(57)【要約】【課題】  乳房において、黄色ブドウ球菌の接触直後から、当該細菌に対する抗体の力価を増強することにより、ウシの乳房炎を予防するワクチン組成物を提供すること。【解決手段】  黄色ブドウ球菌由来の抗原と、カチオン性の官能基及び疎水性の官能基を側鎖に有する多糖からなるナノゲルとを含む、ウシ乳房炎を予防するための、粘膜ワクチン組成物。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
黄色ブドウ球菌由来の抗原と、疎水性の官能基及びカチオン性の官能基が側鎖として付加されている多糖からなるナノゲルとを含む、ウシ乳房炎を予防するための、粘膜ワクチン組成物。
【請求項２】
前記疎水性の官能基がコレステリル基である、請求項１に記載の粘膜ワクチン組成物。
【請求項３】
前記多糖がプルランである、請求項１又は２に記載の粘膜ワクチン組成物。
【請求項４】
前記カチオン性の官能基がアミノ基である、請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の粘膜ワクチン組成物。
【請求項５】
黄色ブドウ球菌由来の抗原を経鼻投与するための、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の粘膜ワクチン組成物。
【請求項６】
ウシ乳房炎を予防するための方法であって、
ウシの粘膜に、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の粘膜ワクチン組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項７】
ウシ乳房炎を予防するための方法であって、
ウシの鼻腔内粘膜に、請求項１〜５のうちのいずれか一項に記載の粘膜ワクチン組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項８】
前記経鼻ワクチン組成物が投与される鼻腔内粘膜が、鼻腔内深部の咽頭扁桃である、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウシ乳房炎を予防するために用いられる粘膜ワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳房炎（乳腺炎）は、細菌が乳房の乳頭口から乳腺内に侵入し、乳腺内で定着して増殖を繰り返すことにより、乳腺細胞が傷付き炎症が生じる、感染性の疾患である。
【０００３】
乳牛の乳房炎は、日本を含め世界各国至る所の乳生産現場で生じ、またその発生頻度も高い。乳房炎に罹患した牛の乳は、その質及び量が低下する。また、乳房炎に対しては抗生物質を用いた治療が通常行なわれるため、治療期間中の抗生物質が残存する牛乳は、出荷することができない。さらに、抗生物質による治療が功を奏しない場合には、採算が合わないとして廃用牛扱いとなり、処分に至ることもある。そのため、乳房炎は、酪農業における経済的損失の主な原因となっており、その予防方法の開発が強く求められている。
【０００４】
乳房炎は、様々な細菌種によって引き起こされる複合的な疾患であるが、それら細菌種の中で、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）が最もよく見られる。そこで、乳房炎の予防等を目的として、当該細菌を標的とするワクチンが開発されている（特許文献１）。
【０００５】
また既に、ＳＴＡＲＴＶＡＣ（登録商標、ＨＩＰＲＡ社）、Ｌｙｓｉｇｉｎ（登録商標、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ社）等の、黄色ブドウ球菌を標的とするワクチンが、市販されている。
【０００６】
しかしながら、これら筋肉注射型ワクチンの多くは、血清中のＩｇＧの抗体価を増加させるものであって、細菌感染防御に資するＩｇＧ以外の抗体（ＩｇＡ等）の乳腺における抗体価は上昇せず、細胞性免疫応答も十分に誘導できない。
【０００７】
また、黄色ブドウ球菌は、極めて早い段階で乳腺上皮細胞に侵入してしまい、その結果、当該細菌が抗体による免疫学的攻撃を受けにくい状態となってしまう。
【０００８】
そのため、乳腺において黄色ブドウ球菌の接触直後からＩｇＡ等の抗体価を増強し、当該細菌の感染を効果的に抑制することのできるワクチンの開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００９−２８６７３０号公報
【特許文献２】特開２０１５−１５１３７５号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｂｏｅｒｈｏｕｔ  Ｅ．ら、Ｖｅｔ  Ｒｅｓ．２０１５年９月２８日；４６：１１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、乳房（乳腺、及びそれから分泌される乳汁等）において、黄色ブドウ球菌の接触直後から、当該細菌に対する抗体（ＩｇＡ等）の力価を増強することにより、乳房炎を予防することのできるワクチン組成物を、提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、前記課題を解決すべく、粘膜ワクチンに着目した。粘膜は、その表面上で免疫反応を誘導し、細菌等の病原体に対する最初の重要な防衛ラインとして機能する。例えば、粘膜は、病原体の体内への侵入を阻害し、また病原体を不活性化するため、当該病原体に対するＩｇＡ等の抗体を分泌する。また、ある粘膜組織において誘導されたＩｇＡ等の産生細胞は、離れた他の粘膜組織に伝播し、当該組織においても前記病原体に対する特異的な粘膜免疫反応が惹起され得る。
【００１３】
粘膜ワクチンは、このような粘膜組織間における免疫反応の伝播を利用するものであり、本発明者らは、当該ワクチンを用いることによって、ウシ乳腺の粘膜組織において黄色ブドウ球菌に対する免疫反応を惹起することを構想した。
【００１４】
また、粘膜に単に抗原を投与しても、免疫原性は通常低い。そのため、粘膜ワクチンを機能させるためには、担体（ベクター、デリバリーシステム等）、強力なアジュバントが必要となる。そこで、本発明者らは、ウシ乳腺の粘膜組織において免疫反応を惹起するワクチンの担体として、カチオン性のナノゲルに着目した。
【００１５】
カチオン性のナノゲルに関しては従前、プルランに側鎖として疎水性のコレステロールとアミノ基を付加したナノゲル（ｃＣＨＰナノゲル）と、肺炎球菌の表面タンパク質（ＰｓｐＡ）との複合体を含むワクチンを、げっ歯類及び霊長類に経鼻投与することによって、肺炎球菌の感染に対する免疫防御機構を誘導することに、本発明者らは成功している（特許文献２）。しかしながら、ウシ等の反芻動物において有効であるか、特に乳腺の粘膜組織において免疫反応を惹起できるかは定かではなかった。
【００１６】
さらに、従前、水中油型乳化剤、アルギン酸ハイドロゲル、並びに黄色ブドウ球菌由来の抗原性タンパク質（Ｅｆｂ及びＬｕｋＭ）からなるワクチンを鼻腔にスプレーで噴霧しても、乳汁のみならず、鼻汁においても、当該抗原性タンパク質特異的ＩｇＡ産生レベルに影響はなかったということ等が報告されており、上述の筋肉注射型ワクチンのみならず、粘膜ワクチンによっても、ウシの乳腺において細菌感染防御に資するＩｇＡ等の抗体価は上昇せず、細胞性免疫応答も十分に誘導できないということが示唆されていた（非特許文献１）。
【００１７】
そこで実際に、ホルマリンにて不活性化した黄色ブドウ球菌と前記ｃＣＨＰナノゲルとの複合体を調製し、それをウシの鼻腔内粘膜に投与した。その結果、前記従前の報告とは異なり、当該ウシの乳汁、すなわちそれを分泌する乳腺（乳房）において、黄色ブドウ球菌に対するＩｇＡ抗体の力価が増強されることが明らかになった。
【００１８】
また、前記鼻腔免疫したウシの乳房に黄色ブドウ球菌を接種した場合、当該接種によって黄色ブドウ球菌に対するＩｇＡ抗体の力価は上昇し、黄色ブドウ球菌の増殖が抑制されることを見出した。すなわち、黄色ブドウ球菌由来の抗原とカチオン性ナノゲルとの複合体を含む粘膜ワクチン組成物で感作することによって、乳房内における黄色ブドウ球菌の増殖の抑制を介して、ウシの乳房炎の予防が可能となるということが、明らかになった。
【００１９】
さらに、前記接種直後から、黄色ブドウ球菌のＣｌｆＡタンパク質に対するＩｇＡ抗体の力価が上昇することも見出した。ＣｌｆＡタンパク質は、黄色ブドウ球菌の膜タンパク質の１種であり、ウシ乳腺上皮細胞表面のＡｎｎｅｘｉｎＡ２タンパク質と結合することにより、黄色ブドウ球菌の当該上皮細胞内への侵入過程を媒介することが知られている（Ａｓｈｒａｆ  Ｓ．ら、Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．、２０１７年１月１９日；７：４０６０８  参照）。また、ウシの乳房炎において、黄色ブドウ球菌が感染早期に乳腺上皮細胞に侵入し、その結果、当該細菌が抗体による免疫学的攻撃を受けにくい状態になることも知られている（Ａｌｍｅｉｄａ  ＲＡ．ら、Ｊ  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．、１９９６年、７９（６）：１０２１〜１０２６ページ  参照）。
【００２０】
したがって、黄色ブドウ球菌由来の抗原とカチオン性ナノゲルとの複合体を含む粘膜ワクチン組成物で感作したウシにおいては、黄色ブドウ球菌が接触した時から、力価の高いＣｌｆＡタンパク質に対する抗体が産生され、当該細菌の乳腺上皮細胞への侵入を抑制することができる。
【００２１】
以上から、本発明者らは、前記ワクチン組成物によって、黄色ブドウ球菌の感染から効果的に防御し、乳房炎を予防することが可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２２】
すなわち、本発明は、ウシ乳房炎を予防するための粘膜ワクチン組成物、及び該組成物を用いたウシ乳房炎の予防方法に関し、より具体的には以下を提供するものである。
＜１＞  黄色ブドウ球菌由来の抗原と、疎水性の官能基及びカチオン性の官能基が側鎖として付加されている多糖からなるナノゲルとを含む、ウシ乳房炎を予防するための、粘膜ワクチン組成物。
＜２＞  前記疎水性の官能基がコレステリル基である、＜１＞に記載の粘膜ワクチン組成物。
＜３＞  前記多糖がプルランである、＜１＞又は＜２＞に記載の粘膜ワクチン組成物。
＜４＞  前記カチオン性の官能基がアミノ基である、＜１＞〜＜３＞のうちのいずれか一項に記載の粘膜ワクチン組成物。
＜５＞  黄色ブドウ球菌由来の抗原を経鼻投与するための、＜１＞〜＜４＞のうちのいずれか一項に記載の粘膜ワクチン組成物。
＜６＞  ウシ乳房炎を予防するための方法であって、ウシの粘膜に、＜１＞〜＜４＞のうちのいずれか一項に記載の粘膜ワクチン組成物を投与する工程を含む、方法。
＜７＞  ウシ乳房炎を予防するための方法であって、ウシの鼻腔内粘膜に、＜１＞〜＜５＞のうちのいずれか一項に記載の粘膜ワクチン組成物を投与する工程を含む、方法。
＜８＞  前記経鼻ワクチン組成物が投与される鼻腔内粘膜が、鼻腔内深部の咽頭扁桃である、＜７＞に記載の方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の粘膜ワクチン組成物によれば、乳房において、黄色ブドウ球菌の接触直後から、当該細菌に対する抗体（ＩｇＡ等）の力価を増強することができる。そして、この力価が増強される抗体には、ウシの乳腺上皮細胞内への侵入に関与する、黄色ブドウ球菌のＣｌｆＡタンパク質に対する抗体が含まれている。このため、本発明によれば、ウシの乳房炎を早期かつ効果的に予防することのできるワクチン組成物を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ホルマリン殺菌黄色ブドウ球菌（ＦＫＳＡ）及びカチオン性ナノゲルとの複合体を用い鼻腔免疫した後の、乳汁における黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対するＩｇＡ抗体価の推移を示すグラフである。図中の、各データの点（黒丸）は、各鼻腔免疫した乳牛から搾取した乳汁における抗体価を示す（３頭の乳牛の１２の乳房から搾取された乳汁  ｎ＝１２）。横軸に付した黒三角は、鼻腔免疫のタイミングを示す。アスタリスク（＊）は、０日目、免疫１〜６週間後の各グループの平均値間において有意差が認められたことを示す（Ｐ＜０．０５）。
【図２】鼻腔免疫した乳牛と非免疫乳牛間で、乳汁における黄色ブドウ球菌に対するＩｇＡ抗体価を比較した結果を示す、グラフである。図中、黒丸は、各鼻腔免疫した乳牛から搾取した乳汁における抗体価を示す（３頭の乳牛の１２の乳房  ｎ＝１２）。白丸は、免疫しなかった乳牛から搾取した乳汁における抗体価を示す（３頭の乳牛の１２の乳房  ｎ＝１２）。バーは平均値を示す。アスタリスク（＊）は、グループ間において有意差が認められたことを示す（Ｐ＜０．０５）。
【図３Ａ】モック（ＰＢＳ）を乳房に注入した乳牛の乳汁における、黄色ブドウ球菌に対するＩｇＡ抗体価を分析した結果を示す、グラフである。図中、黒丸は、鼻腔免疫した乳牛から搾取した各乳汁における抗体価を示す（３頭の乳牛の６の乳房  ｎ＝６）。白丸は、免疫しなかった乳牛から搾取した各乳汁における抗体価を示す（３頭の乳牛の６の乳房  ｎ＝６）。バーは平均値を示す。「０日目」及び「１週間後」は、各々ＰＢＳ注入前及びＰＢＳを注入してから１週間後を示す。
【図３Ｂ】黄色ブドウ球菌を乳房に注入した乳牛の乳汁における、黄色ブドウ球菌に対するＩｇＡ抗体価を分析した結果を示す、グラフである。図中、黒丸は、鼻腔免疫した乳牛から搾取した各乳汁における抗体価を示す（３頭の乳牛の６の乳房  ｎ＝６）。白丸は、免疫しなかった乳牛から搾取した各乳汁における抗体価を示す（３頭の乳牛の６の乳房  ｎ＝６）。バーは平均値を示す。「０日目」及び「１週間後」は、各々黄色ブドウ球菌注入前及び黄色ブドウ球菌を注入してから１週間後を示す。アスタリスク（＊）は、０日目と注入１週間後とにおいて有意差が認められたことを示す（Ｐ＜０．０５）。
【図４】乳房に黄色ブドウ球菌を注入してから１週間後の乳牛の乳汁における黄色ブドウ球菌量を比較した結果を示す、グラフである。図中、黒丸は、各鼻腔免疫した乳牛から搾取した乳汁における菌量を示す（３頭の乳牛の６の乳房  ｎ＝６）。白丸は、免疫しなかった乳牛から搾取した乳汁における菌量を示す（３頭の乳牛の６の乳房  ｎ＝６）。バーは平均値を示す。アスタリスク（＊）は、グループ間において有意差が認められたことを示す（Ｐ＜０．０５）。
【図５】黄色ブドウ球菌を乳房に注入してから１週間後の乳牛の乳汁における、黄色ブドウ球菌量と、当該細菌に対するＩｇＡ抗体の力価との相関を示す、グラフである。図中、黒丸は、各鼻腔免疫した乳牛から搾取した乳汁についてのデータを示す（３頭の乳牛の６の乳房  ｎ＝６）。白丸は、免疫しなかった乳牛から搾取した乳汁についてのデータを示す（３頭の乳牛の６の乳房  ｎ＝６）。統計的相関は、非線形回帰分析にて決定し、Ｐ＜０．０１を統計学上非常に有意とした。
【図６】ＦＫＳＡと、カチオン性ナノゲルあるいはポリアクリル酸ナトリウムとの複合体を用い鼻腔免疫した後（３回の投与後、１回目の免疫から６週間後）、乳牛の乳汁における、ＣｌｆＡタンパク質に対するＩｇＡ抗体の力価を示す、グラフである。図中、黒丸は、ＦＫＳＡ及びカチオン性ナノゲルとの複合体を用い鼻腔免疫した乳牛から搾取した各乳汁における抗体価を示す（３頭の乳牛の１２の乳房  ｎ＝１２）。灰色丸は、ＦＫＳＡ及びポリアクリル酸ナトリウムとの複合体を用い各鼻腔免疫した乳牛から搾取した各乳汁における抗体価を示す（１頭の乳牛の４の乳房  ｎ＝４）。白丸は、免疫しなかった乳牛から搾取した各乳汁における抗体価を示す（３頭の乳牛の１２の乳房  ｎ＝１２）。バーは平均値を示す。アスタリスク（＊）は、グループ間において有意差が認められたことを示す（Ｐ＜０．０５）。
【図７Ａ】モック（ＰＢＳ）を乳房に注入した乳牛の乳汁における、ＣｌｆＡに対するＩｇＡ抗体価の推移を示す、グラフである。図中、黒丸は、ＦＫＳＡ及びカチオン性ナノゲルとの複合体を用い鼻腔免疫した乳牛から搾取した乳汁における抗体価を示す（３頭の乳牛の６の乳房  ｎ＝６）。白丸は、免疫しなかった乳牛から搾取した乳汁における各抗体価を示す（３頭の乳牛の６の乳房  ｎ＝６）。バーは平均値を示す。横軸の数値は、ＰＢＳを注入してからの経過週数を示す（なお「０」はＰＢＳ注入前を示す）。
【図７Ｂ】黄色ブドウ球菌を乳房に注入した乳牛の乳汁における、ＣｌｆＡに対するＩｇＡ抗体価の推移を示す、グラフである。図中、黒丸は、ＦＫＳＡ及びカチオン性ナノゲル複合体を用い鼻腔免疫した乳牛から搾取した各乳汁における抗体価を示す（３頭の乳牛の６の乳房  ｎ＝６）。白丸は、免疫しなかった乳牛から搾取した各乳汁における抗体価を示す（３頭の乳牛の６の乳房  ｎ＝６）。バーは平均値を示す。横軸の数値は、黄色ブドウ球菌を注入してからの経過週数を示すす（なお「０」は黄色ブドウ球菌注入前を示す）。
【図７Ｃ】黄色ブドウ球菌を乳房に注入した乳牛の乳汁における、ＣｌｆＡに対するＩｇＡ抗体価の推移を示す、グラフである。図中、黒丸は、ＦＫＳＡ及びポリアクリル酸ナトリウムとの複合体を用い鼻腔免疫した乳牛から搾取した各乳汁における抗体価を示す。白丸は、モック（ＰＢＳ）を乳房に注入した乳牛の乳汁における抗体価を示す（１頭の乳牛の２の乳房  ｎ＝２）。横軸の数値はＰＢＳあるいは黄色ブドウ球菌を注入してからの経過週数を示す（なお「０」はＰＢＳあるいは黄色ブドウ球菌の注入前を示す）。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（粘膜ワクチン組成物）
本発明の粘膜ワクチン組成物は、黄色ブドウ球菌由来の抗原と、疎水性の官能基及びカチオン性の官能基が側鎖として付加されている多糖からなるナノゲルとを含むことを特徴とする。
【００２６】
本発明において、「黄色ブドウ球菌」は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（スタフィロコッカス・アウレウス）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓとも称される、通性嫌気性のグラム陽性球菌（ブドウ球菌）の１種であって、ウシの乳腺内に侵入して定着し、増殖することによって炎症反応を誘導できる菌を意味する。本発明において用いられる「黄色ブドウ球菌」は、市販されている菌株、各種の研究機関に保存されている菌株（例えば、ＢＭ１００６株、ＳＡ００３株、ＪＥ２株）でもよく、また乳房炎に罹患したウシの乳汁より分離された黄色ブドウ球菌であってもよい。
【００２７】
本発明において、粘膜ワクチン組成物の有効成分である「黄色ブドウ球菌由来の抗原」は、ウシの粘膜に投与することによって当該細菌に対する抗体の産生を誘発する性質（いわゆる、免疫原性）を有していればよく、特に制限はないが、生菌であると、それを被覆している後述のナノゲルが、当該菌の増殖に伴い喪失し易くなり、またワクチン接種による副作用が生じ難いという観点から、不活性化した黄色ブドウ球菌又はその一部が、本発明にかかる抗原として好適に用いられる。
【００２８】
不活性化した黄色ブドウ球菌の調製は、例えば、ホルマリン処理、フェノール処理、加熱処理、紫外線照射処理等の公知の手法を用い、適宜行なうことができる。また、不活性化した黄色ブドウ球菌の「一部」としては、免疫原性を有する限り特に制限はなく、例えば、黄色ブドウ球菌を超音波処理等の物理的処理に供することによって得られる当該菌の断片、黄色ブドウ球菌を加水分解酵素（リゾスタフィン等）を用いた酵素処理に供することによって得られる当該菌の分解産物であってもよい。また、免疫原性を有する限り、黄色ブドウ球菌のタンパク質、ポリペプチド、糖、糖タンパク質、脂質、核酸等も抗原として用いることができる。これらタンパク質等は、黄色ブドウ球菌から単離精製されたものであってもよく、また人工的に合成（例えば、化学合成）されたものであってもよい。
【００２９】
本発明の粘膜ワクチン組成物は、前述の抗原の他、当該抗原を、負に帯電する粘膜表面（上皮細胞）を通過させ、樹状細胞等の免疫系に送達するためのデリバリーシステムとして、カチオン性のナノゲルを含む。本発明にかかるカチオン性のナノゲルは、上記のとおり、疎水性の官能基及びカチオン性の官能基が側鎖として付加されている多糖からなる。
【００３０】
カチオン性のナノゲルを構成する上で主鎖となる「多糖」は、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース等の１種又は２種以上の単糖分子が、２分子以上結合したものであればよい。さらに、多糖は、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、カルボキシメチル等の修飾基を有していてもよい。多糖の具体例としては、プルラン（α−グルコースからなるホモ多糖）、アミロペクチン、アミロース、デキストラン、ヒドロキシエチルデキストラン、マンナン、レバン、イヌリン、キチン、キトサン、キシログルカン、水溶性セルロースが挙げられるが、その化学構造や物理的特性の観点から、プルラン、アミロペクチン、アミロース、デキストラン、ヒドロキシエチルデキストランが好ましく、プルランがより好ましい。
【００３１】
また、多糖の分子量（重量平均分子量）としては、通常１００００〜５０００００ｇ／ｍｏｌであり、好ましくは３００００〜２０００００ｇ／ｍｏｌである。なお、多糖の重量平均分子量は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定することができる。
【００３２】
カチオン性のナノゲルにおいて、多糖の側鎖として付加されている「疎水性の官能基」としては、例えば、炭素数８〜５０（好ましくは、炭素数１２〜５０）の炭化水素基、ステリル基が挙げられるが、官能基の疎水性や食品添加物としての安全性の観点から、好ましくはステリル基であり、より好ましくはコレステリル基である。
【００３３】
多糖の側鎖として付加されている「カチオン性の官能基」としては、例えば、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、イミノ基、アンモニウム基、グアニジノ基、アミジノ基、カチオン性のアミノ酸残基（リシン、アルギニン、ヒスチジン等）が挙げられるが、合成や物理的特性の観点から、好ましくはアミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基であり、より好ましくはアミノ基である。
【００３４】
多糖と、疎水性の官能基又はカチオン性の官能基との結合は、直接的な結合であってもよく、リンカー基を介した間接的な結合であってもよい。リンカー基としては、エステル結合（−ＣＯＯ−又は−Ｏ−ＣＯ−）、エ−テル基（−Ｏ−）、アミド基（−ＣＯＮＨ−又は−ＮＨＣＯ−）、ウレタン結合（−ＮＨＣＯＯ−又は−ＯＣＯＮＨ−）が挙げられる。これらが１個又は複数個組み合わせられ、必要に応じて炭素数１〜１０のアルキレン基、アリ−レン基、アラルキレン基（ベンジレン基、フェネチレン基等）がさらに組み合わせられていてもよい。
【００３５】
多糖に付加される疎水性の官能基数としては、捕捉する前記抗原の形態、サイズ、量等によって適宜調整し得るが、付加される疎水性の官能基数が多くなると、水への溶解性が低下すると共に、ナノゲルの粒径を制御することが難しくなり、分散安定性も低下し易くなる傾向にあることから、通常、１００単糖あたり疎水性の官能基は１〜１０個であり、好ましくは１〜数個（例えば、５個、４個、３個、２個）であり、より好ましくは１〜２個である。また、多糖に付加されるカチオン性の官能基数としては、捕捉する前記抗原の形態、サイズ、量等によって適宜調整し得るが、哺乳動物の細胞表面へのイオン性相互作用が十分に得られ易いという観点から、通常、１００単糖あたりカチオン性の官能基は１〜５０個であり、好ましくは１０〜４０個であり、より好ましくは１５〜２５個である。
【００３６】
また、疎水性の官能基及びカチオン性の官能基が付加された多糖から成る「カチオン性のナノゲル」のサイズ（平均粒径）としては、通常５〜２００ｎｍであるが、サイズが大きくなると、抗原が凝集体を形成し易くなり、また抗原表面をナノゲルにて均一に被覆することが難しくなり、結果として分散安定性も低下し易くなる傾向にあることから、好ましくは１０〜１００ｎｍ、より好ましくは３０〜５０ｎｍである。なお、平均粒径（直径）は、例えば、動的光散乱法（ＤＬＳ、Ｄｙｎａｍｉｃｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）により測定をすることができる。
【００３７】
本発明の「カチオン性のナノゲル」は、例えば、疎水性の官能基が側鎖として付加されている多糖からなるナノゲル（疎水化多糖ナノゲル）を調製し、それにカチオン性の官能基を導入することによって製造することができる。
【００３８】
より具体的には、先ず、炭素数１２〜５０の水酸基含有炭化水素又はステロールと、ＯＣＮ−Ｒ１ＮＣＯ（式中、Ｒ１は炭素数１〜５０の炭化水素基である）で表されるジイソシアナート化合物を反応させて、炭素数１２〜５０の水酸基含有炭化水素又はステロールが１分子反応したイソシアナート基含有疎水性化合物を製造する。得られたイソシアナート基含有疎水性化合物と多糖とを反応させ、炭素数１２〜５０の炭化水素基又はステリル基を含有する疎水性基含有多糖類を製造する。次に、得られた生成物をケトン系の溶媒で精製することにより、純度の高い疎水化多糖ナノゲルを製造することができる（国際公開第００／１２５６４号  参照）。また、疎水化多糖ナノゲルは市販されているので（例えば、日油株式会社製、コレステリル化プルラン）、それを用いることもできる。
【００３９】
次に、減圧乾燥した疎水化多糖ナノゲルを、ジメチルスルホキシド等の溶媒に溶解し、これに１−１’カルボニルジイミダゾールを窒素気流下に加え、数時間（例えば、１時間程度）２０〜４０℃で反応させる。その反応溶液に、カチオン性の官能基を有する化合物（例えば、エチレンジアミン）を徐々に添加し、数時間から数十時間程度（例えば、２４時間程度）攪拌する。得られた反応溶液を蒸留水に対して、数日間透析する。透析後の反応溶液を凍結乾燥することにより、白色固体（カチオン性のナノゲル）を製造することができる（Ａｙａｍｅ  Ｈ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．、２００８年、１９：８８２〜８９０ページ、特許文献２、国際公開２０１４／０５４５８８号  参照）。また、エチレンジアミン等の置換度は、元素分析やＨ−ＮＭＲ等を用いて評価することができる。
【００４０】
本発明の粘膜ワクチン組成物において、前記抗原は、前記カチオン性のナノゲルに捕捉（被覆等）され、複合体を形成している。複合体は、例えば、前記抗原と前記カチオン性のナノゲルをバッファー中において混合し、４〜５０℃で、３０分〜４８時間静置することにより形成される。バッファーとしては特に制限はなく、用いる抗原及びカチオン性のナノゲルの種類によって適宜調整されるが、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．６）、ＰＢＳが挙げられる。前記抗原と前記カチオン性のナノゲルの混合比は、用いる抗原及びカチオン性のナノゲルの種類に応じて適宜調整される。例えば、抗原を不活性化した黄色ブドウ球菌とする場合、その比率（黄色ブドウ球菌の菌体数（ＣＦＵ）：カチオン性のナノゲル（ｍｇ））は、好ましくは１ｘ１０１０ＣＦＵ：０．０１ｍｇ〜１ｘ１０１０ＣＦＵ：１０ｍｇであり、より好ましくは１ｘ１０１０ＣＦＵ：０．０５ｍｇ〜１ｘ１０１０ＣＦＵ：２ｍｇである。また、このようにして調製される複合体は、公知の方法によりその物理化学的性状を解析することが可能である。例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、動的光散乱法、ゼータ電位の測定により解析が可能である。
【００４１】
本発明の粘膜ワクチン組成物は、前記抗原及び前記カチオン性のナノゲルを少なくとも含むものであればよいが、他の成分を含んでいてもよい。「他の成分」としては、薬学的に許容される公知の希釈剤、安定剤、防腐剤、酸化防止剤が挙げられる。希釈剤としては、ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、生理食塩水等が挙げられる。安定剤としては、ゼラチン、デキストラン、ソルビトール等が挙げられる。防腐剤としてはチメロサール、βプロピオラクトン等が挙げられる。酸化防止剤としてはαトコフェロール等が挙げられる。また、免疫原性を高めるという観点から、アジュバント（アルミニウムゲルアジュバント等の無機物質、微生物若しくは微生物由来物質（ＢＣＧ、ムラミルジペプチド、百日せき菌、百日せきトキシン、コレラトキシン等）、界面活性作用物質（サポニン、デオキシコール酸等）、油性物質（鉱油、植物油、動物油等）のエマルジョン等）を含んでいてもよい。
【００４２】
（ウシ乳房炎の予防法）
本発明は、前述の粘膜ワクチン組成物を、ウシの粘膜に投与する工程を含む、ウシ乳房炎を予防するための方法を提供する。
【００４３】
本発明の方法の対象となる「ウシ」としては、好適には乳牛であり、例えば、ホルスタイン種、ガンジー種、ジャージー種、エアシャー種、ブラウンスイス種が挙げられる。また「乳房炎」としては、黄色ブドウ球菌が乳腺に感染することにより生じる炎症であればよく、潜在性乳房炎であってもよく、臨床型乳房炎であってもよい。
【００４４】
本発明におけるウシ乳房炎の「予防」には、ウシ乳房炎の発症の抑制のみならず、その進行の抑制（重篤化の抑制）が含まれる。
【００４５】
本発明の方法において、粘膜ワクチン組成物が投与される「粘膜」としては、当該組成物が投与された場合に、黄色ブドウ球菌に対するＩｇＡ抗体を産生する細胞等を誘導し、当該細胞が乳腺粘膜組織に伝播し得ればよく（いわゆる、共通粘膜免疫機構（ＣＭＩＳ）において、誘導組織として機能する粘膜組織であればよく）、例えば、鼻腔内、口腔内、腸内、咽喉内、耳腔内、結膜のう内、腟内、肛門内の粘膜が挙げられる。これらの中で、消化酵素等の影響が少なく、免疫反応を安定して誘導し易いという観点から、鼻腔内粘膜が好ましい。さらに、粘膜ワクチン組成物がより取り込まれ易いという観点から、鼻腔内深部の咽頭扁桃がより好ましい。
【００４６】
粘膜ワクチン組成物の粘膜への「投与」方法としては特に制限はなく、吹き付け、噴霧、塗布、滴下、注入、注射等により行なうことができる。また、粘膜ワクチン組成物の投与量は、抗原の種類、投与対象の週齢、体重、健康状態等により適宜決定することができるが、薬学的に有効な量であればよい。薬学的に有効な量とは、粘膜ワクチン組成物が含有する抗原に対する免疫反応を誘導するのに必要な抗原量をいい、例えば、投与する抗原が黄色ブドウ球菌の全菌である場合、１×１０１０〜１×１０１１ＣＦＵ（好ましくは３×１０１０〜７×１０１０ＣＦＵ、より好ましくは５×１０１０ＣＦＵ）を、１日１回〜数回投与し、１〜５週間間隔（好ましくは２週間間隔）で全１〜５回（好ましくは３回）投与すればよい。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、本実施例は、以下に示す材料及び方法を用いて行なった。
【００４８】
（乳牛）
臨床又は亜臨床上乳房炎に罹患した経験のない、初産の６頭の若い雌乳牛（ホルスタイン）を、以下の実験に供した。なお、実験に際し、これら乳牛から搾取した乳汁（ミルク）試料の４分の１を、下記基準を用いた評価に供し、乳房炎に罹患していないことを確認した。
【００４９】
ウシ乳房炎についての日本の診断基準：乳汁において、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染が陰性であり、体細胞数（ＳＣＣ）が＜３×１０５細胞／ｍＬである場合に、乳房炎に罹患していないとする。なお、乳汁中の体細胞（主に、白血球）の数は、乳房炎の進行に伴い増大する。
【００５０】
（不活性化黄色ブドウ球菌の調製）
乳牛に投与する抗原として、黄色ブドウ球菌を、Ｋｉｋｕ  Ｙ．ら、Ｊ  Ｖｅｔ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ、２０１６年、７８：１５０５〜１５１０ページに記載の方法に沿って、ホルマリンにより不活性化し、ホルマリン殺菌黄色ブドウ球菌（ＦＫＳＡ）を、調製した。すなわち、黄色ブドウ球菌  ＢＭ１００６株を、０．５％ホルムアルデヒド含有リン酸生理緩衝食塩水（ＰＢＳ）に懸濁し、不活性化のため、室温にて一晩インキュベートした。その後、ＰＢＳにて３回洗浄した。
【００５１】
なお、黄色ブドウ球菌  ＢＭ１００６株（シークエンスタイプ  ３５２、クローナルコンプレックス  ９７、乳房炎惹起性）は、元々は日本の酪農場から提供された乳汁から単離された菌である。また、乳房炎に関するシークエンスタイピングによって、この菌のシークエンスタイプは、乳房炎を引き起こすことが明らかとなっている（Ｈａｔａ  Ｅ.ら，Ｊ  Ｖｅｔ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ、２０１０年、７２：６４７〜６５２ページ  参照）。
【００５２】
（不活性化黄色ブドウ球菌とカチオン性ナノゲルとの複合体形成）
前記抗原のデリバリーシステムとして、カチオン性の多糖  ｃＣＨＰ（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ＣＨＰ）からなるカチオン性ナノゲル（ｃＣＨＰナノゲル）を選択した。ｃＣＨＰナノゲルは、Ａｙａｍｅ  Ｈ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．、２００８年、１９：８８２〜８９０ページ、及びＡｋｉｙｏｓｈｉ  Ｋ．ら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ、１９９８年、５４：３１３〜３２０ページに記載の方法に沿って調製した。
【００５３】
すなわち、減圧乾燥したＣＨＰ（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｐｕｌｌｕｌａｎ）（Ｍｗ＝約１０００００ｇ／ｍｏｌ、コレステロール置換率：１．２／１００単糖）１０００ｍｇをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）２００ｍｌに溶解した。これにカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）３００ｍｇを窒素気流下に加え、３５℃で４時間かけて反応させた。次いで、エチレンジアミン３３００ｍｇを添加し、３５℃で２４時間攪拌し、反応させることにより、ＣＨＰ中のプルランの側鎖にカチオン性の官能基としてアミノ基を導入した。得られた反応溶液を、蒸留水により数日間かけて透析し、凍結乾燥することにより、０．９０５ｇの白色綿状固体を得た（Ｍｗ（原料のＣＨＰに用いられているプルランの分子量から推測される値）＝約１０００００ｇ／ｍｏｌ、収率：８２．３％）。
【００５４】
このようにして合成したｃＣＨＰをＰＢＳに攪拌溶解させた後、超音波処理して得られたｃＣＨＰナノゲル分散液におけるｃＣＨＰナノゲルのサイズ（平均粒径）は、動的光散乱計により分析した結果、３０〜４０（平均３２）ｎｍであった。また、合成したｃＣＨＰナノゲルを１Ｈ−ＮＭＲ測定により分析した結果、エチレンジアミンが１９個導入されていた。
【００５５】
なお、ＣＨＰは、下記式（Ｉ）で表される化合物からなり、当該式中Ｒはそれぞれ独立して、水素原子、又は下記式（II）で表される官能基を表す。また、ｃＣＨＰは、下記式（Ｉ）で表される化合物からなり、当該式中Ｒはそれぞれ独立して、水素原子、―Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣ２Ｈ４ＮＨ２又は下記式（II）で表される官能基を表す。
【００５６】
【化１】
2020019754.tif 000002
【００５７】
【化２】
2020019754.tif 000003
【００５８】
前記と同様に調製したｃＣＨＰナノゲル分散液（ナノゲル２ｍｇ）と共に、前記ＦＫＳＡ（２．５×１０１０ＣＦＵ）を２ｍＬのＰＢＳ液中にて混合し、２５℃で３０分間インキュベートした。そして、１．２５×１０１０ＣＦＵ／ｍＬになるようＰＢＳにて調整し、ＦＫＳＡ捕捉ｃＣＨＰナノゲルを調製した。
【００５９】
なお、ＦＫＳＡ捕捉ｃＣＨＰナノゲルの調製に際しては、粒径１μｍ程度のＦＫＳＡの表面を均一に被覆し得る条件について事前に検討を行い、ｃＣＨＰナノゲルの死菌表面への吸着（被覆）が平衡に達する条件を見出すとともに、前記ＦＫＳＡとｃＣＨＰナノゲルとの量比を決定した。
【００６０】
（不活性化黄色ブドウ球菌とポリアクリル酸ナトリウムとの複合体形成）
前記抗原のデリバリーシステムとして、ポリアクリル酸ナトリウムも用いた。これらの複合体は、ナノゲル調整時と同量のＦＫＳＡを、０．０６ｇのポリアクリル酸ナトリウムを５ｍＬのＰＢＳに溶かしたものと混合した。
【００６１】
（不活性化黄色ブドウ球菌による鼻腔免疫）
３頭の乳牛の鼻腔内に、ＦＫＳＡ捕捉ｃＣＨＰナノゲルを、各回間２週間あけて３回投与することにより（２ｍＬ／回）、鼻腔免疫を行なった。なお、当該投与は、乳牛の鼻腔内深部にある咽頭扁桃に、ソンデ針を筒先に備えたシリンジを用いて、前記ナノゲルを投与することにより行なった。また、後述の乳房内注入試験においては、３回目の鼻腔内投与後４週間以内に黄色ブドウ球菌を乳房内に注入した。
【００６２】
なお、鼻腔免疫後は、乳房における局所的反応（乳房の均一性、乳汁の異常、食欲、及び乳汁の収率）、並びに全身反応（直腸温度、食欲）の点で、健康状態を判定するため、それら乳牛を臨床的に評価した。その結果、データは示さないが、有意な全身又は局所的反応は確認されなかった。
【００６３】
（黄色ブドウ球菌の乳房内注入実験）
泌乳の初期段階にある、６頭の乳牛（３頭は非免疫の乳牛、３頭は鼻腔免疫した乳牛）に、黄色ブドウ球菌  ＢＭ１００６株を注入した。なお、黄色ブドウ球菌注入前に、乳汁試料における細菌学的検査を実施し、黄色ブドウ球菌．は完全に陰性であることを確認している。
【００６４】
黄色ブドウ球菌の乳房への注入は、Ｎａｇａｓａｗａ  Ｙ.ら、Ａｎｉｍ  Ｓｃｉ  Ｊ.、２０１８年、８９：２５９〜２６６ページに記載の方法に沿って行なった。すなわち、黄色ブドウ球菌を、約２０コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）の濃度になるよう、ＰＢＳにて希釈し、黄色ブドウ球菌懸濁液を調製した。また、夕方の搾乳後に、各乳牛にある４つの乳房から２つの乳房を選択し、乳頭を風乾させ、黄色ブドウ球菌懸濁液をそれらの乳腺槽に注入した。残り２つの乳房には、等量のＰＢＳをモックとして注入した。
【００６５】
（乳汁試料の回収）
乳汁試料は、各朝の搾乳において各乳房毎に回収した。乳汁試料は、前記免疫０日（前記鼻腔免疫当日の免疫を行う前）から免疫後６週間、毎週回収した。また、黄色ブドウ球菌の乳房内注入実験を行なった場合には、注入０日（前記注入当日の注入を行う前）から注入後１週間にかけて、ずっと乳汁試料を回収した。
【００６６】
（黄色ブドウ球菌量の分析）
乳汁試料における黄色ブドウ球菌量は、以下のとおりにして分析した。先ず、各乳汁試料の１ｍＬアリコートを、ペトリフィルム黄色ブドウ球菌発現測定用プレート（３Ｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ製）上に播き、３７℃で２４時間インキュベートした。そして、コロニーが赤紫以外に呈色した場合、ペトリフィルム黄色ブドウ球菌発現ディスクに供し、３時間インキュベートした。当該インキュベーション後、ピンク色のゾーンを形成したコロニーを黄色ブドウ球菌として数え、その結果に基づきＣＦＵ／ｍＬを算出した。
【００６７】
（黄色ブドウ球菌に対する特異的ＩｇＡ抗体価の分析）
乳汁試料における黄色ブドウ球菌に対する特異的ＩｇＡ抗体の力価を分析するため、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行った。具体的には、先ず、黄色ブドウ球菌に対する特異的ＩｇＡ抗体を検出するため、ＦＫＳＡを捕捉用抗原としてマイクロタイタープレートに直接コートした。９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃ９６  Ｍａｘｉｓｏｒｐｃｅｒｔ；Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に、ＦＫＳＡ含有ＰＢＳを５×１０６細胞／ウェルになるよう播き、オーブンにて、３７℃で一晩乾燥させた。当該インキュベーション後、Ｔｗｅｅｎ２０含有トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ）にてウェルを洗浄し、乳汁と共に室温にて９０分間インキュベートした。ＴＢＳＴにて５回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヒツジ由来抗ウシＩｇＡ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）をウェルに添加し、室温にて２時間インキュベートした。次いで、新しく調製した基質を添加し、３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）マイクロウェルペルオキシダーゼ基質システム（ＫＰＬ社製）を用い、４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定した。
【００６８】
（黄色ブドウ球菌のＣｌｆＡタンパク質に対する抗体価の分析）
上記のとおり、ＦＫＳＡ捕捉ｃＣＨＰナノゲルを用いた鼻腔免疫を事前に施した３頭の乳牛に対し、黄色ブドウ球菌乳房内注入実験を行なった。また、ＦＫＳＡ捕捉ｃＣＨＰナノゲルを前記ＦＫＳＡとポリアクリル酸ナトリウムとの複合体に代えた以外は、上記同様に、鼻腔免疫及び乳房内注入実験を、１頭の乳牛に対して行なった。なお、ＦＫＳＡとポリアクリル酸ナトリウムとの複合体の１回あたりの投与量は５ｍＬである。さらに、コントロールとして、鼻腔免疫を施さなかった３頭の乳牛に対して、上記のとおり黄色ブドウ球菌を乳房内に注入したものも用意した。
【００６９】
そして、これら乳牛から乳汁試料を各乳房毎に、上記方法にて、黄色ブドウ球菌を乳房内に注入してから４週間回収した。そして、乳汁試料における黄色ブドウ球菌のＣｌｆＡタンパク質に対する抗体の力価を、ＥＬＩＳＡにて分析した。なお、当該ＥＬＩＳＡにおいては、ＦＫＳＡの代わりに、５μｇ／ウェルのＣｌｆＡタンパク質にて、マイクロタイタープレートをコーティングしたこと以外は、前記（黄色ブドウ球菌に対する特異的ＩｇＡ抗体価の分析）同様にして行なった。なお、ＣｌｆＡタンパク質は、大腸菌（ＢＬ２１コンピテント細胞）でＧＳＴ融合タンパクとして発現させ、抽出、精製した後、さらに、ＧＳＴ融合タンパク質切断用プロテアーゼ（ＧＥヘルスケア社製、製品名：ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ）処理によりＧＳＴタグを切断、除去することにより、調製したリコンビナントＣｌｆＡタンパク質（全長）である。
【００７０】
（統計分析）
統計分析に際して、黄色ブドウ球菌量と黄色ブドウ球菌特異的ＩｇＡの抗体価とが正規分布に従うよう、黄色ブドウ球菌量はｌｏｇ１０に変換した。グループ間の差は、スチューデントｔ検定を用いて評価した。黄色ブドウ球菌量と抗体価との関連性は、ＳＡＳソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｊａｐａｎ  Ｌｔｄ．社製）を用いた線形混合モデルに適用することによって分析した。また、スピアマンの順位相関係数及び非線形回帰分析を用い、黄色ブドウ球菌量と抗体価との関係性について評価した。なお、「Ｐ＜０．０５」及び「Ｐ＜０．０１」を、各々「有意」及び「非常に有意」であるとした。
【００７１】
以下に、上記材料及び方法を用いて得られた結果を示す。
【００７２】
（実施例１）
不活性化した黄色ブドウ球菌（ＦＫＳＡ）とカチオン性ナノゲルとの複合体を、乳牛の鼻腔内に投与することにより、当該乳牛の乳汁において、黄色ブドウ球菌に対するＩｇＡ抗体価が増加するかどうかを分析した。
【００７３】
その結果、図１に示すとおり、前記鼻腔免疫した乳牛の乳汁（３頭の乳牛の１２乳房、ｎ＝１２）において、抗黄色ブドウ球菌特異的ＩｇＡ抗体は、免疫前と比して、免疫後２週間、５週間及び６週間において有意に高かった（平均吸光度は、免疫後２週間：０．３７，免疫後２週間：０．６１，免疫後５週間：０．６２及び免疫前：０．１７であった。Ｐ＜０．０５）。
【００７４】
また、図２に示すとおり、ＦＫＳＡによる鼻腔免疫を施した乳牛から採取した乳汁における抗黄色ブドウ球菌特異的ＩｇＡ抗体は、免疫しなかった乳牛（コントロール）のそれと比して、有意に増加した（平均吸光度は、鼻腔免疫群：０．４９  ｖｓ  非免疫群：０．１８であった。Ｐ＜０．０５）。
【００７５】
したがって、黄色ブドウ球菌由来の抗原とカチオン性ナノゲルとの複合体を、乳牛の鼻腔内に投与することにより、当該乳牛の乳汁において、黄色ブドウ球菌に対するＩｇＡ抗体の力価を増強できることが、明らかになった。
【００７６】
（実施例２）
ＦＫＳＡとカチオン性ナノゲルとの複合体によって鼻腔免疫した後、黄色ブドウ球菌を乳房に接種することによって、実験的乳房炎モデルを確立した。そして、当該鼻腔免疫による効果について分析すべく、これらモデルから採取した乳汁における抗黄色ブドウ球菌特異的ＩｇＡ抗体価及び黄色ブドウ球菌の量を調べた。
【００７７】
その結果先ず、抗黄色ブドウ球菌特異的ＩｇＡ抗体価に関しては、図３Ａに示すとおり黄色ブドウ球菌を注入しなかった（モックとしてＰＢＳを注入した）乳房から回収した乳汁において、当該注入０日〜１週間後における有意差は、免疫しなかった乳牛及び鼻腔免疫した乳牛共に認められなかった（各群３頭の乳牛の６つの乳房、各ｎ＝６）。
【００７８】
それに対し、図３Ｂに示すとおり、鼻腔免疫した乳牛の乳房に黄色ブドウ球菌を注入した場合（３頭の乳牛の６つの乳房、ｎ＝６）、当該注入後１週間の抗体価は０日目のそれと比して有意に増加した（平均吸光度は、注入後１週間：０．７２  ｖｓ  ０日目：０．４２であった。Ｐ＜０．０５）。一方、免疫しなかった乳牛において、抗体価の有意な変化は認められなかった（３頭の乳牛の６つの乳房、ｎ＝６）。
【００７９】
次に、乳汁における黄色ブドウ球菌の量を分析した結果、図４に示すとおり、免疫しなかった乳牛と比して、鼻腔免疫した乳牛において、乳房への注入による黄色ブドウ球菌の増殖は、有意に抑制されていた（各群３頭の乳牛の６つの乳房、各ｎ＝６。黄色ブドウ球菌量の平均値（＝ｌｏｇ１０  ＣＦＵ／ｍＬ）は、鼻腔免疫群：３．７  ｖｓ  非免疫群：５．２であった。Ｐ＜０．０５）。
【００８０】
なお、モックを注入した場合、その１週間後の、免疫していない乳牛及び鼻腔免疫した乳牛の双方において、乳汁から黄色ブドウ球菌検出できないことは確認している（各３頭の乳牛の６つの乳房、各ｎ＝６）。
【００８１】
さらに、前述の乳汁における黄色ブドウ球菌の増殖抑制は、ＦＫＳＡとカチオン性ナノゲルとの複合体による鼻腔免疫によって増強した抗黄色ブドウ球菌特異的ＩｇＡ抗体価によることを確認すべく、黄色ブドウ球菌注入後におけるこれら２数値間の相関を、スピアマンの順位相関係数によって分析した。
【００８２】
その結果、図５に示すとおり、黄色ブドウ球菌を注入した乳房において、抗黄色ブドウ球菌特異的ＩｇＡ抗体価と黄色ブドウ球菌量との間にて、非常に有意な負の相関が認められた（６頭の乳牛の１２の乳房，ｎ＝１２，ｒ＝−０．８３２，Ｐ＜０．０１）。
【００８３】
したがって、黄色ブドウ球菌由来の抗原とカチオン性ナノゲルとの複合体を、乳牛の鼻腔内に投与することにより、黄色ブドウ球菌に対するＩｇＡ抗体の力価は増強され、乳房における黄色ブドウ球菌の増殖を抑えられることが、明らかになった。
【００８４】
（実施例３）
次に、黄色ブドウ球菌に対する効果を、黄色ブドウ球菌由来の抗原の担体として、カチオン性ナノゲルを用いた場合と、他の担体（ポリアクリル酸ナトリウム）を用いた場合とで比較した。得られた結果を、図６〜７Ｃに示す。
【００８５】
なお、当該比較に際し、黄色ブドウ球菌に対する効果を評価するため、乳汁におけるＣｌｆＡタンパク質に対するＩｇＡ抗体価を検出した。ＣｌｆＡタンパク質は、黄色ブドウ球菌の膜タンパク質の１種であり、ウシ乳腺上皮細胞表面のＡｎｎｅｘｉｎＡ２タンパク質と結合することにより、黄色ブドウ球菌の当該上皮細胞内への侵入過程を媒介することが知られている（Ａｓｈｒａｆ  Ｓ．ら、Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．、２０１７年１月１９日；７：４０６０８  参照）。したがって、ＣｌｆＡタンパク質に対する抗体価が高ければ、黄色ブドウ球菌の乳腺上皮細胞内への侵入に対する抑制効果が高い、すなわち黄色ブドウ球菌感染に対する防御効果が高いと評価することができる。
【００８６】
先ず、ＦＫＳＡとカチオン性ナノゲルあるいはポリアクリル酸ナトリウムとの複合体を、乳牛の鼻腔内に投与することにより、当該乳牛の乳汁において、ＣｌｆＡに対するＩｇＡ抗体価が増加するかどうかを分析した。
【００８７】
その結果、図６に示すとおり、３回の免疫後（最初の免疫を開始してから６週後）において、カチオン性ナノゲルを用いて事前にＦＫＳＡを鼻腔免疫していた乳牛の乳汁（３頭の乳牛の１２乳房、ｎ＝１２）における、抗ＣｌｆＡ特異的ＩｇＡ抗体価は、免疫しなかった乳牛、及び、ポリアクリル酸ナトリウムを用いて事前にＦＫＳＡを鼻腔免疫していた乳牛と比して、有意に高かった。
【００８８】
次に、前記各鼻腔免疫後、黄色ブドウ球菌を乳房に接種することによって、実験的乳房炎モデルを確立した。そして、各鼻腔免疫による効果について分析すべく、これらモデルから採取した乳汁におけるＣｌｆＡに対するＩｇＡ抗体価を調べた。
【００８９】
その結果、図７Ａ及び７Ｂに示すとおり、免疫しなかった乳牛においては、前述の黄色ブドウ球菌に対する抗体価同様に、黄色ブドウ球菌を乳房に注入しても、ＣｌｆＡタンパク質に対するＩｇＡ抗体価が増強されることはなかった。
【００９０】
それに対し、カチオン性のナノゲルを用い、事前にＦＫＳＡを鼻腔免疫していた乳牛においては、黄色ブドウ球菌注入直後から、ＣｌｆＡタンパク質に対するＩｇＡ抗体価は顕著に上昇した。一方、ポリアクリル酸ナトリウムを用い、事前に鼻腔免疫していた乳牛においては、黄色ブドウ球菌を注入させてから約２週間まで、ＣｌｆＡタンパク質に対するＩｇＡ抗体価の上昇は認められなかった（図７Ｃ  参照）。
【００９１】
また、データには示さないが、黄色ブドウ球菌注入後の臨床症状を、カチオン性ナノゲルを用いた場合、ポリアクリル酸ナトリウムを用いた場合、免疫しなかった場合とで比較すると、カチオン性ナノゲルを用いてＦＫＳＡを鼻腔免疫していた乳牛が最も軽微な症状を示していた。特に、免疫しなかった乳牛における４頭中１頭は、急性型乳房炎となり安楽殺に至ったが、カチオン性ナノゲルを用いて鼻腔免疫した乳牛ではそのような発症例は見られなかった。
【００９２】
したがって、カチオン性ナノゲルを用い、黄色ブドウ球菌由来の抗原を鼻腔免疫した場合、黄色ブドウ球菌の接種直後から、ＣｌｆＡタンパク質に対するＩｇＡ抗体価が上昇することにより、当該細菌の乳房内への侵入を防ぎ、ひいては当該細菌の感染を効果的に防御できることが明らかになった。一方、他の担体を用いた場合には、このような接種直後からの抗体価の上昇は認められず、カチオン性ナノゲルと比して黄色ブドウ球菌に対する感染防御効果は劣ったものであった。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
以上説明したように、本発明によれば、乳房炎を予防することが可能となる。したがって、本発明は、酪農業において極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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