(57)【要約】【課題】無細胞ＤＮＡおよび／または無細胞ＤＮＡと少なくとも微小小胞体由来のＲＮＡを含む核酸を含む生体試料から核酸を単離する新規な方法およびキット、ならびに前記微小小胞体および／または前記生体試料から核酸を抽出する新規な方法およびキットを提供すること。【解決手段】本発明は、無細胞ＤＮＡおよび／または無細胞ＤＮＡおよび少なくとも微小小胞体由来のＲＮＡを含む核酸を含む生体試料から核酸を単離する新規な方法およびキット、ならびに前記微小小胞体および／または前記生体試料から核酸を抽出する新規な方法およびキットを提供する。【選択図】図１
2020202860.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）生体試料を準備する工程、
（ｂ）前記生体試料に由来する無細胞ＤＮＡおよび微小小胞体を捕捉表面または表面内に保持するのに十分な条件で前記生体試料を前記捕捉表面と接触させる工程、ここで、前記捕捉表面は、正に帯電した膜、四級アンモニウムＲ−ＣＨ２−Ｎ＋（ＣＨ３）３で官能化された陰イオン交換体である膜、または正に帯電しかつ四級アンモニウムＲ−ＣＨ２−Ｎ＋（ＣＨ３）３で官能化された膜を含む、
（ｃ）前記無細胞ＤＮＡおよび前記微小小胞体を前記捕捉表面または表面内に保持したまま、前記捕捉表面をフェノール系溶解試薬と接触させて、前記ＤＮＡおよびＲＮＡを前記試料から放出させて均質液を生成する工程、
（ｄ）前記均質液にクロロホルムを添加する工程、および
（ｅ）前記均質液から前記ＤＮＡ、前記ＲＮＡ、または前記ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を抽出する工程、
を含む、生体試料からＤＮＡおよびＲＮＡを抽出する方法。
【請求項２】
前記膜は、正に帯電している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記膜は、四級アンモニウムＲ−ＣＨ２−Ｎ＋（ＣＨ３）３で官能化された陰イオン交換体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記膜は、正に帯電し、かつ四級アンモニウムＲ−ＣＨ２−Ｎ＋（ＣＨ３）３で官能化された陰イオン交換体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記膜の孔径は、少なくとも３μｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記捕捉表面は、互いに直接隣接した３つの膜を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記３つの膜は、互いに同一である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
各膜は、正に帯電している、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
各膜は、四級アンモニウムＲ−ＣＨ２−Ｎ＋（ＣＨ３）３で官能化された陰イオン交換体である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
各膜は、正に帯電し、かつ四級アンモニウムＲ−ＣＨ２−Ｎ＋（ＣＨ３）３で官能化された陰イオン交換体である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記生体試料は血漿または血清である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記生体試料は０．２ｍＬから４ｍＬである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記生体試料は、尿、脳脊髄液、または細胞培地の上澄みである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ａ）は、前記生体試料を濾過して前記生体試料を処理する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記濾過は、０．８μｍのフィルターを用いて行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｂ）は、前記生体試料を前記捕捉表面と接触させた後に、遠心分離工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｂ）は、前記生体試料を前記捕捉表面に接触させた後に、前記捕捉表面を洗浄することをさらに含む、請求項１または請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｃ）は、前記捕捉表面を前記フェノール系溶解試薬と接触させた後に、遠心分離工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｄ）は、前記均質液にクロロホルムを添加する前に前記均質液に対照を添加することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法は、工程（ｅ）からの抽出物をエタノールで調整する工程（ｆ）、前記エタノールで調整した抽出物をシリカカラムに結合させる工程（ｇ）、および前記抽出物を前記シリカカラムから溶出させる工程（ｈ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）生体試料を準備する工程、
（ｂ）前記生体試料に由来する無細胞ＤＮＡおよび微小小胞体を捕捉表面または表面内に保持するのに十分な条件で前記生体試料を捕捉表面と接触させる工程、ここで、前記捕捉表面は、正に帯電した１種以上のビーズ、四級アンモニウムＲ−ＣＨ２−Ｎ＋（ＣＨ３）３で官能化された陰イオン交換体である１種以上のビーズ、または正に帯電しかつ四級アンモニウムＲ−ＣＨ２−Ｎ＋（ＣＨ３）３で官能化された１種以上のビーズを含む、
（ｃ）前記無細胞ＤＮＡおよび前記微小小胞体を前記捕捉表面または表面内に保持したまま、前記捕捉表面をフェノール系溶解試薬と接触させて、前記試料から前記ＤＮＡおよびＲＮＡを放出させて、均質液を生成する工程、
（ｄ）前記均質液にクロロホルムを添加する工程、および
（ｅ）前記均質液から前記ＤＮＡ、前記ＲＮＡ、または前記ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を抽出する工程、
を含む、生体試料からＤＮＡおよびＲＮＡを抽出する方法。
【請求項２２】
前記１種以上のビーズは正に帯電している、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
１種以上のビーズは、四級アンモニウムＲ−ＣＨ２−Ｎ＋（ＣＨ３）３で官能化された陰イオン交換体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記１種以上のビーズは、正に帯電し、かつ四級アンモニウムＲ−ＣＨ２−Ｎ＋（ＣＨ３）３で官能化された陰イオン交換体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記生体試料は血漿または血清である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記生体試料は、０．２ｍＬから４ｍＬである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記生体試料は、尿、脳脊髄液、または細胞培地の上澄みである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
工程（ａ）は、前記生体試料を濾過して前記生体試料を処理する工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記濾過は、０．８μｍのフィルターを用いて行われる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
工程（ｂ）は、前記生体試料を前記捕捉表面と接触させた後に、遠心分離工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
工程（ｂ）は、前記生体試料を前記捕捉表面と接触させた後に、前記捕捉表面を洗浄することをさらに含む、請求項２１または請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
工程（ｃ）は、前記捕捉表面を前記フェノール系溶解試薬に接触させた後に、遠心分離工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
工程（ｄ）は、前記均質液にクロロホルムを添加する前に前記均質液に対照を添加することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
前記方法は、工程（ｅ）からの抽出物をエタノールで調節する工程（ｆ）、前記エタノールで調節した抽出物をシリカカラムに結合させる工程（ｇ）、および前記抽出物を前記シリカカラムから溶出させる工程（ｈ）をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、無細胞ＤＮＡおよび／または無細胞ＤＮＡと少なくとも微小小胞体由来のＲＮＡを含む核酸を含む生体試料から核酸を単離する新規な方法およびキット、ならびに前記微小小胞体および／または前記生体試料から核酸を抽出する新規な方法およびキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
関連出願
本願は、２０１４年７月９日に提出された米国特許仮出願第６２／０２２，５３８号、２０１４年１１月１４日に提出された米国特許仮出願第６２／０７９，７６３号、および２０１５年５月２７日に提出された米国特許仮出願第６２／１６６，８９０号の優先権を主張するものであり、それぞれ、その全内容を参照により本明細書に組み込む。
【０００３】
背景
細胞から放出される膜小胞を総称して微小小胞体と言う。様々な細胞源に由来する微小小胞体は、タンパク質成分および脂質成分について広く研究が行われている。近年、微小小胞体はまた、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含むＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むことが分かった。
【０００４】
細胞から放出される微小小胞体に含まれる遺伝子情報およびタンパク質情報により、現在の研究は、微小小胞体を用いてこれら細胞の状態（例えば、病気の状態あるいは病気の予測）に対するさらなる洞察を得ることに向けられている。また、現在の研究は、無細胞ＤＮＡを用いて、細胞の状態に対するさらなる洞察を得ることにも向けられている。
【０００５】
したがって、無細胞ＤＮＡを単離する方法、生体試料から微小小胞体を単離する方法、および疾患および病気の正確な診断のために高品質の核酸を抽出する方法が求められている。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概要
本発明は、表面にＤＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡ、および／または微小小胞体を捕捉し、次いで前記微小小胞体を溶解して核酸、特に微小小胞体に含まれるＲＮＡを放出させ、前記捕捉表面から前記ＤＮＡおよび／またはＤＮＡと少なくともＲＮＡを含む核酸を溶出させて無細胞ＤＮＡ（「ｃｆＤＮＡ」、循環ＤＮＡとしても知られる）を単離する方法、および／または試料からｃｆＤＮＡと少なくとも微小小胞体由来のＲＮＡを含む核酸を合わせて単離する方法を提供する。当業者には自明であるが、前記微小小胞体画分はまた、ＤＮＡも含む。したがって、前記微小小胞体画分の溶解によりＲＮＡおよびＤＮＡの両方が放出される。さらに、単離されたＤＮＡは、各種供給源（ヌクレオソームおよびその他の無細胞ＤＮＡ供給源などが挙げられるが、これらに限定されない）のいずれかに由来する可能性がある。
【０００７】
試料から核酸（例えば、ｃｆＤＮＡおよび／またはＤＮＡおよび少なくとも試料の微小小胞体画分に由来するＲＮＡを含む核酸）を単離および抽出するのに用いられてきた従来の方法は、超遠心分離を用いて、例えば、１０，０００（×ｇ）超で１〜３時間回転させ、上澄みを除去して、ペレットを洗浄し、そのペレットを溶解して、カラムで核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＤＮＡおよびＲＮＡ）を精製することに依存していた。これら従来の方法は、時間がかかる、面倒である、バッチ間の変動がある、容量の拡大に適さないなど、いくつかの欠点があった。本明細書で提供する単離および抽出方法およびキットは、これらの欠点を克服し、高速で、頑丈、かつ容易に容量を増やすことができる単離および抽出用スピン式カラムを提供する。
【０００８】
核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＤＮＡおよび少なくとも試料に由来するＲＮＡを含む核酸）を単離および抽出する方法およびキットは、以下の一般的な手順を用いる。この手順は、本明細書では「ＥＸ０５２」と言う。まず、試料中の核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＤＮＡおよび微小小胞体画分）を捕捉表面（例えば、メンブレンフィルター）に結合させて、その捕捉表面を洗浄する。次いで、試薬を用いて膜上で溶解させて核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＤＮＡおよびＲＮＡ）を放出させる。次いで、ＰＬＧ（Phase Lock Gel）管を用いてクロロホルムで抽出して、エタノールで調整する。次いで、この核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＤＮＡおよびＲＮＡ）をシリカカラムに結合させて、洗浄し、溶出する。
【０００９】
ＥＸ０５２法およびキットで用いられる膜は、孔が大きく、正に帯電している。態様によっては、１つより多い膜、例えば、２つ以上の膜がＥＸ０５２法およびキットで用いられる。態様によっては、３つの膜が用いられる。ＥＸ０５２法およびキットで用いられる膜の数は、一度に分析することができる試料の総体積と相関する。態様によっては、ＥＸ０５２法およびキットで用いられる膜の層あたり約１ｍｌの試料が処理される。
【００１０】
態様によっては、前記膜は、正に帯電した膜である。態様によっては、前記捕捉表面は陰イオン交換体である。態様によっては、前記捕捉表面は、第四級アミンを含む陰イオン交換体である。態様によっては、前記捕捉表面は、正に帯電した膜であって、第四級アミンを含む陰イオン交換体であるＱ膜である。例えば、前記Ｑ膜で四級アンモニウムＲ−ＣＨ２−Ｎ＋（ＣＨ３）３で官能化される。態様によっては、前記膜の孔径は少なくとも３μｍである。
【００１１】
微小小胞体画分を含む試料の精製は、イオン交換技術を用いて行われる。態様によっては、前記イオン交換技術は、本明細書の実施例に示すものから選択される技術である。
【００１２】
態様によっては、膜上の溶解に用いられる試薬は、フェノール系試薬である。態様によっては、前記溶解試薬はグアニジン試薬である。態様によっては、前記溶解試薬は高塩濃度緩衝液である。態様によっては、前記溶解試薬は、前記溶解試薬はＱＩＡｚｏｌである。態様によっては、前記溶解試薬は、フェノール系溶解試薬、例えばＱＩＡｚｏｌであり、約７００ｕｌの体積で用いられる。
【００１３】
一側面では、生体試料から核酸を抽出する方法は、（ａ）生体試料を準備する工程、（ｂ）微小小胞体画分を捕捉表面または表面内に保持するのに十分な条件で前記生体試料を前記捕捉表面と接触させる工程、（ｃ）前記微小小胞体を前記捕捉表面または表面内に保持しつつ、前記微小小胞体画分を溶解させる工程、および（ｄ）前記微小小胞体画分から前記核酸を抽出する工程を含む。あるいは、前記生体試料から核酸を抽出する方法は、工程（ｂ）の後に前記捕捉表面から前記微小小胞体画分を溶出して、前記溶出済み微小小胞体画分を回収すること、および前記溶出した微小小胞体画分から前記核酸を抽出することをさらに含む。必要に応じて、前記溶出済み微小小胞体画分を回転濃縮器により濃縮して、濃縮微小小胞体画分を得てもよい。次いで、前記濃縮微小小胞体画分から前記核酸を抽出する。
【００１４】
他の側面では、前記生体試料から核酸を抽出する方法は、（ａ）生体試料を準備する工程、（ｂ）捕捉表面または表面内に微小小胞体画分を保持するのに十分な条件で前記生体試料を前記捕捉表面と接触させる工程、および（ｃ）前記微小小胞体を前記捕捉表面または表面内に保持しつつ、前記微小小胞体画分を溶出させる工程を含む。前記溶出済み微小小胞体画分は、さらなる分析のために処理してもよい。必要に応じて、前記溶出済み微小小胞体画分を回転濃縮器で濃縮して、濃縮微小小胞体画分を得てもよい。態様によっては、次いで、前記核酸を前記濃縮微小小胞体画分から抽出する。
【００１５】
態様によっては、前記捕捉表面は膜である。一側面では、前記膜は、再生セルロースを含む。例えば、前記膜は孔径が少なくとも１μｍ、例えば、２〜５μｍの範囲である。態様によっては、前記膜は、孔径が３〜５μｍの範囲である。態様によっては、前記膜は、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）を含む。
【００１６】
態様によっては、前記膜は帯電している。態様によっては、前記膜は、正に帯電している。態様によっては、前記膜は、負に帯電している。
【００１７】
側面によっては、前記膜は官能化されている。例えば、前記膜は四級アンモニウムＲ−ＣＨ２−Ｎ＋（ＣＨ３）３で官能化される。
【００１８】
一態様では、前記捕捉表面は、１つより多い膜を含む。態様によっては、前記捕捉表面は、少なくとも２つの膜を含み、各膜は他の膜と隣接している。態様によっては、前記捕捉表面は、少なくとも３つの膜を含み、前記３つの膜のそれぞれは、互いに直接隣接している。態様によっては、前記捕捉表面は少なくとも４つの膜を含み、前記４つの膜のそれぞれは、互いに直接隣接している。
【００１９】
態様によっては、前記捕捉表面はビーズである。例えば、前記ビーズは磁性を有する。あるいは、前記ビーズは非磁性である。他の態様では、前記ビーズは親和性配位子で官能化される。
【００２０】
態様によっては、前記捕捉表面は、（１種以上の）重合体のスラリーである。態様によっては、前記（１種以上の）重合体のスラリーはビーズ状に成形される。
【００２１】
態様によっては、前記生体試料は血漿である。態様によっては、前記生体試料は血清である。態様によっては、前記生体試料は尿である。態様によっては、前記生体試料は脳脊髄液である。態様によっては、前記生体試料は細胞培地の上澄みである。
【００２２】
側面によっては、本明細書で記載される方法はさらに、前記生体試料を充填緩衝液と接触させる工程を含む。前記充填緩衝液のｐＨは４〜８の範囲である。一側面では、前記充填緩衝液のｐＨは中性である。
【００２３】
本明細書で記載される方法により、微小小胞体からの核酸が抽出される。抽出された核酸は、ＤＮＡおよび／またはＤＮＡおよびＲＮＡであることが好ましい。抽出されたＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、または小ＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ）、またはこれらの任意の組み合わせを含んでいてもよい。
【００２４】
様々な核酸配列決定技術を用いて、核酸（例えば、無細胞ＤＮＡおよび／または生体試料に由来する微小小胞体画分から抽出されたＲＮＡ）を検出して、分析する。微小小胞体を容易に回収することができる非侵襲性のために、診断目的で核酸（例えば、無細胞ＤＮＡおよび／または微小小胞体から抽出された核酸）を分析することは、さまざまな意味合いを持っている。侵襲性組織生検の代わりに微小小胞体分析を用いると、患者の福祉によい影響を及ぼし、長期的な病気の監視を行う能力を向上し、組織細胞が容易に入手できない場合（例えば、卵巣がんや脳がんの患者など）でも発現プロファイルを得る能力を向上させる。
【００２５】
態様によっては、本発明は、例えば、次世代配列決定（ＮＧＳ）アッセイを含む核酸配列決定技術のための工程内管理を提供して頻度の低い配列の多様体を検出する組成物および方法に関する。これらの工程内管理は多くの技術的利点をもたらす。
【００２６】
前記生体試料は体液である。前記体液は、対象者の体のいずれかの場所、好ましくは、周辺部位から単離された液体であってもよい。前記体液としては、例えば、血液、血漿、血清、尿、唾液、髄液、脳脊髄液、胸膜液、乳頭吸引液、リンパ液、呼吸管、腸管、および尿生殖路に含まれる体液、涙液、唾液、母乳、リンパ系由来の液体、精液、脳脊髄液、内臓系液、腹水、腫瘍嚢胞液、羊水、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、前記体液は、尿、血液、血清、または脳脊髄液である。
【００２７】
上記の方法のいずれかにおいて、前記核酸はＤＮＡおよび／またはＤＮＡおよびＲＮＡである。ＲＮＡとしては、メッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、小ＲＮＡ（非タンパク質コードＲＮＡ、非メッセンジャーＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、およびｓｎｏＲＮＡが挙げられる。
【００２８】
上記の方法のいずれかにおいて、前記核酸は、試料から単離された、あるいは試料に由来しており、試料の微小小胞体画分から単離されたＲＮＡを含む。
【００２９】
上記の方法のいずれかにおいて、前記核酸は、無細胞核酸である。無細胞核酸は、本明細書では、循環核酸とも言う。態様によっては、前記無細胞核酸はＤＮＡまたはＲＮＡである。
【００３０】
以下に、本発明の様々な側面および態様を詳細に記述する。自明であるが、本発明の範囲を逸脱することなく、これら詳細の修正を行うことが可能である。さらに、文脈により特に必要がなければ、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【００３１】
特定されたすべての特許、特許出願、および文献は、例えば、本発明に関連して用いられる可能性がある文献に記述された方法を記述および開示する目的で、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの文献は、本願の出願日の前に開示されたもののみが提供される。この点については何ら、本発明者らが、従来の発明のため、あるいは何らかの他の理由でそのような開示に先行する資格がないことを認めるとものと解釈するべきではない。これら文献の内容の日付および表現についてのすべての記述は、出願人に入手可能な情報に基づくものであり、これら文献の日付または内容について何らかの承認を行うものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】２つの個別のプロトコル（手順）を用いて微小小胞体画分を単離して、微小小胞体核酸を放出させ、ＲＮＡおよびＤＮＡを抽出するためのＲＮＡおよびＤＮＡ単離プロトコルの一態様を示す模式図である。
【図２】単一のプロトコルを用いて微小小胞体画分を単離して、微小小胞体核酸を放出させ、ＲＮＡおよびＤＮＡを抽出するためのＲＮＡおよびＤＮＡ単離プロトコルの他の態様を示す模式図である。
【図３】野生型ＢＲＡＦのＲＮＡおよびＤＮＡの検出により示されるように、１回の抽出で微小小胞体ＲＮＡおよびＤＮＡを単離するための相分離におけるクロロホルム濃度の効果を示すグラフである。
【図４】ＧＡＰＤＨのＲＮＡおよびＤＮＡの検出により示されるように、１回の抽出で微小小胞体ＲＮＡおよびＤＮＡを単離するための相分離におけるクロロホルム濃度の効果を示すグラフである。
【図５】相分離でのｐＨの調節がＤＮＡの抽出および検出に影響を及ぼすことを示すグラフである。
【図６】滴定する脳脊髄液（ＣＳＦ）の試料の体積の微小小胞体ＲＮＡの抽出および検出に及ぼす効果を示すグラフである。
【図７】超遠心分離およびＥＸＯ６０単離法で得た微小小胞体ＲＮＡ標的の検出の比較を示すグラフである。
【図８】超遠心分離およびＥＸＯ６０単離法により異なる患者のＣＳＦ試料から得た微小小胞体ＲＮＡ標的の検出の比較を示すグラフである。患者の試料は、患者ＩＤで示される。試料を様々な体積で用いた。（＊）は死体解剖試料を示す。
【図９】ＣＳＦ試料の体積（０．２５ｍｌ、０．５ｍｌ、１．０ｍｌ、および２．０ｍｌ）の、微小小胞体ＲＮＡの異なる単離および抽出方法に及ぼす効果を示すグラフである。ＵＣ（超遠心分離）、ｕＣＳＣ（尿ろ過法）、およびＥＸＯ６０。
【図１０】ＥＸＯ７０プロトコルを用いて２つの異なる尿試料から抽出されたＲＮＡのプロファイルを尿循環幹細胞（ｕＣＳＣ）法によるものと比較したバイオアナライザーによる一連のプロットである。
【図１１】ＥＸＯ７０で単離および抽出した後のＲＮＡの検出と、尿ＣＳＣ法で単離および抽出した後のＲＮＡの検出との相関関係を示すグラフである。
【図１２】ＥＸＯ７０またはｕＣＳＣ法で単離および抽出した後の異なるＲＮＡ標的の検出を示す２つのグラフである。単離された微小小胞体画分（ＥＸＯ７０またはｕＣＳＣ）および単離後の通過画分または上澄み画分（ＥＸＯ７０フローまたはｕＣＳＣフロー）からＲＮＡを抽出して分析した。（Ａ）ｍＲＮＡ標的、（Ｂ）ｍｉＲＮＡ標的。
【図１３】ＰＬＧ管を用いた場合と用いない場合のＤＮＡ抽出を評価するように設計された研究の模式図である。なお、図１３〜図２２３は、市販の循環核酸単離キット（本明細書では市販のＣＮＡキットとも言う）と比較したＥＸ０５２のＤＮＡおよびＲＮＡ単離および抽出法の感度および特異性を示す一連のグラフおよび図である。
【図１４】ＤＮＡ／ＲＮＡ単離の初期の方法（ＥＸ０５２．１）および市販のキットを用いたＤＮＡ抽出（ＰＬＧ管を用いた場合と用いない場合）を示す一連のグラフである。
【図１５】ＤＮＡ／ＲＮＡ単離の初期の方法（ＥＸ０５２．１）および市販のキットを用いたＤＮＡ抽出（ＰＬＧ管を用いた場合と用いない場合）を示す一連のグラフである。
【図１６】ＤＮＡ／ＲＮＡ単離の初期の方法（ＥＸ０５２．１）および市販のキットを用いたＤＮＡ抽出（ＰＬＧ管を用いた場合と用いない場合）を示す一連のグラフである。
【図１７】ＤＮＡ／ＲＮＡ単離の初期の方法（ＥＸ０５２．１）および市販のキットを用いたＤＮＡ抽出（ＰＬＧ管を用いた場合と用いない場合）を示す一連のグラフである。
【図１８】本開示の方法と市販の循環核酸抽出キットを用いたＤＮＡ抽出を示す一連のグラフである。
【図１９】本開示の方法と市販の循環核酸抽出キットを用いたＤＮＡ抽出を示す一連のグラフである。
【図２０】クロロホルム滴定の、フェノール相でのＲＮＡ単離およびＤＮＡ単離に及ぼす効果を示すグラフである。
【図２１】クロロホルム滴定の、ＰＬＧ管内のフェノール相によるＲＮＡ単離およびＤＮＡ単離の効果を評価するように設計された研究の模式図である。
【図２２】クロロホルム滴定の、ＲＮＡ単離（図２２）、ＲＮＡ単離およびＤＮＡ単離（図２３、図２４）、ならびにＤＮＡ単離（図２５、図２６）に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図２３】クロロホルム滴定の、ＲＮＡ単離（図２２）、ＲＮＡ単離およびＤＮＡ単離（図２３、図２４）、ならびにＤＮＡ単離（図２５、図２６）に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図２４】クロロホルム滴定の、ＲＮＡ単離（図２２）、ＲＮＡ単離およびＤＮＡ単離（図２３、図２４）、ならびにＤＮＡ単離（図２５、図２６）に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図２５】クロロホルム滴定の、ＲＮＡ単離（図２２）、ＲＮＡ単離およびＤＮＡ単離（図２３、図２４）、ならびにＤＮＡ単離（図２５、図２６）に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図２６】クロロホルム滴定の、ＲＮＡ単離（図２２）、ＲＮＡ単離およびＤＮＡ単離（図２３、図２４）、ならびにＤＮＡ単離（図２５、図２６）に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図２７】ＲＮｅａｓｙプロトコル（ＰＬＧ管を用いずに）およびクロロホルム滴定を用いたＤＮＡ単離を示すグラフである。
【図２８】ＰＬＧ管を用いない、クロロホルム滴定によるＤＮＡ単離を評価するように設計された研究の模式図である。
【図２９】ＲＮｅａｓｙプロトコル（ＰＬＧ管を用いずに）およびクロロホルム滴定を用いたＤＮＡ単離を示す一連のグラフである。
【図３０】ＲＮｅａｓｙプロトコル（ＰＬＧ管を用いずに）およびクロロホルム滴定を用いたＤＮＡ単離を示す一連のグラフである。
【図３１】ＲＮｅａｓｙプロトコル（ＰＬＧ管を用いずに）およびクロロホルム滴定を用いたＤＮＡ単離を示す一連のグラフである。
【図３２】調整したクロロホルムを添加して、ＤＮＡおよびＲＮＡを共単離することを示すグラフである。
【図３３】ＰＬＧ管を用いない、クロロホルム滴定によるＤＮＡ単離を評価するように設計された研究の模式図である。
【図３４】ＲＮｅａｓｙプロトコル（ＰＬＧ管を用いずに）およびクロロホルム滴定を用いたＤＮＡ単離を示す一連のグラフである。
【図３５】ＲＮｅａｓｙプロトコル（ＰＬＧ管を用いずに）およびクロロホルム滴定を用いたＤＮＡ単離を示す一連のグラフである。
【図３６】ＲＮｅａｓｙプロトコル（ＰＬＧ管を用いずに）およびクロロホルム滴定を用いたＤＮＡ単離を示す一連のグラフである。
【図３７】ＲＮｅａｓｙプロトコル（ＰＬＧ管を用いずに）およびクロロホルム滴定を用いたＤＮＡ単離を示す一連のグラフである。
【図３８】ＲＮｅａｓｙプロトコル（ＰＬＧ管を用いずに）およびクロロホルム滴定を用いたＤＮＡ単離を示す一連のグラフである。
【図３９】ＲＮｅａｓｙプロトコル（ＰＬＧ管を用いずに）およびクロロホルム滴定を用いたＤＮＡ単離を示す一連のグラフである。
【図４０】ＲＮｅａｓｙプロトコル（ＰＬＧ管を用いずに）およびクロロホルム滴定を用いたＤＮＡ単離を示す一連のグラフである。
【図４１】ＲＮｅａｓｙプロトコル（ＰＬＧ管を用いずに）およびクロロホルム滴定を用いたＤＮＡ単離を示す一連のグラフである。
【図４２】ＲＮｅａｓｙプロトコル（ＰＬＧ管を用いずに）およびクロロホルム滴定を用いたＤＮＡ単離を示す一連のグラフである。
【図４３】ＲＮｅａｓｙプロトコル（ＰＬＧ管を用いずに）およびクロロホルム滴定を用いたＤＮＡ単離を示す一連のグラフである。
【図４４】ＲＮｅａｓｙプロトコル（ＰＬＧ管を用いずに）およびクロロホルム滴定を用いたＤＮＡ単離を示す一連のグラフである。
【図４５】相分離におけるｐＨ変化のＤＮＡ単離に及ぼす効果を示すグラフである。
【図４６】ｐＨ滴定による水相からのＤＮＡ単離を評価するように設計された研究の模式図である。
【図４７】ｐＨ調整液を調製する方法を示す模式図である。
【図４８】単離されたＲＮＡおよびＤＮＡのＮａｌａ増幅曲線を示すグラフである。
【図４９】ｐＨ滴定の、水相からのＤＮＡ単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図５０】ｐＨ滴定の、水相からのＤＮＡ単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図５１】ｐＨ滴定の、水相からのＤＮＡ単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図５２】ｐＨ滴定の、水相からのＤＮＡ単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図５３】ｐＨ滴定の、水相からのＤＮＡ単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図５４】ｐＨ滴定の、水相からのＤＮＡ単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図５５】水相のＤＮＡ含有量を決定するのにクロロホルムの添加が重要な因子であることを示すグラフである。
【図５６】ＤＮＡ単離を添加してもＲＮＡ信号は影響されないことを示すグラフである。
【図５７】ｐＨ溶液を添加または未添加の場合のクロロホルム滴定による水相からのＤＮＡ単離を評価するように設計された研究の模式図である。
【図５８】ｐＨ調整液を調製する方法を示す模式図である。
【図５９】ｐＨ溶液を添加または未添加の場合のクロロホルム滴定の、水相からのＤＮＡ単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図６０】ｐＨ溶液を添加または未添加の場合のクロロホルム滴定の、水相からのＤＮＡ単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図６１】ｐＨ溶液を添加または未添加の場合のクロロホルム滴定の、水相からのＤＮＡ単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図６２】ｐＨ溶液を添加または未添加の場合のクロロホルム滴定の、水相からのＤＮＡ単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図６３】ｐＨ溶液を添加または未添加の場合のクロロホルム滴定の、水相からのＤＮＡ単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図６４】ｐＨ溶液を添加または未添加の場合のクロロホルム滴定の、水相からのＤＮＡ単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図６５】ｐＨ溶液を添加または未添加の場合のクロロホルム滴定の、水相からのＤＮＡ単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図６６】ｐＨ溶液を添加または未添加の場合のクロロホルム滴定の、水相からのＤＮＡ単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図６７】ｐＨ溶液を添加または未添加の場合のクロロホルム滴定の、水相からのＤＮＡ単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図６８】ｐＨ溶液を添加または未添加の場合のクロロホルム滴定の、水相からのＤＮＡ単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図６９】４℃または室温でのＱｉａｚｏｌスピン工程の、市販のキットを用いたＲＮＡ単離に及ぼす効果を示すグラフである。
【図７０】４℃または室温でのＱｉａｚｏｌスピン工程の、本開示の方法に及ぼす効果を示すグラフである。
【図７１】４℃または室温でのＱｉａｚｏｌスピン工程で市販のキットを用いたＲＮＡ単離を評価するように設計された研究の模式図、およびその要約である。
【図７２】４℃または室温でのＱｉａｚｏｌスピン工程で市販のキットを用いたＲＮＡ単離を評価するように設計された研究の模式図、およびその要約である。
【図７３】４℃または室温でのＱｉａｚｏｌスピン工程の、市販のキットに及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図７４】４℃または室温でのＱｉａｚｏｌスピン工程の、市販のキットに及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図７５】４℃または室温でのＱｉａｚｏｌスピン工程の、市販のキットに及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図７６】４℃または室温でのＱｉａｚｏｌスピン工程でＥＸ０５２法によるＲＮＡ単離を評価するための研究の模式図、およびその要約である。
【図７７】４℃または室温でのＱｉａｚｏｌスピン工程でＥＸ０５２法によるＲＮＡ単離を評価するための研究の模式図、およびその要約である。
【図７８】４℃または室温でのＱｉａｚｏｌスピン工程の、本開示の方法に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図７９】４℃または室温でのＱｉａｚｏｌスピン工程の、本開示の方法に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図８０】原文に記載なし。
【図８１】エタノールの体積を１．５倍から２．６倍の間で変化させることの効果を評価するように設計された研究の模式図である。エタノールの体積を１．５倍から２．６倍の間で変化させることによる、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図８２】エタノールの体積を１．５倍から２．６倍の間で変化させることの効果を評価するように設計された研究の模式図である。エタノールの体積を１．５倍から２．６倍の間で変化させることによる、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図８３】結合工程の前に室温でプロテイナーゼＫ（ＰｒｏｔＫ）消化を行った結果を示すグラフである。
【図８４】結合工程の前の室温でのＰｒｏｔＫ消化を評価するように設計された研究の模式図である。
【図８５】結合工程の前に室温でＰｒｏｔＫ消化を行った結果を示す一連のグラフである。
【図８６】結合工程の前に室温でＰｒｏｔＫ消化を行った結果を示す一連のグラフである。
【図８７】充填量が血漿８ｍＬ超であることを示すグラフである。
【図８８】通過画分は、血漿８ｍＬまで突破点がないことを示すグラフである。
【図８９】エキソソームおよびヌクレオソームの異なる結合量を示すグラフである。
【図９０】充填量を評価するように設計された研究の模式図である。
【図９１】エキソソームおよびヌクレオソームの異なる結合量を示すグラフである。
【図９２】充填量が血漿８ｍＬ超であることを示す一連のグラフである。
【図９３】充填量が血漿８ｍＬ超であることを示す一連のグラフである。
【図９４】通過画分は、血漿８ｍＬまで突破点がないことを示すグラフである。
【図９５】血漿の充填体積を変化させることの、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図９６】血漿の充填体積を変化させることの、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図９７】血漿の充填体積を変化させることの、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図９８】通過画分は、血漿８ｍＬまで突破点がないことを示すグラフである。
【図９９】血漿の充填体積を変化させることの、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図１００】血漿の充填体積を変化させることの、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図１０１】エキソソームおよびヌクレオソームの異なる結合量を示す一連のグラフである。
【図１０２】エキソソームおよびヌクレオソームの異なる結合量を示す一連のグラフである。
【図１０３】エキソソームおよびヌクレオソームの異なる結合量を示す一連のグラフである。
【図１０４】エキソソームおよびヌクレオソームの異なる結合量を示す一連のグラフである。
【図１０５】エキソソームおよびヌクレオソームの異なる結合量を示す一連のグラフである。
【図１０６】エキソソームおよびヌクレオソームの異なる結合量を示す一連のグラフである。
【図１０７】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１０８】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１０９】本開示の方法によるｃｆＤＮＡの単離を市販のキットを用いたものと比較するように設計された研究の模式図である。
【図１１０】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いたｃｆＤＮＡの単離を比較するように設計された研究の模式図、およびその要約である。
【図１１１】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いたｃｆＤＮＡの単離を比較するように設計された研究の模式図、およびその要約である。
【００３３】
【図１１２】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いたｃｆＤＮＡの単離を示す一連のグラフである。
【図１１３】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いたｃｆＤＮＡの単離を示す一連のグラフである。
【図１１４】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いたｃｆＤＮＡの単離を示す一連のグラフである。
【図１１５】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いたｃｆＤＮＡの単離を示す一連のグラフである。
【図１１６】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いたｃｆＤＮＡの単離を示す一連のグラフである。
【図１１７】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いたｃｆＤＮＡの単離を示す一連のグラフである。
【図１１８】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いたｃｆＤＮＡの単離を示す一連のグラフである。
【図１１９】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いたｃｆＤＮＡの単離を示す一連のグラフである。
【図１２０】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いたｃｆＤＮＡの単離を示す一連のグラフである。
【図１２１】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いたｃｆＤＮＡの単離を示す一連のグラフである。
【図１２２】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いたｃｆＤＮＡの単離を示す一連のグラフである。
【図１２３】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いたｃｆＤＮＡの単離を示す一連のグラフである。
【図１２４】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術のｃｆＤＮＡコピー数（複製数）の比較を示す一連のグラフおよび表である。
【図１２５】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術のｃｆＤＮＡコピー数（複製数）の比較を示す一連のグラフおよび表である。
【図１２６】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術のｃｆＤＮＡコピー数（複製数）の比較を示す一連のグラフおよび表である。
【図１２７】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術のｃｆＤＮＡコピー数（複製数）の比較を示す一連のグラフおよび表である。
【図１２８】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術のｃｆＤＮＡコピー数（複製数）の比較を示す一連のグラフおよび表である。
【図１２９】単離されたＤＮＡおよびＲＮＡの下流分析でのAllPrepマイクロキットの使用を評価するように設計された研究の模式図および要約である。
【図１３０】単離されたＤＮＡおよびＲＮＡの下流分析でのAllPrepマイクロキットの使用を評価するように設計された研究の模式図および要約である。
【図１３１】単離されたＤＮＡおよびＲＮＡの下流分析でのAllPrepマイクロキットの使用を評価するように設計された研究の模式図および要約である。
【図１３２】単離されたＤＮＡおよびＲＮＡの下流分析でのAllPrepマイクロキットの使用を示す一連のグラフである。
【図１３３】単離されたＤＮＡおよびＲＮＡの下流分析でのAllPrepマイクロキットの使用を示す一連のグラフである。
【図１３４】単離されたＤＮＡおよびＲＮＡの下流分析でのAllPrepマイクロキットの使用を示す一連のグラフである。
【図１３５】単離されたＤＮＡおよびＲＮＡの下流分析でのAllPrepマイクロキットの使用を示す一連のグラフである。
【図１３６】単離されたＤＮＡおよびＲＮＡの下流分析でのAllPrepマイクロキットの使用を示す一連のグラフである。
【図１３７】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１３８】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１３９】本開示の方法および市販のキットを用いて単離されたｃｆＤＮＡを比較するように設計された研究の模式図である。
【図１４０】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１４１】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１４２】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１４３】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１４４】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１４５】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１４６】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１４７】本開示の方法および市販のキットを用いて単離されたｃｆＤＮＡを比較するように設計された研究の模式図である。
【図１４８】本開示の方法および市販のキットを用いて単離されたｃｆＤＮＡを比較するように設計された研究の模式図である。
【図１４９】本開示の方法および市販のキットを用いて単離されたｃｆＤＮＡを比較するように設計された研究の模式図である。
【図１５０】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１５１】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１５２】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１５３】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１５４】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１５５】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１５６】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１５７】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１５８】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１５９】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１６０】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１６１】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１６２】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１６３】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１６４】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１６５】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１６６】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１６７】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１６８】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１６９】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１７０】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１７１】本開示の方法が一貫して市販のｃＮＡキットより優れていることを示す一連のグラフである。
【図１７２】本開示の方法および市販のキットを用いて単離されたｃｆＤＮＡを比較するように設計された研究の模式図である。
【図１７３】本開示の方法および市販のキットを用いて単離されたｃｆＤＮＡを比較するように設計された研究の模式図である。
【図１７４】本開示の方法および市販のキットを用いて単離されたｃｆＤＮＡを比較するように設計された研究の模式図である。
【図１７５】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１７６】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１７７】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１７８】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１７９】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１８０】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１８１】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１８２】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１８３】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１８４】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１８５】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１８６】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１８７】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１８８】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１８９】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１９０】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１９１】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１９２】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１９３】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１９４】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１９５】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１９６】本開示の方法および市販のキットを含む異なる単離技術を用いた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離を示す一連のグラフである。
【図１９７】複数の個別のＱｉａｚｏｌ溶出工程の、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離に及ぼす効果示すグラフである。
【図１９８】複数のＱｉａｚｏｌ溶出工程を用いたＤＮＡおよびＲＮＡの単離を評価するように設計された研究の模式図である。
【図１９９】複数の個別のＱｉａｚｏｌ溶出工程の、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図２００】複数の個別のＱｉａｚｏｌ溶出工程の、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図２０１】複数の個別のＱｉａｚｏｌ溶出工程の、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図２０２】複数の個別のＱｉａｚｏｌ溶出工程の、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図２０３】複数のＱｉａｚｏｌ溶出工程を用いたＤＮＡおよびＲＮＡの単離を評価するように設計された研究の模式図である。
【図２０４】複数の個別のＱｉａｚｏｌ溶出工程の、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図２０５】複数の個別のＱｉａｚｏｌ溶出工程の、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図２０６】複数の個別のＱｉａｚｏｌ溶出工程の、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図２０７】エタノール沈殿を伴う二重ＲＮｅａｓｙ充填工程の、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離に及ぼす効果を示すグラフである。
【図２０８】エタノール沈殿を伴う二重ＲＮｅａｓｙ充填工程によるＤＮＡおよびＲＮＡの単離を評価するように設計された研究の模式図、およびその要約である。
【図２０９】エタノール沈殿を伴う二重ＲＮｅａｓｙ充填工程によるＤＮＡおよびＲＮＡの単離を評価するように設計された研究の模式図、およびその要約である。
【図２１０】エタノール沈殿を伴う二重ＲＮｅａｓｙ充填工程の、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図２１１】エタノール沈殿を伴う二重ＲＮｅａｓｙ充填工程の、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図２１２】異なる下流カラムの、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離に及ぼす効果を示すグラフである。
【図２１３】異なる下流カラムを用いたＤＮＡおよびＲＮＡの単離を評価するように設計された研究の模式図である。
【図２１４】異なる下流カラムの、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図２１５】異なる下流カラムの、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図２１６】異なる下流カラムの、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図２１７】異なる下流カラムの、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図２１８】原文に記載なし。
【図２１９】複数のＲＮｅａｓｙ溶出工程によりＤＮＡおよびＲＮＡの単離を評価するように設計された研究の模式図である。
【図２２０】複数のＲＮｅａｓｙ溶出工程のＤＮＡおよびＲＮＡの単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図２２１】複数のＲＮｅａｓｙ溶出工程のＤＮＡおよびＲＮＡの単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図２２２】複数のＲＮｅａｓｙ溶出工程のＤＮＡおよびＲＮＡの単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図２２３】複数のＲＮｅａｓｙ溶出工程のＤＮＡおよびＲＮＡの単離に及ぼす効果を示す一連のグラフである。
【図２２４】血漿中の核酸のサイズ分布を示す一連のグラフである。１ｍＬの血漿から単離された全核酸に対して、ＲＮＡ分解酵素Ａでの消化（「ｃｆＤＮＡ」）、ＤＮＡ分解酵素Ｉでの消化（「ｅｘｏＲＮＡ」）、または偽の（ｍｏｃｋ）処理（「ＥＸ０５２」）を行った。反応が終わった後、単離分に存在する核酸のサイズ分布をBioanalyzer Pico 6000アッセイで測定した。
【図２２５】２ｍｌの血漿からの核酸の連続単離を示すグラフである。ＥＸ０５２カラムに健康な提供者由来の血漿を通して、通過画分に残った材料を市販のｅｘｏＲＮｅａｓｙキット（ＲＮＡ）または市販の循環核酸キット（ＤＮＡ）を用いて単離した。ＢＲＡＦ、ＫＲＡＳ、および１８Ｓ遺伝子に対する（ＲＴ）−定量ＰＣＲを用いて、ΔＣＴの関数として全収量をＥＸ０５２（ＲＮＡ＋ＤＮＡ）と比較した。エラーバーは、３つの全く同じ試料の単離物を示す。
【図２２６】ｅｘｏＲＮＡおよびｃｉＤＮＡのいずれも、血漿から採取した総核酸に実質的に寄与することを示す一連のグラフである。市販のｅｘｏＲＮｅａｓｙキット（ＲＮＡ）または逆転写工程を含む（ＲＮＡ＋ＤＮＡ）または含まない（ＤＮＡ）ＥＸ０５２単離のいずれかを用いて、健康な提供者に由来する１ｍＬの血漿を単離した。ＲＴ−定量ＰＣＲによる絶対定量化を箱ひげ図として示す。これは、個々の提供者を形状としてプロットして、血漿１ｍＬあたりのコピー数の中央値を示している。
【図２２７】総循環核酸を捕捉する本明細書で提供されるＥＸ０５２法の能力を示す一連のグラフである。ＥＸ０５２法は、市販の循環核酸ＤＮＡ単離キットと比較した。
【図２２８】総循環核酸を捕捉する本明細書で提供されるＥＸ０５２法の能力を示す一連のグラフである。ＥＸ０５２法は、市販の循環核酸ＤＮＡ単離キットと比較した。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
発明の詳細な説明
本発明は、表面にＤＮＡおよび微小小胞体を捕捉し、次いで前記微小小胞体を溶解して核酸、特に前記微小小胞体に含まれるＲＮＡを放出させて、前記捕捉表面からＤＮＡおよび／またはＤＮＡおよび少なくともＲＮＡを含む核酸を溶解させて、前記微小小胞体から無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）および／またはｃｆＤＮＡおよび少なくともＲＮＡを含む核酸を単離する方法を提供する。微小小胞体は、細胞の外へ、真核細胞から放出される、あるいは細胞膜から出芽して放出される。これらの膜小胞は、サイズが不均質であり、直径が約１０ｎｍ〜約５０００ｎｍの範囲に渡る。本明細書では、直径が０．８μｍ未満の細胞から放出されるすべての膜小胞をまとめて「微小小胞体」と言う。これら微小小胞体としては、微小小胞体、微小小胞状粒子、プロスタソーム、デキソソーム、テキソソーム、エクトソーム、オンコソーム、アポトーシス小体、レトロウイルス状粒子、およびヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）粒子が挙げられる。当該分野では、細胞内多胞体のエキソサイトーシス（開口放出）によって放出される小さい微小小胞体（直径が約１０〜１０００ｎｍ、３０〜２００ｎｍであることが多い）を「微小小胞体」と言う。
【００３５】
微小小胞体からＤＮＡおよび／またはＤＮＡおよび少なくともＲＮＡを含む核酸単離する現在の方法としては、超遠心分離、例えば、１００ｋＤの濾過器を用いた限外濾過、重合体沈殿技術、および／または粒径に基づく濾過などが挙げられる。しかしながら、診断目的を含む様々な用途で用いるための微小小胞体を単離し、必要に応じて微小小胞体に含まれる核酸、好ましくは微小小胞体ＲＮＡを抽出するのに効率的かつ有効な別の方法が求められている。
【００３６】
本明細書でＥＸ０５２  ＤＮＡおよび／またはＤＮＡおよびＲＮＡ単離法および／またはキットと言う単離および抽出方法および／またはキットは、無細胞ＤＮＡおよび／または微小小胞体に結合する親和性膜を用いたスピン式カラムによる精製過程を採用している。本開示の方法およびキットは、単一カラムで０．２〜４ｍＬの体積を用いて多数の臨床試料を並行して操作する能力がある。ＥＸ０５２手順を用いて単離された無細胞ＤＮＡは非常に純度が高い。単離されたＲＮＡは非常に純度が高く、溶解までは小胞膜で保護されており、無傷の小胞をＥＸ０５２膜から溶出することができる。ＥＸ０５２手順は、血漿入力から実質的にすべての無細胞ＤＮＡを使い尽くすことができ、市販の循環ＤＮＡ単離キットに比べてＤＮＡの収量は同じまたはそれ以上である。ＥＸ０５２手順は、血漿入力から実質的にすべてのｍＲＮＡを使い尽くすことができ、超遠心分離または直接溶解に比べてｍＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ収量は同じまたはそれ以上である。市販のキットおよび／または従来の単離方法に比べて、ＥＸ０５２法および／またはキットは、ｍｉＲＮＡの微小小胞体結合画分が豊富であり、入力材料の量を容易に増やすことができる。この量を増やす能力により、目的の量の少ない転写物の研究が可能になる。市場にある他の市販品と比べて、本開示の方法およびキットは、本明細書で提供される実施例で示される固有の能力を提供する。
【００３７】
ＥＸ０５２法およびキットは、以下の一般的な手順を用いて生体試料から核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＤＮＡおよび少なくともＲＮＡを含む核酸）を単離および抽出する。まず、ｃｆＤＮＡおよび微小小胞体画分を含む試料をメンブレンフィルターに結合させて、このフィルターを洗浄する。次いで、フェノール系試薬を用いて膜上の溶解を行い、核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＤＮＡおよびＲＮＡ）を放出させる。次いで、ＰＬＧ管を用いてクロロホルムで抽出し、エタノールで調整する。次いで、核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＤＮＡおよびＲＮＡ）をシリカカラムに結合させて、洗浄し、溶出する。様々な下流のアッセイのいずれかにより、抽出した核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＤＮＡおよびＲＮＡ）をさらに分析してもよい。
【００３８】
態様によっては、前記方法は以下の工程を含む。前記フィルターは、スピンカラムに含まれている。溶解試薬を添加する前に、前記試料をスピンカラムのメンブレンフィルターに結合させて、このスピンカラムを約５００×ｇで１分間回転させる。通過画分を捨てて、緩衝液をスピンカラムに添加する。スピンカラムを再度、約５０００×ｇで５分間回転させて、残留量をカラムから取り出す。この２回目の回転後、通過画分を捨てる。次いで、スピンカラムをフェノール系溶解試薬と接触させて、約５０００×ｇで５分間回転させて、溶解した微小小胞体および捕捉されたｃｆＤＮＡを含む均質液を回収する。態様によっては、前記溶解緩衝液は、フェノール系溶解緩衝液である。例えば、前記溶解緩衝液はＱＩＡｚｏｌ（登録商標）溶解試薬（Ｑｉａｇｅｎ）である。次いで、この均質液からの核酸を単離および抽出する。態様によっては、核酸の単離および抽出の前にＲＮＡ単離効率のための対照（例えば、本明細書で記載するＱβまたは任意の他の対照）を均質液と混合する。
【００３９】
態様によっては、核酸を次の工程に従って単離する。溶解試薬を添加した後、クロロホルムを均質液に添加して、その溶液を短時間激しく混合する。態様によっては、３５０μｌのクロロホルムを均質液に添加する。次いで、その溶液を４℃、１２，０００×ｇで５分間遠心分離する。次いで、上の水相を新しい回収管に移して、この上の水相に１００％エタノールを２体積に添加して、溶液を混合する。次いで、核酸を単離および／または抽出するための当該技術で認められた様々な方法のいずれかによりこの溶液を処理してもよい。
【００４０】
次いで、単離された核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＤＮＡおよびＲＮＡ）を様々な下流のアッセイのいずれかを用いてさらに分析してもよい。態様によっては、ＤＮＡおよびＲＮＡの同時検出を用いて、起こりうる変異に対する感度を高める。循環核酸には検出可能な変異の複数の考え得る供給源がある。例えば、生きている腫瘍細胞は、試料の微小小胞体画分から単離された考え得るＲＮＡおよびＤＮＡの供給源である。死んだ腫瘍細胞は、無細胞ＤＮＡ源（例えば、アポトーシス性小胞ＤＮＡおよび壊死腫瘍細胞の無細胞ＤＮＡなど）考え得る供給源である。変異した核酸の頻度は、循環血液中では比較的低いので、検出感度を最大にすることは非常に重要になる。ＤＮＡおよびＲＮＡの同時単離により、病気の進行および治療に対する患者の応答を評価するための包括的な臨床情報が得られる。しかしながら、本明細書で提供される方法およびキットに比べて、血液を循環する核酸を検出する市販のキットは、血漿由来の、すなわち死んだ細胞由来のｃｆＤＮＡのみを単離することができる。図２２７〜図２２８で示されるように、ＥＸ０５２ではすべてのｃｆＤＮＡが捕捉された。また、ＥＸ０５２では、ｃｆＤＮＡのみと比べて、ｅｘｏＲＮＡとｃｆＤＮＡを組み合わせた場合でより多数のコピーが検出された。当業者には自明であるが、変異またはその他の生体指標のコピーが多い程、変異およびその他の生体指標の同定の感度と正確度が高まる。
【００４１】
本明細書で用いられる用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡを指す。核酸は、一本鎖または二本鎖であってもよい。いくつかの例では、核酸はＤＮＡである。いくつかの例では、核酸はＲＮＡである。ＲＮＡとしては、メッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、非コードＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびＨＥＲＶ元素が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
本明細書で用いられる用語「生体試料」は、生体材料（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質）を含む試料を指す。
【００４３】
態様によっては、前記生体試料は対象由来の体液を好適に含んでいてもよい。前記体液は、対象の体のいずれかの場所、例えば周辺部位から単離された液体であってもよい。前記体液としては、例えば、血液、血漿、血清、尿、唾液、髄液、脳脊髄液、胸膜液、乳頭吸引液、リンパ液、呼吸管、腸管、および尿生殖路に含まれる体液、涙液、唾液、母乳、リンパ系由来の液体、精液、内臓系液、腹水、腫瘍嚢胞液、羊水、細胞培地の上澄み、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。生体試料はまた、糞便試料または盲腸試料、あるいはこれらから単離された上澄みを含む場合がある。
【００４４】
態様によっては、前記生体試料は、細胞培地の上澄みを好適に含んでいてもよい。
【００４５】
態様によっては、前記生体試料は、対象由来の組織試料を好適に含んでいてもよい。前記組織試料は、対象の体のいずれかの場所から単離されてもよい。
【００４６】
体液の好適な試料体積は、例えば、体液が約０．１ｍｌ〜約３０ｍｌの範囲である。体液の体積は、いくつかの因子、例えば、用いる体液の種類に依存していてもよい。例えば、血清試料の体積は約０．１ｍｌ〜約４ｍｌであってもよく、約０．２ｍｌ〜４ｍｌが好ましい。血漿試料の体積は、約０．１ｍｌ〜約４ｍｌであってもよく、０．５ｍｌ〜４ｍｌが好ましい。尿試料の体積は、約１０ｍｌ〜約３０ｍｌであってもよく、約２０ｍｌが好ましい。
【００４７】
本明細書で提供される実施例では血漿試料を用いたが、当業者には自明であるが、これらの方法は様々な生体試料に適用可能である。
【００４８】
本開示の方法およびキットは、ヒト対象に由来する試料に用いるのに好適である。本開示の方法およびキットは、ヒト対象に由来する試料に用いるのに好適である。また、本開示の方法およびキットは、ヒト対象に由来する試料に用いるのに好適である。本開示の方法およびキットは、非ヒト対象（例えば、齧歯動物、非ヒト霊長類、ペット動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマ）、および／または家畜（例えば、ニワトリ））に由来する試料に用いるのに好適である。
【００４９】
用語「対象」は、核酸を含む粒子を有することが示された、あるいは期待されるすべての動物を含むものとする。特定の態様では、前記対象は、哺乳類、ヒトまたは非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、他の家畜、または齧歯動物（例えばマウス、ラット、モルモットなど）である。ヒト対象は、観察可能な異常（例えば、病気）がない健常なヒトであってもよい。ヒト対象は、観察可能な異常（例えば、病気）を有するヒトであってもよい。前記観察可能な異常は、ヒト自身によって、あるいは医療専門家によって観察されてもよい。用語「対象」、「患者」、および「個体」は、本明細書ではお互いに言い換え可能である。
【００５０】
本明細書で提供される実施例では膜を捕捉表面として用いているが、自明であるが、捕捉表面（例えば、ビーズまたはフィルター、本明細書では膜とも言う）の形態は、本明細書で提供される方法の、生体試料から微小小胞体を効率的に捕捉する能力に影響を及ぼさない。
【００５１】
本明細書で提供される実施例では抽出工程にクロロホルムを用いているが、当業者には自明であるが、核酸抽出でクロロホルムと同じ役割を果たすいずれの化学物質も本明細書で提供される方法に用いることができる。抽出工程に用いられる好適な薬品としては、ジクロロメタン、トルエン、ヘキサン、ＭＴＢＥ、および酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
広範囲の捕捉表面が本明細書で提供される方法に従って微小小胞体を捕捉することができるが、すべての捕捉表面が微小小胞体を捕捉するわけではない（何も捕捉しない表面もある）。
【００５３】
本開示ではまた、使い捨てのプラスチック部品および遠心分離器を用いて生体試料または臨床試料から微小小胞体を単離して濃縮する装置について記載される。例えば、前記装置は、捕捉表面（すなわち、メンブレンフィルター）を含むカラム、外部フリットと内管の間で捕捉表面を固定するホルダー、および回収管を含む。外部フリットは、液体が通過できる大きな網目構造を含み、カラムの一方の端にあることが好ましい。内管は捕捉表面を所定位置に保持し、わずかに円錐形であることが好ましい。回収管は、市販の、すなわち５０ｍｌのＦａｌｃｏｎ管であってもよい。カラムは回転に好適であることが好ましい。すなわち、そのサイズは、標準的な遠心分離器およびマイクロ遠心分離器と相性がよいことが好ましい。
【００５４】
前記捕捉表面が膜である態様では、生体試料から前記微小小胞体画分を単離する装置は少なくとも１つの膜を含む。態様によっては、前記装置は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの膜を含む。態様によっては、前記装置は３つの膜を含む。前記装置が１つより多い膜を含む態様では、これらの膜はすべて、カラムの一方で互いに直接隣接している。前記装置が１つより多い膜を含む態様では、これらの膜はすべて、互いに同一、すなわち、同じ電荷を持つ、かつ／または同じ官能基を有する。
【００５５】
なお、微小小胞体より小さい孔径で濾過しての捕捉は、本明細書で提供される方法での捕捉の一次反応機構ではない。しかしながら、それにもかかわらず、フィルターの孔径は重要である。というのも、例えばｍＲＮＡは２０ｎｍフィルターにひっかかって回収できないが、マイクロＲＮＡは容易に溶出させることができるためである。また、例えば、フィルターの孔径は利用可能な表面捕捉面積の重要なパラメータであるためである。
【００５６】
本明細書で提供される方法では様々な捕捉表面のいずれかが用いられる。態様によっては、前記捕捉表面は膜（本明細書では、フィルターまたはメンブレンフィルターとも言う）である。態様によっては、前記捕捉表面は市販の膜である。態様によっては、前記捕捉表面は市販の帯電膜である。態様によっては、前記捕捉表面は中性である。態様によっては、前記捕捉表面は、Mustang（登録商標）イオン交換膜（ポール社製）、Vivapure（登録商標）Ｑ膜（Sartorius AG製）、Sartobind QまたはVivapure（登録商標）Q Maxi H、Sartobind（登録商標）D（Sartorius AG製）、Sartobind (S)（Sartorius AG製）、Sartobind（登録商標）Q（Sartorius AG製）、Sartobind（登録商標）IDA（Sartorius AG製）、Sartobind（登録商標）Aldehyde（Sartorius AG製）、Whatman（登録商標）DE81（Sigma）、Fast Trap Virus精製カラム（EMDミリポア社製）、サーモサイエンティフィック* Pierce Strong Cation and Anion Exchange（強陽イオン・陰イオン交換）スピンカラムから選択される。
【００５７】
前記捕捉表面が電荷を帯びている態様では、前記捕捉表面は、０．６５ｕｍの正に帯電したQ PES真空濾過（ミリポア社）、３〜５ｕｍの正に帯電したQ RCスピンカラム濾過（Sartorius社製）、０．８ｕｍの正に帯電したQ PES自家製スピンカラム濾過（ポール社製）、０．８ｕｍの正に帯電したQ PESシリンジ濾過（ポール社製）、０．８ｕｍの負に帯電したS PES自家製スピンカラム濾過（ポール社製）、０．８ｕｍの負に帯電したS PESシリンジ濾過（ポール社製）、および５０ｎｍの負に帯電したナイロンシリンジ濾過（Sterlitech製）からなる群より選択される帯電フィルターであってもよい。帯電フィルターは、シリンジ濾過装置内に収められていないことが好ましい。というのも、これらの態様ではＱｉａｚｏｌ／ＲＮＡをフィルターから取り出すのがより困難であるからである。帯電フィルターはカラムの一方の端に収められていることが好ましい。
【００５８】
前記捕捉表面が膜である態様では、前記膜は様々な好適な材料から作製してもよい。態様によっては、前記膜はポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）（例えば、ミリポア社またはポール社製）である。態様によっては、前記膜は再生セルロース（ＲＣ）（例えば、SartoriusまたはPierce製）である。
【００５９】
態様によっては、前記捕捉表面は正に帯電した膜である。態様によっては、前記捕捉表面は、正に帯電した膜であり、かつ第四級アミンを含む陰イオン交換体であるＱ膜である。例えば、前記Ｑ膜は四級アンモニウムＲ−ＣＨ２−Ｎ＋（ＣＨ３）３で官能化される。態様によっては、前記捕捉表面は負に帯電した膜である。態様によっては、前記捕捉表面は、負に帯電したＳ膜であり、かつスルホン酸基を含む陽イオン交換体である。例えば、前記Ｓ膜は、スルホン酸Ｒ−ＣＨ２−Ｓ０３−で官能化される。態様によっては、前記捕捉表面は、ジエチルアミン基Ｒ−ＣＨ２−ＮＨ＋（Ｃ２Ｈ５）２を含む弱塩基性陰イオン交換体であるＤ膜である。態様によっては、前記捕捉表面は金属キレート膜である。例えば、前記膜は、イミノ二酢酸−Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＨ−）２で官能化されたＩＤＡ膜である。態様によっては、前記捕捉表面は、アルデヒド基−ＣＨＯで官能化された微多孔性膜である。他の態様では、前記膜は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロースを含む弱塩基性陰イオン交換体である。すべての帯電膜が、本明細書で提供される方法に用いるのに好適なわけではない。例えば、Sartorius Vivapure Ｓ膜スピンカラムを用いて単離したＲＮＡは、ＲＴ−定量ＰＣＲの阻害を示し、したがって、ＰＣＲに関連した下流のアッセイには適さなかった。
【００６０】
前記捕捉表面が帯電している態様では、微小小胞体は正に帯電したフィルターで単離することができる。
【００６１】
前記捕捉表面が帯電している態様では、微小小胞体の捕捉中のｐＨは７以下である。態様によっては、ｐＨは４超および８以下である。
【００６２】
前記捕捉表面が正に帯電したＱフィルターである態様では、緩衝液系は、２５０ｍＭのビストリスプロパン（ｐＨ：６．５〜７．０）を含む洗浄緩衝液を含む。前記捕捉表面が正に帯電したＱフィルターである態様では、前記溶解緩衝液はＱｉａｚｏｌである。前記捕捉表面が正に帯電したＱフィルターである態様では、前記溶解緩衝液は１体積で存在する。前記捕捉表面が正に帯電したＱフィルターである態様では、前記溶解緩衝液は、１より大きい体積で存在する。
【００６３】
膜材料に応じて、膜の孔径は、３μｍ〜２０ｎｍの範囲である。
【００６４】
捕捉表面の表面電荷は、正、負、または中性であってもよい。態様によっては、前記捕捉表面は、正に帯電したビーズまたは数種のビーズである。
【００６５】
本明細書で提供される方法は溶解試薬を含む。態様によっては、膜上溶解に用いられる試薬は、フェノール系試薬である。態様によっては、前記溶解試薬はグアニジン系試薬である。態様によっては、前記溶解試薬は高塩濃度緩衝液である。態様によっては、前記溶解試薬はＱＩＡｚｏｌである。
【００６６】
本明細書で提供される方法は、充填緩衝液および洗浄緩衝液を含む様々な緩衝液を含む。充填緩衝液および洗浄緩衝液のイオン強度は高くても低くてもよい。塩濃度（例えば、ＮａＣｌ濃度）は０〜２．４Ｍであってもよい。前記緩衝液は様々な成分を含んでいてもよい。態様によっては、前記緩衝液は、以下の成分の１種以上を含んでいる：トリス、ビス−トリス、ビストリスプロパン、イミダゾール、クエン酸塩、メチルマロン酸、酢酸、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）、およびリン酸ナトリウム。本明細書で提供される方法では、充填緩衝液および洗浄緩衝液のｐＨが重要である。充填前に血漿試料のｐＨが５．５以下に設定されているとフィルターが詰まる傾向にある（血漿はカラムで全く回転しない）。また、ｐＨが高くなると、微小小胞体が不安定になるため、微小小胞体ＲＮＡの回収率が低い。ｐＨが中性であると、微小小胞体からのＲＮＡの回収が最適になる。態様によっては、用いられる緩衝液の濃度は１倍、２倍、３倍、または４倍である。例えば、充填緩衝液または結合緩衝液は、濃度が２倍であり、洗浄緩衝液は濃度が１倍である。
【００６７】
態様によっては、前記方法は、例えば、生体試料を捕捉表面と接触させた後に１つ以上の洗浄工程を含む。態様によっては、清浄剤を前記洗浄緩衝液に添加して、非特異的結合（すなわち、汚染物質、細胞の残骸、および循環タンパク質複合体または核酸）の除去を容易にして、より高純度の微小小胞体画分を得る。用いるのに好適な清浄剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−８０、トリトンＸ−１００、ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０）、Ｂｒｉｊ−３５、Ｂｒｉｊ−５８、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ＣＨＡＰＳ、またはＣＨＡＰＳＯが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
態様によっては、前記捕捉表面（例えば膜）は、遠心分離では例えばスピンカラム、真空系では例えば真空フィルターホルダー、または圧力を用いる濾過では例えばシリンジフィルターなど、用いられる装置内に収められている。好ましい態様では、前記捕捉表面は、スピンカラムまたは真空システムに収められている。
【００６９】
核酸の抽出前に生体試料から微小小胞体を単離することは、以下の理由により有益である。１）微小小胞体から核酸を抽出することで、体液試料内の他の微小小胞体から病気または腫瘍に特定の微小小胞体を単離して得た病気または腫瘍に特定の核酸を選択的に分析する機会が得られる。２）最初に微小小胞体を単離せずに体液試料から直接核酸を抽出して得られた核酸種の収率／完全性に比べて、核酸を含む微小小胞体は、より高い完全性を有する核酸種を非常に高い収率で産生する。３）本明細書で記載される方法により、例えば、低濃度で発現した核酸を検出するための容量拡大性や感度を、より多くの体積の試料から微小小胞体を濃縮することで高めることができる。４）核酸抽出工程の前にタンパク質、脂質、細胞の残骸、細胞、およびその他の可能性がある汚染物質、および生体試料内に天然に見られるＰＣＲ阻害物が排除されるので、より高純度で高品質の核酸が抽出される。５）核酸の抽出方法でより多くの選択肢を用いることができる。というのは、単離された微小小胞体画分の体積は試料の開始体積よりも少ないので、小体積カラムフィルターを用いてこれらの画分またはペレットから核酸を抽出することができるからである。
【００７０】
生体試料から微小小胞体を単離するいくつかの方法が当該分野で記載されている。例えば、分画遠心分離法はRaposo et al.の論文(Raposo et al, 1996)、Skog et. al.の論文(Skog et al, 2008)、およびNilsson et. al.の論文(Nilsson et al., 2009)に記載されている。イオン交換および／またはゲル浸透クロマトグラフィーの方法が米国特許第６，８９９，８６３号および６，８１２，０２３号に記載されている。ショ糖密度勾配法、すなわち細胞小器官電気泳動が米国特許第７，１９８，９２３号で記載されている。磁性活性化細胞選別法（ＭＡＣＳ）が、Taylor and Gercel Taylorの論文(Taylor and Gercel-Taylor, 2008) に記載されている。ナノ膜限外濾過濃縮法が、Cheruvanky et al.の論文(Cheruvanky et al, 2007)に記載されている。パーコール勾配単離法が、Miranda et al.の文献(Miranda et al., 2010)に記載されている。さらに、マイクロ流体デバイスにより、微小小胞体を同定して対象の体液から単離してもよい(Chen et al., 2010)。研究開発や核酸生体指標の商業的な応用では、一貫した信頼性のある実践的な方法で生体試料から高品質の核酸を抽出することが望ましい。
【００７１】
したがって、本発明の目的は、生体試料（例えば、体液など）から核酸を含む粒子を素早く容易に単離し、単離された粒子から高品質の核酸を抽出する方法を提供することである。本発明の方法は、実験室または臨床環境、あるいは現場で用いられる小型装置または機器に採用および組み込むのに好適なものであってもよい。
【００７２】
態様によっては、前記試料は、生体試料から核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＤＮＡおよびＲＮＡ）を単離および抽出する前に前処理されていない。
【００７３】
態様によっては、微小小胞体の単離、精製、または富化を行って、前記生体試料に存在する望ましくない大きい粒子、細胞および／または細胞の残骸、および他の汚染物質を除去する前に、前記試料は前処理工程を経ている。前記前処理工程は、１つ以上の遠心分離工程（例えば、分画遠心分離）、１つ以上の濾過工程（例えば、限外濾過）、またはそれらの組み合わせを経て達成してもよい。２つ以上の遠心分離前処理工程を行う場合、前記生体試料はまず低速で遠心分離して、その後高速で遠心分離してもよい。必要に応じて、さらに好適な遠心分離前処理工程を行ってもよい。１つ以上の遠心分離前処理工程に代えて、あるいは加えて、前記生体試料を濾過してもよい。例えば、生体試料をまず、２０，０００ｇで１時間遠心分離して、望ましくない大きい粒子を除去して、その後、前記試料を、例えば０．８μｍフィルターなどで濾過してもよい。
【００７４】
態様によっては、前記試料を前濾過して、０．８μｍ超の粒子を除外する。態様によっては、前記試料は、ＥＤＴＡ、クエン酸ナトリウム、および／またはクエン酸塩−リン酸ブドウ糖などの添加物を含む。前記試料はヘパリンを含まないことが好ましい。というのは、ヘパリンはＲＴ−定量ＰＣＲおよびその他の核酸分析に悪影響を及ぼす可能性があるからである。態様によっては、精製および／または核酸単離および／または抽出の前に前記試料を緩衝液と混合する。態様によっては、前記緩衝液はＸＢＰ緩衝液である。
【００７５】
態様によっては、前記生体試料を前記捕捉表面と接触させる前後に１つ以上の遠心分離工程を行って、微小小胞体を分離し、生体試料画分から単離された微小小胞体を濃縮する。例えば、前記試料を４℃、２０，０００ｇで１時間遠心分離する。望ましくない大きい粒子、細胞および／または細胞の残骸を除去するために、前記試料を約１００〜５００ｇ、好ましくは約２５０〜３００ｇの低速で遠心分離してもよい。これに代えて、あるいは加えて、前記試料をより高速で遠心分離してもよい。遠心分離速度は約２００，０００ｇ以下、例えば、約２，０００ｇから約２００，０００ｇ未満である。遠心分離速度は、約１５，０００ｇ超および約２００，０００ｇ未満、約１５，０００ｇ超および約１００，０００ｇ未満、約１５，０００ｇ超および約５０，０００ｇ未満が好ましい。遠心分離速度は約１８，０００ｇ〜約４０，０００ｇまたは約３０，０００ｇ、約１８，０００ｇ〜約２５，０００ｇがより好ましい。特に好ましい遠心分離速度は約２０，０００ｇである。一般に、遠心分離に好適な時間は約５分〜約２時間、例えば、約１０分〜約１．５時間、より好ましくは約１５分〜約１時間である。約０．５時間が好ましい場合がある。約２０，０００ｇで約０．５時間、生体試料を遠心分離するのが好ましい場合がある。しかしながら、上記の速度および時間を任意の組み合わせ（例えば、約１８，０００ｇ〜約２５，０００ｇまたは約３０，０００ｇ〜約４０，０００ｇで、約１０分〜約１．５時間または約１５分または約１時間、または約０．５時間など）で好適に用いることができる。前記１つ以上の遠心分離工程を周囲温度未満、例えば約０〜１０℃、好ましくは約１〜５℃、例えば、約３℃または約４℃で行ってもよい。
【００７６】
態様によっては、前記生体試料を前記捕捉表面と接触させる前後に１つ以上の濾過工程を行う。孔径が約０．１〜約１．０μｍの範囲、好ましくは約０．８μｍまたは０．２２μｍのフィルターを用いてもよい。また、フィルターの孔隙率を下げながら連続濾過を行ってもよい。
【００７７】
態様によっては、クロマトグラフィー段階で処理する試料の体積を減らすために、前記生体試料を前記捕捉表面と接触させる前後に１つ以上の濃縮工程を行う。濃縮は、前記試料を高速、例えば１０，０００〜１００，０００ｇで遠心分離して、微小小胞体を沈殿させることで行ってもよい。これは一連の分画遠心分離からなっていてもよい。得られたペレット中の微小小胞体を、過程の次の工程のためにより少ない体積で好適な緩衝液中に再構成してもよい。また、この濃縮工程を限外濾過で行ってもよい。実際、この限外濾過は、前記生体試料を濃縮し、微小小胞体画分をさらに精製する。他の態様では、前記濾過は限外濾過、好ましくは接線限外濾過である。接線限外濾過は、所定のカットオフ閾値の膜で分離された２つの区画（濾液および保持液）の間で溶液を濃縮し、分画することからなる。保持液区画の流れおよびこの区画と濾液区画の間の膜間圧を加えることで分離を行う。例えば、らせん膜（ミリポア、アミコン）、平膜または中空繊維（アミコン、ミリポア、Ｓａｒｔｏｒｉｕ、ポール、ＧＦ、Ｓｅｐｒａｃｏｒ）など、様々なシステムを用いて限外濾過を行ってもよい。本発明の範囲内では、カットオフ閾値が１０００ｋＤａ未満、好ましくは１００ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、より好ましくは１００ｋＤａ〜６００ｋＤａの膜を用いることが有益である。
【００７８】
態様によっては、前記生体試料を前記捕捉表面と接触させる前後に１つ以上のサイズ排除クロマトグラフィー工程またはゲル浸透クロマトグラフィー工程が行われる。ゲル浸透クロマトグラフィー工程を行うために、シリカ、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、エチレングリコール−メタクリル酸共重合体、またはこれらの混合物）例えば、アガロース−デキストラン混合物）から選択される支持体を用いるのが好ましい。このような支持体としては、例えば、SUPERDEX（登録商標）200HR (Pharmacia)、TSK G6000 (TosoHaas)、またはSEPHACRYL（登録商標）S (Pharmacia)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
態様によっては、前記生体試料を前記捕捉表面と接触させる前後に１つ以上の親和性クロマトグラフィー工程が行われる。また、いくつかの微小小胞体を特定の表面分子で特徴づけることができる。微小小胞体は細胞膜の出芽から形成されるので、これら微小小胞体は、微小小胞体が由来する細胞で見られる同じ表面分子の多くを共有していることが多い。本明細書で用いられる「表面分子」は、微小小胞体の膜の表面、膜内、または膜上に見られる抗原、タンパク質、脂質、炭水化物、およびマーカーをまとめて指す。これらの表面分子としては、例えば、受容体、腫瘍に関連づけられた抗原、膜タンパク質修飾（例えば、グリコシル化構造）が挙げられる。例えば、腫瘍細胞から出芽する微小小胞体は、細胞表面に腫瘍に関連づけられた抗原を提示していることが多い。したがって、親和性クロマトグラフィーまたは親和性排除クロマトグラフィーを本明細書で提供される方法と組み合わせて用いて、特定の提供者の細胞種から微小小胞体の特定の集団を単離、同定、または富化してもよい(Al-Nedawi et al., 2008; Taylor and Gercel-Taylor, 2008)。例えば、（悪性または非悪性）腫瘍微小小胞体は、腫瘍に関連づけられた表面抗原を担持しており、これらの腫瘍微小小胞体をこれらに特異的な腫瘍に関連づけられた表面抗原を介して検出、単離、および／または富化してもよい。一例では、前記表面抗原は上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）である。上皮細胞接着分子は、肺、結腸直腸、胸、前立腺、頭部および頸部、および肝臓由来であるが血液細胞由来ではない上皮性悪性腫瘍に由来する微小小胞体に特異的である(Balzar et al., 1999; Went et al., 2004)。また、腫瘍に特異的な微小小胞体は、特定の表面マーカー（例えば、ＣＤ８０およびＣＤ８６）の欠如により特徴づけることができる。これらの場合では、これらのマーカーを有する微小小胞体は、腫瘍に特異的なマーカーのさらなる分析のために、例えば、親和性排除クロマトグラフィーにより排除してもよい。親和性クロマトグラフィーは、例えば、様々な支持体、樹脂、ビーズ、抗体、アプタマー、アプタマー類縁体、分子鋳型重合体、または微小小胞体の所望の表面分子を特異的に標的する当該分野で周知の他の分子を用いて達成することができる。
【００８０】
必要に応じて、微小小胞体の単離または核酸の抽出の前に、対照粒子を試料に添加して、内部対照として作用させて微小小胞体精製および／または核酸抽出の効率あるいは品質を評価してもよい。本明細書で記載される方法は、効率的な単離、および微小小胞体画分と共に対照粒子を提供する。これらの対照粒子としては、Ｑβバクテリオファージ、ウイルス粒子、または対照核酸（例えば、少なくとも１個の対照標的遺伝子であって、天然に出現するものでもよく、あるいは組み換えＤＮＡ技術で遺伝子操作されていてもよい）を含む任意の他の粒子などが挙げられる。態様によっては、試料に添加する前に対照粒子の量が分かっている。リアルタイムＰＣＲ分析により前記対照標的遺伝子を定量化してもよい。対照標的遺伝子の定量化を用いて、微小小胞体精製工程または核酸抽出工程の効率または品質を決定してもよい。
【００８１】
前記対照粒子はＱβバクテリオファージ（本明細書ではＱβ粒子と言う）であることが好ましい。本明細書で記載される方法に用いられるＱβ粒子は、天然に出現するウイルス粒子であってもよく、ウイルス粒子の少なくとも１種の成分（例えば、ゲノムの一部あるいは被覆タンパク質）が当該分野で周知の組み換えＤＮＡ技術または分子生物学技術により合成される組み換えまたは遺伝子操作されたウイルスであってもよい。Ｑβは、レビウイルス科に属し、４種のウイルスタンパク質、すなわち、被覆タンパク質、成熟タンパク質、溶解タンパク質、およびＲＮＡ複製酵素をコードする３個の遺伝子からなる線状の一本鎖ＲＮＡゲノムにより特徴づけられる。平均的な微小小胞体とサイズが類似しているため、本明細書で記載する微小小胞体を単離するのと同じ精製方法により、生体試料からＱβを容易に精製することができる。また、Ｑβウイルスの一本鎖遺伝子構造があまり複雑でないため、増幅に基づく核酸アッセイに対照として用いるのに有用である。Ｑβ粒子は、試料中のＱβ粒子量を定量化するために検出または測定される対照標的遺伝子または対照標的配列を含む。例えば、前記対照標的遺伝子はＱβ被覆タンパク質遺伝子である。生体試料にＱβ粒子を添加した後、本明細書で記載される抽出方法により前記Ｑβ粒子に由来する核酸を前記生体試料に由来する核酸と共に抽出する。Ｑβ対照標的遺伝子の検出は、例えば、（１種以上の）目的の生体指標と同時にＲＴ−ＰＣＲ分析により決定することができる。対照標的遺伝子の１０倍希釈液で少なくとも２、３、または４つの濃度の標準曲線を用いてコピー数を決定してもよい。検出されたコピー数および添加されたＱβ粒子量を比較して、単離過程および／または抽出過程の品質を決定してもよい。
【００８２】
好ましい態様では、核酸の抽出の前に前記Ｑβ粒子を尿試料に添加する。例えば、限外濾過前および／または前濾過工程後に前記Ｑβ粒子を尿試料に添加する。
【００８３】
態様によっては、体液試料に添加されたＱβ粒子のコピー数は、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、１，０００個、または５，０００個である。好ましい態様では、体液試料に添加されたＱβ粒子のコピー数は１００個である。Ｑβ粒子のコピー数は、Ｑβバクテリオファージの標的細胞を感染させる能力に基づいて算出してもよい。したがって、Ｑβ粒子のコピー数は、Ｑβバクテリオファージのコロニー形成単位と相関関係がある。
核酸の抽出
【００８４】
本発明は、微小小胞体の単離、精製、または富化を向上させるための捕捉表面の使用に関する。本明細書に開示された方法は、前記微小小胞体から高品質の核酸を抽出するために大きく富化された微小小胞体画分を提供する。本明細書で記載される方法で得られた核酸抽出物は、病気または病状の診断、予後、または監視など、高品質核酸抽出物が求められる、あるいは好ましい様々な用途に有用である場合がある。
【００８５】
最近の研究では、微小小胞体内の核酸が生体指標としての役割を有することが明らかになっている。例えば、ＷＯ２００９／１０００２９では、特に、医療診断、予後、および治療評価におけるＧＢＭ患者の血清の微小小胞体から抽出した核酸の使用が記載されている。ＷＯ２００９／１０００２９ではまた、同じ目的でのヒトの尿中の微小小胞体から抽出した核酸の使用が記載されている。微小小胞体から抽出した核酸の使用は、生検の必要性を回避する可能性があると見なされており、微小小胞体生物学の大きな診断可能性を強調するものである(Skog et al, 2008)。
【００８６】
単離された微小小胞体の品質または純度は、抽出された微小小胞体核酸の品質に直接影響を及ぼす可能性があり、よって、病気の診断、予後、および／または監視のための生体指標アッセイの効率および感度に直接影響を及ぼす。臨床分野で正確で高感度の診断試験の重要性を前提として、生体試料から非常に富化された微小小胞体画分を単離する方法が必要とされている。この必要性に対処するために、本発明は、生体試料から高品質の核酸を抽出するために生体試料から微小小胞体を単離する方法を提供する。本明細書で示すように、大きく富化された微小小胞体画分は、本明細書で記載される方法で生体試料から単離され、その後、この大きく富化された微小小胞体画分から高品質の核酸が抽出される。これら抽出された高品質の核酸は、病気または他の病状の診断、予後、および／または監視で補助となる生体指標の有無を測定または評価するのに有用である。
【００８７】
核酸抽出について述べる場合に本明細書で用いられる用語「高品質」は、18S rRNAおよび28S rRNAを好ましくは約１：１〜約１：２の比、より好ましくは約１：２の比で検出することができる抽出物を意味する。また、本明細書で記載される方法で得られた高品質な核酸抽出物は、ＲＮＡ完全性数（ＲＩＮ）が低タンパク質生体試料（例えば、尿）では５以上、タンパク質生体試料（例えば、血清）では３以上であり、２０ｍｌの低タンパク質生体試料または１ｍｌの高タンパク質生体試料からの核酸収量が５０ｐｇ／ｍｌ以上であることが理想的である。
【００８８】
高品質のＲＮＡ抽出物が望ましい。というのは、ＲＮＡの分解は、例えば遺伝子発現およびｍＲＮＡ分析、非コードＲＮＡ（例えば、小ＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ）の分析など、抽出されたＲＮＡの下流の評価に悪影響を及ぼす可能性があるからである。本明細書で記載される新規な方法によれば、微小小胞体内の核酸の正確な分析を行うことができるように生体試料から単離された微小小胞体から高品質の核酸を抽出することができる。
【００８９】
生体試料から微小小胞体を単離した後、その単離または富化された微小小胞体画分から核酸を抽出してもよい。これを達成するために、態様によっては、まず微小小胞体を溶解してもよい。微小小胞体の溶解および核酸の抽出は、当該分野で周知の様々な方法で達成することができる。態様によっては、核酸の抽出は、当該分野で周知の標準的な手順および技術に従ってフェノール：クロロホルムを用いて達成することができる。また、そのような方法では、核酸結合カラムを用いて微小小胞体内に含まれる核酸を捕捉してもよい。核酸を一旦結合させて、緩衝液または核酸と結合カラムとの相互作用を阻害するのに好適な溶液を用いて溶出させてもよい。これにより、うまく核酸を溶出させることができる。
【００９０】
態様によっては、前記核酸の抽出方法はまた、生体試料から高品質の核酸の抽出を防止する有害因子を除去または軽減する工程を含む。異なる生体試料は様々な有害因子の種を含んでいる可能性があるので、そのような有害因子は異種である。生体試料によっては、過剰ＤＮＡなどの因子が、生体試料からの核酸抽出物の品質に影響を及ぼし得る場合がある。他の試料では、過剰な内因性ＲＮＡ分解酵素などの因子が、生体試料からの核酸抽出物の品質に影響を及ぼし得る場合がある。多くの試薬および方法を用いてこれらの有害因子を除去することができる。これらの方法および試薬をまとめて、本明細書では「抽出向上操作」と言う。例によっては、抽出向上操作は、生体試料に核酸抽出向上試薬を添加することを含む場合がある。内因性ＲＮＡ分解酵素などの有害因子を除去するため、本明細書で定義された抽出向上試薬としては、ＲＮＡ分解酵素阻害剤（例えば、Ｓｕｐｅｒａｓｅ−Ｉｎ（Ａｍｂｉｏｎ社から市販されている）、ＲＮＡ分解酵素ｌＮｐｌｕｓ（プロメガ社から市販されている）、または類似の機能を有する他の試薬など）、プロテアーゼ（ＲＮＡ分解酵素阻害剤として機能してもよい）、ＤＮＡ分解酵素、還元剤、おとり基質（例えば、合成ＲＮＡおよび／または担体ＲＮＡ）、ＲＮＡ分解酵素と結合することができる溶解性受容体、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡ結合分子（例えば、抗ＲＮＡ抗体、塩基性タンパク質、またはシャペロンタンパク質）、ＲＮＡ分解酵素変性物質（例えば、高浸透圧溶液、清浄剤）、またはこれらの組み合わせなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
例えば、前記抽出向上操作は、核酸を抽出する前に、生体試料および／または単離された微小小胞体画分にＲＮＡ分解酵素阻害剤を添加することを含んでいてもよい。前記ＲＮＡ分解酵素阻害剤の濃度は、体積で１μｌ以上の試料に対して０．０２７ＡＵ（１倍）超、あるいは体積で１μｌ以上の試料に対して０．１３５ＡＵ（５倍）以上、あるいは体積で１μｌ以上の試料に対して０．２７ＡＵ（１０倍）以上、あるいは体積で１μｌ以上の試料に対して０．６７５ＡＵ（２５倍）以上、あるいは体積で１μｌ以上の試料に対して１．３５ＡＵ（５０倍）以上であることが好ましい。ここで、１倍の濃度とは、０．０２７ＡＵ以上のＲＮＡ分解酵素阻害剤を用いて１μｌ以上の体液から単離された微小小胞体を処理する酵素条件を指す。５倍の濃度とは、０．１３５ＡＵ以上のＲＮＡ分解酵素阻害剤を用いて１μｌ以上の体液から単離された微小小胞体を処理する酵素条件を指す。１０倍のプロテアーゼ濃度とは、０．２７ＡＵ以上のＲＮＡ分解酵素阻害剤を用いて１μｌ以上の体液から単離された粒子を処理する酵素条件を指す。２５倍の濃度とは、０．６７５ＡＵ以上のＲＮＡ分解酵素阻害剤を用いて１μｌ以上の体液のから単離された微小小胞体を処理する酵素条件を指す。５０倍のプロテアーゼ濃度とは、１．３５ＡＵ以上のＲＮＡ分解酵素阻害剤を用いて１μｌ以上の体液から単離された粒子を処理する酵素条件を指す。前記ＲＮＡ分解酵素阻害剤はプロテアーゼであることが好ましい。この場合、１ＡＵは、１分あたり１μｍｏｌのチロシンに対応するフォリン陽性アミノ酸およびペプチドを放出するプロテアーゼ活性である。
【００９２】
これらの核酸抽出向上試薬は、例えば、ＲＮＡ分解酵素活性の阻害（例えば、ＲＮＡ分解酵素阻害剤）、タンパク質の普遍的分解（例えば、プロテアーゼ）、またはＲＮＡに結合して保護するシャペロンタンパク質（例えば、ＲＮＡ結合タンパク質）など、様々な方法でその機能を発揮してもよい。すべての場合で、このような抽出向上試薬は、生体試料中の有害因子、または単離された粒子からの高品質の核酸抽出を妨げる単離された粒子に関連づけられた有害因子のいくつかまたはすべてを除去、あるいは少なくとも軽減する。
【００９３】
態様によっては、18S rRNAおよび28S rRNAの定量化を用いて核酸抽出の品質を決定してもよい。
核酸生体指標の検出
【００９４】
態様によっては、抽出された核酸は、ＤＮＡおよび／またはＤＮＡおよびＲＮＡを含む。抽出された核酸がＤＮＡおよびＲＮＡを含む態様では、前記ＲＮＡは、さらなる増幅の前に相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写されることが好ましい。そのような逆転写は、単独で、または増幅工程と組み合わせて行ってもよい。逆転写および増幅工程を合わせた方法の一例として、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）がある。これは、例えば、米国特許第５，６３９，６０６号（その教示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載の定量ＲＴ−ＰＣＲなど、さらに定量的に修正してもよい。前記方法の他の例としては、２つの個別の工程、すなわち、ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する第１の逆転写工程、および定量ＰＣＲによりｃＤＮＡの量を定量する第２の工程を含む。以下の実施例で示されるように、本明細書に開示された方法により核酸を含む粒子から抽出されたＲＮＡは、多くの転写物の種を含む。それらの例としては、リボソーム18S rRNAおよび28S rRNA、マイクロＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、病気または病状に関連づけられた転写物、および病状の診断、予後、および監視に重要な生体指標などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
例えば、ＲＴ−ＰＣＲ分析は、反応毎のＣｔ（サイクル閾値）値を決定する。ＲＴ−ＰＣＲでは、陽性反応は蛍光信号の蓄積により検出される。Ｃｔ値は、閾値を超える（すなわち、バックグラウンド値を超える）ために蛍光信号に必要なサイクル数と定義する。Ｃｔ値は、試料中の標的核酸または対照核酸の量に反比例する（すなわち、Ｃｔ値が低い程、試料中の対照核酸の量が多くなる）。
【００９６】
他の態様では、対照核酸のコピー数は、従来の技術で認められている様々な技術の何れかにより測定することができる。そのような技術としては、ＲＴ−ＰＣＲが挙げられるが、これらに限定されない。対照核酸のコピー数は、較正曲線すなわち標準曲線を作製して用いるなど、当該分野で周知の方法で決定することができる。
【００９７】
態様によっては、１種以上の生体指標は遺伝的異常の１つ、または集合であってもよい。本明細書で「生体指標」とは、核酸の量、および核酸を含む粒子内の核酸多様体を指すのに用いられる。具体的には、遺伝的異常としては、遺伝子（例えば、がん遺伝子）または遺伝子パネルの過剰発現、遺伝子（例えば、ｐ５３またはＲＢなどの腫瘍抑制遺伝子）または遺伝子パネルの過小発現、遺伝子または遺伝子パネルのスプライス多様体の代替え生成物、遺伝子コピー数多様体（ＣＮＶ）（例えば、二重微小ＤＮＡ）（Ｈａｈｎ、１９９３）、核酸修飾（例えば、メチル化反応、アセチル化反応、およびリン酸化反応）、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、染色体再編（例えば、逆位、欠失、および重複）、および多くの場合、最終的に変異が遺伝子産物の活性および機能に影響を及ぼして、別の転写性スプライス多様体および／または遺伝子発現量の変化となる遺伝子または遺伝子パネルの変異（挿入、欠失、重複、ミスセンス変異、ナンセンス変異、同義的変異、または任意のその他のヌクレオチドの変化）、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
単離された粒子に存在する核酸の分析は定量分析および／または定性分析である。定量分析の場合、単離された粒子内の特定の目的核酸の相対量あるいは絶対量（発現量）は（以下で記載の）当該分野で周知の方法で測定される。定性的分析の場合、単離された微小小胞体内の特定の目的核酸の種が野生型または多様体のいずれかであるかは、当該分野で周知の方法で同定される。
【００９９】
本発明はまた、（ｉ）対象の診断を補助する、（ｉｉ）対象の病気または他の病状の進行または再発を監視する、あるいは（ｉｉｉ）病気または他の病状の治療を受けている、あるいは治療が予期される対象の治療の有効性の評価を補助する目的で、高品質の核酸の抽出のために生体試料から微小小胞体を単離する新規な方法の使用を含む。ここで、前記方法により得られた核酸抽出物中に１つ以上の生体指標があるか否かが決定され、前記１つ以上の生体指標は、病気または他の病状の診断、進行または再発、あるいは治療の有効性とそれぞれ関連づけられる。
生体試料から微小小胞体を単離するためのキット
【０１００】
本発明の一側面はさらに、本明細書に開示された方法で用いられるキットに関する。前記キットは、生体試料に存在する望ましくない粒子、残骸、および小分子から微小小胞体を分離するのに十分な捕捉表面装置を含む。また、本発明は、必要に応じて、単離工程および必要に応じて行われる後続の核酸抽出工程での前述の試薬の使用についての指示を含む。
【実施例】
【０１０１】
本明細書で提供される実施例では、遠心分離および／または濾過の目的のために様々な膜および装置が用いられるが、自明であるが、これらの方法は、微小小胞体を効率的に捕捉し、核酸、特に微小小胞体に含まれるＲＮＡを放出することができる任意の捕捉表面および／または収納装置と共に用いることができる。
【０１０２】
実施例１  ＥＸ０５２によるＤＮＡの単離、ならびにＲＮＡおよびＤＮＡの共単離
実施例１では、血漿試料からすべてのＤＮＡを単離するＥＸ０５２法の能力を示す。なお、本明細書に示す図のいくつかでは、様々な用語を用いて本明細書でＥＸ０５２と称する単離方法に対するその前駆的な方法を識別している。例えば、図によっては、旧ＥＸ０５２、ＥＸ０５２．１、およびその変種などの用語が含まれる。これらの初期バージョンは、単に比較のために、開示のＥＸ０５２法を用いて達成される単離の方が優れていることを示すために提供されている。用語ＥＸ０５２．２の使用は、単一管でＲＮＡおよびＤＮＡ抽出を行うＥＸ０５２法のことである。
【０１０３】
また、ＥＸ０５２カラムを用いて血漿試料からすべてのＤＮＡを単離することができる。図１および図２に、ＲＮＡに加えてＤＮＡの単離にＥＸ０５２カラムを用いる２つの方法が示されている。具体的には、２つの過程の違いは、使いやすさ、プロトコルの合理化、および再現性の向上のためにＥＸ０５２では１本の管でＲＮＡおよびＤＮＡ抽出を合わせて行うことである。図３は、ＥＸＯ５０によるＲＮＡ＋ＤＮＡ（ＥＸ０５２）でゲインが１．５Ｃｔであることを示している。ＥＸＯ５０は、例えば血漿などの生体試料中の微小小胞体からＲＮＡを単離する方法である。この方法は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／１０７５７１に記載されている。図４は、相分離中にクロロホルム量を増加させると、通常のＥＸＯ５０手順でＤＮＡが共単離されるようにＤＮＡが水相に戻ることを示している。さらに、図５に示すように、相分離のｐＨを最適化することで、ＤＮＡがプレップに加えられる。
【０１０４】
したがって、本開示の方法を用いて血漿試料からすべてのＤＮＡを単離することができる。前記ＤＮＡは、相分離後、ＱＩＡｚｏｌ溶解の低疎水性相から回収する。開示の方法（例えば、ＥＸ０５２で２本の管または単一の管）により、同じ試料体積につき同様の量でＲＮＡとＤＮＡを分離し、前記ＲＮＡおよびＤＮＡを互いに分離することができる。これらの開示の方法により、市販の単離キット（例えば、Ｑｉａｇｅｎ）と同じかそれ以上のｍＲＮＡ、およびより多くのｍｉＲＮＡを捕捉する。
【０１０５】
また、ＥＸ０５２をＲＮＡおよびＤＮＡの共精製に用いてもよい。本明細書で用いられるＥＸ０５２は、特に断りのない限り以下のプロトコルを指す。
【０１０６】
試料の準備：ＥＸ０５２手順を用いて、血漿または血清０．２〜４ｍＬを用いてエキソソームおよびその他の微小小胞体からＲＮＡおよびＤＮＡを単離することができる。前濾過して０．８μｍより大きい粒子を除去した血漿または血清のみを使用することが推奨される。相性のよい血漿管としては、添加剤のＥＤＴＡ、クエン酸ナトリウム、およびクエン酸塩−リン酸ブドウ糖を含む血漿が挙げられる。ヘパリンを含む血漿は、ＲＴ−定量ＰＣＲを阻害する可能性がある。
【０１０７】
次いで、試料を単独で、あるいは結合緩衝液で希釈して、ＥＸ０５２スピンカラムに充填し、５００×ｇで１分間回転させる。通過画分を捨てて、カラムを同じ回収管に戻す。次いで、洗浄緩衝液を添加して、ＥＸ０５２カラムを５０００×ｇで５分間回転させてカラムから残留量を除去する。注記：遠心分離の後、カラムが通過画分と接触しないようにＥＸ０５２スピンカラムを回収管から取り外す。次いで、スピンカラムを新しい回収管に移して、７００μＬのＱｉａｚｏｌを膜に添加する。次いで、スピンカラムを５０００×ｇで５分間回転させて、溶解したエキソソームを含む均質液を回収する。次いで、均質液をＰＬＧ管に移す。
【０１０８】
次いで、均質液を含む管に３５０μｌのクロロホルムを加えて、１５秒間激しく振とうする。次いで、この均質液を含む管を室温で２〜３分間保持し、１２，０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離を行う。遠心分離の後、同じ遠心分離器を次の遠心分離工程に用いる場合は遠心分離器を室温（１５〜２５℃）まで加熱する。
【０１０９】
いかなる相間材料も移らないようにして上の水相を新しい回収管に移す。次いで、２体積の１００％エタノールを添加して、遠心分離器を用いずに、ピペットを上下に数回操作して完全に混合する。次いで、沈殿物（形成されることがある）を含む７００μｌの試料を、２ｍｌの回収管（カタログ番号１０２６４９７）のＲＮｅａｓｙＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムにピペットで入れて、８０００×ｇ（１０，０００ｒｐｍ）以上、室温（１５〜２５℃）で１５秒間遠心分離を行う。通過画分を捨てる。これらの工程を試料の残部を用いて繰り返して、通過画分を捨てる。
【０１１０】
ＥＸ０５２は、生体試料からＤＮＡを単離および検出するのに有用である。小胞ＲＮＡは、例えば病気の組織中の生きた細胞に由来すると考えられている。無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）は、病気の組織中の死んだ細胞（例えば、壊死細胞）に由来すると考えられている。したがって、ｃｆＤＮＡは治療応答の指標として有用であり、ＲＮＡは増加している耐性変異の指標である。
【０１１１】
ＥＸ０５２は、血液中の希な変異の検出に有用である。というのは、ＥＸ０５２により、十分な量の核酸に用いることができる十分に高感度な方法が提供されるからである。生体液中の実際のＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子の量は非常に限られており、ＥＸ０５２により、有効な下流の処理および／または分析に純分な少ない体積での変異の検出に適した、血液のすべての分子を抽出する単離方法が提供される。
【０１１２】
図１３〜図２２３（本実施例でのみ、単に「これらの図」と言う）は、ＥＸ０５２法の特異性および感度を示している。
【０１１３】
研究により、ＥＸＯ５０／５２カラムは、血漿中のすべてのＤＮＡに結合するが、フェノール相からＤＮＡを取り出す手順では単離手順が変動的であるため、満足な結果が得られないことが分かった。本明細書で提供される方法により、ＥＸＯ５０／５２カラムの膜からＤＮＡを再現性よく、効率的に単離および／または抽出することができる。
【０１１４】
ＰＬＧ管を用いたＥｘｏ５２単離で３つの全く同じ試料を単離した場合、そのうちの２つは、市販のｃｆＤＮＡキットのＣＴ値とほとんど同じＣＴ値を示す。ＰＬＧ管を用いないＥｘｏ５２単離で３つの全く同じ試料を単離した場合、そのうちの１つはｃｆＤＮＡキットとほとんど同じＣＴ値を示す。枯渇させた血漿（２倍の結合緩衝液なしでの血漿のＥｘｏ５０通過画分）は、多くのＤＮＡを含んでいない（通常の単離に対して１８Ｓ〜９ＣＴの差）。ほとんどすべてのＤＮＡがＥｘｏ５０カラムに結合した。
【０１１５】
これらの図に示されるように、クロロホルムをＥＸ０５２法に添加すると、ＲＮＡとＤＮＡの両方を共単離することができた。またはクロロホルムを添加すると、ＲＮＡの検出または単離を損傷しなかった。
【０１１６】
ＲＮＡ単離について、ＲＮＡ特異的アッセイを用いた場合は、添加するクロロホルムを増やしてもＲＮＡ単離に影響を及ぼすことはなかった。ＤＮＡ特異的アッセイでは、添加するクロロホルムを増やすとＣＴが低下するが、これはＤＮＡが水相にあるためである。
【０１１７】
ＤＮＡ単離について、添加するクロロホルム量を増やすと、ＤＮＡを検出するアッセイのＣＴは、水相単離では増加し、ＥＸ０５２のフェノール相ＤＮＡ単離では減少した。
【０１１８】
フェノール相からのＥＸＯ５０単離では、最低のＣＴ値（すなわち、最高のＤＮＡ収量）となった。９０μｌのクロロホルムでは、フェノール相からのＤＮＡの収量が最高になった。
【０１１９】
また、ＰＬＧ管を用いない場合のＤＮＡの汚染が観察されないクロロホルムの比率は、約０．１３倍であった。
【０１２０】
これらの図に示すように、３５０μＬのクロロホルムは、ＰＣ抽出中にＥＸ０５２カラムからすべてのＤＮＡを水相に加えるのに十分であった。クロロホルムの量が増えると、ＲＮＡの単離を妨げる場合がある。
【０１２１】
図に示すように、より多くのクロロホルムを添加すると水相中でのＤＮＡの収量が増加したが、フェノール相中でのＤＮＡの収量は低下した（ＥＸ０５２によるＤＮＡの単離）。水相からのＤＮＡの単離では、フェノール相からのＥＸ０５２によるＤＮＡの単離に比べてより多くのＤＮＡが得られる。上相を除いた後、ＤＮＡはフェノール相または水相残部にわずかに残っているようであった。これは、ＰＬＧ管を用いずに相全体を除くことが困難であるためである。ＤＮＡの収量は、ＲＴ反応（最終２０μｌのＲＴ混合物中、１０μｌのＥＸＯ５０溶出液）および１：２に希釈したＥＸＯ５０の溶出液では同様である。ＤＮＡは逆転写混合物とは反応しなかったと思われる。
【０１２２】
ＲＮＡのみのＧＡＰＤＨアッセイを用いて、ＲＮＡのみのＧＡＰＤＨアッセイがクロロホルムの添加量を増やすと影響を受けるかどうかを調べるため、研究を繰り返した。ＲＮＡは、クロロホルムの添加量を増やしても影響を受けなかった。また、ＧＡＰＤＨ＿ＲＮＡ＿ＤＮＡアッセイを用いて、研究を行った。これにより、ＤＮＡによるＲＮＡ信号の置換は見られなかった（約２ＣＴの差）。
【０１２３】
ＢＲＡＦアッセイでは、水相にＤＮＡが存在することでＥＸＯ５０のＲＮＡ画分で信号が２倍に増加することが示された。ＧＡＰＤＨアッセイでは、添加したＤＮＡコピーは、ＲＮＡコピーに比べてわずかであったので、ＥＸＯ５０のＲＮＡ画分へのＤＮＡの添加した効果ははっきりと示されなかった。ＲＮＡコピーとＤＮＡコピーの間にはっきりとした差がある場合、ＲＮＡ信号の置換は示されない可能性がある。
【０１２４】
相分離においてｐＨの変化が何らかの効果があるか否かを決定するために研究を行った。ｐＨの調節により、ＤＮＡを水相に添加する別の手段が得られる。ｐＨが高すぎるとＲＮＡ単離を妨げることがわかった。
【０１２５】
ｐＨが高いとＢＡに問題が生じたようである。例えば、１０ＮのＮａＯＨ試料からのＢＡ特性では、ＤＮＡのピークが最も高かったがＦＵが非常に低い（［ＦＵ］＝４０に比べて［ＦＵ］＝２）ことが示された。ｐＨが高いと、ＲＴ反応に問題が生じたものと思われる。水相のｐＨが高くなると、Ｅｘｏ５０のＤＮＡ単離のＣＴ値が低下したが、ＥＸ０５２のＤＮＡ単離のＣＴ値は増加し、クロロホルム滴定に比べてフェノール相に残るＤＮＡ量が多かった。
【０１２６】
ｐＨを下げることで、ＥＸ０５２のフェノール相からＤＮＡを除いて、水相中に富化させることができた。ＤＮＡはＲＴでは損傷されなかった。ＲＮＡは最も高いｐＨでは損傷を受けた。ＢＡは、３つの高ｐＨ工程で影響を受けた。
【０１２７】
図に示すように、クロロホルムの添加は、水相のＤＮＡ含有量を決定するのに重要な因子であった。高いｐＨの好ましい効果は、クロロホルム量が少ない場合にのみ見られた。ＲＮＡ信号は、ＤＮＡを水相に添加することにより影響を受けなかった。
【０１２８】
図に示すように、ＤＮＡコピー数に及ぼすｐＨ溶液の添加効果はなかった。また、ＤＮＡを水相に取り込むのに、必要なクロロホルム量を変化させる必要はなかった。ｐＨ溶液を用いずに処理した試料と比べて、試料のコピー数は低下した。９０μｌで処理した試料のみで、コピー数が高くなっていた。ｐＨ溶液および量を多くしたクロロホルムはＲＮＡ単離（ｍＲＮＡ）に影響を及ぼさなかった。滴定全体で、（９０μｌのクロロホルム試料を除く）ｐＨ溶液で処理した試料では、ｐＨ溶液を用いずに処理した試料に比べてコピー数がわずかに減少した。
【０１２９】
図に示すように、室温でＱＩＡｚｏｌを回転させると、水相中のＤＮＡ材料の百分率が増加した。これは、量を多くしたクロロホルムを用いた場合のＥＸ０５２手順には当てはまらなかった。
【０１３０】
Ｑｉａｚｏｌの遠心分離工程により、水相のＤＮＡが汚染されたが、ＰＬＧ管を用いない試料においてのみであった。また、室温で遠心分離工程を行ったＰＬＧ管試料では、ＤＮＡがわずかに増えたが、コピー数はＬＯＱ（検出限界）＝３２コピー以下であった。遠心分離工程の温度は、ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの単離に影響を及ぼさなかった。
【０１３１】
室温でＱｉａｚｏｌを回転させると、通常のＥＸ０５２のＤＮＡ単離にＤＮＡが添加されなかった。回転温度に関するＣＴ値の差は見られなかった。遠心分離工程の温度は、ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの単離に影響を及ぼさなかった。
【０１３２】
図に示すように、ＥＸ０５２からのＤＮＡのＲＮｅａｓｙスピンカラムへの結合および溶出は、１．５倍体積〜２．６倍体積の範囲ではエタノール濃度に依存しなかった。
【０１３３】
図に示すように、用いるエタノール濃度が高い程、ＥＸ０５２の性能は向上した。３つのすべてのアッセイのＣＴ値は、エタノール滴定全体を通して一定であった。ＲＮＡ単離の前調整工程におけるエタノール濃度は、ｃｆＤＮＡの回収に影響を及ぼさなかった。
【０１３４】
これらの図に示すように、血漿試料のタンパク質分解酵素Ｋ（ＰｒｏｔＫ）消化により、具体的にはＲＮＡ信号が消失するが、すべての試料で同じＣＴが得られたので、ＰｒｏｔＫによる処理は、ＤＮＡの収量に影響を及ぼさなかった。
【０１３５】
これらの図に示すように、血漿８ｍｌではＥＸ０５２のＤＮＡ充填量に達しなかった。というのは、ＤＮＡの収量は、まだ線状に増加しており、通過画分中に検出可能なＤＮＡは見られなかったためである。これは、小胞の線状の充填量とは対照的であり、小胞では４ｍＬで充填量に達した。通過画分（ＦＴ）中でｃｆＤＮＡは検出されなかったが、ＲＮＡは２ｍＬから蓄積が見られた。試料の出力はＤＮＡでは直鎖状であったが、ＲＮＡではそうではなかった。ＲＮＡは、ＤＮＡとは異なる飽和点を有している。この手順にＰＬＧ管を加えると、収量がわずかに増加したことが分かった。ＥＸ０５２法は、市販のＣＮＡキットに比べてＲＮＡコピーを増加させた。
【０１３６】
態様によっては、前記方法は、チオシアン酸グアニジンにのみ基づく抽出緩衝液を用いて、ＥＸ０５２カラムからＲＮＡおよびＤＮＡを抽出する。
【０１３７】
これらの図に示すように、ＲＮＡ単離では、ＲＬＴ＋高ＤＴＴ（５６℃）の２つの全く同じ試料のうちの１つで、予想ＣＴ値が得られた。全く同じ試料間での変動は、充填混合物を加えた後にＲＮｅａｓｙ膜が目詰まりして生じたと思われる。ＢＡプロファイルは、ＲＬＴ＋高ＤＴＴ（５６℃）のカラム残留物のデータ点で非常に低いＲＮＡ濃度を示したが、１つのＲＮＡ単離でのみ、予想ＣＴ値が得られた。
【０１３８】
これらの図に示すように、ＤＮＡ単離では、AllPrep DNAカラムにより、ＤＮＡ検出アッセイで非常に多いコピー数が得られた。また、カラム残留物のデータ点は非常に高いＣＴ値を示した。ＤＮＡは、高いカットオフ値（１５〜３０ｋｂ）によりAllPrep DNAスピンカラムで失われたと思われる 。ｃｆＤＮＡのサイズは、典型的には３５ｂｐ〜１０ｋｂの範囲である。
【０１３９】
また、これらの図には、様々なＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡの単離手順を用いたマイクロＲＮＡの単離が示される。ＥＸ０５２により、市販のＣＮＡキットに比べてより多くのｍＲＮＡ、およびさらに多くのｍｉＲＮＡが単離された。また、ＥＸ０５２およびＣＮＡキットは、同じ量のＤＮＡを単離した。ＥＸ０５２法は、血漿からすべてのＤＮＡを単離したと思われる。
【０１４０】
これらの図に示すように、ＥＸ０５２は常に市販の循環核酸（ＣＮＡ）キットより結果がよかった。ＥＸ０５２は、３つの異なる血漿プール、異なるＣＮＡ試薬ロット、異なる操作者、および異なる試料源でＣＮＡキットよりも収量が高かった。
【０１４１】
ＥＸ０５２法を用いて、黒色腫集団に由来する試料中のｃｆＤＮＡを分析した。ＥＸ０５２法を用いて得られた結果を、市販のＣＮＡキットを用いて得られた結果と比較した。ＣＮＡキットのアッセイ内の変動（同じ血漿試料を異なる時点で単離したことに基づく）は、ＥＸ０５２法を用いて観察されたアッセイ内の変動よりも大きかった。これらの図に示すように、ＥＸ０５２法の性能は、市販のキットを用いて得られた性能と同じか勝っている。
【０１４２】
これらの図に示すように、３５０μｌのクロロホルムを用いた相分離の後、有機相に約１５％のＤＮＡが残った。二重抽出により、ＤＮＡの収量は約１５％ポイント高められた９０μｌのクロロホルム（ＲＮＡ）を用いた相分離の後、さらに２６０μｌ（合計３５０μｌのクロロホルム）を用いて第２の抽出を行ったところ、ＤＮＡの収量は、通常のＥＸ０５２によるＤＮＡ抽出に比べて約５０％超に過ぎなかった。調整されたＥＸ０５２材料を同じカラムに再充填しても収量は向上しなかった。
【０１４３】
実施例２  がん血漿由来のエキソソームＲＮＡおよび無細胞ＤＮＡのための１工程単離プラットフォームの開発
がん患者の血液中の循環核酸は、医学研究では非常に関心が高い。というのは、組織生検材料を必要とせずに患者の疾病状態および治療の選択肢に関する情報が得られる可能性があるからである。変異の分析に生体液を用いることを探求する如何なる診断試験にも、循環血液中の腫瘍由来の変異の捕捉を最大にすることができる基盤技術（プラットフォーム）が必要である。血漿は、少なくとも核酸の２つの無細胞源を含む。その１つは循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）で、アポトーシス細胞または壊死細胞から生じる。もう１つのＲＮＡは、エキソソーム（ｅｘｏＲＮＡ）を含む細胞外小胞に閉じ込められている。細胞外小胞は体内で細胞により活発に分泌される。生体液中の核酸の総量は非常に限られており、腫瘍変異はＲＮＡおよびＤＮＡの両方に反映されるので、ＲＴ−定量ＰＣＲによる有効な下流の処理およびＮＧＳ（次世代配列決定）による標的再配列決定に十分な少ない体積で血漿試料からｅｘｏＲＮＡおよびｃｆＤＮＡをすべて共単離する方法が考案された。
【０１４４】
図２２４〜図２２６は、本明細書に示される研究を図示している。この研究は、（ｉ）血漿は、無細胞ＤＮＡに加えて無細胞ＲＮＡ含むこと、（ｉｉ）ＥＸ０５２は、大きい体積の生体液からすべてのｅｘｏＲＮＡおよびｃｆＤＮＡを共単離するのに高速で再現性があり、便利な手順であること、および（ｉｉｉ）ｅｘｏＲＮＡおよびｃｆＤＮＡの両方を用いると、定量ＰＣＲおよびＮＧＳによる希な変異体の検出に利用可能な分子が典型的には倍になることを示す。
【０１４５】
図２２７および図２２８は、本明細書で提供されるＥＸ０５２法の総循環核酸を捕捉する能力を示す一連のグラフである。ＥＸ０５２法を市販の循環核酸ＤＮＡ単離キットと比較した。図２２７〜図２２８に示されるように、ＥＸ０５２はすべてのｃｆＤＮＡを捕捉した。また、ＥＸ０５２は、ｃｆＤＮＡ単独と比べてｅｘｏＲＮＡとｃｆＤＮＡの組み合わせでは有意により多くのコピーを検出した。また、図２２８は、患者がｃｆＤＮＡ分析にのみ基づいた生体指標について陰性と同定されても、ＤＮＡとＲＮＡを組み合わせた分析ではその生体指標について陽性と同定されたことを示している。当業者には自明であるが、変異またはその他の生体指標のコピーが多い程、変異またはその他の生体指標の同定の感度および正確度が増す。
【０１４６】
その他の実施形態
本発明をその詳細な説明と合わせて記載したが、上述の記載は、添付の請求項の範囲によって規定される本発明の範囲を例示する意図であって、本発明の範囲を限定する意図ではない。その他の側面、利点、および修正は以下の範囲内に含まれる。
【図１】
2020202860.tif 000003
【図２】
2020202860.tif 000004
【図３】
2020202860.tif 000005
【図４】
2020202860.tif 000006
【図５】
2020202860.tif 000007
【図６】
2020202860.tif 000008
【図７】
2020202860.tif 000009
【図８】
2020202860.tif 000010
【図９】
2020202860.tif 000011
【図１０】
2020202860.tif 000012
【図１１】
2020202860.tif 000013
【図１２】
2020202860.tif 000014
【図１３】
2020202860.tif 000015
【図１４】
2020202860.tif 000016
【図１５】
2020202860.tif 000017
【図１６】
2020202860.tif 000018
【図１７】
2020202860.tif 000019
【図１８】
2020202860.tif 000020
【図１９】
2020202860.tif 000021
【図２０】
2020202860.tif 000022
【図２１】
2020202860.tif 000023
【図２２】
2020202860.tif 000024
【図２３】
2020202860.tif 000025
【図２４】
2020202860.tif 000026
【図２５】
2020202860.tif 000027
【図２６】
2020202860.tif 000028
【図２７】
2020202860.tif 000029
【図２８】
2020202860.tif 000030
【図２９】
2020202860.tif 000031
【図３０】
2020202860.tif 000032
【図３１】
2020202860.tif 000033
【図３２】
2020202860.tif 000034
【図３３】
2020202860.tif 000035
【図３４】
2020202860.tif 000036
【図３５】
2020202860.tif 000037
【図３６】
2020202860.tif 000038
【図３７】
2020202860.tif 000039
【図３８】
2020202860.tif 000040
【図３９】
2020202860.tif 000041
【図４０】
2020202860.tif 000042
【図４１】
2020202860.tif 000043
【図４２】
2020202860.tif 000044
【図４３】
2020202860.tif 000045
【図４４】
2020202860.tif 000046
【図４５】
2020202860.tif 000047
【図４６】
2020202860.tif 000048
【図４７】
2020202860.tif 000049
【図４８】
2020202860.tif 000050
【図４９】
2020202860.tif 000051
【図５０】
2020202860.tif 000052
【図５１】
2020202860.tif 000053
【図５２】
2020202860.tif 000054
【図５３】
2020202860.tif 000055
【図５４】
2020202860.tif 000056
【図５５】
2020202860.tif 000057
【図５６】
2020202860.tif 000058
【図５７】
2020202860.tif 000059
【図５８】
2020202860.tif 000060
【図５９】
2020202860.tif 000061
【図６０】
2020202860.tif 000062
【図６１】
2020202860.tif 000063
【図６２】
2020202860.tif 000064
【図６３】
2020202860.tif 000065
【図６４】
2020202860.tif 000066
【図６５】
2020202860.tif 000067
【図６６】
2020202860.tif 000068
【図６７】
2020202860.tif 000069
【図６８】
2020202860.tif 000070
【図６９】
2020202860.tif 000071
【図７０】
2020202860.tif 000072
【図７１】
2020202860.tif 000073
【図７２】
2020202860.tif 000074
【図７３】
2020202860.tif 000075
【図７４】
2020202860.tif 000076
【図７５】
2020202860.tif 000077
【図７６】
2020202860.tif 000078
【図７７】
2020202860.tif 000079
【図７８】
2020202860.tif 000080
【図７９】
2020202860.tif 000081
【図８０】
2020202860.tif 000082
【図８１】
2020202860.tif 000083
【図８２】
2020202860.tif 000084
【図８３】
2020202860.tif 000085
【図８４】
2020202860.tif 000086
【図８５】
2020202860.tif 000087
【図８６】
2020202860.tif 000088
【図８７】
2020202860.tif 000089
【図８８】
2020202860.tif 000090
【図８９】
2020202860.tif 000091
【図９０】
2020202860.tif 000092
【図９１】
2020202860.tif 000093
【図９２】
2020202860.tif 000094
【図９３】
2020202860.tif 000095
【図９４】
2020202860.tif 000096
【図９５】
2020202860.tif 000097
【図９６】
2020202860.tif 000098
【図９７】
2020202860.tif 000099
【図９８】
2020202860.tif 000100
【図９９】
2020202860.tif 000101
【図１００】
2020202860.tif 000102
【図１０１】
2020202860.tif 000103
【図１０２】
2020202860.tif 000104
【図１０３】
2020202860.tif 000105
【図１０４】
2020202860.tif 000106
【図１０５】
2020202860.tif 000107
【図１０６】
2020202860.tif 000108
【図１０７】
2020202860.tif 000109
【図１０８】
2020202860.tif 000110
【図１０９】
2020202860.tif 000111
【図１１０】
2020202860.tif 000112
【図１１１】
2020202860.tif 000113
【図１１２】
2020202860.tif 000114
【図１１３】
2020202860.tif 000115
【図１１４】
2020202860.tif 000116
【図１１５】
2020202860.tif 000117
【図１１６】
2020202860.tif 000118
【図１１７】
2020202860.tif 000119
【図１１８】
2020202860.tif 000120
【図１１９】
2020202860.tif 000121
【図１２０】
2020202860.tif 000122
【図１２１】
2020202860.tif 000123
【図１２２】
2020202860.tif 000124
【図１２３】
2020202860.tif 000125
【図１２４】
2020202860.tif 000126
【図１２５】
2020202860.tif 000127
【図１２６】
2020202860.tif 000128
【図１２７】
2020202860.tif 000129
【図１２８】
2020202860.tif 000130
【図１２９】
2020202860.tif 000131
【図１３０】
2020202860.tif 000132
【図１３１】
2020202860.tif 000133
【図１３２】
2020202860.tif 000134
【図１３３】
2020202860.tif 000135
【図１３４】
2020202860.tif 000136
【図１３５】
2020202860.tif 000137
【図１３６】
2020202860.tif 000138
【図１３７】
2020202860.tif 000139
【図１３８】
2020202860.tif 000140
【図１３９】
2020202860.tif 000141
【図１４０】
2020202860.tif 000142
【図１４１】
2020202860.tif 000143
【図１４２】
2020202860.tif 000144
【図１４３】
2020202860.tif 000145
【図１４４】
2020202860.tif 000146
【図１４５】
2020202860.tif 000147
【図１４６】
2020202860.tif 000148
【図１４７】
2020202860.tif 000149
【図１４８】
2020202860.tif 000150
【図１４９】
2020202860.tif 000151
【図１５０】
2020202860.tif 000152
【図１５１】
2020202860.tif 000153
【図１５２】
2020202860.tif 000154
【図１５３】
2020202860.tif 000155
【図１５４】
2020202860.tif 000156
【図１５５】
2020202860.tif 000157
【図１５６】
2020202860.tif 000158
【図１５７】
2020202860.tif 000159
【図１５８】
2020202860.tif 000160
【図１５９】
2020202860.tif 000161
【図１６０】
2020202860.tif 000162
【図１６１】
2020202860.tif 000163
【図１６２】
2020202860.tif 000164
【図１６３】
2020202860.tif 000165
【図１６４】
2020202860.tif 000166
【図１６５】
2020202860.tif 000167
【図１６６】
2020202860.tif 000168
【図１６７】
2020202860.tif 000169
【図１６８】
2020202860.tif 000170
【図１６９】
2020202860.tif 000171
【図１７０】
2020202860.tif 000172
【図１７１】
2020202860.tif 000173
【図１７２】
2020202860.tif 000174
【図１７３】
2020202860.tif 000175
【図１７４】
2020202860.tif 000176
【図１７５】
2020202860.tif 000177
【図１７６】
2020202860.tif 000178
【図１７７】
2020202860.tif 000179
【図１７８】
2020202860.tif 000180
【図１７９】
2020202860.tif 000181
【図１８０】
2020202860.tif 000182
【図１８１】
2020202860.tif 000183
【図１８２】
2020202860.tif 000184
【図１８３】
2020202860.tif 000185
【図１８４】
2020202860.tif 000186
【図１８５】
2020202860.tif 000187
【図１８６】
2020202860.tif 000188
【図１８７】
2020202860.tif 000189
【図１８８】
2020202860.tif 000190
【図１８９】
2020202860.tif 000191
【図１９０】
2020202860.tif 000192
【図１９１】
2020202860.tif 000193
【図１９２】
2020202860.tif 000194
【図１９３】
2020202860.tif 000195
【図１９４】
2020202860.tif 000196
【図１９５】
2020202860.tif 000197
【図１９６】
2020202860.tif 000198
【図１９７】
2020202860.tif 000199
【図１９８】
2020202860.tif 000200
【図１９９】
2020202860.tif 000201
【図２００】
2020202860.tif 000202
【図２０１】
2020202860.tif 000203
【図２０２】
2020202860.tif 000204
【図２０３】
2020202860.tif 000205
【図２０４】
2020202860.tif 000206
【図２０５】
2020202860.tif 000207
【図２０６】
2020202860.tif 000208
【図２０７】
2020202860.tif 000209
【図２０８】
2020202860.tif 000210
【図２０９】
2020202860.tif 000211
【図２１０】
2020202860.tif 000212
【図２１１】
2020202860.tif 000213
【図２１２】
2020202860.tif 000214
【図２１３】
2020202860.tif 000215
【図２１４】
2020202860.tif 000216
【図２１５】
2020202860.tif 000217
【図２１６】
2020202860.tif 000218
【図２１７】
2020202860.tif 000219
【図２１８】
2020202860.tif 000220
【図２１９】
2020202860.tif 000221
【図２２０】
2020202860.tif 000222
【図２２１】
2020202860.tif 000223
【図２２２】
2020202860.tif 000224
【図２２３】
2020202860.tif 000225
【図２２４】
2020202860.tif 000226
【図２２５】
2020202860.tif 000227
【図２２６】
2020202860.tif 000228
【図２２７】
2020202860.tif 000229
【図２２８】
2020202860.tif 000230
【手続補正書】
【提出日】令和2年9月8日(2020.9.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）生体試料に由来する無細胞ＤＮＡおよび微小小胞体を捕捉表面または表面内に保持するのに十分な条件で前記生体試料を前記捕捉表面と接触させる工程、ここで、前記捕捉表面は、四級アンモニウムＲ−ＣＨ２−Ｎ＋（ＣＨ３）３で官能化された陰イオン交換体である膜、または正に帯電しかつ四級アンモニウムＲ−ＣＨ２−Ｎ＋（ＣＨ３）３で官能化された膜である、
（ｂ）前記無細胞ＤＮＡおよび前記微小小胞体を前記捕捉表面または表面内に保持したまま、前記捕捉表面をチオシアン酸グアニジン系溶解試薬と接触させて、前記ＤＮＡおよびＲＮＡを前記試料から放出させて均質液を生成する工程、および
（ｃ）前記均質液から前記ＤＮＡ、前記ＲＮＡ、または前記ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を抽出する工程、
を含む、生体試料からＤＮＡおよびＲＮＡを抽出する方法。
【請求項２】
前記均質液にクロロホルムを添加することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記膜は、四級アンモニウムＲ−ＣＨ２−Ｎ＋（ＣＨ３）３で官能化された陰イオン交換体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記膜は、更に正に帯電している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記膜の孔径は、少なくとも３μｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記捕捉表面は、互いに直接隣接した３つの膜を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記３つの膜は、互いに同一である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
各膜は、正に帯電している、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
各膜は、四級アンモニウムＲ−ＣＨ２−Ｎ＋（ＣＨ３）３で官能化された陰イオン交換体である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
各膜は、正に帯電し、かつ四級アンモニウムＲ−ＣＨ２−Ｎ＋（ＣＨ３）３で官能化された陰イオン交換体である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記生体試料は血漿または血清である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記生体試料は０．２ｍＬから４ｍＬの体積を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記生体試料は、尿、脳脊髄液、または細胞培地の上澄みである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ａ）は、前記生体試料を前記捕捉表面と接触させる前後に濾過して前記生体試料を処理する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記濾過は、０．８μｍのフィルターを用いて行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ａ）は、前記生体試料を前記捕捉表面と接触させた後に、遠心分離工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ａ）は、前記生体試料を前記捕捉表面に接触させた後に、前記捕捉表面を洗浄することをさらに含む、請求項１または請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｂ）は、前記捕捉表面を前記チオシアン酸グアニジン系溶解試薬と接触させた後に、遠心分離工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記均質液にクロロホルムを添加する前に前記均質液に対照を添加することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法は、工程（ｃ）からの抽出物をエタノールで調整する工程（ｄ）、前記エタノールで調整した抽出物をシリカカラムに結合させる工程（ｅ）、および前記抽出物を前記シリカカラムから溶出させる工程（ｆ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）生体試料に由来する無細胞ＤＮＡおよび微小小胞体を捕捉表面または表面内に保持するのに十分な条件で前記生体試料を捕捉表面と接触させる工程、ここで、前記捕捉表面は、四級アンモニウムＲ−ＣＨ２−Ｎ＋（ＣＨ３）３で官能化された陰イオン交換体である１種以上のビーズ、または正に帯電しかつ四級アンモニウムＲ−ＣＨ２−Ｎ＋（ＣＨ３）３で官能化された１種以上のビーズである、
（ｂ）前記無細胞ＤＮＡおよび前記微小小胞体を前記捕捉表面または表面内に保持したまま、前記捕捉表面をチオシアン酸グアニジン系溶解試薬と接触させて、前記試料から前記ＤＮＡおよびＲＮＡを放出させて、均質液を生成する工程、および
（ｃ）前記均質液から前記ＤＮＡ、前記ＲＮＡ、または前記ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を抽出する工程、
を含む、生体試料からＤＮＡおよびＲＮＡを抽出する方法。
【請求項２２】
前記均質液にクロロホルムを添加することを更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
１種以上のビーズは、四級アンモニウムＲ−ＣＨ２−Ｎ＋（ＣＨ３）３で官能化された陰イオン交換体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記１種以上のビーズは、更に正に帯電している、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記生体試料は血漿または血清である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記生体試料は、０．２ｍＬから４ｍＬの体積を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記生体試料は、尿、脳脊髄液、または細胞培地の上澄みである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
工程（ａ）は、前記生体試料を前記捕捉表面と接触させる前後に濾過して前記生体試料を処理する工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記濾過は、０．８μｍのフィルターを用いて行われる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
工程（ａ）は、前記生体試料を前記捕捉表面と接触させた後に、遠心分離工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
工程（ａ）は、前記生体試料を前記捕捉表面と接触させた後に、前記捕捉表面を洗浄することをさらに含む、請求項２１または請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
工程（ｂ）は、前記捕捉表面を前記チオシアン酸グアニジン系溶解試薬に接触させた後に、遠心分離工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
工程（ｃ）は、前記均質液にクロロホルムを添加する前に前記均質液に対照を添加することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
前記方法は、工程（ｃ）からの抽出物をエタノールで調節する工程（ｄ）、前記エタノールで調節した抽出物をシリカカラムに結合させる工程（ｅ）、および前記抽出物を前記シリカカラムから溶出させる工程（ｆ）をさらに含む、請求項２１に記載の方法。