(57)【要約】      （修正有）【課題】フコース結合性タンパク質を発現可能な大腸菌を培養して当該タンパク質を製造する方法において、当該タンパク質の効率的な製造方法の提供。【解決手段】フコース結合性タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換して得られた大腸菌を培養する際に大腸菌の増殖状態を適宜計測し、その増殖速度に合わせて炭素源および窒素源を特定の割合で少量ずつ供給することで大腸菌を高密度で培養でき、当該タンパク質を大量に発現させることが可能となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フコース結合性タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換して得られた大腸菌を使用してフコース結合性タンパク質を製造する方法であって、以下の（１）から（５）の工程を含むことを特徴とする、フコース結合性タンパク質の製造方法。
（１）培養槽に炭素源と窒素源を含む培地を添加し、フコース結合性タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換して得られた大腸菌を植菌し、培養液中の炭素源濃度が５．０ｇ／Ｌ以下になるまで、培養液中の溶存酸素濃度を１．０ｍｇ／Ｌ以上に維持しながら攪拌培養する工程。
（２）培養液中の炭素源濃度が５．０ｇ／Ｌ以下となった任意の時点で、供給する窒素源の重量を、供給する炭素源の重量に対して０．１５倍以上２．００倍未満の範囲に維持しながら、培養液への炭素源と窒素源の流加を開始し、培養液中の大腸菌の密度（ＯＤ６００、６００ｎｍにおける培養液の濁度）が６０以上となるまで攪拌培養する工程。
（３）工程（２）の培養液中の大腸菌の密度（ＯＤ６００ｎｍ、６００ｎｍにおける培養液の濁度）が６０以上となった任意の時点で、誘導剤をその添加後の濃度が０．００５ｍＭ以上５．０ｍＭ以下となるように培養液に添加する工程。
（４）工程（３）で誘導剤を培養液に添加したのち、培養液への炭素源と窒素源の供給と撹拌培養を継続し、培養液中の大腸菌の密度が９０以上１８０以下となった任意の時点で培養を停止する工程。
（５）工程（１）から工程（４）までの大腸菌の培養で得られた培養物からフコース結合性タンパク質を回収する工程。
【請求項２】
前記工程（２）から工程（４）において、培養液中の溶存酸素濃度を０．０１ｍｇ／Ｌから５．０ｍｇ／Ｌの範囲に維持しながら炭素源と窒素源を流加する、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記工程（２）から工程（４）において、培養液中の炭素源濃度を５．０ｇ／Ｌ以下に維持しながら炭素源と窒素源を流加する、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
炭素源がグルコースであり、窒素源が酵母エキスである、請求項１から３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
誘導剤がイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドである、請求項１から４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
フコース結合性タンパク質が以下の（ａ）〜（ｄ）である、請求項１から５のいずれかに記載の製造方法：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列を含むフコース結合性タンパク質であって、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質。
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むフコース結合性タンパク質であって、かつ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有し、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質。
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列において、以下の（１）から（３）に記載のアミノ酸置換のいずれか１つ以上を含むアミノ酸配列を含み、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基の、ロイシン残基への置換
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の７２番目のシステイン残基の、グリシン残基およびアラニン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６５番目のグルタミン残基の、ロイシン残基への置換
（ｄ）前記（ｃ）のフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列において、配列番号１の３９番目、６５番目および７２番目以外の領域に１個若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有する、フコース結合性タンパク質。
【請求項７】
フコース結合性タンパク質が以下の（ｅ）〜（ｈ）である、請求項１から５のいずれかに記載の製造方法：
（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列に対し、さらにＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドが付加され、かつＣ末端にシステインを含むオリゴペプチドが付加されたアミノ酸配列からなり、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質。
（ｆ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列に対し、さらにＮ末端にポリヒスチジン配列が付加され、かつＣ末端にシステインを含むオリゴペプチドが付加されたアミノ酸配列からなり、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有し、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質。
（ｇ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列に対し、さらにＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドが付加され、かつＣ末端にシステインを含むオリゴペプチドが付加されたアミノ酸配列において、以下の（４）から（６）に記載のアミノ酸置換のいずれか１つ以上を含むアミノ酸配列を含み、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質
（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基の、ロイシン残基への置換
（５）配列番号１で示されるアミノ酸配列の７２番目のシステイン残基の、グリシン残基およびアラニン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換
（６）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６５番目のグルタミン残基の、ロイシン残基への置換
（ｈ）前記（ｇ）のフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列において、配列番号１の３９番目、６５番目および７２番目以外の領域に１個若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列に対し、さらにＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドが付加され、かつＣ末端にシステインを含むオリゴペプチドが付加されたアミノ酸配列からなり、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有する、フコース結合性タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フコース結合性タンパク質を発現可能な大腸菌を効率よく培養することによる、該タンパク質の効率的な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、糖鎖の機能解析に関する研究が進展するに伴い、糖鎖が糖タンパク質などの生体分子の機能や細胞の分化や認識に重要な役割を果たしていることが明らかになってきている。糖鎖の中でもフコース含有糖鎖は生理機能と関連するものが多く、例えば、特許文献１には、ヒトｉＰＳ細胞表面の未分化糖鎖マーカーとされるＨタイプ１型糖鎖（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）およびＨタイプ３型糖鎖（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ）に結合性を有するレクチンを利用した未分化細胞の検出方法が開示されている。前記Ｈタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に結合性を有するレクチンはグラム陰性細菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）が産生するＢＣ２Ｌ−ＣレクチンのＮ末端ドメインに由来する組換えＢＣ２ＬＣＮであり、この組換えＢＣ２ＬＣＮは前記Ｈタイプ１型糖鎖やＨタイプ３型糖鎖以外に、ルイスＹ型糖鎖（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ）やルイスＸ型糖鎖（Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ）等の複数種のフコース含有糖鎖に高い結合性を有することが知られている（非特許文献１）。
【０００３】
一方、特定の機能を有するタンパク質を安価に製造することを目的に、該タンパク質を発現可能な遺伝子組換え微生物を利用した製造方法がこれまで検討されており（特許文献２）、例えば、遺伝子組換え大腸菌を用いたＦｃ結合性タンパク質の製造方法などが報告されている（特許文献３）。大腸菌や酵母といった微生物の工業的な培養では、必要な栄養源を一度に投入してから培養を行なう回分培養法と比較し、培養中に培地成分を連続的に供給しながら培養する流加培養法の方が、微生物またはその生産物を高い収率で与えることが知られている（以下、培養中に培地成分を連続的に供給することを流加と呼ぶ）。流加培養法は供給する栄養源の濃度を任意に制御ができる利点があるため、高濃度の基質により微生物の増殖や目的物の生産が阻害される場合や、アルコールや有機酸などの副生成物が産生される場合に特に効果的である。副生成物の産生は微生物の増殖を抑制するだけでなく、目的物の品質を低下させたり精製を困難にさせたりするため好ましくない。
【０００４】
流加の対象となる培地成分としては消費量の多い糖類といった炭素源が挙げられる。しかしながら、炭素源の消費速度は微生物の生育状態によって一定ではないため、培養中、炭素源の濃度を一定に維持するためには、微生物による炭素源消費速度を何らかの方法でモニターしつつ、流加量を制御する必要がある。炭素源の消費速度をモニターするための方法として、例えば、オンライングルコース分析計によりグルコース濃度を測定して制御する方法、酸素消費量を指標として炭素源を流加する方法、排ガス組成の分析による方法である呼吸商を指標として流加を行なう方法、オンラインレーザー濁度計により菌体量をモニターする方法、ｐＨ変化を利用する方法、培養液中の溶存酸素濃度の変化によって炭素源の枯渇を検出して炭素源を供給する方法などが開示されている。これらの中で、培養液中の溶存酸素濃度の変化を検出して炭素源を供給する方法は、培地中の炭素源を極めて低濃度に制御することができる利点がある。
【０００５】
大腸菌を効率よく培養するには、培地に炭素源の他に窒素源を含む必要があり、両者の比率が適切であることが重要である。また、流加培養法により大腸菌を培養する場合は、炭素源と窒素源の両方を流加することが必要となる。遺伝子組換え大腸菌を培養して目的物を生産する際、複数の培地成分を流加して培養することの効果や、流加の制御方法については、ヒトプロインスリンを発現可能な大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）株を用いたヒトプロインスリン生産系で開示されている（非特許文献２）。非特許文献２では、炭素源と窒素源（酵母エキス）を混合した溶液を培地に流加してヒトプロインスリン（分子量約１０，０００）を発現可能な大腸菌を培養することで、ヒトプロインスリンを製造する際、前記培地に流加する炭素源と窒素源（酵母エキス）の好ましい濃度について検討している。
【０００６】
一方、前記組換えＢＣ２ＬＣＮは分子量が約１７，０００のタンパク質であり、会合して三量体を形成すると考えられており、分子量および立体構造の面からもヒトプロインスリンとは大きく異なる。よって、非特許文献２で培地に流加する炭素源と窒素源の好ましい濃度について開示があったとしても、この条件を組換えＢＣ２ＬＣＮに適用することは困難である。さらに、遺伝子組換え微生物を用いた組換えＢＣ２ＬＣＮの高効率な発現系は報告例がなく、安定供給および大量供給の観点から、生産性に課題が残されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２０１３／０６５３０２号公報
【特許文献２】特表２０００−５０１９３６号公報
【特許文献３】特開２００８−２４５５８０号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｕｌａｋ，Ｏ等，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１８（１），５９−７２，２０１０．
【非特許文献２】Ｃｈｕｌ  Ｓｏｏ  Ｓｈｉｎ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１３，２４９−２５７，１９９７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、フコース結合性タンパク質を発現可能な大腸菌を効率的に培養することにより、生産性に優れた該タンパク質の製造方法を提供することにある。具体的には、フコース結合性タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換して得られた大腸菌を培養する際に、大腸菌の増殖をモニターし、その増殖速度に合わせて炭素源および窒素源を特定の割合で少量ずつ供給することで大腸菌を高密度で培養し、当該タンパク質を大量に発現させる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは前記課題に対し、流加培養法における溶存酸素濃度を制御するための撹拌条件、および炭素源と窒素源との流加方法について鋭意検討した結果、本発明の完成に至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の第一から第七の発明を包含する：
第一の発明は、フコース結合性タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換して得られた大腸菌を使用してフコース結合性タンパク質を製造する方法であって、以下の（１）から（５）の工程を含むことを特徴とする、フコース結合性タンパク質の製造方法である。
（１）培養槽に炭素源と窒素源を含む培地を添加し、フコース結合性タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換して得られた大腸菌を植菌し、培養液中の炭素源濃度が５．０ｇ／Ｌ以下になるまで、培養液中の溶存酸素濃度を１．０ｍｇ／Ｌ以上に維持しながら攪拌培養する工程。
（２）培養液中の炭素源濃度が５．０ｇ／Ｌ以下となった任意の時点で、供給する窒素源の重量を、供給する炭素源の重量に対して０．１５倍以上２．００倍未満の範囲に維持しながら、培養液への炭素源と窒素源の供給（流加）を開始し、培養液中の大腸菌の密度（ＯＤ６００、６００ｎｍにおける培養液の濁度）が６０以上となるまで攪拌培養する工程。
（３）工程（２）の培養液中の大腸菌の密度（ＯＤ６００ｎｍ、６００ｎｍにおける培養液の濁度）が６０以上となった任意の時点で、誘導剤をその添加後の濃度が０．００５ｍＭ以上５．０ｍＭ以下となるように培養液に添加する工程。
（４）工程（３）で誘導剤を培養液に添加したのち、培養液への炭素源と窒素源の供給（流加）と撹拌培養を継続し、培養液中の大腸菌の密度が９０以上１８０以下となった任意の時点で培養を停止する工程。
（５）工程（１）から工程（４）までの大腸菌の培養で得られた培養物からフコース結合性タンパク質を回収する工程。
第二の発明は、前記工程（２）から工程（４）において、培養液中の溶存酸素濃度を０．０１ｍｇ／Ｌから５．０ｍｇ／Ｌの範囲に維持しながら炭素源と窒素源を供給（流加）する、第一の発明に記載の製造方法である。
第三の発明は、前記工程（２）から工程（４）において、培養液中の炭素源濃度を５．０ｇ／Ｌ以下に維持しながら炭素源と窒素源を供給（流加）する、第一または第二の発明に記載の製造方法である。
第四の発明は、炭素源がグルコースであり、窒素源が酵母エキスである、第一から第三のいずれかに記載の製造方法である。
第五の発明は、誘導剤がイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドである、第一から第四のいずれかに記載の製造方法である。
第六の発明は、フコース結合性タンパク質が以下の（ａ）〜（ｄ）である、第一から第五のいずれかに記載の製造方法である。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列を含むフコース結合性タンパク質であって、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質。
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むフコース結合性タンパク質であって、かつ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有し、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質。
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列において、以下の（１）から（３）に記載のアミノ酸置換のいずれか１つ以上を含むアミノ酸配列を含み、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基の、ロイシン残基への置換
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６５番目のグルタミン残基の、ロイシン残基への置換
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列の７２番目のシステイン残基の、グリシン残基およびアラニン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換
（ｄ）前記（ｃ）のフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列において、配列番号１の３９番目、６５番目および７２番目以外の領域に１個若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有する、フコース結合性タンパク質。
第七の発明は、フコース結合性タンパク質が以下の（ｅ）〜（ｈ）である、第一から第五のいずれかに記載の製造方法である。
（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列に対し、さらにＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドが付加され、かつＣ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドが付加されたアミノ酸配列からなり、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質。
（ｆ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列に対し、さらにＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドが付加され、かつＣ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドが付加されたアミノ酸配列からなり、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有し、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質。
（ｇ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列に対し、さらにＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドが付加され、かつＣ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドが付加されたアミノ酸配列において、以下の（４）から（６）に記載のアミノ酸置換のいずれか１つ以上を含むアミノ酸配列を含み、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質
（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基の、ロイシン残基への置換
（５）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６５番目のグルタミン残基の、ロイシン残基への置換
（６）配列番号１で示されるアミノ酸配列の７２番目のシステイン残基の、グリシン残基およびアラニン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換
（ｈ）前記（ｄ）および／または（ｅ）のフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列において、配列番号１の３９番目、６５番目および７２番目以外の領域に１個若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列に対し、さらにＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドが付加され、かつＣ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドが付加されたアミノ酸配列からなり、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有する、フコース結合性タンパク質。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明のフコース結合性タンパク質の製造方法（以下、本発明の製造方法とする。）は下記工程（１）から（５）を含む製造方法である。
【００１４】
本発明の製造方法の工程（１）は、培養槽に培地を添加したのち、フコース結合性タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換して得られた大腸菌を植菌し、培養液中の炭素源濃度が５．０ｇ／Ｌ以下になるまで、培養液中の溶存酸素濃度を２．０ｍｇ／Ｌ以上に維持しながら攪拌培養する工程である。
【００１５】
本発明の製造方法に使用する培養槽の大きさや形状に特に制限はなく、フコース結合性タンパク質の製造量に応じて適宜選択すればよい。また、撹拌培養の方法も特に制限はなく、例えば、培養槽全体を回転或いは振とうさせて培養液を撹拌する方法、底部に回転羽根を有する培養槽を用いて培養液を撹拌する方法、撹拌翼を用いて培養液を撹拌する方法を挙げることができる。これらの中では、培養装置全体の小型化が可能である点、撹拌効率が高い点、培養する大腸菌への物理的ダメージを低減できる点で、撹拌翼を用いて培養液を撹拌する方法が好ましい。撹拌翼を用いて培養液を撹拌する場合、撹拌翼の直径や形状にも特に制限はなく、培養槽の大きさや培養液の撹拌効率を考慮して適宜選択すればよい。
【００１６】
本発明の製造方法に使用することができる培地に特に制限はなく、例えば、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地や、必要な栄養源を補ったＬｙｓｏｇｅｎｙ  Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）培地などを挙げることができる。また、培地には炭素源、窒素源および無機塩のほかに、当該技術分野において一般的な栄養源を添加してもよい。培養中に供給（流加）する炭素源の一例として、グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、粗糖、糖蜜、グリセリンなどが挙げられる。また、炭素源とあわせて供給（流加）する窒素源としては、酵母エキス、ポリペプトン、カゼインおよびそれらの酵素消化物、コーンスティープリカー、大豆タンパク質、肉エキス、魚肉エキスなどを挙げることができる。これらの炭素源および窒素源の中では、形質転換体の増殖が良好であり、さらに、フコース結合性タンパク質を効率よく製造できる点で、炭素源はグルコースやグリセリンが好ましく、窒素源は酵母エキスが好ましい。
【００１７】
本発明の製造方法における培養温度は、当該技術分野において一般的な温度であれば特に制限はなく、１０℃から４０℃、好ましくは２０℃から３７℃であり、フコース結合性タンパク質の生産性を勘案しつつ、適宜選択すればよい。また、培地のｐＨは当該技術分野において一般的な範囲の中から適宜選択すればよく、例えば宿主が大腸菌の場合、好ましくはｐＨ６．８からｐＨ７．４の範囲が好ましく、より好ましくはｐＨ７．０前後である。また、本発明の製造方法における培養時間は任意に設定できるが、通常は数時間から１００時間の間に設定される。培養時間が長くなると宿主の細胞の活動が弱まり、やがて細胞死による溶菌につながり、目的のフコース結合性タンパク質の構造が変化する恐れがあるため、工程（１）から工程（４）までの培養時間は好ましくは７２時間以内、さらに好ましくは６０時間以内が好適である。
【００１８】
本発明の製造方法では、フコース結合性タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターの導入の有無により、前記形質転換により得られた大腸菌を選択的に増殖させるために、培地に当該発現ベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を添加することが好ましく、例えば、当該ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合には、培地にカナマイシンを添加すればよい。さらに、前記形質転換により得られた大腸菌から培養液へのタンパク質の分泌を促すため、グリシンなどの試薬を培地に添加してもよく、具体的には、宿主が大腸菌の場合、培地に対してグリシンを２％（ｗ／ｖ）以下で添加することが好ましい。この他に培地成分に添加することができる成分として、無機塩としてはリン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウムなどのリン酸塩や塩化カリウム、塩化ナトリウムなどを、金属イオンとしては、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩＩ）、塩化鉄（ＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム・二水和物、硫酸カルシウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化銅、硫酸マンガン、塩化マンガンなどを、ビタミン類としては、ビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシンなどを挙げることができる。
【００１９】
工程（１）における炭素源の濃度は、大腸菌の増殖速度や炭素源の種類に応じて適宜設定すればよいが、炭素源がグルコースの場合は１０ｇ／Ｌから５０ｇ／Ｌであることが好ましい。また、工程（１）における窒素源の濃度も大腸菌の増殖速度や窒素源の種類に応じて適宜設定すればよいが、炭素源が酵母エキスの場合は１０ｇ／Ｌから５０ｇ／Ｌであることが好ましい。
【００２０】
本発明の製造方法の工程（１）では、培養液中の溶存酸素（以下、ＤＯと省略する場合がある。）濃度を計測し、培養液中の炭素源濃度が５．０ｇ／Ｌ以下になるまで、培養液中のＤＯ濃度が１．０ｍｇ／Ｌ以上に維持しながら攪拌培養する。工程（１）では、大腸菌の増殖により炭素源濃度は低下するが、増殖した大腸菌の呼吸によりＤＯ濃度が低下するため、大腸菌を高密度に増殖させる点で、培養液中のＤＯ濃度が１．０ｍｇ／Ｌ以上となるように培養液の撹拌速度の制御を続けて大腸菌を培養する。培養液中のＤＯ濃度が１．０ｍｇ／Ｌ以下になると、増殖した大腸菌が死滅する恐れがある。本発明の製造方法において、ＤＯ濃度の測定方法に特に制限はなく、例えば、ＤＯ電極を使用して測定することができる。また、本発明の製造方法において、培養液中の炭素源の濃度を計測する方法は特に制限はなく、例えば炭素源がグルコースの場合、グルコース分析計を用いてグルコース濃度を測定することができる。
【００２１】
本発明の製造方法の工程（２）は、前記工程（１）における培養液中の炭素源濃度が５．０ｇ／Ｌ以下になった任意の時点で、供給する窒素源となる物質の重量を供給する炭素源となる物質の重量に対して０．１５倍以上２．００倍未満の範囲に維持しながら、培養液への炭素源と窒素源の連続的な供給（以下、培養中に培地成分を連続的に供給することを流加と呼ぶことがある。）を開始し、培養液中の大腸菌の細胞密度（ＯＤ６００ｎｍ、６００ｎｍにおける培養液の濁度）が６０以上となるまで攪拌培養する工程である。工程（２）では、炭素源濃度が５．０ｇ／Ｌを超えた状態で培養を行なうと有機酸が副生して多量に蓄積することにより、大腸菌の増殖やタンパク質生産を阻害する恐れがある。従って、炭素源濃度が５．０ｇ／Ｌ以下になった時点で培養液への炭素源と窒素源の流加を開始し、炭素源と窒素源の流加開始後は、炭素源濃度が５ｇ／Ｌ以下、好ましくは１ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは０．５ｇ／Ｌ以下、最も好ましくは０．１ｇ／Ｌ以下となるよう、炭素源の供給量を制御することが好ましい。また、培養液中の炭素源の枯渇を防ぎ、大腸菌を高密度に増殖させる点で、ＤＯ濃度が０．０１ｍｇ／Ｌから５．０ｍｇ／Ｌの範囲、好ましくは０．０５ｍｇ／Ｌから４．０ｍｇ／Ｌの範囲に維持されるように、炭素源と窒素源の流加量を制御することが好ましい。炭素源の流加量は、例えば炭素源を供給する原料タンクの減少量、または供給ポンプの駆動時間から把握することができる。
【００２２】
培養液中の炭素源の枯渇を計測する方法に特に制限はなく、例えば、大腸菌の呼吸活性の低下により計測することができる。呼吸活性の低下は、例えば培養液のＤＯ濃度の上昇、排ガス中の酸素濃度の上昇、炭酸ガス濃度の低下、ｐＨの上昇として現れる。特に、ＤＯ濃度の上昇は応答が速く、培養液中の炭素源の濃度が十分に維持されている場合には、微生物の呼吸により酸素が消費されるためＤＯ濃度は酸素飽和濃度より低い値に維持されるが、炭素源が枯渇すると微生物の呼吸活性が低下しＤＯ濃度が急激に上昇するため、培養液中の炭素源の枯渇をモニターするのに好ましい指標である。なお、ＤＯ濃度の上昇に連動させて培養液に炭素源を追加する方法をＤＯスタット法という。ＤＯ濃度以外の指標（排ガス組成、炭酸ガス濃度、ｐＨ上昇）でモニターした場合は、ＤＯ濃度を指標とした場合と比較し応答が遅いという欠点がある。
【００２３】
本発明の製造方法における窒素源の流加量は、炭素源流加量と一定の比率を保ちながら流加することが好ましい。窒素源の供給が少ないと大腸菌の増殖が遅く、発現するフコース結合性タンパク質の生産量が低下する。一方で窒素源の供給が多すぎると大腸菌の増殖を阻害することから、流加の際の窒素源供給量（窒素源となる物質の重量）は炭素源供給量（炭素源となる物質の重量）の０．１５倍以上２．００倍未満に設定すればよく、好ましくは０．２０倍以上１．５０倍未満、より好ましくは０．２５倍以上１．００倍未満である。また、流加成分の炭素源がグルコースまたはグリセリンで、窒素源が酵母エキスの場合は、調製した炭素源溶液および窒素源溶液をオートクレーブ（例えば、１２１℃、２０分間）やフィルターろ過により滅菌したのち、クリーンベンチ内で混合した培地を流加することで、培地供給時の炭素源と窒素源の比率を一定に保つことができる。また、培養液の液量増加が抑えられる点で、流加する炭素源と窒素源は高濃度の溶液とすることが好ましく、炭素源をグルコース、窒素源を酵母エキスとした場合、流加するグルコース溶液の濃度は３００ｇ／Ｌから９００ｇ／Ｌ、酵母エキス溶液の濃度は１００ｇ／Ｌから５００ｇ／Ｌに設定することが好ましい。
【００２４】
本発明の製造方法の工程（３）は、工程（２）における培養液への炭素源と窒素源の流加開始後も培養液中のＤＯ濃度の計測と培養液への炭素源と窒素源の流加を継続し、培養液中の大腸菌の密度（ＯＤ６００ｎｍ、６００ｎｍにおける培養液の濁度）が６０以上となった任意の時点で、誘導剤をその添加後の濃度が０．００５ｍＭ以上５．０ｍＭ以下となるように培養液に添加する工程である。
【００２５】
本発明の製造方法で製造されるフコース結合性タンパク質を発現可能な大腸菌の作製に使用した発現ベクターに誘導性のプロモータが含まれているため、工程（３）では、前記タンパク質が効率的に発現できるような条件下で誘導剤を添加して、フコース結合性タンパク質の発現を誘導する。本発明の製造方法で使用することができる誘導剤に特に制限はないが、フコース結合性タンパク質を効率的に発現できる点で、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧとする。）であることが好ましい。ＩＰＴＧ添加濃度は、添加後の濃度が０．００５ｍＭから５．０ｍＭの範囲から適宜選択すればよく、好ましくは０．０１ｍＭから２．０ｍＭである。ＩＰＴＧの添加によるフコース結合性タンパク質の発現誘導に関する種々の条件は、当該技術分野において周知の条件で行えばよく、例えば、培養液のＯＤ６００ｎｍが６０以上となった任意の時点で、ＩＰＴＧをその添加後の濃度が２．０ｍＭ以下の濃度となるよう培養液に添加し、引き続き培養することにより、フコース結合性タンパク質発現を誘導することができる。なお、ＩＰＴＧを添加して誘導を開始した後の培養液の温度は、１０℃から３０℃、好ましくは１５℃から２５℃、より好ましくは２０℃前後とすることで大腸菌の増殖が抑えられ、より効率的にタンパク質の発現が促される。
【００２６】
本発明の製造方法の工程（４）は、前記工程（３）で誘導剤を培養液に添加したのち、工程（２）の条件で培養液への炭素源と窒素源の供給（流加）と撹拌培養を継続し、培養液中の大腸菌の細胞密度が９０以上１８０以下となった任意の時点で培養を停止する工程である。工程（４）において、大腸菌培養の終了は培養液のＯＤ６００ｎｍで判断すればよく、具体的には、ＯＤ６００ｎｍが９０以上１８０以下となった範囲の任意の時点で培養を終了すればよい。培養液のＯＤ６００ｎｍが９０以下の場合は大腸菌の増殖が不十分であり、目的のフコース結合性タンパク質の収量が低下する恐れがある。また、培養液のＯＤ６００ｎｍが１８０以上の場合は、大腸菌の増殖が過剰となるため、大腸菌の溶菌により目的のフコース結合性タンパク質の加水分解する恐れや、立体構造の変化によりフコースを含む糖鎖への結合性が低下する恐れがある。
【００２７】
本発明の製造方法の工程（５）は、前記工程（１）から（４）までの大腸菌の培養で得られた培養物からフコース結合性タンパク質を回収する工程である。本明細書において、培養物とは、培養された形質転換体の大腸菌自体や大腸菌分泌物のほか、培養に用いた培地等も含まれる。工程（５）において、得られた培養物からフコース結合性タンパク質を回収するには、フコース結合性タンパク質の発現形態に応じて当業者が通常用いる回収方法を適宜選択すればよい。すなわち、フコース結合性タンパク質が大腸菌内に発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集めたのち、酵素処理剤や界面活性剤などを添加することにより菌体を破砕し、フコース結合性タンパク質を可溶性画分として回収すればよい。一方、フコース結合性タンパク質が培養液中に分泌される場合は、菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清からフコース結合性タンパク質を回収すればよい。
【００２８】
前記方法により回収されたフコース結合性タンパク質の純度を向上させたい場合には、当該技術分野において公知の方法を用いればよく、一例として、液体クロマトグラフィーを用いた分離精製法を挙げることができる。液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を使用することが好ましく、これらのクロマトグラフィーを組み合わせて行なうことがより好ましい。また、前記クロマトグラフィーにより精製した本発明の改良型フコース結合性タンパク質の純度および分子量は当該技術分野において公知の方法を用いて調べればよく、一例として、Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法やゲルろ過クロマトグラフィー法を挙げることができる。
【００２９】
本発明の製造方法におけるフコース結合性タンパク質とは、Ｈタイプ１型糖鎖（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）、Ｈタイプ３型糖鎖（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ）、ルイスＹ型糖鎖（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ）、ルイスｂ型糖鎖（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ）等のフコース含有糖鎖への結合親和性を有するタンパク質である。具体的には、（ａ）：配列番号１で示される組換えＢＣ２ＬＣＮのアミノ酸配列（ＧｅｎＰｅｐｔに登録番号ＷＰ＿００６４９０８２８として登録されているアミノ酸配列の２番目から１５６番目までのアミノ酸配列と一致する。）のうち１番目のプロリンからＸ番目のアミノ酸までのアミノ酸配列を含むタンパク質であって、Ｘが１２０以上の整数であるタンパク質、または（ｂ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリンからＸ番目のアミノ酸までのアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｈタイプ１型糖鎖および／またはＨタイプ３型糖鎖への結合親和性を有し、Ｘが１２０以上の整数であるタンパク質を、大腸菌の形質転換体で組換えタンパク質として発現させたものである。本発明の製造方法におけるフコース結合性タンパク質は、前記フコース含有糖鎖、特にＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有している限り、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリンからＸ番目のアミノ酸までのアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加してもよく、例えば１５個以下、好ましくは１０個以下のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加してもよい。また、Ｘは１２０以上１５５以下であってよく、１２５以上１５５以下であってよい。
【００３０】
また、本発明の製造方法におけるフコース結合性タンパク質は、熱に対する安定性を向上させる点で、（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基のロイシン残基への置換、（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の７２番目のシステイン残基のグリシン残基およびアラニン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換、（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６５番目のグルタミン残基の、ロイシン残基への置換、のいずれか１つ以上を含んでいてもよい。前記（１）から（３）に記載のアミノ酸置換を行うことにより、熱に対する安定性を向上させることができる。前記（１）から（３）に記載のアミノ酸置換は、単独であっても複数を組み合わせても熱に対する安定性の向上に効果があるが、熱に対する安定性をさらに向上させることができる点で、前記（１）から（３）に記載のアミノ酸置換を複数組合せることがより好ましい。さらに、本発明の製造方法におけるフコース結合性タンパク質は、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合性を有している限り、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリンからＸ番目のアミノ酸までのアミノ酸配列において、前記（１）から（３）の置換により置換された位置以外の領域に１個若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは挿入してもよく、例えば１５個以下、好ましくは１０個以下のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは挿入してもよい。
【００３１】
本発明の製造方法におけるフコース結合性タンパク質は、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有している限り、そのＮ末端側および／またはＣ末端側に、夾雑物質存在下の溶液から分離する際に有用な付加的なアミノ酸配列を有していてもよい。前記付加的なアミノ酸配列としては、ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼや、マルトース結合タンパク質、セルロース結合性ドメイン、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等が挙げられる。これらの付加的なアミノ酸配列の中では、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる精製が容易に行える点で、ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドであることが好ましい。ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドにおけるヒスチジンの繰返し配列数特に制限はないが、ヒスチジンの繰返し配列が短い場合はニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる精製が困難となり、長い場合は、フコース結合性タンパク質の前記糖鎖への結合親和性が損なわれる可能性がある。従って、ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドにおけるヒスチジンの繰返し配列数の長さはヒスチジンが５個から１５個からなる繰返し配列であることが好ましく、５個から１０個からなる繰返し配列であることがより好ましい。前記ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドがフコース結合性タンパク質に付加する位置に特に制限はなく、Ｎ末端側とＣ末端側の双方、または、Ｎ末端側或いはＣ末端側のいずれかであってもよいが、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる精製が効率的に行える点で、前記ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドはフコース結合性タンパク質のＮ末端側に付加されていることが好ましい。
【００３２】
さらに、本発明の製造方法におけるフコース結合性タンパク質は、そのＮ末端側および／またはＣ末端側に、フコース結合性タンパク質をクロマトグラフィー用の支持体等の担体に固定化する際に有用な、システイン残基またはリジン残基を含むオリゴペプチドからなる付加的なアミノ酸配列（以下、担体固定化用タグと呼ぶ。）を有していても良い。前記担体固定化用タグの長さは、フコース結合性タンパク質がＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有している限り、特に制限はない。担体固定化用タグとしては、不溶性担体への固定化が高選択的かつ高効率に行える点で、システイン残基を１つ以上含む２から１０アミノ酸残基からなるオリゴペプチドが好ましく、具体的には、「Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ」の３アミノ酸残基からなるオリゴペプチド、「Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ」の５アミノ酸残基からなるオリゴペプチドおよび「Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ」の７アミノ酸残基からなるオリゴペプチドを例示することができる。前記システインを１つ以上含むオリゴペプチドがフコース結合性タンパク質に付加する位置に特に制限はなく、Ｎ末端側とＣ末端側の双方、Ｎ末端側或いはＣ末端側のいずれかであってもよいが、フコース結合性タンパク質の担体への固定化が効率的に行える点で、前記システイン残基を１つ以上含むオリゴペプチドはフコース結合性タンパク質のＣ末端側に付加されていることが好ましい。
【００３３】
本発明の製造方法におけるフコース結合性タンパク質の具体例としては、配列番号１、配列番号２（配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち１番目から１２７番目までのアミノ酸配列）、配列番号３（配列番号２の７２番目のシステイン残基をグリシン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号４（配列番号２の３９番目のグルタミン残基をロイシン残基に、７２番目のシステイン残基をグリシン残基に置換したアミノ酸配列）配列番号５（配列番号３の３９番目のグルタミン残基をロイシン残基に、６５番目のグルタミン残基をロイシン残基に、７２番目のシステイン残基をグリシン残基に置換したアミノ酸配列）配列番号６（配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したアミノ酸配）、配列番号７（配列番号２で示されるアミノ酸配列のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したアミノ酸配）、配列番号８（配列番号３で示されるアミノ酸配列のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したアミノ酸配）、配列番号９（配列番号４で示されるアミノ酸配列のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したアミノ酸配）および配列番号１０（配列番号５で示されるアミノ酸配列のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したアミノ酸配）のいずれかで示されるフコース結合性タンパク質を挙げることができる。  本発明の製造方法におけるフコース結合性タンパク質のＮ末端側には、宿主での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを付加してもよい。宿主が大腸菌の場合における前記シグナルペプチドとしては、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ、ＴｏｒＴ等といったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示することができる。
【００３４】
本発明の製造方法におけるフコース結合性タンパク質をコードするＤＮＡは、公知の方法により調製することができる。前記ＤＮＡの調製法として、本発明の製造方法におけるフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列から塩基配列に変換し、当該塩基配列を含むＤＮＡを人工的に合成する方法や、本発明の製造方法におけるフコース結合性タンパク質をコードするＤＮＡを直接人工的に調製する方法、またはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａのゲノムＤＮＡ等からＰＣＲ法などのＤＮＡ増幅法を用いて調製する方法を例示することができる。なお、当該調製法において、前記塩基配列を設計する際は、形質転換する大腸菌におけるコドンの使用頻度を考慮することが好ましく、例えば、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないコドン（レアコドン）であるため、これらのコドン以外のコドンを選択して変換することが好ましい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／、アクセス日：２０１８年５月７日）を利用することによっても可能である。
【００３５】
前記方法により調製したフコース結合性タンパク質をコードするＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換するには、当該ＤＮＡそのものを用いて形質転換してもよいが、例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドまたはプラスミド等を基にしたベクター中の適切な位置に当該ＤＮＡを挿入して発現ベクターとし、それを用いて形質転換することが、安定した形質転換が実施できる点で好ましい。ここで、適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、および伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。またベクターに当該ＤＮＡを挿入する際は、発現に必要なプロモータといった機能性ＤＮＡに連結される状態でベクターに挿入することが好ましい。前記発現ベクターとして使用するベクターは、宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、ｐＥＴベクター、ｐＵＣベクター、ｐＴｒｃベクター、ｐＣＤＦベクター、ｐＢＢＲベクター等が例示できる。また、前記プロモータとしては、ｔｒｐプロモータ、ｔａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、ｌｐｐプロモータ、さらにはλファージのλＰＬプロモータ、λＰＲプロモータ等を挙げることができる。前記発現ベクターを用いて宿主である大腸菌を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行えばよく、例えば、宿主として大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株、大腸菌ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）株、大腸菌Ｗ３１１０株などを選択する場合には、公知の文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２５６，１９９２）に記載の方法等を使用することができる。
【００３６】
また、本発明の製造方法で得られたフコース結合性タンパク質の糖鎖への結合親和性の評価は、Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ法や表面プラズモン共鳴法等により評価することができる。一例として、表面プラズモン共鳴法について説明する。表面プラズモン共鳴法による結合親和性評価は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器（ＧＥヘルスケア製）を用い、アナライトを組換えタンパク質、固相を糖鎖として測定することができる。糖鎖を固定したセンサーチップの作製は、ビオチン標識糖鎖を利用して、ストレプトアビジンをコートしたセンサーチップ（Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＳＡ、ＧＥヘルスケア製）や、デキストランがコートされたセンサーチップ（Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５、ＧＥヘルスケア製）にあらかじめストレプトアビジンを固定したものを利用して行うことができる。また、結合性親和評価は当該機器に付属のカイネティクス解析プログラムを利用して行うことができる。
【発明の効果】
【００３７】
本発明の製造方法により、過剰な炭素源供給により副生される有機酸などによる大腸菌の生育阻害およびフコース結合性タンパク質の発現阻害を抑制することができる。その結果、大腸菌に導入した発現ベクターにコードされたフコース結合性タンパク質を大量かつ効率よく生産することが可能となっただけでなく、過剰の原料による生産コスト上昇を抑制する効果、ならびに製品回収後の培養廃液中に残留する有機物の減少による環境汚染の低減および廃液処理コストの抑制効果も得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明の製造方法における各測定パラメーターの推移である。
【図２】実施例１における培養中の溶存酸素（ＤＯ）濃度とグルコース濃度の推移を示したものである。横軸は時間（単位は時間）を示し、縦軸は溶存酸素濃度（単位はｍｇ／Ｌ）およびグルコース濃度（単位はｇ／Ｌ）を示す。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例および比較例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４０】
実施例１
実施例１は、１２７アミノ酸からなる配列番号２（配列番号１の１番目から１２７番目）で示されるフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質（以下、フコース結合性タンパク質１２７とする。）の製造に関するものである。
（１）発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７）ｃｙｓおよび組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７）ｃｙｓの作製
発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７）ｃｙｓは、フコース結合性タンパク質１２７を発現させるための発現ベクターである。フコース結合性タンパク質１２７のアミノ酸配列は配列番号７であり、その５番目から１０番目まではポリヒスチジン配列、１５番目から１４１番目までは配列番号２のアミノ酸配列、１４２番目から１４８番目まではシステインを含むオリゴペプチド配列に相当する。
【００４１】
発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７）ｃｙｓの作製は以下の操作で行った。特開２０１８−００００３８号公報で開示されているプラスミドｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓを鋳型として、配列番号１６および配列番号１７に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして用い、特開２０１８−００００３８号公報に記載の方法によりＰＣＲを実施した。次に、このＰＣＲ産物を鋳型として、配列番号１６および配列番号１７に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして用いて、同様の方法でＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物は、制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化し、同様に制限酵素処理した発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）（メルクミリポア製）とライゲーション反応を行った。このライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７）ｃｙｓを作製した。特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法により、得られた組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７）ｃｙｓを培養し、菌体から抽出することで発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７）ｃｙｓを得た。配列解析により塩基配列を確認した結果、発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７）ｃｙｓには配列番号２のアミノ酸配列をコードする配列番号１２の塩基配列が含まれることを確認した。
（２）組換え大腸菌を用いたフコース結合性タンパク質１２７の生産
前記実施例１の（１）で作製した組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７）ｃｙｓを、培養容器として５００ｍＬのバッフル付き三角フラスコを用いて、１００ｍＬの２×ＹＴ培地にカナマイシン硫酸塩を５０ｍｇ／Ｌの濃度で含む前培養培地（表１、滅菌済み）に植菌し、３０℃で２０時間、毎分１３０回の振とう速度（振幅２５ｍｍ）で前培養を行なった。
【００４２】
【表１】
2020058343.tif 000002
【００４３】
本培養培地の調製は、まず始めに、表２に示す全成分を３Ｌ容の発酵槽に添加して溶液としたのち、オートクレーブ滅菌（１２１℃，２０分間）し、室温まで冷却した。
【００４４】
【表２】
2020058343.tif 000003
【００４５】
次に、表３に示す各成分の水溶液を別々に調製し、カナマイシン硫酸塩水溶液以外の水溶液をオートクレーブ滅菌後（１２１℃，２０分間）、室温まで冷却した。また、カナマイシン硫酸塩水溶液は０．２２μｍの滅菌フィルター（アドバンテック製）で滅菌した。これら滅菌した各成分の水溶液を、前述の表２に示した成分を含む滅菌済み水溶液が入った３Ｌ容の発酵槽に添加（表３に示した量を添加）して、本培養培地を調製した。
【００４６】
【表３】
2020058343.tif 000004
【００４７】
次に、流加用培地（表４に示す成分）を調製した。具体的には、適切な濃度で調製したグルコース水溶液、酵母エキス水溶液、硫酸マグネシウム七水和物水溶液を別々にオートクレーブ滅菌（１２１℃，２０分間）し、室温まで冷却したのち、オートクレーブ滅菌した各水溶液、フィルター滅菌したカナマイシン硫酸塩水溶液および滅菌水を、表４に示す組成となるよう、滅菌容器内で混合することにより調製した。
【００４８】
【表４】
2020058343.tif 000005
【００４９】
調製した本培養培地を含む発酵槽に、前述の前培養液９０ｍＬを添加して、本培養を開始した。本培養は、培養装置としてエイブル製ＢＭＳ−０３ＰＩ型、撹拌翼としてエイブル製φ７０ｍｍの４枚インペラ２段に籠型の網を組み合わせた羽根、ＤＯ電極としてエイブル製ＤＯ電極を用い、フィルター滅菌後の空気の通気量を１．８Ｌ／分、培養温度を３０℃として、培養液のｐＨを６．９から７．１の範囲に調節することで行った。また、培養液のｐＨ調節には、適切な濃度のアンモニア水溶液またはリン酸水溶液を使用した。また、本培養開始時の撹拌回転数は４００ｒｐｍとし、溶存酸素濃度が２．２ｍｇ／Ｌを下回った時点で撹拌回転数をステップで上げていく、いわゆる撹拌回転数カスケードモードと呼ばれる制御方法で培養を続けた。本培養に使用した培養装置では、エイブル製培養制御プログラムをインストールしたコンピューターを用いてＤＯ電極による信号を検出することにより、培養液中のＤＯ濃度、すなわち本培養初期に投入した炭素源の消費状態を確認した。なお、本ＤＯ電極は、前述の本培養培地を発酵槽に添加して３０℃にしたのち、通気量＝１．８Ｌ／分、撹拌翼の速度＝９００ｒｐｍで１０分間撹拌した状態の溶存酸素濃度を７．５ｍｇ／Ｌ（飽和濃度）として校正後に使用した。
【００５０】
培養中に定期的に採取したサンプリング液は、分光光度計（日立ハイテクサイエンス製Ｕ−２９００型）を用いてＯＤ６００（６００ｎｍでの濁度）を、さらにグルコース分析計（ＹＳＩ製２７００型）を用いてグルコース濃度を測定した。
【００５１】
本培養開始から５時間後にＤＯ濃度が下がらなくなり（撹拌回転数が上がらなくなり）、この時のサンプル液の分析値は、ＯＤ６００＝２４、グルコース濃度＝０．１ｇ／Ｌであった。つまり、培養開始時に培養液に添加したグルコースが大腸菌に代謝されて枯渇し、大腸菌の増殖が抑制された結果として酸素消費量が低下し、ＤＯセンサーで示されるＤＯ濃度が上昇したことを示唆している。
【００５２】
本培養開始から６時間後に撹拌回転数カスケード制御を終了して撹拌回転数を８００ｒｐｍに固定し、ＤＯ濃度が３．０ｍｇ／Ｌを超えた時点で表３に示した流加培地（グルコース、酵母エキス、硫酸マグネシウム）が０．２ｍＬずつ滴下供給されるように設定した。供給にはワトソン・マーロウ製定量ポンプ１０１Ｕの高速型を使用し、流速は０．３ｍＬ／分に設定した。
【００５３】
本培養開始から１０時間後にＯＤ６００が７０に達し、培養液の設定温度を２０℃に変更した。培養液が２０℃になったことを確認し、撹拌回転数を６００ｒｐｍに変更し、ＩＰＴＧ（富士フイルム和光純薬製）を用いて調製した０．５ＭのＩＰＴＧ水溶液を１．８ｍＬ添加して、誘導を開始した（ＩＰＴＧの終濃度＝０．５ｍＭ）。本培養開始から２７時間後にＯＤ６００は１００に達し、撹拌翼の回転数を４００ｒｐｍへ下げた。本培養開始から４８時間後にＯＤ６００は１２０に達し、培養を終了した。
【００５４】
ＤＯ濃度の上昇に連動させて培養液に炭素源を追加する方法（ＤＯスタット法）で流加培地を滴下した結果、流加開始時点（本培養開始６時間後）から培養終了（５０時間後）までの期間、培養液中のグルコース濃度は０．１ｇ／Ｌ以下に維持されており、同期間の溶存酸素濃度は０．１ｍｇ／Ｌから３．７ｍｇ／Ｌの範囲で変動した（図２）。これは、培養中にグルコースの不足に呼応して上昇するＤＯ濃度を指標に、断続的に炭素源および窒素源が供給されたことを示している。また、培養終了時の流加培地使用量は４０１ｇであり、本培養を通して投入された全炭素源（グルコース）量は１５６．６ｇ（初期投入量を含む）、全窒素源（酵母エキス）量は７５．１ｇ／Ｌ（初期投入量２９．３ｇ／Ｌを含む）であった。
【００５５】
培養終了後、得られた１６５０ｍＬの培養液を５００ｍＬの遠心分離用容器に分注し、遠心分離機（本体：工機ホールディングス製ＣＲ２２Ｈ、ローター：工機ホールディングス製Ｒ１０Ａ３）を用いて遠心分離（４℃、３，０００×ｇ、１５分）することにより、３２０ｇの菌体を回収した。表５に組成を示す抽出液を回収した菌体に添加して室温で３０分間振とう撹拌したのち、表６に示す添加剤を添加して室温で３０分間、次いで４℃で一晩振とう撹拌後、前述の遠心分離機を用いて遠心分離（４℃、１２，０００×ｇ、３０分）することにより上清を回収することにより、フコース結合性タンパク質１２７を含む可溶性タンパク質抽出液を回収した。回収したフコース結合性タンパク質１２７を含む可溶性タンパク質抽出液は０．２２μｍのフィルター（アドバンテック製）でろ過したのち、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ  Ｒｅｓｉｎ（メルクミリポア製）を用いたニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーにより、フコース結合性タンパク質１２７を精製し、光路長１ｃｍの石英セルを用いて精製したフコース結合性タンパク質１２７を含む水溶液の２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。フコース結合性タンパク質１２７のモル吸光係数を１．０として前記水溶液中のタンパク質濃度を算出後、得られたタンパク質濃度を基に、フコース結合性タンパク質１２７の培養液１Ｌあたりの生産性を算出した結果、生産性は１２４０ｍｇ／Ｌ−培養液であった。
【００５６】
【表５】
2020058343.tif 000006
【００５７】
【表６】
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【００５８】
実施例２
実施例２は、１５５アミノ酸からなる配列番号１で示される組換えＢＣ２ＬＣＮのアミノ酸配列のＮ末端ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質（以下、フコース結合性タンパク質１５５とする。）の製造に関するものである。
（１）発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓおよび組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓの作製
発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓは、フコース結合性タンパク質１５５を発現させるための発現ベクターである。フコース結合性タンパク質１５５のアミノ酸配列は配列番号６であり、その５番目から１０番目まではポリヒスチジン配列、１５番目から１６９番目までは配列番号１のアミノ酸配列（ＧｅｎＰｅｐｔ登録番号：ＷＰ＿００６４９０８２８の２番目から１５６番目の領域のアミノ酸配列に一致）、１７０番目から１７４番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
【００５９】
発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓは、特開２０１８−００００３８号公報で開示されているプラスミドｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓと同一の塩基配列であり、当該公報に開示されている方法で作製した。次いで、発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを作製した。特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法により、得られた組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを培養し、菌体から抽出することで発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを得た。配列解析により塩基配列を確認した結果、発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓには配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号１１の塩基配列が含まれることを確認した。
（２）組換え大腸菌を用いたフコース結合性タンパク質１５５の製造
前記実施例２の（１）で作製した組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを用いた以外は、実施例１に記載の培養条件により、フコース結合性タンパク質１５５を製造した。
【００６０】
本培養開始から５時間後に初発培地に含まれるグルコース（１９．５ｇ／Ｌ）が完全に消費され、同６時間後から流加培地の滴下を開始し、同５０時間後にＯＤ６００が１４０まで達し、培養を終了した。
【００６１】
実施例１と同様にＤＯスタット法で流加培地を滴下した結果、流加開始時点（本培養開始６時間後）から培養終了（５０時間後）までの期間、培養液中のグルコース濃度は０．１ｇ／Ｌ以下に維持されており、同期間の溶存酸素濃度は０．１ｍｇ／Ｌから３．８ｍｇ／Ｌの範囲で変動した。また、培養終了時の流加培地使用量は３８０ｇであり、本培養を通して投入された全炭素源（グルコース）量は１４８．０ｇ（初期投入量を含む）、全窒素源（酵母エキス）量は７２．３ｇ／Ｌ（初期投入量２９．３ｇ／Ｌを含む）であった。
【００６２】
培養終了後、実施例１に記載の方法により、得られた１６００ｍＬの培養液を遠心分離することにより、３３０ｇの菌体を回収した。同様に、実施例１と記載の方法により回収した菌体からフコース結合性タンパク質１５５を精製し、フコース結合性タンパク質１５５の培養液１Ｌあたりの生産性を算出した結果、生産性は９１０ｍｇ／Ｌ−培養液であった。
【００６３】
実施例３
実施例３は、１２７アミノ酸残基からなる配列番号３で示されるフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２の７２番目のシステイン残基をグリシン残基に置換したアミノ酸配列）のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質（以下、フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇとする。）の製造に関するものである。
（１）発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓおよび組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓの作製
発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓは、フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇを発現させるための発現ベクターである。フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇのアミノ酸配列は配列番号８であり、その５番目から１０番目まではポリヒスチジン配列、１５番目から１４１番目までは配列番号３のアミノ酸配列、１４２番目から１４８番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
【００６４】
実施例１の（１）の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７）ｃｙｓを鋳型として、配列番号１６および配列番号１８に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法によりＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩで消化し、同様に制限酵素ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩで処理した実施例１の（１）に記載の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７）ｃｙｓとライゲーション反応を行った。このライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓを得た。特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法により、得られた組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓを培養し、菌体から抽出することで発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓを得た。配列解析により塩基配列を確認した結果、発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓには配列番号３のアミノ酸配列をコードする配列番号１３の塩基配列が含まれることを確認した。
（２）組換え大腸菌を用いたフコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇの製造
前記実施例３の（１）で作製した組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓを用いた以外は、実施例１に記載の培養条件により、フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇを製造した。
【００６５】
本培養開始から５時間後に初発培地に含まれるグルコース（１９．５ｇ／Ｌ）が完全に消費され、同６時間後から流加培地の滴下を開始し、同５２時間後にＯＤ６００が１１０まで達し、培養を終了した。
【００６６】
実施例１と同様にＤＯスタット法で流加培地を滴下した結果、流加開始時点（本培養開始６時間後）から培養終了（５２時間後）までの期間、培養液中のグルコース濃度は０．１ｇ／Ｌ以下に維持されており、同期間の溶存酸素濃度は０．１ｍｇ／Ｌから３．８ｍｇ／Ｌの範囲で変動した。また、培養終了時の流加培地使用量は４５０ｍＬであり、本培養を通して投入された全炭素源（グルコース）量は２２５．６ｇ（初期投入量を含む）、全窒素源（酵母エキス）量は１０３３．５ｇ／Ｌ（初期投入量を含む）であった。
【００６７】
培養終了後、実施例１に記載の方法により、得られた１５７０ｍＬの培養液を遠心分離することにより、３１３ｇの菌体を回収した。同様に、実施例１と記載の方法により回収した菌体からフコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇを精製し、フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇの培養液１Ｌあたりの生産性を算出した結果、生産性は９２０ｍｇ／Ｌ−培養液であった。
【００６８】
実施例４
実施例４は、１２７アミノ酸残基からなる配列番号４で示されるフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２の３９番目のグルタミン残基をロイシン残基に、７２番目のシステイン残基をグリシン残基に置換したアミノ酸配列）のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質（以下、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇとする。）の製造に関するものである。
（１）発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓおよび組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓの作製
発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓは、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇを発現させるための発現ベクターである。フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇのアミノ酸配列は配列番号９であり、その５番目から１０番目まではポリヒスチジン配列、１５番目から１４１番目までは配列番号４のアミノ酸配列、１４２番目から１４８番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
【００６９】
フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇをコードする塩基配列（配列番号１９に示すＸｂａＩとＸｈｏＩの制限酵素サイトを有する塩基配列、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）を合成し、制限酵素ＸｂａＩおよびＸｈｏＩで消化したのち、制限酵素ＸｂａＩおよびＸｈｏＩで処理した発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）（メルクミリポア製）とライゲーション反応を行った。なお、配列番号１９に示す塩基配列の５４番目から７１番目まではポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド、８４番目から４６４番目までは配列番号４のアミノ酸配列に相当するポリペプチド、４６５番目から４８５番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチドをそれぞれコードするポリヌクレオチドに相当する。次に、実施例１に記載の方法により、組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓおよび発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓを得たのち、配列解析により塩基配列を確認した結果、発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓには配列番号４のアミノ酸配列をコードする配列番号１４の塩基配列が含まれることを確認した。
（２）組換え大腸菌を用いたフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇの製造
前記実施例４の（１）で作製した組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓを用いた以外は、実施例１に記載の培養条件により、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇを製造した。
【００７０】
本培養開始から５時間後に初発培地に含まれるグルコース（１９．５ｇ／Ｌ）が完全に消費され、同６時間後から流加培地の滴下を開始し、同４８時間後にＯＤ６００が１１５まで達し、培養を終了した。
【００７１】
実施例１と同様にＤＯスタット法で流加培地を滴下した結果、流加開始時点（本培養開始６時間後）から培養終了（５０時間後）までの期間、培養液中のグルコース濃度は０．１ｇ／Ｌ以下に維持されており、同期間の溶存酸素濃度は０．１ｍｇ／Ｌから３．８ｍｇ／Ｌの範囲で変動した。また、培養終了時の流加培地使用量は４８３ｇであり、本培養を通して投入された全炭素源（グルコース）量は２４０．４ｇ（初期投入量を含む）、全窒素源（酵母エキス）量は１０８．５ｇ／Ｌ（初期投入量を含む）であった。
【００７２】
培養終了後、実施例１に記載の方法により、得られた１６７６ｍＬの培養液を遠心分離することにより、３２７ｇの菌体を回収した。同様に、実施例１と記載の方法により回収した菌体からフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇを精製し、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇの培養液１Ｌあたりの生産性を算出した結果、生産性は８８３ｍｇ／Ｌ−培養液であった。
【００７３】
実施例５
実施例５は、１２７アミノ酸残基からなる配列番号５で示されるフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２の３９番目のグルタミン残基をロイシン残基に、６５番目のグルタミン残基をロイシン残基に、７２番目のシステイン残基をグリシン残基に置換したアミノ酸配列）のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質（以下、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇとする。）の製造に関するものである。
（１）発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓおよび組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓの作製
発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓは、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇを発現させるための発現ベクターである。フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇのアミノ酸配列は配列番号１０であり、その５番目から１０番目まではポリヒスチジン配列、１５番目から１４１番目までは配列番号５のアミノ酸配列、１４２番目から１４８番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
【００７４】
フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇをコードする塩基配列（配列番号２０に示すＸｂａＩとＸｈｏＩの制限酵素サイトを有する塩基配列、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）を合成し、制限酵素ＸｂａＩおよびＸｈｏＩで消化したのち、制限酵素ＸｂａＩおよびＸｈｏＩで処理した発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）（メルクミリポア製）とライゲーション反応を行った。なお、配列番号２０に示す塩基配列の５４番目から７１番目まではポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド、８４番目から４６４番目までは配列番号５のアミノ酸配列に相当するポリペプチド、４６５番目から４８５番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチドをそれぞれコードするポリヌクレオチドに相当する。次に、実施例１に記載の方法により、組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓおよび発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓを得たのち、配列解析により塩基配列を確認した結果、発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓには配列番号５のアミノ酸配列をコードする配列番号１５の塩基配列が含まれることを確認した。
（２）組換え大腸菌を用いたフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇの製造
前記実施例５の（１）で作製した組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓを用いた以外は、実施例１に記載の培養条件により、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇを製造した。
【００７５】
本培養開始から５時間後に初発培地に含まれるグルコース（１９．５ｇ／Ｌ）が完全に消費され、同６時間後から流加培地の滴下を開始し、同４８時間後にＯＤ６００が１２０まで達し、培養を終了した。
【００７６】
実施例１と同様にＤＯスタット法で流加培地を滴下した結果、流加開始時点（本培養開始６時間後）から培養終了（５０時間後）までの期間、培養液中のグルコース濃度は０．１ｇ／Ｌ以下に維持されており、同期間の溶存酸素濃度は０．１ｍｇ／Ｌから３．８ｍｇ／Ｌの範囲で変動した。また、培養終了時の流加培地使用量は４７０ｇであり、本培養を通して投入された全炭素源（グルコース）量は２３４．６ｇ（初期投入量を含む）、全窒素源（酵母エキス）量は１０６．５ｇ／Ｌ（初期投入量を含む）であった。
【００７７】
培養終了後、実施例１に記載の方法により、得られた１５８０ｍＬの培養液を遠心分離することにより、３１０ｇの菌体を回収した。同様に、実施例１と記載の方法により回収した菌体からフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇを精製し、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇの培養液１Ｌあたりの生産性を算出した結果、生産性は９００ｍｇ／Ｌ−培養液であった。
【００７８】
実施例６
実施例６は、実施例４とは異なる宿主大腸菌を用いたフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇの製造に関するものである。
（１）発現ベクターｐＴｒｃ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓおよび組換え大腸菌Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓの作製
発現ベクターｐＴｒｃ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓは、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇを発現させるための発現ベクターである。実施例３の（１）の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓを鋳型として、配列番号２１および配列番号２２に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法によりＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同様に制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＴｒｃ−ＰｅｌＢＶ３Ｋｍ（ＷＯ２０１５／１９９１５４号に記載の方法で作製した発現ベクターｐＴｒｃ−ＰｅｌＢＶ３中のカルベニシリン耐性遺伝子の代わりにカナマイシン耐性遺伝子を導入した発現ベクター）とライゲーション反応を行った。このライゲーション産物を用いて大腸菌Ｗ３１１０を形質転換し、組換え大腸菌Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓを得た。特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法により、得られた組換え大腸菌Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓを培養し、菌体から抽出することで発現ベクターｐＴｒｃ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓを得た。配列解析により塩基配列を確認した結果、発現ベクターｐＴｒｃ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓには配列番号４のアミノ酸配列をコードする配列番号１４の塩基配列が含まれることを確認した。
（２）組換え大腸菌を用いたフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇの製造
前記実施例６の（１）で作製した組換え大腸菌Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓを用いた以外は、実施例１に記載の培養条件により、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇを製造した。
【００７９】
本培養開始から１２時間後に初発培地に含まれるグルコース（１９．５ｇ／Ｌ）が完全に消費され、同１３時間後から流加培地の滴下を開始し、同７２時間後にＯＤ６００が１３０まで達し、培養を終了した。
【００８０】
実施例１と同様にＤＯスタット法で流加培地を滴下した結果、流加開始時点（本培養開始６時間後）から培養終了（５０時間後）までの期間、培養液中のグルコース濃度は０．１ｇ／Ｌ以下に維持されており、同期間の溶存酸素濃度は０．１ｍｇ／Ｌから３．８ｍｇ／Ｌの範囲で変動した。また、培養終了時の流加培地使用量は４６８ｇであり、本培養を通して投入された全炭素源（グルコース）量は２３３．７ｇ（初期投入量を含む）、全窒素源（酵母エキス）量は１０６．２ｇ／Ｌ（初期投入量を含む）であった。
【００８１】
培養終了後、実施例１に記載の方法により、得られた１６５０ｍＬの培養液を遠心分離することにより、３４０ｇの菌体を回収した。同様に、実施例１と記載の方法により回収した菌体からフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇを精製し、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇの培養液１Ｌあたりの生産性を算出した結果、生産性は９５０ｍｇ／Ｌ−培養液であった。
【００８２】
比較例１
本培養で用いる流加培地の組成を表７に記載の組成に変更し、炭素源（グルコース）に対する窒素源（酵母エキス）の重量比を０．１０倍にした以外は、実施例１に記載の組換え大腸菌および培養条件により、フコース結合性タンパク質１２７を製造した。
【００８３】
【表７】
2020058343.tif 000008
【００８４】
本培養開始から５時間後に初発培地に含まれるグルコース（１９．５ｇ／Ｌ）が完全に消費され、同６時間後に撹拌回転数カスケードモードを終了し、回転数８００ｒｐｍ固定で表６に示した流加培地の滴下を開始した。本培養開始１０時間後のＯＤ６００は３０となり、大腸菌の増殖が著しく悪いことが示唆された。本培養開始１５時間後に、ＯＤ６００は３３であったが、ＩＰＴＧを添加し誘導を開始した（ＩＰＴＧの終濃度＝０．５ｍＭ、培養温度＝２０℃）。本培養開始後２４時間後のＯＤ６００は３５、４８時間後のＯＤ６００は３６であった。培養開始から５６時間で培養を終了した。
【００８５】
流加開始時点（本培養開始６時間後）から培養終了（５６時間後）までの期間、培養液中のグルコース濃度は０．１ｇ／Ｌ以下に維持されており、同期間の溶存酸素濃度は０．７ｍｇ／Ｌから３．９ｍｇ／Ｌの範囲で変動した。また、流加培地の使用量は１２０ｍＬであり、本培養を通して投入された全炭素源（グルコース）量は７０．９ｇ（初期投入量を含む）、全窒素源（酵母エキス）量は３４．４ｇ／Ｌ（初期投入量２９．３ｇ／Ｌを含む）であった。
【００８６】
培養終了後、実施例１に記載の方法により、得られた１３００ｍＬの培養液を遠心分離することにより、１００ｇの菌体を回収した。同様に、実施例１と記載の方法により回収した菌体からフコース結合性タンパク質１２７を精製し、フコース結合性タンパク質１２７の培養液１Ｌあたりの生産性を算出した結果、生産性は１３０ｍｇ／Ｌ−培養液であった。
【００８７】
比較例２
ＩＰＴＧによる誘導を行わない以外は、実施例１に記載の組換え大腸菌および培養条件により、フコース結合性タンパク質１２７を製造した。
【００８８】
本培養開始から５時間後に初発培地に含まれるグルコース（１９．５ｇ／Ｌ）が完全に消費され、同６時間後に撹拌回転数カスケードモードを終了し、回転数８００ｒｐｍ固定で表３に示した流加培地の滴下を開始した。本培養開始１０時間後のＯＤ６００は６５となり、大腸菌の増殖が著しく悪いことが示唆された。本培養開始１５時間後にＯＤ６００は６５となり、培養液を２０℃に下げてＩＰＴＧを添加せずにそのまま培養を継続した。本培養開始後２７時間後のＯＤ６００は９５、４８時間後のＯＤ６００は１１５となり、この段階で培養を終了した。
【００８９】
流加開始時点（本培養開始６時間後）から培養終了（４８時間後）までの期間、培養液中のグルコース濃度は０．１ｇ／Ｌ以下に維持されており、同期間の溶存酸素濃度は０．７ｍｇ／Ｌから４．０ｍｇ／Ｌの範囲で変動した。また、流加培地の使用量は３００ｍＬであり、本培養を通して投入された全炭素源（グルコース）量は１４８．０ｇ／Ｌ（初期投入量を含む）であり、全窒素源（酵母エキス）量は７２．３ｇ／Ｌ（初期投入量を含む）であった。
【００９０】
培養終了後、実施例１に記載の方法により、得られた１６００ｍＬの培養液を遠心分離することにより、３１０ｇの菌体を回収した。同様に、実施例１と記載の方法により回収した菌体からフコース結合性タンパク質１２７を精製し、フコース結合性タンパク質１２７の培養液１Ｌあたりの生産性を算出した結果、生産性は７０ｍｇ／Ｌ−培養液であった。
【００９１】
試験例１
試験例１では、表面プラズモン共鳴法により、実施例１で製造したフコース結合性タンパク質１２７、実施例２で製造したフコース結合性タンパク質１５５、実施例３で製造したフコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇ、実施例４で製造したフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇおよび実施例５で製造したフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇの、糖鎖への結合親和性評価を行った。具体的には、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（Ｔ２００  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ）機器（ＧＥヘルスケア製）を用い、アナライトを組換えタンパク質、固相をＨタイプ１型糖鎖またはＨタイプ３型糖鎖としてカイネティクス解析を行った。センサーチップはデキストランがコートされたＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５（ＧＥヘルスケア製）を使用し、デキストランにストレプトアビジン（和光純薬製）をアミンカップリング法により固定したのち、ビオチン標識されたＨタイプ１型糖鎖またはＨタイプ３型糖鎖（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ製）を添加し、ビオチンとストレプトアビジンの反応により各糖鎖をセンサーチップ上に固定してＨタイプ１型糖鎖またはＨタイプ３型糖鎖が固定されたセンサーチップを作製した。糖鎖結合親和性の測定には緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥヘルスケア製）を用い、測定条件は流速を３０μＬ／分、結合時間を６分間、解離時間を３分間または６分間とした。センサーチップの再生は２５ｍＭの水酸化ナトリウムを用い、流速３０μＬ／分、再生時間３０秒で行った。解析はＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（Ｔ２００  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ）機器に付属の解析ソフト（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ｖｅｒｓｉｏｎまたはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ｖｅｒｓｉｏｎ）を用いて行い、１：１  Ｂｉｎｄｉｎｇのフィッティングにより解離定数（ＫＤ）を算出した。
【００９２】
実施例１で製造したフコース結合性タンパク質１２７のＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する解離定数を算出した結果、Ｈタイプ１型糖鎖に対する解離定数は２．４ｎＭ、Ｈタイプ３型糖鎖に対する解離定数は２．５ｎＭであった。実施例２で製造したフコース結合性タンパク質１５５のＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する解離定数を算出した結果、Ｈタイプ１型糖鎖に対する解離定数は３．９ｎＭ、Ｈタイプ３型糖鎖に対する解離定数は１１ｎＭであった。実施例３で製造したフコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２ＧのＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する解離定数を算出した結果、Ｈタイプ１型糖鎖に対する解離定数は２．１ｎＭ、Ｈタイプ３型糖鎖に対する解離定数は５．３ｎＭであった。実施例４で製造したフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２ＧのＨタイプ３型糖鎖に対する解離定数を算出した結果、Ｈタイプ３型糖鎖に対する解離定数は３．９ｎＭであった。実施例５で製造したフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２ＧのＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する解離定数を算出した結果、Ｈタイプ１型糖鎖に対する解離定数は３．９ｎＭ、Ｈタイプ３型糖鎖に対する解離定数は４．６ｎＭであった。
【００９３】
以上の結果から、本発明の製造方法により製造したフコース結合性タンパク質はＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対して結合親和性を有していることが明らかとなった。実施例１から５で製造した各フコース結合性タンパク質のＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖糖鎖への結合親和性評価の結果を表８に示す。
【００９４】
【表８】
2020058343.tif 000009
【００９５】
試験例２
試験例２では、実施例１で製造したフコース結合性タンパク質１２７、実施例２で製造したフコース結合性タンパク質１５５、実施例３で製造したフコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇ、実施例４で製造したフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇおよび実施例５で製造したフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇの熱安定性評価として、各フコース結合性タンパク質の変性中点温度の測定を行った。具体的には、前記各フコース結合性タンパク質のＤ−ＰＢＳ（−）溶液を再生セルロース膜（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、分画分子量３５００）を用いて、透析用緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．５）中で緩衝液交換を行った。透析内液の組換えタンパク質を紫外吸収法により濃度を測定し、透析用緩衝液を用いて５００μｇ／ｍＬになるよう希釈し、示差走査熱量計（マルバーン・パナテリティカル社製、ＭｉｃｒｏＣａｌＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＤＳＣ）を用いて変性中点温度を測定した。なお、変性中点温度はタンパク質の半分が変性する温度であり、変性中点温度が高いほど熱に対する安定性が高いことを示す。変性中点温度の測定条件は、前記透析後の各フコース結合性タンパク質の溶液量を４００μＬ、昇温速度を６０℃／ｈ、加熱温度を４０℃−１１０℃とした。
【００９６】
測定の結果、フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇの変性中点温度は８１．９±０．５℃、フコース結合性タンパク質１５５の変性中点温度は８２．３±０．５℃、フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇの変性中点温度は８８．３±０．５℃、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇの変性中点温度は９４．４℃、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇの変性中点温度は８８．３±０．５℃であった。実施例１から５で製造した各フコース結合性タンパク質の変性中点温度の測定結果を表９に示す。
【００９７】
【表９】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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