(57)【要約】【課題】新たな心筋分化促進剤を提供すること。【解決手段】  本発明に係る心筋分化促進剤は、細胞又は個体に対して適用することにより筋分化を促進する活性を有するオリゴＤＮＡを含む。前記オリゴＤＮＡは好ましくは、５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含み、５’末端側に塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、及び多能性幹細胞に由来する幹細胞からなる群より選択される少なくとも一種に対して適用することにより心筋への分化を促進する活性を有するオリゴＤＮＡを含む心筋分化促進剤。
【請求項２】
前記オリゴＤＮＡは、５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列が２以上連結している、請求項１記載の心筋分化促進剤。
【請求項３】
前記オリゴＤＮＡは、５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列に５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を連結して含む請求項２記載の心筋分化促進剤。
【請求項４】
前記オリゴＤＮＡは、塩基配列５’ＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ３’を含む請求項３記載の心筋分化促進剤。
【請求項５】
前記オリゴＤＮＡは、５’ＴＴＡＧＧＧ３’ 又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含み、５’末端側に塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有する請求項１記載の心筋分化促進剤。
【請求項６】
哺乳類由来の多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、及び多能性幹細胞に由来する幹細胞からなる群より選択される少なくとも一種に対して適用するための請求項１から５のいずれか１項に記載の心筋分化促進剤。
【請求項７】
前記オリゴＤＮＡは５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含む請求項１記載の心筋分化促進剤。
【請求項８】
５’末端側に塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有した請求項７記載の心筋分化促進剤。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかの１項に記載の心筋分化促進剤を使用する心筋分化促進方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋分化促進剤、心筋分化促進方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
わが国の心不全の患者数は約３０万人にのぼる。心不全患者のうち、特に重症心不全に対する根本的治療法は、心臓移植及び人工心臓治療があるものの、ドナーの不足、人工心臓の耐久性等が問題となっている。かかる状況の下、心筋再生治療法の開発が熱望されている。心筋再生治療法の開発には、細胞の心筋への分化誘導技術が必要となる。
【０００３】
多能性幹細胞から心筋細胞への分化誘導に関する研究としては、例えば、マウスＥＳ細胞、霊長類ＥＳ細胞、マウスｉＰＳ細胞に、ヒストン脱アセチル化阻害剤であるトリコスタチンＡを投与することで、これら多能性幹細胞の心筋分化を誘導できることが見出されている（非特許文献１−３）。
【０００４】
しかし、ヒストン脱アセチル化酵素は全ての細胞に存在しており、その阻害剤であるトリコスタチンＡには神経幹細胞から神経細胞への分化を促進し星状細胞（アストロサイト）への分化を抑制する効果も報告されている（非特許文献４）。また、トリコスタチンＡには抗腫瘍作用が認められているが、その作用機序の一端はトリコスタチンＡが細胞周期を阻害することにあり、そのため、トリコスタチンを一定以上の濃度で投与すると正常な細胞に対して毒性を発揮することも広く知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kawamura T, Ono K, Morimoto T, Wada H, Hirai M, Hidaka K, Morisaki T, Heike T, Nakahata T, Kita T, Hasegawa K. Acetylation of GATA-4 is involved in the differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes. J Biol Chem. 2005; 280: 19682-19688. (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15764815)
【非特許文献２】Hosseinkhani M, Hasegawa K, Ono K, Kawamura T, Takaya T, Morimoto T, Wada H, Shimatsu A, Prat SG, Suemori H, Nakatsuji N, Kita T. Trichostatin A induces myocardial differentiation of monkey ES cells. Biochem Biophys Res Commun. 2007; 356: 386-391. (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17368572)
【非特許文献３】Kaichi S, Hasegawa K, Takaya T, Yokoo N, Mima T, Kawamura T, Morimoto T, Ono K, Baba S, Doi H, Yamanaka S, Nakahata T, Heike T. Cell line-dependent differentiation of induced pluripotent stem cells into cardiomyocytes in mice. Cardiovasc Res. 2010; 88: 314-323. (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20547733)
【非特許文献４】Balasubramaniyan V, Boddeke E, Bakels R, Ku&uml;st B, Kooistra S, Veneman A, Copray S. Effects of histone deacetylation inhibition on neuronal differentiation of embryonic mouse neural stem cells. Neuroscience. 2006; 143: 939-951. (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17084985)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決すべき課題は、新たな心筋分化促進剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行い、新たな知見を見出すに至った。
具体的には、典型的な実施形態において、本発明は、以下の項を提供する
項１．多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、及び多能性幹細胞に由来する幹細胞からなる群より選択される少なくとも一種に対して適用することにより心筋への分化を促進する活性を有するオリゴＤＮＡを含む心筋分化促進剤。
【０００８】
項２．ベルベリンもしくはその類縁体化合物又はその塩をさらに含む項１に記載の心筋分化促進剤。
【０００９】
項３．前記オリゴＤＮＡは、５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列が２以上連結している、項１又は２記載の心筋分化促進剤。
【００１０】
項４．前記オリゴＤＮＡは、５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列に５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を連結して含む項３記載の心筋分化促進剤。
【００１１】
項５．前記オリゴＤＮＡは、塩基配列５’ＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ３’を含む項４記載の心筋分化促進剤。
【００１２】
項６．前記オリゴＤＮＡは、５’ＴＴＡＧＧＧ３’ 又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含み、５’末端側に塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有する項１記載の心筋分化促進剤。
【００１３】
項７．哺乳類由来の細胞に対して適用するための項１から６のいずれか１項に記載の心筋分化促進剤。
【００１４】
項８．前記オリゴＤＮＡは５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含む項２記載の心筋分化促進剤。
【００１５】
項９．５’末端側に塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有した項８記載の心筋分化促進剤。
【００１６】
項１０．前記オリゴＤＮＡと前記ベルベリンもしくはその類縁体化合物又はその塩のモル比は１：１０〜１０：１である、項２記載の心筋分化促進剤。
【００１７】
項１１．項１から１０のいずれかの１項に記載の心筋分化促進剤を使用する心筋分化促進方法。
【００１８】
項１２．５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含み、５’末端側に塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有する心筋分化を促進する活性を有するオリゴＤＮＡ。
【００１９】
項１３．５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列が２以上連結している項１４記載のオリゴＤＮＡ。
【００２０】
項１４．５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列に５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を連結して含む項１３記載のオリゴＤＮＡ。
【００２１】
項１５．塩基配列５’ＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ３’を含む項１４記載のオリゴＤＮＡ。
【００２２】
項１６．細胞又は個体に対して適用することにより心筋分化を促進する活性を有し、塩基長が６から２５のいずれかであるオリゴＤＮＡ。
【００２３】
項１７．前記塩基長が９から１８のいずれかである項１６記載のオリゴＤＮＡ。
【００２４】
項１８．前記塩基長が１８である項１６記載のオリゴＤＮＡ。
【００２５】
項１９．５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含み、５’末端側に塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有した項１６記載のオリゴＤＮＡ。
【００２６】
項２０．５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列が２以上連結したことを特徴とする項１９記載のオリゴＤＮＡ。
【００２７】
項２１．塩基配列５’ＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含み、かつ前記塩基長が１７から２３である多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、及び多能性幹細胞に由来する幹細胞からなる群より選択される少なくとも一種の心筋への分化を促進する活性を有するオリゴＤＮＡ。
【００２８】
項２２．オリゴＤＮＡによる心筋分化促進を増強するための増強剤であって、ベルベリンもしくはその類縁化合物又はその塩を含む増強剤。
【００２９】
項２３．前記オリゴＤＮＡは５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含む項２２記載の増強剤。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、心筋分化を強力に促進することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】参考例１におけるＭＨＣ陽性細胞出現結果を示すグラフ
【図２】参考例１におけるオリゴＤＮＡのＭＨＣ陽性細胞出現結果を示すグラフ
【図３】参考例２におけるオリゴＤＮＡ濃度とＭＨＣ陽性細胞出現の関係を示すグラフ
【図４】参考例２におけるオリゴＤＮＡの熱変性の影響を示すグラフ
【図５】参考例３におけるヒト横紋筋肉腫の増殖抑制効果を示すグラフ
【図６】参考例４におけるオリゴＤＮＡ変異型のＭＨＣ陽性細胞の出現を示すグラフ
【図７】参考例５におけるマウス筋芽細胞に対する特異的効果を示すグラフ
【図８】参考例６におけるベルベリン又は類縁体化合物併用の効果を示すグラフ
【図９】参考例７におけるベルベリンによるオリゴＤＮＡ変異型の筋分化促進作用の増強効果を示すグラフ
【図１０】参考例８におけるニワトリ筋芽細胞におけるベルベリン又は類縁体化合物によるオリゴＤＮＡの筋分化促進作用の増強効果を示すグラフ
【図１１】参考例９におけるヒト横紋筋肉腫細胞の種類に起因する効果の差を示すグラフ
【図１２】参考例９におけるオリゴＤＮＡとベルベリンのヒト横紋筋肉腫細胞増殖抑制効果を示すグラフ
【図１３】参考例と本実施例との違いを説明するための図面
【図１４】本発明の実施例１における分化誘導８日目（ｍｙｏＤＮ曝露３日目）のＥＳ細胞の顕微鏡画像
【図１５】本発明の実施例２における分化誘導１１日目（ｍｙｏＤＮ曝露６日後）のｉＰＳ細胞の顕微鏡画像
【図１６】本発明の実施例２における自律的拍動の測定結果
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明の一態様に係る心筋分化促進剤は、細胞又は個体に対して適用することにより心筋分化を促進する活性を有するオリゴＤＮＡを含む。本発明において、「心筋分化を促進する活性を有する」とは、本発明の属する分野における技術常識を参酌して適宜解釈し得るが、一般的には、対照群と比較して、転写因子Ｎｋｘ２―５など心筋細胞あるいは心筋前駆細胞で特異的に発現する遺伝子を発現する細胞や、自律的に拍動する心筋細胞あるいはそのクラスターが出現する数ないし割合を増加させる、あるいは出現時期を早める性質を指す。
【００３３】
前記心筋分化促進剤において前記オリゴＤＮＡは５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含んでいてもよい。本発明において、「５’ＸＸＸＸＸＸ３’又は５’ＹＹＹＹＹＹ３’を含む」には、５’ＸＸＸＸＸＸ３’及び５’ＹＹＹＹＹＹ３’の一方のみを含む場合と、これらの両方を含む場合とを包含する。本発明にかかるオリゴＤＮＡがコア塩基配列を含む実施形態においては、当該オリゴＤＮＡは、５’末端側に、塩基配列ＧＡＡ、塩基配列ＡＧＡ、塩基配列ＡＡＧ又は塩基配列ＡＡＡ；好ましくは塩基配列ＡＧＡ、塩基配列ＡＡＧ又は塩基配列ＡＡＡ；より好ましくは塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有してもよい。かかる実施形態において、「５’末端側に塩基配列ＸＸＸを有する」とは、コア塩基配列よりも５’末端側に塩基配列ＸＸＸを有することを意味し、オリゴＤＮＡの５’末端に塩基配列ＸＸＸを有する場合だけでなく、塩基配列ＸＸＸのさらに５’末端に塩基配列（例えば、Ａ及びＧからなる群より選択される少なくとも１個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個）からなる塩基配列）を有する場合も包含される。また、当該実施形態において、上記塩基配列（塩基配列ＧＡＡ、塩基配列ＡＧＡ、塩基配列ＡＡＧ又は塩基配列ＡＡＡ；好ましくは塩基配列ＡＧＡ、塩基配列ＡＡＧ又は塩基配列ＡＡＡ；より好ましくは塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧ）は、コア配列に連結していることが好ましいが、上記塩基配列とコア配列との間に別の塩基配列（例えば、Ａ及びＧからなる群より選択される少なくとも１個（例えば、好ましくは１〜３個）からなる塩基配列）を介していてもよい。
【００３４】
前記心筋分化促進剤において前記オリゴＤＮＡは５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列が２以上（好ましくは２〜３、より好ましくは２）連結して含んでもよい。すなわち、前記オリゴＤＮＡは、５’ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ３’（配列番号２８）；５’ＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ３’（配列番号２９）；５’ＴＧＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ３’（配列番号３０）；又は５’ＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ３’（配列番号３１）を含んでもよい。これらのコア塩基配列のうち、５’ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ３’、５’ＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ３’等が好ましい。
【００３５】
前記心筋分化促進剤において前記オリゴＤＮＡは５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列に５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を連結して含んでもよい。
【００３６】
前記心筋分化促進剤において前記オリゴＤＮＡは塩基配列５’ＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ３’を含んでもよい。
【００３７】
前記心筋分化促進剤において前記細胞はマウス、ニワトリ又はヒト由来の細胞であってもよい。
【００３８】
本発明の一態様に係る心筋分化促進方法は、前記心筋分化促進剤を使用する。
【００３９】
本発明の一態様に係る心筋分化促進オリゴＤＮＡは、５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含み、５’末端側に塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有する。
【００４０】
前記心筋分化促進オリゴＤＮＡにおいて５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列が２以上連結してもよい。
【００４１】
前記心筋分化促進オリゴＤＮＡにおいて５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列に５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を連結して含んでもよい。
【００４２】
前記心筋分化促進オリゴＤＮＡにおいて塩基配列５’ＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ３’を含んでもよい。
【００４３】
本発明の一態様に係る心筋分化促進剤は細胞又は個体に対して適用することにより心筋分化を促進する活性を有するオリゴＤＮＡとベルベリン又はその類縁体化合物とを含む。
【００４４】
前記心筋分化促進剤において前記オリゴＤＮＡは５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含む。
【００４５】
前記心筋分化促進剤において前記オリゴＤＮＡ５’は末端側に塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有してもよい。
【００４６】
前記オリゴＤＮＡと前記ベルベリン又はその類縁体化合物のモル比は等しくあってもよい。
【００４７】
本発明の一態様に係る心筋分化促進方法は５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含むオリゴＤＮＡとベルベリン又はその類縁体化合物とを含む心筋分化促進剤を使用する。
【００４８】
本発明の一態様に係る増強剤は、オリゴＤＮＡと併用され、細胞又は、個体に対して適用することにより心筋分化を促進する増強剤であって、ベルベリン又はその類縁化合物を含む。
【００４９】
前記増強剤において、５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含むオリゴＤＮＡと併用されてもよい。
【００５０】
本発明の一態様に係るオリゴＤＮＡは細胞又は個体に対して適用することにより心筋分化を促進する活性を有し、塩基長が２５以下が好ましく、２３以下がより好ましく、２１以下がさらに好ましく、１９以下がなお更に好ましい。本発明の一態様において、オリゴＤＮＡの塩基長は、６以上が好ましく、９以上がより好ましく、１５以上がさらに好ましく、１７以上がなお更に好ましい。本発明の一態様において、オリゴＤＮＡの塩基長は、例えば、６から２５のいずれかであり、好ましくは１７から２３である。
【００５１】
前記オリゴＤＮＡにおいて前記塩基長が９から１８のいずれかであってもよい。
【００５２】
前記オリゴＤＮＡにおいて前記塩基長が１３から２３のいずれか、好ましくは１５から２１のいずれか、より好ましくは１７から１９のいずれか、さらに好ましくは１８であってもよい。
【００５３】
前記オリゴＤＮＡにおいて５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含み、５’末端側に塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有しているのが好ましい。
【００５４】
前記オリゴＤＮＡにおいて５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列が２以上連結しているのが好ましい。
【００５５】
また、本発明において、オリゴＤＮＡは、後述する配列番号１〜７、１６のいずれかで示される塩基配列からなるもの；配列番号１〜７、１６のいずれかにおいて１個又は数個（好ましくは１〜３個、より好ましく１個）の塩基が置換、欠失、挿入又は付加された塩基配列からなるもの等が好ましい。また、本発明において、オリゴＤＮＡとしては、５’ＡＡＡＡＧＡＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡ３’（配列番号３２）又は５’ＡＡＡＡＡＧＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡ３’（配列番号３３）で示される塩基配列からなるもの、当該配列番号３２又は３３で示される塩基配列のうち連続する１５〜２１個（好ましくは１７〜１９固、さらに好ましくは１８個）の塩基で示される塩基配列からなるもの、これらの塩基配列いずれかにおいて１個又は数個（好ましくは１〜３個、より好ましく１個）の塩基が置換、欠失、挿入又は付加された塩基配列からなるもの等が好ましい。
【００５６】
また、本発明において、オリゴＤＮＡとしては、
５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＴＸ７ＡＧＧＧＴＸ８ＡＧＧＧＴＸ９Ａ３’（配列番号３４）
［式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５及びＸ６は、それぞれ独立して、Ａ又はＧを示す。Ｘ７及びＸ８、Ｘ９は、それぞれ独立して、Ｔ又はＧを示す。］
で示される塩基配列のうち連続する１５〜２１個（好ましくは１７〜１９固、さらに好ましくは１８個）の塩基で示される塩基配列からなるもの等が好ましい。上記実施形態において、オリゴＤＮＡは、Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＴＸ７ＡＧＧＧＴＸ８ＡＧＧＧを含むものが好ましい。また、配列番号３２においてＸ７としてはＴが好ましい。配列番号３２においてＸ８としてはＧが好ましい。配列番号３２においてＸ９としてはＧが好ましい。
【００５７】
本発明において、上記オリゴＤＮＡは、心筋分化を促進することができる。具体的には、後述するように、心筋特異的転写因子Ｎｋｘ２−５を発現し自律的に拍動する細胞のクラスターの出現が促進されることが確認された。しかも、上記オリゴＤＮＡ群は化学合成が可能で安定構造を有すため、将来的に大量に供給及び保存ができ、また乳酸菌のゲノム配列に由来するため、安全性も高いことが期待される。そのため、本発明の筋分化促進剤は、多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、多能性幹細胞に由来する幹細胞等から心筋細胞への分化誘導、または多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、多能性幹細胞に由来する幹細胞、これらの幹細胞から分化した心筋細胞等を用いた心臓再生治療、創薬のスクリーニングや心臓疾患の治療および研究に供する心筋前駆細胞または心筋細胞の作成等に利用可能である。
【００５８】
本発明においては、上記オリゴＤＮＡには、公知の心筋分化誘導剤（たとえば非特許文献４等に記載のトリコスタチンＡ等）を併用してもよい。これらを併用することでより高い効率で心筋分化を誘導できることが期待できるため好ましい。また、心筋分化誘導に特化した方法で培養した細胞にmyoDN等のオリゴＤＮＡを投与することでより高い効率で心筋分化を誘導できる可能性も十分に高いため好ましい。
【００５９】
本発明においては、本発明の有効成分である上記オリゴＤＮＡそのものを心筋分化促進剤として用いても、薬学的に許容される各種担体（例えば、例えば等張化剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、抗酸化剤、溶解補助剤、粘稠化剤、防腐剤等）と組み合わせた医薬組成物として用いてもよい。
等張化剤としては、例えば、グルコース、トレハロース、ラクトース、フルクトース、マンニトール、キシリトール、ソルビトール等の糖類、グリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等の多価アルコール類、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等の無機塩類等が挙げられる。
ｐＨ調節剤としては、例えば、塩酸、炭酸、酢酸、クエン酸等の酸が挙げられ、さらに水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウム等のアルカリ金属炭酸塩又は炭酸水素塩、酢酸ナトリウム等のアルカリ金属酢酸塩、クエン酸ナトリウム等のアルカリ金属クエン酸塩、トロメタモール等の塩基等が挙げられる。
抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム、乾燥亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム等が挙げられる。
溶解補助剤としては、例えば、安息香酸ナトリウム、グリセリン、Ｄ−ソルビトール、ブドウ糖、プロピレングリコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。
粘稠化剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、エチルセルロース、カルメロースナトリウム、キサンタンガム、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等が挙げられる。
防腐剤としては、例えば、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル等のパラオキシ安息香酸エステル、グルコン酸クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム等の第４級アンモニウム塩、アルキルポリアミノエチルグリシン、クロロブタノール、ポリクォード、ポリヘキサメチレンビグアニド、クロルヘキシジン等が挙げられる。
また、上記医薬組成物は、オリゴＤＮＡ以外に、心筋分化促進作用を有することが知られている化合物をさらに含んでいてもよい。
医薬組成物の実施形態において、組成物中のオリゴＤＮＡの含有量は特に限定されず、例えば、９０質量％以上、７０質量％以上、５０質量％以上、３０質量％以上、１０質量％以上、５質量％以上、１質量％以上等の条件から適宜設定できる。
製剤中の本発明のオリゴＤＮＡの含有量は、投与経路、患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、オリゴＤＮＡの１日投与量が通常１０〜５０００ｍｇ程度、より好ましくは１００〜１０００ｍｇ程度になる量とすればよい。１日１回投与する場合は、１製剤中にこの量が含まれていればよく、１日３回投与する場合は、１製剤中にこの３分の１量が含まれていればよい。
【００６０】
本実施形態における心筋分化促進剤は、例えば次に示す配列番号のオリゴＤＮＡを含む：
ｉＳＮ０１：５’ＡＡＡＡＧＡＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ３’（配列番号１）
ｉＳＮ０２：５’ＡＡＡＧＡＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴ３’（配列番号２）
ｉＳＮ０３：５’ＡＡＧＡＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧ３’（配列番号３）
ｉＳＮ０４：５’ＡＧＡＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡ３’（配列番号４）
ｉＳＮ０５：５’ＧＡＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧ３’（配列番号５）
ｉＳＮ０６：５’ＡＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＴ３’（配列番号６）
ｉＳＮ０７：５’ＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＴＴ３’（配列番号７）
ｉＳＮ０４’：５’ＡＡＧＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡ３’（配列番号１６）
前記配列番号１〜７、及び１６のオリゴＤＮＡはいずれもコア配列ＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ（配列番号２９）を含む。前記配列番号２８で示されるコア配列の５’末端側から２番目と８番目の塩基はＴでもＧでもよい。また前記コア配列の４〜６番目と９〜１１番目に配列ＧＧＧを有するが、心筋分化を活性させるに後者の配列がより重要である。なお、配列ＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列（ＴＴＡＧＧＧ）ｎはテロメアと呼ばれ、真核生物の染色体の末端部に存在する。テロメアは細胞分裂に先立つＤＮＡ複製とともに短くなり、細胞の老化が進むとされる（特許文献１）。
【００６１】
本実施形態における心筋分化促進剤は、より好ましくは、配列番号４及び／又は５１のオリゴＤＮＡ（以下、ｉＳＮ０４、ｉＳＮ０４’）を含む。これらのオリゴＤＮＡは前記コア配列の５’側に配列ＡＧＡ又はＡＡＧを含む。以下、ｉＳＮ０４、ｉＳＮ０４’を併せて、「ｍｙｏＤＮ」と称する。
【００６２】
本実施形態における前記オリゴＤＮＡは一本鎖であってもよい。また、核酸分解酵素に対して耐性を高めるためにホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチドのリン酸基の酸素原子を硫黄原子で置換したもの（例えばホスホロチオエート結合）であってもよいが、これらに限定されない。また、前記オリゴＤＮＡは乳酸菌、大腸菌などの生物からＤＮＡを抽出し断片化したもの、あるいは、化学合成、遺伝子組替え技術によって作成したものであってもよいが、これらに限定されない。
【００６３】
＜心筋分化促進剤の適用対象＞
本実施の形態における心筋分化促進剤は、多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、多能性幹細胞に由来する幹細胞、心筋前駆細胞等に対し適用可能である。本明細書において多能性幹細胞とは、自己複製により増殖する能力を有すると同時に、内胚葉、中胚葉、外胚葉のいずれにも分化でき、最終的には個体を構成する全ての細胞種に分化可能な細胞を示す。多能性幹細胞としては、ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）等が挙げられる。本明細書において多能性幹細胞に由来する幹細胞とは、多能性幹細胞から分化誘導した幹細胞であって、多能性は失ったものの複数または特定の細胞への分化能は依然として有するものを示す。本発明において多能性幹細胞に由来する幹細胞としては、多能性幹細胞を分化誘導することで出現する多分化能性幹細胞が好ましい。本明細書において多分化能性幹細胞とは、ある胚葉の系列に属する複数の細胞種へと分化可能な細胞を示す。本発明において「多分化能性幹細胞」は「多能性幹細胞に由来する幹細胞」と概念として重複する部分がある。従って、本発明においては、多分化能性幹細胞には、多能性幹細胞に由来する多分化能性幹細胞も、多能性幹細胞由来ではない（生体内に存在する、あるいは生体から取り出した）多分化能性幹細胞も含まれる。多分化能性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、骨髄幹細胞等が挙げられる。また、本発明の心筋分化促進剤は、骨芽細胞、脂肪前駆細胞、平滑筋前駆細胞等の前駆細胞に対し適用してもよい。本発明においては、例えば、生体内に存在する多分化能性幹細胞に本発明のオリゴＤＮＡを適用できる。より具体的には、生体内に存在する多分化能性幹細胞に対し、直接本発明のオリゴＤＮＡを適用してもよいし、生体内に存在する多分化能性幹細胞を体外に取り出し、それに本発明のオリゴＤＮＡを適用してもよい。これらの細胞としては、マウス、ヒトを含む哺乳類由来の細胞又はニワトリを含む鳥類由来の細胞を対象とすることができるが、これらに限定されない。
【００６４】
＜心筋分化促進剤の利用形態＞
本発明の心筋分化促進剤は、例えば、上記細胞を培養して心筋への分化誘導する際に培養培地に添加することで使用することができる。より具体的には、例えば、多能性幹細胞を培地（例えば、心筋への分化誘導用の培地）に播種した日を１日目とした場合、３〜７日目、好ましくは４〜６日目に本発明の心筋分化促進剤を当該培地に添加することで心筋分化を促進することができる。また、本発明において心筋分化促進剤は、インビトロで細胞に対し添加してもよいが、インビボで使用してもよい。例えば、被験者に対し細胞、細胞シート等を投与し、被験者の体内で心筋組織を再生中に、当該再生中の組織における心筋前駆細胞等に対し本発明の心筋分化促進剤を投与してもよい。本実施の形態における心筋分化促進剤は通常使用されている各種の担体、賦形剤の成分を配合し、公知の方法に従って、注射薬、塗布薬、錠剤、カプセル剤、シロップ、座薬等に製剤化できるが、これらに限定されない。また、前記筋分化促進剤は、経口、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、経腸、局所、舌下又は直腸手段によって投与することができるが、これらに限定されない。
【００６５】
（本発明の第２の実施形態）
以下、本発明の第２の実施形態について説明する。第２の実施形態の心筋分化促進剤はオリゴＤＮＡにベルベリンもしくはその類縁体化合物（例えば、パルマチン、ヤテオリジン、コランバミン等）又はその塩を併用したものである。好ましくは、オリゴＤＮＡとベルベリン又はその類縁体化合物のモル比を、１：１０〜１０：１、より好ましくは１：５〜５：１、さらに好ましくは１：２〜２：１、なおさらに好ましくは１：１で用いる。オリゴＤＮＡとしては、前述のものが挙げられる。当該実施形態において、心筋分化促進剤中のオリゴＤＮＡの含有量は特に限定されず、例えば、９０質量％以上、７０質量％以上、５０質量％以上、３０質量％以上、１０質量％以上、５質量％以上、１質量％以上等の条件から適宜設定できる。心筋分化促進剤中のオリゴＤＮＡの含有量の上限も特に限定されず、例えば、９０質量％以下、７０質量％以下、５０質量％以下、３０質量％以下、１０質量％以下、５質量％以下、１質量％以下等の条件から適宜設定できる。当該実施形態において、心筋分化促進剤中のベルベリンの含有量は特に限定されず、例えば、９０質量％以上、７０質量％以上、５０質量％以上、３０質量％以上、１０質量％以上、５質量％以上、１質量％以上等の条件から適宜設定できる。心筋分化促進剤中のベルベリンの含有量の上限も特に限定されず、例えば、９０質量％以下、７０質量％以下、５０質量％以下、３０質量％以下、１０質量％以下、５質量％以下、１質量％以下等の条件から適宜設定できる。
【００６６】
当該実施形態においては、安価で安全なベルベリン又はその類縁体化合物をオリゴＤＮＡに併用することによりオリゴＤＮＡの心筋分化促進作用を増強することが可能となる。ベルベリンの類縁体化合物としては、特に限定されず、天然の誘導体、人工の誘導体のいずれも使用し得る。
【００６７】
＜ベルベリン＞
ベルベリン（式１）はオウバク(黄檗)から抽出される生薬の成分で、アルカロイドの一種であり、窒素を含む塩基性の天然有機化合物として知られている。主に、抗菌、抗炎症、中枢抑制又は血圧降下剤として、下痢の止瀉薬、目薬として利用されており、人体に対して安全である。
【００６８】
【化１】
2020019718.tif 000002
【００６９】
ベルベリンは単体では筋分化促進効果は無く、後述の参考例で示されるように、むしろ弱い筋分化抑制効果を有する。しかし、ベルベリンをｉＳＮ０４又は所定の変異体とともに筋芽細胞に作用させたとき、筋分化促進効果が劇的に亢進する。変異体はｉＳＮ０４’でもよく、あるいはｉＳＮ０４の５’末端側より１１番目のＧをＴに置換したオリゴＤＮＡ（配列番号２６）であってもよい。ただし、後述の実施例で示されるように、ｉＳＮ０４の５番目のＴをＧに置換させるとベルベリンによる顕著な増強効果は見られなくなる。
【００７０】
＜パルマチン＞
ベルベリンに代えて、パルマチンをオリゴＤＮＡと併用してもよい。パルマチンはベルベリンと同じくオウバク(黄檗)から抽出される生薬成分であり、式２で示されるように、ベルベリンのメチレンジオキシ基の代わりにジメトキシ基を有す類縁体化合物である。当該実施形態において、心筋分化促進剤中のパルマチンの含有量は特に限定されず、例えば、９０質量％以上、７０質量％以上、５０質量％以上、３０質量％以上、１０質量％以上、５質量％以上、１質量％以上等の条件から適宜設定できる。心筋分化促進剤中のパルマチンの含有量の上限も特に限定されず、例えば、９０質量％以下、７０質量％以下、５０質量％以下、３０質量％以下、１０質量％以下、５質量％以下、１質量％以下等の条件から適宜設定できる。
【００７１】
【化２】
2020019718.tif 000003
【００７２】
ベルベリンもパルマチンも（Ｓ）−レチクリン（Ｃ１９Ｈ２３ＮＯ４）を前駆体としコランバミン（Ｃ２０Ｈ２０ＮＯ４）を経て生合成される。ベルベリンシターゼという酵素がコランバミンをメチレンジオキシ基を有するベルベリンに変換する。また他の酵素がコランバミンをメチル化してパルマチンを生成する。
【００７３】
＜その他の類縁体＞
ベルベリンの類縁体としては、パルマチン以外に、ヤテオリジン、コランバミン等が挙げられる：
【００７４】
【化３】
2020019718.tif 000004
【００７５】
当該実施形態において、心筋分化促進剤中の、ヤテオリジン、コランバミン等のベルベリンの類縁体の含有量は特に限定されず、例えば、９０質量％以上、７０質量％以上、５０質量％以上、３０質量％以上、１０質量％以上、５質量％以上、１質量％以上等の条件から適宜設定できる。心筋分化促進剤中のヤテオリジン、コランバミン等のベルベリンの類縁体の含有量の上限も特に限定されず、例えば、９０質量％以下、７０質量％以下、５０質量％以下、３０質量％以下、１０質量％以下、５質量％以下、１質量％以下等の条件から適宜設定できる。
【００７６】
ベルベリン及びパルマチン等の類縁体を生合成する植物からこれらを抽出及び精製する方法は既に確立されており、安価で利用することが可能である。さらにオリゴＤＮＡよりも安価なベルベリン又はパルマチン等の類縁体を併用することで、効果を高めつつオリゴＤＮＡの利用コストをさらに下げることが可能である。
【００７７】
本発明においてベルベリン又はその誘導体は、塩の状態で用いてもよい。また、ベルベリン又はその誘導体の塩としては、ハロゲン化物（塩化物等）等が挙げられる。また、ベルベリン又はその誘導体の塩としては、酸付加塩及び塩基との塩も挙げられる。酸付加塩の具体例として、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩等の有機酸塩、及びグルタミン酸塩、アスパラギン酸塩等の酸性アミノ酸塩が挙げられる。塩基との塩の具体例としては、ナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩のようなアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩、ピリジン塩、トリエチルアミン塩のような有機塩基との塩、リジン、アルギニン等の塩基性アミノ酸との塩が挙げられる。
【００７８】
本発明において、ベルベリンもしくはその誘導体又はこれらの塩は、前述したオリゴＤＮＡによる心筋分化促進作用を増強することができる。従って、本発明は、オリゴＤＮＡによる心筋分化促進を増強するための増強剤であって、ベルベリンもしくはその類縁化合物又はその塩を含む増強剤を提供する。当該実施形態において、ベルベリンもしくはその類縁化合物又はその塩の種類、配合量、オリゴＤＮＡの種類、使用量、その他成分等については、心筋分化促進剤について前述したのと同様の条件を適宜適用し得る。
【実施例】
【００７９】
以下、本発明の実施例について説明する。
【００８０】
（参考例１）
本発明者らは、マウス骨格筋から採取した衛星細胞を初代培養して得られた筋芽細胞を用い、骨格筋分化に作用する分子をスクリーニングする系を確立した。コラーゲンコートした９６ｗｅｌｌプレートで培養した筋芽細胞に、オリゴＤＮＡなどの分子を添加する。所定時間経過後に、免疫染色によって骨格筋の最終分化マーカーであるミオシン重鎖（ＭＨＣ）の発現を定量化する。このときＤＡＰＩ染色によって細胞核を可視化する。さらにイメージアナライザーを用いて、画像の撮影と解析を自動的に行い、筋分化効率と細胞数をハイスループットで定量する。このようにして、筋芽細胞に対する多種多様な分子の作用を効率的に検討することができる。
【００８１】
配列番号１〜３、及び５〜５１の５０種類のオリゴＤＮＡ群（表１）を用いたスクリーニング結果を図１に示す。マウス筋芽細胞（１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）にそれぞれ１０μＭの濃度のオリゴＤＮＡを曝露し、４８時間後にＭＨＣ陽性細胞の出現割合を測定した。なお、以下の参考例におけるオリゴＤＮＡは一本鎖で構成され、しかも核酸分解酵素に対して耐性を高めるためにホスホジエステル結合のリン酸基の酸素原子を硫黄原子で置換する処理（Ｓ化）を予め行っている。
【００８２】
＜表１＞
iSN01 :  5’AAAAGATTAGGGTGAGGG3’(配列番号1)
iSN02 :  5’AAAGATTAGGGTGAGGGT3’(配列番号2)
iSN03 :  5’AAGATTAGGGTGAGGGTG3’(配列番号3)
iSN04’: 5’AAGTTAGGGTGAGGGTGA3’(配列番号16)
iSN05 : 5’GATTAGGGTGAGGGTGAG3’(配列番号5)
iSN06 : 5’ATTAGGGTGAGGGTGAGT3’(配列番号6)
iSN07 : 5’TTAGGGTGAGGGTGAGTT3’(配列番号7)
iSN08 : 5’AGTTCAACATTAGGGTGA3’(配列番号8)
iSN09 : 5’GTTCAACATTAGGGTGAA3’(配列番号9)
iSN10 : 5’TTCAACATTAGGGTGAAA3’(配列番号10)
iSN11 : 5’TCAACATTAGGGTGAAAA3’(配列番号11)
iSN12 : 5’CAACATTAGGGTGAAAAT3’(配列番号12)
iSN13 : 5’AACATTAGGGTGAAAATG3’(配列番号13)
iSN14 : 5’ACATTAGGGTGAAAATGA3’(配列番号14)
iSN15 : 5’CATTAGGGTGAAAATGAA3’(配列番号15)
【００８３】
図１において、右側のグラフはミオシン重鎖（ＭＨＣ）陽性細胞の割合を、左側のグラフは細胞数を示したものである。いずれも最上段の白色のバー（Ｃｔｒｌ）はオリゴＤＮＡを全く投与しなかった対照群（コントロール）である。なお、左側のグラフにおいては対照群の細胞数は１と正規化している。明らかにＭＨＣ陽性細胞の割合と細胞数とは相補的な関係にある。これは筋芽細胞の分化が促進されれば増殖が抑制されることを意味する。対照群におけるＭＨＣ陽性細胞の比率は高々３％程度である。
【００８４】
一方、オリゴＤＮＡを投与した筋芽細胞のうち、ｉＳＮ０１、０２、０３、０４’、０５、０６及び０７のグループに属するオリゴＤＮＡが投与された筋芽細胞においては６％以上の割合でＭＨＣ陽性細胞が出現した。特にｉＳＮ０４’（配列番号１６）のオリゴＤＮＡが投与された筋芽細胞におけるＭＨＣ陽性細胞の割合は４０％超と非常に高い。
【００８５】
さらに、このｉＳＮ０４’と配列が２塩基異なるｉＳＮ０４（表２、配列番号４）のオリゴＤＮＡとで、同様の条件で比較実験を行った。結果を図２に示す。
【００８６】
＜表２＞
iSN04: 5’AGATTAGGGTGAGGGTGA3’(配列番号4)
【００８７】
図２より明らかなように、配列番号４のオリゴＤＮＡ（ｉＳＮ０４）は配列番号１６のオリゴＤＮＡ（ｉＳＮ０４’）と同程度かそれ以上の筋分化促進作用を示す。
【００８８】
ここで注目すべきことは、前記ｉＳＮ０１〜０７及び前記ｉＳＮ０４’のグループに属するオリゴＤＮＡは、共通して５’ＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ３’（配列番号２９）という塩基配列を有している。
【００８９】
（参考例２）
図３にｉＳＮ０１〜０３（配列番号１〜３）、ｉＳＮ０５〜０７（配列番号５〜７）、ｉＳＮ０４’（配列番号１６）のオリゴＤＮＡを３μＭ及び１０μＭの濃度で筋芽細胞に曝露したときの、４８時間後におけるミオシン重鎖（ＭＨＣ）陽性細胞の割合を測定した結果を示す。同図によれば、オリゴＤＮＡの濃度が３μＭに比べて１０μＭで極端にＭＨＣ陽性細胞割合が増えることから、筋分化の促進には一定量以上の濃度のオリゴＤＮＡが必要であることが判る。
【００９０】
さらに、ｉＳＮ０２（配列番号２）を加熱により変性（ｄｅｎａｔｕｒｅ）させた１０μＭのオリゴＤＮＡ（ｄｅ−ｉＳＮ０２）を４８時間、マウス筋芽細胞（１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に曝露したときのＭＨＣ陽性細胞割合を図４に示す。熱変性処理はオリゴＤＮＡを９５℃で５分間加熱して行った。熱変性によって、ｉＳＮ０２の筋分化促進作用が明らかに失われていることがわかる。この結果は、オリゴＤＮＡの活性が立体構造に依存していることを示唆する。
【００９１】
（参考例３）
図５は、ｍｙｏＤＮすなわちｉＳＮ０４又はｉＳＮ０４’（配列番号４、５１のオリゴＤＮＡ）によるヒト横紋筋肉腫細胞ＫＹＭ１の増殖の抑制効果を示したものである。図１で説明したとおり筋芽細胞の分化と増殖は相補的な関係にある。言い換えればオリゴＤＮＡにより筋芽細胞の分化が促進されれば、その一方で増殖は抑制される。この性質を利用すれば、オリゴＤＮＡによる癌などの悪性腫瘍の増殖及び転移を抑制する効果が期待できる。
【００９２】
図５において（ａ）はヒト横紋筋肉腫細胞ＫＹＭ１（５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）にオリゴＤＮＡ（ｉＳＮ０４’）を曝露したときの骨格筋分化マーカー遺伝子（ＭＹＨ２）の発現量を、（ｂ）は細胞増殖マーカー遺伝子（ＭＫＩ６７）の発現量を、それぞれコントロール（Ｃｔｒｌ）を１．０として定量したものである。両図より明らかなように、筋分化の促進と細胞増殖の抑制は互いに逆の関係にある。
【００９３】
図５（ｃ）は時間経過に伴う横紋筋肉腫の細胞数を計測した結果である。コントロール（Ｃｔｒｌ）と比較すると、ｉＳＮ０４（配列番号４のオリゴＤＮＡ）を曝露したときは明らかにヒト横紋筋肉腫細胞ＫＹＭ１の増殖が抑制されている。
【００９４】
（参考例４）
表３に示すｉＳＮ０４（配列番号４）の一部の塩基を置換又は削除して作成したオリゴＤＮＡの変異型（配列５４〜６２）をマウス筋芽細胞に対しそれぞれ１０μＭの濃度で曝露し、４８時間後にＭＨＣ陽性細胞の出現割合を測定した。表３において「-」は塩基配列が削除されその両端の塩基が直に結合していることを表す。例えばｉＳＮ０４（ｄｅｌ１３−１５）において、５’末端側から１２番目の塩基Ａと、３’末端側から４番目の塩基Ｔは直に結合している。
【００９５】
＜表３＞
iSN04 :5’AGATTAGGGTGAGGGTGA3’(配列番号4)
iSN04(4-18) :5’---TTAGGGTGAGGGTGA3’(配列番号19)
iSN04(7-18) :5’------GGGTGAGGGTGA3’(配列番号20)
iSN04(10-18) :5’---------TGAGGGTGA3’(配列番号21)
iSN04(dell5) :5’AGATTAGGGTGAGG-TGA3’(配列番号22)
iSN04(del14-15) :5’AGATTAGGGTGAG--TGA3’(配列番号23)
iSN04(del13-15) :5’AGATTAGGGTGA---TGA3’(配列番号24)
iSN04(T5G) :5’AGATGAGGGTGAGGGTGA3’(配列番号25)
iSN04(G11T) :5’AGATTAGGGTTAGGGTGA3’(配列番号26)
iSN04(T5G,G11T) :5’AGATGAGGGTTAGGGTGA3’(配列番号27)
【００９６】
結果を図６に示す。同図より明らかなように、ｉＳＮ０４の５’末端側から５番目、１１番目の塩基をＴ、Ｇのいずれに変えても、ＭＨＣ陽性細胞の出現割合は殆ど変わらない。その一方で、５’末端側の３塩基を削除したｉＳＮ０４（４−１８）（配列番号１９）を曝露したときのＭＨＣ陽性細胞の出現割合はＭＱ（コントロール）と同程度であり、当変異型適用による筋分化促進効果は全く認められない。６塩基削除したｉＳＮ０４（７−１８）（配列番号２０）、９塩基削除したｉＳＮ０４（１０−１８）（配列番号２１）を適用した場合においても結果はほぼ同じである。以上の結果は、ｍｙｏＤＮの筋分化促進作用には５’末端側の３塩基（ＡＧＡ又はＡＡＧ）の存在が重要であることを示している。
【００９７】
さらにｉＳＮ０４の５’側から１３〜１５番目のＧをそれぞれ１個、２個、すべて除去したオリゴＤＮＡ（配列番号２２、２３、２４）でも筋分化活性の低下がみられることから、特に当位置における塩基ＧＧＧの役割が大きいことが示唆される。
【００９８】
（参考例５）
ｍｙｏＤＮが筋分化を特異的に促進することを検証するため、ｉＳＮ０４（配列番号４）を用いた実験を行った。それぞれ５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で培養したマウス筋芽細胞又はマウス胎児線維芽細胞にｉＳＮ０４（配列番号４）を１μＭ又は３μＭ、７２時間曝露し、細胞に対する増加抑制効果を観察した。実験はそれぞれ３回行いその平均をプロットした。
【００９９】
図７上のグラフはマウス筋芽細胞に対する増加抑制効果を示したもので、コントロール（Ｃｔｒｌ）の細胞（ｉＳＮ０４を加えていない細胞）が７２時間後に約２倍に増殖したのに対し、ｉＳＮ０４を３μＭ曝露したものは０．０５未満のｐ値で約２割程度の増加に抑えられた。
【０１００】
しかし、同図下のグラフに示されるように、マウス胎児線維芽細胞に対しては、ｉＳＮ０４の３μＭ程度の曝露では、細胞の増殖を抑え込むことができなかった。すなわち、ｍｙｏＤＮは筋分化を特異的に促進する結果として細胞増殖を抑制するのであり、全ての細胞の増殖を抑制するわけではない。
【０１０１】
（参考例６）
ベルベリン又はパルマチンによるｍｙｏＤＮの筋分化促進作用の増強効果を検証する実験を行った。それぞれ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で培養したマウス筋芽細胞にベルベリンのみ又はパルマチンのみをそれぞれ１μＭ、３μＭ又は１０μＭ曝露したものと、併せてｉＳＮ０４を０又は３μＭの濃度で曝露したサンプルについて、４８時間後にＭＨＣ陽性筋細胞の出現割合を測定した。
【０１０２】
図８にその結果を示す。同図より明らかなように、ベルベリン（Ｂｅｒ）単体ではコントロール（白棒のＭＱ）よりもＭＨＣ陽性筋細胞の出現割合が却って低下する。これはベルベリンは本来筋分化を抑制する作用を有する可能性があることを意味する。ところがｉＳＮ０４を３μＭ併せて曝露した場合、ｉＳＮ０４単体を投与したもの（黒棒のＭＱ）に対しＭＨＣ陽性筋細胞の出現割合が１．５〜２倍程度増加する。これはベルベリンはｍｙｏＤＮの効果を増強する機能を有していることを意味する。
【０１０３】
パルマチン（Ｐａｌ）についても、ベルべリンよりも効果は穏やかであるが、ｍｙｏＤＮの効果を増強する性質を有している。一方で、ベルベリン単体投与で観察された弱い筋分化抑制効果は、パルマチン単体投与では認められなかった。
【０１０４】
なお、ベルベリン又はパルマチンによるｉＳＮ０４の増強作用は、いずれの場合も、ｉＳＮ０４とベルベリン又はパルマチンのモル比が１：１のときに最も効果的であった。例えば図８においてｍｙｏＤＮ（ｉＳＮ０４）３μＭに対してベルベリンを１０μＭ投与したとき（Ｂｅｒ１０）のＭＨＣ陽性筋細胞の出現割合はベルベリンを３μＭ投与したとき（Ｂｅｒ３）の割合よりも若干低い。
【０１０５】
（参考例７）
＜表３＞で示されたベルベリンによるｉＳＮ０４変異体（配列番号１９〜２７）の筋分化促進作用の増強効果を明らかにする実験を行った。それぞれ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で培養したマウス筋芽細胞にｉＳＮ０４又はその変異体のみを３μＭの濃度で曝露したサンプルと、併せてベルベリン３μＭを投与したサンプルについて、４８時間後にＭＨＣ陽性筋細胞の出現割合を測定した。
【０１０６】
結果を図９に示す。ベルベリン（Ｂｅｒ）を加えない場合（白棒）、この条件下ではｉＳＮ０４又は変異型を曝露したときのＭＨＣ陽性筋細胞の出現割合は２０％前後であるが、ベルベリンを加えた場合（黒棒）、変異型によって顕著な差が発生する。ｉＳＮ０４及び５’末端側から１１番目のＧをＴに置換したＧ１１Ｔ（配列番号２６）にのみベルベリンによる顕著なｍｙｏＤＮ活性増強効果が確認された。他の変異型については殆ど効果に変化が無いか（配列番号２２のｄｅｌ１５等）、却って効果が抑制される（配列番号１９の４−１８等）。
【０１０７】
図６（参考例４）では、５番目と１１番目の塩基がＴかＧかはｍｙｏＤＮの筋分化促進効果には関係ないことが示されたが、ベルベリンによる増強作用の点からすれば、５番目の塩基として、Ｔがより好適であることが示される。
【０１０８】
（参考例８）
なお、上記参考例においては筋分化の検証にマウス筋芽細胞が用いられたが、本発明はこれに制限されるものではない。他の動物、例えば、鳥類であるニワトリの筋芽細胞を用いた実験でも、オリゴＤＮＡによる筋分化促進作用が認められた。
【０１０９】
本参考例ではそれぞれ直径３ｃｍのディッシュあたり１０５ｃｅｌｌｓの密度で培養したニワトリ筋芽細胞にｉＳＮ０４’を０μＭ、３μＭ又は１０μＭ曝露したものと、ベルベリン１０μＭを併用したサンプルについて、４８時間後にＭＨＣ陽性筋細胞の出現割合を測定した。
【０１１０】
結果を図１０（ａ）に示す。コントロール（図中横軸０μＭの白棒）と比べ、ｉＳＮ０４’を３μＭ又は１０μＭ投与したサンプルではＭＨＣ陽性筋細胞の出現割合は倍増している。ベルベリン（Ｂｅｒ）を併用した場合、ＭＨＣ陽性筋細胞の出現割合はさらに倍増している。本実験でも、ｉＳＮ０４’とベルベリンのモル比が１：１のとき（ともに１０μＭ）に、最も高い筋分化促進作用が認められた。
【０１１１】
さらに図８（参考例６）と同様の実験をニワトリ筋芽細胞に対しても行った。結果を図１０（ｂ）に示す。ニワトリ筋芽細胞に対しても、ベルベリン（Ｂｅｒ）単体では筋分化を抑制するように作用し、ｉＳＮ０４と組み合わせると顕著な筋分化促進作用が確認された。また、パルマチン（Ｐａｌ）についても、ベルべリンよりも効果は穏やかであるが、ｉＳＮ０４の効果を増強することが確認された。
【０１１２】
（参考例９）
ｍｙｏＤＮのヒト横紋筋肉腫細胞の増殖の抑制効果について併せてベルベリンの効果について実験を行った。ヒト横紋筋肉腫細胞ＫＹＭ１、ＲＤ、ＥＲＭＳ１の５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのサンプルそれぞれに対し、１０μＭのｉＳＮ０４を曝露し、２４〜９６時間経過後の細胞数を測定した。結果を図１１に示す。腫瘍株によってｉＳＮ０４の抑制効果が異なることが示されている。
【０１１３】
図１１において（ａ）のグラフはヒト横紋筋肉腫細胞ＫＹＭ１にｉＳＮ０４を曝露した結果を示すものであり、図５（ｃ）で示されたグラフとほぼ同じ条件で追試されたものである。コントロール（Ｃｔｒｌ）と比べて筋肉腫細胞の増殖が半分以下（７２時間後）に抑えられていることが本参考例においても再現されている。一方で、ＲＤ株については９６時間後に０．０５未満のｐ値で２５％程度の抑制が認められた（図１１（ｂ））。ＥＲＭＳ１株では抑制効果が１０％程度であった（同図（ｃ））。
【０１１４】
ＲＤ株についてはｉＳＮ０４と併せてベルベリンを投与すると増殖抑制効果が劇的に改善することが判った。図１２にコントロール（Ｃｔｒｌ）、ｉＳＮ０４のみ（１０μＭ）、ｉＳＮ０４と等モルのベルベリン（Ｂｅｒ）（１０μＭ）を併用したときの９６時間後の細胞数の測定結果を示す。ｉＳＮ０４とベルベリンを併用した場合、ｉＳＮ０４のみの場合と比べて約２５％、コントロールと比べて約５０％の増殖抑制効果が示された。
【０１１５】
［実施例］
以下、本発明の実施例について説明する。前述の参考例では、骨格筋芽細胞にｍｙｏＤＮ等を曝露することにより筋分化促進効果が得られることを示したが、本実施例では多能性幹細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞）を５日間分化誘導した段階でｍｙｏＤＮの代表的オリゴＤＮＡであるｉＳＮ０４（配列番号４）を曝露し、心筋に分化させる方法について説明する。
【０１１６】
まず、曝露対象について参考例と本実施例との違いを、図１３を用いて説明する。多能性幹細胞であるＥＳ細胞は内胚葉、中胚葉、外胚葉に分化し、さらに内胚葉は内臓に、中胚葉は筋肉や骨格に、外胚葉は神経などにそれぞれ分化することが一般に知られている。前述の参考例では既に骨格筋芽細胞にまで分化したいわゆる前駆細胞にオリゴＤＮＡ（ｉＳＮ０４）を曝露し、骨格筋への分化が促進されることを確認した（図１３中左下の太矢印）。これに対し、本実施例ではＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞に由来する細胞がその多能性を失ったものの多分化能性を保持していると考えられる分化誘導５日目の段階でｉＳＮ０４（配列番号４）を曝露する。以下、ＥＳ細胞を用いた実験とその結果について実施例１に、ｉＰＳ細胞を用いたときの結果について実施例２で説明する。
【０１１７】
（実施例１）ＥＳ細胞へのｍｙｏＤＮの曝露
ＥＳ細胞株として、ｈＣＧｐ７を用いた。当細胞株は、心筋特異的転写因子Ｎｋｘ２−５の遺伝子座の一つをＧＦＰに置換したマウスＥＳ細胞株であり、心筋特異的転写因子Ｎｋｘ２−５を発現する段階にまで分化した心筋前駆細胞ないし心筋細胞が緑色の蛍光で示される。このＥＳ細胞をゼラチンコートされた直径３ｃｍの培養容器に３×１０４ｃｅｌｌｓの密度で播種し分化誘導を開始した。なお分化培地は、１０％ＦＢＳ、５％ＨＳ、ＮＥＡＡ、２−ＭＥを含有したＤＭＥＭ培地を用いた。
【０１１８】
分化誘導５日目に１０μＭのｉＳＮ０４（配列番号４）を曝露し、その後２日毎にｉＳＮ０４を含む分化培地を交換し、新たにｉＳＮ０４を曝露した。なお、分化の様子は毎日顕微鏡で観察した。分化誘導８日目（ｉＳＮ０４曝露３日目）の様子を図１４に示す。同図において、上段はコントロールを、下段はｉＳＮ０４の観察結果を示す。それぞれにおいて、左側は位相差画像を右側は蛍光画像を示す。図１４において、コントロールのＥＳ細胞と比較し、ｉＳＮ０４を曝露したＥＳ細胞におけるＧＦＰの発現（灰色がかった部分、実際は緑色）が著しい。また写真では示されていないが、ＧＰＦ陽性細胞のクラスターの自律的な拍動が観察される。
【０１１９】
以上、本実施例によれば、ｍｙｏＤＮは５日間分化誘導したＥＳ細胞に作用して心筋細胞への分化を顕著に促進することが明らかである。なお、本実施例において、ｍｙｏＤＮを曝露した段階において、選択的に心筋へ分化誘導するような措置は講じていない。心筋分化誘導に特化した培養系においてｍｙｏＤＮを用いれば、より多数の心筋細胞を得られる可能性がある。
【０１２０】
（実施例２）ｉＰＳ細胞へのｍｙｏＤＮの曝露
本実施例では対象となる多能性幹細胞としてマウスｉＰＳ細胞株２０Ｄ１７を用いる。本実施例におけるｉＰＳ細胞株は、Ｎａｎｏｇ遺伝子座にＧＦＰノックインしたマウス胎児線維芽細胞にいわゆる初期化４因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ）を導入することで樹立したものである。分化培地や分化方法（培地の交換やｉＳＮ０４の補充等）については、実施例１と同様である。
【０１２１】
分化誘導１１日目（ｉＳＮ０４曝露６日後）の様子を図１５に示す。同図において、上段はコントロールの、下段はｉＳＮ０４を曝露した、それぞれｉＰＳ細胞の位相差顕微鏡画像を示す。iPS細胞を含む多能性幹細胞は身体を構成する全ての細胞種に分化可能なため、ｉＳＮ０４に曝露せずとも心筋細胞は自然発生的に出現するが、コントロールと比較すると、ｉＳＮ０４を曝露したｉＰＳ細胞において心筋と思われる細胞のクラスター（破線で囲った部分）の出現がより顕著に目視される。また、ｉＳＮ０４を曝露したｉＰＳ細胞のクラスターの直径は、コントロールにおけるクラスターの直径を上回っている。
【０１２２】
また写真では示されていないが、この細胞のクラスターの自律的な拍動が観察される。この自律的拍動を測定した結果を図１６に示す。同図において、横軸はｉＳＮ０４を曝露後の日数を、縦軸は分当たりの拍動数を表す。また、白棒はコントロールを、黒棒はｉＳＮ０４を曝露したｉＰＳ細胞を表す。図１６において、ｉＳＮ０４を曝露したｉＰＳ細胞クラスターの分あたりの拍動数はコントロールを２割以上回っている。拍動数の増加は、myoDN曝露によって出現した心筋細胞がコントロールよりも成熟した段階にあることを示唆している。
【０１２３】
以上、本実施例によれば、ｉＰＳ細胞においてもＥＳ細胞とほぼ同様に心筋への分化が促進され、心筋細胞数やクラスターのサイズのみならず拍動数においてもコントロールを上回る効果が得られる。
【０１２４】
以上、本発明によれば、オリゴＤＮＡにより心筋分化を強力に促進することが可能となる。しかも、上記オリゴＤＮＡは化学合成が可能で安定構造を有すため、将来的に大量に供給及び保存ができ、また乳酸菌のゲノム配列由来であるため、安全性も高いと期待される。さらに、安価でしかも安全なベルベリン又はその類縁体化合物を併用することによりオリゴＤＮＡの心筋分化促進作用を増強することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
本発明は、多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、多能性幹細胞に由来する幹細胞等から心筋細胞への分化誘導、または多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、多能性幹細胞に由来する幹細胞、これらの幹細胞から分化した心筋細胞等を用いた心臓再生治療、創薬のスクリーニングや心臓疾患の治療および研究に供する心筋前駆細胞または心筋細胞の作成等に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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