(57)【要約】【課題】副反応が少なく、糖アミノ酸の当量数が少ない場合でも、迅速かつ高収率でペプチド結合を形成し得る糖ペプチド合成方法及び装置を提供する。【解決手段】反応時に反応容器を冷却して溶媒の温度を２５℃以下に保持しながら、２４００ＭＨｚ−２５００ＭＨｚの周波数範囲のシングルモードマイクロ波を照射して反応容器内の溶媒膨潤固相樹脂を前記溶媒の温度より高い温度に加熱する。糖ペプチド合成装置１１は、マイクロ波発振器、加熱・冷却手段、反応容器の収納部、恒温槽一体型導波管及び温度計を備えた装置本体部１２と、反応容器内に供給する液体、気体の供給源及び反応容器内から排出された液体、気体を回収する回収容器を備えた外部ユニット１３とを有している。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸を原料として糖ペプチドを固相合成する方法であって、シングルモードマイクロ波を透過可能な反応容器内に、保護された第１のアミノ酸が結合したマイクロ波吸収性を有する固相樹脂の粒子を溶媒で膨潤させて溶媒膨潤固相樹脂として添加する第１アミノ酸投入工程と、前記反応容器内を撹拌しながら脱保護溶液を添加して前記第１のアミノ酸から保護基を除去する脱保護工程と、脱保護された前記第１のアミノ酸を前記溶媒膨潤固相樹脂に結合させたまま、前記反応容器内から前記脱保護溶液を回収した後、反応容器内に洗浄溶媒を導入して第１のアミノ酸が結合した溶媒膨潤固相樹脂を洗浄後に該洗浄溶媒を回収する脱保護後の洗浄工程と、前記反応容器内を撹拌しながら活性化溶液と共に第２の保護されたアミノ酸を反応容器に添加し、活性化された第２のアミノ酸を脱保護された第１のアミノ酸にカップリングさせて、第１のアミノ酸と第２のアミノ酸とからペプチドを形成するアミノ酸縮合工程と、前記反応容器内から活性化溶液、余剰の第２のアミノ酸及び副産物を回収した後、形成された前記ペプチドを前記溶媒膨潤固相樹脂に結合させたまま、前記反応容器内に洗浄溶媒を導入して前記ペプチドが結合した溶媒膨潤固相樹脂を洗浄後に該洗浄溶媒を回収する縮合後の洗浄工程とを含み、該縮合後の洗浄工程を行った後、前記脱保護工程、前記脱保護後の洗浄工程、前記アミノ酸縮合工程及び前記縮合後の洗浄工程からなるアミノ酸縮合サイクルを、合成する糖ペプチドに対応したアミノ酸を選択添加して１回以上繰り返すとともに、前記脱保護工程、前記アミノ酸縮合工程では、前記反応容器を冷却して溶媒の温度を２５℃以下に保持しながら、２４００ＭＨｚ−２５００ＭＨｚの周波数範囲のシングルモードマイクロ波を照射して反応容器内の溶媒膨潤固相樹脂を前記溶媒の温度より高い温度に加熱することを特徴とする糖ペプチド合成方法。
【請求項２】
前記アミノ酸縮合工程を行うアミノ酸は、１〜１．５当量を添加することを特徴とする請求項１記載の糖ペプチド合成方法。
【請求項３】
アミノ酸を原料として糖ペプチドを固相合成する装置であって、２４００ＭＨｚ−２５００ＭＨｚの周波数範囲のシングルモードマイクロ波を発生させるマイクロ波発振器と、該マイクロ波発振器で発生したマイクロ波を透過し、加熱・冷却手段を有するとともに、シングルモードマイクロ波を透過可能な反応容器の収納部を有する恒温槽一体型導波管と、前記反応容器内の液体の温度を計測するための温度計と、反応容器内に液体を供給する液体供給経路と、反応容器内に気体を供給する気体供給経路と、反応容器内から気体又は液体を排出する排出経路とを備えていることを特徴とする糖ペプチド合成装置。
【請求項４】
前記反応容器は、前記マイクロ波を透過するマイクロ波透過窓部を備えるとともに、外径が前記恒温槽一体型導波管の収納部の内径に対応し、内径が前記反応容器の外径に対応した筒状アダプタを介して前記恒温槽一体型導波管の収納部内に収納されることを特徴とする請求項３記載の糖ペプチド合成装置。
【請求項５】
前記マイクロ波発振器におけるマイクロ波源は、マグネトロン、クライストロン又は半導体であることを特徴とする請求項３又は４記載の糖ペプチド合成装置。
【請求項６】
前記反応容器は、ガラス、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン又はポリエチレンからなることを特徴とする請求項３乃至５のいずれか１項記載の糖ペプチド合成装置。
【請求項７】
前記反応容器に供給される気体は、窒素ガス又はアルゴンガスであることを特徴とする請求項３乃至６のいずれか１項記載の糖ペプチド合成装置。
【請求項８】
前記温度計は、少なくとも前記反応容器内に挿入される部分が、サファイア又はルビーからなる保護管で覆われていることを特徴とする請求項３乃至７のいずれか１項記載の糖ペプチド合成装置。
【請求項９】
前記反応容器は、筒状の容器本体部と、該容器本体部の底部に装着されて粒状物の通過を妨げる濾過フィルタと、前記容器本体部の上部に装着されたキャップ部材と、前記濾過フィルタの下部に接続して容器本体部内への気体の導入又は容器本体部内からの液体の排出を行う経路と、前記キャップ部材を貫通して設けられた前記温度計と、前記キャップ部材を貫通して容器本体部内に液体を導入する経路、気体を導入する経路及び気体を排出する経路とを備えていることを特徴とする請求項３乃至８のいずれか１項記載の糖ペプチド合成装置。
【請求項１０】
前記マイクロ波発振器、前記加熱・冷却手段、前記反応容器の収納部、前記恒温槽一体型導波管及び前記温度計を備えた装置本体部と、反応容器内に供給する液体、気体の供給源及び反応容器内から排出された液体、気体を回収する回収容器を備えた外部ユニットとを有し、前記装置本体部の前記収納部に収納された前記反応容器と前記外部ユニットとは、該外部ユニットに設けられた４個の流路切替弁を介して、前記キャップ部材を貫通した３つの経路及び前記濾過フィルタの下部に接続した経路とがチューブによってそれぞれ接続されていることを特徴とする請求項９記載の糖ペプチド合成装置。
【請求項１１】
前記４個の流路切替弁は、添加、撹拌、反応の操作モードと、洗浄、濾過、回収の操作モードとに、一つの切替手段により同時に連動して切替可能に形成されていることを特徴とする請求項１０記載の糖ペプチド合成装置。
【請求項１２】
前記外部ユニットは、液体を供給するためのシリンジを接続するシリンジ接続部を備えていることを特徴とする請求項１０又は１１記載の糖ペプチド合成装置。
【請求項１３】
前記シリンジから前記反応容器への液体の注入は、該シリンジ内に注入された液体を、該シリンジのプランジャをシリンジ内に押し込むことにより発生したガス圧力又はシリンダ２５に接続したガス源からのガス圧力によって行うことを特徴とする請求項１２記載の糖ペプチド合成装置。
【請求項１４】
前記回収容器は、遠沈管又はガラス瓶であることを特徴とする請求項１０乃至１３のいずれか１項記載の糖ペプチド合成装置。
【請求項１５】
前記外部ユニットは、反応容器保持部を備えていることを特徴とする請求項１０乃至１４のいずれか１項記載の糖ペプチド合成装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖ペプチド合成方法及び装置に関し、詳しくは、アミノ酸を原料とし、マイクロ波を利用して糖ペプチドを固相合成する糖ペプチド合成方法及びこの合成方法の実施に適した構成を有する糖ペプチド合成装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドの合成は、洗浄が簡単に行える固相ペプチド合成法が汎用的に利用されているが、一般に、反応に時間がかかる点、大過剰の試薬の利用が望ましい点、合成中にペプチド鎖が凝集するなどにより反応率が低下する点といった問題があった。これらの問題を解決するため、マイクロ波を用いたペプチド合成装置が開発されている（例えば、特許文献１参照。）。この方法では、マイクロ波のエネルギーを利用した反応促進効果、ペプチド鎖凝集抑制効果などにより、迅速（短時間）かつ高収率で所望のペプチド結合を形成することができるという特徴を有し、マイクロ波利用により高温でペプチド合成を促進させる研究が進められている。
【０００３】
しかし、糖アミノ酸群を使用とした糖ペプチドの合成においては幾つかの問題が存在する。一つ目は、副反応の問題である。立体的に嵩高い基を有する糖アミノ酸群を原料とし、マイクロ波を利用して高温条件下で糖ペプチド合成を行う場合には、ペプチド部位のラセミ化（エピメリ化）が起きやすいこと、糖鎖がβ脱離によりデヒドロアラニンを副生しやすいこと、糖鎖の開裂などの副反応が生じるという問題がある。特に、ＧａｌＮＡｃ−Ｔｈｒは、エピメリ化しやすいことが知られている。
【０００４】
二つ目は、糖アミノ酸の当量数の問題である。固相合成では逐次精製をしないため、各反応を高収率で進める必要があるが、立体的に嵩高い残基を有する糖アミノ酸の縮合反応では、反応が遅く収率も低いという問題があった。このため、糖アミノ酸を過剰量使用して反応を促進するする必要がある。しかし、糖アミノ酸シントンは、高価で入手しにくく、一番の基本となるＧａｌＮＡｃ−Ｔｈｒでも１グラム当たり１００万円以上することから、「大過剰の糖アミノ酸」を利用することは現実的ではない。
【０００５】
三つ目は、糖ペプチド合成の汎用性（普遍性）の問題である。マイクロ波ペプチド合成機では、反応温度を高温にすることによって反応時間を１分にも満たない短時間とすることで、糖ペプチド合成に対応しようとしているが、糖アミノ酸の中には高温でペプチド合成を行うと、糖アミノ酸が破壊されてしまうために合成で利用できない場合があり、汎用合成法にはならない。そもそも、ペプチド合成でも、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ、Ａｒｇや非天然型アミノ酸など加熱反応が適当でない系もあり、マイクロ波ペプチド合成機の有効性はケースバイケースである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第４７７３６９５公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、前記各種問題を抑制しつつ高温で普遍的に糖ペプチドの合成を促進することは、糖アミノ酸の様々な副反応のために非常に困難である。よって、従来のマイクロ波を利用した方法では、原料の糖アミノ酸の立体を保持した精密な糖ペプチド合成という観点から多々問題があり、また糖ペプチドの普遍的な合成法としては不十分であった。
【０００８】
また、従来、一般的に糖アミノ酸を用いた糖ペプチドの合成では、高温による副反応を回避することを目的に室温で合成を行っているが、糖アミノ酸を用いた糖ペプチドの合成を室温条件で行う場合、立体的に嵩高い残基を有する糖アミノ酸の縮合反応では反応が遅く、収率も低いという難点があり、縮合反応を効率的に促進するためには糖アミノ酸が過剰量必要だが、高価なために過剰量を使うのが難しく、糖アミノ酸を過剰量使った上で反応時間を長めにとる必要があるという問題があった。
【０００９】
そこで本発明は、立体的に嵩高い基を有する糖アミノ酸の縮合反応において、副反応が少なく、糖アミノ酸の当量数が少ない場合でも、迅速かつ高収率でペプチド結合を形成し得る糖ペプチド合成方法及び装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するため、本発明の糖ペプチド合成方法は、アミノ酸を原料として糖ペプチドを固相合成する方法であって、シングルモードマイクロ波を透過可能な反応容器内に、保護された第１のアミノ酸が結合したマイクロ波吸収性を有する固相樹脂の粒子を溶媒で膨潤させて溶媒膨潤固相樹脂として添加する第１アミノ酸投入工程と、前記反応容器内を撹拌しながら脱保護溶液を添加して前記第１のアミノ酸から保護基を除去する脱保護工程と、脱保護された前記第１のアミノ酸を前記溶媒膨潤固相樹脂に結合させたまま、前記反応容器内から前記脱保護溶液を回収した後、反応容器内に洗浄溶媒を導入して第１のアミノ酸が結合した溶媒膨潤固相樹脂を洗浄後に該洗浄溶媒を回収する脱保護後の洗浄工程と、前記反応容器内を撹拌しながら活性化溶液と共に第２の保護されたアミノ酸を反応容器に添加し、活性化された第２のアミノ酸を脱保護された第１のアミノ酸にカップリングさせて、第１のアミノ酸と第２のアミノ酸とからペプチドを形成するアミノ酸縮合工程と、前記反応容器内から活性化溶液、余剰の第２のアミノ酸及び副産物を回収した後、形成された前記ペプチドを前記溶媒膨潤固相樹脂に結合させたまま、前記反応容器内に洗浄溶媒を導入して前記ペプチドが結合した溶媒膨潤固相樹脂を洗浄後に該洗浄溶媒を回収する縮合後の洗浄工程とを含み、該縮合後の洗浄工程を行った後、前記脱保護工程、前記脱保護後の洗浄工程、前記アミノ酸縮合工程及び前記縮合後の洗浄工程からなるアミノ酸縮合サイクルを、合成する糖ペプチドに対応したアミノ酸を選択添加して１回以上繰り返すとともに、前記脱保護工程、前記アミノ酸縮合工程では、前記反応容器を冷却して溶媒の温度を２５℃以下に保持しながら、２４００ＭＨｚ−２５００ＭＨｚの周波数範囲のシングルモードマイクロ波を照射して反応容器内の溶媒膨潤固相樹脂を前記溶媒の温度より高い温度に加熱することを特徴とし、特に、前記縮合工程を行うアミノ酸は、１〜１．５当量を添加することを特徴としている。
【００１１】
また、本発明の糖ペプチド合成装置は、糖アミノ酸を原料として糖ペプチドを固相合成する装置であって、２４００ＭＨｚ−２５００ＭＨｚの周波数範囲のシングルモードマイクロ波を発生させるマイクロ波発振器と、該マイクロ波発振器で発生したマイクロ波を透過し、加熱・冷却手段を有するとともに、シングルモードマイクロ波を透過可能な反応容器の収納部を有する恒温槽一体型導波管と、前記反応容器内の液体の温度を計測するための温度計と、反応容器内に液体を供給する液体供給経路と、反応容器内に気体を供給する気体供給経路と、反応容器内から気体又は液体を排出する排出経路とを備えていることを特徴としている。
【００１２】
さらに、本発明の糖ペプチド合成装置は、前記反応容器が、前記マイクロ波を透過するマイクロ波透過窓部を備えるとともに、外径が前記恒温槽一体型導波管の収納部の内径に対応し、内径が前記反応容器の外径に対応した筒状アダプタを介して前記恒温槽一体型導波管の収納部内に収納されることを特徴としている。また、前記マイクロ波発振器におけるマイクロ波源は、マグネトロン、クライストロン又は半導体であることが好ましく、前記反応容器は、ガラス、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン又はポリエチレンからなることが好ましく、前記反応容器に供給される気体は、窒素ガス又はアルゴンガスであることが好ましく、前記温度計は、反応容器内の液体の温度を正確に測定するために、マイクロ波透過性の光ファイバー温度計を使用することが好ましく、少なくとも前記反応容器内に挿入される部分が、サファイア又はルビーからなる保護管で覆われていることが好ましい。
【００１３】
また、本発明における前記反応容器は、筒状の容器本体部と、該容器本体部の底部に装着されて粒状物の通過を妨げる濾過フィルタと、前記容器本体部の上部に装着されたキャップ部材と、前記濾過フィルタの下部に接続して容器本体部内への気体の導入又は容器本体部内からの液体の排出を行う経路と、前記キャップ部材を貫通して設けられた前記温度計と、前記キャップ部材を貫通して容器本体部内に液体を導入する経路、気体を導入する経路及び気体を排出する経路とを備えていることを特徴としている。
【００１４】
さらに、本発明の糖ペプチド合成装置は、前記マイクロ波発振器、前記加熱・冷却手段、前記反応容器の収納部、前記恒温槽一体型導波管及び前記温度計を備えた装置本体部と、反応容器内に供給する液体、気体の供給源及び反応容器内から排出された液体、気体を回収する回収容器を備えた外部ユニットとを有し、前記装置本体部の前記収納部に収納された前記反応容器と前記外部ユニットとは、該外部ユニットに設けられた４個の流路切替弁を介して、前記キャップ部材を貫通した３つの経路及び前記濾過フィルタの下部に接続した経路とがチューブによってそれぞれ接続されていることを特徴としている。
【００１５】
また、前記４個の流路切替弁は、添加、撹拌、反応の操作モードと、洗浄、濾過、回収の操作モードとに、一つの切替手段により同時に連動して切替可能に形成されていることを特徴としている。
【００１６】
さらに、前記外部ユニットは、液体を供給するためのシリンジを接続するシリンジ接続部を備えており、該シリンジから前記反応容器への液体の注入は、該シリンジ内に注入された液体を、該シリンジのプランジャをシリンジ内に押し込むことにより発生したガス圧力又はシリンダ２５に接続したガス源からのガス圧力によって行うこと、前記回収容器は、遠沈管又はガラス瓶であること、前記外部ユニットは、反応容器保持部を備えていることを特徴としている。
【００１７】
なお、本発明におけるアミノ酸とは、アミノ酸又は糖アミノ酸のことをいう。本発明における糖アミノ酸とは、特にアミノ酸残基に糖残基が結合した化合物のことをいい、アミノ酸残基は、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸及びトリプトファンからなる群より選択され、糖残基は、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、キシロース、マンノース、ガラクトース、グルコース、フコース、シアル酸、イズロン酸及びグルクロン酸、並びにこれらの構成糖単位を含むオリゴ糖からなる群より選択され、アミノ酸残基と糖残基とが、グリコシド結合、アミド結合又は炭素−炭素結合により結合しているものである。また、本発明におけるペプチドとは、ペプチド又は糖ペプチドのことをいう。本発明における糖ペプチドとは、特にペプチドを構成するアミノ酸配列内に少なくとも一つの糖アミノ酸を含む化合物のことをいう。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、反応容器及び反応容器内の溶媒温度を、副反応を抑制可能な低温に維持した状態で、マイクロ波エネルギーの選択的な吸収によって溶媒膨潤固相樹脂の温度を溶媒温度よりも高い温度に加熱することにより、固相樹脂に結合しているアミノ酸やペプチド鎖を昇温して反応を活性化することができるので、少ない当量数でも迅速かつ高収率でペプチド結合を形成でき、原料の糖アミノ酸の立体を保持した精密な糖ペプチド合成も、中分子から４０残基以上でも、迅速かつ高効率で可能となる。また、高温に加熱できないアミノ酸や糖アミノ酸、例えばＨｉｓ、Ｃｙｓ、Ａｒｇや非天然型アミノ酸などを使用することも可能となり、高価な試薬を多量に使用することなく、低コスト化も図れ、汎用性も期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の糖ペプチド合成方法の実施に適した構成を有する本発明の糖ペプチド合成装置の一形態例を示す斜視図である。
【図２】筒状アダプタに反応容器を挿入した状態を示す斜視図である。
【図３】糖ペプチド合成装置における流体経路の一例を示す系統図である。
【図４】同じく流体経路を切り替えた状態を示す系統図である。
【図５】本発明の糖ペプチド合成方法の基本的な操作の一例を示す工程図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
図１乃至図５は、本発明の糖ペプチド合成装置の一形態例を示している。図１に示すように、本形態例に示す糖ペプチド合成装置１１は、装置本体部１２と外部ユニット１３とを組み合わせたもので、装置本体部１２は、基本的に、マイクロ波発振器を備えた反応装置が用いられており、例えば、特許第６２３１２９５号公法に示された構成を有する反応装置が用いられている。この装置本体部１２には、２４００〜２５００ＭＨｚの周波数範囲のシングルモードマイクロ波を発生させるマイクロ波発振器と、該マイクロ波発振器で発生したマイクロ波を透過し、加熱・冷却手段を有するとともに、反応容器１４の収納部を有する恒温槽一体型導波管とが内蔵されている（いずれも図示せず）。さらに、装置本体部１２には、反応容器１４内の温度を測定してマイクロ波発振器や恒温槽を制御する温度計１５が設けられている。
【００２１】
マイクロ波発振器におけるマイクロ波発生源には、マグネトロン、クライストロン、半導体を用いることが好ましく、反応容器１４には、マイクロ波を透過可能なガラス、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンなどから形成されたものを使用することが好ましい。さらに、温度計１５における反応容器１４内に挿入される測温部１５ａは、サファイアやルビーで被覆しておくことが好ましい。
【００２２】
前記外部ユニット１３は、糖ペプチドの合成に伴って試薬などの供給や回収を行うためのものであって、装置本体部１２との間は、第１乃至第４の流路を形成する４本のチューブ１６，１７，１８，１９で接続されている。この外部ユニット１３には、液体回収用の遠沈管やガラス瓶２０の液体回収器保持部２１が設けられるとともに、使用前又は使用後の反応容器１４を保持する反応容器保持部２２が複数箇所に設けられており、さらに、前面には、弁切替用レバー２３が設けられ、側面には、ガラス瓶２０の蓋２０ａを開閉するための蓋開閉レバー２４が設けられている。また、外部ユニット１３の上面には、試料や洗浄液といった液体を注入するためのシリンジ２５を接続するシリンジ接続部２６が設けられている。
【００２３】
図２に示すように、前記反応容器１４は、通常は、加熱・冷却手段を構成する金属製、特に熱伝導が良好なアルミニウム製の筒状アダプタ２７に挿入された状態で使用されるもので、筒状アダプタ２７は、装置本体部１２に設けられた反応容器１４の収納部の内径に等しい外径を有し、反応容器１４の外径に等しい内径を有するとともに、マイクロ波を透過するマイクロ波透過窓部２７ａを備えており、反応容器１４を収納した状態で一体的に取り扱われる。
【００２４】
また、反応容器１４の上部には、前記４本のチューブ１６，１７，１８，１９がそれぞれ接続されるチューブ接続部２８，２９，３０，３１と、前記温度計１５の信号線が接続される温度計接続部３２とが設けられている。
【００２５】
図３及び図４は、装置本体部１２と外部ユニット１３とを組み合わせて糖ペプチド合成装置を形成し、糖アミノ酸を原料として糖ペプチドを固相合成する際の流路の状態を示している。まず、図３は、前記弁切替用レバー２３を図２に示した通りに上方に向けたときの各切替弁３３，３４，３５，３６の流路の状態であり、反応容器１４内に液体試料を添加するときの切替状態を示している（以下、試料添加モードという。）。
【００２６】
すなわち、第１切替弁３３は、シリンジ２５と反応容器１４内とを第１流路を形成する第１チューブ１６を介して接続した状態となっており、反応容器１４の上部から挿入された液体試料添加管３７を通して反応容器１４内に液体試料を添加する状態となっている。第２切替弁３４及び第４切替弁３６は、ガス供給経路３８からのガスを流量調節弁３９ａを有する内部流路３９及び第４流路を形成する第３チューブ１８を介して反応容器１４の底部に設けられた濾過フィルタ４０の下部に接続した下部連通管４１に供給して反応容器１４内をバブリングする状態となっている。また、第３切替弁３５は、反応容器１４の上部（天板部）に設けた上部連通管４２にフィルタ４２ａを介して接続した第２流路を形成する第２チューブ１７に接続し、反応容器１４内の気体を排出経路４３を通してガラス瓶２０や遠沈管２０ｂを介して排気経路４３ａから排出する状態となっている。このとき、反応容器１４内の散布管４４に接続された第４流路を形成する第４チューブ１９の流路は、第１切替弁３３及び第２切替弁３４にそれぞれ設けた逆止弁３３ａ，３４ａによって閉塞された状態となっている。
【００２７】
一方、図４は、前記弁切替用レバー２３を９０度右側に倒して各切替弁３３，３４，３５，３６の流路を右方向（時計回り）に９０度回した状態を示している。第１切替弁３３は、シリンジ２５と反応容器１４内の散布管４４とを第４チューブ１９を介して接続し、散布管４４を通して反応容器１４内に洗浄液を散布する状態となっている。同時に、第２切替弁３４は、ガス供給経路３８からのガスを第４チューブ１９を介して散布管４４に供給する状態となっている。第３切替弁３５及び第４切替弁３６は、濾過フィルタ４０の下部の下部連通管４１に第３チューブ１８を介して接続し、散布管４４からのガスによって押し出された反応容器１４内の液体を、第３チューブ１８、第４切替弁３６、第３切替弁３５及び排出経路４３を通してガラス瓶２０や遠沈管２０ａに排出する状態となっている（以下、洗浄モードという。）。
【００２８】
このように、弁切替用レバー２３を操作することにより、外部ユニット１３内の流路を、試料添加モードと洗浄モードとの二つの操作モードに切り替えることにより、液体試料の供給、バブリングによる撹拌、洗浄液の注入、気液の排出などの各種操作を行えるように形成している。
【００２９】
また、反応容器１４内への試料や洗浄液などの液体を注入、添加するための前記シリンダ２５は、シリンジ接続部２６に着脱交換可能に取り付けられるもので、ピペットなどで計量した試料や洗浄液をシリンジ２５内に注入した後、シリンダ２５内の空気をプランジャ２５ａで押し出すことにより、あるいは、シリンダ２５に接続したガス源からのガス圧力によって前記試料や洗浄液を空気やガスの圧力で各経路から反応容器１４内に注入、添加するように形成されている。したがって、プランジャなどのガス圧力作成手段が試料や洗浄液に接触することなく、試料や洗浄液の全量を反応容器１４内に白日に注入することができる。
【００３０】
また、ガス供給経路３８は、窒素ガスやアルゴンガスなどの不活性ガスを一定圧力で供給するもので、圧力計３８ａや安全弁３８ｂ，３８ｃなどを備えており、ガスボンベなどのガス供給源には、圧力調節器が設けられている。また、末端の排気経路４３ａに吸引器を設けることもできる。
【００３１】
図５は、糖ペプチドを固相合成する本発明方法の基本的な操作工程の一例を示すもので、まず、樹脂膨潤工程１０１で、保護された第１のアミノ酸が結合した固相樹脂を溶媒で膨潤させて反応容器内に添加する。そして、反応容器内に脱保護溶液を添加してアミノ酸から保護基を除去する脱保護工程１０２を行う。次いで、脱保護溶液を回収した後、反応容器内に洗浄溶媒を導入して脱保護後の洗浄工程１０３を行う。そして、合成する糖ペプチドに対応した第２のアミノ酸を活性化溶液と共に反応容器内に添加して第１のアミノ酸と第２のアミノ酸とを縮合反応させてペプチドを形成するアミノ酸縮合工程１０４を行う。
【００３２】
次に、反応容器内に洗浄溶媒を導入して縮合後の洗浄工程１０５を行い、必要に応じてアセチルキャッピング工程１０６及びアセチルキャッピング後の洗浄工程１０７を行った後、形成したペプチドに対して、前記脱保護工程１０２、脱保護後の洗浄工程１０３、所定のアミノ酸を縮合反応させるアミノ酸縮合工程１０４、縮合後の洗浄工程１０５を合成後の糖ペプチドに対応したアミノ酸を用いて必要回数繰り返して行う。
【００３３】
そして、所望の糖ペプチドを合成した後、脱保護後の洗浄工程１０３から合成後の洗浄工程１０８を行った後、樹脂から糖ペプチドを切断する切断工程１０９を行って所望の糖ペプチドを得る。
【００３４】
次に、前記糖ペプチド合成装置を使用して糖ペプチドを合成した実施例を説明する。なお、実施例中で使用した略語は、以下に記載した通りである。
【００３５】
ＧａｌＮＡｃ：  Ｎ−アセチルガラクトサミン
Ｈｉｓ  ：  ヒスチジン
Ｃｙｓ  ：  システイン
Ａｒｇ  ：  アルギニン
Ｓｅｒ  ：  セリン
Ｇｌｙ  ：  グリシン
Ｔｈｒ  ：  トレオニン
Ｐｈｅ  ：  フェニルアラニン
ＨＭＰＢ−ＢＨＡ Ｒｅｓｉｎ：  ＨＭＰＢ−ＢＨＡ樹脂
Ｆｍｏｃ：  ９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
ＤＭＦ：    Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＨＢＴＵ：  Ｏ−(ベンゾトリアゾール−１−イル)−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル              ウロニウムヘキサフルオロホスファート
ＨＯＢｔ：  １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＤＩＥＡ：  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
Ａｃ２Ｏ：    無水酢酸
ＣＨ２Ｃｌ２：  ジクロロメタン
ＴＦＡ  ：  トリフルオロ酢酸
ＴＩＰＳ：  トリイソプロピルシラン
Ｈ２Ｏ  ：  水
Ｅｔ２Ｏ：  ジエチルエーテル
ＣＨ３ＣＮ：  アセトニトリル
【実施例１】
【００３６】
ペプチド５残基であるＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅを合成する実験を行った。まず、第１のアミノ酸が結合した樹脂（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＨＭＰＢ−ＢＨＡＲｅｓｉｎ）５０.０ｍｇにＤＭＦ１ｍｌを加え、室温下で２時間振盪して樹脂を膨潤させ、膨潤した樹脂からＤＭＦを除いて反応容器内に入れた（第１アミノ酸投入工程）。脱保護溶液としてＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液１ｍｌを用い、試料添加モードとした外部ユニットに取り付けたシリンジ内に、脱保護溶液をピペットから注入した後、プランジャを押し込むことによって脱保護溶液を反応容器内に添加した。このとき、脱保護溶液は、プランジャによって押し出されたシリンジ内の空気の空気圧で搬送されて反応容器内に移送された。反応容器を収納した恒温槽一体型導波管の恒温槽温度を１０℃とし、マイクロ波によって樹脂を加熱することで反応温度を５０℃とした状態で、窒素ガスでバブリングしながら５分間反応させ、Ｆｍｏｃ基の脱保護を行った（脱保護工程）。
【００３７】
脱保護後、洗浄モードに切り替えて脱保護溶液をガス圧で排出した後、シリンジからＤＭＦ１ｍｌを添加し、反応容器内に散布して底部からガス圧によって排出する洗浄操作を５回繰り返し行った（脱保護後の洗浄工程）。
【００３８】
次に、試料添加モードに切り替えてから、ＤＭＦ１ｍｌに、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを０.０２８６ｍｍｏｌ、ＨＢＴＵを０.０２８７ｍｍｏｌ、ＨＯＢｔを０.０２９６ｍｍｏｌ及びＤＩＥＡを０.０６０３ｍｍｏｌを溶解させた混合液をシリンジから反応容器に添加し、バブリングを行いながら、１０℃の恒温槽中で、マイクロ波で反応温度を５０℃として２０分行い、アミノ酸を縮合、カップリングさせることによってペプチドを形成した（アミノ酸縮合工程）。
【００３９】
ペプチドを形成するアミノ酸縮合工程終了後、洗浄モードに切り替えてＤＭＦ１ｍｌを用いた前記同様の洗浄操作を３回行った（縮合後の洗浄工程）。
【００４０】
洗浄後、試料添加モードに切り替えてＡｃ２Ｏを１.２ｍｌ、ＤＩＥＡを０.６ｍｌ、ＨＯＢｔを５０.０ｍｇ及びＤＭＦを２３.２ｍｌを混合したアセチルキャッピング液１ｍｌをアセチルキャッピングに用い、２５℃の恒温槽中でバブリングを行いながら５分間反応させた（アセチルキャッピング工程）。
【００４１】
アセチルキャッピングを行った後、洗浄モードに切り替えてＤＭＦ１ｍｌを用いた前記同様の洗浄操作を３回行った（アセチルキャッピング後の洗浄工程）。
【００４２】
そして、前記脱保護工程、洗浄工程、アミノ酸縮合工程、洗浄工程、アセチルキャッピング工程、洗浄工程の操作を、上記を含め、計４回（４サイクル）繰り返した。
【００４３】
２サイクル目のアミノ酸縮合は、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを０.０２９４ｍｍｏｌ、ＨＢＴＵを０.０２９０ｍｍｏｌ、ＨＯＢｔを０.０２８９ｍｍｏｌ及びＤＩＥＡを０.０６０３ｍｍｏｌを、ＤＭＦ１ｍｌに溶解させたものを使用して合成における２回目のカップリングを行った。
【００４４】
また、３サイクル目のアミノ酸縮合は、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを０.０２８９ｍｍｏｌ、ＨＢＴＵを０.０２９８ｍｍｏｌ、ＨＯＢｔを０.０２９６ｍｍｏｌ及びＤＩＥＡを０.０６０３ｍｍｏｌを、ＤＭＦ１ｍｌに溶解させたものを使用して合成における３回目のカップリングを行った。
【００４５】
さらに、４サイクル目のアミノ酸縮合は、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを０.０２９５ｍｍｏｌ、ＨＢＴＵを０.０２８７ｍｍｏｌ、ＨＯＢｔを０.０２８９ｍｍｏｌ及びＤＩＥＡを０.０６０３ｍｍｏｌを、ＤＭＦ１ｍｌに溶解させたものを使用して合成における４回目のカップリングを行った。
【００４６】
４回目のアセチルキャッピング工程の後、試料添加モードに切り替えてＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液１ｍｌを用いて１０℃の恒温槽中でマイクロ波で５０℃に加熱し、バブリングを行って５分間、Ｆｍｏｃ基の脱保護を行った。
【００４７】
Ｆｍｏｃ基の脱保護を行った後、洗浄モードに切り替えてＤＭＦ１ｍｌを用いた前記同様の洗浄操作を３回行った。さらに、洗浄液としてＣＨ２Ｃｌ２１ｍｌを用いた洗浄操作を５回行った（合成後の洗浄工程）。
【００４８】
洗浄後、固相樹脂を反応容器から取出して真空乾燥後に、ＴＦＡを９.５ｍｌ、ＴＩＰＳを０.２５ｍｌ及びＨ２Ｏを０.２５ｍｌからなる切断溶液１.５ｍｌを用い、室温下で振盪しながら２時間切断操作を行った（切断工程）。その後、吸引ろ過し、ＴＦＡで洗浄してから、減圧留去した。さらに、Ｅｔ２Ｏを加え、遠心分離を４℃、５０００ｒｐｍで５分間行い、上澄みを除去した。このＥｔ２Ｏを加えた遠心分離操作を３回繰り返してから風乾させた。風乾後の残渣を、Ｈ２Ｏ中２０％ＣＨ３ＣＮ溶液に溶解させ、凍結乾燥を行うことにより、粗生成物１１.４ｍｇ、０.０２４４ｍｍｏｌ、収率９８％超を得た。そして、ジーエルサイエンスのＩＮＥＲＴＳＩＬＯＤＳ−３を用いるＨＰＬＣ分取によって、精製物１０.５ｍｇ、０.０２２５ｍｍｏｌ、収率９２％を得た。
【００４９】
得られた精製物をＢＲＵＫＥＲの１Ｈ−ＮＭＲを用いるプロトン核磁気共鳴分光法による測定とＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを用いるマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析とによって精製物に関する質量スペクトルを得たところ、得られた精製物は、目的物であるＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅであると同定できた。さらに、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析では、所望のペプチド質量に対応する４６７.４８において単一ピークを示しており、不完全なカップリングに対応するピークは検出されなかった。このことから、恒温槽によって冷却した状態で、マイクロ波によってマイクロ波吸収性を有する固相樹脂を溶媒で膨潤させて加熱し、反応温度を５０℃とすることにより、すなわち、恒温槽によって反応容器内の溶媒を冷却しながら、マイクロ波で固相樹脂を溶媒温度より高い温度に加熱することにより、副反応を抑制しながら、アミノ酸を１.２当量としても確実に反応を進めることができ、ペプチドの合成を効率よく、低コストで行えることがわかった。
【実施例２】
【００５０】
実施例１と同じＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅを合成する実験を行った。まず、第１のアミノ酸が結合した樹脂（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＨＭＰＢ−ＢＨＡＲｅｓｉｎ）５０.０ｍｇにＤＭＦ１ｍｌを加え、室温下で２時間振盪して樹脂を膨潤させ、膨潤した樹脂からＤＭＦを除いて反応容器内に入れた。脱保護溶液としてＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液１ｍｌを反応容器内に添加した。恒温槽温度を２５℃とし、バブリングしながら５分間反応させ、Ｆｍｏｃ基の脱保護を行った。脱保護後、ＤＭＦ１ｍｌを使用した洗浄操作を５回繰り返した。
【００５１】
次に、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを０.０２９３ｍｍｏｌ、ＨＢＴＵを０.０２９３ｍｍｏｌ、ＨＯＢｔを０.０２９６ｍｍｏｌ及びＤＩＥＡを０.０６０３ｍｍｏｌをＤＭＦ１ｍｌに溶解させた混合液を反応容器に添加し、バブリングを行いながら、−１０℃の恒温槽中で、マイクロ波で反応温度を２５℃として２０分行った。ペプチドを形成した後、ＤＭＦ１ｍｌを用いた前記同様の洗浄操作を３回行った。
【００５２】
洗浄後、Ａｃ２Ｏを１.２ｍｌ、ＤＩＥＡを０.６ｍｌ、ＨＯＢｔを５０.０ｍｇ及びＤＭＦを２３.２ｍｌを混合したアセチルキャッピング液１ｍｌをアセチルキャッピングに用い、２５℃の恒温槽中でバブリングを行いながら５分間反応させた。その後、ＤＭＦ１ｍｌを用いた洗浄操作を３回行った。
【００５３】
そして、前記脱保護工程、洗浄工程、アミノ酸縮合工程、洗浄工程、アセチルキャッピング工程、洗浄工程の操作を４回繰り返した。
【００５４】
２サイクル目のアミノ酸縮合は、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを０.０２９４ｍｍｏｌ、ＨＢＴＵを０.０２９３ｍｍｏｌ、ＨＯＢｔを０.０２９６ｍｍｏｌ及びＤＩＥＡを０.０６０３ｍｍｏｌを、ＤＭＦ１ｍｌに溶解させたものを使用した。
【００５５】
また、３サイクル目のアミノ酸縮合は、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを０.０２９３ｍｍｏｌ、ＨＢＴＵを０.０２９０ｍｍｏｌ、ＨＯＢｔを０.０３０３ｍｍｏｌ及びＤＩＥＡを０.０６０３ｍｍｏｌを、ＤＭＦ１ｍｌに溶解させたものを使用した。
【００５６】
さらに、４サイクル目のアミノ酸縮合は、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを０.０２９５ｍｍｏｌ、ＨＢＴＵを０.０２９３ｍｍｏｌ、ＨＯＢｔを０.０２９６ｍｍｏｌ及びＤＩＥＡを０.０６０３ｍｍｏｌを、ＤＭＦ１ｍｌに溶解させたものを使用した。
【００５７】
４回目のアセチルキャッピングの後、ＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液１ｍｌを用いて２５℃の恒温槽中でバブリングを行って５分間、Ｆｍｏｃ基の脱保護を行った。その後、ＤＭＦ１ｍｌを用いた洗浄操作を３回行った。さらに、洗浄液としてＣＨ２Ｃｌ２１ｍｌを用いた洗浄操作を５回行った。
【００５８】
洗浄後、固相樹脂を反応容器から取出して真空乾燥後に、ＴＦＡを９.５ｍｌ、ＴＩＰＳを０.２５ｍｌ及びＨ２Ｏを０.２５ｍｌからなる切断溶液１.５ｍｌを用い、室温下で振盪しながら２時間切断操作を行った。その後、吸引ろ過し、ＴＦＡで洗浄してから、減圧留去した。さらに、Ｅｔ２Ｏを加え、遠心分離を４℃、５０００ｒｐｍで５分間行い、上澄みを除去した。このＥｔ２Ｏを加えた遠心分離操作を３回繰り返してから風乾させた。風乾後の残渣を、Ｈ２Ｏ中２０％ＣＨ３ＣＮ溶液に溶解させ、凍結乾燥を行うことにより、粗生成物１２.３ｍｇ、０.０２６３ｍｍｏｌ、収率９８％超を得た。そして、ジーエルサイエンスのＩＮＥＲＴＳＩＬ ＯＤＳ−３を用いるＨＰＬＣ分取によって、精製物１０.７ｍｇ、０.０２２９ｍｍｏｌ、収率９３％を得た。
【００５９】
この結果から、アミノ酸を１.２当量とし、恒温槽温度を−１０℃として反応温度を２５℃としても反応を効率的に進めることができ、実施例１と同様の反応率を得ることができた。
【実施例３】
【００６０】
実施例１と同じＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅを、マイクロ波を使用せずに合成する実験を行った。まず、第１のアミノ酸が結合した樹脂（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＨＭＰＢ−ＢＨＡＲｅｓｉｎ）５０.０ｍｇにＤＭＦ１ｍｌを加え、室温下で２時間振盪して樹脂を膨潤させ、膨潤した樹脂からＤＭＦを除いて反応容器内に入れた。脱保護溶液としてＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液１ｍｌを反応容器内に添加した。恒温槽温度を２５℃とし、バブリングしながら５分間反応させ、Ｆｍｏｃ基の脱保護を行った。脱保護後、ＤＭＦ１ｍｌを使用した洗浄操作を５回繰り返した。
【００６１】
次に、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを０.０２９３ｍｍｏｌ、ＨＢＴＵを０.０２９３ｍｍｏｌ、ＨＯＢｔを０.０２９６ｍｍｏｌ及びＤＩＥＡを０.０６０３ｍｍｏｌをＤＭＦ１ｍｌに溶解させた混合液を反応容器に添加し、バブリングを行いながら、２５℃の恒温槽中で２０分間、縮合反応させてペプチドを形成した後、ＤＭＦ１ｍｌを用いた前記同様の洗浄操作を３回行った。
【００６２】
洗浄後、Ａｃ２Ｏを１.２ｍｌ、ＤＩＥＡを０.６ｍｌ、ＨＯＢｔを５０.０ｍｇ及びＤＭＦを２３.２ｍｌを混合したアセチルキャッピング液１ｍｌをアセチルキャッピングに用い、２５℃の恒温槽中でバブリングを行いながら５分間反応させた。その後、ＤＭＦ１ｍｌを用いた洗浄操作を３回行った。
【００６３】
そして、前記脱保護工程、洗浄工程、アミノ酸縮合工程、洗浄工程、アセチルキャッピング工程、洗浄工程の操作を４回繰り返した。
【００６４】
２サイクル目のアミノ酸縮合は、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを０.０２９４ｍｍｏｌ、ＨＢＴＵを０.０２９３ｍｍｏｌ、ＨＯＢｔを０.０２９６ｍｍｏｌ及びＤＩＥＡを０.０６０３ｍｍｏｌを、ＤＭＦ１ｍｌに溶解させたものを使用した。
【００６５】
また、３サイクル目のアミノ酸縮合は、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを０.０２９３ｍｍｏｌ、ＨＢＴＵを０.０２９５ｍｍｏｌ、ＨＯＢｔを０.０２９６ｍｍｏｌ及びＤＩＥＡを０.０６０３ｍｍｏｌを、ＤＭＦ１ｍｌに溶解させたものを使用した。
【００６６】
さらに、４サイクル目のアミノ酸縮合は、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを０.０２９５ｍｍｏｌ、ＨＢＴＵを０.０２９３ｍｍｏｌ、ＨＯＢｔを０.０２９３ｍｍｏｌ及びＤＩＥＡを０.０６０３ｍｍｏｌを、ＤＭＦ１ｍｌに溶解させたものを使用した。
【００６７】
４回目のアセチルキャッピング工程の後、ＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液１ｍｌを用いて２５℃の恒温槽中でバブリングを行って５分間、Ｆｍｏｃ基の脱保護を行った。その後、ＤＭＦ１ｍｌを用いた洗浄操作を５回行った。さらに、洗浄液としてＣＨ２Ｃｌ２１ｍｌを用いた洗浄操作を５回行った。
【００６８】
洗浄後、固相樹脂を反応容器から取出して真空乾燥後に、ＴＦＡを９.５ｍｌ、ＴＩＰＳを０.２５ｍｌ及びＨ２Ｏを０.２５ｍｌからなる切断溶液１.５ｍｌを用い、室温下で振盪しながら２時間切断操作を行った。その後、吸引ろ過し、ＴＦＡで洗浄してから、減圧留去した。さらに、Ｅｔ２Ｏを加え、遠心分離を４℃、５０００ｒｐｍで５分間行い、上澄みを除去した。このＥｔ２Ｏを加えた遠心分離操作を３回繰り返してから風乾させた。風乾後の残渣を、Ｈ２Ｏ中２０％ＣＨ３ＣＮ溶液に溶解させ、凍結乾燥を行うことにより、粗生成物１０.０ｍｇ、０.０２１４ｍｍｏｌ、収率８７％超を得た。そして、ジーエルサイエンスのＩＮＥＲＴＳＩＬ ＯＤＳ−３を用いるＨＰＬＣ分取によって、精製物９.６ｍｇ、０.０２０５ｍｍｏｌ、収率８４％を得た。
【００６９】
この結果から、アミノ酸を１.２当量として恒温槽温度を２５℃とした従来の方法では、反応は効率的に進まず、実施例２に比べて収率が低くなった。
【実施例４】
【００７０】
糖ペプチド５残基であるＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（Ａｃ３ＧａｌＮＡｃ）−Ｇｌｙ−Ｐｈｅを合成する実験を行った。まず、第１のアミノ酸が結合した樹脂（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＨＭＰＢ−ＢＨＡＲｅｓｉｎ）５０.０ｍｇにＤＭＦ１ｍｌを加え、室温下で２時間振盪して樹脂を膨潤させ、膨潤した樹脂からＤＭＦを除いて反応容器内に入れた。脱保護溶液としてＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液１ｍｌを反応容器内に添加し、恒温槽温度を−１０℃とし、マイクロ波で反応温度を３０℃としてバブリングしながら５分間反応させ、Ｆｍｏｃ基の脱保護を行った。脱保護後、ＤＭＦ１ｍｌを使用した洗浄操作を５回繰り返して行った。
【００７１】
次に、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを０.０３７０ｍｍｏｌ、ＨＢＴＵを０.０３６７ｍｍｏｌ、ＨＯＢｔを０.０３７７ｍｍｏｌ及びＤＩＥＡを０.０７４６ｍｍｏｌをＤＭＦ１ｍｌに溶解させた混合液を反応容器に添加し、バブリングを行いながら、−１０℃の恒温槽中で、マイクロ波で反応温度を３０℃として２０分行った。ペプチドを形成した後、ＤＭＦ１ｍｌを用いた前記同様の洗浄操作を３回行った。
【００７２】
洗浄後、Ａｃ２Ｏを１.２ｍｌ、ＤＩＥＡを０.６ｍｌ、ＨＯＢｔを５０.０ｍｇ及びＤＭＦを２３.２ｍｌを混合したアセチルキャッピング液１ｍｌをアセチルキャッピングに用い、２５℃の恒温槽中でバブリングを行いながら５分間反応させた。その後、ＤＭＦ１ｍｌを用いた洗浄操作を３回行った。
【００７３】
そして、前記脱保護工程、洗浄工程、アミノ酸縮合工程、洗浄工程、アセチルキャッピング工程、洗浄工程の操作を４回繰り返した。
【００７４】
２サイクル目のアミノ酸縮合は、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（Ａｃ３ＧａｌＮＡｃ）−ＯＨを０.０３６８ｍｍｏｌ、ＨＢＴＵを０.０３６７ｍｍｏｌ、ＨＯＢｔを０.０３７７ｍｍｏｌ及びＤＩＥＡを０.０７４６ｍｍｏｌを、ＤＭＦ１ｍｌに溶解させたものを使用した。
【００７５】
また、３サイクル目のアミノ酸縮合は、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを０.０３６７ｍｍｏｌ、ＨＢＴＵを０.０３７２ｍｍｏｌ、ＨＯＢｔを０.０３７７ｍｍｏｌ及びＤＩＥＡを０.０７４６ｍｍｏｌを、ＤＭＦ１ｍｌに溶解させたものを使用した。
【００７６】
さらに、４サイクル目のアミノ酸縮合は、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを０.０３６８ｍｍｏｌ、ＨＢＴＵを０.０３７２ｍｍｏｌ、ＨＯＢｔを０.０３７０ｍｍｏｌ及びＤＩＥＡを０.０７４６ｍｍｏｌを、ＤＭＦ１ｍｌに溶解させたものを使用した。
【００７７】
４回目のアセチルキャッピング工程の後、ＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液１ｍｌを用いて−１０℃の恒温槽中でマイクロ波で反応温度を３０℃とし、バブリングを行って５分間、Ｆｍｏｃ基の脱保護を行った。その後、ＤＭＦ１ｍｌを用いた洗浄操作を３回行った。さらに、洗浄液としてＣＨ２Ｃｌ２１ｍｌを用いた洗浄操作を５回行った。
【００７８】
洗浄後、固相樹脂を反応容器から取出して真空乾燥後に、ＴＦＡを９.５ｍｌ、ＴＩＰＳを０.２５ｍｌ及びＨ２Ｏを０.２５ｍｌからなる切断溶液１.５ｍｌを用い、室温下で振盪しながら２時間切断操作を行った。その後、吸引ろ過し、ＴＦＡで洗浄してから、減圧留去した。さらに、Ｅｔ２Ｏを加え、遠心分離を４℃、５０００ｒｐｍで５分間行い、上澄みを除去した。このＥｔ２Ｏを加えた遠心分離操作を３回繰り返してから風乾させた。風乾後の残渣を、Ｈ２Ｏ中２０％ＣＨ３ＣＮ溶液に溶解させ、凍結乾燥を行うことにより、粗生成物１５.５ｍｇ、０.０１９５ｍｍｏｌ、収率７９％を得た。そして、ジーエルサイエンスのＩＮＥＲＴＳＩＬ ＯＤＳ−３を用いるＨＰＬＣ分取によって、精製物１４.６ｍｇ、０.０１８３ｍｍｏｌ、収率７５％を得た。このことから、糖アミノ酸１.５当量でも３０℃で反応は効率的に進行したことがわかる。
【００７９】
得られた精製物をＢＲＵＫＥＲの１Ｈ−ＮＭＲを用いるプロトン核磁気共鳴分光法による測定とＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いるマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析とによって精製物に関する質量スペクトルを得たところ、得られた精製物は、目的物であるＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（Ａｃ３ＧａｌＮＡｃ）−Ｇｌｙ−Ｐｈｅであると同定できた。さらに、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析では、所望のペプチド質量に対応する７９６．７８４において単一ピークを示しており、不完全なカップリングに対応するピークは検出されなかった。このことから、恒温槽によって冷却した状態で、マイクロ波によってマイクロ波吸収性を有する固相樹脂を溶媒で膨潤させて加熱し、反応温度を３０℃とすることにより、すなわち、恒温槽によって反応容器内の溶媒を冷却しながら、マイクロ波で固相樹脂を溶媒温度より高い温度に加熱することにより、副反応を抑制しながら、アミノ酸を１.５当量としても確実に反応を進めることができ、糖ペプチドの合成を効率よく、低コストで行えることがわかった。
【符号の説明】
【００８０】
１１…糖ペプチド合成装置、１２…装置本体部、１３…外部ユニット、１４…反応容器、１５…温度計、１５ａ…測温部、１６…第１チューブ、１７…第２チューブ、１８…第３チューブ、１９…第４チューブ、２０…ガラス瓶、２０ａ…蓋、２０ｂ…遠沈管、２１…液体回収器保持部、２２…反応容器保持部、２３…弁切替用レバー、２４…蓋開閉レバー、２５…シリンジ、２５ａ…プランジャ、２６…シリンジ接続部、２７…筒状アダプタ、２７ａ…マイクロ波透過窓部、２８，２９，３０，３１…チューブ接続部、３２…温度計接続部、３３…第１切替弁、３３ａ…逆止弁、３４…第２切替弁、３４ａ…逆止弁、３６…第４切替弁、３７…液体試料添加管、３８…ガス供給経路、３８ａ…圧力計、３８ｂ，３８ｃ…安全弁、３９…内部流路、３９ａ…流量調節弁、４０…濾過フィルタ、４１…下部連通管、４２…上部連通管、４２ａ…フィルタ、４３…排出経路、４４…散布管
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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