(57)【要約】      （修正有）【課題】特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープ及びエンハンサーアゴニストペプチドの同定、並びに癌の診断及び／又は治療のために、これらのエピトープを使用する組成物及び方法を提供する。【解決手段】ペプチド、ポリペプチド（タンパク質）として、及び／又はワクチン若しくは他の組成物において、癌の予防又は治療に用い得る、ムチン１のＣ末端サブユニット（ＭＵＣ１−Ｃ）からのヒト細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アゴニストエピトープを開示する。また、ペプチド、タンパク質、又はポリペプチドをコードする核酸、該核酸を含むベクター、ペプチド、ポリペプチド、核酸、又はベクターを含む細胞、及びそれらの組成物を更に開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２】
２０以下のアミノ酸残基を有する、請求項１のペプチド。
【請求項３】
配列番号１又は配列番号２から成る、請求項１のペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項のペプチドをコードする核酸。
【請求項５】
請求項４の核酸を含むベクター。
【請求項６】
（ｉ）請求項１〜３のいずれか１項のペプチドの１以上、（ｉｉ）請求項４の核酸の１以上、又は（ｉｉｉ）請求項５のベクターの１以上を含む、細胞。
【請求項７】
細胞がヒトのである、請求項６の細胞。
【請求項８】
抗原提示細胞又は腫瘍細胞である、請求項６又は７の細胞。
【請求項９】
（ａ）（ｉ）請求項１〜３のいずれか１項のペプチド、（ｉｉ）請求項４の核酸、（ｉｉｉ）請求項５のベクター又は（ｉｖ）請求項６〜８のいずれか１項の細胞の、１以上、及び
（ｂ）医薬的に許容可能な担体
を含む、組成物。
【請求項１０】
免疫刺激／調節分子を更に含む、請求項１０の組成物。
【請求項１１】
免疫刺激／調節分子が、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５／ＩＬ１５Ｒａ、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、ＣＤ７０、ＲＡＮＴＥＳ、Ｇ−ＣＳＦ、ＯＸ−４０Ｌ、４１ＢＢＬ、抗ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ阻害剤、抗ＰＤＬ１、抗ＰＤ１、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１０の組成物。
【請求項１２】
免疫刺激／分子が、（ｉ）キトサンと複合体化されたＩＬ−２をコードするプラスミド及び（ｉｉ）キトサンと混合された組換えＩＬ−１２から成る群から選択される、請求項１０の組成物。
【請求項１３】
化学療法薬、放射性薬剤、代謝拮抗剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、シクロホスファミド、又はそれらの組み合わせを更に含む、請求項９〜１２のいずれか１項の組成物。
【請求項１４】
アルキル化剤、葉酸アンタゴニスト、プリンアンタゴニスト、ピリミジンアンタゴニスト、紡錘体毒、トポイソメラーゼ阻害剤、アポトーシス誘導剤、血管新生阻害剤、ポドフィロトキシン、ニトロソウレア、シスプラチン、カルボプラチン、インターフェロン、アスパラギナーゼ、タモキシフェン、ロイプロリド、フルタミド、メゲストロール、マイトマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イリノテカン、タキソール、ゲルダナマイシン、又はそれらの組み合わせを更に含む、請求項９〜１２のいずれか１項の組成物。
【請求項１５】
アドリアマイシン、アルケラン、アラＣ、ブスルファン、ＣＣＮＵ、カルボプラチン、
シスプラチン、サイトキサン、ダウノルビシン、ＤＴＩＣ、５−ＦＵ、フルダラビン、ハイドレア、イダルビシン、イホスファミド、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、タキソール、ベルバン、ビンクリスチン、ＶＰ−１６、ゲムシタビン、ハーセプチン、イリノテカン、ロイスタチン、ナベルビン、リツキサンＳＴＩ−５７１、タキソテール、トポテカン、カペシタビン、ゼベリン、エンザルタミド、カルシトリオール、又はそれらの組み合わせを更に含む、請求項９〜１２のいずれか１項の組成物。
【請求項１６】
１以上のアジュバントを更に含む、請求項９〜１５のいずれか１項の組成物。
【請求項１７】
１以上のアジュバントが、アラム、アルミニウム塩、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ケイ酸アルミニウム、リン酸カルシウム、不完全フロイントアジュバント、ＱＳ２１、ＭＰＬ−Ａ、ＲＩＢＩ  ＤＥＴＯＸ（商標）、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１６の組成物。
【請求項１８】
顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を更に含む、請求項９〜１７のいずれか１項の組成物。
【請求項１９】
リポソームを更に含む、請求項９〜１８のいずれか１項の組成物。
【請求項２０】
治療有効量の請求項９〜１９のいずれか１項の組成物を被験体へ投与することを含む、被験体においてＭＵＣ１を発現する癌に対する免疫応答を増強する方法であって、被験体において免疫応答が増強される、方法。
【請求項２１】
被験体においてＭＵＣ１を発現する癌を阻害するための方法であって：
（ａ）被験体からリンパ球を得ること
（ｂ）請求項９〜１９のいずれか１項の組成物により、リンパ球を刺激して、ｅｘ  ｖｉｖｏで細胞傷害性Ｔリンパ球を生成すること、及び
（ｃ）細胞傷害性Ｔリンパ球を被験体に投与すること
を含み、被験体においてＭＵＣ１を発現する癌が阻害される、方法。
【請求項２２】
被験体においてＭＵＣ１を発現する癌を阻害するための方法であって：
（ａ）被験体から樹状細胞を得ること
（ｂ）請求項９〜１９のいずれか１項の組成物により、樹状細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで処理すること、及び
（ｃ）処理された樹状細胞を被験体に投与すること
を含み、被験体においてＭＵＣ１を発現する癌が阻害される、方法。
【請求項２３】
被験体においてＭＵＣ１を発現する癌を阻害するための方法であって：
（ａ）被験体から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得ること
（ｂ）ＰＢＭＣから樹状細胞を単離すること
（ｃ）請求項９〜１９のいずれか１項の組成物により、樹状細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで処理すること、
（ｄ）処理した樹状細胞により、ＰＢＭＣをｅｘ  ｖｉｖｏで活性化すること、及び
（ｅ）活性化されたＰＢＭＣを被験体に投与すること
を含み、被験体においてＭＵＣ１を発現する癌が阻害される、方法。
【請求項２４】
被験体においてＭＵＣ１を発現する癌を阻害するための方法であって：
（ａ）被験体から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得ること
（ｂ）ＰＢＭＣから樹状細胞を単離すること
（ｃ）請求項９〜１９のいずれか１項の組成物により、樹状細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで処理すること、
（ｄ）処理した樹状細胞により、ＰＢＭＣをｅｘ  ｖｉｖｏで活性化すること
（ｅ）活性化したＰＢＭＣからＴリンパ球をｅｘ  ｖｉｖｏで単離すること、及び
（ｆ）単離されたＴリンパ球を被験体に投与すること
を含み、被験体においてＭＵＣ１を発現する癌が阻害される、方法。
【請求項２５】
被験体においてＭＵＣ１を発現する癌を阻害するための、請求項９〜１９のいずれか１項の組成物によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激した養子移入Ｔ細胞の使用。
【請求項２６】
酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物であって：
（ａ）酵母ビヒクル；及び
（ｂ）ＭＵＣ１抗原が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含む、少なくとも１のムチン１（ＭＵＣ１）抗原を含む融合蛋白質
を含む、免疫療法組成物。
【請求項２７】
ＭＵＣ１抗原が、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項２６の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物。
【請求項２８】
酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物であって：
（ａ）酵母ビヒクル；及び
（ｂ）少なくとも１のＭＵＣ１抗原を含む、融合タンパク質であって、ＭＵＣ１抗原が、（ｉ）配列番号１６、（ｉｉ）配列番号１６の９２位〜５６６位、又は（ｉｉｉ）異なるＭＵＣ１タンパク質からの対応する配列、に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、及びＭＵＣ１抗原が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含む、融合タンパク質
を含む、免疫療法組成物。
【請求項２９】
ＭＵＣ１抗原が、（ｉ）配列番号１６、（ｉｉ）配列番号１６の９２位〜５６６位、又は（ｉｉｉ）異なるＭＵＣ１タンパク質からの対応する配列、に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、及びＭＵＣ１抗原が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項２８の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物。
【請求項３０】
ＭＵＣ１抗原が、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項２８又は請求項２９の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物。
【請求項３１】
ＭＵＣ１抗原が、配列番号１６の９２位〜５６６位に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２８〜３０のいずれか１項の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物。
【請求項３２】
ＭＵＣ１抗原が、配列番号１６の９２位〜５６６位から成る、請求項２８〜３１のいずれか１項の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物。
【請求項３３】
融合タンパク質が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、請求項２８〜３２のいずれか１項の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物。
【請求項３４】
酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物であって：
（ａ）酵母ビヒクル；及び
（ｂ）少なくとも１のＭＵＣ１抗原を含む、融合タンパク質であって、ＭＵＣ１抗原が、野生型ＭＵＣ１のアミノ酸配列に関して：Ｔ４２２、Ｐ４３０、Ｔ４３１、Ｓ４６２、及
びＡ４７０から選択される配列位置に、少なくとも１のアミノ酸置換によって野生型ＭＵＣ１タンパク質のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する、融合タンパク質
を含む、免疫療法組成物。
【請求項３５】
ＭＵＣ１抗原が、野生型ＭＵＣ１のアミノ酸配列に関して少なくとも以下：Ｔ４２２、Ｐ４３０、及びＴ４３１の配列位置について、アミノ酸置換によって野生型ＭＵＣ１タンパク質のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する、請求項３４の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物。
【請求項３６】
ＭＵＣ１抗原が、野生型ＭＵＣ１のアミノ酸配列に関して以下：Ｔ９３、Ａ１６１、Ｐ１６２、Ｇ１６９、Ｓ１７０、Ｔ１７１、Ａ３９２、Ｃ４０６、Ｔ４２２、Ｐ４３０、Ｔ４３１、Ｔ４４４、Ｄ４４５、及びＳ４６０の配列位置のそれぞれで、アミノ酸置換によって野生型ＭＵＣ１タンパク質のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する、請求項３５の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物。
【請求項３７】
ＭＵＣ１抗原が、野生型ＭＵＣ１のアミノ酸配列に関して、Ｃ４０４位のアミノ酸の置換を更に含む、請求項３４〜３６のいずれか１項の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物。
【請求項３８】
配列番号１４に関するアミノ酸置換が：Ｔ９３Ｌ、Ａ１６１Ｙ、Ｐ１６２Ｌ、Ｇ１６９Ｖ、Ｓ１７０Ｙ、Ｔ１７１Ｌ、Ａ３９２Ｙ、Ｃ４０４Ａ、Ｃ４０６Ｖ、Ｔ４２２Ｋ、Ｐ４３０Ａ、Ｔ４３１Ｌ、Ｔ４４４Ｌ、Ｄ４４５Ｆ、及びＳ４６０Ｙから選択される、請求項３４〜３７のいずれか１項の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物。
【請求項３９】
酵母ビヒクルが全酵母である、請求項２６〜３８のいずれか１項の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物。
【請求項４０】
融合タンパク質が酵母により発現されている、請求項２６〜３９のいずれか１項の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物。
【請求項４１】
酵母ビヒクルが熱で不活性化されている、請求項２６〜４０のいずれか１項の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物。
【請求項４２】
酵母ビヒクルがサッカロマイセス・セレビシエ由来である、請求項２６〜４１のいずれか１項の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物。
【請求項４３】
５．５〜８のｐＨレベルで維持された培地中で、ＭＵＣ１抗原を発現する全酵母を培養することにより製造された、請求項２６〜４２のいずれか１項の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物。
【請求項４４】
個体に請求項２６〜４３のいずれか１項の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物を投与することを含む、全身腫瘍組織量を減少させ、腫瘍の成長を阻害し、及び／又はＭＵＣ１を発現する癌を有する個体の生存を増加させる方法。
【請求項４５】
ＭＵＣ１発現が、組成物が最初に投与される時に、個体の癌で検出される、請求項４４の方法。
【請求項４６】
個体が、少なくとも１の、癌に対する更なる治療法で治療されているか、又は治療されていた、請求項４４又は請求項４５の方法。
【請求項４７】
少なくとも１の更なる治療法が、化学療法、標的癌療法、放射線療法、養子Ｔ細胞移入
、及び／又は１以上の更なる免疫療法組成物の投与から選択される、請求項４６の方法。
【請求項４８】
請求項２６〜４３のいずれか１項の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物を個体に投与することを含む、ＭＵＣ１を発現する癌の発症を予防する、又は遅延させる方法。
【請求項４９】
個体において癌が検出されていない、請求項４８の方法。
【請求項５０】
個体が癌を発症するリスクが高い、請求項４９の方法。
【請求項５１】
癌が上皮細胞起源である、請求項４４〜５０のいずれか１項の方法。
【請求項５２】
癌が：乳癌、小腸癌、胃癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、黒色腫、食道癌、多発性骨髄性白血病（ＭＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、分泌組織の癌、及びそれらの転移性癌から成る群から選択される、請求項４４〜５０のいずれか１項の方法。
【請求項５３】
癌の治療に使用するための、請求項２６〜４３のいずれか１項の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物。
【請求項５４】
癌を有する個体において癌の転移の進行を減退させること、阻止すること、反転させること、又は予防することに用いるための、請求項２６〜４３のいずれか１項の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物。
【請求項５５】
ＭＵＣ１を発現する癌の発症を予防すること又は遅延させることに用いるための、請求項２６〜４３のいずれか１項の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物。
【請求項５６】
癌を治療することに用いるための医薬の調製における、請求項２６〜４３のいずれか１項の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物の使用。
【請求項５７】
癌を有する個体において、癌の転移の進行を減退させること、阻止すること、反転させること、又は予防することに用いるための医薬の調製における、請求項２６〜４３のいずれか１項の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物の使用。
【請求項５８】
ＭＵＣ１を発現する癌の発症を予防すること又は遅延させることに用いるための医薬の調製における、請求項２６〜４３のいずれか１項の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物の使用。
【請求項５９】
配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含むＭＵＣ１タンパク質。
【請求項６０】
被験体においてＭＵＣ１を発現する癌に対する免疫応答を誘導する方法であって：
（ａ）請求項１〜３のいずれか１項のペプチドをコードする核酸を含む第一のポックスウイルスベクターを被験体に投与すること；及び
（ｂ）請求項１〜３のいずれか１項のペプチドをコードする核酸を含む第二のポックスウイルスベクターを被験体に投与すること
を含み、それによって、被験体においてＭＵＣ１を発現する癌に対する免疫応答を誘導する、方法。
【請求項６１】
被験体においてＭＵＣ１を発現する癌に対する免疫応答を誘導する方法であって：
（ａ）請求項５９のＭＵＣ１タンパク質をコードする核酸を含む第一のポックスウイルス
ベクターを被験体に投与すること；及び
（ｂ）請求項５９のＭＵＣ１タンパク質をコードする核酸を含む第二のポックスウイルスベクターを被験体に投与すること
を含み、それによって、被験体においてＭＵＣ１を発現する癌に対する免疫応答を誘導する、方法。
【請求項６２】
第一及び第二のポックスウイルスベクターが、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）をコードする核酸を更に含む、請求項６０又は６１の方法。
【請求項６３】
第一及び第二のポックスウイルスベクターが、１以上の共刺激分子をコードする核酸を更に含む、請求項６０〜６２のいずれか１項の方法。
【請求項６４】
１以上の共刺激分子が、Ｂ７．１、ＩＣＡＭ−１、及びＬＦＡ−３から選択される、請求項６３の方法。
【請求項６５】
第一のポックスウイルスベクターがワクシニアウイルスであり、及び第二のポックスウイルスベクターが鶏痘ウイルスである、請求項６０〜６４のいずれか１項の方法。
【請求項６６】
第一のポックスウイルスベクターが、修飾ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスであり、及び第二のポックスウイルスベクターが鶏痘ウイルスである、請求項６０〜６４のいずれか１項の方法。
【請求項６７】
ＭＶＡウイルスがＭＶＡ−ＢＮである、請求項６６の方法。
【請求項６８】
第一及び第二のポックスウイルスベクターが、プライム−ブーストプロトコルで被験体に投与される、請求項６０〜６７のいずれか１項の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１３年１０月２３日出願の米国仮特許出願第６１／８９４，４８２号（参照により組み込まれる）の利益を主張する。
【０００２】
配列表
本明細書と同時提出の、ヌクレオチド／アミノ酸の配列表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ＭＵＣ１（ＣＤ２２７）は、大型のＮ末端サブユニット（ＭＵＣ１−Ｎ）が、小型のＣ末端サブユニット（ＭＵＣ１−Ｃ）に共有結合したヘテロダイマーから構成される、Ｉ型膜糖タンパク質である。
【０００４】
Ｎ末端サブユニット（ＭＵＣ１−Ｎ）は、可変数のタンデムリピート領域（ＶＮＴＲ）及び非ＶＮＴＲ領域から成る、大型の細胞外ドメインである。ＭＵＣ１−Ｎは、細胞から放出され、進行がんに罹った患者の循環血液中に見出され得る。ＭＵＣ１−Ｎは、乳癌患者における腫瘍マーカー（ＣＡ１５．３）として用いられる（Ｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，４：１５４２−５０（１９８６）参照）。
【０００５】
ＭＵＣ１のＣ末端領域（ＭＵＣ１−Ｃ）には独特の３部分：ＭＵＣ１−Ｎに共有結合している小型の細胞外ドメイン、１回膜貫通型ドメイン、及び細胞質尾部、がある（Ｌａｎ
ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１５２９４−９（１９９０）参照）。細胞質尾部は、βカテニン、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、及びＳｒｃ等のシグナル伝達タンパク質との相互作用のための部位を含有する（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：３５２３９−４２（２００１）参照）。これらのタンパク質は、健全な細胞の側底部に位置しているため、タンパク質−ＭＵＣ１相互作用が顕著であるとは考えられない。しかしながら、ヒト腫瘍細胞における極性の喪失は、細胞質尾部がシグナル伝達タンパク質に曝露されることを可能にし、相互作用が生じ得る（Ｖｅｒｍｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４２２：３２２−６（２００３）参照）。
【０００６】
ＭＵＣ１−Ｃ領域は、癌遺伝子として作用することが示されており、ＭＵＣ１−Ｃがβ−カテニンに結合する場合、ヒト細胞の形質転換につながる（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：６１０７−１０（２００３）；Ｒａｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６９：５１３３−４１（２００９）；及びＷｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６７：１８５３−８（２００７）参照）。また、ＭＵＣ１−Ｃトランスフェクションは、形質転換を誘導し、増殖速度の増大、足場非依存性細胞増殖、化学療法剤に対する抵抗性等の、以前は全長ＭＵＣ１タンパク質に起因すると考えられた発癌活性を付与するのに十分であることが実証されている（Ｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．５：１６３−７５（２００４）参照）。更に、ｃ−Ｓｒｃによって活性化されるＭＵＣ１−Ｃシグナル伝達は、癌細胞の運動性、浸潤、及び転移を刺激する、Ｅ−カドヘリン接着結合及びインテグリン接着斑の両方の破壊に関与し、それによって、上皮間葉転換（ＥＭＴ）においてあり得る、ＭＵＣ１−Ｃの役割が示唆される（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，６：１２６１−７１（２００６）参照）。ＭＵＣ１に関連する遺伝子の過剰発現は、肺癌及び乳癌並び
に薬物耐性を患う患者における予後不良と高度に関連することも見出されている（Ｒｅｎ
ｅｔ  ａｌ．，上記；及びＫｈｏｄａｒｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６９：２８３３−７（２００９）参照）。
【０００７】
多くの臨床試験で、様々なヒト腫瘍の、ワクチン療法のための標的候補として、ＭＵＣ１が評価された。これらの大部分では、ＶＮＴＲ領域のポリペプチドを用いてきた。１のアゴニストエピトープ（Ｐ９３Ｌ）が、天然エピトープと比較して、より効率的にヒト腫瘍細胞を溶解することもできるＴ細胞の生成を増強することが示された（Ｔｓａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１０：２１３９−４９（２００４）参照）。この領域中の、他の二つのアゴニストエピトープの候補が、Ｔ細胞のサイトカイン産生を増強することが示されたが、腫瘍細胞殺傷は報告されなかった（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，５６：２８７−３０１（２００７）参照）。
【０００８】
ワクチンの能力を、より有効であるように増強することが示されている１つの方法は、推定上のＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を変化させることであり、それが、ひいてはＴ細胞活性化及びＴ細胞の特異的な腫瘍細胞殺傷を増強し得る（Ｇｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｒｖ．，２２：３７−４９（１９９５）；及びＴｅｒａｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８：４１−５３（２００２）参照）。しかしながら、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープのアミノ酸に起き得るすべての置換が、エンハンサーアゴニストエピトープをもたらすわけではなく、いくつかの置換は、アンタゴニストエピトープをもたらす。また、腫瘍関連抗原の、推定上のアゴニストエピトープの生成が、ＩＦＮ−γ産生による、Ｔ細胞活性化の増強につながる可能性がよくあるが、ヒト腫瘍細胞表面上のＭＨＣに関連して発現する内生の（天然の）エピトープを活性化Ｔ細胞が認識し、結果としてそれらの腫瘍細胞を溶解しない限り、役に立たない。
【０００９】
新しい、特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープ及びエンハンサーアゴニストペプチド又はＭＵＣ１−Ｃのエピトープを同定すること、並びに癌の診断及び／又は治療のために、これらのエピトープを使用する組成物及び方法を開発することが望まれている。
【発明の概要】
【００１０】
発明の要旨
本発明は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドを提供する。
【００１１】
別の態様においては、本発明は、該ペプチドを含むポリペプチド（タンパク質）、該ペプチドをコードする核酸、該核酸を含むベクター、該ペプチド、ポリペプチド（タンパク質）、核酸、又はベクター、を含む細胞、及びそれらの組成物を提供する。
【００１２】
特に、本発明は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含むＭＵＣ１タンパク質又はポリペプチド（例、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、又は配列番号２３）を提供する。
【００１３】
別の態様においては、本発明は、（ａ）酵母ビヒクル、及び（ｂ）少なくとも１のＭＵＣ１抗原を含む、融合タンパク質であって、ＭＵＣ１抗原が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含む、融合タンパク質、を含む、酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物を提供する。
【００１４】
本発明は、（ａ）酵母ビヒクル、及び（ｂ）少なくとも１のＭＵＣ１抗原を含む、融合タンパク質であって、ＭＵＣ１抗原が、（ｉ）配列番号１６、（ｉｉ）配列番号１６の９
２位〜５６６位、又は（ｉｉｉ）異なるＭＵＣ１タンパク質からの対応する配列、に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、及びＭＵＣ１抗原が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含む、融合タンパク質、を含む、酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物も提供する。
【００１５】
本発明は、（ａ）酵母ビヒクル、及び（ｂ）少なくとも１のＭＵＣ１抗原を含む、融合タンパク質であって、ＭＵＣ１抗原が、配列番号１４等の野生型ＭＵＣ１のアミノ酸配列に関して：Ｔ４２２、Ｐ４３０、Ｔ４３１、Ｓ４６２、及びＡ４７０から選択される配列位置に、少なくとも１のアミノ酸置換によって野生型ＭＵＣ１タンパク質のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む、融合タンパク質、を含む、酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物も提供する。
【００１６】
本発明は、治療有効量の、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、核酸、ベクター、細胞を含む組成物又は酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物を宿主に投与することを含む、宿主においてＭＵＣ１を発現する癌に対する免疫応答を増強する方法であって、宿主において免疫応答が増強される、方法も提供する。
【００１７】
本発明は、治療有効量の、ペプチド、ポリペプチド（タンパク質）、核酸、ベクター、細胞を含む組成物又は酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物を個体に投与することを含む、個体においてＭＵＣ１を発現する癌を治療する方法も提供する。
【００１８】
本発明は、治療有効量の、ペプチド、ポリペプチド（タンパク質）、核酸、ベクター、細胞を含む組成物又は酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物を個体に投与することを含む、ＭＵＣ１を発現する癌を有する個体において癌の転移の進行を減退させる、阻止する、反転させる、又は予防する方法も提供する。
【００１９】
本発明は、治療有効量の、ペプチド、ポリペプチド（タンパク質）、核酸、ベクター、細胞を含む組成物又は酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物を個体に投与することを含む、個体においてＭＵＣ１を発現する癌の発症を予防するか、又は遅延させる方法も提供する。
【００２０】
本発明は、（ａ）被験体からリンパ球を得る（単離する）こと、（ｂ）宿主に対するペプチド、ポリペプチド（タンパク質）、核酸、ベクター、又は細胞を含む組成物により、リンパ球を刺激して、ｅｘ  ｖｉｖｏで細胞傷害性Ｔリンパ球を生成すること、及び（ｃ）細胞傷害性Ｔリンパ球を被験体に投与すること、を含み、被験体においてＭＵＣ１を発現する癌が阻害される、被験体においてＭＵＣ１を発現する癌を阻害する方法を更に提供する。
【００２１】
本発明は、（ａ）被験体から樹状細胞を得る（単離する）こと（ｂ）ペプチド、ポリペプチド（タンパク質）、核酸、ベクター、細胞を含む組成物又は酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物により、樹状細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで処理すること、及び（ｃ）処理された樹状細胞を被験体に投与すること、を含み、被験体においてＭＵＣ１を発現する癌が阻害される、被験体においてＭＵＣ１を発現する癌を阻害する方法を提供する。
【００２２】
更に、本発明は、（ａ）癌を患う被験体から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得ること（ｂ）ＰＢＭＣから樹状細胞を単離すること（ｃ）ペプチド、ポリペプチド（タンパク質）、核酸、ベクター、細胞を含む組成物又は酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物により、樹状細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで処理すること、（ｄ）処理した樹状細胞により、ＰＢＭＣをｅｘ  ｖｉｖｏで活性化すること、及び（ｅ）活性化されたＰＢＭＣを被験体に投与すること、を含み、被験体においてＭＵＣ１を発現する癌が阻害される、被験体においてＭＵＣ１を発現する癌を阻害することを提供する。
【００２３】
本発明は、（ａ）癌を患う被験体から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得ること（ｂ）ＰＢＭＣから樹状細胞を単離すること（ｃ）ペプチド、ポリペプチド（タンパク質）、核酸、ベクター、細胞を含む組成物又は酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物により、樹状細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで処理すること、（ｄ）処理した樹状細胞により、ＰＢＭＣをｅｘ  ｖｉｖｏで活性化すること（ｅ）活性化したＰＢＭＣからＴリンパ球をｅｘ  ｖｉｖｏで単離すること、及び（ｆ）単離されたＴリンパ球を被験体に投与すること、を含み、被験体においてＭＵＣ１を発現する癌が阻害される、被験体においてＭＵＣ１を発現する癌を阻害することを更に提供する。
【００２４】
本発明は、癌を治療するため、被験体においてＭＵＣ１を発現する癌を阻害するため、癌を有する個体において、癌の転移の進行を減退させる、阻止する、反転させる、若しくは予防するため、又はＭＵＣ１を発現する癌の発症を予防する若しくは遅延させるための、ペプチド、ポリペプチド（タンパク質）、核酸、ベクター、細胞を含む組成物又は酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激した養子移入Ｔ細胞の使用を提供する。
【００２５】
更なる態様においては、本発明は、（ａ）配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一のポックスウイルスベクターを被験体に投与すること、及び（ｂ）配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二のポックスウイルスベクターを被験体に投与することを含む、被験体においてＭＵＣ１を発現する癌に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。１つの実施形態においては、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含むＭＵＣ１タンパク質（例、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、又は配列番号２３）をコードする核酸である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明は、ＭＵＣ１を発現又は過剰発現する癌を含むが、それらに限定されない癌の、予防又は治療的処置のためのワクチン及び他の組成物に用いられ得る、ヒト腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）のムチン１（ＭＵＣ１）及びその類似体の、Ｃ末端サブユニットからのヒト細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含む、ペプチドを提供する。特に、本発明は、ＫＹＨＰＭＳＥＹＡＬ（配列番号１）又はＫＹＴＮＰＡＶＡＬ（配列番号２）のアミノ酸配列を含む、それらから本質的になる、又はそれらからなるペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質を提供する。
【００２７】
別の実施形態においては、本発明は、ＭＵＣ１のアミノ酸配列（即ち、ＭＵＣ１タンパク質）又はその断片を含むポリペプチドであって、対応するアミノ酸残基のうちの１以上が、エンハンサーアゴニストエピトープの、配列番号１又は配列番号２のうちの１以上で置換されている、ポリペプチド（例、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、又は配列番号２３）を提供する。
【００２８】
「ポリペプチド」は、一般的に、タンパク質分子の一部又は全体を形成する、連続的、非分枝鎖状に結びつけられた多数のアミノ酸残基から成る直鎖状有機ポリマーであると理解される。「ペプチド」は、一般に、サイズに基づいて、全長タンパク質又はポリペプチドと区別されると考えられ、１つの実施形態においては、任意の基準として約５０個以下のアミノ酸を含有すると理解され得るが、ポリペプチド又は全長タンパク質は、一般的により長い。しかしながら、用語「ペプチド」及び「ポリペプチド」は、いくつかの実施形態においては、本発明において有用なタンパク質を記述するために、交換可能に用いられ得、又は用語「タンパク質」が、全般的に用いられ得る。
【００２９】
本発明のペプチド又はポリペプチドは、任意の好適な長さであり得る。１つの実施形態においては、本発明のペプチドは、２０以下（例、１９以下、１８以下、１７以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、又は１０以下）のアミノ酸残基を有する。更なるアミノ酸残基は、存在する場合、好ましくは、ＭＵＣ１（例、ＭＵＣ１−Ｃ）タンパク質又は本明細書に記載の通りの、ＭＵＣ１の配列由来である。更なるアミノ酸残基が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列の、いずれかの末端又は両末端に配置され得る。
【００３０】
酵母等の宿主細胞での発現用ポリペプチドは、宿主細胞中での組換え発現が可能な最小サイズである。従って、宿主細胞が発現するポリペプチドは、好ましくは少なくとも２５アミノ酸長であり、典型的には、少なくとも２５アミノ酸長若しくは２５アミノ酸長超、又は少なくとも２６アミノ酸長若しくは２６アミノ酸長超、少なくとも２７アミノ酸長若しくは２７アミノ酸長超、少なくとも２８アミノ酸長若しくは２８アミノ酸長超、少なくとも２９アミノ酸長若しくは２９アミノ酸長超、少なくとも３０アミノ酸長若しくは３０アミノ酸長超、少なくとも３１アミノ酸長若しくは３１アミノ酸長超、少なくとも３２アミノ酸長若しくは３２アミノ酸長超、少なくとも３３アミノ酸長若しくは３３アミノ酸長超、少なくとも３４アミノ酸長若しくは３４アミノ酸長超、少なくとも３５アミノ酸長若しくは３５アミノ酸長超、少なくとも３６アミノ酸長若しくは３６アミノ酸長超、少なくとも３７アミノ酸長若しくは３７アミノ酸長超、少なくとも３８アミノ酸長若しくは３８アミノ酸長超、少なくとも３９アミノ酸長若しくは３９アミノ酸長超、少なくとも４０アミノ酸長若しくは４０アミノ酸長超、少なくとも４１アミノ酸長若しくは４１アミノ酸長超、少なくとも４２アミノ酸長若しくは４２アミノ酸長超、少なくとも４３アミノ酸長若しくは４３アミノ酸長超、少なくとも４４アミノ酸長若しくは４４アミノ酸長超、少なくとも４５アミノ酸長若しくは４５アミノ酸長超、少なくとも４６アミノ酸長若しくは４６アミノ酸長超、少なくとも４７アミノ酸長若しくは４７アミノ酸長超、少なくとも４８アミノ酸長若しくは４８アミノ酸長超、少なくとも４９アミノ酸長若しくは４９アミノ酸長超、又は少なくとも５０アミノ酸長若しくは５０アミノ酸長超、又は少なくとも２５〜５０アミノ酸長、少なくとも３０〜５０アミノ酸長、又は少なくとも３５〜５０アミノ酸長、又は少なくとも４０〜５０アミノ酸長、又は少なくとも４５〜５０アミノ酸長であるが、より小型のタンパク質が発現し得、また、相当大型のタンパク質（たとえば、何百アミノ酸長、更には数千アミノ酸長）が発現し得る。
【００３１】
別の実施形態においては、本発明は、ＭＵＣ１を発現又は過剰発現する癌を含むが、それらに限定されない癌の、予防又は治療的処置のためのワクチン及び他の組成物に用いられ得る、ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、ＭＵＣ１のアミノ酸配列又はその断片（例、その免疫原性ドメイン）を含むか、それらから本質的に成るか、又はそれらから成り、該ポリペプチドの１以上の対応するアミノ酸残基が、該ポリペプチドが配列番号１又は配列番号２のエンハンサーアゴニストエピトープの１以上を含むように置換され（ｒｅｐｌａｃｅｄ）ている（例、置換され（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）ている）、ポリペプチドを提供する（即ち、該ポリペプチドのアミノ酸配列が、典型的には、所定の野生型エピトープ配列中に、１、２、３、又はそれ以上のアミノ酸の、異なるアミノ酸との置換を含む、１以上のエンハンサーアゴニストエピトープを含む点で、該ポリペプチドは、天然の又は野生型の、ＭＵＣ１のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する）。この実施形態の１つの態様においては、ポリペプチドは、更なるＭＵＣ１エンハンサーアゴニストエピトープ（その例は、以下に詳細に記載される）を更に含み得る。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態においては、本発明のペプチド及びポリペプチド（タンパク質）は、抗原として用いられる。本発明によれば、本明細書中で一般的に用いる用語「抗原」は、タンパク質（例、ペプチド、部分タンパク質、全長タンパク質）の任意の部分
を指し、該タンパク質は天然に生じるか、或いは合成由来であり、或いは、細胞組成物（全細胞、細胞溶解物、又は破壊された細胞）に対して、生物（全生物、溶解物又は破壊された細胞）に対して、又は炭水化物、若しくは他の分子若しくはその一部に対して設計される。抗原は、免疫系の要素（例、Ｔ細胞、抗体）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、又はｅｘ  ｖｉｖｏで遭遇する、同一又は類似の抗原に対して、抗原特異的免疫応答（例、液性及び／又は細胞性免疫応答）を誘発し得る。
【００３３】
抗原は、単一のエピトープ（例、本明細書に記載の配列番号１又は配列番号２）と同程度に小型であり得、単一の免疫原性ドメイン以上であり得、また複数のエピトープ又は免疫原性ドメインを含み得る。このように、タンパク質抗原のサイズは、約８〜１１アミノ酸（例、ペプチド）と同程度に小型であり得、及びタンパク質のドメイン、全長タンパク質、多量体、融合タンパク質、又はキメラタンパク質と同程度に大型であり得る。本明細書に記載の様々な免疫療法組成物において有用な抗原としては、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質ドメイン（複数可）（例、免疫原性ドメイン）、タンパク質サブユニット、全長タンパク質、多量体、融合タンパク質、及びキメラタンパク質が挙げられる。
【００３４】
免疫応答の刺激に言及する場合、用語「免疫原」は、用語「抗原」のサブセットであり、従って、いくつかの例においては、用語「抗原」と交換可能に用いられ得る。本明細書で用いられる免疫原は、個体への免疫原の投与が、個体の免疫系が遭遇する、同一又は類似の抗原に対して、抗原特異的免疫応答を開始するような、液性及び／又は細胞性免疫応答を誘発する（即ち、免疫原性である）抗原を記述する。１つの実施形態においては、免疫原は、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答（例、ＴＨ１、ＴＨ２、及び／又はＴＨ１７）及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞応答（例、ＣＴＬ応答）を含む、細胞性免疫応答を誘発する。
【００３５】
所定のタンパク質（ポリペプチド）の「免疫原性ドメイン」又は「免疫学的ドメイン」は、動物に投与した場合に免疫原として作用し得る、少なくとも１のエピトープを含有する、抗原の任意の部分、断片若しくはエピトープ（例、ペプチド断片又はサブユニット又は抗体エピトープ又は他の立体構造エピトープ）であり得る。従って、免疫原性ドメインは、単一のアミノ酸よりも大きく、且つ少なくとも、免疫原として作用し得る少なくとも１のエピトープを含有するのに十分なサイズである。例えば、単一のタンパク質が複数の異なる免疫原性ドメインを含有し得る。免疫原性ドメインは、立体構造ドメインが考慮される液性免疫応答の場合等においては、タンパク質内の直鎖配列を必要としない。
【００３６】
エピトープは、本明細書においては、所定の抗原内の、（免疫系に提供された場合、免疫系の適切な共刺激シグナル及び／又は活性化細胞の背景において、免疫応答を誘発するのに十分である）単一の免疫原性部位として定義される。言い換えれば、エピトープは、免疫系の構成要素によって認識される抗原の一部であり、抗原決定基と呼ばれる場合もある。当業者は、Ｔ細胞エピトープは、Ｂ細胞又は抗体エピトープとは、サイズ及び組成が異なること、及び、クラスＩ  ＭＨＣ経路を介して提示されるエピトープは、クラスＩＩ
ＭＨＣ経路を介して提示されるエピトープとは、サイズ及び構造属性が異なることを理解するであろう。例えば、クラスＩ  ＭＨＣ分子により提示されるＴ細胞エピトープは、一般的に８〜１１アミノ酸長である一方で、クラスＩＩ  ＭＨＣ分子によって提示されるエピトープは、長さはそれほど制限されず、最大２５アミノ酸又はそれ以上であり得る。更に、Ｔ細胞エピトープは、該エピトープが結合した特異的なＭＨＣ分子に応じて、構造的特徴が予測されている。エピトープは、直鎖状配列エピトープ（ｌｉｎｅａｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ）又は立体構造エピトープ（保存された結合領域）であり得る。ほとんどの抗体は、立体構造エピトープを認識する。
【００３７】
「標的抗原」は、本発明の免疫療法組成物によって特異的に標的化される抗原（即ち、免疫療法に用いられる抗原が天然抗原のアゴニストであっても、免疫応答の誘発が望まれ
る抗原で、通常、天然抗原）である。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）とも呼ばれる「癌抗原」は、腫瘍細胞が発現する抗原等の、癌に関連する、少なくとも１の抗原を含む抗原である。該抗原を標的とすることにより、腫瘍細胞及び／又は癌も標的となる。癌抗原は、１以上の腫瘍関連タンパク質を含む、１以上のタンパク質からの１以上の抗原を含み得る。特に、「ＭＵＣ１抗原」は、ＭＵＣ１タンパク質（ＭＵＣ１−Ｎ、ＭＵＣ１−Ｃ、又はＭＵＣ１−Ｎ及びＭＵＣ１−Ｃの両方が挙げられる）から誘導、設計、又は産生される抗原である。「ＭＵＣ１アゴニスト抗原」は、本明細書に記載のエンハンサーアゴニストエピトープ等の、少なくとも１のアゴニストエピトープを含む、ＭＵＣ１タンパク質（ＭＵＣ１−Ｎ、ＭＵＣ１−Ｃ又はＭＵＣ１−Ｎ及びＭＵＣ１−Ｃの両方が挙げられる）から誘導、設計、又は産生される抗原である。本発明の好適なエンハンサーアゴニストエピトープは、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を有する。
【００３８】
ＭＵＣ１（「ムチン−１」、「ＤＦ３抗原」又は「ＨＭＦＧ１」とも呼ばれ得る）は、ほとんどの上皮分泌組織で、基低レベルで発現する大型の糖タンパク質であり、上皮細胞起源の悪性疾患によって高レベルで発現する。ＭＵＣ１は、最も典型的には、Ｏ−結合を介して高度にグリコシル化された可変数タンデムリピート（ＶＮＴＲ、典型的には２０〜１２５リピート）を含む大型細胞外ドメイン（ＭＵＣ１−Ｎサブユニットとも呼ばれる）を有する多型Ｉ型膜貫通タンパク質（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ，  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）として見出される。ＭＵＣ１タンパク質は、単一の転写物としてコードされ、そのうえ、それぞれ、ＭＵＣ１−Ｎ及びＭＵＣ１−Ｃ又はα及びβサブユニットとして知られるサブユニットに翻訳後にプロセシングされ、次いで、該２サブユニットの強力な非共有結合性相互作用によりヘテロ二量体タンパク質を形成する。ＭＵＣ１は、高度に保存されたタンパク質ドメインである「ウニ精子タンパク質、エンテロキナーゼ、及びアグリン」（ＳＥＡ）ドメイン内でＮ及びＣサブユニットに切断される。このドメインは、それが最初に精子タンパク質中、エンテロキナーゼ中、及びアグリン中で同定されたことに基づいて命名されており、典型的には膜に係留されたいくつかの高グリコシル化ムチン様タンパク質中に見いだされる。ＭＵＣ１タンパク質は、ＳＥＡドメイン内で、配列番号１１の１０９７位〜１１０１位に対応する配列ＧＳＶＶＶ中に存在するグリシン及びセリン残基の間で切断される（Ｌｉｌｌｅｈｏｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３０７：７４３−７４９（２００３）；Ｐａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２８３：７１５−７２０（２００１）；Ｗｒｅｓｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，１１：６９８−７０６（２００２））。
【００３９】
ＭＵＣ１−Ｃサブユニットは、グリコシル化され、ガレクチン−３リガンドを結合させ、それが今度はＭＵＣ１と上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）及びおそらく他の受容体チロシンキナーゼとを物理的に会合させるために、ブリッジとして機能する細胞外ドメイン（ＥＤ）を含む。ＭＵＣ１−Ｃはまた、リン酸化された場合にＳＨ２ドメインを有するタンパク質のための結合モチーフとして作用し得るいくつかのチロシン残基を含有する、膜貫通（ＴＭ）ドメイン、及び細胞質ドメイン（ＣＤ）を含む（ＭＵＣ１タンパク質並びに知られている、及び推定される機能の詳細な検討については、Ｋｕｆｅ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．＆  Ｔｈｅｒ．，７：８１−８４（２００８）参照）。ＭＵＣ１の選択的スプライシングバリアント（例えば、ＭＵＣ１／Ｙ及びＭＵＣ１／Ｘとして知られる）は、大型のＶＮＴＲ領域を含むＭＵＣ１−Ｎのほとんどを欠くＭＵＣ１の「短縮」型であるが、それは、ＥＤ、ＴＭ及びＣＤの領域並びにＳＥＡドメイン及びＮ末端領域のシグナル配列領域の部分を含む。これらの短縮型では、ＳＥＡドメイン内の切断は生じないかもしれない。
【００４０】
ヒトＭＵＣ１をコードするＤＮＡ及びｃＤＮＡの単離及び配列決定が報告されている（例、Ｓｉｄｄｉｑｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，８５：２３２０−２３２３（１９９８
）；Ａｂｅ  ａｎｄ  Ｋｕｆｅ，ＰＮＡＳ，９０：２８２−２８６（１９９３）；Ｈａｒｅｕｖｅｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８９（３）：４７５−４８６（１９９０）；Ｇｅｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５（２５）：１５２８６−１５２９３（１９９０）；Ｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５（２５）：１５２９４−１５２９９（１９９０）；Ｔｓａｒｆａｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，９３（２）：３１３−３１８（１９９０）；Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１７３（３）：１０１９−１０２９（１９９０）参照）。ＭＵＣ１−Ｎ領域及びＭＵＣ１−Ｃ領域の両方を含有する全長ヒトＭＵＣ１前駆体タンパク質の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受入番号Ｐ１５９４１．３（ＧＩ：２９６４３９２９５）に記載されており、本明細書では配列番号５で表される。選択的転写産物スプライシングにより、配列番号５をコードする遺伝子から、１０の異なるＭＵＣ１アイソフォームが作製され得る。例えば、ＭＵＣ１／Ｙとして知られるアイソフォームは、配列番号５の５４位〜１０５３位を欠いている。他の種々のアイソフォームが、このタンパク質のデータベースの説明に記載されている。
【００４１】
ＭＵＣ１転写産物の様々な変異体が知られているが、上記の例示的な配列番号５に記載のＭＵＣ１のサブユニット、ドメイン、又は領域は、該変異体中に容易に同定し得、本発明において有用なＭＵＣ１抗原を、所定のＭＵＣ１配列、又は別のＭＵＣ１タンパク質からの対応する配列に基づいて設計又は産生し得る。例えば、ヒトＭＵＣ１タンパク質をコードする１のヌクレオチド配列は、本明細書中、配列番号６（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＮＭ＿００２４５６．４（ＧＩ：６５３０１１１６）に対応する）により表される。配列番号６は、２７３アミノ酸のヒトＭＵＣ１タンパク質（ＭＵＣ１／ＺＤとしても知られる、転写産物変異体１）をコードし、そのアミノ酸配列は、配列番号７（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＮＰ＿００２４４７．４；ＧＩ：６５３０１１１７としても見出される）として本明細書に表される。本明細書中、配列番号８（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＮＭ＿００１０１８０１６．１（ＧＩ：６７１８９００６）に対応する）により、別のヒトＭＵＣ１タンパク質をコードする別のヌクレオチド配列が表される。配列番号８は、２６４アミノ酸のヒトＭＵＣ１タンパク質（「ＭＵＣ１／Ｙ」としても知られる、転写産物変異体２）をコードし、そのアミノ酸配列は、配列番号９（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＮＰ＿００１０１８０１６．１；ＧＩ：６７１８９００７中にも見出される）として本明細書に表される。本明細書中、配列番号１０（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＡＹ３２７５８７．１（ＧＩ：３３１５０００３）に対応する）により、別のヒトＭＵＣ１タンパク質をコードする別のヌクレオチド配列が表される。配列番号１０は、２６４アミノ酸のヒトＭＵＣ１タンパク質（「ＭＵＣ１／Ｙ」としても知られる、転写産物変異体２）をコードし、そのアミノ酸配列は、配列番号１１（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＡＡＰ９７０１８．１（ＧＩ：３３１５０００４）中にも見出される）として本明細書に表される。本明細書中、配列番号１２（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＮＭ＿００１０１８０１７（ＧＩ：３２４１２０９５４）に対応する）により、別のヒトＭＵＣ１タンパク質をコードする別のヌクレオチド配列が表される。配列番号１２は、２５５アミノ酸のヒトＭＵＣ１タンパク質（転写産物変異体３）をコードし、そのアミノ酸配列は、配列番号１３（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＮＰ＿００１０１８０１７．１；ＧＩ：６７１８９０６９）中にも見出される）として本明細書に表される。本明細書中、配列番号１４（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＮＭ＿００１１９１２１４中にも見出される）により、なお別の例示的な野生型ＭＵＣ１アミノ酸配列が表される。配列番号１４は、本明細書に記載のＭＵＣ１のいくつかの、アミノ酸位置の基準として用いられるが、他のＭＵＣ１配列における対応する位置は、当業者によって同定され得る。
【００４２】
ヒトＭＵＣ１タンパク質及びＭＵＣ１抗原を含む、本明細書に記載のヒトＭＵＣ１は、様々なＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含有する。かかるＴ細胞エピトープは、
例えば、米国特許第６，５４６，６４３号；米国特許第７，１１８，７３８号；米国特許第７，３４２，０９４号；米国特許第７，６９６，３０６号；及び米国特許出願公開第２００８／００６３６５３号並びにＰＣＴ公開第２０１３／０２４９７２号に記載されており、本発明のＭＵＣ１抗原において、これらのエピトープのいずれか１以上が、該配列を、本明細書に記載の配列内の１以上のアミノ酸を付加、削除、又は、置換することによる等で、その位置（複数可）で、公開されたエピトープ配列に一致させるために、用いられ得る。
【００４３】
本発明において発見されたＭＵＣ１アゴニスト抗原の例が、本明細書中に提供される（実施例参照）。本発明において有用なペプチド、タンパク質、又はポリペプチドは、配列番号１及び配列番号２で表されるＭＵＣ１エンハンサーアゴニストペプチドの少なくとも１を含むか、本質的にそれらから成るか、又はそれらから成る。しかしながら、本発明において使用するためのＭＵＣ１抗原には、他のＭＵＣ１アゴニストエピトープを更に含め得る。１つの実施形態においては、本発明における使用に好適なＭＵＣ１アゴニスト抗原は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又はそれ以上のアミノ酸置換により、野生型（天然）のＭＵＣ１タンパク質若しくはポリペプチド又はそれらのペプチドとは異なるアミノ酸配列を有する、ＭＵＣ１タンパク質若しくはポリペプチド又はそれらのペプチドを含み、該アミノ酸置換は、抗原に１以上のＭＵＣ１アゴニストエピトープを導入する。かかるアミノ酸置換としては、以下：Ｔ９３、Ａ１６１、Ｐ１６２、Ｇ１６９、Ｓ１７０、Ｔ１７１、Ａ３９２、Ｃ４０６、Ｔ４２２、Ｐ４３０、Ｔ４３１、Ｔ４４４、Ｄ４４５、Ｓ４６０、Ｓ４６２、及び／又はＡ４７０、のアミノ酸位置における置換が挙げられ得る（置換の位置は、受入番号ＮＰ＿００１１９１２１４（配列番号１４）で表されるアミノ酸配列を有する野生型ＭＵＣ１に関して提供される（しかし、同一又は同等の位置は、容易に他のいずれかの野生型ＭＵＣ１配列内で同定し得る））。１つの実施形態においては、置換は：Ｔ９３Ｌ、Ａ１６１Ｙ、Ｐ１６２Ｌ、Ｇ１６９Ｖ、Ｓ１７０Ｙ、Ｔ１７１Ｌ、Ａ３９２Ｙ、Ｃ４０６Ｖ、Ｔ４２２Ｋ、Ｐ４３０Ａ、Ｔ４３１Ｌ、Ｔ４４４Ｌ、Ｄ４４５Ｆ、Ｓ４６０Ｙ、Ｓ４６２Ｋ、及び／又はＡ４７０Ｌである。
【００４４】
更に、本発明において有用なＭＵＣ１抗原は、例えば、天然のタンパク質の天然の生物学的機能を不活化又は欠失させる（例、抗原の発現を改善する、又は安全性を増強する）ための、１以上の更なるアミノ酸変異（置換、挿入又は欠失）を含み得る。かかる変異の１例は、基準配列として配列番号１４を用いる場合、野生型タンパク質に関する位置Ｃ４０４での置換である、不活性化変異である。１つの態様においては、不活性化置換は、（配列番号１４に関して）Ｃ４０４Ａである。
【００４５】
本発明のペプチド又はポリペプチド（タンパク質）は、ペプチドを合成することにより、又は細胞内で、ペプチド又はポリぺプチドについての適切なアミノ酸配列をコードする核酸を発現させ、いくつかの実施形態において、細胞よりペプチド又はポリぺプチドを回収すること等の任意の方法によって、調製され得る。酵母−免疫療法組成物に関する、本発明の実施形態において等、いくつかの実施形態においては、ペプチド又はポリペプチドは、細胞から回収されない（下記に詳述）。かかる、ペプチド及びポリペプチドの産生方法の組み合わせも用いられ得る。ペプチドのｄｅ  ｎｏｖｏ合成方法及び組換え的にペプチド又はポリペプチドを製造する方法は当該分野で知られている（例、Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ，２００５；Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，ｅｄ．Ｒｅｉｄ，Ｒ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，２０００；Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ，ｅｄ．Ｗｅｓｔｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｘｆｏｒｄ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ，
２０００；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ２００１；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９４参照）。
【００４６】
本発明は、ペプチド又はポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子も提供する。核酸分子はＤＮＡ（ゲノム若しくはｃＤＮＡ）又はＲＮＡを含み得、一本鎖又は二本鎖であり得る。更に、核酸分子は、ヌクレオチド類似体又は誘導体（例、イノシン又はホスホロチオエートヌクレオチドなど）を含み得る。核酸配列は、ペプチド又はポリペプチドを単独で、又は融合タンパク質の一部としてコードし得る。ペプチド又はポリペプチドをコードする核酸配列は、核酸分子と、細胞への核酸分子の送達及び／又は細胞での核酸分子の発現を可能にするエレメントとを含むコンストラクトの一部として提供され得る。かかるエレメントとしては、例えば、発現ベクター、プロモーター、並びに転写及び／又は翻訳制御配列が挙げられる。かかるコンストラクトは、「組換え核酸分子」とも呼ばれ得る。好適なベクター、プロモーター、転写／翻訳配列、及び他のエレメント、並びにかかる核酸分子及びコンストラクトの調製方法は、当該分野で知られている（例、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，上記；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。語句「核酸分子」は、主に物理的核酸分子を指し、語句「核酸配列」は、主に核酸分子上のヌクレオチド配列を指すが、該２語は、特に、ペプチド又はポリペプチドをコードし得る核酸分子又は核酸配列に関して交換可能に用いられ得る。同様に、語句「組換え核酸分子」は、主に、転写制御配列等のエレメントに作動可能に連結された核酸分子を指すが、語句「核酸分子」と交換可能に用いられ得る。
【００４７】
本発明は更に、核酸分子を含むベクターを提供する。好適なベクターの例としては、プラスミド（例、ＤＮＡプラスミド）及びポックスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、アルファウイルス、バキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｒｖｉｒｕｓ）、及びシンドビスウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。
【００４８】
第１の実施形態においては、ベクターは、プラスミド（例、ＤＮＡプラスミド）である。プラスミドは、キトサンと複合体形成し得る。
【００４９】
第２の実施形態においては、ベクターは、ポックスウイルス（例、コードポックスウイルスベクター及びエントモポックスウイルスベクター）である。好適なポックスウイルスとしては、オルトポックス、アビポックス、パラポックス、ヤタポックス、及びモルシポックス、アライグマポックス、ウサギポックス、カプリポックス（例、羊痘）、レポリポックス、及びスイポックス（例、豚痘）が挙げられる。アビポックスウイルスの例としては、鶏痘、鳩痘、ＡＬＶＡＣ等のカナリア痘、九官鳥痘、ユキヒメドリ痘（ｕｎｃｏｐｏｘ）、ウズラ痘、クジャク痘、ペンギン痘、スズメ痘、ムクドリ痘、及び七面鳥痘が挙げられる。オルトポックスウイルスの例としては、（痘瘡としても知られる）天然痘、牛痘、サル痘、ワクシニア、エクトロメリア、ラクダ痘、アライグマポックス、及びそれらの誘導体が挙げられる。
【００５０】
用語「ワクシニアウイルス」は、野生型ワクシニアウイルス及び、例えば、修飾ワクシニアのアンカラ（ＭＶＡ）、ＮＹＶＡＣ、ＴＲＯＹＶＡＣ、ドライバックス（Ｄｒｙ−Ｖａｘ）（ワクシニアウイルスワイス（Ｗｅｙｔｈ）としても知られる）、ＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ワクシニアウイルスウエスタンリザーブ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ，）、ワクシニアウイルスＥＭ
６３、ワクシニアウイルスリスター（Ｌｉｓｔｅｒ）、ワクシニアウイルスニューヨークシティボードオブヘルス（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）、ワクシニアウイルステンプルオブヘブン（Ｔｅｍｐｌｅ  ｏｆ  Ｈｅａｖｅｎ）、ワクシニアウイルスコペンハーゲン（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）、ＡＣＡＭ１０００、ＡＣＡＭ２０００、及び修飾ワクシニアウイルスアンカラ−バーバリアンノルディック（「ＭＶＡ−ＢＮ」）が挙げられる、後に単離された種々の弱毒株又は分離株のいずれかの、両方を指す。
【００５１】
特定の実施形態においては、ＭＶＡは、１９９４年１月２７日に、寄託番号ＥＣＡＣＣ
９４０１２７０７で、欧州動物細胞培養機関（「ＥＣＡＣＣ」）、健康保護庁、微生物学局（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ポートダウン、ソールズベリー
ＳＰ４  ０ＪＧ、連合王国（「ＵＫ」）に寄託されたＭＶＡ−５７２；２０００年１２月７日に、寄託番号ＥＣＡＣＣ００１２０７０７で、ＥＣＡＣＣに寄託されたＭＶＡ−５７５；２０００年８月３０日に、寄託番号Ｖ０００８００３８で、ＥＣＡＣＣに寄託されたＭＶＡ−バーバリアンノルディック（「ＭＶＡ−ＢＮ」）；及びＭＶＡ−ＢＮの誘導体から成る群から選択される。更なる例示的なポックスウイルスベクターは、米国特許第７，２１１，４３２号に記載されている。
【００５２】
ワクシニアウイルスＭＶＡは、漿尿膜ウイルス（ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｓ  ｖｉｒｕｓ）アンカラ（ＣＶＡ）と呼ばれる、ワクシニアウイルスアンカラ株を、ニワトリ胚線維芽細胞において５１６代連続的に継代することによって生成された（Ｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，３：６−１４（１９７５）参照）。得られた弱毒ＭＶＡのゲノムは、親ＣＶＡ株と比較して、ゲノムＤＮＡの約３１キロ塩基対を欠いており、宿主細胞が、鳥類細胞にかなり限定される（Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：１０３１−１０３８（１９９１）参照）。得られたＭＶＡは、著しく非病原性であることがさまざまな動物モデルで示された（Ｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．，４１：２２５−３４（１９７８））。このＭＶＡ株は、天然痘に対して免疫するためのワクチンとして、ヒトにおける臨床試験で試験されている（Ｍａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｚｂｌ．Ｂａｋｔ．Ｈｙｇ．Ｉ，Ａｂｔ．Ｏｒｇ．Ｂ，１６７：３７５−３９０（１９８７）；及びＳｔｉｃｋｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｔｓｃｈ．Ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．，９９：２３８６−２３９２（１９７４）参照）。これらの研究は、高リスク患者を含む、ヒト１２０，０００人超が関わり、ＭＶＡが、ワクシニアウイルスベースのワクチンに比べて、毒性や感染力を減少させたが、依然として良好な特異的免疫応答を誘導できることを証明した。ＭＶＡ−ＢＮは、他のＭＶＡ株よりも複製能が乏しいので、その、より安全性の高いプロファイルのため好ましいが、ＭＶＡ−ＢＮ及びその誘導体を含むすべてのＭＶＡが、本発明に好適である。
【００５３】
ＭＶＡ及びＭＶＡ−ＢＮの両方が、たとえ非病原性であっても、哺乳動物細胞において、それらのＤＮＡを効率的に複製することができる。この特性は、その、ニワトリ胚線維芽細胞を介した継代の間に生じた、少なくとも２５の更なる変異及び欠失に伴い、２つの重要な宿主域遺伝子を喪失したことの結果である（Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：１０３１−１０３８（１９９１）；及びＡｎｔｏｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，２４４：３６５−３９６（１９９８）参照）。弱毒コペンハーゲン株（ＮＹＶＡＣ）及び宿主域制限アビポックス（ＡＬＶＡＣ）とは対照的に、ＭＶＡにおいては、初期及び後期の転写が両方損なわれず、ウイルスのライフサイクル全体を通じて、連続的な遺伝子発現を可能にする（Ｓｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０８４７−１０８５１（１９９２）参照）。更に、ＭＶＡは、既存のポックスウイルス免疫の条件で用いられ得る（Ｒａｍｉｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：７６５１−７６５５（２０００））。
【００５４】
ＭＶＡ及びＭＶＡ−ＢＮの両方は、祖先の漿尿膜ワクシニアウイルスアンカラ（「ＣＶＡ」）と比較して、ゲノムの約１５％（６つの領域から３１ｋｂ）を欠失している。欠失は、多数の病原性遺伝子及び宿主域遺伝子並びにＡ型封入体の遺伝子に影響を与える。ＭＶＡ−ＢＮはヒト細胞に付着して侵入し、ウイルスにコードされた遺伝子が、非常に効率的に発現する。しかし、子孫ウイルスの集合及び放出は起こらない。ＭＶＡ−ＢＮは、ニワトリ一次胚線維芽（ＣＥＦ）細胞に強く適応し、ヒト細胞中で複製しない。ヒト細胞においては、ウイルス遺伝子が発現し、且つ非感染性ウイルスが産生される。顕著な減衰及び毒性の低下にもかかわらず、前臨床試験において、ＭＶＡ−ＢＮが、ワクシニアに対する、及びＭＶＡゲノムにクローニングされた遺伝子によってコードされる異種遺伝子産物に対する、液性及び細胞性免疫応答の両方を誘発することが示された（Ｈａｒｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｔｈｅｒ．，１０（２）：２８５−３００（２００５）；Ｃｏｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２２（１）：２１−２９（２００３）；Ｄｉ  Ｎｉｃｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１４（１４）：１３４７−１３６０（２００３）；及びＤｉ  Ｎｉｃｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１０（１６）：５３８１−５３９０（２００４）参照）。
【００５５】
ウイルスの繁殖的複製は、典型的には、増幅率で表される。用語「増幅率」は、最初の段階で細胞を感染させる（「インプット」）ために用いられた元々の量に対する、感染した細胞から産生されるウイルス（「アウトプット」）の割合を指す。増幅率「１」は、感染細胞から産生されるウイルスの量が、最初に細胞を感染させるために用いられる量と同じである増幅状態を規定し、感染細胞は、ウイルス感染及び複製を許容することを意味する。１未満の増幅率は、感染細胞が産生するウイルスが、最初の段階で細胞を感染させるために用いられる量よりも少ないことを意味し、ウイルスが、繁殖的複製の能力を欠いていることを示しており、これはウイルス減衰の尺度である。
【００５６】
従って、用語「繁殖的に複製することができない」は、ＭＶＡ又はＭＶＡ誘導体が、例えば、ヒト胚性腎臓２９３細胞株（ＨＥＫ２９３、寄託番号ＥＣＡＣＣ番号８５１２０６０２で寄託）、ヒト骨骨肉腫細胞株１４３Ｂ（寄託番号ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．９１１１２５０２で寄託）、ヒト子宮頸部腺癌細胞株ＨｅＬａ（寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−２でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＴＣ）に寄託）、及びヒト角化細胞株ＨａＣａｔ（Ｂｏｕｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０６（３）：７６１−７１（１９８８）参照）等の１以上のヒト細胞株で、増幅率が１未満であることを意味する。
【００５７】
ＭＶＡ−ＢＮはヒト細胞株ＨＥＫ２９３、１４３Ｂ、ＨｅＬａ、及びＨａＣａｔ中で繁殖的に複製しない（米国特許第６，７６１，８９３号及び米国特許第６，１９３，７５２号、及び国際特許出願公開第２００２／０４２４８０号参照）。例えば、１つの典型的な実験においては、ＭＶＡ−ＢＮは、ＨＥＫ２９３細胞中で０．０５〜０．２の増幅率、１４３Ｂ細胞中で０．０〜０．６の増幅率、ＨｅＬａ細胞中で０．０４〜０．８の増幅率、及びＨａＣａｔ細胞中で０．０２〜０．８を示した。このように、ＭＶＡ−ＢＮは、ヒト細胞株ＨＥＫ２９３、１４３Ｂ、ＨｅＬａ、及びＨａＣａｔのいずれにおいても繁殖的に複製しない。対照的に、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）の初代培養物及びベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６３２で寄託された）におけるＭＶＡ−ＢＮの増幅率は１を超える。従ってＭＶＡ−ＢＮは、容易に増殖させられ得、ＣＥＦ初代培養物中では５００超の増幅率で、ＢＨＫ細胞中では５０超の増幅率で増幅し得る。
【００５８】
上述の通り、ＭＶＡ−ＢＮ及びその誘導体を含むすべてのＭＶＡは、本発明に好適である。用語「誘導体」は、寄託番号ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．Ｖ０００８００３８で、２０００年８月３０日にＥＣＡＣＣに寄託された株と実質的に同じ複製特性を示すが、そのゲノムの
１以上の部分で違いを示すウイルスを指す。寄託されたウイルスと同じ「複製特性」を有するウイルスは、ＢＨＫ細胞において、並びにヒト細胞株ＨＥＫ２９３、１４３Ｂ、ＨｅＬａ及びＨａＣａｔにおいて、ＣＥＦ細胞における寄託株の増幅率と同様の増幅率で複製するウイルスである。
【００５９】
ベクターが宿主（例、ヒト）への投与用である場合、ベクター（例、ポックスウイルス）は、好ましくは標的細胞において低い複製効率を有する（例、細胞あたり約１子孫以下、又は、より好ましくは、細胞あたり０．１子孫以下が産生される）。複製効率は、標的細胞の感染後のウイルス力価の測定によって、経験的に容易に決定され得る。
【００６０】
ポリペプチド（タンパク質）又はポリペプチド（即ち、本明細書に記載の、少なくとも１のＭＵＣ１エンハンサーアゴニストエピトープを含む、又はそれから本質的に成る若しくはそれらから成る、ペプチド又はポリペプチド）をコードする核酸分子に加えて、本発明において有用なベクター（例、プラスミド又はウイルスベクター）は、１以上の免疫刺激／調節分子、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン、及び／又は免疫応答を増強できる分子（例、更なる腫瘍関連抗原）をコードする核酸配列も含み得る。更なる典型的な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ、癌抗原とも呼ばれる）としては、５−α−レダクターゼ、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＡＭ−１、ＡＰＣ、エープリル（Ａｐｒｉｌ）、Ｂメラノーマ抗原遺伝子（ＢＡＧＥ）、βカテニン、Ｂｃｌ１２、ｂｃｒ−ａｂｌ、ブラキュリ、ＣＡ−１２５、カスパーゼ８（ＣＡＳＰ−８、ＦＬＩＣＥとしても知られる）、カテプシン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１／補体受容体２（ＣＲ２）、ＣＤ２２／ＢＬ−ＣＡＭ、ＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩ、ＣＤ３３、ＣＤ３５／補体受容体１（ＣＲ１）、ＣＤ４４／ＰＧＰ−１、ＣＤ４５／白血球共通抗原（ＬＣＡ）、ＣＤ４６／膜補助因子タンパク質（ＭＣＰ）、ＣＤ５２／ＣＡＭＰＡＴＨ−１、ＣＤ５５／崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＤ５９／プロテクチン、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｃ−ｍｙｃ、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）、結腸直腸癌欠失遺伝子（ＤＣＣ）、ＤｃＲ３、Ｅ６／Ｅ７、ＣＧＦＲ、ＥＭＢＰ、Ｄｎａ７８、ファルネシルトランスフェラーゼ、線維芽細胞増殖因子８ａ（ＦＧＦ８ａ）、線維芽細胞増殖因子８ｂ（ＦＧＦ８ｂ）、ＦＬＫ−１／ＫＤＲ、葉酸受容体、Ｇ２５０、Ｇメラノーマ抗原遺伝子ファミリー（ＧＡＧＥファミリー）、ガストリン１７、ガストリン放出ホルモン、ガングリオシド２（ＧＤ２）／ガングリオシド３（ＧＤ３）／モノシアル酸ガングリオシド２（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ−ｍｏｎｏｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ−２）（ＧＭ２）、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：Ｒ１Ｍａｎ（α１−６）Ｒ２［ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ（α１−６）］β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＧｎＴ  Ｖ）、ＧＰ１、ｇｐ１００／Ｐｍｅ１１７、ＧＰ−１００−ｉｎ４、ｇｐ１５、ｇｐ７５／チロシン関連タンパク質−１（ｇｐ７５／ＴＲＰ−１）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ヘパラナーゼ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ヒト乳房腫瘍ウイルス（ＨＭＴＶ）、７０キロダルトン熱ショックタンパク質（ＨＳＰ７０）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、インスリン様成長因子受容体−１（ＩＧＦＲ−１）、インターロイキン１３受容体（ＩＬ−１３Ｒ）、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＫＳＡ、ＬＫＬＲ−ＦＵＴ、メラノーマ抗原をコードするファミリー（少なくともＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、及びＭＡＧＥ−４を含む、ＭＡＧＥファミリー）、マンマグロビン、ＭＡＰ１７、メランＡ／Ｔ細胞認識メラノーマ抗原１（ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ−１）（ＭＡＲＴ−１）、メソテリン、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＴ−ＭＭＰ、ムチン、精巣特異抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１、オステオネクチン、ｐ１５、ｐ１７０／ＭＤＲ１、ｐ５３、Ｐ９７／メラノトランスフェリン、ＰＡＩ−１、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、μＰＡ、ＰＲＡＭＥ、プロバシン、プロジェニポエチン（ｐｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＲＡＧＥ−１、Ｒｂ、ＲＣＡＳ１、変異Ｒａｓ、ＳＡＲＴ−１、ＳＳＸファ
ミリー、ＳＴＡＴ３、ＳＴｎ、ＴＡＧ−７２、形質転換成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、チモシンβ−１５、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、ＴＰ１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＺＡＧ、ｐ１６ＩＮＫ４、及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、並びにそれらの修飾型（例、ＣＥＡ−６Ｄ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
ウイルスベクターの場合は、ペプチドをコードする核酸、及び任意の他の外生遺伝子（複数可）は、好ましくは、得られる組換えウイルスのウイルス生存率に影響しないベクター（例、ポックスウイルス）中の部位又は領域（挿入領域）に挿入される。かかる領域は、組換えウイルスのウイルス生存率に大きく影響せずに組換え体形成を可能にする領域について、ウイルスＤＮＡのセグメントを試験することによって、容易に同定され得る。
【００６２】
チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子は、容易に用いられ得、多くのウイルスに存在する挿入領域である。特に、ＴＫ遺伝子は、検査された全てのポックスウイルスゲノムにおいて見出されている。更なる好適な挿入部位は、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００５／０４８９５７に記載されている。例えば、鶏痘においては、挿入領域としてはＢａｍＨＩ  Ｊフラグメント、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント、ＢａｍＨＩフラグメント、ＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント、長い固有配列（ＬＵＳ）挿入部位（例、ＦＰＶ００６／ＦＰＶ００７及びＦＰＶ２５４／ＦＰＶ２５５）、ＦＰ１４挿入部位（ＦＰＶ０６０／ＦＰＶ０６１）、及び４３Ｋ挿入部位（ＦＰＶ１０７／ＦＰＶ１０８）が挙げられるが、これらに限定されない。ワクシニアにおいては、挿入部位としては４４／４５、４９／５０、及び１２４／１２５が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
ベクターが、ペプチドをコードする核酸、及び／又は他の外生遺伝子（複数可）（例、１以上の免疫刺激／調節分子をコードする）を含む組換え鶏痘ウイルスの場合、ペプチドをコードする核酸は、１の領域（例、ＦＰ１４領域）に挿入され得、外生遺伝子（複数可）は別の領域（例、ＢａｍＨＩ  Ｊ領域）に挿入され得る。
【００６４】
本発明のベクターは、転写調節エレメント又はエンハンサー等の、好適なプロモーター及び調節エレメントを含み得る。好適なプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、レトロウイルスＬＴＲ、アデノウイルス主要後期プロモーター、ヒトＣＭＶ前初期プロモーター（ｈｕｍａｎ  ＣＭＶ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  Ｉ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、並びにＰｒ７．５Ｋプロモーター、３０Ｋプロモーター、４０Ｋプロモーター、Ｉ３プロモーター、Ｐｒｓプロモーター、ＰｒｓＳｙｎＩＩｍプロモーター、ＰｒＬＥ１プロモーター、合成初期／後期（ｓＥ／Ｌ）プロモーター、ＨＨプロモーター、１１Ｋプロモーター、及びＰｉプロモーター等の各種ポックスウイルスプロモーターが挙げられる。プロモーターは、典型的には構成的プロモーターであるが、誘導性プロモーターも本発明のベクターにおいて利用され得る。かかる誘導可能なシステムは、遺伝子発現の調節を可能にする。
【００６５】
本発明の１つの実施形態においては、（１）ペプチド若しくはポリペプチド、（２）ペプチド又はポリペプチドをコードする核酸分子、及び／又は（３）核酸分子を含むベクター、を含む細胞も、本明細書中に提供される。好適な細胞としては、原核細胞並びに真核細胞、例、哺乳動物細胞、酵母、酵母以外の真菌、及びバクテリア（大腸菌等）が挙げられる。細胞は、研究用又はペプチド若しくはポリペプチドの産生用等に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いられ得、又は細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで用いられ得る。１つの実施形態においては、細胞は、本明細書に記載の酵母ベースの免疫療法組成物の酵母ビヒクル成分を提供するために用いられ得る、酵母細胞である。別の実施形態においては、細胞は、ペプチドパルスされた抗原提示細胞であり得る。好適な抗原提示細胞としては、樹状細胞、Ｂリンパ球、単球、マクロファージなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
１つの実施形態においては、細胞は樹状細胞である。異なる成熟段階の樹状細胞は、細胞表面上の発現マーカーに基づいて単離され得る。例えば、成熟樹状細胞は、提示のために新しいタンパク質を捉えることはあまりできないが、増殖及び分化するために休止Ｔ細胞を刺激することは非常に良好にできる。従って、成熟樹状細胞は重要であり得る。成熟樹状細胞は、形態におけるそれらの変化によって、及び種々のマーカーの存在によって、同定され得る。かかるマーカーとしては、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＤ４０、ＣＤ１１、ＣＤ８３及びＭＨＣクラスＩＩ等の細胞表面マーカーが挙げられるが、これらに限定されない。或いは、成熟は炎症性サイトカインの産生の観察又は測定によって、同定され得る。
【００６７】
樹状細胞は、典型的な細胞蛍光法、並びに蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）等の細胞選別技術及び装置を用い、集められ、解析され得る。成熟段階が異なる樹状細胞の細胞表面抗原に特異的な抗体は、商業的に利用可能である。
【００６８】
１つの実施形態においては、細胞は、酵母（例、サッカロミセス）である。従って、本発明は、（ａ）酵母ビヒクル、及び（ｂ）本発明のＭＵＣ１ペプチド又はポリペプチド（タンパク質）を含む抗原、を含む、酵母ベースの免疫療法組成物（本明細書中、全般的に「酵母免疫療法組成物（ｙｅａｓｔ−ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」、「酵母免疫療法製品（ｙｅａｓｔ−ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｐｒｏｄｕｃｔ）」）、「酵母免疫療法組成物（ｙｅａｓｔ−ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ
ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」、「酵母ベースのワクチン（ｙｅａｓｔ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ）」、又はこれらの語句の派生語でも参照される）も提供する。上述の通り、ＭＵＣ１抗原を含有する酵母ベースの免疫療法組成物は、より具体的に、「酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物」と、又はその派生語で呼ばれ得る。「免疫療法組成物」は、被験体において、少なくとも１の治療効果を達成するのに十分な免疫応答を誘発する組成物である。「酵母ベースの免疫療法組成物」（及びその誘導体）は、酵母ビヒクル成分及び抗原成分を含む組成物を指し、Ｔ細胞性の細胞性免疫応答を含むが、これに限定されない、細胞性免疫応答等の、免疫応答を誘発又は誘導し得る。免疫応答としては、一般的に、自然免疫応答及び獲得免疫応答の両方が挙げられ、酵母成分及び抗原成分の両方に対して生じる（抗原特異的免疫応答）。個体に投与する場合、好ましくは、酵母ベースの免疫療法組成物は、該個体に、少なくとも１の、保護、予防、又は治療上の利益を提供する。１つの態様においては、本発明に有用な酵母ベースの免疫療法組成物は、ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞性免疫応答、１つの態様においては、特に標的抗原に対する（例、癌抗原、好ましくはＭＵＣ１に対する）ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞性免疫応答を誘導できる。ＣＤ４＋免疫応答としては、ＴＨ１免疫応答、ＴＨ２免疫応答、ＴＨ１７免疫応答、又は以上の任意の組合せが挙げられ得る。ＣＤ８＋免疫応答としては、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答が挙げられ得る。１つの態様においては、酵母ベースの免疫療法組成物は、被験体において制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の数及び／又は機能性を調節する。
【００６９】
上記の通り、本発明の酵母ベースの免疫療法組成物は、（ａ）酵母ビヒクル、及び（ｂ）ＭＵＣ１抗原又はその免疫原性ドメインを含む、少なくとも１の癌抗原を含み、ＭＵＣ１抗原は、配列番号１及び／又は配列番号２から選択されるアミノ酸配列を有する、少なくとも１のＭＵＣ１エンハンサーアゴニストエピトープを含むか、それから本質的に成るか、又はそれらから成る。癌抗原は、酵母ビヒクルにより（即ち、組換え的に）発現させられ、酵母ビヒクルへ接着させられ、酵母ビヒクルにロードされ、又は酵母ビヒクルと混合される。
【００７０】
いくつかの実施形態においては、癌抗原、ＭＵＣ１抗原、又はそれらの免疫原性ドメインは、融合タンパク質として提供される。例えば、いくつかのＭＵＣ１タンパク質及び融合タンパク質が、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／０２４９７２号に記載されている。かかる
タンパク質及び融合タンパク質は、本発明のエンハンサーアゴニストエピトープを組み込むように、更に修飾され得る。いくつかの実施形態においては、癌抗原及びＭＵＣ１抗原は同一のエレメントである。いくつかの実施形態においては、癌抗原は、ＭＵＣ１抗原に加えて、他の癌抗原（本明細書中、腫瘍関連抗原又はＴＡＡとも呼ばれる）を含む他の抗原を含む。本発明の１つの態様においては、癌抗原として有用な融合タンパク質は、２以上の抗原、例、ＭＵＣ１抗原及びＭＵＣ１抗原ではない別の癌抗原（ＴＡＡ）又は異なる２のＭＵＣ１抗原、を含み得る。１つの態様においては、融合タンパク質は、ＭＵＣ１抗原の２以上の免疫原性ドメイン等の、１以上の抗原の２以上の免疫原性ドメイン、又はＭＵＣ１抗原の２以上のエピトープ等の、１以上の抗原の２以上のエピトープを含み得る。他の種々の癌抗原又はＴＡＡが当該分野で知られており、本明細書中、他の箇所に記載されている。
【００７１】
本発明の酵母ベースの免疫療法組成物において有用であるＭＵＣ１抗原の例は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むか、又はそれから成る。配列番号１６は、酵母ベースの免疫療法組成物に用いるための、ＭＵＣ１抗原を含む融合タンパク質のアミノ酸配列であり、該ＭＵＣ１抗原は、（ａ）タンパク質内において、配列番号１のエンハンサーアゴニストエピトープを含む、いくつかのアゴニストエピトープを形成するための、１５アミノ酸置換の導入、及び（ｂ）不活性化変異である単一アミノ酸置換、を除いて、野生型ＭＵＣ１タンパク質に一致する、全長ＭＵＣ１アゴニストタンパク質である。配列番号１６は、Ｎ末端からＣ末端へ、以下の順序で以下の配列：（１）配列番号１７のアルファ因子リーダー配列（配列番号１６の１位〜８９位に対応）；（２）クローニングを容易にするための、Ｔｈｒ−Ｓｅｒのリンカー配列（配列番号１６の９０位〜９１位に対応）；（３）上記１５アミノ酸のアゴニスト置換及び１の不活性化置換の導入を除いて、野生型タンパク質に一致する、全長ＭＵＣ１アゴニストタンパク質（配列番号１６の９２位〜５６６位に対応）及び（４）ヘキサペプチドのヒスチジンタグ（配列番号１６の５６７位〜５７２位に対応）、を含む。
【００７２】
配列番号１６は、配列番号１５で表されるヌクレオチド配列（酵母の発現のためにコドン最適化）によりコードされる。（配列番号１６の１位〜８９位に対応する）アルファリーダー配列は、配列番号１９で表されるペプチド等の、プロテアソーム分解に対する抵抗性及び／又は安定化した発現を付与するために設計された異なるＮ末端配列で、又は配列番号１８等の、異なる酵母アルファリーダー配列からのＮ末端ペプチドで、又はＭＵＣ１シグナル配列によって、置換され得る。Ｃ末端のヘキサヒスチジンタグは任意であり、タンパク質の同定及び／又は精製を容易にする。
【００７３】
テンプレートとして用いられる野生型ＭＵＣ１タンパク質と比較して、配列番号１６の配列は、以下：（配列番号１６を参照し、配列番号１４に対応する、受入番号ＮＰ＿００１１９１２１４で表される野生型ＭＵＣ１の置換位置を、括弧内に更に参照して示された置換位置）：Ｔ１８４Ｌ（野生型ＭＵＣ１における９３位）、Ａ２３２Ｙ（野生型ＭＵＣ１における１６１位）、Ｐ２３３Ｌ（野生型ＭＵＣ１における１６２位）、Ｇ２４０Ｖ（野生型ＭＵＣ１における１６９位）、Ｓ２４１Ｙ（野生型ＭＵＣ１における１７０位）、Ｔ２４２Ｌ（野生型ＭＵＣ１における１７１位）、Ａ４８３Ｙ（野生型ＭＵＣ１における３９２位）、Ｃ４９５Ａ（野生型ＭＵＣ１における４０４位）、Ｃ４９７Ｖ（野生型ＭＵＣ１における４０６位）、Ｔ５１３Ｋ（野生型ＭＵＣ１における４２２位）、Ｐ５２１Ａ（野生型ＭＵＣ１における４３０位）、Ｔ５２２Ｌ（野生型ＭＵＣ１における４３１位）、Ｔ５３５Ｌ（野生型ＭＵＣ１における４４４位）、Ｄ５３６Ｆ（野生型ＭＵＣ１における４４５位）、及びＳ５５１Ｙ（野生型ＭＵＣ１における４６０位）、のアミノ酸置換を含有する。置換Ｃ４９５Ａ（野生型ＭＵＣ１タンパク質における４０４位）は不活性化変異であり、置換の残りは、アゴニストエピトープを生成するためである。
【００７４】
配列番号１６は、本明細書中、配列番号１と呼ぶエンハンサーアゴニストペプチドを含む。配列番号１は、配列番号１６の５１３位〜５２２位に位置する。
【００７５】
配列番号１６で表される、酵母ベースの免疫療法のためのＭＵＣ１抗原は、Ａ２、Ａ３及びＡ２４を含むいくつかの異なるＨＬＡ型のアゴニストエピトープを含有し、それが、ＭＵＣ１を発現する癌を有する種々の個体において腫瘍を標的とするための、汎用且つ固有の抗原になっている。
【００７６】
本発明の酵母ベースの免疫療法組成物に有用なＭＵＣ１抗原としては、配列番号１６の９２位〜５６６位（配列番号１６内のＭＵＣ１抗原）が挙げられ得る（しかしそれに限定されない）タンパク質、の１部を形成する、融合タンパク質の全長にわたって、又は配列番号１６の明示された断片（例、免疫学的ドメイン又は機能的ドメイン（少なくとも１の生物学的活性を有するドメイン））にわたって、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する、抗原も挙げられる。
【００７７】
本明細書で例示されたもの以外の配列若しくはソース、及び特に、同一の動物種内の配列若しくはソースから由来するか、又は得られる、ＭＵＣ１タンパク質のいずれかの対応する部分を用いて、本明細書に記載のペプチド、ポリペプチド、及び融合タンパク質と類似又は同一の全体構造を有する、ペプチド、ポリペプチド、及び融合タンパク質を作製することは簡単である。例として、単純な配列アラインメントのツール又は方法を用いて、配列番号１６の９２位〜５６６位に対応する任意のソースからの、所定のヒトＭＵＣ１タンパク質における対応する配列を、容易に同定し得る。従って、本明細書に例示の配列と少数の及び／又は保存的な相違を有する配列は、明確に本発明に包含される。
【００７８】
上述の通り、配列番号１６の融合タンパク質に関して上記したもの等の、Ｎ末端側発現配列及びＣ末端側タグは、任意であるが、発現、安定性を改善するか、若しくは促進するため、並びに／又はタンパク質の同定及び／若しくは精製を可能にするために、いくつかの異なる配列から選択し得る。例えば、酵母細胞における抗原の発現の安定性を増強し、及び／又は酵母におけるタンパク質の翻訳後修飾を妨げる、例示的なＮ末端合成配列としては、（配列番号１９により本明細書に表される）配列Ｍ−Ａ−Ｄ−Ｅ−Ａ−Ｐが挙げられる。他の実施形態においては、ＭＵＣ１抗原は、α因子プレプロ配列（アルファ因子シグナルリーダー配列とも呼ばれ、そのアミノ酸配列は、配列番号１７又は配列番号１８により本明細書に例示される）等の酵母タンパク質に、Ｎ末端で連結される。酵母アルファ因子プレプロ配列のための他の配列は、当該分野で知られており、本発明における使用のために包含される。また、酵母内での使用に好適な多くの異なるプロモーターが、当該分野において知られている。更に、短い介在リンカー配列（例、１、２、３、４、又は５アミノ酸のペプチド）が、クローニングを容易にする制限酵素部位を導入するため、宿主ファゴソームプロテアーゼ用の切断部位として、タンパク質又は抗原のプロセシングを加速するため、及びコンストラクトの将来的操作のため等の、様々な理由で、ＭＵＣ１抗原を含む融合タンパク質の各部分の間に導入され得る。
【００７９】
本発明の、酵母に関する実施形態における使用のために、任意の好適な酵母プロモーターが用いられ得、多様な、かかるプロモーターが当業者に知られている。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現用のプロモーターとしては、以下の酵母タンパク質：アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ＡＤＨ１）又はＩＩ（ＡＤＨ２）、ＣＵＰ１、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、翻訳伸長因子ＥＦ−１α（ＴＥＦ２）、グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ；トリオースリン酸デヒドロゲナー
ゼについては、ＴＤＨ３とも呼ばれる）、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（ＧＡＬ７）、ＵＤＰ−ガラクトースエピメラーゼ（ＧＡＬ１０）、シトクロムｃ１（ＣＹＣ１）、Ｓｅｃ７タンパク質（ＳＥＣ７）及び酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ５）をコードする遺伝子のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されず、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨ及びＣＹＣ１／ＧＡＬ１０プロモーター等のハイブリッドプロモーター、細胞中のグルコース濃度が低い（例、約０．１〜約０．２％）場合に誘導されるＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター、並びにＣＵＰ１プロモーター及びＴＥＦ２プロモーターが挙げられる。同様に、いくつかの上流活性化配列（ＵＡＳ：ｕｐｓｔｒｅａｍ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（エンハンサーとも呼ばれる）が知られている。サッカロミセス・セレビシエにおける発現用の上流活性化配列としては、以下のタンパク質：ＰＣＫ１、ＴＰＩ、ＴＤＨ３、ＣＹＣ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＳＵＣ２、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７及びＧＡＬ１０をコードする遺伝子のＵＡＳ、並びにＧＡＬ４遺伝子産物によって活性化される他のＵＡＳが挙げられるが、これらに限定されず、１つの態様においては、ＡＤＨ２  ＵＡＳが用いられる。ＡＤＨ２  ＵＡＳは、ＡＤＲ１遺伝子産物によって活性化されることから、異種遺伝子がＡＤＨ２  ＵＡＳに作動可能に連結される場合、ＡＤＲ１遺伝子を過剰発現するのが好ましい場合がある。サッカロミセス・セレビシエにおける発現用の転写終結配列としては、α因子、ＧＡＰＤＨ、及びＣＹＣ１遺伝子の終結配列が挙げられる。
【００８０】
メチル栄養の（ｍｅｔｈｙｌｔｒｏｐｈｉｃ）酵母において遺伝子を発現する転写制御配列としては、アルコールオキシダーゼ及びギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の転写制御領域が挙げられる。
【００８１】
本発明によれば、酵母ベースの免疫療法組成物において用いられる「酵母ビヒクル」は、任意の酵母細胞（例、全酵母若しくは無傷細胞）又はその誘導体（以下を参照）であり、本発明の酵母ベースの免疫療法組成物（例、治療又は予防組成物）において、１種以上の抗原、その免疫原性ドメイン若しくはそのエピトープと組合せて用いられ得る。従って、酵母ビヒクルとしては、生きている無傷の（全）酵母微生物（即ち、細胞壁を含む、その成分をすべて有する酵母細胞）、死滅した（死んだ）若しくは不活性化された無傷酵母微生物、酵母スフェロプロスト（即ち、細胞壁を欠く酵母細胞）、酵母サイトプラスト（すなわち、細胞壁及び核を欠く酵母細胞）、酵母ゴースト（すなわち、細胞壁、核、及び細胞質を欠く酵母細胞）、サブセルラーの（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）酵母膜抽出物若しくはその画分（酵母膜粒子とも呼ばれ、以前はサブセルラーの酵母粒子と呼ばれた）、任意の他の酵母粒子、又は酵母細胞壁標品が挙げられる、無傷酵母の誘導体、が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００８２】
酵母スフェロプラストは、典型的に、酵母細胞壁の酵素的消化によって製造される。かかる方法は、例えば、Ｆｒａｎｚｕｓｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４：６６２−６７４（１９９１）に記載されている。酵母サイトプラストは、典型的に、酵母細胞の除核によって製造される。かかる方法は、例えば、Ｃｏｏｎ，Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．Ｍｏｎｏｇｒ．，４８：４５−５５（１９７８）に記載されている。酵母ゴーストは、典型的に、透過処理又は溶解した細胞を再封入することによって製造され、その細胞の細胞小器官の少なくとも一部を含有し得るが、含む必要はない。かかる方法は、例えば、Ｆｒａｎｚｕｓｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８，３６０８−３６１４（１９８３）及びＢｕｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，５５３：１８５−１９６（１９７９）に記載されている。酵母膜粒子（サブセルラーの酵母膜抽出物又はその画分）とは、天然の核又は細胞質が欠失した、酵母の膜を指す。粒子は、任意のサイズであり得、天然酵母膜の大きさから、超音波破砕又は当業者に知られている他の膜破砕方法に続く再封入によって製造される微粒子までの大きさが含まれる。サブセルラーの酵母膜抽出物を製造するための方
法は、例えば、Ｆｒａｎｚｕｓｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，６６２−６７４（１９９１）に記載されている。酵母膜部分を含有する酵母膜粒子の画分、及び、酵母膜粒子の調製前に、抗原又は他のタンパク質を酵母により組換え発現させる場合には、目的の抗原又は他のタンパク質を含有する酵母膜粒子の画分、も用い得る。目的の抗原又は他のタンパク質は、膜の内側、膜のいずれかの表面上、又はそれらの組合せに担持され得る（即ち、タンパク質は、膜の内側及び外側の両方にあり得、及び／又は酵母膜粒子の膜を貫通し得る）。１つの実施形態においては、酵母膜粒子は、組換え酵母膜粒子であり、これは、膜の表面上に、又は少なくとも部分的に膜内に埋め込んで、少なくとも１の所望の抗原若しくは目的とする他のタンパク質を含む、無傷の、破砕された、若しくは破砕され再封入された、酵母膜であり得る。酵母細胞壁標品の例は、該酵母細胞壁標品が、被験体に投与されると、疾患標的に対して所望の免疫応答を刺激するように、その表面上に、又は少なくとも部分的に細胞壁内に埋め込んで、抗原を担持する、単離された酵母細胞壁の標品である。
【００８３】
本発明の酵母ビヒクルを製造するためには、本発明において宿主細胞として用いられるものでなければ、任意の酵母株が用いられ得る。酵母は、３綱：子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）及び不完全菌（Ｆｕｎｇｉ  Ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉ）のうちの１に属する単細胞微生物である。免疫調節成分として用いるための酵母の種類の選択について考慮することの１つは、酵母の病原性である。１つの実施形態においては、酵母は、サッカロミセス・セレビシエ等の非病原性株である。非病原性酵母株の選択は、酵母ビヒクルを投与される個体へのあらゆる有害な作用を最小限にする。しかし、当業者に知られているいずれかの手段（例、変異株）によって、酵母の病原性を無効にし得れば、病原性酵母が用いられ得る。本発明の１つの態様によれば、非病原性酵母株が用いられる。
【００８４】
本発明において用られ得る酵母株の属としては、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）（病原性であり得る）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）が挙げられるが、これらに限定されない。１つの態様においては、酵母属は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）又はシゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から選択され、１つの態様においては、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）が用いられる。本発明において用いられ得る酵母株の種としては、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・ケフィア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｅｆｙｒ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、クリプトコッカス・ラウレンティ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｕｒｅｎｔｉｉ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ハンセヌラ・アノマラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ａｎｏｍａｌａ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・マルキシアヌス・バー・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ
ｍａｒｘｉａｎｕｓ  ｖａｒ．ｌａｃｔｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ロドトルラ・ルブラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｒｕｂｒａ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、及びヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が挙げられ
るが、これらに限定されない。これら種の多くが、様々な亜種、タイプ、サブタイプなどを含み、これらが、前述した種内に含まれることが意図されることは、理解すべきである。１つの態様においては、本発明において用いられる酵母種としては、Ｓ．セレビシエ、Ｃ．アルビカンス、Ｈ．ポリモルファ、Ｐ．パストリス及びＳ．ポンべが挙げられる。Ｓ．セレビシエは、操作するのが比較的容易であり、食品添加物としての使用に「一般に安全と認められる（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  Ａｓ  Ｓａｆｅ）」又は「ＧＲＡＳ」（ＧＲＡＳ、食品医薬品局による提案規定（ＦＤＡ  ｐｒｏｐｓｅｄ  Ｒｕｌｅ）６２ＦＲ１８９３８、１９９７年４月１７日）であることから、有用である。本発明の１つの実施形態は、例えば、Ｓ．セレビシエ  ｃｉｒ°株等の、プラスミドを特に高いコピー数に複製することができる酵母株である。該Ｓ．セレビシエ株は、そのような、１以上の標的抗原（複数可）及び／又は抗原融合タンパク質（複数可）及び／又は他のタンパク質を高レベルで発現させることを可能にする発現ベクターを担持できる株の１つである。本発明で有用な、別の酵母株は、サッカロミセス・セレビシエ  Ｗ３０３αである。更に、Ｎ結合グリコシル化を伸長させる酵素の変異等の、発現した標的抗原又は他のタンパク質の翻訳後修飾低減を示すものを含む、任意の変異酵母株が本発明において用いられ得る。本発明の１つの態様においては、酵母ベースの免疫療法組成物は、野生型株（正常なグリコシル化を有する）により作製される同一の抗原と比較して、低グリコシル化されたタンパク質としてＭＵＣ１抗原を産生する変異酵母株を用いて、作製される。かかるＭＵＣ１抗原は、腫瘍細胞が発現するＭＵ１抗原により類似する可能性があり、次いで、抗原提示細胞によって、固有のＴ細胞エピトープにプロセシングされ得るので、特定の抗腫瘍反応を増強する。
【００８５】
一般に、酵母ビヒクル並びに抗原（複数可）及び／又は他の物質は、本明細書に記載のいずれの技術によっても結合され得る。１つの態様においては、酵母ビヒクルに、組成物中に含められる、抗原（複数可）及び／又は他の、若しくは更なる、物質（複数可）が細胞内ロードされる。別の態様においては、抗原（複数可）及び／又は物質（複数可）が、酵母ビヒクルと共有又は非共有結合される。なお別の態様においては、酵母ビヒクル並びに抗原（複数可）及び／又は物質（複数可）が、混合によって結合される。別の態様においては、抗原（複数可）及び／又は物質（複数可）は、組換えにより、酵母ビヒクルに、又は酵母ビヒクルが誘導される酵母細胞若しくは酵母スフェロプラストに、発現する（酵母ビヒクルが無傷の全細胞又はスフェロプラスト以外の場合）。
【００８６】
１つの実施形態においては、酵母ビヒクルを調製するのに用いられる酵母細胞は、ペプチド又はポリペプチドが酵母細胞に発現するように、ペプチド又はポリペプチド（例、抗原）をコードする異種核酸分子でトランスフェクトされる。かかる酵母は、本明細書において、組換え酵母又は組換え酵母ビヒクルとも呼ばれる。次いで、酵母細胞は、医薬的に許容可能な賦形剤で製剤化されて個体に直接投与され、個体への後の投与のために貯蔵され、又は樹状細胞にロードされ得、その後、今度は個体に投与され得る。酵母細胞はまた、死滅させられ得、或いは、酵母スフェロプラスト、サイトプラスト、ゴースト、又はサブセルラーの粒子の形成等により、誘導体化され得、これらのいずれかに続いて、細胞又は誘導体は、貯蔵されるか、個体に直接投与されるか、又は、樹状細胞にロードされ得る。酵母スフェロプラストはまた、抗原を発現する組換えスフェロプラストを作製するために、組換え核酸分子で直接トランスフェクトされ得る（例、スフェロプラストが全酵母から製造され、次いでトランスフェクトされる）。酵母サイトプラスト、酵母ゴースト、又は酵母膜粒子若しくは酵母細胞壁粒子、或いはこれらの画分を含む酵母ビヒクルを作製するために、抗原（複数可）を組換えにより発現する酵母細胞又は酵母スフェロプラストが用いられ得る。
【００８７】
本発明の酵母ビヒクルによって製造される抗原及び／又は他のタンパク質の数は、酵母ビヒクルが妥当に産生し得る、抗原及び／又は他のタンパク質の任意の数であり、典型的
には、少なくとも１から少なくとも約６又はそれ以上の範囲であり、約２〜約６の抗原及び／又は他のタンパク質を含む。
【００８８】
本発明の酵母ビヒクルにおける抗原又は他のタンパク質の発現は、当業者に知られている技術を用いて達成される。簡潔に述べると、宿主酵母細胞に形質転換された場合に、核酸分子の構成的又は調節された発現のいずれかをもたらし得るようにするために、少なくとも１の所望の抗原又は他のタンパク質をコードする核酸分子が、該核酸分子が転写制御配列と作動可能に連結される態様で、発現ベクターに挿入される。１以上の抗原及び／又は他のタンパク質をコードする核酸分子は、１以上の発現ベクター中で、１以上の発現制御配列と作動可能に連結され得る。特に重要な発現制御配列は、プロモーター及び上流活性化配列等の、転写開始を制御するものである。酵母における使用に好適なプロモーターが上記されている。
【００８９】
本発明による、細胞（例、酵母細胞）への核酸分子のトランスフェクションは、核酸分子が細胞に導入され得るいずれかの方法によって達成され得、拡散、能動輸送、浴中超音波破砕（ｂａｔｈ  ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、及び原形質体融合が挙げられるが、これらに限定されない。トランスフェクトされた核酸分子は、当業者に知られている技術を用いて、酵母染色体に組み込まれ得るか、又は染色体外ベクター上で維持され得る。かかる核酸分子を担持する酵母ビヒクルの例は、本明細書に詳しく開示されている。上述した通り、酵母サイトプラスト、酵母ゴースト、並びに酵母膜粒子若しくは細胞壁標品は、無傷の酵母微生物又は酵母スフェロプラストを所望の核酸分子でトランスフェクトし、そこに抗原を産生させ、次いで所望の抗原又は他のタンパク質を含有するサイトプラスト、ゴースト若しくはサブセルラーの酵母膜抽出物又はこれらの画分を製造するのに当業者に知られている技術を用い、微生物又はスフェロプラストを更に操作することによって、組換えによっても製造され得る。
【００９０】
組換え酵母ビヒクルの製造並びに酵母ビヒクルによる抗原及び／又は他のタンパク質の発現のために効果的な条件としては、酵母株を培養し得る有効培地が挙げられる。有効培地は、典型的に、同化可能な炭水化物、窒素及びリン酸供給源、並びに適切な塩、ミネラル類、金属及びビタミンや増殖因子等のその他の栄養素を含む水性培地である。培地は、複合栄養素を含み得るか、又は規定最少培地であり得る。本発明の酵母株は、バイオリアクター、三角フラスコ（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ  ｆｌａｓｋ）、試験管、マイクロタイターディッシュ、及びペトリプレートが挙げられるが、これらに限定されない、様々な容器中で培養され得る。培養は、酵母株に適切な温度、ｐＨ及び酸素濃度で行われる。かかる培養条件は、十分に、当業者の技術の範囲内である（例えば、Ｇｕｔｈｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１９４，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９１）参照）。例えば、１つのプロトコルによれば、酵母ベースのＭＵＣ１免疫療法組成物の、スタータープレート及び／又はスターター培養物から得られた培養物を用いて、好適な培地を含有する液体培養物が接種され得、２５０ｒｐｍで撹拌しながら、３０℃で約２０時間増殖させられる。次いで、必要に応じて、初代培養物はより大きな培養物に増幅され得る。酵母を形質転換するのに用いたベクターからのタンパク質発現（例、ＭＵＣ１発現）は、利用したプロモーターが構成プロモーターの場合、構成性となり得、又は利用したプロモーターが、誘導性プロモーターの場合、プロモーターに適した誘導条件（例、ＣＵＰ１プロモーターの場合には、硫酸銅）の追加により、誘導され得る。誘導性プロモーターの場合には、タンパク質発現の誘導は、培養物を好適な細胞密度（約０．２ＹＵ／ｍｌ又はそれ以上であり得る）まで増殖させた後、開始され得る。
【００９１】
本発明の酵母ベースの免疫療法組成物の培養に好適な培地の非限定的な例の１つが、Ｕ
２培地である。Ｕ２培地は、以下の成分：１５ｇ／Ｌのグルコース、６．７ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム含有酵母窒素原基礎培地、並びに各々０．０４ｍｇ／ｍＬのヒスチジン、トリプトファン、及びアデニン、及び０．０６ｍｇ／ｍＬのロイシン、を含む。本発明の酵母ベースの免疫療法組成物の培養に好適な培地の別の非限定的な例は、ＵＬ２培地である。ＵＬ２培地は、以下の成分：１５ｇ／Ｌのグルコース、６．７ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム含有酵母窒素原基礎培地、並びに各々０．０４ｍｇ／ｍＬのヒスチジン、トリプトファン、及びアデニンを含む。
【００９２】
本発明のいくつかの実施形態においては、酵母は、中性ｐＨ条件下で増殖させられる（時に、「ＤＥＣ」又は「Ｄｅｃ」条件とも呼ばれる）。本明細書で用いる場合、用語「中性ｐＨ」の一般的な使用は、ｐＨ約５．５〜ｐＨ約８、１つの態様においては、ｐＨ約６〜ｐＨ約８のｐＨ範囲を指す。ｐＨメータで測定する場合、微細な変動（例、１／１０又は１／１００）が起こりうることは、当業者に理解されよう。このように、酵母細胞を増殖させるための中性ｐＨの使用とは、これら酵母細胞を、培養中の時間の大半の間、中性ｐＨで増殖させることを意味する。１つの実施形態においては、酵母が、少なくとも５．５のｐＨレベルに維持した培地（即ち、培養培地のｐＨを、ｐＨ５．５を下回らせない）中で増殖させられる。別の態様においては、酵母が、約６、６．５、７、７．５、又は８に維持したｐＨレベルで増殖させられる。１つの態様においては、好適な緩衝液を使用し、緩衝化された培養物又は増殖培地を作製することによって、中性ｐＨが維持される。酵母の培養における中性ｐＨの使用は、酵母を、免疫調節用のビヒクルとして用いることにとって、望ましい特性であるいくつかの生物学的効果を促進する。例えば、酵母を中性ｐＨで培養することは、細胞産生時間に対して負の作用（例、倍加時間の減速）なく、酵母の良好な増殖を可能にする。酵母は、その細胞壁柔軟性を失うことなく、高密度にまで増殖し続け得る。中性ｐＨの使用は、すべての回収密度で、柔軟な細胞壁を有する酵母及び／又は細胞壁消化酵素（例、グルカナーゼ）に対してより感受性のある酵母の製造を可能にする。柔軟な細胞壁を有する酵母は、より酸性の条件下で増殖させた酵母と比較して、例えば、酵母を貪食した抗原提示細胞によるサイトカイン（例、ＩＦＮ−γ、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、及びＩＬ−２が挙げられるが、これらに限定されないＴＨ１型サイトカイン、並びにＩＬ−６等の炎症性サイトカイン）の分泌を促進することにより、異なる又は改善された免疫応答を誘導し得るため、この特性は望ましい。更に、かかる培養方法により、細胞壁内に位置する抗原との高い接触性がもたらされる。別の態様においては、いくつかの抗原についての中性ｐＨの使用は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）での処理により、ジスルフィド結合する抗原の放出を可能にするが、これは、かかる、抗原を発現する酵母をより低いｐＨ（例、ｐＨ５）で、培地中で培養した場合、不可能である。本発明において用いるための酵母を培養するための、中性ｐＨ条件の使用の非限定的な一例においては、上記のＵＬ２培地は、例えば、４．２ｇ／Ｌのビス−トリス（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）を用いて緩衝化される。
【００９３】
１つの実施形態では、特に表面上での、酵母による抗原の発現を制御するために、酵母グリコシル化の量の制御が用いられる。酵母グリコシル化の量は、糖部分が嵩高になりやすいため、抗原、特に、表面上に発現した抗原の免疫原性及び抗原性に影響を与え得る。このように、本発明による酵母の調節においては、酵母表面上の糖部分の存在、及びその、標的抗原（複数可）周辺の３次元空間への影響が考慮されるべきである。酵母のグリコシル化の量を低下又は上昇させるために、任意の方法が、所望により用いられ得る。例えば、グリコシル化を低下させるように選択された酵母変異株（例、ｍｎｎｌ、ｏｃｈ１及びｍｎｎ９変異体）を用い得、又は、変異により、標的抗原上のグリコシル化アクセプター配列を排除し得る。或いは、短縮グリコシル化パターンを有する酵母、例、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）を用い得る。また、グリコシル化を低下させるか、又は改変する方法を用いて、酵母を処理し得る。
【００９４】
本発明の１つの実施形態においては、酵母ビヒクルでの組換えによる抗原の発現に代わるものとして、ポリペプチド（タンパク質）若しくはペプチド、並びに／或いは本発明による抗原として作用する、及び／又は免疫調節剤若しくは生物学的反応修飾剤として有用な、他の分子を、酵母ビヒクルに細胞内ロードする。その後、既に細胞内に抗原及び／又は他のタンパク質を含有する酵母ビヒクルを、個体に投与し得、又は、樹状細胞等の担体にロードし得、それが今度は個体に投与される。ペプチド及びタンパク質は、拡散、能動輸送、リポソーム融合、エレクトロポレーション、食作用、凍結融解サイクル及び浴中超音波破砕等、当業者に知られている技術によって、本発明の酵母ビヒクルに直接挿入し得る。ペプチド、タンパク質、炭水化物、又は他の分子を直接ロードし得る酵母ビヒクルとしては、無傷酵母、及びスフェロプラスト、ゴースト若しくはサイトプラストが挙げられ、これらは、製造後、抗原及び他の物質をロードされ得る。或いは、無傷酵母は、抗原及び／又は物質をロードされ得、次いで、これらから、スフェロプラスト、ゴースト、サイトプラスト、又はサブセルラーの粒子が調製され得る。この実施形態においては、任意の数の抗原及び／又は他の物質、例えば、微生物又はその部分のローディングによって提供される等で、少なくとも１、２、３、４、又は最大数百若しくは最大数千の全整数の抗原及び／又は他の物質が、酵母ビヒクルにロードされ得る。
【００９５】
本発明の別の実施形態においては、抗原及び／又は他の物質が酵母ビヒクルに物理的に結合される。酵母ビヒクルへの抗原及び／又は他の物質の物理的結合は、当該分野において好適な、（抗体若しくは他の結合相手を用いることによる等で、酵母ビヒクルの外側表面への抗原及び／又は他の物質の化学的架橋、又は酵母ビヒクルの外側表面への抗原及び／又は他の物質の生物学的連結が挙げられるが、これらに限定されない共有及び非共有結合方法が挙げられる、任意の方法によって達成され得る。化学的架橋は、例えばグルタルアルデヒド結合、光親和性標識、カルボジイミドによる処理、ジスルフィド結合の連結が可能な化学物質による処理、並びに当該分野で標準的な他の架橋化学物質による処理を含む方法によって達成され得る。或いは、酵母の外側表面が、特定の電荷特性を有する抗原及び／又は他の物質とより融合若しくは結合しそうになるように、酵母膜の脂質二層の電荷又は細胞壁の組成を改変する化学物質が、酵母ビヒクルと接触させられ得る。抗体、結合ペプチド、可溶性受容体、及び他のリガンド等の標的化物質も、融合タンパク質として抗原に組み込まれ得るか、そうでなければ、抗原と酵母ビヒクルとの結合のために抗原に結合され得る。
【００９６】
抗原又は他のタンパク質が、酵母の表面上に発現するか、又は物理的に結合する場合、１つの態様においては、表面上の抗原若しくは他のタンパク質の発現又は含量を最適化するように、スペーサアームが、慎重に選択され得る。スペーサアーム（複数可）のサイズは、どの程度の抗原又は他のタンパク質を、酵母の表面上での結合のために露出させるかに影響を及ぼし得る。従って、どの抗原（複数可）又は他のタンパク質（複数可）が用いられているかに応じて、当業者は、酵母表面上の抗原又は他のタンパク質の適切なスペーシングを達成するスペーサアームを選択する。１つの実施形態においては、スペーサアームは、少なくとも４５０アミノ酸の酵母タンパク質である。スペーサアームは、詳細に上記されている。
【００９７】
なお別の実施形態においては、酵母ビヒクル及び抗原又は他のタンパク質が、緩衝液又は他の好適な製剤（例、混合物）中で、酵母ビヒクル及び抗原又は他のタンパク質を穏やかに混合すること等の、より受動的、非特異的若しくは非共有結合的な機構によって、互いに結合させられる。
【００９８】
１つの実施形態においては、酵母細胞壁標品、酵母膜粒子若しくは酵母断片（即ち、無傷ではない）を製造するような様式で、（異種抗原又は他のタンパク質の発現を伴うか、又は伴わないで）無傷酵母が、粉砕又は処理され得、いくつかの実施形態においては、酵
母断片が、免疫応答を増強するための抗原（例、ＤＮＡワクチン、タンパク質サブユニットワクチン、死滅若しくは不活性化病原体、ウイルスベクターワクチン）を含む他の組成物と共に、提供若しくは投与され得る。酵母を、アジュバントとして用いる小片に粉砕するために、例えば、酵素処理、化学的処理又は物理的な力（例、機械的せん断若しくは超音波破砕）が用いられ得る。
【００９９】
本発明の１つの実施形態においては、本発明において有用な酵母ビヒクルとしては、死滅又は不活性化した酵母ビヒクルが挙げられる。酵母の死滅又は不活性化は、当該分野で知られる、種々の好適な方法のいずれかを用いて達成され得る。例えば、酵母の熱不活性化は、酵母不活性化の標準的方法であり、当業者は、所望により、当該分野で知られる標準的方法によって、標的抗原の構造変化をモニターし得る。或いは、化学的、電気的、放射性若しくはＵＶの方法等の、酵母を不活性化する他の方法が用いられ得る。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．１９４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９９０）等の標準的な酵母培養の教科書に開示されている方法を参照のこと。用いられる不活性化戦略は、いずれも、標的抗原の二次、三次、若しくは四次構造を考慮に入れて、その免疫原性を最適化するような構造を保存すべきである。
【０１００】
酵母ビヒクルは、当業者に知られている多くの方法を用いて、本発明の酵母ベースの免疫療法組成物又は製品に製剤化され得る。例えば、酵母ビヒクルは凍結乾燥により乾燥させられ得る。酵母ビヒクルを含む製剤は、ベーキング又は醸造処理に用いられる酵母についてなされるような、ケーキ若しくは錠剤に酵母を充填することによっても調製され得る。更に、酵母ビヒクルは、宿主若しくは宿主細胞に許容される等張緩衝液等の、医薬的に許容可能な賦形剤と混合され得る。かかる賦形剤の例としては、水、生理食塩水、リンゲル液（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、デキストロース溶液、ハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、及び他の水性生理的平衡食塩水が挙げられる。不揮発性油、ゴマ油、オレイン酸エチル、又はトリグリセリドなどの非水性ビヒクルも用いられ得る。他の有用な製剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、グリセロール又はデキストランなどの増粘剤を含有する懸濁液が挙げられる。賦形剤は、等張性及び化学的安定性を増強する物質等の添加剤も少量含有し得る。緩衝液の例としては、リン酸緩衝液、重炭酸緩衝液及びトリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液が挙げられ、保存剤の例としては、チメロサール、ｍ−又はｏ−クレゾール、ホルマリン及びベンジルアルコールが挙げられる。標準的製剤は、注射液、又は注射用の懸濁液若しくは溶液として好適な液体に溶解させ得る固体のいずれかであり得る。従って、非液体製剤において、賦形剤は、例えば、デキストロース、ヒト血清アルブミン、及び／又は保存剤を含み得、投与前に、これらに滅菌水又は生理食塩水が加えられ得る。
【０１０１】
ペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター又は細胞は単離され得る。用語「単離された」は、本明細書で用いられる場合、生物学的環境（例、細胞、組織、培養培地、体液など）から取り出された又は任意の程度に純度を上げられた（例、合成培地から単離された）、化合物又は組成物を包含する。単離された化合物及び組成物は、従って、合成され、又は天然で産生され得る。
【０１０２】
ペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター又は細胞は、ペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター又は細胞と、担体（例、医薬的又は生理学的に許容可能な担体）とを含む組成物（例、医薬組成物）として製剤化され得る。更に、本発明のペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞又は組成物は、本明細書に記載の方法において、単独で又は医薬製剤の一部として用いられ得る。
【０１０３】
組成物（例、医薬組成物）は、１を超える本発明のペプチド、ポリペプチド、核酸、ベ
クター、若しくは細胞又は組成物を含み得る。本発明のベクター及び組成物は、他の任意の薬剤若しくは組成物又は癌の予防又は治療に有用なプロトコール或いは癌、及び特にＭＵＣ１発現又は過剰発現と関連する癌、の任意の症状を治療又は改善する任意の化合物を更に含み得るか、又はそれらと共に（同時に、逐次的に又は断続的に）投与され得る。例えば、組成物は１以上の他の医薬活性剤又は薬物を含み得る。医薬組成物における使用に好適であり得る、かかる他の医薬活性薬剤又は薬物の例としては、抗癌剤（例、化学療法剤又は放射線療法剤）、代謝拮抗薬、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、シクロフォスファミド、及びそれらの組み合わせが挙げられる。好適な抗癌剤としては、アルキル化剤、葉酸アンタゴニスト、プリンアンタゴニスト、ピリミジンアンタゴニスト、紡錘体毒、トポイソメラーゼ阻害剤、アポトーシス誘導剤、血管新生抑制剤、ポドフィロトキシン、ニトロソウレア、シスプラチン、カルボプラチン、インターフェロン、アスパラギナーゼ、タモキシフェン、ロイプロリド、フルタミド、メゲストロール、マイトマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イリノテカン、タキソール、ゲルダナマイシン（例、１７−ＡＡＧ）、及び当該分野で知られる種々の抗癌ペプチド並びに抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
典型的なアルキル化剤としては、ナイトロジェンマスタード（例、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、ウラシルマスタード、又はクロラムブシル）、アルキルスルホネート（例、ブスルファン）、ニトロソウレア（例、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、又はダカルバジン）が挙げられるが、これらに限定されない。典型的な代謝拮抗剤としては、葉酸類似体（例、メトトレキサート）、ピリミジン類似体（例、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）又はシタラビン）、及びプリン類似体（例、メルカプトプリン又はチオグアニン）が挙げられるが、これらに限定されない。典型的なホルモン及びホルモンアンタゴニストとしては、副腎皮質ステロイド（例、プレドニゾン）、プロゲスチン（例、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、及び酢酸メゲストロール（ｍａｇｅｓｔｒｏｌ））、エストロゲン（例、ジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオール）、抗エストロゲン（例、タモキシフェン）、及びアンドロゲン（例、テストステロンプロプリオネート（ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ  ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ）及びフルオキシメステロン）が挙げられるが、これらに限定されない。他の例示的な薬剤としては、ビンカアルカロイド（例、ビンブラスチン、ビンクリスチン、又はビンデシン）、エピポドフィロトキシン（例、エトポシド又はテニポシド）、抗生物質（例、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、又はマイトマイシン（ｍｉｔｏｃｙｃｉｎ）Ｃ）、酵素（例、Ｌ−アスパラギナーゼ）、白金配位錯体（例、シスプラチンとしても知られるシス−ジアミンジクロロ白金ＩＩ）、置換尿素（例、ヒドロキシ尿素）、メチルヒドラジン誘導体（例、プロカルバジン）、及び副腎皮質抑制剤（例、ミトタン及びアミノグルテチミド）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０５】
同時に、逐次的に又は断続的に、本明細書に開示されたベクター及び組成物と共に投与し得る化学療法剤としては、アドリアマイシン、アルケラン、アラＣ、ブスルファン、ＣＣＮＵ、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎｕｍ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、サイトキサン、ダウノルビシン、ＤＴＩＣ、５−ＦＵ、フルダラビン、ハイドレア、イダルビシン、イホスファミド、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、タキソール（又は、ドセタキセル等の他のタキサン）、ベルバン、ビンクリスチン、ＶＰ−１６、ゲムシタビン（ジェムザール）、ハーセプチン、イリノテカン（カンプトサール、ＣＰＴ−１１）、ロイスタチン、ナベルビン、リツキサンＳＴＩ−５７１、タキソテール、トポテカン（ハイカムチン）、ゼローダ（カペシタビン）、ゼベリン、エンザルタミド（ＭＤＶ−３１００又はＸＴＡＮＤＩ（商標））、及びカルシトリオールが挙げられる。典型的な免疫調節剤及び／又はサイトカインとしては、ＡＳ−１０１（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ  Ｌａｂｓ．）、
ブロピリミン（Ｕｐｊｏｈｎ）、ガンマインターフェロン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球単球コロニー刺激因子；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＩＬ−２（Ｃｅｔｕｓ又はＨｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）、ヒト免疫グロブリン（Ｃｕｔｔｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＩＭＲＥＧ（Ｉｍｒｅｇ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ，Ｌａ．から）、ＳＫ＆Ｆ  １０６５２８、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、及びＴＮＦ−βが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０６】
本発明のペプチド、ポリペプチド（タンパク質）、核酸、ベクター、細胞、及び組成物と組み合わせる、癌の治療に有用な他の薬剤、組成物又はプロトコル（例、治療プロトコル）としては、腫瘍の外科的切除、放射線療法、同種若しくは自己の幹細胞移植、Ｔ細胞養子移入、及び／又は標的型癌療法（例、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、アロマターゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、レチノイド受容体活性化物質、アポトーシス刺激剤、血管新生阻害剤、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤、若しくは免疫刺激剤が挙げられるが、これらに限定されない、腫瘍の成長及び進行に関与する分子を特異的に標的とする小分子薬、生物製剤、又は、モノクローナル抗体療法）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
更なる活性薬剤（例、化学療法剤）が、本明細書に開示のベクター及び組成物の投与前、投与と同時に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）（同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）を含む）、投与と交互に、順次、又は投与後に、投与され得る。特定の実施形態においては、１以上（例、２、３、４、又は５）の化学療法剤が、本明細書に開示のベクター及び組成物と組み合わせて投与される。例えば、化学療法又は標的癌療法と組み合わせて個体に与えられる場合には、免疫療法組成物の有効性を最大にするために、化学療法又は標的癌療法の投与間の「休日」中に、酵母ベースの免疫療法組成物を投与することが望ましい場合がある。腫瘍の外科的切除は、しばしば、酵母ベースの免疫療法組成物の投与に先行し得るが、更なる、又は最も重要な手術は、酵母ベースの免疫療法組成物の投与の間又は投与後に行い得る。
【０１０８】
更なる活性薬剤は、単独で、又は組成物中で投与され得る。更なる活性薬剤は、ベクター（例、プラスミド又はウイルスベクター）、リポソーム（ＳＴＩＭＵＶＡＸ（商標）、Ｌ−ＢＬＰ２５、又はＢＬＰ２５リポソームワクチンとしても知られるテセモチド（ｔｅｃｅｍｏｔｉｄｅ））、又はナノ粒子（例、ＶＥＲＳＡＭＵＮＥ（商標）ナノテクノロジー）中に含めることにより、製剤化され得る。
【０１０９】
担体は、従来用いられるもののいずれかであり得、溶解度、及び活性化合物（複数可）との反応性の欠如など、生理化学的な考慮点によって、及び投与経路によってのみ限定される。本明細書に記載の医薬上許容可能な担体、例えば、ビヒクル、アジュバント、賦形剤、及び希釈剤は、当業者に周知であり、容易に公衆に利用可能である。医薬上許容可能な担体は、活性薬剤（複数可）に対し化学的に不活性であるもの、及び使用条件下、有害な副作用又は毒性を有さないものであることが好ましい。
【０１１０】
担体の選択は、本発明の特定のペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物、及び使用される他の活性薬剤又は薬物、並びにペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物を投与するために用いられる特定の方法によって、ある程度決定される。
【０１１１】
組成物は、更に又は代わりに、１以上の免疫刺激／調節分子を含み得る。インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａ、ＩＬ−１５／ＩＬ−Ｒａ−Ｆｃ、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、腫瘍壊死
因子（ＴＮＦ）−α、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−２、ＬＦＡ−３、ＣＤ７０、ＣＤ７２、ＲＡＮＴＥＳ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＯＸ−４０Ｌ、４１ＢＢＬ、抗ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ阻害剤、抗ＰＤＬ１、抗ＰＤ１、及びそれらの組み合わせ等の、任意の好適な免疫刺激／調節分子が用いられ得る。好ましくは、組成物は、Ｂ７．１、ＩＣＡＭ−１、及びＬＦＡ−３の組み合わせ（ＴＲＩＣＯＭとも呼ばれる）を含む。１以上の免疫刺激／調節分子が、１以上の免疫刺激／調節分子をコードする核酸を含むベクター（例、ポックスウイルスベクター等の組換えウイルスベクター）の形態で投与され得る。例えば、１以上の免疫刺激／調節分子（例、ＩＬ−１２）が、ＤＮＡプラスミドの形態で、キトサンあり又はなしで投与され得る。或いは、１以上の免疫刺激／調節分子が、キトサンと混合されたタンパク質（例、組換えＩＬ−１２）等、タンパク質（例、組換えタンパク質）として投与され得る。１以上の免疫刺激／調節分子は、また、本発明の酵母ベースの免疫療法組成物と組合わせて、又は同時に投与され得る。
【０１１２】
本発明の１つの実施形態においては、組成物は、本発明のペプチド又はポリペプチド（タンパク質）をコードする核酸を含む第一の組換えベクター、並びにＢ７．１、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−３をコードする核酸を含む第二の組換えベクターを含む。別の実施形態においては、本発明のペプチド又はポリペプチド（タンパク質）をコードする核酸、並びにＢ７．１、ＩＣＡＭ−１、及びＬＦＡ−３をコードする核酸は、同一の組換えベクター中にある。第一及び／又は第二のベクターは、別の腫瘍関連抗原（例、ＣＥＡ）、それらの修飾型（例、ＣＥＡ−６Ｄ）、又はそれらのエピトープをコードする核酸を、更に含み得る。
【０１１３】
例えば、組換えベクターは、本発明のペプチドをコードする核酸並びにＢ７−１ポリペプチド、ＩＣＡＭ−１ポリペプチド及びＬＦＡ−３ポリペプチドをコードする核酸を含む、アビポックスベクター（例、カナリア痘ウイルス又は鶏痘ウイルス）であり得る。或いは、組換えベクターは、本発明のペプチドをコードする核酸並びにＢ７−１ポリペプチド、ＩＣＡＭ−１ポリペプチド、及びＬＦＡ−３ポリペプチドをコードする核酸を含む、オルソポックスウイルスであり得る。
【０１１４】
本発明の別の実施形態においては、組成物は、本明細書に記載の酵母ベースの免疫療法組成物を含み、該酵母ベースの免疫療法組成物は、酵母ビヒクル並びに、本発明のペプチド又はポリペプチドを含む、少なくとも１の抗原を含む。
【０１１５】
本発明は、ペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物及び必要に応じて、例えば、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−３等の免疫刺激／調節分子で、樹状細胞に形質導入する方法を提供する。本発明の１つの態様においては、ペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物で形質導入された樹状細胞が、宿主に投与され、細胞傷害性Ｔ細胞応答の活性化等の、免疫応答を生じる。
【０１１６】
本発明は、ＭＵＣ−１を発現する癌に罹患しているか、又は罹患しやすい被験体を治療する方法、及び／又はＭＵＣ−１を発現する癌に対する免疫応答を増強する方法、及び／又はＭＵＣ−１を発現する癌を阻害する方法を提供する。第１の実施形態においては、本発明の方法は、被験体に、治療有効量の１以上のペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物を投与することを含む。本発明のペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、特に、他の個体よりも、かかる癌を発症するリスクが高い個体において、ＭＵＣ１を発現する癌の発症を予防するため、又はＭＵＣ１を発現する癌に罹患した患者を治療するために用いられ得る。本発明のペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、かかる癌の出現を予防し、かかる癌の進行を阻止し、又はかかる癌を除去するのに有用である。より具体的には、
本発明のペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、ＭＵＣ１を発現する腫瘍の発症を予防し、阻害し、若しくは遅延させるため、並びに／又は腫瘍の移動及び／若しくは他の組織への腫瘍の浸潤（転移）を予防し、阻害し、若しくは遅延させるため、並びに／又は、個体における癌の進行を一般的に予防し若しくは阻害するために用いられ得る。本発明のペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、個体における全身腫瘍組織量を減少させること；個体における腫瘍の成長を阻害すること；個体の生存を増加させること；及び／又は個体における癌の進行を予防する、阻害する、反転させる、若しくは遅延させることによる等で、癌の少なくとも１の症状を改善するためにも用いられ得る。本発明のペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、ＭＵＣ１を発現する癌の任意の段階で、被験体を治療するために用いられ得る。
【０１１７】
第２の実施形態においては、本発明の方法は、被験体から樹状細胞（単離することによって）を得ること、樹状細胞を、治療有効量のペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物の１以上で処理すること、及び処理された樹状細胞を被験体に投与することを含む。
【０１１８】
第３の実施形態においては、本発明の方法は、（ａ）被験体から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得る（単離する）こと、（ｂ）ＰＢＭＣから樹状細胞を単離すること、（ｃ）治療有効量のペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物の１以上により、樹状細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで処理すること、（ｄ）処理した樹状細胞により、ＰＢＭＣをｅｘ  ｖｉｖｏで活性化すること、及び（ｅ）活性化されたＰＭＢＣを被験体に投与すること、を含む。
【０１１９】
第４の実施形態においては、本発明の方法は、（ａ）被験体からＰＢＭＣを得る（単離する）こと、（ｂ）ＰＢＭＣから樹状細胞を単離すること、（ｃ）治療有効量のペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物の１以上により、樹状細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで処理すること、（ｄ）処理した樹状細胞により、ＰＢＭＣをｅｘ  ｖｉｖｏで活性化すること、（ｅ）活性化したＰＢＭＣからＴリンパ球をｅｘ  ｖｉｖｏで単離すること、及び（ｆ）単離されたＴリンパ球を被験体に投与すること、を含む、被験体においてＭＵＣ１を発現する癌を阻害するための方法を含む。
【０１２０】
本発明はまた、被験体においてＭＵＣ１を発現する癌を阻害するために、治療有効量のペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物の１以上により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激した養子移入Ｔ細胞の使用を提供する。
【０１２１】
治療（例、ＭＵＣを発現する癌を阻害すること及び／又はＭＵＣ１を発現する癌に対する免疫応答を増強すること）は、腫瘍細胞を破壊すること、全身腫瘍組織量を減少させること、腫瘍の成長を阻害すること、原発性腫瘍のサイズを縮小させること、転移性病変（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｌｅｇｉｏｎｓ）数を減少させること、個体の生存を増加させること、転移性癌の発症の開始を遅延させること、阻害すること、阻止すること、若しくは予防すること（腫瘍浸潤及び／又は原発性癌の外部組織の腫瘍浸潤及び／又は癌の転移進行に関連する他の過程の発症の開始を遅延させること、阻害すること、阻止すること若しくは予防すること等）、原発性癌の進行を遅延させ若しくは阻止すること、腫瘍に対する免疫応答を向上させること、腫瘍抗原に対する長期記憶免疫応答を向上させること、及び／又は個体の全般的健康を向上させることを含むが、これらに限定されない。腫瘍細胞死は、例えば、支持細胞、血管新生、線維状マトリックスなどの存在に起因して、腫瘍サイズの実質的な減少なしに起こり得ることが理解されよう。従って、腫瘍サイズの減少が好ましいが、それは癌の治療に必要ではない。
【０１２２】
ＭＵＣ１を発現する癌は、ＭＵＣ１を発現する任意の癌であり得、原発性及び転移性の癌並びに、リンパ腫、白血病及び骨髄腫（例、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、多発性骨髄性リンパ腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）（ＭＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換Ｂ細胞、バーキットリンパ腫及びホジキンリンパ腫及びいくつかのＢ細胞非ホジキンリンパ腫）等の血液悪性腫瘍含む、ヒト癌腫（卵巣、乳房、小腸、胃、腎臓、膀胱、子宮、精巣、膵臓、直腸結腸、肺、甲状腺、胃、頭頸部、前立腺、食道、及び上皮細胞起源の他の癌）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２３】
ペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、任意の方法によって宿主に投与され得る。例えば、細胞と、ペプチド、ポリペプチド、核酸、又は本明細書に記載の通りの、該核酸の送達及び発現を可能にするコンストラクトの一部としての核酸を含む組成物とを接触させることによって等、種々の技術のいずれかによって、ペプチド、ポリペプチド、又はペプチド若しくはポリペプチドをコードする核酸（例、ベクターとして）は、細胞（例、宿主における）内に導入され得る。核酸を、細胞内に導入及び細胞内で発現させるための具体的なプロトコルは、当該分野で知られている（例、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），上記；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，上記、を参照）。
【０１２４】
本発明の酵母ベースの免疫療法組成物は、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、結節内投与、冠動脈内投与、動脈内投与（例、頸動脈に）、皮下投与、経皮送達、気管内投与、関節内投与、脳室内投与、吸入（例、エアロゾル）、頭蓋内、脊髄内、眼内、耳内、鼻腔内、経口、肺投与、カテーテルの含浸、及び組織への直接注入が挙げられるがこれらに限定されない、許容可能な種々の方法によって投与され得る。１つの態様においては、投与経路としては：静脈内、腹腔内、皮下、皮内、結節内、筋肉内、経皮、吸入、鼻腔内、経口、眼内、関節内、頭蓋内、及び脊髄内が挙げられる。非経口送達としては、皮内、筋肉内、腹腔内、胸膜内、肺内、静脈内、皮下、心房カテーテル及び静脈（ｖｅｎａｌ）カテーテルの経路が挙げられ得る。耳内送達としては、点耳薬が挙げられ得、鼻腔内送達としては、点鼻薬又は鼻腔内注射が挙げられ得、眼内送達としては、点眼薬が挙げられ得る。エアロゾル（吸入）送達もまた、当該技術分野で標準の方法を用いて行われ得る（例えば、Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１８９：１１２７７−１１２８１（１９９２）参照）。１つの態様においては、本発明の酵母ベースの免疫療法組成物は、皮下投与される。１つの態様においては、酵母ベースの免疫療法組成物は、腫瘍環境に直接投与される。
【０１２５】
ペプチド、ポリペプチド（タンパク質）、核酸、ベクター、細胞、及び組成物を宿主（被験体）に投与する、好適な方法は、当該分野で知られている。宿主（被験体又は個体）は、哺乳動物（例、マウス、ラット、ハムスター又はモルモット等の齧歯類、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、霊長類又はヒト）等の任意の好適な宿主であり得る。
【０１２６】
例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸又はベクター（例、組換えポックスウイルス）は、ｅｘ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞をペプチド、ポリペプチド、核酸、若しくはベクターに曝露することにより、又はペプチド、ポリペプチド、核酸、若しくはベクターを宿主へ注入することにより、宿主へ投与され得る。ペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター（例、組換えポックスウイルス）又はベクターの組み合わせ、細胞、及び組成物は、癌病変又は腫瘍への直接注入により、又は局所適用（例、医薬上許容可能な担体とともに）により、直接投与（例、局所投与）され得る。
【０１２７】
ペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、単独で、又
はアジュバントと組み合わせて投与され得、リポソーム中に取り込まれ得（例、米国特許第５，６４３，５９９号、米国特許第５，４６４，６３０号、米国特許第５，０５９，４２１号、及び米国特許第４，８８５，１７２号に記載）、ナノ粒子中に取り込まれ得（例、ＶＥＲＳＡＭＵＮＥ（商標）ナノテクノロジー）、サイトカインとともに投与され得、生物学的応答修飾物質（例、インターフェロン、インターロイキン−２（ＩＬ−２）とともに投与され得、コロニー刺激因子（ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ）とともに投与され得、及び／又は投与された、免疫応答を増強することが知られる、当該分野の他の試薬であり得る。
【０１２８】
好適なアジュバントの例としては、アラム、アルミニウム塩、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ケイ酸アルミニウム（ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｓｉｌｉｃａ）、リン酸カルシウム、不完全フロイントアジュバント、ＱＳ２１（南アメリカの樹木キラヤ・サポナリア・モリナ（Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ）の樹皮に由来する免疫学的アジュバント）等のサポニン、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＰ−Ａ）、及びＲＩＢＩ  ＤＥＴＯＸ（商標）アジュバントが挙げられる。
【０１２９】
本発明における使用に特に好ましいアジュバントは、サイトカインＧＭ−ＣＳＦである。ＧＭ−ＣＳＦは、樹状細胞による抗原プロセシング及び提示を増強するため、効果的なワクチンアジュバントであることが示されている。実験研究及び臨床試験によって、組換えＧＭ−ＣＳＦは、種々の免疫原を対象とした宿主免疫を増強できることが示唆されている。
【０１３０】
ＧＭ−ＣＳＦは、ウイルスベクター（例、ポックスウイルスベクター）を用いて、又は単離されたタンパク質として、医薬製剤中で投与され得る。ＧＭ−ＣＳＦはペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物の最初の投与前、投与の間又は投与後に、宿主へ投与され、宿主の抗原特異的免疫応答を増強し得る。例えば、組換えＧＭ−ＣＳＦタンパク質は、ペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物でのワクチン接種の各日に宿主へ投与され、翌３日間毎日（即ち合計４日間）投与され得る。任意の好適な用量のＧＭ−ＣＳＦが使用できる。例えば、１日当たり５０〜５００μｇ（例、１００μｇ、２００μｇ、３００μｇ、４００μｇ、及びそれらの間の範囲）の組換えＧＭ−ＣＳＦが投与され得る。ＧＭ−ＣＳＦは、任意の好適な方法（例、皮下）により投与され得、好ましくは、ペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物での宿主のワクチン接種部位又はその近傍に投与される。
【０１３１】
１つの実施形態においては、本発明のペプチド又はポリペプチド（タンパク質）は、ヘルパーペプチド又は大きな担体分子に結合させて、ペプチド又はポリペプチドの免疫原性を増強し得る。これらの分子としては、インフルエンザペプチド、破傷風トキソイド、破傷風トキソイドＣＤ４エピトープ、シュードモナス体外毒素Ａ、ポリＬリジン、脂質尾部、小胞体（ＥＲ）シグナル配列などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３２】
本発明のペプチドは又はポリペプチド（タンパク質）は、当該分野で認められた方法を用いて、免疫グロブリン分子とも結合され得る。該免疫グロブリン分子は、腫瘍細胞に存在するが正常な細胞には存在しない又はごく少量しか存在しない表面レセプターに特異的であり得る。該免疫グロブリンは、特定の組織（例、乳房、卵巣、結腸又は前立腺組織）に特異的でもあり得る。かかるペプチド−免疫グロブリン結合体又はポリペプチド−免疫グロブリン結合体は、特定の組織及び／又は細胞へのペプチドの標的化を可能にする。
【０１３３】
ペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、ＭＵＣ１特異的免疫応答、好ましくは細胞性免疫応答を生じるのに効果的な量で、宿主（例、ヒト等の哺乳動物）へ投与される。免疫原としてのペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター又
は細胞の有効性は、当該分野で知られているｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏパラメーターによって決定され得る。これらのパラメーターとしては、抗原特異的な細胞毒性アッセイ、ＭＵＣ１又はＭＵＣ１エピトープを発現する腫瘍の退縮、ＭＵＣ１又はＭＵＣ１エピトープを発現する癌細胞の阻害、サイトカインの産生などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３４】
任意の好適な用量のペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、若しくは細胞又はそれらの組成物が、宿主に投与され得る。適切な用量は、宿主の年齢、体重、身長、性別、全身状態、既往歴、疾患進行、及び全身腫瘍組織量などの要因に応じて変化し、臨床医によって決定され得る。例えば、ペプチドは、ワクチン接種あたり約０．０５ｍｇ〜約１０ｍｇ（例、０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、及びそれらの間の範囲）の用量で宿主（例、ヒト等の哺乳動物）に投与される得、好ましくはワクチン接種あたり約０．１ｍｇ〜約５ｍｇである。種々の用量（例、１、２、３、４、５、６又はそれ以上）が、提供（例、数週間又は数か月の期間にわたって）され得る。１つの実施形態においては、１種の用量が３か月の間毎月提供される。
【０１３５】
ベクターがウイルスベクターの場合、好適な用量は、約１×１０５〜約１×１０１２（例、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、及びそれらの間の範囲）プラーク形成単位（ｐｆｕ）が挙げられ得るが、より低用量又はより高用量が宿主に投与され得る。例えば、約２×１０８ｐｆｕが投与（例、約０．５ｍＬの体積で投与）され得る。
【０１３６】
本発明の細胞（例、細胞傷害性Ｔ細胞）は、注入あたり、約１×１０５細胞〜２×１０１１細胞（例、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、及びそれらの間の範囲）の用量で宿主に投与され得る。細胞は、例えば、１〜３（例、１、２又は３）回の注入で投与され得る。細胞の投与に加え、宿主は、インターロイキン２（ＩＬ−２）等の生物学的応答修飾物質を投与され得る。投与される細胞が細胞傷害性Ｔ細胞の場合、ｉｎ  ｖｉｖｏのＴ細胞の数を更に増やすように細胞傷害性Ｔ細胞に刺激を与えるために、細胞傷害性Ｔ細胞の投与後、ペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、又はそれらの組成物が投与され得る。
【０１３７】
一般に、酵母ベースの免疫療法組成物の好適な単回用量は、好適な期間に亘って、１以上の回数投与した場合に、酵母ビヒクル及びＭＵＣ１抗原を、患者の体の所定の細胞種、組織、又は領域へ、１以上のＭＵＣ１抗原又はエピトープに対する抗原特異的免疫応答を誘発するための有効量で、効果的に提供できる用量である。例えば、１つの実施形態においては、本発明の酵母−ＭＵＣ１の単回用量は、組成物が投与されている生物の体重１キログラム当たり、約１×１０５〜約５×１０７酵母細胞当量である。１酵母単位（ＹＵ）は、１×１０７の酵母細胞又は酵母細胞当量である。１つの態様においては、本発明の酵母ビヒクルの単回用量は、投与あたり（即ち、生物あたり）約０．１ＹＵ（１×１０６の酵母細胞又は酵母細胞当量）〜約１００ＹＵ（１×１０９細胞）である（０．１×１０６細胞ずつのいずれかの中間用量（即ち、１．１ｘ１０６、１．２ｘ１０６、１．３ｘ１０６など）を含む）。１つの実施形態においては、好適な用量としては、１ＹＵ〜４０ＹＵの用量、及び、１つの態様においては、１０ＹＵ〜４０ＹＵ、又は１０ＹＵ〜８０ＹＵが挙げられる。１つの実施形態においては、用量は、同一投与期間中、個体上の異なる部位で投与される。例えば、４０ＹＵ用量は、１の投与期間中に、個体上の４つの異なる部位に１０ＹＵ用量を注入することによって投与し得る。本発明は、ある量の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物（例、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ＹＵ又はそれ以上）を、個体の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上の異なる部位で投与し、単回用量を形成す
ることを含む。
【０１３８】
投与される細胞が樹状細胞の場合、被験体に投与される樹状細胞の量は、被験体の状態に依存して変化し、医師（ｐｒａｃｔｉｔｉｏｎｅｒ）により全ての適切な要因を考慮して決定されるべきである。好ましくは、約１×１０６〜約１×１０１２（例、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、又は約１×１０１１（本明細書に記載の細胞数のいずれかの、間の範囲を含む））の樹状細胞がヒト成人のために利用される。これらの量は、被験体の年齢、体重、大きさ、状態、性別、治療されるべき腫瘍の種類、投与経路、治療が局所か又は全身か、及び他の要因に依存して変化する。当業者は、被験体の特定の状況及びニーズに合わせるために、適切な投与量及び投与スケジュールを当然容易に導き出すことができる。
【０１３９】
本発明は、有効量の本発明のペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター又は細胞により、単独で、又は１以上の免疫刺激／調節分子及び／若しくはアジュバントを含む組成物中又はリポソーム製剤中で、リンパ球を刺激することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ペプチド特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球を作製する方法を提供する。リンパ球は、例えば、末梢血、腫瘍組織、リンパ節、及び胸膜液又は腹水液等の滲出液といった、任意の好適なソースからのリンパ球であり得る。
【０１４０】
ＭＵＣ１ペプチド特異的細胞傷害性Ｔリンパ球は、ＭＵＣ１に対して免疫反応性である。好ましくは、細胞傷害性Ｔリンパ球は、腫瘍細胞及び癌の発生を阻害し、ＭＵＣ１又はそのエピトープを発現する腫瘍細胞の増殖を抑制するか、又は該細胞を死滅させる。細胞傷害性Ｔリンパ球は、抗原特異的であることに加えて、ＭＨＣクラスＩ拘束性であり得る。１つの実施形態においては、細胞傷害性Ｔリンパ球は、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２４拘束性である。細胞傷害性Ｔリンパ球は、好ましくはＣＤ８＋の表現型を有する。
【０１４１】
１つの実施形態においては、リンパ球は宿主から取り出され、ｅｘ  ｖｉｖｏでペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物により刺激され、細胞傷害性Ｔリンパ球を生じる。細胞傷害性Ｔリンパ球は、癌に対する免疫応答を増強するために宿主に投与され得、それによって癌を阻害する。従って、本発明は、宿主において癌を阻害する方法であって、（ａ）リンパ球を（例、宿主から）得ること、（ｂ）ペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞又はそれらの組成物により該リンパ球を刺激して、細胞傷害性Ｔリンパ球を作製すること、及び（ｃ）該細胞傷害性Ｔリンパ球を宿主へ投与すること、を含み、癌が阻害される方法を提供する。
【０１４２】
別の実施形態においては、宿主内のリンパ球は、ペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物の、宿主への投与により刺激され、細胞傷害性Ｔリンパ球を生じ、かかる細胞傷害性Ｔリンパ球は癌への免疫応答を増強し、それによって癌を阻害する。
【０１４３】
本発明はプライム及びブーストのプロトコルを含む。特に、本発明のペプチド、ポリペプチド及びベクターに関する１つの実施形態においては、プロトコルは、本発明のペプチド又はポリペプチド並びに、必要に応じて１以上の免疫刺激／調節分子及び／又は他の腫瘍関連抗原（例、ＣＥＡ）、それらの修飾型、及びそれらの免疫原性エピトープをコードする１以上の組換えベクターを含む組成物による最初の「プライム」と、続いて、本発明のペプチド又はポリペプチド、又は本発明のペプチド又はポリペプチド並びに、必要に応じて１以上の免疫刺激／調節分子及び／又は他の腫瘍関連抗原（例、ＣＥＡ）、それらの修飾型、及びそれらの免疫原性エピトープをコードする１以上のポックスウイルスベクターを含有する組成物による、１回、又は好ましくは複数回の「ブースト」を含む。
【０１４４】
本実施形態においては、最初のプライミングワクチン接種（ｐｒｉｍｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）は、１以上のベクターを含み得る。１つの実施形態においては、単一のベクター（例、ポックスウイルスベクター）が、本発明のペプチド並びに１以上の免疫刺激／調節分子及び／又は他の腫瘍関連抗原（例、ＣＥＡ）、それらの修飾型、及びそれらの免疫原性エピトープの送達に用いられる。別の実施形態においては、２以上のベクター（例、ポックスウイルスベクター）が、プライミングワクチン接種を構成し、これは一回の注入で同時に投与される。
【０１４５】
ブースティングワクチン接種（ｂｏｏｓｔｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｓ）も、１以上のベクター（例、ポックスウイルスベクター）を含み得る。１つの実施形態においては、単一のベクターが、ブースティングワクチン接種の、本発明のペプチド並びに１以上の免疫刺激／調節分子及び／又は他の腫瘍関連抗原（例、ＣＥＡ）、それらの修飾型、及びそれらの免疫原性エピトープの送達に用いられる。別の実施形態においては、２以上のベクターが、ブースティングワクチン接種を構成し、これは一回の注入で同時に投与され得る。
【０１４６】
異なる時間間隔での接種のために、異なるセットの治療用分子を有するベクターを用いた、異種のプライム／ブーストプロトコルを提供するために、異なるベクター（例、ポックスウイルスベクター）が用いられ得る。例えば、１の異種のプライム／ブースト組み合わせにおいて、第一のオルソポックスベクター組成物がプライムに用いられ、第二のアビポックスベクター組成物がブーストに用いられる。
【０１４７】
ベクター（例、ポックスウイルスベクター）の投与のためのスケジュールは、典型的に、ブースティングベクターの繰り返し投与を伴う。ブースティングベクターは、任意の好適な期間（例、２〜４週間ごと）で１〜３回（例、１、２又は３回）、任意の好適な長さの期間（例、合計少なくとも５から１５回のブースティングワクチン接種のために６〜１２週間）投与され得る。例えば、プライマリーワクチン接種は、組換えワクシニア又はＭＶＡベクターを含み得、それに続いて、複数回のブースターワクチン接種では、アビポックスベクター用いる。特定の実施形態においては、宿主は、プライミングベクターで一回ワクチン接種を受けた後、ブースティングベクターにより、２週間ごとに６ブーストを続け、その後、ブースティングベクターにより、４週間ごとに続け、そして疾患の進行に応じた期間、ブースティングベクターを用いて継続する。
【０１４８】
本発明は、被験体又は個体への、本発明の酵母ベースの免疫療法組成物の送達（投与、免疫、ワクチン接種）も含む。投与方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで行われ得るが、典型的にはｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。酵母ベースの免疫療法組成物の、好適な投与経路及び好適な単回投与量は、上記されている。酵母ベースの免疫療法組成物の初回（オリジナル又はプライミング）投与に続いて、例えば、抗原に対する免疫応答が衰えた場合、或いは免疫応答をもたらすか、又は特定の抗原若しくは抗原（複数可）に対する記憶応答を誘導するために必要に応じて、酵母ベースの免疫療法組成物の「ブースター」又は「ブースト」が投与される。ブースターは、約１、２、３、４、５、６、７、又は８週の間隔で、若しくは毎月、隔月、四半期ごと、毎年、及び／又は最初の投与（プライミングの用量）後に、治療されている個体の状態及び投与時における治療の目的（例、予防的、積極的な治療、維持）に応じて、数年ずつ（ｆｅｗ  ｏｒ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｙｅａｒ
ｉｎｃｒｅｍｅｎｔｓ）投与され得る。１つの実施形態においては、投与スケジュールは、数週間から、数ヶ月、数年の期間に亘って、酵母ベースの免疫療法組成物の用量が、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回、又はそれ以上投与されるものである。１つの実施形態においては、用量は、毎週、又は隔週、又は３週毎に１回、又は毎月、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の用量について投与され、続いて、毎週、隔週、３週毎に１回、又は毎月、癌に対する、所望の予防的又は治療的
処置を達成するために、必要に応じた用量が投与される。望まれる場合、次いで、更なるブースターが、維持又は寛解療法と同様又はより長い間隔（数ヶ月又は数年）で与えられ得る。
【０１４９】
１つの実施形態においては、本発明は、医薬的に許容可能な担体中、本発明のペプチド又はポリペプチドをコードする核酸をそのゲノム又はその一部に組み込んだ、第１の組換えベクター（例、ポックスウイルスベクター）を少なくとも有する、キットを更に提供する。第１の組換えベクター（例、ポックスウイルスベクター）は、１以上の免疫刺激／調節分子及び／又は他の腫瘍関連抗原（例、ＣＥＡ）、それらの修飾型、及びそれらの免疫原性エピトープをコードする１以上の核酸も含み得る。第１の組換えベクターに加えて、キットは、医薬的に許容可能な担体中、１以上の免疫刺激／調節分子及び／又は他の腫瘍関連抗原（例、ＣＥＡ）、それらの修飾型、及びそれらの免疫原性エピトープをコードする１以上の核酸を含む、第２の組換えベクターを有し得る。キットは、容器、注射針、該キットを使用する方法の説明書を更に提供する。別の実施形態においては、キットは、ＧＭ−ＣＳＦ等のアジュバント、及び／又は市販のアジュバントを、キットの構成要素とともに使用するための指示書、を更に提供する。
【０１５０】
本発明は、本明細書に記載の、いずれかの酵母ベースの免疫療法組成物、又は本明細書に記載の、かかる組成物の、いずれかの個々の構成成分を含むキットも含む。キットは、ＭＵＣ１の発現又は過剰発現に関連するか、又はそれよって特徴付けられる、癌を予防又は治療するための、本発明の組成物のいずれかを使用するための、更なる試薬及び説明書又は指示書を含み得る。
【０１５１】
上述の通り、ペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、静脈内、及び腫瘍内を含むが、これらに限定されない、様々な経路で宿主に投与され得る。複数回投与が与えらる場合、該投与は、宿主内の１以上の部位にされ得、酵母ベースの免疫療法の場合には、単回用量は、個体の１、２、３、４又はそれ以上の部位に投与するために、該単回用量を等しい分割量に分割して投与され得る。
【０１５２】
ペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物の投与は、「予防的」又は「治療的」であり得る。ペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、予防的に提供される場合、腫瘍形成の前、又はＭＵＣ１を発現する腫瘍の発生の検出の前に、ＭＵＣ１を発現する腫瘍の発生を予防し、阻害し、若しくは遅延させること；及び／又は、かかる腫瘍の転移を予防し、阻害し、若しくは遅延させること、及び／又は、個体における癌の進行を全般的に予防し若しくは阻害すること；を目的として、一般的には、宿主の免疫系の能力が、該宿主が発症しやすい腫瘍に対して戦えるようにするため、又は、宿主の該能力を改良するために提供される。例えば、遺伝性の発癌感受性を有する宿主は、かかる予防的免疫で治療される、好ましい一群の患者である。ペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物の予防的投与は、ＭＵＣ１を発現する癌を予防し、改善し、又は遅延させる。ペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、治療的に提供される場合、ＭＵＣ１を発現する癌の診断時又は診断後に、個体の全身腫瘍組織量を減少させること；個体における腫瘍の成長を阻害すること；個体の生存を増加させること；及び／又は、個体における癌の進行を予防すること、阻害すること、反転させること又は遅延させること等の、癌を改善する目的で、提供される。
【０１５３】
宿主が、既にＭＵＣ１を発現する癌又は転移癌と診断された場合、ペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、化学療法、腫瘍の外科的切除、癌標的療法による治療、同種又は自己幹細胞移植、Ｔ細胞養子移入、他の免疫療法及び／又
は放射線療法等の、他の治療的処置と組み合わせて投与され得る。
【０１５４】
好ましい実施形態においては、ペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物を宿主へ投与すると、結果として、本発明のペプチド並びに必要に応じて１以上の免疫刺激／調節分子及び／又は他の腫瘍関連抗原（例、ＣＥＡ）、それらの修飾型、及びそれらの免疫原性エピトープ（同時投与されたもの）を発現する宿主細胞がもたらされる。本発明のペプチド（即ち、ＭＵＣ１抗原）は、感染した宿主細胞の細胞表面に発現し得る。１以上の免疫刺激／調節分子及び／又は他の腫瘍関連抗原（例、ＣＥＡ）、それらの修飾型、及びそれらの免疫原性エピトープは、細胞表面に発現し得、又は宿主細胞によって活発に分泌され得る。ＭＵＣ１抗原及び免疫刺激／調節分子の両方が発現すると、特定のＴ細胞に必要なＭＨＣ拘束性ペプチド及び該Ｔ細胞に適切なシグナルが提供されて、抗原認識、並びに抗原特異的Ｔ細胞の増殖又はクローン性増殖に役立つ。総合的な結果は、免疫システムのアップレギュレーションである。好ましくは、免疫応答のアップレギュレーションは、癌（例、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌、甲状腺癌、胃癌、頭頸部癌又は前立腺癌）細胞を死滅させること又はその増殖を阻害することができる、抗原特異的ヘルパーＴリンパ球及び／又は細胞傷害性Ｔリンパ球の増加である。
【０１５５】
本発明の方法について、医薬組成物の種々の好適な製剤が存在する。非経口、皮下、静脈内、筋肉内、及び腹腔内投与のための以下の製剤が代表的であるが、決して限定されない。当業者は、本発明のペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞又は組成物のこれらの投与ルートは知られており、特定の化合物を投与するために、１超のルートが用いられ得るものの、特定のルートが別のルートと比べてより即効性があり、より効果的な反応を提供し得ることを理解する。
【０１５６】
注射製剤は、本発明に基づく、これら好ましい製剤の１つである。注射用組成物のために効果的な医薬担体の要件は、当業者に周知である（例、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，Ｂａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈａｌｍｅｒｓ，ｅｄｓ．，ｐａｇｅｓ  ２３８−２５０（１９８２），及びＡＳＨＰ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，４Ｔｈ  ｅｄ．，ｐａｇｅｓ  ６２２−６３０（１９８６）参照）。
【０１５７】
非経口投与に好適な製剤としては、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、及び製剤を、意図されるレシピエントの血液と等張とする溶質を含有し得る水性及び非水性の等張滅菌注射溶液、並びに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、及び保存剤を含有し得る水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。ペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、医薬担体中、生理学的に許容可能な希釈剤中で投与され得、これは例えば滅菌液体又は液体の混合物などであって、水、生理食塩水、デキストロース水溶液及び関連する糖溶液、エタノール、イソプロパノール、若しくはヘキサデシルアルコール等のアルコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコール等のグリコール、ジメチルスルホキシド、２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノール等のグリセロールケタール、ポリ（エチレングリコール）４００等のエーテル、油、脂肪酸、脂肪酸エステル若しくはグリセリド、石鹸若しくは洗剤などの医薬上許容可能な界面活性剤の添加を含むか、若しくは含まないアセチル化脂肪酸グリセリド、ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース若しくはカルボキシメチルセルロース等の懸濁化剤、又は乳化剤及び他の医薬アジュバントが挙げられる。
【０１５８】
非経口製剤で用いられ得る油としては、石油系、動物性、植物性、及び合成油が挙げられる。油の具体的な例としては、ピーナッツ、大豆、胡麻、綿実、トウモロコシ、オリーブ、ワセリン及び鉱物が挙げられる。非経口製剤で用いるのに好適な脂肪酸としては、オ
レイン酸、ステアリン酸、及びイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルは、脂肪酸エステルの好適な例である。
【０１５９】
非経口製剤において用いるのに好適な石鹸としては、脂肪酸アルカリ金属、アンモニウム、及びトリエタノールアミン塩、並びに（ａ）例えば、ハロゲン化ジメチルジアルキルアンモニウム、及びハロゲン化アルキルピリジニウム等のカチオン性界面活性剤、（ｂ）例えば、アルキル、アリール、及びオレフィンスルホネート、アルキル、オレフィン、エーテル、及びモノグリセリドスルフェート、及びスルホスクシネート等のアニオン性界面活性剤、（ｃ）例えば、脂肪アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド、及びポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマー等のノニオン性界面活性剤、（ｄ）例えば、アルキル−ｂ−アミノプロピオネート、及び２−アルキル−イミダゾリン四級アンモニウム塩等の両性界面活性剤、及び（ｅ）それらの混合物を含む、好適な界面活性剤が挙げられる。
【０１６０】
保存剤及び緩衝液が用いられ得る。注射部位の炎症を最小限にする又は排除するために、かかる組成物は、約１２〜約１７の親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）を有する１以上のノニオン性界面活性剤を含有し得る。かかる製剤における界面活性剤の量は、典型的に約５重量％〜約１５重量％の範囲である。好適な界面活性剤としては、ソルビタンモノオレエート等のポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル、及びエチレンオキサイドの疎水性塩基との高分子量付加物（プロピレンオキサイドのプロピレングリコールとの縮合により形成される）が挙げられる。
【０１６１】
非経口製剤は、アンプル及びバイアル等の、単回用量又は複数回用量密閉容器に入れて提示され得、且つ、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得、これは、使用直前に、注射のために滅菌液体賦形剤、例えば水の添加のみを必要する。即席注射溶液及び懸濁液は、滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製され得る。
【０１６２】
本発明の酵母ベースの免疫療法組成物は、最も典型的には、アジュバント又は他の担体なしで、単純な医薬的に許容可能な、ＰＢＳ又は他の緩衝液等の賦形剤中の、酵母ベースの組成物の注射可能な製剤として投与される。
【０１６３】
以下の実施例は、本発明を更に説明するが、当然ながら、決してその範囲を限定すると解釈してはならない。
【実施例】
【０１６４】
実施例１
本実施例では、ＨＬＡ−Ａ２４  ＭＵＣ１−Ｃアゴニストエピトープの解析について説明する。
【０１６５】
Ｉ．材料及び方法
【０１６６】
患者−以前に記載の、イピリムマブと組み合わせたＰＳＡ−ＴＲＩＣＯＭワクチンの臨床試験（Ｍａｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．，１３：５０１−８（２０１２））に登録された、２人の前立腺癌患者からのＰＢＭＣを用いた。国立衛生研究所（ＮＩＨ）臨床センターの施設内審査委員会は、手順を承認しており、インフォームドコンセントは、ヘルシンキ宣言に従って得た。
【０１６７】
ペプチド−ＭＵＣ１のアミノ酸配列を、ＨＬＡ−Ａ２４結合ペプチドに関するコンセンサスモチーフとの一致についてスキャンした。ペプチド／ＭＨＣ複合体の予測される解離半減期により潜在的なＭＨＣ結合ペプチドを順位づける、Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．により開発されたコンピューターアルゴリズムを用いた。（Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：１６３−７５（１９９４））。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）が、ＭＵＣ１のＭＵＣ１−Ｃ領域から、結合親和性を増加させるため、９−ｍｅｒペプチド及び１０−ｍｅｒペプチドの類似体を、単一アミノ酸置換により合成した（表１）。ペプチドの純度は＞９０％だった。
【０１６８】
【表１】
2020058350.tif 000002
【０１６９】
親和性及び結合活性（ａｖｉｄｉｔｙ）アッセイ−Ｔ２−Ａ２４細胞を用いる、ＨＬＡ−Ａ２４ペプチドについての結合アッセイを確立するための多くの試みにもかかわらず、信頼性の高いアッセイは確立できなかった。従って、これらのペプチドは、単に、対応するペプチドでパルスした細胞及び天然ペプチドを発現する腫瘍細胞を溶解する能力に基づいて評価した。
【０１７０】
Ｔ細胞株の樹立−Ｔｓａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８７：９８２−９０（１９９５）に記載されたプロトコルの修正版を、ＭＵＣ１特異的ＣＴＬの作製に用いた。放射線照射した自己ＤＣを、２０μｇ／ｍＬのペプチドで２時間パルスし、次いで、ＰＢＭＣを１０：１の比で添加した。３日後、ヒトＩＬ−２（２０シータス単位（Ｃｅｔｕｓ  ｕｎｉｔｓ）／ｍＬ）を添加した。細胞を、７日ごとに再刺激した。三回目のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激の後、細胞を、抗原提示細胞としての自己エプスタイン−バーウイルス形質転換Ｂ細胞を２：１の比率で用いて再刺激し、ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍＬ）を含有する培地中で維持した。
【０１７１】
サイトカインの検出−様々な濃度（２５、１２．５、６．２５及び３，１３、及び１．５６μｇ／ｍｌ）のペプチドでパルスした自己Ｂ細胞を、ＭＵＣ１特異的Ｔ細胞株と、２：１の比で、２４時間、インキュベートした。ＩＦＮ−γに関して、上清をＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）により解析した。
【０１７２】
腫瘍細胞培養−膵臓癌細胞株ＡＳＰＣ−１（ＨＬＡ−Ａ３ｎｅｇ、ＨＬＡ−Ａ２４ｎｅｇ、ＭＵＣ１＋）、結腸癌細胞株ＳＷ６２０（ＨＬＡ−Ａ２４＋、ＭＵＣ１＋）、及び前立腺癌細胞株ＰＣ３（ＨＬＡ−Ａ２４＋、ＭＵＣ１＋）を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。細胞培養物は、すべてマイコプラズマを含んでおらず、完全培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを追加）（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）中で維持した。Ｋ５６２−Ａ
２．１細胞は、Ｃ．Ｂｒｉｔｔｅｎ博士（Ｊｏｈａｎｎｅｓ  Ｇｕｔｅｎｂｅｒｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｍａｉｎｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し、０．５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を追加した完全培地中で維持した。
【０１７３】
腫瘍細胞溶解の細胞毒性アッセイ、コールド標的阻害及び抗体ブロッキング−Ｔ細胞性のキリング（Ｔ−ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｋｉｌｌｉｎｇ）を測定するために、１６時間１１１インジウム放出アッセイ（Ｔｓａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８７：９８２−９０（１９９５））を用いた。２×１０６の標的細胞を、６０μＣｉ酸化１１１インジウム（１１１Ｉｎ  ｏｘｉｄｅ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ，Ｖｉｅｎｎａ，ＶＡ）で、３７℃で２０分間標識し、９６ウェル丸底培養プレート中、３０００細胞／ウェルで用いた。種々の比率でＴ細胞を添加した。全てのアッセイを、１０％ヒトＡＢ血清（Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｔａｒｚａｎａ，ＣＡ）、グルタミン及び抗生物質（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）で置換したＲＰＭＩ培地中で行った。自然放出は、標的細胞を培地のみとインキュベートすることによって測定し、完全溶解は、２．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とのインキュベーションによって測定した。溶解は、式：
【０１７４】
【数１】
2020058350.tif 000003
【０１７５】
を用いて算出した。対応するペプチドでの前パルスあり又はなしで、Ｋ５６２−Ａ２．１又はＫ５６２−Ａ３細胞を、１：１０の比でウェルに添加することにより、コールド標的阻害アッセイを行った（Ｔｓａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８７：９８２−９０（１９９５））。腫瘍細胞を、１０μｇ／ｍｌの抗ＨＬＡ−Ａ２４抗体又はアイソタイプコントロール抗体（ＵＰＣ１０）とプレインキュベートすることにより、抗体ブロッキングを行った。
【０１７６】
ＩＩ．解析
【０１７７】
ＭＵＣ１−Ｃ領域におけるＨＬＡ−Ａ２４クラスＩ結合ペプチドについて、アルゴリズムは、Ａ２４結合候補を示さなかった。アンカー残基の変更で、３つのＨＬＡ−Ａ２４アゴニストの候補が示された。これらのアゴニストのうち２つ（Ｃ６Ａ及びＣ７Ａ、表１）を用いて研究を行った。第三のアゴニスト候補は、該第三のアゴニスト候補により作製されたＴ細胞株が、腫瘍細胞を溶解しなかったため、記載しない。
【０１７８】
ワクチンを接種した二人の異なる癌患者からのＰＢＭＣを用いて、Ｃ６と命名された天然ペプチドによりＴ細胞株を作製する試みは、不成功であった。しかしながら、対応するアゴニストペプチドＣ６Ａ（配列番号１）でパルスしたＡＰＣを用いて、これらの同一の患者からＴ細胞株を作製することができた。
【０１７９】
溶解について、Ｃ６ＡペプチドでパルスしたＡＰＣ由来のＴ細胞株を、ＭＵＣ１＋、ＨＬＡ−Ａ２４＋の、異なる２つの腫瘍細胞株（ＳＷ６２０；結腸癌、及びＰＣ３；前立腺癌）及びＡＳＰＣ−１膵臓癌細胞株（ＭＵＣ１＋、ＨＬＡ−Ａ２４ｎｅｇ）と比較して評価した。ＨＬＡ−Ａ２４ｎｅｇ株とは対照的に、両方のＨＬＡ−Ａ２４＋細胞株の溶解が観察された（表２参照）。
【０１８０】
【表２】
2020058350.tif 000004
【０１８１】
天然のＣ７ペプチドで得られたＴ細胞株の増殖は不十分であったが、結腸癌細胞株ＳＷ６２０を用いた細胞毒性アッセイにおいて、このＴ細胞株を評価するためには、十分な細胞が利用可能であった。表３から理解できる通り、アゴニストのＣ７Ａペプチドで得られたＴ細胞株は、天然のＣ７ペプチドで得られたＴ細胞株よりも効率的にＳＷ６２０細胞を溶解した。どちらのＴ細胞株も、ＡＳＰＣ−１腫瘍細胞株を溶解しなかった。抗ＨＬＡ−Ａ２４抗体の添加で、腫瘍細胞の溶解が大幅に減少し、それによって、Ｃ６Ａ及びＣ７Ａ特異的Ｔ細胞株の両方について、溶解のＭＨＣ拘束性が実証された（表３）。
【０１８２】
【表３】
2020058350.tif 000005
【０１８３】
Ｃ６Ａアゴニストペプチドにより作製されたＴ細胞株の刺激で、高レベル（ｐｇ／ｍＬ／１０５細胞）のＩＦＮ−γ（２，６５１）、ＧＭ−ＣＳＦ（＞１０，０００）、ＩＬ−８（＞１０，０００）、及びＴＮＦ−α（３７２）並びに低レベル（＜５０）のＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、及びＩＬ−１２が産生された。
【０１８４】
Ｔ細胞株は、天然のＣ７又はアゴニストのＣ７Ａのペプチドでパルスした自己ＡＰＣを用いて、同一の患者から作製できた。次いで、各細胞株を、天然のＣ７又はアゴニストのＣ７ＡのペプチドのいずれかでパルスしたＢ細胞で２４時間刺激し、上清中のサイトカインレベルを解析した。
【０１８５】
表４に示す通り、天然のペプチドにより作製されたＴ細胞株は、アゴニストのＣ７Ａで刺激した場合、天然のＣ７ペプチドと比較して、より多くのＩ型サイトカインＩＦＮ−γを産生した。更に、アゴニストのＣ７Ａペプチドにより作製されたＴ細胞株が、天然及びアゴニストのペプチドの両方により刺激された場合、アゴニストのＣ７ＡペプチドでパルスしたＡＰＣによる刺激によって、天然のＣ７ペプチドと比較して、より多くのＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−８、ＩＬ−１０及びＴＮＦ−αが産生された（表４）。
【０１８６】
【表４】
2020058350.tif 000006
【０１８７】
これらの研究の結果は、本明細書に記載の本発明の文脈において、樹状細胞に対する、ペプチドの単独での使用、古典的な又は新規なアジュバント製剤を伴う使用、或いは様々な生物学的アジュバント又は、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、若しくはＩＬ−１５等のサイトカインを伴う使用を含む、ＭＵＣ１−Ｃのアゴニストエピトープの治療的有用性を支持する。養子Ｔ細胞療法アプローチにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞を活性化するためにも、これらのアゴニストペプチドが用いられ得る。これらのアゴニストエピトープに対するＴ細胞受容体は、遺伝子改変されたＴ細胞の養子移入実験にも用いられ得る。本明細書に記載の通り、アゴニストエピトープを含有する、より長いペプチド又はＭＵＣ１タンパク質自体も用い得る。最後に、ＭＵＣ１導入遺伝子をコードし、これらのアゴニストエピトープについての配列を含む、組換えベクターベースのワクチンが用いられ得る。
【０１８８】
実施例２
本実施例では、配列番号１を含み、ＧＩ−６１０８として知られる、酵母ベースのＭＵＣ１アゴニスト免疫療法組成物の製造を実証する。
【０１８９】
酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）を、銅誘導性プロモーター、ＣＵＰ１の制御下で、ヒトＭＵＣ１アゴニスト抗原を発現し、酵母−ＭＵＣ１アゴニスト免疫療法組成物を製造するよう改変した。ＭＵＣ１アゴニスト抗原は、配列番号１のエンハンサーアゴニストペプチドを含み、受入番号ＮＰ＿００１１９１２１４（配列番号１４）を有する、全長の野生型ＭＵＣ１抗原を用いて設計した（しかし、他の野生型ＭＵＣ１タンパク質を利用して同様のアゴニストを設計し得る）。
【０１９０】
簡潔に述べると、Ｎ末端からＣ末端にインフレームで融合された以下：（１）配列番号１７のα因子リーダー配列（配列番号１６の１位〜８９位に対応）；（２）リンカー配列Ｔｈｒ−Ｓｅｒ（配列番号１６の９０位〜９１位に対応）；（３）１５アミノ酸のアゴニスト置換及び１の不活性置換の導入を除いて、野生型タンパク質に一致する全長ＭＵＣ１アゴニストタンパク質（配列番号１６の９２位〜５６６位に対応）；及び（４）ヘキサペプチドヒスチジンタグ（配列番号１６の５６７位〜５７２位に対応）、の配列要素を有する単一のポリペプチドとして、配列番号１６で表される、ＭＵＣ１アゴニスト抗原を含む融合タンパク質を製造した。配列番号１６は、配列番号１５（酵母の発現のためにコドンを最適化）で表される塩基配列によりコードされる。アルファリーダー配列（配列番号１６の１位〜８９位に対応）は、配列番号１９で表されるペプチド、又は配列番号１８等の、別の酵母アルファリーダー配列からのＮ末端ペプチド、又はＭＵＣ１シグナル配列等の
、プロテアソーム分解に対する抵抗性を付与するため、及び／又は発現を安定化するために設計された異なるＮ末端配列で置換され得る。Ｃ末端のヘキサヒスチジンタグは任意であり、タンパク質の同定及び／又は精製を容易にする。テンプレートとして用いられた野生型ＭＵＣ１タンパク質と比較して、配列番号１６は、以下：（配列番号１６を参照し、括弧内で、配列番号１４と同定された受入番号ＮＰ＿００１１９１２１４で表される野生型ＭＵＣ１における置換の位置を更に参照し、置換位置を示す）：Ｔ１８４Ｌ（野生型ＭＵＣ１中９３位）、Ａ２３２Ｙ（野生型ＭＵＣ１中１６１位）、Ｐ２３３Ｌ（野生型ＭＵＣ１中１６２位）、Ｇ２４０Ｖ、（野生型ＭＵＣ１中１６９位）、Ｓ２４１Ｙ（野生型ＭＵＣ１中１７０位）、Ｔ２４２Ｌ（野生型ＭＵＣ１中１７１位）、Ａ４８３Ｙ（野生型ＭＵＣ１中３９２位）、Ｃ４９５Ａ（野生型ＭＵＣ１中４０４位）、Ｃ４９７Ｖ（野生型ＭＵＣ１中４０６位）、Ｔ５１３Ｋ（野生型ＭＵＣ１中４２２位）、Ｐ５２１Ａ（野生型ＭＵＣ１中４３０位）、Ｔ５２２Ｌ（野生型ＭＵＣ１中４３１位）、Ｔ５３５Ｌ（野生型ＭＵＣ１中４４４位）、Ｄ５３６Ｆ（野生型ＭＵＣ１中４４５位）、及びＳ５５１Ｙ（野生型ＭＵＣ１中４６０位）、のアミノ酸置換を含有する。Ｃ４９５Ａの置換（野生型ＭＵＣ１タンパク質における４０４位）は不活性化変異であり；残りの置換は、アゴニストエピトープを生成するためのものである。配列番号１６は、本明細書中配列番号１と呼ばれるエンハンサーアゴニストペプチドを含む。配列番号１は、配列番号１６の５１３位〜５２２位に位置する。配列番号１６の融合タンパク質を発現するサッカロミセス・セレビシエ全酵母を含む、酵母ベースの免疫療法組成物は、本明細書中、ＧＩ−６１０８と呼ばれる。
【０１９１】
ＧＩ−６１０８のためのＭＵＣ１アゴニスト抗原を含有するプラスミドをＷ３０３α酵母にトランスフェクトし、形質転換体を、ウリジンドロップアウトアガー（ｕｒｉｄｉｎｅ  ｄｒｏｐｏｕｔ  ａｇａｒ）（ＵＤＡ）上での、３０℃で３日の増殖後にセレクションした。単一コロニーを、追加の４日間、ウリジン及びロイシンドロップアウトアガー（ｕｒｉｄｉｎｅ  ａｎｄ  ｌｅｕｃｉｎｅ  ｄｒｏｐｏｕｔ  ａｇａｒ）（ＵＬＤＡ）プレート上に再ストリークし、３０℃でインキュベートし、プラスミドコピー数が増加した細胞についてセレクションした。
【０１９２】
ＧＩ−６１０８の単一コロニーをＵＬＤＡプレートから取り出し、２５ｍＬのＵＬ２液体培地に接種するために用いた（スターター培養）。ビス−トリス４．２ｇ／Ｌを含有する、ｐＨを緩衝したＵＬ２培地（ＢＴ−ＵＬ２）にも、ＧＩ−６１０８を接種し（得られた酵母は、本明細書中、ＧＩ−６１０８−ＤＥＣと呼ばれる）、中性ｐＨの製造条件下で製造された、この酵母ベースの免疫療法（ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）を評価した。ｐＨを緩衝したＵＬ２培地中の培養では、酵母細胞壁上にβグルカンが露出し、抗原提示細胞上のデクチン受容体との相互作用を修飾する結果として、酵母によって誘導される細胞性免疫応答が修飾されると考えられる。従って、ＧＩ−６１０８酵母は、構造的及び機能的に、ＧＩ−６１０８−ＤＥＣ酵母とは異なる。スターター培養物を、３０℃で震盪しながら、約３ＹＵ／ｍＬの密度にまでインキュベートし、次いで、接種して０．３ＹＵ／ｍＬの中間培養物にするために用いた。中間培養物を、密度３ＹＵ／ｍＬにまで増殖させ、次いで、接種して密度０．０４ＹＵ／ｍＬの最終培養物にするために用いた。最終培養物を密度３ＹＵ／ｍＬまで増殖させ、次いで、０．５ｍＭの硫酸銅で３０℃で３時間処理して、ＭＵＣ１アゴニスト抗原の発現を誘導した。
【０１９３】
誘導した細胞を、ＰＢＳで一度洗浄し、５６℃で１時間、熱で死滅させ、次いでＰＢＳ中で３回洗浄した。熱で死滅させた細胞の全タンパク質含量をＡｍｉｄｏｓｃｈｗａｒｚアッセイにより測定し、アゴニスト抗原含量を、Ｃ末端のヘキサヒスチジンエピトープタグを認識するモノクローナル抗体を用いて、ウェスタンブロットによって測定した。抗原量は、ｈｉｓタグ付きＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質から構成される標準曲線に対して補間することによって決定した。
【０１９４】
結果は、ＧＩ−６１０８酵母は、ＵＬ２培地中で十分に抗原を発現することを示し、ＧＩ−６１０８についての抗原含量は約２５３１Ｎｇ／ＹＵであると推定された（データは示さず）。ＧＩ−６１０８−ＤＥＣ酵母による抗原の発現（即ち、ＢＴ−ＵＬ２培地中、中性のｐＨ条件で増殖させたＧＩ−６１０８）は、低すぎて、ウェスタンブロットによる正確な定量化をもたらさなかった（データは示さず）。それでもなお、ＧＩ−６１０８及びＧＩ−６１０８−ＤＥＣの両方を、実施例３に記載の実験に用いた。
【０１９５】
実施例３
本実施例では、ＧＩ−６１０８及びＧＩ−６１０８−ＤＥＣとして知られる本発明の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物が、ＭＵＣ１特異的Ｔ細胞を活性化し得ることを実証する。
【０１９６】
Ｔ細胞株−  Ｔ−３−Ｐ９３Ｌは、ＨＬＡ−Ａ２との関連でＰ９３Ｌと表示される、ＭＵＣ１アゴニストペプチドを特異的に認識するＭＵＣ−１特異的Ｔ細胞株である。Ｐ９３Ｌは、全長ＭＵＣ１−Ｃタンパク質の９２位〜１０１位にまたがるペプチド（例、配列番号１４の９２位〜１０１位に対応するＡＴＷＧＱＤＶＴＳＶ）（このペプチドの２位（配列番号１４の９２位〜１０１位の９３位）のスレオニンがロイシンで置換され、それによってアゴニストペプチドを作製していることを除く）である。Ｐ９３Ｌは、天然（野生型）のペプチドよりも高いレベルでＨＬＡ−Ａ２に結合し、そして天然のペプチドより良好な（ＴＨ１サイトカインのより高い産生）ＭＵＣ１特異的Ｔ細胞の誘導因子である（米国特許出願公開第２００８／００６３６５３号参照）。Ｔ細胞株Ｔ−３−Ｐ９３Ｌは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＨＬＡ−Ａ２陽性、ＭＵＣ１陽性腫瘍標的を特異的に溶解し得る。このＴ細胞株は、ＭＵＣ１−Ｎのサブユニット内にあるＭＵＣ１の一部に特異的である。
【０１９７】
Ｃ１Ａ  Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２との関連でＣ１Ａと表示されるＭＵＣ１アゴニストペプチドを特異的に認識するＭＵＣ−１特異的Ｔ細胞株である。Ｃ１Ａは、全長ＭＵＣ１タンパク質の３９２位〜４０１位にまたがるペプチド（例、配列番号１４の３９２位〜４０１位に対応するＡＬＡＩＶＹＬＩＡＬ）である（このペプチドの１位（配列番号１４の３９２位）のアラニンがチロシンで置換され、それによってアゴニストペプチドを作製していることを除く）。
【０１９８】
Ｃ２Ａ  Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２との関連でＣ２Ａと表示されるＭＵＣ１アゴニストペプチドを特異的に認識するＭＵＣ−１特異的Ｔ細胞株である。Ｃ２Ａは、全長ＭＵＣ１タンパク質の３９７位〜４０６位にまたがるペプチド（例、配列番号１４の３９７位〜４０６位に対応するＹＬＩＡＬＡＶＣＱＣ）である（このペプチドの１０位（配列番号１４の４０６位）のシステインがバリンで置換され、それによってアゴニストペプチドを作製していることを除く）。
【０１９９】
Ｃ３Ａ  Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２との関連でＣ３Ａと表示されるＭＵＣ１アゴニストペプチドを特異的に認識するＭＵＣ−１特異的Ｔ細胞株である。Ｃ３Ａは、全長ＭＵＣ１−Ｃタンパク質の４６０位〜４６８位にまたがるペプチド（例、配列番号１４の４６０位〜４６８位に対応するＳＬＳＹＴＮＰＡＶ）である（このペプチドの１位（配列番号１４の４６０位）のセリンがチロシンで置換され、それによってアゴニストペプチドを作製していることを除く）。
【０２００】
Ｖ１Ａ  Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２との関連でＶＮＴＲ−３と表示されるＭＵＣ１アゴニストペプチドを特異的に認識するＭＵＣ−１特異的Ｔ細胞株である。Ｖ１Ａは、全長ＭＵＣ１タンパク質の１５０位〜１５８位にまたがるペプチド（例、配列番号１４の１５０位〜１５８位に対応するＳＴＡＰＰＡＨＧＶ）である（このペプチドの１位（配列番号１４の１５０位）のセリンがチロシンで置換され、且つこのペプチドの２位（配列番号１４の
１５１位）のスレオニンがロイシンで置換され、それによってアゴニストペプチドを作製していることを除く）。
【０２０１】
Ｖ２Ａ  Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２との関連でＶＮＴＲ−５と表示されるＭＵＣ１アゴニストペプチドを特異的に認識するＭＵＣ−１特異的Ｔ細胞株である。Ｖ２Ａは、全長ＭＵＣ１タンパク質の１４１位〜１４９位にまたがるペプチド（例、配列番号１４の１４１位〜１４９位に対応するＡＰＤＴＲＰＡＰＧ）である（このペプチドの１位（配列番号１４の１４１位）のアラニンがチロシンで置換され、且つこのペプチドの２位（配列番号１４の１４２位）のプロリンがロイシンで置換され、それによってアゴニストペプチドを作製していることを除く）。
【０２０２】
Ｃ５Ａ  Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ３との関連でＣ５Ａと表示されるＭＵＣ１アゴニストペプチドを特異的に認識するＭＵＣ−１特異的Ｔ細胞株である。Ｃ５Ａは、全長ＭＵＣ１タンパク質の４４３位〜４５１位にまたがるペプチド（例、配列番号１４の４４３位〜４５１位に対応するＳＴＤＲＳＰＹＥＫ）である（このペプチドの２位（配列番号１４の４４４位）のスレオニンがロイシンで置換され、且つこのペプチドの３位（配列番号１４の４４５位）のアスパラギン酸がフェニルアラニンで置換され、それによってアゴニストペプチドを作製していることを除く）。
【０２０３】
Ｃ６Ａ  Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２４との関連でＣ６Ａと表示されるＭＵＣ１アゴニストペプチドを特異的に認識するＭＵＣ−１特異的Ｔ細胞株である。Ｃ６Ａは、全長ＭＵＣ１タンパク質の４２２位〜４３１位にまたがるペプチド（例、配列番号１４の４２２位〜４３１位に対応するＴＹＨＰＭＳＥＹＰＴ）である（このペプチドの１位（配列番号１４の４２２位）のスレオニンがチロシンで置換され、このペプチドの９位（配列番号１４の４３０位）のプロリンがアラニンで置換され、且つこのペプチドの１０位（配列番号１４の４３１位）のスレオニンがロイシンで置換され、それによってアゴニストペプチドを作製していることを除く）。このＴ細胞株はまた、実施例１に記載されている。
【０２０４】
Ｔｓａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８７：９８２−９０（１９９５）により記載されたプロトコルの修正版を用いて、ＭＵＣ１特異的ＣＴＬを作製した。放射線照射した自己ＤＣを、２０μｇ／ｍＬのペプチドで２時間パルスし、次いで、ＰＢＭＣを比１０：１で添加した。３日後、ヒトＩＬ−２（２０シータス単位／ｍＬ）を添加した。細胞を、７日ごとに再刺激した。３回目のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）後、細胞を、自己エプスタイン−バーウイルス形質転換Ｂ細胞を抗原提示細胞として用いて、比２：１で再刺激し、ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍＬ）を含有する培地中で維持した。
【０２０５】
最初の実験においては、正常なＨＬＡ−Ａ２のヒトドナーからの樹状細胞（ＤＣ）を：（１）培地単独（Ｍｅｄｉｕｍ）；（２）ＧＩ−６１０６−ＤＥＣ酵母（ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／０２４９７２号に以前記載された、中性ｐＨ条件下で増殖させた陽性コントロールの酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物）；（３）ＧＩ−６１０８酵母（ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３及びＨＬＡ−Ａ２４アゴニストエピトープを含むＭＵＣ１抗原を発現する、実施例２に記載の通りの、本発明の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物）；（４）ＧＩ−６１０８−ＤＥＣ（やはり実施例２に記載の通りに中性ｐＨ条件下で増殖させた、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３及びＨＬＡ−Ａ２４アゴニストエピトープを含むＭＵＣ１抗原を発現する、本発明の酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物）；及び（５）ＧＩ−Ｖｅｃ（酵母コントロール）、空のベクター（ＭＵＣ１抗原インサート無し）を含む酵母、で４８時間培養した。次いで、処理されたＤＣを、ＭＵＣ１特異的ＨＬＡ−Ａ２拘束性Ｔ細胞株Ｐ９３Ｌ，Ｃ１Ａ，Ｃ２Ａ，Ｃ３Ａ，Ｖ１Ａ及びＶ２Ａを刺激するそれらの能力を評価するために、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用いた（Ｔ細胞：ＤＣ比＝１０：１）。ＤＣの各セットにつ
いて、「Ｔ細胞なし」のコントロールも含めた。２４時間培養の上清を回収し、分泌インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）についてスクリーニングした。結果を表５に示す（Ｔ細胞によって産生されるＩＦＮ−γの量として、ｐｇ／ｍｌで表す）。
【０２０６】
【表５】
2020058350.tif 000007
【０２０７】
表５に示す通り、ＧＩ−６１０８で処理し、標準（ＧＩ−６１０８）及び中性ｐＨ（ＧＩ−６１０８−ＤＥＣ）条件の両方の下で製造した、いくつかの異なるＭＵＣ１アゴニストエピトープを発現する樹状細胞は、ＭＵＣ１特異的ＨＬＡ−Ａ２拘束性Ｔ細胞を刺激して、陽性コントロールと同様の様式及びレベルで、相当量のＩＦＮ−γを産生できた。
【０２０８】
第２の実験では、正常なＨＬＡ−Ａ３又はＨＬＡ−Ａ２４のヒトのドナーからのＤＣを：（１）培地単独（Ｍｅｄｉｕｍ）；（２）ＧＩ−６１０６−ＤＥＣ酵母；（３）ＧＩ−６１０８酵母；（４）ＧＩ−６１０８−ＤＥＣ；及び（５）ＧＩ−ＶＥＣ（酵母コントロール）と４８時間培養した。次いで、処理されたＤＣを、ＭＵＣ１特異的ＨＬＡ−Ａ３拘束性Ｔ細胞株Ｃ５Ａ又はＭＵＣ１特異的ＨＬＡ−Ａ２４拘束性Ｔ細胞株Ｃ６Ａを刺激するそれらの能力を評価するために、ＡＰＣとして用いた（Ｔ細胞：ＤＣ比＝１０：１）。ＤＣの各セットについて、「Ｔ細胞なし」コントロールも含めた。２４時間培養の上清を回収し、分泌ＩＦＮ−γについてスクリーニングした。結果を表６に示す（Ｔ細胞によって産生されるＩＦＮ−γの量として、ｐｇ／ｍｌで表す）。
【０２０９】
【表６】
2020058350.tif 000008
【０２１０】
表６に示す通り、ＧＩ−６１０８で処理し、標準（ＧＩ−６１０８）及び中性ｐＨ（ＧＩ−６１０８−ＤＥＣ）条件の両方の下で製造した、Ａ３及びＡ２４のＭＵＣ１アゴニストエピトープを発現する樹状細胞は、ＭＵＣ１特異的ＨＬＡ−Ａ３拘束性Ｔ細胞及びＭＵＣ１特異的ＨＬＡ−Ａ２４拘束性Ｔ細胞の両方を刺激して、陽性コントロールと同様の様式及びレベルで、相当量のＩＦＮ−γを産生できた。
【０２１１】
このデータは、ＭＵＣ１  ＨＬＡ−Ａ２４アゴニストエピトープＣ６Ａを用いて樹立したＭＵＣ１特異的ＨＬＡ−Ａ２４  Ｔ細胞株が、ＨＬＡ−Ａ２／Ａ３／Ａ２４  ＭＵＣ１アゴニストエピトープを含有する、酵母−ＭＵＣ１アゴニストコンストラクト（ＧＩ−６１０８及びＧＩ−６１０８−ＤＥＣ）で処理したヒトＤＣ（ＨＬＡ−Ａ２４陽性）により活性化され得、高レベルのＩＦＮ−γを産生し得ることを示す。更に、このデータは、ＧＩ−６１０６−ＤＥＣベクターがＨＬＡ−Ａ２４  ＭＵＣ１アゴニストエピトープを含有しないため、ＭＵＣ１  ＨＬＡ−Ａ２４アゴニストエピトープ特異的Ｔ細胞株が、天然のＨＬＡ−Ａ２４エピトープによって活性化され得ることを示す。
【０２１２】
実施例４
本実施例では、ＭＵＣ１陽性の癌を患う被験体における第１相臨床試験について説明する。
【０２１３】
オープンラベルの用量漸増第１相臨床試験を、実施例２に記載の、ＧＩ−６１０８として知られている酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物を用いて実行する（標準的な増殖条件の下、又は中性ｐＨ条件下のいずれかでの増殖）。ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、又はＨＬＡ−Ａ２４陽性であり得る、ＭＵＣ１陽性腫瘍を有する１２〜２４の被験体に、皮下投与された４ＹＵ（１ＹＵ×４部位）、１６ＹＵ（４ＹＵ×４部位Ｘ）、４０ＹＵ（１０ＹＵ×４部位）及び８０ＹＵ（２０ＹＵ×４部位）の用量範囲を利用する順次用量漸増コホートプロトコル（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｄｏｓｅ  ｃｏｈｏｒｔ  ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）で、酵母−ＭＵＣ１免疫療法組成物を投与する。酵母−ＭＵＣ１免疫療法は、２週間隔で３ヶ月間、その後毎月投与するか、又は毎月投与する。最大耐量（Ｍ
ＴＤ）又は観察された至適用量（ｂｅｓｔ  ｄｏｓｅ）での患者の拡大コホート（Ｎ＝１０）が、更なる研究のために選択される。結果は、一次エンドポイントとして安全性を、二次エンドポイントとして、抗原特異的Ｔ細胞応答（例、治療中に出現又は増幅する、ＭＵＣ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞）及び臨床活性をモニターする。
【０２１４】
ＧＩ−６１０８は、重大な毒性はなく、安全で、且つ忍容性が良好であると予想される。更に、ＧＩ−６１０８は、統計学的に有意な患者数で、治療により発生するＭＵＣ１特異的Ｔ細胞応答を、又はベースラインの、既存のＭＵＣ１特異的なＴ細胞応答の改善をもたらすことが期待される。一部の患者では、疾患が安定化することも期待される。
【０２１５】
実施例５
本実施例では、ＭＵＣ１−ＣのＨＬＡ−Ａ２４アゴニストエピトープが、ＭＵＣ１特異的細胞を活性化し得ることを実証する。
【０２１６】
ＭＵＣ１  ＨＬＡ−Ａ２４アゴニストエピトープＣ６Ａを用いて樹立したＭＵＣ１特異的ＨＬＡ−Ａ２４  Ｔ細胞株を、ＭＵＣ１  ＨＬＡ−Ａ２／Ａ３  ＭＵＣ１アゴニストエピトープ（ＭＶＡ−ｍＢＮ−ＣＶ３０１）を含有するポックスウイルス（ＭＶＡ）ベクターをトランスフェクトしたＨＬＡ−Ａ２４陽性ヒトＤＣで活性化した。特に、ヒトＤＣを、１０ＭＯＩの（１）ＭＶＡ−ｍＢＮ３３６クローン７３又は（２）ＭＶＡ−ｍＢＮ３３６クローン７７のいずれかで処理すると、高レベルのＩＦＮ−γが産生された（表７参照）。
【０２１７】
【表７】
2020058350.tif 000009
【０２１８】
表７に示す通り、ＭＶＡ−ｍＢＮ−ＣＶ３０１ベクターはＨＬＡ−Ａ２４  ＭＵＣ１アゴニストエピトープを含有しないため、ＭＵＣ１  ＨＬＡ−Ａ２４アゴニストエピトープ特異的Ｔ細胞株は、天然のＨＬＡ−Ａ２４エピトープによって活性化され得る。
【０２１９】
刊行物、特許出願及び特許を含む、本明細書中に引用した全ての参考文献は、それぞれの参考文献が参照によって組み込まれることが個々に且つ具体的に示されているのと同程度又はその全体が本明細書中に記載されているのと同程度まで、参照によって本明細書中に組み込まれる。
【０２２０】
本発明の説明に関して（特に、以下の特許請求の範囲に関して）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び「少なくとも１の（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書中に特記しないか文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方をカバーすると解釈すべきである。１以上の事項の列挙の後で「少なくとも１の」という用語の使用（例えば、「Ａ及びＢのうち少なくとも１の」）は、本明細書中に特記しない又は文脈と明らかに矛盾しない限り、列挙した事項（Ａ若しくはＢ）から選択された１の事項又は列挙した事項（Ａ及びＢ）のうち２以上の任意の組み合わせを意味すると解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特記しない限り、オープンエンドの用語（即ち、「〜を含むがそれらに限定されない」を意味する）と解釈すべきである。本明細書中の値の範囲の記述は、本明細書中に特記しない限り、その範囲内に入る各個別の値に個々に言及する省略方法として働くことのみを意図しており、各個別の値は、それが本明細書中に個々に記述されているかのように本明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中に特記しない又は文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施できる。本明細書中に提供される任意の及び全ての例又は例示的語句（例、「など（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、本発明をよりよく説明することのみを意図しており、特段特許請求されない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中の全ての語句は、特許請求されていない任意の要素を本発明の実施に必須のものとして示していると解釈すべきではない。
【０２２１】
発明を実施するための、発明者が知る最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書中に記載されている。本発明者らは、当業者がかかるバリエーションを適宜使用することを予期しており、本発明者らは、本明細書中に具体的に記載されたのとは異なる方法で本発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、適用法によって許容されるとおり、本明細書中に添付した特許請求の範囲に記載される対象の全ての改変及び均等物を含む。更に、その全ての可能なバリエーションでの上記要素の任意の組合せが、本明細書中に特記しない限り又は文脈と明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。
【配列表】
2020058350000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月11日(2019.12.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載されている発明。
【外国語明細書】
2020058350000001.pdf
2020058350000002.pdf
2020058350000003.pdf