(57)【要約】      （修正有）【課題】組換えタンパク質の製造方法を提供する。【解決手段】組換えタンパク質をコードする核酸で形質転換された原核宿主細胞を発酵させること、溶存酸素濃度が０％より高い条件下で前記組換えタンパク質を収集すること、前記組換えタンパク質を濾過バルクへと精製することとを含み、前記濾過バルクは、検出可能なＤＨＮＡ−リコンビナントタンパク質付加体を含まない方法。更に、組換えタンパク質の製造方法であって、前記組換えタンパク質をコードする核酸で形質転換された、ｍｅｎＥ遺伝子を欠損した原核宿主細胞を発酵させること、前記組換えタンパク質を収集すること、前記組換えタンパク質を濾過バルクへと精製することとを含み、前記濾過バルクは３１０ナノメートルでのＩＥＣアッセイによって測定して、検出可能なＤＨＮＡ−リコンビナントタンパク質付加体を含まず、組換えタンパク質収率が約２０％以上増加する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えタンパク質の製造方法であって、（ａ）前記組換えタンパク質をコードする核酸で形質転換された原核宿主細胞を発酵させること、（ｂ）溶存酸素（ｄＯ２）濃度が０％より高い条件下で前記組換えタンパク質を収集すること、及び（ｃ）前記組換えタンパク質を保存用濾過バルク（ＦＢＳ）へと精製することとを含み、前記濾過バルクが、３１０ｎｍでのイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）アッセイにより測定して、検出可能な１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸（ＤＨＮＡ）−リコンビナントタンパク質付加体を含まない、組換えタンパク質の製造方法。
【請求項２】
前記分析的アッセイが、ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＨＩＣ−ＨＰＬＣ、ＮＭＲ、質量分析法、又はＵＶ分光法によるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｄＯ２が工程（ｂ）の収集操作の間、一貫して０％より高い濃度に維持されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
収集操作がホモジナイズ工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ｄＯ２がホモジナイズ前に約３０％〜約７５％に維持されている、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ｄＯ２がホモジナイズの前に７５％より高い濃度に維持されている、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ｄＯ２がホモジナイズ後に約５０％に維持されている、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項８】
前記ｄＯ２がホモジナイズ後に５０％より高い濃度に維持されている、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項９】
前記ｄＯ２が１．５時間以上の間維持される、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｄＯ２が２時間以上の間維持される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｄＯ２がオーバーレイエアーもしくはスパージドエアー、背圧の上昇、又は撹拌速度で維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
オーバーレイエアーが約０．４ｖｖｍから約０．８ｖｖｍである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
オーバーレイエアーのターゲットが０．６ｖｖｍである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
背圧の上昇が約１．０〜３０ｐｓｉである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
背圧の上昇のターゲットが１９ｐｓｉである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
撹拌速度が約６ワット／リットルから約８ワット／リットルである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
撹拌速度のターゲットが約６ワット／リットルである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
組換えタンパク質の製造方法であって、（ａ）前記組換えタンパク質をコードする核酸で形質転換された、ｍｅｎＥ遺伝子を欠損した原核宿主細胞を発酵させること、（ｂ）前記組換えタンパク質を収集すること、（ｃ）前記組換えタンパク質をＦＢＳへと精製することとを含み、前記濾過バルクが、３１０ｎｍでのイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）アッセイにより測定して、検出可能な１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸（ＤＨＮＡ）−リコンビナントタンパク質付加体を含まない、組換えタンパク質の製造方法。
【請求項１９】
組換えタンパク質の収率が、対照原核宿主細胞使用時の収率と比較して約２０％以上増、約３０％以上増、約４０％以上増、約５０％以上増、約６０％以上増である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
発酵がスケール非依存的である、請求項１〜１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記組換えタンパク質が組換えポリペプチド又は単離された抗体である、請求項１又は１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記原核宿主細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクター属、アゾトバクター属、エルウィニア属、バシラス属、シュードモナス属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、セラチア属、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ属、及びパラコッカス属である、請求項１又は１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願とのクロスリファレンス
本出願は、出典明示によりその全体が本明細書に援用される２０１２年３月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／６１６２９７号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、原核宿主細胞での組換えタンパク質の改良された培養方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
大規模で経済的なタンパク質の精製が、実現可能なバイオテクノロジー産物に求められている。通常、タンパク質は、そのタンパク質の遺伝子を含む組換えプラスミドの挿入によって対象のタンパク質を産生するように操作された哺乳動物又は細菌の細胞株のいずれかを使用して、細胞培養によって作製される。使用する細胞株は生物であるから、塩分、糖分、アミノ酸、ビタミン、微量元素及びペプトンの混合体を通常含有する複合成長培地を供給しなければならない。細胞に与えた化合物の混合体及び細胞自身の副産物から所望のタンパク質を、ヒトの治療として使用するのに十分な純度にまで分離することは、難しい課題である。
【０００４】
治療用組換えタンパク質は、例えばマウス骨髄腫(ＮＳ０)細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞 (Anderson, D. C 及び Krummen, L. (2002) Curr. Opin. Biotech. 13: 117-123；Chu, L. 及び Robinson, D. K. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:180-187)等の哺乳動物宿主細胞、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の細菌宿主細胞を含む幾つかの宿主細胞株で通常製造される。生産性及び細胞によって産生されるタンパク質の特性の観点から、各細胞株にはそれぞれメリットとデメリットがある。大腸菌は、生物活性のために複雑なグリコシル化を必要としない治療用タンパク質の大量生産に最も広く利用されている。大腸菌により発現された異種タンパク質は、可溶性生成物又は不溶性凝集体を蓄積する。タンパク質を単離するために、通常、細胞にペリプラズム収集のための処理を施すか、又は細胞を溶解し、そうでなければ得られない細胞内産物を放出させてもよい。発酵技術及び細胞培養技術の進歩により、標的組換えタンパク質の力価が大幅に増加した。 
【０００５】
選択可能な商業生産細胞株の多くは、高い生産性の必要性と所与の産物に要求される産物の品質特性を提供する能力とのバランスが取れている。ｃＧＭＰに準拠した発酵手順で、品質は、安全性、産物同一性、品質及び純度の点で規制当局の要件を満たすことを確実にする工程全体に組み込まれている。しかしながら、所与の産物がその仕様を満たしていないという問題が時折発生する。課題は、問題を特定し取出し、次いで工程制御が確立されたパラメータの範囲内で維持されるように問題を軽減し、プロセスが一貫して産物仕様を満たす産物を確実に作製することができるようにする強固なプロセスを開発することである。仕様に適合しない産物の発生を減らすか、なくすことが当該技術分野において求められている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は組換えタンパク質の製造方法であり、（ａ）前記組換えタンパク質をコードする核酸で形質転換された原核宿主細胞を発酵させること、（ｂ）前記組換えタンパク質を溶存酸素（ｄＯ２）濃度が０％より高い条件下で収集すること、及び（ｃ）前記組換えタンパク質を保存用濾過バルク（ＦＢＳ）へ精製することとを含み、前記濾過バルクは、３１０ｎｍでのイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）アッセイによって測定して、検出可能な１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸（ＤＨＮＡ）−リコンビナントタンパク質付加体を含まない、組換えタンパク質の製造方法を企図している。一実施態様では、上述の方法において、分析的アッセイはＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＨＩＣ−ＨＰＬＣ、ＮＭＲ、質量分析法、又はＵＶ分光法によるものである。
【０００７】
本発明は組換えタンパク質の製造方法であり、（ａ）前記組換えタンパク質をコードする核酸で形質転換された原核宿主細胞を発酵させること、（ｂ）前記組換えタンパク質をｄＯ２濃度が０％より高い条件下で収集すること、及び（ｃ）前記組換えタンパク質をＦＢＳへ精製することとを含み、前記濾過バルクは、３１０ｎｍでのＩＥＣアッセイによって測定して、検出可能なＤＨＮＡ−リコンビナントタンパク質付加体を含まず、前記リコンビナントタンパク質は組換えポリペプチド又は単離された抗体である、組換えタンパク質の製造方法を企図している。
【０００８】
本発明は組換えタンパク質の製造方法であり、（ａ）前記組換えタンパク質をコードする核酸で形質転換された原核宿主細胞を発酵させること、（ｂ）前記組換えタンパク質をｄＯ２濃度が０％より高い条件下で収集すること、及び（ｃ）前記組換えタンパク質をＦＢＳへ精製することとを含み、前記濾過バルクは、３１０ｎｍでのＩＥＣアッセイによって測定して、検出可能なＤＨＮＡ−リコンビナントタンパク質付加体を含まず、発酵はスケール非依存的である、組換えタンパク質の製造方法を企図している。
【０００９】
本発明は組換えタンパク質の製造方法であり、（ａ）前記組換えタンパク質をコードする核酸で形質転換された原核宿主細胞を発酵させること、（ｂ）前記組換えタンパク質をｄＯ２濃度が０％より高い条件下で収集すること、及び（ｃ）前記組換えタンパク質をＦＢＳへ精製することとを含み、前記濾過バルクは、３１０ｎｍでのＩＥＣアッセイによって測定して、検出可能なＤＨＮＡ−リコンビナントタンパク質付加体を含まず、前記原核宿主細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクター属、アゾトバクター属、エルウィニア属、バシラス属、シュードモナス属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、セラチア属、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ属、パラコッカス属である、組換えタンパク質の製造方法を企図している。
【００１０】
本発明は組換えタンパク質の製造方法であり、（ａ）前記組換えタンパク質をコードする核酸で形質転換された原核宿主細胞を発酵させること、（ｂ）前記組換えタンパク質をｄＯ２濃度が０％より高い条件下で収集すること、及び（ｃ）前記組換えタンパク質をＦＢＳへ精製することとを含み、前記濾過バルクは、３１０ｎｍでのＩＥＣアッセイによって測定して、検出可能なＤＨＮＡ−リコンビナントタンパク質付加体を含まず、前記ｄＯ２は工程（ｂ）の収集操作中一貫して０％より高い濃度を維持している、組換えタンパク質の製造方法を企図している。上述の方法における一実施態様では、収集操作がホモジナイズ工程を含む。別の実施態様では、ｄＯ２はホモジナイズの前に約３０％〜約７５％に維持される。さらに別の実施態様では、ｄＯ２はホモジナイズ前に７５％を上回る濃度に維持される。さらに別の実施態様では、ｄＯ２はホモジナイズ後に約５０％に維持される。別の実施態様では、ｄＯ２はホモジナイズ後に５０％を上回る濃度に維持される。一実施態様では、ｄＯ２は１．５時間以上の時間維持される。さらに別の実施態様では、ｄＯ２は２時間以上の時間維持される。
【００１１】
本発明は組換えタンパク質の製造方法であり、（ａ）前記組換えタンパク質をコードする核酸で形質転換された原核宿主細胞を発酵させること、（ｂ）前記組換えタンパク質をｄＯ２濃度が０％より高い条件下で収集すること、及び（ｃ）前記組換えタンパク質をＦＢＳへ精製することとを含み、前記濾過バルクは、３１０ｎｍでのＩＥＣアッセイによって測定して、検出可能なＤＨＮＡ−リコンビナントタンパク質付加体を含まず、ｄＯ２はオーバーレイもしくはスパージドエアー、背圧の上昇、又は撹拌（すなわち、かき混ぜること）で維持される、組換えタンパク質の製造方法を企図している。一実施態様で、オーバーレイエアーは約０．４ｖｖｍから約０．８ｖｖｍである。別の実施態様では、オーバーレイエアーのターゲットは０．６ｖｖｍである。別の実施態様では、背圧の上昇は約１．０から３０ｐｓｉである。一実施態様では、背圧の上昇のターゲットは１９ｐｓｉである。さらに別の実施態様では、撹拌速度は約６ワット／リットルから８ワット／リットルである。さらに別の実施態様では、撹拌速度は少なくとも６ワット／リットルである。別の実施態様では、撹拌速度のターゲットは６ワット／リットルである。
【００１２】
本発明の別の態様では、組換えタンパク質の製造方法であって、（ａ）前記組換えタンパク質をコードする核酸で形質転換されている、ｍｅｎＥ遺伝子を欠損した原核宿主細胞を発酵させること、（ｂ）前記組換えタンパク質を収集すること、及び（ｃ）前記組換えタンパク質をＦＢＳへ精製することとを含み、前記濾過バルクは、３１０ｎｍでのＩＥＣアッセイによって測定して、検出可能なＤＨＮＡ−リコンビナントタンパク質付加体を含まない、組換えタンパク質の製造方法が企図されている。上記の方法に加えた更なる態様として、組換えタンパク質の収率は、対照原核宿主細胞使用時の収率と比較して約２０％以上増、約３０％以上増、約４０％以上増、約５０％以上増、約６０％以上増である。
【００１３】
本発明の別の態様では、組換えタンパク質の製造方法であって、（ａ）前記組換えタンパク質をコードする核酸で形質転換されている、ｍｅｎＥ遺伝子を欠損した原核宿主細胞を発酵させること、（ｂ）前記組換えタンパク質を収集すること、及び（ｃ）前記組換えタンパク質をＦＢＳへ精製することとを含み、前記濾過バルクは、３１０ｎｍでのＩＥＣアッセイによって測定して、検出可能なＤＨＮＡ−リコンビナントタンパク質付加体を含まない、組換えタンパク質の製造方法が企図されており、ここで、組換えタンパク質の収率は、対照原核宿主細胞使用時の収率と比較して約２０％以上増、約３０％以上増、約４０％以上増、約５０％以上増、約６０％以上増であり、発酵はスケール非依存的である。
【００１４】
本発明の別の態様では、組換えタンパク質の製造方法であって、（ａ）前記組換えタンパク質をコードする核酸で形質転換されている、ｍｅｎＥ遺伝子を欠損した原核宿主細胞を発酵させること、（ｂ）前記組換えタンパク質を収集すること、及び（ｃ）前記組換えタンパク質をＦＢＳへ精製することとを含み、前記濾過バルクは、３１０ｎｍでのＩＥＣアッセイによって測定して、検出可能なＤＨＮＡ−リコンビナントタンパク質付加体を含まない、組換えタンパク質の製造方法が企図されており、ここで、組換えタンパク質の収率は、対照原核宿主細胞使用時の収率と比較して約２０％以上増、約３０％以上増、約４０％以上増、約５０％以上増、約６０％以上増であり、前記組換えタンパク質は組換えポリペプチド又は単離された抗体である。
【００１５】
本発明の別の態様では、組換えタンパク質の製造方法であって、（ａ）前記組換えタンパク質をコードする核酸で形質転換されている、ｍｅｎＥ遺伝子を欠損した原核宿主細胞を発酵させること、（ｂ）前記組換えタンパク質を収集すること、及び（ｃ）前記組換えタンパク質をＦＢＳへ精製することとを含み、前記濾過バルクは、３１０ｎｍでのＩＥＣアッセイによって検出可能なＤＨＮＡ−リコンビナントタンパク質付加体を含まない、組換えタンパク質の製造方法が企図されており、ここで、組換えタンパク質の収率は、対照原核宿主細胞使用時の収率と比較して約２０％以上増、約３０％以上増、約４０％以上増、約５０％以上増、約６０％以上増であり、前記原核宿主細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクター属、アゾトバクター属、エルウィニア属、バシラス属、シュードモナス属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、セラチア属、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ属、パラコッカス属である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】３回の産物製造実験のＣＯＣアッセイ結果を示す。実験２と実験３ではＣＯＣアッセイで期待された結果が出なかった。ＰＷ＝精製水、Ｃ＝展開対照実験、１＝実験１、２＝実験２、３＝実験３
【図２Ａ】実験１〜３の紫外・可視スペクトル（１０ｃｍ）を示す。実験１〜３は近紫外線域を示している。実験１では顕著ではないが、新しい吸光ピークが３２０ｎｍ周辺及び４６０ｎｍに生じている。
【図２Ｂ】実験３から実験１を差し引いた紫外・可視スペクトルを示す。ここで、実験２と３の吸光ピークの差は、実験１より目立たない。
【図３】実験１〜３の３１０ｎｍでモニターしたＩＥＣアッセイの結果を示す。実験２と３で、メインピークの後ろにわずかなショルダーピークが観察される一方、実験１のプロファイルは、参照物質と同等である。
【図４】２８０ｎｍ及び３１０ｎｍでモニターされた元の状態の実験１〜３の二次元ＬＣ−ＭＳの結果を示す。期待される質量が実験１から観察された一方、期待される質量に加え、約１５０ダルトンにさらなる質量が実験２と３で観察された。
【図５】褐色付加体の回収された断片の二次元ＬＣ−ＭＳ及びＭＳ検出器を用いたトリプシンペプチドマップによる質量同定の結果を示す。ＩＥＣアッセイの小さなピークが回収された。二次元ＬＣ−ＭＳ分析から、期待された質量に加え、１５６ダルトンの質量増加が、分割されたショルダーピークで観察された。
【図６】４８．８分、３１０ｎｍで観察された新しい褐色付加体のピークのＬＣ−ＭＳ−ＭＳ分析の結果、＋１５４．００６ダルトンの修飾されたＣｙｓ１８２を持つＴ２０ペプチドであると判定されたことを示す。（システイン、＋１５４．００６ダルトンで）修飾された遊離のＴ６及びＴ１６ペプチドも、質量抽出によって検出された。
【図７】産物の１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣデータと合成ペプチド（ＮＨ２−ＩＶＱＣＲ−ＣＯＯＨ）を比較し、産物サンプルにおいてＣｙｓ−ＮＨ相関がなくなっているのを示す。
【図８】システインのＣＨとアルギニンのＮＨの間に観察された強いｎＯｅによって確認された推定構造を示す。
【図９】回収されたＮＭＲデータに基づいて、褐色付加体の推定構造を示す。
【図１０】原核細胞の、メナキノンを生成する生合成経路を示す。
【図１１】３１０ｎｍでイオン交換クロマトグラフィーにより褐色付加体形成を試験された濾過バルク組換え産物の典型を示す。測定可能な付加体形成は見られなかった。
【図１２】収集操作前後に実施されるＨｉ−ｄＯ工程改善の概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
Ｉ．定義 
別段の定めがない限り、本明細書で使用される下記の用語及び語句は、下記の意味を有するものとする。
【００１８】
用語「撹拌速度」とは、培養ブロス又はホモジネートの混合であり、通常は１分当たりの回転数（ｒｐｍ）として測定される。一実施態様では、撹拌速度は、「単位体積当たりの撹拌動力」によって測定することができる。例えば、１０００リットルの発酵槽中で２００ｒｐｍで、攪拌速度は約６ワット／リットルの値を有する。
【００１９】
用語「抗体」とは、本明細書で最も広い意味で用いられ、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及び、所望の生物活性を示す限り、抗体断片を含む。抗体は、マウス、ヒト、ヒト化、キメラ、又は他の種に由来するものである。本明細書で使用される用語「抗体」は、完全長免疫グロブリン分子又は完全長免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、標的抗原又はその一部に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子）をも指し、そのような標的は、限定されないが、癌細胞又は自己免疫疾患に関連する自己免疫抗体を産生する細胞を含む。本明細書に開示される免疫グロブリンは、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＡ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスのものであってもよい。免疫グロブリンは任意の種に由来することができる。しかしながら一態様では、免疫グロブリンは、ヒト、マウス、又はウサギ由来のものである。
【００２０】
「抗体断片」とは、完全長抗体の一部分、一般に完全長抗体の抗原結合領域又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディー；線形抗体；Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生される断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、癌細胞抗原、ウイルス抗原又は微生物抗原に免疫特異的に結合する上記のいずれかのＣＤＲ（相補性決定領域）、ＥＣＤ（細胞外ドメイン）、及びエピトープ結合断片、単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
【００２１】
「Ｃｌａｒｉｔｙ，Ｏｐａｌｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｏｌｏｒａｔｉｏｎ（ＣＯＣ）アッセイ」とは、底が平らで内径１５〜２５ｍｍの無色透明な中性ガラス製の同一の試験管を使用し、後述の通りに新しく調製された参照懸濁液と試験する液体を比較することと定義され、層の深さは４０ｍｍである。米国薬局方２０１２(USP Monograph 631, Color and Achromicity)、又はヨーロッパ薬局方５．０（EP Method 2.2.2, Degree of Coloration of Liquids)に挙げられている標準色溶液を、適切な色の割り当てを確認するために使用することができる。
【００２２】
用語「１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸（ＤＨＮＡ）」とは、大腸菌細胞由来の化学産物である。Okada Y, Tsuzuki Y, Miyazaki J, Matsuzaki K, Hokari R, Komoto S等 (2006) Gut 55: 681ー8。ＤＨＮＡは、大腸菌細胞のメナキノン（ＭＫ）（ビタミンＫ２とも言う）生合成経路の中間体である。Neidhardt, F.C. (2010) Escherichia coli and Salmonella (ウェブ版: Module 3.2.2 pgs. 36-37)；Inledew, W.J. & R.K. Poole (1984) The respiratory chains of Escherichia coli. Microbiological reviews. 48: 222-271；Nowicka, B. & J. Cruk (2010) Occurrence, Biosynthesis and Function of Isoprenoid Quinones. Biochimica et Biophysica Acta 1797: 1587-1605。
【００２３】
用語「溶存酸素（ｄＯ２）」とは、所与の培地中に溶解又は運搬される酸素量の相対的な尺度である。液体培地中の酸素センサー等の溶存酸素プローブを用いて測定することができる。
【００２４】
本明細書で使用される用語「発酵（する）」又は「発酵させること」とは、目的の組換えタンパク質の産生を誘導するために形質転換された原核生物宿主細胞を培養する工程を指す。
【００２５】
用語「濾過バルク」又は「濾過バルク物質（ＦＢＳ）」は、収集及び精製後の、目的の組換えタンパク質産物を指し、このタンパク質は宿主細胞から放出され、任意の細胞残屑を除去するために遠心分離機にかけられ、更に／又は濾過され、適切なクロマトグラフィーカラム上で精製され、続いて濾過法により濃縮されている。
【００２６】
用語「収集された細胞培養液」とは、ＨＣＣＦとも表され、遠心分離又は濾過などの手段によって細胞が除去されている原核生物細胞培養液又は真核生物細胞培養液を意味する。細胞培養は、原核生物細胞又は真核細胞が制御された条件下で増殖されるプロセスである。用語「細胞培養」とは、動物細胞、又は細菌や酵母などの単細胞原核生物を含む多細胞真核生物由来の細胞の培養を指す。真核生物細胞培養物としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞などの哺乳類細胞、ハイブリドーマ、及び昆虫細胞が挙げられる。適切な細胞培養容器を用いて、分泌されたタンパク質は、足場依存性細胞又は懸濁細胞株から得ることができる。哺乳動物細胞培養物としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はＮＳＯ細胞が挙げられる。
【００２７】
用語「収集操作」又は「収集（すること）」とは、限定されないが、目的の組換えタンパク質の単離及び精製を開始するために、目的の前記組換えタンパク質を産生するように形質転換された発酵した原核宿主細胞培養物を溶解又はホモジナイズし、次いで遠心分離機にかけ、更に／又は濾過することを含むプロセスを指す。
【００２８】
本明細書で使用される用語「Ｈｉ−ｄＯ」とは、収集操作中に溶存酸素濃度が０％より大きくなるように維持する、本明細書記載の改善された工程を指す。これを達成するために、本発明は、ｄＯ２濃度を設定値又はそれ以上、すなわち０％を超える、又は約３０％から約７５％、又は７５％超、又は約５０％、又は５０％超に維持するために使用可能なオーバレイエアーと、背圧と撹拌速度の組み合わせを企図する。別の実施態様では、０％を超える溶存酸素濃度のＨｉ−ｄＯを達成するために空気又は純酸素をブロス中へ直接スパージ（拡散）させることも、当業者であれば可能である。
【００２９】
本明細書で使用される用語「ホモジナイズ」とは、目的の組換えタンパク質を宿主細胞から放出させるための、前記タンパク質で形質転換された原核生物宿主細胞の溶解又は機械的な細胞溶解工程を指す。
【００３０】
用語「背圧の上昇」は、培養ブロスを介して酸素移動速度を上げるために用いられる。背圧は通常、ｐｓｉ又はバールのいずれかで測定される。
【００３１】
「メナキノン（ＭＫ）」とは、ビタミンＫ２の同族体であり、微好気的及び／又は嫌気的条件下で膜結合タンパク質複合体間の呼吸鎖におけるエレクトロンシャトル分子として機能する。用語「ｍｅｎＥ」とは、メナキノンを生成する生合成経路における遺伝子である。
【００３２】
用語「微生物発酵」とは、タンパク質及び小分子（例えば二次代謝産物）を産生するように遺伝子操作された細菌又は酵母の細胞培養を意味する。発酵は、組換え細菌及び酵母、並びに他の微生物を繁殖させ、有用なタンパク質を製造するために用いられる。細胞の生産性、及びこれら生物の増殖は、特定の増殖培地を供給し、様々な環境要因（例えば、ｐＨ、温度、曝気）を制御することによって最大化される。細菌発酵液は、大腸菌培養液由来であってもよい。 
【００３３】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、通常少量存在し得る自然発生的な変異体を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対している。更に、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加え、モノクローナル抗体は他の抗体によって汚染されることなく合成され得る点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で作製しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohler 等 (1975) Nature 256:495によって最初に説明されたハイブリドーマ法、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号）によって作製され得る。「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson 等, Nature, 352:624-628 (1991)及びMarks 等, (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597に記載されている技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。
【００３４】
用語「オーバーレイエアー」とは、培養ブロスを容れる発酵槽の上部から吹き込まれる空気を指す。通常、微細気泡の分散を生じさせるためにしばしば激しい攪拌を伴って、液体培地に空気をバブリングさせることにより酸素が発酵槽に供給される。
【００３５】
本発明において使用される用語「原核宿主細胞」とは、メナキノン生合成経路を利用するものを包含する。一実施態様では、原核生物宿主細胞は、例えば、古細菌、及びグラム陰性菌又はグラム陽性菌などの真正細菌を包含する。有用な細菌の例には、エシェリキア属（例えば、大腸菌）、桿菌（例えば、枯草菌）、腸内細菌、シュードモナス種（例えば、緑膿菌）、サルモネラ菌、霊菌、クレブシエラ菌、プロテウス属、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ属、又はパラコッカス属が挙げられる。一実施態様では、グラム陰性細胞が使用される。別の実施態様では、本発明のための宿主として大腸菌細胞（Bachmann, Cellular and Molecular Biology, 第2巻 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219；ＡＴＣＣ寄託番号 ２７，３２５) ）、及び遺伝子型Ｗ３１１０ △ｆｈｕＡ（△ｔｏｎＡ）ｐｔｒ３ ｌａｃｌｑ ｌａｃＬ８ △ｏｍｐＴ △（ｎｍｐＣ−ｆｅｐＥ）ｄｅｇＰ４１ｋａｎＲ（米国特許第５６３９６３５号）を有する菌株３３Ｄ３を含む、その誘導体が使用される。無論、例えば大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）、大腸菌Ｂ、大腸菌λ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）及び大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ３１６０８）のような他の菌株、並びにその誘導体も好適である。これらの例は限定ではなく例示である。定義された遺伝子型を有する上記記載の任意の細菌の誘導体の作製方法は当技術分野で知られており、例えば、Bass等(1990) Proteins, 8: 309-314に記載されている。無論、細菌の細胞内レプリコンの複製能を考慮して適切な細菌を選択することが必要である。ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７又はｐＫＮ４１０等のよく知られたプラスミドを用いてレプリコンを供給する場合には、例えば、大腸菌、セラチア又はサルモネラ種を宿主として使用するのが好適である。 
【００３６】
本明細書中で使用される「組換えタンパク質」とは通常、ペプチド、及び抗体を含むタンパク質を指す。そのような組換えタンパク質は「異種」、すなわち、大腸菌によって産生されるヒトタンパク質のような、利用される宿主細胞にとって外来である。ポリペプチドは不溶性凝集物、又は可溶性ポリペプチドとして細胞膜周辺腔又は細胞質内に産生され得る。
【００３７】
用語「スケール非依存的」は、本発明の発酵プロセスの容積容量が、例えば、約１リットル以上から、又は約１０リットル以上から、又は約１００リットル以上から、又は約５００リットル以上から、又は約１，０００リットル以上から、又は約１０，０００リットル以上から、又は約１００，０００リットル以上からなど、任意のスケールを使用して達成することができることを意味する。
【００３８】
ＩＩ．本発明の実施方法
本発明は原核細胞系における組換えタンパク質の改良された作製方法に関する。本発明は、組換えタンパク質の製造中に発見される、産物の一部のロットが仕様を満たしていないことの原因になる褐色付加体の形成を防ぐことに基づいている。本明細書で提供する実施例に示すように、褐色の付加体の問題は、収集操作中の不定の酸化還元電位に起因していた。驚くべきことに、収集作業中に溶存酸素環境をゼロより高く維持することにより、又は代替的には、目的の組換えタンパク質の組換え作製で使用する原核宿主細胞ゲノムのｍｅｎＥ遺伝子を遺伝子学的に欠損させることにより、褐色の付加体の形成を防ぐことができるということが発見されている。
【００３９】
原核細胞における組換えタンパク質の組換え作製
上記プロセスの最初の工程では、目的の組換えタンパク質を作製するために使用される異種核酸（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）が、細菌内での発現のために好適な細菌用プロモーターの制御下で、複製可能なベクター内に適切に挿入される。多くのベクターがこの目的のために利用可能であり、適切なベクターの選択は、挿入されるべき核酸の大きさと、ベクターで形質転換されるべき特定の宿主細胞に主に依存する。各ベクターは、その機能（ＤＮＡの増幅又はＤＮＡの発現）及び自身と適合性のある特定の宿主細胞に依存する様々な構成要素を含んでいる。細菌形質転換用ベクターの構成要素は、異種ポリペプチドのためのシグナル配列を含んでもよく、シグナル配列を含むであろうし、また、異種ポリペプチドのための誘導性プロモーターも含むであろう。細菌形質転換用ベクターの構成要素はまた、通常、本明細書に記載の複製起点及び一つ以上のマーカー遺伝子も含む。
【００４０】
異種ポリペプチドが分泌される場合、本明細書中の目的の異種ポリペプチドをコードするＤＮＡは、成熟異種ポリペプチドのＮ末端にあるもののようなシグナル配列を含む。通常、シグナル配列はベクターの構成要素であるか、ベクターに挿入される異種ポリペプチドＤＮＡの一部であってもよい。選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され加工される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）配列のはずである。天然の異種ポリペプチドシグナル配列を認識及び加工しない細菌宿主細胞に関しては、シグナル配列は、任意の一般に知られている細菌シグナル配列により置換される。
【００４１】
発現ベクターは、一つ以上の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は様々な細菌に対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製開始点は殆どのグラム陰性細菌に好適である。
【００４２】
発現ベクターはまた通常、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。この遺伝子は、選択培地で増殖する形質転換された宿主細胞の生存又は増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されない宿主細胞は培地中で生存しないであろう。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質又は他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を与えるか、（ｂ）栄養要求性欠損を補うか、または（ｃ）複合培地からは得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする（例えば、バチラス菌にとってのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。選択方法の一例では、宿主細胞の増殖を抑制する薬物が用いられる。異種遺伝子で首尾よく形質転換されたこれらの細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を産生し、したがって選択レジメンを生き延びる。
【００４３】
異種ポリペプチドを産生するための発現ベクターは、宿主の細菌生物によって認識され、目的の異種ポリペプチドをコードする核酸に作用可能に連結した誘導性プロモーターをまた含む。異種ポリペプチドを産生するための発現ベクターはまた、溶菌酵素をコードする核酸に作用可能に連結した、別の誘導性又は低基底発現のプロモーターも含む。細菌宿主での使用に適した誘導性プロモーターは、β-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系（Chang等, Nature, 275: 615 (1978)；Goeddel 等, Nature, 281: 544 (1979))、ａｒａＢＡＤプロモーターを含むアラビノースプロモーター系 (Guzman等, J. Bacteriol., 174: 7716-7728 (1992)；Guzman 等, J. Bacteriol., 177: 4121-4130 (1995)；Siegele 及び Hu, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 8168-8172 (1997))、ラムノースプロモーター(Haldimann 等, J. Bacteriol., 180: 1277-1286 (1998))、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系(Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980) 、及び欧州特許出願公開第３６７７６号）、Ｐ．ｓｕｂ．ＬｔｅｔＯ−１及びＰ．ｓｕｂ．ｌａｃ／ａｒｅ−１プロモーター(Lutz及びBujard, Nucleic Acids Res., 25: 1203-1210 (1997))、及びｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーター(deBoer 等, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983))が挙げられる。しかし、他の既知の細菌誘導性プロモーター及び低基底発現プロモーターも好適である。これらのヌクレオチド配列は公表されており、それによって当業者は、リンカー又はアダプターを用いてそれらを目的の異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は溶菌酵素をコードする核酸に作用可能に結合させ、必要な制限部位を供給することができる。ｔｒｐプロモーターのように強力かつ高度な漏出性プロモーターが使用される場合、通常、異種ポリペプチドをコードする核酸の発現のためだけに用いられ、溶菌酵素をコードする核酸の発現のためには用いられない。ｔａｃ及びＰＬプロモーターは（異種ポリペプチドと溶菌酵素）両方（をそれぞれコードする核酸の発現）のためではなく、どちらか（をコードする核酸の発現）のために用いることができる。一実施態様では、アルカリホスファターゼ（ｐｈｏＡ）プロモーターは産物（をコードする核酸の発現）のために、また、アラビノース（ａｒａ）プロモーターは溶菌酵素（をコードする核酸の発現）のために用られる。
【００４４】
細菌系で使用するプロモーターは通常、目的の異種ポリペプチドをコードするＤＮＡに作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ（ＳＤ）配列も有する。プロモーターは、制限酵素消化によって細菌源ＤＮＡから取り除き、所望のＤＮＡを含有するベクターに挿入することができる。ｐｈｏＡプロモーターは、制限酵素消化によって細菌源ＤＮＡから取り除き、所望のＤＮＡを含有するベクターに挿入することができる。
【００４５】
上に列挙した成分の一つ以上を含む好適なベクターの構築には、当業者に一般的に知られている標準的なライゲーション技術を用いる。単離されたプラスミド又はＤＮＡ断片は、必要なプラスミドを作製するために望ましい形態に切断、調整、再結合される。
【００４６】
請求項に係る発明のための好適な原核生物宿主細胞には、本明細書に定義されているメナキノン生合成経路を利用している任意のものが含まれる。いくつかの非限定的な例としては、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクター属、アゾトバクター属、エルウィニア属、バシラス属、シュードモナス属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、セラチア属、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ属、パラコッカス属が含まれる。
【００４７】
形質転換とは、ＤＮＡが染色体外要素として又は染色体組み込みによって複製可能であるように、ＤＮＡを原核生物宿主に導入することを意味する。形質転換は、使用する宿主細胞に依存し、その細胞に適した標準技術を用いて行われる。塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は通常、強固な細胞壁を含む細菌細胞のために用いられる。形質転換のための他の方法では、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。使用される更に別の方法はエレクトロポレーションである。
【００４８】
本発明のポリペプチドを産生するために使用する原核細胞は、当該技術分野で知られていて、選択した宿主細胞の培養に適した培地中で増殖させる。適切な培地の例には、必要な栄養サプリメントを加えたルリア−ベルターニ（ＬＢ）ブロスが含まれる。特定の実施態様では、培地は、発現ベクターを含む原核生物細胞の増殖を選択的に可能にするために、発現ベクターの構造に基づいて選ばれた選択剤も含む。例えば、アンピシリンがアンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖用培地に加えられる。炭素、窒素及び無機リン酸源の他に、適切な濃度で任意の必要なサプリメントを、単独で、又は複合窒素源のような他のサプリメントもしくは培地との混合物として含ませてもよい。
【００４９】
発現された遺伝子産物の蓄積のために、宿主細胞は、遺伝子産物の蓄積のために十分な条件下で培養される。そのような条件には、細胞によるタンパク質の発現及び蓄積を可能にする、例えば、温度、栄養素、及び細胞密度条件が含まれる。更に、そのような条件は、当業者に知られているように、細胞が、転写、翻訳、及び分泌タンパク質の場合の一つの細胞区画から別の細胞区画への移動といった基本的な細胞機能を果たすことが可能な条件である。
【００５０】
原核宿主細胞は、適切な温度で培養される。例えば、大腸菌の増殖において標準的な温度は約２０℃から約３９℃の範囲である。一実施態様では、この温度は約２５℃から約３７℃である。別の実施態様では、この温度は約３０℃である。
【００５１】
培地のｐＨは、主に宿主生物に依存しており、約５〜９の任意のｐＨである。大腸菌に関しては、ｐＨは約６．８から約７．４、又は約７．０である。
【００５２】
誘導に関しては、通常、細胞は、一定の光学密度、例えば約８０〜１００のＡ５５０が達成されるまで培養され、その時点で誘導が（誘導物質の添加や、リプレッサー、サプレッサー又は培地成分等の枯渇などによって）開始されて、異種ポリペプチドをコードする遺伝子の発現が誘導される。
【００５３】
産物の蓄積後、場合によっては、その回収前に、ブロス溶解物を細胞に含まれる異種ポリペプチドを放出するのに十分な長さの時間インキュベートされる。代替実施態様では、又は前述の実施態様の後に、前記タンパク質を宿主細胞から放出するため、例えば化学的溶解や浸透圧ショックなど、当技術分野で知られている任意の機械的手段を使用して、培養物中に存在する細胞を機械的に溶解することができる。
【００５４】
一旦溶解されると、溶解物又はホモジネートは保持タンクへ移され、そこで、溶解物／ホモジネートのさらなるバッチの添加が待たれ得、及び／又はその後の回収工程に備え、例えば水での希釈、緩衝液もしくは凝集剤の添加、ｐＨ調整、又は溶解物／ホモジネートの温度の変更もしくは維持などの更なる処理がなされ得る。
【００５５】
次の工程では、異種ポリペプチドが、細胞マトリックスから放出された可溶性又は不溶性産物として、細胞細片と共回収されるのを最小限にするような方法で、溶解物又はホモジネートから回収される。回収は任意の手段によって行い得るが、一実施態様では、異種ポリペプチドを含む屈折粒子の沈降、又は可溶性産物を含む上清の回収を含む。沈降の例は遠心分離である。この場合、回収は膨張床吸着（ＥＢＡ）又は沈降の前に、外側の細胞壁を破壊して透過性を向上させ、より多くの固体の回収を可能にする薬剤の存在下で実施する。このような薬剤の例としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤、又は、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３１６（商標）など例えば両性イオン洗浄剤のような双性イオンを含む。一実施態様では、回収はＥＤＴＡの存在下で実施される。
【００５６】
回収のために遠心分離を利用する場合、相対遠心力（ＲＣＦ）が重要な因子である。ＲＣＦは、溶解時に細胞壁から放出された屈折性粒子と細胞細片の共沈降を最小化するように調整される。この目的のために用いられる特定のＲＣＦは、例えば回収する産物の種類によって異なるが、少なくとも約３０００×ｇであり、より好ましくは約３５００から６０００×ｇ、又は約４０００から６０００×ｇである。
【００５７】
遠心分離時間は、いくつかの要因に依存する。沈降速度は、例えば、屈折粒子の大きさ、形状、及び密度、並びに流体の密度及び粘度に依存する。固体の沈降時間は、例えば、沈降距離と速度に依存する。連続ディスクスタック遠心機が、放出された異種ポリペプチド凝集物の回収、又は細胞細片の大規模な除去に良好に作用すると考えるのが合理的であり、それは、該遠心機では、比較的大きな遠心力と比較的短い沈降距離のために高い流体速度で処理できるからである。
【００５８】
最初の回収工程で捕捉される異種ポリペプチドは、次いで、夾雑タンパク質からさらに精製され得る。一実施態様では、米国特許第５２８８９３１号に開示されているように、凝集した異種ポリペプチドは分離され、続いて同時可溶化され、リフォールディングされる。代替的には、可溶性産物は、下記の標準的な技術によって回収される。
【００５９】
一般的なクロマトグラフィー法及びその利用は当業者に周知である。例えば、Chromatography, 5版, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann, E. (編), Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992)；Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (編), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998)；Chromatography Today, Poole, C. F., 及び Poole, S. K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991)；Scopes, Protein Purification Principles and Practice (1982)；Sambrook, J.等 (編), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989;又は Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M.等(編), John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを参照のこと。以下の方法は、ペリプラズム又は細胞質から放出された可溶性異種ポリペプチドの好適な精製手順の例であり、当該技術分野で周知である：免疫親和性又はイオン交換カラムによる分画、エタノール沈降法、逆相ＨＰＬＣ、シリカ又はＤＥＡＥ等のカチオン交換樹脂によるクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫安精製、及び、例えばＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ−７５を用いたゲル濾過。
【００６０】
本発明の一態様では、発酵プロセスにより大量の抗体産生が行われる。様々な大規模流加発酵法が組換えタンパク質の製造に利用可能である。大規模発酵は限度容量が少なくとも１０００リットル、好ましくは約１，０００から１００，０００リットルである。これらの発酵槽は、撹拌翼を使用して、酸素と栄養分、特にグルコース（好ましい炭素／エネルギー源）を分散させる。小規模発酵とは、通常、容積が約２０リットル以下の発酵槽における発酵を指す。
【００６１】
本明細書で論じるように、請求項に係る発明は、例えば、ペプチド、及び抗体を含むタンパク質等の組換えタンパク質作製のために用いることができる。
【００６２】
本発明の方法により作製可能な組換えペプチド及び組換えタンパク質の例としては、限定されないが、レニン、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、成長ホルモン放出因子を含む成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、リポタンパク質、α１−アンチトリプシン、インスリンＡ−鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、トロンボポエチン、卵胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子、及びフォン・ヴィレブランド因子等の凝固因子、プロテインＣ等の抗凝固因子、心房性ナトリウム利尿因子、肺表面活性剤、ウロキナーゼ又はヒト尿又は組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）等のプラスミノーゲン活性化因子、ボンベシン、トロンビン、造血成長因子、腫瘍壊死因子−α及びβ、エンケファリナーゼ、ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン、ミューラー阻害物質、リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、プロリラキシン、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、β−ラクタマーゼ等の微生物タンパク質、ＤＮＡ分解酵素、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ホルモン又は成長因子のレセプター、インテグリン、プロテインＡ又はＤ、リウマチ因子、神経栄養因子、例えば脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５もしくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、もしくはＮＴ−６）、又はＮＧＦ−β等の神経成長因子、カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）等のカルジオトロフィン（心肥大因子）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ等の線維芽細胞成長因子、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＴＧＦ−α、及びＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、又はＴＧＦ−β５を含むＴＧＦ−β等のトランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子−Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）、デス（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質、ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８、及びＣＤ−１９等のＣＤタンパク質、エリスロポエチン、骨誘導因子、免疫毒素、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インターフェロン−α、−β、及び−γ等のインターフェロン、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ等のコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、ＩＬ−１からＩＬ−１３等のインターロイキン （ＩＬ）、抗ＨＥＲ−２抗体、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｔ細胞レセプター、表面膜タンパク質、崩壊促進因子、ＡＩＤＳエンベロープの一部等のウイルス抗原、輸送タンパク質、ホーミングレセプター、アドレシン、調節タンパク質等の分子がある。
【００６３】
請求項に係る発明によって産生される抗体は、特定の抗原決定基（例えば、癌細胞抗原、ウイルス抗原、微生物抗原、タンパク質、ペプチド、炭水化物、化学物質、核酸又はその断片）に対する抗体の均一な集団であるモノクローナル抗体である。目的の標的に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、培養液中の連続細胞株による抗体分子産生のための、当技術分野で知られている任意の技術を用いて調製することができる。これらとしては、限定されないが、もともとはKohler及びMilstein（1975）Nature 256:495-497)に記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor等（1983）Immunology Today 4:72）、及びＥＢＶハイブリドーマ技術(Cole等 (1985) in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)がある。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、及びＩｇＤを含む任意の免疫グロブリンクラス並びにその任意のサブクラスのものであってもよい。本発明において使用するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、インビトロ又はインビボで培養することができる。
【００６４】
有用なモノクローナル抗体としては、限定されないが、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、抗体断片、又はキメラヒト−マウス（又は他の種）モノクローナル抗体を含む。ヒトモノクローナル抗体は、当技術分野で知られている多くの技術によって作製することができる(Teng 等(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:7308-7312；Kozbor等 (1983) Immunology Today 4:72-79；及びOlsson等 (1982) Methods in Enzymology 92:3-16)。
【００６５】
抗体はまた、二重特異性抗体であってもよい。二重特異性抗体は、第一の結合特異性を一方のアームに有するハイブリッドイムノグロブリン重鎖、及び他方のアームのハイブリッドイムノグロブリン重鎖−軽鎖対（第二の結合特異性を与える）を有する。この非対称構造は、二重特異的分子の半分のみにイムノグロブリン軽鎖が存在することが容易な分離方法をもたらすため、不要なイムノグロブリン鎖の組み合わせから所望の二重特異的化合物を分離することを促進している(国際公開第９４／０４６９０号；Suresh 等 (1986) Methods in Enzymology, 121:210；Rodrigues等(1993) J. of Immunology 151:6954-6961；Carter等(1992) Bio/Technology 10:163-167；Carter等(1995) J. of Hematotherapy 4:463-470；Merchant等(1998) Nature Biotechnology 16:677-681）。二重特異性抗体を作製するための方法は当技術分野で知られている(Milstein 等 (1983) Nature 305:537-539；国際公開第 ９３／０８８２９号；Traunecker 等(1991) EMBO J. 10:3655-3659）。こうした技術を使用して、本明細書で定義するような疾病の治療又は予防における抗体ー薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）としてのコンジュゲーションのために、二重特異性抗体を作製することができる。
【００６６】
本抗体は、定義されているように、癌細胞抗原、ウイルス抗原もしくは微生物抗原に免疫特異的に結合する抗体の、或いは腫瘍細胞もしくはマトリックスに結合する他の抗体の機能的に活性な断片、誘導体又はアナログであってよい。これに関して、「機能的に活性な」は、その断片、誘導体又はアナログが、その断片、誘導体又はアナログが由来する抗体が認識したものと同じ抗原を認識する抗抗イディオタイプ抗体を誘発できることを意味する。具体的には、一つの例示的実施態様では、免疫グロブリン分子のイディオタイプの抗原性は、抗原を特異的に認識するＣＤＲ配列のＣ末端（領域）にある、ＣＤＲ配列及びフレームワーク配列を欠失させることによリ増強され得る。どのＣＤＲ配列が抗原に結合するかを決定するために、ＣＤＲ配列を含有する合成ペプチドを、当該技術分野で知られている任意の結合分析法、例えばＢＩＡコアアッセイによる抗原との結合アッセイにおいて使用することができる（Kabat 等 (1991) in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, National Institute of Health, Bethesda, Md.；Kabat等 (1980) J. of Immunology 125(3):961-969)。
【００６７】
他の有用な抗体は、抗体の断片、例えば限定されないが、可変領域、軽鎖定常領域、及び重鎖のＣＨ１ドメインを含み抗体分子のペプシン消化によって生成されうるＦ（ａｂ′）２断片、及びＦ（ａｂ′）２断片のシスルフィド架橋を還元することで得られうるＦａｂ断片などの抗体断片を含む。他の有用な抗体は、抗体の重鎖及び軽鎖二量体もしくはその任意の最小断片、例えばＦｖｓ又は単鎖抗体（ＳＣＡ）（例えば米国特許第４９４６７７８号；Bird (1988) Science 242:423-42；Huston等 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883；及びWard等 (1989) Nature 334:544-54に記載)、又は抗体と同じ特異性を有する任意の他の分子である。
【００６８】
抗体は、抗体の融合タンパク質又は機能的に活性なその断片であり得、例えばここで、抗体はＮ末端又はＣ末端のいずれかで抗体ではない別のタンパク質のアミノ酸配列（又はその一部、例えばタンパク質の少なくとも１０、２０、もしくは５０のアミノ酸部分）への共有結合（例えばペプチド結合）によって融合される。抗体又はその断片は、定常ドメインのＮ末端で他のタンパク質に共有結合され得る。
【００６９】
本明細書中のモノクローナル抗体は特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が、特定の種に由来する抗体又は特定の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属する抗体における対応配列と同一又は相同である一方、該鎖の残部が、別の種に由来する抗体又は別の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属する抗体における対応配列と同一又は相同である「キメラ」抗体、並びに所望の生物学的活性を示す限りはそのような抗体の断片を含む（米国特許第４８１６５６７号、及びMorrison等(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:6851-6855）。キメラ抗体は、例えば、マウスモノクローナルに由来する可変領域と、ヒト免疫グロブリンの定常領域を有するもののように、異なる部分が異なる動物種に由来する分子である（米国特許第４８１６５６７号；第４８１６３９７号）。キメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）由来の可変ドメイン抗原結合配列、及びヒト定常領域配列を含む霊長類化抗体を含む。
【００７０】
キメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、ヒト及び非ヒト部分の両方を含み、標準的な組換えＤＮＡ技術（その内容全体が本明細書において出典明示により援用される、国際公開第８７／０２６７１号；欧州特許出願公開第１８４１８７号；欧州特許出願公開第１７１４９６号；欧州特許出願公開第１７３４９４号；国際公開第８６／０１５３３号；米国特許第４８１６５６７号；欧州特許出願公開第１２０２３号；Berter 等 (1988) Science 240: 1041-1043；Liu 等 (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 3439-3443；Liu 等(1987) J. Immunol. 139: 3521-3526；Sun 等(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 214-218；Nishimura 等 (1987) Cancer. Res. 47: 999-1005；Wood等(1985) Nature 314: 446-449；及び Shaw 等 (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559；Morrison (1985) Science 229: 1202-1207；Oi 等(1986) BioTechniques 4: 214；米国特許第５２２５５３９号；Jones等 (1986) Nature 321:552-525；Verhoeyan 等 (1988) Science 239: 1534；及び Beidler 等 (1988) J. Immunol. 141: 4053-4060）を用いて作製可能である。
【００７１】
本発明の方法によって生産されうる治療用モノクローナル抗体には、限定されないが、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社、Carter等 (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89:4285-4289;米国特許第５７２５８５６号)；抗ＣＤ２０抗体、例えばキメラ抗ＣＤ２０「Ｃ２Ｂ８」（米国特許第５７３６１３７号）；リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））、オクレリツマブ（２Ｈ７抗体のキメラ又はヒト化変異体）（米国特許第５７２１１０８号、国際公開第０４／０５６３１２号）、又はトシツモマブ（ＢＥＸＸＡＲ（登録商標）；抗ＩＬ−８（St John等 (1993) Chest, 103:932, 及び 国際公開第９５／２３８６５号)；他のインターロイキンを標的とする抗体、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３；ヒト化及び／又は親和性成熟抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗ＶＥＧＦ抗体、例えばヒト化抗ＶＥＧＦ抗体ｈｕＡ４．６．１ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社, Kim 等 (1992) Growth Factors 7: 53-64, 国際公開第９６／３００４６号，国際公開第９８／４５３３１号）；抗ＰＳＣＡ抗体（国際公開第０１／４０３０９）号）；Ｓ２Ｃ６及びそのヒト化変異体を含む抗ＣＤ４０抗体（国際公開第００／７５３４８号）；抗ＣＤ１１ａ（米国特許第５６２２７００号；国際公開第９８／２３７６１号；Steppe等 (1991) Transplant Intl. 4:3-7；Hourmant等 (1994) Transplantation 58:377-380)；抗ＩｇＥ (Presta 等 (1993) J. Immunol. 151:2623-2632；国際公開第 ９５／１９１８１号)；抗ＣＤ１８(米国特許第５６２２７００号;国際公開第９７／２６９１２）；Ｅ２５、Ｅ２６及びＥ２７等の抗ＩｇＥ（米国特許第５７１４３３８号及び第５０９１３１３号；国際公開第９３／０４１７３号；米国特許第５７１４３３８号）；抗Ａｐｏ−２レセプター抗体（国際公開第９８／５１７９３号）；例えばｃＡ２（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）、ＣＤＰ５７１及びＭＡＫ−１９５を含む抗ＴＮＦ−α抗体（米国特許第５６７２３４７号；Lorenz 等 (1996) J. Immunol. 156(4): 1646-1653；Dhainaut 等 (1995) Crit. Care Med. 23(9):1461-1469)；抗組織因子（ＴＦ）（欧州特許第０４２０９３７号）；抗ヒトα４β７インテグリン（国際公開第９８／０６２４８号）；抗ＥＧＦＲ、キメラ化又はヒト化２２５抗体（国際公開第９６／４０２１０号）；抗ＣＤ３抗体、例えばＯＫＴ３（米国特許第４５１５８９３号）；抗ＣＤ２５又は抗ｔａｃ抗体、例えばＣＨＩ−６２１ ＳＩＭＵＬＥＣＴ（登録商標）及びＺＥＮＡＰＡＸ（登録商標）（米国特許第５６９３７６２号）；ＣＤ４抗体，例えばｃＭ−７４１２抗体(Choy等(1996) Arthritis Rheum 39(1):52-56)；抗ＣＤ５２抗体、例えばＣＡＭＰＡＴＨ-１Ｈ(Riechmann等(1988) Nature 332:323-337)；抗Ｆｃレセプター抗体、例えば、Graziano等(1995) J. Immunol. 155(10):4996-5002に記載のＦｃγＲＩに対するＭ２２抗体；抗癌胎児抗原(ＣＥＡ)抗体、例えばｈＭＮ−１４(Sharkey等(1995) Cancer Res. 55(23Suppl): 例えばｈＭＮ−１４(Sharkey等(1995) Cancer Res. 55(23Suppl): 5916s-5920s)；ｈｕＢｒＥ−３、ｈｕ−Ｍｃ３及びＣＨＬ６を含む乳房上皮細胞に対する抗体(Ceriani等(1995) Cancer Res. 55(23):5852s-5856s；及びRichman等(1995) Cancer Res. 55(23 Supp): 5916s-5920s)；大腸癌細胞に結合する抗体、例えばＣ２４２(Litton等(1996) Eur J. Immunol. 26(1):1-9)；抗ＣＤ３８抗体、例えばＡＴ１３／５(Ellis等(1995) J. Immunol. 155(2):925-937)；抗ＣＤ３３抗体、例えばＨｕ Ｍ１９５(Jurcic等(1995) Cancer Res 55(23 Suppl)：5908s-5910s、及びＣＭＡ−６７６又はＣＤＰ７７１；抗ＣＤ２２抗体、例えばＬＬ２又はＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ(Juweid等(1995) Cancer Res 55(23 Suppl)：5899s-5907s)；抗ＥｐＣＡＭ抗体、例えば１７−１Ａ（ＰＡＮＯＲＥＸ（登録商標））；抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、例えばアブシキシマブ又はｃ７Ｅ３ Ｆａｂ（ＲＥＯＰＲＯ（登録商標））；抗ＲＳＶ抗体、例えばＭＥＤＩ−４９３（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標））；抗ＣＭＶ抗体、例えばＰＲＯＴＯＶＩＲ（登録商標）；抗ＨＩＶ抗体、例えばＰＲＯ５４２；抗肝炎抗体、例えば抗Ｈｅｐ Ｂ抗体ＯＳＴＡＶＩＲ（登録商標）；抗ＣＡ１２５抗体ＯｖａＲｅｘ；抗イディオタイプＧＤ３エピトープ抗体ＢＥＣ２；抗ヒト腎細胞癌抗体、例えばｃｈ−Ｇ２５０；ＩＮＧ−１；抗ヒト１７−１Ａ抗体（３６２２Ｗ９４）；抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体（Ａ３３）；ＧＤ３ガングリオシドに対する抗ヒトメラノーマ抗体Ｒ２４；抗ヒト扁平上皮癌（ＳＦ−２５）；及び抗ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体、例えばＳｍａｒｔ ＩＤ１０及び抗ＨＬＡ ＤＲ抗体Ｏｎｃｏｌｙｍ（Ｌｙｍ−１）が含まれる。
【００７２】
ＩＩＩ．方法及びアッセイ
分析方法/アッセイ
Ｃｌａｒｉｔｙ，Ｏｐａｌｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｏｌｏｒａｔｉｏｎ（ＣＯＣ）アッセイ
乳白度は、乳白溶液及び懸濁液の均一性における超顕微鏡的光学密度のために吸収され又は散乱された光の計器測定によっても判定することができる。そのような技術は、比ろう法及び比濁法である。着色試料の濁度計測のため、選択を伴うレシオ比濁比ろう法を用いる。懸濁粒子の光散乱効果は、透過光（比濁法）又は散乱光（比ろう法）のいずれかを観察することにより測定可能である。レシオ比濁法は、比ろう法と比濁法の両方の原理が組み合わさったものである。比濁法及び比ろう法は、微乳白色の懸濁液の測定に有用である。明確に定められた条件下で作製された参照懸濁液を使用しなければならない。適切な色の割り当てを確認するためには、米国薬局方２０１２（USPモノグラフ631,Color and Achromicity）や欧州薬局方５．０(EP Method 2.2.2, Degree of Coloration of Liquids)に記載の標準色溶液（を参照）。懸濁液の光学的特性と分散相の濃度との関係が良くても半経験的であるため、定量的測定のためには検量線の作成が必須である。色は入射光と分散光の両方を減衰させ、濁度値を下げ、負の干渉を与えるため、着色液体の乳白色の判定はレシオ選択を伴うレシオ比濁計又は比ろう計でなされる。色の濃くない着色試料でさえもその効果は大きく、従来の比濁計は使うことができない。透明度と乳白度の機器による評価は、分析者の視力に依存しない、より識別力の高い試験を可能にする。数値結果は、特に安定性試験において、品質モニタリング及びプロセス制御のためにより有用である。例えば、安定性に関する先の数値データは、投薬製剤又は原薬の所与のロットが使用期限の前に保存期限を超えてしまうかどうかの判定に利用され得る。
【００７３】
ＨＰＬＣアッセイ
高圧液体クロマトグラフィーとしても知られており、ＨＰＬＣと略される高性能液体クロマトグラフィーは、液体クロマトグラフィーの特殊な形態であり、生化学及び分析化学において今日頻繁に使用されている。分析物を高圧で液体（移動相）中の固定相のカラムに通し、分離された成分が固定相に残る時間を短縮するので、成分がカラム中に拡散するのに必要な時間が短縮される。このことは得られるクロマトグラム中により狭いピークを生じるので、ＬＣと比較してより良好な分解能及び感度をもたらす。試料溶質の溶解を確実にするように移動相を選択する。固定相について、微粒子シリカの大きな表面積が溶質−固定相の相互作用の差を強調するので、好ましくは微粒子シリカ（もとのままもしくは化学的に修飾された）を使用する。溶質移動相相互作用と比べて、溶質と強力に相互作用する固定相の使用は、非常に長い保持時間、すなわち分析に有用ではない状態を生じる。そのために、固定相は、移動相の相互作用に比べて弱〜中程度の溶質相互作用を提供するように選択されなければならない。結果的に、溶質の性質により、選択されるＬＣの種類が決まる。移動相でより強い相互作用が生じて試料の溶解及び迅速な溶出を確実にするはずであるが、一方、固定相は溶質間の微妙な差に対して応答性が高いはずである。例えば、極性の中性化合物は、極性移動相を溶質の分散的な特性の微妙な差を識別する非極性固定相と共に使用すると、通常、より良好に分析される。ＨＰＬＣの強力な側面の一つは、移動相が変化して保持の機構を改変することができるということである。保持を調整するために、移動相に改質剤を加えることができる。例えば、水性移動相においてｐＨは重要な変数である。
【００７４】
逆相クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）は、非極性固定相及び極性移動相（一つ以上の極性溶媒、例えば水、メタノール、アセトニトリル及びテトラヒドロフランなどからなる）の使用を要する。
【００７５】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）ＨＰＬＣ：  このクロマトグラフィー法は、その疎水性に基づきタンパク質又は抗体／タンパク質バイオコンジュゲートを分析するのに効果的である。疎水性相互作用クロマトグラフィーの背後にある理論は、高塩濃度水性移動相の使用によってタンパク質が樹脂に結合されるということである。塩分調整は、タンパク質が疎水性リガンドのより狭い表面領域に結合するのを可能にする離液効果に寄与する。タンパク質は、塩分濃度を低くするという簡単な方法で溶出される。殆どの治療標的は低塩緩衝液又は無塩緩衝液に溶出される。従って、化合物は、より極性が高く、変性が低い環境で溶出される。例えば、ＨＩＣは、抗体−薬物コンジュゲート又はタンパク質−薬物コンジュゲートにおける薬物添加量分析のために広く利用されている。
【００７６】
ＮＭＲアッセイ
核酸磁気共鳴（ＮＭＲ）検出は、Ｈや１３Ｃなど奇数の質量を有する所定の核がランダムに軸の周囲を回転することに基づく。しかし、強力な磁石の極の間に置かれた場合、スピンは磁場に対してパラレルかアンチパラレルのいずれかに整列されるが、エネルギーがわずかに低いためパラレル方向が好まれる。次いで、核を電磁放射線で照射し、電磁放射線は吸収されてパラレル核を高エネルギー状態にし、その結果として、核は放射線と「共鳴」するようになる。分子中の全ての核は、包含する磁場を変化させる電子雲に取り巻かれており、そのために吸収周波数が変わるので、Ｈ又はＣのいずれも、その配置及び隣接する分子、又は化合物の元素に依存して異なるスペクトルを生じる。
【００７７】
質量分析法
質量分析法はイオンの質量対電荷比（ｍ／ｚ又はｍ／ｑ）を測定するために用いられる分析手法である。これは、最も一般的には、試料成分の質量を表すマススペクトルを作成することによって物理的試料の組成分析を行うために使用される。この手法にはいくつかの応用例があり、例えば、化合物及び／又はそのフラグメントの質量による未知化合物の同定、化合物中の一つ以上の元素の同位体組成の判定、化合物のフラグメンテーションを観察することによる化合物の構造決定、慎重に設計された方法を用いた試料中の化合物の量の定量化（質量分析法は本質的には定量的ではない）、気相イオン化学の基盤研究（減圧におけるイオン及び中性粒子の化学）、様々な他のアプローチを用いた化合物の他の物理的、化学的又は生物学的特性の判定を含む。
【００７８】
質量分析計は質量分析に使用される装置であり、試料の組成を分析するための質量スペクトルを作成する。これは通常、試料をイオン化し、異なる質量のイオンを分離し、イオン束の強度の測定による相対的存在量を記録することによって達成される。典型的な質量分析計は、イオン源、質量分析器、及び検出器の３つの部分を備える。
【００７９】
イオン源の種類は、質量分析により分析できる試料の種類に非常に影響する要因である。電子イオン化及び化学イオン化は、気体及び蒸気に対して用いられる。化学イオン化源において、分析物はイオン化源内での衝突の間の化学イオン分子反応によりイオン化させる。液体及び固体の生物試料と共にしばしば使用される２種類の手法として、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）及びマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）が挙げられる。他の手法としては、高速原子衝撃（ＦＡＢ）、サーモスプレーイオン化、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、二次イオン質量分析法（ＳＩＭＳ）、及び熱イオン化が挙げられる。
【００８０】
紫外線分光法
紫外・可視分光法又は紫外可視吸光度測定法（ＵＶ−Ｖｉｓ又はＵＶ／Ｖｉｓ）は、紫外可視スペクトル領域での吸光分光法又は反射分光法を指す。これは、可視領域とその隣接領域の光（近紫外及び近赤外（ＮＩＲ））を使用することを意味する。可視領域の吸収率又は反射率が対象化学物質の観測される色に直接影響を与える。電磁スペクトルのこの領域で、分子は電子遷移を受ける。この手法は、蛍光が励起状態から基底状態への遷移に関わる一方、吸収が基底状態から励起状態への遷移を示すという意味で、蛍光分光法を補完するものである。ＵＶ分光計は、可視光及び／又は紫外線源（赤色）からの光線を使用する機器であり、（光源は）プリズム又は回折格子によってその成分波長に分離される。各単色（単一波長）光線は順番に、ハーフミラーを備えた装置により等しい強度をもつ二つの光線に分光される。一方の光線、すなわち試料光線（マゼンタ色）は、溶媒が透明である研究対象化合物の溶液を容れた小さな透明容器（キュベット）を通過する。他方の光線、すなわち参照光線（青色）は、溶媒のみを容れた同一のキュベットを通過する。次いで、これらの光線の強度が電子検出器により測定され、比較される。参照光線は殆ど又は全く光吸収を受けないはずだが、その強度をＩ０と定義する。試料光線の強度はＩと定義する。分光計は短時間で自動的に、全ての成分波長を記載されている方法でスキャンする。スキャンされる紫外線（ＵＶ）領域は、通常、２００から４００ｎｍであり、可視部分は４００から８００ｎｍである。
【実施例】
【００８１】
ＩＶ．実施例
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上掲の一般的記述を所与として、他の様々な実施態様が実施され得る。
【００８２】
実施例１：付加体検出
特定の組換えタンパク質製造中に、７つの保存用濾過バルク（ＦＢＳ）が生産され、製品外観基準に反する典型的な結果が、７つのバルク中５つで得られた。製造仕様書ごとに、産物固有の試験指導書がＣＯＣアッセイ（透明度／乳白色度、着色度、及び外観を判定する方法）による産物サンプル評価でイエロー（Ｙ）系の使用を義務付けている。しかし、二つのバルク（実験２及び実験３）に褐色が現れ、ＣＯＣアッセイで期待されるイエロー系の色基準でＹ７以下を満たさなかった。実験１−３のＣＯＣの結果比較は図１に示されている。この相違を更に調べるため、７つのＦＢＳ試料を濃縮して色の純度を高めた。適切な色割り当て確認のために、濃縮サンプルは、米国薬局方２０１２(USP Monograph 631, Color and Achromicity)又は欧州薬局方５．０(EP Method 2.2.2, Degree of Coloration of Liquids)に挙げられている全ての標準色溶液と比較された。試料は、参照試料を調製した５分後、黒い背景に対して垂直に見ながら、拡散昼光下で比較された。光線の拡散は、参照試料Ｉが容易に水と識別可能であり、参照懸濁液ＩＩが容易に参照懸濁液Ｉと識別可能であるようなものでなければならない。液体は、その透明度が、水Ｒもしくは上記条件下での試験時に使用した溶媒の透明度と同じであれば、又は、その乳白色が参照試料Ｉのそれよりも顕著でなければ、透明と見なした。
【００８３】
着色の原因が実験２及び実験３では不明であったことから、この非定型褐色の原因を特定するために複数の治験研究が行われた。実験１−３からの試料の金属、微量元素（金属以外）、及び発色団が分析された。これらの調査の結果、実験２及び実験３で観察された着色は金属又はその他の微量元素が原因ではないことが示唆された（データは示さない）。
【００８４】
発色団がＦＢＳで観察された予期せぬ着色と関係があるのかを判定するため、実験１−３を紫外・可視（ＵＶ／Ｖｉｓ）分光法を用いて層長１ｃｍのキュベットで分析した。紫外スペクトル（２００−６００ｎｍ）は分析試料の観察プロファイルにおける有意な相違は、何も示さなかった。
【００８５】
紫外分光光度計の感度を上げるため、層長１０ｃｍのキュベットを使用して実験を繰り返した。試料の吸光度は分光光度計の光線中の吸収分子の数に比例するため、路長１０ｃｍのキュベットで１ｃｍのキュベットよりも感度が向上した。実験１−３の吸収スペクトルを判定するため、試料が２００−７００ｎｍの間でスキャンされた。実験２と実験３のスペクトルの形は、実験１のそれとは異なっていた。つまり、新しい吸光ピークが、実験１では顕著でなかった約３２０ｎｍ及び約４６０ｎｍの所で観察された（図２Ａ）。この相違は、実験１のスペクトルを実験３のスペクトルから取り去ると、より明白に観察できる（図２Ｂ）。実験２と実験３で観察される４６０ｎｍのピークは、フラビン（例えば、ビタミン）のフィンガープリントと一致する。
【００８６】
１０ｃｍのＵＶ／ｖｉｓの結果に基づき、ＭＳ検出のオプション付きＲＰ−ＨＰＬＣ及びＩＥＣフルスペクトラム分析が、実験１−３からのＦＢＳで実施された。
【００８７】
ＲＰ−ＨＰＬＣでのフルスペクトル検出を利用したところ、実験１−３のクロマトグラフィー上の相違は観察されなかった（データは示さない）。ところが、３１０ｎｍでのＩＥＣで、わずかな相違が観察された。図３で示すように、実験２及び実験３で、メインピークの後ろに小さなピークが観察される一方、実験１のプロファイルは、参照物質と同等である。
【００８８】
インタクトな試料が二次元ＬＣ−ＭＳ用に提出され、２８０ｎｍ及び３００ｎｍでモニターされた。二次元ＬＣ−ＭＳ分析は二つの部分で構成されている。つまり、第一の次元は、断片ピークである第二の次元と、ＲＰ−ＨＰＬＣによって質量分析のために、分離される。この実験から、期待質量が実験１から観察された一方、期待質量に加え、更に約１５７ダルトン多い質量が実験２と３で観察された（図４）。
【００８９】
実施例２：付加体の解明
この付加体を更に解明するために、実験３を分画用に選び（ＩＥＣアッセイからの小さなピーク（図３）は回収した）、更に二次元ＬＣ−ＭＳで分析、及びＭＳ検出と合わせたトリプシンペプチドマップによる質量同定を行った。
【００９０】
二次元ＬＣ−ＭＳ分析（図５）から、期待質量に加え、約１５６ダルトンの質量増加が、分画されたショルダーピークで再び観察された。試料をオンライン還元（ＤＴＴ使用）すると、期待した質量減が観察された。更に４ダルトンが還元分析から未変性分析の間に観察されたのは、ジスルフィド結合の切断、及び４個の水素の付加に因る。付加質量が再び観察されたことは、修飾が非可逆的又は共有結合性であることを示唆する。
【００９１】
トリプシンペプチドマップから、試料が２１４ｎｍ及び３１０ｎｍで回収された。図６に示すように、４５−５５分領域で新しいピークが高まっている。４８．８分３１０ｎｍで観察される新しいピークのＬＣ−ＭＳ−ＭＳ分析は、＋１５４．００６ダルトンによって修飾されたシステイン残基を持つＴ２０ペプチドであると判定された。（システインで、＋１５４．００６ダルトンで）修飾された遊離のＴ６及びＴ１６ペプチドも、質量抽出によって検出された。還元されたＴ２１又は修飾されたＴ２１は検出されなかったが、これはおそらく存在レベルの低さに因る。参照と比較した場合、５０−５６分、３１０ｎｍで溶出が観察された他の二つのピークには、固有の種は含まれていなかった。
【００９２】
付加体構造を判定するために一次元及び二次元１Ｈ ＮＭＲ分析を収集した。追加データはＴＯＣＳＹ（全相関分光法）、ＨＳＱＣ（異核単一量子コヒーレンス）、ＨＭＢＣ（異種核多重結合相関）、及びＲＯＥＳＹ（回転フレームオーバーハウザー効果分光法（ｎＯｅ））を用いて取得した。
【００９３】
ＴＯＣＳＹは互いに結合している全ての陽子間だけでなく、所与のスピン系内の他の全ての陽子間に相関を作り出す。ＨＳＱＣ実験により、直接結合核（すなわち、二種類の化学核）の化学シフトの相関が示され、一方、ＨＭＢＣ実験により、互いに分離している二種類の核の化学シフトと二本以上の化学結合との相関が示される。正確な分子配座（すなわち、分子の三次元構造）を確認するためにＲＯＥＳＹでは、空間を用いるｎＯｅを、化学結合を介さずに利用する。回収されたペプチドで、１８２ｐｐｍで芳香族（キノン）プロトンとＣ＝０との長距離の１Ｈ−１３Ｃ結合が観察された。芳香族領域の回収されたペプチドに対する１Ｈ−１３Ｃ ＨＳＱＣの化学シフトは、ナフタレン−１，４−ジオンに結合した合成モデル化合物について観察されたものとほぼ一致する。ＴＯＣＳＹデータは、産物中のＱ、Ｖ及びＲ共鳴を割り当てる。産物の１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣデータを合成ペプチド（ＮＨ２−ＩＶＱＣＲ−ＣＯＯＨ）と比較すると、図７に示すように産物試料におけるＣｙｓ−ＮＨ相関がなくなっているのが分かった。推定構造が、システインのＣＨとアルギニンのＮＨの間に観察された強いｎＯｅによって確認された（図８）。回収されたＮＭＲデータに基づいて、推定構造が図９に示されている。
【００９４】
組換えタンパク質ー褐色付加体を形成した１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸（ＤＨＮＡ）のような着色種の同定は、ＭＳ、ＮＭＲ、及び遺伝子データに基づくものであった。ＮＭＲデータは、ＤＨＮＡがシステイン残基を介して組換えタンパク質に結合したことを確認した。ＤＨＮＡは、大腸菌細胞のもつメナキノン生合成経路（図１０）由来の産物である。メナキノンは大腸菌に存在するが、その産生は、嫌気性及び／又は微好気的条件にある場合に増加する。メナキノンは、限られた酸素環境中の電子輸送に使用され、また、嫌気（微好気）的条件でジスルフィド結合を形成するタンパク質ＤｓｂＢを活性な酸化状態に戻すために使用される。
【００９５】
実施例３：ＤＨＮＡ−産物付加体の形成を軽減するためのＨｉ−ｄＯ工程
産物の遊離チオールの生成及びその後のＤＨＮＡー産物付加体形成を防止するために、抑制手法が開発された。実験２と実験３が最高の力価及び細胞密度を示した為、発色の原因は収集操作中の低レドックス環境の結果であると判定された。実験２も実験３も、希釈ホモジネートをより長い保持時間に供し、１５℃未満の目標温度を達成するためにより長時間ホモジネートを持続させ、次善のホモジネート混合時間及び速度を有していた（データは示していない）。これらの要因は、産物のジスルフィド結合の還元を促進し、ＤＨＮＡがタンパク質産物の遊離チオールに結合する機会を与えるような低酸素環境を作ることに貢献した。 
【００９６】
ＤＨＮＡ−タンパク質付加体が、還元ジスルフィド結合（すなわち遊離チオール）を引き起こす収集操作中の低レドックス環境中に形成されたため、遊離チオールの生成とＤＨＮＡ−産物付加体の形成を防止するためのアプローチが開発された。このＨｉ−ｄＯと呼ばれる改善された工程制御は、還元環境を取り除く（すなわち遊離チオールを生成しない）ため、収集操作における溶存酸素濃度をゼロより大きい（＞０％）レベルに維持する。
【００９７】
ＤＨＮＡ−産物付加体の形成は発酵及び収集操作上の複数のイベントの組み合わせを要する複雑な生体反応である。発酵工程で作り出されるものは、かなりの割合及び／又は量のＤＨＮＡである。以下の概略図で、典型的な収集操作の主要３工程（発酵後工程、ホモジナイズ工程、ホモジナイズ後工程）を示す。
【００９８】
2020202849.tif 000002
【００９９】
いくつかの生産工程が、それらが還元環境又は遊離チオール生成を軽減するかどうかを判定するために、発酵後/ホモジナイズ前、そしてホモジナイズ後に試験された。これらの試験された工程改善を、表１及び図１２に示す。
【０１００】
2020202849.tif 000003
【０１０１】
表１及び図１２で概説した工程改善の結果を表２に示す。
【０１０２】
2020202849.tif 000004
【０１０３】
褐色着色の原因を知るために根本原因解析が実施された。この分析で、着色された種（ＤＨＮＡ）の同定、その組換えタンパク質産物への結合、付加体（ＤＨＮＡ−タンパク質）の構造、その組成、また、作製工程の中でいつ、どのようにしてＤＨＮＡが産物に結合するのかについての推定メカニズムが明らかになった。表１に要約したように、還元環境を取り除いて遊離チオール生成物の形成を防止するために収集操作の間ゼロより高い（＞０％）溶存酸素濃度を維持することによる、褐色付加体の形成を防止する緩和戦略が実施された。その結果、ＩＥＣ分析が示すように、異常ピーク率は０％で、ＦＢＳにおける褐色付加体の形成は検出されなかった（表２）。
【０１０４】
実施例４：ｍｅｎＥ遺伝子欠損大腸菌宿主細胞の生成
褐色付加体の形成抑制のために、本発明のＨｉ−ｄＯ収集工程に加え、もう一つのアプローチが採られた。このアプローチはｍｅｎＥ遺伝子をゲノムから欠失させる、原核宿主細胞の遺伝子操作を伴い、それによって組換え産物と結合する可能性のあるメナキノン生合成経路からのＤＨＮＡ中間体の生成を阻害する。
【０１０５】
宿主細胞から削除されたｍｅｎＥ遺伝子は、本明細書において出典明示により援用されるBaba等, Construction of E. coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection, Molecular Systems Biology, 21巻, p.1-10 (2006)に記載の方法に従い、インフレーム単一遺伝子性ノックアウト変異体として生成された。ｍｅｎＥ遺伝子は、ＦＬＰ認識標的部位に隣接した（カナマイシン等）耐性カセット及び隣接染色体配列に対して５０塩基対配列同一性を含むＰＣＲ産物を用いた変異体生成の標的遺伝子であった。
【０１０６】
変異体生成は、カナマイシン３０μｇ／ｍＬを含むＬＢ（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉブロス）寒天上で３７℃で好気的に培養された宿主細胞の場合、約１０−１０００のカナマイシン耐性コロニーを生じさせた。
【０１０７】
実施例５：ｍｅｎＥ遺伝子欠失大腸菌宿主細胞を用いた組換えタンパク質作製
ｍｅｎＥ遺伝子欠失大腸菌宿主細胞の、ＤＨＮＡ結合タンパク質付加体を作らない組換えタンパク質作製能が試験された。簡単に述べると、ｍｅｎＥ遺伝子欠失大腸菌細胞は、二つの組換えタンパク質、ＰＲＯＴ１及びＰＲＯＴ２、並びに二つの組換え抗体、ＡＢ１及びＡＢ２をコードするプラスミド構築物で、当業者に周知の標準的な技術（例えば、Simmons 等, Expression of full-length immunoglobulins in E. coli: rapid and efficient production of aglycosylated antibodies, J of Immunol Methods 263 p. 133-147 (2002)を参照)により形質転換されているものだった。この４つの組換えタンパク質／抗体の発酵は、本明細書に記載の通りに進められた（本明細書において出典明示により援用される米国特許第６９７９５５６号も参照）。
【０１０８】
４つ全ての組換えタンパク質／抗体のために濾過バルク組換え産物のＤＨＮＡ−タンパク質付加体形成は、３１０ｎｍでのＩＥＣアッセイによって試験され、検出可能なＤＨＮＡ−タンパク質付加体は見られなかった（ＰＲＯＴ１の実施結果については、図１１参照）。
【０１０９】
驚くべきことに、組換え産物の収率は、ｍｅｎＥ欠失大腸菌細胞を使用した結果、インタクトな野生型ｍｅｎＥ遺伝子を用いた大腸菌宿主細胞の場合の収率と比較して約２０％から５０％増と、顕著な増加を示した。表３にこれらの結果を示す。
【０１１０】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年9月11日(2020.9.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
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＜本発明の更なる実施態様＞
［１］組換えタンパク質の製造方法であって、（ａ）前記組換えタンパク質をコードする核酸で形質転換された原核宿主細胞を発酵させること、（ｂ）溶存酸素（ｄＯ２）濃度が０％より高い条件下で前記組換えタンパク質を収集すること、及び（ｃ）前記組換えタンパク質を保存用濾過バルク（ＦＢＳ）へと精製することとを含み、前記濾過バルクが、３１０ｎｍでのイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）アッセイにより測定して、検出可能な１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸（ＤＨＮＡ）−リコンビナントタンパク質付加体を含まない、組換えタンパク質の製造方法。
［２］前記分析的アッセイが、ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＨＩＣ−ＨＰＬＣ、ＮＭＲ、質量分析法、又はＵＶ分光法によるものである、［１］に記載の方法。
［３］前記ｄＯ２が工程（ｂ）の収集操作の間、一貫して０％より高い濃度に維持されている、［１］に記載の方法。
［４］収集操作がホモジナイズ工程を含む、［３］に記載の方法。
［５］前記ｄＯ２がホモジナイズ前に約３０％〜約７５％に維持されている、［４］に記載の方法。
［６］前記ｄＯ２がホモジナイズの前に７５％より高い濃度に維持されている、［４］に記載の方法。
［７］前記ｄＯ２がホモジナイズ後に約５０％に維持されている、［４］又は［５］に記載の方法。
［８］前記ｄＯ２がホモジナイズ後に５０％より高い濃度に維持されている、［４］又は［５］に記載の方法。
［９］前記ｄＯ２が１．５時間以上の間維持される、［５］に記載の方法。
［１０］前記ｄＯ２が２時間以上の間維持される、［６］に記載の方法。
［１１］前記ｄＯ２がオーバーレイエアーもしくはスパージドエアー、背圧の上昇、又は撹拌速度で維持される、［１］に記載の方法。
［１２］オーバーレイエアーが約０．４ｖｖｍから約０．８ｖｖｍである、［１１］に記載の方法。
［１３］オーバーレイエアーのターゲットが０．６ｖｖｍである、［１２］に記載の方法。
［１４］背圧の上昇が約１．０〜３０ｐｓｉである、［１１］に記載の方法。
［１５］背圧の上昇のターゲットが１９ｐｓｉである、［１４］に記載の方法。
［１６］撹拌速度が約６ワット／リットルから約８ワット／リットルである、［１１］に記載の方法。
［１７］撹拌速度のターゲットが約６ワット／リットルである、［１６］に記載の方法。
［１８］組換えタンパク質の製造方法であって、（ａ）前記組換えタンパク質をコードする核酸で形質転換された、ｍｅｎＥ遺伝子を欠損した原核宿主細胞を発酵させること、（ｂ）前記組換えタンパク質を収集すること、（ｃ）前記組換えタンパク質をＦＢＳへと精製することとを含み、前記濾過バルクが、３１０ｎｍでのイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）アッセイにより測定して、検出可能な１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸（ＤＨＮＡ）−リコンビナントタンパク質付加体を含まない、組換えタンパク質の製造方法。
［１９］組換えタンパク質の収率が、対照原核宿主細胞使用時の収率と比較して約２０％以上増、約３０％以上増、約４０％以上増、約５０％以上増、約６０％以上増である、［１８］に記載の方法。
［２０］発酵がスケール非依存的である、［１］〜［１９］に記載の方法。
［２１］前記組換えタンパク質が組換えポリペプチド又は単離された抗体である、［１］又は［１８］に記載の方法。
［２２］前記原核宿主細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクター属、アゾトバクター属、エルウィニア属、バシラス属、シュードモナス属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、セラチア属、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ属、及びパラコッカス属である、［１］又は［１８］に記載の方法。
【外国語明細書】
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