(57)【要約】      （修正有）【課題】コエンザイムＱ１０生産微生物の、細胞中のコエンザイムＱ１０含有量を増大させる方法の提供。【解決手段】コエンザイムＱ１０生産微生物をエタノールを炭素源とし、１価の硝酸塩を培地に添加し、かつ培地中のアンモニウムイオンと硝酸イオンのモル比が１：４〜４：１の条件下で培養を行うコエンザイムＱ１０の製造方法。好ましくは、培地中の全窒素源濃度が１０〜２００ｍＭの条件で培養を行う製造方法であり、また、１価の硝酸塩が硝酸アンモニウムである製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コエンザイムＱ１０生産微生物をエタノールを炭素源とし、１価の硝酸塩を培地に添加し、かつ培地中のアンモニウムイオンと硝酸イオンのモル比が１：４〜４：１の条件下で培養を行うコエンザイムＱ１０の製造方法。
【請求項２】
培地中の全窒素源濃度が１０〜２００ｍＭの条件で培養を行う請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
１価の硝酸塩が硝酸アンモニウムである請求項１または２記載の製造方法。
【請求項４】
培地中のエタノール濃度が０．１〜２容量％である請求項１〜３いずれか１項記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物によるコエンザイムＱ１０の製造方法に関する。さらに詳しくは、コエンザイムＱ１０生産能を有する微生物の培養に適した培地成分に関する。
【背景技術】
【０００２】
コエンザイムＱ１０は、人の生体内の細胞中におけるミトコンドリアの電子伝達系構成因子であり、酸化的リン酸化反応における電子の運搬子として働くことによりATPの生成に関与している。従来から、コエンザイムＱ１０は、各種疾病に対して優れた薬理及び生理効果を示す物質として、医薬品以外にも栄養補助食品や化粧品に使用される等、幅広い用途で用いられている。
【０００３】
コエンザイムＱ１０の製造法として化学合成法や微生物発酵法が知られている。微生物を用いたコエンザイムＱ１０の製造法において、一般的な培養条件では、微生物内のコエンザイムＱ１０の含量がそれほど高くないため、コエンザイムＱ１０を安価に生産することが困難となっている。そこで、特許文献１では、コエンザイムＱ１０の生産能を有するシュードモナス属の細菌の培養において、菌体内のコエンザイムＱ１０の含量を増加させるために窒素源としてコーンスティブリカーが用いられている。また、特許文献２では、微生物細胞中のコエンザイムＱ１０含量を増加させるための添加剤として、Ｔｗｅｅｎ４０やＴｗｅｅｎ８０のような脂肪酸部分の炭素数が１４〜１８のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの利用が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開昭６３−０１０９９６号公報
【特許文献２】特開２０１３−０７８２９１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、これらの添加剤による微生物中のコエンザイムＱ１０含量の向上効果は十分でなく、コエンザイムＱ１０のより効率的な製造方法が求められていた。本発明は、コエンザイムＱ１０生産微生物の、細胞中のコエンザイムＱ１０含有量を増大させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は上記課題を解決するべく検討を重ねた結果、生育培地に硝酸イオンを適切な濃度で添加することにより、単位菌体当たりのコエンザイムＱ１０の含量を顕著に増大させ、しかもコエンザイムＱ１０の生産に必要な炭素源の量も低下させることができるということを見出した。すなわち、本発明は、コエンザイムＱ１０生産微生物を、エタノールを炭素源とし、１価の硝酸塩を培地に添加し、かつ培地中のアンモニウムイオンと硝酸イオンのモル比が１：４〜４：１の条件下で培養を行うコエンザイムＱ１０の製造方法である。好ましくは、培地中の全窒素源濃度が１０〜２００ｍＭの条件で培養を行う上記製造方法である。また、好ましくは、１価の硝酸塩が硝酸アンモニウムである上記製造方法である。また、好ましくは、培地中のエタノール濃度が０．１〜２容量％である上記製造方法である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、安価かつ簡便な方法で、コエンザイムＱ１０生産微生物の細胞中のコエンザイムＱ１０含有量を、顕著に増加させることができ、さらには炭素源として使用するエタノールの消費量も抑えることができる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明のコエンザイムＱ１０の製造方法は、コエンザイムＱ１０生産微生物を、エタノールを炭素源とし、１価の硝酸塩を培地に添加し、かつ培地中のアンモニウムイオンと硝酸イオンのモル比が１：４〜４：１の条件下で培養を行うコエンザイムＱ１０の製造方法である。
【０００９】
本発明で用いられるコエンザイムＱ１０生産微生物としては、コエンザイムＱ１０を生産することが出来る微生物であれば、細菌、酵母、カビのいずれも制限無く使用することができるが、培地当たりのコエンザイムＱ１０の生産能力として、１μｇ／ｍＬ以上、好ましくは２μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは３μｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは５μｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは１０μｇ／ｍＬ以上の生産能力を有する微生物を用いるのが良い。なおここでいう生産能力は、従来公知の一般的な培養法における生産能力を意味し特に限定されないが、例えば後述する実施例で比較対象とした、１価の硝酸塩無添加の条件で培養した場合の生産能力である。そのようなコエンザイムＱ１０生産微生物としては、具体的には、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、アミノバクター（Ａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロモナス（Ａｇｒｏｍｏｎａｓ）属、アシドフィラス（Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ）属、ブレロミセス（Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ブレラ（Ｂｕｌｌｅｒａ）属、ブレブンジモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、キオノスファエラ（Ｃｈｉｏｎｏｓｐｈａｅｒａ）属、カンジタ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、セリノステルス（Ｃｅｒｉｎｏｓｔｅｒｕｓ）属、エキソフィアラ（Ｅｘｉｓｏｐｈｉａｌａ）属、エキソバシジウム（Ｅｘｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、フィロミセス（Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ）属、フィロバシジエラ（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ）属、フィロバシジウム（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、ゲオトリカム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、グラフィオラ（Ｇｒａｐｈｉｏｌａ）属、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、コッコバエラ（Ｋｏｃｋｏｖａｅｌｌａ）属、クルツマノミセス（Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ）属、ララリア（Ｌａｌａｒｉａ）属、ロイコスポリジウム（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、レギオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミコプラナ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ）属、オースポリジウム（Ｏｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、シュドジマ（Ｐｓｅｄｏｚｙｍａ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、ペトロミセス（Ｐｅｔｒｏｍｙｃ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、リゾモナス（Ｒｈｉｚｏｍｏｎａｓ）属、ロドビウム（Ｒｈｏｄｏｂｉｕｍ）属、ロドプラネス（Ｒｈｏｄｏｐｌａｎｅｓ）属、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、スポリジオボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、サイトエラ（Ｓａｉｔｏｅｌｌａ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属、スポトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、シンポジオミコプシス（Ｓｙｍｐｏｄｉ��ｍｙｃｏｐｓｉｓ）属、ステリグマトスポリジウム（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、タファリナ（Ｔａｐｈａｒｉｎａ）属、トレメラ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、チレチアリア（Ｔｉｌｌｅｔｉａｒｉａ）属、チレチア（Ｔｉｌｌｅｔｉａ）属、トリポスポリウム（Ｔｏｌｙｐｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、チレチオプシス（Ｔｉｌｌｅｔｉｏｐｓｉｓ）属、ウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属、ウデニオミセス（Ｕｄｅｎｉｏｍｙｃｅ）属、キサントフィロミセス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｌｌｏｍｙｃｅｓ）属、キサントバクテリウム（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）属、ペキロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、ハイホモナス（Ｈｙｈｏｍｏｎｕｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属等の微生物を挙げることができる。
【００１０】
培養の容易さや生産性の観点からは、細菌（好ましくは非光合成細菌）及び酵母が好ましく、例えば、細菌ではアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属等が、酵母ではシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、サイトエラ（Ｓａｉｔｏｅｌｌａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属等が挙げられる。好ましい種としては、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ  ＩＦＯ１３２６３）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  ＡＴＣＣ４７１８）、アスペルギルス・クラバータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ  ＪＣＭ１７１８）、アセトバクター・キシリヌム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍ  ＩＦＯ１５２３７）、アミノバクター・アガノウエンシス（Ａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ａｇａｎｏｕｅｎｓｉｓ  ＪＣＭ７８５４）、アグロモナス・オリゴトロフィカ（Ａｇｒｏｍｏｎａｓ  ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈｉｃａ  ＪＣＭ１４９４）、アシドフィラス・ムルチボルム（Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ  ＪＣＭ８８６７）、ブレロミセス・アルバス（Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｓ  ＩＦＯ１１９２）、ブレラ・アルメニカ（Ｂｕｌｌｅｒａ  ａｒｍｅｎｉａｃａ  ＩＦＯ１０１１２）、ブレブンジモナス・ジミヌタ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ  ＪＣＭ２７８８）、クリプトコッカス・ラウレンティー（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｕｒｅｎｔｉｉ  ＩＦＯ０６０９）、キオノスファエラ・アポバシジアリス（Ｃｈｉｏｎｏｓｐｈａｅｒａ  ａｐｏｂａｓｉｄｉａｌｉｓ  ＣＢＳ７４３０）、カンジタ・クルバータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｕｒｖａｔａ  ＡＴＣＣ１０５６７）、セリノステルス・ルテオアルバス（Ｃｅｒｉｎｏｓｔｅｒｕｓ  ｌｕｔｅｏａｌｂｕｓ  ＪＣＭ２９２３）、エキソフィアラ・アルカロフィラ（Ｅｘｉｓｏｐｈｉａｌａ  ａｌｃａｌｏｐｈｉｌａ  ＪＣＭ１２５１９）、エキソバシジウム・グラシル（Ｅｘｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｇｒａｃｉｌｅ  ＩＦＯ７７８８）、フィロミセス・フゾエンシス（Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｚｈｏｕｅｎｓｉｓ  ＩＦＯ１０３７４）、フィロバシジエラ・ネオフォルマス（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ＣＢＳ１３２）、フィロバシジウム・カプスロイゲヌム（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｃａｐｓｕｌｏｉｇｅｎｕｍ  ＣＢＳ１９０６）、ゲオトリカム  ・カピタウム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｐｉｔａｔｕｍ  ＪＣＭ６２５８）、グラフィオラ・シリンドリカム（Ｇｒａｐｈｉｏｌａ  ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ  ＩＦＯ６４２６）、グルコノバクター・スボキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ  ＩＦＯ３２５７）、コッコバエラ・イムペラタエ（Ｋｏｃｋｏｖａｅｌｌａ  ｉｍｐｅｒａｔａｅ  ＪＣＭ７８２６）、クルツマノミセス・ネクタイレイ（Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ  ｎｅｃｔａｉｒｅｉ  ＩＦＯ１０１１８）、ララリア・セラシ（Ｌａｌａｒｉａ  ｃｅｒ��ｓｉ  ＣＢＳ２７５．２８）、ロイコスポリジウム・スコティー（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｓｃｏｔｔｉｉ  ＩＦＯ１２１２）、レギオネラ・アニーサ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ａｎｉｓａ  ＪＣＭ７５７３）、メチロバクテリウム・エキトルグエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｇｕｅｎｓ  ＪＣＭ２８０２）、ミコプラナ・ラモーサ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｒａｍｏｓａ  ＪＣＭ７８２２）、オースポリジウム・マルガリチフェルム（Ｏｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｍａｒｇａｒｉｔｉｆｅｒｕｍ  ＣＢＳ２５３１）、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ  ＩＡＭ  １２０２３）、シュードモナス・シルキリエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｈｕｙｌｋｉｌｌｉｅｎｓｉｓ  ＩＡＭ  １０９２）、シュドジマ・アフィジス（Ｐｓｅｄｏｚｙｍａ  ａｐｈｉｄｉｓ  ＣＢＳ５１７．２３）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ  ＪＣＭ６８９２）、ペトロミセス・アリアセウス（Ｐｅｔｒｏｍｙｃｅｓ  ａｌｌｉａｃｅｕｓ  ＩＦＯ７５３８）、ロドトルラ・グルティニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ  ＩＦＯ１１２５）、ロドトルラ・ミヌタ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ  ＩＦＯ０３８７）、ロドスポリジウム・ジオボバツム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｏｂｏｖａｔｕｍ  ＡＴＣＣ１８３０）、リゾモナス・スベリファシエンス（Ｒｈｉｚｏｍｏｎａｓ  ｓｕｂｅｒｉｆａｃｉｅｎｓ  ＩＦＯ１５２１２）、ロドビウム・オリエンツ（Ｒｈｏｄｏｂｉｕｍ  ｏｒｉｅｎｔｓ  ＪＣＭ９３３７）、ロドプラネス・エレガンス（Ｒｈｏｄｏｐｌａｎｅｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  ＪＣＭ９２２４）、ロドシュードモナス・パルトリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  ＪＣＭ２５２４）、ロドバクター・カプスレータス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＳＢ１００３）、スポロボロミセス・ホルサティカス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｈｏｌｓａｔｉｃｕｓ  ＩＦＯ１０３４）、スポロボロミセス・パラロセウス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ  ＩＦＯ０４７１）、スポリジオボラス・ジョンソニー（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ＩＦＯ１８４０）、サイトエラ・コンプリカタ（Ｓａｉｔｏｅｌｌａ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔａ  ＩＦＯ１０７４８）、シゾサッカロミセス・ポンペ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  ＩＦＯ０３４７）、スフィンゴモナス・パラパウシモビリス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｐａｒａｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ  ＩＦＯ１５１００）、スポトリクム・セルロフィリウム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｐｈｉｌｉｕｍ  ＡＴＣＣ２０４９３）、シンポジオミコプシス・パフィオペジリ（Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｐａｐｈｉｏｐｅｄｉｌｉ  ＪＣＭ８３１８）、ステリグマトスポリジウム・ポリモルファ（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｍ  ＩＦＯ１０１２１）、スフィンゴモナス・アドヘシバ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ａｄｈｅｓｉｖａ  ＪＣＭ７３７０）、タファ���ナ・カエルレスセンス（Ｔａｐｈａｒｉｎａ  ｃａｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ  ＣＢＳ３５１．３５）、トレメラ・メセンテリカ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ  ＡＴＣＣ２４４３８）、トリコスポロン・クタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｃｕｔａｎｅｕｍ  ＩＦＯ１１９８）、チレチアリア・アノマラ（Ｔｉｌｌｅｔｉａｒｉａ  ａｎｏｍａｌａ  ＣＢＳ４３６．７２）、チレチア・カリエス（Ｔｉｌｌｅｔｉａ  ｃａｉｅｓ  ＪＣＭ１７６１）、トリポスポリウム・ブラタム（Ｔｏｌｙｐｏｓｐｏｒｉｕｍｂｕｌｌａｔｕｍ  ＪＣＭ２００６）、チレチオプシス・ワシントネシス（Ｔｉｌｌｅｔｉｏｐｓｉｓ  ｗａｓｈｉｎｔｏｎｅｓｉｓ  ＣＢＳ５４４）、ウスチラゴ・エスクレンタ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ  ＩＦＯ９８８７）、ウデニオミセス・メガロスポラス（Ｕｄｅｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｍｅｇａｌｏｓｐｏｒｕｓ  ＪＣＭ５２６９）、キサントフィロミセス・デンドロロウス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ  ＩＦＯ１０１２９）、キサントバクテリウム・フラブス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ  ｆｌａｖｕｓ  ＪＣＭ１２０４）、ペキロマイセス・リアシヌス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｌａｃｉｎｕｓ  ＡＴＣＣ１０１１４）、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ  ＡＴＣＣ１１５５０）、ハイホモナス・ヒシアナ（Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ  ｈｉｒｓｃｈｉａｎａ  ＡＴＣＣ３３８８６）、リゾビウム・メロッティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ  ＡＴＣＣ９９３０）等が挙げられる。
【００１１】
本発明におけるコエンザイムＱ１０生産微生物としては、上記微生物の野生株のみならず、例えば、上記の微生物のコエンザイムＱ１０生合成に関与する遺伝子の転写及び翻訳活性、或いは発現蛋白質の酵素活性を、改変或いは改良した微生物も好ましく使用することができる。遺伝子の転写及び翻訳活性、或いは発現蛋白質の酵素活性を、改変或いは改良する手段としては、遺伝子組換え（自己遺伝子の改良、増幅、破壊や、外来遺伝子の導入及び該遺伝子の改良、増幅を含む）や、変異源による変異誘発が挙げられるが、変異源による変異誘発が好ましい。
【００１２】
変異誘発は単一の変異誘発として行うことができるが、各変異誘発段階によりコエンザイムＱ１０を生産する能力が改良されうることから、２回以上の変異誘発を行うのが好ましい。変異誘発処理にかけられる微生物細胞の候補としては、通常は、前記増殖方法並びに測定方法により評価した場合にできるだけ高いコエンザイムＱ１０生産能力を有するものが好ましいことは言うまでもない。例えばこのような変異誘発を行った場合、培地当たりのコエンザイムＱ１０の生産能力として、上述した範囲のみならず、より好ましくは１５μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは２０μｇ／ｍＬ以上の生産能力を有する微生物をも用いることが出来る。
【００１３】
変異誘発処理は、任意の適当な変異源を用いて行うことができる。「変異源」なる語は、広義の意味において、例えば変異誘発効果を有する薬剤のみならず、ＵＶ照射のような変異誘発効果を有する処理も含む。適当な変異源の例として、エチルメタンスルホネート、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、ブロモウラシルのようなヌクレオチド塩基類似体及びアクリジン類等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。常用の変異誘発技法に従えば、変異誘発に続き、より高いコエンザイムＱ１０生産能力を有する微生物細胞の適切な選択を行うことができる。
【００１４】
本発明において、生産されるコエンザイムＱ１０の形態としては、酸化型あるいは還元型のどちらでも良く、その混合物でも良い。
【００１５】
本発明で用いられる培地のベースとしては、微生物の増殖に適した多量栄養素や微量栄養素を含む一般的な培地が使用できる。上記栄養素としては、例えば、炭素源（例えば、グルコース、シュークロース、マルトース、デンプン、コーンシロップ、糖蜜等の炭水化物；メタノール、エタノール等のアルコール等）、窒素源（例えば、コーンスチープリカー、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、尿素、ペプトン、イーストエキス、大豆タンパク等）、リン源（例えば、リン酸アンモニウム、リン酸等）、並びに、微量栄養素（例えば、マグネシウム、カリウム、亜鉛、銅、鉄、マンガン、モリブデン、硫酸、塩酸等のミネラル；ビオチン、デスチオビオチン、ビタミンＢ１等のビタミン類；アラニン、ヒスチジン等のアミノ酸；酵母エキスやマルトエキスのビタミン類を含有する天然原料等）からなるが、これらに制限されるものではない。なお、酵母エキス等の天然培地成分中には、リン酸塩等のリン源も含まれる。また、上記の栄養素は、適宜、組み合わせて用いられる。ただし、本発明の製造方法においては、炭素源として少なくともエタノールを使用する必要がある。炭素源として、エタノールを単独で使用してもよく、他の炭素源と併用して用いても良いが、エタノールのみを炭素源として使用するのが好ましい。いずれの場合であっても、培地中のエタノール濃度は０．１〜２容量％であるのが好ましく、０．３〜１．５容量％であるのがより好ましい。
【００１６】
特に工業規模での発酵生産においては、微生物の種類にもよるが、培養中、エタノールを含めた炭素源の濃度を、コエンザイムＱ１０生産能力に実質的に悪影響を及ぼさない濃度に制御するのが好ましい。よって、培養液中の炭素源の濃度が、コエンザイムＱ１０生産能力に実質的に悪影響を及ぼさない濃度、つまり、通常２０ｇ／Ｌ以下、好ましくは５ｇ／Ｌ以下、より好ましくは４ｇ／Ｌ以下となるように、培養を制御するのが好ましい。
【００１７】
炭素源の濃度制御のためには、流加培養法を採用するのが好ましい。ｐＨ、溶存酸素濃度（ＤＯ）或いは残糖濃度等の培養管理指標に基づき、栄養源（特に炭素源）の供給を調節することにより、培養液中の炭素源濃度を制御することができる。栄養源の供給は、微生物の種類にもよるが、培養の当初から開始しても良いし、培養途中から開始してもよい。
【００１８】
本発明では、培地中に１価の硝酸塩を添加する必要がある。その際、用いられる１価の硝酸塩としては特に限定されないが、硝酸アンモニウム、硝酸カリウム、硝酸ナトリウムが好ましく、硝酸アンモニウムが最も好ましい。さらに、本発明においては、培地中のアンモニウムイオンと硝酸イオンのモル比を１：４〜４：１の条件となるように制御する必要がある。そのため、硝酸塩として、硝酸アンモニウム以外の塩を用いる場合は、当該硝酸塩と、アンモニウムイオンの供給源となるアンモニウム塩とを、培地中のアンモニウムイオンと硝酸イオンのモル比を１：４〜４：１の条件となるように適宜組み合わせて使用することができる。この場合、使用するアンモニウム塩としては特に限定されないが、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、水酸化アンモニウムなどが好ましく、硫酸アンモニウムがより好ましい。一方、硝酸塩として硝酸アンモニウムを用いた場合には、アンモニウムイオンと硝酸イオンのモル比は１：１となるため、他のアンモニウム塩を併用する必要はないが、併用しても差し支えない。また、培地中のアンモニウムイオンと硝酸イオンのモル比を１：４〜４：１の範囲内となる限り、硝酸アンモニウムとその他の硝酸塩を組み合わせて使用することも出来る。本発明においてアンモニウムイオンと硝酸イオンのモル比は上記１：４〜４：１を満たせばよいが、３：７〜７：３の範囲内となるのが好ましい。
【００１９】
本発明においては、培地中の全窒素源濃度が１０〜２００ｍＭの条件で培養を実施するのが好ましく、１０〜７０ｍＭの範囲内がより好ましい。この場合の窒素源としては、培地のベースに含まれる窒素源（例えば、コーンスチープリカー、尿素、ペプトン等）の他、アンモニウムイオン源として添加された硝酸アンモニウムや、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどのアンモニウム塩も含まれる。なお、本発明においては、添加する１価の硝酸塩として硝酸アンモニウムを使用する場合は、当該硝酸アンモニウムのみを窒素源として利用することも出来る。
【００２０】
本発明の製造方法においては、上記硝酸塩や窒素源などの栄養源を培養開始時から所定の量培地に添加してもよく、培養中に適宜添加することで供給しても良い。その供給は、連続的であっても良いし、断続的であってもよいが、流加するのが好ましい。硝酸塩や窒素源を流加する場合、アンモニウムイオンと硝酸イオンの比が培養期間を通じて１：４〜４：１になるように制御するのが好ましい。
【００２１】
培養時の温度は、通常、１５〜４５℃、好ましくは２０〜３７℃である。１５℃未満では、微生物の増殖速度が低くなる傾向があり、４５℃を越える高温では、微生物の生存が阻害され易い傾向にある。
【００２２】
培養時のｐＨは、通常４〜９、好ましくは５〜８である。ｐＨ３以下及び、ｐＨ１０以上では、いずれも微生物の増殖が阻害され易い傾向がある。
【００２３】
培養は、所望のコエンザイムＱ１０の生産量に達した時点で終了することができる。培養時間は特に制限されないが、好ましくは、２０〜２００時間であり、特に好ましくは、６０〜１５０時間である。
【００２４】
上記の培養は、通常、好気的に行われる。ここで、「好気的」なる語は、培養中に酸素の制限（酸素の欠乏）が生じないように酸素の供給が行われることを意味し、好ましくは、培養中に酸素の制限が実質的に生じないように酸素の供給が充分に行われることを意味する。培養は、通常は通気下、好ましくは通気攪拌下に行われる。
【００２５】
本発明では、コエンザイムＱ１０生産微生物を用いて、上記のようにして、１価の硝酸塩を添加し、アンモニウムイオンと硝酸イオンのモル比を１：４〜４：１の範囲に設定した生育培地にて培養することで、培地当たりのコエンザイムＱ１０濃度として、３０μｇ／ｍＬ以上、好ましくは６０μｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは７０μｇ／ｍＬ以上という高い値で、コエンザイムＱ１０を生産することができる。
【００２６】
次に、上記培養により生産されたコエンザイムＱ１０の回収について説明する。コエンザイムＱ１０の回収は、公知の方法にて行うことができる。例えば、上記培養で得られた微生物細胞からの有機溶剤を用いる抽出が一般的である。
抽出に用いる有機溶剤としては、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、アルコール類、脂肪酸類、ケトン類、窒素化合物類（ニトリル類、アミド類を含む）、硫黄化合物類等を挙げることができる。
【００２７】
上記有機溶剤のうち、微生物細胞又は該細胞破砕物の湿菌体や乾燥菌体から、コエンザイムＱ１０を抽出・回収するには、親水性有機溶剤を用いるのが好ましい。具体的には、アルコール類としては特に制限されないが、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールが好ましく、ケトン類としてはアセトン、窒素化合物類としてはアセトニトリルが好ましい。
【００２８】
また、上記有機溶剤のうち、微生物細胞又は該細胞破砕物の水性懸濁液から、コエンザイムＱ１０を抽出・回収するには、疎水性有機溶剤を用いるのが好ましく、これは微生物由来の水溶性物質の除去を助成する。また、疎水性有機溶剤としては、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類が好ましい。炭化水素類としては、特に制限されないが、例えば、ヘキサン、ヘプタンが好ましい。
【００２９】
上記の親水性有機溶剤と疎水性有機溶剤の使用量としては、特に制限はされないが、抽出時の濃度として、全溶液の容量に対して、好ましくは親水性有機溶剤が５〜５０容量％、疎水性有機溶剤が２５〜６５容量％の範囲である。両者は混合して使用しても良い。コエンザイムＱ１０の回収において、抽出時の温度は、特に制限さない。
【００３０】
このようにして得られたコエンザイムＱ１０を含有する抽出液を、所望によりカラムクロマトグラフィー、還元処理等により精製した後、晶析操作を用いて、高純度のコエンザイムＱ１０結晶を取得することができる。
【実施例】
【００３１】
以下に実施例を挙げて本発明を詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００３２】
（実施例１）  
コエンザイムＱ１０生産微生物であるロドトルラ・グルティニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）ＩＦＯ１１２５株を、試験管を用いて３ｍＬの培地（リン酸二水素カリウム２９４ｍＭ、リン酸水素二ナトリウム９．０９ｍＭ、塩化ナトリウム１．７１ｍＭ、硫酸マグネシウム７水和物３．２５ｍＭ、硫酸亜鉛７水和物０．２０９ｍＭ、硫酸鉄（II）７水和物０．３２４ｍＭ、硫酸マンガン無水和物０．０６６２ｍＭ、硫酸銅（II）５水和物０．０２ｍＭ、ビタミンＢ１  ３ｐｐｍ、グルコース８３．３ｍＭ、硫酸アンモニウム７５．７ｍＭ、ｐＨ６．０）中で４０〜４２時間培養した。５００ｍＬ容坂口フラスコを用いて、４５ｍＬの培地（リン酸二水素カリウム２９４ｍＭ、リン酸水素二ナトリウム９．０９ｍＭ、塩化ナトリウム１．７１ｍＭ、硫酸マグネシウム７水和物３．２５ｍＭ、硫酸亜鉛７水和物０．２０９ｍＭ、硫酸鉄（II）７水和物０．３２４ｍＭ、硫酸マンガン無水和物０．０６６２ｍＭ、硫酸銅（II）５水和物０．０２ｍＭ、ビタミンＢ１  ３ｐｐｍ、エタノール１容量％からなる基本培地に、硝酸アンモニウムを３０．３ｍＭとなるように添加し、水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ５．５に調整）に、上記試験管培養後の培養液を種菌として播種し、７２時間培養した。培養終了後、培養液を５ｍＬ採取し、遠心分離により湿菌体ペーストを得た。得られた菌体に抽出溶媒（メタノール／クロロホルム＝４／１）を５ｍＬ添加し、６分間攪拌してコエンザイムＱ１０の抽出を行った。得られた溶媒相を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析して、コエンザイムＱ１０生産量を調べた。一方、培養終了後の培養液を一定量採取し、同様に湿菌体ペーストとした上でさらに一晩以上１６０℃で乾燥させ、培養液１ｍＬあたりの乾燥菌体重量を求めた。また、フラスコ培養０時間目と７２時間後の培養液中のエタノール濃度を、それぞれガスクロマトグラフィーにより測定し、フラスコ培養時におけるエタノールの消費量を算出した。
【００３３】
上記コエンザイムＱ１０生産量とエタノール消費量について、後述する比較例１の結果を１００として相対的に評価した結果を表１に示す。硫酸アンモニウムの代わりに１価の硝酸塩である硝酸アンモニウムを培地に添加することで、コエンザイムＱ１０の生産量は、培養液１Ｌあたりで約３％、菌体１ｇ当たりでは約２５％増加することがわかった。一方、エタノール消費量は、約１３％低減できることもわかった。
【００３４】
（実施例２）    
実施例１と同様の手順で試験管培養を行い、その培養液を５００ｍL容坂口フラスコを用いて、４５ｍＬの培地（実施例１のフラスコ培養の基本培地に、アンモニウムイオンと硝酸イオンのモル比が３：７、１：１、７：３となるように、硫酸アンモニウムをそれぞれ９．０９、１５．１５、２１．２ｍＭと、硝酸カリウムをそれぞれ４２．４、３０．３、１８．２ｍＭ添加し、水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ５．５に調整した培地）に播種し、７２時間培養した。実施例１と同様の手順で、コエンザイムＱ１０の生産量とエタノール消費量を定量し、比較例１の結果と相対的に評価した。その結果を表１に示す。
【００３５】
上記結果から、アンモニウムイオンと硝酸イオンのモル比が３：７、１：１、７：３の条件において、１価の硝酸塩として硝酸カリウムを用いた場合でも、コエンザイムＱ１０の生産量は比較例１と比べて増加し、特にアンモニウムイオンと硝酸イオンのモル比が１：１の場合に菌体１ｇあたりの量が最大となることがわかった。さらに、いずれも場合においても、エタノール使用量は低減できることもわかった。
【００３６】
（比較例１）  
実施例１と同様の手順で試験管培養を行い、その培養液を５００ｍL容坂口フラスコを用いて、４５ｍＬの培地（実施例１のフラスコ培養の基本培地に、硫酸アンモニウムを３０．３ｍＭ添加し、水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ５．５に調整した培地）に播種し、７２時間培養した。実施例１と同様の手順で、コエンザイムＱ１０の生産量とエタノール消費量を定量した。その数値を、実施例１，２，比較例２，３の相対評価における基準値とした。
【００３７】
（比較例２）  
実施例１と同様の手順で試験管培養を行い、その培養液を５００ｍL容坂口フラスコを用いて、４５ｍＬの培地（実施例１のフラスコ培養の基本培地に、アンモニウムイオンと硝酸イオンのモル比が３：７、１：１、７：３となるように、硫酸アンモニウムをそれぞれ、９．０９、１５．１５、２１．２ｍＭと、硝酸マグネシウムをそれぞれ２１．２、１５．１５、９．０９ｍＭ添加し、水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ５．５に調整した培地）に播種し、７２時間培養した。実施例１と同様の手順で、コエンザイムＱ１０の生産量とエタノール消費量を定量し、比較例１の結果と相対的に評価した。その結果を表１に示す。
【００３８】
上記結果から、硝酸塩として２価の硝酸塩である硝酸マグネシウムを添加した場合では、いずれの条件においても、菌体１ｇ当たりのコエンザイムＱ１０の量は増加するものの、培養液１Ｌ当たりのコエンザイムＱ１０の量は減少し、エタノール消費量の低減効果もほとんどないことがわかった。
【００３９】
（比較例３）  
実施例１と同様の手順で試験管培養を行い、その培養液を５００ｍL容坂口フラスコを用いて、４５ｍＬの培地（実施例１のフラスコ培養の基本培地に、アンモニウムイオンと硝酸イオンのモル比が３：７、１：１、７：３となるように、硫酸アンモニウムをそれぞれ９．０９、１５．１５、２１．２ｍＭと、硝酸カルシウムをそれぞれ２１．２、１５．１５、９．０９ｍＭ添加し、水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ５．５に調整した培地）に播種し、７２時間培養した。実施例１と同様の手順で、コエンザイムＱ１０の生産量とエタノール消費量を定量し、比較例１の結果と相対的に評価した。その結果を表１に示す。
【００４０】
上記結果から、硝酸塩として２価の硝酸塩である硝酸カルシウムを添加した場合では、いずれの条件においても、培養液１Ｌ当たりのコエンザイムＱ１０の量も、菌体１ｇ当たりのコエンザイムＱ１０の量のいずれも減少し、さらに、エタノール消費量は増加することがわかった。
【００４１】
【表１】
2020058242.tif 000002
【００４２】
（実施例３）    
実施例１と同様の手順で試験管培養を行い、その培養液を５００ｍL容坂口フラスコを用いて、４５ｍＬの培地（実施例１のフラスコ培養の基本培地に、アンモニウムイオンと硝酸イオンのモル比が３：７、１：１、７：３となるように、硫酸アンモニウムをそれぞれ９．０９、１５．１５、２１．２ｍＭと、硝酸ナトリウムをそれぞれ４２．４、３０．３、１８．２ｍＭを添加し、水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ５．５に調整した培地）に播種し、７２時間培養した。また、比較対象として、フラスコ培養において硝酸ナトリウムを添加せず、代わりに硫酸アンモニウムのみを３０．３ｍＭ添加した以外は同条件で培養を実施した。実施例１と同様の手順で、コエンザイムＱ１０の生産量とエタノール消費量を定量し上記比較対象の結果を１００として相対的に評価した。その結果を表２に示す。
【００４３】
上記結果から、アンモニウムイオンと硝酸イオンのモル比が３：７、１：１、７：３の条件において、１価の硝酸塩として硝酸ナトリウムを用いた場合、コエンザイムＱ１０の生産量は培養液１Ｌあたり最大で約７％増加し、特に、菌体１ｇ当たりのコエンザイムＱ１０の量が顕著に増加し、特にアンモニウムイオンと硝酸イオンのモル比が１：１の場合に最大で約１３％増加することがわかった。さらに、エタノール消費量についても、最大で約１３％低減できることがわかった。
【００４４】
【表２】
2020058242.tif 000003
【００４５】
（比較例４）  
実施例１と同様の手順で試験管培養を行い、その培養液を５００ｍL容坂口フラスコを用いて、４５ｍＬの培地（実施例１のフラスコ培養の基本培地に、アンモニウムイオンと硝酸イオンのモル比が１：９、９：１、０：１となるように、硫酸アンモニウムをそれぞれ３．０３ｍＭ、２７．３ｍＭ、０ｍＭ、硝酸カリウムをそれぞれ５４．５ｍＭ、６．０６ｍＭ、６０．６ｍＭ添加し、水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ５．５に調整した培地）に播種し、７２時間培養した。また、比較対象として、フラスコ培養において硝酸カリウムを添加せず、代わりに硫酸アンモニウムを３０．３ｍＭ添加した以外は同条件で培養を実施した。実施例１と同様の手順で、コエンザイムＱ１０の生産量とエタノール消費量を定量し上記比較対象の結果を１００として相対的に評価した。その結果を表３に示す。
【００４６】
上記結果から、いずれの条件においても培養液１Ｌ当たりのコエンザイムＱ１０の量が大幅に減少するなど、硝酸塩の添加効果がないことがわかった。
【００４７】
（比較例５）  
実施例１と同様の手順で試験管培養を行い、その培養液を５００ｍL容坂口フラスコを用いて、４５ｍＬの培地（実施例１のフラスコ培養の基本培地に、アンモニウムイオンと硝酸イオンのモル比が１：９、９：１、０：１となるように、硫酸アンモニウムをそれぞれ３．０３ｍＭ、２７．３ｍＭ、０ｍＭ、、硝酸ナトリウムをそれぞれ５４．５ｍＭ、６．０６ｍＭ、６０．６ｍＭ添加し、水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ５．５に調整した培地）に播種し、７２時間培養した。また、比較対象として、フラスコ培養において硝酸ナトリウムを添加せず、代わりに硫酸アンモニウムを３０．３ｍＭ添加した以外は同条件で培養を実施した。実施例１と同様の手順で、コエンザイムＱ１０の生産量とエタノール消費量を定量し上記比較対象の結果を１００として相対的に評価した。その結果を表３に示す。
【００４８】
上記結果から、いずれの条件においても培養液１Ｌ当たりのコエンザイムＱ１０の量が減少するなど、硝酸塩を添加した効果がないことがわかった。
【００４９】
【表３】
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