(57)【要約】【課題】腫瘍の転移を抑制又は予防するための医薬組成物の提供。【解決手段】B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を含む、腫瘍の転移を抑制又は予防するための医薬組成物。【選択図】図５
2020019714.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を含む、腫瘍の転移を抑制又は予防するための医薬組成物。
【請求項２】
B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を含む、フィブリノーゲンを低減するための医薬組成物。
【請求項３】
前記B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞が、当該医薬組成物の投与対象由来である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞において、血液凝固第X因子の発現が増大されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞が、CCL2又はCXCL1で処理されたものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞が、遺伝子改変されていない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を、生体外で、CCL2又はCXCL1で処理することを含む、血液凝固第X因子の発現が増大されたB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を製造するための方法。
【請求項８】
B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞における血液凝固第X因子の発現を増強するための、CCL2又はCXCL1を含む組成物。
【請求項９】
B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞における血液凝固第X因子の発現を増強するための、CCL2又はCXCL1の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍の転移を抑制又は予防するための組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、日本においても世界的に見ても死因の第１位である。がん治療のための新薬開発は盛んに行われているが、これらは主にがん細胞の増殖を抑える薬剤である。しかしながら、がん細胞は単に増殖を続けるだけでなく、最初に発生した場所（原発巣）から、血管やリンパ管を介して他の臓器へ転移することがある。そのため、がんの治療は依然として困難を極めている。
がん転移を予防するためには、抗がん剤を予防的に投与する他に、検査を定期的に行い、CT画像や血清中の腫瘍マーカー測定により、転移の兆候をいち早く捉えるという戦略が取られている。しかしながら、これでは患者の負担も大きく、積極的にがん転移を抑制することは達成されていないのが現状である。
【０００３】
フィブリノーゲンは、血液凝固第Ｉ因子とも呼ばれ、トロンビンによりフィブリンに転換され凝固血栓を作ることで、血液凝固の役割を果している。これまでの報告によれば、フィブリノーゲンは、がんの転移を助長する環境の形成にも関与しているものと考えられている（非特許文献１）。
しかしながら、がんの転移を助長する環境の形成に関与しているとされるフィブリノーゲンを効果的に低減させ、がん転移を抑制又は予防できるのか否か、どのような方法でフィブリノーゲンを効果的に低減させ、がん転移の抑制又は予防につなげることができるのか、また、どのような細胞がフィブリノーゲンを効果的に低減させることに関連しているのかは、これまで明らかにされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Hiratsuka S., Ishibashi S., Tomita T., Watanabe A., Akashi-Takamura S., Murakami M., Kijima H., Miyake K., Aburatani H., Maru Y.; Primary tumours modulate innate immune signalling to create pre-metastatic vascular hyperpermeability foci. Nat. Commun. 4:1853 (2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、腫瘍の転移を抑制又は予防するための医薬組成物を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞が、腫瘍の転移に関連するフィブリノーゲンを低減するのに有用であること、また、腫瘍の転移を抑制又は予防するのに有用であることを見出した。更に、本発明者らは、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞のフィブリノーゲン除去能は血液凝固第X因子（FX）依存的であることを見出した。本発明は、このような新規な知見に基づいて完成されたものである。
従って、本発明の一実施態様において、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を含む、腫瘍の転移を抑制又は予防するための医薬組成物が提供される。
また、本発明の一実施態様において、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を含む、フィブリノーゲンを低減するための医薬組成物が提供される。
本発明の一実施態様によれば、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞は、当該医薬組成物の投与対象由来のものである。
本発明の一実施態様によれば、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞において、血液凝固第X因子の発現が増大されている。
本発明の一実施態様によれば、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞は、CCL2又はCXCL1で処理されたものである。
本発明の一実施態様によれば、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞は、遺伝子改変されていない。
【０００７】
また、本発明の一実施態様において、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を、生体外で、CCL2又はCXCL1で処理することを含む、血液凝固第X因子の発現が増大されたB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を製造するための方法が提供される。
本発明の別の一実施態様において、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞における血液凝固第X因子の発現を増強するための、CCL2又はCXCL1を含む組成物が提供される。
本発明の更に別の一実施態様において、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞における血液凝固第X因子の発現を増強するための、CCL2又はCXCL1の使用が提供される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の一実施態様によれば、腫瘍の転移を抑制又は予防するのに有用な医薬組成物を提供することができる。
また、本発明の一実施態様によれば、フィブリノーゲンを低減するのに有用な医薬組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞が肺のフィブリノーゲンを除去するモデルである。
【図２】FX-/-担がんマウスから得た、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞をPKH26で標識したものを、野生型マウスに投与して蛍光顕微鏡下で観察された組織染色像である。スケールバーは20μmを表す。
【図３】FX+/-担がんマウスから得た、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞をPKH26で標識したものを、野生型マウスに投与して蛍光顕微鏡下で観察された組織染色像である。スケールバーは20μmを表す。
【図４】免疫組織化学染色に基づいてフィブリノーゲン定量した値の平均値と標準偏差を示すグラフである。横軸において、FX+/- B220+CD11c+NK1.1+は、FX+/-担がんマウス由来のB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を表し、FX-/- B220+CD11c+NK1.1+は、FX-/-担がんマウス由来のB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を表す。縦軸は、DAPIシグナルに対して正規化した値である。統計分析にはWelchのt検定（対応のない、両側検定）を用いた。
【図５】がん細胞転移アッセイにおける腫瘍細胞数の測定結果（平均値と標準偏差）を示すグラフである。横軸において、Non B220+CD11c+NK1.1+は、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を単離する前のCD45陽性細胞を表し、B220+CD11c+NK1.1+は、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を表し、FX過剰発現B220+CD11c+NK1.1+は、FXを過剰発現させたB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を表す。縦軸は、標識された腫瘍細胞数を全組織表面積に対して正規化した値である。統計分析には一元配置分散分析（one-way ANOVA）を用い、Bonferroni補正を適用した。
【図６】がん細胞転移アッセイにおける腫瘍細胞数の測定結果（平均値と標準偏差）を示すグラフである。横軸において、WT B220+CD11c+NK1.1+は、野生型（FX+/+）担がんマウス由来のB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を表し、FX-/- B220+CD11c+NK1.1+は、FX-/-担がんマウス由来のB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を表す。縦軸は、標識された腫瘍細胞数を全組織表面積に対して正規化した値である。統計分析にはWelchのt検定（対応のない、両側検定）を用いた。
【図７】定量RT-PCR法によるFX mRNA発現量の解析結果を示すグラフである。縦軸は、FX mRNA発現レベルをβ-アクチンの遺伝子発現レベルに対して正規化した値である。統計分析には一元配置分散分析（one-way ANOVA）を用い、Bonferroni補正を適用した。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明について詳述する。
本発明の一実施態様は、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を含む、腫瘍の転移を抑制又は予防するための医薬組成物に関する。
また、本発明の一実施態様は、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を含む、フィブリノーゲンを低減するための医薬組成物に関する。
【００１１】
本明細書において、「B220陽性」とは、B220抗原を細胞表面上に発現していることを意味する。本明細書において、「CD11c陽性」とは、CD11c抗原を細胞表面上に発現していることを意味する。本明細書において、「NK1.1陽性」とは、NK1.1抗原を細胞表面上に発現していることを意味する。本明細書において、「B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞」とは、B220抗原、CD11c抗原及びNK1.1抗原を細胞表面上に発現している細胞を意味する。
B220は、主にBリンパ球において、CD11cは、主に樹状細胞において、NK1.1は、主にNK細胞において、それぞれ表面上に確認されるものである。従って、「B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞」とは、実質的に、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の白血球であり得る。なお、CD45は白血球共通抗原として知られ、本発明における、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞は、CD45陽性（CD45抗原を細胞表面上に発現しているもの）であり得る。
B220、CD11c、NK1.1等の細胞表面マーカーの発現は、本発明の技術分野における技術常識に基づき確認することができる。例えば、B220、CD11c、NK1.1等の細胞表面マーカーの発現は、定量RT-PCR法、RT-PCR法、サザンブロティング法等のmRNA発現を測定する方法、又はフローサイトメトリー、ウエスタンブロッティング法、ELISA法等のタンパク質発現を測定する方法を用いて確認することができる。
【００１２】
本明細書において、「腫瘍の転移」とは、腫瘍細胞が原発巣から血管やリンパ管等を介して他の臓器等の遠隔部位へ移動し定着することを言う。転移には、リンパ管を介するリンパ行性転移、血管を介する血行性転移、胸腔や腹腔等の体腔内における漿膜面に拡がる播種性転移が含まれる。
本発明において、転移が抑制又は予防される具体的な部位として、肺が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明の一実施態様では、転移が抑制又は予防される部位は、本発明によりフィブリノーゲンが低減されるところであり得、本発明の医薬組成物は、フィブリノーゲンの発現及び／又は蓄積が認められる、又はフィブリノーゲンの発現が亢進している部位への腫瘍の転移を抑制又は予防するために用いることができる。
【００１３】
本明細書において、「腫瘍」とは、転移の危険性がある腫瘍又はその腫瘍細胞を言う。腫瘍には、良性腫瘍と悪性腫瘍があり、転移が起こるものは一般的には悪性腫瘍と呼ばれるものの、見掛け上或いは病態生理学的に良性腫瘍であっても、転移の危険性があるのであれば本発明の医薬組成物を用いてもよい。また、悪性腫瘍とは、一般的にがんとも言われ、癌腫、肉腫及び血液悪性腫瘍（造血器腫瘍）をも含む広い意味で用いられる。
本発明において、原発巣の腫瘍の種類は特に限定されないが、例えば、肺癌、胃癌、食道癌、肝臓癌、胆道癌、膵臓癌、大腸癌、腎癌、副腎癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、乳癌、皮膚癌、喉頭癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、黒色腫、線維肉腫、皮膚線維肉腫、子宮肉腫、脂肪肉腫、筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、骨肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、脊髄腫瘍及び神経内分泌腫瘍等に由来するものが挙げられ、上皮性であるか、非上皮性であるかを問わない。原発巣の腫瘍の種類としては、好ましくは、肺癌、乳癌及び皮膚癌が想定され、特に好ましくは乳癌が想定される。
例えば、本発明の一実施態様では、肺癌の肺内転移、乳癌の肺転移、及び／又は皮膚癌の肺転移を抑制又は予防するのに有用な医薬組成物が提供される。
【００１４】
本明細書において、「腫瘍の転移を抑制又は予防する」とは、腫瘍から遊離した腫瘍細胞が該腫瘍と異なる部位に定着すること、及び／又は当該部位で増殖することを抑制又は予防することを言う。
本明細書において、「フィブリノーゲンを低減する」とは、細胞レベル、組織レベル又は器官レベルにおいて、フィブリノーゲンの量が低減することを言う。フィブリノーゲンの量は、抗体等を用いる免疫組織化学法で検出することができる。免疫組織化学法で使用する抗体等の試薬は、いずれも市販のものを用いればよい。
例えば、本発明の一実施態様では、肺におけるフィブリノーゲンを低減するのに有用な医薬組成物が提供される。
【００１５】
本発明の一実施態様において、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞は、本発明の技術分野において周知の技術及び装置、例えば、フローサイトメトリー及びフローサイトメーター（セルソーター）によって、ヒト又はヒト以外の哺乳動物由来の細胞群から取得することができる。
B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞は、ヒト又はヒト以外の哺乳動物において様々な箇所に存在しており、例えば、肝臓、肺、血液中において存在している。ヒト又はヒト以外の哺乳動物等の被験者から試料を採取する場合、血液を採取することが被験者への侵襲が少なく最も適している。
【００１６】
本発明の医薬組成物の投与対象は特に限定されず、ヒトであってもヒト以外の哺乳動物であってもよい。
本発明の医薬組成物において、一態様によれば、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞は、当該医薬組成物の投与対象（腫瘍を有する者、がん患者）由来のものである。この場合、投与対象には自らの細胞が投与されることとなり、投与対象への負担が少ないため好ましい。
なお、本発明の医薬組成物において、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞は、当該医薬組成物の投与対象由来のものに限定されるわけではなく、例えば、投与対象において重大な拒絶反応を起こさないような場合には他家細胞も使用し得る。他家細胞としては、人工多能性幹細胞等の幹細胞から分化誘導されたものを用いてもよい。
【００１７】
B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞のフィブリノーゲン除去能は、血液凝固第X因子依存的であることが本発明者らにより確認された。B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞が肺のフィブリノーゲンを除去するモデルを図１に示す。
ヒト又はヒト以外の哺乳動物において、遺伝子変異がない限り或いは遺伝子改変されていない限り、血液凝固第X因子は発現しているのが通常であり、ヒト又はヒト以外の哺乳動物のB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞において血液凝固第X因子は通常発現している。そのため、あえて説明すれば、本発明の一実施態様では、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞において血液凝固第X因子が発現している。また、本発明の一実施態様では、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞において、血液凝固第X因子の発現が増大されているものを用いることが好ましく、例えば、血液凝固第X因子の発現が、未処理B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞における発現量に比べて１０倍以上、２０倍以上、又は３０倍以上増大されているとより好ましい。
【００１８】
血液凝固第X因子は、フィブリノーゲンをフィブリンへと変換する過程に関与するものであることは知られているが、血液凝固第X因子依存的に、がんの転移を助長する環境の形成に関与しているとされるフィブリノーゲンを除去することのできる細胞の特定は、本発明者らにより見出された新たな知見である。
なお、NK1.1は、主にNK細胞において表面上に確認されるものであることを上述したが、細胞傷害性リンパ球の１種であるNK細胞が、直接的に腫瘍細胞の除去に有用であることは知られていても、フィブリノーゲンの除去に有用であることは知られていない。そのため、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞がフィブリノーゲン除去能を有し、腫瘍の転移を抑制又は予防するのに有用であることに関しては、当業者が直ちに予測できたことではない。
【００１９】
本発明の一実施態様において、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞における血液凝固第X因子の発現の増大は、例えば、血液凝固第X因子の発現を増大させる物質で当該細胞を処理することにより行われ得るが、これに限定されるものではない。このような処理は、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞に、直接、血液凝固第X因子の発現を増大させる物質を添加することにより行われてもよいし、細胞培養液等の媒体中で、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞と血液凝固第X因子の発現を増大させる物質を作用させることにより行われてもよい。
本発明の一実施態様では、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞における血液凝固第X因子の発現の増大は、当該細胞をCC又はCXCケモカインファミリーに属する分子で処理することにより行うことができる。当該分子の使用量は、好ましくは５ng/ml以上、より好ましくは８ng/ml以上、更に好ましくは１０ng/ml以上である。
本発明の一実施態様では、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞における血液凝固第X因子の発現の増大は、当該細胞をCCL2又はCXCL1で処理することにより行われるのが特に好ましい。当該分子の使用量は、好ましくは５ng/ml以上、より好ましくは８ng/ml以上、更に好ましくは１０ng/ml以上である。
【００２０】
本発明の医薬組成物において、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞は、遺伝子改変されたものであっても、遺伝子改変されていないものであってもよい。
本発明の一実施態様では、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞が、血液凝固第X因子の発現を増大するように遺伝子改変されている。このような遺伝子改変は、血液凝固第X因子の発現を増大させるような遺伝子を導入することにより行われてもよいし、血液凝固第X因子の発現や蓄積を減少させる因子を抑制するような遺伝子を導入することにより行われてもよい。
本発明の一実施態様では、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞は遺伝子改変されていない。この場合、細胞の遺伝子を改変する場合と比較して操作が簡便で、且つ投与対象に与える二次的な危険性が圧倒的に少なくなるため好ましい。
【００２１】
本発明の一実施態様において、好ましくは、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を含む、腫瘍の転移を抑制又は予防するための医薬組成物は、投与対象である患者から採取されたB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞をCCL2又はCXCL1で処理すること等により、当該細胞における血液凝固第X因子の発現を増大させてから、当該患者に投与するよう用いられるものである。
本発明の一実施態様において、好ましくは、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を含む、フィブリノーゲンを低減するための医薬組成物は、投与対象である患者から採取されたB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞をCCL2又はCXCL1で処理すること等により、当該細胞における血液凝固第X因子の発現を増大させてから、当該患者に投与するよう用いられるものである。
【００２２】
本発明の医薬組成物は、医薬的に許容され得る担体、希釈剤、賦形剤、安定剤等の医薬に使用し得る添加物を含み得る。医薬的に許容され得る担体、希釈剤、賦形剤、安定剤等の医薬に使用し得る添加物としては、本発明の技術分野において周知のものを使用することができる。
本発明の医薬組成物は、特に限定されないが、注射により投与され得る。具体的な投与経路としては、静脈内投与、腹腔内投与、皮内投与及び皮下投与等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の医薬組成物を、腫瘍の転移が想定される部位又はフィブリノーゲンの蓄積が見られる部位に、直接投与してもよい。
本発明の医薬組成物において、投与量や投与回数は、患者の状態及び患者の疾患の状態等に基づき決定され得る。
【００２３】
本発明の一実施態様は、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を、生体外で、CCL2又はCXCL1で処理することを含む、血液凝固第X因子の発現が増大されたB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を製造するための方法に関する。
ここで、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を、生体外で、CCL2又はCXCL1で処理する工程は、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞に、直接、CCL2又はCXCL1を添加することにより行われてもよいし、細胞培養液等の媒体中で、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞とCCL2又はCXCL1を作用させることにより行われてもよい。
なお、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞についての説明は、上記したとおりであり、以下の態様においても同様である。
【００２４】
本発明の一実施態様は、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞における血液凝固第X因子の発現を増強するための、CCL2又はCXCL1を含む組成物に関する。
本発明の一実施態様は、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞における血液凝固第X因子の発現を増強するための、CCL2又はCXCL1の使用に関する。
なお、医薬組成物に関する発明、血液凝固第X因子の発現が増大されたB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を製造するための方法に関する発明、CCL2又はCXCL1を含む組成物に関する発明、及びCCL2又はCXCL1の使用に関する発明において、血液凝固第X因子の発現の増大は、本発明の技術分野における技術常識に基づき確認することができる。例えば、血液凝固第X因子の発現の増大は、定量RT-PCR法、RT-PCR法、サザンブロティング法等のmRNA発現を測定する方法、又はフローサイトメトリー、ウエスタンブロッティング法、ELISA法等のタンパク質発現を測定する方法を用いて確認することができる。
【実施例】
【００２５】
以下において、本発明について、具体的な実施例を参照しながら更に詳細に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００２６】
［実施例１：実験マウスの準備］
１．野生型（FX+/+）担がんマウス
C57BL/6マウス（日本クレア株式会社又は日本エス エル シー株式会社）を使用した。雄及び雌のマウス（6〜8週齢）の皮下に、ルイス肺癌細胞、B16メラノーマ細胞、E0771乳癌細胞のいずれかを注入し移植して、肺癌マウス、皮膚癌（メラノーマ）マウス及び乳癌マウスをそれぞれ準備した。
ルイス肺癌細胞及びB16メラノーマ細胞は、それぞれAmerican Type Culture Collectionから購入したものを使用し、E0771乳癌細胞は、Dr. Sirotnak（Memorial Sloan-Kettering Cancer Center）により樹立され、Dr. Mihich（Roswell Park Memorial Institute）により提供されたものを使用した（Ewens A, Mihich E, Ehrke MJ (2005) Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma, Anticancer Res 25: 3905-3915）。これらのがん細胞は、10％FBS、100単位／mLペニシリンGナトリウム及び100ug/mlストレプトマイシン硫酸塩を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を用いて培養及び継代した。
２．FX-/-担がんマウス（FXノックアウトマウス）
FX Friuli-/-マウスを使用した。このマウスはDr. Highより入手した（Tai SJ, Herzog RW, Margaritis P, Arruda VR, Chu K, Golden JA, Labosky PA, High KA (2008) A viable mouse model of factor X deficiency provides evidence for maternal transfer of factor X. J Thromb Haemost 6: 339-345）。上記野生型の場合と同様に、担がんマウスとする処置を行った。
３．FX+/-担がんマウス
FX-/-マウスと野生型マウス（FX+/+）とのかけあわせにより得た。上記野生型の場合と同様に、担がんマウスとする処置を行った。
【００２７】
［実施例２：B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞の調製］
実施例１で準備した各担がんマウスの肝臓又は肺を2mm角に切断した。この2mm角に切断された肝臓又は肺を、コラゲナーゼ（0.5mg/ml）、ディスパーゼ（1mg/ml）及びDNアーゼ（10ug/ml）を含むリン酸緩衝液（PBS）含有緩衝液に浸し、37℃で45分間振盪した。こうして得られた懸濁液を40μmメッシュ（ファルコン）に通し、凝集体や夾雑物を除去した。
次いで、懸濁液にCD45抗体を結合させた磁気ビーズ（MACS, Miltenyi Biotec）を加えた。その後、懸濁液を磁気ビーズ回収カラム（MACS, Miltenyi Biotec）に通し、CD45を発現している細胞を回収した。
回収したCD45陽性細胞の懸濁液に、抗B220抗体（RA3-6B2, BioLegend）、抗CD11c抗体（HMα2, BioLegend）及び抗NK1.1抗体（PK136, BioLegend）を加えた。使用した抗B220抗体、抗CD11c抗体及び抗NK1.1抗体は、それぞれAlexa488、PE及びAlexa647が導入されたものであった。このように標識した細胞から、セルソーター（MoFlo AstriosEQ）を用いて、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を単離した。
【００２８】
［実施例３：B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞による肺フィブリノーゲン除去の分析］
実施例２でマウスの肝臓から得たB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を蛍光色素PKH26（シグマアルドリッチ）で標識し、標識した、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞30,000個を野生型担がん（肺癌）マウスの尾静脈に注入した。24時間後にマウスから肺を取り出し、凍結後、切片を作成した。この凍結切片に対し、抗フィブリノーゲン抗体（CSI19761A, Cell Sciences Inc）を用いてフィブリノーゲンの免疫染色を行った。凍結切片を蛍光顕微鏡下で観察し、フィブリノーゲンの存在を観測した。
ここで用いたB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞は、FX-/-担がん（肺癌）マウス由来のものと、FX+/-担がん（肺癌）マウス由来のものである。FX-/-担がんマウスから得たB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を用いて蛍光顕微鏡下で観察された組織染色像を図２に示す。FX+/-担がんマウスから得たB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を用いて蛍光顕微鏡下で観察された組織染色像を図３に示す。
また、フィブリノーゲンで染色された領域をフォトショップ（登録商標）により数値化し、DAPIシグナルに対して正規化した。このようにして、FX-/-担がんマウスから得たB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を用いた場合と、FX+/-担がんマウスから得たB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を用いた場合を定量的に比較した結果を図４に示す（N=6／群、4切片／マウス）。
【００２９】
図２及び３において、フィブリノーゲンは緑色の蛍光で染色されている。血液凝固第X因子（FX）の発現が極めて低いFX-/-担がんマウス由来のB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を用いた場合には、フィブリノーゲンの蓄積がはっきりと認められる一方、FXの発現が一方のアレルに存在するFX+/-担がんマウス由来のB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を用いた場合には、フィブリノーゲンの蓄積が前者よりも少ないことが視認できた。
また、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞は、ローダミンで染色されているため、赤い色の蛍光を発する。緑色と赤色の蛍光を重ね合わせた（merged with DAPI）像では、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞がフィブリノーゲンと接している様子が観測された。なお、細胞核はDAPIで染色されており、青色を発している。このことから、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞のほかに、肺実質細胞が存在することが確認された。
図４に示される定量的な比較結果に基づき、FXの発現が一方のアレルに存在するFX+/-担がんマウス由来のB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を用いた場合の方が、FXの発現が極めて低いFX-/-担がんマウス由来のB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を用いた場合よりもフィブリノーゲンを除去する効果が高いことが確認できた。
【００３０】
［実施例４：B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞による腫瘍転移に対する作用の分析（がん細胞転移アッセイ）］
（B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞とCD45陽性細胞との比較）
野生型担がん（肺癌）マウスの肝臓を血清不含培地で24時間培養し、肝臓の培養上清（条件培地）を得た。実施例２でマウスの肺から得たB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を、このように得られた条件培地で刺激した後、この細胞30,000個を野生型担がん（肺癌）マウスの尾静脈に注入した。24時間後、PKH26（シグマアルドリッチ）を取り込ませて赤い蛍光を発するようにしたルイス肺癌細胞20,000個をそのマウスの尾静脈に注入した。それから48時間後にマウスから肺を取り出し、凍結後、切片を作成した。凍結切片を蛍光顕微鏡下で観察し、肺に存在するがん細胞の数を計測した。がん細胞数は全組織表面積に対して正規化した。ここで用いたB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞は、野生型担がん（肺癌）マウス由来のものである。
また、実施例２でマウスの肺から得たB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞に代えて、実施例２においてセルソーターによりB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を単離する前のCD45陽性細胞を用いて、上記と同様に実験を行った。
更に、実施例２でマウスの肺から得たB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞に代えて、FXを過剰発現させたB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を用いて、上記と同様に実験を行った。FXを過剰発現させたB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞は、後述のとおり得たものである。
【００３１】
図５において、実施例２で得たB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を用いた場合（B220+CD11c+NK1.1+）と、実施例２においてセルソーターによりB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を単離する前のCD45陽性細胞を用いた場合（Non B220+CD11c+NK1.1+）と、FXを過剰発現させたB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を用いた場合（FX過剰発現B220+CD11c+NK1.1+）とを比較して示す（N=24切片、4／群、全視野計測／切片、6切片／マウス肺）。
図５より、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を用いた場合に、がん細胞の肺への転移が減少したことを確認できた。また、図５によれば、FXを過剰発現させたB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を用いた場合には、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞によるがん細胞の肺への転移を減少させる作用を増強できることが示された。
なお、ルイス肺癌細胞に代えてE0771乳癌細胞を用いて上記と同様の実験を行った結果、ルイス肺癌細胞を用いた場合と同じように、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞によるがん細胞の肺への転移減少を確認できた。
当該実験で用いたルイス肺癌細胞及びE0771乳癌細胞は、実施例１において記載のものと同じものである。
【００３２】
（野生型マウス由来のB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞と、FXノックアウトマウス由来のB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞との比較）
野生型担がん（肺癌）マウスの肝臓を血清不含培地で24時間培養し、肝臓の培養上清（条件培地）を得た。実施例２でマウスの肝臓から得たB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を、このように得られた条件培地で刺激した後、この細胞30,000個を野生型担がん（肺癌）マウスの尾静脈に注入した。24時間後、PKH26（シグマアルドリッチ）を取り込ませて赤い蛍光を発するようにしたルイス肺癌細胞20,000個をそのマウスの尾静脈に注入した。それから48時間後にマウスから肺を取り出し、凍結後、切片を作成した。凍結切片を蛍光顕微鏡下で観察し、肺に存在するがん細胞の数を計測した。がん細胞数は全組織表面積に対して正規化した。ここで用いたB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞は、野生型（FX+/+）担がん（肺癌）マウス由来のものと、FX-/-担がん（肺癌）マウス由来のものである。
図６に結果を示す（N=60切片、5／群、全視野計測／切片、12切片／マウス肺）。野生型担がんマウス由来のB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞は、FX-/-担がんマウス由来のB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を用いた場合と比較し、顕著にがん細胞の肺への転移を減少させた。野生型担がんマウス由来のB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞はFXを正常に発現するが、FX-/-担がんマウス由来のB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞はFXをほとんど発現しないため、フィブリノーゲン除去能が低下している。そのため、FX-/-担がんマウス由来のB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を用いた場合では、がん細胞が肺により定着しやすくなっていると考えられた。
なお、ルイス肺癌細胞に代えてE0771乳癌細胞を用いて上記と同様の実験を行った結果、ルイス肺癌細胞を用いた場合と同じように、野生型担がんマウス由来のB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞は、FX-/-担がんマウス由来のB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を用いた場合と比較し、顕著にがん細胞の肺への転移を減少させることを確認できた。
当該実験で用いたルイス肺癌細胞及びE0771乳癌細胞は、実施例１において記載のものと同じものである。
【００３３】
（FXを過剰発現させたB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞の作製方法）
なお、上記実験で用いたFXを過剰発現させたB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞は、以下の方法で作製した。
精製蛋白質（FX）をbiotin-sulfo-NHS(サーモ)でビオチン化した。220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞をビオチン−ポリエチレングリコール−脂質でラベルした（Kato K, Itoh C, Yasukouchi T, Nagamune T (2004) Rapid protein anchoring into the membranes of Mammalian cells using oleyl chain and poly(ethylene glycol) derivatives. Biotechnol Prog 20: 897-904）。ラベルを入れた細胞にアビジンを結合させ、最後に、ラベルした細胞とビオチン化したFX蛋白質を混合した。
【００３４】
［実施例５：B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞においてFXの発現を増大させる物質の探索］
実施例３及び４において、FXを発現しているB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞を用いた場合、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞によるフィブリノーゲン除去能及びがん細胞の肺への転移を減少させる作用が有意に示されたことから、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞においてFXの発現を増大させる物質の探索を以下のとおり定量RT-PCR法により行った。
実施例２でマウスの肝臓から得たB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞に、TNFα、SDF1、G-CSF、CCL2、TGFβ、VEGF、CXCL1、IL6、HGFを10ng/mlの濃度で加えて6時間培養した。ここで用いたTNFα、SDF1、G-CSF、CCL2、及びVEGFはR&D Systemsから、CXCL1及びIL6はMiltenyi Biotecから、TGFβはPeprotechから、HGFは和光純薬工業株式会社からそれぞれ購入したものである。また、実施例２でマウスの肝臓から得たB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞に対して何も処理をしないものも用意した。この実施例で用いたB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞は、野生型担がん（肺癌）マウス由来のものである。
このようなB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞から、TRIzol試薬（Invitrogen）を用いて全RNAを抽出し、SuperScript VILO（Invitrogen）を用いてcDNAを合成した。次いで、cDNAをTaqMan PreAmp Master Mix（Applied Biosystems）を用い増幅した。定量PCR分析は、5'-AGGTCCGTGAAATCTTCGAG-3'（配列番号１）及び5'-CATCTCGACACGCTCCTTG-3'（配列番号２）をプライマーとして用い、SYBR Green Master Mix又はTaqMan Fast Advanced Master Mix（Applied Biosystems）を用いて、StepOnePlus（Applied Biosystems）にて行い、95度15秒、60度60秒のサイクルを40回行った。遺伝子の発現レベルは、β-アクチンの遺伝子発現レベルに対して正規化した。
【００３５】
図７に結果を示す（N=4）。B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞をCCL2又はCXCL1で処理した場合に、該細胞におけるFXの発現が著しく増大した。B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞のフィブリノーゲン除去能はFX依存的であり、FX発現量の増加に応じて、B220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞によるがん細胞の肺への転移を減少させる作用が増大することに鑑みて、CCL2又はCXCL1で処理されたB220陽性、CD11c陽性且つNK1.1陽性の細胞は、フィブリノーゲンの低減に極めて有用であり、腫瘍の転移の抑制又は予防に極めて有用であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、腫瘍の転移を抑制又は予防するための医薬及び／又は方法として利用することができ、また、フィブリノーゲンを低減するための医薬及び／又は方法として利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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