(57)【要約】      （修正有）【課題】ワクチン候補として好適な、生きた弱毒化細菌株の製造方法の提供。【解決手段】A.グルタミン酸ラセマーゼおよびおそらくD-アミノ酸トランスアミナーゼを発現することができ、ペプチドグリカン細胞壁を含む細菌株を提供する工程；ならびにB.細菌株が最早機能的グルタミン酸ラセマーゼおよび/または機能的D-アミノ酸トランスアミナーゼを発現することができないように、グルタミン酸ラセマーゼ酵素をコードする遺伝子、および必要に応じて、D-アミノ酸トランスアミナーゼ酵素をコードする遺伝子を不活化する工程であって、前記遺伝子の不活化が前記細菌株をD-グルタミン酸に関して栄養要求性にする、前記工程を含む、前記方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
D-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株を含む医薬組成物、好ましくはワクチンの製造方法であって、該医薬組成物が該組成物の栄養要求性突然変異細菌株の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)にとって好適であり、前記医薬組成物が、
a. D-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株を取得する工程；
b. 前記生きた栄養要求性突然変異細菌株を製薬上許容し得る担体または希釈剤中に導入し、必要に応じてアジュバントを添加する工程；および
c. 必要に応じて、医薬組成物を凍結乾燥する工程、
を含む方法により製造される、前記方法。
【請求項２】
D-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株を含む医薬組成物、好ましくはワクチンの製造方法であって、該医薬組成物が該組成物の栄養要求性突然変異細菌株の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後)にとって好適であり、前記医薬組成物が、
a. グルタミン酸ラセマーゼおよびおそらくD-アミノ酸トランスアミナーゼを発現することができ、ペプチドグリカン細胞壁を含む細菌株を提供する工程；
b. 細菌株が最早機能的グルタミン酸ラセマーゼおよび/または機能的D-アミノ酸トランスアミナーゼを発現することができないように、グルタミン酸ラセマーゼ酵素をコードする遺伝子、および必要に応じて、D-アミノ酸トランスアミナーゼ酵素をコードする遺伝子を不活化する工程であって、前記遺伝子の不活化がかくして前記細菌株をD-グルタミン酸に関して栄養要求性にする、前記工程；ならびに
c. 前記生きた栄養要求性突然変異細菌株を製薬上許容し得る担体または希釈剤中に導入し、必要に応じて、アジュバントを添加する工程；ならびに
d. 必要に応じて、医薬組成物を凍結乾燥する工程、
を含む方法により製造される、前記方法。
【請求項３】
医薬組成物がワクチンであり、製造方法がアジュバントを添加することを含む、請求項１または２に記載の医薬組成物の製造方法。
【請求項４】
工程a)の細菌株がグラム陽性またはグラム陰性細菌である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程a)の細菌株がD-グルタミン酸の合成の唯一の方法としてグルタミン酸ラセマーゼ酵素を有し、前記方法の工程b)がこの酵素、すなわち、グルタミン酸ラセマーゼをコードする遺伝子の不活化を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
工程a)の細菌株が、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、アシネトバクター・バイリ(Acinetobacter baylyi)、アシネトバクター・カルコアセチクス(Acinetobacter calcoaceticus)、アシネトバクター・ヘモリティクス(Acinetobacter haemolyticus)、アシネトバクター・ジュニ(Acinetobacter junii)、アシネトバクター・ルウォフィ(Acinetobacter lwoffii)、アシネトバクター・ノソコミアリス(Acinetobacter nosocomialis)、アシネトバクター・ピッチ(Acinetobacter pittii)、アシネトバクター・ラジオレジステンス(Acinetobacter radioresistens)、アクチノバシラス・リグニエレシ(Actinobacillus lignieresii)、アクチノバシラス・スイス(Actinobacillus suis)、アエロモナス・カビエ(Aeromonas caviae)、アエロモナス・ヒドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、アエロモナス・ベロニ亜種ソブリア(Aeromonas veronii subsp. sobria)、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、アルコバクター・ブツレリ(Arcobacter butzleri)、アルコバクター・ニトロフィギリス(Arcobacter nitrofigilis)、バシラス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バシラス・アントラシス(Bacillus anthracis)、バシラス・バタビエンシス(Bacillus bataviensis)、バシラス・セルロシリティクス(Bacillus cellulosilyticus)、バシラス・セレウス(Bacillus cereus)、バシラス・クラウシ(Bacillus clausii)、バシラス・リシェニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バシラス・プミルス(Bacillus pumilus)、バシラス・スブチリス(Bacillus subtilis)、バシラス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)、バクテロイデス・フラギリス(Bacteroides fragilis)、ボルデテラ・アビウム(Bordetella avium)、ボルデテラ・ブロンキセプティカ(Bordetella bronchiseptica)、ボルデテラ・ペルツシス(Bordetella pertusis)、ボルデテラ・ペトリ(Bordetella petrii)、ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)、ブルセラ・メリテンシス(Brucella melitensis)、ブルセラ・スイス(Brucella suis)、ブルクホルデリア・セノセパシア(Burkholderia cenocepacia)、ブルクホルデリア・マレイ(Burkholderia mallei)、ブルクホルデリア・マルチボランス(Burkholderia multivorans)、ブルクホルデリア・シュードマレイ(Burkholderia pseudomallei)、ブルクホルデリア・サイランデンシス(Burkholderia thailandensis)、カンピロバクター・コンシサス(Campylobacter concisus)、カンピロバクター・フェタス亜種フェタス(Campylobacter fetus subsp. fetus)、カンピロバクター・フェタス亜種ベネレアリス(Campylobacter fetus subsp. venerealis)、カンピロバクター・グラシリス(Campylobacter gracilis)、カンピロバクター・ホミニス(Campylobacter hominis)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・レクタス(Campylobacter rectus)、カンピロバクター・ショワエ(Campylobacter showae)、カンピロバクター・ウプサリエンシス(Campylobacter upsaliensis)、シトロバクター・フレウンジ(Citrobacter freundii)、シトロバクター・コセリ(Citrobacter koseri)、クロストリジウム・アスパラギフォルム(Clostridium asparagiforme)、クロストリジウム・ボツリナム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ブチリカム(Clostridium butyricum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・ペルフリンゲンス(Clostridium perfringens)、クロストリジウム・サッカロブチリカム(Clostridium saccharobutylicum)、クロストリジウム・テタニ(Clostridium tetani)、コリネバクテリウム・ジフ���リア(Corynebacterium diphtheriae)、コリネバクテリウム・シュードツベルクロシス(Corynebacterium pseudotuberculosis)、エンテロバクター・エアロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エリジペロスリックス・ルジオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)、大腸菌(Escherichia coli)、フソバクテリウム・ネクロフォラム(Fusobacterium necrophorum)、フソバクテリウム・ネクレアタム(Fusobacterium nucleatum)、グラヌリカテラ・アジアセンス(Granulicatella adiacens)、グラヌリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ヘモフィルス・エクイゲニタリス(Haemophilus equigenitalis)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・パラインフルエンザ(Haemophilus parainfluenzae)、ヘモフィルス・パラガリナルム(Haemophilus paragallinarum)、ヘモフィルス・パラスイス(Haemophilus parasuis)、ヘモフィルス・プルロニューモニエ(Haemophilus pleuropneumoniae)、ヘモフィルス・ソムナス(Haemophilus somnus)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、レジオネラ・オークリジエンシス(Legionella oakridgensis)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、レプトスピラ・ビフレクサ(Leptospira biflexa)、レプトスピラ・イリニ(Leptospira illini)、レプトスピラ・インテロガンス(Leptospira interrogans)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、リシニバシラス・フシフォルミス(Lysinibacillus fusiformis)、リシニバシラス・スフェリクス(Lysinibacillus sphaericus)、モラクセラ・ボビス(Moraxella bovis)、モルガネラ・モルガニ(Morganella morganii)、マイコバクテリウム・アブセサス(Mycobacterium abscessus)、マイコバクテリウム・アフリカナム(Mycobacterium africanum)、マイコバクテリウム・アビウム(Mycobacterium avium)、マイコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis)、マイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノロア(Neisseria gonorrhoeae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、プレシオモナス・シゲロイデス(Plesiomonas shigelloides)、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)、プロテウス・ハンセリ(Proteus hanseri)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ(Salmonella enterica subsp. enterica)、サルモネラ・エンテリティディス(Salmonella enteritidis)、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、セラチア・プリムチカ(Serratia plymuthica)、シゲラ・ボイジ(Shigella boydii)、シゲラ・ディセンテリア(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレクスネリ(Shigella flexneri)、スタフィロコッカス・アルレッタ(Staphylococcus arlettae)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・カピティス(Staphylococcus capitis)、スタフィロコッカス・カプラ(Staphylococcus caprae)、スタフィロコッカス・カルノサス(Staphylococcus carnosus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・エクオラム(Staphylococcus equorum)、スタフィロコッカス・ヘモリティクス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス(Staphylococcus lugdunensis)、スタフィロコッカス・パステウリ(Staphylococcus pasteuri)、スタフィロコッカス・ペッテンコフェリ(Staphylococcus pettenkoferi)、スタフィロコッカス・シュードインテルメディウス(Staphylococcus pseudointermedius)、スタフィロコッカス・サプロフィティクス(Staphylococcus saprophyticus)、スタフィロコッカス・シミア(Staphylococcus simiae)、スタフィロコッカス・シムランス(Staphylococcus simulans)、スタフィロコッカス・ワルネリ(Staphylococcus warneri)、ステノトロフォモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ディスガラクチア(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ディスガラクチア亜種エクイシミリス(Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis)、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・ウベリス(Streptococcus uberis)、ストレプトコッカス・ズーエピデルミクス(Streptococcus zooepidermicus)、タイロレラ・アシニゲニタリス(Taylorella asinigenitalis)、タイロレラ・エクイゲニタリス(Taylorella equigenitalis)、トレポネマ・カラテウム(Treponema carateum)、トレポネマ・クニクリ(Treponema cuniculi)、トレポネマ・ヒオジセンテリア(Treponema hyodisenteriae)、トレポネマ・パリダム(Treponema pallidum)、トレポネマ・スイス(Treponema suis)、ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・ジスパル(Veillonella dispar)、ベイロネラ・パルブラ(Veillonella parvula)、ベイロネラ・ラッティ(Veillonella ratti)、ビブリオ・コレラ(Vibrio cholerae)、ビブリオ・パラヘモリティクス(Vibrio parahaemolyticus)、ビブリオ・ブルニフィカンス(Vibrio vulnificans)、エルシニア・エンテロコリティカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)およびエルシニア・シュードツベルクロシス(Yersinia pseudotuberculosis)からなる細菌種の一覧から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程a)の前記細菌株が以下の細菌種：アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)およびスタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)からなる一覧から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程a)の前記細菌株がアシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii) Delta0380/Delta3398と命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8588と共に2014年4月14日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたA.バウマンニの細菌株である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程a)の前記細菌株がシュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa) DeltaPA4662と命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8589と共に2014年4月14日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたP.エルギノーサの細菌株である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
工程a)の前記細菌株が132deltamurI/deltadatと命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8587と共に2014年6月11日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたS.オーレウスの細菌株である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
D-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株と、製薬上許容し得る担体または希釈剤および必要に応じて、アジュバントとを含む医薬組成物、好ましくはワクチンであって、該組成物の栄養要求性突然変異細菌株の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)にとって好適なものである、前記医薬組成物。
【請求項１２】
前記医薬組成物がワクチンであり、必要に応じて、前記ワクチンがアジュバントを含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記製薬上許容し得る担体または希釈剤が、水、培養液、生理学的塩濃度の溶液および/またはSPGAなどの安定剤、炭水化物(例えば、ソルビトール、マンニトール、スターチ、スクロース、グルコース、デキストラン)、アルブミンまたはカゼインなどのタンパク質、ウシ血清またはスキムミルクなどのタンパク質含有剤ならびにバッファー(例えば、リン酸バッファー)からなる一覧から選択される、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
アジュバントが、Freundの完全および不完全アジュバント、ビタミンE、非イオン性ブロックポリマー、ムラミルジペプチド、ISCOM(免疫刺激複合体)、サポニン、ミネラルオイル、植物油、カルボポール、大腸菌熱不安定毒素(LT)またはコレラ毒素(CT)、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは酸化アルミニウム、油乳濁液(例えば、Bayol F(登録商標)またはMarcol 52(登録商標)、サポニンおよびビタミンEソルビリゼートの)からなる一覧から選択される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記医薬組成物が、103〜1010個の細菌のD-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株の用量を含む、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記医薬組成物が凍結乾燥形態にある、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
細菌株が、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、アシネトバクター・バイリ(Acinetobacter baylyi)、アシネトバクター・カルコアセチクス(Acinetobacter calcoaceticus)、アシネトバクター・ヘモリティクス(Acinetobacter haemolyticus)、アシネトバクター・ジュニ(Acinetobacter junii)、アシネトバクター・ルウォフィ(Acinetobacter lwoffii)、アシネトバクター・ノソコミアリス(Acinetobacter nosocomialis)、アシネトバクター・ピッチ(Acinetobacter pittii)、アシネトバクター・ラジオレジステンス(Acinetobacter radioresistens)、アクチノバシラス・リグニエレシ(Actinobacillus lignieresii)、アクチノバシラス・スイス(Actinobacillus suis)、アエロモナス・カビエ(Aeromonas caviae)、アエロモナス・ヒドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、アエロモナス・ベロニ亜種ソブリア(Aeromonas veronii subsp. sobria)、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、アルコバクター・ブツレリ(Arcobacter butzleri)、アルコバクター・ニトロフィギリス(Arcobacter nitrofigilis)、バシラス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バシラス・アントラシス(Bacillus anthracis)、バシラス・バタビエンシス(Bacillus bataviensis)、バシラス・セルロシリティクス(Bacillus cellulosilyticus)、バシラス・セレウス(Bacillus cereus)、バシラス・クラウシ(Bacillus clausii)、バシラス・リシェニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バシラス・プミルス(Bacillus pumilus)、バシラス・スブチリス(Bacillus subtilis)、バシラス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)、バクテロイデス・フラギリス(Bacteroides fragilis)、ボルデテラ・アビウム(Bordetella avium)、ボルデテラ・ブロンキセプティカ(Bordetella bronchiseptica)、ボルデテラ・ペルツシス(Bordetella pertusis)、ボルデテラ・ペトリ(Bordetella petrii)、ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)、ブルセラ・メリテンシス(Brucella melitensis)、ブルセラ・スイス(Brucella suis)、ブルクホルデリア・セノセパシア(Burkholderia cenocepacia)、ブルクホルデリア・マレイ(Burkholderia mallei)、ブルクホルデリア・マルチボランス(Burkholderia multivorans)、ブルクホルデリア・シュードマレイ(Burkholderia pseudomallei)、ブルクホルデリア・サイランデンシス(Burkholderia thailandensis)、カンピロバクター・コンシサス(Campylobacter concisus)、カンピロバクター・フェタス亜種フェタス(Campylobacter fetus subsp. fetus)、カンピロバクター・フェタス亜種ベネレアリス(Campylobacter fetus subsp. venerealis)、カンピロバクター・グラシリス(Campylobacter gracilis)、カンピロバクター・ホミニス(Campylobacter hominis)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・レクタス(Campylobacter rectus)、カンピロバクター・ショワエ(Campylobacter showae)、カンピロバクター・ウプサリエンシス(Campylobacter upsaliensis)、シトロバクター・フレウンジ(Citrobacter freundii)、シトロバクター・コセリ(Citrobacter koseri)、クロストリジウム・アスパラギフォルム(Clostridium asparagiforme)、クロストリジウム・ボツリナム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ブチリカム(Clostridium butyricum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・ペルフリンゲンス(Clostridium perfringens)、クロストリジウム・サッカロブチリカム(Clostridium saccharobutylicum)、クロストリジウム・テタニ(Clostridium tetani)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diphtheriae)、コリネバクテリウム・シュードツベルクロシス(Corynebacterium pseudotuberculosis)、エンテロバクター・エアロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エリジペロスリックス・ルジオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)、大腸菌(Escherichia coli)、フソバクテリウム・ネクロフォラム(Fusobacterium necrophorum)、フソバクテリウム・ネクレアタム(Fusobacterium nucleatum)、グラヌリカテラ・アジアセンス(Granulicatella adiacens)、グラヌリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ヘモフィルス・エクイゲニタリス(Haemophilus equigenitalis)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・パラインフルエンザ(Haemophilus parainfluenzae)、ヘモフィルス・パラガリナルム(Haemophilus paragallinarum)、ヘモフィルス・パラスイス(Haemophilus parasuis)、ヘモフィルス・プルロニューモニエ(Haemophilus pleuropneumoniae)、ヘモフィルス・ソムナス(Haemophilus somnus)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、レジオネラ・オークリジエンシス(Legionella oakridgensis)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、レプトスピラ・ビフレクサ(Leptospira biflexa)、レプトスピラ・イリニ(Leptospira illini)、レプトスピラ・インテロガンス(Leptospira interrogans)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、リシニバシラス・フシフォルミス(Lysinibacillus fusiformis)、リシニバシラス・スフェリクス(Lysinibacillus sphaericus)、モラクセラ・ボビス(Moraxella bovis)、モルガネラ・モルガニ(Morganella morganii)、マイコバクテリウム・アブセサス(Mycobacterium abscessus)、マイコバクテリウム・アフリカナム(Mycobacterium africanum)、マイコバクテリウム・アビウム(Mycobacterium avium)、マイコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis)、マイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノロア(Neisseria gonorrhoeae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、プレシオモナス・シゲロイデス(Plesiomonas shigelloides)、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)、プロテウス・ハンセリ(Proteus hanseri)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ(Salmonella enterica subsp. enterica)、サルモネラ・エンテリティディス(Salmonella enteritidis)、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、セラチア・プリムチカ(Serratia plymuthica)、シゲラ・ボイジ(Shigella boydii)、シゲラ・ディセンテリア(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレクスネリ(Shigella flexneri)、スタフィロコッカス・アルレッタ(Staphylococcus arlettae)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・カピティス(Staphylococcus capitis)、スタフィロコッカス・カプラ(Staphylococcus caprae)、スタフィロコッカス・カルノサス(Staphylococcus carnosus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・エクオラム(Staphylococcus equorum)、スタフィロコッカス・ヘモリティクス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス(Staphylococcus lugdunensis)、スタフィロコッカス・パステウリ(Staphylococcus pasteuri)、スタフィロコッカス・ペッテンコフェリ(Staphylococcus pettenkoferi)、スタフィロコッカス・シュードインテルメディウス(Staphylococcus pseudointermedius)、スタフィロコッカス・サプロフィティクス(Staphylococcus saprophyticus)、スタフィロコッカス・シミア(Staphylococcus simiae)、スタフィロコッカス・シムランス(Staphylococcus simulans)、スタフィロコッカス・ワルネリ(Staphylococcus warneri)、ステノトロフォモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ディスガラクチア(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ディスガラクチア亜種エクイシミリス(Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis)、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・ウベリス(Streptococcus uberis)、ストレプトコッカス・ズーエピデルミクス(Streptococcus zooepidermicus)、タイロレラ・アシニゲニタリス(Taylorella asinigenitalis)、タイロレラ・エクイゲニタリス(Taylorella equigenitalis)、トレポネマ・カラテウム(Treponema carateum)、トレポネマ・クニクリ(Treponema cuniculi)、トレポネマ・ヒオジセンテリア(Treponema hyodisenteriae)、トレポネマ・パリダム(Treponema pallidum)、トレポネマ・スイス(Treponema suis)、ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・ジスパル(Veillonella dispar)、ベイロネラ・パルブラ(Veillonella parvula)、ベイロネラ・ラッティ(Veillonella ratti)、ビブリオ・コレラ(Vibrio cholerae)、ビブリオ・パラヘモリティクス(Vibrio parahaemolyticus)、ビブリオ・ブルニフィカンス(Vibrio vulnificans)、エルシニア・エンテロコリティカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)およびエルシニア・シュードツベルクロシス(Yersinia pseudotuberculosis)からなる細菌種の一覧から選択される、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
細菌株が以下の種：アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)およびスタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)からなる一覧から選択される、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
細菌株がアシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii) Delta0380/Delta3398と命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8588と共に2014年4月14日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたA.バウマンニの細菌株である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
細菌株がシュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa) DeltaPA4662と命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8589と共に2014年4月14日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたP.エルギノーサの細菌株である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
細菌株が132deltamurI/deltadatと命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8587と共に2014年6月11日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたS.オーレウスの細菌株である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa) DeltaPA4662と命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8589と共に2014年4月14日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたP.エルギノーサの細菌株である、D-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株。
【請求項２３】
132deltamurI/deltadatと命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8587と共に2014年6月11日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたS.オーレウスの細菌株である、D-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株。
【請求項２４】
医薬、特に、ワクチンとしての使用のための、請求項２２または２３に記載の細菌株。
【請求項２５】
前記組成物の栄養要求性突然変異細菌株の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)の方法における使用のための、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物または請求項２２もしくは２３に記載のD-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株。
【請求項２６】
D-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株を認識することができる抗体またはFab、F(ab')2、Fv、scFv、ジ-scFvおよびsdABからなる群から選択されるその断片であって、組成物の栄養要求性突然変異細菌株の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)にとって好適である、前記抗体またはその断片。
【請求項２７】
D-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株を用いる哺乳動物の免疫化後に得られるかまたは得ることができる抗体またはFab、F(ab')2、Fv、scFv、ジ-scFvおよびsdABからなる群から選択されるその断片であって、組成物の栄養要求性突然変異細菌株の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)にとって好適である、前記抗体またはその断片。
【請求項２８】
請求項２６または２７に記載の抗体またはその断片と、製薬上許容し得る担体または希釈剤、および必要に応じて、アジュバントとを含む、医薬組成物、好ましくは、ワクチンであって、組成物の栄養要求性突然変異細菌株の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)にとって好適である、前記医薬組成物。
【請求項２９】
前記医薬組成物がワクチンであり、必要に応じて、前記ワクチンがアジュバントを含む、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
療法における使用のための、特に、受動免疫化における使用のための、請求項２６または２７に記載の抗体またはその断片。
【請求項３１】
組成物の栄養要求性突然変異細菌株の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)の方法における使用のための、請求項２８に記載の医薬組成物または請求項２６もしくは２７に記載の抗体もしくはその断片。
【請求項３２】
組成物の栄養要求性突然変異細菌株の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)の方法における使用のための、請求項１１〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物または請求項２２もしくは２３に記載のD-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株または請求項２６もしくは２７に記載の抗体もしくはその断片であって、鼻内、皮内、皮下、経口、エアロゾル、筋肉内、ウィングウェブ(wing web)および点眼投与により投与される前記組成物、細菌株または抗体もしくはその断片。
【請求項３３】
請求項２６または２７に記載の抗体またはその断片を含むキットまたはデバイス。
【請求項３４】
イムノアッセイを介して細菌起源の感染を検出するためのキットまたはデバイスであって、
(i)好ましくは、固相支持体に結合される、請求項２６または２７に記載の「捕捉抗体」と呼ばれる第1の抗体；
(ii)蛍光、発光または酵素であってもよいマーカーを含む、第1の抗体により認識される領域以外の領域を認識する「検出抗体」と呼ばれる第2の標識された抗体；
(iii)結合対の第1のメンバーにカップリングされる、第2の抗体に対する親和性を示す試薬；および
(iv)結合対がハプテンと抗体；抗原と抗体；ビオチンとアビジン；ビオチンとストレプトアビジン；ビオチン類似体とアビジン；ビオチン類似体とストレプトアビジン；糖とレクチン；酵素とコファクター；核酸または核酸類似体と相補的核酸または核酸類似体からなる群から選択される、蛍光、発光または酵素にカップリングされた結合対の第2のメンバー、
を含む、前記キットまたはデバイス。
【請求項３５】
哺乳動物に由来する生物試料、特に、細菌疾患に罹患すると疑われる哺乳動物の血漿中の細菌種または細菌株の定性的および/または定量的決定のための、請求項３３または３４に記載のキットまたはデバイスの使用。
【請求項３６】
0.00001〜120mMのD-グルタミン酸濃度の使用を含む、D-グルタミン酸に関する栄養要求性細菌株のin vitroでの培養方法。
【請求項３７】
D-グルタミン酸の濃度範囲が、0.01〜50mMである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
D-グルタミン酸の濃度範囲が、10〜20mMである、請求項３７に記載の方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
弱毒化生細菌ワクチンが提供される。また、そのようなワクチンを取得することができる方法も提供される。
【背景技術】
【０００２】
ヒトなどの温血動物が微生物病原性を克服する手段は複雑なプロセスである。微生物病原性に対する免疫は、温血動物が病原性を回避するか、またはあまり強くない病原性状態に罹患する1つの手段である。所与の病原体に対する不完全な免疫は、病原体に曝露された集団における死亡率および罹患率をもたらす。生きているが弱毒化された微生物に基づくワクチン(弱毒化生ワクチン)が高度に有効な種類の免疫応答を誘導することは一般に同意されている。そのようなワクチンは、一度、動物宿主がワクチン接種されたら、宿主への微生物病原体の進入はより早期の細胞性または体液性免疫の呼び出しの促進を誘導し、感染が臨床的に意義のある割合を推定することができる前に生物のさらなる増殖を制御することができる。殺傷された病原体に基づくワクチン(殺傷ワクチン)はこの型の応答を達成することができないことは一般に事実と認められている。しかしながら、生きた病原体を含有するワクチンは、弱毒化のレベルに応じて、ワクチン接種の際にワクチン接種された宿主が、防御が求められる疾患に罹患し得る危険を呈する。従って、生きた微生物の免疫化属性を有するが、ワクチン接種の際に望ましくない副作用を引き起こすことができないワクチンを有することが望ましい。
【０００３】
しかしながら、ワクチン候補としての弱毒化細菌株の効果的使用を、単に弱毒化のそのようなレベルによって予測することはできないことに留意することが重要である。これに関して、細菌を弱毒化するための一般的アプローチは、1つ以上の毒性因子の除去(遺伝子改変生物-GMO)であるが、多くの場合、毒性因子は防御エピトープとして免疫を誘導する際に役割を果たしてもいる。これらの場合、毒性因子の欠失は細菌の免疫原性能力を不可避的に損傷する。これは勿論、望ましくない状況である。従って、生ワクチンは、好ましくは野生型株の抗原性補体を保持するべきである。
【０００４】
さらに、一度、弱毒化レベルが確立されたら、特定の型のワクチン候補に対する免疫応答およびそのような微生物を含むワクチン組成物の成功は、以下に詳述される多くの因子によって依然として影響され得る。
【０００５】
a. 弱毒化生ワクチン株は、好ましくはその元の状態(通常、毒性野生型株)に戻る可能性が実質的にないべきであり、操作された遺伝子は細菌にいずれも疾患を引き起こさせ得る他の遺伝子により補完されるべきではない(安定な突然変異が好ましい)。
【０００６】
b. 生ワクチン中の内毒素の存在は、これらの分子が重篤な全身反応を引き起こし得ると考えられない場合、欠点となり得る。また、全細胞ワクチンの投与は局所反応性(重篤な疼痛、局所的な腫れおよび浮腫、脂肪織炎または潰瘍など)の古典的な危険因子である。
【０００７】
c. いくらかの複製が体内で起こって、免疫系を刺激するのに十分な微生物およびその抗原を作出すると予想されるため、弱毒化GMOの生存能力および適応性は劇的に影響されるべきではない。事実、遺伝子中の突然変異は複製を阻害するか、またはバイアル中の生きた微生物を損傷し、ワクチンを無効化し得る。従って、それぞれの型の遺伝子改変を、細胞に対する予想外の効果について注意深く評価する必要がある。
【０００８】
d. さらに、遺伝子操作のための遺伝子標的を選択する時に、タンパク質が2つ以上の機能を実行することができる現象である遺伝子共有またはタンパク質副業化を考慮するべきである。副業化する多くのタンパク質は酵素である。一例は、細胞壁生合成における重要な酵素であるが、ジャイレース阻害においても役割を果たすグルタミン酸ラセマーゼ(MurI)である。その多機能性のため、これらの遺伝子中の突然変異が得られない限りMurI標的戦略の有用性を予測し、細菌細胞の生理に対する影響について評価することはできない。
【０００９】
e. さらに、ワクチンにより惹起される免疫応答の型は、感染に対する十分な防御を提供するのに適切なものでないことがある(ワクチン効果不全)。有効なワクチンのための特定の要件は、病原体の性質に応じて変化するであろう。細胞外病原体の場合、主な抗体は生物の防衛のための適応機構を提供するが、細胞内生物の制御においてはT細胞の存在が必須である。結果として、弱毒化生ワクチンは、単純な複製により、ならびにin vivoでの感染中に生じる細菌抗原の改変により、殺傷された細菌またはサブユニット組成物よりも良好な免疫原として働く。それにより、生きた弱毒化株は特に、細胞内段階でより広く十分な免疫応答を生じさせることができた。この意味において、操作された細菌が自然の感染経路を活用する能力は潜在的に損傷され、幅広い防御免疫応答を誘発することができないため、弱毒化の遺伝子標的戦略を、ワクチン候補において注意深く試験するべきである。
【００１０】
f. さらに、弱毒化レベルまたは惹起される免疫応答の型とは無関係に、特定のGMOに関する許容可能なレベルの防御を達成するための投与用量の数(有効かつ持続する)はワクチンスケジュールにとって持続不可能なものであり得る。
【００１１】
g. さらに、ワクチンの投与経路は、上昇する、およびその成功にとって重要である免疫応答の型を決定することができる。投与経路に応じて、ワクチンは異なる方法で生物に進入し得る：皮膚(この場合、抗原は所属リンパ節のTゾーン中で抗原提示細胞として作用するランゲルハンス細胞により取り込まれる)；粘膜(ここで、抗原の捕捉は主としてM細胞によって行われ、免疫応答はパイアー斑中で生じる)または血液(抗原は脾臓マクロファージによってプロセッシングされる脾臓を標的とする)。結果として、一度、GMOについて弱毒化レベルが確立されたら、ワクチン投与の部位はワクチン接種の失敗または成功を決定することができる。これに関して、生きた弱毒化S.オーレウス(S.aureus)株の腹腔内ではなく乳腺内投与は野生型株によるチャレンジ後に乳腺中の細菌量を有意に減少させることが示された。提唱されるワクチン候補であるS.オーレウス8325-4 A523は、ニトロソグアニジンを用いた突然変異誘発後に単離される温度感受性突然変異体であり、低温(32℃未満)ではよく複製するが、哺乳動物の体温に移された場合には分裂回数の制限を受ける。著者らは、ワクチン防御効能の尺度としてワクチン接種動物とワクチン非接種動物との乳腺中の細菌量を比較するために、S.オーレウス8325-4野生型株を用いるチャレンジ実験を実施した。これらの著者らは、以下のように結論付けた：「乳腺内経路により免疫されたマウスの乳腺から回収されるS.オーレウスCFU数は、対照マウスにおいて見いだされるもの(1.5x105CFU)よりも有意に低い(7x102CFU)。逆に、腹腔内プロトコールのいずれかにより免疫されたマウスの乳腺から回収されるCFU数は、対照マウスの腺から回収されるものと同じ高さであった(P>0.5)」。従って、良好である可能性がある候補に関しても、投与経路はワクチンとしての生きた弱毒化突然変異体の効能を決定することができる。
【００１２】
h. 最後に、ワクチンは、同じ細菌種の複数の株に対する交差反応抗体を誘導することはできない。生きた弱毒化株は動物モデルにおいて防御的である抗体を惹起することはできないが、この防御は一般に、ワクチン株を作出するのに用いられる親株がチャレンジ試験においても用いられる場合にのみ見られる。他の株に対する幅広い防御は通常、信頼性が高く生成または試験されない。さらに、産生される抗体は、十分に惹起され、交差反応性であるが、野生型病原体によるチャレンジのモデルにおいて長く続かないし、防御的でもない。
【００１３】
まとめると、生ワクチンは、許容できない病理学的効果を回避するためには十分に弱毒化される(または無毒化される)べきであるが、他方で、それは細菌株とは無関係に疾患に対する宿主における持続的防御を付与することができる十分な免疫応答を惹起しなければならない。
【００１４】
生ワクチンが許容できない病理学的効果を回避するために十分に弱毒化(または無毒化)され、細菌株とは無関係に疾患に対する宿主における持続的防御を付与することができる十分な免疫応答(防御免疫)を惹起することの証明は、容易な仕事ではない。この意味において、WO99/25376は、哺乳動物において抗原に対するT細胞免疫応答を惹起する方法であって、前記哺乳動物に、抗原を発現するリステリア(Listeria)の栄養要求性弱毒化株を投与することを含む前記方法を記載する。前記栄養要求性弱毒化株はタンパク質産物がリステリアの増殖にとって必須である少なくとも1つの遺伝子中に突然変異を有するとそこに記載されている。特に、本発明は、好ましくはHIV-1抗原である異種抗原をコードするDNAをさらに含むD-アラニンの合成のための栄養要求性弱毒化株を記載する。
【００１５】
WO99/25376において、リステリアの栄養要求株がBALB/cマウスにおけるL.モノシトゲネス(L.monocytogenes)によるチャレンジに対する防御を提供することを示し、この株を、この生物により引き起こされる感染に対する防御のためのワクチン組成物における使用にとって好適なものにするとされるとする結果が提示される。しかしながら、そこに提供される実験例は、L.モノシトゲネスの弱毒化栄養要求性D-アラニン突然変異体がCTL(宿主細胞傷害性T細胞)応答を惹起することを確立するに過ぎない。抗体媒介性免疫応答(体液性免疫)はそこでは考慮されておらず、この意味で結果も提供されていない。さらに、この突然変異体の防御効果は、そこでは野生型リステリアを用いるチャレンジの後に感染したマウスの脾臓中の細菌数を測定することにより決定される。この意味において、急性および致死性細菌感染(特に、敗血症を引き起こすもの)に対するワクチンの有効性は、生存アッセイが行われる場合にのみ評価することができる。さらに、D-アラニンなしに注射された突然変異リステリアは、ほとんど防御を提供しないとそこには記載されている。対照的に、野生型株と同じ防御を達成するために突然変異生物の初回接種材料中にD-アラニンを添加した場合(初回免疫化の時点で)、これは、突然変異体の致死用量を約10倍減少させる効果を有し、弱毒化の喪失を考慮する場合、この突然変異体の安全性に関する重大な限界であった。従って、WO99/25376に記載されたD-アラニン突然変異体に関するそこに提供された結果は、細胞外細菌病原体および急性全身感染に対するワクチン候補としてのこれらの突然変異株の有用性を証明することはできない。さらに、これらの突然変異体に関する交差防御データの欠如は、他のL.モノシトゲネス株に対する幅広い防御免疫応答を生成するD-アラニン栄養要求株を含むワクチンの有効性を保証せず、他の細菌種におけるワクチン候補を生成するためのその有用性ははるかに低い。
【００１６】
さらに、WO99/25376の詳細な説明において、発明者らは、以下の提言を行っている：「追加の生成のためのさらなる潜在的な有用な標的は細胞壁成分であるD-グルタミン酸の合成に関与する遺伝子を含む。D-グルタミン酸栄養要求性突然変異体を生成するためには、D-glu+pyrのアルファ-ケトグルタレート+D-alaへの変換および逆反応に関与するdat遺伝子を不活化することが必要である。また、グルタミン酸ラセマーゼ遺伝子dgaを不活化することも必要である」。しかしながら、当業者であれば、そこに提示される情報を考慮すると、リステリアのD-グルタミン酸栄養要求株が、許容できない病理学的効果を回避し、疾患に対する宿主における持続的防御(防御免疫)を付与することができる十分な免疫応答を惹起するために十分なレベルの弱毒化をおそらく付与することができるという成功の合理的期待はないことを知っているであろう。上記で考察された通り、それぞれの遺伝子標的戦略は、事例ごとに評価されるべきである。さらに、グルタミン酸ラセマーゼ酵素は、そのコード遺伝子が操作された場合に細胞の生存能力に影響し得る副業化機能を有する。この意味において、持続的な証拠はなく、そのような株が免疫原性であり得ることも明らかではないため、細菌感染に対する防御を付与するD-グルタミン酸栄養要求性ワクチン株を生成するための標的としてのグルタミン酸ラセマーゼの使用は、以前の発明から外挿することはできない。
【００１７】
後者の記述、すなわち、そのようなD-グルタミン酸栄養要求性ワクチン株が免疫原性であり得ることが明らかではないということは、ワクチン開発の現在の状態において細菌により引き起こされる疾患に対する防御を付与するための生ワクチンとして有用であるD-グルタミン酸栄養要求性微生物の能力を証明する研究も発明も存在しないという事実によってさらに裏付けられる。この意味において、および2013年4月27日から30日までベルリンで行われた23rd ESCMID congress (European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases)のM. P. Cabralら、「Blockade of glutamate racemisation during cell-wall formation prevents biofilm and proliferation of Acinetobacter baumannii in vivo」、Abstract(D-グルタミン酸栄養要求性と毒性のin vivoでの喪失との関係を示す唯一の参考文献)において証明されたD-グルタミン酸栄養要求性突然変異体のかなりのレベルの弱毒化にも拘わらず、ワクチンの開発にとっての主な障害の1つは免疫原性を大幅に損なうことなく(防御)十分なレベルの弱毒化を達成することの難しさであることがわかる。従って、弱毒化と防御との相関を、細菌感染に対する有効なワクチンを開発するためのそれぞれの遺伝子標的改変戦略について常に試験する必要がある。この意味において、上記文献(2013年4月27日から30日までベルリンで行われた23rd ESCMID congress (European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases)のM. P. Cabralら、「Blockade of glutamate racemisation during cell-wall formation prevents biofilm and proliferation of Acinetobacter baumannii in vivo」、Abstract)は、それがグルタミン酸ラセマーゼ遺伝子のインフレーム欠失を特徴とするアシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)株の弱毒化を記載するとしても、A.バウマンニ感染に対するそのような株の防御効能を示すいかなるデータも提供することができない。弱毒化株の防御効能を示すデータの提供は、以下の先行技術文献において示されたワクチンとしてのそのような株の有用性を決定するのに重要である。
【００１８】
M. K. Hondalusら、「Attenuation of and protection induced by a leucine auxotroph of Mycobacterium tuberculosis」、Infection and Immunity 68 (2000) 2888-2898においては、M.ツベルクロシス(M.tuberculosis)のロイシン栄養要求株を、突然変異体がマクロファージ中で複製することができないように対立遺伝子交換により作出した(細菌が弱毒化されたことを証明する)。事実、この文献の図5は、M.ツベルクロシスのロイシン栄養要求株に感染したマウスがどのように感染後22週で100%の生存率を有したかを示すものである(ロイシン栄養要求株が実際に弱毒化されたことを確立する)。しかしながら、ロイシン栄養要求性突然変異体は、静脈内でチャレンジしたBALB/cマウスの臓器負荷および組織病理の減少においてBCG生ワクチンよりも有効ではないことが示された。この文献は、ワクチンを有するために弱毒化株を有するには十分ではないこと、および免疫原性が鍵となる問題であることを例証するものである。
【００１９】
さらに、M. S. Jr Pavelkaら、「Vaccine efficacy of a lysisne auxotroph of Mycobacterium tuberculosis」、Infection and Immunity 71 (2003) 4190-4192においては、M.ツベルクロシス突然変異体(M.ツベルクロシスのリシン栄養要求株)によるマウスの単回静脈内免疫化が、その後のエアロゾルに対する有意な防御応答を生成せず、栄養要求株による単回の免疫化ではBCGによる単回免疫化と比較して肺および脾臓において細菌塊を減少させるには不十分であることが示された。3回免疫されたマウスのみが、単回用量のBCGで免疫された対照マウスと同じ長さで生存した。結果として、再度、免疫原性が弱毒化に由来する鍵となる個別の問題であると結論付けることができる。
【００２０】
さらに、先行技術文献であるAnn-Mari Svennerholmら、「Vaccines against enterotoxigenic Escherichia coli」、Expert review of vaccines 7 (2008) 795-804は、生の経口ベクターとしての遺伝的に弱毒化されたETEC(腸管毒素原性大腸菌)を記載し、安全であると特性評価した。しかしながら、防御に関してこれらの同じ株を評価する場合、下痢の発病率も総糞便量もワクチン対プラセボレシピエントにおいて有意に減少しなかった。
【００２１】
最後に、H. K. Kimら、「Identifying protective antigens of Staphylococcus aureus, a pathogen that suppresses host immune responses」、FASEB J. 25 (2011) 3605-3612は、トランスポゾン挿入突然変異誘発によりNewman株から誘導される3つの弱毒化突然変異体がマウスにおける防御免疫を惹起することができるかどうかを記載する。外部タンパク質、表面タンパク質の発現ならびに表面タンパク質のプロセッシングを遮断するために、これらの突然変異体、すなわち、saeR(S.オーレウス外部タンパク質)、mgrA(多遺伝子調節因子A)およびsrtA(ソルターゼA)を構築した。しかしながら、saeRまたはmgrAを欠く突然変異体は、マウスにおいて弱毒化されるにも拘わらず、その後のS.オーレウス感染に対する防御免疫を付与しなかった。
【００２２】
結果として、特定の誘導体株に関する毒性の低下(良好なレベルの弱毒化)が達成される場合であっても、宿主におけるその防御能力を実験的に評価して、生ワクチンとしてのその有用性を結論付けることができる。
【発明の概要】
【００２３】
本発明の第1の態様は、D-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株を含む医薬組成物、好ましくはワクチンの製造方法であって、該医薬組成物が該組成物の栄養要求性突然変異細菌の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)にとって好適であり、前記医薬組成物が、
a. D-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株を取得する工程；
b. 前記生きた栄養要求性突然変異細菌株を製薬上許容し得る担体または希釈剤中に導入し、必要に応じてアジュバントを添加する工程；および
c. 必要に応じて、医薬組成物を凍結乾燥する工程
を含む方法により製造される、前記方法に関する。
【００２４】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態においては、製造方法は、
a. グルタミン酸ラセマーゼおよびおそらくD-アミノ酸トランスアミナーゼを発現することができ、ペプチドグリカン細胞壁を含む細菌株を提供する工程；
b. 細菌株が最早機能的グルタミン酸ラセマーゼおよび/または機能的D-アミノ酸トランスアミナーゼを発現することができないように、グルタミン酸ラセマーゼ酵素をコードする遺伝子、および必要に応じて、D-アミノ酸トランスアミナーゼ酵素をコードする遺伝子を不活化する工程であって、前記遺伝子の不活化がかくして前記細菌株をD-グルタミン酸に関して栄養要求性にする、前記工程；ならびに
c. 前記生きた栄養要求性突然変異細菌株を製薬上許容し得る担体または希釈剤中に導入し、必要に応じて、アジュバントを添加する工程；ならびに
d. 必要に応じて、医薬組成物を凍結乾燥する工程
を含む。
【００２５】
本発明の第1の態様またはその好ましい実施形態のいずれかの別の好ましい実施形態において、医薬組成物はワクチンであり、製造方法はアジュバントを添加することを含む。
【００２６】
本発明の第1の態様またはその好ましい実施形態のいずれかの別の好ましい実施形態において、工程a)の細菌株はグラム陽性またはグラム陰性細菌である。好ましくは、工程a)の細菌株は、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、アシネトバクター・バイリ(Acinetobacter baylyi)、アシネトバクター・カルコアセチクス(Acinetobacter calcoaceticus)、アシネトバクター・ヘモリティクス(Acinetobacter haemolyticus)、アシネトバクター・ジュニ(Acinetobacter junii)、アシネトバクター・ルウォフィ(Acinetobacter lwoffii)、アシネトバクター・ノソコミアリス(Acinetobacter nosocomialis)、アシネトバクター・ピッチ(Acinetobacter pittii)、アシネトバクター・ラジオレジステンス(Acinetobacter radioresistens)、アクチノバシラス・リグニエレシ(Actinobacillus lignieresii)、アクチノバシラス・スイス(Actinobacillus suis)、アエロモナス・カビエ(Aeromonas caviae)、アエロモナス・ヒドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、アエロモナス・ベロニ亜種ソブリア(Aeromonas veronii subsp. sobria)、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、アルコバクター・ブツレリ(Arcobacter butzleri)、アルコバクター・ニトロフィギリス(Arcobacter nitrofigilis)、バシラス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バシラス・アントラシス(Bacillus anthracis)、バシラス・バタビエンシス(Bacillus bataviensis)、バシラス・セルロシリティクス(Bacillus cellulosilyticus)、バシラス・セレウス(Bacillus cereus)、バシラス・クラウシ(Bacillus clausii)、バシラス・リシェニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バシラス・プミルス(Bacillus pumilus)、バシラス・スブチリス(Bacillus subtilis)、バシラス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)、バクテロイデス・フラギリス(Bacteroides fragilis)、ボルデテラ・アビウム(Bordetella avium)、ボルデテラ・ブロンキセプティカ(Bordetella bronchiseptica)、ボルデテラ・ペルツシス(Bordetella pertusis)、ボルデテラ・ペトリ(Bordetella petrii)、ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)、ブルセラ・メリテンシス(Brucella melitensis)、ブルセラ・スイス(Brucella suis)、ブルクホルデリア・セノセパシア(Burkholderia cenocepacia)、ブルクホルデリア・マレイ(Burkholderia mallei)、ブルクホルデリア・マルチボランス(Burkholderia multivorans)、ブルクホルデリア・シュードマレイ(Burkholderia pseudomallei)、ブルクホルデリア・サイランデンシス(Burkholderia thailandensis)、カンピロバクター・コンシサス(Campylobacter concisus)、カンピロバクター・フェタス亜種フェタス(Campylobacter fetus subsp. fetus)、カンピロバクター・フェタス亜種ベネレアリス(Campylobacter fetus subsp. venerealis)、カンピロバクター・グラシリス(Campylobacter gracilis)、カンピロバクター・ホミニス(Campylobacter hominis)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・レクタス(Campylobacter rectus)、カンピロバクター・ショワエ(Campylobacter showae)、カンピロバクター・ウプサリエンシス(Campylobacter upsaliensis)、シトロバクター・フレウンジ(Citrobacter freundii)、シトロバクター・コセリ(Citrobacter koseri)、クロストリジウム・アスパラギフォルム(Clostridium asparagiforme)、クロストリジウム・ボツリナム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ブチリカム(Clostridium butyricum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・ペルフ��ンゲンス(Clostridium perfringens)、クロストリジウム・サッカロブチリカム(Clostridium saccharobutylicum)、クロストリジウム・テタニ(Clostridium tetani)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diphtheriae)、コリネバクテリウム・シュードツベルクロシス(Corynebacterium pseudotuberculosis)、エンテロバクター・エアロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エリジペロスリックス・ルジオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)、大腸菌(Escherichia coli)、フソバクテリウム・ネクロフォラム(Fusobacterium necrophorum)、フソバクテリウム・ネクレアタム(Fusobacterium nucleatum)、グラヌリカテラ・アジアセンス(Granulicatella adiacens)、グラヌリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ヘモフィルス・エクイゲニタリス(Haemophilus equigenitalis)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・パラインフルエンザ(Haemophilus parainfluenzae)、ヘモフィルス・パラガリナルム(Haemophilus paragallinarum)、ヘモフィルス・パラスイス(Haemophilus parasuis)、ヘモフィルス・プルロニューモニエ(Haemophilus pleuropneumoniae)、ヘモフィルス・ソムナス(Haemophilus somnus)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、レジオネラ・オークリジエンシス(Legionella oakridgensis)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、レプトスピラ・ビフレクサ(Leptospira biflexa)、レプトスピラ・イリニ(Leptospira illini)、レプトスピラ・インテロガンス(Leptospira interrogans)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、リシニバシラス・フシフォルミス(Lysinibacillus fusiformis)、リシニバシラス・スフェリクス(Lysinibacillus sphaericus)、モラクセラ・ボビス(Moraxella bovis)、モルガネラ・モルガニ(Morganella morganii)、マイコバクテリウム・アブセサス(Mycobacterium abscessus)、マイコバクテリウム・アフリカナム(Mycobacterium africanum)、マイコバクテリウム・アビウム(Mycobacterium avium)、マイコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis)、マイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノロア(Neisseria gonorrhoeae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、プレシオモナス・シゲロイデス(Plesiomonas shigelloides)、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)、プロテウス・ハンセリ(Proteus hanseri)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ(Salmonella enterica subsp. enterica)、サルモネラ・エンテリティディス(Salmonella enteritidis)、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、セラチア・プリムチカ(Serratia plymuthica)、シゲラ・ボイジ(Shigella boydii)、シゲラ・ディセンテリア(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレクスネリ(Shigella flexneri)、スタフィロコッカス・アルレッタ(Staphylococcus arlettae)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・カピティス(Staphylococcus capitis)、スタフィロコッカス・カプラ(Staphylococcus caprae)、スタフィロコッカス・カルノサス(Staphylococcus carnosus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・エクオラム(Staphylococcus equorum)、スタフィロコッカス・ヘモリティクス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス(Staphylococcus lugdunensis)、スタフィロコッカス・パステウリ(Staphylococcus pasteuri)、スタフィロコッカス・ペッテンコフェリ(Staphylococcus pettenkoferi)、スタフィロコッカス・シュードインテルメディウス(Staphylococcus pseudointermedius)、スタフィロコッカス・サプロフィティクス(Staphylococcus saprophyticus)、スタフィロコッカス・シミア(Staphylococcus simiae)、スタフィロコッカス・シムランス(Staphylococcus simulans)、スタフィロコッカス・ワルネリ(Staphylococcus warneri)、ステノトロフォモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ディスガラクチア(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ディスガラクチア亜種エクイシミリス(Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis)、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・ウベリス(Streptococcus uberis)、ストレプトコッカス・ズーエピデルミクス(Streptococcus zooepidermicus)、タイロレラ・アシニゲニタリス(Taylorella asinigenitalis)、タイロレラ・エクイゲニタリス(Taylorella equigenitalis)、トレポネマ・カラテウム(Treponema carateum)、トレポネマ・クニクリ(Treponema cuniculi)、トレポネマ・ヒオジセンテリア(Treponema hyodisenteriae)、トレポネマ・パリダム(Treponema pallidum)、トレポネマ・スイス(Treponema suis)、ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・ジスパル(Veillonella dispar)、ベイロネラ・パルブラ(Veillonella parvula)、ベイロネラ・ラッティ(Veillonella ratti)、ビブリオ・コレラ(Vibrio cholerae)、ビブリオ・パラヘモリティクス(Vibrio parahaemolyticus)、ビブリオ・ブルニフィカンス(Vibrio vulnificans)、エルシニア・エンテロコリティカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)およびエルシニア・シュードツベルクロシス(Yersinia pseudotuberculosis)からなる細菌種の一覧から選択される。
【００２７】
より好ましくは、工程a)の前記細菌株は、以下の種：アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)およびスタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)からなる一覧から選択される。さらにより好ましくは、細菌株は、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii) Delta0380/Delta3398と命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8588と共に2014年4月14日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたA.バウマンニの細菌株である。さらにより好ましくは、細菌株は、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa) DeltaPA4662と命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8589と共に2014年4月14日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたP.エルギノーサの細菌株である。さらにより好ましくは、細菌株は、132deltamurI/deltadatと命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8587と共に2014年6月11日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたS.オーレウスの細菌株である。
【００２８】
本発明の第2の態様は、Dグルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株と、製薬上許容し得る担体または希釈剤、および必要に応じて、アジュバントとを含む医薬組成物、好ましくは、ワクチンであって、該組成物の栄養要求性突然変異細菌の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)にとって好適である、前記医薬組成物に関する。
【００２９】
本発明の第2の態様の好ましい実施形態においては、前記医薬組成物はワクチンであり、前記ワクチンは必要に応じてアジュバントを含む。
【００３０】
本発明の第2の態様またはその好ましい実施形態のいずれかの別の好ましい実施形態においては、前記製薬上許容し得る担体または希釈剤は、水、培養液、生理学的塩濃度の溶液および/またはSPGAなどの安定剤、炭水化物(例えば、ソルビトール、マンニトール、スターチ、スクロース、グルコース、デキストラン)、アルブミンまたはカゼインなどのタンパク質、ウシ血清またはスキムミルクなどのタンパク質含有剤ならびにバッファー(例えば、リン酸バッファー)からなる一覧から選択される。
【００３１】
本発明の第2の態様またはその好ましい実施形態のいずれかの別の好ましい実施形態においては、前記アジュバントは、Freundの完全および不完全アジュバント、ビタミンE、非イオン性ブロックポリマー、ムラミルジペプチド、ISCOM(免疫刺激複合体)、サポニン、ミネラルオイル、植物油、カルボポール、大腸菌熱不安定毒素(LT)またはコレラ毒素(CT)、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは酸化アルミニウム、油乳濁液(例えば、Bayol F(登録商標)またはMarcol 52(登録商標)、サポニンおよびビタミンEソルビリゼートの)からなる一覧から選択される。
【００３２】
本発明の第2の態様またはその好ましい実施形態のいずれかの別の好ましい実施形態においては、前記医薬組成物は、103〜1010個の細菌のD-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株の用量を含む。
【００３３】
本発明の第2の態様またはその好ましい実施形態のいずれかの別の好ましい実施形態においては、前記医薬組成物は、凍結乾燥形態にある。
【００３４】
本発明の第2の態様またはその好ましい実施形態のいずれかの別の好ましい実施形態においては、細菌株は、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、アシネトバクター・バイリ(Acinetobacter baylyi)、アシネトバクター・カルコアセチクス(Acinetobacter calcoaceticus)、アシネトバクター・ヘモリティクス(Acinetobacter haemolyticus)、アシネトバクター・ジュニ(Acinetobacter junii)、アシネトバクター・ルウォフィ(Acinetobacter lwoffii)、アシネトバクター・ノソコミアリス(Acinetobacter nosocomialis)、アシネトバクター・ピッチ(Acinetobacter pittii)、アシネトバクター・ラジオレジステンス(Acinetobacter radioresistens)、アクチノバシラス・リグニエレシ(Actinobacillus lignieresii)、アクチノバシラス・スイス(Actinobacillus suis)、アエロモナス・カビエ(Aeromonas caviae)、アエロモナス・ヒドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、アエロモナス・ベロニ亜種ソブリア(Aeromonas veronii subsp. sobria)、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、アルコバクター・ブツレリ(Arcobacter butzleri)、アルコバクター・ニトロフィギリス(Arcobacter nitrofigilis)、バシラス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バシラス・アントラシス(Bacillus anthracis)、バシラス・バタビエンシス(Bacillus bataviensis)、バシラス・セルロシリティクス(Bacillus cellulosilyticus)、バシラス・セレウス(Bacillus cereus)、バシラス・クラウシ(Bacillus clausii)、バシラス・リシェニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バシラス・プミルス(Bacillus pumilus)、バシラス・スブチリス(Bacillus subtilis)、バシラス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)、バクテロイデス・フラギリス(Bacteroides fragilis)、ボルデテラ・アビウム(Bordetella avium)、ボルデテラ・ブロンキセプティカ(Bordetella bronchiseptica)、ボルデテラ・ペルツシス(Bordetella pertusis)、ボルデテラ・ペトリ(Bordetella petrii)、ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)、ブルセラ・メリテンシス(Brucella melitensis)、ブルセラ・スイス(Brucella suis)、ブルクホルデリア・セノセパシア(Burkholderia cenocepacia)、ブルクホルデリア・マレイ(Burkholderia mallei)、ブルクホルデリア・マルチボランス(Burkholderia multivorans)、ブルクホルデリア・シュードマレイ(Burkholderia pseudomallei)、ブルクホルデリア・サイランデンシス(Burkholderia thailandensis)、カンピロバクター・コンシサス(Campylobacter concisus)、カンピロバクター・フェタス亜種フェタス(Campylobacter fetus subsp. fetus)、カンピロバクター・フェタス亜種ベネレアリス(Campylobacter fetus subsp. venerealis)、カンピロバクター・グラシリス(Campylobacter gracilis)、カンピロバクター・ホミニス(Campylobacter hominis)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・レクタス(Campylobacter rectus)、カンピロバクター・ショワエ(Campylobacter showae)、カンピロバクター・ウプサリエンシス(Campylobacter upsaliensis)、シトロバクター・フレウンジ(Citrobacter freundii)、シトロバクター・コセリ(Citrobacter koseri)、クロストリジウム・アスパラギフォルム(Clostridium asparagiforme)、クロストリジウム・ボツリナム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ブチリカム(Clostridium butyricum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・ペルフリンゲンス(Clostridium perfringens)、クロストリジウム・サッカロブチリカム(Clostridium saccharobutylicum)、クロストリジウム・テタニ(Clostridium tetani)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diphtheriae)、コリネバクテリウム・シュードツベルクロシス(Corynebacterium pseudotuberculosis)、エンテロバクター・エアロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エリジペロスリックス・ルジオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)、大腸菌(Escherichia coli)、フソバクテリウム・ネクロフォラム(Fusobacterium necrophorum)、フソバクテリウム・ネクレアタム(Fusobacterium nucleatum)、グラヌリカテラ・アジアセンス(Granulicatella adiacens)、グラヌリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ヘモフィルス・エクイゲニタリス(Haemophilus equigenitalis)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・パラインフルエンザ(Haemophilus parainfluenzae)、ヘモフィルス・パラガリナルム(Haemophilus paragallinarum)、ヘモフィルス・パラスイス(Haemophilus parasuis)、ヘモフィルス・プルロニューモニエ(Haemophilus pleuropneumoniae)、ヘモフィルス・ソムナス(Haemophilus somnus)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、レジオネラ・オークリジエンシス(Legionella oakridgensis)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、レプトスピラ・ビフレクサ(Leptospira biflexa)、レプトスピラ・イリニ(Leptospira illini)、レプトスピラ・インテロガンス(Leptospira interrogans)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、リシニバシラス・フシフォルミス(Lysinibacillus fusiformis)、リシニバシラス・スフェリクス(Lysinibacillus sphaericus)、モラクセラ・ボビス(Moraxella bovis)、モルガネラ・モルガニ(Morganella morganii)、マイコバクテリウム・アブセサス(Mycobacterium abscessus)、マイコバクテリウム・アフリカナム(Mycobacterium africanum)、マイコバクテリウム・アビウム(Mycobacterium avium)、マイコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis)、マイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノロア(Neisseria gonorrhoeae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、プレシオモナス・シゲロイデス(Plesiomonas shigelloides)、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)、プロテウス・ハンセリ(Proteus hanseri)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ(Salmonella enterica subsp. enterica)、サルモネラ・エンテリティディス(Salmonella enteritidis)、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、セラチア・プリムチカ(Serratia plymuthica)、シゲラ・ボイジ(Shigella boydii)、シゲラ・ディセンテリア(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレクスネリ(Shigella flexneri)、スタフィロコッカス・アルレッタ(Staphylococcus arlettae)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・カピティス(Staphylococcus capitis)、スタフィロコッカス・カプラ(Staphylococcus caprae)、スタフィロコッカス・カルノサス(Staphylococcus carnosus)、スタフィロコ���カス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・エクオラム(Staphylococcus equorum)、スタフィロコッカス・ヘモリティクス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス(Staphylococcus lugdunensis)、スタフィロコッカス・パステウリ(Staphylococcus pasteuri)、スタフィロコッカス・ペッテンコフェリ(Staphylococcus pettenkoferi)、スタフィロコッカス・シュードインテルメディウス(Staphylococcus pseudointermedius)、スタフィロコッカス・サプロフィティクス(Staphylococcus saprophyticus)、スタフィロコッカス・シミア(Staphylococcus simiae)、スタフィロコッカス・シムランス(Staphylococcus simulans)、スタフィロコッカス・ワルネリ(Staphylococcus warneri)、ステノトロフォモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ディスガラクチア(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ディスガラクチア亜種エクイシミリス(Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis)、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・ウベリス(Streptococcus uberis)、ストレプトコッカス・ズーエピデルミクス(Streptococcus zooepidermicus)、タイロレラ・アシニゲニタリス(Taylorella asinigenitalis)、タイロレラ・エクイゲニタリス(Taylorella equigenitalis)、トレポネマ・カラテウム(Treponema carateum)、トレポネマ・クニクリ(Treponema cuniculi)、トレポネマ・ヒオジセンテリア(Treponema hyodisenteriae)、トレポネマ・パリダム(Treponema pallidum)、トレポネマ・スイス(Treponema suis)、ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・ジスパル(Veillonella dispar)、ベイロネラ・パルブラ(Veillonella parvula)、ベイロネラ・ラッティ(Veillonella ratti)、ビブリオ・コレラ(Vibrio cholerae)、ビブリオ・パラヘモリティクス(Vibrio parahaemolyticus)、ビブリオ・ブルニフィカンス(Vibrio vulnificans)、エルシニア・エンテロコリティカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)およびエルシニア・シュードツベルクロシス(Yersinia pseudotuberculosis)からなる細菌種の一覧から選択される。
【００３５】
より好ましくは、工程a)の前記細菌株は、以下の種：アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)およびスタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)からなる一覧から選択される。さらにより好ましくは、細菌株は、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii) Delta0380/Delta3398と命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8588と共に2014年4月14日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたA.バウマンニの細菌株である。さらにより好ましくは、細菌株は、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa) DeltaPA4662と命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8589と共に2014年4月14日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたP.エルギノーサの細菌株である。さらにより好ましくは、細菌株は、132deltamurI/deltadatと命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8587と共に2014年6月11日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたS.オーレウスの細菌株である。
【００３６】
本発明の第3の態様は、D-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株であって、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa) DeltaPA4662と命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8589と共に2014年4月14日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたP.エルギノーサの細菌株である、前記細菌株に関する。
【００３７】
本発明の第3の態様はまた、D-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株であって、132deltamurI/deltadatと命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8587と共に2014年6月11日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたS.オーレウスの細菌株である、前記細菌株に関する。
【００３８】
本発明の第4の態様は、医薬としての使用のため、特に、ワクチンとしての使用のための本発明の第3の態様に定義された細菌株に関する。
【００３９】
本発明の第5の態様は、前記組成物の栄養要求性突然変異細菌の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)の方法における使用のための、本発明の第2の態様の医薬組成物または本発明の第3もしくは第4の態様のD-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株に関する。
【００４０】
本発明の第6の態様は、D-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株を認識することができる抗体またはFab、F(ab')2、Fv、scFv、ジ-scFvおよびsdABからなる群から選択されるその断片であって、前記組成物の栄養要求性突然変異細菌の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)にとって好適である、前記抗体またはその断片に関する。
【００４１】
本発明の第7の態様は、D-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株を用いる哺乳動物の免疫化後に得られるか、または得ることができる抗体またはFab、F(ab')2、Fv、scFv、ジ-scFvおよびsdABからなる群から選択されるその断片であって、前記組成物の栄養要求性突然変異細菌の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)にとって好適である、前記抗体またはその断片に関する。
【００４２】
本発明の第8の態様は、本発明の第6または第7の態様のいずれかの抗体またはその断片と、製薬上許容し得る担体または希釈剤、および必要に応じて、アジュバントとを含む、医薬組成物、好ましくは、ワクチンであって、前記組成物の栄養要求性突然変異細菌の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)にとって好適である、前記組成物に関する。本発明の第8の態様の好ましい実施形態においては、前記医薬組成物は、前記ワクチンが必要に応じてアジュバントを含むワクチンである。
【００４３】
本発明の第9の態様は、療法における使用のため、特に、受動免疫における使用のための、本発明の第6または第7の態様の抗体またはその断片に関する。
【００４４】
本発明の第10の態様は、前記組成物の栄養要求性突然変異細菌の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)の方法における使用のための、本発明の第8の態様の医薬組成物または本発明の第6もしくは第7の態様のいずれかの抗体もしくはその断片に関する。
【００４５】
本発明の第11の態様は、前記組成物の栄養要求性突然変異細菌の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)の方法における使用のための、本発明の第2もしくは第8の態様の医薬組成物または本発明の第3の態様のD-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株または本発明の第6もしくは第7の態様のいずれかの抗体もしくはその断片であって、鼻内、皮内、皮下、経口、エアロゾル、筋肉内、ウィングウェブ(wing web)および点眼投与される前記組成物、細菌株または抗体もしくはその断片に関する。
【００４６】
さらに、本発明の著者らは、驚くべきことに、本発明の抗体またはその断片を含むキットまたはデバイスを用いることにより、キットが被験体の生物試料、特に、細菌起源の疾患に罹患することが疑われる被験体の血漿中の細菌種の信頼できる定性的および/または定量的分析を可能にすることを見いだした。
【００４７】
従って、本発明の第12の態様は、本発明の第7または第8の態様のいずれかの抗体またはその断片を含むキットまたはデバイスに関する。
【００４８】
本発明の第12の態様の好ましい実施形態は、
(i)第1の抗体が好ましくは、固相支持体に結合される、本発明の第6または第7の態様のいずれかに定義された「捕捉抗体」と呼ばれる前記第1の抗体；
(ii)第2の抗体が蛍光、発光または酵素であってもよいマーカーを含む、第1の抗体により認識される領域以外の領域を認識する「検出抗体」と呼ばれる前記第2の標識された抗体；
(iii)試薬が結合対の第1のメンバーにカップリングされる、第2の抗体に対する親和性を示す前記試薬；および
(iv)結合対がハプテンと抗体；抗原と抗体；ビオチンとアビジン；ビオチンとストレプトアビジン；ビオチン類似体とアビジン；ビオチン類似体とストレプトアビジン；糖とレクチン；酵素とコファクター；核酸または核酸類似体と相補的核酸または核酸類似体からなる群から選択される、蛍光、発光または酵素にカップリングされた結合対の第2のメンバー
を含むイムノアッセイを介して細菌起源の感染を検出するためのキットまたはデバイスに関する。
【００４９】
本発明の第13の態様は、哺乳動物に由来する生物試料、特に、細菌疾患に罹患すると疑われる哺乳動物の血漿中の細菌種または細菌株の定性的および/または定量的決定のための、本発明の第12の態様のキットまたはデバイスの使用に関する。
【００５０】
本発明の第14の態様は、0.00001〜120mMのD-グルタミン酸濃度の使用を含む、D-グルタミン酸に関する栄養要求性細菌株の培養方法に関する。好ましくは、D-グルタミン酸の濃度範囲は、0.01〜50mMである。より好ましくは、D-グルタミン酸の濃度範囲は、10〜20mMである。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】グラム陽性細菌の細菌壁の一般構造を示す図である(テイコ酸およびタンパク質は記載されない)。PG:ペプチドグリカン(ムレイン)。M：細胞膜。
【図２】グラム陰性細菌の細菌壁の構造および構成を示す図である(リポ多糖およびタンパク質は記載されない)。PG:ペプチドグリカン(ムレイン)。OM：外膜。IM：内膜。
【図３】D-グルタミン酸の形成および細菌細胞壁ペプチドグリカン中へのその組込みで終わる代謝プロセスの順序を示す図である。図面に記載されるdat、murIおよびmurD遺伝子は、それぞれ、Dat、MurIおよびMurDタンパク質をコードする。
【図４】Clustal Omegaプログラムを用いた、A.バウマンニATCC 17978 (A3MIP5_ACIBTおよびA3MA43_ACIBT)、大腸菌(MURI_ECOLI)およびP.エルギノーサ(MURI_PSEAE)の2つのMurIグルタミン酸ラセマーゼのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。全てのグルタミン酸ラセマーゼ中の同一の残基は暗灰色の背景で記載される。
【図５】アシネトバクター・バウマンニATCC 17978突然変異体Δ0380、Δ3398およびΔ0380/Δ3398中の欠失のPCR確認を示す図である。A:オリゴヌクレオチドEXTFW0380およびEXTRV0380を用いて、野生型遺伝子座A1S_0380を担持する株に由来する1116bpの断片または突然変異遺伝子座Δ0380を担持する株に由来する345bpの断片を生成した。B:オリゴヌクレオチドEXTFW3398およびEXTRV3398を用いて、野生型遺伝子座A1S_3398を担持する株に由来する1056bpの断片または突然変異遺伝子座Δ3398を担持する株に由来する516bpの断片を生成した。各レーン中のDNA断片は、以下のマッチアップを有する：MW、分子量パターン；0380、野生型遺伝子座A1S_0380を担持する株から生成されたアンプリコン；3398、野生型遺伝子座A1S_3398を担持する株から生成されたアンプリコン；Δ0380/Δ3398、2つの遺伝子座A1S_0380およびA1S_3398中の欠損株から生成されたアンプリコン；Δ3398およびΔ0380、それぞれ、遺伝子座A1S_3398およびA1S_0380中の欠損株から生成されたアンプリコン。
【図６】A.バウマンニATCC 17978二重突然変異体Δ0380/Δ3398の構築物中の同時組込み物から得られるコロニーのスクリーニングを示す図である。個々のコロニーを、15%スクロースおよび10mM D-グルタミン酸を含むLB寒天から選択し、10mM D-グルタミン酸を含む/含まないLB寒天プレート中の同じ位置に接種した。Δ0380/Δ3398遺伝子型を有するコロニーは、専らD-グルタミン酸を含むプレート中で増殖する；Δ0380遺伝子型を有するコロニーはD-グルタミン酸を用いて/用いずに増殖する。
【図７】A.バウマンニ野生型株ATCC 17978および二重突然変異株Δ0380/Δ3398の増殖および生存能力アッセイを示す図である。Δ0380/Δ3398株は、10mM D-グルタミン酸を添加した培養培地中では正常な増殖を示すが、この化合物の外因的供給がない場合は増殖できない。対照的に、野生型株はD-グルタミン酸を添加した/添加しないLB培地中で正常通り増殖する。各パネルにおいて、黒四角(■)はD-グルタミン酸を含む培地中の野生型株を表す；白四角(□)はD-グルタミン酸を含まない野生型株を表す；黒丸(●)はD-グルタミン酸を含む培地中の二重突然変異体を表し、白丸(○)はD-グルタミン酸を含まない培地中の二重突然変異体を表す。A:二重突然変異体および野生型株の培養物の光密度。B:二重突然変異体および野生型株の培養物の生存能力(Log10CFU/mL)。
【図８】異なる濃度のD-グルタミン酸の存在下での野生型相同体に対するA.バウマンニATCC 17978Δ0380/Δ3398二重突然変異体中の細胞分裂および形態レベルでの差異を示す図である。走査型電子顕微鏡を用いて顕微鏡写真を撮影した。A:両方の株を増大する濃度のD-グルタミン酸で培養し、同じ尺度で顕微鏡写真を撮影した(バーは10μmの尺度を示す)。B:両方の株を0.1mM D-グルタミン酸の存在下で培養し、減少する順序の尺度で進行的に顕微鏡写真を撮影した。
【図９】D-グルタミン酸の非存在下で保持した場合のA.バウマンニATCC 17978突然変異株Δ0380/Δ3398の様々な非定型形態、細胞壁の進行的変性および溶解を示す図である。様々な尺度で透過型電子顕微鏡を用いて顕微鏡写真を撮影した。黒色の矢印は正常な形態または非定型細胞分裂を有する無傷の細菌細胞を示す；破線の矢印は細菌細胞壁を有さない断片化された細胞、溶解した細胞または組織破壊された内容物、分散した遺伝物質、膜および/またはリポソームの凝集体を示す。
【図１０Ａ】100%の感受性マウスが死亡する致死用量(LD)(LD100)を決定するための様々な用量のA.バウマンニ野生型株ATCC 17978(A)およびΔ0380/Δ3398突然変異株(B)(n=6)を用いた腹腔内注射後のBALB/cマウスの生存のパーセンテージを示す図である。(A)LD100=2.5X; (B)LD100=2.5X。マウスの生存を7日間モニタリングした。
【図１０Ｂ】図１０Ａの続きである。
【図１１】2X用量のA.バウマンニ野生型株ATCC 17978、Δ0380株、Δ3398株およびΔ0380/Δ3398株を用いる感染の12時間後のBALB/cマウス(n=8〜9匹のマウス)の肝臓における細菌量を示す図である。P値はMann-WhitneyのU検定によるものである。各ドットはマウスの肝臓の個々の細菌量を表し、各水平線は各群の対応する平均を表す。
【図１２】Δ0380/Δ3398株で0および14日目にマウスを予め免疫した後の、または免疫しなかった(塩水対照)、21日目に投与された4X用量のA.バウマンニ野生型株ATCC 17978を用いる感染の12時間後のBALB/cマウス(n=10)の肝臓、脾臓および肺中の細菌量を示す図である。P値はMann-WhitneyのU検定によるものである。各ドットはマウスの臓器の個々の細菌量を表す。各群の平均値は水平線で表される。
【図１３】ワクチン接種後7および21日目のBALB/cマウス(n=12)、ならびにワクチン接種しなかった対照マウス(塩水対照)におけるA.バウマンニ野生型株ATCC 17978に対して産生されたIgG抗体のLog101/終点力価を示す図である。抗体力価を、間接ELISAにより決定した。*ワクチン非接種マウスの群と比較したP<0.0001；#ワクチン接種後7日目のIgGの産生と比較したP<0.0240；P値はMann-WhitneyのU検定によるものである。ボックスは第1および第3四分位を表す；水平線は中央値を表す；髭は範囲を表す。
【図１４】様々な用量のA.バウマンニ株ATCC 17978(0.01X；0.05X;0.1X; 0.5X;および1X)を用いたワクチン接種後21日目のBALB/cマウス(n=6)、ならびにワクチン接種しなかった対照マウス(0X)におけるA.バウマンニ野生型株ATCC 17978に対して産生されたIgG抗体のLog101/終点力価を示す図である。抗体力価を、間接ELISAにより決定した。*ワクチン非接種マウスの群と比較したP<0.05；P値はMann-WhitneyのU検定によるものである。ボックスは第1および第3四分位を表す；水平線は中央値を表す；髭は範囲を表す。
【図１５】3つの異なるA.バウマンニ株：ATCC 17978、ATCC 19606およびAbH12O-A2に対する、ワクチン接種後21日目のBALB/cマウスおよびワクチン非接種マウス(塩水対照)により産生されるIgG抗体の交差反応性(力価)を示す図である。
【図１６】4X用量のA.バウマンニATCC 17978野生型株を用いる腹腔内感染後のBALB/cマウス(n=12)の生存率を示す図である。ワクチン接種したマウスを、A.バウマンニΔ0380/Δ3398株で0および14日目に免疫し、21日目に野生型株に感染させた。ワクチン非接種マウスに、0および14日目に塩水を投与し、同じ日に野生型株に感染させた。*対照群と比較したワクチン接種群の生存のP<0.0001。P値はMantel-Cox検定(ログランク検定)によるものである。
【図１７】4X用量のA.バウマンニAbH12O-A2株を用いる腹腔内感染後のBALB/cマウス(n=9)の生存率を示す図である。ワクチン接種したマウスを0および14日目にA.バウマンニΔ0380/Δ3398株で免疫し、21日目に臨床株に感染させた。ワクチン非接種マウスに、0および14日目に塩水を投与し、同じ日に臨床株に感染させた。*対照群と比較したワクチン接種群の生存P<0.0001。P値はMantel-Cox検定(ログランク検定)によるものである。
【図１８】0.75X用量の莢膜を有するA.バウマンニAb307-0294株を用いる腹腔内感染後のBALB/cマウス(n=6〜8)の生存率を示す図である。ワクチン接種したマウスを、0および14日目にA.バウマンニΔ0380/Δ3398株で免疫し、21日目に高毒性株に感染させた。ワクチン非接種マウスに、0および14日目に塩水を投与し、同じ日にAb307-0294株に感染させた。*対照群と比較したワクチン接種群の生存P<0.0022。P値はMantel-Cox検定(ログランク検定)によるものである。
【図１９】撹拌(180rpm)しながら37℃で40日間、蒸留水中で増殖させた場合の回収されたA.バウマンニATCC 17978野生型およびΔ0380/Δ3398株のLog10CFU/mLを示す図である。LB(野生型株)および10mM D-グルタミン酸を添加したLB(突然変異株)上に塗布したコロニーを計数することにより、CFUを決定した。全ての培養を3回実施した。
【図２０】A.バウマンニΔ0380/Δ3398を撹拌(180rpm)しながら37℃で8日間、10mM D-グルタミン酸を添加したLB上で培養した場合に、LB(○)および10mM D-グルタミン酸(●)を添加したLBから回収されたこの株の数を示す図である。
【図２１】時間に沿った、100μLのA.バウマンニATCC 17978野生型およびΔ0380/Δ3398株(1X用量)を接種したマウスの血液から回収されたA.バウマンニコロニーの数(Log10CFU/mL)を示す図である。
【図２２】P.エルギノーサのΔPA4662の構築中の分解した同時組込み物のスクリーニングを示す図である。
【図２３】P.エルギノーサのΔPA4662突然変異体中の欠失のPCR確認を例示する図である。プライマーEXTFWPA4662およびEXTRVPA4662を用いて、野生型PA4662対立遺伝子を担持する株に由来する1741bpの断片またはΔPA4662対立遺伝子を担持する株に由来する943bpの断片を生成した。レーン標識および分析した試料は以下の通りである：MW: DNAラダー；ΔPA4662: ΔPA4662突然変異体対立遺伝子を担持する株に由来するアンプリコン；およびPA4662: 野生型PA4662対立遺伝子を担持する株に由来するアンプリコン。
【図２４Ａ】100%の感受性マウスが死亡する致死用量(LD)(LD100)を決定するための様々な用量のP.エルギノーサ野生型株PAO1(A)およびΔPA4662突然変異株(B)(n=4)を用いる腹腔内注射後のBALB/cマウスの生存のパーセンテージを示す図である。(A)LD100=0.4X；(B)LD100>40X。マウスの生存を7日間モニタリングした。
【図２４Ｂ】図２４Ａの続きである。
【図２５】D-グルタミン酸の非存在下で維持した場合のP.エルギノーサの非定型形態ならびに細胞壁の進行的変性および溶解を示す図である。A〜E：MH培地；F〜I：LB培地；J〜T：LB + MgCl2(30mg/L) + CaCl2(75mg/L)。様々な尺度で透過型電子顕微鏡を用いて顕微鏡写真を撮影した。黒色の矢印は正常な形態または非定型細胞分裂を有する無傷の細菌細胞を示す；破線の矢印は細菌細胞壁を有さない断片化された細胞、溶解した細胞または組織破壊された内容物、分散した遺伝物質、膜および/またはリポソームの凝集体を示す。
【図２６】0.4X用量のP.エルギノーサPAO1野生型株を用いる腹腔内感染後のBALB/cマウス(n=8)の生存率を示す図である。ワクチン接種したマウスを、0および14日目にP.エルギノーサΔPA4662株(0.4X用量-A; 0.04X用量-B)で免疫し、25日目に野生型株に感染させた。ワクチン非接種マウスに、0および14日目に塩水を投与し、同じ日に野生型株に感染させた。*対照群と比較したワクチン接種群の生存P<0.0001。P値はMantel-Cox検定(ログランク検定)によるものである。
【図２７】0.4X用量のP.エルギノーサPAO1野生型株の腹腔内注射後のBALB/cマウス(n=8)の生存率を示す図である。(A)においては、マウスをワクチン血清(ΔPA4662ワクチンを用いて生成)で受動免疫したか、または感染前にナイーブな血清を投与した。(B)においては、マウスに、急性敗血症症状の発症後、2回用量のワクチン血清(ΔPA4662株を用いて生成)またはナイーブな血清を投与した。*ナイーブな血清を受けるマウスと比較したワクチン血清で受動免疫されたマウスの生存のP<0.05。P値はMantel-Cox検定(ログランク検定)によるものである。
【図２８】撹拌(180rpm)しながら37℃で157日間、蒸留水中で増殖させた場合に回収されたP.エルギノーサPAO1野生型およびΔPA4662株のLog10CFU/mLを示す図である。LB(野生型株)および10mM D-グルタミン酸を含むLB(突然変異株)上に塗布されたコロニーを計数することにより、CFUを決定した。全ての培養を3回実施した。
【図２９】P.エルギノーサΔPA4662を撹拌(180rpm)しながら37℃で5日間、10mM D-グルタミン酸を含むLB上で培養した場合にLB(○)および10mM D-グルタミン酸を添加したLB(●)から回収されたこの株のコロニー(CFU/mL)の数である。
【図３０】S.オーレウス二重突然変異体ΔmurI/Δdatの構築中の第2のクロスオーバー事象後の単一突然変異体ΔmurIから得られるコロニーのスクリーニングを示す図である。個々のエリスロマイシン感受性コロニーをX-Gal(150μg/mL)を添加したTSB寒天プレートから選択し、10mM D-グルタミン酸を含む/含まないTSB寒天プレート中の同じ位置に接種した。ΔmurI/Δdat遺伝子型を有するコロニーはD-グルタミン酸を含むプレート中でのみ増殖する；ΔmurI遺伝子型を有するコロニー(murI遺伝子を欠くが、dat遺伝子の無傷のコピーを有する)はD-グルタミン酸があってもなくても適切に増殖した。
【図３１】S.オーレウス132突然変異体ΔmurI、ΔdatおよびΔmurI/Δdat中の欠失のPCR確認を示す図である。用いたプライマーは、A:murIF/murIR；B:murIExtF/murIExtR；C:murIseqF/murIseqR；D:datF/datR；E:datExtF/datExtR；およびF:datseqF/datseqRであった。レーン：MM、分子マーカーGeneRuler 1kb；ΔmurI、突然変異遺伝子座ΔmurIを担持する株から得られる断片；Δdat、突然変異遺伝子座Δdatを担持する株から得られる断片；ΔmurI/Δdat、2つの遺伝子座ΔmurIおよびΔdat中に欠損がある株から得られる断片；野生型、2つの遺伝子座murIおよびdatを担持するS.オーレウス132野生型株から得られる断片。
【図３２】S.オーレウス132野生型および二重突然変異株ΔmurI/Δdatの増殖および生存能力アッセイを示す図である。ΔmurI/Δdat株は20mMのD-グルタミン酸を添加したTSB中では正常な増殖を示すが、この化合物を外因的に供給しない場合は増殖することができない。対照的に、野生型株はD-グルタミン酸を含む/含まないTSB中で増殖する。それぞれの記号は、凡例に示される1つの株を表す。A:培養物の濁度；B:培養物の生存能力。
【図３３】様々な濃度のD-グルタミン酸の存在下でのS.オーレウス野生型株に対する、S.オーレウス132二重突然変異体ΔmurI/Δdat中の形態レベルでの変化を示す図である。走査型電子顕微鏡を用いて画像を撮影した。A:両方の株を増大する濃度のD-グルタミン酸でインキュベートし、同じ尺度で顕微鏡写真を撮影した(水平のバーは10μmの尺度を示す)；B:両方の株を0.1mM D-グルタミン酸を添加した培地中で培養し、減少する順序の尺度で進行的に画像を撮影した。
【図３４】D-グルタミン酸の非存在下で保持した場合のS.オーレウス132二重突然変異株ΔmurI/Δdatの様々な非定型形態、細胞壁の進行的分解および溶解を示す図である。水平バーにより特定される異なる尺度上で透過型電子顕微鏡を用いて画像を撮影した。黒色の矢印は正常な形態または非定型細胞分裂を有する無傷の細菌細胞を示す；破線の矢印は細菌細胞壁を有さない断片化された細胞、溶解された細胞または組織破壊された内容物、分散した遺伝物質、膜および/またはリポソームの凝集体を示す。
【図３５Ａ】100%の感受性マウスが死亡する致死用量(LD)(LD100)を決定するための様々な用量のS.オーレウス132野生型(A)およびΔmurI/Δdat突然変異体(B)(n=3〜4)を用いる腹腔内注射後のBALB/cマウスの生存のパーセンテージを示す図である。(A)LD100=3X；(B)LD100>30X。マウスの生存を14日間モニタリングした。
【図３５Ｂ】図３５Ａの続きである。
【図３６】マウスを0および14日目に10X用量のΔmurI/Δdat株で予め免疫した後の、または免疫しなかった(塩水対照)、5X用量のS.オーレウス132野生型株を用いる感染の20時間後のBALB/cマウス(n=4〜6)の脾臓(A)および血液培養物(B)中の細菌量を示す。各ドットはマウスの脾臓の個々の細菌量を表す。各群の平均値は水平線で表される。ワクチン非接種マウス群と比較したP=0.0095。P値はMann-WhitneyのU検定によるものである。各マウスからの血液培養物を振盪せずに37℃で18時間インキュベートした：(+)陽性；(-)陰性。
【図３７】5X用量のS.オーレウス132野生型株を用いる感染の22時間後のBALB/cマウス(n=8〜9)の脾臓(A)および血液(B)中の細菌量を示す図である。マウスを0および14日目に8X用量のΔmurI/Δdat株で免疫したか、または免疫しなかった(塩水対照)。各ドットはマウスの脾臓または血液の個々の細菌量を表す。各群の平均値は水平線で表される。ワクチン非接種マウス群と比較したP=0.0006およびP=0.0002。P値はMann-WhitneyのU検定によるものである。
【図３８】5X用量のS.オーレウス132野生型株を用いる腹腔内感染後のBALB/cマウス(n=10〜13)の生存パーセントを示す図である。ワクチン接種したマウスを0および14日目に10X用量のΔmurI/Δdat株で免疫したが、非免疫マウスには同じ日に塩水を投与した。*ワクチン非接種マウス群と比較したP=0.031。P値はMann-WhitneyのU検定によるものである。マウスの生存を96時間までモニタリングした。
【図３９】10X用量のΔmurI/Δdat株で予め免疫したBALB/cマウス(n=8〜10)、および非免疫マウス(塩水対照)中の同系S.オーレウス132Δspa株に対して産生されたIgG抗体のLog101/終点力価を示す図である。抗体力価を間接ELISAにより決定した。*ワクチン非接種マウス群と比較したP=0.0001。P値はMann-WhitneyのU検定によるものである。ボックスは第1および第3四分位を表す；水平線は中央値を表す；髭は範囲を表す。
【図４０Ａ−Ｂ】異なる起源：(A)USA300LAC(ヒト)；(B)RF122(ウシ)；(C)ED133(ヒツジ)；(D)ED98(家禽)のS.オーレウス株に対する、10X用量のΔmurI/Δdat株で予め免疫したBALB/cマウス(n=6〜9)、および非免疫マウス(塩水対照)により産生されたIgG抗体の交差反応性(Log101/終点力価)を示す図である。抗体力価を間接ELISAにより決定した。非免疫マウス群と比較した#P<0.0001および*P<0.0006。P値はMann-WhitneyのU検定によるものである。ボックスは第1および第3四分位を表す；水平線は中央値を表す；髭は範囲を表す。
【図４０Ｃ−Ｄ】図４０Ａ−Ｂの続きである。
【図４１】撹拌(180rpm)しながら室温で5日間、蒸留水中で増殖させた場合に回収されたS.オーレウス野生型およびΔmurI/Δdat株のLog10CFU/mLを示す図である。TSB寒天(野生型)および10mM D-グルタミン酸を添加したTSB(二重突然変異株)上に塗布されたコロニーを計数することによりCFUを決定した。全ての培養を3回実施した。
【図４２】S.オーレウスΔmurI/Δdat株を撹拌(180rpm)しながら37℃で11日間、20mM D-グルタミン酸を添加したTSB上で培養した場合のTSB(○)および10mM D-グルタミン酸を添加したTSB(●)から回収されたこの株のコロニー数(CFU/mL)を示す図である。
【図４３】時間に沿った、亜致死性0.7X用量のS.オーレウス132野生型株および10X用量のΔmurI/Δdat株を腹腔内接種したマウス(n=3/群)の腎臓(CFU/g)(A)、脾臓(CFU/g)(B)、および血液試料(CFU/ml)(C)中で回収されたS.オーレウスコロニーの数を示す図である。1匹のマウス(群あたり/株あたり)を感染後1、2および6日目に安楽死させた。時間ゼロで接種されたCFU/マウスを各株についてY軸に示す。コロニーを、TSB寒天(野生型株)またはTSB寒天+10mM D-グルタミン酸(ΔmurI/Δdat株)中で回収した。
【図４４】様々な用量のP.エルギノーサ株PAO1(0.1X;0.4X;1X;4X;10Xおよび40X)を用いるワクチン接種後40日目のBALB/cマウスならびにワクチン非接種対照マウス(0X)においてP.エルギノーサ株PAO1に対して産生されたIgG抗体の終点力価Log10を示す図である。抗体力価を間接ELISAにより決定した。*非免疫マウス群と比較したP<0.001；P値は対応のないt検定によるものである。ボックスは第1および第3四分位を表す；水平線は中央値を表す；髭は範囲を表す。
【図４５】ワクチン接種後7および25日目のBALB/cマウス(n=5)、ならびにワクチン非接種対照マウスにおいてP.エルギノーサ株PAO1に対して産生されたIgG抗体の終点力価Log10を示す図である。抗体力価を間接ELISAにより決定した。#非免疫マウス群と比較したP<0.001；*ワクチン接種後7および25日目の比較のP<0.05；P値は対応のないt検定によるものである。ボックスは第1および第3四分位を表す；水平線は中央値を表す；髭は範囲を表す。
【図４６】複数のP.エルギノーサ株：PAO1、PA28562、PA51430664、PA26132、PAST175、PA29475およびPA12142に対する、ワクチン接種後34日目のBALB/cマウスおよびワクチン非接種対照マウス(塩水対照)により産生されたIgG抗体の交差反応性(力価)を示す図である。
【図４７】マウスを0および15日目にΔPA4662株で予め免疫した後の、または免疫しなかった(塩水対照)、22日目に投与された0.4X用量のP.エルギノーサ野生型株PAO1を用いる感染の10時間後のBALB/cマウス(n=8)の肝臓、脾臓および肺における細菌量を示す図である。P値は対応のないt検定によるものである。各ドットはマウスの臓器の個々の細菌量を表す。各群の平均値を水平線で表す。
【図４８Ａ】それぞれ、Δ0380/Δ3398、ΔPA4662およびΔmurI/Δdatワクチン株を用いるワクチン接種後7日目(1回目のワクチン投与後)、21日目(2回目の投与後)、35日目(3回目の投与後)、49日目(4回目の投与後)および63日目(例外として、5回目の投与後)のBALB/cマウス(n=2〜3/用量/経路)においてA.バウマンニ株ATCC 17978(A)、P.エルギノーサ株PAO1(B)および同系S.オーレウス株132Δspa(C)に対して産生されたIgG抗体のLog101/終点力価を示す図である。異なる投与経路(腹腔内、皮下、筋肉内、鼻内)および異なるワクチン用量(0.1Xおよび1X、Δ0380/Δ3398、0.4Xおよび0.04X、ΔPA4662、0.2X、1X、3Xおよび10X ΔmurI/Δdat)を用いて、マウスに0、14、28、42および56日目(例外として)に連続的にワクチン接種した。抗体力価を間接ELISAにより決定した。ワクチン接種したマウスにおいて産生されたIgG力価をワクチン非接種マウス群と比較した。多重比較検定(#P<0.05)と共に一元配置分散分析(反復測定ANOVA)(*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001)を用いて、統計的有意性を決定した。各ドットはマウスのIgGの個々の終点力価Log10を表す。各群の平均値を水平線で表す。
【図４８Ｂ】図４８Ａの続きである。
【図４８Ｃ−１】図４８Ｂの続きである。
【図４８Ｃ−２】図４８Ｃ−１の続きである。
【図４９】ワクチン接種後34日目のBALB/cマウス(n=8)およびワクチン非接種対照マウス(筋肉内投与を用いる)においてP.エルギノーサ株PAO1に対して産生されたIgG抗体のLog101/終点力価を示す図である。抗体力価を間接ELISAにより決定した。*対照マウス群と比較したP<0.0001；P値は対応のないt検定によるものである。ボックスは第1および第3四分位を表す；水平線は中央値を表す；髭は範囲を表す。
【図５０】0.4X用量のP.エルギノーサPAO1野生型株を用いる腹腔内感染後のBALB/cマウス(n=8)の生存パーセントを示す図である。ワクチン接種したマウスを、0、14および28日目に筋肉内経路によりP.エルギノーサΔPA4662株で免疫し、35日目に野生型株に感染させた。ワクチン非接種マウスに、0、14および28日目に塩水を投与し、同じ日に野生型株に感染させた。*ワクチン非接種群と比較したワクチン接種群の生存のP<0001。P値はMantel-Cox検定(ログランク検定)によるものである。
【図５１】時間に沿った、100μLのP.エルギノーサPAO1野生型およびΔPA4662株(0.4X用量)を接種したマウス(n=3/群)の血液から回収されたP.エルギノーサコロニーの数(Log10CFU/mL)を示す図である。
【図５２】D-グルタミン酸を添加した直後(増殖対照)ならびに12および18時間の37℃での乾燥ストレス後のTSBプレート上でのS.オーレウス野生型(WT)および二重突然変異体ΔmurI/Δdat(ΔΔ)株の細胞生存能力を示す図である。全ての培養および希釈系列を3回実施した。
【図５３】S.オーレウス132野生型株を用いる腹腔内感染後のBALB/cマウス(n=5)の生存パーセントを示す図である。マウスを、ワクチン血清またはナイーブな血清で受動免疫した。*ナイーブな血清を受けたマウスと比較したワクチン血清を投与したマウスの生存のP=0.0429。P値はMantel-Cox検定(ログランク検定)によるものである。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
定義
本発明の文脈において、用語「D-グルタミン酸」は分子式C5H9NO4、分子量147.129(g/mol)を有し、グルタミン酸のD-エナンチオマー形態を有する化合物または分子と理解される。その系統名は「D-グルタミン酸」であるが、それを(限定されるものではないが)「D-Glu」、「D-2-アミノペンタン酸」、「グルタミン酸D型」、「（R）-2-アミノペンタン酸」およびH-D-Glu-OHと指定することもできる。IUPAC(International Union of Pure and Applied Chemistry)システムにおけるその命名は、(2R)-2-アミノペンタン酸であり、「PubChem Compound」データベースにおけるその識別子は6893-26-1である。
【００５３】
本発明の文脈において、用語「グルタミン酸ラセマーゼ」は、L-グルタミン酸のD-グルタミン酸への相互変換反応を触媒スルタンパク質と理解され、細菌壁合成にとって必要である。そのEC識別子(Enzyme Commission番号)は5.1.1.3である。このタンパク質はそのECコードによりヌクレオチドまたはアミノ酸配列データベースにおいて容易かつ常に同定され、その指定は変化してもよいため、触媒活性がL-グルタミン酸=D-グルタミン酸である酵素を指す。従って、いくつかのアシネトバクター・バウマンニ株においては、グルタミン酸ラセマーゼ酵素機能は、指定が特にL-アラニン-LD-グルタミン酸ラセマーゼ/エピメラーゼ、Asp/Glu/ヒダントインラセマーゼ、バシトラシン合成酵素1(BA1)、アスパラギン酸/グルタミン酸ラセマーゼであるタンパク質に属してもよい。
【００５４】
本発明の文脈において、用語「D-アミノ酸トランスアミナーゼ」は、D-アラニンおよび2-オキソグルタル酸のピルビン酸およびD-グルタミン酸への相互変換反応を触媒するタンパク質と理解される。そのEC識別子は2.6.1.21である。このタンパク質はそのECコードによりヌクレオチドまたはアミノ酸配列データベースにおいて容易かつ常に同定され、その指定は変化してもよいため、触媒活性がD-アラニン+2-オキソグルタル酸=ピルビン酸+D-グルタミン酸である酵素を指す。
【００５５】
本発明の文脈において、用語「D-グルタミン酸に関して栄養要求性である」は、この化合物を合成することができないために、かくして指定の細菌が増殖のために依存する、D-グルタミン酸物質を生成する機能的代謝経路の欠如と理解される。
【００５６】
本発明の文脈において、用語「MurI」は用語「グルタミン酸ラセマーゼ」と同義であると理解される。
【００５７】
本発明の文脈において、用語「Dat」は用語「D-アミノ酸トランスアミナーゼ」と同義であると理解される。
【００５８】
本発明の文脈において、用語「murI」はグルタミン酸ラセマーゼタンパク質をコードする遺伝子またはヌクレオチド配列と理解される。アシネトバクター・バウマンニ、シュードモナス・エルギノーサおよびスタフィロコッカス・オーレウス株に応じて、グルタミン酸ラセマーゼタンパク質をコードする染色体遺伝子を、(限定されるものではないが)murI、murI_1もしくはmurI_2と呼ぶか、またはそれらをその染色体遺伝子座によって独自に同定することができる。
【００５９】
本発明の文脈において、用語「dat」はD-アミノ酸トランスアミナーゼタンパク質をコードする遺伝子またはヌクレオチド配列と理解される。スタフィロコッカス・オーレウス株に応じて、D-アミノ酸トランスアミナーゼタンパク質をコードする染色体遺伝子を(限定されるものではないが)datと呼ぶか、またはそれをその染色体遺伝子座によって独自に同定することができる。
【００６０】
本発明の文脈において、用語「不活化」は、特定の遺伝子またはタンパク質の一方または両方の分子的改変または負の調節による、その一方または両方の発現の遮断と理解される。分子的改変は、従来の組換えDNA技術の使用を含み、次に、1つまたはいくつかのヌクレオチドの置換、1つまたはいくつかのヌクレオチドの挿入、遺伝子の部分的または完全な欠失、突然変異誘発による化学的に誘導された、または放射線により誘導された破壊を含む。遺伝子またはタンパク質の発現の負の調節は、転写および転写後の遺伝子サイレンシングを含む。
【００６１】
本発明の文脈において、用語「アシネトバクター・バウマンニ」は、「真正細菌」ドメイン、「プロテオバクテリア」門、「ガンマプロテオバクテリア」網、「シュードモナス」目、「モラクセラ」科、「アシネトバクター」属、「カルコアセチクス/バウマンニ」複合体および「A.バウマンニ」種に属する任意の微生物と定義される。かくして定義された微生物は、グラム陰性であり、絶対好気性であり、非発酵性であり、オキシダーゼ陰性であることを特徴とする。
【００６２】
本発明の文脈において、用語「ATCC 17978」とは、American Type Culture Collectionにおいて識別子17978を有し、「真正細菌」ドメイン、「プロテオバクテリア」門、「ガンマプロテオバクテリア」網、「シュードモナス」目、「モラクセラ」科、「アシネトバクター」属、「カルコアセチクス/バウマンニ」複合体および「A.バウマンニ」種に属する任意の細菌株を指す。
【００６３】
本発明の文脈において、用語「遺伝子座A1S_0380」は、A.バウマンニ株ATCC 17978の染色体中の物理的位置「0380」と定義され、その遺伝子はA1S_0380またはmurIと呼ばれ、その産物はグルタミン酸ラセマーゼタンパク質である。
【００６４】
本発明の文脈において、用語「遺伝子座A1S_3398」は、A.バウマンニ株ATCC 17978の染色体中の物理的位置「3398」と定義され、その遺伝子はA1S_3398またはmurIと呼ばれ、その産物はグルタミン酸ラセマーゼタンパク質である。
【００６５】
本発明の文脈において、用語「Δ0380」は、アシネトバクター・バウマンニ株ATCC 17978の染色体中の遺伝子座A1S_0380の非存在と定義される。
【００６６】
本発明の文脈において、用語「Δ3398」は、アシネトバクター・バウマンニ株ATCC 17978の染色体中の遺伝子座A1S_3398の非存在と定義される。
【００６７】
本発明の文脈において、用語「二重突然変異Δ0380/Δ3398」は、アシネトバクター・バウマンニ株ATCC 17978の染色体中の遺伝子座A1S_0380およびA1S_3398の同時的非存在と定義される。
【００６８】
本発明の文脈において、用語「ATCC 19606」は、American Type Culture Collectionにおいて識別子19606を有し、「真正細菌」ドメイン、「プロテオバクテリア」門、「ガンマプロテオバクテリア」網、「シュードモナス」目、「モラクセラ」科、「アシネトバクター」属、「カルコアセチクス/バウマンニ」複合体および「A.バウマンニ」種に属する任意の細菌株を指す。
【００６９】
本発明の文脈において、本明細書で用いられる用語「AbH12O-A2」とは、かくして指定され、「真正細菌」ドメイン、「プロテオバクテリア」門、「ガンマプロテオバクテリア」網、「シュードモナス」目、「モラクセラ」科、「アシネトバクター」属、「カルコアセチクス/バウマンニ」複合体および「A.バウマンニ」種に属する細菌株を指す。それは、いくらかの患者の死亡を引き起こした病院での大流行において単離された高侵襲性株であり、複数の抗生物質に関するその耐性パターンを特徴とする(Merinoら、Antimicrob Agents Chemother, 54(6):2724-7 (2010)に記載されている)。
【００７０】
本発明の文脈において、本明細書で用いられる用語「Ab307-0294」とは、かくして指定され、「真正細菌」ドメイン、「プロテオバクテリア」門、「ガンマプロテオバクテリア」網、「シュードモナス」目、「モラクセラ」科、「アシネトバクター」属、「カルコアセチクス/バウマンニ」複合体および「A.バウマンニ」種に属する細菌株を指す。それは、モデル病原体として研究されているA.バウマンニの高毒性莢膜株である(Russoら、Infection and Immunity, 78 (9): 3993-4000 (2010)に記載されている)。
【００７１】
本発明の文脈において、用語「シュードモナス・エルギノーサ」は、「真正細菌」ドメイン、「プロテオバクテリア」門、「ガンマプロテオバクテリア」網、「シュードモナス」目、「シュードモナス」科、「シュードモナス」属および「P.エルギノーサ」種に属する任意の生物と定義される。P.エルギノーサはグラム陰性、好気性、単極移動性の球桿菌である。
【００７２】
本発明の文脈において、用語「PAO1」とは、普遍的識別子PAO1を有し、「真正細菌」ドメイン、「プロテオバクテリア」門、「ガンマプロテオバクテリア」網、「シュードモナス」目、「シュードモナス」科、「シュードモナス」属および「P.エルギノーサ」種に属する任意の細菌株を指す。
【００７３】
本発明の文脈において、用語「PA4662」は、P.エルギノーサ株PAO1の染色体中の物理的位置「4662」と定義され、その遺伝子はPA4662またはmurIと呼ばれ、その産物はグルタミン酸ラセマーゼタンパク質である。
【００７４】
本発明の文脈において、用語「ΔPA4662」は、シュードモナス・エルギノーサ株PAO1の染色体中の遺伝子座PA4662の非存在と定義される。
【００７５】
本発明の文脈において、本明細書で用いられる用語「PA28562」、「PA51430664」、「PA26132」および「PA29475」とは、かくして指定され、「真正細菌」ドメイン、「プロテオバクテリア」門、「ガンマプロテオバクテリア」網、「シュードモナス」目、「シュードモナス」科、「シュードモナス」属および「P.エルギノーサ」種に属する細菌株を指す。
【００７６】
本発明の文脈において、本明細書で用いられる用語「PAST175」とは、MLST配列型175(ST175)を有し、「真正細菌」ドメイン、「プロテオバクテリア」門、「ガンマプロテオバクテリア」網、「シュードモナス」目、「シュードモナス」科、「シュードモナス」属および「P.エルギノーサ」種に属する細菌株を指す。この株は、M. Garcia-Castilloら、Journal of Clinical Microbiology 49 (2011) 2905-2910に記載のように、国際的に拡散した高リスククローンとして以前に同定された。
【００７７】
本発明の文脈において、本明細書で用いられる用語「PA12142」とは、M. Tomasら、Antimicrobial Agents and Chemotherapy 54 (2010) 2219-2224に記載された細菌株12142(流行性リバプール株)を指す。この株は、「真正細菌」ドメイン、「プロテオバクテリア」門、「ガンマプロテオバクテリア」網、「シュードモナス」目、「シュードモナス」科、「シュードモナス」属および「P.エルギノーサ」種に属する。
【００７８】
本発明の文脈において、用語「スタフィロコッカス・オーレウス」は、「真正細菌」ドメイン、「フィルミクテス」門、「バシラス」網、「バシラス」目、「スタフィロコッカス」科、「スタフィロコッカス」属および「S.オーレウス」種に属する任意の微生物と定義される。かくして定義された微生物は、グラム陰性、条件的嫌気性の球菌であることを特徴とする。
【００７９】
本発明の文脈において、用語「132」とは、同じ指定を有し、「真正細菌」ドメイン、「フィルミクテス」門、「バシラス」網、「バシラス」目、「スタフィロコッカス」科、「スタフィロコッカス」属および「S.オーレウス」種に属する任意の細菌株を指す。これは、臨床メチシリン耐性株(Vergara-Irigarayら、Infection and Immunity, 77 (9):3978-3991 (2009))であり、「スタフィロコッカス・オーレウス」の栄養要求性突然変異体を生成するためのモデルとして本発明において用いられたものである。
【００８０】
本発明の文脈において、用語「ΔmurI」は、スタフィロコッカス・オーレウス株132の染色体中の遺伝子座murIの非存在と定義される。
【００８１】
本発明の文脈において、用語「Δdat」は、スタフィロコッカス・オーレウス株132の染色体中の遺伝子座datの非存在と定義される。
【００８２】
本発明の文脈において、用語「二重突然変異ΔmurI/Δdat」は、スタフィロコッカス・オーレウス株132の染色体中のmurIおよびdatの同時的非存在と定義される。
【００８３】
本発明の文脈において、本明細書で用いられる用語「132Δspa」は、同じ指定を有し、「真正細菌」ドメイン、「フィルミクテス」門、「バシラス」網、「バシラス」目、「スタフィロコッカス」科、「スタフィロコッカス」属および「S.オーレウス」種に属する微生物を意味する。かくして定義された微生物は、spa遺伝子中に欠失を有するS.オーレウス132株である(Vergara-Irigarayら、Infection and Immunity, 77 (9):3978-3991 (2009))。
【００８４】
本発明の文脈において、本明細書で用いられる用語「RN4220」は、同じ指定を有し、「真正細菌」ドメイン、「フィルミクテス」門、「バシラス」網、「バシラス」目、「スタフィロコッカス」科、「スタフィロコッカス」属および「S.オーレウス」種に属する微生物を意味する。かくして定義された微生物は、S.オーレウスクローニング中間株である(Nairら、Journal Bacteriology, 193(9): 2332-2335 (2011))。
【００８５】
本発明の文脈において、本明細書で用いられる用語「USA300LAC」は、同じ指定を有し、「真正細菌」ドメイン、「フィルミクテス」門、「バシラス」網、「バシラス」目、「スタフィロコッカス」科、「スタフィロコッカス」属および「S.オーレウス」種に属する微生物を意味する。かくして定義された微生物は、健康な個体における市中感染の原因となる流行性メチシリン耐性S.オーレウス株である(Diepら、Lancet 4; 397(9512):731-739 (2006))。
【００８６】
本発明の文脈において、本明細書で用いられる用語「RF122」とは、MLST配列型151(ST175)およびクローン複合体151(CC151)を有し、「真正細菌」ドメイン、「フィルミクテス」門、「バシラス」網、「バシラス」目、「スタフィロコッカス」科、「スタフィロコッカス」属および「S.オーレウス」種に属する細菌株を指す。かくして定義された微生物は、ウシ臨床型乳腺炎から単離されたウシ乳腺炎を引き起こす株である(Herron-Olson Lら、PloS ONE 2:e1120 (2007))。
【００８７】
本発明の文脈において、本明細書で用いられる用語「ED133」とは、MLST配列型133(ST175)およびクローン複合体133(CC133)を有し、「真正細菌」ドメイン、「フィルミクテス」門、「バシラス」網、「バシラス」目、「スタフィロコッカス」科、「スタフィロコッカス」属および「S.オーレウス」種に属する細菌株を指す。かくして定義された微生物は、フランスにおいて単離されたヒツジ乳腺炎を引き起こす株である(Guinaneら、Genome Biol Evol 2:454-466 (2010))。
【００８８】
本発明の文脈において、本明細書で用いられる用語「ED98」とは、MLST配列型5(ST5)およびクローン複合体5(CC5)を有し、「真正細菌」ドメイン、「フィルミクテス」門、「バシラス」網、「バシラス」目、「スタフィロコッカス」科、「スタフィロコッカス」属および「S.オーレウス」種に属する細菌株を指す。かくして定義された微生物は、疾患を有するブロイラー鶏から単離された鳥適合株である(Lowderら、PNAS 106(46):19545-50 (2009))。
【００８９】
本発明の文脈において、用語「グルタミン酸ラセマーゼ欠損細菌株」は、機能的形態および/または活性形態のグルタミン酸ラセマーゼ酵素を産生することができない任意の細菌株と理解される。この欠損は、それをコードする遺伝子の発現の遮断、酵素活性に影響する転写後改変および翻訳後改変、この酵素のアロステリック調節または細胞における位置に起因するものであってもよい。
【００９０】
本発明の文脈において、用語「受動免疫化」は、個体に対して免疫を付与する意図でのその個体への抗体またはその断片の投与を指すために用いられる。
【００９１】
本発明の文脈において、表現「治療上有効量」とは、所望の効果をもたらすことができる本発明の抗体または本発明の弱毒化細菌株の量を指す。前記組成物中で用いることができる製薬上許容し得るアジュバントおよび担体は、当業者には公知の担体である。本発明により提供される組成物を、該組成物を好適な剤形に、および選択される投与経路にとって薬理学的に許容し得る賦形剤と共に製剤化するための任意の投与経路を介して促進することができる。
【００９２】
本発明の文脈において、用語「ワクチン」とは、疾患に対する免疫系の応答を確立するために用いられる抗原調製物を指す。
発明の詳細な説明
既に述べた通り、細菌株がD-グルタミン酸を産生する能力を完全に失っている場合、それはD-グルタミン酸に関して栄養要求性である。本発明を通して、本発明者らは、D-グルタミン酸に関して栄養要求性である細菌株が、それらをワクチンとしての使用にとって特に好適なものにする特徴を有することを示す。これらの特定の型の細菌株(D-グルタミン酸に関して栄養要求性である)は十分に無毒であり(弱毒化される)、許容できない病理学的効果を回避する、宿主における十分なレベルの免疫を誘導する、および毒性野生型株に戻る可能性が実質的にないため、これは事実である。
【００９３】
これらの特徴は全て、様々な細菌株において潜在的な用途を有するワクチン(普遍性)の設計および産生のための新規技術プラットフォームを提供する。この事実(本発明の多用途性または普遍性)は、著者らが3つの完全に無関係の細菌種(アシネトバクター・バウマンニ(A.バウマンニ)、シュードモナス・エルギノーサ(P.エルギノーサ)およびスタフィロコッカス・オーレウス(S.オーレウス))において本発明を実施したため、本発明を通して明確に証明される。これらの完全に無関係の細菌種のそれぞれについて、D-グルタミン酸栄養要求株を産生し、以下の実施例で示されるように、これらの突然変異株は全て十分に無毒であり(弱毒化される)、許容できない病理学的効果を回避したが、宿主において十分なレベルの免疫を誘導することができた。結果として、これらの株は優れたワクチン候補である。
【００９４】
上記を証明するために、本発明の著者らは最初に、全てのD-グルタミン酸栄養要求株が宿主において許容できない病理学的効果をもたらすことができない弱毒化株を生じることを証明する必要があった。この目的のために、著者らは院内感染病原体A.バウマンニを用いた(実施例5を参照されたい)。
【００９５】
この目的のために、また実施例5に示されるように、本発明の著者らは、一方ではA.バウマンニ野生型株ATCC 17978の接種材料の腹腔内投与により、他方では二重突然変異株Δ0380/Δ3398(グルタミン酸ラセマーゼ酵素が欠損するA.バウマンニ株、かくして、D-グルタミン酸栄養要求株)の接種材料の腹腔内投与により、BALB/cマウスにおいて全身感染を誘導した。
【００９６】
図10Aは、この実験の結果の一部；特に、増大する用量の野生型株に感染させた場合のマウスの様々な生存のパーセンテージを例示する。このデータから、2X以降の用量がマウスの生存の徐々の低下をもたらすと結論付けることができる。事実、野生型株ATCC 17978に関する、マウスの生存を0%にまで低下させるのに必要な最小用量と理解される致死用量100(LD100)は2.5Xであることを観察することができる。さらに、この図面はまた、用量が3Xを超える場合、生存パーセンテージの非常に急速な低下が観察されることも示した。
【００９７】
他方、図10Bは、増大する用量の二重突然変異株Δ0380/Δ3398に感染させたマウスの様々なレベルの生存率を示す。この場合、および図10Aとは明確に対照的に、LD100(致死用量100)は6Xである。この用量は、野生型株に対応する致死用量よりも確実にはるかに高い。事実、6X用量は、マウスの死亡が細菌の複製に起因するものではないが、敗血性ショックに起因するものであったと本発明の著者らが堅く信じるほど高く、これ(二重突然変異株)が無毒であるか、または弱毒化された細菌株であることを明確に示している。
【００９８】
さらに、および上記結果を確認するために、本発明の著者らは、実施例6で観察することができるように、A.バウマンニの以下の接種材料：野生型株ATCC 17978および突然変異株Δ0380、Δ3398およびΔ0380/Δ3398の腹腔内投与によりBALB/cマウスにおける全身感染を誘導した。
【００９９】
この意味において、本発明の実施例に示されるように、前記段落で使用および言及された全ての株のうち、二重突然変異株Δ0380/Δ3398のみがD-グルタミン酸に関して栄養要求性であり、かくして、増殖および生存のための培養培地中への外因性D-グルタミン酸の添加を必要とすると考えられることに留意することが重要である。さらに、実施例6に例示される急性感染のモデルにおいて、感染は細菌の血液を介する急速な拡散によって生じ、かくして、感染後11〜30時間でマウスの死亡をもたらすこともわかる(図10Aを参照されたい)。最後に、肝臓における細菌計数から、本発明の著者らは異なる株の侵襲および複製能力の測定値を得ることができることに留意することも重要である。
【０１００】
前記および図11に示されるように、実施例6に例示される実験から以下の平均値が得られた：野生型株に感染したマウスの肝臓中では8.29Log10CFU(コロニー形成単位)/g；Δ0380株に感染したマウスの肝臓中では6.88Log10CFU/g；突然変異株Δ3398に感染したマウスの肝臓中では8.06 Log10CFU/gおよび二重突然変異株Δ0380/Δ3398に感染したマウスの肝臓中では1.59 Log10CFU/g。
【０１０１】
これらの結果に基づいて、二重突然変異株Δ0380/Δ3398および突然変異株Δ0380の計数は野生型株について観察されるものよりもかなり低いと結論付けることができる。最も劇的かつ明確な低下は、二重突然変異株Δ0380/Δ3398のコロニー数を分析する場合に観察されるものであり、平均細菌量のほぼ7Log10の値の低下が観察された。さらに、驚くべきことに、二重突然変異株に感染したマウスの44.4%において、細菌は回収されなかった。
【０１０２】
結果として、再度、これは、これ(二重突然変異株)が無毒であるか、または弱毒化された細菌株であることを明確に示している。
【０１０３】
それにも拘わらず、本発明の著者らは、プラットフォームの普遍性を確認するために、2つのさらなる完全に無関係の細菌種、すなわち、P.エルギノーサおよびS.オーレウスに関するD-グルタミン酸栄養要求株を用いるさらなる実験を行った。本発明者らが以下に示すように、これらの2つの種の栄養要求株はまた、宿主において許容できない病理学的効果をもたらすことができない弱毒化株を産生した。
【０１０４】
この意味において、実施例16に示されるように、急性敗血症感染中の3つの株の致死用量を決定するために、BALB/cマウスに様々な用量のP.エルギノーサPAO1野生型株および突然変異株ΔPA4662を投与した。マウスを、感染後7日間モニタリングし、様々な用量の注射された細菌について生存率を決定した。
【０１０５】
図24Aにおいて、本発明者らは、増大する用量のP.エルギノーサPAO1野生型株に感染した動物における様々な程度の生存を観察することができる。この株については、LD100は0.4Xである。図24Bにおいては、本発明者らは、増大する用量のΔPA4662突然変異株に感染した動物における様々な程度の生存を観察することができる。この株については、LD100は40Xを超え、敗血性ショックに由来する(細菌の複製によるものではない)マウスの死亡をもたらし得る非常に高用量の細菌接種材料である。これは、この株(ΔPA4662)が野生型株と比較して非常に低い毒性を有することを示している(野生型株のLD100よりも100倍高い用量のみがマウスの生存率を50%低下させる)。
【０１０６】
最後に、本発明の著者らは、さらなる細菌種を用いることにより、すなわち、S.オーレウス種に属するD-グルタミン酸栄養要求株も宿主において許容できない病理学的効果をもたらすことができない弱毒化された株を産生することを証明することにより、本発明のプラットフォーム技術の普遍性の概念をさらに確認した。
【０１０７】
この意味において、および実施例25に例示されるように、3%ブタムチンを含む腹腔内注射によりS.オーレウス132野生型および二重突然変異株でBALB/cマウスの全身感染をもたらした。
【０１０８】
図35Aに示されるように、これらのマウスの生存を0%にまで低下させる野生型株の最小用量は、LD100=3Xであると決定された。図35Aとは明確に対照的に、図35Bは、野生型株のLD100よりも10倍高い二重突然変異体の用量の接種は100%の生存率をもたらすことを示している。従って、二重突然変異体の致死用量は、30X LD100>30Xよりも高い。これは、S.オーレウスの二重突然変異体が野生型の対応物よりも低い毒性能力を示す弱毒化された株であることを明確に示している。
【０１０９】
まとめると、これらのデータは、D-グルタミン酸に関して栄養要求性である全ての細菌株が弱毒化されていることを示す。しかしながら、細菌株はまた免疫応答を生成し、防御を誘導することができなければならないため、それがワクチン候補として有用であるように弱毒化されるだけでは十分ではないことが広く知られている。さらに、これらの突然変異株は交差防御を付与するのに免疫学的に必要な全ての抗原を選択的に含有するべきである。
【０１１０】
かくして、異なるワクチン接種レジメンに対する抗体により媒介される免疫応答を評価するために、著者らは、0および14日目に1X用量を用いることにより二重突然変異株Δ0380/Δ3398の腹腔内注射によりBALB/cマウスを免疫する実施例8に例示される実験を行った。さらに、対照マウスのさらなる群に、同様に0および14日目に塩水血清を投与した。免疫化後7日目に、単回用量のワクチンで免疫した(0日目に投与した)マウスからの血清を回収し、同様に、1回目の投与の21日後に、残りの用量でも免疫したマウスからの血清も、塩水血清を注射した血清から、対照マウスからの血清と共に回収した。
【０１１１】
これらの血清を用いて、ATCC 17978、ATCC 19606およびAbH12O-A2などのA.バウマンニの異なる株に対してELISA技術を用い、かくして、幅広い免疫応答を生成するワクチンの能力を測定することにより、抗体(IgG)の力価を決定した(実施例9)。A.バウマンニ株AbH12O-A2が、いくらかの患者を殺傷した病院での大流行において単離された高侵襲性株であり、複数の抗生物質に対する耐性パターンを特徴とすることは注目に値する。
【０１１２】
全ての免疫したマウスにおいて、ワクチン非接種マウスと比較して野生型株に対して有意なレベルの抗体が検出された(図13)。抗体産生は、ワクチン非接種マウスと比較して、7および21日目に、すなわち、それぞれ、二重突然変細菌株Δ0380/Δ3398の第1の用量および第2の用量の注射後に有意に上昇した。さらに、21日目(二重突然変異株Δ0380/Δ3398の2回連続の注射後)での抗体の産生は、7日目での抗体の産生よりも有意に高かった。A.バウマンニ野生型株ATCC 17978に対する21日目で得られた抗体の産生は、A.バウマンニ株ATCC 19606およびA.バウマンニAbH12O-A2に対して得られたものと類似していた(図15)。この結果は、Δ0380/Δ3398株を用いる免疫化が野生型株に対する抗体を生成するだけでなく、ATCC 19606株およびAbH12O-A2株などの異なる耐性および毒性パターンを有する多の細菌株に対して反応するIgG抗体も生成することを示している。
【０１１３】
さらに、これらの細菌(D-グルタミン酸に関して栄養要求性である細菌株)が強力な免疫応答を生成することができたことをさらに確認するために、細菌種P.エルギノーサおよびS.オーレウスにおいてさらなる実験を行った。
【０１１４】
実施例16に例示されるように、投与後40日目で検出した場合でも、IgG産生を有意に誘発するには、0.1XのP.エルギノーサΔPA4662突然変異株の1回ワクチン用量で十分である(図44)。それにも拘わらず、0.4Xと等しいか、またはそれより多いワクチン用量はより高レベルのIgG産生を惹起する。さらに、IgG産生は、第2のワクチン用量が投与される場合に有意により高い(図45)。
【０１１５】
さらに、ΔPA4662をワクチン接種されたマウスおよび塩水を投与されたマウスから得られた血清を用いて異なる株のP.エルギノーサに関してELISAを実施して、ΔPA4662ワクチンが幅広い免疫応答を生成する能力を測定した。P.エルギノーサ株PAO1に関して観察されたものと同様の結果がPA28562株に関して得られたが、試験した残りのP.エルギノーサ株に関しても高レベルの交差反応性が見られた(図46)。これは、ΔPA4662株を用いる免疫化が同系野生型株に対する抗体を生成するだけでなく、複数のP.エルギノーサ株に対して反応するIgG抗体も生成することを示している。
【０１１６】
最後に、実施例28および29に例示されるように、本発明の著者らは、S.オーレウスの株(S.オーレウス132Δspa、プロテインA欠損と呼ばれる)に対する抗体により媒介される免疫応答ならびにヒトおよび動物起源の4つの無関係のS.オーレウス株に対する交差反応性を評価した。この目的のために、BALB/cマウスを、0および14日目に二重突然変異株ΔmurI/Δdatの腹腔内注射により免疫した。21日目に採取された各マウスに由来する血清試料を用いて、同系S.オーレウス132Δspa株(図39)、ならびに流行性MRSA市中感染型USA300LAC株および動物起源の3つの株(図40)に対する抗体(IgG)の力価を決定した。図39および40に示されるように、二重突然変異株ΔmurI/Δdatで免疫された全てのマウスは、ワクチン非接種マウスと比較して、各細菌に対する有意なレベルの特異的抗体を産生したが、これは、同系Δspa対応物だけでなく、臨床流行株ならびにウシ、ヒツジおよび家禽などの異なる宿主から単離された他の株を認識するIgG抗体を惹起するS.オーレウスΔmurI/Δdat突然変異体の能力を示している。
【０１１７】
従って、提示されたデータは、今までのところ、D-グルタミン酸に関して栄養要求性である全ての細菌株が弱毒化されていることを示すだけでなく、これらの株が免疫応答を生成し、交差防御を付与するために免疫学的に必要な全ての抗原を含有することも示している。
【０１１８】
最後に、D-グルタミン酸に関して栄養要求性である細菌株が許容可能なレベルの防御を付与するかどうかを検証するために、本発明の著者らは、院内感染病原体A.バウマンニを用いる一連の実験を行って、二重突然変異株Δ0380/Δ3398のワクチンとしての有効性を評価した。実施例10に例示されるように、突然変異株Δ0380/Δ3398を0および14日目にBALB/cマウスに投与した。対照マウスには同様に0および14日目に塩水のみを投与した。1回目の注射の21日後、マウスをA.バウマンニ株ATCC 17978、AbH12O-A2およびAb307-0294で独立にチャレンジして、致死全身感染を確立した。チャレンジ後、マウスを7日間モニタリングして、対照マウス(ワクチン非接種)と比較したワクチン接種マウスの生存率を決定した。
【０１１９】
A.バウマンニATCC 17978株に感染させた場合、最初の24時間でワクチン非接種マウス群において11匹の死亡が観察されたが、これは、この群における死亡率が92%であることを意味する。対照的に、全てのワクチン接種したマウスがチャレンジに対して生存し、感染を克服したが、これは、この群における生存率が100%であることを意味する(図16を参照されたい)。
【０１２０】
さらに、Δ0380/Δ3398株を用いる免疫化により産生される応答が、高毒性および病原性株を含む他のA.バウマンニ株による致死的感染からの防御を提供するのに十分なものであるかどうかを決定した。AbH12O-A2株を用いるチャレンジの場合、最初の19時間でワクチン非接種マウス群において9匹の死亡が観察されたが、これは、死亡率が100%であることを意味する。対照的に、全てのワクチン接種したマウスは生存した(100%の生存率)(図17を参照されたい)。
【０１２１】
Ab307-0294莢膜株によるチャレンジの場合、本発明者らは最初の24時間以内でワクチン非接種マウス群における100%の死亡率およびΔ0380/Δ3398株で予め免疫したマウス群における83%の生存率を記録した(図18を参照されたい)。これは、突然変異株を用いるワクチン接種が顕著な毒性を有するA.バウマンニ株により引き起こされる全身感染に対する防御を付与することを確認するものである。
【０１２２】
これらの結果は全て、Δ0380/Δ3398株を用いるワクチン接種が多様な群のA.バウマンニ株による感染に対する防御免疫を提供することができることを示唆する。
【０１２３】
さらに、D-グルタミン酸に関して栄養要求性である他の細菌株も許容可能なレベルの防御を付与するかどうかを検証するために、本発明の著者らは、病原体P.エルギノーサ(実施例18に例示される)およびS.オーレウス(実施例26および27に例示される)を用いるさらなる実験を行った。
【０１２４】
実施例18に例示されるように、PA4662突然変異株を0および14日目にBALB/cマウスに投与した。対照マウスには同じ日に塩水のみを投与した。1回目の注射の25日後、マウスをP.エルギノーサPAO1でチャレンジして、致死的全身感染を確立した。チャレンジ後、マウスを7日間モニタリングして、対照マウスと比較したワクチン接種したマウスの生存率を決定した。
【０１２５】
P.エルギノーサPAO1野生型株に感染させた場合、最初の15時間でワクチン非接種マウス群において8匹の死亡が観察されたが、これは、この群における死亡率が100%であることを意味する。対照的に、全てのワクチン接種したマウスはチャレンジに対して生存し、感染を克服したが、これは、この群における生存率が100%であることを意味する(図26を参照されたい)。
【０１２６】
実施例26に示されるように、ワクチンとしてのS.オーレウス二重突然変異株ΔmurI/Δdatの有効性(防御レベル)を評価するために、BALB/cマウスを0および14日目に二重突然変異株ΔmurI/Δdatで腹腔内的に免疫した。1群のマウスに同じ日に塩水を投与した。21日目に、マウスをS.オーレウス野生型株の致死的接種材料に感染させた。感染後20または22時間(それぞれ、図36および37)で、マウスの脾臓および血液中の細菌計数を決定した。従って、S.オーレウスの二重突然変異株ΔmurI/Δdatを用いるワクチン接種の防御効果は、細菌量の有意な減少を引き起こすこの株を用いる予備免疫化として確認された。
【０１２７】
さらに、実施例27に示されるように、ΔmurI/Δdat株を用いて予め免疫されたBALB/cマウスを致死用量のS.オーレウス132野生型株でチャレンジした場合、非免疫マウスと比較して生存の有意差が観察された。この場合、ワクチン接種群の8匹のマウスがチャレンジに対して生存し、感染を克服したが、これは、この群における生存率が61.5%であることを意味するが(図38)、ワクチン非接種群においては90%の死亡率が観察された。
【０１２８】
総合すると、これらの結果は、ΔPA4662およびΔmurI/Δdat株を用いるワクチン接種がそれぞれ、P.エルギノーサおよびS.オーレウスによる感染に対する防御免疫を提供することを示している。
【０１２９】
本明細書に記載される実験例は、D-グルタミン酸に関して栄養要求性である細菌株が許容できない病理学的効果を回避するのに十分に無毒である(弱毒化される)、投与経路とは無関係に宿主における十分なレベルの免疫を誘導する、ならびに能動または受動免疫化におけるその使用のための実質的なレベルの安全性(環境的安全性と宿主にとっての安全性の両方)を有することを確立する手順および結果を提供する。
【０１３０】
従って、本発明の一実施形態は、D-グルタミン酸を産生することが最早できないワクチン候補として好適な生きた弱毒化細菌に関する。
【０１３１】
ワクチン候補としての本発明による使用のための生きた弱毒化細菌を、以下に説明されるいくつかの方法で取得することができる。この意味において、グラム陽性細菌とグラム陰性細菌は両方とも、それらにその特徴的な形状を与え、それらに機械的防御を提供するペプチドグリカン細胞壁を有すると理解することが重要である。ムレインとしても知られるペプチドグリカンは、糖とアミノ酸とからなるポリマーであり、細菌(古細菌ではない)の細胞膜の外側のメッシュ様層を形成し、細胞壁を形成する。糖成分はβ-(1,4)結合N-アセチルグルコサミンとN-アセチルムラミン酸の交互の残基からなる。
【０１３２】
ペプチドグリカン層は、グラム陰性細菌(7〜8ナノメートル)におけるよりもグラム陽性細菌(20〜80ナノメートル)において実質的に厚く、S-層の結合を有する。ペプチドグリカンはグラム陽性細菌の乾燥重量の約90%を形成するが、グラム陰性株では10%に過ぎない。かくして、高レベルのペプチドグリカンの存在は、グラム陽性としての細菌の特性評価の主要な決定因子である。グラム陽性株においては、結合の役割および血清型決定の目的で重要である。グラム陽性細菌とグラム陰性細菌の両方について、約2nmの粒子はペプチドグリカン細胞壁を通過することができる。
【０１３３】
図1および2に明確に例示されるように、D-グルタミン酸は、ペプチドグリカン細胞壁の主成分の1つであり、かくして、D-グルタミン酸は細胞壁ペプチドグリカン合成にとって必要である。2つの酵素がD-グルタミン酸の形成を触媒する(図3を参照されたい):
1. 化学反応：L-グルタミン酸⇔D-グルタミン酸を触媒する酵素であるグルタミン酸ラセマーゼ(EC5.1.1.3)、MurI。かくして、この酵素は1つの基質L-グルタミン酸と、1つの生成物D-グルタミン酸とを有する；および
2. 以下の化学反応:D-アラニン + 2-オキソグルタル酸⇔ピルビン酸 + D-グルタミン酸を触媒する酵素であるD-アミノ酸トランスアミナーゼ、Dat(EC2.6.1.21)。従って、この酵素の2つの基質はD-アラニンおよび2-オキソグルタル酸であるが、その2つの生成物はピルビン酸およびD-グルタミン酸である。
【０１３４】
D-グルタミン酸は、一度合成されたら、特定の酵素、すなわち、UDP-N-アセチルムラモイル-L-アラニン:D-グルタミン酸リガーゼ酵素(EC6.3.2.9)によるペプチドグリカン細胞壁にモノマー単位として付加される。
【０１３５】
従って、D-グルタミン酸の形成を触媒することができる2つの酵素は、グルタミン酸ラセマーゼとD-アミノ酸トランスアミナーゼである。しかしながら、D-アミノ酸トランスアミナーゼ酵素は全ての細菌株に存在するわけではない。対照的に、グルタミン酸ラセマーゼ遺伝子は、アシネトバクター・バウマンニ、バシルス・アントラシス、バシルス・セレウス、バシルス・スブチリス、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、大腸菌、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、スタフィロコッカス・オーレウス、シュードモナス・エルギノーサ、ストレプトコッカス・ピオゲネスなどのペプチドグリカンを産生する全ての種において保存されている。
【０１３６】
大腸菌を含む、これらの細菌の多くにおいて、かくしてD-グルタミン酸の合成を触媒することができる唯一のタンパク質、すなわち、グルタミン酸ラセマーゼが存在する。これらの場合、この酵素は細胞中のD-グルタミン酸の唯一の供給源であるため、細菌増殖にとって必須である。しかしながら、スタフィロコッカス・ヘモリティクス、バシルス・スフェリクス、バシルス種YM-1およびS.オーレウスなどの他の細菌においては、Datタンパク質とMurIタンパク質は両方とも存在し、かくして、互いに機能的に相補的であり得る。
【０１３７】
大腸菌と同様、A.バウマンニATCC 17978はDatタンパク質を有することができないが、MurIをコードする2つの異なる遺伝子、特に、MurI1(A1S_0380遺伝子座)およびMurI2(A1S_3398遺伝子座)を含む。両遺伝子は、アミノ酸レベルで互いに29.8%の同一性を示し、それぞれ、大腸菌K12 MurIタンパク質との33.2%および23.2%の同一性を示す。
【０１３８】
従って、D-グルタミン酸に関する栄養要求株を、その遺伝子またはグルタミン酸ラセマーゼMurIをコードする異なる遺伝子の不活化、およびまた、DatとMurIタンパク質の両方をさらに含む細菌については、D-アミノ酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のさらなる不活化を介して容易に取得することができる。これは、Dat酵素を含まない細菌については、いくつかの場合、D-グルタミン酸に関する栄養要求株を産生するために、大腸菌株K12およびP.エルギノーサ株PAO1の場合などでは、グルタミン酸ラセマーゼの単一の遺伝子の不活化が必要であり、他の場合、A.バウマンニATCC 17978の株の場合と同様、グルタミン酸ラセマーゼをコードする2つの異なる遺伝子の不活化が必要であるか、またはいくつかの他の場合、A.バウマンニ株ABNIH10の場合など、すなわち、グルタミン酸ラセマーゼをコードする遺伝子の全体を不活化することにより、グルタミン酸ラセマーゼのための3つの異なる遺伝子の不活化が必要であることを意味する。他の場合、スタフィロコッカス・オーレウス、スタフィロコッカス・ヘモリティクス、バシルス・スフェリクスおよびバシルス種YM-1のようないくつかのグラム陽性細菌の場合と同様、MurIタンパク質をコードする遺伝子ならびにD-トランスアミナーゼ酵素Datをコードする遺伝子の両方の不活化が必要である。
【０１３９】
結果として、本発明の第1の態様は、D-グルタミン酸に関して栄養要求性である生きた弱毒化細菌株に基づくワクチンの設計および産生のための新規プラットフォーム技術に関する。この新規プラットフォーム技術は、様々な細菌株における潜在能力を有する(普遍性)。著者らは実施例に示されるように3つの完全に無関係の細菌種(アシネトバクター・バウマンニ(A.バウマンニ)、シュードモナス・エルギノーサ(P.エルギノーサ)およびスタフィロコッカス・オーレウス(S.オーレウス))において本発明を実施したため、この事実(本発明の多用途性または普遍性)は本発明を通して明確に示された。
【０１４０】
かくして、本発明の第1の態様の好ましい実施形態は、D-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株を含む医薬組成物、好ましくは、ワクチンの製造方法であって、該医薬組成物が該組成物の栄養要求性突然変異細菌株の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)にとって好適であり、前記医薬組成物が、a. D-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株を取得する工程；
b. 前記生きた栄養要求性突然変異細菌株を製薬上許容し得る担体または希釈剤中に導入し、必要に応じてアジュバントを添加する工程；および
c. 必要に応じて、前記医薬組成物を凍結乾燥する工程
を含む方法により製造される、前記方法に関する。
【０１４１】
本発明の第1の態様の別の好ましい実施形態においては、製造方法は、
a. グルタミン酸ラセマーゼおよびおそらくD-アミノ酸トランスアミナーゼを発現することができ、ペプチドグリカン細胞壁を含む細菌株を提供する工程；
b. 細菌株が最早機能的グルタミン酸ラセマーゼおよび/または機能的D-アミノ酸トランスアミナーゼを発現することができないように、グルタミン酸ラセマーゼ酵素をコードする遺伝子、必要に応じて、D-アミノ酸トランスアミナーゼ酵素をコードする遺伝子を不活化する工程であって、前記遺伝子の不活化がかくして前記細菌株をD-グルタミン酸に関して栄養要求性にする、前記工程；ならびに
c. 前記生きた栄養要求性突然変異細菌株を製薬上許容し得る担体または希釈剤中に導入し、必要に応じて、アジュバントを添加する工程；ならびに
d. 必要に応じて、前記医薬組成物を凍結乾燥する工程
を含む。
【０１４２】
上記の工程b)に記載の不活化は、不活化が機能的グルタミン酸ラセマーゼおよび/または機能的D-アミノ酸トランスアミナーゼタンパク質を発現することができなくなるという条件で、挿入、欠失、置換またはその組合せであってもよい。機能的グルタミン酸ラセマーゼおよび/または機能的D-アミノ酸トランスアミナーゼタンパク質は、野生型タンパク質の調節特性を有するタンパク質であると理解される。従って、欠損し、かくして、D-グルタミン酸の合成に参画することができないグルタミン酸ラセマーゼおよび/または機能的D-アミノ酸トランスアミナーゼタンパク質は非機能的タンパク質であると考えられる。
【０１４３】
本発明の第1の態様またはその好ましい実施形態のいずれかの別の好ましい実施形態においては、医薬組成物はワクチンであり、製造方法はアジュバントの添加を含む。
【０１４４】
本発明の第1の態様またはその好ましい実施形態のいずれかの別の好ましい実施形態においては、工程a)の細菌株は、グラム陽性またはグラム陰性細菌である。好ましくは、工程a)の細菌株は、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、アシネトバクター・バイリ(Acinetobacter baylyi)、アシネトバクター・カルコアセチクス(Acinetobacter calcoaceticus)、アシネトバクター・ヘモリティクス(Acinetobacter haemolyticus)、アシネトバクター・ジュニ(Acinetobacter junii)、アシネトバクター・ルウォフィ(Acinetobacter lwoffii)、アシネトバクター・ノソコミアリス(Acinetobacter nosocomialis)、アシネトバクター・ピッチ(Acinetobacter pittii)、アシネトバクター・ラジオレジステンス(Acinetobacter radioresistens)、アクチノバシラス・リグニエレシ(Actinobacillus lignieresii)、アクチノバシラス・スイス(Actinobacillus suis)、アエロモナス・カビエ(Aeromonas caviae)、アエロモナス・ヒドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、アエロモナス・ベロニ亜種ソブリア(Aeromonas veronii subsp. sobria)、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、アルコバクター・ブツレリ(Arcobacter butzleri)、アルコバクター・ニトロフィギリス(Arcobacter nitrofigilis)、バシラス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バシラス・アントラシス(Bacillus anthracis)、バシラス・バタビエンシス(Bacillus bataviensis)、バシラス・セルロシリティクス(Bacillus cellulosilyticus)、バシラス・セレウス(Bacillus cereus)、バシラス・クラウシ(Bacillus clausii)、バシラス・リシェニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バシラス・プミルス(Bacillus pumilus)、バシラス・スブチリス(Bacillus subtilis)、バシラス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)、バクテロイデス・フラギリス(Bacteroides fragilis)、ボルデテラ・アビウム(Bordetella avium)、ボルデテラ・ブロンキセプティカ(Bordetella bronchiseptica)、ボルデテラ・ペルツシス(Bordetella pertusis)、ボルデテラ・ペトリ(Bordetella petrii)、ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)、ブルセラ・メリテンシス(Brucella melitensis)、ブルセラ・スイス(Brucella suis)、ブルクホルデリア・セノセパシア(Burkholderia cenocepacia)、ブルクホルデリア・マレイ(Burkholderia mallei)、ブルクホルデリア・マルチボランス(Burkholderia multivorans)、ブルクホルデリア・シュードマレイ(Burkholderia pseudomallei)、ブルクホルデリア・サイランデンシス(Burkholderia thailandensis)、カンピロバクター・コンシサス(Campylobacter concisus)、カンピロバクター・フェタス亜種フェタス(Campylobacter fetus subsp. fetus)、カンピロバクター・フェタス亜種ベネレアリス(Campylobacter fetus subsp. venerealis)、カンピロバクター・グラシリス(Campylobacter gracilis)、カンピロバクター・ホミニス(Campylobacter hominis)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・レクタス(Campylobacter rectus)、カンピロバクター・ショワエ(Campylobacter showae)、カンピロバクター・ウプサリエンシス(Campylobacter upsaliensis)、シトロバクター・フレウンジ(Citrobacter freundii)、シトロバクター・コセリ(Citrobacter koseri)、クロストリジウム・アスパラギフォルム(Clostridium asparagiforme)、クロストリジウム・ボツリナム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ブチリカム(Clostridium butyricum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・ペ��フリンゲンス(Clostridium perfringens)、クロストリジウム・サッカロブチリカム(Clostridium saccharobutylicum)、クロストリジウム・テタニ(Clostridium tetani)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diphtheriae)、コリネバクテリウム・シュードツベルクロシス(Corynebacterium pseudotuberculosis)、エンテロバクター・エアロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エリジペロスリックス・ルジオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)、大腸菌(Escherichia coli)、フソバクテリウム・ネクロフォラム(Fusobacterium necrophorum)、フソバクテリウム・ネクレアタム(Fusobacterium nucleatum)、グラヌリカテラ・アジアセンス(Granulicatella adiacens)、グラヌリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ヘモフィルス・エクイゲニタリス(Haemophilus equigenitalis)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・パラインフルエンザ(Haemophilus parainfluenzae)、ヘモフィルス・パラガリナルム(Haemophilus paragallinarum)、ヘモフィルス・パラスイス(Haemophilus parasuis)、ヘモフィルス・プルロニューモニエ(Haemophilus pleuropneumoniae)、ヘモフィルス・ソムナス(Haemophilus somnus)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、レジオネラ・オークリジエンシス(Legionella oakridgensis)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、レプトスピラ・ビフレクサ(Leptospira biflexa)、レプトスピラ・イリニ(Leptospira illini)、レプトスピラ・インテロガンス(Leptospira interrogans)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、リシニバシラス・フシフォルミス(Lysinibacillus fusiformis)、リシニバシラス・スフェリクス(Lysinibacillus sphaericus)、モラクセラ・ボビス(Moraxella bovis)、モルガネラ・モルガニ(Morganella morganii)、マイコバクテリウム・アブセサス(Mycobacterium abscessus)、マイコバクテリウム・アフリカナム(Mycobacterium africanum)、マイコバクテリウム・アビウム(Mycobacterium avium)、マイコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis)、マイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノロア(Neisseria gonorrhoeae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、プレシオモナス・シゲロイデス(Plesiomonas shigelloides)、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)、プロテウス・ハンセリ(Proteus hanseri)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ(Salmonella enterica subsp. enterica)、サルモネラ・エンテリティディス(Salmonella enteritidis)、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、セラチア・プリムチカ(Serratia plymuthica)、シゲラ・ボイジ(Shigella boydii)、シゲラ・ディセンテリア(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレクスネリ(Shigella flexneri)、スタフィロコッカス・アルレッタ(Staphylococcus arlettae)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・カピティス(Staphylococcus capitis)、スタフィロコッカス・カプラ(Staphylococcus caprae)、スタフィロコッカス・カルノサス(Staphylococcus carnosus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・エクオラム(Staphylococcus equorum)、スタフィロコッカス・ヘモリティクス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス(Staphylococcus lugdunensis)、スタフィロコッカス・パステウリ(Staphylococcus pasteuri)、スタフィロコッカス・ペッテンコフェリ(Staphylococcus pettenkoferi)、スタフィロコッカス・シュードインテルメディウス(Staphylococcus pseudointermedius)、スタフィロコッカス・サプロフィティクス(Staphylococcus saprophyticus)、スタフィロコッカス・シミア(Staphylococcus simiae)、スタフィロコッカス・シムランス(Staphylococcus simulans)、スタフィロコッカス・ワルネリ(Staphylococcus warneri)、ステノトロフォモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ディスガラクチア(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ディスガラクチア亜種エクイシミリス(Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis)、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・ウベリス(Streptococcus uberis)、ストレプトコッカス・ズーエピデルミクス(Streptococcus zooepidermicus)、タイロレラ・アシニゲニタリス(Taylorella asinigenitalis)、タイロレラ・エクイゲニタリス(Taylorella equigenitalis)、トレポネマ・カラテウム(Treponema carateum)、トレポネマ・クニクリ(Treponema cuniculi)、トレポネマ・ヒオジセンテリア(Treponema hyodisenteriae)、トレポネマ・パリダム(Treponema pallidum)、トレポネマ・スイス(Treponema suis)、ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・ジスパル(Veillonella dispar)、ベイロネラ・パルブラ(Veillonella parvula)、ベイロネラ・ラッティ(Veillonella ratti)、ビブリオ・コレラ(Vibrio cholerae)、ビブリオ・パラヘモリティクス(Vibrio parahaemolyticus)、ビブリオ・ブルニフィカンス(Vibrio vulnificans)、エルシニア・エンテロコリティカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)およびエルシニア・シュードツベルクロシス(Yersinia pseudotuberculosis)からなる細菌種の一覧から選択される。より好ましくは、工程a)の前記細菌株は、以下の種：アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)およびスタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)からなる一覧から選択される。さらにより好ましくは、細菌株は、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii) Delta0380/Delta3398と命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8588と共に2014年4月14日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたA.バウマンニの細菌株である。さらにより好ましくは、細菌株は、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa) DeltaPA4662と命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8589と共に2014年4月14日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたP.エルギノーサの細菌株である。さらにより好ましくは、細菌株は、132deltamurI/deltadatと命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8587と共に2014年6月11日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたS.オーレウスの細菌株である。
【０１４５】
さらに、本発明の第1の態様の1つのさらなる実施形態は、ワクチン候補として好適な生きた弱毒化細菌株の製造方法(以後、「本発明の生きた弱毒化細菌株の製造方法」という)であって、
a. グルタミン酸ラセマーゼおよびおそらくD-アミノ酸トランスアミナーゼを発現することができ、ペプチドグリカン細胞壁を含む細菌株を提供する工程；ならびに
b. 細菌株が機能的グルタミン酸ラセマーゼおよび/または機能的D-アミノ酸トランスアミナーゼを発現することが最早できないように、グルタミン酸ラセマーゼ酵素をコードする遺伝子、および必要に応じて、D-アミノ酸トランスアミナーゼ酵素をコードする遺伝子を不活化する工程
を含み、前記遺伝子の不活化がかくして前記細菌株をD-グルタミン酸に関して栄養要求性にする、前記方法に関する。
【０１４６】
「本発明の生きた弱毒化細菌株の製造方法」の好ましい実施形態においては、工程a)の細菌株はグラム陽性またはグラム陰性細菌である。
【０１４７】
「本発明の生きた弱毒化細菌株の製造方法」の別の好ましい実施形態においては、工程a)の細菌株は、D-グルタミン酸の合成の唯一の方法としてグルタミン酸ラセマーゼ酵素を有し、かくして、当該方法は、この酵素、すなわち、グルタミン酸ラセマーゼをコードする遺伝子の不活化を含む。
【０１４８】
「本発明の生きた弱毒化細菌株の製造方法」のより好ましい実施形態においては、工程a)の細菌株は、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、アシネトバクター・バイリ(Acinetobacter baylyi)、アシネトバクター・カルコアセチクス(Acinetobacter calcoaceticus)、アシネトバクター・ヘモリティクス(Acinetobacter haemolyticus)、アシネトバクター・ジュニ(Acinetobacter junii)、アシネトバクター・ルウォフィ(Acinetobacter lwoffii)、アシネトバクター・ノソコミアリス(Acinetobacter nosocomialis)、アシネトバクター・ピッチ(Acinetobacter pittii)、アシネトバクター・ラジオレジステンス(Acinetobacter radioresistens)、アクチノバシラス・リグニエレシ(Actinobacillus lignieresii)、アクチノバシラス・スイス(Actinobacillus suis)、アエロモナス・カビエ(Aeromonas caviae)、アエロモナス・ヒドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、アエロモナス・ベロニ亜種ソブリア(Aeromonas veronii subsp. sobria)、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、アルコバクター・ブツレリ(Arcobacter butzleri)、アルコバクター・ニトロフィギリス(Arcobacter nitrofigilis)、バシラス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バシラス・アントラシス(Bacillus anthracis)、バシラス・バタビエンシス(Bacillus bataviensis)、バシラス・セルロシリティクス(Bacillus cellulosilyticus)、バシラス・セレウス(Bacillus cereus)、バシラス・クラウシ(Bacillus clausii)、バシラス・リシェニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バシラス・プミルス(Bacillus pumilus)、バシラス・スブチリス(Bacillus subtilis)、バシラス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)、バクテロイデス・フラギリス(Bacteroides fragilis)、ボルデテラ・アビウム(Bordetella avium)、ボルデテラ・ブロンキセプティカ(Bordetella bronchiseptica)、ボルデテラ・ペルツシス(Bordetella pertusis)、ボルデテラ・ペトリ(Bordetella petrii)、ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)、ブルセラ・メリテンシス(Brucella melitensis)、ブルセラ・スイス(Brucella suis)、ブルクホルデリア・セノセパシア(Burkholderia cenocepacia)、ブルクホルデリア・マレイ(Burkholderia mallei)、ブルクホルデリア・マルチボランス(Burkholderia multivorans)、ブルクホルデリア・シュードマレイ(Burkholderia pseudomallei)、ブルクホルデリア・サイランデンシス(Burkholderia thailandensis)、カンピロバクター・コンシサス(Campylobacter concisus)、カンピロバクター・フェタス亜種フェタス(Campylobacter fetus subsp. fetus)、カンピロバクター・フェタス亜種ベネレアリス(Campylobacter fetus subsp. venerealis)、カンピロバクター・グラシリス(Campylobacter gracilis)、カンピロバクター・ホミニス(Campylobacter hominis)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・レクタス(Campylobacter rectus)、カンピロバクター・ショワエ(Campylobacter showae)、カンピロバクター・ウプサリエンシス(Campylobacter upsaliensis)、シトロバクター・フレウンジ(Citrobacter freundii)、シトロバクター・コセリ(Citrobacter koseri)、クロストリジウム・アスパラギフォルム(Clostridium asparagiforme)、クロストリジウム・ボツリナム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ブチリカム(Clostridium butyricum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・ペルフリンゲンス(Clostridium perfringens)、クロストリジウム・サッカロブチリカム(Clostridium saccharobutylicum)、クロストリジウム・テタニ(Clostridium tetani)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diphtheriae)、コリネバクテリウム・シュードツベルクロシス(Corynebacterium pseudotuberculosis)、エンテロバクター・エアロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エリジペロスリックス・ルジオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)、大腸菌(Escherichia coli)、フソバクテリウム・ネクロフォラム(Fusobacterium necrophorum)、フソバクテリウム・ネクレアタム(Fusobacterium nucleatum)、グラヌリカテラ・アジアセンス(Granulicatella adiacens)、グラヌリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ヘモフィルス・エクイゲニタリス(Haemophilus equigenitalis)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・パラインフルエンザ(Haemophilus parainfluenzae)、ヘモフィルス・パラガリナルム(Haemophilus paragallinarum)、ヘモフィルス・パラスイス(Haemophilus parasuis)、ヘモフィルス・プルロニューモニエ(Haemophilus pleuropneumoniae)、ヘモフィルス・ソムナス(Haemophilus somnus)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、レジオネラ・オークリジエンシス(Legionella oakridgensis)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、レプトスピラ・ビフレクサ(Leptospira biflexa)、レプトスピラ・イリニ(Leptospira illini)、レプトスピラ・インテロガンス(Leptospira interrogans)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、リシニバシラス・フシフォルミス(Lysinibacillus fusiformis)、リシニバシラス・スフェリクス(Lysinibacillus sphaericus)、モラクセラ・ボビス(Moraxella bovis)、モルガネラ・モルガニ(Morganella morganii)、マイコバクテリウム・アブセサス(Mycobacterium abscessus)、マイコバクテリウム・アフリカナム(Mycobacterium africanum)、マイコバクテリウム・アビウム(Mycobacterium avium)、マイコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis)、マイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノロア(Neisseria gonorrhoeae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、プレシオモナス・シゲロイデス(Plesiomonas shigelloides)、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)、プロテウス・ハンセリ(Proteus hanseri)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ(Salmonella enterica subsp. enterica)、サルモネラ・エンテリティディス(Salmonella enteritidis)、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、セラチア・プリムチカ(Serratia plymuthica)、シゲラ・ボイジ(Shigella boydii)、シゲラ・ディセンテリア(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレクスネリ(Shigella flexneri)、スタフィロコッカス・アルレッタ(Staphylococcus arlettae)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・カピティス(Staphylococcus capitis)、スタフィロコッカス・カプラ(Staphylococcus caprae)、スタフィロコッカス・カルノサス(Staphylococcus carnosus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・エクオラム(Staphylococcus equorum)、スタフィロコッカス・ヘモリティクス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス(Staphylococcus lugdunensis)、スタフィロコッカス・パステウリ(Staphylococcus pasteuri)、スタフィロコッカス・ペッテンコフェリ(Staphylococcus pettenkoferi)、スタフィロコッカス・シュードインテルメディウス(Staphylococcus pseudointermedius)、スタフィロコッカス・サプロフィティクス(Staphylococcus saprophyticus)、スタフィロコッカス・シミア(Staphylococcus simiae)、スタフィロコッカス・シムランス(Staphylococcus simulans)、スタフィロコッカス・ワルネリ(Staphylococcus warneri)、ステノトロフォモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ディスガラクチア(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ディスガラクチア亜種エクイシミリス(Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis)、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・ウベリス(Streptococcus uberis)、ストレプトコッカス・ズーエピデルミクス(Streptococcus zooepidermicus)、タイロレラ・アシニゲニタリス(Taylorella asinigenitalis)、タイロレラ・エクイゲニタリス(Taylorella equigenitalis)、トレポネマ・カラテウム(Treponema carateum)、トレポネマ・クニクリ(Treponema cuniculi)、トレポネマ・ヒオジセンテリア(Treponema hyodisenteriae)、トレポネマ・パリダム(Treponema pallidum)、トレポネマ・スイス(Treponema suis)、ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・ジスパル(Veillonella dispar)、ベイロネラ・パルブラ(Veillonella parvula)、ベイロネラ・ラッティ(Veillonella ratti)、ビブリオ・コレラ(Vibrio cholerae)、ビブリオ・パラヘモリティクス(Vibrio parahaemolyticus)、ビブリオ・ブルニフィカンス(Vibrio vulnificans)、エルシニア・エンテロコリティカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)およびエルシニア・シュードツベルクロシス(Yersinia pseudotuberculosis)からなる細菌種の一覧から選択される。
【０１４９】
「本発明の生きた弱毒化細菌株の製造方法」のさらにより好ましい実施形態においては、工程a)の前記細菌株は、以下の種：アシネトバクター・バウマンニ、シュードモナス・エルギノーサおよびスタフィロコッカス・オーレウスからなる一覧から選択される。
【０１５０】
「本発明の生きた弱毒化細菌株の製造方法」のさらにより好ましい実施形態においては、工程a)の前記細菌株は、ATCC 17978と指定されたA.バウマンニの細菌株であり、前記方法はA1S_0380およびA1S_3398遺伝子座の不活化を含む(実施例2を参照されたい)。
【０１５１】
「本発明の生きた弱毒化細菌株の製造方法」のさらにより好ましい実施形態においては、工程a)の前記細菌株は、PAO1と指定されたP.エルギノーサの細菌株であり、前記方法はPA4662遺伝子を不活化することを含む(実施例15を参照されたい)。
【０１５２】
「本発明の生きた弱毒化細菌株の製造方法」のさらにより好ましい実施形態においては、工程a)の前記細菌株は、132と指定されたS.オーレウスの細菌株であり、前記方法はmurIおよびdat遺伝子を不活化することを含む(実施例22を参照されたい)。
【０１５３】
さらに、本文を通して既に述べた通り、in vivoでの免疫原性以外のその予想外の弱毒化のため、本発明で定義された細菌株は弱毒化生ワクチンのための基礎として非常に好適である。
【０１５４】
前記段落に記載の本発明の細菌株のワクチンとしての使用と関連して、本発明はさらに、すなわち本発明の第2の態様として、本明細書に定義される栄養要求性突然変異細菌株を含む、生きた弱毒化医薬組成物、特に、弱毒化生ワクチン組成物に関する。
【０１５５】
これらの組成物は、栄養要求性突然変異細菌の野生型形態による感染に対する動物およびヒトの防御にとって特に好適である。そのような動物を、胎盤動物(ヒトを含む)、有袋動物および単孔動物からなる群から選択することができる。そのような医薬組成物、特に、ワクチン組成物は、免疫学的に有効な量の本明細書に定義される生きた弱毒化細菌を含む。免疫学的に有効な量の上記の生きた弱毒化細菌に加えて、本発明による医薬組成物、特に、ワクチンはまた、製薬上許容し得る担体を含有する。そのような担体は水のような単純なものであってもよいが、例えば、細菌が培養された培養液を含んでもよい。別の好適な担体は、例えば、生理的塩濃度の溶液である。
【０１５６】
投与される有用な用量は、ワクチン接種される年齢、体重および動物、投与の様式ならびにワクチン接種が求められる病原体の種類に応じて変化するであろう。
【０１５７】
医薬組成物、特に、ワクチンは、免疫応答を誘発するのに十分な任意の用量の細菌を含んでもよい。103〜1010個の細菌の用量は、例えば、非常に好適な用量である。
【０１５８】
必要に応じて、アジュバント活性を有する1つ以上の化合物を、医薬組成物、特に、ワクチンに添加することができる。アジュバントは、免疫系の非特異的刺激因子である。それらはワクチンに対する宿主の免疫応答を増強する。当業界で公知のアジュバントの例は、Freundの完全および不完全アジュバント、ビタミンE、非イオン性ブロックポリマー、ムラミルジペプチド、ISCOM(免疫刺激複合体、例えば、欧州特許EP109942を参照されたい)、サポニン、ミネラルオイル、植物油、およびカルボポールである。粘膜適用にとって特に好適なアジュバントは、例えば、大腸菌熱不安定毒素(LT)またはコレラ毒素(CT)である。
【０１５９】
他の好適なアジュバントは、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは酸化アルミニウム、油乳濁液(例えば、Bayol(登録商標)またはMarco(登録商標)、サポニンまたはビタミンEソルビリゼートの)である。
【０１６０】
本発明において有用な製薬上許容し得る担体または希釈剤の他の例としては、SPGAなどの安定剤、炭水化物(例えば、ソルビトール、マンニトール、スターチ、スクロース、グルコース、デキストラン)、アルブミンまたはカゼインなどのタンパク質、ウシ血清またはスキムミルクなどのタンパク質含有剤およびバッファー(例えば、リン酸バッファー)が挙げられる。特に、そのような安定剤をワクチンに添加する場合、ワクチンは凍結乾燥にとって非常に好適である。従って、より好ましい形態では、ワクチンは凍結乾燥形態にある。
【０１６１】
動物またはヒトへの投与のために、本発明による医薬組成物、特に、ワクチンを、特に、鼻内、皮内、皮下、経口、エアロゾルまたは筋肉内により与えることができる。家禽への適用のためには、ウィングウェブおよび点眼薬が非常に好適である。本発明の医薬、医薬組成物またはワクチンを、無症状の患者ならびに疾患の症状を既に示している患者の両方において用いることができる。
【０１６２】
従って、本発明の第2の態様は、D-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株と、製薬上許容し得る担体または希釈剤および必要に応じて、アジュバントとを含む医薬組成物、好ましくはワクチンであって、該組成物の栄養要求性突然変異細菌の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)にとって好適である前記医薬組成物に関する。
【０１６３】
本発明の第2の態様の好ましい実施形態においては、前記医薬組成物はワクチンであり、前記ワクチンは必要に応じてアジュバントを含む。
【０１６４】
本発明の第2の態様またはその好ましい実施形態のいずれかの別の好ましい実施形態においては、前記製薬上許容し得る担体または希釈剤は、水、培養液、生理的塩濃度の溶液および/またはSPGAなどの安定剤、炭水化物(例えば、ソルビトール、マンニトール、スターチ、スクロース、グルコース、デキストラン)、アルブミンまたはカゼインなどのタンパク質、ウシ血清またはスキムミルクなどのタンパク質含有剤およびバッファー(例えば、リン酸バッファー)からなる一覧から選択される。
【０１６５】
本発明の第2の態様またはその好ましい実施形態のいずれかの別の好ましい実施形態においては、前記アジュバントは、Freundの完全および不完全アジュバント、ビタミンE、非イオン性ブロックポリマー、ムラミルジペプチド、ISCOM(免疫刺激複合体)、サポニン、ミネラルオイル、植物油、カルボポール、大腸菌熱不安定毒素(LT)またはコレラ毒素(CT)、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは酸化アルミニウム、油乳濁液(例えば、Bayol(登録商標)またはMarco(登録商標)、サポニンまたはビタミンEソルビリゼートの)からなる一覧から選択される。
【０１６６】
本発明の第2の態様またはその好ましい実施形態のいずれかの別の好ましい実施形態においては、前記医薬組成物は、103〜1010個の細菌のD-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株の用量を含む。
【０１６７】
本発明の第2の態様またはその好ましい実施形態のいずれかの別の好ましい実施形態においては、前記医薬組成物は、凍結乾燥形態にある。
【０１６８】
本発明の第2の態様またはその好ましい実施形態のいずれかの別の好ましい実施形態においては、細菌株は、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、アシネトバクター・バイリ(Acinetobacter baylyi)、アシネトバクター・カルコアセチクス(Acinetobacter calcoaceticus)、アシネトバクター・ヘモリティクス(Acinetobacter haemolyticus)、アシネトバクター・ジュニ(Acinetobacter junii)、アシネトバクター・ルウォフィ(Acinetobacter lwoffii)、アシネトバクター・ノソコミアリス(Acinetobacter nosocomialis)、アシネトバクター・ピッチ(Acinetobacter pittii)、アシネトバクター・ラジオレジステンス(Acinetobacter radioresistens)、アクチノバシラス・リグニエレシ(Actinobacillus lignieresii)、アクチノバシラス・スイス(Actinobacillus suis)、アエロモナス・カビエ(Aeromonas caviae)、アエロモナス・ヒドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、アエロモナス・ベロニ亜種ソブリア(Aeromonas veronii subsp. sobria)、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、アルコバクター・ブツレリ(Arcobacter butzleri)、アルコバクター・ニトロフィギリス(Arcobacter nitrofigilis)、バシラス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バシラス・アントラシス(Bacillus anthracis)、バシラス・バタビエンシス(Bacillus bataviensis)、バシラス・セルロシリティクス(Bacillus cellulosilyticus)、バシラス・セレウス(Bacillus cereus)、バシラス・クラウシ(Bacillus clausii)、バシラス・リシェニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バシラス・プミルス(Bacillus pumilus)、バシラス・スブチリス(Bacillus subtilis)、バシラス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)、バクテロイデス・フラギリス(Bacteroides fragilis)、ボルデテラ・アビウム(Bordetella avium)、ボルデテラ・ブロンキセプティカ(Bordetella bronchiseptica)、ボルデテラ・ペルツシス(Bordetella pertusis)、ボルデテラ・ペトリ(Bordetella petrii)、ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)、ブルセラ・メリテンシス(Brucella melitensis)、ブルセラ・スイス(Brucella suis)、ブルクホルデリア・セノセパシア(Burkholderia cenocepacia)、ブルクホルデリア・マレイ(Burkholderia mallei)、ブルクホルデリア・マルチボランス(Burkholderia multivorans)、ブルクホルデリア・シュードマレイ(Burkholderia pseudomallei)、ブルクホルデリア・サイランデンシス(Burkholderia thailandensis)、カンピロバクター・コンシサス(Campylobacter concisus)、カンピロバクター・フェタス亜種フェタス(Campylobacter fetus subsp. fetus)、カンピロバクター・フェタス亜種ベネレアリス(Campylobacter fetus subsp. venerealis)、カンピロバクター・グラシリス(Campylobacter gracilis)、カンピロバクター・ホミニス(Campylobacter hominis)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・レクタス(Campylobacter rectus)、カンピロバクター・ショワエ(Campylobacter showae)、カンピロバクター・ウプサリエンシス(Campylobacter upsaliensis)、シトロバクター・フレウンジ(Citrobacter freundii)、シトロバクター・コセリ(Citrobacter koseri)、クロストリジウム・アスパラギフォルム(Clostridium asparagiforme)、クロストリジウム・ボツリナム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ブチリカム(Clostridium butyricum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・ペルフリンゲンス(Clostridium perfringens)、クロストリジウム・サッカロブチリカム(Clostridium saccharobutylicum)、クロストリジウム・テタニ(Clostridium tetani)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diphtheriae)、コリネバクテリウム・シュードツベルクロシス(Corynebacterium pseudotuberculosis)、エンテロバクター・エアロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エリジペロスリックス・ルジオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)、大腸菌(Escherichia coli)、フソバクテリウム・ネクロフォラム(Fusobacterium necrophorum)、フソバクテリウム・ネクレアタム(Fusobacterium nucleatum)、グラヌリカテラ・アジアセンス(Granulicatella adiacens)、グラヌリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ヘモフィルス・エクイゲニタリス(Haemophilus equigenitalis)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・パラインフルエンザ(Haemophilus parainfluenzae)、ヘモフィルス・パラガリナルム(Haemophilus paragallinarum)、ヘモフィルス・パラスイス(Haemophilus parasuis)、ヘモフィルス・プルロニューモニエ(Haemophilus pleuropneumoniae)、ヘモフィルス・ソムナス(Haemophilus somnus)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、レジオネラ・オークリジエンシス(Legionella oakridgensis)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、レプトスピラ・ビフレクサ(Leptospira biflexa)、レプトスピラ・イリニ(Leptospira illini)、レプトスピラ・インテロガンス(Leptospira interrogans)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、リシニバシラス・フシフォルミス(Lysinibacillus fusiformis)、リシニバシラス・スフェリクス(Lysinibacillus sphaericus)、モラクセラ・ボビス(Moraxella bovis)、モルガネラ・モルガニ(Morganella morganii)、マイコバクテリウム・アブセサス(Mycobacterium abscessus)、マイコバクテリウム・アフリカナム(Mycobacterium africanum)、マイコバクテリウム・アビウム(Mycobacterium avium)、マイコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis)、マイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノロア(Neisseria gonorrhoeae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、プレシオモナス・シゲロイデス(Plesiomonas shigelloides)、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)、プロテウス・ハンセリ(Proteus hanseri)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ(Salmonella enterica subsp. enterica)、サルモネラ・エンテリティディス(Salmonella enteritidis)、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、セラチア・プリムチカ(Serratia plymuthica)、シゲラ・ボイジ(Shigella boydii)、シゲラ・ディセンテリア(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレクスネリ(Shigella flexneri)、スタフィロコッカス・アルレッタ(Staphylococcus arlettae)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・カピティス(Staphylococcus capitis)、スタフィロコッカス・カプラ(Staphylococcus caprae)、スタフィロコッカス・カルノサス(Staphylococcus carnosus)、スタフィロコ���カス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・エクオラム(Staphylococcus equorum)、スタフィロコッカス・ヘモリティクス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス(Staphylococcus lugdunensis)、スタフィロコッカス・パステウリ(Staphylococcus pasteuri)、スタフィロコッカス・ペッテンコフェリ(Staphylococcus pettenkoferi)、スタフィロコッカス・シュードインテルメディウス(Staphylococcus pseudointermedius)、スタフィロコッカス・サプロフィティクス(Staphylococcus saprophyticus)、スタフィロコッカス・シミア(Staphylococcus simiae)、スタフィロコッカス・シムランス(Staphylococcus simulans)、スタフィロコッカス・ワルネリ(Staphylococcus warneri)、ステノトロフォモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ディスガラクチア(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ディスガラクチア亜種エクイシミリス(Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis)、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・ウベリス(Streptococcus uberis)、ストレプトコッカス・ズーエピデルミクス(Streptococcus zooepidermicus)、タイロレラ・アシニゲニタリス(Taylorella asinigenitalis)、タイロレラ・エクイゲニタリス(Taylorella equigenitalis)、トレポネマ・カラテウム(Treponema carateum)、トレポネマ・クニクリ(Treponema cuniculi)、トレポネマ・ヒオジセンテリア(Treponema hyodisenteriae)、トレポネマ・パリダム(Treponema pallidum)、トレポネマ・スイス(Treponema suis)、ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・ジスパル(Veillonella dispar)、ベイロネラ・パルブラ(Veillonella parvula)、ベイロネラ・ラッティ(Veillonella ratti)、ビブリオ・コレラ(Vibrio cholerae)、ビブリオ・パラヘモリティクス(Vibrio parahaemolyticus)、ビブリオ・ブルニフィカンス(Vibrio vulnificans)、エルシニア・エンテロコリティカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)およびエルシニア・シュードツベルクロシス(Yersinia pseudotuberculosis)からなる細菌種の一覧から選択される。
【０１６９】
より好ましくは、工程a)の前記細菌株は、以下の種：アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)およびスタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)からなる一覧から選択される。さらにより好ましくは、細菌株は、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii) Delta0380/Delta3398と命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8588と共に2014年4月14日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたA.バウマンニの細菌株である。さらにより好ましくは、細菌株は、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa) DeltaPA4662と命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8589と共に2014年4月14日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたP.エルギノーサの細菌株である。さらにより好ましくは、細菌株は、132deltamurI/deltadatと命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8587と共に2014年6月11日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたS.オーレウスの細菌株である。
【０１７０】
本発明の第3の態様は、本発明の第1の態様の方法により、または本発明の第1の態様の好ましい実施形態のいずれかにより得られるか、または得ることができる生きた弱毒化細菌株に関する。
【０１７１】
本発明の第3の態様の異なる実施形態は、生きた弱毒化D-グルタミン酸栄養要求性細菌株において、グルタミン酸ラセマーゼ酵素をコードする遺伝子、および、存在する場合、D-アミノ酸トランスアミナーゼ酵素をコードする遺伝子が不活化されることを特徴とする、ワクチンとして好適な前記株に関する。
【０１７２】
そのような不活化は、不活化が機能的グルタミン酸ラセマーゼおよび機能的D-アミノ酸トランスアミナーゼタンパク質を発現することができなくなるという条件で、挿入、欠失、置換またはその組合せであってもよい。機能的グルタミン酸ラセマーゼおよび/または機能的D-アミノ酸トランスアミナーゼタンパク質は、野生型タンパク質の調節特性を有するタンパク質であると理解される。従って、欠損し、かくして、D-グルタミン酸の合成に参画することができないグルタミン酸ラセマーゼおよび/または機能的D-アミノ酸トランスアミナーゼタンパク質は非機能的タンパク質であると考えられる。
【０１７３】
本発明の第3の態様の好ましい実施形態においては、細菌株はグラム陽性またはグラム陰性細菌である。
【０１７４】
本発明の第3の態様の別の好ましい実施形態においては、細菌株は、D-グルタミン酸の合成の唯一の方法としてグルタミン酸ラセマーゼ酵素を有し、かくして、該細菌は、この酵素、すなわち、グルタミン酸ラセマーゼをコードする遺伝子の不活化を特徴とする。
【０１７５】
本発明の第3の態様のより好ましい実施形態においては、細菌株は、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、アシネトバクター・バイリ(Acinetobacter baylyi)、アシネトバクター・カルコアセチクス(Acinetobacter calcoaceticus)、アシネトバクター・ヘモリティクス(Acinetobacter haemolyticus)、アシネトバクター・ジュニ(Acinetobacter junii)、アシネトバクター・ルウォフィ(Acinetobacter lwoffii)、アシネトバクター・ノソコミアリス(Acinetobacter nosocomialis)、アシネトバクター・ピッチ(Acinetobacter pittii)、アシネトバクター・ラジオレジステンス(Acinetobacter radioresistens)、アクチノバシラス・リグニエレシ(Actinobacillus lignieresii)、アクチノバシラス・スイス(Actinobacillus suis)、アエロモナス・カビエ(Aeromonas caviae)、アエロモナス・ヒドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、アエロモナス・ベロニ亜種ソブリア(Aeromonas veronii subsp. sobria)、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、アルコバクター・ブツレリ(Arcobacter butzleri)、アルコバクター・ニトロフィギリス(Arcobacter nitrofigilis)、バシラス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バシラス・アントラシス(Bacillus anthracis)、バシラス・バタビエンシス(Bacillus bataviensis)、バシラス・セルロシリティクス(Bacillus cellulosilyticus)、バシラス・セレウス(Bacillus cereus)、バシラス・クラウシ(Bacillus clausii)、バシラス・リシェニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バシラス・プミルス(Bacillus pumilus)、バシラス・スブチリス(Bacillus subtilis)、バシラス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)、バクテロイデス・フラギリス(Bacteroides fragilis)、ボルデテラ・アビウム(Bordetella avium)、ボルデテラ・ブロンキセプティカ(Bordetella bronchiseptica)、ボルデテラ・ペルツシス(Bordetella pertusis)、ボルデテラ・ペトリ(Bordetella petrii)、ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)、ブルセラ・メリテンシス(Brucella melitensis)、ブルセラ・スイス(Brucella suis)、ブルクホルデリア・セノセパシア(Burkholderia cenocepacia)、ブルクホルデリア・マレイ(Burkholderia mallei)、ブルクホルデリア・マルチボランス(Burkholderia multivorans)、ブルクホルデリア・シュードマレイ(Burkholderia pseudomallei)、ブルクホルデリア・サイランデンシス(Burkholderia thailandensis)、カンピロバクター・コンシサス(Campylobacter concisus)、カンピロバクター・フェタス亜種フェタス(Campylobacter fetus subsp. fetus)、カンピロバクター・フェタス亜種ベネレアリス(Campylobacter fetus subsp. venerealis)、カンピロバクター・グラシリス(Campylobacter gracilis)、カンピロバクター・ホミニス(Campylobacter hominis)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・レクタス(Campylobacter rectus)、カンピロバクター・ショワエ(Campylobacter showae)、カンピロバクター・ウプサリエンシス(Campylobacter upsaliensis)、シトロバクター・フレウンジ(Citrobacter freundii)、シトロバクター・コセリ(Citrobacter koseri)、クロストリジウム・アスパラギフォルム(Clostridium asparagiforme)、クロストリジウム・ボツリナム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ブチリカム(Clostridium butyricum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・ペルフリンゲンス(Clostridium perfringens)、クロストリジウム・サッカロブチリカム(Clostridium saccharobutylicum)、クロストリジウム・テ���ニ(Clostridium tetani)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diphtheriae)、コリネバクテリウム・シュードツベルクロシス(Corynebacterium pseudotuberculosis)、エンテロバクター・エアロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エリジペロスリックス・ルジオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)、大腸菌(Escherichia coli)、フソバクテリウム・ネクロフォラム(Fusobacterium necrophorum)、フソバクテリウム・ネクレアタム(Fusobacterium nucleatum)、グラヌリカテラ・アジアセンス(Granulicatella adiacens)、グラヌリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ヘモフィルス・エクイゲニタリス(Haemophilus equigenitalis)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・パラインフルエンザ(Haemophilus parainfluenzae)、ヘモフィルス・パラガリナルム(Haemophilus paragallinarum)、ヘモフィルス・パラスイス(Haemophilus parasuis)、ヘモフィルス・プルロニューモニエ(Haemophilus pleuropneumoniae)、ヘモフィルス・ソムナス(Haemophilus somnus)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、レジオネラ・オークリジエンシス(Legionella oakridgensis)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、レプトスピラ・ビフレクサ(Leptospira biflexa)、レプトスピラ・イリニ(Leptospira illini)、レプトスピラ・インテロガンス(Leptospira interrogans)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、リシニバシラス・フシフォルミス(Lysinibacillus fusiformis)、リシニバシラス・スフェリクス(Lysinibacillus sphaericus)、モラクセラ・ボビス(Moraxella bovis)、モルガネラ・モルガニ(Morganella morganii)、マイコバクテリウム・アブセサス(Mycobacterium abscessus)、マイコバクテリウム・アフリカナム(Mycobacterium africanum)、マイコバクテリウム・アビウム(Mycobacterium avium)、マイコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis)、マイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノロア(Neisseria gonorrhoeae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、プレシオモナス・シゲロイデス(Plesiomonas shigelloides)、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)、プロテウス・ハンセリ(Proteus hanseri)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ(Salmonella enterica subsp. enterica)、サルモネラ・エンテリティディス(Salmonella enteritidis)、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、セラチア・プリムチカ(Serratia plymuthica)、シゲラ・ボイジ(Shigella boydii)、シゲラ・ディセンテリア(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレクスネリ(Shigella flexneri)、スタフィロコッカス・アルレッタ(Staphylococcus arlettae)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・カピティス(Staphylococcus capitis)、スタフィロコッカス・カプラ(Staphylococcus caprae)、スタフィロコッカス・カルノサス(Staphylococcus carnosus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・エクオラム(Staphylococcus equorum)、スタフィロコッカス・ヘモリティクス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス(Staphylococcus lugdunensis)、スタフィロコッカス・パステウリ(Staphylococcus pasteuri)、スタフィロコッカス・ペッテンコフェリ(Staphylococcus pettenkoferi)、スタフィロコッカス・シュードインテルメディウス(Staphylococcus pseudointermedius)、スタフィロコッカス・サプロフィティクス(Staphylococcus saprophyticus)、スタフィロコッカス・シミア(Staphylococcus simiae)、スタフィロコッカス・シムランス(Staphylococcus simulans)、スタフィロコッカス・ワルネリ(Staphylococcus warneri)、ステノトロフォモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ディスガラクチア(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ディスガラクチア亜種エクイシミリス(Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis)、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・ウベリス(Streptococcus uberis)、ストレプトコッカス・ズーエピデルミクス(Streptococcus zooepidermicus)、タイロレラ・アシニゲニタリス(Taylorella asinigenitalis)、タイロレラ・エクイゲニタリス(Taylorella equigenitalis)、トレポネマ・カラテウム(Treponema carateum)、トレポネマ・クニクリ(Treponema cuniculi)、トレポネマ・ヒオジセンテリア(Treponema hyodisenteriae)、トレポネマ・パリダム(Treponema pallidum)、トレポネマ・スイス(Treponema suis)、ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・ジスパル(Veillonella dispar)、ベイロネラ・パルブラ(Veillonella parvula)、ベイロネラ・ラッティ(Veillonella ratti)、ビブリオ・コレラ(Vibrio cholerae)、ビブリオ・パラヘモリティクス(Vibrio parahaemolyticus)、ビブリオ・ブルニフィカンス(Vibrio vulnificans)、エルシニア・エンテロコリティカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)およびエルシニア・シュードツベルクロシス(Yersinia pseudotuberculosis)からなる細菌種の一覧から選択される。
【０１７６】
本発明の第3の態様のさらにより好ましい実施形態においては、前記細菌株は、以下の種：アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)およびスタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)からなる一覧から選択される。
【０１７７】
本発明の第3の態様のさらにより好ましい実施形態においては、前記細菌株は、A1S_0380およびA1S_3398遺伝子座の不活化を特徴とするATCC 17978と指定されたA.バウマンニの細菌株である(実施例2を参照されたい)。
【０１７８】
本発明の第3の態様のさらにより好ましい実施形態においては、前記細菌株は、PA4662遺伝子の不活化を特徴とするPAO1と指定されたP.エルギノーサの細菌株である(実施例15を参照されたい)。
【０１７９】
本発明の第3の態様のさらにより好ましい実施形態においては、前記細菌株は、murIおよびdat遺伝子の不活化を特徴とする132と指定されたS.オーレウスの細菌株である(実施例22を参照されたい)。
【０１８０】
本発明の第3の態様のさらにより好ましい実施形態においては、前記細菌株は、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii) Delta0380/Delta3398と命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8588と共に2014年4月14日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたA.バウマンニの細菌株である。
【０１８１】
本発明の第3の態様のさらにより好ましい実施形態においては、前記細菌株は、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa) DeltaPA4662と命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8589と共に2014年4月14日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたP.エルギノーサの細菌株である。
【０１８２】
本発明の第3の態様のさらにより好ましい実施形態においては、前記細菌株は、132deltamurI/deltadatと命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8587と共に2014年6月11日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたS.オーレウスの細菌株である。
【０１８３】
本発明の第4の態様は、医薬としての使用のため、特に、ワクチンとしての使用のための、本発明の第3の態様で定義された細菌株に関する。
【０１８４】
本発明の第5の態様は、前記組成物の栄養要求性突然変異細菌の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)の方法における使用のための、本発明の第2の態様の医薬組成物または本発明の第3の態様のD-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株に関する。
【０１８５】
本発明の第6の態様は、D-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株を認識することができる抗体またはFab、F(ab')2、Fv、scFv、ジ-scFvおよびsdABからなる群から選択されるその断片であって、前記組成物の栄養要求性突然変異細菌の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)にとって好適である、前記抗体またはその断片に関する。
【０１８６】
本発明の第7の態様は、D-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株を用いる哺乳動物の免疫化後に得られるか、または得ることができる抗体またはFab、F(ab')2、Fv、scFv、ジ-scFvおよびsdABからなる群から選択されるその断片であって、前記組成物の栄養要求性突然変異細菌の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)にとって好適である、前記抗体またはその断片に関する。
【０１８７】
本発明の第7の態様の好ましい実施形態においては、免疫化のために用いられる哺乳動物は、胎盤動物(ヒトを含む)、有袋動物および単孔動物からなる群から選択される。
【０１８８】
本発明の第8の態様は、本発明の第6または第7の態様のいずれかの抗体またはその断片と、製薬上許容し得る担体または希釈剤、および必要に応じて、アジュバントとを含む、医薬組成物、好ましくは、ワクチンであって、前記組成物の栄養要求性突然変異細菌の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)にとって好適である、前記組成物に関する。本発明の第9の態様の好ましい実施形態においては、前記医薬組成物は、前記ワクチンが必要に応じてアジュバントを含むワクチンである。
【０１８９】
本発明の第9の態様は、療法における使用のため、特に、受動免疫における使用のための、本発明の第6または第7の態様の抗体またはその断片に関する。
【０１９０】
本発明の第10の態様は、前記組成物の栄養要求性突然変異細菌の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)の方法における使用のための、本発明の第8の態様の医薬組成物または本発明の第6もしくは第7の態様のいずれかの抗体もしくはその断片に関する。
【０１９１】
本発明の第11の態様は、前記組成物の栄養要求性突然変異細菌の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)の方法における使用のための、本発明の第2もしくは第8の態様の医薬組成物または本発明の第3の態様のD-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株または本発明の第6もしくは第7の態様のいずれかの抗体もしくはその断片であって、鼻内、皮内、皮下、経口、エアロゾル、筋肉内、ウィングウェブおよび点眼投与される前記組成物、細菌株または抗体もしくはその断片に関する。
【０１９２】
この意味において、A.バウマンニ、P.エルギノーサおよびS.オーレウス種の3つのD-グルタミン酸栄養要求株についてIgG血清レベルの変化が観察されたが、これらのレベルはワクチンが腹腔内、筋肉内、皮下または鼻内経路により投与されるかどうかに依存する。同様に、ワクチンの投与スケジュール(用量組成および投与頻度)は、産生される抗体の最終レベルに影響し得る(実施例34を参照されたい)。従って、最適な抗体力価のための最も適切なスケジュールおよびワクチン接種経路を、それぞれの病原体について決定する必要があり得る。この目的のために、腹腔内(日常的に用いられるものではない)以外の投与経路により得られる体液性応答と、防御効能とを相関させるために、ΔPA4662ワクチン株は腹腔内経路と類似する高レベルのIgGを惹起したため、著者らは筋肉内(ヒトにおける好ましい投与経路)により投与されるこの株の使用を評価した(実施例18を参照されたい)。これに関して、マウスをP.エルギノーサPAO1野生型で以前のようにチャレンジした。チャレンジ後、著者らは、ワクチン非接種マウス群においては100%の死亡率を観察したが、ワクチン接種マウスは全て100%の生存を示した(図50を参照されたい)。この結果は、筋肉内投与経路を用いるワクチン接種が少なくとも腹腔内経路と同程度に有効であることを示唆している。
【０１９３】
さらに、本発明の医薬、医薬組成物またはワクチン組成物を、無症状の患者ならびに疾患の症状を既に示していた患者の両方において用いることができることがわかる。
【０１９４】
さらに、本発明の著者らは驚くべきことに、本発明の抗体またはその断片を含むキットまたはデバイスを用いることにより、キットまたはデバイスは被験体の生物試料中、特に、細菌起源の疾患に罹患すると疑われる被験体の血漿中の細菌種の信頼できる定性的および/または定量的分析を可能にすることを見出した。
【０１９５】
従って、本発明のさらなる態様、すなわち、本発明の第12の態様は、哺乳動物に由来する生物試料中、特に、細菌疾患に罹患すると疑われる哺乳動物の試料中の細菌種の定性的および/または定量的決定における使用のための、本発明の抗体またはその断片を含むキットまたはデバイスに関する。
【０１９６】
本発明の第12の態様の好ましい実施形態は、
(i)第1の抗体が好ましくは、固相支持体に結合される、感染を引き起こす細菌種を認識することができる本発明の第6または第7の態様に従って得られるか、または得ることができる「捕捉抗体」と呼ばれる前記第1の抗体；
(ii)第2の抗体が蛍光、発光または酵素であってもよいマーカーを含む、第1の抗体により認識される領域以外の領域を認識する「検出抗体」と呼ばれる前記第2の標識された抗体；
(iii)試薬が結合対の第1のメンバーにカップリングされる、第2の抗体に対する親和性を示す前記試薬；および
(iv)結合対がハプテンと抗体；抗原と抗体；ビオチンとアビジン；ビオチンとストレプトアビジン；ビオチン類似体とアビジン；ビオチン類似体とストレプトアビジン；糖とレクチン；酵素とコファクター；核酸または核酸類似体と相補的核酸または核酸類似体からなる群から選択される、蛍光、発光または酵素にカップリングされた結合対の第2のメンバー
を含む、イムノアッセイにより細菌起源の感染を検出するためのキットに関する。
【０１９７】
本発明の文脈において、第1の抗体は「捕捉抗体」と呼ばれ、この抗体が、該抗体が特異的に結合する全ての細菌種を試料から回収するために用いられることを意味する。それが本発明の第7の態様に従って得られたものであるという条件で、捕捉抗体として用いることができる抗体の型に実際上制限はない。捕捉抗体としての使用にとって好適な抗体としては、限定されるものではないが、以下のもの：「無傷の抗体」、「Fab」断片、「F(ab')2」断片、「Fv」断片、一本鎖Fv断片または「scFv」、「ダイアボディ」および「二特異的抗体」(Bab)が挙げられる。
【０１９８】
これらの抗体断片は全て、当業界で公知の従来技術を用いて、例えば、当業界で公知のアミノ酸の欠失、挿入、置換、もしくは付加および/または組換えおよび/または他の任意の改変(例えば、グリコシル化およびリン酸化の変化などの、翻訳後および化学的改変)を用いることによりさらに改変することができる。
【０１９９】
捕捉抗体として好適な抗体としては、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方が挙げられる。ポリクローナル抗体の産生のために、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、ヒト、鳥などの様々な宿主を免疫することができる。宿主の種に応じて、様々なアジュバントを用いて免疫学的応答を増大させることができる。
【０２００】
モノクローナル抗体の産生のために、従来の技術を用いることができる。例えば、モノクローナル抗体を、Ausubel, FMら(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc.; rings edition, 2003)のユニット11.4〜11.11に詳述される手順を用いるKohlerら、Nature, 256:495 (1975)により初めて記載されたハイブリドーマ法を用いて取得することができる。あるいは、モノクローナル抗体を、ファージライブラリーを用いる、それぞれ、マウスおよびヒト抗体の単離を記載するMcCaffertyら、Nature 348:552-554 (1990)、Clacksoiiら、Nature, 352: 624-628 (1991)およびMarksら、J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991)に記載された技術を用いて生成されるファージ抗体ライブラリーから組換えDNAを単離することができる。その後の刊行物は、鎖シャッフリング(Marksら、Bio / Technology, 10:779-783 (1992))、ならびに非常に大きいファージライブラリーを構築するための戦略としての組合せ感染およびin vivoでの組換え(Waterhouseら、Nucl Acids Res, 21: 2265-2266 (1993))による高親和性ヒト抗体(nM範囲)の産生を記載している。かくして、これらの技術はモノクローナル抗体の単離のためのモノクローナル抗体の伝統的なハイブリドーマ技術に対する実行可能な代替手段である。
【０２０１】
本発明の第13の態様は、哺乳動物に由来する生物試料、特に、細菌疾患に罹患すると疑われる哺乳動物の血漿中の細菌種または細菌株の定性的および/または定量的決定のための、本発明の第12の態様のキットまたはデバイスの使用に関する。
【０２０２】
最後に、本発明の第14の態様は、様々な濃度のD-グルタミン酸の使用を含む、D-グルタミン酸に関して栄養要求性である細菌株の培養方法に関する。
【０２０３】
本発明の第14の態様の好ましい実施形態においては、D-グルタミン酸の濃度範囲は、0.00001〜120mMである。
【０２０４】
本発明のこの態様のさらにより好ましい実施形態においては、D-グルタミン酸の前記濃度範囲は、0.01〜50mMである。
【０２０５】
さらにより好ましくは、D-グルタミン酸の前記濃度範囲は、10〜20mMである。
【０２０６】
最後に、本発明のさらなる態様は、D-グルタミン酸に関する殺傷された(死滅した)栄養要求性突然変異細菌株またはその殺傷された細菌の免疫学的断片ならびにこれらの細菌の使用または本発明に記載の使用のためのその免疫学的断片に関する。
【０２０７】
以下の実施例の目的は、単に本発明を例示することであり、それを限定するものではない。
【実施例】
【０２０８】
〔実施例１〕A.バウマンニATCC 17978グルタミン酸ラセマーゼ酵素をコードする遺伝子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の分析および同定
本発明の著者らは、Protein Knowledgebase (UniProtKB)データベース検索ツールを用いてA.バウマンニATCC 17978ゲノム注釈中のグルタミン酸ラセマーゼ酵素をコードする遺伝子に関する検索を行った。MurIタンパク質(A1S_0380遺伝子座およびA1S_3398遺伝子座)に対応する2つのアミノ酸配列を同定した。これらの配列を、互いに、および他の細菌種に存在する他のグルタミン酸ラセマーゼタンパク質配列と比較し、そのゲノムをClustal Omegaアラインメントツールを用いて配列決定した。
【０２０９】
以前の分析の結果として、A.バウマンニATCC 17978ゲノム中のグルタミン酸ラセマーゼタンパク質をコードする遺伝子を同定した。かくして、可能なグルタミン酸ラセマーゼの2つの候補遺伝子：murIと呼ばれる288アミノ酸のタンパク質をコードするA1S_0380と注釈される遺伝子およびこれもmurIと呼ばれる266アミノ酸のタンパク質をコードするA1S_3398遺伝子が見出された。
【０２１０】
図4は、A.バウマンニATCC 17978の両方のMurI(A1S_0380遺伝子座)およびMurI(A1S_3398遺伝子座)タンパク質を含む異なるグルタミン酸ラセマーゼタンパク質ならびに大腸菌K12株およびP.エルギノーサPAO1株のグルタミン酸ラセマーゼ遺伝子のアミノ酸配列のアラインメントを示す。A.バウマンニATCC 17978のA1S_0380遺伝子座にコードされるMurIタンパク質とA1S_3398遺伝子座にコードされるMurIタンパク質は、アミノ酸配列レベルで互いに29.8%の類似性を有し、それらは、大腸菌(K12株)のMurIタンパク質とのそれぞれ33.2%および23.2%の類似性を有し、P.エルギノーサ(PAO1株)のMurIタンパク質とのそれぞれ35.8%および37.5%の類似性を有する。
【０２１１】
〔実施例２〕グルタミン酸ラセマーゼ遺伝子を有さない様々なA.バウマンニ突然変異株の構築および特性評価
自滅ベクターpMo130を用いて相同二重組換えを実行して、様々な突然変異株を構築した。最初に、A1S_0380 murIおよびA1S_3398 murI遺伝子を独立に欠失させ、それぞれ、Δ0380およびΔ3398と呼ばれる両突然変異株を得た。それぞれの遺伝子の上流および下流の領域に対応する約1.000bpの断片をPCRにより増幅してこれらの突然変異体を構築した。両方の断片を、得られる組換えプラスミドを用いてpMo130ベクター中にクローニングして、相同二重組換えによりA1S_0380 murIおよびA1S_3398 murI遺伝子を除去した。
【０２１２】
A1S_0380 murI遺伝子上流断片を、オリゴヌクレオチドUP0380(NotI)FおよびUP0380(BamHI)Rを用いるPCR増幅により取得し、得られたPCR産物をNotIおよびBamHI制限酵素により消化した。A1S_0380 murI遺伝子下流断片を、オリゴヌクレオチドDOWN0380(BamHI)FおよびDOWN0380(SphI)Rを用いるPCR増幅により取得し、得られたPCR産物をBamHIおよびSphI制限酵素で消化した。消化された遺伝子座A1S_0380 murI遺伝子上流および下流断片を、NotIおよびSphI酵素を用いて予め線状化されたpMo130ベクター中にライゲーションし、pMo130UP/DOWN0380と呼ばれる組換えプラスミドを得た。
【０２１３】
組換えプラスミドpMo130UP/DOWN3398を、前記事例と同じ方法で取得した。この事例において用いられたオリゴヌクレオチドは、遺伝子座A1S_3398 murI遺伝子の上流断片増幅についてはUP3398(NotI)F_IIおよびUP3398(BamHI)R_IIであり、下流断片増幅についてはDOWN3398(BamHI)FおよびDOWN3398(SphI)Rであった。
【０２１４】
プラスミドpMo130UP/DOWN0380およびpMo130UP/DOWN3398を、エレクトロポレーションにより大腸菌TG1中に導入した。それぞれの前記プラスミドで形質転換された様々なTG1株を、37℃で18h、カナマイシン(50μg/mL)を含むLB中で培養した。得られたコロニーにピロカテコール(0.45M)を噴霧し、pMo130プラスミドのxylEリポーター遺伝子を発現する黄色のコロニーのみを選択した。オリゴヌクレオチドUP0380(NotI)FおよびDOWN0380(SphI)Rを、黄色のカナマイシン耐性TG1コロニー中にエレクトロポレーションにより導入されたプラスミドpMo130UP/DOWN0380の同時的な上流および下流断片の増幅のために用いた。次いで、オリゴヌクレオチドUP3398(NotI)F_IIおよびDOWN3398(SphI)Rを、プラスミドpMo130UP/DOWN3398の同時的な上流および下流断片の増幅のために用いた。
【０２１５】
形質転換されたTG1から得られたプラスミドpMo130UP/DOWN0380およびpMo130UP/DOWN3398を、上記のように、エレクトロポレーションによりA.バウマンニATCC 17978中に個別に導入した。同時組込み物コロニーを、カナマイシン(50μg/mL)を含むLB寒天培地中で選択し、黄色のコロニー(XylE+)を選択するためにピロカテコール(0.45M)を噴霧した。同時組込み物コロニーのその後の個々の分解のために、これらのものを1mLのLB培地中に接種し、撹拌しながら37℃で少なくとも4時間増殖させた。培養物を連続希釈し、15%スクロースを含有するLB寒天中に播種した(pMo130プラスミド中に含まれるsacB遺伝子はスクロースに対する感受性を付与する)。得られたコロニーにピロカテコールを噴霧し、白色のコロニー(分解された同時組込み物)をPCRにより分析して、プラスミドpMo130UP/DOWN0380およびpMo130UP/DOWN3398の、それぞれ、対立遺伝子A1S_0380およびA1S_3398との対立遺伝子交換により産生された、Δ0380およびΔ3398欠失を確認した。オリゴヌクレオチドEXTRV0380と共にEXTFW0380およびINTRV0380と共にINTFW0380を用いて、Δ0380突然変異を確認した。オリゴヌクレオチドEXTRV3398と共にEXTFW3398およびINTRV3398と共にINTFW3398を用いて、Δ3398突然変異を確認した。
【０２１６】
二重突然変異体(Δ0380/Δ3398)を、単一突然変異体を構築するための以前に記載されたプロトコールに従って構築した。pMo130UP/DOWN3398プラスミドをエレクトロポレーションによりΔ0380突然変異体に導入し、二重突然変異体を含むコロニーは増殖するためにD-グルタミン酸を必要とするため、コロニーを10mM D-グルタミン酸を含む/含まないLB寒天中で増殖させて、可能性のあるA.バウマンニATCC 17978二重突然変異体Δ0380/Δ3398を同定したことを除いて、以前に行われたように同時組込み物コロニーを分解した。
【０２１７】
Δ0380突然変異体中のΔ0380遺伝子座、Δ3398突然変異体中のΔ3398遺伝子座および二重突然変異体中のΔ0380遺伝子座とΔ3398遺伝子座の両方の存在、ならびに対応する野生型遺伝子座の非存在を、それぞれ必要に応じて、以下のオリゴヌクレオチド対: EXTFW0380/EXTRV0380、INTFW0380/INTRV0380、EXTFW3398/EXTRV3398、INTFW3398/INTRV3398、UP0380(NotI)F/DOWN0380(SphI)R、UP3398(NotI)F_II/DOWN3398(SphI)Rを用いるPCRにより確認した。
【０２１８】
図5は、3つの構築されたA.バウマンニATCC 17978突然変異株中に存在する様々な突然変異を確認するために実施されたPCRの結果を示す。構築されたそれぞれの新しい突然変異株(Δ0380、Δ3398およびΔ0380/Δ3398)中の、野生型遺伝子座A1S_0380 murIまたはA1S_3398 murIまたは対応する突然変異体Δ0380およびΔ3398の存在を、上記のオリゴヌクレオチドを用いるPCRにより確認した。
【０２１９】
D-グルタミン酸の存在下および非存在下での様々な突然変異株の培養により、A.バウマンニATCC 17978中のグルタミン酸ラセマーゼタンパク質をコードする単一の遺伝子の喪失がこの細菌の増殖に影響しないことが示された。しかしながら、二重突然変異株Δ0380/Δ3398は、増殖を可能にするために培養培地にD-グルタミン酸を外因的に添加する必要がある、栄養要求性である。図6は、二重突然変異株Δ0380/Δ3398遺伝子型を有するコロニーを選択する方法を示す。この株は、D-グルタミン酸を添加したLB寒天中でのみ増殖する。この特徴を用いて、増殖するためにD-グルタミン酸を必要としない個々のΔ0380突然変異を有する同時組込み物を選択する。
【０２２０】
まとめると、得られた結果は、試験した2つの野生型遺伝子座、すなわち、A1S_0380 murIとA1S_3398 murIの両方のいずれかの存在が、D-グルタミン酸を添加しないLB寒天中での正常な増殖にとって十分であること、ならびに両遺伝子の同時的欠失により、この株がLB寒天中で増殖できなくなることを示している。次いで、A.バウマンニATCC 17978のA1S_0380 murIおよびA1S_3398 murI遺伝子が、この株におけるD-グルタミン酸の産生を担う唯一の遺伝子であることが示される。
【０２２１】
〔実施例３〕液体培養培地中での二重突然変異体(Δ0380/Δ3398)の増殖および生存能力に対するD-グルタミン酸の効果
増殖および生存能力曲線を決定するために、A.バウマンニ野生型株ATCC 17978および二重突然変異株を、10mM D-グルタミン酸を添加したLB中、37℃で18h培養した。細菌培養物を遠心分離し、ペレットをLBで2回洗浄し、OD600nm=0.1に調整した。次いで、100μLを、10mM D-グルタミン酸を含む/含まない100mLの液体LB中に接種し、これらの培養物を撹拌しながら37℃でインキュベートし、60分毎に7時間にわたって、最後に24時間後に試料を採取して、培地の光密度を決定した。同時に、試料を6時間まで2時間毎に採取し、最後に、別の試料を24時間後に採取して、10mM D-グルタミン酸を含むLB寒天中でCFU(コロニー形成単位)を決定した。全ての培養を3回行った。
【０２２２】
野生型株ATCC 17978ならびに突然変異株Δ0380/Δ3398の増殖曲線を作製して、時間の関数としてのD-グルタミン酸の非存在の効果ならびにこの化合物の存在下および非存在下でのこれらの株の生存能力を評価した。D-グルタミン酸を含まない培養培地中の二重突然変異株Δ0380/Δ3398の細菌増殖の完全な非存在(図7A)が観察された。しかしながら、D-グルタミン酸の存在下でのこの株の増殖は、同じ条件での野生型株の増殖と同様であった。D-グルタミン酸の非存在下での二重突然変異株Δ0380/Δ3398の6時間にわたる細胞生存能力を分析する場合、野生型株と違って、二重突然変異株の生存能力はこの化合物の限界のため、培養の最初の4時間で有意に低下する(1log10)ことが観察された(図7B)。
【０２２３】
〔実施例４〕電子顕微鏡によるA.バウマンニ野生型株ATCC 17978および二重突然変異株(Δ0380/Δ3398)の形態学的分析
走査型電子顕微鏡(SEM)により顕微鏡写真を撮影するために、A.バウマンニ野生型株ATCC 17978および二重突然変異株を、10mM D-グルタミン酸を添加したLB中、37℃で18h培養した。細菌培養物を遠心分離し、ペレットを0.1%NaClで2回洗浄し、LB中に再懸濁した。50μLの最終培養物を、0、0.1、1.25および10mMの濃度でD-グルタミン酸を含む5mLのLB中に接種した。培養物を撹拌しながら37℃で2時間インキュベートした後、遠心分離し、PBSで2回洗浄した。次いで、ペレットを0.1M PBS pH7.4中の4%パラホルムアルデヒドで30min固定した。固定後、試料をPBSで再度2回洗浄し、各試料を、増大する系列のエタノール(50%、70%、90%および100%)中でそれぞれ10分間脱水した。次いで、試料を、CO2(Bal-Tec CPD 030)を用いて臨界点まで乾燥し、アルミニウム支持体中で固定し、金の層で被覆した(Bal-Tec SCD 004スパッタコーター)。Jeol JSM-6400透過型電子顕微鏡を用いて、観察を行い、写真を撮影した。
【０２２４】
透過型電子顕微鏡(TEM)により顕微鏡写真を撮影するために、二重突然変異株Δ0380/Δ3398を、37℃で18h、10mM D-グルタミン酸を添加したLB寒天中で培養した。MH寒天へのその後の継代を実施し、それを37℃で18hインキュベートした。インキュベーション後、2〜3個のコロニーをPBSバッファー中に溶解し、懸濁液を遠心分離し、得られたペレットを最初にカコジレートバッファーで洗浄し、その直後、0.2Mカコジル酸ナトリウムバッファーpH7.4中で調製された冷2.5%グルタルアルデヒド中、室温で4時間固定した。次いで、ペレットをカコジレートバッファーで洗浄し、アセトン中で脱水し、SPURR(Spurr's Epoxy Embedding Medium)中に包埋した。これらの試料の超薄切片(70nm)を取得し、それらをJEOL JEM1010(80kV)透過型電子顕微鏡の下での観察のために酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色した。
【０２２５】
顕微鏡レベルで、D-グルタミン酸の外因的供給が減少するにつれてΔ0380/Δ3398株中で有意な形態学的および構造的変化が観察された。図8は、様々な濃度のD-グルタミン酸の存在下で培養された両方の株の走査型顕微鏡を用いて撮影した顕微鏡写真を示す。従って、図8Aにおいては、二重突然変異株Δ0380/Δ3398がD-グルタミン酸の非存在下では分裂することができない理由を見ることができる。0mM D-グルタミン酸で図中に見られる細菌細胞は、この化合物と共に予め増殖させた接種材料を連想させる。0.1mM D-グルタミン酸の存在下で、細菌細胞はいくらかの増殖を示すが、それは非常にゆっくりであり、不規則な分裂パターンを示す非常に特異なものであり、それらは非定型二分裂を示す細胞の線維状凝集体を形成する。プロトプラストの塊も観察される(細胞壁の非存在は細胞膜のみによって取り囲まれる細菌原形質、プロトプラストを残す)。1.25mMのD-グルタミン酸の存在下では、前記条件(より高い増殖速度を反映する)に関してであるが、多くのプロトプラストに関してより高い細胞密度が見られる。非定型二分裂を示すいくらかの細胞凝集体は生き続けるが、数が少ない場合、ここで細胞の一部はその野生型形態と同様の外見を有する。最後に、10mM D-グルタミン酸を添加した培地中では、全ての細胞は密度レベルと細胞形態レベルとの両方において、その野生型相同体と類似する外見を有する。非定型分裂は観察されない。
【０２２６】
さらに、図8Bに見られるように、本発明の著者らは、0.1mM D-グルタミン酸を含む細菌調製物において、異なる尺度で、二重突然変異株Δ0380/Δ3398と野生型株の両方のいくつかの顕微鏡写真を撮影した。この後者の株は、典型的な二分裂と共に、典型的なグラム陰性球桿菌形態および規則的細胞分裂パターンを有し、高い細胞密度が観察される。二重突然変異体の場合、その後の低い細胞密度と共に、前記形態および非定型細胞分裂が観察される。プロトプラストは構造的に無傷の細胞形態の近くに常に見え、以前のものの誘導または「ゴースト」として生じるため、プロトプラストの存在は明らかである。これらの複合体内では、細胞表面が粗く不規則であるため、細胞壁の外見は野生型株と比較して異なる。3つ以上の単位からなる大量の細胞線維が観察されるため、分裂レベルでの大きな変化も明らかである。
【０２２７】
走査型電子顕微鏡と同様、透過型電子顕微鏡試験を実施し、それらは、D-グルタミン酸の非存在下で保持した場合、二重突然変異株Δ0380/Δ3398の細胞壁が、グルタミン酸ラセマーゼタンパク質機能の不活化の結果としての進行的破壊、細胞溶解およびその後に起こる細菌の死滅を経験する。図9は、半剛性構造を失うコンフォメーションが変化した細胞から、外膜のいくらかの破裂および置換、細胞内の内容物(特に、遺伝物質)の溶解および押出しを示す細胞までの異なる段階の細胞壁変性を示す。グルタミン酸ラセマーゼはDNAジャイレースの調節において作用することができる酵素であるため、内膜(D-グルタミン酸で増殖させた接種材料の残余物)を依然として維持し、その中に遺伝物質が分散した細胞も見られる。最後に、細菌破壊の機構は以下の通りである：細胞壁の非存在は細胞膜のみによって取り囲まれる細菌原形質(プロトプラスト)を残し、この株を、培地の等張性の変化に対して非常に感受性が高い生物にする。次いで、プロトプラストが破裂し、「ゴースト」と呼ばれる細胞膜の残渣を残す時に起こるクリアリング現象が起こり、膜およびリポソーム凝集体も生成される。
【０２２８】
〔実施例５〕急性感染モデルにおけるBALB/cマウス中でのA.バウマンニ野生型ATCC 17978および二重突然変異株Δ0380/Δ3398の致死用量(LD)の決定
本発明の著者らは、A.バウマンニ野生型株ATCC 17978および二重突然変異株Δ0380/Δ3398の塩水中の接種材料の腹腔内投与を介してBALB/cマウスにおける全身感染をもたらした。接種材料を調製するために、OD600nm=0.7に達するまで振盪しながら37℃でLB(野生型株)およびLB + 10mM D-グルタミン酸(二重突然変異株)中で細菌を培養した(この接種材料を1Xと呼ぶ)。培養物を遠心分離し、細菌ペレットをLBで2回洗浄した。一度洗浄したら、細菌懸濁液を、以前のOD600nmに従って、0.9%NaClを用いて様々な用量(0.1X、1X、2X、2.5X、3X、4X、6X、8Xおよび10X)に調整し、メスのBALB/cマウス中に腹腔内的に接種した(100μL)(1XはOD600nm=0.7を有する細菌接種材料と理解される；0.1Xは10倍に希釈された1X細菌接種材料と理解される；2Xは2倍に濃縮された1X細菌接種材料と理解される)。マウスを感染後7日間モニタリングして、様々な用量での生存を決定した。致死用量(LD)を、両方の場合において観察された生存に従って決定した。LD100は100%のマウスに関する最小致死用量と理解される。
【０２２９】
図10Aは、マウスを増大する用量の野生型株に感染させた場合のマウスにおける異なる程度の生存を示す。2X用量に関してマウスの生存における徐々の減少が観察され、LD100(2.5X)を決定することができ、LD100はマウスの生存を0%に低下させるのに必要な最小用量と理解される。投与される用量が3Xより多い場合、生存のより急速な低下が観察される。
【０２３０】
図10Bは、増大する用量の二重突然変異株Δ0380/Δ3398に感染させたマウスにおける異なる程度の生存を示す。この株の場合、LD100は6Xであり、非常に高い用量の細菌接種材料であり、この株が低毒性であることを示している。同様に、野生型株の場合、投与される細菌用量がLD100より多い場合、マウスの生存のより急速な低下が観察される。
【０２３１】
〔実施例６〕BALB/cマウスにおけるA.バウマンニ野生型株ATCC 17978ならびに突然変異株Δ0380、Δ3398およびΔ0380/Δ3398を用いる全身感染モデルにおける肝臓中の細菌量の決定
上記のように、A.バウマンニ野生型株ATCC 17978ならびに突然変異株Δ0380、Δ3398およびΔ0380/Δ3398の塩水中の接種材料の腹腔内投与を介してBALB/cマウスにおいて全身感染を確立した。OD600nm=0.1(1X)に達するまで振盪しながら37℃で、野生型株ならびに単一突然変異株Δ0380およびΔ3398をLB中で、二重突然変異株Δ0380/Δ3398をLB + 10mM D-グルタミン酸中で培養した。培養物を遠心分離し、細菌ペレットをLBで2回洗浄した。一度洗浄したら、細菌懸濁液を、以前のOD600nmに従って、0.9%NaClを用いて2X用量に調整し、オスのBALB/cマウス(n=8〜9)中に腹腔内的に接種した(100μL)。マウスを、感染後12時間でチオペンタールナトリウムを用いて犠牲にした。肝臓を抽出し、無菌的に重量を計り、0.9%NaCl中でホモジェナイズした後、肝臓1グラムあたりのCFUを、LB寒天(野生型株、Δ0380およびΔ3398)および10mM D-グルタミン酸を含むLB寒天(二重突然変異株Δ0380/Δ3398)中で決定した。
【０２３２】
感染は血液を介して急速に拡散しながら起こり、感染後11〜30時間でマウスの死亡を引き起こすことがこの急性感染モデルにおいて観察される(図10A)。臓器中の細菌計数に基づいて、本発明の著者らは異なる株の侵襲および複製能力の測定値を得ることができる。かくして、以下の平均値が得られた：8.29Log10CFU/g(野生型株に感染したマウス)； 6.88Log10CFU/g(Δ0380株に感染したマウス)； 8.06 Log10CFU/g(Δ3398株に感染したマウス)および1.59 Log10CFU/g。(Δ0380/Δ3398株に感染したマウス)。(図11)。
【０２３３】
これらの値に基づいて、野生型株と比較してΔ0380株およびΔ0380/Δ3398株の計数における有意差が観察された(P<0.0001、Mann-Whitney U検定)。二重突然変異株Δ0380/Δ3398のコロニー計数を分析した場合、最も劇的かつ明確な減少が観察され、平均細菌量および臓器から細菌が回収されなかった動物の44.4%においてほぼ7log値の低下が得られた。
【０２３４】
〔実施例７〕二重突然変異株Δ0380/Δ3398で予め免疫したBALB/cマウスにおけるA.バウマンニ野生型株ATCC 17978を用いる全身感染モデルにおける肝臓、脾臓、および肺中の細菌量の決定
ワクチンとしてのΔ0380/Δ3398株の効能(防御のレベル)を評価するために、オスのBALB/cマウス(n=10)を、0および14日目に1X用量の塩水中のΔ0380/Δ3398株を用いて腹腔内的に免疫した(100μL)。対照マウス群(n=10)には、0および14日目に同一の様式で100μLの塩水を投与した。21日目に、マウスを、腹腔内注射によりA.バウマンニ野生型株ATCC 17978の4X接種材料に感染させた。感染の12時間後にマウスをチオペンタールナトリウムで犠牲にした。それぞれのマウスの肝臓、脾臓および肺を無菌的にプロセッシングし、上記のようにCFUを決定した。細菌接種材料を調製し、上記のように調整した。
【０２３５】
かくして、二重突然変異株Δ0380/Δ3398を用いる予備免疫化が致死用量のA.バウマンニATCC 17978に感染させたマウスの様々な臓器の細菌量の非常に有意な減少を引き起こすことが観察された場合、この株を用いるワクチン接種の防御効果が確認された。事実、非免疫マウスの細菌量と比較して、免疫したマウスのそれぞれの臓器の細菌量の大きな減少が観察された(P<0.0001、Mann-Whitney U検定)(図12)。
【０２３６】
〔実施例８〕Δ0380/Δ3398株を用いる様々なワクチン接種レジメンを受けたBALB/cマウスにおける間接ELISAによるA.バウマンニATCC 17978に対するIgG抗体の定量
様々なワクチン接種レジメンでの抗体媒介性免疫応答を評価するために、オスのBALB/cマウス(n=12)を、0および14日目に1X用量の塩水中のΔ0380/Δ3398株の腹腔内注射(100μL)により免疫した。対照マウス群(n=12)には0および14日目に同一の様式で100μLの塩水を投与した。免疫化の後7日目に、単回用量のワクチン(0日目に投与)で免疫した12匹のマウスから血清を取得し、21日目に、塩水を注射した対照マウス(n=12)の血清と一緒に、2回用量のワクチン(0および14日目に投与)(n=12)で免疫した残りのマウスから血清を取得した。血清を取得するために、マウスをチオペンタールナトリウムで麻酔し、後眼窩静脈叢の穿刺により採血した。血清を遠心分離により血液細胞から分離し、その後の分析まで-80℃で保存した。1X、0.5X、0.1X、0.05Xおよび0.01X用量のワクチンを同一の様式で調製し、以前に行ったように、マウス(n=6/用量)を0および14日目に免疫した。21日目に、血清を、免疫したマウスおよび塩水を注射した対照マウス(0X)から取得した。
【０２３７】
IgGの定量を間接酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により実施した。96ウェルELISAプレートを、A.バウマンニ野生型株ATCC 17978で「被覆」し、100mM炭酸-重炭酸バッファー、pH9.6中、4℃で18hのインキュベーション後、ウェルの底部に固定した。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で5回洗浄して、固定されなかった細菌を除去した。ウェルあたり200μLのブロッキング溶液(PBS中の5%スキムミルク)と共に25℃で1hインキュベートすることにより、残留部位を遮断した。プレートの内容物を吸引し、洗浄バッファー(PBS中の0.005%Tween 20)で5回洗浄した。プレートを、希釈バッファー(5〜10%FCSを含むDMEM培養培地)中に連続希釈した100μLの血清と共に25℃で1hインキュベートした。洗浄バッファーを用いて5回の洗浄を実施して、反応しなかった抗体を除去した。希釈バッファー中に1/5000に希釈されたウェルあたり100μLの第2抗体(ペルオキシダーゼ標識マウスIgG)を添加した。それを暗室中、25℃で1hインキュベートした。プレートを洗浄バッファーで5回洗浄して、反応しなかった標識抗抗体を除去した。100μLのTMB基質(ペルオキシダーゼ基質)と共に3minインキュベートすることにより、現像を実施した。ウェルあたり50μLの1M HClを用いて、反応を停止させた。色の読み取りを450nmで行った。その都度、IgG力価を決定するために、終点力価、ブランク吸光度読取り(希釈バッファーの吸光度)を0.1値超える値を有する最大血清希釈率を求める。
【０２３８】
上記で考察された通り、それぞれのマウスから採取された血液試料を用いて、A.バウマンニATCC 17978に関してELISA技術により抗体(IgG)力価を決定し、かくして、免疫応答を生成するワクチンの能力を測定した。野生型株に対する有意なレベルの抗体が、ワクチン非接種マウスと比較して全ての免疫したマウスにおいて検出された(図13)。抗体産生は、ワクチン非接種マウスと比較して、7日目と21日目の両方(それぞれ、Δ0380/Δ3398株の1回の注射後および2回の注射後)において有意に高かった。さらに、21日目(Δ0380/Δ3398株に合わせた2回の連続する注射の後)での抗体産生は、7日目(Δ0380/Δ3398株の1回の注射)での抗体産生よりも有意に多かった。
【０２３９】
他方、様々な用量のΔ0380/Δ3398株の効能を決定して、マウス免疫系を刺激するのに必要な最小用量を決定した。その目的のために、6匹のマウスの群を、以下の用量のそれぞれ：0.5X、0.1X、0.05Xおよび0.01X(それぞれ、2、10、20および100倍低い)で0および14日目に免疫した。対照群のマウスと比較して0.01X用量で免疫したマウス群の間で、21日目でのIgG抗体産生間に有意差が観察された(P<0.01、Mann-Whitney U検定)(図14)が、より高いワクチン用量よりもその程度は低かった。これは、マウスにおけるIgG産生を誘発するには1X用量よりも100倍低い用量で十分であることを示し、ワクチンとしてのこの株の効能を示している。
【０２４０】
〔実施例９〕A.バウマンニATCC 17978、A.バウマンニATCC 19606およびA.バウマンニAbH12O-A2に関する、Δ0380/Δ3398株で免疫したBALB/cマウスのIgG抗体を用いる交差反応アッセイ
以前に得られた血清を用いてA.バウマンニATCC 19606およびA.バウマンニAbH12O-A2に関してELISAを実施して、Δ0380/Δ3398株を用いて免疫したBALB/cマウスにおける抗体媒介性免疫応答を評価し、かくして、幅広い免疫応答を生成するワクチンの能力を測定した。アシネトバクター・バウマンニAbH12O-A2株は、いくらかの患者の死亡を引き起こした病院での大流行において単離された高侵襲性株であり、複数の抗生物質に関するその耐性パターンを特徴とすることが指摘されなければならない。その目的のために、A.バウマンニATCC 17978、A.バウマンニATCC 19606およびA.バウマンニAbH12O-A2を含むプレートを、上記のように「被覆」した。PBSを用いて5回の洗浄を実施した後、PBS中の5%スキムミルクを用いて遮断を実施した。プレートの内容物を吸引し、洗浄バッファーで5回洗浄した。プレートを、希釈バッファー中に1/5に希釈された100μLの試験血清と共に25℃で1時間インキュベートした。洗浄バッファーを用いて5回の洗浄を実施し、ウェルあたり100μLの1/5000に希釈されたペルオキシダーゼ標識マウスIgGを添加した。プレートを5回洗浄し、100μLのTMB基質と共に3分間インキュベートすることにより現像を実施した。ウェルあたり50μLの1M HClを用いて反応を停止させ、450nmで現像した色を読み取った。上記のようにその都度、終点力価を決定した。
【０２４１】
A.バウマンニATCC 17978株に関して観察されたものと類似する結果がA.バウマンニATCC 19606株およびA.バウマンニAbH12O-A2株に関して得られたが(図15)、類似する抗体力価が観察され、Δ0380/Δ3398株を用いる免疫化が同系野生型株に対する抗体を生成するだけでなく、ATCC 19606株およびAbH12O-A2株などの異なる耐性および毒性パターンを示す他の株に対するIgG抗体も生成することを示している。
【０２４２】
〔実施例１０〕Δ0380/Δ3398突然変異体を用いる免疫化による異なるA.バウマンニ株によるチャレンジに対するBALB/cマウスの防御
ワクチンとしての突然変異株Δ0380/Δ3398の効能を評価するために、0および14日目にBALB/cマウス(n=6〜12)に100μLのΔ0380/Δ3398株(塩水中の1X*用量)を投与した。対照マウスには、同様に0および14日目に塩水のみを投与した。2回目の注射の21日後、マウスを独立にA.バウマンニATCC 17978株(塩水中の4X用量)、AbH12O-A2株(塩水中の4X用量)およびAb307-0294株(0.75X)でチャレンジして、両方の場合に致死的全身感染を確立した(100μLの腹腔内注射)。チャレンジ後、マウスを7日間モニタリングして、対照マウス(ワクチン非接種)と比較したワクチン接種マウスの生存率を決定した。
【０２４３】
*Ab307-0294株を用いるチャレンジの場合、ワクチン接種したマウスに、0および14日目に、それぞれ、0.1Xおよび1X用量のΔ0380/Δ3398株を投与した。
【０２４４】
4X用量のA.バウマンニATCC 17978株に感染させた場合、ワクチン非接種マウス群において最初の24時間に11匹の死亡が観察されたが、これはこの群(n=12)における死亡率が92%であることを意味する。対照的に、全てのワクチン接種マウス(n=12)はチャレンジに対して生存し、感染を克服したが、これはこの群における生存率が100%であることを意味する(図16を参照されたい)。2つの群の間の生存の差異は、高度に統計的に有意であった(P<0.0001、Mantel-Coxのログランク検定による)。
【０２４５】
さらに、Δ0380/Δ3398株を用いる免疫化により産生された応答が、高毒性および病原性株を含む、他のA.バウマンニ株による致死的感染からの防御を提供するのに十分なものであるかどうかを決定した。AbH12O-A2株によるチャレンジの場合、ワクチン非接種マウス群において最初の19時間で9匹の死亡が観察されたが、これは100%の死亡率(n=9)を意味する。他方、全てのワクチン接種マウスは生存した(n=9; 100%の生存率)(図17を参照されたい)。2つの群の間の生存の差異は、高度に統計的に有意であった(P<0.0001、Mantel-Coxのログランク検定による)。
【０２４６】
Ab307-0294莢膜株によるチャレンジの場合、本発明者らはワクチン非接種マウス群において最初の24時間以内に100%の死亡率およびΔ0380/Δ3398株で予め免疫されたマウス群において83%の生存率を記録した(図18を参照されたい)。これは、突然変異株を用いるワクチン接種が顕著な毒性を有するA.バウマンニ株により引き起こされる全身感染に対する防御を付与することを確認するものである。2群間の生存の差異は高度に統計的に有意であった(P<0.0022、Mantel-Coxのログランク検定による)。
【０２４７】
これらの結果は全て、Δ0380/Δ3398株を用いるワクチン接種が多様な群のA.バウマンニ株による感染に対する防御免疫を提供することができることを示唆している。
【０２４８】
〔実施例１１〕Δ0380/Δ3398株の環境安全評価-水浸透圧溶解(osmolisis)の評価
ワクチン酵素の活性成分を構成する生きた弱毒化細菌株は、一度、それがワクチン接種した個体を離れたら、一般環境中で複製および持続することができるべきではない。A.バウマンニATCC 17978野生型およびΔ0380/Δ3398突然変異株が一般環境中で長時間追跡される能力を比較するために、本発明者らは、細胞浸透圧溶解による生存能力の喪失を観察するのに必要な時間にわたって37℃、撹拌(180rpm)条件下で、栄養素または塩の寄与がない水の中でのこれらの株の生存を評価した。LB寒天(野生型株)および10mM D-グルタミン酸を添加したLB寒天(突然変異株)中のCFU計数の決定のために、培養物の毎日の試料を2日間にわたって、および最後に週に2回取得した。全ての培養を3回実施した。
【０２４９】
培養の5日以内およびその後に生きている細菌は回収されなかったため、Δ0380/Δ3398突然変異株の生存能力の有意な低下が観察された。対照的に、その野生型対応物である野生型株は、培養の29日目まで生きたままであり、40日目で全体として回復不可能であった(図19を参照されたい)。2つの株間の生存の差異は高度に有意であった(P=0.0061、Studentのt検定による)。
【０２５０】
〔実施例１２〕Δ0380/Δ3398株における栄養要求表現型の安定性の評価
D-グルタミン酸化合物に関するA.バウマンニΔ0380/Δ3398の栄養要求性の不可逆性を試験するために、Δ0380/Δ3398株を、撹拌条件(180rpm)下、37℃で8日間、最適条件で10mM D-グルタミン酸を添加した100mLのLB中で増殖させた。LB寒天および10mM D-グルタミン酸を添加したLB寒天中でのCFUの決定のために、この培養物からの試料を、インキュベーション期間の開始時ならびに1、2、7および8日目に取得した。全ての培養を3回実施した。表現型復帰の仮想の事例においては、培地中の前記化合物の存在または非存在とは無関係に、長時間にわたって寒天プレート中で同様の細菌計数が回収されるはずである。対照的に、本発明者らは、培養物をD-グルタミン酸を含む/含まない寒天培地上に塗布した場合に得られる細菌計数間に有意差を観察した。
【０２５１】
得られる細菌計数は、インキュベーションの初期段階(0日)ならびに1、2、7および8日目で、最初の事例(D-グルタミン酸を添加した寒天プレート)において有意に高かった(図20を参照されたい)(P=0.0006、Studentのt検定による)。D-グルタミン酸を含まない寒天プレート中での有意により少ない数のコロニーの回収は、添加した培地中での増殖中の細菌細胞の細胞質中のこの化合物の蓄積に由来する残存する増殖に起因するものであり得る。この差異は、Δ0380/Δ3398株が長時間にわたって依然としてD-グルタミン酸に関して栄養要求性であり、野生型表現型に復帰する可能性がないことを示している。
【０２５２】
〔実施例１３〕マウスにおける腹腔内投与後のA.バウマンニΔ0380/Δ3398株のin vivoでのクリアランス
ワクチンとしてのA.バウマンニΔ0380/Δ3398の安全性を評価するために、互いに独立して塩水媒体中で調製された1X用量の野生型およびΔ0380/Δ3398突然変異株を腹腔内接種(100μL)されたBALB/cマウスの血液から、細菌計数を実施した。投与の45分後ならびに2、4、6、12および18時間後、マウスを安楽死させ、心臓から直接、血液を取得し、10mM D-グルタミン酸を含む/含まないLB寒天上に塗布した(栄養要求株についてはD-グルタミン酸を含む、および野生型については含まない)。
【０２５３】
本発明者らは、投与の45分後に野生型およびΔ0380/Δ3398株について得られた細菌計数間の有意差を観察した(図21を参照されたい)。Δ0380/Δ3398突然変異株の場合、6時間を超えたらコロニーは回収されなかった。これらの結果は、この生きた弱毒化細菌はその投与から数時間以内に体内から排出されるため、ワクチン候補としてのこの株の投与のための安全性の許容し得る閾値を示唆している。
【０２５４】
〔実施例１４〕グルタミン酸ラセマーゼをコードするP.エルギノーサPAO1中の遺伝子の同定
Protein Knowledgebase (UniProtKB)およびPseudomonas Genome Databaseを用いるP.エルギノーサPAO1のゲノム配列の分析により、単一の推定グルタミン酸ラセマーゼ遺伝子：265アミノ酸のタンパク質をコードするPA4662が示された。図4は、P.エルギノーサPAO1に由来するこの推定グルタミン酸ラセマーゼの予測アミノ酸配列と、A.バウマンニATCC 17978に由来する2つの報告されたグルタミン酸ラセマーゼおよび大腸菌K12に由来する1つの報告されたグルタミン酸ラセマーゼとを比較、整列させるものである。P.エルギノーサPAO1のPA4662によりコードされるMurIタンパク質は、大腸菌K12によりコードされるMurIタンパク質(MURI_ECOLI)との37.5%のアミノ酸配列類似性、A.バウマンニ(A3M1P5_ACIBT)のA1S_0380遺伝子座によりコードされるMurIタンパク質との35.9%のアミノ酸配列類似性およびA.バウマンニのA1S_3398遺伝子座(A3MA43_ACIBT)によりコードされるMurIタンパク質との37.5%の類似性を有する。
【０２５５】
〔実施例１５〕P.エルギノーサグルタミン酸ラセマーゼ欠損突然変異株の構築および特性評価
本発明者らは、PA4662のコード領域に対応するインフレーム欠失を有する、ΔPA4662と命名される突然変異対立遺伝子を構築するためのin vitroでの方法を用いた。この突然変異対立遺伝子を、pEX18Gm対立遺伝子交換システムを用いることによってP.エルギノーサPAO1株の染色体中で対応する野生型対立遺伝子に置換した。
【０２５６】
pEX18Gmプラスミドを用いて、PAO1株における対立遺伝子交換により、P.エルギノーサPA4662遺伝子中の印のない欠失、ΔPA4662を生成した。P.エルギノーサPAO1のPA4662の上流および下流領域に広がる、長さ約1kbの2つのPCR断片をクローニングすることにより、pEX18GmUP/DOWNPA4662プラスミドを構築した。上流断片を、プライマーUPPA4662(HindIII)F_IIおよびUPPA4662(NotI)Rを用いて増幅し、得られたPCR産物をHindIIIおよびNotIで消化した。下流断片を、DOWNPA4662(NotI)FおよびDOWN0380(XbaI)Rを用いて増幅し、得られたPCR産物をNotIおよびXbaIで消化した。消化された上流および下流断片を、HindIIIおよびXbaIで線状化されたpEX18Gmベクターにライゲーションして、pEX18GmUP/DOWNPA4662を生成した。
【０２５７】
pEX18GmUP/DOWNPA4662プラスミドを、最初に形質転換により大腸菌S17-1中に導入した。簡単に述べると、エレクトロコンピテントな大腸菌S17-1細胞を、電気パルスを印加した後37℃で一晩、15μg/mlのゲンタマイシンと共に培養した。インキュベーション後、得られたコロニーを、プライマーUPPA4662(HindIII)F_IIおよびDOWNPA4662(XbaI)Rを用いるPCRにより分析して、pEX18GmUP/DOWNPA4662プラスミドの所望の存在を確認した。
【０２５８】
pEX18GmUP/DOWNPA4662プラスミドを、上記のようにエレクトロポレーションによってP.エルギノーサPAO1株中に導入し、細胞を30μg/mlゲンタマイシンを含むLB中、37℃で3日間培養した。独立して、単離された同時組込み物コロニーを、10mM D-グルタミン酸および15%スクロースを添加した1mLのLB培地中に接種し、振盪しながら37℃で一晩増殖させた。次いで、培養物を、NaCl0.9%を用いて連続希釈し、希釈液を、15%スクロースおよび10mM D-グルタミン酸を含有するLB寒天上に塗布した。分解された同時組込み物の個々のコロニーを、15%スクロースおよび10mM D-グルタミン酸を含有するLB寒天プレートから拾い、10mM D-グルタミン酸を含む/含まないLB寒天プレート上の同等の位置にパッチ中で接種した。ΔPA4662遺伝子型を示す分解物(resolvant)は、D-グルタミン酸を含むLB寒天上でのみ増殖し、野生型遺伝子型を示す分解物はD-グルタミン酸を含む、または含まないLB寒天上で増殖した。
【０２５９】
このP.エルギノーサ株において、得られるΔPA4662単一突然変異体は増殖のために外因性D-グルタミン酸を必要とした。図22は、D-グルタミン酸を含有するLB寒天上でのみ増殖するΔPA4662突然変異遺伝子型を示す個々の分解された同時組込み物と、増殖のためにD-グルタミン酸を必要としない野生型遺伝子型を示す個々の分解された同時組込み物とを区別するために用いられたパッチ試験を例示する。
【０２６０】
新しく構築された突然変異体中のPA4662の適切な野生型またはインフレーム欠失変異体の存在を、プライマーUPPA4662(HindIII)F_II/DOWNPA4662(XbaI)R; INTFWPA4662/INTRVPA4662およびEXTFWPA4662/EXTRVPA4662を用いるPCRにより確認した(最後の組合せのプライマーを用いるスクリーニングを図23に例示する)。
【０２６１】
本発明者らの結果は、高度に相同なpEX18GmUP/DOWNPA4662プラスミドを用いる対立遺伝子交換により導入されたP.エルギノーサPAO1株のPA4662遺伝子座での単一のインフレーム欠失が、外因性D-グルタミン酸に関する厳密な増殖要件を付与することを示していた。この知見は、PA4662が機能的グルタミン酸ラセマーゼの産生を指令するP.エルギノーサPAO1における唯一の遺伝子であることを示している。
【０２６２】
〔実施例１６〕急性感染のマウスモデルにおけるP.エルギノーサ野生型およびΔPA4662グルタミン酸ラセマーゼ欠損株の致死用量(LD)の決定。間接ELISAによる抗体免疫応答(IgG)の評価
BALB/cマウス(n=4匹のマウス/群)に、様々な用量のP.エルギノーサPAO1野生型およびΔPA4662を、急性敗血症感染中のこれらの株の致死用量を決定するために投与した。
【０２６３】
投与される接種材料の調製のために、OD600nm=0.7(1X用量)となるまで振盪しながら37℃でLB(野生型株)および10mM D-グルタミン酸を添加したLB(ΔPA4662突然変異株)中で細菌を増殖させた。次いで、培養物を遠心分離し、細菌ペレットをLBで2回洗浄した。細胞洗浄後、細菌懸濁液を、NaCl0.9%を用いて、以前のOD600nm値に従って様々な用量(0.1X、0.4X、1X、4X、10Xおよび40X)に調整し、腹腔内注射によりBALB/cマウスに接種(100μL)した(1XはOD600nm=0.7を有する細菌接種材料を意味し、0.1Xは1:10に希釈された細菌接種材料を意味し、2Xは2:1に濃縮された細菌接種材料などを意味する)。
【０２６４】
マウスを感染後7日間モニタリングし、様々な用量の注射された細菌について生存率を決定した。それぞれの細菌株の致死用量(LD)力価を、両方の場合のマウスの観察された生存を考慮して決定したが、LD100は100%の感受性マウスが死亡する最小用量を意味する。
【０２６５】
図24Aにおいて、本発明者らは、増大する用量のP.エルギノーサPAO1野生型株に感染した動物における異なる程度の生存を見ることができる。この株について、LD100は0.4Xである。図24Bにおいて、本発明者らは、増大する用量のΔPA4662突然変異株に感染した動物における異なる程度の生存を見ることができる。この株について、LD100は40Xを超え、非常に高用量の細菌接種材料であり、敗血性ショックに由来する(細菌の複製に起因するものではない)マウスの死亡をもたらし得る。これは、この株が非常に低い毒性を有する(野生株のLD100よりも100倍高い用量のみがマウスの生存を50%低下させる)ことを示す。
【０２６６】
さらに、本発明者らは、間接ELISAにより抗体免疫応答(IgG)を評価した。その目的のために、4匹のマウスの群を、以下の用量：0.1X、0.4X、1X、4X、10Xおよび40Xの1つで1回免疫した。図44に示されるように、ワクチン投与の40日後に検出した場合でも、IgG産生を有意に(P<0.001)誘発するには、0.1XのΔPA4662突然変異株(1X=5x108CFU/mL)の1回ワクチン用量で十分である。それにも拘わらず、0.4Xと等しいか、またはそれより多いワクチン用量は、より高レベルのIgG産生を惹起する。
【０２６７】
図45に示されるように、IgGレベルは、第1のワクチン用量(0.4X)を投与した後、7日目で有意に増加した。しかしながら、第2のワクチン用量を投与する場合(0.4X)、抗体産生は有意により高い。
【０２６８】
最後に、3回用量(0.4X)のΔPA4662株をワクチン接種したマウス(0、14および28日目で投与した)および塩水を投与したマウス(同じ日に)から34日目に得られた血清を用いて、異なる株のP.エルギノーサに関してELISAを実施して、幅広い免疫応答を生成するΔPA4662ワクチンの能力を測定した。P.エルギノーサPAO1株に関して観察されたものと類似する結果が、PA28562株についても得られたが、試験した残りのP.エルギノーサ株(PA51430664、PA26132、PAST175、PA29475およびPA12142)に関して高レベルの交差反応性も見られた(図46)。これは、ΔPA4662株を用いる免疫化が同系野生型株に対する抗体を生成するだけでなく、複数のP.エルギノーサ株に対して反応するIgG抗体も生成することを示している。
【０２６９】
〔実施例１７〕電子顕微鏡によるP.エルギノーサPAO1野生型株およびΔPA4662突然変異株の形態学的分析
透過型電子顕微鏡(TEM)による電子顕微鏡写真を取得するために、ΔPA4662突然変異株を37℃で18h、10mM D-グルタミン酸を添加したLB寒天中で最初に増殖させ、最後にMH寒天、LBならびにMgCl2(30mg/L)およびCaCl2(75mg/L)を添加したLB上に塗布し、37℃で18hインキュベートした。インキュベーション後、2〜3個のコロニーをPBSバッファー中に溶解し、懸濁液を遠心分離し、得られたペレットを最初にカコジレートバッファーで洗浄し、すぐに細胞を、カコジル酸ナトリウムバッファー(0.2M、pH7.4)中で調製された2.5%氷冷グルタルアルデヒド中、室温で4時間固定した。次いで、ペレットをカコジレートバッファーで洗浄し、アセトン中で脱水し、Spurr(Spurr's Epoxy Embedding Medium)中に包埋した。試料の超薄切片(70nm)を、JOEL JEM 1010(80kV)透過型電子顕微鏡中での観察のために酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色した。
【０２７０】
図25は、剛性構造を失うコンフォメーションが変化した細胞から、外膜のいくらかの破裂および置換、細胞内の内容物(特に、遺伝物質)の溶解および押出しを示す細胞までの異なる段階のΔPA4662突然変異株の細胞壁変性を示す。細菌破壊の機構はこの順序に従ってもよい：1)細胞壁の非存在が細胞膜内側のみによって取り囲まれる細菌原形質(プロトプラスト)を残し、この細胞を、培地の等張性の変化に対して全体として曝露させる；2)プロトプラストが破裂し、凝集することができる「ゴースト」と呼ばれる微量の細胞膜を残し、個々の膜およびリポソーム凝集体も見ることができる。
【０２７１】
〔実施例１８〕ΔPA4662突然変異体を用いる免疫化によるP.エルギノーサPAO1株によるチャレンジに対するBALB/cマウスの防御
ワクチンとしてのΔPA4662の効能を評価するために、BALB/cマウス(n=8)に、0および14日目に100μLのΔPA4662株(塩水中の0.4X用量)を投与した。対照マウスには同様に0および14日目に塩水のみを投与した。2回目の注射の25日後、マウスをP.エルギノーサPAO1野生型株(塩水中の0.4X用量)でチャレンジして、両方の場合における致死的全身感染(100μLの腹腔内注射)を確立した。チャレンジ後、マウスを7日間モニタリングして、対照マウス(ワクチン非接種)と比較したワクチン接種マウスの生存率を決定した。
【０２７２】
0.4X用量のP.エルギノーサPAO1野生型株に感染させた場合、最初の15時間でワクチン非接種マウス群において8匹の死亡が観察されたが、これは、この群(n=8)の死亡率が100%であることを意味する。対照的に、全てのワクチン接種マウス(n=8)がチャレンジに対して生存し、感染を克服したが、これは、この群における生存率が100%であることを意味する(図26Aを参照されたい)。2群間の生存の差異は、非常に統計的に有意であった(P<0.0001、Mantel-Coxのログランク検定による)。
【０２７３】
これらの結果は、ΔPA4662株を用いるワクチン接種がP.エルギノーサによる感染に対する防御免疫を提供することができることを示唆している。
【０２７４】
これらの結果は、以下のようにさらに確認される。第1に、図26Bは、0.4X用量のP.エルギノーサPAO1野生型株による腹腔内感染後のBALB/cマウス(n=8)の生存パーセント(87.5%のワクチン効能)を示す。ワクチン接種マウスを、0および14日目にP.エルギノーサΔPA4662株(0.04X用量)で免疫し、25日目に野生型株に感染させた。ワクチン非接種マウスに0および14日目に塩水を投与し、同じ日に野生型株に感染させた。*ワクチン非接種群と比較したワクチン接種群の生存のP<0.0001)。第2に、図47は、ワクチン接種マウスは10時間の急性敗血症感染後の肝臓、脾臓および肺中のP.エルギノーサのCFUの有意な減少を有していた。
【０２７５】
ヒトにおける投与のための好ましい経路の1つを用いたワクチンとしてのΔPA4662株の防御効能を評価するために、BALB/cマウス(n=8/群)に、筋肉内経路を用いて0、14および28日目に100μLのΔPA4662株(塩水中の0.4X用量)を注射した。対照マウスには同様に0、14および28日目に塩水のみを投与した。34日目に、安楽死させることなく全てのマウスに由来する顎下腺静脈から血液を採取し、血清を分離し、上記のようにIgGの定量を実施した。IgG抗体産生間の有意差が、対照群と比較して免疫されたマウス群間で観察された(P<0.0001、対応のないt検定による)(図49)。
【０２７６】
35日目に、マウスをP.エルギノーサPAO1野生型株(塩水中の0.4X用量)でチャレンジして、両方の場合における致死的全身感染を確立した(100μLの腹腔内注射)。チャレンジ後、マウスを7日間モニタリングして、対照マウス(ワクチン非接種)と比較したワクチン接種マウスの生存率を決定した。チャレンジ後、ワクチン非接種マウス群において8匹の死亡が観察されたが、これは、この群における死亡率が100%であることを意味する。対照的に、全てのワクチン接種マウスはこのチャレンジに対して生存し、感染を克服した。これは、この群における生存率が100%であることを意味する(図50を参照されたい)。ワクチン接種マウスと対照マウスとの生存の差異は、非常に統計的に有意であった(P<0.0001、Mantel-Coxのログランク検定による)。この結果は、筋肉内投与経路を用いるワクチン接種が腹腔内経路と同程度に有効であることを示唆している。
【０２７７】
〔実施例１９〕ΔPA4662ワクチン抗血清を用いる受動免疫化
細菌曝露前のワクチン接種スケジュールの完了が可能でない状況では、個体が抗体を合成することができない場合、またはさらには病原体への曝露後に、受動免疫化の使用が有益であり得る。ΔPA4662ワクチン接種を用いた場合に形成された抗体を宿主から取り出し、別のレシピエントに移し、そこでそれらは即時の受動免疫を提供するか、または感染症と闘うのを助けることができる。
【０２７８】
本発明者らは最初に、ΔPA4662株を用いて免疫されたマウスからのワクチン血清を用いて、P.エルギノーサへの曝露の前にマウスを受動免疫化することができるかどうかを決定した。1回用量のワクチンまたはナイーブな血清を、0.4X用量のP.エルギノーサPAO1野生型株を用いる感染の3.5h前に、BALB/cマウス(n=8)への腹腔内注射(200μL)により投与し、マウスの生存を、チャレンジ後3日間モニタリングした。図27Aに示されるように、ワクチン血清を投与された全てのマウスが疾患から保護されたが、ナイーブな血清を受けるマウスの50%が感染に屈服した(P=0.025; Mantel-Cox検定(ログランク検定))。
【０２７９】
これらの結果は、ΔPA4662株をワクチン接種されたマウスからの血清を用いる受動免疫化は、感染前に投与された場合、感染からの有意なレベルの防御を付与することができるが、P.エルギノーサPAO1急性敗血症に対する防御免疫を提供するためには抗体だけで十分であることを示している。
【０２８０】
次に、本発明者らは、ΔPA4662株で免疫されたマウスからのワクチン血清を、P.エルギノーサの致死的感染を既に受けている非免疫マウスに薬剤として与えて、疾患の予後を改善することができるかどうかを決定した。処置として、2回用量のワクチンまたはナイーブな血清(150〜200μL)を、0.4X用量のP.エルギノーサPAO1野生型株による感染の2hおよび4.5h後にBALB/cマウス(n=7)への静脈内注射により与えた。マウスの生存を2日間にわたってモニタリングした。勿論、血清を用いる最初の処置が投与された場合、全てのマウスが急性敗血症感染の目に見える症状を呈した。図27Bに示されるように、致死用量のP.エルギノーサを受ける全てのマウスが感染に屈服したが、ワクチン血清を投与されたマウスはナイーブな血清を受けるマウスよりも有意に長く生存した(P=0.0112; Mantel-Cox検定(ログランク検定))。かくして、ワクチン血清は、急性致死性疾患の発症後数時間、マウスの生命維持を提供し、直ちに防御するのを助けた。防御および処置とワクチン血清との相関に関して、これらの結果はまた、最適な抗体力価および投与スケジュールを決定する必要があり得ることを示唆している。
【０２８１】
〔実施例２０〕ΔPA4662株の環境安全評価-水浸透圧溶解の評価
ワクチン候補はまた、一度、それがワクチン接種された個体から離れたら、一般環境中で複製、持続することができない1つの細菌を意味すると解釈されるべきである。一般環境中で長時間追跡されるP.エルギノーサPAO1野生型株およびΔPA4662突然変異株の能力を比較するために、本発明者らは、細胞浸透圧溶解による生存能力の喪失を観察するのに必要な時間にわたって、37℃で撹拌(180rpm)しながら、栄養素または塩の寄与がない水の中でのこれらの株の生存を評価した。
【０２８２】
最初の3日間は毎日培養物の試料を取得し、次に、62日目までは週に2回、最後に、LB寒天(野生型株)および10mM D-グルタミン酸を添加したLB寒天(突然変異株)中でのCFU計数の決定のために2週間毎に少なくとも1回、試料を取得した。全ての培養を3回実施した。
【０２８３】
ΔPA4662株の生存能力の有意な低下が見られ、培養の17日以内およびその後に生きた細菌は回収されなかった。対照的に、その野生型対応物である野生型株は、培養の25日目以後も依然として広く回収可能であり(図28を参照されたい)、143日目まで生存した。
【０２８４】
〔実施例２１〕ΔPA4662株における栄養要求性表現型の安定性の評価
D-グルタミン酸化合物に関するP.エルギノーサΔPA4662の栄養要求性の不可逆性を試験するために、ΔPA4662株を、撹拌(180rpm)しながら37℃で5日間、最適条件で10mM D-グルタミン酸を添加した100mLのLB中で増殖させた。この培養物からの試料を、LB寒天および10mM D-グルタミン酸を添加したLB寒天中でのCFUの決定のために、インキュベーションの開始時ならびに3および5日目に取得した。全ての培養を3回実施した。表現型復帰の仮想の事例においては、培地中の前記化合物の存在または非存在とは無関係に、長時間にわたって寒天プレート中で同様の細菌計数が回収されるはずである。対照的に、本発明者らは、培養物をD-グルタミン酸を含む/含まない寒天培地上に塗布した場合に得られる細菌計数間に有意差を観察した。
【０２８５】
得られる細菌計数は、インキュベーションの初期段階(0日)ならびに3および5日目で、最初の事例(D-グルタミン酸を添加した寒天プレート)において有意に高かった(図29を参照されたい)(P=0.0059、Studentのt検定による)。D-グルタミン酸を含まない寒天プレート中での有意により少ない数のコロニーの回収は、添加した培地中での増殖中の細菌細胞の細胞質中のこの化合物の蓄積に由来する残存する増殖に起因するものであり得る。この差異は、ΔPA4662株が長時間にわたって依然としてD-グルタミン酸に関して栄養要求性であり、野生型表現型に復帰する可能性がないことを示している。
【０２８６】
さらに、図51において、本発明者らは、腹腔内投与の1時間後の野生型およびΔPA4662株について得られた細菌計数間に有意差を観察した。ΔPA4662突然変異株の場合、1時間を超えたらコロニーは回収されなかった。これらの結果は、この生きた弱毒化細菌はその投与から数時間以内に血液から排出されるため、ワクチン候補としてのこの株の投与のための安全性の許容し得る閾値を示唆している。
【０２８７】
〔実施例２２〕グルタミン酸ラセマーゼおよび/またはD-アミノ酸トランスアミナーゼを含まないS.オーレウスの単一および二重突然変異株の構築および特性評価
温度感受性複製ベクターpMADを用いて相同二重組換えを実行して、突然変異株を構築した。最初に、注釈付きグルタミン酸ラセマーゼ(murI)およびD-アミノ酸トランスアミナーゼ(dat)遺伝子の印のない欠失を独立に達成した。それぞれの単一突然変異株を、それぞれ、ΔmurIおよびΔdatと呼んだ。
【０２８８】
これらの2つの突然変異株の構築を達成するために、遺伝子に隣接する上流(左)および下流(右)のDNAに対応する1000bpの断片をPCRにより増幅し、シャトルプラスミドpMAD中に別々にクローニングした。得られた組換えプラスミドを用いて、S.オーレウス132野生型株の染色体上に位置する染色体のmurIおよびdat遺伝子を除去した。
【０２８９】
S.オーレウス132は、D-グルタミン酸に対する栄養要求性突然変異株を生成するために「スタフィロコッカス・オーレウス」種のモデル生物として本発明において用いられる臨床MRSA株である。これは、メチシリンに耐性の臨床株(MRSA)である(Vergara-Irigarayら、Infection and Immunity, 77 (9): 3978-3991 (2009))。
【０２９０】
murI遺伝子の上流断片を、murIUP(MluI)FとmurIUP(NotI)Rのプライマー対の組合せを用いるPCR増幅により取得した後、MluIおよびNotI制限酵素により消化した。murI遺伝子の下流断片を、murIDOWN(NotI)FおよびmurIDOWN(BglII)Rプライマーを用いるPCR増幅により取得した後、NotIおよびBglII酵素で消化した。murI遺伝子の消化された上流および下流断片を、MluIおよびBglII酵素で予め線状化されたpMAD中にクローニングし、pMAD_UP/DOWN_murIと命名された構築物を得た。
【０２９１】
同じ戦略を、pMAD_UP/DOWN_datプラスミドの構築のために完了させた。この場合、dat遺伝子の上流および下流断片を、それぞれ、datUP(MluI)F/datUP(NotI)RとdatDOWN(NotI)F/datDOWN(BglII)Rのプライマー対を用いて増幅した。
【０２９２】
pMAD_UP/DOWN_murIおよびpMAD_UP/DOWN_datを、エレクトロポレーションにより大腸菌TG1中に導入した。形質転換体コロニーを、アンピシリン(100μg/mL)+ X-Gal(150μg/mL)を添加したLB寒天上で選択した。37℃で18hインキュベートした後、アンピシリン耐性の青色コロニーを、それぞれ、murIExtF/murIExtRまたはdatExtF/datExtRのプライマー組合せを用いてpMAD_UP/DOWN_murIまたはpMAD_UP/DOWN_datの存在についてPCRによりチェックした。
【０２９３】
大腸菌TG1細胞から抽出された構築物pMAD_UP/DOWN_murIおよびpMAD_UP/DOWN_datを、中間クローニング株S.オーレウスRN4220中に独立に導入した後、標的化されたS.オーレウス132株中にエレクトロポレーションした。組換えプラスミドを含有するS.オーレウスRN4220コロニーの選択を、30℃で24〜48hインキュベートした後、エリスロマイシン(10μg/mL) + X-Gal(150μg/mL)を添加したTSB寒天上で実施した。
【０２９４】
それぞれの組換えプラスミドを、S.オーレウスRN4220から抽出し、エレクトロポレーションによりS.オーレウス132野生型株中に独立に導入した。その上、それぞれの構築物を担持するS.オーレウス132のエリスロマイシン耐性青色コロニーを、30℃で24〜48h、エリスロマイシン(10μg/mL) + X-Gal(150μg/mL)を添加したTSB寒天上で増殖させた。
【０２９５】
S.オーレウス132野生型株の染色体murI遺伝子を欠失させるために、pMAD_UP/DOWN_murIを担持するS.オーレウス132野生型の1つのコロニーを、10μg/mLのエリスロマイシンを含む5mLのTSBに移し、30℃で2h増殖させた。その後、培養物を、murI遺伝子の上流または下流領域での単一交差型組換えを介するpMAD_UP/DOWN_murIの細菌染色体への組込みをもたらす、pMAD複製に関する非許容温度である43.5℃でインキュベートした。6時間後、TSB培養物を連続希釈し、エリスロマイシン(10μg/mL) + X-Gal(150μg/mL)を添加したTSAプレート上に拡散させ、43.5℃で18hインキュベートした。いくつかの得られたコロニーを、抗生物質を含まない5mLのTSBに移し、30℃で18hインキュベートして、染色体からのpMAD_UP/DOWN_murIの切り出しをもたらす第2の交差事象を誘導した。pMAD_UP/DOWN_murIを最早含有しない白色コロニーの選択を、X-Gal(150μg/mL)を含むTSBプレート上に連続希釈液を塗布することにより実行した。それぞれの選択されたコロニーを、X-Gal(150μg/mL)ならびにX-Gal(150μg/mL) + エリスロマイシン(10μg/mL)を含むTSA上に移した。エリスロマイシン感受性白色コロニーを、murIExtF/murIExtR、murIseqF/murIseqRおよびmurIF/murIRプライマー対を用いてmurI遺伝子の欠失(ΔmurI)についてPCRによりチェックした。
【０２９６】
S.オーレウス132野生型株の染色体からのdat遺伝子の欠失を、murIについて以前に記載されプロトコールに従うが、pMAD_UP/DOWN_datプラスミドを用いて実施した。この場合、dat遺伝子を最早含有しないと疑われるコロニー(Δdat)を、datExtF/datExtR、datseqF/datseqRおよびdatF/datRのプライマー組合せを用いて確認した。
【０２９７】
二重突然変異株ΔmurI/Δdatを生成するために、pMAD_UP/DOWN_datプラスミドをエレクトロポレーションによりΔmurI突然変異株に導入し、単一突然変異体について以前に記載されたのと同じプロトコールを実施した。この場合、二重遺伝子欠失を有するコロニーは増殖のためにこのD-アミノ酸を必要とするため、二重突然変異体の回収には培地に外因性D-グルタミン酸を添加する必要があった(それぞれ、TSBまたはTSB寒天については20または10mM)。S.オーレウス132野生型株のゲノム中のmurIおよびdat遺伝子座の非存在を、以下のプライマー：murIExtF/murIExtR、murIseqF/murIseqR、murIF/murIR、datExtF/datExtR、datseqF/datseqRおよびdatF/datRを用いるPCRにより確認した。
【０２９８】
D-グルタミン酸を含む/含まない培地中での異なる突然変異株の培養により、murIまたはdat遺伝子の単一の欠失が細菌増殖に影響しないことが示された。しかしながら、二重突然変異株は、増殖のために培地中にD-グルタミン酸の存在を必要とする。図30は、選択されたエリスロマイシン感受性白色コロニーについて実行されたコロニースクリーニング法が単一突然変異体ΔmurIの第2の交差事象から得られることを表す。
【０２９９】
図31は、S.オーレウス132野生型の3つの突然変異株における異なる欠失のPCR確認を示す。今までのところ得られた結果は、2つの野生型遺伝子座murIまたは/およびdatのいずれかの存在が、D-グルタミン酸を添加しないTSB寒天中でのS.オーレウス132の正常な増殖にとって十分であること、ならびに両遺伝子の同時的欠失によりこの株がD-グルタミン酸の存在なしには増殖できなくなることを示している。結論として、S.オーレウス132のmurIおよびdat遺伝子は、この株におけるD-グルタミン酸の生合成に関与する唯一の遺伝子であることが示される。
【０３００】
かくして、グルタミン酸ラセマーゼとD-アミノ酸トランスアミナーゼ酵素の両方の不活化はD-グルタミン酸に対する栄養要求性をもたらすこと、およびスタフィロコッカス・オーレウス種に属する栄養要求性突然変異体を取得するための方法が、選択される株とは無関係であることは注目に値する。
【０３０１】
〔実施例２３〕液体培養培地中での二重突然変異株ΔmurI/Δdatの増殖および生存能力に対するD-グルタミン酸の効果
S.オーレウス132野生型と比較したS.オーレウス二重突然変異株ΔmurI/Δdatの増殖および生存能力曲線を評価するために、両株を100mlのTSBおよび20mM D-グルタミン酸を添加したTSB中に1/200の最終希釈率となるように指数増殖期に接種し、一定の振盪(180rpm)を加えながら37℃でインキュベートした。1、2、3、4、5および18hで、培養物の光密度および細菌濃度を決定した。光密度を、各フラスコのアリコートをOD600nmで測定することにより評価し、細菌濃度(CFU/mL)を、TSB寒天プレート上に連続10倍希釈液を拡散させることにより算出した。全ての培養を3回実施した。
【０３０２】
S.オーレウス野生型株ならびに二重突然変異株ΔmurI/Δdatの増殖曲線を実施して、時間に沿った培地中のD-グルタミン酸の非存在の効果、ならびに、この化合物の存在下および非存在下での株の生存能力を評価した。
【０３０３】
D-グルタミン酸を含まないTSB培地中の二重突然変異株について、増殖の全体的非存在が観察され(図23A)、培地にD-グルタミン酸を添加した場合、ぼぼ全体的に回復した。細菌の生存能力に関して(図32B)、二重突然変異株の生存能力は培養培地中でのD-グルタミン酸の制限のため、18hで有意に低下した(2Log10)ことが示される。
【０３０４】
〔実施例２４〕電子顕微鏡によるS.オーレウス132野生型および二重突然変異株ΔmurI/Δdatの形態学的分析
電子顕微鏡試料を調製するために、20mMのD-グルタミン酸を添加したTSB中のS.オーレウス野生型および二重突然変異株ΔmurI/Δdatの液体培養物(37℃で16h)から回収されたペレットを、塩水中で2回洗浄し、1mLのTSB中に再懸濁した。50μLの各懸濁液を、増大する濃度のD-グルタミン酸：0、0.1、1.5および20mMを添加した5mLのTSBに移し、一定の振盪(180rpm)を加えながら37℃で3時間インキュベートした。得られた細菌培養物を遠心分離し、ペレットをPBSで2回洗浄した。その後、ペレットを室温で振盪しながら30分間、PBS 1M pH7.4中のパラホルムアルデヒド4%を用いて固定した。試料をPBSでさらに2回洗浄し、一連の増大するアルコール濃度(50%、70%、90%、100%)でそれぞれ15分間脱水した。最後に、試料を、CO2(Bal-Tec CPD 030)を用いて臨界点で乾燥した。1滴の各試料をスライドカバー上に置き、金コーティング(Bal-Tec SCD 004スパッタコーター)のためにアルミニウム支持体上に固定した。試料を、透過型電子顕微鏡Jeol JSM-6400中で観察および写真撮影した。
【０３０５】
顕微鏡観察により、培地減少におけるD-グルタミン酸としての二重突然変異株ΔmurI/Δdatの実質的な形態学的および構造的変化を検出することができた。図33は、様々な濃度のD-グルタミン酸を添加したTSB培地中で増殖させた後の野生型と二重突然変異株とを比較する走査型電子顕微鏡画像を示す。
【０３０６】
図33Aは、二重突然変異株がD-グルタミン酸を外部から添加しなければ分裂することができないことを示す。従って、0mMのD-グルタミン酸では、検出される細菌細胞は、この化合物の存在下で予め増殖させた初期接種材料とほぼ一致する。連想させる(reminiscent)細胞内D-グルタミン酸のために起こった不完全な細胞分裂の結果として、いくらかの異常な細胞形状を観察することもできる。二重突然変異株を0.1mMのD-グルタミン酸を添加した培地中でインキュベートした場合、いくらかの細胞分裂が起こったが、低濃度のこのD-アミノ酸のため非定型であり続ける。かくして、細胞壁生合成および分裂のプロセスは完全ではなく、かくして、変形した細胞およびプロトプラスト(ペプチドグリカンを欠くが、細胞膜は依然として担持する細菌細胞)を生成する。1.5mMのD-グルタミン酸の存在下では、細菌密度は、より低濃度のこの化合物を含む培地から誘導される培養物と関連してわずかに低下したが、これは、二重突然変異株のより高い増殖速度を示している。プロトプラストおよび長くなった形状が依然として存在するが、野生型株と同じ構成を有する定型の球状細菌細胞を観察することができる。最後に、培地に20mM D-グルタミン酸を添加した場合、二重突然変異株の細胞密度ならびに形態は、野生型株により示されるものと同等である。非定型分裂パターンは観察されない。
【０３０７】
他方、図33Bは、0.1mMのD-グルタミン酸を添加した培地中でインキュベートした二重突然変異株および野生型株の細菌培養物の様々な走査型電子顕微鏡写真を示す。野生型株は、グラム陽性球菌の特徴的な球形の形状、高い細胞密度および典型的な分裂パターンを示す。S.オーレウスの分裂は、不完全な細胞壁分離を特徴とし、かくして、ペプチドグリカンのセグメントにより接続されたままであるブドウ状クラスター中の細菌細胞に見える。逆に、二重突然変異株の細胞は、不完全な細胞分裂の悪化の結果として、大きく圧縮された凝集体または集合体の一部を形成するようになる。培地中の十分な濃度のD-グルタミン酸の欠如は、ペプチドグリカン生合成および正確な細胞壁分裂を損傷させた。実際、細胞密度は、野生型調製物において観察されるものよりも低い。さらに、通常ではない長くなった細胞などの、豊富な変形した形状が見える。この条件下では、二重突然変異株はまた、野生型株と比較して粗く不規則な表面を示す。
【０３０８】
さらに、細胞壁の進行的分解、細菌変性およびその後の細菌の死滅を、透過型電子顕微鏡により二重突然変異株において検出した。この目的のために、試料調製物を、実施例4に記載のようにD-グルタミン酸の非存在下での二重突然変異株の短期的維持により取得した。図34から見られるように、この手法により、細菌死滅までの様々な徐々の分解段階の観察が可能になった。ペプチドグリカンは細胞系の機械的に耐性の部分であるため、観察された初期の形態学的変化は、ムレイン層の減少およびその結果としての細胞サイズの増加(プロトプラスト)を含んでいた。細胞質構成要素の押出しをもたらす、細胞膜の透過性および破壊を観察することもできる。これらの崩壊した細胞の周囲には大量の破片、膜凝集体、リポソームおよび遺伝物質を見ることができる。他方、いくらかの細菌細胞は、依然として無傷のエンベロープを維持し、従って、典型的なS.オーレウスの細菌形状およびサイズを観察することができる。
【０３０９】
〔実施例２５〕急性感染モデルにおけるBALB/cマウス中でのS.オーレウス野生型132および二重突然変異株ΔmurI/Δdatの致死用量(LD)の決定
BALB/cマウス中で全身感染をもたらすために、S.オーレウス野生型および二重突然変異株の3%のブタムチンを含む塩水接種材料を、マウスに腹腔内投与した。
【０３１０】
接種材料の調製のために、細菌を、0.7のOD600nmに達するまで振盪(180rpm)しながら37℃で、TSB(野生型)および20mM D-グルタミン酸を添加したTSB(二重突然変異株)中で増殖させた。培養物を遠心分離し、塩水血清で2回洗浄し、3%のブタムチンを含む塩水血清(腹腔内敗血症モデルのための野生型および突然変異株)または塩水血清(例に従って動物を免疫するための二重突然変異株)中に、約108CFU/mLの最終濃度となるように再懸濁した。この懸濁液は1Xと呼ばれ、250μLの容量がマウスに投与される場合、5x107CFU/マウスに相当する。細菌懸濁液を、様々な用量にさらに調整した(例えば、3Xの懸濁液は3倍濃縮された細菌接種材料などと理解される)。BALB/c(n=3〜4)マウスに、様々な用量(250μL)の細菌懸濁液を腹腔内接種し、感染後14日間モニタリングした。LD100は、100%のマウスが死亡する最小致死用量と定義される。
【０３１１】
図35Aにおいて、増大する用量のS.オーレウス野生型株を投与した場合のマウスにおける様々な程度の生存が示される。マウスの生存を0%に低下させる最小用量は3Xと決定された。図35Bには、増大する用量の二重突然変異株を投与した場合のマウスにおける生存が例示される。明確に対照的に、この図面は野生型株のLD100よりも10倍高い二重突然変異株の用量の接種が100%の生存率をもたらすことを示す。従って、二重突然変異株の致死用量は、30X LD100>30Xよりも高い。これは、S.オーレウスの二重突然変異株が高度に弱毒化された株であり、野生型対応株よりも低い毒性を示すことを明確に示している。
【０３１２】
〔実施例２６〕全身感染モデルを用いた二重突然変異株ΔmurI/Δdatで予め免疫されたBALB/cマウスの脾臓および血液中の細菌量の決定
ワクチンとしてのS.オーレウス二重突然変異株ΔmurI/Δdatの有効性(防御レベル)を評価するために、2つの独立した実験を実施した。
【０３１３】
最後に、BALB/cマウス(n=4〜6)を、0および14日目に塩水血清中の二重突然変異株ΔmurI/Δdat(10X用量)で腹腔内的に予備免疫(250μL)した。1群のマウスには、0および14日目に250μLの塩水を同様に投与した。21日目に、マウスに、S.オーレウス132野生型株の致死接種材料(5X用量、3%のブタムチンを含む250μL)を腹腔内感染させた。感染の20時間後に、マウスをチオペンタールナトリウムで安楽死させた。各マウスの脾臓を無菌的に取り出した後、塩水中でホモジェナイズし、臓器1グラムあたりのCFUを、TSB寒天中に連続希釈液を塗布することにより決定した。血液中の細菌の存在を、マウスの心臓から無菌的に取り出された50μLの血液試料を5mのTSB培地中に接種することにより評価した。細菌接種材料を、以前に記載のように調製および調整した。
【０３１４】
この株を用いる予備免疫化が致死用量のS.オーレウス132野生型株に感染したマウスの脾臓中の細菌量の有意な減少を引き起こすことが観察された場合、二重突然変異株ΔmurI/Δdatを用いるワクチン接種の防御効果が確認された。実際、本発明者らは、非免疫マウスと比較して免疫マウスの細菌量の大きな減少(2Log10)を観察した(P=0.0095、Mann-Whitney U検定、図36A)。さらに、全てのワクチン接種マウスの血液中の細菌の非存在(陰性血液培養物)は、ワクチン接種の防御効果をさらに支持する(図36B)。
【０３１５】
これらの結果は以下のようにさらに確認される。第1に、図37は、二重突然変異株ΔmurI/Δdat(この場合、8X用量)で予め免疫されたBALB/cマウス(n=8〜9)において、脾臓(図37A)および血液(図37B)中の細菌計数は、S.オーレウス132野生型株の致死接種材料(5X用量、3%のブタムチンを含む250μL)に感染させた22時間後に、非免疫群と比較して有意に低かったことを示す(それぞれ、P=0.0006およびP=0.0002、Mann-Whitney U検定による)。免疫化スケジュールを、上記のように実施した。
【０３１６】
〔実施例２７〕ΔmurI/Δdat突然変異株を用いる免疫化によるS.オーレウス132株を用いたチャレンジに対するBALB/cマウスの防御
ワクチンとしてのΔmurI/Δdatの効能を評価するために、BALB/cマウス(n=10〜13)に、0および14日目に250μLのΔmurI/Δdat株(塩水中の10X用量)を投与した。対照マウスには、同様に0および14日目に塩水のみを投与した。2回目の注射の7日後、マウスを致死用量のS.オーレウス132野生型株(3%ブタムチンを含む塩水中の5X用量)でチャレンジして、両方の場合における致死的全身感染を確立した。チャレンジ後、マウスをモニタリングして、対照群(ワクチン非接種)と比較したワクチン接種マウスの生存率を決定した。
【０３１７】
5X用量のS.オーレウス132野生型株に感染させた場合、ワクチン非接種マウス群において9匹の死亡が観察されたが、これは、この群(n=10)における死亡率が90%であることを意味する。対照的に、ワクチン接種群(n=13)の8匹のマウスがチャレンジに対して生存し、感染を克服したが、これは、この群における生存率が61.5%であることを意味する(図38を参照されたい)。2群間の生存の差異は、統計的に有意であった(P<0.031、Mann-Whitney U検定による)。
【０３１８】
これらの結果は、ΔmurI/Δdat株を用いるワクチン接種が、S.オーレウスによるその後の感染に対する防御免疫を提供することができることを示している。
【０３１９】
〔実施例２８〕二重突然変異株ΔmurI/Δdatを用いるワクチン接種を受けたBALB/cマウスにおける間接ELISAによる同系S.オーレウス132Δspa株に対するIgG抗体の定量
抗体により媒介されるワクチン接種に対する免疫応答を評価するために、BALB/cマウス(n=10)を、0および14日目に塩水中の二重突然変異株ΔmurI/Δdat(10X用量)の腹腔内注射(250μL)により免疫した。21日目に、マウスをチオペンタールナトリウムで麻酔し、後眼窩静脈叢の穿刺により採血した。血清を遠心分離により血液細胞から分離し、分析まで-80℃で保存した。
【０３２０】
IgGの検出を、関節酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いて実施した。96ウェルELISAプレートを、全S.オーレウス132Δspa株で被覆した。この株は、プロテインAを欠損するS.オーレウス132野生型株の同系株である。かくして、全細菌を、炭酸-重炭酸バッファー100mM、pH9.6(OD600=1を有する培養物の1/10希釈液)中、4℃で18hのインキュベーション後にウェルの底部に固定した。リン酸緩衝生理食塩溶液(PBS)バッファーで5回洗浄して、固定されなかった細菌を除去した。残留部位の遮断を2工程で実施して、マウス血清との非特異的相互作用を減少させた。最初に、ウェルあたり100μLのブロッキング溶液(PBS中の5%スキムミルク)と共に室温で1h、次に、100μLのウサギ血清(1/1000)と共に37℃で1h、プレートをインキュベートした。洗浄バッファー(PBS中の0.005%Tween 20)を用いる5回の洗浄工程の後、希釈バッファー(5〜10%のFCSを含むDMEM培地)中の100μLの連続希釈された血清と共に4℃で一晩、プレートをインキュベートした。次の日、洗浄バッファーを用いる5回の洗浄を行って、未反応の抗体を除去し、希釈バッファー中に1/5000に希釈された、ウェルあたり100μLの第2抗体(抗マウスIgGペルオキシダーゼHRP標識)を添加した。インキュベーションを、室温で1hにわたって行った。プレートを洗浄バッファーで5回洗浄した。現像プロセスを実施するために、プレートを100μlのTMB(HRP-ペルオキシダーゼ基質)と共に3minインキュベートした。反応を、ウェルあたり50μLの1M HClを用いて停止させた。比色測定を450nmで実施した。陽性(抗ストレプトコッカス・オーレウスモノクローナル抗体)、陰性(ワクチン非接種マウスからの血清)および参考(希釈バッファー)対照を、全てのプレートに含有させた。それぞれの血清に関するIgGの力価を決定するために、終点力価を見積もった。力価を、参考対照(希釈バッファー)よりも0.1ポイント高い吸光度を示す最終血清希釈率と定義した。
【０３２１】
かくして、各マウスから採取された血液試料を用いて、ELISAによりS.オーレウス132Δspa株に対する抗体(IgG)の力価を決定し、従って、免疫応答を生成するワクチンの能力を測定した。IgG抗体産生間の有意差が、対照群のマウスと比較して10X用量のΔmurI/Δdat突然変異株で免疫したマウス群間で観察された(P<0.0001、Mann-Whitney U検定による)(図39)が、これは、マウスにおいてIgG応答を誘発する際のこの株の効能を示している。
【０３２２】
〔実施例２９〕関連しないS.オーレウス株に対する二重突然変異株ΔmurI/Δdatを用いて生成されたIgG抗体の交差反応性
USA300LAC、RF122、ED133およびED98株に関して実施例28に示された血清を用いてELISAを実施して、異なる起源に由来する関連しないS.オーレウス株に対するΔmurI/Δdat株で免疫されたBALB/cマウスにおける抗体媒介性免疫応答を評価し、かくして、幅広い免疫応答を生成するワクチンの能力を測定した。S.オーレウスUSA300LACは、健康な個体における異常な侵襲性疾患を引き起こす流行性MRSA株であり、米国、カナダおよび欧州における市中感染の主な原因である。他方、RF122(ウシ、ST151およびCC151)、ED133(ヒツジ、ST133およびCC133)ならびにED98(家禽、ST5およびCC5)を、家畜における発病を引き起こす動物宿主に適合したS.オーレウス株の3つの主要なクローンの代表的な株として選択した。
【０３２３】
その目的のために、プレートを実施例28に記載のように処理したが、独立に、それぞれの上記株を用いて予め「被覆」した。
【０３２４】
図40に示されるように、4つの関連しないS.オーレウス株に対する有意に高い力価の抗体が検出されたが、これは、ΔmurI/Δdat株を用いる免疫化が同系132Δspa株に対する抗体だけでなく、関連する臨床株USA300LAC、ならびに動物宿主に良好に適合した3つの他の株に対する抗体も生成することを示している。
【０３２５】
〔実施例３０〕ΔmurI/Δdat株の環境安全評価-水浸透圧溶解および乾燥条件に対する耐性の評価
弱毒化生ワクチン候補は、一度、それが関連する危険性を最小化し続ける目的でワクチン接種された個体から離れたら、一般環境中で持続できるべきではない。
【０３２６】
一般環境中で長時間追跡されるS.オーレウス野生型およびΔmurI/Δdat株の能力を比較するために、本発明者らは、細胞浸透圧溶解による生存能力の喪失を観察するのに必要な時間にわたって、室温、撹拌(180rpm)条件下で、栄養素または塩のいかなる寄与もない水の中でのこれらの株の生存を評価した。TSB寒天(野生型株)および10mM D-グルタミン酸を添加したTSB寒天(突然変異株)中でのCFU計数の決定のために、懸濁液の毎日の試料を取得した。全ての培養を3回実施した。
【０３２７】
図41に示されるように、ΔmurI/Δdat突然変異株の生存能力の低下が、24時間の2-Log10の減少に関する時間経過である時間に沿って観察された。さらに、培養の72時間を超えたらΔmurI/Δdat株の生きた細菌は回収されなかった。
【０３２８】
さらに、図52は、野生型株と比較した乾燥に対する二重突然変異株ΔmurI/Δdatの耐性を示す。乾燥耐性を評価するために、指数増殖期の洗浄された細胞の希釈系列をニトロセルロースフィルター(0.45μm孔径)にスポットすることにより、野生型および二重突然変異株の細胞生存能力を試験した。フィルターを乾燥しない(増殖対照)か、または37℃の滅菌ペトリ皿の内部で12もしくは18時間乾燥(乾燥ストレス条件)した後、それらをD-グルタミン酸を添加したTSBプレート上に置き、37℃で24時間インキュベートした。全ての培養および希釈系列を3回実施した。
【０３２９】
図中に示されるように、細胞生存能力の差異は、増殖対照(乾燥フィルターなし)と比較して乾燥条件下で保持した後に野生型株について観察されなかった。対照的に、ΔmurI/Δdat株の2-Log10希釈された培養物の増殖は、12時間の乾燥後に低下した。18時間の乾燥ストレス下で保持した場合、同じ希釈率の二重突然変異株において細胞生存能力の完全な非存在(増殖なし)が観察された。これらの結果は、ΔmurI/Δdat株が野生型親株よりも乾燥に対してより感受性であることを示し、ワクチンとしてのその使用に関する安全性の適切な閾値をさらに支持する。
【０３３０】
〔実施例３１〕S.オーレウスΔmurI/Δdat株における栄養要求性表現型の安定性の評価
D-グルタミン酸化合物に関するS.オーレウスΔmurI/Δdatの栄養要求性の不可逆性を試験するために、ΔmurI/Δdat株を、撹拌(180rpm)しながら37℃で11日間、最適条件で20mM D-グルタミン酸を添加した100mLのTSB中で増殖させた。TSB寒天および10mM D-グルタミン酸を添加したTSB寒天中でのCFUの決定のために、インキュベーションの開始時ならびに3、5および11日目に、この培養物からの試料を取得した。全ての培養を3回実施した。表現型復帰の仮想の事例においては、培地中の前記化合物の存在または非存在とは無関係に、長時間にわたって寒天プレート中で同様の細菌計数が回収されるはずである。対照的に、本発明者らは、培養物をD-グルタミン酸を含む/含まない寒天培地上に塗布した場合に得られる細菌計数間に有意差を観察した。
【０３３１】
得られる細菌計数は、インキュベーションの初期段階(0日)ならびに3、5および11日目で、最初の事例(D-グルタミン酸を添加した寒天プレート)において有意に高かった(図42を参照されたい)。この差異は、ΔmurI/Δdat株が長時間にわたって依然としてD-グルタミン酸に関して栄養要求性であり、野生型表現型に復帰する可能性がないことを示している。
【０３３２】
〔実施例３２〕マウスにおける腹腔内投与後のS.オーレウスΔmurI/Δdat株のin vivoでのクリアランス
ワクチンとして用いられる生物に接種された場合のS.オーレウスΔmurI/Δdat株の安全性を評価するために、野生型株と比較したΔmurI/Δdat株を接種されたBALB/cマウスの脾臓、腎臓および血液中の細菌量を決定した。マウス(n=3/株)に、致死量未満の0.7X用量の野生型株および10X(13倍高い用量)のΔmurI/Δdat株を腹腔内投与した(250μL)。両培養物を、以前に記載されたように互いに独立して3%のブタムチンを含む塩水中で調製した。1群あたり1匹のマウスを感染後1、2および6日目にチオペンタールナトリウムで麻酔して、臓器および血液中の細菌量を決定した。かくして、脾臓および腎臓を上記のように無菌的に処理し、臓器1グラムあたりのCFUを、TSB寒天(野生型)および10mM D-グルタミン酸(二重突然変異株)を添加したTSB寒天中に連続希釈液を塗布することにより決定した。
【０３３３】
急性敗血症モデルにおいて、感染は、血液を介する細菌の急速な拡散と共に生じ、感染後24〜48時間でマウスの死亡のピークをもたらす。従って、臓器および血液中の細菌計数から、特定の株の侵襲および複製能力の尺度を得ることができる。
【０３３４】
図43において、本発明者らは、長時間にわたって、野生型株に感染したマウスと比較した、ΔmurI/Δdat株を投与されたマウスに由来する腎臓、脾臓および血液中の細菌量間に顕著な差異を観察した。感染の最大ピークが24〜48時間と予想される場合であっても、感染後1日目でも2日目でもΔmurI/Δdat株についてコロニーは回収されなかった。事実、毒性野生型株のCFU回収は、1:13に希釈された接種材料が投与されたとしても、これらの感染後の最大計数に達した。
【０３３５】
結果として、ΔmurI/Δdat株の「in vivo」でのクリアランスは、24時間より前に起こり、これは弱毒化生ワクチンとしてのその投与のための適切な安全性レベルを意味する。
【０３３６】
〔実施例３３〕S.オーレウス132ΔmurI/Δdatワクチン抗血清を用いる受動免疫化
本発明者らは次に、ブドウ球菌感染に対してマウスを防御するためにS.オーレウス132ΔmurI/Δdat株で免疫されたマウスからのワクチン血清の効能を探索した。
【０３３７】
ワクチンまたはナイーブな血清(150μL)を、5X用量の毒性S.オーレウス132野生型株を用いるチャレンジの3.5h前にBALB/cマウス(n=5)の腹腔に注射し、マウスの生存を14日間モニタリングした。
【０３３８】
図53に示されるように、ワクチン血清で受動免疫された全てのマウスはチャレンジから防御されたが、ナイーブな血清を受けるマウスの60%は感染に屈服した(P=0.0429; Mantel-Cox検定(ログランク検定))。
【０３３９】
これらの結果は、二重突然変異株ΔmurI/Δdatを用いて生成された、S.オーレウス抗血清の導入が、有意なレベルのマウスの防御を付与し、毒性S.オーレウス132野生型株による感染の3.5時間前に投与された場合、死亡を防止することを示している。
【０３４０】
〔実施例３４〕ワクチン投与のための様々な経路の活用
投与のスケジュールと経路は両方とも、ワクチン接種手順の最終的な成功における重要な因子である特定のワクチンの潜在的な免疫原性を決定付けることができる。
【０３４１】
従って、本発明者らは、異なる投与経路(腹腔内、筋肉内、皮下および鼻内)を用いることにより惹起された抗体免疫応答(IgG)がこの変数により影響され得るかどうかを評価した。また、投与スケジュール、すなわち、投与およびワクチン用量(細菌接種材料含量)の数も考慮した。
【０３４２】
全ての経路が、物質の吸収、バイオアベイラビリティおよび代謝などの、利点と欠点の両方を有する。現在では、認可されたヒトワクチンの大部分は、筋肉内、皮下および皮内投与経路を用いる、非経口のものである。筋肉内ワクチン接種は現在まで究極の方法と考えられるが、鼻内経路は、容易な自己投与、粘膜ならびに全身免疫の誘導を提供する。また、液体製剤と乾燥粉末製剤は両方とも、このように投与することができる。最後に、鼻内投与は、高感染性の疾患の大流行後の、障壁ワクチン接種にとって最もよく適している。
【０３４３】
粘膜は微生物および他の外部因子に集中的に曝露され、それらは強力な免疫活性の場所である。A.バウマンニ、P.エルギノーサおよびS.オーレウスは呼吸器感染(特に)の一般的な原因であり、従って、鼻内ワクチン接種の使用はこれらの微生物により引き起こされる定着および疾患を防止するのに有益であり得る。
【０３４４】
試験した3つの非経口経路を比較した場合、本発明者らは、抗体媒介性免疫応答の生成における腹腔内、皮下および筋肉内投与の間に差異を認めなかった。また、A.バウマンニおよびP.エルギノーサ由来ワクチンの鼻内投与後に、類似する高い抗体力価が認められた。対照的に、S.オーレウスワクチンは、粘膜免疫化を介してより低い程度でIgG産生を惹起した(図48A〜C)。一般に、反復的免疫化は長時間にわたってIgG産生を促進した。
【０３４５】
ワクチン用量を考慮して、微生物に応じて様々なパターンの体液性応答が見られた。非経口経路(P.エルギノーサについては鼻内経路も)を用いて投与された、両方の試験した用量の弱毒化生A.バウマンニおよびP.エルギノーサワクチン(それぞれ、1Xおよび0.1X；0.4Xおよび0.04X)は、抗体の産生を効率的に誘発した(図48A〜B)。S.オーレウスワクチンの場合(図48C)、最も低用量(1X)を用いて鼻内経路によりマウスを免疫した場合、IgG力価の顕著な低下が観察された。それにも拘わらず、ワクチン接種のための非経口経路の使用は、最も低い細菌用量(腹腔内および筋肉内経路については0.2X；ならびに皮下経路については1X)を用いた場合でも有効であった。
【０３４６】
マウス防御のためのワクチン投与の様々な経路の効能を評価するために、一度、免疫化スケジュールがP.エルギノーサ由来ワクチンで終了させたら、マウスを致死用量(0.4X)の野生型PAO1株(以前に記載されたように腹腔内的に投与される)でチャレンジし、上記のように生存をモニタリングした。ワクチンの5回目の投与後に産生された高い抗体力価について予想されたように、全てのマウスが生存し、IgGと防御との間の良好な相関を示している。かくして、評価した全ての投与経路は、この微生物により引き起こされる急性敗血症を防止するのに好適であり得る。
【０３４７】
配列表
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【０３４８】
2020019801.tif 000003
【０３４９】
2020019801.tif 000004
【０３５０】
2020019801.tif 000005
【受託番号】
【０３５１】
2020019801.tif 000006
【０３５２】
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【０３５３】
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【０３５４】
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【０３５５】
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【０３５６】
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【０３５７】
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【０３５８】
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【０３５９】
2020019801.tif 000014
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０Ａ−Ｂ】
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【図４０Ｃ−Ｄ】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４８Ｃ−１】
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【図４８Ｃ−２】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
2020019801.tif 000073
【図５３】
2020019801.tif 000074
【配列表】
2020019801000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月31日(2019.10.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
製薬上許容し得る担体又は希釈剤と、免疫原性的に有効な量のアシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)又はスタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)の生きた弱毒化突然変異体とを含む、アシネトバクター・バウマンニ、シュードモナス・エルギノーサ又はスタフィロコッカス・オーレウスによって引き起こされる感染に対してそれを必要とする温血動物又はヒトにワクチン接種するための医薬組成物であって、前記突然変異体がグルタミン酸ラセマーゼを欠損し、且つD-グルタミン酸について栄養要求性であり、前記医薬組成物の投与が、前記感染に対して前記温血動物又はヒトを防御する、前記医薬組成物。
【請求項２】
前記医薬組成物がワクチンである、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記医薬組成物がアジュバントを含む、請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記製薬上許容し得る担体又は希釈剤が、水、培養液、生理学的塩及び/又は安定剤を含む溶液、炭水化物、タンパク質、タンパク質含有剤並びにバッファーから成る群より選択される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記炭水化物が、ソルビトール、マンニトール、スターチ、スクロース、グルコース及びデキストランから成る群より選択される、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記タンパク質がアルブミン又はカゼインである、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記タンパク質含有剤がウシ血清又はスキムミルクである、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記バッファーがリン酸バッファーである、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記アジュバントが、Freundの完全及び不完全アジュバント、ビタミンE、非イオン性ブロックポリマー、ムラミルジペプチド、免疫刺激複合体(ISCOM)、サポニン、ミネラルオイル、植物油、カルボポール、大腸菌熱不安定毒素(LT)、コレラ毒素(CT)、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウム、油乳濁液及びビタミンEソルビリゼートから成る群より選択される、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記免疫原性的に有効な量が、103〜1010個細胞の前記アシネトバクター・バウマンニ、シュードモナス・エルギノーサ又はスタフィロコッカス・オーレウスの生きた弱毒化突然変異体を含む、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記医薬組成物が凍結乾燥形態にある、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記シュードモナス・エルギノーサの生きた弱毒化突然変異体が、株番号8589の下で、2014年4月14日にSpanish Type Culture Collectionにブダペスト条約の下で寄託されたシュードモナス・エルギノーサDeltaPA4662である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記アシネトバクター・バウマンニの生きた弱毒化突然変異体が、株番号8588の下で、2014年4月14日にSpanish Type Culture Collectionにブダペスト条約の下で寄託されたアシネトバクター・バウマンニDelta0380/Delta3398である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記スタフィロコッカス・オーレウスの生きた弱毒化突然変異体が、株番号8587の下で、2014年6月11日にSpanish Type Culture Collectionにブダペスト条約の下で寄託されたS.オーレウス132deltamurI/deltadatである、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１５】
製薬上許容し得る担体又は希釈剤と、免疫原性的に有効な量のシュードモナス・エルギノーサの生きた弱毒化突然変異体とを含む、シュードモナス・エルギノーサによって引き起こされる感染に対してそれを必要とする温血動物又はヒトを防御するための医薬組成物であって、前記突然変異体がグルタミン酸ラセマーゼを欠損し、且つD-グルタミン酸について栄養要求性であり、前記医薬組成物の投与が、前記感染に対して前記温血動物又はヒトを防御する、前記医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０７】
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）D-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株を含む医薬組成物、好ましくはワクチンの製造方法であって、該医薬組成物が該組成物の栄養要求性突然変異細菌株の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)にとって好適であり、前記医薬組成物が、
a. D-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株を取得する工程；
b. 前記生きた栄養要求性突然変異細菌株を製薬上許容し得る担体または希釈剤中に導入し、必要に応じてアジュバントを添加する工程；および
c. 必要に応じて、医薬組成物を凍結乾燥する工程、
を含む方法により製造される、前記方法。
（２）D-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株を含む医薬組成物、好ましくはワクチンの製造方法であって、該医薬組成物が該組成物の栄養要求性突然変異細菌株の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後)にとって好適であり、前記医薬組成物が、
a. グルタミン酸ラセマーゼおよびおそらくD-アミノ酸トランスアミナーゼを発現することができ、ペプチドグリカン細胞壁を含む細菌株を提供する工程；
b. 細菌株が最早機能的グルタミン酸ラセマーゼおよび/または機能的D-アミノ酸トランスアミナーゼを発現することができないように、グルタミン酸ラセマーゼ酵素をコードする遺伝子、および必要に応じて、D-アミノ酸トランスアミナーゼ酵素をコードする遺伝子を不活化する工程であって、前記遺伝子の不活化がかくして前記細菌株をD-グルタミン酸に関して栄養要求性にする、前記工程；ならびに
c. 前記生きた栄養要求性突然変異細菌株を製薬上許容し得る担体または希釈剤中に導入し、必要に応じて、アジュバントを添加する工程；ならびに
d. 必要に応じて、医薬組成物を凍結乾燥する工程、
を含む方法により製造される、前記方法。
（３）医薬組成物がワクチンであり、製造方法がアジュバントを添加することを含む、（１）または（２）に記載の医薬組成物の製造方法。
（４）工程a)の細菌株がグラム陽性またはグラム陰性細菌である、（１）〜（３）のいずれか１に記載の方法。
（５）工程a)の細菌株がD-グルタミン酸の合成の唯一の方法としてグルタミン酸ラセマーゼ酵素を有し、前記方法の工程b)がこの酵素、すなわち、グルタミン酸ラセマーゼをコードする遺伝子の不活化を含む、（２）に記載の方法。
（６）工程a)の細菌株が、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、アシネトバクター・バイリ(Acinetobacter baylyi)、アシネトバクター・カルコアセチクス(Acinetobacter calcoaceticus)、アシネトバクター・ヘモリティクス(Acinetobacter haemolyticus)、アシネトバクター・ジュニ(Acinetobacter junii)、アシネトバクター・ルウォフィ(Acinetobacter lwoffii)、アシネトバクター・ノソコミアリス(Acinetobacter nosocomialis)、アシネトバクター・ピッチ(Acinetobacter pittii)、アシネトバクター・ラジオレジステンス(Acinetobacter radioresistens)、アクチノバシラス・リグニエレシ(Actinobacillus lignieresii)、アクチノバシラス・スイス(Actinobacillus suis)、アエロモナス・カビエ(Aeromonas caviae)、アエロモナス・ヒドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、アエロモナス・ベロニ亜種ソブリア(Aeromonas veronii subsp. sobria)、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、アルコバクター・ブツレリ(Arcobacter butzleri)、アルコバクター・ニトロフィギリス(Arcobacter nitrofigilis)、バシラス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バシラス・アントラシス(Bacillus anthracis)、バシラス・バタビエンシス(Bacillus bataviensis)、バシラス・セルロシリティクス(Bacillus cellulosilyticus)、バシラス・セレウス(Bacillus cereus)、バシラス・クラウシ(Bacillus clausii)、バシラス・リシェニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バシラス・プミルス(Bacillus pumilus)、バシラス・スブチリス(Bacillus subtilis)、バシラス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)、バクテロイデス・フラギリス(Bacteroides fragilis)、ボルデテラ・アビウム(Bordetella avium)、ボルデテラ・ブロンキセプティカ(Bordetella bronchiseptica)、ボルデテラ・ペルツシス(Bordetella pertusis)、ボルデテラ・ペトリ(Bordetella petrii)、ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)、ブルセラ・メリテンシス(Brucella melitensis)、ブルセラ・スイス(Brucella suis)、ブルクホルデリア・セノセパシア(Burkholderia cenocepacia)、ブルクホルデリア・マレイ(Burkholderia mallei)、ブルクホルデリア・マルチボランス(Burkholderia multivorans)、ブルクホルデリア・シュードマレイ(Burkholderia pseudomallei)、ブルクホルデリア・サイランデンシス(Burkholderia thailandensis)、カンピロバクター・コンシサス(Campylobacter concisus)、カンピロバクター・フェタス亜種フェタス(Campylobacter fetus subsp. fetus)、カンピロバクター・フェタス亜種ベネレアリス(Campylobacter fetus subsp. venerealis)、カンピロバクター・グラシリス(Campylobacter gracilis)、カンピロバクター・ホミニス(Campylobacter hominis)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・レクタス(Campylobacter rectus)、カンピロバクター・ショワエ(Campylobacter showae)、カンピロバクター・ウプサリエンシス(Campylobacter upsaliensis)、シトロバクター・フレウンジ(Citrobacter freundii)、シトロバクター・コセリ(Citrobacter koseri)、クロストリジウム・アスパラギフォルム(Clostridium asparagiforme)、クロストリジウム・ボツリナム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ブチリカム(Clostridium butyricum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・ペルフリンゲンス(Clostridium perfringens)、クロストリジウム・サッカロブチリカム(Clostridium saccharobutylicum)、クロストリジウム・テタニ(Clostridium tetani)、コリネバクテリウム���ジフテリア(Corynebacterium diphtheriae)、コリネバクテリウム・シュードツベルクロシス(Corynebacterium pseudotuberculosis)、エンテロバクター・エアロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エリジペロスリックス・ルジオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)、大腸菌(Escherichia coli)、フソバクテリウム・ネクロフォラム(Fusobacterium necrophorum)、フソバクテリウム・ネクレアタム(Fusobacterium nucleatum)、グラヌリカテラ・アジアセンス(Granulicatella adiacens)、グラヌリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ヘモフィルス・エクイゲニタリス(Haemophilus equigenitalis)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・パラインフルエンザ(Haemophilus parainfluenzae)、ヘモフィルス・パラガリナルム(Haemophilus paragallinarum)、ヘモフィルス・パラスイス(Haemophilus parasuis)、ヘモフィルス・プルロニューモニエ(Haemophilus pleuropneumoniae)、ヘモフィルス・ソムナス(Haemophilus somnus)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、レジオネラ・オークリジエンシス(Legionella oakridgensis)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、レプトスピラ・ビフレクサ(Leptospira biflexa)、レプトスピラ・イリニ(Leptospira illini)、レプトスピラ・インテロガンス(Leptospira interrogans)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、リシニバシラス・フシフォルミス(Lysinibacillus fusiformis)、リシニバシラス・スフェリクス(Lysinibacillus sphaericus)、モラクセラ・ボビス(Moraxella bovis)、モルガネラ・モルガニ(Morganella morganii)、マイコバクテリウム・アブセサス(Mycobacterium abscessus)、マイコバクテリウム・アフリカナム(Mycobacterium africanum)、マイコバクテリウム・アビウム(Mycobacterium avium)、マイコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis)、マイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノロア(Neisseria gonorrhoeae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、プレシオモナス・シゲロイデス(Plesiomonas shigelloides)、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)、プロテウス・ハンセリ(Proteus hanseri)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ(Salmonella enterica subsp. enterica)、サルモネラ・エンテリティディス(Salmonella enteritidis)、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、セラチア・プリムチカ(Serratia plymuthica)、シゲラ・ボイジ(Shigella boydii)、シゲラ・ディセンテリア(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレクスネリ(Shigella flexneri)、スタフィロコッカス・アルレッタ(Staphylococcus arlettae)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・カピティス(Staphylococcus capitis)、スタフィロコッカス・カプラ(Staphylococcus caprae)、スタフィロコッカス・カルノサス(Staphylococcus carnosus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・エクオラ��(Staphylococcus equorum)、スタフィロコッカス・ヘモリティクス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス(Staphylococcus lugdunensis)、スタフィロコッカス・パステウリ(Staphylococcus pasteuri)、スタフィロコッカス・ペッテンコフェリ(Staphylococcus pettenkoferi)、スタフィロコッカス・シュードインテルメディウス(Staphylococcus pseudointermedius)、スタフィロコッカス・サプロフィティクス(Staphylococcus saprophyticus)、スタフィロコッカス・シミア(Staphylococcus simiae)、スタフィロコッカス・シムランス(Staphylococcus simulans)、スタフィロコッカス・ワルネリ(Staphylococcus warneri)、ステノトロフォモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ディスガラクチア(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ディスガラクチア亜種エクイシミリス(Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis)、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・ウベリス(Streptococcus uberis)、ストレプトコッカス・ズーエピデルミクス(Streptococcus zooepidermicus)、タイロレラ・アシニゲニタリス(Taylorella asinigenitalis)、タイロレラ・エクイゲニタリス(Taylorella equigenitalis)、トレポネマ・カラテウム(Treponema carateum)、トレポネマ・クニクリ(Treponema cuniculi)、トレポネマ・ヒオジセンテリア(Treponema hyodisenteriae)、トレポネマ・パリダム(Treponema pallidum)、トレポネマ・スイス(Treponema suis)、ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・ジスパル(Veillonella dispar)、ベイロネラ・パルブラ(Veillonella parvula)、ベイロネラ・ラッティ(Veillonella ratti)、ビブリオ・コレラ(Vibrio cholerae)、ビブリオ・パラヘモリティクス(Vibrio parahaemolyticus)、ビブリオ・ブルニフィカンス(Vibrio vulnificans)、エルシニア・エンテロコリティカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)およびエルシニア・シュードツベルクロシス(Yersinia pseudotuberculosis)からなる細菌種の一覧から選択される、（１）〜（３）のいずれか１に記載の方法。
（７）工程a)の前記細菌株が以下の細菌種：アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)およびスタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)からなる一覧から選択される、（６）に記載の方法。
（８）工程a)の前記細菌株がアシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii) Delta0380/Delta3398と命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8588と共に2014年4月14日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたA.バウマンニの細菌株である、（７）に記載の方法。
（９）工程a)の前記細菌株がシュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa) DeltaPA4662と命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8589と共に2014年4月14日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたP.エルギノーサの細菌株である、（７）に記載の方法。
（１０）工程a)の前記細菌株が132deltamurI/deltadatと命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8587と共に2014年6月11日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたS.オーレウスの細菌株である、（７）に記載の方法。
（１１）D-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株と、製薬上許容し得る担体または希釈剤および必要に応じて、アジュバントとを含む医薬組成物、好ましくはワクチンであって、該組成物の栄養要求性突然変異細菌株の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)にとって好適なものである、前記医薬組成物。
（１２）前記医薬組成物がワクチンであり、必要に応じて、前記ワクチンがアジュバントを含む、（１１）に記載の医薬組成物。
（１３）前記製薬上許容し得る担体または希釈剤が、水、培養液、生理学的塩濃度の溶液および/またはSPGAなどの安定剤、炭水化物(例えば、ソルビトール、マンニトール、スターチ、スクロース、グルコース、デキストラン)、アルブミンまたはカゼインなどのタンパク質、ウシ血清またはスキムミルクなどのタンパク質含有剤ならびにバッファー(例えば、リン酸バッファー)からなる一覧から選択される、（１１）または（１２）に記載の医薬組成物。
（１４）アジュバントが、Freundの完全および不完全アジュバント、ビタミンE、非イオン性ブロックポリマー、ムラミルジペプチド、ISCOM(免疫刺激複合体)、サポニン、ミネラルオイル、植物油、カルボポール、大腸菌熱不安定毒素(LT)またはコレラ毒素(CT)、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは酸化アルミニウム、油乳濁液(例えば、Bayol F(登録商標)またはMarcol 52(登録商標)、サポニンおよびビタミンEソルビリゼートの)からなる一覧から選択される、（１１）〜（１３）のいずれか１に記載の医薬組成物。
（１５）前記医薬組成物が、103〜1010個の細菌のD-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株の用量を含む、（１１）〜（１４）のいずれか１に記載の医薬組成物。
（１６）前記医薬組成物が凍結乾燥形態にある、（１１）〜（１５）のいずれか１に記載の医薬組成物。
（１７）細菌株が、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、アシネトバクター・バイリ(Acinetobacter baylyi)、アシネトバクター・カルコアセチクス(Acinetobacter calcoaceticus)、アシネトバクター・ヘモリティクス(Acinetobacter haemolyticus)、アシネトバクター・ジュニ(Acinetobacter junii)、アシネトバクター・ルウォフィ(Acinetobacter lwoffii)、アシネトバクター・ノソコミアリス(Acinetobacter nosocomialis)、アシネトバクター・ピッチ(Acinetobacter pittii)、アシネトバクター・ラジオレジステンス(Acinetobacter radioresistens)、アクチノバシラス・リグニエレシ(Actinobacillus lignieresii)、アクチノバシラス・スイス(Actinobacillus suis)、アエロモナス・カビエ(Aeromonas caviae)、アエロモナス・ヒドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、アエロモナス・ベロニ亜種ソブリア(Aeromonas veronii subsp. sobria)、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、アルコバクター・ブツレリ(Arcobacter butzleri)、アルコバクター・ニトロフィギリス(Arcobacter nitrofigilis)、バシラス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バシラス・アントラシス(Bacillus anthracis)、バシラス・バタビエンシス(Bacillus bataviensis)、バシラス・セルロシリティクス(Bacillus cellulosilyticus)、バシラス・セレウス(Bacillus cereus)、バシラス・クラウシ(Bacillus clausii)、バシラス・リシェニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バシラス・プミルス(Bacillus pumilus)、バシラス・スブチリス(Bacillus subtilis)、バシラス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)、バクテロイデス・フラギリス(Bacteroides fragilis)、ボルデテラ・アビウム(Bordetella avium)、ボルデテラ・ブロンキセプティカ(Bordetella bronchiseptica)、ボルデテラ・ペルツシス(Bordetella pertusis)、ボルデテラ・ペトリ(Bordetella petrii)、ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)、ブルセラ・メリテンシス(Brucella melitensis)、ブルセラ・スイス(Brucella suis)、ブルクホルデリア・セノセパシア(Burkholderia cenocepacia)、ブルクホルデリア・マレイ(Burkholderia mallei)、ブルクホルデリア・マルチボランス(Burkholderia multivorans)、ブルクホルデリア・シュードマレイ(Burkholderia pseudomallei)、ブルクホルデリア・サイランデンシス(Burkholderia thailandensis)、カンピロバクター・コンシサス(Campylobacter concisus)、カンピロバクター・フェタス亜種フェタス(Campylobacter fetus subsp. fetus)、カンピロバクター・フェタス亜種ベネレアリス(Campylobacter fetus subsp. venerealis)、カンピロバクター・グラシリス(Campylobacter gracilis)、カンピロバクター・ホミニス(Campylobacter hominis)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・レクタス(Campylobacter rectus)、カンピロバクター・ショワエ(Campylobacter showae)、カンピロバクター・ウプサリエンシス(Campylobacter upsaliensis)、シトロバクター・フレウンジ(Citrobacter freundii)、シトロバクター・コセリ(Citrobacter koseri)、クロストリジウム・アスパラギフォルム(Clostridium asparagiforme)、クロストリジウム・ボツリナム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ブチリカム(Clostridium butyricum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・ペルフリンゲンス(Clostridium perfringens)、クロストリジウム・サッカロブチリカム(Clostridium saccharobutylicum)、クロストリジウム・テタニ(Clostridium tetani)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diphtheriae)、コリネバクテリウム・シュードツベルクロシス(Corynebacterium pseudotuberculosis)、エンテロバクター・エアロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エリジペロスリックス・ルジオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)、大腸菌(Escherichia coli)、フソバクテリウム・ネクロフォラム(Fusobacterium necrophorum)、フソバクテリウム・ネクレアタム(Fusobacterium nucleatum)、グラヌリカテラ・アジアセンス(Granulicatella adiacens)、グラヌリカテラ・エレガンス(Granulicatella elegans)、ヘモフィルス・エクイゲニタリス(Haemophilus equigenitalis)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・パラインフルエンザ(Haemophilus parainfluenzae)、ヘモフィルス・パラガリナルム(Haemophilus paragallinarum)、ヘモフィルス・パラスイス(Haemophilus parasuis)、ヘモフィルス・プルロニューモニエ(Haemophilus pleuropneumoniae)、ヘモフィルス・ソムナス(Haemophilus somnus)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、レジオネラ・オークリジエンシス(Legionella oakridgensis)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、レプトスピラ・ビフレクサ(Leptospira biflexa)、レプトスピラ・イリニ(Leptospira illini)、レプトスピラ・インテロガンス(Leptospira interrogans)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、リシニバシラス・フシフォルミス(Lysinibacillus fusiformis)、リシニバシラス・スフェリクス(Lysinibacillus sphaericus)、モラクセラ・ボビス(Moraxella bovis)、モルガネラ・モルガニ(Morganella morganii)、マイコバクテリウム・アブセサス(Mycobacterium abscessus)、マイコバクテリウム・アフリカナム(Mycobacterium africanum)、マイコバクテリウム・アビウム(Mycobacterium avium)、マイコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis)、マイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノロア(Neisseria gonorrhoeae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、プレシオモナス・シゲロイデス(Plesiomonas shigelloides)、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)、プロテウス・ハンセリ(Proteus hanseri)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ(Salmonella enterica subsp. enterica)、サルモネラ・エンテリティディス(Salmonella enteritidis)、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、セラチア・プリムチカ(Serratia plymuthica)、シゲラ・ボイジ(Shigella boydii)、シゲラ・ディセンテリア(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレクスネリ(Shigella flexneri)、スタフィロコッカス・アルレッタ(Staphylococcus arlettae)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・カピティス(Staphylococcus capitis)、スタフィロコッカス・カプラ(Staphylococcus caprae)、スタフィロコッカス・カルノサス(Staphylococcus carnosus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・エクオラム(Staphylococcus equorum)、スタフィロコッカス・ヘモリティクス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス(Staphylococcus lugdunensis)、スタフィロコッカス・パステウリ(Staphylococcus pasteuri)、スタフィロコッカス・ペッテンコフェリ(Staphylococcus pettenkoferi)、スタフィロコッカス・シュードインテルメディウス(Staphylococcus pseudointermedius)、スタフィロコッカス・サプロフィティクス(Staphylococcus saprophyticus)、スタフィロコッカス・シミア(Staphylococcus simiae)、スタフィロコッカス・シムランス(Staphylococcus simulans)、スタフィロコッカス・ワルネリ(Staphylococcus warneri)、ステノトロフォモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ディスガラクチア(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ディスガラクチア亜種エクイシミリス(Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis)、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・ウベリス(Streptococcus uberis)、ストレプトコッカス・ズーエピデルミクス(Streptococcus zooepidermicus)、タイロレラ・アシニゲニタリス(Taylorella asinigenitalis)、タイロレラ・エクイゲニタリス(Taylorella equigenitalis)、トレポネマ・カラテウム(Treponema carateum)、トレポネマ・クニクリ(Treponema cuniculi)、トレポネマ・ヒオジセンテリア(Treponema hyodisenteriae)、トレポネマ・パリダム(Treponema pallidum)、トレポネマ・スイス(Treponema suis)、ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・ジスパル(Veillonella dispar)、ベイロネラ・パルブラ(Veillonella parvula)、ベイロネラ・ラッティ(Veillonella ratti)、ビブリオ・コレラ(Vibrio cholerae)、ビブリオ・パラヘモリティクス(Vibrio parahaemolyticus)、ビブリオ・ブルニフィカンス(Vibrio vulnificans)、エルシニア・エンテロコリティカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)およびエルシニア・シュードツベルクロシス(Yersinia pseudotuberculosis)からなる細菌種の一覧から選択される、（１１）〜（１６）のいずれか１に記載の医薬組成物。
（１８）細菌株が以下の種：アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)およびスタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)からなる一覧から選択される、（１７）に記載の医薬組成物。
（１９）細菌株がアシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii) Delta0380/Delta3398と命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8588と共に2014年4月14日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたA.バウマンニの細菌株である、（１８）に記載の医薬組成物。
（２０）細菌株がシュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa) DeltaPA4662と命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8589と共に2014年4月14日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたP.エルギノーサの細菌株である、（１８）に記載の医薬組成物。
（２１）細菌株が132deltamurI/deltadatと命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8587と共に2014年6月11日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたS.オーレウスの細菌株である、（１８）に記載の医薬組成物。
（２２）シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa) DeltaPA4662と命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8589と共に2014年4月14日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたP.エルギノーサの細菌株である、D-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株。
（２３）132deltamurI/deltadatと命名され、Fundacion Profesor Novoa Santosにより株番号8587と共に2014年6月11日にSpanish Type Culture Collectionの前にブダペスト条約の下で寄託されたS.オーレウスの細菌株である、D-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株。
（２４）医薬、特に、ワクチンとしての使用のための、（２２）または（２３）に記載の細菌株。
（２５）前記組成物の栄養要求性突然変異細菌株の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)の方法における使用のための、（１）〜（２１）のいずれか１に記載の医薬組成物または（２２）もしくは（２３）に記載のD-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株。
（２６）D-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株を認識することができる抗体またはFab、F(ab')2、Fv、scFv、ジ-scFvおよびsdABからなる群から選択されるその断片であって、組成物の栄養要求性突然変異細菌株の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)にとって好適である、前記抗体またはその断片。
（２７）D-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株を用いる哺乳動物の免疫化後に得られるかまたは得ることができる抗体またはFab、F(ab')2、Fv、scFv、ジ-scFvおよびsdABからなる群から選択されるその断片であって、組成物の栄養要求性突然変異細菌株の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)にとって好適である、前記抗体またはその断片。
（２８）（２６）または（２７）に記載の抗体またはその断片と、製薬上許容し得る担体または希釈剤、および必要に応じて、アジュバントとを含む、医薬組成物、好ましくは、ワクチンであって、組成物の栄養要求性突然変異細菌株の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)にとって好適である、前記医薬組成物。
（２９）前記医薬組成物がワクチンであり、必要に応じて、前記ワクチンがアジュバントを含む、（２８）に記載の医薬組成物。
（３０）療法における使用のための、特に、受動免疫化における使用のための、（２６）または（２７）に記載の抗体またはその断片。
（３１）組成物の栄養要求性突然変異細菌株の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)の方法における使用のための、（２８）に記載の医薬組成物または（２６）もしくは（２７）に記載の抗体もしくはその断片。
（３２）組成物の栄養要求性突然変異細菌株の野生型形態による感染に対する動物および/またはヒトの予防的処置(感染前)および/または治療的処置(感染後もしくは感染により引き起こされる疾患の臨床徴候後)の方法における使用のための、（１１）〜（２１）のいずれか１に記載の医薬組成物または（２２）もしくは（２３）に記載のD-グルタミン酸に関する生きた栄養要求性突然変異細菌株または（２６）もしくは（２７）に記載の抗体もしくはその断片であって、鼻内、皮内、皮下、経口、エアロゾル、筋肉内、ウィングウェブ(wing web)および点眼投与により投与される前記組成物、細菌株または抗体もしくはその断片。
（３３）（２６）または（２７）に記載の抗体またはその断片を含むキットまたはデバイス。
（３４）イムノアッセイを介して細菌起源の感染を検出するためのキットまたはデバイスであって、
(i)好ましくは、固相支持体に結合される、（２６）または（２７）に記載の「捕捉抗体」と呼ばれる第1の抗体；
(ii)蛍光、発光または酵素であってもよいマーカーを含む、第1の抗体により認識される領域以外の領域を認識する「検出抗体」と呼ばれる第2の標識された抗体；
(iii)結合対の第1のメンバーにカップリングされる、第2の抗体に対する親和性を示す試薬；および
(iv)結合対がハプテンと抗体；抗原と抗体；ビオチンとアビジン；ビオチンとストレプトアビジン；ビオチン類似体とアビジン；ビオチン類似体とストレプトアビジン；糖とレクチン；酵素とコファクター；核酸または核酸類似体と相補的核酸または核酸類似体からなる群から選択される、蛍光、発光または酵素にカップリングされた結合対の第2のメンバー、
を含む、前記キットまたはデバイス。
（３５）哺乳動物に由来する生物試料、特に、細菌疾患に罹患すると疑われる哺乳動物の血漿中の細菌種または細菌株の定性的および/または定量的決定のための、（３３）または（３４）に記載のキットまたはデバイスの使用。
（３６）0.00001〜120mMのD-グルタミン酸濃度の使用を含む、D-グルタミン酸に関する栄養要求性細菌株のin vitroでの培養方法。
（３７）D-グルタミン酸の濃度範囲が、0.01〜50mMである、（３６）に記載の方法。
（３８）D-グルタミン酸の濃度範囲が、10〜20mMである、（３７）に記載の方法。
以下の実施例の目的は、単に本発明を例示することであり、それを限定するものではない。