(57)【要約】      （修正有）【課題】微生物細胞から高品質多価不飽和含有油を入手するための方法であって、揮発性有機溶媒を使用しない、容易に入手できる装置を使用して実施できる方法の提供。【解決手段】藻類、酵母、真菌、原生生物または細菌等、微生物油を含む細胞を溶解する工程、酸を添加し解乳化する工程、油を分離する工程、および油を回収する工程を含む方法により、一定量のアラキドン酸および/またはドコサヘキサエン酸を含有し、特定のアニシジン値、ぺルオキシド値および／またはリン含有値である油を製造する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
[0001]本出願は、２０１３年１２月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／９１８，９２２号明細書の出願日の利益を主張するものであり、上記特許出願の開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［発明の背景］
[0002]本明細書では、１つ以上の微生物細胞から１種以上の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含む微生物油を入手するための方法であって、溶解細胞組成物を形成するために細胞を溶解し、およびその後に溶解細胞組成物から油を回収することによる方法が開示される。さらに本明細書では、本明細書に記載した少なくとも１つの方法によって微生物細胞から回収される１種以上のＰＵＦＡを含む微生物油が開示される。
【０００３】
[0003]１種以上のＰＵＦＡを含有する微生物油は、例えば、藻類および真菌などの微生物によって生成される。
【０００４】
[0004]微生物細胞からＰＵＦＡ含有油を入手するための典型的な方法は、微生物細胞バイオマスを生成するために発酵槽、ポンドまたはバイオリアクター内で所望の油を生成できる微生物を増殖させる工程；その中でバイオマスが増殖させられた発酵培地からバイオマスを分離する工程；乾燥細胞から油を抽出するために水非混和性有機溶媒（例えば、ヘキサン）を使用して微生物細胞バイオマスを乾燥する工程；および油から有機溶媒（例えば、ヘキサン）を除去する工程を包含している。この方法は、さらに細胞バイオマスを含有する発酵培地を水で希釈し、その後に希釈発酵培地からバイオマスを分離するために遠心分離する工程を包含することができる。
【０００５】
[0005]微生物細胞からＰＵＦＡ含有油を入手するためのまた別の方法は、微生物細胞バイオマスを生成するために発酵槽、ポンドまたはバイオリアクター内で所望の油を生成できる微生物を増殖させる工程；細胞壁を破壊するために機械的力（例えば、ホモジナイゼーション）、酵素的処理または化学的処理を使用することによってその中で細胞が増殖させられたＰＵＦＡ含有油を発酵培地内に放出させる工程；ならびに水混和性有機溶媒、例えば、イソプロピルアルコールを使用して結果として生じるＰＵＦＡ含有油、細胞断片および液体を含む組成物から油を回収する工程を含んでいる。油は、組成物から機械的に分離することができ、油および水性バイオマス廃棄物流の両方からアルコールが除去されなければならない。
【０００６】
[0006]微生物細胞からＰＵＦＡ含有油を入手するための上述の方法のいずれかの工業的規模の使用は、危険な稼働状態をもたらし、かつ費用のかかる防爆装置の使用を必要とする大量の揮発性および可燃性有機溶媒の使用を必要とする。さらに、有機溶媒の使用は、揮発性有機化合物（ＶＯＣ）放出に関する厳密な環境的規制に対応するための費用のかかる溶媒回収方法の実行を必要とする有機溶媒廃棄物流を生成し、これはしたがって結果的により多くの労働力およびコストのかかる装置の必要を生じさせる。
【０００７】
[0007]さらに、細胞を乾燥させるため、および／または回収した油から溶媒を除去するための上述の方法における熱の使用は、ＰＵＦＡ含有油を分解させ、エネルギー使用量を増加させることがあり、これはさらに加工処理コストを増大させる可能性がある。分解は、例えば微生物細胞壁の完全性が破壊される、および／または微生物細胞が熱に曝露される場合のように、ＰＵＦＡ含有油が酸素に曝露させられた場合に発生する。
【０００８】
[0008]微生物細胞からＰＵＦＡ含有油を入手するための無溶媒法は、微生物細胞バイオマスを生成するために発酵槽、ポンドまたはバイオリアクター内で所望の油を生成できる微生物を増殖させる工程；；細胞壁を破壊するために機械的力（例えば、ホモジナイゼーション）、酵素的処理または化学的処理を使用することによってその中で細胞が増殖させられた発酵培地内にＰＵＦＡ含有油を放出させる工程；ならびにｐＨを上昇させる、塩を添加する、加熱する、および／または結果として生じる組成物を撹拌する工程によってＰＵＦＡ含有油、細胞断片および液体を含む結果として生じる組成物から原油を回収する工程を含んでいる。しかし細胞からＰＵＦＡ含有油を入手するためのこの無溶媒法は、長い油回収時間、大量の塩および／または多数の工程を必要とすることがあり、これらは全てが加工処理コストを増加させる可能性がある。
【０００９】
[0009]結果として、微生物細胞から高品質ＰＵＦＡ含有油を入手するための方法であって、揮発性有機溶媒を使用しない、容易に入手できる装置を使用して実施できる、必要とする工程数が最小である、油回収時間がより短い、および高収率の高品質ＰＵＦＡ含有油を提供できる方法に対する必要が依然として存在する。
【００１０】
[0010]本明細書では、１つ以上の微生物細胞から１種以上の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含む微生物油を入手するための方法であって：（ａ）溶解細胞組成物を形成するために微生物油を含む細胞を溶解する工程；（ｂ）解乳化溶解細胞組成物を形成するために溶解細胞組成物のｐＨを低下させる工程を含む、溶解細胞組成物を解乳化する工程；（ｃ）解乳化溶解細胞組成物から油を分離する工程；および（ｄ）油を回収する工程を含む方法が開示される。
【００１１】
[0011]本明細書では、１つ以上の微生物細胞から１種以上の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含む微生物油を入手するための方法であって：（ａ）溶解細胞組成物を形成するために微生物油を含む細胞を溶解する工程；（ｂ）解乳化溶解細胞組成物を形成するために溶解細胞組成物のｐＨを約６以下へ低下させる工程を含む、溶解細胞組成物を解乳化する工程；（ｃ）解乳化溶解細胞組成物から油を分離する工程；および（ｄ）油を回収する工程を含む方法が開示される。
【００１２】
[0012]本明細書では、１つ以上の微生物細胞から１種以上の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含む微生物油を入手するための方法であって：（ａ）溶解細胞組成物を形成するために微生物油を含む細胞を溶解する工程；（ｂ）解乳化溶解細胞組成物を形成するために、溶解細胞組成物の重量で約０．５％〜約２０％の量の酸を添加することにより溶解細胞組成物のｐＨを低下させる工程を含む、溶解細胞組成物を解乳化する工程；（ｃ）解乳化溶解細胞組成物から油を分離する工程；および（ｄ）油を回収する工程を含む方法が開示される。
【００１３】
[0013]本明細書では、１つ以上の微生物細胞から１種以上の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含む微生物油を入手するための方法であって：（ａ）溶解細胞組成物を形成するために微生物油を含む細胞を溶解する工程；（ｂ）解乳化溶解細胞組成物を形成するために溶解細胞組成物のｐＨを約６以下へ低下させる工程を含む、溶解細胞組成物を解乳化する工程；（ｃ）解乳化溶解細胞組成物から油を分離する工程；および（ｄ）油を回収する工程を含み、（ａ）または（ｂ）の少なくとも１つは、組成物を少なくとも７０℃の温度へ加熱する工程をさらに含む、方法が開示される。
【００１４】
[0014]本明細書では、１つ以上の微生物細胞から１種以上の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含む微生物油を入手するための方法であって：（ａ）溶解細胞組成物を形成するために微生物油を含む細胞を溶解する工程；（ｂ）解乳化溶解細胞組成物を形成するために、溶解細胞組成物の重量で約０．５％〜約２０％の量の酸を添加することにより溶解細胞組成物のｐＨを低下させる工程を含む、溶解細胞組成物を解乳化する工程；（ｃ）解乳化溶解細胞組成物から油を分離する工程；および（ｄ）油を回収する工程を含み、（ａ）または（ｂ）の少なくとも１つは、組成物を少なくとも７０℃の温度へ加熱する工程をさらに含む、方法が開示される。
【００１５】
[0015]本明細書では、１つ以上の微生物細胞から１種以上の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含む微生物油を入手するための方法であって：（ａ）溶解細胞組成物を形成するために微生物油を含む細胞を溶解する工程；（ｂ）解乳化溶解細胞組成物を形成するために溶解細胞組成物のｐＨを約６以下へ低下させるために酸を添加する工程、および溶解細胞組成物を攪拌する工程を含む、溶解細胞組成物を解乳化する工程；（ｃ）解乳化溶解細胞組成物から油を分離する工程；および（ｄ）油を回収する工程を含む方法が開示される。
【００１６】
[0016]本明細書では、１つ以上の微生物細胞から１種以上の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含む微生物油を入手するための方法であって：（ａ）溶解細胞組成物を形成するために微生物油を含む細胞を溶解する工程；（ｂ）解乳化溶解細胞組成物を形成するために溶解細胞組成物のｐＨを低下させる工程を含む、溶解細胞組成物を解乳化する工程；（ｃ）解乳化溶解細胞組成物から油を分離する工程；および（ｄ）油を回収する工程を含み、（ａ）および（ｂ）は、１工程の溶解および解乳化する工程を形成するために一緒に結合される、方法が開示される。
【００１７】
[0017]本明細書では、１つ以上の微生物細胞から１種以上の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含む微生物油を入手するための方法であって：（ａ）溶解細胞組成物を形成するために微生物油を含む細胞を溶解する工程；（ｂ）解乳化溶解細胞組成物を形成するために溶解細胞組成物を解乳化する工程；（ｃ）解乳化溶解細胞組成物から油を分離する工程；および（ｄ）油を回収する工程を含み、（ａ）および（ｂ）は、ｐＨを上昇させる工程を含む１工程の溶解および解乳化する工程を形成するために一緒に結合される、方法が開示される。
【００１８】
[0018]本明細書では、１つ以上の微生物細胞から１種以上の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含む微生物油を入手するための方法であって：（ａ）溶解細胞組成物を形成するために好適なｐＨで微生物油を含む細胞を溶解する工程；（ｂ）解乳化溶解細胞組成物から油を分離する工程；および（ｃ）油を回収する工程を含み、解乳化溶解細胞組成物は溶解する工程中に入手される、方法が開示される。
【００１９】
[0019]本明細書では、本明細書に記載した方法のいずれかによって入手される微生物油が開示される。
【００２０】
[0020]多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は、脂肪酸のメチル末端から第１二重結合の位置に基づいて分類される；ω−３（ｎ−３）脂肪酸は、第３炭素で第１二重結合を含有するが、他方ω−６（ｎ−６）脂肪酸は、第６炭素で第１二重結合を含有する。例えば、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）は、炭素２２個の鎖長および６つの二重結合を備えるω−３長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡ）であり、「２２：６ｎ−３」と称されることが多い。１つの実施形態では、ＰＵＦＡは、ω−３脂肪酸、ω−６脂肪酸およびそれらの混合物から選択される。また別の実施形態では、ＰＵＦＡは、ＬＣ−ＰＵＦＡから選択される。さらにまた別の実施形態では、ＰＵＦＡは、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、アラキドン酸（ＡＲＡ）、γ−リノール酸（ＧＬＡ）、ジホモ−γ−リノール酸（ＤＧＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）およびそれらの混合物から選択される。また別の実施形態では、ＰＵＦＡは、ＤＨＡ、ＡＲＡおよびそれらの混合物から選択される。また別の実施形態では、ＰＵＦＡは、ＤＨＡである。さらにまた別の実施形態では、ＰＵＦＡはＡＲＡである。
【００２１】
[0021]ＬＣ−ＰＵＦＡは、少なくとも３つの二重結合を含有し、１８個以上の炭素または２０個以上の炭素の鎖長を有する脂肪酸である。ω−６シリーズのＬＣ−ＰＵＦＡには、ジ−ホモ−γリノール酸（Ｃ２０：３ｎ−６）、アラキドン酸（Ｃ２０：４ｎ−６）（「ＡＲＡ」）、ドコサテトラエン酸またはアドレン酸（Ｃ２２：４ｎ−６）およびドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５ｎ−６）（「ＤＰＡ  ｎ−６」）が含まれるがそれらに限定されない。ω−３シリーズのＬＣ−ＰＵＦＡには、エイコサトリエン酸（Ｃ２０：３ｎ−３）、エイコサテトラエン酸（Ｃ２０：４ｎ−３）、エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５ｎ−３）（「ＥＰＡ」）、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５ｎ−３）およびドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６ｎ−３）が含まれるがそれらに限定されない。ＬＣ−ＰＵＦＡにはさらにまた、Ｃ２４：６（ｎ−３）およびＣ２８：８（ｎ−３）を含むがそれらに限定されない２２個を超える炭素および４つ以上の二重結合を備える脂肪酸が含まれる。
【００２２】
[0022]ＰＵＦＡは、遊離脂肪酸、塩、脂肪酸エステル（例えば、メチルもしくはエチルエステル），モノアシルグリセロール（ＭＡＧ）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）および／またはリン脂質（ＰＬ）の形態であってよい。
【００２３】
[0023]高不飽和脂肪酸（ＨＵＦＡ）は、４つ以上の不飽和炭素−炭素結合を含有するω−３および／またはω−６多価不飽和脂肪酸である。
【００２４】
[0024]本明細書で使用する「細胞」は、油含有生体物質、例えば油性微生物由来の生体物質を意味する。微生物によって生成される、または微生物細胞から入手される油は、「微生物油」と呼ばれる。藻類および／または真菌によって生成される油は、さらにまた各々藻類油および／または真菌油と呼ばれる。
【００２５】
[0025]本明細書で使用する「微生物細胞」または「微生物」は、例えば、藻類、細菌、真菌、原生生物、酵母およびそれらの組み合わせなどの生物、例えば単細胞生物を意味する。一部の実施形態では、微生物細胞は、真核細胞である。微生物細胞には、金色藻類（例えば、ストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）界の微生物）；緑色藻類；珪藻類；渦鞭毛藻類（例えばクリプトコディニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ）もしくはＣ．コーニイ（Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ）を含む、例えば、クリプトコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属のメンバーを含む渦鞭毛植物（Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）目の微生物）；スラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目の微細藻類；酵母（子嚢菌綱（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）もしくは担子菌網（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ））；ならびにムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）およびモルティエレラ属シュムッケリ亜属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｓｅｃｔ．ｓｃｈｍｕｃｋｅｒｉ）を含むがそれらに限定されないモルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属およびフィチウム・インシジオスム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍ）を含むがそれには限定されないフィチウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）属の真菌が含まれるがそれらに限定されない。
【００２６】
[0026]１つの実施形態では、微生物細胞は、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、クリプトコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属またはスラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目に由来する。さらにまた別の実施形態では、微生物細胞は、クリプトコディニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  Ｃｏｈｎｉｉ）に由来する。さらにまた別の実施形態では、微生物細胞は、クリプトコディニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  Ｃｏｈｎｉｉ）、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎｅ）、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属およびそれらの混合物から選択される。
【００２７】
[0027]さらにまた別の実施形態では、微生物細胞には、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、コニディオボラス（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、フィチウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）属、フィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、エントモフトラ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ）属、エキノスポランジウム（Ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ）属およびサプロレグニア（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ）属に属する微生物が含まれるがそれらに限定されない。また別の実施形態では、ＡＲＡは、モルティエレラ・エロンガタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｅｌｏｎｇａｔａ）、モルティエレラ・エキシグア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｅｘｉｇｕａ）、モルティエレラ・ヒグロフィラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）、モルティエレラ属シュムッケリ亜属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｓｃｈｍｕｃｋｅｒｉ）およびモルティエレラ・ミヌティッシマ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ）を含むがそれらに限定されないモルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属に由来する微生物細胞から入手される。別の実施形態では、ＡＲＡは、モルティエレラ・エロンガタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｅｌｏｎｇａｔａ）ＩＦＯ８５７０、モルティエレラ・エキシグア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｅｘｉｇｕａ）ＩＦＯ８５７１、モルティエレラ・ヒグロフィラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）ＩＦＯ５９４１、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）ＩＦＯ８５６８、ＡＴＣＣ１６２６６、ＡＴＣＣ３２２２１、ＡＴＣＣ４２４３０、ＣＢＳ２１９．３５、ＣＢＳ２２４．３７、ＣＢＳ２５０．５３、ＣＢＳ３４３．６６、ＣＢＳ５２７．７２、ＣＢＳ５２９．７２、ＣＢＳ６０８．７０およびＣＢＳ７５４．６８ならびにそれらの突然変異体由来の微生物細胞から入手される。さらにまた別の実施形態では、微生物細胞は、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）に由来する。
【００２８】
[0028]さらにまた、微生物細胞は、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属（種にはアルジメンタレ種（ａｒｕｄｉｍｅｎｔａｌｅ）、アウレウム種（ａｕｒｅｕｍ）、ベンチコラ種（ｂｅｎｔｈｉｃｏｌａ）、グロボサム種（ｇｌｏｂｏｓｕｍ）、キネイ種（ｋｉｎｎｅｉ）、モチバム種（ｍｏｔｉｖｕｍ）、マルチルジメンタレ種（ｍｕｌｔｉｒｕｄｉｍｅｎｔａｌｅ）、パチデルマム種（ｐａｃｈｙｄｅｒｍｕｍ）、プロリフェラム種（ｐｒｏｌｉｆｅｒｕｍ）、ロゼウム種（ｒｏｓｅｕｍ）、ストリアツム種（ｓｔｒｉａｔｕｍ）が含まれる））；シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属（種にはアグレガタム種（ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）、リムナセウム種（ｌｉｍｎａｃｅｕｍ）、マングロベイ種（ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）、ミヌツム種（ｍｉｎｕｔｕｍ）、オクトスポラム種（ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｍ）が含まれる）；ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属（種には、アモエボイデア種（ａｍｏｅｂｏｉｄｅａ）、ケルグエレンシス種（ｋｅｒｇｕｅｌｅｎｓｉｓ）、ミヌタ種（ｍｉｎｕｔａ）、プロフンダ種（ｐｒｏｆｕｎｄａ）、ラジエート種（ｒａｄｉａｔｅ）、サイレンス種（ｓａｉｌｅｎｓ）、サルカリアナ種（ｓａｒｋａｒｉａｎａ）、シゾキトロプス種（ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｏｐｓ）、ビスルゲンシス種（ｖｉｓｕｒｇｅｎｓｉｓ）、ヨルケンシス種（ｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）が含まれる）；オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉａｃｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属；オブロンギキトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属；シシオイドチティウム（Ｓｉｃｙｏｉｄｏｃｈｙｔｉｕｍ）属；パリエンティキトリウム（Ｐａｒｉｅｎｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属；ボトリオキトリウム（Ｂｏｔｒｙｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属；およびそれらの組み合わせを含むがそれらに限定されないスラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目の微細藻類に由来する。ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属内で記載された種は、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属のメンバーであると考えられるであろう。また別の実施形態では、微生物細胞は、スラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目に由来する。さらにまた別の実施形態では、微生物細胞は、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に由来する。さらにまた別の実施形態では、微生物細胞は、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に由来する。さらにまた別の実施形態では、微生物細胞は、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属またはそれらの混合物から選択される。
【００２９】
[0029]１つの実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物を形成するために微生物油を含む微生物細胞を溶解する工程を含む。用語「溶解する」および「溶解する工程」は、それにより微生物細胞の壁および／または膜が破壊される方法を意味する。１つの実施形態では、微生物細胞は、機械的、化学的、酵素的、物理的およびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの処理を受けさせることによって溶解される。また別の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物を形成するために微生物油を含む微生物細胞を溶解する工程を含むが、このとき溶解する工程は機械的、化学的、酵素的、物理的およびそれらの組み合わせから選択される。
【００３０】
[0030]一部の実施形態では、細胞の溶解前に、細胞は洗浄および／または低温殺菌することができる。一部の実施形態では、細胞を洗浄する工程は、何らかの細胞外水溶性または水分散性化合物を除去するために水などの水溶液を使用する工程を含んでいる。一部の実施形態では、細胞は、１回、２回、３回またはそれ以上洗浄することができる。一部の実施形態では、細胞を低温殺菌する工程は、何らかの望ましくない酵素、例えば、油を分解させる可能性がある、またはＰＵＦＡの収率を低下させる可能性がある酵素を不活性化するために細胞を加熱する工程を含む。一部の実施形態では、細胞は洗浄され、その後に溶解される前に低温殺菌される。一部の実施形態では、溶解される細胞は、発酵ブロス内に含有されている。
【００３１】
[0031]一部の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物を形成するために微生物油を含む未洗浄微生物細胞を溶解する工程を含む。一部の実施形態では、微生物油を含む微生物細胞を含む発酵ブロスは、最初に例えば水を用いて洗浄され、その後に溶解細胞組成物を形成するために細胞が溶解される。他の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物を形成するために発酵培地内で未洗浄細胞を溶解する工程を含む。
【００３２】
[0032]機械的処理には、ホモジナイゼーション、超音波、冷間圧縮、粉砕およびそれらの組み合わせが含まれるがそれらに限定されない。一部の実施形態では、本方法は、ホモジナイゼーションによって細胞を溶解する工程を含む。一部の実施形態では、本方法は、ホモジナイザーを用いて細胞を溶解する工程を含む。
【００３３】
[0033]ホモジナイゼーションには、フレンチ（Ｆｒｅｎｃｈ）細胞プレス、ソニケーター、ホモジナイザー、マイクロフルイダイザー、ボールミル、ロッドミル、ペブルミル、ビーズミル、高圧研磨ロール、垂直軸インパクター、工業用ブレンダー、高剪断ミキサー、パドルミキサー、ポリトロンホモジナイザー、工業用ホモジナイザー（例えば、Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ製ＶＨＰホモジナイザーならびにＡＰＶ  Ｒａｎｎｉｅ製およびＡＰＶ  Ｇａｕｌｉｎ製ホモジナイザー）、工業用剪断流体プロセッサー（例えば、マイクロフルイディクス高剪断流体プロセッサー）、細胞溶解／ビーズミル型ホモジナイザー（例えば、Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ製およびＢｕｈｌｅｒ製）ならびにそれらの組み合わせが含まれるがそれらに限定されない。一部の実施形態では、細胞は、任意選択的に加熱されるホモジナイザー内を貫流する。一部の実施形態では、好適なホモジナイゼーションは、高圧および／または低圧のいずれかでのホモジナイザーの１〜３回の通過を含むことができる。
【００３４】
[0034]一部の実施形態では、ホモジナイゼーション中の圧力は、１５０ｂａｒ〜１，４００ｂａｒ；１５０ｂａｒ〜１，２００ｂａｒ；１５０ｂａｒ〜９００ｂａｒ；１５０ｂａｒ〜３００ｂａｒ；３００ｂａｒ〜１，４００ｂａｒ；３００ｂａｒ〜１，２００ｂａｒ；３００ｂａｒ〜９００ｂａｒ；４００ｂａｒ〜８００ｂａｒ；５００ｂａｒ〜７００ｂａｒまたは６００ｂａｒである。一部の実施形態では、ホモジナイゼーション中の圧力は、２，０００ｐｓｉ〜２０，０００ｐｓｉ；２，０００ｐｓｉ〜１８，０００ｐｓｉ；２，０００ｐｓｉ〜１６，０００ｐｓｉ；２，０００ｐｓｉ〜１４，０００ｐｓｉ；２，０００ｐｓｉ〜１２，０００ｐｓｉ；２，０００ｐｓｉ〜１０，０００ｐｓｉ；２，０００ｐｓｉ〜８，０００ｐｓｉ；２，０００ｐｓｉ〜６，０００ｐｓｉ；２，０００ｐｓｉ〜４，０００ｐｓｉ；４，０００ｐｓｉ〜２０，０００ｐｓｉ；４，０００ｐｓｉ〜１８，０００ｐｓｉ；４，０００ｐｓｉ〜１６，０００ｐｓｉ；４，０００ｐｓｉ〜１４，０００ｐｓｉ；４，０００ｐｓｉ〜１２，０００ｐｓｉ；４，０００ｐｓｉ〜１０，０００ｐｓｉ；４，０００ｐｓｉ〜８，０００ｐｓｉ；４，０００ｐｓｉ〜６，０００ｐｓｉ；６，０００ｐｓｉ〜２０，０００ｐｓｉ；６，０００ｐｓｉ〜１８，０００ｐｓｉ；６，０００ｐｓｉ〜１６，０００ｐｓｉ；６，０００ｐｓｉ〜１４，０００ｐｓｉ；６，０００ｐｓｉ〜１２，０００ｐｓｉ；６，０００ｐｓｉ〜１０，０００ｐｓｉ；６，０００ｐｓｉ〜８，０００ｐｓｉ；８，０００ｐｓｉ〜２０，０００ｐｓｉ；８，０００ｐｓｉ〜１８，０００ｐｓｉ；８，０００ｐｓｉ〜１６，０００ｐｓｉ；８，０００ｐｓｉ〜１４，０００ｐｓｉ；８，０００ｐｓｉ〜１２，０００ｐｓｉ；８，０００ｐｓｉ〜１０，０００ｐｓｉ；１０，０００ｐｓｉ〜２０，０００ｐｓｉ；１０，０００ｐｓｉ〜１８，０００ｐｓｉ；１０，０００ｐｓｉ〜１６，０００ｐｓｉ；１０，０００ｐｓｉ〜１４，０００ｐｓｉ；１０，０００ｐｓｉ〜１２，０００ｐｓｉ；１２，０００ｐｓｉ〜２０，０００ｐｓｉ；１２，０００ｐｓｉ〜１８，０００ｐｓｉ；１２，０００ｐｓｉ〜１６，０００ｐｓｉ；１２，０００ｐｓｉ〜１４，０００ｐｓｉ；１４，０００ｐｓｉ〜２０，０００ｐｓｉ；１４，０００ｐｓｉ〜１８，０００ｐｓｉ；１４，０００ｐｓｉ〜１６，０００ｐｓｉ；１６，０００ｐｓｉ〜２０，０００ｐｓｉ；１６，０００ｐｓｉ〜１８，０００ｐｓｉまたは１８，０００ｐｓｉ〜２０，０００ｐｓｉである。
【００３５】
[0035]一部の実施形態では、微生物細胞は、均質化される前に高剪断ミキサー内で混合される。一部の実施形態では、高剪断ミキサーは、少なくとも５，０００ｒｐｍ；少なくとも７，５００ｒｐｍ；少なくとも１０，０００ｒｐｍ；少なくとも１２，５００ｒｐｍ；少なくとも１５，０００ｒｐｍ；５，０００ｒｐｍ〜１５，０００ｒｐｍ；５，０００ｒｐｍ〜１２，５００ｒｐｍ；５，０００ｒｐｍ〜１０，０００ｒｐｍ；５，０００ｒｐｍ〜７，５００ｒｐｍ；７，５００ｒｐｍ〜１５，０００ｒｐｍ；７，５００ｒｐｍ〜１２，５００ｒｐｍ；７，５００ｒｐｍ〜１０，０００ｒｐｍ；１０，０００ｒｐｍ〜１５，０００ｒｐｍ；１０，０００ｒｐｍ〜１２，５００ｒｐｍまたは１２，５００ｒｐｍ〜１５，０００ｒｐｍの範囲内で操作される。
【００３６】
[0036]物理的処理には、抵抗、対流、蒸気、流体浴、ソーラーおよびそれらの組み合わせを含むがそれらに限定されない加熱が含まれるがそれらに限定されない。一部の実施形態では、細胞は、その壁の中／壁の上に抵抗コイルを備えるタンク内で加熱される。一部の実施形態では、細胞は、その中を貫通するチューブを備える液体浴内で加熱される。
【００３７】
[0037]化学的処理には、細胞のｐＨを上昇させる工程；細胞のｐＨを低下させる工程；細胞を化学薬品と接触させる工程およびそれらの組み合わせが含まれるがそれらに限定されない。
【００３８】
[0038]一部の実施形態では、細胞は、細胞のｐＨを上昇させる工程によって溶解される。一部の実施形態では、ｐＨは塩基を添加する工程によって上昇させられる。塩基には、水酸化物（例えば、ＬｉＯＨ、ＮａＯＨ、ＫＯＨおよびＣａ（ＯＨ）２ならびにそれらの組み合わせ）；炭酸塩（例えば、Ｎａ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、ＭｇＣＯ３およびそれらの組み合わせ）；重炭酸塩（例えば、ＬｉＨＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、ＫＨＣＯ３およびそれらの組み合わせ）ならびにそれらの組み合わせが含まれるがそれらに限定されない。塩基は、固体（例えば、結晶、顆粒およびペレット）；液体（例えば、水溶液）およびそれらの組み合わせの形態であってよい。
【００３９】
[0039]一部の実施形態では、塩基は、１〜１２、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜５、２〜１２、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜５、３〜１０、３〜６、３〜５、４〜１０、４〜８、４〜６、５〜１０または５〜８のｐＫｂを有する。本明細書で使用する用語「ｐＫｂ」は、塩基の結合定数Ｋｂの負の対数を意味する。Ｋｂは、水中の塩基のイオン化の平衡定数を意味する：
【数１】
2020058364.tif 000002
；および塩基ＢのＫｂは：
【数２】
2020058364.tif 000003
であると規定されている。
【００４０】
[0040]一部の実施形態では、ｐＨは、約８以上；約９以上；約１０以上；約１１以上および約１２以上から選択される。他の実施形態では、ｐＨは、７〜１３；７〜１２；７〜１１；７〜１０；７〜９；８〜１３；８〜１２；８〜１１；８〜１０；８〜９；９〜１２；９〜１１；９〜１０；１０〜１２；および１０〜１１のｐＨから選択される。
【００４１】
[0041]一部の実施形態では、細胞のｐＨは、塩素アルカリ法によって上昇させることができる。一部の実施形態では、塩化ナトリウムおよび細胞を含有する発酵ブロスは、細胞のｐＨを上昇させる水酸化ナトリウムの形成を生じさせる電気分解にかけられる。一部の実施形態では、発酵ブロスは、塩化ナトリウムに代えて、または追加して、塩化カルシウムもしくは塩化カリウムを含み、電気分解は各々水酸化カルシウムもしくは水酸化カリウムの形成を生じさせ、それにより細胞のｐＨを上昇させる。
【００４２】
[0042]一部の実施形態では、細胞は、細胞のｐＨを低下させる工程によって溶解される。一部の実施形態では、ｐＨは酸を添加する工程によって低下させられる。酸には、硫酸；リン酸；塩酸；臭化水素酸；ヨウ化水素酸；次亜塩素酸；亜塩素酸；塩素酸；過塩素酸；フルオロ硫酸；硝酸；フルオロアンチモン酸；フルオロホウ酸；ヘキサフルオロリン酸；クロム酸；ホウ酸；酢酸；クエン酸；ギ酸およびそれらの組み合わせが含まれるがそれらに限定されない。一部の実施形態では、ｐＨは、約７以下、約６．５以下、約６以下、約５．５以下、約５以下、約４．５以下、約４以下、約３．５以下、約３以下、約２．５以下、約２以下、約１．５以下、約１以下および約０．５以下から選択される。他の実施形態では、ｐＨは、約０．５〜約７；約０．５〜約６．５；約０．５〜約６；約０．５〜約５．５；約０．５〜約５；約０．５〜約４．５；約０．５〜約４；約０．５〜約３．５；約０．５〜約３；約０．５〜約２．５；約０．５〜約２；約０．５〜約１．５；約０．５〜約１；約１〜約７；約１〜約６．５；約１〜約６；約１〜約５．５；約１〜約５；約１〜約４．５；約１〜約４；約１〜約３．５；約１〜約３；約１〜約２．５；約１〜約２；約１〜約１．５；約１．５〜約７；約１．５〜約６．５；約１．５〜約６；約１．５〜約５．５；約１．５〜約５；約１．５〜約４．５；約１．５〜約４；約１．５〜約３．５；約１．５〜約３；約１．５〜約２．５；約１．５〜約２；約２〜約７；約２〜約６．５；約２〜約６；約２〜約５．５；約２〜約５；約２〜約４．５；約２〜約４、約２〜約３．５；約２〜約３；約２〜約２．５；約２．５〜約７；約２．５〜約６．５；約２．５〜約６；約２．５〜約５．５；約２．５〜約５；約２．５〜約４．５；約２．５〜約４；約２．５〜約３．５；約２．５〜約３；約３〜約７；約３〜約６．５；約３〜約６；約３〜約５．５；約３〜約５；約３〜約４．５；約３〜約４；約３〜約３．５；約３．５〜約７；約３．５〜約６．５；約３．５〜約６；約３．５〜約５．５；約３．５〜約５；約３．５〜約４．５；約３．５〜約４；約４〜約７；約４〜約６．５；約４〜約６；約４〜約５．５；約４〜約５；約４〜約４．５；約４．５〜約７；約４．５〜約６．５；約４．５〜約６；約４．５〜約５．５；約４．５〜約５；約５〜約７；約５〜約６．５；約５〜約６；約５〜約５．５；約５．５〜約７；約５．５〜約６．５；約５．５〜約６；約６〜約７；約６〜約６．５および約６．５〜約７から選択される。
【００４３】
[0043]一部の実施形態では、酸は、ｐＨを低下させるために、細胞ブロスの重量（または容積）で約２％〜約１０％、約２％〜約９％、約２％〜約８％、約２％〜約７％、約２％〜約６％、約３％〜約６％、約４％〜約６％、約５％〜約６％、約２％〜約５％、約２％〜約４％、約２％〜約３％、約３％〜約５％、約３％〜約４％または約４％〜約５％の量で添加される。
【００４４】
[0044]酵素的処理は、細胞を１種以上の酵素と接触させる工程を意味する。酵素には、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キチナーゼ、ペクチナーゼおよびそれらの組み合わせが含まれるがそれらに限定されない。プロテアーゼの非限定的な例には、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、アラカーゼ（ａｌａｃａｓｅ）およびそれらの組み合わせが含まれる。セルラーゼの非限定的な例には、スクラーゼ、マルターゼ、ラクターゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、リゾチーム、ノイラミニダーゼ、ガラクトシダーゼ、α−マンノシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、プルラナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ガラクトシルセラミダーゼ、アセチルガラクトサミニダーゼ、フコシダーゼ、ヘキソサミニダーゼ、イヅロニダーゼ、マルターゼ−グルコアミラーゼおよびそれらの組み合わせが含まれる。キチナーゼの非限定的な例にはキトトリオシダーゼが含まれる。ペクチナーゼの非限定的な例には、ペクトリアーゼ、ペクトザイム（ｐｅｃｔｏｚｙｍｅ）、ポリガラクツロナーゼおよびそれらの組み合わせが含まれる。一部の実施形態では、一部の酵素は加熱する工程によって活性化される。一部の実施形態では、溶解は、酵素の使用を含んでいない。
【００４５】
[0045]本明細書で使用する「溶解細胞組成物」は、細胞断片および細胞の他の内容物を含む１つ以上の溶解細胞を微生物油（溶解細胞由来）と組み合わせて、および任意選択的に液体（例えば、水）、栄養素および微生物細胞を含有するブロスを含む組成物を意味する。一部の実施形態では、微生物細胞は、水を含む発酵ブロスまたは発酵培地中に含有されている。一部の実施形態では、溶解細胞組成物は、１つ以上の溶解細胞、細胞断片、微生物油、細胞の天然内容物および発酵ブロスからの水性成分を含む組成物を意味する。１つの実施形態では、溶解細胞組成物は、液体、細胞断片および微生物油を含む。一部の実施形態では、溶解細胞組成物は、連続水相および分散油相の混合物を含む水中油型エマルジョンの形態である。一部の実施形態では、分散油相は、乳化溶解細胞組成物の重量（または容積）で約１％〜約６０％；約１％〜約５０％；約１％〜約４０％；約１％〜約３０％；約１％〜約２０％；約５％〜約６０％；約５％〜約５０％；約５％〜約４０％；約５％〜約３０％；約５％〜約２０％；約１０％〜約６０％；約１０％〜約５０％；約１０％〜約４０％；約２０％〜約６０％；２０％〜５０％、２０％〜約４０％；約３０％〜約６０％；約３０％〜約５０％または約４０％〜約６０％の濃度で存在する。
【００４６】
[0046]一部の実施形態では、微生物細胞を溶解する工程は、タンパク質、リン脂質、炭水化物およびそれらの組み合わせを含むがそれらに限定されない細胞または細胞バイオマス中の内因性物質からのエマルジョンの形成を生じさせる。何らかの特定の理論に拘束されなくても、本発明の方法は、乳化溶解細胞組成物を破壊または解乳化し、微生物油を溶解細胞組成物から分離することを可能にすると考えられる。用語「エマルジョン」および「乳化」は、１つの相または層がもう１つの相または層中に分散している２つ以上の非混和性相または層の混合物を意味する。用語「破断する」、「破壊する」、「解乳化する」、「解乳化」、「解乳化する工程」および「破壊する工程」は、エマルジョンの非混和性の相または層を分離する方法を意味する。例えば、乳化溶解細胞組成物を解乳化または破壊する工程は、それにより乳化溶解細胞組成物が１つ以上の相または層を有するエマルジョンから２つ以上の相または層を有する組成物に変化する方法を意味する。例えば、一部の実施形態では、本発明の方法は、乳化溶解細胞組成物を単一相から２つ以上の相へ破壊する。一部の実施形態では、２つ以上の相は、油相および水相を含んでいる。一部の実施形態では、本発明の方法は、乳化溶解細胞組成物を少なくとも３つの相へ破壊する。一部の実施形態では、３つの相は油相、水相および固相から選択される。一部の実施形態では、これらの相は、油相、エマルジョン相、水相および固相から選択される。
【００４７】
[0047]一部の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物のｐＨを低下させる工程によって溶解細胞組成物を解乳化する工程を含んでいる。一部の実施形態では、ｐＨは酸を添加する工程によって低下させられる。酸には、硫酸；リン酸；塩酸；臭化水素酸；ヨウ化水素酸；次亜塩素酸；亜塩素酸；塩素酸；過塩素酸；フルオロ硫酸；硝酸；フルオロアンチモン酸；フルオロホウ酸；ヘキサフルオロリン酸；クロム酸；ホウ酸；酢酸；クエン酸；ギ酸およびそれらの組み合わせが含まれるがそれらに限定されない。一部の実施形態では、ｐＨは、７以下；約６．５以下；約６以下；約５．５以下；約５以下；約４．５以下；約４以下；約３．５以下；約３以下；約２．５以下；約２以下；約１．５以下；約１以下および約０．５以下から選択される。一部の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物のｐＨを約６以下へ低下させる工程を含んでいる。他の実施形態では、ｐＨは、約０．５〜約７；約０．５〜約６．５；約０．５〜約６；約０．５〜約５．５；約０．５〜約５；約０．５〜約４．５；約０．５〜約４；約０．５〜約３．５；約０．５〜約３；約０．５〜約２．５；約０．５〜約２；約０．５〜約１．５；約０．５〜約１；約１〜約７；約１〜約６．５；約１〜約６；約１〜約５．５；約１〜約５；約１〜約４．５；約１〜約４；約１〜約３．５；約１〜約３；約１〜約２．５；約１〜約２；約１〜約１．５；約１．５〜約７；約１．５〜約６．５；約１．５〜約６；約１．５〜約５．５；約１．５〜約５；約１．５〜約４．５；約１．５〜約４；約１．５〜約３．５；約１．５〜約３；約１．５〜約２．５；約１．５〜約２；約２〜約７；約２〜約６．５；約２〜約６；約２〜約５．５；約２〜約５；約２〜約４．５；約２〜約４、約２〜約３．５；約２〜約３；約２〜約２．５；約２．５〜約７；約２．５〜約６．５；約２．５〜約６；約２．５〜約５．５；約２．５〜約５；約２．５〜約４．５；約２．５〜約４；約２．５〜約３．５；約２．５〜約３；約３〜約７；約３〜約６．５；約３〜約６；約３〜約５．５；約３〜約５；約３〜約４．５；約３〜約４；約３〜約３．５；約３．５〜約７；約３．５〜約６．５；約３．５〜約６；約３．５〜約５．５；約３．５〜約５；約３．５〜約４．５；約３．５〜約４；約４〜約７；約４〜約６．５；約４〜約６；約４〜約５．５；約４〜約５；約４〜約４．５；約４．５〜約７；約４．５〜約６．５；約４．５〜約６；約４．５〜約５．５；約４．５〜約５；約５〜約７；約５〜約６．５；約５〜約６；約５〜約５．５；約５．５〜約７；約５．５〜約６．５；約５．５〜約６；約６〜約７；約６〜約６．５および約６．５〜約７から選択される。一部の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物のｐＨを約０．５〜約６へ低下させる工程を含んでいる。
【００４８】
[0048]一部の実施形態では、本方法は、細胞ブロスまたは溶解細胞組成物の重量（または容積）で約０．５％〜約２０％、約０．５％〜約１５％、約０．５％〜約１０％、約０．５％〜約９％、約０．５％〜約８％、約０．５％〜約７％、約０．５％〜約６％、約０．５％〜約５％、約０．５％〜約４％、約０．５％〜約３％、約０．５％〜約２％および約０．５％〜約１％の量で酸を添加する工程によって溶解細胞組成物を解乳化する工程を含む。１つの実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物の重量で約０．５％〜約２０％の量で酸を添加する工程によって溶解細胞組成物を解乳化する工程を含む。
【００４９】
[0049]一部の実施形態では、本方法は、細胞を溶解前、溶解中または溶解後に加熱する工程をさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物および／または細胞を少なくとも１０℃、少なくとも２０℃、少なくとも２５℃、少なくとも３０℃、少なくとも３５℃、少なくとも４０℃、少なくとも４５℃、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、少なくとも７０℃、少なくとも７５℃、少なくとも８０℃、少なくとも８５℃、少なくとも９０℃、少なくとも９５℃または少なくとも１００℃へ加熱する工程を含む。他の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物および／または細胞を約１０℃〜約１００℃、約１０℃〜約９０℃、約１０℃〜約８０℃、約１０℃〜約７０℃、約２０℃〜約１００℃、約２０℃〜約９０℃、約２０℃〜約８０℃、約２０℃〜約７０℃、約３０℃〜約１００℃、約３０℃〜約９０℃、約３０℃〜約８０℃、約３０℃〜約７０℃、約４０℃〜約１００℃、約４０℃〜約９０℃、約４０℃〜約８０℃、約５０℃〜約１００℃、約５０℃〜約９０℃、約５０℃〜約８０℃、約５０℃〜約７０℃、約６０℃〜約１００℃、約６０℃〜約９０℃、約６０℃〜約８０℃、約７０℃〜約１００℃、約７０℃〜約９０℃、約８０℃〜約１００℃、約８０℃〜約９０℃または約９０℃〜約１００℃へ加熱する工程を含んでいる。また別の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物を約７０℃〜約１００℃、約７０℃〜約９０℃、約８０℃〜約１００℃、約８０℃〜約９０℃または約９０℃〜約１００℃へ加熱する工程を含む。さらにまた別の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物を少なくとも７０℃、少なくとも７５℃、少なくとも８０℃、少なくとも８５℃、少なくとも９０℃、少なくとも９５℃または少なくとも１００℃へ加熱する工程を含む。さらにまた別の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物を少なくとも７０℃へ加熱する工程をさらに含む。さらにまた別の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物を約７０℃〜約１００℃へ加熱する工程をさらに含む。
【００５０】
[0050]一部の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物が５ミクロン〜２５ミクロン；５ミクロン〜２０ミクロン；５ミクロン〜１５ミクロン；１０ミクロン〜２５ミクロン；１０ミクロン〜２０ミクロン；１０ミクロン〜１５ミクロン；１５ミクロン〜２５ミクロン；１５ミクロン〜２０ミクロンおよび２０ミクロン〜２５ミクロンから選択される平均粒径を含むようになるまで溶解細胞組成物を加熱する工程をさらに含む。また別の実施形態では、溶解細胞組成物の平均粒径は、２５ミクロン以下、２０ミクロン以下、１５ミクロン以下、１０ミクロン以下および５ミクロン以下から選択される。また別の実施形態では、溶解細胞組成物の平均粒径は、２５ミクロン以下である。一部の実施形態では、平均粒径は、例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＳ  １３  ３２０粒径分析装置（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、カリフォルニア州ブレア（Ｂｒｅａ，ＣＡ））を使用して測定できる。一部の実施形態では、平均粒径は、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＭＳ２０００粒径分析装置（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国ウスターシャー（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ））を使用して測定できる。一部の実施形態では、溶解細胞組成物は、溶解細胞組成物を解乳化するために十分な期間にわたり加熱される。
【００５１】
[0051]一部の実施形態では、細胞および／または溶解細胞組成物は、閉鎖型システムまたはエバポレーターを備えるシステム内で加熱することができる。一部の実施形態では、エバポレーターを備えるシステム内で、細胞および／または溶解細胞組成物中に存在する水の一部分が蒸発によって除去されるように細胞および／または溶解細胞組成物を加熱することができる。一部の実施形態では、１つの方法は、細胞および／または溶解細胞組成物中に存在する水を重量（または容積）で１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％まで除去するために、エバポレーターを備えるシステム内で細胞および／または溶解細胞組成物を加熱する工程を含む。一部の実施形態では、１つの方法は、重量（または容積）で１％〜５０％、１％〜４５％、１％〜４０％、１％〜３５％、１％〜３０％、１％〜２５％、１％〜２０％、１％〜１５％、１％〜１０％、１％〜５％、５％〜５０％、５％〜４５％、５％〜４０％、５％〜３５％、５％〜３０％、５％〜２５％、５％〜２０％、５％〜１５％、５％〜１０％、１０％〜５０％、１０％〜４５％、１０％〜４０％、１０％〜３５％、１０％〜３０％、１０％〜２５％、１０％〜２０％、１０％〜１５％、１５％〜５０％、１５％〜４５％、１５％〜４０％、１５％〜３５％、１５％〜３０％、１５％〜２５％、１５％〜２０％、２０％〜５０％、２０％〜４５％、２０％〜４０％、２０％〜３５％、２０％〜３０％、２０％〜２５％、２５％〜５０％、２５％〜４５％、２５％〜４０％、２５％〜３５％、２５％〜３０％、３０％〜５０％、３０％〜４５％、３０％〜４０％、３０％〜３５％、３５％〜５０％、３５％〜４５％、３５％〜４０％、４０％〜５０％、４０％〜４５％または４５％〜５０％の水を除去するために、エバポレーターを備えるシステム内で細胞および／または溶解細胞組成物を加熱する工程を含む。
【００５２】
[0052]一部の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物に乳化剤を添加する工程をさらに含む。一部の実施形態では、乳化剤は洗剤である。一部の実施形態では、乳化剤は界面活性剤である。一部の実施形態では、乳化剤は、溶解前、溶解中または溶解後に添加される。１つの実施形態では、乳化剤は、溶解後に添加される。一部の実施形態では、乳化剤は、溶解細胞組成物に添加される。本明細書で使用する用語「乳化剤」は、エマルジョンを安定化する物質を意味する。乳化剤は、イオン性乳化剤、非イオン性乳化剤およびそれらの組み合わせから選択される。一部の実施形態では、乳化剤は、イオン性乳化剤である。
【００５３】
[0053]一部の実施形態では、イオン性乳化剤は、アニオン性乳化剤、カチオン性乳化剤およびそれらの組み合わせから選択される。一部の実施形態では、アニオン性乳化剤は、アニオン性硫酸塩乳化剤、例えば、硫酸アルキル（例えば、ラウリル硫酸アンモニウム、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）／ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびそれらの組み合わせ）、アルキル硫酸エーテル（例えば、ラウレス硫酸ナトリウム／ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ミレス硫酸ナトリウムおよびそれらの組み合わせ）およびそれらの組み合わせ；アニオン性スルホン酸塩乳化剤、例えば、ドキュセート（例えば、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、スルホン酸塩フルオロ界面活性剤（例えば、パーフルオロオクタンスルホン酸塩およびパーフルオロブタンスルホン酸塩）、アルキルベンゼンスルホン酸塩およびそれらの組み合わせ）；アニオン性リン酸塩乳化剤（例えば、リン酸アルキルアリールエーテル、リン酸アルキルエーテルおよびそれらの組み合わせ）；アニオン性カルボン酸塩乳化剤（例えば、カルボン酸アルキル（例えば、ステアリン酸ナトリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、カルボン酸フルオロ界面活性剤（例えば、パーフルオロノナン酸塩、パーフルオロオクタン酸塩およびそれらの組み合わせ）およびそれらの組み合わせ）；ならびにそれらの組み合わせであってよい。一部の実施形態では、乳化剤は、アニオン性乳化剤である。１つの実施形態では、アニオン性乳化剤は、アニオン性硫酸塩乳化剤、アニオン性スルホン酸塩乳化剤、アニオン性リン酸塩乳化剤、アニオン性カルボン酸塩乳化剤およびそれらの組み合わせから選択される。また別の実施形態では、アニオン性乳化剤は、アニオン性硫酸塩乳化剤である。さらにまた別の実施形態では、アニオン性硫酸塩乳化剤は、ラウリル硫酸アンモニウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウレス硫酸ナトリウム、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ミレス硫酸ナトリウムおよびそれらの組み合わせから選択される。さらにまた別の実施形態では、アニオン性硫酸塩乳化剤は、ドデシル硫酸ナトリウムである。
【００５４】
[0054]一部の実施形態では、カチオン性乳化剤は、ｐＨ依存性第一級アミン；ｐＨ依存性第二級アミン；ｐＨ依存性第三級アミン；オクテニジン二塩酸塩；永久的帯電第四級アンモニウムカチオン（例えば、アルキルトリメチルアンモニウム塩（例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）／臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣ）およびそれらの組み合わせ）、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、塩化ベンゼトニウム（ＢＺＴ）、５−ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサン、塩化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウム（ＤＯＤＡＢ）およびそれらの組み合わせ）；ならびにそれらの組み合わせであってよい。
【００５５】
[0055]一部の実施形態では、乳化剤の分子量は、５００ｇ／モル以下、４５０ｇ／モル以下、４００ｇ／モル以下、３５０ｇ／モル以下および３００ｇ／モル以下から選択される。さらにまた別の実施形態では、乳化剤の分子量は、２５０ｇ／モル〜５００ｇ／モル、２５０ｇ／モル〜４５０ｇ／モル、２５０ｇ／モル〜４００ｇ／モル、２５０ｇ／モル〜３５０ｇ／モル、２５０ｇ／モル〜３００ｇ／モル、３００ｇ／モル〜５００ｇ／モル、３００ｇ／モル〜４５０ｇ／モル、３００ｇ／モル〜４００ｇ／モル、３００ｇ／モル〜３５０ｇ／モル、３５０ｇ／モル〜５００ｇ／モル、３５０ｇ／モル〜４５０ｇ／モル、３５０ｇ／モル〜４００ｇ／モル、４００ｇ／モル〜５００ｇ／モル、４００ｇ／モル〜４５０ｇ／モルおよび４５０ｇ／モル〜５００ｇ／モルから選択される。例えば、ＳＤＳの分子量は２８８ｇ／モルであり、ＣＴＡＢの分子量は３６４ｇ／モルである。さらにまた別の実施形態では、乳化剤の分子量は、２５０ｇ／モル〜４５０ｇ／モル、２５０ｇ／モル〜４００ｇ／モル、２５０ｇ／モル〜３５０ｇ／モルおよび２５０ｇ／モル〜３００ｇ／モルから選択される。
【００５６】
[0056]一部の実施形態では、乳化剤は粉末として添加される。一部の実施形態では、乳化剤は、５％〜５０％、５％〜４５％、５％〜４０％、５％〜３５％、５％〜３０％、１０％〜５０％、１０％〜４５％、１０％〜４０％、１０％〜３５％、１０％〜３０％、１５％〜５０％、１５％〜４５％、１５％〜４０％、１５％〜３５％、１５％〜３０％、２０％〜５０％、２０％〜４５％、２０％〜４０％、２０％〜３５％、２０％〜３０％、２５％〜５０％、２５％〜４５％、２５％〜４０％、２５％〜３５％、２５％〜３０％、３０％〜５０％、３０％〜４５％、３０％〜４０％および３０％〜３５％の量の乳化剤濃度を有する溶液で添加される。
【００５７】
[0057]一部の実施形態では、（例えば、粉末形または溶液形にある）乳化剤は、発酵ブロスまたは溶解細胞組成物の重量（または容積）で０．２％〜１０％、０．２％〜９．５％、０．２％〜９％、０．２％〜８．５％、０．２％〜８％、０．２％〜７．５％、０．２％〜７％、０．２％〜６．５％、０．２％〜６％、０．２％〜５．５％、０．２％〜５％、０．２％〜４．５％、０．２％〜４％、０．２％〜３．５％、０．２％〜３％、０．２％〜２．５％、０．２％〜２％、０．２％〜１．５％、０．２％〜１％、０．２％〜０．５％、０．５％〜１０％、０．５％〜９．５％、０．５％〜９％、０．５％〜８．５％、０．５％〜８％、０．５％〜７．５％、０．５％〜７％、０．５％〜６．５％、０．５％〜６％、０．５％〜５．５％、０．５％〜５％、０．５％〜４．５％、０．５％〜４％、０．５％〜３．５％、０．５％〜３％、０．５％〜２．５％、０．５％〜２％、０．５％〜１．５％、０．５％〜１％、１％〜１０％、１％〜９．５％、１％〜９％、１％〜８．５％、１％〜８％、１％〜７．５％、１％〜７％、１％〜６．５％、１％〜６％、１％〜５．５％、１％〜５％、１％〜４．５％、１％〜４％、１％〜３．５％、１％〜３％、１％〜２．５％、１％〜２％、１％〜１．５％、１．５％〜１０％、１．５％〜９．５％、１．５％〜９％、１．５％〜８．５％、１．５％〜８％、１．５％〜７．５％、１．５％〜７％、１．５％〜６．５％、１．５％〜６％、１．５％〜５．５％、１．５％〜５％、１．５％〜４．５％、１．５％〜４％、１．５％〜３．５％、１．５％〜３％、１．５％〜２．５％、１．５％〜２％、２％〜１０％、２％〜９．５％、２％〜９％、２％〜８．５％、２％〜８％、２％〜７．５％、２％〜７％、２％〜６．５％、２％〜６％、２％〜５．５％、２％〜５％、２％〜４．５％、２％〜４％、２％〜３．５％、２％〜３％、２％〜２．５％、２．５％〜１０％、２．５％〜９．５％、２．５％〜９％、２．５％〜８．５％、２．５％〜８％、２．５％〜７．５％、２．５％〜７％、２．５％〜６．５％、２．５％〜６％、２．５％〜５．５％、２．５％〜５％、２．５％〜４．５％、２．５％〜４％、２．５％〜３．５％、２．５％〜３％、３％〜１０％、３％〜９．５％、３％〜９％、３％〜８．５％、３％〜８％、３％〜７．５％、３％〜７％、３％〜６．５％、３％〜６％、３％〜５．５％、３％〜５％、３％〜４．５％、３％〜４％および３％〜３．５％から選択される量で添加される。また別の実施形態では、（例えば、粉末形または溶液形にある）乳化剤は、発酵ブロスまたは溶解細胞組成物の重量（または容積）で０．２％〜５％、０．５％〜５％、１％〜５％、１．５％〜５％、２％〜５％、２．５％〜５％および３％〜５％から選択される量で添加される。さらにまた別の実施形態では、乳化剤は、溶解細胞組成物の重量で０．２％〜１０％の量で添加される。
【００５８】
[0058]一部の実施形態では、乳化剤は、発酵ブロスまたは溶解細胞組成物の界面張力（例えば、表面張力）を低下させる。本明細書で使用する用語「界面張力」または「表面張力」は、２つの相間の界面で長さが１メートル当たりの想像線に作用する力を意味する。一部の実施形態では、乳化剤によって形成されるエマルジョンの界面張力は、内因性物質によって形成されるエマルジョンより小さい。一部の実施形態では、界面張力は、ダイン（ｄｙｎｅ）／ｃｍで測定できる。
【００５９】
[0059]一部の実施形態では、乳化剤は、発酵ブロスまたは溶解細胞組成物のζ電位の絶対値を上昇させる（すなわち、正のζ電位を上昇させる、または負のζ電位を低下させる）。一部の実施形態では、アニオン性乳化剤の添加は、発酵ブロスまたは溶解細胞組成物のζ電位における下方移動を生じさせることができる（すなわち、正のζ電位を低下させる、または負のζ電位を上昇させる）。一部の実施形態では、カチオン性乳化剤の添加は、発酵ブロスまたは溶解細胞組成物のζ電位における上方移動を生じさせることができる（すなわち、正のζ電位を上昇させる、または負のζ電位を低下させる）。本明細書で使用する用語「ζ電位」は、エマルジョン中の粒子間の界面動電位を意味する。一部の実施形態では、ζ電位は、ｍＶで測定できる。一部の実施形態では、乳化剤によって形成されるエマルジョンのζ電位の絶対値は、内因性物質によって形成されるエマルジョンより高い。
【００６０】
[0060]一部の実施形態では、イオン性乳化剤の添加は、水中油型エマルジョンをもたらす。一部の実施形態では、水中油型エマルジョンには、油、水およびイオン性乳化剤が含まれるがそれらに限定されない。
【００６１】
[0061]一部の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物に塩を添加する工程をさらに含む。用語「塩］は、酸由来の水素イオンを金属（例えば、アルカリ金属、アルカリ土類金属および遷移金属）または正荷電化合物（例えば、ＮＨ４＋）で置換することによって形成されたイオン性化合物を意味する。一部の実施形態では、塩は、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、硫酸塩またはそれらの組み合わせであってよい。塩中に存在する負荷電イオン種には、ハロゲン化物、硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、リン酸水素、リン酸二水素、炭酸塩、重炭酸塩およびそれらの組み合わせが含まれるがそれらに限定されない。一部の実施形態では、塩は、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、グルタミン酸一ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化カリウム、塩化鉄、硫酸鉄、硫酸アルミニウム、酢酸アンモニウムおよびそれらの組み合わせから選択される。一部の実施形態では、塩はＮａＯＨを含まない。塩は、固体（例えば、結晶形、非晶質形、ペレット形および／または顆粒形）および／または例えば水を含有する溶液（例えば、希釈溶液、飽和溶液または超飽和溶液）として添加することができる。
【００６２】
[0062]一部の実施形態では、塩は、５ｇ／Ｌ〜２５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ〜１５ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ〜２５ｇ／Ｌまたは１０ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌの量で添加される。
【００６３】
[0063]他の実施形態では、塩は、溶解細胞組成物に溶解細胞組成物の重量（または容積）で２０％以下、１５％以下、１０％以下、７．５％以下、５％以下または２％以下の量で添加される。一部の実施形態では、塩は、溶解細胞組成物に溶解細胞組成物の重量（または容積）（例えば、ブロス総重量（または容積））で約０．０５％〜約２０％、約０．１％〜約２０％、約０．１％〜約１５％、約０．１％〜約１０％、約０．５％〜約２０％、約０．５％〜約１５％、約０．５％〜約１０％、約０．５％〜約５％、約０．５％〜約４％、約０．５％〜約３％、約０．５％〜約２．５％、約０．５％〜約２％、約０．５％〜約１．５％、約０．５％〜約１％、約１％〜約２０％、約１％〜約１５％、約１％〜約１０％、約１％〜約５％、約１％〜約４％、１％〜約３％、約１％〜約２．５％、約１％〜約２％、約１％〜約１．５％、約１．５％〜約５％、約１．５％〜約４％、約１．５％〜約３％、約１．５％〜約２．５％、約１．５％〜約２％、約２％〜２０％、約２％〜約１５％、約２％〜約１０％、約２％〜約５％、約２％〜約４％、約２％〜約３％、約２％〜約２．５％、約２．５％〜約５％、約２．５％〜約４％、約２．５％〜約３％、約３％〜約５％、約３％〜約４％、約４％〜約５％、約５％〜約２０％、約５％〜約１５％、約５％〜約１０％、約１０％〜約２０％、約１０％〜約１５％または約１５％〜約２０％の量で添加される。例えば、溶解細胞組成物の重量が１，０００ｋｇである場合、重量（または容積）で０．５％〜２０％の量で添加される塩は、溶解細胞組成物に５ｋｇ〜２００ｋｇの塩の添加を必要とする。一部の実施形態では、塩は、溶解細胞組成物に溶解細胞組成物の重量（または容積）で約０．０５％〜約２０％、（重量（または容積）で）約０．１％〜約２０％、約０．５％〜約１５％または（重量（または容積）で）約２％〜約１０％の量で添加される。
【００６４】
[0064]一部の実施形態では、本方法は、（ｉ）細胞の溶解前、溶解中または溶解後に；（ｉ）溶解細胞組成物の解乳化前、解乳化中または解乳化後に、またはそれらの組み合わせで攪拌する工程をさらに含む。用語「攪拌する工程」および「撹拌」は、細胞および／または溶解細胞組成物における運動に力を適用して影響を及ぼす方法を意味する。一部の実施形態では、本方法は、かき混ぜる工程、混合する工程、ブレンドする工程、震動させる工程、振動させる工程またはそれらの組み合わせによって細胞および／または溶解細胞組成物を攪拌する工程を含む。
【００６５】
[0065]一部の実施形態では、攪拌機は、細胞組成物または溶解細胞組成物中に塩基および／または塩を分散させる分散様式攪拌機である。一部の実施形態では、攪拌機は加熱板を有する。一部の実施形態では、撹拌機はかき混ぜ用マントルを有する。一部の実施形態では、攪拌機は１つ以上のインペラを有する。本明細書で使用する「インペラ」は、回転すると細胞組成物または溶解細胞組成物に運動を付与するように配列された器具を意味する。本発明とともに使用するために好適なインペラには、等厚翼インペラ、ラッシュトン（Ｒｕｓｈｔｏｎ）ブレードインペラ、軸流インペラ、半径流インペラ、凹面ブレードディスクインペラ、高効率インペラ、プロペラ、パドル、タービンおよびそれらの組み合わせが含まれる。
【００６６】
[0066]一部の実施形態では、本発明の方法は、細胞および／または溶解細胞組成物を各々０．１ｈｐ／１，０００ｇａｌ〜１０ｈｐ／１，０００ｇａｌ、０．５ｈｐ／１，０００ｇａｌ〜８ｈｐ／１，０００ｇａｌ、１ｈｐ／１，０００ｇａｌ〜６ｈｐ／１，０００ｇａｌまたは２ｈｐ／１，０００ｇａｌ〜５ｈｐ／１，０００ｇａｌ（細胞または組成物）で攪拌する工程を含む。一部の実施形態では、本方法は、細胞および／または溶解細胞組成物を各々０．１ｈｐ／１０００ｇａｌ〜１０ｈｐ／１０００ｇａｌ（細胞または組成物）で攪拌する工程を含む。
【００６７】
[0067]一部の実施形態では、本発明は、１０ｒｐｍ以下、２０ｒｐｍ以下、５０ｒｐｍ以下、１００ｒｐｍ以下、１５０ｒｐｍ以下、２００ｒｐｍ以下、２５０ｒｐｍ以下、３００ｒｐｍ以下、３５０ｒｐｍ以下、４００ｒｐｍ以下、１０ｒｐｍ〜４００ｒｐｍ、１０ｒｐｍ〜３５０ｒｐｍ、１０ｒｐｍ〜３００ｒｐｍ、１０ｒｐｍ〜２５０ｒｐｍ、１０ｒｐｍ〜２００ｒｐｍ、１０ｒｐｍ〜１５０ｒｐｍ、１０ｒｐｍ〜１００ｒｐｍ、１０ｒｐｍ〜５０ｒｐｍ、１０ｒｐｍ〜２０ｒｐｍ、２０ｒｐｍ〜４００ｒｐｍ、２０ｒｐｍ〜３５０ｒｐｍ、２０ｒｐｍ〜３００ｒｐｍ、２０ｒｐｍ〜２５０ｒｐｍ、２０ｒｐｍ〜２００ｒｐｍ、２０ｒｐｍ〜１５０ｒｐｍ、２０ｒｐｍ〜１００ｒｐｍ、２０ｒｐｍ〜５０ｒｐｍ、５０ｒｐｍ〜４００ｒｐｍ、５０ｒｐｍ〜３５０ｒｐｍ、５０ｒｐｍ〜３００ｒｐｍ、５０ｒｐｍ〜２５０ｒｐｍ、５０ｒｐｍ〜２００ｒｐｍ、５０ｒｐｍ〜１５０ｒｐｍ、５０ｒｐｍ〜１００ｒｐｍ、１００ｒｐｍ〜４００ｒｐｍ、１００ｒｐｍ〜３５０ｒｐｍ、１００ｒｐｍ〜３００ｒｐｍ、１００ｒｐｍ〜２５０ｒｐｍ、１００ｒｐｍ〜２００ｒｐｍ、１００ｒｐｍ〜１５０ｒｐｍ、１５０ｒｐｍ〜４００ｒｐｍ、１５０ｒｐｍ〜３５０ｒｐｍ、１５０ｒｐｍ〜３００ｒｐｍ、１５０ｒｐｍ〜２５０ｒｐｍ、１５０ｒｐｍ〜２００ｒｐｍ、２００ｒｐｍ〜４００ｒｐｍ、２００ｒｐｍ〜３５０ｒｐｍ、２００ｒｐｍ〜３００ｒｐｍ、２００ｒｐｍ〜２５０ｒｐｍ、２５０ｒｐｍ〜４００ｒｐｍ、２５０ｒｐｍ〜３５０ｒｐｍ、２５０ｒｐｍ〜３００ｒｐｍ、３００ｒｐｍ〜４００ｒｐｍ、３００ｒｐｍ〜３５０ｒｐｍまたは３５０ｒｐｍ〜４００ｒｐｍで攪拌する工程を含む。一部の実施形態では、攪拌する工程は、３５０ｒｐｍ以下の速度で行われる。
【００６８】
[0068]一部の実施形態では、本方法は、細胞および／または溶解細胞組成物を９０ｆｔ／分〜１，２００ｆｔ／分、２００ｆｔ／分〜１，０００ｆｔ／分、３００ｆｔ／分〜８００ｆｔ／分、４００ｆｔ／分〜７００ｆｔ／分または５００ｆｔ／分〜６００ｆｔ／分のインペラ先端速度を有する攪拌機を使用して攪拌する工程を含んでいる。一部の実施形態では、本方法は、２００ｆｔ／分〜１０００ｆｔ／分のインペラ先端速度を有する攪拌機を用いて攪拌する工程を含む。
【００６９】
[0069]一部の実施形態では、本方法は、細胞および／または溶解細胞組成物を５ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、５ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、５ｃｍ／秒〜５００ｃｍ／秒、５ｃｍ／秒〜３５０ｃｍ／秒、５ｃｍ／秒〜３００ｃｍ／秒、５ｃｍ／秒〜２５０ｃｍ／秒、５ｃｍ／秒〜２００ｃｍ／秒、５ｃｍ／秒〜１５０ｃｍ／秒、５ｃｍ／秒〜１００ｃｍ／秒、５ｃｍ／秒〜５０ｃｍ／秒、５ｃｍ／秒〜２５ｃｍ／秒、２５ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、２５ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、２５ｃｍ／秒〜５００ｃｍ／秒、２５ｃｍ／秒〜３５０ｃｍ／秒、２５ｃｍ／秒〜３００ｃｍ／秒、２５ｃｍ／秒〜２５０ｃｍ／秒、２５ｃｍ／秒〜２００ｃｍ／秒、２５ｃｍ／秒〜１５０ｃｍ／秒、２５ｃｍ／秒〜１００ｃｍ／秒、２５ｃｍ／秒〜５０ｃｍ／秒、５０ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、５０ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、５０ｃｍ／秒〜５００ｃｍ／秒、５０ｃｍ／秒〜３５０ｃｍ／秒、５０ｃｍ／秒〜３００ｃｍ／秒、５０ｃｍ／秒〜２５０ｃｍ／秒、５０ｃｍ／秒〜２００ｃｍ／秒、５０ｃｍ／秒〜１５０ｃｍ／秒、５０ｃｍ／秒〜１００ｃｍ／秒、１００ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、１００ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、１００ｃｍ／秒〜５００ｃｍ／秒、１００ｃｍ／秒〜３５０ｃｍ／秒、１００ｃｍ／秒〜３００ｃｍ／秒、１００ｃｍ／秒〜２５０ｃｍ／秒、１００ｃｍ／秒〜２００ｃｍ／秒、１００ｃｍ／秒〜１５０ｃｍ／秒、１５０ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、１５０ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、１５０ｃｍ／秒〜５００ｃｍ／秒、１５０ｃｍ／秒〜３５０ｃｍ／秒、１５０ｃｍ／秒〜３００ｃｍ／秒、１５０ｃｍ／秒〜２５０ｃｍ／秒、１５０ｃｍ／秒〜２００ｃｍ／秒、２００ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、２００ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、２００ｃｍ／秒〜５００ｃｍ／秒、２００ｃｍ／秒〜３５０ｃｍ／秒、２００ｃｍ／秒〜３００ｃｍ／秒、２００ｃｍ／秒〜２５０ｃｍ／秒、２５０ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、２５０ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、２５０ｃｍ／秒〜５００ｃｍ／秒、２５０ｃｍ／秒〜３５０ｃｍ／秒、２５０ｃｍ／秒〜３００ｃｍ／秒、３００ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、３００ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、３００ｃｍ／秒〜５００ｃｍ／秒、３００ｃｍ／秒〜３５０ｃｍ／秒、３５０ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、３５０ｃｍ／秒〜８５０ｃｍ／秒、３５０ｃｍ／秒〜８００ｃｍ／秒、３５０ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、３５０ｃｍ／秒〜７００ｃｍ／秒、３５０ｃｍ／秒〜６５０ｃｍ／秒、３５０ｃｍ／秒〜６００ｃｍ／秒、３５０ｃｍ／秒〜５５０ｃｍ／秒、３５０ｃｍ／秒〜５００ｃｍ／秒、３５０ｃｍ／秒〜４５０ｃｍ／秒、３５０ｃｍ／秒〜４００ｃｍ／秒、４００ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、４００ｃｍ／秒〜８５０ｃｍ／秒、４００ｃｍ／秒〜８００ｃｍ／秒、４００ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、４００ｃｍ／秒〜７００ｃｍ／秒、４００ｃｍ／秒〜６５０ｃｍ／秒、４００ｃｍ／秒〜６００ｃｍ／秒、４００ｃｍ／秒〜５５０ｃｍ／秒、４００ｃｍ／秒〜５００ｃｍ／秒、４００ｃｍ／秒〜４５０ｃｍ／秒、４５０ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、４５０ｃｍ／秒〜８５０ｃｍ／秒、４５０ｃｍ／秒〜８００ｃｍ／秒、４５０ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、４５０ｃｍ／秒〜７００ｃｍ／秒、４５０ｃｍ／秒〜６５０ｃｍ／秒、４５０ｃｍ／秒〜６００ｃｍ／秒、４５０ｃｍ／秒〜５５０ｃｍ／秒、４５０ｃｍ／秒〜５００ｃｍ／秒、５００ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、５００ｃｍ／秒〜８５０ｃｍ／秒、５００ｃｍ／秒〜８００ｃｍ／秒、５００ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、５００ｃｍ／秒〜７００ｃｍ／秒、５００ｃｍ／秒〜６５０ｃｍ／秒、５００ｃｍ／秒〜６００ｃｍ／秒、５００ｃｍ／秒〜５５０ｃｍ／秒、５５０ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、５５０ｃｍ／秒〜８５０ｃｍ／秒、５５０ｃｍ／秒〜８００ｃｍ／秒、５５０ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、５５０ｃｍ／秒〜７００ｃｍ／秒、５５０ｃｍ／秒〜６５０ｃｍ／秒、５５０ｃｍ／秒〜６００ｃｍ／秒、６００ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、６００ｃｍ／秒〜８５０ｃｍ／秒、６００ｃｍ／秒〜８００ｃｍ／秒、６００ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、６００ｃｍ／秒〜７００ｃｍ／秒、６００ｃｍ／秒〜６５０ｃｍ／秒、６５０ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、６５０ｃｍ／秒〜８５０ｃｍ／秒、６５０ｃｍ／秒〜８００ｃｍ／秒、６５０ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、６５０ｃｍ／秒〜７００ｃｍ／秒、７００ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、７００ｃｍ／秒〜８５０ｃｍ／秒、７００ｃｍ／秒〜８００ｃｍ／秒、７００ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、７５０ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、７５０ｃｍ／秒〜８５０ｃｍ／秒、７５０ｃｍ／秒〜８００ｃｍ／秒、８００ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、８００ｃｍ／秒〜８５０ｃｍ／秒または８５０ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒のインペラ先端速度を有する攪拌機を使用して攪拌する工程を含んでいる。用語「インペラ先端速度」は、インペラがその中心軸の周囲を回転するときのインペラの最も外側の部分の速度を意味する。
【００７０】
[0070]一部の実施形態では、攪拌する工程（および本明細書に記載した任意選択的な追加の工程）は、インペラを含む容器内で実施されるが、このときインペラ径対容器容積の比は、０．１〜０．５、０．１〜０．４、０．２〜０．５、０．２〜０．４、０．３〜０．５または０．３〜０．４である。
【００７１】
[0071]一部の実施形態では、攪拌する工程（および本明細書に記載した任意選択的な追加の工程）は、インペラを含む容器内で実施されるが、インペラ径対容器内径の比は、少なくとも０．２５、少なくとも０．３４、少なくとも０．６５、０．２５〜０．６５、０．２５〜０．３３、０．３〜０．６、０．３〜０．５、０．３〜０．４、０．３４〜０．６５、０．３４〜０．６、０．３４〜０．５５、０．３７〜０．５５、０．４〜０．６５、０．４〜０．６、０．４〜０．５または０．４２〜０．５５である。
【００７２】
[0072]一部の実施形態では、攪拌する工程は、細胞および／または溶解細胞組成物が１０〜１０，０００、１，０００〜１０，０００、１，５００〜１０，０００または２，０００〜１０，０００のレイノルズ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）数によって記載される流動条件下に置かれるように細胞および／または溶解細胞組成物を混合する工程を含む。一部の実施形態では、攪拌する工程中の溶解細胞エマルジョンは、２，０００以上、３，０００以上もしくは５，０００以上、または２，０００〜１０，０００、３，０００〜１０，０００もしくは５，０００〜１０，０００のレイノルズ数を有する。
【００７３】
[0073]一部の実施形態では、撹拌容器は２つのインペラを有することができる。一部の実施形態では、インペラはラッシュトンブレードインペラである。一部の実施形態では、インペラは少なくとも最小インペラの直径に等しい間隔をあけて相互に離れている。一部の実施形態では、インペラは、先端間の距離が３０インチ〜４０インチ、３３インチ〜３７インチ、３３インチ、３４インチ、３５インチ、３６インチまたは３７インチである。一部の実施形態では、撹拌容器は、少なくとも１０，０００Ｌ、少なくとも２０，０００Ｌ、少なくとも３０，０００Ｌ、少なくとも４０，０００Ｌまたは少なくとも５０，０００Ｌの容積を有する。一部の実施形態では、撹拌容器は、９０インチ〜１１０インチ、９５インチ〜１０５インチ、９８インチ、９９インチ、１００インチ、１０１インチまたは１０２インチの内径を有する。一部の実施形態では、第１インペラは、撹拌容器の底部から１５インチ〜２０インチ、１６インチ〜１９インチまたは１７インチ〜１８インチに位置し、第２インペラは第１インペラの上方６０インチ〜８０インチ、６５インチ〜７５インチ、６８インチ、６９インチ、７０インチ、７１インチ、７２インチ、７３インチ、７４インチまたは７５インチに位置する。一部の実施形態では、溶解細胞組成物は、少なくとも５０ｒｐｍ、少なくとも６０ｒｐｍまたは少なくとも７０ｒｐｍで撹拌される。一部の実施形態では、溶解細胞組成物は、５０ｒｐｍ〜７０ｒｐｍ、５０ｒｐｍ〜６０ｒｐｍまたは６０ｒｐｍ〜７０ｒｐｍで撹拌される。
【００７４】
[0074]一部の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物を攪拌する工程をさらに含む。一部の実施形態では、溶解細胞組成物を攪拌する方法は、溶解細胞組成物を解乳化する。
【００７５】
[0075]一部の実施形態では、解乳化中に形成される油滴の平均粒径は、５ミクロン〜５０ミクロン；５ミクロン〜４５ミクロン；５ミクロン〜４０ミクロン；５ミクロン〜３５ミクロン；５ミクロン〜３０ミクロン；５ミクロン〜２５ミクロン；５ミクロン〜２０ミクロン；５ミクロン〜１５ミクロン；１０ミクロン〜５０ミクロン；１０ミクロン〜４５ミクロン；１０ミクロン〜４０ミクロン；１０ミクロン〜３５ミクロン；１０ミクロン〜３０ミクロン；１０ミクロン〜２５ミクロン；１０ミクロン〜２０ミクロン；１０ミクロン〜１５ミクロン；１５ミクロン〜５０ミクロン；１５ミクロン〜４５ミクロン；１５ミクロン〜４０ミクロン；１５ミクロン〜３５ミクロン；１５ミクロン〜３０ミクロン；１５ミクロン〜２５ミクロン；１５ミクロン〜２０ミクロン；２０ミクロン〜５０ミクロン；２０ミクロン〜４５ミクロン；２０ミクロン〜４０ミクロン；２０ミクロン〜３５ミクロン；２０ミクロン〜３０ミクロン；２０ミクロン〜２５ミクロン；２５ミクロン〜５０ミクロン；２５ミクロン〜４５ミクロン；２５ミクロン〜４０ミクロン；２５ミクロン〜３５ミクロン；２５ミクロン〜３０ミクロン；３０ミクロン〜５０ミクロン；３０ミクロン〜４５ミクロン；３０ミクロン〜４０ミクロン；３０ミクロン〜３５ミクロン；３５ミクロン〜５０ミクロン；３５ミクロン〜４５ミクロン；３５ミクロン〜４０ミクロン；４０ミクロン〜５０ミクロン；４０ミクロン〜４５ミクロンおよび４５ミクロン〜５０ミクロンから選択される。また別の実施形態では、解乳化中に形成される油滴の平均粒径は、少なくとも１０ミクロン、少なくとも１５ミクロン、少なくとも２０ミクロン、少なくとも２５ミクロン、少なくとも３０ミクロン、少なくとも３５ミクロンおよび４０ミクロン以上から選択される。また別の実施形態では、解乳化中に形成される油滴の平均粒径は、少なくとも１０ミクロン、少なくとも１５ミクロン、少なくとも２０ミクロンおよび少なくとも２５ミクロンから選択される。一部の実施形態では、平均粒径は、例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＳ  １３  ３２０粒径分析装置（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、カリフォルニア州ブレア）を使用して測定できる。一部の実施形態では、平均粒径は、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＭＳ２０００粒径分析装置（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国ウスターシャー）を使用して測定できる。
【００７６】
[0076]一部の実施形態では、溶解細胞組成物は、解乳化溶解細胞組成物を形成するために乳化剤、酸、塩、加熱および撹拌のうちの１つ以上にかけられる。
【００７７】
[0077]一部の実施形態では、本方法は、１工程の溶解および解乳化する工程を形成するために溶解する工程および解乳化する工程を一緒に組み合わせることをさらに含む。
【００７８】
[0078]一部の実施形態では、本方法は、１工程の溶解および解乳化する工程を形成するために、細胞および溶解細胞組成物のｐＨを上昇させる工程を含む溶解する工程および解乳化する工程を一緒に組み合わせることをさらに含む。一部の実施形態では、１工程の溶解および解乳化する工程は、細胞および溶解細胞組成物のｐＨを約８以上へ上昇させる工程を含んでいる。一部の実施形態では、１工程の溶解および解乳化する工程は、細胞および溶解細胞組成物のｐＨを上昇させるために塩基を添加する工程を含む。一部の実施形態では、１工程の溶解および解乳化する工程は、細胞および溶解細胞組成物のｐＨを約８以上へ上昇させるために塩基を添加する工程を含む。
【００７９】
[0079]一部の実施形態では、１工程の溶解および解乳化する工程に添加できる塩基は、既に本明細書で上記の塩基から選択される。一部の実施形態では、１工程の溶解および解乳化する工程の細胞および溶解細胞組成物のｐＨは、約８以上；約９以上；約１０以上；約１１以上および約１２以上から選択されるｐＨへ上昇させることができる。他の実施形態では、１工程の溶解および解乳化する工程の細胞および溶解細胞組成物のｐＨは、７〜１３；７〜１２；７〜１１；７〜１０；７〜９；８〜１３；８〜１２；８〜１１；８〜１０；８〜９；９〜１２；９〜１１；９〜１０；１０〜１２および１０〜１１から選択されるｐＨへ上昇させることができる。
【００８０】
[0080]一部の実施形態では、細胞は、解乳化溶解細胞組成物を形成するために好適なｐＨで溶解される。一部の実施形態では、好適なｐＨは、既に本明細書で上記の塩基を添加する工程によって達成される。一部の実施形態では、好適なｐＨは、７〜１３；７〜１２；７〜１１；７〜１０；７〜９；８〜１３；８〜１２；８〜１１；８〜１０；８〜９；９〜１３；９〜１２；９〜１１；９〜１０；１０〜１３；１０〜１２および１０〜１１から選択される。他の実施形態では、好適なｐＨは、１０〜１３から選択される。さらにまた別の実施形態では、好適なｐＨは、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２および少なくとも１３から選択される。
【００８１】
[0081]一部の実施形態では、好適なｐＨは、細胞ブロスまたは組成物の重量（または容積）で約０．５％〜約２０％、約０．５％〜約１５％、約０．５％〜約１０％、約０．５％〜約９％、約０．５％〜約８％、約０．５％〜約７％、約０．５％〜約６％、約０．５％〜約５％、約０．５％〜約４％、約０．５％〜約３％、約０．５％〜約２％および約０．５％〜約１％から選択される量で塩基を添加する工程によって達成される。１つの実施形態では、好適なｐＨは、ブロスの重量で約０．５％〜約２０％の量で塩基を添加する工程によって達成される。
【００８２】
[0082]他の実施形態では、好適なｐＨは、既に本明細書で上記の酸を添加する工程によって達成される。一部の実施形態では、好適なｐＨは、７以下；約６．５以下；約６以下；約５．５以下；約５以下；約４．５以下；約４以下；約３．５以下；約３以下；約２．５以下；約２以下；約１．５以下；約１以下および約０．５以下から選択される。一部の実施形態では、好適なｐＨは、約６以下から選択される。他の実施形態では、ｐＨは、約０．５〜約７；約０．５〜約６．５；約０．５〜約６；約０．５〜約５．５；約０．５〜約５；約０．５〜約４．５；約０．５〜約４；約０．５〜約３．５；約０．５〜約３；約０．５〜約２．５；約０．５〜約２；約０．５〜約１．５；約０．５〜約１；約１〜約７；約１〜約６．５；約１〜約６；約１〜約５．５；約１〜約５；約１〜約４．５；約１〜約４；約１〜約３．５；約１〜約３；約１〜約２．５；約１〜約２；約１〜約１．５；約１．５〜約７；約１．５〜約６．５；約１．５〜約６；約１．５〜約５．５；約１．５〜約５；約１．５〜約４．５；約１．５〜約４；約１．５〜約３．５；約１．５〜約３；約１．５〜約２．５；約１．５〜約２；約２〜約７；約２〜約６．５；約２〜約６；約２〜約５．５；約２〜約５；約２〜約４．５；約２〜約４、約２〜約３．５；約２〜約３；約２〜約２．５；約２．５〜約７；約２．５〜約６．５；約２．５〜約６；約２．５〜約５．５；約２．５〜約５；約２．５〜約４．５；約２．５〜約４；約２．５〜約３．５；約２．５〜約３；約３〜約７；約３〜約６．５；約３〜約６；約３〜約５．５；約３〜約５；約３〜約４．５；約３〜約４；約３〜約３．５；約３．５〜約７；約３．５〜約６．５；約３．５〜約６；約３．５〜約５．５；約３．５〜約５；約３．５〜約４．５；約３．５〜約４；約４〜約７；約４〜約６．５；約４〜約６；約４〜約５．５；約４〜約５；約４〜約４．５；約４．５〜約７；約４．５〜約６．５；約４．５〜約６；約４．５〜約５．５；約４．５〜約５；約５〜約７；約５〜約６．５；約５〜約６；約５〜約５．５；約５．５〜約７；約５．５〜約６．５；約５．５〜約６；約６〜約７；約６〜約６．５および約６．５〜約７から選択される。一部の実施形態では、好適なｐＨは、約０．５〜約６から選択される。
【００８３】
[0083]一部の実施形態では、本方法は、未洗浄解乳化溶解細胞組成物を形成するために微生物油を含む未洗浄溶解細胞を解乳化する工程およびその後に未洗浄解乳化溶解細胞組成物から油を分離する工程を含んでいる。未洗浄解乳化溶解細胞組成物は、それにより溶解細胞組成物が、例えば後に遠心分離によって除去される水またはバッファーを用いて洗浄されない方法を意味する。溶解細胞組成物を洗浄する工程は、細胞から得られる油の総収率を減少させる可能性がある。
【００８４】
[0084]また別の実施形態では、溶解細胞組成物が洗浄される回数は、１回、２回、３回以上減少させることができる。一部の実施形態では、洗浄する工程は、１回、２回または３回以下である。
【００８５】
[0085]一部の実施形態では、溶解細胞組成物を形成する工程、溶解細胞組成物に乳化剤を添加する工程、溶解細胞組成物を酸と接触させる、もしくは溶解細胞組成物のｐＨを低下させる工程、溶解細胞組成物を塩と接触させる工程、溶解細胞組成物を加熱する工程および溶解細胞組成物を撹拌する工程の様々な組み合わせを単一容器内で発生させることができる。一部の実施形態では、細胞を形成する工程、細胞を酸と接触させる、もしくは溶解細胞組成物のｐＨを低下させる工程、溶解細胞組成物に乳化剤を添加する工程、細胞を塩と接触させる工程、細胞を加熱する工程および細胞を撹拌する工程の様々な組み合わせを単一容器内で発生させることができる。一部の実施形態では、単一容器は、発酵容器を含んでいる。一部の実施形態では、発酵容器は、少なくとも２０，０００Ｌ、少なくとも５０，０００Ｌ、少なくとも１００，０００Ｌ、少なくとも１２０，０００Ｌ、少なくとも１５０，０００Ｌ、少なくとも２００，０００Ｌまたは少なくとも２２０，０００Ｌの容積を有することができる。一部の実施形態では、発酵容器は、２０，０００Ｌ〜２２０，０００Ｌ、２０，０００Ｌ〜１００，０００Ｌ、２０，０００Ｌ〜５０，０００Ｌ、５０，０００Ｌ〜２２０，０００Ｌ、５０，０００Ｌ〜１５０，０００Ｌ、５０，０００Ｌ〜１００，０００Ｌ、１００，０００Ｌ〜２２０，０００Ｌ、１００，０００Ｌ〜１５０，０００Ｌ、１００，０００Ｌ〜１２０，０００Ｌ、１５０，０００Ｌ〜２２０，０００Ｌ、１５０，０００Ｌ〜２００，０００Ｌまたは２００，０００Ｌ〜２２０，０００Ｌの容積を有することができる。
【００８６】
[0086]一部の実施形態では、容器内で形成された多量の細胞および／または溶解細胞組成物は、１つ以上の撹拌容器内に移すことができる。一部の実施形態では、撹拌容器は、少なくとも２０，０００Ｌ、少なくとも３０，０００Ｌ、少なくとも４０，０００Ｌまたは少なくとも５０，０００Ｌの容積を有する。一部の実施形態では、撹拌容器は、２０，０００Ｌ〜５０，０００Ｌ、２０，０００Ｌ〜４０，０００Ｌ、２０，０００Ｌ〜３０，０００Ｌ、３０，０００Ｌ〜５０，０００Ｌ、３０，０００Ｌ〜４０，０００Ｌまたは４０，０００Ｌ〜５０，０００Ｌの容積を有することができる。
【００８７】
[0087]一般に、本明細書に記載した方法は、微生物細胞から微生物油を入手する、分離する、またはさもなければ回収するために有機溶媒を利用しない。一部の実施形態では、微生物細胞から微生物油を入手する際に有機溶媒は使用されない。また別の実施形態では、有機溶媒は、微生物油を入手するために十分な量または濃度で細胞に添加されない、溶解細胞組成物に添加されない、および／または本明細書に開示した方法中に油に添加されない。有機溶媒には、極性溶媒、非極性溶媒、水混和性溶媒、水非混和性溶媒およびそれらの組み合わせが含まれる。
【００８８】
[0088]一部の実施形態では、本方法は、解乳化溶解細胞組成物から油を分離する工程をさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、解乳化溶解細胞組成物を遠心分離する工程によって解乳化溶解細胞組成物から油を分離する工程を含む。一部の実施形態では、解乳化溶解細胞組成物を放置することによって解乳化溶解細胞組成物から油が分離されるが、このとき油は重力を使用して解乳化溶解細胞組成物から（例えば、分離層として）分離される。一部の実施形態では、分離は、親油性膜によって達成される。一部の実施形態では、分離する工程は、１０℃〜１００℃の温度で遠心分離する工程を含む。一部の実施形態では、油は、最初にｐＨを（例えば、本明細書で上記の塩基を添加する工程によって）上昇させ、その後に油を入手するために解乳化溶解細胞組成物を遠心分離する工程によって解乳化溶解細胞組成物から分離される。
【００８９】
[0089]一部の実施形態では、解乳化溶解細胞組成物のｐＨは、解乳化溶解細胞組成物に塩基を添加する工程によって上昇させられる。解乳化溶解細胞組成物に添加できる塩基は、上記の塩基と同一である。一部の実施形態では、ｐＨは、約７．５以上；約８以上；約９以上；約１０以上；約１１以上および約１２以上から選択される。他の実施形態では、ｐＨは、７〜１３；７〜１２；７〜１１；７〜１０；７〜９；８〜１３；８〜１２；８〜１１；８〜１０；８〜９；９〜１２；９〜１１；９〜１０；１０〜１２および１０〜１１のｐＨから選択される。
【００９０】
[0090]一部の実施形態では、本方法は、少なくとも１０℃、少なくとも２０℃、少なくとも２５℃、少なくとも３０℃、少なくとも３５℃、少なくとも４０℃、少なくとも４５℃、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、少なくとも７０℃、少なくとも７５℃、少なくとも８０℃、少なくとも８５℃、少なくとも９０℃、少なくとも９５℃または少なくとも１００℃の温度で解乳化溶解細胞組成物を遠心分離する工程によって解乳化溶解細胞組成物から油を分離する工程を含む。一部の実施形態では、本方法は、１０℃〜１００℃、１０℃〜９０℃、１０℃〜８０℃、２０℃〜１００℃、２０℃〜９０℃、２０℃〜８０℃、２５℃〜１００℃、２５℃〜９０℃、２５℃〜８０℃、２５℃〜７５℃、３０℃〜１００℃、３０℃〜９０℃、３０℃〜８０℃、４０℃〜１００℃、４０℃〜９０℃、４０℃〜８０℃、５０℃〜１００℃、５０℃〜９０℃、５０℃〜８０℃、５０℃〜７０℃、６０℃〜１００℃、６０℃〜９０℃、６０℃〜８０℃、６０℃〜７０℃、７０℃〜１００℃、７０℃〜９０℃、７０℃〜８０℃、８０℃〜１００℃、８０℃〜９０℃または９０℃〜１００℃の温度で解乳化溶解細胞組成物を遠心分離する工程によって解乳化溶解細胞組成物から油を分離する工程を含む。
【００９１】
[0091]一部の実施形態では、遠心分離する工程は、（解乳化溶解細胞組成物の遠心分離機への）１キログラム／分（ｋｇ／分）〜５００ｋｇ／分、１ｋｇ／分〜４００ｋｇ／分、１ｋｇ／分〜３００ｋｇ／分、１ｋｇ／分〜２００ｋｇ／分、１ｋｇ／分〜１００ｋｇ／分、１ｋｇ／分〜７５ｋｇ／分、１ｋｇ／分〜５０ｋｇ／分、１ｋｇ／分〜４０ｋｇ／分、１ｋｇ／分〜３０ｋｇ／分、１ｋｇ／分〜２５ｋｇ／分、１ｋｇ／分〜１０ｋｇ／分、１０ｋｇ／分〜５００ｋｇ／分、１０ｋｇ／分〜４００ｋｇ／分、１０ｋｇ／分〜３００ｋｇ／分、１０ｋｇ／分〜２００ｋｇ／分、１０ｋｇ／分〜１００ｋｇ／分、１０ｋｇ／分〜７５ｋｇ／分、１０ｋｇ／分〜５０ｋｇ／分、１０ｋｇ／分〜４０ｋｇ／分、１０ｋｇ／分〜３０ｋｇ／分、２０ｋｇ／分〜５００ｋｇ／分、２０ｋｇ／分〜４００ｋｇ／分、２０ｋｇ／分〜３００ｋｇ／分、２０ｋｇ／分〜２００ｋｇ／分、２０ｋｇ／分〜１００ｋｇ／分、２０ｋｇ／分〜７５ｋｇ／分、２０ｋｇ／分〜５０ｋｇ／分、２０ｋｇ／分〜４０ｋｇ／分、２５ｋｇ／分〜５００ｋｇ／分、２５ｋｇ／分〜４００ｋｇ／分、２５ｋｇ／分〜３００ｋｇ／分、２５ｋｇ／分〜２００ｋｇ／分、２５ｋｇ／分〜１００ｋｇ／分、２５ｋｇ／分〜７５ｋｇ／分、２５ｋｇ／分〜５０ｋｇ／分、３０ｋｇ／分〜６０ｋｇ／分、３０ｋｇ／分〜５０ｋｇ／分、３０ｋｇ／分〜４０ｋｇ／分、５０ｋｇ／分〜５００ｋｇ／分、１００ｋｇ／分〜５００ｋｇ／分または２００ｋｇ／分〜５００ｋｇ／分の供給速度で実施される。
【００９２】
[0092]一部の実施形態では、本方法は、１，０００ｇ〜２５，０００ｇ、１，０００ｇ〜２０，０００ｇ、１，０００ｇ〜１０，０００ｇ、２，０００ｇ〜２５，０００ｇ、２，０００ｇ〜２０，０００ｇ、２，０００ｇ〜１５，０００ｇ、３，０００ｇ〜２５，０００ｇ、３，０００ｇ〜２０，０００ｇ、５，０００ｇ〜２５，０００ｇ、５，０００ｇ〜２０，０００ｇ、５，０００ｇ〜１５，０００ｇ、５，０００ｇ〜１０，０００ｇ、５，０００ｇ〜８，０００ｇ、１０，０００ｇ〜２５，０００ｇ、１５，０００ｇ〜２５，０００ｇまたは少なくとも１，０００ｇ、少なくとも２，０００ｇ、少なくとも４，０００ｇ、少なくとも５，０００ｇ、少なくとも７，０００ｇ、少なくとも８，０００ｇ、少なくとも１０，０００ｇ、少なくとも１５，０００ｇ、少なくとも２０，０００ｇまたは少なくとも２５，０００ｇの遠心力で解乳化溶解細胞組成物を遠心分離する工程を含む。本明細書で使用する「ｇ」は、標準重力またはおよそ９．８ｍ／ｓ２を意味する。一部の実施形態では、本方法は、解乳化溶解細胞組成物を４，０００ｒｐｍ〜１４，０００ｒｐｍ、４，０００ｒｐｍ〜１０，０００ｒｐｍ、６，０００ｒｐｍ〜１４，０００ｒｐｍ、６，０００ｒｐｍ〜１２，０００ｒｐｍ、８，０００〜１４，０００ｒｐｍ、８，０００ｒｐｍ〜１２，０００ｒｐｍまたは８，０００ｒｐｍ〜１０，０００ｒｐｍで遠心分離する工程を含んでいる。
【００９３】
[0093]一部の実施形態では、油は、例えば、デカントする工程、脱脂する工程、真空吸引する工程、ポンピングする工程、吸出し吸引する工程、引抜き吸引する工程、サイフォン吸引する工程、またはさもなければ分離した組成物の表面から微生物油を回収する工程によって回収することができる。
【００９４】
[0094]一部の実施形態では、本方法は、油から水を除去するために回収されている油を乾燥する工程を含む。一部の実施形態では、油を加熱する工程は、水を蒸発させるために油を加熱する工程を含むことができるがそれには限定されない。一部の実施形態では、乾燥する工程後、油は油の重量（または容積）％（パーセンテージ）で３％未満、２．５％未満、２％未満、１．５％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満または０％である含水率を有する。一部の実施形態では、乾燥する工程後、油は、油の重量（または容積）％で０％〜３％、０％〜２．５％、０％〜２％、０％〜１．５％、０％〜１％、０％〜０．５％、０．１％〜３％、０．１％〜２．５％、０．１％〜２％、０．１％〜１．５％、０．１％〜１％、０．１％〜０．５％、０．５％〜３％、０．５％〜２．５％、０．５％〜２％、０．５％〜１．５％、０．５％〜１％、１％〜３％、１％〜２．５％、１％〜２％、１％〜１．５％、１．５％〜３％、１．５％〜２．５％、１．５％〜２％、２％〜３％、２％〜２．５％または２．５％〜３％の含水率を有する。
【００９５】
[0095]本明細書では、本明細書に開示した方法のいずれかによって微生物細胞から入手できる微生物油が開示される。一部の実施形態では、油は、少なくとも３０重量（または容積）％のアラキドン酸を含む。一部の実施形態では、油は、少なくとも３０重量（または容積）％のドコサヘキサエン酸を含む。
【００９６】
[0096]アニシジン値（ＡＶ）は、ＡＯＣＳ公式法Ｃｄ  １８−９０にしたがって決定される。１つの実施形態では、本明細書に記載した油は、約５０未満；約４０未満；約３０未満；約２０未満；約１５未満または約１０未満のＡＶを有する。一部の実施形態では、油は、約５０未満のＡＶを有する。用語の「アニシジン値」は、例えば油の酸化中に発生するアルデヒドおよびケトンなどの二次反応産物の尺度を意味する。
【００９７】
[0097]ペルオキシド値（ＰＶ）は、ＡＯＣＳ公式法Ｃｄ  ８−５３にしたがって決定される。１つの実施形態では、本明細書に記載した油は、約２０ｍｅｑ／ｋｇ未満；約１０ｍｅｑ／ｋｇ未満または約５ｍｅｑ／ｋｇ未満のＰＶを有する。一部の実施形態では、油は、約５ｍｅｑ／ｋｇ未満のＰＶを有する。用語の「ペルオキシド値」は、油の酸化中に発生する、例えばペルオキシドおよびヒドロペルオキシドなどの一次反応産物の尺度を意味する。本明細書で使用するペルオキシド値は、ｍｅｑ／ｋｇで測定される。
【００９８】
[0098]一部の実施形態では、油は、１００ｐｐｍ以下、９５ｐｐｍ以下、９０ｐｐｍ以下、８５ｐｐｍ以下、８０ｐｐｍ以下、７５ｐｐｍ以下、７０ｐｐｍ以下、６５ｐｐｍ以下、６０ｐｐｍ以下、５５ｐｐｍ以下、５０ｐｐｍ以下、４５ｐｐｍ以下、４０ｐｐｍ以下、３５ｐｐｍ以下、３０ｐｐｍ以下、２５ｐｐｍ以下、２０ｐｐｍ以下、１５ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下、９ｐｐｍ以下、８ｐｐｍ以下、７ｐｐｍ以下、６ｐｐｍ以下、５ｐｐｍ以下、４ｐｐｍ以下、３ｐｐｍ以下、２ｐｐｍ以下または１ｐｐｍ以下のリン含量を有する。一部の実施形態では、油は、８ｐｐｍ以下のリン含量を有する。
【００９９】
[0099]一部の実施形態では、油は、１種以上のＰＵＦＡを含む。一部の実施形態では、油は、（ＰＵＦＡの重量で）少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％のＰＵＦＡを含む。一部の実施形態では、油は、（ＤＨＡの重量で）少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％のＤＨＡを含む、および／または（ＤＰＡ  ｎ−６の重量で）少なくとも１０％、少なくとも１５％または少なくとも２０％のＤＰＡ  ｎ−６、および／または（ＥＰＡの重量で）少なくとも１０％、少なくとも１５％または少なくとも２０％のＥＰＡ、および／または（ＡＲＡの重量で）少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％または少なくとも８０％のＡＲＡを含む。一部の実施形態では、油は、（ＥＰＡの重量で）５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満または５％未満のＥＰＡを含む。一部の実施形態では、油は、（ＤＨＡの重量で）５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満または５％未満のＤＨＡを含む。一部の実施形態では、油は、重量（または容積）で１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満または０．５％未満のステロールを含む。
【０１００】
[0100]一部の実施形態では、油は、重量（または容積）で少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または５０％〜９５％、５０％〜９０％、５０％〜８５％、５０％〜８０％、５０％〜７５％、６０％〜９５％、６０％〜９０％、６０％〜８５％、７０％〜９５％、７０％〜９０％、７０％〜８５％、７５％〜９５％、７５％〜９０％または７５％〜８５％のトリグリセリドを含む。
【０１０１】
[0101]一部の実施形態では、トリグリセリドは、重量（または容積）で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％のＤＨＡを含む。一部の実施形態では、トリグリセリドは、重量（または容積）で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％または少なくとも８０％のＡＲＡを含む。一部の実施形態では、トリグリセリドは、重量（または容積）で少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１５％、少なくとも１０％または少なくとも５％のＥＰＡを含む。
【０１０２】
[0102]１つの実施形態では、本明細書に記載した方法のいずれかによって入手および／または回収された微生物油は原油である。また別の実施形態では、本明細書に記載した油は精製油である。「原油」は、それ以上加工処理せずに微生物細胞から入手される油である。「精製油」は、精製する、漂白するおよび／または脱臭する標準的な加工処理を用いて原油を処理することによって入手される油である。例えば、米国特許第５，１３０，２４２号明細書を参照されたい。一部の実施形態では、精製する工程には、焼灼精製、ゴム除去、酸処理、アルカリ処理、冷却、加熱、漂白、脱臭、脱酸およびそれらの組み合わせが含まれるがそれらに限定されない。
【０１０３】
[0103]一部の実施形態では、本方法は、微生物細胞を含む発酵ブロスを濃縮する工程を含む。一部の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物を濃縮する工程を含む。本明細書で使用する「濃縮する工程」は、組成物から水を除去する工程を意味する。濃縮する工程には、蒸発させる工程、化学的に乾燥する工程、遠心分離する工程などおよびそれらの組み合わせを含むことができるがそれらに限定されない。一部の実施形態では、細胞組成物または溶解細胞組成物は、溶解細胞組成物の重量（または容積）で少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％または少なくとも３０％の油濃度を提供するために濃縮される。一部の実施形態では、細胞組成物または溶解細胞組成物は、溶解細胞組成物の重量（または容積）で４％〜４０％、４％〜３０％、４％〜２０％、４％〜１５％、５％〜４０％、５％〜３０％、５％〜２０％、１０％〜４０％、１０％〜３０％、１０％〜２０％、１５％〜４０％、１５％〜３０％、２０％〜４０％、２０％〜３０％、２５％〜４０％または３０％〜４０％の油濃縮物を提供するために濃縮される。
【０１０４】
[0104]本発明とともに使用するための微生物細胞にとって効果的な培養条件には、油生産を許容する効果的な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素条件が含まれるがそれらに限定されない。効果的な培地は、その中で微生物細胞、例えばスラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目微生物細胞が培養される任意の培地を意味する。そのような培地は、典型的には、同化できる炭素、窒素およびリン酸塩基源ならびに適切な塩、鉱物、金属および他の栄養素、例えばビタミン類を有する水性培地を含んでいる。本発明とともに使用するための微生物細胞は、従来型発酵バイオリアクター、振とうフラスコ、試験管、マイクロタイター皿およびペトリ皿内で培養できる。
【０１０５】
[0105]一部の実施形態では、微生物細胞は、少なくとも３０重量（または容積）％の油、少なくとも３５重量（または容積）％の油、少なくとも４０重量（または容積）％の油、少なくとも５０重量（または容積）％の油、少なくとも６０重量（または容積）％の油、少なくとも７０重量（または容積）％の油または少なくとも８０重量（または容積）％の油を含む。一部の実施形態では、本発明とともに使用するための微生物細胞は、少なくとも０．１グラム／Ｌ／時（ｇ／Ｌ／時）のＤＨＡ、少なくとも０．２ｇ／Ｌ／時のＤＨＡ、少なくとも０．３ｇ／Ｌ／時のＤＨＡまたは少なくとも０．４ｇ／Ｌ／時のＤＨＡを生成できる。一部の実施形態では、本発明とともに使用するための微生物細胞は、少なくとも０．０１グラム／Ｌ／時（ｇ／Ｌ／時）のＡＲＡ、少なくとも０．０５ｇ／Ｌ／時のＡＲＡ、少なくとも０．１ｇ／Ｌ／時のＡＲＡ、少なくとも０．２ｇ／Ｌ／時のＡＲＡ、少なくとも０．３ｇ／Ｌ／時のＡＲＡまたは少なくとも０．４ｇ／Ｌ／時のＡＲＡを生成できる。
【０１０６】
[0106]一部の実施形態では、本明細書に記載した方法のいずれかによって入手される油、消費されたバイオマスまたはそれらの組み合わせは、例えばベビーフード、人工栄養乳、飲料、ソース、乳製品を主原料とする食品（例えば、牛乳、ヨーグルト、チーズおよびアイスクリーム）、油（例えば、調理油またはサラダドレッシング）およびオーブンで焼いた商品；栄養補助食品（例えば、カプセル形もしくは錠剤形）；任意の非ヒト動物（例えば、それらの製品（例えば、肉、乳汁もしくは卵）がヒトによって消費される動物）用の飼料または飼料添加物；食品添加物；および医薬品（直接的または補助療法の用途において）などの食品または食品成分として直接的に使用できる。用語「動物」は、動物界に属するあらゆる生物を意味しており、それらから製品（例えば、乳汁、卵、家禽肉、牛肉、豚肉または羊肉）が由来する任意のヒト動物および非ヒト動物が含まれる。一部の実施形態では、油および／またはバイオマスは海産食品において使用できる。海産食品は、限定なく、魚、エビおよび貝類に由来する。用語「製品」には、限定なく、肉、卵、乳汁または他の製品を含むそのような動物に由来する任意の製品が含まれる。油および／またはバイオマスがそのような動物に与えられる場合、多価不飽和油は、これらの油中のそれらの含量を増加させるためにそのような動物の肉、乳汁、卵または他の製品に組み込むことができる。
【０１０７】
［実施例］
［実施例１］
[0107]微生物細胞（シゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．））を含有する細胞ブロス（３００ｇ）を６０℃で１時間低温殺菌した。未洗浄細胞ブロスを１８０ＲＰＭの速度で撹拌し、６０℃へ加熱した。細胞はブロスのｐＨを７〜７．５へ調整するために５０重量％のＮａＯＨ溶液およびＡｌｃａｌａｓｅ（登録商標）２．４ＦＧ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（ノースカロライナ州フランクリントン（Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ））から入手可能）をブロス重量に基づいて０．５％の量で添加する工程により溶解した。撹拌を維持しながら、溶解細胞組成物のｐＨは、９８重量％のＨ２ＳＯ４溶液を添加する工程によって４へ調整した。溶解細胞組成物の重量で２％の量の固体のＮａＣｌを添加し、この組成物を９０℃へ加熱し、２０時間保持した。５０重量％のＮａＯＨ溶液を添加する工程によって組成物のｐＨを７．５〜８．５へ調整し、その後原油を生じさせるために８０００ｒｐｍで５分間遠心分離（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｒｖｅｌｌ  ＳＴ４０Ｒ遠心機）すると、これは（ＤＨＡの重量で）９１．７％のＤＨＡを産生した。
【０１０８】
［実施例２］
[0108]微生物細胞（シゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．））を含有する細胞ブロス（３００ｇ）を６０℃で１時間低温殺菌した。解乳化溶解細胞組成物は、細胞ブロスのｐＨを２に調整するために重量で２０％のＨ２ＳＯ４溶液を添加し、その後にこのブロスを９０℃へ加熱し、４５時間保持することによって形成した。組成物のｐＨを７．５〜８．５へ調整するために５０重量％のＮａＯＨ溶液を添加し、その後に原油を生じさせるためにこの組成物を８０００ｒｐｍで５分間遠心分離する（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｓｏｒｖｅｌｌ  ＳＴ４０Ｒ遠心機）工程によって解乳化溶解細胞組成物から微生物油を分離すると、これは（ＤＨＡの重量で）５１．６２％のＤＨＡを産生した。
【０１０９】
［実施例３］
[0109]微生物細胞（シゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．））を含有する細胞ブロス（３００ｇ）を６０℃で１時間低温殺菌した。解乳化溶解細胞組成物は、細胞ブロスのｐＨを２に調整するために、２０重量％のＨ２ＳＯ４溶液、ブロスの重量で２％の量の固体ＮａＣｌを添加する工程；およびブロスを９０℃へ加熱して１８時間保持する工程によって形成した。原油を生じさせるためにこの組成物を８０００ＲＰＭで５分間遠心分離する（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｓｏｒｖｅｌｌ  ＳＴ４０Ｒ遠心機で）工程によって解乳化溶解細胞組成物から微生物油を分離すると、これは（ＤＨＡの重量で）３８．８２％のＤＨＡを産生した。
【０１１０】
［実施例４］
[0110]微生物細胞（シゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．））を含有する細胞ブロス（３００ｇ）を６０℃で１時間低温殺菌した。解乳化溶解細胞組成物は、ブロスの重量で２％の、９８重量％のＨ２ＳＯ４溶液を添加し、ブロスを９０℃で４時間加熱する工程によって形成した。組成物のｐＨを７〜８．５へ調整するために５０重量％のＮａＯＨ溶液を添加し、９０℃で２１時間保持し、その後に原油を生じさせるためにこの組成物を８０００ＲＰＭで５分間遠心分離する（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｓｏｒｖｅｌｌ  ＳＴ４０Ｒ遠心機）工程によって解乳化溶解細胞組成物から微生物油を分離すると、これは（ＤＨＡの重量で）７２％のＤＨＡを産生した。原油は、１４５のアニシジン値（ＡＶ）を有していた。
【０１１１】
［実施例５］
[0111]微生物細胞（シゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．））を含有する細胞ブロス（３００ｇ）を６０℃で１時間低温殺菌した。未洗浄細胞ブロスを１８０ＲＰＭの速度で撹拌し、６０℃へ加熱した。細胞はブロスのｐＨを７〜７．５へ調整するために５０重量％のＮａＯＨ溶液およびＡｌｃａｌａｓｅ  ２．４ＦＧ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（ノースカロライナ州フランクリントン）をブロス重量に基づいて０．５％の量で添加する工程により溶解した。撹拌を維持しながら、溶解細胞組成物のｐＨは、９８重量％のＨ２ＳＯ４溶液を添加する工程、およびその後に組成物を９０℃へ加熱する工程によって４へ調整した。９０℃で４５時間放置した後、原油を生じさせるためにこの組成物を８０００ＲＰＭで５分間遠心分離すると（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｓｏｒｖｅｌｌ  ＳＴ４０Ｒ遠心機）、これは（ＤＨＡの重量で）８１％のＤＨＡを産生した。原油は、１４．５のＡＶを有している。
【０１１２】
［実施例６］
[0112]微生物細胞（シゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．））を含有する細胞ブロス（３００ｇ）を６０℃で１時間低温殺菌した。解乳化溶解細胞組成物は、ブロスの重量で２．５％の、９８重量％のＨ２ＳＯ４溶液を添加する工程、およびその後にブロスを９０℃へ５時間加熱する工程によって形成した。組成物のｐＨを７〜８．５へ調整するために５０重量％のＮａＯＨ溶液を添加し、９０℃で数時間保持した後、その後に原油を生じさせるためにこの組成物を８０００ＲＰＭで５分間遠心分離する（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｓｏｒｖｅｌｌ  ＳＴ４０Ｒ遠心機）工程によって解乳化溶解細胞組成物から微生物油を分離すると、これは（ＤＨＡの重量で）９２．５％のＤＨＡを産生した。
【０１１３】
［実施例７］
[0113]微生物細胞（シゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．））を含有する細胞ブロス（３５０ｇ）を６０℃で１時間低温殺菌した。解乳化溶解細胞組成物は、ブロスの重量で２％の、９８重量％のＨ２ＳＯ４溶液を添加する工程、およびその後にブロスを９０℃へ５〜６時間加熱する工程によって形成した。組成物のｐＨを７〜８．５へ調整するために５０重量％のＮａＯＨ溶液を添加し、９０℃で数時間保持した後、その後に原油を生じさせるためにこの組成物を８０００ＲＰＭで５分間遠心分離する（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｓｏｒｖｅｌｌ  ＳＴ４０Ｒ遠心機）工程によって解乳化溶解細胞組成物から微生物油を分離すると、これは（ＤＨＡの重量で）８２．６３％のＤＨＡを産生した。
【０１１４】
［実施例８］
[0114]微生物細胞（シゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．））を含有する細胞ブロス（３５０ｇ）を６０℃で１時間低温殺菌した。解乳化溶解細胞組成物は、ブロスの重量で１％の、９８重量％のＨ２ＳＯ４溶液を添加する工程、およびその後にブロスを９０℃へ５〜１０時間加熱する工程によって形成した。ｐＨを７〜８．５へ調整するために５０重量％のＮａＯＨ溶液を添加する工程、および原油を生じさせるためにこの組成物を８０００ＲＰＭで５分間遠心分離する（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｓｏｒｖｅｌｌ  ＳＴ４０Ｒ遠心機）工程によって解乳化溶解細胞組成物から微生物油を分離すると、これは（ＤＨＡの重量で）４２％のＤＨＡを産生した。
【０１１５】
［実施例９］
[0115]微生物細胞（シゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．））を含有する細胞ブロス（３５０ｇ）を６０℃で１時間低温殺菌した。解乳化溶解細胞組成物は、ブロスの重量で３％の、９８重量％のＨ２ＳＯ４溶液を添加する工程、およびその後にブロスを９０℃へ１〜５時間加熱する工程によって形成した。ｐＨを７〜８．５へ調整するために５０重量％のＮａＯＨ溶液を添加する工程、および原油を生じさせるためにこの組成物を８０００ＲＰＭで５分間遠心分離する（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｓｏｒｖｅｌｌ  ＳＴ４０Ｒ遠心機）工程によって解乳化溶解細胞組成物から微生物油を分離すると、これは（ＤＨＡの重量で）８８％のＤＨＡを産生した。
【０１１６】
［実施例１０］
[0116]微生物細胞（シゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．））を含有する細胞ブロス（３５０ｇ）を６０℃で１時間低温殺菌した。解乳化溶解細胞組成物は、ブロスの重量で４％の、７０重量％の硝酸溶液を添加する工程、およびその後にブロスを９０℃へ１時間加熱する工程によって形成した。ｐＨを７〜８．５へ調整するために５０重量％のＮａＯＨ溶液を添加する工程、および原油を生じさせるためにこの組成物を８０００ＲＰＭで５分間遠心分離する（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｓｏｒｖｅｌｌ  ＳＴ４０Ｒ遠心機）工程によって解乳化溶解細胞組成物から微生物油を分離すると、これは（ＤＨＡの重量で）８２％のＤＨＡを産生した。
【０１１７】
［実施例１１］
[0117]微生物細胞（シゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．））を含有する細胞ブロス（３５０ｇ）を６０℃で１時間低温殺菌した。解乳化溶解細胞組成物は、ブロスの重量で２％の、７０重量％の硝酸溶液を添加する工程、およびブロスを９０℃へ５〜６時間加熱する工程によって形成した。ｐＨを７〜８．５へ調整するために５０重量％のＮａＯＨ溶液を添加する工程、および原油を生じさせるためにこの組成物を８０００ＲＰＭで５分間遠心分離する（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｓｏｒｖｅｌｌ  ＳＴ４０Ｒ遠心機）工程によって解乳化溶解細胞組成物から微生物油を分離すると、これは（ＤＨＡの重量で）５８．５％のＤＨＡを産生した。
【０１１８】
［実施例１２］
[0118]微生物細胞（シゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．））を含有する細胞ブロス（３５０ｇ）を６０℃で１時間低温殺菌した。解乳化溶解細胞組成物は、ブロスの重量で２．５％の、７０重量％の硝酸溶液を添加する工程、およびブロスを９０℃へ５時間加熱する工程によって形成した。ｐＨを７〜８．５へ調整するために５０重量％のＮａＯＨ溶液を添加し、９０℃で数時間保持した後、その後に原油を生じさせるためにこの組成物を８０００ＲＰＭで５分間遠心分離する（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｓｏｒｖｅｌｌ  ＳＴ４０Ｒ遠心機）工程によって解乳化溶解細胞組成物から微生物油を分離すると、これは（ＤＨＡの重量で）７４％のＤＨＡを産生した。
【０１１９】
［実施例１３］
[0119]微生物細胞（シゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．））を含有する細胞ブロス（３５０ｇ）を６０℃で１時間低温殺菌した。解乳化溶解細胞組成物は、ブロスの重量で４％のリン酸を添加する工程、およびブロスを９０℃へ５時間加熱する工程によって形成した。組成物のｐＨを７〜８．５へ調整するために５０重量％のＮａＯＨ溶液を添加し、９０℃で数時間保持した後、その後に原油を回収するためにこの組成物を８０００ＲＰＭで５分間遠心分離する（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｓｏｒｖｅｌｌ  ＳＴ４０Ｒ遠心機）工程によって解乳化溶解細胞組成物から微生物油を分離した。この組成物の４５ｇのサンプルは、１．０ｍＬの原油を産生した。
【０１２０】
［実施例１４］
[0120]微生物細胞（シゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．））を含有する細胞ブロス（３５０ｇ）を６０℃で１時間低温殺菌した。解乳化溶解細胞組成物は、ブロスの重量で８％のリン酸を添加する工程、およびブロスを９０℃へ３時間加熱する工程によって形成した。組成物のｐＨを７〜８．５へ調整するために５０重量％のＮａＯＨ溶液を添加し、９０℃で数時間保持した後、その後に原油を回収するためにこの組成物を８０００ＲＰＭで５分間遠心分離する（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｓｏｒｖｅｌｌ  ＳＴ４０Ｒ遠心機）工程によって解乳化溶解細胞組成物から微生物油を分離した。この組成物の４５ｇのサンプルは、０．５ｍＬの原油を産生した。
【０１２１】
［実施例１５］
[0121]微生物細胞（シゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．））を含有する細胞ブロス（２０００Ｌ）を１９０ｒｐｍで攪拌する処理タンク内に配置した。解乳化溶解細胞組成物は、ブロスの重量で４％の、９８重量％のＨ２ＳＯ４溶液を添加する工程、およびブロスを９０〜９５℃へ１時間加熱することによって形成した。組成物を７５℃へ冷却し、ｐＨを７〜８．５へ調整するために５０重量％のＮａＯＨ溶液を添加し、組成物を一晩混合し、原油を生じさせるために１７５４ＲＰＭ、８Ｌ／分で組成物をインラインで遠心分離する工程によって解乳化溶解細胞組成物から微生物油を分離すると、（ＤＨＡの重量で）９３％のＤＨＡおよび０．６９ｍｅｑのペルオキシド値（ＰＶ）、２３．９のＡＶおよび１．０４の遊離脂肪酸（ＦＦＡ）含量を備える原油が産生した。
【０１２２】
［実施例１６］
[0122]微生物細胞（シゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．））を含有する細胞ブロス（５５０Ｌ）を１９３ｒｐｍで攪拌する処理タンク内に配置した。細胞ブロスを６０℃へ加熱し、５０重量％のＮａＯＨ溶液を添加する工程によってｐＨを７．３〜７．５に調整し、アルカラーゼをブロスの重量で０．５％の量で添加した。２時間後、９８重量％のＨ２ＳＯ４溶液を添加する工程によって溶解細胞組成物のｐＨを４に調整し、撹拌を維持しながら９０℃へ加熱した。９０℃で２０時間後、組成物を７５℃へ冷却し、５０重量％のＮａＯＨ溶液を添加する工程によってｐＨを８．５へ調整し、組成物を一晩保持し、原油を生じさせるために１７５４ＲＰＭ、８Ｌ／分で組成物をインラインで遠心分離する工程によって解乳化溶解細胞組成物から微生物油を分離すると、（ＤＨＡの重量で）８４％のＤＨＡおよび０ｍｅｑのＰＶ、７．３のＡＶならびに０．１７のＦＦＡ含量を備える原油が産生した。
【０１２３】
［実施例１７］
[0123]微生物細胞（モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属）を含有する細胞ブロス（２５００〜３０００Ｌ）は、沈着させるために数時間にわたりデカンテーションタンク内に配置した。沈着したら、バイオマス無含有液体の５０〜６０％を廃棄するためにポンプ作用で排出した。濃縮未洗浄低温殺菌細胞ブロスは、その後に処理タンクとインライン関係にある高剪断ミキサー（６０ＨｚでＳｉｅｍｅｎｓ  ＵＬＴＲＡ−Ｔｕｒｒａｘ  ＵＴＬ  １０００／１０）に通して通過させた。解乳化溶解細胞組成物は、ｐＨを０．９〜１．５に調整するために、ブロスの重量で３％の、９８重量％のＨ２ＳＯ４溶液を添加する工程によって形成し、脱イオン水中のブロスの１０ｍＬ希釈液中の１ｍＬが２５μｍ以下の粒径を生じさせるまで９４℃へ２０〜２４時間加熱した。解乳化溶解細胞組成物は、固形含量１０％（Ｏｍｎｉｍａｒｋ  Ｕｗａｖｅ湿度計を用いて生成した数字）へ脱酸素水を用いて希釈し、水の添加が８５℃未満への温度低下を引き起こした場合は８５℃へ再加熱した。微生物油は、組成物を３０分間混合しながら、またはサンプルの遠心分離がエマルジョン相の完全な非存在を証明するまでｐＨを７．８〜８．２へ調整するために５０％のＮａＯＨ溶液を添加することにより、および原油を回収するために１７５０ＲＰＭおよび７Ｌ／分の流量で７〜１０時間にわたりインラインで遠心分離（Ｓｅｉｔａｌ  ＳＲ１０１０）することにより解乳化溶解細胞組成物から分離した。
【０１２４】
[0124]細胞ブロスの３つの個別バッチには、各々独立して上記の方法を受けさせた。
バッチ１の原油は、８６．６％のＡＲＡ（ＡＲＡの重量で）ならびに２６．１のＡＶおよび０．３９ｍｅｑのＰＶを備える乾燥濾過原油を産生した。
バッチ２の原油は、８７．６％のＡＲＡ（ＡＲＡの重量で）ならびに１４のＡＶおよび０．３１ｍｅｑのＰＶを備える乾燥濾過原油を産生した。
バッチ３の原油は、８５％のＡＲＡ（ＡＲＡの重量で）ならびに２４．７のＡＶおよび０．５１ｍｅｑのＰＶを備える乾燥濾過原油を産生した。
【０１２５】
［実施例１８］
[0125]微生物細胞（モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属）を含有する細胞ブロス（１０００ｍＬ）を７０℃で１時間低温殺菌した。解乳化溶解細胞組成物は、ｐＨを０．７〜１．０のｐＨに調整するためにブロスの重量で４％の硝酸（７０％溶液）を添加する工程、および２００ｒｐｍの速度で３０時間撹拌しながらブロスを９０℃へ加熱する工程によって形成した。ｐＨを８．０〜８．２へ調整するためにＮａＯＨの５０重量／重量％溶液を添加し、その後に原油を生じさせるためにこの組成物を８，０００ｇで５分間遠心分離する（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｓｏｒｖｅｌｌ  ４０Ｒ）工程によって解乳化溶解細胞組成物から微生物油を分離すると、これは（ＡＲＡの重量で）７４．１３％のＡＲＡおよび２７．９のＡＶを備える原油を産生した。
【０１２６】
［実施例１９］
[0126]微生物細胞（モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属）を含有する細胞ブロス（１０００ｍＬ）を７０℃で１時間低温殺菌した。解乳化溶解細胞組成物は、ｐＨを０．７〜１．５のｐＨに調整するためにブロスの重量で１５％のリン酸（８５％溶液）を添加する工程、および２００ｒｐｍの速度で５０時間撹拌しながら組成物を９０℃へ加熱する工程によって形成した。ｐＨを８．０〜８．２へ調整するために５０重量／重量％のＮａＯＨ溶液を添加する工程、およびその後に原油を生じさせるためにこの組成物を８，０００ｇで（５分間遠心分離するＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｓｏｒｖｅｌｌ  ４０Ｒ）工程によって解乳化溶解細胞組成物から微生物油を分離すると、これは（ＡＲＡの重量で）４２．６１％のＡＲＡを産生した。原油は、１６．１のＡＶを有していた。
【０１２７】
［実施例２０］
[0127]微生物細胞（モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属）を含有する細胞ブロス（１０００ｍＬ）を７０℃で１時間低温殺菌した。解乳化溶解細胞組成物は、ｐＨを０．７〜１．５のｐＨに調整するためにブロスの重量で６％の塩酸（３２％溶液）を添加する工程、および２００ｒｐｍの速度で５０時間撹拌しながらブロスを９０℃へ加熱することによって形成した。ｐＨを８．０〜８．２へ調整するために５０重量／重量％のＮａＯＨ溶液を添加し、その後に原油を生じさせるためにこの組成物を８，０００ｇで５分間遠心分離する（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｓｏｒｖｅｌｌ  ４０Ｒ）工程によって解乳化溶解細胞組成物から微生物油を分離すると、これは（ＡＲＡの重量で）７２．６１％のＡＲＡを産生した。原油は、１１．１のＡＶを有していた。
【０１２８】
［実施例２１］
[0128]微生物細胞（シゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．））を含有する細胞ブロス（３００ｇ）を６０℃で１時間低温殺菌した。解乳化溶解細胞組成物は、ｐＨを１１へ調整するために１２．５重量％のＮａＯＨ溶液を細胞ブロスに添加する工程、ブロスの重量で２％のＮａＣｌを添加する工程、および組成物を９０℃へ加熱する工程によって形成した。９０℃で２５時間置いた後、原油を生じさせるためにこの組成物を８０００ＲＰＭで５分間遠心分離する（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｓｏｒｖｅｌｌ  ＳＴ４０Ｒ遠心機）工程によって解乳化溶解細胞組成物から微生物油を分離すると、これは（ＤＨＡの重量で）７１％のＤＨＡを産生した。
【０１２９】
［実施例２２］
[0129]微生物細胞（モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属）を含有する未洗浄細胞ブロスは、７０℃で１時間低温殺菌し、その後に処理タンクとインライン関係にある高剪断ミキサー（Ｓｉｅｍｅｎｓ  ＵＬＴＲＡ−Ｔｕｒｒａｘ  ＵＴＬ  １０００／１０（６０Ｈｚで））に通して通過させた。解乳化溶解細胞組成物は、ｐＨを．０７〜１．５に調整するために、ブロスの重量で３．５％の、９８％硫酸溶液を添加する工程；９０℃へ加熱する工程；および２００ｒｐｍの速度で撹拌しながら２８時間保持する工程によって形成した。５０％のＮａＯＨおよび組成物の重量で２％のＮａＣｌを添加する工程によって組成物を中和してｐＨを８．０へ調整し、原油を生じさせるために組成物を遠心分離する（Ｓｅｉｔａｌ  ＳＲ１０１０）工程によって解乳化溶解細胞組成物から微生物油を分離すると、これは７７．４％のＡＲＡ（ＡＲＡの重量で）ならびに１２．４のＡＶ、２．２７％のＦＦＡ含量および０．１３ｍｅｑのＰＶを備える原油を産生した。
【０１３０】
［実施例２３］
[0130]微生物細胞（クリプトコディニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ））を含有する洗浄細胞ブロス（７５０ｇ）を６０℃で１時間低温殺菌した。細胞は、細胞ブロスをホモジナイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ  Ｍ１１０）に１２，０００ＰＳＩで２回通過させることによって機械的に溶解した。溶解細胞組成物は、丸底フラスコ内に配置し、重組成物の量で４％の硫酸（９８％純粋）溶液を添加する工程によって解乳化し、２００ＲＰＭで撹拌しながら９０℃へ加熱し、２８時間保持した。５０％のＮａＯＨ溶液を添加する工程によって組成物を中和してｐＨを８．０へ調整し、その後に原油を生じさせるためにこの組成物を８０００ｇで５分間遠心分離する（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｓｏｒｖｅｌｌ  ４０Ｒ）工程によって解乳化溶解細胞組成物から微生物油を分離すると、これは（ＤＨＡの重量で）（ＦＡＭＥ分析に基づく）４５％のＤＨＡならびに１２．３５のＡＶおよび１．０９ｍｅｑのＰＶを備える原油を産生した。
【０１３１】
［実施例２４］
[0131]微生物細胞（シゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．））を含有する未洗浄細胞ブロス（７５０ｇ）は６０℃で１時間低温殺菌し、２５０ＲＰＭで攪拌する１Ｌのフラスコ内に配置した。温度は、粘度が原因で長くなる混合時間を短縮させるために６０℃へ上昇させた。解乳化溶解細胞組成物は、ｐＨを１２．６２に調整するために、ブロスの重量で４％の、５０％のＮａＯＨを添加する工程；９０℃へ加熱する工程；およびｐＨが７．７５へ低下するまで２６時間にわたり反応させる工程によって形成した。微生物油は、原油を生じさせるためにこの組成物を（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｓｏｒｖｅｌｌ  ４０Ｒ遠心機で）８０００ｇで５分間遠心分離する工程によって解乳化溶解細胞組成物から分離すると、これは（ＤＨＡの重量で）８８％のＤＨＡを産生した。
【０１３２】
［実施例２５］
[0132]微生物細胞（シゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．））を含有する未洗浄細胞ブロス（７５０ｇ）は６０℃で１時間低温殺菌し、２５０ＲＰＭで攪拌する１Ｌのフラスコ内に配置した。温度は、粘度が原因で長くなる混合時間を短縮させるために６０℃へ上昇させた。解乳化溶解細胞組成物は、ｐＨを１２．９３に調整するために、ブロスの重量で４％の、５０％のＮａＯＨを添加する工程；９０℃へ加熱する工程；およびｐＨが７．９５へ低下するまで２６時間にわたり反応させる工程によって形成した。原油を生じさせるためにこの組成物を８０００ｇで５分間遠心分離する（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｓｏｒｖｅｌｌ  ＳＴ）工程によって解乳化溶解細胞組成物から微生物油を分離すると、これは（ＤＨＡの重量で）（ＦＡＭＥ分析に基づく）８２．５％のＤＨＡを産生した。
【０１３３】
［実施例２６］
[0133]微生物細胞（シゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．））を含有する未洗浄細胞ブロス（７５０ｇ）は６０℃で１時間低温殺菌し、２５０ＲＰＭで攪拌する１Ｌのフラスコ内に配置した。温度は、粘度が原因で長くなる混合時間を短縮させるために６０℃へ上昇させ、ｐＨは７．５へ上昇した。解乳化溶解細胞組成物は、ｐＨを１２．２８に調整するために、ブロスの重量で３．５％の、５０％のＮａＯＨ溶液を添加する工程；９０℃へ加熱する工程；およびｐＨが７．８８へ低下するまで３２時間にわたり反応させる工程によって形成した。原油を生じさせるためにこの組成物を８０００ｇで５分間遠心分離する（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｓｏｒｖｅｌｌ  ４０Ｒ遠心機）工程によって解乳化溶解細胞組成物から微生物油を分離すると、これは（ＤＨＡの重量で）（ＦＡＭＥ分析に基づく）８８％のＤＨＡを産生した。
【０１３４】
［実施例２７］
[0134]微生物細胞（シゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．））を含有する未洗浄細胞ブロス（７５０ｇ）は６０℃で１時間低温殺菌し、２５０ＲＰＭで攪拌する１Ｌのフラスコ内に配置した。温度は、粘度が原因で長くなる混合時間を短縮させるために６０℃へ上昇させた。解乳化溶解細胞組成物は、ｐＨを１２．８７に調整するために、ブロスの重量で４．０％の、５０％のＮａＯＨ溶液を添加する工程；９０℃へ加熱する工程；およびｐＨが８．１５へ低下するまで３６時間にわたり反応させる工程によって形成した。原油を生じさせるためにこの組成物を８０００ｇで（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｓｏｒｖｅｌｌ  ４０Ｒ遠心機）５分間遠心分離する工程によって解乳化溶解細胞組成物から微生物油を分離すると、これは（ＤＨＡの重量で）（ＦＡＭＥ分析に基づく）８４％のＤＨＡを産生した。
【０１３５】
［比較例１］
[0135]微生物細胞（シゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．））を含有する細胞ブロス（３００ｇ）を６０℃で１時間低温殺菌した。未洗浄細胞ブロスを１８０ＲＰＭの速度で撹拌し、６０℃へ加熱した。細胞は、ｐＨを７〜７．５へ調整するために５０重量％のＮａＯＨ溶液およびブロス重量に基づいて０．５％の量でＡｌｃａｌａｓｅ（登録商標）２．４ＦＧ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（ノースカロライナ州フランクリントンから入手可能）を添加する工程により溶解した。撹拌を維持しながら、溶解細胞組成物はｐＨを１０〜１１に調整するために１２．５重量％のＮａＯＨ溶液および組成物の重量で２％の量のＣａＣｌ２を同時に添加する工程、およびその後に組成物を９０℃へ加熱して６８時間にわたり保持する工程によって解乳化した。原油を生じさせるためにこの組成物を８０００ＲＰＭで５分間遠心分離する（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｓｏｒｖｅｌｌ  ＳＴ４０Ｒ遠心機）工程によって解乳化溶解細胞組成物から微生物油を分離すると、これは（ＤＨＡの重量で）６２．５％のＤＨＡおよび４３．８のＡＶを備える原油を産生した。
【０１３６】
さらなる実施形態は以下のとおりである。
［実施形態１］
１つ以上の微生物細胞から１種以上の多価不飽和脂肪酸を含む微生物油を入手するための方法であって：
（ａ）溶解細胞組成物を形成するために前記微生物油を含む前記細胞を溶解する工程；
（ｂ）解乳化溶解細胞組成物を形成するために前記溶解細胞組成物を酸を添加することにより解乳化する工程；
（ｃ）前記解乳化溶解細胞組成物から前記油を分離する工程；および
（ｄ）前記油を回収する工程
を含み、（ｂ）は前記溶解細胞組成物のｐＨを０．５〜６．０へ低下させる工程を含む、方法。
［実施形態２］
（ａ）または（ｂ）の少なくとも１つは、前記細胞または前記溶解細胞組成物を少なくとも７０℃へ加熱する工程をさらに含む、実施形態１に記載の方法。
［実施形態３］
（ｂ）は、
（ｅ）前記溶解細胞組成物に乳化剤を添加する工程；
（ｆ）前記溶解細胞組成物の重量で０．５％〜２０％の量で前記酸を添加する工程；
（ｇ）前記溶解細胞組成物の重量で０．０５％〜２０％の量で塩を添加する工程；及び
（ｈ）前記溶解細胞組成物を攪拌する工程
のうちの少なくとも１の工程をさらに含む、実施形態１または２に記載の方法。
［実施形態４］
前記乳化剤は、イオン性乳化剤である、実施形態３に記載の方法。
［実施形態５］
前記イオン性乳化剤は、アニオン性硫酸塩乳化剤、アニオン性スルホン酸塩乳化剤、アニオン性リン酸塩乳化剤、アニオン性カルボン酸塩乳化剤およびそれらの組み合わせから選択されるアニオン性乳化剤である、実施形態４に記載の方法。
［実施形態６］
前記イオン性乳化剤は、ラウリル硫酸アンモニウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウレス硫酸ナトリウム、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ミレス硫酸ナトリウムおよびそれらの組み合わせから選択されるアニオン性硫酸塩乳化剤である、実施形態４に記載の方法。
［実施形態７］
前記乳化剤は、前記溶解細胞組成物の重量で０．２％〜１０％の量で添加される、実施形態３〜６のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態８］
前記塩は、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、硫酸塩およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態３〜７のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態９］
（ａ）は、前記細胞を撹拌する工程をさらに含む、実施形態１〜８のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態１０］
前記酸は、硫酸、リン酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、次亜塩素酸、亜塩素酸、塩素酸、過塩素酸、フルオロ硫酸硝酸、フルオロアンチモン酸、フルオロホウ酸、ヘキサフルオロリン酸、クロム酸、ホウ酸、酢酸、クエン酸、ギ酸およびそれらの組み合わせから選択される、実施形態１〜９のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態１１］
前記酸は、硫酸である、実施形態１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態１２］
（ａ）の前記細胞は、未洗浄である、および／または、（ａ）の前記細胞は、発酵ブロス内に含有されている、実施形態１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態１３］
（ｃ）は、前記溶解細胞組成物を遠心分離する工程をさらに含む、実施形態１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態１４］
前記多価不飽和脂肪酸は、ω−３脂肪酸、ω−６脂肪酸およびそれらの混合物から選択される、実施形態１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態１５］
前記多価不飽和脂肪酸は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、アラキドン酸（ＡＲＡ）、γ−リノール酸（ＧＬＡ）、ジホモ−γ−リノール酸（ＤＧＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）およびそれらの混合物から選択される、実施形態１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態１６］
前記多価不飽和脂肪酸は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）である、実施形態１５に記載の方法。
［実施形態１７］
前記多価不飽和脂肪酸は、アラキドン酸（ＡＲＡ）である、実施形態１５に記載の方法。
［実施形態１８］
前記微生物細胞は、藻類、酵母、真菌、原生生物または細菌細胞である、実施形態１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態１９］
前記微生物細胞は、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、クリプトコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属またはスラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目に由来する、実施形態１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態２０］
前記微生物細胞は、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属またはそれらの混合物に由来する、実施形態１９に記載の方法。
［実施形態２１］
前記微生物細胞は、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）に由来する、実施形態１９に記載の方法。
［実施形態２２］
前記溶解細胞組成物は、液体、細胞断片および微生物油を含む、実施形態１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態２３］
有機溶媒は、前記細胞から前記油を入手するためには使用されない、実施形態１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態２４］
前記解乳化溶解細胞組成物の平均粒径は、２５ミクロン以下である、実施形態１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態２５］
（ｄ）の前記油は、原油である、実施形態１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態２６］
（ｄ）は、精製油を入手するために前記原油を精製する工程をさらに含む、実施形態２５に記載の方法。
［実施形態２７］
前記油は、少なくとも３０重量％のアラキドン酸を含む、実施形態１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態２８］
前記油は、少なくとも３０重量％のドコサヘキサエン酸を含む、実施形態１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態２９］
前記油は、５０未満のアニシジン値を有する、実施形態１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態３０］
前記油は、８ｐｐｍ以下のリン含量を有する、実施形態１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態３１］
前記油は、５ｍｅｑ／ｋｇ未満のペルオキシド値を有する、実施形態１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態３２］
（ａ）および（ｂ）は、１工程の溶解および解乳化する工程を形成するために一緒に結合される、実施形態１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態３３］
（ｃ）は、前記解乳化溶解細胞組成物の前記ｐＨを上昇させる工程をさらに含む、実施形態１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態３４］
１つ以上の微生物細胞から１種以上の多価不飽和脂肪酸を含む微生物油を入手するための方法であって：
（ａ）０．５〜６．０のｐＨを有する解乳化溶解細胞組成物を形成するために前記微生物油を含む前記細胞を酸を添加することにより溶解する工程；
（ｂ）前記解乳化溶解細胞組成物から前記油を分離する工程；および
（ｃ）前記油を回収する工程
を含み、前記解乳化溶解細胞組成物は前記溶解する工程で得られる、方法。
【外国語明細書】
2020058364000001.pdf