(57)【要約】      （修正有）【課題】菌、植物、植物細胞、組織及び種子に、殺虫活性を付与するための組成物及び方法の提供。【解決手段】Bacillus thuringiensis由来の毒素ポリペプチドのコード配列を含む組成物が提供される。コード配列は、植物及び細菌における形質転換及び発現のためのＤＮＡ構築物又は発現カセットに使用することができる。組成物はまた、形質転換した細菌、植物、植物細胞、組織及び種子も含む。特に、単離された毒素核酸分子が提供される。さらに、前記ポリヌクレオチドに対応するアミノ酸配列、及びこれらのアミノ酸配列に特異的に結合する抗体も包含される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
殺虫性活性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が、
ａ）配列番号１〜２０のいずれかに示されるヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号２１〜７４のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号２１〜７４のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択される、組換え核酸分子。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列が、植物における発現のために設計されている合成配列である、請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項３】
前記ヌクレオチド配列が、植物細胞における前記ヌクレオチド配列の発現を指令することができるプロモータに作動可能に連結している、請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項４】
請求項１に記載の組換え核酸分子を含む発現カセット。
【請求項５】
異種ポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項４に記載の発現カセット。
【請求項６】
請求項１に記載の組換え核酸を含む宿主細胞。
【請求項７】
細菌宿主細胞である、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
植物細胞である、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の宿主細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項１０】
前記植物が、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、キャベツ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科の植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、コメ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、オオムギ、及びナタネからなる群から選択される、請求項９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１１】
請求項１に記載の核酸分子を含むトランスジェニック植物。
【請求項１２】
ａ）配列番号２１〜７４のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ）配列番号２１〜７４のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、殺虫活性を有する組換えポリペプチド。
【請求項１３】
異種アミノ酸配列をさらに含む、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１２に記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項１５】
前記組成物が、粉末、粉塵、ペレット、顆粒、スプレー、乳濁剤、コロイド、溶液からなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物が、細菌細胞の培養物の乾燥、凍結乾燥、均質化、抽出、ろ過、遠心分離、沈降、又は濃縮により調製される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ポリペプチドの約１重量％〜約９９重量％を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
チョウ目、カメムシ目、甲虫目、線虫類、又はハエ目の害虫集団を防除する方法であって、前記集団を、殺虫有効量の請求項１２に記載のポリペプチドと接触させるステップを含む方法。
【請求項１９】
チョウ目、カメムシ目、甲虫目、線虫、又はハエ目の害虫を死滅させる方法であって、前記害虫を殺虫有効量の請求項１２に記載のポリペプチドと接触させる、または前記害虫に前記ポリペプチドを摂食させるステップを含む方法。
【請求項２０】
殺虫活性を有するポリペプチドを生成する方法であって、前記ポリペプチドをコードする核酸分子を発現させる条件下で、請求項６に記載の宿主細胞を培養するステップを含む方法。
【請求項２１】
殺虫性活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物をゲノムに安定に組み入れた植物又は植物細胞であって、前記ヌクレオチド配列が、
ａ）配列番号１〜２０のいずれかに示されるヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号２１〜７４のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；及び
ｃ）配列番号２１〜７４のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択される、植物又は植物細胞。
【請求項２２】
植物を害虫から保護する方法であって、植物又はその細胞において、殺虫性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させるステップを含み、前記ヌクレオチド配列が、
ａ）配列番号１〜２０のいずれかに示されるヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号２１〜７４のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；及び
ｃ）配列番号２１〜７４のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択される方法。
【請求項２３】
前記植物が、チョウ目、カメムシ目、甲虫目、線虫類、又はハエ目の害虫に対する殺虫活性を有する殺虫性ポリペプチドを産生する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
植物における収量を増加する方法であって、殺虫活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物をゲノムに安定に組み入れた植物又はその種子を畑で栽培するステップを含み、前記ヌクレオチド配列が、
ａ）配列番号１〜２０のいずれかに示されるヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号２１〜７４のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；及び
ｃ）配列番号２１〜７４のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択され、
前記畑が、前記ポリペプチドが殺虫活性を有する害虫に外寄生されている方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月７日に提出された米国仮特許出願第６１／７７４，１１０号明細書、並びに各々２０１３年３月８日に提出された米国仮特許出願第６１／７７４，６２７号明細書；同第６１／７７４，６２９号明細書；同第６１／７７４，６３５号明細書；同第６１／７７４，６３８号明細書；同第６１／７７４，６４２号明細書；同第６１／７７４，６４５号明細書；同第６１／７７４，６４７号明細書；同第６１／７７４，６５０号明細書；同第６１／７７４，６５５号明細書；及び同第６１／７７４，６５９号明細書の利益を主張する。尚、これらの文献の内容は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。
【０００２】
電子データにて提出した配列表の参照
配列表の公式コピーをＡＳＣＩＩフォーマット化配列表（ファイル名：「ＡＰＡ１３−６００８ＵＳ０１＿ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ」、２０１４年３月５日作成、サイズ：４１１キロバイト）としてＥＦＳ−Ｗｅｂにより電子データにて提出し、これを本明細書と一緒に提出する。このＡＳＣＩＩフォーマット化文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。
【０００３】
本発明は、分子生物学の分野に関する。殺虫性タンパク質をコードする新規遺伝子が提供される。これらのタンパク質及びそれらをコードする核酸配列は、殺虫性製剤の調製及び害虫抵抗性トランスジェニック植物の作製に有用である。
【背景技術】
【０００４】
バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）は、昆虫の特定の目及び種に対して特異的に有毒であるが、植物及び他の非標的生物には無害な結晶性封入体を産生するその能力によって特徴付けられる、グラム陽性胞子形成土壌細菌である。そのため、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）株又はその殺虫性タンパク質を含む組成物は、農業害虫又は、ヒト若しくは動物の様々な疾患を媒介する昆虫を防除するための環境的に許容される殺虫剤として使用することができる。
【０００５】
バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）由来の結晶（Ｃｒｙ）タンパク質（デルタ−エンドトキシン）は、主にチョウ目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）、カメムシ目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａｎ）、ハエ目（Ｄｉｐｔｅｒａｎ）、及び甲虫目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａｎ）の幼虫に対して強力な殺虫活性を有する。これらのタンパク質はまた、ハチ目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）、ヨコバイ亜目（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ）、シラミ目（Ｐｈｔｈｉｒａｐｔｅｒａ）、ハジラミ目（Ｍａｌｌｏｐｈａｇａ）、及びダニ（Ａｃａｒｉ）害虫目、並びに他の無脊椎動物目、例えば線形動物（Ｎｅｍａｔｈｅｌｍｉｎｔｈｅｓ）、扁形動物（Ｐｌａｔｙｈｅｌｍｉｎｔｈｅｓ）、及び有毛足虫（Ｓａｒｃｏｍａｓｔｉｇｏｒｐｈｏｒａ）などに対しても活性を示している（Ｆｅｉｔｅｌｓｏｎ（１９９３）Ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｆａｍｉｌｙ  ｔｒｅｅ．Ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）。これらのタンパク質は初め、主としてその殺虫活性に基づいて、ＣｒｙＩ〜ＣｒｙＶとして分類された。主要なクラスは、チョウ目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）特異的（Ｉ）、チョウ目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）及びハエ目（Ｄｉｐｔｅｒａ）特異的（ＩＩ）、甲虫目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）特異的（ＩＩＩ）、ハエ目（Ｄｉｐｔｅｒａ）特異的（ＩＶ）、並びに線虫（ｎｅｍａｔｏｄｅ）特異的（Ｖ）及び（ＶＩ）であった。タンパク質は、亜科にさらに分類され；それぞれの科の中で、より密接に関連するタンパク質は、Ｃｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃ、などの区分を示す文字が割り当てられた。それぞれの区分の中で、さらにより密接に関連するタンパク質は、Ｃｒｙ１Ｃ１、Ｃｒｙ１Ｃ２、などの名称が付与された。
【０００６】
昆虫標的特異性よりもむしろアミノ酸配列の相同性に基づいて、Ｃｒｙ遺伝子に関する命名法が記載されている（Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２：８０７−８１３）。この分類では、各毒素に、第１階級（アラビア数字１つ）、第２階級（大文字１つ）、第３階級（小文字１つ）、及び第４階級（別のアラビア数字１つ）を含む固有の名称が割り当てられている。第１階級のローマ数字は、アラビア数字に置き換えられている。４５％未満の配列同一性を有するタンパク質は、異なる第１階級を有し、第２及び第３階級についての基準は、それぞれ７８％及び９５％である。
【０００７】
結晶タンパク質は、昆虫の中腸に摂取され、そして可溶化されるまで殺虫活性を示さない。摂取されたプロトキシンは、昆虫の消化管でプロテアーゼにより加水分解されて、活性な毒性分子となる（Ｈｏｅｆｔｅ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅｌｅｙ（１９８９）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５３：２４２−２５５）。この毒素は、標的幼虫の中腸の頂端刷子縁の受容体に結合し、イオンチャンネル又は孔を形成しながら頂端膜に移入し、これによって幼虫の死をもたらす。
【０００８】
デルタ−エンドトキシンは、一般に、５つの保存配列ドメイン、及び３つの保存構造ドメインを有する（例えば、ｄｅ  Ｍａａｇｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １７：１９３−１９９参照）。第１の保存された構造ドメインは、７つのαヘリックスから成り、膜挿入及び孔形成に関与する。ドメインＩＩは、グリークキー（Ｇｒｅｅｋ  ｋｅｙ）立体配置に配置された３つのβシートから成り、そしてドメインＩＩＩは、「ゼリーロール」（ｊｅｌｌｙ−ｒｏｌｌ）構造の２つの逆平行βシートから成る（ｄｅ  Ｍａａｇｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、前掲）。ドメインＩＩ及びＩＩＩは、受容体の認識及び結合に関与しており、そのため、毒素特異性の決定因子と考えられる。
【０００９】
デルタ−エンドトキシン以外にも、殺虫性タンパク質毒素には、いくつかの他の公知のクラスがある。ＶＩＰ１／ＶＩＰ２毒素（例えば、米国特許第５，７７０，６９６号明細書）は、他のバイナリー（「Ａ／Ｂ」）毒素の作用機序と同様に、受容体依存性エンドサイトーシスとそれに続く細胞の被毒を含むと考えられる機序により、昆虫に対して強力な活性を示す、バイナリー殺虫性毒素である。ＶＩＰ、Ｃ２、ＣＤＴ、ＣＳＴ、又は炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）浮腫及び致死毒素などのＡ／Ｂ毒素は、単量体としての「Ｂ」成分の特異的な、受容体を介した結合を通して、標的細胞と最初に相互作用する。続いて、これらの単量体は、ホモヘプタマーを形成する。次に、「Ｂ］ヘプタマー−受容体複合体は、ドッキングプラットホームとして機能し、これは、後に酵素の「Ａ」成分と結合し、受容体依存性エンドサイトーシスを通して「Ａ」成分のサイトゾルへの移動を可能にする。細胞のサイトゾル内に進入すると、「Ａ」成分は、例えば、Ｇ−アクチンのＡＤＰ−リボシル化、又は環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の細胞内レベルの増加により、正常な細胞機能を阻害する。例えば、Ｂａｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ６８：３７３−４０２を参照されたい。
【００１０】
バチルス・チューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）をベースとする殺虫剤の過度の使用が、既にコナガ、プルテラ・キシロステラ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）（Ｆｅｒｒｅ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｒｉｅ（２００２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．４７：５０１−５３３）の野外個体群における抵抗性を引き起こしている。抵抗性の最も一般的な機序は、毒素と、その特異的中腸受容体との結合の減少である。これは、同じ受容体を共用する他の毒素にも交差耐性を付与し得る（Ｆｅｒｒｅ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｒｉｅ（２００２））。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
昆虫がもたらし得る壊滅、そして害虫を防除することによる収量の向上のために、新規形態の殺虫性毒素をみいだすことが引き続き求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
細菌、植物、植物細胞、組織及び種子に、殺虫活性を付与するための組成物及び方法が提供される。組成物は、殺虫性及び殺昆虫性ポリペプチドの配列をコードする核酸分子、そのような核酸分子を含むベクター、及び前記ベクターを含む宿主細胞を含む。組成物はまた、殺虫性ポリペプチド配列、及びそのようなポリペプチドに対する抗体も含む。ヌクレオチド配列は、生物（微生物及び植物を含む）における形質転換及び発現のためのＤＮＡ構築物又は発現カセットに使用することができる。ヌクレオチド又はアミノ酸配列は、生物（微生物又は植物を含むが、これらに限定されるわけではない）における発現のために設計された合成配列であってもよい。さらに、組成物は、本発明のヌクレオチド配列を含有する細菌、植物、植物細胞、組織及び種子も含む。
【００１３】
特に、殺虫性タンパク質をコードする単離又は組換え核酸分子が提供される。さらに、殺虫性タンパク質に対応するアミノ酸配列も包含される。特に、本発明は、配列番号２１〜７４に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又は配列番号１〜２０に示されるヌクレオチド配列、並びにそれらの生物学的に活性な変異体及び断片を含む、単離又は組換え核酸分子を提供する。本発明のヌクレオチド配列に相補的であるか、又は本発明の配列若しくはその相補体とハイブリダイズするヌクレオチド配列も包含される。さらに、本発明のヌクレオチド配列、又は本発明のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、並びにそれらの生物学的に活性な変異体及び断片を含む、ベクター、宿主細胞、植物、及び種子も提供される。
【００１４】
本発明のポリペプチドを作製する方法、並びに、チョウ目（ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）、カメムシ目（ｈｅｍｉｐｔｅｒａｎ）、甲虫目（ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａｎ）、線虫（ｎｅｍａｔｏｄｅ）、又はハエ目（ｄｉｐｔｅｒａｎ）の害虫を防除又は死滅させるためにこれらのポリペプチドを使用する方法も提供される。また、サンプル中の本発明の核酸ポリペプチドを検出する方法及びキットも含まれる。
【００１５】
本発明の組成物及び方法は、増強された害虫抵抗性又は耐性を有する生物の作製に有用である。これらの生物及び該生物を含む組成物は、農業上の目的のために望ましい。本発明の組成物はまた、殺虫活性を有する改変又は改良タンパク質を作製する上で、又は産物もしくは生物中の殺虫性タンパク質又は核酸の存在を検出する上で有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、生物、特に植物又は植物細胞において、害虫抵抗性又は耐性を制御するための組成物及び方法に関する。「抵抗性」とは、本発明のポリペプチドの摂取、あるいは、それ以外の接触時に、害虫（例えば、昆虫）を死滅させることを意味する。「耐性」とは、害虫の移動、摂食、生殖、又はその他の機能の障害又は抑制を意味する。本方法は、本発明の殺虫性タンパク質をコードするヌクレオチド配列で生物を形質転換することを含む。特に、本発明のヌクレオチド配列は、殺虫活性を有する植物及び微生物を調製するのに有用である。従って、形質転換された細菌、植物、植物細胞、植物組織及び種子が提供される。組成物は、バチルス属（ｂａｃｉｌｌｕｓ）又は他の種の殺虫性核酸及びタンパク質である。前記配列は、目的とする生物への後の形質転換のための発現ベクターの構築に、他の相同性（又は部分的相同性）遺伝子の単離のためのプローブとして、並びに、例えば、エンドトキシンのＣｒｙ１、Ｃｒｙ２及びＣｒｙ９ファミリーのメンバーを用いて、ドメインスワッピング又はＤＮＡシャッフリングなどの当技術分野で公知の方法による改変殺虫性タンパク質の作製のために用いられる。前記タンパク質は、チョウ目、カメムシ目、甲虫目、ハエ目、及び線虫の害虫集団を防除するか又は死滅させるために、並びに殺虫活性を有する組成物を作製するために用いられる。
【００１７】
「殺虫性毒素」又は「殺虫性タンパク質」は、限定するものではないが、チョウ目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）、ハエ目（Ｄｉｐｔｅｒａ）、及び甲虫（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）目、又は線虫（ｎｅｍａｔｏｄｅ）門のメンバーなどの１種又は複数の害虫に対して毒性活性を有する毒素、あるいは、このようなタンパク質に対して相同性を有するタンパク質を意味する。殺虫性タンパク質は、例えば、バチルス属（ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、クロストリジウム・ビファーメタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）及びパエニバチルス・ポリピアエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）などの生物から単離されている。殺虫性タンパク質は、本明細書に開示する完全長ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列、及び、別の下流の開始部位の使用か、又は殺虫活性を有するより短いタンパク質を産生するプロセシングのいずれかの理由で、完全長配列よりも短いアミノ酸配列を含む。プロセシングは、タンパク質が発現される生物において、又はタンパク質の摂取後に害虫において起こり得る。
【００１８】
殺虫性タンパク質は、デルタ−エンドトキシンを包含する。デルタ−エンドトキシンは、ｃｒｙ１からｃｒｙ７２、ｃｙｔ１及びｃｙｔ２、並びにＣｙｔ様毒素として同定されたタンパク質を含む。現在、多様な特異性及び毒性を有する２５０を超える公知の種のデルタエンドトキシンが存在する。包括的一覧については、Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２：８０７−８１３を参照し、定期的更新については、ｗｗｗ．ｂｉｏｌｓ．ｓｕｓｘ．ａｃ．ｕｋ／Ｈｏｍｅ／Ｎｅｉｌ＿Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ／Ｂｔ／ｉｎｄｅｘのＣｒｉｃｋｍｏｒｅ  ｅｔ
ａｌ．（２００３）“Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｔｏｘｉｎ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，”を参照されたい。
【００１９】
従って、本明細書では、殺虫活性を付与する新規の単離又は組換えヌクレオチド配列が提供される。これらの配列は、デルタ−エンドトキシンタンパク質又はバイナリー毒素と相同性を有するポリペプチドをコードする。また、殺虫性タンパク質のアミノ酸配列も提供される。この遺伝子の翻訳から生じたタンパク質は、細胞が、それを摂取した害虫を防除するか、又は死滅させることを可能にする。
【００２０】
核酸分子、並びにその変異体及び断片
本発明の１つの態様は、殺虫性タンパク質及びポリペプチド又はその生物学的に活性な部分をコードするヌクレオチド配列を含む単離又は組換え核酸分子、並びに、配列相同性の領域を有するタンパク質をコードする核酸を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分な核酸分子に関する。また、本明細書に定義するストリンジェントな条件下で、本発明のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列も包含される。本明細書で用いるように、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、組換えＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）並びにヌクレオチド類似体を使用して作製したＤＮＡ又はＲＮＡの類似体を含むものとする。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖のどちらであってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。用語「組換え（体）」は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、（例えば、化学組成若しくは構造において）天然に存在するものとは異なるように、ネイティブポリヌクレオチド又はポリペプチドに対して、操作されたポリヌクレオチド又はポリペプチドを包含する。別の実施形態では、「組換え」ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて天然に存在する内部配列（すなわち、イントロン）を含まない。こうしたポリヌクレオチドの典型的な例は、いわゆる相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）である。
【００２１】
単離又は組換え核酸（若しくはＤＮＡ）は、本明細書において、その自然の環境にはもはや存在せず、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで又は組換え細菌若しくは植物宿主細胞に存在する核酸（又はＤＮＡ）を指すために用いられる。一部の実施形態では、単離又は組換え核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて、該核酸に天然にフランキングしている配列（好ましくは、タンパク質をコードする配列）（すなわち、核酸の５’及び３’末端に位置する配列）を含まない。本発明の目的のために、「単離（された）」は、核酸分子を指すのに用いられる場合、単離染色体を除外する。例えば、様々な実施態様において、単離されたデルタ−エンドトキシンをコードする核酸分子は、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいて、該核酸分子に天然にフランキングしている約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、又は０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含み得る。様々な実施形態において、細胞材料を実質的に含まないデルタ−エンドトキシンタンパク質は、約３０％、２０％、１０％、又は５％（乾燥重量）未満の非デルタ−エンドトキシンタンパク質（本明細書において「混入タンパク質」とも呼ばれる）を有するタンパク質の調製物を含む。
【００２２】
本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１〜２０に示される配列、並びにその変異体、断片及び相補体を含む。「相補体」とは、所与のヌクレオチド配列にハイブリダイズして、これにより安定な二本鎖を形成できるように、所与のヌクレオチド配列に対して十分に相補性であるヌクレオチド配列を意味する。これらのヌクレオチド配列によってコードされる殺虫性タンパク質の対応するアミノ酸配列は、配列番号２１〜７４に示される。
【００２３】
殺虫性タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列の断片である核酸分子も本発明に包含される。「断片」とは、殺虫性タンパク質をコードするヌクレオチド配列の部分を意味する。ヌクレオチド配列の断片は、殺虫性タンパク質の生物学的に活性な部分をコードし得るものか、あるいは、以下に開示する方法を用いてハイブリダイゼーションプローブ又はＰＣＲプライマーとして使用できる断片であってもよい。殺虫性タンパク質をコードするヌクレオチド配列の断片である核酸分子は、意図する用途に応じて、少なくとも約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１３５０、１４００の連続ヌクレオチド、又は本明細書に開示する殺虫性タンパク質をコードする完全長ヌクレオチド配列に存在するヌクレオチド数までを含む。「連続」ヌクレオチドとは、互いに隣接しているヌクレオチド残基を意味する。本発明のヌクレオチド配列の断片は、殺虫性タンパク質の生物活性を保持しているため、殺虫活性を保持するタンパク質断片をコードする。従って、本明細書に開示する生物学的に活性な断片も包含される。「活性を保持する」とは、断片が、殺虫性タンパク質の殺虫活性の少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上を有することを意味する。一実施形態では、殺虫活性は、甲虫目殺虫活性である。別の実施形態では、殺虫活性は、チョウ目殺虫活性である。別の実施形態では、殺虫活性は、線虫類殺虫活性である。別の実施形態では、殺虫活性は、ハエ目殺虫活性である。別の実施形態では、殺虫活性は、カメムシ目殺虫活性である。殺虫活性を測定するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、Ｃｚａｐｌａ  ａｎｄ  Ｌａｎｇ（１９９０）Ｊ．Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．８３：２４８０−２４８５；Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５２：１９９−２０６；Ｍａｒｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．ｏｆ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ
Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ  ７８：２９０−２９３；及び米国特許第５，７４３，４７７号明細書を参照されたい。尚、これらは全て、その全体を参照により本明細書に組みこむものとする。
【００２４】
本発明のタンパク質の生物学的に活性な部分をコードする殺虫性タンパク質コードヌクレオチド配列の断片は、少なくとも約１５、２５、３０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００の連続アミノ酸、又は本発明の完全長殺虫性タンパク質に存在するアミノ酸の総数までをコードし得る。一部の実施形態では、断片は、タンパク質分解性の切断断片である。例えば、タンパク質分解性の切断断片は、配列番号２１〜７４に関して、少なくとも約１００のアミノ酸、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、若しくは約１６０のアミノ酸のＮ末端又はＣ末端の欠損を有していてもよい。一部の実施形態では、本発明に包含される断片は、例えば、タンパク質分解又はコード配列への停止コドンの挿入による、Ｃ末端結晶化ドメインの除去によって得られる。例えば、配列番号２５、２６、３９〜４５、４９〜５１、５８、６３〜６４、６６、６８、及び７２〜７４に示される切断型アミノ酸配列を参照されたい。切断部位は、配列番号２５、２６、３９〜４５、４９〜５１、５８、６３〜６４、６６、６８、又は７２〜７４の末端により表される切断部位のいずれかの側で、（対応する完全長配列と比較して）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又はそれ以上のアミノ酸だけ変動し得ることとは理解されよう。
【００２５】
本発明の好ましい殺虫性タンパク質は、配列番号１〜２０のヌクレオチド配列に十分に同一であるヌクレオチド配列によってコードされるか、又は殺虫性タンパク質は、配列番号２１〜７４に示されるアミノ酸と十分に同一である。「十分に同一」とは、本明細書に記載するアラインメントプログラムの１つを使用して、標準的なパラメーターを用いて参照配列と比較した場合に、少なくとも約６０％又は６５％の配列同一性、約７０％又は７５％の配列同一性、約８０％又は８５％の配列同一性、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸又はヌクレオチド配列を意味する。当業者であれば、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置などを考慮することにより、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために、これらの数値を適切に調節できることを認識されよう。
【００２６】
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸の同一性（％）を決定するために、配列を最適に比較する目的でアラインメントする。２つの配列間の同一性（％）は、両配列が共通に有する同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性（％）＝同一の位置の数／位置の総数（例えば重複位置）×１００）。一実施形態において、２つの配列は同じ長さである。別の実施形態では、同一性（％）は、参照配列（例えば、配列番号１〜７４のいずれかとして本明細書に開示する配列）の全長にわたって計算する。２つの配列間の同一性（％）は、許容できるギャップを含む、又は含まない、以下に記載のものと同様の技術を使用して決定することができる。典型的には、同一性（％）の算出に際し、完全な一致を計数する。ギャップ、すなわち、ある残基が、一方の配列には存在するが、他方には存在しないアラインメント内の位置を、非同一残基を有する位置としてみなす。
【００２７】
２つの配列間の同一性（％）の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列の比較に使用した数学的アルゴリズムの非制限的な例としては、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７にあるように改変された、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸプログラムに組み込まれている。本発明の殺虫性物質様核酸分子と相同性のヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて、ＢＬＡＳＴヌクレオチド探索を実施することができる。本発明の殺虫性タンパク質分子と相同性のアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて、ＢＬＡＳＴタンパク質探索を実施することができる。比較を目的とするギャップ付きアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９に記載されているように、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０中の）を用いることができる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを用いて、分子間の距離関係を検出する反復探索を実施することもできる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）前掲を参照されたい。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＸ及びＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトパラメーターを用いることができる。アラインメントはまた、検査によって手動で行ってもよい。
【００２８】
配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの別の非制限的な例は、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムである（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０）。ＣｌｕｓｔａｌＷは、配列を比較して、アミノ酸又はＤＮＡ配列の全長をアラインメントし、このようにして、全アミノ酸配列の配列保存についてのデータを取得することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムは、いくつかの市販されているＤＮＡ／アミノ酸解析ソフトウェアパッケージ、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のＡＬＩＧＮＸモジュールで使用されている。ＣｌｕｓｔａｌＷを用いてアミノ酸配列をアラインメントした後、アミノ酸同一性（％）を評価することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントの解析に有用なソフトウェアプログラムの非制限的例としては、ＧＥＮＥＤＯＣ（商標）がある。ＧＥＮＥＤＯＣ（商標）（Ｋａｒｌ  Ｎｉｃｈｏｌａｓ）は、複数のタンパク質同士のアミノ酸（又はＤＮＡ）類似性及び同一性の評価を可能にする。配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの別の非制限的な例としては、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ
４：１１−１７のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｄ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡから市販されている）の一部である、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを使用する場合には、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティー：１２、及びギャップペナルティー：４を用いることができる。
【００２９】
特に記載のない限り、配列同一性又は類似性を決定するために、以下のパラメーターを用いて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８（３）：４４３−４５３のアルゴリズムを用いたＧＡＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０を使用する：ヌクレオチド配列の同一性（％）及び類似性（％）については、ギャップウェイト（ＧＡＰ  Ｗｅｉｇｈｔ）：５０及びレングスウェイト（Ｌｅｎｇｔｈ  Ｗｅｉｇｈｔ）：３、並びにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリング・マトリックスを用い；アミノ酸配列の同一性（％）又は類似性（％）については、ギャップウェイト：８及びレングスウェイト：２、並びにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングプログラムを用いる。また、等価なプログラムを用いてもよい。「等価なプログラム」とは、ＧＡＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０によって生成された対応するアラインメントと比較したとき、同一のヌクレオチド残基の一致及び同一の配列同一性（％）を有するアラインメントを、対象となる任意の２つの配列について、生成する任意の配列比較プログラムを意味する。
【００３０】
本発明はまた、変異体核酸分子も包含する。殺虫性タンパク質をコードするヌクレオチド配列の「変異体」は、本明細書に開示した殺虫性タンパク質をコードするが、遺伝子コードの縮重のために保存的に異なる配列、並びに、前述したように十分に同一な配列を含む。天然に存在する対立遺伝子変異体は、周知の分子生物学技術、例えば、以下に概説するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びハイブリダイゼーション技術を用いることによって同定することができる。また、変異体ヌクレオチド配列は、合成により得られたヌクレオチド配列も含み、これらは、例えば、部位特異的突然変異誘発によって作製されているが、以下に述べるような本発明に開示する殺虫性タンパク質を依然としてコードする。本発明に包含される変異体タンパク質は、生物学的に活性であり、すなわち、ネイティブタンパク質の要望される生物活性、すなわち、殺虫活性を引き続き有している。「活性を保持する」とは、変異体が、ネイティブタンパク質の殺虫活性の少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％を有することを意味する。殺虫活性を測定するための方法は、当分野において公知である。例えば、Ｃｚａｐｌａ
ａｎｄ  Ｌａｎｇ（１９９０）Ｊ．Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．８３：２４８０−２４８５；Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５２：１９９−２０６；Ｍａｒｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．ｏｆ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ  ７８：２９０−２９３；並びに米国特許第５，７４３，４７７号明細書を参照されたい。尚、これらは全て、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。
【００３１】
当業者はさらに、本発明のヌクレオチド配列の突然変異によって変化を導入することができ、これにより、タンパク質の生物学的活性を変えることなく、コードされる殺虫性タンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらし得ることも理解されよう。従って、１つ又は複数のアミノ酸置換、付加又は欠失が、コードされるタンパク質に導入されるように、１つ又は複数のヌクレオチド置換、付加、又は欠失を本明細書に開示の対応するヌクレオチド配列に導入することによって、単離核酸分子の変異体を作出することができる。突然変異は、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ介在突然変異誘発などの標準的な技術によって導入することができる。このような変異体ヌクレオチド配列も本発明に包含される。
【００３２】
例えば、保存的アミノ酸置換は、１つ又は複数の予測される非必須アミノ酸残基に実施してもよい。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を変化させることなく、殺虫性タンパク質の野生型配列から改変することができる残基であるのに対し、「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要とされる残基である。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。
【００３３】
デルタ−エンドトキシンは、一般に、５つの保存配列ドメインと、３つの保存構造ドメインとを有する（例えば、ｄｅ  Ｍａａｇｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １７：１９３−１９９を参照）。第１の保存構造ドメインは、７つのαヘリックスから構成され、膜挿入及び孔形成に関与する。ドメインＩＩは、グリークキー立体配置に配置された３つのβシートから構成され、ドメインＩＩＩは、「ゼリーロール（ｊｅｌｌｙ−ｒｏｌｌ）」構造の２つの逆平行のβシートから構成される（ｄｅ  Ｍａａｇｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、前掲）。ドメインＩＩ及びＩＩＩは、受容体の認識及び受容体との結合に関与することから、毒素特異性の決定因子と考えられている。
【００３４】
アミノ酸置換は、機能を保持する非保存領域中で実施してもよい。一般に、このような置換は、残基が、タンパク質の活性に必須である、保存アミノ酸残基、又は保存モチーフ内に常在するアミノ酸残基に対しては行なわれない。保存され、しかもタンパク質活性に必須であると考えられる残基の例としては、例えば、類似又は関連毒素と本発明の配列とのアラインメントに含まれる全てのタンパク質の間で同一の残基（例えば、相同性タンパク質のアラインメントにおいて同一の残基）がある。保存されているが、保存的アミノ酸置換が可能であり、依然として活性を保持し得る残基の例としては、例えば、類似又は関連毒素と本発明の配列とのアラインメントに含まれる全てのタンパク質の間で保存的置換のみを有する残基（例えば、相同性タンパク質のアラインメントに含まれる全てのタンパク質の間で保存的置換のみを有する残基で同一の残基）がある。しかし、当業者であれば、機能的変異体が、保存残基においてわずかな保存された変化又は非保存の変化を有し得ることは理解されよう。
【００３５】
あるいは、変異体ヌクレオチド配列は、飽和突然変異誘発などにより、コード配列の全部又は一部に沿って無作為に突然変異を導入することによって作製することもでき、得られた突然変異体を、それが殺虫活性を付与する能力についてスクリーニングすることにより、活性を保持する突然変異体を同定することができる。突然変異誘発後、コードされたタンパク質を組換えにより発現させることができ、タンパク質の活性を標準的なアッセイ技術を用いて決定することができる。
【００３６】
ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどの方法を用いて、対応すると思われる殺虫性配列を同定することができるが、このような配列は、本発明の配列と実質的な同一性（例えば、参照配列の全長にわたって少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の配列同一性）を有すると共に、殺虫活性を有するか、又は付与する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）及びＩｎｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）を参照されたい。
【００３７】
ハイブリダイゼーション法において、殺虫性ヌクレオチド配列の全部又は一部を用いて、ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。このようなｃＤＮＡ及びゲノムライブラリーの構築方法は、一般に当技術分野において公知であり、また、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１、前掲に開示されている。いわゆるハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、又はその他のオリゴヌクレオチドであってよく、３２Ｐなどの検出可能な基、又は、他の放射性同位体、蛍光化合物、酵素、若しくは酵素補因子などの任意の他の検出可能なマーカを用いて、標識してもよい。ハイブリダイゼーション用のプローブを、本明細書に開示する公知の殺虫性タンパク質コードヌクレオチド配列に基づいて合成オリゴヌクレオチドを標識することにより作製することができる。加えて、ヌクレオチド配列又はコードされたアミノ酸配列における保存ヌクレオチド若しくはアミノ酸残基に基づいて設計された変性プライマーを使用することもできる。プローブは、典型的には、本発明の殺虫性タンパク質をコードするヌクレオチド配列又はその断片若しくは変異体の少なくとも約１２、少なくとも約２５、少なくとも約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、又は２５０の連続ヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。ハイブリダイゼーション用プローブを調製するための方法は、一般に当分野において公知であり、また、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１、前掲（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【００３８】
例えば、本明細書に開示する全殺虫性配列、又はその１つ又は複数の部分を、対応する殺虫性タンパク質様配列及びメッセンジャーＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることができるプローブとして用いてもよい。様々な条件下で特異的なハイブリダイゼーションを達成するために、このようなプローブは、ユニークであると共に、好ましくは長さが少なくとも約１０ヌクレオチド、又は長さが少なくとも約２０ヌクレオチドの配列を含む。このようなプローブを用いて、ＰＣＲにより選択した生物又はサンプルから、対応する殺虫性配列を増幅することができる。この技術は、対象の生物から、さらに別のコード配列を単離するために、又は生物中のコード配列の存在を決定するための診断アッセイとして用いることもできる。ハイブリダイゼーション技術は、プレーティングしたＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングを含む（プラーク又はコロニーのいずれか；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）。
【００３９】
従って、本発明は、ハイブリダイゼーション用のプローブ、並びに本発明のヌクレオチド配列の全部又は一部（少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約４００、少なくとも約５００、１０００、１２００、１５００、２０００、３０００、３５００、又は本明細書に開示するヌクレオチドの完全長まで）とのハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド配列を包含する。このような配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実施してよい。「ストリンジェントな条件」又は「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブが、その標的配列に、検出可能に、その他の配列より強度に（例えば、少なくともバックグラウンドの２倍）ハイブリダイズする条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、かつ、様々な状況において異なり得る。ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件のストリンジェンシーを制御することによって、プローブと１００％相補的な標的配列を同定することができる（相同性プロービング）。あるいは、より低い程度の類似性が検出されるように、ストリンジェンシー条件を調整して配列中にいくらかのミスマッチを許容することもできる（異種プロービング）。一般に、プローブは、長さが約１０００ヌクレオチド未満であり、好ましくは長さが５００ヌクレオチド未満である。
【００４０】
典型的には、ストリンジェントな条件とは、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３において約１．５Ｍ未満のＮａイオン、典型的には約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（又はその他の塩）であり、かつ、温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、また長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチド超）については少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成され得る。低ストリンジェンシー条件の例としては、３０〜３５％のホルムアミドのバッファー溶液、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を用いた３７℃でのハイブリダイゼーション、及び１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）による５０〜５５℃での洗浄が挙げられる。中程度ストリンジェンシー条件の例としては、４０〜４５％のホルムアミド、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳにおける３７℃でのハイブリダイゼーション、及び０．５×〜１×ＳＳＣによる５５〜６０℃での洗浄が挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例としては、５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳにおいて３７℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣによる６０〜６５℃での洗浄が挙げられる。任意選択で、洗浄バッファーは、約０．１％〜約１％ＳＤＳを含んでもよい。ハイブリダイゼーションの期間は、一般に、約２４時間未満、通常約４〜約１２時間である。
【００４１】
特異性は、典型的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、重要な因子は、最終洗浄溶液のイオン強度及び温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの場合、Ｔｍは、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４の式：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ  Ｍ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ（式中、Ｍは、一価のカチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシン及びシトシンヌクレオチドの割合（％）であり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合（％）であり、Ｌは、塩基対中のハイブリッドの長さである）から概算することができる。Ｔｍは、（規定のイオン強度及びｐＨ下で）相補的標的配列の５０％が、完全に一致したプローブとハイブリダイズする温度である。Ｔｍは、１％のミスマッチにつき約１℃低下する；従って、要望される同一性の配列とハイブリダイズするように、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、及び／又は洗浄条件を調整することができる。例えば、≧９０％の同一性を有する配列が求められる場合、Ｔｍを１０℃減少させることができる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度及びｐＨで、特異的配列及びその相補体の熱融解温度（ｔｈｅｒｍａｌ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。
しかし、極めてストリンジェントな条件は、熱融解温度（Ｔｍ）よりも１、２、３、若しくは４℃低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を使用することができ；中程度にストリンジェントな条件は、熱融解温度（Ｔｍ）よりも６、７、８、９、若しくは１０℃低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を使用することができ；低ストリンジェンシー条件は、熱融解温度（Ｔｍ）よりも１１、１２、１３、１４、１５、若しくは２０℃低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を使用することができる。式、ハイブリダイゼーション及び洗浄組成、並びに要望されるＴｍを用いることで、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄溶液のストリンジェンシーの変動が本質的に説明されることを当業者は理解するだろう。要望されるミスマッチの程度により、Ｔｍが４５℃（水溶液）又は３２℃（ホルムアミド溶液）を下回る場合、より高い温度を使用できるようにＳＳＣ濃度を増加することが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに対する詳細な指針は、以下：Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）にみいだされる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【００４２】
単離タンパク質並びにその変異体及び断片
殺虫性タンパク質もまた本発明に包含される。「殺虫性タンパク質」とは、配列番号２１〜７４に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。また、その断片、生物学的に活性な部分、及び変異体も提供され、本発明の方法を実施するために用いることができる。「組換えタンパク質」又は「組換えポリペプチド」は、その自然の環境にはもはや存在せず、組換えタンパク質又は組換えポリペプチドが、天然に存在するものとは（例えば、化学組成若しくは構造が）異なるように、ネイティブタンパク質に対して操作されたタンパク質を指すために用いられる。
【００４３】
「断片」又は「生物学的に活性な部分」は、配列番号２１〜７４に示されるアミノ酸配列と十分に同一なアミノ酸配列を含み、しかも殺虫活性を示すポリペプチド断片を含む。
殺虫性タンパク質の生物学的に活性な部分は、長さが、例えば、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、又はそれ以上のアミノ酸であるポリペプチドであってよい。このような生物学的に活性な部分は、組換え技術によって調製することができ、また、殺虫活性について評価することができる。殺虫活性を測定するための方法は、当分野においてよく知られている。例えば、Ｃｚａｐｌａ  ａｎｄ  Ｌａｎｇ（１９９０）Ｊ．Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．８３：２４８０−２４８５；Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５２：１９９−２０６；Ｍａｒｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．ｏｆ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ  ７８：２９０−２９３；及び米国特許第５，７４３，４７７号明細書を参照されたい。尚、これらの文献は全て、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。本明細書で用いられるように、断片は、配列番号２１〜７４の少なくとも８つ連続したアミノ酸を含む。しかし、本発明は、それ以外の断片、例えば前記タンパク質中の、長さ約１０、２０、３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、又はそれ以上のアミノ酸の任意の断片も包含する。
【００４４】
「変異体」とは、配列番号２１〜７４のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも約６０％、６５％、約７０％、７５％、約８０％、８５％、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質又はポリペプチドを意味する。変異体はまた、ストリンジェントな条件下で、配列番号１〜２０の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子又はその相補体によってコードされるポリペプチドを含む。変異体は、突然変異誘発によりアミノ酸配列が異なるポリペプチドを含む。本発明によって包含される変異体タンパク質は、生物学的に活性であり、すなわち、ネイティブタンパク質の要望される生物活性を引き続き有し、すなわち、殺虫活性を保持している。殺虫活性を測定するための方法は、当分野において公知である。
例えば、Ｃｚａｐｌａ  ａｎｄ  Ｌａｎｇ（１９９０）Ｊ．Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．８３：２４８０−２４８５；Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５２：１９９−２０６；Ｍａｒｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．ｏｆ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ  ７８：２９０−２９３；及び米国特許第５，７４３，４７７号明細書を参照されたい。尚、これらの文献は全て、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。
【００４５】
細菌遺伝子、例えば、本発明のａｘｍｉ遺伝子は、オープンリーディングフレームの開始点に近接して複数のメチオニン開始コドンを有することが極めて多い。往々にして、１つ又は複数のこれらの開始コドンからの翻訳開始により、機能性タンパク質の生成がもたらされ得る。これらの開始コドンは、ＡＴＧコドンを含んでもよい。しかし、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）などの細菌は、開始コドンとしてコドンＧＴＧも認識し、ＧＴＧコドンから翻訳を開始するタンパク質は、最初のアミノ酸としてメチオニンを含む。稀に、細菌系での翻訳は、ＴＴＧコドンを開始することができるが、このイベントにおいて、ＴＴＧは、メチオニンをコードする。さらに、細菌において、これらのコドンのどれが天然に使用されているのか先験的に決定されることは少ない。従って、別のメチオニンコドンのうちの１つを使用しても、殺虫性タンパク質の生成が達成され得ることが理解される。これらの殺虫性タンパク質は、本発明に包含され、本発明の方法で用いることができる。植物に発現させるとき、適正な翻訳のために、別の開始コドンをＡＴＧに改変する必要があることは理解されよう。
【００４６】
本発明の様々な実施形態において、殺虫性タンパク質は、本明細書に開示する完全長ヌクレオチドから推定されるアミノ酸配列、及び別の下流の開始部位の使用によって、完全長配列よりも短いアミノ酸配列を含む。従って、本発明のヌクレオチド配列並びに／又は本発明のヌクレオチド配列を含むベクター、宿主細胞、及び植物（並びに本発明のヌクレオチド配列を作製及び使用する方法）は、表１に記載するアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【００４７】
本発明のポリペプチド、又はその変異体もしくは断片に対する抗体もまた包含される。
抗体を作製するための方法は、当分野において公知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；米国特許第４，１９６，２６５号明細書を参照）。
【００４８】
従って、本発明の一態様は、本発明のタンパク質又はペプチド分子及びその相同体、融合物若しくは断片の１つ又は複数に特異的に結合する抗体、一本鎖抗原結合分子、又はその他のタンパク質に関する。特に好ましい実施形態では、抗体は、配列番号２１〜７４に記載されるアミノ酸配列又はその断片を有するタンパク質と特異的に結合する。別の実施形態では、抗体は、配列番号２１〜７４に記載されるアミノ酸配列又はその断片から選択されるアミノ酸配列を含む融合タンパク質と特異的に結合する。
【００４９】
本発明の抗体を用いて、本発明のタンパク質又はペプチド分子を定量的又は定性的に検出するか、又は本発明のタンパク質の翻訳後修飾を検出することができる。本明細書で用いられるように、結合が、非関連分子の存在によって競合的に阻害されていなければ、抗体又はペプチドは、本発明のタンパク質又はペプチド分子と「特異的に結合する」と言う。
【００５０】
本発明の抗体は、本発明のタンパク質又はペプチド分子の検出に有用なキット内に収容してもよい。本発明はさらに、本発明のタンパク質又はペプチド分子（特に、配列番号２１〜７４に示されるアミノ酸配列によりコードされるタンパク質、本発明の抗体と特異的に結合することができるその変異体又は断片を含む）を検出する方法も含み、この方法は、本発明の抗体とサンプルを接触させるステップと、該サンプルが、本発明のタンパク質又はペプチド分子を含有するかどうかを決定するステップを含む。目的のタンパク質又はペプチド分子の検出のために抗体を使用する方法は、当分野では公知である。
【００５１】
改変又は改良された変異体
殺虫性タンパク質のＤＮＡ配列は、様々な方法によって改変することができること、また、これらの改変により、本発明の殺虫性タンパク質によってコードされるものとは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列が生じ得ることは認識されよう。このタンパク質は、配列番号２１〜７４の１つ又は複数のアミノ酸のアミノ酸置換、欠失、切断短縮、及び挿入（最大約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、約１２５、約１３０、約１３５、約１４０、約１４５、約１５０、約１５５、又はそれ以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含む）を含む様々な方法で改変され得る。このような操作のための方法は当分野において一般に公知である。例えば、殺虫性タンパク質のアミノ酸配列変異体は、ＤＮＡ中の突然変異によって調製することができる。これはまた、突然変異誘発及び／又は指向性進化でのいくつかの形態の１つによって達成され得る。一部の態様では、アミノ酸配列中でコードされる変化は、タンパク質の機能に実質的に影響を及ぼさない。このような変異体は、要望される殺虫活性を有する。しかし、殺虫活性を付与する殺虫性タンパク質の能力が、本発明の組成物にこのような技術を用いることによって改善され得ることは理解されよう。例えば、ＸＬ−１Ｒｅｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のように、ＤＮＡ複製中に高い割合の塩基の誤取り込みを示す宿主細胞において、殺虫性タンパク質を発現することができる。このような株での増殖後、ＤＮＡを単離し（例えば、プラスミドＤＮＡを調製することによって、又はＰＣＲにより増幅し、得られたＰＣＲ断片をベクターにクローニングすることによって）、非突然変異誘発株において殺虫性タンパク質突然変異体を培養した後、例えば、殺虫活性について試験するためのアッセイを実施することによって、殺虫活性を有する突然変異遺伝子を同定することができる。一般に、タンパク質は、混合した後、摂食アッセイで使用する。例えば、Ｍａｒｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．ｏｆ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ  ７８：２９０−２９３を参照されたい。このようなアッセイは、植物を１種又は複数の害虫と接触させた後、植物が生存する能力及び／又は害虫を死滅させる能力を決定することを含み得る。毒性の増大をもたらす突然変異の例は、Ｓｃｈｎｅｐｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２：７７５−８０６にみいだされる。
【００５２】
あるいは、実質的に活性に影響を及ぼすことなく、多数のタンパク質のタンパク質配列のアミノ又はカルボキシ末端に改変を実施してもよい。これは、ＰＣＲ増幅に用いられるオリゴヌクレオチドにアミノ酸コード配列を包含させることによってタンパク質コード配列を改変又は伸長するＰＣＲ増幅を含む、ＰＣＲなどの、近年の分子法によって導入される挿入、欠失、又は改変を含み得る。これ以外にも、付加されるタンパク質配列は、タンパク質融合物を作製するために当分野で一般的に使用されるものなどの、全タンパク質コード配列を含でもよい。このような融合タンパク質は、多くの場合、（１）目的とするタンパク質の発現を増大させるために、（２）タンパク質精製、タンパク質検出、又は当分野で公知の他の実験での使用を容易にする目的で、結合ドメイン、酵素活性、又はエピトープを導入するために、（３）細胞内小器官、例えばグラム陰性細菌の細胞膜周辺腔、又は真核細胞の小胞体（後者により、タンパク質のグリコシル化が起こることが多い）へのタンパク質の分泌又は翻訳をターゲティングするために使用される。
【００５３】
本発明の変異体ヌクレオチド及びアミノ酸配列はまた、ＤＮＡシャッフリングなどの突然変異誘発及び組換え誘導手順から得られた配列を包含する。このような手順を用いて、１つ又は複数の異なる殺虫性タンパク質コード領域を使用することにより、要望される特性を有する新規の殺虫性タンパク質を作出することができる。このように、組換えポリヌクレオチドのライブラリーは、実質的な配列同一性を有し、しかもｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで相同的に組換えることができる配列領域を含む関連配列ポリヌクレオチドの集団から作製される。例えば、この手法を用いて、目的とする改善された特性、例えば、増大した殺虫活性を有するタンパク質をコードする新規の遺伝子を得るために、目的のドメインをコードする配列モチーフを、本発明の殺虫性遺伝子と他の公知の殺虫性遺伝子との間でシャッフルしてもよい。このようなＤＮＡシャッフリングの戦略は、当分野において公知である。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７−１０７５１；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１；Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：４３６−４３８；Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７２：３３６−３４７；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：４５０４−４５０９；Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：２８８−２９１；及び米国特許第５，６０５，７９３号明細書及び同第５，８３７，４５８号明細書を参照されたい。
【００５４】
ドメインスワッピング又はシャッフリングは、改変された殺虫性タンパク質を作製するための別の機序である。ドメインは、殺虫性タンパク質間で交換することができ、これによって、改善された殺虫活性又は標的スペクトルを有するハイブリッド又はキメラ毒素が得られる。組換えタンパク質を作製し、殺虫活性についてそれらを試験するための方法は、当分野において公知である（例えば、Ｎａｉｍｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：５３２８−５３３０；ｄｅ  Ｍａａｇｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：１５３７−１５４３；Ｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１７９５４−１７９５８；Ｓｃｈｎｅｐｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２０９２３−２０９３０；Ｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．９１９９９）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：２９１８−２９２５を参照）。
【００５５】
また別の実施形態では、以下：エラープローンＰＣＲ、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、アセンブリＰＣＲ、セクシャル（ｓｅｘｕａｌ）ＰＣＲ突然変異誘発、ｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異誘発、カセット突然変異誘発、リクルーシブ・アンサンブル突然変異誘発（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、エクスポネンシャル・アンサンブル突然変異誘発（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、部位特異的突然変異誘発、遺伝子リアセンブリ（ｇｅｎｅ  ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ）、遺伝子部位飽和突然変異誘発、順列突然変異誘発（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、合成ライゲーションリアセンブリ（ＳＬＲ）、組換え、繰返し配列組換え、ホスホチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ウラシル含有鋳型突然変異誘発、ギャップド・デュプレックス突然変異誘発（ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、ポイントミスマッチ修復突然変異誘発（ｐｏｉｎｔ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、修復欠損宿主株突然変異誘発、化学突然変異誘発、放射線突然変異誘発、欠失突然変異誘発、制限−選択突然変異誘発、制限−精製突然変異誘発、人工遺伝子合成、アンサンブル突然変異誘発（ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、キメラ核酸多量体作出の１つ又は複数を用いて、変異体ヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列を得ることができる。
【００５６】
ベクター
本発明の殺虫性配列は、目的の植物において発現させるための発現カセットにおいて提供することができる。「植物発現カセット」とは、植物細胞においてオープンリーディングフレームからタンパク質の発現を誘導することができるＤＮＡ構築物を意味する。典型的には、これらはプロモータ及びコード配列を含む。多くの場合、このような構築物はまた、３’非翻訳領域も含む。このような構築物は、葉緑体（若しくはその他の色素体）、小胞体、又はゴルジ装置などの特定の細胞内構造への、翻訳と同時又は翻訳後のペプチドの輸送を促進するための「シグナル配列」又は「リーダー配列」を含有してもよい。
【００５７】
「シグナル配列」とは、細胞膜を通して、翻訳と同時又は翻訳後のペプチドの輸送を誘導することがわかっているか、又はそのように考えられている配列を意味する。真核生物では、これは、典型的にはゴルジ装置への分泌を伴い、その結果一部はグリコシル化される。細菌の殺虫性毒素は、プロトキシンとして合成されることが多いが、これは、標的害虫の腸管内でタンパク質分解的に作用する（Ｃｈａｎｇ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５０７−５１６）。本発明の一部の実施形態では、シグナル配列は、ネイティブ配列内に位置するものであるか、又は本発明の配列に由来するものであってもよい。「リーダー配列」とは、翻訳されると、翻訳と同時に、細胞内小器官へのペプチド鎖の輸送を引き起こすのに十分なアミノ酸配列をもたらす任意の配列を意味する。従って、これは、小胞体への通過、液胞、色素体（葉緑体を含む）、ミトコンドリアなどへの通過によって、輸送及び／又はグリコシル化をターゲティングするリーダー配列を含む。
【００５８】
「植物形質転換ベクター」とは、植物細胞の効率的な形質転換に必要とされるＤＮＡ分子を意味する。このような分子は、１つ又は複数の植物発現カセットから構成されるものでよく、２つ以上の「ベクター」ＤＮＡ分子に組織化され得る。例えば、バイナリーベクターは、植物細胞の形質転換のために必要な全てのシス及びトランス作用機能をコードするために２つの非連続的なＤＮＡベクターを使用する植物形質転換ベクターである（Ｈｅｌｌｅｎｓ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５：４４６−４５１）。「ベクター」は、異なる宿主細胞間での移動のために設計された核酸構築物を指す。「発現ベクター」は、外来細胞において異種ＤＮＡ配列又は断片を取り込み、組み込み、及び発現させる能力を有するベクターを指す。
カセットは、本発明の配列に作動可能に連結された５’及び／又は３’調節配列を含む。
「作動可能に連結された」とは、プロモータと第２配列との間の機能的連結を意味し、ここで、プロモータ配列は、第２配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始及び媒介する。一般に、作動可能に連結されたとは、連結される核酸配列が連続的であると共に、２つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合には連続的であり、しかも同じリーディングフレーム内にあることを意味する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、微生物宿主細胞又は植物宿主細胞などの宿主細胞において、前記ヌクレオチド配列の発現を指令することができる異種プロモータに作動可能に連結されている。このカセットはさらに、生物に共形質転換しようとする少なくとも１つの追加の遺伝子を含有していてもよい。あるいは、追加の遺伝子（群）を複数の発現カセット上に提供してもよい。
【００５９】
様々な実施形態において、本発明のヌクレオチド配列は、プロモータ、例えば、植物プロモータと作動可能に連結している。「プロモータ」は、下流のコード配列の転写を指令するように機能する核酸配列をいう。プロモータは、他の転写及び翻訳調節核酸配列（「制御配列」とも呼ばれる）と共に、目的のＤＮＡ配列の発現に必要である。
【００６０】
このような発現カセットは、調節領域の転写調節下になるように殺虫性配列を挿入するための複数の制限酵素部位を備えている。
【００６１】
発現カセットは、転写の５’−３’方向に、植物において機能する、転写及び翻訳開始領域（すなわちプロモータ）、本発明のＤＮＡ配列、並びに翻訳及び転写終結領域（すなわち終結領域）を含む。プロモータは、植物宿主及び／又は本発明のＤＮＡ配列に対して、ネイティブ若しくは類似であってもよいし、又は、外来若しくは異種であってもよい。
さらに、プロモータは、天然の配列であっても、又は合成配列であってもよい。プロモータが植物宿主に対して「ネイティブ」又は「相同性」である場合、そのプロモータは、プロモータが導入された天然の植物に存在することを意味する。プロモータが、本発明のＤＮＡ配列に対して「外来」又は「異種」である場合、本発明の作動可能に連結されたＤＮＡ配列に対して、プロモータが、ネイティブではないか、又は天然に存在するプロモータではないことを意味する。
【００６２】
終結領域は、転写開始領域に対してネイティブであってもよいし、目的の作動可能に連結されたＤＮＡ配列に対してネイティブであってもよいし、植物宿主に対してネイティブであってもよく、又は別の起源に由来するもの（すなわち、プロモータ、目的のＤＮＡ配列、植物宿主、又はその任意の組合せに対して外来又は異種）であってもよい。オクトピンシンターゼ及びノパリンシンターゼ終結領域などの好都合な終結領域は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミドから入手することができる。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１−１４４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６４：６７１−６７４；Ｓａｎｆａｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：１４１−１４９；Ｍｏｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１２６１−１２７２；Ｍｕｎｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ  ９１：１５１−１５８；Ｂａｌｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７８９１−７９０３；並びにＪｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５：９６２７−９６３９もまた参照されたい。
【００６３】
必要に応じて、形質転換された宿主細胞での発現を増大させるように、遺伝子を最適化してもよい。すなわち、発現の向上のために宿主細胞に好ましいコドンを用いて遺伝子を合成することができるし、又は宿主に好ましいコドン使用頻度でコドンを用いて遺伝子を合成することもできる。一般に、遺伝子のＧＣ含量は増加する。例えば、宿主の好ましいコドン使用頻度の考察のためには、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｇｏｗｒｉ（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１−１１を参照されたい。植物に好ましい遺伝子を合成するための方法が当分野において入手可能である。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号明細書及び同第５，４３６，３９１号明細書、並びにＭｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：４７７−４９８（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００６４】
一実施形態では、殺虫性タンパク質は、葉緑体での発現のためにターゲティングされる。この方法において、殺虫性タンパク質が葉緑体中に直接挿入されない場合には、発現カセットは、殺虫性タンパク質を葉緑体に誘導する輸送ペプチドをコードする核酸をさらに含み得る。このような輸送ペプチドは当分野において公知である。例えば、Ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：１０４−１２６；Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７５４４−１７５５０；Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８；Ｒｏｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４１４−１４２１；及びＳｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：４７８−４８１を参照されたい。
【００６５】
葉緑体にターゲティングされる殺虫性遺伝子は、植物核とこの細胞小器官の間のコドン使用頻度の差を考慮して、葉緑体での発現のために最適化することができる。この方法では、葉緑体に好ましいコドンを用いて、目的の核酸を合成することができる。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００６６】
植物形質転換
本発明の方法は、ヌクレオチド構築物を植物に導入するステップを含む。「導入」とは、構築物が植物の細胞内部に進入できるような様式で、植物にヌクレオチド構築物を付与することを意味する。本発明の方法は、植物にヌクレオチド構築物を導入する特定の方法の使用を必要とせず、ヌクレオチド構築物が、植物の少なくとも１つの細胞の内部に進入できることだけを必要とする。ヌクレオチド構築物を植物に導入するための方法は当分野において公知であり、限定はしないが、安定な形質転換法、一過性形質転換法、及びウイルス媒介法などが挙げられる。
【００６７】
「植物」とは、全植物、植物器官（例えば、葉、幹、根など）、種子、植物細胞、むかご、胚、及びその子孫を意味する。植物細胞は、分化した、又は未分化細胞のいずれであってもよい（例えば、カルス、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉細胞、根細胞、師部細胞、花粉）。
【００６８】
「トランスジェニック植物」又は「形質転換植物」又は「安定に形質転換された」植物若しくは細胞若しくは組織は、植物細胞に外因性核酸配列若しくはＤＮＡ断片が取り込まれた、又は組み込まれた植物を指す。これらの核酸配列は、外因性の、又は非形質転換植物細胞に存在しない核酸配列、並びに、内因性の、又は非形質転換植物細胞に存在する核酸配列を含む。「異種」は、一般に、細胞、又はそれらが存在するネイティブゲノムの一部に対して内因性ではなく、感染、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、マイクロプロジェクションなどによって細胞に付加された核酸配列を指す。
【００６９】
本発明のトランスジェニック植物は、本明細書に開示する新規の毒素配列の１つ又は複数を発現する。一部の実施形態では、本発明のタンパク質又はヌクレオチド配列は、植物において、該植物に有用な農業特性を付与するタンパク質又はＲＮＡをコードする他の遺伝子と組み合わせるのが有利である。形質転換植物に有用な農業特性を付与するタンパク質又はＲＮＡをコードする遺伝子としては、１種又は複数の除草剤に対する耐性を付与するタンパク質、及び特定の昆虫に対する耐性を付与するタンパク質、特定の疾患に対する耐性を付与するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、線虫若しくは昆虫防除をもたらすＲＮＡをコードするＤＮＡなどを挙げることができる。このような遺伝子は、特に、公開ＰＣＴ特許出願：国際公開第９１／０２０７１号パンフレット及び同第９５／０６１２８号パンフレット、並びに米国特許第７，９２３，６０２号明細書及び米国特許出願公開第２０１００１６６７２３号明細書に記載されている。尚、これらは各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７０】
形質転換植物細胞及び植物に、特定の除草剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードするＤＮＡの中でも、以下のものを挙げることができる：グルホシネート除草剤に対する耐性を付与する、国際公開第２００９／１５２３５９号パンフレットに記載のｂａｒ若しくはＰＡＴ遺伝子又はストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）遺伝子、グリホサート及びその塩など、標的としてＥＰＳＰＳを有する除草剤に対する耐性を付与する好適なＥＰＳＰＳをコードする遺伝子（米国特許第４，５３５，０６０号明細書、同第４，７６９，０６１号明細書、同第５，０９４，９４５号明細書、同第４，９４０，８３５号明細書、同第５，１８８，６４２号明細書、同第４，９７１，９０８号明細書、同第５，１４５，７８３号明細書、同第５，３１０，６６７号明細書、同第５，３１２，９１０号明細書、同第５，６２７，０６１号明細書、同第５，６３３，４３５号明細書）、グリホサート−ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（例えば、米国特許第８，２２２，４８９号明細書、同第８，０８８，９７２号明細書、同第８，０４４，２６１号明細書、同第８，０２１，８５７号明細書、同第８，００８，５４７号明細書、同第７，９９９，１５２号明細書、同第７，９９８，７０３号明細書、同第７，８６３，５０３号明細書、同第７，７１４，１８８号明細書、同第７，７０９，７０２号明細書、同第７，６６６，６４４号明細書、同第７，６６６，６４３号明細書、同第７，５３１，３９９号明細書、同第７，５２７，９５５号明細書、及び同第７，４０５，７０４号明細書）、グリホサートオキシドレダクターゼをコードする遺伝子（例えば、米国特許第５，４６３，１７５号明細書）、又はＨＰＰＤ阻害剤耐性タンパク質をコードする遺伝子（例えば、国際公開第２００４／０５２１９１号パンフレット、同第１９９６３８５６７号パンフレット、米国特許第６７９１０１４号明細書、国際公開第２０１１／０６８５６７号パンフレット、同第２０１１／０７６３４５号パンフレット、同第２０１１／０８５２２１号パンフレット、同第２０１１／０９４２０５号パンフレット、同第２０１１／０６８５６７号パンフレット、同第２０１１／０９４１９９号パンフレット、同第２０１１／０９４２０５号パンフレット、同第２０１１／１４５０１５号パンフレット、同第２０１２０５６４０１号パンフレット、並びにＰＣＴ／ＵＳ２０１３／５９５９８号パンフレットに記載のＨＰＰＤ阻害剤耐性遺伝子）。
【００７１】
標的としてＥＰＳＰＳを有する除草剤に対する耐性を付与する好適なＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡ配列の中でも、特に、植物ＥＰＳＰＳ、とりわけ、トウモロコシＥＰＳＰＳ、具体的には、２つの突然変異（特に、アミノ酸位置１０２の突然変異とアミノ酸位置１０６の突然変異（国際公開第２００４／０７４４４３号パンフレット））を含むトウモロコシＥＰＳＰＳをコードする遺伝子で、米国特許出願公開第６５６６５８７号明細書に記載されており、本明細書では以後二重突然変異体トウモロコシＥＰＳＰＳ若しくは２ｍＥＰＳＰＳと呼ぶ遺伝子、又はアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）から単離されたＥＰＳＰＳをコードする遺伝子で、米国特許第５，６３３，４３５号明細書の配列番号２及び配列番号３により記載されている遺伝子（ＣＰ４とも呼ばれる）が挙げられる。
【００７２】
標的としてＥＰＳＰＳを有する除草剤に対する耐性を付与する好適なＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡ配列の中でも、特に、アルスロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）由来の、ＥＰＳＰＳをコードする遺伝子ＧＲＧ２３、さらには、突然変異体ＧＲＧ２３  ＡＣＥ１、ＧＲＧ２３  ＡＣＥ２、若しくはＧＲＧ２３  ＡＣＥ３、具体的には、国際公開第２００８／１００３５３号パンフレットに記載のＧＲＧ２３の突然変異体若しくは変異体、例えば、国際公開第２００８／１００３５３号パンフレットに記載の配列番号２９のＧＲＧ２３（ａｃｅ３）Ｒ１７３Ｋが挙げられる。
【００７３】
ＥＰＳＰＳをコードする、より具体的には、前記遺伝子をコードするＤＮＡ配列の場合には、これらの酵素をコードする配列の前に、輸送ペプチド、とりわけ、米国特許第５，５１０，４７１号明細書又は同第５，６３３，４４８号明細書に記載の「最適化輸送ペプチド」をコードする配列が位置しているのが有利である。
【００７４】
本発明の核酸と組み合わせることができる除草剤耐性の形質の例として、以下のものがさらに挙げられる：少なくとも１つのＡＬＳ（アセト乳酸シンターゼ）阻害剤（国際公開第２００７／０２４７８２号パンフレット）；突然変異シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＡＬＳ／ＡＨＡＳ遺伝子（米国特許第６，８５５，５３３号明細書）；代謝により２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）に耐性を付与する、２，４−Ｄ−モノオキシナーゼコード遺伝子（米国特許第６，１５３，４０１号明細書）；代謝によりジカンバ（３，６−ジクロロ−２−メトキシ安息香酸）に対する耐性を付与する、ジカンバモノオキシゲナーゼコード遺伝子（米国特許第２００８／０１１９３６１号明細書及び米国特許第２００８／０１２０７３９号明細書）。
【００７５】
様々な実施形態では、本発明の核酸は、１種又は複数のＨＰＰＤ除草剤耐性遺伝子、並びに／又はグリホサート及び／若しくはグルホシネートに対して耐性の１種又は複数の遺伝子などの１種又は複数の除草剤耐性遺伝子とスタッキングさせる。
【００７６】
昆虫に対する耐性の特性に関するタンパク質をコードするＤＮＡ配列の中でも、より具体的には、文献に広く記載され、当分野でもよく知られているＢｔタンパク質が挙げられる。また、フォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）属などの細菌から抽出されたタンパク質（国際公開第９７／１７４３２号パンフレット及び国際公開第９８／０８９３２号パンフレット）も挙げられる。
【００７７】
昆虫に対する耐性の新たな特性を付与する昆虫のタンパク質をコードするこうしたＤＮＡ配列の中でも、より具体的には、文献に広く記載され、当分野でもよく知られているＢｔ  Ｃｒｙ又はＶＩＰタンパク質が挙げられる。これらは、以下のものを含む：Ｃｒｙ１Ｆタンパク質又はＣｒｙ１Ｆタンパク質由来のハイブリッド（例えば、米国特許第６，３２６，１６９号明細書；米国特許第６，２８１，０１６号明細書；米国特許第６，２１８，１８８号明細書に記載のハイブリッドＣｒｙ１Ａ−Ｃｒｙ１Ｆタンパク質、若しくはそれらの毒性断片）、Ｃｒｙ１Ａタイプタンパク質又はその毒性断片、好ましくはＣｒｙ１Ａｃタンパク質又はＣｒｙ１Ａｃタンパク質由来のハイブリッド（例えば、米国特許第５，８８０，２７５号明細書に記載のハイブリッドＣｒｙ１Ａｂ−Ｃｒｙ１Ａｃタンパク質）又は欧州特許第４５１８７８号明細書に記載のＣｒｙ１Ａｂ又はＢｔ２タンパク質若しくはその殺虫性断片、国際公開第２００２／０５７６６４号パンフレットに記載のＣｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ２Ａｆ若しくはＣｒｙ２Ａｇタンパク質又はそれらの毒性断片、国際公開第２００７／１４０２５６号パンフレットに記載のＣｒｙ１Ａ．１０５タンパク質（配列番号７）若しくはその毒性断片、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＢＧ２０４２８のＶＩＰ３Ａａ１９タンパク質、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＢＧ２０４２８のＶＩＰ３Ａａ２０タンパク質（国際公開第２００７／１４２８４０号パンフレットに記載の配列番号２）、ＣＯＴ２０２若しくはＣＯＴ２０３ワタイベントにおいて生成されるＶＩＰ３Ａタンパク質（それぞれ、国際公開第２００５／０５４４７９号パンフレット及び国際公開第２００５／０５４４８０号パンフレット）、国際公開第２００１／４７９５２号パンフレットに記載のＣｒｙタンパク質、Ｅｓｔｒｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２８；９３（１１）：５３８９−９４及び米国特許第６，２９１，１５６号明細書に記載のＶＩＰ３Ａａタンパク質若しくはその毒性断片、ゼノラブダス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ）属（国際公開第９８／５０４２７号パンフレットに記載）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属（特に、セラチア・エントモフィラ（Ｓ．ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）若しくはフォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）属種株由来の殺虫性タンパク質、例えば、国際公開第９８／０８９３２号パンフレット（例えば、Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７（１１）：５０１７−２４；Ｆｆｒｅｎｃｈ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ  ａｎｄ  Ｂｏｗｅｎ，２０００，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．；５７（５）；８２８−３３）に記載されるようなフォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）属由来のＴｃタンパク質。また、前記配列、特に、その毒性断片の配列のいずれかからいくつか（１〜１０、好ましくは１〜５）のアミノ酸が異なる前記タンパク質、あるいは、色素体輸送ペプチドなどの輸送ペプチド、又は別のタンパク質若しくはペプチドと誘導した前記タンパク質のいずれか１つの任意の変異体若しくは突然変異体も本明細書に含まれる。
【００７８】
様々な実施形態では、本発明の核酸は、植物の場合、除草剤耐性、昆虫耐性、干ばつ耐性、線虫防除、水利用効率、窒素利用効率、改善された栄養価、疾患抵抗性、改善された光合成、改善された繊維品質、ストレス耐性、改善された繁殖などの望ましい形質を付与する１つ又は複数の遺伝子と組み合わせることができる。
【００７９】
同じ種の植物において、本発明の遺伝子と組み合わせることができる（例えば、交雑により、又は本発明のキメラ遺伝子を用いて、別のトランスジェニックイベントを含む植物を再形質転換することにより）特に有用なトランスジェニックイベントとして、以下のものが挙げられる：イベント５３１／ＰＶ−ＧＨＢＫ０４（ワタ、昆虫防除、国際公開第２００２／０４０６７７号パンフレットに記載）；イベント１１４３−１４Ａ（ワタ、昆虫防除、寄託なし、国際公開第２００６／１２８５６９号パンフレットに記載）；イベント１１４３−５１Ｂ（ワタ、昆虫防除、寄託なし、国際公開第２００６／１２８５７０号パンフレットに記載）；イベント１４４５（ワタ、除草剤耐性、寄託なし、米国特許出願第２００２−１２０９６４号明細書若しくは国際公開第２００２／０３４９４６号パンフレットに記載）；イベント１７０５３（コメ、除草剤耐性、ＰＴＡ−９８４３として寄託、国際公開第２０１０／１１７７３７号パンフレットに記載）；イベント１７３１４（コメ、除草剤耐性、ＰＴＡ−９８４４として寄託、国際公開第２０１０／１１７７３５号パンフレットに記載）；イベント２８１−２４−２３６（ワタ、昆虫防除−除草剤耐性、ＰＴＡ−６２３３として寄託、国際公開第２００５／１３２６６号パンフレット若しくは米国特許出願第２００５−２１６９６９号明細書に記載）；イベント３００６−２１０−２３（ワタ、昆虫防除−除草剤耐性、ＰＴＡ−６２３３として寄託、米国特許出願第２００７−１４３８７６号明細書若しくは国際公開第２００５／１０３２６６号パンフレットに記載）；イベント３２７２（トウモロコシ、品質形質、ＰＴＡ−９９７２として寄託、国際公開第２００６／０９８９５２号パンフレット若しくは米国特許出願第２００６−２３０４７３号明細書に記載）；イベント３３３９１（コムギ、除草剤耐性、ＰＴＡ−２３４７として寄託、国際公開第２００２／０２７００４号パンフレットに記載）；イベント４０４１６（トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１５０８として寄託、国際公開第１１／０７５５９３号パンフレットに記載）；イベント４２Ａ４７（トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１５０９として寄託、国際公開第２０１１／０７５５９５号パンフレットに記載）；イベント５３０７（トウモロコシ、昆虫防除、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−９５６１として寄託、国際公開第２０１０／０７７８１６号パンフレットに記載）；イベントＡＳＲ−３６８（ベントグラス、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４８１６として寄託、米国特許出願第２００６−１６２００７号明細書若しくは国際公開第２００４／０５３０６２号パンフレットに記載）；イベントＢ１６（トウモロコシ、除草剤耐性、寄託なし、米国特許出願第２００３−１２６６３４号明細書に記載）；イベントＢＰＳ−ＣＶ１２７−９（ダイズ、除草剤耐性、ＮＣＩＭＢ番号４１６０３として寄託、国際公開第２０１０／０８０８２９号パンフレットに記載）；イベントＢＬＲ１（ナタネ、雄性不稔性の回復、ＮＣＩＭＢ４１１９３として寄託、国際公開第２００５／０７４６７１号パンフレットに記載）；イベントＣＥ４３−６７Ｂ（ワタ、昆虫防除、ＤＳＭ  Ａ��Ｃ２７２４として寄託、米国特許出願第２００９−２１７４２３号明細書若しくは国際公開第２００６／１２８５７３号パンフレットに記載）；イベントＣＥ４４−６９Ｄ（ワタ、昆虫防除、寄託なし、米国特許出願第２０１０−００２４０７７号明細書に記載）；イベントＣＥ４４−６９Ｄ（ワタ、昆虫防除、寄託なし、国際公開第２００６／１２８５７１号パンフレットに記載）；イベントＣＥ４６−０２Ａ（ワタ、昆虫防除、寄託なし、国際公開第２００６／１２８５７２号パンフレットに記載）；イベントＣＯＴ１０２（ワタ、昆虫防除、寄託なし、米国特許出願第２００６−１３０１７５号明細書若しくは国際公開第２００４／０３９９８６号パンフレットに記載）；イベントＣＯＴ２０２（ワタ、昆虫防除、寄託なし、米国特許出願第２００７−０６７８６８号明細書若しくは国際公開第２００５／０５４４７９号パンフレットに記載）；イベントＣＯＴ２０３（ワタ、昆虫防除、寄託なし、国際公開第２００５／０５４４８０号パンフレットに記載）；）；イベントＤＡＳ２１６０６−３／１６０６（ダイズ、除草剤耐性、ＰＴＡ−１１０２８として寄託、国際公開第２０１２／０３３７９４号パンフレットに記載）；イベントＤＡＳ４０２７８（トウモロコシ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１０２４４として寄託、国際公開第２０１１／０２２４６９号パンフレットに記載）；イベントＤＡＳ−４４４０６−６／ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１（ダイズ、除草剤耐性、ＰＴＡ−１１３３６として寄託、国際公開第２０１２／０７５４２６号パンフレットに記載）；イベントＤＡＳ−１４５３６−７／ｐＤＡＢ８２９１．４５．３６．２（ダイズ、除草剤耐性、ＰＴＡ−１１３３５として寄託、国際公開第２０１２／０７５４２９号パンフレットに記載）；イベントＤＡＳ−５９１２２−７（トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  １１３８４として寄託、米国特許出願第２００６−０７０１３９号明細書に記載）；イベントＤＡＳ−５９１３２（トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、寄託なし、国際公開第２００９／１００１８８号パンフレットに記載）；イベントＤＡＳ６８４１６（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１０４４２として寄託、国際公開第２０１１／０６６３８４号パンフレット若しくは国際公開第２０１１／０６６３６０号パンフレットに記載）；イベントＤＰ−０９８１４０−６（トウモロコシ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８２９６として寄託、米国特許出願第２００９−１３７３９５号明細書若しくは国際公開第０８／１１２０１９号パンフレットに記載）；イベントＤＰ−３０５４２３−１（ダイズ、品質形質、寄託なし、米国特許出願第２００８−３１２０８２号明細書若しくは国際公開第２００８／０５４７４７号パンフレットに記載）；イベントＤＰ−３２１３８−１（トウモロコシ、ハイブリダイゼーション系、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−９１５８として寄託、米国特許出願第２００９−０２１０９７０号明細書若しくは国際公開第２００９／１０３０４９号パンフレットに記載）；イベントＤＰ−３５６０４３−５（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８２８７として寄託、米国特許出願第２０１０−０１８４０７９号明細書若しくは国際公開第２００８／００２８７２号パンフレットに記載）；イベントＥＥ−１（ナス、昆虫防除、寄託なし、国際公開第０７／０９１２７７号パンフレットに記載）；イベントＦＩ１１７（トウモロコシ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ２０９０３１として寄託、米国特許出願第２００６−０５９５８１号明細書若しくは国際公開第９８／０４４１４０号パンフレットに記載）；イベントＦＧ７２（ダイズ、除草剤耐性、ＰＴＡ−１１０４１として寄託、国際公開第２０１１／０６３４１３号パンフレットに記載）；イベントＧＡ２１（トウモロコシ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ２０９０３３として寄託、米国特許出願第２００５−０８６７１９号明細書若しくは国際公開第９８／０４４１４０号パンフレットに記載）；イベントＧＧ２５（トウモロコシ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ
２０９０３２として寄託、米国特許出願第２００５−１８８４３４号明細書若しくは国際公開第９８／０４４１４０号パンフレットに記載）；イベントＧＨＢ１１９（トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３９８として寄託、国際公開第２００８／１５１７８０号パンフレットに記載）；イベントＧＨＢ６１４（トウモロコシ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６８７８として寄託、米国特許出願第２０１０−０５０２８２号明細書若しくは国際公開第２００７／０１７１８６号パンフレットに記載）；イベントＧＪ１１（トウモロコシ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ２０９０３０として寄託、米国特許出願第２００５−１８８４３４号明細書若しくは国際公開第９８／０４４１４０号パンフレットに記載）；イベントＧＭ  ＲＺ１３（テンサイ、ウイルス耐性、ＮＣＩＭＢ−４１６０１として寄託、国際公開第２０１０／０７６２１２号パンフレットに記載）；イベントＨ７−１（テンサイ、除草剤耐性、ＮＣＩＭＢ４１１５８若しくはＮＣＩＭＢ４１１５９として寄託、米国特許出願第２００４−１７２６６９号明細書若しくは国際公開第２００４／０７４４９２号パンフレットに記載）；イベントＪＯＰＬＩＮ１（コムギ、除草剤耐性、寄託なし、米国特許出願第２００８−０６４０３２号明細書に記載）；イベントＬＬ２７（ダイズ、除草剤耐性、ＮＣＩＭＢ４１６５８として寄託、国際公開第２００６／１０８６７４号パンフレット若しくは米国特許出願第２００８−３２０６１６号明細書に記載）；イベントＬＬ５５（ダイズ、除草剤耐性、ＮＣＩＭＢ４１６６０として寄託、国際公開第２００６／１０８６７５号パンフレット若しくは米国特許出願第２００８−１９６１２７号明細書に記載）；イベントＬＬｃｏｔｔｏｎ２５（ワタ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３３４３として寄託、国際公開第２００３／０１３２２４号パンフレット若しくは米国特許出願第２００３−０９７６８７号明細書に記載）；イベントＬＬＲＩＣＥ０６（コメ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ２０３３５３として寄託、米国特許第６，４６８，７４７号明細書若しくは国際公開第２０００／０２６３４５号パンフレットに記載）；イベントＬＬＲｉｃｅ６２（コメ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ２０３３５２として寄託、国際公開第２０００／０２６３４５号パンフレットに記載）；イベントＬＬＲＩＣＥ６０１（コメ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−２６００として寄託、米国特許出願第２００８−２２８９０６０号明細書若しくは国際公開第２０００／０２６３５６号パンフレットに記載）；イベントＬＹ０３８（トウモロコシ、品質形質、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５６２３として寄託、米国特許出願第２００７−０２８３２２号明細書若しくは国際公開第２００５／０６１７２０号パンフレットに記載）；イベントＭＩＲ１６２（トウモロコシ、昆虫防除、ＰＴＡ−８１６６として寄託、米国特許出願第２００９−３００７８４号明細書若しくは国際公開第２００７／１４２８４０号パンフレットに記載）；イベントＭＩＲ６０４（トウモロコシ、昆虫防除、寄託なし、米国特許出願第２００８−１６７４５６号明細書若しくは国際公開第２００５／１０３３０１号パンフレットに記載）；イベントＭＯＮ１５９８５（ワタ、昆虫防除、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−２５１６として寄託、米国特許出願第２００４−２５０３１７号明細書若しくは国際公開第２００２／１００１６３号パンフレットに記載）；イベントＭＯＮ８１０（トウモロコシ、昆虫防除、寄託なし、米国特許出願第２００２−１０２５８２号明細書若に記載）；イベントＭＯＮ８６３（トウモロコシ、昆虫防除、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−２６０５として寄託、国際公開第２００４／０１１６０１号パンフレット若しくは米国特許出願第２００６−０９５９８６号明細書に記載）；イベントＭＯＮ８７４２７（トウモロコシ、受粉調節、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−７８９９として寄託、国際公開第２０１１／０６２９０４号パンフレットに記載）；イベントＭＯＮ８７４６０（トウモロコシ、ストレス耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８９１０として寄託、国際公開第２００９／１１１２６３号パンフレット若しくは米国特許出願第２０１１−０１３８５０４号明細書に記載）；イベントＭＯＮ８７７０１（ダイズ、昆虫防除、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８１９４として寄託、米国特許出願第２００９−１３００７１号明細書若しくは国際公開第２００９／０６４６５２号パンフレットに記載）；イベントＭＯＮ８７７０５（ダイズ、品質形質−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−９２１４として寄託、米国特許出願第２０１０−００８０８８７号明細書若しくは国際公開第２０１０／０３７０１６号パンフレットに記載）；イベントＭＯＮ８７７０８（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−９６７０として寄託、国際公開第２０１１／０３４７０４号パンフレットに記載）；イベントＭＯＮ８７７１２（ダイズ、収量、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１０２９６として寄託、国際公開第２０１２／０５１１９９号パンフレットに記載）、イベントＭＯＮ８７７５４（ダイズ、品質形質、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−９３８５として寄託、国際公開第２０１０／０２４９７６号パンフレットに記載）；イベントＭＯＮ８７７６９（ダイズ、品質形質、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８９１１として寄託、米国特許出願第２０１１−００６７１４１号明細書若しくは国際公開第２００９／１０２８７３号パンフレットに記載）；イベントＭＯＮ８８０１７（トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５５８２として寄託、米国特許出願第２００８−０２８４８２号明細書若しくは国際公開第２００５／０５９１０３号パンフレットに記載）；イベントＭＯＮ８８９１３（ワタ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４８５４として寄託、国際公開第２００４／０７２２３５号パンフレット若しくは米国特許出願第２００６−０５９５９０号明細書に記載）；イベントＭＯＮ８８３０２（ナタネ、除草剤耐性、ＰＴＡ−１０９５５として寄託、国際公開第２０１１／１５３１８６号パンフレットに記載）；イベントＭＯＮ８８７０１（ワタ、除草剤耐性、ＰＴＡ−１１７５４として寄託、国際公開第２０１２／１３４８０８号パンフレットに記載）；イベントＭＯＮ８９０３４（トウモロコシ、昆虫防除、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−７４５５として寄託、国際公開第０７／１４０２５６号パンフレット若しくは米国特許出願第２００８−２６０９３２号明細書に記載）；イベントＭＯＮ８９７８８（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６７０８として寄託��米国特許出願第２００６−２８２９１５号明細書若しくは国際公開第２００６／１３０４３６号パンフレットに記載）；イベントＭＳ１１（ナタネ、受粉調節−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８５０若しくはＰＴＡ−２４８５として寄託、国際公開第２００１／０３１０４２号パンフレットに記載）；イベントＭＳ８（ナタネ、受粉調節−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−７３０として寄託、国際公開第２００１／０４１５５８号パンフレット若しくは米国特許出願第２００３−１８８３４７号明細書に記載）；イベントＮＫ６０３（トウモロコシ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−２４７８として寄託、米国特許出願第２００７−２９２８５４号明細書に記載）；イベントＰＥ−７（コメ、昆虫防除、寄託なし、国際公開第２００８／１１４２８２号パンフレットに記載）；イベントＲＦ３（ナタネ、受粉調節−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−７３０として寄託、国際公開第２００１／０４１５５８号パンフレット若しくは米国特許出願第２００３−１８８３４７号明細書に記載）；イベントＲＴ７３（ナタネ、除草剤耐性、寄託なし、国際公開第２００２／０３６８３１号パンフレット若しくは米国特許出願第２００８−０７０２６０号明細書に記載）；イベントＳＹＨＴ０Ｈ２／ＳＹＨ−０００Ｈ２−５（ダイズ、除草剤耐性、ＰＴＡ−１１２２６として寄託、国際公開第２０１２／０８２５４８号パンフレットに記載）；イベントＴ２２７−１（テンサイ、除草剤耐性、寄託なし、国際公開第２００２／４４４０７号パンフレット若しくは米国特許出願第２００９−２６５８１７号明細書に記載）；イベントＴ２５（トウモロコシ、除草剤耐性、寄託なし、米国特許出願第２００１−０２９０１４号明細書若しくは国際公開第２００１／０５１６５４号パンフレットに記載）；イベントＴ３０４−４０（ワタ、昆虫防除−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８１７１として寄託、米国特許出願第２０１０−０７７５０１号明細書若しくは国際公開第２００８／１２２４０６号パンフレットに記載）；イベントＴ３４２−１４２（ワタ、昆虫防除、寄託なし、国際公開第２００６／１２８５６８号パンフレットに記載）；イベントＴＣ１５０７（トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、寄託なし、米国特許出願第２００５−０３９２２６号明細書若しくは国際公開第２００４／０９９４７号パンフレットに記載）；イベントＶＩＰ１０３４（トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３９２５として寄託、国際公開第２００３／０５２０７３号パンフレットに記載）、イベント３２３１６（トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、ＰＴＡ−１１５０７として寄託、国際公開第２０１１／０８４６３２号パンフレットに記載）、イベント４１１４（トウモロコシ、昆虫防除−除草剤耐性、ＰＴＡ−１１５０６として寄託、国際公開第２０１１／０８４６２１号パンフレットに記載）、任意選択で、イベントＥＥ−ＧＭ１／ＬＬ２７若しくはイベントＥＥ−ＧＭ２／ＬＬ５５とスタッキングしたイベントＥＥ−ＧＭ３／ＦＧ７２（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  アクセッション番号ＰＴＡ−１１０４１）（国際公開第２０１１／０６３４１３Ａ２号パンフレット）、イベントＤＡＳ−６８４１６−４（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０４４２、国際公開第２０１１／０６６３６０Ａ１号パンフレット）、イベントＤＡＳ−６８４１６−４（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０４４２、国際公開第２０１１／０６６３８４Ａ１号パンフレット）、イベントＤＰ−０４０４１６−８（トウモロコシ、昆虫防除、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１１５０８、国際公開第２０１１／０７５５９３Ａ１号パンフレット）、イベントＤＰ−０４３Ａ４７−３（トウモロコシ、昆虫防除、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１１５０９、国際公開第２０１１／０７５５９５Ａ１号パンフレット）、イベントＤＰ−００４１１４−３（トウモロコシ、昆虫防除、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１１５０６、国際公開第２０１１／０８４６２１Ａ１号パンフレット）、イベントＤＰ−０３２３１６−８（トウモロコシ、昆虫防除、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１１５０７、国際公開第２０１１／０８４６３２Ａ１号パンフレット）、イベントＭＯＮ−８８３０２−９（ナタネ、除草剤耐性、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０９５５、国際公開第２０１１／１５３８４Ａ１号パンフレット）、イベントＤＡＳ−２１６０６−３（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１１０２８、国際公開第２０１２／０３３７９４Ａ１号パンフレット）、イベントＭＯＮ−８７７１２−４（ダイズ、品質形質、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２９６、国際公開第２０１２／０５１１９９Ａ２号パンフレット）、イベントＤＡＳ−４４４００６−６（ダイズ、スタッキングした除草剤耐性、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１１３３６、国際公開第２０１２／０７５４２６Ａ１号パンフレット）、イベントＤＡＳ−１４５３６−７（ダイズ、スタッキングした除草剤耐性、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１１３３５、国際公開第２０１２／０７５４２９Ａ１号パンフレット）、イベントＳＹＮ−０００Ｈ２−５（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１１２２６、国際公開第２０１２／０８２５４８Ａ２号パンフレット）、イベントＤＰ−０６１０６１−７（ナタネ、除草剤耐性、入手可能な寄託番号なし、国際公開第２０１２０７１０３９Ａ１号パンフレット）、イベントＤＰ−０７３４９６−４（ナタネ、除草剤耐性、入手可能な寄託番号なし、
米国特許第２０１２１３１６９２号明細書）、イベント８２６４．４４．０６．１（ダイズ、スタッキングした除草剤耐性、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１１３３６、国際公開第２０１２０７５４２６Ａ２号パンフレット）、イベント８２９１．４５．３６．２（ダイズ、スタッキングした除草剤耐性、アクセッション番号ＰＴＡ−１１３３５、国際公開第２０１２０７５４２９Ａ２号パンフレット）、イベントＳＹＨＴ０Ｈ２（ダイズ、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１１２２６、国際公開第２０１２／０８２５４８Ａ２号パンフレット）、イベントＭＯＮ８８７０１（ワタ、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１１７５４、国際公開第２０１２／１３４８０８Ａ１号パンフレット）、イベントＫＫ１７９−２（ムラサキウマゴヤシ、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１１８３３、国際公開第２０１３／００３５５８Ａ１号パンフレット）、イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１（ダイズ、スタッキングした除草剤耐性、アクセッション番号ＰＴＡ−１１９９３、国際公開第２０１３／０１００９４Ａ１号パンフレット）、イベントＭＺＤＴ０９Ｙ（トウモロコシ、アクセッション番号ＰＴＡ−１３０２５、国際公開第２０１３／０１２７７５Ａ１号パンフレット）。
【００８０】
植物細胞の形質転換は、当分野において公知のいくつかの技術のうちの１つによって達成することができる。本発明の殺虫性遺伝子は、植物細胞での発現を取得又は増強するように修飾してもよい。典型的には、このようなタンパク質を発現する構築物は、遺伝子の転写を駆動するためのプロモータ、並びに、転写終結及びポリアデニル化を可能にするための３’非翻訳領域を含む。このような構築物の構成は、当分野において公知である。一部のケースでは、得られたペプチドが分泌されるか、又はそうでなければ植物細胞内でターゲティングされるように、遺伝子を操作することが有用な場合もある。例えば、遺伝子を、小胞体へのペプチドの輸送を容易にするためのシグナルペプチドを含むように操作することができる。また、イントロンのｍＲＮＡプロセシングが発現に必要となるように、植物発現カセットを操作して、イントロンを含有させるのが好ましい場合もある。
【００８１】
典型的には、この「植物発現カセット」は、「植物形質転換ベクター」に挿入されるだろう。この植物形質転換ベクターは、植物形質転換を達成するために必要な１つ又は複数のＤＮＡベクターから含むものでもよい。例えば、２つ以上の連続したＤＮＡセグメントを含む植物形質転換ベクターを使用することが、当分野において一般的に実施されている。これらのベクターは、当分野では一般に「バイナリーベクター」と呼ばれる。バイナリーベクター並びにヘルパープラスミドを有するベクターは、効率的な形質転換を達成するのに必要なＤＮＡセグメントのサイズ及び複雑性が極めて大きいアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介の形質転換に極めて頻繁に使用され、また、個別のＤＮＡ分子に機能を分離する上で有利である。バイナリーベクターは、典型的に、Ｔ−ＤＮＡ導入に必要なシス作用配列（例えば左境界及び右境界）、植物細胞において発現できるように操作された選択マーカ、及び「目的とする遺伝子」（トランスジェニック植物の作製が望まれる植物細胞において発現できるように操作された遺伝子）を含有するプラスミドベクターを含む。このプラスミドベクター上には、細菌複製に必要な配列も存在する。シス作用配列は、植物細胞への効率的な導入及びそこでの発現を可能とするように配置されている。例えば、選択マーカ遺伝子及び殺虫性遺伝子は、左境界と右境界の間に位置する。多くの場合、第２プラスミドベクターは、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）から植物細胞へのＴ−ＤＮＡの導入を媒介するトランス作用因子を含む。このプラスミドは、往々にして、当分野では理解されているように、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）による植物細胞の感染、及び境界配列での切断によるＤＮＡの導入及びｖｉｒ媒介ＤＮＡ導入を可能にする、病原性機能（Ｖｉｒ遺伝子）を含む（Ｈｅｌｌｅｎｓ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５：４４６−４５１）。いくつかのタイプのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株（例えば、ＬＢＡ４４０４、ＧＶ３１０１、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５など）を植物形質転換に使用することができる。マイクロプロジェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコールなどの他の方法による植物の形質転換には、第２プラスミドベクターは必要ではない。
【００８２】
一般に、植物形質転換方法は、異種ＤＮＡを標的植物細胞（例えば、未成熟又は成熟胚、懸濁培養液、未分化カルス、プロトプラストなど）に導入するステップと、続いて、最大閾値レベルの適切な選択（選択マーカー遺伝子に応じて）を適用することによって、非形質転換細胞集団の群から形質転換植物細胞を回収するステップを含む。典型的には、外植片を、新しく供給した同じ培地に移した後、常用的に培養する。その後、形質転換した細胞を、最大閾値レベルの選択試薬を補充した再生培地に配置して、形質転換細胞をシュートに分化させる。次に、シュートを選択発根培地に移し、根づいたシュート又は小植物を回収する。その後、トランスジェニック小植物は成熟植物へと生育し、稔性の種子を産生する（例えば、Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６：２７１−２８２；Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：７４５−７５０）。典型的には、外植片を、新しく供給した同じ培地に移した後、常用的に培養する。これらの技術についての一般的な記載及びトランスジェニック植物を作製するための方法は、Ａｙｒｅｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋ（１９９４）Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １３：２１９−２３９及びＢｏｍｍｉｎｅｎｉ  ａｎｄ  Ｊａｕｈａｒ（１９９７）Ｍａｙｄｉｃａ  ４２：１０７−１２０にみいだされる。形質転換された材料は多くの細胞を含むことから、形質転換細胞と非形質転換細胞の両方が、対象とする標的カルス又は組織又は細胞群のあらゆる断片に存在する。非形質転換細胞を死滅させて、形質転換細胞を増殖させる能力によって、形質転換植物の培養物が得られる。往々にして、非形質転換細胞を除去する能力は、迅速な形質転換植物細胞の回収及びトランスジェニック植物の作製の成功への制約となる。
【００８３】
形質転換プロトコル並びにヌクレオチド配列を植物に導入するためのプロトコルは、形質転換の標的となる、植物又は植物細胞の種類、すなわち単子葉又は双子葉植物かに応じて変わり得る。トランスジェニック植物の作製は、限定はしないが、以下：マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、直接的な遺伝子導入、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）による植物細胞への異種ＤＮＡの導入（アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換）、粒子に付着させた異種外来ＤＮＡを用いた植物細胞のボンバードメント、バリスティック粒子加速、エアロゾルビーム形質転換（米国特許出願公開第２００１００２６９４１号明細書；米国特許第４，９４５，０５０号明細書；国際出願第９１／００９１５号パンフレット；米国特許第２００２０１５０６６号明細書）、Ｌｅｃ１形質転換、及びＤＮＡを導入するための様々な他の非粒子直接媒介方法を含む、複数の方法のうちの１つによって実施することができる。
【００８４】
葉緑体の形質転換のための方法は当分野では公知である。例えば、Ｓｖａｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：８５２６−８５３０；Ｓｖａｂ  ａｎｄ  Ｍａｌｉｇａ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：９１３−９１７；Ｓｖａｂ  ａｎｄ  Ｍａｌｉｇａ（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：６０１−６０６を参照されたい。前記方法は、選択マーカを含むＤＮＡの微粒子銃送達、及び相同組換えを介した色素体ゲノムへの該ＤＮＡのターゲティングによるものである。さらに、色素体の形質転換は、核にコードされ、かつ色素体を標的とするＲＮＡポリメラーゼを組織優先的に発現させることにより、色素体由来のサイレントトランスジーンのトランス活性化によって達成することができる。このようなシステムは、ＭｃＢｒｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：７３０１−７３０５に報告されている。
【００８５】
植物細胞に異種外来ＤＮＡを組み込んだ後、培地に最大閾値レベルの適切な選択を適用して、非形質転換細胞を死滅させてから、この選択処理から生き残った推定形質転換細胞を分離して、定期的に新しい培地に移すことにより増殖させる。連続的継代及び適切な選択による負荷により、プラスミドベクターで形質転換された細胞を同定し、増殖させる。
次に、分子及び生化学的方法を用いて、トランスジェニック植物のゲノムに組み込まれた目的の異種遺伝子の存在を確認することができる。
【００８６】
形質転換された細胞は、従来の方法に従って植物へと生育させることができる。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５：８１−８４を参照されたい。続いて、これらの植物を生育させて、同じ形質転換株又は異なる株のいずれかを用いて受粉させ、こうして得られたハイブリッドで、要望される表現型特徴の構成的発現を有するものを同定する。要望される表現型特徴の発現が、安定に維持され、かつ遺伝されることを確実にするために、２世代以上を生育させてもよく、その後、要望される表現型特徴の発現が達成されたかを確認するために種子を収穫してもよい。このように、本発明は、本発明のヌクレオチド構築物、例えば、そのゲノムに安定に組み込まれた本発明の発現カセット、を有する形質転換した種子（「トランスジェニック種子」ともいう）を提供する。
【００８７】
植物形質転換の評価
植物細胞に異種外来ＤＮＡを導入した後、植物ゲノムにおける異種遺伝子の形質転換又は組込みは、組み入れられた遺伝子に関連する核酸、タンパク質及び代謝物の分析などの様々な方法によって確認される。
【００８８】
ＰＣＲ解析は、土壌に移植する前の早期段階で、形質転換細胞、組織又はシュートを、組み入れられた遺伝子の存在についてスクリーニングするための迅速な方法である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。ＰＣＲは、目的の遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー又はアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ベクターバックグラウンドなどを用いて実施する。
【００８９】
植物形質転換は、ゲノムＤＮＡのサザンブロット解析によって確認することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１、前掲）。一般に、全ＤＮＡを形質転換体から抽出し、適切な制限酵素で消化し、アガロースゲルで分画した後、ニトロセルロース又はナイロン膜に移す。続いて、膜又は「ブロット」を、例えば放射標識した３２Ｐ標的ＤＮＡ断片でプローブし、標準的な技術に従って植物ゲノムへの導入遺伝子の組み込みを確認する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１、前掲）。
【００９０】
ノザンブロット解析では、当分野において常用される標準的な手順に従って、ＲＮＡを形質転換体の特定の組織から単離し、ホルムアルデヒドアガロースゲルで分画した後、ナイロンフィルター上にブロッティングする（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１、前掲）。続いて、殺虫性遺伝子によりコードされるＲＮＡの発現を、当分野において公知の方法により、殺虫性遺伝子由来の放射性プローブと上記フィルターをハイブリダイズすることによって試験する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１、前掲）。
【００９１】
殺虫性タンパク質上に存在する１つ又は複数のエピトープに結合する抗体を用いて、標準的な手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１、前掲）により、殺虫性遺伝子によってコードされるタンパク質の存在を確認するために、ウェスタンブロット、生化学アッセイなどをトランスジェニック植物に実施してもよい。
【００９２】
植物における殺虫活性
本発明の別の態様では、殺虫活性を有する殺虫性タンパク質を発現するトランスジェニック植物を作製することができる。例として前述した方法を使用して、トランスジェニック植物を作製することができるが、トランスジェニック植物細胞を作製する方法は、本発明にとって重要ではない。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介の形質転換、微粒子銃形質転換、及び非粒子媒介方法などの当分野において公知の又は記載されている方法を、実験者の判断で使用してよい。殺虫性タンパク質を発現する植物は、例えば、カルスの形質転換、形質転換したカルスの選択、及びこのようなトランスジェニックカルスからの稔性植物の再生などの、当分野において記載されている一般的な方法によって単離することができる。このようなプロセスでは、植物細胞におけるその発現が、形質転換細胞を同定又は選択する能力を付与する限りにおいて、任意の遺伝子を選択マーカとして用いてよい。
【００９３】
クロラムフェニコール、アミノグリコシドＧ４１８、ヒグロマイシンなどに対する抵抗性などの、植物細胞で使用するための多数のマーカが開発されている。葉緑体代謝に関与する産物をコードする他の遺伝子もまた選択マーカとして用いることができる。例えば、グリホサート、ブロモキシニル、又はイミダゾリノンなどの植物除草剤に対する抵抗性を付与する遺伝子は、特に有用となり得る。このような遺伝子は報告されている（Ｓｔａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：６３１０−６３１４（ブロモキシニル抵抗性ニトリラーゼ遺伝子）；及びＳａｔｈａｓｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：２１８８（ＡＨＡＳイミダゾリノン抵抗性遺伝子）。さらに、本明細書に開示する遺伝子は、細菌又は植物細胞の形質転換を評価するためのマーカとして有用である。植物、植物器官（例えば、葉、幹、根など）、種子、植物細胞、むかご、又はその子孫におけるトランスジーンの存在を検出するための方法は、当分野において公知である。一実施形態において、トランスジーンの存在は、殺虫活性について試験することにより検出される。
【００９４】
殺虫性タンパク質を発現する稔性植物を殺虫活性について試験して、最適活性を示す植物をその後の育種のために選択することができる。害虫活性についてアッセイするための方法は、当分野において利用可能である。一般に、タンパク質を混合した後、摂食アッセイに用いる。例えば、Ｍａｒｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．ｏｆ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ  ７８：２９０−２９３を参照されたい。
【００９５】
本発明は、限定するものではないが、単子葉及び双子葉植物などの任意の植物種の形質転換に用いることができる。目的とする植物の例には、限定はしないが、以下：トウモロコシ（ｃｏｒｎ）（トウモロコシ（ｍａｉｚｅ））、モロコシ、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科の植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、コメ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、オオムギ、及びナタネ、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種、ムラサキウマゴヤシ、ライムギ、キビ、ベニバナ、ピーナッツ、サツマイモ、キャッサバ、コーヒー、ココナッツ、パイナップル、柑橘類の木、ココア、茶、バナナ、アボカド、イチジク、グァバ、マンゴー、オリーブ、パパイア、カシュー、マカダミヤ、アーモンド、オートムギ、野菜、観葉植物、及び球果植物が含まれる。
【００９６】
野菜としては、限定はしないが、トマト、レタス、インゲンマメ、ライマメ、エンドウ、並びにキュウリ属（Ｃｕｒｃｕｍｉｓ）のメンバー（例えば、キュウリ、カンタロープ、及びマスクメロンなど）が挙げられる。観葉植物としては、限定はしないが、アザレア、アジサイ、ハイビスカス、バラ、チューリップ、スイセン、ペチュニア、カーネーション、ポインセチア、及びキクが挙げられる。好ましくは、本発明の植物は、穀物植物である（例えば、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科の植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、コメ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、オオムギ、ナタネなど）。
【００９７】
害虫防除における使用
害虫防除において、又は殺虫剤として他の生物を操作する上で、本発明のヌクレオチド配列又はその変異体を含む株を使用する一般的な方法は、当分野において公知である。例えば、米国特許第５，０３９，５２３号明細書及び欧州特許出願第０４８０７６２Ａ２号明細書を参照されたい。
【００９８】
本発明のヌクレオチド配列、若しくはその変異体を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株、又は本発明の殺虫性遺伝子及びタンパク質を含むように遺伝子的に改変された微生物を、農業穀物及び生産物を害虫から保護するために使用することができる。本発明の一態様において、細胞を標的害虫の環境に適用した場合に細胞中で生産された毒素の活性を延長する試薬を用いて、毒素（殺虫剤）を産生する生物の全細胞、すなわち、溶解していない細胞を処理する。
【００９９】
あるいは、殺虫性遺伝子を細胞宿主に導入することによって、殺虫剤を産生させる。殺虫性遺伝子の発現によって、直接的又は間接的に、殺虫剤が細胞内に産生及び維持される。本発明の一態様では、これらの細胞を、細胞が標的害虫の環境に適用されると、細胞中に産生される毒素の活性を持続させる条件下で処理する。こうして得られた産物は、毒素の毒性を保持する。続いて、標的害虫を宿している環境、例えば、土壌、水、及び植物の枝葉への適用のために、これらの天然に封入された殺虫剤を従来の技術に従って製剤化することができる。例えば、欧州特許出願公開第Ａ０１９２３１９号明細書、及びそこに引用される文献を参照されたい。これ以外にも、例えば、得られた材料を殺虫剤として適用できるようにするために、本発明の遺伝子を発現する細胞を製剤化することも可能である。
【０１００】
本発明の活性成分は、通常、組成物の形態で適用され、他の化合物と共に、同時に又は連続的に、処置しようとする穀物区域又は植物に適用することができる。これらの化合物は、肥料、除草剤、抗凍結剤、界面活性剤、洗浄剤、殺虫性石鹸、ドーマントオイル（ｄｏｒｍａｎｔ  ｏｉｌｓ）、ポリマー、及び／又は１回の製剤の適用後に標的区域の長期投与を可能にする徐放性もしくは生分解性担体製剤であってよい。それらはまた、必要に応じて、別の農学的に許容される担体、界面活性剤、又は製剤の分野で慣用的に使用される適用を促進する補助剤と一緒に、選択的除草剤、化学的殺虫剤、殺ウイルス剤、殺微生物剤、殺アメーバ剤、殺虫剤、殺真菌剤、殺菌剤、殺線虫剤、軟体類駆除剤、又はこれらの調製物のいくつかの混合物であってもよい。好適な担体及び補助剤は、固体又は液体であってよく、これらは、製剤技術で通常使用される物質、例えば、天然もしくは再生鉱物、溶媒、分散剤、湿潤剤、粘着剤、結合剤又は肥料に相当する。同様に、製剤は、標的害虫による殺虫性製剤の摂食又は摂取を可能にするように、摂食可能な「餌」として調製するか、又は「捕虫器」として形成してもよい。
【０１０１】
本発明の細菌株によって産生される殺虫性タンパク質の少なくとも１つを含む、本発明の活性成分又は本発明の農薬組成物を適用する方法としては、葉への適用、種子コーティング及び土壌への適用がある。適用回数及び適用の割合は、対応する害虫による外寄生の強度に応じて変動する。
【０１０２】
前記組成物は、粉末、粉塵、ペレット、顆粒、スプレー、乳濁剤、コロイド、溶液などとして製剤化することができ、前記ポリペプチドを含む細胞培養物の乾燥、凍結乾燥、均質化、抽出、ろ過、遠心分離、沈降、又は濃縮のような従来の手段によって調製することができる。少なくとも１種の前記殺虫性ポリペプチドを含むこのような組成物の全てにおいて、前記ポリペプチドは、約１重量％〜約９９重量％の濃度で存在し得る。
【０１０３】
チョウ目、カメムシ目、ハエ目、又は甲虫目の害虫は、所与の区域において本発明の方法により死滅させるか、若しくは数を減少させる、又は被害を受けやすい害虫による外寄生を防ぐために環境区域に予防的に適用することができる。好ましくは、害虫に、殺虫有効量のポリペプチドを摂取させるか、又はそれと接触させる。「殺虫有効量」とは、少なくとも１種の害虫を死滅させるか、又は害虫の増殖、摂食、若しくは正常な生理学的発達を顕著に抑制することができる殺虫剤の量を意味する。この量は、防除しようとする特定の標的害虫、処置しようとする特定の環境、場所、植物、穀物、又は農業用地、環境条件、並びに殺虫に有効なポリペプチド組成物の適用の方法、割合、濃度、安定性及び量などの因子に応じて変動し得る。製剤はまた、気候条件、環境への配慮、及び／又は適用頻度及び／又は害虫外寄生の重度に関しても変わり得る。
【０１０４】
本明細書に記載する殺虫性組成物は、細菌細胞、結晶及び／若しくは胞子懸濁液、又は単離タンパク質成分のいずれかを、要望の農業的に許容される担体と共に製剤化することによって作製することができる。組成物は、投与前に、凍結乾燥、フリーズドライ、乾燥などの適切な手段で、又は水性担体、媒体若しくは適切な希釈剤、例えば、食塩水又は他のバッファー中で製剤化することができる。製剤化された組成物は、粉塵若しくは顆粒材料、あるいは油（植物油若しくは鉱物油）、又は水もしくは油／水乳濁剤中の懸濁液として、又は湿潤可能な粉末として、又は農業適用に適した任意の他の担体材料と組み合わせた形態であってよい。好適な農学的担体は、固体又は液体であってよく、当分野において公知である。用語「農学的に許容される担体」は、農薬製剤技術に通常用いられる全ての補助剤、不活性成分、分散剤、界面活性剤、粘着剤、結合剤などを含み；これらは、農薬製剤分野の当業者には周知である。製剤は、１種以上の固体又は液体補助剤と混合してもよく、従来の製剤技術を用いて、適切な補助剤と共に、殺虫性組成物を例えば、均一に混合、ブレンド及び／又は粉砕するなどの様々な手段によって調製することができる。適切な製剤及び適用法は、米国特許第６，４６８，５２３号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１０５】
「害虫」は、限定はしないが、昆虫、真菌、細菌、線虫、ダニ、マダニなどを含む。昆虫害虫は、以下：甲虫目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、ハエ目（Ｄｉｐｔｅｒａ）、ハチ目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）、チョウ目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）、ハジラミ目（Ｍａｌｌｏｐｈａｇａ）、ヨコバイ亜類（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ）、カメムシ目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）、バッタ目（Ｏｒｔｈｒｏｐｔｅｒａ）、アザミウマ目（Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ）、ハサミムシ目（Ｄｅｒｍａｐｔｅｒａ）、シロアリ目（Ｉｓｏｐｔｅｒａ）、シラミ目（Ａｎｏｐｌｕｒａ）、ノミ目（Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ）、トビケラ目（Ｔｒｉｃｈｏｐｔｅｒａ）など、特に甲虫目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、チョウ目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）及びハエ目（Ｄｉｐｔｅｒａ）から選択される昆虫を含む。
【０１０６】
甲虫目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）は、オサムシ（Ａｄｅｐｈａｇａ）及びカブトムシ（Ｐｏｌｙｐｈａｇａ）亜目を含む。オサムシ（Ａｄｅｐｈａｇａ）亜目は、オサムシ（Ｃａｒａｂｏｉｄｅａ）及びミズスマシ（Ｇｙｒｉｎｏｉｄｅａ）上科を含み、またカブトムシ（Ｐｏｌｙｐｈａｇａ）亜目は、ガムシ（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｏｉｄｅａ）、ハネカクシ（Ｓｔａｐｈｙｌｉｎｏｉｄｅａ）、ジョウカイボン（Ｃａｎｔｈａｒｏｉｄｅａ）、カッコウムシ（Ｃｌｅｒｏｉｄｅａ）、コメツキムシ（Ｅｌａｔｅｒｏｉｄｅａ）、ナガフナガタムシ（Ｄａｓｃｉｌｌｏｉｄｅａ）、ドロムシ（Ｄｒｙｏｐｏｉｄｅａ）、マルトゲムシ（Ｂｙｒｒｈｏｉｄｅａ）、ヒダラムシ（Ｃｕｃｕｊｏｉｄｅａ）、ツチハンミョウ（Ｍｅｌｏｉｄｅａ）、モルデロイデア（Ｍｏｒｄｅｌｌｏｉｄｅａ）、ゴミムシダマシ（Ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｏｉｄｅａ）、ナガシンクイムシ（Ｂｏｓｔｒｉｃｈｏｉｄｅａ）、コガネムシ（Ｓｃａｒａｂａｅｏｉｄｅａ）、カミキリムシ（Ｃｅｒａｍｂｙｃｏｉｄｅａ）、ハムシ（Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｏｉｄｅａ）、及びゾウリムシ（Ｃｕｒｃｕｌｉｏｎｏｉｄｅａ）上科を含む。オサムシ（Ｃａｒａｂｏｉｄｅａ）上科は、ハンミョウ（Ｃｉｃｉｎｄｅｌｉｄａｅ）、オサムシ（Ｃａｒａｂｉｄａｅ）、及び水カブトムシ（Ｄｙｔｉｓｃｉｄａｅ）科を含む。ミズスマシ（Ｇｙｒｉｎｏｉｄｅａ）上科は、ミズスマシ（Ｇｙｒｉｎｉｄａｅ）科を含む。ガムシ（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｏｉｄｅａ）上科は、ガムシ（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｄａｅ）科を含む。ハネカクシ（Ｓｔａｐｈｙｌｉｎｏｉｄｅａ）上科は、シデムシ（Ｓｉｌｐｈｉｄａｅ）及びハネカクシ（Ｓｔａｐｈｙｌｉｎｉｄａｅ）科を含む。ジョウカイボン（Ｃａｎｔｈａｒｏｉｄｅａ）上科は、ジョウカイボン（Ｃａｎｔｈａｒｉｄａｅ）及びホタル（Ｌａｍｐｙｒｉｄａｅ）科を含む。カッコウムシ（Ｃｌｅｒｏｉｄｅａ）上科は、カッコウムシ（Ｃｌｅｒｉｄａｅ）及びカツオブシムシ（Ｄｅｒｍｅｓｔｉｄａｅ）科を含む。コメツキムシ（Ｅｌａｔｅｒｏｉｄｅａ）上科は、コメツキムシ（Ｅｌａｔｅｒｉｄａｅ）及びタマムシ（Ｂｕｐｒｅｓｔｉｄａｅ）科を含む。ヒダラムシ（Ｃｕｃｕｊｏｉｄｅａ）上科は、テントウムシ（Ｃｏｃｃｉｎｅｌｌｉｄａｅ）科を含む。ツチハンミョウ（Ｍｅｌｏｉｄｅａ）上科は、ツチハンミョウ（Ｍｅｌｏｉｄａｅ）科を含む。ゴミムシダマシ（Ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｏｉｄｅａ）上科は、ゴミムシダマシ（Ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｄａｅ）科を含む。コガネムシ（Ｓｃａｒａｂａｅｏｉｄｅａ）上科は、クロツヤムシ（Ｐａｓｓａｌｉｄａｅ）及びコガネムシ（Ｓｃａｒａｂａｅｉｄａｅ）科を含む。カミキリムシ（Ｃｅｒａｍｂｙｃｏｉｄｅａ）上科は、カミキリムシ（Ｃｅｒａｍｂｙｃｉｄａｅ）科を含む。ハムシ（Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｏｉｄｅａ）上科は、ハムシ（Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｉｄａｅ）科を含む。ゾウリムシ（Ｃｕｒｃｕｌｉｏｎｏｉｄｅａ）上科は、ゾウリムシ（Ｃｕｒｃｕｌｉｏｎｉｄａｅ）及びキクイムシ（Ｓｃｏｌｙｔｉｄａｅ）科を含む。
【０１０７】
ハエ目（Ｄｉｐｔｅｒａ）は、長角亜目（Ｎｅｍａｔｏｃｅｒａ）、短角亜目（Ｂｒａｃｈｙｃｅｒａ）及び還縫亜目（Ｃｙｃｌｏｒｒｈａｐｈａ）を含む。長角亜目（Ｎｅｍａｔｏｃｅｒａ）は、ガガンボ（Ｔｉｐｕｌｉｄａｅ）、チョウバエ（Ｐｓｙｃｈｏｄｉｄａｅ）、カ（Ｃｕｌｉｃｉｄａｅ）、ヌカカ（Ｃｅｒａｔｏｐｏｇｏｎｉｄａｅ）、ユスリカ（Ｃｈｉｒｏｎｏｍｉｄａｅ）、ブユ（Ｓｉｍｕｌｉｉｄａｅ）、ケバエ（Ｂｉｂｉｏｎｉｄａｅ）、及びタマバエ（Ｃｅｃｉｄｏｍｙｉｉｄａｅ）科を含む。短角亜目（Ｂｒａｃｈｙｃｅｒａ）は、ミズアブ（Ｓｔｒａｔｉｏｍｙｉｄａｅ）、アブ（Ｔａｂａｎｉｄａｅ）、ツルギアブ（Ｔｈｅｒｅｖｉｄａｅ）、ムシヒキアブ（Ａｓｉｌｉｄａｅ）、ムシヒキアブモドキ（Ｍｙｄｉｄａｅ）、ツリアブ（Ｂｏｍｂｙｌｉｉｄａｅ）、及びアシナガバエ（Ｄｏｌｉｃｈｏｐｏｄｉｄａｅ）科を含む。還縫亜目（Ｃｙｃｌｏｒｒｈａｐｈａ）は、無額嚢群（Ａｓｃｈｉｚａ）及び無額嚢群（Ａｓｃｈｉｚａ）門を含む。無額嚢群（Ａｓｃｈｉｚａ）門は、ノミバエ（Ｐｈｏｒｉｄａｅ）、ハナアブ（Ｓｙｒｐｈｉｄａｅ）、及びメバエ（Ｃｏｎｏｐｉｄａｅ）科を含む。無額嚢群（Ａｓｃｈｉｚａ）門は、無弁翅（Ａｃａｌｙｐｔｒａｔａｅ）及び弁翅（Ｃａｌｙｐｔｒａｔａｅ）節を含む。無弁翅（Ａｃａｌｙｐｔｒａｔａｅ）節は、マダラバエ（Ｏｔｉｔｉｄａｅ）、ミバエ（Ｔｅｐｈｒｉｔｉｄａｅ）、ハモグリバエ（Ａｇｒｏｍｙｚｉｄａｅ）、及びショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉｄａｅ）科を含む。弁翅（Ｃａｌｙｐｔｒａｔａｅ）節は、シラミバエ（Ｈｉｐｐｏｂｏｓｃｉｄａｅ）、ヒツジバエ（Ｏｅｓｔｒｉｄａｅ）、ヤドリバエ（Ｔａｃｈｉｎｉｄａｅ）、ハナバエ（Ａｎｔｈｏｍｙｉｉｄａｅ）、イエバエ（Ｍｕｓｃｉｄａｅ）、クロバエ（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒｉｄａｅ）、及びニクバエ（Ｓａｒｃｏｐｈａｇｉｄａｅ）科を含む。
【０１０８】
チョウ目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）は、アゲハチョウ科（Ｐａｐｉｌｉｏｎｉｄａｅ）、シロチョウ科（Ｐｉｅｒｉｄａｅ）、シジミチョウ科（Ｌｙｃａｅｎｉｄａｅ）、タテハチョウ科（Ｎｙｍｐｈａｌｉｄａｅ）、マダラチョウ科（Ｄａｎａｉｄａｅ）、ジャノメチョウ科（Ｓａｔｙｒｉｄａｅ）、セセリチョウ科（Ｈｅｓｐｅｒｉｉｄａｅ）、スズメガ科（Ｓｐｈｉｎｇｉｄａｅ）、ヤママユガ科（Ｓａｔｕｒｎｉｉｄａｅ）、シャクガ科（Ｇｅｏｍｅｔｒｉｄａｅ）、ヒトリガ科（Ａｒｃｔｉｉｄａｅ）、ヤガ科（Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ）、ドクガ科（Ｌｙｍａｎｔｒｉｉｄａｅ）、スカシバガ科（Ｓｅｓｉｉｄａｅ）及びヒロズコガ科（Ｔｉｎｅｉｄａｅ）を含む。
【０１０９】
線虫は、ヘテロデラ属（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ）種、メロイドジン属（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）種、及びグロボデラ属（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ）種を含むネコブ、シスト、及びネグサレ線虫などの寄生性線虫を含み、特に、限定はしないが、ヘテロデラ・グリシン（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ）（ダイズシスト線虫）；ヘテロデラ・シャクチイ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｓｃｈａｃｈｔｉｉ）（ビートシスト線虫）；ヘテロデラ・アベナエ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ａｖｅｎａｅ）（穀類シスト線虫）；並びにグロボデラ・ロストシエンシス（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ  ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）及びグロボデラ・パイリダ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ  ｐａｉｌｉｄａ）（ジャガイモシスト線虫）などのシスト線虫のメンバーを含む。ネグサレ線虫は、プラティレンクス属（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）種を含む。
【０１１０】
半翅類（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａｎ）（カメムシ目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）、ヨコバイ亜目（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ）、又はカメムシ亜目（Ｈｅｔｅｒｏｐｔｅｒａ）と称される種を含む）の害虫は、限定はしないが、以下を含む：メクラカメムシ科（Ｌｙｇｕｓ）種、例えば、ウエスターン・ターニシュド・プラントバッグ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｔａｒｎｉｓｈｅｄ  ｐｌａｎｔ  ｂｕｇ）（リグス・ヘスペルス（Ｌｙｇｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｕｓ））、メクラカメムシ（リグス・リネオラリス（Ｌｙｇｕｓ  ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ））、及びミドリメクラカメムシ（リグス・エリスス（Ｌｙｇｕｓ  ｅｌｉｓｕｓ））；アブラムシ、例えば、モモアカアブラムシ（ミズス・ペルシカエ（Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ））、ワタアブラムシ（アフィス・ゴシピ（Ａｐｈｉｓ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、チェリーアブラムシ若しくはブラックチェリーアブラムシ（ミズス・セラシ（Ｍｙｚｕｓ  ｃｅｒａｓｉ））、ダイズアブラムシ（アフィス・グリシンズ・マツムラ（Ａｐｈｉｓ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ  Ｍａｔｓｕｍｕｒａ））；トビイロウンカ（ニラパルバタ・ルゲンス（Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ  ｌｕｇｅｎｓ））、及びツマグロヨコバイ（ネホティックス属種（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ  ｓｐｐ．））；並びにカメムシ、例えば、ミドリカメムシ（アクロステヌム・ヒラレ（Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ  ｈｉｌａｒｅ））、クサギカメムシ（ハリオモルファ・ハリス（Ｈａｌｙｏｍｏｒｐｈａ  ｈａｌｙｓ））、ミナミアオカメムシ（ネザラ・ビリデュラ（Ｎｅｚａｒａ  ｖｉｒｉｄｕｌａ））、イネカメムシ（エバルス・プナクス（Ｏｅｂａｌｕｓ  ｐｕｇｎａｘ））、フォレストバグ（ｆｏｒｅｓｔ  ｂｕｇ）（ペンタトマ・ルフィペス（Ｐｅｎｔａｔｏｍａ  ｒｕｆｉｐｅｓ））、ヨーロッパカメムシ（ラフィガステル・ヌブロサ（Ｒｈａｐｈｉｇａｓｔｅｒ  ｎｅｂｕｌｏｓａ））、及びカメムシ（トロイラス・ルリダス（Ｔｒｏｉｌｕｓ  ｌｕｒｉｄｕｓ））。
【０１１１】
主要な作物についての本発明の昆虫害虫には以下が含まれる：トウモロコシ：オストリニア・ヌビラリス（Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）（ヨーロッパアワノメイガ）；アグロティス・イプシロン（Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ）（タマナヤガ）；ヘリコベルパ・ゼア（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）（アメリカタバコガ）；スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（ヨトウガ）；ジアトラエア・グランジオセラ（Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）（南西部アワノメイガ）；エラスモパルプス・リグノセルス（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）（モロコシマダラメイガ）；ジアトラエア・サッカラリス（Ｄｉａｔｒａｅａ  ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）（シュガーケーンボーラー）；ジアブロティカ・ビルジフェラ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）（ウェスタンコーンルートワーム）；ジアブロティカ・ロンギコルニス・バルベリ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｌｏｎｇｉｃｏｒｎｉｓ  ｂａｒｂｅｒｉ）（ノーザンコーンルートワーム）；ジアブロティカ・ウンデシムプンクタタ・ホワルディ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ  ｈｏｗａｒｄｉ）（サザンコーンルートワーム）；メラノツス属（Ｍｅｌａｎｏｔｕｓ）種（ワイヤーワーム）；シクロセファラ・ボレアリス（Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ  ｂｏｒｅａｌｉｓ）（ノーザンマスクドコガネムシ（ホワイトグラブ））；シクロセファラ・イムマクラタ（Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ  ｉｍｍａｃｕｌａｔａ）（サザンマスクドコガネムシ（ホワイトグラブ））；ポピリア・ジャポニカ（Ｐｏｐｉｌｌｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）（マメコガネ）；カエトクネマ・プリカリア（Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ
ｐｕｌｉｃａｒｉａ）（トウモロコシノミハムシ）；スフェノフォルス・マイディス（Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ  ｍａｉｄｉｓ）（トウモロコシゾウムシ）；ロパロシフム・マイディス（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ  ｍａｉｄｉｓ）（トウモロコシ葉アブラムシ）；アヌラフィス・マイディラディシス（Ａｎｕｒａｐｈｉｓ  ｍａｉｄｉｒａｄｉｃｉｓ）（トウモロコシ根アブラムシ）；アメリカコバネナガカメムシ（Ｂｌｉｓｓｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ）（チンチバグ（ｃｈｉｎｃｈ  ｂｕｇ））；メラノプルス・フェムルブルム（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ）（アカアシバッタ）；メラノプルス・サングイニペス（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ）（移動性バッタ）；ヒレミア・プラチュラ（Ｈｙｌｅｍｖａ  ｐｌａｔｕｒａ）（タネバエ）；アグロミザ・パルビコルニス（Ａｇｒｏｍｙｚａ  ｐａｒｖｉｃｏｒｎｉｓ）（トウモロコシ斑点モグリバエ）；アナフォトリプス・オブスクルス（Ａｎａｐｈｏｔｈｒｉｐｓ  ｏｂｓｃｒｕｒｕｓ）（アザミウマ）；ソレノプシス・ミレスタ（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｍｉｌｅｓｔａ）（盗賊アリ）；テトラニクス・ウルチカエ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｕｒｔｉｃａｅ）（ナミハダニ）；
モロコシ：キロ・パルテルス（Ｃｈｉｌｏ  ｐａｒｔｅｌｌｕｓ）（ソルガムボーラー）；スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（ツマジロクサヨトウ）；スポドプテラ・コスミオイデス（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｃｏｓｍｉｏｉｄｅｓ）；スポドプテラ・エリダニア（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｒｉｄａｎｉａ）；ヘリコベルパ・ゼア（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）（アメリカタバコガ）；エラスモパルプス・リグノセルス（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）（モロコシマダラメイガ）；フェルチア・サブテラネア（Ｆｅｌｔｉａ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）（グラニュレートカットワーム）；フィロファガ・クリニタ（Ｐｈｙｌｌｏｐｈａｇａ  ｃｒｉｎｉｔａ）（ホワイトグラブ）；エレオデス（Ｅｌｅｏｄｅｓ）、コノデルス（Ｃｏｎｏｄｅｒｕｓ）及びアエオルス属（Ａｅｏｌｕｓ）種（ワイヤーワーム）；オウレマ・メラノプス（Ｏｕｌｅｍａ  ｍｅｌａｎｏｐｕｓ）（穀類のハムシ）；カエトクネマ・プリカリア（Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ  ｐｕｌｉｃａｒｉａ）（トウモロコシノミハムシ）；スフェノフォルス・マイディス（Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ  ｍａｉｄｉｓ）（トウモロコシゾウムシ）；ロパロシフム・マイディス（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ
ｍａｉｄｉｓ）（トウモロコシ葉アブラムシ）；サイファ・フラヴァ（Ｓｉｐｈａ  ｆｌａｖａ）（キイロサトウキビアブラムシ）；アメリカコバネナガカメムシ（Ｂｌｉｓｓｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ）（チンチバグ）；ソルガムタマバエ（Ｃｏｎｔａｒｉｎｉａ  ｓｏｒｇｈｉｃｏｌａ）（ソルガムミッジ）；テトラニクス・キナバリヌス（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）（ニセナミハダニ）；テトラニクス・ウルチカエ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｕｒｔｉｃａｅ）（ナミハダニ）；
コムギ：シューダレチア・ウニプンクタタ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｕｎｉｐｕｎｃｔａｔａ）（アーミーワーム）；スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（ツマジロクサヨトウ）；エラスモパルプス・リグノセルス（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）（モロコシマダラメイガ）；アグロチス・オルトゴニア（Ａｇｒｏｔｉｓ  ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ）（ウェスタンカットワーム）；エラスモパルプス・リグノセルス（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）（モロコシマダラメイガ）；オウレマ・メラノプス（Ｏｕｌｅｍａ  ｍｅｌａｎｏｐｕｓ）（穀類のハムシ）；ヒペラ・プンクタタ（Ｈｙｐｅｒａ  ｐｕｎｃｔａｔａ）（クローバーゾウムシ）；ジュウイチホシウリハムシ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ  ｈｏｗａｒｄｉ）（サザンコーンルートワーム）；ロシアコムギアブラムシ；ムギミドリアブラムシ（Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）（グリーンバグ）；ムギヒゲナガアブラムシ（Ｍａｃｒｏｓｉｐｈｕｍ  ａｖｅｎａｅ）（イギリス穀類アブラムシ）；メラノプルス・フェムルブルム（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ）（アカアシバッタ）；メラノプルス・ディフェレンチアリス（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ）（ディファレンシャルグラスホッパー）；メラノプルス・サングイニペス（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ）（移動性バッタ）；マイエチオラ・デストラクター（Ｍａｙｅｔｉｏｌａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）（ヘシアンバエ）；シトディプロシス・モセラナ（Ｓｉｔｏｄｉｐｌｏｓｉｓ
ｍｏｓｅｌｌａｎａ）（ムギアカタマバエ）；メロミザ・アメリカーナ（Ｍｅｒｏｍｙｚａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）（ムギキモグリバエ）；ヒレミア・コアルクタタ（Ｈｙｌｅｍｙａ  ｃｏａｒｃｔａｔａ）（コムギハナアブ）；フランクリニエラ・フスカ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ  ｆｕｓｃａ）（タバコアザミウマ）；ケフス・シンクトゥス（Ｃｅｐｈｕｓ  ｃｉｎｃｔｕｓ）（ムギクキハバチ）；チューリップサビダニ（Ａｃｅｒｉａ  ｔｕｌｉｐａｅ）（ムギカールマイト（ｗｈｅａｔ  ｃｕｒｌ  ｍｉｔｅ））；
ヒマワリ：スレイマ・ヘリアンサナ（Ｓｕｌｅｉｍａ  ｈｅｌｉａｎｔｈａｎａ）（サンフラワーバッドモス（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ  ｂｕｄ  ｍｏｔｈ）；ホメオソマ・エレクテルム（Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ  ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ）（サンフラワーモス）；ジゴグラーマ・エクスクラマチオニス（ｚｙｇｏｇｒａｍｍａ  ｅｘｃｌａｍａｔｉｏｎｉｓ）（サンフラワービートル）；ボチルス・ギボスス（Ｂｏｔｈｙｒｕｓ  ｇｉｂｂｏｓｕｓ）（キャロットビートル）；ネオラシオプテラ・マートフェルドティアナ（Ｎｅｏｌａｓｉｏｐｔｅｒａ  ｍｕｒｔｆｅｌｄｔｉａｎａ）（サンフラワーシードミッジ）；
ワタ：ヘリオチス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）（コットンバッドワーム）；ヘリコベルパ・ゼア（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）（コットンボールワーム）；シロイチモジヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ）（ビートアワヨトウ）；ワタアカミムシガ（Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ）（ピンクボールワーム）；アントノムス・グランディス（Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）（ワタミゾウムシ）；アフィス・ゴシピ（Ａｐｈｉｓ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）（ワタアブラムシ）；シューダトモスケリス・セリアツス（Ｐｓｅｕｄａｔｏｍｏｓｃｅｌｉｓ  ｓｅｒｉａｔｕｓ）（ワタノミハムシ）；トリアレウロデス・アブチロネア（Ｔｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ  ａｂｕｔｉｌｏｎｅａ）（バンデッドウィングド・ホワイトフライ（ｂａｎｄｅｄｗｉｎｇｅｄ  ｗｈｉｔｅｆｌｙ））；リグス・リネオラリス（Ｌｙｇｕｓ  ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ）（ミドリメクラカメムシ）；メラノプルス・フェムルブルム（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ）（アカアシバッタ）；メラノプルス・ディフェレンチアリス（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ）（ディファレンシャルグラスホッパー）；トリプス・タバキ（Ｔｈｒｉｐｓ  ｔａｂａｃｉ）（タマネギアザミウマ）；フランクリンキエラ・フスカ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｋｉｅｌｌａ  ｆｕｓｃａ）（タバコアザミウマ）；テトラニクス・キナバリヌス（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）（ニセナミハダニ）；テトラニクス・ウルチカエ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｕｒｔｉｃａｅ）（ナミハダニ）；
コメ：ジアトラエア・サッカラリス（Ｄｉａｔｒａｅａ  ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）（シュガーケーンボーラー）；スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（ヨトウガ）；スポドプテラ・コスミオイデス（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ
ｃｏｓｍｉｏｉｄｅｓ）；スポドプテラ・エリダニア（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｒｉｄａｎｉａ）；ヘリコベルパ・ゼア（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）（アメリカタバコガ）；コラスピス・ブルネア（Ｃｏｌａｓｐｉｓ  ｂｒｕｎｎｅａ）（ブドウコラスピス）；リゾホプトルス・オリゾフィルス（Ｌｉｓｓｏｒｈｏｐｔｒｕｓ  ｏｒｙｚｏｐｈｉｌｕｓ）（イネミズゾウムシ）；シトフィルス・オリザエ（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）（イネゾウムシ）；ネフォテティクス・ニグロピクツス（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ  ｎｉｇｒｏｐｉｃｔｕｓ）（イネヨコバイ）；アメリカコバネナガカメムシ（Ｂｌｉｓｓｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ）（チンチバグ）；アクロステルヌム・ヒラレ（Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ  ｈｉｌａｒｅ）（アオカメムシ）；チロ・スプレッサリス（Ｃｈｉｌｕ  ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ）（ニカメイガ）；
ダイズ：シュードプルシア・インクルデンス（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ  ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）（ダイズシャクトリムシ）；アンチカルシア・ゲムマタリス（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ  ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）（ハッショウマメイモムシ）；プラチペナ・スカブラ（Ｐｌａｔｈｙｐｅｎａ  ｓｃａｂｒａ）（グリーンクローバーワーム）；オストリニア・ヌビラリス（Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）（ヨーロッパアワノメイガ）；アグロティス・イプシロン（Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ）（タマナヤガ）；シロイチモジヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ）（ビートアワヨトウ）；スポドプテラ・コスミオイデス（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｃｏｓｍｉｏｉｄｅｓ）；スポドプテラ・エリダニア（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｒｉｄａｎｉａ）；ヘリオチス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）（コットンバッドワーム）；ヘリコベルパ・ゼア（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）（コットンボールワーム）；インゲンテントウ（Ｅｐｉｌａｃｈｎａ  ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ）（メキシカンビーンビートル）；ミズス・ペルシカエ（Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ）（モモアカアブラムシ）；ジャガイモヒメヨコバイ（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｆａｂａｅ）（ジャガイモリーフホッパー）；アクロステルヌム・ヒラレ（Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ  ｈｉｌａｒｅ）（アオカメムシ）；メラノプルス・フェムルブルム（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ）（アカアシバッタ）；メラノプルス・ディフェレンチアリス（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ）（ディファレンシャルグラスホッパー）；ヒレミア・プラチュラ（Ｈｙｌｅｍｙａ  ｐｌａｔｕｒａ）（タネバエ）；セリコトリプス・バリアビリス（Ｓｅｒｉｃｏｔｈｒｉｐｓ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）（ダイズアザミウマ）；トリプス・タバキ（Ｔｈｒｉｐｓ  ｔａｂａｃｉ）（タマネギアザミウマ）；テトラニクス・ツルケスタニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉ）（イチゴハダニ）；テトラニクス・ウルチカエ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｕｒｔｉｃａｅ）（ナミハダニ）；
オオムギ：オストリニア・ヌビラリス（Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）（ヨーロッパアワノメイガ）；アグロティス・イプシロン（Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ）（タマナヤガ）；ムギミドリアブラムシ（Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）（グリーンバグ）；アメリカコバネナガカメムシ（Ｂｌｉｓｓｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ）（チンチバグ）；アクロステルヌム・ヒラレ（Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ  ｈｉｌａｒｅ）（アオカメムシ）；エウスキスツス・セアヴス（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｓｅｒｖｕｓ）（チャイロカメムシ）；エウスキスツス・ヘロス（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｈｅｒｏｓ）（ネオトロピカルチャイロカメムシ）；デリア・プラチュラ（Ｄｅｌｉａ  ｐｌａｔｕｒａ）（タネバエ）；マイエチオラ・デストラクター（Ｍａｙｅｔｉｏｌａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）（ヘシアンバエ）；ペトロビア・ラテンス（Ｐｅｔｒｏｂｉａ  ｌａｔｅｎｓ）（チャイロコムギダニ）；
ナタネ：ブレビコリネ・ブラシカエ（Ｂｒｅｖｉｃｏｒｙｎｅ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）（ダイコンアブラムシ）；フィロトレタ・クルシフェラエ（Ｐｈｙｉｌｏｔｒｅｔａ  ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）（ノミハムシ）；マメストラ・コンフィグラタ（Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｃｏｎｊｇｕｒａｔａ）（ベルタアーミーワーム（Ｂｅｒｔｈａ  ａｒｍｙｗｏｒｍ））；プルテラ・キシロステラ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）（コナガ）；デリア属（Ｄｅｌｉａ）種（ネクイムシ）。
【０１１２】
植物収量を増加させるための方法
植物収量を増加させるための方法が提供される。この方法は、本明細書に開示する殺虫性ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを発現する植物又は植物細胞を用意するステップと、前記ポリペプチドが殺虫活性を有する害虫が外寄生する（又はそのような害虫による外寄生を被りやすい）畑に、前記植物又はその種子を栽培するステップを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、チョウ目（ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）、甲虫目（ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａｎ）、ハエ目（ｄｉｐｔｅｒａｎ）、カメムシ目（ｈｅｍｉｐｔｅｒａｎ）、及び線虫（ｎｅｍａｔｏｄｅ）類の害虫に対する殺虫活性を有し、前記畑は、チョウ目（ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）、甲虫目（ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａｎ）、ハエ目（ｄｉｐｔｅｒａｎ）、カメムシ目（ｈｅｍｉｐｔｅｒａｎ）、及び線虫（ｎｅｍａｔｏｄｅ）類の害虫によって外寄生されている。本明細書で定義するように、植物の「収量」は、植物によって産生されるバイオマスの品質及び／又は量を指す。「バイオマス」とは、任意の測定された植物産物を意味する。バイオマス産生の増加は、測定される植物産物の収量の任意の向上である。植物収量の増加は、いくつかの商業的な用途を有する。例えば、植物の葉のバイオマスの増加は、ヒト又は動物が消費するための葉野菜の収量を増加させ得る。さらに、葉バイオマスの増加を用いて、植物由来の医薬又は工業製品の生産量を増加させることができる。収量の増加は、殺虫性配列を発現しない植物と比較して、限定はしないが、少なくとも１％増加、少なくとも３％増加、少なくとも５％増加、少なくとも１０％増加、少なくとも２０％増加、少なくとも３０％増加、少なくとも５０％増加、少なくとも７０％増加、少なくとも１００％又はそれ以上の収量の増加を含む、任意の統計学的に有意な増加を含み得る。特定の方法において、植物収量は、本明細書に開示する殺虫性タンパク質を発現する植物の害虫抵抗性の改善によって増加する。殺虫性タンパク質の発現は、害虫が、外寄生又は摂食する能力の低下をもたらす。
【０１１３】
また、植物は、１種又は複数の除草剤、殺虫剤、若しくは殺真菌剤などの１種又は複数の化学組成物で処理することもできる。化学組成物の例を以下に挙げる：果物／野菜除草剤：アトラジン、ブロマシル、ジウロン、グリホサート、リヌロン、メトリブジン、シマジン、トリフルラリン、フルアジホップ、グルホシネート、ハロスルフロンゴワン、パラコート、プロピザミド、セトキシジム、ブタフェナシル、ハロスルフロン、インダジフラム；果物／野菜殺虫剤：アルジカルブ、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、カルバリル、カルボフラン、クロピリホス、シペルメトリン、デルタメトリン、アバメクチン、シフルトリン／ベータ−シフルトリン、エスフェンバレート、ラムダ−シハロトリン、アセキノシル、ビフェナゼート、メトキシフェノジド、ノバルロン、クロマトフェノジド、チアクロプリド、ジノテフラン、フルアクリピリム、スピロジクロフェン、ガンマ−シハロトリン、スピロメシフェン、スピノサド、リナキシピル、シアジピル、トリフルムロン、スピロテトラマト、イミダクロピリド、フルベンジアミド、チオジカルブ、メタフルミゾン、スルホキサフロル、シフルメトフェン、シアノピラフェン、クロチアニジン、チアメトキサム、スピノトラム、チオジカルブ、フロニカミド、メチオカルブ、エマメクチン安息香酸塩、インドキサカルブ、フェナミホス、ピリプロキシフェン、フェノブタチン−オキシド；果物／野菜殺真菌剤：アメトクトラジン、アゾキシストロビン、ベンチアバリカルブ、ボスカリド、カプタン、カルベンダジム、クロロタロニル、銅、シアゾファミド、シフルフェナミド、シモキサニル、シプロコナゾール、シプロジニル、ジフェノコナゾール、ジメトモルフ、ジチアノン、フェナミドン、フェンヘキサミド、フルアジナム、フルジオキソニル、フルオピコリド、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルキサピロキサド、フォルペット、ホセチル、イプロジオン、イプロバリカルブ、イソピラザム、クレソキシム−メチル、マンコゼブ、マンジプロパミド、メタラキシル／メフェノキサム、メチラム、メトラフェノン、ミクロブタニル、ペンコナゾール、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロパモカルブ、プロピコナゾール、プロピネブ、プロキナジド、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、ピリメタニル、キノキシフェン、スピロキサミン、イオウ、テブコナゾール、チオフェネート−メチル、トリフロキシストロビン；
穀類除草剤：
２．４−Ｄ、アミドスルフロン、ブロモキシニル、カルフェントラゾン−Ｅ、クロロトルロン、クロルスルフロン、クロジナホップ−Ｐ、クロピラリド、ジカンバ、ジクロホップ−Ｍ、ジフルフェニカン、フェノキサプロップ、フロラスラム、フルカルバゾン−ＮＡ、フルフェナセト、フルピロスルフロン−Ｍ、フルロキシピル、フルタモン、グリホセート、ヨードスルフロン、イオキシニル、イソプロツロン、ＭＣＰＡ、メソスルフロン、メトスルフロン、ペンジメタリン、ピノキサデン、プロポキシカルバゾン、プロスルホカルブ、ピロクススラム、スルホスルフロン、チフェンスルフロン、トラルコキシジム、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリフルラリン、トリトスルフロン；穀類殺真菌剤：アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、カルベンダジム、クロロタロニル、シフルフェナミド、シプロコナゾール、シプロジニル、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フェンプロピジン、フェンプロピモルフ、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルキンコナゾール、フルキサピロキサド、イソピラザム、クレソキシム−メチル、メトコナゾール、メトラフェノン、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロクロラズ、プロピコナゾール、プロキナジド、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、キノキシフェン、スピロキサミン、テブコナゾール、チオファネート−メチル、トリフロキシストロビン；穀類殺虫剤：ジメトエート、ラムダ−シハルトリン、デルタメトリン、アルファ−シペルメトリン、β−シフルトリン、ビフェントリン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、クロルフィリホス、ピリミカルブ、メチオカルブ、スルオキサフロル；トウモロコシ除草剤：アトラジン、アラクロル、ブロモキシニル、アセトクロル、ジカンバ、クロピラリド、（Ｓ−）ジメテナミド、グルホシネート、グリホセート、イソキサフルトール、（Ｓ−）メトラクロル、メソトリオン、ニコスルフロン、プリミスルフロン、リムスルフロン、スルコトリオン、ホラムスルフロン、トプラメゾン、テムボトリオン、サフルフェナシル、チエンカルバゾン、フルフェナセト、ピロキサスルフォン；トウモロコシ殺虫剤：カルボフラン、クロルピリホス、ビフェントリン、フィプロニル、イミダクロプリド、ラムダ−シハロトリン、テフルトリン、テルブホス、チアメトキサム、クロチアニジン、スピロメシフェン、フルベンジアミド、トリフルムロン、リナキシピル、デルタメトリン、チオジカルブ、β−シフルトリン、シペルメトリン、ビフェントリン、ルフェヌロン、テブピリンホス、エチプロール、シアジピル、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、アベルメクチン；トウモロコシ殺真菌剤：アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、シプロコナゾール、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フェニトロパン、フルオロピラム、フルオキサストロビン、フルキサピロキサド、イソピラザム、メトコナゾール、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロピコナゾール、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、テブコナゾール、トリフロキシストロビン；コメ除草剤：ブタクロル、プロパニル、アジムスル��ロン、ベンスルフロン、シハロホップ、ダイムロン、フェントラザミド、イマゾスルフロン、メフェナセト、オキサジクロメホン、ピラゾスルフロン、ピリブチカルブ、キンクロラク、チオベンカルブ、インダノファン、フルフェナセト、フェントラザミド、ハロスルフロン、オキサジクロメホン、ベンゾビシクロン、ピリフタリド、ペノキススラム、ビスピリバク、オキサジアルギル、エトキシスルフロン、プレチラクロル、メソトリオン、テフリルトリオン、オキサジアゾン、フェノキサプロプ、ピリミスルファン；コメ殺虫剤：ジアジノン、フェノブカルブ、ベンフラカルブ、ブプロフェジン、ジノテフラン、フィプロニル、イミダクロプリド、イソプロカルブ、チアクロプリド、クロマフェノジド、クロチアニジン、エチプロール、フルベンジアミド、リナキシピル、デルタメトリン、アセタミピリド、チアメトキサム、シアジピル、スピノサド、スピノトラム、エマメクチン−安息香酸塩、シペルメトリン、クロルピリホス、エトフェンプロックス、カルボフラン、ベンフラカルブ、スルホキサフロル；コメ殺真菌剤：アゾキシストロビン、カルベンダジム、カルプロパミド、ジクロシメト、ジフェノコナゾール、エジフェンホス、フェリムゾン、ゲンタマイシン、ヘキサコナゾール、ヒメキサゾール、イプロベンホス（ＩＢＰ）、イソプロチオラン、イソチアニル、カスガマイシン、マンコゼブ、メトミノストロビン、オリサストロビン、ペンシクロン、プロベナゾール、プロピコナゾール、プロピネブ、ピロキロン、テブコナゾール、チオファネート−メチル、チアジニル、トリシクロゾール、トリフロキシストロビン、バリダマイシン；ワタ除草剤：ジウロン、フルオメツロン、ＭＳＭＡ、オキシフルオルフェン、プロメトリン、トリフルラリン、カルフェントラゾン、クレトジム、フルアジホップ−ブチル、グリホセート、ノルフルラゾン、ペンジメタリン、ピリチオバク−ナトリウム、トリフロキシスルフロン、テプラロキシジム、グルホシネート、フルミオキサジン、チジアズロン；ワタ殺虫剤：アセフェート、アルジカルブ、クロルピリホス、シペルメトリン、デルタメトリン、アバメクチン、アセタミプリド、エマメクチン安息香酸塩、イミダクロプリド、インドキサカルブ、ラムダ−シハロトリン、スピノサド、チオジカルブ、ガンマ−シハロトリン、スピロメシフェン、ピリダリル、フロニカミド、フルベンジアミド、トリフルムロン、リナキシピル、ベータ−シフルトリン、スピロテトラマト、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、ジネトフラン、フルベンジアミド、シアジピル、スピノサド、スピノトラム、ガンマシハロトリン、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオルエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、チオジカルブ、アベルメクチン、フロニカミド、ピリダリル、スピロメシフェン、スルホキサフロル；ワタ殺真菌剤：アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、カルベンダジム、クロロタロニル、銅、シプロコナゾール、ジフェノコナゾール、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フェナミドン、フルアジナム、フルオロピラム、フルオロキサストロビン、フルキサピロキサド、イプロジオン、イソピラザム、イ��チアニル、マンコゼブ、マネブ、メトミノストロビン、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロピネブ、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、キントゼン、テブコナゾール、テトラコナゾール、チオファネート−メチル、トリフロキシストロビン；ダイズ除草剤：アラクロル、ベンタゾン、トリフルラリン、クロリムロン−エチル、クロランスラム−メチル、フェノキサプロプ、フォメサフェン、フルアジホップ、グリホセート、イマザモックス、イマザキン、イマゼタピル、（Ｓ−）メトラクロル、メトリブジン、ペンジメタリン、テプラロキシジム、グルホシネート；ダイズ殺虫剤：ラムダ−シハロトリン、メトミル、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、フルベンジアミド、リナキシピル、シアジピル、スピノサド、スピノトラム、エマメクチン−安息香酸塩、フィプロニル、エチプロール、デルタメトリン、β−シフルトリン、ガンマ及びラムダシハロトリン、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオルエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、スピロテトラマト、スピノジクロフェン、トリフルムロン、フロニカミド、チオジカルブ、ベータ−シフルトリン；ダイズ殺真菌剤：アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、カルベンダジム、クロロタロニル、銅、シプロコナゾール、ジフェノコナゾール、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フルアジナム、フルオロピラム、フルオキサストロビン、フルトリアホール、フルキサピロキサド、イソピラザム、イプロジオン、イソチアニル、マンコゼブ、マネブ、メトコナゾール、メトミノストロビン、ミクロブタニル、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロピコナゾール、プロピネブ、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、テブコナゾール、テトラコナゾール、チオファネート−メチル、トリフロキシストロビン；テンサイ除草剤：クロリダゾン、デスメジファム、エトフメセート、フェンメジファム、トリアレート、クロピラリド、フルアジホップ、レナシル、メタミトロン、キンメラック、シクロキシジム、トリフルスルフロン、テプラロキシジム、キザロホップ；テンサイ殺虫剤：イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、デルタメトリン、β−シフルトリン、ガンマ／ラムダシハロトリン、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオルエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、テフルトリン、リナキシピル、シナキシピル、フィプロニル、カルボフラン；カノーラ除草剤：クロピラリド、ジクロホップ、フルアジホップ、グルホシネート、グリホセート、メタザクロル、トリフルラリン、エタメトスルフロン、キンメラック、キザロホップ、クレトジム、テプラロキシジム；カノーラ殺真菌剤：アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、カルベンダジム、シプロコナゾール、ジフェノコナゾール、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フルアジナム、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルシラゾール、フルキサピロキサド、イプロジン、イソピラザム、メピコート−クロリド、メトコナゾール、メト���ノストロビン、パクロブトラゾール、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロクロラズ、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、テブコナゾール、チオファネート−メチル、トリフロキシストロビン、ビンクロゾリン；カノーラ殺虫剤：カルボフラン、チアクロプリド、デルタメトリン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、アセタミプリド、ジネトフラン、β−シフルトリン、ガンマ及びラムダシハロトリン、タウ−フルバレリエート（ｔａｕ−Ｆｌｕｖａｌｅｒｉａｔｅ）、エチプロール、スピノサド、スピノトラム、フルベンジアミド、リナキシピル、シアジピル、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオルエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン。
【０１１４】
本発明の遺伝子を別の植物に導入する方法
さらに、本発明の核酸を別の植物に導入する方法も提供される。本発明の核酸又はその断片を、循環選択、戻し交雑、系統育種、系統選択、集団選択、突然変異育種及び／又は遺伝子マーカ増強選択により第２植物に導入することができる。
【０１１５】
従って、一実施形態では、本発明の方法は、本発明の核酸を含む第１植物を第２植物と交雑させて、Ｆ１子孫植物を作製するステップと、本発明の核酸を含むＦ１子孫植物を選択するステップとを含む。本発明の方法はさらに、選択した子孫植物を本発明の核酸を含む第１植物と交雑させて、戻し交雑子孫植物を作製するステップ、及び本発明の核酸を含む戻し交雑子孫植物を選択するステップも含む。殺虫活性を評価する方法は、本明細書の他所に記載されている。本方法はさらに、これらのステップを１回又は複数回連続して繰り返すことにより、本発明の核酸を含む第２の、又はより高度の戻し交雑子孫植物を選択するステップを含んでもよい。
【０１１６】
要望される表現型についての植物の選択を含む任意の育種方法を本発明の方法に用いることができる。一部の実施形態では、Ｆ１植物を自家受粉させて、分離Ｆ２世代を作製してもよい。続いて、形質が育種集団内で同型接合又は一定となるまで、各世代（Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５など）において要望される表現型（例えば、殺虫活性）を呈示する個別の植物を選択することができる。
【０１１７】
第２植物は、除草剤耐性、昆虫耐性、干ばつ耐性、線虫防除、水利用効率、窒素利用効率、改善された栄養価、疾患抵抗性、改善された光合成、改善された繊維品質、ストレス耐性、改善された繁殖などの要望される形質を有する植物であり得る。第２植物は、本明細書の他所に記載されるようにエリートイベントであってもよい。
【０１１８】
様々な実施形態において、植物部分（全植物、植物器官（葉、茎、根など）、種子、植物細胞、むかご、胚など）を、得られた交雑から収穫し、川下使用（例えば、食品、飼料、生物燃料、油、粉、ミールなど）のために繁殖させるか、又は収集することができる。
【０１１９】
植物生産物を得る方法
本発明はまた、商品生産物を取得する方法にも関し、これは、本発明の核酸を含む穀物からの穀粒を収穫及び／又は粉砕して、商品生産物を取得するステップを含む。限定はしないが、以下：動物用飼料、商品、並びにヒトが消費するための食品としての使用、又はヒトが消費するための組成物及び商品における使用を意図する植物生産物及び副産物、特に、失活種子／穀粒製品、例えば、このような穀粒／種子から生産される（半）加工製品（前記製品は、全若しくは加工種子又は穀粒であるか、これを含む）、動物試料、トウモロコシ又はダイズミール、トウモロコシ又はダイズ粉、トウモロコシ、コーンスターチ、ダイズミール、ダイズ粉、フレーク、ダイズタンパク質濃縮物、ダイズタンパク質単離物、織り目加工のダイズタンパク質濃縮物、化粧品、ヘアケア製品、ダイズナッツバター、納豆、テンペ、加水分解ダイズタンパク質、ホイップクリーム、ショートニング、レチシン、食用丸ダイズ（未加工、炒り豆、又は枝豆）、ダイズヨーグルト、ダイズチーズ、豆腐、湯葉、並びに調理、脱穀、蒸し、焼成若しくはパーボイルド穀粒などを含む農学的及び商業的に重要な製品及び／又は組成物は、これらの製品及び組成物が、本明細書に記載するヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列を、このようなヌクレオチド配列を含有するあらゆる植物に特徴的であるものとして、検出可能な量で含有していれば、本発明の範囲に含まれるものとする。
【０１２０】
以下の実施例は、例示のために提供されるのであって、限定としてではない。
【実施例】
【０１２１】
実施例１．バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）由来の新規殺虫性遺伝子の発見
以下のステップを用いて、新規の殺虫性遺伝子を表１に列挙する細菌株から同定した：・菌株からの全ＤＮＡの調製。全ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡと染色体外ＤＮＡの両方を含有する。染色体外ＤＮＡは、以下：様々なサイズのプラスミド；ファージ染色体；他の非特定決定染色体外分子の一部又は全部の混合物を含有する。
・ＤＮＡの配列決定。全ＤＮＡをＮｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕａｎｃｉｎｇ法で配列決定する。
・相同性及び／又は他のコンピュータ解析による推定毒素遺伝子の同定。
・必要であれば、複数のＰＣＲ又はクローニング戦略（例えば、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ）の１つによる目的の遺伝子の配列完成。
【０１２２】
【表１】
2020058357.tif 000002
【０１２３】
【表２】
2020058357.tif 000003
【０１２４】
実施例２．発現及び精製
表２に記載するアミノ酸配列の各々をコードする遺伝子を、表１に列挙する対応株から、３’末端にＡｓｃＩリンカーを組み入れたプライマーを含むＨＥＲＣＵＬＡＳＥ（登録商標）ＩＩ融合ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅した。増幅したＰＣＲ産物をＡｓｃＩで消化し、ｐＭａｌＣ４Ｘベクターに連結した。クローンを配列決定により確認してから、プラスミドをＢｌ２１コンピテント細胞において形質転換した。単一コロニーをＬＢ培地に接種し、対数期まで３７℃で増殖させ、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて、２０℃で１８時間誘導した。精製タンパク質を１：５０比のＸａ因子で、室温にて一晩消化した。精製したタンパク質を標準的プロトコルに従い、選択した昆虫害虫に対するバイオアッセイに付した。結果を以下の表２に示す。害虫は表３に示し、表３の後に、スコアリングシステムを示す。
【０１２５】
【表３】
2020058357.tif 000004
【０１２６】
【表４】
2020058357.tif 000005
【０１２７】
発育阻害スコア：
０＝活性なし
１＝非均一発育阻害
２＝若干の均一発育阻害（対照の７５％のサイズ）
３＝強度の均一発育阻害（対照の７４〜２６％のサイズ）
４＝重度の均一発育阻害（対照の２５％未満のサイズ）
【０１２８】
死滅率スコア：
０＝活性なし
１＝２５％以下の死滅率
２＝５０％以下の死滅率
３＝７５％以下の死滅率
４＝７５％を超える死滅率
【０１２９】
実施例３．殺虫活性についての追加アッセイ
本発明のヌクレオチド配列を、それが殺虫性タンパク質を産生する能力について試験することができる。害虫に対して殺虫剤として作用する殺虫性タンパク質の能力は、一般に、いくつかの方法で評価される。当分野において公知の１つの方法は、摂食アッセイを実施するものである。このような摂食アッセイにおいて、害虫を、試験しようとする化合物を含む試料又は対照試料のいずれかに暴露する。多くの場合、これは、試験材料、又はこのような材料の適切な希釈液を、害虫が摂取する材料、例えば、人工食餌上に載せることによって行なわれる。試験材料は、液体、固体、又はスラリーから構成されるものであってよい。試験材料を前記表面に載せた後、乾燥させてよい。あるいは、試験材料を溶融した人工食餌と混合した後、アッセイチャンバに配分してもよい。アッセイチャンバは、例えば、カップ、皿、又はマイクロプレートのウェルであってもよい。
【０１３０】
吸引害虫（例えばアブラムシ）のためのアッセイは、試験材料の摂取が可能となるように、仕切り、理想的には吸引昆虫の吸引口部分によって突き通すことのできる部分によって、昆虫から試験材料を分離することを含み得る。多くの場合、試験材料は、試験化合物の摂取を促進するために、スクロースなどの摂食刺激剤と混合する。
【０１３１】
他のタイプのアッセイは、害虫の口、又は腸への試験材料のマイクロインジェクション、並びに、トランスジェニック植物の作製に続いて、害虫によるトランスジェニック植物に対する摂食能力試験を含み得る。植物試験は、通常消費される植物部分、例えば、葉に付着した小さなケージの単離、又は、昆虫を含むケージにおける全植物の単離を含み得る。
【０１３２】
害虫をアッセイするための他の方法及びアプローチは、当分野において公知であり、例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｅｉｓｌｅｒ，ｅｄｓ．（１９９２）Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  ｂｉｏａｓｓａｙｓ  ｗｉｔｈ  ａｒｔｈｒｏｐｏｄｓ．ＣＲＣ，Ｂｏｃａ
Ｒａｔｏｎ，ＦＬにみいだすことができる。あるいは、刊行物「Ａｒｔｈｒｏｐｏｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｔｅｓｔｓ」及び「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ」において、又は米国昆虫学会（Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）（ＥＳＡ）のメンバーによる論文によって、アッセイが一般的に記載されている。
【０１３３】
一部の実施形態では、本明細書に開示する殺虫性タンパク質の毒素領域をコードするＤＮＡ領域を、マルトース（Ｍａｌｔｏｓｅ）結合タンパク質（ＭＢＰ）をコードするｍａｌＥ遺伝子の後ろの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＭＡＬ−Ｃ４ｘにクローニングする。これらのインフレーム融合により、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてＭＢＰ−Ａｘｍｉ融合タンパク質の発現が達成される。
【０１３４】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のために、ＢＬ２１＊ＤＥ３を個々のプラスミドで形質転換する。単一コロニーを、カルベニシリン及びグルコースで補充したＬＢに接種した後、３７℃で一晩増殖させた。翌日、新しい培地に、一晩培養液の１％を接種した後、３７℃で対数増殖期まで増殖させる。続いて、培養液を、２０℃で一晩かけて、０．３ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘導する。各細胞ペレットを、２０ｍＭトリス−Ｃｌバッファー、ｐＨ７．４＋２００ｍＭ  ＮａＣｌ＋１ｍＭ  ＤＴＴ＋プロテアーゼ阻害剤中に懸濁させてから、超音波処理する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を用いて、融合タンパク質の発現を確認することができる。
【０１３５】
次に、全細胞遊離抽出液を、ＭＢＰ−ａｘｍｉ融合タンパク質のアフィニティ精製のための高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）に取り付けたアミロースカラムに流し込む。結合した融合タンパク質を、１０ｍＭマルトース溶液を用いて樹脂から溶出する。次に、精製済み融合タンパク質をＸａ因子又はトリプシンのいずれかで切断して、Ａｘｍｉタンパク質からアミノ末端ＭＢＰタグを除去した。タンパク質の切断及び可溶性をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定する。
【０１３６】
実施例４．植物発現のための遺伝子のベクター化
本発明の遺伝子の各コード領域を、植物における発現のために、適切なプロモータ及び終結配列と結合する。このような配列は当分野において公知であり、単子葉植物における発現用のコメアクチンプロモータ又はトウモロコシユビキチンプロモータ、双子葉植物における発現用のシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＵＢＱ３プロモータ又はＣａＭＶ３５Ｓプロモータ、及びｎｏｓ又はＰｉｎＩＩターミネータなどが挙げられる。プロモータ−遺伝子−ターミネータ構築物を作製及び確認するための技術は、当分野において公知である。
【０１３７】
本発明の一態様では、合成ＤＮＡ配列を設計及び作製する。これらの合成配列は、親配列と比較して、改変されたヌクレオチド配列を有するが、親配列と実質的に同一のタンパク質をコードする。
【０１３８】
本発明の別の態様では、得られるペプチドが、植物小器官、例えば、小胞体又はアポプラストをターゲティングするように、修飾した形態の合成遺伝子を設計する。融合タンパク質による植物小器官のターゲティングをもたらすことがわかっているペプチド配列は、当分野において公知である。例えば、当分野において、シロバナルーピン（Ｗｈｉｔｅ  Ｌｕｐｉｎ）のルピナス・アルブス（Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｌｂｕｓ）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＩＤ  ＧＩ：１４２７６８３８；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １２７：５９４−６０６）由来の酸性ホスファターゼ遺伝子のＮ末端領域は、異種タンパク質による小胞体のターゲティングをもたらすことがわかっている。得られる融合タンパク質が、Ｃ末端においてペプチドＮ末端−リシン−アスパラギン酸−グルタミン酸−ロイシン（すなわち、「ＫＤＥＬ」モチーフ（配列番号７５））を含む小胞体保持配列も含有するならば、この融合タンパク質は、小胞体をターゲティングするであろう。融合タンパク質が、Ｃ末端において小胞体ターゲティング配列を欠失しているならば、このタンパク質は、小胞体をターゲティングするが、最終的にはアポプラストに隔離されるであろう。
【０１３９】
このように、上記遺伝子は、本発明のアミノ酸配列のＮ末端に融合したシロバナルーピン（Ｗｈｉｔｅ  Ｌｕｐｉｎ）のルピナス・アルブス（Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｌｂｕｓ）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＩＤ  ＧＩ：１４２７６８３８，Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、前掲）由来の酸性ホスファターゼ遺伝子のＮ末端３１アミノ酸、並びにＣ末端におけるＫＤＥＬ（配列番号７５）配列を含む融合タンパク質をコードする。従って、得られるタンパク質は、植物細胞において発現されると、植物小器官をターゲティングすることが予測される。
【０１４０】
前述した植物発現カセットは、形質転換細胞及び組織の選択を補助するための適切な植物選択マーカと組み合わせて、植物形質転換ベクターに連結する。これらは、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介の形質転換からのバイナリーベクター又はエアロゾル若しくは微粒子銃形質転換用の単純なプラスミドベクターを含み得る。
【０１４１】
実施例５．ダイズ形質転換
ダイズ形質転換は、当分野では公知の方法、例えば、Ｐａｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２５：２０６により記載される方法を実質的に用い、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）媒介の形質転換ダイズハーフシード外植片を使用して記載されるものを用いて達成する。選択マーカとしてテンボトリオンを用いて、形質転換体を同定する。緑色のシュートの外観を観察し、除草剤イソキサフルトール又はテンボトリオンに対する耐性の指標として記録する。耐性トランスジェニックシュートは、イソキサフルトール又はテンボトリオンで処理しなかった野生型ダイズシュートと比較して、正常な緑化を示すのに対し、同量のイソキサフルトール又はテンボトリオンで処理した野生型ダイズシュートは、完全に漂白されるであろう。これは、ＨＰＰＤタンパク質の存在が、イソキサフルトール又はテンボトリオンなどのＨＰＰＤ阻害除草剤に対する耐性を可能にすることを示している。
【０１４２】
耐性緑色シュートを発根培地に移すか、又は移植する。根付いた小植物を馴化期間後に温室に移す。続いて、トランスジーンを含む植物に、ＨＰＰＤ阻害除草剤、例えば、硫酸アンモニウムメチルエステルナタネ油を補充した１００ｇＡＩ／ｈａのテンボトリオン又は３００ｇＡＩ／ｈａのメソトリオンを噴霧する。適用から１０日後、除草剤の適用による症状を評価し、同じ条件下で野生型植物に観察された症状と比較する。
【０１４３】
実施例６．ワタＴ０植物定着及び選択
ワタ形質転換を当分野では公知の方法、ＰＣＴ特許文献：国際公開第００／７１７３３号パンフレットに記載のものにある特に好ましい方法を用いて達成する。再生した植物を温室に移す。馴化期間後、十分に生育した植物に、ＨＰＰＤ阻害剤、例えば、硫酸アンモニウム及びメチルエステルナタネ油を補充した１００若しくは２００ｇＡＩ／ｈａのテンボトリオン当量を噴霧する。噴霧の適用から７日後、除草剤の処理による症状を評価し、同じ条件下で同じ処理に付した野生型ワタ植物に観察された症状と比較する。
【０１４４】
実施例７．本明細書に記載する殺虫性タンパク質を用いたトウモロコシ細胞の形質転換
トウモロコシの雌穂を受粉から８〜１２日後に収集する。胚を雌穂から単離するが、０．８〜１．５ｍｍサイズの胚が、形質転換での使用に好ましい。胚を、適切なインキュベーション培地、例えば、ＤＮ６２Ａ５Ｓ培地（３．９８ｇ／ＬのＮ６塩；１ｍＬ／Ｌ（１０００×ストック）のＮ６ビタミン；８００ｍｇ／ＬのＬ−アスパラギン；１００ｍｇ／ＬのＭｙｏ−イノシトール；１．４ｇ／ＬのＬ−プロリン；１００ｍｇ／Ｌのカザミノ酸；５０ｇ／Ｌのスクロース；１ｍＬ／Ｌ（１ｍｇ／ｍＬストック）の２，４−Ｄ）上に胚盤側を上にして載せる。しかし、ＤＮ６２Ａ５Ｓ以外の培地及び塩も好適であり、当分野では公知である。胚は、暗所にて２５℃で一晩インキュベートする。しかし、胚を一晩インキュベートすることそれ自体は必要ではない。
【０１４５】
得られた外植片を、メッシュスクエア（１プレートあたり３０〜４０）に移し、約３０〜４５分間、浸透圧培地に移し、続いて、ビーミングプレートに移す（例えば、ＰＣＴ公開番号：国際公開第０１３８５１４号パンフレット及び米国特許第５，２４０，８４２号明細書を参照）。
【０１４６】
植物細胞中の、本発明の遺伝子に対して設計されたＤＮＡ構築物は、本質的にＰＣＴ公開番号：国際公開第０１３８５１４号パンフレットに記載の条件を用い、エアロゾルビームアクセレータを使用して植物組織へと加速させる。ビーム後、胚を浸透圧培地上で約３０分間インキュベートしてから、暗所にて２５℃で一晩インキュベーション培地上に置く。ビームを受けた外植片が過度の損傷を受けるのを回避するために、それらを、回復培地に移す前に少なくとも２４時間インキュベートする。次に、胚を約５日間暗所にて２５℃で回復期培地に広げて置き、その後、選択培地に移す。外植片を、使用する特定の選択の性質及び特徴に応じて、最大８週間まで選択培地中でインキュベートする。選択期間後、得られたカルスを、成熟体細胞胚の形成が観察されるまで、胚成熟培地に移す。次に、得られた成熟体細胞胚を微光の下に配置してから、当分野では公知の方法により再生プロセスを開始する。得られたシュートを発根培地上で根付かせ、得られた植物を苗床ポットに移して、トランスジェニック植物として成長させる。
【０１４７】
【表５】
2020058357.tif 000006
【０１４８】
溶液のｐＨを、１Ｎ  ＫＯＨ／１Ｎ  ＫＣｌを用いてｐＨ５．８に調節し、ゲルライト（シグマ）を３ｇ／Ｌまで添加した後、培地をオートクレーブで処理する。５０℃まで冷却した後、２ｍｌ／Ｌの５ｍｇ／ｍｌ硝酸銀のストック溶液（フィトテクノロジー・ラボ）を添加する。
【０１４９】
実施例８．アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換による植物細胞における本発明の遺伝子の形質転換
雌穂を受粉の８〜１２日後に収集する。胚を雌穂から単離するが、０．８〜１．５ｍｍサイズの胚が、形質転換での使用に好ましい。胚を、適切なインキュベーション培地上に胚盤側を上にして載せ、暗所にて２５℃で一晩インキュベーションする。しかし、胚を一晩インキュベーションすることそれ自体は必要ではない。胚を、約５〜１０分間、Ｔｉプラスミド媒介導入に適切なベクターを含むアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株と接触させた後、約３日間（暗所にて２２℃）共培養培地上で培養する。共培養後、外植片を５〜１０日間（暗所にて２５℃）回復期培地に移す。外植片を、使用する特定の選択の性質及び特徴に応じて、８週間まで選択培地中でインキュベートする。選択期間後、得られたカルスを、成熟体細胞胚の形成が観察されるまで、胚成熟培地に移す。続いて、得られた成熟体細胞胚を微光の下に配置してから、再生プロセスを当分野において公知のように開始する。
【０１５０】
実施例９．コメの形質転換
適切な発育段階にある胚を含む未成熟コメ種子を、温室内で十分に制御された条件下で栽培したドナー植物から収集する。種子の滅菌後、未成熟胚を切除し、３日間固体培地上で前誘導する。前誘導後、要望されるベクターを有するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の懸濁液中に、胚を数分間浸漬する。続いて、アセトシリンゴンを含有する固体培地上で胚を共培養し、暗所にて４日間インキュベートする。次に、外植片を、選択剤としてホスホフィノトリシンを含有する第１選択培地に移す。約３週間後、発生中のカルスを有する胚盤を複数の小さな切片に切断してから、同じ選択培地に移した。その後の継代培養を約２週間毎に実施する。各継代培養時に、活発に成長するカルスを小さな切片に切断して、第２選択培地上でインキュベートする。数週間後、ホスフィノトリシンに対して明らかに抵抗性のカルスを選択再生培地に移す。発生した小植物を完全伸長のためにハーフストレングスＭＳ上で培養する。植物を土壌に移した後、温室で栽培する。
【０１５１】
本明細書に記載する全ての刊行物及び特許出願は、本発明が関連する当業者の知識レベルを示すものである。全ての刊行物及び特許出願は、あたかも各々の個別の刊行物又は特許出願が、参照により組み込まれていることが、具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０１５２】
上述の本発明は、理解を明瞭にする目的で、説明及び例示として幾分詳しく記載してきたが、特定の変更及び改変を添付の特許請求の範囲内で実践し得ることは明らかであろう。
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年12月12日(2019.12.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
殺虫性活性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が、
ａ）配列番号１７または１８に示されるヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号６７または６８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号６７または６８のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択される、組換え核酸分子。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列が、植物における発現のために設計されている合成配列である、請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項３】
前記ヌクレオチド配列が、植物細胞における前記ヌクレオチド配列の発現を指令することができるプロモータに作動可能に連結している、請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項４】
請求項１に記載の組換え核酸分子を含む発現カセット。
【請求項５】
異種ポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項４に記載の発現カセット。
【請求項６】
請求項１に記載の組換え核酸を含む宿主細胞。
【請求項７】
細菌宿主細胞である、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
植物細胞である、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の宿主細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項１０】
前記植物が、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、キャベツ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科の植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、コメ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、オオムギ、及びナタネからなる群から選択される、請求項９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１１】
請求項１に記載の核酸分子を含むトランスジェニック植物。
【請求項１２】
ａ）配列番号６７または６８のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ）配列番号６７または６８のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、殺虫活性を有する組換えポリペプチド。
【請求項１３】
異種アミノ酸配列をさらに含む、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１２に記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項１５】
前記組成物が、粉末、粉塵、ペレット、顆粒、スプレー、乳濁剤、コロイド、溶液からなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物が、細菌細胞の培養物の乾燥、凍結乾燥、均質化、抽出、ろ過、遠心分離、沈降、又は濃縮により調製される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ポリペプチドの約１重量％〜約９９重量％を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
チョウ目、カメムシ目、甲虫目、線虫類、又はハエ目の害虫集団を防除する方法であって、前記集団を、殺虫有効量の請求項１２に記載のポリペプチドと接触させるステップを含む方法。
【請求項１９】
チョウ目、カメムシ目、甲虫目、線虫、又はハエ目の害虫を死滅させる方法であって、前記害虫を殺虫有効量の請求項１２に記載のポリペプチドと接触させる、または前記害虫に前記ポリペプチドを摂食させるステップを含む方法。
【請求項２０】
殺虫活性を有するポリペプチドを生成する方法であって、前記ポリペプチドをコードする核酸分子を発現させる条件下で、請求項６に記載の宿主細胞を培養するステップを含む方法。
【請求項２１】
殺虫性活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物をゲノムに安定に組み入れた植物又は植物細胞であって、前記ヌクレオチド配列が、
ａ）配列番号１７または１８に示されるヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号６７または６８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；及び
ｃ）配列番号６７または６８のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択される、植物又は植物細胞。
【請求項２２】
植物を害虫から保護する方法であって、植物又はその細胞において、殺虫性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させるステップを含み、前記ヌクレオチド配列が、
ａ）配列番号１７または１８に示されるヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号６７または６８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；及び
ｃ）配列番号６７または６８のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択される方法。
【請求項２３】
前記植物が、チョウ目、カメムシ目、甲虫目、線虫類、又はハエ目の害虫に対する殺虫活性を有する殺虫性ポリペプチドを産生する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
植物における収量を増加する方法であって、殺虫活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物をゲノムに安定に組み入れた植物又はその種子を畑で栽培するステップを含み、前記ヌクレオチド配列が、
ａ）配列番号１７または１８に示されるヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号６７または６８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；及び
ｃ）配列番号６７または６８のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択され、
前記畑が、前記ポリペプチドが殺虫活性を有する害虫に外寄生されている方法。
【外国語明細書】
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