(57)【要約】【課題】天然の皮膚に類似した構造を有する皮膚様組織を安定的に製造する方法を提供する。【解決手段】本発明は、皮膚様組織の製造方法であって、  多孔膜を有する細胞培養容器の前記多孔膜の上にのせた、表皮層と真皮層とを含む皮膚様組織の角層側の表面を、相対湿度４５％〜７５％の気相に曝露しながら、前記細胞培養容器の前記多孔膜の外側面に培地を接触させて気相培養する工程、を含む、方法を提供する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚様組織の製造方法であって、
多孔膜を有する細胞培養容器の前記多孔膜の上にのせた、表皮層と真皮層とを含む皮膚様組織の角層側の表面を、相対湿度４５％〜７５％の気相に曝露しながら、前記細胞培養容器の前記多孔膜の外側面に培地を接触させて気相培養する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
前記細胞培養容器が、前記細胞培養容器の外側に充填される培地由来の水蒸気が前記細胞培養容器の内側に混入することを防止する手段を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記皮膚様組織が、単離された皮膚組織又は三次元培養皮膚である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記皮膚様組織が、
（１）多孔膜を有する細胞培養容器の前記多孔膜の上に線維芽細胞を播種して線維芽細胞層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する工程；
（２）前記線維芽細胞層の上に、線維芽細胞とハイドロゲル化剤とを含む溶液を注いで、線維芽細胞を含むハイドロゲル層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する工程；及び
（３）前記ハイドロゲル層の上にケラチノサイトを播種してケラチノサイト層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する工程、
を含む工程によって作製される三次元培養皮膚である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記ハイドロゲル化剤が、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロナート、ヒアルロナン、フィブリン、アルギナート、アガロース、キトサン、キチン、セルロース、ペクチン、デンプン、ラミニン、フィブリノーゲン／トロンビン、フィブリリン、エラスチン、ガム、セルロース、寒天、グルテン、カゼイン、アルブミン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン／ニドジェン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、ポリ（アクリル酸）およびその誘導体、ポリ（エチレンオキシド）およびその共重合体、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、マトリゲルならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記気相培養する工程において、培地がマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記気相培養する工程において、培地がヘパラナーゼ阻害剤を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法により得られる、皮膚様組織。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚様組織の製造方法、及びそれにより得られる皮膚様組織に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は生体内と生体外の環境を分ける体表を覆う器官である。皮膚は、物理的なバリアとして働き、乾燥や有害物質が生体内へ侵入することから守り、生命の維持に不可欠な役割を果たしている。
【０００３】
天然皮膚においては、大きく分けて、表皮と真皮の二つの層から構成されており、表皮と真皮の間には表皮基底膜と呼ばれる薄くて繊細な膜が存在する。表皮基底膜は、約０．１μｍ程度の非常に薄い構造体であり、表皮と真皮の接合部にシート状に存在する。表皮基底膜は、基本構造であるラミナデンサ（ｌａｍｉｎａ  ｄｅｎｓａ）とラミナルシダ（ｌａｍｉｎａ  ｄｅｎｓａ）に加えて、ケラチノサイトのヘミデスモソーム、アンカリングフィラメント、アンカリング線維などから構成されており、特に該基本構造はＩＶ型コラーゲン、各種ラミニン、及びプロテオグリカンなどで構成されている。表皮基底細胞と基本構造、特にラミナデンサを結合しているアンカリングフィラメントの主要な成分はラミニン５であり、基本構造と真皮のコラーゲン線維は、ＶＩＩ型コラーゲンを主成分とするアンカリング線維によって連結されている。またアンカリングフィラメントとアンカリング線維は互いに結合でき、これらはアンカリング複合体と称される複合体を形成する。このような構造によって、生体の最外層に存在する皮膚は外界からの力学的なストレスに負けない強度を備えている。
【０００４】
何らかの原因により生来の皮膚（すなわち、天然皮膚）が損傷を受けた場合に、その代替物として用いるための人工皮膚の需要が高まっている。また、皮膚に対する医薬や化粧品の作用や薬物を試験するための実験材料としての人工皮膚の需要も高まっている。いずれの用途においても、天然の皮膚の構造を可能な限り模倣した人工皮膚の開発が強く望まれている。
【０００５】
皮膚構造を模倣した様々な人工皮膚（三次元培養皮膚）を作製する方法が開発されており、既に実用化されているものも存在する。例えば、ヒト線維芽細胞を含むＩ型コラーゲンゲルの上に正常ヒト表皮ケラチノサイトを培養して表皮層を形成する方法が知られているが、この方法により得られる人工皮膚は、真皮を模倣するコラーゲンゲルと表皮を模倣する表皮層との間に基底膜が十分に形成されないことが知られている。そのため、このような人工皮膚を用いる場合には、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、又はマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤とマトリックスタンパク質産生亢進剤の両者を投与することで皮膚基底膜構造の再形成を促進させることができる（特許文献1）。また、セリンプロテアーゼを阻害する物質及び表皮基底膜成分の主要構成成分であるＩＶ型、ＶＩＩ型コラーゲン又はラミニン５の産生量を高める物質が、マトリックスプロテアーゼ阻害剤による基底膜形成を促進させることも知られている（特許文献２）。また、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤とヘパラナーゼ阻害剤とを添加した培地を用いることにより、表皮基底膜及び真皮の高次構造の形成を促進させることも知られている（特許文献３）。しかしながら、これらの方法により製造された人工皮膚は、天然皮膚よりも角層の間隙が広く、密度が低いものであり、天然皮膚の構造を模倣しているとはいいがたいものであった。
【０００６】
また、別の方法として、予め播種した線維芽細胞に細胞外マトリックスを形成させ、その上にケラチノサイトを播種することで、人工皮膚を作製させる方法も知られている（非特許文献１）。しかしながら、この方法は作製に時間がかかってしまったり、得られた人工皮膚の真皮の細胞密度が高すぎるなどの問題があった。また、この方法により製造された人工皮膚も、品質にばらつきが大きく、十分なものとはいえなかった。
【０００７】
ヒト表皮同等物を低湿度条件で培養する方法によって、そのバリア機能が向上することは知られているが（非特許文献２）、当該方法はヒト表皮同等物に適用されるものであり、天然の皮膚構造を模倣した人工皮膚は得られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００１−２６９３９８号公報
【特許文献２】特開２００４−７５６６１号公報
【特許文献３】特許第５７４４４０９号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｅｌ  Ｇｈａｌｂｚｏｕｒｉ  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｍａｔｒｉｘ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｄｅｒｍａｌ  ｍａｔｒｉｘ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  ２００９  Ｊａｎ；３０（１）：７１−７８
【非特許文献２】Ｓｕｎ  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｏｗｅｒｅｄ  ｈｕｍｉｄｉｔｙ  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２０１５  Ｊａｎ；２１（１）：１５−２２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、皮膚様組織の製造方法、及びそれにより得られる皮膚様組織を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて研究開発を行ってきた。その結果、多孔膜を有する細胞培養容器の前記多孔膜の上にのせた表皮層又は表皮層同等物と真皮層又は真皮層同等物とを含む皮膚様組織の角層側の表面を、相対湿度４５％〜７５％の気相に曝露しながら、前記細胞培養容器の前記多孔膜の外側面に培地を接触させて気相培養することにより、天然の皮膚に類似した構造を有する皮膚様組織を安定的に製造することができることを見出した。すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
【００１２】
［１］  皮膚様組織の製造方法であって、
多孔膜を有する細胞培養容器の前記多孔膜の上にのせた前記、表皮層と真皮層とを含む皮膚様組織の角層側の表面を、相対湿度４５％〜７５％の気相に曝露しながら、前記細胞培養容器の前記多孔膜の外側面に培地を接触させて気相培養する工程、
を含む、方法。
［２］  前記細胞培養容器が、前記細胞培養容器の外側に充填される培地由来の水蒸気が前記細胞培養容器の内側に混入することを防止する手段を有する、［１］に記載の方法。
［３］  前記皮膚様組織が、単離された皮膚組織又は三次元培養皮膚である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］  前記皮膚様組織が、
（１）多孔膜を有する細胞培養容器の前記多孔膜の上に線維芽細胞を播種して線維芽細胞層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する工程；
（２）前記線維芽細胞層の上に、線維芽細胞とハイドロゲル化剤とを含む溶液を注いで、線維芽細胞を含むハイドロゲル層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する工程；及び
（３）前記ハイドロゲル層の上にケラチノサイトを播種してケラチノサイト層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する工程、
を含む工程によって作製される三次元培養皮膚である、［１］又は［２］に記載の方法。
［５］  前記ハイドロゲル化剤が、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロナート、ヒアルロナン、フィブリン、アルギナート、アガロース、キトサン、キチン、セルロース、ペクチン、デンプン、ラミニン、フィブリノーゲン／トロンビン、フィブリリン、エラスチン、ガム、セルロース、寒天、グルテン、カゼイン、アルブミン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン／ニドジェン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、ポリ（アクリル酸）およびその誘導体、ポリ（エチレンオキシド）およびその共重合体、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、マトリゲルならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、［４］に記載の方法。
［６］  前記気相培養する工程において、培地がマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤を含む、［１］〜［５］のいずれか１項に記載の方法。
［７］  前記気相培養する工程において、培地がヘパラナーゼ阻害剤を含む、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の方法。
【００１３】
［８］  ［１］〜［７］のいずれか１項に記載の方法により得られる、皮膚様組織。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、従来の方法により得られる皮膚様組織よりも、天然の皮膚の構造に近い皮膚様組織が、安定的に提供可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、一実施態様における本発明の皮膚様組織の製造方法に用いる培養容器の断面図である。
【図２】図２は、一実施態様における本発明の皮膚様組織（三次元培養皮膚）の製造方法を示す概要図である。
【図３】図３は、１００％相対湿度（ＲＨ）又は５０％ＲＨで培養した三次元培養皮膚のＨＥ染色像を示す。（Ａ）１００％ＲＨ、１２日間培養。（Ｂ）１００％ＲＨで１４日間培養。（Ｃ）５０％ＲＨで５日間培養。（Ｄ）５０％ＲＨで７日間培養。
【図４】図４は、１００％ＲＨ又は５０％ＲＨで培養した三次元培養皮膚の蛍光染色像を示す。（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）１００％ＲＨで培養した三次元培養皮膚、（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）５０％ＲＨで培養した三次元培養皮膚。（Ａ、Ｂ）緑：抗Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ抗体、赤：抗ＢＨ抗体、青：Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（核）。（Ｃ、Ｄ）緑：抗ＴＧａｓｅ−１抗体、赤：抗Ｉｎｖｏｌｕｒｉｎ抗体、青：Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（核）。（Ｅ、Ｆ）赤：抗Ｃｏｒｎｅｏｄｅｓｍｏｓｉｎ抗体、青：Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（核）。（Ｇ、Ｈ）赤：抗Ｋｉ６７抗体、青：Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（核）。
【図５】図５は、１００％ＲＨ又は５０％ＲＨで培養した三次元培養皮膚、及びヒト皮膚の電子顕微鏡写真である。ＳＣ：角層、ＳＧ〜ＳＰ：顆粒層〜有棘層、ＳＢ〜ｄｅｒｍ：基底層〜真皮。
【図６】図６は、１００％ＲＨ又は５０％ＲＨで培養した三次元培養皮膚の蛍光染色像を示す。（Ａ、Ｃ、Ｅ）１００％ＲＨで培養した三次元培養皮膚、（Ｂ、Ｄ、Ｆ）５０％ＲＨで培養した三次元培養皮膚。（Ａ、Ｂ）緑：抗Ｌａｍｉｎｉｎ３３２抗体、青：Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（核）。（Ｃ、Ｄ）緑：抗Ｔｙｐｅ  ＶＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ抗体、青：Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（核）。（Ｅ、Ｆ）緑：抗Ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ−１抗体、青：Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（核）。
【図７】図７は、１００％ＲＨ又は５０％ＲＨで培養した三次元培養皮膚、及びヒト皮膚の基底膜付近の電子顕微鏡写真である。矢頭：ヘミデスモソーム、ＬＤ：ラミナデンサ、ＣＦ：コラーゲン線維。
【図８】図８は、１００％ＲＨ又は７０％ＲＨで培養した三次元培養皮膚のＨＥ染色像を示す。（Ａ）１００％ＲＨ、１４日間培養。（Ｂ）７０％ＲＨ，１４日間培養。
【図９】図９は、１００％ＲＨ又は４０％ＲＨで培養した三次元培養皮膚のＨＥ染色像を示す。（Ａ）１００％ＲＨ、１４日間培養。（Ｂ）４０％ＲＨ、１４日間培養。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を実施するための形態について図面を参照しつつ詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は下記の形態のみに限定されることはない。本明細書中で用いられる「約」を伴う値は、その値±２０％、より好ましくは１０％の範囲の値も含まれることを意味する。
【００１７】
＜皮膚様組織の製造方法＞
一実施態様において、本発明は、皮膚様組織の製造方法であって、
多孔膜を有する細胞培養容器の前記多孔膜の上にのせた、表皮層と真皮層とを含む皮膚様組織の角層側の表面を、相対湿度４５％〜７５％（例えば、相対湿度約５０％）の気相に曝露しながら、前記細胞培養容器の前記多孔膜の外側面に培地を接触させて気相培養する工程、を含む方法を提供する。
【００１８】
従来の、相対湿度１００％の環境において培養された皮膚様組織は、天然皮膚よりも角層の間隙が広くて密度が低いものであり、天然皮膚の構造を模倣した人工皮膚とはいいがたいものであった（例えば、図７の１００％ＲＨの列の電子顕微鏡写真を参照）。
【００１９】
しかしながら、本発明の方法であれば、従来の１００％ＲＨの雰囲気下で作製された皮膚様組織と比較して、角層の厚さが天然皮膚の厚さに近く、密度が高くなった皮膚様組織が得られる（例えば、図７の矢印参照）。また、４５％ＲＨ〜７５％ＲＨの雰囲気下で作製された皮膚様組織は、表皮層の構造のみならず、基底膜が密な構造となり、ラミナデンサも厚くなる。さらに、ラミニン３３２及びＶＩＩ型コラーゲンなどの発現も高くなり、基底膜の再構成が促進された、天然皮膚の構造に近い皮膚様組織が得られる（図６〜７参照）。
【００２０】
本明細書において、「皮膚様組織」とは、表皮層又と真皮層とを含む、天然皮膚構造を模倣した構造体をいい、例えば、生体から単離された皮膚組織、又は、インビトロで再構築された三次元培養皮膚である。本明細書において、「表皮層」とは、主にケラチノサイトを含む層をいう。また、本明細書において「真皮層」とは、主に線維芽細胞を含む層をいう。真皮層は、線維芽細胞から産生されたコラーゲンを含む層であってもよく、外部から追加されたハイドロゲル、例えばコラーゲンゲルを含む層であってもよい。また、本明細書において、「基底膜」とは、表皮層と真皮層との間に形成される膜状の構造体をいう。
【００２１】
本発明の方法において、培養するための温度は、典型的に細胞培養を行う温度であればよく、例えば、２０℃〜４２℃、好ましくは３０℃〜３９℃、例えば約３７℃である。
【００２２】
一実施態様において、気相培養する期間は、基底膜の再構成が促進される期間培養すればよく、例えば、１日〜２８日間、好ましくは３日〜２１日間、より好ましくは７日〜２１日間、例えば１４日間であってもよい。
【００２３】
気相の相対湿度は、例えば、気相の相対湿度を制御できるインキュベータを用いることによって調節することができる。例えば、細胞培養容器を、４５％ＲＨ〜７５％ＲＨの気相に制御したインキュベータ内に設置することによって、湿度を制御することができる。この場合、細胞培養容器の外側に充填される培地由来の水蒸気が前記細胞培養容器の内側に混入することを防止する手段を有する細胞培養容器を用いることが好ましい。そのような手段を有する細胞培養容器の例としては、例えば図１に記載される構造を有する細胞培養容器を用いることができる。簡単に説明すると、細胞培養容器の蓋には、セルカルチャーインサートの内径とほぼ同径又はそれよりも大きい孔が設けられており、その孔に、セルカルチャーインサートと接して、細胞培養容器の外側に充填される培地由来の水蒸気が前記細胞培養容器の内側に混入することを防止するガラスリング等が設けられている。これにより、皮膚様組織（例えば、三次元培養皮膚）の角質層側の気相を厳密に制御することが可能となる。
【００２４】
一実施態様において、本発明において用いられる皮膚様組織は、
（１）多孔膜を有する細胞培養容器の前記多孔膜の上に線維芽細胞を播種して線維芽細胞層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する工程；
（２）前記線維芽細胞層の上に、線維芽細胞とハイドロゲル化剤とを含む溶液を注いで、線維芽細胞を含むハイドロゲル層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する工程；及び
（３）前記ハイドロゲル層の上にケラチノサイトを播種してケラチノサイト層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する工程、
を含む工程によって作製される三次元培養皮膚であってもよい（図２参照）。多孔膜を有する細胞培養容器（例えば、セルカルチャーインサート）の前記多孔膜の上に線維芽細胞を播種して線維芽細胞層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する（工程（１））。本発明の一実施態様において用いられるセルカルチャーインサートとは、細胞は透過できないが、培地等は透過できる多孔性の孔を有する膜を備えた細胞培養容器をいう。多孔膜の培養表面の反対側、つまり、付着細胞の付着面の裏側からも培地等を供給することができる。本発明に用いられる細胞培養容器、例えばセルカルチャーインサートは、市販のものを使用してもよい。
【００２５】
本発明で用いられる培地は、皮膚様組織の製造に従来から使用されている任意の培地を用いることができ、例えば、１０％の牛胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）；１０％の牛胎児血清、トランスフェリン５μｇ／ｍｌ、インシュリン５μｇ／ｍｌ、ｔｒｉ−ヨードチロニン２ｎＭ、コレラトキシン０．１ｎＭ、ヒドロコーチゾン０．４μｇ／ｍｌを含むＤＭＥＭ−Ｈａｍ’ｓＦ１２（３：１）；ケラチノサイト増殖培地（ＫＧＭ）と１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭとを１：１に混合した培地、等を用いることができるが、これらに限定されない。
【００２６】
工程（１）で播種される線維芽細胞の細胞数は、例えば、０．０１×１０６〜１０．０×１０６個／ｃｍ２、好ましくは０．０５×１０６〜５．０×１０６個／ｃｍ２、より好ましくは０．１×１０６〜１．０×１０６個／ｃｍ２の量で播種する。工程（１）で播種される細胞は、線維芽細胞の他、真皮に含まれる他の細胞、例えば、肥満細胞、Ｍｅｉｓｓｎｅｒ小体、組織球、神経細胞、樹状細胞、血管内皮細胞及び形質細胞からなる群から選択される１以上の細胞を含んでもよい。
【００２７】
工程（１）の培養期間は、線維芽細胞がコンフルエント又はサブコンフルエントとなり、細胞外マトリクスを産生する期間培養することが好ましく、例えば、１日〜１４日間、好ましくは３日〜１０日間、より好ましくは５日〜９日間、例えば約７日間である。これにより、増殖した線維芽細胞が培養面を覆い、なおかつ、細胞外マトリクスを産生させることができる。
【００２８】
工程（１）の後、前記線維芽細胞層の上に、線維芽細胞とハイドロゲル化剤とを含む溶液を注いで、線維芽細胞を含むハイドロゲル層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する（工程（２））。本発明において用いることができるハイドロゲル化剤は、例えば、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロナート、ヒアルロナン、フィブリン、アルギナート、アガロース、キトサン、キチン、セルロース、ペクチン、デンプン、ラミニン、フィブリノーゲン／トロンビン、フィブリリン、エラスチン、ガム、セルロース、寒天、グルテン、カゼイン、アルブミン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン／ニドジェン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、ポリ（アクリル酸）およびその誘導体、ポリ（エチレンオキシド）およびその共重合体、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、マトリゲルならびにそれらの組み合わせからなる群から選択することができ、好ましくは、コラーゲンである。
【００２９】
工程（２）の線維芽細胞とハイドロゲル化剤とを含む溶液は、例えば、０．０１×１０６〜１０．０×１０６個／ｍＬ、好ましくは０．０５×１０６〜５．０×１０６個／ｍＬ、より好ましくは０．０５×１０６〜１．０×１０６個／ｍＬの密度の線維芽細胞を含んでいる。当該溶液を、工程（１）により得られる線維芽細胞層の上に注ぎ、ハイドロゲル層を形成させる。工程（２）で形成されるハイドロゲル層の厚さは、その後の培養段階での鉛直方向の収縮を考慮して、例えば、１ｍｍ〜１０ｍｍとなるように調製すればよい。工程（２）で播種される細胞は、線維芽細胞の他、真皮に含まれる他の細胞、例えば、肥満細胞、Ｍｅｉｓｓｎｅｒ小体、組織球、神経細胞、樹状細胞、血管内皮細胞及び形質細胞からなる群から選択される１以上の細胞を含んでもよい。工程（１）及び（２）において用いられる線維芽細胞は、好ましくは真皮線維芽細胞である。
【００３０】
工程（２）の培養期間は、例えば、１日〜７日間、好ましくは２日〜５日間、より好ましくは２日〜４日間、例えば約３日間である。
【００３１】
工程（２）の後、前記ハイドロゲル層の上にケラチノサイト（表皮角化細胞）を播種してケラチノサイト層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する（工程（３））。工程（３）で播種されるケラチノサイトの細胞数は、例えば、０．０１×１０６〜１０．０×１０６個／ｃｍ２、好ましくは０．０５×１０６〜５．０×１０６個／ｃｍ２、より好ましくは０．１×１０６〜１．０×１０６個／ｃｍ２の量で播種する。工程（３）で播種される細胞は、ケラチノサイトの他、表皮に含まれる他の細胞、例えば、メラニン細胞、ランゲルハンス細胞、及びメルケル細胞からなる群から選択される１以上の細胞を含んでもよい。
【００３２】
工程（３）は、ケラチノサイトがコンフルエント又はサブコンフルエントになる期間培養することが好ましく、例えば、１日〜７日間、好ましくは２日〜５日間、より好ましくは２日〜４日間、例えば約３日間である。
【００３３】
本発明において用いられる細胞は、初代細胞であってもよく、初代細胞を継代操作して増殖させた細胞であってもよく、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、又はＭｕｓｅ細胞等の多能性幹細胞から分化誘導して得られる細胞を用いてもよく、株化された細胞であってもよい。また、用いられる細胞は、いずれの動物由来であってもよいが、脊椎動物由来が好ましく、哺乳動物由来がより好ましく、ヒト由来であることが最も好ましい。
【００３４】
一実施態様において、気相培養する工程で用いられる培地は、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤（ＭＭＰ阻害剤）を含んでもよい。培地には、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤が皮膚基底膜及び真皮の再生・修復を促進するために十分な濃度において含有され、典型的には培地に対して０．００００００１〜１０重量％、好適には０．０００００１〜１０重量％で含有される。
【００３５】
本発明において使用するマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤としては、マトリックスメタロプロテアーゼに対して阻害活性を有する物質であればよく、特に制限はない。マトリックスメタロプロテアーゼとしては、例えばゼラチナーゼ、コラゲナーゼ、ストロメライシン、マトリライシン等が挙げられる。従って、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤は、例えばゼラチナーゼ、コラゲナーゼ、ストロメライシン、マトリライシン等を阻害する物質として選択することができる。
【００３６】
マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤の具体例としては、ＣＧＳ２７０２３Ａ物質（Ｎ−ヒドロキシ−２−［［（４−メトキシフェニル）スルホニル］３−ピコリル）アミノ］−３−メチルブタンアミド塩酸塩）（Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  １９９７，  Ｖｏｌ．  ４０，ｐ．２５２５−２５３２）、ＭＭＰ−インヒビター（ｐ−ＮＨ２−Ｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＮＨＯＨ）（ＦＮ−４３７）（ＢＢＲＣ，１９９４，  Ｖｏｌ．１９９，  ｐ．１４４２−１４４６）などが挙げられる。好適には、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤はＣＧＳ２７０２３Ａ物質である。
【００３７】
一実施態様において、気相培養する工程で用いられる培地は、ヘパラナーゼ阻害剤を含んでもよい。培地には、ヘパラナーゼ阻害剤が皮膚基底膜及び真皮の再生・修復を促進するために十分な濃度において含有され、典型的には培地に対して０．００００００１〜１０重量％、好適には０．０００００１〜１０重量％で含有される。
【００３８】
本発明において使用するヘパラナーゼ阻害剤としては、ヘパラナーゼに対して阻害活性を有する物質であればよく、特に制限はない。ヘパラナーゼは種々の細胞に存在し、様々なヘパラン硫酸プロテオグリカンのヘパラン硫酸鎖を特異的に分解する酵素である。皮膚では、表皮を構成する表皮角化細胞及び真皮の線維芽細胞、血管内皮細胞などが産生する。
【００３９】
ヘパラナーゼ阻害剤の具体例としては、１−［４−（１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−フェニル］−３−［４−（１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−フェニル］−ウレア（「ＢＩＰＢＩＰＵ」ともいう。）や、ＳＦ−４（「Ｈｅｐａｒａｓｔａｔｉｎ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ」ともいう。）が挙げられる。
【００４０】
上記のようにして本発明の方法によって得られる皮膚様組織は、動物実験代替法の一つ、例えば皮膚モデルとして用いることができる。例えば、皮膚の化学物質（例えば、化粧料、工業製品、家庭用品、薬剤、皮膚外用剤等）に対する反応性を評価する方法に用いることができる。また、本発明の方法によって得られる皮膚様組織は、従来の皮膚様組織と比較してバリア機能が亢進した組織が得られるため、皮膚科学の基礎研究においても有用な皮膚モデルとして使用することが可能である。さらにまた、本発明で得られる皮膚様組織は、従来の三次元培養皮膚と比較してヒト皮膚の構造に近いことから、外部からのバリア機能も高く、熱傷、創傷等を治癒するための皮膚様組織としても有用である。
【００４１】
＜皮膚様組織を用いた皮膚のバリア機能を改善及び／又は回復させる対象物質を評価する方法＞
一実施態様において、本発明の皮膚様組織に、対象物質を添加することによって、皮膚のバリア機能を改善及び／又は回復させる対象物質を評価する方法を提供することができる。
【００４２】
例えば、本発明の皮膚様組織に対象物質を添加後、皮膚様組織の表面から蒸発する水分蒸散量を測定することによって、皮膚のバリア機能の変化を評価することができる。また、本発明の皮膚様組織に対象物質を添加後、皮膚のバリア機能に関連する公知のマーカー（例えば、Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ、Ｌｏｒｉｃｒｉｎ、ＺＯ−１、Ｃｌａｕｄｉｎ−１など）の発現を調べることによって皮膚のバリア機能の変化を評価することができる。
【００４３】
本実施態様において、皮膚のバリア機能を改善及び／又は回復させる対象物質としては、例えば、低分子化合物、ペプチド、タンパク質、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出物又は細胞培養上清、植物由来の化合物又は抽出物（例えば、生薬エキス、生薬由来の化合物）、及び微生物由来の化合物もしくは抽出物又は培養産物などであってもよい。
【実施例】
【００４４】
以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。
【００４５】
＜実施例１＞
１．材料及び実験方法
１―１．三次元培養皮膚の作製方法
セルカルチャーインサート（φ１２ｍｍ、多孔膜の平均孔径：０．４μｍ）にヒト真皮線維芽細胞（０．２×１０６個）を播種し、２００μＭ  アスコルビン酸―２−リン酸マグネシウム（ＡＰＭ）、１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭを用いて２日に１回培地交換して１週間培養した。その上にヒト真皮線維芽細胞を含んだ０．５％Ｉ型コラーゲン−１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ溶液を分注して、ヒト真皮線維芽細胞の上にコラーゲンゲルを作製し、３日間培養した。
【００４６】
さらにＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２（クラボウ）培地中に分散した表皮角化細胞を５×１０５個／ウェルとなるようにコラーゲンゲルの上に播種し、インサート外にＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２と１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭを１：１で混合し２００μＭ  ＡＰＭを添加した培地を内側と同じ液面高さまで添加して３日間培養した。
【００４７】
その後、インサートまたはガラスリング内の培地を取り除き、外側に皮膚モデル用培地（１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭとＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２  ＥＧＦ（−）を１：１で混合してＣａ  １．８ｍＭに調製）培地に２００μＭ  ＡＰＭ、１０μＭ  Ｎ−ヒドロキシ−２−［［（４−メトキシフェニル）スルホニル］３−ピコリル）アミノ］−３−メチルブタンアミド塩酸塩（ＣＧＳ２７０２３Ａ（ＭＭＰ阻害剤））、１０μＭ  ＢＩＰＢＩＰＵ（ヘパラナーゼ阻害剤）をインサートの底面の高さまで添加して、インサート内部を空気に曝した状態で気液境界培養を行った。２〜３日に１回培地交換して２週間培養した。
【００４８】
１−２．低湿度培養法
１−１で作製した三次元培養皮膚を１週間程度、気液境界培養したところで、３７℃・５０％ＲＨ、又は３７℃・１００％ＲＨの雰囲気に制御したインキュベータ内に入れて培養を行った。インキュベータ内の湿度は湿度制御装置（キッツマイクロフィルター社、ＡＨＣＵ−２）を用いて制御した。三次元培養皮膚を入れたプレートは蓋に穴をあけてクローニングリングをはめて、三次元培養皮膚の表面のみが外気に直接触れるようにした（図１参照）。
【００４９】
２．結果
５０％ＲＨで培養した三次元培養皮膚は、１００％ＲＨで培養した三次元培養皮膚と比較して、ケラチノサイト層及び真皮層（コラーゲンゲル層）が薄くなっており、表皮細胞の形態が全体的により平らな形状を有していた（図３）。
【００５０】
また、表皮の分化マーカー（フィラグリン（Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）、ブレオマイシン水解酵素（ＢＨ）、トランスグルタミナーゼ−１（ＴＧａｓｅ−１）、インボルクリン（Ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ）、コルネオデスモシン（Ｃｏｒｎｅｏｄｅｓｍｏｓｉｎ））や、細胞増殖マーカーであるＫｉ６７の発現を免疫染色によって調べた結果、５０％ＲＨで培養した三次元培養皮膚は、１００％ＲＨで培養した三次元培養皮膚と比較して、平らな顆粒層において表皮分化マーカーが密集して染色されていた（図４）。細胞増殖マーカーであるＫｉ６７は、５０％ＲＨで培養した三次元培養皮膚の方が、わずかに発現が減少していたが、その発現は維持されていた（図４）。
【００５１】
電子顕微鏡を用いて、さらに両者の表皮層の形態を調べたところ、１００％ＲＨで培養した三次元培養皮膚では正常ヒト皮膚より角層が厚く膨潤しており、細胞間隙が広がった特徴的な形態をしているのに対し、５０％ＲＨで培養した三次元培養皮膚は、その特徴が無くなっており、より天然の皮膚に近い表皮構造を有することが明らかとなった（図５の矢印参照）。
【００５２】
さらに、基底膜及び真皮の細胞外マトリックスについて調べた。ラミニン３３２、ＶＩＩ型コラーゲンは、５０％ＲＨで培養した三次元培養皮膚の方が、基底膜付近に集積して強く発現していることが明らかとなった（図６）。また、電子顕微鏡を用いて、基底膜付近の形態を調べたところ、５０％ＲＨで培養した三次元培養皮膚の方が、ラミナデンサが厚くなっており、細胞外マトリックスも高密度となっており、より天然の皮膚に近い構造を有することが明らかとなった（図７）。
【００５３】
＜実施例２＞
１．材料及び実験方法
１―１．三次元培養皮膚の作製方法
実施例１と同じ材料及び作製方法により作製した。
【００５４】
１−２．低湿度培養法
１−１で作製した三次元培養皮膚を１週間程度、気液境界培養したところで、３７℃・４０％ＲＨ、３７℃・７０％ＲＨ、又は３７℃・１００％ＲＨの雰囲気に制御したインキュベータ内に入れて培養を行った。インキュベータ内の湿度は湿度制御装置（キッツマイクロフィルター社、ＡＨＣＵ−２）を用いて制御した。三次元培養皮膚を入れたプレートは蓋に穴をあけてクローニングリングをはめて、三次元培養皮膚の表面のみが外気に直接触れるようにした（図１参照）。
【００５５】
２．結果
７０％ＲＨで培養した三次元培養皮膚は、１００％ＲＨで培養した三次元培養皮膚と比較して、ケラチノサイト層及び真皮層（コラーゲンゲル層）が薄く、表皮細胞の形態が全体的により平らな形状を有しており、前述の５０％ＲＨで培養した三次元培養皮膚と同様の特徴を示した（図８）。一方で、４０％ＲＨで培養した三次元培養皮膚は、表皮細胞層、真皮層ともにほとんど存在しておらず、培養皮膚としての形状を維持していなかった（図９）。
【００５６】
以上の結果より、低湿度の環境で培養することによって、表皮層、真皮層及び基底膜の再構築に影響を与え、天然の皮膚に近い構造を有する三次元培養皮膚が得られることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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