(57)【要約】【課題】本発明は、金属酸化物を担体として用いる核酸の回収方法において、核酸を含む試料から核酸の回収率を向上させる方法および当該方法に用いる核酸回収用キットを提供する。【解決手段】本発明の核酸の回収方法は、金属酸化物製の担体に核酸を吸着させた後、核酸を溶出させることによって核酸を回収する方法であって、核酸を溶出させる溶出液に、リン酸系イオン液体を含む溶液を用いる方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を含む試料から核酸を回収する方法であって、以下の工程Ａ〜工程Ｃ：
工程Ａ：金属酸化物製の担体と核酸を含む液状試料とを混合し、前記担体に前記核酸を吸着させる工程、
工程Ｂ：工程Ａにおいて混合した溶液から、前記核酸が吸着した担体を分離する工程、
工程Ｃ：工程Ｂにおいて分離した前記核酸が吸着した担体に、アニオン部分がリン酸系アニオンであるイオン液体を含む溶出液を加えて核酸を溶出させる工程、
を含む核酸の回収方法。
【請求項２】
前記イオン液体のカチオン部分が、有機アンモニウムカチオンおよび／または有機ホスホニウムカチオンである請求項１に記載の核酸の回収方法。
【請求項３】
前記金属酸化物が、酸化アルミニウム、酸化セリウム、酸化ジルコニア、酸化マグネシウム、酸化チタンまたは二酸化ケイ素である請求項１または２に記載の核酸の回収方法。
【請求項４】
前記核酸を含む試料が、血液、尿、唾液、粘膜、汗、培養細胞、培養細胞の培養液、組織試料または標本である請求項１から３のいずれかに記載の核酸の回収方法。
【請求項５】
金属酸化物製の担体と、アニオン部分がリン酸系アニオンであるイオン液体を含む溶出液とを備えた核酸回収用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を含む試料から核酸を回収する方法、及び核酸回収用のキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸を用いた実験技術の発展により新規遺伝子探索やその解析が可能となった。がんなどの疾患を特定するためにヒトのゲノムが解析され、病原体の感染を特定するためにそれらのゲノムが解析されるなど、医療現場においても遺伝子解析を利用したスクリーニング検査や臨床検査などが行われている。
【０００３】
また、遺伝子解析の標的としては、ゲノムのような長鎖核酸ばかりではなく、短鎖核酸も注目されている。近年発見されたｍｉＲＮＡは１８塩基以上２５塩基以下の１本鎖ＲＮＡであり、６０塩基以上９０塩基以下のＰｒｅ−ｍｉＲＮＡから生合成される。これらは、タンパク質の合成や遺伝子の発現を調節する機能を持っていることから疾患と関連があるとされ、遺伝子解析の対象として注目されている。また、メタゲノミック診断法のように、臨床検体中の病原体由来の数百塩基対の核酸断片を次世代シーケンサーで網羅的に解析する方法も注目されている。このように、遺伝子解析の標的は、遺伝子探索の進化と共に多様化する傾向があり、体液中に極微量しか存在しない核酸についても解析の対象となる場合がある。よって、従来よりも高い収率で核酸を含む試料から核酸を回収する方法が求められている。
【０００４】
核酸を含む試料から核酸を回収する方法としては、フェノール・クロロホルムを用いて核酸を抽出する方法、エタノールで核酸を沈殿させる方法、および固相担体に核酸を吸着させて回収する方法などが挙げられる。
【０００５】
これらのうち、固相担体に核酸を吸着させる方法は、有機溶媒を利用する必要がないため、簡便に核酸を回収することができる。
【０００６】
固相担体を利用した方法としては、特許文献１に二酸化ケイ素を核酸回収用の担体として用いる方法が記載されており、特許文献２には、酸化アルミニウム粒子やジルコニア粒子を核酸回収用の担体として用いる方法が記載されている。
【０００７】
また、固相担体を利用した核酸の回収効率を向上させる方法としては、特許文献３に、酸化アルミニウム表面にポリマーを吸着させて核酸回収用の担体として用いる方法が記載されている。
【０００８】
また、特許文献４には、二酸化ケイ素の担体に核酸を吸着させる前工程として、アンモニウム塩またはホスホニウム塩を核酸に加えて核酸を安定化させ、核酸の分解を防ぐ方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５２３４８０９号明細書
【特許文献２】国際公開第９２／１８１５４号
【特許文献３】国際公開第２０１６／１５２７６３号
【特許文献４】特開２０１２−１３５３１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記の従来の固相担体を利用した核酸の回収方法のうち、特許文献３に記載の核酸の回収方法は、比較的高い収量で核酸を回収できる方法であるとされている点で注目される。本発明は、固相担体を利用した核酸の回収方法において、特に体液中に極微量にしか存在していない核酸も高い収率で回収することを可能とするような、さらに高い収率で核酸を含む試料から核酸を回収する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、金属酸化物製の担体を用いて核酸を回収する方法において、担体に吸着した核酸を溶出する際に、アニオン部分がリン酸系アニオンであるイオン液体を溶出液として用いることで、核酸の回収率が向上することを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
本発明は以下の通りである。
（１）核酸を含む試料から核酸を回収する方法であって、以下の工程Ａ〜工程Ｃ：
工程Ａ：金属酸化物製の担体と核酸を含む液状試料とを混合し、前記担体に前記核酸を吸着させる工程、
工程Ｂ：工程Ａにおいて混合した溶液から、前記核酸が吸着した担体を分離する工程、
工程Ｃ：工程Ｂにおいて分離した前記核酸が吸着した担体に、アニオン部分がリン酸系アニオンであるイオン液体を含む溶出液を加えて核酸を溶出させる工程、
を含む核酸の回収方法。
（２）前記イオン液体のカチオン部分が、有機アンモニウムカチオンおよび／または有機ホスホニウムカチオンである（１）に記載の核酸の回収方法。
（３）前記金属酸化物が、酸化アルミニウム、酸化セリウム、酸化ジルコニア、酸化マグネシウム、酸化チタンまたは二酸化ケイ素である（１）または（２）に記載の核酸の回収方法。
（４）前記核酸を含む試料が、血液、尿、唾液、粘膜、汗、培養細胞、培養細胞の培養液、組織試料または標本である（１）から（３）のいずれかに記載の核酸の回収方法。
（５）金属酸化物製の担体と、アニオン部分がリン酸系アニオンであるイオン液体を含む溶出液とを備えた核酸回収用キット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、固相担体を利用する核酸を含む試料からの核酸の回収において、従来よりも核酸を高収率に回収することが可能となる。特に、体液中に極微量にしか存在していないような核酸も回収して検出できるようになることから、遺伝子解析等への適用に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、核酸を含む試料から金属酸化物製の担体に核酸を吸着させ、当該核酸が吸着した担体に溶出液を添加して核酸を溶出させて回収する方法であって、溶出液に、アニオン部分がリン酸系アニオンであるイオン液体を用いることを特徴とする。
【００１５】
イオン液体は、カチオン部分とアニオン部分とから構成される塩であって、少なくとも常温において液体である物質である。本発明では、カチオン部分が有機カチオン（有機化合物の陽イオン）であり、アニオン部分が後記する「リン酸系アニオン」であるイオン液体を用いる。
【００１６】
本発明で用いるイオン液体のカチオン部分を構成する有機カチオンの具体例としては、有機アンモニウムカチオン、有機ホスホニウムカチオン、有機スルホニウムカチオンなどが挙げられるが、これらの中でも、核酸との相互作用に優れており、効率的に溶出できるという点で、有機アンモニウムカチオンと有機ホスホニウムカチオンが好ましい。
【００１７】
有機アンモニウムカチオンの具体例としては、イミダゾリウムカチオン、アンモニウムカチオン、ピリジニウムカチオン、キノリニウムカチオン、ピロリジニウムカチオン、ピペラジニウムカチオン、ピペラジニウムカチオン、モルホリニウムカチオン、ピリダジニウムカチオン、ピリミジニウムカチオン、ピラジニウムカチオン、ピラゾリウムカチオン、チアゾリウムカチオン、オキサゾリウムカチオン、トリアゾリウムカチオン、グアニジウムカチオン、４−アザ−１−アゾニア−ビシクロ−［２，２，２］オクタニウムなどが挙げられる。また、これらの有機アンモニウムカチオンには、任意の位置にアルキル基などの置換基を有していてもよく、置換基の数は複数でもよい。
【００１８】
上記の有機アンモニウムカチオンのうち、イミダゾリウムカチオン、アンモニウムカチオン、ピリジニウムカチオン、ピロリジニウムカチオン、ピペラジニウムカチオンについて具体例を以下に挙げる。
【００１９】
イミダゾリウムカチオンの具体例としては、１−メチルイミダゾリウム、１−エチルイミダゾリウム、１−プロピルイミダゾリウム、１−ブチルイミダゾリウムなどのモノアルキルイミダゾリウム、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム、１−エチル−３メチルイミダゾリウム、１−アリル−３−メチルイミダゾリウム、１，３−ジアリルイミダゾリウム、１−ベンジル−３−メチルイミダゾリウム、１−メチル−３−オクチルイミダゾリウムなどのジアルキルイミダゾリウム、また、１−エチル−２，３−ジメチルイミダゾリウム１−ブチル−２，３−ジメチルイミダゾリウム、１，２−ジメチル−３−プロピルイミダゾリウムなどのトリアルキルイミダゾリウム、１−シアノプロピル−３−メチルイミダゾリウム、１，３−ビスシアノメチルイミダゾリウム、１，３−ビス（３−シアノプロピル）イミダゾリウム、１−(２−ヒドロキシエチル)−３−メチルイミダゾリウム、１−メトキシエチル−３−メチルイミダゾリウム、１−［２−（２−メトキシエトキシ）−エチル］−３−メチルイミダゾリウム、１，３−ジエトキシイミダゾリウム、１，３−ジメトキシイミダゾリウム、１，３−ジヒドロキシイミダゾリウム、１−メチル−３−（３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，８−トリデカフルオロオクチルイミダゾリウム、１−メチル−３−［（トリエトキシシリル）プロピル］イミダゾリウムなどが挙げられる。
【００２０】
アンモニウムカチオンとしては、モノアルキルアンモニウム、モノヒドロキシアルキルアンモニウムなどの第一級アンモニウムカチオン、ジアルキルアンモニウム、ジヒドロキシアルキルアンモニウムなどの第二級アンモニウムカチオン、トリアルキルアンモニウム、トリヒドロキシアルキルアンモニウムなどの第三級アンモニウムカチオン、テトラアルキルアンモニウム、テトラヒドロキシアルキルアンモニウムなどの第四級アンモニウムカチオンなどが挙げられる。
【００２１】
第一級アンモニウムカチオンの具体例としては、メチルアンモニウム、エチルアンモニウム、プロピルアンモニウム、ブチルアンモニウム、ヘキシルアンモニウム、オクチルアンモニウム、フェニルアンモニウム、モノエタノールアンモニウム（またはヒドロキシエチルアンモニウム）、プロパノールアンモニウム（またはヒドロキシプロピルアンモニウム）などのモノヒドロキシアルキルアンモニウム、メトキシプロピルアンモニウム、ＤＬ−イソプロパノールアンモニウム、４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアンモニウムなどが挙げられる。
【００２２】
第二級アンモニウムカチオンの具体例としては、ジメチルアンモニウム、ジエチルアンモニウム、ジプロピルアンモニウム、ジブチルアンモニウム、ジヘキシルアンモニウム、ジオクチルアンモニウムなどのジアルキルアンモニウム、また、ジフェニルアンモニウム、ピペリジニウム、Ｎ−メチルエタノールアンモニウム、ジエタノールアンモニウム、ジイソプロパノールアンモニウムなどが挙げられる。
【００２３】
第三級アンモニウムカチオンの具体例としては、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、トリプロピルアンモニウム、トリブチルアンモニウム、トリヘキシルアンモニウム、トリオクチルアンモニウム、トリフェニルアンモニウム、Ｎ，Ｎ−ジメチルイソプロピルアンモニウム、Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアンモニウム、トリエタノールアンモニウムなどが挙げられる。
【００２４】
第四級アンモニウムカチオンの具体例としては、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、テトラへキシルアンモニウム、トリヘキシルテトラデシルアンモニウム、（２−ヒドロキシエチル）トリメチルアンモニウム、Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｎ−（２−メトキシエチル）−Ｎ−メチルアンモニウム、トリス（２−ヒドロキシエチル）メチルアンモニウム、トリメチル（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ヘプタデカフルオロデシル）アンモニウム、トリメチル−（４−ビニルベンジル）アンモニウム、トリブチル−（４−ビニルベンジル）アンモニウム、２−（メタクリロイルオキシ）エチルトリメチルアンモニウム、ベンジルジメチル（オクチル）アンモニウム、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−フェノキシエチル）−１−ドデシルアンモニウム、コリニウム、などが挙げられる。
【００２５】
ピリジニウムカチオンの具体例としては、１−エチルピリジニウム、１−ブチルピリジニウム、１−（３−ヒドロキシプロピル）ピリジニウム、１−エチル−３−メチルピリジニウム、１−ブチル−３−メチルピリジニウム、１−ブチル−４−メチルピリジニウム、１−（３−シアノプロピル）ピリジニウムなどが挙げられる。
【００２６】
ピロリジニウムカチオンの具体例としては、１−メチル−１−プロピルピロリジニウム、１−ブチル−１−メチルピロリジニウム、１−（２−ヒドロキシエチル）−１−メチルピロリジニウム、１−エチル−１−メチルピロリジニウムなどが挙げられる。
【００２７】
ピペリジニウムカチオンの具体例としては、１−メチル−１−プロピルピペリジニウム、１−ブチル−１−メチルピペリジニウム、１−（２−ヒドロキシエチル）−１−メチルピペリジニウム、１−エチル−１−メチルピペリジニウムなどが挙げられる。
【００２８】
有機ホスホニウムカチオンの具体例としては、テトラメチルホスホニウム、テトラエチルホスホニウム、テトラプロピルホスホニウム、テトラブチルホスホニウム、テトラヘキシルホスホニウム、トリヘキシルテトラデシルホスホニウム、トリフェニルメチルホスホニウム、（２−シアノエチル）トリエチルホスホニウム、（３−クロロプロピル）トリオクチルホスホニウム、トリブチル（４−ビニルベンジル）ホスホニウム、トリイソブチルメチルホスホニウム、トリエチルメチルホスホニウム、トリブチルメチルホスホニウム、トリブチルヘキサデシルホスホニウムなどが挙げられる。
【００２９】
有機スルホニウムカチオンの具体例としては、トリエチルスルホニウム、トリブチルスルホニウム、１−エチルテトラヒドロチオフェニウム、１−ブチルテトラヒドロチオフェニウムなどが挙げられる。
【００３０】
本発明で用いるイオン液体のアニオン部分は、リン酸系アニオンである。以下、本明細書において、アニオン部分がリン酸系アニオンであるイオン液体を「リン酸系イオン液体」と記載する場合がある。リン酸系アニオンには、無機リン酸系アニオン、有機リン酸系アニオンのいずれも含まれる。
【００３１】
無機リン酸系アニオンの具体例としては、リン酸イオン、亜リン酸イオン、ホスホン酸イオン、亜ホスホン酸イオン、ホスフィン酸イオン、亜ホスフィン酸イオン、ポリリン酸イオン、三リン酸イオンなどが挙げられる。ここで、リン酸イオンには、リン酸イオン（３価のアニオン）、リン酸水素イオン（２価のアニオン）、リン酸二水素イオン（１価のイオン）も含まれる。
【００３２】
有機リン酸系アニオンの具体例としては、リン酸モノエステルイオン、リン酸ジエステルイオン、有機ホスホン酸イオン、ホスホン酸モノエステルイオン、有機ホスフィン酸イオン、などが挙げられる。
【００３３】
リン酸モノエステルイオンの具体例としては、リン酸アデノシン−リン酸イオン、アデノシン二リン酸イオン、アデノシン三リン酸イオン、Ｌ−アルコスビン酸２−リン酸イオン、メチルリン酸イオン、エチルリン酸イオン、プロピルリン酸イオン、ブチルリン酸イオン、ペンチルリン酸イオン、ヘキシルリン酸イオン、デシルリン酸イオン、フェニルリン酸イオン、フィチン酸イオン、α−グリセロリン酸イオン、β−グリセロリン酸イオン、２−シアノエチルリン酸イオン、ナフチルリン酸イオン、２−アミノエチルリン酸イオン、１，１′−ビナフチル−２，２′−ジイルリン酸イオンなどが挙げられる。
【００３４】
リン酸ジエステルイオンの具体例としては、ジメチルリン酸イオン、ジエチルリン酸イオン、ジプロピルリン酸イオン、ジブチルリン酸イオン、ジペンチルリン酸イオン、ジヘキシルリン酸イオン、ジフェニルリン酸イオンなどが挙げられる。
【００３５】
有機ホスホン酸イオンの具体例としては、（１−アミノエチル）ホスホン酸、（アミノメチル）ホスホン酸イオン、（４−アミノベンジル）ホスホン酸イオン、（３−ブロモプロピル）ホスホン酸イオン、（２−ブロモエチル）ホスホン酸イオン、（４−ブロモブチル）ホスホン酸イオン、（２−クロロエチル）ホスホン酸イオン、ベンズヒドリルホスホン酸イオン、１，４−ブチレンジホスホン酸イオン、シンナミルホスホン酸イオン、メチルホスホン酸イオン、エチルホスホン酸イオン、プロピルホスホン酸イオン、ブチルホスホン酸イオン、ペンチルホスホン酸イオン、ヘキシルホスホン酸イオン、デシルホスホン酸、フェニルホスホン酸イオン、４−アミノ−１−ヒドロキシブタン−１，１−ジホスホン酸イオンなどが挙げられる。
【００３６】
ホスホン酸モノエステルイオンの具体例としては、ホスホン酸メチルエステルイオン、ホスホン酸エチルエステルイオン、ホスホン酸プロピルエステルイオン、ホスホン酸ブチルエステルイオン、ホスホン酸ペンチルエステルイオン、ホスホン酸ヘキシルエステルイオン、ホスホン酸フェニルエステルイオンなどが挙げられる。
【００３７】
有機ホスフィン酸イオンの具体例としては、メチルホスフィン酸イオン、エチルホスフィン酸イオン、プロピルホスフィン酸イオン、ブチルホスフィン酸イオン、ペンチルホスフィン酸イオン、ヘキシルホスフィン酸イオン、デシルホスフィン酸イオン、フェニルホスフィン酸イオン、ジフェニルホスフィン酸イオンなどが挙げられる。
【００３８】
リン酸系イオン液体のカチオン部分を構成する有機カチオンと、アニオン部分を構成するリン酸系アニオンの具体的な組み合わせについては、上記の有機カチオンとリン酸系アニオンを組み合わせた際に、水溶性を示すリン酸系イオン液体となる組み合わせを選択することが好ましい。通常、リン酸系イオン液体が水溶性を示すためには、カチオンまたはアニオンのいずれか一方が水溶性であることが必要であり、カチオンとアニオンがともに水溶性である組み合わせがさらに好ましい。核酸を回収した後の解析工程では水溶性の反応液を利用することが多いため、水溶性のリン酸系イオン液を溶出液として核酸を回収すれば、回収した核酸をそのまま、分析工程に利用することが可能となる。本明細書中で水溶性のリン酸系イオン液体とは、水に対して溶解可能な性質を表し、水に対する溶解度が少なくとも５０ｍＭ以上のリン酸系イオン液体を指す。
【００３９】
イオン液体は、後記の本発明の方法の工程Ｃにおいて、溶出液として用いる。溶出液中のイオン液体の濃度は、特に限定されないが、通常５０ｍＭ以上であればよく、好ましくは１００ｍＭ以上である。溶出液の溶媒としては、水や緩衝液を用いることができる。溶出液のｐＨは、４以上９以下が好ましく、５以上８以下がより好ましい。ｐＨは、例えば、イオン液体を構成するカチオンまたはアニオンを塩として含む溶液を用いて調整することができる。また、イオン液体は、溶出液としてそのまま工程Ｃで用いてもよい。
【００４０】
本発明において核酸を吸着させてその回収に用いる担体は、金属酸化物から製造される。金属酸化物の具体例としては、酸化セリウム、酸化ジルコニウム、酸化アルミニウム（アルミナ）、酸化カルシウム、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、酸化チタン、二酸化ジルコニウム、二酸化ケイ素（シリカ）、酸化鉄などが挙げられる。担体は、単一の金属酸化物からなるものを使用してもよく、シリカ−アルミナのような金属酸化物の混合物からなるものを使用してもよい。より好ましくは、リン酸系イオン液体のアニオン部分を構成するリン酸系アニオンと静電相互作用で結合できる、プラス電荷を持った金属酸化物であり、具体的には、酸化セリウム、酸化ジルコニウム、酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、二酸化ジルコニウムである。
【００４１】
金属酸化物は粒状のものがよい。粒径はそろっていても、異なる粒径のものを混合して利用してもよい。粒径は、本発明では日本工業規格に規格するＪＩＳ  Ｚ−８８０１−１：２００６に基づいたふるい目開きの寸法で定義する。例えば、上記ＪＩＳ標準による目開きにして４５μｍのふるいを通過し、３２μｍのふるいを通過できない粒子は、３２μｍ以上４５μｍ未満の粒径となる。
【００４２】
本発明に用いる担体としては、上記の金属酸化物の表面にポリマーを吸着させて用いてもよい。特に、酸化アルミニウムや酸化セリウムの表面にポリマーを吸着させた担体を用いると、核酸を高い収量で回収することができるため好ましい。ポリマーは、基本単位である単量体やモノマーと呼ばれる繰り返し単位が多数繋がった化合物の総称である。上記ポリマーには、１種類の単量体からなるホモポリマーと２種類以上の単量体からなるコポリマーのいずれもが含まれ、任意の重合度のポリマーを用いることができる。また、上記ポリマーには、天然ポリマーと合成ポリマーのいずれもが含まれる。
【００４３】
ポリマーとしては、例えば、ポリビニルアルコール又はポリビニルピロリドンなどのポリビニル系ポリマー、ポリアクリルアミド、ポリ(Ｎ−イソプロピルアクリルアミド)又はポリ(Ｎ−(ヒドロキシメチル)アクリルアミドなどのポリアクリルアミド系ポリマー、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール又はポリテトラメチレンエーテルグリコールなどのポリアルキレングリコール系のポリマー、ポリ(２−エチル−２−オキサゾリン)、(ヒドロキシプロピル)メチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、２−ヒドロキシエチルセルロース又はヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース等を用いることができる。また、上記のポリマーが含まれる共重合体も用いることができる。
【００４４】
また、フィコール、アガロース、キチン、デキストランなどのポリサッカライド又はポリサッカライド類縁体、またはアルブミンなどのタンパク質やペプチドを用いてもよい。
【００４５】
ポリマーの官能基の一部をイオン化させたり、陽性や陰性を示す官能基に置換したり、側鎖にアセチル基など水溶性を発現する官能基を導入してもよい。
【００４６】
ポリマーを担体に吸着させる方法は、例えば、ポリマーを溶解させてポリマー溶液を調製し、担体に接触させる方法が挙げられる。具体的には、ポリマー溶液に担体を浸漬させたり、ポリマー溶液を担体に滴下したり、ポリマー溶液を担体に塗布したり、ポリマー溶液を霧状にして担体に吹き付けたりすることができる。ここで、ポリマーを担体にコーティングすることは、ポリマーを担体に吸着させることの一態様である。
【００４７】
ポリマー溶液に、酸化アルミニウムを浸漬させる方法は特に限定されない。例えば、ピペッティング、転倒混合、スターラー、ミキサー、ボルテックス、ミル等の分散機や超音波処理装置などで撹拌してもよい。
【００４８】
本発明で用いる核酸を含む試料には、核酸を含む任意の試料を使用できる。核酸には、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ（キメラ）及び人工核酸などが挙げられる。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、マイクロＤＮＡ、セルフリ−ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡなどが挙げられる。また、ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡもしくはｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ、それらの前駆体又は合成ＲＮＡなどが挙げられる。合成ＤＮＡ及び合成ＲＮＡは、所定の塩基配列（天然型配列又は非天然型配列のいずれでもよい）に基づいて、例えば自動核酸合成機を用いて、人工的に作製できる。
【００４９】
また、核酸を含む試料には、例えば、生物学的試料も挙げられる。生物学的試料には、培養細胞、培養細胞の培養液、組織試料や標本などの細胞由来試料、細菌、真菌、原生生物やウイルスなどの微生物由来試料、血液、尿、唾液、粘膜、汗、痰、精液などの体液試料、便などのヒトを含む動物由来試料、核酸の他にタンパク質、糖や脂質などの生物学的機能を有する化合物を含む生体試料などを利用することができる。これらのうち、好ましくは、培養細胞や体液であり、更に好ましくは血液である。血液には、全血、血漿、血清、血球などが含まれる。
【００５０】
本発明において、核酸を含む試料は液体状態で用いる。核酸を含む試料が体液等の液体試料である場合には、採取後そのまま核酸を含む液状試料として用いてもよいし、採取後に溶液を加え希釈した後、核酸を含む液状試料として用いてもよい。核酸を含む試料が、細胞ペレットや組織片等の固体試料である場合には、採取後に水や緩衝液で液体状態に調製して、核酸を含む液状試料として本発明に用いることができる。
【００５１】
核酸を含む試料は、必要に応じて、以下のような処理をしてもよい。これは、核酸が生物学的試料において細胞膜、細胞壁、小胞、リポソーム、ミセル、リボソーム、ヒストン、核膜、ミトコンドリア、ウイルスのキャプシド、エンベロープ、エンドソームまたはエキソソームのような化合物に内包されていたり、これらが相互作用していたりすることが多いためである。より収率よく核酸を回収するために、これらから遊離させることを目的とした処理を行ってもよい。
【００５２】
具体的には、核酸を含む試料として、大腸菌を用いる場合、核酸の回収効率を高めるために、以下のような処理を行うことができる。例えば、大腸菌が含まれる溶液に対して０．２Ｍの水酸化ナトリウムと１％のＳＤＳの混合液を加えることができ（アルカリ変性法）、また、１０％のサルコシル溶液を加えることもできる（サルコシルによる非変性法）。また、これらの溶液にリゾチームを添加しておいてもよい。また、プロテイナーゼＫにより３７℃で１時間処理を行うこともできる。他の方法として超音波処理を行うこともできる。
【００５３】
核酸を含む試料として酵母を用いる場合、核酸の回収効率を高めるために、以下のような処理を行うことができる。例えば、生化学工業株式会社やナカライテスク株式会社から市販されているザイモリエースで処理した後に１０％のＳＤＳを加えることもできる。
【００５４】
核酸を含む試料として、細胞を用いる場合、核酸の回収効率を高めるために、以下のような処理を行うことができる。例えば、１％のＳＤＳを加えることができる。他の方法として、塩化グアニジニウム、グアニジンチオシアン酸塩、尿素などを、例えば各終濃度が４Ｍ以上となるように加えてもよい。この溶液に対して、サルコシルを０．５％以上になるよう加えてもよい。また、メルカプトエタノールを５０ｍＭ以上の濃度になるよう加えてもよい。
【００５５】
上記の操作において、核酸の分解を抑制するために、核酸の分解酵素の阻害剤を添加してもよい。ＤＮＡ分解酵素の阻害剤として、ＥＤＴＡを１ｍＭ以下の濃度で添加することができる。また、ＲＮＡ分解酵素の阻害剤として市販されている「ＲＮａｓｉｎ  Ｐｌｕｓ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」（プロメガ株式会社）、「Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」（タカラバイオ株式会社）、「ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」（東洋紡株式会社）などを使用することができる。
【００５６】
核酸を含む試料にＤＮＡとＲＮＡが混在している場合には、フェノール・クロロホルム抽出によって分離することもできる。例えば、フェノール・クロロホルム抽出を酸性条件で行えばＲＮＡは水相、ＤＮＡはクロロホルム相に分離され、中性条件で行えばＲＮＡとＤＮＡは水相に分配される。この性質を利用して、取得したい核酸の種類に応じて条件を選択できる。上記のクロロホルムはｐ−ブロモアニソールに置換することもできる。
【００５７】
フェノール・クロロホルム抽出は、市販試薬である「ＩＳＯＧＥＮ」（登録商標：株式会社ニッポンジーン）、「ＴＲＩｚｏｌ」（登録商標：ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ＲＮＡｉｓｏ（タカラバイオ株式会社）、「３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）  ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｒｏｍ  ｌｉｑｕｉｄ  ｓａｍｐｌｅ  ｋｉｔ」（東レ株式会社）を利用することもできる。以上の処理は、その一工程のみを行ってもよく、他の操作における工程と組み合わせることもできる。また、それに用いる溶液の濃度は、必要に応じて変えることもできる。
【００５８】
本発明において核酸を含む液状試料として、核酸、人工核酸、色素やリン酸基等の修飾が施された核酸を溶解させた溶液や、体液等の液体試料やその希釈液、細胞ペレットや組織片等の固体試料の希釈液も用いることができる。また、液体試料や固体試料を含む核酸を含む試料に対し、上記のいずれかの処理を行った後に得られる溶液をそのまま核酸を含む液状試料として用いてもよいし、必要に応じて希釈してもよい。希釈する溶液は特に限定されないが、水やＴｒｉｓ−塩酸緩衝液などの核酸の希釈に汎用される溶液を使用することが好ましい。また、カオトロピック塩として塩化グアニジニウム、グアニジンチオシアン酸塩、尿素を、例えば各終濃度が４Ｍ以上となるように加えてもよい。
【００５９】
本発明において、試料から回収する核酸の長さは特に限定されず、数十塩基長の短い核酸からゲノムのように長い核酸まで高収率で回収することができる。本発明の方法によれば、特に、従来技術では回収率の低かった１０００塩基長以下の短鎖核酸、さらに、１００塩基長以下のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡやｍｉＲＮＡも高収率で回収することができる。塩基長の短い核酸を回収する場合には、金属酸化物として酸化アルミニウムや酸化セリウムを用いることが好ましい。
【００６０】
本発明において、担体に核酸を吸着させるとは、可逆的に脱離可能となる吸着を指す。
【００６１】
担体に吸着した核酸の回収率は、以下のとおり求めることができる。はじめに核酸を含む液状試料中の核酸量を算出する。次に核酸が吸着した担体に対して溶出液を加え、溶出した後の溶液中の核酸量を算出し、核酸の溶出量を算出する。得られた値を核酸の回収量とし、その値を、核酸を含む液状試料中の核酸量で割ることで、核酸の回収率が算出できる。
【００６２】
核酸量の定量の方法としては、吸光度測定、蛍光測定、発光測定、電気泳動、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイを使用した解析、シーケンサーを使った解析などが挙げられる。非修飾の核酸であれば、２６０ｎｍにおける吸光度を測定することで核酸量を定量することができる。また、蛍光色素が修飾された核酸であれば、その蛍光色素に由来する蛍光強度を、濃度既知の溶液における蛍光強度と比較することで核酸量を定量できる。その他、電気泳動により行うことができる。電気泳動による回収率の算出方法は、濃度既知のサンプルと同時に回収操作を行ったサンプルを泳動し、ゲルを染色してバンドの濃度を画像解析により比較することで決定することができる。
【００６３】
本発明の一態様は、核酸を含む試料から核酸を回収する方法であって、
工程Ａ：金属酸化物製の担体と核酸を含む液状試料とを混合し、前記担体に前記核酸を吸着させる工程、
工程Ｂ：工程Ａにおいて混合した溶液から、前記核酸が吸着した担体を分離する工程、
工程Ｃ：工程Ｂにおいて分離した前記核酸が吸着した担体に、アニオン部分がリン酸系アニオンであるイオン液体を含む溶出液を加えて核酸を溶出させる工程、
を含む。以下、それぞれの工程について詳細に説明する。
【００６４】
工程Ａは、金属酸化物製の担体と、核酸を含む液状試料とを混合し、前記担体に核酸を吸着させる工程である。金属酸化物製の担体と核酸を含む液状試料の混合方法は特に限定されないが、例えばピペッティングや転倒混合により行ってもよく、ミキサー、ボルテックスなどの装置を使用してもよい。混合時間は、特に限定されないが５分程度であればよく、それ以上の時間混合してもよい。また、金属酸化物製の担体をカラムに充填し、核酸を含む液状試料を通過させてもよい。
【００６５】
工程Ｂは、工程Ａにおいて混合した混合物から、前記核酸が吸着した金属酸化物製の担体を分離する工程である。分離の方法としては、工程Ａで得られる混合物を遠心分離し、核酸が吸着した金属酸化物製の担体を沈殿させ、上清を除く方法が挙げられる。核酸が吸着した金属酸化物製の担体の比重は水より重いため、遠心操作により容易に沈殿させることができる。遠心分離の条件は、６０００Ｇで１分間処理すればよく、１００００Ｇ以上の遠心力で１分間処理することがより好ましい。他の分離方法としては、限外ろ過膜を用いる方法が挙げられる。核酸が吸着した担体の粒径より小さな孔径を持つ限外ろ過膜に対し、工程Ａで得られた混合物を通過させ、核酸が吸着した担体を分離する。このような限外ろ過膜はキット化されており、メルク株式会社製の「ウルトラフリー」（登録商標）やＰａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製の「ナノセップ」（登録商標）に代表される遠心ろ過キットを入手して利用することができる。
【００６６】
また、工程Ｂの操作の後に、必要に応じて以下のような処理をしてもよい。これは、工程Ａの後に、金属酸化物製の担体の表面に目的となる核酸以外のタンパク質や脂質などが吸着している可能性があるためである。例えば、より高純度に核酸を単離するため、洗浄や分解の処理を行うことができる。具体的には、非特異的に吸着した化合物を除去するために水で洗浄する、非特異的に吸着したタンパク質を除去するために界面活性剤で洗浄する、イオンや低分子化合物を除去するために界面活性剤を含む溶液で洗浄する、非特異的に吸着した疎水性化合物を除去するために有機溶媒で洗浄する、非特異的に吸着したタンパク質を分解するためにタンパク質分解酵素を添加する、ＤＮＡのみを単離するためにＲＮＡ分解酵素を添加する及びＲＮＡのみを単離するためにＤＮＡ分解酵素を添加する、などの様々な処理をすることができる。
【００６７】
工程Ｃは、工程Ｂにおいて分離した前記核酸が吸着した担体に、アニオン部分がリン酸系アニオンであるイオン液体（リン酸系イオン液体）を含む溶出液を加えて核酸を溶出させる工程である。核酸が吸着した金属酸化物製の担体にリン酸系イオン液体を含む溶出液を加えた後、静置したまま核酸を溶出させてもよいし、ピペッティングや転倒混合などにより担体と溶出液とを混合して核酸を溶出させてもよい。混合は、ミキサー、ボルテックスなどの装置を使用して行ってもよい。静置または混合の時間は、特に限定されないが、５分程度であればよく、それ以上の時間であってもよい。
【００６８】
上記溶出液を加えて溶出させた核酸を回収するにあたって、金属酸化物製の担体と核酸を溶出させた溶液を分離したい場合には、工程Ｃにおいて、核酸が吸着した担体に溶出液を加えて得られた混合物を遠心分離し、金属酸化物製の担体を沈殿させ、核酸が溶出している上清を取得する方法が挙げられる。金属酸化物製の担体の比重は水より重いため、遠心操作により容易に沈殿させることができる。遠心分離の条件は、６０００Ｇで１分間処理すればよく、１００００Ｇ以上の遠心力で１分間処理することがより好ましい。
【００６９】
他の分離方法としては、限外ろ過膜を用いる方法が挙げられる。金属酸化物製の担体の粒径より小さな孔径を持つ限外ろ過膜に対し、工程Ｃにおいて得られた混合物を通過させ、金属酸化物製の担体を分離する。このような限外ろ過膜はキット化されており、メルク株式会社製の「ウルトラフリー」（登録商標）やＰａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製の「ナノセップ」（登録商標）に代表される遠心ろ過キットを入手して利用することができる。
【００７０】
回収された核酸は、必要に応じて、化学修飾を行うことができる。化学修飾には、核酸の末端に対する蛍光色素修飾、消光剤修飾、ビオチン修飾、アミノ化、カルボキシル化、マレインイミド化、スクシンイミド化、リン酸化及び脱リン酸化などが挙げられ、他にはインターカレーターによる染色が挙げられる。これらの修飾は化学反応により導入されてもよく、酵素反応により導入されてもよい。上記定量の前にこれらの修飾基を導入し、回収された核酸自身を定量するのではなく、化学修飾を経て導入された修飾基を定量することで、間接的に核酸を定量することができる。本発明により核酸が回収され、特に短鎖核酸であっても高収率に回収されるため、上記定量において高感度に定量することが可能となる。
【００７１】
本発明の方法によって、溶出液中に回収された核酸は、そのままＤＮＡチップなどによる遺伝子検出や、ＰＣＲなどによる増幅といった後工程に供することができる。また、後工程の反応条件などによっては、水や緩衝液などで、適当な濃度希釈して用いればよい。
【００７２】
本発明の核酸回収用キットは、核酸を含む試料から、核酸を効率的に回収するために利用することができる。
【００７３】
本発明の核酸回収用キットは、その構成成分として、金属酸化物製の担体と、アニオン部分がリン酸系アニオンであるイオン液体を含む溶出液が含まれる。また、これらの他に、キットには説明書が含まれていてもよい。当該説明書には、溶出液の調製方法や、核酸回収のプロトコールなどが記載されていてもよい。
【実施例】
【００７４】
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明する。
【００７５】
＜材料と方法＞
実施例及び比較例で利用した金属酸化物は、以下のとおり入手した。塩基性のガンマ酸化アルミニウム（Ｎ６１３）は日揮触媒化成株式会社より入手した。アナターゼ型酸化チタン（２０５−０１７１５）およびルチル型酸化チタン（２０１−１３６４５）は和光純薬株式会社から入手した。酸化マグネシウム（ＪＲＣ−ＭＧＯ−３）、酸化セリウム（ＪＲＣ−ＣＥＯ−２）、酸化ジルコニウム（ＪＲＣ−ＺＲＯ−４）はそれぞれ触媒学会の参照触媒から入手した。二酸化ケイ素は、二酸化ケイ素の膜を用いているＱＩＡＧＥＮ社の「ｍｉＲＮｅａｓｙ  ＭｉＮｉ  Ｋｉｔ」を用いた。また、特に断らない限り、金属酸化物は、ふるい分けなどせずに購入したまま、担体として用いた。
【００７６】
核酸を含む試料の調製に実施例及び比較例で使用した核酸は、以下のとおり入手した。核酸は、配列番号１で表される塩基配列の３´末端をＣｙ３で蛍光標識したＲＮＡをつくばオリゴ株式会社より購入し、「ＲＮＡ−１」として特に精製することなくそのまま実験に用いた。また、配列番号２で表される塩基配列の５´末端をＣｙ３で蛍光標識したＤＮＡをユーロフィンジェノミクス株式会社より購入し、「ＤＮＡ−１」として特に精製することなくそのまま実験に用いた。
【００７７】
その他の試薬については、和光純薬株式会社、東京化成株式会社、シグマ−アルドリッチジャパン合同会社から購入し、特に精製することなくそのまま実験に用いた。
【００７８】
ミキサーは東京理化器械株式会社のＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００を、蛍光プレートリーダーはモレキュラーデバイスジャパン株式会社のＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ  ＧＥＮＭＩＮＩＥＭを用いた。
【００７９】
＜実施例１＞
金属酸化物製の担体として、特許文献２で使用されていた酸化アルミニウムＡと組成の近い、塩基性のガンマ酸化アルミニウム（Ｎ６１３Ｎ、日揮触媒化成株式会社）を用いて、核酸の回収を行った。
【００８０】
酸化アルミニウムは、日本工業規格に規格するＪＩＳ  Ｚ８８０１−１：２００６に基づくふるいを使って、粒径３２μｍ以上４５μｍ未満に分画した。続いて、分画した酸化アルミニウムにエタノールを加えてボルテックスした後、遠心機で遠心して上清を除く操作を２回繰り返して洗浄したものを使用した。
【００８１】
リン酸系イオン液体を含む溶出液として、０．５Ｍリン酸モノエタノールアンモニウム（ｐＨ＝７）を用いた。ｐＨは、モノエタノールアミンを用いて調整した。
【００８２】
最初に１．５ｍＬチューブに、１．０ｍｇの酸化アルミニウムを量り取った。続いて、核酸を含む液状試料として、３３．３ｐｍоｌのＲＮＡ−１をヌクレアーゼフリー水に溶解させて調製したＲＮＡ−１水溶液を用意し、その１００μＬを加え、３０分間ミキサーで攪拌した。遠心（２００００Ｇ、１分）して上清を捨て、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を２００μＬ加えて、ボルテックスした後、遠心（２００００Ｇ、１分）して上清を捨てた。もう一度、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を２００μＬ加えて、ボルテックスした後、遠心（２００００Ｇ、１分）して上清を捨てた。その後、溶出液として、５０μＬの０．５Ｍリン酸モノエタノールアンモニウム（ｐＨ＝７）を加え、ミキサーで１時間攪拌した。最後に、遠心機で遠心（２００００Ｇ、１分）して核酸溶液を回収した。
【００８３】
回収率は、Ｃｙ３の蛍光測定により以下のように算出した。蛍光プレートリーダーで、酸化アルミニウムに加える前の３３３ｎｍｏｌのＲＮＡ−１水溶液の蛍光強度と、回収した核酸溶液の蛍光強度を測定した。回収した核酸溶液は２倍濃縮されていることから、以下の式（Ｉ）を用いて、核酸の回収率を算出した。
【００８４】
核酸の回収率＝（回収した核酸の蛍光強度／２）／（酸化アルミニウムに加える前のＲＮＡ−１水溶液の蛍光強度）・・・式（Ｉ）。
【００８５】
結果を表１に示す。溶出液としてリン酸系イオン液体であるリン酸モノエタノールアンモニウムを含む溶液を用いると、リン酸系イオン液体を用いない比較例１〜４の結果と比べて、核酸を高い収率で回収できることを確認した。
【００８６】
＜比較例１＞
溶出液を０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７）に変更した以外は、実施例１と同様の条件および操作で核酸の回収を行った。結果を表１に示す。イオン液体を含まない溶出液を用いた本比較例の核酸の回収率は、実施例１の回収率と比べて、著しく低い結果となった。
【００８７】
＜比較例２＞
比較例２では、０．５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）を溶出液として用いた以外は、比較例１と同様の条件および操作で核酸の回収を行った。結果を表１に示す。イオン液体を含まない溶出液を用いた本比較例では、核酸をほとんど回収することができなかった。
【００８８】
＜比較例３＞
比較例３では、０．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）にリン酸二水素ナトリウムを０．５Ｍになるように溶解させた、トリス塩酸緩衝液−リン酸二水素ナトリウム混合溶液を溶出液として用いた以外は、比較例１と同様の条件および操作で核酸の回収を行った。結果を表１に示す。イオン液体を含まない溶出液を用いた本比較例の核酸の回収率は、実施例１の回収率と比べて、著しく低い結果となった。
【００８９】
＜比較例４＞
核リン酸系イオン液体を、溶出液ではなく、核酸を含む試料に添加して、核酸の回収を行った。特許文献４には、核酸を含む試料にあらかじめ４級アンモニウム塩または４級ホスホニウム塩を添加した状態で核酸を回収する方法が記載されており、具体的にはリン酸塩が使用できることが記載されている。そこで、この特許文献４の結果と比較するために、リン酸系イオン液体を核酸を含む液状試料に予め添加し、イオン液体を含まない溶出液を用いて、核酸の回収を行った。
【００９０】
核酸を含む試料として、３３．３ｐｍоｌのＲＮＡ−１を０．５Ｍリン酸テトラブチルホスホニウム（ｐＨ＝７）１００μｌに溶解させたＲＮＡ−１溶液を用いた以外は、比較例１と同様の条件および操作で核酸の回収を行った。
【００９１】
結果を表１に示す。本比較例では、核酸をほとんど回収することができなかった。
【００９２】
【表１】
2020058270.tif 000002
【００９３】
＜実施例２＞
リン酸系イオン液体を含む溶出液を０．５Ｍリン酸テトラブチルホスホニウム（ｐＨ＝７）に変更した以外は、実施例１と同様の条件および操作で核酸を回収した。溶出液のｐＨは、４０％テトラブチルホスホニウム水溶液を用いて調整した。結果を表２に示す。溶出液としてリン酸テトラブチルホスホニウムを含む溶液を用いても、核酸を高い収率で回収できることを確認した。
【００９４】
＜実施例３＞
リン酸系イオン液体を含む溶出液を０．５Ｍリン酸テトラエチルアンモニウム（ｐＨ＝７）に変更した以外は、実施例１と同様の条件および操作で核酸を回収した。溶出液のｐＨは、２０％テトラエチルアンモニウムヒドロキシド水溶液を用いて調整した。結果を表２に示す。溶出液としてリン酸テトラエチルアンモニウムを含む溶液を用いても、核酸を高い収率で回収できることを確認した。
【００９５】
＜実施例４＞
リン酸系イオン液体を含む溶出液を０．５Ｍリン酸ジエタノールアンモニウム（ｐＨ＝７）に変更した以外は、実施例１と同様の条件および操作で核酸を回収した。溶出液のｐＨは、ジエタノールアミンを用いて調整した。結果を表２に示す。溶出液としてリン酸ジエタノールアンモニウムを含む溶液を用いても、核酸を高い収率で回収できることを確認した。
【００９６】
＜実施例５＞
リン酸系イオン液体を含む溶出液を０．５Ｍ  リン酸Ｎ−メチルエタノールアンモニウム（ｐＨ＝７）に変更した以外は、実施例１と同様の条件および操作で核酸を回収した。溶出液のｐＨは、Ｎ−メチルエタノールアミンを用いて調整した。結果を表２に示す。溶出液としてリン酸Ｎ−メチルエタノールアンモニウムを含む溶液を用いても、核酸を高い収率で回収できることを確認した。
【００９７】
＜実施例６＞
リン酸系イオン液体を含む溶出液を０．５Ｍリン酸ジイソプロパノールアンモニウム（ｐＨ＝７）に変更した以外は、実施例１と同様の条件および操作で核酸を回収した。溶出液のｐＨは、ジイソプロパノールアミンを用いて調整した。結果を表２に示す。溶出液としてリン酸ジイソプロパノールアンモニウムを含む溶液を用いても、核酸を高い収率で回収できることを確認した。
【００９８】
＜実施例７＞
リン酸系イオン液体を含む溶出液を０．５Ｍリン酸トリエタノールアンモニウム（ｐＨ＝７）に変更した以外は、実施例１と同様の条件および操作で核酸を回収した。溶出液のｐＨは、トリエタノールアミンを用いて調整した。結果を表２に示す。溶出液としてリン酸トリエタノールアンモニウムを含む溶液を用いても、核酸を高い収率で回収できることを確認した。
【００９９】
＜実施例８＞
リン酸系イオン液体を含む溶出液を０．５Ｍリン酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ＝７）に変更した以外は、実施例１と同様の条件および操作で核酸を回収した。溶出液のｐＨは、トリエチルアミンを用いて調整した。結果を表２に示す。溶出液としてリン酸トリエチルアンモニウムを含む溶液を用いても、核酸を高い収率で回収できることを確認した。
【０１００】
＜実施例９＞
リン酸系イオン液体を含む溶出液を０．５Ｍリン酸ピペリジニウム（ｐＨ＝７）に変更した以外は、実施例１と同様の条件および操作で核酸を回収した。溶出液のｐＨは、ピペリジンを用いて調整した。結果を表２に示す。溶出液としてリン酸ピペリジニウムを含む溶液を用いても、核酸を高い収率で回収できることを確認した。
【０１０１】
＜実施例１０＞
リン酸系イオン液体を含む溶出液を０．５Ｍ  リン酸Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアンモニウム（ｐＨ＝７）に変更した以外は、実施例１と同様の条件および操作で核酸を回収した。溶出液のｐＨは、Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミンを用いて調整した。結果を表２に示す。溶出液としてリン酸Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアンモニウムを含む溶液を用いても、核酸を高い収率で回収できることを確認した。
【０１０２】
＜実施例１１＞
リン酸系イオン液体を含む溶出液を０．５Ｍリン酸プロパノールアンモニウム（ｐＨ＝７）に変更した以外は、実施例１と同様の条件および操作で核酸を回収した。溶出液のｐＨは、プロパノールアミンを用いて調整した。結果を表２に示す。溶出液としてリン酸プロパノールアンモニウムを含む溶液を用いても、核酸を高い収率で回収できることを確認した。
【０１０３】
＜実施例１２＞
リン酸系イオン液体を含む溶出液を０．５Ｍリン酸メトキシプロピルアンモニウム（ｐＨ＝７）に変更した以外は、実施例１と同様の条件および操作で核酸を回収した。溶出液のｐＨは、メトキシプロピルアミンを用いて調整した。結果を表２に示す。溶出液としてリン酸メトキシプロピルアンモニウムを含む溶液を用いても、核酸を高い収率で回収できることを確認した。
【０１０４】
＜実施例１３＞
リン酸系イオン液体を含む溶出液を０．５Ｍリン酸コリニウム（ｐＨ＝７）に変更した以外は、実施例１と同様の条件および操作で核酸を回収した。溶出液のｐＨは、コリンを用いて調整した。結果を表２に示す。溶出液としてリン酸コリニウムを含む溶液を用いても、核酸を高い収率で回収できることを確認した。
【０１０５】
＜実施例１４＞
リン酸系イオン液体を含む溶出液を０．５Ｍリン酸ＤＬ−イソプロパノールアンモニウム（ｐＨ＝７）に変更した以外は、実施例１と同様の条件および操作で核酸を回収した。溶出液のｐＨは、ＤＬ−イソプロパノールアミンを用いて調整した。結果を表２に示す。溶出液としてリン酸ＤＬ−イソプロパノールアンモニウムを含む溶液を用いても、核酸を高い収率で回収できることを確認した。
【０１０６】
＜実施例１５＞
リン酸系イオン液体を含む溶出液を０．５Ｍリン酸４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアンモニウム（ｐＨ＝７）に変更した以外は、実施例１と同様の条件および操作で核酸を回収した。溶出液のｐＨは、リン酸を用いて調整した。結果を表２に示す。溶出液としてリン酸４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアンモニウムを含む溶液を用いても、核酸を高い収率で回収できることを確認した。
【０１０７】
＜実施例１６＞
リン酸系イオン液体を含む溶出液を０．５Ｍリン酸テトラブチルホスホニウム（ｐＨ＝７）と０．５Ｍリン酸テトラエチルアンモニウム（ｐＨ＝７）を等量で混合した溶液に変更した以外は、実施例１と同様の条件および操作で核酸を回収した。０．５Ｍリン酸テトラブチルホスホニウムのｐＨは、４０％テトラブチルホスホニウム水溶液を用いて調整し、０．５Ｍリン酸テトラエチルアンモニウムのｐＨは、２０％テトラエチルアンモニウムヒドロキシド水溶液を用いて調整した。結果を表２に示す。溶出液としてリン酸テトラブチルホスホニウムとリン酸テトラエチルアンモニウムとを含む溶液を用いても、核酸を高い収率で回収できることを確認した。
【０１０８】
＜実施例１７＞
回収する対象となる核酸をＲＮＡ−１からＤＮＡ−１に変更した以外は、実施例２と同様の条件および操作で核酸の回収を行った。結果を表２に示す。リン酸系イオン液体を含む溶液を溶出液に用いることで、ＲＮＡだけでなく、ＤＮＡについても高い収率で回収できることがわかった。
【０１０９】
【表２】
2020058270.tif 000003
【０１１０】
＜実施例１８＞
核酸の回収用担体に用いる金属酸化物として、アナターゼ型の酸化チタンを用いた以外は、実施例２と同様の条件および操作で核酸の回収を行った。結果を表３に示す。本結果から、金属酸化物としてアナターゼ型酸化チタンを用いた場合も、リン酸系イオン液体を利用しない比較例５と比較して、高い収率で回収できることを確認した。
【０１１１】
＜比較例５＞
溶出液として０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７）を用いた以外は、実施例１８と同様の条件および操作で核酸の回収を行った。結果を表３に示す。イオン液体を含まない溶出液を用いた本比較例の核酸の回収率は、実施例１８と比べて半分以下に減少した。
【０１１２】
＜実施例１９＞
核酸の回収用担体に用いる金属酸化物として、ルチル型の酸化チタンを用いた以外は、実施例２と同様の条件および操作で核酸の回収を行った。結果を表３に示す。本結果から、金属酸化物としてルチル型酸化チタンを用いた場合も、リン酸系イオン液体を利用しない比較例６と比較して、高い収率で回収できることを確認した。
【０１１３】
＜比較例６＞
溶出液として０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７）を用いた以外は、実施例１９と同様の条件および操作で核酸の回収を行った。結果を表３に示す。イオン液体を含まない溶出液を用いた本比較例の核酸の回収率は、実施例１９と比べて半分以下に減少した。
【０１１４】
＜実施例２０＞
核酸の回収用担体に用いる金属酸化物として、酸化セリウムを用いた以外は、実施例２と同様の条件および操作で核酸の回収を行った。結果を表３に示す。本結果から、金属酸化物として酸化セリウムを用いた場合も、リン酸系イオン液体を利用しない比較例７と比較して、高い収率で回収できることを確認した。
【０１１５】
＜比較例７＞
溶出液に０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７）を用いた以外は、実施例２０と同様の条件および操作で核酸の回収を行った。結果を表３に示す。イオン液体を含まない溶出液を用いた本比較例の核酸の回収率は、実施例２０と比べて著しく減少した。
【０１１６】
＜実施例２１＞
核酸の回収用担体に用いる金属酸化物として、二酸化ジルコニウムを用いた以外は、実施例２と同様の条件および操作で核酸の回収を行った。結果を表３に示す。本結果から、金属酸化物として二酸化ジルコニウムを用いた場合も、リン酸系イオン液体を利用しない比較例８と比較して、高い収率で回収できることを確認した。
【０１１７】
＜比較例８＞
溶出液に０．５Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ＝７）を用いた以外は、実施例２１と同様の条件および操作で核酸の回収を行った。結果を表３に示す。イオン液体を含まない溶出液を用いた本比較例の核酸の回収率は、実施例２１と比べて著しく減少した。
【０１１８】
＜実施例２２＞
核酸の回収用担体に用いる金属酸化物として、酸化マグネシウムを用いた以外は、実施例２と同様の条件および操作で核酸の回収を行った。結果を表３に示す。本結果から、金属酸化物として酸化マグネシウムを用いた場合も、リン酸系イオン液体を利用しない比較例９と比較して、高い収率で回収できることを確認した。
【０１１９】
＜比較例９＞
溶出液に０．５Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ＝７）を用いた以外は、実施例２２と同様の条件および操作で核酸の回収を行った。結果を表３に示す。イオン液体を含まない溶出液を用いた本比較例の核酸の回収率は、実施例２２と比べて著しく減少した。
【０１２０】
＜実施例２３＞
核酸の回収用担体に用いる金属酸化物として、二酸化ケイ素を用いた以外は、実施例２と同様の条件および操作で核酸の回収を行った。結果を表３に示す。本結果から、金属酸化物として二酸化ケイ素を用いた場合もリン酸系イオン液体を利用しない比較例１０と比較して、高い収率で回収できることを確認した。
【０１２１】
＜比較例１０＞
溶出液に０．５Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ＝７）を用いた以外は、実施例２３と同様の条件および操作で核酸の回収を行った。結果を表３に示す。イオン液体を含まない溶出液を用いた本比較例の核酸の回収率は、実施例２３と比べて減少した。
【０１２２】
＜実施例２４＞
特許文献３に記載の核酸の回収方法を参考に、核酸の回収用担体に用いる金属酸化物として、酸化アルミニウムを選択し、水溶性の中性ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ、１０ｋＤａ）が吸着した酸化アルミニウムを核酸の回収用担体として使用し、核酸を含む試料から、核酸の回収を行った。
【０１２３】
酸化アルミニウムは、実施例１と同様の方法で処理し、以下の方法で、ＰＥＧが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体を作製した。最初に１．５ｍＬチューブに、１．０ｍｇの酸化アルミニウムを量り取った。続いて、１０ｗｔ％のポリエチレングリコール水溶液を１００μＬ加えて、ミキサーで３０分攪拌した。遠心（２００００Ｇ、１分）した後、上清を捨て、ポリエチレングリコールを表面に吸着させた酸化アルミニウム担体を得た。
【０１２４】
実施例４と同様にして、溶出液として、０．５Ｍリン酸ジエタノールアンモニウム（ｐＨ＝７）を用いて核酸の回収を行った。結果を表３に示す。本結果から、核酸の回収用担体として水溶性中性ポリマーを吸着させた酸化アルミニウムを用いた場合も、リン酸系イオン液体を利用しない比較例１１と比較して、高い収率で回収できることを確認した。
【０１２５】
＜比較例１１＞
溶出液に０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７）を用いた以外は、実施例２４と同様の条件および操作で核酸の回収を行った。結果を表３に示す。イオン液体を含まない溶出液を用いた本比較例の核酸の回収率は、実施例２４と比べて減少した。
【０１２６】
【表３】
2020058270.tif 000004
【０１２７】
＜実施例２５＞
核酸を含む試料として、核酸を含む血清を用いて核酸の回収を行った。核酸を含む液状試料として、３３．３ｐｍоｌのＲＮＡ−１が溶解したグアニジン水溶液（２５ｍＭ、ｐＨ＝７のＨＥＰＥＳ緩衝液中に、７Ｍになるようにグアニジンチオシアン酸塩を溶解させたもの）１００μＬとヒト血清５０μＬの混合溶液を用いた。溶出液には、イオン液体として０．５Ｍリン酸テトラブチルホスホニウムを含む溶出液（ｐＨ＝７）を実施例２と同様の方法で調製して用いた。
【０１２８】
１．５ｍＬチューブに酸化アルミニウム１．０ｍｇを計量し、上記核酸を含む液状試料を加え、３０分間ミキサーで攪拌した。遠心（２００００Ｇ、１分）して上清を捨て、ＨＥＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ＝７）を４００μＬ加えて、ボルテックスした後、遠心（２００００Ｇ、１分）して上清を捨てた。次に、０．５％ＳＤＳを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ＝７）を４００μＬ加えて、ボルテックスした後、遠心（２００００Ｇ、１分）して上清を捨てた。さらに、ＨＥＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ＝７）を４００μＬ加えて、ボルテックスした後、遠心（２００００Ｇ、１分）して上清を捨てた。その後、上記溶出液５０μＬを加え、ミキサーで１時間攪拌した。最後に、遠心機で遠心（２００００Ｇ、１分）して核酸溶液を回収した。核酸の回収率の算出は、実施例１と同様に行った。結果を表４に示す。
【０１２９】
核酸を含む試料として血清を用いた場合にも、核酸を高い収率で回収できることを確認した。
【０１３０】
＜実施例２６＞
実施例３と同様の方法で０．５Ｍリン酸テトラエチルアンモニウム（ｐＨ＝７）を調製して、溶出液として用いた以外は、実施例２５と同様の条件および操作で核酸の回収を行った。結果を表４に示す。実施例２５と同様に、核酸を高い収率で回収できることを確認した。
【０１３１】
＜実施例２７＞
実施例６と同様の方法で０．５Ｍリン酸ジイソプロパノールアンモニウム（ｐＨ＝７）を含む溶液を調製して溶出液として用いた以外は、実施例２５と同様の条件および操作で核酸の回収を行った。結果を表４に示す。実施例２５と同様に、核酸を含む試料として血清を用いた場合にも核酸を高い収率で回収できることを確認した。
【０１３２】
【表４】
2020058270.tif 000005
【０１３３】
＜まとめ＞
実施例1〜２７の結果から、金属酸化物製の担体を用いて核酸を回収する方法において、担体に吸着した核酸を溶出する際に、アニオン部分がリン酸系アニオンであるイオン液体を含む溶液を溶出液として用いることで、高い収率で核酸を回収できることがわかった。また、実施例１〜１６の結果から、溶出液として用いるリン酸系イオン液体の種類によらず、高い回収率で核酸を回収できることがわかった。実施例１７の結果から、本発明の方法によれば、核酸の種類によらず、高い回収率で核酸を回収できることがわかった。実施例１８〜２４の結果から、本発明の方法によれば、核酸回収用の担体として用いる金属酸化物の種類に限らず、高い回収率で核酸を回収できることがわかった。実施例２４の結果から、水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した金属酸化物製の担体を用いた場合においても、高い収率で核酸を回収できることがわかった。実施例２５〜２７の結果から、本発明の方法を用いれば、核酸を含む試料として血清を用いた場合にも高い回収率で核酸を回収できることがわかった。
【配列表】
2020058270000001.app