(57)【要約】【課題】キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を生成する方法を提供すること。【解決手段】本発明のいくつの実施形態では、抗原−結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ領域）、ヒンジ領域、及びエンドドメインをコード化するベクターのライブラリーからのベクターのランダムな結合によって前記ＣＡＲをコード化するベクターを生成することによりＣＡＲのライブラリースクリーニングを実施する。本発明のいくつかの実施形態では、前記ベクターはトランスポゾンを含有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１４年２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／９４０，３３９号の利益を主張し、その全体を参照により本明細書に組み入れる。
本発明は通常分子生物学及び医薬の分野に関する。特に本発明はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
養子Ｔ細胞移入は癌の治療に使用可能な有望な治療アプローチである。養子Ｔ細胞移入には  、選択的に腫瘍細胞を死滅可能な抗原特異的Ｔ細胞の単離及び増殖を含む。通常、Ｔ細胞は被験体から得られインビトロで培養される。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をＴ細胞にインビトロで導入し、抗原の発現に基づいて、前述の被験体に再導入されたＴ細胞に選択的に腫瘍細胞を死滅させることができる（例えば、Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋら、２０１３；Ｂｅｒｒｙら、２０１３）。
養子Ｔ細胞移入に関連した一つの問題は、例えば特定の癌を治療する目的で、どのＣＡＲが所定の患者集団においてより効果的に作用するかについて可変性が大きいことである。生成可能であり癌に対する治療活性を発揮しうる見込みのある異なるＣＡＲが多数存在することによって、現在臨床医にとってどのＣＡＲが所定の癌または癌のサブタイプに対する治療活性を提示できるのか予測することを非常に難しくなっている。養子Ｔ細胞移入の大きな治療可能性によって、新たなＣＡＲを特定及び生成する方法の向上に対する明らかなニーズが存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋら，Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｔｒａｎｓｆｕｓ  Ｍｅｄ  Ｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ２０１３  Ｄｅｃ；４０（６）：３８８−４０２．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、いくつかの態様において、ＣＡＲの生成方法及び具体的なＣＡＲを提供する。いくつかの態様では、特定の癌または癌のサブタイプに対する活性についてスクリーニング可能な多数のＣＡＲの生成方法が提供される。この方法において、特定の癌または癌のサブタイプに対する向上した治療可能性を発揮可能なＣＡＲを生成及び特定可能である。本明細書で提供されるＣＡＲを治療目的で被験体またはヒト患者に投与し、例えば癌を治療できる。
【０００５】
所定の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する特定のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）デザイン標的化Ｔ細胞が異なる患者に対し様々な治療可能性を示し得ることは、臨床データより明らかである。例えば、キメラＣＤ２８／ＣＤ３ζまたはＣＤ１３７／ＣＤ３−ζにより活性化される第二世代ＣＤ１９特異的ＣＡＲは、自己遺伝子改変Ｔ細胞を慢性よりも急性のＢ系統白血病患者に投与した場合に、優れた臨床応答性を発揮できる。この課題に取り組むため、本発明では、所定の腫瘍に対し向上した抗腫瘍効果を発揮可能なＣＡＲ種を生成する方法を提供する。
【０００６】
例えば、本発明で提供する方法を用いて所定の患者の癌を治療する能力について多数のＣＡＲを生成及びスクリーニングしても良い。このように、前述の方法を用いて患者に対する治療を個別化し、特定の患者または特定の癌患者のサブセットに対する向上した治療可能性を呈する特定のＣＡＲを選択しても良い。遺伝子療法への臨床アプローチとして、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゾンシステムからＤＮＡプラスミドを電気移動が可能であり、例えば、小さな患者サブセットに個別のＣＡＲデザインを製造するコストや複雑さを軽減しても良い。これらのＣＡＲ＋Ｔ細胞を個別化する方法に、所定の患者に利益をもたらす能力をスクリーニング及びアセスメント可能な多数のＣＡＲ分子の生成を利用しても良い。
【０００７】
いくつかの態様では、三重部位特異的組換えシステム（「ＥＺ−ＣＡＲ」プラットフォームとも称する）を用いたＣＡＲ分子ハイスループットアセンブリ方法が提供される。いくつかの実施形態では、これらの方法により原型的なＣＡＲの下記の３コンポーネントの迅速な組み合わせが可能になる：（ｉ）特異性を定義する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、（ｉｉ）細胞表面からｓｃＦｖを付加するスキャフォールド／ヒンジ、及び（ｉｉｉ）１つまたは複数の細胞内シグナリングドメイン。例えば、下記に記載の実施例に示すように、クリニカルグレードのＣＤ１９ＲＣＤ２８ｍζ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＣＧ  ＣＡＲ）と共にＥＺ  ＣＡＲプラットフォームを用いてキメラＣＤ２８／ＣＤ３−ζを介して活性化されるＣＤ１９特異的ＣＡＲを生成した。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のまたは本発明により製造されるＣＡＲを、膜結合型ＩＬ−１５と共にＴ細胞に共発現しても良い。このようにして、前述のＴ細胞は、インビトロまたはインビボで顕著に増殖することなく休止状態で生存または存在しても良い。対照的に、従来の記載にあるとおり、サイトカインをインビトロで取り除いた状態では、ＣＡＲ発現Ｔ細胞は通常死滅し、ある場合においてはＴ細胞を臨床で投与する際にこの細胞死が安全性をもたらしても良い。Ｔ細胞増殖は通常自律性細胞アッセイを用いて測定される。よって、従来特定されたＣＡＲとは対照的に、本発明では、抗原性刺激なしにインビトロでＴ細胞が維持不可能である場合、インビトロでの自律増殖なしで細胞毒性を誘導可能なＣＡＲを提供する。望ましい特定の実施形態によっては、本発明によるまたは本明細書に記載の方法により製造されるＣＡＲは、膜結合型ＩＬ−１５の前述のＴ細胞での共発現ありまたはなしでＴ細胞中に発現しても良い。
【０００９】
本発明の一つの態様は、（ａ）１つまたは複数の特徴的な抗原結合ドメインをコード化する複数の第一のベクター、（ｂ）１つまたは複数の特徴的なヒンジドメインをコード化する複数の第二のベクター、及び（ｃ）１つまたは複数の特徴的なエンドドメインをコード化する複数の第三のベクターを含む組成物であって、少なくとも２つの第一、第二、及び第三のベクターが複数の２つ以上の特徴的な抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、及び／またはエンドドメインをコード化するベクターをそれぞれ含み、さらに前述のベクターが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコード化する第四のベクターの生成を可能にする相同組換え部位を含む、前述の組成物に関する。
【００１０】
本発明では、抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、及びエンドドメインといったタンパク質ドメイン及びポリペプチドを参照して使用するように、用語「特徴的な」は異なるポリペプチド（アミノ酸）配列を有する、含む、またはからなるドメインを意味する。例えば、２つの「特徴的な」抗原結合ドメインは同一の抗原（実際には抗原上の同一のエピトープでもよい）に結合しても良いが、前述の抗原結合ドメインは、連続するアミノ酸組成物がそれぞれ異なる場合に、「特徴的」である。同様に２つの「特徴的な」抗原結合ドメインもまた、連続するアミノ酸組成物が異なる場合、異なる抗原及びエピトープに特異的に結合しても良い。逆に、本明細書において、同一のアミノ酸配列の２つの分子（ポリペプチド）は「特徴的な」ポリペプチドではない。
【００１１】
いくつかの実施形態では、前述の複数の第一のベクターが複数の特徴的な抗原結合ドメインをコード化し、前述の複数の第二のベクターが一つのヒンジドメインをコード化し、及び前述の複数の第三のベクターが複数の特徴的なエンドドメインをコード化する。いくつかの実施形態では、前述の複数の第一のベクターが複数の特徴的な抗原結合ドメインをコード化し、前述の複数の第二のベクターが、複数の特徴的なヒンジドメインをコード化し、及び前述の複数の第三のベクターが複数の特徴的なエンドドメインをコード化する。いくつかの実施形態では、前述の複数の第一のベクターが複数の特徴的な抗原結合ドメインをコード化し、前述の複数の第二のベクターが複数の特徴的なヒンジドメインをコード化し、及び前述の複数の第三のベクターが一つのエンドドメインをコード化する。いくつかの実施形態では、前述の複数の第一のベクターが一つの抗原結合ドメインをコード化し、前述の複数の第二のベクターが複数の特徴的なヒンジドメインをコード化し、及び前述の複数の第三のベクターが複数の特徴的なエンドドメインをコード化する。いくつかの実施形態では、前述の抗原結合ドメインがｓｃＦｖを含むまたはからなる。前述の第三のベクターが膜貫通ドメインをコード化しても良い。前述の第二のベクターが膜貫通ドメインをコード化。いくつかの実施形態では、前述の組成物がさらに１つまたは複数の膜貫通ドメインをコード化する複数の第五のベクター含み、前述の第一のベクター、前述の第二のベクター、前述の第三のベクター、及び前述の第五のベクターは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコード化する第四のベクターを生成するための相同組換え部位を含む。前述の第一のベクターが第一の相同組換え配列及び第二の相同組換え部位を含んでも良い。前述の第二のベクターが前述の第二の相同組換え配列及び第三の相同組換え配列を含んでも良い。前述の第三のベクターが前述の第三の相同組換え配列及び第四の相同組換え配列を含んでも良い。前述の第三のベクターが前述の第三の相同組換え配列及び第四の相同組換え配列を含んでも良い。前述の第四のベクターは、前述の第一の相同組換え配列及び前述の第四の相同組換え配列を含む。前述の第一のベクター、前述の第二のベクター、及び／または前述の第三のベクターがトランスポーゼースをコード化しても良い。前述のトランスポーゼースはサケ科型Ｔｃ１様トランスポーゼース（ＳＢ）であっても良い。いくつかの実施形態では、前述の第一のベクター、前述の第二のベクター、前述の第三のベクター、前記第四のベクター及び／または前述の第五のベクターのうち１、２、３、４、または全てがＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）またはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターである。もしくは、いくつかの実施形態では、前述の第一のベクター、前述の第二のベクター、前述の第三のベクター、前述の第四のベクター、及び／または前述の第五のベクターは、例えばＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）またはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターではない。いくつかの実施形態では、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）またはｐｉｇｇｙＢａｃベクターなしにＣＡＲが生成されても良く、その後前述のＣＡＲはＴ細胞をトランスフェクトするために適切なベクターに挿入されても（例えば、Ｓｉｎｇｈら、２０１５に記載のようにＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）ベクターに挿入されても）良い。しかしながら、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞のトランスフェクトに適切なベクターに存在しているＣＡＲの生成によって、プロセスを簡略化したりＣＡＲの生成及びＴ細胞のトランスフェクションに要する工程数を減らしたりしても良い。前述の特徴的な抗原結合ドメインが異なる抗原に選択的に結合しても良い。いくつかの実施形態では、前述の特徴的な抗原結合ドメインが同一の抗原に選択的に結合する。前述の抗原結合ドメインが、ＣＤ１９、汎用抗原（マウス）、ＨＥＲ−３、ＧＤ２、Ｇｐ７５、ＣＳ１タンパク質、メソテリン、ホスファチジルセリン、ｃＭｙｃ、ＣＤ２２、ＣＤ４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３ｅ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ３０、Ｇｐ７５、ＣＤ３８、ＣＤ３３、ＣＤ２０、Ｈｅｒ１／ＨＥＲ３融合物、ＧＤ２、炭水化物、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、ＲＯＲ１、ｃ−ＭＥＴ、ＥＧＦＲ、デクチン、エボラ、真菌、ＧＰ、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＨＥＲＶＫ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＴＧＦ−ｂ２Ｒ、ＩｇＧ４、ビオチン、またはＯ−ＡｃＧＤ２に選択的に結合しても良い。前述の特徴的な抗原結合ドメインがｓｃＦｖを含むまたはからなっても良い。前述のヒンジ領域が、１２ＡＡペプチド（ＧＡＧＡＧＣＡＡＧＴＡＣＧＧＣＣＣＴＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＴＴＧＣＣＣＴ、配列番号１）、ｔ−２０ＡＡペプチド、ＩｇＧ４  Ｆｃ  Δ  ＥＱ、ＩｇＧ４  Ｆｃ  Δ  Ｑ、（ｔ−１２ＡＡ＋ｔ−２０ＡＡ）、ｍＫａｔｅ、ｐｈｉＬｏｖ、ｄｓＲｅｄ、Ｖｅｎｕｓ、ｅＧＦＰ、ＣＨ３  ＨＡ、（ＣＤ８α＋ｔ−２０ＡＡ）、Ｄｏｕｂｌｅ  ｔ−２０ＡＡ、（ｔ−２０ＡＡ＋ＣＤ８α）、（ＣＤ８α＋Ｌｅｕｃｉｎｅ  Ｚｉｐｐｅｒ  Ｂａｓｅｐ１）、（ＣＤ８α＋Ｌｅｕｃｉｎｅ  Ｚｉｐｐｅｒ  Ａｃｉｄ１）、２Ｄ３、ＣＤ８α、またはＩｇＧ４Ｆｃを含んでまたはからなっていても良い。少なくとも１つの前述のエンドドメインがＣＤ３ζを含んでも良い。少なくとも１つの前述のエンドドメインが１つまたは複数のＩＴＡＭドメインを含んでも良い。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの前述のエンドドメインが、（ＣＤ２８＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８＋ＣＤ２７＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８＋４−１ＢＢ＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８＋ＣＤ２７＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８＋４−１ＢＢ＋ＣＤ２７＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８＋４−１ＢＢ＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ζ）、（４−１ＢＢ＋ＣＤ３ζ）、（４−１ＢＢ＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ζ）、（４−１ＢＢ＋ＣＤ２７＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２７＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２７＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８Δ＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８Δ＋ＣＤ２７＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８Δ＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８Δ＋４−１ＢＢ＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８Δ＋４−１ＢＢ＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８Δ＋ＣＤ２７＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８Δ＋４−１ＢＢ＋ＣＤ２７＋ＣＤ３ζ）、（４−１ＢＢ＋ＩＣＯＳ＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８＋ＩＣＯＳ＋ＣＤ３ζ���、（ＩＣＯＳ＋ＣＤ３ζ）、またはＣＤ３ζ若しくはＣＤ２８のみを含む。いくつかの実施形態では、前述のＣＡＲを、例えばｉＱｕｅ（商標）Ｓｃｒｅｅｎｅｒ（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ、ニューメキシコ州アルバカーキ）を用いて活性を試験しても良い。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞等の細胞に発現される場合、ＣＡＲを１つまたは複数の特徴（例えば、生存率、活性化シグナルの上方調節、ＣＤ２５の上方調節、サイトカイン  放出、及び／または細胞死滅）についてフローサイトメトリーといった手法を用いて評価しても良い。
【００１２】
本発明の別の態様は、複数の特徴的な抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、及びエンドドメインをコード化するキメラ抗原受容体をコード化するベクターのコレクションを含む組成物であって、該コレクションにおける前述のベクターを前述のドメインに対してランダム化した前述の組成物に関する。
【００１３】
さらに本発明の別の態様は、それぞれキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコード化する複数のベクターを製造する方法であって、（ｉ）（例えば上記記載のように）本発明の複数のベクターを含む前述の組成物を得ること、及び（ｉｉ）前述の組成物を、前述のベクターにコード化される前述の特徴的な抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン及び／またはエンドドメインを相同組換えにより組み替え可能とする条件に供することにより、複数の第四のベクターを製造することを含み、該第四のベクターがそれぞれＣＡＲをコード化する前述の方法に関する。前述の方法は、前述のＣＡＲを細胞中で発現することをさらに含んでも良い。前述の方法は、前述のＣＡＲの活性を試験することをさらに含んでも良い。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の前述の第一のベクターがｓｃＦｖ領域をコード化する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の前述の第三のベクターが膜貫通ドメインをコード化する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の前述の第二のベクターが膜貫通ドメインをコード化する。前述の方法は、膜貫通ドメインをコード化する第五のベクターを前述の第一のベクター、第二のベクター、及び第三のベクターに組換えによりランダムに組み込んで前述の第四のベクターを形成することをさらに含んでも良い。いくつかの実施形態では、前述の第一のベクター及び前述の第二のベクターは、複数の特徴的なｓｃＦｖ領域及び複数の特徴的なヒンジ領域をコード化する複数のベクターからランダムに結合される。いくつかの実施形態では、前述の第一のベクター及び前述の第三のベクターは、複数の特徴的なｓｃＦｖ領域及び複数の特徴的なエンドドメインをコード化する複数のベクターからランダムに結合される。いくつかの実施形態では、前述の第二のベクター及び前述の第三のベクターは、複数の特徴的なヒンジ領域及び複数の特徴的なエンドドメインをコード化する複数のベクターからランダムに結合される。いくつかの実施形態では、前述の第一のベクター、前述の第二のベクター、及び前述の第三のベクターは、複数の特徴的なｓｃＦｖ領域、複数の特徴的なヒンジ領域、及び複数の特徴的なエンドドメインをコード化する複数のベクターからランダムに結合される。前述の方法は、複数のｓｃＦｖ領域をコード化するベクターの第一のライブラリーからの前述の第一のベクターのランダムな結合、複数のｓｃＦｖ領域をコード化するベクターの第二のライブラリーからの前述の第二のベクターのランダムな結合、及び複数のエンドドメインをコード化するベクターの第三のライブラリーからの前述の第三のベクターのランダムな結合により前述の第四のベクターを生成することによって、前述のＣＡＲをコード化する前述の第四のベクターを形成することをさらに含んでも良い。前述の第一のベクターは、第一の相同組換え配列及び第二の相同組換え部位を含んでも良い。前述の第二のベクターが前述の第二の相同組換え配列及び第三の相同組換え配列を含んでも良い。前述の第三のベクターが前述の第三の相同組換え配列及び第四の相同組換え配列を含んでも良い。前述の第三のベクターが前述の第三の相同組換え配列及び第四の相同組換え配列を含んでも良い。前述の第四のベクターが前述の第一の相同組換え配列及び前述の第四の相同組換え配列を含んでも良い。前述の第一のベクター、前述の第二のベクター、及び／または前述の第三のベクターがトランスポーゼースをコード化しても良い。いくつかの実施形態では、前述の方法が、第六のベクターがトランスポーゼースをコード化し、１つまたは複数の前述の第四のベクター及び前述の第六のベクターを細胞に導入する、電気穿孔する、またはトランスフェクトすることを含む。前述のトランスポーゼースがサケ科型Ｔｃ１様トランスポーゼース（ＳＢ）であっても良い。前述の方法は、前述のＣＡＲ発現Ｔ細胞の増殖を刺激可能な人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）の存在下で前述のＣＡＲをトランスフェクトした細胞を培養または提供することをさらに含んでも良い。いくつかの実施形態では、前述のｓｃＦｖ領域、前述のヒンジ領域、及び前述のエンドドメインをそれぞれＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  （ＳＢ）またはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターでコード化する。いくつかの実施形態では、前述の組換えにより、前述の第一のベクター、前述の第二のベクター、及び／または前述の第三のベクターそれぞれが、複数の特徴的なｓｃＦｖ領域、前述のヒンジ領域、及びエンドドメインをコード化する複数のベクターからランダムに結合される。いくつかの実施形態では、前述の第一のベクター、前述の第二のベクター、及び前述の第三のベクターはそれぞれトランスポゾンを含有し、前述の相同組換えによる結合が部位特異的組換えを含む。いくつかの実施形態では、前述の第一のベクター及び前述の第二のベクターがそれぞれ第一の相同組換え部位を有し、前述の第二のベクター及び前述の第三のベクターがそれぞれ第二の相同組換え部位を有する。いくつかの実施形態では、前述の第一のベクターが第三の組換え部位を有し、前述の第四のベクターが第四の組換え部位を有し、前述の第三の組換え部位及び第四の組換え部位が細胞における相同組換えを可能とする。前述の細胞が、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞といったＴ細胞であっても良い。いくつかの実施形態では、前述の細胞が、幹細胞または人工多能性幹細胞といった多能性細胞である。いくつかの実施形態では、前述の細胞が幹細胞、人工多能性幹細胞、または幹細胞に由来する。前述の細胞が人工多能性幹細胞由来のＴ細胞またはＮＫ細胞であっても良い。いくつかの実施形態では、前述の特徴的な抗原結合ドメインが、異なる抗原を選択的に認識する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９個またはそれ以上のｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、前述の特徴的な抗原結合ドメインが、同一抗原を選択的に認識する（すなわち、特異的に結合する）少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９個またはそれ以上のｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、前述の抗原結合ドメインが、ＣＤ１９、汎用抗原（マウス）、ＨＥＲ−３、ＧＤ２、Ｇｐ７５、ＣＳ１タンパク質、メソテリン、ホスファチジルセリン、ｃＭｙｃ、ＣＤ２２、ＣＤ４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３ｅ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ３０、Ｇｐ７５、ＣＤ３８、ＣＤ３３、ＣＤ２０、Ｈｅｒ１／ＨＥＲ３融合物、ＧＤ２、炭水化物、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、ＲＯＲ１、ｃ−ＭＥＴ、ＥＧＦＲ、デクチン、エボラ、真菌、ＧＰ、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＴＧＦ−ｂ２Ｒ、ＩｇＧ４、ビオチン、またはＯ−ＡｃＧＤ２に選択的に（特異的に）結合する。いくつかの実施形態では、前述の抗原結合ドメインがｓｃＦｖを含むまたはからなる。前述のヒンジ領域が１２ＡＡペプチド（ＧＡＧＡＧＣＡＡＧＴＡＣＧＧＣＣＣＴＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＴＴＧＣＣＣＴ、配列番号１）、ｔ−２０ＡＡペプチド、ＩｇＧ４  Ｆｃ  Δ  ＥＱ、ＩｇＧ４  Ｆｃ  Δ  Ｑ、（ｔ−１２ＡＡ＋ｔ−２０ＡＡ）、ｍＫａｔｅ、ｐｈｉＬｏｖ、ｄｓＲｅｄ、Ｖｅｎｕｓ、ｅＧＦＰ、ＣＨ３  ＨＡ、（ＣＤ８α＋ｔ−２０ＡＡ）、Ｄｏｕｂｌｅ  ｔ−２０ＡＡ、（ｔ−２０ＡＡ＋ＣＤ８α）、（ＣＤ８α＋Ｌｅｕｃｉｎｅ  Ｚｉｐｐｅｒ  Ｂａｓｅｐ１）、（ＣＤ８α＋Ｌｅｕｃｉｎｅ  Ｚｉｐｐｅｒ  Ａｃｉｄ１）、２Ｄ３、ＣＤ８α、またはＩｇＧ４Ｆｃをコード化しても良い。前述のエンドドメインがＣＤ３ζをコード化しても良い。前述のエンドドメインが１つまたは複数のＩＴＡＭドメインをコード化。いくつかの実施形態では、前述のエンドドメインが、（ＣＤ２８＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８＋ＣＤ２７＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８＋４−１ＢＢ＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８＋ＣＤ２７＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８＋４−１ＢＢ＋ＣＤ２７＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８＋４−１ＢＢ＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ζ）、（４−１ＢＢ＋ＣＤ３ζ）、（４−１ＢＢ＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ζ）、（４−１ＢＢ＋ＣＤ２７＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２７＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２７＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８Δ＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８Δ＋ＣＤ２７＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８Δ＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８Δ＋４−１ＢＢ＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８Δ＋４−１ＢＢ＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８Δ＋ＣＤ２７＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８Δ＋４−１ＢＢ＋ＣＤ２７＋ＣＤ３ζ）、（４−１ＢＢ＋ＩＣＯＳ＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８＋ＩＣＯＳ＋ＣＤ３ζ）、（ＩＣＯＳ＋ＣＤ３ζ）、またはＣＤ３ζ若しくはＣＤ２８のみをコード化する。いくつかの実施形態では、前述のＣＡＲを、例えばｉＱｕｅ（商標）Ｓｃｒｅｅｎｅｒ（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ、Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ、ＮＭ）を用いて活性について試験しても良い。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞等の細胞に発現される場合、ＣＡＲを１つまたは複数の特徴（例えば、生存率、活性化シグナルの上方調節、ＣＤ２５の上方調節、サイトカイン放出、及び／または細胞死滅）についてフローサイトメトリーといった手法を用いて評価しても良い。いくつかの実施形態では、前述の活性が、前述のＣＡＲが癌細胞選択的に結合する、病原体に選択的に結合する、自己免疫疾患に関与する細胞に選択的に結合するまたはＴ細胞の活性化、Ｔ細胞の破壊、Ｔ細胞の分化、Ｔ細胞の増殖、Ｔ細胞の脱分化、Ｔ細胞の移動、Ｔ細胞によるサイトカイン産生、またはＴ細胞による死滅を促進する能力を備える。
【００１４】
いくつかの実施形態では、前述の癌細胞が、卵巣癌、リンパ腫、腎細胞癌、Ｂ細胞悪性腫瘍、ＣＬＬ、Ｂ−ＡＬＬ、ＡＬＬ、白血病、Ｂ細胞悪性腫瘍またはリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、無痛性Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、ＡＭＬ、子宮頸癌、乳癌、結腸直腸癌、卵巣癌、神経芽細胞腫、皮膚癌、メラノーマ、肺癌、骨肉腫、神経膠腫、上皮由来腫瘍、前立腺癌、または小児癌である。前述の病原体がウイルス、真菌、または細菌であっても良い。いくつかの実施形態では、前述の試験が、単一細胞イメージング、単一細胞遺伝学、単一Ｔ細胞またはＴ細胞集団のアセスメント、特異的な死滅または連続的死滅の測定、遺伝子発現、タンパク質発現、標的に近づくまたは標的から遠のく移動、増殖、活性化誘発細胞死、サイトカイン分泌、またはケモカイン分泌を含む。前述の方法が、単一のＣＡＲを該単一のＣＡＲの特性に基づいて前述の複数のベクターから選択することをさらに含んでも良い。前述の方法が、前述の単一のＣＡＲを被験体に治療上投与することをさらに含んでも良い。前述の被験体が、例えばヒトといった哺乳類であっても良い。
【００１５】
本発明の別の態様は、ＣＡＲ２１７（配列番号２）、ＣＡＲ１９４（配列番号３）、ＣＡＲ２１２（配列番号４）、ＣＡＲ２１３（配列番号５）、ＣＡＲ２６５（配列番号６）、ＣＡＲ２１４（配列番号５６）、ＣＡＲ２１５（配列番号５７）、ＣＡＲ２１６（配列番号５８）、ＣＡＲ２１８（配列番号５９）、ＣＡＲ１９３（配列番号５５）、またはＣＡＲ２６８（配列番号７）を含むまたはからなるポリペプチドに関する。
【００１６】
さらに本発明の別の態様は、ＣＡＲ２１７（配列番号２）、ＣＡＲ１９４（配列番号３）、ＣＡＲ２１２（配列番号４）、ＣＡＲ２１３（配列番号５）、ＣＡＲ２６５（配列番号６）、ＣＡＲ２１４（配列番号５６）、ＣＡＲ２１５（配列番号５７）、ＣＡＲ２１６（配列番号５８）、ＣＡＲ２１８（配列番号５９）、ＣＡＲ１９３（配列番号５５）、またはＣＡＲ２６８（配列番号７）を含むまたはからなる前述のポリペプチドを発現する形質転換Ｔ細胞に関する。前述の細胞が不死化細胞であっても良い。前述のＴ細胞がαβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、幹細胞、または前述の免疫システムの細胞を含む幹細胞由来の細胞であっても良い。
【００１７】
本発明の別の態様は、本発明の前述の形質転換Ｔ細胞を含む医薬品に関する。
【００１８】
さらに本発明の別の態様は、ＣＡＲ２１７（配列番号２）、ＣＡＲ１９４（配列番号３）、ＣＡＲ２１２（配列番号４）、ＣＡＲ２１３（配列番号５）、ＣＡＲ２６５（配列番号６）、ＣＡＲ２１４（配列番号５６）、ＣＡＲ２１５（配列番号５７）、ＣＡＲ２１６（配列番号５８）、ＣＡＲ２１８（配列番号５９）、ＣＡＲ１９３（配列番号５５）、またはＣＡＲ２６８（配列番号７）を含むまたはからなるキメラ抗原受容体をコード化する核酸に関する。前述の核酸が、例えばαβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、幹細胞、または多能性細胞由来のＴ細胞といったＴ細胞に含まれても良い。前述のＴ細胞が医薬的に許容される担体または賦形剤に含まれても良い。
【００１９】
本発明の別の態様は、異なるＣＡＲをコード化するベクターのライブラリーを含む組成物であって、該ライブラリーの前述のベクターを特徴的な抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン及び／またはエンドドメインについてランダム化した、前述の組成物に関する。いくつかの実施形態では、前述のライブラリーは、特徴的な抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、及びエンドドメインについてランダム化したものである。いくつかの実施形態では、前述のライブラリーは、特徴的な抗原結合ドメイン及びエンドドメインについてランダム化したものである。いくつかの実施形態では、前述のライブラリーは、特徴的な抗原結合ドメイン及びヒンジドメインについてランダム化したものである。いくつかの実施形態では、前述のライブラリーは、特徴的な抗原ヒンジドメイン及びエンドドメインについてランダム化したものである。
【００２０】
表１に、ＣＡＲを生成するために本発明の方法で使用する  抗原結合ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、及びエンドドメインの例を示す。前述の抗原結合ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、及びエンドドメインは非限定的な例として表１に示されるもので、特定の臨床適用において望まれる実質的にいかなる抗原結合ドメイン（例えば、癌性細胞、細菌、真菌、ウイルス、またはウイルス感染細胞の標的化）を選択しても良いことが期待される。表１では、前述の抗原結合ドメインの標的が提供される（例えば、「ＣＤ１９」とはＣＤ１９に選択的に結合するｓｃＦｖ領域を意味しても良い）。いくつかの実施形態では、前述の抗原結合ドメインは前述の抗原に選択的に結合するｓｃＦｖを含むまたはからなる。望ましくは、前述のｓｃＦｖの一部（例えば、ｓｃＦｖの可変領域の一部）はランダム化されても良い。いくつかの実施形態では、前述の抗原結合ドメインはタンパク質に選択的に結合する。もしくは、前述の抗原結合ドメインは真菌、ウイルス、細菌、または癌性細胞といった標的上に発現される炭水化物に選択的に結合しても良い。例えば、いくつかの実施形態では、前述の抗原結合ドメインは、真菌細胞壁に見られるβ−グルカン及び炭水化物に選択的に結合可能なデクチン−１を含むまたはからなる。いくつかの実施形態では、前述のＣＡＲはウイルスに選択的に  結合しても良く、例えば、前述のＣＡＲは肝炎エンベロープタンパク質といったウイルスタンパク質に結合しても良い（例えば、Ｋｒｅｂｓら、２０１３）。いくつかの実施形態では、前述の抗原結合ドメインはサイトカインである。前述の抗原結合ドメインは、タンパク質、炭水化物、または糖に選択的に結合しても良い。いくつかの実施形態では、単一の標的や抗原に選択的に結合する複数の抗原結合ドメインからＣＡＲが生成され、または該抗原結合ドメインはオーバーラップする抗原を有しても良い。いくつかの実施形態では、異なる標的または抗原選択的に結合する複数の抗原結合ドメインからＣＡＲが生成される。ＣＡＲにおけるエンドドメインにより、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞といったＣＡＲを発現する細胞中で抑制シグナル（例えば、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＢＴＬＡ、ＩＴＩＭ、ＳＨＰ−１、ＬＡＩＲ−１、ＴＩＧＩＴ、Ｓｉｇｌｅｃｓ）または刺激シグナル（例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＬＣＫ、ＤＡＰ１０、ＩＴＡＭ、ＺＡＰ−７０、ＬＡＴ、ＳＬＰ−７６、サイトカインやサイトカイン受容体、それらの組み合わせ及び変異）が発生しても良い。抗原結合領域が抗原を選択的に認識する場合、エンドドメインは、ＣＡＲを含む細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）が細胞死滅を活性化する、移動する、分化する、脱分化する、または該細胞でアポトーシスシグナル誘導を導くようにさせるまたは促進してもよい。前述のアポトーシスシグナルはＣＴＬＡ４アポトーシスシグナル及び／またはＰＤ１（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅａｔｈ  １）アポトーシスシグナルを含んでまたはからなっていても良い。いくつかの実施形態では、複数の特徴的なＣＡＲが、Ｔ細胞またはＮＫ細胞といった細胞中で発現されても良い。例えば、第��のＣＡＲ及び第二のＣＡＲが細胞中で発現されても良く、前述の第一のＣＡＲは健康な細胞上の抗原に選択的に結合して第一のエンドドメインを介して抑制シグナルを誘導し（例えば、前述のＴ細胞またはＮＫ細胞が前述の健康な細胞を損傷する可能性を低くする）、前述の第二のＣＡＲは標的細胞（例えば、癌性細胞、真菌、ウイルス感染細胞、細菌）上の抗原に選択的に結合して第二のエンドドメインを介して刺激シグナルを誘導する（例えば、前述のＴ細胞またはＮＫ細胞による前述の標的細胞の細胞死滅を促進または引き起こす）。本発明の方法で生成されるＣＡＲを、組み込みＤＮＡ（例えば、トランスポーゼース／トランスポゾンベクターまたはシステムを介した電気穿孔及び相同組換えを用いて）または非組み込みＤＮＡ若しくはＲＮＡ（例えば、レンチウイルスまたはレトロウイルスといったウイルスベクターを用いたｍＲＮＡのウイルス搬送）としてＴ細胞またはＮＫ細胞といった標的細胞に挿入しても良い。いくつかの実施形態では、本発明によるＣＡＲをコード化するＴ細胞は不死化細胞であり、そのような不死化細胞は、ＣＡＲの治療可能性または毒性を評価または測定するように機能し用いられても良い。このようにして、多くのＣＡＲを望ましい薬理学的プロファイル、疾患細胞または病原体に対する毒性、健康な細胞における毒性の欠如、及び／または治療有効性についてスクリーニングしても良い。
【表１−１】
2020058380.tif 000002
【表１−２】
2020058380.tif 000003
【表１−３】
2020058380.tif 000004
【表１−４】
2020058380.tif 000005
【００２１】
例えばいくつかの実施形態では、表２に示すように、下記の抗原結合ドメイン、ヒンジ／スキャフォールド、膜貫通ドメイン、及びエンドドメインを用いても良い。例えば表１または表２のシグナリングドメインに含まれる配列の例として、ＣＤ２７（配列番号４１）、ＣＤ２８（配列番号４２）、ＣＤ２８Δ（配列番号４３）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）（配列番号４４）、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）（配列番号４５）、ＩＣＯＳ（配列番号４６）及びＣＤ３ζ（配列番号４７）があげられる。表２に記載のｓｃＦｖ抗ＥＧＦＲドメインの例としてニモツズマブ（配列番号４８）及びセツキシマブ（配列番号４９）があげられる。表２に記載のｓｃＦｖ抗ホスファチジルセリンの例としてバビツキシマブ（配列番号５０）があげられる。
表２：ＣＡＲの生成に使用するライブラリーの例
【表２−１】
2020058380.tif 000006
【表２−２】
2020058380.tif 000007
【表２−３】
2020058380.tif 000008
【表２−４】
2020058380.tif 000009
【００２２】
本明細書で使用する「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」または「ＣＡＲ」といった用語は人工的なＴ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、またはキメラ免疫受容体を含む。通常ＣＡＲは、人工的な特異性を特定の免疫エフェクター細胞に付与可能な遺伝子組換え受容体である。ＣＡＲを用いてモノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に付与し、例えば養子細胞療法に使用するための多数の特異的Ｔ細胞を生成させても良い。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは前述の細胞は腫瘍関連抗原に対する特異性を持つ。好ましい実施形態では、ＣＡＲはエンドドメイン（細胞内活性化ドメインを含む）、膜貫通ドメイン、ヒンジまたはスキャフォールド領域、及び標的化ドメインを含む細胞外ドメイン（例えば、モノクローナル抗体由来のｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態では、前述の細胞外標的化ドメインは受容体のレセプターであっても良い（例えば、タンパク質受容体選択的に結合するペプチド）。いくつかの実施形態では、前述の悪性細胞に特異的なＣＡＲを用いて（例えば、癌性Ｂ系統細胞を標的とする抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖを用いて）Ｔ細胞に特異性を付与することにより悪性細胞を標的化できる。
【００２３】
ｓｃＦｖ領域、ヒンジ／スキャフォールド領域、膜貫通ドメイン、及びエンドドメインの例を表１に示す。また関連する配列の例も本明細書中に記載する。ただし表１では、前述のｓｃＦｖ領域は特定の標的に対する複数のｓｃＦｖ域を意味しても良い（例えば、表１の「ＣＤ１９」は単一のモノクローナル抗体配列を意味しても良く、またはいくつかの好ましい実施形態では、ＣＤ１９を選択的に標的化するモノクローナル抗体由来の複数のｓｃＦｖ領域を意味しても良い）。本発明の方法を使用して、例えば表１に記載のｓｃＦｖ領域、ヒンジ／スキャフォールド、膜貫通ドメイン、及びエンドドメインの任意の組み合わせの融合物を含むＣＡＲを生成可能であることが期待される。例えば、いくつかの実施形態では、前述のＣＡＲは、ＩｇＧ４  Ｆｃヒンジ／スキャフォールド領域、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、及びＣＤ２８及びＣＤ３ζを含むエンドドメインに融合したＣＤ１９（例えばマウス、ヒト、またはヒト化モノクローナル抗体由来の）を選択的に標的とするｓｃＦｖ領域を含んでいても良い。いくつかの実施形態では、前述のＣＡＲは、ＩｇＧ４  Ｆｃ  ヒンジ／スキャフォールド領域、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、及びＣＤ２８及びＣＤ３ζを含むエンドドメインに融合したＲＯＲ１を選択的に標的とするｓｃＦｖ領域を含んでいても良い。いくつかの実施形態では、前述のＣＡＲは、ＩｇＧ４  Ｆｃヒンジ／スキャフォールド領域、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、及び４−１ＢＢ及びＣＤ３ζを含むエンドドメインに融合したＲＯＲ１を選択的に標的とするｓｃＦｖ領域を含んでいても良い。いくつかの実施形態では、前述のＣＡＲは、ＩｇＧ４  Ｆｃヒンジ／スキャフォールド領域、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、及びＣＤ２８及びＣＤ３ζを含むエンドドメインに融合したＣＤ１９（例えばマウス、ヒト、またはヒト化モノクローナル抗体由来の）を選択的に標的とするｓｃＦｖ領域を含んでいても良い。
【００２４】
本明細書で使用する用語「抗原」は、抗体またはＴ細胞受容体に結合可能な分子を意味する。通常抗原を使用して体液性免疫応答及び／または細胞性免疫応答を誘導することによりＢ及び／またはＴリンパ球が産生されてもよい。
【００２５】
本明細書における「ａ」または「ａｎ」は一つまたはそれ以上を意味しても良い。請求項にいて、「を含む」という用語をあわせて使用する場合、「ａ」または「ａｎ」は一つまたは一つ以上を意味してもよい。
【００２６】
代替の用語のみを参照するよう明示的に記載される場合または該代替の用語が相互排他的である場合を除き、請求項に使用される用語「または」は「及び／または」を意味するが、本開示は代替の用語及び「及び／または」のみを参照する定義を支持する。本明細書における「他の（別の）」は、少なくとも第二またはそれ以上の選択肢を意味しても良い。
【００２７】
本出願全体において、用語「約」は、ある数値が該数値を求める際に使用した装置や方法の固有のバリエーションまたは被験体間において存在するバリエーションを含むことを意味するものとして使用される。
【００２８】
本発明のその他の目的、特徴、利点は以下の記載において明らかとなる。ただし、本発明の精神及び範囲に基づく種々の変更及び改変は詳細な説明から当業者にとって明らかであるように、本発明の好ましい実施形態を示す詳細な説明や具体的な実施例は、例示目的のみにおいて提示されるものである。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
（ａ）１つまたは複数の特徴的な抗原結合ドメインをコード化する複数の第一のベクター、
（ｂ）１つまたは複数の特徴的なヒンジドメインをコード化する複数の第二のベクター、及び
（ｃ）１つまたは複数の特徴的なエンドドメインをコード化する複数の第三のベクターを含む組成物であって、
少なくとも２つの第一、第二、及び第三のベクターが複数の２つ以上の特徴的な抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、及び／またはエンドドメインをコード化するベクターをそれぞれ含み、さらに前記ベクターが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコード化する第四のベクターの生成を可能にする相同組換え部位を含む、前記組成物。
（項目２）
前記複数の第一のベクターが複数の特徴的な抗原結合ドメインをコード化し、前記複数の第二のベクターが一つのヒンジドメインをコード化し、及び前記複数の第三のベクターが複数の特徴的なエンドドメインをコード化する、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記複数の第一のベクターが複数の特徴的な抗原結合ドメインをコード化し、前記複数の第二のベクターが、複数の特徴的なヒンジドメインをコード化し、及び前記複数の第三のベクターが複数の特徴的なエンドドメインをコード化する、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記複数の第一のベクターが複数の特徴的な抗原結合ドメインをコード化し、前記複数の第二のベクターが複数の特徴的なヒンジドメインをコード化し、及び前記複数の第三のベクターが一つのエンドドメインをコード化する、項目１に記載の組成物。
（項目５）
前記複数の第一のベクターが一つの抗原結合ドメインをコード化し、前記複数の第二のベクターが複数の特徴的なヒンジドメインをコード化し、及び前記複数の第三のベクターが複数の特徴的なエンドドメインをコード化する、項目１に記載の組成物。
（項目６）
前記抗原結合ドメインがｓｃＦｖを含むまたはからなる、項目１〜５に記載の前記組成物。
（項目７）
前記第三のベクターが膜貫通ドメインをコード化する、項目１〜５に記載の前記組成物。
（項目８）
前記第二のベクターが膜貫通ドメインをコード化する、項目１〜５に記載の前記組成物。
（項目９）
前記組成物がさらに１つまたは複数の膜貫通ドメインをコード化する複数の第五のベクター含み、前記第一のベクター、前記第二のベクター、前記第三のベクター、及び前記第五のベクターは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコード化する第四のベクターを生成するための相同組換え部位を含む、項目１〜８に記載の前記組成物。
（項目１０）
前記第一のベクターが第一の相同組換え配列及び第二の相同組換え部位を含む、項目１〜９に記載の前記組成物。
（項目１１）
前記第二のベクターが前記第二の相同組換え配列及び第三の相同組換え配列を含む、項目１〜１０に記載の前記組成物。
（項目１２）
前記第三のベクターが前記第三の相同組換え配列及び第四の相同組換え配列を含む、請求項１〜１１に記載の前記組成物。
（項目１３）
前記第三のベクターが前記第三の相同組換え配列及び第四の相同組換え配列を含む、項目１〜１２に記載の前記組成物。
（項目１４）
前記第四のベクターは、前記第一の相同組換え配列及び前記第四の相同組換え配列を含む、項目１〜１３に記載の前記組成物。
（項目１５）
前記第一のベクター、前記第二のベクター、及び／または前記第三のベクターがトランスポーゼースをコード化する、項目１〜１４に記載の前記組成物。
（項目１６）
前記トランスポーゼースはサケ科型Ｔｃ１様トランスポーゼース（ＳＢ）である、項目１〜１５に記載の前記組成物。
（項目１７）
前記第一のベクター、前記第二のベクター、前記第三のベクター、及び／または前記第五のベクターのうち１、２、３、４、５個がＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）またはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターである、項目１〜１６に記載の前記組成物。
（項目１８）
前記特徴的な抗原結合ドメインが異なる抗原に選択的に結合する、項目１〜１７に記載の前記組成物。
（項目１９）
前記特徴的な抗原結合ドメインが同一の抗原に選択的に結合する、項目１〜１８に記載の前記組成物。
（項目２０）
前記抗原結合ドメインが、ＣＤ１９、汎用抗原（マウス）、ＨＥＲ−３、ＧＤ２、Ｇｐ７５、ＣＳ１  タンパク質、メソテリン、ホスファチジルセリン、ｃＭｙｃ、ＣＤ２２、ＣＤ４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３ｅ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ３０、Ｇｐ７５、ＣＤ３８、ＣＤ３３、ＣＤ２０、Ｈｅｒ１／ＨＥＲ３融合物、ＧＤ２、炭水化物、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、ＲＯＲ１、ｃ−ＭＥＴ、ＥＧＦＲ、デクチン、エボラ、真菌、ＧＰ、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＨＥＲＶＫ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＴＧＦ−ｂ２Ｒ、ＩｇＧ４、ビオチン、またはＯ−ＡｃＧＤ２に選択的に結合する、項目１〜１９に記載の前記組成物。
（項目２１）
前記特徴的な抗原結合ドメインがｓｃＦｖを含むまたはからなる、項目１〜２０に記載の前記組成物。
（項目２２）
前記ヒンジ領域が、１２ＡＡペプチド（ＧＡＧＡＧＣＡＡＧＴＡＣＧＧＣＣＣＴＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＴＴＧＣＣＣＴ、配列番号１）、ｔ−２０ＡＡペプチド、ＩｇＧ４  Ｆｃ  Δ  ＥＱ、ＩｇＧ４  Ｆｃ  Δ  Ｑ、（ｔ−１２ＡＡ＋ｔ−２０ＡＡ）、ｍＫａｔｅ、ｐｈｉＬｏｖ、ｄｓＲｅｄ、Ｖｅｎｕｓ、ｅＧＦＰ、ＣＨ３  ＨＡ、（ＣＤ８  α＋ｔ−２０ＡＡ）、Ｄｏｕｂｌｅ  ｔ−２０  ＡＡ、（ｔ−２０ＡＡ＋ＣＤ８α）、（ＣＤ８α＋Ｌｅｕｃｉｎｅ  Ｚｉｐｐｅｒ  Ｂａｓｅｐ１）、（ＣＤ８α＋Ｌｅｕｃｉｎｅ  Ｚｉｐｐｅｒ  Ａｃｉｄ１）、２Ｄ３、ＣＤ８α、またはＩｇＧ４Ｆｃをコード化する、項目１〜２１に記載の前記組成物。
（項目２３）
少なくとも１つの前記エンドドメインがＣＤ３ζを含む、項目１〜２２に記載の前記方法。
（項目２４）
少なくとも１つの前記エンドドメインが１つまたは複数のＩＴＡＭドメインを含む、請求項１〜２３に記載の前記方法。
（項目２５）
少なくとも１つの前記エンドドメインが、（ＣＤ２８＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８＋ＣＤ２７＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８＋４−１ＢＢ＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８＋ＣＤ２７＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８＋４−１ＢＢ＋ＣＤ２７＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８＋４−１ＢＢ＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ζ）、（４−１ＢＢ＋ＣＤ３ζ）、（４−１ＢＢ＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ζ）、（４−１ＢＢ＋ＣＤ２７＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２７＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２７＋ＯＸ  ４０＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８Δ＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８Δ＋ＣＤ２７＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８Δ＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８Δ＋４−１ＢＢ＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８Δ＋４−１ＢＢ＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８Δ＋ＣＤ２７＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８Δ＋４−１ＢＢ＋ＣＤ２７＋ＣＤ３ζ）、（４−１ＢＢ＋ＩＣＯＳ＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８＋ＩＣＯＳ＋ＣＤ３ζ）、（ＩＣＯＳ＋ＣＤ３ζ）、またはＣＤ３ζ若しくはＣＤ２８のみを含む、項目１〜２４に記載の前記方法。
（項目２６）
複数の特徴的な抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、及びエンドドメインをコード化するキメラ抗原受容体をコード化するベクターのコレクションを含む組成物であって、該コレクションにおける前記ベクターを前記ドメインに対してランダム化した前記組成物。
（項目２７）
それぞれキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコード化する複数のベクターを製造する方法であって、（ｉ）項目１〜２５のいずれか１項に記載の前記組成物を得ること、及び（ｉｉ）前記組成物を、前記ベクターにコード化される前記特徴的な抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン及び／またはエンドドメインを相同組換えにより組み替え可能とする条件に供することにより、複数の第四のベクターを製造することを含み、該第四のベクターがそれぞれＣＡＲをコード化する前記方法。
（項目２８）
前記ＣＡＲを細胞中で発現することをさらに含む、項目２７に記載の前記方法。
（項目２９）
前記ＣＡＲの活性を試験することをさらに含む、項目２７〜２８に記載の前記方法。
（項目３０）
１つまたは複数の前記第一のベクターがｓｃＦｖ領域をコード化する、項目２７〜２９に記載の前記方法。
（項目３１）
１つまたは複数の前記第三のベクターが膜貫通ドメインをコード化する、項目２７〜３０に記載の前記方法。
（項目３２）
１つまたは複数の前記第二のベクターが膜貫通ドメインをコード化する、項目２７〜３０に記載の前記方法。  
（項目３３）
膜貫通ドメインをコード化する第五のベクターを前記第一のベクター、第二のベクター、及び第三のベクターに組換えによりランダムに組み込んで前記第四のベクターを形成することをさらに含む、項目２７〜３２に記載の前記方法。
（項目３４）
前記第一のベクター及び前記第二のベクターは、複数の特徴的なｓｃＦｖ領域及び複数の特徴的なヒンジ領域をコード化する複数のベクターからランダムに結合される、項目２７〜３３に記載の前記方法。
（項目３５）
前記第一のベクター及び前記第三のベクターは、複数の特徴的なｓｃＦｖ領域及び複数の特徴的なエンドドメインをコード化する複数のベクターからランダムに結合される、項目２７〜３４に記載の前記方法。
（項目３６）
前記第二のベクター及び前記第三のベクターは、複数の特徴的なヒンジ領域及び複数の特徴的なエンドドメインをコード化する複数のベクターからランダムに結合される、項目２７〜３５に記載の前記方法。
（項目３７）
前記第一のベクター、前記第二のベクター、及び前記第三のベクターは、複数の特徴的なｓｃＦｖ領域、複数の特徴的なヒンジ領域、及び複数の特徴的なエンドドメインをコード化する複数のベクターからランダムに結合される、項目２７〜３６に記載の前記方法。
（項目３８）
複数のｓｃＦｖ領域をコード化するベクターの第一のライブラリーからの前記第一のベクターのランダムな結合、複数のｓｃＦｖ領域をコード化するベクターの第二のライブラリーからの前記第二のベクターのランダムな結合、及び複数のエンドドメインをコード化するベクターの第三のライブラリーからの前記第三のベクターのランダムな結合により前記第四のベクターを生成することによって、前記ＣＡＲをコード化する前記第四のベクターを形成することさらに含む、項目２７〜３６に記載の前記方法。
（項目３９）
前記第一のベクターは、第一の相同組換え配列及び第二の相同組換え部位を含む、項目２７〜３８に記載の前記方法。
（項目４０）
前記第二のベクターが前記第二の相同組換え配列及び第三の相同組換え配列を含む、項目２７〜３９に記載の前記方法。
（項目４１）
前記第三のベクターが前記第三の相同組換え配列及び第四の相同組換え配列を含む、項目２７〜４０に記載の前記方法。
（項目４２）
前記第三のベクターが前記第三の相同組換え配列及び第四の相同組換え配列を含む、項目２７〜４１に記載の前記方法。
（項目４３）
前記第四のベクターが前記第一の相同組換え配列及び前記第四の相同組換え配列を含む、項目２７〜４２に記載の前記方法。
（項目４４）
前記第一のベクター、前記第二のベクター、及び／または前記第三のベクターがトランスポーゼースをコード化する、項目２７〜４３に記載の前記方法。
（項目４５）
第六のベクターがトランスポーゼースをコード化し、１つまたは複数の前記第四のベクター及び前記第六のベクターを細胞に導入する、電気穿孔する、またはトランスフェクトすることを含む、項目２７〜４４に記載の前記方法。
（項目４６）
前記トランスポーゼースがサケ科型Ｔｃ１様トランスポーゼース（ＳＢ）である、項目４５に記載の前記方法。
（項目４７）
前記ＣＡＲ発現Ｔ細胞の増殖を刺激可能な人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）の存在下で前記ＣＡＲをトランスフェクトした細胞を培養または提供することをさらに含む、項目２７〜４６に記載の前記方法。
（項目４８）
前記ｓｃＦｖ領域、前記ヒンジ領域、及び前記エンドドメインをそれぞれＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  （ＳＢ）またはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターでコード化する、項目２７〜４７に記載の前記方法。
（項目４９）
前記組換えにより、前記第一のベクター、前記第二のベクター、及び／または前記第三のベクターそれぞれが、複数の特徴的なｓｃＦｖ領域、前記ヒンジ領域、及びエンドドメインをコード化する複数のベクターからランダムに結合される、項目２７〜４８に記載の前記方法。
（項目５０）
前記第一のベクター、前記第二のベクター、及び前記第三のベクターはそれぞれトランスポゾンを含有し、前記相同組換えによる結合が部位特異的組換えを含む、項目２７〜４９に記載の前記方法。
（項目５１）
前記第一のベクター及び前記第二のベクターがそれぞれ第一の相同組換え部位を有し、前記第二のベクター及び前記第三のベクターがそれぞれ第二の相同組換え部位を有する、項目５０に記載の前記方法。
（項目５２）
前記第一のベクターが第三の組換え部位を有し、前記第四のベクターが第四の組換え部位を有し、前記第三の組換え部位及び第四の組換え部位が細胞における相同組換えを可能とする、項目５０〜５１に記載の前記方法。
（項目５３）
前記細胞がＴ細胞である、項目２８〜５２に記載の前記方法。
（項目５４）
前記Ｔ細胞がαβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞である、項目５３に記載の前記方法。
（項目５５）
前記細胞が多能性細胞である、項目５３に記載の前記方法。
（項目５６）
前記多能性細胞が幹細胞または人工多能性幹細胞である、項目５５に記載の前記方法。
（項目５７）
前記細胞が幹細胞、人工多能性幹細胞、または幹細胞に由来する、項目５３に記載の前記方法。
（項目５８）
前記細胞が人工多能性幹細胞由来のＴ細胞またはＮＫ細胞である、項目５６〜５７に記載の前記方法。
（項目５９）
前記特徴的な抗原結合ドメインが、異なる抗原を選択的に認識する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９個またはそれ以上のｓｃＦｖを含む、項目２７〜５８に記載の前記方法。
（項目６０）
前記特徴的な抗原結合ドメインが、同一抗原を選択的に認識する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９個またはそれ以上のｓｃＦｖを含む、項目２７〜５９に記載の前記方法。
（項目６１）
前記抗原結合ドメインが、ＣＤ１９、汎用抗原（マウス）、ＨＥＲ−３、ＧＤ２、Ｇｐ７５、ＣＳ１タンパク質、メソテリン、ホスファチジルセリン、ｃＭｙｃ、ＣＤ２２、ＣＤ４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３ｅ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ３０、Ｇｐ７５、ＣＤ３８、ＣＤ３３、ＣＤ２０、Ｈｅｒ１／ＨＥＲ３融合物、ＧＤ２、炭水化物、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、ＲＯＲ１、ｃ−ＭＥＴ、ＥＧＦＲ、デクチン、エボラ、真菌、ＧＰ、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＨＥＲＶＫ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＴＧＦ−ｂ２Ｒ、ＩｇＧ４、ビオチン、またはＯ−ＡｃＧＤ２に選択的に結合する、項目２７〜６０に記載の前記方法。
（項目６２）
前記抗原結合ドメインがｓｃＦｖを含むまたはからなる、項目２７〜６１に記載の前記方法。
（項目６３）
前記ヒンジ領域が１２ＡＡペプチド（ＧＡＧＡＧＣＡＡＧＴＡＣＧＧＣＣＣＴＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＴＴＧＣＣＣＴ、配列番号１）、ｔ−２０  ＡＡペプチド、ＩｇＧ４  Ｆｃ  Δ  ＥＱ、ＩｇＧ４  Ｆｃ  Δ  Ｑ、（ｔ−１２ＡＡ＋ｔ−２０ＡＡ）、ｍＫａｔｅ、ｐｈｉＬｏｖ、ｄｓＲｅｄ、Ｖｅｎｕｓ、ｅＧＦＰ、ＣＨ３  ＨＡ、（ＣＤ８  α＋ｔ−２０ＡＡ）、Ｄｏｕｂｌｅ  ｔ−２０  ＡＡ、（ｔ−２０ＡＡ＋ＣＤ８α）、（ＣＤ８α＋Ｌｅｕｃｉｎｅ  Ｚｉｐｐｅｒ  Ｂａｓｅｐ１）、（ＣＤ８α＋Ｌｅｕｃｉｎｅ  Ｚｉｐｐｅｒ  Ａｃｉｄ１）、２Ｄ３、ＣＤ８α、またはＩｇＧ４  Ｆｃをコード化する、項目２７〜６２に記載の前記方法。
（項目６４）
前記エンドドメインがＣＤ３ζをコード化する、項目２７〜６３に記載の前記方法。
（項目６５）
前記エンドドメインが１つまたは複数のＩＴＡＭドメインをコード化する、項目２７〜６４に記載の前記方法。
（項目６６）
前記エンドドメインが、（ＣＤ２８＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８＋ＣＤ２７＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８＋４−１ＢＢ＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８＋ＣＤ２７＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８＋４−１ＢＢ＋ＣＤ２７＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８＋４−１ＢＢ＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ζ）、（４−１ＢＢ＋ＣＤ３ζ）、（４−１ＢＢ＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ζ）、（４−１ＢＢ＋ＣＤ２７＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２７＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２７＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８Δ＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８Δ＋ＣＤ２７＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８Δ＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８Δ＋４−１ＢＢ＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８Δ＋４−１ＢＢ＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８Δ＋ＣＤ２７＋ＯＸ４０＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８Δ＋４−１ＢＢ＋ＣＤ２７＋ＣＤ３ζ）、（４−１ＢＢ＋ＩＣＯＳ＋ＣＤ３ζ）、（ＣＤ２８＋ＩＣＯＳ＋ＣＤ３ζ）、（ＩＣＯＳ＋ＣＤ３ζ）、またはＣＤ３ζ若しくはＣＤ２８のみをコード化する、項目２７〜６５に記載の前記方法。
（項目６７）
前記活性が、前記ＣＡＲが癌細胞選択的に結合する、病原体に選択的に結合する、自己免疫疾患に関与する細胞に選択的に結合するまたはＴ細胞の活性化、Ｔ細胞の破壊、Ｔ細胞の分化、Ｔ細胞の増殖、Ｔ細胞の脱分化、Ｔ細胞の移動、Ｔ細胞によるサイトカイン産生、またはＴ細胞による死滅を促進する能力を備える、項目２９〜６６に記載の前記方法。
（項目６８）
前記癌細胞が、卵巣癌、リンパ腫、腎細胞癌、Ｂ細胞悪性腫瘍、ＣＬＬ、Ｂ−ＡＬＬ、ＡＬＬ、白血病、Ｂ細胞悪性腫瘍またはリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、無痛性Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、ＡＭＬ、子宮頸癌、乳癌、結腸直腸癌、卵巣癌、神経芽細胞腫、皮膚癌、メラノーマ、肺癌、骨肉腫、神経膠腫、上皮由来腫瘍、前立腺癌、または小児癌である、項目６７に記載の前記方法。
（項目６９）
前記病原体がウイルス、真菌、または細菌である、項目６７に記載の前記方法。
（項目７０）
前記試験が、単一細胞イメージング、単一細胞遺伝学、単一Ｔ細胞またはＴ細胞集団のアセスメント、特異的な死滅または連続的死滅の測定、遺伝子発現、タンパク質発現、標的に近づくまたは標的から遠のく移動、増殖、活性化誘発細胞死、サイトカイン分泌、またはケモカイン分泌を含む、項目２９〜６９に記載の前記方法。
（項目７１）
単一のＣＡＲを該単一のＣＡＲの特性に基づいて前記複数のベクターから選択することをさらに含む、項目２７〜７０に記載の前記方法。
（項目７２）
前記単一のＣＡＲを被験体に治療上投与することをさらに含む、項目７１に記載の前記方法。
（項目７３）
前記被験体が哺乳類である、項目７２に記載の前記方法。
（項目７４）
前記哺乳類がヒトである、項目７３に記載の前記方法。
（項目７５）
ＣＡＲ２１７（配列番号２）、ＣＡＲ１９４（配列番号３）、ＣＡＲ２１２（配列番号４）、ＣＡＲ２１３（配列番号５）、ＣＡＲ２６５（配列番号６）、ＣＡＲ２１４（配列番号５６）、ＣＡＲ２１５（配列番号５７）、ＣＡＲ２１６（配列番号５８）、ＣＡＲ２１８（配列番号５９）、ＣＡＲ１９３（配列番号５５）、またはＣＡＲ２６８（配列番号７）を含むまたはからなるポリペプチド。
（項目７６）
項目７５に記載の前記ポリペプチドを発現する形質転換Ｔ細胞。
（項目７７）
前記細胞が不死化細胞である、項目７６に記載の前記形質転換細胞。
（項目７８）
前記Ｔ細胞がαβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、幹細胞、または前記免疫システムの細胞を含む幹細胞由来の細胞である、項目７６に記載の前記Ｔ細胞。
（項目７９）
項目７６−７８のいずれか１項に記載の前記形質転換Ｔ細胞を含む医薬品。
（項目８０）
ＣＡＲ２１７（配列番号２）、ＣＡＲ１９４（配列番号３）、ＣＡＲ２１２（配列番号４）、ＣＡＲ２１３（配列番号５）、ＣＡＲ２６５（配列番号６）、ＣＡＲ２１４（配列番号５６）、ＣＡＲ２１５（配列番号５７）、ＣＡＲ２１６（配列番号５８）、ＣＡＲ２１８（配列番号５９）、ＣＡＲ１９３（配列番号５５）、またはＣＡＲ２６８（配列番号７）を含むまたはからなるキメラ抗原受容体をコード化する核酸。
（項目８１）
前記核酸がＴ細胞に含まれる、項目８０に記載の前記核酸。
（項目８２）
前記Ｔ細胞がαβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、幹細胞、または多能性細胞由来のＴ細胞である、項目８１に記載の前記核酸。
（項目８３）
前記Ｔ細胞が医薬的に許容される担体または賦形剤に含まれる、項目８１に記載の前記核酸。
（項目８４）
異なるＣＡＲをコード化するベクターのライブラリーを含む組成物であって、該ライブラリーの前記ベクターを特徴的な抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン及び／またはエンドドメインについてランダム化した、前記組成物。
（項目８５）
前記ライブラリーは、特徴的な抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、及びエンドドメインについてランダム化したものである、項目８４に記載の前記組成物。
（項目８６）
前記ライブラリーは、特徴的な抗原結合ドメイン及びエンドドメインについてランダム化したものである、項目８４に記載の前記組成物。
（項目８７）
前記ライブラリーは、特徴的な抗原結合ドメイン及びヒンジドメインについてランダム化したものである、項目８４に記載の前記組成物。
（項目８８）
前記ライブラリーは、特徴的な抗原ヒンジドメイン及びエンドドメインについてランダム化したものである、項目８４に記載の前記組成物。
【００２９】
以下に記載の図面は本明細書の一部を構成するものであり、本発明の所定の態様をさらに明示するために本明細書に含まれる。本明細書に示す具体的な実施形態の詳細な記載と共に１つまたは複数の図面を参照することにより本発明はさらに理解されうる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】クローニングベクターを用いて、（ｉ）特定のｓｃＦｖ、（ｉｉ）細胞外ヒンジ、及び（ｉｉｉ）エンドドメインを発現する３つのドナープラスミドによりＣＡＲを再構築した。このアプローチを、ヒンジ、膜貫通、及び細胞内領域が異なるＣＡＲのパネルの生成に採用できる。コンポーネントであるｓｃＦｖ、ＩｇＧ４  Ｆｃ（大ヒンジ）またはＣＤ８ａ（中ヒンジ）またはペプチドのみ（小ヒンジ）、及び
【化１】
2020058380.tif 000010
と異なるシグナリングドメインと組み合わせて、三重組換え部位システムを用いてＣＡＲ分子を構築する。３つのドナープラスミド（エントリークローン）にコード化されたｓｃＦｖ並びに特徴的なスキャフォールド及びシグナリングドメインのライブラリーを前述の発現ＤＮＡ  ベクターに組み替える。このアプローチにより前述のｓｃＦｖ−Ｂ−スキャフォールド−Ｃ−シグナリングドメインのフォーマットにおける複数のＣＡＲ種を生成した。
【図２Ａ】図２Ａは、電気穿孔後６６日目のフローサイトメトリーによるＴ細胞におけるＣＡＲ（Ｆｃ）及びＣＤ８＋の発現を示す。細胞をＣＤ１９抗原（クローン４）で負荷したａＡＰＣで増殖した。図２Ｂは、ＣＤ１９＋ＥＬ−４の溶解とバックグラウンドであるＣＤ１９ｎｅｇＥＬ−４の溶解の比較を示す。ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞、三重組換え部位（ＥＺ  ＣＡＲ）によるクリニカルグレード（ＣＧ）のＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞、及びＣＡＲｎｅｇＴ細胞を用いて４時間クロミウムリリースアッセイを行った。前述のＣＡＲｎｅｇＴを照射済み抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）負荷Ｋ５６２由来ａＡＰＣクローン＃４で増殖した。
【図２Ｂ】図２Ａは、電気穿孔後６６日目のフローサイトメトリーによるＴ細胞におけるＣＡＲ（Ｆｃ）及びＣＤ８＋の発現を示す。細胞をＣＤ１９抗原（クローン４）で負荷したａＡＰＣで増殖した。図２Ｂは、ＣＤ１９＋ＥＬ−４の溶解とバックグラウンドであるＣＤ１９ｎｅｇＥＬ−４の溶解の比較を示す。ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞、三重組換え部位（ＥＺ  ＣＡＲ）によるクリニカルグレード（ＣＧ）のＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞、及びＣＡＲｎｅｇＴ細胞を用いて４時間クロミウムリリースアッセイを行った。前述のＣＡＲｎｅｇＴを照射済み抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）負荷Ｋ５６２由来ａＡＰＣクローン＃４で増殖した。
【図３】ＣＡＲデザインを示す。ＣＡＲ２１２＝配列番号４、ＣＡＲ２１３＝配列番号５、ＣＡＲ２１４＝配列番号５６、ＣＡＲ２１５＝配列番号５７、ＣＡＲ２１６＝配列番号５８、ＣＡＲ２１７＝配列番号２、ＣＡＲ２１８＝配列番号５９、ＣＡＲ１９３＝配列番号５５。
【図４】Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトラッキングプラスミド。
【図５−１】ＣＡＲ発現。
【図５−２】ＣＡＲ発現。
【図６】ＣＡＲ発現動態。
【図７】表現型。
【図８Ａ−１】図８Ａ及び図８Ｂは延長された表現型を示す。
【図８Ａ−２】図８Ａ及び図８Ｂは延長された表現型を示す。
【図８Ｂ−１】図８Ａ及び図８Ｂは延長された表現型を示す。
【図８Ｂ−２】図８Ａ及び図８Ｂは延長された表現型を示す。
【図９】ウエスタンブロット分析。
【図１０】増殖動態。
【図１１】全細胞における増殖倍数。
【図１２】ＣＡＲ＋Ｔ細胞における増殖倍数。
【図１３】細胞毒性。
【図１４】４−１ＢＢ  ＣＡＲｓにおける細胞毒性。
【図１５】ＴＭドメインにおける細胞毒性。
【図１６】スペーサー（ＩｇＧ４対ＣＤ８）における細胞毒性。
【図１７】ＩＦＮ−γ産生。
【図１８】４−１ＢＢ  ＣＡＲｓにおけるＩＦＮ−γ産生。
【図１９】ＴＭドメインにおけるＩＦＮ−γ産生。
【図２０】スペーサー（ＩｇＧ４対ＣＤ８）におけるＩＦＮ−γ産生。
【図２１】ＳＢ１１トランスポーゼースのＰＣＲに関連した安全性。
【図２２】ＣＡＲコピー数（ｑＰＣＲ）に関連した安全性。
【図２３】自律増殖に関連した安全性。図示されるように、自律増殖の喪失が認められた。
【図２４】ＣＡＲデザイン。ＣＡＲの例を図の右手に示す。
【図２５】ＣＤ３−ζ。Ｑｕｅｒｙ＝配列番号５１、Ｓｕｂｊｅｃｔ（上段）＝配列番号５２、Ｓｕｂｊｅｃｔ（中段）＝配列番号５３、Ｓｕｂｊｅｃｔ（下段）＝配列番号５４。
【図２６】ＣＡＲデザイン。
【図２７】ＣＡＲ。
【図２８】ＣＡＲ発現。
【図２９】増殖動態。
【図３０】増殖動態。
【図３１】細胞毒性。
【図３２】細胞毒性。
【図３３】メモリーマーカーのＣＡＲ＋Ｔ細胞におけるＣＤ２７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８及びＣＣＲ７のパーセント発現（図２６に示す発現コンストラクト）を示す。
【図３４】ＩＦＮ−γ産生。
【図３５】ＩＦＮ−γ産生（ＰＭＡ−Ｉｏｎ）。
【図３６】自律増殖。
【図３７】ＣＡＲコピー数。
【図３８】ＣＡＲコピー数。
【図３９】ＣＡＲコピー数。
【図４０Ａ】図４０Ａ〜図４０Ｅに、前述のＣＡＲ  ＤＮＡ（ｐＳＢＳＯ  ＥＺ  ＣＡＲ）を有するプラスミドを２９３−ＨＥＫ細胞にリポフェクタミンによりトランスフェクトした。抗Ｆｃまたは抗イディオタイプ（抗ＣＤ１９ｓｖＦｖ）抗体で染色した前述のトランスフェクトした細胞をフローサイトメトリーで分析した。
【図４０Ｂ】図４０Ａ〜図４０Ｅに、前述のＣＡＲ  ＤＮＡ（ｐＳＢＳＯ  ＥＺ  ＣＡＲ）を有するプラスミドを２９３−ＨＥＫ細胞にリポフェクタミンによりトランスフェクトした。抗Ｆｃまたは抗イディオタイプ（抗ＣＤ１９ｓｖＦｖ）抗体で染色した前述のトランスフェクトした細胞をフローサイトメトリーで分析した。
【図４０Ｃ】図４０Ａ〜図４０Ｅに、前述のＣＡＲ  ＤＮＡ（ｐＳＢＳＯ  ＥＺ  ＣＡＲ）を有するプラスミドを２９３−ＨＥＫ細胞にリポフェクタミンによりトランスフェクトした。抗Ｆｃまたは抗イディオタイプ（抗ＣＤ１９ｓｖＦｖ）抗体で染色した前述のトランスフェクトした細胞をフローサイトメトリーで分析した。
【図４０Ｄ】図４０Ａ〜図４０Ｅに、前述のＣＡＲ  ＤＮＡ（ｐＳＢＳＯ  ＥＺ  ＣＡＲ）を有するプラスミドを２９３−ＨＥＫ細胞にリポフェクタミンによりトランスフェクトした。抗Ｆｃまたは抗イディオタイプ（抗ＣＤ１９ｓｖＦｖ）抗体で染色した前述のトランスフェクトした細胞をフローサイトメトリーで分析した。
【図４０Ｅ】図４０Ａ〜図４０Ｅに、前述のＣＡＲ  ＤＮＡ（ｐＳＢＳＯ  ＥＺ  ＣＡＲ）を有するプラスミドを２９３−ＨＥＫ細胞にリポフェクタミンによりトランスフェクトした。抗Ｆｃまたは抗イディオタイプ（抗ＣＤ１９ｓｖＦｖ）抗体で染色した前述のトランスフェクトした細胞をフローサイトメトリーで分析した。
【図４１Ａ−１】図４１Ａに、  Ｎａｌｍ−６、ＥＬ−４ＣＤ１９＋細胞、ＧＦＰを発現するようあらかじめ改変されたＭＣＬ及びＣＬＬ（標的）を有する患者腫瘍細胞。５×１０３個の標的細胞を、ＣＤ１９ＲＩｇＧ４ＣＤ２８ＣＡＲ  Ｔ細胞、ＣＤ１９ＲＣＤ８αＣＤ２８  ＣＡＲ  Ｔ細胞、及びＣＡＲｎｅｇＴ細胞（前述のコントロールとして使用）の濃度を上げながら４時間培養した。４時間後、前述の細胞をＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ社のｉＱｕｅにより測定しデータを専用のソフトウェアで分析した。図４２Ｂのグラフは、腫瘍細胞に対するＣＡＲ  Ｔ細胞の死滅割合を示す。エフェクター対標的細胞の比率は０〜４０細胞であった。
【図４１Ａ−２】図４１Ａに、  Ｎａｌｍ−６、ＥＬ−４ＣＤ１９＋細胞、ＧＦＰを発現するようあらかじめ改変されたＭＣＬ及びＣＬＬ（標的）を有する患者腫瘍細胞。５×１０３個の標的細胞を、ＣＤ１９ＲＩｇＧ４ＣＤ２８ＣＡＲ  Ｔ細胞、ＣＤ１９ＲＣＤ８αＣＤ２８  ＣＡＲ  Ｔ細胞、及びＣＡＲｎｅｇＴ細胞（前述のコントロールとして使用）の濃度を上げながら４時間培養した。４時間後、前述の細胞をＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ社のｉＱｕｅにより測定しデータを専用のソフトウェアで分析した。図４２Ｂのグラフは、腫瘍細胞に対するＣＡＲ  Ｔ細胞の死滅割合を示す。エフェクター対標的細胞の比率は０〜４０細胞であった。
【図４１Ｂ】図４１Ａに、  Ｎａｌｍ−６、ＥＬ−４ＣＤ１９＋細胞、ＧＦＰを発現するようあらかじめ改変されたＭＣＬ及びＣＬＬ（標的）を有する患者腫瘍細胞。５×１０３個の標的細胞を、ＣＤ１９ＲＩｇＧ４ＣＤ２８ＣＡＲ  Ｔ細胞、ＣＤ１９ＲＣＤ８αＣＤ２８  ＣＡＲ  Ｔ細胞、及びＣＡＲｎｅｇＴ細胞（前述のコントロールとして使用）の濃度を上げながら４時間培養した。４時間後、前述の細胞をＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ社のｉＱｕｅにより測定しデータを専用のソフトウェアで分析した。図４２Ｂのグラフは、腫瘍細胞に対するＣＡＲ  Ｔ細胞の死滅割合を示す。エフェクター対標的細胞の比率は０〜４０細胞であった。
【図４２】５×１０３個の標的細胞（ＥＬ−４  ＣＤ１９＋グランザイムＢ細胞レポーター）を、クリニカルグレードのＣＤ１９ＲＩｇＧ４ＣＤ２８ＣＡＲ  Ｔ細胞、ＥＺ  ＣＤ１９ＲＣＤ８αＣＤ２８  ＣＡＲ  Ｔ細胞及びＣＡＲｎｅｇＴ細胞（前述のコントロールとして使用）の濃度を上げながら４時間及び１０時間培養した。培養時間経過後、前述の細胞はＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ社のｉＱｕｅにより測定し及びデータを専用のソフトウェアで分析した。グラフは、腫瘍細胞に対するＣＡＲ  Ｔ細胞の死滅割合を示す。エフェクター対標的細胞の比率は０〜２０細胞であった。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を生成する方法を提供する。前述の方法では、抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ領域）、ヒンジ領域、膜貫通領域、及び／またはエンドドメインをそれぞれコード化する複数のベクターを利用する。例えばいくつかの実施形態では、第一のベクターは前述の抗原結合ドメインをコード化し、第二のベクターは、前述のヒンジ領域をコード化し、及び第三の領域はエンドドメインをコード化する。いくつかの実施形態では、前述の膜貫通領域は、前述の第二のベクター、前述の第三のベクター、または第四のベクターのいずれかにコード化される。いくつかの好ましい実施形態では、前述のベクターは、相同組替えにより、前述の抗原結合ドメイン、前述のヒンジ領域、前述の膜貫通領域、及び前述のエンドドメインを含むＣＡＲをコード化する核酸を形成することができる。このようにして、多くのＣＡＲを、例えば前述のＣＡＲが選択的に結合する抗原を発現する癌性細胞の選択的認識及び死滅といった望ましい活性のために生成及びスクリーニングしてもよい。前述のＣＡＲはその後、組み込み核酸（例えば、トランスポーゼース／トランスポゾンを用いて前述の宿主ゲノムに組み込まれたＤＮＡ）または非組み込み核酸（例えば、レンチウイルスまたはレトロウイルスといったウイルスベクターによって搬送されるｍＲＮＡ）としてＴ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞といった細胞中で発現されても良い。前述のＣＡＲを発現する前述のＴ細胞またはＮＫ細胞はその後、医薬品または賦形剤として、疾患（例えば、癌、真菌感染、細菌感染、またはウイルス感染）を治療または予防するためにヒト患者等の被験体に投与してもよい。
Ｉ．ライブラリー生成
【００３２】
複数のｓｃＦｖ領域、ヒンジ／スキャフォールド領域、膜貫通ドメイン、及びエンドドメイン（シグナリングドメイン）をコード化するライブラリーは、当業者に周知の方法で生成しても良い。いくつかの実施形態では、２つまたは３つの前述のｓｃＦｖ領域、ヒンジ／スキャフォールド領域、及びエンドドメイン（シグナリングドメイン）に対して複数の選択肢がある。いくつかの実施形態では、２つ、３つ、または全ての前述のｓｃＦｖ領域、ヒンジ／スキャフォールド領域、膜貫通ドメイン、及びエンドドメイン（シグナリングドメイン）に対して複数の選択肢がある。表１に示すようなｓｃＦｖ領域、ヒンジ／スキャフォールド領域、膜貫通ドメイン、及びエンドドメイン（シグナリングドメイン）の例があげられる。いくつかの実施形態では、前述のライブラリーは、複数の抗癌または腫瘍標的化抗原といった異なる抗原を標的化する複数のｓｃＦｖをコード化しても良い。他の実施形態では、前述のライブラリーは、単一の標的（例えば、ＣＤ１９といった単一の抗癌抗原）に選択的に結合する複数の異なるｓｃＦｖをコード化しても良い。このようにして、前述の方法を用いて、どの腫瘍標的化コンストラクトが所定の細胞サンプル（例えば個別化医療に用いられる）により効果的に作用するかを特定しても良いし、または前述の方法を用いて、所定の抗原の標的化により効果的に機能する新たなＣＡＲを特定しても良い。通常前述のｓｃＦｖ領域は、抗体の可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、必要に応じて前述のＶＬ及びＶＨ領域部分をランダム化しても良い。通常のライブラリー生成方法は、例えば、酵母ライブラリー、細菌またはファージライブラリー、浸潤Ｂ細胞、ハイブリドーマ（ヒト及びげっ歯類由来のものを含む）、またはラマ、ラクダ、及びウマライブラリー由来のライブラリーの生成方法及びコンピューターによる方法（例えばＬｅｎｎａｒｄ、２００２を参照）を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、前述のｓｃＦｖをコード化する異なるベクター、ヒンジ／スキャフォールド領域、膜貫通ドメイン、及びエンドドメインを融合し、ＣＡＲをコード化する単一のベクターを形成する。トランスポゾン媒介相同組換えを介して前述の融合を生じても良い。
【００３４】
例えば、いくつかの実施形態では、前述のｓｃＦｖをコード化するベクター、ヒンジ／スキャフォールド領域、膜貫通ドメイン、及び／またはエンドドメインはＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）またはｐｉｇｇｙＢａｃＤＮＡプラスミドであっても良い。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）及びｐｉｇｇｙＢａｃＤＮＡプラスミドについては、例えばＭａｉｔｉら（２０１３）、Ｓｉｎｇｈら（２００８）、及びＨｕｌｓら（２０１３）に記載されている。いくつかの実施形態では、前述のトランスポゾンは、サケ科型Ｔｃ１様トランスポーゼース（ＳＢ）に媒介される。いくつかの好ましい実施形態では、前述のＣＡＲをコード化するベクターは、Ｓｉｎｇｈら、２０１４またはＨｕｌｓらに記載の前述の方法によって、ヒト癌患者といった被験体由来のＴ細胞にトランスフェクトまたは組み込まれる。例えば、前述のＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）システム由来のＤＮＡベクターを用いて、リコンビナントウイルスベクターのＴ細胞への形質導入に関連したコスト及び製造上の問題を解消できる。電気穿孔後に、前述のトランスポゾン／トランスポーゼースは、前述のＴ細胞でのＣＡＲ及び他の導入遺伝子の発現に使用したプラスミドの組込み効率を向上できる。人工的な抗原提示細胞（ａＡＰＣ）が結合した前述のＳＢシステムは、ヒト用途に適したＣＡＲ（＋）Ｔ細胞を選択的に増殖及び製造可能である。いくつかの実施形態では、２つのＤＮＡプラスミド、ＳＢトランスポゾン（目的のＣＡＲをコード化する）及びＳＢトランスポーゼース（例えば、ＳＢ１１）の同期した電気移動後に、可溶性リコンビナントヒトＩＬ−２及びＩＬ−２１の存在下で前述のγ照射ａＡＰＣの７日間添加（刺激サイクル）により安定した組み込み体の回収を行っても良い。例えば、４サイクル（２８日間の連続培養）実施し、臨床上好ましい数の目的のＣＡＲを安定して発現するＴ細胞を生成しても良い。トランスポゾン／トランスポーゼースシステムの利用を、例えＨａｃｋｅｔｔらに記載されるようにＣＡＲを発現するＴ細胞の搬送に適用しても良い。
ＩＩ．キメラ抗原受容体
【００３５】
本発明の実施形態は、抗原特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドをコード化する核酸の生成及び特定を含む。いくつかの実施形態では、前述のＣＡＲはヒト化され免疫原性が低下している（ｈＣＡＲ）。
【００３６】
いくつかの実施形態では、前述のＣＡＲは、１つまたは複数の抗原間の共通のスペースを含むエピトープを認識しても良い。デクチン−１といったパターン認識受容体を、炭水化物抗原に対する特異性を得るために使用しても良い。ある実施形態では、前述の結合領域は、モノクローナル抗体の相補性決定領域、モノクローナル抗体の可変領域、及び／またはそれらの抗原結合断片を含んでも良い。いくつかの実施形態では前述の結合領域はｓｃＦｖである。別の実施形態では、受容体または細胞標的に結合するペプチド（例えば、サイトカイン）が選択肢として含まれていても良くまたは  ＣＡＲの前述の結合領域でｓｃＦｖ領域に置換されていても良い。よって、いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、複数のｓｃＦｖ領域及び／または他の標的化タンパク質をコード化する複数のベクターから生成されても良い。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗原を補完することによって特定の抗原に対する特異性を持つ受容体を提供する抗原受容体（例えば、イムノグロブリン及びＴ細胞受容体）タンパク質の前述の可変ドメインに見られる短いアミノ酸配列である。抗原受容体の各ポリペプチド鎖は、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を有する。前述の抗原受容体は一般的に２つのポリペプチド鎖で構成されるため、前述の抗原に接触可能な各抗原受容体に六つのＣＤＲが存在する−各重鎖及び軽鎖は３つのＣＤＲを含有する。イムノグロブリン及びＴ細胞受容体選択性に関連するほとんどの配列バリエーションは通常ＣＤＲに見られるため、これらの領域は「超可変ドメイン」と称されることもある。これらの内、ＶＪ（重鎖及びＴＣＲαβ鎖の場合におけるＶＤＪ）領域の組換えによってコード化されるＣＤＲ３が最も高い可変性を示す。
【００３７】
本発明により生成されるＣＡＲコード化核酸は、ヒト患者の細胞性免疫療法を高めるために１つまたは複数のヒト遺伝子または遺伝子断片を含んでも良い。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法により、全長ＣＡＲｃＤＮＡまたはコーディング領域を生成しても良い。前述の抗原結合領域またはドメインは、参照により本明細書に組み入れる米国特許第７，１０９，３０４号に記載されるような、特定のヒトモノクローナル抗体由来の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の前述のＶＨ及びＶＬ鎖の断片を含んでいても良い。いくつかの実施形態では、前述のｓｃＦｖはヒト抗原特異的抗体の抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前述のｓｃＦｖ領域は、ヒト細胞での発現のためのヒトコドン利用のために最適化される配列によってコード化される抗原特異的ｓｃＦｖである。
【００３８】
ＣＡＲの前述の抗原結合ドメインの配置は、二重特異性抗体または多量体といった多重体であっても良い。前述の多量体を、前述の軽鎖及び重鎖の前述の可変部分の交差対形成により、二重特異性抗体と称される抗体に形成することもできる。いくつかの実施形態では、前述のＣＡＲの前述のヒンジ部分を短縮または除外しても良い（すなわち、抗原結合ドメイン、膜貫通領域及び細胞内シグナリングドメインを含むだけのＣＡＲを生成する）。本発明では、例えば表１に示すようなヒンジの多重度を用いても良い。いくつかの実施形態では、前述のヒンジ領域は第一のシステインを保持していても良くまたはプロリンまたはセリン置換により変異させてもよく、または第一のシステインまでトランケートされていてもよい。本発明において、抗原結合領域として使用するｓｃＦｖから前述のＦｃ部分を除去してＣＡＲを生成しても良い。いくつかの実施形態では、前述のＦｃドメインの一つのみ、例えばヒトイムノグロブリン由来の前述のＣＨ２またはＣＨ３ドメインのいずれかを抗原結合領域がコード化しても良い。一つは、二量体化及びオリゴマー化を向上するために改変されたヒトイムノグロブリンの前述のヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域を含むことができる。いくつかの実施形態では、前述のヒンジ部分は、８−１４アミノ酸ペプチド（例えば、１２ＡＡペプチド）、ＣＤ８α部分、または前述のＩｇＧ４  Ｆｃを含むまたはからなることが可能である。いくつかの実施形態では、前述の抗原結合ドメインは、ＣＤ８αといったオリゴマー化を促進するドメインを利用して細胞表面にサスペンドされていてもよい。いくつかの実施形態では、前述の抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）クローン２Ｄ３（例えばＳｉｎｇｈら、２００８に記載のｍＡｂクローン２Ｄ３）に認識されるドメインを利用して細胞表面にサスペンドされていてもよい。
【００３９】
通常、ＣＡＲの前述のエンドドメインまたは細胞内シグナリングドメインは、前述のＣＡＲを含む免疫細胞の少なくとも１つの前述のノーマルエフェクター機能の活性化を引き起こすまたは促進できる。例えば、前述のエンドドメインは、例えばサイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性といったＴ細胞のエフェクター機能を促進しても良い。ナイーブ、メモリー、またはメモリー型Ｔ細胞における前述のエフェクター機能に、抗原依存性増殖が含まれても良い。前述の用語「細胞内シグナリングドメイン」または「エンドドメイン」は、前述のエフェクター機能シグナルを形質導入する及び／または前述の細胞が特化した機能を発揮するように指示することができるＣＡＲの一部分を意味する。一般的に、細胞内シグナリングドメイン全体がＣＡＲに含まれても良いが、エンドドメインの切断部分が含まれていても良い。通常、エンドドメインは切断型エンドドメインを含み、前述の切断型エンドドメインは、シグナル細胞中でエフェクター機能を形質導入する能力を維持する。
【００４０】
いくつかの実施形態では、エンドドメインは、他の類似の分子及び断片と同様に、前述のＴ細胞受容体のζ鎖またはその同族体のいずれか（例えば、η、δ、γ、またはε）、ＭＢ１鎖、Ｂ２９、Ｆｃ  ＲＩＩＩ、Ｆｃ  ＲＩ、及びシグナリング分子の組み合わせ（ＣＤ３ζ及びＣＤ２８、ＣＤ２７、４−１ＢＢ、ＤＡＰ−１０、ＯＸ４０、及びそれらの組み合わせ）を含む。ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃεＲＩといった前述の活性化タンパク質のファミリーの他のメンバーの細胞内シグナリング部分が使用可能である。これらの代替となる膜貫通及び細胞内ドメインの例が、例えば本明細書に参照により組み込まれるＧｒｏｓｓら（１９９２）、Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉら（１９９３）、Ｍｏｒｉｔｚら（１９９４）、Ｈｗｕら（１９９５）、Ｗｅｉｊｔｅｎｓら（１９９６）、及びＨｅｋｅｌｅら（１９９６）に記載されている。いくつかの実施形態では、エンドドメインは前述のヒトＣＤ３ζ細胞内ドメインを含んでも良い。
【００４１】
前述の抗原特異的細胞外ドメイン及び前述の細胞内シグナリングドメインは、好ましくは膜貫通ドメインに結合される。ＣＡＲに含まれていても良い膜貫通ドメインは、例えば、前述のヒトＩｇＧ４  Ｆｃヒンジ及びＦｃ領域、前述のヒトＣＤ４膜貫通ドメイン、前述のヒトＣＤ２８膜貫通ドメイン、前述の膜貫通ヒトＣＤ３ζドメイン、またはシステイン変異ヒトＣＤ３ζドメイン、または前述のＣＤ１６及びＣＤ８及びエリスロポエチン受容体といったヒト膜貫通シグナリングタンパク質由来の膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインの例を表１に示す。
【００４２】
いくつかの実施形態では、前述のエンドドメインは、例えば改変ＣＤ２８細胞内シグナリングドメイン、またはＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ−４０（ＣＤ１３４）、ＤＡＰ１０、または４−１ＢＢ  ＣＤ１３７）といった共刺激受容体共刺激受容体をコード化する配列を含む。いくつかの実施形態では、より効果的に形質転換Ｔ細胞活性化するために、ＣＤ３ζ主導の一次シグナル及びヒト共刺激受容体により供される付加シグナルの両方がＣＡＲに含まれていても良く、それによってインビボ持続性及び養子免疫療法の治療上の成功を促進するようにしても良い。表１に示すように、前述のエンドドメインまたは細胞内受容体  シグナリングドメインは、ＣＤ３のζ鎖のみまたはＣＤ２８、ＣＤ２７、ＤＡＰ１０、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ２、４−１ＢＢといったＦｃγＲＩＩＩ共刺激シグナリングドメインを一緒に含んでいても良い。いくつかの実施形態では、前述のエンドドメインは、１つまたは複数のＴＣＲζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬ−２Ｒβ／ＣＤ１２２、ＩＬ−２Ｒα／ＣＤ１３２、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、及びＣＤ４０の一部のまたは全てを含む。いくつかの実施形態では、１、２、３、４またはそれ以上の細胞質ドメインがエンドドメインに含まれていても良い。例えばいくつかのＣＡＲでは、少なくとも２つまたは３つのシグナリングドメインの融合により相加効果または相乗効果が得られることが認められた。
【００４３】
いくつかの態様では、単離された核酸セグメント及びＣＡＲをコード化するＤＮＡ配列を含む発現カセットが生成されても良い。種々のベクターを使用しても良い。いくつかの好ましい実施形態では、前述のベクターによりＣＡＲをコード化するＤＮＡの搬送が可能となりＴ細胞等を免疫しても良い。ＣＡＲ発現は、ＭＮＤＵ３プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、またはユビキチンプロモーターといった調節真核生物プロモーターの制御下にあっても良い。また、前述のベクターは、他の理由がなければ、インビトロでの操作を容易にするために選択可能なマーカーを含有していても良い。いくつかの実施形態では、前述のＣＡＲをＤＮＡテンプレートからインビトロ転写されたｍＲＮＡによって発現可能である。
【００４４】
キメラ抗原受容体分子は組換え体であり、抗原を結合する能力及び細胞質テールに存在する免疫受容体活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を介した活性化シグナルを形質導入する能力の両方によって識別される。抗原結合部分（例えば、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）から生成される）を利用した受容体コンストラクトにとって「普遍的」であることの付加的利点は、受容体コンストラクトが、ＨＬＡ非依存的に前述の標的細胞表面においてナイーブ抗原に結合可能であることである。例えば、ｓｃＦｖコンストラクトが、前述のＣＤ３複合体のζ鎖、前述のＦｃ受容体γ鎖、及びチロシンキナーゼＳｋｙ（Ｅｓｈｈａｒら、１９９３、Ｆｉｔｚｅｒ−Ａｔｔａｓら、１９９８）の前述の細胞内部分をコード化する配列に融合しても良い。ＣＴＬによる腫瘍認識及び溶解を含む再指向Ｔ細胞エフェクターメカニズムは、いくつかのマウス及びヒト抗原−ｓｃＦｖ：ζシステム（Ｅｓｈｈａｒら、１９９７、Ａｌｔｅｎｓｃｈｍｉｄｔら、１９９７、Ｂｒｏｃｋｅｒら、１９９８）について記載されている。
【００４５】
前述の抗原結合領域は、例えばヒトまたは非ヒトｓｃＦｖ由来でも良い。マウスモノクローナル抗体といった非ヒト抗原結合領域利用により生じうる問題はヒトエフェクター機能性の低下及び腫瘍塊に浸透する能力の低下である。さらに、非ヒトモノクローナル抗体は、ヒト宿主により外来性タンパク質として認識されうるため、そうした外来性抗体を繰り返し注入することにより、免疫応答が誘導され有害な過敏性反応を惹き起こす可能性がある。マウス系モノクローナル抗体では、この影響はヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答と称される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲがヒト抗体またはｓｃＦｖ配列を含むことにより、いくつかのマウス抗体と比較してＨＡＭＡ応答がわずかに認められるか全く認められない。同様に、ＣＡＲがヒト配列を含むことを利用して免疫媒介認識または前述のレシピエントに存在する内在性のＴ細胞による除去のリスクを低減または回避してもよく、それによりＨＬＡに基づいて加工抗原が認識される可能性もある。
【００４６】
いくつかの実施形態では、前述のＣＡＲは以下を含む：ａ）細胞内シグナリングドメイン、ｂ）膜貫通ドメイン、ｃ）ヒンジ領域、及びｄ）抗原結合領域を含む細胞外ドメイン。いくつかの実施形態では、前述の細胞内シグナリングドメイン及び膜貫通ドメインは、ヒンジ領域をコード化するベクター及び抗原結合領域をコード化するベクターと融合（例えば、トランスポゾン指向性相同組換えを介して）可能な単一のベクターによって前述のエンドドメインにコード化される。他の実施形態では、前述の細胞内シグナリング領域及び膜貫通領域は、融合する（例えば、トランスポゾン指向性相同組換えにより）２つの別々のベクターにコード化されても良い。
【００４７】
いくつかの実施形態では、抗原結合領域を含む細胞外ドメインとも称されるＣＡＲの前述の抗原特異的部分は、腫瘍関連抗原を選択的に標的化する。腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞の細胞表面に発現される限り、種類を問わない。本発明によって生成されるＣＡＲに標的化されても良い腫瘍関連抗原の例として、ＣＤ１９、ＣＤ２０、がん胎児性抗原、αフェトタンパク質、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ５６、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＡＫＴ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、上皮腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、デクチン−１等があげられる。いくつかの実施形態では、前述のＣＡＲの抗原特異的部分はｓｃＦｖである。腫瘍標的化ｓｃＦｖの例を表１に示す。いくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原の量が少ない場合、持続性を向上する目的でＣＡＲを膜結合サイトカイン等と共発現してもよい。例えば、ＣＡＲは膜結合ＩＬ−１５と共発現可能である。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ＨＡ−１、サバイビン、ＷＴ１、及びｐ５３といった細胞内腫瘍関連抗原をＣＡＲで標的化してもよい。これはＨＬＡに関連して前述の細胞内腫瘍関連抗原に由来する加工ペプチドを認識する汎用Ｔ細胞上に発現されるＣＡＲによって行われても良い。また、ＨＬＡに関連して前述の細胞内の加工された腫瘍関連抗原を認識するＴ細胞受容体対を発現するために、前述の汎用Ｔ細胞を遺伝子組換えしても良い。
【００４９】
ＣＡＲに認識される前述の病原体は原則としていかなる種類の病原体でも良いが、いくつかの実施形態では前述の病原体は真菌、細菌、またはウイルスである。ウイルス病原体の例には、アデノウイルス科のファミリーのウイルス、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＲＳウイルス  （ＲＳＶ）、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、ＨＳＶ及びＨＨＶファミリーのウイルス、ピコナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、レトロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、パポバウイルス科、ポリオーマウイルス、ラブドウイルス科、及びトガウイルス科が含まれる。例となる病原体ウイルスは、天然痘、インフルエンザ、流行性耳下腺炎、麻疹、水痘、エボラ、及び風疹を惹き起こす。例となる病原体真菌にはＣａｎｄｉｄａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ、及びＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓが含まれる。病原体細菌の例には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａが含まれる。いくつかの実施形態では前述の病原体受容体デクチン−１を使用してアスペルギルス等の真菌の細胞壁上の炭水化物構造を認識するＣＡＲを生成しても良い。別の実施形態では、ウイルス感染及び病態を緩和するために、ウイルス決定因子（例えば、ＣＭＶ及びエボラ由来の前述の糖タンパク質）認識する抗体に基づいてＣＡＲを作成可能である。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ネイキッドＤＮＡまたはＣＡＲをコード化する適切なベクターを被験体のＴ細胞（例えば、癌または他の疾患のヒト患者から得たＴ細胞）に導入できる。ネイキッドＤＮＡを用いた電気穿孔によりＴ細胞を安定的にトランスフェクトする方法は当該分野において知られている（例えば、米国特許第６，４１０，３１９号参照）。通常、ネイキッドＤＮＡはプラスミド発現ベクターで発現するよう正方向に含まれる本発明のキメラ受容体をコード化するＤＮＡ指す。いくつかの実施形態では、前述のネイキッドＤＮＡの使用により、本発明の方法により生成したＣＡＲを発現するＴ細胞の製造に要する時間を短縮可能である。
【００５１】
もしくは、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクター）を用いて、前述のキメラコンストラクトをＴ細胞に導入可能である。通常、被験体由来のＴ細胞をトランスフェクトするために用いるＣＡＲをコード化するベクターは前述の被験体のＴ細胞において非複製となる。多数のベクターが、ウイルスに基づくことが知られており、前述の細胞で維持されるウイルスのコピー数は細胞の生存率を維持するために十分低くなっている。図解のベクターには、ＨＩＶ、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶ、またはＢＰＶに基づくベクターと同様に前述のｐＦＢ−ｎｅｏベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標））を含む。
【００５２】
前述のトランスフェクトまたは形質導入したＴ細胞が、ＣＡＲを膜表面タンパク質として望ましいレベルでの望ましい制御により発現可能になると、前述のキメラ受容体が前述の宿主細胞において望ましいシグナル誘導を生じるよう機能するかどうか判定できる。続いて、前述の形質導入したＴ細胞を前述の被験体に再導入または投与して、前述の被験体における抗腫瘍応答を活性化しても良い。投与を容易にするために、前述の形質導入したＴ細胞を医薬組成物としても良いし、好ましくは医薬的に許容される適当な担体または希釈剤を用いてインビボ投与に適したインプラントとしても良い。そのような組成物またはインプラントの作製手段は当該分野の記載に見られる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １６ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ編（１９８０）参照）。必要に応じて、ＣＡＲを発現する形質導入したＴ細胞を、カプセル、溶液、注射液、吸入剤、または噴霧剤といった半固形または液体の製剤にそれぞれの投与経路に応じた通常の方法によって製剤化できる。当該分野で周知の手段を利用することにより、標的組織または臓器に到達するまで、前述の組成物の放出及び吸収を防ぎまたは最小限に抑えて前述の組成物の持続放出を確実にすることができる。通常、前述のキメラ受容体を発現する前述の細胞を阻害しない医薬的に許容される剤型が好ましく用いられる。よって、望ましくは前述の形質導入したＴ細胞をハンクス液または生理食塩水といった平衡塩類溶液を含有する医薬組成物として得られる。
ＩＶ．人工的な抗原提示細胞
【００５３】
いくつかの場合、ａＡＰＣはＣＡＲ系治療組成物及び細胞療法製品の製造に有用である。前述の製剤及び抗原提示システムの使用についての一般的な指針については、例えば、米国特許第６，２２５，０４２号、６，３５５，４７９号、６，３６２，００１号及び６，７９０，６６２号、米国特許出願第２００９／００１７０００号及び２００９／０００４１４２号、及び国際公開ＷＯ２００７／１０３００９を参照。
【００５４】
ａＡＰＣを用いてＣＡＲを発現するＴ細胞を増殖しても良い。腫瘍抗原の存在下で、抗原提示細胞によりＴ細胞に送られたシグナルは、Ｔ細胞プログラミング及びその後の治療有効性に影響しうる。これをふまえてＴ細胞に供される前述のシグナルの最適なコントロールを可能にする人工抗原提示細胞の開発が盛んになった（Ｔｕｒｔｌｅら、２０１０）。目的の抗体または抗原に加えて、前述のａＡＰＣシステムは、少なくとも一つの外因性補助分子を含んでも良い。いかなる適切な補助分子の数や組み合わせも可能である。前述の補助分子を、同時刺激性分子及び接着分子といった補助分子から選択しても良い。同時刺激性分子の例として、Ｔ細胞表面でＣＤ２８  及び／またはＣＴＬＡ−４分子に結合することによって、例えばＴ細胞増殖、Ｔｈ１分化、短期Ｔ細胞生存、及びインターロイキン（ＩＬ）−２等のサイトカイン分泌（Ｋｉｍら、２００４参照）に影響を与えるＣＤ７０及びＢ７．１  （Ｂ７またはＣＤ８０とも称される）があげられる。接着分子は、セレクチン等の炭水化物結合糖タンパク質、インテグリン等の膜貫通結合糖タンパク質、カドヘリン等のカルシウム依存性タンパク質、及び、例えば細胞間または細胞・マトリックス間の接触を促進する細胞内接着分子（ＩＣＡＭ）等の１回膜貫通イムノグロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリータンパク質を含んでいても良い。  接着分子の例として、ＬＦＡ−３及びＩＣＡＭ−１等のＩＣＡＭがあげられる。選択、クローニング、製剤化、及び同時刺激性分子及び接着分子を含む例示補助分子の発現に有用な手法、方法、及び試薬については、例えば、米国特許第６，２２５，０４２号、６，３５５，４７９号、及び６，３６２，００１号に例示されている。
【００５５】
ａＡＰＣとなるために選択された細胞は、好ましくは細胞内抗原プロセシング、細胞内ペプチドトラフィッキング、及び／または細胞内ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子−ペプチド負荷において欠損を示すか、変温性（すなわち、哺乳類細胞株より温度変化に敏感でない）であるか、または欠損及び変温特性の双方を備える。好ましくは、ａＡＰＣとなるために選択された細胞は、前述の細胞に導入される外因性ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子及び補助分子コンポーネントに対して少なくとも一つの内因性の対応物（例えば、上記内因性ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子及び／または内在性の補助分子）を発現する能力を欠く。さらに、ａＡＰＣは好ましくは、改変前にａＡＰＣを生成するために細胞が有していた欠損及び変温性特性を維持する。昆虫細胞株といった抗原プロセシング（ＴＡＰ）欠損細胞株に関連するトランスポーターを構成するａＡＰＣまたは該トランスポーターに由来するａＡＰＣが例としてあげられる。変温性昆虫細胞株の例として、シュナイダー２細胞株等のショウジョウバエ細胞株（例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  Ｊ．ｍ  １９７２）があげられる。前述のシュナイダー細胞株の作製、増殖、及び培養方法は、米国特許第６，２２５，０４２号、６，３５５，４７９号、及び６，３６２，００１号に図解されている。
【００５６】
ａＡＰＣを凍結融解サイクルに供しても良い。例えば、ａＡＰＣを含有する適切なレセプタクルを適当な量の液体窒素、固形二酸化炭素（ドライアイス）、または同様の低温材料に接触させることにより、急速凍結を起こしてａＡＰＣを凍結しても良い。その後、前述の低温材料から前述のａＡＰＣを除去するか環境室温条件下に曝露することにより、または微温浴または手で温めることにより融解時間を短縮することによって、前述の凍結ａＡＰＣを融解する。付加的に、融解前にａＡＰＣの凍結及び保存期間を延長しても良い。凍結したａＡＰＣは使用前に融解後凍結乾燥しても良い。ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及び他の保存料といった前述の凍結融解手順に悪影響を及ぼす可能性のある保存料は前述の凍結融解サイクルに供されるａＡＰＣを含有する培地に含まれない方が良い、または保存料を元々含まない培地にａＡＰＣを移動するなど基本的に除去しておく。
【００５７】
他の好ましい実施形態では、架橋により異種の核酸及び前述のａＡＰＣの内因性の核酸を活性化することにより、原則として細胞増殖、複製または核酸発現が活性化後に起こらない。例えば、外因性ＭＨＣ及び補助分子の発現、ａＡＰＣ表面におけるそれら分子の提示、及び選択したペプチドとともに提示されたＭＨＣ分子の負荷後のある時点でａＡＰＣを不活性化しても良い。これにより、不活性化され選択されたａＡＰＣ負荷ペプチドが、原則として増殖または複製できない状態で、選択されたペプチド提示機能を維持しても良い。前述の架橋により、原則として細菌及びウイルスといった微生物による汚染のないａＡＰＣが、ａＡＰＣの抗原提示細胞機能を実質的に低下させることなく得られる。よって、架橋によりａＡＰＣを用いて開発された細胞療法製品の安全性に関する懸念を低減させａＡＰＣの重要なＡＰＣ機能が維持できる。架橋及びａＡＰＣに関連した方法では、例えば、参照により本明細書に組み入れる米国特許出願第２００９００１７０００号を参照。ＩＶ
【実施例】
【００５８】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を明示する目的で含まれる。以下の実施例に記載の手法は本発明者らにより見出された代表的手法に従って本発明の実施において十分に機能するものであり、発明の実施の好ましい様式を構成するものであると当業者に認識される。しかしながら、本発明の開示における本発明の精神及び範囲から逸脱することなく本明細書に記載の具体的な実施形態の種々の変更が可能であり、類似または同様の結果が得られることが当業者に理解される。
実施例１：
材料及び方法
【００５９】
クリニカルグレードのＤＮＡプラスミドの生成
前述のＳＢトランスポゾンであるＣｏＯｐＣＤ１９ＲＣＤ２８ζ／ｐＳＢＳＯは、伸長因子１ａ（ＥＦ−１ａ  ［Ｋｉｍら、１９９０］）及び前述のヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）の５９非翻訳領域［Ｓｉｎｇｈら、２０１１、Ｄａｖｉｅｓら、２０１０］含むＥＦ−１／ＨＴＬＶハイブリッド複合プロモーター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）下で前述のヒトコドン最適化（ＣｏＯｐ）第二世代ＣｏＯｐＣＤ１９ＲＣＤ２８ζ  ＣＡＲを発現する。このＤＮＡプラスミドの起源を図Ｓ１に示す。  前述のＳＢトランスポーゼースであるＳＢ１１は、前述のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター下においてシス型の前述のＤＮＡ  プラスミド  ｐＣＭＶ−ＳＢ１１に発現される（Ｓｉｎｇｈら、２０１１、Ｓｉｎｇｈら、２００８）。  いずれのプラスミドも全体を配列決定し、Ｗａｉｓｍａｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ウィスコンシン州マディソン）においてＥ．Ｃｏｌｉ細菌株ＤＨ５ａ選択用カナマイシンを用いて製造した。
【００６０】
三重部位特異的組換えＤＮＡプラスミド−ＥＺ−Ｂｕｉｌｄ−ＣＡＲの生成
上記ＣＡＲ（ＣｏＯｐＣＤ１９ＲＣＤ２８ｚ／ｐＳＢＳＯ）由来のＤＮＡ配列を用いて、ＣＤ３ζシグナリングドメインに抱合されるＣＤ１９  ＳｃＦｖ部分、ヒンジＩｇＧ４  Ｆｃ部分及びドメインＣＤ２８膜貫通部分及び細胞質部分をλ組換え部位に隣接させ、ＰＣＲ産物としてＧｅｎｅａｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により合成した。これら３つの部分を、ＢＰクロナーゼ酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりそれぞれｐＤｏｎｏｒｓ２２１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。ｓｃＦｖ−Ｂ−スキャフォールド−Ｃ−シグナリングドメイン型のＥＺ−Ｂｕｉｌｄ  ＣＤ１９ＣＤ２８ζ  ＣＡＲを生成するＬＲ  ＰＬＵＳクロナーゼ酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって三重部位特異的組換えＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙプラスミドを用いて前述の３つのプラスミドを組み替えた（図１）。
【００６１】
細胞数カウント
トリパンブルー色素排除試験法を用いて生細胞と死細胞を識別し、細胞数をＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｅｃｅｌｏｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（Ｓｉｎｇｈら、２０１１）を用いてカウントした。
【００６２】
ＰＢＭＣ単離
二人の健康な男性ボランティアドナー由来の白血球除去輸血製品をＫｅｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ＬＬＣ（テネシー州メンフィス）から購入した。末梢血単核細胞細胞（ＰＢＭＣ）を、ｃＧＭＰ準拠のＢｉｏｓａｆｅ  Ｓｅｐａｘ（エザン、スイス）の本発明に適応したシステムにより単離した。簡潔には、ＣＳ−９００キットの全てのクランプを閉めた後、１００ｍＬのＦｉｃｏｌｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を無菌的にＬｕｅｒロックコネクター付き密度勾配培地バッグ（「ｆｉｃｏｌｌバッグ」）へ６０ｍＬシリンジを使って移し、チューブをハンドヘルドシーラー（Ｓｅｂｒａ、Ｍｏｄｅｌ＃２３８０）で加熱密封した。前述のキットを、２０ｍＬの２５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（Ｂａｘｔｅｒ）（２％ｖ／ｖ、洗浄バッファー）を含むＣｌｉｎｉＭＡＣＳバッファー（ＰＢＳ／ＥＤＴＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｃａｔ＃７００２６）を入れた洗浄用１，０００ｍＬバッグ、最終製品バッグ［Ｃｏｕｐｌｅｒ（Ｂａｘｔｅｒ／Ｆｅｎｗａｌ  ４Ｒ２０１４）付き３００ｍＬトランスファーパック］、及び試薬／血液バッグにスパイクで接続した。密度勾配系分離プロトコル（ｖ１２６）を用いて、シリンジピストンをＳｅｐａｘ  ａＡＰＣ（クローン＃４）の遠心室及びカバーに装着しＣＡＲ＋Ｔ細胞を選択的に増殖した。ｃ照射ａＡＰＣを用いて前述の遺伝子改変Ｔ細胞を数的に増殖した。ＷＣＢ由来の融解ａＡＰＣをＶｕｅＬｉｆｅ細胞培養バッグを用いてＣＭ中で６０日間増殖し、Ｂｉｏｓａｆｅ  Ｓｅｐａｘ  ＩＩ集菌手順に従って集菌した。簡潔には、ＣＳ−４９０．１キットを、Ｌｕｅｒロック接続により３００ｍＬアウトプットバッグ（トランスファーパック）に接続した。前述のピットに分離室を設置し、前述のチューブを光学センサへ挿入し活栓をＴ位置にあわせた。圧力センサラインを接続後、前述の製品バッグ及び上清／血漿バッグをホルダーに吊るした。Ｓｅｐａｘメニューから改変プロトコルＰＢＳＣｖ３０２を選択し、インプット製品の処理容量（最初の量）を＃８４０ｍＬに設定した。バリデーション及びキット試験後、前述の手順を開始した。終了後、前述のバッグを取り外し、クランプを閉め、前述のキットを取り外した。前述の最終製品バッグから前述の細胞を無菌的に除去し、洗浄培地（１０％  ＨＳＡ含有Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ）で二回洗浄後、細胞数をカウントした。ＣＩＳ  ＢＩＯ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌラジエーター（ＩＢＬ−４３７Ｃ＃０９４３３）を用いてａＡＰＣを照射し（１００Ｇｙ）、後で用いるため速度制御フリーザー（Ｐｌａｎｅｒ  Ｋｒｙｏ  ７５０）で凍結保存培地に凍結保存した。抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）負荷Ｋ５６２由来ａＡＰＣクローン＃４を用いて、遺伝子改変していないコントロール（ＣＡＲｎｅｇ）の自己コントロールＴ細胞を増殖した。培養で得た前述のａＡＰＣを、ローディング培地（ＬＭ）と称する０．２％アセチルシステイン（Ａｃｅｔａｄｏｔｅ、Ｃｕｍｂｅｒｌａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含有する無血清Ｘ−Ｖｉｖｏ  １５（カタログ番号０４−７４４Ｑ、Ｌｏｎｚａ）で一晩培養した。翌日、細胞を洗浄し、Ｇａｍｍａ  Ｃｅｌｌ  １０００  Ｅｌｉｔｅ  Ｃｓ−１３７ラジエーター（ＭＤＳ  Ｎｏｒ��ｉｏｎ）で照射し（１００Ｇｙ）、１０６個の細胞／ｍＬ濃度で１ｍｇ／１０６個の細胞の機能性グレード精製抗ヒトＣＤ３（クローン−ＯＫＴ３、１６−００３７−８５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とともにＬＭに再懸濁し、３−Ｄローテーター（Ｌａｂ−Ｌｉｎｅ）で静かに攪拌しながら４℃で３０分間培養した。ＬＭで三回洗浄後、前述の細胞を実験に使用または後で用いるために蒸気層の液体窒素中のアリコート中で凍結した。
【００６３】
ＣＡＲ＋Ｔ細胞の製造
融解したＰＢＭＣを、（ｉ）ヒトＴ細胞キット（カタログ番号ＶＰＡ−１００２、Ｌｏｎｚａ、一つのキュベット中１００μＬ中２×１０７個の細胞）に再懸濁した。（ｉ）は、（ｉｉ）ＣＤ１９ＲＣＤ２８ＣＡＲトランスポゾンコード化ＤＮＡプラスミド（ＣｏＯｐＣＤ１９ＲＣＤ２８／ｐＳＢＳＯ）（キュベット中２×１０７個のＰＢＭＣに対し１５μｇの超らせんＤＮＡ）及び（ｉｉｉ）ＳＢ１１トランスポーゼースコード化ＤＮＡプラスミド（ｐＣＭＶＳＢ１１）（キュベット中２×１０７個のＰＢＭＣに対し５μｇの超らせんＤＮＡ）をそれぞれ含む。混合物をただちにキュベット（Ｌｏｎｚａ）へ移し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩ（Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｕ−１４、Ａｍａｘａ／Ｌｏｎｚａ）を用いて電気穿孔し（培養０日目とする）、１０％ＲＰＭＩ完全培地中で２〜３時間休ませ、培地の半量を交換後、５％ＣＯ２中３７℃で一晩培養した。翌日、細胞を集菌し、カウントし、フローサイトメトリーで表現型を決定し、ｃ照射ａＡＰＣと１：２の比率で（ＣＡＲ＋Ｔ細胞：ａＡＰＣ）共培養した。この日を培養１日目とし７日間の刺激サイクルを開始した。月・水・金のスケジュールで１日目及び７日目以降にそれぞれＩＬ−２１（カタログ番号ＡＦ−２００−２１、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）及びＩＬ−２（カタログ番号ＮＤＣ６５４８３−１１６−０７、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を添加した。ＮＫ細胞は、特に組織培養プロセス初期に異常増殖が起こる場合、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の数的増殖を抑制できる。よって、２５％ＨＳＡ（８０ｍＬ／１０７個の細胞）含有ＣｌｉｎｉＭＡＣＳバッファー中を入れたＣＤ５６ビーズ（カタログ番号７０２０６、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０ｍＬビーズ／１０７個の細胞）を充填したＬＳカラム（カタログ番号１３０−０４２−４０１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６＋細胞が＄１０％の場合、ＣＤ５６欠乏とした。
【００６４】
ＣＡＲｎｅｇコントロールＴ細胞の生成
コントロールとして、５×１０６個のモックトランスフェクトしたＰＢＭＣを照射済み抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）負荷Ｋ５６２由来ａＡＰＣクローン＃４と１：１の比率で７日間刺激サイクルで共培養した。全ての培養物にＩＬ−２１（３０ｎｇ／ｍＬ）を培養１日目以降添加し、培養開始後７日目からＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）を添加した。全てのサイトカインを１日おきに添加した。
【００６５】
細胞の免疫表現型
１００ｍＬのＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳ、０．１％アジ化ナトリウム）中で細胞を抗体を用いて４℃で３０分間染色した。免疫表現型の獲得はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて実施し、ＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ３．００．０６１２を用いて分析した。
【００６６】
クロミウムリリースアッセイ
５１Ｃｒ標識標的細胞を用いた標準４時間クロミウムリリースアッセイで、Ｔ細胞の細胞毒性を評価した。Ｔ細胞を底面プレート（Ｃｏｓｔａｒ）にトリプリケートに播種した（１×１０５、０．５×１０５、０．２５×１０５、０．１２５×１０５）。培養後、５０μＬの上清をＬｕｍａＰｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上に回収し、ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で読み出し、パーセント特異的な溶解を下記のとおり計算した。
実験的５１Ｃｒ放出−自発的５１Ｃｒ放出×１００
最大５１Ｃｒ放出−自発的５１Ｃｒ放出
【００６７】
自発的及び最大放出を、ＣＭまたは０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）で培養した標的細胞培養の調節上清中のクロミウムを測定することによりそれぞれ求め、９６−ウェルＶ（製造元：Ｎｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、オンタリオ州ソーンヒル、カナダ）中５×１０３個の標的細胞で０．０６２５×１０５個の細胞／ウェルであった。
実施例２：
【００６８】
ＣＤ１９＋  ＣＡＲの生成
実施例１に記載の方法（「ＥＺ」法と称する）を用いてＣＤ１９＋ＣＡＲを生成した。得られたＣＤ１９＋ＣＡＲ（ＣＤ１９ＣＡＲ）を前述の方法で生成したクリニカルグレート（「ＣＧ」）のＣＤ１９ＣＡＲと比較した。
【００６９】
得られたデータにより、前述の三重部位−組換えシステムで前述のクリニカルグレート
ＣＤ１９ＣＡＲ（ＣＧ）と同様のＣＤ１９ＣＡＲ（ＥＺ）が生成されたことがわかった。前述のプラスミドの組換え部位に残されたフットプリントはＣＡＲの発現及び機能に干渉していなかった（図２Ａ及び図２Ｂ）。
実施例３：
【００７０】
ＣＡＲ含有（ＣＤ８、ＣＤ２８）膜貫通ドメイン及び（ＣＤ２８、４−１ＢＢ）シグナリングドメインの生成
試験した種々のＣＡＲは同様の増殖、細胞毒性、及びＴｈ１細胞毒性を示した。ＣＤ１９−ＢＢ−ｚはＴｈ２  サイトカインの産生低下を示し、インビボでマウスの疾患コントロールに効果的であった（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４、２００９）。しかしながら、インビトロでは抗原性刺激なしに細胞が維持された事実に対する懸念がある。
【００７１】
表２は臨床におけるＣＡＲを示す。いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲは表２に示す特異的なコンストラクトを有していない。もしくは、いくつかの実施形態では、本発明の方法を用いて、臨床で現在使用されているＣＡＲと異なる表２に記載のＣＡＲの特徴を有するＣＡＲの他のバリエーションを生成しても良い。
表２：臨床におけるＣＡＲ
【表２−５】
2020058380.tif 000011
【００７２】
図３は具体的なＣＡＲコンストラクトデザインを示す。図３に示すように、ＣＤ１９ｓｃｆｖ、ＣＤ８ａヒンジ若しくはＩｇＧ４  Ｆｃストーク、ＣＤ８膜貫通（ＴＭ）若しくはＣＤ２８  ＴＭ若しくはＣＤ１３７  ＴＭ、及びＣＤ２８若しくはＣＤ１３７エンドドメインとＣＤ３ζエンドドメインを介したシグナリングの組み合わせを用いて、種々のＣＡＲの概略図を作成した。
【００７３】
図３に示す前述のＣＡＲコンストラクトはその後ＳＩＭ及びＦＲＡタグを含有するＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙプラスミドにクローン化され、共通のＣＶｓｅｑ７プライマーを用いて増幅される場合、競合する再増殖試験におけるトラッキングが可能となった。前述のＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトラッキングプラスミドを図４に示す。
【００７４】
図３に示す前述のＣＡＲコンストラクトをＡｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩを用いてＴ細胞に電気穿孔し、サイトカイン（ＩＬ２、ＩＬ−２１）の存在下でａＡＰＣと２８日間共培養した。電気穿孔翌日（１日目）及びａＡＰＣとの共培養開始２８日後（２８日目）のＣＡＲ発現を示す。ＣＤ３及び抗ＣＤ１９ｓｃｆｖ特異的Ａｂを用いてＴ細胞及びＣＡＲを識別したＣＤ３及びＣＡＲのドットプロッティングを示す。図５はＣＡＲ発現結果を示す。
【００７５】
図３に示す前述のＣＡＲコンストラクトをＣＡＲ発現について経時的に２８日間評価を行った。２１日間経過後、ほとんどの培養物が、＞８０％のＣＡＲ発現を示した。図６にＣＡＲ発現動態を示す。
【００７６】
図３は、ａＡＰＣと２８日間共培養した後ＣＡＲでヌクレオフェクトした培養物中のＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞のパーセント発現を示す。図７にこれら表現型結果を示す。
【００７７】
２８日間の共培養後、ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＣＡＲを発現する図３に記載の細胞）を、メモリー（ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７）、活性化（ＣＤ６９、ＨＬＡ−ＤＲ）、細胞毒性（Ｐｅｒｆｏｒｉｎ、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）、消耗／老化（ＣＤ５７、ＫＬＲＧ１、ＰＤ１）、及び接着（ＣＤ３９、ＣＤ１５０）に関連するマーカーの発現について評価した。この延長された表現型の結果を図８Ａ及び図８Ｂに示す。
【００７８】
ウエスタンブロットを用いてＣＤ３ζ発現についてＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＣＡＲを発現する図３に記載の細胞）を評価した。細胞溶解物を変性条件に供した後移し、キメラＣＤ３ζの発現を、一次マウス抗ヒトＣＤ３ζｍＡｂ及びＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧを用いてＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅによって測定した。ＣＡＲコンストラクトのサイズに対応して５２、７１及び７８ｋＤでキメラＣＤ３ζバンドが観察される。図９にこれらのウエスタンブロット結果を示す。
【００７９】
前述のＣＡＲコンストラクトで電気穿孔したＴ細胞（図３に記載）を１日目及びその後７日毎に２８日間かけてＫ５６２ａＡＰＣで刺激した。各刺激サイクルの最後に、細胞をトリパンブルー色素排除試験法によりカウントし、ＣＤ３及びＣＡＲ発現の表現型を決定した。図１０のグラフは、全細胞、ＣＤ３細胞、及びＣＡＲ＋Ｔ細胞の経時的な推定細胞数を示す。
【００８０】
細胞増殖を測定した。共培養１４日目、２１日目、２８日目の全細胞（図１１）及びＣＡＲ＋Ｔ細胞（図１２）の細胞増殖率を１日目のカウント数（電気穿孔後）との比較により求めた。図１１及び図１２に結果を示す。
【００８１】
前述のＣＡＲ発現Ｔ細胞（ＣＡＲ＋Ｔ細胞）の細胞毒性を測定した。標準４時間クロミウムリリースアッセイで、ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＣＡＲを発現する図３に記載の細胞）のＣＤ１９＋腫瘍標的に対する細胞毒性（Ｄａｕｄｉβ２ｍ、ＮＡＬＭ−６及びＣＤ１９＋ＥＬ−４）をＣＤ１９ｎｅｇＥＬ−４との比較により評価した。結果を図１３、図１４、図１５、及び図１６に示す。
【００８２】
細胞内ＩＦＮ−γ産生。  ＣＡＲ＋Ｔ細胞（図３に記載の前述のコンストラクトを発現する細胞）を、タンパク質トランスポートインヒビターの存在下で（ＣＤ１９＋及びＣＤ１９ｎｅｇ）刺激細胞と４〜６時間培養し、固定し、透過処理し、ＩＦＮ−γ特異的ｍＡｂで染色した。ＰＭＡ−イノマイシンをポジティブコントロールとして用いた。細胞内ＩＦＮ−γ産生の結果を図１７、図１８、図１９、及び図２０に示す。
【００８３】
ＳＢ１１トランスポーゼースのＰＣＲ。ＣＡＲ＋Ｔ細胞から単離したＤＮＡ（図３）を、サーマルサイクラーでＳＢ１１特異的プライマーを用いて増幅した。ＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として用い、線形化ｐＣＭＶ−ＳＢ１１プラスミド及びＳＢ１１を発現するＪｕｒｋａＴ細胞由来ゲノムＤＮＡをポジティブコントロールとして使用した。ＣＡＲｎｅｇ細胞（ＤＮＡなし）をネガティブコントロールとして使用した。これらのＰＣＲ結果を図２１に示す。
【００８４】
ＣＡＲコピー数を定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により測定した。ＣＡＲ細胞中の導入遺伝子（図３に示す前述のＣＡＲコンストラクト）の積算数を、ＩｇＧ４Ｆｃストーク及び逆方向の繰り返し配列／同方向の繰り返し配列（ＩＲ／ＤＲ）に特異的なプライマー及びプローブを用いてゲノムＤＮＡを増幅することにより評価した。ＲＮＡｓｅＰ遺伝子を内部コントロールとして用い、前述のＪｕｒｋａＴ細胞株を発現するＣＡＲの単一コピーを用いて標準曲線を生成した。結果を図２２に示す。
【００８５】
次に、ＣＡＲ＋Ｔ細胞を、自律増殖の有無に基づいて測定した。ＣＡＲ＋Ｔ細胞（図３に記載のＣＡＲコンストラクトを発現する細胞）の異常増殖を、サイトカイン及びａＡＰＣの非存在下でＴ細胞を培養することによりモニター及び測定した。細胞を７日間毎にカウントし、生細胞率／死滅細胞率（１日目より）を計算しプロットした。図２３に示すように、＞８０％のＴ細胞が１４日目までに死滅し自律増殖の喪失が認められた。
【００８６】
種々のＣＡＲを発現（＞８０％）、増殖（〜１０１０）することができ、同程度の細胞毒性（〜６０％、Ｄａｕｄｉ）が見られた。スキャフォールデイングドメイン（ＩｇＧ４またはＣＤ８α）を用いてＣＡＲを組み立てたが、発現または有効性に影響はなかった。膜貫通ドメイン（ＣＤ８、ＣＤ２８）は有効性に影響しなかった。４−１ＢＢ膜貫通ドメイン（２１６）は発現（抗ｓｃＦｖ  Ａｂ）に影響したが、細胞毒性及びサイトカイン産生には影響しなかった。シグナリングドメイン、ＣＤ２８、及び４−１ＢＢの組み合わせには効果はなかった。ＣＡＲ＋Ｔ細胞はメモリー／エフェクター表現型を示した。４−１ＢＢドメイン（２１２、２１４、２１７）のみを含有するＣＡＲは他と比べて高いＣＣＲ７発現を示した。メモリー（ＣＤ２７ｈｉ、ＣＤ４５ＲＡｈｉ、ＣＣＲ７ｌｏ）、活性化（ＣＤ６９ｍｅｄ、ＨＬＡ−ＤＲｈｉ）、細胞溶解（ｇｒａｎｚｙｍｅｈｉ、ｐｅｒｆｏｒｉｎｌｏ）、及び接着（ＣＤ３９ｈｉ、ＣＤ１５０ｌｏ）に関するマーカーの発現が見られたが、阻害マーカー（ＣＤ５７、ＰＤ１、ＫＬＲＧ１）については無視できる発現量であった。４−１ＢＢドメインを含有するものを含む全てのＣＡＲがＳＢ１１トランスポーゼースを有さず自己増殖しなかった。
実施例４
【００８７】
ＣＤ３−ζ含有ＣＡＲの生成
ＣＤ３ζ含有ＣＡＲを本実施例で提供する。ＣＡＲデザインの一般的なダイアグラムを図２４に示す。図２４にＣＡＲデザイン（図２４、右）と抗体分子（図２４、左）との比較を示す。
【００８８】
図２５にＣＤ３ζ配列を示す。ＣＤ３ζの配列及びアイソフォームを図２５に示す。前述のＣＡＲデザインは、前述のエンドドメインシグナリング部分の一つを形成し３つのＩＴＡＭを持つＣＤ３ζ（アイソフォーム１）を含んでいた。
【００８９】
図２６及び図２７に具体的なＣＡＲコンストラクトを示す。図２６は、ＣＤ２８またはＣＤ１３７エンドドメインを介したシグナリングの大（ＩｇＧ４）、中（ＣＤ８ａヒンジ）、及び小（ＩｇＧ１２ａａ）ストークを有するＣＤ１９特異的ＣＡＲの概略図を示す。異なるストーク及びシグナリングのＣＡＲ分子の命名を図２７に示す。
【００９０】
ＣＡＲ発現を測定した。ＣＡＲの発現（図２６に示す）を、電気穿孔翌日（１日目）及びａＡＰＣによる２８日間の共培養後（２８日目）に測定した。図２８にＣＤ３及びＣＡＲのドットプロット（ＣＤ１９ｓｃｆｖ特異的ｍＡｂにより測定）を示す。
【００９１】
前述のＣＡＲについて増殖動態を測定した。ＣＡＲコンストラクトで電気穿孔したＴ細胞（図２６に示す）をａＡＰＣと７日間刺激サイクルで共培養した。ＣＤ３及びＣＡＲの発現について細胞数をカウントし評価した。図２９及び図３０に結果を示す。
【００９２】
前述のＣＡＲ＋Ｔ細胞の細胞毒性を測定した。２８日間の共培養後、ＣＡＲ＋Ｔ細胞（図２６に記載のコンストラクトを発現する細胞）を腫瘍標的に対する細胞毒性についてクロミウムリリースアッセイで評価した。図３１に示すように、パーセント細胞毒性を、ＣＤ１９＋及びＣＤ１９ｎｅｇ腫瘍標的に対するＣＤ１９ＲＣＤ２８（ＣＡＲ１９４）及びＣＤ１９ＲＣＤ１３７（ＣＡＲ２１７）ＣＡＲの様々なエフェクター対標的比率で測定した。図３２に示すとおり、Ｅ：Ｔ比２０：１で、ＣＡＲ＋Ｔ細胞（図２６に記載のコンストラクトを発現する細胞）におけるＣＤ１９＋ＥＬ−４のパーセント溶解のデータが得られた。ＣＡＲ＋Ｔ細胞（図２６に記載のコンストラクトを発現する細胞）におけるＣＤ２７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８及びＣＣＲ７のパーセント発現を測定した。結果を図３３に示す。
【００９３】
前述のＣＡＲ＋Ｔ細胞について細胞内サイトカイン産生を測定した。刺激細胞（ＣＤ１９＋及びＣＤ１９ｎｅｇ）をタンパク質トランスポートインヒビターの存在下でＣＡＲ＋Ｔ細胞（図２６に記載のＣＡＲを発現する細胞）により４時間培養し、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２ｍＡｂで染色した。ＰＭＡ−イノマイシンをポジティブコントロールとして用い、Ｔ細胞のみをネガティブコントロールとして用いた。図３４に刺激後のＩＦＮ−γ産生細胞の割合を示す。図３５に細胞刺激カクテル（ＰＭＡ−イノマイシン）で培養後のＩＦＮ−γ及び／またはＩＬ−２産生細胞の分解を示す。
【００９４】
前述のＣＡＲ＋Ｔ細胞を自律増殖の有無について測定した。ＣＡＲ＋Ｔ細胞（図２６に記載のＣＡＲを発現する細胞）を、１８日間の外的刺激（サイトカイン及びａＡＰＣ）の非存在下での異常増殖の喪失について評価した。１８日後、＞８０％の前述の細胞が死滅し、望まない増殖の喪失を示した。図３６に示すとおり自律増殖の喪失が観察された。
【００９５】
前述のＣＡＲ＋Ｔ細胞におけるＣＡＲコピー数を測定した。組み込まれたＣＡＲ分子のコピー数を、ＩｇＧ４−Ｆｃ及びＩＲ／ＤＲ領域に特異的なプライマー／プローブを用いてｑＰＣＲにより評価した。図３７に示すとおり、組み込まれたＣＡＲコピー数（図２６に示すＣＡＲ）をＩＲ／ＤＲプローブを用いて観察した。図３８及び図３９に示すとおり、ＣＡＲコピー数データのコンパイルについて、２つの別々の実験として試験されたＣＡＲコンストラクトの表及びグラフとして提供される（図３のＣＡＲコンストラクト及び図２６のＣＡＲコンストラクトの両方）（Ｐ４９１；Ｃ７１４及びＧＣＲ３５７８６１）。
【００９６】
これらのデータは、本明細書に記載の前述の培養システムにおいて、種々のスペーサーを持つＣＡＲがインビトロで発現及び増殖可能であるであることを示す。全ＣＡＲが同様のＣＡＲ発現を有することが観察された。ＣＤ１９＋ＥＬ−４ｓの最大細胞毒性はＣＤ８ヒンジ領域を有するＣＡＲに認められた。ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ２８の同様の発現が試験した全てのＣＡＲに観察された。ＩｇＧ４−Ｆｃストークを含有するＣＡＲを除き、ＣＡＲコピー数として測定される高い組込み頻度が全てのＣＡＲに認められた。自律増殖及びＳＢ１１の喪失がＰＣＲにより認められた。既報に反して、これらの試験において前述のＣＡＲにおける１２ａａスペーサーの含有は機能性の改善をもたらさなかった。
実施例５
【００９７】
主要成分からのＣＡＲの迅速なアセンブリ
本発明者らは、クリニカルグレードのＣＤ１９ＲＣＤ２８ｍζ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＣＧ  ＣＡＲ）と共にＥＺ  ＣＡＲプラットフォームを用いてキメラＣＤ２８／ＣＤ３−ζを介して活性化されるＣＤ１９特異的ＣＡＲを生成した。クリニカルグレードＣＤ２８／ＣＤ３−ζ及びＥＺ  ＣＡＲ  ＣＤ１９ＲＣＤ２８ｍζ  ＣＡＲ配列の両方をＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンベクターへ挿入し、Ｔ細胞に電気穿孔した。電気穿孔後、前述のＴ細胞を、Ｔ細胞の抗原特異的増殖ためのＣＤ１９＋人工抗原提示細胞（活性化及び増殖性細胞と称する、またはＡａＰＣ）の存在下で培養した。Ｔ細胞表面のＣＡＲの発現をフローサイトメトリー（Ｆｃ＋発現）で毎週測定した結果、クリニカルグレードＣＤ１９  ＣＡＲＴ細胞及びＥＺ  ＣＤ１９  ＣＡＲＴ細胞における同様のＣＡＲ発現が示された。またクロミウムリリースアッセイ（ＣＲＡ）を実施し、ＥＺ  ＣＡＲプラットフォームにより生成したＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞の腫瘍細胞に対する死滅機能を評価した。培養４時間後、特異的な細胞溶解の割合はＥＺ  ＣＡＲＴ細胞では５２％、ＣＧ  ＣＡＲＴ細胞では４９％であった。
【００９８】
これらの結果によりこれらの方法を用いて機能性ＣＡＲ＋Ｔ細胞が生成されたことが明らかになった。本発明者らはその後、ＣＡＲ分子の下記３つのコンポーネントを含有するプラスミドのライブラリーと組み合わせて上記方法により迅速なＣＡＲ産生を行った：（ｉ）抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ（ｉｉ）サイズの異なる５つのヒンジ（大ＩｇＧ４ａ及びＩｇＧ４ΔＥＱ、中ＣＤ８α、小ｔ−２０ＡＡ及びｔ−１２ＡＡ）及び（ｉｉｉ）７つのシグナリングドメインと前述のＣＤ３ζドメインの異なる組み合わせ（ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２８ΔＹ１７３→Ｆ１７３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８）。前述のＣＡＲ導入遺伝子を含有するプラスミドによるＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションを利用して２７の異なるＣＡＲコンストラクトをスクリーニングすることにより細胞表面での前述のＣＡＲタンパク質の発現を確保した。個々のＣＡＲ分子のハイスループット試験を前述のｉＱｕｅ（商標）Ｓｃｒｅｅｎｅｒ（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ、ニューメキシコ州アルバカーキ）及びハイスループットフローサイトメーターを用いて実施した。細胞毒性アッセイは、蛍光グランザイムＢレポーターまたはＧＦＰを発現する改変標的細胞を用いて行った。図４０Ａ〜図４０Ｅに結果を示す。
【００９９】
ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ社のｉＱｕｅ（商標）を用いて付加実験を行うことにより前述のＣＡＲ分子をスクリーニングした。ｉＱｕｅ（商標）は、ハイスループットフローサイトメトリーを利用し、多重化能力及び細胞ごとの分析により大きな集団を検査して情報を得る補完的技術である。本発明者らは、ＣＡＲのパネルで改変したＴ細胞の治療可能性を報告するためにこの技術を採用した。前述のウェルのＴ細胞を、生存率だけでなく活性化シグナル（例えば、ＣＤ２５の上方調節）、サイトカイン放出、及び死滅について染色可能である。よって本発明者らはｉＱｕｅ  Ｓｃｒｅｅｎｅｒを採用し、多重化ビーズ系サイトカイン検出及び細胞系アッセイを実施する性能を利用した。得られた結果は、本技術を用いてＥＺ  ＣＡＲプラットフォームにより生成された異なる多数のＣＡＲ  Ｔ細胞を試験可能であることを示す。ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ社のｉＱｕｅ（商標）を用いてデータを生成した。ＣＡＲ  Ｔ細胞の２集団を標的細胞を死滅させる能力について評価した。結果を図４１Ａ−Ｂ及び図４２に示す。これらの結果により、ＣＡＲ分子は活性が認められたためｉＱｕｅ（商標）方法を効果的に利用してＣＡＲ活性を評価可能であることが明らかである。
*  *  *
【０１００】
本開示において開示及び請求される全ての方法は過度の実験なしに実施及び遂行可能である。本発明の前述の組成物及び方法は好ましい実施形態について記載されているが、本発明の概念、精神、及び範囲から逸脱することなく本明細書に開示された前述の方法及び前述の方法の工程や工程の順序に変更を加えても良いことは当業者にとって明白である。より詳細には、同一または同様の結果が得られる限り、化学的及び生理学的に関連する所定の物質を本明細書に記載の物質で置換可能であることは明白である。全てのそうした同様の置換基及び改変は当業者にとって明らかであり、別記請求項に定義される本発明の精神、範囲及び概念に包含されるとみなされる。
参考文献
以下に記載の文献は、本明細書の記載における補完的かつ例示的手順またはその他補足的な詳細を提供する範囲において、参照により本明細書に組み入れる。
米国特許公開第２００９／００１７０００号
米国特許公開第２００９／０００４１４２号
米国特許第６，２２５，０４２号
米国特許第６，３５５，４７９号
米国特許第６，３６２，００１号
米国特許第６，４１０，３１９号
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
2020058380.tif 000015
【図４】
2020058380.tif 000016
【図５−１】
2020058380.tif 000017
【図５−２】
2020058380.tif 000018
【図６】
2020058380.tif 000019
【図７】
2020058380.tif 000020
【図８Ａ−１】
2020058380.tif 000021
【図８Ａ−２】
2020058380.tif 000022
【図８Ｂ−１】
2020058380.tif 000023
【図８Ｂ−２】
2020058380.tif 000024
【図９】
2020058380.tif 000025
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４０Ｄ】
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【図４０Ｅ】
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【図４１Ａ−１】
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【図４１Ａ−２】
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【図４１Ｂ】
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【図４２】
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【配列表】
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