(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した担体の、抗体の保持力や分離性能を、長期的に維持できる保存液を提供することにある。【解決手段】  ｐＨ範囲が５．５から８．５の緩衝液と、防腐剤と、を含んでなるＦｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体の保存液。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ範囲が５．５から８．５の緩衝液と、
防腐剤と、を含んでなる
Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体の保存液。
【請求項２】
前記Ｆｃ結合性タンパク質が、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ及びそのアミノ酸変異体のいずれかであることを特徴とする、請求項１に記載の保存液。
【請求項３】
前記緩衝液が、クエン酸水溶液又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン水溶液であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の保存液。
【請求項４】
前記防腐剤が、ＰｒｏＣｌｉｎ１５０、ＰｒｏＣｌｉｎ２００、ＰｒｏＣｌｉｎ３００、ＰｒｏＣｌｉｎ９５０又はアジ化ナトリウムであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の保存液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体の保存液に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ガンや免疫疾患等の治療に抗体を含む医薬品（抗体医薬品）が用いられている。抗体医薬品に用いる抗体は、遺伝子工学的手法により得られた、当該抗体を発現可能な細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等）を培養後、カラムクロマトグラフィー等を用いて高純度に精製し製造するが、前記抗体は、酸化、還元、異性化、糖鎖付加等の修飾を受けることで多様な分子の集合体となっていることが判明しており、薬効や安全性への影響が懸念されている。特に抗体のＦｃ領域に結合した糖鎖の構造は多岐に渡り、抗体医薬品の薬効や副作用に大きく関わる重要な因子であるが、その構造をコントロールする方法は限定的である（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
ヒトＦｃ受容体（ＦｃγＲＩＩＩＡ）をリガンドとして用いた分析カラムが開発されたことにより（例えば、非特許文献２）、ｐＨグラジェント溶出法を用いることで、抗体の糖鎖構造や活性に基づいた分析が可能となった（例えば、非特許文献３参照）。しかしながら、この様なアフィニティ分析カラムを長期的に保存し分析の正確性を担保するためには、長期保存可能な保存液が必須であるが、従来、長期保存が可能となる液組成が開発されておらず、改善が望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｐａｔｒｉｃｋ  Ｈｏｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９、９、９３６−９４９（２００９）
【非特許文献２】東ソー研究・技術報告、第６１巻（２０１７）、３３−４１
【非特許文献３】Ｍａｓａｔｏ  Ｋｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｓ、８：３９５５（２０１８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体の、抗体の保持力や分離性能を、長期的に維持できる保存液を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に係る保存液は、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体の保存液として用いられ、ｐＨ範囲が５．５から８．５の緩衝液と防腐剤とを含んでなる。
【０００７】
また、本発明に係る保存液の一態様においては、前記Ｆｃ結合性タンパク質が、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ及びそのアミノ酸変異体のいずれかである。
【０００８】
また、本発明に係る保存液の一態様においては、溶前記緩衝液が、クエン酸水溶液又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン水溶液である。
【０００９】
また、本発明に係る保存液の一態様においては、前記防腐剤が、ＰｒｏＣｌｉｎ１５０、ＰｒｏＣｌｉｎ２００、ＰｒｏＣｌｉｎ３００、ＰｒｏＣｌｉｎ９５０又はアジ化ナトリウムである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を、長期間、機能を維持した状態で保存することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】カラムの抗体保持時間測定を行った際に得られるクロマトグラムとピーク番号を示す。
【図２】保存液のｐＨと保持時間維持率の関係を示す折線グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、ｐＨ範囲が５．５から８．５の緩衝液と防腐剤とを含んでなる、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体の保存液である。以下、本発明の一実施形態について説明する。
【００１３】
なお、本発明の保存液は、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体のみではなく、当然、当該担体を充填したカラムに対しても使用することができる。
【００１４】
Ｆｃ結合性タンパク質とは、ヒトＦｃγＲＩ、ヒトＦｃγＲＩＩ、ヒトＦｃγＲＩＩＩ、補体タンパク質Ｃ１ｑ、マウスＦｃγＲＩ、マウスＦｃγＲＩＩ、マウスＦｃγＲＩＩＩ、マウスＦｃγＲＩＶ等が挙げられ、各々を構成するアミノ酸が部分的に置換した変異体を用いてもよい。
【００１５】
不溶性担体とは、抗体の吸着／溶出に用いる溶液や溶剤に対して不溶性であり、かつＦｃ結合性タンパク質を共有結合で固定化するための官能基（例えば、ヒドロキシ基）を有した物質であればよく、ジルコニア、ゼオライト、シリカ、皮膜シリカ等の無機系物質に由来した担体であってもよいし、セルロース、アガロース、デキストラン等の天然有機高分子物質に由来した担体であってもよいし、ポリアクリル酸、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリメタクリレート、ビニルポリマー等の合成有機高分子物質に由来した担体であってもよい。
【００１６】
Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムとして、ＴＳＫｇｅｌ  ＦｃＲ−ＩＩＩＡ−ＮＰＲ（東ソー社製）を例示することができる。
【００１７】
緩衝液は、ｐＨ５．５からｐＨ８．５の間で緩衝機能があればよい。具体的には、グリシン、酢酸、コハク酸、クエン酸、リン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ＭＥＳ（２−モルフォリノエタンスルフォン酸）、ＡＤＡ（Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルフォン酸））、ＡＣＥＳ（Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルフォン酸）、コラミン塩酸、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルフォン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルフォン酸）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルフォン酸）などの緩衝剤の水溶液を例示することができる。緩衝剤の濃度としては、１ｍＭ以上であればよいが、５ｍＭ以上１０００ｍＭ以下であるとより好ましく、１０ｍＭ以上３００ｍＭ以下であるとさらに好ましい。また、添加剤として塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、酢酸ナトリウムなどの塩類、マンニトール、ソルビトール、白糖などの糖類、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、トライトンＸ−１００などの界面活性剤を含んでいてもよい。
【００１８】
防腐剤はリガンドの安定性に影響が無い範囲かつ微生物の増殖を抑制し得るものであればよい。具体的には、ＰｒｏＣｌｉｎ１５０、ＰｒｏＣｌｉｎ２００、ＰｒｏＣｌｉｎ３００、ＰｒｏＣｌｉｎ９５０、アジ化ナトリウム、ベンジルアルコール、チメロサール、パラベンなどを例示することができるが、ＰｒｏＣｌｉｎ１５０、ＰｒｏＣｌｉｎ２００、ＰｒｏＣｌｉｎ３００、ＰｒｏＣｌｉｎ９５０、アジ化ナトリウムは中でも好ましい。
【００１９】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【実施例】
【００２０】
以下の通り、実施例で用いる溶離液等の調製を行った。
（１）溶離液
クエン酸水素二ナトリウム１．５水和物（ナカライテスク製）を６．５７８ｇ取り、ミリＱ水に溶解後、メスフラスコで５００ｍＬにメスアップした。溶液を０．２μｍのフィルターでろ過し、５０ｍＭクエン酸二ナトリウム水溶液を調製した。
（２）カラム洗浄緩衝液
クエン酸（和光純薬製）を４．８０３ｇ取り、４５０ｍＬのミリＱ水に溶解後、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ４．５に調整した。調整後の溶液を５００ｍＬにメスアップした後にｐＨを微調整した。溶液を０．２μｍのフィルターでろ過し、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）を調製した。
（３）抗体サンプル
市販の抗体（サングロポール：ＣＳＬベーリング製）を終濃度２ｇ／Ｌとなるように５０ｍＭのクエン酸二ナトリウム水溶液で希釈し、調製した。
（４）保存液１
１．９２ｇのクエン酸を約９００ｍＬの純水に溶解させて、防腐剤として０．２５ｍＬのＰｒｏＣｌｉｎ３００（シグマアルドリッチ製）を加えた後、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを５．１に調整した。調整後の溶液を１Ｌにメスアップした後にｐＨを微調整し、ｐＨ５．１の保存液を調製した。同様の手法を用いて、ｐＨ６．０及びｐＨ６．５の保存液もそれぞれ調製した。
（５）保存液２
１．２１ｇのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（和光純薬製）を約９００ｍＬの純水に溶解させて、防腐剤として０．２５ｍＬのＰｒｏＣｌｉｎ３００を加えた後、２Ｎの塩酸でｐＨを７．０に調整した。調整後の溶液を１Ｌにメスアップした後にｐＨを微調整し、ｐＨ７．０の保存液を調製した。同様の手法を用いて、ｐＨ８．０及びｐＨ９．０の保存液をそれぞれ調製した。
（３）保存液３
１．９２ｇのクエン酸と２．９２ｇの塩化ナトリウム（和光純薬製）を約９００ｍＬの純水に溶解させて、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを６．５に調整した。調整後の溶液を１Ｌにメスアップした後にｐＨを微調整し、塩化ナトリウムを５０ｍＭ含むｐＨ６．５の保存液を調製した。同様の手法を用いて、塩化ナトリウムを１５０ｍＭ、３００ｍＭ及び１０００ｍＭをそれぞれ含むｐＨ６．５の保存液を調製した。
【００２１】
（抗体の保持時間の測定）
溶離液と抗体サンプルをクロマト装置（東ソー製）に設置した。カラムオーブン温度は２５℃、サンプル負荷量は１０μＬ、流速は０．３ｍＬ／分、検出器は２８０ｎｍの吸光度測定に設定した。試験に供する１４本のＦｃ結合性タンパク質固定化カラム（東ソー製、ＴＳＫｇｅｌ  ＦｃＲ−ＩＩＩＡ−ＮＰＲ）を準備し、それぞれ溶離液での平衡化、及びアイソクラティック法を用いた抗体のクロマト分析を繰り返し、抗体の保持時間を測定した。代表的なクロマトグラムを図１に示す。抗体保持力の指標としてピーク３の保持時間を測定値として抽出した。測定後、カラムにカラム洗浄緩衝液を通液して洗浄し、溶離液を通液して再平衡化した。
【００２２】
（実施例１）  保存液のｐＨによる比較
調製した各々の保存液１、２をＦｃ結合性タンパク質固定化カラムに１ｍＬ／ｍｉｎで１０分間通液してカラムの内液を置換し、カラム出入口をエンドプラグで密栓した後、加速劣化試験として４５℃で６５時間保温した。上述したのと同様の手順で、再び各カラムについて抗体の保持時間を測定し、試験前後の保持時間差を下式に従って処理し、保持時間維持率を算出した。
式）保持時間維持率（％）＝試験後ピーク３保持時間／試験前ピーク３保持時間×１００
図２からも分かるように、ｐＨ５．１及びｐＨ９．０の保存液を用いた際は、保存安定性が低下することが判明した。
【００２３】
（実施例２）  保存液の防腐剤成分による比較
保存液１の防腐剤の成分、濃度を表１のように変更したものを調製し、各々の保存液をＦｃ結合性タンパク質固定化カラムに１ｍＬ／ｍｉｎで１０分間通液してカラムの内液を置換し、カラム出入口をエンドプラグで密栓した後、加速劣化試験として４５℃で６５時間保温した。上述したのと同様の手順で、再び各カラムについて抗体の保持時間を測定し、加速劣化試験前の保持時間と比較を行い、実施例１に記載の算出式にて保持時間維持率を算出した。
【００２４】
【表１】
2020019726.tif 000003
【００２５】
（実施例３）  塩強度の影響
調製した各々の保存液３をＦｃ結合性タンパク質固定化カラムに１ｍＬ／ｍｉｎで１０分間通液してカラムの内液を置換し、カラム出入口をエンドプラグで密栓した後、加速劣化試験として４５℃で６５時間保温した。上述したのと同様の手順で、再び各カラムについて抗体の保持時間を測定し、加速劣化試験前の保持時間と比較を行い、実施例１に記載の算出式にて保持時間維持率を算出した。
【００２６】
【表２】
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【図１】
2020019726.tif 000005
【図２】
2020019726.tif 000006