(57)【要約】【課題】安全性に優れ、長期摂取が可能なＰＰＡＲγ活性化剤及びＰＰＡＲγ活性化食品組成物を提供すること。【解決手段】本願発明者が鋭意検討して見出したのは、トマト等の食品に含まれるアポリコペノイドを有効成分とするＰＰＡＲγ活性化剤及びＰＰＡＲγ活性化用食品組成物である。アポリコペノイドは、パーシャルアゴニストとして濃度依存的にＰＰＡＲγを活性化する。本発明に係るＰＰＡＲγ活性化剤又はＰＰＡＲγ活性化用食品組成物は、脂肪細胞の分化促進、アディポネクチン産生促進、及びグルコースの取込み促進作用を有する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＰＡＲγ活性化剤であって、
その有効成分は、アポリコペノイドである。
【請求項２】
請求項１のＰＰＡＲγ活性化剤であって、
前記アポリコペノイドが、アポ−１２’−リコペナールである。
【請求項３】
請求項１又は２のＰＰＡＲγ活性化剤であって、
その用途は、ＰＰＡＲγのパーシャルアゴニストである。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れかのＰＰＡＲγ活性化剤であって、
前記アポ−１２’−リコペナールが植物由来である。
【請求項５】
アディポネクチンの産生促進剤であって、
その有効成分は、アポ−１２’−リコペナールである。
【請求項６】
グルコースの取込み促進剤であって、
その有効成分は、アポ−１２’−リコペナールである。
【請求項７】
ＰＰＡＲγ活性化用食品組成物であって、
含有するのは、アポリコペノイドである。
【請求項８】
請求項７のＰＰＡＲγ活性化用食品組成物であって、
前記アポリコペノイドが、アポ−１２’−リコペナールである。
【請求項９】
請求項７又は８のＰＰＡＲγ活性化用食品組成物であって、
その用途は、ＰＰＡＲγのパーシャルアゴニストである。
【請求項１０】
請求項７乃至９の何れかのＰＰＡＲγ活性化用食品組成物であって、
前記アポ−１２’−リコペナールが植物由来である。
【請求項１１】
アディポネクチンの産生促進用食品組成物であって、
アポ−１２’−リコペナールを含有する。
【請求項１２】
グルコースの取込み促進用食品組成物であって、
アポ−１２’−リコペナールを含有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明が関係するのは、アポリコペノイド、より好ましくはアポ−１２’−リコペナールを有効成分とするＰＰＡＲγ活性化剤及びＰＰＡＲγ活性化用食品組成物である。
【背景技術】
【０００２】
脂質や糖質の代謝に関与する核内受容体として、核内受容体ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）が知られている。
【０００３】
ＰＰＡＲのうち、ＰＰＡＲγは、脂肪細胞に比較的強い特異性を持って発現しており、脂肪細胞分化の中心的な役割を果たしている。合成物質系のＰＰＡＲγ活性化剤として、チアゾリジン誘導体類が知られている。チアゾリジン誘導体類は、ＰＰＡＲγを完全に活性化させるフルアゴニストであり、インスリン抵抗性改善薬としても使用されているが、肝機能障害、浮腫、心不全、肝障害、体重増加などの副作用が認められることがある。したがって、副作用の問題から日常的に摂取するには不向きであるため、長期的に摂取する場合には、天然由来の成分のうち、その効果が医薬品より抑えられたパーシャルアゴニストが求められる。天然物由来のＰＰＡＲ活性化作用を有する成分としては、ウコンに含まれるクルクミンや、油脂の一種であるモノアシルグリセロール、お茶などに含まれるカテキン類（特許文献１）、温州みかんなどのマンダリン系柑橘類に多く含まれるβ−クリプトキサンチンが知られている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１６−０２７０１４号
【特許文献２】特開２０１２−２１４４８８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、安全性に優れ、日常的かつ長期的な摂取が可能なＰＰＡＲγ活性化剤及びＰＰＡＲγ活性化用食品組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明者が鋭意検討して見出したのは、トマト等の食品に含まれるリコピンの代謝物であるアポリコペノイドのＰＰＡＲγ活性化機能である。すなわち、食品に含まれる成分であるアポリコペノイドがＰＰＡＲγを活性化する。この観点から、本発明を定義すると、以下のとおりである。
【０００７】
本発明に係るＰＰＡＲγ活性化剤又はＰＰＡＲγ活性化用食品組成物が含有するのは、アポリコペノイドであり、より好ましくは、アポ−１２’−リコペナールである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明が可能にするのは、天然成分由来のＰＰＡＲγ活性化剤及びＰＰＡＲγ活性化用食品組成物の提供である。すなわち、パーシャルアゴニスト作用を有し、医薬よりも穏やかにＰＰＡＲγを活性化する有効成分として、トマト等の食品に含まれるアポリコペノイドを見出したことにより、安全性に優れ、日常的かつ長期的な摂取が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】アポリコペナールのＰＰＡＲγ活性能を示す図である。
【図２】アポ−１２’−リコペナールの最大活性化能がフルアゴニストであるトログリタゾンより低いことを示す図である。
【図３】アポ−１２’−リコペナールがトログリタゾンと競合してＰＰＡＲγ活性化を抑えることを示す図である。
【図４】アポ−１２’−リコペナールによるＰＰＡＲγの下流にある遺伝子のｍＲＮＡ発現促進能を示す図である。
【図５】アポ−１２’−リコペナールによるトリグリセライド蓄積促進能を示すグラフである。
【図６】アポ−１２’−リコペナールによるアディポネクチンのｍＲＮＡ発現およびタンパク質発現促進能を示すグラフである。
【図７】アポ−１２’−リコペナールによるグルコース取込み促進能を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本実施の形態に係るＰＰＡＲγ活性化剤及びＰＰＡＲγ活性化用食品組成物が少なくとも含有するのは、アポリコペノイドであり、より好ましくは、アポ−１２’−リコペナールである。アポ−１２’−リコペナール以外にも、例えば、その他のＰＰＡＲγ活性化剤等の他の成分を含んでいても良い。当該ＰＰＡＲγ活性化剤及びＰＰＡＲγ活性化用食品組成物は、脂肪細胞分化促進、アディポネクチン産生促進、及びグルコースの取込み促進作用を有する。
【００１１】
＜アポリコペノイド＞
アポリコペノイドは生体内、又はトマト果実中、若しくはトマト加工品に存在し、非酵素的な開裂やβ−カロテン−９’，１０’−オキシゲナーゼによる酵素的な開裂により生成されることが知られている。天然においては、スイカ、ピンクグレープフルーツ等の植物にも含まれている。アポリコペノイドを例示すると、アルデヒド体であり下記の化学構造を有するアポ−１２’−リコペナールの他、同じくアルデヒド体であるアポ−１０’−リコペナール、アルコール体であるアポ−６’−リコペノール、アポ−８’−リコペノール、アポ−１０’−リコペノール、アポ−１２’−リコペノール及びカルボン酸体であるアポ−６’−リコペン酸、アポ−８’−リコペン酸、アポ−１０’−リコペン酸、アポ−１２’−リコペン酸などが知られている。なお、本発明において用いられるアポリコペノイドは、天然物からの抽出物を必要に応じて適宜精製したものでもよいし、合成品であってもよい。
【００１２】
【化１】
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【００１３】
本発明に係るアポリコペノイド、より好ましくは、アポ−１２’−リコペナールは、ＰＰＡＲγ活性化のパーシャルアゴニストである。一方、チアゾリジン誘導体類、例示するとトログリタゾンは、ＰＰＡＲγを完全に活性化させるフルアゴニストである。ここで、パーシャルアゴニストは、単体で使用する場合はＰＰＡＲγを穏やかに活性化し、フルアゴニストと併用する場合はフルアゴニストと競合し、結果としてフルアゴニストのＰＰＡＲγ活性化を弱める効果を有する。
【００１４】
＜核内受容体＞
核内受容体は、生体内の脂溶性低分子化合物をリガンドとするリガンド依存的な転写因子であり、リガンドが結合すると核内に移行してＤＮＡに結合し転写を制御する。発生や細胞増殖、分化、形態形成、代謝などの様々な生物学的現象を調節しており、様々な疾患の発症や治療に関わっていることから、創薬の重要な分子標的となっている。脂質や糖質の代謝に関与する代表的な核内受容体として、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）がある。
【００１５】
＜ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体＞
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）は、リガンド依存的核内受容体であり、脂質や糖代謝において重要な役割を果たしている。ＰＰＡＲには３つのサブタイプが存在し、ＰＰＡＲαは主に筋肉や肝臓、ＰＰＡＲβ/δは様々な臓器、ＰＰＡＲγは脂肪細胞に多く発現していることが知られている。ＰＰＡＲγの活性化は脂肪細胞の分化を促進し、小型脂肪細胞を増やして血糖値を低下させることやアディポネクチンの産生量を増加させることが知られていることから、肥満に関連する高脂血症や糖尿病に対する創薬の分子標的となっている。
【００１６】
ＰＰＡＲγの作用機構について、より詳しくは、そのリガンドにより脂肪細胞の分化を促進してアディポネクチンの産生を促進することで血糖値を低下させることが知られている。そのため、ＰＰＡＲγは２型糖尿病の創薬ターゲットとなっている。
【００１７】
＜アディポネクチン＞
本発明において、脂肪細胞でＰＰＡＲγが活性化されるとアディポネクチンの産生が促進される。アディポネクチンは、脂肪細胞から特異的に分泌されるアディポサイトカインの一種である。肥満に起因する脂肪細胞の肥大化などによって脂肪細胞が機能異常をきたすと、アディポネクチンの産生は不足する。アディポネクチンの産生不足は、インスリン抵抗性や、インスリン抵抗性と密接な関係にある２型糖尿病の発症に関与していることが知られている。
【００１８】
＜グルコース取込み＞
本発明におけるグルコース取込みは、脂肪細胞内へのグルコースの取込みを指す。その機構は、以下のとおりである。ＰＰＡＲγが活性化されるとグルコーストランスポーター４遺伝子（Ｇｌｕｔ４）の発現が促進される。それにより、グルコース輸送体であるＧＬＵＴ４はインスリン依存的に細胞膜に移動し、脂肪細胞内にグルコースを取り込むものと推定される。
【００１９】
＜ＰＰＡＲγ活性化剤＞
本発明のＰＰＡＲγ活性化剤は、２型糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化及び肥満に有効である。投与形態は医薬等の製剤技術分野において通常使用しうるものであり、例示すると、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、溶液、シロップ剤、乳液等による経口投与が挙げられる。本発明のＰＰＡＲγ活性化剤を投与する対象は、動物、中でも哺乳類が挙げられる。特に制限はないが、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ等が挙げられ、ヒトであることが好ましい。
【００２０】
＜食品組成物＞
本発明の食品組成物には、可食性の、炭水化物、蛋白質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、糖質（ブドウ糖、等）、天然物又は人口甘味剤、クエン酸、炭酸水、果汁、安定剤、保存剤、結合剤、増粘剤、乳化剤などを適宜配合することができる。本発明の食品組成物を摂取させる対象は、動物、中でも哺乳類が挙げられる。哺乳類としては、特に制限はないが、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ等が挙げられ、ヒトであることが好ましい。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２２】
＜実施例１＞
アポ−６’−リコペナール、アポ−８’−リコペナール、アポ−１２’−リコペナールについて、培養細胞を用いたレポーターアッセイによりＰＰＡＲγ活性化能を評価した。試験にはアフリカミドリザル腎由細胞株であるＣＶ−１細胞を使用し、５％ウシ胎児血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシンを加えた高グルコースダルベッコ改変イーグル培地を用いて、３７℃ 、５％ＣＯ２−９５％ 空気中で培養した。ＣＶ−１細胞を１０ｃｍディッシュに播種して２４時間培養した。２４時間後、リポフェクタミン試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ｐ４ｘＵＡＳｇ−ｔｋ−ｌｕｃ（ホタルルシフェラーゼ遺伝子上流に４コピーのＧＡＬ４結合ドメインのための上流活性化配列（ＵＡＳ）とチミジンキナーゼ遺伝子プロモータとを含むレポータープラスミド）、ｐＭ−ｈＰＰＡＲγ（ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインとヒトＰＰＡＲγのリガンド結合ドメインとのキメラタンパク質用発現ベクター）、およびｐＲＬ−ＣＭＶ（トランスフェクション効率を標準化するためのウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子のレポータープラスミド）をＣＶ−１細胞にトランスフェクションし、４時間培養した。その後、被験物質を終濃度１、５、１０、２０、５０μＭとなるように前述の培地に添加して２４時間培養した。なお、陽性対照にはＰＰＡＲγフルアゴニストであるトログリタゾンを終濃度１μＭで、陰性対照は被験物質を溶解させる溶媒として用いたテトラヒドロフランを終濃度０．５％（ｖ／ｖ）となるように添加した。培養終了後、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した細胞を溶解させ、細胞溶解液を用いてＤｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてホタルおよびウミシイタケのルシフェラーゼ活性を測定することにより、ＰＰＡＲγ活性化作用を評価した。ＰＰＡＲγ活性は以下のように定義した。ＰＰＡＲγ活性＝（ホタルルシフェラーゼ活性）／（ウミシイタケルシフェラーゼ活性）。各被験物質のＰＰＡＲγ活性を陰性対照のＰＰＡＲγ活性で除した相対値を図１に示した。
【００２３】
その結果、アポ−６’−リコペナールとアポ−８’−リコペナールには活性化が認められなかったが、アポ−１２’−リコペナールのみＰＰＡＲγを活性化した。
【００２４】
＜実施例２＞
実施例１と同様の方法でフルアゴニストであるトログリタゾン及びパーシャルアゴニストであるアポ−１２’−リコペナールを、それぞれ細胞毒性がない最大濃度及び最大溶解濃度からＰＰＡＲγ活性が検出されない濃度まで濃度を振ってＰＰＡＲγ活性化作用を評価し、その結果を図２に示した。
【００２５】
その結果、アポ−１２’−リコペナールはフルアゴニストであるトログリタゾンと同様に濃度依存的にＰＰＡＲγを活性化した。また、アポ−１２’−リコペナールの最大活性はトログリタゾンと比べて５．８倍低かった。
【００２６】
＜実施例３＞
実施例１と同様の方法でＰＰＡＲγフルアゴニストであるトログリタゾンを終濃度１μＭとなるように添加し、そこにさらにアポ−１２’−リコペナールを終濃度１０、２０、４０μＭとなるように添加してＰＰＡＲγ活性化作用を評価し、その結果を図３に示した。
【００２７】
その結果、アポ−１２’−リコペナールは濃度依存的にトログリタゾンのＰＰＡＲγ活性化作用を抑制した。
【００２８】
＜実施例４＞
マウス由来３Ｔ３−Ｌ１細胞を用いて、アポ−１２’−リコペナールの脂肪細胞分化促進作用を評価した。３Ｔ３−Ｌ１細胞は、脂肪細胞へ分化誘導されることで細胞内に脂肪滴を蓄積する特徴を有しており、脂質代謝の細胞モデル系として広く用いられている。培地には１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシンを加えた高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用い、３７℃ 、５％ＣＯ２−９５％ 空気中で培養した。コンフルエントになった３Ｔ３−Ｌ１細胞をさらに２日培養した後、２μｇ／ｍＬ インスリン、２６．５ｎＭ デキサメタゾン、１２５ｎＭ ３-イソブチル-１-メチルキサンチンを含んだ前述の培地に交換した（ここを０日目とする）。４８時間培養した後、２μｇ／ｍＬ インスリンを含んだ前述の培地に変え、以降２日おきに新鮮な同培地に交換し９日目まで培養した。０日目から９日目まで、被験物質は終濃度１０、２０、４０μＭ、陰性対照はＤＭＳＯを終濃度０．５％（ｖ／ｖ）となるように各培地に添加して培養した。９日目に細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でＴｏｔａｌ  ＲＮＡ抽出して、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ｇＤＮＡ  Ｅｒａｓｅｒ（タカラバイオ）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ）を用いて脂肪細胞分化マーカーであるａＰ２、Ｃ／ＥＢＰα、ＰＰＡＲγ、Ｇｌｕｔ４のｍＲＮＡ発現量を定量した。なお、得られた解析結果は内部標準である３６Ｂ４遺伝子の発現量を用い補正し、陰性対照との相対値として図４に示した。
【００２９】
その結果、アポ−１２’−リコペナールは、脂肪細胞分化マーカーであるａＰ２、Ｃ／ＥＢＰα、ＰＰＡＲγ、Ｇｌｕｔ４のｍＲＮＡ発現を促進した。
【００３０】
＜実施例５＞
実施例３と同様の方法で３Ｔ３−Ｌ１細胞を１１日目まで分化させ、細胞を溶解させて細胞溶解液を用いてラボアッセイ  トリグリセライド（Ｗａｋｏ）によるトリグリセライドの定量を行った。トリグリセライドの蓄積量の増加は、脂肪細胞の分化の促進を意味する。なお、トリグリセライド量はプロテインアッセイＢＣＡキット（Ｗａｋｏ）で測定したタンパク質量で補正し図５に示した。
【００３１】
その結果、アポ−１２’−リコペナールは、トリグリセライドの蓄積量を増加させた。つまり、脂肪細胞の分化を促進した。
【００３２】
＜実施例６＞
実施例４と同様の方法で３Ｔ３−Ｌ１細胞を９日目まで分化させ、合成したｃＤＮＡを鋳型としてアディポネクチンｍＲＮＡ発現量を定量した。また、９日目の培養上清を回収し、Ｍｏｕｓｅ  Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ  ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ  （Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて培養上清中のアディポネクチンのタンパク質発現量を定量した。なお、得られた解析結果は陰性対照との相対値として図６に示した。
【００３３】
その結果、アポ−１２’−リコペナールは、アディポネクチンのｍＲＮＡ発現およびタンパク質の産生を促進した。
【００３４】
＜実施例７＞
実施例４と同様の方法で３Ｔ３−Ｌ１細胞を４日目まで分化させ、グルコース細胞内取込量測定キット（コスモバイオ）を使用し、製品の標準プロトコールに従って細胞内へのグルコース取込み量を定量した。すなわち、４日目の細胞から培地を除去して無血清のＤＭＥＭに交換し６時間培養した。その後、インスリンありのウェルはインスリンを終濃度１μＭで添加した２％（ｖ／ｖ）ウシ血清アルブミン含有Ｋｒｅｂｓ  Ｒｉｎｇｅｒ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｈｅｐｅｓ（ＫＲＰＨ）バッファーに、インスリンなしのウェルは２％（ｖ／ｖ）ウシ血清アルブミン含有ＫＲＰＨバッファー交換して３７℃で１８分間培養した。その後全てのウェルに終濃度１ｍＭとなるように２-デオキシグルコース（２ＤＧ）を添加して２０分間培養した。培養終了後、細胞溶解液を８０℃で１５分間熱処理、冷却遠心（１５，０００×ｇ、２０分間）して上清を回収し、得られた上清中の２−デオキシグルコース−６−リン酸量を定量して２ＤＧの細胞内取込み量とした。
【００３５】
その結果、アポ−１２’−リコペナールは、脂肪細胞への２ＤＧの取込みを促進した（図７）。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明に係るアポリコペノイド及びアポ−１２’−リコペナールは食品由来の成分であり、安全性に優れ、長期摂取が可能である。したがって、本発明が有用な分野は、糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化及び肥満からなる群の少なくとも１つの疾病の治療及び／又は予防のための医薬、サプリメント、機能性食品及び食品添加物である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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