(57)【要約】【課題】タンパク質キナーゼ阻害剤に対する感受性予測用組成物を提供する。【解決手段】組成物は、活性型ＲＯＮ（Recepteur d’Origine Nantais）の発現レベルを測定する製剤を含む、ｃ−ＭＥＴ、Ｌｃｋ、又はＶＥＧＦＲタンパク質キナーゼ阻害剤に対する感受性予測用組成物である。本発明の組成物はタンパク質キナーゼ阻害剤に対する感受性予測効果に優れるため、癌の治療に有用に使用することができる。【選択図】図１ａ
2020202839.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性型ＲＯＮ（Recepteur d’Origine Nantais）の発現レベルを測定する製剤を含む、ｃ−ＭＥＴ、Ｌｃｋ、又はＶＥＧＦＲタンパク質キナーゼ阻害剤に対する感受性予測用組成物。
【請求項２】
前記活性型ＲＯＮの発現レベルは、ＲＯＮ遺伝子のスプライシング変異体（Splicing variant）または突然変異（Mutant）の発現レベルを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記スプライシング変異体は、配列番号１のＲＯＮΔ１５５、配列番号２のＲＯＮΔ１６０及び配列番号３のＲＯＮΔ１６５からなる群から選択された一つ以上である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記突然変異は、配列番号４のポリペプチド内のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されたものである、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記突然変異は、配列番号４のポリペプチド内１２５４番目のアミノ酸がＭからＴに置換されたもの、配列番号４のポリペプチド内１３３５番目のアミノ酸がＲからＧに置換されたもの、配列番号４のポリペプチド内５２３番目のアミノ酸がＲからＱに置換されたもの、配列番号４のポリペプチド内１２３２番目のアミノ酸がＤからＶに置換されたもの、及び配列番号４のポリペプチド内１２６８番目のアミノ酸がＭからＴに置換されたものからなる群から選択された一つ以上である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記タンパク質キナーゼ阻害剤は、ＣＪ１２４９５、ＣＪ１２５２４、ＣＪ１２５６７、Ｋ２５２ａ、ＳＵ１１２７４、ＰＨＡ−６６５７５２、ＡＲＱ−１９７、ＰＦ−０２３４１０６６、ＪＮＪ−３８８７７６０５、フォレチニブ（Foretinib）、ＳＧＸ５２３、ＭＰ４７０、ＡＭＧ１０２、ＡＭＧ７０６、ＬＹ２８０１６５３、ＸＬ−１８４、ベバシズマブ（bevacizumab）、ＸＬ６４７、及びザクティマ（Zactima）からなる群から選択された一つ以上である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記タンパク質キナーゼ阻害剤は、癌、乾癬、関節リウマチ、炎症性腸疾患または慢性閉塞性肺疾患に対する治療剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記癌は、ＡＣＴＨ生成腫瘍、急性リンパ球性またはリンパ芽球性白血病、急性または慢性のリンパ球性白血病、急性非リンパ球性白血病、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、頸癌、慢性骨髄性白血病、腸癌、Ｔ−ゾーンリンパ腫、子宮内膜症、食道癌、胆汁膀胱癌、ユーイング肉腫（Ewing’s sarcoma）、頭頚部癌、舌癌、ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、中皮腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、神経芽細胞腫、乳腺癌、頸癌、前立腺癌、膵臓癌、大腸癌、陰茎癌、網膜芽細胞腫、皮膚癌、胃癌、甲状腺癌、子宮癌、睾丸癌、ウィルムス腫瘍、及びトロホブラスト腫瘍(trophoblastoma)からなる群から選択された一つ以上である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記発現レベルを測定する製剤は、ｍＲＮＡに特異的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド、プライマー対またはプローブを含むものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記プライマー対は、（ａ）配列番号５で表される正方向プライマー；及び（ｂ）配列番号６で表される逆方向プライマーからなるものである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記発現レベルを測定する製剤は、タンパク質に特異的に結合する抗体、ペプチドまたはヌクレオチドを含むものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記発現レベルを測定する製剤は、ＲＯＮのリン酸化を検出することができる抗体を含むものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物を含む、タンパク質キナーゼ阻害剤に対する感受性予測用キット。
【請求項１４】
（ａ）対象から得られた生物学的試料内の活性型ＲＯＮ（Recepteur d’Origine Nantais）の発現レベルを測定するステップ；及び（ｂ）（ａ）ステップで測定した結果に基づいて前記対象のｃ−ＭＥＴ、Ｌｃｋ、又はＶＥＧＦＲタンパク質キナーゼ阻害剤に対する感受性を判定するステップ；を含み、前記活性型ＲＯＮの発現が確認された場合、前記対象は、タンパク質キナーゼ阻害剤に対する感受性があると判定するものである、タンパク質キナーゼ阻害剤に対する感受性の予測方法。
【請求項１５】
前記活性型ＲＯＮの発現レベルは、ＲＯＮ遺伝子のスプライシング変異体（Splicing variant）または突然変異（Mutant）の発現レベルを含むものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記活性型ＲＯＮの発現レベルが対照群の発現レベルに比べて高発現である場合、前記対象は、タンパク質キナーゼ阻害剤に対する感受性があると判定するものである、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質キナーゼ阻害剤に対する感受性予測用バイオマーカー及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、抗癌療法において、抗癌剤を投与したときの生体の反応性は、薬剤の標的となる癌細胞のこの薬剤に対する感受性に大きく依存する。そのような癌細胞の薬剤に対する感受性は、癌細胞によって大きく異なる。そのような感受性の差は、この薬剤の標的分子またはこれに関連する因子の量的または質的な差、または薬剤耐性の獲得等に起因する。このような背景を踏まえ、標的となる癌細胞が薬剤に対して感受性を示す場合に特異的に表れる癌細胞の遺伝的変化を確認することができれば、早期に薬剤の効果判定、治療法の確立、新たな治療法の選択などが可能となり、非常に有益である。また、治療に先立って、生体組織片等により取得された癌組織において、通常の方法により癌細胞を分離した後、薬剤処理を施して、この癌細胞が薬剤感受性であるかどうかを、前記の変化により測定すると、この薬剤による治療が有効かどうかを事前に予測することができるため、臨床的に非常に有用である。
【０００３】
一方、タンパク質キナーゼは、他のタンパク質をリン酸化させ、タンパク質の活性、位置、及び機能を調節し、多様な細胞内の過程を制御する酵素である。そのようなタンパク質キナーゼの制御機能の異常は、癌、免疫疾患、神経疾患、代謝性疾患、及び感染症などの疾病メカニズムと密接に関連している。前記タンパク質キナーゼには、Ａｂｌ、ＡＣＫ、ＡＬＫ、Ａｒｇ、ＡＲＫ５、Ａｕｒｏｒａ、Ａｘｌ、Ｂｍｘ、ＢＴＫ、ＣＤＫ、ＣＨＫ、ｃ−Ｋｉｔ、ｃ−ＭＥＴ、ｃ−ＲＡＦ、ｃ−ＳＲＣ、ＥＧＦＲ、ＦＡＫ、Ｆｅｓ、ＦＧＦＲ、Ｆｌｔ３、ＧＳＫ３、ＩＧＦ、ＩＫＫ、ＪＡＫ、Ｌｃｋ、ＬＩＭＫ、Ｌｙｎ、ＭＥＫ、Ｍｅｒ、ＭＫ−２、Ｐ３８ａｌｐｈａ、ＰＤＧＦＲ、ＰＤＫ、Ｐｉｍ、ＰＫＡ、ＰＫＢ、ＰＫＣＲ、Ｐｌｋ−１／３、Ｒｅｔ、ＲＯＮ、Ｒｏｓ、Ｒｓｅ、Ｔｉｅ、Ｔｒｋ、Ｔｙｒｏ３、ＶＥＧＦＲ、ＹＥＳなどが含まれる。
【０００４】
その中、癌細胞での非正常なｃ−ＭＥＴ活性化は、抗癌治療の予後を悪化させることと密接に関係があり、ｃ−ＭＥＴの過発現及び突然変異が非小細胞性肺癌のような種々の癌で観察された。腫瘍の浸潤及び転移は、癌患者の主な死亡原因であるため、ｃ−ＭＥＴ信号伝達を阻害させることは、癌の治療に有効であると期待される。
【０００５】
ＲＯＮ（Recepteur d’Origine Nantais）はＭＥＴ（ｃ−ＭＥＴ）の系列に属するタンパク質受容体であり、肝臓から分泌され、大食細胞の作用を調節する血清タンパク質（macrophage-stimulating protein、MSP）の受容体である（非特許文献１）。ＲＯＮの発現は、乳癌及び大腸直腸癌で非正常に調節されており、特に大腸直腸癌の転移と密接に関連している。そのようなＲＯＮの活性度は、真核生物で遺伝子発現調節の重要な過程の一つである、選択的スプライシング（alternative splicing）により調節される。ＲＯＮΔ１５５、ＲＯＮΔ１６０及びＲＯＮΔ１６５は、そのようなスプライシングによるエクソンのスキッピング（skipping）により生成される形態であり、リガンドがなくても、構造的に常に活性化される。
【０００６】
また、ＲＯＮ遺伝子の突然変異は、種々の癌の発症及び悪性度と相関関係がある。
特許文献１に記載されたＣＪ１２４９５、ＣＪ１２５３７、ＣＪ１２５２４及びＣＪ１２５６７は、癌細胞の非正常な増殖を抑制する機能を有する抗癌剤であり、そのようなタンパク質キナーゼの活性を阻害する阻害剤である。
【０００７】
上述したように、抗癌剤は、耐性と毒性に関して個人差が大きく、同じ患者でも約半数以上で耐性を示す問題があるため、適合した治療反応性標識者を用いた選別は、抗癌剤治療の画期的な進歩をもたらすことができる。これに対し、特定の遺伝子による個別の抗癌剤の治療反応性に関する研究が最近継続的に活発に展開されている。
【０００８】
ただし、特定の薬剤に対する生体反応に関連する要素の複合的作用、治療剤及び投与方式の多様性と膨大な試料確保の困難により、まだ見事な成果が出ないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】韓国登録特許第１０−１３５０００６号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Zhou YQ、He C、Chen YQ、Wang D、Wang MH:Altered expression of the RON receptor tyrosine kinase in primary human colorectal adenocarcinomas:generation of different splicing RON variants and their oncogenic potential. Oncogene 2003、22(2):186-197
【非特許文献２】Myers et al.(1985)Nature 313:495
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
このような状況の下で、本発明者らは、大腸癌において抗癌剤であるタンパク質キナーゼ阻害剤に対する感受性を予測することができるバイオマーカーを開発するために鋭意努力した。その結果、大腸癌での感受性を予測するバイオマーカーとしてＲＯＮ遺伝子の変異体及び突然変異を分析し、ＲＯＮの活性化に伴う感受性を分析し、大腸癌細胞でＲＯＮの活性化またはＲＯＮ遺伝子の変異体及び突然変異の発現様相により、特定の薬物に対する感受性による癌細胞のサイズ及び重量の減少の程度が異なることを確認することにより、本発明を完成した。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、タンパク質キナーゼ阻害剤に対する感受性予測用バイオマーカー、組成物、キット、及び方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記のような目的を達成するために、本発明は、活性型ＲＯＮ（Recepteur d’Origine Nantais）を含む、タンパク質キナーゼ阻害剤に対する感受性予測用バイオマーカーを提供する。
【００１４】
また、本発明は、活性型ＲＯＮ（Recepteur d’Origine Nantais）の発現レベルを測定する製剤を含む、タンパク質キナーゼ阻害剤に対する感受性予測用組成物を提供する。
また、本発明は、前記組成物を含む、タンパク質キナーゼ阻害剤に対する感受性予測用キットを提供する。
【００１５】
また、本発明は、タンパク質キナーゼ阻害剤に対する感受性予測方法を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤に対する感受性予測用バイオマーカーを利用すれば、個々の患者の前記感受性を治療開始前に確実に判定することができ、治療効果が高い抗癌剤の選択が可能となる。また、効果が得られない抗癌剤の使用を回避することができるため、不必要な副作用を回避することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１ａ】図１ａは、大腸癌細胞株（ＨＴ２９、ｃｏｌｏ３２０ｈｓｒ、ＭＫＮ２８）及び大腸癌患者の試料からのＲＯＮ野生型またはＲＯＮΔ１５５またはＲＯＮΔ１６０変異体に対するＲＴ−ＰＣＲの確認結果を示す。
【図１ｂ】図１ｂは、大腸癌細胞株（ＨＴ２９、ｃｏｌｏ３２０ｈｓｒ、ＭＫＮ２８）及び大腸癌患者の試料からのＲＯＮ野生型またはＲＯＮΔ１５５またはＲＯＮΔ１６０変異体に対するウェスタンブロット及び免疫沈降（ＩＰ）の確認結果を示す。
【図１ｃ】図１ｃは、大腸癌患者の試料からのＰ−ＲＯＮに対するＩＨＣの結果を示す。
【図２ａ】図２ａは、ＰＤＸ−モデルでの薬物感受性テスト過程を図式的に示す。
【図２ｂ】図２ｂは、ＰＤＸ−モデル製作過程でのＲＯＮ変異体に対して陽性と判断された大腸癌患者の試料である１１６番の試料を移植した場合、そうでない１３０番の試料を移植した場合の癌のサイズを測定した結果を示す。
【図３ａ】図３ａは、大腸癌患者の試料である１１６番及び８７番をヌードマウスに移植した患者由来の大腸癌組織移植モデル（Xenograft model、PDX-model）にＣＪ１２５６７を投与した場合、マウスで生成された癌組織を示すイメージである。
【図３ｂ】図３ｂは、前記マウスから獲得した癌組織のサイズを測定した結果を示す。
【図３ｃ】図３ｃは、前記マウスから獲得した癌組織の重量を測定した結果を示す。
【図３ｄ】図３ｄは、前記マウスから獲得した癌組織のＩＨＣの結果を示す。
【図３ｅ】図３ｅは、前記マウスから獲得した癌組織のウェスタンブロッティング結果を示す。
【図４ａ】図４ａは、ＣＪ１２４９５によるＲＯＮのリン酸化抑制を示す。
【図４ｂ】ＲＯＮ突然変異遺伝子を導入した細胞でＲＯＮのリン酸化抑制を示す。
【図４ｃ】図４ｃは、ＲＯＮ遺伝子変異体でＲＯＮのリン酸化抑制を示す。
【図５ａ】図５ａは、ＣＪ１２４９５による細胞の移動性阻害を示す。
【図５ｂ】ＲＯＮ突然変異遺伝子を導入した細胞での移動性阻害を示す。
【図５ｃ】図５ｃは、ＲＯＮ遺伝子変異体での細胞の移動性阻害を示す。
【図６ａ】図６ａは、ＣＪ１２４９５による細胞転移抑制を示す。
【図６ｂ】図６ｂは、ＲＯＮ突然変異遺伝子を導入した細胞での細胞転移抑制を示す。
【図６ｃ】図６ｃは、ＲＯＮ遺伝子変異体での細胞転移抑制を示す。
【図７ａ】図７ａは、ＣＪ１２５２４によるＲＯＮのリン酸化抑制を示す。
【図７ｂ】図７ｂは、ＲＯＮ遺伝子変異体でＲＯＮのリン酸化抑制を示す。
【図７ｃ】図７ｃは、ＣＪ１２５２４による細胞死滅を示す。
【図７ｄ】図７ｄは、ＲＯＮ遺伝子変異体での細胞死滅を示す。
【図７ｅ】図７ｅは、ＣＪ１２５２４による細胞の転移抑制を示す。
【図８ａ】図８ａは、ＲＯＮ活性癌細胞−移植モデル（Xenograft model）にＣＪ１２５２４を投与した場合、前記マウスから獲得した癌組織のサイズ及び重量を測定した結果を示す。
【図８ｂ】図８ｂは、前記マウスで生成された癌組織のサイズを示すイメージである。
【図８ｃ】図８ｃは、前記マウスから獲得した癌組織のＩＨＣの結果を示す。
【図８ｄ】図８ｄは、前記マウスから獲得した癌組織のウェスタンブロッティング結果を示す。
【図９】ＲＯＮ活性がない胃癌組織移植モデルにＣＪ１２５３７を投与した場合、腫瘍体積を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明についてより詳しく説明する。
本発明の一態様によれば、本発明は、活性型ＲＯＮ（Recepteur d’Origine Nantais）を含む、タンパク質キナーゼ阻害剤に対する感受性予測用バイオマーカーを提供する。
【００１９】
本発明において、用語「ＲＯＮ（Recepteur d’Origine Nantais）」は、ＭＥＴ（ｃ−ＭＥＴ）系列に属するタンパク質受容体であり、肝臓から分泌され、大食細胞の作用を調節する血清タンパク質（macrophage stimulating protein、MSP）の受容体である。前記ＲＯＮタンパク質及び遺伝子は、当業界において公知となっており、公知となったデータベースからその配列を得ることができる。具体的には、ＲＯＮタンパク質の配列はＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＰ＿００２４３８．２に開示されたものであってもよく、ＲＯＮ遺伝子の配列はＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＭ＿００２４４７．１に開示されたものであってもよい。
【００２０】
本発明では、ＲＯＮが活性化されていたり、活性型で存在する場合、タンパク質キナーゼ阻害剤に対する感受性が高いことを確認し、それにより活性型ＲＯＮをバイオマーカーとして利用することができる。前記活性型ＲＯＮは、ＤＮＡレベル、ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベルなど、すべての発現レベルにおいて活性型であることを確認することができるすべてのものを含む概念として理解することができる。一例として、ＲＯＮタンパク質にリン酸化、例えば、ＲＯＮタンパク質のキナーゼドメインにリン酸化されており、活性化された形態で存在するものであってもよく、ＭＳＰのようなリガンドの存在下で活性型に誘導された形態であってもよい。また、他の一例として、リガンドがなくても、常に活性化されている形態としてＲＯＮ遺伝子のスプライシング変異体（Splicing variant）または突然変異（Mutant）を含むことができる。
【００２１】
したがって、本発明の一例として、ＲＯＮ（Recepteur d’Origine Nantais）遺伝子のスプライシング変異体（Splicing variant）または突然変異（Mutant）を含む、タンパク質キナーゼ阻害剤に対する感受性予測用バイオマーカーを提供する。
【００２２】
本明細書で使用される用語、「変異体（variant）」とは、その遺伝子が選択的スプライシング（alternative splicing）によりエクソン部位が削除され、生成されたＲＯＮ  ｉｓｏｆｏｒｍを意味する。
【００２３】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の変異体は、前記ＲＯＮ（Recepteur d’Origine Nantais）遺伝子のエクソン５、６、及び１１からなる群から選択された一つ以上がスプライシング（alternative splicing）により欠損したものであってもよい。より好ましくは、前記ＲＯＮ遺伝子の変異体は、エクソン５、６、及び１１が欠損したＲＯＮΔ１５５、エクソン５及び６が欠損したＲＯＮΔ１６０またはエクソン１１が欠損したＲＯＮΔ１６５であってもよい。
【００２４】
前記ＲＯＮ遺伝子の変異体ＲＯＮΔ１５５は配列番号１、ＲＯＮΔ１６０は配列番号２、ＲＯＮΔ１６５は配列番号３に示した。
本発明によれば、そのようなＲＯＮの選択的スプライシング（Alternative splicing）メカニズムによりエクソンが欠失されているスプライシング変異体は、特異的にヒト大腸癌細胞と患者の組織で多く発見され、その発現有無に応じて薬物に対する感受性が異なる。
【００２５】
本明細書で使用される用語、「突然変異（Mutant）」とは、該当遺伝子のヌクレオチド及びアミノ酸配列が塩基置換、欠失、挿入、増幅、及び再配列されたものを含む。ヌクレオチド変異は、参照配列（例えば、野生型配列）に対するヌクレオチド配列の変化（例えば、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、逆位または置換、例えば、単一のヌクレオチド多形性（ＳＮＰ））を指す。同用語は、また、別に表さなければ、ヌクレオチド配列の補体での対応する変化も含む。ヌクレオチド変異は体細胞突然変異または配線多形性であってもよい。
【００２６】
また、アミノ酸変異は、参照配列（例えば、野生型配列）と比較してアミノ酸配列の変化（例えば、１つ以上のアミノ酸の挿入、置換または欠失、例えば、内部欠失またはＮ−またはＣ−末端の末端切断（truncation））を指す。
【００２７】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の突然変異は、配列番号４のポリペプチド内のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されたものであり得る。
本発明の好ましい具現例によると、本発明の突然変異は、配列番号４のポリペプチド内１２５４番目のアミノ酸がＭからＴに置換されたもの、配列番号４のポリペプチド内１３３５番目のアミノ酸がＲからＧに置換されたもの、配列番号４のポリペプチド内５２３番目のアミノ酸がＲからＱに置換されたもの、配列番号４のポリペプチド内１２３２番目のアミノ酸がＤからＶに置換されたもの、及び配列番号４のポリペプチド内１２６８番目のアミノ酸がＭからＴに置換されたものからなる群から選択された一つ以上であってもよい。
【００２８】
本発明のバイオマーカーは、タンパク質キナーゼ阻害剤である抗癌剤に対する感受性の指標になることができ、抗癌剤に対する感受性マーカーとしての正確性及び信頼性も卓越するため、癌の発生、発展、及び／または転移の治療に使用することができる。
【００２９】
本明細書で使用される用語「感受性」とは、個々の患者の癌に対して特定の薬物が効果を示すかどうかを意味する。
例えば、前記特定薬物は、主に抗癌剤であり、それら抗癌剤には癌の種類に応じて効果を示す場合と効果を示さない場合がある。また、有効であると認められている種類の癌であっても、個々の患者により効果を示す場合と効果を示さない場合があることが知られている。このような個々の患者の癌に対して抗癌剤が効果を示すかどうかを抗癌剤感受性という。したがって、本発明により治療開始前に効果を期待できる患者（反応者）と、効果が期待できない患者（無反応者）を予測することができれば、有効性と安全性が高い化学療法が実現され得る。
【００３０】
本明細書で使用される用語「予測」とは、本願で対象患者が薬物または薬物セットに対して有利にまたは不利に反応する可能性を指すのに使用される。一実施態様では、予測はそのような反応の程度に関する。例えば、予測は、患者が処置した後、例えば、特定の治療剤の処置及び／または原発性腫瘍の手術的除去及び／または特定期間中の化学療法後に癌の再発なしに生存するかどうか、及び／またはそのような確率に関する。本発明の予測は、大腸癌患者に対する最も適合した治療方法を選択することにより、治療を決定するのに臨床的に使用することができる。本発明の予測は、患者が治療処置、例えば、与えられた治療的処置、例えば、与えられた治療剤または組み合わせ物の投与、手術的介入、化学療法などに有利に反応するか、または治療的処置後に患者の長期生存が可能かどうかを予測するにおいて有用なツールである。
【００３１】
本発明の好ましい具現例によると、本発明のタンパク質キナーゼは、Ａｂｌ、ＡＣＫ、ＡＬＫ、Ａｒｇ、ＡＲＫ５、Ａｕｒｏｒａ、Ａｘｌ、Ｂｍｘ、ＢＴＫ、ＣＤＫ、ＣＨＫ、ｃ−Ｋｉｔ、ｃ−ＭＥＴ、ｃ−ＲＡＦ、ｃ−ＳＲＣ、ＥＧＦＲ、ＦＡＫ、Ｆｅｓ、ＦＧＦＲ、Ｆｌｔ３、ＧＳＫ３、ＩＧＦ、ＩＫＫ、ＪＡＫ、Ｌｃｋ、ＬＩＭＫ、Ｌｙｎ、ＭＥＫ、Ｍｅｒ、ＭＫ−２、Ｐ３８ａｌｐｈａ、ＰＤＧＦＲ、ＰＤＫ、Ｐｉｍ、ＰＫＡ、ＰＫＢ、ＰＫＣＲ、Ｐｌｋ−１／３、Ｒｅｔ、ＲＯＮ、Ｒｏｓ、Ｒｓｅ、Ｔｉｅ、Ｔｒｋ、Ｔｙｒｏ３、ＶＥＧＦＲ、及びＹＥＳからなる群から選択された一つ以上であってもよく、より具体的には、ｃ−ＭＥＴ、ｃ−ＲＡＦ、ｃ−ＳＲＣ、ＥＧＦＲ、ＦＡＫ、Ｆｅｓ、ＦＧＦＲ、ＭＥＫ、Ｍｅｒ、ＭＫ−２、Ｐ３８ａｌｐｈａ、ＰＤＧＦＲ、ＰＤＫ、Ｐｉｍ、ＰＫＡ、ＰＫＢ、ＰＫＣＲ、Ｐｌｋ−１／３、Ｒｅｔ、ＲＯＮであってもよく、最も具体的には、ｃ−ＭＥＴ及びＲＯＮであってもよい。
【００３２】
本発明の好ましい具現例によると、本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤は、ＣＪ１２４９５、ＣＪ１２５３７、ＣＪ１２５２４、ＣＪ１２５６７、Ｋ２５２ａ、ＳＵ１１２７４、ＰＨＡ−６６５７５２、ＡＲＱ−１９７、ＰＦ−０２３４１０６６、ＰＦ−０４２１７９０３、ＪＮＪ−３８８７７６０５、フォレチニブ（Foretinib）、ＳＧＸ５２３、ＭＰ４７０、ＡＭＧ１０２、ＡＭＧ７０６、ＬＹ２８０１６５３、ＸＬ−１８４、フラボピリドール（Flavopihdol）、オロモウシン（olomoucine）、ロスコビチン（roscovitine）、プルバノロール（purvanolols）、ＣＧＰ７４５１４Ａ、ロスコビチン（roscovitine）、ベバシズマブ（bevacizumab）、セツキシマブ（cetuximab）、ゲフィチニブ（gefitinib）、エルロチニブ（erlotinib）、パニツムマブ（panitumumab）、ＰＫＩ−１６６、ＥＫＢ−５６９、ＨＫＩ−２７２（ＷＡＹ−１７７８２０）、ラパチニプ（lapatinib）、カネルチニブ（canertinib）、ＡＥＥ７８８、ＸＬ６４７、ＢＭＳ  ５５９９６２６、及びザクティマ（Zactima）からなる群から選択された一つ以上であってもよい。より具体的には、ＣＪ１２４９５、ＣＪ１２５３７、ＣＪ１２５２４、ＣＪ１２５６７、Ｋ２５２ａ、ＳＵ１１２７４、ＰＨＡ−６６５７５２、ＡＲＱ−１９７、ＰＦ−０２３４１０６６、ＰＦ−０４２１７９０３、ＪＮＪ−３８８７７６０５、フォレチニブ（Foretinib）、ＳＧＸ５２３、ＭＰ４７０、ＡＭＧ１０２、ＡＭＧ７０６、ＬＹ２８０１６５３またはＸＬ−１８４であってもよく、最も具体的には、ＣＪ１２４９５、ＣＪ１２５３７、ＣＪ１２５２４、またはＣＪ１２５６７であってもよい。
【００３３】
前記ＣＪ１２４９５、ＣＪ１２５３７、ＣＪ１２５２４及びＣＪ１２５６７は、タンパク質キナーゼの活性を阻害する阻害剤として韓国登録特許第１０−１３５０００６号に記載されており、本明細書に参照として含まれる。本発明において、前記ＣＪ１２４９５、ＣＪ１２５３７、ＣＪ１２５２４及びＣＪ１２５６７は癌細胞の非正常な増殖を抑制する機能を有する抗癌剤として使用される。
【００３４】
具体的には、本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤は、韓国登録特許第１０−１３５０００６号に記載された下記化学式（１）で示される化合物またはその塩であってもよい。
【００３５】
【化１】
2020202839.tif 000003
【００３６】
より具体的には、本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤としてＣＪ１２４９５は韓国登録特許第１０−１３５０００６号の実施例１で製造した「４−エトキシ−Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）チエノ［３，２−ｂ］ピリジン−７−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド」であり、下記化学式（２）で表される化合物であってもよい。また、ＣＪ１２５３７は前記ＣＪ１２４９５の塩酸塩（ＨＣｌ  ｓａｌｔ）であり、即ち、「４−エトキシ−Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）チエノ［３，２−ｂ］ピリジン−７−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドの塩酸塩」である。
【００３７】
【化２】
2020202839.tif 000004
【００３８】
また、より具体的には、本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤としてＣＪ１２５２４は韓国登録特許第１０−１３５０００６号の実施例８で製造した「４−エトキシ−Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−（ピリジン−２−イル）チエノ［３，２−ｂ］ピリジン−７−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド」であり、下記化学式（３）で示される化合物であってもよい。また、ＣＪ１２５６７は前記ＣＪ１２５２４の塩酸塩（ＨＣｌ  ｓａｌｔ）であり、即ち、「４−エトキシ−Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−（ピリジン−２−イル）チエノ［３，２−ｂ］ピリジン−７−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドの塩酸塩」である。
【００３９】
【化３】
2020202839.tif 000005
【００４０】
本発明の他の態様によると、本発明は、活性型ＲＯＮ（Recepteur d’Origine Nantais）の発現レベルを測定する製剤を含む、タンパク質キナーゼ阻害剤に対する感受性予測用組成物を提供する。前記活性型ＲＯＮは、前記で説明した通りであり、具体的には、前記活性型ＲＯＮの発現レベルは、ＲＯＮ遺伝子のスプライシング変異体（Splicing variant）または突然変異（Mutant）の発現レベルを含むものであってもよい。本発明において、前記発現レベルは、ＤＮＡレベル、ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベルなど、すべての発現レベルを意味するものとして理解することができる。
【００４１】
本発明の好ましい具現例によると、本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤は、癌、乾癬、関節リウマチ、炎症性腸疾患または慢性閉塞性肺疾患に対する治療剤であってもよい。
本発明の好ましい具現例によると、前記癌はＡＣＴＨ生成腫瘍、急性リンパ球性またはリンパ芽球性白血病、急性または慢性のリンパ球性白血病、急性非リンパ球性白血病、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、頸癌、慢性骨髄性白血病、腸癌、Ｔ−ゾーンリンパ腫、子宮内膜症、食道癌、胆汁膀胱癌、ユーイング肉腫（Ewing’s sarcoma）、頭頚部癌、舌癌、ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、中皮腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、神経芽細胞腫、乳腺癌、頸癌、前立腺癌、膵臓癌、大腸癌、陰茎癌、網膜芽細胞腫、皮膚癌、胃癌、甲状腺癌、子宮癌、睾丸癌、ウィルムス腫瘍、及びトロホブラスト腫瘍(trophoblastoma)からなる群から選択された一つ以上であってもよい。より具体的には、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、神経芽細胞腫、乳腺癌、頸癌、前立腺癌、膵臓癌、大腸癌、陰茎癌、網膜芽細胞腫、皮膚癌、胃癌、甲状腺癌、子宮癌、睾丸癌、ウィルムス腫瘍、及びトロホブラスト腫瘍(trophoblastoma)からなる群から選択された一つ以上であってもよく、最も具体的には、大腸癌であってもよい。
【００４２】
本明細書で使用される用語「大腸癌（colon cancer）」とは、直腸癌、結腸癌及び肛門癌を通称することを意味する。
本明細書において特別な言及がない限り、本明細書で使用される表現「発現レベルの測定」とは、該当試料内で検出しようとする対象を検出することを意味する。本発明では、その検出しようとする対象は、試料内の該当タンパク質の活性形態如何を含むことができ、遺伝子の変異体または突然変異のｍＲＮＡ及び／またはタンパク質を全て含むことができる。即ち、タンパク質の活性形態如何だけでなく、遺伝子の変異体または突然変異の産物であるＲＮＡまたは遺伝子産物であるタンパク質を検出することにより、前記発現有無を確認することができる。
【００４３】
前記検出は、通常は、試料からＲＮＡまたはタンパク質を抽出し、抽出物中のＲＮＡまたはタンパク質を検出することにより行うことができる。そのようなＲＮＡまたはタンパク質の検出は、免疫分析学的方法、ハイブリッド化反応及び増幅反応により測定することができるが、これに限定されず、当業界において公知となった多様な技術を用いて容易に行うことができる。
【００４４】
本発明の好ましい具現例によると、前記発現レベルを測定する製剤は、ｍＲＮＡ、例えば、前記スプライシング変異体（Splicing variant）または突然変異（Mutant）のｍＲＮＡに特異的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド、プライマー対またはプローブを含むことができる。
【００４５】
前記ｍＲＮＡの発現有無を測定する製剤は、前記遺伝子に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、プライマー対、プローブ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。即ち、核酸の検出は、遺伝子を暗号化する核酸分子、または前記核酸分子の相補物にハイブリッド化される１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する増幅反応により行うことができる。
【００４６】
例えば、プライマーを用いたｍＲＮＡの検出は、ＰＣＲのような増幅方法を使用して遺伝子配列を増幅した後、当分野において公知となった方法で遺伝子の増幅有無を確認することにより行うことができる。
【００４７】
本発明の好ましい具現例によると、前記プライマー対は、（ａ）配列番号５で表される正方向プライマー；及び（ｂ）配列番号６で表される逆方向プライマーからなりうる。
また、本発明の好ましい具現例によると、前記発現レベルを測定する製剤は、ＲＯＮタンパク質、例えば、活性型ＲＯＮタンパク質または突然変異タンパク質に特異的に結合する抗体、ペプチドまたはヌクレオチドを含むことができる。また、ＲＯＮタンパク質の活性型有無を確認するためのＲＯＮのリン酸化検出抗体を含むことができる。
【００４８】
前記タンパク質の発現有無を測定する製剤は、前記タンパク質に対して特異的に結合する抗体を意味し、多クローン抗体、単クローン抗体、組換え抗体、及びそれらの組み合わせを全て含むことができる。
【００４９】
前記抗体は、多クローン抗体、単クローン抗体、組換え抗体、及び２つの全長の軽鎖及び２つの全長の重鎖を有する完全な形態だけでなく、抗体分子の機能的な断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖをすべて含む。抗体の生産は、本発明が属する分野に広く公知となった技術を用いて容易に製造することができ、製造されて商業的に販売される抗体を利用することができる。
【００５０】
本発明の組成物は、上述した遺伝子の発現有無を測定する製剤だけでなく、抗原−抗体複合体の形成を定量または定性的に測定可能にするラベル、免疫学的分析に使用される通常のツール、試薬などをさらに含むことができる。
【００５１】
抗原−抗体複合体の形成を定性または定量的に測定可能にするラベルには、酵素、蛍光物、リガンド、発光物、ミクロ粒子（microparticle）、酸化還元分子及び放射線同位元素等があり、必ずしもこれに制限されるものではない。検出ラベルとして利用可能な酵素には、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヘキソキナーゼとＧＤＰａｓｅ、ＲＮａｓｅ、グルコースオキシダーゼとルシフェラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ホスホエノールピルビン酸デカルボキシラーゼ、β−ラクタマーゼなどがあり、これらに制限されない。蛍光物には、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、フルオレスカミンなどがあり、これに限定されない。リガンドは、ビオチン誘導体などがあり、これに制限されない。発光物はアクリジニウムエステル、ルシフェリン、ルシフェラーゼなどがあり、これに限定されない。ミクロ粒子には、コロイド金、着色されたラテックスなどがあり、これに限定されない。酸化還元分子は、フェロセン、ルテニウム錯体、ビオロゲン、キノン、Ｔｉイオン、Ｃｓイオン、ジイミド、１，４−ベンゾキノン、ヒドロキノン、Ｋ４Ｗ（ＣＮ）８、［Ｏｓ（ｂｐｙ）３］２＋、［ＲＵ（ｂｐｙ）３］２＋、［ＭＯ（ＣＮ）８］４−などがあり、これに限定されない。放射線同位元素には、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅなどがあり、これらに制限されない。
【００５２】
前記のツールまたは試薬の一例として、適合した担体、溶解剤、洗浄剤、緩衝剤、安定化剤などが含まれるが、これらに限定されない。標識物質が酵素である場合には、酵素活性を測定することができる基質及び反応停止剤を含むことができる。担体は、可溶性担体、不溶性担体があり、可溶性担体の一例として、当分野において公知となった生理学的に許容される緩衝液、例えば、ＰＢＳがあり、不溶性担体の一例としてポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、多糖類、その他の紙、ガラス、金属、アガロース及びそれらの組み合わせであってもよい。
【００５３】
本発明の組成物は、上述したバイオマーカーを有効成分として含むため、重複した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
本発明の他の態様によると、本発明は、前記組成物を含む、タンパク質キナーゼ阻害剤に対する感受性予測用キットを提供する。
【００５４】
前記キットは、前記遺伝子の発現レベルを測定する製剤だけでなく、免疫学的分析に使用される当分野において一般に使用されるツール、試薬などを含むことができる。
前記のツールまたは試薬の一例として、適合した担体、検出可能な信号を生成することができる標識物質、発色団（chromophores）、溶解剤、洗浄剤、緩衝剤、安定化剤などが含まれるが、これらに限定されない。標識物質が酵素である場合には、酵素活性を測定することができる基質及び反応停止剤を含むことができる。担体は、可溶性担体、不溶性担体があり、可溶性担体の一例として、当分野において公知となった生理学的に許容される緩衝液、例えば、ＰＢＳがあり、不溶性担体の一例としてポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、多糖類、ラテックスに金属をメッキした磁性微粒子のような高分子、その他の紙、ガラス、金属、アガロース及びそれらの組み合わせであってもよい。
【００５５】
本発明のキットは、上述したバイオマーカーを構成として含むため、重複した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
本発明の他の態様によると、本発明は、（ａ）対象から得られた生物学的試料内活性型ＲＯＮ（Recepteur d’Origine Nantais）の発現レベルを測定するステップ；及び（ｂ）（ａ）ステップで測定した結果に基づいて前記対象のタンパク質キナーゼ阻害剤に対する感受性を判定するステップと；を含むタンパク質キナーゼ阻害剤に対する感受性の予測方法を提供する。
【００５６】
前記測定された活性型ＲＯＮの発現レベルは、前記で説明した通りであり、具体的にはＲＯＮ遺伝子のスプライシング変異体（Splicing variant）または突然変異（Mutant）の発現レベルを含むことができる。
【００５７】
本発明の好ましい具現例によると、前記（ａ）ステップの活性型ＲＯＮの発現が確認された場合、前記対象は、タンパク質キナーゼ阻害剤に対する感受性があるものと判定する。
【００５８】
本発明の予測方法は、対象患者から生物学的試料を獲得し、前記試料内で、上述した遺伝子の変異体または突然変異からなるグループから選択される１つまたは複数個の発現レベルを測定した後、その発現が確認されると、当該試料がタンパク質キナーゼ阻害剤に対して感受性があると判定する工程を含んでなる。
【００５９】
即ち、本発明の予測方法は、試料内での特定の変異体または突然変異の発現有無を癌細胞の抗癌剤に対する感受性の指標とすることを特徴とする。
また、本発明の好ましい具現例によると、前記（ａ）ステップの活性型ＲＯＮの発現レベルが対照群の発現レベルに比べて高発現である場合、前記対象は、タンパク質キナーゼ阻害剤に対する感受性があるものと判定する。
【００６０】
本発明は、前記発現レベルを対照群試料の発現レベルと比較することをさらに含むことができる。
本発明の予測方法は、対象患者から生物学的試料を獲得し、前記試料内で、上述した遺伝子の変異体または突然変異からなるグループから選択される１つまたは複数個の発現レベルを測定した後、対照群と比較し、その発現様相により、当該試料がタンパク質キナーゼ阻害剤に対して感受性があると判定する工程を含んでなる。
【００６１】
本明細書で特別な言及がない限り、本明細書で使用される用語「対照群」とは、健常人の当該遺伝子変異体またはそのタンパク質の発現レベル；健常人の該当遺伝子野生型またはそのタンパク質の発現レベル；比較対象である該当疾患患者の該当遺伝子変異体またはそのタンパク質の発現レベル；または比較対象である該当疾患患者の該当遺伝子野生型またはそのタンパク質の発現レベルを意味する。
【００６２】
より詳しくは、本発明の前記（ｂ）ステップは、前記（ａ）ステップで測定した発現レベルの結果を基礎として、対照群の活性型ＲＯＮ、例えば、ＲＯＮ遺伝子変異体、突然変異または野生型の値に比べて高発現されたことが確認された場合、対象患者から獲得された当該腫瘍細胞が抗癌剤であるタンパク質キナーゼ阻害剤に対して感受性があると判定するものである。
【００６３】
本明細書において、前記発現レベルを言及しながら使用される用語「高発現」とは、バイオマーカーが非正常プロセス、疾患もしくは個体内のその他の病態を示すか、またはその兆候である場合、健康、または野生型（正常）の個体から取得された生物学的試料から検出されるバイオマーカーの値もしくはレベル範囲より高い生物学的試料内のバイオマーカーの値、あるいはレベルを指す。また、バイオマーカーの「正常」発現レベルまたは値と比較して「差動（differential）レベル」または「差動値」を有したり、「相違して発現された」ものとして称することができ、発現において定量的な差だけでなく、定性的な差をともに含む。
【００６４】
本発明の好ましい具現例によると、前記高発現は、前記対象の発現レベルが対照群の発現レベルと比較して１．２倍以上に増加したことを意味する。
本発明において、前記遺伝子の変異体または突然変異の存在及び発現は、上述したように、タンパク質キナーゼ阻害剤に対する感受性に影響を与えることができる。
【００６５】
前記変異体または突然変異の検出は、当業界に広く公知となっている技術を利用し、標的分子クローニング及び配列分析により行うことができる。例えば、ＤＮＡ配列分析；対立遺伝子−特異的ヌクレオチド混入検定及び対立遺伝子−特異的プライマー延長検定（例えば、対立遺伝子−特異的ＰＣＲ、対立遺伝子−特異的ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）及びギャップ−ＬＣＲ）をはじめとするプライマー延長検定；対立遺伝子−特異的オリゴヌクレオチド混成化検定（例えば、オリゴヌクレオチドライゲーション検定）；切断剤からの保護を用いて核酸の二重らせん内のミスマッチされた塩基を検出する切断保護検定；ＭｕｔＳタンパク質の結合分析；変異体及び野生型核酸分子の移動性を比較する電気泳動分析；変性−勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ、例えば、文献［Myers et al.(1985)Nature 313:495］と同様）；ミスマッチされた塩基対におけるＲＮａｓｅ切断の分析；ヘテロ二重らせんＤＮＡの化学的または酵素的切断の分析；質量分光測定法（例えば、ＭＡＬＤＩＴＯＦ）；遺伝的ビット分析（ＧＢＡ）；５’ヌクレアーゼ検定（例えば、タックマン（ＴａｑＭａｎ（登録商標））；及び分子ビーコンを使用する検定を含むが、これらに限定されない。
【００６６】
本明細書で使用される用語「生物学的試料」とは、本発明のバイオマーカーの発現が検出される個体から得られるすべての試料を意味する。
前記生物学的試料は、唾液（saliva）、生検（biopsy）、血液、皮膚組織、液体培養物、糞便及び尿からなる群から選択されたいずれか一つであり、特にこれに限定されず、本発明の技術分野において一般的に使用されている方法で処理して準備することができる。
【００６７】
本発明の方法は、上述したバイオマーカーを利用して、感受性があると判定するため、重複した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
【実施例】
【００６８】
以下、実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨に基づいて、本発明の範囲がそのような実施例により制限されないということは、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００６９】
実験方法及び条件
ＲＴ−ＰＣＲ
大腸癌細胞株またはヒト大腸癌患者の試料をＴｒｉｚｏｌ  ＲＮＡ抽出法で総ＲＮＡを抽出し、１μｇの総ＲＮＡをｃＤＮＡに再合成した後、ＲＯＮプライマー対（配列番号５の正方向プライマー５’−ＣＴＣＴＧＧＧＧＡＣＣＡＧＧＴＴＴＴＣＣ−３’及び配列番号６の逆方向プライマー５’−ＡＣＣＡＴＣＡＡＴＧＧＣＡＧＧＧＡＧＴＧ−３’）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、１％のアガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ）に電気泳動した後、Ｅｔ−Ｂｒ染色を行った。ＲＴ−ＰＣＴの条件は、下記表１に示した。
【００７０】
【表１】
2020202839.tif 000006
【００７１】
ウェスタンブロット
試料をＲＩＰＡバッファーを用いて細胞を溶解させた後、高速遠心分離器を用いてタンパク質を抽出し、各細胞当り３０μｇのタンパク質をウェスタンブロット（western blot）法で電気泳動してタンパク質を分離した後、ＰＶＤＦメンブレン（ＰＤＶＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）にトランスファーしてＲＯＮ抗体を５％のスキムミルク（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）に各１：２０００の割合で希釈し、４℃で１２時間反応させた。次に、１５分間、３回ずつＴＢＳ−Ｔバッファーで洗浄した後、２次抗体を５％のスキムミルク（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）に各１：２０００の割合で希釈し、常温で２時間反応させ、１５分間、３回ずつＴＢＳ−Ｔバッファーで洗浄し、ＥＣＬバッファーを利用し、ＰＶＤＦメンブレン（ＰＤＶＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）の発光を誘導し、Ｘ−ｒａｙフィルムを利用し、ＲＯＮタンパク質の発現を現像した。また、免疫沈降（immunoprecipitation）法で、各細胞当り５００μｇのタンパク質に１μｇのＲＯＮ抗体を入れて４℃で１２時間反応した後、抗−抗体ｂｅａｄを添加してＲＯＮ抗体を沈降させ、ウェスタンブロット（western blot）法で電気泳動してタンパク質を分離した後、ＰＶＤＦメンブレン（ＰＤＶＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）にトランスファーし、ｐ−Ｔｙｒ抗体を５％のスキムミルク（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）に各１：１０００の割合で希釈し、４℃で１２時間反応させた。次に、１５分間、３回ずつＴＢＳ−Ｔバッファーで洗浄した後、２次抗体を５％のスキムミルク（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）に各１：２０００の割合で希釈し、室温で２時間反応させ、１５分間、３回ずつＴＢＳ−Ｔバッファーで洗浄し、ＥＣＬバッファーを利用し、ＰＶＤＦメンブレン（ＰＤＶＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）の発光を誘導し、Ｘ−ｒａｙフィルムを用いてｐ−Ｔｙｒ  ＲＯＮタンパク質の発現を現像した。
【００７２】
免疫組織化学
薬物投与終了後、組織を摘出して１０％のホルマリン溶液（ｆｏｒｍａｌｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に固定し、翌日、パラフィンブロック（ｐａｒａｆｆｉｎ  ｂｌｏｃｋ）を製作した後、５μｍに組織を分割（ｓｅｃｔｉｏｎ）してキシレン（Ｘｙｌｅｎｅ）処理後、１００％、９５％、７０％ＥｔＯＨで処理を行った後、３％のＢＳＡでブロッキング（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した後、ホスホＲＯＮ（ｐｈｏｓｐｈｏ−ＲＯＮ）とＲＯＮ抗体を１％のＢＳＡに各１：１００の割合で希釈し、４℃で１２時間反応させた。次に、１５分間、３回ずつＰＢＳ−Ｔバッファーで洗浄した後、２次抗体を１％のＢＳＡに各１：１００の割合で希釈し、室温で２時間反応させ、１５分間、３回ずつＴＢＳ−Ｔバッファーで洗浄し、ＤＡＢ基質（ＤＡＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）で処理し、ヘマトキシリン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）で処理した後、脱水（ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）過程を進め、マウント液（ｍｏｕｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を１〜２滴（ｄｒｏｐ）落としてカバーガラス（ｃｏｖｅｒｓｌｉｐ）で覆った後、タンパク質の発現を染色した。
【００７３】
大腸癌組織移植モデル（Xenograft model、PDX -model）
９０％ＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ溶液で凍結保存患者組織由来マウスモデル（ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ）の腫瘍を氷（ｉｃｅ）で溶かした後、ＨＢＢＳ＋５％ＦＢＳ＋１Ｘ  ペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）／ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）＋１Ｘ  ゲンタマイシン（Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）／アンフォテリシン（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ）Ｂが添加された培地（ｍｅｄｉａ）に安定化をさせて３ｍｍ３ほど切り取ってマウスの表皮を切開して移植した後、縫合し、腫瘍の生成を確認し、腫瘍のサイズが４００〜５００ｍｍ３になると、組織を摘出してさらに３ｍｍ３ずつ切り取った後、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ）に移植して腫瘍生成を確認し、薬物投与を行った。
【００７４】
抗癌剤の処理
本発明で使用される抗癌剤はｃ−ＭＥＴ阻害剤であり、韓国特許第１０−１３５０００６号に記載されたＣＪ１２５６７であり、陽性対照群としては、ＬＹ２８０１６５３（Ｌｉｌｙ  Ｃｏ．）を用いた。
【００７５】
腫瘍生成有無を確認した後、サイズが１００ｍｍ３になった時、各薬物投与グループに分けた後、ＣＪ１２５６７とＬＹ−２８０１６５３を０．５％のメチルセルロース（Ｍｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）で溶解してＣＪ１２５６７は３０ｍｐｋと１００ｍｐｋで投与し、ＬＹ−２８０１６５３は３０ｍｐｋで毎日経口投与して１４日間進め、薬物投与進行中３日ごとにカリパス（ｃａｌｉｐｅｒ）を使用し、腫瘍のサイズを測定し、マウスの体重を測定した。
【００７６】
ＲＯＮ遺伝子の突然変異
ＲＯＮの変異遺伝子（ＲＯＮ  Ｍ１２５４Ｔ、ＲＯＮ  Ｒ１３３５Ｇ及びＲＯＮ  Ｒ５２３Ｑ）を用いた。
【００７７】
［実施例１］
大腸癌患者組織のＲＯＮ遺伝子の変異体スクリーニング
本発明者らは、大腸癌患者組織内のＲＯＮ遺伝子の変異体を確認するために、合計２００例の大腸癌患者の組織試料を分析した。
【００７８】
まず、大腸癌細胞株（ＨＴ２９、ｃｏｌｏ３２０ｈｓｒ、ＭＫＮ２８）及び大腸癌患者の試料からのＲＯＮ野生型またはＲＯＮΔ１５５またはＲＯＮΔ１６０変異体の発現を確認するために、本発明者らが製作したプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００７９】
その結果、図１ａで示されるように、大腸癌細胞株であるＨＴ２９細胞株はＲＯＮΔ１６０変異体、ｃｏｌｏ３２０ｈｓｒ細胞株はＲＯＮΔ１５５変異体が発現していることが確認された。また、大腸癌患者の試料である８７番及び１１６番でＲＯＮΔ１５５またはＲＯＮΔ１６０変異体の発現を確認した。
【００８０】
その後、前記ＲＴ−ＰＣＲを行った大腸癌患者試料と同じ試料におけるＲＯＮの発現を確認するためにウェスタンブロット（図１ｂ）及び免疫組織化学（図１ｃ）を行った。
その結果、図１ｂ及び１ｃで示されるように、ＲＯＮΔ１５５またはＲＯＮΔ１６０変異体が確認された大腸癌患者の試料である８７番及び１１６番でＲＯＮのタンパク質のサイズは、大腸癌細胞株であるＨＴ２９細胞株のＲＯＮΔ１６０変異体タンパク質のサイズと同様であった。また、ｐ−Ｔｙｒ  ＲＯＮタンパク質の発現を有することから、ＲＯＮΔ１６０変異体がＲＯＮのタンパク質の活性化を引き起こすことが分かった。
【００８１】
［実施例２］
ＲＯＮ変異体発現患者由来大腸癌組織移植モデル（Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｄｅｌ、ＰＤＸ−ｍｏｄｅｌ）におけるＣＪ１２５６７に対する薬物感受性の分析
Ｉｎ  ｖｉｖｏ上でＣＪ１２５６７の薬物感受性を分析するために、本発明者らは、前記実施例１のｍＲＮＡ及び蛋白質レベルでＲＯＮ変異体に対して陽性と判断された大腸癌患者の試料である８７番及び１１６番試料を、ヌードマウスに移植し、患者由来大腸癌組織移植モデル（Xenograft model、PDX-model）を作製した。
【００８２】
一方、前記組織移植モデルを製作する過程において、図２ｂで示されるように、ＲＯＮ変異体に対して陽性と判断された大腸癌患者の試料である１１６番の試料を移植した場合、そうでない１３０番の試料を移植した場合より癌組織のサイズが遥かに大きく急速に生成されたことを確認することができた。
【００８３】
前記患者由来大腸癌組織移植が移植されたマウスに、それぞれＣＪ１２５６７（３０ｍｐｋ、１００ｍｐｋ）、陽性対照群としてＬＹ２８０１６５３（３０ｍｐｋ）及び正常対照群としてビヒクル（Ｖｅｈｉｃｌｅ、０．５％Ｍｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）を投与し、それらの癌組織のサイズ及び重量を測定し、ＩＨＣ及びウェスタンブロッティングを行って薬物感受性を確認した。
【００８４】
２−１．１１６番の患者由来大腸癌組織移植モデル（Xenograft model、PDX-model）におけるＣＪ１２５６７の薬物感受性
図３ａ〜図３ｃで示されるように、大腸癌患者の試料である１１６番をヌードマウスに移植した患者由来大腸癌組織移植モデル（Xenograft model、PDX-model）にＣＪ１２５６７  ３０ｍｐｋを投与した場合、癌のサイズ及び重量が正常対照群であるビヒクル群に比べて、それぞれ５３．１５％、４７．８７％と有意に減少した。また、これは陽性対照群であるＬＹ２８０１６５３投与群と類似の数値である。
【００８５】
また、ＣＪ１２５６７  １００ｍｐｋを投与した場合、癌のサイズ及び重量が正常対照群であるビヒクル群に比べて、それぞれ３５．０５％、１８．０９％と大きく減少した。これは、陽性対照群であるＬＹ２８０１６５３投与群に比べて、より顕著に癌のサイズ及び重量を減少させた結果である（図３ａ〜図３ｃ）。
【００８６】
また、ＣＪ１２５６７  １００ｍｐｋを投与した場合、ｐ−ＲＯＮ、ＲＯＮ、ＭＳＰ及びｐ−ＥＲＫタンパク質に対して免疫組織化学法（図３ｄ）及びウェスタンブロット（図３ｅ）を行った結果、ＣＪ１２５６７  １００ｍｐｋとＬＹ２８０１６５３  ３０ｍｐｋは両方とも総ＲＯＮタンパク質の量は変化がないが、ＲＯＮの活性型であるｐ−ＲＯＮタンパク質の発現が減少し、ＭＳＰとｐ−ＥＲＫタンパク質の発現も減少することが確認されたところ、ｐ−ＲＯＮタンパク質の発現減少を通じたＭＳＰとｐ−ＥＲＫタンパク質の発現減少を引き起こして感受性が高くなることを示す。
【００８７】
２−２．８７番の患者由来大腸癌組織移植モデル（Xenograft model、PDX-model）におけるＣＪ１２５６７の薬物感受性
図３ａ〜図３ｃで示されるように、大腸癌患者の試料である８７番をヌードマウスに移植した患者由来大腸癌組織移植モデル（Xenograft model、PDX-model）にＣＪ１２５６７  ３０ｍｐｋを投与した場合、癌のサイズ及び重量が正常対照群であるビヒクル投与群に比べて、それぞれ６４．０２％、６１．３６％と有意に減少した。また、陽性対照群であるＬＹ２８０１６５３投与群に比べて顕著に癌のサイズ及び重量を減少させた。
【００８８】
また、ＣＪ１２５６７  １００ｍｐｋを投与した場合、癌のサイズ及び重量が正常対照群であるビヒクル群に比べて、それぞれ５６．４３％、４０．９１％と大きく減少した。これは、陽性対照群であるＬＹ２８０１６５３投与群に比べて、より顕著に癌のサイズ及び重量を減少させた結果である（図３ａ〜図３ｃ）。
【００８９】
そのような結果は、大腸癌患者の試料内にＲＯＮ遺伝子の変異体が存在する場合、ＣＪ１２５６７に対する感受性が高いことを示す。
したがって、活性化されたＲＯＮ及びＲＯＮ遺伝子変異体は、ｃ−ＭＥＴ阻害剤であるＣＪ１２５６７に対する感受性予測用バイオマーカーとしての可能性を示す。
【００９０】
［実施例３］
ＲＯＮ遺伝子の野生型、突然変異（Mutant）及び変異体（variant）におけるＣＪ１２４９５に対する薬物感受性の分析
３−１．ＣＪ１２４９５によるＲＯＮのリン酸化阻害
本発明者らは、ＣＪ１２４９５で処理してＲＯＮ遺伝子の野生型、突然変異（Mutant）及び変異体（variant）におけるＲＯＮリン酸化阻害能を分析した。
【００９１】
まず、マウスの胚性線維芽細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３）にＲＯＮ野生型遺伝子を過発現させ、ＭＳＰで処理して活性化させた後、ＣＪ１２４９５で処理してＲＯＮのリン酸化抑制程度を確認した。
【００９２】
その結果、図４ａで示されるように、ＲＯＮタンパク質に免疫沈降した後、ホスホチロシン（ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）抗体でウェスタンブロットを分析したとき、ＭＳＰによるＲＯＮのリン酸化を通じて活性化されたことが分かり、ＣＪ１２４９５化合物により活性化されたＲＯＮのリン酸化が抑制されることを確認することができた。
【００９３】
また、マウスの胚性線維芽細胞株にそれぞれＲＯＮ変異遺伝子（ＲＯＮ  Ｍ１２５４Ｔ、ＲＯＮ  Ｒ１３３５Ｇ及びＲＯＮ  Ｒ５２３Ｑ）を過発現させ、ＭＳＰで処理して活性化させた後、ＣＪ１２４９５で処理してＲＯＮのリン酸化抑制の程度を確認した。
【００９４】
その結果、図４ｂで示されるように、ＲＯＮタンパク質に免疫沈降した後、ホスホチロシン（ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）抗体でウェスタンブロットを分析したとき、それぞれのＲＯＮ突然変異遺伝子を導入した細胞で活性化されたＲＯＮのリン酸化阻害を確認することができた。
【００９５】
また、マウスの胚性線維芽細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３）にそれぞれＲＯＮ遺伝子変異体であるＲＯＮ活性型Δ１６０遺伝子及びＲＯＮ活性型Δ１６５遺伝子を過発現させた後、ＣＪ１２４９５で処理してＲＯＮのリン酸化抑制程度を確認した。
【００９６】
その結果、図４ｃ（ＲＯＮ活性型Δ１６０遺伝子）及び図４ｄ（ＲＯＮ活性型Δ１６５遺伝子）で示されるように、ＲＯＮタンパク質に免疫沈降した後、ホスホチロシン（ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）抗体でウェスタンブロットを分析したとき、それぞれのＣＪ１２４９５で処理したグループで活性型ＲＯＮのリン酸化が抑制されることを確認することができた。
【００９７】
そのような結果から、ＭＳＰを通じて活性化されたり、活性型のＲＯＮ遺伝子を有している場合は、ＣＪ１２４９５に対する感受性が高くなるため、ＣＪ１２４９５のＲＯＮのリン酸化抑制効果が優れて発揮されることを確認することができた。
【００９８】
３−２．ＣＪ１２４９５によるＲＯＮリン酸化阻害に伴う細胞の移動抑制効果
本発明者らは、ＣＪ１２４９５で処理してＲＯＮ遺伝子の野生型、突然変異（Mutant）及び変異体（variant）におけるＲＯＮのリン酸化阻害に伴う細胞の移動抑制効果を分析した。
【００９９】
まず、マウスの胚性線維芽細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３）にＲＯＮの野生型遺伝子を過発現させ、ＭＳＰで処理して活性化させた後、ＣＪ１２４９５で処理して細胞の移動を確認した。
【０１００】
その結果、図５ａで示されるように、細胞移動測定法（migration assay）で分析したとき、ＭＳＰにより活性化され、増加した細胞の移動性がＣＪ１２４９５により抑制されることを確認することができた。
【０１０１】
また、マウスの胚性線維芽細胞株にそれぞれＲＯＮ突然変異遺伝子（ＲＯＮ  Ｍ１２５４Ｔ及びＲＯＮ  Ｒ１３３５Ｇ）を過発現させ、ＭＳＰで処理してＲＯＮを活性化させた後、ＣＪ１２４９５で処理して細胞移動性を確認した。
【０１０２】
その結果、図５ｂで示されるように、細胞移動測定法（migration assay）で分析したとき、それぞれのＲＯＮ突然変異遺伝子を導入し、ＣＪ１２４９５で処理した全グループで、ＭＳＰにより活性化され、増加した細胞移動性が抑制されることを確認することができた。
【０１０３】
また、マウスの胚性線維芽細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３）にＲＯＮ遺伝子変異体であるＲＯＮ活性型Δ１６０遺伝子及びＲＯＮ活性型Δ１６５遺伝子を過発現させた後、ＣＪ１２４９５で処理して細胞移動性阻害効果を確認した。
【０１０４】
その結果、図５ｃで示されるように、細胞移動測定法（migration assay）で分析したとき、それぞれのＣＪ１２４９５で処理した全グループで細胞の移動性が抑制されることを確認することができた。
【０１０５】
そのような結果から、ＭＳＰを通じて活性化されたり、活性型のＲＯＮ遺伝子を有している場合は、ＣＪ１２４９５に対する感受性が高くなるため、ＣＪ１２４９５による細胞移動性抑制効果が優れて発揮されることを確認することができた。
【０１０６】
３−３．ＣＪ１２４９５によるＲＯＮリン酸化阻害に伴う細胞転移性抑制効果
本発明者らは、ＣＪ１２４９５で処理してＲＯＮ遺伝子の野生型、突然変異（Mutant）及び変異体（variant）におけるＲＯＮリン酸化阻害に伴う細胞転移性抑制効果を分析した。
【０１０７】
マウスの胚性線維芽細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３）にそれぞれＲＯＮ遺伝子野生型及びＲＯＮ突然変異遺伝子（Ｒ５２３Ｑ）を過発現させ、ＭＳＰで処理してＲＯＮを活性化させた後、ＣＪ１２４９５で処理して細胞浸潤の程度を確認した。
【０１０８】
その結果、図６ａで示されるように、それぞれＲＯＮ野生型とＲ５２３Ｑ突然変異遺伝子が導入され、ＭＳＰで処理した全グループで、ＣＪ１２４９５で処理したとき、ＭＳＰにより活性化され、増加した細胞転移が抑制されることを確認することができた。
【０１０９】
また、マウスの胚性線維芽細胞株にそれぞれＲＯＮ突然変異遺伝子（ＲＯＮ  Ｍ１２５４Ｔ及びＲＯＮ  Ｒ１３３５Ｇ）を過発現させ、ＭＳＰで処理してＲＯＮを活性化させた後、ＣＪ１２４９５で処理して細胞浸潤の程度を確認した。
【０１１０】
その結果、図６ｂで示されるように、それぞれのＲＯＮ突然変異遺伝子を導入し、ＭＳＰで処理した全グループで、ＣＪ１２４９５で処理したとき、ＭＳＰにより活性化され、増加した細胞転移が抑制されることを確認することができた。
【０１１１】
また、マウスの胚性線維芽細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３）にＲＯＮ遺伝子変異体であるＲＯＮ活性型Δ１６０遺伝子及びＲＯＮ活性型Δ１６５遺伝子を過発現させた後、ＣＪ１２４９５で処理して細胞浸潤の程度を確認した。
【０１１２】
その結果、図６ｃで示されるように、それぞれのＣＪ１２４９５で処理した全グループで、ＣＪ１２４９５で処理したとき、ＭＳＰにより活性化され、増加した細胞転移が抑制されることを確認することができた。
【０１１３】
そのような結果は、癌細胞内にＲＯＮが活性化されている場合、例えば、ＲＯＮ遺伝子の変異体または突然変異が存在する場合、ＣＪ１２４９５に対する感受性が高いことを示している。
【０１１４】
したがって、活性型ＲＯＮ、例えば、ＲＯＮ遺伝子の変異体または突然変異は、ＣＪ１２４９５に対する感受性予測用バイオマーカーとしての可能性を示す。
また、活性型ＲＯＮを発現する場合、ＣＪ１２４９５はこれに対する抗癌剤の薬物として用いることができる。
【０１１５】
［実施例４］
ＲＯＮ遺伝子の野生型、突然変異（Mutant）及び変異体（variant）におけるＣＪ１２５２４に対する薬物感受性の分析
４−１．ＣＪ１２５２４によるＲＯＮのリン酸化阻害
本発明者らは、ＣＪ１２５２４で処理してＲＯＮ遺伝子の野生型、突然変異（Mutant）及び変異体（variant）におけるＲＯＮリン酸化阻害能を分析した。
【０１１６】
常にＲＯＮが活性化されており、ｐ−ＲＯＮの発現が高い大腸癌細胞株であるＨＴ２９とＨＣＴ８をＣＪ１２５２４で処理し、ＣＪ１２５２４によるＲＯＮのリン酸化阻害能を確認した。
【０１１７】
その結果、図７ａで示されるように、ＣＪ１２５２４を濃度別に処理した細胞でＲＯＮのリン酸化が抑制されることを確認した。
また、ＲＯＮが発現されない大腸癌細胞株であるＣｏｌｏ３２０ＨＳＲに常時発現されるＲＯＮ活性型Δ１５５とΔ１６０遺伝子を導入した後、ＣＪ１２５２４で処理し、ＣＪ１２５２４によるＲＯＮのリン酸化阻害能を確認した。
【０１１８】
その結果、図７ｂで示されるように、ＲＯＮ活性型Δ１５５とΔ１６０遺伝子を導入し、ＣＪ１２５２４で処理したとき、ＲＯＮのリン酸化が減少することを確認した。
４−２．ＣＪ１２５２４によるＲＯＮのリン酸化阻害に伴う細胞死誘導
本発明者らはＣＪ１２５２４で処理してＲＯＮのリン酸化阻害に伴う細胞死誘導効果を分析した。
【０１１９】
常にＲＯＮがリン酸化されており、ｐ−ＲＯＮの発現が高い大腸癌細胞株であるＨＴ２９とＨＣＴ８をＣＪ１２５２４で処理し、細胞死誘導有無を確認した。
その結果、図７ｃで示されるように、ＣＪ１２５２４を濃度別に処理したとき、細胞死も、濃度別に増加することを確認した。このとき、ＲＯＮのリン酸化が減少し、切断されたカスパーゼ３（cleaved caspase 3）の発現が増加した。
【０１２０】
また、ＲＯＮが発現されない大腸癌細胞株であるＣｏｌｏ３２０ＨＳＲにＲＯＮ常時活性型遺伝子であるΔ１５５とΔ１６０を導入してＣＪ１２５２４を濃度別に処理し、細胞死の誘導有無を確認した。
【０１２１】
その結果、図７ｄで示されるように、ＣＪ１２５２４を濃度別に処理したとき、細胞死も濃度別に増加することを確認した。このとき、ＲＯＮのリン酸化が減少し、アポトーシス（apoptosis）マーカーである切断されたカスパーゼ３（cleaved caspase 3）の発現が濃度別に増加することを確認した。
【０１２２】
４−３．ＣＪ１２５２４によるＲＯＮリン酸化阻害に伴う細胞転移性抑制効果
本発明者らは、ＣＪ１２５２４で処理してＲＯＮのリン酸化阻害に伴う細胞転移性抑制効果を分析した。
【０１２３】
ＲＯＮが常にリン酸化されている大腸癌細胞株であるＨＣＴ８をＣＪ１２５２４で処理して細胞浸潤の程度を確認した。
その結果、図７ｅで示されるように、ＣＪ１２５２４で処理したとき、細胞転移の程度が６０％程度抑制されることを確認した。
【０１２４】
［実施例５］
ＲＯＮ活性癌細胞移植モデル（Xenograft model）におけるＣＪ１２５２４に対する薬物感受性の分析
Ｉｎ  ｖｉｖｏ上でＣＪ１２５２４の薬物感受性を分析するために、本発明者らは、前記ＲＯＮ活性について陽性と判断された癌細胞株を、ヌードマウスに移植し、癌細胞由来組織移植モデル（Xenograft model、PDX-model）を作製した。
【０１２５】
５−１．Ｉｎ  ｖｉｖｏ移植モデル（In vivo Xenograft model）においてＣＪ１２５２４による腫瘍抑制の確認
常にＲＯＮが活性を示すＨＣＴ８細胞株を用いた動物モデルにＣＪ１２５２４を濃度別に１４日間投与した。
【０１２６】
その結果、図８ａで示されるように、腫瘍のサイズを測定したとき、腫瘍の成長が抑制されること（左）を確認することができた。このとき、マウスの体重減少はほとんど認められなかった（右）。
【０１２７】
また、図８ｂで示されるように、薬物投与を終了した後、腫瘍組織を摘出し、腫瘍の重量を測定したとき、ＣＪ１２５２４を投与した全グループで腫瘍の重量が減少したことを確認することができた。
【０１２８】
５−２．Ｉｎ  ｖｉｖｏ移植モデル（In vivo Xenograft model）においてＣＪ１２５２４によるＲＯＮのリン酸化阻害
ＣＪ１２５２４投与を終了した後、組織を摘出してＲＯＮのリン酸化減少有無を確認した。
【０１２９】
その結果、免疫化学染色法（図８ｃ）及びウェスタンブロット（図８ｄ）で分析したとき、ＣＪ１２５２４処理グループでＲＯＮのリン酸化が減少することを確認した。
そのような結果は、癌細胞内にＲＯＮが活性を示す場合、例えば、ＲＯＮ遺伝子の変異体または突然変異が存在する場合、ＣＪ１２５２４に対する感受性が高いことを示す。
【０１３０】
したがって、活性型ＲＯＮ、例えば、ＲＯＮ遺伝子の変異体または突然変異は、ＣＪ１２５２４に対する感受性予測用バイオマーカーとしての可能性を示す。
また、活性型ＲＯＮを発現する場合、ＣＪ１２４９５はこれに対する抗癌剤の薬物として用いることができる。
【０１３１】
［実施例６］
ＲＯＮ活性がない癌細胞移植モデルにおけるＣＪ１２５３７に対する感受性の分析
６−１．Ｉｎ  ｖｉｖｏ移植モデルにおいてＣＪ１２５３７による腫瘍抑制の確認
ＲＯＮ活性がないＣｏｌｏ３２０ＨＳＲ細胞株を用いた動物モデルにおいてＣＪ１２５３７により腫瘍形成が抑制されるかどうかを確認した。
【０１３２】
具体的には、ＲＯＮ活性がないＣｏｌｏ３２０ＨＳＲ細胞株を用いた動物モデル（対照群）と、前記Ｃｏｌｏ３２０ＨＳＲ細胞株に常時発現されるＲＯＮ活性型Δ１５５とΔ１６０遺伝子、またはＲＯＮ  Ｍ１２５４Ｔ突然変異を導入した細胞株を用いた動物モデルを製作し、ＣＪ１２５３７による腫瘍形成抑制能を比較した。
【０１３３】
その結果、表２で示されるように、ＣＪ１２５３７を濃度別に処理したとき、ＲＯＮ活性がない対照群の動物モデルでは、腫瘍形成が全く抑制されなかったが、ＲＯＮ活性型変異体では、腫瘍形成が抑制されることを確認することができた。
【０１３４】
【表２】
2020202839.tif 000007
【０１３５】
６−２．ＲＯＮ活性がない胃癌組織移植モデルにおけるＣＪ１２５３７による腫瘍抑制の確認
ＲＯＮ活性がない胃癌組織移植マウスモデルにおいてＣＪ１２５３７による腫瘍抑制効果を確認しようとした。
【０１３６】
具体的には、５〜６週齢のＢａｌｂ／ｃヌードマウスに１×１０７細胞（ＭＫＮ１  ｐａｒｅｎｔ、ＭＫＮ１ＲＯＮΔ１６０ｓｔａｂｌｅ  ｃｅｌｌ）をマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）と１：１（ｖ／ｖ）で皮下注射した。腫瘍のサイズが９０〜１００ｍｍ３になったとき、グループを分けて薬物投与を行った。ビヒクル（vehicle）、ＣＪ１２５３７  ３０ｍｐｋ、１００ｍｐｋ、陽性対照群であるＡｍｇｅｎ  ３０ｍｐｋを２週間経口で（oral）毎日薬物投与した。腫瘍サイズは３日に１回測定し、薬物投与が終了した後、犠牲にして組織を摘出し、腫瘍の重量を測定した。このとき、組織からタンパク質を抽出し、ｐ−ＲＯＮと関連タンパク質の発現の変化をウェスタンブロット分析方法を使用して確認した。また、薬物投与を終了した後、腫瘍サイズの変化を確認するために薬物投与を終了した後も３日に一回ずつ、腫瘍サイズを測定して比較分析した。
【０１３７】
その結果、ＭＫＮ１細胞を移植したマウスモデルでは、ＲＯＮの活性化が認められず、ＲＯＮ活性がない場合、ＣＪ１２５３７を投与しても腫瘍体積に特別な変化が観察されず（図９）、ＣＪ１２５３７に対する感受性がないことを確認することができた。
【０１３８】
そのような結果から、ＲＯＮ活性が存在しない場合には、ＣＪ１２５３７に対する感受性がないことが認められた。
【図１ａ】
2020202839.tif 000008
【図１ｂ】
2020202839.tif 000009
【図１ｃ】
2020202839.tif 000010
【図２ａ】
2020202839.tif 000011
【図２ｂ】
2020202839.tif 000012
【図３ａ】
2020202839.tif 000013
【図３ｂ】
2020202839.tif 000014
【図３ｃ】
2020202839.tif 000015
【図３ｄ】
2020202839.tif 000016
【図３ｅ】
2020202839.tif 000017
【図４ａ】
2020202839.tif 000018
【図４ｂ】
2020202839.tif 000019
【図４ｃ】
2020202839.tif 000020
【図４ｄ】
2020202839.tif 000021
【図５ａ】
2020202839.tif 000022
【図５ｂ】
2020202839.tif 000023
【図５ｃ】
2020202839.tif 000024
【図６ａ】
2020202839.tif 000025
【図６ｂ】
2020202839.tif 000026
【図６ｃ】
2020202839.tif 000027
【図７ａ】
2020202839.tif 000028
【図７ｂ】
2020202839.tif 000029
【図７ｃ】
2020202839.tif 000030
【図７ｄ】
2020202839.tif 000031
【図７ｅ】
2020202839.tif 000032
【図８ａ】
2020202839.tif 000033
【図８ｂ】
2020202839.tif 000034
【図８ｃ】
2020202839.tif 000035
【図８ｄ】
2020202839.tif 000036
【図９】
2020202839.tif 000037
【配列表】
2020202839000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月26日(2020.8.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
【図１ａ】図１ａは、大腸癌細胞株（ＨＴ２９、ｃｏｌｏ３２０ｈｓｒ、ＭＫＮ２８）及び大腸癌患者の試料からのＲＯＮ野生型またはＲＯＮΔ１５５またはＲＯＮΔ１６０変異体に対するＲＴ−ＰＣＲの確認結果を示す。
【図１ｂ】図１ｂは、大腸癌細胞株（ＨＴ２９、ｃｏｌｏ３２０ｈｓｒ、ＭＫＮ２８）及び大腸癌患者の試料からのＲＯＮ野生型またはＲＯＮΔ１５５またはＲＯＮΔ１６０変異体に対するウェスタンブロット及び免疫沈降（ＩＰ）の確認結果を示す。
【図１ｃ】図１ｃは、大腸癌患者の試料からのＰ−ＲＯＮに対するＩＨＣの結果を示す。
【図２ａ】図２ａは、ＰＤＸ−モデルでの薬物感受性テスト過程を図式的に示す。
【図２ｂ】図２ｂは、ＰＤＸ−モデル製作過程でのＲＯＮ変異体に対して陽性と判断された大腸癌患者の試料である１１６番の試料を移植した場合、そうでない１３０番の試料を移植した場合の癌のサイズを測定した結果を示す。
【図３ａ】図３ａは、大腸癌患者の試料である１１６番及び８７番をヌードマウスに移植した患者由来の大腸癌組織移植モデル（Xenograft model、PDX-model）にＣＪ１２５６７を投与した場合、マウスで生成された癌組織を示すイメージである。
【図３ｂ】図３ｂは、前記マウスから獲得した癌組織のサイズを測定した結果を示す。
【図３ｃ】図３ｃは、前記マウスから獲得した癌組織の重量を測定した結果を示す。
【図３ｄ】図３ｄは、前記マウスから獲得した癌組織のＩＨＣの結果を示す。
【図３ｅ】図３ｅは、前記マウスから獲得した癌組織のウェスタンブロッティング結果を示す。
【図４ａ】図４ａは、ＣＪ１２４９５によるＲＯＮのリン酸化抑制を示す。
【図４ｂ】ＲＯＮ突然変異遺伝子を導入した細胞でＲＯＮのリン酸化抑制を示す。
【図４ｃ】図４ｃは、ＲＯＮ遺伝子変異体でＲＯＮのリン酸化抑制を示す。
【図４ｄ】図４ｄは、ＲＯＮ遺伝子変異体でＲＯＮのリン酸化抑制を示す。
【図５ａ】図５ａは、ＣＪ１２４９５による細胞の移動性阻害を示す。
【図５ｂ】ＲＯＮ突然変異遺伝子を導入した細胞での移動性阻害を示す。
【図５ｃ】図５ｃは、ＲＯＮ遺伝子変異体での細胞の移動性阻害を示す。
【図６ａ】図６ａは、ＣＪ１２４９５による細胞転移抑制を示す。
【図６ｂ】図６ｂは、ＲＯＮ突然変異遺伝子を導入した細胞での細胞転移抑制を示す。
【図６ｃ】図６ｃは、ＲＯＮ遺伝子変異体での細胞転移抑制を示す。
【図７ａ】図７ａは、ＣＪ１２５２４によるＲＯＮのリン酸化抑制を示す。
【図７ｂ】図７ｂは、ＲＯＮ遺伝子変異体でＲＯＮのリン酸化抑制を示す。
【図７ｃ】図７ｃは、ＣＪ１２５２４による細胞死滅を示す。
【図７ｄ】図７ｄは、ＲＯＮ遺伝子変異体での細胞死滅を示す。
【図７ｅ】図７ｅは、ＣＪ１２５２４による細胞の転移抑制を示す。
【図８ａ】図８ａは、ＲＯＮ活性癌細胞−移植モデル（Xenograft model）にＣＪ１２５２４を投与した場合、前記マウスから獲得した癌組織のサイズ及び重量を測定した結果を示す。
【図８ｂ】図８ｂは、前記マウスで生成された癌組織のサイズを示すイメージである。
【図８ｃ】図８ｃは、前記マウスから獲得した癌組織のＩＨＣの結果を示す。
【図８ｄ】図８ｄは、前記マウスから獲得した癌組織のウェスタンブロッティング結果を示す。
【図９】ＲＯＮ活性がない胃癌組織移植モデルにＣＪ１２５３７を投与した場合、腫瘍体積を測定した結果を示す。