(57)【要約】      （修正有）【課題】腫瘍溶解性ＨＳＶベクターの提供。【解決手段】細胞（がん細胞等）の表面に存在する分子（タンパク質、脂質、又は炭水化物の決定基）に特異的な非ＨＳＶリガンド及び１以上のＨＳＶ遺伝子座、好ましくは、正常（即ち、非がん性）細胞におけるＨＳＶの複製に必要な、１以上のＨＳＶ遺伝子（複数可）、に挿入された、１以上のマイクロＲＮＡ標的配列の、１以上のコピーを含む、組換え腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）を提供する。また、ｏＨＳＶを含むストック及び医薬組成物並びにｏＨＳＶを用いる、腫瘍細胞を殺傷するための方法を更に提供する。【選択図】図１
2020058341.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）がん細胞の表面に存在するタンパク質に特異的である非ＨＳＶリガンド、
（ｂ）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）−１２４の標的配列の４コピーであって、前記コピーのそれぞれが８ヌクレオチドのスペーサーによって分離され、正常な（非がん性）細胞におけるＨＳＶ複製に必要なＨＳＶ遺伝子の１つ以上の遺伝子座に挿入されたコピー、及び
（ｃ）ＩＣＰ０遺伝子、ＩＣＰ３４．５遺伝子、ＬＡＴ遺伝子及びＩＣＰ４遺伝子の１コピーと、ＩＣＰ４７プロモーターとを含むＨＳＶゲノム中の内部反復（接合部）領域の欠失
を含む、組換え腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）。
【請求項２】
リガンドが、ＨＳＶの表面に露出したウイルスエンベロープの糖タンパク質に組み込まれている、請求項１に記載のｏＨＳＶ。
【請求項３】
ウイルスエンベロープの糖タンパク質が、ｇＤ又はｇＣである、請求項２に記載のｏＨＳＶ。
【請求項４】
リガンドが、ｇＤの残基１〜２５の間に組み込まれている、請求項３に記載のｏＨＳＶ。
【請求項５】
非ＨＳＶリガンドが、ＥＧＦＲ又はＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合することができる、請求項１に記載のｏＨＳＶ。
【請求項６】
リガンドが、細胞受容体に結合する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）又はペプチドホルモン若しくは非ペプチドホルモン又は成長因子である、請求項１に記載のｏＨＳＶ。
【請求項７】
非カノニカルな受容体を介したベクター侵入を促進するＨＳＶのｇＢ又はｇＨ糖タンパク質の変異体を更に含む、請求項１に記載のｏＨＳＶ。
【請求項８】
ｍｉＲ−１２４の標的配列がＩＣＰ４遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に挿入されている、請求項１に記載のｏＨＳＶ。
【請求項９】
（ａ）がん細胞の表面に存在するタンパク質に特異的な非ＨＳＶリガンドであって、該非ＨＳＶリガンドがＥＧＦＲ又はＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合するｓｃＦｖであり、且つｏＨＳＶのウイルスエンベロープの糖タンパク質の残基１〜２５の間に挿入されており、該糖タンパク質がｇＤである、非ＨＳＶリガンド、
（ｂ）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）−１２４の標的配列の逆相補配列の４コピーであって、前記コピーのそれぞれが８ヌクレオチドのスペーサーによって分離され、ｏＨＳＶゲノムのＩＣＰ４の３’ 非翻訳領域（ＵＴＲ）に挿入されたコピー、及び
（ｃ）ＩＣＰ０遺伝子、ＩＣＰ３４．５遺伝子、ＬＡＴ遺伝子及びＩＣＰ４遺伝子の１コピーと、ＩＣＰ４７プロモーターとを含むＨＳＶゲノム中の内部反復（接合部）領域の欠失
を含む、組換え腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）。
【請求項１０】
導入遺伝子を更に含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のｏＨＳＶ。
【請求項１１】
導入遺伝子が、腫瘍溶解性因子、がんに対する患者の免疫応答を誘導するタンパク質又はポリペプチド、マトリクスメタロプロテイナーゼ、プロドラッグの変換を触媒するタンパク質若しくはポリペプチド、シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼ、又はプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）から選択されるペプチドをコードする、請求項１０に記載のｏＨＳＶ。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のｏＨＳＶをコードする、核酸。
【請求項１３】
細菌人工染色体（ＢＡＣ）である、請求項１２に記載の核酸。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のｏＨＳＶベクターを含む、ウイルスストック。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のｏＨＳＶ及び医薬的に許容可能な担体を含む、組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のｏＨＳＶががん性細胞に感染するのに十分な条件下で細胞を前記ｏＨＳＶに曝露することを含む、がん性細胞を殺傷する方法であって、がん性細胞内でのｏＨＳＶの複製が細胞死をもたらす、方法。
【請求項１７】
細胞がインビボのである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
細胞が腫瘍内にある、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
腫瘍が多形性膠芽腫である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
腫瘍が動物の脳内にある、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ｏＨＳＶが、該ｏＨＳＶ、そのストック、又はその組成物を動物に頭蓋内注入することによって細胞に曝露される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
動物がヒトである、請求項２０又は２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１３年１０月２８日出願の米国仮特許出願第６１／８９６，４９７号（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）の優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府支援の研究及び開発に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所により交付された、補助金番号ＣＡ１１９２９８、ＣＡ１６３２０５、ＣＡ１７５０５２、ＮＳ０４０９２３、及びＤＫ０４４９３５における政府の支援によりなされた。本発明においては、政府が一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
多形性膠芽腫（ＧＢＭ）は、併用療法の適用・利用が可能にもかかわらず、一様に致死的な疾患である。前臨床試験は、腫瘍溶解性ＨＳＶ（「ｏＨＳＶ」）ベクターを含む、複製可能なウイルスが、有望な代替治療手段の典型であるが、患者試験における治療の有効性は限られていることを示唆する。ベクターの安全性の達成は、腫瘍細胞における溶菌複製も無効にし得るベクター突然変異の抑制に依存している。
【発明の概要】
【０００４】
発明の要旨
本発明は、ベクターの、腫瘍関連細胞表面受容体への再標的化（ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ）と、正常な脳では高度に発現するが、腫瘍細胞中には実質的に存在しない、細胞のマイクロＲＮＡ（「ｍｉＲ」）によるベクター複製の阻害とを組み合わせることにより、減衰なく、腫瘍に選択的なベクター複製ができるｏＨＳＶを提供する。ｍｉＲ応答性エレメントは、インビトロ又は異種脳腫瘍モデルでの、原発性腫瘍細胞における溶解性のベクター複製を妨げることなく、ヌードマウスの脳においてベクターの病原性を抑える。この新しいベクターの設計は、より安全でより効果的なベクタープラットフォームを提供するはずであり、患者の腫瘍への適用のために、更に発展し得る。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１は、Ｔ１２４エレメントの有効性及び特異性に関する実験結果からのデータを提示する。３’ＵＴＲ中に、Ｔ１２４（ｐｆＬｕｃ−Ｔ１２４）又はコントロール配列（ｐｆＬｕｃ−Ｃｔｒｌ）を含有するホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）発現プラスミドを、ウミシイタケルシフェラーゼ（ｐｒＬｕｃ）内部コントロールプラスミドと共に、２４時間前に合成ｐｒｅ−ｍｉＲ−１２４又はｐｒｅ−ｍｉＲ−２１をトランスフェクションしたＨＥＫ２９３ＡＤ細胞へ共トランスフェクションした。４８時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を、ｒＬｕｃ活性に正規化された、ｆＬｕｃ活性の３回の測定からの平均±標準偏差として示す。ペア間の統計学的有意差は、対応するＰ値の下に角括弧で示す（対応のないｔ検定）。
【図２】図２は、神経膠腫細胞におけるウイルス複製に関する実験結果からのデータを提示する。（Ａ）ベクターの図。親ＫＯＳ−３７  ＢＡＣは、ウイルスのＵＬ３７とＵＬ３８遺伝子間に、ｌｏｘＰが隣接したＢＡＣ、クロラムフェニコール耐性及びｌａｃＺ配列（「ＢＡＣ」）を含有する（Ｇｉｅｒａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ＫＧＢＡＣ及びＫＧ４：Ｔ１２４ＢＡＣを作製するための修飾を、以下説明する：ｇＢ：ＮＴ、ウイルス侵入を増進する、ｇＢ遺伝子中の二重突然変異；ｇＣ−ｅＧＦＰ、２Ａペプチド配列を介した、完全なｇＣ  ＯＲＦの、ＧＦＰへの融合；Δ接合部、ＩＣＰ４遺伝子の１コピーを含む、完全な内部反復領域の欠失；ＩＣＰ４：Ｔ１２４、残存するＩＣＰ４遺伝子の３’ＵＴＲにおけるＴ１２４の挿入。ＵＬ、ウイルスゲノムの、固有の長いセグメント；ＵＳ、固有の短いセグメント。（Ｂ）患者由来の培養神経膠腫細胞における、ウイルス複製に対するＴ１２４の影響。Ｇｌｉ６８及びＧＢＭ３０細胞に、ＫＧ又はＫＧ４：Ｔ１２４ウイルスを、０．０１のＭＯＩで、トリプリケートで感染させた。感染後、表示された時点で、細胞溶解物及び上清を回収し、Ｕ２ＯＳ細胞で力価を測定した。値は平均±標準偏差である。（Ｃ）ＬＶ１２４に感染したＧｌｉ６８細胞におけるｍｉＲ−１２４の発現。細胞を５ｃｆｕ／細胞で感染させ、翌日、ピューロマイシン含有培地でセレクション（３日間）し、全ＲＮＡ抽出のために回収した。コントロールＲＮＡは、未感染のＧｌｉ６８細胞及びＵ２ＯＳ細胞由来であった。ｍｉＲ−１２４のレベルは、定量的ＲＴ−ＰＣＲによりトリプリケートで決定し、ＲＮＵ４３のレベルに正規化した。Ｕ２ＯＳ細胞に対する、増加倍数±標準偏差を示す。すべての対について、Ｐ＜０．０５（対応のないｔ検定）。（Ｄ）ＫＧ及びＫＧ４：Ｔ１２４の、ｍｉＲ−１２４形質導入細胞並びにコントロールのＧＢＭ３０細胞及びＧｌｉ６８細胞におけるウイルスの複製。細胞を、５ｃｆｕ／細胞で、ＬＶ１２４又はＬＶ１３７Ｒに感染させ、ピューロマイシンで３日間セレクションし、０．０１のＭＯＩで、ＫＧ又はＫＧ４：Ｔ１２４に重複感染させた。７２及び９６時間後に回収し、混合した細胞溶解物と上清中の感染性ＨＳＶの力価を、Ｕ２ＯＳ細胞で測定した。結果は、ＨＳＶ感染のトリプリケートからの平均値±標準偏差である。角括弧は、対応するＰ値を有する、有意差のある対を示す（対応のないｔ検定）。
【図３】図３は、ヌードマウスの脳における、ＫＧ４：Ｔ１２４ウイルスの複製及び毒性に関する実験結果からのデータを提示する。４．８×１０９ゲノムコピーのＫＧ又はＫＧ４：Ｔ１２４を、４匹のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの頭蓋内に、それぞれ注入した（ｎ＝４／群）。（Ａ）動物の、ベクター注入後の経時的な体重。左、ＫＧを注入した動物；Ｘ、動物の死亡。右、ＫＧ４：Ｔ１２４を注入したマウス；黒丸、動物の屠殺。（Ｂ）ベクター注入後の、マウス脳における経時的な全ウイルスゲノムコピー。ベクター注入後５、１４、２１及び３３日目に屠殺した、ＫＧ４：Ｔ１２４を注入したマウス一匹並びに５日目に安楽死させた、重篤な疾患症状の、ＫＧ注入群からの最後の生存動物からの脳を回収し、ＤＮＡを単離し、脳あたりのウイルスベクターゲノムの総数を、ｑＰＣＲにより測定した。（Ｃ）この実験における動物のカプラン・マイヤー生存プロット。矢印は、ＫＧ４：Ｔ１２４注入群から１匹の動物を屠殺する日を示す。Ｐ＝０．００５８、ログランク検定。
【図４】図４は、ヒト神経膠芽腫のヌードマウスモデルの、ＥＧＦＲへ再標的化した（ＥＧＦＲ−ｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ）、ｍｉＲ−１２４に感受性のＨＳＶベクター処理に関する実験結果からのデータを提示する。研和した（Ｔｒｉｔｕｒａｔｅｄ）ＧＢＭ３０細胞を頭蓋内移植し、５日後に、ＰＢＳ又は１．８×１０８ｇｃのＫＧＥ若しくはＫＧＥ−４：Ｔ１２４ウイルスを、同一座標で注入した。（Ａ）カプラン・マイヤー生存プロット。ログランク統計：ＫＧＥとＰＢＳとの比較、Ｐ＝０．０１８８；ＫＧＥ−４：Ｔ１２４とＰＢＳとの比較、Ｐ＝０．０００９；ＫＧＥとＫＧＥ−４：Ｔ１２４との比較、Ｐ＝０．８３２７。（Ｂ）腫瘍細胞移植後の経時的な動物の体重。Ｘ、動物の死又は安楽死。
【図５−１】図５は、ＫＭＭＰ９が、酵素的に活性なＭＭＰ９の過剰発現を調節することを実証するデータを提示する。（Ａ）ＫＭＭＰ９及びＫＧｗの構造。（Ｂ）ＫＭＭＰ９、ＫＧｗ、又はＫＧ（ＭＯＩ＝０．１）のいずれかで感染させた、ベロ細胞の細胞溶解物のウェスタンブロット解析。βチューブリンとＨＳＶ糖タンパク質Ｂは、それぞれ、細胞及びウイルスのローディングコントロールとして可視化した。略語：Ｍ、ＫＭＭＰ９；Ｇ、ＫＧｗ；ＫＧ、コントロールウイルス；ｕｎ．、未感染；ｇＢ、糖タンパク質Ｂ；Ｓｕｐ．、上清。
【図５−２】図５は、ＫＭＭＰ９が、酵素的に活性なＭＭＰ９の過剰発現を調節することを実証するデータを提示する。原発性ＧＢＭ細胞株（Ｃ）又はベロ細胞（Ｄ）を、ＭＯＩ＝１で、ＫＧｗ又はＫＭＭＰ９に感染させた。感染後２４時間目に、細胞溶解物及び上清を回収し、１０％ポリアクリルアミド／０．１％ゼラチンゲルに、混合して（Ｃ）又は別々に（Ｄ）ロードした。電気泳動後、ゲルを、３７℃で一晩インキュベーションし、０．０５％クマシーブルーで染色し、脱染し、画像を記録した。略語：Ｍ、ＫＭＭＰ９；Ｇ、ＫＧｗ；ＫＧ、コントロールウイルス；ｕｎ．、未感染；ｇＢ、糖タンパク質Ｂ；Ｓｕｐ．、上清。
【図６】図６は、ＫＭＭＰ９及びＫＧｗが、同等の細胞侵入と増殖パターンを示すことを実証するデータを提示する。（Ａ）パネルの左側へ列挙した細胞を、パネルの上に列挙したｇｃ／細胞の多重度でウイルスに感染させた。６時間後、細胞を固定し、ＩＣＰ４について免疫染色した。（Ｂ）ＧＢＭ３０及び（Ｃ）ＧＢＭ１６９細胞を解離し、２００ｇｃ／細胞でＫＭＭＰ９又はＫＧｗに感染させた。細胞溶解物を、１、２、４及び６ｄｐｉで回収して、ウイルスゲノムコピーの力価を、ｑＰＣＲにより決定した。いずれの宿主細胞株中でも、２ウイルス間で有意差が観察されなかった（ＧＢＭ３０：Ｐ＝０．２０；ＧＢＭ１６９：Ｐ＝０．１１）。
【図７】図７は、ＫＭＭＰ９が、ＫＧｗと比較して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで同等以上の腫瘍細胞の殺傷を示すことを実証するデータを提示する。Ｕ８７、ＳＮＢ１９又はＧＢＭ３０細胞を、３又は７日間、１０又は１００ｇｃ／細胞で感染させた。非感染細胞に対する、細胞生存のパーセンテージを、ＭＴＴアッセイにより測定した（ｎ＝３；アスタリスク：ｐ＜０．０５、対応のないスチューデントｔ検定）。
【図８】図８は、ＭＭＰ９が、スフェロイド中のｏＨＣＶの感染力を向上させることを実証するデータを提示する。ＧＢＭ３０細胞を、懸濁液中で増殖させ、１×１０３ｐｆｕの、ＫＭＭＰ９又はＫＧｗのいずれかで感染させた。両方のベクター中のｇＣ−Ｔ２ａ−ｅＧＦＰカセットからの緑色蛍光を、ホールマウントスフェロイドにおいて、２〜６ｄｐｉに毎日可視化した。（Ａ）３及び５ｄｐｉにおける代表的な画像。（Ｂ）ベクターあたり６スフェロイドにおいて定量したｅＧＦＰシグナルの平均で、ＫＧｗに対する、ＫＭＭＰ９の、約２倍の感染性増大（Ｐ＝０．００６）が示された。（Ｃ〜Ｅ）２群のＧＢＭ３０スフェロイドに、スフェロイドあたり４×１０７ゲノムコピーで、ＫＭＭＰ９又はＫＧｗを感染させた。スフェロイドを固定し、ＤＡＰＩで染色し、５μｍの間隔で、Ｚ断面の共焦点画像を記録した。パネル（Ｃ）は、ＫＭＭＰ９群及びＫＧｗ群からの、それぞれの、０μｍ〜１５０μｍで３Ｄ再構成した後の、２の代表的なスフェロイドを示す。青、ＤＡＰＩ；緑、ｅＧＦＰ。パネル（Ｄ）は、Ｚ＝１００μｍで、各群からの、２のスフェロイドのＺ断面を示す。（Ｅ）各スフェロイドを、Ｚ軸上の深度（下から上へ：０〜２０μｍ；２５〜５０μｍ；５５〜８０μｍ；８５〜１００μｍ；１０５〜１２０μｍ、及び１２５〜１４０μｍ）に関して、５つのセグメントに分割した。スフェロイドの各セグメントにおける相対的なシグナル強度を、ＤＡＰＩシグナルで除したｅＧＦＰシグナルを平均することによって算出した。ｎ＝７；アスタリスク：Ｐ＜０．０５。
【図９】図９は、ＧＢＭのヌードマウスモデルの、ＫＭＭＰ９処理に関するデータを提示する。ＧＢＭ３０細胞を、頭蓋内に移植し、５日後、ＫＭＭＰ９、ＫＧｗ又はＰＢＳを、同じ座標（ブレグマに対し、前方０．５ｍｍ、側方（右）２ｍｍ、深度３ｍｍ）で注入した。動物を毎日モニタリングし、罹患の徴候を示した時に屠殺した。データを、カプラン・マイヤー生存プロットとして提示する。ＫＭＭＰ９又はＫＧｗで処理した動物は、ＰＢＳ（Ｐ＜０．０１）で処理したものよりも有意に長く生存した。ＫＭＭＰ９とＫＧｗとの間に有意差は認められなかった（ｎ＝４、Ｐ＝０．６１、ログランク検定）。
【図１０】図１０は、ウイルス又はモック（ＰＢＳ）で処理されたＧＢＭ３０動物の治療あたり１の動物の、Ｔ２強調脳ＭＲＩ画像を示す。（Ａ）治療を、ＧＢＭ３０移植後１０日目に行って、処理１日前（−１日目）並びに処理後３、６、９及び１３日目に、画像を収集した。（Ｂ）同日に腫瘍体積を算出した。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
発明の詳細な説明
本発明は、細胞（がん細胞等）の表面に存在する分子（タンパク質、脂質、又は炭水化物の決定基）に特異的な非ＨＳＶリガンド及び１以上のＨＳＶ遺伝子座、好ましくは、正常（即ち、非がん性）細胞におけるＨＳＶの複製に必要な、１以上のＨＳＶ遺伝子（複数
可）、に挿入された、１以上のマイクロＲＮＡ標的配列の、１以上のコピーを含む、組換えｏＨＳＶを提供する。本発明は、本発明のｏＨＳＶを含むストック及び医薬組成物並びに本発明のｏＨＳＶを用いる、腫瘍細胞を殺傷するための方法を更に提供する。
【０００７】
本発明のｏＨＳＶの非ＨＳＶリガンドは、リガンドによる所望の細胞の標的化を促進するため、ｇＤ又はｇＣ等の、ｏＨＳＶの表面に露出した糖タンパク質に組み込まれる。例えば、リガンドは、ｇＤの残基１〜２５の間に組み込まれ得る。ＧＢＭ及び他のがん細胞を標的とするための好ましいリガンドとしては、それらがＥＧＦＲ及びＥＧＦＲｖＩＩＩの、ＣＤ１３３、ＣＸＣＲ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣｌＣ−３／アネキシン−２／ＭＭＰ−２、ヒトトランスフェリン受容体及びＥｐＣＡＭを標的とするものが挙げられ、リガンドは、かかる受容体又は細胞表面分子を標的とし得る。即ち、リガンドは、かかる受容体又は細胞表面分子を特異的に結合させることができ得る。抗体、ｓｃＦｖ（単鎖抗体）及びＶＨＨ（単一ドメイン抗体）等のＥＧＦＲ特異的及びＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的リガンドは、文献に記載されている（Ｋｕａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８８，９６２−６９（２０００）；Ｗｉｃｋｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５（１４）：３１４０−８（１９９５）；Ｏｍｉｄｆａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２５：２９６−３０５（２００４）；Ｕｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２１：５６１−９（２０１３）も参照；Ｂｒａｉｄｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１５，１５７９−９２（２００８）も参照）。
【０００８】
ｏＨＳＶはまた、又は代わりに、リガンドを組み込むことによって、必ずしもがんに関連しない他の細胞表面分子又は受容体に標的化され得る。例えば、リガンドとしては、天然のリガンド（例、ＥＧＦＲを標的とし得るＥＧＦ、ｔｒｋＡを標的とし得るＮＧＦ等の成長因子）、ペプチド性又は非ペプチド性のホルモン、標的分子の結合に関して選択されたペプチド（例、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）、等からの結合ドメインが挙げられ得る。本発明のｏＨＳＶは、非カノニカルな（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ）受容体を介した（ｔｈｏｕｇｈ）ベクター侵入を促進する、ｇＢ及び／又はｇＨの突然変異体形態も含み得る（そして好ましくは、ｏＨＳＶゲノム内の一方又は両方のこれら遺伝子においても、かかる突然変異を有する）。
【０００９】
本発明のベクターに含める、好ましいマイクロＲＮＡ標的配列（好ましくは、その、タンデムの複数コピー）は、神経へ適用するための特定の用途（例、ＧＢＭ等の神経系腫瘍を治療するために本発明のｏＨＳＶを用いる場合、非がん性ニューロンを保護するため）を有する、ｍｉＲ−１２４である。他のマイクロＲＮＡ標的配列は、或いは、他の種類の組織を保護するために使用され得、所望の組織又は細胞種を保護するために、好適なマイクロＲＮＡ標的配列を選択することは、当該分野の通常の技術の範囲内である。例えば、ｍｉＲ−１２２及びｍｉＲ−１９９は、正常な肝細胞で発現するが、原発性肝臓がんではしない。従って、ｍｉＲ−１２２及び／又はｍｉＲ−１９９のマイクロＲＮＡ標的配列のうちの一方か、又はそれら組み合わせが、肝臓がんの治療のための、本発明のｏＨＳＶの実施形態において使用され得る。同様に、ｍｉＲ−１２８及び／又はｍｉＲ−１３７マイクロＲＮＡに対する標的配列は、正常な脳の保護のために、ｏＨＳＶ中で用いることができる。典型的なマイクロＲＮＡ標的配列は、マイクロＲＮＡの逆相補配列（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）であり得る。
【００１０】
マイクロＲＮＡ標的配列（複数可）は、好ましくは、マイクロＲＮＡの存在下でその遺伝子をサイレンシングするために、ＨＳＶ遺伝子の３’非翻訳領域（「ＵＴＲ」）に含められる。好ましくは、マイクロＲＮＡ標的配列の複数コピー（２コピー、３コピー、４コピー、５コピー、６コピー、又はそれ以上等）が、タンデムに挿入される。好ましくは、マイクロＲＮＡ標的配列の複数コピーは、４以上のヌクレオチド（より好ましくは８以上
のヌクレオチド）のスペーサーによって分離される。理論に拘束されることは望まないが、より大きな間隔（例、約８ヌクレオチド超）が、安定性の増大をもたらすと考えられている。
【００１１】
より好ましくは、ＨＳＶ感染の溶解効果からの、非がん性細胞の保護を促進するために、マイクロＲＮＡ標的配列の複数コピーが、非がん性細胞における複製に必須であるＨＳＶ遺伝子の３’ＵＴＲに挿入されており、このことは当業者に知られている。好ましくは、該部位は、マイクロＲＮＡが標的とする遺伝子の、ＨＳＶゲノム内のその通常の（又は天然の）遺伝子座における３’ＵＴＲである。本発明の好ましいｏＨＳＶは、ＩＣＰ４遺伝子の天然のコピーを両方有するベクター中の、一方又は両方のＩＣＰ４遺伝子コピー等のＩＣＰ４遺伝子の、３’ＵＴＲに挿入されたマイクロＲＮＡ標的配列の複数コピーを含む。
【００１２】
本発明のＨＳＶベクターのゲノムは、更に、（緑色蛍光タンパク質等の）レポータータンパク質、（腫瘍壊死因子（「ＴＮＦ」）又はＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（「ＴＲＡＩＬ」）等の）腫瘍殺傷活性を増強する腫瘍溶解性因子若しくは作用因子、又は治療的に重要な他の遺伝子産物（例、ペプチド、薬物で活性化した酵素、抗体、治療用ＲＮＡ等）をコードする等の、１以上の外因性の発現カセット（即ち、プロモーター、エンハンサー、及び他の好適な調節エレメントと作動可能に連結されたコーディング配列を含有する）を含み得る。好ましい外因性発現カセットは、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）及び神経膠芽腫の基底膜の主要構成成分である、ＩＶ型コラーゲン（Ｍａｍｍａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１８３（４）：１２９３−１３０５（２０１３），ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｊｐａｔｈ．２０１３．０６．０２６．Ｅｐｕｂ  ２０１３  Ａｕｇ  ５）を分解するマトリクスメタロプロテイナーゼ９（「ＭＭＰ９」）等のマトリクスメタロプロテイナーゼをコードし、従って、本発明のベクターによる、水平伝播に起因する腫瘍細胞への感染を増進し、腫瘍殺傷活性を増進する。本発明のＨＳＶの水平伝播を増進する、他の遺伝子をコードする発現カセットも好ましい。
【００１３】
他の好適な外因性発現カセットは、本発明のＨＳＶが治療のために使用されるがん又は腫瘍に対する、患者の免疫応答を誘導するタンパク質又はポリペプチドをコードする。例えば、かかる発現カセットとしては、サイトカイン（例、ＩＬ−２及びＩＦＮ  Ｂ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（「ＣＴＬＡ−４」）に対する抗体（Ｈｏｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３６３（８）：７１１−２３（２０１０））、プログラム細胞死タンパク質１（「ＰＤ１」）のリガンド又は該受容体自体のいずれかに対する抗体（Ｔｏｐａｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３６６（２６）：２４４３−５４（２０１２））、及び上皮細胞接着分子（「ＥｐＣＡＭ」）（Ｐａｔｒｉａｒｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｒｅｖ．，３８：６８−７５（２０１２））等の因子をコードする、１以上の核酸を含み得る。上述の通り、ＥｐＣＡＭは、本発明のベクターによって認識される標的化マーカーとしても機能し得る。また、治療されるべきがんがＣＮＳのがん以外、より具体的には、神経膠腫又は神経膠芽腫以外の場合、別の導入遺伝子が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）をコードし得る。
【００１４】
他の好ましい発現カセットは、プロドラッグの、活性薬剤への変換を触媒するタンパク質又はポリペプチドをコードする。例えば、かかる発現カセットは、本発明のベクターに感染した腫瘍又はがん性細胞において、局所的に、５−フルオロシトシン（「５−ＦＣ」）を５−フルオロウラシル（「５−ＦＵ」）に変換できるシトシンデアミナーゼ等の酵素（例、Ａｋｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．，８６（５）：５８１−８６（２００２）参照）をコードし得、５−ＦＵへの全身曝露を最小限にしながら、５−ＦＵが、かかる細胞又は腫瘍内で局所的に作用することを可能にする。同様に、かか
る発現カセットは、ガンシクロビルを活性化し得る、（例、ＨＳＶ前初期プロモーター又は強力な構成的プロモーターに作動可能に連結された）チミジンキナーゼ（ｔｋ）、又はリボヌクレオチドレダクターゼの活性を阻害又は減衰させ得る、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）をコードし得る。特定の実施形態においては、本発明のベクターは、天然の機能的なＨＳＶ  ｔｋ遺伝子も含有し得る。
【００１５】
本発明のベクター内では、外因性発現カセット内のコード配列は、構成的プロモーター又は誘導性若しくは組織特異的プロモーターの等の、所望の任意の遺伝子調節配列と作動可能に連結され得、その多くの例が当該分野で知られている。例えば、一般的に使用される構成的プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターであり、他のプロモーター（例、ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーター、及びＨＳＶ前初期プロモーター（例、ＩＣＰ４プロモーター）等）も用いられ得る。
【００１６】
また、特定の実施形態においては、本発明のベクターゲノムは、ＩＣＰ４７遺伝子についてのプロモーターと共にディプロイド遺伝子（ｄｉｐlｏｉｄ  ｇｅｎｅｓ）ＩＣＰ０
、ＩＣＰ３４．５、ＬＡＴ及びＩＣＰ４の各１コピーを含む内部反復（接合部）領域を欠失している（ｃｏｎｔａｉｎｓ  ａ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ）。他の実施形態においては、接合部を欠失させる代わりに、接合部領域における遺伝子、特にＩＣＰ０及び／又はＩＣＰ４７の発現が、それら遺伝子の欠失、そうでなければ、限定的なそれらの突然変異誘発によってサイレンシングされ得る。
【００１７】
本発明のベクターは、ＨＳＶウイルス学の分野の当業者に知られている標準的な方法により製造され得る。しかしながら、ＨＳＶゲノムの操作及び本発明のベクターの製造を容易にするために、本発明は、本発明のベクターをコードする核酸も提供する。好ましい核酸は、細菌のシステムにおいてＨＳＶの操作を容易にする、本発明のベクターをコードする細菌人工染色体（「ＢＡＣ」）である。
【００１８】
本発明のｏＨＳＶは、インビボかインビトロかに関わらず、がん性細胞を標的とし、殺傷するために用いられ得ることを認識すべきである。好ましい用途は、特にヒト患者において、及び／又は（種々の哺乳動物種において異種移植片となり得る）ヒト腫瘍／細胞に対して、本発明のベクターを治療的に使用することである。しかし、該方法は、コンパニオンアニマル（例、ネコ及びイヌ）、又は農業に重要（例、ウシ、ヒツジ、ウマ等）な、若しくは動物学的に重要な動物等の動物にも使用され得る。治療に本発明のベクターが用いられ得る、例示的な腫瘍／がん性細胞としては、中枢神経系のがん、特に多形性膠芽腫が挙げられる。
【００１９】
一般的に、本発明のｏＨＳＶベクターは、細胞が、好適な数のウイルスに確実に遭遇するように、細胞集団に十分なウイルスが送達され得る場合に、最も有用である。従って、本発明は、本発明のｏＨＳＶベクターを含むストック、好ましくは均質なストック、を提供する。ＨＳＶストックの調製及び解析は、当該分野で周知である。例えば、ウイルスストックは、ｏＨＳＶベクターで形質導入した細胞を含有するローラーボトル中で製造され得る。次いで、ウイルスストックは、連続ナイコデンツ勾配（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｎｙｃｏｄｅｎｚｅ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）で精製し、等分し、必要となるまで保存され得る。ウイルスストックは、主に、ウイルス遺伝子型及びそれらを調製するために用いられるプロトコル及び細胞株に依存して、力価が相当異なる。好ましくは、かかるストックは、少なくとも約１０５プラーク形成単位（ｐｆｕ）（少なくとも約１０６ｐｆｕ等、又はいっそう好ましくは少なくとも約１０７ＰＦＵ）のウイルス力価を有する。なおより好ましい実施形態においては、力価は、少なくとも約１０８ＰＦＵ、又は少なくとも約１０９ＰＦＵであり得、そして少なくとも約１０１０ＰＦＵ又は少なくとも約１０１１ＰＦＵの高
力価ストックが、最も好ましい。かかる力価は、例えば、ベクターが標的とする受容体を発現する細胞を用いて確立され得る。
【００２０】
本発明は、更に、本発明のｏＨＳＶベクター及び担体、好ましくは生理学的に許容可能な担体、を含む組成物を提供する。組成物の担体は、ベクターにとって好適な、任意の担体であり得る。担体は、典型的には液体であるが、固体、又は液体及び固体成分の組み合わせでもあり得る。担体は、望ましくは、医薬的に許容可能な（例、生理学的又は薬理学的に許容可能な）担体（例、賦形剤又は希釈剤）である。医薬的に許容可能な担体は周知であり、容易に入手可能である。担体の選択は、組成物を投与するために用いられる、特定のベクター及び特定の方法によって、少なくともある程度決定される。組成物は、特に、組成物の安定性を高めるため及び／又はその最終用途のために、他の任意の好適な成分を、更に含み得る。従って、本発明の組成物の好適な、多種多様の製剤がある。以下の製剤及び方法は、単なる例示であり、決して限定的なものではない。
【００２１】
非経口投与のための好適な製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤を、意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る水性及び非水性の等張無菌注射溶液、並びに、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、及び保存剤を含み得る水性及び非水性無菌懸濁液が挙げられる。製剤は、アンプル及びバイアル等の単位用量又は複数回用量の密封容器にて提示され得、使用直前に、例えば注射用水といった無菌の液体担体の添加のみを要する冷凍乾燥（凍結乾燥）条件で保存され得る。即席注射溶液及び懸濁液は、既述の種類の滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製され得る。
【００２２】
更に、組成物は、更なる治療的又は生物学的活性剤を含み得る。例えば、特定の適応症の治療に有用な治療因子が存在し得る。イブプロフェン又はステロイド等の、炎症を制御する因子は、ベクターのインビボ投与及び生理学的苦痛に関連する、腫れ又は炎症を低減するため、組成物の一部とされ得る。免疫系抑制剤は、ベクター自体又は疾患に関連する任意の免疫応答を低減させるために、組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）と共に投与され得る。或いは、免疫増強剤は、疾患に対して、特に、本発明のベクターが用いられるべきがん又は腫瘍に対して、身体の自然防御をアップレギュレートする組成物中に含められ得る。抗生物質、即ち、殺菌剤（ｍｉｃｒｏｂｉｃｉｄｅｓ）及び防カビ剤（ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ）は、遺伝子導入手順及び他の疾患に関連した感染のリスクを低減するために存在し得る。
【実施例】
【００２３】
実施例１
目的：多形性膠芽腫（ＧＢＭ）は、有効な治療がない、浸潤性の脳腫瘍である。ｏＨＳＶベクターは、ヒトＧＢＭモデルの治療のために動物において設計されているが、患者の試験においては、有効性は不調と判明した。我々は、ベクターの減衰なく、高度に選択的な腫瘍溶解を実現する新しいｏＨＳＶ設計の開発を模索してきた。
【００２４】
実験計画：我々は、感染を全面的に再標的化して（ｆｕｌｌｙ  ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ）、ＥＧＦＲを介することにより、及びニューロン特異的ｍｉＲ−１２４によって認識される配列の複数コピーを、不可欠なＨＳＶのＩＣＰ４前初期遺伝子の３’ＵＴＲに導入することによって、正常なニューロンにおけるベクターの複製を阻止することにより、腫瘍細胞に選択的に感染して複製するように改変された、ｏＨＳＶを報告する。ｍｉＲ−１２４は、ニューロンに多く発現するが、ＧＢＭでほぼ検出不能なため、選択された。ベクターは、有効性について、異種脳腫瘍治療実験で試験した。
【００２５】
結果：ｍｉＲ−１２４感受性ウイルスの、ヌードマウス頭蓋内への高用量の接種は、ｍｉＲ−１２４のＩＣＰ４  ｍＲＮＡとの相互作用による、正常な脳におけるウイルス複製
の阻止と整合して、発症又はウイルス複製の証拠をもたらさなかった。ヌードマウスにおける、ＥＧＦＲへ再標的化したｍｉＲ１２４感受性ＨＳＶによる、ヒト原発性ＧＢＭの同所性モデルの治療は、親の、ＥＧＦＲへ再標的化したウイルスによる治療に匹敵する長期生存（＞５０％）を実証し、従って、ｍｉＲ−１２４認識エレメントが、有効性の低下をもたらさなかったことを示す。
【００２６】
結論：我々は、減衰していないｏＨＳＶの特異性は、ベクター感染の腫瘍標的化と、腫瘍には存在しないが、正常組織で多く発現する細胞性マイクロＲＮＡを介した、オフターゲットベクターの複製排除とを組み合わせることによって最大化し得ると結論付ける。
【００２７】
序論
ＧＢＭは、効果的な治療が見つけにくいままの、最も悪性形態のがんの一つである。手術並びに放射線及び化学療法等の標準的な医療行為では、長期の臨床効果が限られることがわかっている。単純ヘルペスウイルス１型（ｏＨＳＶ−１）由来のものを含む腫瘍溶解性ベクターは、代替治療戦略の候補として、多くの研究室で開発中である（１）。ｏＨＳＶベクターは、原発性ＧＢＭの動物モデルの治療に有望なことが示されているが、良好な安全性プロファイルを提供するのとは別に、初期の臨床試験からの結果は、有効な腫瘍殺傷、又は患者の生存における、一貫性のある改善を示していない（２）（３）。
【００２８】
ＨＳＶの減衰を達成するための最も一般的な方法は、感染に対する宿主の自然免疫応答を回避する非必須遺伝子、ニューロン等の非分裂細胞中での複製のためのヌクレオチドプールを提供する非必須遺伝子、及び細胞のアポトーシスを防止する非必須遺伝子を、機能的に欠失させることであった（２）。がん細胞におけるウイルス複製は、特定の自然免疫応答の喪失（４）、並びに迅速な細胞分裂及び不活性なアポトーシス経路（２）によって促進される。しかし、これらの特性は、現在のｏＨＳＶが、腫瘍において積極的に複製するためには、一様に十分なわけではない。
【００２９】
ベクターの有効性を改善するための最初の段階として、我々は、以前に、カノニカルなＨＳＶ侵入受容体からの感染を、発現が多い腫瘍細胞表面受容体（例、ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲｖＩＩＩ）へと向け直すための、ＨＳＶを全面的に再標的化するための方法を開発した（５）。再標的化したｏＨＳＶは、同所性マウスモデルにおいて、ヒトＧＢＭ細胞についての確固たる腫瘍溶解性活性及び高い特異性を示し、ヒト腫瘍の、高レベルの破壊をもたらした。またこの治療ベクターは、ベクターに関連する毒性なしに、処理された動物の大部分に長期の生存をもたらした。しかし、最も多く発現する腫瘍関連細胞表面マーカーは、正常な細胞型とある程度共有されているので、我々は、腫瘍において複製を低減させることなく、正常な脳におけるウイルス複製を阻止するために、独立したメカニズムを用いて、腫瘍を標的とする非減衰性のベクターの安全性を増大させるように努めた。
【００３０】
最近の研究では、腫瘍標的化に対する代替的アプローチとして、正常細胞とがん細胞との間のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）発現プロファイルの違いを利用している（６）。神経膠芽腫、ニューロン及び神経前駆細胞（ＮＰＣ）で差次的に発現する、少なくとも３０のｍｉＲＮＡが同定されている（７）（８）。このことは、これらの差が、腫瘍細胞中でのスムーズな複製を可能にしながら、正常な脳細胞中でのウイルス複製を制限するために用いられ得ることを示唆する。本明細書において、我々は、本質的に野生型のウイルスの、不可欠なＩＣＰ４遺伝子への、ｍｉＲ−１２４認識エレメントの取り込みが、ｍｉＲ−１２４が多く発現する、正常な脳組織中でのＨＳＶ複製を防止することを示す。我々は、更に、ｍｉＲ−１２４応答エレメントは、ＥＧＦＲへ再標的化したベクターの腫瘍溶解活性を低下させなかったことを示す。重要なことに、腫瘍表現型はｍｉＲ−１２４の不在が継続することによって決まるため、細胞の、溶解性のウイルス複製からの回避機構としてｍｉＲ−１２４がアップレギュレートされると、細胞の制御不能な増殖能力が制限され、
その結果、ベクターの有効性が損なわれない可能性がある。ベクター産生は、ｍｉＲ−１２４を欠く細胞中で行われるため、ストック調製の間には、ｍｉＲ−１２４耐性ウイルス突然変異体を生成する選択圧はない。総合すると、これらの特徴は、ベクターの安全性及び腫瘍選択性をもたらし、様々な腫瘍型に好適な、腫瘍溶解性ベクター設計のための一般的戦略を示唆する。
【００３１】
結果
ｍｉＲ−１２４応答エレメントの検証。ニューロンにおいて、ＧＢＭ細胞よりも高レベルで発現する複数のｍｉＲＮＡのうち、ｍｉＲ−１２４が最も量が多く、ＧＢＭでの発現は最少である（６）。我々は、異なる８ヌクレオチド（ｎｔ）のスペーサーによって分離された、成熟ｍｉＲ−１２４の逆相補配列の、タンデムの４コピーから成るｍｉＲ−１２４応答エレメント（Ｔ１２４）を設計した。この配列の機能性を評価するために、我々は、それをホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）発現プラスミドの３’ＵＴＲに挿入し、ほとんど又は全くｍｉＲ−１２４を発現しないと報告されているＵ２ＯＳ骨肉腫細胞に対する共トランスフェクション実験を、特異的（ｐｒｅ−ｍｉＲ−１２４）又は非特異的（ｐｒｅ−ｍｉＲ−２１）ｍｉＲＮＡ前駆体により行った（９）。正規化のために、ウミシイタケルシフェラーゼ（ｒＬｕｃ）発現プラスミドを含めた。結果（ｐｆＬｕｃ−Ｔ１２４、図１）は、モックを共トランスフェクションした細胞又はｐｒｅ−ｍｉＲ−２１を共トランスフェクションした細胞と比較して、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１２４と共トランスフェクションした細胞において、２４時間での、ｆＬｕｃ活性の極端な低下を示した。対照的に、ｍｉＲ−２１配列の４コピーを逆向きに含有するコントロールのｆＬｕｃプラスミドをトランスフェクションした細胞（ｐｆＬｕｃ−Ｃｔｒｌ、モック）と、ｐｆＬｕｃ−Ｃｔｒｌとｐｒｅ−ｍｉＲ−２１又はｐｒｅ−ｍｉＲ−１２４のいずれかとを共トランスフェクションした細胞との間には、ｆＬｕｃ発現にほとんど差が観察されなかった（図１）。これらの結果は、ｍｉＲ−１２４媒介性の、遺伝子発現の制限のための効率的かつ特異的な標的としての、Ｔ１２４エレメントの機能性を実証する。
【００３２】
ｍｉＲ−１２４発現に対する、Ｔ１２４で修飾されたＨＳＶの複製感受性。我々は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）上のＨＳＶ−１  ＫＯＳ株の全長ゲノムクローン、ＫＯＳ−３７
ＢＡＣへ、一連の修飾を導入する（１１）ために、大腸菌におけるダブルのＲｅｄ組換え（ｄｏｕｂｌｅ  Ｒｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）（１０）を用いた。産物、ＫＧＢＡＣ（図２Ａ）は、ＩＣＰ４７遺伝子のプロモーターと共に、ディプロイド遺伝子ＩＣＰ０、ＩＣＰ３４．５、ＬＡＴ及びＩＣＰ４の各１コピーを含有する内部反復（接合部）領域について欠失させた。この欠失は、欠失させた４遺伝子の残存コピーの操作を容易にし、ウイルスの腫瘍溶解活性を増強する導入遺伝子を組み込むための候補の広大なスペースを提供し、神経毒性因子ＩＣＰ３４．５の発現を低下させることによって、腫瘍特異性を増大させる（１２）。ＩＣＰ４７発現の消失は、ウイルス特異的Ｔ細胞による、感染がん細胞の免疫認識に効果をもたらす（４）。ＫＧＢＡＣは、ＧＦＰオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（２Ａペプチド配列を介して糖タンパク質Ｃ（ｇＣ）ＯＲＦに融合した）も含有し（１３）（１４）、後期（複製後）のウイルス遺伝子発現のモニタリングを可能にする。最後に、ＫＧＢＡＣは、非カノニカルな受容体を介してＨＳＶの侵入を亢進させるために、我々によって示された、ｇＢ遺伝子中の１対の突然変異を含有する（１５）（１６）。我々は、Ｔ１２４配列を、ＫＧＢＡＣの残存ＩＣＰ４遺伝子の３’ＵＴＲに組換え、ＫＧ４：Ｔ１２４ＢＡＣを作製した（図２Ａ）。Ｕ２ＯＳ−Ｃｒｅ細胞のトランスフェクションにより、ＢＡＣコンストラクトを、両方ウイルス粒子に変換し、同時にｌｏｘＰ部位間に位置するＢＡＣ配列を除去した。プラーク精製に続き、ＫＧ及びＫＧ４：Ｔ１２４ウイルスのストックを調製し、Ｕ２ＯＳ細胞に対して力価を測定した。
【００３３】
我々は、最初に、ＩＣＰ４の３’ＵＴＲ中に、タンデムのｍｉＲ−１２４の４標的部位を含めることが、培養中のヒトＧＢＭ細胞中で、ウイルス複製に影響を与えるか否かを決
定した。結果（図２Ｂ）は、原発性神経膠芽腫の２株、Ｇｌｉ６８及びＧＢＭ３０、のスフェロイドにおいて、ＫＧ４：Ｔ１２４がＫＧと同様の速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）で複製すること、及び該２ウイルスの収率が、各時点で実質的に異ならないことを示した。次いで、我々は、複製及びウイルス収量は、ヒトのｍｉＲ−１２４を発現するレンチウイルス（ＬＶ１２４）によるこれらの株の形質導入に感受性であるか否かを決定した。図２Ｃは、逆転写した小ＲＮＡに対するリアルタイムｑＰＣＲにより測定し、内生ＲＮＵ４３レベルに対して標準化した、Ｕ２ＯＳ、Ｇｌｉ６８、及びＧｌｉ６８−ＬＶ１２４細胞中のｍｉＲ−１２４の相対レベルを示す。ＫＧは、Ｇｌｉ６８−ＬＶ１２４及びヒトｍｉＲ−１３７の逆相補配列を発現させるレンチウイルスコンストラクト（ＬＶ１３７Ｒ）で形質導入したＧｌｉ６８細胞に対して、同等に良好に、同様の力価にまで増殖した（図２Ｄ）。対照的に、ＫＧ４：Ｔ１２４は、前者に関しては、後者と比べて増殖は乏しく、同様の結果が、ＬＶ１２４で形質導入したＧＢＭ３０細胞と、ＬＶ１３７Ｒで形質導入したＧＢＭ３０細胞との比較で得られた（図２Ｄ）。組み合わせると、これらの観察は、（ｉ）ＩＣＰ４遺伝子中のＴ１２４エレメントは、ｍｉＲ−１２４依存的様式でＨＳＶの複製を制限する手段として有効であり、且つ、（ｉｉ）ＧＢＭの２株における内生ｍｉＲ−１２４のレベルは、この効果を最小限にするのに足る低さであることを強く示した。更に、ｑＲＴ−ＰＣＲのデータは、ＫＧに比べ、ＫＧ４：Ｔ１２４の増殖及び力価が損なわれないことについて、Ｕ２ＯＳ細胞が好適であることを確認した。
【００３４】
ＫＧ４：Ｔ１２４は、マウス脳で複製せず、疾患を惹起しない。原発性神経膠腫培養細胞における外因性ｍｉＲ−１２４の発現が、ＫＧ４：Ｔ１２４ベクターの増殖防止に非常に有効であることが示されたため、我々は、次に、マウスの脳におけるｍｉＲ−１２４の内生レベルが、ベクターの複製及び野生型ウイルスと関連する典型的な神経疾患発症（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）を予防するために十分であるか否かを試験した。我々は、ヒト及びマウスの成熟ｍｉＲ−１２４は配列が同一であることを指摘する（１７）。我々は、宿主の抗ウイルス応答の効果を制限し、それによってウイルスにおけるＴ１２４挿入の直接的な効果の同定を容易にするために、これらの実験にヌードマウスを用いた。ＨＳＶ複製及び発症に対して高感受性であり（１８）（１９）（２０）、以前、ヒト腫瘍細胞を用いた腫瘍治療の有効性の実験用に用いられているため、ＢＡＬＢ／Ｃｎｕ／ｎｕマウスを選択した（２１）（１２、２２）（５）。我々は、ＫＧコントロールベクター及びｍｉＲ−１２４に感受性の試験ベクターＫＧ４：Ｔ１２４を、等ゲノムコピー（ｇｃ）数（４．８×１０９ｇｃ）の右半球へ頭蓋内接種後、それらの、ヌードマウスの脳中で複製する能力及び致死的な感染を惹起する能力の両方について、比較した。結果は、コントロールベクターの注入は、感染した脳内に存在する総ｇｃ数の２倍の増加（図３Ｂ）を伴う、動物の、５日以内の迅速な死（図３Ａ、Ｃ）をもたらすことを示した。対照的に、ＫＧ４：Ｔ１２４を注入したマウスの健康状態の観察可能な変化は、それらの正常な体重増加によって例示される通り、屠殺まで、３３日間の観察期間にわたってなく（図３Ａ）、及びウイルスｇｃ含量は、この期間の間中、インプットの約０．４％にまで、途切れることなく減少した（図３Ｂ）。コントロール又は試験ベクターを接種した動物間の生存の差（図３Ｃ）は、非常に有意であった（Ｐ＝０．００５８、ログランク検定）。このことは、ＩＣＰ４遺伝子の３’ＵＴＲに挿入した、ｍｉＲ−１２４認識配列の４コピーが、ＨＳＶ高感受性ヌードマウスの脳における、致死性のベクター複製を阻止できることを示した。従って、これらの配列は、単独で、脳内におけるベクターの毒性を抑えるのに十分であった。
【００３５】
ウイルスストック調製の間の、ｍｉＲ−１２４標的部位の喪失又は突然変異による不活性化は、あっても稀であるという、これらの結果からの示唆を確認するために、ＤＮＡを、ＫＧ４：Ｔ１２４のウイルスストックから単離し、ＩＣＰ４  ３’ＵＴＲ中のＴ１２４挿入部位全体をＰＣＲに供した。ゲル電気泳動及びＤＮＡ配列決定による、産物の解析は、ＰＣＲ産物サイズの異常又はヌクレオチドのばらつきの証拠を示さなかった（データは
示さず）。同様に、ＫＧ４：Ｔ１２４ウイルス（１．５×１０１０ｇｃ）で正常ＢＡＬＢ／ｃマウスに頭蓋内接種後、３時間又は２１日で単離された脳の全ＤＮＡのＰＣＲ解析及び配列決定解析は、Ｔ１２４領域全体で異常を示さなかった（データは示さず）。これらの結果は、ＫＧ４：Ｔ１２４のウイルスの増殖の間又はｉｎ  ｖｉｖｏで、ｍｉＲ−１２４非感受性変異体がセレクションされる可能性についての懸念を和らげた。
【００３６】
ｍｉＲ−１２４応答エレメントは、ＥＧＦＲを標的とする腫瘍溶解性ＨＳＶ活性を損なわない。次に、我々は、防御性のｍｉＲ−１２４認識エレメントが、ヒトＧＢＭのヌードマウスモデルにおける、ウイルスの殺腫瘍活性に悪影響を及ぼすか否かを確認しようとした。これらの動物の脳に接種した場合、ＫＧは非常に有毒であったため（図３Ｃ）、担がんマウスの生存実験において、このウイルスを治療コントロールとして用いることには、腫瘍よりも、むしろウイルスに起因する動物の死をもたらし得るので、注目しなかった（ｎｏｔ  ａｔｔｒａｃｔｉｖｅ）。その代わりに、我々は、全面的にＥＧＦＲへ再標的化した野生型ＨＳＶ−１  ＫＯＳは、ヌードマウスの脳に対して非毒性であるが、ヌードマウスにおける同所性ヒトＧＢＭの治療に有効であるという、我々の公開所見に基づいて、全面的にＥＧＦＲへ再標的化したＫＧの誘導体にｍｉＲ−１２４結合部位４コピーを導入した（５）。従って、それぞれＫＧＥ及びＫＧＥ−４：Ｔ１２４と呼ばれる、ＫＧと、ＫＧ４：Ｔ１２４の、ＥＧＦＲへ再標的化した型の比較は、ウイルスの腫瘍溶解活性に対する、ｍｉＲ−１２４部位のあらゆる制限的な効果を特定するはずである。我々は、ヌードマウスに浸潤性の頭蓋内腫瘍を確立するために、患者由来の、球形成性ＧＢＭ３０細胞を用いた（５）。動物を毎日観察し、罹患の徴候を示した時に安楽死させた。我々の公開結果と同様に、同一の定位座標に腫瘍細胞を接種後５日目に、ＰＢＳを注入したマウスは、腫瘍細胞移植の数週間以内に死亡した（中央値２１．５日；図４Ａ、Ｂ）。対照的に、ＥＧＦＲへ再標的化したコントロールウイルス、ＫＧＥ、又は再標的化したＴ１２４含有ベクター、ＫＧＥ−４：Ｔ１２４のいずれかを用いた腫瘍の治療は、半数の動物を、実験の期間（９０日）保護し、これら二群についての生存期間中央値は同等だった（それぞれ７９．５日及び８５．５日、Ｐ＝０．８３、ログランク検定）。これらの結果は、ＫＧＥ−４：Ｔ１２４のＩＣＰ４遺伝子におけるｍｉＲ−１２４部位が、ＧＢＭ３０腫瘍治療の有効性を損なわないことを示した。
【００３７】
考察
我々の目標は、完全なウイルス機能を発現するが、ＧＢＭ−関連受容体を発現する細胞にのみ感染し得、且つ腫瘍中のみで高効率で複製し、正常な脳細胞ではしない腫瘍溶解性ＨＳＶベクターを設計することであった。腫瘍選択的感染及び溶解性ウイルスの増殖は、全面的なウイルス侵入再標的化（５）及び正常な脳組織におけるウイルス複製の、細胞性、ｍｉＲＮＡ媒介性制限との組み合わせに依存した。溶解性感染は、腫瘍表現型、標的受容体及び腫瘍特異的ｍｉＲＮＡ発現プロファイルの維持に重要な、標的細胞の２つの別個の特性を必要とするので、この、形質導入及び転写後の腫瘍標的化との組み合わせは、非常に安全且つ効果的なｏＨＳＶを提供する見込みがある。この一般的戦略は、異なるがんに合わせた標的化及びｍｉＲＮＡの応答エレメントを用いて、広く適用可能であり、その適用は、同型の個々の腫瘍間で、特定の抗原及びｍｉＲＮＡ発現に差異がある可能性を考慮することによって、パーソナライズ治療に関して最適化し得る。
【００３８】
ＧＢＭにおいては、改変された遺伝子発現には、正常な脳組織と比較して複数のｍｉＲＮＡの実質的なダウンレギュレーションが含まれ（２３〜２５）、正常脳において改変ウイルスの複製を選択的に減衰させるために用い得る可能性のある、いくつかのｍｉＲＮＡが提示される。ｍｉＲ−１２４は、ニューロン分化の強力な誘導因子として認識され（２６）、ＧＢＭ中で最も高度にダウンレギュレートされたｍｉＲＮＡの１つである（６）ため、我々は、正常な脳組織におけるｏＨＳＶ複製を阻止する手段として、このｍｉＲＮＡに焦点を当てた。ｍｉＲ−１２４（Ｔ１２４）に関する反復認識部位（Ｒｅｐｅａｔ  ｒ
ｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ）を、産物がＨＳＶの溶菌サイクルを開始するために絶対に必要な、ウイルスＩＣＰ４遺伝子の３’ＵＴＲに導入した。我々は、神経膠腫細胞では、Ｔ１２４＋ウイルスは、Ｔ１２４を欠くコントロールウイルスと実質的に同程度に、着実に複製し得るのに対し、ｍｉＲ−１２４のレンチウイルス発現が、その複製を選択的に阻止することを見出した。更に、Ｔ１２４エレメントは、非常に多量の頭蓋内ベクター投与（４．８×１０９粒子）から、ヌードマウスを完全に保護するのに十分であった。一方、コントロールベクターは、５日以内にすべての動物を死滅させた。これらの動物の脳における全ウイルスゲノムコピー数を決定したところ、Ｔ１２４＋ベクター複製の証拠は示されず、むしろ経時ウイルスゲノム含量の漸進的な減少の証拠が示された。Ｔ１２４配列は、ウイルスストック及び感染動物から精製したＤＮＡに対して増幅した、ＩＣＰ４
３’ＵＴＲのサイズ及び配列決定解析で評価された通り、腫瘍のない動物又は我々の腫瘍治療実験からの長期生存動物（ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｕｒｖｉｖｏｒｓ）における明白な神経疾患発症の欠如と整合して、安定であった。最後に、我々は、Ｔ１２４エレメントが、ヌードマウス中のヒトＧＢＭモデルにおいて、このウイルスの腫瘍溶解効果を低下させないことを実証するために、再標的化した、マウス細胞に感染し損ねるウイルスを用いた。
【００３９】
腫瘍受容体を標的とするウイルスと、正常細胞におけるウイルス複製のｍｉＲＮＡ媒介性阻止との組み合わせは、標的受容体を腫瘍（例、ＥＧＦＲ）と共有し得る、正常な細胞の増殖感染を阻止することにより、溶解性ウイルスの標的特異性を増強させる。我々の結果は、ｍｉＲ−１２４に対する標的配列４コピーの、ＩＣＰ４遺伝子の３’ＵＴＲへの挿入が、ヌードマウスにおいて、非常に高用量のウイルスによる神経疾患発症を完全に阻止するが、ｍｉＲ−１２４を発現するすべての脳細胞でそうではないことを示す。例えば、海馬及び副脳室帯（ｓｕｂ−ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）（ＳＶＺ）に位置する、ニューロン前駆細胞（ＮＰＣ）は、ｍｉＲ−１２４標的配列によって保護されることが期待されていない（これらの細胞は、ｍｉＲ−１２４の発現が最少であることを含む、ＧＢＭ細胞のｍｉＲＮＡ発現プロファイルと同様のプロファイルを有しているため）（２７）。しかし、いくつかのｍｉＲＮＡは、ＮＰＣ中で、神経膠腫中よりも、最大１００倍高レベルで発現する（２７）（２８）（２９）（３０）。このことは、同じウイルスの同一又は他の不可欠な遺伝子へ操作された更なるｍｉＲＮＡに対する標的部位を、より様々な脳細胞における複製を、腫瘍特異的ウイルス複製を損なうことなく阻止するために、用いる可能性を示唆する。
【００４０】
我々の研究は、腫瘍抗原へのウイルス標的化と、正常組織における、ｍｉＲＮＡで制限された複製との組み合わせが、腫瘍の、効果的且つ高度に特異的なウイルス療法のための魅力的な戦略であることを示唆するが、個々の腫瘍は、治療へのその応答が、腫瘍抗原レベルのばらつき及びおそらく、ｍｉＲＮＡの含量のばらつきに起因して、異なる可能性が高い。例えば、ＧＢＭに分類された腫瘍間に有意な差があり、更には分子的に定義されたＧＢＭのサブタイプ内でさえも、遺伝子発現プロファイルの不均一性が残っている（３１）。このように、再標的化した単一ウイルスは、すべてのＧＢＭ又は同一サブタイプのすべてのＧＢＭに対して有効ではない。更に、腫瘍内の既存の、又は治療によって誘発される、細胞間のばらつきの結果として、耐性細胞集団が、主にｏＨＳＶ感受性腫瘍中に出現し得ることが予期され得る。過去数年にわたる開発は、多くの異なる腫瘍型で同定された、自己複製する、化学療法抵抗性及び放射線抵抗性のがん幹細胞（ＣＳＣ）の小集団が、治療に最も適切な標的であることを示唆する（３２）。所定の腫瘍からの個々のＣＳＣの比較は困難であるが、腫瘍内でのそれらのばらつきは、完全な腫瘍細胞集団のそれに比べると、限定的であり得る。文献での報告は、種々の神経膠腫幹細胞（ＧＳＣ）マーカーを記述しており（３３）、再標的化した腫瘍溶解性ウイルスが、ヌードマウスにおけるヒトＧＢＭの確立及び維持に関して、これら各々の重要性を見分けるために用いられ得る。我々は、再標的化した個々のベクターに対して部分的な応答を示す腫瘍が、種々のＧＳＣの
候補マーカーへ再標的化したベクターの組み合わせで、より効果的に治療し得ることを期待している。これらベクターの各々も、我々の、ＥＧＦＲへ再標的化したウイルスと同様に、特定の正常細胞を標的にし得るので、これらの正常細胞では、ｍｉＲＮＡ媒介性ウイルス複製阻止の重要性が増す。更に、Ｋａｍｂａｒａら（３４）により、ｏＨＳＶ分野において先駆けて開発されたように、極めて重要なウイルス複製機能の発現を制御するために、細胞種特異的又は発生段階特異的プロモーターを使用してさらなる特異性を獲得することが可能であり得る。これらの特徴は、高活性且つ高度に特異的な腫瘍溶解性ベクターのカクテルをもたらし得るが、ＫＧＥ−４：Ｔ１２４等のベクターは、免疫調節因子、腫瘍細胞の遊走阻害因子又は腫瘍の細胞外マトリクスを分解し、それによって腫瘍内のウイルスの伝播を促進するタンパク質分解酵素をコードする遺伝子等の、治療効果を増進し得る導入遺伝子を収容する十分なスペースを有することは、注目に値する。
【００４１】
要約すると、本実施例で説明したＫＧＥ−４：Ｔ１２４ベクターは、完全なウイルス複製機能を含有する、新規な種類のｏＨＳＶの典型であるが、腫瘍関連受容体へ再標的化するウイルスエンベロープと、正常な組織中で発現するが腫瘍中ではしないｍｉＲＮＡに対する複製感受性との組み合わせから腫瘍特異性を導き出す。この、制御システムの組み合わせは、他の腫瘍型に適用し得るが、腫瘍溶解性ベクターに関しては、以前には記述されていない。我々の戦略の重要な利点は、（ｉ）ベクターが任意の欠陥遺伝子を含有せず、腫瘍において最大限のウイルス複製を可能にし、最適な腫瘍溶解性ウイルス療法を提供すること、並びに（ｉｉ）ベクターの複製が、重要な腫瘍関連細胞表面マーカーの発現及び正常組織のものと実質的に異なる、腫瘍特異的な、ｍｉＲＮＡ発現のプロファイルの両方を必要とすること、である。我々の戦略についての、最も説得力のある議論は、正常な脳におけるベクターの複製を制御するために選択されたｍｉＲＮＡが、神経膠芽腫では、腫瘍表現型を損なうこと無しにはアップレギュレートされ得ないことである（７、２５、３５）。我々のベクターによって認識される、腫瘍特異的ＥＧＦＲｖＩＩＩ変異体等の標的受容体の喪失は、同様の効果を有し得る。従って、ほとんどのがん治療において、腫瘍が治療を逃れる能力を発達させるが、腫瘍抗原を標的とする、ｍｉＲＮＡで調節されるウイルスでは、その結果は生じそうにない。総合すると、これらの議論は、我々のアプローチが、ＧＢＭ及び他のがんの治療のための、高度に選択的、安全且つ効果的な腫瘍溶解性ＨＳＶベクター系を提供するという期待を支持している。
【００４２】
材料及び方法
細胞培養。Ｕ２ＯＳ、ＨＥＫ２９３Ｔ及びＨＥＫ２９３ＡＤ細胞は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）からのものであり、５〜１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加したＡＴＣＣ推奨培地中、３７℃で、５％ＣＯ２インキュベーター中で増殖させた。安定的にＣｒｅリコンビナーゼ（Ｕ２ＯＳ−Ｃｒｅ）を発現するＵ２ＯＳ細胞株は、レトロウイルス形質導入（Ｙ．Ｍ．及びＪ．Ｃ．Ｇ．、未発表の結果）によって作製された。患者由来のＧＢＭ３０及びＧｌｉ６８の原発性神経膠腫スフェロイド株は、Ｅ．Ａ．Ｃｈｉｏｃｃａ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｓｃｈｏｏｌ，ＭＡ）の好意により提供され、１０ｎｇ／ｍＬの組換えヒト上皮成長因子（ｒｈＥＧＦ）及び１０ｎｇ／ｍＬの組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（両方Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗａｒｗｉｃｋ，ＰＡから）を加えた、２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７  ｗ／ｏ  ビタミンＡ、２ｍｇ／ｍＬアムホテリシンＢ（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１００μｇ／ｍＬゲンタマイシン（Ｌｏｎｚａ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を加えたニューロベイサル（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ）培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で増殖させた。
【００４３】
プラスミド。ｐｆＬｕｃ−Ｔ１２４は、８ｎｔで分離されたｈｓａ−ｍｉＲ−１２４配
列の逆相補配列の、タンデムの４リピートを含有し、一方、ｐｆＬｕｃ−Ｃｔｒｌは、８ｎｔで分離されたｈｓａ−ｍｉＲ−２１の逆鎖配列の、タンデムの４リピートを含有する。プラスミドは、両方、ｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）（ｍｉＲＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）中のルシフェラーゼ遺伝子の３’ＵＴＲに、アニールした相補的オリゴヌクレオチドを挿入することによって構築した。オリゴヌクレオチドは、Ｔ１２４−Ｆ、Ｔ１２４−Ｒ、ＴｃｏｎＦ及びＴｃｏｎＲであった（表１）。アニールしたオリゴヌクレオチドは、ＳｐｅＩ及びＳａｃＩで消化し、ＳｐｅＩ−ＳａｃＩで消化したｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）にライゲーションした。
【００４４】
ＨＳＶゲノム改変。細菌人工ゲノム（ＢＡＣ）上に、ＫＯＳ  ＨＳＶ−１株の完全ゲノムを含有するＫＯＳ−３７  ＢＡＣ（１１）は、Ｄａｖｉｄ  Ｌｅｉｂ（Ｄａｒｔｍｏｕｔｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，ＮＨ）の好意により提供された。このＢＡＣにおけるＨＳＶ固有の短い（Ｕｓ）領域は、公開されたＨＳＶ−１  ＫＯＳ（３６）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＪＱ６７３４８０）の配列（１３２，２７５位〜１４５，６０８位）に対して逆向きである。更に詳細に後述する修飾は、実質的にはＴｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１０）に記載の通り、ダブルのＲｅｄ組換えにより導入した。プラスミドのｐＥＰｋａｎ−Ｓ及びｐＢＡＤ−Ｉ−ｓｃｅＩ（１０）は、Ｎｉｋｏｌａｕｓ  Ｏｓｔｅｒｒｉｅｄｅｒ（Ｆｒｅｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の好意により提供された。変更を、ＰＣＲ解析、制限酵素消化物のＦＩＧＥ解析、及びＤＮＡの局所的な配列決定により確認した。
【００４５】
本研究で使用されるベクターを、以下の通り順次得た。完全なＨＳＶ内部反復領域又は「接合部」（ＩＲＬ、ＩＲＳ）の欠失、トセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ）ウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）翻訳終結／再開配列（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ／ｒｅｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（１３）（３７）を介した、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の、糖タンパク質Ｃ（ｇｃ）ＯＲＦへの融合、ｇＢのコード配列内の２つのミスセンス突然変異の導入（ｇＢ：Ｎ／Ｔ；（１５）により、ＫＧＢＡＣを、ＫＯＳ−３７  ＢＡＣから得た。ｐｆＬｕｃ−Ｔ１２４からのＴ１２４エレメントの、ＩＣＰ４遺伝子の３’ＵＴＲへの挿入により、ＫＧ４：Ｔ１２４ＢＡＣを、ＫＧＢＡＣから作製した。再標的化したベクターＫＧＥＢＡＣは、ｇＤ遺伝子のアミノ末端領域を、ｇＤの１位と２５位との間にヒトＥＧＦＲ特異的単鎖抗体の配列を、及びコドン３８においてミスセンス突然変異を含有する、ｇＤ−ｓｃＥＧＦＲの対応する領域と置換することによって、ＫＧＢＡＣから得た（５）。ＫＧＥ−４：Ｔ１２４ＢＡＣは、ＫＧ４：Ｔ１２４ＢＡＣとＫＧＥＢＡＣからの修飾を兼ね備えている。
【００４６】
ウイルスの増殖及び精製。Ｕ２ＯＳ−Ｃｒｅ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＬＴＸ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクションすることにより、ＢＡＣ  ＤＮＡを、感染性ウイルスに変換した。これらの細胞内で発現したＣｒｅリコンビナーゼは、ＫＯＳ−３７  ＢＡＣ及び誘導体中に位置する、ｌｏｘＰ組換えシグナル間の、ウイルス増殖阻害ＢＡＣエレメント及び、隣接するｌａｃＺ遺伝子の除去を可能にした（１１）。限界希釈によって１プラークを単離し、Ｘ−ｇａｌ染色により、ｌａｃＺ遺伝子の消失について試験した（３８）。無色のプラークを、２ラウンドの更なる限界希釈に供し、ＢＡＣ／ｌａｃＺ領域の正確な除去を、精製ウイルス粒子ＤＮＡの局所的なＤＮＡ配列決定により確認した。ウイルスストックの生物学的力価（ＰＦＵ／ｍＬ）を、Ｕ２ＯＳ細胞に対して決定した。物理的力価を、下記の通り、ウイルスｇＤ遺伝子についての定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって、ゲノムコピー（ｇｃ）／ｍＬで決定した。
【００４７】
ルシフェラーゼアッセイ。ＨＥＫ２９３ＡＤ細胞を、ウミシイタケルシフェラーゼ発現プラスミドｐｒＬｕｃで、種々のホタルルシフェラーゼ発現プラスミドとｐｒｅ−ｍｉＲ（商標）ｍｉＲＮＡ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ（Ａｍｂｉｏｎ）との組み合わせとともに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクションした。翌日、細胞を溶解し、ホタル対ウミシイタケの、ルシフェラーゼの発現比を、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  ＬＢ−９５３  ＡｕｔｏＬｕｍａｔ  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＵＳＡ，Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ，ＴＮ）を用いて決定した。
【００４８】
ｍｉＲＮＡのレンチウイルス発現。Ｕ−８７ヒト神経膠芽腫細胞からのゲノムＤＮＡを、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ  ＧＣ−ｒｉｃｈ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び表１に列挙したｍｉＲ−１２４プライマー対を用いる、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−３遺伝子からのヒトｐｒｉ−ｍｉＲ−１２４配列のＰＣＲ増幅のための、鋳型として用いた。３２０−ｂｐの産物を、ＢａｍＨＩ及びＮｄｅＩで消化し、ｍｉＲＮＡＳｅｌｅｃｔ  ｐＥＰ−ｍｉＲベクター（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のイントロン中の対応する部位間にクローニングし、配列を確認した。その後、プロモーター−イントロン−ｐｒｉ−ｍｉＲ−１２４の領域を、内在ＥＦ１プロモーターの置換により、ｐＣＤＨ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−Ｐｕｒｏ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）に移し、レンチウイルス発現プラスミドｐＣＤＨ−ｍｉＲ−１２４を作製した。同様の手順を用い、ｐｒｉ−ｍｉＲ−１３７の配列を逆向きに含有するコントロールレンチウイルスプラスミド（ｐＣＤＨ−ｍｉＲ−１３７Ｒ）を構築した。ｐｒｉ−ｍｉＲ−１３７のクローニングに用いたＰＣＲプライマーを、表１に列挙する。レンチウイルスＬＶ１２４及びＬＶ１３７を、それぞれｐＣＤＨ−ｍｉＲ−１２４又はｐＣＤＨ−ｍｉＲ−１３７Ｒと、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのパッケージングプラスミドｐＬＰ１、ｐＬＰ２、ｐＬＰ−ＶＳＶＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とを共トランスフェクションすることにより作製した。上清を７２時間後に回収し、０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を通過させ、４℃で１６時間、６，８００×ｇで遠心分離することにより濃縮した。ペレットをＤＭＥＭに再懸濁し、力価を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対する、１ｍＬ当たりのピューロマイシン耐性コロニー形成単位（ＣＦＵ）として測定した。
【００４９】
研和した（ｔｒｉｔｕｒａｔｅｄ）２×１０５のＧｌｉ６８細胞又はＧＢＭ３０細胞を、８μｇ／ｍＬのポリブレンの存在下で、ＬＶ１２４又はＬＶ１３７Ｒのいずれかと、懸濁液中５ｃｆｕ／細胞で９０分間感染させ、プレーティングした。翌日、細胞に、３０μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含有する新鮮培地を与え、７２時間後に、ＫＧ又はＫＧ４：Ｔ１２４ウイルスのいずれかを、０．０１ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで重複感染させた。ＨＳＶ感染後７２及び９６時間で、細胞及び上清から、感染性ウイルス粒子を回収し、Ｕ２ＯＳ細胞に対して力価を測定した。ｑＲＴ−ＰＣＲによるｍｉＲ−１２４レベルの測定のため、ＲＮＡを、下記の通り、並行させたＬＶ１２４感染Ｇｌｉ６８細胞の培養から、ピューロマイシンのセレクションの７２時間後に単離した。
【００５０】
ＲＮＡ単離及び逆転写（ＲＴ）−ｑＰＣＲ。製造業者の説明書に従って、ＴＲＩｚｏｌ
Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｕ２ＯＳ細胞、Ｇｌｉ６８細胞及びＬＶ１２４を感染させたＧｌｉ６８細胞から全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ試料を、ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理し、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００ｃ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を用いて定量し、品質保証のため、ＭＯＰＳ−ホルムアルデヒドゲル上で可視化した。成熟ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４のレベルを、ＴａｑＭａｎ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に従って、ＲＮＵ４３に対して相対
的に決定した。ＴａｑＭａｎプライマー及びプローブを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手した。全てのＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ反応を、トリプリケートで行った。
【００５１】
動物。３〜４週齢のＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ無胸腺マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から購入し、ＢＳＬ２施設に収容した。動物の全処置は、ピッツバーグ大学動物実験委員会（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＣＵＣ）によって承認された、実験動物の管理及び使用のための指針（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）中の要件及び推奨事項（施設内実験動物研究所、（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１９８５年）に従って行った。
【００５２】
頭蓋内毒性。頭蓋内のウイルス接種を、（５）に記載の通りに（ａ  ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ）行った。マウスに、４．８×１０９ｇｃのＫＧ又はＫＧ４：Ｔ１２４ウイルスを受容させた（ｎ＝４／群）。毎日、動物を、罹患の徴候についてモニタリングし、一日置きに体重を測定した。ＫＧ群のマウスは全て、５日目までに死亡し、同日に他の群のマウス１匹を屠殺した。ＫＧ４：Ｔ１２４群の残りの動物を、１４日目、２１日目及び３３日目に屠殺した。全ＤＮＡ抽出及びウイルスゲノムについてのｑＰＣＲのために、下記の通り、安楽死させたマウスから全脳を採取した。
【００５３】
ウイルスゲノムについてのｑＰＣＲ。ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用い、製造業者の手順に従って、マウス脳又はウイルスストックからＤＮＡを抽出した。ｑＰＣＲのための標準曲線を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳｔｅｐＯｎｅ（商標）及びＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍｓの手引に記載のプロトコルを用いて、完全ＨＳＶ−１（ＫＯＳ株）ｇＤのコード配列（ｐＥ−ｇＤ１８）を含有するｐＥＮＴＲ１Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プラスミドからのＤＮＡに対して作成した。プライマー及びプローブの配列を表１に列挙する。
【００５４】
【表１】
2020058341.tif 000003
【００５５】
腫瘍モデル及び処理。（５）に記載の通り、ヌードマウスへの、ヒトＧＢＭ３０細胞の頭蓋内移植を行った。５日目に、ウイルス（１．８×１０８ｇｃのＫＧＥ又はＫＧＥ−４：Ｔ１２４、ｎ＝８／群）又はＰＢＳ（ｎ＝２）を、やはり（５）に記載の通り、同じ座標で接種した。上記「頭蓋毒性。」の通り、動物の健康及び安否（ｗｅｌｌ−ｂｅｉｎｇ）をモニタリングした。罹患の徴候を示した時に、動物を安楽死させた。
【００５６】
統計解析。ウェルチの補正による対応のないｔ検定は、Ｗｉｎｄｏｗｓ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ；ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ
）用のＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．０１を用いて行った。動物生存データは、同じソフトウェアを用いて、カプラン・マイヤープロット（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  ｐｌｏｔｓ）としてグラフ化して、マンテル・コックス  ログランク検定（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ  ｌｏｇ−ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ）により比較した。
【００５７】
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７．  Ｋａｒｓｙ  Ｍ，Ａｒｓｌａｎ  Ｅ，Ｍｏｙ  Ｆ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｏｎ  Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｉｎ  Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ．  Ｇｅｎｅｓ  ＆  ｃａｎｃｅｒ．２０１２；３：３−１５．
８．  Ｒｉｄｄｉｃｋ  Ｇ，Ｆｉｎｅ  ＨＡ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ−ｓｃａｌｅ  ｄａｔａ  ｆｒｏｍ  ｇｌｉｏｍａｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２０１１；７：４３９−５０．
９．  Ｋｕｍａｒ  ＭＳ，Ｌｕ  Ｊ，Ｍｅｒｃｅｒ  ＫＬ，Ｇｏｌｕｂ  ＴＲ，Ｊａｃｋｓ  Ｔ．Ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２００７；３９：６７３−７．
１０．  Ｔｉｓｃｈｅｒ  ＢＫ，ｖｏｎ  Ｅｉｎｅｍ  Ｊ，Ｋａｕｆｅｒ  Ｂ，Ｏｓｔｅｒｒｉｅｄｅｒ  Ｎ．Ｔｗｏ−ｓｔｅｐ  ｒｅｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｍａｒｋ
ｅｒｌｅｓｓ  ＤＮＡ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２００６；４０：１９１−７．
１１．  Ｇｉｅｒａｓｃｈ  ＷＷ，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ＤＬ，Ｗａｒｄ  ＳＬ，Ｖａｎｈｅｙｎｉｎｇｅｎ  ＴＫ，Ｒｏｍｉｎｅ  ＪＤ，Ｌｅｉｂ  ＤＡ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＨＳＶ−１  ｓｔｒａｉｎｓ  １７  ａｎｄ  ＫＯＳ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６；１３５：１９７−２０６．
１２．  Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＪＪ，Ｄｅｌｍａｎ  ＫＡ，Ｂｕｒｔ  ＢＭ，Ｍａｒｉｏｔｔｉ  Ａ，Ｍａｌｈｏｔｒａ  Ｓ，Ｚａｇｅｒ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｓａｆｅｔｙ，ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒｕｓｅｓ（Ｇ２０７  ａｎｄ  ＮＶ１０２０）ｆｏｒ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．２００２；９：９３５−４５．
１３．  Ｓｚｙｍｃｚａｋ  ＡＬ，Ｖｉｇｎａｌｉ  ＤＡ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ２Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００５；５：６２７−３８．
１４．  Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ＶＡ，Ｗｕ  Ｃ，ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｅ  Ｐ，Ｓａｃｈｓ  ＭＳ，Ｒｙａｎ  ＭＤ，Ｂｒｏｗｎ  ＪＤ．Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｌｅａｓｅ
ｏｆ  ｎａｓｃｅｎｔ  ｃｈａｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ  ａｔ  ａ  ｓｅｎｓｅ  ｃｏｄｏｎ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００８；２８：４２２７−３９．
１５．  Ｕｃｈｉｄａ  Ｈ，Ｃｈａｎ  Ｊ，Ｇｏｉｎｓ  ＷＦ，Ｇｒａｎｄｉ  Ｐ，Ｋｕｍａｇａｉ  Ｉ，Ｃｏｈｅｎ  ＪＢ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｄｏｕｂｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ
ｉｎ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｇＢ  ｃｏｍｐｅｎｓａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｇＤ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０１０；８４：１２２００−９．
１６．  Ｕｃｈｉｄａ  Ｈ，Ｃｈａｎ  Ｊ，Ｓｈｒｉｖａｓｔａｖａ  Ｉ，Ｒｅｉｎｈａｒｔ  Ｂ，Ｇｒａｎｄｉ  Ｐ，Ｇｌｏｒｉｏｓｏ  ＪＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｖｅｌ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｇＢ  ａｎｄ  ｇＨ  Ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔ  ｔｈｅ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｋｎｏｗｎ  ｇＤ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｈｅｒｐｅｓ
Ｓｉｍｐｌｅｘ  Ｖｉｒｕｓ  １  Ｅｎｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ−ｔｏ−Ｃｅｌｌ  Ｓｐｒｅａｄ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０１３；８７：１４３０−４２．
１７．  Ｃａｏ  Ｘ，Ｐｆａｆｆ  ＳＬ，Ｇａｇｅ  ＦＨ．Ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｍｉＲ−１２４  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｎｅｕｒａｌ  ｔｕｂｅ．Ｇｅｎｅｓ  ＆  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  ２００７；２１：５３１−６．
１８．  Ｆｕｊｉｏｋａ  Ｎ，  Ａｋａｚａｗａ  Ｒ，Ｏｈａｓｈｉ  Ｋ，Ｆｕｊｉｉ  Ｍ，Ｉｋｅｄａ  Ｍ，Ｋｕｒｉｍｏｔｏ  Ｍ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１８  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｃｕｔｅ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９９９；７３：２４０１−９．
１９．  Ｍａｎｉｃｋａｎ  Ｅ，Ｒｏｕｓｅ  ＲＪ，Ｙｕ  Ｚ，Ｗｉｒｅ  ＷＳ，Ｒｏｕｓｅ  ＢＴ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１９９５；１５５：２５９−６５．
２０．  Ｓｅｔｈｉ  ＫＫ，Ｏｍａｔａ  Ｙ，Ｓｃｈｎｅｗｅｉｓ  ＫＥ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｆｒｏｍ  ｆａｔａｌ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｈ−２−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９８３；６４（Ｐｔ  ２）：４４３−７．
２１．  Ｃｕｒｒｉｅｒ  ＭＡ，Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ  ＲＡ，Ｓａｗｔｅｌｌ  ＮＭ，Ｍａｈｌｌｅｒ  ＹＹ，Ｓｔｒｏｕｐ  Ｇ，Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＭＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｒＲｐ４５０  ａｌｏｎｅ  ａｎｄ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．２００８；１６：８７９−８５．
２２．  Ｈｏｎｇ  ＣＳ，Ｆｅｌｌｏｗｓ  Ｗ，Ｎｉｒａｎｊａｎ  Ａ，Ａｌｂｅｒ  Ｓ，Ｗａｔｋｉｎｓ  Ｓ，Ｃｏｈｅｎ  ＪＢ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｃｔｏｐｉｃ  ｍａｔｒｉｘ
ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ
ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ＨＳＶ  ｖｅｃｔｏｒ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．２０１０；１７：１２００−５．
２３．  Ｚｈａｎｇ  Ｙ，Ｃｈａｏ  Ｔ，Ｌｉ  Ｒ，Ｌｉｕ  Ｗ，Ｃｈｅｎ  Ｙ，Ｙａｎ
Ｘ，ｅｔ  ａｌ．ＭｉｃｒｏＲＮＡ−１２８  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｇｌｉｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｅ２Ｆ３ａ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２００９；８７：４３−５１．
２４．  Ｓｈｉ  Ｌ，Ｃｈｅｎｇ  Ｚ，Ｚｈａｎｇ  Ｊ，Ｌｉ  Ｒ，Ｚｈａｏ  Ｐ，Ｆｕ
Ｚ，ｅｔ  ａｌ．ｈｓａ−ｍｉｒ−１８１ａ  ａｎｄ  ｈｓａ−ｍｉｒ−１８１ｂ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｓ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．２００８；１２３６：１８５−９３．
２５．  Ｓｉｌｂｅｒ  Ｊ，Ｌｉｍ  ＤＡ，Ｐｅｔｒｉｔｓｃｈ  Ｃ，Ｐｅｒｓｓｏｎ  ＡＩ，Ｍａｕｎａｋｅａ  ＡＫ，Ｙｕ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．ｍｉＲ−１２４  ａｎｄ  ｍｉＲ−１３７  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．ＢＭＣ  Ｍｅｄ．２００８；６：１４．
２６．  Ｍａｉｏｒａｎｏ  ＮＡ，Ｍａｌｌａｍａｃｉ  Ａ．Ｔｈｅ  ｐｒｏ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍｉＲ−１２４：ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｏａｄ  ｔｏ  ｂｅｃｏｍｅ  ａ  ｎｅｕｒｏｎ．ＲＮＡ  Ｂｉｏｌ．７：５２８−３３．
２７．  Ｌａｖｏｎ  Ｉ，Ｚｒｉｈａｎ  Ｄ，Ｇｒａｎｉｔ  Ａ，Ｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｏ，Ｆａｉｎｓｔｅｉｎ  Ｎ，Ｃｏｈｅｎ  ＭＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｌｉｏｍａｓ  ｄｉｓｐｌａｙ  ａ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｒｅｍｉｎｉｓｃｅｎｔ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｎｅｕｒｏ  Ｏｎｃｏｌ．１２：４２２−３３．
２８．  Ｋａｒｐｏｗｉｃｚ  Ｐ，Ｗｉｌｌａｉｍｅ−Ｍｏｒａｗｅｋ  Ｓ，Ｂａｌｅｎｃｉ  Ｌ，ＤｅＶｅａｌｅ  Ｂ，Ｉｎｏｕｅ  Ｔ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｏｏｙ  Ｄ．Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００９；２９：３８８５−９６．
２９．  Ｋａｔｏｈ  Ｙ，Ｋａｔｏｈ  Ｍ．Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｔｏ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  
ｍｉＲＮＡ  （ｒｅｖｉｅｗ）．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２００８；２２：２７１−５．
３０．Ｏｃａｎａ  ＯＨ，Ｎｉｅｔｏ  ＭＡ．Ａ  ｎｅｗ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｌｏｏｐ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ−ｃｅｌｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ．ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．２００８；９：５２１−２．
３１．  Ｖｅｒｈａａｋ  ＲＧ，Ｈｏａｄｌｅｙ  ＫＡ，Ｐｕｒｄｏｍ  Ｅ，Ｗａｎｇ  Ｖ，Ｑｉ  Ｙ，Ｗｉｌｋｅｒｓｏｎ  ＭＤ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ＰＤＧＦＲＡ，  ＩＤＨ１，  ＥＧＦＲ，  ａｎｄ  ＮＦ１．Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ．１７：９８−１１０．
３２．  Ｎｄｕｏｍ  ＥＫ，Ｈａｄｊｉｐａｎａｙｉｓ  ＣＧ，Ｖａｎ  Ｍｅｉｒ  ＥＧ．Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｃａｎｃｅｒ  ｊｏｕｒｎａｌ．２０１２；１８：１００−６．
３３．  Ｈｅ  Ｊ，Ｌｉｕ  Ｙ，Ｌｕｂｍａｎ  ＤＭ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍａｒｋｅｒｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１２；１９：６０５０−５．
３４．  Ｋａｍｂａｒａ  Ｈ，Ｏｋａｎｏ  Ｈ，Ｃｈｉｏｃｃａ  ＥＡ，Ｓａｅｋｉ  Ｙ．Ａｎ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ＨＳＶ−１  ｍｕｔａｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＩＣＰ３４．５  ｕｎｄｅｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ａ  ｎｅｓｔｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ
ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌｓ  ｅｖｅｎ  ｗｈｅｎ
ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ  ｆｒｏｍ  ａ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００５；６５：２８３２−９．
３５．  Ｘｉａ  Ｈ，Ｃｈｅｕｎｇ  ＷＫ，Ｎｇ  ＳＳ，Ｊｉａｎｇ  Ｘ，Ｊｉａｎｇ  Ｓ，Ｓｚｅ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｂｒａｉｎ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｍｉＲ−１２４  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ  ｔｒａｉｔｓ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｇｌｉｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１２；２８７：９９６２−７１．
３６．  Ｍａｃｄｏｎａｌｄ  ＳＪ，Ｍｏｓｔａｆａ  ＨＨ，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＬＡ，Ｄａｖｉｄｏ  ＤＪ．Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １  ｓｔｒａｉｎ  ＫＯＳ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０１２；８６：６３７１−２．
３７．  Ｋａｊｉ  Ｋ，Ｎｏｒｒｂｙ  Ｋ，Ｐａｃａ  Ａ，Ｍｉｌｅｉｋｏｖｓｋｙ  Ｍ，Ｍｏｈｓｅｎｉ  Ｐ，Ｗｏｌｔｊｅｎ  Ｋ．Ｖｉｒｕｓ−ｆｒｅｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２００９；４５８：７７１−５．
３８．  Ｋｒｉｓｋｙ  ＤＭ，Ｍａｒｃｏｎｉ  ＰＣ，Ｏｌｉｇｉｎｏ  Ｔ，Ｒｏｕｓｅ
ＲＪ，Ｆｉｎｋ  ＤＪ，Ｇｌｏｒｉｏｓｏ  ＪＣ．Ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＨＳＶ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．１９９７；４：１１２０−５．
【００５８】
実施例２
本実施例は、ベクター分布と殺傷活性の増進のための、マトリクスメタロプロテイナーゼ９による、腫瘍標的化１型ｏＨＳＶの強化（ａｒｍｉｎｇ）について説明する。
【００５９】
材料及び方法
細胞株。ヒト神経膠芽腫ＳＮＢ１９、Ｕ２５１、Ｕ８７（Ｄｒ．Ｈ  Ｏｋａｄａ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈの好意により提供）、Ｊ／Ａ、Ｊ／Ｃ、Ｊ／ＥＧＦＲ［９］、アフリカミドリザル腎臓ベロ細胞及び７ｂ［１５］細胞を、標準的な方法により培養した。
【００６０】
細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で培養した。原発性神経膠芽腫細胞株ＧＢＭ１６９、ＯＧ２（Ｄｒ．Ｂａｌｖｅｅｎ  Ｋａｕｒ，Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの好意により提供）、ＧＢＭ３０を、グルタマックス、Ｂ２７、ヒトβ−ＦＧＦ、ＥＧＦ、ヘパリン及びペニシリン−ストレプトマイシンを添加したニューロベイサル培地中で、スフェロイドとして培養した。
【００６１】
プラスミド。ＫＧｗ  ＢＡＣを、プライマー５’−ＴＧＣＣＣＧＴＣＧＣＧＣＧＴＧＴＴＴＧＡＴＧＴＴＡＡＴＡＡＡＴＡＡＣＡＣＡＴＡＡＡＴＴＴＧＧＣＴＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＣＣＡＧＴＧＴＧＧＴＧＧ−３’（配列番号１２）
【００６２】
及び５’−ＣＴＧＡＡＡＴＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＴＧＣＧＧＧＣＧＧＴＣＣＡＴＴＡＡＡＧＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＴＣＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＴＡＴＴＧＴ−３’（配列番号１３）を用いてｐｃＤＮＡ３．１ＧＷから増幅させたゲートウェイカセットを挿入することによって、ＫＧＥ−４：Ｔ１２４ＢＡＣから作製した。
【００６３】
プラスミドｐＣＡＧＨからのＣＡＧプロモーター［１０］を、ｐＥｎｔｒ−ＭＭＰ９へクローニングすることにより、ｐＥｎＣＭを作製した。ｐＥｎｔｒ−ＭＭＰ９は、以前報告されたプラスミド、ｐＣＭＶ６−ＸＬ４−ＭＭＰ９からのｍｍｐ９  ｃＤＮＡを、ｐＥｎｔｒ１Ａプラスミドにクローニングすることにより作製した［１３］。
【００６４】
ＨＳＶゲノム改変。細菌人工ゲノム（ＢＡＣ）上に、ＫＯＳ  ＨＳＶ−１株の完全ゲノムを含有するＫＯＳ−３７  ＢＡＣ［１４］は、Ｄａｖｉｄ  Ｌｅｉｂ  （Ｄａｒｔｍｏｕｔｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，ＮＨ）の好意により提供された。細菌人工染色体（ＢＡＣ）上のＨＳＶ−１  ＫＯＳ株の全長ゲノムクローン、ＫＯＳ−３７  ＢＡＣ［１４］へ、一連の修飾を導入するために、大腸菌におけるダブルのＲｅｄ組換え［２４］を用いた。産物、ＫＧＢＡＣ（図５）では、ＩＣＰ４７遺伝子のプロモーターと共に、ディプロイド遺伝子ＩＣＰ０、ＩＣＰ３４．５、ＬＡＴ及びＩＣＰ４の各１コピーを含有する内部反復（接合部）領域について欠失させた。
【００６５】
ＫＧｗＧ４：Ｔ１２４ＢＡＣ（ＫＧｗ、と呼ばれる）を、（ｐｃＤＮＡ３．１ＧＷからの）ゲートウェイカセット及びウシ成長ホルモンポリアデニル化配列の、Ｒｅｄ／ＥＴ組換え技術（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ  ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を介した、ＵＬ３−ＵＬ４遺伝子間領域への挿入により、ＫＧＥ−４：Ｔ１２４ＢＡＣ（実施例１に記載）から作製した。ＭＭＰ９発現ベクターＫＭＭＰ９Ｇ４：Ｔ１２４ＢＡＣ（ＫＭＭＰ９と呼ばれる）を、ＬＲクロナーゼ反応により、ＧＷカセットをＣＡＧプロモーター−ＭＭＰ９カセットで（ｗｉｔｈ  ｗｉｔｈ）置換することによって、ＫＧｗＧ４：Ｔ１２４ＢＡＣから得た。ウイルスを製造するために、ベロ７ｂ細胞に、ＫＧｗＧ４：Ｔ１２４ＢＡＣ又はＫＭＭＰ９Ｇ４：Ｔ１２４ＢＡＣのいずれかをトランスフェクションした。全ての組換えベクターを、関係する修飾領域全体のＦＩＧＥマッピング、ＰＣＲ及びＤＮＡ配列決定により確認した。
【００６６】
ウイルスの増殖及び精製。ベロ７ｂ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＬＴ
Ｘ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクションすることにより、ＢＡＣ  ＤＮＡを、感染性ウイルスに変換した。ウイルスストックの生物学的力価（ＰＦＵ／ｍＬ）を、ベロ細胞に対して決定した。物理的力価を、下記の通り、ウイルスｇＤ遺伝子についての定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって、ゲノムコピー（ｇｃ）／ｍＬで決定した。
【００６７】
ウイルスゲノムについてのｑＰＣＲ。ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用い、製造業者の手順に従って、ウイルスストックからＤＮＡを抽出した。ｑＰＣＲのための標準曲線を、Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳｔｅｐＯｎｅ（商標）及びＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍｓの手引に記載のプロトコルを用いて、完全ＨＳＶ−１（ＫＯＳ株）ｇＤのコード配列（ｐＥ−ｇＤ１８）を含有するｐＥＮＴＲ１Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プラスミドからのＤＮＡに対して作成した。プライマー及びプローブ配列：ｇＤフォワード：５’−ＣＣＣＣＧＣＴＧＧＡＡＣＴＡＣＴＡＴＧＡＣＡ−３’（配列番号１４）；ｇＤリバース：５’−ＧＣＡＴＣＡＧＧＡＡＣＣＣＣＡＧＧＴＴ−３’（配列番号１５）；プローブ：５’−ＦＡＭ−ＴＴＣＡＧＣＧＣＣＧＴＣＡＧＣＧＡＧＧＡ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号１６）を列挙する。
【００６８】
ウエスタンブロッティング。細胞を１％ＮＰ４０緩衝液中で溶解し、溶解物を１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、タンパク質ブロットを、抗ＭＭＰ−９ポリクローナル抗体（１：１０００希釈）（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）又は抗ｇＤ抗体（１：２０００）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、及びＨＲＰ結合抗ウサギ二次抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と反応させた。ブロットを化学発光基質（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて発光させた。ローディングの違いを検出するため、各ブロットの下部を、抗βチューブリンポリクローナル抗体（１：３０００）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と反応させた。ブロットを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて発光させた。
【００６９】
ゼラチンザイモグラフィー。試料は、０．２％のゼラチンを含有する１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離する前は、還元剤処理も加熱もしなかった。ゲルを、ザイモグラフィー洗浄緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．５，２．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中で洗浄し、インキュベーション緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．５，５ｍＭ  ＣａＣｌ２，１μＭ  ＺｎＣｌ２）中、３７℃で１６時間インキュベーションし、１％クマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色し、脱染緩衝液（４％メタノール、８％酢酸）を用いて脱染した［１３］。
【００７０】
侵入アッセイ。Ｊ／Ａ、Ｊ／Ｃ及びＪ／ＥＧＦＲ細胞を、１０，０００ｇｃ／細胞、１，０００ｇｃ／細胞又は１００ｇｃ／細胞で、ＫＭＭＰ９、ＫＧｗ又はＫＧ（ｇＤを発現：野生型）に６時間感染させ、モノクローナルのマウス抗ＩＣＰ４（（１：３００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びＣｙ３−結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ（１：４００；Ｓｉｇｍａ）で免疫染色した［９］。
【００７１】
ＭＴＴアッセイ。細胞を、４８ウェルプレートに播種し、３又は６日間、１００ｇｃ／細胞（ＭＯＩ  ０．２）で感染させた。次いで、細胞を、３７℃で３時間、０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ）溶液で処理した。ＭＴＴ溶液を除去後、１００％ＤＭＳＯを加え、Ｗａｌｌａｃ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によりＯＤ５７０を記録した。細胞生存率（Ｐｅｒｃｅｎｔ
ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）を、１００％×ＯＤ（感染）／ＯＤ（非感染）として算
出した。
【００７２】
スフェロイド培養及び共焦点イメージング。スフェロイドを解離させ、計数した。３，０００細胞を、懸濁液中で２日間、スフェロイドが形成されるまで個々に増殖させた。各スフェロイドを、マイクロアッセイプレート中で、別々に、１０００ｐｆｕ又は４×１０７ｇｃのＫＭＭＰ９又はＫＧｗに感染させた。蛍光顕微鏡により、ｅＧＦＰの画像を毎日取得した。共焦点イメージングのために、スフェロイドを、感染の際、グラスボトムディッシュ（Ｗｉｌｌｃｏ  ｗｅｌｌｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に移した。スフェロイドを、５ｄｐｉで、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、ＤＡＰＩを含む封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で処理し、ＦＶ１０００共焦点イメージングシステム（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）を用いて、Ｚ切片画像を得た。
【００７３】
腫瘍モデル及び処理。３〜４週齢のＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ無胸腺マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から購入し、ＢＳＬ２施設に収容した。動物の全処置は、ピッツバーグ大学動物実験委員会（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＣＵＣ）によって承認された、実験動物の管理及び使用のための指針（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ
ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）中の要件及び推奨事項（実験動物研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９８５年）に従って行った。
【００７４】
［９］に記載の通り、ヌードマウスへの、２×１０５ヒトＧＢＭ３０細胞の頭蓋内移植を行った。５又は１０ｄｐｉで、５．６５×１０９ゲノムコピーのＫＭＭＰ９、ＫＧｗ、又はＰＢＳ（ｎ＝３〜４／群）を、やはり［９］に記載の通り、腫瘍細胞を注入するのと同じ座標（ブレグマに対し、前方０．５ｍｍ、側方（右）２ｍｍ、深度３ｍｍ）で接種した。動物の健康及び安否をモニタリングし、動物を、罹患の徴候を示した時に安楽死させた。
【００７５】
ＭＲＩイメージング。各処理群（ＫＭＭＰ９、ＫＧｗ、ＰＢＳ）から、無作為に数匹のマウスを選択した。処理１日前（ＧＢＭ３０移植後９日目）及び処理後３、６、９及び１３日目に動物をイメージングした。直径２．０ｃｍの、Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＳｐｅｃ  ９４／３０  ｍａｇｎｅｔ（Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＳｐｉｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、受信専用マウス脳コイル（ｒｅｃｅｉｖｅ−ｏｎｌｙ  ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎ  ｃｏｉｌ）及び直径７０ｍｍのリニアボリュームコイル（ｌｉｎｅａｒ  ｖｏｌｕｍｅ  ｃｏｉｌ）を用いて、イメージングを行った。麻酔したマウスに、０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＭａｇｎｅｖｉｓｔ（Ｂａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｗａｙｎｅ，ＮＪ）を腹腔内注入し、Ｔ２強調画像（繰り返し時間＝３，５００ｍｓ、エコー時間＝１２ｍｓ、レアファクター（ｒａｒｅ  ｆａｃｔｏｒ）＝８、平均数（ｎａｖｇｓ）＝４）を冠状に、目的の領域を横断して、４００  ＭＨｚ  Ｂｒｕｋｅｒ  ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ  ｂｏｒｅ  ｍａｇｎｅｔ  ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｐａｒａｖｉｓｉｏｎ  ４．０（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｉｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）で取得した。
【００７６】
統計解析。ウェルチの補正による対応のないｔ検定は、Ｗｉｎｄｏｗｓ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ；ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）用のＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．０１を用いて行った。動物生存データは、同じソフトウェアを用いて、カプラン・マイヤープロットとしてグラフ化して、マンテル・コックス  ログランク検定により比較した。
【００７７】
結果
ＭＭＰ９を発現させる、再標的化したｍｉＲにより制御されるベクターのコンストラクト及び特性解析
本研究のためのベクター改変及び設計は、図５Ａに図解されており、すべてのウイルス溶解の機能を変化させることを避け、従って正常な脳におけるウイルス増殖を回避しながら、腫瘍細胞において複製及び溶解活性を最大にするよう意図される複数の修飾を含む。
【００７８】
ＫＧｗＧ４：Ｔ１２４ＢＡＣ（本明細書中、ＫＧｗ、コントロールベクターと呼ばれる）を作製するために、ゲートウェイカセット（Ｇｗ）及びウシ成長ホルモンポリアデニル化配列を、ＫＧＥ−４：Ｔ１２４（実施例１に記載）のＵＬ３遺伝子座とＵＬ４遺伝子座との間に挿入した。ＭＭＰ９を発現する腫瘍溶解性ベクターは、ゲートウェイカセットを、ＣＡＧ（ＣＭＶニワトリβアクチン）プロモーターによってドライブされるＭＭＰ９遺伝子と置換することにより得た（ＫＭＭＰ９Ｇ４：Ｔ１２４ＢＡＣは、本明細書中、ＫＭＭＰ９と呼ばれる）。
【００７９】
ＫＭＭＰ９に感染したベロ細胞のウェスタンブロット解析では、ＭＭＰ９の的確な発現を確認した（図５Ｂ）。ゼラチンザイモグラフィーは、ＫＭＭＰ９に感染させた原発性の３ＧＢＭ株、ＧＢＭ３０、ＧＢＭ１６９及びＯＧ２において、コントロールベクターを感染させた細胞と比較して（図５Ｃ）、またＫＭＭＰ９で感染させたベロ細胞の上清中で、コントロールを感染させたベロ細胞と比較して、高いゼラチナーゼ活性を示した（図５Ｄ）。
【００８０】
次いで、我々は、ＭＭＰ９発現が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の認識を介するウイルス侵入に影響するか否かを決定した。ウイルスの侵入について試験した細胞株としては、ｇＤ受容体がないことに起因して、野生型ＨＳＶに対して耐性があるＥＧＦＲ形質導入Ｊ１．１−２細胞（Ｊ／ＥＧＦＲ）（（Ｎａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，４１３：１２−１８（２０１１））、ヒトのＨＶＥＭを発現するＪ／Ａ細胞（Ｕｃｈｉｄａ
ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８３：２９５１−２９６１（２００９））、及びヒトネクチン−１を発現するＪ／Ｃ細胞（Ｆｒａｍｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８１：１０８７９−８８９（２００７））が挙げられた。ＨＶＥＭ及びネクチン−１は、野生型ｇＤに対する天然の受容体である。ウイルス侵入を、感染後６時間目の、ＨＳＶの前初期タンパク質ＩＣＰ４についての免疫染色によって検出した。図６Ａに示す通り、ＥＧＦＲへ再標的化したウイルスＫＭＭＰ９及びＫＧｗの、Ｊ／ＥＧＦＲ細胞への侵入は、ｇＤ：ｗｔを発現する、親のＨＳＶ−１ベクターの、Ｊ／Ａ細胞又はＪ／Ｃ細胞への侵入と同程度の効率であった。再標的化したウイルスはいずれも、ウイルスのインプット（１０，０００ｇｃ／細胞）が多くても、Ｊ／Ａ又はＪ／Ｃ細胞への侵入が検出可能ではなかった。このことは、ＭＭＰ９の発現は、再標的化したベクター感染の効率や特異性に影響を及ぼさないことを実証した。
【００８１】
我々は、ＭＭＰ９発現が、培養中のヒトＧＢＭ細胞におけるウイルスの複製に影響を与え得るか否かも、評価した。結果（図６Ｂ及び６Ｃ）は、ＫＭＭＰ９が、原発性神経膠芽腫の２株、ＧＢＭ１６９とＧＢＭ３０のスフェロイドにおいて、ＫＧｗと同様の速度で複製されること、及び該２ウイルスの収率（ｑＰＣＲにより測定）は、いずれの時点においても、実質的に異なっていないことを示した。
【００８２】
ＫＭＭＰ９の腫瘍溶解活性を評価するために、ＥＧＦＲを発現することが知られる、Ｕ８７ＭＧ、ＳＮＢ１９及びＧＢＭ３０を含むＨＳＶ許容状態のヒト神経膠腫株を、ＭＯＩ
０．００５（１００ｇｃ／細胞）で感染させ、細胞生存率を、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセ
イにより、感染後３日目（図７Ａ）及び７日目（図７Ｂ）に測定した。ＫＭＭＰ９は、後者の時点で、ＫＧｗに比べて、有意に高い２細胞株の殺傷を示し、ＭＭＰ９がベクター媒介性の腫瘍溶解を増強し得ることを示唆した。
【００８３】
ＭＭＰ−９は、スフェロイド培養において、ＨＳＶの感染性を増大させる。
細胞でのＭＭＰ−９発現上昇の、腫瘍細胞スフェロイドにおけるＨＳＶ伝播に対する影響を評価するために、ＧＢＭ３０及びＧＢＭ１６９細胞を、単一のスフェロイドとして培養し、ＫＭＭＰ９又はＫＧｗウイルスに感染させた（図８Ａ）。５ｄｐｉでは、ＫＭＭＰ９は、ＫＧｗに比べて、ベクター発現ｅＧＦＰの分布を増強させることを示した。各スフェロイドにおけるｅＧＦＰ陽性細胞の定量化は、ＫＭＭＰ９感染スフェロイドにおいて、ＫＧｗ感染スフェロイドに対する、６ｄｐｉでの約１．５倍の増大を実証した（図８Ｂ；Ｐ＝０．００６）。
【００８４】
原発腫瘍由来スフェロイドのＨＳＶ感染性に対する、ＭＭＰ９の影響を更に定量化するために、ＧＢＭ３０細胞を、ＫＭＭＰ９又はＫＧｗのいずれかに感染させ、ウイルス侵入及び感染性を評価するための手段として、ベクターにより発現させられるｅＧＦＰを、共焦点顕微鏡によってイメージングした。５μｍのＺ切片のスタックからの３次元再構成は、スフェロイド内ＫＧｗと比較して、ＫＭＭＰ９の相対的感染力の増強を明らかにした。（図８Ｃ）。我々は、Ｚ軸上の深度の観点から、各スフェロイドの５つのセグメントにおける感染性の違いも検証した（図８Ｄ及び８Ｅ）（底部から上方に０〜２０μｍ、２５〜５０μｍ、５５〜８０μｍ、８５〜１００μｍ、１０５〜１２０μｍ及び１２５〜１４０μｍ）。最も外側のセグメント（０〜２０μｍ）では違いが認められなかった（図８Ｄ及び８Ｅ）が、ＫＭＭＰ９は、スフェロイドのより深部（２５μｍ〜５０及び５０〜８５μｍ、Ｐ＜０．０５）で、ＫＧｗよりも有意に高い感染性を示した。このことはＭＭＰ９がスフェロイド全体へのベクター伝播を増進することを示唆した。スフェロイド間ですべてのセグメントを比較した場合（対応のあるｔ検定、Ｐ＝０．０１３）も、有意差が認められた。
【００８５】
ＭＭＰ９腫瘍溶解性ベクターは、マウスにおけるＧＢＭの治療に非常に有効である。
我々は以前、ＧＢＭ３０は、ヌードマウスにおいて、腫瘍細胞接種後２０日以内に動物の死に至る、致死性の腫瘍を一貫して確立することを示した［９］。我々は、ヌードマウス［９］における、浸潤性の頭蓋内腫瘍を確立するために、患者由来の、球形成性ＧＢＭ３０細胞を用いた。動物を毎日観察し、罹患の徴候を示した時に安楽死させた。公表された我々の結果と同様に、腫瘍細胞接種後５日目にＰＢＳを同じ定位座標に注入したマウスは、腫瘍細胞移植の数週間以内（中央値１８日；図９）に死亡した。対照的に、ＭＭＰ９を発現するウイルスであるＫＭＭＰ９、又はコントロールウイルスＫＧｗのいずれかを用いる、腫瘍の治療は、少なくとも３５日間、半数の動物を防護し、これら２群についての生存期間中央値は、同等であった（それぞれ２９日及び３１．５日、Ｐ＝０．６１、ログランク検定）。これらの結果は、ＭＭＰ９処理された動物の５０％が、処理なしの１８日と比較して、最大３５日生存することを示した（図９）。
【００８６】
並行した独立実験において、腫瘍接種後１０日目のベクター注入により、同所性ＧＢＭ３０異種移植モデルにおける、ＫＭＭＰ９及びＫＧｗの抗腫瘍効果を、モック（ＰＢＳ）治療と比較した。磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）により、マウスを、処理１日前、及び処理後３、６、９及び１３日目に、再度、腫瘍サイズの変化について、イメージングした。図１０Ａは、各群からの例のＴ２強調画像を示す。各群からの、処理開始時に同等な腫瘍体積を有する単体の動物の比較では、ＭＭＰ９が、ＫＧｗベクター（図１０Ｂ）よりも強い腫瘍溶解効果を有することが明らかである。
【００８７】
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１８．  Ｙｉｎ，Ａ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｓ：ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ  ｔｒｉａｌｓ．Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｌ  Ｈｅｍａｔｏｌ，２０１３．８７（３）：ｐ．２６５−８２．
１９．  Ｗｏｎｇ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｆｏｒ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１２．１３（９）：ｐ．１７８６−９４．
２０．  Ｗａｋｉｍｏｔｏ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｉｎｎａｔｅ
ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｏｎ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｋｉｌｌ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，２００３．１０（１１）：ｐ．９８３−９０．
２１．  ＭｃＫｅｅ，Ｔ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｎ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｎ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００６．６６（５）：ｐ．２５０９−１３．
２２．  Ｙｕｎ，Ｃ．Ｏ．，Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ
ｓｐｒｅａｄ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，２００８．１０（４）：ｐ．３５６−６１．
２３．  Ｄｍｉｔｒｉｅｖａ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎａｓｅ  ＡＢＣ  Ｉ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ｓｐｒｅａｄ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｉｃａｃｙ．Ｃｌｉｎ  
Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１１．１７（６）：ｐ．１３６２−７２．
２４．  Ｔｉｓｃｈｅｒ，Ｂ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｗｏ−ｓｔｅｐ  ｒｅｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｍａｒｋｅｒｌｅｓｓ  ＤＮＡ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２００６．４０（２）：ｐ．１９１−７．
２５．  Ｉｓｈｉｄａ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ−２’−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ａｎｄ  ａｎ
ＨＳＶ  ａｍｐｌｉｃｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｖｉｒｕｓ，ＨＦ１０  ａｓ  ａ  ｈｅｌｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ，２０１０．２８８（１）：ｐ．１７−２７．
【００８８】
刊行物、特許出願及び特許を含む、本明細書中に引用した全ての参考文献は、それぞれの参考文献が参照によって組み込まれることが個々に且つ具体的に示されているのと同程度及びその全体が本明細書中に記載されているのと同程度まで、参照によって本明細書中に組み込まれる。米国特許出願公開第２０１３／００９６１８６号及び国際公開第ＷＯ２０１１／１３０７４９号として公開された、米国仮特許出願第６１／３２５，１３７号の優先権を主張する、米国特許出願第１３／６４１，６４９号（ＰＣＴ出願第ＵＳ２０１１／０３２９２３号の国内段階）の内容も、その全体が本明細書に組み込まれ、米国特許出願公開第２０１３／００９６１８６号の段落［００３９］、［００４０］及び［００４１］が特に注目される。Ｍａｚｚａｃｕｒａｔｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１４  Ｓｅｐ  ９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１４．１７７．［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］もまた、その全体が参照により組み込まれる。
【００８９】
本発明の説明に関して（特に、以下の特許請求の範囲に関して）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書中に特記しないか文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方をカバーすると解釈すべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特記しない限り、オープンエンドの用語（即ち、「〜を含むがそれらに限定されない」を意味する）と解釈すべきである。本明細書中の値の範囲の記述は、本明細書中に特記しない限り、その範囲内に入る各個別の値に個々に言及する省略方法として働くことのみを意図しており、各個別の値は、それが本明細書中に個々に記述されているかのように本明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中に特記しない又は文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施できる。本明細書中に提供される任意の及び全ての例又は例示的語句（例、「など（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、本発明をよりよく説明することのみを意図しており、特段特許請求されない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中の全ての語句は、特許請求されていない任意の要素を本発明の実施に必須のものとして示していると解釈すべきではない。
【００９０】
発明を実施するための発明者が知る最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書中に記載されている。これらの好ましい実施形態のバリエーションは、上述の説明を読めば当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がかかるバリエーションを適宜使用することを予期しており、本発明者らは、本明細書中に具体的に記載されたのとは異なる方法で本発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、適用法によって許容されるとおり、本明細書中に添付した特許請求の範囲に記載される対象の全ての改変及び均等物を含む。更に、その全ての可能なバリエーションでの上記要素の任意の組合せが、本明細書中に特記しない又は文脈と明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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