(57)【要約】【課題】脂質の生産性に優れる、脂質の製造方法を提供する。【解決手段】セルロース合成酵素及びアルジナン合成に関与するポリケチド合成酵素からなる群より選ばれる、少なくとも１つのタンパク質の発現が低下又は喪失した藻類を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させ、生産させた脂肪酸又は脂質を培養後の藻体から回収し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を得る、脂質の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース合成酵素及びアルジナン合成に関与するポリケチド合成酵素からなる群より選ばれる、少なくとも１つのタンパク質の発現が低下又は喪失した藻類を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させ、
生産させた脂肪酸又は脂質を培養後の藻体から回収し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を得る、脂質の製造方法。
【請求項２】
セルロース合成酵素及びアルジナン合成に関与するポリケチド合成酵素からなる群より選ばれる、少なくとも１つのタンパク質の発現が低下又は喪失した藻類を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させ、
生産させた脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を培養後の藻体から回収する、脂質の回収方法。
【請求項３】
前記セルロース合成酵素の発現と、前記ポリケチド合成酵素の発現がそれぞれ低下又は喪失している、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記藻類がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記セルロース合成酵素が、下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）であり、前記ポリケチド合成酵素が、下記タンパク質（Ｃ）又は（Ｄ）である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつセルロース合成酵素活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアルジナン合成に関与するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、藻類を用いた脂質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸は脂質の主要構成成分の１つであり、生体内においてグリセリンとエステル結合をしてトリアシルグリセロール等の脂質を構成し、多くの動植物においてエネルギー源として貯蔵され利用される物質である。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質（油脂）は、食用又は工業用として広く利用されている。
例えば、炭素数１２〜１８前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として、また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として、いずれも洗浄剤又は殺菌剤として利用されている。同じく高級アルコールの誘導体としてアルキルアミン塩やモノ又はジアルキル４級アミン塩等のカチオン性界面活性剤は、繊維処理剤や毛髪リンス剤又は殺菌剤として、ベンザルコニウム型４級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤として日常的に利用されている。また、植物油脂はバイオディーゼル燃料の原料としても利用されている。
このように脂肪酸や脂質の利用は多岐にわたる。そのため、植物等において生体内での脂肪酸や脂質の生産性を向上させる試みが行われている。
【０００３】
近年、持続可能な社会の実現に向けて再生可能エネルギーに関する研究が推し進められている。特に光合成微生物は、二酸化炭素の削減効果に加えて、穀物と競合しないバイオ燃料生物として期待されている。
特に近年、バイオ燃料生産に有用であるとして、藻類が注目を集めている。藻類は、バイオディーゼル燃料として利用可能な脂質を光合成によって生産でき、しかも食料と競合しないことから、次世代のバイオマス資源として注目されている。また、藻類は植物に比べ、高い脂質生産・蓄積能力を有するとの報告もある。
【０００４】
一方で、藻類は硬い細胞壁や細胞外層に覆われているため、藻体内からの脂質の回収効率は一般的に低い。そのため、藻類を用いて脂質を製造する際には、細胞壁を物理的ないし化学的に破壊することが必要である。しかし現状では、藻類の細胞壁の十分な破壊が達成できているわけではない。そのため、藻体内からの脂質の回収効率がより優れた脂質の製造方法の開発に需要がある。例えば、イカダモ（Scenedesmus）属に属する微細藻類の湿藻体を、全質量に対して５質量％から９６質量％の水分を含むように調整し、湿藻体中の藻類の細胞壁を破壊処理し、処理物から油脂類を抽出する工程を含む、油脂類を抽出する方法が報告されている（特許文献１）。
しかしながら藻体の形質を分子遺伝学的に改質させることにより、藻体内からの脂質の回収効率を向上させることについては報告がない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−０６８７４１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、脂質の生産性に優れる、脂質の製造方法の提供を課題とする。
また本発明は、藻体内からの脂質の回収効率に優れる、脂質の回収方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ナンノクロロプシスは分子生物学的にも研究が進んでおり、相同組換えやゲノム編集が可能である（Oliver Kilian et al., PNAS, 2011 December, 108(52) p.21265-21269；Qintao Wang et al., the Plant Journal, 2016 August, 88, p.1071-1081）。このような状況の下、本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討を重ねた。
藻類は細胞壁に覆われており、さらに藻類の一部はアルジナン層と呼ばれる硬い殻のような構造を持つ。ゆえに、これまで藻類から脂質を回収する際には、細胞壁及びアルジナン層を物理的又は化学的に破壊する必要があった。
【０００８】
そこで発明者らは、細胞壁の構成成分であるセルロースを合成する酵素（以下、「セルロース合成酵素」、若しくは「CES」ともいう）をコードする遺伝子（以下、「セルロース合成酵素遺伝子」、若しくは「CES遺伝子」ともいう）又は、アルジナン層の構築に関与すると思われるポリケチド合成酵素（以下、「アルジナン合成に関与するPKS」ともいう）をコードする遺伝子（以下、「ポリケチド合成酵素遺伝子」、若しくは「PKS遺伝子」ともいう）を破壊した藻類を作出した。そして、当該藻類改変体を用いて脂質の回収を行ったところ、当該藻類改変体は野生株と比較して高い脂質の回収効率を示すことを見出した。
本発明はこれらの知見に基づき完成されるに至ったものである。
【０００９】
本発明は、CES及びアルジナン合成に関与するPKSからなる群より選ばれる、少なくとも１つのタンパク質の発現が低下又は喪失した藻類（以下、「藻類改変体」ともいう）を用いる、脂質の製造方法に関する。
【００１０】
また本発明は、CES及びアルジナン合成に関与するPKSからなる群より選ばれる、少なくとも１つのタンパク質の発現が低下又は喪失した藻類を用いる、脂質の回収方法に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明で用いる藻類改変体は、藻体内からの脂質の回収効率に優れる。
よって、本発明の脂質の回収方法は、野生株の藻類を使用したときと比べて、効率よく脂質を回収できる。また、本発明の脂質の製造方法は、野生株の藻類を使用したときと比べて、脂質の回収が容易である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書における「脂質」は、中性脂質（トリアシルグリセロール等）、ろう、セラミド等の単純脂質；リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等の複合脂質；及びこれらの脂質から誘導される、脂肪酸（遊離脂肪酸）、アルコール類、炭化水素類等の誘導脂質を包含するものである。
一般に誘導脂質に分類される脂肪酸は、脂肪酸そのものを指し、「遊離脂肪酸」を意味する。本発明では単純脂質及び複合脂質分子中の脂肪酸部分を「脂肪酸残基」と表記する。そして、特に断りのない限り、「脂肪酸」は「遊離脂肪酸」と、塩又はエステル化合物等に含まれる「脂肪酸残基」の総称として用いる。
また本明細書において、「脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質」は、「遊離脂肪酸」と「当該脂肪酸残基を有する脂質」を総称して用いる。更に本明細書において、「脂肪酸組成」とは、前記遊離脂肪酸と脂肪酸残基とを合計した全脂肪酸（総脂肪酸）の重量に対する各脂肪酸の重量の割合を意味する。脂肪酸の重量（生産量）や脂肪酸組成は、実施例で用いた方法により測定できる。
なお、本明細書において、「脂肪酸」とは、脂肪族カルボン酸であれば特に制限はないが、好ましくはアシル基の炭素原子数が２以上２２以下、より好ましくは炭素原子数が４以上２２以下、より好ましくは炭素原子数が６以上２２以下、より好ましくは炭素原子数が８以上２２以下、より好ましくは炭素原子数が１０以上２２以下、さらに好ましくは炭素原子数が１２以上２０以下であることをいう。
さらに本明細書において、脂肪酸や、脂肪酸を構成するアシル基の表記において「Cx:y」とあるのは、炭素原子数がxであり、二重結合の数がyであることを表す。「Cx」は炭素原子数がxの脂肪酸やアシル基を表す。
【００１３】
本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science，1985，vol．227，p．1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析（Search  homology）プログラムを用いて、Unit  size  to  compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
また本明細書において「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook，David  W．Russell.，Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press］記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
さらに明細書において、遺伝子の「上流」とは、翻訳開始点からの位置ではなく、対象として捉えている遺伝子又は領域の5'側に続く領域を示す。一方、遺伝子の「下流」とは、対象として捉えている遺伝子又は領域の3'側に続く領域を示す。
【００１４】
本発明において、藻類改変体として、CES及びアルジナン合成に関与するPKSからなる群より選ばれる、少なくとも１つのタンパク質の発現が低下又は喪失した藻類を使用する。また、本発明で用いる藻類改変体は、CES及びアルジナン合成に関与するPKSの発現が共に低下又は喪失していることが好ましい。
本発明で用いる藻類改変体は、CES及びアルジナン合成に関与するPKSからなる群より選ばれる、少なくとも１つのタンパク質の発現が低下又は喪失している天然の藻類であってもよく、前記タンパク質の発現を低下又は喪失させた藻類を用いることもできる。
このような藻類においてCES又はアルジナン合成に関与するPKSの発現の低下又は喪失は、該タンパク質をコードする遺伝子、又はその周辺の塩基配列を解析することで確認できる。
【００１５】
CES又はアルジナン合成に関与するPKSの発現が低下又は喪失した前記藻類は、死滅することなく、若しくは生育性を大きく損なうことなく、セルロースの合成又はアルジナン合成が阻害される。その結果、このような藻類においては、セルロース由来の細胞壁又はアルジナン層の構築が阻害されるため、脂質の製造の過程において脂質の回収効率が向上する。
このように回収効率が向上した藻類改変体は、脂質の製造に好適に用いることができる。
【００１６】
藻類の細胞は、細胞壁と呼ばれる構造に覆われており、セルロースがその主成分である。セルロースは複数のサブユニットからなるセルロース合成酵素複合体によって合成される。この複合体の活性部位は、サブユニットA（以下、「CESA」という）が担っていると考えられる。ゆえに、藻類においてCES（好ましくはCESを構成するいずれか１つのサブユニット、好ましくはCESA）の発現を低下又は喪失させることにより、セルロース合成が阻害されることで細胞壁構築が阻害され、物理的又は化学的処理による細胞破壊が容易となることから、藻体からの脂質の回収が容易である藻類を得ることができる。
本発明における「セルロース合成酵素」とは、CES遺伝子から発現したタンパク質からなる酵素(あるいは複合体)で、セルロースの生合成に関与する酵素のことをいう。
また、本明細書において、「セルロース合成活性」（以下、「CES活性」ともいう）とは、セルロース合成反応を触媒する活性を意味する。
【００１７】
また一部の藻類は、セルロース由来の細胞壁の外側に、難分解性のアルジナンを含む細胞壁を有する。セルロース由来の細胞壁に加えて、アルジナン由来の細胞壁（以下、「アルジナン層」ともいう）を有することで、藻類は非常に硬い殻のような構造を獲得している。このアルジナン生合成については知見が蓄積されていないが、PKSの関与が示唆されている。ゆえに、アルジナン合成に関与するPKSの発現を低下又は喪失させることにより、アルジナン合成が阻害されることでアルジナン層構築が阻害され、物理的又は化学的処理による細胞破壊が容易となることが推定されることから、藻体からの脂質の回収が容易な藻類を得ることができると考えられる。
【００１８】
本発明に用いる藻類改変体は、CES又はアルジナン合成に関与するPKSの発現が低下又は喪失しているため、セルロース合成又はアルジナン合成が阻害されている。なお、藻類改変体において上記CES又はアルジナン合成に関与するPKSの発現が低下又は喪失されていることは、例えば後述の実施例に記載の方法によって確認することができる。
【００１９】
本明細書において、培養物（ここで「培養物」とは、培養した後の培養液及び藻類改変体をいう）から常法に従い単離することで、脂質を回収することができる。
培養物から脂質を回収する方法としては、常法から適宜選択することができる。例えば、前述の培養物を熱処理、高圧処理、高温高圧処理、ビーズ等を用いた物理的破砕、ハンドプレス法等の圧搾、酸若しくはアルカリ処理、消化酵素等の化学的処理、等の方法により細胞を破砕した後に、ろ過、遠心分離、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、エタノール抽出法等により脂質成分を単離することで、脂質を回収することができる。
なお、より大規模な培養を行った場合は、培養物より油分を圧搾又は溶媒抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行うことで、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。
【００２０】
本発明の製造方法において製造される脂質、及び本発明の回収方法によって得られる脂質は、その利用性の点から、脂肪酸又は脂肪酸化合物を含んでいることが好ましく、炭素原子数が２以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含んでいることがより好ましく、炭素原子数が４以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含んでいることがより好ましく、炭素原子数が６以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含んでいることがより好ましく、炭素原子数が８以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含んでいることがより好ましく、炭素原子数が１０以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含んでいることがより好ましく、炭素原子数が１２以上２０以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含んでいることがさらに好ましい。
脂質中に含まれる脂肪酸エステル化合物は、生産性の点から、単純脂質又は複合脂質が好ましく、単純脂質がさらに好ましく、TAGがさらにより好ましい。
【００２１】
本発明の製造方法により得られる脂肪酸は、食用として用いる他、可塑剤、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。
【００２２】
本発明に用いる藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス（Chlamydomonas）属の藻類、クロレラ属の藻類、ファエオダクティラム（Phaeodactylum）属の藻類、又は真正眼点藻綱に属する藻類が好ましく、真正眼点藻綱に属する藻類がより好ましい。真正眼点藻綱に属する藻類の具体例としては、ナンノクロロプシス属の藻類、モノドプシス（Monodopsis）属の藻類、ビスケリア（Vischeria）属の藻類、クロロボトリス（Chlorobotrys）属の藻類、ゴニオクロリス（Goniochloris）等が挙げられる。なかでも、ナンノクロロプシス属の藻類が好ましい。ナンノクロロプシス属の藻類の具体例としては、ナンノクロロプシス・オセアニカ、ナンノクロロプシス・オキュラータ(Nannochloropsis oculata)、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Nannochloropsis gaditana）、ナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis salina）、ナンノクロロプシス・リムネティカ（Nannochloropsis limnetica）、ナンノクロロプシス・グラニュラータ（Nannochloropsis granulata）、ナンノクロロプシス・エスピー（Nannochloropsis sp．）等が挙げられる。なかでも、ナンノクロロプシス・オセアニカ、又はナンノクロロプシス・ガディタナが好ましく、ナンノクロロプシス・オセアニカがより好ましい。
なお、ナンノクロロプシス・オセアニカ等の藻類は、私的又は公的な研究所等の保存機関より入手することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株は、国立環境研究所（NIES）から入手することができる。
【００２３】
藻類の培地は天然海水又は人工海水をベースにしたものを使用してもよいし、市販の培養培地を使用してもよい。具体的な培地としては、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、ダイゴＩＭＫ培地、Ｌ１培地、ＭＮＫ培地、等を挙げることができる。なかでも、脂質の生産性向上及び栄養成分濃度の観点から、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、又はダイゴＩＭＫ培地が好ましく、ｆ／２培地、又はダイゴＩＭＫ培地がより好ましく、ｆ／２培地がさらに好ましい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上のため、培地に、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類、微量金属等を適宜添加することができる。
培地に接種する藻類の量は適宜選択することができ、生育性の点から培地当り１〜５０％（vol/vol）が好ましく、１〜１０％（vol/vol）がより好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、５〜４０℃の範囲である。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、好ましくは１０〜３５℃であり、より好ましくは１５〜３０℃である。
また藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。光照射は、光合成が可能な条件であればよく、人工光でも太陽光でもよい。光照射時の光強度としては、藻類の生育促進、及び脂肪酸の生産性向上の観点から、好ましくは１〜４，０００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは１０〜２，５００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは１００〜２，５００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは２００〜２，５００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは２５０〜２，５００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは３００〜２，５００μmol/m2/sの範囲である。また、光照射の間隔は、特に制限されないが、前記と同様の観点から、明暗周期で行うことが好ましく、２４時間のうち明期が好ましくは８〜２４時間、より好ましくは１０〜１８時間、さらに好ましくは１２時間である。
また藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。気体中の二酸化炭素の濃度は特に限定されないが、生育促進、及び脂肪酸の生産性向上の観点から０．０３（大気条件と同程度）〜１０％が好ましく、より好ましくは０．０５〜５％、さらに好ましくは０．１〜３％、よりさらに好ましくは０．３〜１％である。炭酸塩の濃度は特に限定されないが、例えば炭酸水素ナトリウムを用いる場合、生育促進の観点から０．０１〜５質量％が好ましく、より好ましくは０．０５〜２質量％、さらに好ましくは０．１〜１質量％である。
培養時間は特に限定されず、長期間（例えば１５０日程度）行なってもよい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、培養期間は、好ましくは３〜９０日間、より好ましくは７〜３０日間、さらに好ましくは１４〜２１日間である。なお、培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、振とう培養が好ましい。
【００２４】
本発明で発現を低下又は喪失させるCESは、CES活性を示すタンパク質（酵素）であれば特に制限はない。
本発明で発現を低下又は喪失させるCESは、例えば、ゲノム情報を基にBlastで解析し、CESとアノテーションされたものを候補として選択できる。またはBlastpによってアミノ酸配列を解析し、CESとアノテーションされたものもまた候補として選択できる。更に選択したタンパク質をコードする遺伝子を破壊又は欠失させた藻類を培養し細胞壁のセルロース層への影響を調べることでタンパク質を確認してもよい。
【００２５】
本発明における好ましいCESとしては、下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）が挙げられる。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつCES活性を有するタンパク質。
【００２６】
配列番号１のアミノ酸配列からなる前記タンパク質（Ａ）は、ナンノクロロプシス属に属する藻類であるナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株由来のセルロース合成酵素複合体のサブユニットAを構成するタンパク質（以下、「CESA1」ともいう）である。本発明の配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質（前記タンパク質（Ａ））はCES活性を有する。
【００２７】
タンパク質（Ｂ）は、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列との同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつCES活性を有する。
一般に、酵素タンパク質をコードしているアミノ酸配列は、必ずしも全領域の配列が保存されていなければ酵素活性を示さないというものではなく、アミノ酸配列が変化しても酵素活性に影響を与えない領域も存在することが知られている。このような酵素活性に必須でない領域においては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加といった変異が導入されても酵素本来の活性を維持することができる。本発明で規定するタンパク質において、このようにCES活性が保持され、かつアミノ酸配列が一部変異したタンパク質も包含する。
【００２８】
前記タンパク質（Ｂ）において、CES活性の点から、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９４％以上がより好ましく、９６％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
【００２９】
また、前記タンパク質（Ｂ）として、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上３００個以下、好ましくは１個以上２６３個以下、より好ましくは１個以上２２５個以下、より好ましくは１個以上１８８個以下、より好ましくは１個以上１５０個以下、より好ましくは１個以上１１２個以下、より好ましくは１個以上７５個以下、より好ましくは１個以上６０個以下、より好ましくは１個以上４５個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上７個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつCES活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００３０】
前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）の発現を低下又は喪失させるために、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子（CES遺伝子）の発現を抑制、あるいは遺伝子を欠失させることも好ましい。前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子として、下記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子が挙げられる。
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつCES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００３１】
配列番号２で表される塩基配列からなる前記ＤＮＡ（ａ）は、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であり、ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株由来のCESA1遺伝子である。
【００３２】
前記ＤＮＡ（ｂ）において、CES活性の点から、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９４％以上がより好ましく、９６％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
【００３３】
また前記ＤＮＡ（ｂ）として、配列番号２で表される塩基配列において、１又は複数個（例えば１個以上９０３個以下、好ましくは１個以上７９０個以下、より好ましくは１個以上６７７個以下、より好ましくは１個以上５６４個以下、より好ましくは１個以上４５１個以下、より好ましくは１個以上３３８個以下、より好ましくは１個以上２２５個以下、より好ましくは１個以上１８０個以下、より好ましくは１個以上１３５個以下、より好ましくは１個以上９０個以下、より好ましくは１個以上４５個以下、さらに好ましくは１個以上２２個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつＣＥＳ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｂ）として、前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつCES活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。
【００３４】
また、本発明で発現を低下又は喪失させるPKSは、アルジナン合成に関与するタンパク質（酵素）であれば特に制限はない。
本発明で発現を低下又は喪失させるPKSは、例えば、ゲノム情報を基にBlastで解析し、PKSとアノテーションされたものを候補として選択できる。またはBlastpによってアミノ酸配列を解析し、PKSとアノテーションされたものも候補として選択できる。更に選択したタンパク質をコードする遺伝子を破壊又は欠失させた藻類を培養し、細胞壁のアルジナン層の影響を調べることでタンパク質を確認してもよい。
【００３５】
本発明における好ましいPKSとしては、下記タンパク質（Ｃ）又は（Ｄ）が挙げられる。
（Ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアルジナン合成に関与するタンパク質。
【００３６】
配列番号３のアミノ酸配列からなる前記タンパク質（Ｃ）は、ナンノクロロプシス属に属する藻類であるナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株由来のPKSの１種（以下、「PKS3」ともいう）である。本発明の配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質（前記タンパク質（Ｃ））はアルジナン合成に関与する。
【００３７】
タンパク質（Ｄ）は、前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列との同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアルジナン合成に関与する。
一般に、酵素タンパク質をコードしているアミノ酸配列は、必ずしも全領域の配列が保存されていなければ酵素活性を示さないというものではなく、アミノ酸配列が変化しても酵素活性に影響を与えない領域も存在することが知られている。このような酵素活性に必須でない領域においては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加といった変異が導入されても酵素本来の活性を維持することができる。本発明で規定するタンパク質において、このように上記アルジナン合成に関与する性質が保持され、かつアミノ酸配列が一部変異したタンパク質も包含する。
【００３８】
前記タンパク質（Ｄ）において、前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８６％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９４％以上がより好ましく、９６％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
【００３９】
また、前記タンパク質（Ｄ）として、前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１２０３個以下、好ましくは１個以上１０５３個以下、より好ましくは１個以上９０２個以下、より好ましくは１個以上７５２個以下、より好ましくは１個以上６０１個以下、より好ましくは１個以上４２１個以下、より好ましくは１個以上３００個以下、より好ましくは１個以上２４０個以下、より好ましくは１個以上１８０個以下、より好ましくは１個以上１２０個以下、より好ましくは１個以上６０個以下、さらに好ましくは１個以上３０個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつアルジナン合成に関与するタンパク質が挙げられる。
【００４０】
前記タンパク質（Ｃ）又は（Ｄ）の発現を低下又は喪失させるために、前記タンパク質（Ｃ）又は（Ｄ）をコードする遺伝子（PKS遺伝子）の発現を抑制、あるいは遺伝子を欠失させることも好ましい。前記タンパク質（Ｃ）又は（Ｄ）をコードする遺伝子として、下記ＤＮＡ（ｃ）又は（ｄ）からなる遺伝子が挙げられる。
（ｃ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつアルジナン合成に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００４１】
配列番号４で表される塩基配列からなる前記ＤＮＡ（ｃ）は、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であり、ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株由来のPKS3遺伝子である。
【００４２】
前記ＤＮＡ（ｄ）において、前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８６％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９４％以上がより好ましく、９６％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
【００４３】
また前記ＤＮＡ（ｄ）として、配列番号４で表される塩基配列において、１又は複数個（例えば１個以上３６１２個以下、好ましくは１個以上３１６０個以下、より好ましくは１個以上２７０９個以下、より好ましくは１個以上２２５７個以下、より好ましくは１個以上１８０６個以下、より好ましくは１個以上１２６４個以下、より好ましくは１個以上９０３個以下、より好ましくは１個以上７２２個以下、より好ましくは１個以上５４１個以下、より好ましくは１個以上３６１個以下、より好ましくは１個以上１８０個以下、さらに好ましくは１個以上９０個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつアルジナン合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｄ）として、前記ＤＮＡ（ｃ）又は（ｄ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアルジナン合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。
【００４４】
CES又はアルジナン合成に関与するPKSの発現を低下又は喪失する方法を説明する。
本発明において、CES又はアルジナン合成に関与するPKSの発現を低下又は喪失する方法としては、常法より適宜選択することができる。例えば、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子を欠失（一部若しくは全長）する方法、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子をダウンレギュレートする方法、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子のプロモーターを改変する方法、アンチセンス、プロモーター競合などのゲノム編集技術を利用する方法、等が挙げられる。なかでも、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子を欠失、又はCES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子をダウンレギュレートすることにより、CES又はアルジナン合成に関与するPKSの発現を低下又は喪失することが好ましい。
また、CES又はアルジナン合成に関与するPKSの発現を低下又は喪失する方法に代えて、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子を不活性化する方法、CES又はアルジナン合成に関与するPKSタンパク自体の欠損や変異の導入、薬剤の添加などによるCES又はアルジナン合成に関与するPKSタンパク質の機能を弱化する方法等を適宜選択することもできる。これらの方法により得られる効果は、CES又はアルジナン合成に関与するPKSの発現を低下又は喪失する方法により得られる効果と同等である。
【００４５】
CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子を欠失又は不活性化することにより、CES又はアルジナン合成に関与するPKSの発現を低下又は喪失する方法について説明する。
CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子を欠失又は不活性化する方法としては、常法から適宜選択することができる。例えば、前記藻類自体が有する相同組換え能を利用した遺伝子破壊方法、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（Transcription activator-like effector nuclease、TALEN）やクリスパー（CRISPR、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat）といったゲノム編集技術を利用した方法、突然変異等を利用した変異導入方法、など一般的な方法により、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子を欠失又は不活性化することができる。
具体的には、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の一部を含むDNA断片または適当なプラスミド（ベクター）にクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを藻類の細胞内に取り込ませ、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の一部領域における相同組換えによってゲノム上のCES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の欠失や、これらを分断してCES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子を不活性化することが可能である。
また、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジンなどの変異誘発剤の使用、紫外線やガンマ線等の照射によりCES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の突然変異を誘発する方法、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子中（例えば、CES又はアルジナン合成に関与するPKSを発現するために重要な部位）に部位特異的点突然変異（例えば、フレームシフト突然変異、インフレーム突然変異、終止コドンの挿入など）を誘発する方法、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の全部又は一部を他の任意のDNA断片（例えば、任意の選択マーカー）で置換する方法、などによりCES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子をランダムに不活性化することができる。
本発明において、相同組換えにより、ゲノム上のCES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子を欠失又は不活性化することが好ましい。
本発明において、相同組換えにより、ゲノム上のCES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子を欠失又は不活性化することが好ましい。
【００４６】
相同組換えによりCES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子を欠失又は不活性化するときは、前記藻類に、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の相同組換え用プラスミド又は相同組換え用DNAカセットを導入する。
ここで使用するCES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の相同組換え用プラスミド又は相同組換え用DNAカセットは、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の全部又は一部を標的領域とする。そして、標的領域をコードするゲノムの上流側の一部と相同的な塩基配列と、ゲノムの下流側の一部と相同的な塩基配列を有するプラスミド又はDNAカセットを構築し、これを前記藻類に導入することが好ましい。
相同組換えに必要なCES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の上流及び下流の塩基配列の情報は、例えば国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information, NCBI）などから入手することができる。
【００４７】
また、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子が相同組換え用プラスミド又は相同組換え用DNAカセットと置換され、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子が欠失又は不活性化したことを確認するために、相同組換え用プラスミド又は相同組換え用DNAカセットに組み込まれる選択マーカーとして、通常用いられる選択マーカーから適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができる選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、及びハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子をマーカー遺伝子として使用することもできる。選択マーカーのベクターへの導入は、制限酵素処理やライゲーション等の常法により行うことができる。
【００４８】
CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子を欠失又は不活性化するために用いる、前記相同組換え用プラスミド又は相同組換え用DNAカセットは、通常用いられるプラスミド（ベクター）を使用して作製することができる。使用できるプラスミドとしては、例えば、pUC18（タカラバイオ社製）、pUC19（タカラバイオ社製）、pUC118（タカラバイオ社製）、P66（Chlamydomonas Center）、P-322（Chlamydomonas Center）、pPha-T1（Journal of Basic Microbiology, 2011, vol. 51, p. 666-672参照）、又はpJET1（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。特に、pUC18、pPha-T1、又はpJET1が好ましく用いられる。
CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の欠失又は不活性化に用いる相同組換え用プラスミド又は相同組換え用DNAカセットのサイズは、藻類への導入効率や、相同組換え効率などを考慮し、適宜設定することができる。例えば、相同配列として用いる標的領域の上流又は下流塩基配列はそれぞれ300bp以上が好ましく、500bp以上がより好ましい。またその上限値は、2.5kbpが好ましく、2kbpがより好ましい。
【００４９】
前記相同組換え用プラスミド又は相同組換え用DNAカセットを藻類に導入する形質転換方法は、藻類の種類やCES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の相同組換え用プラスミド又は相同組換え用DNAカセットに応じて常法より適宜選択することができる。例えば、カルシウムイオンを用いる形質転換方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、エレクトロポレーション法、LP形質転換方法、アグロバクテリウムを用いた方法、パーティクルガン法等が挙げられる。また、本発明では、Randor  Radakovits,  et  al.，Nature  Communications，DOI:10.1038/ncomms1688，2012等に記載のエレクトロポレーション法を用いて形質転換を行うこともできる。
また、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol. 108(52)の記載の方法を参考にして、目的の遺伝子の上流の配列、プロモーター、選択マーカー遺伝子、ターミネーター、及び目的の遺伝子の下流の配列からなるＤＮＡ断片（遺伝子破壊カセット）を用いて宿主を形質転換することもできる。
【００５０】
CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子が欠失又は不活性化した藻類の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、薬剤耐性遺伝子が宿主細胞中に導入された結果、藻類が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムＤＮＡを鋳型としたPCR法等によって、目的DNA断片の導入を確認することもできる。
【００５１】
CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子をダウンレギュレートして、CES又はアルジナン合成に関与するPKSの発現を低下又は喪失する方法について説明する。
CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の発現の抑制、又はCES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の上流に位置するプロモーターを特定しこれを欠失若しくは不活性化することで、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の発現量が減少する（CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子のダウンレギュレーション）。CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の発現量が減少すると、セルロース合成又はアルジナン合成に関与するCES又はアルジナン合成に関与するPKSタンパク質の発現が阻害される。その結果、前記藻類においてセルロース由来の細胞壁又はアルジナン層の構築が阻害されることが推定される。よって、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の発現量を減少させることで、物理的又は化学的処理による細胞破壊が容易となることから、藻体からの脂質の回収が容易である藻類を得ることができると考えられる。
【００５２】
CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子をダウンレギュレートさせる方法は、常法より適宜選択することができる。例えば、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジンなどの変異誘発剤、ＵＶ、ガンマ線等の照射によりCES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子のプロモーターや転写・翻訳開始領域の突然変異を誘発する方法、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子のプロモーター配列や転写・翻訳開始領域中に他の任意のDNA断片（例えば、任意のリプレッサー、任意の選択マーカー等）を挿入する方法、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子のプロモーター配列や転写・翻訳開始領域の全部又は一部を他の任意のDNA断片（例えば、任意のリプレッサー、任意の選択マーカー等）で置換する方法、アンチセンス法、RNA干渉法、プロモーター競合等があげられる。
【００５３】
本発明は、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の塩基配列及びその上流の塩基配列からなる領域の上流側の一部と相同的な塩基配列と、ゲノム上のCES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の塩基配列及びその下流の塩基配列からなる領域の下流側の一部と相同的な塩基配列を有する、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の相同組換え用プラスミド又は相同組換え用DNAカセットも提供する。この相同組換え用プラスミド又は相同組換え用DNAカセットは、前記CES又はアルジナン合成に関与するPKSの発現を低下又は喪失させた藻類の作製に好適に用いることができる。
【００５４】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の脂質の製造方法、及び脂質の回収方法を開示する。
【００５５】
＜１＞CES及びアルジナン合成に関与するPKSからなる群より選ばれる、少なくとも１つのタンパク質の発現が低下又は喪失した藻類を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させ、
生産させた脂肪酸又は脂質を培養後の藻体から回収し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を得る、脂質の製造方法。
【００５６】
＜２＞CES及びアルジナン合成に関与するPKSからなる群より選ばれる、少なくとも１つのタンパク質の発現が低下又は喪失した藻類を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させ、
生産させた脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を培養後の藻体から回収する、脂質の回収方法。
＜３＞前記CES又はアルジナン合成に関与するPKSをコードする遺伝子を欠失若しくは不活性化、又は前記CES又はアルジナン合成に関与するPKSをコードする遺伝子をダウンレギュレートすることにより、前記CES又はアルジナン合成に関与するPKSの発現を低下又は喪失する、前記＜１＞又は＜２＞項に記載の方法。
＜４＞前記CESの発現と、前記アルジナン合成に関与するPKSの発現がそれぞれ低下又は喪失している、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項記載の方法。
＜５＞前記藻類が、真正眼点藻綱に属する藻類である、前記＜１＞〜＜４＞のいずれか１項記載の方法。
＜６＞前記真正眼点藻綱に属する藻類がナンノクロロプシス属に属する藻類である、前記＜５＞項記載の方法。
＜７＞前記ナンノクロロプシス属に属する藻類が、ナンノクロロプシス・オセアニカ、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ、ナンノクロロプシス・サリナ、ナンノクロロプシス・リムネティカ、ナンノクロロプシス・グラニュラータ、ナンノクロロプシス・エスピー、からなる群より選ばれる少なくとも１つの藻類、好ましくはナンノクロロプシス・ガディタナ、又はナンノクロロプシス・オセアニカである、前記＜６＞項記載の方法。
【００５７】
＜８＞前記CESが、下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）である、前記＜１＞〜＜７＞のいずれか１項記載の方法。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつCES活性を有するタンパク質。
＜９＞前記タンパク質（Ｂ）が、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上３００個以下、好ましくは１個以上２６３個以下、より好ましくは１個以上２２５個以下、より好ましくは１個以上１８８個以下、より好ましくは１個以上１５０個以下、より好ましくは１個以上１１２個以下、より好ましくは１個以上７５個以下、より好ましくは１個以上６０個以下、より好ましくは１個以上４５個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上７個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつCES活性を有するタンパク質、である、前記＜８＞項に記載の方法。
＜１０＞前記CESをコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子である、前記＜３＞〜＜９＞のいずれか１項記載の方法。
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつCES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜１１＞前記ＤＮＡ（ｂ）が、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上９０３個以下、好ましくは１個以上７９０個以下、より好ましくは１個以上６７７個以下、より好ましくは１個以上５６４個以下、より好ましくは１個以上４５１個以下、より好ましくは１個以上３３８個以下、より好ましくは１個以上２２５個以下、より好ましくは１個以上１８０個以下、より好ましくは１個以上１３５個以下、より好ましくは１個以上９０個以下、より好ましくは１個以上４５個以下、さらに好ましくは１個以上２２個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加されており、かつCES活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつCES活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、である、前記＜１０＞項に記載の方法。
＜１２＞前記アルジナン合成に関与するPKSが、下記タンパク質（Ｃ）又は（Ｄ）である、前記＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項記載の方法。
（Ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつアルジナン合成に関与するタンパク質。
＜１３＞前記タンパク質（Ｄ）が、前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１２０３個以下、好ましくは１個以上１０５３個以下、より好ましくは１個以上９０２個以下、より好ましくは１個以上７５２個以下、より好ましくは１個以上６０１個以下、より好ましくは１個以上４２１個以下、より好ましくは１個以上３００個以下、より好ましくは１個以上２４０個以下、より好ましくは１個以上１８０個以下、より好ましくは１個以上１２０個以下、より好ましくは１個以上６０個以下、さらに好ましくは１個以上３０個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつアルジナン合成に関与するタンパク質、である、前記＜１２＞項に記載の方法。
＜１４＞前記アルジナン合成に関与するPKSをコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ｃ）又は（ｄ）からなる遺伝子である、前記＜３＞〜＜１３＞のいずれか１項記載の方法。
（ｃ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつアルジナン合成に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜１５＞前記ＤＮＡ（ｄ）が、前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上３６１２個以下、好ましくは１個以上３１６０個以下、より好ましくは１個以上２７０９個以下、より好ましくは１個以上２２５７個以下、より好ましくは１個以上１８０６個以下、より好ましくは１個以上１２６４個以下、より好ましくは１個以上９０３個以下、より好ましくは１個以上７２２個以下、より好ましくは１個以上５４１個以下、より好ましくは１個以上３６１個以下、より好ましくは１個以上１８０個以下、さらに好ましくは１個以上９０個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつアルジナン合成に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアルジナン合成に関与するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、である、前記＜１４＞項に記載の方法。
【００５８】
＜１６＞前記藻類を、光強度が１〜４，０００μmol/m2/sの範囲、好ましくは１０〜２，５００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは１００〜２，５００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは２００〜２，５００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは２５０〜２，５００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは３００〜２，５００μmol/m2/sの範囲、の条件で培養する、前記＜１＞〜＜１５＞のいずれか１項記載の方法。
＜１７＞ｆ／２培地を用いて前記形質転換体を培養する、前記＜１＞〜＜１６＞のいずれか１項記載の方法。
＜１８＞前記脂質が、脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくは炭素原子数が２以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が４以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が６以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が８以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が１０以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、さらに好ましくは炭素原子数が１２以上２０以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、を含む、前記＜１＞〜＜１７＞のいずれか１項記載の方法。
【００５９】
＜１９＞脂質を製造するための、前記＜１＞〜＜１５＞のいずれか１項記載の藻類の使用。
＜２０＞脂質を回収するための、前記＜１＞〜＜１５＞のいずれか１項記載の藻類の使用。
＜２１＞前記脂質が、脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくは炭素原子数が２以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が４以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が６以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が８以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が１０以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、さらに好ましくは炭素原子数が１２以上２０以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、を含む、前記＜１９＞又は＜２０＞項記載の使用。
【実施例】
【００６０】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。ここで、本実施例で用いたプライマーの塩基配列を表１に示す。
【００６１】
【表１】
2020058322.tif 000002
【００６２】
作製例１  ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株におけるＣＥＳＡ１遺伝子破壊株の作製
（１）ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドの構築
ゼオシン耐性遺伝子（配列番号１０）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表１に示す配列番号１３及び配列番号１４のプライマー対を用いてゼオシン耐性遺伝子断片を増幅した。また、ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表１に示す配列番号１５と配列番号１６のプライマー対、及び配列番号１７と配列番号１８のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、VCP1プロモーター配列（配列番号９）及びVCP1ターミネーター配列（配列番号１１）を増幅した。さらに、プラスミドベクターpUC19（タカラバイオ社製、配列番号３８）を鋳型として、表１に示す配列番号１９及び配列番号２０のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、プラスミドベクターpUC19を増幅した。これら４つの増幅断片をそれぞれ制限酵素DpnI（東洋紡株式会社製）にて処理し、High  Pure  PCR  Product  Purification  Kit（Roche  Applied  Science社製)を用いて精製した。その後、得られた４つの断片をIn-Fusion  HD  Cloning  Kit（Clontech社製）を用いて融合し、ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを構築した。
なお、本発現用プラスミドは、VCP1プロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、VCP1ターミネーター配列の順に連結したインサート配列とpUC19ベクター配列からなる。
【００６３】
（２）遺伝子破壊用プラスミドの構築
ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株のゲノム配列情報を基に、BLAST解析により、本発明で用いるCES候補遺伝子としてCESA1遺伝子（配列番号２）を、又アルジナン合成に関与するPKS候補遺伝子としてPKS3遺伝子（配列番号４）を同定した。
ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表１に示す配列番号２１と配列番号２２のプライマー対、及び配列番号２３及び配列番号２４のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、CESA1遺伝子上流の相同配列（配列番号５）及びCESA1遺伝子下流の相同配列（配列番号６）を増幅した。またプラスミドベクターｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製、配列番号３７）を鋳型として、表１に示す配列番号２５及び配列番号２６のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、プラスミドベクターｐＵＣ１１８を増幅した。さらに前記ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、配列番号２７及び配列番号２８のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット（VCP1プロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、VCP1ターミネーター配列）を増幅した。これら4つの増幅断片を、前述と同様の方法にて融合し、CESA1遺伝子破壊用プラスミドを構築した。
なお、本プラスミドはCESA1遺伝子上流の相同配列、VCP1プロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、VCP1ターミネーター配列、CESA1遺伝子下流の相同配列の順で連結したインサート配列とpUC118ベクター配列からなる。
【００６４】
（３）相同組換えによるCESA1遺伝子破壊株の作製
前記CESA1遺伝子破壊用プラスミドを鋳型として、表１に示す配列番号２１及び配列番号２４のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、CESA1遺伝子相同組換え用ＤＮＡ断片（CESA1遺伝子上流の相同配列、VCP1プロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、VCP1ターミネーター配列、CESA1遺伝子下流の相同配列）を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を、High  Pure  PCR  Product  Purification  Kit（Roche  Applied  Science社製)を用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。
約１０９細胞のナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株を、３８４ｍＭのソルビトール溶液で洗浄して塩を完全に除去し、形質転換の宿主細胞として用いた。上記で増幅したＤＮＡ断片を、約５００ｎｇずつ宿主細胞に混和し、５０μＦ、５００Ω、２，２００ｖ／２ｍｍの条件でエレクトロポレーションを行った。ｆ／２液体培地（ＮａＮＯ３  ７５ｍｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ  ６ｍｇ、ビタミンＢ１２  ０．５μｇ、ビオチン  ０．５μｇ、チアミン  １００μｇ、Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ、Ｎａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ  ４．４ｍｇ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ  ３．１６ｍｇ、ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １２μｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２１μｇ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  １８０μｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ７μｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ７μｇ／人工海水１Ｌ）にて２４時間回復培養を行った後に、２μｇ／ｍＬのゼオシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、２５℃、０．３％ＣＯ２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて２〜３週間培養した。得られたコロニーをCESA1遺伝子破壊株（以下、「ΔCESA1株」ともいう）として選抜した。なお相同組換えによるCESA1遺伝子の破壊の確認は、表１に示す配列番号２９及び配列番号１４のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、目的のＤＮＡ断片がCESA1遺伝子に挿入されていることを確認することで行った。
【００６５】
作製例２  ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株におけるPKS3遺伝子破壊株の作製
（１）パロモマイシン耐性遺伝子発現用プラスミドの構築
パロモマイシン耐性遺伝子（配列番号１２）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表１に示す配列番号３０及び配列番号３１のプライマー対を用いてパロモマイシン耐性遺伝子のＤＮＡ断片を増幅した。また、作製例１で作製したゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを鋳型に、表１に示す配列番号１６及び配列番号１７のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＶＣＰ１プロモーター、ＶＣＰ１ターミネーター及びｐＵＣ１９ベクター配列からなるＤＮＡ断片を増幅した。これら２つのＤＮＡ断片を作製例１と同様の方法にて融合し、パロモマイシン耐性遺伝子発現用プラスミドを構築した。
なお、本発現用プラスミドは、VCP1プロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、VCP1ターミネーター配列の順に連結したインサート配列とpUC19ベクター配列からなる。
【００６６】
（２）遺伝子破壊用プラスミドの構築
ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表１に示す配列番号３２と配列番号３３のプライマー対、及び配列番号３４と配列番号３５のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、PKS3遺伝子上流の相同配列（配列番号７）及びPKS3遺伝子下流の相同配列（配列番号８）を増幅した。またプラスミドベクターｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）を鋳型として、表１に示す配列番号２５及び配列番号２６のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、プラスミドベクターｐＵＣ１１８を増幅した。さらに前記パロモマイシン耐性遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、配列番号２７及び配列番号２８のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、パロモマイシン耐性遺伝子発現カセット（VCP1プロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、VCP1ターミネーター配列）を増幅した。これら4つの増幅断片を、前述と同様の方法にて融合し、PKS3遺伝子破壊用プラスミドを構築した。
なお、本プラスミドはPKS3遺伝子上流の相同配列、VCP1プロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、VCP1ターミネーター配列、PKS3遺伝子下流の相同配列の順で連結したインサート配列とpUC118ベクター配列からなる。
【００６７】
（３）相同組換えによるPKS3遺伝子破壊株の作製
前記PKS3遺伝子破壊用プラスミドを鋳型として、表１に示す配列番号３２及び配列番号３５のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、PKS3遺伝子相同組換え用断片（PKS3遺伝子上流の相同配列、VCP1プロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、VCP1ターミネーター配列、PKS3下流の相同配列）を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を、作製例１と同様の方法で調製し、形質転換を行った。ｆ／２液体培地にて２４時間回復培養を行った後に、５００μｇ／ｍＬのパロモマイシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、２５℃、０．３％ＣＯ２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて２〜３週間培養した。得られたコロニーをPKS3遺伝子破壊株（以下、「ΔPKS3株」ともいう）として選抜した。なお相同組換えによるPKS3遺伝子の破壊の確認は、表１に示す配列番号３６及び配列番号１４のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、目的のＤＮＡ断片がPKS3の遺伝子に挿入されていることを確認することで行った。
【００６８】
（４）CESA1遺伝子及びPKS3遺伝子の二重破壊株の作製
作製例１で作製したCESA1遺伝子破壊株を親株とし、PKS3遺伝子破壊株の作製と同様の方法で形質転換を行った。ｆ／２液体培地にて２４時間回復培養を行った後に、５００μｇ／ｍＬのパロモマイシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、２５℃、０．３％ＣＯ２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて２〜３週間培養した。得られたコロニーをCESA1遺伝子及びPKS3遺伝子の二重破壊株（以下、「ΔCESA1/PKS3株」ともいう）として選抜した。なお相同組換えによるPKS3遺伝子の破壊の確認は、表１に示す配列番号３６及び配列番号１４のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、目的のＤＮＡ断片がPKS3の遺伝子に挿入されていることを確認することで行った。
【００６９】
実施例１  遺伝子破壊株の脂質抽出率評価
（１）ヘキサンによる脂質抽出
試料には、作製例１で作製したΔCESA1株と作製例２で作製したΔPKS3株及びΔCESA1/PKS3株、陰性対照株の野生型の藻体（以下、「野生株」若しくは「ＷＴ」ともいう）を使用した。藻体はｆ／２培地の窒素濃度を１５倍、リン濃度を５倍に増強した培地（以下、「Ｎ１５Ｐ５培地」ともいう）５０ｍＬに播種し、２５℃、０．３％ＣＯ２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて３週間培養した。
培養液１ｍＬを試験管に採取し、ヘキサン２ｍＬ及び内部標準として１ｍｇ／ｍＬの７−ペンタデカノン（Alfa Aesar社製）を５０μＬ添加して激しく撹拌した。その後３，０００rpmにて５分間遠心分離し、上層のヘキサン層をパスツールピペットにて回収した。得られたヘキサン層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、０．５Ｎ水酸化カリウム／メタノール溶液０．７ｍＬを添加し、８０℃で３０分恒温した。続いて１ｍＬの１４％三フッ化ホウ素溶液（ＳＩＧＭＡ社製）を添加し、８０℃にて１０分恒温した。その後、ヘキサン、飽和食塩水を各１ｍＬ添加し激しく撹拌し、室温にて３０分放置後、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸エステルを得た。
【００７０】
また、試料中に含まれる総脂肪酸量の解析は以下の方法で行った。
培養液１ｍＬに、内部標準として１ｍｇ／ｍＬの７−ペンタデカノン（Alfa Aesar社製）を５０μＬ添加後、０．５ｍＬのクロロホルム、１ｍＬのメタノール及び１０μＬの２Ｎ塩酸を培養液に添加して激しく攪拌後３０分間放置し、その後さらに０．５ｍＬのクロロホルムおよび０．５ｍＬの１．５％ＫＣｌを添加して攪拌後、３，０００ｒｐｍ、１５分遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、０．５Ｎ水酸化カリウム／メタノール溶液０．７ｍＬを添加し、８０℃で３０分恒温した。続いて１ｍＬの１４％三フッ化ホウ素溶液（ＳＩＧＭＡ社製）を添加し、８０℃にて１０分恒温した。その後、ヘキサン、飽和食塩水を各１ｍＬ添加し激しく撹拌し、室温にて３０分放置後、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸エステルを得た。
【００７１】
得られた脂肪酸エステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。ガスクロマトグラフィー解析は下記の条件で行った。
＜ガスクロマトグラフィー条件＞
分析装置：Agilent technology 7890A
キャピラリーカラム：ＤＢ−１  ＭＳ  ３０ｍ×２００μｍ×０．２５μｍ（J＆W  Scientific）
移動層：高純度ヘリウム
カラム内流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
昇温プログラム：１００℃（１分間）→１０℃／ｍｉｎ→３００℃（５分間）
平衡化時間：１分間
注入口：スプリット注入（スプリット比：１００：１）
圧力：１４．４９ｐｓｉ，１０４ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：１μＬ
洗浄バイアル：メタノール・クロロホルム
検出器温度：３００℃
【００７２】
また、脂肪酸エステルの同定は、同サンプルを同条件でガスクロマトグラフ質量分析解析に供することにより行った。
ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。各ピーク面積を、内部標準である７−ペンタデカノンのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、各脂肪酸量を算出しその総和を総脂肪酸量とした。得られた総脂肪酸量を基に、ヘキサン抽出による抽出効率を以下の式で計算した。
抽出率（％）＝ヘキサン抽出により得られた総脂肪酸量／試料中の総脂肪酸量×１００
得られた抽出率を表２に示す。抽出率（％）は独立ラインの平均値±標準偏差（ＳＤ）の形式で表示した。なお、以下の表において、野生株は「ＷＴ」と記載し、遺伝子破壊株はそれぞれΔCESA1株を「ΔCES」、ΔPKS3株を「ΔPKS」、ΔCESA1/PKS3株を「ΔCP」と表記した。なお、本実施例でいう「総脂肪酸量」とは、C12:0量、C14:0量、C16:1量、C16:0量、C18:n量、C20:5量の合計を意味する。なお、Ｃｘ：ｙとあるのは炭素原子数がｘで二重結合数がｙの脂肪酸を表す。また、Ｃ１８：ｎの「ｎ」は０〜５の整数を表し、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ１８：４、及びＣ１８：５の脂肪酸の総和を表す。
【００７３】
【表２】
2020058322.tif 000003
【００７４】
表２より明らかなように、ΔCESA1株、ΔPKS3株及びΔCESA1/PKS3株は、野生株と比較して高い抽出率を示した。特にΔCESA1/PKS3株では、大幅に抽出率が増加した。
【００７５】
（２）ビーズ破砕による脂質抽出
前記藻体の培養液１ｍＬを１５，０００ｒｐｍにて遠心分離し、上清を捨てて細胞を回収した。破砕用ビーズ（０．５ｍｍ）を０．４ｍｇ使って、マルチビーズショッカー（安井機械製）１，０００ｒｐｍにて３０秒破砕を行った。
破砕後のサンプルを前述と同様の方法でヘキサン抽出し、抽出された総脂肪酸量を解析して、ビーズ破砕による脂質抽出効率を計算した。得られた抽出効率を表３に示す。抽出率（％）は独立ラインの平均値±標準偏差の形式で表示した。
【００７６】
【表３】
2020058322.tif 000004
【００７７】
表３より明らかなように、ΔCESA1株、ΔPKS3株及びΔCESA1/PKS3株は、野生株と比較して高い抽出率を示した。特にΔCESA1/PKS3株では、大幅に抽出率が増加した。
【００７８】
（３）ハンドプレスによる脂質の圧搾抽出
前記藻体を遠心分離（３，０００ｒｐｍ、５分間）にて回収し、凍結乾燥させた。乾燥藻体５〜１０ｍｇを２枚のプランクトンネット（孔径１μｍ）ではさみ、さらに外側を２枚のＮｏ．２ろ紙（アドバンテック社製）で挟んだ。次に、２枚のテフロン（登録商標）加工された鉄板ではさみ、ハンドプレス機ＴＭ−２６（東邦マシナリー社製）にセットして、８０℃、５０ＭＰａで１０分間加圧した。
加圧後のろ紙を回収し、ろ紙に染み出した脂質成分をクロロホルム10ｍＬで抽出した。抽出した脂質成分は前述と同様の方法で総脂肪酸量を解析し、ハンドプレスによる脂質抽出効率を計算した。得られた抽出効率を表４に示す。抽出率（％）は独立ラインの平均値±標準偏差の形式で表示した。
【００７９】
【表４】
2020058322.tif 000005
【００８０】
表４より明らかなように、ΔCESA1株、ΔPKS3株及びΔCESA1/PKS3株は、野生株と比較して高い抽出率を示した。特にΔCESA1/PKS3株では、大幅に抽出率が増加した。
【００８１】
以上のことから、CES及びアルジナン合成に関与するPKSの少なくとも１つの発現が低下又は喪失した本発明に用いる藻類改変体は、野生株と比較して、いずれの方法によっても脂質の回収が容易であることが明らかとなった。さらに、CES及びアルジナン合成に関与するPKSを両方欠失させた藻類改変体は、野生株と比べて、脂質の回収が特に容易であることが明らかとなった。
【配列表】
2020058322000001.app