(57)【要約】【課題】本発明は、担子菌の菌糸体を培養するための培地であって、ＤＮＪ等の有用成分を含む有用物質を短時間に高収率で得ることができる培地を提供する。【解決手段】本発明の培地は、担子菌の培養に用いる培地であって、前記培地は培地基材と桑葉とを含み、前記培地基材１００質量部に対して前記桑葉を１０〜５００質量部の割合で含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
担子菌の培養に用いる培地であって、
前記培地は培地基材と桑葉とを含み、
前記培地は前記培地基材１００質量部に対して前記桑葉を１０〜５００質量部の割合で含む、培地。
【請求項２】
前記培地基材はバガスと米ぬかとを含み、
前記培地基材はバガス１００質量部に対して、米ぬかを１０〜９０質量部含む、請求項１に記載の培地。
【請求項３】
前記担子菌がシイタケ、霊芝、エリンギ、またはヤマブシタケから選択される少なくとも一種である、請求項１または２に記載の培地。
【請求項４】
以下の工程（ａ）を含む、有用物質の取得方法。
（ａ）請求項１〜３のいずれか一項に記載の培地を用いて、担子菌を培養する、培養工程
【請求項５】
以下の工程（ｂ１）〜（ｂ３）から選択される少なくとも１種の工程を含む、請求項４に記載の有用物質の取得方法。
（ｂ１）工程（ａ）の後の培養後培地に対して抽出処理を行う、抽出工程
（ｂ２）工程（ａ）の後の培養後培地に対して圧搾処理を行う、圧搾工程
（ｂ３）工程（ａ）の後の培養後培地に対して乾燥処理を行う、乾燥工程
【請求項６】
請求項４または５に記載の方法で得られる有用物質。
【請求項７】
請求項６に記載の有用物質を含む飲食物。
【請求項８】
請求項６に記載の有用物質を含む医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、担子菌の培養に用いる培地、有用物質の取得方法、有用物質およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、厚生労働省の平成２８年「国民健康・栄養調査」によると糖尿病有病者と糖尿病予備群は、いずれも約１，０００万人と推計されており、糖尿病の予防と対策は急務となっている。桑葉には、１−デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）と呼ばれるブドウ糖の類縁化合物が含まれていることが知られており、ＤＮＪは小腸α-グルコシダーゼの活性中心に結合することにより、強力なα-グルコシダーゼ阻害活性を発揮することが知られている（非特許文献１）。この阻害活性により糖質（でんぷん）の分解が妨げられることで、食後の血糖値の上昇を抑制することができるとして、桑葉の有する血糖値改善作用は、糖尿病の治療や病態の改善につながるものとして注目されている。
例えば、非特許文献２、３においては、ラットの糖尿病モデルや２型糖尿病患者に対し、桑葉粉末の投与試験を行うことで、空腹時血糖の改善効果が見られたという報告がされている。
【０００３】
近年、ＤＮＪを含有する桑葉製品（桑茶、桑食品、サプリメント等）が販売されている。桑葉を加工する方法としては従来、桑葉をそのまま、又は蒸気、熱湯でブランチングして乾燥させ、その後粉砕して粉末にする方法や、桑葉を粉砕して乾燥させる方法が知られている。しかしながらＤＮＪは、桑葉に０．０６％程度とごく低濃度しか存在せず、血糖値改善効果を期待するにはかなりの桑葉加工品を摂取する必要があった。近年、ＤＮＪを濃縮する技術として、桑葉から水及びアルコールにより抽出した桑葉エキスを陽イオン交換樹脂又は活性炭で脱色・脱臭処理する方法が報告されている（特許文献１）。
【０００４】
一方、担子菌の子実体や菌糸体には、抗酸化物質をはじめとする各種の生理活性機能を有する成分が含有されていることが知られており、様々な疾病の予防や改善、特に糖尿病の予防治療剤あるいは血糖値上昇抑制剤としての提案もなされている。
【０００５】
例えば、特許文献２には、担子菌の一種である金耳の子実体若しくは菌糸体を水で抽出処理した抽出液、その濃縮液、その乾燥物又はその乾燥粉砕物を有効成分とする血糖上昇抑制剤が開示されており、また、特許文献３には、マイタケの菌糸体若しくは子実体を熱水処理して得られる可溶性物質等を有効成分とするＩ型及びII型糖尿病に対して改善効果を有する物質が開示されている。
【０００６】
このような背景から、担子菌類から有効成分を抽出する種々の方法が提案されている。例えば、特許文献４には、担子菌類を主としてバガスからなる培地に接種し、菌糸を繁殖させた後、この菌糸体繁殖培地を圧搾して、有効成分を採取する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−３３３７２８号公報
【特許文献２】特開平９−６７２６８号公報
【特許文献３】特開平６−３１２９３６号公報
【特許文献４】特開昭５４-４６８５９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Evans, S. V., et al.  Phytochemistry, 24, 1953- 1955.
【非特許文献２】Andallu, B.et al.  Clin. Chim. Acta, 314, 47-53
【非特許文献３】Andallu and Varadacharyulu  Clin. Chim. Acta, 338, 3-10.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように、ＤＮＪを濃縮する製造技術として、陽イオン交換樹脂や活性炭を用いることができるが、操作性、コスト、および効率等の観点から問題があるためＤＮＪを高濃度で含有する桑葉製品を安価に製造するための方法が望まれていた。
一方、担子菌の子実体や菌糸体から有効成分を抽出する方法については上述したように複数の報告があるが、担子菌の培地原料に起因する成分については着眼されていなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意研究の結果、従来の培地に桑葉を加えた培地を用いて担子菌の菌糸体を培養すると、菌糸体の成長が通常よりも早く、また培養後の抽出液や乾燥物にＤＮＪが従来よりも極めて高濃度に含まれることを見出した。
【００１１】
すなわち、本発明は例えば以下の［１］〜［８］を提供する。
[１]
担子菌の培養に用いる培地であって、
前記培地は培地基材と桑葉とを含み、
前記培地は前記培地基材１００質量部に対して前記桑葉を１０〜５００質量部の割合で含む、培地。
[２]
前記培地基材はバガスと米ぬかとを含み、
前記培地基材はバガス１００質量部に対して、米ぬかを１０〜９０質量部含む、項１に記載の培地。
[３]
前記担子菌がシイタケ、霊芝、エリンギ、またはヤマブシタケから選択される少なくとも一種である、項１または２に記載の培地。
[４]
以下の工程（ａ）を含む、有用物質の取得方法。
（ａ）項１〜３のいずれか一項に記載の培地を用いて、担子菌を培養する、培養工程
[５]
以下の工程（ｂ１）〜（ｂ３）から選択される少なくとも１種の工程を含む、項４に記載の有用物質の取得方法。
（ｂ１）工程（ａ）の後の培養後培地に対して抽出処理を行う、抽出工程
（ｂ２）工程（ａ）の後の培養後培地に対して圧搾処理を行う、圧搾工程
（ｂ３）工程（ａ）の後の培養後培地に対して乾燥処理を行う、乾燥工程
[６]
項４または５に記載の方法で得られる有用物質。
[７]
項６に記載の有用物質を含む飲食物。
[８]
項６に記載の有用物質を含む医薬。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の培地によれば、従来の手法と比べて、ＤＮＪを高濃度に含む有用物質を短時間に高収率で得ることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は培養後菌糸蔓延日における各試験例の写真である。
【図２】図２は実施例２における桑葉のＩＣ50の算出方法の凡例である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の培地は担子菌の培養に用いられる培地であり、下記培地基材と桑葉とを含む。
本発明の培地は、培地基材１００質量部に対して桑葉を１０〜５００質量部の割合で含むことが好ましく、２５〜４００質量部の割合で含むことがより好ましく、４０〜１００質量部の割合で含むことがさらに好ましい。特に培地基材１００質量部に対して、桑葉を４５〜５５質量部の割合で含むことが最も好ましい。
【００１５】
本発明の培地は、さらに含水させたものであることが好ましく、培地の調製時に水を添加してもよいし、使用直前に水を添加してもよい。培地の含水量は、培養の対象となる担子菌の種類や培養条件などによって適宜調整することができるが、培地全体を１００質量％とした際に、５０〜８０質量％、好ましくは６０〜７５質量％の水分を含むことが好ましい。また、培地は、必要に応じて他の栄養成分として、酵母エキス、乾燥酵母、クロレラ、スピルリナ、コーンミールなどが添加されていてもよい。
本発明の培地を製造する方法は特に限定されず、培地基材と桑葉とを前記の比率で配合したものを混合することで行うことができ、例えば市販のミキサーやブレンダーなどを適宜用いて行うことができる。
【００１６】
＜培地基材＞
本発明の培地に用いる培地基材としては、例えば、バガス（さとうきびの搾り粕）、米ぬか、トウモロコシの茎葉、小麦ふすま、稲藁、茅、熊笹、または竹などが挙げられ、これらは一種単独で用いても、二種以上を混合して用いてもよい。培地基材としては、特にバガスおよび米ぬかが好適に用いられる。バガスおよび米ぬかはそれぞれ単独で培地基材として用いることもできるが、混合して用いることがより好ましい。特に、培地基材がバガスと米ぬかとを含む場合には、バカス１００質量部に対して、米ぬかを１０〜９０質量部含むことが好ましく、３０〜８０質量部含むことがより好ましく、６０〜７０質量部含むことが最も好ましい。
【００１７】
＜桑葉＞
桑葉とは、クワ科（Moraceae）の植物、例えばヤマグワ（Morus bombycis）、マグワ・カラグワ（Morus albaL．）、ケグワ（Morus tiliaefolia、Morus cathayana）、トウグワ（Morus alba）、ハチジョウグワ（Morus kagayamae Koidz.）、またはそれらの同属もしくは近縁の植物の葉のことをいう。後述する抽出液等におけるＤＮＪの含有率の観点から、桑樹の枝先端から５０ｃｍ以内の部位に生えている桑葉を用いることが好ましい。また、用いる桑の品種は特に限定されず、きぬゆたか、一ノ瀬、はやてさかり、しんいちのせ、みなみさかり、剣持、赤木、改良鼠返し、鶴田、松本一号、たちみどり、および改良秋田など一般的に栽培されているものから選択することができ、特に後述する抽出液等におけるＤＮＪの含有率の観点から、きぬゆたか、鶴田、松本一号、はやてさかり、たちみどり、および改良秋田を選択することが好ましい。これらの桑葉のうち、一種の桑葉を用いてもよいし、複数種の桑葉を適宜混合して用いてもよい。
【００１８】
培地基材に混合する際の桑葉の状態は、特に限定されず、全葉、または桑葉の細片、粉末（桑葉末）もしくはこれらの懸濁液、または桑葉抽出液、桑葉濃縮抽出液および桑葉エキス末などの抽出物等を用いることができるが、乾燥させた全葉または細片を用いることが好ましい。なお、用いる桑葉は培地基材に混合する前に、安全面の観点から例えば８０℃〜９５℃、１０分〜１時間などの条件で殺菌処理を行うことが好ましい。
【００１９】
桑葉を乾燥する工程は、当技術分野で通常用いられる方法によって実施することができる。例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥、熱風乾燥等の方法により常法において行われる。凍結乾燥は、例えば、凍結乾燥機を用いて桑葉を−２５〜−１５℃程度で２４時間程度予備凍結させた後、１ｍｍＨｇ以下の減圧下で２４〜４８時間程度凍結乾燥させることにより行われる。噴霧乾燥は、例えば、桑葉の破砕物を適量の水に分散させ、噴霧乾燥機を用い、熱風入口温度１３０〜１８０℃程度、熱風出口温度６０〜９０℃程度の条件下で噴霧乾燥させることにより行われる。熱風乾燥は、例えば、通風乾燥機を用い、４０〜７０℃程度、好ましくは５０〜６０℃程度で、２〜６時間程度、好ましくは３〜５時間程度乾燥させることにより行われる。また、製茶機を用いて乾燥を行ってもよく、この場合、通常、冷却工程、粗揉工程、揉捻工程、中揉工程、精揉工程、及び乾燥工程が含まれる。
【００２０】
本発明の一様態においては、前記桑葉の代わりに、または桑葉とともに、桑の木の葉以外の部分、例えば枝条、根、樹皮（根皮）、実（集合果）等を用いてもよい。これらの部分を用いる場合の様態は特に限定されないが、桑葉と同様に破砕してから乾燥させたものを用いることが好ましい。
【００２１】
＜担子菌＞
本明細書において担子菌とは、担子菌門（Basidiomycota）に属する菌類を指し、具体的には、マツタケ、シイタケ、エノキダケ、ヒラタケ、ナメコ、イグチ、シメジ、チチタケ、コフキサルノコシカケ、ツガサルノコシカケ、カワラダケ、マンネンダケ（霊芝）、マイタケ、キクラゲ、シロキクラゲ、ヒラタケ、ヤマブシダケ、マンネンダケ、ブクリョウなど各種のものが挙げられる。これらの中でも、培養容易性、栄養価、薬効等の観点から、シイタケ、霊芝、エリンギ、およびヤマブシタケが特に好ましく用いられる。
本発明において用いられる菌糸体は、特に限定はされないが、例えば、食用にされる子実体の前段階の菌糸の状態のものを使用することができる。当該菌糸体は、培養により生産されたものであってもよいし、天然より採取されたものであってもよい。
【００２２】
＜有用物質の取得方法＞
本発明に係る有用物質の取得方法は、菌糸体の培養を行う培養工程（ａ）を含む。前記有用物質の取得方法は、後述の工程（ｂ１）〜（ｂ３）から選択される少なくとも１種の工程を含むことが好ましい。なお、本発明では、工程（ｂ１）を抽出工程、工程（ｂ２）を圧搾工程、工程（ｂ３）を乾燥工程とも記す。
【００２３】
［培養工程（ａ）］
上記培養工程は、上述の本発明の培地を用いて、担子菌を培養する、培養工程である。前記培養工程は、培地上に担子菌を接種し、温度および湿度さらには照度が調節された培養室内において所定期間培養する工程であり、培地内に菌糸体を増殖させて菌糸体を含む培地を取得することを目的とする工程である。本発明においては培養工程後の培地を培養後培地と称することもある。
培養条件としては、特に限定されないが、例えば温度１５〜２８℃、湿度６０〜９０％ＲＨ程度に維持された培養室、好ましくは温度２０〜２５℃、湿度６５〜８５％ＲＨ程度に維持された培養室で、好ましくは培地内に菌糸体が充分蔓延するまで、通常２〜６ヶ月間培養する。
接種法としては胞子接種法、菌糸接種法、菌根接種法などから任意のものが用いられるが、好ましくは所望の保存菌株の子実体の菌傘部組織（菌叢）から採取した菌糸体を寒天培地または液体培地で培養した菌糸体を上記培地に摂取する手法が用いられる。
【００２４】
［任意処理］
本発明の取得方法においては、培養後培地について、抽出工程、圧搾工程、または乾燥工程を行う前に加熱処理を行ってもよい。加熱処理は、培養後培地を、通常６０℃以上、好ましくは６０〜１００℃、より好ましくは６５〜１００℃、さらに好ましくは７０〜９０℃に加熱する。前記加熱処理は、通常１時間以上、好ましくは１〜３時間、より好ましくは１〜２時間行う。加熱処理は、大気圧下で行ってもよく、オートクレーブ内で、加圧下で行ってもよい。
なお、加熱処理は、温度を二段階以上に分けて行ってもよく、二段階以上に温度を分けて行う場合には、段階的に温度を上げることが好ましい。例えば、培養後培地が７０〜８０℃になる温度で１０分〜２時間保持した後に、培養後培地の温度が８０℃を超えて９０℃以下になる温度で１０分〜２時間保持する方法で加熱することが好ましい。
【００２５】
また、加熱処理に加えて、例えば、酵素添加処理、破砕・擂潰処理等が行われてもよい。
なお、任意工程前後における培地の含水量は、５５〜８５質量％に維持することが好ましく、６０〜８０質量％に維持することがより好ましい。
【００２６】
本発明の有用物質の取得方法の一様態においては、前記培養工程において得られた培養後培地について、さらに抽出処理、圧搾処理、または乾燥処理を行うことで、培養後培地に含有される有用物質を取得する。抽出処理、圧搾処理、および乾燥処理は、いずれか一つの処理のみを行ってもよいし、複数の処理を組み合わせて行ってもよく、さらに同一の培地に対していずれか一つの処理を繰り返して行ってもよい。
【００２７】
[抽出工程（ｂ１）]
工程（ｂ１）は、工程（ａ）の後の培養後培地に対して抽出処理を行う、抽出工程である。
抽出工程としては例えば、培養後培地を粉砕して粉砕物に水を加え、遠心分離、濾過等により有用物質を含有する抽出液を得るための抽出処理を行う工程が挙げられる。
本発明における抽出処理は、好ましくは以下の工程であるが、これに限定されない。
１２メッシュ通過分が３０重量％以下となるように解束した培養後培地に水等を加え、３０〜８０℃の温度に保ちながら、撹拌、加熱することで抽出するか、７０重量％以上が１２メッシュ通過分となるまで粉砕した、または擂潰した培養後培地を懸濁化して濾過することにより抽出する。得られた抽出液については、さらに、安全面の点から、殺菌工程（例えば８０℃〜９５℃、１０分〜１時間）を設けることが好ましい。また、必要に応じて任意の手法で精製を行ってもよい。なお、抽出は、温度を二段階以上に分けて行ってもよく、二段階以上に温度を分けて行う場合には、段階的に温度を上げることが好ましい。例えば、培養後培地等の抽出対象物が３０〜５０℃になる温度で３０分〜２時間保持した後に、抽出対象物の温度が６０〜８０℃になる温度で３０分〜２時間保持し抽出することが好ましい。
【００２８】
本発明の一実施形態では、上記で得られた抽出液をさらに濃縮したり乾燥することにより、ＤＮＪ含有率がさらに高い有用物質を得ることができる。乾燥方法としては、特に制限されないが、例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥、熱風乾燥、低温除湿乾燥等が挙げられる。大量連続処理が可能であり、乾燥速度が速い、熱の影響を受けにくいなどの理由から、好ましくは、噴霧乾燥により乾燥を行う。乾燥して粉末状とすることにより、保存性や流通性が高まるとともに、後述する食品等の製造において都合よく使用できる。
【００２９】
[圧搾工程（ｂ２）]
工程（ｂ２）は、工程（ａ）の後の培養後培地に対して圧搾処理を行う、圧搾工程である。
圧搾工程としては例えば、プレス処理等の圧搾処理により培養後培地を圧搾して有用成分を含有する圧搾液を得るための圧搾処理を行う工程が挙げられる。
プレス処理等の圧搾処理により有用物質を得る方法の場合、上記培養後培地に水を加える必要はない。このため、濃縮処理を行うことなく、有用成分を高濃度で含有する圧搾液を得ることができる。
【００３０】
上記圧搾処理は、通常５０〜２００ｋｇ／ｃｍ2の加圧下で、１〜１０分間程度、好ましくは８０〜１８０ｋｇ／ｃｍ2の加圧下で、３〜５分間程度行われる。また、本発明では、このような圧搾操作は、１回でもよく、同一または異なった圧力条件下で複数回に分けて行うこともできる。必要に応じて、得られた圧搾液に殺菌処理を行ってもよい。
【００３１】
また、得られた圧搾液を、上述した抽出液に対して行われ得る濃縮方法や乾燥方法と同様の手段により、濃縮または乾燥させることで、ＤＮＪ含有率がさらに高い圧搾液を得ることができる。
【００３２】
[乾燥処理（ｂ３）]
工程（ｂ３）は、工程（ａ）の後の培養後培地に対して乾燥処理を行う、乾燥工程である。
乾燥工程としては例えば、培養後培地を乾燥させる乾燥処理を行う。乾燥処理は、自然乾燥、加熱乾燥、加圧乾燥、常圧乾燥、真空乾燥、凍結乾燥等の従来用いられている方法を適宜用いて行うことができる。加熱により乾燥する場合は、６０℃以上、好ましくは６０〜１００℃、より好ましくは６５〜１００℃、さらに好ましくは７０〜９０℃で乾燥を行い、加熱時間は、通常１時間以上、好ましくは１〜３時間、より好ましくは１〜２時間行う。なお、乾燥は、温度を二段階以上に分けて行ってもよく、二段階以上に温度を分けて行う場合には、段階的に温度を上げることが好ましい。例えば、培養後培地等が７０〜８０℃になる温度で１０分〜２時間保持した後に、培養後培地等が温度が８０℃を超えて９０℃以下になる温度で１０分〜２時間保持し乾燥することが好ましい。
なお、ここでの乾燥処理は、培養後培地の含水量を１０質量％以下にすることを意味し、上記任意処理において行われ得る加熱処理とは区別される。
前記乾燥処理が行われた乾燥物は、任意の手法で粉砕・顆粒化してもよい。
【００３３】
(有用物質)
本発明における有用物質は、前記抽出処理、圧搾処理、または乾燥処理の結果物である、抽出液、圧搾液、乾燥物、または前記抽出液もしくは圧搾液の乾燥物等の形態で取得される。
前記有用物質は、有用成分として特にＤＮＪが高濃度に含有されておいることが特徴であり、さらに桑葉および担子菌由来の種々の糖類、たんぱく質、アミノ酸類、ミネラル、ビタミン類等が有用成分として含有される。
【００３４】
(飲食物)
本発明の一様態においては、有用物質を含む飲食物が提供される。飲食物としては、具体的には上述の抽出液、圧搾液、乾燥物、並びに前記抽出液、圧搾液の乾燥物等を用いて製造した飲食物である。
より具体的には、スープ、茶、青汁、ジュース、乳飲料、ココア飲料、ゼリー状飲料、およびプリン、ヨーグルトなどの半固形飲食物、パン、クッキーなどの菓子、バター、ジャムなどのスプレッド類等の形態もとりうる。
【００３５】
本発明の飲食物には、種々の食品添加物、例えば各種栄養素、種々のビタミン、ミネラル、食物繊維、多価不飽和脂肪酸、分散剤及び乳化剤等の安定剤、甘味料、呈味成分、フレーバー等を配合することができる。
【００３６】
本発明の飲食物には、機能性食品、健康食品、栄養補助食品、サプリメント、および保健機能食品が包含され、典型的な食品形態ではないもの、すなわちエキス、細粒、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、流動食等の各種医薬品的な形状を有する飲食物も包含される。医薬形態の飲食物は乾燥粉末や抽出液等に適当な賦形剤（例えば、でん粉、加工でん粉、乳糖、ブドウ糖、水等）を加えた後、慣用の手段を用いて製造することができる。
【００３７】
（医薬品）
本発明の一様態においては、上述の有用物質の取得方法によって取得された有用物質を含有する医薬品が提供される。具体的には、上述の抽出液、圧搾液、乾燥物、並びに前記抽出液、圧搾液の乾燥物等を用いて製造した医薬品であり、疾患の予防、病態改善、治療に使用することができる。
【００３８】
これら医薬品は、例えば錠剤、コーティング錠、糖衣錠、硬ゼラチンカプセル剤若しくは軟ゼラチンカプセル剤、液剤、乳濁剤又は懸濁剤の形態で経口的に投与することができるが、例えば、座剤の形態で経直腸投与、軟膏、クリーム剤、ゲル剤又は液剤の形態で局部的又は経皮的投与、 例えば注射用液剤の形態で静脈内投与・筋肉内投与・皮下投与することもできる。
【００３９】
対象疾患は特に限定されず、例えば、肝障害、虚血性再灌流障害、動脈硬化などの循環器系疾患、胃潰瘍、胃粘膜障害などの消化器官系疾患、呼吸器系疾患、糖尿病、白内障、皮膚疾患、各種炎症性疾患、神経疾患、癌などが挙げられ、特に糖尿病の予防・治療・病態改善における効果が期待できる。
【００４０】
本発明の有用物質を前記飲食物および医薬として用いる場合の摂取量または投与量はその用途によっても異なり、特に限定される必要はないが、通常、抽出液の乾燥物（粉末）に換算して１日あたり４０ｍｇ〜６ｇ、好ましくは４００ｍｇ〜１．８ｇである。
【００４１】
＜その他の利用形態＞
上記抽出処理または圧搾処理後の固体残渣には、抽出または圧搾しきれなかった菌糸体などの成分が含まれている。このため、この残渣を乾燥・粉砕して得られた粉砕物は、例えば、飲食物、植物活性剤、家畜の飼料等として利用することができる。
また、上述の抽出液、圧搾液、乾燥物、並びに前記抽出液、圧搾液の乾燥物等を前記固体残渣、または公知の植物活性剤や飼料に添加することで、植物や家畜の生育をさらに促進することができる。
また、前記固体残渣に水を加えて、遠心分離、濾過等によりさらに有用物質を抽出することもできる。
【実施例】
【００４２】
次に本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
［作製例１］
水分５％以下まで乾燥させた殺菌済み桑葉、水分１０％以下まで乾燥させ、５ｍｍのふるいに掛けて大きな繊維を除いたバガス、および脱脂米ぬかを準備し、以下の手法で培地を作製した。各所定量は以下の表１に記載される。試験例１は比較例、試験例２〜６が本発明に係る実施例である。
【００４３】
表１に記載の所定量の桑葉、バガス、脱脂米ぬかを混合機に加えてよく混合し、所定量の水を加え更によく混合し、各培地を得た。各培地を表１に記載の各充填量となるように秤量し、培養容器（エブリーパック深型Ｎｏ１（株式会社大創産業社製））に詰めた。
培地が充填された培養容器を、殺菌釜に入れ密閉し、ボイラーを点火して釜内温度を上昇させ、釜内の空気を蒸気と共に排出したのち弁を閉めることで常圧殺菌を行った。釜内温度が１０５℃以上になってから、６．５時間その温度を維持した。殺菌釜内で１晩放冷したのち、無菌環境下の放冷室内で、培地温度が２０℃以下となるまで冷却した。
【表１】
2020005539.tif 000002
［実験例１］
【００４４】
作製例１で作製した培地が詰められた培養容器に、無菌室でシイタケの菌糸を約３ｇ接種した。
培地内温度が２５℃を超えないように、室温を１８〜２２℃に保持し、湿度を８０％以上、ＣＯ2濃度は２５００ｐｐｍ以下、暗黒条件下において培養した。
なお、暗黒条件下とは、明かりを付けずに培養を行ったことを意味し、本実験例では点検時以外は、暗黒条件を維持して培養を行った。
培養中においては適宜目視で確認（点検）を行い、各時点における菌糸のおおよその長さを表２に記載した。培養開始から２ヶ月以内にはいずれの培地においても菌糸の蔓延が確認できた。菌糸が蔓延した日を菌糸蔓延日とする。
【表２】
2020005539.tif 000003
［実験例２］
【００４５】
抽出に関する試験
菌糸の生育の様子や成長速度、培地に添加した桑葉の量等から、試験例４の培養後培地が最も優れた培地であると推測した。試験例４の培養後培地を選択し、抽出試験を実施した。
実験例１における菌糸蔓延日後も培養を続け、菌糸蔓延日より1ヶ月後の培養後培地をバット内で解束して良く混合し、バットをラップで覆い、冷蔵庫で次工程まで保管した。
冷蔵庫から解束した培地を取出し、培地１００ｇを量り取り、ミキサーに入れ、更に２００ｍｌの水を入れてミキサーにより懸濁し、懸濁物をステンレスボールに移した。ミキサー内部を水１００ｍｌで洗い、該洗浄した水についても、前記ステンレスボールに移した。ステンレスボールをラップで覆った。
前記ステンレスボールを、５０℃にセットしたウォーターバスで加温し、ステンレスボール内の懸濁物を時々かき混ぜながら、懸濁物を加温した。懸濁物の温度を温度計で計り、懸濁物が４０℃に達したら、撹拌を行い、懸濁物を４０℃で１時間保持した。
次いで、ウォーターバスの設定温度を８０℃に変更し、ステンレスボール内の懸濁物を時々かき混ぜながら、懸濁物を加温した。懸濁物の温度を温度計で計り、懸濁物が７０℃に達したら、撹拌を行い、懸濁物を７０℃で１時間保持し、抽出を行った。
抽出後の懸濁液を、二重にしたガーゼを用いて濾過することで抽出液を得た。得られた抽出液はセライト５４５（メルクミリポア社）およびハイフロースーパーセルで吸引ろ過を行い、ついで孔径１．０、さらに孔径０．４５μｍの精密ろ過膜を用いて吸引ろ過を行った。ろ過後の抽出液を耐熱瓶に２０ｍｌ詰め、９０℃、３０分間加熱することで殺菌処理を行った。
【００４６】
成分分析結果
上記抽出前後の培地について成分分析を行った。
試験例４の培地は培養前４００ｇ（８０ｇ×５個、桑葉が合計８０ｇ）であったのに対して、培養後には２９６ｇであり、培養後の培地１００ｇあたりには２７ｇの桑葉（桑葉に由来する成分）が含まれていると判断した。
【００４７】
今回の実施例で使用した桑葉のサンプル（殺菌桑葉粗粉砕物）について株式会社機能性植物研究所において、ＨＰＬＣ（ポンプ：LC-20AD、カラムオーブン：CTO-20A、オートインジェクター：SIL-20AC：（株式会社島津製作所）、およびタンデム型質量分析装置API-3200（商標）（株式会社エービー・サイエックス）を用いて測定を行ったところ、ＤＮＪは８６．８ｍｇ／１００ｇ、２−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−１−デオキシノジリマイシン（Ｇａｌ−ＤＮＪ）９８．３ｍｇ／１００ｇが含有されることが確認できた。
【００４８】
一方、上記抽出液に含まれているＧａｌ−ＤＮＪおよびＤＮＪの量について同様に株式会社機能性植物研究所において測定を行った結果、ＤＮＪ９．２２ｍｇ／１００ｇ、Ｇａｌ−ＤＮＪは１．２４ｍｇ／１００ｇであった。
【００４９】
菌糸の培養によって、Ｇａｌ−ＤＮＪおよびＤＮＪの量が一切変わらない場合には、培養後の培地には重量当たりＧａｌ−ＤＮＪが２６．５４ｍｇ／１００ｇ（培養後の培地重量）含まれており、ＤＮＪが２３．４４ｍｇ／１００ｇ（培養後の培地重量）含まれていることになる。また、上述のように培養後の培地１００ｇあたり３００ｍｌの水を用いて抽出しているため、抽出液１００ｇ中には、Ｇａｌ−ＤＮＪが６．６４ｍｇ／１００ｇ（抽出液重量）含まれており、ＤＮＪが５．８６ｍｇ／１００ｇ（抽出液重量）含まれていることになる。
【００５０】
培養した場合（実測値）と、培養によってＧａｌ−ＤＮＪおよびＤＮＪの量が一切変わらないと仮定した場合（計算値）において、含まれているＧａｌ−ＤＮＪおよびＤＮＪの合計総量には大きな差はないが、実測値においては合計総量に対してＤＮＪの割合が大きいことがわかる。
すなわち、本発明の培地を用いた培養によって、桑葉に由来すると考えられるＤＮＪの量が増加おり、これはＧａｌ−ＤＮＪおよびＤＮＪの総量に大きな差が無いことから、本発明の培地を用いて培養することにより、Ｇａｌ−ＤＮＪが、より血糖値改善効果の高いＤＮＪに変化しているためであると推測することができる。
【００５１】
α-グルコシダーゼ阻害活性についての試験
上記抽出前後の培地についてα−グルコシダーゼのＩＣ50を算出した。
乾燥桑葉０．２ｇを秤量し５０％エタノールを２０ｍＬで１０分間振とう抽出を行い、回収した上澄みをフィルター（孔径０．４５μｍ：メルクミリポア社）を用いてろ過して所望の濃度に調製したものを各試験サンプルとした。
ラット小腸アセトンパウダー（品番Ｉ１６３０、ＳＩＧＭＡ社）０．５ｇに、０．１Ｍマレイン酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０）を２０ｍＬ加え、超音波処理（１ｍｉｎ×３回）を行った後、遠心分離（４℃、３０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ）を行い、回収した上澄みをフィルター（孔径０．４５μｍ：メルクミリポア社）を用いてろ過したものをイオン交換水で４倍に希釈することで、α-グルコシダーゼ溶液を調製した。
【００５２】
試験サンプル１００μＬと０．１Ｍマレイン酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０）７００μＬ及び０．５Ｍマルトース溶液１００μＬとを混合しプレインキュベート（３７℃、５ｍｉｎ）行い、その後、α-グルコシダーゼ溶液１００μＬを加えてさらにインキュベート（３７℃、６０ｍｉｎ）した。終了後に５００ｍＭ  炭酸ナトリウムを１０００μＬ加えることで反応を停止させた。
停止後の各溶液に対してＬＣ−ＭＳ／ＭＳ定量分析によりグルコースの濃度を定量し、コントロール（試験サンプルの代わりにイオン交換水で反応させたもの）と比較することで、各試験サンプルにおけるα-グルコシダーゼ阻害活性を測定した。各試験サンプルにおける算出した阻害活性率を図２のようにプロットし、次数を４として多項式近似曲線およびその数式を作製し、当該数式に基づいてα−グルコシダーゼ活性５０％阻害濃度（ＩＣ50）を計算した。
（式）ｙ＝ｄ＋（ａ−ｄ）／（１＋（ｘ／ｃ）＾ｂ）（a = 52358291.9、b = -0.062207、c = 4.67429E82、d = -296.43829）（相関係数：0.99852）。
【００５３】
乾燥桑葉におけるＩＣ50は０．４９９ｍｇ／ｍｌであった。
一方、菌糸培養後の抽出液に含まれる水可溶部の固形分は３５ｍｇ／ｍｌであり、α−グルコシダーゼ活性を５０％阻害するための希釈倍率は１３３．３倍であった。つまり、抽出液に含まれる水可溶部の固形分重量当たりのＩＣ50は０．２６３ｍｇ／ｍｌであった。
抽出液のＩＣ50は乾燥桑葉に比べて小さく、これは上述したように、菌糸培養および抽出処理により含有されるＤＮＪが増加するためにα−グルコシダーゼの阻害活性が大きくなっていることが理由だと考えられる。
【図１】
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【図２】
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