(57)【要約】【課題】HTLV-1のホストゲノムへの挿入部位を簡易且つ適切に同定するHTLV-1挿入部位同定方法を提供する。【解決手段】第１プライマーを使用して、宿主ゲノムにHTLV-1プロウイルスが組み込まれている一本鎖核酸を合成する第１工程と、一本鎖核酸の末端にPoly-Aテールを付加する第２工程と、dTアダプタープライマーを使用して、Poly-Aテールから二本鎖核酸を合成する第３工程と、第２プライマーと第１アダプタを使用してPCR法により第１の核酸増幅を行う第４工程と、第３プライマーと第２アダプタを使用してPCR法により第２の核酸増幅を行う第５工程と、を有する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１記載の配列である第１プライマーを使用して、宿主ゲノムにHTLV-1プロウイルスが組み込まれている一本鎖核酸を合成する第１工程と、
合成された一本鎖核酸の末端にPoly-Aテールを付加する第２工程と、
５’側に一本鎖核酸とは反応しない第１アダプタ及び第２アダプタが付加されている配列番号２記載の配列であるdTアダプタープライマーを使用して、Poly-Aテールから二本鎖核酸を合成する第３工程と、
配列番号３記載の配列である第２プライマーと配列番号５記載の配列である第１アダプタを使用してPCR法により第１の核酸増幅を行う第４工程と、
配列番号４記載の配列である第３プライマーと配列番号６記載の配列である第２アダプタを使用してPCR法により第２の核酸増幅を行う第５工程と、
を有することを特徴とするHTLV-1挿入部位同定方法。
【請求項２】
前記dTアダプタープライマーは、dTプライマーに、５’側から順に前記第１アダプタ及び前記第２アダプタが付加されていることを特徴とする請求項１に記載のHTLV-1挿入部位同定方法。
【請求項３】
配列番号２に示される塩基配列であることを特徴とするdTアダプタープライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＴ細胞性白血病ウイルスＩ型(以下、HTLV-1と略することがある。)のホストゲノムへの挿入部位を同定するHTLV-1挿入部位同定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
成人Ｔ細胞白血病/リンパ腫(adult T-cell leukemia/lymphoma,以下「ATL」と略することがある。)は、HTLV-I感染により惹起されるCD4陽性T細胞の悪性腫瘍である。HTLV-Iは生体内において、ウイルスの複製よりも感染細胞のクローナルな増殖によりそのコピー数を増やし、その副産物としてATLを発症すると考えられる。ATLは、日本でも九州や四国地方に多いというように病気の発症に地域的特徴のある病気である。
【０００３】
ATLは、発症後の予後が非常に悪く２年以内に多くが死亡する症例であり、母乳や精液、血液等によって感染し、キャリアは日本全国に約100万人といわれ、100人に１人近い割合となる。キャリアのうち発症するのは５〜10％とされ、年間約700の発症例が報告されている。潜伏期間は30〜70年といわれ、中高年層の発症が多くみられる。
【０００４】
ATLに対する治療法は少なく、その中でも治療成績が優れるものとしてはmLSG15 (VCAP/AMP/VECP)という治療法があり、この治療法は抗がん剤を数種類組み合わせて、期間を開けながら各抗がん剤を順に投与していく治療法である。しかしながらmLSG15 (VCAP/AMP/VECP)でも根治できる患者さんの数は少ない。
【０００５】
HTLV-1のホストゲノムへの挿入部位と病態との関連は示唆されている(非特許文献１)。キャリアでは元々転写が不活化されているゲノム領域に組み込まれている頻度が高いことが確認されており(非特許文献２)、対照的に遺伝子近傍に挿入されているクローンはそのサイズが大きい傾向があり、ATLでは転写開始点近傍に組み込みが多いと報告されている(非特許文献１)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Doi K, Wu X, Taniguchi Y, Yasunaga J, Satou Y, Okayama A, Nosaka K, Matsuoka M. Preferential selection of human T-cell leukemia virus type I provirus integration sites in leukemic versus carrier states. Blood.106:1048-1053, 2005.
【非特許文献２】Gillet NA, Malani N, Melamed A, Gormley N, Carter R, Bentley D, Berry C, Bushman FDTaylor GP, Bangham CR. The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infectedT-cell clones. Blood. 117:3113-3122, 2011.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明においては、ATL発症のリスクを有効且つ適切に判定するために、HTLV-1のホストゲノムへの挿入部位を簡易且つ適切に同定するHTLV-1挿入部位同定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明にかかるHTLV-1挿入部位同定方法は、配列番号１記載の配列である第１プライマーを使用して、宿主ゲノムにHTLV-1プロウイルスが組み込まれている一本鎖核酸を合成する第１工程と、合成された一本鎖核酸の末端にPoly-Aテールを付加する第２工程と、５’側に一本鎖核酸とは反応しない第１アダプタ及び第２アダプタが付加されている配列番号２記載の配列であるdTアダプタープライマーを使用して、Poly-Aテールから二本鎖核酸を合成する第３工程と、配列番号３記載の配列である第２プライマーと配列番号５記載の配列である第１アダプタを使用してPCR法により第１の核酸増幅を行う第４工程と、配列番号４記載の配列である第３プライマーと配列番号６記載の配列である第２アダプタを使用してPCR法により第２の核酸増幅を行う第５工程と、を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、HTLV-1のホストゲノムへの挿入部位を簡易且つ適切に同定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本実施形態にかかるHTLV-1挿入部位同定方法の概要を説明する図である。
【図２】図２Ａは既存のHTLV-1モノクローナリティ解析に用いられるサザンブロット法のHTLV-1検出感度を示す図であり、図２Ｂは本実施形態にかかる同定方法のHTLV-1検出感度を示す図である。
【図３】図３Ａは、無症候性キャリアと成人Ｔ細胞白血病患者とにおけるHTLV-1挿入部位の検出を比較する電気泳動写真図である。図３Ｂは、本発明同定方法と既存のリアルタイムPCRを用いたHTLV-1プロウイルス量の測定結果の相関性を示す図である。図３Ｃは、無症候性キャリアと成人Ｔ細胞白血病患者とにおけるPCR産物のシーケンス解析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００１２】
ATL細胞におけるHTLV-1プロウイルスの挿入部位はモノクローナルなパターンを示すが、ATL細胞のプロウイルス挿入部位は症例ごとに異なる。本発明にかかるHTLV-1挿入部位同定方法は簡易且つ適切に挿入部位を同定できる。以下、本発明にかかる同定方法の工程を説明する。
【００１３】
図１は本実施形態にかかるHTLV-1挿入部位同定方法を説明する図である。図１に示されるように第１工程では、配列番号１記載の配列(CAAGGCCTACCACCCCTCAT)である第１プライマーを使用して、宿主ゲノムにHTLV-1プロウイルスが組み込まれている一本鎖核酸を合成する。第１プライマーは好ましくはビオチン標識されている。
【００１４】
第２工程は、ポリアデニル化の工程であり、合成された一本鎖核酸の末端にPoly-Aテールを付加する。Poly-Aテールは多数のATPから構成されており、一本鎖核酸をアデニン塩基で伸長することに相当する。Poly-Aテールは好ましくは100〜300塩基のアデニン（A）ヌクレオチドである。
【００１５】
第３工程では、５’側に一本鎖核酸とは反応しない第１アダプタ及び第２アダプタが付加されている配列番号２記載の配列(ACAGCAGGTCAGTCAAGCAGTAGCAGCAGTTCGATAACATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTBN)であるdTアダプタープライマーを使用して、Poly-Aテールからの二本鎖核酸を合成する。即ち、dTプライマーは、一本鎖核酸の3’側に存在する約100〜300塩基のPoly-Aテールにアニールする23個のデオキシチミジン残基で構成され、本実施形態のdTアダプタープライマーは、dTプライマーの５’側に第１アダプタ及び第２アダプタが付加されている。ここで第１アダプタは配列番号５に記載された配列(ACAGCAGGTCAGTCAAGCAGTA)からなり、第2アダプタは配列番号６に記載された配列(AGCAGTAGCAGCAGTTCGATAA)からなる。
【００１６】
第４工程では、配列番号３記載の配列(CCTGACCCTGCTTGCTCAAC)である第２プライマーと配列番号５に記載された配列(ACAGCAGGTCAGTCAAGCAGTA)の第１アダプタとを使用してPCR法により第１の核酸増幅を行う。
【００１７】
PCRの特異性を向上させるため、更に、第５工程にて、配列番号４記載の配列(AAAGTTCCACCCCTTTCCCTTT)である第３プライマーと配列番号６に記載された配列(AGCAGTAGCAGCAGTTCGATAA)の第２アダプタとを使用してPCR法により第２の核酸増幅を行う。この第５工程では、dTアダプタープライマーは、第１アダプタが喪失されてdTプライマーの５’側に第２アダプタのみが付加されている状態となっている。上述した本実施形態にかかるHTLV-1挿入部位同定方法によれば、下記実施例にて示されているように、HTLV-1のホストゲノムへの挿入部位を既存のサザンブロット法と比較して簡易且つ適切に同定できる。
【実施例】
【００１８】
1.HTLV-1 プロウィルスゲノムの調整
通院患者からInformed consentを得た後、末梢血あるいは手術で摘出された固形腫瘍部(臨床献体)からゲノムDNAを抽出した。サンプルDNAの抽出は、Ficoll-paque Plus(Amaersham Bioscience)を用いた密度勾配遠心により、PBMC を分離し、分離したPBMCからQIAamp DNABlood Mini Kit(QIAGEN)を用いてゲノムDNAを抽出する手法によった。
【００１９】
2.HTLV-1挿入部位解析
2-1.第１工程
下記表１及び表２に記載される条件にて、宿主ゲノムにHTLV-1プロウイルスが組み込まれている一本鎖核酸を合成した。モナーク PCR & DNA クリーンアップ キット(NEB:T1030)を使用し、ゲノムDNAと余剰配列番号１記載の配列(CAAGGCCTACCACCCCTCAT)である第１プライマーを除去した。7.4μLの一本鎖核酸が抽出された。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
【表２】
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【００２２】
2-2.第２工程
Terminal Transferase(NEB:M0315)を使用し、下記表３に記載される条件にて、合成された一本鎖核酸の末端にPoly-Aテールを付加した。
【００２３】
【表３】
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【００２４】
インキュベーションは37℃にて30分間行った。インキュベーションの間、１サンプルあたり25μlのMagnosphereTM MS300/Streptavidin標識(Takara:5325)をDynaMagTM-2(Invitrogen:123.21D)又は8連PCRチューブ用マグネットスタンド MABI-Mag200(Cosmobio:MABI0812)で1分間静置させた。MagnosphereTM MS300/Streptavidinは表面にストレプトアビジンが固定化された親水性表面の磁性粒子である。上澄みを除去した後、MagnosphereTM MS300/Streptavidin標識を×１緩衝溶液で希釈し、１サンプルあたり100μlとなるように調整した。100μlのMagnosphereTMMS300/Streptavidin標識をサンプルに加え、室温にて10分間ボルテックスで攪拌した。その後、上記同方法を用いて上清を取り除いた。
【００２５】
2-3.第３工程
下記表４の反応混合物で複数回混和した後、PCR反応チューブへ移し、表５に記載される条件にて２本鎖DNA合成の後、100μlの１×緩衝液を添加し、1.5mlチューブへ移し、D DynaMagTM-2(Invitrogen:123.21D)又は8連PCRチューブ用マグネットスタンド MABI-Mag200(Cosmobio:MABI0812)で1分間静置させた。上清除去後、100μlの１×緩衝液を添加し、ボルテックスで攪拌後、再び１分間DynaMagTM-2を作用させ、上清を除去した。
【００２６】
【表４】
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【００２７】
【表５】
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【００２８】
2-4.第４工程
下記表６の反応混合物で複数回混和した後、PCR反応チューブへ移し、表７に記載される条件にて第１PCRを行った。
【００２９】
【表６】
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【００３０】
【表７】
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【００３１】
2-5.第５工程
第１PCRの結果物を蒸留水で1:100の割合で希釈し、下記表８及び表９に記載される条件にて第２PCRを行った。
【００３２】
【表８】
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【００３３】
【表９】
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【００３４】
3.既存法と本発明法とにおけるHTLV-1検出感度の比較
3-1.既存サザンブロット法のHTLV-1検出感度
非感染細胞株であるJurkatとHTLV-1感染細胞株であるTL-Om1からQIAamp DNABlood Mini Kit(QIAGEN)を用いてゲノムDNAを抽出した上で、サザンブロット法によるHTLV-1プロウイルスの挿入解析を行った。図２Ａは、既存のHTLV-1モノクローナリティ解析に用いられるサザンブロット法のHTLV-1検出感度を示す図である。
【００３５】
3-2.本発明におけるHTLV-1検出感度
「2-5.第５工程」における反応産物が目的のものであるかどうかをアガロースゲル電気泳動により確認した。PCRの反応液の一部を泳動の目安となる色素を含み、比重を高めるためのローディングバッファーと混合し、アガロースゲルのウェルにアプライした。電気泳動を行った後、エチジウムブロマイド(EtBr)で染色を行い、UVトランスイルミネーター上で確認した。図２Ｂは、本発明にかかるHTLV-1挿入部位同定方法にて同定したHTLV-1挿入部位につき、第５工程後のPCRの反応液についての電気泳動写真図である。図２Ａ及び図２Ｂの結果から、従来のサザンブロット法のHTLV-1検出感度と比較して、本発明にかかる方法のHTLV-1検出感度がすぐれていることが判明した。
【００３６】
4.無症候性キャリアと成人Ｔ細胞白血病患者とにおけるHTLV-1挿入部位の検出
4-1.本発明同定方法の第５工程後のPCRの反応液の電気泳動写真図
３例の無症候性キャリア(AC)の末梢血検体からFicoll-paque Plus(Amaersham Bioscience)を用いた密度勾配遠心により、PBMCを分離し、分離したPBMCからQIAamp DNABlood Mini Kit(QIAGEN)を用いてゲノムDNAを抽出した。本発明にかかるHTLV-1挿入部位同定方法にて同定したHTLV-1挿入部位をアガロースゲルのウェルにアプライして電気泳動を行った後、EtBrで染色を行い、UVトランスイルミネーター上で確認した(AC16,AC17,AC20)。
【００３７】
４例のATL患者の末梢血あるいは手術で摘出された固形腫瘍部(臨床献体)からFicoll-paque Plus(Amaersham Bioscience)を用いた密度勾配遠心により、PBMCを分離し、分離したPBMCからQIAamp DNABlood Mini Kit(QIAGEN)を用いてゲノムDNAを抽出した。本発明にかかる同定方法を適用し、第５工程後の反応液の一部をアガロースゲルのウェルにアプライして電気泳動を行った後、EtBrで染色を行い、UVトランスイルミネーター上で確認した(ATL115,ATL140,ATL198,ATL153)。
【００３８】
図３Ａは、無症候性キャリアと成人Ｔ細胞白血病患者とにおけるHTLV-1挿入部位の検出を比較する電気泳動写真図である。図３Ａに示されているように、本発明にかかる同定方法を使用することによりACとATL患者とを明確に識別できることが判明した。
【００３９】
4-2.本発明同定方法とqPCRを用いたHTLV-1プロウイルスPCR増幅法との相関性
本発明同定方法とリアルタイムPCRを用いたHTLV-1プロウイルス量の測定結果の相関性を調べた。1μgのDNAあたりのウイルスコピー数を算出して比較を行なった。図３Ｂは、本発明同定方法とリアルタイムPCRを用いたHTLV-1プロウイルス量の測定結果の相関性を示す図である。図３Ｂに示されているように、本発明同定方法と既存方法との高い相関性が確認された。
【００４０】
4-3.本発明同定方法の第５工程後のPCR産物のシーケンス解析
３例の無症候性キャリア(AC)及び４例のATL患者の末梢血あるいは手術で摘出された固形腫瘍部(臨床献体)からFicoll-paque Plus(Amaersham Bioscience)を用いた密度勾配遠心により、PBMCを分離し、分離したPBMCからQIAamp DNABlood Mini Kit(QIAGEN)を用いてゲノムDNAを抽出し、本発明にかかる同定方法を適用し、第５工程後のPCR産物のシーケンス解析をサンガー法にて行った。図３Ｃは、無症候性キャリアと成人Ｔ細胞白血病患者とにおけるPCR産物のシーケンス解析を示す図である。図３Ｃに示されているように、ACの細胞ではHTLV-1プロウイルスの挿入部位はポリクローナルなパターンを示すが、ATL患者の細胞ではHTLV-1プロウイルスの挿入部位はモノクローナルなパターンを示すことが明確に示された。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
ATL発症のリスク算定及びATL診断に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００４２】
配列番号１〜４：プライマー
配列番号５，６：アダプター
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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