(57)【要約】【課題】結晶化の遅いPHA共重合体の結晶化速度を向上させ、射出成形、フィルム成形、ブロー成形、繊維の紡糸、押出発泡、ビーズ発泡などの加工におけるPHA共重合体の溶融加工性を改善し、生産性を向上する。【解決手段】共重合PHA（A）を合成するAeromonas属由来のPHA 合成酵素をコードする遺伝子と、前記共重合PHA（A）とは融点が10℃以上異なるPHA（B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子の両方を有する微生物を培養することによって、融点の10℃以上異なる2種類以上のPHAを前記微生物の細胞内で同時に生産する工程を含む、PHA混合品の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
共重合PHA（A）を合成するAeromonas属由来のPHA 合成酵素をコードする遺伝子と、前記共重合PHA（A）より融点が10℃以上高いPHA（B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子の両方を有し、Cupriavidus属である微生物を培養することによって、融点の10℃以上異なる2種類以上のPHAを前記微生物の細胞内で同時に生産する工程を含む、PHA混合品の製造方法であって、
PHA（B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子が、Aeromonas属とは異なる生物種由来のPHA合成酵素をコードする遺伝子であり、
共重合PHA（A）が、少なくとも３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含有する共重合体であり、
共重合PHA（A）を合成するAeromonas属由来のPHA合成酵素をコードする遺伝子が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、または前記アミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し、且つPHA合成酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であり、
前記PHA混合品における共重合PHA（A）とPHA（B）の合計量に対するPHA（B）の量が、0.1重量％以上50重量％以下である、PHA混合品の製造方法。
【請求項２】
共重合PHA（A）が、３−ヒドロキシヘキサン酸をモノマーユニットとして8モル％以上含有する共重合体である請求項１に記載のPHA混合品の製造方法。
【請求項３】
得られるPHA混合品が、DSC曲線において、85〜180℃の間で少なくとも２つの吸熱ピークを示し、最も高温側の吸熱ピークの熱量が0.2 〜20 J/gである、請求項１又は２に記載のPHA混合品の製造方法。
【請求項４】
共重合PHA（A）が、３−ヒドロキシヘキサン酸をモノマーユニットとして３モル％以上８モル％未満含有する共重合体である請求項１に記載のPHA混合品の製造方法。
【請求項５】
得られるPHA混合品が、DSC曲線において、85〜180℃の間で１つの吸熱ピークしか示さず、160℃より高い部分の吸熱量が0.5〜12 J/gである、請求項１〜２，４のいずれか１項に記載のPHA混合品の製造方法。
【請求項６】
共重合PHA（A）を合成するAeromonas属由来のPHA 合成酵素をコードする遺伝子と、前記共重合PHA（A）より融点が10℃以上高いPHA（B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子の両方を有し、Cupriavidus属である微生物であって、
PHA（B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子が、Aeromonas属とは異なる生物種由来のPHA合成酵素をコードする遺伝子であり、
共重合PHA（A）が、少なくとも３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含有する共重合体であり、
共重合PHA（A）を合成するAeromonas属由来のPHA合成酵素をコードする遺伝子が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、または前記アミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し、且つPHA合成酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、微生物。
【請求項７】
微生物がCupriavidus necatorである請求項６に記載の微生物。
【請求項８】
PHA（B）を合成するPHA合成酵素が、ポリヒドロキシブチレートを合成するPHA合成酵素である、請求項６又は７に記載の微生物。
【請求項９】
PHA（B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子が、Cupriavidus属由来のPHA合成酵素をコードする遺伝子である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１０】
PHA（B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子が、Cupriavidus necatorに由来する配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、または前記アミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し、且つPHA合成酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、請求項９に記載の微生物。
【請求項１１】
さらに、R体特異的エノイル-CoAヒドラターゼをコードする遺伝子を有しており、当該R体特異的エノイル-CoAヒドラターゼをコードする遺伝子の発現が強化されている請求項６〜１０のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１２】
さらに、phbA遺伝子および／またはbktＢ遺伝子を有しており、当該phbA遺伝子の発現が抑制されている、および／または、当該bktB遺伝子の発現が強化されている、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、融点の異なる２つ以上のPHAを細胞内で生産するための微生物、およびそれを用いた結晶固化速度の速いPHAの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヒドロキシアルカン酸（以下、PHAと略す）は、多くの微生物種の細胞内にエネルギー貯蔵物質として生産、蓄積される熱可塑性ポリエステルである。微生物によって様々な天然の炭素源から生産されるPHAは、土中や水中の微生物により完全に生分解されるため、自然界の炭素循環プロセスに取り込まれることになる。したがって、PHAは生態系への悪影響がほとんどない環境調和型のプラスチックであると言える。近年、環境汚染、廃棄物処理、石油資源の観点から、合成プラスチックが深刻な社会問題となるに至り、PHAが環境にやさしいグリーンプラスチックとして注目され、その実用化が切望されている。
【０００３】
微生物中に最初に発見されたPHAは、３−ヒドロキシ酪酸（以下、3HBと略す）のホモポリマーであるポリヒドロキシブチレート（PHB）である。PHBは高結晶性であり、結晶化度が高いため硬くて脆く、しかも融点付近の温度（180℃）で速やかに熱分解するため、溶融加工性が低く実用範囲は極めて限られるという問題を有している。
【０００４】
そこで、PHBの結晶化度を下げて脆性を改善するため、他の3-ヒドロキシアルカン酸をPHB骨格中に導入する試みがなされた。その一つとして、3HBと３−ヒドロキシヘキサン酸（以下、3HHと略す）の共重合ポリエステルP(3HB-co-3HH)（以下PHBHと略す）が発見された。長い側鎖構造を持つ3HHをモノマーユニットとして含有するPHBHは、PHBと比べて結晶化度が低いため、しなやかで柔らかい物性を有し、脆性が改善されている。しかもPHBHは融点が低いため、溶融加工性の改善も期待できる。しかし、PHBHは結晶固化速度が非常に遅く、加熱溶融後室温まで冷却しても、しばらくは柔らかく粘性を持つことや、粘着性があるため成形時にすぐに離型しないということがわかった。そのためPHBHの実用化には、実生産が連続的に行えない場合がある。また、結晶固化速度の速い既存の汎用樹脂の加工に使用している加工機器が、PHBHの加工に利用できない場合があることも明らかとなった。フィルムやシート、繊維、発泡体、成形品、不織布への加工では、溶融加工したポリマーを冷却する際に当該ポリマーの結晶固化速度が速いことが、生産工程の連続化、ひいては生産性の向上と低コストに繋がるため非常に重要である。
【０００５】
そこでPHBHの結晶固化速度を速める試みがされてきた。そのための一般的な方法として、結晶核剤を添加する方法が試みられている。例えば、特許文献１ではPHBHに結晶核剤として窒化ホウ素を使用し結晶化促進効果が得られている。しかし、これは高価な材料であり、しかも生分解性を持たない。このため、より安価で生分解性のある結晶核剤が検討された。
【０００６】
特許文献２および３では、PHBHに対してより高い融点を有し、しかも生分解性であるPHBを結晶核剤として添加して、結晶固化速度を速くする技術が開示されている。この先行文献では、PHBHとPHBの混合法として、例えばPHBHとPHBを熱クロロホルム等の溶媒に溶解、混合後、クロロホルムを蒸発させることによるポリマーの析出や、２種類のポリマーをドライアイスで冷却しながら粉砕し混合する方法、PHBは溶融しないでPHBHのみ融解させた状態での混合、乾燥ポリマー粉末のミキシングによる混合などが試みられている。しかしながら、溶媒に溶解して混合する方法では、PHBHの溶解や晶析のために非常に大量の溶媒が必要となり、コスト高となる。また、PHBHとPHBの混合法として、メタノールで晶析し混合ポリマーを回収する方法も知られているが、この方法では、晶析時にポリマーと結晶核剤の溶解度の違いから、均一に分散した状態で晶析が行われないなどの可能性があり、実用的でない。ポリマーを粉砕後混合する方法や乾燥ポリマー粉末をミキシングする方法では、ポリマーを均一に混合することは困難であり、結晶核剤の効果が低下することが予想される。特にPHBHおよび結晶核剤の粒子径は小さいほどよく混合し、また核形成部位の数が多くなるため高い効果が期待されるが、上記の混合法では微粒子での混合効果は期待できない。さらに、PHBをPHBH中に均一に分散させるためにはPHBの融点以上での加工が必要となるが、一般的なPHBの融点は高く、しかも上記のようにその融点付近の温度で熱分解するため、PHBをPHBH中に分散させる際に熱によるPHBやPHBHの劣化、分子量低下などの問題が避けがたい。
【０００７】
これらの問題を解消するため、培養を制御することで微生物にPHBHと結晶核剤となるPHAを混ざった状態で生産させる手法が発明された。例えば特許文献４では、培養途中で炭素源を変化させることで、PHBHと、PHBまたは3HHモノマーの共重合比率の低いPHBHの混合物を微生物に生産させる手法が報告されている。また非特許文献１では、特定の植物油と吉草酸ナトリウムを炭素源として培養することで、3HBと3-ヒドロキシ吉草酸（以下、3HVと略す）の共重合ポリエステルP(3HB-co-3HV)（以下、PHBVと略す）とPHBの混合物を細胞内で共生産できることが示唆されている。これらの方法では、PHB等の結晶核剤成分を別途生産する必要がなく、コスト的にも大きなメリットがある。しかしながら、培養途中で炭素源を変化させる特許文献４の方法では非連続的に2種類のPHAが生産されるため培養制御が非常に難しく、さらに生産性も低いため安定したポリマーの生産が困難である。また非特許文献１の方法では、特定の植物油を使った場合にしか目的の効果が得られない上に、2種類のPHAの混合量比を制御することが難しく、実用的でない。
【０００８】
その他に、２種類のPHAを細胞内共生産した例として、以下の報告がある。例えば非特許文献２は、Pseudomonas属の野生株61-3株が3つのPHA合成酵素をコードする遺伝子を有することを報告している。この3つのPHA合成酵素のうち、2つは炭素鎖長6から12の中鎖3-ヒドロキシアルカン酸を基質とし、残る1つは3HBのみを基質とする。そのため、この61-3株をオクタン酸やドデカン酸などの脂肪酸を含む培地で培養すると、中鎖PHAとPHBが細胞内で共生産されることになる。また非特許文献３と４では、中鎖PHAを合成するPseudomonas oleovoransに対し、様々な細菌由来のPHB合成酵素をコードする遺伝子を導入すると、中鎖PHAとPHBが細胞内で共生産されることが報告されている。また非特許文献５では、PHBを合成するRalstonia eutrophaに対し、Allochromatium vinosum由来の中鎖PHA合成酵素をコードする遺伝子を導入すると、PHBと中鎖PHAが細胞内で共生産されることが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平６−１５７８７８号公報
【特許文献２】特表平８−５１０４９８号公報
【特許文献３】国際公開第２００２／５０１５６号公報
【特許文献４】特開２００４−２５０６２９号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Wing-Hin Lee, Ching-Yee Loo, Christopher T. Nomura, Kumar Sudesh, Bioresource Technology, vol. 99, pp. 6844-6851, (2008)
【非特許文献２】Hiromi Matsusaki, Sumihide Manji, Kazunori Taguchi, Mikiya Kato, Toshiaki Fukui, Yoshiharu Doi, Journal of Bacteriology, vol. 180, pp. 6459-6467, (1998)
【非特許文献３】Arnulf Timm, David Byrom, Alexander Steinbuchel, Applied Microbiology and Biotechnology, vol. 33, pp. 296-301, (1990)
【非特許文献４】Matthias Liebergesell, Frank Mayer, Alexander Steinbuchel, Applied Microbiology and Biotechnology, vol. 40, pp. 292-300, (1993)
【非特許文献５】Kawalpreet K. Aneja, Richard D. Ashby, Daniel K. Y. Solaiman, Biotechnology Letters, vol. 31, pp. 1601-1612, (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、結晶化の遅いPHA共重合体の結晶化速度を向上させ、射出成形、フィルム成形、ブロー成形、繊維の紡糸、押出発泡、ビーズ発泡などの加工におけるPHA共重合体の溶融加工性を改善し、生産性を向上することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、主ポリマーであるPHBHなどの共重合PHAを合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子と、結晶核剤となるより高融点のPHAを合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子の両方を持つ微生物を用いて、上記2つのPHAを同一細胞内で共生産させることにより、得られるPHA共重合体含有樹脂の結晶化速度が著しく向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
即ち、本発明の第一は、共重合PHA（A）を合成するAeromonas属由来のPHA 合成酵素をコードする遺伝子と、前記共重合PHA（A）とは融点が10℃以上異なるPHA（B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子の両方を有する微生物を培養することによって、融点の10℃以上異なる2種類以上のPHAを前記微生物の細胞内で同時に生産する工程を含む、PHA混合品の製造方法に関する。共重合PHA（A）は、少なくとも3HBと3HHをモノマーユニットとして含有する共重合体であるのが好ましく、得られるPHA混合品は、DSC曲線において、85〜180℃の間で少なくとも２つの吸熱ピークを示し、最も高温側の吸熱ピークの熱量が0.2 〜20 J/gであるか、または、DSC曲線において、85〜180℃の間で１つの吸熱ピークしか示さず、160℃より高い部分の吸熱量が0.5〜10 J/gであるのが好ましい。
【００１４】
本発明の第２は、共重合PHA（A）を合成するAeromonas属由来のPHA 合成酵素をコードする遺伝子と、前記共重合PHA（A）とは融点が10℃以上異なるPHA（B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子の両方を有する微生物に関する。共重合PHA（A）を合成するAeromonas属由来のPHA合成酵素をコードする遺伝子は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、または前記アミノ酸配列に対して８５％以上の配列相同性を有し、且つPHA合成酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であるのが好ましく、また、PHA（B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子は、Aeromonas属とは異なる生物種由来のPHA合成酵素をコードする遺伝子であるのが好ましく、Cupriavidus属由来のPHA合成酵素をコードする遺伝子であるのがより好ましく、Cupriavidus necatorに由来する配列番号４で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子、または前記アミノ酸配列に対して８５％以上の配列相同性を有し、且つPHA合成酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であるのがさらに好ましい。
【００１５】
さらに、微生物はCupriavidus属であるのが好ましく、Cupriavidus necatorであるのがより好ましい。また、さらに、R体特異的エノイル-CoAヒドラターゼをコードする遺伝子を有しており、当該R体特異的エノイル-CoAヒドラターゼをコードする遺伝子の発現が強化されているか、あるいは、phbA遺伝子および／またはbktＢ遺伝子を有しており、当該phbA遺伝子の発現が抑制されている、および／または、当該bktＢ遺伝子の発現が強化されている微生物が好ましい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、結晶化の遅いＰＨＡ共重合体の結晶化速度を著しく向上でき、射出成形、フィルム成形、ブロー成形、繊維の紡糸、押出発泡、ビーズ発泡などの加工におけるＰＨＡ共重合体の溶融加工性または加工速度を改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例２で得られたＰＨＡ混合品について測定したＤＳＣ曲線
【図２】実施例５で得られたＰＨＡ混合品について測定したＤＳＣ曲線
【図３】比較例１で得られたＰＨＡについて測定したＤＳＣ曲線
【図４】実施例９で得られたＰＨＡ混合品について測定したＤＳＣ曲線
【図５】実施例９で得られたＰＨＡ混合品についてアニール処理後に測定したＤＳＣ曲線
【図６】実施例１０で得られたＰＨＡ混合品について測定したＤＳＣ曲線
【図７】実施例１０で得られたＰＨＡ混合品についてアニール処理後に測定したＤＳＣ曲線
【図８】比較例２で得られたＰＨＡについて測定したＤＳＣ曲線
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明について、さらに詳細に説明する。
【００１９】
本発明においては、共重合PHA（A）を合成するAeromonas属由来のPHA 合成酵素をコードする遺伝子と、前記共重合PHAとは融点が10℃以上異なるPHA（B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子の両方を有する微生物（以下、「本発明の微生物」という）を使用する。
【００２０】
本発明の微生物において、共重合PHA（A）を合成するAeromonas属由来のPHA 合成酵素をコードする遺伝子は、Aeromonas属由来で、共重合PHA を合成しうるPHA合成酵素をコードする遺伝子であれば特に限定されないが、モノマーユニットとして少なくとも3HBと3HHを含有する共重合PHAを合成できるPHA合成酵素をコードする遺伝子であるのが好ましく、3HBと3HH の共重合体であるPHBHを合成できるPHA合成酵素をコードする遺伝子であるのがより好ましい。そのようなPHA合成酵素をコードする遺伝子として、例えば、Aeromonas caviaeやAeromonas hydrophilaに由来するPHA合成酵素をコードする遺伝子が好ましく、Aeromonas caviaeに由来するPHA合成酵素をコードする遺伝子がより好ましい。Aeromonas caviaeに由来するPHA合成酵素をコードする遺伝子としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、または前記アミノ酸配列に対して８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列相同性を有し、且つPHA合成酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。なお、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子の具体例としては、例えば、配列番号２記載の遺伝子が挙げられる。また、配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して８５％以上の配列相同性を有し且つPHA合成酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の具体例としては、例えば、配列番号３記載の遺伝子が挙げられる。
【００２１】
本発明の微生物は、上記共重合PHA（A）を合成するAeromonas属由来のPHA 合成酵素をコードする遺伝子に加えて、前記共重合PHA（A）とは融点が10℃以上異なるPHA（B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子の、少なくとも２種類のPHA合成酵素をコードする遺伝子を有することが特徴である。なお、本発明の微生物は、上記共重合PHA（A）を合成するAeromonas属由来のPHA 合成酵素をコードする遺伝子と、PHA（B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子以外に、第３のPHA合成酵素をコードする遺伝子を有していても良い。また、本発明の微生物は、前記共重合PHA（A）を合成するAeromonas属由来のPHA 合成酵素をコードする遺伝子、および／または、PHA（B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子を、１つの細胞内に複数有していてもよい。
【００２２】
ここで、共重合PHA（A）とPHA（B）は、お互いの融点が10℃以上異なる限り特に限定されないが、共重合PHA（A）に比べて、PHA（B）の方が融点が高いのが好ましい。PHA（B）の融点は165℃以上が好ましく、170℃以上がより好ましい。PHA（B）が共重合PHA（A）よりも高い融点を有する場合、共重合PHA（A）は主ポリマーであり、PHA（B）は共重合PHA（A）に対する結晶核剤となりうる。そのようなPHA（B）としては、共重合PHAであっても良いし、ホモポリマーであるPHBであっても良い。PHA（B）が共重合PHAである場合、PHA（B）はPHBHであってもPHBVであっても、それ以外の共重合体であっても良いが、PHA（B）は、ポリマーユニットとして3HBを95モル%以上含むものが好ましく、3HBを97モル%以上含むものがより好ましく、3HBを99モル%以上含むものがさらに好ましい。PHA（B）として特に好ましいのはホモポリマーであるPHBである。
【００２３】
前記PHA（B）を合成しうるPHA合成酵素をコードする遺伝子としては特に限定されない。例えば、PHA（B）として高融点の共重合PHAを合成できるPHA合成酵素をコードする遺伝子として、Aeromonas caviae由来のPHA 合成酵素の１アミノ酸置換体（例えばPhaCACA505W）をコードする遺伝子が挙げられる。PhaCACA505Wは3HBを99モル%以上含む共重合PHAを合成できる。一方、PHBを合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子は数多く存在し（例えば、Biopolymers Volume 3a, Polyesters I, Edited by Y. DOI and A. STEINBUCHEL, 2002参照）、そのいずれをも用いることができるが、具体的には、 Acinetobacter属、Aeromonas属、Alcaligenes属、Allochromatium属、Azorhizobium属、Azotobacter属、Bacillus属、Burkholderia属、Caulobacter属、Chromobacterium属、Comamonas属、Cupriavidus属、Ectothiorhodospira属、Klebsiella属、Methylobacterium属、Paracoccus属、Pseudomonas属、Ralstonia属、Rhizobium属、Rhodobacter属、Rhodococcus属、Rhodospirillum属、Rickettsia属、Sinorhizobium属、Sphingomonas属、Synechocystis属、Thiococcus属、Thiocystis属、Vibrio属、Wautersia属、Zoogloea属に由来するPHA合成酵素をコードする遺伝子や、その改変体をコードする遺伝子等が挙げられる。本発明においては、PHA（B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子として、Aeromonas属とは異なる生物種由来のPHA合成酵素をコードする遺伝子が好ましく、Cupriavidus属由来のPHA合成酵素をコードする遺伝子がより好ましく、Cupriavidus necator由来のPHA合成酵素をコードする遺伝子がさらに好ましく、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、または前記アミノ酸配列に対して８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列相同性を有し、且つPHA合成酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が特に好ましい。配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子としては、例えば、Cupriavidus necatorに由来する配列番号５記載の遺伝子が挙げられる。
【００２４】
本発明において、上記２種類のPHA合成酵素をコードする遺伝子を有するための、宿主となる微生物は特に限定されず、Acinetobacter属、Aeromonas属、Alcaligenes属、Allochromatium属、Azorhizobium属、Azotobacter属、Bacillus属、Burkholderia属、Candida属、Caulobacter属、Chromobacterium属、Comamonas属、Cupriavidus属、Ectothiorhodospira属、Escherichia属、Klebsiella属、Methylobacterium属、Nocardia属、Paracoccus属、Pseudomonas属、Ralstonia属、Rhizobium属、Rhodobacter属、Rhodococcus属、Rhodospirillum属、Rickettsia属、Saccharomyces属、Sinorhizobium属、Sphingomonas属、Synechocystis属、Thiococcus属、Thiocystis属、Vibrio属、Wautersia属、Zoogloea属に属する微生物等が挙げられるが、この中でもAeromonas属、Alcaligenes属、Cupriavidus属、Escherichia属、Pseudomonas属、Ralstonia属等に属する微生物等がより好ましく、Cupriavidus属、Escherichia属、Ralstonia属に属する微生物がより好ましく、Cupriavidus属に属する微生物がさらにより好ましく、Cupriavidus necatorが特に好ましい。
【００２５】
本発明の微生物において、共重合PHA（A）を合成するAeromonas属由来のPHA 合成酵素をコードする遺伝子と、PHA（B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子の、少なくとも２種類のPHA合成酵素をコードする遺伝子を同一細胞内に保有させる方法としては特に限定されない。しかし、そのような微生物は自然界でこれまでに発見されていないことから、宿主となる微生物に、共重合PHA（A）を合成するAeromonas属由来のPHA 合成酵素をコードする遺伝子か、PHA（B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子のいずれか、或いはその両方を、遺伝子組み換え技術などを用いて導入する必要がある。例えば、共重合PHA（A）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子を元々有するAeromonas属に属する微生物に、PHA （B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子を導入しても良いし、PHB等のPHA （B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子を有する微生物（例えばCupriavidus necator）に、共重合PHA（A）を合成するAeromonas属由来のPHA 合成酵素をコードする遺伝子を導入しても良い。また、宿主となる任意の微生物に、共重合PHA（A）を合成するAeromonas属由来のPHA 合成酵素をコードする遺伝子と、PHA（B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子の両方を導入しても良い。後述する発現量やその比の調節のしやすさの観点からは、宿主となる任意の微生物に、共重合PHA（A）を合成するAeromonas属由来のPHA 合成酵素をコードする遺伝子と、PHA（B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子の両方を導入するのが好ましく、特に、Cupriavidus 属に属する微生物に、共重合PHA（A）を合成するAeromonas属由来のPHA 合成酵素をコードする遺伝子と、Cupriavidus属に属する微生物由来の PHBを合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子の両方を導入するのが好ましい。その場合、Cupriavidus 属に属する微生物が本来有するPHA合成酵素をコードする遺伝子については、そのまま存在していても良く、破壊または欠失していても良いが、破壊または欠失して発現しない状態であるのが、好ましい。
【００２６】
上記PHA合成酵素をコードする遺伝子の導入方法としては特に限定されず、宿主の染色体上に直接挿入または置換する方法、宿主が保有するメガプラスミド上に導入する形式、あるいはプラスミド、ファージ、ファージミドなどのベクター上に配置して導入する形式のどれを選択しても良いし、併用しても良い。ただし、プラスミドは培養中に脱落する可能性があることから、共重合PHA（A）を合成するAeromonas属由来のPHA 合成酵素をコードする遺伝子とPHA（B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子のいずれか、或いは両方が宿主の染色体上に挿入または置換されていることが好ましい。前記導入、挿入、置換、配置方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、宿主となる微生物の染色体上に上記PHA合成酵素をコードする遺伝子を置換或いは挿入するには、相同組換え法等が利用できる。
【００２７】
本発明の微生物は、共重合PHA（A）を合成するAeromonas属由来のPHA 合成酵素をコードする遺伝子と、PHA（B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子それぞれの上流に、その発現に関わる「発現調節配列」を有していることが好ましい。ここでいう「発現調節配列」とは、具体的には、PHA合成酵素をコードする遺伝子の開始コドンの上流に位置し、その遺伝子の転写量を制御するDNA配列、またはその遺伝子から転写された伝令RNAの翻訳量を調節するDNA配列（例えばSD配列（Shine Dalgarno配列））、あるいはその両方を含むDNA配列である。共重合PHA（A）を合成するAeromonas属由来のPHA 合成酵素をコードする遺伝子と、PHA（B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子のそれぞれ上流に連結する発現調節配列としては、宿主が元々有する発現調節配列を利用することもできるし、自然界に存在する任意の発現調節配列を利用することもできるし、人工的に構築または改変された発現調節配列を利用しても良い。また、共重合PHA（A）を合成するAeromonas属由来のPHA 合成酵素をコードする遺伝子と、PHA（B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子が同一のオペロンに含まれる場合には、発現調節配列を共有することもできる。
【００２８】
本発明の微生物において使用される発現調節配列は特に限定されず、上述するように宿主の本来有する発現調節配列を用いても良いし、PHA合成酵素をコードする遺伝子を導入する際に、その上流に位置する発現調節配列をそのまま一緒に導入しても良いし、導入するPHA合成酵素をコードする遺伝子のどちらか或いは両方において、それぞれ好ましい発現調節配列を選択して連結させて、宿主に導入しても良い。
【００２９】
微生物の作製の容易性と後述する発現量のコントロールの観点からは、共重合PHA（A）を合成するAeromonas属由来のPHA 合成酵素をコードする遺伝子の発現調節配列としては、宿主の本来有していたPHA合成酵素をコードする遺伝子のための発現調節配列を利用し、PHA（B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子の発現調節配列を、目的の発現量や翻訳量などからPHA合成酵素の細胞内存在量を最適化できるものを適宜選択し、PHA（B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子と連結させて導入するか、その上流に挿入するのが好ましい。
【００３０】
PHA（B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子の発現調節配列としては、天然由来や、改変体問わず、使用でき、特に限定されない。具体的には、遺伝子の転写量を制御するプロモーターとして、大腸菌由来のプロモーターである配列番号６記載のlacプロモーター、配列番号７記載のtrpプロモーターや、それらの改変体である配列番号８記載のlacUV5プロモーター、配列番号５６記載のlacN15プロモーター、配列番号５７記載のlacN16プロモーター、配列番号５８記載のlacN17プロモーター、配列番号５９記載のlacN19プロモーター、配列番号６０記載のlacN20プロモーター、配列番号６１記載のlacN21プロモーター、配列番号９記載のtacIプロモーター、配列番号１０記載のtacIIプロモーター、配列番号１１記載のticプロモーター、配列番号１２記載のtrcプロモーターの他、Cupriavidus necator由来のphaCABオペロンのプロモーターである配列番号１３記載のREPプロモーターや、その改変体である配列番号１４記載のREPN17プロモーター、Cupriavidus necator由来のphasinをコードするphaP1遺伝子のプロモーターである配列番号１５記載のphaP1プロモーターなどを使用することができる。これらのプロモーターは、Cupriavidus necator由来のphaC1遺伝子のSD配列である配列番号１６記載の配列REP-SDや、その改変体である配列番号１７記載の配列REP-SDM、その他公知のSD配列やそれに準じた配列を連結することにより、発現調節配列として利用することができる。また、Cupriavidus necator由来のA1067、A1068、A1069、 phaJ4aの４遺伝子を含むオペロンのプロモーターおよびA1067のSD配列からなる配列番号１８記載の発現調節配列PJ4aや、Aeromonas caviae由来のphaPCJオぺロンのプロモーターおよびphaPのSD配列からなる配列番号１９記載の発現調節配列Pacなど、その他任意の公知の発現調節配列を利用することもできる。さらに、上記の発現調節配列に対し、塩基の欠失、置換、挿入により改変を加えた発現調節配列も使用することもできる。
【００３１】
本発明においては、使用する上記発現調節配列を適宜選択することで、それぞれのPHA合成酵素の細胞内存在量を調整し、共重合PHA（A）とそれと融点の異なるPHA（B）の２種類のPHAの生産量とその割合をコントロールすることができる。生産される融点の異なる上記２種類のPHAの割合をコントロールする観点から、細胞内における各PHA合成酵素の存在量比、あるいは、各PHA合成酵素をコードする遺伝子の発現量比を調整することが好ましい。この観点に基づいて、共重合PHA（A）を合成するAeromonas属由来のPHA 合成酵素をコードする遺伝子の発現調節配列と、PHA（B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子の発現調節配列の組み合わせを選択することが好ましい。そのような発現調節配列の組み合わせは、例えば使用するプロモーターの強さや、対象となるPHA合成酵素の酵素活性、宿主の代謝系などを考慮して、選択することができる。
【００３２】
例えば、共重合PHA（A）がモノマーユニットとして3HHを有し、その3HHモノマーの共重合比率が比較的高い場合、具体的には共重合PHA（A）が、3HHモノマーユニットを8モル％以上含有する共重合体である場合、PHA（B）の含有量は、後述する理由から、生産されるPHA混合品における共重合PHA（A）とPHA（B）の合計量に対し、0.1〜20重量%の範囲となるように制御されるのが好ましい。そのようなPHA混合品を得るための微生物としては、特に限定されないが、共重合PHA（A）を合成するAeromonas属由来のPHA 合成酵素をコードする遺伝子が染色体上に挿入または置換されたCupriavidus necator H16株を宿主とすることが好ましい。この場合、共重合PHA（A）を合成するAeromonas属由来のPHA 合成酵素をコードする遺伝子の発現調節配列としては、Cupriavidus necator H16株が本来有するREPとREP-SDからなる発現調節配列が好ましい。その場合、PHA（B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子の発現調節配列としては、プロモーターとして上記lacプロモーター、lacプロモーターのスペーサー配列に変異を導入した改変体（例えば、lacN15プロモーター、lacN16プロモーター、lacN17プロモーター、lacN19プロモーター、lacN20プロモーター、lacN21プロモーター）、またはREPプロモーターのいずれかと、SD配列としてREP-SDまたはその改変体であるREP-SDMのどちらかの組み合わせからなる発現調節配列、または前記PJ4a、或いはPHA合成酵素の細胞内存在量をそれらと同程度に調節できる発現調節配列が好ましく、配列番号６と１６で表されるDNA配列を含む発現調節配列、配列番号６と１７で表されるDNA配列を含む発現調節配列、配列番号５６と１７で表されるDNA配列を含む発現調節配列、配列番号５９と１７で表されるDNA配列を含む発現調節配列、または配列番号１８で表される発現調節配列、或いはそれらと同等の発現強度を有する発現調節配列がより好ましい。また、共重合PHA（A）を合成するAeromonas属由来のPHA 合成酵素をコードする遺伝子の発現調節配列の発現強度と、PHA（B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子の発現調節配列の発現強度の比が、上記好ましい組み合わせと同程度となる別の組み合わせも、同じく好ましく採用出来る。
【００３３】
また、共重合PHA（A）として3HHモノマーユニットを8モル％以上含有する共重合体を生産させるためには、使用する微生物として、上記２種類のPHA合成酵素をコードする遺伝子を有しているだけでなく、得られる共重合PHA（A）中の3HHモノマーの共重合比率が高められる工夫がなされている微生物を使用するのが好ましい。そのような工夫としては、R体特異的エノイル-CoAヒドラターゼをコードする遺伝子の発現を強化する方法、または、β−ケトチオラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子のうちphbA遺伝子の発現を抑制する、および／または、bktB遺伝子の発現を強化する方法等が挙げられる。R体特異的エノイル-CoAヒドラターゼをコードする遺伝子の発現を強化する方法としては、特に限定されないが、例えばCupriavidus necatorを宿主とする場合には、染色体上に存在するR体特異的エノイル-CoAヒドラターゼをコードする遺伝子（phaJ4a、phaJ4b等）の上流に、REPプロモーターとREP-SDからなる発現調節配列、REPプロモーターとREP-SDMからなる発現調節配列、REPプロモーターの改変体であるPEPN17プロモーターとREP-SDからなる発現調節配列、前記PEPN17プロモーターとREP-SDMからなる発現調節配列、またはその他公知の大腸菌由来のプロモーター（例えばtrpプロモーター）とREP-SDやREP-SDMを含む任意のSD配列からなる発現調節配列を挿入する方法などが挙げられる。一方、phbA遺伝子の発現を抑制する、および／または、bktB遺伝子の発現を強化する方法としては、例えば、国際公開第2009/145164号に記載された方法などを使用することができる。もちろんこれらの方法を利用せず、例えば通気攪拌条件や炭素源などの培養条件を変更することによって、得られる共重合PHA（A）中の3HHモノマーの共重合比率を高めてもかまわない。
【００３４】
一方、共重合PHA（A）がモノマーユニットとして3HHを有し、3HHモノマーの共重合比率がそれほど高くない場合、具体的には共重合PHA（A）が3HHモノマーユニットを3モル％以上8モル％未満含有する共重合体である場合、PHA（B）の含有量は、後述する理由から、生産されるPHA混合品における共重合PHA（A）とPHA（B）の合計量に対し、3重量%以上となるように制御されるのが好ましい。一般に、共重合PHA（A）中の3HHモノマーの共重合比率が8モル％未満の場合は、PHA（B）の含有量はある程度高いのが好ましく、従って、PHA（B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子に連結される発現調節配列は、ある程度発現強度の高いものを使用するのが好ましい。そのようなPHA混合品を得るための微生物としては、特に限定されないが、共重合PHA（A）を合成するAeromonas属由来のPHA 合成酵素をコードする遺伝子が染色体上に挿入または置換されたCupriavidus necator H16株を宿主とすることが好ましい。この場合、共重合PHA（A）を合成するAeromonas属由来のPHA 合成酵素をコードする遺伝子の発現調節配列としては、Cupriavidus necator H16株が本来有するREPとREP-SDからなる発現調節配列が好ましい。また、PHA（B）を合成するPHA合成酵素をコードする遺伝子の発現調節配列としては、上記REPとREP-SDからなる発現調節配列、またはlacUV5プロモーターとREP-SDからなる発現調節配列、lacプロモーターとREP-SDからなる発現調節配列、tacIプロモーターとREP-SDからなる発現調節配列、或いはそれらと同等の発現活性を有する発現調節配列が好ましく、配列番号１３と１６で表されるDNA配列を含む発現調節配列、配列番号８と１６で表されるDNA配列を含む発現調節配列、配列番号６と１６で表されるDNA配列を含む発現調節配列、配列番号９と１６で表されるDNA配列を含む発現調節配列、或いはそれらと同等の発現強度を有する発現調節配列がより好ましい。
【００３５】
本発明においては、本発明の微生物を培養することによって、細胞内に融点の10℃以上異なる2種類のPHAを好ましくは同時に生産させ、菌体からPHAを回収することで、２種類のPHAを含むPHA混合品を製造することができる。
【００３６】
培養時の炭素源としては、本発明のＰＨＡ生産微生物が資化可能であればどんな炭素源でも使用可能であるが、好ましくは、グルコース、フルクトース、シュークロースなどの糖類；パーム油、パーム核油、コーン油、やし油、オリーブ油、大豆油、菜種油、ヤトロファ油などの油脂やその分画油類、あるいはその精製副産物；ラウリン酸、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリンスチン酸などの脂肪酸やそれらの誘導体等が好ましい。より好ましくは、パーム油、パーム核油などの植物油脂のほか、パーム油やパーム核油を分別した低融点分画であるパームオレイン、パームダブルオレインやパーム核油オレイン、また特に食糧との競合を避ける観点から、ＰＦＡＤ（パーム油脂肪酸蒸留物）やＰＫＦＡＤ（パーム核油脂肪酸蒸留物）、菜種油の脂肪酸蒸留物といった油脂の精製副産物等が挙げられる。
【００３７】
本発明のＰＨＡの生産においては、上記炭素源、炭素源以外の栄養源である窒素源、無機塩類、そのほかの有機栄養源を含む培地を用いて、前記微生物を培養することが好ましい。窒素源としては、例えばアンモニア、尿素、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えばリン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。そのほかの有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
【００３８】
培養温度、培養時間、培養時ｐＨ、培地等の条件は、使用する微生物において通常使用されるような培養条件でよい。
【００３９】
本発明において、菌体からのPHA混合品の回収方法は、特に限定されないが、例えば次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてPHA混合品を抽出する。このPHA混合品を含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体由来の不溶物を除去し、その濾液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてPHA混合品を沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてPHA混合品を回収する。
【００４０】
本発明により生産されるPHA混合品は、融点の10℃以上異なる少なくとも２種類のPHAを含有する。うち、融点の低いPHAが、Aeromonas属由来のPHA 合成酵素によって合成される共重合PHA（A）であり、融点の高い方のPHAがもう一つのPHA合成酵素によって合成されるPHA（B）であるのが好ましく、融点の低い方の共重合PHA（A）が主ポリマーであり、融点の高い方のPHA（B）がその結晶核剤となるのがより好ましい態様である。共重合PHA（A）は3HHと3HBをモノマーユニットとして含有する共重合体であるのが好ましい。PHA（B）としては、共重合PHAであっても良いし、ホモポリマーであるPHBであっても良い。PHA（B）が共重合PHAである場合、ポリマーユニットとして3HBを95モル%以上含むものが好ましく、3HBを97モル%以上含むものがより好ましく、3HBを99モル%以上含むPHAがさらに好ましい。PHA（B）として特に好ましいのはPHBである。また、PHA（B）の融点は165℃以上が好ましく、170℃以上がより好ましい。
【００４１】
本発明において、２種類またはそれ以上の融点の異なるPHAの混合品が得られていることは、例えば、特許文献３に記載されたようなクロロホルムを使用した析出法や、後述する示差走査熱量測定（DSC）によって確認することができるが、これらに限定されない。なお、PHAの結晶化状態は、精製工程、加工工程などによる熱履歴や、保存時の温度・時間経過により変化する場合があるので、DSCによって評価する場合、これらの影響を最小化する観点から、測定対象を未加工の状態で速やかに測定するのが好ましい。
【００４２】
共重合PHA（A）が、3HHモノマーユニットを8モル％以上含有する共重合体である場合、その融点は概ね130℃以下であり、もう一つのPHA（B）との融点の差が大きいことから、上記DSCによる評価が容易となる。一般にPHAはDSC曲線において、85〜180℃の間でその融点に由来する吸熱ピークを示す。共重合PHA（A）が、3HHモノマーユニットを8モル％以上含有する共重合体であり、PHA（B）がPHBである場合、PHA混合品中に含まれる共重合PHA（A）とPHA（B）は、例えば図２に代表されるように、85〜180℃の間でそれぞれ明確に異なる2つの吸熱ピークを示すことが多い。但し、高融点PHAの含有量が極めて少ない場合は、それに由来する吸熱ピークがはっきりと確認出来ない場合もある。
【００４３】
共重合PHA（A）が、3HHモノマーユニットを8モル％以上含有する共重合体である場合、PHA混合品における共重合PHA（A）とPHA（B）の合計量に対するPHA（B）の量は、下限値が0.1重量%以上であるのが好ましく、0.5重量%以上であるのがより好ましく、1重量%以上であるのがさらに好ましく、1.2重量％以上であるのが特に好ましく、2重量％以上であるのがとりわけ好ましい。また、前記PHA（B）の量の上限値は、20重量%以下であるのが好ましく、15重量%以下であるのがより好ましく、12重量%以下であるのがさらに好ましく、9重量％以下であるのが特に好ましく、7重量％以下であるのがとりわけ好ましい。PHA（B）の量が少なすぎると、結晶核剤としての効果が得られず、PHA（B）の量が多すぎると、ポリマーの延性が低下する場合がある。PHA（B）を上記好ましい量で含有するPHA混合品は、DSC曲線におけるもっとも高温側の吸熱ピークの熱量の下限値が、概ね、0.2 J/g以上、より好ましくは0.5 J/g以上、さらに好ましくは1 J/g以上、特に好ましくは1.5 J/g以上、とりわけ好ましくは2 J/g以上となり、前記熱量の上限値が、概ね、20 J/g以下、より好ましくは18 J/g以下、さらに好ましく15 J/g以下、特に好ましくは12 J/g以下、とりわけ好ましくは8 J/g以下となることで、確認出来る。
【００４４】
一方、共重合PHA（A）が3HHモノマーユニットを8モル％未満しか含有しない共重合体である場合、その融点は比較的高く、もう一つのPHA（B）との融点の差が小さくなるため、DSC曲線において、融点に由来する吸熱ピークが重なり、図４に代表されるように85〜180℃の間で見かけ上は単一の吸熱ピークしか示さないことがある。その場合においても、融点の異なる2つのPHAが生産できていることは、160℃より高い部分に吸熱部分があるかどうかで判断できる。3HHモノマーユニットの含有量が3モル％以上8モル％未満の共重合PHA（A）は、それのみであれば、そのDSC曲線における吸熱ピークは図８に示すように160℃より低いところで終了するが、PHBなどの高融点PHA（B）との混合品である場合、PHBの融点が165℃以上であることからDSC曲線における吸熱ピークは160℃よりも高いところで終了することになる（図４および６）。また、共重合PHA（A）の3HHモノマーユニットの含有量が8モル％以上であるがPHA（B）の含有量が極めて少なく、それに由来する吸熱ピークが明確でない場合もこのようにして確認出来る。
【００４５】
PHA混合品が、DSC曲線において85〜180℃の間で見かけ上は単一の吸熱ピークしか示さない場合の好ましいPHA（B）の含有量については、160℃より高い部分の吸熱ピーク面積（吸熱量）で類推することが可能である。本発明においてはPHA混合品がDSC曲線において単一の吸熱ピークしか示さない場合、160℃より高い部分の吸熱量の下限値は、0.3 J/g以上となるのが好ましく、0.4 J/g以上となるのがより好ましく、0.5 J/g以上となるのがさらに好ましく、1.5J/g以上となるのがさらにより好ましく、3 J/g以上となるのが特に好ましい。また、前記吸熱量の上限値は、15 J/g以下となるのが好ましく、13 J/g以下となるのがより好ましく、12 J/g以下となるのがさらに好ましく、10 J/g以下となるのがさらにより好ましく、8 J/g以下となるのが特に好ましい。
【００４６】
共重合PHA（A）が、3HHモノマーユニットを3モル％以上8モル％未満含有する共重合体である場合、PHA（B）は、PHA混合品における共重合PHA（A）とPHA（B）の合計量に対し3重量%以上含まれていることが好ましく、5重量％以上含まれていることがより好ましく、10重量％以上含まれていることがさらに好ましく、12重量％以上含まれているのが特に好ましい。PHA（B）の量が少なすぎると、結晶核剤としての効果が得られない。共重合PHA（A）が、3HHモノマーユニットを3モル％以上8モル％未満含有する共重合体である場合、PHA（B）の含有量の上限は特に限定されず、かなり多くてもポリマーへの物性に大きな影響を与えることはないが、通常50重量％以下であり、40重量％以下であるのが好ましく、30重量％以下であるのがより好ましい。さらに、シート成形の場合など特定の成形条件においては、20重量％以下とするのが特に好ましい場合もある。
【００４７】
また、得られたPHA混合品をアニール処理したのちに、DSCを行うことで、より高い精度で、PHA混合品中のPHA（B）含有量を推定することができる。特に、アニール処理を行わない場合のDSCにおいて85〜180℃の間で見かけ上単一の吸熱ピークしか示さないPHA混合品であっても、160℃で30分アニール処理を行った後に、DSCを行うと、図５に代表されるように、概ね160℃を境に明確に２つのピークを示すようになる。高融点側の吸熱ピークが、PHA（B）に由来する吸熱ピークであり、その熱量の大きさから、PHA混合品中のPHA（B）の割合を推定することができる。
【００４８】
例えば、共重合PHA（A）が、3HHモノマーユニットを8モル％以上含有する共重合体である場合、アニール処理によって出現した高融点側の吸熱ピークの熱量の下限値は、1.0 J/g以上となるのが好ましく、1.5 J/g以上となるのがより好ましく、2 J/g以上となるのがさらに好ましく、2.5 J/g以上となるのが特に好ましい。また、前記熱量の上限値は、13 J/g以下となるのが好ましく、10 J/g以下となるのがより好ましく、9 J/g以下となるのがさらに好ましく、7 J/g以下となるのが特に好ましい。一方、共重合PHA（A）が、3HHモノマーユニットを3モル％以上8モル％未満含有する共重合体である場合、アニール処理によって出現した高融点側の吸熱ピークの熱量の下限値は、2 J/g以上となるのが好ましく、3 J/g以上となるのがより好ましく、4 J/g以上となるのがさらにより好ましく、8 J/g以上となるのが特に好ましい。前記熱量の下限値は、40 J/g以下となるのが好ましく、37 J/g以下となるのがより好ましく、35 J/g以下となるのがさらにより好ましく、30 J/g以下となるのが特に好ましい。
【００４９】
本発明において生産されるPHAの分子量は特に限定されないが、共重合PHA（A）、PHA（B）のいずれにおいても、多くの用途では、溶融加工性の観点から重量平均分子量で30万〜300万であることが好ましく、より好ましくは40万〜250万、さらに好ましくは50万〜200万である。PHAの重量平均分子量が30万未満では、強度などの機械的特性が不十分である場合があり、300万を超えると、成形性が劣る場合がある。但し、用途によっては重量平均分子量が10万〜20万程度が好ましい場合もある。
【００５０】
本発明により生産されるPHA混合品は、結晶化速度が改善されたものであるが、その他の添加剤、例えば酸化防止剤、紫外線吸収剤、染料・顔料などの着色剤、可塑剤、滑剤、無機充填剤、帯電防止剤、防カビ剤、抗菌剤、発泡剤、難燃剤等を必要に応じて含有することができる。また、他の結晶核剤を含有してもよい。
【００５１】
以上のようにして得られる樹脂組成物を成形加工することにより成形体を製造することができる。成形加工方法としては従来公知の方法でよく、例えば射出成形、フィルム成形、ブロー成形、繊維の紡糸、押出発泡、ビーズ発泡などが挙げられる。なお、本発明の製造方法によって得られるPHA混合品は、結晶化速度が改善されているだけでなく、主ポリマーである共重合PHAと結晶核剤となる高融点PHAが分子レベルで分散しているため、共重合PHAと結晶核剤となる高融点PHAをそれぞれ個別に生産してブレンドした場合に比べて、より簡易な方法で結晶核剤を微細に分散させられるだけでなく、より低い温度、例えば170℃以下の温度で成形加工することも可能である。
【００５２】
前記成形体は、例えば各種容器、包装材、農園芸用のフィルム、医療材料等に用いることが出来る。
【実施例】
【００５３】
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお、菌株の育種、PHAのモノマー組成分析、PHA混合品におけるPHA混合比率の分析、結晶化の評価、固化時間の測定方法は以下の通りである。
【００５４】
（菌株の育種）
本実施例における遺伝子操作は、Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている方法で行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主などは市場の供給者から購入し、その取扱説明書にしたがって使用することができる。なお、本実施例に用いられる酵素は、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。
【００５５】
（PHAのモノマー組成分析）
得られたPHAのモノマー組成分析はガスクロマトグラフィーによって測定した。得られたPHAあるいはその混合品約２０ｍｇに２ｍｌの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱することによってメチルエステル化した。冷却後、これに１．５ｇの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生がとまるまで放置した。４ｍｌのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、遠心して、上清中の3HBメチルエステルと3HHメチルエステルの組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析し、3HHモノマー比率を算出した。ガスクロマトグラフは島津製作所ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ  ＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧１００ｋＰａとし、サンプルは１μlを注入した。温度条件は、初発温度１００℃から２００℃まで８℃／分の速度で昇温、さらに２００℃から２９０℃まで３０℃／分の速度で昇温した。
【００５６】
（PHA混合品におけるPHA混合比率の分析）
培養後精製して得られたPHAについて、示差走査熱量計（エスアイアイ・ナノテクノロジー（株）製DSC220）を用いて以下の方法でPHA混合比率を評価した。
【００５７】
DSCにおいて、2〜5 mgのPHAを、5 〜190℃まで10℃/分の速度で昇温し、DSC曲線を得た。
【００５８】
＜得られたDSC曲線において85〜180℃の間で2つ以上の明確なピークが見られる場合＞
DSC曲線において低温側の主吸熱ピーク（85〜180℃の間で3つ以上のピークが見られる場合は最も高温側のピークを除いた中での最大ピーク）が示す融点をTm1、もっとも高温側の吸熱ピークが示す融点をTm2とする。当該DSC曲線において、吸熱ピーク全体の融解開始前のベースラインと融解終了後のベースラインを直線で結び、もっとも高温側の吸熱ピークと隣の吸熱ピークの間にある極大点から垂直方向に直線を引き、該二つの直線とDSC曲線に囲まれる領域の面積を、高温側の吸熱ピーク熱量として測定した。
【００５９】
上記方法で測定した高温側の吸熱ピーク熱量を、別途作成した検量線と比較することにより、この高温側の吸熱ピーク熱量によって示されるPHA(B)に相当するPHBの含量を推定した。検量線の作成方法を以下に示す。
【００６０】
後述する実施例１と同様の方法で、Cupriavidus necator H16株を用いて、融点170℃以上のPHBを生産した。また、同じく実施例１と同様の方法で、特開2013-9627号公報記載のKNK-631株を用いて、融点130℃以下であるPHBHを生産した。次に得られたPHBとPHBHを混合し、次の様にして共生産品を擬似的に再現したPHBH/PHB混合品を作製した。まずPHBとPHBHをそれぞれクロロホルムに10 g/Lの濃度で溶かし、各ポリマー溶液を得た。次にPHBとPHBHの重量比が1:99となるように、各ポリマー溶液を混合した。ヘキサン400 mlに対して、攪拌しながら穏やかに混合ポリマー溶液100 mlを添加した。析出したポリマーを濾過分別し、60℃で乾燥してPHBH/PHB混合品を得た。同様の方法で、PHBとPHBHの重量比が3:97、5:95、7:93、10:90であるPHBH/PHB混合品を得た。得られた5種のPHBH/PHB混合品についてDSCを行い、高温側の吸熱ピーク熱量を測定した。得られた結果の高温側の吸熱ピーク熱量から、PHA混合品中のPHB含量を推定するための検量線を作成した。
【００６１】
＜得られたDSC曲線において85〜180℃の間で１つのピークしか見られない場合＞
当該DSC曲線において、吸熱ピーク全体の融解開始前のベースラインと融解終了後のベースラインを直線で結び、160℃で垂直方向に直線を引き、該二つの直線とDSC曲線に囲まれる160℃より高い部分の融解熱量を測定した。
【００６２】
上記方法で測定した160℃より高い部分の融解熱量を、別途作成した検量線と比較することにより、PHA混合品中に含まれるPHBの含量を推定した。検量線の作成方法を以下に示す。
【００６３】
後述する実施例１と同様の方法で、Cupriavidus necator H16株を用いて、PHBを生産した。また、同じく実施例１と同様の方法で、US7384766号公報記載のKNK-005株を用いて、PHBHを生産した。次に得られたPHBとPHBHを混合し、次の様にして共生産品を擬似的に再現したPHBH/PHB混合品を作製した。まずPHBとPHBHをそれぞれクロロホルムに10 g/Lの濃度で溶かし、各ポリマー溶液を得た。次にPHBとPHBHの重量比が10:90となるように、各ポリマー溶液を混合した。ヘキサン400 mlに対して、攪拌しながら穏やかに混合ポリマー溶液100 mlを添加した。析出したポリマーを濾過分別し、60℃で乾燥してPHBH/PHB混合品を得た。同様の方法で、PHBとPHBHの重量比が7:93、15:85、20:80であるPHBH/PHB混合品を得た。得られた4種のPHBH/PHB混合品についてDSCを行い、160℃より高い部分の融解熱量を測定した。得られた結果の160℃より高い部分の融解熱量から、PHA混合品中のPHB含量を推定するための検量線を作成した。
【００６４】
（アニール法によるPHA混合品の評価）
培養後精製して得られたPHAについて、示差走査熱量計（エスアイアイ・ナノテクノロジー（株）製DSC220）を用いて以下の方法でPHA混合状態のアニール法による評価を行った。
【００６５】
DSCにおいて、4.5〜5.5 mgのPHAを、23℃から160℃まで10℃/分の速度で昇温し、160℃で30分保持してアニール処理を行った後に、23℃まで10℃/分の速度で降温し、その後、23℃から200℃まで10℃/分の速度で昇温したときのDSC曲線を得た。当該DSC曲線において、60℃のDSC曲線上の点と融解終了後のベースラインを直線で結び、もっとも高温側の吸熱ピークと隣の吸熱ピークの間にある極大点から垂直方向に直線を引き、該二つの直線とDSC曲線に囲まれる領域の面積を高温側の吸熱ピーク熱量として測定した。
【００６６】
（PHAの結晶化の評価）
得られたPHAの結晶化は、示差走査熱量計を用いて測定を行うことにより評価した。示差走査熱量測定において、2〜5 mgのPHAを5℃から170℃まで10℃ /分で昇温して5分間保持したあと、170℃から5℃まで10℃/分で冷却した際に得られた発熱曲線における結晶化ピーク温度（Tc）および結晶化発熱量（Hc）から結晶化のし易さを評価した。結晶化ピーク温度（Tc）が高く、結晶化発熱量（Hc）が大きいほど結晶化が優れている。
【００６７】
（PHAの固化時間の測定）
得られたPHAの固化時間の測定は、小型混練機（DSM社製Xplore  ５ｃｃ  Micro−Compounder）を用いて行った。小型混練機のシリンダー設定温度150℃（実施例１〜３、６、比較例１）または170℃（実施例９〜１１、比較例２）、スクリュ回転数100 rpmで3分間（実施例１〜３、６、比較例１）または１分間（実施例９〜１１、比較例２）溶融混練した後、直径3 mmのノズルから溶融したストランド状のPHAを排出し、ストランド状のPHAを直ちに55℃（実施例１〜３、６比較例１）または50℃（実施例９〜１１、比較例２）の湯浴中に浸漬させた際にストランドが完全に固化するまでに要する時間を固化時間とした。固化時間が短いほど結晶化が早く、固化性が改善されていることを示す。
【００６８】
（製造例１）KNK-005 ΔphaZ1,2,6株の作製
まずphaZ6遺伝子の破壊を目的とし、遺伝子置換用プラスミドの作製を行った。C. necator H16株のゲノムDNAを鋳型とし、配列番号20および配列番号21で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。ポリメラーゼはKOD-plus（東洋紡社製）を用いた。同様に配列番号22および配列番号23で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。さらに、上記PCRで得られた2種DNA断片を鋳型とし、配列番号20および配列番号23で示したDNAをプライマーとしてPCRを行い、得られたDNA断片を制限酵素SmiIで消化した。このDNA断片を、特開2007-259708号公報に記載のベクターpNS2X-sacBをSmiIで消化したDNA断片と、DNAリガーゼ（Ligation High、東洋紡社製）を用いて連結し、phaZ6構造遺伝子より上流および下流のDNA配列を有する遺伝子破壊用プラスミドpNS2X-phaZ6(-+)を作製した。
【００６９】
次に遺伝子破壊株の作製を行った、遺伝子破壊用プラスミド pNS2X-phaZ6(-+)を大腸菌S17-1株（ATCC47055）に導入し、KNK-005株（US7384766号参照）とNutrient Agar培地（DIFCO社製）上で混合培養して接合伝達を行った。KNK-005株は配列番号3に記載のPHA合成酵素をコードする遺伝子を有する、C. necator H16株を宿主とする菌株である。
【００７０】
上記接合伝達後の菌株から、250 mg/Lのカナマイシン硫酸塩を含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム2 g/L、塩化ナトリウム5 g/L、硫酸マグネシウム七水和物0.2 g/L、リン酸二水素アンモニウム1 g/L、リン酸水素二カリウム1 g/L、寒天15 g/L、pH6.8）上で生育する菌株を選択し、前記プラスミドがKNK-005株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をNutrient Broth培地（DIFCO社製）で2世代培養した後、15 %のショ糖を含むNutrient Agar培地で生育する菌株を選択した。得られた菌株からphaZ6遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを全長欠失したものをPCRにより選別し、うち1株をKNK-005 ΔphaZ6株と命名した。KNK-005 ΔphaZ6株は、染色体上のphaZ6遺伝子を全長欠失し、染色体上に配列番号3に記載のPHA合成酵素をコードする遺伝子を有する菌株である。
【００７１】
次にphaZ1遺伝子の破壊を目的とし、遺伝子置換用プラスミドの作製を行った。C. necator H16株のゲノムDNAを鋳型とし、配列番号24および配列番号25で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。ポリメラーゼはKOD-plusを用いた。同様に配列番号26および配列番号27で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。さらに、上記PCRで得られた2種DNA断片を鋳型とし、配列番号24および配列番号27で示したDNAをプライマーとしてPCRを行い、得られたDNA断片を制限酵素SmiIで消化した。このDNA断片を、pNS2X-sacBをSmiIで消化したDNA断片と、DNAリガーゼを用いて連結し、phaZ1構造遺伝子より上流および下流のDNA配列を有する遺伝子破壊用プラスミドpNS2X-phaZ1(-+)を作製した。
【００７２】
phaZ6遺伝子破壊と同様に、KNK-005 ΔphaZ6株を親株としてpNS2X-phaZ1(-+)を用いてphaZ1遺伝子の破壊を行った。得られた株はKNK-005 ΔphaZ1,6株と命名した。KNK-005 ΔphaZ1,6株は、染色体上のphaZ1遺伝子およびphaZ6遺伝子を全長欠失し、染色体上に配列番号3に記載のPHA合成酵素をコードする遺伝子を有する菌株である。
【００７３】
次にphaZ2遺伝子の破壊を目的とし、遺伝子置換用プラスミドの作製を行った。C. necator H16株のゲノムDNAを鋳型とし、配列番号28および配列番号29で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。ポリメラーゼはKOD-plusを用いた。同様に配列番号30および配列番号31で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。さらに、上記PCRで得られた2種DNA断片を鋳型とし、配列番号28および配列番号31で示したDNAをプライマーとしてPCRを行い、得られたDNA断片を制限酵素SmiIで消化した。このDNA断片を、pNS2X-sacBをSmiIで消化したDNA断片と、DNAリガーゼを用いて連結し、phaZ2構造遺伝子より上流および下流のDNA配列を有する遺伝子破壊用プラスミドpNS2X-phaZ2(-+)を作製した。
【００７４】
phaZ6遺伝子破壊と同様に、KNK-005 ΔphaZ1,6株を親株としてpNS2X-phaZ2(-+)を用いてphaZ2遺伝子の破壊を行った。得られた株はKNK-005 ΔphaZ1,2,6株と命名した。KNK-005 ΔphaZ1,2,6株は、染色体上のphaZ1遺伝子およびphaZ6遺伝子を全長欠失し、phaZ2遺伝子の16番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号3に記載のPHA合成酵素をコードする遺伝子を有する菌株である。
【００７５】
（製造例２）KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6株の作製
さらに染色体上のphaJ4b遺伝子の上流にphaJ4b遺伝子の発現を強化するための発現調節配列を挿入することを目的とし、発現調節配列挿入用プラスミドを作製した。C. necator H16株のゲノムDNAを鋳型とし、配列番号32および配列番号33で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。ポリメラーゼはKOD-plusを用いた。同様に配列番号34および配列番号35で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。さらに同様に、配列番号36および配列番号37で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。上記PCRで得られた3種のDNA断片を鋳型とし、配列番号32および配列番号35で示したDNAをプライマーとしてPCRを行い、得られた断片をSmiIで消化した。このDNA断片を、pNS2X-sacBをSmiIで消化したDNA断片と、DNAリガーゼを用いて連結し、phaJ4b構造遺伝子より上流のDNA配列、phaC1プロモーターとphaC1SD配列からなる発現調節配列、およびphaJ4b構造遺伝子配列を有するDNA挿入用プラスミドpNS2X-sacB+phaJ4bU-REP-phaJ4bを作製した。
【００７６】
上記遺伝子破壊と同じ方法で、製造例１で得られたNK005ΔphaZ1,2,6株を親株としてpNS2X-sacB+phaJ4bU-REP-phaJ4bを用いてphaJ4b遺伝子の上流に発現調節配列を挿入した。得られた株はKNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6株と命名した。KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6株は、染色体上のphaZ1遺伝子およびphaZ6遺伝子を全長欠失し、phaZ2遺伝子の16番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、phaJ4b遺伝子の直上流にphaC1プロモーター(REP)およびphaC1SD配列(REP-SD)からなる発現調節配列が挿入され、染色体上に配列番号3に記載のPHA合成酵素をコードする遺伝子を有する菌株である。
【００７７】
（製造例３）PHB生産用プラスミドpCUP2-REP-phaCReの作製
製造例２で作製したKNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6株に導入するためのPHB生産用プラスミドpCUP2-REP-phaCReを作製した。
【００７８】
まず、C. necator H16株のゲノムDNAを鋳型とし、配列番号38および配列番号39で示したDNAをプライマーとしてPCRを行い、得られたDNA断片をEcoRIとSpeIで消化した。ポリメラーゼはKOD-plusを用いた。このDNA断片を、特開2007-259708号公報記載のpCUP2ベクターをMunIとSpeIで消化したDNA断片と、DNAリガーゼを用いて連結し、phaC1プロモーターとphaC1SD配列からなる発現調節配列、およびphaCRe構造遺伝子配列を有するPHB生産用プラスミドpCUP2-REP-phaCReを作製した。
【００７９】
（製造例４）PHB生産用プラスミドpCUP2-PJ4a-phaCReの作製
製造例２で作製したKNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6株に導入するためのPHB生産用プラスミドpCUP2-PJ4a-phaCReを作製した。
【００８０】
まず、C. necator H16株のゲノムDNAを鋳型とし、配列番号40および配列番号41で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。同様に配列番号39および配列番号42で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。上記PCRで得られた2種類のDNA断片を鋳型として、配列番号39および配列番号40で示したDNAをプライマーとしてPCRを行い、得られたDNA断片をMunIとSpeIで消化した。ポリメラーゼはKOD-plusを用いた。このDNA断片を、pCUP2ベクターをMunIとSpeIで消化したDNA断片と、DNAリガーゼを用いて連結し、発現調節配列PJ4a、およびphaCRe構造遺伝子配列を有するPHB生産用プラスミドpCUP2-PJ4a-phaCReを作製した。
【００８１】
（製造例５）PHB生産用プラスミドpCUP2-Plac-phaCReの作製
製造例２で作製したKNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6株に導入するためのPHB生産用プラスミドpCUP2-Plac-phaCReを作製した。
【００８２】
まず、C. necator H16株のゲノムDNAを鋳型とし、配列番号39および配列番号43で示したDNAをプライマーとしてPCRを行い、得られたDNA断片をMunIとSpeIで消化した。ポリメラーゼはKOD-plusを用いた。このDNA断片を、pCUP2ベクターをMunIとSpeIで消化したDNA断片と、DNAリガーゼを用いて連結し、phaC1SD配列（REP-SD）からなる発現調節配列、およびphaCRe構造遺伝子配列を有するPHB生産用プラスミドpCUP2-SD-phaCReを作製した。
【００８３】
次にpCR(R)2.1-TOPO(R)（Invitrogen社製）を鋳型とし、配列番号44および配列番号45で示したDNAをプライマーとしてPCRを行い、得られたDNA断片をMunIで消化した。ポリメラーゼはKOD-plusを用いた。このDNA断片を、pCUP2-SD-phaCReをMunIで消化したDNA断片と、DNAリガーゼを用いて連結し、lacプロモーターとphaC1SD配列からなる発現調節配列、およびphaCRe構造遺伝子配列を有するPHB生産用プラスミドpCUP2-Plac-phaCReを作製した。
【００８４】
（製造例６）製造例２記載のKNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6株を親株とする、PHB生産用プラスミド導入株の作製
PHBHとPHBを共生産する菌株の作製を目的とし、製造例２で作製したKNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6株を親株とし、製造例３〜５記載のプラスミドのいずれかを導入した菌株を作製した。
【００８５】
まず、KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6株をNutrient Broth培地で一晩培養した。得られた培養液0.5 mlをNutrient Broth培地100 mlに接種し、30℃で3時間培養した。得られた培養液を氷上で速やかに冷却し、菌体を回収して氷冷した蒸留水で良く洗浄した後、得られた菌体を2 mlの蒸留水に懸濁した。菌体液を各プラスミド溶液と混合し、キュベットに注入してエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションは、MicroPulserエレクトロポレーター（バイオ・ラッド社製）を使用し、電圧1.5 kV、抵抗800 Ω、電流25 μFの条件で行った。エレクトロポレーション後、菌体溶液を回収して5 mlのNutrient Broth培地を添加し、30℃で3時間培養した。得られた培養液を、100 mg/lのカナマイシン硫酸塩を含むNutrient Agar培地に塗布した。30℃で3日間培養し、得られたコロニーから各プラスミドが導入された菌株を取得した。得られた菌株をそれぞれ、KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-Plac-phaCRe株、KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-PJ4a-phaCRe株、KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-REP-phaCRe株と命名した。
【００８６】
（製造例７）KNK-005 Ptrp-phaJ4a ΔphaZ1::PJ4a-phaCRe ΔphaZ2,6株の作製
染色体上のphaJ4a遺伝子の上流に発現調節配列を挿入することを目的とし、発現調節配列挿入用プラスミドを作製した。C. necator H16株のゲノムDNAを鋳型とし、配列番号46および配列番号47で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。ポリメラーゼはKOD-plusを用いた。同様に配列番号48および配列番号49で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。さらにプラスミドpKK388-1（CLONTECH社製）を鋳型とし、配列番号50および配列番号51で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。上記PCRで得られた3種のDNA断片を鋳型とし、配列番号46および配列番号49で示したDNAをプライマーとしてPCRを行い、得られた断片をSmiIで消化した。このDNA断片を、pNS2X-sacBをSmiIで消化したDNA断片と、DNAリガーゼを用いて連結し、phaJ4a構造遺伝子より上流のDNA配列、trpプロモーターとphaC1SD配列からなる発現調節配列、およびphaJ4a構造遺伝子配列を有するDNA挿入用プラスミドpNS2X-sacB+phaJ4aU-trp-phaJ4aを作製した。
【００８７】
製造例２と同様の方法で、KNK-005 ΔphaZ1,2,6株を親株としてpNS2X-sacB+phaJ4aU-trp-phaJ4aを用いてphaJ4a遺伝子の上流に発現調節配列を挿入した。得られた株はKNK-005 Ptrp-phaJ4a ΔphaZ1,2,6株と命名した。KNK-005 Ptrp-phaJ4a ΔphaZ1,2,6株は、染色体上のphaZ1遺伝子およびphaZ6遺伝子を全長欠失し、phaZ2遺伝子の16番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、phaJ4a遺伝子の直上流にtrpプロモーターおよびphaC1SD配列からなる発現調節配列が挿入され、染色体上に配列番号3に記載のPHA合成酵素をコードする遺伝子を有する菌株である。
【００８８】
次に、KNK-005 Ptrp-phaJ4a ΔphaZ1,2,6株のphaZ1遺伝子を欠失した領域に、PHB生産用の遺伝子発現カセットを導入することを目的とし、DNA挿入用プラスミドを作製した。まずC. necator H16株のゲノムDNAを鋳型とし、配列番号24および配列番号52で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。ポリメラーゼはKOD-plusを用いた。同様に配列番号27および配列番号53で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。上記PCRで得られた2種のDNA断片を鋳型とし、配列番号24および配列番号27で示したDNAをプライマーとしてPCRを行い、得られた断片をSmiIで消化した。このDNA断片を、pNS2X-sacBをSmiIで消化したDNA断片と、DNAリガーゼを用いて連結し、phaZ1構造遺伝子より上流のDNA配列、配列番号62記載のDNA配列、およびphaZ1構造遺伝子より下流のDNA配列を有するDNA挿入用プラスミドpNS2X-sacB-dZ1ULを作製した。
【００８９】
次に、製造例４で作製したpCUP2-PJ4a-phaCReをMunIとSpeIで消化して得られるDNA断片を、pNS2X-sacB-dZ1ULをMunIとSpeIで消化して得られるDNA断片と、DNAリガーゼを用いて連結し、phaZ1構造遺伝子より上流のDNA配列、発現調節配列PJ4a、phaCRe構造遺伝子配列、およびphaZ1構造遺伝子より下流のDNA配列を有するDNA挿入用プラスミドpNS2X-sacB-dZ1UL-PJ4a-phaCReを作製した。
【００９０】
製造例２と同様の方法で、KNK-005 Ptrp-phaJ4a ΔphaZ1,2,6株を親株としてpNS2X-sacB-dZ1UL-PJ4a-phaCReを用いてphaZ1遺伝子を欠失した領域にPHB生産用の遺伝子発現カセットを挿入した。得られた株はKNK-005 Ptrp-phaJ4a ΔphaZ1::PJ4a-phaCReΔphaZ2,6株と命名した。KNK-005 Ptrp-phaJ4a ΔphaZ1::PJ4a-phaCReΔphaZ2,6株は、染色体上のphaZ1遺伝子およびphaZ6遺伝子を全長欠失し、phaZ2遺伝子の16番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、phaJ4a遺伝子の直上流にtrpプロモーターおよびphaC1SD（REP-SD）配列からなる発現調節配列が挿入され、phaZ1遺伝子を欠失した領域に発現調節配列であるPJ4aおよびphaCRe構造遺伝子配列が挿入され、染色体上に配列番号3に記載のPHA合成酵素をコードする遺伝子を有する菌株である。
【００９１】
（製造例８）KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔphaZ2,6株の作製
製造例２で作製したKNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6株のphaZ1遺伝子を欠失した領域に、PHB生産用の遺伝子発現カセットを導入することを目的とし、DNA挿入用プラスミドを作製した。まずプラスミドpCUP2-Plac-phaCReを鋳型とし、配列番号63および配列番号39で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。得られた断片をEcoRIおよびSpeIで消化し、pNS2X-sacB-dZ1ULをMunIおよびSpeIで消化したDNA断片と、DNAリガーゼを用いて連結し、phaZ1構造遺伝子より上流のDNA配列、lacプロモーターおよびphaC1SD（REP-SD）からなる発現調節配列、phaCRe構造遺伝子配列、およびphaZ1構造遺伝子より下流のDNA配列を有するDNA挿入用プラスミドpNS2X-sacB-dZ1UL-Plac-phaCReを作製した。
【００９２】
製造例２と同様の方法で、KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6株を親株としてpNS2X-sacB-dZ1UL-Plac-phaCReを用いてphaZ1遺伝子を欠失した領域にPHB生産用の遺伝子発現カセットを挿入した。得られた株はKNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCReΔphaZ2,6株と命名した。KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCReΔphaZ2,6株は、染色体上のphaZ1遺伝子およびphaZ6遺伝子を全長欠失し、phaZ2遺伝子の16番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、phaJ4b遺伝子の直上流にREPプロモーターおよびphaC1SD（REP-SD）配列からなる発現調節配列が挿入され、phaZ1遺伝子を欠失した領域にlacプロモーター、phaC1SD（REP-SD）配列、およびphaCRe構造遺伝子配列が挿入され、染色体上に配列番号3に記載のPHA合成酵素をコードする遺伝子を有する菌株である。
【００９３】
（製造例９）KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::PlacN15SDM-phaCRe ΔphaZ2,6株の作製
製造例２で作製したKNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6株のphaZ1遺伝子を欠失した領域に、PHB生産用の遺伝子発現カセットを導入することを目的とし、DNA挿入用プラスミドを作製した。まずC. necator H16株のゲノムDNAを鋳型とし、配列番号64および配列番号39で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。得られた断片をMunIおよびSpeIで消化し、pNS2X-sacB-dZ1ULをMunIおよびSpeIで消化したDNA断片と、DNAリガーゼを用いて連結し、phaZ1構造遺伝子より上流のDNA配列、REP-SDMからなる発現調節配列、phaCRe構造遺伝子配列、およびphaZ1構造遺伝子より下流のDNA配列を有するDNA挿入用プラスミドpNS2X-sacB-dZ1UL-SDM-phaCReを作製した。
【００９４】
次にpCUP2-Plac-phaCReを鋳型とし、配列番号44および配列番号65で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。同様に配列番号66および配列番号45で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。上記PCRで得られた2種のDNA断片を鋳型とし、配列番号44および配列番号45で示したDNAをプライマーとしてPCRを行い、得られた断片をMunIで消化した。このDNA断片を、pNS2X-sacB-dZ1UL-SDM-phaCReをMunIで消化したDNA断片と、DNAリガーゼを用いて連結し、phaZ1構造遺伝子より上流のDNA配列、lacN15プロモーターおよびREP-SDMからなる発現調節配列、phaCRe構造遺伝子配列、およびphaZ1構造遺伝子より下流のDNA配列を有するDNA挿入用プラスミドpNS2X-sacB-dZ1UL-PlacN15SDM-phaCReを作製した。
【００９５】
製造例２と同様の方法で、KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6株を親株としてpNS2X-sacB-dZ1UL-PlacN15SDM11-phaCReを用いてphaZ1遺伝子を欠失した領域にPHB生産用の遺伝子発現カセットを挿入した。得られた株はKNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::PlacN15SDM-phaCRe ΔphaZ2,6株と命名した。KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::PlacN15SDM-phaCReΔphaZ2,6株は、染色体上のphaZ1遺伝子およびphaZ6遺伝子を全長欠失し、phaZ2遺伝子の16番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、phaJ4b遺伝子の直上流にREPプロモーターおよびphaC1SD（REP-SD）配列からなる発現調節配列が挿入され、phaZ1遺伝子を欠失した領域にlacN15プロモーター、REP-SDM配列、およびphaCRe構造遺伝子配列が挿入され、染色体上に配列番号3に記載のPHA合成酵素をコードする遺伝子を有する菌株である。
【００９６】
（製造例１０）KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::PlacN19SDM-phaCRe ΔphaZ2,6株の作製
製造例２で作製したKNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6株のphaZ1遺伝子を欠失した領域に、PHB生産用の遺伝子発現カセットを導入することを目的とし、DNA挿入用プラスミドを作製した。pCUP2-Plac-phaCReを鋳型とし、配列番号44および配列番号67で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。同様に配列番号66および配列番号45で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。上記PCRで得られた2種のDNA断片を鋳型とし、配列番号44および配列番号45で示したDNAをプライマーとしてPCRを行い、得られた断片をMunIで消化した。このDNA断片を、pNS2X-sacB-dZ1UL-SDM-phaCReをMunIで消化したDNA断片と、DNAリガーゼを用いて連結し、phaZ1構造遺伝子より上流のDNA配列、lacN19プロモーターおよびREP-SDMからなる発現調節配列、phaCRe構造遺伝子配列、およびphaZ1構造遺伝子より下流のDNA配列を有するDNA挿入用プラスミドpNS2X-sacB-dZ1UL-PlacN19SDM-phaCReを作製した。
【００９７】
製造例２と同様の方法で、KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6株を親株としてpNS2X-sacB-dZ1UL-PlacN19SDM11-phaCReを用いてphaZ1遺伝子を欠失した領域にPHB生産用の遺伝子発現カセットを挿入した。得られた株はKNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::PlacN19SDM-phaCRe ΔphaZ2,6株と命名した。KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::PlacN19SDM-phaCReΔphaZ2,6株は、染色体上のphaZ1遺伝子およびphaZ6遺伝子を全長欠失し、phaZ2遺伝子の16番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、phaJ4b遺伝子の直上流にREPプロモーターおよびphaC1SD（REP-SD）配列からなる発現調節配列が挿入され、phaZ1遺伝子を欠失した領域にlacN19プロモーター、REP-SDM配列、およびphaCRe構造遺伝子配列が挿入され、染色体上に配列番号3に記載のPHA合成酵素をコードする遺伝子を有する菌株である。
【００９８】
（実施例１）KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-Plac-phaCRe株によるPHA混合品の生産
製造例６で得られたKNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-Plac-phaCRe株を以下の条件で培養、精製し、PHA混合品を生産した。得られたPHA混合品の3HHモノマー比率は、10.1モル%であった。
【００９９】
また、得られたPHA混合品についてアニール法による評価を行った結果、高温側の吸熱ピーク熱量は2.2 J/gであった。
【０１００】
さらに、得られたPHA混合品についてPHA混合比率の分析、結晶化の評価、固化時間の測定を行った。得られた結果を表１および表２に示した。
【０１０１】
（培養）
菌株は以下のように培養した。
【０１０２】
種培地の組成は、１％（ｗ／ｖ）肉エキス、１％（ｗ／ｖ）バクトトリプトン、０．２％（ｗ／ｖ）イーストエキス、０．９％（ｗ／ｖ）リン酸水素二ナトリウム１２水和物、０．１５％（ｗ／ｖ）リン酸二水素カリウム、５０μｇ／Ｌカナマイシン、ｐＨ６．８とした。
【０１０３】
前培養培地の組成は、１．１％（ｗ／ｖ）リン酸水素二ナトリウム１２水和物、０．１９％（ｗ／ｖ）リン酸二水素カリウム、１．２９％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム、０．１％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム七水和物、０．５％（ｖ／ｖ）微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６％（ｗ／ｖ）塩化鉄（ＩＩ）六水和物、１％（ｗ／ｖ）塩化カルシウム二水和物、０．０２％（ｗ／ｖ）塩化コバルト六水和物、０．０１６％（ｗ／ｖ）硫酸銅五水和物、０．０１２％（ｗ／ｖ）塩化ニッケル六水和物を溶かしたもの）、５０μｇ／Ｌカナマイシンとした。炭素源には、パームダブルオレイン油を２．５％（ｗ／ｖ）の濃度で用いた。
【０１０４】
ＰＨＡ生産培地の組成は、０．５７８％（ｗ／ｖ）リン酸水素二ナトリウム・１２水和物、０．１０１％（ｗ／ｖ）リン酸二水素カリウム、０．４３７％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム、０．１５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム七水和物、０．７５％（ｖ／ｖ）微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６％（ｗ／ｖ）塩化鉄（II）六水和物、１％％（ｗ／ｖ）塩化カルシウム二水和物、０．０２％（ｗ／ｖ）塩化コバルト六水和物、０．０１６％（ｗ／ｖ）硫酸銅五水和物、０．０１２％（ｗ／ｖ）塩化ニッケル六水和物を溶かしたもの）とした。炭素源はＰａｌｍ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｄｉｓｔｉｌｌａｔｅ（ＰＦＡＤ；ＭＡＬＡＹＳＩＡＮ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＳＤＮ  ＢＤＨより入手。遊離脂肪酸含量９５．０％、脂肪酸組成 Ｃ１２：０  ０．２％、Ｃ１４：０  １．２％。Ｃ１６：０  ４７．６％、Ｃ１６：１  ０．３％、Ｃ１８：１３５．７％。Ｃ１８：２  ９．７％。Ｃ１８：３  ０．４％、Ｃ２０：０  ０．４％；融点４３．８℃）を以下の手順で乳化したものを用いた。
【０１０５】
ＰＦＡＤを５５０ｇおよび水を４５０ｇ量り取り、それぞれ６０℃に加熱後、水に４．７ｇのリン酸水素二ナトリウム１２水和物、および２．７５ｇのカゼインナトリウムを溶解させた。溶解後、ＰＦＡＤと混合し、ホモミキサー（ＳＩＬＶＥＲＳＯＮ社製、ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＩＸＥＲ  ＥＭＵＬＳＩＦＥＲ）を用いて攪拌数２５００ｒｐｍにて予備乳化を行った。さらにこの予備乳化液を高圧ホモジナイザー（ＰＡＮＤ２Ｋ型、ニロ・ソアビ社製）にて圧力１０ｂａｒｒにて乳化操作を行い、乳化物を得た。
【０１０６】
各菌株のグリセロールストック50 μlを種培地10 mlに接種して24時間培養し、1.8 Lの前培養培地を入れた3 Lジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製MDL-300型）に1.0 %(v/v)接種した。運転条件は、培養温度30℃、攪拌速度500 rpm、通気量1.8 L/minとし、pHは6.7から6.8の間でコントロールしながら、28時間培養した。pHコントロールには7 %水酸化アンモニウム水溶液を使用した。
【０１０７】
PHA生産培養は2 LのPHA生産培地を入れた10 Lジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製MDL-1000型）に前培養種母を25 %(v/v)接種した。運転条件は、培養温度32℃、攪拌速度450 rpm、通気量3.0 L/minとし、pHは6.7から6.8の間でコントロールした。pHコントロールには7 %水酸化アンモニウム水溶液を使用した。培養は45〜54時間行った。
【０１０８】
（精製）
培養経時および培養終了時、培養ブロスをサンプリングし、遠心分離によって菌体を回収、エタノールで洗浄後真空乾燥し、乾燥菌体を取得した。
【０１０９】
得られた乾燥菌体1 gに100 mlのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のPHAを抽出した。菌体残渣を濾別し、エバポレーターで総容量が30 mlになるまで濃縮後、90 mlのヘキサンを徐々に添加し、1時間穏やかに攪拌した。析出したPHAを濾別後、50℃で3時間真空乾燥し、精製PHAとして取得した。
【０１１０】
（実施例２）KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-PJ4a-phaCRe株によるPHA混合品の生産
KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6/pCUP2-Plac-phaCRe株に代えて、製造例６で作製したKNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-PJ4a-phaCRe株を用いて、実施例１と同様の方法でPHA混合品を生産した。得られたPHA混合品の3HHモノマー比率は、11.5モル%であった。
【０１１１】
また、得られたPHA混合品についてアニール法による評価を行った結果、高温側の吸熱ピーク熱量は3.7 J/gであった。
【０１１２】
さらに、得られたPHA混合品についてPHA混合比率の分析、結晶化の評価、固化時間の測定を行った。得られた結果を表１および表２に示した。また、得られたPHA混合品のDSC曲線を図１に示す。
【０１１３】
（実施例３）KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-REP-phaCRe株によるPHA混合品の生産
KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-Plac-phaCRe株に代えて、製造例６で作製したKNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-REP-phaCRe株を用いて、実施例１と同様の方法でPHA混合品を生産した。得られたPHA混合品の3HHモノマー比率は、9.9モル%であった。
【０１１４】
また、得られたPHA混合品についてアニール法による評価を行った結果、高温側の吸熱ピーク熱量は9.5 J/gであった。
【０１１５】
さらに、得られたPHA混合品についてPHA混合比率の分析、結晶化の評価、固化時間の測定を行った。得られた結果を表１および表２に示した。
【０１１６】
（実施例４）KNK-005 Ptrp-phaJ4a ΔphaZ1::PJ4a-phaCRe ΔphaZ2,6株によるPHA混合品の生産
KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-Plac-phaCRe株に代えて、製造例７で作製したKNK-005 Ptrp-phaJ4a ΔphaZ1::PJ4a-phaCReΔphaZ2,6株を用いて、実施例１と同様の方法でPHA混合品を生産した。得られたPHA混合品の3HHモノマー比率は、11.5モル%であった。さらに、得られたPHA混合品についてPHA混合比率の分析を行った。得られた結果を表１に示した。
【０１１７】
（実施例５）KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-REP-phaCRe株によるPHA混合品の生産
KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-Plac-phaCRe株に代えて、製造例６で作製したKNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-REP-phaCRe株を用いて、実施例１と同様の方法でPHA混合品を生産した。但し、培養時の炭素源として乳化PFADの代わりに、パームダブルオレイン油を使用した。得られたPHA混合品の3HHモノマー比率は、11.5モル%であった。さらに、得られたPHA混合品についてPHA混合比率の分析を行った。得られた結果を表１に示した。また、得られたPHA混合品のDSC曲線を図２に示す。
【０１１８】
（実施例６）KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔphaZ2,6株によるPHA混合品の生産
KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-Plac-phaCRe株に代えて、製造例８で作製したKNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔphaZ2,6株を用いて、実施例１と同様の方法でPHA混合品を生産した。但し、培養にはカナマイシンを添加しない培地を使用し、培養時の炭素源として乳化PFADの代わりに、パーム油を使用した。得られたPHA混合品の3HHモノマー比率は、11.0モル%であった。さらに、得られたPHA混合品についてPHA混合比率の分析を行った。得られた結果を表１および表２に示した。また、アニール法による評価を行った結果、高温側の吸熱ピーク熱量は4.5 J/gであった。このアニール法により求められた高温側熱量の数値から、別途作成した検量線（共生産品を擬似的に再現したPHBH/PHB混合品を、同様にアニール法により高温側熱量を測定）により、PHB含有量の推定値を求めたところ、4.2重量%と、アニール処理を行わない場合のDSC結果により求められた数値と一致することが確認された。
【０１１９】
（実施例７）KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::PlacN15SDM-phaCRe ΔphaZ2,6株によるPHA混合品の生産
KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔphaZ2,6株に代えて、製造例９で作製したKNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::PlacN15SDM-phaCReΔphaZ2,6株を用いて、実施例６と同様の方法でPHA混合品を生産した。得られたPHA混合品の3HHモノマー比率は、10.8モル%であった。さらに、得られたPHA混合品についてPHA混合比率の分析を行った。得られた結果を表１に示した。
【０１２０】
（実施例８）KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::PlacN19SDM-phaCRe ΔphaZ2,6株によるPHA混合品の生産
KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔphaZ2,6株に代えて、製造例１０で作製したKNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac19SDM-phaCReΔphaZ2,6株を用いて、実施例６と同様の方法でPHA混合品を生産した。得られたPHA混合品の3HHモノマー比率は、10.3モル%であった。さらに、得られたPHA混合品についてPHA混合比率の分析を行った。得られた結果を表１に示した。
【０１２１】
（比較例１）KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6株によるPHAの生産
KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-Plac-phaCRe株に代えて、製造例２で作製したKNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6株を用いて、実施例１と同様の方法でPHAを生産した。得られたPHAすなわちPHBHの3HHモノマー比率は、10.4モル%であった。さらに、得られたPHAについてPHA混合比率の分析、結晶化の評価、固化時間の測定を行った。得られた結果を表１および表２に示した。なお、得られたPHAのDSC曲線を図３に示す。吸熱ピークは143℃程度で終了し、PHBを生産していないため、高温側の吸熱ピークは存在しないことがわかる。
【０１２２】
【表１】
2020058391.tif 000002
【０１２３】
表１に示したように、比較例１では155℃付近に吸熱ピークが見られないのに対し、実施例１〜８では、154〜165℃付近に吸熱ピークが観察された。このことから、PHB生産用遺伝子カセットの導入により、PHBHとPHBが同一細胞内で共生産されていることが確認出来た。なお、実施例１〜８で見られた高温側の吸熱ピーク（Tm2）はPHB由来であるが、PHBの融点は本来175℃であることから、PHBを融点の低いPHBHと混合するとPHBの融点が低温側にシフトすることも確認された。高温側の吸熱ピーク熱量およびPHBの推定含有量は、phaCRe遺伝子を連結した発現調節配列、phaCRe遺伝子の導入形式、および炭素源により変化した。なお、実施例１〜８で得られたPHA混合品中のPHBH の3HHモノマー比率は、上記PHA混合品としての3HHモノマー比率とPHB推定含有量から、約10〜13モル％程度であることが確認された。
【０１２４】
【表２】
2020058391.tif 000003
【０１２５】
表２に示したように、比較例１と比べ、実施例１〜３、６では結晶化ピーク温度Tcが高温側に変化し、結晶化発熱量Hcが増大した。また実施例１〜３、６の固化時間は、比較例１と比べて2倍以上短くなった。これらの結果からPHBHとPHBを共生産することにより、ポリマーの結晶固化速度が大きく改善されることが確認出来た。
【０１２６】
（製造例１１）PHB生産用プラスミドpCUP2-PlacUV5-phaCReの作製
製造例１で作製したKNK-005 ΔphaZ1,2,6株に導入するための、PHB生産用プラスミドpCUP2-PlacUV5-phaCReを作製した。
【０１２７】
まず、C. necator H16株のゲノムDNAを鋳型とし、配列番号54および配列番号55で示したDNAをプライマーとしてPCRを行い、得られたDNA断片をMunIで消化した。ポリメラーゼはKOD-plusを用いた。このDNA断片を、製造例5のpCUP2-SD-phaCReをMunIで消化したDNA断片と、DNAリガーゼを用いて連結し、lacUV5プロモーターとphaC1SD配列からなる発現調節配列、およびphaCRe構造遺伝子配列を有するPHB生産用プラスミドpCUP2-PlacUV5-phaCReを作製した。
【０１２８】
（製造例１２）製造例１で作製したKNK-005 ΔphaZ1,2,6株を親株とする、PHB生産用プラスミド導入株の作製
PHBHとPHBを共生産する菌株の作製を目的とし、製造例１で作製したKNK-005 ΔphaZ1,2,6株を親株とし、製造例３および１１記載のプラスミドのいずれかを導入した菌株を作製した。
【０１２９】
まず、KNK-005 ΔphaZ1,2,6株をNutrient Broth培地で一晩培養した。得られた培養液0.5 mlをNutrient Broth培地100 mlに接種し、30℃で3時間培養した。得られた培養液を氷上で速やかに冷却し、菌体を回収して氷冷した蒸留水で良く洗浄した後、得られた菌体を2 mlの蒸留水に懸濁した。菌体液を各プラスミド溶液と混合し、キュベットに注入してエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションは、MicroPulserエレクトロポレーター（バイオ・ラッド社製）を使用し、電圧1.5 kV、抵抗800 Ω、電流25μFの条件で行った。エレクトロポレーション後、菌体溶液を回収して5 mlのNutrient Broth培地を添加し、30℃で3時間培養した。得られた培養液を、100 mg/lのカナマイシン硫酸塩を含むNutrient Agar培地に塗布した。30℃で3日間培養し、得られたコロニーから各プラスミドが導入された菌株を取得した。得られた菌株をそれぞれ、KNK-005 ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-REP-phaCRe株、KNK-005 ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-PlacUV5-phaCRe株と命名した。
【０１３０】
（製造例１３）KNK-005 ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔphaZ2,6株の作製
製造例１で作製したKNK-005 ΔphaZ1,2,6株のphaZ1遺伝子を欠失した領域に、PHB生産用の遺伝子発現カセットを導入した株を作製した。
【０１３１】
製造例２と同様の方法で、KNK-005 ΔphaZ1,2,6株を親株として、製造例８に記載のpNS2X-sacB-dZ1UL-Plac-phaCReを用いてphaZ1遺伝子を欠失した領域にPHB生産用の遺伝子発現カセットを挿入した。得られた株はKNK-005 ΔphaZ1::Plac-phaCReΔphaZ2,6株と命名した。KNK-005 ΔphaZ1::Plac-phaCReΔphaZ2,6株は、染色体上のphaZ1遺伝子およびphaZ6遺伝子を全長欠失し、phaZ2遺伝子の16番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、phaZ1遺伝子を欠失した領域にlacプロモーター、phaC1SD（REP-SD）配列、およびphaCRe構造遺伝子配列が挿入され、染色体上に配列番号3に記載のPHA合成酵素をコードする遺伝子を有する菌株である。
【０１３２】
（実施例９）KNK-005 ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-REP-phaCRe株によるPHA混合品の生産
KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-Plac-phaCRe株に代えて、製造例１２で作製したKNK-005 ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-REP-phaCRe株を用いて、実施例１と同様の方法でPHA混合品を生産した。得られたPHA混合品の3HHモノマー比率は、4.8モル%であった。さらに、得られたPHA混合品についてPHA混合比率の分析、アニール法による評価、固化時間の測定を行った。得られた結果を表３に示した。また、得られたPHA混合品のDSC曲線を図４に、アニール法によるアニール処理後のDSC曲線を図５に示す。
【０１３３】
（実施例１０）KNK-005 ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-PlacUV5-phaCRe株によるPHA混合品の生産
KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-Plac-phaCReに代えて、製造例１２で作製したKNK-005 ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-PlacUV5-phaCRe株を用いて、実施例１と同様の方法でPHA混合品を生産した。得られたPHA混合品の3HHモノマー比率は、3.7モル%であった。さらに、得られたPHA混合品についてPHA混合比率の分析、アニール法による評価、固化時間の測定を行った。得られた結果を表３に示した。また、得られたPHA混合品のDSC曲線を図６に、アニール法によるアニール処理後のDSC曲線を図７に示す。
【０１３４】
（実施例１１）KNK-005 ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔphaZ2,6株によるPHA混合品の生産
KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔphaZ2,6株に代えて、製造例１３で作製したKNK-005 ΔphaZ1::Plac-phaCReΔphaZ2,6株を用いて、実施例６と同様の方法でPHA混合品を生産した。得られたPHA混合品の3HHモノマー比率は、4.1モル%であった。さらに、得られたPHA混合品についてPHA混合比率の分析、アニール法による評価、固化時間の測定を行った。得られた結果を表３に示した。
【０１３５】
（比較例２）KNK-005 ΔphaZ1,2,6株によるPHAの生産
KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-Plac-phaCReに代えて、製造例１で作製したKNK-005 ΔphaZ1,2,6株を用いて、実施例１と同様の方法でPHAを生産した。得られたPHAすなわちPHBHの3HHモノマー比率は、4.8モル%であった。さらに、得られたPHAについてPHA混合比率の分析、アニール法による評価、固化時間の測定を行った。得られた結果を表３に示した。また、得られたPHAのDSC曲線を図８に示す。
【０１３６】
【表３】
2020058391.tif 000004
【０１３７】
表３の結果から、PHBHとPHBを共生産することにより、160℃より高い部分に融解熱量が生じ、ポリマーの結晶固化速度が大きく改善されることがわかった。なお、実施例９〜１１で得られたPHA混合品中のPHBH の3HHモノマー比率は、上記PHA混合品としての3HHモノマー比率とPHB推定含有量から、約４〜６モル％の範囲内であることが確認された。
【図１】
2020058391.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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