(57)【要約】【課題】レゴラフェニブの副作用を簡便に精度よく予測するための方法を提供すること。【解決手段】レゴラフェニブによる副作用を予測する方法であって、被検者のCYP2D6遺伝子の配列を解析し、CYP2D6遺伝子の配列に基づいて、レゴラフェニブによる副作用を予測することを特徴とする方法。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
レゴラフェニブによる副作用を予測する方法であって、被検者のCYP2D6遺伝子の配列を解析し、CYP2D6遺伝子の配列に基づいて、レゴラフェニブによる副作用を予測することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記予測が、CYP2D6遺伝子の配列が活性低下型変異を有しない場合にレゴラフェニブによる副作用が起こりやすいという指標に基づくものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
活性低下型変異が100 C>T変異、3173 A>C変異、3915 C>T変異、CYP2D6欠失変異またはそ
れらの組み合わせである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記予測が、CYP2D6遺伝子の配列が活性低下型変異を含むアリルを有しない場合にレゴラフェニブによる副作用が起こりやすいという指標に基づくものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記アリルがCYP2D6*10、CYP2D6*51、CYP2D6*P430L、CYP2D6*36、またはCYP2D6*41である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
被検者のCYP2D6遺伝子の配列を解析するためのプライマーまたはプローブを含む、レゴラフェニブによる副作用を予測するためのキット。
【請求項７】
100 C>T変異、3173 A>C変異、または3915 C>T変異を検出するためのプライマーまたはプ
ローブを含む、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
前記プローブが、配列番号３〜５のいずれかの塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記プライマーが、配列番号３〜５のいずれかの塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅するためのプライマーセットである、請求項７に記載のキット。
【請求項１０】
レゴラフェニブによる副作用を予測する方法であって、被検者由来のCYP2D6遺伝子を含む試料とレゴラフェニブを反応させ、下記代謝産物M-3の生成量を測定して、該測定量に基
づいて、レゴラフェニブによる副作用を予測することを特徴とする方法。
【化１】
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【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療・診断分野に関し、詳しくは遺伝子診断による薬剤副作用の予測技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
レゴラフェニブ（4-[4-({[4-Chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl]carbamoyl}amino)-3-fluorophenoxy]-N-methylpyridine-2-carboxamide hydrate、以下、REGと省略することもある）は進行した大腸がんの治療（三次治療）や消化管間質腫瘍の治療に使用される抗がん剤であるが、肝不全、劇症肝炎、肝機能障害、黄疸など肝臓における副作用等のレゴラフェニブ誘発性肝障害（RILI）が問題になっている。したがって、レゴラフェニブの投与を決定するにあたっては、副作用の起こりやすさを事前に予測する技術が求められる。
しかしながら、レゴラフェニブの副作用のメカニズムは不明であり、副作用にどのような因子が関与するかも不明であるため、レゴラフェニブの副作用に関する遺伝子やその変異などは知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、レゴラフェニブの副作用を簡便に精度よく予測するための方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らはレゴラフェニブの副作用に関与する遺伝子を探索するために鋭意検討を行った。その結果、CYP2D6（シトクロムP450 2D6）がレゴラフェニブの代謝に関与していることを見出し、レゴラフェニブのCYP2D6による代謝産物が副作用に関与することを初めて見いだした。そして、CYP2D6の遺伝子型を解析し、活性低下型変異を有する場合に副作用が起こりにくく、そのような変異を有しない、または有していても正常型遺伝子のコピー数が多いことにより活性が正常である場合に副作用が起こりやすいというように、遺伝子配列を解析することにより、レゴラフェニブの副作用の予測ができることを見出し、本発明の完成に至った。
【０００５】
本発明は以下のとおりである。
[１]レゴラフェニブによる副作用を予測する方法であって、被検者のCYP2D6遺伝子の配列を解析し、CYP2D6遺伝子の配列に基づいて、レゴラフェニブによる副作用を予測することを特徴とする方法。
[２]前記予測が、CYP2D6遺伝子の配列が活性低下型変異を有しない場合にレゴラフェニブによる副作用が起こりやすいという指標に基づくものである、[１]に記載の方法。
[３]活性低下型変異が100 C>T変異、3173 A>C変異、3915 C>T変異、CYP2D6全欠損型変異
またはそれらの組み合わせである、[２]に記載の方法。
[４]前記予測が、CYP2D6遺伝子の配列が活性低下型変異を含むアリルを有しない場合にレゴラフェニブによる副作用が起こりやすいという指標に基づくものである、[１]に記載の方法。
[５]前記アリルがCYP2D6*10、CYP2D6*51、CYP2D6*2+P430L、CYP2D6*36、またはCYP2D6*41である、[４]に記載の方法。
[６]被検者のCYP2D6遺伝子の配列を解析するためのプライマーまたはプローブを含む、レゴラフェニブによる副作用を予測するためのキット。
[７]100 C>T変異、3173 A>C変異、または3915 C>T変異を検出するためのプライマーまた
はプローブを含む、[６]に記載のキット。
[８]前記プローブが、配列番号３〜５のいずれかの塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する、[７]に記載のキット。
[９]前記プライマーが、配列番号３〜５のいずれかの塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅するためのプライマーセットである、[７]に記載のキット。
[１０]レゴラフェニブによる副作用を予測する方法であって、被検者由来のCYP2D6遺伝子を含む試料とレゴラフェニブを反応させ、下記代謝産物M-3の生成量を測定して、該測定
量に基づいて、レゴラフェニブによる副作用を予測することを特徴とする方法。
【化１】
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【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、レゴラフェニブの副作用を簡便に精度よく予測することができる。治癒切除不能な進行・再発の結腸・直腸癌の三次治療には、レゴラフェニブ以外に、トリフルリジン・チピラシル塩酸塩等も使用できる。よって、CYP2D6遺伝子のタイピングにより、RILIの発症リスクを予測することは、上述の治療における方針を決定する上で極めて有用である。したがって、本発明は、REGを用いる薬物治療に貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ヒトにおけるレゴラフェニブの主代謝経路の模式図。
【図２】大腸菌発現系CYPを用いたレゴラフェニブのin vitro代謝試験の結果を示す図。
【図３】レゴラフェニブ及びM-3のHepG2に対する細胞毒性試験の結果を示す図。
【図４】同定されたCYP2D6アリルを示す図。
【図５】種々のCYP2D6アリルを一過性発現させた293T細胞を用いたレゴラフェニブのin vitro代謝試験の結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
＜１＞本発明の方法
本発明の方法は、レゴラフェニブによる副作用を予測する方法であって、被検者のCYP2D6遺伝子の配列を解析し、CYP2D6遺伝子の配列に基づいて、レゴラフェニブによる副作用を予測することを特徴とする。
【０００９】
レゴラフェニブによる副作用としては、特に制限されないが、肝不全、劇症肝炎、肝機能障害、黄疸など肝臓における副作用等のレゴラフェニブ誘発性肝障害（RILI）が挙げら
れる。
【００１０】
被検者としては、ヒトが好ましく、ヒトCYP2D6遺伝子としては、ゲノム上の配列としては、GenBank Accession No. NG_008376.3に登録された塩基配列が例示され、cDNA配列と
しては配列番号１の塩基配列が例示される。これは野生型配列の一例であり、解析対象となる被検者由来のヒトCYP2D6遺伝子は、これらの配列の類似配列を有する遺伝子であってCYP2D6の活性を有する酵素をコードする遺伝子であればよい。解析対象は、ゲノム配列でもcDNA配列でもいずれでもよい。
【００１１】
CYP2D6遺伝子の配列解析としては、全長を解析してもよいし、一部を解析してもよい。一部としては変異部位を含む領域が挙げられる。
【００１２】
配列解析の結果、CYP2D6遺伝子の配列が活性低下型変異を含まない場合、または活性低下型変異を含むが正常型遺伝子のコピー数が多い（例えば２以上）場合にレゴラフェニブの副作用の可能性が高く、活性低下型変異を含む場合（ただし正常型遺伝子のコピー数が多い場合を除く）にレゴラフェニブの副作用の可能性が低い、という判断基準が提供される。
【００１３】
ここで、活性低下型変異としては、CYP2D6の活性、すなわち、レゴラフェニブを代謝して図１に示す化合物M-3を生成する活性を、野生型CYP2D6の1/10未満、好ましくは1/100未満に低下させる変異を意味する。なお、後述するCYP2D6*5アリルのようにCYP2D6全欠損型変異でもよい。
【００１４】
CYP2D6遺伝子が活性低下型変異を有するか否かはCYP2D6遺伝子の配列を解析し、下記に示すような特定の一塩基多型 (SNP) やアリル（ハプロタイプ）を有しているか否かを確
認することで判別することができる。また、活性低下型変異は下記に示すような変異に限られず、未同定の変異でもよいので、その遺伝子を発現させ、CYP2D6の活性を測定し、野生型と比べて活性が1/10未満、好ましくは1/100未満に低下していることを確かめること
ができれば、その遺伝子が活性低下型変異を有していると判断することもできる。
【００１５】
一方、活性低下型変異を含まないことは、CYP2D6遺伝子の配列が野生型（CYP2D6*1）であることや、後述の実施例で示すような、CYP2D6*2、CYP2D6*35、CYP2D6*2+R414Cなどの
活性がある程度（例えば、野生型の1/10以上）維持されるアリル（中間型）を有することを確認することで判別してもよい。
【００１６】
CYP2D6遺伝子の活性低下型変異の一例としてSNPが挙げられる。
具体的なSNPとしては、以下のようなものが例示される。なお、以下の記載において、
数字  塩基１＞塩基２という記載は、数字の位置の塩基における多型であって、塩基１がメジャー塩基、塩基２がマイナー塩基であり、マイナー塩基が変異型であることを意味する。
【００１７】
＜100 C>T変異＞
100 C>T変異は、GRCh37（hg19）ヒトゲノム参照アセンブリにおいて第22番染色体の42526694番目の塩基（GenBank Accession No. NG_008376.3の100位、配列番号１の100位に相当する塩基）におけるシトシン（C）/チミン（T）の多型を意味し、CYP2D6のアミノ酸配
列（配列番号２）の34番目のプロリン（P）をセリン（S）に置換する。このSNPはNational Center for Biotechnology InformationのdbSNPデータベース（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）build147にrs1065852として登録されている（ただし、相補鎖なのでG/A多型として登録）。
このCがTに変換される変異を有しない場合、すなわち、この塩基がCである場合はレゴ
ラフェニブによる副作用が高いと予測できる。また、対立遺伝子を考慮して解析した場合は、CC＞CT＞TTの順でレゴラフェニブによる副作用が高いと予測できる。 
【００１８】
＜3173 A>C変異＞
3173 A>C変異は、GRCh37（hg19）ヒトゲノム参照アセンブリにおいて第22番染色体の42523621番目の塩基（GenBank Accession No. NG_008376.3の3173位、配列番号１の1001位
に相当する塩基）におけるアデニン（A）/シトシン（C）の多型を意味し、CYP2D6のアミ
ノ酸配列（配列番号２）の334番目のグルタミン酸（E）をアラニン（A）に置換する。こ
のSNPはdbSNPデータベースbuild147にrs72549348として登録されている（ただし、相補鎖なのでT/G多型として登録）。
このAがCに変換される変異を有しない場合、すなわち、この塩基がAである場合はレゴ
ラフェニブによる副作用が高いと予測できる。また、対立遺伝子を考慮して解析した場合は、AA＞AC＞CCの順でレゴラフェニブによる副作用が高いと予測できる。 
【００１９】
＜3915 C>T変異＞
3915 C>T変異は、GRCh37（hg19）ヒトゲノム参照アセンブリにおいて第22番染色体の42522879番目の塩基（GenBank Accession No. NG_008376.3の3915位、配列番号１の1289位
に相当する塩基）におけるシトシン（C）/チミン（T）の多型を意味し、CYP2D6のアミノ
酸配列（配列番号２）の430位のプロリン（P）をロイシン（L）に置換する。このSNPはdbSNPデータベースbuild147にrs570615819として登録されている（ただし、相補鎖なのでG/A多型として登録）。
このCがTに変換される変異を有しない場合、すなわち、この塩基がCである場合はレゴ
ラフェニブによる副作用が高いと予測できる。また、対立遺伝子を考慮して解析した場合は、CC＞CT＞TTの順でレゴラフェニブによる副作用が高いと予測できる。
【００２０】
なお、これらのSNPについて、SNP塩基及びその前後６０ｂｐの領域を含む合計１２１ｂｐの長さの配列を、それぞれ配列番号３〜５に示した。それぞれ６１番目の塩基が多型を有する。
【００２１】
なお、上記SNPの塩基を直接解析する代わりに、上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基の
多型を分析してもよい。ここで「上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基」とは、上記の塩基とｒ2＞０．５、好ましくはｒ2＞０．８、さらに好ましくはｒ2＞０．９の関係を満たす
塩基をいう。上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基は、例えば、HapMapデータベース(http://www.hapmap.org/index.html.ja)等を用いて同定することができる。
なお、いずれのSNPも、二本鎖DNAのどちらの鎖を解析してもよい。
【００２２】
上記SNPの塩基の種類など、CYP2D6遺伝子の配列を解析し、得られた解析結果を上記の
ような基準（活性低下型変異を有する場合にレゴラフェニブの副作用の可能性が低い、活性低下型変異を有さない、または有していても正常型遺伝子のコピー数が多いことにより活性が正常である場合にレゴラフェニブの副作用の可能性が高い）に基づいてレゴラフェニブによる副作用と関連付けることにより、レゴラフェニブによる副作用を検査又は予測することができる。
なお、上記SNPは単独で解析されてもよいし、上記SNPの少なくとも１つを含む複数のSNPsをまとめて解析（アリル解析またはハプロタイプ解析）してもよい。CYP2D6のアリルはPharmVar (https://www.pharmvar.org/)に登録されている。
【００２３】
ここで、100 C>T変異を含むアリルとしては、CYP2D6*10が挙げられる。
CYP2D6*10：100C>T+4181G>C
また、3173A>C変異を含むアリルとしては、CYP2D6*51が挙げられる。
CYP2D6*51：2851C>T+3173A>C+4181G>C
また、3915 C>T変異を含むアリルとしては、CYP2D6*2+P430Lが挙げられる。
CYP2D6*2+P430L：2851C>T+3915C>T+4181G>C
【００２４】
活性低下型変異を含むその他のアリルとして、CYP2D6*36や、CYP2D6*41が挙げられる。CYP2D6*36：100C>T+4129C>G+4132A>G+4156C>T+4157A>C+4159G>C+4165T>G+4169C>G+4181G>C
CYP2D6*41：2851C>T+2989G>A+4181G＞C
【００２５】
これらのアリルをホモで含むか、組み合わせで含む場合にレゴラフェニブの副作用の可能性が低いと予測することができる。
また、これらのアリルをCYP2D6全欠損型変異（CYP2D6*5）と組み合わせで含む場合にレゴラフェニブの副作用の可能性が低いと予測することができる。
【００２６】
SNP解析、アリル解析などの配列解析に用いる試料としては、ゲノムDNA、mRNA、cDNAなど遺伝子配列解析可能な要素を含む試料であれば特に制限されないが、例えば、血液、尿等の体液サンプル、口腔粘膜などの細胞、毛髪等の体毛などが挙げられる。多型の解析にはこれらの試料を直接使用することもできるが、これらの試料からゲノムDNA等を常法に
より単離し、これを用いて解析することが好ましい。 
【００２７】
多型の解析は、通常の遺伝子多型解析方法によって行うことができる。例えば、シークエンス解析、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、インベーダー法などが挙げられるが、これらに限定されない。なお、SNPやアリルを解析する場合には、CYP2D6遺伝子の全体を解
析してもよく、CYP2D6遺伝子の一部のみを解析してもよい。例えば、シークエンス解析の場合、CYP2D6遺伝子全体をシークエンス解析してもよいし、多型を示す塩基の５’側 数
十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定してもよい。なお、シークエンス反応の前に、あらかじめ多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲなどによって増幅しておくことが好ましい。
【００２８】
また、多型の解析は、ＰＣＲによる増幅の有無を調べることによって行うことができる。例えば、多型を示す塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、３’末端が各多型に対応するプライマーをそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用してＰＣＲを行い、増幅産物の有無によってＳＮＰやアリルがどのタイプの多型であるかを決定することができる。また、ＬＡＭＰ法（特許第３３１３３５８号明細書）、ＮＡＳＢＡ法（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；特許２８４３５８６号明細書）、ＩＣＡＮ法（特
開２００２−２３３３７９号公報）などによって増幅の有無を調べることもできる。その他、単鎖増幅法を用いてもよい。 
【００２９】
また、多型部位を含むＤＮＡ断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（single-strand conformation polymorphism）法（Genomics.
1992 Jan 1; 12(1): 139-146.）が挙げられる。具体的には、まず、目的の多型部位を含むＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度の違いによってＳＮＰやアリルがどのタイプの多型であるかを決定することができる。 
さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる（ＲＦＬＰ法）。この場合、まず、ＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片を分離し、検出されたＤＮＡ断片の大きさによってＳＮＰやアリルがどのタイプの多型であるかを決定することができる。 
【００３０】
また、ハイブリダイゼーションの有無を調べることによって多型の種類を解析することも可能である。すなわち、各塩基に対応するプローブを用意し、いずれのプローブにハイブリダイズするかを調べることによってＳＮＰやアリルがどのタイプの多型であるかを調べることもできる。 
【００３１】
このようにしてSNPやアリルがどのタイプの多型であるかを決定することで、レゴラフ
ェニブによる副作用を検査するためのデータを得ることができる。 
【００３２】
上記CYP2D6の配列解析の結果を受け、レゴラフェニブによる副作用の可能性が低いと予測された場合には、レゴラフェニブを患者に投与し、レゴラフェニブによる副作用の可能性が高いと予測された場合には、レゴラフェニブの投与を中止し、その代わりに、トリフルリジン・チピラシル塩酸塩等の他の抗がん剤を投与するなど、治療方針を決定することができる。
【００３３】
＜２＞本発明の検査用試薬
本発明はまた、レゴラフェニブによる副作用を検査するためのプライマーやプローブなどの検査試薬を提供する。このようなプローブとしては、上記多型部位を含み、ハイブリダイゼーションの有無によって多型部位の塩基の種類を判定できるプローブが挙げられる。具体的には、配列番号３〜５のいずれかにおいて塩基配列の６１番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有する１０塩基以上の長さのプローブや、CYP2D6遺伝子中の多型塩基を含む配列を有する１０塩基以上の長さのプローブが挙げられる。プローブの長さは好ましくは、１５〜３５塩基であり、より好ましくは２０〜３５塩基である。
【００３４】
また、プライマーとしては、上記多型部位を増幅するためのＰＣＲに用いることのできるプライマーセット、又は上記多型部位を配列解析（シークエンシング）するために用いることのできるプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号３〜５のいずれかにおいて塩基配列の６１番目の塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーや、CYP2D6遺伝子中の多型塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーの長さは１０〜５０塩基が好ましく、１５〜３５塩基がより好ましく、２０〜３５塩基がさらに好ましい。 
【００３５】
上記多型部位をシークエンシングするためのプライマーとしては、多型部位塩基の５’側領域、好ましくは３０〜１００塩基上流の配列を有するプライマーや、多型部位塩基の３’側領域、好ましくは３０〜１００塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示される。ＰＣＲによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては、多型部位塩基を含む配列を有し、多型部位塩基を３’側に含むプライマーや、多型部位塩基を含む配列の相補配列を有し、多型部位塩基の相補塩基を３’側に含むプライマーなどが例示される。 
【００３６】
なお、本発明の検査用試薬はこれらのプライマーやプローブに加えて、ＰＣＲ用のポリメラーゼやバッファー、ハイブリダイゼーション用試薬などを含むものであってもよい。
【００３７】
＜３＞レゴラフェニブ代謝産物による副作用予測
本発明では、レゴラフェニブ代謝産物がレゴラフェニブの副作用に関係することを初めて見出した。したがって、代謝産物M-3の生成量に基づいて副作用予測を行うこともでき
る。例えば、被検者由来のCYP2D6遺伝子を含む試料、例えば、細胞などを用意し、インビトロでレゴラフェニブを添加してインキュベートし、その後、M-3の生成量を測定し、測
定結果をコントロールと比較することで、代謝産物M-3の生成量に基づく副作用予測がで
きる。例えば、コントロールとして副作用の少ない対象由来の細胞を用い、これと比較し
て代謝産物M-3の生成量が多いときには、副作用の危険性が高いと予測できる。あるいは
、被検者由来のCYP2D6遺伝子を細胞に導入し、該細胞をインビトロで培養してレゴラフェニブを添加してインキュベートし、その後、M-3の生成量を測定し、測定結果をコントロ
ールと比較することによっても、代謝産物M-3の生成量に基づく副作用予測ができる。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００３９】
発明者らは、レゴラフェニブ（ＲＥＧ）誘発性肝障害（ＲＩＬＩ）の発症リスクと関連する変異をスクリーニングしたところ、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の100 C>T(P34S)多型を見出
した（GG vs GA+AA:P<0.0067）。そして、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子とＲＩＬＩの発症リスクの関係を調べるためにさらなる検討を行った。
ＲＩＬＩの発症リスクを決定するＣＹＰ２Ｄ６遺伝子型を同定するために、日本人被検者のゲノムを用いてＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のコード領域上のすべての遺伝子型解析を行い、得られた遺伝子型をもとにＲＩＬＩ患者とＲＩＬＩを発症しなかった患者との間で関連解析を行ったところＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の活性正常型群（ＥＭ）は活性中間型群（ＩＭ）および活性低下型群（ＰＭ）に比べて、ＲＩＬＩの発症リスクが高いことを明らかにした。またこの肝障害を誘発するメカニズムにはＲＥＧの代謝物であるＭ−３が関与している可能性を明らかにした。
具体的手順は以下の通り。
【００４０】
＜被検者＞
ＲＥＧを投与された被検者（大腸がん患者）８３人のうち、ＲＥＧにより肝障害が誘発されなかった被検者、グレード１、２、３、および４の肝障害が誘発された被検者はそれぞれ６６、５、８、３、および１人であった。これらのうちグレード２、３、および４の肝障害が誘発された被検者をＲＩＬＩグループ、それ以外をｎｏｎ−ＲＩＬＩグループとし、ケース−コントロール関連解析を行った。被検者はすべて日本人である。なお、各グレードはCommon  Terminology  Criteria  for  Adverse  Events  （ＣＴＣＡＥ）  ｖ5.0を元に判定された。被検者のゲノムはすべて国立がん研究センターから提供された。なお、本研究は、全ての被検者から書面によるインフォームド・コンセントを得ており、国立がん研究センターおよび理化学研究所の倫理審査委員会の承認を得たものである。
【００４１】
ＲＩＬＩ被検者１２名およびｎｏｎ−ＲＩＬＩ被検者７１名について、次世代シークエンサーによる薬物動態関連遺伝子のターゲットシークエンシング (Yoshihama,T. ｅｔ al. Oncotarget 9:29789-800 (2018)) を実施し、関連解析を行った。同定された変異とＲ
ＩＬＩとの関連は、フィッシャーの正確確率検定（Fisher’s  exact  test）により評価した。この関連解析はadditive  model（Ｇ ｖｓ Ａ）、dominant  model  （ＧＧ＋ＧＡ
ｖｓ ＡＡ）、およびrecessive  model（ＧＧ ｖｓ ＧＡ＋ＡＡ）を用いて行った。その結果、ＣＹＰ２Ｄ６*１０を決定する変異であるＣＹＰ２Ｄ６ １００Ｃ＞Ｔはadditive  modelおよびdominant  modelにおいてＲＩＬＩの発症と有意な関連を示した（表１）。
【００４２】
【表１】
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【００４３】
そこで、CYP2D6がレゴラフェニブの副作用に直接関与するのではないかと考え、副作用発生メカニズムの解析を行った。
ＲＥＧの主代謝物であるＭ−２およびＭ−３は薬物代謝酵素であるＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ２Ｊ２で生成されることがバイエル薬品株式会社のレゴラフェニブ（スチバーガ錠４０ｍｇ）の医薬品インタビューフォームに記載されている（図１）。しかしながら、ＣＹＰ２Ｄ６によってＭ−２やＭ−３が生成される報告は存在しない。そこで、大腸菌発現系のＣＹＰ２Ｃ１９、２Ｊ２、２Ｄ６、および３Ａ４（積水メディカル）を用いて、各分子種におけるＲＥＧからのＭ−２およびＭ−３の生成活性を評価した。リン酸緩衝液（最終濃度０．１Ｍ、ｐＨ７．４）７４μＬに５ｍＭ塩化マグネシウム（最終濃度０．１ｍＭ）２μＬ、各分子種の大腸菌発現系２μＬ（最終Ｐ４５０濃度２ｐｍｏＬ／ｍＬ）およびＲＥＧ（最終濃度０．１、１、１０、１００μＭ）２μＬをインキュベーションチューブに添加した。３７℃で３分間プレインキュベーションした後、１０ｍＭのＮＡＤＰＨ生成系を１０μＬ添加することにより、反応を開始した。３７℃で、１０分間インキュベーションした後、内部標準物質としてチクロピジン（最終濃度１００ｎＭ）を含むアセトニトリルを１００μＬ添加することで反応を停止した。１０，０００ｘｇで５分間遠心分離した後、上清中のＭ−２およびＭ−３濃度をＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定した。バイエル薬品株式会社の報告通りＲＥＧからのＭ−２生成にはＣＹＰ３Ａ４のみが関与しており、ＣＹＰ２Ｄ６はＭ−２を生成しなかった（図２および表２）。一方、ＲＥＧからのＭ−３生成にはＣＹＰ３Ａ４および２Ｊ２が関与していたが、さらにＣＹＰ２Ｄ６もＣＹＰ３Ａ４の３２％のＭ−３生成活性を示すことが明らかとなった（図２および表２）。
【００４４】
【表２】
2020058274.tif 000005
【００４５】
Ｍ−３が肝細胞に与える影響は報告されていないため、ヒト肝がん由来細胞株であるＨｅｐＧ２を用いてＭ−３の細胞毒性試験を行った。ＨｅｐＧ２は１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用いて３７℃のＣＯ２インキュベーター内で細胞毒性試験の実施まで継代培養した。継代回数は上限を２０回とした。培養したＨｅｐＧ２を１×１０６細胞／ｍＬの懸濁液にし、５００μＬずつコラーゲンコートされた２４ウェルプレートに播種した。３７℃
で２４時間培養後、０、１、３、１０、３０、および１００μＭのＲＥＧおよびＭ−３を溶解した培地と培養培地を交換した。３７℃で２４時間培養後、Cell  Counting  Kit-8
（同仁化学研究所）を使用し、製造販売業者の指示に従って、細胞の生存率を算出した。３０および１００μＭのＭ−３は同濃度のＲＥＧ曝露よりもＨｅｐＧ２の細胞生存率が有意に低いことを明らかにした（図３）。
【００４６】
以上のＲＥＧの代謝試験およびＭ−３の細胞毒性試験の結果より、ＣＹＰ２Ｄ６がＭ−３を生成することでＲＩＬＩを発現している可能性が示唆された。またＣＹＰ２Ｄ６遺伝子には１００Ｃ＞Ｔ以外にも代謝活性に影響を与える変異が数多く存在する。そこで、被検者８３名の詳細なＣＹＰ２Ｄ６遺伝子型を決定し、その結果を用いて関連解析を行う必要性が示唆された。
【００４７】
次世代シークエンサーを用いたターゲットシークエンシングにより、被検者８３名のＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のコード領域および既知のスプライシングサイトのすべての一塩基変異（ＳＮＶ）および挿入と欠失（ＩＮＤＥＬ）を探索した。またTaqMan Copy Number Assay（アプライドバイオシステムズ）を用いて、タンデムに並んだすべてのＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のコピー数変異（ＣＮＶ）を製造販売業者の指示に従って調べた (Hosono, N. et al. Clin Chem 55, 1549-54 (2009))。その結果、以下の１０種類を同定した（図４）。
【００４８】
正常型（ＣＹＰ２Ｄ６＊１）、
２８５１Ｃ＞Ｔ＋４１８１Ｇ＞Ｃ（ＣＹＰ２Ｄ６＊２）、
ｆｕｌｌ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ（ＣＹＰ２Ｄ６＊５）、
１００Ｃ＞Ｔ＋４１８１Ｇ＞Ｃ（ＣＹＰ２Ｄ６＊１０）、
３１Ｇ＞Ａ＋２８５１Ｃ＞Ｔ＋４１８１Ｇ＞Ｃ（ＣＹＰ２Ｄ６＊３５）、
１００Ｃ＞Ｔ＋４１２９Ｃ＞Ｇ＋４１３２Ａ＞Ｇ＋４１５６Ｃ＞Ｔ＋４１５７Ａ＞Ｃ＋４１５９Ｇ＞Ｃ＋４１６５Ｔ＞Ｇ＋４１６９Ｃ＞Ｇ＋４１８１Ｇ＞Ｃ（ＣＹＰ２Ｄ６＊３６）、
２８５１Ｃ＞Ｔ＋２９８９Ｇ＞Ａ＋４１８１Ｇ＞Ｃ（ＣＹＰ２Ｄ６＊４１）、
２８５１Ｃ＞Ｔ＋３１７３Ａ＞Ｃ＋４１８１Ｇ＞Ｃ（ＣＹＰ２Ｄ６＊５１）、
２８５１Ｃ＞Ｔ＋３８６６Ｃ＞Ｔ＋４１８１Ｇ＞Ｃ（ＣＹＰ２Ｄ６＊２＋Ｒ４１４Ｃ）、および
２８５１Ｃ＞Ｔ＋３９１５Ｃ＞Ｔ＋４１８１Ｇ＞Ｃ（ＣＹＰ２Ｄ６＊２＋Ｐ４３０Ｌ）
【００４９】
塩基の位置は参照配列ＮＧ＿００８３７６．３のＡＴＧのＡを最初の塩基として算出した。すべてのアリル情報とＣＮＶの結果から被検者８３名のＣＹＰ２Ｄ６の遺伝子型を決定した（表３）。
【００５０】
【表３】
2020058274.tif 000006
【００５１】
同定された１０種類のＣＹＰ２Ｄ６アリルのうち＊５は遺伝子全欠損、＊３６は機能消失および＊４１は発現量の低下であることが明らかであるが、その他の７種類のＣＹＰ２
Ｄ６アリルのＭ−３生成活性は不明であった。そこで、ＣＹＰ２Ｄ６の各アリルのコード領域を含むコンストラクトを作製しヒト胎児由来腎臓細胞である２９３Ｔ細胞に一過性に発現させ、ＲＥＧ曝露時のＭ−３生成活性を評価した。インフュージョンクローニングキット（タカラ）を用いて、Integrated  DNA  Technologiesによって合成された７種類の
ＣＹＰ２Ｄ６アリルのコード領域を含むｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１ベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック）に組み込んだコンストラクトを製造販売業者の指示に従って作製した。また野生型のＰ４５０オキシドレダクターゼ（ＰＯＲ）のコンストラクトも同様に作製した。１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用いて３７℃のＣＯ２インキュベーター内で継代培養した２９３Ｔ細胞１×１０６細胞／ｍＬの懸濁液にし、５００μＬずつコラーゲンコートされた２４ウェルプレートに播種した。継代回数は上限を２０回とした。３７℃で２４時間培養後、リポフェクタミン３０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて、各ＣＹＰ２Ｄ６アリルおよびＰＯＲを製造販売業者の指示に従って２９３Ｔ細胞に共発現した。それらの細胞の培養培地を０．１、１、１０、および１００μＭのＲＥＧを溶解した培地と交換した。３７℃で２４時間培養後、上清中のＭ−３濃度を測定することで各ＣＹＰ２Ｄ６アリルのＭ−３の生成活性を評価した（図５および表４）。Ｍ−３の代謝クリアランス（Ｖｍａｘ／Ｋｍ）の比較により、＊１、＊２、＊３５および＊２＋Ｒ４１４ＣアリルのＭ−３活性は正常型（Ｗｔ）、＊１０、＊５１および＊２＋Ｐ４３０Ｌアリルは減少型（Ｖ）と判定した（表４）。
【００５２】
【表４】
2020058274.tif 000007
【００５３】
ＲＩＬＩ被検者１２名およびｎｏｎ−ＲＩＬＩ被検者７１名のＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の詳細な遺伝子型および各アリルのin  vitro代謝試験の結果からすべての被検者のＣＹＰ２
Ｄ６遺伝子の詳細な遺伝子型を同定した（表３）。ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の遺伝子型は以前
の報告に従って活性正常型群（ＥＭ）、活性中間型群（ＩＭ）および活性低下型群（ＰＭ）とした （Zanger,  U．et  Al. Pharmacogenetics11:573-85 (2001)）。
【００５４】
これらの遺伝子型を用いてＲＩＬＩとの関連解析を行った。ＥＭ vs ＩＭ vs ＰＭは２ｘ３、ＥＭvs ＩＭ＋ＰＭおよびＥＭ＋ＩＭ vs ＰＭは２ｘ２のフィッシャーの正確確率
検定およびオッズ比とその９５％信頼区間（ＣＩ）により評価した。ＣＹＰ２Ｄ６のＥＭはＩＭおよびＰＭに比べてＲＩＬＩの発症リスクが高いことを明らかにした（表５）。
【００５５】
【表５】
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【００５６】
以上の結果からＣＹＰ２Ｄ６の活性が正常である場合、Ｍ−３が多く生成し、肝におけるＭ−３に対する曝露量が高く、その結果、肝障害リスクが高くなるメカニズムが示唆された。また、ＣＹＰ２Ｄ６活性が低い場合は、Ｍ−３の生成量が少なく、肝における曝露量も低く、肝障害リスクが低くなることが示唆された。
【００５７】
以上の通り、ＣＹＰ２Ｄ６のＥＭではＲＩＬＩの発症リスクが高いことが明らかとなった。治癒切除不能な進行・再発の結腸・直腸癌の三次治療には、トリフルリジン・チピラシル塩酸塩等も使用できる。よって、ＣＹＰ２Ｄ６のタイピングにより、ＲＩＬＩの発症リスクを予測することは、上述の治療における方針を決定する上で極めて有用である。したがって、本発明は、ＲＥＧを用いる薬物治療に貢献するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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