(57)【要約】      （修正有）【課題】骨髄間葉系幹細胞等のＰＤＧＦＲα陽性細胞の刺激に伴う、血中動員、損傷組織への集積を促進し、体内での組織再生を誘導する治療薬の提供。【解決手段】細胞遊走刺激活性を有し、ＨＭＧＢ１タンパク質の一部からなる特定のアミノ酸配列を有する、合成されたペプチド又は細胞を用いて製造されたペプチドであって、タグが付加されている及び／又はタグ由来のペプチド断片が付加されているペプチド、ペプチドをコードするＤＮＡ、ＤＮＡを有するベクター、並びにベクターを有する形質転換細胞。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群より選択される、骨髄間葉系幹細胞遊走刺激活性を有するペプチド：
（１）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１７０番目のアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１８５番目のアミノ酸配列からなるペプチド；
（３）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列からなるペプチド；
（４）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における２番目から１７０番目のアミノ酸配列からなるペプチド；
（５）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における２番目から１８５番目のアミノ酸配列からなるペプチド；
（６）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における２番目から１９５番目のアミノ酸配列からなるペプチド；
（７）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における８５番目から１６９番目のアミノ酸配列からなるペプチド；
（８）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における８９番目から１８５番目のアミノ酸配列からなるペプチド；
（９）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における８９番目から１９５番目のアミノ酸配列からなるペプチド；および
（１０）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における９３番目から２１５番目のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
ペプチドが、合成されたペプチドである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ペプチドが、細胞を用いて製造されたペプチドである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
ペプチドが、タグが付加されているペプチドである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
ペプチドが、タグ由来のペプチド断片が付加されているペプチドである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドをコードするDNA。
【請求項７】
請求項６に記載のDNAを有するベクター。
【請求項８】
請求項６に記載のDNAまたは請求項７に記載のベクターを有する形質転換細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織再生を誘導するためのペプチドとその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内の各臓器、組織には、その構造や機能の恒常性を維持している組織幹細胞が存在していることが明らかになりつつある。例えば心臓には心筋幹細胞が、脳には神経幹細胞が、皮膚には表皮幹細胞や毛包幹細胞が存在し、生涯にわたり心筋細胞、神経細胞、表皮細胞や毛包上皮細胞を供給して心臓、脳、皮膚の構造・機能を維持している。一方、骨髄の中には赤血球、白血球、血小板といった血液細胞へと分化する造血幹細胞が存在する。これら造血幹細胞に由来する血液細胞は、血流を介して体内のあらゆる臓器や組織を循環し、酸素供給、免疫反応、止血・損傷組織修復など生命維持に不可欠な機能を果たしている。即ち、骨髄造血幹細胞はその局在する組織である骨髄や骨組織の恒常性維持というよりもむしろ、末梢循環を介して生体内すべての組織の恒常性維持に寄与していると言える。
【０００３】
近年、骨髄内に、造血幹細胞に加えて、骨、軟骨、脂肪などの中胚葉組織、さらには神経や表皮など外胚葉組織にも分化可能な間葉系幹細胞が存在していることが明らかにされたものの、その生体内における存在意義は未だ不明な点が多い。しかし、末梢循環を介して血液細胞を供給することによりすべての組織、臓器の恒常性を維持している造血幹細胞が骨髄内に存在しているのであれば、同様に骨髄内に存在する間葉系幹細胞も、末梢循環を介して骨、軟骨、脂肪、神経、上皮などに分化可能な細胞を、必要とする生体内組織・臓器に提供することにより、生体組織の恒常性維持に寄与している可能性が予想される。
【０００４】
現在、骨髄間葉系幹細胞を骨髄血採血により採取し、細胞培養により増殖させた後、難治性組織損傷部位あるいは末梢循環血中に移植して、損傷組織の再生を誘導する再生医療が精力的に開発されつつある。既に脳梗塞、心筋梗塞、難治性皮膚潰瘍などの再生医療において、骨髄間葉系幹細胞移植の臨床応用が進められている。さらに、移植した骨髄間葉系幹細胞は生体内局所で炎症・免疫反応抑制作用、線維性瘢痕形成抑制作用を発揮することが明らかとなり、骨髄移植や輸血後の重篤な副作用である移植片対宿主反応（graft versus host disease, GVHD）や自己免疫疾患である強皮症に対する新しい治療法として、骨髄間葉系幹細胞移植療法の臨床試験が開始されている。しかし、骨髄間葉系幹細胞を含有する骨髄血は、腸骨に太い針を何度も刺入するという観血的手法でのみ採取される。また、骨髄間葉系幹細胞は体外で継代培養を続けると次第に増殖能力や多分化能を失ってしまう。さらに、生体内移植の安全性を保証する高品質管理に基づいた骨髄間葉系幹細胞培養はCPC（cell processing center）等の特殊培養設備を必要とするため、現時点では極めて限られた大学や企業でのみ実施可能である。即ち、骨髄間葉系幹細胞を用いた再生医療を難治性組織損傷に苦しんでいる世界中の多くの患者に届けるためには、あらゆる医療施設で実施可能な間葉系幹細胞再生医療のための技術開発が喫緊の課題である。
【０００５】
HMGB1（High mobility group box 1：高移動性グループ1タンパク質）は、約30年前に核内クロマチン構造を制御して遺伝子発現やDNA修復を制御する非ヒストンクロマチンタンパク質として同定された。HMGB1タンパク質の構造は主に二つのDNA結合ドメインから構成され、N末端側にあるDNA結合ドメインをA-box、C末端側のDNA結合ドメインをB-boxと呼ぶ。過去の研究により、HMGB1分子内でTLRと結合して炎症反応を喚起するドメインはB-box内に存在することが明らかにされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO2008/053892
【特許文献２】WO2007/015546
【特許文献３】WO2009/133939
【特許文献４】WO2009/133943
【特許文献５】WO2009/133940
【特許文献６】特表2005-537253
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Bustinら、 Mol Cell Biol、19：5237-5246、1999年
【非特許文献２】Horiら、J. Biol. Chem.、270、25752-25761、1995年
【非特許文献３】Wangら、Science、 285：248-251、1999年
【非特許文献４】Mullerら、EMBO J、20：4337-4340、2001年
【非特許文献５】Wangら、Science、 285：248-251、1999年
【非特許文献６】Germaniら、J Leukoc Biol. Jan;81(1):41-5、2007年
【非特許文献７】Palumboら、J. Cell Biol.、164：441-449、2004年
【非特許文献８】Merenmiesら、J. Biol. Chem.、266：16722-16729、1991年
【非特許文献９】Wu Yら、Stem cells、25:2648-2659、2007年
【非特許文献１０】Tamaiら、Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Apr 4. [Epub ahead of print]、 108：6609-6614、2011年
【非特許文献１１】Yangら、J Leukoc Biol. Jan;81(1):59-66、2007年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
最近本発明者らは、皮膚基底膜領域の接着分子遺伝子異常により、生下時より全身皮膚が剥離して全身熱傷様の症状を呈する遺伝性皮膚難病「表皮水疱症」における剥離表皮の再生機序の解明を目的とする研究を進め、剥離表皮から血中に放出されるHMGB1（High mobility group box 1：高移動性グループ1タンパク質）が骨髄中に存在するPDGFRα(platelet-derived growth factor receptor alpha)陽性細胞を刺激して血中に動員し、剥離表皮部への集積を誘導していること、さらに剥離表皮部に集積したPDGFRα陽性細胞は線維芽細胞や表皮細胞に分化して損傷皮膚の再生に強く寄与していることを、GFP（green fluorescent protein）トランスジェニック骨髄細胞を移植した表皮水疱症モデルマウスを用いることにより明らかにした。さらに、マウスに皮膚潰瘍や脳梗塞を作成した後に組み換えHMGB1タンパク質を尾静脈から投与することにより、骨髄よりPDGFRα陽性細胞が血中動員され、さらに皮膚潰瘍部や脳梗塞部に集積して皮膚潰瘍や脳梗塞の再生を強く誘導することを明らかにした。骨髄内PDGFRα陽性細胞は骨、軟骨、脂肪、さらには神経や上皮にも分化可能な間葉系幹細胞であることが既に報告されている。即ち、HMGB1投与により骨髄内PDGFRα陽性間葉系幹細胞を末梢循環に動員することにより、体外に取り出して特殊な培養をすることなく生体内で損傷組織に多くの間葉系幹細胞を集積させることが可能になった。
【０００９】
HMGB1を生体内骨髄間葉系幹細胞血中動員による損傷組織再生誘導医薬として開発することにより、あらゆる医療機関で骨髄間葉系幹細胞による再生誘導医療が実施できるようになる。その結果、上述した現在の骨髄間葉系幹細胞を用いた再生医療が直面している多くの課題が解決される。
【００１０】
上述したように、HMGB1医薬は骨髄間葉系幹細胞の血中動員、損傷組織への集積を促進し、体内での組織再生を誘導する画期的な治療薬である。本発明者らのこれまでの研究では、高濃度の組み換えHMGB1タンパク質をマウスやラットに投与しても全く副作用は観察されなかった。また、表皮剥離以外に重篤な症状の無い表皮水疱症患者末梢血中に極めて高濃度のHMGB1が存在しているという本発明者らの観察事実と併せて、HMGB1投与の安全性は高いと予測されるが、HMGB1には炎症性の作用があるという報告もある。このようにHMGB1については複数の知見があるが、HMGB1タンパク質の断片の間葉系幹細胞に対する作用や組織再生における役割に関する知見は何ら得られていなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、HMGB1タンパク質の1から84番目までのアミノ酸からなるペプチド、85から169番目までのアミノ酸からなるペプチドとして、それぞれの組み換えタンパク質をHEK293細胞の培地中に分泌させた。培地中の目的タンパク質をカラムクロマトグラフィー法によってそれぞれのタンパク質を精製し、PDGFRα陽性骨髄間葉系幹細胞株（MSC-1）に対するマイグレーション活性を確認した。その結果、本発明者らは、1から84番目までのアミノ酸からなるペプチドにマイグレーション活性を認めることが出来た。
【００１２】
次に本発明者らは、MSC-1に対するマイグレーション活性が認められた1から84番目のアミノ酸からなるペプチドのうち、さらに１から44番目のアミノ酸からなるペプチド、45から84番目のアミノ酸からなるペプチドを作製し、それぞれマイグレーション活性を調べた。その結果、作製したいずれのペプチド断片もPDGFRα陽性骨髄間葉系幹細胞株（MSC-1）に対してマイグレーション活性を示すことを確認した。
【００１３】
そこで、それぞれの断片部分を中心に少しずつオーバーラップするさまざまなペプチド断片を化学合成し、PDGFRα陽性骨髄間葉系幹細胞株（MSC-1）に対するマイグレーション活性の評価を試みた。その結果本発明者らは、マイグレーション活性を示す複数のペプチドの同定に成功した。
【００１４】
さらに本発明者らは、同定したペプチドがPDGFRα陽性細胞である皮膚線維芽細胞に対してもマイグレーション活性を有することや、脳梗塞モデルマウスの脳梗塞巣のサイズを縮小させる効果があることを確認した。
【００１５】
本発明者らは、HMGB1タンパク質の2から84番目までのアミノ酸からなるペプチド、89から215番目までのアミノ酸からなるペプチドとして、それぞれの組み換えタンパク質を大腸菌に発現させた。発現させたタンパク質をカラムクロマトグラフィー法によって精製し、PDGFRα陽性骨髄間葉系幹細胞株（MSC-1）およびヒト骨髄間葉系幹細胞に対するマイグレーション活性を確認した。その結果本発明者らは、２から84番目までのアミノ酸からなるペプチド、89から215番目までのアミノ酸からなるペプチドにマイグレーション活性を認めることが出来た。
【００１６】
次に本発明者らは、MSC-1およびヒト骨髄間葉系幹細胞に対するマイグレーション活性が認められた2から84番目のアミノ酸からなるペプチドのうち、さらに2から44番目のアミノ酸からなるペプチド、45から84番目のアミノ酸からなるペプチドを作製し、それぞれ、マイグレーション活性を調べた。その結果、作製したいずれのペプチド断片もPDGFRα陽性骨髄間葉系幹細胞株（MSC-1）およびヒト骨髄間葉系幹細胞に対してマイグレーション活性を示すことを確認した。
【００１７】
次に本発明者らは、MSC-1およびヒト骨髄間葉系幹細胞に対するマイグレーション活性が認められた89から215番目のアミノ酸からなるペプチドのうち、Ｃ末を徐々に短く削った89から205番目のアミノ酸からなるペプチド、89から195番目のアミノ酸からなるペプチド、89から185番目のアミノ酸からなるペプチドを作製し、それぞれ、マイグレーション活性を調べた。その結果、作製したペプチド断片のうちＣ末を削るほどPDGFRα陽性骨髄間葉系幹細胞株（MSC-1）およびヒト骨髄間葉系幹細胞に対してマイグレーション活性が増強された。
【００１８】
また、2から84番目のアミノ酸からなるペプチドにC末端のアスパラギン酸、グルタミン酸からなるAcidic tail の全部もしくは一部（１０もしくは２０もしくは３０アミノ酸配列）を付加した3種類の融合ペプチドを作成したところ、驚くべきことに、いずれにおいても２−８４のペプチドのマイグレーション活性が極めて減弱することが明らかになった。このことは、Acidic tail の全体もしくは一部が、全長のHMGB1においてマイグレーション活性を抑制性に制御していることを示している。今回、断片化によって少なくとも3か所以上のマイグレーション活性ドメインが明らかになり、いずれのドメインも全長の状態ではacidic tail によって抑制されている可能性が示唆された。
【００１９】
さらに本発明者らは、同定したペプチドが皮膚損傷モデルの治療効果があることを確認した。
【００２０】
本願は、この知見に基づき、以下の発明を提供するものである。
〔１〕
以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の物質を含有する、細胞遊走を刺激するために用いられる組成物；
（ａ）細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
（ｂ）（ａ）に記載のペプチドを分泌する細胞
（ｃ）（ａ）に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター。
〔２〕
以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の物質を含有する、細胞を骨髄から末梢血に動員するために用いられる組成物；
（ａ）細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
（ｂ）（ａ）に記載のペプチドを分泌する細胞
（ｃ）（ａ）に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター。
〔３〕
以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の物質を含有する、組織を再生するために用いられる組成物；
（ａ）細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
（ｂ）（ａ）に記載のペプチドを分泌する細胞
（ｃ）（ａ）に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター。
〔４〕
遊走が刺激される、または骨髄から末梢血に動員される細胞がPDGFRα陽性細胞である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の組成物。
〔５〕
遊走が刺激される、または骨髄から末梢血に動員される細胞が幹細胞である、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の組成物。
〔６〕
遊走が刺激される、または骨髄から末梢血に動員される細胞が骨髄細胞である、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の組成物。
〔７〕
遊走が刺激される、または骨髄から末梢血に動員される細胞が骨髄間葉系幹細胞である、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の組成物。
〔８〕
細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチドが、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列もしくは１番目から１８５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなる、細胞遊走刺激活性を有するペプチドである、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の組成物。
〔９〕
細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチドが、以下のいずれかのアミノ酸配列を含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドである、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の組成物；
（１）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１７番目から２５番目のアミノ酸配列
（２）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における４５番目から７４番目のアミノ酸配列
（３）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における５５番目から８４番目のアミノ酸配列
（４）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における８５番目から１６９番目のアミノ酸配列、および
（５）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における８９番目から１８５番目のアミノ酸配列。
〔１０〕
細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチドが、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列もしくは１番目から１８５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、以下のいずれかのアミノ酸配列を含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドである、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の組成物；
（１）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１７番目から２５番目のアミノ酸配列
（２）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における４５番目から７４番目のアミノ酸配列
（３）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における５５番目から８４番目のアミノ酸配列
（４）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における８５番目から１６９番目のアミノ酸配列、および
（５）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における８９番目から１８５番目のアミノ酸配列。
〔１１〕
以下のいずれかのアミノ酸配列を含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドを含有する、細胞遊走を刺激するために用いられる組成物；
（１）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１７番目から２５番目のアミノ酸配列
（２）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における４５番目から７４番目のアミノ酸配列
（３）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における５５番目から８４番目のアミノ酸配列
（４）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における８５番目から１６９番目のアミノ酸配列、および
（５）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における８９番目から１８５番目のアミノ酸配列。
〔１２〕
以下のいずれかのアミノ酸配列を含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドを含有する、細胞を骨髄から末梢血に動員するために用いられる組成物；
（１）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１７番目から２５番目のアミノ酸配列
（２）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における４５番目から７４番目のアミノ酸配列
（３）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における５５番目から８４番目のアミノ酸配列
（４）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における８５番目から１６９番目のアミノ酸配列、および
（５）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における８９番目から１８５番目のアミノ酸配列。
〔１３〕
以下のいずれかのアミノ酸配列を含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドを含有する、組織を再生するために用いられる組成物；
（１）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１７番目から２５番目のアミノ酸配列
（２）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における４５番目から７４番目のアミノ酸配列
（３）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における５５番目から８４番目のアミノ酸配列
（４）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における８５番目から１６９番目のアミノ酸配列、および
（５）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における８９番目から１８５番目のアミノ酸配列。
〔１４〕
ペプチドが、合成されたペプチドである、〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の組成物。
〔１５〕
ペプチドが、細胞を用いて製造されたペプチドである、〔１〕〜〔１４〕のいずれかに記載の組成物。
〔１６〕
ペプチドが、タグが付加されているペプチドである、〔１〕〜〔１５〕のいずれかに記載の組成物。
〔１７〕
ペプチドが、タグ由来のペプチド断片が付加されているペプチドである、〔１〕〜〔１５〕のいずれかに記載の組成物。
〔１８〕
細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド。
〔１９〕
配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列もしくは１番目から１８５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなる、細胞遊走刺激活性を有するペプチドである、〔１８〕に記載のペプチド。
〔２０〕
以下のいずれかのアミノ酸配列を含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドである、〔１８〕に記載のペプチド；
（１）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１７番目から２５番目のアミノ酸配列
（２）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における４５番目から７４番目のアミノ酸配列
（３）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における５５番目から８４番目のアミノ酸配列
（４）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における８５番目から１６９番目のアミノ酸配列、および
（５）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における８９番目から１８５番目のアミノ酸配列。
〔２１〕
配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列もしくは１番目から１８５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、以下のいずれかのアミノ酸配列を含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドである、〔１８〕に記載のペプチド；
（１）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１７番目から２５番目のアミノ酸配列
（２）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における４５番目から７４番目のアミノ酸配列
（３）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における５５番目から８４番目のアミノ酸配列
（４）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における８５番目から１６９番目のアミノ酸配列、および
（５）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における８９番目から１８５番目のアミノ酸配列。
〔２２〕
以下のいずれかのアミノ酸配列を含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド；
（１）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１７番目から２５番目のアミノ酸配列
（２）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における４５番目から７４番目のアミノ酸配列
（３）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における５５番目から８４番目のアミノ酸配列
（４）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における８５番目から１６９番目のアミノ酸配列、および
（５）配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における８９番目から１８５番目のアミノ酸配列。
〔２３〕
ペプチドが、合成されたペプチドである、〔１８〕〜〔２２〕のいずれかに記載のペプチド。
〔２４〕
ペプチドが、細胞を用いて製造されたペプチドである、〔１８〕〜〔２２〕のいずれかに記載のペプチド。
〔２５〕
ペプチドが、タグが付加されているペプチドである、〔１８〕〜〔２２〕のいずれかに記載のペプチド。
〔２６〕
ペプチドが、タグ由来のペプチド断片が付加されているペプチドである、〔１８〕〜〔２２〕のいずれかに記載のペプチド。
〔２７〕
〔１８〕〜〔２６〕のいずれかに記載のペプチドをコードするDNA。
〔２８〕
〔２７〕に記載のDNAを有するベクター。
〔２９〕
〔２７〕に記載のDNAまたは〔２８〕に記載のベクターを有する形質転換細胞。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】HEK293細胞を利用してペプチドおよびタンパク質を生産するための発現ベクターを示す図である。
【図２】図２Aは、PDGFRα陽性株化骨髄間葉系幹細胞のペプチドに対するマイグレーション活性を示す写真である。陽性コントロールである全長のHMGB1(1-215)、1から84番目のアミノ酸からなるペプチド（1-84）、85から169番目のアミノ酸からなるペプチド（85-169）、1から44番目のアミノ酸からなるペプチド（1-44）、45から84番目のアミノ酸からなるペプチド（45-84）を比較した。これらのペプチドはいずれもHEK293を利用して生産した。図２Bは、ヒト骨髄間葉系幹細胞のPDGFRαの発現の有無をウエスタンブロットで確認した図である。ヒトの骨髄間葉系幹細胞におけるPDGFRαの発現が確認された。
【図３】PDGFRα陽性株化骨髄間葉系幹細胞のペプチドに対するマイグレーション活性を示す写真である。HMGB1の45から215番目のアミノ酸からなるペプチド(45-215)、および63から215番目のアミノ酸からなるペプチド（63-215）を比較した。これらのペプチドはいずれもHEK293を利用して生産した。
【図４】PDGFRα-GFPマウスから骨髄細胞を採取し、一定期間接着細胞培養皿を使用して培養後、MACSを使用してCD11b陽性細胞とCD11b陰性細胞を分離し、それぞれの細胞のGFP蛍光を観察した写真である。
【図５】HMGB1_1-44ペプチドの、骨髄間葉系幹細胞の初代培養細胞に対するマイグレーション活性を示した写真である。
【図６】骨髄間葉系幹細胞の初代培養細胞（PDGFRα陽性、Lin陰性、c-kit陰性）の骨分化能（A）、脂肪細胞分化能（B）を示す写真である。
【図７】PDGFRα陽性株化骨髄間葉系幹細胞の、各種合成ペプチドに対するマイグレーション活性を示す写真である。
【図８】図８Aは、PDGFRα陽性株化骨髄間葉系幹細胞の、各種合成ペプチドに対するマイグレーション活性を示す写真である。図８Bは、図８Aにおける左下の写真のマイグレーション活性を定量化したグラフである。それぞれの合成ペプチド及びネガティブコントロールに向かって遊走した細胞数を顕微鏡下で計測した。ネガティブコントロールの平均値を100とした場合のそれぞれの値をグラフにした。図８Cは、骨髄間葉系幹細胞（MSC-1）に対する各種ペプチドのマイグレーション活性の結果を示す写真である。グラフは写真のスポットについてそれぞれの細胞数を計測し平均化し、ネガティブコントロールに対する（％）比として示した。
【図９】PDGFRα陽性株化骨髄間葉系幹細胞の、各種合成ペプチドに対するマイグレーション活性を示す写真である。
【図１０】PDGFRα陽性株化骨髄間葉系幹細胞の各種ペプチドに対するマイグレーション活性を示す写真および図である。恒常的にペプチドを分泌するHEK293細胞由来、一過性にプラスミドをトランスフェクションしてペプチドを分泌するHEK293細胞由来、大腸菌由来、合成ペプチドそれぞれの生産系を利用して製造した各HMGB1_1-44ペプチド（1-44）を、陽性コントロールである全長HMGB1と比較した。
【図１１】PDGFRα陽性株化骨髄間葉系幹細胞のPDGFRα、Lineage marker、CD44に対するFACS解析の図である。
【図１２】Aは、マウスケラチノサイトにおけるHMGB1_1-34ペプチド(1-34)に対するマイグレーション活性を示す写真である。Bは、PDGFRα-GFPマウスの皮膚におけるケラチン５の免疫組織化学像写真である。ケラチン５陽性細胞であるケラチノサイトはPDGFRαを発現しない。
【図１３】Aは、マウス皮膚線維芽細胞におけるHMGB1_1-34ペプチド(1-34)に対するマイグレーション活性を示す写真である。Bは、PDGFRα-GFPマウスの皮膚におけるビメンチンの免疫組織化学像写真である。ビメンチン陽性細胞である皮膚線維芽細胞の一部はPDGFRαを発現している。
【図１４】PDGFRα-GFPマウスの皮膚線維芽細胞と野生型マウス(C57/Bl6 mouse)の線維芽細胞のFACS解析の図である。マウス皮膚線維芽細胞のほぼ98%以上においてPDGFRαが発現している。
【図１５】合成ペプチド（1-44）による血中へのPDGFRα陽性CD44陽性細胞の動員をFACSで示した図である。
【図１６】合成ペプチド（1-44）および陰性コントロールのPBSを投与したラット脳梗塞モデルの脳の断面写真である。合成ペプチド（1-44）において脳梗塞サイズの縮小が観察された。
【図１７】合成ペプチド（1-44）および陰性コントロールのPBSを投与したラット脳梗塞モデルの脳の右脳面積に対する脳梗塞巣面積の割合を示した図および写真である。同一脳から４つの断面を作製しそれぞれの面積を計測している。
【図１８Ａ】ヒトHMGB1のN末側に6XHis tag とTEV protease 切断配列を付加した図である。このタンパクを発現するcDNAを新たに作製し大腸菌発現ベクターに挿入した。
【図１８Ｂ−Ｄ】図１８Ｂは、PDGFRα陽性株化骨髄間葉系幹細胞のHMGB1断片に対するマイグレーション活性を示す写真である。これらの断片はいずれも大腸菌を利用して生産した。図１８Ｃは、PDGFRα陽性株化骨髄間葉系幹細胞のHMGB1断片に対するマイグレーション活性を定量し、それぞれの活性の平均値をグラフ化した図である。図１８Ｄは、PDGFRα陽性株化骨髄間葉系幹細胞のHMGB1断片に対するマイグレーション活性を定量し平均値を示した表である。
【図１９】図Ａは８９番目のアミノ酸から２１５番目のアミノ酸からなるHMGB1断片を、大腸菌を用いて生産し、ニッケルアフィニティー精製したもの（I: input）を陰イオン交換カラムでさらに精製し各フラクションをSDS-PAGEした写真である。Mは分子量マーカーである。低い塩濃度では１５．５kDaの断片（*３）が溶出され、塩濃度が高くなるにつれて１６kDa（*２）、１７kDa（*１）の断片が順次溶出されている。（*３）および(*２)は（*１）の分解産物であると予想される。図Ｂは図Ａで分取したフラクションのPDGFRα株化骨髄間葉系幹細胞に対するマイグレーション活性を示す写真である。NCはネガティブコントロール、2-215はポジティブコントロールである。切断片と思われるもっとも低分子の断片（*３）がより長い断片（*１）（*２）よりも強い活性を認める。この活性は2-215よりも強い。図Ｃは８９番目のアミノ酸から２０５番目のアミノ酸からなるHMGB1断片を、大腸菌を用いて生産し、ニッケルアフィニティー精製したものを陰イオン交換カラムでさらに精製し各フラクションをSDS-PAGEした写真である。低い塩濃度ではもっとも短い断片（*４）が溶出され、塩濃度が高くなるにつれて（*５）、（*６）と長い断片が溶出されている。（*５）および(*６)は（*４）の分解産物であると予想される。さらに、精製したHMGB1断片８９−１９５、および８９−１８５を同時にSDS-PAGEしている。Mは分子量マーカーである。図Ｄは、図Ｃで分取したフラクションのPDGFRα株化骨髄間葉系幹細胞に対するマイグレーション活性を示す写真である。NCはネガティブコントロールであり、切断片と思われるもっとも低分子の断片（*４）が、より長い断片（*５）または（*６）よりも強い活性を認める。なお、あらかじめC末をさらに短くしたHMGB1断片８９−１９５および８９−１８５にはよりいっそう強い活性が認められた。
【図２０】図ＡはHMGB1断片８５−１６９のマイグレーション活性を示した写真である。ポジティブコントロールであるHMGB1断片２−２１５以上の活性を認める。図Ｂは、図Ａのマイグレーション活性を定量化し平均値をグラフとしたものである。図Ｃは、図Ｂの平均値を示した表である。
【図２１−１】図Aは、骨髄間葉系幹細胞の細胞株（MSC-1）の大腸菌で作成したHMGB1の断片、2-215、2-205、2-195、2-185に対するマイグレーション活性を示した図である。図Bは、大腸菌で生産したHMGB1の断片のヒト骨髄間葉系幹細胞に対するマイグレーション活性を示す写真である。
【図２１−２】図Cは、精製したヒトHMGB1の断片（2-84）にヒトHMGB1のAcidic tail の断片（186-215）,（186-205）,（186-195）を付加した融合断片「（2-84）＋（186-215）, （2-84）＋（186-205）, （2-84）＋（186-195）」それぞれに対しSDS-PAGEを行いさらに泳動ゲルに対しCBBを用いタンパク染色を行った図である。精製されたそれぞれの断片が確認できた。図Ｄは、精製した断片を使用してMSC-1に対するマイグレーション活性を確認した図である。2-84の断片にAcidic tail の配列を付加した融合断片はいずれもマイグレーション活性を示さなかった。一方2-84の断片そのものはマイグレーション活性を示した。
【図２２】ラット背部に作製した皮弁の１週間後の写真である。PBSはネガティブコントロール群である。さらに、HEK293細胞で生産した全長を含むHMGB1（１−２１５（HEK））および、1番目から44番目までのアミノ酸を合成したペプチド(１−４４（合成ペプチド）)投与群を比較した。矢印は壊死した皮膚組織である。
【図２３】ラット背部に作製した皮弁の５週間後の写真である。PBSはネガティブコントロール群である。さらに、HEK293細胞で生産した全長を含むHMGB1（１−２１５（HEK））および、1番目から44番目までのアミノ酸を合成したペプチド(１−４４（合成ペプチド）)投与群を比較した。赤く変色している部分は皮膚潰瘍形成部分である。
【図２４】ラット背部に作製した皮弁の７週間後の写真である。 PBSはネガティブコントロール群である。さらに、HEK293細胞で生産した全長を含むHMGB1（１−２１５（HEK））および、1番目から44番目までのアミノ酸を合成したペプチド(１−４４（合成ペプチド）)投与群を比較した。
【図２５】ラット背部に作製した皮弁に発生した創傷部分（壊死部分）の面積を定量化したグラフである。皮弁作製１から３週間後はHEK293細胞で生産した全長を含むHMGB1（１−２１５（HEK））および、1番目から44番目までのアミノ酸を合成したペプチド(１−４４（合成ペプチド）)投与群がネガティブコントロール群に比較して創傷部分の縮小効果が認められた。４週間後以降では１−４４（合成ペプチド）が他の2群に比較してさらに縮小効果が認められた。
【図２６】化学合成したHMGB1ペプチド（1-44）と(17-25)を、皮膚損傷を作製したラットの尾静脈から投与した。皮膚損傷作成後2週間後、6週間後のそれぞれの皮弁全体の面積に対する皮膚損傷部位の面積の比率（％）を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の物質を含有する、細胞遊走を刺激するために用いられる組成物を提供する。
（ａ）細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
（ｂ）（ａ）に記載のペプチドを分泌する細胞
（ｃ）（ａ）に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター
本発明の細胞遊走を刺激するために用いられる組成物には、試薬組成物および医薬組成物が含まれる。本明細書において、試薬組成物は試薬とも表現され、医薬組成物は医薬、薬剤または薬学的組成物とも表現される。
【００２３】
本発明の細胞遊走を刺激するために用いられる試薬組成物は、例えば、再生医療、再生誘導医療開発のための基礎研究および臨床研究に必要な試薬として使用することができる。例えば、該試薬組成物を使用することにより、実験動物における生体組織に細胞を動員し、組織修復、組織機能再建の程度を検討することが可能になる。また例えば、該試薬組成物を使用することにより、試験管内で細胞の動員による組織再生誘導研究を行うことができる。
【００２４】
また本発明の細胞遊走を刺激するために用いられる医薬組成物は、例えば、再生医療、再生誘導医療における医薬として使用することができる。例えば、該医薬組成物を使用することにより、組織を再生することができる。また例えば、該医薬組成物は、いわゆる予防医薬として組織幹細胞の減少による組織・臓器機能の低下を予防することができ、あるいは、抗加齢医薬として加齢性変化の進行を遅延させることができる。
【００２５】
なお、本明細書において、細胞遊走を刺激するために用いられる組成物は、細胞遊走を刺激するために用いられる剤、細胞遊走の刺激剤、細胞遊走を誘導するために用いられる組成物、細胞遊走を誘導するために用いられる剤、細胞遊走の誘導剤、または細胞の誘導剤とも表現される。
本発明において、細胞遊走刺激活性とは、細胞遊走を刺激する活性を意味する。本明細書において、細胞遊走刺激活性は、細胞遊走誘導活性または細胞誘導活性とも表現される。
【００２６】
本発明は、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の物質を含有する、骨髄細胞を骨髄から末梢血に動員するために用いられる組成物を提供する。
（ａ）細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
（ｂ）（ａ）に記載のペプチドを分泌する細胞
（ｃ）（ａ）に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター
本発明の骨髄細胞を骨髄から末梢血に動員するために用いられる組成物には、試薬組成物および医薬組成物が含まれる。
【００２７】
本発明の組織を再生するために用いられる試薬組成物は、例えば、再生医療、再生誘導医療開発のための基礎研究および臨床研究に必要な試薬として使用することができる。また本発明の組織を再生するために用いられる医薬組成物は、例えば、再生医療、再生誘導医療における医薬として使用することができる。例えば、該医薬組成物を使用することにより、末梢循環中に骨髄組織幹細胞を動員し、組織を再生することができる。また例えば、該医薬組成物を利用して末梢血中に動員させた細胞を体外へ回収後、濃縮して組織に投与して治療することも可能である。従来の方法では体内深部にある骨髄から細胞を回収するため、生体に対して侵襲があるが、本発明の医薬組成物を用いれば、低侵襲に骨髄細胞を末梢血から回収し、骨髄細胞移植等に利用できる。なお、本明細書において、骨髄細胞を骨髄から末梢血に動員するために用いられる組成物は、骨髄細胞を骨髄から末梢血に誘導するために用いられる組成物とも表現される。
【００２８】
本発明は、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の物質を含有する、組織を再生するために用いられる組成物を提供する。
（ａ）細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
（ｂ）（ａ）に記載のペプチドを分泌する細胞
（ｃ）（ａ）に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター
本発明の組織を再生するために用いられる組成物には、試薬組成物および医薬組成物が含まれる。
【００２９】
本発明の組織を再生するために用いられる試薬組成物は、例えば、再生医療、再生誘導医療開発のための基礎研究および臨床研究に必要な試薬として使用することができる。また本発明の組織を再生するために用いられる医薬組成物は、例えば、再生医療、再生誘導医療における医薬として使用することができる。
【００３０】
なお、本明細書において、組織を再生するために用いられる組成物は、組織再生を誘導または促進するために用いられる組成物、組織再生を誘導または促進するために用いられる剤、組織再生誘導剤または組織再生促進剤とも表現される。また組織再生には、組織修復も含まれる。
【００３１】
本発明の組織を再生するために用いられる組成物は、投与・添加部位を選ばない。すなわち、該組成物は、再生が必要な組織、再生が必要な組織とは異なる組織、血中など、いずれの組織に投与されても、その効果を発揮することができる。例えば、該組成物を投与・添加することにより、投与・添加部位またはその近傍の組織に細胞が動員され、組織再生が誘導または促進される。また例えば、該組成物を損傷組織部位またはその近傍に投与・添加することにより、該損傷組織に細胞が動員され、組織再生が誘導または促進される。また例えば、該組成物を再生が必要な組織とは異なる組織に投与・添加することにより、骨髄から再生が必要な組織に末梢循環を介して骨髄細胞が動員され、組織再生が誘導または促進される。ここで、「末梢循環」とは、「血液循環」、「末梢循環血流」とも称される。
【００３２】
再生が必要な組織としては、損傷している組織、壊死している組織、術後組織、機能が低下している組織、線維化している組織、老化した組織、病気の組織等が例示でき、例えば、生体皮膚組織、体内生検（手術）組織（脳、肺、心臓、肝臓、胃、小腸、大腸、膵臓、腎臓、膀胱、脾臓、子宮、精巣や血液など）が例示できる。
【００３３】
再生が必要な組織とは異なる組織への投与とは、再生が必要な部位以外の部位（再生が必要な部位とは異なる部位）に投与することを意味する。したがって、「再生が必要な組織とは異なる組織」は、再生が必要な組織とは異なる部位、再生が必要な部位とは異なる部位、再生が必要な組織から離れた部位、再生が必要な部位から離れた部位、再生が必要な部位から遠位にある部位、再生が必要な組織から遠位にある組織、遠位部、遠位組織と表現することもできる。すなわち、本発明の組成物は、体外から直接薬剤を投与することが困難な組織（脳、心臓など）を再生するために、有効に利用される。
【００３４】
再生が必要な組織に動員された細胞は、種々の細胞に分化し、再生が必要な組織の機能的再生および機能維持、機能強化に寄与する。本発明において、再生が必要な組織としては、虚血、疎血・低酸素状態に起因する種々の病態、外傷、熱傷、炎症、自己免疫、遺伝子異常などによって損傷した組織が挙げられるが、これら原因に限定されるものではない。
【００３５】
本発明における組織としては、骨髄由来細胞が分化可能な組織である限り、特に制限はないが、例えば皮膚組織、骨組織、軟骨組織、筋組織、脂肪組織、心筋組織、神経系組織、肺組織、消化管組織、肝・胆・膵組織、泌尿・生殖器など、生体内のすべての組織が例示できる。また、上記組成物を用いることで、難治性皮膚潰瘍、皮膚創傷、水疱症、脱毛症などの皮膚疾患はもとより、脳梗塞、心筋梗塞、骨折、肺梗塞、胃潰瘍、腸炎、などの再生が必要な組織において、機能的組織再生を誘導する治療が可能となる。上記組成物が投与される動物種としては特に制限はなく、哺乳類、鳥類、魚類等が挙げられる。哺乳類としては、ヒト又は非ヒト動物が挙げられ、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、ブタ、イヌ、ウサギ、ハムスター、モルモット、ウマ、ヒツジ、クジラなどが例示できるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
また、再生が必要な組織とは異なる組織としては、血液組織、筋肉組織、皮下組織、皮内組織、腹腔等が例示できる。
【００３７】
神経組織としては、中枢神経組織が挙げられるが、これに限定されない。また、神経組織を再生するために用いられる組成物は、例えば、脳梗塞、脳出血、脳挫傷等の治療に使用できるが、これらに制限されない。また骨組織を再生するために用いられる組成物は、例えば、骨折の治療に使用できるが、これに限定されない。また皮膚組織を再生するために用いられる組成物は、例えば、皮膚潰瘍、手術創の縫合不全、熱傷、切傷、挫傷、皮膚びらん、擦過傷等の治療に使用できるが、これらに制限されない。
【００３８】
また、本発明において、遊走が刺激される細胞または骨髄から末梢血に動員される細胞としては、未分化な細胞、種々の分化段階にある細胞が挙げられるが、これらに制限されない。また、本発明において、遊走が刺激される細胞または骨髄から末梢血に動員される細胞としては、幹細胞、非幹細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。幹細胞には、循環性の幹細胞、または非循環性の幹細胞が含まれる。非循環性の幹細胞としては、組織に常在している組織幹細胞が例示できる。循環性の幹細胞としては、血中循環性の幹細胞が例示できる。
【００３９】
また、遊走が刺激される細胞または骨髄から末梢血に動員される細胞としては、骨髄由来細胞または造血系幹細胞が挙げられるが、これに制限されない。本明細書において「造血系幹細胞」とは好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球、マクロファージなどの白血球の他、赤血球、血小板、肥満細胞、樹状細胞などの血球系の細胞に分化可能な幹細胞であり、マーカーとしてヒトではCD34陽性、CD133陽性、マウスではCD34陰性、c-Kit陽性、Sca-1陽性、Lineage marker 陰性であることが知られている。また、造血系幹細胞は、培養皿で培養する場合、単独で培養することが困難であり、ストローマ細胞との共培養が必要であることが特徴である。
【００４０】
本明細書において、「骨髄細胞」とは、骨髄内に存在する細胞を意味し、一方、「骨髄由来細胞」とは、骨髄から骨髄外に動員された「骨髄細胞」を意味する。「骨髄細胞」は骨髄中に存在する組織前駆細胞集団を含む細胞を含む。また「骨髄由来細胞」はmesoangioblastを含む細胞であってもよく、mesoangioblastを除く細胞であってもよい。
【００４１】
組織前駆細胞は、血液系以外の特定組織細胞への一方向性分化能を持つ未分化細胞と定義され、上述した間葉系組織、上皮系組織、神経組織、実質臓器、血管内皮への分化能を有する未分化細胞を含む。
【００４２】
「骨髄細胞」、「骨髄由来細胞」は、造血系幹細胞及びこれに由来する白血球、赤血球、血小板、骨芽細胞、ファイブロサイトなどの分化細胞、または、これまで骨髄間葉系幹細胞あるいは骨髄間質多能性幹細胞あるいは骨髄多能性幹細胞と呼ばれている細胞に代表される幹細胞である。本明細書において、「骨髄幹細胞」とは、骨髄内に存在する幹細胞を意味し、一方、「骨髄由来幹細胞」とは、骨髄から骨髄外に動員された「骨髄幹細胞」を意味する。本発明において、遊走が刺激される細胞または骨髄から末梢血に動員される細胞としては、「骨髄由来幹細胞」が挙げられるが、これに制限されない。「骨髄細胞」、「骨髄由来細胞」は、骨髄採取（骨髄細胞採取）、あるいは末梢血採血により単離することができる。造血系幹細胞は非付着細胞であるが、「骨髄細胞」、「骨髄由来細胞」の一部は、骨髄採取（骨髄細胞採取）、末梢血採血により得られた血液中の単核球分画細胞培養により、付着細胞として得られる。
【００４３】
また、「骨髄細胞」、「骨髄由来細胞」は、間葉系幹細胞を含み、骨芽細胞（分化を誘導するとカルシウムの沈着を認めることで特定可能）、軟骨細胞（アルシアンブルー染色陽性、サフラニン-O染色陽性などで特定可能）、脂肪細胞（ズダンIII染色陽性で特定可能）、さらには線維芽細胞、平滑筋細胞、ストローマ細胞、腱細胞、などの間葉系細胞、さらには神経細胞、上皮細胞（たとえば表皮角化細胞、腸管上皮細胞はサイトケラチンファミリーを発現する）、血管内皮細胞への分化能力を有することが好ましい。分化後の細胞は上記細胞に限定されるものではなく、肝臓、腎臓、膵臓などの実質臓器細胞への分化能も含む。
【００４４】
本明細書において、「骨髄間葉系幹細胞」、「骨髄間質多能性細胞」、あるいは「骨髄多能性幹細胞」とは、骨髄内に存在する細胞であって、骨髄から直接あるいはその他の組織（血液や皮膚、脂肪、その他の組織）から間接的に採取され、培養皿（プラスチックあるいはガラス製）への付着細胞として培養・増殖可能であり、骨、軟骨、脂肪などの間葉系組織（間葉系幹細胞）、あるいは骨格筋、心筋、さらには神経組織、上皮組織（多能性幹細胞）への分化能を有するという特徴を持つ細胞であり、骨髄細胞採取によって取得することができる細胞である。
【００４５】
一方、また、骨髄から骨髄外に動員された「骨髄由来骨髄間葉系幹細胞」、「骨髄由来骨髄間質多能性細胞」、あるいは「骨髄由来骨髄多能性幹細胞」は、末梢血採血、さらには脂肪など間葉組織、皮膚などの上皮組織、脳などの神経組織からの採取によって取得することができる細胞である。
【００４６】
また、これら細胞は、採取後直接、あるいは一度培養皿へ付着させた細胞を生体の損傷部に投与することにより、例えば皮膚を構成するケラチノサイトなどの上皮系組織、脳を構成する神経系の組織への分化能も有するという特徴も持つ。
【００４７】
骨髄間葉系幹細胞、骨髄間質多能性幹細胞、骨髄多能性幹細胞、あるいは骨髄から骨髄外へ動員されたこれら細胞は、骨芽細胞（分化を誘導するとカルシウムの沈着を認めること等で特定可能）、軟骨細胞（アルシアンブルー染色陽性、サフラニン-O染色陽性等で特定可能）、脂肪細胞（ズダンIII染色陽性等で特定可能）の他に、例えば線維芽細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、ストローマ細胞、腱細胞などの間葉系細胞、神経細胞、色素細胞、表皮細胞、毛包細胞(サイトケラチンファミリー、ヘアケラチンファミリー等を発現する)、上皮系細胞（たとえば表皮角化細胞、腸管上皮細胞はサイトケラチンファミリー等を発現する）、内皮細胞、さらに肝臓、腎臓、膵臓等の実質臓器細胞に分化する能力を有することが好ましいが、分化後の細胞は上記細胞に限定されるものではない。
【００４８】
ヒト骨髄細胞、ヒト骨髄由来細胞としては、骨髄採取（骨髄細胞採取）、末梢血採血、脂肪採取によって取得し、直接あるいは単核球分画を分離後に培養して付着細胞として取得できる細胞が例示できるが、これに制限されるものではない。ヒト骨髄細胞、ヒト骨髄由来細胞のマーカーとしては、PDGFRα陽性、Lin陰性、CD45陰性、CD44陽性、CD90陽性、CD29陽性、Flk-1陰性、CD105陽性、CD73陽性、CD90陽性、CD71陽性、Ｓtro-1陽性、CD106陽性、CD166陽性、CD31陰性の全部または一部が例示できるが、これらに制限されるものではない。
【００４９】
また、マウス骨髄細胞、マウス骨髄由来細胞としては、骨髄採取（骨髄細胞採取）、末梢血採血、脂肪採取によって取得し、直接あるいは単核球分画を分離後に培養して付着細胞として取得できる細胞が例示できるが、これに制限されるものではない。マウス骨髄細胞、マウス骨髄由来細胞のマーカーとしては、CD44陽性、PDGFRα陽性、PDGFRβ陽性、CD45陰性、Lin陰性、Sca-1陽性、c-kit陰性、CD90陽性、CD29陽性、Flk-1陰性の全部または一部が例示できるが、これらに制限されるものではない。
【００５０】
本発明において、遊走が刺激される細胞または骨髄から末梢血に動員される細胞としては、PDGFRα陽性細胞が挙げられるが、これに制限されない。また、PDGFRα以外のマーカーとしてはCD29陽性、CD44陽性、CD90陽性、CD271陽性、CD11ｂ陰性、Flk-1陰性の全部または一部が例示できるが、これらに制限されるものではない。PDGFRα陽性細胞としては、PDGFRα陽性の骨髄由来細胞、PDGFRα陽性の骨髄由来骨髄間葉系幹細胞、PDGFRα陽性の組織に常在している組織細胞（例えば、線維芽細胞などが例示できる）、PDGFRα陽性の骨髄由来細胞であって、骨髄採取（骨髄細胞採取）、末梢血採血により得られた血液中の単核球分画細胞培養により、付着細胞として得られる細胞などが例示できるが、これらに制限されるものではない。
【００５１】
本発明の組成物には、上記（ａ）から（ｃ）に記載の物質のうちの少なくとも１つの物質以外に別の物質が含まれてもよい。本発明の組成物において、上記（ａ）から（ｃ）に記載の物質のうちの少なくとも１つの物質以外の物質としては、細胞遊走刺激活性、細胞動員活性、または組織再生促進活性を阻害しない限り、特に制限はない。例えば、本発明の組成物には、上記（ａ）から（ｃ）に記載の物質のうち少なくとも１つの物質に加え、上記（ａ）から（ｃ）に記載の物質の機能を強化する関連分子（群）、上記（ａ）から（ｃ）に記載の物質の期待される効果以外の作用を抑制する分子（群）、細胞の増殖や分化を制御する因子、これら因子あるいは細胞の機能を強化・維持するその他の因子を含むことが可能である。
【００５２】
本発明におけるHMGB1タンパク質としては、ヒト由来のHMGB1タンパク質として配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、当該タンパク質をコードするDNAとして、配列番号：２に記載の塩基配列を含むDNAが例示できるが、これらに限定されるものではない。
【００５３】
また、マウス由来のHMGB1タンパク質として配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、当該タンパク質をコードするDNAとして、配列番号：４に記載の塩基配列を含むDNAが例示できるが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
さらに、ラット由来のHMGB1タンパク質として配列番号：５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、当該タンパク質をコードするDNAとして、配列番号：６に記載の塩基配列を含むDNAが例示できるが、これらに限定されるものではない。
【００５５】
本発明の組成物は、細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチドを含有する。本発明のHMGB1タンパク質の一部からなるペプチドとしては、細胞遊走刺激活性を有するドメインを含んでいる限り、特に制限されない。
【００５６】
HMGB1タンパク質の一部からなるペプチドの細胞遊走刺激活性は、例えば実施例の記載の方法の他、以下に示す方法によって確認することができるが、これに限定されず、その他の試験管内あるいは生体内細胞遊走能測定方法で測定することもできる。
・ HMGB1タンパク質やペプチドを挿入したシリコンチューブを皮下などに埋め込み、一定時間後に取り出してチューブ内に遊走した細胞を確認する方法。
・ HMGB1タンパク質やペプチドを樹脂ビーズなどに結合させ生体組織内に埋め込み、一定時間後に取り出してビーズに遊走した細胞を確認する方法。
・ ゼラチン、ヒアルロン酸などの徐放作用のある高分子体にHMGB1タンパク質やペプチドをしみこませ生体組織内に埋め込み、一定時間後に取り出して高分子体に遊走した細胞を確認する方法。
【００５７】
本発明において、細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチドとしては、以下のペプチドを例示することが出来るが以下に限定されない。
【００５８】
本発明において、細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチドとしては、細胞を骨髄から末梢血に動員する活性、または組織再生促進活性を有するペプチドがあげられる。
【００５９】
本発明において、細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチドとしては、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列もしくは１番目から１８５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなる、細胞遊走刺激活性を有するペプチドが挙げられる。
【００６０】
また本発明において、細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチドとしては、以下のいずれかのアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドが挙げられる。なお、以下のアミノ酸配列は、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列の一部である。
（１）１７番目から２５番目のアミノ酸配列
（２）４５番目から７４番目のアミノ酸配列
（３）５５番目から８４番目のアミノ酸配列
（４）８５番目から１６９番目のアミノ酸配列、
（５）８９番目から１８５番目のアミノ酸配列、および
（６）９３番目から２１５番目のアミノ酸配列。
【００６１】
また本発明において、細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチドとしては、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列もしくは１番目から１８５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、以下のいずれかのアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドが挙げられる。なお、以下のアミノ酸配列は、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列の一部である。
（１）１７番目から２５番目のアミノ酸配列を含むペプチド
（２）４５番目から７４番目のアミノ酸配列を含むペプチド
（３）５５番目から８４番目のアミノ酸配列を含むペプチド
（４）８５番目から１６９番目のアミノ酸配列を含むペプチド、および
（５）８９番目から１８５番目のアミノ酸配列を含むペプチド。
【００６２】
本発明において、細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチドとしては、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列の一部からなる、細胞遊走刺激活性を有するペプチドであって、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１７番目から２５番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドが挙げられる。このようなペプチドの例として、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチド（該ペプチドのアミノ酸数は１９５以下の自然数から選択されるアミノ酸数である）、１番目から１８５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチド（該ペプチドのアミノ酸数は１８５以下の自然数から選択されるアミノ酸数である）、１番目から１７０番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチド（該ペプチドのアミノ酸数は１７０以下の自然数から選択されるアミノ酸数である）、１番目から８４番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチド（該ペプチドのアミノ酸数は８４以下の自然数から選択されるアミノ酸数である）、または１番目から４４番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチド（該ペプチドのアミノ酸数は４４以下の自然数から選択されるアミノ酸数である）であって、該アミノ酸配列において１７番目から２５番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドが挙げられるが、これに制限されない。
【００６３】
以下に「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において１７番目から２５番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」について記載するが、該ペプチドに包含される「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１８５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において１７番目から２５番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」などの他のペプチドについても同様に記載しうる。
【００６４】
本発明において、「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において１７番目から２５番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」は、「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列から選択される連続したアミノ酸配列からなるペプチドであって、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列において１７番目から２５番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」とも表現しうる。
【００６５】
本発明において、「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において１７番目から２５番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」には、下記（１）〜（６０）のいずれかのアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列において１７番目から２５番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドが含まれる。
【００６６】
本発明において、「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において１７番目から２５番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」には、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列において下記（１）〜（５７）および（５９）〜（６１）のいずれかのアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドが含まれる。
【００６７】
本発明において、「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において１７番目から２５番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」には、下記（１）〜（６１）のいずれかのアミノ酸配列からなる細胞遊走刺激活性を有するペプチド含まれる。なお、以下のアミノ酸配列は、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列の一部である。
（１）１番目から４４番目のアミノ酸配列
（２）１番目から２５番目のアミノ酸配列
（３）１番目から３４番目のアミノ酸配列
（４）１番目から４２番目のアミノ酸配列
（５）１番目から４３番目のアミノ酸配列
（６）１番目から４５番目のアミノ酸配列
（７）１番目から４６番目のアミノ酸配列
（８）１番目から４７番目のアミノ酸配列
（９）１番目から４８番目のアミノ酸配列
（１０）１番目から４９番目のアミノ酸配列
（１１）１番目から５０番目のアミノ酸配列
（１２）１番目から５１番目のアミノ酸配列
（１３）１番目から５２番目のアミノ酸配列
（１４）１番目から６２番目のアミノ酸配列
（１５）１番目から８４番目のアミノ酸配列
（１６）１０番目から２５番目のアミノ酸配列
（１７）１１番目から２５番目のアミノ酸配列
（１８）１１番目から２７番目のアミノ酸配列
（１９）１１番目から２８番目のアミノ酸配列
（２０）１１番目から２９番目のアミノ酸配列
（２１）１１番目から３０番目のアミノ酸配列
（２２）１１番目から３４番目のアミノ酸配列
（２３）１１番目から４４番目のアミノ酸配列
（２４）１２番目から２５番目のアミノ酸配列
（２５）１２番目から３０番目のアミノ酸配列
（２６）１３番目から２５番目のアミノ酸配列
（２７）１３番目から３０番目のアミノ酸配列
（２８）１４番目から２５番目のアミノ酸配列
（２９）１４番目から３０番目のアミノ酸配列
（３０）１５番目から２５番目のアミノ酸配列
（３１）１５番目から３０番目のアミノ酸配列
（３２）１６番目から２５番目のアミノ酸配列
（３３）１６番目から３０番目のアミノ酸配列
（３４）１７番目から３０番目のアミノ酸配列
（３５）１番目から７０番目のアミノ酸配列
（３６）１番目から８１番目のアミノ酸配列
（３７）１番目から１７０番目のアミノ酸配列
（３８）２番目から２５番目のアミノ酸配列
（３９）２番目から３４番目のアミノ酸配列
（４０）２番目から４２番目のアミノ酸配列
（４１）２番目から４３番目のアミノ酸配列
（４２）２番目から４４番目のアミノ酸配列
（４３）２番目から４５番目のアミノ酸配列
（４４）２番目から４６番目のアミノ酸配列
（４５）２番目から４７番目のアミノ酸配列
（４６）２番目から４８番目のアミノ酸配列
（４７）２番目から４９番目のアミノ酸配列
（４８）２番目から５０番目のアミノ酸配列
（４９）２番目から５１番目のアミノ酸配列
（５０）２番目から５２番目のアミノ酸配列
（５１）２番目から６２番目のアミノ酸配列
（５２）２番目から７０番目のアミノ酸配列
（５３）２番目から８１番目のアミノ酸配列
（５４）２番目から８４番目のアミノ酸配列
（５５）２番目から１７０番目のアミノ酸配列
（５６）１７番目から４４番目のアミノ酸配列
（５７）１番目から１８５番目のアミノ酸配列
（５８）１番目から１９５番目のアミノ酸配列
（５９）２番目から１８５番目のアミノ酸配列
（６０）２番目から１９５番目のアミノ酸配列、および
（６１）１７番目から２５番目のアミノ酸配列。
【００６８】
本発明において、細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチドとしては、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列の一部からなる、細胞遊走刺激活性を有するペプチドであって、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における４５番目から７４番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドが挙げられる。このようなペプチドの例として、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチド（該ペプチドのアミノ酸数は１９５以下の自然数から選択されるアミノ酸数である）、１番目から１８５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチド（該ペプチドのアミノ酸数は１８５以下の自然数から選択されるアミノ酸数である）、１番目から１７０番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチド（該ペプチドのアミノ酸数は１７０以下の自然数から選択されるアミノ酸数である）、１番目から８４番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチド（該ペプチドのアミノ酸数は８４以下の自然数から選択されるアミノ酸数である）、または４５番目から８４番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチド（該ペプチドのアミノ酸数は４０以下の自然数から選択されるアミノ酸数である）であって、該アミノ酸配列において４５番目から７４番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドが挙げられるが、これに制限されない。
【００６９】
以下に「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において４５番目から７４番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」について記載するが、該ペプチドに包含される「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１８５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において４５番目から７４番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」などの他のペプチドについても同様に記載しうる。
【００７０】
本発明において、「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において４５番目から７４番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」は、「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列から選択される連続したアミノ酸配列からなるペプチドであって、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列において４５番目から７４番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」とも表現しうる。
【００７１】
本発明において、「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において４５番目から７４番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」には、下記（ａ）〜（ｋ）のいずれかのアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列において４５番目から７４番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドが含まれる。
【００７２】
本発明において、「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において４５番目から７４番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」には、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列において下記（ａ）〜（ｈ）および（ｊ）〜（ｌ）のいずれかのアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドが含まれる。
【００７３】
本発明において、「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において４５番目から７４番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」には、下記（ａ）〜（ｌ）のいずれかのアミノ酸配列からなる細胞遊走刺激活性を有するペプチド含まれる。なお、以下のアミノ酸配列は、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列の一部である。
（ａ）１番目から８４番目のアミノ酸配列
（ｂ）４５番目から８４番目のアミノ酸配列
（ｃ）１番目から８１番目のアミノ酸配列
（ｄ）１番目から１７０番目のアミノ酸配列
（ｅ）２番目から８１番目のアミノ酸配列
（ｆ）２番目から８４番目のアミノ酸配列
（ｇ）２番目から１７０番目のアミノ酸配列
（ｈ）１番目から１８５番目のアミノ酸配列
（ｉ）１番目から１９５番目のアミノ酸配列
（ｊ）２番目から１８５番目のアミノ酸配列
（ｋ）２番目から１９５番目のアミノ酸配列、および
（ｌ）４５番目から７４番目のアミノ酸配列。
【００７４】
本発明において、細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチドとしては、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列の一部からなる、細胞遊走刺激活性を有するペプチドであって、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における５５番目から８４番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドが挙げられる。
【００７５】
このようなペプチドの例として、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチド（該ペプチドのアミノ酸数は１９５以下の自然数から選択されるアミノ酸数である）、１番目から１８５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチド（該ペプチドのアミノ酸数は１８５以下の自然数から選択されるアミノ酸数である）、１番目から１７０番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチド（該ペプチドのアミノ酸数は１７０以下の自然数から選択されるアミノ酸数である）、１番目から８４番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチド（該ペプチドのアミノ酸数は８４以下の自然数から選択されるアミノ酸数である）、または４５番目から８４番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチド（該ペプチドのアミノ酸数は４０以下の自然数から選択されるアミノ酸数である）であって、該アミノ酸配列において５５番目から８４番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドが挙げられるが、これに制限されない。
【００７６】
以下に「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において５５番目から８４番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」について記載するが、該ペプチドに包含される「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１８５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において５５番目から８４番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」などの他のペプチドについても同様に記載しうる。
【００７７】
本発明において、「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において５５番目から８４番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」は、「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列から選択される連続したアミノ酸配列からなるペプチドであって、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列において５５番目から８４番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」とも表現しうる。
【００７８】
本発明において、「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において５５番目から８４番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」には、下記（A）〜（J）のいずれかのアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列において５５番目から８４番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドが含まれる。
【００７９】
本発明において、「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において５５番目から８４番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」には、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列において下記（A）〜（G）および（I）〜（K）のいずれかのアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドが含まれる。
【００８０】
本発明において、「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において５５番目から８４番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」には、下記（A）〜（K）のいずれかのアミノ酸配列からなる細胞遊走刺激活性を有するペプチド含まれる。なお、以下のアミノ酸配列は、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列の一部である。
（A）１番目から８４番目のアミノ酸配列
（B）４５番目から８４番目のアミノ酸配列
（C）１番目から１７０番目のアミノ酸配列
（D）２番目から８４番目のアミノ酸配列
（F）２番目から１７０番目のアミノ酸配列を含むペプチド
（G）１番目から１８５番目のアミノ酸配列
（H）１番目から１９５番目のアミノ酸配列
（I）２番目から１８５番目のアミノ酸配列
（J）２番目から１９５番目のアミノ酸配列、および
（K）５５番目から８４番目のアミノ酸配列。
【００８１】
本発明において、細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチドとしては、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列の一部からなる、細胞遊走刺激活性を有するペプチドであって、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における８５番目から１６９番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドが挙げられる。
【００８２】
このようなペプチドの例として、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチド（該ペプチドのアミノ酸数は１９５以下の自然数から選択されるアミノ酸数である）、１番目から１８５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチド（該ペプチドのアミノ酸数は１８５以下の自然数から選択されるアミノ酸数である）、１番目から１７０番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチド（該ペプチドのアミノ酸数は１７０以下の自然数から選択されるアミノ酸数である）、または８９番目から１８５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチド（該ペプチドのアミノ酸数は１０１以下の自然数から選択されるアミノ酸数である）であって、該アミノ酸配列において８５番目から１６９番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドが挙げられるが、これに制限されない。
【００８３】
以下に「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において８５番目から１６９番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」について記載するが、該ペプチドに包含される「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１８５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において８５番目から１６９番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」などの他のペプチドについても同様に記載しうる。
【００８４】
本発明において、「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において８５番目から１６９番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」は、「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列から選択される連続したアミノ酸配列からなるペプチドであって、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列において８５番目から１６９番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」とも表現しうる。
【００８５】
本発明において、「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において８５番目から１６９番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」には、下記（i）〜（vi）のいずれかのアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列において８５番目から１６９番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドが含まれる。
【００８６】
本発明において、「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において８５番目から１６９番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」には、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列において下記（i）〜（iii）および（v）〜（vii）のいずれかのアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドが含まれる。
【００８７】
本発明において、「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において８５番目から１６９番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」には、下記（i）〜（vii）のいずれかのアミノ酸配列からなる細胞遊走刺激活性を有するペプチド含まれる。なお、以下のアミノ酸配列は、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列の一部である。
（i）１番目から１７０番目のアミノ酸配列
（ii）２番目から１７０番目のアミノ酸配列
（iii）１番目から１８５番目のアミノ酸配列
（iv）１番目から１９５番目のアミノ酸配列
（v）２番目から１８５番目のアミノ酸配列
（vi）２番目から１９５番目のアミノ酸配列、および
（vii）８５番目から１６９番目。
【００８８】
本発明において、細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチドとしては、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列の一部からなる、細胞遊走刺激活性を有するペプチドであって、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における８９番目から１８５番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドが挙げられる。このようなペプチドの例として、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチド（該ペプチドのアミノ酸数は１９５以下の自然数から選択されるアミノ酸数である）、１番目から１８５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチド（該ペプチドのアミノ酸数は１８５以下の自然数から選択されるアミノ酸数である）であって、該アミノ酸配列において８９番目から１８５番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドが挙げられるが、これに制限されない。
【００８９】
以下に「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において８９番目から１８５番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」について記載するが、該ペプチドに包含される「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１８５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において８９番目から１８５番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」などの他のペプチドについても同様に記載しうる。
【００９０】
本発明において、「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において８９番目から１８５番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」は、「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列から選択される連続したアミノ酸配列からなるペプチドであって、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列において８９番目から１８５番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」とも表現しうる。
【００９１】
本発明において、「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において８９番目から１８５番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」には、下記（I）〜（VI）のいずれかのアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列において８９番目から１８５番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドが含まれる。
【００９２】
本発明において、「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において８９番目から１８５番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」には、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列において下記（I）および（III）〜（V）のいずれかのアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドが含まれる。
【００９３】
本発明において、「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１番目から１９５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において８９番目から１８５番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」には、下記（I）〜（V）のいずれかのアミノ酸配列からなる細胞遊走刺激活性を有するペプチド含まれる。なお、以下のアミノ酸配列は、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列の一部である。
（I）１番目から１８５番目のアミノ酸配列
（II）１番目から１９５番目のアミノ酸配列
（III）２番目から１８５番目のアミノ酸配列
（IV）２番目から１９５番目のアミノ酸配列、および
（V）８９番目から１８５番目のアミノ酸配列。
【００９４】
本発明において、細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチドとしては、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列の一部からなる、細胞遊走刺激活性を有するペプチドであって、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における９３番目から２１５番目のアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。
【００９５】
このようなペプチドの例として、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列において４５番目から２１５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチド（該ペプチドのアミノ酸数は１７１以下の自然数から選択されるアミノ酸数である）、６３番目か２１５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチド（該ペプチドのアミノ酸数は１５３以下の自然数から選択されるアミノ酸数である）、または８９番目から２１５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチド（該ペプチドのアミノ酸数は１２３以下の自然数から選択されるアミノ酸数である）であって、該アミノ酸配列において９３番目から２１５番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドが挙げられるが、これに制限されない。
【００９６】
以下に「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における４５番目か２１５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において９３番目から２１５番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」について記載するが、該ペプチドに包含される「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における６３番目か２１５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において８９番目から２１５番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」などの他のペプチドについても同様に記載しうる。
【００９７】
本発明において、「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における４５番目から２１５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において９３番目から２１５番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」は、「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における４５番目から２１５番目のアミノ酸配列から選択される連続したアミノ酸配列からなるペプチドであって、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列において９３番目から２１５番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」とも表現しうる。
【００９８】
本発明において、「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における４５番目から２１５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において９３番目から２１５番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」には、下記（W）〜（Y）のいずれかのアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列において９３番目から２１５番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドが含まれる。
【００９９】
本発明において、「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における４５番目から２１５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において９３番目から２１５番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」には、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における４５番目から２１５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列において下記（X）〜（Z）のいずれかのアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドが含まれる。
【０１００】
本発明において、「配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における４５番目から２１５番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、該アミノ酸配列において９３番目から２１５番目のアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド」には、下記（W）〜（Z）のいずれかのアミノ酸配列からなる細胞遊走刺激活性を有するペプチド含まれる。なお、以下のアミノ酸配列は、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列の一部である。
（W）４５番目から２１５番目のアミノ酸配列を含むペプチド
（X）６３番目から２１５番目のアミノ酸配列を含むペプチド
（Y）８９番目から２１５番目のアミノ酸配列を含むペプチド、および
（Z）９３番目から２１５番目のアミノ酸配列を含むペプチド。
【０１０１】
すなわち本発明において細胞遊走刺激活性を有するHMGB1タンパク質の一部からなるペプチドとして次のペプチドを例示することが出来るがこれらに限定されない。
<１>１番目から４４番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<２>１番目から２５番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<３>１番目から３４番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<４>１番目から４２番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<５>１番目から４３番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<６>１番目から４５番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<７>１番目から４６番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<８>１番目から４７番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<９>１番目から４８番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<１０>１番目から４９番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<１１>１番目から５０番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<１２>１番目から５１番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<１３>１番目から５２番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<１４>１番目から６２番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<１５>１番目から８４番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<１６>１０番目から２５番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<１７>１１番目から２５番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<１８>１１番目から２７番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<１９>１１番目から２８番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<２０>１１番目から２９番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<２１>１１番目から３０番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<２２>１１番目から３４番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<２３>１１番目から４４番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<２４>１２番目から２５番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<２５>１２番目から３０番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<２６>１３番目から２５番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<２７>１３番目から３０番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<２８>１４番目から２５番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<２９>１４番目から３０番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<３０>１５番目から２５番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<３１>１５番目から３０番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<３２>１６番目から２５番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<３３>１６番目から３０番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<３４>１７番目から２５番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<３５>１７番目から３０番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<３６>４５番目から７４番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<３７>４５番目から８４番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<３８>４５番目から２１５番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<３９>５５番目から８４番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<４０>６３番目から２１５番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<４１>１番目から７０番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<４２>１番目から８１番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<４３>１番目から１７０番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<４４>２番目から２５番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<４５>２番目から３４番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<４６>２番目から４２番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<４７>２番目から４３番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<４８>２番目から４４番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<４９>２番目から４５番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<５０>２番目から４６番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<５１>２番目から４７番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<５２>２番目から４８番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<５３>２番目から４９番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<５４>２番目から５０番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<５５>２番目から５１番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<５６>２番目から５２番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<５７>２番目から６２番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<５８>２番目から７０番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<５９>２番目から８１番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<６０>２番目から８４番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<６１>２番目から１７０番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<６２>８５番目から１６９番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<６３>８９番目から１８５番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<６４>８９番目から１９５番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<６５>８９番目から２０５番目のアミノ酸配列を含むペプチド
（６６）８９番目から２１５番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<６７>９３番目から２１５番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<６８>１７番目から４４番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<６９>１番目から１８５番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<７０>１番目から１９５番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<７１>１番目から２０５番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<７２>２番目から１８５番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<７３>２番目から１９５番目のアミノ酸配列を含むペプチド、および
<７４>２番目から２０５番目のアミノ酸配列を含むペプチド。
【０１０２】
さらに本発明においては、次のように規定されるペプチドも、細胞遊走刺激活性を有するペプチドとして例示することができる：
配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列の一部を含む、細胞遊走刺激活性を有するペプチドであって、以下の条件を満たすペプチド：
上記<１>から<７４>の群より２つのペプチドを選択し、短い方をＡとし、長い方をBとし、ここで、
Aを少なくとも含み、かつBの全部または一部からなるペプチド。
【０１０３】
また本発明は、以下のいずれかのアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドとその用途も提供する。このようなペプチドには、例えば、以下のいずれかのアミノ酸配列に対して、１または複数（例えば200個以下、100個以下、50個以下、40個以下、30個以下、20個以下、10個以下、5個以下、3個以下、2個以下が挙げれれるが、これらに限定されない）のアミノ酸配列が付加された細胞遊走刺激活性を有するペプチドも含まれる。なお、以下のいずれかのアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドには、配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドは含まれない。
「１」配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１７番目から２５番目のアミノ酸配列
「２」配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における４５番目から７４番目のアミノ酸配列
「３」配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における５５番目から８４番目のアミノ酸配列
「４」配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における８５番目から１６９番目のアミノ酸配列、および
「５」配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における８９番目から１８５番目のアミノ酸配列。
【０１０４】
マウス、ラットおよびヒトのHMGB1は1番目から85番目までのアミノ酸配列をA-box、86番目から169番目までのアミノ酸配列をB-boxとして知られている。マウス、ラットおよびヒトの1番目から169番目までのアミノ酸配列はすべて一致し、100%相同性を保っている。また、マウス、ラットおよびヒトのHMGB2においても、14番目から25番目のアミノ酸配列はHMGB1と一致している。
【０１０５】
本発明は、上述の、細胞遊走刺激活性を有するペプチドを提供する。また、本発明は、該ペプチドをコードするDNA、該DNAが挿入されたベクター、及び該ベクターが導入された形質転換細胞を提供する。本発明のペプチドをコードするDNA、該DNAが挿入されたベクター、及び該ベクターが導入された形質転換細胞は公知の技術を用いて作成される。上記ＤＮＡは、本発明のペプチドをコードする限り、例えば、人工的に合成されたDNA（例えば縮重変異体）であってもよい。
【０１０６】
本発明は、本発明のペプチドであって細胞を用いて製造されたペプチド、本発明のペプチドであって人工的に合成されたペプチドも提供する。本発明のペプチドは、該ペプチドをコードするDNAを適当な発現系に組み込んで遺伝子組換え体（recombinant）として得ることができるし、または、人工的に合成することもできる。本発明のペプチドを遺伝子工学的な手法によって得るためには、該ペプチドをコードするDNAを適当な発現系に組み込んで発現させれば良い。
【０１０７】
したがって、本発明は、以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、本発明のペプチドの製造方法を提供する：
（ａ）本発明のペプチドをコードするDNAを細胞に導入し、該ペプチドを発現させる工程、
（ｂ）細胞から該ペプチドを回収する工程。
【０１０８】
また本発明は、以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、HMGB1タンパク質と比較して高い細胞遊走刺激活性を有する、本発明のペプチドの製造方法を提供する。
（ａ）本発明のペプチドをコードするDNAを細胞に導入し、該ペプチドを発現させる工程、および、
（ｂ）細胞から該ペプチドを回収する工程。
当該製造方法は、さらに次の工程を含むことが出来る。
（ｃ）HMGB1タンパク質と比較して高い細胞遊走刺激活性を有する、該ペプチドを選択する工程。
【０１０９】
本発明に応用可能なホストとしては、原核生物の細胞、真核生物の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明に応用可能なホストとしては、細菌（例えば大腸菌）、酵母、動物細胞（例えばHEK293細胞やCHO細胞などの哺乳動物細胞、カイコ細胞などの昆虫細胞）、植物細胞などもまた挙げられるが、これらに制限されない。
【０１１０】
本発明に応用可能なホスト／ベクター系としては、例えば、発現ベクターpGEXと大腸菌を示すことができる。pGEXは外来遺伝子をグルタチオン S-トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として発現させることができる（Gene, 67:31-40, 1988）ので、本発明のペプチドをコードするDNAを組み込んだpGEXをヒートショックでBL21のような大腸菌株に導入し、適当な培養時間の後に isopropylthio-β-D-galactoside（IPTG）を添加してGST融合ペプチドの発現を誘導する。本発明によるGSTはグルタチオンセファロース4Bに吸着するため、発現生成物はアフィニティークロマトグラフィーによって容易に分離・精製することが可能である。
【０１１１】
本発明のペプチドの遺伝子組換え体を得るためのホスト／ベクター系としては、この他にも次のようなものを応用することができる。まず細菌をホストに利用する場合には、タグ等を利用した融合タンパク質の発現用ベクターが市販されている。また、本発明の遺伝子組換え体には、タグやその一部のペプチドが付加した状態のものも含まれる。
【０１１２】
本発明のペプチドに付加されるタグとしては、本発明のペプチドの活性に影響しない限り、特に制限はなく、例えば、ヒスチジンタグ（例えば６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ）、HAタグ、FLAGタグ、ＧＳＴタグ、Ｔ７-タグ、ＨＳＶ-タグ、Ｅ-タグ、ｌｃｋタグ、Ｂ-タグなどが挙げられる。
【０１１３】
酵母では、Pichia属酵母が糖鎖を備えたタンパク質の発現に有効なことが公知である。糖鎖の付加という点では、昆虫細胞をホストとするバキュロウイルスベクターを利用した発現系も有用である（Bio/Technology, 6:47-55, 1988）。更に、哺乳動物の細胞を利用して、CMV、RSV、あるいはSV40等のプロモーターを利用したベクターのトランスフェクションが行われており、これらのホスト／ベクター系は、いずれも本発明のペプチドの発現系として利用することができる。また、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターセンダイウイルスベクター、センダイウイルスエンベロープベクター、パピローマウイルスベクター等のウイルスベクターを利用して遺伝子を導入することもできるが、これらに限定されるものではない。該ベクターには、遺伝子発現を効果的に誘導するプロモーターDNA配列や、遺伝子発現を制御する因子、DNAの安定性を維持するために必要な分子が含まれてもよい。
【０１１４】
得られた本発明のタンパク質は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一なタンパク質として精製することができる。タンパク質の分離、精製は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればタンパク質を分離、精製することができる。
【０１１５】
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Marshak et al., Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
【０１１６】
また、本発明のペプチドは、実質的に精製されたペプチドであることが好ましい。ここで「実質的に精製された」とは、本発明のペプチドの精製度（タンパク質成分全体における本発明のペプチドの割合）が、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、100％若しくは100％に近いことを意味する。100％に近い上限は当業者の精製技術や分析技術に依存するが、例えば、99.999％、99.99％、99.9％、99％などである。
【０１１７】
また、上記の精製度を有するものであれば、如何なる精製方法によって精製されたものでも、実質的に精製されたタンパク質に含まれる。例えば、上述のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、または組み合わせることにより、実質的に精製されたタンパク質を例示できるが、これらに限定されるものではない。
【０１１８】
本発明における本発明のペプチドを分泌する細胞としては、該ペプチドをコードするDNAに分泌シグナルをコードするDNA（例えば、ATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG CTG CTC TGG GTT CCA GGT TCC ACT GGT GAC；配列番号：１０）を結合させたDNAを、公知の発現ベクターや遺伝子治療用ベクターに挿入することで作製されたベクターを、線維芽細胞（例えば正常皮膚線維芽細胞およびそれに由来する株化細胞）などの哺乳類細胞や昆虫細胞、その他の細胞に導入することによっても作製することができる。分泌シグナルをコードするDNAとしては上述の配列を有するDNAが例示されるが、これに限定されない。また、これら細胞が由来する動物種に特に制限はないが、ベクターが投与される対象動物種の細胞、対象自身の細胞、あるいはベクターが投与される対象の血縁にあたる者に由来する細胞を使用することが好ましい。
【０１１９】
一方HMGB1の一部からなるペプチドを人工的に合成することも出来る。本発明におけるペプチド合成法では、ペプチド液相合成法およびペプチド固相合成法のいずれの方法によってペプチドを化学合成することができる。本発明においてはペプチド固相合成法によって合成したペプチドが好ましい。ペプチド固相合成法はペプチドを化学的に合成する際に、一般的に用いられる方法のひとつである。表面をアミノ基で修飾した直径0.1mm程度のポリスチレン高分子ゲルのビーズなどを固相として用い、ここから脱水反応によって1つずつアミノ酸鎖を伸長していく。目的とするペプチドの配列が出来上がったら固相表面から切り出し、目的の物質を得る。固相合成法により、バクテリア中で合成させることの難しいリボソームペプチドの合成や、D体や重原子置換体などの非天然アミノ酸の導入、ペプチド及びタンパク質主鎖の修飾なども可能である。固相法において70から100個を超える長いペプチド鎖を合成する場合、ネイティブケミカルライゲーション法を用いて、2つのペプチド鎖を結合させる事により合成することが可能である。
【０１２０】
本発明の組成物の投与方法は、経口投与または非経口投与が挙げられ、非経口投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられるが、これらに限定されない。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本発明の組成物を全身または局部的（例えば、皮下、皮内、皮膚表面、眼球あるいは眼瞼結膜、鼻腔粘膜、口腔内および消化管粘膜、膣・子宮内粘膜、または損傷部位など）に投与できる。
【０１２１】
また、本発明の組成物の投与方法としては、例えば、血管内投与（動脈内投与、静脈内投与等）、血液内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与が例示されるが、これらに限定されない。
【０１２２】
また投与部位に制限はなく、再生が必要な組織部位もしくはその近傍、再生が必要な組織とは異なる部位、または、再生が必要な組織に対して遠位かつ異所である部位が例示できる。例えば、血中（動脈内、静脈内等）、筋肉、皮下、皮内、腹腔内が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２３】
また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。本発明のペプチドを投与する場合、例えば、一回の投与につき、体重1 kgあたり0.0000001mgから1000mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり0.00001から100000mg/bodyの範囲で投与量が選択できる。本発明のペプチドを分泌する細胞や該ペプチドをコードするDNAが挿入された遺伝子治療用ベクターを投与する場合も、該ペプチドの量が上記範囲内となるように投与することができる。しかしながら、本発明の医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。
【０１２４】
本発明の医薬組成物は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体が適宜使用できる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
【０１２５】
本発明はまた、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の物質を含有するキットを提供する。
（ａ）細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
（ｂ）（ａ）に記載のペプチドを分泌する細胞
（ｃ）（ａ）に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター
該キットは、細胞遊走を刺激するために、骨髄細胞を骨髄から末梢血に動員するために、あるいは、組織を再生するために使用できる。該キットとしては、（１）フィブリノゲンに溶解した上記物質、および（２）トロンビンを含むキット、または、（１）上記物質、（２）フィブリノゲン、および（３）トロンビンを含むキットが例示できる。本発明においては、市販のフィブリノゲンやトロンビンを使用することができる。例えば、フィブリノゲンHT-Wf(ベネシスー三菱ウェルファーマー)、ベリプラスト（ZLBベーリング）、ティシール（バクスター）、ボルヒール（化血研）、タココンブ（ZLBベーリング）が挙げられるが、これらに制限されるものではない。
【０１２６】
また、細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド、該ペプチドを分泌する細胞、該ペプチドをコードするDNAが挿入されたベクターの用途は、以下（１）〜（９）のように表現することもできる。
（１）以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の物質の有効量を投与する工程を含む、細胞遊走を刺激する方法；
（ａ）細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
（ｂ）（ａ）に記載のペプチドを分泌する細胞
（ｃ）（ａ）に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター
（２）以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の物質の有効量を投与する工程を含む、細胞を骨髄から末梢血に動員する方法；
（ａ）細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
（ｂ）（ａ）に記載のペプチドを分泌する細胞
（ｃ）（ａ）に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター
（３）以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の物質の有効量を投与する工程を含む、組織を再生させる方法；
（ａ）細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
（ｂ）（ａ）に記載のペプチドを分泌する細胞
（ｃ）（ａ）に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター
（４）細胞遊走を刺激するために用いられる組成物の製造における以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の物質の使用；
（ａ）細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
（ｂ）（ａ）に記載のペプチドを分泌する細胞
（ｃ）（ａ）に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター
（５）細胞を骨髄から末梢血に動員するために用いられる組成物の製造における以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の物質の使用；
（ａ）細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
（ｂ）（ａ）に記載のペプチドを分泌する細胞
（ｃ）（ａ）に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター
（６）組織を再生するために用いられる組成物の製造における以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の物質の使用；
（ａ）細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
（ｂ）（ａ）に記載のペプチドを分泌する細胞
（ｃ）（ａ）に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター
（７）細胞遊走を刺激する方法に使用するための、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の物質；
（ａ）細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
（ｂ）（ａ）に記載のペプチドを分泌する細胞
（ｃ）（ａ）に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター
（８）細胞を骨髄から末梢血に動員する方法に使用するための、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の物質；
（ａ）細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
（ｂ）（ａ）に記載のペプチドを分泌する細胞
（ｃ）（ａ）に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター
（９）組織を再生する方法に使用するための、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の物質；
（ａ）細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
（ｂ）（ａ）に記載のペプチドを分泌する細胞
（ｃ）（ａ）に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター
【０１２７】
また以下のいずれかのアミノ酸配列を少なくとも含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドの用途についても上記と同様に言い換えることができる。
「１」配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における１７番目から２５番目のアミノ酸配列
「２」配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における４５番目から７４番目のアミノ酸配列
「３」配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における５５番目から８４番目のアミノ酸配列
「４」配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における８５番目から１６９番目のアミノ酸配列、および
「５」配列番号：１、３、５のいずれかに記載のアミノ酸配列における８９番目から１８５番目のアミノ酸配列。
【０１２８】
なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【０１２９】
本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、下記の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０１３０】
HEK293を利用したHMGB1およびHMGB1由来ペプチドの精製
新生マウス皮膚からTrizol (invitrogen) を用いてRNAを抽出し、SuperScript III cDNA synthesis kit（Invitrogen）を用いてcDNAを合成した。このcDNAをテンプレートとしてHMGB1のcDNAをPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）法を用いて増幅した。分泌シグナルとしてIgG κ鎖signal 配列、精製のためにアミノ酸配列のN末端にHA tag、GST tagおよび6XHis tagの配列を付加したタンパク質を発現するように、哺乳類細胞でタンパク質を発現させるプラスミドベクターpCAGGSに挿入した（図１）。さらにHis tagと目的タンパク質およびペプチドの間にHRV3Cで切断される配列を挿入した。HRV3C切断後は目的タンパク質およびペプチドのN末端側にGly Pro Gly Thy Gln（配列番号：７）のペプチド断片が付加される。なお全長HMGB1およびペプチドのcDNAはPCR法を用いて制限酵素サイトを付加しベクターのKpnIおよびEcoRI部分に挿入した。
【０１３１】
ヒト胎児腎細胞由来HEK293培養細胞株にポリエチレンイミン（PEI）を用いて上記で作製したpCAGGS発現ベクターをトランスフェクションし、48時間後細胞及び培養上清を回収した。細胞及び培養上清は、4℃で4400g・5分間遠心を行うことにより、上清と細胞を分離して、それぞれ回収した。回収した上清は、さらに直径0．8μm孔をもつセルロースアセテートフィルターを通過させ、次に0.45μmの孔を持つニトロセルロースフィルターを通過させることによって、不溶画分を除去したサンプルを調製した。本サンプルを、50mM NaCl含50mM Tris HCl pH8.0 (50mL)で平衡化した5 mL HisTrap FF(GE)に挿入し、吸着成分をさらに10mM イミダゾール含有50mM NaCl 50mM Tris HCl pH8.0で洗浄して、非特異的吸着成分を除去した。特異的吸着成分を、カラムから、100mM イミダゾール含有50mM NaCl 50mM Tris HCl pH8.0で溶出した。吸着画分はそれぞれ、500μLずつシリコンコートしたプラスチックチューブに分画し、タンパク質含有フラクションをまとめた。その後、脱塩カラムPD10（GE）を用いてイミダゾールを除去し、50mM Tris HCl pH. 7.5, 150mM NaCl を用いて溶出した。溶出したサンプルにHRV3C(Novagen)を添加し、4℃、8時間反応させた。タグの切断後、サンプルを50mM Tris HCl pH.7.5,150 mM NaClで平衡化したHiTrap Heparin 1 mL カラム(GE)に結合させ、50mM Tris HCl pH.7.5,150 mM NaClでカラム内部を洗浄後、50mM Tris HCl pH.7.5,1000 mM NaClで結合タンパク質もしくはペプチドを溶出した。
【０１３２】
マイグレーションアッセイ
マウス骨髄間葉系幹細胞株（MSC-1細胞、大阪大学玉井ら作製（PDGFRα-positive cells in bone marrow are mobilized by high mobility group box 1 (HMGB1) to regenerate injured epithelia.（tamai et. al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Apr 4.）））をディッシュからトリプシンを使用して4℃、1200rpm、10分の遠心により回収した。ペレットをほぐし、細胞濃度が2.0〜3.0×106個/mlになるように、10%FBS(Fetal bovine serum)含D-MEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)を加え混濁した。HEK293にて生産した組み換えタンパク質およびペプチドを10%FBS 含D-MEMに希釈した。陰性コントロールとしてはPBS(Phosphate buffered saline)を使用した。アクリル製ボイデンチャンバーを使用し、上層には、3X106個/mlに調製されたマウス骨髄間葉系幹細胞株を、下層には希釈したタンパク質もしくはペプチドを入れた。より詳細には、48穴ケモタキシスチャンバー(NEURO PROBE 48WELL CHEMOTAXIS CHAMBER)の底板穴にタンパク質またはペプチド溶解液を28μlずつ入れ、底板の上に8μm 孔のポリカーボネートメンブレン(Neuro Probe, Inc, Cat: 866-417-0014)を載せて、さらに上板を載せてネジでしっかり止めた。上板穴に細胞濃度調整をすませたマウス骨髄間葉系幹細胞株を50μl入れた。チャンバーは37℃、5%CO2のインキュベーター内で静置した。4時間後チャンバーのメンブレンを回収し、Diff-Quik(Sysmex, Cat: 16920)を用いて、膜の孔を通り抜け下層に向かってマイグレーションした細胞を染色により検出した。
【０１３３】
結果
マウス全長HMGB1（1-215）および1番目から84番目までのペプチド（1-84）、85番目から169番目までのペプチド（85-169）、1番目から44番目までのペプチド（1-44）、45番目から84番目までのペプチド（45-84）および陰性コントロール（PBS）のマイグレーション活性の有無を確認した。タンパク質およびペプチドはそれぞれ50μg/mlの濃度で使用した。85-169においてはマイグレーション活性を検出しなかったが、他の1-215、1-84、1-44、45-84においてマイグレーション活性を示した（図２）。
【０１３４】
更に45番目から215番目までのペプチド（45-215）、63番目から215番目までのペプチド（63-215）をそれぞれ5、15、25μg/mlの濃度で使用し、マイグレーション活性を確認した（図３）。
【０１３５】
考察
マウス、ラットおよびヒトのHMGB1（それぞれ配列番号：３、５および１）は1番目から85番目までのアミノ酸配列はA-box、86番目から169番目までのアミノ酸配列はB-boxとして知られている。マウス、ラットおよびヒトの1番目から185番目までのアミノ酸配列はすべて一致し、100%相同性を保っている。186番目から215番目までのアミノ酸配列はグルタミン酸およびアスパラギン酸の繰り返し配列であり、マウスとラットでは100％一致するがヒトとは2アミノ酸のみ異なる。85-169はマイグレーション活性が検出されず、この断片には活性がないか、或いは活性が今回の実験条件では検出限界以下であったものと考えられる。一方で1-84、1-44、45-84では、いずれにも良好なマイグレーション活性を認めることから、1番目から44番目までのアミノ酸配列の間と45番目から84番目までのアミノ酸配列の間の少なくとも2カ所にマイグレーション活性を有するドメインが存在することが予想された。HMGB1は樹状細胞などの細胞をマイグレーションさせることが知られているが、RAGEと呼ばれるレセプターをHMGB1が刺激することで誘発されると考えられている。HMGB1の中に存在するRAGE 結合 ドメインは１５０から１８１番目のアミノ酸に相当する部分に存在することが知られている。今回骨髄間葉系幹細胞をマイグレーションさせたドメインがRAGE結合ドメインと異なる部位でありなおかつ少なくとも2か所も発見したことは驚くべきことである。
【０１３６】
45-215、63-215いずれにも濃度依存的にマイグレーション活性を認めた。なお63-215に比較して45-215に強い活性を認めた。そのため、少なくとも63番目から84番目までのアミノ酸の間にマイグレーション活性を有するドメインが1カ所存在することが予想された。さらに、以下のHEK293を用いて生産したペプチドについても、骨髄間葉系幹細胞株MSC-1に対するマイグレーション活性を示した：
1番目から42番目のアミノ酸配列を含むペプチド(1-42)、
1番目から43番目のアミノ酸配列を含むペプチド(1-43)、
1番目から45番目のアミノ酸配列を含むペプチド(1-45)、
1番目から46番目のアミノ酸配列を含むペプチド(1-46)、
1番目から47番目のアミノ酸配列を含むペプチド(1-47)、
1番目から48番目のアミノ酸配列を含むペプチド(1-48)、
1番目から49番目のアミノ酸配列を含むペプチド(1-49)、
1番目から50番目のアミノ酸配列を含むペプチド(1-50)、
1番目から51番目のアミノ酸配列を含むペプチド(1-51)、
1番目から52番目のアミノ酸配列を含むペプチド(1-52)、
1番目から62番目のアミノ酸配列を含むペプチド(1-62)。
【実施例２】
【０１３７】
初代培養PDGFRα陽性骨髄間葉系幹細胞のソーティングとマイグレーション活性の確認
ドナーマウス：B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J（PDGFRα-GFP Mouse）から大腿骨および脛骨を切り出し、周囲に付着した筋およびその他の組織を取り除いた後、骨を細かく破砕し、0.2％コラゲナーゼ(Roche, REF:10103586001)DMEM, 2% FBS(filtrated)に37℃、40分反応させた。40μmナイロンメッシュに通し、さらに細胞塊や筋組織を除去した。1200rpm、10分遠心し、αMEM10%FBS1%P/S培養液に懸濁し、37℃ 5％CO2インキュベーターにて100％コンフルエントになるまで培養した。細胞を回収し、CD11b マイクロビーズ(Miltenyi Biotec, order No:130-049-601)に付属しているプロトコールに従って以下の実験を行った。細胞をPBS(-)で107 個/90μl毎に調整し、CD11b マイクロビーズを107 個毎に10μlずつ加えて、4℃、15分間反応させた。その後、2回洗浄し、PBS(-)500μlに混濁した。AutoMACSセパレーターにチューブをセットし、"Depletes"分離プログラムにより細胞を回収した。回収した細胞を、接着細胞用培養皿に播種し、接着後蛍光顕微鏡を使用してGFPの蛍光を観察した。CD11b陰性細胞を使用し、前述のHEK293で生産したペプチド1-44に対するマイグレーション活性を調べた。ペプチドは40μg/mlの濃度で使用した。
【０１３８】
結果
CD11b陽性細胞にはPDGFRαGFP細胞はほとんど見られず、CD11b陰性細胞にはPDGFRαGFP細胞を多数認めた（図４）。また、CD11b陰性、PDGFRα陽性の細胞に対してHEK293を使用して生産した1-44のペプチドは強いマイグレーション活性を示した（図５）。
【０１３９】
考察
CD11b陰性、PDGFRα陽性の細胞には、骨髄中の多能性幹細胞一種である骨髄間葉系幹細胞が多く含まれると考えられる。1-44のペプチドは株化した骨髄間葉系幹細胞株の他、初代培養の骨髄間葉系幹細胞に対してもマイグレーション活性を有すると考えられる。
【０１４０】
ヒト骨髄間葉系幹細胞におけるPDGFRαタンパクの発現の確認
方法
ヒト間葉系幹細胞（hMSC, human Mesenchymal Stem Cell）（タカラバイオ株式会社、製品番号PT034）をヒト間葉系幹細胞専用完全合成培地キット（MSCGM-CD(tm) BulletKit(tm)）（タカラバイオ株式会社、製品番号B0632）を使用して製品マニュアルに従い培養した。少なくとも実験に使用する細胞は5継代以内の細胞を使用した。
【０１４１】
ウエスタンブロットに使用するために約5 x 107個の細胞を回収し１mLのPBSに懸濁した。細胞懸濁液に6x SDS-PAGE サンプルバッファー200μLを加え95℃で5分間加熱した。ポジティブコントロールとしてラットPDGFRαを発現させた大腸菌（JM109）の菌体破砕液をサンプルバッファーで溶解し使用した。さらに7.5％SDS-PAGEゲルにサンプル20μLと分子量マーカーとしてPrecision Plus Dual color Standerd（Bio-Rad（cat#：161-0374）の電気泳動を行った。電気泳動終了後ゲルを回収し、定法に従ってPVDF膜に転写した。サンプルが転写されたPVDF膜は0.1%Tween20（PBS-T）含有2%スキムミルクを用いて1時間室温で浸透しブロッキングを行った。PBS-Tを用いて膜に付着した余分なスキムミルクを洗浄した。1次抗体としてPDGFRA Rabbit anti-Human Polyclonal antibody（Lifespan Bioscience（cat#：LS-C9640）をPBS-T含2%スキムミルクに3000倍希釈し溶解し、ブロッキングを行った膜を1時間浸透させた。さらに膜をPBS-Tに10分間浸透させ、合計3回洗浄を行った。2次抗体としてAnti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey(GE healthcare（cat#：NA934）をPBS-T含2％スキムミルクに15000倍希釈し、膜を1時間浸透させた。さらに膜をPBS-Tに10分間浸透させ、合計3回洗浄を行った。ECL Prime（GE healthcare（cat#：RPN2232）を製品マニュアルに従い使用しPDGFRαのバンドを検出した。
【０１４２】
結果
ポジティブコントロールである大腸菌で生産したラットPDGFRαが約170kDaのサイズにバンドが認められた。一方、ヒト骨髄間葉系幹細胞のPDGFRαはやや分子量が大きい位置に検出された（図２B）。
【０１４３】
考察
マウスだけではなくヒトの骨髄間葉系幹細胞においてもPDGFRαタンパクの発現がウエスタンブロットで検出された。大腸菌で生産したラットPDGFRαに比較してやや大きなサイズにみられるのは糖鎖等の修飾によるものの可能性が考えられる。PDGFRαはヒトにおいても骨髄間葉系幹細胞においても発現を確認できた。
【実施例３】
【０１４４】
＜初代培養PDGFRα陽性骨髄間葉系幹細胞の多能性の確認＞
PDGFRα陽性、Lineage陰性、c-kit陰性細胞のFACSソーティング
C57Bl6マウス（6週齢、雄）に対しイソフルランを用い十分に深い麻酔を施行し、二酸化炭素を吸入させ安楽死させた。大腿骨及び脛骨を取り出し、脂肪および筋組織を切除し、EtOHに浸し骨に付着した組織を十分に取り除いた。26G針をつけたシリンジを使い骨髄組織を取出した。取り出した骨髄細胞に0.2% Collagenase A を含むDMEMを加え、37℃で40分間 インキュベートした。10% FBS DMEMを加え遠心機で1500rpmの速度で 10分間遠心を行った。上精を捨て沈殿した骨髄細胞を回収した。
【０１４５】
直径10cmの培養皿に播種し10%FBS 含DMEM 、1X ストレプトマイシン・ペニシリンで5％CO2、37℃のインキュベーターを用い培養した。3日おきに新しい培地と交換した。付着した細胞の培地を捨て、細胞に10ml のPBSを加え２回洗浄する。0.25% トリプシン5ml を加え37℃、10分間インキュベートした。培養皿から剥がれた細胞を回収し10% FBS 含DMEMを加えトリプシンの反応を止めた。細胞を遠心機で1200rpm の速度で3min遠心し沈殿した細胞を回収した。回収した細胞を丸底96 wellに、1×106細胞を100μlの2% FBS含 PBSに希釈し各ウェルに分注した。一次抗体としてAPC-mouse Lineage antibody cocktail(BD Phamingen, Cat.558074)は、1 well当り10μlずつ加え、PE-mouse CD140a(PDGFRa)(BD Bioscience, Cat.12-1401-81)、FITC-mouse c-kit (BD Bioscience)をそれぞれ1μlずつ各ウェルに加え、遮光し4℃、20分間反応させる。2% FBS含 PBS を200μlずつ各ウェルに加え 遠心機を用い1500rpmの速度で 10分間遠心し遠心上精をすてた。 さらに2回同様に細胞を洗浄した。細胞はBD FACSAria セルソーターを使用し細胞のソーティングを行った。
骨分化誘導
細胞が70％コンフルエントになった状態で、Osteogenic differentiation培地 (R & D, SC010で培地を調整ずみ)を2〜3日毎に交換した。37℃ 5％CO2インキュベーターにて培養した。約３週間培養を継続した。
ALP染色
骨分化誘導した細胞をキットの固定液(あらかじめ固定準備液から調整)にて、10秒固定した。Fast Blue RR Saltと基質原液にて作った基質液(武藤化学、Cat.No.1568-2)にて、37℃で3分染色した。ALP陽性細胞は青紫色に着色する。
脂肪分化誘導
細胞が100％コンフルエントになった状態で、Adipogenic differentiation 培地 (R & D, SC010で培地を調整ずみ)を3〜4日毎に交換した。37℃ 5％CO2インキュベーターにて培養した。約2週間培養を継続した。
Oil Red染色
脂肪分化誘導した細胞を、キット付属のPropylene Glycol固定液にて固定し、その後、oil red O solution(DBS, item#KT 025)を用いて、脂肪細胞の染色を行った。
【０１４６】
結果
骨分化誘導した細胞において青紫色に染まる細胞が認められ、骨芽細胞へ分化することが示された（図６Ａ）。脂肪分化誘導下では、赤色に染まった脂肪細胞の油滴が認められ、脂肪細胞へ分化することが示された（図６Ｂ）。
【０１４７】
考察
骨髄中のPDGFRα陽性細胞の中に少なくとも骨分化、脂肪分化可能な骨髄間葉系幹細胞が含まれていることが考えられた。
【実施例４】
【０１４８】
合成ペプチドのマイグレーション活性の確認
以下のペプチドを、MBL（株式会社医学生物学研究所）に依頼し固相法で合成した。なお、マウスHMGB1の配列（配列番号：３）に基づき、ペプチドを合成した。以降の実施例における合成ペプチドも同様にマウスHMGB1の配列に基づき作成されたものである。
HMGB1の1番目から10番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(1-10)、
1番目から34番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(1-34)、
37番目から62番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(37-62)、
27番目から62番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(27-62)、
56番目から72番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(56-72)、
11番目から20番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(11-20)、
11番目から25番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(11-25)、
11番目から30番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(11-30)、
11番目から34番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(11-34)、
11番目から44番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(11-44)、
17番目から44番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(17-44)、
1番目から25番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(1-25)、および
陽性コントロールとしてHEK293で生産したマウス全長HMGB1(1-215(HEK))を、100μg/mlになるように調整し、ケモタキシスチャンバーの下層に入れ、株化骨髄間葉系幹細胞（MSC-1）に対するマイグレーション活性を検討した。
【０１４９】
結果
少なくとも、合成ペプチド(11-34)、(1-34)、(11-44)、(1-44)、(11-30)には、陽性コントロールと同等以上の活性を認めた（図７）。また、合成ペプチド(11-25)、(1-25)にも活性を認めた（図７）。
【０１５０】
考察
実施例1の結果から1番目から44番目までのアミノ酸配列、45番目から84番目までのアミノ酸のなかにそれぞれマイグレーション活性部分が少なくとも1カ所ずつ存在することが予想された。今回実施例４の結果から、合成ペプチド(11-34)においても強いマイグレーション活性を有しており、少なくとも11番目から34番目までのアミノ酸配列の中に活性中心があると予想された。また、活性は若干弱いものの合成ペプチド(11-25)にも活性を認め、11番目から25番目までのアミノ酸配列に活性中心部分があり、その前後のアミノ酸配列は活性を増強する配列であると予想された。
【実施例５】
【０１５１】
方法
さらに活性中心部分を絞り込むために短いペプチドを以下のように合成した。
HMGB1の11番目から27番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(11-27)、
11番目から28番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(11-28)、
11番目から29番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(11-29)、
12番目から30番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(12-30)、
13番目から30番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(13-30)、
14番目から30番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(14-30)、
15番目から30番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(15-30)、
16番目から30番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(16-30)、
17番目から30番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(17-30)、
18番目から30番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(18-30)、
19番目から30番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(19-30)、
20番目から30番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(20-30)、
21番目から30番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(21-30)、
10番目から25番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(10-25)、
11番目から25番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(11-25)、
12番目から25番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(12-25)、
13番目から25番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(13-25)、
14番目から25番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(14-25)、
15番目から25番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(15-25)、
16番目から25番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(16-25)、
17番目から25番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(17-25)、
186番目から215番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(186-215)。
【０１５２】
陽性コントロールとして1日齢マウス皮膚(1匹分)をPBSに浸し4℃12時間インキュベートした遠心上清（skin extract）、およびHEK293で生産したマウス全長HMGB 1(HMGB1(HEK_1-215))を使用した。ケモタキシスチャンバーの上層には株化骨髄間葉系幹細胞株（MSC-1）を入れ、これらのタンパク質・合成ペプチドは5μMもしくは10μMの濃度でケモタキシスチャンバーの下層に挿入した。マイグレーションアッセイは実施例１と同様の方法で施行した。
【０１５３】
結果
少なくとも5μMの濃度の合成ペプチド(11-27)、(11-28)、(11-29)、(12-30)、(13-30)、(14-30)、（10-25）に強いマイグレーション活性を認めた。また、合成ペプチド(11-25)、(12-25)、(13-25)、(14-25)、(15-25)、(15-30)、(16-25)、(16-30)、(17-25)、(17-30)では弱い活性を認めた。（図８A、図８B）
【０１５４】
考察
実施例４の結果から11番目から25番目のアミノ酸配列の中にマイグレーション活性を有するドメインが存在すると予想されたため、マイグレーション活性を有するドメインのうち一箇所は、17番目のアミノ酸から25番目のアミノ酸の間（9アミノ酸）に存在することが考えられる。
【０１５５】
各HMGB1断片の骨髄間葉系幹細胞に対するマイグレーション活性の比較
方法
HMGB1の断片からなる合成ペプチド15-30,16-30,17-30,17-44,45-74,55-84それぞれの骨髄間葉系幹細胞（MSC-1）に対するマイグレーション活性の強さをネガティブコントロール（PBS）と比較した。前述と同様にボイデンチャンバー法を行った。ペプチドはそれぞれ10μMになるようにチャンバーの下層に挿入した。チャンバーの上層には1.5 X 106個の細胞を1mLの10%FBS含DMEMに拡散させ挿入した。上層と下層の間には直径8μm の孔のポリカーボネート膜を挿入した。37℃、5％CO2のインキュベーターで4時間インキュベートした後、膜を回収し下層側に移動した細胞のみをディフ・クイック染色（Diff-Quik stain（商標））で染色した。染色後風乾し顕微鏡にて下層側に移動した細胞の数を計測し平均値を計算した。
【０１５６】
結果
いずれのペプチドにおいても陰性コントロールに比較してより強いマイグレーションの活性を認めた。
【０１５７】
考察
合成ペプチドは、HEK293や大腸菌などの細菌を使用した製造方法に比較して、安価で安定した生産量を確保できる他、生物由来の毒素などのコンタミネーションが予防できるなど医薬品製造においては非常に優れた製造方法である。一方、生物内での生成と異なり、翻訳後修飾やフォールディングが正確に行われないため、疎水性の高いアミノ酸からなる低分子のペプチドは水溶液に対し極めて難溶性となることがしばしばある。本実施例においても、マイグレーション活性が比較的弱いペプチドであったため、ネガティブコントロールに対する活性の強さを、顕微鏡を使用し正確に検出した。いずれのペプチドにおいてもネガティブコントロールに比較し強いマイグレーション活性を検出した（図８C）。
【実施例６】
【０１５８】
合成ペプチドのマイグレーション活性の確認
実施例４において使用した合成ペプチド(1-44)、(1-34)、45番目のアミノ酸から74番目のアミノ酸からなるペプチド(45-74)、55番目のアミノ酸から84番目のアミノ酸からなるペプチド(55-84)を実施例５と同様にケモタキシスチャンバーを使用してマイグレーションアッセイを施行した。それぞれ10μMおよび５μMの2種類の濃度で同時に行なった。
【０１５９】
結果
合成ペプチド(1-44)、(1-34)に比較して弱いものの、合成ペプチド(45-74)にも合成ペプチド(55-84)にもマイグレーション活性を認めた（図９）。
【０１６０】
考察
実施例1の結果では、HEK293で生産したペプチド(1-84)、(1-44)、(45-84)にPDGFRα陽性間葉系幹細胞に対する強いマイグレーション活性が認められた。実施例４の結果から合成ペプチドにおいても合成ペプチド(1-44)、(1-34)において強い活性が保存されていることが示された。一方、今回の実施例６の結果では、合成ペプチド(45-74)、(55-84)は若干減弱しているものの、同様に、マイグレーション活性が認められた。
【０１６１】
HEK293などの真核生物の細胞でペプチドやタンパク質が合成される際、糖鎖修飾などの修飾が行われることが知られている。一方合成したペプチドは修飾を行っていない。45番目から84番目までのアミノ酸配列の合成ペプチド「（45-74）および（55-84）」のマイグレーション活性に比較し、HEK293で生産したペプチド(45-84)のマイグレーション活性が強いのは、何らかの修飾を受けている可能性が示唆される。
【０１６２】
また、これまでメソアンギオブラストを用いた過去の実験（Palumboら、J. Cell Biol.、164：441-449、2004年）では、細胞に対するHMGB1（全長215アミノ酸）のマイグレーション活性は、C末端を切断した1から187番目までのアミノ酸からなる配列では保存されているが、１から89番目までのアミノ酸からなる配列および、90から176番目からの配列および1番目から176番目までの配列いずれにおいてもほとんどなくなることが示されている。また、HMGB1のレセプターの一つとして知られているRAGEのリガンドとして予想されている部位は150から181番目のアミノ酸からなる配列であるが、RAGEのドミナントネガティブによってもマイグレーション活性が抑制されることが前述の文献で示されている。また、別の報告（Yangら、J Leukoc Biol. Jan;81(1):59-66、2007年）では樹状細胞をHMGB1がマイグレーションさせる際にもRAGEレセプターを利用していることが示されており、これまではHMGB1によるマイグレーション活性はRAGEのリガンド部分であるHMGB1のC末端側のペプチドが注目されていた。
【０１６３】
本実施例では、これまでに細胞のマイグレーション活性がないとされていた部分であるN末端側のペプチドに、2箇所のマイグレーション活性部位を同定することに成功した。過度の炎症は組織再生において阻害因子となることが知られている。今回発見した活性部分がRAGEのリガンドと全く異なる部分であることから、樹状細胞のような炎症系の細胞の動員を避けつつPDGFRα陽性の幹細胞を動員することが可能になり、より副作用の少ない医薬品の開発が可能になると予想される。
【実施例７】
【０１６４】
ペプチド(1-44)と全長HMGB1とのマイグレーション活性の比較定量
実施例１と同様に、HEK293細胞にポリエチレンイミンを用いてマウスHMGB1（1-44）発現ベクターをトランスフェクションし、細胞上清中に分泌されるHMGB1を回収し精製した（HEK293 transient）。また、同様にトランスフェクションした後2μg/mlのピューロマイシンを培養液中に添加し恒常的にHMGB1（1-44）を分泌する細胞を薬剤選択した。この細胞上清中に分泌されたHMGB1を精製した(HMGB1-stable)。
【０１６５】
大腸菌を利用したHMGB1由来ペプチドの生産
大腸菌による1番目のアミノ酸から44番目までのアミノ酸のペプチドを作製するために、HRV3Cで切断されるマウスHMGB1の1番目のアミノ酸から44番目までのアミノ酸をコードするcDNAのN末側に付加するキメラペプチドを発現するcDNA をpENTR ベクター（インビトロジェン社製）に挿入した。LR反応を行いpDEST17 ベクターに組み替えを行った。本発現ベクターはT7 プロモーターを有し、大腸菌でタンパク質を発現することが可能である。また、6XHis tag をN末端側に付加する。HRV3C切断後は6X His tagは切除され、ペプチドのN末端側にGly Pro Gly Thy Gln（配列番号：７）のペプチド断片が付加される。
【０１６６】
大腸菌BL21（DE3）にエレクトロポレーション法にて上記発現ベクターをトランスフォームした。SOC培地を加え37℃で60分間シェーカーにて培養を行った。カルベニシリン含有LB寒天培地上に播種し、37℃にて18時間インキュベートした。単一コロニーを採取しカルベニシリン含有LB培地を加え、37℃でシェーカーにて培養を行った。O.D.600=0.4-0.5になったらIPTGを終濃度0.1mMになるよう加え、以降30℃で振った。6時間後大腸菌を回収し3500rpm で30分間遠心を行い沈殿した大腸菌を回収した。大腸菌に6M尿素含有50mM NaCl含50mM Tris HCl pH8.0 を加えピペッティングを行い溶菌した。6M尿素含有50mM NaCl含50mM Tris HCl pH8.0で平衡化した5 mL HisTrap FF(GE)に挿入し、吸着成分をさらに６M 尿素、10mM イミダゾール含有50mM NaCl 50mM Tris HCl pH8.0で洗浄して、非特異的吸着成分を除去した。特異的吸着成分を、カラムから、６M尿素、300mM イミダゾール含有50mM NaCl 50mM Tris HCl pH8.0で溶出した。吸着画分はそれぞれ、500μLずつシリコンコートしたプラスチックチューブに分画し、タンパク質含有フラクションをまとめた。その後、脱塩カラムPD10（GE）を用いてイミダゾールを除去し、50mM Tris HCl pH. 7.5, 150mM NaCl を用いて溶出した。溶出したサンプルにHRV3C(Novagen)を添加し、4℃、8時間反応させた。タグの切断後、サンプルを50mM Tris HCl pH.7.5,150 mM NaClで平衡化したHisTrap FF 1 mL カラムを使用し非結合画分であるペプチドを回収した。
【０１６７】
合成ペプチド(1-44)は前述と同じペプチドを準備した。これらのペプチドおよびタンパク質を2μMの濃度で使用し株化骨髄間葉系幹細胞（MSC-1）に対するマイグレーションアッセイを行った。ケモタキシスチャンバーの孔の面積とマイグレーションした細胞の面積を、画像解析ソフトを用いて計測した。
【０１６８】
結果
等モルあたりでは全長のHMGB1に対してHEK293で産生したペプチド（1-44）も、大腸菌で産生したペプチド（1-44）も約1.6倍高いマイグレーション活性を示した。等質量あたりでは全長のHMGB1に対してHEK293で産生したペプチド（1-44）も、大腸菌で産生したペプチド（1-44）も約8倍高いマイグレーション活性を示した。合成ペプチド(1-44)は全長のHMGB1に対し等モルでは0.57倍であったが、等質量あたりでは2.86倍の高いマイグレーション活性を示した（図１０）。
【０１６９】
考察
実施例１及び実施例６等から、マイグレーション活性の中心は1番目から44番目までのアミノ酸配列、および45番目から84番目までのアミノ酸配列のなかにそれぞれ少なくとも1カ所以上存在し、全体としては2カ所以上の活性部位が存在することが考えられる。さらに、今回、実施例７の結果から、当質量あたりでは、HEK293で生産したペプチド(1-44)は全長のHMGB1に比較して8倍近いマイグレーション活性（等モルで約1.6倍）を有することが示された。さらに、HEK293で生産したペプチド(45-84)も同等のマイグレーション活性を有する（図２）。以上からHMGB1の中には、等モル量の全長HMGB1を上回るマイグレーション活性を持つ部位が少なくとも1番目から44番目のアミノ酸配列、45番目から84番目のアミノ酸配列の2カ所に存在するが、全長HMGB1の活性は、これら2カ所の活性の和より極めて弱いことが明らかとなった。全長のHMGB1の結晶解析の結果から1番目から44番目までのペプチドと45番目から84番目までのペプチドは互いに隣接しているため、互いの活性を阻害している可能性が予想される。ペプチド化することによって阻害が解消され、それぞれの活性が増強されたと考えられる。
【実施例８】
【０１７０】
株化骨髄間葉系幹細胞（MSC-1）のPDGFRα、Lineage marker、CD44の発現FACS解析
マウス由来骨髄間葉系幹細胞株MSC-1を直径10cmの培養皿に播種し10%FBS 含DMEM 1Xストレプトマイシン・ペニシリンで5％CO2、37℃のインキュベーターを用い培養した。80-90％コンフルエントに増殖した後、培地を捨て、細胞に10mlのPBSを加え、２回洗浄した。0.25% トリプシン5mlを加え、37℃、10分間インキュベートした。培養皿から剥がれた細胞を回収し、10% FBS 含有DMEMを加え、トリプシンの反応を止めた。細胞を遠心機で1200rpm の速度で3min遠心し、沈殿した細胞を回収した。回収した細胞を丸底96 well に、1×106細胞は、100μlの2% FBS含有PBSに希釈し、各ウェルに分注した。一次抗体として、APC-mouse Lineage antibody cocktail(BD Phamingen, Cat.558074)を、1well当り10μlずつ加え、PE-mouse CD140a(PDGFRα)(BD Bioscience, Cat.12-1401-81)、FITC-mouse CD44(BD Bioscience, Cat.553-133)をそれぞれ1μlずつ各ウェルに加え、遮光し、4℃、20分間反応させた。2% FBS含有PBSを200μlずつ各ウェルに加え 遠心機を用いて1500rpmの速度で10分間遠心し、上清をすてた。 さらに2回、同様に細胞を洗浄した。PBS100μlに細胞を懸濁し、BD FACSCantTMIIで解析を行った。
【０１７１】
結果
株化骨髄間葉系幹細胞（MSC-1）はPDGFRα陽性、Lineage陰性、CD44陽性であった（図１１）。
【０１７２】
考察
マイグレーション活性に使用している本細胞は、PDGFRα陽性の骨髄間葉系幹細胞の性質を保持している。
【実施例９】
【０１７３】
マウスケラチノサイトに対する合成ペプチド（1-34）のマイグレーション活性
C57/Bl6新生マウスに対しイソフルランおよび二酸化炭素吸入によって安楽死させた後、EtOH, PBSでよく洗浄した。真皮ごと皮膚を剥離し、PBSで血を洗い流した。剥離した皮膚をディスパーゼI(三光純薬, Cat: GD81060)の中に4℃、16時間静置した。攝子で表皮と真皮を剥離し、表皮をトリプシン(Nacalai tesque, Cat: 3554-64)の中に、10分、37℃で静置した。白く濁り始めたら、S-MEM(GIBCO, Cat: 11380)15%FBS(Ca−)P/Sで反応を止め、160×G、5分で遠心した。CnT-07 培地(CELLnTEC, Cat: CnT-07 BM)に懸濁し、10cmディッシュに播種した。5％CO2、37℃で培養し、3日ごとに培地を交換し、80〜90％コンフルエントで継代を行った。細胞をトリプシンでディッシュから回収し、10％FBS含有D-MEMでトリプシンを不活性化した。その後、前述のマイグレーションアッセイ法にしたがって、1番目から34番目までのアミノ酸配列からなる合成ペプチド（1-34）のマイグレーション活性を調べた。
【０１７４】
マウスケラチノサイトのPDGFRαの発現
B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/Jマウスの新生に4％PFAで還流固定を行った。新生皮膚を1.0×1.0 cm2に切り出し、4％PFA, 12時間 + 30%スクロース、12時間、4℃でさらに浸潤固定した。PBS(‐)で洗浄し、OTCコンパウンドで凍結包埋した。クリオスタットで8μmの凍結切片を切り出した。PBSで2回洗浄し、コンパウンドを洗い流し、10％ ヤギ血清PBSで、室温で1時間ブロッキングした。1次抗体は10％ヤギ血清PBSで500倍希釈したウサギ抗-ケラチン5(Covance, Cat: PRB-160P) 、もしくはウサギ抗-ビメンチン(Abcam, Cat: ab7783-500) を用い、5時間、4℃でインキュベートした。その後、PBSで2回洗浄した。2次抗体は10％ヤギ血清PBSで500倍希釈した Alexa Fluor 546 ヤギ 抗-ウサギ IgG(H+L)(Invitrogen, Cat: A11035) を用い、45分間室温でインキュベートした。その後、PBSで2回洗浄した。2μg/mlのDAPI（4',6-diamino-2-phenylindole）で3分間、室温でインキュベートした。さらにPBSで2回洗浄し、蛍光体退光防止剤を含むマウント剤を載せて封入した。
【０１７５】
結果
マウスケラチノサイトに対して合成ペプチド（1-34）はマイグレーション活性を示さなかった（図１２Ａ）。また、マウスケラチノサイトのマーカーであるケラチン5陽性細胞においてGFPの蛍光は観察されなかった（図１２Ｂ）。
【０１７６】
考察
ケラチノサイトはPDGFRαを発現してなかった。またケラチノサイトに対して合成ペプチド（1-34）はマイグレーション活性を有していなかった。
【実施例１０】
【０１７７】
マウス皮膚線維芽細胞に対する合成ペプチド（1-34）のマイグレーション活性
C57/Bl6新生マウスに対しイソフルランおよび二酸化炭素吸入によって安楽死させた後EtOH, PBSでよく洗浄した。真皮ごと皮膚を剥離し、PBSで血を洗い流した。剥離した皮膚を鋏でよく切り刻み破砕した。0.2%コラゲナーゼ(Roche, REF:10103586001) DMEM (Nacalai tesque, Cat: 08458-45)の中に切り刻まれた皮膚を入れて、37℃, 30分振盪した。DMEM30%FBS/P/Sで反応を止めて、160×G, 5分で遠心した。10cmディッシュに播種した。5％CO2、37℃で培養し、3日ごとに培地を交換し、80〜90％コンフルエントで継代を行った。細胞をトリプシンでディッシュから回収し10％FBS含D-MEMでトリプシンを不活性化後、前述のマイグレーションアッセイ法にしたがって、1番目から34番目までのアミノ酸配列からなる合成ペプチド（1-34）のマイグレーション活性を調べた。
【０１７８】
B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/Jマウスの新生児に4％PFAで還流固定を行った。新生児皮膚を1.0×1.0 cm2に切り出し、4％PFA、12時間 + 30%スクロース, 4℃でさらに浸潤固定した。PBS(‐)で、洗浄し、OTCコンパウンドで凍結包埋した。クリオスタットで8μmの凍結切片を切り出した。PBSで2回洗浄し、コンパウンドを洗い流し、10％ ヤギ血清PBSで、室温で1時間ブロッキングした。1次抗体は10％ ヤギ血清PBSで500倍希釈したウサギ抗-ビメンチン(Abcam, Cat: ab7783-500) を使用し、5時間、4℃でインキュベートした。その後、PBSで2回洗浄した。2次抗体は10％ ヤギ血清PBSで500倍希釈した Alexa Fluor 546 ヤギ 抗-ウサギ IgG(H+L)(Invitrogen, Cat: A11035)  を使用し45分間 室温でインキュベートした。その後PBSで2回洗浄し、2μg/mlのDAPI（4',6-diamino-2-phenylindole）で3分間、室温でインキュベートした。さらにPBSで2回洗浄し、蛍光体退光防止剤を含むマウント剤を載せて封入した。
【０１７９】
結果
合成ペプチド（1-34）は皮膚線維芽細胞に対してマイグレーション活性を示した（図１３Ａ）。また、線維芽細胞のマーカーであるビメンチン陽性細胞においてGFPの蛍光が陽性である細胞が観察された(図１３Ｂ)。
【０１８０】
考察
皮膚線維芽細胞はPDGFRαを発現していた。皮膚線維芽細胞に対して合成ペプチド（1-34）はマイグレーション活性を有していた。骨髄間葉系幹細胞も新生皮膚線維芽細胞もPDGFRα陽性であり、いずれにおいてもペプチド(1-34)に対してマイグレーション活性をもち、PDGFRα陰性細胞であるケラチノサイトにはマイグレーション活性を示さなかった。ペプチド（1-34）を含むアミノ酸配列がマイグレーション活性を示す細胞のマーカーとしてPDGFRαが有益であると予想された。
【実施例１１】
【０１８１】
マウス皮膚線維芽細胞におけるFACSによるPDGFRαの発現確認
B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J新生マウスをEtOH, PBSでよく洗浄した。皮膚を筋肉から剥がし、3mm幅の細片にした。500unit/mlのディスパーゼの入った5%FBS-DMEMに移し４℃で18時間インキュベートした。真皮と表皮を剥離し、真皮を鋏でよく切り刻み破砕した。0.2%コラゲナーゼ含DMEMの中に細かく刻んだ真皮を入れて、37℃、 30分温浴中で振盪した。30%FBS含DMEMを加え遠心機で160×G, 5分間遠心した。沈殿した細胞を10cmディッシュに播種した。5％CO2、37℃で培養し、3日ごとに培地を交換し、80〜90％コンフルエントで継代を行った。細胞をトリプシンでディッシュから回収し10％FBS含D-MEMを加えた後細胞を遠心し回収した。細胞のGFP蛍光をBD FACSCantTMIIで検出し解析を行った。
【０１８２】
結果
新生マウス皮膚の線維芽細胞の98％以上がPDGFRα陽性であった（図１４）。
【０１８３】
考察
FACSでPDGFRα陽性細胞の数を定量化した。免疫組織化学の結果と同様に線維芽細胞のほとんどがPDGFRα陽性細胞であることが示された。
【実施例１２】
【０１８４】
方法
C57Bl6 マウス（8週齢、雌）の尾静脈から10μgの合成ペプチド（1番目のアミノ酸から44番目のアミノ酸）を200 μl のPBSに希釈し30ゲージ針付きシリンジを用いて投与した。陰性コントロールには同量のPBSを投与した。12時間後イソフルランによる全身麻酔下で左心室から末梢血液を採血した。3mlのPBS(Nacalai tesque, Cat.14249-95)加えた後、Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare,Cat.17-1440-02) 3mlを重層した。遠心機を用い400G、25℃で45分間遠心を行った。上層の血清を捨てて、中間層の白いバンドとして見える細胞のみを回収した。回収した細胞にPBS 45ml を加えて、遠心機を用いて800G、25℃で20分間遠心を行った。上清すててPBS 10ml加え遠心機で1500rpmの速度、25℃で 10分間遠心を行った。上清すてて、HLB(溶血用緩衝液)(免疫生物研究所社製)を1ml加えピペッティングし5分間静置する。10mlのPBS加えて1500rpm の速度、25℃で10分間遠心を行った。沈殿した単核細胞を回収した。回収した単核細胞を丸底96 well プレートに、1×106 個/ 100μl(2% FBS 含PBS)で調整した。PE-mouse CD140a(PDGFRα)(BD Bioscience, Cat.12-1401-81)もしくはFITC-mouse CD44(BD Bioscience, Cat.553-133)を、それぞれ単核細胞の入ったウェルに1μlずつ加え遮光し20分間4℃でインキュベートした。PBS 200μlずつ加え、1500rpm の速度、4℃で10分間遠心を行った。上精を捨て再度PBS 200μlずつ加え、1500rpm の速度、4℃で10分間遠心を行った。PBS 100μlに細胞を懸濁後、1％パラホルムアルデヒド300μlを加えた。なおイソタイプコントロール用抗体を使用して同様にコントロールを作製した。FACSCantTMIIを使用して上記で調整した細胞の解析を行った。
【０１８５】
結果
陰性コントロール群（PBS投与群）では、末梢血中のPDGFRα陽性かつCD44陽性細胞の割合は平均1.33％であったのに対し、ペプチド（1-44）投与群では平均4.33％に増えていた。（図１５）
【０１８６】
考察
HMGB1の1番目のアミノ酸から44番目のアミノ酸までのペプチドを合成し、マウスの静脈内に投与したところ、12時間後にPDGFRα陽性かつCD44陽性の細胞が増加した。実施例８においてはin vitro におけるPDGFRα陽性かつCD44陽性である骨髄間葉系幹細胞に対するマイグレーション活性を認めた。本実施例ではin vivoにおいても末梢血中にPDGFRα陽性かつCD44陽性の細胞を動員することが示された。PDGFRα陽性とCD44陽性はいずれも骨髄間葉系幹細胞のマーカーである。骨髄間葉系幹細胞は再生医療に有効であることが知られており、本ペプチドの静脈内投与が損傷組織の治療に有効であることが期待される。
【実施例１３】
【０１８７】
中大脳動脈塞栓糸モデルの作製
8-10週齢雄Wister Ratを使用した。体温モニター付きホットマットで保温しながらラットにイソフルランで吸入麻酔を施行した。十分な麻酔効果を確認した後、頚部の毛を除去し皮膚を露出させ術部をアルコール消毒した。頚部正中線上の皮膚をメスで切開した。右外頸動脈を結紮し右総頸動脈に緊張を加えて一時的に血流を止めた後、4号ナイロンモノフィラメントの先端をシリコンによってコートした塞栓糸を右外頸動脈から右内頸動脈に向けて挿入した。総頸動脈の緊張をゆるめ血流に乗せて塞栓糸を内頸動脈から中大脳動脈分岐部まですすめ血流を遮断した。さらに、右総頸動脈にかけている糸を結紮し血流を50分間完全に遮断した。塞栓糸を抜去し総頸動脈の糸を緩めた後、皮膚を縫合し手術を終了した。
【０１８８】
治療薬の投与
合成ペプチド（1-44）５０μｇを尾静脈から投与した。初回投与は脳梗塞作成後6時間とし、以後、24時間間隔で計5回（計5日間）投薬した。
【０１８９】
脳梗塞サイズの確認
最終薬剤投与から14日後に十分に深い麻酔をラットに行った後、二酸化炭素を充満した容器内で心臓の拍動および呼吸の停止したことを確認した。脳を取り出し速やかに10%。緩衝ホルマリン中に浸し固定した。パラフィン包埋後切片を薄切し、ヘマトキシリン・エオジン染色を行った。切片はブレグマから前方1.92mm（1.92）、0.60mm(0.60)および後方1.56mm(-1.56)、3.24mm(-3.24)の4枚をそれぞれの脳に対し作製し面積を比較した。
【０１９０】
結果
合成ペプチド（1-44）を投与した群（N=10）のうち皮質まで梗塞巣が拡大したのは1匹のみで残りの9匹は基定核にとどまっていた（図１６  A1（ブレグマからの距離前方1.92mm）、B1（ブレグマからの距離前方0.60mm）、C1（ブレグマからの距離後方1.56mm）、D1（ブレグマからの距離後方3.24mm））に対し、陰性コントロール群（N=11）のうち8匹において基定核から皮質にかけて梗塞巣が拡大した（図１６  A2（ブレグマからの距離前方1.92mm）、B2（ブレグマからの距離前方0.60mm）、C2（ブレグマからの距離後方1.56mm）、D2（ブレグマからの距離後方3.24mm））。また作製した４箇所の切片に対し、それぞれ右脳の脳梗塞部分の面積を測定し右脳正常脳面積に対する%比を計測した。いずれの切片においても有意に合成ペプチド投与群の梗塞面積が陰性コントロール群に比較して縮小していた（図１７）。
【０１９１】
考察
近年、脳梗塞患者においても、自己の骨髄間葉系幹細胞を静脈内投与することで、治療予後が改善するとの報告もあり、骨髄内の細胞による脳梗塞に対する治療効果が明らかになりつつある。また、齧歯類の実験によって骨髄間葉系幹細胞は骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等に分化することが知られていたが、さらに上皮細胞、神経細胞など様々な細胞に分化することが明らかになっている。また、骨髄細胞は種々の成長因子や細胞増殖因子を分泌するため、梗塞部に移動した骨髄細胞が分泌する物質による神経保護作用も期待できる。
【０１９２】
なお、ラットでは脳の脳梗塞サイズは、虚血の48時間後までに梗塞のサイズの8割から9割はほぼ確定し、その後7日間かけて徐々に拡大することが知られている。また、一度虚血が起きると治療の有無にかかわらず確実に壊死を来すコアと呼ばれる部分と、治療によって壊死を避ける可能性のあるペナンブラと呼ばれる部分の存在が知られており、脳梗塞の治療は梗塞が広がる以前にペナンブラを壊死させないことが目標となる。
【０１９３】
大脳は主に基定核、大脳皮質に分けられ、特に基定核は大脳皮質に比較し低酸素に弱いため脳梗塞の際には最も障害を受けやすい。本結果においても、合成ペプチド（1-44）による梗塞巣の縮小は主に皮質においてみられ、基定核は壊死を起こしているものがほとんどであった。大脳皮質は、感覚、運動の中枢であり、これらの機能を改善することは脳梗塞治療後の社会復帰において極めて重要であり、脳梗塞の有効な治療薬が少ない現状から本ペプチドの医薬品としての必要性は高いと期待される。
【０１９４】
本実験では、脳梗塞作成6時間後にペプチドの投与を行い、19日後に脳梗塞のサイズの縮小効果を認めた。治療効果は骨髄細胞による神経保護作用、神経組織等への分化による組織再生によると予想される。HMGB1の一部からなるペプチドは、損傷部位やその近傍に投与された場合だけでなく、損傷部位とは遠位かつ異所の静脈内に投与された場合であっても、損傷部位に細動を動員できることが強く示唆された。なお、実施例４、５、６におけるペプチドにおいて、マイグレーション活性が弱いため、活性が検出されていないように見受けられるペプチドがあるが、これらの一部は本アッセイ方法の検出限界以下の活性であることが考えられる。ペプチドを溶解する溶媒、マイグレーション活性測定時間、チャンバー上層に挿入する細胞数を最適化することによって活性が検出される可能性がある。現在、脳梗塞の治療に使用されている医薬品であるｔPAに関して、梗塞後出血等の副作用を防ぐために、脳梗塞発症後4時間以内に投与しなければならない、画像診断の判定をしなければならない、などの投与基準が厳密に規定されている。脳梗塞は突発的に発症するため予め発症を予測することは困難である。そのため脳梗塞を発症した人の多くは医療機関に受診するころには時間が経過しており、tPAの適応外となっていることが多い。一方、本実施例では脳梗塞作成6時間後の投与で治療効果を得ており、本ペプチドには抗凝固活性はないと考えられることから6時間以降の投与も可能で、脳梗塞を発症した多くの人に適応されると予想される。また、本実施例ではラット（約２５０ｇ/個体）1匹に対し５０μｇ/回投与しているが、体重1キログラムあたり２００μｇに相当する。脳梗塞を発症した患者に経静脈的に投与する量としては適切な量と考えられる。
【実施例１４】
【０１９５】
HMGB1断片の発現ベクター作製、タンパク質・ペプチドの発現、骨髄間葉系幹細胞のマイグレーションアッセイ方法
ヒトHMGB1のN末端側のメチオニン(M)を削除し、代わりにMKHHHHHHENLYFQ（配列番号：１１）を付加した。HHHHHH（配列番号：１２）は発現したタンパク質もしくはペプチドを、ニッケルカラムを用いて精製するためのtag(6xHis tag)であり、ENLYFQG（配列番号：１３）はTEV protease が認識する配列である（図１８Ａ）。またT7 promoter、lac operator の下流に目的のタンパクもしくはペプチド（2-215, 2-84, 2-44, 45-84, 2-62, 2-70, 2-81, 2-170, 93-215,85-169）をコードするcDNAを挿入し、さらに薬剤耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子、複製開始点をpBR322 ori、f1 ori を使用したベクターを構築した。本発現ベクターを用いて作製したタンパク質もしくはペプチドをTEV protease で切除すると、2番目のアミノ酸から始まるヒトHMGB1のタンパク質もしくはペプチドを作製することができる。作製したプラスミドを用いてBL-21(DE3)を形質転換した。カナマイシン含有LB培地中で、37℃で一晩振盪培養した菌液5 mlを100 mlのLB培地に移し、37℃、140 rpmで振盪培養した。濁度計で濁度を測定し、OD 0.5〜0.7になったら終濃度1 mMになるようにIsopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) を加えた。2-215, 2-84, 2-70, 2-81, 2-170, 93-215,85-169は37℃で5時間、2-44, 45-84, 2-62は15℃で一晩の振盪培養後、集菌した。発現したタンパク、ペプチドの確認はSDS-PAGEを行った後タンパク染色およびtagもしくは抗HMGB1抗体によるウエスタンブロットによっておこなった。
【０１９６】
各HMGB1断片の精製（2-215, 2-84, 2-44, 45-84, 2-62, 2-70, 2-81, 2-170, 93-215）
集菌した菌体に平衡バッファー (PBS (137 mM NaCl, 8.1 mM Na2HPO4, 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH2PO4), 10 mM imidazole; pH7.4) を3 ml加え、超音波破砕を行った。4℃、15,000 rpmで10分間の遠心分離を行い、上清を回収した。マイクロバイオスピンカラム (Bio-Rad社) にHis-Pur（商標） Ni-NTA Resin (Thermo Scientific社) を1 ml充填し、平衡バッファーで平衡化した。タンパク質溶液を入れ2000 rpmで2分間遠心後、洗浄バッファー (PBS, 25 mM imidazole; pH 7.4) でResinを洗浄した。溶出バッファー (PBS, 250 mM or 500 mM imidazole) で段階的に溶出し、各フラクションをSDS-PAGE (e-PAGEL（登録商標） 15% (ATTO)) に供して溶出タンパク質を確認した。ニッケルカラムによるアフィニティ精製後、2-215はQ sepharose（商標） Fast Flow (GE healthcare社)を、93-215はQ sepharose（商標） Fast Flow (GE healthcare社)およびSP sepharose（商標） Fast Flow (GE healthcare社)を、その他はSP sepharose（商標） Fast Flow (GE healthcare社) を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行った。
【０１９７】
ヒトHMGB1断片（2-215, 2-84, 2-44, 45-84, 2-62, 2-70, 2-81, 2-170）
マイクロバイオスピンカラムに各sepharoseを1 mlずつ充填し、PBSでsepharoseの平衡化を行った。アフィニティ精製を行ったタンパク質溶液を充填後、PBSで洗浄した。溶出バッファー (20 mM HEPES, 1 M NaCl; pH 7.5) で溶出を行い、各フラクションをSDS-PAGEで確認した。
【０１９８】
ヒトHMGB1断片(93-215)
アフィニティ精製を行ったタンパク質溶液を、QおよびSPの両sepharoseでそれぞれ陰イオン交換、陽イオン交換を行った。さらに、SP sepharose（商標） Fast Flow充填時の通過画分をQ sepharose（商標） Fast Flowに充填して陰イオン交換を行った 。各フラクションをSDS-PAGEで確認した。
【０１９９】
ヒトHMGB1断片(85-169)
集菌した菌体に0.1 gあたり1 mlのバッファー (PBS, 10 mM imidazole; pH7.4) を加え、超音波破砕を行った。4℃、20,000 rpmで1時間の遠心分離を行い、上清を回収した。BioLogic DuoFlow (Bio-Rad社) を用いてカラムクロマトグラフィーで精製を行った。まず、HisTrap（商標） FF 5 ml (GE healthcare社)、Buffer Aに菌体破砕溶液 (PBS, 10 mM imidazole (pH7.4))、Buffer B にPBS, 500 mM imidazole (pH 7.4) を用いてアフィニティ精製を行った。カラムをBuffer Aで平衡化後、タンパク質溶液を充填し以下のプログラムで洗浄及び精製を行った。プログラムは以下の通りで行った：
Isocratic Flow (Buffer A: 97%, Buffer B: 3%, 20 ml)→Linear Gradient (Buffer A: 97%→0%, Buffer B: 3%→100%, 20 ml)→Isocratic Flow (Buffer B: 100%, 20 ml)→Fraction Collection (20〜40 mlを2 mlずつ)
各フラクションはSDS-PAGEで確認を行った。
【０２００】
次にイオン交換精製を行った。カラムには85-169はHiTrap（商標） SP HP 5 ml (GE health care社) を、Buffer AにはPBS (pH 7.4)、Buffer Bには20 mM HEPES, 1 M NaCl (pH 7.5) のバッファーを用いた。カラムを適量のBuffer Aで平衡化後、アフィニティ精製を行ったタンパク質溶液を充填し以下のプログラムで洗浄及び精製を行った。プログラムは以下の通りで行った：
Isocratic Flow (Buffer A: 100%, Buffer B: 0%, 10 ml)→Isocratic Flow (Buffer A: 50%, Buffer B: 50%, 2 ml)→Isocratic Flow (Buffer A: 0%, Buffer B: 100%, 20 ml)→Fraction Collection (10〜32 mlを1 mlずつ)
各フラクションはSDS-PAGEで確認を行った。
【０２０１】
濃度測定
各断片の濃度測定はブラッドフォード法 (Bio-Rad Protein Assay) を用いたBSA換算で行った。
Migration Assay
骨髄間葉系幹細胞株MSC-1に対する上記の各ペプチドのマイグレーション活性の確認を行った。それぞれの断片を含む500mMNaCl含リン酸バッファーを2倍容のDMEMで終濃度２μMに希釈してチャンバーの下層に挿入し、8μmの穴を有するポリカーボネート膜を挟んで、上層には10%FBS含有DMEM に拡散したMSC-1を挿入した。37℃、5%CO2インキュベーターで4時間インキュベートした後、ディフ・クイック染色（Diff-Quik stain（商標））を使用し、上層から下層側にマイグレーションした細胞を検出した。
【０２０２】
結果
2-215, 2-84, 2-44, 45-84, 2-62, 2-70, 2-81, 2-170, 93-215すべてにおいて骨髄間葉系幹細胞に対するマイグレーション活性が認められた。（図18B）2-215のマイグレーション活性を1とした場合モル濃度あたり、2-84は2.37倍、2-44は1.82倍、45-84は2.04倍の活性が認められ、等質量に換算するとそれぞれ5.5倍、7.1倍、8.1倍であった。(図18C、D)
【０２０３】
考察
大腸菌で作製したヒトHMGB1(2-215)のN末端側を断片化することでマイグレーション活性の増強が認められた。さらにN末端側には少なくとも2-44および45-84の2箇所にマイグレーション活性が認められた。これは真核生物の培養細胞（HEK293細胞）で作製したHMGB1断片と同様の結果であった。断片化によりMSC-1のレセプターに対するエピトープが露出しレセプターに結合しやすくなっているのではないかと予想される。タンパク質によっては断片化によって活性を失うものがあるが、本タンパク質では断片化によってむしろ活性が増強している。タンパク質の発現においてHEK293などの真核細胞では糖鎖付加などの翻訳後修飾が行われることが知られており、レセプターのリガンドではこれらの有無が活性を左右することがある。そのため真核細胞と同様の翻訳後修飾が行われない大腸菌で作製したタンパク質が修飾だけではなく、大腸菌で生産した断片においても活性を保持していることから、これらの断片による活性は翻訳後修飾が必須ではないことを示している。以上のことから、HMGB1の断片化によってより高い活性を有する骨髄間葉系幹細胞の動員薬を開発することが可能になる。さらに翻訳後修飾が必須ではないことから、大腸菌や化学合成を用いた生産法が可能になり、より安価で安定した品質の製剤を作製することが可能である。また、本実施例に記載のペプチドとその他の実施例に記載のペプチドの比較（例えば1-44と2-44の比較、あるいは、1-84と2-84の比較）から、ＨＭＧＢ１タンパク質のファーストメチオニンの有無はマイグレーション活性に影響しないことが判明した。よって、あるペプチドがマイグレーション活性を有する場合、そのペプチドからファーストメチオニンを除去したペプチドもまたマイグレーション活性を有すると考えられる。また、ファーストメチオニンが除去されたペプチドがマイグレーション活性を有する場合、そのペプチドにファーストメチオニンを付加したペプチドもまたマイグレーション活性を有すると考えられる。
【実施例１５】
【０２０４】
方法
ヒトHMGB1のN末端側のメチオニン(M)を削除し、代わりにMKHHHHHHENLYFQ（配列番号：１１）を付加した。HHHHHH（配列番号：１２）は発現したタンパク質もしくはペプチドを、ニッケルカラムを用いて精製のためのtag(6xHis tag)であり、ENLYFQG（配列番号：１３）はTEV protease が認識する配列である（図１８A）。またT7 promoter 、lac operator の下流に目的のタンパクもしくはペプチド（89-215, 89-205, 89-195, 89-185）をコードするcDNAを挿入し、さらに薬剤耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子、複製開始点をpBR322 ori、f1 ori を使用したベクターを構築した。本発現ベクターを用いて作製したタンパク質もしくはペプチドをTEV protease で切除すると、2番目のアミノ酸から始まるヒトHMGB1のタンパク質もしくはペプチドを作製することができる。
【０２０５】
作製したプラスミドを用いてBL-21(DE3)を形質転換した。カナマイシン含有LB培地中で、37℃で一晩振盪培養した菌液5 mlを100 mlのLB培地に移し、37℃、140 rpmで振盪培養した。濁度計で濁度を測定し、OD 0.5〜0.7になったら終濃度1 mMになるようにIsopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) を加えたヒトHMGB1断片（89-215, 89-205, 89-195, 89-185）を15℃で一晩の振盪培養後、集菌した。発現したタンパク、ペプチドの確認はSDS-PAGEを行った後タンパク染色およびtagもしくは抗HMGB1抗体によるウエスタンブロットによっておこなった。
【０２０６】
各HMGB1断片（89-215, 89-205, 89-195, 89-185）の精製
集菌した菌体に0.1 gあたり2 mlのバッファー (PBS, 10 mM imidazole; pH7.4) を加え、超音波破砕を行った。4℃、20,000 rpmで1時間の遠心分離を行い、上清を回収した。BioLogic DuoFlow (Bio-Rad社) を用いてカラムクロマトグラフィーで精製を行った
【０２０７】
ヒトHMGB1断片(89-215)
集菌した菌体に0.1 gあたり1 mlのバッファー (PBS, 10 mM imidazole; pH7.4) を加え、超音波破砕を行った。4℃、20,000 rpmで1時間の遠心分離を行い、上清を回収した。BioLogic DuoFlow (Bio-Rad社) を用いてカラムクロマトグラフィーで精製を行った。まず、HisTrap（商標） FF 5 ml (GE healthcare社)、Buffer Aに菌体破砕溶液 (PBS, 10 mM imidazole (pH7.4))、Buffer B にPBS, 500 mM imidazole (pH 7.4) を用いてアフィニティ精製を行った。カラムをBuffer Aで平衡化後、タンパク質溶液を充填し以下のプログラムで洗浄及び精製を行った。プログラムは以下の通りで行った：
Isocratic Flow (Buffer A: 97%, Buffer B: 3%, 20 ml)→Linear Gradient (Buffer A: 97%→0%, Buffer B: 3%→100%, 20 ml)→Isocratic Flow (Buffer B: 100%, 20 ml)→Fraction Collection (20〜40 mlを2 mlずつ)
各フラクションはSDS-PAGEで確認を行った。
【０２０８】
次にイオン交換精製を行った。89-215はHiTrap（商標） Q HP 5 ml (GE healthcare社) を用い、Buffer AにはPBS (pH 7.4)、Buffer Bには20 mM HEPES, 1 M NaCl (pH 7.5) のバッファーを用いた。カラムを適量のBuffer Aで平衡化後、アフィニティ精製を行ったタンパク質溶液を充填し以下のプログラムで洗浄及び精製を行った。プログラムは以下の通りで行った：
Isocratic Flow (Buffer A: 100%, Buffer B: 0%, 10 ml)→Isocratic Flow (Buffer A: 50%, Buffer B: 50%, 2 ml)→Isocratic Flow (Buffer A: 0%, Buffer B: 100%, 20 ml)→Fraction Collection (10〜32 mlを1 mlずつ)
各フラクションはSDS-PAGEで確認を行った。
【０２０９】
ヒトHMGB1断片(89-205, 89-195, 89-185)
可溶性タンパク質溶液の調製はヒトHMGB1断片(89-215)と同様に行った。その後、各カラムクロマトグラフィーにて以下のようにグラジエント溶出を行った。
まず、HisTrap（商標） FF 5 ml、Buffer A (PBS, 10 mM imidazole (pH7.4))、Buffer B (PBS, 500 mM imidazole (pH 7.4)) を用いてアフィニティ精製を行った。カラムをBuffer Aで平衡化後、タンパク質溶液を充填し以下のプログラムで洗浄及び精製を行った。プログラムは以下の通りで行った：
→Isocratic Flow (Buffer A: 97%, Buffer B: 3%, 50 ml)→Linear Gradient (Buffer A: 97%→0%, Buffer B: 3%→100%, 120 ml)→Fraction Collection (50〜170 mlを5 mlずつ)
各フラクションはSDS-PAGEで確認を行った。
【０２１０】
次にイオン交換精製を行った。カラムにはヒトHMGB1断片(89-215),(89-205)はHiTrap（商標） Q HP 5 mlを用い、それ以外はHiTrap（商標） SP HP 5 ml を用いた。Buffer AにはPBS (pH 7.4)、Buffer Bには7ｘPBS (pH 7.4) を用いた。カラムを適量のBuffer Aで平衡化後、アフィニティ精製を行ったタンパク質溶液を充填し以下のプログラムで洗浄及び精製を行った。プログラムは以下の通りで行った：
Isocratic Flow (Buffer A: 100%, Buffer B: 0%, 50 ml)→Linear Gradient (Buffer A: 100%→0%, Buffer B: 0%→100%, 50 ml)→  Isocratic Flow (Buffer A: 0%, Buffer B: 100%, 5 ml)→Fraction Collection (50〜105 mlを3 mlずつ)
各フラクションはSDS-PAGEで確認を行った。
【０２１１】
濃度測定
各断片の濃度測定はブラッドフォード法 (Bio-Rad Protein Assay) を用いたBSA換算で行った。
Migration Assay
骨髄間葉系幹細胞株MSC-1に対する上記の各ペプチドのマイグレーション活性の確認を行った。それぞれの断片を含む500mMNaCl含リン酸バッファーを2倍容のDMEMで終濃度２μMに希釈してチャンバーの下層に挿入し、8μmの穴を有するポリカーボネート膜を挟んで、上層には10%FBS含有DMEM に拡散したMSC-1を挿入した。37℃、5%CO2インキュベーターで4時間インキュベートした後、ディフ・クイック染色（Diff-Quik stain（商標））を使用し、上層から下層側にマイグレーションした細胞を検出した。
【０２１２】
結果
ヒトHMGB1断片（89-215）をニッケルカラムでアフィニティ精製行った後、イオン交換クロマトグラフィー（Qカラム）を用いて塩濃度を徐々に上げることによってグラジエント溶出を行った。フラクション6、7では15.5kDaのペプチドがフラクション8、9では15.5、16、17kDaのペプチドが、フラクション10、11では16、17kDaのペプチドが分収された。（図19A）
【０２１３】
フラクション6と7を混合したサンプル（6+7）とフラクション9および10の骨髄間葉系幹細胞（MSC-1）に対するマイグレーション活性を調べたところフラクション6と7を混合したサンプル（6+7）に強い活性を認めたがフラクション9と10の活性は弱かった。（図19B）
【０２１４】
ヒトHMGB1断片（89-205）をニッケルカラムでアフィニティ精製行った後、イオン交換クロマトグラフィー（Qカラム）を用いて塩濃度を徐々に上げることによってグラジエント溶出を行った。フラクション6において最も短い断片(*4)から先に溶出され、フラクション7では次に短い断片（*5）がさらに最も長い断片（*6）が溶出された。一方89-195および89-185はニッケルカラムアフィニティー精製によって単一の断片として精製できた。（図19C）
【０２１５】
フラクション6、7、8の骨髄間葉系幹細胞（MSC-1）に対するマイグレーション活性を調べたところフラクション6に強い活性を認め、フラクション7、8となるに従い弱くなった。一方89-195および89-185は89-215のいずれの断片よりも強い活性を認めた。（図19D）
【０２１６】
考察
ヒトHMGBN1断片（89-215、89-205、89-195、89-185）を、大腸菌を用いて作製した。89-215、89-205の骨髄間葉系幹細胞マイグレーション活性は弱かったが、大腸菌由来のプロテアーゼによると思われる切断が起きており（図19A、C）、短い切断片に強い活性が認められた(図19B、D)。一方、89-195、89-185は強い骨髄間葉系幹細胞マイグレーション活性が認められた(図19C、D)。HMGB1のC末端186〜215番目のアミノ酸にはグルタミンとアスパラギン酸の繰り返し配列が存在する。これらの配列はタンパク質の安定化に寄与していると言われている。本研究によってはじめてこの部分がHMGB1断片（89-215）のマイグレーション活性を抑制しており、この配列を除去することによってHMGB1断片（89-215）のマイグレーション活性を増強することができることを明らかにした。なおHMGB1のC末に存在するグルタミン酸とアスパラギン酸の繰り返し配列（１８６番目から２１５番目のアミノ酸配列）は、acidic-tail と呼ばれRAGEとの結合に必須であるとの知見がある。また、RAGEは樹状細胞等がHMGB1によってマイグレーションする際のレセプターであることから、マイグレーション活性を発揮するにはC末およびRAGE  リガンド部分が必要であると予想されたが、実際は、驚くべきことに骨髄間葉系幹細胞に対するマイグレーション活性にはC末がない方がよいことが分かった。このことは、大腸菌でC末を含有するHMGB1断片を作製した際に大腸菌由来のプロテアーゼによると思われる分解産物の方が分解されていないHMGB1断片以上のマイグレーション活性を示し、さらにC末を欠如したHMGB1断片を作製したところC末を有するHMGB1断片より強い活性を発揮したことから初めて明らかになった。通常はタンパク質の特定の活性に寄与する部位は1か所であるが、驚くべきことにHMGB1の骨髄間葉系幹細胞に対するマイグレーション活性に寄与する部分は複数部位あり、さらに驚くべきことにそれぞれの部位の活性は等分子数あたりにすると全長のHMGB1の約2倍の活性を有していた。また、通常は生理活性を有するペプチドは、長さが短くなるほど不安定化し活性が低くなるが、驚くべきことに短い断片の方が長い断片以上の強い活性を有するものが存在した。
【実施例１６】
【０２１７】
方法
ヒトHMGB1のN末端側のメチオニン(M)を削除し、代わりにMKHHHHHHENLYFQ（配列番号：１１）を付加した。HHHHHH（配列番号：１２）は発現したタンパク質もしくはペプチドを、ニッケルカラムを用いて精製のためのtag(6xHis tag)であり、ENLYFQG（配列番号：１３）はTEV protease が認識する配列である（図１８A）。またT7 promoter、lac operatorの下流に目的のタンパクもしくはペプチド（85-169, 2-215）をコードするcDNAを挿入し、さらに薬剤耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子、複製開始点をpBR322 ori、f1 oriを使用したベクターを構築した。本発現ベクターを用いて作製したタンパク質もしくはペプチドをTEV proteaseで切除すると、2番目のアミノ酸から始まるヒトHMGB1のタンパク質もしくはペプチドを作製することができる。
【０２１８】
作製したプラスミドを用いてBL-21(DE3)を形質転換した。カナマイシン含有LB培地中で、37℃で一晩振盪培養した菌液5 mlを100 mlのLB培地に移し、37℃、140 rpmで振盪培養した。濁度計で濁度を測定し、OD 0.5〜0.7になったら終濃度1 mMになるようにIsopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)を加えたヒトHMGB1断片（85-169）を15℃で一晩の振盪培養後、集菌した。発現したタンパク、ペプチドの確認はSDS-PAGEを行った後タンパク染色およびtagもしくは抗HMGB1抗体によるウエスタンブロットによっておこなった。
【０２１９】
集菌した菌体に0.1 gあたり1 mlのバッファー (PBS, 10 mM imidazole; pH7.4)を加え、超音波破砕を行った。4℃、20,000 rpmで1時間の遠心分離を行い、上清を回収した。BioLogic DuoFlow (Bio-Rad社) を用いてカラムクロマトグラフィーで精製を行った。まず、HisTrap（商標） FF 5 ml (GE healthcare社)、Buffer Aに菌体破砕溶液 (PBS, 10 mM imidazole (pH7.4))、Buffer B にPBS, 500 mM imidazole (pH 7.4) を用いてアフィニティ精製を行った。カラムをBuffer Aで平衡化後、タンパク質溶液を充填し以下のプログラムで洗浄及び精製を行った。プログラムは以下の通りで行った：
Isocratic Flow (Buffer A: 97%, Buffer B: 3%, 20 ml)→Linear Gradient (Buffer A: 97%→0%, Buffer B: 3%→100%, 20 ml)→  Isocratic Flow (Buffer B: 100%, 20 ml)→Fraction Collection (20〜40 mlを2 mlずつ)
各フラクションはSDS-PAGEで確認を行った。
【０２２０】
濃度測定
組換えタンパク質の濃度測定はブラッドフォード法 (Bio-Rad Protein Assay) を用いたBSA換算で行った。
【０２２１】
Migration Assay
骨髄間葉系幹細胞株MSC-1に対する上記の各ペプチドのマイグレーション活性の確認を行った。それぞれの断片を含む500mMNaCl含リン酸バッファーを2倍容のDMEMで終濃度２μMに希釈してチャンバーの下層に挿入し、8μmの穴を有するポリカーボネート膜を挟んで、上層には10%FBS含有DMEM に拡散したMSC-1を挿入した。37℃、5%CO2インキュベーターで4時間インキュベートした後、ディフ・クイック染色（Diff-Quik stain（商標））を使用し、上層から下層側にマイグレーションした細胞を検出した。
【０２２２】
結果
ヒトHMGB1断片（85-169）はヒトHMGB1断片（2-215）よりも強い骨髄間葉系幹細胞マイグレーション活性が認められた。（図20A）マイグレーション活性を1とした場合モル濃度あたり、1.59倍、等質量に換算するとそれぞれ3.6倍であった。(図20B、C)
【０２２３】
考察
ヒトHMGB1断片（85-169）にも(89-195)や（89-185）と同様に（2-215）より強い骨髄間葉系幹細胞マイグレーション活性を認めた。以上のことから85〜185番目のアミノ酸配列中に骨髄間葉系幹細胞動員活性を有する配列が少なくとも一箇所存在すると予想される。実施例１ではHEK293で生産したHMGB1断片85-169にマイグレーション活性を認めなかった。本実施例では大腸菌で生産したHMGB1断片85-169でマイグレーション活性を認めている。この違いは、生産方法の違いによってマイグレーション活性が極めて減弱したかもしくは消失したものと予想される。HEK293のような真核生物と大腸菌のような原核生物では、翻訳後修飾やフォールディングなどに違いがあるため同じタンパクやペプチドを生産させても性質が異なることがしばしばある。
【０２２４】
本研究により、HMGB1のアミノ酸配列中には少なくとも、3箇所の骨髄間葉系幹細胞動員活性配列が存在し、それらの活性はC末端のグルタミン酸、アスパラギン酸の繰り返し配列によって抑制することで制御されていることが明らかになった。C末端の抑制配列を除去したHMGB1断片を作製することで活性型の強い骨髄幹細胞動員作用を有する製剤を作ることが可能になる。
【実施例１７】
【０２２５】
マウス間葉系幹細胞マイグレーション活性１
【０２２６】
方法
HMGB1断片の精製
KOD-Plus-ver.2 (Toyobo社)を用いてinverse PCRを行った。前述のヒトHMGB1の2番目から215番目までのアミノ酸を含むHMGB1断片用発現ベクターを鋳型のプラスミドとした。2番目から205番目のアミノ酸、2番目から195番目のアミノ酸、2番目から185番目のアミノ酸それぞれをコードするcDNAとN末端側に存在するヒスチジンタグ、TEVプロテアーゼ認識配列、プラスミドのバックボーンも含めてPCR法で増幅した。なおこのPCR産物から作製される遺伝子産物はN末端からヒスチジンタグ、TEVプロテアーゼ認識配列、ヒトHMGB1断片がタンデムに配列したタンパクとなる。PCR産物に制限酵素DpnI(Toyobo社)を添加することで鋳型プラスミドを消化した。次にT4 Polynucleotide kinase (NEB社)を用いてPCR産物にリン酸基を付加し、ligase (2x Quick Ligase; NEB社 or Ligation Convenience kit; Nippongene社)を用いてself-ligationを行った。これを大腸菌JM109株に形質転換し、カナマイシンによる選抜でコロニーを得た。GenElute Plasmid Miniprep kit (SIGMA-ALDRICH社)を用いてプラスミド抽出を行い、シークエンス解析により塩基配列を確認後、大腸菌BL21 (DE3)株に形質転換し、コロニーを得た。
【０２２７】
発現誘導
それぞれのコロニーを終濃度50mg/Lカナマイシン含有LB培地中で、37℃で一晩振盪培養した菌液5 mlを100 mlのLB培地に移し、37℃、140 rpmで振盪培養した。濁度計で濁度を測定し、OD 0.5-0.7になったら終濃度1 mMになるようにIsopropyl -β-D - thiogalactopyranoside(IPTG)を加えた。さらに15℃で一晩の振盪培養後、集菌した。
【０２２８】
組換えタンパク精製
集菌した菌体に平衡バッファー (PBS (137 mM NaCl, 8.1 mM Na2HPO4, 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH2PO4), 10 mM imidazole; pH7.4) を12 ml (25-50 mg/ml), Leupeptin hydrochlorideを終濃度 5 μg/mlになるように加え、超音波破砕を行った。4℃、15,000 rpmで60分間の遠心分離を行い、上清を回収した。上清の一部をとり抗ヒトHMGB1抗体を使用したウエスタンブロット法を行い目的タンパクの発現の確認を行った。残りの上清を0.45 μmのフィルターを通し、除菌した。目的タンパクの精製はBioLogic DuoFlow (Bio-Rad社)を用いてカラムクロマトグラフィーで行った。
【０２２９】
まず、HisTrap（商標） FF 5 ml、Buffer A (PBS, 10 mM imidazole (pH7.4))、Buffer B (PBS, 500 mM imidazole (pH 7.4))を用いてアフィニティ精製を行った。カラムをBuffer Aで平衡化後、タンパク質溶液を充填し以下のプログラムで洗浄及び精製を行った。
【０２３０】
プログラム:
Isocratic Flow (Buffer A: 97%, Buffer B: 3%, 50 ml)
Linear Gradient (Buffer A: 97%→0%, Buffer B: 3%→100%, 120 ml)
Fraction Collection (50〜170 mlを5 mlずつ)
各フラクションはSDS-PAGE (e-PAGEL（登録商標）5-20% (ATTO))で確認を行った。
【０２３１】
次にイオン交換精製を行った。カラムにはGNX-E-022のみHiTrap（商標）Q HP 5 mlを用い、それ以外はHiTrap（商標） SP HP 5 mlを用いた。Buffer AにはPBS (pH 7.4)、Buffer Bには7ｘPBS (pH 7.4)を用いた。カラムを適量のBuffer Aで平衡化後、アフィニティ精製を行ったタンパク質溶液を充填し、以下のプログラムで洗浄及び精製を行った。
【０２３２】
プログラム:
Isocratic Flow (Buffer A: 100%, Buffer B: 0%, 50 ml, 4 ml/min)
Linear Gradient (Buffer A: 100%→0%, Buffer B: 0%→100%, 50 ml, 4ml/min)
Isocratic Flow (Buffer A: 0%, Buffer B: 100%, 5 ml, 4ml/min)
Fraction Collection (50〜105 mlを3 mlずつ)
各フラクションはSDS-PAGEし、ゲルのタンパク染色を行うことで精製タンパクの確認を行った。
【０２３３】
濃度測定
組換えタンパク質の濃度測定は、ブラッドフォード法(Bio-Rad Protein Assay)を用いたBSA換算で行った。
【０２３４】
マイグレーションアッセイ
骨髄間葉系幹細胞株MSC-1に対する上記の各ペプチドのマイグレーション活性の確認を行った。それぞれの断片を含む500mMNaCl含リン酸バッファーを2倍容のDMEMで終濃度２μMに希釈してチャンバーの下層に挿入し、8μmの穴を有するポリカーボネート膜を挟んで、上層には10%FBS含有DMEM に拡散したMSC-1を挿入した。37℃、5%CO2インキュベーターで4時間インキュベートした後、ディフ・クイック染色（Diff-Quik stain（商標））を使用し、上層から下層側にマイグレーションした細胞を検出した。
【０２３５】
結果
2-215の断片、2-205の断片に比較し、2-195の断片および2-185の断片で強いマイグレーション活性が認められた（図２１Ａ）。
【０２３６】
考察
186番目から215番目までの断片はアスパラギン酸とグルタミン酸合計30アミノ酸の繰り返し配列であり、Acidic-tailと呼ばれている。今回のデータからHMGB1の骨髄間葉系幹細胞のマイグレーション活性はAcidic-tailによって強く抑制されており、特にC末端側20アミノ酸の配列が抑制に関与していることが示唆された。これまでのデータからHMGB1の骨髄間葉幹細胞遊走活性作用の活性ドメインは複数個所同定されており、これらのすべての活性を抑制しているかは、さらに詳細な実験が必要である。
【０２３７】
ヒト間葉系幹細胞マイグレーション活性２
方法
ヒトHMGB1断片(2-215、2-84、2-44、45-84、85-169、89-185、89-195、89-205)については前述の実施例14、15、16と同様に大腸菌に生産させ適切なカラムを用い精製を行った。ただし、89-215については、実施例15における89-205と同様の方法で精製した。
【０２３８】
濃度測定
各断片の濃度測定はブラッドフォード法 (Bio-Rad Protein Assay) を用いたBSA換算で行った。
【０２３９】
Migration Assay
各断片について前述のマウス由来骨髄間葉系幹細胞（MSC-1）に対するマイグレーションアッセイと同様にヒト由来骨髄間葉系幹細胞に対して行った。断片は最終濃度2μM相当を使用した。またヒト由来骨髄間葉系幹細胞は4継代目のhMSC（human Mesenchymal Stem Cell,Takara社製）を使用した。増殖用の培地は、間葉系幹細胞増殖培地（MF medium,TOYOBO社製）を使用し、37℃、5%CO2インキュベーターで培養した。2-4日ごとに新鮮な培地に取り替え、80％コンフルエントになった時点で継代を行った。
【０２４０】
結果
ヒトHMGB1断片(2-215、2-84、2-44、45-84)については実施例１４と同様にヒトHMGB1断片(2-215)よりもHMGB1断片（2-84、2-44、45-84)により強い活性を認めた。ヒトHMGB1断片(89-185、89-195、89-205、89-215)については、実施例１５と同様にC末のacidic-tail を短くした活性ヒトHMGB1断片(89-185、89-195)により強い活性が認められた。ヒトHMGB1断片(85-169)については実施例１６と同様にヒトHMGB1断片(2-215)より強い活性が認められた。（図21Ｂ）
【０２４１】
考察
ヒト由来骨髄間葉系幹細胞においてもマウス由来骨髄間葉系幹細胞と同様のマイグレーション活性がそれぞれの断片において認められた。少なくともヒトHMGB1断片（2-44、45-84、85-169）にヒト骨髄間葉系幹細胞に対するマイグレーション活性を有する部位が独立に存在することが明らかになった。このことは、通常タンパクの特定の活性を有する部位は１か所であるため、複数の活性部位の存在は驚くべき結果であった。また、それぞれの断片の活性が全長に近い配列（2-215）の活性よりも強いことも驚くべきことであった。一方、RAGE binding 部位は150番目から183番目までのアミノ酸配列であるが、89番目から169番目のアミノ酸配列にも活性があることからヒト骨髄間葉系幹細胞に対するマイグレーション活性はRAGEを必要としない可能性が示唆された。ヒトHMGB1断片(89-185、89-195、89-205、89-215)については、マウス由来の細胞の場合と同様に、C末のacidic-tailを欠如した断片により強い活性が生じた。このことはヒト骨髄間葉系幹細胞のマイグレーションにおいても、C末端はマイグレーション活性において抑制性に働いており、C末のacidic-tailを短くしたり、欠如することによって、より強い活性のHMGB1断片を作製することが可能になると考えられる。
【０２４２】
ヒトHMGB1の断片2-84にヒトHMGB1のAcidic tail の断片186-215,186-205,186-195を付加した融合断片のマイグレーション活性の変化
方法
ヒトHMG1断片2-84のC末端に同じくヒトHMGB1の断片186-215,186-205もしくは186-195が付加されるように融合したcDNAを作成した。なお前述のように、大腸菌で発現される断片が、ヒトHMGB1のN末端側のメチオニン(M)が削除され、代わりにMKHHHHHHENLYFQ（配列番号：１１）を付加されるように、発現ベクターを設計した。なおHHHHHH（配列番号：１２）は発現したタンパク質もしくはペプチドを、ニッケルカラムを用いて精製するためのタグ(6xHis tag)であり、ENLYFQG（配列番号：１３）はTEV protease が認識する配列である（図１８）。またT7 promoter、lac operatorの下流に上述のcDNAを挿入し、さらに薬剤耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子、複製開始点をpBR322 ori、f1 ori を使用したベクターを構築した。本発現ベクターを用いて作製したタンパク質もしくはペプチドをTEV proteaseで切除すると、2番目のアミノ酸から始まるヒトHMGB1のタンパク質もしくはペプチドを作製することができる。
【０２４３】
作製したプラスミドを用いてBL-21(DE3)を形質転換した。カナマイシン含有LB培地中で、37℃で一晩振盪培養した菌液5 mlを100 mlのLB培地に移し、37℃、140 rpmで振盪培養した。濁度計で濁度を測定し、OD 0.5〜0.7になったら終濃度1 mMになるようにIsopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) を加え15℃で一晩の振盪培養後、集菌した。
【０２４４】
各HMGB1断片（2-84＋186-215, 2-84＋186-205, 2-84＋186-195）の精製
集菌した菌体に平衡バッファー (PBS (137 mM NaCl, 8.1 mM Na2HPO4, 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH2PO4), 10 mM imidazole; pH7.4) を終濃度 5 μg/mlになるように加え、超音波破砕を行った。4℃、15,000 rpmで60分間の遠心分離を行い、上清を回収した。残りの上清を0.45 μmのフィルターを通し、除菌した。目的タンパクの精製はBioLogic DuoFlow (Bio-Rad社)を用いてカラムクロマトグラフィーで行った。
【０２４５】
次にイオン交換精製を行った。2-84＋186-215, 2-84＋186-205, 2-84＋186-195はHiTrap（商標） Q HP 5 ml (GE healthcare社)を用い、Buffer AにはPBS (pH 7.4)、Buffer Bには7ｘPBS (pH 7.4)のバッファーを用いた。カラムを適量のBuffer Aで平衡化後、アフィニティ精製を行ったタンパク質溶液を充填し以下のプログラムで洗浄及び精製を行った。プログラムは以下の通りで行った：
Isocratic Flow (Buffer A: 100%, Buffer B: 0%, 50 ml, 4 ml/min)
Linear Gradient (Buffer A: 100%→0%, Buffer B: 0%→100%, 50 ml, 4ml/min)
Isocratic Flow (Buffer A: 0%, Buffer B: 100%, 5 ml, 4ml/min)
Fraction Collection (50〜105 mlを3 mlずつ)
各フラクションはSDS-PAGEし、ゲルのタンパク染色を行うことで精製タンパクの確認を行った。
なお、各断片はヒトHMGB1を認識する抗体を用いてウエスタンブロットを行い目的の断片であることの確認をおこなった。
【０２４６】
MSC-1を用いたHMGB1断片（2-84）、およびHMGB1融合断片（2-84＋186-215、 2-84＋186-205、 2-84＋186-195）マイグレーションアッセイ
前述の方法で作成した断片を使用し骨髄間葉系幹細胞株MSC-1を使用したマイグレーションアッセイを行った。マイグレーションアッセイは既述と同様に行った。
【０２４７】
結果
断片2-84はマイグレーション活性を示したが、Acidic-tailの配列をそれぞれ、10アミノ酸、20アミノ酸、30アミノ酸付加したヒトHMGB1融合断片はいずれもマイグレーション活性を示さなかった（図21Ｃ）。
【０２４８】
考察
前述の実施例からヒトHMGB1断片89-215は間葉系幹細胞に対する極めて弱いマイグレーション活性を有するが、C末端側に存在するAcidic tailを削っていくとマイグレーション活性が増強することを示している。このことと本実施例からAcidic tailには2-84の断片および89-185の断片が有するマイグレーション活性を減弱する機能を有していることが明らかになった。また、2-84の断片には複数のマイグレーション活性のコア領域が存在するが、2-84の断片に186-215の断片を融合するとマイグレーション活性がほぼ消失することから2-84に存在するコア領域のすべてについて抑制されていると予想された。HMGB1という一つの分子の中に少なくとも3か所以上の骨髄間葉系幹細胞に対するマイグレーション活性のコア配列が存在するという発見は驚くべきことである。さらにC末端に存在するわずか30アミノ酸のAcidic tail がHMGB1のN末端側の2-84の断片に少なくとも2か所存在するコア配列のマイグレーション活性をほぼ完全に抑制し、85-185の断片に存在するコア配列のマイグレーション活性についても抑制しており、ひいてHMGB 1全体のマイグレーション活性を減弱させていることの発見も極めて驚くべきことである。HMGB1の1-85断片はLPS（リポポリサッカロイド）などによって惹起される炎症に対する抗炎症効果があるとされているが、Wei Gongらは、1-85の断片に186-215断片を融合した断片には1-85の断片よりもLPSに投与による死亡率を減少させることを報告している。（Journal of Biomedicine and Biotechnology Volume 2010, Article ID 915234, doi:10.1155/2010/915234）Wei Gongらの論文では1-85の抗炎症効果の増強のためにはAcidic tail は必要であることを示しているが、本発明によって骨髄間葉系幹細胞の遊走にはむしろAcidic tail は阻害することがあきらかになった。本発明から、骨髄間葉系幹細胞投与によって治療効果がみられるような疾患においては、Acidic tail は短くするか完全に削除する方がより治療効果を改善できることが期待される。
【実施例１８】
【０２４９】
方法
実験動物はSDラット（雄、8週齢）を使用した。イソフルランによる吸入麻酔によって十分な麻酔を施行した後、背部に横3cm縦7cmの短冊状の皮膚切開を作製した。ただし、頭側の一辺は切除せず、皮膚は皮下の組織から十分に遊離した。切開した3辺を周囲の皮膚と4号絹糸を用いて縫合し、テガダーム（3M社製）を使用して保護し細菌感染を予防した。
【０２５０】
ラットにHEK293で作製したマウス全長HMGB1(100μg/回/日)、化学合成したHMGB1ペプチド(1〜44アミノ酸、50μg/回/日)を、手術後6時間を初回として以後24時間ごとに計5回薬剤をリン酸緩衝液で200μlに希釈し尾静脈から投与した。陰性コントロールにはリン酸緩衝生理的食塩水を投与した。1週間後テガダームを除去し1週ごとに創傷部位を観察した。壊死部分、潰瘍形成部分の面積を測定した。
【０２５１】
結果
手術1週後に陰性コントロール群では5匹中4匹に皮膚壊死が発生した。全長HMGB1投与群では5匹中3匹で皮膚壊死が発生した。HMGB1ペプチド（1〜44アミノ酸）群では5匹中1匹で皮膚壊死が発生した。手術7週後には陰性コントロール群では5匹中4匹において皮膚の強い拘縮が起きているのに対し、全長HMGB1投与群では5匹中3匹で、HMGB1ペプチド（1〜44アミノ酸）群では5匹中2匹で拘縮が認められた（図24）。
【０２５２】
考察
HEK293で産生した全長を含むHMGB1投与群およびHMGB1ペプチド（1〜44アミノ酸）投与群で1週間後の壊死組織の縮小効果を認め、HMGB1ペプチド（1〜44アミノ酸）群ではより縮小効果が認められた。１週間後、2週間後、3週間後では創傷面積がいずれもネガティブコントロール群の半分の面積に縮小していた。３週間後以降はHMGB1ペプチド（1〜44アミノ酸）投与群が他の2群に比較してさらに創傷面積が縮小していた。7週間の治癒過程においても、HMGB1ペプチド（1〜44アミノ酸）群の方がより創傷面積が小さい傾向にあった。7週間後の創傷部分の拘縮においてもHMGB1ペプチド（1〜44アミノ酸）群がもっとも拘縮が軽度であった。骨髄間葉系幹細胞は低酸素状態における皮膚細胞の増殖を促進することが知られており、HMGB1によって動員された骨髄間葉系幹細胞が 皮弁作製によって生じた低栄養、低酸素による皮膚壊死の拡大を抑制し、創傷治癒を促進したと予想された。このような効果は皮膚の疎血、外傷、手術による損傷の拡大抑制とともに治癒後美容面においてもすぐれた効果があることが示唆される。
【実施例１９】
【０２５３】
方法
実験動物は1群15匹のSDラット（雄、8週齢）を使用した。イソフルランによる吸入麻酔によって
十分な麻酔を施行した後、背部に横3cm縦7cmの短冊状の皮膚切開を作製した。ただし、頭側の一辺は切除せず、皮膚は皮下の組織から十分に遊離した。切開した3辺を周囲の皮膚と4号絹糸を用いて縫合し、テガダーム（3M社製）を使用して保護し細菌感染を予防した。
【０２５４】
創傷を作製したラットに化学合成したHMGB1ペプチド(1〜44アミノ酸、50μg/回/日)もしくはHMGB1ペプチド（17〜25アミノ酸、50μg/回/日）を、手術後6時間を初回として以後24時間ごとに計5回薬剤をリン酸緩衝液で200μlに希釈し尾静脈から投与した。陰性コントロールにはリン酸緩衝生理的食塩水を投与した。1週間後テガダームを除去し創傷作製2週間後の創傷部位を観察した。非治癒部分（潰瘍、壊死）の面積を測定した。
【０２５５】
結果
皮弁作成2週間後の皮弁全体の面積に対する非治癒部分の面積の比率（％）を算出した。HMGB1ペプチド（1〜44アミノ酸）群では非治癒部分は平均14.1%であったのに対し、HMGB1ペプチド（17〜25アミノ酸、50μg/回/日）群では平均9.1％であった。さらに皮弁作成6週間後の皮弁全体の面積に対する非治癒部分の面積の比率（％）を算出したところ、HMGB1ペプチド（1〜44アミノ酸）群では非治癒部分は平均4.1%であったのに対し、HMGB1ペプチド（17〜25アミノ酸、50μg/回/日）群では平均3.5％であった（図２６）。
【０２５６】
考察
実施例１９における皮膚損傷モデルの試験において、HEK293で産生した全長を含むHMGB1投与群に比較し化学合成したHMGB1ペプチド（1〜44アミノ酸）投与群で損傷1週間後から7週間までの治癒過程において、HMGB1ペプチド（1〜44アミノ酸）群の方がより創傷面積が小さい傾向にあった。また化学合成した今回の試験によってHMGB1ペプチド（17〜25アミノ酸）群では、HMGB1ペプチド（1〜44アミノ酸、50μg/回/日）群と同等以上の皮膚損傷の改善効果が認められた。In vitro での骨髄間葉系幹細胞動員活性部位（コア配列）は複数か所あるが、現時点で判明している最も短い配列は、17番目から25番目のアミノ酸の９つのアミノ酸からなる配列である。他間葉系幹細胞動員活性部位のコア配列の長さは30アミノ酸の長さもしくは85アミノ酸の長さが必要であった。今回in vitro ばかりではなくin vivo においてもわずか９つのアミノ酸からなるHMGB1ペプチド（17〜25アミノ酸）群にも皮膚損傷の改善効果が認められ、９アミノ酸をコアドメインとして含むペプチドは、HEK293などの真核生物由来の培養細胞から作製するタンパク製剤に比較しはるかに安価で安定した生産が可能になることが期待される。
【産業上の利用可能性】
【０２５７】
本発明によって、全長が約200アミノ酸からなるHMGB1タンパク質に対し、例えば、分子量が10分の1以下の、PDGFRα陽性細胞動員活性を維持したペプチドが提供された。このようなペプチドは、大腸菌や真核生物由来培養細胞を利用した生産方法の他に、ペプチド合成機を使用した化学的合成による生産が可能であるため、ペプチドを医薬品として製造する場面において、精製純度の向上、安定生産、コスト削減が期待されるようになった。
【０２５８】
また、大腸菌や培養細胞で組み換えペプチドを産生する場合、全長のHMGB1に比較してモル比で約2倍、質量比で約6倍程度の活性の向上が認められた。このため医薬品の臨床応用の際には、投与量を抑えることが可能になるため、コストの削減の他、副作用の抑制効果も期待できる。
【０２５９】
また、全長のHMGB1は、エンドトキシンの一種であるLPS(Lipopolysaccharide)との結合活性を有することが知られている。また、HMGB1を1から79番目のアミノ酸配列や88から162番目のアミノ酸配列のHMGB1断片とすると、LPSとの結合活性が失われるとの報告がある（Youn et al,. J Immunol 2008;180;5067-5074）。
【０２６０】
医薬品にLPSが少量でも混入すると、発熱などをおこし、しばしば重篤な副作用につながるため、医薬品へのLPSの混入は厳しく規制されている。HMGB1がLPSと親和性を有することから、医薬品に混入したLPSを完全に除去することは困難である。しかしペプチド化によってLPSとの親和性が低下することから、医薬品へのLPSの混入も軽減できると予想される。それゆえ、本発明において特定されたPDGFRα陽性細胞動員部分からなるペプチドを用いることで、いっそう安全な医薬品の開発が可能になる。
【０２６１】
再生が必要な組織、または、その近傍組織に本発明のペプチドを直接投与することにより、該組織の再生を誘導または促進できる。さらに、静脈内投与などの方法で、再生が必要な組織とは異なる組織に本発明のペプチドを投与することにより、再生が必要な組織の再生を誘導または促進できる。例えば脳梗塞の様な体内深部臓器の疾患を治療する場合、損傷部位（脳）への治療薬の直接投与は困難である。一方、本発明では、一般診療において広く施行されている静脈投与による治療を可能にしたため、治療薬を任意の回数、濃度で安全かつ簡便に投与することが可能となり、このことは従来の治療方法と比較して優れた効果である。
【０２６２】
また、最近開発された骨髄細胞を使用した脳梗塞の治療法として、患者本人の骨髄から細胞を採取し血液循環中に再投与する方法が有効であることが知られている。しかし、骨髄細胞採取の際には体内深部の骨髄に太い針を刺して吸引する必要があるため大きな侵襲を伴うことが避けられない。これに対し、本発明では、薬剤を静脈内投与することで骨髄細胞を直接血液循環中に動員する事が可能である。そのため、脳梗塞の患者に頻回に投与しても大きな侵襲を伴うことがない。
【０２６３】
骨髄由来の多能性幹細胞は間葉系、上皮系、神経系などの多様な細胞に分化する潜在能力を有するが、損傷部位に移動した後は周囲のニッチ環境に応じて分化し組織修復を誘導すると考えられる。再生医療や細胞治療では、希少な骨髄多能性幹細胞を生体外で培養し増殖させた後に治療に利用するが、従来の医薬品と異なり、培養過程で起きうる細胞の劣化（癌化や細菌、ウイルスなどのコンタミネーション）の危険があるため十分な安全管理が必要である。これに対して、本発明は、細胞を体外に取り出し人工的操作を加えることはしないため安全性が高い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ−Ｄ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
2020058344.tif 000024
【図２２】
2020058344.tif 000025
【図２３】
2020058344.tif 000026
【図２４】
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【図２５】
2020058344.tif 000028
【図２６】
2020058344.tif 000029
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年10月25日(2019.10.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。