(57)【要約】【課題】新規細胞培養基材の提供。【解決手段】本発明は、バラマンディの鱗に由来するコラーゲンを含む、細胞培養基材に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バラマンディの鱗に由来するコラーゲンを含む、細胞培養基材。
【請求項２】
前記バラマンディ鱗に由来するコラーゲンが、アミノ酸１０００残基当たりのヒドロキシプロリンが８０残基以上という特徴を有する、請求項１に記載の細胞培養基材。
【請求項３】
前記バラマンディ鱗に由来するコラーゲンが、α1鎖とα2鎖の分子量差が５ＫＤａ以下という特徴を有する、請求項１または２に記載の細胞培養基材。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養基材を含む、細胞培養用のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、広くバラマンディの鱗由来のコラーゲン線維を含む細胞培養基材等に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療分野においては、細胞培養基材の原料としてコラーゲンゲルが広く使用されている。その原料の大半は、資源量が多く、収率が高い牛や豚などの脊椎動物の真皮に依存しているが、これらのコラーゲンの使用に問題がないわけではない。例えば、東南アジアの一部地域では、文化的に哺乳類由来の製品の取り扱いが制限されているという問題がある。
【０００３】
また、２０００年代初頭に問題となったＢＳＥ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）等の病原体からの感染症を回避する必要もあり、牛や豚に変わるコラーゲン原料の探索が産業上の課題となっている。
【０００４】
そこで、養殖によって量産体制を築きやすく、尚且脊椎動物よりも感染リスクが低い魚由来コラーゲンの利用が検討されているが、従来の魚由来のコラーゲンから調製された線維ゲルの多くは、恒温動物由来のものとの比較で熱安定性の観点で不十分なものであり、牛や豚由来のコラーゲンゲルのような力学的安定な線維ゲルを形成することができない。
【０００５】
近年では、魚類コラーゲンを細胞培養へ利用した例も出てきている。例えば、東南アジア等の温暖な地域に生息するティラピア（日本名イズミダイ）から抽出されるコラーゲンモノマーは、変性温度が高いことが報告されている。
【０００６】
ティラピアについては、特開２０１４−２１８４５３号公報や特開２０１２−１２６６８１号公報において、ティラピアの皮や鱗から抽出したコラーゲンを原料とするコラーゲン線維ゲルと、その細胞培養基材としての用途が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１４−２１８４５３号公報
【特許文献２】特開２０１２−１２６６８１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、ティラピアの鱗由来のコラーゲンのように、モノマー状態での温度安定性が高くても、線維形成を起こしたコラーゲン会合体が３７℃においても熱的に安定であるかは不明である。実際、特開２０１４−２１８４５３号公報においては、魚鱗由来のコラーゲンが線維形成速度の速さや細胞との良好な接着性から好ましい旨が記載されているものの、ティラピアの鱗から調製したコラーゲンゲルの細胞培養基材としての適正は検討されていない。
【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、３７℃で三次元的に細胞培養が可能な魚由来のコラーゲン線維ゲルを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、バラマンディの鱗由来のコラーゲン線維ゲルがティラピアの鱗由来のものと比較して顕著に細胞培養基材として適していることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
［１］  バラマンディの鱗に由来するコラーゲンを含む、細胞培養基材。
［２］  前記バラマンディ鱗に由来するコラーゲンが、アミノ酸１０００残基当たりのヒドロキシプロリンが８０残基以上という特徴を有する、［１］に記載の細胞培養基材。
［３］  前記バラマンディ鱗に由来するコラーゲンが、α1鎖とα2鎖の分子量差が５ＫＤａ以下という特徴を有する、［１］または［２］に記載の細胞培養基材。
［４］  ［１］〜［３］のいずれかに記載の細胞培養基材を含む、細胞培養用のキット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、バラマンディの鱗に由来するコラーゲンを利用することで、細胞接着性や細胞伸展活性の高い細胞培養基材の提供が可能になる。バラマンディの鱗から調製したコラーゲン線維ゲルは従来ウシやブタの真皮由来のコラーゲンを原料としていた細胞培養基材に匹敵する特性を有するため、特に三次元培養環境に適した培養基材の代替材料となり得る。
【００１３】
バラマンディ由来のコラーゲンとしては、その皮由来のものが知られている（特開２０１５−１８０６２２号公報）。しかしながら、バラマンディの皮由来のコラーゲンは、同公報においてヒドロキシプロリン含量が検出されないほど少ないことが示唆されている点で鱗由来のものと異なり、また、それから調製されたコラーゲン線維ゲルの熱安定性も鱗由来のものより劣っている。
【００１４】
更に、ＷＯ２０１７／００２７６７においては、バラマンディの鱗から調製したゼラチンが開示されているが、ゼラチンは熱変性によりコラーゲンの立体構造や分子量が変化したものであり、コラーゲン線維ゲルとは異なる。例えば、ゼラチンゲルはランダムコイル構造をとるゼラチン分子が分子間で架橋した構造を有するのに対し、コラーゲン線維ゲルは三重らせん構造をとるコラーゲン分子が自己集合してできたコラーゲン線維が分子間架橋したこと構造を有する。特に本発明のコラーゲン線維ゲルは、３７℃で線維化したコラーゲン線維ゲルが５０度に昇温した後でもＧ’が９０Ｐａ以上の値を示す点でＷＯ２０１７／００２７６７に記載のゼラチンとは異なっている。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】バラマンディ鱗由来のコラーゲンをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた結果を示す（ＰＣ−Ｓ：ブタ皮、ＢＣ：バラマンディ鱗、ＢＣ−Ｓ：バラマンディ皮、ＴＣ：ティラピア鱗（セルキャンパスＡＱ−３ＬＥ）、ＣＭＴ：ブタ腱（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ  Ｔｙｐｅ−ＩＰ））。
【図２】ゲル内細胞の生死判定の染色結果を示す。
【図３】ゲル内細胞の細胞骨格の顕微鏡像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、必要に応じて図面を参照しつつ、本発明を実施するための形態（以下、単に「本実施形態」という。）について詳細に説明するが、本発明は下記本実施形態に限定されるものではない。本発明は、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変形が可能である。
【００１７】
第一の実施形態において、本発明は、バラマンディの鱗由来のコラーゲンを含む、細胞培養基材を提供する。
【００１８】
コラーゲンは、分子量１０万程度のα鎖３本から構成される、少なくとも部分的にらせん構造（コラーゲンらせん）を有する。α鎖の中でもアミノ酸組成のわずかな違いによってα1鎖、α2鎖に大別される。生体内に存在するコラーゲンの多くはヘテロ３量体（α1×２本、α2×１本）を形成しているが、中には３本のα1鎖から構成されるホモ３量体を有するコラーゲンも存在している。各モノマーにはグリシン残基が３個目ごとに、またその他のアミノ酸残基としてプロリン残基、ヒドロキシプロリン残基が高頻度に現れる。コラーゲンを構成するアミノ酸の中でも、プロリンとヒドロキシプロリンは三重らせん構造の熱安定性に寄与していることが知られている。
【００１９】
コラーゲン分子には構造の違いによって１９種類の型の存在が報告されており、さらに同じ型に分類されるコラーゲンにも数種類の異なる分子種が存在する場合がある。
【００２０】
中でも、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ型およびＩＶ型コラーゲンが主にバイオマテリアルの原料として用いられている。Ｉ型はほとんどの結合組織に存在し、細胞外マトリックスを構成する。生体内で最も量の多いコラーゲン型である。特に腱、真皮および骨に多く、工業的にはコラーゲンはこれらの部位から抽出される場合が多い。ＩＩ型は軟骨を形成するコラーゲンである。ＩＩＩ型は少量ではあるがＩ型と同様の部位に存在することが多い。ＩＶ型は基底膜を形成するコラーゲンである。Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型はコラーゲン線維として生体内に存在し、主に組織あるいは器官の強度を保つ役割を果たしている。ＩＶ型は線維形成能力を有しないが、４分子で構成される網目状会合体を形成し、基底膜における細胞分化に関与しているとされる。
【００２１】
本発明で使用するバラマンディ（Ｌａｔｅｓ  ｃａｌｃａｒｉｆｅｒ）の鱗由来のコラーゲンはＩＩＩ型コラーゲンに類似の分子量分布を有するが、特に断らない限り、どのタイプのコラーゲンを含んでいてもよい。
【００２２】
本明細書で使用する場合、コラーゲン線維とは、バラマンディの鱗から抽出され得るコラーゲンの線維であって、少なくとも三重らせん構造を有する線維を意味する。
【００２３】
コラーゲン線維は、熱安定性の観点から、アミノ酸１０００残基あたりのヒドロキシプロリンが８０残基以上であるものが好ましい。バラマンディの鱗由来のコラーゲンにおけるヒドロキシプロリン含量は、８％以上と高含有であり、好ましい。この値はブタ皮膚由来のコラーゲンのヒドロキシプロリン含量には及ばないものの、魚コラーゲンとしては非常に含有量が高いといえる。
【００２４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合、通常、コラーゲンは２００ｋＤａ付近に１本のβ鎖のバンドを示し、そして１００ｋＤａ付近にα1鎖とα2鎖の２本のバンドを示す。一方、ゼラチンは３００ｋＤａ以下に広い分布を示す。また、ゼラチンはα鎖の分解が進んだ低分子量成分を多く有する。
【００２５】
本実施形態におけるコラーゲンは、その線維を構成するα1鎖とα2鎖の分子量の違いが５ｋＤａ以下であることを特徴とする。ブタ皮膚由来のＩ型コラーゲンなど、一般的なＩ型コラーゲンにおけるα1鎖とα2鎖の分子量は１０ｋＤａ以上であるのに対し、バラマンディの鱗由来のコラーゲンは、実施例に結果を示すとおり、α1鎖とα2鎖の分子量が約３．９ｋＤａと近いことを特徴としている。理論に拘束されることを意図するものではないが、α1鎖とα2鎖の分子量が近いバラマンディの鱗由来のコラーゲンは、ヘテロ３量体のＩ型よりも線維形成が活発なＩＩＩ型コラーゲンのようなホモ体に近い構造であると考えられる。
【００２６】
α1鎖とα2鎖の分子量の違いは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）等の、分子量に基づくタンパク質の分離に適した手法を用いることにより確認することができる。具体的には、分子量差は、分子量マーカーの各バンドの移動度と分子量との関係から検量線を作成し、検量線に各α鎖の移動度を適用することで算出可能である。
【００２７】
本実施形態におけるゲルは、ゲルを構成するモノマーとしての変性温度が高い、つまり、コラーゲン線維が３７．０℃で三重らせん構造を維持していることを特徴とする。例えば、ティラピアの鱗由来のコラーゲンの変性温度は約３５．７であるのに対し、バラマンディの鱗由来のコラーゲンの変性温度は約３６．１℃である。変性温度は円二色性スペクトル（ＣＤ）などの当業者に公知の手段で確認することができる。
【００２８】
ＣＤでコラーゲンを測定した場合、三重らせんに起因する２２１ｎｍの正のピークが確認できるが、ゼラチンではこのようなピークは見られない。
【００２９】
変性温度の高さに加え、本実施形態におけるゲルは貯蔵弾性率（Ｇ’）の観点でもティラピアの鱗由来のものより優れている。貯蔵弾性率は、レオメーターなどの動的粘弾性特性を評価できる装置を用いて決定することができる。本明細書で使用する場合、貯蔵弾性率（Ｇ’）は、特に断らない限り、０．２７重量％のコラーゲンを含むｐＨ７の水溶液を回転型レオメーターＭＣＲ３０２（Ａｎｔｏｎ−Ｐａａｒ社製）上で１０℃から３７℃まで昇温した場合の値を意味する。この条件で測定した場合、バラマンディの鱗を原料とするコラーゲン線維ゲルの貯蔵弾性率Ｇ’は９０Ｐａ以上である。同じ条件でバラマンディの鱗を原料とするコラーゲン線維ゲルの貯蔵弾性率を測定した場合、昇温による変性過程の軟化温度は４５℃以上である。この「軟化温度」とは、温度を３７℃で一定にした時に到達したＧ’の最後の１０分間の平均値が、昇温に伴い５％減少した時の温度である。
【００３０】
本発明のコラーゲン線維ゲルのコラーゲン濃度は用途に応じて適宜変更することができる。例えば、細胞などを培養するための培地に使用する場合、コラーゲンの濃度は０．２０％〜０．５３％の範囲であってもよい。コラーゲン濃度が０．２０％未満の場合、細胞の牽引力に抵抗する硬さを得ることが難しい。コラーゲン濃度が０．５３％以上の場合、ゲル作製に用いるコラーゲン水溶液の粘度が高いため、緩衝液等との混合が不十分となりゲルの均質性が損なわれる。ゲルの硬さは幹細胞の分化に影響するため（Ｅｖｅｎ−Ｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  １２６，  ６４５−６４７  （２００６））、ゲルの硬さが不均一だと細胞培養基材として好ましくない。
【００３１】
本発明のコラーゲン線維ゲルは、コラーゲン線維を構成しているコラーゲン分子間を架橋する方法により製造することができ、コラーゲン線維ゲルの弾性率を効果的に高められるという観点から、コラーゲンの線維化途上に架橋反応を起こす方法が好ましく用いられる。具体的方法としては、例えば、ｐＨ１〜５、好ましくはｐＨ３程度の、濃度３％以下のコラーゲン水溶液に、ｐＨ６〜１０、好ましくはｐＨ７程度のリン酸ナトリウム緩衝液を、原料となるコラーゲンの変性温度以下の温度（例えば１０℃程度）で混合し、所定のコラーゲン濃度を有する溶液を得た後、静置等する方法が挙げられる。緩衝液は任意に架橋剤を含んでもよい。
【００３２】
コラーゲン水溶液は、例えば鱗を原料として、酢酸などの酸やペプシンなどの酵素を用いた公知の抽出法により製造することができる。コラーゲン水溶液の濃度は、いったん沈殿もしくは乾燥させたコラーゲンを溶解する際のコラーゲン／溶媒の重量比により調節できる。コラーゲン濃度が３％を超えると粘度が高くなり、リン酸水素ナトリウム緩衝液との混合不十分により不均一なゲルが生じる場合があるので好ましくない。好ましい濃度は１％以下である。
【００３３】
緩衝液に架橋剤を含める場合の濃度は特に限定されない。しかしながら、架橋剤の濃度は、リン酸水素ナトリウム緩衝液中の濃度よりもむしろ、コラーゲン水溶液と混合した後の濃度（ゲル中の濃度）がゲル形成の成否やゲルの物性を左右する。コラーゲン線維ゲル中の架橋剤濃度は５〜８０ｍＭの範囲が好ましい。コラーゲン線維ゲル中の架橋剤濃度が５ｍＭ未満の場合、コラーゲン分子に架橋が導入されにくくなり、ゲルの弾性率が不足する場合があり好ましくない。一方、架橋剤濃度が８０ｍＭを超えると、コラーゲン水溶液とリン酸ナトリウム緩衝液混合後のゲル化速度が速過ぎて、成形性が悪化する場合があり好ましくない。より好ましくは１０〜３０ｍＭの範囲である。
【００３４】
ゲル化速度が速過ぎて成形性が悪い場合、必要に応じて、線維化抑制剤として塩化ナトリウムなどの無機塩を添加することができる。添加する無機塩の濃度は、コラーゲン線維ゲル中の濃度として３０〜１５０ｍＭの範囲が好ましい。ゲル中の無機塩の濃度が３０ｍＭ未満の場合、コラーゲンの線維化が速すぎてコラーゲン線維ネットワークが発達せず、ゲルが弱くなる場合がある。ゲル中の無機塩の濃度が１５０ｍＭを超える場合、コラーゲン線維化が抑制され、ゲルが弱くなる場合がある。より好ましくは５０〜１３０ｍＭの範囲である。
【００３５】
本発明のコラーゲン線維ゲルにおいて、コラーゲン分子間を架橋するために用いられる架橋剤は、タンパク質を架橋でき、水溶性を有するものであれば特に限定されるものではない。タンパク質の架橋剤については、文献（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  １８，  ｐ．９５−１０５  （１９９７））に詳細に記載されている。中でも、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド系架橋剤、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＥＤＣ）などのカルボジイミド系架橋剤、ヘキサメチレンジイソシアネートなどのイソシアネート系架橋剤、エチレングリコールジエチルエーテルなどのポリエポキシ系架橋剤が経済性、安全性および操作性の観点から好ましく用いられる。特に、ＥＤＣ、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド・スルホン酸塩などの水溶性カルボジイミドをｐＨ６〜１０のリン酸緩衝液に溶かした溶液として使用することが好ましい。
【００３６】
一方、ゼラチン分子は、熱変性により変化してランダムコイル構造をとるが、冷却によりらせん構造が回復し、近傍の分子どうしがらせん構造部分を共有して会合・凝集することにより、架橋ゲルを形成し得る。
【００３７】
上記コラーゲン線維ゲルを含む細胞培養基材は培養細胞の足場となるものであり、任意の培地に使用することができる。コラーゲン線維ゲルは三次元培養の培地として好適に使用される。細胞培養基材は単独で提供してもよいし、あるいは、細胞培養に必要な血清等の成分を含む培地やキットとして提供してもよい。細胞培養基材や培地は細胞培養用容器内に含めることができる。細胞培養用容器の種類については特に限定されないが、細胞培養用消耗品として広く用いられているプラスチック製のディッシュやプレートなどが好ましく用いられる。プラスチックとコラーゲンは親和性が低く、ガラス等に比べゲルを剥がしやすい。
【００３８】
本発明のコラーゲン線維ゲルを含む培地において、細胞を接着・増殖させ、あるいは必要に応じて分化させることができる。培養細胞は特に限定されず、例えば、体細胞、生殖細胞、幹細胞等に使用することができる。幹細胞としては、幹細胞胚性幹細胞や人工多能性幹細胞、あるいは間葉系幹細胞などの体性幹細胞が挙げられる。本発明のコラーゲン線維ゲルは、軟骨細胞のように、平面培養では脱分化しやすく長期継代培養が困難な細胞を培養するのに特に適している。
【００３９】
バラマンディの鱗からのコラーゲン抽出は公知の方法を用いて行うことができる。例えば、魚鱗を原料とし、酵素を用いてコラーゲンを可溶化処理する方法は当業者に公知であり、例えば、特許第４８６３４３３号公報及び特許第５６９２７７０号公報に記載されている。
【００４０】
例えば、抽出に使用する酵素としては、鱗を加水分解してコラーゲンを抽出できる酵素、例えば、ペプシンなどが好適に使用できる。酵素の添加量は、特に制限されないが、魚鱗の乾燥重量に対して１〜１５重量％とすることが好ましい。
【００４１】
抽出工程の前に、魚鱗に含まれるリン酸カルシウム等の無機物を取り除き、ひいては抽出効率を上げるために脱灰処理を行うことが好ましい。その他にも、鱗に含まれる不要なタンパク質や脂質を除去するために、鱗を特定の酸を含む水溶液や有機溶媒で洗浄してもよい。
【００４２】
魚鱗由来コラーゲンの取得方法は、魚鱗を脱灰する工程、脱灰された魚鱗に対して１５℃〜３５℃の温度範囲の酸性水溶液中でプロテアーゼを作用させる工程、および可溶化されたコラーゲンを回収する工程を含んでいてもよい。原料とする魚鱗は、腐敗を防ぐために採取後に冷蔵保存もしくは冷凍保存しておくことが好ましい。採取された魚鱗にはかなりの夾雑物、例えば背鰭、尾鰭等が付着・混入していたり、その表面に余剰タンパク質が付着している。そこで、保存前にこれらを取り除く目的で、原料とする魚鱗は採取された後に前処理として洗浄しておくことが好ましい。
【００４３】
具体的には、夾雑物は水洗することにより除去すればよく、表面に付着した余剰タンパク質は、例えば、１〜１５重量％、好ましくは５〜１０重量％の塩化ナトリウム水溶液、あるいは０．０１〜０．５Ｍ、好ましくは０．０５〜０．２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液で、１０〜７２時間、好ましくは２４〜４８時間洗浄することにより除去すればよい（アルカリ処理）。洗浄は、洗浄液を交換して繰り返し洗浄することが好ましく、特に、表面に付着した余剰タンパク質を除去する際には、洗浄後の廃液が濁らない程度まで、好ましくは３〜５回程度まで、洗浄液を交換して繰り返し洗浄するのが良い。
【００４４】
前記プロテアーゼ処理に用いるプロテアーゼ水溶液の溶媒としては、ｐＨが２〜５の範囲であれば特に限定されないが、安価で取り扱いが容易な塩酸、酢酸、およびリン酸が好ましく用いられる。酸の濃度は前記ｐＨによって規定される。
【００４５】
コラーゲン線維ゲルの製造においては、例えば、プロテアーゼ処理を１５℃〜３５℃の温度範囲の酸性水溶液中で行ってもよい。これにより、コラーゲンの変成を起こさずにコラーゲンの抽出効率を向上させ、高収率を実現することができる。温度が１５℃未満の場合、プロテアーゼ活性が低くなりコラーゲンの抽出効率が低下する場合が考えられ、好ましくない。温度が３５℃以上の場合、プロテアーゼ活性は高くなるものの、コラーゲンの変成が起こる場合が考えられ、好ましくない。従って、プロテアーゼ処理は１５℃〜３５℃の温度範囲で、より好ましくは２０〜３０℃の温度範囲で行う。
【００４６】
プロテアーゼ処理はプロテアーゼ失活に伴うコラーゲン可溶化能の低下とともに終了すれば良く、例えば、処理時間を１２〜４８時間程度とすればよい。また、抽出効率を高める目的で攪拌羽根などを用いて前記処理液を攪拌してもよい。
【００４７】
酸性水溶液に溶解したコラーゲンは、例えば、哺乳動物等由来のコラーゲン調製に従来から使用されている通常の物理的分離手段によって回収すればよく、その方法は特に限定されない。例えば、プロテアーゼ処理後に、遠心分離や濾過等の手段で魚鱗残渣と分離したコラーゲン水溶液に塩化ナトリウム等を加えて塩濃度を上昇させるか、もしくは水酸化ナトリウム等を加えてｐＨを中性付近に調整することにより、コラーゲンを線維化し、該線維化したコラーゲンを例えば遠心分離法等により分離回収すればよい。
【００４８】
その後、さらに必要に応じて、例えば精製水に再度溶解し、前記のような方法で線維化−回収操作を一回あるいは複数回繰り返して行うことにより、精製を行うこともできる。なお、コラーゲンの調製は、コラーゲンの変成を抑制するため、前記各前処理、回収、精製等の各工程を、可能な限り室温以下で実施することが好ましい。
【００４９】
第二の実施形態において、細胞培養基材は細胞培養用のキットとして提供される。
【００５０】
かかるキットにおいて、例えば、細胞培養基材は容器に収容されうる。このような容器の種類については特に限定されないが、広く用いられているプラスチック製のディッシュやプレートなどが好ましい。プラスチックとコラーゲンは親和性が低く、ガラスと比べゲルを剥がしやすいという利点もある。
【００５１】
容器には培養する細胞に適した培地を含めてもよい。培地の組成は、培養する組成により変化するため限定することを意図するものではないが、通常、無機塩類、各種アミノ酸、糖類、ビタミン類、更には血清などを含む。
【００５２】
以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５３】
＜実験＞
１．魚鱗からの可溶性コラーゲンの抽出
（１）魚鱗の前処理（アルカリ処理、ならびに脱灰処理）
バラマンディの鱗（Ａ．Ｏ．ＫＩＮＧＤＯＭ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＣＯ．，ＬＴＤから入手）を水で十分に洗浄し、鰭等の夾雑物を除去した後、風乾した。洗浄した乾燥魚鱗を０．１Ｍ  水酸化ナトリウム水溶液に浸漬し、攪拌羽根を用いて２４時間穏やかに攪拌した。金網で魚鱗をろ過し、水でｐＨが中性を示すまで繰り返し洗浄した。さらに、魚鱗をｐＨ２の希塩酸に浸漬した状態で２４時間穏やかに攪拌することで脱灰処理を行った。金網で魚鱗をろ過し、水でｐＨが中性を示すまで繰り返し洗浄し、凍結乾燥処理を行った。得られた凍結乾燥鱗を冷凍庫で保管したものをコラーゲン抽出に供した。
【００５４】
（２）魚鱗からのコラーゲン抽出
凍結乾燥鱗３５０ｇを３０００ｍＬの０．５Ｍ  酢酸水溶液に加え、攪拌羽根を用いて室温で３日間穏やかに攪拌した。この水溶液を遠心（１００００×ｇ，２０分）し、魚鱗を沈殿させた。上清を回収し、ガラス繊維フィルター（メルク株式会社製）ならびにメンブレンフィルター（メルク株式会社製。０．６５μｍに続いて０．４５μｍのものを使用した。）を用いて吸引ろ過を行い、酸可溶性成分を回収した。
【００５５】
続けて、金網で魚鱗をろ過し、水でｐＨが中性を示すまで繰り返し洗浄した。魚鱗を７ｇのペプシン（富士フイルム和光純薬社。ペプシン１ｇに対してタンパク１００ｇを加水分解できる活性を有する）を含む１０００ｍＬの０．５Ｍ  酢酸水溶液に加え、攪拌羽根を用いて室温で３日間穏やかに攪拌した。この水溶液を遠心（１００００×ｇ，２０分）し、魚鱗を沈殿させた。上清を回収し、ガラス繊維フィルター（メルク株式会社製）ならびにメンブレンフィルター（メルク株式会社製。０．６５μｍに続いて０．４５μｍのものを使用した。）を用いて吸引ろ過を行い、ペプシン処理成分を回収した。
【００５６】
（３）抽出したコラーゲンの精製
上記の酸可溶性成分、ペプシン処理成分に対し、それぞれ終濃度が０．９Ｍになるように塩化ナトリウム水溶液を加え、ガラス棒で混合した後、４℃で２４時間静置して塩析した。これを遠心（１００００×ｇ，２０分）し、沈殿物を３００ｍｌの０．５Ｍ  酢酸水溶液に溶解した。この塩析工程を３回繰り返し、コラーゲンの酢酸水溶液をセルロースチューブに入れて蒸留水に対して透析し、凍結乾燥した。脱灰処理した鱗の乾燥重量に対する抽出後の凍結乾燥体の重量から、コラーゲン抽出の収率を算出した。凍結乾燥体をｐＨ３の希塩酸に任意の濃度で溶解させて、酸可溶性コラーゲン、ペプシン抽出コラーゲンを調製した。
【００５７】
２．コラーゲンの構造解析
（１）アミノ酸組成による一次構造の確認
バラマンディ鱗由来のコラーゲン（ＢＣ）の１次構造を調べるためペプシン抽出コラーゲンについてアミノ酸自動分析を行った。コントロールとして、上記と同様の抽出方法で調製したティラピア鱗由来のペプシン抽出コラーゲン（ＴＣ）と、ブタ皮膚由来のペプシン抽出コラーゲン（ＰＣ−Ｓ）（新田ゼラチン社製。商品名「コラーゲンＢＭ」）を使用した。
測定は一般財団法人日本食品分析センターに依頼し、アミノ酸１０００残基に対する各アミノ酸組成を算出した。結果を以下の表に示す。
【表１】
2020058323.tif 000002
【００５８】
（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるコラーゲンの同定
上記１．（１）〜（３）で抽出・精製されたバラマンディ鱗のペプシン抽出コラーゲンの分子量分布を電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）によって調べた。泳動ゲルには３〜８％トリスアセテートゲル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。０．０６％濃度のコラーゲン溶液を１ウェルにつき１０μＬ量アプライし、ゲル１枚につき２０ｍＡの定電流で電気泳動を行った。コントロールとして、バラマンディ皮コラーゲン（ＢＣ−Ｓ）、セルキャンパスＡＱ−０３ＬＥ（ＴＣ）（ティラピア鱗由来コラーゲン、多木化学株式会社製）、Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ  ＴｙｐｅＩ−Ｐ（ＣＭＴ）（ブタ腱由来コラーゲン、新田ゼラチン株式会社製）を使用した。
【００５９】
分子量マーカーとしては、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ  Ｈｉｇｈ  Ｒａｎｇｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用い、泳動後のゲルはＱｕｉｃｋ−ＣＢＢ  ｐｌｕｓ（富士フイルム和光純薬社製）を用いて染色を行った。
【００６０】
結果を図１に示す。
【００６１】
図１に示すとおり、ブタ皮膚由来のコラーゲン（ＰＣ−Ｓ）、バラマンディ鱗由来のコラーゲン（ＢＣ）、バラマンディ皮由来のコラーゲン（ＢＣ−Ｓ）ともに、１２０ｋＤａ付近にα鎖、１２０ｋＤａ付近にα鎖、２４０ｋＤａ付近にβ鎖、２７０ｋＤａ以上の位置にγ鎖を示す泳動バンドが得られた。
【００６２】
ＢＣとＢＣ−Ｓのα鎖の泳動パターンは、鱗、皮ともにα1鎖とα2鎖間の距離が近いヘテロ３量体構造をしていることが示唆された。α1鎖とα2鎖間の分子量バンド距離が近いことは、バラマンディの鱗由来のコラーゲンがＩＩＩ型コラーゲンのようなホモ体に近い構造を有していることを示唆している。
【００６３】
図１に示す分子量差は、バラマンディ鱗由来のコラーゲン（ＢＣ）が約４.０ｋＤａ、バラマンディ皮由来のコラーゲン（ＢＣ−Ｓ）が約５．５ｋＤａ、ティラピア鱗由来のコラーゲン（ＴＣ）が約１１．０ｋＤａ、ブタ皮膚由来のコラーゲンが約１０．０ｋＤａであった。
【００６４】
このように、バラマンディ鱗由来コラーゲンは、処理方法を問わずブタ皮膚やティラピア鱗等に由来する一般的なＩ型コラーゲンの分子量差が１０ｋＤａ以上となるのに対し、分子量差が５．０ｋＤａ以下となることが分かった。
【００６５】
４．ゲル包埋細胞培養による評価
（１）ゲル包埋細胞培養
氷冷した０．３％  上記１．（１）〜（３）で抽出・精製されたバラマンディ鱗由来のペプシン抽出コラーゲン、５倍濃縮ＤＭＥ培養液（５ｘＤＭＥ，新田ゼラチン株式会社製）および再構成用緩衝液（新田ゼラチン株式会社製）を７：２：１の割合で混合し、コラーゲン溶液を調整した。その後、当該コラーゲン溶液にマウス由来線維芽細胞であるＮＩＨ３Ｔ３細胞を４．２×１０Ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度で分散し、２４ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり５００μｌずつ分注し、３７℃インキュベータ内で１時間ゲル化した。ゲル化後、１０％ＣＳ含有ＤＭＥＭ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ製）を加え、３７℃で培養を開始した。  コントロールとして、バラマンディ皮コラーゲン（ＢＣ−Ｓ）  、セルキャンパスＡＱ−０３Ａ（ＴＣ）（ティラピア鱗由来コラーゲン、多木化学株式会社製）、Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ  ＴｙｐｅＩ−Ａ（ＣＭＴ）
（ブタ腱由来コラーゲン、新田ゼラチン株式会社製）を使って同様の培養を行なった。
【００６６】
（３）染色によるゲル内細胞の生死判定
３．（１）で７日間培養した細胞が包埋されたゲルをＤＰＢＳ（−）（富士フイルム和光純薬株式会社製）で洗浄後、Ｃｅｌｌｓｔａｉｎ（登録商標）−Ｄｏｕｂｌｅ  ＳｔａｉｎｉｎｇＫｉｔ（同仁化学研究所製）を用いて３７℃で１５分間インキュベートし染色した。その後、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、ゲル内の生死細胞の分布を観察した。
【００６７】
結果を図２に示す。この二重染色法では、生細胞は細胞質がカルセインＡＭにより緑色に染まり、死細胞は細胞核が赤く染まる。バラマンディ鱗由来コラーゲン（ＢＣ）、バラマンディ皮由来コラーゲン（ＢＣ−Ｓ）、ティラピア鱗由来コラーゲン（ＴＣ）、ブタ腱由来コラーゲン（ＣＭＴ）で培養した細胞はいずれ緑色に染まっており、生存していることがわかる。
【００６８】
（４）染色によるゲル内細胞の細胞骨格観察
３．（１）で７日間培養した細胞が包埋されたゲルをＤＰＢＳ（−）（富士フイルム和光純薬株式会社製）で洗浄した。その後、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ製）を加え、３０分間室温で静置した後、再びＤＰＢＳ（−）で洗浄した。１００ｍＭ  Ａｃｔｉ−Ｓｔａｉｎ４８８（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｔｏｎ製）を加え、遮光かつ室温環境下６０分間静置し、ＤＰＢＳ（−）で洗浄し、染色した。その後、共焦点レーザー顕微鏡を用いてゲル内部の細胞骨格の形状を観察した。
【００６９】
その結果を図３に示す。この染色法では、細胞骨格である線維（ｆアクチン）が緑色に染まり、細胞形態が観察できる。バラマンディ鱗由来コラーゲン（ＢＣ）、ブタ腱由来コラーゲン（ＣＭＴ）で培養した細胞は紡錘形に大きく伸展していることに対し、バラマンディ皮由来コラーゲン（ＢＣ−Ｓ）、ティラピア鱗由来コラーゲン（ＴＣ）で培養した細胞は、伸展があまり見られず、細胞形態を支えているアクチン線維がばらばらになり、細胞形態が丸くなっていた。このことは、バラマンディ鱗由来コラーゲンが特異的に細胞接着性を高め、細胞形態を維持する効果を有することを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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