(57)【要約】【課題】脱細胞化組織を効率的に製造することが可能な脱細胞化組織の製造方法を提供する。【解決手段】脱細胞化組織の製造方法は、第一の処理液を用いて、細胞が破壊されている生体組織に含まれるＤＮＡを分解する工程（Ｓ１）と、第二の処理液を用いて、ＤＮＡが分解された生体組織を脱脂する工程（Ｓ２）と、第三の処理液を用いて、脱脂された生体組織を洗浄する工程（Ｓ３）を含み、工程（Ｓ１）、工程（Ｓ２）及び工程（Ｓ３）の少なくとも一つが流通式で実施される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の処理液を用いて、細胞が破壊されている生体組織に含まれるＤＮＡを分解する第一の工程と、
第二の処理液を用いて、該ＤＮＡが分解された生体組織を脱脂する第二の工程と、
第三の処理液を用いて、該脱脂された生体組織を洗浄する第三の工程を含み、
前記第一の工程、前記第二の工程及び前記第三の工程の少なくとも一つが流通式で実施される、脱細胞化組織の製造方法。
【請求項２】
前記第一の処理液は、酵素又は界面活性剤を含む液体であることを特徴とする請求項１に記載の脱細胞化組織の製造方法。
【請求項３】
前記第二の処理液は、有機溶媒を含む液体であることを特徴とする請求項１又は２に記載の脱細胞化組織の製造方法。
【請求項４】
前記有機溶媒は、エタノールであることを特徴とする請求項３に記載の脱細胞化組織の製造方法。
【請求項５】
前記第三の処理液は、水を主溶媒とすることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の脱細胞化組織の製造方法。
【請求項６】
液化ガスを含む液体を用いて、生体組織の細胞を破壊する第四の工程を更に含み、
前記第四の工程は、前記液化ガスが液体状態を維持する所定の環境下で実施されることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の脱細胞化組織の製造方法。
【請求項７】
前記液化ガスは、液化ジメチルエーテルである請求項６に記載の脱細胞化組織の製造方法。
【請求項８】
前記所定の環境は、１〜４０℃、０．２〜５ＭＰａの環境であることを特徴とする請求項７に記載の脱細胞化組織の製造方法。
【請求項９】
前記第一の工程、前記第二の工程、前記第三の工程及び前記第四の工程の少なくとも一つの工程は、接触槽で実施され、
前記接触槽は、上流側の端面に、多孔質の部材を有することを特徴とする請求項６乃至８のいずれか一項に記載の脱細胞化組織の製造方法。
【請求項１０】
前記第一の工程、前記第二の工程、前記第三の工程又は前記第四の工程は、４〜４０℃で実施されることを特徴とする請求項６乃至９のいずれか一項に記載の脱細胞化組織の製造方法。
【請求項１１】
前記第一の工程、前記第二の工程及び前記第三の工程の少なくとも一つの工程で用いられた処理液から夾雑物を除去する工程を更に含むことを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の脱細胞化組織の製造方法。
【請求項１２】
第一の処理液を用いて、細胞が破壊されている生体組織に含まれるＤＮＡを分解する第一の手段と、
第二の処理液を用いて、該ＤＮＡが分解された生体組織を脱脂する第二の手段と、
第三の処理液を用いて、該脱脂された生体組織を洗浄する第三の手段を含み、
前記第一の手段、前記第二の手段及び前記第三の手段の少なくとも一つが流通式であることを特徴とする脱細胞化組織の製造装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脱細胞化組織の製造方法及び脱細胞化組織の製造装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療において、患者の欠損した器官を再生するための支持組織として、ヒトまたは異種哺乳動物の生体組織から、細胞質成分、細胞質ゾル成分、細胞骨格、細胞膜成分等の細胞成分が除去されている脱細胞化組織が再移植されている。脱細胞化組織は、エラスチン、コラーゲン（Ｉ型、ＩＶ型等）、ラミニン等の細胞外マトリックス成分を主成分とする。
【０００３】
特許文献１には、ポリエチレングリコール水溶液を用いて、生体組織の細胞を破壊する工程と、ＤＮａｓｅを用いて、細胞が破壊された生体組織に含まれるＤＮＡを分解させる工程と、ＰＢＳを用いて、ＤＮＡが分解した生体組織を洗浄する工程を含む脱細胞化組織の製造方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、細胞が破壊された生体組織に含まれるＤＮＡを分解させる工程と、ＰＢＳを用いて、ＤＮＡが分解した生体組織を洗浄する工程に長時間を要するため、脱細胞化組織を効率的に製造することができないという問題がある。
【０００５】
本発明は、脱細胞化組織を効率的に製造することが可能な脱細胞化組織の製造方法及び脱細胞化組織の製造装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一態様は、脱細胞化組織の製造方法において、第一の処理液を用いて、細胞が破壊されている生体組織に含まれるＤＮＡを分解する第一の工程と、第二の処理液を用いて、該ＤＮＡが分解された生体組織を脱脂する第二の工程と、第三の処理液を用いて、該脱脂された生体組織を洗浄する第三の工程を含み、前記第一の工程、前記第二の工程及び前記第三の工程の少なくとも一つが流通式で実施される。
【０００７】
本発明の他の一態様は、脱細胞化組織の製造装置において、第一の処理液を用いて、細胞が破壊されている生体組織に含まれるＤＮＡを分解する第一の手段と、第二の処理液を用いて、該ＤＮＡが分解された生体組織を脱脂する第二の手段と、第三の処理液を用いて、該脱脂された生体組織を洗浄する第三の手段を含み、前記第一の手段、前記第二の手段及び前記第三の手段の少なくとも一つが流通式である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の一態様によれば、脱細胞化組織を効率的に製造することが可能な脱細胞化組織の製造方法及び脱細胞化組織の製造装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本実施形態の脱細胞化組織の製造方法の一例を示すフローチャートである。
【図２】本実施形態の脱細胞化組織の製造装置の一例を示す概略図である。
【図３】実施例の細胞破壊装置を示す概略図である。
【図４】実施例の脱細胞化組織の製造装置を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の実施形態を図面を参照して説明する。
【００１１】
（脱細胞化組織の製造方法）
図１に、本実施形態の脱細胞化組織の製造方法の一例を示す。
【００１２】
脱細胞化組織の製造方法は、第一の処理液を用いて、細胞が破壊されている生体組織に含まれるＤＮＡを分解する工程（Ｓ１）と、第二の処理液を用いて、ＤＮＡが分解された生体組織を脱脂する工程（Ｓ２）と、第三の処理液を用いて、脱脂された生体組織を洗浄する工程（Ｓ３）を含み、工程（Ｓ１）、工程（Ｓ２）及び工程（Ｓ３）の少なくとも一つが流通式で実施される。このため、脱細胞化組織を効率的に製造することができる。
【００１３】
本明細書及び特許請求の範囲において、流通式とは、処理液が接触槽に流入し、接触槽から流出する過程で生体組織に対して処理液による処理を実施する方式、すなわち、処理液が接触槽を流通する過程で生体組織に対して処理液による処理を実施する方式である。
【００１４】
工程（Ｓ１）では、例えば、酵素又は界面活性剤を含む液体を、細胞が破壊されている生体組織に接触させて、細胞が破壊されている生体組織に含まれるＤＮＡを分解させる。
【００１５】
酵素としては、特に限定されないが、ＤＮａｓｅ（例えば、ＤＮａｓｅＩ）、トリプシン等が挙げられる。
【００１６】
界面活性剤としては、特に限定されないが、イオン系界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））、非イオン系界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）等が挙げられる。
【００１７】
ＤＮａｓｅとしては、例えば、ＤＮａｓｅＩ等が挙げられる。
【００１８】
液体としては、生理的に適合すれば、特に限定されないが、生理食塩水、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）等の水を主溶媒とする液体が挙げられ、二種以上を併用してもよい。これらの中でも、生理食塩水が好ましい。
【００１９】
ＤＮａｓｅを含む液体を、細胞が破壊されている生体組織に接触させる方法としては、特に限定されないが、細胞が破壊されている生体組織を、ＤＮａｓｅを含む液体と混合して撹拌する方法、細胞が破壊されている生体組織に、ＤＮａｓｅを含む液体を流通させる方法等が挙げられる。これらの中でも、効率的にＤＮＡを分解させることが可能な点で、細胞が破壊されている生体組織に、ＤＮａｓｅを含む液体を流通させる方法が好ましい。
【００２０】
なお、細胞が破壊されている生体組織を、ＤＮａｓｅを含む液体と混合して撹拌する場合、ＤＮａｓｅを含む液体を適宜交換してもよい。
【００２１】
ＤＮａｓｅを含む液体を、細胞が破壊されている生体組織に接触させる環境の温度は、４〜４０℃であることが好ましい。ＤＮａｓｅを含む液体を、細胞が破壊されている生体組織に接触させる環境の温度が４℃以上であると、生体組織に含まれる細胞外マトリックスの氷結晶による損傷を抑制することができ、４０℃以下であると、生体組織に含まれるタンパク質の変性を抑制することができる。
【００２２】
また、ＤＮａｓｅを含む液体を、細胞が破壊されている生体組織に接触させる環境の温度は、２５〜３７℃であることがより好ましい。一般的に、ＤＮａｓｅは、２５〜３７℃の範囲で高い活性を示し、効率的にＤＮＡを分解することができる。
【００２３】
工程（Ｓ２）では、例えば、工程（Ｓ１）により、ＤＮＡが分解した生体組織を、有機溶媒を含む液体と接触させて、ＤＮＡが分解した生体組織を脱脂する。
【００２４】
本明細書及び特許請求の範囲において、脱脂とは、生体組織より脂溶性成分を除去することである。
【００２５】
有機溶媒としては、ＤＮＡが分解した生体組織を脱脂することが可能な生理的に許容し得る有機溶媒であれば、特に限定されないが、エタノール等が挙げられ、二種以上を併用してもよい。これらの中でも、生体組織に無害な点で、エタノールが好ましい。
【００２６】
液体としては、生理的に適合すれば、特に限定されないが、生理食塩水、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）等の水を主溶媒とする液体が挙げられ、二種以上を併用してもよい。これらの中でも、生理食塩水が好ましい。
【００２７】
ＤＮＡが分解した生体組織を、有機溶媒を含む液体と接触させる方法としては、特に限定されないが、ＤＮＡが分解した生体組織を、有機溶媒を含む液体と混合して撹拌する方法、ＤＮＡが分解した生体組織に、有機溶媒を含む液体を流通させる方法等が挙げられる。これらの中でも、効率的に脱脂することが可能な点で、ＤＮＡが分解した生体組織に、有機溶媒を含む液体を流通させる方法が好ましい。
【００２８】
なお、ＤＮＡが分解した生体組織を、有機溶媒を含む液体と混合して撹拌する場合、有機溶媒を含む液体を適宜交換してもよい。
【００２９】
ＤＮＡが分解した生体組織を、有機溶媒を含む液体と接触させる環境の温度は、４〜４０℃であることが好ましい。ＤＮＡが分解した生体組織を、有機溶媒を含む液体と接触させる環境の温度が４℃以上であると、生体組織に含まれる細胞外マトリックスの氷結晶による損傷を抑制することができ、４０℃以下であると、生体組織に含まれるタンパク質の変性を抑制することができる。
【００３０】
なお、工程（Ｓ１）と工程（Ｓ２）を同時に実施してもよいし、工程（Ｓ１）と工程（Ｓ２）の順序を逆にしてもよい。
【００３１】
工程（Ｓ３）では、例えば、工程（Ｓ２）により、脱脂された生体組織を液体と接触させて、脱脂された生体組織を洗浄する。
【００３２】
本明細書及び特許請求の範囲において、洗浄とは、生体組織から水溶性成分を除去することである。
【００３３】
液体としては、生理的に適合すれば、特に限定されないが、生理食塩水、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）等の水を主溶媒とする液体が挙げられ、二種以上を併用してもよい。これらの中でも、生理食塩水が好ましい。
【００３４】
脱脂された生体組織を液体と接触させる方法としては、特に限定されないが、脱脂された生体組織を液体と混合して撹拌する方法、脱脂された生体組織に液体を流通させる方法等が挙げられる。これらの中でも、効率的に洗浄することが可能な点で、脱脂された生体組織に液体を流通させる方法が好ましい。
【００３５】
なお、ＤＮＡが分解した生体組織を液体と混合して撹拌する場合、液体を適宜交換してもよい。
【００３６】
脱脂された生体組織を液体と接触させる環境の温度は、４〜４０℃であることが好ましい。脱脂された生体組織を液体と接触させる環境の温度が４℃以上であると、生体組織に含まれる細胞外マトリックスの氷結晶による損傷を抑制することができ、４０℃以下であると、生体組織に含まれるタンパク質の変性を抑制することができる。
【００３７】
また、本実施形態の脱細胞化組織の製造方法は、細胞が破壊されている生体組織に含まれるＤＮＡを分解させる工程の前工程として、生体組織の細胞膜成分を溶解し、生体組織の細胞を破壊する工程を更に含んでいてもよい。
【００３８】
（生体組織の細胞破壊方法）
生体組織の細胞破壊方法としては、特に限定されないが、液化ガスを含む液体と生体組織を接触させる方法、機械的方法（超音波、マイクロビーズ、凍結等）（例えば、特表２０１６−５２３５４１号公報）、化学的方法（酸、アルカリ、界面活性剤等）、機械的方法と化学的方法を組み合わせる方法がある、超臨界二酸化炭素を生体組織に浸透させる方法（例えば、特開平６−２１８０３６号公報）等が挙げられる。これらの中でも、脱細胞化組織に、実質的に損傷がなく、液化ガスが残留しにくくなる点で、液化ガスを含む液体と生体組織を接触させる方法が好ましい。
【００３９】
ここで、液化ガスを含む液体は、細胞膜成分を溶解するため、生体組織の細胞を破壊することができる。
【００４０】
本明細書及び特許請求の範囲において、液化ガスとは、常温常圧（０℃、１ａｔｍ（０．１０１３２５ＭＰａ）で気体である物質の液化物である。
【００４１】
液化ガスとしては、生体組織の細胞を破壊することが可能であれば、特に限定されないが、ジメチルエーテル、エチルメチルエーテル、ホルムアルデヒド、ケテン、アセトアルデヒド、プロパン、ブタン、液化石油ガス等が挙げられ、二種以上を併用してもよい。これらの中でも、比較的低温低圧で液化する点で、エチルメチルエーテル、ジメチルエーテルが好ましく、ジメチルエーテルが特に好ましい。
【００４２】
ジメチルエーテルは、１〜４０℃、０．２〜５ＭＰａ程度で液化するため、装置のコストが安価となる。また、液化ジメチルエーテルは、常温常圧下で容易に気化することから、脱細胞化組織に残留しにくい。
【００４３】
液化ガスを含む液体と生体組織を接触させる場合は、液化ガスの液体状態を維持するため、気密状態の抽出槽内等の飽和蒸気圧以上の環境下で実施される。
【００４４】
液化ガスを含む液体と生体組織を接触させる方法としては、特に限定されないが、液化ガスを含む液体に生体組織を浸漬する方法、生体組織に液化ガスを含む液体を流通させる方法等が挙げられる。これらの中でも、効率的に細胞を破壊することが可能な点で、生体組織に液化ガスを含む液体を流通させる方法が好ましい。
【００４５】
液化ガスを含む液体は、溶媒をさらに含んでいてもよい。
【００４６】
溶媒としては、特に限定されないが、エタノール、水、生理食塩水、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）等が挙げられ、二種以上を併用してもよい。
【００４７】
溶媒の添加量は、液化ガス中の溶解度以下となるようにすることが好ましい。これにより、液化ガスを含む液体を均一にすることができる。
【００４８】
液化ガスの温度は、１〜４０℃であることが好ましく、１０〜３０℃であることがさらに好ましい。
【００４９】
液化ガスの圧力は、０．２〜５ＭＰａであることが好ましく、０．３〜０．７ＭＰａの範囲内であることがさらに好ましい。
【００５０】
生体組織を液化ガスを含む液体に接触させた後、常温常圧に戻すと、液化ガスは、気化するため、液化ガスを簡便に除去することができる。
【００５１】
なお、生体組織を液化ガスを含む液体に接触させる工程を複数回繰り返してもよい。
【００５２】
（生体組織）
生体組織としては、細胞壁を有する植物、菌類、古細菌、真正細菌、もしくは細胞壁を有しない動物のいずれかから得られる組織のことを意味する。特に限定されないが、葉、枝、樹木、花弁、茎、根、果肉、果皮及び種子や、ヒトまたは異種哺乳動物由来の皮膚、血管、心臓弁膜、角膜、羊膜、硬膜等を含む軟組織またはその一部、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脳等を含む臓器またはその一部等、骨、軟骨、腱またはその一部等が挙げられる。
【００５３】
（脱細胞化組織の製造装置）
本実施形態の脱細胞化組織の製造装置は、第一の処理液を用いて、細胞が破壊されている生体組織に含まれるＤＮＡを分解する第一の手段と、第二の処理液を用いて、ＤＮＡが分解された生体組織を脱脂する第二の手段と、第三の処理液を用いて、脱脂された生体組織を洗浄する第三の手段を含み、第一の手段、第二の手段及び第三の手段の少なくとも一つが流通式であれば、特に限定されない。
【００５４】
本実施形態の脱細胞化組織の製造装置は、第一の処理液を貯蔵する第一の貯蔵手段と、第二の処理液を貯蔵する第二の貯蔵手段と、第三の処理液を貯蔵する第三の貯蔵手段を更に含むことが好ましい。また、本実施形態の脱細胞化組織の製造装置は、第一の貯蔵手段から接触槽に第一の処理液を送液する第一の送液手段と、第二の貯蔵手段から接触槽に第二の処理液を送液する第二の送液手段と、第三の貯蔵手段から接触槽に第三の処理液を送液する第三の送液手段を更に含むことが好ましい。
【００５５】
また、本実施形態の脱細胞化組織の製造装置は、液化ガスを含む液体を用いて、生体組織の細胞を破壊する細胞破壊手段と、液化ガスを含む液体を貯蔵する第四の貯蔵手段と、第四の貯蔵手段から接触槽に液化ガスを含む液体を送液する第四の送液手段を更に含むことが好ましい。この場合、細胞破壊手段は、流通式であることが好ましい。
【００５６】
また、本実施形態の脱細胞化組織の製造装置は、送液された各処理液と、細胞が破壊されている生体組織を接触させる接触手段と、細胞が破壊されている生体組織と接触した処理液を回収する回収手段と、回収された処理液に混入した夾雑物を除去する分離手段と、回収手段から分離手段に処理液を送液する第五の送液手段を更に有することが好ましい。
【００５７】
また、本実施形態の脱細胞化組織の製造装置は、内部の温度を検知して調整する温度検知調整手段をさらに有することが好ましい。
【００５８】
図２に、本実施形態の脱細胞化組織の製造装置の一例を示す。
【００５９】
脱細胞化組織の製造装置１００は、第一の処理液を貯蔵するタンク１と、第二の処理液を貯蔵するタンク５と、第三の処理液を貯蔵するタンク１'と、液化ガスを含む液体を貯蔵するタンク１''を有する。また、脱細胞化組織の製造装置１００は、第一の処理液を送液する加圧式ポンプ３（例えば、シリンジポンプ）と、第二の処理液を送液するポンプ６（例えば、プランジャーポンプ）と、第三の処理液を送液する加圧式ポンプ３'（例えば、シリンジポンプ）と、液化ガスを含む液体を送液する加圧式ポンプ３''（例えば、シリンジポンプ）を有する。
【００６０】
また、脱細胞化組織の製造装置１００は、送液された各処理液と、細胞が破壊されている生体組織９を接触させる接触槽８と、細胞が破壊されている生体組織９と接触した各処理液を回収する回収槽１１を有する。
【００６１】
接触槽８中を流通する処理液の流通速度は、接触槽８の壁面付近と中央部とで速度が均一とならず、抽出効率が抑制されてしまうことがある。そこで、接触槽８の上流側の端面に、接触槽８の壁面付近から中央部に生じる速度分布の均一化を促進する部材を有していてもよい。
【００６２】
接触槽８の壁面付近から中央部に生じる速度分布の均一化を促進する部材としては、特に限定されないが、速度分布の均一化の効率の点から、微小孔を有する多孔質の部材が好ましい。
【００６３】
さらに、脱細胞化組織の製造装置１００は、回収された各処理液中に混入した夾雑物を除去する分離手段１５、１５'、１６を有する。
【００６４】
また、脱細胞化組織の製造装置１００は、夾雑物が除去された第一の処理液をタンク１に送液する、夾雑物が除去された第二の処理液をタンク５に送液する、夾雑物が除去された第三の処理液をタンク１'に送液する、又は、気化した液化ガスを凝縮器１５''に輸送するポンプ１２（例えば、プランジャーポンプ）を有する。
【００６５】
さらに、脱細胞化組織の製造装置１００は、内部の温度を検知して調整する温度検知調整手段１７を有する。
【００６６】
また、脱細胞化組織の製造装置１００は、バルブ２、２'、２''、４、４'、４''、７、１０、１３、１４、１４'、１４''と、背圧弁１８と、を有する。
【００６７】
次に、脱細胞化組織の製造装置１００を用いて、脱細胞化組織を製造する方法を説明する。
【００６８】
まず、工程（Ｓ１）では、接触槽８に、細胞が破壊されている生体組織９を導入し、タンク１内に、第一の処理液を充填する。次に、バルブ２、４、７、１０を開状態とし、その他のバルブを閉状態とした後、タンク１内に充填された第一の処理液を、加圧式ポンプ３を用いて、接触槽８に流通させる。細胞が破壊されている生体組織９は、例えば、ＤＮａｓｅの作用により、ＤＮＡが分解される。次に、ＤＮＡの分解物を含む第一の処理液が回収槽１１で回収される。このとき、加圧式ポンプを用いることで、気泡が入りやすい水を主溶媒とする第一の処理液のキャビテーションの発生を防ぐことができる。
【００６９】
次に、バルブ１４を開状態とし、その他のバルブを閉状態とした後、回収されたＤＮＡの分解物を含む第一の処理液を、ポンプ１２を用いて、タンク１に送液する。このとき、ＤＮＡの分解物は、分離手段１５により、除去されるため、夾雑物が除去された第一の処理液をタンク１で回収することができる。タンク１で回収される第一の処理液は、そのまま再度、接触槽８に流通させ、細胞が破壊されている生体組織９のＤＮＡ分解に用いることができる。このため、第一の処理液を交換したり、追加したりせずに、少量の第一の処理液でＤＮＡを分解することができる。
【００７０】
工程（Ｓ２）では、タンク５内に、第二の処理液を充填する。次に、バルブ７、１０を開状態とし、その他のバルブを開状態とした後、タンク５内に充填された第二の処理液を、ポンプ６を用いて、接触槽８に流通させ、ＤＮＡが分解された生体組織９を脱脂し、除去された脂質を含む第二の処理液が回収槽１１で回収される。次に、バルブ１４を開状態とし、その他のバルブを閉状態とした後、回収された脂質を含む第二の処理液を、ポンプ１２を用いて、タンク５に送液する。このとき、脂質は、分離手段１６により、除去されるため、夾雑物が除去された第二の処理液をタンク５で回収することができる。タンク５で回収される第二の処理液は、そのまま再度、接触槽８に流通させ、ＤＮＡが分解された生体組織９の脱脂に用いることができる。このため、第二の処理液を交換したり、追加したりせずに、少量の第二の処理液で脱脂することができる。
【００７１】
工程（Ｓ３）では、タンク１'内に、第三の処理液を充填する。次に、バルブ２'、４'、７、１０を開状態とし、その他のバルブを開状態とした後、タンク１'内に充填された第三の処理液を、加圧式ポンプ３'を用いて、接触槽８に流通させ、脱脂された生体組織９を洗浄し、除去された水溶性化合物を含む第三の処理液が回収槽１１で回収される。このとき、加圧式ポンプを用いることで、気泡が入りやすい水を主溶媒とする第三の処理液のキャビテーションの発生を防ぐことができる。次に、バルブ１４'を開状態とし、その他のバルブを閉状態とした後、回収された水溶性化合物を含む第三の処理液を、ポンプ１２を用いて、タンク１'に送液する。このとき、水溶性化合物は、分離手段１５'により、除去されるため、夾雑物が除去された第三の処理液をタンク１'で回収することができる。タンク１'で回収された第三の処理液は、そのまま再度、接触槽８に流通させ、脱脂された生体組織９の洗浄に用いることができる。このため、第三の処理液を交換したり、追加したりせずに、少量の第三の処理液で洗浄することができる。
【００７２】
また、脱細胞化組織の製造装置１００は、後述するように、液化ガスを含む液体を用いて、生体組織の細胞を破壊することができる。液化ガスを含む液体を用いて、細胞を破壊する場合には、液化ガスを含む液体が気化することで、生体組織に乾燥によるダメージが生じるおそれがある。液化ガスを含む液体を送液する際には、加圧式ポンプ３''を用いるが、背圧弁１８により圧力を調整することができるため、液化ガスを含む液体の気化の調節、抑制が可能となり、乾燥による生体組織へのダメージを低減することができる。
【００７３】
なお、細胞破壊、ＤＮＡ分解、脱脂及び洗浄を、以下の操作により、流通式で、連続的に実施することができる。
【００７４】
まず、接触槽８内に生体組織９を導入する。次に、タンク１''内に、液化ガスを含む液体を充填し、タンク１内に、第一の処理液を充填し、タンク５内に、第二の処理液を充填し、タンク１'内に、第三の処理液を充填する。次に、バルブ２''、４''、７、１０を開状態とし、背圧弁１８を所定の圧力に調整し、その他のバルブを閉状態とした後、タンク１''内に充填された液化ガスを含む液体を加圧式ポンプ３''により送液する。次に、加圧式ポンプ３''を停止し、バルブ２''、４''を閉状態とし、送液を終了する。次に、バルブ１９を開状態として、液化ガスの飽和蒸気圧未満とすることにより、バルブ４''とバルブ１４''の間に存在する液化ガスを気化させる。このとき、必要に応じて、ポンプを用いて、気化したジメチルエーテルを排出してもよい。また、バルブ１９を開状態とする代わりに、バルブ１４''を開状態として、気化した液化ガスを、ポンプ１２を用いて、凝縮器１５''に輸送して、液化させ、再利用してもよい。次に、バルブ２、４、７、１０を開状態とし、その他のバルブを閉状態とした後、タンク１内に充填された第一の処理液を加圧式ポンプ３により送液する。このとき、背圧弁１８の設定圧力を上記の所定の圧力から徐々に大気圧へ減圧することで、接触槽８内に残留する液化ガスの気化の抑制が可能となり、乾燥による生体組織９へのダメージを低減することができる。次に、加圧式ポンプ３を停止し、バルブ２、４を閉状態とし、送液を終了する。次に、タンク５内に充填された第二の処理液を、ポンプ６により送液する。次に、ポンプ６を停止し、送液を終了する。次に、バルブ２'、４'を開状態とし、タンク１'内に充填された第三の処理液を加圧式ポンプ３'により送液する。次に、加圧式ポンプ３'を停止し、バルブ２'、４'、７、１０を閉状態とし、送液を終了する。
【００７５】
以上のように、細胞破壊、ＤＮＡ分解、脱脂及び洗浄を、流通式で、連続的に実施することで、処理時間を短縮することができる。
【実施例】
【００７６】
以下に、本発明の実施例を説明するが、本発明は、実施例に限定されない。
【００７７】
［実施例１］
（ブタ由来の大動脈の細胞破壊）
図３に示す細胞破壊装置を用いて、ブタ由来の大動脈組織５５の細胞を破壊した。
【００７８】
具体的には、抽出槽５４に、ブタ由来の大動脈組織５５を仕込んだ。次に、分離槽６０を予めジメチルエーテルで置換し、バルブ５２、５３、５６、５８、５９を閉状態とした。次に、背圧弁５７の設定圧力を０．７ＭＰａとし、バルブ５２、５３、５６、５８を開状態とし、ポンプ５１を用いて、液化ジメチルエーテルを流通させ、液化ジメチルエーテルで抽出槽５４が満たされたところで、バルブ５３、５６を閉状態とし、ブタ由来の大動脈組織５５を液化ジメチルエーテルに浸漬し、リン脂質等の細胞膜成分を抽出した。次に、バルブ５３、５６を開状態とし、液化ジメチルエーテルの流量を１ｍＬ／ｍｉｎに調整して、抽出液を分離槽６０で回収した。次に、バルブ５８を閉状態とし、分離槽６０を装置から取り外し、ドラフト内で大気圧として、液化ジメチルエーテルを揮発させた。
【００７９】
上記の操作により、液化ジメチルエーテル６０ｍＬとブタ由来の大動脈組織５５を接触させた後、バルブ５３を閉状態とし、バルブ５６、５８、５９を開状態とし、抽出槽５４内の圧力を大気圧とし、抽出槽５４内の液化ジメチルエーテルを揮発させて排気した。その結果、細胞が破壊されたブタ由来の大動脈組織を得た。
【００８０】
（細胞が破壊されたブタ由来の大動脈組織のＤＮＡ分解、脱脂及び洗浄）
図４に示す脱細胞化組織の製造装置を用いて、細胞が破壊されたブタ由来の大動脈組織６６のＤＮＡ分解、脱脂及び洗浄を流通式で実施した。
【００８１】
具体的には、接触槽６５に、細胞が破壊されたブタ由来の大動脈組織６６を仕込んだ。次に、タンク６１内に、０．２ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、０．０５ＭのＭｇＣｌ２（和光純薬工業社製）を含む生理食塩水を充填し、バルブ６２、６４、６７を開状態とし、バルブ７１を閉状態とした。次に、タンク６１内に充填したＤＮａｓｅＩ、ＭｇＣｌ２を含む生理食塩水を、シリンジポンプ６３を用いて、１ｍＬ／ｍｉｎで接触槽６５に流通させ、細胞が破壊されたブタ由来の大動脈組織６６に含まれるＤＮＡを分解させ、ＤＮＡの分解物を回収槽６８で回収した。
【００８２】
次に、タンク６９内に、８０体積％のエタノールを含む生理食塩水を充填し、バルブ６２、６４を閉状態とし、バルブ６７、７１を開状態とした。次に、タンク６９内に充填したエタノールを含む生理食塩水を、プランジャーポンプ７０を用いて、１ｍＬ／ｍｉｎで接触槽６５に流通させ、ＤＮＡが分解したブタ由来の大動脈組織６６を脱脂し、除去された脂質を回収槽６８で回収した。
【００８３】
次に、タンク６９内から、エタノールを含む生理食塩水を排出した後、タンク６９内に、生理食塩水を充填した。次に、タンク６９内に充填した生理食塩水を、プランジャーポンプ７０を用いて、１ｍＬ／ｍｉｎで接触槽６５に流通させ、脱脂されたブタ由来の大動脈組織６６を洗浄し、除去された抽出物を回収槽６８で回収した。その結果、ブタ由来の大動脈組織の脱細胞化組織を得た。
【００８４】
［比較例１］
細胞が破壊されたブタ由来の大動脈組織６６のＤＮＡ分解、脱脂及び洗浄をバッチ式で実施した、即ち、各処理液と混合して振とうした以外は、実施例１と同様にして、ブタ由来の大動脈組織の脱細胞化組織を得た。
【００８５】
表１に、ブタ由来の大動脈組織の脱細胞化組織及び未処理のブタ由来の大動脈組織の乾燥質量あたりのＤＮＡ量を示す。
【００８６】
【表１】
2020005622.tif 000003
ここで、ＤＮＡは、フェノール・クロロホルム抽出により、ブタ由来の大動脈組織の脱細胞化組織及び未処理のブタ由来の大動脈組織から抽出した。また、ＤＮＡ量は、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを用いて、２本鎖のＤＮＡ量を定量した。
【００８７】
表１から、実施例１のブタ由来の大動脈組織の脱細胞化組織は、乾燥質量あたりのＤＮＡ量が少なく、脱細胞化組織を効率的に製造できることがわかる。
【００８８】
これに対して、比較例１のブタ由来の大動脈組織の脱細胞化組織は、細胞が破壊されたブタ由来の大動脈組織６６のＤＮＡ分解、脱脂及び洗浄を流通式で実施していないため、乾燥質量あたりのＤＮＡ量が多く、脱細胞化組織を効率的に製造することができない。
【００８９】
［実施例２］
脱脂及び洗浄をバッチ式で実施した以外は、実施例１と同様にして、ブタ由来の大動脈組織の脱細胞化組織を得た。
【００９０】
具体的には、ＤＮＡが分解したブタ由来の大動脈組織６６を、８０体積％のエタノールを含む生理食塩水に入れた後、振とうさせ、脱脂した。また、脱脂されたブタ由来の大動脈組織６６を、生理食塩水に入れた後、振とうさせ、洗浄した。
【００９１】
［実施例３］
ＤＮＡ分解及び洗浄をバッチ式で実施した以外は、実施例１と同様にして、ブタ由来の大動脈組織の脱細胞化組織を得た。
【００９２】
具体的には、細胞が破壊されたブタ由来の大動脈組織６６を、０．２ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、０．０５ＭのＭｇＣｌ２（和光純薬工業社製）を含む生理食塩水に入れた後、振とうさせ、細胞が破壊されたブタ由来の大動脈組織６６に含まれるＤＮＡを分解させた。また、脱脂されたブタ由来の大動脈組織６６を、生理食塩水に入れた後、振とうさせ、洗浄した。
【００９３】
［実施例４］
ＤＮＡ分解及び脱脂をバッチ式で実施した以外は、実施例１と同様にして、ブタ由来の大動脈組織の脱細胞化組織を得た。
【００９４】
具体的には、細胞が破壊されたブタ由来の大動脈組織６６を、０．２ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、０．０５ＭのＭｇＣｌ２（和光純薬工業社製）を含む生理食塩水に入れた後、振とうさせ、細胞が破壊されたブタ由来の大動脈組織６６に含まれるＤＮＡを分解させた。また、ＤＮＡが分解したブタ由来の大動脈組織６６を、８０体積％のエタノールを含む生理食塩水に入れた後、振とうさせ、脱脂した。
【００９５】
表２に、ブタ由来の大動脈組織の脱細胞化組織のＤＮＡ残存量、脂質残存量及び水溶性化合物残存量を示す。
【００９６】
【表２】
2020005622.tif 000004
実施例１のブタ由来の大動脈組織の脱細胞化組織は、ＤＮＡ残存量と同様にして、脱脂残存量及び水溶性化合物残存量も、比較例１のブタ由来の大動脈組織の脱細胞化組織よりも少なくなる。
【００９７】
実施例２のブタ由来の大動脈組織の脱細胞化組織は、ＤＮＡ分解を流通式で実施し、脱脂及び洗浄をバッチ式で実施したため、ＤＮＡ残存量が、比較例１のブタ由来の大動脈組織の脱細胞化組織よりも少なくなる。
【００９８】
実施例３のブタ由来の大動脈組織の脱細胞化組織は、脱脂を流通式で実施し、ＤＮＡ分解及び洗浄をバッチ式で実施したため、脂質残存量が、比較例１のブタ由来の大動脈組織の脱細胞化組織よりも少なくなる。
【００９９】
実施例４のブタ由来の大動脈組織の脱細胞化組織は、洗浄を流通式で実施し、ＤＮＡ分解及び脱脂をバッチ式で実施したため、水溶性化合物残存量が、比較例１のブタ由来の大動脈組織の脱細胞化組織よりも少なくなる。
【０１００】
以上のことから、ＤＮＡ分解、脱脂及び洗浄の少なくとも一つの工程を流通式で実施すると、脱細胞化組織を効率的に製造できることがわかる。
【符号の説明】
【０１０１】
１、１'、１''、５    タンク
２、２'、２''、４、４'、４''、７、１０、１３、１４、１４'、１４''、１９    バルブ
１８    背圧弁
３、３'、３''    加圧式ポンプ
６、１２    ポンプ
８    接触槽
９    生体組織
１１    回収槽
１５、１５'、１６    分離手段
１５''    凝縮器
１７    温度検知調整手段
１００    脱細胞化組織の製造装置
【先行技術文献】
【特許文献】
【０１０２】
【特許文献１】特表２００５−５３１３５５号公報
【図１】
2020005622.tif 000005
【図２】
2020005622.tif 000006
【図３】
2020005622.tif 000007
【図４】
2020005622.tif 000008