(57)【要約】      （修正有）【課題】免疫系を賦活化する細胞および当該細胞を含む医薬組成物の提供。【解決手段】ヒトパピローマウイルスの初期遺伝子Ｅ６タンパク質およびＥ７タンパク質並びにＥ６タンパク質とＥ７タンパク質との融合タンパク質から選択される少なくとも１つのタンパク質とＣＤ１ｄタンパク質を発現する哺乳動物細胞であって、ＣＤ１ｄリガンドによってパルスされた細胞。あるいは、ヒトパピローマウイルスの初期遺伝子Ｅ６タンパク質およびＥ７タンパク質を別々のタンパク質として発現する細胞。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトパピローマウイルスの初期遺伝子E6タンパク質およびE7タンパク質並びにE6タンパク質とＥ７タンパク質との融合タンパク質から選択される少なくとも１つのタンパク質とCD1dタンパク質を発現する哺乳動物細胞であって、CD1dリガンドによってパルスされた細胞。
【請求項２】
ヒトパピローマウイルスの初期遺伝子E6タンパク質およびE7タンパク質を別々のタンパク質として発現する、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
E6タンパク質とＥ７タンパク質との融合タンパク質を発現する、請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
融合タンパク質が、Ｅ７タンパク質、Ｅ６タンパク質、およびＥ７タンパク質をこの順番で含む融合タンパク質である、請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
Ｅ７タンパク質、Ｅ６タンパク質、およびＥ７タンパク質をこの順番で含む融合タンパク質。
【請求項６】
Ｅ７タンパク質、Ｅ６タンパク質、およびＥ７タンパク質をこの順番で含む融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項７】
Ｅ７タンパク質、Ｅ６タンパク質、およびＥ７タンパク質をこの順番で含む融合タンパク質をコードする核酸を含む、当該融合タンパク質の発現ベクター。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞、請求項５に記載の融合タンパク質、請求項６に記載の核酸、または請求項７に記載のベクターを含む、医薬組成物。
【請求項９】
ヒトパピローマウイルスに感染したヒト対象に投与するための、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ヒト対象がが、ヒトパピローマウイルスに起因するがんを有する、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ヒトパピローマウイルスに起因するがんが、子宮頸がん、肛門がん、および膣がんからなる群から選択されるがんである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫系を賦活化する細胞および当該細胞を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、子宮頸がんの原因として知られるウイルスである。ＨＰＶは、子宮頸がんの他には、外因上皮内腫瘍および膣上皮内腫瘍の原因であり、これらは進行するとそれぞれ外陰がんおよび膣がんとなる。また、近年では中咽頭癌の発症リスクとしても知られている。子宮頸がんの原因となるＨＰＶの代表は、１６型および１８型であり、子宮頸がんの原因の約６５％を１６型および１８型のＨＰＶが占める。１６型および１８型のＨＰＶによる子宮頸がんは、他の高リスク型の子宮頸がんに比べて、がん化が早い。２０代から３０代の子宮頸がんでは、約８割から９割が、１６型および１８型のＨＰＶを原因とする。
【０００３】
CD1dと標的タンパク質を共発現する細胞をCD1dリガンドでパルスして得られる細胞は、人工アジュバントベクター細胞（aAVC）と呼ばれ、投与された対象において自然免疫と、当該標的タンパク質に対する獲得免疫を誘発する（特許文献１〜３および非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】WO2007/097370
【特許文献２】WO2010/061930
【特許文献３】WO2013/018778
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Shimizu K. et al., 2007, J. Immunol., Vol. 178, pp2853-2861
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、免疫系を賦活化する細胞および当該細胞を含む医薬組成物を提供する。
【０００７】
本発明によれば、Ｅ６タンパク質またはＥ７タンパク質を発現する人工アジュバントベクター細胞（aAVC）は、NKT細胞を活性化し、さらにE6およびE7抗原特異的T細胞を誘導し、抗腫瘍効果を示した。本発明によればまた、Ｅ６タンパク質とＥ７タンパク質との融合タンパク質のうち、Ｅ７タンパク質、Ｅ６タンパク質、およびＥ７タンパク質がこの順番で連結した融合タンパク質は、細胞内におけるタンパク質発現が高かった。本発明はこのような知見に基づく発明である。
【０００８】
従って、本発明によれば、例えば、以下に示される発明（例えば、産業上利用可能な発明）が提供される。
（１）ヒトパピローマウイルスの初期遺伝子E6タンパク質およびE7タンパク質並びにE6タンパク質とＥ７タンパク質との融合タンパク質から選択される少なくとも１つのタンパク質とCD1dタンパク質を発現させた哺乳動物細胞であって、CD1dリガンドによってパルスされた細胞。
（２）ヒトパピローマウイルスの初期遺伝子E6タンパク質およびE7タンパク質を別々のタンパク質として発現させた、上記（１）に記載の細胞。
（３）ヒトパピローマウイルスの初期遺伝子E6タンパク質およびE7タンパク質を融合タンパク質として発現させた、上記（２）に記載の細胞。
（４）融合タンパク質が、Ｅ７タンパク質、Ｅ６タンパク質、およびＥ７タンパク質をこの順番で含む融合タンパク質である、上記（３）に記載の細胞。
（５）Ｅ７タンパク質、Ｅ６タンパク質、およびＥ７タンパク質をこの順番で含む融合タンパク質。
（６）Ｅ７タンパク質、Ｅ６タンパク質、およびＥ７タンパク質をこの順番で含む融合タンパク質をコードする核酸。
（７）Ｅ７タンパク質、Ｅ６タンパク質、およびＥ７タンパク質をこの順番で含む融合タンパク質をコードする核酸を含む、当該融合タンパク質の発現ベクター。
（８）請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞、請求項５に記載の融合タンパク質、請求項６に記載の核酸、または請求項７に記載のベクターを含む、医薬組成物。
（９）ヒトパピローマウイルスに感染したヒト対象に投与するための、請求項８に記載の医薬組成物。
（１０）ヒト対象が、ヒトパピローマウイルスに起因するがんを有する、請求項９に記載の医薬組成物。
（１１）ヒトパピローマウイルスに起因するがんが、子宮頸がん、肛門がん、および膣がんからなる群から選択されるがんである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、CD1dを発現するHEK293細胞をCD1dリガンドでパルスし、その後、HPV-16型のE6またはE7タンパク質をコードするmRNAをトランスフェクションして、指定した時間培養した細胞におけるE6またはE7タンパク質の発現を示す（パネルAおよびB）。パネルCおよびDは、CD1dの細胞表面上の発現をフローサイトメトリーによって分析した結果を示す。
【図２】図２は、CD1dを発現するHEK293細胞をCD1dリガンドでパルスし、E6またはE7タンパク質を発現する細胞によるNKT細胞の増幅を調べた結果を示す。パネルAは、実験のスキームを示す。パネルBは、NKT細胞の活性化を示す。
【図３】図３は、CD1dを発現するNIH3T3細胞をCD1dリガンドでパルスし、E6またはE7タンパク質を発現する細胞の、メラノーマ細胞移植モデルにおける抗腫瘍効果を示す。
【図４】図４は、E6タンパク質もしくはE7タンパク質またはこれらの融合タンパク質をHEK293細胞に発現させたときのE6タンパク発現量を示す。図４は、E6タンパク発現量を抗E6抗体を用いたウェスタンブロット法によって定量した結果である。図中において、＃１：E6発現HEK293細胞、＃２：E7発現HEK293細胞、＃３：E6-E7発現HEK293細胞、＃４：E6-E7-E6発現HEK293細胞、＃５：E7-E6-E7発現HEK293細胞、および＃６：E7-E6発現HEK293細胞である。発現量は#１を１とした場合の比率(E6蛋白質発現比)として表示している。
【図５】図５は、E6タンパク質もしくはE7タンパク質またはこれらの融合タンパク質をHEK293細胞に発現させたときのE７タンパク発現量を示す。図５は、E７タンパク発現量を抗E７抗体を用いたウェスタンブロット法によって定量した結果である。図中において、＃１：E6発現HEK293細胞、＃２：E7発現HEK293細胞、＃３：E6-E7発現HEK293細胞、＃４：E6-E7-E6発現HEK293細胞、＃５：E7-E6-E7発現HEK293細胞、および＃６：E7-E6発現HEK293細胞である。発現量は#２を１とした場合の比率(E7蛋白質発現比)として表示している。
【図６】図６は、CD1dを発現するNIH3T3細胞をCD1dリガンドでパルスし、E7-E6-E7タンパク質を発現する細胞の、メラノーマ細胞移植モデルにおける抗腫瘍効果を示す。
【図７】図７は、CD1dを発現するNIH3T3細胞をCD1dリガンドでパルスし、E7-E6-E7タンパク質を発現する細胞を投与し、E6および E7特異的CD8T細胞の誘導をE6又はE7ペプチドを添加した樹状細胞で再免疫した際のIFN-γ産生細胞数(spot数)として示す。
【発明の具体的な説明】
【００１０】
本明細書では、「対象」とは、哺乳動物であり得、例えば、ヒトおよび非ヒト哺乳動物が含まれる。本明細書では、「対象」には、例えば、ＨＰＶ（例えば、HPV-16型および／またはHPV-18型）に感染したヒト対象（特に女性）および当該感染により上昇した発がんリスクを有するヒト対象（特に女性）、並びに当該感染により発がんしたヒト対象（特に女性）が含まれる。
【００１１】
本明細書では、「処置」とは、治療的処置および予防的処置を含む意味で用いられる。本明細書では、「治療」とは、疾患もしくは状態の進行の遅延または停止、並びに疾患もしくは状態の改善および治癒を含む意味で用いられる。本明細書では「予防」とは、疾患または状態の発症を抑制すること、および、その発症率を低下させることを含む意味で用いられる。
【００１２】
本明細書では、「ヒトパピローマウイルス」（HPV）とは、パピローマウイルス科に属するウイルスの一つであり、パピローマ（または乳頭腫）と呼ばれるイボを形成させるウイルスである。HPVとしては、１８０以上の遺伝子型が存在するが、中でもHPV-16型とHPV-18型が発がん性リスクを高める。全世界の子宮頸がんの約５０％がHPV-16型を有する。HPV-16型は、初期遺伝子としてE1〜E7を有し、後期遺伝子としてL1およびL2を有する。E6およびE7が発がんと関連し得る。E6タンパク質としては、例えば、HPV-16型のE6タンパク質、例えば、GenBank登録番号：NP_041325.1の下で登録されたアミノ酸配列（または配列番号1に記載のアミノ酸配列）に対応するアミノ酸配列を有するE6タンパク質が挙げられる。E6タンパク質としてはまた、例えば、HPV-18型のE6タンパク質、例えば、GenBank登録番号：NP_040310.1のアミノ酸配列（または配列番号2に記載のアミノ酸配列）に対応するアミノ酸配列を有するE6タンパク質が挙げられる。E7タンパク質としては、例えば、HPV-16型のE7タンパク質、例えば、GenBank登録番号：NP_041326.1の下で登録されたアミノ酸配列（または配列番号3に記載のアミノ酸配列）に対応するアミノ酸配列を有するE7タンパク質が挙げられる。E7タンパク質としてはまた、例えば、HPV-18型のE7タンパク質、例えば、GenBank登録番号：NP_040311.1の下で登録されたアミノ酸配列（または配列番号4に記載のアミノ酸配列）に対応するアミノ酸配列を有するE7タンパク質が挙げられる。本明細書では、「あるアミノ酸配列に対応する」とは、当該アミノ酸配列のオーソログであって、当該アミノ酸配列を有するタンパク質と同質の機能性を有するタンパク質をいう。E6タンパク質およびE7タンパク質としてはそれぞれ、例えば、上記アミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の配列同一性を有するE6タンパク質およびE7タンパク質が含まれ得る。配列同一性は、例えば、NEEDLE program (Journal of Molecular Biology、1970、Vol.48、p.443-453)検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Identityを意味し得る。前記のパラメータは以下の通りであり得る。Gap penalty = 10、Extend penalty = 0.5、およびMatrix = EBLOSUM62。
【００１３】
本明細書では、「人工アジュバントベクター細胞」（aAVC）とは、CD1dと抗原（例えば、E6タンパク質およびE7タンパク質）を発現する細胞であって、CD1dでパルスされた細胞を意味する。CD1dでパルスされた細胞は、CD1dを発現する細胞をCD1dリガンドと共に培養することによって得られ得る。細胞に付着しなかったCD1dリガンドは、洗浄によって除去することができる。CD1dは、CD1ファミリーのタンパク質であり、MHCクラスI様の糖タンパク質である。CD1dは、糖脂質を提示して、例えば、NKT細胞を活性化さ得る。CD1dとしては、例えば、ヒトのCD1d、例えば、GenBank登録番号：AAH27926.1の下で登録されたアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。CD1dリガンドは、CD1dに結合する糖脂質を意味する。CD1dリガンドとしては、例えば、α-GalCer（α-ガラクトシルセラミド）、α-C-GalCer（α-C-ガラクトシルセラミド）、iGB3（イソグロボトリヘキソシルセラミド）、GD3（ガングリオシド3）、GSL-1（α-結合型グルクロン酸）、GSL-1'SA（ガラクツロン酸）が挙げられ、CD1dリガンドとして用いられ得る。CD1dリガンドとしては、例えば、α-GalCer、α-C-GalCerが好ましく用いられ得る。
【００１４】
aAVCは、哺乳動物に投与されると、NKT細胞を活性化し、樹状細胞を成熟化させ、自然免疫を誘導すると共に獲得免疫を誘導する。aAVCがタンパク質を発現する場合、当該タンパク質に対する獲得免疫も誘導される。aAVCは、樹状細胞、がん細胞、およびそれ以外の細胞（例えば、体細胞）のいずれを用いても、自然免疫および獲得免疫を誘導する。aAVCは、投与対象と同種同系であっても同種異系であっても、対象において自然免疫および獲得免疫を誘導する。aAVCが同種異系の場合、対象において自然免疫および獲得免疫を誘導した後に、aAVC自体は、対象の免疫系により非自己として排除され得る。標的タンパク質をaAVCに発現させることによって、aAVCを投与された対象において、当該標的タンパク質特異的な獲得免疫を誘導させることができる。標的タンパク質は、aAVCにおいては、部分ペプチドに分解され得、部分ペプチドが獲得免疫を誘発し得る。aAVCは、CD1dを発現し、かつCD1dリガンドによってパルスされている。aAVCは、制御配列に作動可能に連結したCD1dをコードする外来性の遺伝子を有し得る。aAVCは、制御配列に作動可能に連結した標的タンパク質をコードする外来性の遺伝子を有し得る。aAVCは、内在性の標的タンパク質を発現し得る。
【００１５】
本明細書では、「細胞」は、哺乳動物の細胞であり、例えば、ヒト細胞であり得る。細胞としては、樹状細胞および非樹状細胞が挙げられる。細胞としては、腫瘍細胞および非腫瘍細胞が挙げられる。細胞としては、がん細胞および非がん細胞が挙げられる。細胞としては、不死化細胞および初代細胞が挙げられる。細胞としては、体細胞およびそれ以外の細胞が挙げられる。細胞は、投与対象に対して、同種同系であってもよく、同種異系であってもよい。細胞としては、例えば、ヒト細胞およびヒト細胞株、例えば、ヒト胎児腎細胞株、例えば、HEK293細胞が挙げられる。
【００１６】
本明細書では、「融合タンパク質」とは、２つ以上のタンパク質またはその部分ペプチドを含むタンパク質を言う。融合タンパク質において、２つ以上のタンパク質は、スペーサーを挟んで、またはスペーサーを挟まずに連結され得る。スペーサーは、ペプチド、例えば、１〜２０アミノ酸長、１〜１０アミノ酸長、または１〜５アミノ酸長のペプチドであり得る。本明細書では、融合タンパク質において、タンパク質Aとタンパク質BがN末端側からこの順番で連結する場合、「タンパク質A−タンパク質B」と表記する。本明細書では、融合タンパク質において、タンパク質Bとタンパク質AがN末端側からこの順番で連結する場合、「タンパク質B−タンパク質A」と表記する。融合タンパク質は、これを構成する各タンパク質またはその部分ペプチドをコードする遺伝子をインフレームで連結することによって設計することができる。
【００１７】
本明細書では、「核酸」とは、デオキシリボ核酸（DNA）およびリボ核酸（RNA）を意味する。タンパク質をコードする核酸としては、DNAおよびmRNAが挙げられる。DNAは、mRNAから逆転写して得られる配列を有するcDNAであり得る。mRNAは、安定化のための核酸修飾を有していてもよい。
【００１８】
本明細書では、「発現ベクター」とは、制御配列と制御配列に作動可能に連結したタンパク質をコードする核酸を含み、細胞中で、または、試験管内で、当該タンパク質をコードするmRNAを転写させることができるベクターを意味する。発現ベクターは、例えば、細胞中で複製するための複製起点、および制御配列と制御配列に作動可能に連結したタンパク質をコードする核酸を含み得る。発現ベクターは、これを導入された細胞を選択するための選択マーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子）を有することができる。哺乳動物細胞で発現させるための制御配列としては、特に限定されないが例えば、RNAポリメラーゼIIのプロモーターが挙げられ、例えば、CMV即時早期、HSVチミジンキナーゼ、早期および後期SV40、レトロウイルスのLTR、メタロチオネインIなどのプロモーターが挙げられる。大腸菌で発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰＲ、ラムダＰＬ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、などのプロモーターが挙げられる。試験管内で発現させるためのプロモーターとしては、特に限定されないが例えば、ＳＰ６、Ｔ７、およびＴ３プロモーターが挙げられる。発現ベクターとしては、プラズミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、人工染色体、レトロウイルス、レンチウイルス、麻疹ウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびセンダイウイルスなどが挙げられる。
【００１９】
本明細書では、「がん」とは、良性および悪性の新生物であり、ステージ０、ステージ１、ステージ２、ステージ３、およびステージ４のがんを含む。がんとしては、固形がんおよび血液がん（例えば、白血病）などの造血器腫瘍が挙げられる。固形がんとしては、上皮がんおよび肉腫が挙げられる。がんとしては、白血病、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫、脳腫瘍、乳がん、子宮体がん、子宮頸がん、卵巣がん、膣がん、食道がん、胃がん、虫垂がん、大腸がん、肝がん（例えば、肝細胞がん）、胆のうがん、胆管がん、膵臓がん、副腎がん、消化管間質腫瘍、中皮腫（例えば、胸膜、腹膜、および心膜）、頭頸部がん（例えば、咽頭がん、口腔がん、歯肉がん、舌がん、頬粘膜がん）、唾液腺がん、副鼻腔がん（例えば、上顎洞がん、前頭洞がん、篩骨洞がん、蝶型骨洞がん）、甲状腺がん、腎臓がん、肺がん、骨肉腫、前立腺がん、精巣腫瘍、腎細胞がん、膀胱がん、横紋筋肉腫、皮膚がん、肛門がん、神経芽細胞腫、中枢神経がん、ウィルムス腫瘍、生殖細胞がん、軟組織肉腫、グリオーマ、およびグリオブラストーマが挙げられる。ヒトパピローマウイルスに起因するがんとしては、例えば、子宮頸がん、肛門がん、および膣がんが挙げられる。
【００２０】
本発明によれば、「標的タンパク質」とは、生体において誘発される獲得免疫の抗原特異性が向けられるタンパク質をいう。標的タンパク質は、内因性のタンパク質であってもよく、外因性のタンパク質であってもよい。本明細書では、標的タンパク質は、E6タンパク質、E7タンパク質およびＥ６タンパク質とＥ７タンパク質との融合タンパク質からなる群から選択される１以上のHPVのタンパク質であり得る。E6タンパク質、およびE7タンパク質は、例えば、HPV-16型およびHPV-18型からなる群から選択されるHPVのタンパク質であり得る。本発明の融合タンパク質に含まれるE6タンパク質部分およびE7タンパク質部分もまた、例えば、HPV-16型およびHPV-18型からなる群から選択されるHPVのタンパク質であり得る。
【００２１】
本明細書では、「発現する」とは、細胞内でタンパク質をコードする核酸から当該タンパク質が産生したことによって当該細胞が当該タンパク質を有することを意味する。
【００２２】
本発明によれば、抗原であるE6タンパク質および／またはE7タンパク質を発現するaAVCは、NKT細胞を誘導し、抗腫瘍効果を奏する。従って、本発明によれば、E6タンパク質および／またはE7タンパク質を発現するaAVC、当該aAVCを含む医薬組成物、および当該aAVCを含む、がんを処置することに用いるための医薬組成物が提供される。
【００２３】
本発明によれば、Ｅ６タンパク質とＥ７タンパク質との融合タンパク質が提供される。Ｅ６タンパク質とＥ７タンパク質との融合タンパク質としては、Ｅ６−Ｅ７、Ｅ７−Ｅ６、Ｅ６−Ｅ７−Ｅ６、およびＥ７−Ｅ６−Ｅ７からなる群から選択される融合タンパク質、並びにこれらの融合タンパク質を含むタンパク質が挙げられる。本発明によれば、Ｅ６タンパク質とＥ７タンパク質との融合タンパク質としては、Ｅ６−Ｅ７、Ｅ７−Ｅ６、Ｅ６−Ｅ７−Ｅ６、およびＥ７−Ｅ６−Ｅ７からなる群から選択される融合タンパク質、並びにこれらの融合タンパク質を含むタンパク質をそれぞれコードする核酸（例えば、DNAまたはmRNA）が提供される。本発明によれば、Ｅ６−Ｅ７、Ｅ７−Ｅ６、Ｅ６−Ｅ７−Ｅ６、およびＥ７−Ｅ６−Ｅ７からなる群から選択される融合タンパク質、並びにこれらの融合タンパク質を含むタンパク質をそれぞれコードする核酸を含む、発現ベクターが提供される。本発明によれば、哺乳動物細胞において上記融合タンパク質を発現させることに用いるための、発現ベクターが提供される。本発明によれば、大腸菌において上記融合タンパク質を発現させることに用いるための、発現ベクターが提供される。本発明によれば、インビトロにおいて上記融合タンパク質をコードする遺伝子を転写させること（および好ましくは翻訳させること）に用いるための、発現ベクターが提供される。本発明によればまた、上記融合タンパク質の少なくとも１以上を有する細胞が提供される。aAVCに用いられ得る細胞は、哺乳動物の細胞であり、例えば、ヒト細胞であり得る。aAVCに用いられ得る細胞は、樹状細胞または非樹状細胞であり得る。細胞は、腫瘍細胞または非腫瘍細胞であり得る。aAVCに用いられ得る細胞は、がん細胞または非がん細胞であり得る。aAVCに用いられ得る細胞は、不死化細胞または初代細胞であり得る。aAVCに用いられ得る細胞は、体細胞またはそれ以外の細胞であり得る。aAVCに用いられ得る細胞は、投与対象に対して、同種同系であってもよく、同種異系であってもよい。aAVCに用いられ得る細胞は、例えば、ヒト細胞株、例えば、ヒト胎児腎細胞株、例えば、HEK293細胞であり得る。
ここで、Ｅ６−Ｅ７融合タンパク質のアミノ酸配列の一例は、配列番号５〜８のいずれかに示される。また、Ｅ７−Ｅ６融合タンパク質のアミノ酸配列の一例は、配列番号９〜１２のいずれかに示される。また、Ｅ６−Ｅ７−Ｅ６融合タンパク質のアミノ酸配列の一例は、配列番号１３〜２０に示される。また、Ｅ７−Ｅ６−Ｅ７融合タンパク質のアミノ酸配列の一例は、配列番号２１〜２８に示される。これらの融合タンパク質は、細胞内で発現しさえすれば、樹状細胞に貪食された際に樹状細胞内で小さなペプチドに分解され、これによりＨＰＶに対する免疫系が誘導されると考えられる。したがって、適宜、融合タンパク質におけるタンパク質間の連結部にはリンカーが導入されていてもよい。
本発明によれば、抗原であるＥ６タンパク質とＥ７タンパク質との融合タンパク質を発現するaAVCは、NKT細胞を誘導し、抗腫瘍効果を奏する。従って、本発明によれば、Ｅ６タンパク質とＥ７タンパク質との融合タンパク質を発現するaAVC、当該aAVCを含む医薬組成物、および当該aAVCを含む、がんを処置することに用いるための医薬組成物が提供される。
【００２４】
【表１】
2020202750.tif 000002
【００２５】
上記表１において、Ａ−Ｂ融合タンパク質は、Ｎ末端から、Ａタンパク質およびＢタンパク質がこの順番で連結したタンパク質を意味し、そのアミノ酸配列の酸配列番号の一例が表中に記載されている。上記表１のアミノ酸配列は、スペーサーを介して連結されていてもよく、スペーサーを介さずに連結されていてもよい。
【００２６】
従って、本発明によれば、本発明の融合タンパク質、例えば、Ｅ７−Ｅ６−Ｅ７である融合タンパク質もしくはＥ７−Ｅ６−Ｅ７を含む融合タンパク質、当該融合タンパク質をコードする核酸、当該核酸を含む遺伝子発現ベクター、当該融合タンパク質を発現するヒト細胞またはヒト細胞株（例えば、ヒト胎児腎細胞株、例えば、HEK293細胞）、当該核酸を有するヒト細胞またはヒト細胞株（例えば、ヒト胎児腎細胞株、例えば、HEK293細胞）が提供される｛ここで、当該細胞または細胞株は、さらにCD1dを発現していてもよい｝。本発明によればまた、本発明の融合タンパク質を発現するヒト細胞またはヒト細胞株を含む医薬組成物、および本発明の融合タンパク質をコードする核酸を有するヒト細胞またはヒト細胞株を含む医薬組成物が提供される。本発明によればさらに、本発明の融合タンパク質、例えば、Ｅ７−Ｅ６−Ｅ７である融合タンパク質もしくはＥ７−Ｅ６−Ｅ７を含む融合タンパク質、当該融合タンパク質をコードする核酸、当該融合タンパク質を発現するヒトａＡＶＣ、および当該融合タンパク質をコードする核酸を有するヒトａＡＶＣが提供される。本発明によればさらにまた、当該ヒトａＡＶＣを含む医薬組成物もまた、提供される。
【００２７】
Ｅ６タンパク質もしくはＥ７タンパク質またはＥ６タンパク質とＥ７タンパク質との融合タンパク質は、細胞に発現ベクターを導入することによって当該細胞に発現させることができる。Ｅ６タンパク質もしくはＥ７タンパク質またはＥ６タンパク質とＥ７タンパク質との融合タンパク質はまた、細胞にこれらのいずれか１以上をコードするmRNAを導入することによって当該細胞に発現させることができる。発現ベクターやmRNAは当業者に周知の方法を用いて細胞に導入することができる。導入方法としては、例えば、リポフェクション、エレクトロポレーション、およびリン酸カルシウム法などが挙げられる。
【００２８】
本発明によれば、Ｅ６タンパク質もしくはＥ７タンパク質またはＥ６タンパク質とＥ７タンパク質との融合タンパク質を発現するaAVCまたは当該aAVCを含む医薬組成物を製造する方法であって、当該タンパク質または融合タンパク質をコードするmRNAを細胞に導入することを含む、方法が提供される。本発明によれば、Ｅ７−Ｅ６−Ｅ７である融合タンパク質もしくはＥ７−Ｅ６−Ｅ７を含む融合タンパク質を発現するaAVCを製造する方法が提供される。本発明によれば、Ｅ７−Ｅ６−Ｅ７である融合タンパク質もしくはＥ７−Ｅ６−Ｅ７を含む融合タンパク質を発現するaAVCを製造する方法は、当該融合タンパク質をコードするmRNAを細胞に導入することを含む。本発明のaAVCを製造する方法は、細胞にCD1dを発現させることと、CD1dを発現する細胞をCD1dリガンド存在下で培養することとを含み得る。本発明のaAVCを製造する方法は、細胞がCD1dを発現している場合には、CD1dを人為的に発現させることを含まなくてもよい。本発明のaAVCを製造する方法は、CD1dを発現する細胞をCD1dリガンド存在下で培養することを含み得る。
【００２９】
本発明によれば、ヒトパピローマウイルスのＥ６タンパク質もしくはＥ７タンパク質またはその両方を発現するaAVCを、その必要のある対象に投与することを含む、方法が提供される。本発明によれば、がんをその必要のある対象において処置する方法であって、ヒトパピローマウイルスのＥ６タンパク質もしくはＥ７タンパク質またはその両方を発現するaAVCの治療上有効量を当該対象に投与することを含む、がんを処置する方法が提供される。本発明によれば、がんは、ヒトパピローマウイルスの感染を伴うがんであり得る。
【００３０】
本発明によれば、Ｅ７−Ｅ６−Ｅ７である融合タンパク質もしくはＥ７−Ｅ６−Ｅ７を含む融合タンパク質を発現するaAVCを、その必要のある対象に投与することを含む、方法が提供される。本発明によれば、がんをその必要のある対象において処置する方法であって、Ｅ７−Ｅ６−Ｅ７である融合タンパク質もしくはＥ７−Ｅ６−Ｅ７を含む融合タンパク質を発現するaAVCの治療上有効量を当該対象に投与することを含む、がんを処置する方法が提供される。
【００３１】
本発明によれば、がんを処置することに用いるための医薬の製造における、ヒトパピローマウイルスのＥ６タンパク質もしくはＥ７タンパク質またはその両方を発現するaAVCの使用が提供される。本発明によれば、がんを処置する方法に用いるための、ヒトパピローマウイルスのＥ６タンパク質もしくはＥ７タンパク質またはその両方を発現するaAVCの使用が提供される。
【００３２】
本発明によれば、がんを処置することに用いるための医薬の製造における、本発明の融合タンパク質、例えば、Ｅ７−Ｅ６−Ｅ７である融合タンパク質もしくはＥ７−Ｅ６−Ｅ７を含む融合タンパク質を発現するaAVCの使用が提供される。本発明によれば、がんを処置する方法に用いるための、本発明の融合タンパク質、例えば、Ｅ７−Ｅ６−Ｅ７である融合タンパク質もしくはＥ７−Ｅ６−Ｅ７を含む融合タンパク質を発現するaAVCが提供される。
【００３３】
本発明によれば、医薬組成物は、本発明のaAVCと薬学的に許容可能な賦形剤を含んでいてもよい。本発明によれば、医薬組成物は、非経口投与（例えば、静脈内投与、腫瘍内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、脳室内投与、および髄液内投与）され得る。薬学的に許容可能な賦形剤としては、例えば、緩衝剤、等張化剤、分散剤、増粘剤、ゲル化剤、抗酸化剤、保存剤、および無痛化剤が挙げられる。
【００３４】
本発明によれば、ヒトパピローマウイルスに感染したヒト対象において、本発明のａＡＶＣは、抗ウイルス作用を発揮すると期待できる。したがって、本発明の医薬または医薬組成物は、ヒトパピローマウイルスに感染したヒト対象（特に女性）および当該感染により上昇した発がんリスクを有するヒト対象（特に女性）、並びに当該感染により発がんしたヒト対象（特に女性）を処置することに用いることができる。本発明の方法は、ヒトパピローマウイルスに感染したヒト対象（特に女性）および当該感染により上昇した発がんリスクを有するヒト対象（特に女性）、並びに当該感染により発がんしたヒト対象（特に女性）を処置する方法であり得る。また、本発明の医薬または医薬組成物は、ヒトパピローマウイルスに感染したヒト対象において、ヒトパピローマウイルス感染を処置することに用いることができる。
【実施例】
【００３５】
実施例１：ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の各種ウイルスタンパク質を発現した細胞の調製
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の各種ウイルスタンパク質を発現したＨＥＫ２９３株を調製し、α-GalCerを用いてパルスした。
【００３６】
ＨＰＶの各種ウイルスタンパク質として、ＨＰＶ１６型の初期遺伝子Ｅ６およびＥ７によりそれぞれコードされるＥ６およびＥ７タンパク質を用い、加えて、これらの融合タンパク質を設計して用いた。融合タンパク質は、Ｅ６とＥ７とをこの順番で連結させた融合タンパク質（Ｅ６−Ｅ７；配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する）、Ｅ７とＥ６とをこの順番で連結させた融合タンパク質（Ｅ７−Ｅ６；配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する）、Ｅ６とＥ７とＥ６とをこの順番で連結させた融合タンパク質（Ｅ６−Ｅ７−Ｅ６；配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する）、およびＥ７とＥ６とＥ７とをこの順番で連結させた融合タンパク質（Ｅ７−Ｅ６−Ｅ７；配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する）を設計して用いた。
【００３７】
Ｅ６、Ｅ７、および設計した融合タンパク質それぞれをpGEM4Z-hPVベクター（Promega社、Cat#P2161）のHindIII-EcoRI切断部位にクローニングした。クローニングに際しては、各タンパク質をコードする遺伝子の最初のコドンの上流にKozak配列（CCACC）を導入し、その上流にHindIII制限酵素認識部位を導入し、終止コドンの下流にEcoRI制限酵素認識部位を導入して、ベクターに組み込んだ。このようにして、挿入方向は、T7プロモーターにより転写がなされる方向とした。T7プロモーターを用いたインビトロ転写系によって、E6、E7および各種融合タンパク質をコードするｍRNAを調製した。
【００３８】
タンパク質発現細胞としては、CD1dを発現するHEK293細胞またはNIH3T3細胞を用いた（例えば、J Immunol. 2007;178:2853-2861参照）。培地はAIM-Vまたは10%FCS含有RPMI1640を用い、37℃、5％ CO2条件下で培養した。CD1dリガンドであるα-GalCer（500 ng/mL）を培地に添加し、さらに培養を行うことによって、細胞にα-GalCerをパルスした。培地を交換し、インビトロ転写系によって得られたｍRNAをHEK293細胞またはNIH3T3細胞にエレクトロポレーション法によって導入した。E6およびE7に関しては、導入４時間後、８時間後、および１６時間後に、細胞を回収して、E6、およびE7タンパク質の発現量をウェスタンブロット法によって確認した。結果は、図１のパネルAおよびBに示される通りであった。
【００３９】
図１のパネルAおよびBに示されるように、HEK293細胞におけるHPVのE6タンパク質およびE7タンパクの質がそれぞれ確認された。得られたHEK293細胞のCD1dの発現をPE-conjugated抗CD1d抗体をFACS Cariburを用いてフローサイトメトリー法により確認した。結果は、図1のパネルCおよびDに示される通りであった。いずれのHEK293細胞においてもCD1dの発現が確認された。
【００４０】
実施例２：CD1dリガンドでパルスしたCD1dとE6またはE7とを発現する細胞の免疫応答
図２のパネルAに示されるように、マウスに対して実施例１で得られた細胞を静脈内投与し、３日後に当該マウス体内における免疫応答を調べた。
【００４１】
実施例１と同様に、α-GalCerをパルスした、CD1dを発現する細胞にE6またはE7をコードするmRNAを導入し、導入４〜１２時間後の細胞を回収した。得られた細胞（５×１０5細胞）をマウス(C57BLZ6、6〜8週、雌）に尾静脈より静脈内投与した。投与3日後にマウスから脾臓を単離して、セルストレイナーで濾し、さらに赤血球をACK lysing bufferで溶血し、5%FCS含有RPMIで脾細胞を調製した。抗CD19抗体およびCD1d-dimer/Galを用いて脾細胞を染色し、フローサイトメトリーにより分析した。（結果は、図２のパネルBに示される通りであった。
【００４２】
図２のパネルBに示されるように、細胞投与群においてCD19陰性CD1d-dimer/Gal陽性のNKT細胞群の増加が認められた。このことから、投与した細胞は、NKT細胞の賦活化能を有することが明らかとなった。
【００４３】
実施例３：肺転移モデル動物を用いた抗腫瘍効果の検討
本実施例では、実施例２で調製した細胞を肺転移モデル動物に移植して、その抗腫瘍効果を検討した。
【００４４】
（肺転移モデル動物の作製、評価）
Ｂ１６メラノーマ細胞をＰＢＳで３×１０5／２００μｌに調製し、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６，６〜８週，雌）に尾静脈より静脈内投与した。これに対して、メラノーマ細胞の投与後３〜６時間後に実施例２で調製した細胞を静脈内投与した。対照群としては、PBSを投与した。投与群１には、実施例２に準じてNIH3T3細胞を用いて調製したE6発現細胞を投与した。投与群２には、実施例２で調製したE7発現細胞を投与した。２週間後にマウスから肺を取り出し、Ｂ１６の肺転移を観察した。結果は、図３に示される通りであった。
【００４５】
図３に示されるように、対照群では、メラノーマ細胞の肺転移が強く観察され、肺全体がメラノーマ細胞により黒色を呈するのに対して、投与群１（E6発現細胞投与群）および投与群２（E7発現細胞投与群）では、メラノーマ細胞に起因する黒色がほとんど認められなかった。このことから、実施例で作製したE6発現細胞およびE7発現細胞はそれぞれ、抗腫瘍効果を有することが明らかとなった。実施例２および３の結果から、E6を発現する、α-GalCerでパルスしたCD1d発現細胞は、NKT細胞をインビボで活性化し、自然免疫を活性化すると共に、抗腫瘍効果を奏することが明らかとなった。
【００４６】
実施例４：E6とE7との融合タンパク質の調製
本発明では、E6とE7との融合タンパク質を調整し、HEK293細胞において発現させた。融合タンパク質は、実施例1に記載された通りにmRNAとして細胞に導入した。導入4時間後に細胞を回収し、細胞溶解物を得て、ウェスタンブロット法によってタンパク質の発現量を確認した。抗体は、図４では、抗E6抗体を用い、図５では、抗E7抗体を用いた。図１と同様に、ウェスタンブロット法で各々のタンパクを検出し、画像としてコンピュータに取り込み、画像解析ソフトImage Reader LAS-1000 proを用いて分析した。発現量は、指定された量のE6標品またはE7標品のバンドの濃さから検量線を作製し、評価したい各バンドの濃さを評価することによって求めた。結果は、各々の単独発現細胞の発現量を１とし、それに対する比として図４および５に示した。
図４および５において、＃１〜＃６は以下細胞の溶解物に対応する。
＃１：E6発現HEK293細胞
＃２：E7発現HEK293細胞
＃３：E6-E7発現HEK293細胞
＃４：E6-E7-E6発現HEK293細胞
＃５：E7-E6-E7発現HEK293細胞
＃６：E7-E6発現HEK293細胞
【００４７】
図４に示されるように、E6-E7融合タンパク質は、E6タンパク質の半分程度のE6発現効率を示したが、E7-E6-E7融合タンパク質は、E6と同等のE6発現効率を示した。
【００４８】
図５に示されるように、E6-E7融合タンパク質およびE6-E7-E6融合タンパク質は、E7タンパク質の5分の1から4分の1のE7発現効率を示したのに対して、E7-E6-E7融合タンパク質は、その倍以上のE7発現効率を示した。
【００４９】
実施例５：E6とE7との融合タンパク質の抗腫瘍効果
実施例３と同様の方法を用いて、Ｂ１６メラノーマ細胞（３×１０5細胞）を移植することによって作製した肺転移モデル動物（ｎ＝５）に実施例４で調製したE7-E6-E7発現HEK293細胞（５×１０5細胞）を移植して、その抗腫瘍効果を検討した。結果は図６に示される通りであった。図６に示されるように、対照群では、メラノーマ細胞の肺転移が強く観察され、肺全体がメラノーマ細胞により黒色を呈するのに対して、E7-E6-E7投与群では、メラノーマ細胞に起因する黒色がほとんど認められなかった。このことから、実施例で作製したE7-E6-E7発現細胞は、自然免疫系を賦活化して抗腫瘍効果を発揮することができることが明らかとなった。
【００５０】
実施例６：ａＡＶＣによるキラーＴ細胞の活性化
マウスに実施例４で調製したE7-E6-E7発現HEK293細胞（５×１０5細胞；aAVC-E7-6-7）を投与し、７日後に脾臓からCD8単独陽性T細胞（５×１０5細胞）を取りだし、当該細胞をE6又はE7ペプチドを添加した樹状細胞（１×１０5細胞）で２４時間刺激した際の細胞からのIFN-γ産生CD8T細胞数(スポット数)をELISPOTアッセイを用いて調べた。このIFN-γの産生は、通常キラーT細胞の殺傷効果機能と相関するとされ、このサイトカン産生測定が広く用いられている。結果は図７に示される通りであった。図７に示されるように、E7-E6-E7投与群では、E6特異的およびE7特異的に反応し、IFN-γを産生するCD8T細胞が検出された。このことから、E7-E6-E7を発現するaAVCは、E6及びE7特異的キラーT細胞を誘導することが明らかとなった。
【００５１】
以上から、E7-E6-E7融合タンパク質は、E6とE7とを融合させて発現させるのに適した融合タンパク質であることが明らかとなった。また、E7-E6-E7発現細胞は、自然免疫系を賦活化して抗腫瘍効果を発揮することができることに加えて、E6特異的およびE7特異的に反応し、IFN-γを産生するCD8T細胞が誘導されることも明らかとなった。このことから、E7-E6-E7発現細胞は、自然免疫系を賦活化すると共に、E6特異的およびE7特異的に反応し、IFN-γを産生するCD8T細胞が誘導し、これによって抗腫瘍効果を発揮すると考えられる。なお、aAVCにおいて、E7-E6-E7融合タンパク質を発現させると、細胞内でE6とE7が分解されてE6およびE7にそれぞれ由来する小さな部分ペプチドが生じる。従って、E7-E6-E7融合タンパク質を発現するaAVCは、E6を発現するaAVCやE7を発現するaAVCと同様に抗腫瘍効果を発揮すると分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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