(57)【要約】【課題】認知機能を改善するための手段の提供。【解決手段】本技術により、ラクトフェリン分解物を有効成分として含む、認知機能改善用組成物が提供される。前記組成物は、ラクトフェリンをペプシンにより分解して得られた分解物であってよい。前記組成物は、記憶力を維持するために用いられる。また、前記組成物は、脳内のアミロイドβ量を低下させるために用いられてもよい。さらに、当該組成物は、医薬組成物又は飲食品組成物であってもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトフェリン分解物を有効成分として含む、認知機能改善用組成物。
【請求項２】
前記ラクトフェリン分解物が、ラクトフェリンをペプシンにより分解して得られた分解物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が、記憶力を維持するために用いられる、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が、脳内のアミロイドβ量を低下させるために用いられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、β−セクレターゼを阻害するために用いられる、請求項1〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ラクトフェリン分解物が、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が飲食品組成物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が医薬組成物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、認知機能改善用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
認知機能の維持や改善は、若年層から老年層まで幅広い世代で求められている。特に、記憶力や思考力、判断力などの維持や改善は、日常生活を行う上でも重要である。さらに、老年層において加齢による認知機能の低下を防ぐことは、健康寿命の延長や、生活の質の低下を抑制することにもつながる。
【０００３】
これまでに、認知機能を維持又は改善するための組成物についての種々の提案がされている。例えば、特許文献１には、「１００重量部あたり、タンパク質を５〜５０重量部、脂質としての中鎖脂肪酸トリグリセリドを５〜８０重量部、及び炭水化物１〜５０重量部含有する認知機能障害の予防または治療剤。」（請求項１３）が記載されている。また、特許文献２には、「ラクトフェリンを少なくとも０．１ｇ／１００ｋｃａｌ組成物の濃度で含む摂取可能組成物。」（請求項１）が記載されており、当該組成物を「認知障害の治療又は予防において使用する」（請求項１１）ことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１６／０１３６１７号
【特許文献２】特表２０１２−５２６５２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
以上のとおり、認知機能を維持又は改善することが求められている。そこで、本技術は、新たな認知機能改善用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ラクトフェリン分解物を投与することによって認知機能を改善できることを見出した。すなわち、本技術は以下を提供する。
【０００７】
［１］ラクトフェリン分解物を有効成分として含む、認知機能改善用組成物。
［２］前記ラクトフェリン分解物が、ラクトフェリンをペプシンにより分解して得られた分解物である、［１］に記載の組成物。
［３］前記組成物が、記憶力を維持するために用いられる、［１］又は［２］に記載の組成物。
［４］前記組成物が、脳内のアミロイドβ量を低下させるために用いられる、［１］〜［３］のいずれか一つに記載の組成物。
［５］前記組成物が、β−セクレターゼを阻害するために用いられる、［１］〜［４］のいずれか一つに記載の組成物。
［６］  前記ラクトフェリン分解物が、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドを含む、［１］〜［５］のいずれか一つに記載の組成物。
［７］前記組成物が飲食品組成物である、［１］〜［６］のいずれか一つに記載の組成物。
［８］前記組成物が医薬組成物である、［１］〜［６］のいずれか一つに記載の組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本技術の組成物により、認知機能を改善することができる。
なお、本技術の効果は、ここに記載された効果に限定されず、本明細書内に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物の３か月間の投与後のＪ２０マウスの新規物体認識試験（トレーニング）の結果を示すグラフである。
【図２】ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物の３か月間の投与後のＪ２０マウスの新規物体認識試験（リテンション）の結果を示すグラフである。
【図３】ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物の３か月間の投与後のＪ２０マウスの新規物体認識試験の結果を示すグラフである。
【図４】ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物の３か月間の投与後のＪ２０マウスの脳内におけるアミロイドβ１−４０量の測定結果を示すグラフである。
【図５】ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物の３か月間の投与後のＪ２０マウスの脳内におけるアミロイドβ１−４２量の測定結果を示すグラフである。
【図６】ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物の３か月間の投与後のＪ２０マウスの脳内におけるβ−セクレターゼの発現レベルを示すグラフである。
【図７】ラクトフェリン、種々のラクトフェリン分解物、及びラクトフェリン由来ペプチドのいずれかを含む培養液中でアストロサイトを培養した場合における、当該培養液中のアミロイドβ１−４２量の変化を示すグラフである。
【図８】配列番号１のアミノ酸配列からなるウシラクトフェリン由来ペプチドの一次構造を示す図である。
【図９】配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドと配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドとの結合体であるウシラクトフェリン由来ペプチドの一次構造を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下に本技術の好ましい実施形態について説明する。ただし、本技術は以下の好ましい実施形態に限定されず、本技術の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
【００１１】
＜認知機能改善用組成物＞
本技術に従う認知機能改善用組成物は、ラクトフェリン分解物を有効成分として含む。本技術の組成物は、認知機能を改善するために適している。また、本技術の組成物によって、脳内のアミロイドβ量（例えばアミロイドβ１−４０又はアミロイドβ１−４２）を低下させることもできる。そのため、本技術の組成物は、例えば脳内のアミロイドβ量の増加により低下した認知機能の改善のために又は脳内のアミロイドβ量の増加による認知機能の低下を防ぐために適している。
本技術の組成物の有効成分であるラクトフェリン分解物は乳蛋白質分解物であり、食品として長年使用されてきた乳由来の成分である。これらの成分は、生体への安全性が高い。そのため、本技術の組成物は、安心してヒトに投与することができる。また、本技術の組成物を長期間、連続的に投与しても副作用を心配する必要性が少ない。
【００１２】
本技術の組成物は、認知機能を改善するために用いることができる。
本技術において、「認知機能の改善」とは、認知機能の維持、認知機能の向上、及び認知機能低下の予防を包含する。
本技術において、「認知機能」とは、例えば記憶力、認知能力、学習能力、思考力、言語能力、判断力、計算力、又は情緒能力であってよい。例えば、本技術の組成物は、記憶力、認知能力、学習能力、思考力、言語能力、判断力、計算力、及び情緒能力のうちの一つ以上を維持し若しくは向上させるために用いられてよく、又は、記憶力、認知能力、学習能力、思考力、言語能力、判断力、計算力、及び情緒能力のうちの一つ以上の低下を予防するために用いられてもよい。本技術の組成物は、特には視覚的な認知機能の改善に適している。
【００１３】
本技術の組成物は、好ましくは記憶力、認知能力、又は学習能力を維持若しくは向上するために用いられてよく、又は記憶力、認知能力、又は学習能力の低下を予防するために用いられる。例えば、本技術の組成物は、より好ましくは視覚的な記憶力、視覚的な認知能力、又は視覚的な学習能力を維持若しくは向上するために用いられてよく、又は視覚的な記憶力、視覚的な認知能力、又は視覚的な学習能力の低下を予防するために用いられる。
【００１４】
また、本技術において、「認知機能の改善」は、失語、失認、失行、又は実行機能障害の改善及び予防を包含する。すなわち、本技術の組成物は、失語、失認、失行、又は実行機能障害の改善又は予防のために用いられてもよい。
【００１５】
また、本技術の組成物は、認知機能低下を伴う疾患を有する又は有する可能性のある対象（特にはヒト）の認知機能を改善するために用いられてもよい。当該疾患は、例えばアルツハイマー病、脳血管認知症、記憶障害、ピック病、びまん性レビー小体病などの神経変性疾患；例えば脳梗塞、脳出血、慢性硬膜下血腫、脳腫瘍、脳炎、正常圧水頭症などの脳疾患；例えばクロイツフェルト・ヤコブ病などの感染症；レビー小体型認知症；前頭側頭型認知症；認知症を伴うパーキンソン病；又は、精神疾患である。
【００１６】
さらに、本技術の組成物は、脳内のアミロイドβ量を低下させるために用いることができる。より特には、本技術の組成物は、海馬内のアミロイドβ量を低下させるために用いられてよく、又は、大脳皮質内のアミロイドβ量を低下させるために用いられてよい。
本技術の組成物は脳内のアミロイドβ量を低下させるために適している。そのため、本技術の組成物は、例えば、脳内のアミロイドβの蓄積に起因する疾患を予防又は緩和するために用いられてもよい。当該疾患は、例えばアルツハイマー病、脳アミロイド血管症、又は遺伝性アミロイド性脳出血であってよい。
また、本技術の組成物は、脳内のアミロイドβの蓄積に起因する疾患を有する又は有する可能性のある対象（特にはヒト）の認知機能を改善するために用いられてもよい。
また、本技術は、ラクトフェリン分解物を有効成分として含む、脳内のアミロイドβ量低下用組成物も提供する。当該組成物によって、脳内のアミロイドβ量を低下させることができるので、上記のとおりの疾患を予防又は緩和することができる。本技術の認知機能改善用組成物について述べた内容（例えば有効成分、組成、及び使用方法の詳細など）が、当該アミロイドβ量低下用組成物にも当てはまる。そのため、当該アミロイドβ量低下用組成物についての説明は省略する。
【００１７】
なお、本明細書において、「疾患の緩和」は、例えば、症状若しくは疾患の好転、症状若しくは疾患の悪化の防止若しくは遅延、症状若しくは疾患の進行の逆転、防止、若しくは遅延、又は、症状若しくは疾患の治癒を意味する。また、本明細書において、「疾患の予防」は、例えば、症状若しくは疾患の発症の防止若しくは遅延、又は、疾患若しくは症状の発症リスク若しくは発現リスクの低下を意味する。
【００１８】
本技術の組成物は、β−セクレターゼを阻害するために用いられてよい。β−セクレターゼはアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰともいう）を切断し、これによりＣＴＦβが生成する。ＣＴＦβがさらに切断されることによって、アミロイドβ（例えばアミロイドβ１−４０又はアミロイドβ１−４２）が生成する。そのため、β−セクレターゼを阻害することによって、アミロイドβの生成を抑制することができる。
【００１９】
本技術において、β−セクレターゼの阻害とは、β−セクレターゼの発現の阻害及びβ−セクレターゼの活性の阻害を包含する。本技術の組成物は、β−セクレターゼの発現阻害又はβ−セクレターゼの活性阻害のいずれか一方又は両方のために用いられてよく、特には当該発現阻害ために用いられてよい。本技術の組成物は、β−セクレターゼの発現を阻害するために特に適している。
【００２０】
また、本技術は、ラクトフェリン分解物を含むβ−セクレターゼ阻害用組成物も提供する。例えば、本技術のβ−セクレターゼ阻害用組成物は、アミロイドβ量を低下させるために用いられてよい。また、本技術のβ−セクレターゼ阻害用組成物は、脳内のアミロイドβの蓄積に起因する疾患を予防又は緩和するために用いられてもよく、又は、認知機能改善のために用いられてもよい。
【００２１】
また、β−セクレターゼは、ラクトフェリン分解物によってだけでなく、ラクトフェリンによっても阻害されることが分かった。そのため、本技術は、ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物を含むβ−セクレターゼ阻害剤も提供する。
【００２２】
ラクトフェリンは、例えば乳、涙、唾液、及び血液などの体液中に存在する鉄結合性の糖蛋白質である。ラクトフェリンは、哺乳動物、例えばヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、水牛、ラクダ、ヤク、ウマ、ロバ、ラマ、ウシ又はヒトなどの乳に含まれる。すなわち、本技術において用いられるラクトフェリンは、哺乳動物の乳由来のものであってよい。含有量及び入手容易性の観点から、例えばウシ又はヒトの乳が、ラクトフェリンを入手するための源として好ましい。すなわち、本技術において用いられる「ラクトフェリン分解物」のラクトフェリンとして、例えばウシ又はヒトの乳に由来するラクトフェリンが用いられてよい。乳は、初乳、移行乳、常乳、及び末期乳のいずれでもよい。本技術において、市販入手可能なラクトフェリンが用いられてもよい。
【００２３】
本技術において用いられる「ラクトフェリン分解物」のラクトフェリンは、哺乳動物の乳由来のものに限定されない。例えば、当該乳を処理して得られる脱脂乳又はホエーから常法（例えば、イオンクロマトグラフィー等）によって分離されたラクトフェリン、遺伝子操作によって微生物、動物細胞、又はトランスジェニック動物から産生された組換えラクトフェリン、合成ラクトフェリン、又はそれらの混合物であってもよい。また、ラクトフェリンは、非グリコシル化又はグリコシル化されたものでもよい。
【００２４】
本技術において用いられる「ラクトフェリン分解物」として、例えばラクトフェリンの酵素分解物、酸分解物、及びアルカリ分解物を挙げることができる。本技術において、ラクトフェリン分解物は、認知機能改善作用を有する限りにおいて、いずれの分解物が用いられてもよい。
本技術において、ラクトフェリン分解物は、ラクトフェリンよりも少ない量で、ラクトフェリンと同程度の認知機能改善作用を発揮する。
【００２５】
好ましくは、当該ラクトフェリン分解物は、酵素による加水分解によって得られる加水分解物である。当該酵素として、例えばプロテアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、キモシン、プラスミン、ペプシン、パパイン、ペプチダーゼ、及びアミノペプチダーゼを挙げることができるが、これらに限定されない。当該酵素は、細菌由来又は動物由来のいずれであってもよい。細菌由来の酵素として、例えばバシラス属、ビフィドバクテリウム属、エンテロコッカス属、ラクトバシラス属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ペディオコッカス属、プロピオンバクター属、シュードモナス属、及びストレプトコッカス属に由来する酵素が挙げられる。動物由来の酵素として、例えば、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、水牛、ラクダ、ヤク、ウマ、ロバ、ラマ、ウシ、及びヒトに由来する酵素を挙げることができる。本技術において用いられるラクトフェリン分解物を得るために、上述の酵素を、単独で又は２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
【００２６】
本技術の一つの実施態様において、ラクトフェリン分解物を得るために用いられる酵素は、好ましくはペプシンである。すなわち、本技術の一つの実施態様において、ラクトフェリン分解物は、ラクトフェリンのペプシン分解物であってよい。ラクトフェリンのペプシン分解物は、優れた認知機能改善作用を有する。また、ラクトフェリンのペプシン分解物は、脳内のアミロイドβ量を低下させるために適している。
【００２７】
好ましくは、本技術において用いられるラクトフェリンのペプシン分解物は、以下の配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドを含む。
配列番号１：Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe
本明細書内において、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端にさらにアミノ酸が１残基〜１００残基、１残基〜５０残基、１残基〜３０残基、又は１残基〜１０残基が付加されたペプチドであってよく、又は、配列番号１のアミノ酸配列のみからなるペプチドであってもよい。
【００２８】
配列番号１のアミノ酸配列のみからなるペプチドは、ラクトフェリシン（登録商標）又はウシ・ラクトフェリシンとも呼ばれ、ＬＦｃｉｎ又はＬＦｃｉｎ  Ｂとも表記される。配列番号１のアミノ酸配列のみからなるペプチドは、ウシラクトフェリンのペプシン消化により生成する抗菌性ペプチドである。
【００２９】
配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド、特には配列番号１のアミノ酸配列のみからなるペプチドは、脳内におけるアミロイドβ量を低下させることができる。そのため、当該ペプチドを含むペプシン分解物は、より確実にアミロイドβ量を低下させることができる。
【００３０】
配列番号１のアミノ酸配列のみからなるペプチドは、図８に示されるとおり、同アミノ酸配列中の２つのシステイン残基がジスルフィド結合した構造を有しうる。当該ペプチドは、例えば特開平５−２３８９４８号公報に記載された方法によって調製することができる。
【００３１】
また、本技術の他の実施態様において、ラクトフェリン分解物を得るために用いられる酵素は、トリプシン又はパパインであってもよい。すなわち、本技術の他の実施態様において、ラクトフェリン分解物は、ラクトフェリンのトリプシン分解物又はパパイン分解物であってよい。これら分解物は、優れた認知機能改善作用を有する。また、これら分解物は、脳内のアミロイドβ量を低下させるために適している。
【００３２】
本技術において用いられるラクトフェリン分解物の平均分子量は、好ましくは５０００ダルトン（以下、「Ｄａ」とする）以下又は未満、より好ましくは２０００Ｄａ以下である。当該平均分子量は、例えば１０００Ｄａ以上であってよい。
特に好ましくは、本技術において用いられるラクトフェリン分解物は、１０００Ｄａ以上且つ５０００Ｄａ以下、特には１０００Ｄａ以上且つ２０００Ｄａ以下、より特には１２００Ｄａ以上且つ２０００Ｄａ以下、さらにより特には１６００Ｄａの数平均分子量を有するペプシン分解物である。
また、本技術において用いられるラクトフェリン分解物は、１０００Ｄａ以上且つ５０００Ｄａ以下、特には１０００Ｄａ以上且つ２０００Ｄａ以下、より特には１２００Ｄａ以上且つ２０００Ｄａ以下、さらにより特には１６００Ｄａの数平均分子量を有するトリプシン分解物であってもよい。
また、本技術において用いられるラクトフェリン分解物は、１０００Ｄａ以上且つ５０００Ｄａ以下、特には１０００Ｄａ以上且つ２０００Ｄａ以下、より特には１２００Ｄａ以上且つ２０００Ｄａ以下、さらにより特には１６００Ｄａの数平均分子量を有するパパイン分解物であってもよい。
＜平均分子量の算定方法＞
本技術におけるラクトフェリン分解物の平均分子量は、以下の数平均分子量の概念により求めるものである。
数平均分子量（Number Average of Molecular Weight）は、例えば文献（社団法人高分子学会編、「高分子科学の基礎」、第１１６〜１１９頁、株式会社東京化学同人、１９７８年）に記載されているとおり、高分子化合物の分子量の平均値を次のとおり異なる指標に基づき示すものである。
すなわち、タンパク質加水分解物等の高分子化合物は不均一な物質であり、かつ分子量に分布があるため、タンパク質加水分解物の分子量は、物理化学的に取り扱うためには、平均分子量で示す必要があり、数平均分子量（以下、Ｍｎと略記することがある。）は、分子の個数についての平均であり、ペプチド鎖ｉの分子量がＭｉであり、その分子数をＮｉとすると、次の式により定義される。
【００３３】
【数１】
2020058346.tif 000002
【００３４】
ラクトフェリンの酵素加水分解物は、例えば特開２０１６−１２１１０９号公報に記載された方法により製造可能である。当該公報に記載されているとおり、当該方法は、ラクトフェリンを酵素により加水分解する酵素反応工程を含む。当該酵素反応工程における反応条件は、例えば酵素の種類などの要因によって当業者により適宜選択されてよい。例えば、ラクトフェリンの蛋白質換算質量１ｇ当たり１０００〜２００００単位（活性単位）の割合で酵素が用いられることが好ましい。また、酵素反応の温度は特に限定されず、酵素作用が発現する範囲から選ばれ、通常３０〜６０℃の範囲から選ばれる。酵素反応の反応時間は、例えば１〜７２時間、好ましくは１〜４８時間、好ましくは２〜２０時間、より好ましくは２〜１０時間である。
酵素反応は、例えば酵素を失活することにより停止される。当該失活は、酵素反応溶液を、例えば８０℃で３０分〜１３０℃で２秒間保持することにより行われる。
当該酵素反応工程後、例えば反応溶液のｐＨ調整工程及び反応産物の精製工程が行われてもよい。当該ｐＨ調整工程では、反応溶液のｐＨが例えば弱酸性〜中性に調整される。当該精製工程では、（ａ）濾過、（ｂ）精密濾過及び限外濾過膜などの膜分離処理、及び（ｃ）樹脂吸着分離からなる群から選択される、いずれか１種又はこれらの２種以上の組合せの処理が行われてよい。当該精製工程により、当該失活液中に含まれる不溶物の除去、及び、脂肪及び乳糖などの不要な成分を低減することができる。その結果、溶液状態で透明であり、かつ、溶液状態での長期保存においても混濁、沈殿、凝集及び褐変等がほとんど生じない、いわゆる保存安定性に優れたラクトフェリン分解物を得ることができる。また、精製工程により、ラクトフェリン分解物の風味及び外観を向上させることができる。
【００３５】
（ａ）の濾過は、公知の方法により実施することができ、例えば、珪藻土を用い、公知の装置により実施することができる。濾過を行うことにより、加水分解失活液中に存在する加水分解反応時及び／又は酵素加熱失活時に生成した不溶物を除去できる。
【００３６】
（ｂ）の膜分離処理は、公知の装置を用いて行うことができる。当該装置として、例えば精密濾過モジュール、並びに、限外濾過モジュールを挙げることができる。限外濾過モジュールとしては、例えば分画分子量３，０００〜２０，０００、好ましくは３，０００〜１０，０００のものを挙げることができる。これらの濾過モジュールは、例えば旭化成社より、マイクローザＭＦシリーズ及びマイクローザＵＦシリーズとして市販されている。この場合、膜分離処理後の膜透過画分としてラクトフェリン分解物を含有する溶液が得られる。膜分離処理を行うことにより、（ａ）の濾過と同様、加水分解失活液中に存在する加水分解反応時及び／又は酵素加熱失活時に生成した不溶物を除去できる。
【００３７】
（ｃ）の樹脂吸着分離は、公知の方法により実施することができ、例えば、樹脂をカラムに充填し、前記加水分解失活液を、当該カラムを通過させることにより実施することができる。樹脂としては、例えば商品名：ダイヤイオン（三菱化学社製）、セパビーズ（三菱化学社製）、アンバーライトＸＡＤ（オルガノ社製）、ＨＳ（味の素ファインテクノ社製）等が挙げられる。樹脂吸着分離は、これらの樹脂をカラムに充填して前記加水分解失活液を連続的に流入させ、流出させることによる連続方式で行うこともでき、また、前記加水分解失活液中に樹脂を投入し、一定時間接触させた後、加水分解失活液と樹脂とを分離するバッチ方式で行うこともできる。加水分解失活液中には、保存期間中に混濁、沈殿、凝集及び褐変等を惹起する因子（例えば、疎水性アミノ酸を多く含むペプチド等）が残存している可能性があり、樹脂吸着分離を行うことにより、これらの因子を除去できる。
【００３８】
精製工程後、ラクトフェリン分解物を含有する溶液を殺菌してもよい。殺菌方法は、常法による加熱処理方法等を用いることができる。加熱処理は、例えば７０℃３０分〜１４０℃２秒間で行われる。
【００３９】
得られたラクトフェリン分解物を含有する溶液は、そのまま本技術において使用することもでき、また、必要に応じて、当該溶液を公知の方法により濃縮して得た濃縮液を本技術において使用することもできる。また、当該溶液又は当該濃縮液を公知の方法により乾燥して粉末を得、当該粉末を本技術において使用してもよい。
【００４０】
本技術の有効成分であるラクトフェリン分解物の含有量は、本技術の組成物の全質量に対して０．０１〜７０質量％の範囲であることが好ましく、０．０２〜４０質量％の範囲であることがより好ましく、０．０５〜１０質量％の範囲であることが更に好ましく、０．２〜２質量％の範囲であることが特に好ましい。
【００４１】
本技術において用いられるラクトフェリン分解物は、以下の配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドと以下の配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドとの結合体を含んでもよい。
配列番号２：Val Ser Gln Pro Glu Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser Pro Ile Gln Cys Ile 
配列番号３：Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Ala 
本明細書内において、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端にさらにアミノ酸が１残基〜１００残基、１残基〜５０残基、１残基〜３０残基、又は１残基〜１０残基が付加されたペプチドであってよく、又は、配列番号２のアミノ酸配列のみからなるペプチドであってもよい。
配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドも、配列番号３のアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端にさらにアミノ酸が１残基〜１００残基、１残基〜５０残基、１残基〜３０残基、又は１残基〜１０残基が付加された付加されたものであってよく、又は、配列番号３のアミノ酸配列のみからなるペプチドであってもよい。
配列番号２のアミノ酸配列のみからなるペプチドと配列番号３のアミノ酸配列のみからなるペプチドとの結合体は、ラクトフェリシン（登録商標）又はヒト・ラクトフェリシンとも呼ばれ、ＬＦｃｉｎ若しくはＬＦｃｉｎ  Ｈとも表記される。当該結合体は、ヒトラクトフェリンのペプシン消化により生成する抗菌性ペプチドである。
【００４２】
配列番号２のアミノ酸配列のみからなるペプチドと配列番号３のアミノ酸配列のみからなるペプチドとの結合体は、図９に示されるとおり、配列番号２のアミノ酸配列中の２つのシステイン残基がジスルフィド結合し且つ配列番号２のアミノ酸配列中の１つのシステイン残基と配列番号３のアミノ酸配列中の１つのシステイン残基とがジスルフィド結合した構造を有しうる。当該結合体は、例えばBellamy, W.ら、Journal of Applied Bacteriology, 第73巻、1992年、第472〜479頁に記載された方法によって調製することができる。
【００４３】
本技術の組成物は、好ましくは経口的に投与される。本技術の組成物による認知機能改善作用にとって、経口投与が特に適している。  
【００４４】
本技術の組成物は、例えば医薬、飲食品、又は飼料として用いられてよい。本技術の組成物には、これらの用途に用いられる場合に含まれる追加成分が適宜含まれてよい。
【００４５】
＜医薬組成物＞
本技術の認知機能改善用組成物は、医薬組成物として用いることができる。すなわち、本技術は、認知機能改善用の医薬組成物も提供する。
【００４６】
本技術における有効成分は、食品として長年使用されてきた乳由来の成分を有効成分とするため、患者の疾患の種類に関係なく安心して投与できる可能性が高い。また、長期間、連続的に投与しても副作用を心配する必要性も少ない。更に、他の薬剤との併用においても安全性が高い。
【００４７】
本技術の組成物を医薬組成物として利用する場合、当該医薬組成物は、経口投与及び非経口投与のいずれでもよく、投与方法に応じて、適宜所望の剤形に製剤化することができる。例えば、経口投与の場合、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の固形製剤；溶液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等に製剤化することができる。また、非経口投与の場合、例えば胃ろう、経鼻投与、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、又は髄腔内注射等を介して投与されてよい。
【００４８】
また、製剤化に際しては、本技術の医薬組成物には、通常製剤化に用いられている賦形剤、ｐＨ調整剤、着色剤、矯味剤などの種々の成分が含まれてよい。また、本技術の効果を損なわない限り、本技術の医薬組成物には、公知の又は将来的に見出される認知機能の改善のために用いられる医薬成分が含まれてよい。本技術の医薬組成物の製剤化は、剤形に応じて適宜公知の方法により実施できる。製剤化に際しては、適宜、製剤担体を配合して製剤化してもよい。
【００４９】
加えて、製剤化は剤形に応じて適宜公知の方法により実施できる。製剤化に際しては、有効成分であるラクトフェリン分解物のみを製剤化してもよく、適宜、製剤担体を配合して製剤化してもよい。
【００５０】
なお、製剤担体を配合する場合、本技術の有効成分であるラクトフェリン分解物の含有量は、剤形に合わせて適宜選択されてよい。本技術の有効成分であるラクトフェリン分解物の含有量は、医薬組成物の全質量に対して０．０１〜７０質量％の範囲であることが好ましく、０．０２〜４０質量％の範囲であることがより好ましく、０．０５〜１０質量％の範囲であることが更に好ましく、０．２〜２質量％の範囲であることが特に好ましい。
【００５１】
本技術の医薬組成物の投与期間は、対象となる症状又は疾患に応じて適宜決定されてよい。例えば、本技術の医薬組成物は、例えば２週間以上、好ましくは４週間以上、より好ましくは２か月以上にわたって継続的に摂取されてよい。本技術の医薬組成物の摂取は、例えば摂取開始から例えば３か月後、好ましくは６か月後、より好ましくは１年後に終了されてもよい。
本技術の医薬組成物は、例えば毎日摂取されてよく、又は、例えば１日おき又は２日おきなど所定の間隔で摂取されてもよい。
本技術の医薬組成物を摂取する場合、ラクトフェリン分解物の摂取量は、１日当たり例えば０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重であってよい。
【００５２】
また、前記製剤担体としては、剤形に応じて、各種有機又は無機の担体や基剤を用いることができる。本技術の組成物の製剤化のために用いられる成分として、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、及び矯味矯臭剤が挙げられる。
【００５３】
賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、α−デンプン、デキストリン、カルボキシメチルデンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等のセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルラン；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム等の珪酸塩誘導体；リン酸カルシウム等のリン酸塩誘導体；炭酸カルシウム等の炭酸塩誘導体；硫酸カルシウム等の硫酸塩誘導体等が挙げられる。
【００５４】
結合剤としては、例えば、上記賦形剤の他、ゼラチン；ポリビニルピロリドン；マクロゴール等が挙げられる。
【００５５】
崩壊剤としては、例えば、上記賦形剤の他、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン又はセルロース誘導体等が挙げられる。
【００５６】
滑沢剤としては、例えば、タルク；ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；コロイドシリカ；ピーガム、ゲイロウ等のワックス類；硼酸；グリコール；フマル酸、アジピン酸等のカルボン酸類；安息香酸ナトリウム等のカルボン酸ナトリウム塩；硫酸ナトリウム等の硫酸塩類；ロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム等のラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物等の珪酸類；デンプン誘導体等が挙げられる。
【００５７】
安定剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；無水酢酸；ソルビン酸等が挙げられる。
【００５８】
矯味矯臭剤としては、例えば、甘味料、酸味料、香料等が挙げられる。
【００５９】
＜飲食品＞
本技術の組成物は、飲食品組成物であってよい。すなわち、本技術は、認知機能改善用飲食品組成物を提供する。本技術の飲食品組成物は、認知機能改善作用を効果的に発揮することができる。
【００６０】
本技術の飲食品組成物の例として、例えば清涼飲料若しくは乳飲料などの飲料又は当該飲料の濃縮原液及び当該飲料を調製するために用いられる粉末；例えば加工乳及び発酵乳などの乳製品；育児用調製粉乳；経腸栄養食；及び機能性食品が挙げられる。
また、本技術の飲食品組成物の例として、例えば炭酸飲料、栄養飲料、若しくは果実飲料などの飲料又は当該飲料の濃縮原液及び当該飲料を調製するために用いられる粉末；例えばアイスクリーム、アイスシャーベット、及びかき氷などの冷菓；例えばそば、うどん、はるさめ、餃子の皮、しゅうまいの皮、中華麺、及び即席麺などの麺類；例えばキャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、及び焼き菓子などの菓子類；例えばかまぼこ、ハム、及びソーセージなどの水産又は畜産加工食品；例えばサラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、及びドレッシングなどの油脂及び油脂加工食品；例えばソース及びたれなどの調味料；例えばスープ、シチュー、サラダ、惣菜、漬物、及びパンなどの調理された食品を挙げることができる。本技術の飲食品組成物は、例えば液状及びタブレット状のサプリメントであってもよい。
【００６１】
これらの飲食品は、当業者に既知の方法により製造されてよい。これらの飲食品の製造方法において、ラクトフェリン分解物を添加する時点及び方法は、当業者により適宜選択されてよい。
【００６２】
また、本技術の飲食品組成物は、例えば認知機能改善用という保健用途又は認知機能改善作用に起因して奏される作用に関する保健用途が表示された飲食品として提供又は販売されることが可能である。
「表示」行為には、需要者に対して前記用途を知らしめるための全ての行為が含まれ、前記用途を想起又は類推させうるような表現であれば、表示の目的、表示の内容、及び表示する対象物又は媒体等の如何に拘わらず、全て本技術の「表示」行為に該当する。
本技術の飲食品は、例えば「記憶力の維持のために」、「学習能力の維持のために」又は「認知機能の改善のために」などの表示が付されてよい。
【００６３】
「表示」は、需要者が上記用途を直接的に認識できるような表現により行われることが好ましい。具体的には、飲食品に係る商品又は商品の包装に前記用途を記載したものを譲渡し、引き渡し、譲渡若しくは引き渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類に上記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、又はこれらを内容とする情報に上記用途を記載して電磁的（インターネット等）方法により提供する行為等が挙げられる。
【００６４】
表示内容としては、行政等によって認可された表示（例えば、行政が定める各種制度に基づいて認可を受け、そのような認可に基づいた態様で行う表示等）であることが好ましい。また、そのような表示内容を、包装、容器、カタログ、パンフレット、ＰＯＰ（Point of purchase advertising）等の販売現場における宣伝材、その他の書類等へ付することが好ましい。
【００６５】
また、「表示」には、例えば健康食品、機能性表示食品、経腸栄養食品、特別用途食品、保健機能食品、特定保健用食品、栄養機能食品、及び医薬用部外品などの製品であることを示す表示が含まれる。より具体的な表示の例として、好ましくは消費者庁によって認可される表示、例えば特定保健用食品制度又はこれに類似する制度にて認可される表示などが挙げられる。消費者庁によって認可される表示の例として、例えば特定保健用食品としての表示、条件付き特定保健用食品としての表示、身体の構造や機能に影響を与える旨の表示、及び疾病リスク減少表示などを挙げることができる。より具体的には、健康増進法施行規則（平成１５年４月３０日日本国厚生労働省令第８６号）に定められた特定保健用食品としての表示（特に保健の用途の表示）及びこれに類する表示が、典型的な例である。
【００６６】
本技術の飲食品組成物に含まれるラクトフェリン分解物の含有量は、当業者により適宜選択されてよい。本技術の有効成分であるラクトフェリン分解物の含有量は、飲食品組成物の全質量に対して０．０１〜７０質量％の範囲であることが好ましく、０．０２〜４０質量％の範囲であることがより好ましく、０．０５〜１０質量％の範囲であることが更に好ましく、０．２〜２質量％の範囲であることが特に好ましい。
【００６７】
本技術の飲食品組成物の摂取期間は、対象となる症状又は疾患に応じて適宜決定されてよい。例えば、本技術の飲食品は、例えば２週間以上、好ましくは４週間以上、より好ましくは２か月以上にわたって継続的に摂取されてよい。本技術の飲食品の摂取は、例えば摂取開始から例えば３か月後、好ましくは６か月後、より好ましくは１年後に終了されてもよい。また、本技術の飲食品は、例えば０歳から１００歳の間のいずれかの期間に継続して摂取されてよい。
本技術の飲食品組成物は、例えば毎日摂取されてよく、又は、例えば１日おき又は２日おきなど所定の間隔で摂取されてもよい。
本技術の飲食品組成物を摂取する場合、ラクトフェリン分解物の摂取量は、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重であってよい。
【００６８】
本技術は、以下の方法及び物も提供する。
［１］ラクトフェリン分解物を、認知機能改善用組成物の製造のために使用する方法。
［２］認知機能を改善するために用いられる、ラクトフェリン分解物。
［３］ラクトフェリン分解物を投与することで、認知機能を改善する方法。
【実施例】
【００６９】
以下に実施例を用いて本技術をさらに詳しく説明するが、本技術はこれら実施例に限定されるものではない。
【００７０】
［試験例１（新規物体認識試験）］
【００７１】
（１）試料の調製
ウシラクトフェリン（森永乳業社製）を用意した。また、ラクトフェリン分解物を以下のとおりに製造した。すなわち、ウシラクトフェリン（森永乳業社製）を精製水にて５質量％となるように溶解し、塩酸溶液にてｐＨ３に調製した。調製したラクトフェリンを４５℃に加温し、次いでラクトフェリンの質量に対して３質量％のペプシンを添加して攪拌しながら６時間反応させて加水分解を行った。加水分解反応が終了後、反応液を８０℃に加温し、１０分間保温して酵素を失活させた。反応液を冷却後、水酸化ナトリウム溶液を添加して反応液のｐＨを６に調整し、その後反応液を凍結乾燥してラクトフェリン分解物を製造した。なお、製造したラクトフェリン分解物の数平均分子量をHPLC法により測定し、１６００Ｄａであることを確認した。
【００７２】
（２）新規物体認識試験
アルツハイマー病モデルマウスとして、ＡＰＰ（ａｍｙｌｏｉｄｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）家族性変異のＳｗｅｄｉｓｈ変異とＩｎｄｉａｎａ変異を導入したＡＰＰを過剰発現しているＪ２０マウスを用い、新規物体認識試験を行った。
【００７３】
試験には、９カ月齢Ｊ２０マウスを使用した。複数のマウスを、コントロール群（ｎ＝７）、２％ラクトフェリン含有餌群（ｎ＝６）、及び０．５％ラクトフェリン分解物含有餌群（ｎ＝７）の３群に分け、それぞれの餌を自由に与えて３カ月間飼育した。コントロール群のマウスにはオリエンタル酵母のMF（基礎飼料）を与えた。２％ラクトフェリン含有餌群のマウスに与えられた餌は、２％のラクトフェリンを含むこと以外は、コントロール群のマウスに与えられた餌と同じである。０．５％ラクトフェリン分解物含有餌群に与えられた餌も、０．５％のラクトフェリン分解物を含むこと以外は、コントロール群のマウスに与えられた餌と同じである。コントロール群のマウスに与えられた餌は、ラクトフェリン及びラクトフェリン分解物のいずれも含まない。
【００７４】
次いで、測定用ケージに１匹のマウスを入れて３分間慣れさせることを３日間行った。その後、トレーニングセッションにおいて、同じ形をした物体Ａ及びＢ（ファミリア物体）を２つケージ内に入れ、５分間それぞれの物体に対する接触時間を計測した。６時間後、リテンションセッションにおいて、物体Ｂを形の異なる物体Ｃ（新規物体）に変えて、同様に接触時間を計測した。それぞれの物体に対する接触時間の割合（新規物体接触時間／ファミリア物体接触時間）をｏｂｊｅｃｔ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅとして評価した。
【００７５】
（３）結果
トレーニングセッションにおける各物体への接触時間の平均値を以下の表１及び図１に示し、リテンションセッションにおける各物体への接触時間の平均値を以下の表２及び図２に示す。また、各群におけるｏｂｊｅｃｔ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅの平均値を以下の表３及び図３に示す。表１〜３及び図１〜３において、「対照」がコントロール群の結果であり、「ＬＦ」が、２％ラクトフェリン含有餌群の結果であり、「ＬＦ分解物」が、０．５％ラクトフェリン分解物含有餌群の結果である。
【００７６】
【表１】
2020058346.tif 000003
【００７７】
【表２】
2020058346.tif 000004
【００７８】
【表３】
2020058346.tif 000005
【００７９】
認知機能が正常であるマウスは、新規な物体に興味を示す傾向がある。したがって、リテンションにおいて物体Ｃに対する接触時間が長いほど、トレーニングの際に物体Ａ及びＢを記憶しており、物体Ｃが新規な物体であるということを認識していることを表す。
表１〜３及び図１〜３に示されるとおり、０．５％ラクトフェリン分解物含有餌群は、コントロール群に比べて接触時間及びｏｂｊｅｃｔ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅが有意により高かった。したがって、ラクトフェリン分解物を摂取することで、記憶力や学習能力、視覚的認知記憶の低下を予防できることが認められた。
【００８０】
また、上記の試験において、ラクトフェリン分解物の量はラクトフェリンの量の４分の１であったが、ラクトフェリン分解物によって、ラクトフェリンと同程度の結果が得られた。そのため、ラクトフェリン分解物は、ラクトフェリンよりも少ない量でより効果的に認知機能改善作用を発揮できることがわかった。
【００８１】
［試験例２（脳内のアミロイドβ量の定量）］
【００８２】
（１）アミロイドβ定量試験
上記試験例１の新規物体認識試験が終了した後、コントロール群（ｎ＝７）、２％ラクトフェリン含有餌群（ｎ＝６）、０．５％ラクトフェリン分解物含有餌群（ｎ＝７）の各群のマウスを麻酔下でＰＢＳを用いて灌流した後、脳を取り出した。脳から大脳皮質と海馬を分離摘出した後、液体窒素に入れ凍結させ実験に使う前まで−８０℃に保管し、不可溶性アミロイドβ１−４０およびアミロイドβ１−４２を定量した。
【００８３】
前記不可溶性アミロイドβ１−４０およびアミロイドβ１−４２の定量は、以下のとおりに行われた。
大脳皮質又は海馬の重さの１９倍量のＴＢＳ溶液を入れホモジナイズした後１００，０００ｒｐｍで２０分間遠心し上清を吸引して除去し、沈殿物にその重さの１０倍量の６Ｍ  ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ溶液を入れ超音波処理を３０秒間行った。その後、室温で１時間置いた後、１００，０００ｒｐｍで２０分間遠心し、その上清を用いて不可溶性アミロイドβ１−４０及びアミロイドβ１−４２の定量をＥＬＩＳＡ  ｋｉｔを用いて行った。ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔは、Ｈｕｍａｎ／Ｒａｔ  ｂｅｔａ−Ａｍｙｌｏｉｄ（４０）ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｗａｋｏ，Ｃａｔ  Ｎｏ，２９４−６４７０１）及びＨｕｍａｎ／Ｒａｔ  ｂｅｔａ−Ａｍｙｌｏｉｄ（４２）ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｗａｋｏ，Ｃａｔ  Ｎｏ，２９０−６２６０１）を用い、ＷａｋｏのＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔに同封されたプロトコルに従って定量した。
【００８４】
（２）結果
各群における大脳皮質中アミロイドβ１−４０量及び海馬中アミロイドβ１−４０量の平均値を以下の表４及び図４に示し、各群における大脳皮質中アミロイドβ１−４２量及び海馬中アミロイドβ１−４２量の平均値を以下の表５及び図５に示す。表４、５及び図４、５において、「対照」がコントロール群の結果であり、「ＬＦ」が、２％ラクトフェリン含有餌群の結果であり、「ＬＦ分解物」が、０．５％ラクトフェリン分解物含有餌群の結果である。
【００８５】
【表４】
2020058346.tif 000006
【００８６】
【表５】
2020058346.tif 000007
【００８７】
表４、５及び図４、５に示されるとおり、０．５％ラクトフェリン分解物含有餌群は、コントロール群に比べて、大脳皮質中及び海馬中のアミロイドβ１−４０量及びアミロイドβ１−４２量が有意に低下していた。したがって、ラクトフェリン分解物を摂取することで、脳内のアミロイドβ量を、特には大脳皮質中及び海馬中のアミロイドβ量を低下できることが認められた。
【００８８】
また、上記の試験において、ラクトフェリン分解物の量はラクトフェリンの量の４分の１であったが、ラクトフェリン分解物によって、ラクトフェリンと同程度の結果が得られた。そのため、ラクトフェリン分解物は、ラクトフェリンよりも少ない量でより効果的に脳内のアミロイドβ量を低下できることがわかった。
【００８９】
［試験例３（β−セクレターゼ阻害作用の評価）］
【００９０】
（１）β−セクレターゼの阻害作用評価試験
試験例２の（１）において述べたホモジナイズ、遠心、及び上清吸引除去によって得られた細胞サンプルに発現しているβ−セクレターゼレベルを抗β-セクレターゼ抗体を用いてＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔを行い測定した。
【００９１】
前記Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔは、以下のとおりに行われた。
前記細胞サンプル中の細胞をRIPA溶液中で１０秒間超音波処理し、15,000rpm、10分、4℃で遠心後、上清を回収した。上清にサンプルバッファー（62.5 mM Tris-HCl (pH6.8)、２％ SDS、１０％  glycerol、0.０２５％  bromophenolblue）を加え、９５℃で５分間熱処理してWestern blot用サンプルを得た。１０％SDS−ポリアクリルアミドゲルに、各Western blot用サンプル２０μｇを入れて電気泳動を行い蛋白質を分離した。分離された蛋白質をＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフロライド）メンブレンにトランスファーした後、室温で１時間ブロッキング（５％  ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ／ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０、ＴＢＳ−Ｔ）を行った。その後、メンブレンを洗浄バッファー（ＴＢＳ−Ｔ）で１０分間、１回洗浄した。洗浄後、抗β−セクレターゼ抗体（R&D社、Ｃａｔ  Ｎｏ．MAB９３１）又は抗Actin抗体（Proteintech社製、Ｃａｔ  Ｎｏ．20536-1-AP）をＴＢＳ−Ｔバッファーで１,０００倍希釈した抗体溶液をメンブレンと接触させ、４℃で１６時間反応を行った。反応後、メンブレンを洗浄バッファーで１０分間、３回洗浄した後、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識Rabbit IgG二次抗体（Cell signaling社、Ｃａｔ  Ｎｏ．7074S、２．５％  ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ／ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で５，０００倍希釈）を入れて室温で１時間反応させた後、メンブレンを洗浄バッファーで１０分間、３回洗浄した。化学発光をＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｍａｇｅｒ−６００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）装置で検出した。検出結果から、アクチンへの前記抗Actin抗体及び前記二次抗体の結合による化学発光のシグナル量に対する、β−セクレターゼへの前記抗β−セクレターゼ抗体及び前記二次抗体の結合による化学発光の相対的なシグナル量を算出した。当該相対的なシグナル量が、β−セクレターゼの発現量の指標として利用できる。
【００９２】
（２）結果
各群における相対的なシグナル量の平均値を以下の表６及び図６に示す。表６及び図６において、「対照」がコントロール群の結果であり、「ＬＦ」が、２％ラクトフェリン含有餌群の結果であり、「ＬＦ分解物」が、０．５％ラクトフェリン分解物含有餌群の結果である。
【００９３】
【表６】
2020058346.tif 000008
【００９４】
表６及び図６に示されるとおり、コントロール群と比較して、ラクトフェリン分解物群は、β−セクレターゼへ結合した抗体による相対的なシグナル量が有意に少なかった。そのため、ラクトフェリン分解物は、β−セクレターゼの阻害作用、特には発現阻害作用を有することが分かる。
【００９５】
また、表６及び図６に示されるとおり、コントロール群と比較して、ラクトフェリン群も、β−セクレターゼへ結合した抗体による相対的なシグナル量が有意に少なかった。そのため、ラクトフェリンが、β−セクレターゼの阻害作用、特には発現阻害作用を有することも分かる。
【００９６】
また、上記の試験において、ラクトフェリン分解物の量はラクトフェリンの量の４分の１であったが、ラクトフェリン分解物によって、ラクトフェリンと同程度の結果が得られた。そのため、ラクトフェリン分解物は、ラクトフェリンよりも少ない量でより効果的にβ−セクレターゼを阻害することができることも分かる。
【００９７】
［試験例４（種々のラクトフェリン分解物のアミロイドβ量低下作用）］
【００９８】
（１）試料の調製
ウシラクトフェリン（森永乳業社製）を精製水にて５質量％となるように溶解し、水酸化ナトリウム溶液にてpH７．５に調製した。調製したラクトフェリン溶液を５０℃に加温し、次いでラクトフェリンの質量に対して３質量％のパパイン、トリプシンをそれぞれ添加して攪拌しながら５時間反応させて加水分解を行った。加水分解反応が終了後、反応液を９０℃に加温し、１０分間保温して酵素を失活させた。反応液を冷却後、1N 塩酸溶液を添加して反応液のpHを６に調整し、その後反応液を凍結乾燥してラクトフェリン加水分解物を製造した。なお、製造したラクトフェリン加水分解物の数平均分子量をHPLC法より測定し、1600Daであることを確認した。以上のとおりにして、ウシラクトフェリンのパパイン分解物及びトリプシン分解物を調製した。
【００９９】
試験例１の（１）において述べたとおりに、ウシラクトフェリンのペプシン分解物を調製した。
また、配列番号１のアミノ酸配列のみからなるウシラクトフェリン由来ペプチド（ラクトフェリシン、森永乳業株式会社）も用意した。
【０１００】
（２）細胞培養実験
生まれて１日目のＷｉｓｔａｒラットから大脳皮質を採取し、当該大脳皮質から髄膜を除去して、脳組織を得た。当該脳組織を、メスを用いて細切した。細切した脳組織を、トリプシン（０．２５％）及びＤＮａｓｅＩ （０．１ｍｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ培地に入れ、３７℃で１５分間インキュベートし組織を破砕した。その後、８００ｒｐｍで５分間遠心してから上清を吸引して除去し、沈殿物に１０％ウシ胎児血清及び１００μｇ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシンを含んだＤＭＥＭ溶液を加えて、沈殿物をガラスピペットで分散させた。分散物を培養フラスコに播き、培養を行った（３７℃、５％ ＣＯ２）。細胞がｃｏｎｆｌｕｅｎｔになり次第、恒温振とう機を用い３７℃、２００ｒｐｍの条件で１時間振とうし、接着力が弱いミクログリアを除去して、アストロサイトを得た。
【０１０１】
次いで、１０％ウシ胎児血清及び１００μｇ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシンを含んだＤＭＥＭ溶液を入れた６０ｍｍｄｉｓｈに１×１０６個のアストロサイトを播き７２時間培養した後、血清を除去するために、細胞を、無血清のＤＭＥＭ培養液で１回洗浄した。当該洗浄後、当該細胞を、無血清ＤＭＥＭ培養液中で、１０μｇ／ｍｌのウシラクトフェリン、１０μｇ／ｍｌのラクトフェリン分解物（前記ペプシン分解物、前記トリプシン分解物、若しくは前記パパイン分解物）、若しくは１０μｇ／ｍｌの前記ウシラクトフェリン由来ペプチドの存在下で、又はこれらの不在下（対照）でさらに１７時間培養した。１７時間の培養後、アミロイドβ１−４２（株式会社ペプチド研究所、4349-v)を２μｇ／ｍＬとなるように培地中に添加し、さらに３時間培養した。３時間の培養後、培養上清を回収し、アミロイドβ１−４２を定量した。
【０１０２】
前記アミロイドβ１−４２の定量はELISA kit（Ｈｕｍａｎ／Ｒａｔ  ｂｅｔａ−Ａｍｙｌｏｉｄ（４２）ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｗａｋｏ，Ｃａｔ  Ｎｏ，２９０−６２６０１））を用い、ＷａｋｏのＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔに同封されたプロトコルに従って定量した。
【０１０３】
（３）結果
前記実験の結果を以下の表７及び図７に示す。表７及び図７において、「対照」が、ウシラクトフェリン、ラクトフェリン分解物、及び前記ウシラクトフェリン由来ペプチドの不在下における培養の結果を示し、「ＬＦ」が、ウシラクトフェリン存在下での培養の結果を示し、「ペプシン分解物」、「トリプシン分解物」、及び「パパイン分解物」が、これら分解物それぞれの存在下における培養結果を示し、「ＬＦｃｉｎ」は、１０μｇ／ｍｌの前記ウシラクトフェリン由来ペプチド存在下における培養結果を示す。表７及び図７において示される結果は、対照について測定されたアミロイドβ１−４２量を１とした場合の相対値である。
【０１０４】
【表７】
2020058346.tif 000009
【０１０５】
表７及び図７に示されるとおり、対照と比較して、ラクトフェリン分解物存在下において、アミロイドβ１−４２量が有意に減少した。これにより、ラクトフェリン分解物によって、アミロイドβ１−４２存在下でアストロサイトを培養した場合の培養上清中のアミロイドβ１−４２を、減少させることができることが分かる。よって、アストロサイトによるアミロイドβ１−４２の分解が、ラクトフェリン分解物によって誘導及び／又は促進されることが分かる。この結果から、ラクトフェリン分解物は、脳内におけるアミロイドβ１−４２量を低下させることができることが分かる。
【０１０６】
また、表７及び図７に示されるとおり、対照と比較して、前記ウシラクトフェリン由来ペプチド存在下において、アミロイドβ１−４２量が有意に減少した。これにより、前記ウシラクトフェリン由来ペプチドによって、アミロイドβ１−４２存在下でアストロサイトを培養した場合の培養上清中のアミロイドβ１−４２を、減少させることができることが分かる。よって、アストロサイトによるアミロイドβ１−４２の分解が、前記ウシラクトフェリン由来ペプチドによって誘導及び／又は促進されることが分かる。この結果から、前記ウシラクトフェリン由来ペプチドは、脳内におけるアミロイドβ１−４２量を低下させることができることが分かる。
また、前記ラクトフェリン分解物が前記ウシラクトフェリン由来ペプチドを含むことによって、前記ラクトフェリン分解物による作用（アストロサイトによるアミロイドβ１−４２の分解の誘導及び／又は促進、並びに、脳内におけるアミロイドβ１−４２量の減少）が、より確実に奏されることが分かる。
【０１０７】
また、表７及び図７に示されるとおり、対照と比較して、ラクトフェリン存在下において、アミロイドβ１−４２量は有意に減少しなかった。この結果及び前記ラクトフェリン分解物及び前記ウシラクトフェリン由来ペプチドに関する結果より、前記ラクトフェリン分解物及び前記ウシラクトフェリン由来ペプチドは、ラクトフェリンよりも、アストロサイトによるアミロイドβ１−４２の分解の誘導及び／又は促進のために適していると分かる。
【０１０８】
以上のとおり、アストロサイトによるアミロイドβ１−４２の分解が、ラクトフェリン分解物によって誘導及び／又は促進される。すなわち、本技術は、ラクトフェリン分解物を含む、アストロサイトによるアミロイドβ１−４２分解の誘導及び／又は促進用組成物も提供する。当該組成物は、好ましくは、上記で説明した配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドを含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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