように、ＲＮＬＳ処置はＢＳＡ処置に比べて細胞数の増加と生存細胞率の増加を示し、ＲＮＬＳがアポトーシス抵抗性の生存因子として機能することが示唆される。
（ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害は生体外で黒色腫細胞に対し細胞障害性を示す）
【０２４０】
ＲＮＬＳの発現とシグナル伝達を阻害することによる機能的結果を黒色腫で確認する３つの手法を用いた。第一に、ＲＮＬＳ発現の低減が細胞生存率にもたらす効果を評価した。ｓｉＲＮＡでＲＮＬＳをノックダウンした結果、黒色腫細胞株Ａ３７５．Ｓ２およびＳｋＭｅｌ２８の生存率は顕著に低下した（図１９Ａ、それぞれｐ＝０．０３、ｐ＝０．００３）。第二に、ＲＮＬＳペプチドＲＰ−２２０はｒＲＮＬＳの保護効果およびシグナル伝達特性を模倣するため、細胞外ＲＮＬＳの受容体の重要な領域と相互作用する可能性があると考えられ、また、ＲＰ−２２０に対する抗体は阻害性を有する可能性があると考えられている。そこで、ＲＰ−２２０に対するモノクローナル抗体のパネルを開発し、がん細胞の生存に対する効果を試験した。ＲＮＬＳに対して生成した２種類のモノクローナル抗体（クローン番号２８−４（ｍ２８−ＲＮＬＳ）および３７−１０（ｍ３７−ＲＮＬＳ））は、試験したすべての（合計５個の）黒色腫細胞株の生存率を低減した。代表例を図１９Ｂ〜図１９Ｃに示す。ｍ２８−ＲＮＬＳは、処置濃度の増加に関連して細胞毒性レベルの増加を示した（ｐ＜０．０５、図１９Ｂ）。第三に、ＲＰ−２２０の正味電荷を減少させることによってペプチド拮抗剤（ＲＰ−２２０Ａ）を生成した（第３位のリジン／アルギニンをアラニンに変更した（図１９Ｄ））。ＲＰ２２０ＡはＲＮＬＳ依存性シグナル伝達を媒介せず、ＰＭＣＡ４ｂに結合して内在性ＲＮＬＳの作用に拮抗する（Wangら、2015 PLoS ONE. 10:e0122932）。ＲＰ−２２０Ａは投与量を増やすと培養下の黒色腫細胞に対し細胞傷害性を有することがわかった（ｐ＜０．００５、図１９Ｄ）。
（ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害は生体内で腫瘍の増殖を阻止する）
【０２４１】
Ａ３７５．Ｓ２（ヒト黒色腫）細胞を無胸腺ヌードマウスに皮下注射し、腫瘍を発生させた。腫瘍体積が約５０ｍｍ3に達すると、個体をウサギＩｇＧ（対照）またはＲＮＬＳ中和モノクローナル抗体ｍ２８−ＲＮＬＳで処置した。試験中、個体の全般的な健康状態と活動は維持され、抗体処置に毒性は認められなかった。腫瘍サイズを１日おきに測定したところ、すべての試験時点でｍ２８−ＲＮＬＳ処置により腫瘍体積が減少した（ｐ＜０．０５、図２０Ａ）。１１日目に個体を全体の腫瘍サイズと潰瘍形成によって屠殺した。細胞増殖マーカーＫｉ６７を有する異種移植腫瘍から採取した切片をＩＨＣ染色し、抗ＲＮＬＳ抗体で処置した腫瘍では、ウサギＩｇＧで処置した腫瘍に比べて細胞増殖が有意に減少したことがわかった。すなわち、対照群の陽性細胞数は３５．１±２．３／高倍率視野であったのに対し、ＲＮＬＳ抗体処置群では１３．４±３．０であった（ｎ＝１４、ｐ＝０．０００４（図２０Ｂ）。
（ＲＮＬＳシグナル伝達を阻害すると内因性ＲＮＬＳ発現とＳＴＡＴ３活性化が阻止されアポトーシスと細胞周期停止が誘発される）
【０２４２】
ＳＴＡＴ３はＲＮＬＳ遺伝子のプロモーター領域に結合して発現を増大することが知られており、正のＲＮＬＳ−ＳＴＡＴ３フィードバックループが示唆されている（Sonawaneら、2014 Biochemistry（生化学）53(44):6878-6892）。対照ＩｇＧで処置した異種移植腫瘍とｍ２８−ＲＮＬＳで処置した異種移植腫瘍の免疫蛍光組織染色と細胞可溶化液の試験を行い、この関連性をさらに調査した。ＩＦで評価したところ、ＲＮＬＳとリン酸化ＳＴＡＴ３および総ＳＴＡＴ３の有意な共発現が腫瘍試料に認められた（図２１Ａ）。ｍ２８−ＲＮＬＳ処置により、ＲＮＬＳタンパク質の発現が劇的に低下し、総ＳＴＡＴ３およびリン酸化ＳＴＡＴ３でも同様であった（図２１Ａ）。タンパク質発現の変化は、図２１Ｂ〜図２１Ｃに示すようにウェスタンブロット法で確認した。ｍ２８−ＲＮＬＳで処置した腫瘍では、リン酸化ＳＴＡＴ３（７０５位のチロシン；ｐ−Ｙ705−ＳＴＡＴ３）と総ＳＴＡＴ３が有意に減少した（ｎ＝８、ｐ＜０．００５、図２１Ｂ〜図２１Ｃ）。
【０２４３】
ＲＮＬＳ発現の有意な減少が黒色腫細胞で主に起こっているかどうかを試験するため、ヒトとマウスの特異的プライマーを用いて腫瘍塊の腫瘍（ヒト）ＲＮＬＳと内因性（マウス）ＲＮＬＳを増幅した。図２１Ｄに示すように、ｍ２８−ＲＮＬＳ処置によりマウスＲＮＬＳの発現は有意に減少したが、ヒト（腫瘍）の発現には影響しなかったことから、腫瘍浸潤性細胞がＲＮＬＳの産生と分泌に重要な役割をもつことが示唆される。
【０２４４】
さらに、細胞周期阻害因子ｐ２１の発現の増加が認められた。抗体での処置により、腫瘍試料では細胞周期制御因子ｐ２１の発現が顕著に増加した。すなわち、抗体処置群では陽性細胞が２４．２±２．４であったのに対し、対照群では１２．２±１．０であった（ｎ＝１４、ｐ＝０．００９）（図２１Ｅ）。末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを用いたｄＵＴＰニック末端標識（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling; TUNEL）法で染色を行ったところ、抗体で処置した腫瘍ではアポトーシスを起こした細胞数の平均値が対照群に比べて有意に増加したことが明らかになった。すなわち、抗体処置群では陽性細胞の平均値は１３．３±０．６であったのに対し、対照群では４．３±０．２であった（ｎ＝１４、ｐ＜０．００１）（図２１Ｅ）。アポトーシスの増加はｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化やその後のＢ細胞リンパ腫２関連タンパク質Ｂａｘの活性化と時間的に関連していた（図２１Ｆ）。これらのデータは、抗ＲＮＬＳ抗体で処置することにより、総ＳＴＡＴ３およびリン酸化ＳＴＡＴ３が顕著に減少し、細胞増殖が低減し、かつ腫瘍細胞のアポトーシスが起こることを示している。
（ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害によってＣＤ８６陽性ＴＡＭのＣＤ１６３陽性ＴＡＭに対する比が増加する）
【０２４５】
メラニン細胞は黒色腫の組織スポットに含まれたＲＮＬＳの主な発生源ではないようであった。というのも、ＲＮＬＳの染色とメラニン細胞の染色との重複はごくわずかだったためである（図１７Ａ）。黒色腫ではマクロファージなどの免疫系細胞が有意に浸潤する場合が多い。浸潤性マクロファージは腫瘍の大部分のＲＮＬＳに関与するようであった。というのも、各組織スポットで認められたＲＮＬＳ染色のうちかなりの成分が汎マクロファージマーカーＣＤ６８と有意に重複していたためである（図２２Ａ、上）。さらに調査し、ＲＮＬＳが主にＣＤ１６３陽性（Ｍ２様）ＴＡＭと共発現することを確認した（図２２Ａ、中央）。ＲＮＬＳとＣＤ８６陽性（Ｍ１様）マクロファージの共発現はごくわずかであった（図２２Ａ、下）。Ｍ２様（ＣＤ１６３陽性）マクロファージは免疫回避に関連し、がんの発症と拡散を促進することがわかっている。一方、Ｍ１様（ＣＤ８６陽性）マクロファージは一般的に炎症を誘発し、腫瘍の増殖を阻害する（Biswasら、2010 Nat Immunol. 11:889-96；Mantovaniら、Trends in Immunology（免疫の傾向）23:549-55)。ｍ２８−ＲＮＬＳ抗体で異種移植片を処置することにより、ＣＤ１６３陽性ＴＭＡの数が大幅に減少し、残った細胞は検出できるほどのＲＮＬＳ発現値を示さなかった（図２２Ｂ）。
（実施例３：細胞膜カルシウムＡＴＰアーゼＰＭＣＡ４ｂを介する持続的なレナラーゼシグナル伝達により膵臓がんの増殖が促進される）
【０２４６】
ＲＮＬＳは、膵臓がんでは異常が起こるＭＡＰＫ経路およびＰＩ３Ｋ経路に関与する生存因子として機能し、発現がシグナル伝達因子および転写ＳＴＡＴ３の活性化因子によって発現を制御される（Sonawaneら、2014 Biochemistry（生物化学）53(44):6878-6892）ため、ＲＮＬＳの発現およびシグナル伝達の制御異常はがん細胞の生存にとって有利であり、腫瘍形成を促進する可能性があると仮定されている（Guoら、2014 Curr Opin Nephrol Hypertens. 23(5):513-8）。
【０２４７】
本明細書では、一部の種類のがんでＲＮＬＳ発現が増加することを実証する。膵管腺がん（ＰＤＡＣ）患者のコホートでは、全体の生存率は腫瘍におけるＲＮＬＳ発現と逆相関し、ＲＮＬＳが病態形成に関与することが示唆された。ｓｉＲＮＡまたは阻害性をもつ抗ＲＮＬＳ抗体を用いてＲＮＬＳ発現を阻害すると、培養ＰＤＡＣ細胞の生存率は低下した。異種移植マウスモデルでは、ＲＮＬＳモノクローナル抗体ｍ２８−ＲＮＬＳはＰＤＡＣの増殖を阻害し、ＳＴＡＴ３を下方制御しｐ２１およびｐ３８を上方制御することによってアポトーシスおよび細胞周期停止を起こした。腫瘍細胞でＲＮＬＳ発現が下方制御されることによってＰＭＣＡ４ｂ（ＲＮＬＳ受容体）の発現も同等に低減し、阻害性をもつＲＮＬＳ抗体を用いた場合に観察されたのと同様に腫瘍サイズが減少した。これらの結果から、ＲＮＬＳ経路はがんの生存に有利なこれまで認識されていなかった機能を有することが明らかであり、ＲＮＬＳの発現が予後マーカーとして機能する可能性があることがわかり、さらには、膵臓がんを管理するための新規な治療標的が特定される。
【０２４８】
ＲＮＬＳ発現の増加がＰＤＡＣの病態形成に関与することと、ＲＮＬＳシグナル伝達を阻害することが治療に有用であることについて証拠を示す。また、観察したＲＮＬＳシグナル伝達阻害剤の抗腫瘍活性に関与する分子機構を調査する。
【０２４９】
総合すれば、これらの知見は、ＲＮＬＳによるシグナル伝達が上方制御されるとＰＤＡＣの病態形成に関与することを示す。ここでは、腫瘍のＲＮＬＳ発現値が高いことによって全体の３年死亡率が２倍に上昇することを実証し、ＲＮＬＳが診断マーカーまたは予後マーカーとしてされることを裏付ける。さらに、ＲＮＬＳは分泌型タンパク質であるため、バイオマーカーとして初発時の腫瘍検出に使用してもよく、処置への応用または再発に関する代替マーカーとして用いてもよい。
【０２５０】
ＲＮＬＳによる細胞保護の主な機構は、ＡＫＴ、ＥＲＫ、およびＳＴＡＴを活性化し、抗アポトーシス因子であるＢｃｌ２を増加させ、実行型カスパーゼの活性化を防止する能力である（Wangら、2014 Journal of the American Society of Nephrology DOI:10.1681/asn.2013060665）。Ｐａｎｃ１細胞でのＲＮＬＳシグナル伝達の阻害は、ｐ３８ＭＡＰＫの持続的活性化とその後に続くアポトーシスに関連する。ｐ３８は、炎症、細胞分化、細胞周期の制御、およびアポトーシスに関連するとされてきたストレス活性化タンパク質キナーゼである（Onoら、2000 Cellular Signaling 12(1)：1-13）。たとえば、神経成長因子を除去すると、ＪＮＫおよびｐ３８の持続的活性化とＥＲＫの下方制御に伴い、アポトーシスが起こる（Xiaら、1995 Science. 270(5240):1326-31）。しかし、ある条件ではｐ３８を阻害することでアポトーシスを阻止できる（Onoら、2000 Cellular Signalling. 12(1):1-13）ため、アポトーシスでのｐ３８の役割は明らかに状況に依存する。本明細書に記載のデータは、Ｐａｎｃ１細胞でｍ２８−ＲＮＬＳに依存してｐ３８が活性化することがアポトーシスに関連するという説明と合致する。
【０２５１】
膵臓がんの異種移植片では、ＲＮＬＳシグナル伝達を阻害するとＫｉ−６７の発現が顕著に低減する。Ｋｉ−６７は細胞分裂レベルの評価に利用されるため、このデータはＲＮＬＳシグナルを阻害すると腫瘍の増殖率が低減するという説明と合致する。細胞周期進行を決定する重要な因子の多くは同定されており、これにはサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）と２種類の内因性ＣＤＫ阻害因子（すなわち、サイクリン依存性キナーゼ４阻害因子（ＩＮＫ４）とＣＤＫ相互作用タンパク質／キナーゼ阻害タンパク質（ＣＩＰ／ＫＩＰ）ファミリーのセットが含まれる（Jungら、2010 Cellular Signalling（細胞シグナル伝達）22(7):1003-12）。データから、ＣＩＰ／ＫＩＰファミリーに属するＣＤＫ阻害因子であるｐ２１の発現はＲＮＬＳシグナル伝達により制御されることが明らかである。ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害はｐ２１発現の顕著な増加と関連する。ｐ２１は細胞をＧ０期に維持し、Ｇ１期からＳ期への移行を阻止し、Ｇ１期、またはＳ期への移行期で停止させる負の制御因子である（Jungら、2010 Cellular Signaling（細胞シグナル伝達）22(7):1003-12）ため、ｐ２１の上方制御がｍ２８−ＲＮＬＳで処置した腫瘍に見られる細胞増殖の低減の原因になった可能性がある。また、ｐ３８が細胞周期進行に影響を及ぼすこともわかっており（Onoら、2000 Cellular Signalling（細胞シグナル伝達）12(1):1-13）、抗ＲＮＬＳ処置によるｐ３８細胞の活性化も細胞周期進行に関与したと考えられる。
【０２５２】
近年、ＲＮＬＳ遺伝子発現を調節する調節プロモーター配列や転写因子が研究されており（Sonawaneら、2014 Biochemistry. 53(44):6878-6892）、そのデータはＳＴＡＴ３の重要な役割を示している。試験結果から、ＳＴＡＴ３を上方制御するシグナルがＲＮＬＳ遺伝子発現を増大し、ＲＮＬＳはＳＴＡＴ３活性を増大する正のフィードバックループがＲＮＬＳとＳＴＡＴ３との間に存在すると示唆される。ＲＮＬＳとＳＴＡＴ３との間にこのような相互作用が存在することは、がんの病態形成におけるＲＮＬＳシグナル伝達の役割に関して重要な意味を有する。ＳＴＡＴファミリータンパク質（特にＳＴＡＴ３）は、悪性形質転換とがん進行を促進する炎症微小環境の誘導・維持と強く関連づけられている（Yuら、2009 Nat Rev Cancer. 9(11):798-809）。がん細胞ではＳＴＡＴ３シグナル伝達が持続的に活性化されることが多く、この活性化により、腫瘍細胞の増殖が誘発され、さらには、腫瘍微小環境の炎症を維持する多数の遺伝子の産生が増加する。がん細胞および非形質転換と間質細胞との間に正のＳＴＡＴ３フィードバックループがあることは、がんで証明されている（Catlett-Falconeら、1999 Immunity. 10(1):105-15；Yuら、2007 Nat Rev Immunol. 7(1):41-51；Araら、2009 Cancer Res. 69(1):329-37）。たとえば、ＳＴＡＴ３は多発性骨髄腫患者では恒常的に活性化される。ＩＬ−６依存性ヒト骨髄腫細胞株Ｕ２６６では、ＩＬ−６はヤヌスキナーゼを介してＳＴＡＴ３を活性化し、それによって抗アポトーシス因子が上方制御され、腫瘍細胞の生存が促進される（Catlett-Falconeら、1999 Immunity. 10(1):105-15）。同様に、ＳＴＡＴ３は膵管腺がんの大部分で恒常的に活性化され、ＫＲＡＳが誘導する水腫瘍形成の開始と進行に必要だと考えられる（Corcoranら、2011 Cancer Res. 71(14):5020-9）。
【０２５３】
ＳＴＡＴ３経路とＲＮＬＳは、ＰＤＡＣの発症で最も一般的かつ重要な環境因子である喫煙の促進にも関与する可能性がある（Muscatら、1997 Cancer epidemiology, biomarkers & prevention（がん疫学、バイオマーカーと予防）：（発行：American Association for Cancer Research、協力：American Society of Preventive Oncology）6(1):15-9；Boyleら、1996 International journal of cancer Journal international du cancer（がん国際ジャーナル）67(1):63-71；Fuchsら、1996 Archives of internal medicine（内科学）156(19):2255-60）。煙草の煙の主要成分であるニコチンは、がんの増殖速度と血管新生を増大することが示されている（Heeschenら、2002 J Clin Invest. 110(4):527-36；Heeschenら、2001 Nat Med. 7(7):833-9）。ニコチンの腫瘍増殖や転移の作用はアセチルコリン受容体α−７ｎＡＣＨＲとの相互作用に起因しＪＡＫ−ＳＴＡＴ３およびＭＥＫ−ＥＲＫ１−２で下流シグナル伝達カスケードを起こすと考えられている（Momiら、2013 Oncogene（がん遺伝子）32(11):1384-95）。これに関して、ニコチンはＳｐ１とＳＴＡＴ３の相乗効果によりＲＮＬＳプロモーター活性を増大する（Sonawaneら、2014 Biochemistry（生化学）53(44):6878-6892）。
【０２５４】
以前より、ＰＭＣＡ４ｂは細胞シグナル伝達、心肥大、およびがんに関与する原形質膜ＡＴＰアーゼとみなされてきた（Cartwrightら、2007 Annals of the New York Academy of Sciences. 1099(1):247-53；Pintonら、2001 EMBO J. 20(11): 2690-2701； Oceandyら、2011 Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1813(5):974-8）。ＰＭＣＡ４ｂはＣａ2+を細胞基質から外環境へ輸送し、局所的なカルシウム濃度を制御すると考えられる。細胞基質のＣａ2+を制御する役割の他、ＰＭＣＡ４ｂは同じくＲａｓとＭＡＰＫを通じてシグナル伝達する巨大分子複合体の中心である（Araら、2009 Cancer Res. 69(1):329-37；Corcoranら、2011 Cancer Res. 71(14):5020-9；Muscatら、1997 Cancer epidemiology, biomarkers & prevention（がん疫学、バイオマーカーと予防）：（発行：American Association for Cancer Research、協力：American Society of Preventive Oncology. 6(1):15-9）。たとえば、腫瘍抑制因子ＲＡＳＳＦ１との相互作用を通じてＲａｓシグナル伝達およびＥＲＫ活性化を調節する（Armesillaら、2004 Journal of Biological Chemistry（米国生化学分子生物学会誌）279(30):31318-28）。このデータは、ＲＮＬＳはＰＭＣＡ４ｂを介してシグナル伝達し、ＰＭＣＡ４ｂの発現を下方制御するかＰＭＣＡ４ｂの酵素作用を阻害することが膵臓腺がん細胞にとって細胞傷害性を有することを示す。これらの知見から、ＰＭＣＡ４ｂはＰＤＡＣの管理で治療標的となると示唆される。
【０２５５】
つまり、これらの知見によってＲＮＬＳをＰＤＡＣの生存と増殖を促進する分泌型タンパク質であると実証される。このことによりＲＮＬＳを阻害する治療をがんの処置に使用することについてさらに調査するための構想が得られる。このことに関して、ＲＮＬＳは、がんにおいて活性であるＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３に関与し相互に関連する複数のシグナルを調節し、この分子は特に魅力的な治療標的となる可能性がある（図２７Ｅ）。
【０２５６】
以下、本実施例に使用した物質と方法を記載する。
（試薬）
【０２５７】
ヒト膵管腺がん細胞株ＢｘＰＣ−３、Ｐａｎｃ１、およびＭｉａＰａＣａ−２をAmerican Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, USA)から入手し、推奨されるとおりに維持した。ｐ３８遮断剤ＳＢ２０３５８０およびＳＴＡＴ３遮断剤ＳｔａｔｔｉｃをAbcam (Cambridge, UK)から購入した。ＪＮＫ阻害剤ＳＰ６００１２５およびＥＲＫ阻害剤Ｕ０１２６をそれぞれSigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)、Cell Signaling Technologies (Beverly MA, USA)から入手した。組換えヒトＲＮＬＳ（ｒＲＮＬＳ）を発現させ、精製し、濃縮し、上記のとおりＰＢＳで透析した（Desirら、2012 J Am Heart Assoc. 1(4):e002634）。ウサギ抗ＲＮＬＳモノクローナル抗体（ＡＢ１７８７００）、抗ＲＮＬＳヤギポリクローナル抗体（ＡＢ３１２９１）、ヤギＩｇＧおよびウサギＩｇＧをＡｂｃａｍから購入した。
（抗ＲＮＬＳモノクローナル抗体ｍ２８−ＲＮＬＳ（１Ｄ−２８−４ともいう）とｍ３７−ＲＮＬＳ（１Ｄ−３７−１０ともいう）の合成）
【０２５８】
ＲＮＬＳペプチドＲＰ−２２０をＫＬＨと結合させ、これを用いて６体のウサギを免疫化し、選択した個体の脾臓から採取したリンパ球を骨髄腫細胞に融合させ、ハイブリドーマを生成した。ハイブリドーマの上清を、ｒＲＮＬＳで選別し、選択したハイブリドーマをクローニングし、増殖させて抗体を精製した。条件を調節したハイブリドーマからプロテインＡ親和性クロマトグラフィーによってモノクローナル抗体を精製した。
【０２５９】
Biacore T100（登録商標）システムで測定した結合親和性が高かったことに基づき、２つのクローンｍ２８−ＲＮＬＳ（ＫＤ値＝０．３１６ｎＭ）とｍ３７−ＲＮＬＳ（ＫＤ値＝２．６７ｎＭ）を選択した。ｍ２８−ＲＮＬＳのヌクレオチド配列をＰＣＲで決定し、合成し、哺乳類の発現ベクターにクローニングした。２９３−Ｆ細胞に一過性発現させることで合成したｍ２８−ＲＮＬＳを、プロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。
（組織標本）
【０２６０】
ヒトのがんｃＤＮＡアレイ（Screen cDNA Arrays IおよびII、膵臓がんｃＤＮＡアレイ）をOriGene Technologies（Rockville, MD, USA）から入手した。関連する症状の報告はオンラインで入手できる（http://www.origene.com/assets/documents/TissueScan）。US Biomax(Rockville, MD, USA)から入手したヒトの膵臓がん組織と正常組織の試料を免疫組織化学試験または免疫蛍光試験に用いた。
（定量ＰＣＲ）
【０２６１】
様々な遺伝子の相対発現値をｑＰＣＲで評価した。ＲＮＬＳのｍＲＮＡ値、２’−５’−オリゴアデニル酸合成酵素１（ＯＡＳ１）、β−アクチン、および１８ＳリボソームＲＮＡをＴａｑＭａｎ（登録商標）Gene ExpressionリアルタイムＰＣＲ試験法（Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA）で評価した。結果を閾値サイクル（Ｃｔ）値で表した。標的転写産物の定量結果を内在対照である１８ＳリボソームＲＮＡまたはβアクチンの値に対して正規化した相対値を比較Ｃｔ法（ΔＣｔ）で求め、試験細胞株の間に見られる遺伝子発現の相対的変化を２−ΔΔＣｔ法で製造者のプロトコールに従い分析した（User Bulletin No. 2, Applied Biosystems）。
（免疫組織染色分析とウェスタンブロット分析）
【０２６２】
過去に文献に記載された方法で免疫組織化学分析を実施した（Guoら、2012 Cancer science（がん科学）103(8):1474-80）。要約すると、腫瘍組織をホルマリン固定し、パラフィン包埋して、５μｍの小片に切断してスライドガラスに置いた。スライドガラスの脱パラフィンと水和を行った後、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ：６）を入れた圧力釜で抗原を賦活化した。切片を３％過酸化水素で３０分間、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０に溶解した２．５％正常ウマ血清で１時間、ブロッキングした後、一次抗体およびアイソタイプ対照ＩｇＧと共に４℃で一晩インキュベートした。本試験に用いた抗体は以下のとおりである：ｍ２８−ＲＮＬＳ（５００ｎｇ／ｍｌ）；ヤギ抗ＲＮＬＳポリクローナル抗体（２５０ｎｇ／ｍｌ）（Ａｂｃａｍ、ａｂ３１２９１）；ウサギ抗Ｋｉ６７モノクローナル抗体（Vector Lab、ＶＰ−ＲＭ０４、１：１００）；ウサギ抗ｐ２１モノクローナル抗体、リン酸化Ｔｙｒ705−Ｓｔａｔ３および総Ｓｔａｔ３（以上Cell Signaling Technologies、それぞれ♯２９４７、１：１００；♯９１４５、１：４００）。ＩｍｍＰＲＥＳＳペルオキシダーゼ−抗ウサギＩｇＧ（Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)を用いて一次抗体を検出した。Vector DAB Substrate Kitを用いて発色させ、ヘマトキシリンでカウンター染色した（Vector Laboratories）。カメラ付き顕微鏡Olympus BX41（Olympus America Inc, Center Valley, PA, USA）でスライドを観察し、撮影した。
【０２６３】
上記の方法でウェスタンブロット分析を実施した（Wangら、2014 Journal of the American Society of Nephrology DOI:10.1681/asn.2013060665）。
（組織マイクロアレイ）
【０２６４】
膵臓組織マイクロアレイをUS BioMaxから購入した。組織マイクロアレイスライドを上記のとおり染色した（Nicholsonら、2014 Journal of the American College of Surgeons（アメリカ外科学会誌）219(5):977-87）。要約すると、ｍ２８−ＲＮＬＳと汎サイトケラチンマウスモノクローナル抗体（1:100, DAKO M3515）を用いて４℃で一晩かけて標本を同時染色した。二次抗体Alexa 488結合ヤギ抗マウス抗体（1：100、Molecular Probes、Eugene、OR）とEnvision抗ウサギ抗体（ＤＡＫＯ）を用いて室温で１時間染色した。スライドをトリス緩衝液で洗浄（それぞれ５分間×３回）した後、Ｃｙ５−チラミド（Perkin-Elmer Life Science Products, Boston, MA）と共にインキュベートし、セイヨウワサビペルオキシダーゼで活性化した。Ｃｙ５は発光ピーク（赤色）が組織の自己蛍光のスペクトル（緑色〜橙色）の範囲に含まれないため、Ｃｙ５を用いた。４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールを含有するProlong Gold褪色防止剤を添加してカバーガラスでスライドを封止し、核を見やすくした可視化した。
（細胞生存率試験）
【０２６５】
トリパンブルーで選別することにより細胞生存率を評価し、BioRad TC10（商標）自動細胞計数器で細胞を数えた。一部の試験では、上記のようにＷＳＴ−１試薬（Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA）を用いて細胞生存率を決定した（Wangら、2014 Journal of the American Society of Nephrology（米国腎臓学会誌）DOI:10.1681/asn.2013060665)。
（アポトーシスおよび細胞周期の分析）
【０２６６】
細胞周期を分析するため、１０ｍＭのＥＤＴＡで培養細胞を分離し、氷冷した７０％エタノールで固定化し、RNAse Aで消化し、ヨウ化プロピジウムで染色した。プロピジウム染色をBD FACSCalibur（商標）流動細胞計測器（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）で検出し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（商標）ソフトウェアで解析した。
【０２６７】
以前より行われている方法でアポトーシスを検出し、定量した（Guoら、2012 Cancer Science（がん科学）103(8):1474-80）。要約すると、製造者の指示に従い、ＦＩＴＣ標識したアネキシンＶとヨウ化プロピジウムで細胞を染色した(Bender MedSystems, Burlingame, CA, USA)。少なくとも２０，０００例をBD FACSCalibur（商標）流動細胞計測器（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）で収集し、CellQuest（商標）ソフトウェアで解析した。
（ＲＮＡ干渉）
【０２６８】
ＲＮＬＳを標的とする４種の個別のｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡのＳＭＡＲＴプールをDharmacon（Lafayette, CO, USA）から購入した。DharmaFECT（商標）4試薬（Dharmacon）を用いて、製造者の提案に従い、ＲＮＬＳのｓｉＲＮＡまたは汎用的な陰性対照ｓｉＲＮＡ（Control siRNA, Dharmacon）を細胞に形質移入した。
【０２６９】
安定に形質移入されたＰａｎｃ１細胞株を生成するため、ＲＮＬＳのｓｈＲＮＡ（ｓｈ−ＲＮＬＳ）または対照ｓｈＲＮＡ（ｓｈ−対照）を有するレンチウイルス（Santa Cruz）を用いて、製造者のプロトコールに従い細胞を形質導入した。細胞を２回形質導入することでｓｈＲＮＡコピー数を増加させ、８０μｇ／ｍｌのピューロマイシンで１０日間かけて選択した後、安定なクローンを確立した。ノックダウン効率をｑＰＣＲで決定した。
マウス異種移植腫瘍モデル
【０２７０】
１８〜２０ｇの雌の無胸腺ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）をCharles River（Willimantic, CT）から入手し、特定の無菌施設でオートクレーブ滅菌済みの敷藁を使用し、１２時間の明暗周期でＭｉｃｒｏｉｓｏｌａｔｏｒ（登録商標）ケージ内で飼育した。VACHS IACUCの承認を受けた研究プロトコールに従い、マウスには水と食餌を自由に摂らせ、腫瘍の増殖、活性、摂食、疼痛の徴候を観察した。
【０２７１】
ＢｘＰＣ３細胞（ＰＢＳ（ｐＨ７．６）溶液、１００μｌ中２×１０6個）を皮下注射し、異種移植腫瘍を確立した。腫瘍体積が５０〜１００ｍｍ3に達すると、マウスを対照群（ウサギＩｇＧ処置群（ｎ＝１４）、４０μｇを腹腔内注射（ＩＰ））と、ｍ２８−ＲＮＬＳを投与する実験群（ｎ＝１４）（３日毎に４０μｇ（ＩＰ））とに分けた。腫瘍サイズをデジタルノギスで測定し、体積を公式（縦×横2）×π／２に従って計算した。別の個体群（それぞれｎ＝６）では、ｓｈ−ＲＮＬＳまたはｓｈ−対照Ｐａｎｃ１細胞（ＰＢＳ（ｐＨ７．６）溶液、１００μｌ中２×１０6個）を皮下注射した。これらの個体には他に処置を行わず、最大３０日間にわたり腫瘍のサイズと体積を測定した。
【０２７２】
実験終了時にマウスを屠殺し、腫瘍を切除して直ちに液体窒素で瞬間冷凍し、−８０℃で保存した。製造者の指示に従い、ＴＵＮＥＬ試験でアポトーシスを検査した（Roche in situ Apotosis Detection System)。切片を光学顕微鏡で検査し、無作為に選択した５例の高倍率視野（拡大率：２００倍）で１０００個以上の細胞を計測し、アポトーシス指数を決定した。
（統計分析）
【０２７３】
ウィルコクソン順位検定およびマンホイットニーのＵ検定を、対応データと独立データにそれぞれ用いた。適切である場合、ノンパラメトリックな反復測定、ＡＮＯＶＡ（フリードマン検定）を使用して統計的有意性を評価した。フリードマン検定で統計的有意性が明らかになった場合、ダン検定を用いて対比較を行った。データはすべて平均値±標準誤差（平均値±ＳＥＭ）であり、Ｐ値＜０．０５を統計的有意差と認めた。組織アレイのデータの統計分析は、ＳＰＳＳ（登録商標）ソフトウェアのバージョン２１．０（SPSS Inc., Chicago, IL, USA）で行った。
【０２７４】
以下、本実施例の結果について説明する。
（ＰＤＡＣでのＲＮＬＳ過剰発現と生存率低下との関連）
【０２７５】
ＲＮＬＳ発現がヒトの正常組織とがん組織とで異なるかどうかを判断するため、１５種類の異なるがんを市販のヒト組織ｃＤＮＡアレイを定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）スクリーニングにより検査した。ＲＮＬＳの発現は膵臓がん、膀胱がん、乳がん、および黒色腫で有意に増加した（図２３Ａ）。膵臓腫瘍では特に生存率が低く、治療選択肢が限られているため、膵臓腫瘍に注目した。ＲＮＬＳの発現はＰＤＡＣ（約３倍）でも膵神経内分泌腫瘍（８倍）でも高かった（図２３Ｂ）。抗ＲＮＬＳモノクローナルｍ２８−ＲＮＬＳを用いた免疫細胞化学試験では、悪性度１〜４のＰＤＡＣでＲＮＬＳの発現が見られ、主にがん細胞に局在することがわかった（図２３Ｃおよび図２８）。ＲＮＬＳは、がん細胞ではほとんど細胞質に分布すると思われた；というのも、ＲＮＬＳはどの悪性度の腫瘍にも見られたが、分化の進んだがん（悪性度Ｉ〜ＩＩＩ）で最も明らかであった。膵神経内分泌腫瘍では、ＲＮＬＳは腫瘍全体の細胞で発現されていた（図２９）。ＲＮＬＳ遺伝子発現は、ＫＲＡＳ変異を有する膵管腺がん細胞株（ＰＤＡＣＣ）（ＭｉａＰａＣａ２およびＰａｎｃ１）では野生型ＫＲＡＳを有する細胞株（ＢｘＰＣ３など）の場合に比べて多かった（図３０）。
【０２７６】
ＰＤＡＣ患者６９名のＲＮＬＳ発現を、ホルマリン固定パラフィン包埋処理した腫瘍コアと対にした隣接正常組織とで構成した組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を用いて特性評価した。試料を採取した個体の人口統計学的特性と臨床的特性を表３に示す。対にしたＰＤＡＣ腫瘍と非腫瘍隣接組織の中から１３８個の組織スポットを、ＲＮＬＳタンパク質の発現について自動免疫蛍光顕微鏡定量システム（ＡＱＵＡ）で無作為に検査した（Gould Rothbergら、2009 Journal of Clinical Oncology（臨床腫瘍学会誌）27(34):5772-80）ところ、全体のＲＮＬＳ値がＰＤＡＣ腫瘍では隣接する非腫瘍膵組織の２倍超であった（ｐ＜０．００１、図２３Ｄ）。
【０２７７】
【表３】
2020138972.tif 000005
【０２７８】
ＲＮＬＳ発現の増加がＰＤＡＣ患者の臨床的挙動に影響するかどうかを判断するため、発現値が予後に影響するかが問題となった。腫瘍のＲＮＬＳ発現値が高い個体（ｎ＝３４、ＲＮＬＳのＡＱＵＡ値＞中央値）では３年生存率が劇的に下がった（２４％対４９％、ｐ＝０．０２４、図２３Ｅ）。これらの知見は、腫瘍のＲＮＬＳ発現値がＰＤＡＣでは有用な予後マーカーとなる可能性があり、より悪性度の高い表現型を有する患者の部分集合を特定するのに役立つ可能性があることを示す。
（ＲＮＬＳはＰＭＣＡ４ｂを介してシグナル伝達し膵臓がん細胞の生存因子として作用する）
【０２７９】
ＲＮＬＳを媒介するシグナル伝達は、毒性ストレスにさらされたＨＫ−２細胞をアポトーシスから防御する（Leeら、2013 J Am Soc Nephrol. 24(3):445-55; Wangら、2014 Journal of the American Society of Nephrology（米国腎臓学会誌）DOI:10.1681/asn.2013060665)。ＲＮＬＳシグナル伝達がストレス下の膵管腺がん細胞（ＰＤＡＣＣ）の生存に有利であるかどうかを調べるため、培養下のＢｘＰＣ３細胞、Ｐａｎｃ１細胞、およびＭｉａＰａＣａ２細胞に４８時間血清を与えず、次の７２時間は組換えＲＮＬＳ（ｒＲＮＬＳ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を培地に添加し、全細胞数と生存細胞数（トリパンブルーで選別）を測定した。ＢＳＡに比べてｒＲＮＬＳはＰＤＡＣＣの生存率を２〜５倍に増大した（図２４Ａ）。
【０２８０】
過酸化水素水またはシスプラチンによる傷害にさらされたＨＫ−２細胞にｒＲＮＬＳを添加することで得られる細胞保護はＥＲＫ活性化に依存することが実証されている（Leeら、2013 J Am Soc Nephrol. 24(3):445-55；Wangら、2014 Journal of the American Society of Nephrology（米国腎臓学会誌）DOI:10.1681/asn.2013060665）。図２４Ｂに示す結果は、ＭＡＰＫキナーゼＭＥＫ１の阻害剤であるＵ０１２６で前処理することによってｒＲＮＬＳの保護効果が抑制されたことから、ｒＲＮＬＳもＥＲＫに依存してＰＤＡＣＣの生存率を改善することを示す。
【０２８１】
ｓｉＲＮＡを用いてＰＭＣＡ４ｂの発現を特異的に下方制御することにより、膵臓がんでＲＮＬＳ依存性のシグナル伝達にＰＭＣＡ４ｂが関与していることについての証拠が得られた。対照実験では、非対象ｓｉＲＮＡはＰＭＣＡ４ｂ遺伝子の発現にもＲＮＬＳを介するＥＲＫリン酸化にも影響しなかった（図２４Ｃ）。一方、ＰＭＣＡ４ｂを標的とするｓｉＲＮＡは遺伝子発現を９０％超も低減し、ＲＮＬＳに依存するＥＲＫリン酸化を約７０％低減した（図２４Ｃ）。ＰＭＣＡ４ｂの阻害は、ＲＮＬＳを媒介するＳＴＡＴ３リン酸化に対しては認識できるほどの影響をもたず、他にもＲＮＬＳ受容体が存在すると示唆される。
【０２８２】
ｒＲＮＬＳが存在する場合にＰＤＡＣ細胞数で観察された増加は、細胞死を予防し、かつ／または細胞増殖を増大するＲＮＬＳシグナル伝達と合致する。ＰＤＡＣＣの明らかな生存率上昇が細胞増殖の増大によるものか、細胞死の比率が低下したことによるものかを調べるため、ＲＮＬＳが細胞周期に及ぼす影響を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析で検査した。図２４Ｄに示すように、ＢＳＡでの処理に比べてｒＲＮＬＳは細胞周期プログラムに何の影響も与えず、このことは、ＲＮＬＳは増殖プログラムには関係なく、細胞死を防止し、生存因子として機能することを示している。
（ＲＮＬＳシグナル伝達を阻害すると膵臓がんの増殖が阻止される）
【０２８３】
ＲＮＬＳの発現とシグナル伝達を阻害することによる膵臓がんでの機能的結果を確認するため、ｓｉＲＮＡでＲＮＬＳをノックダウンすることにより、ＲＮＬＳ発現の低減が生体外で細胞生存率にもたらす効果を評価した。この処置により、ＰＤＡＣＣ細胞Ｐａｎｃ１株およびＭｉａＰａＣａ２株の生存率は顕著に低下した（図２５Ａおよび図３１）。ＲＮＬＳペプチドＲＰ−２２０はｒＲＮＬＳの保護効果およびシグナル伝達特性を模倣するため、細胞外ＲＮＬＳの受容体の重要な領域と相互作用する可能性があると考えられ、また、ＲＰ−２２０に対して生成された抗体は阻害性を有する可能性があると考えられている。ウサギでＲＰ−２２０に対し生成されたモノクローナル抗体のパネルから、高親和性を有することに基づいて２種類のクローン（ｍ２８−ＲＮＬＳおよびｍ３７−ＲＮＬＳ）を選択した（ＫＤ値はそれぞれ０．３１６ｎＭ、２．６７ｎＭ）。図２５Ｂおよび図２５Ｃに示す代表例は、ｍ２８−ＲＮＬＳ、ｍ３７−ＲＮＬＳ、および市販のポリクローナル抗体（ＲＰ−２２０の部分配列に対する）のＰＤＡＣＣの増殖に対する阻害効果を示す。培養細胞でのこれらの試験により、ＲＮＬＳが自己分泌／傍分泌経路を介してＰＤＡＣＣの増殖を刺激するよう作用する可能性が示唆される。
【０２８４】
ＲＮＬＳシグナル伝達を阻害することが生体内での腫瘍の増殖に影響するかどうかを判断するため、ｓｈＲＮＡを用いて、安定に形質移入された２種類のＰａｎｃ１細胞株を生成した。一方には非標的ｓｈＲＮＡ（ｓｈ−対照）、もう一に方はＲＮＬＳを標的とするｓｈＲＮＡ（ｓｈ−ＲＮＬＳ）を形質移入した。ｓｈ−ＲＮＬＳを形質移入した細胞では、ｑＰＣＲで評価したＲＮＬＳ発現が９０％超も減少していた（図３１）。意外なことに、ＲＮＬＳを標的とするｓｈＲＮＡによってＲＮＬＳ発現を阻害した結果、ＲＮＬＳ受容体であるＰＭＣＡ４ｂの発現が顕著に減少し、ＲＮＬＳとＰＭＣＡ４ｂの発現が同時制御されることが示唆される（図３２）。形質移入細胞を無胸腺ヌードマウスに皮下注射して腫瘍サイズを３０日間にわたって評価した。８日目以降、マウスを屠殺した３０日目まで、ｓｈ−ＲＮＬＳを形質移入した細胞によって発生した腫瘍の体積はｓｈ−対照を形質移入した細胞の場合に比べて有意に小さかった（図２５Ｄ）。宿主マウスによるＲＮＬＳの産生と分泌には影響がなかったことから、この結果は、ｓｈ−ＲＮＬＳを形質移入した腫瘍細胞ではＲＮＬＳ受容体ＰＭＣＡ４ｂも同時に阻害されたため循環ＲＮＬＳに無反応だったことを示す。
【０２８５】
阻害性を有する抗体の治療効果を評価するため、ＢｘＰＣ３細胞を無胸腺ヌードマウスに皮下注射し、ウサギＩｇＧ（対照）またはｍ２８−ＲＮＬＳで処置し、腫瘍体積を３週間後まで測定した。図２５Ｅに示すように、ウサギＩｇＧに比べ、ｍ２８−ＲＮＬＳでの処置は腫瘍体積を有意に低減した。まとめると、培養ＰＤＡＣＣ細胞とＰＤＡＣＣの生体内モデルで行ったこれらの試験は、ＲＮＬＳ経路が膵臓がんの増殖を調節し、治療標的となる可能性があるという説得力のある証拠となる。
（ｍ２８−ＲＮＬＳ腫瘍細胞のアポトーシスおよび細胞周期停止の誘導）
【０２８６】
ウサギＩｇＧでの処置またはＲＮＬＳ値を低減するｍ２８−ＲＮＬＳでの処置を受けたマウスから採取したＢｘＰＣ３異種移植腫瘍の切片により、抗体で処置した腫瘍ではアポトーシスが約２倍増大したことが明らかになった（ＴＵＮＥＬ染色）（図２６Ａ）。ｍ２８−ＲＮＬＳでは２８．４±３．３（陽性細胞数／高倍率視野）であったのに対し、ＩｇＧの場合は１４．８±２．３であった（ｎ＝１４、ｐ＝０．００２）。培養下のＰａｎｃ１細胞のＦＡＣＳ分析結果により、ｍ２８−ＲＮＬＳがアポトーシスを引き起こしたことが確認された（図２６Ｂおよび図３３）。ｍ２８−ＲＮＬＳ抗体で処置することにより、処置の１日後に始まったｐ３８ＭＡＰＫの持続的リン酸化が起こった（図２６Ｃ）。
【０２８７】
ｍ２８−ＲＮＬＳによるＢｘＰＣ３腫瘍の処置はさらに、細胞増殖マーカーＫｉ６７の発現を２．５倍低減し（ｍ２８−ＲＮＬＳ対ＩｇＧ：１３７．１±１４．９対３４０．２±１１．９（陽性細胞数／高倍率視野）、ｎ＝１４、ｐ＝１．４×１０-8）（図２６Ｄ、上）、さらには細胞周期制御因子ｐ２１の発現を約４倍増大した（ｍ２８−ＲＮＬＳ対ＩｇＧ：１７８．１±１１．４対４２．２±４．７．６（陽性細胞数／高倍率視野）、ｎ＝１４、ｐ＝１．６×１０-10）（図２６Ｄ、下）。Ｐａｎｃ１細胞のＦＡＣＳ分析を実施し、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害が細胞周期に及ぼす効果について調べた。図２６Ｅのデータから、Ｇ１期前に大きなピークが出現していることから明らかなように、ＲＮＬＳの阻害がアポトーシスを引き起こしたことが確認できる。これらのデータからは、Ｇ２期に顕著な減少が明らかであり、ｍ２８−ＲＮＬＳによるＲＮＬＳシグナル伝達の阻害がＧ２期前の細胞周期停止を引き起こしたことがわかる。
（正のＲＮＬＳ−ＳＴＡＴ３フィードバックループの存在とｍ２８−ＲＮＬＳによるその妨害）
【０２８８】
ＳＴＡＴ３はＲＮＬＳ遺伝子のプロモーター領域に結合してその発現を増大する（Sonawaneら、2014 Biochemistry（生化学）53(44):6878-6892）。ＲＮＬＳで処置したＨＫ−２細胞ではＳＴＡＴ３の７２７位のセリンのリン酸化（ｐ−Ｓｅｒ727−ＳＴＡＴ３）および７０５位のチロシンのリン酸化（ｐ−Ｙ705−ＳＴＡＴ３）がそれぞれ２倍と４倍に増加したのに対し、ＳＴＡＴ１には変化がない（図３４）という所見から、正のＲＮＬＳ−ＳＴＡＴ３フィードバックループが示唆される。図２７Ａ〜Ｂに示すように、ＲＮＬＳをＰＤＡＣＣ株Ｐａｎｃ１に添加すると、リン酸化ＳＴＡＴ３（ｐ−Ｓｅｒ727−ＳＴＡＴ３およびｐ−Ｙ705−ＳＴＡＴ３）が急速に増加した。Ｐａｎｃ１でｍ２８−ＲＮＬＳによるＲＮＬＳシグナル伝達の阻害の結果ｐ−Ｙ705−ＳＴＡＴ３が長期的かつ持続的に減少した（図２７Ｃ〜図２７Ｄ）という知見からもＲＮＬＳ−ＳＴＡＴ３フィードバックループの存在が裏付けられる。
＜配列表＞
【０２８９】
＜配列番号１：抗原配列１ａ；ＰＲＴ；ヒト（homo sapiens）＞
AVWDKADDSGGRMTTAC
【０２９０】
＜配列番号２：抗原配列１ｂ；ＰＲＴ；ヒト＞
AVWDKAEDSGGRMTTAC
【０２９１】
＜配列番号３：抗原配列１ｃ；ＰＲＴ；ヒト＞
CTPHYAKKHQRFYDEL
【０２９２】
＜配列番号４：抗原配列１ｄ；ＰＲＴ；ヒト＞
CIRFVSIDNKKRNIESSEIGP
【０２９３】
＜配列番号５：抗原配列１ｅ；ＰＲＴ；ヒト＞
PGQMTLHHKPFLAC
【０２９４】
＜配列番号６：抗原配列１ｆ；ＰＲＴ；ヒト＞
CVLEALKNYI
【０２９５】
＜配列番号７：抗原配列３ａ；ＰＲＴ；ヒト＞
PSAGVILGC
【０２９６】
＜配列番号８：ヒトレナラーゼ−１タンパク質（３７位のアミノ酸がグルタミン酸になる多型）；ＰＲＴ；ヒト＞
【化１】
2020138972.tif 000006
【０２９７】
＜配列番号９：１Ｄ−２８−４の重鎖の全長アミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ（oryctolagus cuniculus）＞
【化２】
2020138972.tif 000007
【０２９８】
＜配列番号１０：１Ｄ−２８−４の軽鎖の全長アミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
【化３】
2020138972.tif 000008
【０２９９】
＜配列番号１１：１Ｄ−２８−４の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
LSSFAVG
【０３００】
＜配列番号１２：１Ｄ−２８−４の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
IISSVGITRYASWAAG
【０３０１】
＜配列番号１３：１Ｄ−２８−４の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
YGYSGDVNRLDL
【０３０２】
＜配列番号１４：１Ｄ−２８−４の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
SQSVYDNNNLA
【０３０３】
＜配列番号１５：１Ｄ−２８−４の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
GASTLAS
【０３０４】
＜配列番号１６：１Ｄ−２８−４の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
LGEFSCSSADCFA
【０３０５】
＜配列番号１７：１Ｄ−３７−１０の重鎖の全長アミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
【化４】
2020138972.tif 000009
【０３０６】
＜配列番号１８：１Ｄ−３７−１０の軽鎖の全長アミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
【化５】
2020138972.tif 000010
【０３０７】
＜配列番号１９：１Ｄ−３７−１０の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
LSDYAII
【０３０８】
＜配列番号２０：１Ｄ−３７−１０の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
IIGSSGDTFYATWAKG
【０３０９】
＜配列番号２１：１Ｄ−３７−１０の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
RYAGTTDYHDAFDP
【０３１０】
＜配列番号２２：１Ｄ−３７−１０の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
SQNIYNYLS
【０３１１】
＜配列番号２２：１Ｄ−３７−１０の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
KASTLTS
【０３１２】
＜配列番号２４：１Ｄ−３７−１０の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
QINYSIYNHYNII
【０３１３】
＜配列番号２５：１Ｆ−２６−１の重鎖の全長アミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
【化６】
2020138972.tif 000011
【０３１４】
＜配列番号２６：１Ｆ−２６−１の軽鎖の全長アミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
【化７】
2020138972.tif 000012
【０３１５】
＜配列番号２７：１Ｆ−２６−１の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
LSSYGVT
【０３１６】
＜配列番号２８：１Ｆ−２６−１の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
LIGDRGTTFYASWAKS
【０３１７】
＜配列番号２９：１Ｆ−２６−１の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
GSGYGARI
【０３１８】
＜配列番号３０：１Ｆ−２６−１の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
SQSVYKNNYLA
【０３１９】
＜配列番号３１：１Ｆ−２６−１の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
ETSKLAS
【０３２０】
＜配列番号３２：１Ｆ−２６−１の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
QGGYSGVDFMA
【０３２１】
＜配列番号３３：１Ｆ−４２−７の重鎖の全長アミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
【化８】
2020138972.tif 000013
【０３２２】
＜配列番号３４：１Ｆ−４２−７の軽鎖の全長アミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
【化９】
2020138972.tif 000014
【０３２３】
＜配列番号３５：１Ｆ−４２−７の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
LTTYGVT
【０３２４】
＜配列番号３６：１Ｆ−４２−７の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
LIGDRGTTYYASWVNG
【０３２５】
＜配列番号３７：１Ｆ−４２−７の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
GSGYGARI
【０３２６】
＜配列番号３８：１Ｆ−４２−７の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
SQTVYNNNYLS
【０３２７】
＜配列番号３９：１Ｆ−４２−７の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
ETSKLSS
【０３２８】
＜配列番号４０：１Ｆ−４２−７の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
QGGYSGVDFM
【０３２９】
＜配列番号４１：３Ａ−５−２の重鎖の全長アミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
【化１０】
2020138972.tif 000015
【０３３０】
＜配列番号４２：３Ａ−５−２の軽鎖の全長アミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
【化１１】
2020138972.tif 000016
【０３３１】
＜配列番号４３：３Ａ−５−２の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
LNNYHIY
【０３３２】
＜配列番号４４：３Ａ−５−２の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
IIFNGGTYYARWTKG
【０３３３】
＜配列番号４５：３Ａ−５−２の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
GDGI
【０３３４】
＜配列番号４６：３Ａ−５−２の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
SQSVFNNNYLA
【０３３５】
＜配列番号４７：３Ａ−５−２の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
SASTLAS
【０３３６】
＜配列番号４８：３Ａ−５−２の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列；ＰＲＴ；アナウサギ＞
AGSFDCNSGDCVA
【０３３７】
＜配列番号４９：ヒトレナラーゼ−１の核酸配列（１１１位のヌクレオチドに多型の可能性が認められる）；ＤＮＡ；ヒト＞
【化１２】
2020138972.tif 000017
【０３３８】
＜配列番号５０：ヒトレナラーゼ−２のアミノ酸配列（３７位のアミノ酸がグルタミン酸になる多型が認められる；ＰＲＴ；ヒト＞
【化１３】
2020138972.tif 000018
【０３３９】
＜配列番号５１：ヒトレナラーゼ−２の核酸配列（１１１位のヌクレオチドに多型の可能性が認められる）；ＤＮＡ；ヒト＞
【化１４】
2020138972.tif 000019
【０３４０】
＜配列番号５２：１Ｄ−２８−４の重鎖の全長核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
【化１５】
2020138972.tif 000020
【０３４１】
＜配列番号５３：１Ｄ−２８−４の軽鎖の全長核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
【化１６】
2020138972.tif 000021
【０３４２】
＜配列番号５４：１Ｄ−２８−４の重鎖ＣＤＲ１の核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
ctcagtagttttgcagtgggc
【０３４３】
＜配列番号５５：１Ｄ−２８−４の重鎖ＣＤＲ２の核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
atcattagtagtgttggtattacacgctacgcgagctgggcggccggc
【０３４４】
＜配列番号５６：１Ｄ−２８−４の重鎖ＣＤＲ３の核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
tatggttatagtggtgatgttaatcggttggatctc
【０３４５】
＜配列番号５７：１Ｄ−２８−４の軽鎖ＣＤＲ１の核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
agtcagagtgtttatgataacaacaacttagcc
【０３４６】
＜配列番号５８：１Ｄ−２８−４の軽鎖ＣＤＲ２の核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
ggtgcatccactctggcatct
【０３４７】
＜配列番号５９：１Ｄ−２８−４の軽鎖ＣＤＲ３の核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
ctaggcgaatttagttgtagtagtgctgattgttttgct
【０３４８】
＜配列番号６０：１Ｄ−３７−１０の重鎖の全長核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
【化１７】
2020138972.tif 000022
【０３４９】
＜配列番号６１：１Ｄ−３７−１０の軽鎖の全長核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
【化１８】
2020138972.tif 000023
【０３５０】
＜配列番号６２：１Ｄ−３７−１０の重鎖ＣＤＲ１の核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
ctcagtgactatgcaataatc
【０３５１】
＜配列番号６３：１Ｄ−３７−１０の重鎖ＣＤＲ２の核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
attattggtagtagtggtgacacattctacgcgacctgggcgaaaggc
【０３５２】
＜配列番号６４：１Ｄ−３７−１０の重鎖ＣＤＲ３の核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
cgttatgctggtactactgattatcatgatgcttttgatccc
【０３５３】
＜配列番号６５：１Ｄ−３７−１０の軽鎖ＣＤＲ１の核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
agtcagaacatttacaactacttatcc
【０３５４】
＜配列番号６６：１Ｄ−３７−１０の軽鎖ＣＤＲ２の核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
aaggcctccactctgacttct
【０３５５】
＜配列番号６７：１Ｄ−３７−１０の軽鎖ＣＤＲ３の核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
caaatcaattactctatttataatcattataatattatt
【０３５６】
＜配列番号６８：１Ｆ−２６−１の重鎖の全長核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
【化１９】
2020138972.tif 000024
【０３５７】
＜配列番号６９：１Ｆ−２６−１の軽鎖の全長核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
【化２０】
2020138972.tif 000025
【０３５８】
＜配列番号７０：１Ｆ−２６−１の重鎖ＣＤＲ１の核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
ctcagtagctatggagtgacc
【０３５９】
＜配列番号７１：１Ｆ−２６−１の重鎖ＣＤＲ２の核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
ttgattggtgatcgtggtactacgttctacgcgagctgggcgaaaagc
【０３６０】
＜配列番号７２：１Ｆ−２６−１の重鎖ＣＤＲ３の核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
Gggagtgggtatggtgctcgcatc
【０３６１】
＜配列番号７３：１Ｆ−２６−１の軽鎖ＣＤＲ１の核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
agtcagagtgtttataagaacaactacttagcc
【０３６２】
＜配列番号７４：１Ｆ−２６−１の軽鎖ＣＤＲ２の核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
gaaacatccaaactggcatct
【０３６３】
＜配列番号７５：１Ｆ−２６−１の軽鎖ＣＤＲ３の核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
caaggcggttatagtggtgttgattttatggct
【０３６４】
＜配列番号７６：１Ｆ−４２−７の重鎖の全長核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
【化２１】
2020138972.tif 000026
【０３６５】
＜配列番号７７：１Ｆ−４２−７の軽鎖の全長核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
【化２２】
2020138972.tif 000027
【０３６６】
＜配列番号７８：１Ｆ−４２−７の重鎖ＣＤＲ１の核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
ctcactacctatggagtgacc
【０３６７】
＜配列番号７９：１Ｆ−４２−７の重鎖ＣＤＲ２の核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
ttgattggtgatcgcggtaccacttactacgcgagctgggtgaatggc
【０３６８】
＜配列番号８０：１Ｆ−４２−７の重鎖ＣＤＲ３の核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
gggagtggatatggtgctcgcatc
【０３６９】
＜配列番号８１：１Ｆ−４２−７の軽鎖ＣＤＲ１の核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
agtcagactgtttataacaataactacttatcc
【０３７０】
＜配列番号８２：１Ｆ−４２−７の軽鎖ＣＤＲ２の核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
gaaacatccaaactgtcatct
【０３７１】
＜配列番号８３：１Ｆ−４２−７の軽鎖ＣＤＲ３の核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
ggcggttatagtggtgttgattttatggct
【０３７２】
＜配列番号８４：３Ａ−５−２の重鎖の全長核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
【化２３】
2020138972.tif 000028
【０３７３】
＜配列番号８５：３Ａ−５−２の軽鎖の全長核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
【化２４】
2020138972.tif 000029
【０３７４】
＜配列番号８６：３Ａ−５−２の重鎖ＣＤＲ１の核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
ctcaataactaccacatatac
【０３７５】
＜配列番号８７：３Ａ−５−２の重鎖ＣＤＲ２の核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
atcattttcaatggtggcacatattacgcgagatggacaaaaggc
【０３７６】
＜配列番号８８：３Ａ−５−２の重鎖ＣＤＲ３の核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
ggggacggcatc
【０３７７】
＜配列番号８９：３Ａ−５−２の軽鎖ＣＤＲ１の核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
agtcagagtgtttttaataacaactatttagcc
【０３７８】
＜配列番号９０：３Ａ−５−２の軽鎖ＣＤＲ２の核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
tctgcatccactctggcgtct
【０３７９】
＜配列番号９１：３Ａ−５−２軽鎖ＣＤＲ３の核酸配列；ＤＮＡ；アナウサギ＞
Gcaggcagttttgattgtaatagtggtgattgtgttgct
【０３８０】
＜配列番号９２：代替のヒトレナラーゼ−１タンパク質（３７位のアミノ酸がアスパラギン酸になる多型が認められる）；ＰＲＴ；ヒト＞
【化２５】
2020138972.tif 000030
【０３８１】
＜配列番号９３：代替のヒトレナラーゼ−１の核酸配列（１１１位のヌクレオチドに多型の可能性が認められる）；ＤＮＡ；ヒト＞
【化２６】
2020138972.tif 000031
【０３８２】
＜配列番号９４：代替のヒトレナラーゼ−２のアミノ酸配列（３７位のアミノ酸がアスパラギン酸になる多型が認められる）；ＰＲＴ；ヒト＞
【化２７】
2020138972.tif 000032
【０３８３】
＜配列番号９５：代替のヒトレナラーゼ−２の核酸配列（１１１位のヌクレオチドに多型の可能性が認められる）；ＤＮＡ；ヒト＞
【化２８】
2020138972.tif 000033
【０３８４】
本明細書で引用したすべての特許、特許出願、および刊行物それぞれの開示内容全体は、これらを参照することによって本明細書に組み込まれる。
【０３８５】
特定の態様を参照して本発明を開示したが、当然ながら、本発明の真の精神および範囲から逸脱しない範囲で本発明のこれら以外の実施形態や変形を他の当業者が考案してもよい。添付の特許請求の範囲はそのような態様および同等の変形をすべて含むと解釈するものとする。
【図１Ａ】
2020138972.tif 000034
【図１Ｂ】
2020138972.tif 000035
【図２】
2020138972.tif 000036
【図３】
2020138972.tif 000037
【図４】
2020138972.tif 000038
【図５Ａ】
2020138972.tif 000039
【図５Ｂ】
2020138972.tif 000040
【図５Ｃ−ｉ】
2020138972.tif 000041
【図５Ｃ−ｉｉ】
2020138972.tif 000042
【図５Ｄ】
2020138972.tif 000043
【図５Ｅ−ｉ】
2020138972.tif 000044
【図５Ｅ−ｉｉ】
2020138972.tif 000045
【図５Ｆ】
2020138972.tif 000046
【図５Ｇ−ｉ】
2020138972.tif 000047
【図５Ｇ−ｉｉ】
2020138972.tif 000048
【図５Ｈ】
2020138972.tif 000049
【図５Ｉ−ｉ】
2020138972.tif 000050
【図５Ｉ−ｉｉ】
2020138972.tif 000051
【図５Ｊ】
2020138972.tif 000052
【図６】
2020138972.tif 000053
【図７】
2020138972.tif 000054
【図８】
2020138972.tif 000055
【図９】
2020138972.tif 000056
【図１０】
2020138972.tif 000057
【図１１】
2020138972.tif 000058
【図１２】
2020138972.tif 000059
【図１３】
2020138972.tif 000060
【図１４】
2020138972.tif 000061
【図１５】
2020138972.tif 000062
【図１６】
2020138972.tif 000063
【図１７Ａ】
2020138972.tif 000064
【図１７Ｂ】
2020138972.tif 000065
【図１７Ｃ】
2020138972.tif 000066
【図１７Ｄ】
2020138972.tif 000067
【図１８Ａ】
2020138972.tif 000068
【図１８Ｂ】
2020138972.tif 000069
【図１９Ａ】
2020138972.tif 000070
【図１９Ｂ】
2020138972.tif 000071
【図１９Ｃ】
2020138972.tif 000072
【図１９Ｄ】
2020138972.tif 000073
【図２０Ａ】
2020138972.tif 000074
【図２０Ｂ】
2020138972.tif 000075
【図２１Ａ】
2020138972.tif 000076
【図２１Ｂ】
2020138972.tif 000077
【図２１Ｃ】
2020138972.tif 000078
【図２１Ｄ】
2020138972.tif 000079
【図２１Ｅ】
2020138972.tif 000080
【図２１Ｆ】
2020138972.tif 000081
【図２２Ａ】
2020138972.tif 000082
【図２２Ｂ】
2020138972.tif 000083
【図２２Ｃ】
2020138972.tif 000084
【図２３Ａ】
2020138972.tif 000085
【図２３Ｂ】
2020138972.tif 000086
【図２３Ｃ】
2020138972.tif 000087
【図２３Ｄ】
2020138972.tif 000088
【図２３Ｅ】
2020138972.tif 000089
【図２４Ａ】
2020138972.tif 000090
【図２４Ｂ】
2020138972.tif 000091
【図２４Ｃ】
2020138972.tif 000092
【図２４Ｄ】
2020138972.tif 000093
【図２５Ａ】
2020138972.tif 000094
【図２５Ｂ】
2020138972.tif 000095
【図２５Ｃ】
2020138972.tif 000096
【図２５Ｄ】
2020138972.tif 000097
【図２５Ｅ】
2020138972.tif 000098
【図２６Ａ】
2020138972.tif 000099
【図２６Ｂ】
2020138972.tif 000100
【図２６Ｃ】
2020138972.tif 000101
【図２６Ｄ】
2020138972.tif 000102
【図２６Ｅ】
2020138972.tif 000103
【図２７Ａ】
2020138972.tif 000104
【図２７Ｂ】
2020138972.tif 000105
【図２７Ｃ】
2020138972.tif 000106
【図２７Ｄ】
2020138972.tif 000107
【図２７Ｅ】
2020138972.tif 000108
【図２８】
2020138972.tif 000109
【図２９】
2020138972.tif 000110
【図３０】
2020138972.tif 000111
【図３１】
2020138972.tif 000112
【図３２】
2020138972.tif 000113
【図３３】
2020138972.tif 000114
【図３４】
2020138972.tif 000115
【配列表】
2020138972000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月5日(2020.6.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の任意の発明。
【外国語明細書】
2020138972000001.pdf