(57)【要約】      （修正有）【課題】優れた抗菌活性を示すペプチド系抗菌化合物、及びそのスクリーニング方法の提供。【解決手段】一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。2020138908.tif 000042【選択図】図１
2020138908.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
2020138908.tif 000030
（一般式（Ｉ）において、
Ｒ１は、以下で表される置換基から選択され；
2020138908.tif 000031
（式（２）において、Ｒ５は、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基又はヒドロキシ基を表す）
2020138908.tif 000032
（式（３）において、Ｒ６及びＲ７は、同一又は異なっていてもよく、各々独立して、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基を表し、Ｒ８は、各出現において同一又は異なっていてもよく、各々独立して、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、ｎは、０〜２の整数を表す）
2020138908.tif 000033
（式（４）において、Ｒ９は、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表す）
2020138908.tif 000034
（式（５）において、Ｒ１０は、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基又はヒドロキシ基を表す）
2020138908.tif 000035
（式（６）において、Ｒ１１は、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基又はヒドロキシ基を表し、Ｒ１２は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を表し、ｍは０〜４の整数である）
又は
炭素数１〜３の直鎖状アルキル基
式（１）〜（６）において、−−−は結合部位を表す：
Ｒ２は、イソブチル基であり：
Ｒ３は、以下で表される置換基から選択され：
2020138908.tif 000036
（式（４）において、Ｒ９は、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表す）
2020138908.tif 000037
（式（６）において、Ｒ１１は、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基又はヒドロキシ基を表し、Ｒ１２は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を表し、ｍは０〜４の整数である）
2020138908.tif 000038
（式（７）において、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、同一又は異なっていてもよく、各々独立して、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表す）
又は
2020138908.tif 000039
(式（８）においてＲ１６は、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、Ｒ１７は、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基又はヒドロキシ基を表す）
式（１）、（４）、（６）、（７）〜（８）において、−−−は結合部位を表す：
Ｒ４は、ｓｅｃ−ブチル基である。）
但し、Ｒ１が式（４）で表される基であって、Ｒ９が水素原子であり、かつ、Ｒ３が式（８）で表される基であって、Ｒ１６及びＲ１７が水素原子である化合物は除く。
【請求項２】
Ｒ１は、以下で表される置換基から選択され；
2020138908.tif 000040
Ｒ３は、以下で表される置換基から選択される、請求項１に記載の化合物又はその塩。
2020138908.tif 000041
（但し、Ｒ１がＳで表される置換基であり、かつ、Ｒ３がＱで表される置換基である化合物は除く。）
【請求項３】
Ｒ１及びＲ３の組み合わせが以下の組み合わせから選択される、請求項１又は２に記載の化合物又はその塩。
（Ｒ１、Ｒ３）：（Ａ、Ｑ）、（Ａ、Ｖ）、（Ｋ、Ｖ）、（Ｖ、Ｏ）、（Ｓ、Ｖ）、（Ｖ、Ｑ）、（Ｙ、Ｏ）、（Ｙ、Ｑ）、（Ｙ、Ｖ）（Ｎ、Ｑ）、（Ｖ、Ｙ）、（Ｖ、Ｓ）（Ｎ、Ｖ）、（Ｎ、Ｏ）、（Ｄ、Ｏ）、（Ｄ、Ｙ）、（Ｄ、Ｖ）
ここで、Ｖ、Ｄ、Ｋ、Ｓ、Ｎ、Ｙ、Ａ、Ｏ、Ｑは、請求項２で定義した通りである。
【請求項４】
（ｉ）Ｒ１が炭素数１〜３の直鎖状アルキル基であり、Ｒ３が式（８）で表される置換基である、（ｉｉ）Ｒ１が炭素数１〜３の直鎖状アルキル基であり、Ｒ３が式（１）で表される置換基である、又は、（ｉｉｉ）Ｒ１が式（３）で表される置換基であり、Ｒ３が式（１）で表される置換基である、請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を含む、感染症を治療するための薬学的組成物。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を含む抗菌剤。
【請求項７】
細菌膜に存在する物質Ａと相互作用して抗菌活性を示すペプチド系の候補化合物のスクリーニング方法であって、
以下の工程：
（１）物質Ａと相互作用して抗菌活性を示すことが知られているペプチド系化合物の類似化合物のライブラリーを提供すること；
（２）前記ライブラリー中の類似化合物を物質Ａと接触させて、各々の類似化合物と物質Ａとの錯体を形成させること；
（３）（２）で得られた類似化合物と物質Ａとの個々の錯体を分配し、溶媒を添加することにより当該錯体から物質Ａを溶離させること；
（４）各々の錯体から得られた各溶離液を採取して、各々の類似化合物についての物質Ａと錯体を形成した程度を分析すること：
（５）溶離液を採集した後に残った各々の類似化合物を回収し、各類似化合物の抗菌活性を測定すること；
を含む、前記スクリーニング方法。
【請求項８】
前記化合物Ａがメナキノンである、請求項７に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
（４）の工程において、各々の錯体から得られた溶離液の蛍光を測定することにより、各々の類似化合物についての物質Ａと錯体を形成した程度を分析する、請求項７又は８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記類似化合物が、ビーズ結合型ペプチドである、請求項７〜９のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
類似化合物のライブラリーが、ＯＢＯＣ法を用いて調製される、請求項１０に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
物質Ａと相互作用して抗菌活性を示すことが知られているペプチド系化合物が、ライソシンＥである、請求項７〜１１のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のペプチド系化合物及びそのスクリーニング方法に関する。具体的には、メナキノン等に作用し、抗菌作用を示すペプチド系化合物及び当該ペプチド系化合物を含む薬学的組成物に関する。また、本発明は、細菌膜に存在する物質と相互作用して抗菌活性を示すペプチド系化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、多様な耐性菌の出現が報告されており、従来の抗生物質とは異なる作用機序並びに、従来よりも低濃度で抗菌活性及び治療効果を示す化合物の創出が求められている。また、新規作用機序を示す化合物として、メナキノン結合性抗生物質の存在が報告されているが、これらの抗生物質は、抗菌活性を示す濃度が十分低いとは言えず、意図しない副作用等を誘発する可能性が高まる。
【０００３】
近年、バクテリア膜に存在するメナキノンと相互作用し抗菌活性を示す化合物としてライソシンＥが発見され、この物質は真核生物に対しては無害である（非特許文献１）。この物質の作用機序は既知の抗生物質の作用機序とは異なり、細菌の呼吸鎖に不可欠な要素であるメナキノンとの選択的相互作用により、細菌膜の機能を乱すことが知られている。
ライソシンＥはメシチリン耐性ブドウ球菌に対して有効であることが知られているが（非特許文献２）、より高い抗菌活性を示す化合物の開発は引き続き重要である。
【０００４】
一方、メナキノン結合性ペプチド化合物を迅速に合成・選出する方法は報告されていない。個別の化合物の合成及び特性の調査には長大な時間を要するため、スクリーニングとして要求されるレベルを満たすものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１４−２１７３２２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Hamamoto H, Urai M, Ishii K, Yasukawa J, Paudel A, Murai M, Kaji T, Kuranaga T, Hamase K, Katsu T, Su J, Adachi T, Uchida R, Tomoda H, Yamada M, Souma M, Kurihara H, Inoue M, Sekimizu. Nat. Chem. Biol. 2015, 11 (2): 127-133.
【非特許文献２】Murai M, Kaji T, Kuranaga T, Hamamoto H, Sekimizu K, Inoue M. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2015、54 (5): 1556-1560
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、優れたメナキノン結合能を示し、優れた抗菌活性を示すペプチド系抗菌化合物及びそのスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
即ち、本発明は、
［１］以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
2020138908.tif 000003
（一般式（Ｉ）において、
Ｒ１は、以下で表される置換基から選択され；
2020138908.tif 000004
（式（２）において、Ｒ５は、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基又はヒドロキシ基を表す）
2020138908.tif 000005
（式（３）において、Ｒ６及びＲ７は、同一又は異なっていてもよく、各々独立して、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基を表し、Ｒ８は、各出現において同一又は異なっていてもよく、各々独立して、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、ｎは、０〜２の整数を表す）
2020138908.tif 000006
（式（４）において、Ｒ９は、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表す）
2020138908.tif 000007
（式（５）において、Ｒ１０は、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基又はヒドロキシ基を表す）
2020138908.tif 000008
（式（６）において、Ｒ１１は、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基又はヒドロキシ基を表し、Ｒ１２は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を表し、ｍは０〜４の整数である）
又は
炭素数１〜３の直鎖状アルキル基
式（１）〜（６）において、−−−は結合部位を表す：
Ｒ２は、イソブチル基であり：
Ｒ３は、以下で表される置換基から選択され：
2020138908.tif 000009
（式（４）において、Ｒ９は、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表す）
2020138908.tif 000010
（式（６）において、Ｒ１１は、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基又はヒドロキシ基を表し、Ｒ１２は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を表し、ｍは０〜４の整数である）
2020138908.tif 000011
（式（７）において、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、同一又は異なっていてもよく、各々独立して、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表す）
又は
2020138908.tif 000012
(式（８）においてＲ１６は、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、Ｒ１７は、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基又はヒドロキシ基を表す）
式（１）、（４）、（６）、（７）〜（８）において、−−−は結合部位を表す：
Ｒ４は、ｓｅｃ−ブチル基である。）
但し、Ｒ１が式（４）で表される基であって、Ｒ９が水素原子であり、かつ、Ｒ３が式（８）で表される基であって、Ｒ１６及びＲ１７が水素原子である化合物は除く。
［２］Ｒ１は、以下で表される置換基から選択され；
2020138908.tif 000013
Ｒ３は、以下で表される置換基から選択される、［１］に記載の化合物又はその塩。
2020138908.tif 000014
（但し、Ｒ１がＳで表される置換基であり、かつ、Ｒ３がＱで表される置換基である化合物は除く。）
［３］Ｒ１及びＲ３の組み合わせが以下の組み合わせから選択される、［１］又は［２］に記載の化合物又はその塩。
（Ｒ１、Ｒ３）：（Ａ、Ｑ）、（Ａ、Ｖ）、（Ｋ、Ｖ）、（Ｖ、Ｏ）、（Ｓ、Ｖ）、（Ｖ、Ｑ）、（Ｙ、Ｏ）、（Ｙ、Ｑ）、（Ｙ、Ｖ）（Ｎ、Ｑ）、（Ｖ、Ｙ）、（Ｖ、Ｓ）（Ｎ、Ｖ）、（Ｎ、Ｏ）、（Ｄ、Ｏ）、（Ｄ、Ｙ）、（Ｄ、Ｖ）
ここで、Ｖ、Ｄ、Ｋ、Ｓ、Ｎ、Ｙ、Ａ、Ｏ、Ｑは、請求項２で定義した通りである。
［４］（ｉ）Ｒ１が炭素数１〜３の直鎖状アルキル基であり、Ｒ３が式（８）で表される置換基である、（ｉｉ）Ｒ１が炭素数１〜３の直鎖状アルキル基であり、Ｒ３が式（１）で表される置換基である、又は、（ｉｉｉ）Ｒ１が式（３）で表される置換基であり、Ｒ３が式（１）で表される置換基である、［１］に記載の化合物又はその塩。
［５］［１］〜［４］のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を含む、感染症を治療するための薬学的組成物。
［６］［１］〜［４］のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を含む抗菌剤。
［７］細菌膜に存在する物質Ａと相互作用して抗菌活性を示すペプチド系の候補化合物のスクリーニング方法であって、
以下の工程：
（１）物質Ａと相互作用して抗菌活性を示すことが知られているペプチド系化合物の類似化合物のライブラリーを提供すること；
（２）前記ライブラリー中の類似化合物を物質Ａと接触させて、各々の類似化合物と物質Ａとの錯体を形成させること；
（３）（２）で得られた類似化合物と物質Ａとの個々の錯体を分配し、溶媒を添加することにより当該錯体から物質Ａを溶離させること；
（４）各々の錯体から得られた各溶離液を採取して、各々の類似化合物についての物質Ａと錯体を形成した程度を分析すること：
（５）溶離液を採集した後に残った各々の類似化合物を回収し、各類似化合物の抗菌活性を測定すること；
を含む、前記スクリーニング方法。
［８］前記化合物Ａがメナキノンである、［７］に記載のスクリーニング方法。
［９］（４）の工程において、各々の錯体から得られた溶離液の蛍光を測定することにより、各々の類似化合物についての物質Ａと錯体を形成した程度を分析する、［７］又は［８］に記載のスクリーニング方法。
［１０］前記類似化合物が、ビーズ結合型ペプチドである、［７］〜［９］のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
［１１］類似化合物のライブラリーが、ＯＢＯＣ法を用いて調製される、［１０］に記載のスクリーニング方法。
［１２］物質Ａと相互作用して抗菌活性を示すことが知られているペプチド系化合物が、ライソシンＥである、［７］〜［１１］のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、優れたメナキノン結合能を示し、優れた抗菌活性を示すペプチド系抗菌化合物を提供することができる。
更に、本発明により、細菌膜に存在する物質と相互作用して抗菌活性を示すペプチド系化合物を有効にスクリーニングすることができる方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ライソシンＥの構造
【図２】本発明のスクリーニング方法の基本的なスキームを示す。
【図３ａ】ライソシンＥを基準化合物としてＯＢＯＣ法により類似化合物を合成する概略図
【図３ｂ】ライソシンＥを基準化合物としてＯＢＯＣ法により類似化合物を合成する概略図
【図４】ライソシンＥを用いたスクリーニング方法の全体的模式図を示す。
【図５】ビーズ結合型ライソシンＥの合成スキーム
【図６】ビーズ結合型ペプチド３０、ＢＬＰ１、およびＢＬＰ２の蛍光強度の測定結果
【図７】ライソシンＥのメナキノン錯体形成アッセイ及び抗菌アッセイの測定結果
【図８】ライソシンＥに基づくＯＢＯＣライブラリーの構築のスキーム
【図９】ビーズ結合型ライソシンＥ類似体のメナキノン−複合体形成アッセイによる化合物選定の模式図
【図１０】ビーズからのペプチドの開裂の手順の模式図
【図１１】ライソシンＥ類似体の抗菌アッセイの評価結果
【図１２】図１１のａのプレートのビーズ結合型ペプチドの構造
【図１３】図１１のｂのプレートのビーズ結合型ペプチドの構造
【図１４】図１１のｃのプレートのビーズ結合型ペプチドの構造
【図１５】化合物１、Ａ１、Ａ２及びＡ３の１Ｈ ＮＭＲの化学シフトの比較
【図１６】化合物１、Ａ１、Ａ２及びＡ３の１３Ｃ ＮＭＲの化学シフトの比較
【図１７】全合成した３５種類のライソシンＥ類似体の抗菌活性の評価結果
【図１８ａ】ライソシンＥ類似体Ａ１〜Ａ１４、Ａ１６〜Ａ１８の構造
【図１８ｂ】ライソシンＥ類似体Ａ１５、Ｃ２の構造
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書において、「アルキル基」は、特に言及しない場合には例えば炭素数１〜６個、好ましくは炭素数１〜４個、更に好ましくは炭素数１〜３個程度の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基などを挙げることができる。
【００１２】
本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。
【００１３】
１．一般式（Ｉ）で表される化合物
本発明の１つの実施態様は、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物である。
2020138908.tif 000015
【００１４】
一般式（Ｉ）の化合物は、ライソシンＥを基準化合物として、後述する本発明のスクリーニング方法を用いて、見出された化合物である。ライソシンＥは、図１で示すように１２のアミノ酸残基から構成される環状ペプチド化合物であるが、本発明者らは、その個々の残基について、当該化合物の生物学的に重要な構造の変更を最小化し、全体的な合成の効率も考慮して検討したところ、第３番目の残基であるＬ−Ｓｅｒ−３、第６番目の残基であるＬ−Ｌｅｕ−６、第９番目の残基であるＤ−Ｇｌｎ−９及び第１１番目の残基であるＬ−Ｉｌｅ−１１を可変部位と決定し、構造改変することにより抗菌活性に優れた化合物を得られると考えた。そして、第３番目の残基の置換基、第６番目に残基の置換基、第９番目の残基の置換基、及び第１１番目の残基の置換基を、夫々、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４と規定し（図３ａ参照）、ライソシンＥの類似化合物のライブラリーを構築して、スクリーニングを実施したところ、Ｌ−Ｌｅｕ−６、Ｌ−Ｉｌｅ−１１は強力な抗菌活性に不可欠な残基である可能性が高いことを見出した。
【００１５】
一般式（Ｉ）において、Ｒ１は、以下の式（１）〜（６）表される置換基、又は炭素数１〜３の直鎖状アルキル基から選択される。
【００１６】
2020138908.tif 000016
【００１７】
2020138908.tif 000017
式（２）において、Ｒ５は、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基又はヒドロキシ基を表し、好ましくは、水素原子である。
【００１８】
2020138908.tif 000018
式（３）において、Ｒ６及びＲ７は、同一又は異なっていてもよく、各々独立して、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表す。Ｒ８は、各出現において同一又は異なっていてもよく、各々独立して、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表す。Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、好ましくは、いずれも水素原子である。
ｎは、０〜２の整数を表し、好ましくは２である。ここで、ｎが０の場合は、Ｒ８は存在しない。
【００１９】
2020138908.tif 000019
式（４）において、Ｒ９は、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、好ましくは、水素原子である。
【００２０】
2020138908.tif 000020
式（５）において、Ｒ１０は、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基又はヒドロキシ基を表し、好ましくは、水素原子である。
【００２１】
2020138908.tif 000021
式（６）において、Ｒ１１は、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基又はヒドロキシ基を表し、好ましくは、水素原子である。
Ｒ１２は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を表す。一価の置換基としては、炭素数１〜３のアルキル基、ヒドロキシ基等が挙げられる。
ｍは０〜４の整数であり、好ましくは、０である。即ち、好ましい側面においては、ベンゼン環上に置換基は存在しない。
【００２２】
炭素数１〜３の直鎖状アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基が挙げられるが、好ましくは、メチル基である。
【００２３】
式（１）〜（６）において、−−−は、式（Ｉ）で表される化合物への結合部位を表す。
【００２４】
Ｒ２は、イソブチル基である。
【００２５】
一般式（Ｉ）において、Ｒ３は、以下の式（１）、（４）、（６）、（７）、（８）で表される置換基から選択される。
【００２６】
2020138908.tif 000022
【００２７】
2020138908.tif 000023
Ｒ９については、Ｒ１において説明したのと同様である。
【００２８】
2020138908.tif 000024
Ｒ１１、Ｒ１２、ｍについては、Ｒ１において説明したのと同様である。
【００２９】
2020138908.tif 000025
式（７）において、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、同一又は異なっていてもよく、各々独立して、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基を表す。Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、好ましくは、いずれも水素原子である。
【００３０】
2020138908.tif 000026
式（８）において、Ｒ１６は、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、好ましくは、水素原子である。Ｒ１７は、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基又はヒドロキシ基を表し、好ましくは、水素原子である。
【００３１】
式（７）〜（８）において、−−−は、式（Ｉ）で表される化合物への結合部位を表す。
【００３２】
Ｒ４は、ｓｅｃ−ブチル基である。
【００３３】
但し、一般式（Ｉ）で表す化合物から、Ｒ１が式（４）で表される基であってＲ９が水素原子であり、かつ、Ｒ３が式（８）で表される基であってＲ１６及びＲ１７が水素原子である化合物は除く。
【００３４】
Ｒ１及びＲ３の両方が式（４）で表される基、または、式（６）で表される基である場合は、Ｒ１、Ｒ３の各基は同一であっても異なる基であってもよい。
【００３５】
本発明の１つの好ましい態様においては、一般式（Ｉ）において、Ｒ１は、以下で表される置換基から選択され；
2020138908.tif 000027
Ｒ３は、以下で表される置換基から選択される、化合物である。
2020138908.tif 000028
但し、Ｒ１がＳで表される置換基であり、かつ、Ｒ３がＱで表される置換基である化合物は除く。
【００３６】
（ａ）本発明の１つの好ましい側面においては、式（Ｉ）において、Ｒ１が炭素数１〜３の直鎖状アルキル基であり、Ｒ３が式（８）で表される置換基である化合物である。
（ｂ）本発明の１つの好ましい側面においては、式（Ｉ）において、Ｒ１が炭素数１〜３の直鎖状アルキル基であり、Ｒ３が式（１）で表される置換基である化合物である。
（ｃ）本発明の１つの好ましい側面においては、式（Ｉ）において、Ｒ１が式（３）で表される置換基であり、Ｒ３が式（１）で表される置換基である化合物である。
（ｄ）本発明の１つの好ましい側面においては、式（Ｉ）において、Ｒ１が式（１）で表される置換基であり、Ｒ３が式（７）で表される置換基である化合物である。
（ｅ）本発明の１つの好ましい側面においては、式（Ｉ）において、Ｒ１が式（４）で表される置換基であり、Ｒ３が式（１）で表される置換基である化合物である。
（ｆ）本発明の１つの好ましい側面においては、式（Ｉ）において、Ｒ１が式（１）で表される置換基であり、Ｒ３が式（８）で表される置換基である化合物である。
（ｇ）本発明の１つの好ましい側面においては、式（Ｉ）において、Ｒ１が式（６）で表される置換基であり、Ｒ３が式（７）で表される置換基である化合物である。
（ｈ）本発明の１つの好ましい側面においては、式（Ｉ）において、Ｒ１が式（６）で表される置換基であり、Ｒ３が式（８）で表される置換基である化合物である。
（ｉ）本発明の１つの好ましい側面においては、式（Ｉ）において、Ｒ１が式（６）で表される置換基であり、Ｒ３が式（１）で表される置換基である化合物である。
（ｊ）本発明の１つの好ましい側面においては、式（Ｉ）において、Ｒ１が式（５）で表される置換基であり、Ｒ３が式（８）で表される置換基である化合物である。
（ｋ）本発明の１つの好ましい側面においては、式（Ｉ）において、Ｒ１が式（１）で表される置換基であり、Ｒ３が式（６）で表される置換基である化合物である。
（ｌ）本発明の１つの好ましい側面においては、式（Ｉ）において、Ｒ１が式（１）で表される置換基であり、Ｒ３が式（４）で表される置換基である化合物である。
（ｍ）本発明の１つの好ましい側面においては、式（Ｉ）において、Ｒ１が式（５）で表される置換基であり、Ｒ３が式（１）で表される置換基である化合物である。
（ｎ）本発明の１つの好ましい側面においては、式（Ｉ）において、Ｒ１が式（５）で表される置換基であり、Ｒ３が式（７）で表される置換基である化合物である。
（ｏ）本発明の１つの好ましい側面においては、式（Ｉ）において、Ｒ１が式（２）で表される置換基であり、Ｒ３が式（７）で表される置換基である化合物である。
（ｐ）本発明の１つの好ましい側面においては、式（Ｉ）において、Ｒ１が式（２）で表される置換基であり、Ｒ３が式（６）で表される置換基である化合物である。
（ｑ）本発明の１つの好ましい側面においては、式（Ｉ）において、Ｒ１が式（２）で表される置換基であり、Ｒ３が式（１）で表される置換基である化合物である。
上記の（ａ）〜（ｑ）の化合物は優れた抗菌活性を示す。
【００３７】
本発明のより好ましい側面においては、式（Ｉ）において、（ｉ）Ｒ１が炭素数１〜３の直鎖状アルキル基であり、Ｒ３が式（８）で表される置換基である、（ｉｉ）Ｒ１が炭素数１〜３の直鎖状アルキル基であり、Ｒ３が式（１）で表される置換基である、又は、（ｉｉｉ）Ｒ１が式（３）で表される置換基であり、Ｒ３が式（１）で表される置換基である、化合物である。
Ｒ１及びＲ３の組み合わせが（ｉ）〜（ｉｉｉ）の組み合わせである場合は、より優れた抗菌活性を示す。
【００３８】
本発明の更に好ましい態様においては、Ｒ１及びＲ３の組み合わせが以下の組み合わせから選択される。
（Ｒ１、Ｒ３）：（Ａ、Ｑ）、（Ａ、Ｖ）、（Ｋ、Ｖ）、（Ｖ、Ｏ）、（Ｓ、Ｖ）、（Ｖ、Ｑ）、（Ｙ、Ｏ）、（Ｙ、Ｑ）、（Ｙ、Ｖ）（Ｎ、Ｑ）、（Ｖ、Ｙ）、（Ｖ、Ｓ）（Ｎ、Ｖ）、（Ｎ、Ｏ）、（Ｄ、Ｏ）、（Ｄ、Ｙ）、（Ｄ、Ｖ）
ここで、Ｖ、Ｄ、Ｋ、Ｓ、Ｎ、Ｙ、Ａ、Ｏ、Ｑは、上記で定義した通りである。
Ｒ１及びＲ３の組み合わせが上記の組み合わせである場合は、優れた抗菌活性を示す。
【００３９】
また、本発明の更に好ましい態様においては、Ｒ１及びＲ３の組み合わせが以下の組み合わせから選択される。
（Ｒ１、Ｒ３）：（Ａ、Ｑ）、（Ａ、Ｖ）、（Ｋ、Ｖ）
Ｒ１及びＲ３の組み合わせが上記の組み合わせである場合は、より優れた抗菌活性を示す。
【００４０】
本発明の化合物を製造する方法に限定はなく、如何なる方法で得られたものでもよい。例えば、化学合成によって得られたものであってもよく、微生物を用いて発現させたものであってもよく、生物体から分離したものであってもよく、それらを組み合わせて得られたものでもよい。本発明の化合物を製造する方法の一例を実施例に示す。
【００４１】
２．薬学的組成物
本発明のもう１つの実施態様は、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む感染症を治療するための薬学的組成物である。
【００４２】
また、本発明の１つの実施態様は、哺乳動物、特にヒトにおける感染症の治療方法であって、そのような治療を必要とする哺乳動物に、有効量の一般式（Ｉ）の本発明の化合物又はそれらの薬学的に許容される塩、或いは、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む薬学的組成物を投与する方法である。
【００４３】
感染症の例としては、グラム陽性菌に起因する感染症が挙げられる。本発明の薬学的組成物は、特に、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を含む黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、Staphylococcus simulans、Staphylococcus haemolyticus、Staphylococcus pseudintermedius、セレウス菌(Bacillus cereus)、枯草菌(Bacillus subtilis)及びリステリア菌(Listeria monocytogenes)等に起因する感染症の治療に好適に使用できる。
【００４４】
本発明の薬学的組成物は、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩に加えて、その他の成分を含有することができる。
【００４５】
その他の成分としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬学的に許容され得る担体や賦形剤等が挙げられる。
かかる担体としては、特に制限はなく、例えば、後述する剤形等に応じて適宜選択することができる。また、前記薬学的組成物中の前記「その他の成分」の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４６】
本発明の薬学的組成物の剤形としては、特に制限はなく、例えば、後述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができる。
具体的には、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶剤、懸濁剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散布剤等が挙げられる。
【００４７】
前記経口固形剤としては、例えば、前記有効成分に、賦形剤、更には必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸等が挙げられる。
前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等が挙げられる。
前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
前記着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄等が挙げられる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。
【００４８】
前記経口液剤としては、例えば、前記有効成分に、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。
前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。
【００４９】
前記注射剤としては、例えば、前記有効成分に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。
前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が挙げられる。
【００５０】
前記軟膏剤としては、例えば、前記有効成分に、公知の基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等を配合し、常法により混合し、製造することができる。
前記基剤としては、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィン等が挙げられる。前記保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等が挙げられる。
【００５１】
前記貼付剤としては、例えば、公知の支持体に前記軟膏剤としてのクリーム剤、ゲル剤、ペースト剤等を、常法により塗布し、製造することができる。前記支持体としては、例えば、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布、軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルム、発泡体シート等が挙げられる。
【００５２】
本発明の薬学的組成物中の有効成分である、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩の、組成物全体に対する含有量は、特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができるが、組成物全体を１００質量部としたときに、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩の合計量として、０．００１〜１００質量部の含量で配合することが好ましく、より好ましくは０．０１〜９９質量部、特に好ましくは０．１〜９５質量部、更に好ましくは１〜９０質量部の含量で配合することができる。
【００５３】
本発明の薬学的組成物の投与対象動物としては、特に制限はないが、例えば、ヒト；マウス；ラット；サル；ウマ；ウシ、ブタ、ヤギ、ニワトリ等の家畜；ネコ、イヌ等のペット；等が挙げられる。
【００５４】
また、前記薬学的組成物の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記薬学的組成物の剤形等に応じ、適宜選択することができ、経口投与、腹腔内投与、呼吸器への吸入、血液中への注射、腸内への注入等が挙げられる。
また、前記薬学的組成物の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である個体の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、成人への１日の投与量は、有効成分の量として、１ｍｇ〜３０ｇが好ましく、１０ｍｇ〜１０ｇがより好ましく、１００ｍｇ〜３ｇが特に好ましい。
また、前記薬学的組成物の投与時期としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、予防的に投与されてもよいし、治療的に投与されてもよい。
本発明の薬学的組成物は、他の公知の抗感染症剤と併用してもよい。このような公知の抗感染症剤としては、グラム陽性菌に起因する感染症を治療又は予防する公知の抗感染症剤等が挙げられる。
【００５５】
本発明のもう１つの実施態様は、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む抗菌剤である。
【００５６】
本発明の抗菌剤により、グラム陽性菌：メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を含む黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、Staphylococcus simulans、Staphylococcus haemolyticus、Staphylococcus pseudintermedius、セレウス菌(Bacillus cereus)、枯草菌(Bacillus subtilis)及びリステリア菌(Listeria monocytogenes)等を殺滅、除去又はこれらの菌の増殖を抑制することができる。
【００５７】
本発明の抗菌剤は、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩に加えて、その他の成分を含有することができる。「その他の成分」、抗菌剤の剤型については、本発明の薬学的組成物について記載したのと同様のものを使用することができる。
【００５８】
本発明の薬学的組成物は、他の公知の抗菌剤を併用することができる。このような公知の抗菌剤としては、様々なものが挙げられるが、例えばβラクタム系抗菌剤（ペニシリン等）、テトラサイクリン系抗菌剤（ドキシサイクリン等）、マクロライド系抗菌剤（クラリスロマイシン等）、アミノグリコシド系抗菌剤（ゲンタマイシン等）、キノロン系抗菌剤（レボフロキサシン等）、グリコペプチド系抗菌剤（バンコマイシン等）、リポペプチド系抗菌剤（コリスチン等）等が挙げられる。
【００５９】
３．スクリーニング方法
本発明の１つの実施態様は、細菌膜に存在する物質Ａと相互作用して抗菌活性を示すペプチド系の候補化合物のスクリーニング方法である（以下「本発明のスクリーニング方法」とも言う）。
本発明のスクリーニング方法は、以下の工程を含む。
（１）物質Ａと相互作用して抗菌活性を示すことが知られているペプチド系化合物の類似化合物のライブラリーを提供すること；
（２）前記ライブラリー中の類似化合物を物質Ａと接触させて、各々の類似化合物と物質Ａとの錯体を形成させること；
（３）（２）で得られた類似化合物と物質Ａとの個々の錯体を分配し、溶媒を添加することにより当該錯体から物質Ａを溶離させること；
（４）各々の錯体から得られた各溶離液を採取して、各々の類似化合物についての物質Ａと錯体を形成した程度を分析すること：
（５）溶離液を採集した後に残った各々の類似化合物を回収し、各類似化合物の抗菌活性を測定すること。
以下、本発明のスクリーニング方法の各工程について詳細に説明する。
【００６０】
本発明のスクリーニング方法において用いることができる細菌膜に存在する物質Ａとしては、メナキノン、デメチルメナキノン、メチルメナキノン、ジメチルメナキノン、メチオナキノン、ユビキノン、ロドキノン、プラストキノン、クロロビウムキノン、ジヒドロメナキノン、テトラヒドロメナキノン、ヘキサヒドロメナキノンが挙げられる。
【００６１】
（１−１）物質Ａと相互作用して抗菌活性を示すことが知られているペプチド系化合物の類似化合物のライブラリーの構築
本発明のスクリーニング方法は、物質Ａと相互作用して抗菌活性を示すことが知られているペプチド系化合物を部分的に構造改変することにより得られる類似化合物群をスクリーニングすることにより行われる。ここで、構造改変を行うペプチド系化合物は、直鎖状のペプチド化合物、環状ペプチド化合物のいずれでもよい。
また、ペプチド系化合物には、各アミノ酸残基がアミド結合で結合したペプチド化合物に加えて、アミノ酸残基の一部がエステル結合等のアミド結合以外の結合様式により結合した部位を含む化合物も含まれる。
【００６２】
このような既知のペプチド系化合物の類似化合物のライブラリーは、公知の複合ペプチドの固相全合成法を用いて得ることができる。
本発明のスクリーニング方法においては、類似化合物はビーズ結合型ペプチド系化合物であることが好ましい。ビーズ結合型ペプチド系化合物のライブラリー（化合物群）は、ＯＢＯＣ（ｏｎｅ−ｂｅａｄ−ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）法を用いて調製することが好ましい。ＯＢＯＣ法を用いると、個々のビーズに構造的に特有の類似体をサブマイクログラムの量で担持することができる。また、１０００種類以上の類似化合物を同時に調製することができる。
【００６３】
ＯＢＯＣ法はＬａｍ，Ｋ．Ｓ等により開発された方法であり（Lam, K.S.; Lebl, M.; Krchnak, V. Chem. Rev. 1997, 97, 411）、小サイズのペプチドライブラリーを構築する有効な手法ではあるものの、これまで、複雑な天然ペプチドの合成には殆ど適用されなかった。本発明者等は、ライソシンＥの全固相合成で用いた手法を採用することにより高効率でビーズ結合型ペプチド系化合物のライブラリーを構築できるのではないかと考えた。
即ち、本発明者等が行ったライソシンＥの固相全合成においては、図１に示す化合物７をＷａｎｇ樹脂に結合させてＷａｎｇ樹脂結合型７を得て、これを起点として化合物４〜６及び化合物８〜１４を用いて段階的なペプチド鎖の伸長を行い、これに続くマクロラクタム化、および保護基の酸による除去によって、総収率８．０％で達成された。
【００６４】
ＯＢＯＣ法を用いたビーズ結合型ペプチド系化合物のライブラリーの調製方法においては、分割混合法（ｓｐｌｉｔ−ａｎｄ−ｍｉｘ法）が好適に用いられる。図２は、本発明のスクリーニング方法の基本的なスキームを示しているが、その上段部に本発明で用いるビーズ結合型ペプチド系化合物のＯＢＯＣライブラリーを構築する方法が示されている。
【００６５】
まず、物質Ａと相互作用して抗菌活性を示すことが知られているペプチド系化合物のペプチド残基のうち、可変にするペプチド残基部と変化させないペプチド残基部を選定する。図２においては、「Ａ」と「Ｂ」が不変（共通）ペプチド残基部であり、「Ｘ」と「Ｙ」が可変ペプチド残基である。
図２の上段に示すように、ビーズを共通のペプチド成分である「Ａ」と結合させ、次に可変残基である「Ｘ」の部位にペプチド成分１〜３を結合させると３種類のビーズ結合型ジペプチドが得られる（図２の上段部の左から２番目の図）。こうして得られた３種類のビーズ結合型ジペプチドの全てに共通のペプチド成分である「Ｂ」を結合し、次に、可変の残基である「Ｙ」の部位にペプチド成分４〜６を結合させる。その結果、９（＝３２）種類のビーズ結合型テトラペプチドが得られる（図２の上段部の右の図）。この操作を繰り返すことにより、ＯＢＯＣライブラリーとして、所定の可変残基部位に所望のペプチド成分を導入したビーズ結合型ペプチド系化合物のライブラリーを得ることができる。図２の下段部は、ＯＢＯＣ法を用いてビーズ結合型ライソシン類似体が得られる例を模式的に示している。
【００６６】
本発明のスクリーニング方法において、ＯＢＯＣ法を用いてビーズ結合型ペプチド系化合物のライブラリーを構築するにあたり、どのアミノ酸残基で構造改変を行うかは、物質Ａと相互作用して抗菌活性を示すことが知られているペプチド系化合物の生物学的に重要な構造への影響を最小化し、全体的な合成の効率も考慮して決定される。一例として、ライソシンＥにおいて検討した結果を以下に示す。
まず、１１番目の残基のＣα−立体中心とＧｌｙ−４のＣα−メチレンは、生物活性を示す三次元構造に潜在的に影響することから、これらを保持した。次に、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−５−メチルヘキサンアミド、Ｄ−Ａｒｇ−２／７、Ｎ−Ｍｅ−Ｄ−Ｐｈｅ−５、及びＤ−Ｔｒｐ−１０については、化学変異させると抗菌活性を低下させることから、これらの残基は変更しなかった。更に、Ｌ−Ｇｌｕ−８は固体担体への結合部位として必須であり、また、Ｌ−Ｔｈｒ−１／１２を変化させると固相エステル化の収率に影響を与えると推定されたため、これらの残基も変更しなかった。以上の点を考慮して、Ｌ−Ｓｅｒ−３、Ｌ−Ｌｅｕ−６、Ｄ−Ｇｌｎ−９及びＬ−Ｉｌｅ−１１をライブラリーの構築における可変部位と決定した。
【００６７】
本発明のスクリーニング方法において、ＯＢＯＣ法を用いてビーズ結合型ペプチド系化合物のライブラリーを構築するにあたり、可変部位のペプチドの側鎖をどのように変更するかについては、これらの物理化学的性質の観点から多様化するのが望ましい。可変部位のペプチド側鎖に導入する基として、例えば、疎水性基、酸性基、塩基性基、水酸基又は水酸基含有基、１級アミド基及び芳香族基からなる群から少なくとも１以上を選択し、これらの基に属する適切な置換基を採用することができる。
【００６８】
また、本発明のスクリーニング方法で得られるペプチド系の候補化合物の構造を決定するためにＭＳ／ＭＳ分析が用いられるが、ＭＳ／ＭＳ分析により、一つのビーズ上の特有の構造を明確に決定することを可能にするためには、ペプチド系の候補化合物の配列中の各可変残基は固有の分子量を有さなければならない。従って、可変部位のペプチド側鎖に導入する基の分子量は、通常異なることが好ましい。
【００６９】
ビーズ結合型ペプチド系化合物のライブラリーの調製方法において用いるビーズとしては、ペプチド固相合成で通常用いられる樹脂、例えば、Ｗａｎｇ樹脂、２−クロロトリチル（Ｂａｒｌｏｓ）樹脂、ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ、ＴｅｎｔａＧｅｌ等が使用できるが、許容される溶媒種の多様性、ビーズサイズの均一性の点から、ＴｅｎｔａＧｅｌが好ましい。
【００７０】
また、ペプチド系化合物とビーズを連結するリンカーとしては、ペプチド固相合成で通常用いられる種々のリンカーを用いることができるが、酸に安定なリンカーを用いると側鎖を保護基で修飾しなくてもビーズ結合型ペプチド系化合物を調製することが可能であることから好ましい。また、光分解性のリンカーを用いると、試薬等を用いなくてもビーズ結合型ペプチド系化合物に単に光を照射することで、ビーズからペプチド系化合物を遊離させることができるため好ましい。
本発明のスクリーニング方法においては、ｏ−ニトロベラトリルリンカー、
メチオニンリンカー等を好適に使用することができる。
【００７１】
（１−２）ライブラリー中の類似化合物を物質Ａと接触させて、各々の類似化合物と物質Ａとの錯体を形成させる工程
（１）の工程で得られた物質Ａと相互作用して抗菌活性を示すことが知られているペプチド系化合物の類似化合物群を、物質Ａを接触させる手法としては、例えば、物質Ａの溶液を類似化合物に噴霧する方法、物質Ａの溶液に類似化合物群を溶解又は分散させる方法等が挙げられる。
本発明のスクリーニング方法においては、ＯＢＯＣ法を用いて調製したライブラリー中のビーズ結合型ペプチド系化合物、及び、メナキノン等の物質Ａをメタノール等のアルコール系溶媒に添加することで、各々のビーズ結合型ペプチド系化合物とメシチリン等の物質Ａを接触させることが好ましい。両者を接触させると、ビーズ結合型ペプチド系化合物群の個々のビーズ結合型ペプチド系化合物とメナキノン等の物質Ａとの錯体が形成される。
【００７２】
（１−３）工程（２）で得られた類似化合物と物質Ａとの個々の錯体を分配し、溶媒を添加することにより当該錯体から物質Ａを溶離させる工程
工程（２）で得られた類似化合物と物質Ａとの個々の錯体、好適には、ビーズ結合型ペプチド系化合物とメナキノン等の物質Ａとの個々の錯体を分配する方法としては、各々の錯体をマイクロプレートに分配することが好ましい。ビーズ結合型ペプチド系化合物では１つのビーズに１種類のペプチド系化合物が担持されていることから、マイクロプレートの１つのウェルには１種類のビーズ結合型ペプチド系化合物を分配することができる。マイクロプレートのウェルの数は、ビーズ結合型ペプチド系化合物群中の化合物の種類に応じて適宜選択することができ、例えば、９６−ウェルのマイクロプレート等を使用することができる。
【００７３】
マイクロプレート等に分配した後、前記類似化合物と錯体を形成していない未結合の物質Ａを取り除くため、有機溶媒で洗浄する。この際に使用する有機溶媒としては、例えばメタノール等を用いることができる。
【００７４】
次に、前記類似化合物と物質Ａとの錯体から物質Ａを溶離させるために溶媒を添加する。ここで用いる溶媒は、類似化合物と物質Ａとの錯体の種類に応じて適宜選択されるが、ビーズ結合型ペプチド系化合物とメナキノンの錯体の場合は、長鎖アルカノールを使用することができ、特にｎ−ブタノールを好適に使用することができる。また、この際に、ｎ−ブタノール等を添加した分散液を３０〜６０℃に加温することが好ましく、５０℃に加温することが特に好ましい。
上記の工程により、各々の錯体から物質Ａが溶離して、物質Ａの溶離液を得ることができる。
【００７５】
（１−４）各々の錯体から得られた各溶離液を採取して、各々の類似化合物についての物質Ａと錯体を形成した程度を分析する工程
（３）の工程で得られた各々の錯体から各溶離液を採取して、各々の類似化合物について物質Ａとの錯体を形成した程度を分析する。これにより、各々の類似化合物が物質Ａを取り込むことができる程度、即ち、各々の類似化合物が物質Ａと相互作用する程度を判定することができる（第１スクリーニング工程）。
各々の類似化合物について物質Ａとの錯体を形成した程度を分析する手法としては、物質Ａの量を定量的又は定性的に検出することができる分析方法を適宜選択することができる。物質Ａがメナキノンの場合は、溶離液の蛍光強度を測定することにより、各々の類似化合物について物質Ａとの錯体を形成した程度を分析することができる。更に、メナキノンの溶離液にＮａＢＨ４等の還元剤を添加することにより、メナキノンを以下の下段の式に表される還元型メナキノンにすると、蛍光強度の測定感度が向上するため、より定量的な分析が可能になり好ましい。
2020138908.tif 000029
【００７６】
次に、各々の類似化合物が物質Ａを取り込むことができる程度、即ち、各々の類似化合物が物質Ａと相互作用する程度を判定するには、物質Ａと相互作用して抗菌活性を示すことが知られているペプチド系化合物についての分析値を比較することにより、当該既知のペプチド系化合物よりも物質Ａと相互作用する程度が高いか否かを判定する。物質Ａがメナキノンの場合は、メナキノンと相互作用することが公知であるペプチド系化合物、例えばライソシンＥを用いた場合の溶離液の蛍光強度と、類似化合物について得られた溶離液の蛍光強度を比較して、類似化合物についての蛍光強度値が前者の蛍光強度より高ければ、当該類似化合物をペプチド系の候補化合物の１つとして選定することができる。
このようにしてペプチド系の候補化合物として選定された化合物の集団（化合物群）を、「ペプチド系の候補化合物群Ａ」とも言う。
【００７７】
（１−５）溶離液を採集した後に残った各々の類似化合物を回収し、各類似化合物の抗菌活性を測定する工程
次に、溶離液を採集した後に残った各々の類似化合物を回収し、各類似化合物の抗菌活性を測定する。
ここで、類似化合物がビーズ結合型ペプチド系化合物である場合は、ビーズを除去してペプチド系化合物を得て、その抗菌活性を測定する（図２の下段の右側を参照）。ビーズ結合型ペプチド系化合物からビーズを除去する手法は、用いるビーズの種類、リンカーの種類等に応じて選択することができるが、リンカーとして光分解性のリンカーを用いると紫外線等の光を照射することによりビーズを除去することができる。
【００７８】
本工程においては、（３）の工程の後に回収した全ての類似化合物について抗菌活性を測定してもよいが、（４）の工程で選定された「ペプチド系の候補化合物群Ａ」について抗菌活性を測定するのが好ましい。
【００７９】
抗菌活性の測定としては、種々の菌の感受性を調べることができるが、例えば、グラム陽性菌：メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を含む黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、Staphylococcus simulans、Staphylococcus haemolyticus、Staphylococcus pseudintermedius、セレウス菌(Bacillus cereus)、枯草菌(Bacillus subtilis)及びリステリア菌(Listeria monocytogenes)等に対する活性を測定することができる。また、抗菌活性は、ＢＣＳの存在下（例えば、１０％添加）又は非存在下で評価することができる。
【００８０】
ペプチド系の候補化合物群Ａについて抗菌活性を測定し、それらの結果を、物質Ａと相互作用して抗菌活性を示すことが知られているペプチド系化合物の抗菌活性の測定結果と比較することにより、ペプチド系の候補化合物として選定することができる。
【００８１】
ペプチド系の候補化合物群Ａ中の各化合物、又は、抗菌活性を測定した結果選定されたペプチド系の候補化合物の配列は、これら化合物をＭＳ／ＭＳシークエンス分析にかけることにより決定することができる。ここで、ペプチド系の化合物が環状ペプチドである場合は、塩基性条件又は酸性条件下で加水分解して直鎖ペプチドを得て、これをＭＳ／ＭＳシークエンス分析に供する。
【００８２】
（１−６）ライソシンＥを用いたスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法の一例として、メナキノンと相互作用して抗菌活性を示すことが知られているペプチド系化合物としてライソシンＥを用いたスクリーニング方法について説明する。
【００８３】
ライソシンＥを基準化合物としてＯＢＯＣ法により類似化合物を合成する概略図を図３ａ及び図３ｂに示す。
図３の上段左の図は、ビーズ結合型ライソシンＥの構造を示している。ここで、ビーズとしてＴｅｎｔａＧｅｌを用い、リンカーとして光分解性リンカーであるｏ−ニトロベラトリルリンカーを用いた。
可変部位としては、上記で説明した理由から、Ｌ−Ｓｅｒ−３、Ｌ−Ｌｅｕ−６、Ｄ−Ｇｌｎ−９及びＬ−Ｉｌｅ−１１を選定した。そして、これら可変部位の各ペプチド残基の側鎖をＲ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４と定めた（図３ａの上段の左図を参照）。
【００８４】
次に、可変部位のＲ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４として導入する基として、疎水性基、酸性基、塩基性基、水酸基含有基、１級アミド基及び芳香族基を選択した。これらに加えて、メチル基での置換も採用した。さらに、これらの基に属する具体的な置換基を、それぞれの置換基が異なる物理化学的特性を持つように選定した。
上記で選定した置換基のリストを図３ａの上段の右図に示す。各基の右の括弧内には、各々の置換基を示す記号と、分子量が記載されている。
【００８５】
図３ｂは、ライソシンＥベースのＯＢＯＣライブラリーを構築するために用いる化合物（アミノ酸成分）のリストを示す。リストの上段の４〜１０の化合物は、本ＯＢＯＣ法で共通して用いる化合物、つまり、不変ペプチド部位を構成する。
リストの下段の化合物１１〜２６は、本ＯＢＯＣライブラリーの構築に用いる分割混合法でランダム化させる化合物を示す。これらの化合物が可変部位に導入される。これらの内、化合物１１〜１４は、ライソシンＥに由来する化合物であり、化合物１５〜２６は人工的に導入する化合物である。
【００８６】
上記の化合物を用いて、分割混合法によりビーズ結合型ライソシンＥ系化合物のＯＢＯＣライブラリーを構築する。ここで、４種類の可変部位において、夫々７種類のペプチド基を導入していることから、７４＝２４０１種類の化合物を得ることができる。
このように、本発明のスクリーニング方法では、１つのビーズに１種類のペプチド系化合物が固有的に結合した非常に多くの種類のビーズ結合型ペプチド系化合物を合成することができるため、有効なスクリーニングを行うことが可能である。
【００８７】
図４に、ライソシンＥを用いたスクリーニング方法の全体的模式図を示す。
分割混合法により得られるビーズ結合型ライソシンＥ系化合物をメタノールに分散し、メナキノンを添加する。これにより、ビーズ結合型ライソシンＥ系化合物とメナキノンとの錯体が形成される。そして、この分散液中の各々のビーズ結合型ライソシンＥ系化合物を９６ウェルのマイクロプレートに分配する。次に、各ウェルにメタノールを加えて、ビーズ結合型ライソシンＥ系化合物に結合していないメナキノンを洗浄する。
【００８８】
次に、各ウェルにｎ−ブタノールを５０℃の条件下で添加して、錯体からメナキノンンを溶離させる。そして、ビーズ結合型ライソシンＥ系化合物と溶離液を分離する。
上記の操作で得られた各溶離液を採取して、各々のビーズ結合型ライソシンＥ系化合物についてメナキノンとの錯体を形成した程度を分析する。これにより、各々のライソシンＥの類似化合物がメナキノンを取り込むことができる程度、即ち、各々のライソシンＥ類似化合物がメナキノンと相互作用する程度を判定する（第１スクリーニング工程）。分析手法としては蛍光強度の測定を用いるのが好ましい。また、ＮａＢＨ４を添加することにより、メナキノンを還元型メナキノンに変換すると、蛍光強度の測定感度が向上するため、より定量的な分析が可能になり好ましい（図４の中段参照）。
そして、各試料の蛍光強度の測定結果をビーズ結合型ライソシンＥを用いた場合の蛍光強度と比較して、ライソシンＥよりもメナキノンと相互作用する程度が高いか否かを判定する。ライソシンＥを用いた場合よりも蛍光強度が高ければ、当該ライソシンＥ類似化合物を候補化合物の１つとして選定することができる。このようにして、候補化合物を選定してライソシンＥ類似化合物の集団（化合物群）を得る。以下この化合物群を「ライソシンＥ系候補化合物群Ａ」とも言う。
【００８９】
上記の工程で、メナキノンが遊離したビーズ結合型ライソシン系化合物を回収する。次に、回収したビーズ結合型ライソシンＥ系化合物について、ビーズを除去してライソシンＥ系化合物を得る。ビーズを除去する手法としては、光を照射することによりビーズを除去することができる（図４の中段参照）。
こうして得られたライソシンＥ系化合物について抗菌活性を測定するが、全てのライソシンＥ類似化合物について抗菌活性を測定してもよいが、上記の第１のスクリーニング工程で選定された「ライソシンＥ系候補化合物群Ａ」について抗菌活性を測定するのが好ましい。
【００９０】
抗菌活性の測定としては、種々の菌の感受性を調べることができるが、例えば、グラム陽性菌：メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を含む黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、Staphylococcus simulans、Staphylococcus haemolyticus、Staphylococcus pseudintermedius、セレウス菌(Bacillus cereus)、枯草菌(Bacillus subtilis)及びリステリア菌(Listeria monocytogenes)等に対する活性を測定することができる。また、抗菌活性は、ＢＣＳの存在下（例えば、１０％添加）又は非存在下で評価することができる。
【００９１】
ライソシンＥ系候補化合物群Ａについて抗菌活性を測定し、それらの結果を、ライソシンＥの抗菌活性の測定結果と比較することにより、ライソシンＥ系の候補化合物として選定することができる。
【００９２】
ライソシンＥ系候補化合物群Ａ中の各化合物、又は、抗菌活性を測定した結果選定されたライソシンＥ系の候補化合物の配列は、これら化合物をＭＳ／ＭＳシークエンス分析にかけることにより決定することができる。この際に、塩基性条件又は酸性条件下で加水分解して直鎖ペプチドを得て、これをＭＳ／ＭＳシークエンス分析に供する。
【実施例】
【００９３】
以下に、本発明の実施形態について実施例を用いて詳述するが、本発明はその要旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【００９４】
［参考実施例１］
ビーズ結合ライソシンＥの合成と構造決定、アッセイの最適化
本発明のスクリーニング方法を実施するに当たり、１ビーズは１μｇ未満のペプチドしか含まないため、少量のペプチドで実施可能な手順を設計する必要がある。そこで、本発明者等は、最初に、本発明のＯＢＯＣ戦略の実現可能性を検証するために、ＴｅｎｔａＧｅｌビーズを使用してライソシンＥ（化合物１）を合成することを目的とした。
【００９５】
（１）合成の一般論
本明細書において、特記しない限り、空気および／または湿気の影響を受けるすべての反応は、乾燥溶媒中、アルゴン（Ａｒ）雰囲気下で行った。ＣＨ２Ｃｌ２、ＤＭＦ、およびＥｔ２Ｏは、Ｇｌａｓｓ  Ｃｏｎｔｏｕｒ溶媒分配システム（Ｎｉｋｋｏ  Ｈａｎｓｅｎ）によって精製した。特記しない限り、他の全ての試薬はそのまま使用した。固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）は、密閉反応容器を用いてマイクロ波支援ペプチド合成機ＭＷＳ−１０００（ＥＹＥＬＡ）にて行い、当該密閉反応容器内の反応温度は、内部温度プローブによってモニターした。
旋光度は、Ｐ−２２００旋光計（ＪＡＳＣＯ）で記録した。赤外線（ＩＲ）スペクトルは、ＣａＦ２上の薄膜としてＦＴ／ＩＲ−４１００分光計（ＪＡＳＣＯ）に記録した。１Ｈおよび１３ＣＮＭＲスペクトルは、ＥＣＸ５００（１ＨＮＭＲでは５００ＭＨｚ）分光計、ＥＣＺ５００Ｒ（１ＨＮＭＲでは５００ＭＨｚ）分光計（ＪＥＯＬ）、またはＣｒｙｏＰｒｏｂｅ（１Ｈでは８００ＭＨｚ）を装備したＡｖａｎｃｅ  ＩＩＩ  ＨＤ  ８００ＭＨｚ（１Ｈでは８００ＭＨｚ、１３ＣＮＭＲでは２００ＭＨｚ）（Ｂｒｕｋｅｒ）で記録した。
化学シフトは、内部標準（ＤＭＳＯ−ｄ６、１Ｈδ２．５０、１３Ｃδ３９．５）として残留溶媒のピークを用い、δ（ｐｐｍ）で表記する。ＨＲＭＳスペクトルは、ＭｉｃｒＯＴＯＦＩＩ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）エレクトロスプレーイオン化飛行時間型（ＥＳＩ−ＴＯＦ）質量分析計で記録した。
ＵＶ吸光度はＵＶ−１８００  ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）で測定した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）実験は、ＰＵ−２０８９Ｐｌｕｓインテリジェントポンプを備えたＨＰＬＣシステムまたはＰＵ−２０８６Ｐｌｕｓインテリジェントポンプを備えたＨＰＬＣシステムで行った（ＪＡＳＣＯ）。超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）実験は、Ｘ−ＬＣシステム（ＪＡＳＣＯ）で行った。
【００９６】
（２）ビーズ結合型ペプチドの合成の一般的手順
化合物２９の調製
５ｍＬのＬｉｂｒａＴｕｂｅ（Ｈｉｐｅｐ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中のＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｍａｃｒｏｂｅａｄｓ（２７、２６〜２８μｍｏｌ、０．２５ｍｏｌ／ｇ、６５５５０ビーズ／ｇ）をＤＭＦ（１．００ｍＬ×３）で洗浄した。  ＬｉｂｒａＴｕｂｅ中のビーズに、ＤＭＦ（５００μＬ）中のヒドロキシエチルフォトリンカー（２８．３当量）、Ｎ、Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（３当量）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、３当量）の溶液を室温で加えた。室温で２時間撹拌した後、混合物を濾過し、ＤＭＦ（１．００ｍＬ×３）で洗浄して光分解性リンカー結合樹脂を得た。
ＬｉｂｒａＴｕｂｅ中の上記光分解性リンカー結合樹脂に、ＤＭＦ（１．００ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ−ＯＡｌｌｙｌ（７，５当量）、Ｎ、Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（５当量）および４−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン（０．５当量）の溶液を室温で添加した。室温で１２時間撹拌した後、反応混合物を濾過し、ＤＭＦ（１．００ｍＬ×３）およびＣＨ２Ｃｌ２（１．００ｍＬ×３）で洗浄して、アミノ酸担持ビーズを得た。
上記の予め充填されたビーズに、残りのヒドロキシ基をキャッピングするために室温でＡｃ２Ｏ／ＣＨ２Ｃｌ２（１／３、１．００ｍＬ）を加えた。室温で３０分間撹拌した後、反応混合物を濾過し、ＣＨ２Ｃｌ２（１．００ｍＬ×３）、ＭｅＯＨ（１．００ｍＬ×３）、およびＥｔ２Ｏ（１．００ｍＬ×３）で洗浄し、真空乾燥して化合物２９を得た。
【００９７】
（３）置換率の決定
Ｆｍｏｃ保護樹脂をピペリジン／ＤＭＦ（１／４、１００μＬ）で室温にて３０分間処理した。反応混合物をＤＭＦ（２．９０ｍＬ）で希釈した。得られた混合物の３０１ｎｍでのＵＶ吸収を測定した。ピペリジン／ＤＭＦ（１／４）の溶液から得られた対照吸光度を差し引くことによってバックグラウンド吸光度を相殺した。アミノ酸置換率（ｘｍｍｏｌ／ｇ）は以下の式によって決定した。ここで、ａはＦｍｏｃ保護樹脂の重量（ｍｇ）であり、そしてｂは３０１ｎｍでの吸光度である。
ｘ＝（１００００×ｂ）／（７８００×ａ）
【００９８】
（４）ビーズ結合型ライソシンＥの合成
ビーズ結合型ライソシンＥの調製は、光開裂可能なリンカー２８とＴｅｎｔａＧｅｌビーズ２７のアミンとの結合体ら開始した（スキーム１（図５））。次に、リンカーの第二級アルコールをＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯＡｌｌｙｌ７のカルボン酸と縮合させて、化合物２９を２ステップにわたって９０％の収率で得た（３．２ｎｍｏｌ／ビーズ）。このようにして得られたビーズをＦｍｏｃ系固相ペプチド合成に供した。アミドカップリングは、合成を容易にするためにマイクロ波照射下４０℃で行った。更に、ペプチドの鎖間凝集を防ぐために、ＮＭＰを溶媒として使用した。
直鎖ドデカペプチドは、６サイクルのピペリジンによるＮα脱保護、ＨＯＡｔ／ＨＡＴＵ媒介アミド化（４〜６、９、１１、１２）、ＤＩＣ／ＤＭＡＰによるエステル化（１０）、次いで、３サイクルのＮα脱保護およびアミド化（８、１３、および１４）によって、２９より伸長した。次いで、生成物のＮ末端のＦｍｏｃ基およびＣ末端のアリル基を、ピペリジン、続いてＰｄ（ＰＰｈ３）４およびモルホリンで処理することにより除去して、マクロラクタム前駆体を得た。
次いで、ＰｙＢＯＰ／２，４，６−コリジンを使用してビーズ上環化を行い、３７員環マクロラクタムを得た。最後に、マクロラクタムを水性ＴＦＡで処理すると、側鎖保護基が脱離してビーズ結合型ライソシンＥ（化合物３０）が得られた。３０のリンカーはＭｅＯＨに分散し紫外線（３６５ｎｍ）を照射することにより開裂し、粗製物１が得られた。２６ステップにわたる化合物２９から化合物１までの全体の収率は、ＭＳおよび高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析によって５．１％と計算され、この手順の効率が前の全合成（８．０％）に匹敵することを実証した。その結果、合成後の１ビーズは、ライソシンＥを０．２５μｇ含んでいた。
【００９９】
また、図６に示す蛍光強度の測定したビーズ結合型ペプチド３０は以下の手順で合成した。
ビーズ結合ペプチド３０：
ビーズ２９（３７．４ｍｇ、８．３０μｍｏｌ、置換率０．２２２ｍｍｏｌ／ｇ）を、上記のマイクロ波照射ペプチド固相合成、ビーズ上におけるエステル化、ビーズ上におけるマクロラクタム化、および脱保護に供して３０を得た（４０．０ｍｇ）。
【０１００】
（５）合成したペプチドの構造決定
ＯＢＯＣ法においては、１つのビーズを使用して構造決定することが不可欠である。しかしながら、環状ペプチドの配列決定は、複数の位置での開環によって引き起こされるそれらの複雑な断片化パターンのために、一般的に問題がある。そこで、分析を単純化するために、化合物１の大環状化合物を、Ｌ−Ｔｈｒ−１と−１２との間の単一エステル結合を利用することによって直鎖状化した。具体的には、化合物１をＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ中の１％ＮＨ３で処理して直鎖状セコ酸（化合物３１）を生成した。化合物３１のマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法によるＭＳ／ＭＳ分析は、化合物１のアミノ酸配列に一致するフラグメントイオンを与え、これにより構造決定が可能であった。その高い感度のために、ＭＳ／ＭＳシーケンス分析は１ビーズ上の化合物１（０．０４μｇ）の１５％しか必要としなかった。
【０１０１】
（６）メナキノン錯体形成アッセイ
次に、ビーズ上に結合したライソシンＥ（化合物３０）及びメナキノン（ＭＫ−４；化合物２）を用いて、ビーズ上複合体形成アッセイの実行可能性を評価した。化合物２を化合物３０のＭｅＯＨ溶液に添加すると、化合物３０の色は黄色から赤色に変化し（図７のａ）、これは、ライソシンＥの構造と化合物２との間の選択的芳香族間相互作用を示している（図７のｂ）。しかしながら、この色の変化の度合いは、結合した化合物２の量には比例しなかった。
そこで、本発明者らは、化合物２を定量するための蛍光ベースの方法を開発した。３０のビーズ１個をＭｅＯＨ中の化合物２と共にインキュベートし、次いでマイクロプレートウェルに分注した。ビーズ未結合の化合物２を洗浄した後、ビーズに結合した化合物２を疎水性条件（ｎ−ＢｕＯＨ、５０℃）下で溶出して、化合物２を含有する溶出液を回収した。次に、化合物２のナフトキノン部分をｎ−ＢｕＯＨ中のＮａＢＨ４で還元して蛍光ヒドロキノン２Ｈを生成した（λｍａｘｅｘｃ＝２５０ｎｍ、λｍａｘｅｍｉｔ＝４３０ｎｍ）。最後に、化合物３０のビーズ１個からの２Ｈの蛍光強度を評価してビーズに結合した化合物２の量を決定した。
この方法は誤差が小さく（１０２６±６４ａ．ｕ．）、高精度を示すことが分かった（図５および図６）。なお、錯体形成アッセイの間、化合物１の構造は変化しなかった：ＵＨＰＬＣおよび質量分析により、錯体形成アッセイの前後で化合物１の量が変化していないことを検証した。
【０１０２】
（７）抗菌アッセイ
最後に、黄色ブドウ球菌に対する抗菌アッセイを小型化して、液相中の化合物１の活性を評価した。ＭＳ／ＭＳによる構造決定は単一ビーズに由来する化合物１の１５％を消費するため、化合物１の０．２１μｇに対応する８５％をアッセイに適用した。化合物１の量が微量のため、実験は単一濃度で実施し、増殖培地の容量は１ウェルあたり４０μＬとした。それでも、化合物１のＭＩＣ値（２〜４μｇ／ｍＬ）を考慮すると、その抗菌効果を検出するには、約０．１６〜０．３２μｇの化合物１が必要であり、活性の検出限界を下げることが好ましい。そのため、本発明者らは、高感度アッセイを確立するための条件を探索した。
【０１０３】
化合物１は黄色ブドウ球菌感染マウス（ＥＤ５０＝０．５ｍｇ／ｋｇ）において強力な治療効果を有するので、本発明者等はインビボ条件を模倣することにより化合物１のインビトロ活性を改善することを試みた。添加剤のスクリーニングにより、ウシの子牛血清（ＢＣＳ）が化合物１の抗菌活性を劇的に増強することが明らかになった。具体的には、黄色ブドウ球菌に対する化合物１のＭＩＣ値は、１０％ＢＣＳを増殖培地に添加することによって６４分の１（０．０６２５μｇ／ｍＬ）となった。図７のｃに示されるように、天然の化合物１（Ａ／Ｂ）の０．０４μｇおよび単一ビーズ由来の化合物１（Ｃ／Ｄ）の８５％の両方の添加は黄色ブドウ球菌の増殖を完全に阻害したが、対照ウェル（Ｅ／Ｆ）では増殖が観察された。
【０１０４】
このようにして確立された実験プロトコルは、合成、構造決定、および単一ビーズ由来の化合物１のみを使用することによる性能評価を可能にした。したがって、ＯＢＯＣ戦略全体はこれらのプロトコルに従って設計した（図５を参照）。
【０１０５】
第一に、２４０１種類のビーズ結合型ペプチドは、分割−混合手法を用いた並行固相合成によって生成する。第二に、ビーズをＭｅＯＨ中で化合物２と混合し、マイクロプレートウェルに分配し、ＭｅＯＨおよびｎ−ＢｕＯＨで順次処理して、化合物２を含有する溶出液とビーズ結合型ペプチドを分離した。第三に、溶出液へのＮａＢＨ４の添加によって生成される２Ｈの蛍光強度を測定することによって、ペプチドと化合物２の錯化活性を評価した。第４に、１５％の単一ビーズ由来のペプチドを直鎖状化して、その配列をＭＳ／ＭＳ分析によって決定した。第５に、同じペプチドの８５％を用いてペプチドの抗微生物活性を評価した。スクリーニングを容易にするために、第三段階の陽性化合物のみを第四および第五段階に使用する。
【０１０６】
［実施例１］
ライソシンＥに基づくＯＢＯＣライブラリーの構築
２４０１種類のペプチドを含むＯＢＯＣライブラリーは、第３残基、第６残基、第９残基及び第１１残基の縮合時に分割混合法を適用することによって構築した（スキーム２（図８））。アミド化、エステル化、マクロ環化、および脱保護のための試薬と条件は、スキーム１で開発したものと同じであるが、ランダム化には１２種類のアミノ酸１５−２６を新たに使用した。
ここで、実際には、３倍のビーズ数（約７５１０ビーズ）を使用することで、合成上の効率を損なうことなくライブラリーカバー率を最大化することを計画した（ペプチドの予想カバー率＝９５％）。このようにして、７５１０個のビーズ（７：１ビーズあたり３．２ｎｍｏｌ）からなる７−結合型２９を３段階でジペプチド３２（化合物３２）に変換した。
第６残基での最初のランダム化として、化合物３２のビーズを７つの反応容器に分割し、それらを天然物と同じＦｍｏｃアミノ酸（１２）および６つのＦｍｏｃアミノ酸（１１、１５、１７、１９、２２、２３、および２５）と別々に縮合させ、続いてピペリジンで処理した。次いで、全てのビーズを再度混合し、化合物５および化合物４を用いて縮合を行い、７つの構造を含むヘキサペプチド３３を得た。７つの成分（化合物１１、１５、１７、１９、２２、２３及び２５）を使用する第３残基での２回目のランダム化に続いて、化合物６、９及び１０の縮合／Ｎα−脱保護を順次行い、ノナペプチド３４（４９種から構成される）を得た。さらに３個のアミノ酸残基の導入、第１１残基および第９残基でのランダム化および第１０残基の縮合により、直鎖ドデカペプチド３６（２，４０１種から構成される）を合成した。
最後に、ビーズ３６はパラジウムを用いたアリル基の除去、マクロ環化、およびビーズ上での脱保護により２４０１種のビーズ結合型環状ペプチドに変換した。
【０１０７】
以下にライソシンＥに基づくＯＢＯＣライブラリーを構築した手法の詳細を記載する。
【０１０８】
（１）分割混合法による合成の手順
２４０１種のビーズ結合型ペプチドをペプチド合成機で調製した。基本的操作手順は以下の通りである。
工程１：固体担持Ｎα−Ｆｍｏｃペプチド（ａ μｍｏｌ、ａ＜５０）をＣＨ２Ｃｌ２を含む７つの５ｍＬ ＬｉｂｒａＴｕｂｅに分割し、真空乾燥した。
工程２：固相担持Ｎα−Ｆｍｏｃペプチドをピペリジン／ ＮＭＰ（１／４、室温、１０分）で脱保護した。
工程３：５ｍＬのＬｉｂｒａＴｕｂｅ中の樹脂をＮＭＰ（２ｍＬ、３０秒×５）で洗浄した。
工程４：バイアル中のアミノ酸（４．０当量）を、ＮＭＰ中のＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ'、Ｎ'−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、４．０当量、０．４５Ｍ）／１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ、４．０当量、０．４５Ｍ）の溶液によって活性化した。活性化アミノ酸の溶液に、ＮＭＰ中のｉ−Ｐｒ２ＮＥｔ（８．０当量、２．０Ｍ）の溶液を加えた。 得られた混合物を反応容器に移した。バイアルをＮＭＰ（０．００７２×１ｍＬ）で洗浄した。 溶液を反応容器に移した。
工程５：活性化アミノ酸を樹脂上のペプチドとカップリングさせ（４０℃、１００Ｗ； ２０分）、樹脂を含有する反応容器をＮＭＰで洗浄した（２ｍＬ、３０秒×５）。
ステップ６：７バッチの樹脂を１つのＬｉｂｒａＴｕｂｅでＣＨ２Ｃｌ２と混合した。
【０１０９】
工程１〜６は、残基−３、−６、−９及び−１１の縮合のために行われた。
工程２〜５は、残基−２、−４、−５、−７及び−１０の縮合のために行われた。
９のカップリングを室温で４０分間行った。
【０１１０】
（２）ビーズ上エステル化
５ｍＬのＬｉｂｒａＴｕｂｅ中のビーズ結合ヘプタペプチド（ａ μｍｏｌ、ａ＜５０）に、ＮＭＰ／ＣＨ２Ｃｌ２（１／９、５００μＬ）中のＮ、Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド（８．０当量）および１０（８．０当量）の溶液を加えた。混合物に、Ｎ、Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（１．０当量）を加えた。室温で３時間撹拌した後、反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（１．００ｍＬ×５）およびＮＭＰ（１．００ｍＬ×５）で洗浄してビーズ結合デプシペプチドを得、これをさらに精製することなく次の反応に使用した。
【０１１１】
（３）ビーズ上マクロラクタム化および脱保護
ＬｉｂｒａＴｕｂｅ中のビーズ結合デプシペプチド３６またはＳ５に、ＣＨ２Ｃｌ２（５００μＬ）中のＰｄ（ＰＰｈ３）４（０．２５当量）およびモルホリン（２４当量）の溶液を加えた。室温で３０分間撹拌した後、反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（１．００ｍＬ×５）で洗浄してビーズ結合ペプチドを得た。
ＬｉｂｒａＴｕｂｅ中の上記ビーズ結合ペプチドに、ＮＭＰ／ＣＨ２Ｃｌ２（１／９、５００μＬ）中のＰｙＢＯＰ（５．０当量）および２，４，６−コリジン（１０当量）の溶液を加えた。室温で１２〜１４時間撹拌した後、反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（１．００ｍＬ×３）、ＮＭＰ（１．００ｍＬ×３）、およびＣＨ２Ｃｌ２（１．００ｍＬ×３）で洗浄し、１時間真空乾燥し、ビーズ結合マクロラクタムを得た。
上記ビーズ結合マクロラクタムに、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ（１９／１、２．００ｍＬ）を加えた。室温で１時間撹拌した後、反応混合物を濾過し、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ（１９／１、１．００ｍＬ×３）、ＭｅＯＨ（１．００ｍＬ×３）、およびＥｔ２Ｏ（１．００ｍＬ×３）で洗浄し、真空下で乾燥させてビーズ結合型ライソシンＥ類似体を得た。
【０１１２】
図５のスキーム１における化合物１の収率および図１７の表の再合成された化合物の収率によると、ペプチドの全体的な収率は２％−１２％（ビーズあたり約０．１−０．６μｇのペプチド）であると推定された。
【０１１３】
［実施例２］
ビーズ結合型ライソシンＥ類似体のメナキノン−複合体形成アッセイ、ＭＳ／ＭＳによる構造決定、抗菌アッセイ
（１）ビーズ結合型ライソシンＥ類似体のＭＫ−４−複合体形成アッセイ
実施例１において合成した７５１０のビーズ結合ペプチドを用いて、ＭＫ−４（メナキノン（化合物２））−複合化アッセイを以下の一般的手順に従って行った。
【０１１４】
メナキノン錯化アッセイの一般的手順
ＬｉｂｒａＴｕｂｅのビーズ結合型ライソシンＥ類似体に、ＭｅＯＨ中のメナキノン−４（化合物２）の溶液（１０ｍＭ、１．０ｍＬ／１０００ビーズ）を加えた。混合物を室温で１２時間インキュベートした。ＭｅＯＨ中のビーズの懸濁液（２００ビーズ／２００μＬ）を２．０ｍＬマイクロチューブに移した。
マイクロピペットを使用して、マイクロチューブ内の各ビーズを９６ウェル濾過プレート（２７８０１１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１ビーズ／ウェル）の各ウェルに化合物２の溶液（２０μＬ／ビーズ）を移した。各ウェルにＭｅＯＨ（４００μＬ）を加え、ビーズを濾過した（×３）。プレート内のビーズを真空下で０．５〜１時間乾燥した。乾燥したビーズを、マイクロピペットを用いて、ＭｅＯＨ（２０μＬ／ウェル）を含む９６ウェルＰＣＲプレート（６５２２７０、Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、１ビーズ／ウェル）に移した。溶液を４０℃のＡｒ気流下で除去して、化合物２とビーズ結合ペプチドとの複合体を得た。
【０１１５】
プレート中の化合物２とビーズ結合型ペプチドとの複合体に、室温でｎ−ＢｕＯＨ（３０μＬ／ウェル）を加えた。懸濁液を５０℃で１時間インキュベートした。プレート中に得られた混合物を３５００×ｇ、室温で１０秒間遠心した。各ウェルの上清を黒色ポリスチレン平底９６ウェルプレート（６５５０８６、Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）の対応するウェルに移した。溶液を４０℃のＡｒ流下で濃縮して溶出物２を得た。
プレート中の上記溶出物２に、室温でｎ−ＢｕＯＨ（２５μＬ／ウェル）を加えた。プレートを室温で１０分間ボルテックスした。得られた溶液に、ｎ−ＢｕＯＨ中のＮａＢＨ４の溶液（１．０ｍＭ、２５μＬ／ウェル）を加えた。プレートを室温で１０分間ボルテックスした。各ウェルのメナヒドロキノンの蛍光（２Ｈ、Ｅｘ．２５０ｎｍ／Ｅｍ．４３０ｎｍ）を、Ｇｅｍｉｎｉ  ＥＭマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で３分毎（０、３および６分）に室温で測定した。各ビーズの３つのデータ点を平均し、そしてビーズ数に対してプロットした。
上記の手順により７５１０ウェルからの蛍光強度を定量した結果を図８に示す。
【０１１６】
図９に示されるように、蛍光強度は有意に変動しており、ペプチドのＭＫ錯形成活性を示している。ライソシンＥ構造を有する化合物３０が、１０２６±６４ａ．ｕ．（スキーム２）の強度を示したため、本発明者らは、＞１０００ａ．ｕ．の強度を示す２４１個のビーズをヒットビーズとして定義した（図８のチャートの上部の囲み内）。また、その後の実験のために、ビーズ全体のおよそ上位３％が選択された。
【０１１７】
（２）ライソシンＥ類似体の構造決定
次に、２４１個のビーズ結合ペプチドの構造を決定した。構造決定は以下の手順に則り行った。
【０１１８】
（ａ）ビーズ由来ペプチドの分離
（ａ−１）開裂反応用ビーズの調製
メナキノン錯化アッセイの後、光反応のためにビーズを次のように洗浄した。
マイクロピペットを用いて、９６ウェルＰＣＲプレート（１ビーズ／ウェル）中のビーズを、ＭｅＯＨ（５０μＬ／ビーズ）を含む濾過プレート（１ビーズ／ウェル）に移した。各ウェルにＤＭＳＯ（４００μＬ）を加え、ビーズをろ過した（×３）。各ウェルにＭｅＯＨ（４００μＬ）を加え、ビーズを濾過した（×２）。プレート中のビーズを真空下で１時間乾燥した。乾燥したビーズを、マイクロピペットを用いて、ＭｅＯＨ（２０μＬ／ビーズ）を含む９６ウェルＰＣＲプレート（１ビーズ／ウェル）に移した。懸濁液を４０℃のＡｒ流下で乾燥して乾燥ビーズを得、これを光反応に使用した。
【０１１９】
（ａ−２）ビーズからのペプチドの開裂
９６ウェルＰＣＲプレート（１ビーズ／ウェル）中の上記洗浄ビーズ結合ペプチドに、ＭｅＯＨ（２０μＬ／ウェル）を加えた。マイクロプレートに、簡易ＵＶランプ（ＡＳ  ＯＮＥ、ＳＬＵＶ−６、６Ｗ）を用いて、１５分毎にランプ位置を２行ずつずらして室温で合計１時間ＵＶ光（λ＝３６５ｎｍ）を照射した（図１０）。得られた溶液を４０℃のＡｒ流下で濃縮して、粗ライソシンＥ類似体（１ペプチド／ウェル）を得た。
【０１２０】
（ａ−３）抗菌活性アッセイおよびＭＳ／ＭＳシーケンス分析のためのペプチドの分離
９６ウェルＰＣＲプレートの粗ペプチドにＭｅＯＨ（１００μＬ／ウェル）を加えた。プレートに８連キャップを装着し、室温で１分間超音波処理した。プレート中の得られた混合物を３５００×ｇ、室温で１０秒間遠心した。８連キャップをプレートから注意深く取り除いた。溶液を穏やかにピペッティングした後（×３）、ＭｅＯＨ中の粗ペプチドの溶液（８５μＬ／ウェル）を９６ウェル丸底プレート（３３６７、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。丸底プレート中の溶液（８５μＬ／ウェル）を４０℃のＡｒ流中で乾燥させて粗ペプチドを得、これを抗菌活性アッセイに使用した。ＰＣＲプレートに残った溶液（２５μＬ／ウェル）を４０℃のＡｒ気流下で乾燥し、粗ペプチドを得て、これをＭＳ／ＭＳシークエンス分析に使用した。
【０１２１】
（ｂ）ＭＳ／ＭＳシーケンス解析
９６ウェルＰＣＲプレートの粗ペプチドに、１％ＮＨ３を含むＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（１／９、２０μＬ／ウェル）を加えた。混合物を室温で１２〜１４時間インキュベートした。反応混合物を４０℃のＡｒ流下で濃縮して、加水分解した直鎖状ペプチドを得た。
粗製直鎖状ペプチドを、０．１％ＴＦＡ（２．５μＬ／ウェル、４．０ｍｇ／ｍＬ）を含有するＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ（７／３）中のα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸の溶液およびクエン酸水素二アンモニウム溶液に溶解した。Ｈ２Ｏ中（０．００２５μＬ／ウェル、１００ｍｇ／ｍＬ）。得られたペプチド溶液をＴＯＦ／ＴＯＦ５８００（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）上でＭＳ／ＭＳ配列決定分析にかけた。
【０１２２】
２４１個のペプチドのうち、２３７個が明確な断片化パターン（図１１）を与え、それらの構造を明確に確立することを可能にした（図１２〜１４の各表を参照）。その結果、それらは１６６の異なる構造を持つことが分かった。重要なことに、１６６の化合物のうちの１つが化合物１（ライソシンＥ）であることが判明し、何千ものペプチドの混合物から活性分子を選択するための２−錯形成アッセイの信頼性が実証された。
【０１２３】
（３）ライソシンＥ類似体の抗菌アッセイ
最後に、メナキノン錯化アッセイにおいて１６６個の陽性化合物を用いて溶液中抗菌アッセイを行った。そして、単一ビーズ由来のペプチドの残り８５％を１０％ＢＣＳ添加培地４０μＬ中でＭＳＳＡ１と別々にインキュベートした。抗菌アッセイは以下の手順により行った。
【０１２４】
（ａ）抗菌活性測定用ビーズの調製
９６ウェルＰＣＲプレート（１ビーズ／ウェル）中のビーズを、マイクロピペットを用いてＭｅＯＨ（５０μＬ）を含むろ過プレート（１ビーズ／ウェル）に移した。ウェルにＤＭＳＯ（４００μＬ／ウェル）を加え、ビーズを濾過した（×３）。ウェルにＭｅＯＨ（４００μＬ／ウェル）を加え、ビーズを濾過した（×２）。プレート中のビーズを真空下で１時間乾燥した。乾燥したビーズを、マイクロピペットを用いて、ＭｅＯＨ（２０μＬ／ビーズ）を含む９６ウェルＰＣＲプレート（１ビーズ／ウェル）に移した。懸濁液を４０℃のＡｒ流下で乾燥して乾燥ビーズを得、これを光反応に使用した。
【０１２５】
（ｂ）抗菌活性測定のためのサンプル分離
９６ウェルＰＣＲプレートの粗ペプチドにＭｅＯＨ（１００μＬ／ウェル）を加えた。プレートに８連キャップを装着し、そして室温で１分間超音波処理した。プレート中の得られた混合物を３５００×ｇ、室温で１０秒間遠心した。８連キャップをプレートから注意深く取り除いた。溶液を穏やかにピペッティングした後（×３）、ＭｅＯＨ中の粗ペプチドの溶液（８５μＬ／ウェル）を９６ウェル丸底プレートに移した。丸底プレート中の溶液を４０℃のＡｒ流下で乾燥させて粗ペプチドを得た。プレート中の粗ペプチドにＤＭＳＯ（１μＬ／ウェル）を加えた。プレートを抗菌活性アッセイに供した。
【０１２６】
（ｃ）抗菌活性アッセイ
ＤＭＳＯ（１μＬ ／ウェル）中のペプチドの溶液に、陽イオン調整ミュラーヒントンブロスを含有する１０％ウシ血清中の黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ １３７０９株の懸濁液［４０μＬ／ウェル、２×１０５コロニー形成単位（４０μＬ ／ウェル）を添加した。 ＣＦＵ）、２１ｇ／Ｌミュラーヒントンブロス（Ｄｉｆｃｏ）、５０ｍｇ／Ｌ Ｃａ２＋（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏで調整）、および２５ｍｇ／Ｌ Ｍｇ２＋（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏで調整）］。プレートを３７℃で１８時間インキュベートし、培地の濁度を調べた。
【０１２７】
その結果、化合物１を含む２６の化合物はＭＳＳＡ１の増殖を完全に抑制した（図１２〜図１４）。２つのアッセイで同定された２５個の人工ペプチドをＡ１〜Ａ２５（Ａ群）と命名した。
【０１２８】
本発明のスクリーニング方法のＯＢＯＣ戦略を検証し、詳細な生物学的活性を評価するために、Ａ１〜Ａ２５を大規模に再合成することにした。さらに、第一のアッセイで陽性でありそして第二のアッセイで陰性であった、Ｂ１〜Ｂ５およびＣ１〜Ｃ５の１０個のペプチドを大規模合成のために選択した。具体的には、Ｂ１〜Ｂ５（グループＢ）は２−錯形成アッセイにおける上位５つの化合物に対応し、Ｃ１〜Ｃ５（グループＣ）は残りの１３５の化合物から無作為に抽出した。
【０１２９】
［実施例３］
３５種の人工類似体の合成
化合物１の３５種の人工類似体（Ａ１〜Ａ２５、Ｂ１〜Ｂ５、およびＣ１〜Ｃ５）は、化合物１の合成経路に従って数ミリグラム規模で、別々に合成した。原材料は、２４段階で全体的収率の１．８〜１２％でＡ１〜Ａ２５、Ｂ１〜Ｂ５、およびＣ１〜Ｃ５を生成するために、ＨＰＬＣにより精製した（表１および図Ｓ２〜Ｓ４）。各化合物の合成手順について以下に記載する。
【０１３０】
ペプチドＡ１〜Ａ２５、Ｂ１〜Ｂ５及びＣ１〜Ｃ５をペプチド合成機で調製した。基本的操作手順は以下の通りである。
工程１：固体担持Ｎα−Ｆｍｏｃペプチドをピペリジン／ＮＭＰ（１／４、室温、１０分）で脱保護した。
工程２：反応容器［２０ｍＬ  ＬｉｂｒａＴｕｂｅ（Ｈｉｐｅｐ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、５０μｍｏｌ以上のＳ１用）または５ｍＬ  ＬｉｂｒａＴｕｂｅ（５０μｍｏｌ未満のＳ１用）］内の樹脂をＮＭＰ
［５ｍＬ（５０μｍｏｌ以上のＳ１用）または２ｍＬ（５０μｍｏｌ未満のＳ１用）、４０秒×６］にて洗浄した。
工程３：バイアル中のアミノ酸（４．０当量）を、ＮＭＰ中のＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、４．０当量、０．４５Ｍ）／１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ、４．０当量、０．４５Ｍ）の溶液によって活性化した。
活性化アミノ酸の溶液に、ＮＭＰ中のｉ−Ｐｒ２ＮＥｔ（８．０当量、２．０Ｍ）の溶液を加えた。得られた混合物を反応容器に移した。このバイアルをＳ１のａμｍｏｌ用にＮＭＰ（０．００７２×ａｍＬ）で洗浄した。当該溶液を反応容器に移した。
工程４：活性化アミノ酸を樹脂上のペプチドとカップリングさせ（４０℃、２００Ｗ；２０分）、樹脂を含有する反応容器をＮＭＰ［５ｍＬ（５０μｍｏｌ以上のＳ１用）または２ｍＬ（５０μｍｏｌ未満のＳ１用）、４０秒×６］にて洗浄した。
工程１〜４を繰り返し、アミノ酸を固体担体上に縮合させた。
【０１３１】
ペプチドＡ１〜Ａ２５、Ｂ１〜Ｂ５及びＣ１〜Ｃ５の合成
アミノ酸担持樹脂Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、ａμｍｏｌ）は、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから購入した。反応容器中の樹脂Ｓ１［２０ｍＬのＬｉｂｒａＴｕｂｅ（５０以上のａ）または５ｍＬのＬｉｂｒａＴｕｂｅ（５０未満のａ）］を、ＣＨ２Ｃｌ２［５ｍＬ（５０以上のａ）または２ｍＬ（５０未満のａ）、４０秒×３］およびＮＭＰ［５ｍＬ（５０以上のａ）または２ｍＬ（５０未満のａ）、４０秒×６］で洗浄した。樹脂を６サイクル（６、Ｘ２、５、４、Ｘ１、および６）のマイクロ波照射ペプチド固相合成に供してペプチドＳ２を得た。ここで、Ｘ２は化合物１１、１２、１７、２２、２３、および２５のうちの１つであり、Ｘ１は化合物１１、１５、１７、１９、２２、２３、および２５のうちの１つである。
樹脂結合ペプチドＳ２をマイクロ波照射ペプチド固相合成条件で処理した（９のカップリングは室温で４０分間行った）。反応混合物をＮＭＰ／ＣＨ２Ｃｌ２［１／９、５ｍＬ（５０以上のａ）または２ｍＬ（５０未満のａ）、４０秒×６］で洗浄してペプチドＳ３を得た。
【０１３２】
バイアル中の１０（８．０当量）に、ＮＭＰ／ＣＨ２Ｃｌ２（１／９）中のＮ、Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（８．０当量、０．５７Ｍ）の溶液を加えた。得られた混合物を反応容器［２０ｍＬ  ＬｉｂｒａＴｕｂｅ（５０以上のａ）または５ｍＬ  ＬｉｂｒａＴｕｂｅ（５０未満のａ）］内の樹脂結合ペプチドＳ３に移した。バイアルをＮＭＰ／ＣＨ２Ｃｌ２（１／９、０．００４７×１ｍＬ）で洗浄した。得られた溶液を反応容器に移した。反応混合物を室温で５分間撹拌し、次いでＮＭＰ／ＣＨ２Ｃｌ２（１／９）中の４−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン（１．０当量、０．８２Ｍ）の溶液を加えた。室温で２時間撹拌した後、得られた混合物をＮＭＰ／ＣＨ２Ｃｌ２［１／９、５ｍＬ（５０以上のａ）または２ｍＬ（５０未満のａ）、４０秒×６］で洗浄した。このカップリング反応を繰り返した（２度）。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２［５ｍＬ（５０以上のａ）または２ｍＬ（５０未満のａ）、４０秒×６］およびＮＭＰ［５ｍＬ（５０以上のａ）または２ｍＬ（５０未満のａ）、４０秒×６］で洗浄し、ペプチドＳ４を得た。
【０１３３】
樹脂結合ペプチドＳ４をマイクロ波照射ペプチド固相合成（Ｘ３は化合物１１、１４、１７、１９、２３及び２５のうちの１つ、Ｘ４は化合物１３、１６、１８、２０、２１、２４、および２６のうちの１つ）の３サイクル（Ｘ４、８、およびＸ３）にかけた。上記のマイクロ波照射ペプチド固相合成のステップ１および２によって、Ｎα−Ｆｍｏｃ基を除去した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２［５ｍＬ（５０の以上のａ）または２ｍＬ（５０未満のａ）、４０秒×６］で洗浄してペプチドＳ５を得た。
反応容器［２０ｍＬ  ＬｉｂｒａＴｕｂｅ（５０以上のａ）または５ｍＬ  ＬｉｂｒａＴｕｂｅ（５０未満のａ）］内の樹脂結合ペプチドＳ５に、ＣＨ２Ｃｌ２中のＰｄ（ＰＰｈ３）４（０．２５当量、０．０１３Ｍ）およびモルホリン（２４当量、２．６Ｍ）の溶液を添加した。
室温で３０分間撹拌した後、反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２［５ｍＬ（５０以上のａ）または２ｍＬ（５０未満のａ）、４０秒×６］、ＮＭＰ［５ｍＬ（５０以上のａ）または２ｍＬ（５０未満のａ）、４０秒×６）およびＮＭＰ／ＣＨ２Ｃｌ２［１／９、５ｍＬ（５０以上のａ）または２ｍＬ（５０未満のａ）、４０秒×６］で洗浄し、ペプチドＳ６を得た。
反応容器中の樹脂結合ペプチドＳ６［２０ｍＬ  ＬｉｂｒａＴｕｂｅ（５０以上のａ）または５ｍＬ  ＬｉｂｒａＴｕｂｅ（５０未満のａ）］に、ＮＭＰ／ＣＨ２Ｃｌ２（１／９）および２，４，６−コリジン（１０当量）中のＰｙＢＯＰ溶液を加えた。室温で１１時間撹拌した後、反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２［５ｍＬ（５０以上のａ）または２ｍＬ（５０未満のａ）、４０秒×６］、ＮＭＰ［５ｍＬ（５以上のａ）または２ｍＬ（５０未満のａ、４０秒×６）、およびＣＨ２Ｃｌ２［５ｍＬ（５０以上のａ）または２ｍＬ（５０未満のａ）、４０秒×６］で洗浄し、真空乾燥して、ペプチドＳ７を得た。２０ｍＬのＬｉｂｒａＴｕｂｅ中の樹脂結合ペプチドＳ７について、樹脂結合ペプチドを３つの５ｍＬのＬｉｂｒａチューブに均等に分割した。
【０１３４】
５ｍＬのＬｉｂｒａＴｕｂｅ中の樹脂結合ペプチドＳ７に、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ（１９／１、２．０ｍＬ）を加えた。室温で１時間撹拌した後、反応混合物を濾過し、そしてＴＦＡ／Ｈ２Ｏ（１９／１、１．０ｍＬ、４０秒×６）で洗浄した。合わせた濾液を２時間撹拌した。得られた混合物を濃縮して粗ペプチドを得た。粗ペプチドにＥｔ２Ｏ（１０ｍＬ）を加えた。得られた混合物を室温で１分間超音波処理し、そして有機層を除去した。同じ手順を繰り返した（２度）。残渣を真空乾燥して粗ペプチドを得た。
粗ペプチドを、０．０５％ＴＦＡを含有し、０．０５％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏを含有するＭｅＣＮに溶解した［２５／７５、８．０ｍＬ（５０以上のａの各バッチに対して）または５．０ｍＬ（５０未満のａに対して）］。溶液をＩｎｅｒｔＳｅｐ  Ｓｌｉｍ  Ｃ１８−Ｂ［８４０ｍｇ（５０以上のａの各バッチについて）または３６０ｍｇ（５０未満のａについて）］に充填した。カラムは、０．０５％ＴＦＡ［２５／７５、８．０ｍＬ（５０以上のａの各バッチに対して）または５．０ｍＬ（５０未満のａに対して）］を含有し、０．０５％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏを含有するＭｅＣＮで洗浄し、不純物を除去した。粗ペプチドは、０．０５％ＴＦＡ［６０／４０、１６ｍＬ（５０以上のａの各バッチについて）または１０ｍＬ（５０未満のａについて）］を含有し、０．０５％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏを含有するＭｅＣＮで溶出し、そして凍結乾燥した。
残渣を逆相ＨＰＬＣにより精製して、化合物１（ライソシンＥ）類似体を得た。
【０１３５】
（合成実施例１）
ペプチドＡ１の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物２５、Ｘ２として化合物１２、Ｘ３として化合物１３、およびＸ４として化合物１４を用いて上記の一般的手順に供した。
粗製Ａ１を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３ ２０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５０分間かけて６０／４０から８５／１５、流速：５．０ｍＬ ／分、検出：ＵＶ ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３ ２０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝３０分間かけて３７．５／６２．５から４５／５５、次いで１０分かけて４５／５５、流速：５．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ ２８０ｎｍ）により精製し、Ａ１（ｔＲ＝２９．６〜３１．４分、１８．７ｍｇ、１０．９μｍｏｌ、２５工程で１０％）：白色の固体；［α］Ｄ＝＋２２．２°（ｃ＝０．８００、ＭｅＯＨ）； ＩＲ（フィルム）ｖ１１３５、１１８３、１２０２、１４３６、１５３８、１６２７、１６６８、２３６２、２９５７、３２７２ｃｍ−１； １Ｈ ＮＭＲ（８００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）、図１４参照；１３Ｃ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）、図１５参照；
Ｃ７５Ｈ１１７Ｎ２０Ｏ１９［Ｍ＋Ｈ］＋１６０１．８７９８のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値１６０１．８７９５を得た。
【０１３６】
（合成実施例２）
ペプチドＡ２の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物２５、Ｘ２として化合物１２、Ｘ３として化合物１６、およびＸ４として化合物１４を使用して、上記の一般手順に供した。
粗製Ａ２を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  ２０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５０分間かけて６０／４０から８５／１５、流速：５．０ｍＬ  ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  ２０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝３０分間かけて３７．５／６２．５から４５／５５、次いで１０分かけて４５／５５、流速：５．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）により精製し、Ａ２（ｔＲ＝３５．７〜３７．１分、１２．４ｍｇ、７．３７μｍｏｌ、２５工程で６．９％）：白色の固体；［α］Ｄ２３＝＋２６．２°（ｃ＝０．４２７、ＭｅＯＨ）；ＩＲ（フィルム）ｖ１１３９、１２０３、１４５４、１５４０、１６２７、１６７８、２３３８、２３６０、２９５９、３２７６、３６２５、３７３０ｃｍ−１； １Ｈ ＮＭＲ（８００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）、図１４参照；１３Ｃ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）、図１５参照；Ｃ75Ｈ118Ｎ19Ｏ18［Ｍ＋Ｈ］＋１５７２．８８９７のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値１５７２．８９２７を得た。
【０１３７】
（合成実施例３）
ペプチドＡ３の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物１９、Ｘ２として化合物１２、Ｘ３として化合物１６、およびＸ４として化合物１４を使用して、上記の一般手順に供した。
粗製Ａ３を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  ２０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５０分間かけて６０／４０から８５／１５、流速：５．０ｍＬ  ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  ２０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ  ＋  ０．０５％ＴＦＡ、Ａ／Ｂ＝５０分間かけて３７．５／６２．５、流速：５．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）により精製し、Ａ３（ｔＲ＝２７．６〜２９．９分、１３．８ｍｇ、７．４３μｍｏｌ、２５工程で６．９％）：白色の固体；［α］Ｄ２４＝＋２５．０°（ｃ＝０．４４７、ＭｅＯＨ）； ＩＲ（フィルム）ｖ１１４１、１２００、１４６５、１５１５、１６２９、１６７７、１７４０、２３０５、３２７４、３７４２ｃｍ−１； １Ｈ ＮＭＲ（８００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）、図１４参照；１３Ｃ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）、図１５参照；Ｃ78Ｈ125Ｎ20Ｏ18［Ｍ＋Ｈ］＋  １６２９．９４７５のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値１６２９．９４７７を得た。
【０１３８】
（合成実施例４）
ペプチドＡ４の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．７４６ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物１５、Ｘ２として化合物１２、Ｘ３として化合物２０、およびＸ４として化合物１４を使用して、上記の一般手順に供した。
粗製Ａ４を、第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil ＯＤＳ−４  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝２５分間かけて３５／６５から５０／５０次いで５分かけて５０／５０まで、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−４  １０×２５０ｍｍ、溶出液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝４０分間かけて７０／３０から９０／１０、流速：２．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２２０ｎｍ）により精製し、Ａ４（ｔＲ＝１４．１−１６．０分、１．２２ｍｇ、０．７０５μｍｏｌ、２５工程で４．１％）：白色の固体；Ｃ７７Ｈ１２３Ｎ２０Ｏ１８［Ｍ＋Ｈ］＋１６１５．９３１９のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値１６１５．９２７７を得た。
【０１３９】
（合成実施例５）
ペプチドＡ５の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物１１、Ｘ２として化合物１２、Ｘ３として化合物１６、およびＸ４として化合物１４を使用して、上記の一般手順に供した。
粗製Ａ５を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５０分間かけて２５／７５から５０／５０まで、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝６０分間かけて４５／５５から７５／２５、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）により精製し、Ａ５（ｔＲ＝５５．５〜５６．８分、０．６８４ｍｇ、０．４０２μｍｏｌ、２５工程で１．８％）：白色の固体；Ｃ７５Ｈ１１８Ｎ１９Ｏ１９［Ｍ＋Ｈ］＋１５８８．８８４６のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値１５８８．８８９５を得た。
【０１４０】
（合成実施例６）
ペプチドＡ６の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物１５を、Ｘ２として化合物１２、Ｘ３として化合物１３、およびＸ４として化合物１４を用いて上記の一般的手順に供した。
粗製Ａ６を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５０分間かけて２５／７５から５０／５０、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝６０分間かけて４５／５５から７５／２５、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）により精製し、Ａ６（ｔＲ＝５４．３〜５５．８分、３．７１ｍｇ、２．１３μｍｏｌ、２５工程で９．８％）：白色の固体；Ｃ７７Ｈ１２１Ｎ２０Ｏ１９［Ｍ＋Ｈ］＋１６２９．９１１１のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値１６２９．９１１１を得た。
【０１４１】
（合成実施例７）
ペプチドＡ７の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物２３、Ｘ２として化合物１２、Ｘ３として化合物２０、およびＸ４として化合物１４を使用して、上記の一般手順に供した。
粗製Ａ７を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５０分間かけて２５／７５から５０／５０、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝６０分間かけて４５／５５から７５／２５、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）により精製し、Ａ７（ｔＲ＝５１．０〜５２．８分、３．５３ｍｇ、１．８５μｍｏｌ、２５工程で８．８％）：白色の固体；Ｃ８１Ｈ１２３Ｎ２０Ｏ１９［Ｍ＋Ｈ］＋１６７９．９２６８のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値１６７９．９２７６を得た。
【０１４２】
（合成実施例８）
ペプチドＡ８の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物２３、Ｘ２として化合物１２、Ｘ３として化合物１３、およびＸ４として化合物１４を使用して上記の一般手順に供した。
粗製Ａ８を第一逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝４８分間かけて２５／７５から４９／５１、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、６０分かけてグラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝６０分間かけて４５／５５から７５／２５、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）により精製し、Ａ８（ｔＲ＝５５．７〜５７．１分、２．２７ｍｇ、１．２６μｍｏｌ、２５工程で５．６％）：白色の固体；Ｃ８１Ｈ１２１Ｎ２０Ｏ２０［Ｍ＋Ｈ］＋１６９３．９０６１のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値１６９３．９０８６を得た
【０１４３】
（合成実施例９）
ペプチドＡ９の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．７４６ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物２３、Ｘ２として化合物１２、Ｘ３として化合物１６、およびＸ４として化合物１４を使用して、上記の一般手順に供した。
粗製Ａ９を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil ＯＤＳ−４  ４．６×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝２０分間かけて３５／６５から５０／５０、次いで１５分間かけて５０／５０、流速：１．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−４  １０×２５０ｍｍ、溶出液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝４０分間かけて７０／３０から９０／１０、流速：２．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２２０ｎｍ）により精製し、Ａ９（ｔＲ＝１７．４〜２０．１分、１．２５  ｍｇ、０．７０３μｍｏｌ、２５工程で３．８％）：白色の固体；Ｃ８１Ｈ１２２Ｎ１９Ｏ１９［Ｍ＋Ｈ］＋１６６４．９１５９のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値１６６４．９２０７を得た。
【０１４４】
（合成実施例１０）
ペプチドＡ１０の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．７４６ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物２２、Ｘ２として化合物１２、Ｘ３として化合物１３、およびＸ４として化合物１４を使用して、上記の一般手順に供した。
粗製Ａ１０を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil ＯＤＳ−４  ４．６×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝２０分間かけて３５／６５から５０／５０、次いで１５分かけて５０／５０まで、流速：１．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−４  １０×２５０ｍｍ、溶出液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝４０分間かけて７０／３０から９０／１０、流速：２．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２２０ｎｍ）により精製し、Ａ１０（ｔＲ＝１５．６〜１８．３分、１．１８ｍｇ、０．６７１μｍｏｌ、２５工程で３．７％）：白色の固体；Ｃ７６Ｈ１１８Ｎ２１Ｏ２０［Ｍ＋Ｈ］＋１６４４．８８５７のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値１６４４．８８７１を得た。
【０１４５】
（合成実施例１１）
ペプチドＡ１１の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物１５、Ｘ２として化合物１２、Ｘ３として化合物２４、およびＸ４として化合物１４を使用して、上記の一般手順に供した。
粗製Ａ１１を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５０分間かけて５５／４５から８０／２０、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ／ＭｅＣＮ（２／１）＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５０分間かけて４０／６０〜７５／２５、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）により精製し、Ａ１１（ｔＲ＝２７．３〜２８．０分、３．３５ｍｇ、１．８８μｍｏｌ、２５工程で８．３％）：白色の固体；Ｃ８１Ｈ１２２Ｎ１９Ｏ１９［Ｍ＋Ｈ］＋１６６４．９１５９のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値１６６４．９１４５を得た。
【０１４６】
（合成実施例１２）
ペプチドＡ１２の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．７４６ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物１５、Ｘ２として化合物１２、Ｘ３として化合物２１およびＸ４として化合物１４を用いて上記の一般手順に供した。
粗製Ａ１２を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil ＯＤＳ−４  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝２５分間かけて３５／６５から５０／５０、次いで３０分かけて５０／５０、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−４  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝３０分間かけて７０／３０から８５／１５、流速：２．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２２０ｎｍ）により精製し、Ａ１２（ｔＲ＝１７．４〜１８．９分、０．９４４ｍｇ、０．５５４μｍｏｌ、２５工程で３．４％）：白色の固体；Ｃ７５Ｈ１１８Ｎ１９Ｏ１９［Ｍ＋Ｈ］＋１５８８．８８４６のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値１５８８．８８７３を得た。
【０１４７】
（合成実施例１３）
ペプチドＡ１３の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物２２、Ｘ２として化合物１２、Ｘ３として化合物１６およびＸ４として化合物１４を用いて上記の一般的手順に供した。
粗製Ａ１３を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５０分間かけて５５／４５から８０／２０、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝４０分間かけて３０／７０から５０／５０、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）により精製し、Ａ  １３（ｔＲ＝３２．９〜３３．９分、２．５５ｍｇ、１．４７μｍｏｌ、２５工程で６．１％）：白色の固体；Ｃ７６Ｈ１１９Ｎ２０Ｏ１９［Ｍ＋Ｈ］＋１６１５．８９５５のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値１６１５．８９６７を得た。
【０１４８】
（合成実施例１４）
ペプチドＡ１４の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．７４６ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物２２、Ｘ２として化合物１２、Ｘ３として化合物２０、およびＸ４として化合物１４を使用して、上記の一般手順に供した。
粗製Ａ１４を第１逆相ＨＰＬＣカラム（Inertsil ＯＤＳ−４  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝２５分間かけて３５／６５から５０／５０、次いで３０分かけて５０／５０、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−４  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝１８分間かけて７０／３０から７９／２１、流速：２．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２２０ｎｍ）により精製し、Ａ１４（ｔＲ＝１３．２〜１４．９分、０．９３９ｍｇ、０．５３８μｍｏｌ、２５工程で３．６％）：白色の固体；Ｃ７６Ｈ１２０Ｎ２１Ｏ１９［Ｍ＋Ｈ］＋１６３０．９０６４のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値１６３０．９１１２を得た。
【０１４９】
（合成実施例１５）
ペプチドＡ１５の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．７４６ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物２５、Ｘ２として化合物１２、Ｘ３として化合物２４、およびＸ４として化合物２３を使用して、上記の一般手順に供した。
粗製Ａ１５を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil ＯＤＳ−４  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝２０分間かけて３５／６５から５０／５０、次いで１０分かけて５０／５０まで、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−４  １０×２５０ｍｍ、溶出液Ａ）：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝３０分間かけて７０／３０から８５／１５、流速：２．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２２０ｎｍ）により精製し、Ａ１５（ｔＲ＝１１．０〜１２．８分、１．５４ｍｇ、０．８５５μｍｏｌ、２５工程で５．８％）：白色の固体；Ｃ８２Ｈ１１６Ｎ１９Ｏ２０［Ｍ＋Ｈ］＋１６８６．８６３９のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値１６８６．８６６２を得た。
【０１５０】
（合成実施例１６）
ペプチドＡ１６の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．７４６ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物１７、Ｘ２として化合物１２、Ｘ３として化合物２０、およびＸ４として化合物１４を使用して、上記の一般手順に供した。
粗製Ａ１６を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil ＯＤＳ−４  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝２５分間かけて３５／６５から５０／５０、次いで５分かけて５０／５０まで、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−４  １０×２５０ｍｍ、溶出液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝３０分間かけて７０／３０から８５／１５、流速：２．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２２０ｎｍ）により精製し、Ａ１６（ｔＲ＝１３．２〜１５．５分、１．５８ｍｇ、０．９０５μｍｏｌ、２５工程で５．９％）：白色の固体；Ｃ７６Ｈ１１９Ｎ２０Ｏ２０［Ｍ＋Ｈ］＋１６３１．８９０４のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値１６３１．８８８９を得た。
【０１５１】
（合成実施例１７）
ペプチドＡ１７の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物１７、Ｘ２として化合物１２、Ｘ３として化合物２４、およびＸ４として化合物１４を使用して、上記の一般手順に供した。
粗製Ａ１７を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５０分間かけて５５／４５から８０／２０、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５０分間かけて３０／７０から５５／４５、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）により精製し、Ａ１７（ｔＲ＝３４．１〜３５．２分、３．１３ｍｇ、１．８６μｍｏｌ、２５工程で９．３％）：白色の固体；Ｃ８０Ｈ１１８Ｎ１９Ｏ２１［Ｍ＋Ｈ］＋１６８０．８７４４のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値１６８０．８７６６を得た。
【０１５２】
（合成実施例１８）
ペプチドＡ１８の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．７４６ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物１７、Ｘ２として化合物１２、Ｘ３として化合物１６、およびＸ４として化合物１４を使用して、上記の一般手順に供した。
粗製Ａ１８を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil ＯＤＳ−４  ４．６×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝２０分間かけて３５／６５から５０／５０、次いで１５分かけて５０／５０まで、流速：１．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil ＯＤＳ−４  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝３５分間かけて７０／３０から８７．５／１２．５、流速：２．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２２０ｎｍ）により精製し、Ａ１８（ｔＲ＝２３．２〜２５．３分、０．８２１ｍｇ、０．４７４μｍｏｌ、２５工程で２．６％）：白色の固体；Ｃ７６Ｈ１１８Ｎ１９Ｏ２０［Ｍ＋Ｈ］＋１６１６．８７９５のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値１６１６．８８１１を得た。
【０１５３】
（合成実施例１９）
ペプチドＡ１９の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物１７、Ｘ２として化合物１２、Ｘ３として化合物２１、およびＸ４として化合物１４を使用して、上記の一般手順に供した。
粗製Ａ１９を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５０分間かけて３０／７０から５５／４５、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝３５分間かけて６０／４０から８０／２０、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）により精製し、Ａ１９（ｔＲ＝２０．３〜２１．６分、２．０４ｍｇ、１．２７μｍｏｌ、２５工程で５．１％）：白色の固体；Ｃ７４Ｈ１１４Ｎ１９Ｏ２１［Ｍ＋Ｈ］＋１６０４．８４３１のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値１６０４．８４０９を得た。
【０１５４】
（合成実施例２０）
ペプチドＡ２０の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物１１を、Ｘ２として化合物２５、Ｘ３として化合物２１、およびＸ４として化合物１４を用いて上記の一般手順に供した。
粗製Ａ２０を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５０分間かけて３０／７０から５５／４５、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝２５分間かけて６０／４０から７４．３／２５．７、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）により精製し、Ａ２０（ｔＲ＝１４．０〜１６．２分、１．２６ｍｇ、０．７６７μｍｏｌ、２５工程で３．２％）：白色の固体；Ｃ７０Ｈ１０８Ｎ１９Ｏ２０［Ｍ＋Ｈ］＋  １５３４．８０１３のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値１５３４．７９９９を得た。
【０１５５】
（合成実施例２１）
ペプチドＡ２１の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物１５を、Ｘ２として化合物２３、Ｘ３として化合物２０、およびＸ４として化合物１４を使用して、上記の一般手順に供した。
粗製Ａ２１を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５０分間かけて２５／７５から５０／５０、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５０分間かけて４５／５５から７５／２５、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）により精製し、Ａ２１（ｔＲ＝３５．９〜３７．７分、３．８６ｍｇ、２．０４μｍｏｌ、２５工程で１０％）：白色の固体；Ｃ８０Ｈ１２１Ｎ２０Ｏ１９［Ｍ＋Ｈ］＋１６６５．９１１１のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値１６６５．９０７１を得た。
【０１５６】
（合成実施例２２）
ペプチドＡ２２の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．７４６ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物１７、Ｘ２として化合物１２、Ｘ３として化合物１６、およびＸ４として化合物２３を使用して、上記の一般手順に供した。
粗製Ａ２２を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil ＯＤＳ−４  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、Ａ／Ｂ＝５分間かけて３５／６５、次いでグラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝２５分間かけて３５／６５から６０／４０、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）、第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil   ＯＤＳ−４  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝２５分間かけて６５／３５から７０／３０、次いで５分かけて７０／３０、流速：３．０ｍＬ／分、検出：フォトダイオードアレイ検出器１９９〜６５１ｎｍ）、および第３逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil ＯＤＳ−４  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝３５分間かけて７０／３０から８７．５／１２．５、流速：２．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２２０ｎｍ）により精製し、Ａ２２（ｔＲ＝１７．８〜１９．４分、０．９６９ｍｇ、０．５４４μｍｏｌ、２５工程で３．２％）：白色の固体；Ｃ７９Ｈ１１６Ｎ１９Ｏ２１［Ｍ＋Ｈ］＋１６６６．８５８８のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値１６６６．８６２４を得た。
【０１５７】
（合成実施例２３）
ペプチドＡ２３の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物２３、Ｘ２として化合物２５、Ｘ３として化合物１８、およびＸ４として化合物１１を使用して、上記の一般手順に供した。
粗製Ａ２３を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５０分間かけて３０／７０から３７．５／６２．５、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ）、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５０分間かけて４５／５５から７０／３０、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）により精製し、Ａ２３（ｔＲ＝２９．７〜３１．５分、２．３３ｍｇ、１．４４μｍｏｌ、２５工程で６．４％）：白色の固体；Ｃ７４Ｈ１０６Ｎ１９Ｏ２２［Ｍ＋Ｈ］＋１６１２．７７５４のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値１６１２．７７４６を得た。
【０１５８】
（合成実施例２４）
ペプチドＡ２４の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物２５、Ｘ２として化合物２２、Ｘ３として化合物１６、およびＸ４として化合物１９を用いて上記の一般手順に供した。
粗製Ａ２４を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５６分間かけて２４／７６から７３／２７、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝４０分間かけて２０／８０から３５／６５、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）により精製し、Ａ２４（ｔＲ＝２４．２〜２６．０分、３．１７ｍｇ、１．７４μｍｏｌ、２５工程で８．４％）：白色の固体；Ｃ７３Ｈ１１５Ｎ２１Ｏ１９［Ｍ＋２Ｈ］２＋７９４．９３３４のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値７９４．９３４６を得た。
【０１５９】
（合成実施例２５）
ペプチドＡ２５の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物２５、Ｘ２として化合物１７、Ｘ３として化合物１８、およびＸ４として化合物１４を使用して、上記の一般手順に供した。
粗製Ａ２５を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５０分間かけて２５／７５から５０／５０、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５０分間かけて４５／５５から７０／３０、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）により精製し、Ａ２５（ｔＲ＝３８．２〜３９．８分、３．１８ｍｇ、２．００μｍｏｌ、２５工程で９．１％）：白色の固体；Ｃ７２Ｈ１０８Ｎ１９Ｏ２２［Ｍ＋Ｈ］＋１５９０．７９１１のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値１５９０．７９０３を得た。
【０１６０】
（合成実施例２６）
ペプチドＢ１の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物１５を、Ｘ２として化合物２５、Ｘ３として化合物２１、およびＸ４として化合物１４を使用して、上記の一般手順に供した。
粗製Ｂ１を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５０分間かけて３０／７０から５５／４５、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５０分間かけて４５／５５から７０／３０、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ  ２８０ｎｍ）により精製し、Ｂ１（ｔＲ＝４０．０〜４２．６分、２．２４ｍｇ、１．３５μｍｏｌ、２５工程で６．１％）：白色の固体；Ｃ７２Ｈ１１３Ｎ１９Ｏ１９［Ｍ＋２Ｈ］２＋７７３．９２２５のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値７７３．９２３４を得た。
【０１６１】
（合成実施例２７）
ペプチドＢ２の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物１７、Ｘ２として化合物１２、Ｘ３として化合物１６、およびＸ４として化合物２５を使用して、上記の一般手順に供した。
粗製Ｂ２を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝６０分かけて４０／６０から７０／３０、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５０分間かけて２５／７５から５０／５０、流速：３．０ｍＬ  ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）により精製し、Ｂ２（ｔＲ＝２５．４〜２６．５分、３．３５ｍｇ、２．１３μｍｏｌ、２５工程で９．９％）：白色の固体；Ｃ７３Ｈ１１２Ｎ１９Ｏ２０［Ｍ＋Ｈ］＋１５７４．８３２６のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値１５７４．８３５７を得た。
【０１６２】
（合成実施例２８）
ペプチドＢ３の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物１７、Ｘ２として化合物１２、Ｘ３として化合物２０、およびＸ４として化合物２３を使用して、上記の一般手順に供した。
粗Ｂ３を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝６０分間かけて４０／６０から７０／３０、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５０分かけて２５／７５から５０／５０、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）により精製し、Ｂ５（ｔＲ＝３０．８〜３２．２分、４．３４ｍｇ、２．４２μｍｏｌ、２５工程で１１％）：白色の固体；Ｃ７９Ｈ１１７Ｎ２０Ｏ２１［Ｍ＋Ｈ］＋１６８１．８６９７のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値１６８１．８７２７を得た。
【０１６３】
（合成実施例２９）
ペプチドＢ４の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物２３、Ｘ２として化合物１１、Ｘ３として化合物２６、およびＸ４として化合物１９を使用して、上記の一般手順に供した。
粗製Ｂ４を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝４０分間かけて２５／７５から３５／６５、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５０分間かけて４５／５５から６２．５／５７．５、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）により精製し、Ｂ４（ｔＲ＝１８．４〜１９．８分、０．７４３ｍｇ、０．４０１μｍｏｌ、２５工程で２．０％）：白色の固体；Ｃ７６Ｈ１１４Ｎ２０Ｏ２０［Ｍ＋２Ｈ］２＋８１３．４２５４のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値８１３．４２７６を得た。
【０１６４】
（合成実施例３０）
ペプチドＢ５の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物１７、Ｘ２として化合物１２、Ｘ３として化合物２４、およびＸ４として化合物１７を使用して、上記の一般手順に供した。
粗製Ｂ５を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝３８分かけて２５／７５から４４／５６、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝４０分間かけて５０／５０から７０／３０、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）により精製し、Ｂ５（ｔＲ＝２７．３〜２８．０分、４．１２ｍｇ、２．４５μｍｏｌ、２５工程で１２％）：白色の固体；Ｃ７８Ｈ１１２Ｎ１９Ｏ２３［Ｍ＋Ｈ］＋１６８２．８１７３のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値１６８２．８１７５を得た。
【０１６５】
（合成実施例３１）
ペプチドＣ１の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物１５、Ｘ２として化合物１２、Ｘ３として化合物２４、およびＸ４として化合物１１を使用して、上記の一般手順に供した。
粗製Ｃ１を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５０分かけて２５／７５から５０／５０、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５０分かけて４５／５５から７０／３０、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）により精製し、Ｃ１（ｔＲ＝３８．２〜３９．６分、３．４４ｍｇ、１．９６μｍｏｌ、２５工程で８．８％）：白色の固体；Ｃ７８Ｈ１１６Ｎ１９Ｏ２０［Ｍ＋Ｈ］＋１６３８．８６３９のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値１６３８．８６２７を得た。
【０１６６】
（合成実施例３２）
ペプチドＣ２の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物２５、Ｘ２として化合物２５、Ｘ３として化合物２４、およびＸ４として化合物２３を使用して、上記の一般手順に供した。
粗製Ｃ２を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５０分間かけて３０／７０から５５／４５、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝３５分間かけて６０／４０から８０／２０、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）により精製し、Ｃ２（ｔＲ＝７．６９〜９．１９分、１．４８ｍｇ、０．８４３μｍｏｌ、２５工程で４．０％）：白色の固体；Ｃ７９Ｈ１１０Ｎ１９Ｏ２０［Ｍ＋Ｈ］＋１６４４．８１６９のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値１６４４．８１３９を得た。
【０１６７】
（合成実施例３３）
ペプチドＣ３の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物１１、Ｘ２として化合物２５、Ｘ３として化合物２４、およびＸ４として化合物２５を使用して、上記の一般手順に供した。
粗製Ｃ３を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５０分かけて３０／７０から５５／４５、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝３０分かけて６０／４０から７３．３／２６．７、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）により精製し、Ｃ３（ｔＲ＝７．５１〜８．８２分、０．８７０ｍｇ、０．５１７μｍｏｌ、２５工程で２．５％）：白色の固体；Ｃ７３Ｈ１０７Ｎ１９Ｏ２０［Ｍ＋２Ｈ］２＋７８４．８９６４のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値７８４．８９５７を得た。
【０１６８】
（合成実施例３４）
ペプチドＣ４の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物１７、Ｘ２として化合物２３、Ｘ３として化合物１３、およびＸ４として化合物１４を使用して上記の一般手順に供した。
粗製Ｃ４を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝４５分かけて２５／７５〜４７．５／５２．５、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５０分かけて４５／５５〜７０／３０、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ  ２８０ｎｍ）により精製し、Ｃ４（ｔＲ＝４０．４〜４１．９分、１．６２ｍｇ、０．９５５μｍｏｌ、２５工程で４．１％）：白色の固体；Ｃ７９Ｈ１１５Ｎ２０Ｏ２２［Ｍ＋Ｈ］＋１６９５．８４８９のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値１６９５．８４８４を得た。
【０１６９】
（合成実施例３５）
ペプチドＣ５の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｗａｎｇ樹脂）−ＯＡｌｌｙｌ（Ｓ１、置換率：０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｘ１として化合物１７、Ｘ２として化合物２３、Ｘ３として化合物２４、およびＸ４として化合物２５を使用して、上記の一般手順に供した。
粗製Ｃ５を第１逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５０分かけて２５／７５から５０／５０、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）および第２逆相ＨＰＬＣ（カラム：Inertsil Ｃ８−３  １０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：ＭｅＯＨ＋０．０５％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、グラジエント溶離：Ａ／Ｂ＝５０分かけて４５／５５から７０／３０、流速：３．０ｍＬ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ）により精製し、Ｃ５（ｔＲ＝３２．２〜３４．６分、１．５４ｍｇ、０．９１３μｍｏｌ、２５工程で４．３％）：白色の固体；Ｃ８０Ｈ１１０Ｎ１９Ｏ２２［Ｍ＋Ｈ］＋１６８８．８０６７のHRMS理論値（ＥＳＩ）、実測値１６８８．８０９５を得た。
【０１７０】
［実施例４］
３５種の人工類似体の抗菌スペクトルとＭＫ−４依存的膜破壊活性
全合成した３５種類のライソシンＥ類似体の抗菌活性を評価し、ライソシンＥ（化合物１）の抗菌活性と比較した（図１７）。ＭＩＣアッセイは、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのプロトコルに従って行った。ペプチドの抗菌活性は微量希釈法を用いて測定した。
【０１７１】
ＭＩＣ値は、６株のグラム陽性細菌：ＭＳＳＡ１、ＭＲＳＡ４、Staphylococcus haemolyticus、セレウス菌、枯草菌、およびリステリアモノサイトゲネスに対して決定された。さらに、ＭＳＳＡ１に対するペプチドの効果はＢＣＳ添加ならびに非添加条件にて評価した。各Ａ群、Ｂ群、またはＣ群の化合物は、１０％ＢＣＳの存在下でのＭＳＳＡ１に対する活性の降順で記載した。化合物がＢＣＳ存在下でのＭＳＳＡ１に対して同じＭＩＣ値を示したとき、ＢＣＳ非存在下でのＭＳＳＡ１の値をそれらの順序付けに使用した。活性の強さは、カラーグラデーションヒートマップ形式で表示した。
【０１７２】
最も重要なことには、ＭＳＳＡ１に対するＡ１〜Ａ１１の１１個の新規類似体のＭＩＣ値は、増殖培地に１０％ＢＣＳを添加すると０．０１５μｇ／ｍＬ〜０．０６２５μｇ／ｍＬであることが分かった。従って、化合物１（０．０６２５μｇ／ｍＬ）の活性に比べ、より効力がある、または同じ効力がある。これらのうち、３つの人工ペプチドＡ１、Ａ２、およびＡ３は、天然の化合物１よりも４倍高い抗菌活性を示した。化合物１（０．１２５μｇ／ｍＬ）と同様に、Ａ１〜Ａ３もBCS添加ＭＲＳＡ４（それぞれ０．２５、０．１２５、および０．１２５μｇ／ｍＬ）に対して高い活性を示し、ＭＲＳＡ感染症の治療における潜在的有用性が示唆された。さらに、７つの化合物Ａ１２〜Ａ１８は化合物１よりやや弱いものの、強力な抗菌効果を保持した。
一方、Ａ群の残りの７つのペプチドＡ１９〜Ａ２５は、ＭＩＣ値が４．０μｇ／ｍＬよりも高いため、偽陽性化合物として分類される。単一濃度による抗菌アッセイ（図５）の結果によると、Ｂ群（Ｂ１〜Ｂ５）およびＣ群（Ｃ１〜Ｃ５）の化合物はいずれも低いＭＩＣ値を持っていなかった。その結果、Ａ群の２６個のペプチドの６９％が顕著な活性を示した一方で、Ｂ群およびＣ群の１０個のペプチドは強力な抗菌活性を示さなかった。このように、本発明のスクリーニング方法により複数の活性類似体を発見することができ、本発明の方法の妥当性が確認された。
【０１７３】
次に、ＢＣＳを使用せずに、６つのグラム陽性菌に対するＡ群〜Ｃ群の３６化合物の抗菌活性を評価した。天然の化合物１および１８個の類似体Ａ１〜Ａ１８はＭＲＳＡ４を含む全ての株に対して活性を示したが、Ａ１９〜Ａ２５、Ｂ１〜Ｂ５、およびＣ１〜Ｃ５は細菌に対して弱いまたは無視できる程度の影響しか及ぼさなかった。興味深いことに、ＢＣＳは、ＭＳＳＡ１に対するＡ１〜Ａ１４の活性を１６〜５３３倍増強したが、添加剤はＡ１５〜Ａ１８の活性を２〜４倍しか増大させなかった。
Ａ１〜Ａ１８の菌株選択性は類似していることが分かった：これらはStaphylococcus haemolyticusおよびセレウス菌に対してより顕著な抗菌活性を示し、リステリアモノサイトゲネスに対しては抗菌活性が弱い。Ａ１５とＡ１７は他のペプチドとわずかに異なっていたが、Ｌ．モノサイトゲネス（ＭＩＣ＝６４μｇ／ｍＬ）、セレウス菌と枯草菌（ＭＩＣ＝１６μｇ／ｍＬ）には各々弱い影響しかなかった。これらの結果は、化合物１の構造変化が株選択性を変化させるのに有効であることを実証した。
【０１７４】
合成されたライソシンＥ類似体がライソシンＥと同様の作用機序を有することを確認するために、細菌細胞膜のモデルとしてリポソームを用いることによって３６の合成ペプチドのＭＫ−４（化合物２）依存的膜破壊活性を推定した。卵黄ホスファチジルコリン（ＰＣ）／卵黄ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）（５０：５０の比）を含む大きな単層小胞（ＬＵＶｓ）を調製した。ＰＣ／ＰＧからなるＬＵＶに対してＭＫ−４（２）の１．２５モル％、またはＵＱ−１０（ユビキノン（化合物３））の１．２５モル％で添加して、化合物３に対する化合物２への選択性を評価した。ＰＣ／ＰＧ／２、ＰＣ／ＰＧ／３、およびＰＣ／ＰＧを含む３つのＬＵＶｓの中に、カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）を蛍光指示薬として封入した。３種類のＬＵＶに対するペプチドの膜破壊活性は、様々な濃度の蛍光変化（％）を測定することによって５０％効果濃度（ＥＣ５０）として定量した。
【０１７５】
ＰＣ／ＰＧ／２、ＰＣ／ＰＧ／３、およびＰＣ／ＰＧ  ＬＵＶについての化合物１のＥＣ５０値は、それぞれ１９．５ｎＭ、９２．０ｎＭ、および５５９ｎＭであると決定され（図１６）、化合物１による化合物２依存的な膜破壊が確認された。化合物１の、化合物２に対する選択性指数は、４．７（＝９２．０／１９．５）であった。注目すべきことに、３５の類似体のうち２７（Ａ１〜Ａ２２、Ｂ１、Ｂ２、およびＣ１〜Ｃ３）が、ＰＣ／ＰＧ／２  ＬＵＶについて２．９を超える選択性指数を有していた。
顕著な膜破壊性を示す類似体は、２−錯体形成アッセイにおける強力な活性を反映したと考えられる（図８）。重要なことに、Ａ１〜Ａ１１の１１個の最も強力な抗菌化合物は、ＰＣ／ＰＧ／２  ＬＵＶ（ＥＣ５０＝１０．７〜３８．８ｎＭ）に対して化合物１（１９．５ｎＭ）に匹敵する膜破壊活性を示した。したがって、化合物１とＡ１〜Ａ１１は同じ化合物２依存的な作用機序を有することが示唆される。また、Ａ７（１９．７）、Ａ１４（＞１９．７）、およびＡ１６（２０．６）の選択性指数がＡ１（４．７）のそれよりも高いことは注目に値する。
【０１７６】
以上の結果から、抗菌および２選択的膜破壊活性の構造的要件に関する貴重な情報を集めることができた（図１８ａ）。最も注目すべきことに、化合物１および１１個すべての強力な類似体Ａ１〜Ａ１１は残基−６でロイシン（Ｌ）を、そして残基−１１でイソロイシン（Ｉ）を共有する。Ａ１５以外の活性の低いＡ１２〜Ａ１８でさえ、同じ２つの残基を持っている。したがって、これらの残基は強力な抗菌機能に不可欠である可能性が最も高い。
保存された残基−６および−１１とは対照的に、残基−３および−９は多様な構造を許容する。
化合物１の残基−３および−９、Ａ１〜Ａ１４、およびＡ１６〜Ａ１８は、それぞれ７および５アミノ酸残基に対応する。それらの中で、最も高い抗菌活性を有するＡ１〜Ａ３は、残基−３にアラニン（Ａ）またはリジン（Ｋ）および残基−９にバリン（Ｖ）またはグルタミン（Ｑ）を有する。一方、最も高い化合物２−選択性を有するＡ７、Ａ１４およびＡ１６の全てにおいて、残基−９にオルニチン（Ｏ）を含み、このことはこれら部分構造の特異的効果を意味する。注目すべきことに、化合物１および最も強力なＡ１は、残基−３におけるヒドロキシ基の存在または非存在においてのみ異なる。
【０１７７】
Ａ１５は、残基−３、−９、および−１１において、化合物１と異なる（図１８ｂ）。すなわち、Ａ１５では、化合物１のセリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、およびイソロイシン（Ｉ）が、それぞれアラニン（Ａ）および２つのチロシン（Ｙ）に置換されている。興味深いことに、Ａ１５の残基−６のロイシン（Ｌ）をアラニン（Ａ）に変化させると、非抗菌性Ｃ２が得られ、これもまた、残基−６の側鎖の活性に対する意義を裏付けるものである。全体として、本戦略は、化合物１の機能を増強および調節するための重要な構造因子を抽出するのに有効であることが証明された。
【図１】
2020138908.tif 000043
【図２】
2020138908.tif 000044
【図３ａ】
2020138908.tif 000045
【図３ｂ】
2020138908.tif 000046
【図４】
2020138908.tif 000047
【図５】
2020138908.tif 000048
【図６】
2020138908.tif 000049
【図７】
2020138908.tif 000050
【図８】
2020138908.tif 000051
【図９】
2020138908.tif 000052
【図１０】
2020138908.tif 000053
【図１１】
2020138908.tif 000054
【図１２】
2020138908.tif 000055
【図１３】
2020138908.tif 000056
【図１４】
2020138908.tif 000057
【図１５】
2020138908.tif 000058
【図１６】
2020138908.tif 000059
【図１７】
2020138908.tif 000060
【図１８ａ】
2020138908.tif 000061
【図１８ｂ】
2020138908.tif 000062