(57)【要約】【課題】本発明は、剤による重篤な副作用や放射線被爆がなく、腫瘍細胞を兵糧攻めにするという極めてシンプルで侵襲性の低い療法を改善して、根治を可能とする療法に使用される腫瘍封止剤を提供することを目的とする。【解決手段】本発明によれば、ニードルアクセス可能な腫瘍に直接注入可能であり、腫瘍部位の血管を透過し、腫瘍組織に選択的に集積及び／又は接着し、生体内の水分により膨潤し、一定時間定着して、腫瘍及び腫瘍周囲の細胞や血管を圧迫し、腫瘍全体を覆うことにより、血管を含む周辺組織から腫瘍組織を遮断及び／又は隔離する微粒子状の腫瘍封止剤、あるいは腫瘍部位の血管と腫瘍組織間を遮断する微粒子状の腫瘍封止剤に関する。【選択図】図２
2020058784.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高吸水性高分子化合物を基材とする微粒子を含む腫瘍封止剤。
【請求項２】
高吸水性高分子化合物が、下記：
ＰＳ１−Ｘ−ＰＳ２    （１）
（式中、ＰＳ１及びＰＳ２は多糖類であり、Ｘはスペーサーである）
で表される構造を有する、請求項１に記載の腫瘍封止剤。
【請求項３】
ＰＳ１及びＰＳ２は同一であるか又は異なっていてもよく、独立して、βグルカン、キチン、キトサン、及びそれらの誘導体、並びにこれらの混合物からなる群から選択される、請求項２に記載の腫瘍封止剤。
【請求項４】
βグルカン又はその誘導体が、セルロース又はカルボキシメチルセルロースである、請求項３に記載の腫瘍封止剤。
【請求項５】
Ｘが、１種以上のポリカルボン酸無水物である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の腫瘍封止剤。
【請求項６】
Ｘが、１，２，３，４−ブタンテトラカルボン酸二無水物（ＢＴＣＡ）、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＰＥＧＤＥ）、ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ＢＰＤＡ）、ジフェニルスルホンテトラカルボン酸二無水物（ＤＳＤＡ）、ＰＥＧ（ポリエチングリコール）４００、ＰＥＧ２０００、及びエピクロロヒドリンからなる群から１種以上選択される架橋剤に由来する、請求項２〜４のいずれか１項に記載の腫瘍封止剤。
【請求項７】
高吸水性高分子化合物が、下記：
【化１】
2020058784.tif 000005
（式中、ｍ〜ｒは、１００〜２００である）
からなる群から１種以上選択される、請求項１に記載の腫瘍封止剤。
【請求項８】
微粒子が２０ｎｍ〜５００ｎｍの粒子径を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の腫瘍封止剤。
【請求項９】
微粒子がエマルションの形態で存在する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の腫瘍封止剤。
【請求項１０】
微粒子が造影剤及び／又は色素を包含する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の腫瘍封止剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍部位の血管を透過し、腫瘍組織に選択的に集積及び／又は接着し、生体内の水分により膨潤し、一定時間定着して、腫瘍及び腫瘍周囲の細胞や血管を包囲し、腫瘍全体あるいは一部を覆うことにより、血管を含む周辺組織から腫瘍組織を遮断及び／又は隔離する微粒子状のデバイス、あるいは腫瘍部位の血管と腫瘍組織間を遮断する微粒子状のデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓がんの低侵襲治療の一つとして、肝動脈塞栓術（ＴＡＥ：ｔｒａｎｓ−ｃａｔｈｅｔｅｒ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｅｍｂｏｌｉｚａｔｉｏｎ）がある。肝臓の障害度が高く、手術ができないほど進行している場合など緩和医療や終末期医療に採用されている。これは、栄養動脈を塞栓し、血液が運ぶ栄養や酸素の供給を絶ち、がんを兵糧攻めにして死滅させる治療法である。肝細胞は、肝動脈と門脈血管から栄養等を受けているが、がん化した肝細胞は肝動脈からしか栄養供給を受けない。一方、正常な肝細胞では門脈からの血流が７０％を占めているため、肝動脈を塞栓しても正常細胞が死滅することはないと言われている。
【０００３】
また、肝動脈塞栓術に抗がん剤を併用する肝動脈塞栓化学療法（ＴＡＣＥ：ｔｒａｎｓ−ｃａｔｈｅｔｅｒ  ｃｈｅｍｏ−ｅｍｂｏｌｉｚａｔｉｏｎ）では、造影剤と抗がん剤の混濁液を注入後に塞栓材で栄養動脈を塞栓する。このとき、混濁液が門脈に流れ出ることがあり、肝動脈と門脈を塞栓して肝梗塞を起こす危険性がある。更に造影剤、抗がん剤及び塞栓材が胆嚢や膵臓に流れれば胆嚢炎や膵炎になる可能性もある。
【０００４】
このような危険性に鑑み、前述のような混濁液ではなく、高分子ポリマーを基材とする数十μｍ〜数百μｍ程度の粒子径の球状ビーズ（マイクロスフィア）に抗がん剤を吸着させ、閉塞した血管内で徐放する機能を備えることによって、薬剤等が血管内に一機に流出することを抑制する塞栓材も出現してきた。
【０００５】
塞栓材には、前述のように高分子ポリマーを原材料として体内に永久留置する永久塞栓材と、デンプンやゼラチンのような生体分解性物質を原材料として分解代謝される一時塞栓材がある。しかし、多くの一時塞栓材は塞栓効果が充分ではなく、またゼラチンなど動物由来物質は国内の学会で禁忌とされている。
【０００６】
一方、塞栓効果の比較的大きな永久塞栓材では永久留置のリスクを覚悟しなければならない。肝硬変のような元々肝臓の機能が損なわれている場合には、肝エネルギーレベルの低下に伴って代謝障害が発生し、肝不全を起こしやすくなる。できるだけ肝機能のダメージを抑えるためには、肝動脈と門脈の血流の再疎通が必要になる。
【０００７】
そこで、特許文献１は、カテーテルや目的外の血管内において凝集詰まりを起こすことなく、血管内の目的部位にて完全に塞栓し、特定時間後に血流閉塞状態が解除され、生体内で分解され、代謝又は体外に排出する生分解性物質からなる塞栓材を提案している。
【０００８】
動脈塞栓療法（ＴＡＥ／ＴＡＣＥ）では、塞栓効果の不十分な一時塞栓材を使用したり、隙間の生じる球形の塞栓ビーズ等を用いて不完全な塞栓状況が生じると、正常細胞への血流を阻害してダメージを与えるばかりでなく、腫瘍環境を低酸素状態に導き、悪性化の元凶となるリスクが高まる。
【０００９】
非特許文献１によると、低酸素状態では、正常細胞さえもがんに対抗する免疫細胞の働きを抑制するタンパク質を分泌し、免疫細胞の一部はがんの味方に回るという。低酸素状態によって悪性度の低いがん細胞は死滅しても、組織に浸潤して拡大するような悪性度の高いがん細胞は、他臓器に転移して浸潤能力を高めるという恐るべき状況が現出することが記載されている。
【００１０】
一般に、がん治療においては、がん組織のみを処置することは極めて難しい。外科的切除においては、がん細胞の取り残しを避けるため正常組織まで広めに切除する。抗がん剤を用いる化学療法においては、点滴や静脈注射による投与で全身の正常組織にも大きなダメージを与えている。放射線照射においては、粒子線などビームが絞られてきたものの、放射線の通過する正常組織へのダメージは避けられない。腫瘍組織及び腫瘍細胞のみを選択的に治療できる療法が望まれる所以である。
【００１１】
上記の通り、マイクロカテーテルを用いた療法（ＴＡＥ／ＴＡＣＥ）では、医師の技量によるところも多いが、マイクロカテーテルを用いて腫瘍近傍の動脈の中から、腫瘍の栄養動脈を選択的に塞栓することができる。
【００１２】
薬物を投与する化学療法では、腫瘍のみを選択に腫瘍に送達させる工夫がなされるようになってきた。一つは、腫瘍に特異的な標識を目指して腫瘍細胞のみに薬剤が奏功する分子標的機能の付与であり、アクティブターゲティング方式と呼ばれている。これに対し腫瘍組織及び腫瘍細胞に特徴的な性質及び構造に即して薬剤が送達されるパッシブターゲティング方式もある。
【００１３】
パッシブターゲティングの代表的な原理がＥＰＲ効果（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  Ｅｆｆｅｃｔ）である。
【００１４】
正常組織の血管は内皮細胞が隙間なく詰まっているため、高分子物質等が血管の途中から漏れ出ることはないが、腫瘍血管は構造的に不完全で内皮細胞間の隙間が大きく、５０ｎｍ〜５００ｎｍであると言われている。５００ｎｍ以下の粒径を有する微粒子であれば、腫瘍血管を透過することができる（Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）。
【００１５】
また、腫瘍組織ではリンパ管が未発達であり、物質の循環が不完全になっている。そのため腫瘍血管を透過した物質は、結果的に腫瘍近辺に滞留し、集積することになる（Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）。
【００１６】
薬剤送達に上記ＥＰＲ効果を利用したＤＤＳ（Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）製剤の研究も盛んになっているが、実用化された例は少ない。例えば、リュープリンやアドリアマイシンが知られている。薬剤を腫瘍近傍まで送達しても、然るべきタイミングで細胞内に打込まなければ、薬剤としての効果は薄い。このため、細胞内に薬剤を浸透させる更に巧妙な仕掛けが必要となる。
【００１７】
医用材料として、優れた生体適合性、生体分解性、生体環境応答性などの目覚ましい進歩があり、動物由来のリスクを回避できる人工合成化学物質が開発されている。
【００１８】
人工合成化学物質として液晶を形成することが知られている両親媒性化合物において、ミセル構造、ベクシル構造、デンドリマー構造などの生体接着性に劣るラメラ構造ではなく、キュービック構造や逆ヘキサゴナル構造などの生体接着性に優れた非ラメラ構造等を自己組織化する低分子液晶化合物が報告されている（特許文献２、特許文献３）。
【００１９】
例えば、特許文献２及び３には、注射剤用基材（特許文献２）や、生体接着性を活かした癒着防止剤（特許文献３）が開発されている。しかし、これらの特許文献では、塞栓材若しくは封止材、又は塞栓若しくは封止の用途に関する記述は無い。
【００２０】
また、非特許文献２、特許文献４〜５には、非ラメラ液晶を用いた動脈塞栓用塞栓材が開示されている。しかし、非特許文献２、特許文献４〜６に記載の塞栓剤は、両親媒性化合物と水溶性有機溶媒等との混合液を非ラメラ液晶の前駆体としており、血管内でバルクの液晶ゲルを形成させて血流を制御し、又は血管を閉塞する血管内に限定した塞栓であって、ＥＰＲ効果を活用した腫瘍組織への直接的集積や封止を意図していない。
【００２１】
これまでに、本発明者らは、ＥＰＲ効果を活用した腫瘍組織への直接的集積や封止を目的として、非ラメラ液晶を形成することが可能な低分子の両親媒性化合物を基材とする微粒子を含む生体分解性腫瘍封止剤を開発した（特許文献７）。しかしながら、細胞障害性を少なからず有しており、正常組織への障害が懸念された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】特開２００４−３１３７５９号公報
【特許文献２】国際公開第２０１１／０７８３８３号
【特許文献３】国際公開第２０１４／１７８２５６号
【特許文献４】中国特許第１０３０４０７４１号明細書
【特許文献５】中国特許第１０１８２２６３５号明細書
【特許文献６】中国特許第１０３５３６９７４号明細書
【特許文献７】国際公開第２０１７／１０４８４０号
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】日経サイエンス２０１４年１１月号  Ｒ．Ｋ．ジェイン「腫瘍血管を味方につける」Ｐ６１
【非特許文献２】「中国の科学技術の今を伝えるＳｃｉｅｎｃｅ  Ｐｏｒｔａｌ  Ｃｈｉｎａ」第４８号：新薬の研究・開発−呉伝斌『「放出制御製剤におけるキュービック液晶」についての研究の進展』２０１０年９月６日
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明は、腫瘍細胞を兵糧攻めにし、具体的には酸素及び栄養を遮断することにより細胞死に導く療法により、侵襲性が低く、医薬品による副作用や放射線の被爆リスクを排除し、腫瘍の悪性化を回避し、他の療法との併用療法も可能である、患者のＱＯＬを向上させることができる腫瘍封止剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、高吸水性高分子化合物を基材とする微粒子が、腫瘍血管内皮細胞の間隙を透過し、血管外の腫瘍組織に集積して、生体内の水分と接触することによって膨潤し、ゲル状組成物を形成することにより、腫瘍への酸素と栄養の供給並びに腫瘍からの誘導因子の伝達を遮断することによって、その腫瘍細胞を壊死に至らしめることを見出し、本発明を完成させた。
【００２６】
すなわち、本発明は以下を包含する。
［１］高吸水性高分子化合物を基材とする微粒子を含む腫瘍封止剤。
［２］高吸水性高分子化合物が、下記：
ＰＳ１−Ｘ−ＰＳ２    （１）
（式中、ＰＳ１及びＰＳ２は多糖類であり、Ｘはスペーサーである）
で表される構造を有する、上記［１］に記載の腫瘍封止剤。
［３］ＰＳ１及びＰＳ２は、同一であるか又は異なっていてもよく、独立して、βグルカン、キチン、キトサン、及びそれらの誘導体、並びにこれらの混合物からなる群から選択される、上記［２］に記載の腫瘍封止剤。
［４］βグルカン又はその誘導体が、セルロース、カルボキシメチルセルロース、又はＴＥＭＰＯ酸化セルロースである、上記［３］に記載の腫瘍封止剤。
［５］Ｘが、１種以上のポリカルボン酸無水物である、上記［２］〜［４］のいずれかに記載の腫瘍封止剤。
［６］Ｘが、１，２，３，４−ブタンテトラカルボン酸二無水物（ＢＴＣＡ）、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＰＥＧＤＥ）、ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ＢＰＤＡ）、ジフェニルスルホンテトラカルボン酸二無水物（ＤＳＤＡ）、ＰＥＧ（ポリエチングリコール）４００、ＰＥＧ２０００、及びエピクロロヒドリンからなる群から１種以上選択される架橋剤に由来する、上記［２］〜［４］のいずれかに記載の腫瘍封止剤。
［７］高吸水性高分子化合物が、下記：
【００２７】
【化１】
2020058784.tif 000003
【００２８】
（式中、ｍ〜ｒは、１００〜２００である）
からなる群から１種以上選択される、上記［１］に記載の腫瘍封止剤。
［８］微粒子が２０ｎｍ〜５００ｎｍの粒子径を有する、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の腫瘍封止剤。
［９］微粒子がエマルションの形態で存在する、上記［１］〜［８］のいずれかに記載の腫瘍封止剤。
［１０］微粒子が造影剤及び／又は色素を包含する、上記［１］〜［９］のいずれかに記載の腫瘍封止剤。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、腫瘍細胞を兵糧攻めにする療法によって、抗がん剤等による重篤な副作用や外科手術による大きな外傷もなく、固形悪性腫瘍を治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、細胞間の隙間に本発明のナノデバイス（高吸収性高分子化合物）が侵入する様子を模式化した図である。
【図２】図２は、ナノデバイスの作用機序を示す図である。
【図３】図３は、乳癌細胞移植マウスにおいて、本発明のナノデバイスを投与された腫瘍と投与されていない腫瘍におけるルシフェリン発現による発光量の違いから、該ナノデバイスによる抗腫瘍効果を示す図である。
【図４】図３の担癌マウスへの本発明のナノデバイス投与による腫瘍体積の変化と、非投与腫瘍の体積変化とを比較した図である。
【図５】図５は、担癌動物モデルにおける抗腫瘍効果を検証した図である。ナノデバイス（封止剤）としてポリアクリルアミド系の高吸水性高分子化合物（本明細書中、「ＭＤ２」と称する場合がある）を癌組織に投与し、経時的に腫瘍サイズを測定した。
【図６】図６は、担癌動物モデルにおける抗腫瘍効果を検証した図である。ナノデバイス（封止剤）としてカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を原料とした高吸水性高分子化合物（本明細書中、「ＭＤ３」と称する場合がある）を癌組織に投与し、投与８日後に腫瘍を摘出し、腫瘍サイズを測定した。
【図７】図７は、ナノデバイス（ＭＤ３）による酸素遮断効果を示す図である。
【図８】図８は、インビトロにおけるナノデバイス（ＭＤ３）によるタンパク質／栄養素の遮断効果を示す図である。タンパク質／栄養素の供給源としてＦＢＳを用い、ナノデバイスによりタンパク質の透過が遮断される割合を示す。
【図９】図９は、インビトロにおけるナノデバイス（ＭＤ３）によるヘモグロビンの遮断効果を示す図である。ヘモグロビンの供給源としてＦＢＳを用い、ナノデバイスによりヘモグロビンの透過が遮断される割合を示す。
【図１０】図１０は、インビトロにおけるナノデバイス（ＭＤ３）によるグルコースの遮断効果を示す図である。ヘモグロビンの供給源としてＦＢＳを用い、ナノデバイスによりグルコースの透過が遮断される割合を示す。
【図１１】図１１は、乳癌細胞移植マウスにおける、ナノデバイス（ＭＤ３）による腫瘍血管の阻血効果（酸素濃度減少）を示す図である。
【図１２】図１２は、腫瘍内血流の低下をＩＣＧを用いた血管造影により測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る腫瘍封止剤は、高吸水性高分子化合物を基材とし、腫瘍血管内皮細胞の間隙を透過し得る粒子径を有する微粒子であって、この微粒子がその間隙を透過後、高い生体接着性により間隙近傍に存在する腫瘍組織に付着した後、生体内の水分と接触することによって膨潤し、ゲル状組成物によるバリアを形成して、腫瘍への酸素と栄養の供給並びに腫瘍からの誘導因子の伝達を遮断することによって、その腫瘍細胞を壊死に至らしめ、その後、付着した微粒子が生体内で分解及び／又は代謝されることを特徴とする。また、本発明に係る腫瘍封止剤は、上記特徴を有するが、腫瘍への栄養血管を圧迫して血流を阻止することにより、腫瘍部位での血中の酸素濃度及び栄養供給を減少させ、腫瘍細胞を壊死させる効果も有することから、本発明の腫瘍封止剤には、上記の付加的効果を有する血流阻止剤としても機能する。
【００３２】
１．高吸水性高分子化合物
本発明の腫瘍封止剤は、水分により膨潤し、ゲル状組成物を形成することができる高吸水性高分子化合物を含有し、生体分解性及び／又は生体代謝性であってもよい。本明細書で使用するとき、用語「高吸水性」とは、吸水量又は膨潤率が、乾燥時における基材の重量又は容積の少なくとも２〜１０，０００倍となる材料の特性を意味する。また、用語「高分子」化合物とは、一般的には、複数の単量体の繰り返し構造から構成される重合体を意味するが、本明細書においては、さらに架橋された重合体を含むものを指す。高分子化合物の分子量は、典型的には、約１０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａであるが、これに限定されず、使用の目的に応じて適宜変更可能である。なお、本発明において使用される高吸収性高分子化合物は、後述する式（１）で表される化合物の他に、ポリアクリルアミド、グリコサミノグリカン、グリコサミノグリカン架橋体、コラーゲン、コラーゲン架橋体、ポリアクリル酸、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリ−Ｌ−乳酸、またはこれらの誘導体であってもよい。また、本発明において使用される高吸水性高分子化合物の膨潤度は、上記の通り、重量比又は体積比で２〜１０，０００倍であってもよく、例えば、２〜１，０００倍、２〜５００倍、２〜３００倍、２〜２００倍、又は２〜１００倍（上限値として、９０倍、８０倍、７０倍、６０倍、５０倍、４０倍、３０倍、２０倍、１５倍、１０倍、９倍、８倍、７倍、６倍、５倍、４倍、３倍）であり得る。後述する式（１）で表される化合物では、Ｘ（スペーサー）は架橋剤に由来する分子であるが、架橋剤を減少させて化合物を合成すると膨潤度及び膨潤速度が高くなる傾向にあった（データ示さず）。
【００３３】
本発明の腫瘍封止剤として使用される高吸水性高分子化合物は、上記の特性を有するものであれば限定されないが、典型的には、下記の式（１）：
ＰＳ１−Ｘ−ＰＳ２    （１）
（式中、ＰＳ１及びＰＳ２は多糖類であり、Ｘはスペーサーである）
で表される構造を有するものであることが好ましい。より具体的には、上記「ＰＳ１」及び「ＰＳ２」は同一であるか又は異なっていてもよく、独立して、βグルカン、キチン、キトサン、及びそれらの誘導体、並びにこれらの混合物からなる群から選択される。当業者であれば、本発明には、例えば、「ＰＳ１」がβグリカンであり、「ＰＳ２」がキチンである高吸水性高分子化合物、又は「ＰＳ１」がβグリカンであり、「ＰＳ２」がキトサンである高吸水性高分子化合物が包含されることを理解し得る。
【００３４】
ＰＳ１及びＰＳ２として表される多糖類としては、βグルカン、キチン、キトサン、アミロース、デンプン、グリコーゲン及びそれらの誘導体、並びにこれらの混合物が挙げられる。βグルカンには、限定されないが、セルロースが含まれ、また、βグルカンの誘導体には、典型的には、カルボキシメチルセルロース及びＴＥＭＰ（２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル）酸化セルロースが含まれる。
【００３５】
上記の式（１）で表される構造中のスペーサー（「Ｘ」）は、架橋剤に由来する分子であって、多糖（「ＰＳ１」及び「ＰＳ２」）を架橋反応によって連結させ得るものであれば限定されない。また、Ｘは、分子間に限らず、分子内の架橋にも使用され得る。より具体的には、本発明において架橋反応によって多糖類を連結することができる架橋剤としては、カルボン酸無水物、例えば、１，２，３，４−ブタンテトラカルボン酸二無水物（ＢＴＣＡ）、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＰＥＧＤＥ）、ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ＢＰＤＡ）、ジフェニルスルホンテトラカルボン酸二無水物（ＤＳＤＡ）、ＤＳＤＡ及びエピクロロヒドリンからなる群から１種以上選択されることが好ましい。なお、本発明において、使用される高吸水性高分子化合物が、高吸水性となるためには、分子内に同種又は異種の解離（イオン）性官能基を有することが好ましい。解離性官能基としては、典型的には−ＣＯＯ−Ｎａ＋が例示されるが、水分子の結合と保持には、このような結合性アニオンと遊離アニオンが不可欠である。また、当業者であれば、製造した高吸水性高分子化合物の吸水量や膨潤率を好ましい数値となることを目的として、多糖類の種類、使用量及び比率、並びに架橋剤の種類、添加量、比率及び架橋密度（単に、架橋度としてもよい）などを適宜選択することができる。
【００３６】
ゲル状組成物を形成することが可能な高吸水性高分子化合物の例としては、限定されないが、下記：
【００３７】
【化２】
2020058784.tif 000004
【００３８】
（式中、ｍ〜ｒは、１００〜２００である）
からなる群から１種以上選択される。これらの高吸水性高分子化合物の合成は、周知の技術を用いて製造されてもよい（例えば、国際公開第ＷＯ２０１２／１４７２５５号、特表２０１２−１２４６２を参照されたい）。
【００３９】
例えば、セルロースを原料とした高吸水性高分子化合物は、その鎖間をテトラカルボン酸で架橋された構造を有する。該高吸水性高分子化合物を製造する方法は、簡単には以下の通りである。出発原料であるセルロースを、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）／Ｎ，Ｎ，−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、ＬｉＣｌ／Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、フッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）／ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のいずれかに溶解させ、室温・常圧下においてＮ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ）を触媒としてポリカルボン酸無水物とエステル架橋反応を行う。ポリカルボン酸無水物としては１，２，３，４−ブタンテトラカルボン酸二無水物（ＢＴＣＡ）、もしくは３，３’，４，４’−ジフェニルスルホンテトラカルボン酸二無水物（ＤＳＤＡ）が望ましい。このエステル架橋反応によって、セルロースの水酸基とカルボン酸無水物間でエステル化が進行し、セルロース分子鎖間でエステル性架橋が形成されると同時に、カルボン酸無水物はカルボキシル基に変換される。また、本発明によれば、天然由来高分子鎖に限定されず、その誘導体も使用可能である。例えば、セルロースに関しては、カルボキシルメチルセルロース（ＣＭＣ）、ＣＭＣナトリウムや、アンモニウムＣＭＣを用いてもよい。ＣＭＣを原料とした高吸水性高分子材料の製造については、後述する実施例２を参考にして行うことができる。
【００４０】
上記エステル架橋反応で得られた反応物をメタノール、アセトンなどの有機溶媒に沈殿させ、塩基性水溶液によってｐＨ７になるまで中和を行う。この中和反応により、生成したカルボキシル基は、カルボン酸塩へ変換される。これら操作によって、吸水性の役割を果たすカルボン酸塩と、保水性の役割を果たすエステル性架橋された三次元架橋構造とを持つ生分解性高吸水性高分子が得られる。
【００４１】
架橋セルロース、架橋キチンなどの吸水・保水性能は、架橋密度（例えば、ポリカルボン酸架橋密度）に依存するため、架橋剤の仕込み濃度、反応溶媒、原料であるセルロースなどの重合度などを制御することで様々な用途に適した特性を持つ高吸水性高分子化合物を得ることが可能である。
【００４２】
出発原料としては、セルロースの他に、キチン、キトサン、又はアミロースなどの多糖類、さらにはこれらの混合物を用いても同様の性能を持つ高吸水性高分子を得ることができる。ただし、出発原料としてキトサンや多糖類を用いる場合は、溶媒として酸水溶液と有機溶媒の混合系、例えば１０％酢酸水溶液／メタノール／ＮＭＰの１：１：１混合溶媒などを用いて行うことができる。なかでも綿のセルロースなど、重合度１５００以上のセルロースを用いることで、現行市販品と同等以上の吸水性能を持つ生分解性高吸水性高分子が得られるので好ましい。
【００４３】
２．高吸水性高分子化合物の性質
本発明に係る生体分解性及び／又は生体代謝性の腫瘍封止剤に用いる高吸水性高分子化合物は、水分と接触することによって膨潤し、ゲル状組成物を形成することができる。高吸水性高分子化合物は、上述したように、広範な環境条件下で高い安定性を示す。上記高吸水性高分子化合物を腫瘍封止剤として用いる場合、該高吸水性高分子化合物が、生体内の水分によりゲル状物質として元の容積の数十倍〜数百倍に膨潤することによって、腫瘍細胞表面へ物理的に密着する現象を利用する。
【００４４】
本発明に係る高吸水性高分子化合物が膨潤したゲルを形成できる水性媒体としては、特に限定するものではないが、滅菌水、精製水、蒸留水、イオン交換水、超純水などの水；生理的食塩水、塩化ナトリウム水溶液、塩化カルシウム水溶液、塩化マグネシウム水溶液、硫酸ナトリウム水溶液、硫酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、酢酸ナトリウム水溶液等の電解質水溶液；リン酸緩衝溶液、トリス塩酸緩衝溶液などの緩衝溶液；グリセリン、エチレングリコール、エタノール等の水溶性有機物を含有する水溶液；グルコース、スクロース、マルトース等の糖分子を含有する水溶液；ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール等の水溶性高分子を含む水溶液；オクチルグルコシド、ドデシルマルトシド、プルロニック（ポリエチレングリコール／ポリプロピレングリコール／ポリエチレングリコール共重合体）等の界面活性剤を含む水溶液；細胞内液、細胞外液、間質液、リンパ液、髄液、血液、胃液、血清、血漿、唾液、涙、精液、尿などの体液等が挙げられる。
【００４５】
３．生体分解性及び／又は生体代謝性の腫瘍封止剤
本発明に係る生体分解性及び／又は生体代謝性の腫瘍封止剤は、高吸水性高分子化合物を基材とし、腫瘍血管内皮細胞の間隙を透過し得る粒子径を有するナノ微粒子であって、この微粒子がその間隙を透過後、高い生体接着性により間隙近傍に存在する腫瘍組織に付着した後、生体内の水分と接触することによって膨潤し、ゲル状組成物を形成して、腫瘍への酸素と栄養の供給並びに腫瘍からの誘導因子の伝達を遮断することによって、その腫瘍細胞を壊死に至らしめ、その後、付着した微粒子が生体内で分解及び／又は代謝されることを特徴とする。
【００４６】
上記の通り、本発明の腫瘍封止剤は、腫瘍血管内皮細胞の間隙を透過し得るナノオーダーのサイズであることが必要とされるため、ナノ微粒子の生成では、基材とする高吸水性高分子化合物の上記エステル重合反応プロセス中に微粒子化を行うことが好ましい。このナノ微粒子化には、限定されないが、マイクロフルイディクスを用いて行うことができる。マイクロフルイディクスは、反応物質の流量及び流速を調整することで反応量を制御できるため、したがって、重合反応を進めながら生成するポリマー量に対応した微粒子化を行うことにより粒径を管理することができるため非常に好ましい。また、マイクロフルイディクスの使用は、上記のように粒子径のコントロールが比較的容易であるだけでなく、粒子形状が球体に近いこと、化学修飾の工程を付加し易いことが利点として挙げられる。しかしながら、マイクロフルイディクスで調製されたナノ微粒子は水分を含んだハイドロゲル状態にあるため、フリーズドライにより固体の微粉末状態にすることが好ましい。
【００４７】
ナノ微粒子は水分に触れると膨潤するため、水分を遮断するため油性溶液中で保管し、その脂質と共に水性媒体にてエマルション化することが好ましい。ナノ微粒子をエマルションの形態に調製するための水性媒体は、特に限定するものではないが、滅菌水、精製水、蒸留水、イオン交換水、超純水などの水；生理的食塩水、塩化ナトリウム水溶液、塩化カルシウム水溶液、塩化マグネシウム水溶液、硫酸ナトリウム水溶液、硫酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、酢酸ナトリウム水溶液等の電解質水溶液；リン酸緩衝溶液、トリス塩酸緩衝溶液などの緩衝溶液；グリセリン、エチレングリコール、エタノール等の水溶性有機物を含有する水溶液；グルコース、スクロース、マルトース等の糖分子を含有する水溶液；ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール等の水溶性高分子を含む水溶液；オクチルグルコシド、ドデシルマルトシド、プルロニック（ポリエチレングリコール／ポリプロピレングリコール／ポリエチレングリコール共重合体）等の界面活性剤を含む水溶液；細胞内液、細胞外液、間質液、リンパ液、髄液、血液、胃液、血清、血漿、唾液、涙、精液、尿などの体液等が挙げられる。
【００４８】
上記微粒子の基剤として、上記高吸水性高分子化合物のみ含有してもよいが、さらに、機能性物質（例えば、薬剤、造影剤、色素など）を包含してもよい。実用上、腫瘍封止剤の封止状況（具体的には、血管を透過した後に腫瘍部位に付着、留置する状態や、付着後に徐々に生体分解する経緯）を可視化するために、造影剤や色素のいずれか又はその両者を含有させてもよい。このように、本発明の腫瘍封止剤は、造影剤及び／又は色素を包含することができることから、臨床的にがんの診断に応用することができる。
【００４９】
造影剤として、Ｘ線ＣＴ用には、疎水性造影剤であるヨウド系リピオドール、水性造影剤であるイオパミロン等、ＭＲＩ用には、Ｇｄ（ガドリニウム）系又はＦｅ（鉄）系の磁性物質、エコー用には超音波リポソーム粒子が挙げられる。これらは、１種類又は２種類以上を含有させてもよい。
【００５０】
また、手術前及び手術中の視認性を確保する色素として、疎水性のクマリンや水溶性のフルオレセイン、ピラニン、シアニンなどの蛍光色素、ルシフェリンなどの発光色素が挙げられる。これらは、１種類又は２種類以上を含有させてもよい。
【００５１】
さらに、造影剤と色素を同時に、それぞれ１種類又は２種類以上を含有させてもよい。
【００５２】
上記高吸水性高分子化合物と造影剤又は／及び色素との配合比は、１００：１〜１：１００であってもよく、例えば、９５：５、１０：１、９０：１０、１０：２、８０：２０、１０：３、７０：３０、６０：４０、５０：５０、４０：６０、３０：７０、２０：８０、１０：９０、５：９５であり得る。好ましくは１００：１〜５０：５０であり、さらに好ましくは１０：１〜１０：３である。
【００５３】
一般的に、腫瘍組織においては、腫瘍抹消血管は新生血管が多く、これらの血管を構成する血管内皮細胞同士やがん細胞同士は正常細胞より接着性が低下していることから、細胞と細胞との間には数ナノメートルから数マイクロメートルの隙間がある。その間隙にナノ微粒子を拡散させることができる。図１は、腫瘍組織中の細胞外微小環境における本発明の腫瘍封止剤、細胞及び間隙のサイズを比較したものである。間隙は間質と呼ばれ、コラーゲンや線維芽細胞、血管（がん組織では新生血管）、リンパ管などで構成される。がん組織では、通常、リンパ管が発達しておらず、がん微小環境の間質には、コラーゲンや線維芽細胞などの存在により微粒子の流動性を阻害している。本発明は、作用機序の１つとして、この血管内皮細胞同士の間隙を微粒子が透過し、腫瘍組織に集積及び定着するというＥＰＲ効果（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ＆  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔ）を利用したものである。さらに、本発明の腫瘍封止剤は、がん細胞間の間隙に侵入し、生体内の水分により数百倍に膨潤し、周囲のがん細胞や血管等を圧迫して、腫瘍全体を覆うことにより阻血効果をもたらす（図２）。
【００５４】
高吸水性高分子化合物を基材とする微粒子は、後述するように、ジェットミルに代表される乾式粉砕技術、高圧ホモジナイザーやスプレイドライ、フリーズドライなどの湿式粉砕技術および乳化重合技術やマイクロ流体技術を用いて調製されるが、粒径サイズは均一ではなく、様々なサイズが混在しているが、２０ｎｍ〜５００ｎｍの粒径サイズが主体（微粒子全体で好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上を占め、場合により１００％占めてもよい）であって、２０ｎｍ未満の微粒子又は５００ｎｍ超の微粒子も存在し得る。したがって、本明細書において、使用の形態に応じて、微粒子を粒径サイズによって特定する場合、「２０ｎｍ〜５００ｎｍ」である粒径を有する微粒子には、例えば、「１０ｎｍ〜２００ｎｍ」の粒径を有する微粒子、「３００ｎｍ〜７００ｎｍ」の粒径を有する微粒子等を排除することを意図しない。一方で、「２０ｎｍ〜５００ｎｍ」の粒径サイズには、例示的に「２０ｎｍ〜４００ｎｍ」、「２０ｎｍ〜３００ｎｍ」、「２０ｎｍ〜２００ｎｍ」、「２０ｎｍ〜１００ｎｍ」、「３０ｎｍ〜５００ｎｍ」、「３０ｎｍ〜４００ｎｍ」、「３０ｎｍ〜３００ｎｍ」、「３０ｎｍ〜２００ｎｍ」、「３０ｎｍ〜１００ｎｍ」、「４０ｎｍ〜５００ｎｍ」、「４０ｎｍ〜４００ｎｍ」、「４０ｎｍ〜３００ｎｍ」、「４０ｎｍ〜２００ｎｍ」、「４０ｎｍ〜１００ｎｍ」、「５０ｎｍ〜５００ｎｍ」、「５０ｎｍ〜４００ｎｍ」、「５０ｎｍ〜３００ｎｍ」、「５０ｎｍ〜２００ｎｍ」、「５０ｎｍ〜１００ｎｍ」、「１００ｎｍ〜５００ｎｍ」、「１００ｎｍ〜４００ｎｍ」、「１００ｎｍ〜３００ｎｍ」、「１００ｎｍ〜２００ｎｍ」なども包含することが意図される。
【００５５】
上記微粒子は、典型的には、任意の順番で、１種類又は２種類以上の上記高吸水性高分子化合物又はその塩、造影剤又は／及び色素（含有させる場合）、１種類又は２種類以上の適量の製薬上許容される界面活性剤、及び適量の水性媒体（例えば、生理食塩水、注射用水）等を加えて撹拌・ホモジナイズすることによって調製できる。
【００５６】
上記製薬上許容される界面活性剤としては、製薬又は化粧品分野で使用される任意のものを使用することができ、以下に限定するものではないが、例えば、プルロニック（例えば、プルロニックＦ１２７；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン（２００ＥＯ）（７０ＰＯ））、ポリソルベート８０（オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン；Ｔｗｅｅｎ  ８０）等を用いることができる。
【００５７】
一実施形態において、本発明の腫瘍封止剤は、上記微粒子を分散可能な濃度（例えば、０．００１〜１５重量％）で含んでもよいが、投与対象、投与量などによって決定される。
【００５８】
上記微粒子の確認方法として、微粒子の構造は、例えば、Ｘ線小角散乱（ＳＡＸＳ）やクライオＴＥＭによって解析できる。また、微粒子の粒子径分布は、例えば、動的光散乱法やゼータ電位・粒径測定装置などによって測定できる。
【００５９】
本発明の微粒子は、上記のように、１種類以上の高吸水性高分子化合物を界面活性剤等と混合し、撹拌及びホモジナイズすることにより調製することができるが、後述する実施例１及び２に示されるように、超音波破砕やマイクロ流体技術を用いても調製することができる。ここで、「マイクロ流体技術」とは、微小空間で流体を扱う技術の総称であるが、該技術に使用されるデバイスを「マイクロ流体デバイス」と呼ぶ。これは、半導体微細加工技術や精密機械加工技術を応用して作製された、深さ及び幅が典型的には数μｍ〜数１００μｍ程度の流路構造を有する装置である。本明細書では、粉砕法によるフィルタリングあるいは乳化重合技術及びマイクロ流体技術を用いて微粒子を作製しているが、所望の粒径を有する微粒子を安定に調製することができることから、該技術を用いて微粒子を作製することが好ましい。なお、微粒子の粒径は、当業者に周知の一般的な方法を用いて測定することができる。
【００６０】
４．生体分解性腫瘍封止剤の性質と特徴
（１）シリンジ又はマイクロカテーテル通過性
本発明に係る腫瘍封止剤は、前述したように、上記高吸水性高分子化合物をナノ微粒子化して、油性媒体に分散したエマルションを含む。本エマルションによって、シリンジ又はマイクロカテーテルの通過性を確保している。
（２）腫瘍血管透過性
腫瘍組織に特異的に形成された腫瘍新生血管は、血管を覆うペリサイト（血管周皮細胞）が減少しているため、腫瘍血管における内皮細胞間の間隙は、正常細胞と比較して広がっている。その間隙を漏れ出る粒子が存在する。本発明の腫瘍封止剤は、その間隙を通過するのに十分小さな粒子径を持つ。間隙の大きさは個人差があり、腫瘍種別、部位にもよるが、一般に５ｎｍ以上７００ｎｍ以下とされている。
（３）異なる粒子径で構成される分散性
上記腫瘍血管の間隙は大小様々である。本発明の腫瘍封止剤は、粒子径は単一ではなく数百ｎｍ幅の分布をもつエマルションのため、どの間隙からも透過することによって集積密度を増加させることができる。
（４）腫瘍組織集積性
前述のように腫瘍血管を透過した微粒子は、腫瘍周辺に放出されるが、正常組織と異なり腫瘍組織では、リンパ管網が未発達である。このため体液と共にリンパ管経由で、他の部位に運ばれることは無い。従って、放出された微粒子即ち本発明の腫瘍封止剤は、腫瘍部位に留まる集積性がある。前記（２）と（４）を合わせてＥＰＲ効果と呼ぶ。
（５）酸素と栄養の遮断性
本発明の腫瘍封止剤がゲル状態となって集合体化するため、稠密に腫瘍組織を封止することによって、腫瘍細胞は増殖に必要な栄養と酸素が遮断され、細胞死（壊死）に至る。
（６）伝達系転写誘導因子の伝達阻害性
腫瘍組織・細胞からは、各種誘導因子が発せられる。例えば、低酸素ストレス下のがん細胞から発せられるＨＩＦ（低酸素誘導因子）は、ＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）に伝達して腫瘍血管新生を促し、腫瘍への栄養と酸素の供給量を増大させ増殖に寄与している。本発明の腫瘍封剤は、腫瘍組織を隙間なく覆い封じ込めることによって、これら腫瘍から発せられる伝達因子の拡散を阻止することで悪性化を食い止めることができる。
（７）速やかな代謝・排泄
本発明の腫瘍封剤は、腫瘍細胞が壊死するのに十分な時間・期間を経た後は、体内酵素による分解又は可溶化、一部はさらなる分解などを経て、体外へ排泄される。
（８）視認性及び可視化性
（５）までは本発明の腫瘍封剤の基本的な機能に限定した性質であるが、実用上の機能として、医師が使用する場面で有用な機能を付加している。
第一が、目視による視認性である。色素（蛍光色素を含む）を包含することによって、他の医薬品との取り違えリスクを軽減し、更にはマーカーとして手術部位・範囲を表示することで、間違った箇所への施術を回避できる。
第二に、造影剤を包含させることにより、術中の画像装置によるモニタリングで的確な箇所へ十分な施術が行われている又は行われたかを確認することができる。さらには、造影剤のみを使用した時のように流出せずに腫瘍部位に定着するため、再度造影剤を注入する手術をすることなく、術後の腫瘍の状況を画像装置でモニタリングできる可視化性を有する。
（９）塞栓性
本発明の腫瘍封止剤は、動脈塞栓用塞栓材としても使用できる。塞栓材としては、永久塞栓材と同等の塞栓効果を発揮する一時塞栓材として、永久留置リスクを回避でき、更に腫瘍封止効果と塞栓効果との相乗効果を期待することもできる。
【００６１】
５．生体分解性腫瘍封止剤の使用
上記の通りに調製した腫瘍封止剤は、例えば、固形悪性腫瘍を診断及び／又は治療するために使用することができる。本明細書で使用するとき、「固形悪性腫瘍」には、有棘細胞がん、乳がん、皮膚リンパ腫、血管肉腫、肝胆道系のがん、頭頸部がん、肺がん、中皮腫、縦隔がん、食道がん、胃がん、膵臓がん、小腸がん、結腸がん、結直腸がん、大腸がん、肛門がん、腎臓がん、尿道がん、膀胱、前立腺、尿道がん、陰茎がん、睾丸がん、婦人科臓器のがん、卵巣がん、内分泌系のがん、皮膚がん、脳を含む中枢神経系のがん；軟組織及び骨肉腫；並びに皮膚及び眼内起源の黒色腫を含む。使用形態としては、限定されないが、１種類又は２種類以上の高吸水性高分子を基材とする微粒子を油性媒体中に分散させたエマルションの形態で使用してもよく、又は該微粒子を含む医薬組成物として使用してもよい。このように、本発明の腫瘍封止剤は、固形悪性腫瘍などのがんの診断に適用可能であるだけでなく、がんの治療に応用することもできることから、「セラノスティクス・デバイス」として称することができる。
【００６２】
本発明によれば、シリンジ又はマイクロカテーテルを用いて、腫瘍封止剤が腫瘍近傍の動脈から腫瘍を塞栓及び／又は血流を阻止するように導入されてもよい。一態様において、本発明の生体分解性腫瘍封止剤は、ニードルアクセス可能ながんを治療対象とすることができるため、例えば、シリンジを用いて腫瘍近傍に局所投与することができる。ここで、導入時の生体分解性腫瘍封止剤の量、濃度、回数、及び頻度等は、対象（被験者）の性別、年齢、体重、患部の状態等を考慮して、医師及び獣医師が、適宜、調整することができる。ここで、本発明の生体分解性腫瘍封止剤による治療対象は、哺乳動物であることが好ましく、哺乳動物としては、限定されないが、ヒト、サル等の霊長類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等のげっ歯類、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、フェレット等が挙げられる。
【００６３】
後述する実施例３においては、乳癌細胞移植マウスにエマルション形態の腫瘍封止剤（実施例１）の１００μＬを注射器によって、腫瘍近傍の血管より投与（具体的には、注入）し、抗腫瘍効果が得られた。ヒトへの適用に関しては、これらの乳癌細胞移植マウスの実験結果に基づいて、単純に体重換算すれば、例えば、ヒトの固形悪性腫瘍に対しては、本発明の生体分解性腫瘍封止剤を１回あたり１０ｍｌ〜２００ｍｌ程度の量を腫瘍近傍の血管より投与することに相当する。また、本発明の生体分解性腫瘍封止剤は、所望の治療効果が得られるまで、複数回（例えば、２〜１０回）、適宜、間隔（例えば、１日に２回、１日に１回、１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回）をおいて投与されてもよい。なお、本発明の生体分解性腫瘍封止剤の１回あたりの投与量（具体的には、注入量）及び投与頻度は、上記に限定されるものではなく、当業者（例えば、医師又は獣医師）が、適宜調整して決定され得る。
【００６４】
本発明の腫瘍封止剤を医薬組成物として使用する場合には、有効成分としての腫瘍封止剤の他に、担体、賦形剤、及び／又は安定化剤等を適宜添加して形態で使用されてもよい。また、本発明によれば、腫瘍封止剤、溶媒（生理食塩水など）、担体等をそれぞれ封入した容器（バイアル等）、及び使用説明書等を含むキットとして提供される。また、本発明の腫瘍封止剤は医用材料を包含する。
【実施例】
【００６５】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００６６】
［実施例１］セルロースを原料とした高吸水性高分子化合物の製造
１ｇのセルロース（株式会社スギノマシン）を塩化リチウム（ＬｉＣｌ）／Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）溶液（５ｇ  ＬｉＣｌ／９５ｇ  ＮＭＰ）に添加し、室温で２日間十分に撹拌し溶解させた。触媒としてＮ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ）を１．１４ｇ添加し、架橋剤として１，２，３，４−ブタンテトラカルボン酸二無水物（ＢＴＣＡ）を３．０７ｇ加えて、撹拌しながら２４時間室温下で反応させた。このエステル架橋反応によって、セルロース分子鎖間に架橋を形成された。その後、反応生成物を１Ｌのメタノール溶液中に析出させた後、１０％水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７．０に調整した。続いて、沈殿物をホモジナイザーで粉砕し、ガラスフィルターを用いてろ過した。ろ過後、メタノールと水を用いて洗浄及びろ過を数回繰り返し、最終的に７０℃の条件で減圧乾燥してセルロース高吸水性高分子化合物を得た。なお、使用した試薬は、特に明示されていない場合、いずれも東京化成工業株式会社から購入したものである（以下、同様）。
【００６７】
［実施例２］カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を原料とした高吸水性高分子化合物の合成
１．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液１００ｍｌをビーカー内で撹拌しながら、５ｇのＣＭＣ（三晶株式会社）をダマにならないよう少量ずつ加えて完全に溶解させた。架橋剤としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＰＥＧＤＥ）を０．５ｍｌ添加し、室温で１０分間よく撹拌し、その後、６０℃で３時間架橋反応させた。反応生成物のハイドロゲルにメタノール２００ｍｌを加え、ホモジナイザーで湿式粉砕した。粉砕後、粒状になったハイドロゲルの粒子を、ガラスフィルターを用いてろ過した。ろ過後、洗浄液のｐＨが中性付近になるまでメタノールと水を用いて洗浄及びろ過を数回繰り返し、最終的に７０℃の条件で減圧乾燥してＣＭＣ高吸水性高分子化合物を得た。
【００６８】
［実施例３］腫瘍部位の血流阻止効果に関する評価
（１）乳癌細胞移植マウスの作製
ルシフェラーゼを安定に発現する４Ｔ１乳癌細胞（４Ｔ１−Ｌｕｃ）を入手し、ヌードマウスＢａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ（日本チャールス・リバー株式会社）の皮下に２．５×１０７細胞／ｍｌのＰＢＳ／Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）＝１／１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の細胞懸濁液を０．０４ｍｌ移植した。
【００６９】
（２）血流阻止効果
上記の乳癌細胞を移植されたマウス腫瘍部位に、実施例１で作製した腫瘍封止剤（エマルション）を局所投与した。投与後、ルシフェラーゼの基質であるＤ−ルシフェリンを含むリン酸緩衝生理食塩水を腹腔内投与により投与して血流循環させ、上記乳癌細胞のルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）活性をＩｎ  ｖｉｖｏイメージング装置（ＩＶＩＳ）（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）で経時的に観察した。腫瘍部位では、血中のルシフェリンの存在によりＬｕｃ活性に基づいて蛍光が確認される。図３Ａに示されるように、エマルションの非投与マウスでは、移植した乳癌細胞のＬｕｃ発現により継続的に蛍光を観察できるのに対して、エマルションを投与したマウスでは、投与直後から蛍光が減少したことから、エマルションの投与により、血中のＤ−ルシフェリンの腫瘍への送達、エマルション投与により腫瘍部位への血流が阻止されることが示唆された。また、この観察結果について、非投与マウスに対する投与マウスにおけるＬｕｃ活性の比を算出し、経時的な変化を図３Ｂとして示す。
【００７０】
（３）腫瘍抑制
エマルションを複数回投与した場合の腫瘍体積の変化について検討した。上記（１）に記載したように、４Ｔ１−Ｌｕｃを移植されたヌードマウスを用いて経時的に観察した。エマルションの投与は、初回（１日目）、２日目、３日目、及び４日目に行った。腫瘍体積の経時的な変化を図４に示す。図４から明らかなように、生理食塩水を投与した対照と比較して、エマルションを投与したマウスの腫瘍体積は減少した。これは、およそ４回投与後から、腫瘍体積の減少は顕著となった。
【００７１】
［実施例４］担癌動物モデルにおける抗腫瘍効果の確認
本実施例では、実施例３で採用された乳癌細胞を皮下移植したマウスを担癌動物モデルとして用い、封止剤として市販のポリアクリルアミド系の高吸水性高分子化合物（粒径：５００〜６００ｎｍ）（三洋化成工業株式会社）（以下、「ＭＤ２」と称する場合がある）、及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を原料とした高吸水性高分子化合物（粒径：６００〜１５００ｎｍ）（以下、「ＭＤ３」と称する場合がある）を用いて、それらによるバリア形成に基づく抗腫瘍効果を検討した。
【００７２】
（１）抗腫瘍効果
高吸収性高分子化合物を含む腫瘍封止剤（生理食塩水に含有する）及び生理食塩水のみ（対照）をマウスに局所投与し、腫瘍成長の変化を観察した。
【００７３】
（ａ）ポリアクリルアミド系の高吸水性高分子化合物（ＭＤ２）による抗腫瘍効果
図５に示されるように、生理食塩水（１００μｌ）のみを投与した対照では、腫瘍成長が経時的に観察された。これとは対照的に、生理食塩水に高吸水性高分子化合物を含有させた溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を投与した場合には、腫瘍成長を顕著に抑制することができた。６日目で比較してみると、両者に有意な差が認められた。
（ｂ）ＣＭＣ系の高吸水性高分子化合物（ＭＤ３）の場合
高吸収性高分子の投与前後による腫瘍体積の変化を測定した結果を図６にまとめた。図６Ａは、ビヒクルとして生理食塩水のみを用いた場合の結果を示す。投与直前の腫瘍体積を基準として、投与８日後に腫瘍を摘出し、腫瘍体積を比較検討した。生理食塩水のみを投与した対照では、腫瘍は３４２％に増大したが、高吸収性高分子を投与した対象では、６９％まで腫瘍体積が減少した。さらに、ビヒクルとして、生理食塩水＋リピオドールを用いた場合の結果を図６Ｂに示す。図６Ａの結果と同様に、腫瘍体積の減少を観察することができたが、リピオドールの含有によって、腫瘍抑制効果は増大した。
【００７４】
（２）封止効果（酸素遮断効果）
本発明の高吸収性高分子化合物（ＭＤ３）による腫瘍組織への酸素供給の遮断効果を検証した。実験動物の腫瘍部位における、高吸収性高分子化合物による低酸素状態を可視化するために、インビボ光音響３次元断層イメージングＭＳＯＴ（ＭｕｌｔｉＳｐｅｃｔｒａｌ  Ｏｐｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）（機種名：ＭＳＯＴ  ｉｎＶｉｓｉｏｎ  ２５６−ＴＧ；住友ファーマインターナショナル株式会社）を用いた。このシステムでは、ヘモグロビンの酸素飽和度を可視化することにより、画像として、酸素が豊富な酸化ヘモグロビンを赤色、及び脱酸素の還元ヘモグロビンを青色に区別するこができる。該システムによる低酸素状態を可視化した画像を図７に示す。左右の腫瘍に対して、高吸収性高分子化合物を投与していない対照の腫瘍（左側）では、酸素が豊富な状態（赤色）として確認できた。これに対して、高吸収性高分子化合物を投与した腫瘍（右側）では、脱酸素の状態（青色）として視認され、腫瘍部位は低酸素状態にあることが確認できた。これにより、本発明の高吸収性高分子化合物が封止剤として抗腫瘍効果を有することが示された。
【００７５】
［実施例５］インビトロにおける高吸収性高分子化合物のタンパク質及び栄養素の遮断能力の検討
本発明の高吸収性高分子化合物による腫瘍組織への血中の各種物質の供給遮断は、生体内の水分と接触による高吸収性高分子化合物の膨潤によるものと考えられる。これを検証するために、本実施例では、インビトロにおいて高吸収性高分子化合物をゲル化し、ゲルに対するタンパク質及び栄養素の通過（透過性）を指標として遮断効果を検討した。まず、高吸収性高分子化合物（ＭＤ３）のゲルをＰＢＳ（−）を用いて調製した（最終濃度：０．０１ｇ／ｍＬ）。次に、底を綿栓した２．５ｍｌのシリンジに、上記で調製したゲルを所定の容積（０．２、０．５、及び１．０ｍｌ）で注入した。続いて、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（１００％又は１０％）をシリンジ内のゲル上に充填した。その後、ゲルを通過したＦＢＳを回収し、該ＦＢＳ中に残存する各成分（タンパク質／栄養素、ヘモグロビン、及びヘモグロビン）の量を、対照の各成分量と比較することによって、ゲルによる封止効果を検証した。なお、対照は、ゲルを充填せずに、底に綿栓をしたシリンジを通過させたＦＢＳである。
【００７６】
（１）タンパク質／栄養素の遮断
ゲルを通過して、回収されたＦＢＳ中に残存するタンパク質の量を紫外分光光度計により測定し、標準曲線から求めた。ゲルによって遮断されたタンパク質の割合は、対照のＦＢＳ中に存在するタンパク質の量とゲルを通過させた後のＦＢＳに残存する量とを比較することにより算出した。より具体的には、以下の式：
遮断されたタンパク質（％）＝（対照中のタンパク質の量−ゲルを通過させた後に残存するタンパク質の量）×１００／対照中のタンパク質の量
により求めた。結果を図８に示す。希釈されたＦＢＳ（１０％）を用いた場合、ゲルが飽和に至っていないため、タンパク質の遮断効果が顕著に見られた。希釈していないＦＢＳ（１００％）を用いた場合には、ゲルが飽和した状態であるため、希釈したＦＢＳと比較して、タンパク質の遮断効果は小さかった。容積が０．５ｍｌ及び１．０ｍｌのＭＤ３を用いた場合には、有意差が認められた。
【００７７】
（２）ヘモグロビンの遮断
上記（１）のタンパク質／栄養素の遮断実験と同様にして、ゲルによるヘモグロビンの遮断効果について検討した。結果を図９に示す。容積が０．５ｍｌと１．０ｍｌのＭＤ３を用いた場合には、ヘモグロビンの遮断効果に有意差が認められた。
【００７８】
（３）グルコースの遮断
上記（１）のタンパク質／栄養素の遮断実験と同様にして、ゲルによるグルコースの遮断効果について検討した。結果を図１０に示す。１．０ｍＬのＭＤ３を用いた場合、約８０％のグルコースがゲルに捕捉されたが、使用したゲルの量により、その効果は顕著に異なった。また、装填したＦＢＳの濃度の違いによって、遮断効果に差は生じなかった。
【００７９】
このように、本発明の高吸収性高分子化合物は、タンパク質／栄養素、グルコース、ヘモグロビンなどの血清成分の透過を阻止できることが判明した。
【００８０】
［実施例６］腫瘍血管における酸素濃度の測定及び阻血効果の検証
４Ｔ１−Ｌｕｃ細胞を移植したマウスを用いて、さらに高吸収性高分子化合物の投与による腫瘍血管の阻血効果（酸素濃度減少）を検証した。該高吸収性高分子化合物（ＭＤ３）の投与から１日後に、光音響３次元断層イメージングで腫瘍内の酸素状態を測定すると、ＭＤ３を投与した側の腫瘍組織（左）では、還元型ヘモグロビン（青色）が増加していた（図１１）。これにより、腫瘍組織内で血中酸素濃度が減少していることが観察され、血流が遮断されたことが推定された。
【００８１】
さらに、血清タンパク質と結合すると、ピーク波長８４５ｎｍの発光を発するインドシアニングリーン（ＩＣＧ）を造影剤として用いて、腫瘍組織内の血流を該造影剤の発光シグナルを経時的に測定することにより、血流の変化を測定した。ＭＤ３が投与された上記のマウスにおいて、投与１日後に、ＩＣＧ（株式会社同仁化学研究所、２．５ｍｇ／ｍＬ、１００μＬ（３２０ｎｍｏｌ））を投与し、ＬＥＤ（発光ダイオード）照射によって蛍光を励起させ、近赤外光イメージング装置（パーキンエルマー、ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を用いて撮像し、画像から発光シグナルを測定した（図１２）。その結果、ＭＤ３が投与されていない腫瘍組織では、ＩＣＧによる発光が観察され、血流があることが観察された。これに対して、ＭＤ３を投与した腫瘍組織では、ＩＣＧによる発光が観察されず、血流が観察されなかった（図１２Ａ）。得られた画像からＩＣＧシグナルを平均して数値化し、経時的にプロットした結果を図１２Ｂに示す。ＭＤ３を投与していない腫瘍組織では、ＩＣＧ投与の直後からそのシグナルが増大したが、ＭＤ３を投与した腫瘍組織ではＩＣＧシグナルが増大しなかった。以上の結果から、高吸収性高分子化合物は、腫瘍組織への血流を遮断できることは判明した。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明の腫瘍封止剤の微粒子を用いることにより、癌の転移又は浸潤を防ぐ低侵襲性療法の新たな選択肢が増えることが期待される。また、該微粒子は、塞栓剤として分解性や可視化機能のアドバンテージを有しており、動脈塞栓療法の新しい塞栓剤としての可能性が拓け、更に造影剤及び／又は色素を包含することができるため、癌の診断や施術時のマーキング材への応用も展開できる。
【００８３】
本明細書に引用する全ての刊行物及び特許文献は、参照により全体として本明細書中に援用される。なお、例示を目的として、本発明の特定の実施形態を本明細書において説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の改変が行われる場合があることは、当業者に容易に理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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