(57)【要約】【課題】容易に入手でき、安全性が高く、製剤に安定配合が可能な物質を用いた歯肉線維芽細胞等の歯ぐき細胞増殖促進剤を提供すること。【解決手段】（Ａ）成分：トコフェロール酢酸エステル及びニコチン酸トコフェロールの少なくともいずれかを０．００５〜２質量％含む、歯ぐき細胞増殖促進剤である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）成分：トコフェロール酢酸エステル及びニコチン酸トコフェロールの少なくともいずれかを０．００５〜２質量％含む、歯ぐき細胞増殖促進剤。
【請求項２】
（Ｂ）成分：メントン、カルボン、シネオール、リモネン、アネトール、オイゲノール、メントール、及びシンナミックアルデヒドからなる群から選択される少なくとも１種、をさらに含む請求項１に記載の歯ぐき細胞増殖促進剤。
【請求項３】
前記歯ぐき細胞が、歯肉線維芽細胞である請求項１又は２に記載の歯ぐき細胞増殖促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯ぐき細胞増殖促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＥは、脂溶性のビタミンであり、健康補助食品（サプリメント）として馴染み深い物質である。ビタミンＥの同族体は一般的に８種類あるといわれている。中でも、α−トコフェロールが、強力な生理作用を有している。
【０００３】
α−トコフェロールの代表的な生理作用として、抗酸化作用が知られている。α−トコフェロールは、この抗酸化作用により、動脈硬化症等に関与すると考えられている活性酸素・フリーラジカルを消去して身体を守る役割を果たしている。また、血行促進作用もα−トコフェロールの代表的な作用である。このようなビタミンＥやビタミンＥ誘導体の作用に着目した技術が種々提案されている（例えば、特許文献１〜３参照）。
特許文献１は、細胞表面に存在する糖タンパク質の一群であるＥ−カドヘリン強化作用に着目し、上皮バリア機能等を向上させる技術である。特許文献２は、抗疲労効果を向上させる技術である。特許文献３は、放射線障害を予防あるいは治療する技術である。
【０００４】
その他、細胞増殖効果に関する技術も複数報告されている（例えば、特許文献４及び非特許文献１、２参照）。特許文献４には、ビタミンＥの細胞増殖効果について、老化させた皮膚線維芽細胞においてその増殖を促進することが開示されている。一方、非特許文献１、２には、血管平滑筋細胞やマウス肺がん細胞において、その増殖を抑制する効果が報告されている。従って、細胞に対するビタミンＥの作用は、対象となる細胞の種類によって、細胞増殖作用となったり、細胞増殖抑制作用となったりするといえる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１６／１０４５２４号公報
【特許文献２】特許第５７９４７６１号公報
【特許文献３】特開２００８−１３７９４２号公報
【特許文献４】特開２００８−９４８１３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｏｓｃｏｂｏｉｎｉｋ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，「α−Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ（ｖｉｔａｍｉｎ  Ｅ）ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ，１９９１，Ｖｏｌ．２８６、Ｎｏ．１、ｐｐ．２６４−２６９
【非特許文献２】Ｔｏｍｏｈｉｒｏ  Ｙａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  「Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｒｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ」、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２０００，Ｖｏｌ．２１、Ｎｏ．１１、ｐｐ．２１２９−２１３３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
歯ぐき細胞の１種である歯肉線維芽細胞の増殖促進は、線維芽細胞が産生するコラーゲン等の細胞外マトリックス産生を増加させることにもつながる。その結果、加齢や喫煙等による歯肉の痩せ、歯肉退縮の改善に繋がり審美的な回復が望める。
【０００８】
また、歯肉線維芽細胞の増殖促進は、創傷治癒の促進にもつながる。創傷治癒は、１）止血期、２）炎症期、３）細胞増殖期、４）組織再構築期の４つのフェーズが複雑に入り組んだ現象である。歯肉線維芽細胞の増殖効果は、特に３）細胞増殖期に作用することで創傷治癒を早める効果が期待できる。
【０００９】
よって、再生美容又は創傷治癒などの再生医療のために、容易に入手でき、しかも安全性が高く、製剤に安定配合が可能な物質による歯肉線維芽細胞の増殖促進が望まれている。
【００１０】
本発明の課題は、容易に入手でき、安全性が高く、製剤に安定配合が可能な物質を用いた歯肉線維芽細胞等の歯ぐき細胞の細胞増殖促進剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題について鋭意検討した結果、トコフェロールの中でも、トコフェロール酢酸エステル及びニコチン酸トコフェロールの少なくともいずれかを一定以上の濃度で含むことにより、上記の課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。また、所定の（Ｂ）成分をさらに含むことにより、歯肉線維芽細胞等の歯ぐき細胞の細胞増殖促進効果が一層高まることを見出した。
即ち、本発明者らは、下記の〔１〕〜〔３〕を提供する。
〔１〕（Ａ）成分：トコフェロール酢酸エステル及びニコチン酸トコフェロールの少なくともいずれかを０．００５〜２質量％含む、歯ぐき細胞増殖促進剤。
〔２〕（Ｂ）成分：メントン、カルボン、シネオール、リモネン、アネトール、オイゲノール、メントール、及びシンナミックアルデヒドからなる群から選択される少なくとも１種、をさらに含む上記〔１〕に記載の歯ぐき細胞増殖促進剤。
〔３〕前記歯ぐき細胞が、歯肉線維芽細胞である上記〔１〕又は上記〔１〕に記載の歯ぐき細胞増殖促進剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、容易に入手でき、安全性が高く、製剤に安定配合が可能な物質を用いた歯肉線維芽細胞等の歯ぐき細胞の細胞増殖促進剤を提供し得る。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。
なお、本明細書中、別途記載がない限り、「ＡＡ〜ＢＢ」と記載する場合は、ＡＡ以上ＢＢ以下を意味する。また、各成分の含有量は、歯ぐき細胞増殖促進剤の総量に対する割合である。さらに、「歯ぐき細胞」とは、歯肉線維芽細胞、歯根膜細胞、歯肉上皮細胞の総称をいう。
【００１４】
［１．歯ぐき細胞増殖促進剤］
本発明の歯ぐき細胞増殖促進剤は、トコフェロール酢酸エステル及びニコチン酸トコフェロールの少なくともいずれかを０．００５〜２質量％含む。本発明の歯ぐき細胞増殖促進剤が歯ぐき細胞増殖促進効果を奏することは、本願明細書の実施例にて証明されている。
なお、歯ぐき細胞増殖促進効果は、歯肉線維芽細胞増殖促進効果、歯ぐき細胞成長促進効果、歯ぐき細胞増加効果、歯ぐき細胞活性化効果、歯ぐき細胞賦活効果、歯ぐきリモデリング促進効果、歯ぐき細胞防御力強化効果、歯ぐき防御力効果、歯ぐき修復効果、歯ぐき細胞代謝促進効果、歯ぐき細胞分裂促進効果と言い換える事ができる。
【００１５】
［１−１．（Ａ）成分］
（Ａ）成分は、トコフェロール酢酸エステル及びニコチン酸トコフェロールの少なくともいずれかである。当該成分を０．００５〜２質量％の含有量で含むことで、歯ぐき細胞増殖促進効果を奏する。特に、本願明細書の実施例にて証明されているとおり、当該成分の含有量が０．００３質量％であると、歯ぐき細胞増殖促進効果が確認されない（比較例４参照）。
【００１６】
（Ａ）成分の含有量は、本発明の所望の効果を発現する観点から、０．００５〜２質量％である。（Ａ）成分の含有量の下限は、細胞増殖効果を確保する観点から、０．００５質量％以上であり、０．０１質量％以上が好ましい。また、その上限は、細胞障害が生じることを抑制する観点から、２質量％以下であり、１．２質量％以下が好ましく、１質量％以下がより好ましい。
（Ａ）成分の含有量は、０．００５〜２質量％であり、０．００５〜１．２質量％が好ましく、０．０１〜１質量％がより好ましい。
【００１７】
（トコフェロール酢酸エステル）
トコフェロール酢酸エステル（酢酸トコフェロール、酢酸ｄｌ−αトコフェロール、ビタミンＥ酢酸エステル、酢酸ｄ−α−トコフェロール等ともいう）は、トコフェロールをアセチル化して得られる化合物である。トコフェロール酢酸エステルは、日本薬局方、旧化粧品原料基準（粧原基）又は医薬部外品原料規格の適合品を使用可能であり、ＤＭＳニュートリションジャパン等から入手可能である。
トコフェロール酢酸エステルの化学式を下記式（１）に示す。
【００１８】
【化１】
2020019713.tif 000002
【００１９】
（ニコチン酸トコフェロール）
ニコチン酸トコフェロール（トコフェロールニコチン酸エステル、ニコチン酸ｄｌ−α−トコフェロール、ビタミンＥニコチン酸エステル、ニコチン酸ｄ−α−トコフェロール等ともいう）は、α−トコフェロールにニコチン酸クロリド又は無水ニコチン酸を作用させてエステル化することで得られる化合物である。ニコチン酸トコフェロールも、日本薬局方、旧化粧品原料基準（粧原基）又は医薬部外品原料規格の適合品を使用可能であり、エーザイフード・ケミカル社等から入手可能である。
ニコチン酸トコフェロールの化学式を下記式（２）に示す。
【００２０】
【化２】
2020019713.tif 000003
【００２１】
［１−２．（Ｂ）成分］
本発明の歯ぐき細胞増殖促進剤は、上記（Ａ）成分に加えて、メントン、カルボン、シネオール、リモネン、アネトール、オイゲノール、メントール、シンナミックアルデヒドからなる群から選択される少なくとも１種の（Ｂ）成分をさらに含むことが好ましい。上記（Ａ）成分とともに、（Ｂ）成分をさらに含むことで、歯ぐき細胞増殖促進効果の発現をより向上し得る。
（Ｂ）成分としては、精油から単離したものや合成したものを使用してもよいし、これらを含む精油を使用してもよい。
【００２２】
（Ｂ）成分の含有量の下限は、細胞増殖効果を確保する観点から、０．００００１質量％以上が好ましい。また、その上限は、細胞培養培地（ＤＭＥＭ培地）への溶解性の観点から、５質量％以下が好ましく、２質量％以下がより好ましい。
（Ｂ）成分の含有量は、本発明の所望の効果の発現をより向上させるという観点から、０．００００１〜５質量％が好ましく、０．００００１〜２質量％がより好ましい。
【００２３】
（Ａ）成分と（Ｂ）成分とを併用する場合、（Ｂ）成分の質量に対する（Ａ）成分の質量の比（Ａ／Ｂ）は、０．００１〜２０００００が好ましく、０．００２〜１２００００がより好ましく、０．００５〜１０００００がさらに好ましい。（Ｂ）成分の質量に対する（Ａ）成分の質量の比（Ａ／Ｂ）が上記の範囲であると、本発明の所望の効果の発現がより向上する。
【００２４】
本発明の歯ぐき細胞増殖促進剤の形状及び剤形は特に限定されない。例えば、液体系（液体、液状、ペースト状）、固体系（固体、固形状）等の各種形状に調整できる。中でも、口腔に適用する製剤、特に歯肉に適用する製剤として調整することが好ましい。
【００２５】
本発明の歯ぐき細胞増殖促進剤は、局所投与剤として歯ぐき表面に直接適用することが好ましい。局所投与の手段としては、特に制限はない。例えば、外用製剤として塗布や貼付等の投与手段により、歯ぐき細胞増殖促進剤が歯ぐき表面に接触される手段が挙げられる。
【００２６】
外用製剤の具体例としては、口腔用塗布剤、口腔用貼付剤、口腔用噴霧剤、含嗽剤、洗口剤、歯磨剤、咀嚼剤、口腔内溶解剤、口腔内崩壊剤が挙げられる。
【００２７】
本発明の歯ぐき細胞増殖促進剤は、上記の外用製剤に配合可能な各種成分を、本発明の効果を損なわない範囲で添加することができる。
当該成分としては、例えば、界面活性剤、粘結剤、粘稠剤、甘味剤、防腐剤、香料、酸味料、滑沢剤、研磨剤、着色剤、保存料、光沢剤、流動化剤、結合剤、崩壊剤、薬用成分、水等の溶剤（溶媒）、賦形剤が挙げられる。以下に当該成分の具体例を示す。
【００２８】
研磨剤としては、例えば、無水ケイ酸、結晶性シリカ、非晶性シリカ、シリカゲル、アルミノシリケート等のシリカ系研磨剤、ゼオライト、リン酸水素カルシウム無水和物、リン酸水素カルシウム２水和物、ピロリン酸カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化アルミニウム、アルミナ、炭酸マグネシウム、第３リン酸マグネシウム、ケイ酸ジルコニウム、第３リン酸カルシウム、ハイドロキシアパタイト、第４リン酸カルシウム、合成樹脂系研磨剤が挙げられる。
研磨剤は、一種単独で、又は二種以上を組み合わせて使用し得る。
【００２９】
粘結剤としては、例えば、増粘性シリカ、プルラン、ゼラチン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カラギーナン、アルギン酸ナトリウム、キサンタンガム、ポリアクリル酸ナトリウム、アラビアガム、グアーガム、ローカストビーンガム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマーが挙げられる。
粘結剤は、一種単独で、又は二種以上を組み合わせて使用し得る。
【００３０】
粘稠剤（湿潤剤）としては、例えば、ソルビトール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、グリセリン、ポリエチレングリコールが挙げられる。
粘稠剤は、一種単独で、又は二種以上を組み合わせて使用し得る。
【００３１】
界面活性剤としては、例えば、アニオン界面活性剤、ノニオン界面活性剤が挙げられる。
界面活性剤は、一種単独で、又は二種以上を組み合わせて使用し得る。
【００３２】
アニオン界面活性剤としては、例えば、Ｎ−アシルアミノ酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、Ｎ−アシルスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、グリセリン脂肪酸エステルの硫酸塩、ＰＯＥアルキルスルホコハク酸塩、ＰＯＥアルキルエーテル硫酸塩、ＰＯＥアルキルエーテルリン酸塩が挙げられる。これらのうち、汎用性の点で、Ｎ−アシルアミノ酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩などが好ましく、発泡性・耐硬水性の点で、ラウロイルサルコシンナトリウム、アルキル鎖の炭素鎖長として炭素数が１０〜１６のα−オレフィンスルホン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムなどがより好ましい。
【００３３】
ノニオン界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重合体、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、グリセリンエステルのポリオキシエチレンエーテル、ショ糖脂肪酸エステル、アルキロールアミド、グリセリン脂肪酸エステルが挙げられる。これらのうち、汎用性の点で、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、アルキロールアミド、ソルビタン脂肪酸エステルなどが好適に用いられる。ポリオキシエチレンアルキルエーテルは、アルキル鎖の炭素鎖長が、炭素数で１４〜１８であることが好ましい。ポリオキシエチレンアルキルエーテルは、エチレンオキサイド平均付加モル数が１５〜３０であることが好ましい。ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油は、エチレンオキサイド平均付加モル数（平均付加ＥＯ）が２０〜１００であることが好ましい。アルキロールアミドは、アルキル鎖の炭素鎖長が炭素数１２〜１４であることが好ましい。ソルビタン脂肪酸エステルは、脂肪酸の炭素数が１２〜１８であることが好ましい。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルは、脂肪酸の炭素数が１６〜１８であることが好ましい。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルは、エチレンオキサイド平均付加モル数が１０〜４０であることが好ましい。
【００３４】
甘味剤としては、例えば、サッカリンナトリウム、ステビオサイド、ネオヘスペリジンヒドロカルコン、グリチルリチン、ペリラルチン、ｐ−メトキシシンナミックアルデヒド、ソーマチン、パラチノース、マルチトール、キシリトール、アラビトールが挙げられる。
甘味剤は、一種単独で、又は二種以上を組み合わせて使用し得る。
【００３５】
防腐剤としては、例えば、安息香酸ナトリウム、メチルパラベン、エチルパラベン、ブチルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル、エチレンジアミン四酢酸塩、塩化ベンザルコニウムが挙げられる。
防腐剤は、一種単独で、又は二種以上を組み合わせて使用し得る。
【００３６】
香料としては、例えば、天然香料、合成香料（単品香料）、調合香料（油脂香料（油性香料）、粉末香料等）が挙げられる。
香料は、一種単独で、又は二種以上を組み合わせて使用することができる。
【００３７】
薬用成分としては、例えば以下の成分が挙げられる：縮合リン酸塩、エタンヒドロキシジホスフォネート等の歯石予防剤；塩化ナトリウム等の収斂剤；塩化ストロンチウム、酢酸ストロンチウム、塩化亜鉛等の知覚過敏抑制剤など。
【００３８】
着色剤としては、例えば、ベニバナ赤色素、クチナシ黄色素、クチナシ青色素、シソ色素、紅麹色素、赤キャベツ色素、ニンジン色素、ハイビスカス色素、カカオ色素、スピルリナ青色素、タマリンド色素等の天然色素や、赤色３号、赤色１０４号、赤色１０５号、赤色１０６号、黄色４号、黄色５号、緑色３号、青色１号等の法定色素、リボフラビン、銅クロロフィリンナトリウム、二酸化チタンが挙げられる。
【００３９】
光沢剤としては、例えば、シェラック、カルナウバロウ、キャンデリラロウなどのワックス類、ステアリン酸カルシウムが挙げられる。
【００４０】
本発明の歯ぐき細胞増殖促進剤が液体系である場合のｐＨ（２０℃）は、通常、６〜１０であり、７〜９であることが好ましい。ｐＨ調整剤としては、例えば、酢酸、塩酸、硫酸、硝酸、クエン酸、リン酸、リンゴ酸、グルコン酸、マレイン酸、コハク酸、グルタミン酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等の酸やアルカリ、緩衝剤が挙げられる。
【００４１】
溶剤としては、例えば、水、及び、エタノール、プロパノールなどの炭素原子数３以下の低級アルコールが挙げられる。溶剤は、液体系の場合に通常含有される。溶剤として水を含有する場合、その含有量は、歯ぐき細胞増殖促進剤の全量に対して２０〜９５％であることが好ましい。溶剤として低級アルコールを含有する場合、その含有量は、歯ぐき細胞増殖促進剤の全量に対して１〜２０％であることが好ましい。
【００４２】
歯ぐき細胞増殖促進剤を食品製剤として使用する場合、通常、賦形剤が含有される。賦形剤としては、例えば、水飴、ブドウ糖、果糖、転化糖、デキストリン、オリゴ糖が挙げられる。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。以下の実施例は、本発明を好適に説明するためのものであって、本発明を限定するものではない。
【００４４】
［細胞増殖率の評価］
９６ウェルプレートにヒト歯肉線維芽細胞を播種し、ＤＭＥＭ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で一晩定着をさせた。所定量の各成分を含有するエタノール又はＤＭＳＯ溶液（歯ぐき細胞増殖促進剤）を調製し、最終的に各表に記載した量になるよう添加したＤＭＥＭ培地に培地交換し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で４８時間培養した。その後、培地中の終濃度が１０質量％となるよう細胞増殖試薬（ロシュ・ダイアグノティックス）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で０．５時間培養、マイクロプレートリーダーで培養上清の吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。
無添加培地で培養させた細胞上清（対照）の吸光度（比較例１）を１００とした際の相対値を、細胞増殖率として算出し、下記基準で評価した。
【００４５】
［評価基準］
Ａ：細胞増殖率が１４０％以上
Ｂ：細胞増殖率が１２０％以上１４０％未満
Ｃ：細胞増殖率が１１０％以上１２０％未満
Ｄ：細胞増殖率が１１０％未満
【００４６】
（実施例１〜２４及び比較例１〜５）
表１〜２の種類及び含有量の歯ぐき細胞増殖促進剤を用いた。細胞増殖率の評価結果と併せて表１〜２に記す。
【００４７】
【表１】
2020019713.tif 000004
【００４８】
【表２】
2020019713.tif 000005
【００４９】
実施例の結果から、本発明の歯ぐき細胞増殖促進剤を用いた場合、細胞増殖率の有意な増加がみられた。特にＢ成分を併用した場合、細胞増殖率の評価が全てＡであり、細胞増殖効果の向上が見られた。一方、Ｂ成分単独の使用（比較例２，３）の場合や、Ａ成分を使用してもその含有量が０．００５質量％未満である場合（比較例４，５）、Ｂ成分の有無にかかわらず、細胞増殖率の有意な増加は見られなかった。そのため、Ａ成分を０．００５質量％以上使用することで、歯ぐき細胞増殖促進剤の有効成分として利用し得ることがわかる。