(57)【要約】【課題】本発明は、凝乳特性が改善されたキモシン変異体に関する。【解決手段】前記キモシン変異体は、キモシン活性を有する親ポリペプチド中の１又は２以上の位置に変異を形成する工程、及び変異ポリペプチドを生産及び単離する工程、及び単離されたキモシンポリペプチド変異体を取得する工程を含む、キモシン変異体を生産する方法によって生産され、当該変異体は、キモシン活性を維持している。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離キモシンポリペプチド変異体を生産する方法であって、以下の工程：
（ａ）キモシン活性を有する親ポリペプチド中の１又は２以上の位置に変異を形成する工程、ここで当該変異が、位置１１７、１３４、１４１、１４３、１５６、２４１、２７９、２８０、２８１、２９８、３００、３０７、３０９、３１１、３２５、３５０、３５２及び３５３のいずれかに対応するアミノ酸位置における、置換、欠失、又は挿入を含む；及び
（ｂ）工程（ａ）の変異ポリペプチドを生産及び単離することにより、単離キモシンポリペプチド変異体を取得する工程、ここで当該変異体はキモシン活性を有する；
を含み、そして、
（ｉ）前記親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号１のポリペプチド（ウシキモシン）と親ポリペプチドとのアラインメントにより決定され、即ち、配列番号１のポリペプチドが、親ポリペプチド中の対応するアミノ酸配列を決定するのに使用され；及び
（ｉｉ）当該親ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸位置５９〜アミノ酸位置３８１に対応する、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）と６５％以上の配列同一性を有する；
当該方法。
【請求項２】
当該単離キモシンポリペプチド変異体が：
−配列番号１の成熟ポリペプチドを含有するウシキモシンのＣ／Ｐ比と比較してより高いＣ／Ｐ比をもたらすキモシン活性；及び
−配列番号２の成熟ポリペプチドを含有するラクダキモシンのＣ／Ｐ比と比較してより高いＣ／Ｐ比をもたらすキモシン活性；
を有する、請求項１に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
【請求項３】
前記変異が１又は２以上のアミノ酸位置の置換を含み、当該置換が、１３４Ｑ、１４１Ｅ、１４３Ｆ、２８０Ｉ、２８１Ｖ、２９８Ｅ、３００Ｒ、３０７Ｄ、３０９Ｄ、３０９Ｗ、３１１Ｉ、３５２Ｌ、３５２Ｑ、３５３Ｌ又は３５３Ｑである、請求項１又は２に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
【請求項４】
前記置換が、Ｈ１３４Ｑ、Ｑ１４１Ｅ、Ｉ１４３Ｆ、Ｌ２８０Ｉ、Ｆ２８１Ｖ、Ｑ２９８Ｅ、Ｑ３００Ｒ、Ｎ３０７Ｄ、Ｇ３０９Ｄ、Ｇ３０９Ｗ、Ｌ３１１Ｉ、Ｑ３５２Ｌ、Ｅ３５２Ｌ、Ｅ３５２Ｑ、Ｋ３５３Ｌ又はＫ３５３Ｑである、請求項３に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
【請求項５】
前記変異が１又は２以上のアミノ酸位置の置換を含み、当該置換が：
Ｆ２８１Ｖ＋Ｖ３０６Ｉ＋Ｉ３２１Ｌ；
Ｈ１３４Ｑ＋Ｉ１５４Ｌ＋Ｄ２１６Ｓ；
Ｖ２６１Ａ＋Ｖ２６３Ｉ＋Ｇ３０９Ｗ＋Ｌ３１１Ｉ＋Ｙ３２６Ｆ；
Ｄ１５６Ｖ＋Ｇ３０９Ｄ＋Ｍ３１４Ｌ＋Ｖ３１７Ｉ；
Ｈ１３４Ｑ＋Ｌ２８０Ｉ＋Ｇ３０９Ｗ；
Ｒ１１９Ｑ＋Ｄ１５６Ｖ＋Ｖ３７５Ｌ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｒ１１９Ｓ＋Ｈ２０４Ｒ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｈ１３４Ｑ＋Ｙ３６５Ｆ＋Ｖ３７５Ｌ；
Ｙ１９４Ｉ＋Ｒ２１３Ｑ＋Ｇ３０９Ｄ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｄ１１７Ｎ＋Ｉ３２１Ｌ；
Ｙ１８５Ｆ＋Ｄ３２５Ｍ＋Ｅ３５２Ｑ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｌ２２４Ｖ＋Ｌ３１１Ｉ；
Ｓ１３２Ｆ＋Ｈ１３４Ｑ＋Ｍ２００Ｉ＋Ｍ２１５Ｌ＋Ｇ２２１Ｅ；
Ｆ２８１Ｖ＋Ｇ３０９Ｗ＋Ｓ３３１Ｙ＋Ｄ３３７Ｅ；
Ｄ１５６Ｖ＋Ｇ３０９Ｄ＋Ｍ３１４Ｌ＋Ｖ３１７Ｉ；
Ｇ１２８Ｄ＋Ｌ１８８Ｉ＋Ｙ３２６Ｆ；
Ｒ１１９Ｓ＋Ｖ２４１Ｉ＋Ｌ２８０Ｉ＋Ｌ３１１Ｉ  ＋Ｄ３２５Ｍ；  
Ｒ１１９Ｑ＋Ｓ２８４Ｔ＋Ｔ２９７Ｓ＋Ｖ３０６Ｉ＋Ｇ３０９Ｗ  
Ｋ２７９Ｖ＋Ｖ２８１Ｆ；
Ｑ２９８Ｅ＋Ｑ３００Ｒ；
Ｈ３５０Ｎ＋Ｑ３５２Ｅ＋Ｋ３５３Ｌ；
Ｄ３０７Ｎ＋Ｄ３０９Ｇ；又は
Ｑ１４１Ｅ＋Ｉ１４３Ｆ
である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
【請求項６】
前記親ポリペプチドが、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）に対して９５％以上の配列同一性を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
【請求項７】
前記親ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸位置５９〜アミノ酸位置３８１に対応する、配列番号２の成熟ポリペプチド（ラクダキモシン）に対して９５％以上の配列同一性を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法により生産された単離キモシンポリペプチド。
【請求項９】
単離キモシンポリペプチド変異体であって：
（ａ）キモシン活性を有する親ポリペプチド中の１又は２以上の位置に変異を有し、当該変異が、位置１１７、１３４、１４１、１４３、１５６、２４１、２７９、２８０、２８１、２９８、３００、３０７、３０９、３１１、３２５、３５０、３５２及び３５３のいずれかの位置に対応するアミノ酸位置における、置換、欠失、又は挿入を含み；且つ
（ｂ）当該変異体がキモシン活性を有し；
ここで、
（ｉ）前記親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号１のポリペプチド（ウシキモシン）と親ポリペプチドとのアラインメントにより決定され、即ち、配列番号１のポリペプチドが、親ポリペプチド中の対応するアミノ酸配列を決定するのに使用され；及び
（ｉｉ）当該親ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸位置５９〜アミノ酸位置３８１に対応する、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）と９０％以上の配列同一性を有し；及び
（ｉｉｉ）：当該単離変異ポリペプチドが、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）に対して１００％未満の配列同一性を有し；そして、
配列番号１の成熟ポリペプチドを含有するウシキモシンのＣ／Ｐ比と比較してより高いＣ／Ｐ比をもたらすキモシン活性を有する、当該単離キモシンポリペプチド変異体。
【請求項１０】
前記親ポリぺプチドが、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）に対して９７％以上の配列同一性を有し；かつ
前記単離されたウシキモシン変異体が、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）に対して、１０個未満のアミノ酸変異（例えば置換）を含む、請求項９に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
【請求項１１】
前記変異が、１又は２以上のアミノ酸位置における置換を含み、当該置換が、Ｄ１１７Ｎ、Ｈ１３４Ｑ、Ｑ１４１Ｅ、Ｉ１４３Ｆ、Ｄ１５６Ｖ、Ｖ２４１Ｉ、Ｖ２７９Ｍ、Ｌ２８０Ｉ、Ｆ２８１Ｖ、Ｑ２９８Ｅ、Ｑ３００Ｒ、Ｎ３０７Ｄ、Ｇ３０９Ｄ、Ｇ３０９Ｗ、Ｌ３１１Ｉ、Ｄ３２５Ｍ、Ｈ３５０Ｎ、Ｑ３５２Ｌ、Ｅ３５２Ｌ、Ｅ３５２Ｑ、Ｋ３５３Ｌ又はＫ３５３Ｑである、請求項９又は１０に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
【請求項１２】
前記変異が、１又は２以上のアミノ酸位置における置換を含み、当該置換が：
Ｆ２８１Ｖ＋Ｖ３０６Ｉ＋Ｉ３２１Ｌ；
Ｈ１３４Ｑ＋Ｉ１５４Ｌ＋Ｄ２１６Ｓ；
Ｖ２６１Ａ＋Ｖ２６３Ｉ＋Ｇ３０９Ｗ＋Ｌ３１１Ｉ＋Ｙ３２６Ｆ；
Ｄ１５６Ｖ＋Ｇ３０９Ｄ＋Ｍ３１４Ｌ＋Ｖ３１７Ｉ；
Ｈ１３４Ｑ＋Ｌ２８０Ｉ＋Ｇ３０９Ｗ；
Ｒ１１９Ｑ＋Ｄ１５６Ｖ＋Ｖ３７５Ｌ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｒ１１９Ｓ＋Ｈ２０４Ｒ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｈ１３４Ｑ＋Ｙ３６５Ｆ＋Ｖ３７５Ｌ；
Ｙ１９４Ｉ＋Ｒ２１３Ｑ＋Ｇ３０９Ｄ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｄ１１７Ｎ＋Ｉ３２１Ｌ；
Ｙ１８５Ｆ＋Ｄ３２５Ｍ＋Ｅ３５２Ｑ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｌ２２４Ｖ＋Ｌ３１１Ｉ；
Ｓ１３２Ｆ＋Ｈ１３４Ｑ＋Ｍ２００Ｉ＋Ｍ２１５Ｌ＋Ｇ２２１Ｅ；
Ｆ２８１Ｖ＋Ｇ３０９Ｗ＋Ｓ３３１Ｙ＋Ｄ３３７Ｅ；
Ｄ１５６Ｖ＋Ｇ３０９Ｄ＋Ｍ３１４Ｌ＋Ｖ３１７Ｉ；
Ｇ１２８Ｄ＋Ｌ１８８Ｉ＋Ｙ３２６Ｆ；
Ｒ１１９Ｓ＋Ｖ２４１Ｉ＋Ｌ２８０Ｉ＋Ｌ３１１Ｉ  ＋Ｄ３２５Ｍ；  
Ｒ１１９Ｑ＋Ｓ２８４Ｔ＋Ｔ２９７Ｓ＋Ｖ３０６Ｉ＋Ｇ３０９Ｗ  
Ｋ２７９Ｖ＋Ｖ２８１Ｆ；
Ｑ２９８Ｅ＋Ｑ３００Ｒ；
Ｈ３５０Ｎ＋Ｑ３５２Ｅ＋Ｋ３５３Ｌ；
Ｄ３０７Ｎ＋Ｄ３０９Ｇ；又は
Ｑ１４１Ｅ＋Ｉ１４３Ｆ
である、請求項９又は１０に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
【請求項１３】
単離キモシンポリペプチド変異体であって、
（ａ）キモシン活性を有する親ポリペプチド中の１又は２以上の位置における変異を有し、ここで当該変異が、位置１１７、１３４、１４１、１４３、１５６、２４１、２７９、２８０、２８１、２９８、３００、３０７、３０９、３１１、３２５、３５０、３５２及び３５３のいずれかの位置に対応するアミノ酸位置における、置換、欠失、又は挿入を含み；且つ
（ｂ）当該変異体がキモシン活性を有し；
そして、
（ｉ）前記親ポリペプチドのアミノ酸配列位置が、配列番号１のポリペプチド（ウシキモシン）と親ポリペプチドとのアラインメントにより決定され、即ち、配列番号１のポリペプチドが、親ポリペプチド中の対応するアミノ酸配列を決定するのに使用され；及び
（ｉｉ）当該親ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸位置５９〜アミノ酸位置３８１に対応する、配列番号２の成熟ポリペプチド（ラクダキモシン）と９０％以上の配列同一性を有し；及び
（ｉｉｉ）：当該単離変異ポリペプチドが、配列番号２の成熟ポリペプチド（ラクダキモシン）に対して１００％未満の配列同一性を有し；そして、
配列番号２の成熟ポリペプチドを含有するラクダキモシンのＣ／Ｐ比と比較してより高いＣ／Ｐ比をもたらすキモシン活性を有する、当該単離キモシンポリペプチド変異体。
【請求項１４】
前記変異が１又は２以上のアミノ酸位置における置換を含み、当該置換が：
Ｆ２８１Ｖ＋Ｖ３０６Ｉ＋Ｉ３２１Ｌ；
Ｈ１３４Ｑ＋Ｉ１５４Ｌ＋Ｄ２１６Ｓ；
Ｖ２６１Ａ＋Ｖ２６３Ｉ＋Ｇ３０９Ｗ＋Ｌ３１１Ｉ＋Ｙ３２６Ｆ；
Ｄ１５６Ｖ＋Ｇ３０９Ｄ＋Ｍ３１４Ｌ＋Ｖ３１７Ｉ；
Ｈ１３４Ｑ＋Ｌ２８０Ｉ＋Ｇ３０９Ｗ；
Ｒ１１９Ｑ＋Ｄ１５６Ｖ＋Ｖ３７５Ｌ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｒ１１９Ｓ＋Ｈ２０４Ｒ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｈ１３４Ｑ＋Ｙ３６５Ｆ＋Ｖ３７５Ｌ；
Ｙ１９４Ｉ＋Ｒ２１３Ｑ＋Ｇ３０９Ｄ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｄ１１７Ｎ＋Ｉ３２１Ｌ；
Ｙ１８５Ｆ＋Ｄ３２５Ｍ＋Ｅ３５２Ｑ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｌ２２４Ｖ＋Ｌ３１１Ｉ；
Ｓ１３２Ｆ＋Ｈ１３４Ｑ＋Ｍ２００Ｉ＋Ｍ２１５Ｌ＋Ｇ２２１Ｅ；
Ｆ２８１Ｖ＋Ｇ３０９Ｗ＋Ｓ３３１Ｙ＋Ｄ３３７Ｅ；
Ｄ１５６Ｖ＋Ｇ３０９Ｄ＋Ｍ３１４Ｌ＋Ｖ３１７Ｉ；
Ｇ１２８Ｄ＋Ｌ１８８Ｉ＋Ｙ３２６Ｆ；
Ｒ１１９Ｓ＋Ｖ２４１Ｉ＋Ｌ２８０Ｉ＋Ｌ３１１Ｉ＋Ｄ３２５Ｍ；
Ｒ１１９Ｑ＋Ｓ２８４Ｔ＋Ｔ２９７Ｓ＋Ｖ３０６Ｉ＋Ｇ３０９Ｗ
Ｋ２７９Ｖ＋Ｖ２８１Ｆ；
Ｑ２９８Ｅ＋Ｑ３００Ｒ；
Ｈ３５０Ｎ＋Ｑ３５２Ｅ＋Ｋ３５３Ｌ；
Ｄ３０７Ｎ＋Ｄ３０９Ｇ；又は
Ｑ１４１Ｅ＋Ｉ１４３Ｆ
である、請求項１３に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
【請求項１５】
食品又は飼料製品を生産する方法であって、
請求項８〜１４のいずれか１項に記載の有効量の単離キモシンポリペプチド変異体を食品又は試料成分に添加すること、及び、食品又は飼料製品を取得するための更なる生産工程を実施することを含み；
当該製品（ｍｉｌｋ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ）が乳製品であり、当該方法が、乳に請求項８〜１４のいずれか１項に記載の有効量の単離キモシンポリペプチド変異体を添加すること、及び、当該乳製品を取得するための更なる生産工程を実施することを含み；かつ
当該乳が、豆乳、又は羊、山羊、バッファロー、ヤク、リャマ、ラクダ若しくは牛の乳であり；かつ
当該乳製品が、発酵乳製品、クワルク（ｑｕａｒｋ）又はチーズである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凝乳特性が改善されたキモシン変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
凝乳酵素（例えばキモシンやペプシン）による乳の凝固は、チーズの製造における最も重要な工程の１つである。酵素による乳の凝固は２段階のプロセスである。即ち、タンパク質分解酵素であるキモシン又はペプシンがκ−カゼインを攻撃し、その結果としてカゼイン・ミセル構造の準安定状態になる第１段階と、その後に乳が凝固して凝固物を形成する第２段階である。
【０００３】
哺乳動物の胃に存在する凝乳酵素であるキモシン（ＥＣ  ３．４．２３．４）とペプシン（ＥＣ  ３．４．２３．１）は、広範なペプチダーゼのクラスに属するアスパラギン酸プロテアーゼである。
【０００４】
キモシンとペプシンは、胃の粘膜細胞で産生されるとき、それぞれ、酵素として不活性なプレ−プロキモシン及びプレ−プロペプシンとして生じる。キモシンが分泌されるとき、Ｎ末端のペプチド断片、即ちプレ断片（シグナル・ペプチド）が開裂して分離し、プロ断片を含むプロキモシンになる。プロキモシンは、酵素として実質的に不活性な形態だが、酸性条件下で活性化されてプロ断片が自己触媒的に除去され、活性なキモシンになる。この活性化は、生体内では胃内腔の中で適切なｐＨ条件下にて起こり、試験管内では酸性条件下で起こる。
【０００５】
ウシ、即ちＢｏｓ  ｔａｕｒｕｓのプレ−プロキモシン、プロキモシン、キモシンの構造的特徴と機能的特徴がこれまで精力的に研究されてきた。ウシのプレ−プロキモシン分子のプレ部分は１６個のアミノ酸残基を含み、対応するプロキモシンのプロ部分は、長さが４２個のアミノ酸残基を有する。活性なウシキモシンは３２３個のアミノ酸残基を含んでいて、ＡとＢという２つの形態の混合物である。そのどちらの形態も活性である。
【０００６】
キモシンは、哺乳動物のさまざまな種（例えばウシ、ラクダ、ヤギ、バッファロー、ヒツジ、ブタ、ヒト、サル、ラット）で自然に産生される。
【０００７】
ウシキモシンは、酪農業で利用するため長年にわたって市販されてきた。
【０００８】
ＷＯ  ０２／３６７５２Ａ２（Ｃｈｒ．  Ｈａｎｓｅｎ）には、ラクダキモシンの組み換え産生が記載されている。
【０００９】
以下に列挙した参考文献は、本発明の文脈においてキモシンの突然変異体を記述している参考文献と見なすことができる：
−  Ｓｕｚｕｋｉ他：部位特異的突然変異誘発によりキモシンにおけるＴｈｒ２１８、Ｌｙｓ２２０、Ａｓｐ３０４の機能上の寄与が明らかになる、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第４巻、１９９０年１月、６９〜７１ページ；
−  Ｓｕｚｕｋｉ他：部位特異的突然変異誘発によるキモシンの触媒特性の変化、  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２巻、１９８９年５月、５６３〜５６９ページ；
−  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｉｎｋ他：グリコシル化によるキモシンの生産増大、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１２５巻、２００６年９月、３０４〜３１０ページ；
−  Ｐｉｔｔｓ他：Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉの中で産生されるキモシンｐＨ最適化突然変異体の発現とキャラクテリゼーション、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２８巻、１９９３年３月、６９〜８３ページ；
−  Ｍ．Ｇ．  Ｗｉｌｌｉａｍｓ他：ウシキモシンの点突然変異体の突然変異誘発、生化学的キャラクテリゼーション、Ｘ線構造分析、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、第１０巻、１９９７年９月、９９１〜９９７ページ；
−  Ｓｔｒｏｐ他：酵素サブサイト特異性の操作：Ｖａｌ１１１ｐｈｅ部位が突然変異した子ウシキモシンの調製、動的キャラクテリゼーション、２．０  ＡＮＧ分解能でのＸ線分析、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２９巻、１９９０年１０月、９８６３〜９８７１ページ；  
−  Ｓｕｐａｎｎｅｅ他：凝乳活性に影響を与える子ウシキモシンＢの部位特異的突然変異、Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第６２巻、１９９８年６月、１３３〜１３９ページ；
−  Ｚｈａｎｇ他：組み換えプロキモシンにおけるジスルフィド結合Ｃｙｓ４５−Ｃｙｓ５０の機能上の意味、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  ａｃｔａ、第１３４３巻、１９９７年１２月、２７８〜２８６ページ。
【００１０】
先行技術に関する上記のどの参考文献にも、本明細書／末尾の請求項に記載したどのキモシン突然変異体／変異体についても、直接的かつあいまいさなく記載されてはいない。
【発明の概要】
【００１１】
本発明によって解決すべき問題は、凝乳特性が改善されたキモシン変異体を提供することである。
【００１２】
本明細書の実施例で議論しているように、発明者は、改善されたラクダキモシン変異体（本明細書の実施例６参照）と改善されたウシキモシン変異体（本明細書の実施例７参照）を多数同定した。
【００１３】
発明者は、ラクダ変異体とウシ変異体の比較分析に基づき、本明細書において重要な多数のアミノ酸位置をさらに同定した。重要であるというのは、これらアミノ酸位置の１又は２以上が変異した変異体を作ることによって改善されたキモシン変異体が得られる可能性があるという意味である。
【００１４】
本分野で知られているように、異なる哺乳動物種（例えばウシ、ラクダ、ヒツジ、ブタ、ラット）から得られた天然の野生型キモシンポリペプチド配列は、配列の類似度／一致度が比較的大きい。
【００１５】
本明細書の図１に、関連するさまざまなキモシン配列のアラインメントによってそのことを例示してある。
【００１６】
このように配列が互いに比較的似ていることを考慮すると、異なる天然の野生型キモシンの３Ｄ構造も互いに比較的似ていると考えられる。
【００１７】
本発明の文脈では、得られた天然の野生型キモシン（例えばウシキモシン又はラクダキモシン）を、本明細書では、親ポリペプチド、即ち本発明のキモシンポリペプチド変異体を作るために変異を起こさせる親ポリペプチドの一例とすることができる。
【００１８】
理論に囚われなければ、ここで議論するキモシンに関連するアミノ酸位置は、本明細書に関係する興味の対象となるあらゆるキモシン酵素（例えばウシ、ラクダ、ヒツジ、ブタ、ラットなどのキモシン）において一般に重要であると考えられる。重要であるというのは、これらのアミノ酸位置の１又は２以上が変異した変異体を作ることによって一般に改善されたキモシン変異体（例えばウシ、ラクダ、ヒツジ、ブタ、ラットの改善されたキモシン変異体）が得られる可能性があるという意味である。
【００１９】
本明細書で検討したように、興味の対象となる親キモシンポリペプチド（例えばラクダ、ヒツジ、ウシなど）のアミノ酸位置を求めるための参照配列として、本明細書では、公知のウシキモシンＢプレプロキモシン配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｐ００７９４、本明細書では配列番号１として開示）を用いる。
【００２０】
配列番号１のウシキモシンＢプレプロキモシンは、本明細書では、代わりにウシ（Ｂｏｓ  ｂｏｖｉｓ）キモシンＢ又は単純にウシキモシンと呼ぶ。この配列も本明細書の図１に示されている。
【００２１】
本明細書に関係する別のキモシン配列は、本明細書において配列番号２で示したＣａｍｅｌｉｕｓ  ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓの公知のキモシン配列である。それを本明細書では代わりにラクダキモシンと呼ぶ。この配列も本明細書の図１に示されている。
【００２２】
本発明の文脈では、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）との配列同一性が少なくとも６５％である（例えばヒツジ又はラットからの）親キモシンポリペプチドは、本明細書では、例えばウシ又はラクダのキモシンと十分な構造的関連性があると見なせるため、本明細書に記載したアミノ酸位置のうちの任意の位置が変異した変異体を作ることによる改善が可能であると考えられる。
【００２３】
したがって本発明の第１の特徴は、単離キモシンポリペプチド変異体を生産する方法に関するものであり、この方法は、
（ａ）キモシン活性を有する親ポリペプチド中の１又は２以上の位置に、変異として、位置１１７、１３４、１４１、１４３、１５６、２４１、２７９、２８０、２８１、２９８、３００、３０７、３０９、３１１、３２５、３５０、３５２、３５３のいずれかに対応するアミノ酸位置における置換又は欠失又は挿入を含む変異を形成する工程と；
（ｂ）工程（ａ）の変異ポリペプチドを生産して単離することにより、キモシン活性を有する単離されたキモシンポリペプチド変異体を取得する工程を含んでいて；さらに、
（ｉ）親ポリペプチドのアミノ酸位置は、配列番号１のポリペプチド（ウシキモシン）と親ポリペプチドのアラインメントにより決定され、即ち、配列番号１のポリペプチドを使用して親ポリペプチド中の対応するアミノ酸配列が決定され；
（ｉｉ）親ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸位置５９からアミノ酸位置３８１までに対応する成熟ポリペプチド（ウシキモシン）との配列同一性が少なくとも６５％である。
【００２４】
本分野で知られているように、当業者であれば、自らの一般的な知識に基づいてキモシンとキモシン変異体を定型的な作業によって生産して精製することができよう。
【００２５】
言い換えるならば、興味の対象となるキモシン活性を有する本発明に関係する親ポリペプチドを（例えばウシ、ラクダ、ヒツジ、ブタ、ラットから）当業者が一旦入手すると、興味の対象となるそのような親キモシンの変異体を作るのは当業者にとって定型的な作業である。
【００２６】
本発明の第２の特徴は、第１の特徴の方法によって、又は本明細書に関係するその特徴の任意の実施態様によって得られる単離されたキモシンポリペプチド変異体に関する。
【００２７】
上記の第２の特徴に関連する“得られる”という用語は、単離されたキモシンポリペプチド変異体が、第１の特徴の方法によって、又は本明細書に関係するその特徴の任意の実施態様によって得られたものであることと理解すべきである。
【００２８】
したがって第２の特徴に関連する“得られる”という用語は、“得ることができる”であると理解してはならない。
【００２９】
本明細書で検討したように、本明細書の実施例では、親ポリペプチドとして配列番号１のポリペプチド（ウシ）を用いて変異体を作った。そのような変異体を本明細書ではウシキモシン変異体と呼ぶことができよう。
【００３０】
したがって本発明の第３の特徴は、単離されたキモシンポリペプチド変異体に関するものであり、この単離されたキモシンポリペプチド変異体は、
（ａ）キモシン活性を有する親ポリペプチド中の１又は２以上の位置に変異として、位置１１７、１３４、１４１、１４３、１５６、２４１、２７９、２８０、２８１、２９８、３００、３０７、３０９、３１１、３２５、３５０、３５２、３５３のいずれかの位置に対応するアミノ酸位置における置換又は欠失又は挿入を含む変異を持ち；かつ
（ｂ）この変異体はキモシン活性を持ち；さらに、
（ｉ）親ポリペプチドのアミノ酸位置は、配列番号１のポリペプチド（ウシキモシン）と親ポリペプチドのアラインメントにより決定され、即ち、配列番号１のポリペプチドを使用して親ポリペプチド中の対応するアミノ酸配列が決定され；
（ｉｉ）親ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸位置５９からアミノ酸位置３８１までに対応する成熟ポリペプチド（ウシキモシン）との配列同一性が少なくとも９０％であり；
（ｉｉｉ）この単離された変異ポリペプチドは、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）との配列同一性が１００％未満である。
【００３１】
本明細書で検討したように、本明細書の実施例では、親ポリペプチドとして配列番号２のポリペプチド（ラクダ）を用いて変異体を作った。そのような変異体を本明細書ではラクダキモシン変異体と呼ぶことができよう。
【００３２】
したがって本発明の第４の特徴は、単離されたキモシンポリペプチド変異体に関するものであり、この単離されたキモシンポリペプチド変異体は、
（ａ）キモシン活性を有する親ポリペプチド中の１又は２以上の位置に変異として、位置１１７、１３４、１４１、１４３、１５６、２４１、２７９、２８０、２８１、２９８、３００、３０７、３０９、３１１、３２５、３５０、３５２、３５３のいずれかの位置に対応するアミノ酸位置における置換又は欠失又は挿入を含む変異を持ち；
（ｂ）この変異体はキモシン活性を持ち；さらに、
（ｉ）親ポリペプチドのアミノ酸位置は、配列番号１のポリペプチド（ウシキモシン）と親ポリペプチドのアラインメントにより決定され、即ち、配列番号１のポリペプチドを使用して親ポリペプチド中の対応するアミノ酸配列が決定され；
（ｉｉ）親ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸位置５９からアミノ酸位置３８１までに対応する成熟ポリペプチド（ラクダキモシン）と配列同一性が少なくとも９０％であり；
（ｉｉｉ）この単離された変異ポリペプチドは、配列番号２の成熟ポリペプチド（ラクダキモシン）との配列同一性が１００％未満である。
【００３３】
本明細書に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、本分野では、例えば興味の対象となる食品又は飼料製品（例えば興味の対象となる乳製品であり、チーズ製品が可能であろう）の製造に使用できる。
【００３４】
したがって本発明の第５の特徴は、食品又は飼料製品を生産する方法に関するものであり、この方法は、本明細書に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体の有効量を食品又は飼料成分に添加した後、追加製造工程を実施することによって食品又は飼料製品を得ることを含んでいる。
【００３５】
本発明の実施態様を以下に説明するが、それは単なる例示にすぎない。
【００３６】
定義
【００３７】
本明細書に関連する用語のあらゆる定義は、本明細書に関連する技術的文脈に関係する当業者が理解すると考えられるものに従っている。
【００３８】
“キモシン”という用語は、ＥＣ  ３．４．２３．４クラスの酵素に関する。キモシンは大きな特異性を持ち、カゼインのκ鎖に存在する単一の１０５−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−｜−Ｍｅｔ−Ａｌａ−１０８結合の開裂によって乳を凝固させる。本分野で用いられている別の名前はレンニンである。
【００３９】
“キモシン活性”という用語は、本発明の文脈で当業者が理解するキモシン酵素のキモシン活性に関する。
【００４０】
当業者は、本明細書に関連するキモシン活性を求める方法を知っている。
【００４１】
本明細書の実施例４には、比キモシン活性を求める標準的な方法の一例が示されている。比キモシン活性は、凝固活性又は凝乳活性とも呼ばれる。
【００４２】
本明細書の実施例５には、タンパク質分解活性を求める標準的な方法の一例が示されている。
【００４３】
本分野で知られているように、本明細書に関連するいわゆるＣ／Ｐ比は、比凝固活性（Ｃ）をタンパク質分解活性（Ｐ）で割ることによって求められる。
【００４４】
本分野で知られているように、より大きなＣ／Ｐ比は、一般に、例えばチーズ製造中のタンパク質の損失が非特異的なタンパク質分解により少なくなること（即ちチーズの収率が向上すること）と、成熟中のチーズにおける苦い味の発達が減ることを意味する。
【００４５】
“単離された変異体”という用語は、人の手によって改変された変異体を意味する。１つの特徴では、変異体は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって判断すると、少なくとも１％が純粋である（例えば少なくとも５％が純粋である、少なくとも１０％が純粋である、少なくとも２０％が純粋である、少なくとも４０％が純粋である、少なくとも６０％が純粋である、少なくとも８０％が純粋である、少なくとも９０％が純粋である）。
【００４６】
“成熟ポリペプチド”という用語は、翻訳とあらゆる翻訳後修飾（例えばＮ末端プロセシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化など）の後に最終形態になったペプチドを意味する。本発明の文脈では、本明細書に関連する成熟キモシンポリペプチドを、活性なキモシンポリペプチド配列、即ちプレ部分及び／又はプロ部分の配列がないキモシンポリペプチド配列と見なすことができる。成熟ポリペプチドの本明細書に関連する例は、例えば、配列番号１のアミノ酸位置５９からアミノ酸位置３８１までの成熟ポリペプチド（ウシキモシン）、又は配列番号２のアミノ酸位置５９からアミノ酸位置３８１までの成熟ポリペプチド（ラクダキモシン）である。
【００４７】
“親”又は“キモシン活性を有する親ポリペプチド”という表現は、変異によって本発明の酵素変異体を生じさせるポリペプチドを意味する。親は、天然の（野生型）ポリペプチドでも、その変異体でもよい。
【００４８】
“配列同一性”という用語は、２つのアミノ酸配列の間の関連性、又は２つのヌクレオチド配列の間の関連性に関する。
【００４９】
本発明の目的では、２つのアミノ酸配列の間の配列同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：欧州分子生物学オープン・ソフトウエア・スイート、Ｒｉｃｅ他、２０００年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．、第１６巻：２７６〜２７７ページ）のＮｅｅｄｌｅプログラム（バージョン３．０．０又はそれ以降のものが好ましい）において実現されているニードルマン−ヴンシュ・アルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ、１９７０年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、第４８巻：４４３〜４５３ページ）を用いて求められる。使用するオプションのパラメータは、ギャップを空けるペナルティが１０、ギャップを延長するペナルティが０．５、ＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＥＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅで標識した“最長の一致”（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力をパーセント同一性として用い、それは以下のように計算する：
（一致する残基×１００）／（アラインメントの長さ-アラインメントにおけるギャップの合計数）。
【００５０】
本発明の目的では、２つのデオキシリボヌクレオチド配列の間の配列同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：欧州分子生物学オープン・ソフトウエア・スイート、Ｒｉｃｅ他、２０００年、上記文献）のＮｅｅｄｌｅプログラム（バージョン３．０．０又はそれ以降のものが好ましい）において実現されているニードルマン−ヴンシュ・アルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ、１９７０年、上記文献）を用いて求められる。使用するオプションのパラメータは、ギャップを空けるペナルティが１０、ギャップを延長するペナルティが０．５、ＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ  ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅで標識した“最長の一致”（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力をパーセント同一性として用い、それは以下のように計算する：
（一致するデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ-アラインメントにおけるギャップの合計数）。
【００５１】
“変異体”という用語は、キモシン活性を有するペプチドで、変異、即ち置換及び／又は挿入及び／又は欠失を１又は２以上（いくつか）の位置に含んでいるものを意味する。置換は、ある位置を占めている１個のアミノ酸が異なるアミノ酸で置き換えられることを意味する。欠失は、ある位置を占めている１個のアミノ酸が除去されることを意味する。挿入は、ある位置を占めている１個のアミノ酸の隣に１〜３個のアミノ酸が付加されることを意味する。
【００５２】
アミノ酸は、天然のアミノ酸でも非天然のアミノ酸でもよく、例えばＤ−アラニンを特にＤ−異性体（又はＤ−形態）で置換することが理論的に可能であろう。
【００５３】
“野生型”キモシンペプチドという用語は、天然の生物（例えば自然界に見られる哺乳動物（例えばラクダやウシ））が発現するキモシンを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本明細書に関連するさまざまなキモシン配列のアラインメント。示してある“Ｂｏｓ＿ｂｏｖｉｓ＿ｃｈｙｍｏｓｉｎ＿Ｂ”は、本明細書の配列番号１のウシキモシンであり、示してある“Ｃａｍｅｌｕｓ＿ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ”は、本明細書の配列番号２のラクダキモシンである。本明細書に記載したように参照配列として配列番号１のウシキモシンを用いると、ウシキモシンでは位置１０に“Ｖ”があり、ラクダキモシンでは同じ位置１０に“Ａ”があることがわかる。例えばウシ／ラットでは位置３５２に“Ｑ”があり、ラクダ／Ｃ．＿ｂａｃｔｒｉａｎｕｓでは同じ位置３５２に“Ｅ”があることもわかる。
【００５５】
図１に示したキモシン配列に関し、ヒツジは、ウシ配列番号１との配列同一性が９４．５％であり、Ｃ．＿ｂａｃｔｒｉａｎｕｓは、ウシ配列番号１との配列同一性が８３．２％であり、Ｃａｍｅｌｕｓ＿ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ（配列番号２のラクダキモシン）は、ウシ配列番号１との配列同一性が８４％であり、ブタは、ウシ配列番号１との配列同一性が８０．３％であり、ラットは、ウシ配列番号１との配列同一性が７１．９％である。
【００５６】
本発明の文脈で当業者であれば理解できるように、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン、即ち配列番号１のアミノ酸位置５９〜３８１）に対する例えばヒツジ、Ｃ．＿ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ、ラクダ、ブタ、ラットのキモシンの成熟ポリペプチド配列の配列同一性の程度は、上記の配列同一性の程度と比較的似ている。
【００５７】
【図２】ウシキモシンの３Ｄ構造。この３Ｄ構造は公開されている。一例として、アミノ酸位置２９６と２９４がウシキモシンのどこに存在するかを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
興味の対象となるキモシンのアミノ酸位置の決定
【００５９】
上述のように、本明細書に関連する興味の対象となるキモシンポリペプチド（例えばラクダ、ヒツジ、ウシなど）のアミノ酸位置を決定するための参照配列として、本明細書では、本明細書で配列番号１として開示した公知のウシキモシン配列を用いる。
【００６０】
本発明の目的では、配列番号１に開示したポリペプチド（ウシキモシン）を用いて別のキモシンポリペプチドの対応するアミノ酸残基を決定する。別のキモシンポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１で開示したポリペプチドとアラインメントさせ、このアラインメントに基づき、本明細書の実施例１に記載したＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを用いて、配列番号１に開示したポリペプチドの任意のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置の番号を決定する。
【００６１】
別のキモシンポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基が何であるかは、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：欧州分子生物学オープン・ソフトウエア・スイート、Ｒｉｃｅ他、２０００年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．、第１６巻：２７６〜２７７ページ）のＮｅｅｄｌｅプログラム（バージョン３．０．０又はそれ以降のものが好ましい）において実現されているニードルマン−ヴンシュ・アルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ、１９７０年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、第４８巻：４４３〜４５３ページ）を用いて確認することができる。
【００６２】
当業者にとって、本明細書に関連する興味の対象となるキモシンポリペプチド（例えばラクダ、ヒツジ、ウシなど）のアミノ酸位置を上記の周知のコンピュータ・プログラムに基づいて決定することは定型的な作業である。
【００６３】
本明細書の図１には、アラインメントの一例が示されている。
【００６４】
単なる一例として、図１において、例えば、本明細書で用いるウシ参照配列番号１では位置５０に“Ｇ”があり、“Ｃａｍｅｌｕｓ＿ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ”（本明細書の配列番号２）ではこの位置５０に“Ａ”があることがわかる。
【００６５】
変異体の命名法
【００６６】
本発明の変異体を記述するにあたり、参照が容易であるようにするため以下に記述する命名法を採用する。受け入れられているＩＵＰＡＣの一文字又は三文字でのアミノ酸略記法を用いる。
【００６７】
この“命名法”の項で議論する以下の具体的な変異体は、本発明に関連する変異体ではない可能性がある。即ちこの“命名法”の項では、単に本明細書に関連して用いる命名法をそのまま説明している。
【００６８】
置換。アミノ酸の置換については、以下の命名法を用いる：元のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸。したがって位置２２６のトレオニンがアラニンで置換されたとすると、“Ｔｈｒ２２６Ａｌａ”又は“Ｔ２２６Ａ”と表わされる。複数の変異は加算記号（“＋”）によって分離され、例えば“Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ”又は“Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ”となる。これは、位置２０５のグリシン（Ｇ）がアルギニン（Ｒ）で置換され、位置４１１のセリン（Ｓ）がフェニルアラニン（Ｆ）で置換されていることを表わす。例えば“２２６Ａ”で表わされる置換は、位置２２６の親アミノ酸（例えばＴ、Ｑ、Ｓか、それ以外の親アミノ酸）がアラニンで置換されていることを意味する。
【００６９】
欠失。アミノ酸の欠失については、以下の命名法を用いる：元のアミノ酸、位置、＊。したがって位置１９５のグリシンが欠失している場合には、“Ｇｌｙ１９５＊”又は“Ｇ１９５＊”と表わされる。複数の欠失は加算記号（“＋”）によって分離され、例えば“Ｇｌｙ１９５＊＋Ｓｅｒ４１１＊”又は“Ｇ１９５＊＋Ｓ４１１＊”となる。
【００７０】
挿入。アミノ酸の挿入については、以下の命名法を用いる：元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸。したがって位置１９５のグリシンの後にリシンが挿入された場合には、“Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓ”又は“Ｇ１９５ＧＫ”と表わされる。複数のアミノ酸の挿入は、［元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸＃１、挿入されたアミノ酸＃２；など］と表わされる。例えば位置１９５のグリシンの後にリシンとアラニンが挿入されると、“Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａ”又は“Ｇ１９５ＧＫＡ”として示される。
【００７１】
このような場合、挿入されたアミノ酸残基は、その挿入されたアミノ酸残基の前のアミノ酸残基の位置番号にアルファベットの小文字を付加して表わされる。上記の例では、配列は以下のようになろう。
【００７２】
【表１】
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【００７３】
複数の変異。複数の変異を含む変異体は、加算記号（“＋”）によって分離される。例えば“Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ＋Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ”又は“Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ”であり、位置１７０のアルギニンと位置１９５のグリシンがそれぞれチロシンとグルタミン酸で置換されていることを表わす。
【００７４】
異なる置換。異なる置換を１つの位置に導入できる場合には、それらの異なる置換をコンマで分離する。例えば“Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ，Ｇｌｕ”又は“Ｒ１７０Ｙ，Ｅ”は、位置１７０のアルギニンがチロシン又はグルタミン酸で置換されていることを表わす。したがって“Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ，Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，Ａｌａ”又は“Ｙ１６７Ｇ，Ａ＋Ｒ１７０Ｇ，Ａ”は、以下の変異体：“Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ”、“Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ”、“Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ”、“Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ”を表わす。
【００７５】
単離されたキモシンポリペプチド変異体を生産する方法
【００７６】
上述のように、本分野で知られていることだが、当業者であれば、一般的な知識に基づき、キモシンとキモシン変異体を定型的な作業で生産して精製することができる。
【００７７】
言い換えるならば、興味の対象であるキモシン活性を有する本明細書に関連する親ポリペプチドを当業者が一旦入手すると、そのような興味の対象である親キモシンの変異体を作ることは当業者にとって定型的な作業である。
【００７８】
キモシン（変異体又は親）を生産して単離する適切な方法の一例として、例えばＷＯ０２／３６７５２Ａ２（Ｃｈｒ．  Ｈａｎｓｅｎ）に記載されている技術に基づく周知の真菌組み換え発現／産生法が可能であろう。
【００７９】
当業者にとって、キモシン活性を有する親ポリペプチドの１又は２以上の位置に変異を形成することも定型的な作業である。なお変異には、少なくとも１つのアミノ酸位置での置換、欠失、挿入が含まれる。
【００８０】
当業者に知られているように、これは、いわゆる部位特異的突然変異誘発と組み換え発現／産生に基づく技術によって実施できる。
【００８１】
当業者にとって、本明細書に関連する親ポリペプチド（例えばラクダ又はウシの野生型キモシン）及び／又は本明細書に関連する変異体がキモシン活性を有するかどうかを判断することも定型的な作業である。
【００８２】
本分野で知られているように、キモシン活性は、いわゆるＣ／Ｐ比によって判断することができる。なおＣ／Ｐ比は、比凝固活性（Ｃ）をタンパク質分解活性（Ｐ）で割ることによって求まる。
【００８３】
本分野で知られているように、より大きなＣ／Ｐ比は、一般に、例えばチーズ製造中のタンパク質の損失が非特異的なタンパク質分解により少なくなること（即ちチーズの収率が向上すること）と、成熟中のチーズにおける苦い味の発達が減ることを意味する。
【００８４】
本明細書の実施例４には、比凝固活性（Ｃ）を求める適切な方法が記載されており、本明細書の実施例５には、タンパク質分解活性（Ｐ）を求める適切な方法が記載されている。
【００８５】
本明細書に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、本明細書の配列番号１の成熟ポリペプチドを含むウシキモシンのＣ／Ｐ比よりも大きなＣ／Ｐ比を与えるキモシン活性を有する変異体であることが好ましい。
【００８６】
本明細書に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、本明細書の配列番号２の成熟ポリペプチドを含むラクダキモシンのＣ／Ｐ比よりも大きなＣ／Ｐ比を与えるキモシン活性を有する変異体であることが好ましい。
【００８７】
本明細書に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、
−  本明細書の配列番号１の成熟ポリペプチドを含むウシキモシンのＣ／Ｐ比よりも大きなＣ／Ｐ比を与えるキモシン活性と；
−  本明細書の配列番号２の成熟ポリペプチドを含むラクダキモシンのＣ／Ｐ比よりも大きなＣ／Ｐ比を与えるキモシン活性
を有する変異体であることがより好ましい。
【００８８】
上述のように、本明細書に関連する興味の対象であるキモシンポリペプチド（例えばラクダ、ヒツジ、ウシなど）のアミノ酸位置を決定するための参照配列として、本明細書では、本明細書で配列番号１として開示した公知のウシキモシン配列を用いる。
【００８９】
上述のように、当業者にとって、本明細書に関連する興味の対象であるキモシンポリペプチド（例えばラクダ、ヒツジ、ウシなど）の本明細書に関連するアミノ酸位置を例えば本明細書で議論した配列アラインメント用コンピュータ・プログラムに基づいて決定することは定型的な作業である。
【００９０】
例えば本明細書の第１の特徴による方法の“親ポリペプチドは、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）との配列同一性が少なくとも６５％である”という表現は、親キモシンポリペプチドの配列に基づく制限を利用して本明細書に関連する変異体を作ることに関係している。
【００９１】
言い換えるならば、成熟ウシキモシンとの配列同一性が少なくとも６５％である（例えばヒツジ又はブタからの）成熟親キモシンポリペプチドは、本明細書で関連していると言える程度に例えばウシ又はラクダのキモシンと構造が十分に一致していると考えられる。即ち本発明の文脈では、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）との配列同一性が少なくとも６５％である（例えばヒツジ又はラットからの）成熟親キモシンポリペプチドは、本明細書では、例えばウシ又はラクダのキモシンと構造が十分に関連していると見なせるため、本明細書に記載した任意のアミノ酸位置における変異体を作ることによる改善が可能であると考えられる。
【００９２】
配列番号２のラクダキモシンポリペプチドは、配列番号１のウシポリペプチド（即ち位置１から３８１までの配列番号１全体であり、その中にプレ配列とプロ配列が含まれる）との配列同一性が８４％である。
【００９３】
本発明の文脈では、当業者なら理解できるように、キモシン活性を有する本明細書に関連する親ポリペプチドは、すでに、例えば対応する野生型キモシンの変異体である可能性がある。
【００９４】
例えば、配列番号２のラクダキモシンポリペプチドと比べて例えば５〜１０個の変異（例えば置換）を有するラクダキモシン変異体は、相変わらず、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシ）との配列同一性が例えば本明細書の第１の特徴で必要とされる少なくとも６５％である親ポリペプチドであろう。
【００９５】
言い換えるならば、本明細書に関連する単離されたキモシンポリペプチド変異体は、例えば本明細書の第１の特徴の位置以外の位置に変異（例えば置換）を含んでいてもよい。
【００９６】
本明細書の図１に示したキモシン配列に関し、ヒツジは、ウシ配列番号１との配列同一性が９４．５％であり、Ｃ．＿ｂａｃｔｒｉａｎｕｓは、ウシ配列番号１との配列同一性が８３．２％であり、Ｃａｍｅｌｕｓ＿ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ（配列番号２のラクダキモシン）は、ウシ配列番号１との配列同一性が８４％であり、ブタは、ウシ配列番号１との配列同一性が８０．３％であり、ラットは、ウシ配列番号１との配列同一性が７１．９％である。
【００９７】
本発明の文脈では、当業者なら理解できるように、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン、即ち配列番号１のアミノ酸位置５９〜３８１）に対する例えばヒツジ、Ｃ．＿ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ、ラクダ、ブタ、ラットのキモシンの成熟ポリペプチド配列の配列同一性の程度は、上記の配列同一性の程度と比較的似ている。
【００９８】
好ましい変異体：
【００９９】
上述のように、例えば第１の特徴は、変異が、位置１１７、１３４、１４１、１４３、１５６、２４１、２７９、２８０、２８１、２９８、３００、３０７、３０９、３１１、３２５、３５０、３５２、３５３のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置における置換、欠失、挿入のいずれかを含む単離されたキモシンポリペプチド変異体に関する。
【０１００】
好ましい一実施態様は、変異が、位置１３４、１４１、１４３、２８０、２８１、２９８、３００、３０７、３０９、３１１、３５２、３５３のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置における置換、欠失、挿入のいずれかを含む単離されたキモシンポリペプチド変異体に関する。
【０１０１】
少なくとも１つの変異は置換であることが好ましかろう。即ち本明細書に関連する好ましい一実施態様は、変異が、位置１１７、１３４、１４１、１４３、１５６、２４１、２７９、２８０、２８１、２９８、３００、３０７、３０９、３１１、３２５、３５０、３５２、３５３のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置における置換を含む単離されたキモシンポリペプチド変異体に関する。
【０１０２】
変異が、位置１３４、１４１、１４３、２８０、２８１、２９８、３００、３０７、３０９、３１１、３５２、３５３のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置における置換を含む単離されたキモシンポリペプチド変異体が好ましい。
【０１０３】
置換は、１１７Ｎ、１３４Ｑ、１４１Ｅ、１４３Ｆ、１５６Ｖ、２４１Ｉ、２７９Ｍ、２８０Ｉ、２８１Ｖ、２９８Ｅ、３００Ｒ、３０７Ｄ、３０９Ｄ、３０９Ｗ、３１１Ｉ、３２５Ｍ、３５０Ｎ、３５２Ｌ、３５２Ｑ、３５３Ｌ、３５３Ｑのいずれかであることが好ましい。
【０１０４】
本発明の文脈では、当業者なら理解できるように、親キモシンポリペプチドの例えば位置１５６にすでに“Ｖ”がある場合には、この特定の親キモシンポリペプチドで置換１５６Ｖを行なうことについて話すのは意味がない。本明細書の図１からわかるように、ラット野性型キモシンでは位置１５６に“Ｖ”がある。置換１５６Ｖは、図１のその特定のラットキモシンポリペプチド配列については本明細書と無関係であると見なすことができる。
【０１０５】
置換は、１３４Ｑ、１４１Ｅ、１４３Ｆ、２８０Ｉ、２８１Ｖ、２９８Ｅ、３００Ｒ、３０７Ｄ、３０９Ｄ、３０９Ｗ、３１１Ｉ、３５２Ｌ、３５２Ｑ、３５３Ｌ、３５３Ｑのいずれかであることが好ましい。
【０１０６】
置換は、Ｄ１１７Ｎ、Ｈ１３４Ｑ、Ｑ１４１Ｅ、Ｉ１４３Ｆ、Ｄ１５６Ｖ、Ｖ２４１Ｉ、Ｖ２７９Ｍ、Ｌ２８０Ｉ、Ｆ２８１Ｖ、Ｑ２９８Ｅ、Ｑ３００Ｒ、Ｎ３０７Ｄ、Ｇ３０９Ｄ、Ｇ３０９Ｗ、Ｌ３１１Ｉ、Ｄ３２５Ｍ、Ｈ３５０Ｎ、Ｑ３５２Ｌ、Ｅ３５２Ｌ、Ｅ３５２Ｑ、Ｋ３５３Ｌ、Ｋ３５３Ｑのいずれかであることが好ましい。
【０１０７】
本発明の文脈では、当業者なら理解できるように、親キモシンポリペプチドの例えば位置１５６に“Ｄ”がない場合には、この特定の親キモシンポリペプチドで置換Ｄ１５６Ｖ行なうことについて話すのは意味がない。本明細書の図１からわかるように、ラット野性型キモシンでは位置１５６に“Ｖ”がある。したがって置換Ｄ１５６Ｖは、図１のその特定のラットキモシンポリペプチド配列については本明細書と無関係であると見なすことができる。
【０１０８】
好ましい一実施態様では、置換は、Ｈ１３４Ｑ、Ｑ１４１Ｅ、Ｉ１４３Ｆ、Ｌ２８０Ｉ、Ｆ２８１Ｖ、Ｑ２９８Ｅ、Ｑ３００Ｒ、Ｎ３０７Ｄ、Ｇ３０９Ｄ、Ｇ３０９Ｗ、Ｌ３１１Ｉ、Ｑ３５２Ｌ、Ｅ３５２Ｌ、Ｅ３５２Ｑ、Ｋ３５３Ｌ、Ｋ３５３Ｑのいずれかである。
【０１０９】
好ましい一実施態様では、置換は、
Ｆ２８１Ｖ＋Ｖ３０６Ｉ＋Ｉ３２１Ｌ；
Ｈ１３４Ｑ＋Ｉ１５４Ｌ＋Ｄ２１６Ｓ；
Ｖ２６１Ａ＋Ｖ２６３Ｉ＋Ｇ３０９Ｗ＋Ｌ３１１Ｉ＋Ｙ３２６Ｆ；
Ｄ１５６Ｖ＋Ｇ３０９Ｄ＋Ｍ３１４Ｌ＋Ｖ３１７Ｉ；
Ｈ１３４Ｑ＋Ｌ２８０Ｉ＋Ｇ３０９Ｗ；
Ｒ１１９Ｑ＋Ｄ１５６Ｖ＋Ｖ３７５Ｌ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｒ１１９Ｓ＋Ｈ２０４Ｒ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｈ１３４Ｑ＋Ｙ３６５Ｆ＋Ｖ３７５Ｌ；
Ｙ１９４Ｉ＋Ｒ２１３Ｑ＋Ｇ３０９Ｄ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｄ１１７Ｎ＋Ｉ３２１Ｌ；
Ｙ１８５Ｆ＋Ｄ３２５Ｍ＋Ｅ３５２Ｑ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｌ２２４Ｖ＋Ｌ３１１Ｉ；
Ｓ１３２Ｆ＋Ｈ１３４Ｑ＋Ｍ２００Ｉ＋Ｍ２１５Ｌ＋Ｇ２２１Ｅ；
Ｆ２８１Ｖ＋Ｇ３０９Ｗ＋Ｓ３３１Ｙ＋Ｄ３３７Ｅ；
Ｄ１５６Ｖ＋Ｇ３０９Ｄ＋Ｍ３１４Ｌ＋Ｖ３１７Ｉ；
Ｇ１２８Ｄ＋Ｌ１８８Ｉ＋Ｙ３２６Ｆ；
Ｒ１１９Ｓ＋Ｖ２４１Ｉ＋Ｌ２８０Ｉ＋Ｌ３１１Ｉ＋Ｄ３２５Ｍ；
Ｒ１１９Ｑ＋Ｓ２８４Ｔ＋Ｔ２９７Ｓ＋Ｖ３０６Ｉ＋Ｇ３０９Ｗ；
Ｋ２７９Ｖ＋Ｖ２８１Ｆ；
Ｑ２９８Ｅ＋Ｑ３００Ｒ；
Ｈ３５０Ｎ＋Ｑ３５２Ｅ＋Ｋ３５３Ｌ；
Ｄ３０７Ｎ＋Ｄ３０９Ｇ；
Ｑ１４１Ｅ＋Ｉ１４３Ｆ
のいずれかである。
【０１１０】
キモシン活性を有する好ましい親ポリペプチド：
【０１１１】
親ポリペプチドは、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）との配列同一性が少なくとも７０％であることが好ましく、親ポリペプチドは、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）との配列同一性が少なくとも７５％であることがより好ましい。
【０１１２】
単なる一例として、本明細書に関連する適切な親ポリペプチドとして、例えばウシキモシンＡが可能であろう。本分野で知られているように、ウシキモシンＡは、本明細書の配列番号１のウシキモシンＢとアミノ酸が１個しか異なっていない可能性がある。
【０１１３】
上述のように、本明細書の実施例では、配列番号１のポリペプチド（ウシ）を親ポリペプチドとして用いて変異体を作った。このような変異体を本明細書ではウシキモシン変異体と呼ぶことができよう。
【０１１４】
したがって好ましい一実施態様では、親ポリペプチドは、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）との配列同一性が少なくとも９０％である。親ポリペプチドは、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）との配列同一性が少なくとも９５％であることがより好ましく、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）との配列同一性が少なくとも９７％であることがさらに好ましい。親ポリペプチドは、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）であることが好ましかろう。
【０１１５】
本発明の文脈では、当業者なら理解できるように、キモシン活性を有する本明細書に関連する親ポリペプチドは、すでに、例えば対応する野生型キモシンの変異体である可能性がある。
【０１１６】
例えば、配列番号１の野生型ウシキモシンポリペプチドと比べて例えば５〜１０個の変異（例えば置換）を有するウシキモシン変異体は、相変わらず、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）との配列同一性が少なくとも９５％である親ポリペプチドであろう。
【０１１７】
配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシ）は長さがアミノ酸３２３個であるため、配列番号１の成熟野生型ウシキモシンポリペプチドと比べて例えば２５個のアミノ酸置換を持つウシキモシン変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）との配列同一性が少なくとも９５％の親ポリペプチドにはならない。
【０１１８】
言い換えるならば、そして一般に、本明細書に関連する単離されたキモシンポリペプチド変異体は、例えば本明細書の第１の特徴の位置以外の位置に変異（例えば置換）を含んでいてもよい。
【０１１９】
上述のように、本明細書の実施例では、配列番号２のポリペプチド（ラクダ）を親ポリペプチドとして用いて変異体を作った。このような変異体を本明細書ではラクダキモシン変異体と呼ぶことができよう。
【０１２０】
したがって好ましい一実施態様では、親ポリペプチドは、配列番号２の成熟ポリペプチド（ラクダキモシン）との配列同一性が少なくとも９０％である。親ポリペプチドは、配列番号２の成熟ポリペプチド（ラクダキモシン）との配列同一性が少なくとも９５％であることがより好ましく、配列番号２の成熟ポリペプチド（ラクダキモシン）との配列同一性が少なくとも９７％であることがさらに好ましい。親ポリペプチドは、配列番号２の成熟ポリペプチド（ラクダキモシン）であることが好ましかろう。
【０１２１】
本発明の文脈では、当業者なら理解できるように、配列番号２の成熟ポリペプチド（ラクダ）との配列同一性が少なくとも９０％である親ポリペプチドは、本明細書の第１の特徴の項目（ｉｉ）の配列番号１（ウシ）に基づく配列同一性の条件に相変わらず当てはまる。即ちそれは、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）との配列同一性が少なくとも６５％である親ポリペプチドになる。
【０１２２】
ウシキモシンの単離された変異体：
【０１２３】
上述のように、本明細書の実施例では、配列番号１のポリペプチド（ウシ）を親ポリペプチドとして用いて変異体を作った。このような変異体を本明細書ではウシキモシン変異体と呼ぶことができよう。
【０１２４】
上述のように、第３の特徴は、単離されたキモシンポリペプチド変異体に関するものであり、この単離されたキモシンポリペプチド変異体は、
（ａ）キモシン活性を有する親ポリペプチド中の１又は２以上の位置に変異として、位置１１７、１３４、１４１、１４３、１５６、２４１、２７９、２８０、２８１、２９８、３００、３０７、３０９、３１１、３２５、３５０、３５２、３５３のいずれかの位置に対応するアミノ酸位置における置換又は欠失又は挿入を含む変異を持ち；かつ
（ｂ）この変異体はキモシン活性を持ち；さらに、
（ｉ）親ポリペプチドのアミノ酸位置は、配列番号１のポリペプチド（ウシキモシン）と親ポリペプチドのアラインメントにより決定され、即ち、配列番号１のポリペプチドを使用して親ポリペプチド中の対応するアミノ酸配列が決定され；
（ｉｉ）親ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸位置５９からアミノ酸位置３８１までに対応する成熟ポリペプチド（ウシキモシン）との配列同一性が少なくとも９０％であり；
（ｉｉｉ）この単離された変異ポリペプチドは、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）との配列同一性が１００％未満である。
【０１２５】
上記の定義と好ましい実施態様は、この特徴にも関係する。
【０１２６】
本明細書に記載の単離されたウシキモシンポリペプチド変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドを含むウシキモシンのＣ／Ｐ比よりも大きいＣ／Ｐ比を与えるキモシン活性を有することが好ましい。
【０１２７】
好ましい一実施態様では、親ポリペプチドは、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）との配列同一性が少なくとも９２％である。親ポリペプチドは、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）との配列同一性が少なくとも９５％であることがより好ましく、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）との配列同一性が少なくとも９７％であることがそれ以上に好ましい。
【０１２８】
本発明の文脈では、当業者なら理解できるように、単離されたキモシン変異体は、上記以外のアミノ酸位置に変異（例えば置換）を含んでいてもよい。
【０１２９】
例えば、配列番号１の野生型ウシキモシンポリペプチドと比べて例えば５〜１０個の変異（例えば置換）を有するウシキモシン変異体は、相変わらず、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）との配列同一性が少なくとも９５％である親ポリペプチドであろう。
【０１３０】
単離されたウシキモシン変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）と比べて３０個未満のアミノ酸変異（例えば置換）を含むことが好ましかろう。あるいは単離されたウシキモシン変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）と比べて２０個未満のアミノ酸変異（例えば置換）を含むことが好ましかろう。あるいは単離されたウシキモシン変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）と比べて１０個未満のアミノ酸変異（例えば置換）を含むことが好ましかろう。あるいは単離されたウシキモシン変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）と比べて５個未満のアミノ酸変異（例えば置換）を含むことが好ましかろう。
【０１３１】
本発明の文脈では、当業者なら理解できるように、上記の項目（ｉｉｉ）の“単離されたポリペプチド変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）との配列同一性が１００％未満である”という表現は、本明細書に記載の単離されたウシキモシン変異体が、もちろん、配列番号１の公知の野生型ウシキモシン配列と１００％一致したポリペプチド配列を持ってはいないことに関する。
【０１３２】
好ましい一実施態様は、変異が、位置１３４、１４１、１４３、２８０、２８１、２９８、３００、３０７、３０９、３１１、３５２、３５３のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置における置換、欠失、挿入のいずれかを含む単離されたウシキモシンポリペプチド変異体に関する。
【０１３３】
少なくとも１つの変異は置換であることが好ましかろう。即ち本明細書に関連する好ましい実施態様は、変異が、位置１１７、１３４、１４１、１４３、１５６、２４１、２７９、２８０、２８１、２９８、３００、３０７、３０９、３１１、３２５、３５０、３５２、３５３のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置に置換を含む単離されたキモシンポリペプチド変異体に関する。
【０１３４】
単離されたキモシンポリペプチド変異体では、変異が、位置１３４、１４１、１４３、２８０、２８１、２９８、３００、３０７、３０９、３１１、３５２、３５３のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置に置換を含むことが好ましい。
【０１３５】
置換は、１１７Ｎ、１３４Ｑ、１４１Ｅ、１４３Ｆ、１５６Ｖ、２４１Ｉ、２７９Ｍ、２８０Ｉ、２８１Ｖ、２９８Ｅ、３００Ｒ、３０７Ｄ、３０９Ｄ、３０９Ｗ、３１１Ｉ、３２５Ｍ、３５０Ｎ、３５２Ｌ、３５２Ｑ、３５３Ｌ、３５３Ｑのいずれかであることが好ましい。
【０１３６】
置換は、１３４Ｑ、１４１Ｅ、１４３Ｆ、２８０Ｉ、２８１Ｖ、２９８Ｅ、３００Ｒ、３０７Ｄ、３０９Ｄ、３０９Ｗ、３１１Ｉ、３５２Ｌ、３５２Ｑ、３５３Ｌ、３５３Ｑのいずれかであることが好ましい。
【０１３７】
置換は、Ｄ１１７Ｎ、Ｈ１３４Ｑ、Ｑ１４１Ｅ、Ｉ１４３Ｆ、Ｄ１５６Ｖ、Ｖ２４１Ｉ、Ｖ２７９Ｍ、Ｌ２８０Ｉ、Ｆ２８１Ｖ、Ｑ２９８Ｅ、Ｑ３００Ｒ、Ｎ３０７Ｄ、Ｇ３０９Ｄ、Ｇ３０９Ｗ、Ｌ３１１Ｉ、Ｄ３２５Ｍ、Ｈ３５０Ｎ、Ｑ３５２Ｌ、Ｅ３５２Ｌ、Ｅ３５２Ｑ、Ｋ３５３Ｌ、Ｋ３５３Ｑのいずれかであることが好ましい。
【０１３８】
好ましい一実施態様では、置換は、
Ｆ２８１Ｖ＋Ｖ３０６Ｉ＋Ｉ３２１Ｌ；
Ｈ１３４Ｑ＋Ｉ１５４Ｌ＋Ｄ２１６Ｓ；
Ｖ２６１Ａ＋Ｖ２６３Ｉ＋Ｇ３０９Ｗ＋Ｌ３１１Ｉ＋Ｙ３２６Ｆ；
Ｄ１５６Ｖ＋Ｇ３０９Ｄ＋Ｍ３１４Ｌ＋Ｖ３１７Ｉ；
Ｈ１３４Ｑ＋Ｌ２８０Ｉ＋Ｇ３０９Ｗ；
Ｒ１１９Ｑ＋Ｄ１５６Ｖ＋Ｖ３７５Ｌ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｒ１１９Ｓ＋Ｈ２０４Ｒ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｈ１３４Ｑ＋Ｙ３６５Ｆ＋Ｖ３７５Ｌ；
Ｙ１９４Ｉ＋Ｒ２１３Ｑ＋Ｇ３０９Ｄ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｄ１１７Ｎ＋Ｉ３２１Ｌ；
Ｙ１８５Ｆ＋Ｄ３２５Ｍ＋Ｅ３５２Ｑ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｌ２２４Ｖ＋Ｌ３１１Ｉ；
Ｓ１３２Ｆ＋Ｈ１３４Ｑ＋Ｍ２００Ｉ＋Ｍ２１５Ｌ＋Ｇ２２１Ｅ；
Ｆ２８１Ｖ＋Ｇ３０９Ｗ＋Ｓ３３１Ｙ＋Ｄ３３７Ｅ；
Ｄ１５６Ｖ＋Ｇ３０９Ｄ＋Ｍ３１４Ｌ＋Ｖ３１７Ｉ；
Ｇ１２８Ｄ＋Ｌ１８８Ｉ＋Ｙ３２６Ｆ；
Ｒ１１９Ｓ＋Ｖ２４１Ｉ＋Ｌ２８０Ｉ＋Ｌ３１１Ｉ＋Ｄ３２５Ｍ；
Ｒ１１９Ｑ＋Ｓ２８４Ｔ＋Ｔ２９７Ｓ＋Ｖ３０６Ｉ＋Ｇ３０９Ｗ；
Ｋ２７９Ｖ＋Ｖ２８１Ｆ；
Ｑ２９８Ｅ＋Ｑ３００Ｒ；
Ｈ３５０Ｎ＋Ｑ３５２Ｅ＋Ｋ３５３Ｌ；
Ｄ３０７Ｎ＋Ｄ３０９Ｇ；
Ｑ１４１Ｅ＋Ｉ１４３Ｆ
のいずれかである。
【０１３９】
ラクダキモシンの単離された変異体：
【０１４０】
上述のように、本明細書の実施例では、配列番号２のポリペプチド（ラクダキモシン）を親ポリペプチドとして用いて変異体を作った。このような変異体を本明細書ではラクダキモシン変異体と呼ぶことができよう。
【０１４１】
上述のように、第４の特徴は、単離されたキモシンポリペプチド変異体に関するものであり、この単離されたキモシンポリペプチド変異体は、
（ａ）キモシン活性を有する親ポリペプチド中の１又は２以上の位置に変異として、位置１１７、１３４、１４１、１４３、１５６、２４１、２７９、２８０、２８１、２９８、３００、３０７、３０９、３１１、３２５、３５０、３５２、３５３のいずれかの位置に対応するアミノ酸位置における置換又は欠失又は挿入を含む変異を持ち；
（ｂ）この変異体はキモシン活性を持ち；さらに、
（ｉ）親ポリペプチドのアミノ酸位置は、配列番号１のポリペプチド（ウシキモシン）と親ポリペプチドのアラインメントにより決定され、即ち、配列番号１のポリペプチドを使用して親ポリペプチド中の対応するアミノ酸配列が決定され；
（ｉｉ）親ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸位置５９からアミノ酸位置３８１までに対応する成熟ポリペプチド（ラクダキモシン）と配列同一性が少なくとも９０％であり；
（ｉｉｉ）この単離された変異ポリペプチドは、配列番号２の成熟ポリペプチド（ラクダキモシン）との配列同一性が１００％未満である。
【０１４２】
上記の定義と好ましい実施態様は、この特徴にも関係する。
【０１４３】
本明細書に記載の単離されたラクダキモシンポリペプチド変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドを含むラクダキモシンのＣ／Ｐ比よりも大きなＣ／Ｐ比を与えるキモシン活性を持つ変異体であることが好ましい。
【０１４４】
好ましい一実施態様では、親ポリペプチドは、配列番号２の成熟ポリペプチド（ラクダキモシン）との配列同一性が少なくとも９２％である。親ポリペプチドは、配列番号２の成熟ポリペプチド（ラクダキモシン）との配列同一性が少なくとも９５％であることがより好ましく、配列番号２の成熟ポリペプチド（ラクダキモシン）との配列同一性が少なくとも９７％であることがより一層好ましい。
【０１４５】
本発明の文脈では、当業者なら理解できるように、単離されたキモシン変異体は、上記以外のアミノ酸位置の変異（例えば置換）を含んでいてもよい。
【０１４６】
例えば、配列番号２の野生型ラクダキモシンポリペプチドと比べて例えば５〜１０個の変異（例えば置換）を有するラクダキモシン変異体は、相変わらず、配列番号２の成熟ポリペプチド（ラクダキモシン）との配列同一性が少なくとも９５％である親ポリペプチドであろう。
【０１４７】
単離されたラクダキモシン変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチド（ラクダキモシン）と比べて３０個未満のアミノ酸変異（例えば置換）を含んでいることが好ましかろう。あるいは単離されたラクダキモシン変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチド（ラクダキモシン）と比べて２０個未満のアミノ酸変異（例えば置換）を含んでいることが好ましかろう。あるいは単離されたラクダキモシン変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチド（ラクダキモシン）と比べて１０個未満のアミノ酸変異（例えば置換）を含んでいることが好ましかろう。あるいは単離されたラクダキモシン変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチド（ラクダキモシン）と比べて５個未満のアミノ酸変異（例えば置換）を含んでいることが好ましかろう。
【０１４８】
本発明の文脈では、当業者なら理解できるように、上記の項目（ｉｉｉ）の“単離されたポリペプチド変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチド（ラクダキモシン）との配列同一性が１００％未満である”という表現は、本明細書に記載の単離されたラクダキモシン変異体が、もちろん、公開されている配列番号２の野生型ラクダキモシン配列と１００％一致したポリペプチド配列を持ってはいないことと関係している。
【０１４９】
好ましい一実施態様は、変異が、位置１３４、１４１、１４３、２８０、２８１、２９８、３００、３０７、３０９、３１１、３５２、３５３のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置に置換、欠失、挿入のいずれかを含む単離されたラクダキモシンポリペプチド変異体に関する。
【０１５０】
少なくとも１つの変異は置換であることが好ましかろう。即ち本明細書に関連する好ましい実施態様は、変異が、位置１１７、１３４、１４１、１４３、１５６、２４１、２７９、２８０、２８１、２９８、３００、３０７、３０９、３１１、３２５、３５０、３５２、３５３のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置に置換を含む単離されたキモシンポリペプチド変異体に関する。
【０１５１】
単離されたキモシンポリペプチド変異体は、変異が、位置１３４、１４１、１４３、２８０、２８１、２９８、３００、３０７、３０９、３１１、３５２、３５３のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置に置換を含んでいることが好ましい。
【０１５２】
置換は、１１７Ｎ、１３４Ｑ、１４１Ｅ、１４３Ｆ、１５６Ｖ、２４１Ｉ、２７９Ｍ、２８０Ｉ、２８１Ｖ、２９８Ｅ、３００Ｒ、３０７Ｄ、３０９Ｄ、３０９Ｗ、３１１Ｉ、３２５Ｍ、３５０Ｎ、３５２Ｌ、３５２Ｑ、３５３Ｌ、３５３Ｑのいずれかであることが好ましい。
【０１５３】
置換は、１３４Ｑ、１４１Ｅ、１４３Ｆ、２８０Ｉ、２８１Ｖ、２９８Ｅ、３００Ｒ、３０７Ｄ、３０９Ｄ、３０９Ｗ、３１１Ｉ、３５２Ｌ、３５２Ｑ、３５３Ｌ、３５３Ｑのいずれかであることが好ましい。
【０１５４】
置換は、Ｄ１１７Ｎ、Ｈ１３４Ｑ、Ｑ１４１Ｅ、Ｉ１４３Ｆ、Ｄ１５６Ｖ、Ｖ２４１Ｉ、Ｖ２７９Ｍ、Ｌ２８０Ｉ、Ｆ２８１Ｖ、Ｑ２９８Ｅ、Ｑ３００Ｒ、Ｎ３０７Ｄ、Ｇ３０９Ｄ、Ｇ３０９Ｗ、Ｌ３１１Ｉ、Ｄ３２５Ｍ、Ｈ３５０Ｎ、Ｑ３５２Ｌ、Ｅ３５２Ｌ、Ｅ３５２Ｑ、Ｋ３５３Ｌ、Ｋ３５３Ｑのいずれかであることが好ましい。
【０１５５】
好ましい一実施態様では、置換は、
Ｆ２８１Ｖ＋Ｖ３０６Ｉ＋Ｉ３２１Ｌ；
Ｈ１３４Ｑ＋Ｉ１５４Ｌ＋Ｄ２１６Ｓ；
Ｖ２６１Ａ＋Ｖ２６３Ｉ＋Ｇ３０９Ｗ＋Ｌ３１１Ｉ＋Ｙ３２６Ｆ；
Ｄ１５６Ｖ＋Ｇ３０９Ｄ＋Ｍ３１４Ｌ＋Ｖ３１７Ｉ；
Ｈ１３４Ｑ＋Ｌ２８０Ｉ＋Ｇ３０９Ｗ；
Ｒ１１９Ｑ＋Ｄ１５６Ｖ＋Ｖ３７５Ｌ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｒ１１９Ｓ＋Ｈ２０４Ｒ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｈ１３４Ｑ＋Ｙ３６５Ｆ＋Ｖ３７５Ｌ；
Ｙ１９４Ｉ＋Ｒ２１３Ｑ＋Ｇ３０９Ｄ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｄ１１７Ｎ＋Ｉ３２１Ｌ；
Ｙ１８５Ｆ＋Ｄ３２５Ｍ＋Ｅ３５２Ｑ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｌ２２４Ｖ＋Ｌ３１１Ｉ；
Ｓ１３２Ｆ＋Ｈ１３４Ｑ＋Ｍ２００Ｉ＋Ｍ２１５Ｌ＋Ｇ２２１Ｅ；
Ｆ２８１Ｖ＋Ｇ３０９Ｗ＋Ｓ３３１Ｙ＋Ｄ３３７Ｅ；
Ｄ１５６Ｖ＋Ｇ３０９Ｄ＋Ｍ３１４Ｌ＋Ｖ３１７Ｉ；
Ｇ１２８Ｄ＋Ｌ１８８Ｉ＋Ｙ３２６Ｆ；
Ｒ１１９Ｓ＋Ｖ２４１Ｉ＋Ｌ２８０Ｉ＋Ｌ３１１Ｉ＋Ｄ３２５Ｍ；
Ｒ１１９Ｑ＋Ｓ２８４Ｔ＋Ｔ２９７Ｓ＋Ｖ３０６Ｉ＋Ｇ３０９Ｗ；
Ｋ２７９Ｖ＋Ｖ２８１Ｆ；
Ｑ２９８Ｅ＋Ｑ３００Ｒ；
Ｈ３５０Ｎ＋Ｑ３５２Ｅ＋Ｋ３５３Ｌ；
Ｄ３０７Ｎ＋Ｄ３０９Ｇ；
Ｑ１４１Ｅ＋Ｉ１４３Ｆ
のいずれかである。
【０１５６】
乳製品を生産する方法
【０１５７】
上述のように、本明細書に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、本分野では、例えば興味の対象となる乳製品（例えばチーズ製品）の生産に使用できる。
【０１５８】
上述のように、本発明の１つの特徴は、食品又は飼料製品を製造するため、本明細書に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体の有効量を食品又は飼料成分に添加した後、追加製造工程を実施してその食品又は飼料製品を得ることを含む方法に関する。
【０１５９】
食品又は飼料製品は乳製品であることが好ましく、この方法は、本明細書に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体の有効量を乳に添加した後、追加製造工程を実施してその乳製品を得ることを含んでいる。
【０１６０】
乳として、例えば豆乳、ヒツジの乳、ヤギの乳、バッファローの乳、ヤクの乳、ラマの乳、ラクダの乳、牛乳が可能である。
【０１６１】
乳製品として、例えば発酵乳製品、クワルク（ｑｕａｒｋ）又は、チーズが可能である。
【０１６２】
本願明細書中の側面／態様−項目の形式での提示
ここで記載する本発明の側面及び好ましい態様は、いわゆる項目の形式で提示／記載されてもよい。以下を参照されたい。
１．
単離キモシンポリペプチド変異体を生産する方法であって、以下の工程：
（ａ）キモシン活性を有する親ポリペプチド中の１又は２以上の位置に変異を形成する工程、ここで当該変異が、位置１１７、１３４、１４１、１４３、１５６、２４１、２７９、２８０、２８１、２９８、３００、３０７、３０９、３１１、３２５、３５０、３５２及び３５３のいずれかに対応するアミノ酸位置における、置換、欠失、又は挿入を含む；及び
（ｂ）工程（ａ）の変異ポリペプチドを生産及び単離することにより、単離キモシンポリペプチド変異体を取得する工程、ここで当該変異体はキモシン活性を有する；
を含み、そして、
（ｉ）前記親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号１のポリペプチド（ウシキモシン）と親ポリペプチドとのアラインメントにより決定され、即ち、配列番号１のポリペプチドが、親ポリペプチド中の対応するアミノ酸配列を決定するのに使用され；及び
（ｉｉ）当該親ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸位置５９〜アミノ酸位置３８１に対応する、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）と６５％以上の配列同一性を有する；
当該方法。
２．
当該単離キモシンポリペプチド変異体が：
−配列番号１の成熟ポリペプチドを含有するウシキモシンのＣ／Ｐ比と比較してより高いＣ／Ｐ比をもたらすキモシン活性；及び
−配列番号２の成熟ポリペプチドを含有するラクダキモシンのＣ／Ｐ比と比較してより高いＣ／Ｐ比をもたらすキモシン活性；
を有する、項目１に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
３．
前記変異が、位置１３４、１４１、１４３、２８０、２８１、２９８、３００、３０７、３０９、３１１、３５２及び３５３のいずれかに対応する１つ以上のアミノ酸位置における、置換、欠失、又は挿入を含む、項目１又は２に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
４．
前記変異が、位置１１７、１３４、１４１、１４３、１５６、２４１、２７９、２８０、２８１、２９８、３００、３０７、３０９、３１１、３２５、３５０、３５２及び３５３のいずれかに対応する１つ以上のアミノ酸位置における置換含む、項目１〜３のいずれか１項に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
５．
前記変異が、位置１３４、１４１、１４３、２８０、２８１、２９８、３００、３０７、３０９、３１１、３５２及び３５３のいずれかに対応する１つ以上のアミノ酸位置における置換含む、項目１〜４のいずれか１項に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
６．
前記置換が、１１７Ｎ、１３４Ｑ、１４１Ｅ、１４３Ｆ、１５６Ｖ、２４１Ｉ、２７９Ｍ、２８０Ｉ、２８１Ｖ、２９８Ｅ、３００Ｒ、３０７Ｄ、３０９Ｄ、３０９Ｗ、３１１Ｉ、３２５Ｍ、３５０Ｎ、３５２Ｌ、３５２Ｑ、３５３Ｌ又は３５３Ｑである、項目４に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
７．
前記置換が、１３４Ｑ、１４１Ｅ、１４３Ｆ、２８０Ｉ、２８１Ｖ、２９８Ｅ、３００Ｒ、３０７Ｄ、３０９Ｄ、３０９Ｗ、３１１Ｉ、３５２Ｌ、３５２Ｑ、３５３Ｌ又は３５３Ｑである、項目６に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
８．
前記置換が、Ｄ１１７Ｎ、Ｈ１３４Ｑ、Ｑ１４１Ｅ、Ｉ１４３Ｆ、Ｄ１５６Ｖ、Ｖ２４１Ｉ、Ｖ２７９Ｍ、Ｌ２８０Ｉ、Ｆ２８１Ｖ、Ｑ２９８Ｅ、Ｑ３００Ｒ、Ｎ３０７Ｄ、Ｇ３０９Ｄ、Ｇ３０９Ｗ、Ｌ３１１Ｉ、Ｄ３２５Ｍ、Ｈ３５０Ｎ、Ｑ３５２Ｌ、Ｅ３５２Ｌ、Ｅ３５２Ｑ、Ｋ３５３Ｌ又はＫ３５３Ｑである、項目４に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
９．
前記置換が、Ｈ１３４Ｑ、Ｑ１４１Ｅ、Ｉ１４３Ｆ、Ｌ２８０Ｉ、Ｆ２８１Ｖ、Ｑ２９８Ｅ、Ｑ３００Ｒ、Ｎ３０７Ｄ、Ｇ３０９Ｄ、Ｇ３０９Ｗ、Ｌ３１１Ｉ、Ｑ３５２Ｌ、Ｅ３５２Ｌ、Ｅ３５２Ｑ、Ｋ３５３Ｌ又はＫ３５３Ｑである、項目８に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
１０．
前記変異が１又は２以上のアミノ酸位置の置換を含み、当該置換が：
Ｆ２８１Ｖ＋Ｖ３０６Ｉ＋Ｉ３２１Ｌ；
Ｈ１３４Ｑ＋Ｉ１５４Ｌ＋Ｄ２１６Ｓ；
Ｖ２６１Ａ＋Ｖ２６３Ｉ＋Ｇ３０９Ｗ＋Ｌ３１１Ｉ＋Ｙ３２６Ｆ；
Ｄ１５６Ｖ＋Ｇ３０９Ｄ＋Ｍ３１４Ｌ＋Ｖ３１７Ｉ；
Ｈ１３４Ｑ＋Ｌ２８０Ｉ＋Ｇ３０９Ｗ；
Ｒ１１９Ｑ＋Ｄ１５６Ｖ＋Ｖ３７５Ｌ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｒ１１９Ｓ＋Ｈ２０４Ｒ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｈ１３４Ｑ＋Ｙ３６５Ｆ＋Ｖ３７５Ｌ；
Ｙ１９４Ｉ＋Ｒ２１３Ｑ＋Ｇ３０９Ｄ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｄ１１７Ｎ＋Ｉ３２１Ｌ；
Ｙ１８５Ｆ＋Ｄ３２５Ｍ＋Ｅ３５２Ｑ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｌ２２４Ｖ＋Ｌ３１１Ｉ；
Ｓ１３２Ｆ＋Ｈ１３４Ｑ＋Ｍ２００Ｉ＋Ｍ２１５Ｌ＋Ｇ２２１Ｅ；
Ｆ２８１Ｖ＋Ｇ３０９Ｗ＋Ｓ３３１Ｙ＋Ｄ３３７Ｅ；
Ｄ１５６Ｖ＋Ｇ３０９Ｄ＋Ｍ３１４Ｌ＋Ｖ３１７Ｉ；
Ｇ１２８Ｄ＋Ｌ１８８Ｉ＋Ｙ３２６Ｆ；
Ｒ１１９Ｓ＋Ｖ２４１Ｉ＋Ｌ２８０Ｉ＋Ｌ３１１Ｉ  ＋Ｄ３２５Ｍ；  
Ｒ１１９Ｑ＋Ｓ２８４Ｔ＋Ｔ２９７Ｓ＋Ｖ３０６Ｉ＋Ｇ３０９Ｗ  
Ｋ２７９Ｖ＋Ｖ２８１Ｆ；
Ｑ２９８Ｅ＋Ｑ３００Ｒ；
Ｈ３５０Ｎ＋Ｑ３５２Ｅ＋Ｋ３５３Ｌ；
Ｄ３０７Ｎ＋Ｄ３０９Ｇ；又は
Ｑ１４１Ｅ＋Ｉ１４３Ｆ
である、項目４に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
１１．
前記親ポリペプチドが、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）に対して７５％以上の配列同一性を有する、項目１〜１０のいずれか１項に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
１２．
配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）に対して９５％以上の配列同一性を有する、項目１１に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
１３．
前記親ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸位置５９〜アミノ酸位置３８１に対応する、配列番号２の成熟ポリペプチド（ラクダキモシン）に対して９５％以上の配列同一性を有する、項目１０に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
１４．
項目１〜１３のいずれか１項に記載の方法により生産された単離キモシンポリペプチド。
１５．
単離キモシンポリペプチド変異体であって：
（ａ）キモシン活性を有する親ポリペプチド中の１又は２以上の位置に変異を有し、当該変異が、位置１１７、１３４、１４１、１４３、１５６、２４１、２７９、２８０、２８１、２９８、３００、３０７、３０９、３１１、３２５、３５０、３５２及び３５３のいずれかの位置に対応するアミノ酸位置における、置換、欠失、又は挿入を含み；且つ
（ｂ）当該変異体がキモシン活性を有し；
ここで、
（ｉ）前記親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号１のポリペプチド（ウシキモシン）と親ポリペプチドとのアラインメントにより決定され、即ち、配列番号１のポリペプチドが、親ポリペプチド中の対応するアミノ酸配列を決定するのに使用され；及び
（ｉｉ）当該親ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸位置５９〜アミノ酸位置３８１に対応する、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）と９０％以上の配列同一性を有し；及び
（ｉｉｉ）：当該単離変異ポリペプチドが、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）に対して１００％未満の配列同一性を有する；
当該単離キモシンポリペプチド変異体。
１６．
配列番号１の成熟ポリペプチドを含有するウシキモシンのＣ／Ｐ比と比較してより高いＣ／Ｐ比をもたらすキモシン活性を有する、項目１５に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
１７．
前記親ポリペプチドが、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）に対して９７％以上の配列同一性を有する、項目１５又は１６に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
１８．
前記単離されたウシキモシン変異体が、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）に対して、１０個未満のアミノ酸変異（例えば置換）を含む、項目１５〜１７のいずれか１項に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
１９．
前記変異が、位置１３４、１４１、１４３、２８０、２８１、２９８、３００、３０７、３０９、３１１、３５２及び３５３のいずれかに対応する１つ以上のアミノ酸位置における、置換、欠失又は挿入を含む、項目１５〜１８のいずれか１項に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
２０．
前記変異が、位置１１７、１３４、１４１、１４３、１５６、２４１、２７９、２８０、２８１、２９８、３００、３０７、３０９、３１１、３２５、３５０、３５２及び３５３のいずれかに対応する１つ以上のアミノ酸位置における置換を含む、項目１５〜１９のいずれか１項に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
２１．
前記変異が、位置１３４、１４１、１４３、２８０、２８１、２９８、３００、３０７、３０９、３１１、３５２及び３５３のいずれかに対応する１つ以上のアミノ酸位置における置換を含む、項目２０に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
２２．
前記置換が、１１７Ｎ、１３４Ｑ、１４１Ｅ、１４３Ｆ、１５６Ｖ、２４１Ｉ、２７９Ｍ、２８０Ｉ、２８１Ｖ、２９８Ｅ、３００Ｒ、３０７Ｄ、３０９Ｄ、３０９Ｗ、３１１Ｉ、３２５Ｍ、３５０Ｎ、３５２Ｌ、３５２Ｑ、３５３Ｌ又は３５３Ｑである、項目２０に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
２３．
前記置換が、１３４Ｑ、１４１Ｅ、１４３Ｆ、２８０Ｉ、２８１Ｖ、２９８Ｅ、３００Ｒ、３０７Ｄ、３０９Ｄ、３０９Ｗ、３１１Ｉ、３５２Ｌ、３５２Ｑ、３５３Ｌ又は３５３Ｑである、項目２２に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
２４．
前記置換が、Ｄ１１７Ｎ、Ｈ１３４Ｑ、Ｑ１４１Ｅ、Ｉ１４３Ｆ、Ｄ１５６Ｖ、Ｖ２４１Ｉ、Ｖ２７９Ｍ、Ｌ２８０Ｉ、Ｆ２８１Ｖ、Ｑ２９８Ｅ、Ｑ３００Ｒ、Ｎ３０７Ｄ、Ｇ３０９Ｄ、Ｇ３０９Ｗ、Ｌ３１１Ｉ、Ｄ３２５Ｍ、Ｈ３５０Ｎ、Ｑ３５２Ｌ、Ｅ３５２Ｌ、Ｅ３５２Ｑ、Ｋ３５３Ｌ又はＫ３５３Ｑである、項目２２に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
２５．
前記変異が、１又は２以上のアミノ酸位置における置換を含み、当該置換が：
Ｆ２８１Ｖ＋Ｖ３０６Ｉ＋Ｉ３２１Ｌ；
Ｈ１３４Ｑ＋Ｉ１５４Ｌ＋Ｄ２１６Ｓ；
Ｖ２６１Ａ＋Ｖ２６３Ｉ＋Ｇ３０９Ｗ＋Ｌ３１１Ｉ＋Ｙ３２６Ｆ；
Ｄ１５６Ｖ＋Ｇ３０９Ｄ＋Ｍ３１４Ｌ＋Ｖ３１７Ｉ；
Ｈ１３４Ｑ＋Ｌ２８０Ｉ＋Ｇ３０９Ｗ；
Ｒ１１９Ｑ＋Ｄ１５６Ｖ＋Ｖ３７５Ｌ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｒ１１９Ｓ＋Ｈ２０４Ｒ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｈ１３４Ｑ＋Ｙ３６５Ｆ＋Ｖ３７５Ｌ；
Ｙ１９４Ｉ＋Ｒ２１３Ｑ＋Ｇ３０９Ｄ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｄ１１７Ｎ＋Ｉ３２１Ｌ；
Ｙ１８５Ｆ＋Ｄ３２５Ｍ＋Ｅ３５２Ｑ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｌ２２４Ｖ＋Ｌ３１１Ｉ；
Ｓ１３２Ｆ＋Ｈ１３４Ｑ＋Ｍ２００Ｉ＋Ｍ２１５Ｌ＋Ｇ２２１Ｅ；
Ｆ２８１Ｖ＋Ｇ３０９Ｗ＋Ｓ３３１Ｙ＋Ｄ３３７Ｅ；
Ｄ１５６Ｖ＋Ｇ３０９Ｄ＋Ｍ３１４Ｌ＋Ｖ３１７Ｉ；
Ｇ１２８Ｄ＋Ｌ１８８Ｉ＋Ｙ３２６Ｆ；
Ｒ１１９Ｓ＋Ｖ２４１Ｉ＋Ｌ２８０Ｉ＋Ｌ３１１Ｉ  ＋Ｄ３２５Ｍ；  
Ｒ１１９Ｑ＋Ｓ２８４Ｔ＋Ｔ２９７Ｓ＋Ｖ３０６Ｉ＋Ｇ３０９Ｗ  
Ｋ２７９Ｖ＋Ｖ２８１Ｆ；
Ｑ２９８Ｅ＋Ｑ３００Ｒ；
Ｈ３５０Ｎ＋Ｑ３５２Ｅ＋Ｋ３５３Ｌ；
Ｄ３０７Ｎ＋Ｄ３０９Ｇ；又は
Ｑ１４１Ｅ＋Ｉ１４３Ｆ
である、項目２０に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
２６．
単離キモシンポリペプチド変異体であって、
（ａ）キモシン活性を有する親ポリペプチド中の１又は２以上の位置における変異を有し、ここで当該変異が、位置１１７、１３４、１４１、１４３、１５６、２４１、２７９、２８０、２８１、２９８、３００、３０７、３０９、３１１、３２５、３５０、３５２及び３５３のいずれかの位置に対応するアミノ酸位置における、置換、欠失、又は挿入を含み；且つ
（ｂ）当該変異体がキモシン活性を有し；
そして、
（ｉ）前記親ポリペプチドのアミノ酸配列位置が、配列番号１のポリペプチド（ウシキモシン）と親ポリペプチドとのアラインメントにより決定され、即ち、配列番号１のポリペプチドが、親ポリペプチド中の対応するアミノ酸配列を決定するのに使用され；及び
（ｉｉ）当該親ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸位置５９〜アミノ酸位置３８１に対応する、配列番号２の成熟ポリペプチド（ラクダキモシン）と９０％以上の配列同一性を有し；及び
（ｉｉｉ）：当該単離変異ポリペプチドが、配列番号２の成熟ポリペプチド（ラクダキモシン）に対して１００％未満の配列同一性を有する；
当該単離キモシンポリペプチド変異体。
２７．
配列番号２の成熟ポリペプチドを含有するラクダキモシンのＣ／Ｐ比と比較してより高いＣ／Ｐ比をもたらすキモシン活性を有する、項目２６に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
２８．
前記親ポリペプチドが、配列番号２の成熟ポリペプチド（ラクダキモシン）と９７％以上の配列同一性を有する、項目２６又は２７に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
２９．
配列番号２の成熟ポリペプチド（ラクダキモシン）と比較して１０アミノ酸未満の変異（例えば置換）を有する、項目２６〜２８のいずれか１項に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
３０．
前記変異が、位置１３４、１４１、１４３、２８０、２８１、２９８、３００、３０７、３０９、３１１、３５２及び３５３のいずれかに対応する１つ以上のアミノ酸位置における、置換、欠失又は挿入を含む、項目２６〜２９のいずれか１項に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
３１．
前記変異が、位置１１７、１３４、１４１、１４３、１５６、２４１、２７９、２８０、２８１、２９８、３００、３０７、３０９、３１１、３２５、３５０、３５２及び３５３のいずれかに対応する１つ以上のアミノ酸位置における置換を含む、項目２６〜３０のいずれか１項に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
３２．
前記変異が、位置１３４、１４１、１４３、２８０、２８１、２９８、３００、３０７、３０９、３１１、３５２及び３５３のいずれかに対応する１つ以上のアミノ酸位置における置換を含む、項目３１に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
３３．
前記置換が、１１７Ｎ、１３４Ｑ、１４１Ｅ、１４３Ｆ、１５６Ｖ、２４１Ｉ、２７９Ｍ、２８０Ｉ、２８１Ｖ、２９８Ｅ、３００Ｒ、３０７Ｄ、３０９Ｄ、３０９Ｗ、３１１Ｉ、３２５Ｍ、３５０Ｎ、３５２Ｌ、３５２Ｑ、３５３Ｌ又は３５３Ｑである、項目３１に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
３４．
前記置換が、１３４Ｑ、１４１Ｅ、１４３Ｆ、２８０Ｉ、２８１Ｖ、２９８Ｅ、３００Ｒ、３０７Ｄ、３０９Ｄ、３０９Ｗ、３１１Ｉ、３５２Ｌ、３５２Ｑ、３５３Ｌ又は３５３Ｑである、項目３３に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
３５．
前記置換が、Ｄ１１７Ｎ、Ｈ１３４Ｑ、Ｑ１４１Ｅ、Ｉ１４３Ｆ、Ｄ１５６Ｖ、Ｖ２４１Ｉ、Ｖ２７９Ｍ、Ｌ２８０Ｉ、Ｆ２８１Ｖ、Ｑ２９８Ｅ、Ｑ３００Ｒ、Ｎ３０７Ｄ、Ｇ３０９Ｄ、Ｇ３０９Ｗ、Ｌ３１１Ｉ、Ｄ３２５Ｍ、Ｈ３５０Ｎ、Ｑ３５２Ｌ、Ｅ３５２Ｌ、Ｅ３５２Ｑ、Ｋ３５３Ｌ又はＫ３５３Ｑである、項目３３に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
３６．
前記置換が：
Ｆ２８１Ｖ＋Ｖ３０６Ｉ＋Ｉ３２１Ｌ；
Ｈ１３４Ｑ＋Ｉ１５４Ｌ＋Ｄ２１６Ｓ；
Ｖ２６１Ａ＋Ｖ２６３Ｉ＋Ｇ３０９Ｗ＋Ｌ３１１Ｉ＋Ｙ３２６Ｆ；
Ｄ１５６Ｖ＋Ｇ３０９Ｄ＋Ｍ３１４Ｌ＋Ｖ３１７Ｉ；
Ｈ１３４Ｑ＋Ｌ２８０Ｉ＋Ｇ３０９Ｗ；
Ｒ１１９Ｑ＋Ｄ１５６Ｖ＋Ｖ３７５Ｌ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｒ１１９Ｓ＋Ｈ２０４Ｒ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｈ１３４Ｑ＋Ｙ３６５Ｆ＋Ｖ３７５Ｌ；
Ｙ１９４Ｉ＋Ｒ２１３Ｑ＋Ｇ３０９Ｄ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｄ１１７Ｎ＋Ｉ３２１Ｌ；
Ｙ１８５Ｆ＋Ｄ３２５Ｍ＋Ｅ３５２Ｑ；
Ｙ７９Ｓ＋Ｌ２２４Ｖ＋Ｌ３１１Ｉ；
Ｓ１３２Ｆ＋Ｈ１３４Ｑ＋Ｍ２００Ｉ＋Ｍ２１５Ｌ＋Ｇ２２１Ｅ；
Ｆ２８１Ｖ＋Ｇ３０９Ｗ＋Ｓ３３１Ｙ＋Ｄ３３７Ｅ；
Ｄ１５６Ｖ＋Ｇ３０９Ｄ＋Ｍ３１４Ｌ＋Ｖ３１７Ｉ；
Ｇ１２８Ｄ＋Ｌ１８８Ｉ＋Ｙ３２６Ｆ；
Ｒ１１９Ｓ＋Ｖ２４１Ｉ＋Ｌ２８０Ｉ＋Ｌ３１１Ｉ＋Ｄ３２５Ｍ；
Ｒ１１９Ｑ＋Ｓ２８４Ｔ＋Ｔ２９７Ｓ＋Ｖ３０６Ｉ＋Ｇ３０９Ｗ
Ｋ２７９Ｖ＋Ｖ２８１Ｆ；
Ｑ２９８Ｅ＋Ｑ３００Ｒ；
Ｈ３５０Ｎ＋Ｑ３５２Ｅ＋Ｋ３５３Ｌ；
Ｄ３０７Ｎ＋Ｄ３０９Ｇ；又は
Ｑ１４１Ｅ＋Ｉ１４３Ｆ
である、項目３１に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
３７．
食品又は飼料製品を生産する方法であって、
項目１４〜３６のいずれか１項に記載の有効量の単離キモシンポリペプチド変異体を食品又は試料成分に添加すること、及び、食品又は飼料製品を取得するための更なる生産工程を実施することを含む、当該方法。
３８．
前記製品が乳製品（ｍｉｌｋ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ）であり、前記方法が、乳に項目１４〜３６のいずれか１項に記載の有効量の単離キモシンポリペプチド変異体を添加すること、及び、当該乳製品を取得するための更なる生産工程を実施することを含む、項目３７に記載の食品又は飼料製品を生産する方法。
３９．
前記乳が、豆乳、又は羊、山羊、バッファロー、ヤク、リャマ、ラクダ又は牛の乳である、項目３８に記載の食品又は飼料製品を生産する方法。
４０．
前記乳製品が、発酵乳製品、クワルク（ｑｕａｒｋ）又はチーズである、項目３８又は３９に記載の食品又は飼料製品を生産する方法。
【実施例１】
【０１６３】
キモシンタンパク質配列と変異体配列のアラインメントと位置番号決定
【０１６４】
ＥＢＩ（ＥＢＩ、ツールズ、多重配列アラインメント、ＣＬＵＳＴＡＬＷ”、
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｓｔｌｗ２／）が提供していてＬａｒｋｉｎ  Ｍ．Ａ．、Ｂｌａｃｋｓｈｉｅｌｄｓ  Ｇ．、Ｂｒｏｗｎ  Ｎ．Ｐ．、Ｃｈｅｎｎａ  Ｒ．、ＭｃＧｅｔｔｉｇａｎ  Ｐ．Ａ．、ＭｃＷｉｌｌｉａｍ  Ｈ．、Ｖａｌｅｎｔｉｎ  Ｆ．、Ｗａｌｌａｃｅ  Ｉ．Ｍ．、Ｗｉｌｍ  Ａ．、Ｌｏｐｅｚ  Ｒ．、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊ．Ｄ．、Ｇｉｂｓｏｎ  Ｔ．Ｊ．、Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｄ．Ｇ．（２００７年）、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、第２３巻（２１）、２９４７〜２９４８ページに記載されているＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを用いてキモシンタンパク質配列をアラインメントした。
【０１６５】
多重配列アラインメントのためのＣｌｕｓｔａｌＷ２の設定は、タンパク質重み付けマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ、ギャップ・オープン＝１０、延長＝０．０５、ギャップ距離＝８、末端のギャップなし、繰り返し＝なし、ＮＵＭＩＴＥＲ＝１、クラスタ化＝ＮＪであった。
【０１６６】
参照配列として、ウシキモシンＢプレプロキモシンを用いた（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｐ００７９４、本明細書では配列番号１として開示）。ただしＮ末端のメチオニンが番号１であり（ＭＲＣＶ…）、Ｃ末端のイソロイシンが番号３８１である（タンパク質配列中の…ＬＡＫＡＩ）。変異体をウシＢプレプロキモシンに対してアラインメントし、対応するウシキモシン残基に合わせて残基の位置番号を決定した。
【実施例２】
【０１６７】
キモシン変異体の設計
【０１６８】
さまざまな戦略を利用してキモシン変異体を設計した。
【０１６９】
ラクダキモシンに言及するときには、本明細書に記載した配列番号２のポリペプチドを含むラクダキモシンを参照する。
【０１７０】
配列番号２のラクダキモシンは、ラクダキモシン変異体を作るのに用いるキモシン活性を有する本明細書に関連する親ポリペプチドと見なすことができる。
【０１７１】
ウシキモシンに言及するときには、本明細書に記載した配列番号１のポリペプチドを含むウシキモシンを参照する。
【０１７２】
配列番号１のウシキモシンは、ラクダキモシン変異体を作るのに用いるキモシン活性を有する本明細書に関連する親ポリペプチドと見なすことができる。
【０１７３】
ウシキモシンＢとの配列同一性が２５％以上である公知のアスパラギン酸プロテアーゼ配列の大きな集合のアラインメントに基づいてラクダキモシンの変異体を設計した。
【０１７４】
変異は一般に超可変領域に導入されたが、保存された領域は変化しなかった。各変異体コンストラクトに多数の変異を導入し、単一の変異のそれぞれが多数の変異体コンストラクトの中に確実に存在するようにした（結果の考察に関しては以下の実施例６参照）。
【０１７５】
ウシキモシンとラクダキモシンの比較に基づいてウシキモシンの変異体を設計した。ウシの残基を例えばラクダの対応する残基に変更した（結果の考察に関しては以下の実施例７参照）。
【実施例３】
【０１７６】
キモシン変異体酵素材料の調製
【０１７７】
あらゆるキモシン変異体を合成遺伝子として合成し、（ＷＯ  ０２／３６７５２Ａ２に記載されている）ｐＧＡＭｐＲ−Ｃに実質的に対応する真菌発現ベクターに挿入した。
【０１７８】
当業者に知られている分子生物学の標準的なプロトコルを利用してこれらのベクターを入れて大腸菌を形質転換し、プラスミドＤＮＡを精製した。
【０１７９】
変異体のプラスミドを個別に入れてアスペルギルス・ニガー株を形質転換し、実質的にＷＯ  ０２／３６７５２Ａ２に記載されているようにしてタンパク質を産生させ、標準的なクロマトグラフィ技術を利用して精製した。
【０１８０】
本分野で知られているように、当業者であれば、自らの一般的な知識に基づいてキモシンとキモシン変異体（例えば本明細書に記載したウシキモシン変異体とラクダキモシン変異体）を産生させて精製することができよう。
【実施例４】
【０１８１】
比キモシン活性の測定
【０１８２】
４．１  凝固活性の測定
【０１８３】
国際酪農連盟が開発した標準的な方法（ＩＤＦ法）であるＲＥＭＣＡＴ法を利用して凝乳活性を測定した。
【０１８４】
凝乳活性は、低温加熱低脂肪乳粉末から調製した基準乳基質が０．５ｇ／リットルの塩化カルシウム溶液（ｐＨ約６．５）によって凝固するのが目に見えるようになるまでに必要な時間から求めた。レンネット・サンプルの凝固時間を、凝乳活性がわかっていてＩＤＦ標準１１０Ｂによる酵素組成がサンプルと同じである参照基準の凝固時間と比較する。サンプルと参照基準を同じ化学的条件及び物理的条件のもとで測定した。変異体サンプルは、８４ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ  ５．５）を用いて約３  ＩＭＣＵ／ｍｌに調節した。その後、３２℃±１℃の一定温度に維持することのできる水浴に入れたガラス製試験管の中で、一定の撹拌のもと、２００μｌの酵素をあらかじめ加熱した１０ｍｌの乳（３２℃）に添加した。
【０１８５】
レンネットの全凝乳活性（強度）は、サンプルと同じ酵素組成を持つ基準に対し、国際凝乳単位（ＩＭＣＵ）／ｍｌを単位として、以下の式に従って計算した：
強度（単位はＩＭＣＵ／ｍｌ）＝Ｓ基準×Ｔ基準×Ｄサンプル／Ｄ基準×Ｔサンプル
Ｓ基準：レンネットに関する国際基準の凝乳活性
Ｔ基準：基準希釈液で得られた凝固時間（単位は秒）
Ｄサンプル：サンプルの希釈因子
Ｄ基準：基準の希釈因子
Ｔサンプル：希釈したレンネット・サンプルに関し、酵素の添加から凝集までに要した凝固時間（単位は秒）。
【０１８６】
４．２  全タンパク質含量の測定
【０１８７】
Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社からのＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイ・キットを利用し、指示書に従って全タンパク質含量を測定した。
【０１８８】
４．３  比凝固活性の計算
【０１８９】
凝固活性（ＩＭＣＵ／ｍｌ）を全タンパク質含量（１ｍｌ当たりの全タンパク質（ｍｇ））で割ることによって比凝固活性（ＩＭＣＵ／全タンパク質（ｍｇ））を求めた。
【実施例５】
【０１９０】
タンパク質分解活性の測定
【０１９１】
蛍光標識したＢｏｄｉｐｙ−ＦＬカゼイン（ＥｎｚＣｈｅｋ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｐｒｏｂｅｓ、Ｅ６６３８）を基質として用いて全タンパク質分解活性を測定した。カゼイン誘導体にｐＨ非感受性緑色蛍光Ｂｏｄｉｐｙ−ＦＬを大量に標識すると、この共役体の蛍光がほぼ完全に消える。プロテアーゼを触媒とした加水分解によって蛍光Ｂｏｄｉｐｙ−ＦＬが放出される。この方法は非常に感度がよく、この実験に不可欠であった。なぜならＣＨＹＭＡＸ  Ｍは、これまでに知られているあらゆる凝固剤のうちで全タンパク質分解活性が最も小さいからである。
【０１９２】
このアッセイは、望むｐＨに調節した０．２Ｍのリン酸緩衝液の中で、基質の最終濃度を０．０４ｍｇ／ｍｌにして実施した。基質と酵素をリン酸緩衝液の中で調製し、１部の基質を１部の酵素と混合する前に、（実施例４に従って）あらゆる酵素変異体を５０  ＩＭＣＵ／ｍｌに規格化した。９６ウエルのＮｕｎｃ  Ｆｌｕｏｒｏ微量滴定プレートの中で基質と酵素を混合し、密封し、３２℃で６０分間インキュベートした。インキュベーションの後、封を除去し、蛍光を蛍光計で記録した。
【実施例６】
【０１９３】
ラクダキモシン変異体の評価
【０１９４】
実施例４に従い、すべての変異体についてｐＨ  ６．５での比凝固活性（ＩＭＣＵ／全タンパク質（ｍｇ））を求めた。以下の戦略を利用して変異体をランク付けした。比活性が最も低い変異体には１点を与え、２番目に低いものには２点を与え、というようにする。
【０１９５】
同じランキング戦略をＣ／Ｐ比にも適用した。比凝固活性（ＩＭＣＵ／ｍｇ）をタンパク質分解活性で割ることにより、すべての変異体についてｐＨ  ６．５でのＣ／Ｐ比を求めた。
【０１９６】
両方のランキング戦略を利用して各変異体の合計点を求め、その合計点に基づいて最終ランキングを作成した。
【０１９７】
基準として、ラクダ野生型遺伝子とウシ野生型遺伝子を含めた。
【０１９８】
【表２】
2020058367.tif 000004
“×”は変化がないこと、即ち突然変異がないことを示す。
【０１９９】
すべての変異体が多数の突然変異を含んでいたため、ランク付けした変異体のデータを統計的方法と３Ｄ構造分析を利用してより詳しく調べ、プラスの効果又はマイナスの効果を持つ個々のアミノ酸の変化を明らかにした。この調査では、以下の実施例７で議論するウシ変異体も評価した／含めた。
【０２００】
以下の突然変異が同定された。
【０２０１】
【表３】
2020058367.tif 000005
“＋”は、プラスのアミノ酸置換を意味する。即ち“＋＋”は“＋”よりもプラスが大きい。
“−”は、マイナスのアミノ酸置換を意味する。即ち“−−”は“−”よりもマイナスが大きい。
この表の右欄の説明は、個々の突然変異がウシキモシンの３Ｄ構造のどこに位置するかに関係している。ウシキモシンの３Ｄ構造は公開されている。一例として、図２に、アミノ酸位置２９６と２９４がウシキモシンのどこに存在しているかを示す。
【０２０２】
結論：
【０２０３】
上記の結果から、ラクダキモシンに存在する以下の突然変異がプラスであること（即ちラクダ野生型キモシンと比べてＣ／Ｐ比が改善されていること）がわかった。
Ｄ１１７Ｎ
Ｈ１３４Ｑ
Ｌ２８０Ｉ
Ｄ１５６Ｖ
Ｖ２４１Ｉ
Ｄ３２５Ｍ
Ｌ３１１Ｉ
Ｇ３０９Ｗ
Ｇ３０９Ｄ
Ｖ２７９Ｍ
【実施例７】
【０２０４】
ウシキモシン変異体の評価
【０２０５】
ｐＨ  ６．５だけでのＣ／Ｐ比に基づいてウシキモシン変異体を評価した。
【０２０６】
【表４】
2020058367.tif 000006
【０２０７】
すべての変異体が多数の突然変異を含んでいたため、ランク付けした変異体のデータを統計的方法と３Ｄ構造分析を利用してより詳しく調べ、プラスの効果又はマイナスの効果を持つ個々のアミノ酸の変化を明らかにした。この調査では、実施例６で議論したラクダ変異体も評価した／含めた。
【０２０８】
ウシキモシンでは、以下の突然変異がプラスであることが判明した。
【０２０９】
【表５】
2020058367.tif 000007
“＋”は、プラスのアミノ酸置換を意味する。即ち“＋＋”は“＋”よりもプラスが大きい。
“−”は、マイナスのアミノ酸置換を意味する。即ち“−−”は“−”よりもマイナスが大きい。
【０２１０】
結論：
【０２１１】
上記の結果から、ウシキモシンに存在する以下の突然変異がプラスであること（即ちウシ野生型キモシンと比べてＣ／Ｐ比が改善されていること）がわかった。
Ｑ３００Ｒ
Ｈ３５０Ｎ
Ｋ３５３Ｌ
Ｑ１４１Ｅ
Ｉ１４３Ｆ
【実施例８】
【０２１２】
キモシンの中でプラスの突然変異になる位置
【０２１３】
実施例６と７に記載した結果を比較することにより、以下のデータが得られる。
【０２１４】
触媒となるクレフト領域２７９〜２８１
【０２１５】
実施例７に示されているように、ウシキモシンに２つの突然変異Ｋ２７９ＶとＶ２８１Ｆが存在する結果としてＣ／Ｐ比にマイナスの影響があった。ラクダキモシンでは、突然変異Ｖ２７９Ｋの結果としてやはりマイナスの結果になった（実施例６）。したがって位置２８１の最適なアミノ酸はＶであることが結論される。また、ラクダの突然変異Ｌ２８０Ｉはプラスの効果を持つことも観察された。
【０２１６】
小さなローブ領域２９８〜３００
【０２１７】
実施例７に示されているように、ウシキモシンに２つの突然変異Ｑ２９８ＥとＱ３００Ｒが存在する結果としてＣ／Ｐ比にプラスの影響があった。
【０２１８】
触媒となるクレフト領域３５０〜３５３
【０２１９】
実施例７に示されているように、ウシキモシンに３つの突然変異Ｈ３５０Ｎ、Ｑ３５２Ｅ、Ｋ３５３Ｌが存在する結果としてＣ／Ｐ比にプラスの影響があった。
【０２２０】
ラクダキモシンでは、Ｌ３５３Ｑがプラスの効果を有するのに対し、Ｌ３５３Ｋはマイナスの効果を有することが観察された（実施例６）。
【０２２１】
小さなローブ領域３０７〜３１１
【０２２２】
実施例７に示されているように、ウシキモシンに２つの突然変異Ｄ３０７ＮとＤ３０９Ｇが存在する結果としてＣ／Ｐ比にマイナスの影響があった。
【０２２３】
ラクダキモシンでは、Ｇ３０９ＤとＧ３０９Ｗがプラスの効果を有する。これは、ウシキモシンの突然変異Ｄ３０７Ｎがマイナスの効果の原因であることを意味する。ラクダキモシンでは、突然変異Ｌ３１１Ｉが有利な効果を持つことがわかった。
【０２２４】
骨格領域１３４〜１４３
【０２２５】
実施例７に示されているように、ウシキモシンに２つの突然変異Ｑ１４１ＥとＩ１４３Ｆが存在している結果としてＣ／Ｐ比にプラスの影響があった。
【０２２６】
ラクダキモシンでＨ１３４がＱに変化すると有利な効果がもたらされることがわかった。
【０２２７】
【表６】
2020058367.tif 000008
【図１】
2020058367.tif 000009
【図２】
2020058367.tif 000010
【配列表】
2020058367000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月7日(2020.1.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離キモシンポリペプチド変異体を生産する方法であって、以下の工程：
（ａ）キモシン活性を有する親ポリペプチド中の１又は２以上の位置に変異を形成する工程、ここで当該変異が位置３１１に対応する１つ以上のアミノ酸位置における置換を含む；及び
（ｂ）工程（ａ）の変異ポリペプチドを生産及び単離することにより、単離キモシンポリペプチド変異体を取得する工程、ここで当該変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドを含有するラクダキモシンのＣ／Ｐ比と比較してより高いＣ／Ｐ比をもたらすキモシン活性を有する；
を含み、そして、
（ｉ）前記親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号１のポリペプチド（ウシキモシン）と親ポリペプチドとのアラインメントにより決定され、即ち、配列番号１のポリペプチドが、親ポリペプチド中の対応するアミノ酸配列を決定するのに使用され；及び
（ｉｉ）当該親ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸位置５９〜アミノ酸位置３８１に対応する、配列番号２の成熟ポリペプチド（ラクダキモシン）と９０％以上の配列同一性を有する；
当該方法。
【請求項２】
前記変異が位置３１１に対応する１つ以上のアミノ酸位置における置換である、請求項１に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
【請求項３】
前記置換が３１１Ｉである、請求項２に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
【請求項４】
前記置換がＬ３１１Ｉである、請求項２に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
【請求項５】
単離キモシンポリペプチド変異体であって：
（ａ）キモシン活性を有する親ポリペプチド中の１又は２以上の位置に変異を有し、当該変異が、位置３１１に対応する１つ以上のアミノ酸位置における置換を含み；且つ
（ｂ）当該変異体が、配列番号２の成熟ポリペプチドを含有するラクダキモシンのＣ／Ｐ比と比較してより高いＣ／Ｐ比をもたらすキモシン活性を有し；
そして、
（ｉ）前記親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号１のポリペプチド（ウシキモシン）と親ポリペプチドとのアラインメントにより決定され、即ち、配列番号１のポリペプチドが、親ポリペプチド中の対応するアミノ酸配列を決定するのに使用され；及び
（ｉｉ）当該親ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸位置５９〜アミノ酸位置３８１に対応する、配列番号２の成熟ポリペプチド（ラクダキモシン）と９０％以上の配列同一性を有し；及び
（ｉｉｉ）：当該単離変異ポリペプチドが、配列番号２の成熟ポリペプチド（ラクダキモシン）に対して１００％未満の配列同一性を有する、当該単離キモシンポリペプチド変異体。
【請求項６】
配列番号２の成熟ポリペプチド（ラクダキモシン）に対して１０個未満のアミノ酸変異（例えば置換）を有する、請求項５に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
【請求項７】
前記変異が位置３１１に対応する１つ以上のアミノ酸位置における置換である、請求項５又は６のいずれかに記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
【請求項８】
前記置換が３１１Ｉである、請求項７に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
【請求項９】
前記置換がＬ３１１Ｉである、請求項８に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
【請求項１０】
食品又は飼料製品を生産する方法であって、
請求項５〜９のいずれか１項に記載の有効量の単離キモシンポリペプチド変異体を食品又は試料成分に添加すること、及び、食品又は飼料製品を取得するための更なる生産工程を実施することを含む、当該方法。
【外国語明細書】
2020058367000001.pdf