(57)【要約】      （修正有）【課題】比色法を用いて、増幅反応産物を検出する方法の提供。【解決手段】試料が標的核酸鋳型分子を含有する場合に増幅反応が起こって増幅反応産物を産生するような条件下で、試料を反応ミックスと接触させる。反応ミックスは、増幅反応を触媒するための酵素、および少なくとも1種の造塩発色剤を含む。標的核酸鋳型分子が存在する場合には、増幅反応は、反応ミックスの開始pHを変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こし、それにより標的核酸の存在が示される。標的核酸鋳型分子が存在しない場合には、増幅反応は、反応ミックスの開始pHを十分に変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こすのに適切な数のプロトンを生成せず、それにより増幅反応産物が産生されていないことが示される。【選択図】図３
2020058377.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料における増幅反応産物の比色検出のための方法であって、該方法が、試料が標的核酸鋳型分子を含有する場合に増幅反応が起こって増幅反応産物を産生するような条件下で、試料を反応ミックスと接触させる工程を含み、
該反応ミックスが、開始pHを有し、かつ
8.0の開始pHを有する溶液中1 mM〜19 mMの濃度でのトリス緩衝液と同等の緩衝能力を有する緩衝液；
増幅反応を触媒するための酵素；および
造塩発色剤
を含み、
標的核酸鋳型分子が存在する場合には、増幅反応が、反応ミックスの開始pHを変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こし、それにより標的核酸の存在が示され、および、標的核酸鋳型分子が存在しない場合には、増幅反応が、反応ミックスの開始pHを十分に変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こすのに適切な数のプロトンを生成せず、それにより増幅反応産物が産生されていないことが示される、方法。
【請求項２】
増幅反応産物の検出が、造塩発色剤を含まない反応ミックスを用いた増幅反応と比べて加速されている、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
造塩発色剤を含まない反応ミックスを用いた増幅反応が、蛍光インターカレート色素、分子ビーコン、ハイブリダイゼーションプローブ、色素ベースの検出、紫外-可視、アガロースゲル、またはラテラルフローアッセイによる増幅反応産物の検出を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
反応ミックスの比色変化が、増幅反応の実行中にわたって検出される、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
反応ミックスの比色変化が、増幅反応の実行後に検出される、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
反応ミックスの比色変化の検出が、増幅反応産物の存在のデジタル表示と関連している、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
反応ミックスの比色変化が、反応ミックスの蛍光または吸光度を測定することによって検出される、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
反応ミックスの比色変化が、反応ミックスの視覚的検出によって検出される、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
反応ミックスの比色変化の検出により、増幅反応の指数関数期またはプラトー期が得られていることが示される、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
反応ミックスの比色変化が、増幅反応の実行前の開始時間から60分未満で検出される、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
増幅反応が熱サイクル反応である、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
増幅反応が等温反応である、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
等温反応が、鎖置換増幅、多置換増幅、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、ローリングサークル増幅、またはループ介在等温増幅である、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
造塩発色剤が比色剤または蛍光剤である、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
造塩発色剤が、フェノールレッド、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、ニュートラルレッド、ナフトールフタレイン、クレゾールレッド、クレゾールフタレイン、またはフェノールフタレインである、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
造塩発色剤が、50μM〜260μMの濃度である、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
酵素がDNAポリメラーゼである、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
DNAポリメラーゼがBstまたはTaqである、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
酵素が、逆転写酵素、RNAポリメラーゼ、RNアーゼ、ヘリカーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、TAQポリメラーゼ、または一本鎖結合タンパク質である、請求項1に記載の方法。
【請求項２０】
酵素がBstまたはBst 2.0ポリメラーゼであり、造塩発色剤がフェノールレッドである、請求項1に記載の方法。
【請求項２１】
反応ミックスが塩基をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項２２】
塩基が水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムである、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
反応ミックスが酸をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項２４】
酸が塩酸または硫酸である、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
反応ミックスが、dNTP、プライマー、および一価陽イオンのうちの少なくとも1つをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項２６】
一価陽イオンが、アンモニウム、第四級アンモニウム、またはカリウムである、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
試料と反応ミックスとの接触が、増幅反応の開始に先立って0.1未満のpH単位で反応ミックスの開始pHを補う、請求項1に記載の方法。
【請求項２８】
反応ミックスの開始pHが、pH 6〜pH 10である、請求項1に記載の方法。
【請求項２９】
反応ミックスの開始pHが、pH 7.5〜pH 8.8である、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
反応ミックスの開始pHが、pH 8〜pH 8.8である、請求項28に記載の方法。
【請求項３１】
検出可能な比色変化が、50μmのセル光路長で定量可能である、請求項1に記載の方法。
【請求項３２】
第2の造塩発色剤をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３３】
造塩発色剤がフェノールレッドであり、第2の造塩発色剤がブロモチモールブルーである、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
造塩発色剤がクレゾールレッドであり、第2の造塩発色剤がブロモチモールブルーである、請求項32に記載の方法。
【請求項３５】
増幅反応産物がDNAまたはRNAである、請求項1に記載の方法。
【請求項３６】
核酸鋳型分子がDNAまたはRNAである、請求項1に記載の方法。
【請求項３７】
試料が、10μlの反応ミックスあたり、4.8×10-9〜4.8×10-18のヒドロニウムイオン等価物を反応ミックスに与える、請求項1に記載の方法。
【請求項３８】
試料が、試料を反応ミックスと接触させると5〜40％に希釈される、請求項1に記載の方法。
【請求項３９】
試料が、pH 3〜pH 11のpHである、請求項1に記載の方法。
【請求項４０】
検出可能な比色変化が、反応ミックスの画像化に基づいて検出される、請求項1に記載の方法。
【請求項４１】
画像化が、反応ミックスの画像の対比における変化の決定を含む、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
画像化が、反応ミックスの画像のHSV値またはRGB値における変化の決定を含む、請求項40に記載の方法。
【請求項４３】
増幅反応産物の比色検出のためのキットであって、
8.0の開始pHを有する溶液中1 mM〜19 mMの濃度でのトリス緩衝液と同等の緩衝能力を有する緩衝液；
増幅反応を触媒するための酵素；
造塩発色剤；ならびに
試料が標的核酸鋳型分子、反応ミックスを含有する場合に増幅反応が起こって増幅反応産物を産生する条件下で、該緩衝液および該酵素および該造塩発色剤を含む反応ミックスと試料を接触させることについての説明を含む、使用説明書であって、標的核酸鋳型分子が存在する場合には、増幅反応が、反応ミックスの開始pHを変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こし、それにより標的核酸の存在が示され、および、標的核酸鋳型分子が存在しない場合には、増幅反応が、反応ミックスの開始pHを十分に変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こすのに適切な数のプロトンを生成せず、それにより増幅反応産物が産生されていないことが示される、使用説明書
を含む、キット。
【請求項４４】
酸または塩基をさらに含む、請求項43に記載のキット。
【請求項４５】
塩基が水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムである、請求項44に記載のキット。
【請求項４６】
酸が塩酸または硫酸である、請求項44に記載のキット。
【請求項４７】
dNTP、プライマー、および一価陽イオンのうちの少なくとも1つをさらに含む、請求項43に記載のキット。
【請求項４８】
一価陽イオンが、アンモニウム、第四級アンモニウム、またはカリウムである、請求項47に記載のキット。
【請求項４９】
造塩発色剤が、フェノールレッド、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、ニュートラルレッド、ナフトールフタレイン、クレゾールレッド、クレゾールフタレイン、またはフェノールフタレインである、請求項43に記載のキット。
【請求項５０】
造塩発色剤が、50μM〜260μMの濃度である、請求項43に記載のキット。
【請求項５１】
酵素が、逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、RNアーゼ、ヘリカーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、TAQポリメラーゼ、または一本鎖結合タンパク質である、請求項43に記載のキット。
【請求項５２】
酵素がBstまたはBst 2.0ポリメラーゼであり、造塩発色剤がフェノールレッドである、請求項43に記載のキット。
【請求項５３】
試料における増幅反応産物の比色検出のための方法であって、該方法が、試料が標的核酸鋳型分子を含有する場合に増幅反応が起こって増幅反応産物を産生するような条件下で、試料を反応ミックスと接触させる工程を含み、
該反応ミックスが、開始pHを有し、かつ
増幅反応を触媒するための酵素；および
造塩発色剤
を含み、
標的核酸鋳型分子が存在する場合には、増幅反応が、反応ミックスの開始pHを変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こし、それにより標的核酸の存在が示され、検出可能な比色変化を50μmのセル光路長で定量することができ、および、標的核酸鋳型分子が存在しない場合には、増幅反応が、反応ミックスの開始pHを十分に変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こすのに適切な数のプロトンを生成せず、それにより増幅反応産物が産生されていないことが示される、方法。
【請求項５４】
増幅反応産物の検出が、造塩発色剤を含まない反応ミックスを用いた増幅反応と比べて加速されている、請求項53に記載の方法。
【請求項５５】
造塩発色剤を含まない反応ミックスを用いた増幅反応が、蛍光インターカレート色素、分子ビーコン、ハイブリダイゼーションプローブ、色素ベースの検出、紫外-可視、アガロースゲル、またはラテラルフローアッセイによる増幅反応産物の検出を含む、請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
反応ミックスの比色変化が、増幅反応の実行中にわたって検出される、請求項53に記載の方法。
【請求項５７】
反応ミックスの比色変化が、増幅反応の実行後に検出される、請求項53に記載の方法。
【請求項５８】
反応ミックスの比色変化の検出が、増幅反応産物の存在のデジタル表示と関連している、請求項53に記載の方法。
【請求項５９】
反応ミックスの比色変化が、反応ミックスの蛍光または吸光度を測定することによって検出される、請求項53に記載の方法。
【請求項６０】
反応ミックスの比色変化が、反応ミックスの視覚的検出によって検出される、請求項53に記載の方法。
【請求項６１】
反応ミックスの比色変化の検出により、増幅反応の指数関数期またはプラトー期が得られていることが示される、請求項53に記載の方法。
【請求項６２】
反応ミックスの比色変化が、増幅反応の実行前の開始時間から60分未満で検出される、請求項53に記載の方法。
【請求項６３】
増幅反応が熱サイクル反応である、請求項53に記載の方法。
【請求項６４】
増幅反応が等温反応である、請求項53に記載の方法。
【請求項６５】
等温反応が、鎖置換増幅、多置換増幅、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、ローリングサークル増幅、またはループ介在等温増幅である、請求項64に記載の方法。
【請求項６６】
造塩発色剤が比色剤または蛍光剤である、請求項53に記載の方法。
【請求項６７】
造塩発色剤が、フェノールレッド、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、ニュートラルレッド、ナフトールフタレイン、クレゾールレッド、クレゾールフタレイン、またはフェノールフタレインである、請求項53に記載の方法。
【請求項６８】
造塩発色剤が、50μM〜260μMの濃度である、請求項53に記載の方法。
【請求項６９】
酵素がDNAポリメラーゼである、請求項53に記載の方法。
【請求項７０】
DNAポリメラーゼがBstまたはTaqである、請求項69に記載の方法。
【請求項７１】
酵素が、逆転写酵素、RNAポリメラーゼ、RNアーゼ、ヘリカーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、TAQポリメラーゼ、または一本鎖結合タンパク質である、請求項53に記載の方法。
【請求項７２】
酵素がBstまたはBst 2.0ポリメラーゼであり、造塩発色剤がフェノールレッドである、請求項53に記載の方法。
【請求項７３】
反応ミックスが塩基をさらに含む、請求項53に記載の方法。
【請求項７４】
塩基が水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムである、請求項73に記載の方法。
【請求項７５】
反応ミックスが酸をさらに含む、請求項53に記載の方法。
【請求項７６】
酸が塩酸または硫酸である、請求項75に記載の方法。
【請求項７７】
dNTP、プライマー、および一価陽イオンのうちの少なくとも1つをさらに含む、請求項53に記載の方法。
【請求項７８】
一価陽イオンが、アンモニウム、第四級アンモニウム、またはカリウムである、請求項77に記載の方法。
【請求項７９】
試料と反応ミックスとの接触が、増幅反応の開始に先立って0.1未満のpH単位で反応ミックスの開始pHを補う、請求項53に記載の方法。
【請求項８０】
反応ミックスの開始pHが、pH 6〜pH 10である、請求項53に記載の方法。
【請求項８１】
反応ミックスの開始pHが、pH 7.5〜pH 8.8である、請求項80に記載の方法。
【請求項８２】
反応ミックスの開始pHが、pH 8〜pH 8.8である、請求項80に記載の方法。
【請求項８３】
第2の造塩発色剤をさらに含む、請求項53に記載の方法。
【請求項８４】
造塩発色剤がフェノールレッドであり、第2の造塩発色剤がブロモチモールブルーである、請求項83に記載の方法。
【請求項８５】
造塩発色剤がクレゾールレッドであり、第2の造塩発色剤がブロモチモールブルーである、請求項83に記載の方法。
【請求項８６】
増幅反応産物がDNAまたはRNAである、請求項53に記載の方法。
【請求項８７】
核酸鋳型分子がDNAまたはRNAである、請求項53に記載の方法。
【請求項８８】
試料が、10μlの反応ミックスあたり、4.8×10-9〜4.8×10-18のヒドロニウムイオン等価物を反応ミックスに与える、請求項53に記載の方法。
【請求項８９】
試料が、試料を反応ミックスと接触させると5〜40％に希釈される、請求項53に記載の方法。
【請求項９０】
試料が、pH 3〜pH 11のpHである、請求項53に記載の方法。
【請求項９１】
反応ミックスが、8.0の開始pHを有する溶液中1 mM〜19 mMの濃度でのトリス緩衝液と同等の緩衝能力を有する緩衝液をさらに含む、請求項53に記載の方法。
【請求項９２】
検出可能な比色変化が、反応ミックスの画像化に基づいて検出される、請求項53に記載の方法。
【請求項９３】
画像化が、反応ミックスの画像の対比における変化の決定を含む、請求項92に記載の方法。
【請求項９４】
画像化が、反応ミックスの画像のHSV値またはRGB値における変化の決定を含む、請求項92に記載の方法。
【請求項９５】
試料における増幅反応産物の比色検出のための方法であって、該方法が、試料が標的核酸鋳型分子を含有する場合に増幅反応が起こって増幅反応産物を産生するような条件下で、試料を反応ミックスと接触させる工程を含み、
該反応ミックスが、開始pHを有し、かつ
増幅反応を触媒するための酵素；および
少なくとも2種の造塩発色剤
を含み、
標的核酸鋳型分子が存在する場合には、増幅反応が、反応ミックスの開始pHを変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こし、それにより標的核酸の存在が示され、および、標的核酸鋳型分子が存在しない場合には、増幅反応が、反応ミックスの開始pHを十分に変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こすのに適切な数のプロトンを生成せず、それにより増幅反応産物が産生されていないことが示される、方法。
【請求項９６】
増幅反応産物の検出が、造塩発色剤を含まない反応ミックスを用いた増幅反応と比べて加速されている、請求項95に記載の方法。
【請求項９７】
造塩発色剤を含まない反応ミックスを用いた増幅反応が、蛍光インターカレート色素、分子ビーコン、ハイブリダイゼーションプローブ、色素ベースの検出、または紫外-可視による増幅反応産物の検出を含む、請求項96に記載の方法。
【請求項９８】
反応ミックスの比色変化が、増幅反応の実行中にわたって検出される、請求項95に記載の方法。
【請求項９９】
反応ミックスの比色変化が、増幅反応の実行後に検出される、請求項95に記載の方法。
【請求項１００】
反応ミックスの比色変化の検出が、増幅反応産物の存在のデジタル表示と関連している、請求項95に記載の方法。
【請求項１０１】
反応ミックスの比色変化が、反応ミックスの蛍光または吸光度を測定することによって検出される、請求項95に記載の方法。
【請求項１０２】
反応ミックスの比色変化が、反応ミックスの視覚的検出によって検出される、請求項95に記載の方法。
【請求項１０３】
反応ミックスの比色変化の検出により、増幅反応の指数関数期またはプラトー期が得られていることが示される、請求項95に記載の方法。
【請求項１０４】
反応ミックスの比色変化が、増幅反応の実行前の開始時間から60分未満で検出される、請求項95に記載の方法。
【請求項１０５】
増幅反応が熱サイクル反応である、請求項95に記載の方法。
【請求項１０６】
増幅反応が等温反応である、請求項95に記載の方法。
【請求項１０７】
等温反応が、鎖置換増幅、多置換増幅、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、ローリングサークル増幅、またはループ介在等温増幅である、請求項106に記載の方法。
【請求項１０８】
造塩発色剤のうちの少なくとも1種が、比色剤または蛍光剤である、請求項95に記載の方法。
【請求項１０９】
造塩発色剤のうちの少なくとも1種が、フェノールレッド、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、ニュートラルレッド、ナフトールフタレイン、クレゾールレッド、クレゾールフタレイン、またはフェノールフタレインである、請求項95に記載の方法。
【請求項１１０】
造塩発色剤のうちの少なくとも1種が、50μM〜260μMの濃度である、請求項95に記載の方法。
【請求項１１１】
酵素がDNAポリメラーゼである、請求項95に記載の方法。
【請求項１１２】
DNAポリメラーゼがBstまたはTaqである、請求項111に記載の方法。
【請求項１１３】
酵素が、逆転写酵素、RNAポリメラーゼ、RNアーゼ、ヘリカーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、TAQポリメラーゼ、または一本鎖結合タンパク質である、請求項111に記載の方法。
【請求項１１４】
酵素がBstまたはBst 2.0ポリメラーゼであり、造塩発色剤がフェノールレッドである、請求項95に記載の方法。
【請求項１１５】
反応ミックスが塩基をさらに含む、請求項95に記載の方法。
【請求項１１６】
塩基が水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムである、請求項115に記載の方法。
【請求項１１７】
反応ミックスが酸をさらに含む、請求項95に記載の方法。
【請求項１１８】
酸が塩酸または硫酸である、請求項117に記載の方法。
【請求項１１９】
dNTP、プライマー、および一価陽イオンのうちの少なくとも1つをさらに含む、請求項95に記載の方法。
【請求項１２０】
一価陽イオンが、アンモニウム、第四級アンモニウム、またはカリウムである、請求項119に記載の方法。
【請求項１２１】
試料と反応ミックスとの接触が、増幅反応の開始に先立って0.1未満のpH単位で反応ミックスの開始pHを補う、請求項95に記載の方法。
【請求項１２２】
反応ミックスの開始pHが、pH 6〜pH 10である、請求項95に記載の方法。
【請求項１２３】
反応ミックスの開始pHが、pH 7.5〜pH 8.8である、請求項122に記載の方法。
【請求項１２４】
反応ミックスの開始pHが、pH 8〜pH 8.8である、請求項122に記載の方法。
【請求項１２５】
検出可能な比色変化が、50μmのセル光路長で定量可能である、請求項95に記載の方法。
【請求項１２６】
1種の造塩発色剤がフェノールレッドであり、もう1種の造塩発色剤がブロモチモールブルーである、請求項95に記載の方法。
【請求項１２７】
1種の造塩発色剤がクレゾールレッドであり、もう1種の造塩発色剤がブロモチモールブルーである、請求項95に記載の方法。
【請求項１２８】
増幅反応産物がDNAまたはRNAである、請求項95に記載の方法。
【請求項１２９】
核酸鋳型分子がDNAまたはRNAである、請求項95に記載の方法。
【請求項１３０】
試料が、10μlの反応ミックスあたり、4.8×10-9〜4.8×10-18のヒドロニウムイオン等価物を反応ミックスに与える、請求項95に記載の方法。
【請求項１３１】
試料が、試料を反応ミックスと接触させると5〜40％に希釈される、請求項95に記載の方法。
【請求項１３２】
試料が、pH 3〜pH 11のpHである、請求項95に記載の方法。
【請求項１３３】
反応ミックスが、8.0の開始pHを有する溶液中1 mM〜19 mMの濃度でのトリス緩衝液と同等の緩衝能力を有する緩衝液をさらに含む、請求項95に記載の方法。
【請求項１３４】
検出可能な比色変化が、反応ミックスの画像化に基づいて検出される、請求項95に記載の方法。
【請求項１３５】
画像化が、反応ミックスの画像の対比における変化の決定を含む、請求項134に記載の方法。
【請求項１３６】
画像化が、反応ミックスの画像のHSV値またはRGB値における変化の決定を含む、請求項134に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その開示が参照により本明細書に組み入れられる、2014年4月24日に出願された米国特許仮出願第61/983,687号の恩典を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、ASCIIフォーマットにおいて電子出願され、その全体が参照により本明細書に組み入れられる配列表を含む。2015年4月14日に作成された前記ASCIIコピーは、28770PCT_CRF_sequencelisting.txtという名称であり、サイズが5,524バイトである。
【０００３】
連邦支援の研究開発に関する陳述
本発明は、アメリカ国立衛生研究所のSmall Business Innovation Research Program（助成金番号1R41AI114068-01）により授与された政府の援助でなされた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。
【０００４】
発明の分野
本発明は、核酸増幅反応産物の比色検出のための方法および組成物に関する。特に、本発明は、1種または複数種の造塩発色剤を含む反応ミックスを用いた、核酸増幅反応産物の加速された比色検出に関する。
【背景技術】
【０００５】
発明の背景
関連技術の説明
特定の核酸配列および核酸バイオマーカーの検出のためのいくつかの現在の方法は、蛍光法を含む。PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）およびLAMP（ループ介在増幅）などの核酸増幅スキームを用いて試料から核酸配列を増幅するために、DNAプライマーを設計する。典型的に、結果として生じたアンプリコンを、インターカレートする蛍光体または分子プローブを用いて、蛍光技術を通して検出および定量する。しかし、これらの技術には、光学部品、励起源、および蛍光放射の検出のための1つまたは複数のセンサーを含む、高性能の計器装備が必要である。これらの計器は、潜在的に、大きく、扱いにくく、かつ高価である。あるいは、アンプリコンを、アガロースゲルまたはラテラルフローアッセイを用いて比色法で視覚化することができる。しかし、これらの技術には、追加の工程が必要であって、結果までの時間を増大させ、いくつかの場合には、ゲルボックスなどの計器装備が必要である。
【発明の概要】
【０００６】
増幅反応産物の比色検出のための方法およびキットを、本明細書において開示する。方法は、試料が標的核酸鋳型分子を含有する場合に増幅反応が起こって増幅反応産物を産生するような条件下で、試料を反応ミックスと接触させる工程を含む。反応ミックスは、増幅反応を触媒するための酵素、および造塩発色剤を含む。いくつかの態様において、反応ミックスは、2種以上の造塩発色剤を含む。いくつかの態様において、反応ミックスはまた、8.0の開始pHを有する溶液中1 mM〜19 mMの濃度でのトリス緩衝液と同等の緩衝能力を有する緩衝液も含む。標的核酸鋳型分子が存在する場合には、増幅反応は、反応ミックスの開始pHを変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こし、それにより標的核酸の存在が示される。いくつかの態様において、検出可能な比色変化は、50μmのセル光路長で定量される。標的核酸鋳型分子が存在しない場合には、増幅反応は、反応ミックスの開始pHを十分に変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こすのに適切な数のプロトンを生成せず、それにより増幅反応産物が産生されていないことが示される。
【０００７】
キットは、増幅反応を触媒するための酵素、造塩発色剤、および任意で、8.0の開始pHを有する溶液中1 mM〜19 mMの濃度でのトリス緩衝液と同等の緩衝能力を有する緩衝液を含む。キットは、試料が標的核酸鋳型分子を含有する場合に増幅反応が起こって増幅反応産物を産生する条件下で、緩衝液および酵素および造塩発色剤を含む反応ミックスと試料を接触させることについての説明を含む、使用説明書であって、反応ミックスが開始pHを有する、使用説明書をさらに含む。標的核酸鋳型分子が存在する場合には、増幅反応は、反応ミックスの開始pHを変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こし、それにより標的核酸の存在が示される。標的核酸鋳型分子が存在しない場合には、増幅反応は、反応ミックスの開始pHを十分に変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こすのに適切な数のプロトンを生成せず、それにより増幅反応産物が産生されていないことが示される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
本発明のこれらのおよび他の特徴、局面、および利点は、以下の説明および添付の図面に関して、より良好に理解されるようになるであろう。
【０００９】
【図１】ある態様による、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）由来の鋳型核酸分子標的領域のDNA配列（SEQ ID NO: 23）を示す。
【図２】ある態様による、陽性および陰性の等温増幅反応についてのpH測定値を示すグラフである。
【図３】ある態様による、陽性および陰性の等温増幅反応の反応終点での色（色相）の検出を示すグラフである。
【図４】ある態様による、陽性および陰性の等温増幅反応産物のゲル電気泳動アッセイの結果を示す。
【図５】ある態様による、種々のトリス緩衝液濃度を用いた増幅反応についての正規化された色相値を示す。
【図６】ある態様による、様々な量の追加のヒドロニウムイオン等価物を用いた増幅反応についての正規化された色相値を示す。
【図７Ａ】ある態様による、種々の造塩発色剤濃度を用いた増幅反応についての正規化された色相値を示す。
【図７Ｂ】ある態様による、種々の造塩発色剤濃度を用いた増幅反応についての正規化された色相値を示す。
【図７Ｃ】ある態様による、種々の造塩発色剤濃度を用いた増幅反応についての正規化された色相値を示す。
【図７Ｄ】ある態様による、種々の造塩発色剤濃度を用いた増幅反応についての正規化された色相値を示す。
【図８】ある態様による、様々なポリメラーゼと、LAMP増幅の視覚的検出との適合性を示す。
【図９】ある態様による、様々なチャネル深さを用いた増幅反応についての正規化された色相値を示す。
【図１０】ある態様による、SDAについての経時的な正規化された色相値を示す。
【図１１】ある態様による、PCRについての経時的な正規化された色相値を示す。
【図１２】ある態様による、造塩発色剤の組み合わせを用いた増幅反応についての正規化された対比変化を示す。
【図１３】ある態様による、様々なDNA鋳型濃度についての経時的な正規化された対比変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
核酸増幅反応産物の比色検出のための組成物および方法を、本明細書において開示する。いくつかの態様において、増幅された反応産物を、視覚的な色変化の観察によって、または増幅反応ミックスにおける造塩発色剤の色変化の吸光度もしくは蛍光を測定することによって検出する。
【００１１】
定義
特許請求の範囲および明細書において使用される用語は、別段の指定がない限り、下記に示すように定義される。
【００１２】
「比色法」または「比色」という用語は、溶液中の有色化合物の濃度を定量する、または別の方法で観察する技術を指す。「比色検出」とは、溶液中のそのような有色化合物、および／または該化合物の色の変化を検出する任意の方法を指す。方法は、中でも、視覚的観察、吸光度測定、または蛍光測定を含んでもよい。
【００１３】
「造塩発色剤」という用語は、いくつかの化学反応時に色を変化させる組成物を指す。特に、造塩発色剤は、pH変化とともに色を変化させる組成物を指すことができる。異なる造塩発色剤は、異なるpH移行範囲にわたって色を変化させ得る。
【００１４】
「移行pH範囲」または「pH移行範囲」という用語は、その範囲にわたって特定の試料または化合物の色が変化する、pH範囲を指す。試料についての具体的な移行pH範囲は、試料中の造塩発色剤に依存し得る（上記を参照されたい）。
【００１５】
「核酸増幅」または「増幅反応」という用語は、DNA、RNA、またはそれらの改変型を増幅する方法を指す。核酸増幅は、等温反応または熱サイクル反応などの、いくつかの技術を含む。より具体的には、核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ループ介在等温増幅（LAMP）、鎖置換増幅（SDA）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（RPA）、ヘリカーゼ依存性増幅（HDA）、多置換増幅（MDA）、ローリングサークル増幅（RCA）、および核酸配列ベース増幅（NASBA）などの方法を含む。「等温増幅」という用語は、増幅反応の温度を変化させることなく行われる増幅法を指す。プロトンが、増幅反応の間、放出される：増幅反応の間、一本鎖DNA鋳型に付加されるデオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP）1個につき、1個のプロトン（H＋）が放出される。
【００１６】
「十分量」という用語は、望ましい効果を生じるのに十分な量、例えば、細胞におけるタンパク質凝集を調節するのに十分な量を意味する。
【００１７】
2つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における、パーセント「同一性」という用語は、下記の配列比較アルゴリズム（例えば、BLASTPおよびBLASTNまたは当業者が利用可能な他のアルゴリズム）のうちの1つを用いて、または目視検査によって測定されるような、比較して最大一致のためにアラインメントした際に同じである特定のパーセンテージのヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有する、2つ以上の配列または部分配列を指す。用途に応じて、パーセント「同一性」は、比較される配列のある領域にわたって、例えば、機能ドメインにわたって存在することができるか、あるいは、比較される2つの配列の完全長にわたって存在することができる。
【００１８】
配列比較のためには、典型的に1つの配列が、試験配列がそれに対して比較される参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを用いる際には、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要な場合は、部分配列座標を設計して、配列アルゴリズムプログラムパラメータを設計する。次いで、配列比較アルゴリズムが、設計されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を算出する。
【００１９】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所的相同性アルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性探索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実装（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.におけるGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）によって、または目視検査によって実施することができる（一般的に、下記のAusubel et al.を参照されたい）。
【００２０】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適しているアルゴリズムの1つの例は、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されているBLASTアルゴリズムである。BLAST解析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通して公的に利用可能である。
【００２１】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される際、単数形の「ある」、「1つの」（「a」、「an」）、および「その（the）」は、文脈上明らかに他に規定されない限り、複数の指示物を含むことに、注意しなければならない。
【００２２】
本発明の組成物
核酸増幅反応産物の加速されたかつ効率的な比色検出のための組成物および方法を、本明細書において開示する。ある態様において、比色アッセイを、増幅された核酸産物の存在を視覚的に検出するために使用し、これは、高価なかつ高性能の計器装備の必要性を排除する。
【００２３】
いくつかの態様において、増幅産物の比色検出は、増幅反応産物を得るために標的核酸鋳型分子を増幅することによって達成される。増幅反応は、反応ミックスを含む。ある態様において、反応ミックスは、核酸鋳型分子、増幅反応を触媒するための1種または複数種の酵素、および比色検出のための1種または複数種の造塩発色剤を含む。さらなる態様において、反応ミックスはまた、8.0の開始pHを有する溶液中1 mM〜19 mMの濃度でのトリス緩衝液と同等の緩衝能力を有する緩衝液も含む。さらなる態様において、反応ミックスはまた、複数の核酸プライマー、デオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP）、酵素に適した塩、および核酸増幅を可能にする他の非緩衝化学物質も含む。
【００２４】
増幅反応の間、核酸鋳型分子中に取り込まれるdNTP1個につき1個のプロトンが放出される。したがって、反応ミックスのpHは、増幅反応中にわたって低下する。ある態様において、標的核酸が存在する場合には、増幅反応は、反応ミックスの開始pHを変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こし、それにより標的核酸の存在が示され、および、標的核酸が存在しない場合には、増幅反応は、造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こすのに十分な、反応ミックスの開始pHを変化させるのに十分な数のプロトンを生成せず、それにより増幅反応産物が産生されていないことが示される。ある態様において、反応ミックス中の造塩発色剤（またはpH指示薬）は、（1）増幅反応が行われる前の反応ミックスの開始pHと（2）増幅反応が行われた後の反応ミックスの終了pHとの間の期待されるpH変化よりも狭い、造塩発色剤の比色変化のための移行pH範囲を有する。
【００２５】
ある態様において、造塩発色剤は比色剤または蛍光剤である。適した造塩発色剤は、中でも、フェノールレッド、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、ニュートラルレッド、ナフトールフタレイン、クレゾールレッド、クレゾールフタレイン、フェノールフタレイン、メチルレッド、およびチモールフタレインを含む。これらの造塩発色剤の広範囲の濃度を、反応ミックスにおいて使用することができる。異なる造塩発色剤は、異なる移行pH範囲を有する。いくつかの態様において、造塩発色剤は、pH 5〜10、pH 6〜9、またはpH 6.5〜8.8の移行pH範囲を有する。別の態様において、造塩発色剤は、反応ミックスにおいて25〜100μMの濃度である。別の態様において、造塩発色剤は、50〜260μMの濃度である。いくつかの態様において、2種以上の造塩発色剤の組み合わせを反応ミックスにおいて使用し、これは、増幅反応の開始時には補色であり、かつ終了時には類似色であることによって、反応ミックスの正規化された色対比変化を増大させる。さらなる態様において、造塩発色剤の組み合わせは、フェノールレッドおよびブロモチモールブルーを含む。さらなる態様において、造塩発色剤の組み合わせは、クレゾールレッドおよびブロモチモールブルーを含む。
【００２６】
1つの例において、フェノールレッドは、約6.4〜8.0の移行pH範囲を有する造塩発色剤である。移行pH範囲の上限で、フェノールレッドは赤色であり、移行pH範囲の下限で、フェノールレッドは黄色である。反応ミックスの開始pHが、8.0あたりまたはそれより上であり、反応ミックスの終了pHが移行pH範囲内または6.4あたりもしくはそれより下である限り、フェノールレッドを含有する反応ミックスは、増幅反応中にわたって赤色から黄色に色を変化させる。
【００２７】
いくつかの態様において、反応ミックスの開始pHは、所望の開始pHに達するまで酸または塩基を反応ミックスに添加することによって調整される。反応ミックスの終了pHは、試料増幅反応を行って、終了pHを測定する（例えば、微小pH電極で）ことによって決定される。ある態様において、増幅反応のための造塩発色剤を、移行pH範囲が開始pHと終了pHとの間にあるように選択する。さらなる態様において、造塩発色剤を、移行pH範囲が終了pHよりも開始pHに対してより近いように選択する。造塩発色剤はまた、増幅反応を触媒するために使用される特定の酵素に基づいて選択することもできる。pHが望ましくないH+濃度まで低下するため、反応ミックス中の酵素は、終了pHの近くで、増幅反応の重合作用を終結する。ある態様において、追加のヒドロニウムイオンまたはヒドロニウムイオン等価物を、試料を介して反応ミックスに添加する。例えば、10μlの反応ミックスあたり、4.8×10-9〜4.8×10-18の追加のヒドロニウムイオン等価物が、増幅反応が進行するために許容され得る。さらなる態様において、4.8×10-10〜4.8×10-18、4.8×10-12〜4.8×10-18、または4.8×10-15〜4.8×10-18が、許容され得る。
【００２８】
一般的に、酵素は、選択された造塩発色剤の移行pH範囲を包含するかまたはそれに近いpH範囲内で、増幅反応を触媒すると考えられる。種々の酵素を反応のために使用することができ、異なる酵素は、異なるpH範囲で増幅反応を触媒する。例えば、Bstポリメラーゼは、6.6〜9.0のpH範囲内で増幅反応を触媒すると考えられている。Bstポリメラーゼのための好ましい開始pHは、7よりも上、より好ましくは8.2よりも上、およびより好ましくは8.8である。Bstポリメラーゼのための好ましい開始pHの他の例は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、1996年4月17日に出願された米国特許第5,830,714号において見出される。ある態様において、Bstポリメラーゼが活性を有するpH範囲（6.6〜9.0）は、フェノールレッドの移行pH範囲（6.4〜8.0）を包含するため、フェノールレッドは、反応ミックスにおいてBstポリメラーゼと組み合わされる。別の態様において、Uエキソクレノウ断片（ヘリカーゼ依存性増幅すなわちHDAのためのポリメラーゼ）が活性を有する開始pH（約7.5）は、メチルレッドの移行pH範囲（4.8〜6.2）よりも高いため、メチルレッドは、反応ミックスにおいてUエキソクレノウ断片と組み合わされる。
【００２９】
BstまたはBst 2.0ポリメラーゼ以外に、増幅反応を触媒するために使用することができる他の酵素は、サーマス・アクアチカス（Thermus aquaticus）（TAQ）由来のポリメラーゼ、DNAポリメラーゼI〜IV、Kapaポリメラーゼ、RNAポリメラーゼI〜V、T7 RNAポリメラーゼ、逆転写酵素、任意のDNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼ、ヘリカーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、および一本鎖結合タンパク質を含む。いくつかの態様において、等温増幅反応は、phi29-DNAポリメラーゼ、クレノウDNAポリメラーゼ、Vent DNAポリメラーゼ、Deep Vent DNAポリメラーゼ、Bst DNAポリメラーゼ、9oNm（商標）DNAポリメラーゼ、U エキソクレノウ断片、またはそれらの変異体およびバリアンドなどの、鎖置換ポリメラーゼである酵素を使用する。いくつかの態様において、酵素に適した塩もまた、反応ミックスに添加する。ある特定の態様において、反応ミックスの開始pHは、増幅反応を触媒するために使用される具体的な酵素にとって最適なpHに基づいて設定される。ある態様において、DNA試料全体のpHは、pH 3〜pH 11である。
【００３０】
他の態様において、蛍光造塩発色剤を、増幅の間に放出されたプロトンを検出するために使用する。反応ミックスのpHが増幅反応の間に変化するにつれて、造塩発色剤は、光学特性（振幅および放射される波長）を変化させ得る。蛍光造塩発色剤は、フルオレセイン、ピラニン、およびpHrodo色素（Life Technologies, Carlsbad CA）を含む。
【００３１】
反応ミックスに添加される塩基および／または酸は、反応ミックスの開始pHを、造塩発色剤の移行pH範囲の上限あたりまたはそれより上に維持する。例えば、塩酸（HCl）もしくは硫酸（H2SO4）などの酸、または水酸化ナトリウム（NaOH）もしくは水酸化カリウム（KOH）などの塩基を、反応ミックスに添加することができる。いくつかの態様において、酸または塩基は、反応ミックスの開始pHを、pH 6〜10、pH 7〜8、またはpH 8〜8.6に調整する。ある態様において、反応ミックスは、0.1未満のpH単位で反応ミックスの開始pHを補うことができる。別の態様において、反応ミックスは、造塩発色剤の移行pH範囲の上限の2 pH単位上よりは低い開始pHを有する。さらなる態様において、反応ミックスは、造塩発色剤の移行pH範囲の上限の1 pH単位上、0.5 pH単位上、または0.1 pH単位上よりは低い開始pHを有する。さらなる態様において、いかなる色変化も特異的なかつ持続された増幅によってのみ達成されるように、反応ミックスの開始pHから十分に離れたpH移行範囲を設定することによって、非特異的増幅に由来するノイズは最小化される。
【００３２】
ある態様において、反応ミックスは、増幅反応のためにいかなる追加の緩衝剤も必要としない。なぜなら、緩衝剤は、増幅反応の間にpHの大きな変化が起こることを阻止し得るためである。別の態様において、反応ミックスは、反応混合物の緩衝能力が増幅の間の期待されるpHの変化未満であるように、最小量の緩衝剤を含有する。いくつかの態様において、緩衝液は、1 mM〜3 mMの濃度である。さらなる態様において、緩衝液は1 mMの濃度である。ある特定の態様において、使用される緩衝液は、トリス緩衝液（pH 8.8に配合）、HEPES（pH 7〜9）、またはTAPS（pH 7〜9）である。別の態様において、使用される緩衝液は、8.0の開始pHを有する溶液中1 mM〜19 mMの濃度でのトリス緩衝液と同等の緩衝能力を有する緩衝液である。この幅広い範囲の適した緩衝液濃度により、反応ミックスは、最小の（＜1mM）トリス緩衝液等価物での反応セットアップとは異なり、反応セットアップの間の望ましくない開始pH変化に耐えることが可能になる（2013年3月13日に出願された、米国特許出願第13/799,995号を参照されたい）。これらの望ましくないpHの変化は、試料試薬を介して反応物に添加されるヒドロニウムまたは水酸化物イオン等価物のために起こる。比色検出および酵素動態は開始pHに依存するため、開始pHの変化を回避するほど十分高いが、増幅時の色変化を可能にするほど十分低い、反応ミックスにおける緩衝能力の存在が重要になる。さらなる態様において、反応ミックスのpHは、pH 7.5〜8.8である。表1は、8.0の開始pHを有する溶液中1 mM〜19 mMの濃度でのトリス緩衝液と同等の緩衝能力を有する種々の緩衝液を示す。緩衝能力（β）は、1リットルの緩衝液のpHを1pH単位変化させるのに必要とされる酸または塩基の等価物として定義される。これは、β＝2.3*C*（Ka*[H3O＋]/(Ka＋[H3O＋])2）として算出することができ、式中、Cは緩衝液濃度であり、Kaは緩衝液についての解離定数であり、[H3O＋]は緩衝液のヒドロニウムイオン濃度（反応開始pHから算出される）である。（8.0の開始pHを有する溶液における）1 mM〜19 mMトリスの緩衝能力は、0.000575〜0.010873の範囲にわたることが見出された。緩衝液の開始pHは、反応生化学（ポリメラーゼ機能、核酸融解など）と適合性である7.5〜8.8の範囲内であるように考慮された。他の態様において、緩衝液は、8.0の開始pHを有する溶液中1.5 mM〜19 mM、2 mM〜19 mM、3 mM〜19 mM、4 mM〜19 mM、5 mM〜19 mM、6 mM〜19 mM、7 mM〜19 mMまたはその他の濃度でのトリス緩衝液と同等の緩衝能力を有する。他の態様において、緩衝液は、8.8の開始pHを有する溶液中1.92 mM〜36.29 mM、3 mM〜36.29 mM、4 mM〜36.29 mM、5 mM〜36.29 mMまたはその他の濃度でのトリス緩衝液と同等の緩衝能力を有する。他の態様において、緩衝液は、7.5の開始pHを有する溶液中1.48 mM〜27.92 mM、2 mM〜27.92 mM、3 mM〜27.92 mM、4 mM〜27.92 mM、5 mM〜27.92 mMまたはその他の濃度でのトリス緩衝液と同等の緩衝能力を有する。
【００３３】
（表１）緩衝能力の表
2020058377.tif 000003
【００３４】
ある態様において、マグネシウム化合物を反応ミックスに添加する。なぜなら、マグネシウムは、鋳型中へのヌクレオチドの取り込みを促進し、ポリメラーゼの活性に影響を及ぼすためである。さらなる態様において、反応ミックスにおけるマグネシウム化合物（硫酸マグネシウムなど）の濃度は、少なくとも0.5 mM、少なくとも1 mM、少なくとも2 mM、または少なくとも4 mMである。ある態様において、添加するマグネシウムイオンの濃度は、dNTPの濃度、核酸鋳型、およびプライマーに依存する。ある態様において、反応ミックスにおけるdNTP対硫酸マグネシウムの比は、1:2未満、1:3未満、1:4未満、または1:5未満である。
【００３５】
いくつかの態様において、一価陽イオンを反応ミックスに添加する。一価陽イオンは、中でも、カリウム、アンモニウム、および第四級アンモニウムを含む。一価陽イオンは、核酸鋳型の融解特性に影響を与え、酵素の効率を改善することができる。ある態様において、カリウムは、反応ミックスにおいて50 mM未満、または15 mM未満の濃度である。別の態様において、第四級アンモニウム塩は、反応ミックスにおいて2 mMより高い、5 mMより高い、または8 mMより高い濃度である。別の態様において、アンモニウム化合物（塩化アンモニウムなど）は、反応ミックスにおいて15 mM未満、または10 mM未満の濃度である。アンモニウム（NH4＋）はいくらかの緩衝能を有し、したがって、反応ミックスにおけるアンモニウム化合物の最終濃度は、最適な増幅収率を維持しながら最小化されるべきである。
【００３６】
ある態様において、反応ミックスの他の試薬の濃度は、増幅反応において一般的に使用されるような量に保たれる。その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Notomi T et. al. Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15; 28(12): E63；Nature Protocols 2008, Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products, 2008 3(5): pg 880を参照されたい。ある態様において、BstまたはBst 2.0酵素を使用し、酵素の量は、合わせた流体のマイクロリットルあたり少なくとも0.8単位である。この態様において、ベタインもまた、0〜1.5 Mまたは0.8 M〜1 Mの濃度で反応ミックス中に存在し、プライマーの総濃度は、3.6μM〜6.2μMである。いくつかの態様において、以下の試薬の任意のものが、反応ミックス中に存在する：20 mMのトリス緩衝液（pH 8.8）、10 mMのKCl、8 mMのMgSO4、10 mM の(NH4)2SO4、0.1％のTween 20、0.8 Mのベタイン、各々1.4 mMのdNTP、0.5 mMのMnCl2、1.6μMのFIP、0.2μMのF3、0.2μMのB3、5.2μM（2*(1.6+0.8+0.2)）の総濃度のプライマー、および10μLあたり8 UのBst/Bst 2.0。
【００３７】
上記の試薬濃度は、造塩発色pHセンサーを使用して増幅反応の間に放出されるプロトンを検出することができるように、良好な増幅収率および低い緩衝能力を提供することが見出されている。いくつかの態様において、反応ミックス試薬の濃度は、酵素の選択に依存する。さらなる態様において、適切な試薬濃度に関する手引きは、酵素の製造業者から入手可能である。ある態様において、反応ミックス体積に対する試料体積の比は、反応ミックスを添加すると試料が5％〜40％に希釈されるようなものである。
【００３８】
いくつかの態様において、増幅反応試薬は、反応ミックスに添加する前に別々に保存される。なぜなら、いくつかの試薬は、安定性のために必要とされる特定の条件を有するためである。例えば、酵素は、酵素の安定性を確実にするために他の試薬とは別々の適度な緩衝溶液中で長期に保存され得る。緩衝剤は、反応ミックスにおいて残りの試薬と混合すると、pH変化を著しく遮断しないように十分に希釈される。加えて、関心対象の特定の遺伝子用のプライマーは、別々の溶液において、または凍結乾燥形態で提供され得る。
【００３９】
いくつかの態様において、増幅反応をマイクロチューブ内で行う。他の態様において、増幅反応を流体またはマイクロ流体構造内で行う。いくつかの態様において、流体またはマイクロ流体構造は、試薬および核酸試料を別々に受け、次いで構成要素を一緒に混合するウェル、チャンバー、またはチャネルである。別の態様において、流体またはマイクロ流体構造は、あらかじめ混合された反応ミックスを受けるウェル、チャンバー、またはチャネルである。さらなる態様において、流体またはマイクロ流体構造は、比色観察のための長い光路、または蛍光／吸光励起源および検出器を有する。別の態様において、流体またはマイクロ流体構造は、凍結乾燥形態の試薬を受け、その後、核酸試料および水和溶液を受ける。ある態様において、チャンバーの流体またはマイクロ流体構造は、50μm〜400μmの範囲であるか、またはそれより長いチャネル深さを有する。さらなる態様において、比色観察は、50μm、50μm〜400μm、または50μm以上のチャネル深さ（光路長）について達成される。
【００４０】
いくつかの態様は、増幅産物の比色検出のためのキットを含む。キットは、1種または複数種の造塩発色剤、増幅反応を触媒するための1種または複数種の酵素、ならびに、試料が標的核酸鋳型分子を含有する場合に増幅反応が起こって増幅反応産物を産生する条件下で、緩衝液および酵素および造塩発色剤を含む反応ミックスと試料を接触させることについての説明書であって、該反応ミックスが開始pHを有して、標的核酸鋳型分子が存在する場合には、増幅反応が、反応ミックスの開始pHを変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こし、それにより標的核酸の存在が示され、および、標的核酸鋳型分子が存在しない場合には、増幅反応が、造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こすのに十分な、反応ミックスの開始pHを変化させるのに十分な数のプロトンを生成せず、それにより増幅反応産物が産生されていないことが示される、説明書を含み得る。別の態様において、説明書は、核酸鋳型分子を、反応ミックス中で造塩発色剤および酵素と、（1）増幅反応産物を産生するために核酸鋳型分子を増幅する増幅反応、および（2）反応ミックスの終了pHが、造塩発色剤の検出可能な比色変化を生じるほど十分に低く、それにより増幅反応産物が産生されていることが示されるような、十分な数のプロトンの生成、を結果としてもたらす条件下で接触させることについてのものである。さらなる態様において、キットはまた、酸または塩基、dNTP、プライマー、および一価陽イオンも含む。さらなる態様において、キットは、以下の試薬を以下の濃度で含む。
・マイクロリットルあたり少なくとも0.8単位のBstまたはBst 2.0ポリメラーゼ；
・0.8 Mのベタイン；
・合計で3.6μMのプライマー；
○1.6μMのFIPおよびBIPプライマー
○0.2μMのF3およびB3
・8 mMの硫酸マグネシウム；
・10 mMの硫酸アンモニウム；
・10 mMの塩化カリウム；
・反応ミックスの開始pHを調整するための水酸化ナトリウム；
・0.1％のTween20；
・各々1.4 mMのdNTP
・50μMのフェノールレッド
さらなる態様において、キットは、各々0.8μMのループFおよびループBプライマーを含む。
【００４１】
本発明の方法
増幅反応は、核酸鋳型からヌクレオチドを増幅する。いくつかの態様において、増幅反応は、鎖置換反応などの等温増幅反応である。さらなる態様において、鎖置換反応は、鎖置換が可能であるような反応条件下で、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって提供される。鎖置換反応の例は、鎖置換増幅（SDA）、多置換増幅（MDA）、ローリングサークル増幅（RCA）、またはループ介在等温増幅（LAMP）を含む。他の態様において、増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などの他の非等温増幅反応を含む。
【００４２】
ある特定の態様において、行われる増幅反応はLAMPである。LAMP反応においては、高い温度で動的平衡にある二本鎖または一本鎖のDNA鋳型を、2つまたは3つのペアのプライマーを用いて増幅する。プライマーは、LAMP Designer（Premier Biosoft, Palo Alto, CA）などのプライマー設計ソフトウェアを用いて、DNA鋳型に基づいて設計する。LAMP反応の最初の工程において、FIP（フォワードインナープライマー）のF2領域が、それぞれの相補的な（F2c）位置で一本鎖DNAにアニールする。次に、鎖置換活性を有するポリメラーゼが、F2の3'端から鋳型に沿ってdNTPを取り込む。ヌクレオチドの取り込みによってプロトンが放出され、反応ミックスのpHを低下させる。次いで、F3フォワードプライマーが、F2領域の上流でかつ鋳型上のF3c領域にアニールする。F3フォワードプライマーは、鋳型鎖を増幅し始め、これが、プロトンをさらに放出して、以前に合成されたFIPが取り込まれた鎖を置換する。この一本鎖は、F1配列（標的配列内）をその相補的なF1c配列（FIP内）に沿って含有する。これにより、F1cが5'端でF1にアニールするようなステムループが形成される。同時に、BIP（バックワードインナープライマー）が鎖のもう一方の末端にアニールし、ヌクレオチドがB2から伸長して、より多くのプロトンを放出する。次いで、バックワードプライマーB3が、B2領域の下流のB3c領域に結合し、BIPにより増幅された鎖を置換し、伸長を促進して二本鎖を作製する。この時点で、この置換された鎖は、B1配列（標的配列内）をその相補的なB1c配列（BIP内）に沿って含有し、3'端に別のステムループを形成する。この時点で、構造体は、各末端に2つのステムループ構造を有し、そこから連続的な置換および伸長が起こって鋳型が増幅される。LAMP反応は、ステムループ構造を有するより多くのアンプリコンを産生するためにさらなるフォワードおよびバックワードのループプライマーを添加することによって、増幅することができる。
【００４３】
LAMP手順は、固定された温度で起こることができ、いかなる高価な熱サイクリング装備の必要性も最小化する。典型的に、等温法は、選択される試薬によって決定される設定温度を必要とする。例えば、酵素は、LAMP法において60〜65℃で最も良好に機能する。
【００４４】
核酸増幅反応産物の比色検出は、増幅反応中にわたってリアルタイムで、または増幅反応の実施後に行うことができる。反応ミックスの比色変化の検出は、増幅反応産物の有無のデジタル表示と関連し得る。換言すると、反応ミックスの色変化の視覚的観察は、増幅反応産物が存在しているかまたは存在していないかに関する情報を提供することができる。ある特定の態様において、反応ミックスの比色変化の検出により、増幅反応の指数関数期またはプラトー期が得られていることが示される。
【００４５】
いくつかの態様において、増幅反応産物の検出は、造塩発色剤を含まない反応ミックスを用いた増幅反応と比べて加速されている。さらなる態様において、反応ミックスの比色変化は、増幅反応の開始時間から60分未満で検出される。反応ミックス中の造塩発色剤（弱酸または弱塩基）が、増幅反応の間に生成されたプロトンを吸収し、遊離プロトンの再結合が、増幅反応の検出を加速するように作用することから、増幅反応産物の加速された検出が得られる。造塩発色剤が色を変化させるのに十分なpH移行を生成するのに最小の増幅が必要とされるように、反応を設計することができる。蛍光インターカレート色素、分子ビーコン、ハイブリダイゼーションプローブ、色素ベースの検出、紫外-可視、または他の検出法を用いた従来の増幅技術は、増幅シグナルが検出可能となるのに、ある一定の閾値量の増幅が起こることを必要とする。しかし、本発明の方法は、造塩発色剤の色変化が検出可能となるのに相対的により少ない閾値量の増幅を必要とし、そのため、増幅反応産物の検出は、従来の増幅法と比べて加速されている。
【００４６】
いくつかの態様において、増幅反応産物は、反応ミックスの色変化の観察によって視覚的に検出される。さらなる態様において、ヒトの眼を視覚的検出のために使用する。別の態様において、カメラ、コンピュータ、またはいくつかの他の光学装置を、視覚的検出のため、または反応ミックスを画像化するために使用する。画像化プログラムは、Photoshop（Adobe, San Jose CA）、ImageJ（National Institutes of Health, Bethesda MD）、およびMATLAB（Math Works, Natick MA）を含む。別の態様において、増幅反応産物を、蛍光分光法を用いて、反応ミックスの蛍光を測定することにより検出する。別の態様において、増幅反応産物を、吸光分光法を用いて、反応ミックスの吸光度を測定することにより検出する。さらなる態様において、反応ミックスの吸光度または蛍光における終点での変化または全体的変化を、所定の波長または波長のセットにおいて測定する。
【実施例】
【００４７】
下記は、本発明を実施するための具体的態様の実施例である。実施例は、例証となる目的のためにのみ提供され、本発明の範囲を限定するようには決して意図されない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関しては精度を確実にする努力がなされているが、いくらかの実験誤差および偏差が、当然許容されるべきである。
【００４８】
本発明の実施は、別段の指示がない限り、当技術分野の技能内の、タンパク質化学、生化学、組み換えDNA技術、および薬理学の従来の方法を使用する。そのような技術は、文献において完全に説明されている。例えば、T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993)；A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition)；Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989)；Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)；Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)；Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B(1992)を参照されたい。
【００４９】
実施例1：核酸増幅反応産物の比色検出
核酸増幅反応産物の比色検出のためのアッセイにおいて、以下の試薬を一緒に混合して2×試薬ミックスを作製した。
・16 mMの硫酸マグネシウム（Sigma Aldrich）
・20 mMの硫酸アンモニウム（Sigma Aldrich）
・20 mMの塩化カリウム（Sigma Aldrich）
・試薬ミックスの開始pHを8.8のpHに調整する濃度の水酸化ナトリウム（Sigma Aldrich）
【００５０】
効率的な最初の重合化を可能にするために、試薬ミックスを、8.8の初期pHに調節した。試薬ミックスを、滅菌のために1時間オートクレーブした。次いで、以下の成分を試薬ミックスに添加して（滅菌形態において）、反応ミックスを生成した。
・0.1％（v/v）のTween20（Sigma Aldrich）
・各々1.4 mMのdNTP（NEB）
・50μMのフェノールレッド（Sigma Aldrich）
・マイクロリットルあたり0.8単位のBstポリメラーゼ（NEB）（酵素保存緩衝液は、反応ミックスに対して1 mMトリス緩衝液、5 mM KCl、0.01 mM EDTA、0.1 mM DTT、0.01％ Triton X-100（v/v）、および5％グリセロール（w/v）をもたらす）
・0.8 Mのベタイン（Sigma Aldrich）
【００５１】
プライマーおよび核酸鋳型を、反応ミックスに添加した。プライマーは、LAMP用に設計し、上述のように3.6μMの総濃度の2つのペアのプライマー（1×トリスEDTA緩衝液中に溶解）を含んだ。プライマーF3は配列：
2020058377.tif 000004
を有し；プライマーB3は配列：
2020058377.tif 000005
を有し；プライマーFIPは配列：
2020058377.tif 000006
を有し；およびプライマーBIPは配列：
2020058377.tif 000007
を有する。核酸鋳型分子を、マンソン住血吸虫から精製した。図1は、核酸鋳型分子のSM1-7標的領域を示す（Hamburger et al, Detection of Schistosoma mansoni and Schistosoma haematobium DNA by Loop-Mediated Isothermal Amplification: Identification of infected Snails from Early Prepatency, Am J Trop Med Hyg, 2010を参照されたい）。陽性試験反応物は鋳型DNAを含有し、陰性対照反応物は水を含有した。反応ミックスは、7.5〜8.5の範囲の開始pHを有した。反応ミックスを、マイクロチューブ中で63℃までサーマルサイクラー上で加熱して、鋳型増幅を可能にした。45分のあらかじめ決められた反応期間の間に十分な鋳型増幅が起こり、該反応期間後に、結果として生じた反応ミックスの色を視覚的に観察した。
【００５２】
増幅過程の間に、反応ミックスのpHは、反復可能な様式で7.5〜8.5から約6.6に低下した。図2は、反復された陽性（試験）および陰性（陰性対照）の増幅反応についてのpH測定値を示すグラフである。使用した造塩発色剤は、6.8〜8.2の移行pH範囲を有するフェノールレッドであった。フェノールレッドは、この移行pH範囲にわたって赤色から黄色に（pHが上限pHから下限pHに下がる際に）色を変化させる。アッセイにおいて、反応ミックスは、核酸増幅の間のpH変化に応答して、赤色（pH 8.0）から黄色（pH 6.6）に色を変化させた。図3は、反応終点での陽性および陰性の増幅反応の反応ミックスの画像のHSV（色相、彩度、明度）を用いた対比値における差を示すグラフである。色変化は、色相変数において定量的に示される。色変化が標的DNA増幅によるものであったことを確認するために、終点での反応物をゲル電気泳動を用いて解析し、アンプリコンの存在を検証した（図4）。
【００５３】
この方法を用いて、DNA鋳型の増幅を、反応終点でまたは反応中にわたってリアルタイムで、反応ミックスにおける色変化を視覚的に観察することにより、または反応ミックスの吸光度もしくは蛍光を測定することにより、容易に観察することができる。この機構は、他の比色検出技術と比較してはるかに大きな対比差を生じ、高価な光学計器装備の必要なく画像化することができる。
【００５４】
実施例2：視覚的造塩発色剤を用いたLAMP増幅の検出
LAMP反応を、以下を含む反応ミックスで行った：10 mM (NH4)2SO4、15 mM KCl、0.1 mM EDTA、0.1 mM DTT、0.01％ Triton X-100（v/v）、5％グリセロール、8 mM MgSO4、各々1.4 mMのdNTP、0.1％ v/v Tween-20、0.8 Mベタイン。異なる標的に特異的な3つのプライマーペアを、FIP/BIPについては各々1.6μM、F3/B3については各々0.2μM、ループB/Fについては各々0.4μMの最終濃度になるように添加した。最終反応物体積は10μLであり、63℃で様々なインキュベーション時間の間保持した。
【００５５】
図5において、反応ミックスの最終トリス緩衝液濃度を、0.34 mMから19 mMまで変動させた（様々な量のpH 8.8に配合したトリス緩衝液によって）。反応を、ラムダファージDNA用のプライマー、5 ngのラムダDNA（New England Biolabs）、0.8 U/μl Bst 2.0 DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）、および0.2 mMニュートラルレッド（Sigma Aldrich）で行った。次いで、反応チューブを画像化し、正規化された色相値を、反応ミックスの色について算出した。正規化された色相値は、陽性反応物と鋳型を含まない陰性反応物との間の色相値における差として定義した。視覚化閾値（点線）を上回る正規化された色相値における変化によって示される色変化が、19 mMトリスという高さの緩衝液濃度について観察された。これは、＞1 mMおよび＜19 mMトリスと同等の緩衝能力を有する反応ミックスが、視覚的色変化の検出に十分なpH変化を可能にすることを示す。
【００５６】
図6において、反応ミックスに添加される過剰のヒドロニウムイオンに対するこの視覚的検出法の許容度を評価した。この許容度は、ある範囲のヒドロニウムまたは水酸化物イオン等価物を反応物に添加し得る多種多様のDNA試料の使用を可能にするために重要である。反応を、2 mMの最終トリス緩衝液濃度、5 ngラムダDNA標的、0.8 U/μL Bst DNAポリメラーゼ、および0.2 mMニュートラルレッド造塩発色剤で行った。正規化された色相値における変化により、この視覚的検出ケミストリーが、10 uLの反応物あたり、4.8×10-9から4.8×10-18までの追加のヒドロニウムイオン等価物によって機能することが示される。
【００５７】
図7A〜図7Dにおいて、様々なpH指示薬および増幅標的とLAMP増幅の視覚的検出との適合性を評価した。反応を、1.2〜1.3 mMの範囲の最終トリス緩衝液濃度および0.8 U/μL Bst DNAポリメラーゼで行った。3種の異なる指示薬：50μMフェノールレッド、260μMクレゾールレッド、および160μMブロモチモールブルーを、5 ngラムダDNA標的とともに試験した（図7A）。正規化された色相値における高い対比変化が、試験したすべての指示薬について観察された。
【００５８】
濃度の掃引もまた、ラムダ標的とともに、これらの指示薬ブロモチモールブルー（図7B左上）、クレゾールレッド（図7B右上）、ニュートラルレッド（図7B左下）、およびフェノールレッド（図7B右下）について行い、上記ケミストリーと適合性である広範囲の濃度が示された。130 ngのマンソン住血吸虫gDNAを50μMフェノールレッドとともに（図7C）、およびヒトGAPDH mRNAを0.2 mMニュートラルレッドとともに（図7D）用いたLAMPアッセイもまた試験し、これらの標的の視覚的検出を終点で示した。
【００５９】
図8において、様々なポリメラーゼとLAMP増幅の視覚的検出との適合性を評価した。反応を、1.3 mMの最終トリス緩衝液濃度、5 ngラムダDNA標的、および0.2 mMニュートラルレッドで行った。0.8 U/μlの2種の異なるポリメラーゼ、Bst 2.0およびGspm 2.0（OptiGene）を使用した。高い色対比変化が、両方のポリメラーゼについて60分のインキュベーション後に観察された（図8）。
【００６０】
（表２）使用した配列
2020058377.tif 000008
【００６１】
実施例3：ミリメートルに満たない光路長におけるLAMP増幅の視覚的検出
LAMP反応を、実施例1のように、1.3 mMの最終トリス緩衝液濃度（pH 8.8に配合した緩衝液）、0.8 U/μlのBst 2.0 DNAポリメラーゼ、5 ngラムダDNA鋳型、および、0.2 mMニュートラルレッドまたは160μMブロモチモールブルーで行った。陽性反応物および鋳型を含まない陰性反応物の両方を、増幅後に、様々なチャネル深さを有するフローチャンバーに添加した（ニュートラルレッドについては図9A、およびブロモチモールブルーについては図9B）。これらのフローチャンバーは、50μm〜400μmの範囲にわたるチャネル深さを有し、アクリル樹脂に機械加工されていた。陽性反応物と陰性反応物との間の高い色対比差（視覚的検出閾値；点線を上回る）が、50μmおよびそれを上回るチャネル深さについて観察された。これにより、この視覚的検出ケミストリーが、ミリメートルに満たない光路長（深さ）およびそれを上回るものを有する反応チャンバーにおける使用に適用可能であることが示される。そのような反応チャンバーを、使用する試薬の量を低減させるため、および複数の反応がある一定の占有面積において（例えば、マイクロ流体カートリッジにおいて）起こるのを可能にするために使用することができる。
【００６２】
実施例4：視覚的造塩発色剤を用いた鎖置換増幅（SDA）の検出
SDA反応を、以下を含む反応ミックスを用いて行った：1.3 mMの最終トリス緩衝液濃度（pH 8.8に配合した緩衝液）、10 mM (NH4)2SO4、50 mM KCl（pH 8.5に調節）、8 mM MgSO4、各々4.4 mMのdATP、dGTP、dTTP、0.8 mM dCTP-αS（TriLink Biotechnologies）、0.1％ v/v Tween-20、0.8 Mベタイン、0.32 U/μl Bst DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）、0.2U/uL BSoBI（New England Biolabs）、および0.2 mMニュートラルレッド造塩発色剤。ヒトBRCA1用に設計したプライマー（SDAf: SEQ ID NO: 17; SDAr: SEQ ID NO: 18; BF: SEQ ID NO: 19; BR: SEQ ID NO: 20）を、各々0.5μMの最終濃度で反応物に添加した。5 ngのHeLa gDNAを25μLの最終反応物体積に添加して、65℃で様々なインキュベーション時間の間保持した。経時的な正規化された色相値における変化（図10）により、この視覚的検出ケミストリーがSDAで機能することが示される。
【００６３】
実施例5：視覚的造塩発色剤を用いたPCR増幅の検出
PCR反応を、以下を含む反応ミックスを用いて行った：50 mM KClおよび2 mM MgCl2（8.5に調節したpH）、各々0.5 mMのdNTP、5U Taq DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）、および0.2 mMニュートラルレッド造塩発色剤。酵素保存緩衝液およびプライマー（フォワード：SEQ ID NO: 21；リバース：SEQ ID NO: 22）からの持ち越し総トリス-HCl濃度は、最終反応ミックスにおいて1.15 mMであった。プライマーを、大腸菌（Escherichia coli）16s rRNA遺伝子用に設計し、各々0.5μMの最終濃度で反応物に添加した。10 ngの大腸菌gDNAを25μLの最終反応物体積に添加して、最初に95℃ホールドで2分間保持し、その後、95℃で10秒間、55℃で30秒間、68℃で30秒間の50サイクルを行った。経時的な正規化された色相値における変化（図11）により、この視覚的検出ケミストリーがPCRで機能することが示される。
【００６４】
実施例6：造塩発色剤の組み合わせによる視覚的検出対比差の増大
LAMP反応を、実施例1のように、1.3 mMの最終トリス緩衝液濃度（pH 8.8に配合した緩衝液）、0.8 U/μlのBst 2.0 DNAポリメラーゼ、および5 ngラムダDNA鋳型で行った。色対比変化を、50μM濃度のフェノールレッド、ならびに、それぞれ50μMおよび160μM濃度のフェノールレッドおよびブロモチモールブルーの組み合わせについて評価した（図12A）。色対比変化をまた、260μM濃度のクレゾールレッド、ならびに、それぞれ260μMおよび160μM濃度のクレゾールレッドおよびブロモチモールブルーの組み合わせについても評価した（図12B）。対比値を、式：0.299R＋0.587G＋0.114Bを用いて、反応ミックスの画像のRGB値から算出した。正規化された対比変化を、バックラウンドに対して正規化した、陽性反応物対比値と陰性反応物対比値との間の差として定義した。造塩発色剤の組み合わせの使用による正規化された対比変化における増大により、そのような組み合わせの有用性が示される。
【００６５】
実施例7：視覚的造塩発色剤を用いた定量のための増幅のリアルタイム色モニタリング
LAMP反応を、実施例1のように、1.3 mMの最終トリス緩衝液濃度（pH 8.8に配合した緩衝液）、0.8 U/μlのBst 2.0 DNAポリメラーゼ、それぞれ50μMおよび160μM濃度のフェノールレッドおよびブロモチモールブルー、ならびに様々なラムダDNA鋳型濃度で行った。色対比変化を、0.5 fg/μl、0.05 pg/μl、および0.5 pg/μlの最終濃度のラムダDNA標的について評価した。対比値を、実施例5に記載したように、反応ミックスの画像のRGB値から算出した。結果（図13）によって、より高いDNA濃度は、より低いDNA濃度よりも早く、視覚的対比における検出可能な変化をもたらすことが示される。したがって、本発明者らは、このケミストリーのリアルタイム色モニタリングにより様々な標的濃度を識別できることを示す。
【００６６】
本発明を、好ましい態様および種々の代替態様に関して特に示し、説明してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、形態および詳細における種々の変更がその中でなされ得ることが、当業者により理解されるであろう。
【００６７】
本明細書の本文内で引用されたすべての参照文献、公布された特許、および特許出願は、すべての目的で、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【図１】
2020058377.tif 000009
【図２】
2020058377.tif 000010
【図３】
2020058377.tif 000011
【図４】
2020058377.tif 000012
【図５】
2020058377.tif 000013
【図６】
2020058377.tif 000014
【図７Ａ】
2020058377.tif 000015
【図７Ｂ】
2020058377.tif 000016
【図７Ｃ】
2020058377.tif 000017
【図７Ｄ】
2020058377.tif 000018
【図８】
2020058377.tif 000019
【図９】
2020058377.tif 000020
【図１０】
2020058377.tif 000021
【図１１】
2020058377.tif 000022
【図１２】
2020058377.tif 000023
【図１３】
2020058377.tif 000024
【配列表】
2020058377000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月6日(2020.1.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料における増幅反応産物の比色検出のための組成物であって、該組成物が、
１または複数の緩衝剤を含む緩衝液であって、該緩衝液が、8.0のpHを有する溶液中1.5 mM〜19 mMの濃度でのトリス緩衝液と同等の正味の緩衝能力を有する、緩衝液と、
増幅反応を触媒するための酵素と、
反応ミックスの開始pHと反応ミックスの期待される終了pHとの間の移行pH範囲を有する比色剤であって、該反応ミックスの期待される終了pHが、前記増幅反応によって影響を受ける、比色剤と、
を含む反応ミックスを含む、組成物。
【請求項２】
前記増幅反応によって引き起こされる比色剤の比色変化が、50μmのセル光路長で定量可能である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記反応ミックスが、少なくとも２種の比色剤を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記増幅反応産物の検出が、比色剤を含まない反応ミックスを用いた増幅反応と比べて加速されており、かつ、該比色剤を含まない反応ミックスを用いた増幅反応が、蛍光インターカレート色素、分子ビーコン、ハイブリダイゼーションプローブ、紫外-可視、アガロースゲル、またはラテラルフローアッセイによる増幅反応産物の検出を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記増幅反応が、鎖置換増幅、多置換増幅、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、ローリングサークル増幅、またはループ介在等温増幅のような等温反応である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記比色剤または少なくとも２種の比色剤が、50μM〜260μMの濃度である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記試料の核酸鋳型分子を含む溶液が、0.1未満のpH単位で反応ミックスの開始pHを補うことができ、かつ、該溶液が、10μlの反応ミックスあたり、4.8×10-9〜4.8×10-18のヒドロニウムイオン等価物を反応ミックスに与える、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
酸または塩基をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
dNTP、プライマー、および一価陽イオンのうちの少なくとも1つをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
酵素が、逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、RNアーゼ、ヘリカーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、TAQポリメラーゼ、または一本鎖結合タンパク質である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記比色剤または少なくとも２種の比色剤が、フェノールレッド、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、ニュートラルレッド、ナフトールフタレイン、クレゾールレッド、クレゾールフタレイン、およびフェノールフタレインのうちの１つまたは複数を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記比色剤または少なくとも２種の比色剤の移行pHが、pH5〜10である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
キットは、増幅反応を触媒するための酵素、造塩発色剤、および任意で、8.0の開始pHを有する溶液中1 mM〜19 mMの濃度でのトリス緩衝液と同等の緩衝能力を有する緩衝液を含む。キットは、試料が標的核酸鋳型分子を含有する場合に増幅反応が起こって増幅反応産物を産生する条件下で、緩衝液および酵素および造塩発色剤を含む反応ミックスと試料を接触させることについての説明を含む、使用説明書であって、反応ミックスが開始pHを有する、使用説明書をさらに含む。標的核酸鋳型分子が存在する場合には、増幅反応は、反応ミックスの開始pHを変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こし、それにより標的核酸の存在が示される。標的核酸鋳型分子が存在しない場合には、増幅反応は、反応ミックスの開始pHを十分に変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こすのに適切な数のプロトンを生成せず、それにより増幅反応産物が産生されていないことが示される。
[本発明1001]
試料における増幅反応産物の比色検出のための方法であって、該方法が、試料が標的核酸鋳型分子を含有する場合に増幅反応が起こって増幅反応産物を産生するような条件下で、試料を反応ミックスと接触させる工程を含み、
該反応ミックスが、開始pHを有し、かつ
8.0の開始pHを有する溶液中1 mM〜19 mMの濃度でのトリス緩衝液と同等の緩衝能力を有する緩衝液；
増幅反応を触媒するための酵素；および
造塩発色剤
を含み、
標的核酸鋳型分子が存在する場合には、増幅反応が、反応ミックスの開始pHを変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こし、それにより標的核酸の存在が示され、および、標的核酸鋳型分子が存在しない場合には、増幅反応が、反応ミックスの開始pHを十分に変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こすのに適切な数のプロトンを生成せず、それにより増幅反応産物が産生されていないことが示される、方法。
[本発明1002]
増幅反応産物の検出が、造塩発色剤を含まない反応ミックスを用いた増幅反応と比べて加速されている、本発明1001の方法。
[本発明1003]
造塩発色剤を含まない反応ミックスを用いた増幅反応が、蛍光インターカレート色素、分子ビーコン、ハイブリダイゼーションプローブ、色素ベースの検出、紫外-可視、アガロースゲル、またはラテラルフローアッセイによる増幅反応産物の検出を含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
反応ミックスの比色変化が、増幅反応の実行中にわたって検出される、本発明1001の方法。
[本発明1005]
反応ミックスの比色変化が、増幅反応の実行後に検出される、本発明1001の方法。
[本発明1006]
反応ミックスの比色変化の検出が、増幅反応産物の存在のデジタル表示と関連している、本発明1001の方法。
[本発明1007]
反応ミックスの比色変化が、反応ミックスの蛍光または吸光度を測定することによって検出される、本発明1001の方法。
[本発明1008]
反応ミックスの比色変化が、反応ミックスの視覚的検出によって検出される、本発明1001の方法。
[本発明1009]
反応ミックスの比色変化の検出により、増幅反応の指数関数期またはプラトー期が得られていることが示される、本発明1001の方法。
[本発明1010]
反応ミックスの比色変化が、増幅反応の実行前の開始時間から60分未満で検出される、本発明1001の方法。
[本発明1011]
増幅反応が熱サイクル反応である、本発明1001の方法。
[本発明1012]
増幅反応が等温反応である、本発明1001の方法。
[本発明1013]
等温反応が、鎖置換増幅、多置換増幅、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、ローリングサークル増幅、またはループ介在等温増幅である、本発明1012の方法。
[本発明1014]
造塩発色剤が比色剤または蛍光剤である、本発明1001の方法。
[本発明1015]
造塩発色剤が、フェノールレッド、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、ニュートラルレッド、ナフトールフタレイン、クレゾールレッド、クレゾールフタレイン、またはフェノールフタレインである、本発明1001の方法。
[本発明1016]
造塩発色剤が、50μM〜260μMの濃度である、本発明1001の方法。
[本発明1017]
酵素がDNAポリメラーゼである、本発明1001の方法。
[本発明1018]
DNAポリメラーゼがBstまたはTaqである、本発明1017の方法。
[本発明1019]
酵素が、逆転写酵素、RNAポリメラーゼ、RNアーゼ、ヘリカーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、TAQポリメラーゼ、または一本鎖結合タンパク質である、本発明1001の方法。
[本発明1020]
酵素がBstまたはBst 2.0ポリメラーゼであり、造塩発色剤がフェノールレッドである、本発明1001の方法。
[本発明1021]
反応ミックスが塩基をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1022]
塩基が水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムである、本発明1021の方法。
[本発明1023]
反応ミックスが酸をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1024]
酸が塩酸または硫酸である、本発明1023の方法。
[本発明1025]
反応ミックスが、dNTP、プライマー、および一価陽イオンのうちの少なくとも1つをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1026]
一価陽イオンが、アンモニウム、第四級アンモニウム、またはカリウムである、本発明1025の方法。
[本発明1027]
試料と反応ミックスとの接触が、増幅反応の開始に先立って0.1未満のpH単位で反応ミックスの開始pHを補う、本発明1001の方法。
[本発明1028]
反応ミックスの開始pHが、pH 6〜pH 10である、本発明1001の方法。
[本発明1029]
反応ミックスの開始pHが、pH 7.5〜pH 8.8である、本発明1028の方法。
[本発明1030]
反応ミックスの開始pHが、pH 8〜pH 8.8である、本発明1028の方法。
[本発明1031]
検出可能な比色変化が、50μmのセル光路長で定量可能である、本発明1001の方法。
[本発明1032]
第2の造塩発色剤をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1033]
造塩発色剤がフェノールレッドであり、第2の造塩発色剤がブロモチモールブルーである、本発明1032の方法。
[本発明1034]
造塩発色剤がクレゾールレッドであり、第2の造塩発色剤がブロモチモールブルーである、本発明1032の方法。
[本発明1035]
増幅反応産物がDNAまたはRNAである、本発明1001の方法。
[本発明1036]
核酸鋳型分子がDNAまたはRNAである、本発明1001の方法。
[本発明1037]
試料が、10μlの反応ミックスあたり、4.8×10-9〜4.8×10-18のヒドロニウムイオン等価物を反応ミックスに与える、本発明1001の方法。
[本発明1038]
試料が、試料を反応ミックスと接触させると5〜40％に希釈される、本発明1001の方法。
[本発明1039]
試料が、pH 3〜pH 11のpHである、本発明1001の方法。
[本発明1040]
検出可能な比色変化が、反応ミックスの画像化に基づいて検出される、本発明1001の方法。
[本発明1041]
画像化が、反応ミックスの画像の対比における変化の決定を含む、本発明1040の方法。
[本発明1042]
画像化が、反応ミックスの画像のHSV値またはRGB値における変化の決定を含む、本発明1040の方法。
[本発明1043]
増幅反応産物の比色検出のためのキットであって、
8.0の開始pHを有する溶液中1 mM〜19 mMの濃度でのトリス緩衝液と同等の緩衝能力を有する緩衝液；
増幅反応を触媒するための酵素；
造塩発色剤；ならびに
試料が標的核酸鋳型分子、反応ミックスを含有する場合に増幅反応が起こって増幅反応産物を産生する条件下で、該緩衝液および該酵素および該造塩発色剤を含む反応ミックスと試料を接触させることについての説明を含む、使用説明書であって、標的核酸鋳型分子が存在する場合には、増幅反応が、反応ミックスの開始pHを変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こし、それにより標的核酸の存在が示され、および、標的核酸鋳型分子が存在しない場合には、増幅反応が、反応ミックスの開始pHを十分に変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こすのに適切な数のプロトンを生成せず、それにより増幅反応産物が産生されていないことが示される、使用説明書
を含む、キット。
[本発明1044]
酸または塩基をさらに含む、本発明1043のキット。
[本発明1045]
塩基が水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムである、本発明1044のキット。
[本発明1046]
酸が塩酸または硫酸である、本発明1044のキット。
[本発明1047]
dNTP、プライマー、および一価陽イオンのうちの少なくとも1つをさらに含む、本発明1043のキット。
[本発明1048]
一価陽イオンが、アンモニウム、第四級アンモニウム、またはカリウムである、本発明1047のキット。
[本発明1049]
造塩発色剤が、フェノールレッド、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、ニュートラルレッド、ナフトールフタレイン、クレゾールレッド、クレゾールフタレイン、またはフェノールフタレインである、本発明1043のキット。
[本発明1050]
造塩発色剤が、50μM〜260μMの濃度である、本発明1043のキット。
[本発明1051]
酵素が、逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、RNアーゼ、ヘリカーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、TAQポリメラーゼ、または一本鎖結合タンパク質である、本発明1043のキット。
[本発明1052]
酵素がBstまたはBst 2.0ポリメラーゼであり、造塩発色剤がフェノールレッドである、本発明1043のキット。
[本発明1053]
試料における増幅反応産物の比色検出のための方法であって、該方法が、試料が標的核酸鋳型分子を含有する場合に増幅反応が起こって増幅反応産物を産生するような条件下で、試料を反応ミックスと接触させる工程を含み、
該反応ミックスが、開始pHを有し、かつ
増幅反応を触媒するための酵素；および
造塩発色剤
を含み、
標的核酸鋳型分子が存在する場合には、増幅反応が、反応ミックスの開始pHを変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こし、それにより標的核酸の存在が示され、検出可能な比色変化を50μmのセル光路長で定量することができ、および、標的核酸鋳型分子が存在しない場合には、増幅反応が、反応ミックスの開始pHを十分に変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こすのに適切な数のプロトンを生成せず、それにより増幅反応産物が産生されていないことが示される、方法。
[本発明1054]
増幅反応産物の検出が、造塩発色剤を含まない反応ミックスを用いた増幅反応と比べて加速されている、本発明1053の方法。
[本発明1055]
造塩発色剤を含まない反応ミックスを用いた増幅反応が、蛍光インターカレート色素、分子ビーコン、ハイブリダイゼーションプローブ、色素ベースの検出、紫外-可視、アガロースゲル、またはラテラルフローアッセイによる増幅反応産物の検出を含む、本発明1054の方法。
[本発明1056]
反応ミックスの比色変化が、増幅反応の実行中にわたって検出される、本発明1053の方法。
[本発明1057]
反応ミックスの比色変化が、増幅反応の実行後に検出される、本発明1053の方法。
[本発明1058]
反応ミックスの比色変化の検出が、増幅反応産物の存在のデジタル表示と関連している、本発明1053の方法。
[本発明1059]
反応ミックスの比色変化が、反応ミックスの蛍光または吸光度を測定することによって検出される、本発明1053の方法。
[本発明1060]
反応ミックスの比色変化が、反応ミックスの視覚的検出によって検出される、本発明1053の方法。
[本発明1061]
反応ミックスの比色変化の検出により、増幅反応の指数関数期またはプラトー期が得られていることが示される、本発明1053の方法。
[本発明1062]
反応ミックスの比色変化が、増幅反応の実行前の開始時間から60分未満で検出される、本発明1053の方法。
[本発明1063]
増幅反応が熱サイクル反応である、本発明1053の方法。
[本発明1064]
増幅反応が等温反応である、本発明1053の方法。
[本発明1065]
等温反応が、鎖置換増幅、多置換増幅、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、ローリングサークル増幅、またはループ介在等温増幅である、本発明1064の方法。
[本発明1066]
造塩発色剤が比色剤または蛍光剤である、本発明1053の方法。
[本発明1067]
造塩発色剤が、フェノールレッド、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、ニュートラルレッド、ナフトールフタレイン、クレゾールレッド、クレゾールフタレイン、またはフェノールフタレインである、本発明1053の方法。
[本発明1068]
造塩発色剤が、50μM〜260μMの濃度である、本発明1053の方法。
[本発明1069]
酵素がDNAポリメラーゼである、本発明1053の方法。
[本発明1070]
DNAポリメラーゼがBstまたはTaqである、本発明1069の方法。
[本発明1071]
酵素が、逆転写酵素、RNAポリメラーゼ、RNアーゼ、ヘリカーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、TAQポリメラーゼ、または一本鎖結合タンパク質である、本発明1053の方法。
[本発明1072]
酵素がBstまたはBst 2.0ポリメラーゼであり、造塩発色剤がフェノールレッドである、本発明1053の方法。
[本発明1073]
反応ミックスが塩基をさらに含む、本発明1053の方法。
[本発明1074]
塩基が水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムである、本発明1073の方法。
[本発明1075]
反応ミックスが酸をさらに含む、本発明1053の方法。
[本発明1076]
酸が塩酸または硫酸である、本発明1075の方法。
[本発明1077]
dNTP、プライマー、および一価陽イオンのうちの少なくとも1つをさらに含む、本発明1053の方法。
[本発明1078]
一価陽イオンが、アンモニウム、第四級アンモニウム、またはカリウムである、本発明1077の方法。
[本発明1079]
試料と反応ミックスとの接触が、増幅反応の開始に先立って0.1未満のpH単位で反応ミックスの開始pHを補う、本発明1053の方法。
[本発明1080]
反応ミックスの開始pHが、pH 6〜pH 10である、本発明1053の方法。
[本発明1081]
反応ミックスの開始pHが、pH 7.5〜pH 8.8である、本発明1080の方法。
[本発明1082]
反応ミックスの開始pHが、pH 8〜pH 8.8である、本発明1080の方法。
[本発明1083]
第2の造塩発色剤をさらに含む、本発明1053の方法。
[本発明1084]
造塩発色剤がフェノールレッドであり、第2の造塩発色剤がブロモチモールブルーである、本発明1083の方法。
[本発明1085]
造塩発色剤がクレゾールレッドであり、第2の造塩発色剤がブロモチモールブルーである、本発明1083の方法。
[本発明1086]
増幅反応産物がDNAまたはRNAである、本発明1053の方法。
[本発明1087]
核酸鋳型分子がDNAまたはRNAである、本発明1053の方法。
[本発明1088]
試料が、10μlの反応ミックスあたり、4.8×10-9〜4.8×10-18のヒドロニウムイオン等価物を反応ミックスに与える、本発明1053の方法。
[本発明1089]
試料が、試料を反応ミックスと接触させると5〜40％に希釈される、本発明1053の方法。
[本発明1090]
試料が、pH 3〜pH 11のpHである、本発明1053の方法。
[本発明1091]
反応ミックスが、8.0の開始pHを有する溶液中1 mM〜19 mMの濃度でのトリス緩衝液と同等の緩衝能力を有する緩衝液をさらに含む、本発明1053の方法。
[本発明1092]
検出可能な比色変化が、反応ミックスの画像化に基づいて検出される、本発明1053の方法。
[本発明1093]
画像化が、反応ミックスの画像の対比における変化の決定を含む、本発明1092の方法。
[本発明1094]
画像化が、反応ミックスの画像のHSV値またはRGB値における変化の決定を含む、本発明1092の方法。
[本発明1095]
試料における増幅反応産物の比色検出のための方法であって、該方法が、試料が標的核酸鋳型分子を含有する場合に増幅反応が起こって増幅反応産物を産生するような条件下で、試料を反応ミックスと接触させる工程を含み、
該反応ミックスが、開始pHを有し、かつ
増幅反応を触媒するための酵素；および
少なくとも2種の造塩発色剤
を含み、
標的核酸鋳型分子が存在する場合には、増幅反応が、反応ミックスの開始pHを変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こし、それにより標的核酸の存在が示され、および、標的核酸鋳型分子が存在しない場合には、増幅反応が、反応ミックスの開始pHを十分に変化させて造塩発色剤の検出可能な比色変化を引き起こすのに適切な数のプロトンを生成せず、それにより増幅反応産物が産生されていないことが示される、方法。
[本発明1096]
増幅反応産物の検出が、造塩発色剤を含まない反応ミックスを用いた増幅反応と比べて加速されている、本発明1095の方法。
[本発明1097]
造塩発色剤を含まない反応ミックスを用いた増幅反応が、蛍光インターカレート色素、分子ビーコン、ハイブリダイゼーションプローブ、色素ベースの検出、または紫外-可視による増幅反応産物の検出を含む、本発明1096の方法。
[本発明1098]
反応ミックスの比色変化が、増幅反応の実行中にわたって検出される、本発明1095の方法。
[本発明1099]
反応ミックスの比色変化が、増幅反応の実行後に検出される、本発明1095の方法。
[本発明1100]
反応ミックスの比色変化の検出が、増幅反応産物の存在のデジタル表示と関連している、本発明1095の方法。
[本発明1101]
反応ミックスの比色変化が、反応ミックスの蛍光または吸光度を測定することによって検出される、本発明1095の方法。
[本発明1102]
反応ミックスの比色変化が、反応ミックスの視覚的検出によって検出される、本発明1095の方法。
[本発明1103]
反応ミックスの比色変化の検出により、増幅反応の指数関数期またはプラトー期が得られていることが示される、本発明1095の方法。
[本発明1104]
反応ミックスの比色変化が、増幅反応の実行前の開始時間から60分未満で検出される、本発明1095の方法。
[本発明1105]
増幅反応が熱サイクル反応である、本発明1095の方法。
[本発明1106]
増幅反応が等温反応である、本発明1095の方法。
[本発明1107]
等温反応が、鎖置換増幅、多置換増幅、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、ローリングサークル増幅、またはループ介在等温増幅である、本発明1106の方法。
[本発明1108]
造塩発色剤のうちの少なくとも1種が、比色剤または蛍光剤である、本発明1095の方法。
[本発明1109]
造塩発色剤のうちの少なくとも1種が、フェノールレッド、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、ニュートラルレッド、ナフトールフタレイン、クレゾールレッド、クレゾールフタレイン、またはフェノールフタレインである、本発明1095の方法。
[本発明1110]
造塩発色剤のうちの少なくとも1種が、50μM〜260μMの濃度である、本発明1095の方法。
[本発明1111]
酵素がDNAポリメラーゼである、本発明1095の方法。
[本発明1112]
DNAポリメラーゼがBstまたはTaqである、本発明1111の方法。
[本発明1113]
酵素が、逆転写酵素、RNAポリメラーゼ、RNアーゼ、ヘリカーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、TAQポリメラーゼ、または一本鎖結合タンパク質である、本発明1111の方法。
[本発明1114]
酵素がBstまたはBst 2.0ポリメラーゼであり、造塩発色剤がフェノールレッドである、本発明1095の方法。
[本発明1115]
反応ミックスが塩基をさらに含む、本発明1095の方法。
[本発明1116]
塩基が水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムである、本発明1115の方法。
[本発明1117]
反応ミックスが酸をさらに含む、本発明1095の方法。
[本発明1118]
酸が塩酸または硫酸である、本発明1117の方法。
[本発明1119]
dNTP、プライマー、および一価陽イオンのうちの少なくとも1つをさらに含む、本発明1095の方法。
[本発明1120]
一価陽イオンが、アンモニウム、第四級アンモニウム、またはカリウムである、本発明1119の方法。
[本発明1121]
試料と反応ミックスとの接触が、増幅反応の開始に先立って0.1未満のpH単位で反応ミックスの開始pHを補う、本発明1095の方法。
[本発明1122]
反応ミックスの開始pHが、pH 6〜pH 10である、本発明1095の方法。
[本発明1123]
反応ミックスの開始pHが、pH 7.5〜pH 8.8である、本発明1122の方法。
[本発明1124]
反応ミックスの開始pHが、pH 8〜pH 8.8である、本発明1122の方法。
[本発明1125]
検出可能な比色変化が、50μmのセル光路長で定量可能である、本発明1095の方法。
[本発明1126]
1種の造塩発色剤がフェノールレッドであり、もう1種の造塩発色剤がブロモチモールブルーである、本発明1095の方法。
[本発明1127]
1種の造塩発色剤がクレゾールレッドであり、もう1種の造塩発色剤がブロモチモールブルーである、本発明1095の方法。
[本発明1128]
増幅反応産物がDNAまたはRNAである、本発明1095の方法。
[本発明1129]
核酸鋳型分子がDNAまたはRNAである、本発明1095の方法。
[本発明1130]
試料が、10μlの反応ミックスあたり、4.8×10-9〜4.8×10-18のヒドロニウムイオン等価物を反応ミックスに与える、本発明1095の方法。
[本発明1131]
試料が、試料を反応ミックスと接触させると5〜40％に希釈される、本発明1095の方法。
[本発明1132]
試料が、pH 3〜pH 11のpHである、本発明1095の方法。
[本発明1133]
反応ミックスが、8.0の開始pHを有する溶液中1 mM〜19 mMの濃度でのトリス緩衝液と同等の緩衝能力を有する緩衝液をさらに含む、本発明1095の方法。
[本発明1134]
検出可能な比色変化が、反応ミックスの画像化に基づいて検出される、本発明1095の方法。
[本発明1135]
画像化が、反応ミックスの画像の対比における変化の決定を含む、本発明1134の方法。
[本発明1136]
画像化が、反応ミックスの画像のHSV値またはRGB値における変化の決定を含む、本発明1134の方法。