(57)【要約】【課題】動物実験を行わない、インフルエンザワクチンの適切な毒性評価方法を提供する。【解決手段】LA-4細胞株へ、評価対象の不活化インフルエンザワクチンを添加した際における遺伝子Irf7、MX2、Lgals3bp、Cxcl11、Psmb9、Lgals9、Zbp1、Ifi47、Tapbp、Psme1、及び、Trafd1の少なくとも何れか一つの発現量を測定し、毒性参照用インフルエンザワクチン添加時の発現量と比較することで、評価対象のインフルエンザワクチンの毒性をin vitroで評価する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
LA-4細胞株へ、評価対象の不活化インフルエンザワクチンを添加した際における遺伝子Irf7、MX2、Lgals3bp、Cxcl11、Psmb9、Lgals9、Zbp1、Ifi47、Tapbp、Psme1、及び、Trafd1の少なくとも何れか一つの発現量を測定し、毒性参照用インフルエンザワクチン添加時の発現量と比較することで、評価対象の不活化インフルエンザワクチンの毒性をin vitroで評価する毒性評価方法。
【請求項２】
LA-4細胞株へ、評価対象の不活化インフルエンザワクチンを添加した際における遺伝子Irf7、MX2、Lgals3bp、及び、Cxcl11の少なくとも何れか一つの発現量を測定し、毒性参照用インフルエンザワクチン添加時の発現量と比較することで、評価対象の不活化インフルエンザワクチンの毒性をin vitroで評価する請求項１記載の毒性評価方法。
【請求項３】
LA-4細胞株へ、不活化インフルエンザワクチン及び評価対象のアジュバントを添加した際における遺伝子Irf7、MX2、Lgals3bp、Cxcl11、Psmb9、Lgals9、Zbp1、Ifi47、Tapbp、Psme1、Trafd1及び、Timp1の少なくとも何れか一つの発現量を測定し、前記アジュバントを添加しない前記不活化インフルエンザワクチン添加時の発現量と比較することで、評価対象のアジュバントの毒性をin vitroで評価する毒性評価方法。
【請求項４】
LA-4細胞株へ、不活化インフルエンザワクチン及び評価対象のアジュバントを添加した際における遺伝子Irf7、Lgals3bp、及び、Lgals9の少なくとも何れか一つの発現量を測定し、前記アジュバントを添加しない前記不活化インフルエンザワクチン添加時の発現量と比較することで、評価対象のアジュバントの毒性をin vitroで評価する請求項３記載の毒性評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザワクチンのin vitroでの毒性評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンのロット毎の品質管理及びその安全性評価は、動物に接種した後にみられる生体変化（体重減少、体温変動、病理等）を指標に行われてきた(非特許文献１乃至４)。
【０００３】
しかし、近年、3R (Replacement（代替）Reduction（削減) Refinement（改善）)の観点から、動物を用いない代替試験法の開発が世界的に求められている(非特許文献５)。3Rは、動物愛護管理法が定める動物実験の国際原則である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】福島若葉ら，厚生労働科学研究費補助金（新型インフルエンザ等新興・再興感染症研究事業）ワクチンの有効性・安全性評価とVPD （vaccine preventable diseases） 対策への適用に関する分析疫学研究 平成26年度総括・分担研究報告書，pp15-26，2015
【非特許文献２】福島若葉ら，厚生労働科学研究費補助金（新型インフルエンザ等新興・再興感染症研究事業）ワクチンの有効性・安全性評価とVPD（vaccine preventable diseases）対策への適用に関する分析疫学研究 平成27年度総括・分担研究報告書，pp15-26，2016
【非特許文献３】Kiso M, et al.：PLoS Pathog. 2010；6(2)：e1000786
【非特許文献４】Itoh Y, et al.：Nature. 2009；460(7258)：1021-1025
【非特許文献５】鍵山直子、動物実験研究者必見動物実験の倫理指針と苦痛度評価、日本薬理学雜誌141(3), 141-149, 2013
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、動物実験を行わない、インフルエンザワクチンの適切な毒性評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明にかかる評価対象のインフルエンザワクチンの毒性をin vitroで評価する毒性評価方法は、LA-4細胞株へ、評価対象のインフルエンザワクチンを添加した際における遺伝子Irf7、MX2、Lgals3bp、Cxcl11、Psmb9、Lgals9、Zbp1、Ifi47、Tapbp、Psme1、及び、Trafd1の少なくとも何れか一つの発現量を測定し、毒性参照用インフルエンザワクチン添加時の発現量と比較することで、評価対象のインフルエンザワクチンの毒性をin vitroで評価する方法である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、in vitroでインフルエンザワクチンの適切な毒性評価が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】マウス肺上皮細胞株(LA-4)において、ワクチン濃度依存的に発現する遺伝子群を探索する図である。
【図２】ラット肺線維芽細胞株(JTC-19)において、ワクチン濃度依存的に発現する遺伝子群を探索する図である。
【図３】ラット肺上皮細胞株(L-2)において、ワクチン濃度依存的に発現する遺伝子群を探索する図である。
【図４】ヒト胎児気管支上皮細胞株(CCD-Br)において、ワクチン濃度依存的に発現する遺伝子群を探索する図である。
【図５】マウス肺上皮細胞株(LA-4)において、HAワクチン、およびアルミニウムアジュバント添加HAワクチンの濃度依存的に発現する遺伝子群を探索する図である。
【図６】マウス肺上皮細胞株(LA-4)において、低分子化合物アジュバント添加HAワクチンの濃度依存的に発現する遺伝子群を探索する図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００１０】
本実施形態にかかる発明においては、LA-4細胞株へ、評価対象のインフルエンザワクチンを添加した際における遺伝子Irf7、MX2、Lgals3bp、Cxcl11、Psmb9、Lgals9、Zbp1、Ifi47、Tapbp、Psme1、及び、Trafd1の少なくとも何れか一つの発現量を測定する。そして毒性参照用インフルエンザワクチン添加時の発現量と比較することで、評価対象のインフルエンザHAワクチンの毒性をin vitroで評価する。
【００１１】
LA-4細胞株は、マウス肺腺腫由来の細胞株である。インフルエンザワクチンは、インフルエンザウイルスをホルマリン等で処理して感染性を失わせたものを材料に調整されたワクチンである。インフルエンザウイルスは特に限定されるものでなく、A型又はB型の何れの型も含まれる。インフルエンザワクチンには、ウイルス粒子全体を不活性化した全粒子ワクチンと、全粒子ワクチン中に含まれる発熱に関係する物質をエーテル処理にて取り除いた成分ワクチンとが含まれる。
【００１２】
発現量が測定される遺伝子は、下記表１に示されるIrf7、MX2、Lgals3bp、Cxcl11、Psmb9、Lgals9、Zbp1、Ifi47、Tapbp、Psme1、及び、Trafd1の少なくとも何れか一つである。
【００１３】
【表１】
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【００１４】
LA-4細胞株へ、評価対象のインフルエンザワクチンを添加した際における発現量が測定される遺伝子は、Irf7、MX2、Lgals3bp、及び、Cxcl11の少なくとも何れか一つとすることが好ましい。
【００１５】
また、本実施形態にかかる発明においては、LA-4細胞株へ、インフルエンザワクチン及び評価対象のアジュバントを添加した際における遺伝子Irf7、MX2、Lgals3bp、Cxcl11、Psmb9、Lgals9、Zbp1、Ifi47、Tapbp、Psme1、Trafd1及び、Timp1の少なくとも何れか一つの発現量を測定し、そして、アジュバントを添加しないインフルエンザワクチン添加時の発現量、および毒性参照用インフルエンザワクチン添加時の発現量と比較することで、評価対象のアジュバントの毒性をin vitroで評価することも可能である。
【００１６】
また、好ましくは、本実施形態にかかる発明においては、LA-4細胞株へ、インフルエンザワクチン及び評価対象のアジュバントを添加した際における遺伝子Irf7、Lgals3bp、及び、Lgals9の少なくとも何れか一つの発現量を測定し、そして、アジュバントを添加しないインフルエンザワクチン添加時の発現量、および毒性参照用インフルエンザワクチン添加時の発現量と比較することで、評価対象のアジュバントの毒性をin vitroで評価することも可能である。
【００１７】
評価対象のアジュバントは、特に限定されるものではないが、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム等のアルミニウム塩、低分子化合物アジュバント、キトサン、オリゴデオキシヌクレオチド、水中油型エマルジョン等が挙げられる。
【実施例】
【００１８】
1.発現量の濃度依存が見られる培養細胞と遺伝子の組み合わせ
所定の培養細胞へ評価対象の不活化インフルエンザワクチンを添加した際、添加したワクチン濃度に依存して発現する遺伝子セットの探索を行った。
【００１９】
1-1.マウス肺上皮細胞株(LA-4)
所定の培養細胞としてマウス肺上皮細胞株(LA-4)を選択した。細胞株LA-4はHam’s F12培地に2mM L-グルタミン、1% 非必須アミノ酸、15％ ウシ胎仔血清を添加した培地（継代用培地）にて、37℃、5%CO2の環境下で継代維持した。実験日の前日に細胞を0.25% トリプシン-EDTA溶液にて処理し、ポリスチレンでコーティングされた96ウェル平底プレートに0.5〜1x104 cells/wellの濃度で継代した。実験日に80% confluent程度であることを目視で確認した。細胞に添加するワクチンは、毒性参照用インフルエンザワクチン(全粒子不活化インフルエンザワクチン、以下「RE」と記すことがある、Lot 4, 平成19年2月25日)であった。ワクチンは1ウェル当たり50uLとなるように希釈系列を準備し、継代用培地50uL、ウシ胎仔血清7.5uLと混合した(添加用培地)。96ウェルプレート内の継代用培地を除いて添加用培地と交換し、37℃、5%CO2の環境下にて細胞を培養した。1日後に添加用培地を除き、細胞を専用の試薬で可溶化させ、マーカー遺伝子の発現解析を行った。結果を図１に示す。図１に示されるように、マウス肺上皮細胞株(LA-4)では、Irf7、MX2、Lgals3bp、Cxcl11、Psmb9、Lgals9、Zbp1、Ifi47、Tapbp、Psme1、及び、Trafd1が、ワクチン濃度依存的に発現することが判明した。なお、ワクチン濃度が0.25 U/mL以上になると発現量が減少するのは細胞自体が死亡することに起因する。
【００２０】
1-2.ラット肺線維芽細胞株(JTC-19)
所定の培養細胞としてマウス肺上皮細胞株(LA-4)の代わりにラット肺線維芽細胞株(JTC-19)を使用する以外は、上記の1-1.マウス肺上皮細胞株(LA-4)と同様に実験を行った。結果を図２に示す。図２に示されるように、ラット肺線維芽細胞株(JTC-19)では、明確なワクチン濃度依存的に発現する遺伝子セットを見出すことはできなかった。
【００２１】
1-3.ラット肺上皮細胞株(L-2)
所定の培養細胞としてマウス肺上皮細胞株(LA-4)の代わりにラット肺上皮細胞株(L-2)を使用する以外は、上記の1-1.マウス肺上皮細胞株(LA-4)と同様に実験を行った。結果を図３に示す。図３に示されるように、ラット肺上皮細胞株(L-2)では、明確なワクチン濃度依存的に発現する遺伝子を複数見出すことはできなかった。
【００２２】
1-4.ヒト胎児気管支上皮細胞株(CCD-Br)
所定の培養細胞としてマウス肺上皮細胞株(LA-4)の代わりにヒト胎児気管支上皮細胞株(CCD-Br)を使用する以外は、上記の1-1.マウス肺上皮細胞株(LA-4)と同様に実験を行った。結果を図４に示す。図４に示されるように、ヒト胎児気管支上皮細胞株(CCD-Br)では、明確なワクチン濃度依存的に発現する遺伝子セットを複数見出すことはできなかった。
【００２３】
1-5.
以上より、LA-4細胞株を使用する場合に、添加したワクチン濃度に依存して発現する遺伝子セットとして、Irf7、MX2、Lgals3bp、Cxcl11、Psmb9、Lgals9、Zbp1、Ifi47、Tapbp、Psme1、及び、Trafd1を見出した。
【００２４】
2.アジュバント添加ワクチンの毒性評価試験
2-1.アジュバントを添加しない場合のワクチンの毒性評価試験
マウス肺上皮細胞株(LA-4)をHam’s F12培地に2mM L-グルタミン、1% 非必須アミノ酸、15％ ウシ胎仔血清を添加した培地（継代用培地）にて、37℃、5%CO2の環境下で継代維持した。実験日の前日に細胞を0.25% トリプシン-EDTA溶液にて処理し、ポリスチレンでコーティングされた96ウェル平底プレートに0.5〜1x104cells/wellの濃度で継代した。実験日に80% confluent程度であることを目視で確認した。細胞に添加するワクチンは、インフルエンザHAワクチン、および毒性参照用インフルエンザワクチン(全粒子不活化インフルエンザワクチン  Lot 4, 平成19年2月25日)であった。ワクチンは1ウェル当たり50uLとなるように準備し、継代用培地50uL、ウシ胎仔血清7.5uLと混合した(添加用培地)。96ウェルプレート内の継代用培地を除いて添加用培地と交換し、37℃、5%CO2の環境下にて細胞を培養した。1日後に添加用培地を除き、細胞を専用の試薬で可溶化させ、マーカー遺伝子の発現解析を行った。
【００２５】
2-2.アルミニウムアジュバントを添加した場合のワクチンの毒性評価試験
次に、マウス肺上皮細胞株(LA-4)をHam’s F12培地に2mM L-グルタミン、1% 非必須アミノ酸、15％ ウシ胎仔血清を添加した培地（継代用培地）にて、37℃、5%CO2の環境下で継代維持した。実験日の前日に細胞を0.25% トリプシン-EDTA溶液にて処理し、ポリスチレンでコーティングされた96ウェル平底プレートに0.5〜1x104cells/wellの濃度で継代した。実験日に80% confluent程度であることを目視で確認した。細胞に添加するワクチンは、インフルエンザHAワクチン、および毒性参照用インフルエンザワクチン(全粒子不活化インフルエンザワクチン  Lot 4, 平成19年2月25日)であった。細胞に添加するアジュバントは、水酸化アルミニウムアジュバントであった。アジュバント添加HAワクチンはそれぞれ1ウェル当たり50uLとなるように希釈系列を準備し、継代用培地50uL、ウシ胎仔血清7.5uLと混合した(添加用培地)。96ウェルプレート内の継代用培地を除いて添加用培地と交換し、37℃、5%CO2の環境下にて細胞を培養した。1日後に添加用培地を除き、細胞を専用の試薬で可溶化させ、マーカー遺伝子の発現解析を行った。
【００２６】
結果を図５に示す。図５に示されるように、Lgals9、Lgals3bp、Irf7、MX2、Tapbp、及び、Trafd1が、アジュバント添加HAワクチンの濃度依存的に発現することが判明した。また、インフルエンザHAワクチン及びアジュバントを投与した場合の遺伝子発現量が、毒性参照用インフルエンザワクチンのみを投与した場合の遺伝子発現量を超える場合は、そのアジュバントの毒性は低いものではないと判断できた。
【００２７】
2-3.低分子化合物アジュバントを添加した場合のワクチンの毒性評価試験
次に、マウス肺上皮細胞株(LA-4)をHam’s F12培地に2mM L-グルタミン、1% 非必須アミノ酸、15％ ウシ胎仔血清を添加した培地（継代用培地）にて、37℃、5%CO2の環境下で継代維持した。実験日の前日に細胞を0.25% トリプシン-EDTA溶液にて処理し、ポリスチレンでコーティングされた96ウェル平底プレートに0.5〜1x104cells/wellの濃度で継代した。実験日に80% confluent程度であることを目視で確認した。細胞に添加するワクチンは、インフルエンザHAワクチン、および毒性参照用インフルエンザワクチン(全粒子不活化インフルエンザワクチン  Lot 4, 平成19年2月25日)であった。細胞に添加するアジュバントは、フラボノイドの一種であるDMXAA(5-6-dimethylxanthenone-4-acetic acid)であった。なおDMXAAはSTINGリガンドとして自然免疫を活性化し、アルミニウム塩アジュバント（Alum）以上の強いアジュバント活性を示す傾向がある。
【００２８】
アジュバント添加HAワクチンはそれぞれ1ウェル当たり50uLとなるように希釈系列を準備し、継代用培地50uL、ウシ胎仔血清7.5uLと混合した(添加用培地)。96ウェルプレート内の継代用培地を除いて添加用培地と交換し、37℃、5%CO2の環境下にて細胞を培養した。1日後に添加用培地を除き、細胞を専用の試薬で可溶化させ、マーカー遺伝子の発現解析を行った。
【００２９】
結果を図６に示す。図６に示されるように、Lgals9、Lgals3bp、Irf7、Psme1、及び、Timp1が、アジュバント添加HAワクチンの濃度依存的に発現することが判明した。また、インフルエンザHAワクチン及びアジュバントを投与した場合の遺伝子発現量が、毒性参照用インフルエンザワクチンのみを投与した場合の遺伝子発現量を超える場合は、そのアジュバントの毒性は低いものではないと判断できた。
【００３０】
3.評価対象のワクチンの毒性評価試験
所定の培養細胞としてマウス肺上皮細胞株(LA-4)を選択した。細胞株LA-4はHam’s F12培地に2mM L-グルタミン、1% 非必須アミノ酸、15％ ウシ胎仔血清を添加した培地（継代用培地）にて、37℃、5%CO2の環境下で継代維持した。実験日の前日に細胞を0.25% トリプシン-EDTA溶液にて処理し、ポリスチレンでコーティングされた96ウェル平底プレートに0.5〜1x104 cells/wellの濃度で継代した。実験日に80% confluent程度であることを目視で確認した。細胞に添加する評価対象のインフルエンザHAワクチン、および毒性参照用インフルエンザワクチン(全粒子不活化インフルエンザワクチン、Lot 4, 平成19年2月25日)は1ウェル当たり50uLとなるように準備し、継代用培地50uL、ウシ胎仔血清7.5uLと混合した(添加用培地)。96ウェルプレート内の継代用培地を除いて添加用培地と交換し、37℃、5%CO2の環境下にて細胞を培養した。1日後に添加用培地を除き、細胞を専用の試薬で可溶化させ、マーカー遺伝子の発現量を比較したところ、インフルエンザHAワクチン添加時のマーカー遺伝子の発現量は毒性参照用インフルエンザワクチン添加時のマーカー遺伝子の発現量を超えなかった。（図5のHAとRE）この結果から評価対象のインフルエンザHAワクチンの毒性は強いものではなく安全性は認められるものと判断できた。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
インフルエンザワクチンの毒性評価に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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