(57)【要約】      （修正有）【課題】正常細胞を標的とすることによる副作用リスクが低減されているタンパク質性結合分子の提供。【解決手段】少なくとも１つのリンカーにより互いに分離される異なる結合部位に対する少なくとも２つの異なる特異的Ｖｈ又はＶｈｈ結合ドメインを含むタンパク質性分子であって、該タンパク質性分子は単一ポリペプチド鎖を含み、少なくとも１つの特異的Ｖｈ又はＶｈｈ結合ドメインは、ＭＨＣ１−ＭＡＧＥペプチド複合体に特異的に結合し、少なくとも２つの異なる特異的Ｖｈ又はＶｈｈ結合ドメインの異なる結合部位のうちの１つ又は複数は、ＭＨＣ１ＨＬＡ−Ａ０２０１によって提示されるＭＡＧＥ−ＡペプチドＹＬＥＹＲＱＶＰＧ、ＭＨＣ１ＨＬＡ−ＣＷ７によって提示されるＭＡＧＥ−ＡペプチドＥＧＤＣＡＰＥＥＫ、又はそれらの組み合わせから選択され、少なくとも１つのそのようなＶｈ又はＶｈｈ結合ドメインはＣＤ３に特異的に結合する、タンパク質性分子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのリンカーにより互いに分離される異なる結合部位に対する少なくとも２つの異なる特異的結合ドメインを含むタンパク質性分子であって、該タンパク質性分子は単一ポリペプチド鎖を含み、少なくとも１つの特異的結合ドメインは、ＭＨＣ１−ＭＡＧＥペプチド複合体に特異的に結合し、少なくとも２つの異なる特異的結合ドメインの異なる結合部位のうちの１つ又は複数は、ＭＨＣ１ＨＬＡ−Ａ０２０１によって提示されるＭＡＧＥ−ＡペプチドＹＬＥＹＲＱＶＰＧ、ＭＨＣ１ＨＬＡ−ＣＷ７によって提示されるＭＡＧＥ−ＡペプチドＥＧＤＣＡＰＥＥＫ、又はそれらの組み合わせから選択され、少なくとも１つのそのような結合ドメインはＣＤ３に特異的に結合する、タンパク質性分子。
【請求項２】
異なる特異的結合ドメインのうちの２つ以上は、異常細胞に特有の２つ以上の表面分子における結合部位を標的とする、請求項１に記載のタンパク質性分子。
【請求項３】
少なくとも１つのそのような結合ドメインはＶｈドメインである、請求項１又は２に記載のタンパク質性分子。
【請求項４】
エフェクター部分をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質性分子。
【請求項５】
少なくとも２つのＶｈドメインを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質性分子。
【請求項６】
異なる結合部位に特異的な少なくとも２つのＶｈドメインとＦｃ単量体とを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質性分子。
【請求項７】
２つのＦｃ単量体を介して二量体化された２つの請求項６に記載のタンパク質性分子を含む二量体タンパク質性分子。
【請求項８】
２つの異なる請求項６に記載のタンパク質性分子を含む、請求項７に記載のヘテロ二量体分子。
【請求項９】
異常細胞に関連する疾患の治療における使用のための、請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質性分子。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のタンパク質性分子と適切な賦形剤とを含む医薬製剤。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質性分子をコードする核酸分子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載の核酸分子及び／又は請求項１２に記載のベクターを含む細胞であって、前記核酸分子は好ましくはゲノムに組み込まれている、細胞。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質性分子を製造するための方法であって、請求項１３に記載の細胞を培養するステップと、前記タンパク質性分子を発現させるステップと、前記タンパク質性分子を培養物から分離するステップと、を含む方法。
【請求項１５】
Ｆｉｇ．１又はＦｉｇ．２に記載のドメイントポロジーを有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質性分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患及び癌における異常細胞を標的とする抗体様分子の分野に関する。本発明はまた、異常細胞を標的としつつ、正常細胞には本質的な影響を与えないそのようなタンパク質性分子に関する。特に、本発明は、異常細胞上の少なくとも２つの異なる結合部位に特異的な結合ドメインを含む（単鎖）タンパク質性分子に関する。
【背景】
【０００２】
今日の創薬の世界における主な課題は、悪性疾患（例えば、癌、自己免疫疾患）に関連する異常細胞に十分に特異的である治療用分子の設計である。そのような特異性は、健常な細胞に許容可能な低い薬物関連有害反応を実現するのに必要とされる。克服すべき主な障害は、異常細胞上に標的分子が存在するだけでなく、より低頻度ではあれ、健常な細胞上にも標的分子が存在することである。真に腫瘍特異的な標的又は異常細胞特異的な標的は極めて稀である。
【開示】
【０００３】
したがって、本発明は、異常細胞を標的とすることに関して改善された特異性を有し、意図せずに正常細胞を標的とすることによって誘導される望ましくない副作用のリスクが低減されているタンパク質性結合分子を提供する。
【０００４】
すなわち、本発明は、少なくとも１つのリンカーにより分離される異なる結合部位に対する少なくとも２つの異なる特異的結合ドメインを含むタンパク質性分子であって、単一ポリペプチド鎖を含むタンパク質性分子を提供する。
【０００５】
本発明によれば、「タンパク質性分子」は、単一メッセンジャーＲＮＡ分子からの発現産物として得ることができる少なくとも一連なりのアミノ酸残基を含む分子である。さらに、本発明によれば、タンパク質性分子は、任意の翻訳後修飾及び／又は任意の他の修飾（例えば、化学的修飾に起因するもの（例えば、エフェクター部分の連結））の結果として、炭水化物、ジスルフィド結合、リン酸化、硫酸化等を含んでもよい。本発明の一実施形態において、タンパク質性分子は、少なくとも２つの特異的結合ドメインを含む単一ポリペプチド鎖を含む。好ましい実施形態において、本発明のタンパク質性分子は、少なくとも１つのリンカーにより分離される結合ドメインを含む。当然のことながら、本発明のタンパク質性分子はまた、例えば、ペプチド結合によって、又は当技術分野で知られている任意のリンカー化学によって連結されたタンパク質ドメイン又はアミノ酸配列を備えた他の官能基を含むことができる。
【０００６】
「ポリペプチド鎖」は、一連なりのアミノ酸残基と定義される。「特異的結合ドメイン」は、分子間のバックグラウンド相互作用よりも高い結合親和性で、分子上の結合部位（例えばエピトープ）に優先的に結合するドメインである。本発明において、「バックグラウンド相互作用」は、ＫＤ  １０Ｅ−４Ｍよりも低い親和性を有する相互作用である。特異的結合ドメインは、ＫＤ  約１０Ｅ−５Ｍよりも高い親和性で結合することが好ましい。本発明のタンパク質性分子における特異的結合ドメインは、少なくとも結合部位でそれらのフォールディングを可能にする分子サイズを有する。サイズの上限において、結合ドメインは、依然として適切及び安定なフォールディング及び発現を可能にするサイズを有する。通常、これらのサイズ要件を満たすドメインは約２５〜最大５００アミノ酸残基長であり、好ましいドメインは４０〜２００アミノ酸残基長であり、より好ましくは、ドメインは、ほぼ免疫グロブリンの重鎖（「Ｖｈ」）の可変ドメインのサイズである。本発明のタンパク質性分子に関しては、免疫分子中に存在する特異的結合ドメイン（例えば、Ｔ細胞受容体及び免疫グロブリン中に存在するもの）が特に有用である。特に、Ｖｈ配列は、本発明のタンパク質性分子における好ましい特異的結合ドメインである。Ｖｈドメインは、特異的結合ドメインとしての使用に特に適している。Ｖｈドメインは、比較的安定であり、種々の発現系を介して得るのが容易である。さらに、例えばドメイン安定性又は溶解性をさらに改善する工学的方法は容易に利用可能である。Ｖｈ配列で構成されるそのような結合ドメインに関して利用可能な良好な供給源はファージディスプレイライブラリーである。また、そのような結合ドメインに関する良好な供給源は天然ライブラリー、合成ライブラリー及び半合成ライブラリーである。
【０００７】
上述のように、本発明のタンパク質性分子における特異的結合ドメインは少なくとも１つのリンカーにより分離される。これらのリンカーは、ペプチド結合によって結合ドメインと結合されることが好ましい。多くの場合、４〜１５アミノ酸残基の簡素なＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーで十分であり得るが、アミノ酸鎖のより大きな可撓性が望ましい場合、及び／又は連続したドメイン間のより大きな間隔が望ましい場合には、より長い又はより複雑なリンカーを使用してもよい。好ましいリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、（ＧｌｙＳｅｒＴｈｒＳｅｒＧｌｙＳｅｒ）ｎ、又はタンパク質フォールディングのための可撓性、及びポリペプチドがその二重又は多重活性（すなわち、２つ以上の異なる結合部位に結合すること）を示すための可撓性を提供する任意の他のリンカーである。適切なリンカーのさらなる例は、ヒトマルチドメイン血漿タンパク質中のドメインを結合するリンカー配列である。免疫グロブリンを含むマルチドメイン血漿タンパク質のリンカー配列を使用することはいくつかの利点を有する。本発明の分子における血漿中で露出されるこれらのヒトアミノ酸配列の使用は有害な免疫応答に対するリスクを低減させ得る。さらに、これらのリンカー配列は、いくつかのタンパク質−標的相互作用を同時に発揮するのに必要とされるドメイン間の可撓性をマルチドメインタンパク質に提供するように自然選択により最適化されている（マルチドメインタンパク質では２つ以上のドメインを含む）。ドメイン間のリンカーを含むそのようなマルチドメイン血漿タンパク質の例は、ビトロネクチン、フィブリノゲン、第ＶＩＩＩ因子、フィブロネクチン、フォンビルブラインド因子、第ＸＩＩ因子、プラスミノーゲン、第Ｈ因子、第Ｉ因子、Ｃ１、Ｃ３、ベータ２−糖タンパク質１、免疫グロブリンＭ及び免疫グロブリンＧである。本発明の単鎖分子においてドメインを共有結合するのに特に適したリンカーの例は、好ましくはヒト由来の免疫グロブリン中のヒンジ領域のアミノ酸配列に基づくリンカーである。
【０００８】
本発明によれば、本発明のタンパク質性分子の少なくとも２つの特異的結合ドメインは、少なくとも２つの異なる結合部位に対して結合親和性を付与された異なる結合ドメインである。本発明において、結合部位は、異常細胞の細胞表面に関連する分子（の一部）であることが理解されよう。異なる結合部位が異なる分子の一部であるか、又は同じ分子上に位置するか、又はそれらの任意の組み合わせであることは本発明の一部である。すなわち、本発明によれば、本発明のタンパク質性分子の少なくとも２つの異なる特異的結合ドメインにより標的とされる少なくとも２つの異なる結合部位は異常細胞の細胞表面に関連する。本発明の好ましい実施形態では、異なる結合部位が、同じ異常細胞の表面に配置されている。好ましい結合部位は、異常細胞表面分子に位置する結合部位である。そのような細胞表面分子の例は、インテグリン、細胞表面受容体、細胞表面マーカー、及びＴ細胞エピトープと複合体形成された主要組織適合性複合体分子である。
【０００９】
「異常細胞」は、その健常な正常対応物から逸脱した細胞と定義される。異常細胞は、例えば腫瘍細胞及び自己免疫細胞である。
【００１０】
本発明によれば、異常細胞の細胞表面に関連する少なくとも２つの異なる結合部位に結合するのに特に適している少なくとも２つの異なる特異的結合ドメインを含むタンパク質性分子（「多重特異性」タンパク質性分子）が提供される。単一結合分子で異常細胞（例えば腫瘍細胞）上の２つ以上の標的結合部位を標的とすることにより、両方の標的が１つの健常な細胞上にも存在するというリスクが著しく減少する。異なる標的結合部位それぞれに対する結合分子の親和性は、すべての異なる結合部位と同時に結合する方向に大きく偏るようにＫｏｎ及びＫｏｆｆが設計されることが好ましい。異なる標的結合部位のうちの１つのみを有する正常細胞は、好ましくは、十分に長い時間は拘束されず、それにより有害な影響の発生が低減される。すなわち、本発明のタンパク質性分子の特異性は、異常細胞上の多重結合部位に結合するためのそれらのアビディティーを増大させることによって増大される。アビディティーは、好ましくは、タンパク質性分子における少なくとも２つの異なる結合ドメインのうちの少なくとも１つのドメインの複数コピー、好ましくは２〜６コピーを組み込むことによって増大させる（「多価」タンパク質性分子）。Ｆｉｇ．１及びＦｉｇ．２は多数の好ましい分子デザインを示す。本発明のタンパク質性分子の少なくとも２つの異なる特異的結合ドメイン各々の少なくとも１つのコピーがそれぞれの結合部位に結合しなくてはならないことは理解されよう。当然のことながら、２つ以上のコピーが同時に結合することが好ましく、タンパク質性分子に存在する結合ドメインのすべてのコピーが同時に結合することが最も好ましい。
【００１１】
本発明のさらなる実施形態では、少なくとも１つのリンカーにより互いに分離される異なる結合部位に対する少なくとも３つの特異的結合ドメインを含むタンパク質性分子が提供される。
【００１２】
本発明のタンパク質性分子は、正常細胞を上回る異常細胞に対する特異性を提供する最小数の異なる特異的結合ドメインを含むことが好ましい。また、本発明のタンパク質性分子が、所望の特異性を提供するのに必要とされる異なる特異的結合ドメイン各々の最小数のコピーを含むことが好ましい。特異性に関する本発明のこれらの最適タンパク質性分子は、種々の数の異なる結合ドメイン、種々の数の異なるドメイン各々のコピー、及び種々の数の異なるドメイン及びコピーに応じてあり得る異なるドメイントポロジーを有するタンパク質性分子から選択される。本発明のタンパク質性分子は、２つ又は３つの異なる結合ドメインを含むことが好ましい。本発明のタンパク質性分子は、異なるドメイン各々の１〜６コピーを含むことが好ましい。したがって、本発明の典型的なタンパク質性分子は、２つの異なる結合ドメインＡ、Ｂを含み、各ドメインの４コピーを有し、ドメイントポロジーＡ−Ｂ−Ａ−Ｂ−Ａ−Ｂ−Ａ−Ｂを有する。異なるドメイン、ドメインのコピー及びトポロジーの数に関する好ましいタンパク質性分子のいくつかの典型的な例についてはＦｉｇ．１及びＦｉｇ．２を参照されたい。
【００１３】
反復タンパク質性構造は発現困難な場合がある。同じ分子に、又はさらには分子上の同じ結合部位に特異的な（やや）異なる結合ドメインを選択することにより、反復性構造に関する発現問題は大いに減少される。これらの発現問題は、連続したドメインの結合のために異なるリンカーを選択することによりさらに解決が図られる。すなわち、本発明の典型的に好ましい分子の例は下記構造を有する。
Ａ−リンカー１−Ｂ’−リンカー２−Ａ”−リンカー３−Ｂ−リンカー１−Ａ’−リンカー２−Ｂ”
【００１４】
すなわち、本発明によれば、異常細胞の細胞表面に関連する少なくとも３つの異なる結合部位に結合するのに特に適した少なくとも３つの異なる特異的結合ドメインを含むタンパク質性分子が提供される。好ましい実施形態において、本発明のタンパク質性分子は、少なくとも１つのＶｈドメインを含む特異的結合ドメインを含む。より好ましくは、本発明のタンパク質性分子における２つ、３つ又はそれ以上の特異的結合ドメインはすべてＶｈドメインである。すなわち、本発明のタンパク質性分子は、少なくとも１つの特異的結合ドメインがＶｈドメインであるタンパク質性分子である。好ましくは、ＶｈドメインはヒトＶｈドメインである。
【００１５】
上述のように、本発明の好ましい実施形態において、本発明のタンパク質性分子により標的とされる異なる結合部位は同じ異常細胞の表面に位置する。結合部位を含む分子が、本発明の結合分子と一緒に腫瘍細胞へ内部移行されることが好ましい。好ましい実施形態において、細胞は内部移行の結果としてアポトーシスへと進む。標的異常細胞への結合の際に標的異常細胞溶解又は食作用を媒介するタンパク質性分子も本発明に包含される。すなわち、本発明は、少なくとも１つの結合ドメインが、受容体に対するリガンド、又はそのようなリガンドの受容体結合断片及び／又は誘導体であるタンパク質性分子を提供する。腫瘍細胞上の標的受容体に対するそのような結合ドメインの結合によって本発明の結合タンパク質性分子の内部移行が誘導されることが好ましい。受容体に対する好適なリガンドは、いくつかの例を挙げると、増殖因子、レクチン、キナーゼ、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、Ｔｏｌｌ様受容体リガンド及びＴ細胞エピトープである。
【００１６】
好ましい一実施形態において、本発明のタンパク質性分子は、特異的結合ドメインを含むポリペプチド鎖に連結された少なくとも１つのエフェクター部分をさらに含む。好ましくは、エフェクター部分は、治療用分子の効力を改善し、及び／又は治療用分子の有効性を増大させる。エフェクター部分が、ペプチド結合により、好ましくはリンカーにより本発明のタンパク質性分子に共有結合されることは本発明の一部である。あるいは、本発明の一部として、エフェクター分子は、当技術分野で知られている任意の他の適切なリンカー化学を適用してタンパク質性分子に連結される。さらに別に実施形態において、本発明のタンパク質性分子は、エフェクター部分上に結合部位に対する特異的結合ドメインを含む。本発明のそのような結合分子の利点は結合事象の順序における柔軟性である。本発明のタンパク質性分子はまず、異常細胞上で標的結合部位に結合することができ、続いて、異常細胞上に局在化したタンパク質性分子に曝露されたエフェクター部分への結合がなされる。本発明のそのようなタンパク質性分子は例えば癌の治療に使用される。そのようなタンパク質性分子の利点は、異常細胞にエフェクター部分を特異的に送達することができ、正常細胞がエフェクター部分の有害作用に曝露されることを防ぐことである。
【００１７】
本発明による好ましいエフェクター部分は多数であり、例えば毒素、スタチン、アポプチン、キレート化放射性金属イオン、及び放射性ヨウ素である。本発明による他の適切なエフェクター部分は、リシンＡ、ゲロニン、サポリン、インターロイキン−２、インターロイキン−１２、ウイルスタンパク質Ｅ４ｏｒｆ４及びＮＳ１、並びに非ウイルス性細胞タンパク質ＨＡＭＬＥＴ、ＴＲＡＩＬ及びｍｄａ−７であり、その中でも後者の５つは、アポプチンのように、そのようなエフェクター部分のうちの少なくとも１つを含む本発明のタンパク質性分子の内部移行後に異常細胞でアポトーシスを特異的に誘導する。
【００１８】
本発明のタンパク質性分子が、まず標的異常細胞に結合した後、内部移行するように設計される場合、エフェクター部分は続いてその細胞内（細胞障害性）機能を有し得る。そのようなエフェクター部分は、細胞障害性効果の特異性に対する寄与を有することが好ましい。したがって、異常細胞において細胞死を誘導するが、正常細胞では誘導しない分子をエフェクター部分として使用することが好ましい。そのような特異的エフェクター部分の例はアポプチンである。
【００１９】
したがって、本発明は、エフェクター部分をさらに含むタンパク質性分子を提供する。
【００２０】
上述のように、本発明の好ましいタンパク質性分子は少なくとも２つの異なる特異的結合ドメインを含む。特に好適な特異的結合ドメインはＶｈ配列に基づくドメインである。すなわち、本発明はまた、少なくとも２つのＶｈドメインを含むタンパク質性分子を提供する。本発明のそのような分子のいくつかの例をＦｉｇ．１及びＦｉｇ．２に示す。好ましい実施形態において、これらのＶｈドメインはヒトＶｈ配列に由来する。Ｖｈドメインはそれ自体、既に比較的安定であることが理解されよう。依然として、ヒトＶｈドメインの安定性及び溶解性は、当技術分野で知られている技術アプローチによりさらに改善させることができる。ヒトＶｈ配列の「ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚａｔｉｏｎ）」と呼ばれるプロセスを適用することはその目的に特に適している。ここでは、ドメインの結合特異性及び親和性に寄与しないヒトＶｈ配列における選択されたアミノ酸残基が、ラマＶｈドメインの対応部位に存在するアミノ酸残基に置換される。安定性／溶解性の改善に寄与する好ましいアミノ酸置換は、Ｇｌｕ６Ａｌａ、Ａｌａ３３Ｃｙｓ、Ｖａｌ３７Ｐｈｅ、Ｇｌｙ４４Ｇｌｕ、Ｌｅｕ４５Ａｒｇ、Ｔｒｐ４７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ７４Ａｌａ、Ａｒｇ８３Ｌｙｓ、Ａｌａ８４Ｐｒｏ、Ｔｒｐ１０３Ａｒｇ、又はＬｅｕ１０８Ｇｌｎである。したがって、本発明はまた、安定性及び／又は溶解性の改善を伴うラクダ化されたヒトＶｈドメインを含むタンパク質性分子を提供する。
【００２１】
本発明のタンパク質性分子に導入され得る他の機能は、半減期の改善（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を包含することができるか、又は１つ又は複数の結合ドメインがＨＳＡにおける結合部位に結合し得る）、又は補体活性化（免疫グロブリンのＦｃ単量体を包含することができ、この場合、本発明の分子は二量体化され得る。）に関連し得る。導入可能な他の官能基は、サイトカイン、ホルモン、Ｔｏｌｌ様受容体リガンド、（活性化）補体タンパク質等である。
【００２２】
すなわち、本発明は、異なる結合部位に特異的な少なくとも２つのＶｈドメインとＦｃ単量体とを含むタンパク質性分子を提供する。また、本発明は、２つのＦｃ単量体を介して二量体化された２つのタンパク質性分子を含む二量体タンパク質性分子を提供する。免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含むタンパク質性分子も本発明の一部である。Ｆｃ単量体に類似してＣＨ３ドメインは二量体化ドメインとして機能し得る。ホモ二量体及びヘテロ二量体タンパク質性分子は本発明の一部である。ホモ二量体結合分子は、同一のアームを有する二量体化されたＦｃ単量体を含む。本発明のヘテロ二量体タンパク質性分子の不均一性は、ヘテロ二量体における２つのＦｃ単量体に由来するものであり、それら各々の特異的結合ドメイン、リンカー及び／又はエフェクター部分の型、数及び／又はトポロジーが異なる。すなわち、一実施形態において、本発明は、２つの異なるタンパク質性分子を含むヘテロ二量体分子を提供する。２つの異なるタンパク質性分子は、それぞれのＦｃ単量体を介して二量体化される。好ましい対形成生化学を適用すると、ヘテロ二量体はホモ二量体より優先的に形成される。例えば、２つの異なるＦｃ単量体は、Ｒｉｄｇｗａｙら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９９６に記載される「ノブ・イントゥ・ホール」（“ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ”）ＣＨ３ドメイン工学技術を適用すると強制的な対形成に付される。二量体化されたＦｃ単量体を含む本発明のタンパク質性分子の利点は、これらのタンパク質性分子が結合する異常細胞の表面での食作用及び／又は細胞溶解活性の局在化である。これらの活性は、これらの異常細胞に特異的に結合された本発明のタンパク質性分子により誘導される、異常細胞に対する有害作用を増強し得る。本発明のそのようなヘテロ二量体タンパク質性分子の利点は、２つのアームにおける異なる／異なって位置する特異的結合ドメインに関して、その空間的可撓性が増大することである。
【００２３】
本発明の一実施形態では、異常細胞上の少なくとも２つの異なる結合部位に特異的な少なくとも２つの異なる結合ドメイン各々の１又は複数コピーを含む結合分子が提供される。癌及び自己免疫疾患のような細胞異常は、異常細胞表面上の表面分子の特有の組み合わせの存在、及び／又は表面分子の比較的高い細胞表面密度を呈する。すなわち、本発明のタンパク質性分子により標的とされる少なくとも２つの異なる結合部位が異常細胞上に位置することは本発明の好ましい実施形態の１つである。これら少なくとも２つの異なる結合部位がすべて正常細胞上に存在するわけではなく、及び／又は正常細胞上ではより少ない数で存在するのがより一層好ましい。例は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）における結合部位に対する特異的結合ドメインの少なくとも１つのコピー、及び大腸癌中に結腸の異常細胞において発現される改変されたグリコシル化パターンを伴うＭＵＣ−１における結合部位に対する特異的結合ドメインの少なくとも１つのコピーを含む本発明のタンパク質性分子である。改変ＭＵＣ−１は結腸の正常細胞では発現されず、ＣＥＡは結腸の腫瘍細胞上で過剰発現される。すなわち、少なくとも２つの異なる結合部位のすべてが異常細胞に特有であり、正常細胞上では全く存在しないのが最も好ましい。結合部位のそのような組み合わせの例は、ＨＬＡと複合体形成された２つの特異的マーカーに由来するＴ細胞エピトープである。すなわち、好ましい実施形態において、本発明のタンパク質性分子は、異常細胞に関連する疾患の治療における使用のために提供される。
【００２４】
対象への投与に関して、本発明のタンパク質性分子を製剤化しなくてはならない。通常、これらのタンパク質性分子は非経口投与される。製剤化に関しては、単に注射用の生理食塩水だけで十分であり得る。安定面の理由から、より複雑な製剤が必要な場合もある。本発明は、通常の添加剤を備える凍結乾燥組成物及び液体組成物を意図する。したがって、本発明は、本発明の実施形態のいずれかによるタンパク質性分子と適切な賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００２５】
本発明によるタンパク質性分子の投与量は、いわゆる用量上昇（ｒｉｓｉｎｇ−ｄｏｓｅ）実験において動物研究及び臨床研究を通じて確立されなくてはならない。通常、用量は今日の抗体投与量と同程度である（モルレベルでは、本発明の分子の重量は抗体の重量とは異なり得る）。通常、そのような投与量は３〜１５ｍｇ／ｋｇ（体重）、又は１回当たり２５〜１０００ｍｇである。
【００２６】
例えば、腫瘍療法の分野では、本発明のタンパク質性分子は、単一結合部位に結合する現在の単一作用物質に取って代わると予測される。さらに、特に治療がより困難な腫瘍では、本発明によるタンパク質性分子の第１の適用は、（少なくとも初期には）おそらく他の治療（標準的なケア）と組み合わせて行われる。当然のことながら、本発明はまた、現在の治療が十分効率的ではないか、又は治療オプションが現在利用可能ではない任意の他の腫瘍の新規又は第１の治療における使用のためのタンパク質性分子を提供する。すなわち、本発明はまた、本発明のタンパク質性分子と従来の細胞分裂阻害剤及び／又は殺腫瘍剤とを含む医薬組成物を提供する。また、本発明は、癌のアジュバント療法における使用のための医薬組成物であって、本発明のタンパク質性分子を含む組成物を提供する。さらに、本発明は、癌の併用化学療法的治療における使用のための医薬組成物であって、本発明のタンパク質性分子を含む組成物を提供する。本発明の医薬組成物と組み合わされる化学療法的治療の例は、エトポシド、パクリタキセル、ドキソルビシン及びメタトレキサートである。
【００２７】
本発明の医薬組成物は、典型的には、癌、特に本発明の好ましいタンパク質性分子の少なくとも２つの異なる結合部位が腫瘍細胞上に存在する形態の癌の治療においてそれらの用途が見出される。本発明の結合ドメインを使用して、腫瘍特異的抗原を提示する腫瘍を特定するのは容易である。これはｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができる（画像）。
【００２８】
当然のことながら、本発明はまた、本発明の実施形態のいずれかによるタンパク質性分子をコードする核酸分子を含む。本発明の分子は、原核生物及び真核生物中で産生させることができる。原核生物のコドン使用頻度は真核生物のコドン使用頻度と異なり得る。本発明の核酸はこれらの点で適合させることができる。同様に、分泌に必要なエレメント、並びにプロモーター、ターミネーター、エンハンサー等を付加させてもよい。また、タンパク質性分子の単離及び／又は精製に必要及び／又は有益であるエレメントを付加させてもよい。典型的には、本発明の核酸は、それらが産生される宿主に適した発現ベクター中に供給される。産生プラットフォームの選択は、分子のサイズ、タンパク質フォールディングに関する予想される課題、グリコシル化を必要とするさらなる配列が存在するかどうか、単離及び／又は精製に関する予想される課題等に依存する。例えば、本発明の特異的結合ドメインがジスルフィド結合を含むか含まないかは、好ましい産生プラットフォームの選択のガイドとなる。したがって、典型的には、本発明の核酸は、本発明のタンパク質性分子が産生される産生及び精製プラットフォームに適合する。すなわち、本発明は、本発明のタンパク質性分子をコードする核酸分子を含むベクターを提供する。真核生物における安定な発現のために、本発明のタンパク質性分子をコードする核酸は、（発現停止されていない適切な部位で）宿主細胞ゲノムに組み込まれることが好ましい。
【００２９】
すなわち、一実施形態において、本発明は、宿主細胞のゲノムに核酸を組み込むための手段を含むベクターを含む。本発明は、タンパク質性分子コード核酸分子が存在し、それにより本発明のタンパク質性分子を産生することが可能な宿主細胞又は生物をさらに含む。すなわち、好ましい実施形態において、本発明は、（好ましくはゲノムに組み込まれている）本発明の核酸分子及び／又は（本発明のタンパク質性分子をコードする核酸分子を含む）本発明のベクターを含む細胞を含む。
【００３０】
また、本発明のタンパク質性分子を製造するための方法であって、（好ましくは細胞のゲノムに組み込まれている）本発明のタンパク質性分子をコードする核酸分子及び／又は（本発明のタンパク質性分子をコードする核酸分子を含む）本発明のベクターを含む本発明の細胞を培養することと、タンパク質性分子を発現させることと、タンパク質性分子を培養物から分離することと、を含む方法が本発明に包含される。
【００３１】
上述の実施形態のいずれかによる本発明の典型的なタンパク質性分子は、このセクションにおいて、あるいはＦｉｇ．１及びＦｉｇ．２において、あるいは以下及び実施例セクションで提供される例によって説明される結合分子により提供及び例示される。すなわち、本発明は、Ｆｉｇ．１又はＦｉｇ．２に記載のタンパク質性分子を提供する。
【００３２】
略語：
Ａｂ：抗体；ＡＤＣＣ：抗体依存性細胞媒介性細胞障害性；ＣＤＣ：補体依存性細胞障害性；ＣＤＲ：相補性決定領域；ＣＨ：抗体の重鎖の定常ドメイン；ＣＨＯ：チャイニーズハムスター卵巣；ＤＡＭＰｓ：損傷関連分子パターン；ＨＥＫ：ヒト胎児由来腎臓；ＩＥＰ：等電点；Ｉｇ：免疫グロブリン；ＭＡＧＥ：メラノーマ関連抗原；ＭＨＣ：主要組織適合性複合体；ＰＡＭＰｓ：病原体関連分子パターン；ＲＡ：関節リウマチ；ｓｃ−Ｆｖ：単鎖可変断片；ＳＬＥ：全身性エリテマトーデス；ＶＨＨ又はｓｄＡｂ：単一ドメイン抗体；ＴＣＲ：Ｔ細胞受容体；ＶＨ、Ｖｈ又はＶＨ：抗体重鎖ドメインの可変アミノ酸配列。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１−１】Ｆｉｇ．１：  各々が異なる結合部位に結合する２つ以上の異なる結合ドメイン各々の１又は複数コピーを含む本発明の結合分子であって、一実施形態において本発明の一部としてのエフェクター部分を含む結合分子のトポロジーの例。  １：  ２つの異なる結合ドメイン「Ｄ１」及び「Ｄ２」を含み、結合部位１に関しては二価であり、結合部位２に関しては一価である結合分子のトポロジー。  ２：  ２つの異なる結合ドメインを含み、結合部位１に関しては一価であり、結合部位２に関しては多価（例えば三価〜六価）である結合分子。本発明による多くの単鎖ポリペプチドの２つの例を示す。単一結合ドメイン及び第２の結合ドメインの多重コピーの位置に関するすべてのあり得る並べ替えもまた本発明の一部であり、波括弧（ａｃｃｏｌａｄｅ）間の異なるドメインの集合（ｅｎｓｅｍｂｌｅ）及びドメインの数により可視化される。  ３：  各々が異なる結合部位に結合する２つの異なる結合ドメインを含み、第１の結合ドメインの２〜６コピーを有し、第２の結合ドメインの２〜６コピーを有し、両方の結合部位に関して多価を提供する結合分子。例として、同じ結合部位に結合する結合ドメインが連続した順序で連結される結合分子が示される。両方の種類のすべての結合ドメインの単鎖結合分子におけるドメイン位置に関する並べ替えにより得られるすべてのドメイントポロジーもまた本発明の一部である。  ４：  それぞれ、３つ、４つ、５つ又は６つの異なる結合部位に結合する３つ、４つ、５つ又は６つの異なる結合ドメインを含み、例えば、結合部位１に関して一価又は多価であり、結合部位２に関して一価又は多価である結合分子（３〜６の異なる結合部位に関する価は例えば一価〜六価である）。例として、それぞれ、結合分子において３つ、４つ、５つ及び６つの異なる結合ドメインを伴う、１〜６のクラスター化された同一結合ドメインが連続した順序で連結される４つの結合分子が示される。３〜６の異なる結合ドメインの１〜６のすべてのコピーの、単鎖結合分子におけるドメイン位置に関する並べ替えにより得られるすべてのドメイントポロジーもまた本発明の一部である。  ５：  各々が別個の異なる結合部位に結合する２つの異なる結合ドメインを含み、結合部位１に関しては一価又は多価である１つの結合ドメインを有し、結合部位２に関しては一価又は多価である第２の結合ドメインを有し（価はともに例えば一価〜六価）、結合分子に（共有）結合された１つ又は複数のエフェクター部分を伴う結合分子。例として、結合分子のＣ末端に共有結合されたエフェクター部分を伴う、１〜６の結合ドメインの２セットが連続した順序で連結される結合分子が示される。単鎖結合分子における各ドメイン位置に関する並べ替えにより得られるすべてのドメイントポロジーもまた本発明の一部である。
【図１−２】Ｆｉｇ．１：  各々が異なる結合部位に結合する２つ以上の異なる結合ドメイン各々の１又は複数コピーを含む本発明の結合分子であって、一実施形態において本発明の一部としてのエフェクター部分を含む結合分子のトポロジーの例。  ６：  ５に類似するが、ここでは３〜６の異なる結合ドメイン（その各々に関して、結合ドメインの１〜６コピーが結合分子の一部である。）を有する。
【図２】Ｆｉｇ．２：  本発明のタンパク質性分子の好ましいドメイントポロジーの例を示す画。ＶＨドメイン及び多重特異性であるマルチドメインタンパク質の構築のための別個のリンカー配列のあり得る組み合わせの例が提供される。レーンａ〜レーンｈでは、２つ又は３つの異なる結合ドメインを含み、種々の結合ドメインの１、２、３又は４コピーを含む本発明のタンパク質性分子の例（いずれにおいても、すべてのコピーが２つ又は３つの異なるリンカーで連結されている。）が提供される（本発明のさらなる好ましいドメイントポロジーに関してはＦｉｇ．１  例１〜４も参照）。レーンｉ及びレーンｋでは、本発明の例示される好ましいタンパク質性分子が、異なる結合ドメインを含む単鎖ポリペプチドに連結されたエフェクター部分をさらに含む（少なくとも１つのエフェクター部分を含む本発明のさらなる好ましいタンパク質性分子は、Ｆｉｇ．１  例５及び６に提供される）。レーンｊ及びレーンｋでは、本発明の例示される好ましいタンパク質性分子は、異なる結合ドメインに連結されたＦｃ単量体をさらに含む。
【図３】Ｆｉｇ．３：  ＨＬＡ−Ａ１／ＭＡＧＥ−Ａ１特異性を有する二重特異的ｓｃＦｖ抗ＣＤ３×ｓｃＴＣＲβαの模式図である。
【図４】Ｆｉｇ．４：  一次ヒトＴリンパ球への二重特異的ｓｃＦｖ抗ＣＤ３×ｓｃＴＣＲβαの結合を示す。一次ヒトＴリンパ球への二重特異的ｓｃＦｖ抗ＣＤ３×ｓｃＴＣＲβαの結合は、ＦＩＴＣ標識抗Ｖα−１２．１特異的ｍＡｂを使用してフローサイトメトリーにより確証された。簡潔に述べると、０．５×１０６個の一次ヒトＴリンパ球を（氷上で）３０分間インキュベートして、２９３Ｔ細胞からの上清は、二重特異的ｓｃＦｖ×ｓｃＴＣＲを発現した。次に、ＦＩＴＣ標識抗Ｖα−１２．１  １μｇを添加して、３０分間インキュベートした。非関連ＦＩＴＣ標識抗体で染色した二重特異的ｓｃＦｖ×ｓｃＴＣＲにより結合された細胞（陰性対照、白）、及びＶα−１２．１で標識されたｓｃＦｖ×ｓｃＴＣＲにより結合された細胞が示される。
【図５】Ｆｉｇ．５：  一次ヒトＴリンパ球が、ＨＬＡ−Ａ１／ＭＡＧＥ−Ａ１陽性腫瘍細胞を特異的に死滅させることを示す。Ｘ軸：エフェクター（：）標的細胞比  １０（：）１、３（：）１、１（：）１、０．３（：）１。−‥−‥−線は、メラノーマ細胞特異的抗原２Ｇ１２特異的二重特異的分子を伴うＴリンパ球を表し、直線（−）は、Ｔリンパ球＋ＨＬＡ−Ａ１−ＭＡＧＥ−Ａ１特異的二重特異的分子を表し、−−−−線は、二重特異的分子を伴わないＴリンパ球を表す。一次ヒトＴリンパ球は、ＨＬＡ−Ａ１／ＭＡＧＥ−Ａ１二重特異性ｓｃＦｖ×ｓｃＴＣＲで、又は２Ｇ１２抗原特異的ｓｃＦｖ×ｓｃＦｖのいずれかで標識された。これらのＴリンパ球を５１Ｃｒ標識ＨＬＡ−Ａ１／ＭＡＧＥ−Ａ１及び２Ｇ１２抗原陽性メラノーマ細胞ＭＺ２ＭＥＬ３．０とともに４時間インキュベートした。陰性対照として、ＭＡＧＥ−Ａ１の発現を失ったが、依然として２Ｇ１２発現を有するＭＺ２−ＭＥＬ２．２細胞を使用した。図示したように、５１Ｃｒ放出アッセイにより、ｓｃＦｖ×ｓｃＴＣＲ標識ヒトＴリンパ球による特異的腫瘍細胞死滅が実証される。
【詳細な説明】
【００３４】
本発明のさらなる態様は、本発明の結合分子を提供する方法に関する。上述のように、この方法は通常、所望の結合分子をコードする核酸構築物を提供することを包含する。核酸構築物は、好ましくはプラスミド又は発現ベクターを介して、原核生物宿主細胞へ、及び／又は植物細胞中で、及び／又は真核生物宿主細胞中で（構築物を発現することが可能である）導入することができる。一実施形態において、結合分子を提供する本発明の方法は、結合分子をコードする１つ又は複数の核酸を宿主細胞に供給するステップと、宿主細胞により核酸を発現させるステップと、を含む。
【００３５】
本発明の結合分子は、例えば植物細胞、真核細胞で、又は原核細胞で発現される。適切な発現系の非限定的な例は、タバコ植物、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。また、無細胞組換えタンパク質産生プラットフォームが適している。好ましい宿主細胞は、例えば細菌株ＢＬ２１若しくは株ＳＥ１のような細菌、又は哺乳動物宿主細胞、より好ましくはヒト宿主細胞である。適切な哺乳動物宿主細胞としては、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ−２３）細胞又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられ、これらは市販され得る。Ｓ２又はＳ９細胞のような昆虫細胞もまた、バキュロウイルス又は昆虫細胞発現ベクターを用いて使用され得るが、本発明のポリペプチドがグリコシル化を含むエレメントを包含する場合には、それらはあまり適さない。本発明により産生された結合分子は、宿主細胞から、又はそれらが分泌される場合には、宿主細胞の培養培地から抽出又は単離される。したがって、一実施形態において、本発明の方法は、結合分子をコードする１つ又は複数の核酸を宿主細胞に供給することと、宿主細胞により核酸を発現させることと、を含む。別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、２つ以上の異なる結合分子をコードする１つ又は複数の核酸を宿主細胞に供給することと、宿主細胞により核酸を発現させることと、を含む。例えば、一実施形態では、多重単鎖結合分子の単離を可能にし、及び／又はＦｃ二量体化を介して形成されるホモ二量体及び／又はヘテロ二量体の単離を可能にするすべてがＦｃ単量体を含む２つ以上の異なる結合分子をコードする核酸が提供される。（哺乳動物）宿主細胞における（哺乳動物）タンパク質の組換え発現に関する方法は当技術分野で知られている。
【００３６】
明らかであろうが、本発明の結合分子は、多くの治療上の用途及び非治療上の用途（例えば、診断又は科学的用途）においてその使用が見出されている。診断目的に適した本発明のタンパク質性分子は、それらの治療上の有益性のために適用される本発明のタンパク質性分子により標的とされる異常細胞上の結合部位を露出する分子の発現レベルをモニタリングするのに特に有用である。このようにして、療法が依然として有効であるかどうか、又は異常細胞上の１つ又は複数の異なる結合部位を標的とする本発明の他のタンパク質性分子を代わりに適用させるべきかどうかがモニタリングされる。このことは、第１の標的とされる結合部位の発現レベルがある特定の閾値以下である場合に有益であるのに対して、他の又は新たな結合部位が（依然として）、これらの代替的な結合部位に適当な特異的結合ドメインを含む本発明のタンパク質性分子に関して新たに標的とされる結合部位として役立ち得る。本発明の結合分子はまた、（循環している）腫瘍細胞の検出に、細胞障害性化合物の標的細胞特異的送達に、又は免疫刺激分子の送達に使用され得る。
【００３７】
ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで、標的細胞で又は標的細胞中で生物学的プロセスに対する調節効果を誘導する方法であって、調節効果を誘導するのに有効である量で、細胞を本発明の結合分子と接触させることを含む方法が提供される。本発明によれば、調節効果又は組み合わせた調節効果は、事実上アゴニスト性であるか、若しくは刺激性であるか、若しくは活性化しており、又は効果は、事実上妨害するか、若しくはアンタゴニスト性であるか、又はそれらの任意の組み合わせである。さらに、調節効果は、結合分子における異なる結合ドメインに関して事実上付加的若しくは相乗的又はそれらの組み合わせである。
【００３８】
結合分子は、対象、より好ましくはヒト対象における異常細胞の生物学的プロセスに対する調節効果に使用されることが好ましい。ヒトにおける治療上の用途に関して、当然のことながら、結合分子は、非哺乳動物由来のアミノ酸配列を含有しないことが好ましい。ヒトアミノ酸配列のみを含有する結合分子がより好ましい。したがって、１つ又は複数の疾患特異的結合部位を認識して、そこに結合して、続いて細胞表面で又は細胞中で生物学的プロセスに対して調節効果を誘導することが可能な治療上有効な量の結合分子を患者に投与して、疾患特異的結合部位を発現しない（正常）細胞の生存率に影響を及ぼすことなく、結合部位を発現する罹患細胞の根絶を刺激することができる。正常細胞の悪化、若しくはさらには死亡を最低限に抑えるか、又は全体としてそれを回避すると同時に、罹患細胞を死滅させることは概して、結合分子の投与後の患者の治療上の結末を改善させる。
【００３９】
したがって、薬剤としての本発明の結合分子の使用もまた提供される。別の態様では、本発明は、癌、自己免疫疾患、又は本発明のタンパク質性分子で、１つ又は複数の疾患特異的結合部位を発現する細胞を標的とすると、その症状が低減される任意の他の疾患の治療用の薬剤の製造のための結合分子の使用を提供する。例えば、結合分子は、各種癌（例えば、固形腫瘍、悪性血液疾患）の治療用の薬剤の製造に使用されることが有利である。
【００４０】
ヒト由来の抗体断片は、ファージが呈する巨大抗体レパートリーから単離することができる。本発明の一態様は、２つ以上の選択される異なる結合部位（例えばエピトープ）に特異的な２つ以上のヒト抗体断片の選択のためのヒト抗体ファージディスプレイライブラリーの使用である。これらの抗体断片は通常、低親和性を示す。結合すること、及び特異的かつ効率的な様式で調節生物学的活性を発揮することが可能な高アビディティー抗体鎖の生成を可能にする方法が提供される。本発明の一態様は、多重結合ドメインを含む結合分子の開発である。すなわち、同一の結合ドメインの第２、第３、第４等のコピー（多価）、及び別個の結合部位に結合することが可能な各々異なるヒトＶｈドメインを有する１つ又は複数の異なるヒトＶｈドメインの少なくとも１つのコピー（多特異性）と組み合わせたある特定の結合部位に結合することが可能な、好ましくはヒトＶｈドメイン。このようにして、第１の結合部位に関するアビディティー、及び第２、第３、第４等の結合部位に特異的な多重結合ドメインが適用される場合には、この第２、第３、第４等の結合部位に関するアビディティーが増強される。
【００４１】
したがって、異なる結合部位に特異的な異なる結合ドメインの少なくとも１つのコピーと官能的に結合された結合部位に特異的な結合ドメインの少なくとも２つのコピーを含むタンパク質性分子が提供される。これらの異なる結合ドメインは、結合ドメインに隣接するアミノ酸残基間のペプチド結合を介して互いに官能的に結合されることが好ましく、連続した単鎖タンパク質性分子を提供する（Ｆｉｇ．１及びＦｉｇ．２）。結合ドメインが、ペプチド結合以外の結合及び／又は結合相互作用を介して一緒に連結されることも本発明の一部である。互いにタンパク質性分子を連結させる代替的方法が多数あり、タンパク質連結化学の技術分野の当業者に知られている。ペプチド結合に基づかないタンパク質連結化学は、共有結合相互作用及び／又は非共有結合相互作用に基づき得る。
【００４２】
生物学的プロセスを調節することが可能な本発明の一価又は多価結合分子形態における多重特異性タンパク質性分子は、例えば、２つの異なるヒトＶｈドメインの少なくともコピーから構成され、それらは、発現時に単鎖ポリペプチド構築物を得るようにＤＮＡレベルで多量体化される。
【００４３】
ヒトＶｈドメインは通常、当分野で必要とされる安定性及び効率的な発現に対する基準を満たさない。それらは、不安定性であり、溶解性に乏しく、不十分に発現される傾向にある。「ラクダ化」と呼ばれるプロセスを使用して、ヒトＶｈをより安定な抗体断片へ変換させてもよい。
【００４４】
ヒト抗体生殖系列領域Ｖｈ−３は、ラマの抗体Ｖｈ断片と高い相同性を示す。ラマは、重鎖及び軽鎖で構成される抗体、及び重鎖のみを含有する抗体の２つの型の抗体を有する。これらの重鎖のみの抗体は、重鎖及び軽鎖で構成される古典的な抗体と類似して抗原を結合する。最小の機能性ラマ抗体結合ドメインであるＶｈｈドメイン（（単一）ドメイン抗体（（ｓ）ｄＡｂ）とも呼ばれる。）は良好に発現されることがわかっており、高い親和性で抗原を結合し得る。さらに、ヒトＶｈ中のいくつかのアミノ酸でラマＶｈｈのアミノ酸を置換することにより、ラマｓｄＡｂの発現の容易さ及び安定性のような特徴のいくつかを、例えばヒトＶｈに移行させることができることが示されている。次に、多特異性を有する抗体分子は、各々が異なる結合部位に対する親和性を有するいくつかの異なる「ラクダ化された」ヒトＶｈドメインの１又は複数コピーの、１つの単一分子へのライゲーションにより生成させることができる。さらに、続いて高アビディティー抗体分子は、同じ結合部位に結合するラクダ化されたヒトＶｈドメインのいくつかの、１つの単一分子へのライゲーションにより生成させることができる。
【００４５】
少なくとも２つの結合部位の各々に関して、本発明のタンパク質性分子は、短リンカー、例えば短Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーにより散在され、かつ結合分子の他の標的結合部位に特異的な、短リンカーにより散在されるラクダ化されたヒトＶｈドメインにペプチド結合によって結合される１〜１２、より好ましくは１〜６、さらに好ましくは１〜３のラクダ化されたヒトＶｈドメインを含む。別の実施形態では、少なくとも２つの異なる結合部位のうちの少なくとも１つに関して、本発明のタンパク質性分子は、短リンカーにより散在される４〜６のラクダ化されたヒトＶｈドメインを含むことが好ましく、これによって、この標的とされる結合部位を露出する４〜６の標的分子を架橋する能力を有する分子を提供する。さらに好ましい実施形態では、分子のこの架橋は、４〜６の結合ドメインに対して、標的とされる結合部位を露出する表面分子を発現する細胞においてアポトーシスを誘導する。
【００４６】
単一結合部位に特異的な結合分子と比較して、本発明のタンパク質性分子は、とりわけ有効性及び特異性に関して下記利点を有する。本発明のタンパク質性結合分子は、異常細胞に特異的な多重結合部位を同時に標的とすることにより、及び／又は異常細胞に特有の結合部位の組み合わせを同時に標的とすることにより、異常細胞に対する特異性の増大を有する。このようにして、異常細胞はより効率的に標的とされ、このことは、健常な細胞を（過剰に）標的とすることを回避し、その結果、有毒な望ましくない副作用に対するリスクを著しく低減させる。異常細胞に対するこの高い特異性は、異常細胞上及びおそらく健常な細胞上に存在する個々の結合部位に対して比較的低い親和性を有する一方で、異常細胞に特有の異なる結合部位の組み合わせを露出する異常細胞に対して比較的高いアビディティーを有する本発明のタンパク質性分子により達成される。
【００４７】
以下、本発明の分子の適切な治療上の標的を提供する結合部位のこれらの組み合わせに関していくつかの例が提供される。さらに、本発明の多重特異性タンパク質性分子を用いれば、標的とするのが困難な、及び／又は到達するのが困難な異常細胞は、少なくとも１つの結合ドメインによって「ヒット」されるより高い可能性を有し、それにより、単一分子／単一標的療法と比較した場合、治療活性が少なくともある程度は提供され、成功率が増大する。例えば、異常細胞に対する高い特異性は、結合部位の組み合わせを特有に発現するか、又は健常な細胞に比べて結合部位を高度に発現するか、又はそれらの任意の組み合わせである異常細胞に対して、異なる結合ドメインが、それらが組み合わさると比較的高いアビディティーを有するものの、個々にはそれぞれの結合部位に対して比較的低い親和性を有する場合において、異なる結合ドメインの１又は複数コピーが本発明の結合分子において組み合わされる場合に達成される。
【００４８】
以下で例示されるように、本発明のタンパク質性分子における種々のドメイントポロジーの例がＦｉｇ．１及びＦｉｇ．２に提供される。一例では、健常な細胞上、及び異常細胞上にともに存在する表面マーカーに特異的な２つ以上の異なる低親和性結合ドメインを組み合わせることにより、表面マーカーが、健常な細胞上での発現レベルと比較して、異常細胞上で高度に発現される場合に、異常細胞に高度に特異的な本発明のタンパク質性分子が依然として提供される。したがって、好ましい実施形態において、本発明のタンパク質性分子の異常細胞に対する所望の高い特異性及びそれに伴う異常細胞根絶に対する高い有効性（健常な細胞には本質的な変更をもたらさない。）は、例えば、
（ｉ）正常細胞と比較して特有性のレベルに関して最適な標的結合部位、
（ｉｉ）異なる結合部位の最適な数（好ましくは２又は３）、
（ｉｉｉ）各々選択された結合部位に関する結合ドメインの最適な数（好ましくは１〜６）、
（ｉｖ）最適なドメイントポロジー、
（ｖ）各々の結合ドメインの最適な親和性（好ましくはＫＤ  １０Ｅ−５Ｍよりも大きい）、
（ｖｉ）タンパク質性分子に関する最適なアビディティー、
（ｖｉｉ）分子サイズに基づく最適な腫瘍浸透能力（糸球体濾過を低減するには６５ｋＤａより大きいことが好ましい）及び等電点（好ましくは５〜９）、
（ｖｉｉｉ）本発明のタンパク質性分子の細胞取り込みを最適に容易とすること（例えば、アポトーシス促進活性を可能にするため）
に関する選択によって調節可能である（「混合及び適合」アプローチ）。
【００４９】
一実施形態において、本発明の多重特異性タンパク質性分子の使用は、異常細胞による免疫回避のリスクを低減させる方法を提供する。現行のプラクティスに従えば、単一標的結合部位療法を適用することは、異常細胞による望ましくない免疫回避を引き起こし、療法を無効にするリスクを有している。概して、自然発生する突然変異率により、及び／又は選択した（免疫）療法の圧力下で、異常細胞上の結合部位は最終的には突然変異し得る。あるいは、本発明のタンパク質性分子で、異常細胞上の２つ以上の異なる結合部位を標的とすることにより、本発明のタンパク質性分子により標的とされる他の結合部位の１つ又はいくつかにおける突然変異の発生後でさえ、少なくとも１つ又はいくつかの結合部位への有効な結合が依然として存在する。このようにして、所望の治療上の効果の少なくとも一部が維持される。開発中又は市場での既存療法を上回るこの改善された治療上の有効性は、本発明の実施形態により提供される多くの利点の１つである。
【００５０】
危険シグナルを発現又は露出する患者における細胞又は分子は、いくつかの損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）に関して、及び／又は１つ又は複数のＤＡＭＰ上のいくつかの結合部位に関して、一価様式で又は多価様式で又はそれらの任意の組み合わせで、多重特異性である本発明の結合分子により効率的に標的とされる。ＤＡＭＰは、例えば、虚血及び炎症時に、例えば癌細胞のような異常細胞により露出される。本発明の多重特異性結合分子が、細胞タンパク質を架橋する能力を有することは、本発明の一部であり、続いて、これらの架橋されたタンパク質により媒介される経路の活性化時に生物学的プロセスを誘導する。そのような経路の例は、Ｆｃ受容体媒介プロセス（例えば、Ｆｃ断片及び結合された分子を含む複合体のＦｃ受容体媒介取り込み）及び免疫系の補体経路である。別の例は、ホジキン／リード−シュテンベルグ細胞により過剰発現されるＣＤ３０上の多重結合部位に結合する本発明のタンパク質性分子によるホジキンリンパ腫細胞上でのＣＤ３０の架橋である。ＣＤ３０の架橋は、とりわけ、アポトーシス促進シグナル伝達、及び異常細胞における抗増殖性シグナル伝達をもたらす。ＭＨＣ１−ＭＡＧＥ１ペプチド複合体に特異的な少なくとも４つ、好ましくは４〜６のドメインを含む本発明のタンパク質性分子がメラノーマ細胞上のＭＨＣ１−ＭＡＧＥ１ペプチド複合体を標的とし、そのクラスター形成を誘導すると、標的とされる異常細胞のアポトーシスが誘導される。本発明のこれらの分子の特異性及び有効性の増大は、例えば、ＭＨＣ１分子上のエピトープに特異的な１つ又は複数の低親和性結合ドメインを導入することにより達成される。
【００５１】
本発明のタンパク質性分子により標的とされるのに特に適した分子の種類は、細胞受容体及びそれらのリガンド並びに（タンパク質性）結合パートナーである。細胞受容体及びそれらのリガンドの例は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の種類、例えばホルモン及び神経伝達物質である。ＧＰＣＲは、とりわけ癌において役割を果たす。ＧＰＣＲは、活性化単量体形態で作用し、及び／又はＧＰＣＲは、活性化ホモ二量体又はヘテロ二量体形態で作用する。より上位の多量体が同様に存在するにつれ、ＧＰＣＲは活性化する。ＧＰＣＲホモマー及びヘテロマーは、例えば単量体形態で同じＧＰＣＲに比較して疾患プロセスで、異なる活性及び役割を有することができることは明らかである。このことは、本発明の結合分子により、疾患及び障害中のＧＰＣＲ媒介生物学的プロセスにおいて介入するいくつかの方法を提供する。本発明の結合分子により、ＧＰＣＲ単量体及び／又はホモマー、及び／又はヘテロマー、及び／又はＧＰＣＲリガンド、及び／又はＧＰＣＲ−リガンド相互作用を標的とすることにより、ある特定の疾患に寄与する生物学的プロセスは、特異的かつ効率的な様式で調節することができる。例えば、アゴニスト効果を有する本発明の結合分子は、活性なＧＰＣＲヘテロ二量体を形成する２つの異なるＧＰＣＲに結合する２つの異なる結合ドメインを含み、それにより複合体形成を容易とする。あるいは、結合分子を阻止することが、本発明により設計され、ＧＰＣＲ二量体形成、それによりＧＰＣＲ二量体媒介活性化を防止する。概して、任意の受容体モザイクが本発明の結合分子により阻害性又は刺激性様式のいずれかで標的とされることは本発明の一部である。受容体−受容体コンタクトへの介入が細胞の細胞外部位で対処されることが好ましいことは理解されよう。
【００５２】
結合分子が、同時に受容体上の１つ又は複数のアロステリック結合部位及び／又は１つ又は複数のリガンド結合部位を標的とすることにより、単量体受容体、ホモマー若しくはヘテロマーに関して、アロステリック分子として及び／又はオルソステリックリガンド分子として作用することは本発明の一部である。続いて、これらの結合部位は、同じ受容体分子上、又は異なる受容体分子上に位置する。本発明の結合分子はまた、アゴニスト活性、相乗活性及び／又は共刺激活性を有し得る。当然のことながら、受容体上のそれらの結合部位に対して、例えばアロステリック効果を有するリガンドの結合を防止する、活性化の一部として受容体オリゴマー化をもたらすアロステリック効果を阻害することもまた、本発明のさらに異なる結合分子により確立される。
【実施例】
【００５３】
それぞれが、Ｆｉｇ．１及びＦｉｇ．２に示されているものなどの少なくとも２つの異なる特異的結合ドメインを含む本発明のタンパク質性分子により一価又は多価（好ましくは二価〜六価、なおより好ましくは二価／三価／四価）様式で標的とされる多数（好ましくは２つ又は３つ）の異なる結合部位の例が、本明細書において、及び以下の実施例１〜５において提供される。
【００５４】
実施例１：
少なくとも２つの異なる結合部位と結合する結合ドメインを含む本発明のタンパク質性分子であって、結合部位の各々が、２つ以上の異なる結合ドメインにより一価又は多価様式で標的とされ、結合ドメインは、例えばＦｉｇ．１及びＦｉｇ．２に示される結合ドメイントポロジーを有する、タンパク質性分子の非包括的な例は下記の通りである。
１．  例えば乳癌における異常細胞を標的とするためのタンパク質性分子であって、改変ＭＵＣ−１の１つ又は２つのエピトープ、及び上皮腫瘍抗原の１つ又は２つのエピトープ、及び／又は癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の１つ又は２つのエピトープ、及び／又はＥｒｂＢ２の１つ又は２つのエピトープ、及び／又はＬｅ（ｙ）ハプテンの１つ又は２つのエピトープに結合する結合ドメインを含むタンパク質性分子
２．  消化器悪性腫瘍（例えば、膵癌、胃癌、大腸癌）を治療するためのタンパク質性分子であって、改変ＭＵＣ−１の１つ又は２つのエピトープ、及びＣＥＡの１つ又は２つのエピトープに結合する結合ドメインを含み、２〜４の異なる特異的結合ドメインの１〜３コピーを有するタンパク質性分子
３．  大腸癌を治療するためのタンパク質性分子であって、ＣＥＡ、結腸特異的抗原（ＣＳＡｐ）及びムチン−１（ＭＵＣ−１）の１つ又は２つのエピトープに結合する結合ドメインを含み、３つの異なる特異的結合ドメイン各々の１〜３コピーを有するタンパク質性分子
４．  乳癌及び乳癌関連転移を治療するためのタンパク質性分子であって、メラニン細胞分化マーカーであるメランＡ及び／又はＭＩＴＦの１つ又は２つのエピトープ、及び／又は神経細胞マーカーであるネスチン及び／又はｂ３−チューブリンの１つ又は２つのエピトープに結合する結合ドメインを、例えば、上皮マーカーである上皮膜抗原及び／又は上皮特異的抗原上の結合部位に対する結合ドメインと併せて含むタンパク質性分子
５．  肺癌又は腸癌を治療するためのタンパク質性分子であって、癌胎児性抗原の２つ以上のエピトープに結合する結合ドメインを含むタンパク質性分子
６．  卵巣癌を治療するためのタンパク質性分子であって、ＣＡ−１２５の２つ以上のエピトープに結合する結合ドメインを含むタンパク質性分子
７．  例えば腫瘍の増生を予防することによって乳癌を治療するためのタンパク質性分子であって、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ受容体の１つ又は複数の異なるエピトープ、好ましくは３〜５の異なるエピトープに結合する結合ドメインを含むタンパク質性分子
８．  ＣＤ２０及びＣＤ２２を発現しているＢ細胞腫瘍を伴う非ホジキンリンパ腫を治療するためのタンパク質性分子であって、ＣＤ２０の１つ又は複数のエピトープに結合する結合ドメインを、ＣＤ２２の１つ又は複数のエピトープに結合する結合ドメインと併せて含むタンパク質性分子
９．  胚細胞性腫瘍を治療するためのタンパク質性分子であって、α−フェトプロテインの２つ又は３つのエピトープに結合する結合ドメインを含み、異なる結合ドメイン各々の２又は３コピーを有するタンパク質性分子
１０．  慢性リンパ球性白血病を治療するためのタンパク質性分子であって、ＣＤ５２の２つ又は３つのエピトープに結合する結合ドメインを含み、異なる結合ドメイン各々の２又は３コピーを有するタンパク質性分子
１１．  関節リウマチ又はクローン病を治療するためのタンパク質性分子であって、腫瘍壊死因子−αの１つ又は複数のエピトープ、及びインターロイキン−１の１つ又は複数のエピトープに結合する結合ドメインを含むタンパク質性分子
１２．  大腸癌を治療するためのタンパク質性分子であって、血管内皮増殖因子の１つ又は複数のエピトープ、及び上皮増殖因子受容体の１つ又は複数のエピトープに結合する結合ドメインを含むタンパク質性分子
１３．  脳新生物多形神経膠芽腫を治療するためのタンパク質性分子であって、上皮増殖因子受容体の１つ又は複数のエピトープ、及び上皮増殖因子受容体突然変異体ｖＩＩＩ型に結合する結合ドメインを含むタンパク質性分子
１４．  急性骨髄性白血病を治療するためのタンパク質性分子であって、ＣＤ３３の２つ以上のエピトープに結合する結合ドメインを含むタンパク質性分子
１５．  神経膠芽腫を治療するためのタンパク質性分子であって、神経細胞マーカーであるネスチン及びβ３−チューブリンの１つ又は複数のエピトープに結合する結合ドメインを含むタンパク質性分子
１６．  Ｂ急性リンパ芽球性白血病を治療するためのタンパク質性分子であって、Ｂリンパ系抗原であるＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４５から選択されるいずれかの１つ又は２つのエピトープ、及びＴ細胞マーカーであるＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ５６から選択されるいずれかの１つ又は２つのエピトープ、及び／又は骨髄マーカーであるＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ３３から選択されるいずれかの１つ又は２つのエピトープに結合する結合ドメインを含むタンパク質性分子
１７．  多発性骨髄腫を治療するためのタンパク質性分子であって、ＣＤ３８の１つ又は複数のエピトープ、及びＣＤ１３８の１つ又は複数のエピトープに結合する結合ドメインを含むタンパク質性分子
１８．  多発性骨髄腫を治療するためのタンパク質性分子であって、タンパク質ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ２０及びＣＤ１１７のうちの２つ又は３つの１つ又は２つのエピトープに結合する結合ドメインを含むタンパク質性分子
１９．  細胞増殖を阻害することによってリンパ腫を治療するためのタンパク質性分子であって、ＣＤ２０の２つ又は３つのエピトープに結合する結合ドメインを含み、異なる特異的結合ドメイン各々の２又は３コピーを有し、結合ドメインの結合によって、リンパ腫細胞の表面上でＣＤ２０がクラスター化されて、３つ以上のＣＤ２０単量体で構成される多量体になる、タンパク質性分子
２０．  腫瘍性疾患を治療するためのタンパク質性分子であって、２つ又は３つの抗原の１つ又は２つのエピトープ、又は単一の抗原の２つ又は３つの結合部位に結合する結合ドメインを含み、異なる特異的結合ドメイン各々の１〜３コピーを有し、抗原は、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３３、インターロイキン−４受容体、前立腺特異的抗原、Ｌｅｗｉｓ（ｙ）炭水化物、メソテリン、ムチン−１、トランスフェリン受容体、前立腺特異的膜抗原、血管内皮増殖因子、血管内皮増殖因子受容体、ｅｐｃａｍ、ＣＴＬＡ−４である、タンパク質性分子
２１．  異常細胞を発現しているＦＡＳを含む異常を治療するためのタンパク質性分子であって、細胞死受容体ＦＡＳの２つ又は３つのエピトープに結合する結合ドメインを含み、異なる結合ドメイン各々の２又は３コピーを有し、結合ドメインの結合によって、標的細胞の表面上で４つ以上のＦＡＳ分子がクラスター化されて多量体になり、ＦＡＳ媒介性アポトーシスが誘導される、タンパク質性分子
２２．  バーシカン−ＴＬＲ２相互作用及び／又はバーシカン−ＴＬＲ４相互作用及び／又はバーシカン−ＣＤ１４相互作用によって媒介される癌細胞の浸潤及び転移を阻害するためのタンパク質性分子であって、癌細胞マーカー及び腫瘍間質細胞マーカーであるバーシカンの１つ又は複数のエピトープ、及びＴｏｌｌ様受容体−２（ＴＬＲ２）の１つ又は複数のエピトープ、及び／又はＴｏｌｌ様受容体−４（ＴＬＲ４）の１つ又は複数のエピトープ、及び／又はＣＤ１４の１つ又は複数のエピトープに結合する結合ドメインを含むタンパク質性分子
２３．  化学療法又は放射線療法後のアポトーシス媒介性抗腫瘍療法のためのタンパク質性分子であって、ＴＬＲ２の１つ又は複数のエピトープ、及びＴＬＲ４の１つ又は複数のエピトープに結合して、ＴＬＲ２／ＴＬＲ４活性に対するアゴニスト作用をもたらす結合ドメインを含むタンパク質性分子
２４．  基底細胞癌を治療するためのタンパク質性分子であって、ＴＬＲ７の２つ以上のエピトープに結合して、ＴＬＲ７活性に対するアゴニスト作用をもたらす結合ドメインを含むタンパク質性分子
２５．  炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患を治療するためのタンパク質性分子であって、２つ又は３つの抗原の１つ又は２つのエピトープ、又は単一の抗原の２つ又は３つの結合部位に結合する結合ドメインを含み、抗原は、例えば、一般に、インターフェロン及び／又はサイトカイン及び／又はインターロイキン及び／又はケモカイン及び／又はそれらの受容体から選択され、特に、例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、α−インターフェロン、α−インターフェロン受容体、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−α受容体、γ−インターフェロン、γ−インターフェロン受容体、ＨＬＡクラスＩＩ抗原受容体、インターロイキン−１β、インターロイキン−１β受容体、インターロイキン６、インターロイキン６受容体、インターロイキン１５、インターロイキン１５受容体、ＩｇＥ、ＩｇＥ受容体、ＩＣＡＭ−１から選択される、タンパク質性分子
２６．  ホジキンリンパ腫を治療するためのタンパク質性分子であって、ＣＤ２０及び／又はＣＤ３０及び／又はＣＤ２５の１つ又は２つの結合部位に結合する結合ドメインを、ＣＤ１６及び／又はＣＤ６４上の結合部位に対する少なくとも２つの結合ドメインと併せて含み、それぞれ、ナチュラルキラー細胞上でのＣＤ１６の架橋と、その後の、ナチュラルキラー細胞に結合した細胞の溶解、及び／又はＣＤ６４陽性細胞に結合した細胞に対して発揮される食作用及び細胞傷害性をもたらすタンパク質性分子
２７．  種々の癌を治療するためのタンパク質性分子であって、上皮増殖因子受容体又はその変異体の１つ又は２つの結合部位、及びインスリン様増殖因子受容体の１つ又は２つの結合部位に結合する結合ドメインを含むタンパク質性分子
２８．  関節リウマチを治療するためのタンパク質性分子であって、腫瘍壊死因子αの１つ又は２つの結合部位、及びＣＤ２０の１つ又は２つの結合部位に結合して、細胞への結合の際に補体及び／又は細胞媒介性溶解をもたらす結合ドメイン、及び／又はＣＤ８０及び／又はＣＤ８６上の１つ又は２つの結合部位に結合し、それにより細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４アンタゴニストとして作用し、それにより陽性Ｔ細胞シグナルを阻止する結合ドメインを含むタンパク質性分子
２９．  非ホジキンリンパ腫を治療するためのタンパク質性分子であって、ヒトＢ細胞タンパク質であるＣＤ１９及び／又はＣＤ２０上の１つ又は複数の結合部位、及び／又は１つ又は複数の代替的なヒトＢ細胞マーカー、並びに細胞傷害誘発受容体（例えば、Ｔ細胞上のＣＤ３、及び／又はナチュラルキラー細胞上のＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６）、及び／又は顆粒球、単球及びマクロファージ上のＦＣγＲＩ（ＣＤ６４）及びＦＣＡＲ（ＣＤ８９）と複合体を形成したＴ細胞受容体）のエピトープに結合する結合ドメインを含むタンパク質性分子
３０．  Ｈｅｒ２／Ｈｅｒ１を発現している異常細胞（例えば乳癌）を伴う任意の異常を治療するためのタンパク質性分子であって、Ｈｅｒ２上の１つ又は複数の結合部位、及びＨｅｒ１上の１つ又は複数の結合部位に結合する結合ドメインを含むタンパク質性分子
３１．  腫瘍特異的な様式でＭＨＣ１と関連してペプチドを提示する腫瘍を治療するためのタンパク質性分子であって、ＭＨＣ１α鎖ドメインα１及び／又はドメインα２及び／又はドメインα３及び／又はβ２ミクログロブリン上の１つ又は複数の結合部位に結合し、ＭＨＣ１−ペプチド複合体に結合する結合ドメインを含むタンパク質性分子
３２．  腫瘍特異的な様式でＭＨＣ２と関連してペプチドを提示する腫瘍を治療するためのタンパク質性分子であって、ＭＨＣ２α鎖ドメインα１及び／又はドメインα２及び／又はβ鎖ドメインβ１及び／又はドメインβ２上の１つ又は複数の結合部位に結合し、ＭＨＣ２−ペプチド複合体に結合する結合ドメインを含むタンパク質性分子
３３．  黒色腫を治療するためのタンパク質性分子であって、ＭＡＲＴ−１及び／又はｇｐ１００及び／又はチロシナーゼ上の１つ又は複数の結合部位に結合する結合ドメインを含むタンパク質性分子
３４．  前立腺癌を治療するためのタンパク質性分子であって、次の前立腺癌関連抗原：前立腺特異的抗原（ＰＳＡ（カリクレイン３（ＫＬＫ３）とも呼ばれる））、トムゼン・フリーデンライヒ（ＴＦ）抗原、前立腺幹細胞抗原、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ（前立腺特異的酸性ホスファターゼ（ＰＳＡＰ）とも呼ばれる）、ヒトＨＬＡ−Ａ２制限ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ（例えば、九量体ペプチドＦＬＦＬＬＦＦＷＬ（前立腺酸性ホスファターゼ由来）、ＴＬＭＳＡＭＴＮＬ（前立腺酸性ホスファターゼ由来）、ＡＬＤＶＹＮＧＬＬ（前立腺酸性ホスファターゼ由来）、ヒトＨＬＡ−Ａ２．１制限ＣＴＬエピトープＩＬＬＷＱＰＩＰＶ（前立腺酸性ホスファターゼ−３由来）、前立腺の６回膜貫通型上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、ヒトＨＬＡ−Ａ２．１制限ＣＴＬエピトープＬＬＬＧＴＩＨＡＬ（ＳＴＥＡＰ−３由来）、ムチン（ＭＵＣ−１及び−２）、ＭＵＣ−１−３２ｍｅｒ（ＣＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡ）、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、Ｌｅｗｉｓｙ、Ｔｎ（ｃ）、ＴＦ（ｃ）クラスター、ＧＭ２、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、カリクレイン４、プロステイン、ＢＡ４６由来のＨＬＡ−Ａ２．１制限エピトープ、ＰＴＨ−ｒＰ、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ｈＴＥＲＴ、及びＭＡＧＥ−Ａ８）から選択される任意の単一分子又は２つ以上の分子の任意の組み合わせの１つ又は複数の結合部位に結合する結合ドメインを含むタンパク質性分子
３５．  前立腺癌を治療するためのタンパク質性分子であって、ＨＬＡ−Ａ２によって提示されるＰＳＡの１４６−ＫＬＱＣＶＤＬＨＶ−１５４、１４１−ＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶ−１５０、１５４−ＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶ−１６３、１５４−ＹＩＳＮＤＶＣＡＱＶ−１６３、及び／又はＨＬＡ−Ａ３によって提示されるＰＳＡの１６２−ＱＶＨＰＱＫＶＴＫ−１７０、及び／又はＨＬＡ−Ａ２４によって提示されるＰＳＡの１５２−ＣＹＡＳＧＷＧＳＩ−１６０、２４８−ＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩ−２５７、及び／又はＨＬＡ−Ａ２によって提示されるＰＳＭＡの４−ＬＬＨＥＴＤＳＡＶ−１２、７１１−ＡＬＦＤＩＥＳＫＶ−７１９、２７−ＶＬＡＧＧＦＦＬＬ−３５、及び／又はＨＬＡ−Ａ２４によって提示されるＰＳＭＡの１７８−ＮＹＡＲＴＥＤＦＦ−１８６、２２７−ＬＹＳＤＰＡＤＹＦ−２３５、６２４−ＴＹＳＶＳＦＤＳＬ−６３２、及び／又はＨＬＡ−Ａ２によって提示されるＰＡＰの２９９−ＡＬＤＶＹＮＧＬＬ−３０７、及び／又はＨＬＡ−Ａ２４によって提示されるＰＡＰの２１３−ＬＹＣＥＳＶＨＮＦ−２２１、及び／又はＭＨＣ−２によって提示されるＰＡＰの１９９−ＧＱＤＬＦＧＩＷＳＫＶＹＤＰＬ−２１３、２２８−ＴＥＤＴＭＴＫＬＲＥＬＳＥＬＳ−２４２、及び／又は、ＨＬＡ−Ａ２によって提示されるＰＳＣＡの１４−ＡＬＱＰＧＴＡＬＬ−２２、１０５−ＡＩＬＡＬＬＰＡＬ−１１３、７−ＡＬＬＭＡＧＬＡＬ−１５、２１−ＬＬＣＹＳＣＫＡＱＶ−３０、及び／又はＤＲＢ１＊０４０４によって提示されるカリクレイン４の１５５−ＬＬＡＮＧＲＭＰＴＶＬＱＣＶＮ−１６９、及び／又はＤＲＢ１＊０７０１によって提示されるカリクレイン４の１６０−ＲＭＰＴＶＬＱＣＶＮＶＳＶＶＳ−１７４、及び／又はＤＰＢ１＊０４０１によって提示されるカリクレイン４の１２５−ＳＶＳＥＳＤＴＩＲＳＩＳＩＡＳ−１３９から選択されるＴ細胞エピトープのうちの２つ以上に結合する結合ドメインを、好ましくは、上記Ｔ細胞エピトープを露出している上記ＭＨＣ分子に結合する結合ドメインと併せて含むタンパク質性分子
３６．  卵巣癌を治療するためのタンパク質性分子であって、タンパク質ＮＹ−ＥＳＯ−１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、メソテリン、癌抗原（ＣＡ）１５−３、癌胎児性抗原及びＣＡ−１２５のうちの２つ又は３つの任意の組み合わせにおける各タンパク質の１つ又は２つのエピトープに結合する結合ドメインを含み、異なる結合ドメイン各々の１又は２コピーを有するタンパク質性分子
３７．  卵巣癌を治療するためのタンパク質性分子であって、６つのタンパク質ＮＹ−ＥＳＯ−１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、メソテリン、癌抗原（ＣＡ）１５−３、癌胎児性抗原及びＣＡ−１２５の各々の１つのエピトープに結合する結合ドメインを含むタンパク質性分子
３８．  Ｈｅｒ−２及び／又はＨｅｒ−１の過剰発現に関連する悪性腫瘍を治療するためのタンパク質性分子であって、ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕ由来のＴ細胞エピトープペプチド３６９〜３７６内の結合部位、及び／又はＭＨＣ−ペプチド３６９〜３７６複合体の結合部位、及び表面発現Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの１つ又は複数の結合部位、及び／又は表面発現Ｈｅｒ−１の１つ又は複数の結合部位に結合する結合ドメインを含むタンパク質性分子
３９．  多発性骨髄腫を治療するためのタンパク質性分子であって、ＣＤ４４−ｖ６、ＣＤ４４−ｖ９、ＣＤ４４−ｖ１０として知られるＣＤ４４スプライス変異体の１つ又は２つのエピトープ、及び／又はＣＤ３８及びＣＤ１３８の１つ又は２つのエピトープに結合する結合ドメインを含むタンパク質性分子
４０．  種々の癌を治療するため、特に卵巣癌を治療するためのタンパク質性分子であって、Ｅｐｃａｍの１つ又は２つのエピトープ、及び／又は葉酸受容体の１つ又は２つのエピトープに結合する結合ドメインを含むタンパク質性分子
４１．  腎癌を治療するためのタンパク質性分子であって、ＣＡＩＸの１つ又は２つのエピトープ、及び／又はＣＤ７０の１つ又は２つのエピトープに結合する結合ドメインを含むタンパク質性分子
４２．  腫瘍細胞の表面上の２つの受容体の同時発現を伴う種々の癌を治療するためのタンパク質性分子であって、ＰＤＧＦ受容体の１つ又は複数のエピトープ、及びＶＥＧＦ受容体の１つ又は複数のエピトープに結合する結合ドメインを含むタンパク質性分子
４３．  腫瘍細胞上の２つの表面分子の同時発現を伴う種々の癌を治療するためのタンパク質性分子であって、ＥｒｂＢ１の１つ又は複数のエピトープ、及びＥｒｂＢ２の１つ又は複数のエピトープに結合する結合ドメインを含み、各結合部位に対して１つ、より好ましくは２つ又は３つの結合ドメインを有するタンパク質性分子
【００５５】
当然、個々の表面分子が異常細胞に特有の特徴を有する、異常細胞によって発現される表面分子の組み合わせが特に興味深い。しかし、前述の通り、これらの標的は珍しい。表１は、異常細胞に特有である標的が見いだされている腫瘍の一覧を示す。これらの特有の標的は、これだけに限定されないが、ＭＨＣ分子と複合体を形成したＭＡＧＥ変異体などの種々の癌・精巣抗原に由来するＴ細胞エピトープである。本発明の結合ドメインを使用して、標的ＭＨＣ−ペプチド複合体を示す腫瘍を同定することは容易である。これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ（イメージング）で行うことができる。したがって、異常細胞に特有の２つ以上の表面分子における結合部位を標的とする結合ドメインが本発明のタンパク質性分子において組み合わされる場合に、異常細胞に対する高い特異性が実現される。そのような本発明の分子により、異常細胞上で同時発現される２つの異なる抗原であって、２つのうちの１つ又は両方が健康な細胞上でも（中程度に）発現される抗原を標的とする本発明の分子よりもさらに高い特異性がもたらされる。例は、メラノーマ細胞上での、異常細胞に特有の２つのＴ細胞受容体エピトープ、すなわち、ＭＨＣ１ＨＬＡ−Ａ０２０１によって提示されるＭＡＧＥ−ＡペプチドＹＬＥＹＲＱＶＰＧ及びＭＨＣ１ＨＬＡ−ＣＷ７によって提示されるＭＡＧＥ−ＡペプチドＥＧＤＣＡＰＥＥＫの同時発現である。これらの２つのメラノーマ細胞特異的結合部位を本発明のタンパク質性分子によって標的とすることにより、高度に特異的な結合がもたらされる。異常細胞上にそのような腫瘍特異的ＭＨＣ−ペプチド複合体が１つしか存在しない場合には、本発明の効果的なタンパク質性分子は、例えば、その複合体に特異的な２つ又は３つの異なる結合ドメイン、及びその特定の種類のＭＨＣ１ＨＬＡ分子に結合する結合ドメインを含む。
【００５６】
その代わりに、又はそれに加えて、ＭＨＣ−ペプチド複合体に結合する結合ドメインは、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００及びチロシナーゼなどのメラニン細胞系列によって特異的に発現される細胞表面タンパク質に結合する結合ドメインに連結している。腫瘍細胞特異的抗原（すなわちＭＨＣ−ＭＡＧＥペプチド複合体）に対する親和性が高い結合ドメインとメラニン細胞系列の表面マーカーに対する親和性が低い結合ドメインを組み合わせることにより、異常細胞に対する本発明のタンパク質性分子の特異性がさらに改善される。特に、メラニン細胞系列の表面マーカーに対する親和性が、本発明のタンパク質性分子とメラニン細胞系列の正常な細胞との結合に関して極めて高いある特定の閾値を下回る場合。
【００５７】
異常細胞によって発現され、健康な細胞によっては全く／ほとんど発現されない表面分子上の結合部位を標的とする少なくとも２つの異なる特異的結合ドメインを含む本発明のタンパク質性分子の他の例は、大腸癌を治療するための、Ａ３３及び線維芽細胞活性化タンパク質に結合するタンパク質性分子である。本発明の多特異性タンパク質性分子が標的とするのに適した腫瘍細胞上の２つの異なる標的結合部位のさらに別の例はＤａｓ−１及びＣＥＡである。Ｄａｓ−１及びＣＥＡの両方を標的とする結合性分子は、例えば食道癌を治療するために適している。
【００５８】
いくつかの腫瘍に関しては、異常細胞の表面上の腫瘍マーカーはこれまでに１つのみ同定されている。これらの場合の例として、本発明のタンパク質性分子は、腫瘍マーカー上の少なくとも１つの結合部位に結合し、腫瘍に関連する組織に特異的な細胞表面分子上の少なくとも１つの結合部位に結合する異なる結合ドメインを含む。
【００５９】
本発明のタンパク質性分子によって異常細胞を特異的に標的とするのに適した結合部位を選択するための良好な供給源は、Ｔ細胞により定義づけられる腫瘍抗原が列挙されたＰｅｐｔｉｄｅ  Ｄａｔａｂａｓｅである（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｙｎｄｅら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７；Ｈｏｕｇｈｔｏｎら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２００２；Ｐａｒｍｉａｎｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｉｍｍｕｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｐｅｐｔｉｄｅｄａｔａｂａｓｅ／Ｔｃｅｌｌｅｐｉｔｏｐｅｓ．ｈｔｍ）。このデータベースにより、腫瘍細胞に特有である、又は腫瘍細胞によって過剰発現される、示されているクラスのＨＬＡを含むＭＨＣ分子と複合体を形成した抗原ペプチドの組み合わせが提供される。
【００６０】
実施例２（抗体断片の選択）：
多特異性タンパク質は、例えば、これだけに限定されないが、抗体、アルファヘリックス及びＴ細胞受容体などの任意の抗原結合性ドメインから築かれる。腫瘍関連表面抗原及びＭＨＣ制限抗原に特異的な抗体Ｖｈ断片は、マウス、ラット、ウサギ、ラマ又はヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞から得られる。抗体断片は、動物を（部分的に）精製された抗原、腫瘍細胞又は腫瘍細胞溶解物で免疫化した後に得ることもできる。あるいは、ヒト、マウス、ラット又はラマ由来の抗体断片は、抗体ファージ、酵母、リンパ球又はリボソームディスプレイライブラリーから入手することができる。そのような抗体ライブラリー（ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｖｈ又はＶｈｈ）は、免疫された種だけでなく免疫されていない種からも構築することができる。
【００６１】
２．１  ＭＨＣ制限癌・精巣抗原に特異的なヒト抗体断片の選択
例えば、ＭＨＣにより提示されるエピトープに特異的なヒト抗体断片を得るために、選択のためにヒト抗体Ｆａｂ、ＶＨＣＨ又はＶｈファージディスプレイライブラリーを基本的にＣｈａｍｅｓらに記載されている通り使用し、まず、ヒトＦａｂファージ（１０１３コロニー形成単位）を、２％脱脂粉乳（ＰＢＳＭ）を含有するＰＢＳ中、室温で１時間プレインキュベートした。平行して、ストレプトアビジンでコーティングしたビーズ（Ｄｙｎａｌ）２００μｌを、ＰＢＳＭ中で１時間、平衡化する。その後のラウンドのために、ビーズ１００μｌを使用する。ｐａｎ−ＭＨＣ結合体を枯渇させるために、各選択ラウンドに対して、無関連のペプチド（Ｓａｎｑｕｉｎ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を含有するビオチン化ＭＨＣクラスＩ−ペプチド（ＭＨＣ−ｐ）複合体２００ｎＭをファージに加え、回転させながら３０分インキュベートする。平衡化したビーズを加え、混合物を回転させながら１５分インキュベートする。磁力を用いてビーズをチューブの側面に引き付ける。その後、枯渇したファージ画分にビオチン化ＭＨＣ−ｐ複合体を、量を減らしながら（第１のラウンドには２００ｎＭ、第２のラウンド及び第３のラウンドには２０ｎＭ）加え、継続的に回転させながら室温で１時間インキュベートする。同時に、ｐａｎ−ＭＨＣクラスＩ結合性可溶性Ｆａｂ（Ｄ３）をファージ−ＭＨＣ−ｐ複合混合物に加える（ラウンド１〜３について、それぞれ５０μｇ、１０μｇ、及び５μｇ）。平衡化した、ストレプトアビジンでコーティングしたビーズを加え、混合物を回転させながら１５分インキュベートする。ファージを磁力によって選択する。結合していないファージを、ＰＢＳＭを用いた５つの洗浄ステップ、０．１％Ｔｗｅｅｎを含有するＰＢＳを用いた５つのステップ、及びＰＢＳを用いた５つのステップによって除去する。新しく調製したトリエチルアミン（１００ｍＭ）５００μｌと一緒に１０分インキュベートすることによってファージをビーズから溶出させる。次いで、溶液のｐＨを、１Ｍのトリス（ｐＨ７．５）５００μｌを加えることによって中和する。溶出したファージを対数増殖しているＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞（ＯＤ６００ｎｍ０．５）と一緒に３７℃で３０分インキュベートする。細菌を２×ＴＹＡＧプレートで一晩成長させる。次の日に、コロニーを回収し、種菌１０μｌを５０ｍｌの２×ＴＹＡＧに使用する。細胞をＯＤ６００ｎｍが０．５になるまで成長させ、この懸濁液５ｍｌに、Ｍ１３ｋ０７ヘルパーファージ（５×１０１１コロニー形成単位）を感染させる。３７℃で３０分インキュベーションした後、細胞を遠心分離し、２５ｍｌの２×ＴＹＡＫに再懸濁させ、３０℃で一晩成長させる。ファージを以前に記載されている通り培養上清から採取し、次のラウンドのパニングに使用する。２回、３回又は４回の選択ラウンドの後に、特異的な結合体の濃縮を得、個々のクローンを特異的なペプチド／ＭＨＣ複合体の結合についてＥＬＩＳＡによって分析する。
【００６２】
２．２  ＭＨＣにより提示されるペプチドエピトープに特異的なヒトＦａｂは抗原陽性細胞に結合する
次いで、選択されたＦａｂファージを、ペプチドエピトープと一緒にローディングしたＭＨＣ陽性ＥＢＶ形質転換Ｂ−ＬＣＬに結合するそれらの能力について分析する。ＨＬＡ−Ａ０２０１により提示されるエピトープについて、Ｂ−ＬＣＬ株ＢＳＭ（０．５×１０６）をペプチドエピトープ（１００μｌのＰＢＳ中１０μｇ）と一緒に３７℃で３０分ローディングし、その後、Ｆａｂファージと一緒にインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析する。
【００６３】
次いで、ファージを使用して、別個の組織学的起源の腫瘍細胞株を染色し、フローサイトメトリーによって分析する。
【００６４】
実施例３（ラクダ化単一ドメインＶｈドメインを含む多特異性タンパク質の製造）：
３．１  多特異性Ｖｈタンパク質を製造するための遺伝子の設計
ヒト抗体生殖細胞系遺伝子ＶＨ３は、ラマ単一ドメインＶＨＨに対して高い相同性を示す。ヒトＶＨ３遺伝子のアミノ酸４４、４５及び４７をラマＶＨＨのこれらの位置に存在するアミノ酸で置き換えることにより、ヒトＶＨ３遺伝子の安定性及び発現が増強されることが示されている（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，１９９）。選択されたヒトＶｈの多くの発現及び安定性のために、ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚａｔｉｏｎ）と呼ばれるプロセスである、アミノ酸４４、４５及び４７のラマＶＨＨアミノ酸での置き換えが有効であり得る。発現されると６つのＶｈドメインを含むように、少なくとも２つの別個のＭＨＣ／ペプチドエピトープに結合する少なくとも２つの別個のヒトＶｈドメインを含む遺伝子を一緒にする。この目的のために、６つのコドン最適化したラクダ化Ｖｈドメインに、各Ｖｈドメインの間にリンカー（（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、（ＧＳＴＳＧＳ）ｎ、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ、ＥＦＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰＶＬＥＳＳＧＳＧ又はタンパク質の折り畳みの柔軟性をもたらす任意の他のリンカー、又はＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（ＩｇＧ１）、ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ（ＩｇＧ３）、又はＥＳＫＹＧＰＰ（ＩｇＧ４））を用いて作動可能に連結したｐｅｌＢ分泌シグナルを含む遺伝子を設計する。この遺伝子は、例えば、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成され、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させるためにｐＳｔａｂｙ１．２ベクター（Ｄｅｌｐｈｉ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）にクローニングする。
【００６５】
実施例４（六量体ＡＨ５  Ｖｈタンパク質の製造及び精製）：
多特異性Ｖｈタンパク質を発現させるために、ｐＳｔａｂｙ−多特異性タンパク質ベクターを、電気穿孔によってＳＥ１細菌に導入する。陽性クローンを、２％グルコースの存在下、２５℃〜３０℃でＯＤ６００＝０．８まで成長させる。次いで、細菌ＴＹＡＧ培地を、０．１〜１ｍＭのＩＰＴＧを含有するＴＹ培地と交換して、発現を誘導する。２５℃〜３０℃で一晩培養した後、細菌及び培地を回収する。細菌をＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＮａＣｌと一緒に氷上で３０分インキュベートした後、ペリプラズム画分を採取する。次いで、タンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【００６６】
多特異性Ｖｈタンパク質を培地及び細菌からＮｉ−アフィニティー精製を用いて単離する。この目的のために、培地を、Ｎｉとカップリングしたセファロース−ビーズと一緒にインキュベートし、穏やかに撹拌しながら一晩インキュベートする。細胞内タンパク質を得るために、細菌を溶解させ、細胞の壊死組織片を遠心分離によって除去する。ＰＢＳを用いて一晩透析した後、Ｎｉ−セファロースを用いて多特異性Ｖｈタンパク質を精製する。多特異性Ｖｈタンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、タンパク質の濃度をＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって決定する。
【００６７】
実施例５（循環及び腫瘍の侵入を改善するための多特異性遺伝子の構築）：
治療用タンパク質の薬物動態的性質、例えば、それらの分布、代謝及び排出は、形状、電荷及びサイズなどの因子に左右される。大部分の小血漿分子（ＭＷ＜５０〜６０ｋＤａ）の半減期は非常に短いが、より大きな血漿タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及び免疫グロブリン（Ｉｇ）などの半減期は非常に長い（ＨＳＡについては１９日、Ｉｇについては１〜４週間）。実際に、治療用タンパク質と連結すると、ＩｇＧ−Ｆｃ又はヒト血清アルブミンを加えることにより、循環時間、腫瘍の侵入及び抗腫瘍効果が延長されることが示されている。さらに、ＩｇＧ−Ｆｃと多特異性タンパク質をカップリングすることにより、免疫細胞の腫瘍部位への動員が可能になり、それにより、癌性組織に対する免疫特異的応答が可能になる。
【００６８】
５．１  ＩｇＧ１−Ｆｃ及びヒト血清アルブミンを有する多特異性タンパク質の構築
真核細胞において発現させるためにコドン最適化した多特異性構築物をＩｇＧ１−Ｆｃ領域又はヒト血清アルブミンと連結し、ｐｃＤＮＡ−３．１＋ベクター（Ｇｅｎｅａｒｔ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にクローニングする。
【００６９】
実施例６（ＣＤ８＋ＣＴＬクローン８２／３０からのＭＡＧＥ−１特異的（ｓｃＦｖ）−ＴＣＲの単離及びクローニング）：
下記の実施例では標準のクローニング技法を使用した。技法は、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．らのＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）又は引用されている刊行物に記載されている。
【００７０】
ＴＣＲ  Ｖβのクローニング：
ＴＣＲは、α鎖及びβ鎖からなるヘテロ二量体である。ＴＣＲα鎖及びβ鎖は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーであり、Ｖ遺伝子、Ｊ遺伝子、Ｄ遺伝子及びＣ遺伝子の会合の組み合わせによって生成される。ＴＣＲポリペプチドはジスルフィド連結しており、それらのＮ末端は高度に多型的であり、可変ドメインであり、抗原認識に関与する。ＭＡＧＥ−１特異的ＣＴＬクローン８２／３０（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，１９９２）を、このＣＴＬクローンから得たｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．）増幅によって得た。
【００７１】
ｃＤＮＡを得るために、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉら（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．及びＳａｃｃｈｉ，Ｎ．，１９８７）による方法に従って全ＲＮＡをＴ細胞クローン８２／３０細胞から単離し、基本的にＭａｎｉａｔｉｓらに記載されている通り、ｃＤＮＡに移した。ＰＣＲによるｃＤＮＡ配列の増幅は、対象の遺伝子の配列が既知である場合にのみ可能である。一般に、ＰＣＲのために、配列の５’末端及び３’末端と相補的な２種のプライマーをＤＮＡ合成の開始点として使用する。Ｔ細胞クローン８２／３０由来のＴＣＲα鎖及びβ鎖の５’末端の配列は未知であったので、ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の急速増幅）と呼ばれるＰＣＲ法を用いてＴＣＲα鎖を増幅した。ＴＣＲβ鎖は、ＲＡＣＥ−ＰＣＲにより、表２に記載のプライマーを使用して増幅した。
【００７２】
α鎖及びβ鎖のｃＤＮＡを合成し、Ｖα遺伝子セグメント、Ｖβ遺伝子セグメント及びＣβ遺伝子セグメント（表２）を増幅するために使用するオリゴヌクレオチドプライマー：
約３５０〜４５０塩基対の断片をアガロースゲルから単離し、精製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳＡ）にライゲーションした。ライゲーション混合物を、選択し増大させた細菌に導入した。これらの選択された細菌のコロニーからＤＮＡを単離し、制限酵素消化によって分析して、増幅されたＴＣＲβ断片の存在を確認した。
【００７３】
３つの陽性コロニーをＤＮＡ配列決定に供した。これらの３つの個々のクローンの配列を比較し、同一であることが見いだされた。しかし、増幅されたＴＣＲβ断片から得られた配列はＴＣＲβ遺伝子のシグナル配列を含まなかった。ＴＣＲ−Ｖβ遺伝子の完全な配列を得るために、この部分配列を既知のＴＣＲβ配列すべてと比較した。配列のアラインメントにより、ＴＣＲβファミリー１（ＴＣＲβ．１）由来の配列とほぼ１００％の相同性が示された。この配列相同性に基づいて、ＴＣＲβ．１の５’末端と相補的なプライマーを合成し、完全なＴＣＲ可変性β．１ドメインを増幅するために使用した。ＤＮＡを「直接配列決定」に供した。得られた配列を分析することにより、増幅されたＴＣＲβ断片と、シグナル配列及びＴＣＲβファミリー１由来のＴＣＲβ鎖の可変領域の主要部分の１００％の相同性が示された。この配列に基づいて、単鎖ＴＣＲ構築物へのＴＣＲ可変性β鎖のクローニングを可能にするプライマーを設計した。
【００７４】
実施例７（ＴＣＲα鎖のクローニング）：
ＴＣＲα鎖をクローニングするために、異なる手法に従った。まず、ＴＣＲ  Ｖα鎖が属するファミリーを決定するために、ファミリータイピングＰＣＲを実施した。２１の異なるＴＣＲ可変性α鎖が記載されている。ファミリータイピングＰＣＲにおいて、鋳型ｃＤＮＡを、ファミリー特異的な５’プライマー及び不変のプライマーを用いて個々に増幅した別々の試料に分けた。多数のＰＣＲ反応により、増幅された断片がもたらされた。どの断片がＴＣＲ  Ｖα断片に対応するかを決定するために、３２Ｐ標識Ｃαプローブを用いてサザンブロットを実施した。ファミリー番号１２に対応するＴＣＲαプライマーを用いて実施したＰＣＲ反応においてのみ陽性シグナルが観察された。このＰＣＲ反応の残りのＤＮＡを、プライマー除去を用いて上述の通り精製し、ＤＮＡ配列決定に供した。得られた配列をファミリー番号１２の唯一の既知のメンバーのＴＣＲα配列と比較した。多様性領域以外は、１００％の相同性が観察された。これにより、ＴＣＲα鎖の完全な可変領域を増幅するために使用することができるプライマーを設計することが可能になった。ＣＴＬクローン８２／３０に由来するＴＣＲのＶα及びＶβの配列は、それぞれ配列番号１及び配列番号２として示されている。
【００７５】
実施例８:
８．１  二ドメイン単鎖ＴＣＲ分子の構築
単鎖ＴＣＲ分子を構築するために、単鎖分子の容易な構築を可能にするクローニングベクターを設計した。ベクターを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の多重クローニング部位を特別に設計したポリリンカー（表３）と置き換えることによって作出した。ＴＣＲ  Ｖα断片及びＴＣＲ  Ｖβ断片をクローニングするために、これらの断片を柔軟なリンカー配列の前又はリンカー配列の後ろにクローニングすることを可能にするプライマーを設計した。
【００７６】
ＴＣＲ  Ｖα断片及びＴＣＲ  Ｖβ断片を増幅するために、２つの別々のＰＣＲ反応を実施して、Ｖ領域のシグナル配列及び成熟タンパク質の最初で実際に始まる断片を含む断片を生成した。柔軟なリンカーの隣にクローニングすることを可能にする制限酵素を用いてＤＮＡ断片を消化した。ＤＮＡ精製のために陽性細菌コロニーを成長させ、ＤＮＡをＤＮＡ配列決定に供した。正しい配列を有するＤＮＡクローンを使用して、キメラ単鎖ＴＣＲ構築物を構築した。次いで、柔軟なリンカー配列の前にＴＣＲ  Ｖα断片又はＴＣＲ  Ｖβ断片のいずれかを含有するクローンを、シグナル配列を欠くＴＣＲ  Ｖα断片及びＴＣＲ  Ｖβ断片にライゲーションした。このように、３つの異なる単鎖ＴＣＲを構築した（Ｖα−２１２リンカー−Ｖβ、Ｖβ−２１２リンカー−Ｖα及びＶα−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３、リンカー−Ｖβ）。
【００７７】
８．２  二重特異性抗ＣＤ３×ｓｃＴＣＲβα分子の構築
ｓｃＴＣＲβαを、ＯＫＴ−３細胞から得た抗ＣＤ３特異的ｓｃＦｖの隣にクローニングし、ｐＢｕｌｌｅｔレトロウイルスベクターに導入した。ｓｃＦｖ×ｓｃＴＣＲの概略図がＦｉｇ．３に示されている。
【００７８】
実施例９：
ｐＢｕｌｌｅｔレトロウイルスベクターを、カルシウム−リン酸トランスフェクションによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。トランスフェクションの４日後にこれらの細胞から上清を回収し、多様な実験のために使用した。
【００７９】
９．１  ｓｃＦｖ×ｓｃＴＣＲは、初代ヒトＴリンパ球に結合する
初代ヒトＴリンパ球を血液から標準のフィコール分離によって単離し、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清と一緒にインキュベートした。氷上で３０分のインキュベーション期間後、細胞を洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識したＴＣＲ  Ｖα−１２．１特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又は無関連のＦＩＴＣで標識したｍＡｂと一緒にインキュベートした。氷上で３０分のインキュベーション期間後、細胞を洗浄し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて固定し、フローサイトメトリーによって分析した。Ｆｉｇ．４に示されている通り、二重特異性ｓｃＦｖ×ｓｃＴＣＲは初代ヒトＴリンパ球に結合する。
【００８０】
実施例１０：
二重特異性ｓｃＦｖ抗ＣＤ３×ｓｃＴＣＲβαで標識した初代ヒトＴリンパ球は、ＨＬＡ−Ａ０１／ＭＡＧＥ−Ａ１陽性メラノーマ細胞を特異的に死滅させる。
【００８１】
固定化したＯＫＴ−３を用いて２日にわたって活性化した初代ヒトＴリンパ球を、ｓｃＦｖ×ｓｃＴＣＲを用いて標識し、５１Ｃｒで標識したＨＬＡ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ１陽性メラノーマ細胞（ＭＺ２−ＭＥＬ３．０）及びＨＬＡ−Ａ１陽性、ＭＡＧＥ−Ａ１陰性メラノーマ細胞（ＭＺ−ＭＥＬ２．２．）と一緒にインキュベートした。４時間のインキュベーション期間後に５１Ｃｒの放出を測定し、それにより、ｓｃＦｖ×ｓｃＴＣＲで標識したＴ−リンパ球によってＨＬＡ−Ａ１／ＭＡＧＥ−Ａ１  ＭＺ２−ＭＥＬ３．０メラノーマ細胞のみが死滅したことが示された（Ｆｉｇ．５）。
【００８２】
実施例１１：
１１．１  ＨＬＡ−Ａ０２０１により提示される多ＭＡＧＥ−Ａペプチド及びヒトＣＤ３に対する特異性を有する二重特異性単一ドメイン（ｓｄ）Ａｂ  ＶＨ×ＶＨの構築
遺伝子はラクダ化ヒトＡＨ５  ＶＨ及びラクダ化マウス抗ＣＤ３ＶＨ（ＯＫＴ−３から得た）で構成された。生じたｓｄＡｂ  ＡＨ５×ＣＤ３の配列をＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）による遺伝子合成によって一緒にし、ｐＳｔａｂｙ１．２発現ベクターにクローニングした。この二重特異性単一ドメイン抗体（ＢｓｄＡＢ）ＡＨ５×ＣＤ３のＤＮＡ配列については配列番号３を、ＢｓｄＡＢ  ＡＨ５×ＣＤ３のアミノ酸配列については配列番号４を参照されたい。
【００８３】
表：
表１：ヒト癌によるＭＡＧＥ−Ａ発現の頻度の例
2020058354.tif 000002
【００８４】
表２：オリゴヌクレオチドプライマー
Ｖα−ＡＴＧ：  ５’ＧＣＧ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＡＣＧ  ＴＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＣＡＴ  ＧＣＴ  ＧＡＣ  ＴＧＣ  ＣＡＧ  Ｃ  ３’
Ｖα−３’：  ５’ＣＧＴ  ＣＴＡ  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＡＧＧ  ＴＡＡ  ＣＴＣ  ＡＡＧ  ＣＧＣ  ＡＧ  ３’
Ｖβ−ＡＴＧ：  ５’ＣＣＧ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＡＣＧ  ＴＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＧ  ＣＴＴ  ＣＡＧ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＣＴＧ  ３’
Ｖβ−３’：  ５’ＧＣＧ  ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＡＧＣ  ＡＣＴ  ＧＴＣ  ＡＧＣ  ＣＧＧ  ＧＴＧ  ＣＣ  ３’
【００８５】
表３：
２１２リンカー：
５’  ＧＴＡ  ＣＧＡ  ＡＴＴ  ＣＧＣ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＧＧＣ  ＴＣＴ  ＡＣＴ  ＴＣＣ  ＧＧＴ  ＡＧＣ  ＡＡＡＴＣＣ  ＴＣＴ  ＧＡＡ  ＧＧＣ  ＡＡＡ  ＧＧＴ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＧＣＧ  ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＧＣＴ  ＣＧＡ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ３’
（ＧＬＹ）４ＳＥＲ３リンカー：
５’  ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＧＣＧ  ＧＴＴ  ＣＡＧ  ＧＣＧ  ＧＡＧ  ＧＴＧ  ＧＣＴ  ＣＴＧ  ＧＣＧ  ＧＴＧ  ＧＣＧ  ＧＡＴ  ＣＧＡ  ３’
【００８６】
配列：
配列番号１（ＣＴＬ８２／３０から得たＨＬＡ−Ａ１／ＭＡＧＥ−Ａ１特異的ＴＣＲ可変領域ＶアルファのＤＮＡ配列）：
ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＡＴＧ  ＣＴＧ  ＡＣＴ  ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＴＴＧ  ＡＧＧ  ＧＣＡ  ＧＴＣ  ＡＴＡ  ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＡＴＣ  ＴＧＴ  ＧＴＴ  ＧＴＡ  ＴＣＣ  ＡＧＣ  ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＧＴＡ  ＡＣＴ  ＣＡＡ  ＧＣＧ  ＣＡＧ  ＡＣＴ  ＧＡＡ  ＡＴＴ  ＴＣＴ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＧＡＴ  ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＴＴＧ  ＧＡＣ  ＴＧＴ  ＧＴＧ  ＴＡＴ  ＧＡＡ  ＡＣＣ  ＣＧＴ  ＧＡＴ  ＡＣＴ  ＡＣＴ  ＴＡＴ  ＴＡＣ  ＴＴＡ  ＴＴＣ  ＴＧＧ  ＴＡＣ  ＡＡＧ  ＣＡＡ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＡＧＴ  ＧＧＡ  ＧＡＡ  ＴＴＧ  ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＣＴＴ  ＡＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＧ  ＡＡＣ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＧＡＴ  ＧＡＧ  ＣＡＡ  ＡＡＴ  ＧＡＡ  ＡＴＡ  ＡＧＴ  ＧＧＴ  ＣＧＧ  ＴＡＴ  ＴＣＴ  ＴＧＧ  ＡＡＣ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＡＡＡ  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＡＧＴ  ＴＣＣ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＡＣＡ  ＧＣＣ  ＴＣＡ  ＣＡＡ  ＧＴＣ  ＧＴＧ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＧＴＡ  ＴＡＣ  ＴＴＣ  ＴＧＴ  ＧＣＴ  ＣＴＧ  ＧＧＡ  ＧＧＧ  ＧＴＧ  ＡＡＴ  ＡＡＴ  ＡＡＴ  ＧＣＡ  ＧＧＣ  ＡＡＣ  ＡＴＧ  ＣＴＣ  ＡＣＣ  ＴＴＴ  ＧＧＡ  ＧＧＧ  ＧＧＡ  ＡＣＡ  ＡＧＧ  ＴＴＡ  ＡＴＧ  ＧＴＣ  ＡＡＡ  ＣＣＣ
【００８７】
配列番号２（ＣＴＬ８２／３０から得たＨＬＡ−Ａ１／ＭＡＧＥ−Ａ１特異的ＴＣＲ可変領域ＶベータのＤＮＡ配列）：
ＡＴＧ  ＧＧＣ  ＴＴＣ  ＡＧＧ  ＣＴＧ  ＣＴＣ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＧＴＧ  ＧＣＣ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＧＧＡ  ＧＣＡ  ＧＧＣ  ＣＣＡ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＧＴＣ  ＡＣＡ  ＣＡＡ  ＡＣＣ  ＣＣＡ  ＡＡＧ  ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＡＴＣ  ＡＣＡ  ＧＣＡ  ＡＣＴ  ＧＧＡ  ＣＡＧ  ＣＧＡ  ＧＴＧ  ＡＣＧ  ＣＴＧ  ＡＧＡ  ＴＧＣ  ＴＣＣ  ＣＣＴ  ＡＧＧ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＣＴＣ  ＴＣＴ  ＧＴＧ  ＴＡＣ  ＴＧＧ  ＴＡＣ  ＣＡＡ  ＣＡＧ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＧＧＣ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＴＴＣ  ＣＴＣ  ＡＴＴ  ＣＡＣ  ＴＡＴ  ＴＡＴ  ＡＡＴ  ＧＧＡ  ＧＡＡ  ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＧＣＡ  ＡＡＡ  ＧＧＡ  ＡＡＣ  ＡＴＴ  ＣＴＴ  ＧＡＡ  ＣＧＡ  ＴＴＣ  ＴＣＣ  ＧＣＡ  ＣＡＡ  ＣＡＧ  ＴＴＣ  ＣＣＴ  ＧＡＣ  ＴＴＧ  ＣＡＣ  ＴＣＴ  ＧＡＡ  ＣＴＡ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＡＧＣ  ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＣＴＧ  ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＴＴＧ  ＴＡＴ  ＴＴＣ  ＴＧＴ  ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＡＡＣ  ＡＴＡ  ＧＣＧ  ＧＧＣ  ＧＧＧ  ＡＧＴ  ＴＡＴ  ＡＣＧ  ＣＡＧ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＧＧＣ  ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＡＣＣ  ＣＧＧ  ＣＴＧ  ＡＣＡ  ＧＴＧ  ＣＴＣ
【００８８】
配列番号３（二重特異性単一ドメイン抗体（ＢｓｄＡＢ）ＡＨ５×ＣＤ３のＤＮＡ配列）：
ＡＴＧＡＡＡＴＡＣＣＴＡＴＴＧＣＣＴＡＣＧＧＣＡＧＣＣＧＣＴＧＧＡＴＴＧＴＴＡＴＴＡＣＴＣＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＣＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＡＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡＧＴＡＡＴＡＡＡＴＡＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＣＧＧＴＧＧＧＡＧＣＴＡＣＴＡＣＧＴＣＣＣＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＡＡＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＧＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＧＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＣＡＡＧＡＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＴＡＣＴＡＧＧＴＡＣＡＣＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＡＡＡＡＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＡＴＡＣＡＴＴＡＡＴＣＣＴＡＧＣＣＧＴＧＧＴＴＡＴＡＣＴＡＡＴＴＡＣＡＡＴＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＧＡＣＴＡＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＡＴＣＡＴＴＡＣＴＧＣＣＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＧＧＣＣＧＣＡＧＡＡＣＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＡＴＧＧＧＧＣＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＴＡＡ
【００８９】
配列番号４（二重特異性単一ドメイン抗体（ＢｓｄＡＢ）ＡＨ５×ＣＤ３のアミノ酸配列）：
ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＡＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＡＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＨＨＨＨＨＨ
【００９０】
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【図１−１】
2020058354.tif 000003
【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年12月23日(2019.12.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのリンカーにより互いに分離される異なる結合部位に対する少なくとも２つの異なる特異的Ｖｈ又はＶｈｈ結合ドメインを含むタンパク質性分子であって、該タンパク質性分子は単一ポリペプチド鎖を含み、少なくとも１つの特異的Ｖｈ又はＶｈｈ結合ドメインは、ＭＨＣ１−ＭＡＧＥペプチド複合体に特異的に結合し、少なくとも２つの異なる特異的Ｖｈ又はＶｈｈ結合ドメインの異なる結合部位のうちの１つ又は複数は、ＭＨＣ１ＨＬＡ−Ａ０２０１によって提示されるＭＡＧＥ−ＡペプチドＹＬＥＹＲＱＶＰＧ、ＭＨＣ１ＨＬＡ−ＣＷ７によって提示されるＭＡＧＥ−ＡペプチドＥＧＤＣＡＰＥＥＫ、又はそれらの組み合わせから選択され、少なくとも１つのそのようなＶｈ又はＶｈｈ結合ドメインはＣＤ３に特異的に結合する、タンパク質性分子。
【請求項２】
異なる特異的結合ドメインのうちの２つ以上は、異常細胞に特有の２つ以上の表面分子における結合部位を標的とする、請求項１に記載のタンパク質性分子。
【請求項３】
少なくとも１つのそのような結合ドメインはＶｈドメインである、請求項１又は２に記載のタンパク質性分子。
【請求項４】
エフェクター部分をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質性分子。
【請求項５】
少なくとも２つのＶｈドメインを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質性分子。
【請求項６】
異なる結合部位に特異的な少なくとも２つのＶｈドメインとＦｃ単量体とを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質性分子。
【請求項７】
２つのＦｃ単量体を介して二量体化された２つの請求項６に記載のタンパク質性分子を含む二量体タンパク質性分子。
【請求項８】
２つの異なる請求項６に記載のタンパク質性分子を含む、請求項７に記載のヘテロ二量体分子。
【請求項９】
異常細胞に関連する疾患の治療における使用のための、請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質性分子。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のタンパク質性分子と適切な賦形剤とを含む医薬製剤。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質性分子をコードする核酸分子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載の核酸分子及び／又は請求項１２に記載のベクターを含む細胞であって、前記核酸分子は好ましくはゲノムに組み込まれている、細胞。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質性分子を製造するための方法であって、請求項１３に記載の細胞を培養するステップと、前記タンパク質性分子を発現させるステップと、前記タンパク質性分子を培養物から分離するステップと、を含む方法。
【請求項１５】
Ｆｉｇ．１又はＦｉｇ．２に記載のドメイントポロジーを有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質性分子。
【外国語明細書】
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