(57)【要約】  【課題】歯周病菌が細胞に侵入するのを抑制する手段を提供すること。  【解決手段】α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、銅クロロフィリンナトリウム、フラボン、及びレスベラトロールからなる群より選択される少なくとも１種を含有する、歯周病菌細胞侵入抑制用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レスベラトロール及びフラボンからなる群より選択される少なくとも１種を含有する、歯周病菌細胞侵入抑制用組成物。
【請求項２】
歯周病菌がＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
細胞が歯肉上皮細胞である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
口腔用組成物である、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯周病菌細胞侵入抑制用組成物（歯周病菌が細胞に侵入するのを抑制するための組成物）等に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周病は細菌（歯周病菌）の感染によって引き起こされる炎症性疾患であり、このため歯周病の予防又は治療のために重要な要因の一つとして、歯周病菌の活動を抑制することが挙げられる。このため、歯周病菌の殺菌又は抑制を目的に、数多くの口腔用組成物が研究開発されてきている（例えば特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１２−１１１７３２号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２１６  （２００２）  ２１７〜２２２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
歯周病菌であるP. gingivalisは、細胞（特に歯肉細胞）に侵入することが知られてい
る。侵入した菌は、強力な細胞傷害性を発揮する。侵入した菌の幾分かはリソソームで分解されるが、たとえ分解される運命となってもP. gingivalisはかなり長い時間オートラ
イソソーム内で生き続け、細胞傷害性を発揮するのである。さらには細胞内に侵入した菌の半数近くは初期エンドソームからrecycling pathwayを経由して細胞外に出て、周囲の
細胞に再侵入する。こたのめ、P. gingivalisは細胞間を往来し・生き長らえ・増殖し・
感染を続けるのである（例えば次のウェブページを参照：http://web.dent.osaka-u.ac.jp/~prevent/research01.html）。しかも、歯肉細胞内へ歯周病菌が侵入すると、歯周病菌殺菌又は抑制効果を奏する有効成分を含有する口腔用組成物を口腔内に適用しても、有効成分が歯周病菌まで到達することが難しくなるため、歯周病菌を殺菌又は抑制することが難しい。以上のことから、歯周病菌が細胞に侵入するのを抑制する手段を見出すことは歯周病の予防又は治療に大きく貢献すると考えられるため、本発明者らは検討を行った。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、特定の化合物が、歯周病菌が細胞に侵入するのを抑制する効果を奏することを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成させるに至った。
【０００７】
本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、銅クロロフィリンナトリウム、フラボン、及びレスベラトロールからなる群より選択される少なくとも１種を含有する、歯周病菌細胞侵入抑制用組成物。
項２．
歯周病菌がＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓである、項１に記載の組成物。
項３．
細胞が歯肉上皮細胞である、項１又は２に記載の組成物。
項４．
口腔用組成物である、項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、歯周病菌が細胞に侵入するのを効率的に抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】被験物質として銅クロロフェリンナトリウム１ｍＭを用いてベシクルビーズ（擬似Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の細胞侵入の程度を検討した際の、共焦点レーザー顕微鏡観察像を、図１に示す。図１左側に被験物質無添加のときの結果を、図１右側に被験物質添加のときの結果を、それぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明に包含される各実施形態について、さらに詳細に説明する。
【００１１】
本発明に包含される組成物は、歯周病菌が細胞に侵入するのを抑制するために用いられる。よって、本発明に包含される当該組成物は、歯周病菌細胞侵入抑制用組成物ということができる。以下、本発明に包含される当該組成物を「本発明の組成物」ということがある。
【００１２】
本発明の組成物は、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、銅クロロフィリンナトリウム、フラボン（２，３−ジデヒドロフラバン−４−オン）、及びレスベラトロールからなる群より選択される１種以上を含有する。なお、本発明の組成物に含まれるこれらの成分をまとめて有効成分と呼ぶことがある。有効成分は１種単独で又は２種以上組み合わせて本発明の組成物に含まれ得る。
【００１３】
本発明に含まれる有効成分の量は、本発明の効果を奏する範囲であれば特に制限されず、適宜設定することができる。例えば、０．１〜１００質量％でありえる。なお、１００質量％の場合であって且つ１種類の有効成分しか含まれない場合には、その有効成分そのものということになる。この状態も本発明の組成物に包含される。なお、この場合は特に歯周病菌細胞侵入抑制剤ということもできる。
【００１４】
なお、α−シクロデキストリン及びβ−シクロデキストリンについては、それぞれ、例えば３ｍＭ以上含まれることが好ましく、４ｍＭ以上又は５ｍＭ以上含まれることがより好ましく、６ｍＭ以上、７ｍＭ以上、８ｍＭ以上、９ｍＭ以上、又は１０ｍＭ以上含まれることがさらに好ましい。上限は本発明の効果が奏される範囲であれば特に制限されないが、例えば３０ｍＭ以下、２５ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、１５ｍＭ以下、又は１０ｍＭ以下が例示される。
【００１５】
また、銅クロロフィリンナトリウム、フラボン及びレスベラトロールについては、それぞれ、例えば０．３ｍＭ以上含まれることが好ましく、０．４ｍＭ以上又は０．５ｍＭ以上含まれることがより好ましく、０．６ｍＭ以上、０．７ｍＭ以上、０．８ｍＭ以上、０．９ｍＭ以上、又は１ｍＭ以上含まれることがさらに好ましい。上限は本発明の効果が奏される範囲であれば特に制限されないが、例えば５ｍＭ以下、４．５ｍＭ以下、４ｍＭ以下、３．５ｍＭ以下、３ｍＭ以下、２．５ｍＭ以下、２ｍＭ以下、１．５ｍＭ以下、または１ｍＭ以下が例示される。
【００１６】
本発明の組成物が細胞侵入を抑制する歯周病菌としては、本発明の効果が損なわれない限り特に制限されないが、歯周病菌の中でもＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（「Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ」と表記することがある）が好ましい。
【００１７】
本発明の組成物は、固形組成物、液体組成物でありえる。また、例えば口腔用組成物として好ましく用いることができる。当該口腔用組成物は、例えば医薬品、医薬部外品として用いることができる。また、本発明の口腔用組成物の形態は、特に限定するものではないが、常法に従って例えば軟膏剤、ペースト剤、パスタ剤、ジェル剤、液剤、スプレー剤、洗口液剤、液体歯磨剤、練歯磨剤、ガム剤等の形態（剤形）にすることができる。なかでも、洗口液剤、液体歯磨剤、練歯磨剤、軟膏剤、ペースト剤、液剤、ジェル剤であることが好ましい。
【００１８】
本発明の口腔用組成物は、本発明の効果を損なわない範囲で、口腔用組成物に配合し得る任意成分を単独で又は２種以上さらに含有してもよい。
【００１９】
例えば、界面活性剤として、ノニオン界面活性剤、アニオン界面活性剤または両性界面活性剤を配合することができる。具体的には、ノニオン界面活性剤としてはショ糖脂肪酸エステル、マルトース脂肪酸エステル、ラクトース脂肪酸エステル等の糖脂肪酸エステル；脂肪酸アルカノールアミド類；ソルビタン脂肪酸エステル；脂肪酸モノグリセライド；ポリオキシエチレン付加係数が８〜１０、アルキル基の炭素数が１３〜１５であるポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレン付加係数が１０〜１８、アルキル基の炭素数が９であるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；セバシン酸ジエチル；ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；脂肪酸ポリオキシエチレンソルビタン等が挙げられる。アニオン界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等の硫酸エステル塩；ラウリルスルホコハク酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテルスルホコハク酸ナトリウム等のスルホコハク酸塩；ココイルサルコシンナトリウム、ラウロイルメチルアラニンナトリウム等のアシルアミノ酸塩；ココイルメチルタウリンナトリウム等が挙げられる。両性イオン界面活性剤としては、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン等の酢酸ベタイン型活性剤；Ｎ−ココイル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミンナトリウム等のイミダゾリン型活性剤；Ｎ−ラウリルジアミノエチルグリシン等のアミノ酸型活性剤等が挙げられる。これらの界面活性剤は、単独または２種以上を組み合わせて配合することができる。その配合量は、通常、組成物全量に対して０．１〜５質量％である。
【００２０】
また、香味剤として、メントール、カルボン酸、アネトール、オイゲノール、サリチル酸メチル、リモネン、オシメン、ｎ−デシルアルコール、シトロネール、α−テルピネオール、メチルアセタート、シトロネニルアセタート、メチルオイゲノール、シネオール、リナロール、エチルリナロール、チモール、スペアミント油、ペパーミント油、レモン油、オレンジ油、セージ油、ローズマリー油、珪皮油、シソ油、冬緑油、丁子油、ユーカリ油、ピメント油、ｄ−カンフル、ｄ−ボルネオール、ウイキョウ油、ケイヒ油、シンナムアルデヒド、ハッカ油、バニリン等の香料を、単独または２種以上を組み合わせて組成物全量に対して０.００１〜１．５質量％配合することができる。
【００２１】
また、サッカリンナトリウム、アセスルファームカリウム、ステビオサイド、ネオヘスペリジルジヒドロカルコン、ペリラルチン、タウマチン、アスパラチルフェニルアラニルメチルエステル、ｐ−メトキシシンナミックアルデヒド等の甘味剤を、組成物全量に対して０.０１〜１質量％配合することができる。
【００２２】
さらに、湿潤剤として、ソルビット、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、１，３―ブチレングリコール、ポリプロピレングリコール、キシリット、マルチット、ラクチット、ポリオキシエチレングリコール等を単独または２種以上を組み合わせて配合することができる。
【００２３】
防腐剤として、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン等のパラベン類、安息香酸ナトリウム、フェノキシエタノール、塩酸アルキルジアミノエチルグリシン等を配合することができる。
【００２４】
着色剤として、青色１号、黄色４号、赤色２０２号、緑３号等の法定色素、群青、強化群青、紺青等の鉱物系色素、酸化チタン等を配合してもよい。
【００２５】
ｐＨ調整剤として、クエン酸、リン酸、リンゴ酸、ピロリン酸、乳酸、酒石酸、グリセロリン酸、酢酸、硝酸、またはこれらの化学的に可能な塩や水酸化ナトリウム等を配合してもよい。これらは、組成物のｐＨが４〜８、好ましくは５〜７の範囲となるよう、単独または２種以上を組み合わせて配合することができる。ｐＨ調整剤の通常配合量は０．０１〜２重量％である。
【００２６】
なお、本発明の口腔用組成物には、さらに、薬効成分として、例えば、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩酸クロルヘキシジン、グルコン酸クロルヘキシジン等のカチオン性殺菌剤、酢酸ｄｌ−α−トコフェロール、コハク酸トコフェロール、またはニコチン酸トコフェロール等のビタミンＥ類、ドデシルジアミノエチルグリシン等の両性殺菌剤、トリクロサン、イソプロピルメチルフェノール等の非イオン性殺菌剤、デキストラナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、ムタナーゼ、リゾチーム、溶菌酵素（リテックエンザイム）等の酵素、モノフルオロリン酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、フッ化第一錫等のフッ化物、トラネキサム酸やイプシロンアミノカプロン酸、アルミニウムクロルヒドロキシルアラントイン、ジヒドロコレステロール、グリチルレチン酸、グリセロフォスフェート、クロロフィル、塩化ナトリウム、カロペプタイド、グリチルリチン酸ジカリウム、アラントイン、ヒノキチオール、硝酸カリウム等を、単独または２種以上を組み合わせて配合することができる。
【００２７】
また、基剤として、アルコール類、シリコン、アパタイト、白色ワセリン、パラフィン、流動パラフィン、マイクロクリスタリンワックス、スクワラン、プラスチベース等を添加することも可能である。 
【００２８】
口腔用組成物は、公知の方法（例えば常法）に従って調製することができる。
【００２９】
なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。また、本発明は、本明細書に説明した構成要件を任意の組み合わせを全て包含する。
【００３０】
また、上述した本発明の各実施形態について説明した各種特性（性質、構造、機能等）は、本発明に包含される主題を特定するにあたり、どのように組み合わせられてもよい。すなわち、本発明には、本明細書に記載される組み合わせ可能な各特性のあらゆる組み合わせからなる主題が全て包含される。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。
【００３２】
ベシクルビーズの調製
Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓは恒常的に、外膜小胞Ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ（ＯＭＶｓ）を分泌していることが知られている。ＯＭＶｓにはＰ．  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのほぼ全ての細胞傷害性因子が含まれており、しかもＯＭＶｓ単独でも
細胞内に侵入する。ＯＭＶｓを培養細胞に添加するとエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれるのである。このため、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓから精製したＯＭＶｓを粒子（例えば蛍光ビーズ）にコーティングさせることにより、細胞侵入能を有する擬似Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを調製することができる。
【００３３】
そこで、まず以下のようにして、当該擬似Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（ＯＭＶｓコーティングされた蛍光ビーズ）を調製した。なお、以下、ＯＭＶｓのことを単に「ベシクル」と呼ぶことがある。
【００３４】
５０μｌ蛍光ビーズ液（１．３５ｘ１０９個ビーズ含む）をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、２００μｌの０．１Ｍ  ＭＥＳ  ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（２−モルホリノエタンスルホン酸一水和物緩衝液）で洗浄した。洗浄後、１００００ｒｐｍで遠心し、上清除去後、７３．８μｌ  ０．１Ｍ  ＭＥＳ  ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒに再懸濁した。
【００３５】
再懸濁したビーズ液に、８６．２μｌ（ベシクルの総タンパク質量が１００μｇになるように調整）のベシクル液を加え、シーソーシェーカーで揺らしながら室温にてインキュベートした。なお、ベシクル液は、上記非特許文献１（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２１６  （２００２）  ２１７〜２２２）を参照して作製した。インキュベート後、２ｇ／ｍｌ  ＥＤＡＣ  ４０μｌを加え、遮光して室温でインキュベートした。ここに、１Ｍグリシン水溶液２５μｌと１ｇ／ｍｌ  ＥＤＡＣ（1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide Hydrochloride）水溶液  ２５μｌを加え（反応停
止）、遮光して室温でインキュベート後、１３０００ｒｐｍで遠心した。遠心後、上清を除去し、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。洗浄後、１ｍｌのＰＢＳに懸濁させた。当該懸濁液７４μｌ（８サンプル分）をチューブに移し、１２，０００ｒｐｍで遠心した。遠心後、上清を除去し、４５０μｌのＭＥＭで再懸濁した。これをベシクルビーズ液として、以下検討に用いた。
【００３６】
なお、用いた１Ｍグリシン水溶液及びＥＤＡＣ水溶液は、ＰＢＳ（−）を用いて調製した。
【００３７】
ベシクルビーズの細胞侵入阻害試験
Ｃａ９−２２細胞（ヒト歯肉上皮細胞由来）３００μｌを各ウェルに継代し（接種量：５ｘ１０４  ｃｅｌｌｓ／３００μｌ）、１日間培養した。１日間培養した古い培地を捨て、各種濃度の被験物質（１０ｍＭ、１ｍＭ、又は０．１ｍＭ）を溶解したＭＥＭ培地２００μｌに置換し、予め超音波でベシクルビーズをよく分散させたベシクルビーズ液５０μｌずつ各ウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。（したがって、細胞に処理した各被験物質の濃度（処理濃度）は、初期濃度の０．８倍であり、８ｍＭ、０．８ｍＭ、又は０．０８ｍＭである。）
【００３８】
インキュベート後、スライドを氷上に置き、ＰＢＳ（＋）  ２５０μｌで３回洗浄した。洗浄後、ＰＢＳ（＋）を除去し、０．３ｍｇ／ｍｌ  ビオチン  ２００μｌを添加した後、氷上、遮光でインキュベートし、細胞膜を標識した。ビオチン処理後、０．１Ｍグリシンを含むＰＢＳ（＋）で１回洗浄した後、さらにＰＢＳ（＋）で２回洗浄した。
【００３９】
ＰＢＳ（＋）を除去し、４％のＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）  ２００μｌを添加して、細胞を固定した。細胞固定後、０．１Ｍ  グリシンを含むＰＢＳ（−）で１回洗浄した後、さらにＰＢＳ（−）で２回洗浄した。ＰＢＳを除去し、１％  ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むＰＢＳ（−）  ２００μｌを添加し、２５℃で３０分インキュベートした。インキュベート終了後、ＢＳＡを除去し、２００μｌ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４
８８  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  （１：１０００  ｉｎ  １％  ＢＳＡ／ＰＢＳ（−））を添加して室温でインキュベートし、細胞膜を標識したビオチンを染色した。細胞膜染色後、ＰＢＳ（−）で３回洗浄を行い、共焦点レーザー顕微鏡で観察した（細胞膜染色：励起光４８８ｎｍ、放出光５１９ｎｍ；ベシクルビーズ：励起光５８０ｎｍ、放出光６０５ｎｍ）。被験物質として銅クロロフェリンナトリウム１ｍＭを用いて検討した際の、共焦点レーザー顕微鏡観察像を、図１に示す。図１左側に被験物質無添加のときの結果を、図１右側に被験物質添加のときの結果を、それぞれ示す。
【００４０】
共焦点レーザー顕微鏡観察では、60x oilレンズを使用し、観察視野内の細胞数が２０
〜４０個になる領域をランダムに３箇所選び観察した（Ｎ＝３）。そして、領域に含まれる細胞内に存在するビーズ数をカウントすることにより、１細胞あたりのベシクルビーズ侵入数（beads/cell）を算出した。また、各被験物質の細胞侵入阻害効果を検討するため、以下の式でベシクルビーズの細胞侵入率を算出した。
【００４１】
ベシクルビーズ細胞侵入率（％）＝
被験物質含有培地で処理した１細胞あたりのベシクル侵入数／被験物質非含有培地（ＭＥＭ培地のみ）で処理した１細胞あたりのベシクル侵入数×100
【００４２】
さらに、３箇所（Ｎ＝３）でのベシクルビーズ細胞侵入率の平均値及び標準偏差（ＳＤ）も算出した。
【００４３】
各被験物質を用いた場合の検討結果を、表１、表２、及び表３に示す。なお、特に細胞侵入阻害効果が高いことを示す値（細胞侵入率平均値）に二重下線を引いた。また、表２及び表３において、ポジティブコントロールであるメチル-β-シクロデキストリンについてだけは、表１と同じく１０ｍＭの濃度で用いた際の結果を示す。
【００４４】
【表１】
2020019800.tif 000002
【００４５】
【表２】
2020019800.tif 000003
【００４６】
2020019800.tif 000004
【００４７】
【表３】
2020019800.tif 000005
【図１】
2020019800.tif 000006