(57)【要約】      （修正有）【課題】鉄関連障害を治療および診断するためにＲＧＭｃに結合する抗体を使用する方法の提供。【解決手段】反発性ガイダンス分子ｃ（Ｒｅｐｕｌｓｉｖｅ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃ）（「ＲＧＭｃ」）に結合する単離された抗体またはこの抗体断片であって、それぞれ特定のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、可変軽ドメイン領域、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３からなる群から選択されるドメインまたは領域を含む、単離された抗体またはこの抗体断片。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
反発性ガイダンス分子ｃ（Ｒｅｐｕｌｓｉｖｅ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃ）（「ＲＧＭｃ」）に結合する単離された抗体またはこの抗体断片であって、抗体が、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｅ）配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｇ）配列番号９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｈ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｐ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｑ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｒ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｓ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｔ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｕ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｗ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｘ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸を含むＣＤＲ２および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｙ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｚ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、ならびに（ａａ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖からなる群から選択されるドメインまたは領域を含む、単離された抗体またはこの抗体断片。
【請求項２】
抗体が、免疫グロブリン分子、ジスルフィド連結したＦｖ、親和性成熟した抗体、ｓｃＦｖ、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、多重特異性抗体、Ｆａｂ、二重特異性抗体、ＤＶＤ、Ｆａｂ’、二特異性抗体、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖからなる群から選択される、請求項１に記載の単離された抗体または抗体断片。
【請求項３】
モノクローナル抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項２に記載の単離された抗体または抗体断片。
【請求項４】
ヒトＩｇＭ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、ヒトＩｇＧ１定常ドメイン、ヒトＩｇＥ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３定常ドメインおよびヒトＩｇＡ定常ドメインからなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項１に記載の単離された抗体または抗体断片。
【請求項５】
抗体が、配列番号３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域または配列番号９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域を含む、請求項１に記載の単離された抗体または抗体断片。
【請求項６】
抗体が、配列番号４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域または配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を含む、請求項１に記載の単離された抗体または抗体断片。
【請求項７】
抗体が、配列番号３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域および配列番号４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を含む、請求項１に記載の単離された抗体または抗体断片。
【請求項８】
抗体が、配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域および配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を含む、請求項１に記載の単離された抗体または抗体断片。
【請求項９】
抗体が、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域および配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を含む、請求項１に記載の単離された抗体または抗体断片。
【請求項１０】
抗体が、配列番号９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域および配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を含む、請求項１に記載の単離された抗体または抗体断片。
【請求項１１】
抗体が、配列番号１１のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖を含む、請求項１に記載の単離された抗体または抗体断片。
【請求項１２】
抗体が、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖を含む、請求項１に記載の単離された抗体または抗体断片。
【請求項１３】
抗体が、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖を含む、請求項１に記載の単離された抗体または抗体断片。
【請求項１４】
抗体が、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖を含む、請求項１に記載の単離された抗体または抗体断片。
【請求項１５】
抗体が、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖を含む、請求項１に記載の単離された抗体または抗体断片。
【請求項１６】
抗体が、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖を含む、請求項１に記載の単離された抗体または抗体断片。
【請求項１７】
抗体が、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖を含む、請求項１に記載の単離された抗体または抗体断片。
【請求項１８】
抗体が、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖を含む、請求項１に記載の単離された抗体または抗体断片。
【請求項１９】
抗体が、配列番号１１のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖を含む、請求項１に記載の単離された抗体または抗体断片。
【請求項２０】
抗体が、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖を含む、請求項１に記載の単離された抗体または抗体断片。
【請求項２１】
抗体が、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖を含む、請求項１に記載の単離された抗体または抗体断片。
【請求項２２】
抗体が、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖を含む、請求項１に記載の単離された抗体または抗体断片。
【請求項２３】
免疫接着（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｏｎ）分子、造影剤および治療剤からなる群から選択される作用物質をさらに含む、請求項１から２２に記載の抗体または抗体断片。
【請求項２４】
造影剤が、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識およびビオチンからなる群から選択される、請求項２３に記載の単離された抗体または抗体断片。
【請求項２５】
放射性標識が、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏおよび１５３Ｓｍからなる群から選択される、請求項２４に記載の単離された抗体または抗体断片。
【請求項２６】
配列番号３−３４のいずれか１つをコードする単離された核酸。
【請求項２７】
請求項１または５から２２のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片をコードする単離された核酸。
【請求項２８】
請求項１または５から２２に記載の抗体、抗体断片、これらの混合物または誘導体を含む、医薬組成物。
【請求項２９】
治療的または予防的に有効な量の抗体を、これを必要とする対象に投与するステップを含む、鉄代謝疾患を治療する方法であって、抗体が、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｅ）配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｇ）配列番号９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｈ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｊ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｋ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｌ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｍ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｎ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｏ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｐ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｑ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１２のアミノ酸を含むＣＤＲ２および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｒ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｓ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、ならびに（ｔ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖からなる群から選択されるドメインまたは領域を含み、対象における鉄代謝疾患が治療的または予防的に治療される、方法。
【請求項３０】
鉄代謝疾患が、慢性疾患の貧血（ＡＣＤ）、鉄剤不応性鉄欠乏性貧血、慢性腎疾患の貧血、赤血球生成促進剤に対する耐性およびβ−サラセミアからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
抗体または抗体断片が、免疫グロブリン分子、ジスルフィド連結したＦｖ、モノクローナル抗体、親和性成熟した抗体、ｓｃＦｖ、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、ヒト化抗体、ヒト抗体、多重特異性抗体、Ｆａｂ、二重特異性抗体、ＤＶＤ、Ｆａｂ’、二特異性抗体、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
抗体または抗体断片が、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配列番号９からなる群から選択される配列を含む可変重領域を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
抗体または抗体断片が、配列番号４、配列番号６、配列番号８および配列番号１０からなる群から選択される配列を含む可変軽領域を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
抗体または抗体断片が、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６または配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２または配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８または配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変軽ドメインを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
抗体または抗体断片が、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３または配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９または配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５または配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変重ドメインを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
抗体または抗体断片が、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変重ドメインならびに配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変軽ドメインを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
抗体または抗体断片が、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変重ドメインならびに配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変軽ドメインを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
抗体または抗体断片が、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変重ドメインならびに配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変軽ドメインを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
抗体または抗体断片が、配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変重ドメインならびに配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変軽ドメインを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
対象が鉄関連障害を有するかどうかを決定する方法であって、
（ａ）対象由来の試料中の膜結合性ＲＧＭｃまたは可溶性ＲＧＭｃのレベルを測定するステップ、および
（ｂ）試料中のＲＧＭｃのレベルを正常な対照と比較するステップ
を含み、
ＲＧＭｃの変化したレベルが、対象が鉄関連障害を有することを示し、
ＲＧＭｃのレベルが、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｅ）配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｇ）配列番号９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｈ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｊ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｋ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｌ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｍ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｎ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｏ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｐ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｑ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１２のアミノ酸を含むＣＤＲ２および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｒ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｓ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、ならびに（ｔ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖からなる群から選択されるドメインまたは領域を含む抗体を使用して測定される、方法。
【請求項４１】
抗体または抗体断片が、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配列番号９からなる群から選択される配列を含む可変重領域を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
抗体または抗体断片が、配列番号４、配列番号６、配列番号８および配列番号１０からなる群から選択される配列を含む可変軽領域を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
抗体または抗体断片が、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６または配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２または配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８または配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変軽ドメインを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
抗体または抗体断片が、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３または配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９または配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５または配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変重ドメインを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
抗体または抗体断片が、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変重ドメインならびに配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変軽ドメインを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
抗体または抗体断片が、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変重ドメインならびに配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変軽ドメインを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
抗体または抗体断片が、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変重ドメインならびに配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変軽ドメインを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
抗体または抗体断片が、配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変重ドメインならびに配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変軽ドメインを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
抗体または抗体断片が、免疫接着分子、造影剤および治療剤からなる群から選択される作用物質をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項５０】
造影剤が、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識およびビオチンからなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
放射性標識が、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏおよび１５３Ｓｍからなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
正常な対照と比較して減少したレベルの膜結合性ＲＧＭｃが、対象が鉄過剰負荷に関連する鉄関連障害を有することを示す、請求項４０に記載の方法。
【請求項５３】
正常な対照と比較して増加したレベルの膜結合性ＲＧＭｃが、対象が鉄欠乏に関連する鉄関連障害を有することを示す、請求項４０に記載の方法。
【請求項５４】
ステップ（ａ）の前に、対象が、癌、急性感染症、慢性感染症、自己免疫疾患、肝疾患および慢性腎疾患からなる群から選択される障害と診断される、請求項４０に記載の方法。
【請求項５５】
試料が血液試料および血清試料からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項５６】
ステップ（ａ）がイムノアッセイである、請求項４０に記載の方法。
【請求項５７】
イムノアッセイが酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ＥＬＩＳＡがサンドイッチＥＬＩＳＡである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
正常な対照における膜結合性ＲＧＭｃのレベルと比較して減少したレベルの膜結合性ＲＧＭｃが、対象が鉄過剰負荷に関連する鉄関連障害を有することを示す、請求項４０に記載の方法。
【請求項６０】
正常な対照における膜結合性ＲＧＭｃのレベルと比較して増加したレベルの膜結合性ＲＧＭｃが、対象が鉄欠乏に関連する鉄関連障害を有することを示す、請求項４０に記載の方法。
【請求項６１】
ＲＧＭｃが、膜結合性ＲＧＭｃ、可溶性ＲＧＭｃ、膜結合性ＲＧＭｃの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、膜結合性ＲＧＭｃのバリアント、可溶性ＲＧＭｃのバリアントまたは前述のいずれかの組合せである、請求項４０に記載の方法。
【請求項６２】
方法が、ヘプシジンの存在、量または濃度について試験試料をアッセイするステップをさらに含み、（ｉ）ヘプシジンについてアッセイされる試験試料がＲＧＭｃについてアッセイされる試験試料と同じであるまたは（ｉｉ）ヘプシジンについてアッセイされる試験試料がＲＧＭｃについてアッセイされる試験試料と異なる試験試料である、のいずれかであるが、ヘプシジンについてアッセイされる試験試料源およびＲＧＭｃについてアッセイされる試験試料源が同じであり、それにより、試験試料中のヘプシジンの存在、量または濃度が決定される、請求項４０に記載の方法。
【請求項６３】
試験試料または複数の試験試料が、ＲＧＭｃおよびヘプシジンについて同時にまたはいずれかの順序で連続してアッセイされる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
方法が、ヘプシジンの存在、量または濃度についての試験試料のアッセイの結果を使用するステップをさらに含み、（ｉ）ヘプシジンについてアッセイされる試験試料がＲＧＭｃについてアッセイされる試験試料と同じであるまたは（ｉｉ）ヘプシジンについてアッセイされる試験試料がＲＧＭｃについてアッセイされる試験試料と異なる試験試料である、のいずれかであるが、ヘプシジンについてアッセイされる試験試料源およびＲＧＭｃについてアッセイされる試験試料源が同じである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
正常な対照における可溶性ＲＧＭｃのレベルと比較して減少したレベルの可溶性ＲＧＭｃが、対象が鉄欠乏に関連する鉄関連障害を有することを示す、請求項４０に記載の方法。
【請求項６６】
正常な対照における可溶性ＲＧＭｃのレベルと比較して増加したレベルの可溶性ＲＧＭｃが、対象が鉄過剰負荷に関連する鉄関連障害を有することを示す、請求項４０に記載の方法。
【請求項６７】
対象が、癌、急性感染症、慢性感染症、自己免疫疾患、肝疾患および慢性腎疾患からなる群から選択される障害と診断されている、請求項４０に記載の方法。
【請求項６８】
試料が血液試料および血清試料からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項６９】
ステップ（ａ）がイムノアッセイである、請求項４０に記載の方法。
【請求項７０】
イムノアッセイが酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７１】
ＥＬＩＳＡがサンドイッチＥＬＩＳＡである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７２】
試験試料中のＲＧＭｃまたはこの断片の存在、量または濃度を決定する方法であって、少なくとも１つの抗体および少なくとも１つの検出可能な標識を利用するイムノアッセイによりＲＧＭｃ（またはこの断片）について試験試料をアッセイするステップを含み、試験試料中のＲＧＭｃの存在、量または濃度の直接指標または間接指標として検出可能な標識により生成されるシグナルを、対照または較正物質中のＲＧＭｃの存在、量または濃度の直接指標または間接指標として生成されるシグナルと比較するステップを含み、少なくとも１つの抗体のうちの１つが、ＲＧＭｃまたはこの断片に特異的に結合する単離された抗体であり、抗体が（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｅ）配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｇ）配列番号９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｈ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｊ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｋ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｌ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｍ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｎ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｏ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｐ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｑ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１２のアミノ酸を含むＣＤＲ２および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｒ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｓ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、ならびに（ｔ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖からなる群から選択されるドメインまたは領域を含み、それにより、試験試料中のＲＧＭｃまたはこの断片の存在、量または濃度が決定される、方法。
【請求項７３】
試験試料中のＲＧＭｃまたはこの断片の存在、量または濃度が、対象が鉄関連障害を発症するリスクを有するまたはこのリスクがあるかどうかを決定または評価するために使用される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
ＲＧＭｃが膜結合性ＲＧＭｃまたは可溶性ＲＧＭｃである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
正常な対照における膜結合性ＲＧＭｃのレベルと比較して減少したレベルの膜結合性ＲＧＭｃが、対象が鉄過剰負荷に関連する鉄関連障害を有することを示す、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
正常な対照における膜結合性ＲＧＭｃのレベルと比較して増加したレベルの膜結合性ＲＧＭｃが、対象が鉄欠乏に関連する鉄関連障害を有することを示す、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
正常な対照における可溶性ＲＧＭｃのレベルと比較して減少したレベルの可溶性ＲＧＭｃが、対象が鉄欠乏に関連する鉄関連障害を有することを示す、請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
正常な対照における可溶性ＲＧＭｃのレベルと比較して増加したレベルの可溶性ＲＧＭｃが、対象が鉄過剰負荷に関連する鉄関連障害を有することを示す、請求項７４に記載の方法。
【請求項７９】
鉄関連障害が、癌、急性感染症、慢性感染症、自己免疫疾患、肝疾患および慢性腎疾患からなる群から選択される、請求項７３に記載の方法。
【請求項８０】
以下のステップ：
（ａ）捕捉抗体／ＲＧＭｃ（またはこの断片）複合体を形成するように、試験試料を、ＲＧＭｃ（またはこの断片）上のエピトープに結合する、少なくとも１つの捕捉抗体と接触させるステップ、
（ｂ）捕捉抗体／ＲＧＭｃ（またはこの断片）／検出抗体複合体を形成するように、捕捉抗体／ＲＧＭｃ（またはこの断片）複合体を、検出可能な標識を含み、捕捉抗体が結合しないＲＧＭｃ（またはこの断片）上のエピトープに結合する、少なくとも１つの検出抗体と接触させるステップ、および
（ｃ）（ｂ）において形成される捕捉抗体／ＲＧＭｃ（またはこの断片）／検出抗体複合体中の検出可能な標識により生成されるシグナルに基づいて試験試料中のＲＧＭｃ（またはこの断片）の存在、量または濃度を決定するステップ
を含み、それにより、試験試料中のＲＧＭｃ（またはこの断片）の存在、量または濃度が決定される、請求項７２に記載の方法。
【請求項８１】
以下のステップ：
（ａ）捕捉抗体／ＲＧＭｃ（またはこの断片）複合体を形成するように、試験試料を、ＲＧＭｃ（またはこの断片）上のエピトープに結合する、少なくとも１つの捕捉抗体と接触させ、同時にまたはいずれかの順序で連続して、試験試料を、少なくとも１つの捕捉抗体に結合するための試験試料中の任意のＲＧＭｃ（またはこの断片）と競合できる、検出可能に標識されたＲＧＭｃ（またはこの断片）と接触させるステップであって、試験試料中に存在する任意のＲＧＭｃ（またはこの断片）および検出可能に標識されたＲＧＭｃが互いに競合して、捕捉抗体／ＲＧＭｃ（またはこの断片）複合体および捕捉抗体／検出可能に標識されたＲＧＭｃ（またはこの断片）複合体をそれぞれ形成する、ステップ、および
（ｂ）（ｂ）において形成される捕捉抗体／検出可能に標識されたＲＧＭｃ（またはこの断片）複合体中の検出可能な標識により生成されるシグナルに基づいて試験試料中のＲＧＭｃの存在、量または濃度を決定するステップ
を含み、捕捉抗体／検出可能に標識されたＲＧＭｃ（またはこの断片）複合体中の検出可能な標識により生成されるシグナルが試験試料中のＲＧＭｃの量または濃度に反比例し、それにより、試験試料中のＲＧＭｃの存在、量または濃度が決定される、請求項７２に記載の方法。
【請求項８２】
ヘプシジンについて試験試料をアッセイするステップをさらに含む、請求項７２から８１のいずれかに記載の方法。
【請求項８３】
ＲＧＭｃ（またはこの断片）について試験試料をアッセイするためのキットであって、ＲＧＭｃ（またはこの断片）について試験試料をアッセイするための少なくとも１つの成分およびＲＧＭｃ（またはこの断片）について試験試料をアッセイするための指示書を含み、少なくとも１つの成分が、ＲＧＭｃ（またはこの断片）に特異的に結合する単離された抗体を含む少なくとも１つの組成物を含み、抗体が、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｅ）配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｇ）配列番号９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｈ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｊ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｋ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｌ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｍ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｎ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｏ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｐ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｑ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１２のアミノ酸を含むＣＤＲ２および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｒ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｓ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、ならびに（ｔ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖からなる群から選択されるドメインまたは領域を含み、抗体が場合によって検出可能に標識されている、キット。
【請求項８４】
試験試料中でアッセイされるＲＧＭｃまたはこの断片が、対象が鉄関連障害を発症するリスクを有するまたはこのリスクがあるかどうかを決定または評価するために使用される、請求項８３に記載のキット。
【請求項８５】
ＲＧＭｃが膜結合性ＲＧＭｃまたは可溶性ＲＧＭｃである、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
ヘプシジンについて試験試料をアッセイするための少なくとも１つの成分およびヘプシジンについて試験試料をアッセイするための指示書をさらに含む、請求項８３に記載のキット。
【請求項８７】
ＲＧＭｃが、膜結合性ＲＧＭｃ、可溶性ＲＧＭｃ、膜結合性ＲＧＭｃの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、膜結合性ＲＧＭｃのバリアント、可溶性ＲＧＭｃのバリアントまたは前述のいずれかの組合せである、請求項８３または８５に記載のキット。
【請求項８８】
治療的または予防的に有効な量の抗体を、これを必要とする対象に投与するステップを含む、鉄代謝疾患を治療する方法であって、抗体が、（ａ）配列番号４３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｂ）配列番号４４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｃ）配列番号５１のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｄ）配列番号５２のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｅ）配列番号５３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｆ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｇ）配列番号５７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｈ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｇ）配列番号６９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｈ）配列番号７０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｉ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｊ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｋ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｌ）配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｍ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｎ）配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｏ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｐ）配列番号１４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｏ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｐ）配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｑ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号９６のアミノ酸を含むＣＤＲ２および配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｒ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｓ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｔ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｕ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖からなる群から選択されるドメインまたは領域を含み、対象における鉄代謝疾患が治療的または予防的に治療される、方法。
【請求項８９】
鉄代謝疾患が、慢性疾患の貧血（ＡＣＤ）、鉄剤不応性鉄欠乏性貧血、慢性腎疾患の貧血、赤血球生成促進剤に対する耐性およびβ−サラセミアからなる群から選択される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
抗体または抗体断片が、免疫グロブリン分子、ジスルフィド連結したＦｖ、モノクローナル抗体、親和性成熟した抗体、ｓｃＦｖ、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、ヒト化抗体、ヒト抗体、多重特異性抗体、Ｆａｂ、二重特異性抗体、ＤＶＤ、Ｆａｂ’、二特異性抗体、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖからなる群から選択される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
抗体または抗体断片が、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５７および配列番号６９からなる群から選択される配列を含む可変重領域を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９２】
抗体または抗体断片が、配列番号４４、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５８および配列番号７０からなる群から選択される配列を含む可変軽領域を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９３】
抗体または抗体断片が、配列番号９８、配列番号９９および配列番号１００または配列番号１２２、配列番号１２３および配列番号１２４または配列番号１２８、配列番号１２９および配列番号１３０、配列番号１４０、配列番号１４１および配列番号１４２または配列番号１７６、配列番号１７７および配列番号１７８の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変軽ドメインを含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９４】
抗体または抗体断片が、配列番号９５、配列番号９６および配列番号９７または配列番号１１９、配列番号１２０および配列番号１２１または配列番号１２５、配列番号１２６および配列番号１２７または配列番号１３７、配列番号１３８および配列番号１３９、配列番号１７３、配列番号１７４および配列番号１７５の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変重ドメインを含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９５】
抗体または抗体断片が、配列番号９５、配列番号９６および配列番号９７の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変重ドメインならびに配列番号９８、配列番号９９および配列番号１００の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変軽ドメインを含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９６】
抗体または抗体断片が、配列番号１１９、配列番号１２０および配列番号１２１の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変重ドメインならびに配列番号１２２、配列番号１２３および配列番号１２４の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変軽ドメインを含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９７】
抗体または抗体断片が、配列番号１２５、配列番号１２６および配列番号１２７の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変重ドメインならびに配列番号１２８、配列番号１２９および配列番号１３０の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変軽ドメインを含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９８】
抗体または抗体断片が、配列番号１３７、配列番号１３８および配列番号１３９の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変重ドメインならびに配列番号１４０、配列番号１４１および配列番号１４２の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変軽ドメインを含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９９】
抗体または抗体断片が、配列番号１７３、配列番号１７４および配列番号１７５の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変重ドメインならびに配列番号１７６、配列番号１７７および配列番号１７８の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変軽ドメインを含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項１００】
対象が鉄関連障害を有するかどうかを決定する方法であって、
（ａ）対象由来の試料中の膜結合性ＲＧＭｃまたは可溶性ＲＧＭｃのレベルを測定するステップ、および
（ｂ）試料中のＲＧＭｃのレベルを正常な対照と比較するステップ
を含み、ＲＧＭｃのレベルが、
（ａ）配列番号４３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｂ）配列番号４４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｃ）配列番号５１のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｄ）配列番号５２のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｅ）配列番号５３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｆ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｇ）配列番号５７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｈ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｇ）配列番号６９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｈ）配列番号７０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｉ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｊ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｋ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｌ）配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｍ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｎ）配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｏ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｐ）配列番号１４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｏ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｐ）配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｑ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号９６のアミノ酸を含むＣＤＲ２および配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｒ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｓ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｔ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｕ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖からなる群から選択されるドメインまたは領域を含む抗体を使用して測定され、ＲＧＭｃの変化したレベルが、対象が鉄関連障害を有することを示す、方法。
【請求項１０１】
抗体または抗体断片が、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５７および配列番号６９からなる群から選択される配列を含む可変重領域を含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
抗体または抗体断片が、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５８および配列番号７０からなる群から選択される配列を含む可変軽領域を含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
抗体または抗体断片が、配列番号９８、配列番号９９および配列番号１００または配列番号１２２、配列番号１２３および配列番号１２４または配列番号１２８、配列番号１２９および配列番号１３０、配列番号１４０、配列番号１４１および配列番号１４２または配列番号１７６、配列番号１７７および配列番号１７８の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変軽ドメインを含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０４】
抗体または抗体断片が、配列番号９５、配列番号９６および配列番号９７または配列番号１１９、配列番号１２０および配列番号１２１または配列番号１２５、配列番号１２６および配列番号１２７または配列番号１３７、配列番号１３８および配列番号１３９、配列番号１７３、配列番号１７４および配列番号１７５の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変重ドメインを含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０５】
抗体または抗体断片が、配列番号９５、配列番号９６および配列番号９７の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変重ドメインならびに配列番号９８、配列番号９９および配列番号１００の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変軽ドメインを含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０６】
抗体または抗体断片が、配列番号１１９、配列番号１２０および配列番号１２１の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変重ドメインならびに配列番号１２２、配列番号１２３および配列番号１２４の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変軽ドメインを含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０７】
抗体または抗体断片が、配列番号１２５、配列番号１２６および配列番号１２７の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変重ドメインならびに配列番号１２８、配列番号１２８および配列番号１３０の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変軽ドメインを含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０８】
抗体または抗体断片が、配列番号１３７、配列番号１３８および配列番号１３９の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変重ドメインならびに配列番号１４０、配列番号１４１および配列番号１４２の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変軽ドメインを含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０９】
抗体または抗体断片が、配列番号１７３、配列番号１７４および配列番号１７５の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変重ドメインならびに配列番号１７６、配列番号１７７および配列番号１７８の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を含む可変軽ドメインを含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１１０】
抗体または抗体断片が、免疫接着分子、造影剤および治療剤からなる群から選択される作用物質をさらに含む、請求項１００から１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
造影剤が、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識およびビオチンからなる群から選択される、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
放射性標識が、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏおよび１５３Ｓｍからなる群から選択される、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
正常な対照と比較して減少したレベルの膜結合性ＲＧＭｃが、対象が鉄過剰負荷に関連する鉄関連障害を有することを示す、請求項１００に記載の方法。
【請求項１１４】
正常な対照と比較して増加したレベルの膜結合性ＲＧＭｃが、対象が鉄欠乏に関連する鉄関連障害を有することを示す、請求項１００に記載の方法。
【請求項１１５】
ステップ（ａ）の前に、対象が、癌、急性感染症、慢性感染症、自己免疫疾患、肝疾患および慢性腎疾患からなる群から選択される障害と診断される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１１６】
試料が血液試料および血清試料からなる群から選択される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１１７】
ステップ（ａ）がイムノアッセイである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１１８】
イムノアッセイが酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
ＥＬＩＳＡがサンドイッチＥＬＩＳＡである、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
方法が、ヘプシジンの存在、量または濃度について試験試料をアッセイするステップをさらに含み、（ｉ）ヘプシジンについてアッセイされる試験試料はＲＧＭｃについてアッセイされる試験試料と同じであるまたは（ｉｉ）ヘプシジンについてアッセイされる試験試料はＲＧＭｃについてアッセイされる試験試料と異なる試験試料である、のいずれかであるが、ヘプシジンについてアッセイされる試験試料源およびＲＧＭｃについてアッセイされる試験試料源は同じであり、それにより、試験試料中のヘプシジンの存在、量または濃度が決定される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１２１】
試験試料または複数の試験試料が、ＲＧＭｃおよびヘプシジンについて同時にアッセイされるまたはいずれかの順序で連続してアッセイされる、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
方法が、ヘプシジンの存在、量または濃度についての試験試料のアッセイの結果を使用するステップをさらに含み、（ｉ）ヘプシジンについてアッセイされる試験試料はＲＧＭｃについてアッセイされる試験試料と同じであるまたは（ｉｉ）ヘプシジンについてアッセイされる試験試料はＲＧＭｃについてアッセイされる試験試料と異なる試験試料である、のいずれかであるが、ヘプシジンについてアッセイされる試験試料源およびＲＧＭｃについてアッセイされる試験試料源が同じである、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
試験試料中のＲＧＭｃまたはこの断片の存在、量または濃度を決定する方法であって、少なくとも１つの抗体および少なくとも１つの検出可能な標識を利用するイムノアッセイによりＲＧＭｃ（またはこの断片）について試験試料をアッセイするステップを含み、試験試料中のＲＧＭｃの存在、量または濃度の直接指標または間接指標として検出可能な標識により生成されるシグナルを、対象または較正物質中のＲＧＭｃの存在、量または濃度の直接指標または間接指標として生成されるシグナルと比較するステップを含み、少なくとも１つの抗体のうちの１つが、ＲＧＭｃまたはこの断片に特異的に結合する単離された抗体であり、抗体が、（ａ）配列番号４３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｂ）配列番号４４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｃ）配列番号５１のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｄ）配列番号５２のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｅ）配列番号５３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｆ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｇ）配列番号５７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｈ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｇ）配列番号６９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｈ）配列番号７０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｉ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｊ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｋ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｌ）配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｍ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｎ）配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｏ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｐ）配列番号１４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｏ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｐ）配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｑ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号９６のアミノ酸を含むＣＤＲ２および配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｒ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｓ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｔ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｕ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖からなる群から選択されるドメインまたは領域を含み、それにより、試験試料中のＲＧＭｃまたはこの断片の存在、量または濃度が決定される、方法。
【請求項１２４】
試験試料中のＲＧＭｃまたはこの断片の存在、量または濃度が、対象が鉄関連障害を発症するリスクを有するまたはこのリスクがあるかどうかを決定または評価するために使用される、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
ＲＧＭｃが膜結合性ＲＧＭｃまたは可溶性ＲＧＭｃである、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２６】
正常な対照における膜結合性ＲＧＭｃのレベルと比較して減少したレベルの膜結合性ＲＧＭｃが、対象が鉄過剰負荷に関連する鉄関連障害を有することを示す、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２７】
正常な対照における膜結合性ＲＧＭｃのレベルと比較して増加したレベルの膜結合性ＲＧＭｃが、対象が鉄欠乏に関連する鉄関連障害を有することを示す、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２８】
正常な対照における可溶性ＲＧＭｃのレベルと比較して減少したレベルの可溶性ＲＧＭｃが、対象が鉄欠乏に関連する鉄関連障害を有することを示す、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２９】
正常な対照における可溶性ＲＧＭｃのレベルと比較して増加したレベルの可溶性ＲＧＭｃが、対象が鉄過剰負荷に関連する鉄関連障害を有することを示す、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１３０】
鉄関連障害が、癌、急性感染症、慢性感染症、自己免疫疾患、肝疾患および慢性腎疾患からなる群から選択される、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１３１】
以下のステップ：
（ａ）捕捉抗体／ＲＧＭｃ（またはこの断片）複合体を形成するように、試験試料を、ＲＧＭｃ（またはこの断片）上のエピトープに結合する、少なくとも１つの捕捉抗体と接触させるステップ、
（ｂ）捕捉抗体／ＲＧＭｃ（またはこの断片）／検出抗体複合体を形成するように、捕捉抗体／ＲＧＭｃ（またはこの断片）複合体を、検出可能な標識を含み、捕捉抗体が結合しないＲＧＭｃ（またはこの断片）上のエピトープに結合する、少なくとも１つの検出抗体と接触させるステップ、および
（ｃ）（ｂ）において形成される捕捉抗体／ＲＧＭｃ（またはこの断片）／検出抗体複合体中の検出可能な標識により生成されるシグナルに基づいて試験試料中のＲＧＭｃ（またはこの断片）の存在、量または濃度を決定するステップ
を含み、それにより、試験試料中のＲＧＭｃ（またはこの断片）の存在、量または濃度が決定される、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１３２】
以下のステップ：
（ａ）捕捉抗体／ＲＧＭｃ（またはこの断片）複合体を形成するように、試験試料を、ＲＧＭｃ（またはこの断片）上のエピトープに結合する、少なくとも１つの捕捉抗体と接触させ、同時にまたはいずれかの順序で連続して、試験試料を、少なくとも１つの捕捉抗体に結合するための試験試料中の任意のＲＧＭｃ（またはこの断片）と競合できる、検出可能に標識されたＲＧＭｃ（またはこの断片）と接触させるステップであって、が試験試料中に存在する任意のＲＧＭｃ（またはこの断片）および検出可能に標識されたＲＧＭｃが互いに競合して、捕捉抗体／ＲＧＭｃ（またはこの断片）複合体および捕捉抗体／検出可能に標識されたＲＧＭｃ（またはこの断片）複合体をそれぞれ形成する、ステップ、および
（ｂ）（ｂ）において形成される捕捉抗体／検出可能に標識されたＲＧＭｃ（またはこの断片）複合体中の検出可能な標識により生成されるシグナルに基づいて試験試料中のＲＧＭｃの存在、量または濃度を決定するステップ
を含み、捕捉抗体／検出可能に標識されたＲＧＭｃ（またはこの断片）複合体中の検出可能な標識により生成されるシグナルが試験試料中のＲＧＭｃの量または濃度に反比例し、それにより、試験試料中のＲＧＭｃの存在、量または濃度が決定される、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１３３】
ヘプシジンについて試験試料をアッセイするステップをさらに含む、請求項１２３から１３２のいずれかに記載の方法。
【請求項１３４】
ＲＧＭｃ（またはこの断片）について試験試料をアッセイするためのキットであって、ＲＧＭｃ（またはこの断片）について試験試料をアッセイするための少なくとも１つの成分およびＲＧＭｃ（またはこの断片）について試験試料をアッセイするための指示書を含み、少なくとも１つの成分が、ＲＧＭｃ（またはこの断片）に特異的に結合する単離された抗体を含む少なくとも１つの組成物を含み、抗体が、（ａ）配列番号４３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｂ）配列番号４４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｃ）配列番号５１のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｄ）配列番号５２のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｅ）配列番号５３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｆ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｇ）配列番号５７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｈ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｇ）配列番号６９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｈ）配列番号７０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｉ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｊ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｋ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｌ）配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｍ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｎ）配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｏ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｐ）配列番号１４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｏ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｐ）配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｑ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号９６のアミノ酸を含むＣＤＲ２および配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｒ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｓ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｔ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｕ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖からなる群から選択されるドメインまたは領域を含み、抗体が場合によって検出可能に標識されている、キット。
【請求項１３５】
試験試料中でアッセイされるＲＧＭｃまたはこの断片が、対象が鉄関連障害を発症するリスクを有するまたはこのリスクがあるかどうかを決定または評価するために使用される、請求項１３４に記載のキット。
【請求項１３６】
ＲＧＭｃが膜結合性ＲＧＭｃまたは可溶性ＲＧＭｃである、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
ヘプシジンについて試験試料をアッセイするための少なくとも１つの成分およびヘプシジンについて試験試料をアッセイするための指示書をさらに含む、請求項１３４に記載のキット。
【請求項１３８】
ＲＧＭｃが、膜結合性ＲＧＭｃ、可溶性ＲＧＭｃ、膜結合性ＲＧＭｃの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、膜結合性ＲＧＭｃのバリアント、可溶性ＲＧＭｃのバリアントまたは前述のいずれかの組合せである、請求項１３４または１３７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１１年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／５７０，７１５号の利益を主張し、この内容は参照により完全に本明細書に組み込まれている。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−ＷｅｂによりＡＳＣＩＩフォーマットにおいて提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている配列表を含む。２０１３年２月１３日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、０２９９９６−１７６７−ＷＯＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、１０５，７８２バイトのサイズである。
【０００３】
本発明は、鉄関連障害を治療および診断するための抗体およびこの抗体を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
鉄恒常性は身体の正常機能に不可欠である。鉄はヘモグロビン産生の中心となるので、不十分なレベルの鉄は鉄欠乏性貧血を生じる。鉄過剰負荷はまた、腸からの鉄吸収を不適切に増加させることにより鉄のバランスを乱す可能性もある。この増加は、多くの場合、肝臓、膵臓、心臓、下垂体および他の臓器において鉄の沈着を生じ、組織損傷およびこれらの臓器の正常な機能障害を引き起こす。
【０００５】
様々な鉄関連疾患は、少なくとも部分的に、鉄の誤調節に起因し、診断することおよび治療することが難しくなり得る。このような障害には、肝疾患、性腺機能低下症、糖尿病、肝硬変、心筋症、鉄欠乏性貧血および慢性疾患の貧血（「ＡＣＤ」）が含まれる。そして、それは、感染症、悪性腫瘍および／または慢性炎症に関連する鉄の不均等分布により特徴付けられる。鉄関連障害に関連する症状は、多くの場合、不明確であり、影響がすぐに現れない傾向があるので、現在の処置は、多くの場合、鉄障害を適切に診断し、治療することができない。これらの困難さにより、適切な治療を施す遅れを引き起こすことがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、鉄関連障害のための診断および治療の信頼できる方法が必要とされている。慢性疾患の貧血を含む、鉄関連障害のための現在の治療選択には、エポエチンアルファ、エポエチンベータおよびダルベポエチンなどの赤血球生成剤の投与が含まれる。さらなる治療には、経口または非経口（ｐａｒｅｎｔａｌ）の鉄療法および／または輸血が含まれる。しかしながら、鉄療法は限られた効能しかなく、通常、ＡＣＤ対象には勧められていない。さらに、輸血は多臓器機能不全について進行中の問題があり、救命治療患者において死亡率が高くなっている。したがって、十分な様式でエポエチンおよびこの関連する類似体に反応しない対象にとって非常に特異的で、良好な忍容性を示し、有用な治療として役立ち得る、鉄関連疾患を治療する新規方法についての必要性が存在している。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
一態様では、本発明は、反発性ガイダンス分子ｃ（Ｒｅｐｕｌｓｉｖｅ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃ）（「ＲＧＭｃ」）に結合する単離された抗体またはこの抗体断片に関する。抗体は（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｅ）配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｇ）配列番号９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｈ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｊ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｋ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｌ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｍ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｎ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｏ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｐ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｑ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸を含むＣＤＲ２および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｒ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｓ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｔ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖からなる群から選択されるドメインまたは領域を含む。抗体は、免疫グロブリン分子、ジスルフィド連結したＦｖ、親和性成熟した抗体、ｓｃＦｖ、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、ヒト化抗体、ヒト抗体、多重特異性抗体、Ｆａｂ、二重特異性抗体、ＤＶＤ、Ｆａｂ’、二特異性抗体、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖであってもよい。抗体または抗体断片は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項２に記載の単離された抗体または抗体断片。抗体または抗体断片は、ヒトＩｇＭ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、ヒトＩｇＧ１定常ドメイン、ヒトＩｇＥ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３定常ドメインおよびヒトＩｇＡ定常ドメインからなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。
【０００８】
単離された抗体または抗体断片は、配列番号３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域または配列番号９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域を含んでもよい。抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域または配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を含んでもよい。抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域および配列番号４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を含んでもよい。
【０００９】
抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域および配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を含んでもよい。抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域および配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を含んでもよい。抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域および配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域を含んでもよい。抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖を含んでもよい。
【００１０】
抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖を含んでもよい。抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖を含んでもよい。
【００１１】
抗体は、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖を含んでもよい。
【００１２】
抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖を含んでもよい。抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖を含んでもよい。抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖を含んでもよい。抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖を含んでもよい。抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖を含んでもよい。
【００１３】
抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖を含んでもよい。
【００１４】
抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖を含んでもよい。
【００１５】
抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖を含んでもよい。抗体または抗体断片は、免疫接着（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｏｎ）分子、造影剤および治療剤からなる群から選択される作用物質をさらに含んでもよい。造影剤は、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識またはビオチンであってもよい。放射性標識は、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏまたは１５３Ｓｍであってもよい。
【００１６】
別の態様では、本発明はまた、本明細書に記載されている、抗体またはこの断片のいずれか１つをコードする単離された核酸に関する。本開示はまた、本明細書に記載されている抗体、抗体断片、これらの混合物または誘導体を含む医薬組成物に関する。
【００１７】
別の態様では、本発明はまた、鉄代謝疾患を治療する方法に関する。方法は、治療的または予防的に有効な量の抗体を、これを必要とする対象に投与するステップを含み、抗体が、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｅ）配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｇ）配列番号９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｈ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｊ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｋ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｌ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｍ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｎ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｏ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｐ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｑ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１２のアミノ酸を含むＣＤＲ２および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｒ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｓ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、ならびに（ｔ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｕ）配列番号４３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｖ）配列番号４４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｗ）配列番号５１のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｘ）配列番号５２のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｙ）配列番号５３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｚ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ａａ）配列番号５７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｂｂ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｃｃ）配列番号６９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｄｄ）配列番号７０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｅｅ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｆｆ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｇｇ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｈｈ）配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｉｉ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｊｊ）配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｋｋ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｌｌ）配列番号１４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｍｍ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｎｎ）配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｏｏ）配列番号９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｐｐ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｑｑ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｒｒ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｓｓ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖からなる群から選択されるドメインまたは領域を含み、対象における鉄代謝疾患は治療的または予防的に治療される。例えば、この方法で治療される鉄代謝疾患は、慢性疾患の貧血（ＡＣＤ）、鉄剤不応性鉄欠乏性貧血、慢性腎疾患の貧血、赤血球生成促進剤に対する耐性およびβ−サラセミアからなる群から選択されてもよい。
【００１８】
別の態様では、本発明はまた、対象が鉄関連障害を有するかどうかを決定する方法に関する。この方法は、
ａ．対象由来の試料中の膜結合性ＲＧＭｃまたは可溶性ＲＧＭｃのレベルを測定するステップ、および
ｂ．試料中のＲＧＭｃのレベルを正常な対照または較正物質のＲＧＭｃのレベルと比較するステップであって、ＲＧＭｃの変化したレベルが、対象が鉄関連障害を有することを示す、ステップ、および
ｃ．対象が鉄関連障害を有すると診断するステップ
を含む。対象と比較して変化したレベルのＲＧＭｃが、対象が鉄関連障害を有することを示し得る。上記の方法において、正常な対照のＲＧＭｃレベルと比較して減少したレベルの膜結合性ＲＧＭｃが、対象が鉄過剰負荷に関連する鉄関連障害を有することを示す。上記の方法において、正常な対照のＲＧＭｃレベルと比較して減少したレベルの膜結合性ＲＧＭｃが、対象が鉄過剰負荷に関連する鉄関連障害を有することを示す。上記の方法において、正常な対照のＲＧＭｃレベルと比較して増加したレベルの膜結合性ＲＧＭｃが、対象が鉄欠乏に関連する鉄関連障害を有することを示す。上記の方法において、正常な対照のＲＧＭｃレベルと比較して減少したレベルの可溶性ＲＧＭｃが、対象が鉄欠乏に関連する鉄関連障害を有することを示す。上記の方法において、正常な対照のＲＧＭｃレベルと比較して増加したレベルの可溶性ＲＧＭｃが、対象が鉄過剰負荷に関連する鉄関連障害を有することを示す。上記の方法において、対象は、癌、急性感染症、慢性感染症、自己免疫疾患、肝疾患および慢性腎疾患からなる群から選択される障害と以前に診断されているまたは診断されている場合がある。上記の方法において、試料は血液試料および血清試料からなる群から選択されてもよい。上記の方法において、ステップａ）は酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などのイムノアッセイである。
【００１９】
詳細には、ＥＬＩＳＡはサンドイッチＥＬＩＳＡであってもよい。上記の方法において、試料中の膜結合性ＲＧＭｃまたは可溶性ＲＧＭｃのレベルは上記の単離された抗体のいずれかを使用して決定されてもよい。
【００２０】
別の態様では、本発明はまた、試験試料中のＲＧＭｃまたはこの断片の存在、量または濃度を決定する方法に関する。この方法は、少なくとも１つの抗体および少なくとも１つの検出可能な標識を利用するイムノアッセイによりＲＧＭｃ（またはこの断片）について試験試料をアッセイするステップを含み、試験試料中のＲＧＭｃの存在、量または濃度の直接指標または間接指標として検出可能な標識により生成されるシグナルを、対照または較正物質中のＲＧＭｃの存在、量または濃度の直接指標または間接指標として生成されるシグナルと比較するステップを含み、少なくとも１つの抗体のうちの１つが、ＲＧＭｃまたはこの断片に特異的に結合する単離された抗体であり、抗体が、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｅ）配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｇ）配列番号９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｈ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｊ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｋ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｌ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｍ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｎ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｏ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｐ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｑ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１２のアミノ酸を含むＣＤＲ２および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｒ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｓ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｔ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｕ）配列番号４３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｖ）配列番号４４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｗ）配列番号５１のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｘ）配列番号５２のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｙ）配列番号５３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｚ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ａａ）配列番号５７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｂｂ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｃｃ）配列番号６９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｄｄ）配列番号７０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｅｅ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｆｆ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｇｇ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｈｈ）配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｉｉ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｊｊ）配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｋｋ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｌｌ）配列番号１４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｍｍ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｎｎ）配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｏｏ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｐｐ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｑｑ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｒｒ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｓｓ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖からなる群から選択されるドメインまたは領域を含み、それにより、試験試料中のＲＧＭｃまたはこの断片の存在、量または濃度が決定される。
【００２１】
上記の方法において、試験試料中のＲＧＭｃまたはこの断片の存在、量または濃度が、対照が鉄関連障害を発症するリスクを有するまたはこのリスクがあるかどうかを決定または評価するために使用される。上記の方法において、ＲＧＭｃは膜結合性ＲＧＭｃまたは可溶性ＲＧＭｃである。上記の方法において、正常な対照のＲＧＭｃレベルと比較して減少したレベルの膜結合性ＲＧＭｃが、対象が鉄過剰負荷に関連する鉄関連障害を有することを示す。上記の方法において、正常な対照のＲＧＭｃのレベルと比較して増加したレベルの膜結合性ＲＧＭｃが、対象が鉄欠乏に関連する鉄関連障害を有することを示す。上記の方法において、正常な対象のＲＧＭｃのレベルと比較して減少したレベルの可溶性ＲＧＭｃが、対象が鉄欠乏に関連する鉄関連障害を有することを示す。上記の方法において、正常な対照のＲＧＭｃレベルと比較して増加したレベルの可溶性ＲＧＭｃが、対象が鉄過剰負荷に関連する鉄関連障害を有することを示す。上記の方法において、鉄関連障害は、癌、急性感染症、慢性感染症、自己免疫疾患、肝疾患および慢性腎疾患からなる群から選択される。さらに、上記の方法は以下のステップ：
ａ．捕捉抗体／ＲＧＭｃ（またはこの断片）複合体を形成するように、試験試料を、ＲＧＭｃ（またはこの断片）上のエピトープに結合する、少なくとも１つの捕捉抗体と接触させるステップ、
ｂ．捕捉抗体／ＲＧＭｃ（またはこの断片）／検出抗体複合体を形成するように、捕捉抗体／ＲＧＭｃ（またはこの断片）複合体を、検出可能な標識を含み、捕捉抗体が結合しないＲＧＭｃ（またはこの断片）上のエピトープに結合する、少なくとも１つの検出抗体と接触させるステップ、および
ｃ．（ｂ）において形成される捕捉抗体／ＲＧＭｃ（またはこの断片）／検出抗体複合体中の検出可能な標識により生成されるシグナルに基づいて試験試料中のＲＧＭｃ（またはこの断片）の存在、量または濃度を決定するステップ
をさらに含んでもよく、それにより、試験試料中のＲＧＭｃ（またはこの断片）の存在、量または濃度が決定される。
【００２２】
代替として、上記方法は以下のステップ：
ａ．捕捉抗体／ＲＧＭｃ（またはこの断片）複合体を形成するように、試験試料を、ＲＧＭｃ（またはこの断片）上のエピトープに結合する、少なくとも１つの捕捉抗体と接触させ、同時にまたはいずれかの順序で連続して、試験試料を、少なくとも１つの捕捉抗体に結合するための試験試料中の任意のＲＧＭｃ（またはこの断片）と競合できる、検出可能に標識されたＲＧＭｃ（またはこの断片）と接触させるステップであって、試験試料中に存在する任意のＲＧＭｃ（またはこの断片）および検出可能に標識されたＲＧＭｃが互いに競合して、捕捉抗体／ＲＧＭｃ（またはこの断片）複合体および捕捉抗体／検出可能に標識されたＲＧＭｃ（またはこの断片）複合体をそれぞれ形成する、ステップ、および
ｂ．（ｂ）において形成される捕捉抗体／検出可能に標識されたＲＧＭｃ（またはこの断片）複合体中の検出可能な標識により生成されるシグナルに基づいて試験試料中のＲＧＭｃの存在、量または濃度を決定するステップをさらに含んでもよく、捕捉抗体／検出可能に標識されたＲＧＭｃ（またはこの断片）複合体中の検出可能な標識により生成されるシグナルが試験試料中のＲＧＭｃの量または濃度に反比例し、それにより、試験試料中のＲＧＭｃの存在、量または濃度が決定される。上記の方法は、ヘプシジンについて試験試料をアッセイするステップをさらに含んでもよい。
【００２３】
別の態様では、本発明はまた、対象が鉄関連障害を有するかどうかを決定する方法に関する。この方法は、
ａ．対象由来の第１の試料中の膜結合性ＲＧＭｃまたは可溶性ＲＧＭｃのレベルを測定するステップ、
ｂ．対象由来の第２の試料中のヘプシジンのレベルを測定するステップ、
ｃ．第１の試料中のＲＧＭｃのレベルを正常な対照または較正物質中のＲＧＭｃのレベルと比較するステップ、および
ｄ．第２の試料中のヘプシジンのレベルを正常な対照または較正物質中のヘプシジンのレベルと比較するステップであって、変化したレベルのＲＧＭｃおよびヘプシジンの各々が、対象が鉄関連障害を有することを示す、ステップ、および
ｅ．対象が鉄関連障害を有すると診断するステップ
を含む。
【００２４】
上記の方法において、正常な対象における膜結合性ＲＧＭｃのレベルと比較して減少したレベルの膜結合性ＲＧＭｃが、対象が鉄過剰負荷に関連する鉄関連障害を有することを示す。上記の方法において、正常な対照における膜結合性ＲＧＭｃのレベルと比較して増加したレベルの膜結合性ＲＧＭｃが、対象が鉄欠乏に関連する鉄関連障害を有することを示す。上記の方法において、正常な対照における可溶性ＲＧＭｃのレベルと比較して減少したレベルの可溶性ＲＧＭｃが、対象が鉄欠乏に関連する鉄関連障害を有することを示す。上記の方法において、正常な対照における可溶性ＲＧＭｃのレベルと比較して増加したレベルの可溶性ＲＧＭｃが、対象が鉄過剰負荷に関連する鉄関連障害を有することを示す。上記の方法において、正常な対照におけるヘプシジンのレベルと比較して減少したレベルのヘプシジンが、対象が鉄過剰負荷に関連する鉄関連障害を有することを示す。上記の方法において、正常な対照におけるヘプシジンのレベルと比較して増加したレベルのヘプシジンが、対象が鉄欠乏に関連する鉄関連障害を有することを示す。
【００２５】
上記の方法において、対象は、癌、急性感染症、慢性感染症、自己免疫疾患、肝疾患および慢性腎疾患からなる群から選択される障害と診断されている。上記の方法において、膜結合性ＲＧＭｃまたは可溶性ＲＧＭｃのレベルならびに第１の試料および第２の試料の各々におけるヘプシジンのレベルが連続して決定される。上記の方法において、膜結合性ＲＧＭｃまたは可溶性ＲＧＭｃのレベルならびに第１の試料および第２の試料の各々におけるヘプシジンのレベルが連続して決定される。
【００２６】
上記の方法において、試料は血液試料および血清試料からなる群から選択される。上記の方法において、ステップａ）は酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）である。例えば、ＥＬＩＳＡはサンドイッチＥＬＩＳＡである。上記の方法において、試料中の膜結合性ＲＧＭｃまたは可溶性ＲＧＭｃのレベルは上記の単離された抗体のいずれかを使用して決定される。
【００２７】
ＲＧＭｃ（膜結合性ＲＧＭｃ、可溶性ＲＧＭｃ、膜結合性ＲＧＭｃの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性ＲＧＭｃまたは可溶性ＲＧＭｃ）のバリアントまたはこれらの任意の組合せなど）およびヘプシジンについての任意のアッセイは、同じ種類の方法または異なる方法を使用しておよび同じ患者などの同じ供給源から得た同じ試験試料または異なる試験試料を使用して同時またはいずれかの順序で連続して行われてもよい。代替として、方法はまた、同じ患者などの同じ供給源から得た試験試料のアッセイから得たデータを使用するステップを含んでもよいが、異なる時点でヘプシジンについてアッセイされるか、または異なる時点でヘプシジンについて得られアッセイされる。
【００２８】
別の態様では、本発明はまた、ＲＧＭｃ（またはこの断片）について試験試料をアッセイするためのキットに関する。このキットは、ＲＧＭｃ（またはこの断片）について試験試料をアッセイするための少なくとも１つの成分およびＲＧＭｃ（またはこの断片）について試験試料をアッセイするための指示書を含んでもよく、少なくとも１つの成分が、ＲＧＭｃ（またはこの断片）に特異的に結合する単離された抗体を含む少なくとも１つの組成物を含み、抗体が、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｅ）配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｇ）配列番号９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｈ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｊ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｋ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｌ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｍ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｎ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｏ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｐ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｑ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１２のアミノ酸を含むＣＤＲ２および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｒ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｓ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｔ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｕ）配列番号４３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｖ）配列番号４４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｗ）配列番号５１のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｘ）配列番号５２のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｙ）配列番号５３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｚ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ａａ）配列番号５７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｂｂ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｃｃ）配列番号６９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｄｄ）配列番号７０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｅｅ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｆｆ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｇｇ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｈｈ）配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｉｉ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｊｊ）配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｋｋ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｌｌ）配列番号１４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｍｍ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｎｎ）配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｏｏ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｐｐ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｑｑ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｒｒ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｓｓ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖からなる群から選択されるドメインまたは領域を含み、抗体が場合によって検出可能に標識されている。上記のキットにおいて、試験試料中でアッセイされるＲＧＭｃまたはこの断片が、対象が鉄関連障害を発症するリスクを有するまたはこのリスクがあるかどうかを決定または評価するために使用される。さらに、アッセイされるＲＧＭｃは膜結合性ＲＧＭｃまたは可溶性ＲＧＭｃである。キットは、ヘプシジンについて試験試料をアッセイするための少なくとも１つの成分およびヘプシジンについて試験試料をアッセイするための指示書をさらに含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】鉄恒常性に関連するシグナル伝達経路の簡略図を示す。
【図２】鉄恒常性に関連するシグナル伝達経路の別の簡略図を示す。
【図３】ラットにおいてヒト化５Ｆ９．２３（ｈ５Ｆ９．２３）が血中鉄レベルを増加させることを示すヒストグラムである。図３は、０、２０、６０または２００ｍｇ／ｋｇの静脈注射により１週間に１回処置したラットのデータを示す。血中鉄レベルは、使用した全てのｈ５Ｆ９．２３用量において有意に増加した（有意性：＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。このデータは、ラットにおいてｈ５Ｆ９．２３が血中鉄レベルを増加させることを示す。
【図４】ラットにおいてｈ５Ｆ９．２３が飽和トランスフェリン１レベル（％）を増加させることを示すヒストグラムである。飽和トランスフェリン１レベルは、０、２０、６０または２００ｍｇ／ｋｇのｈ５Ｆ９．２３のＩＶ注射により１週間に１回処置したラットにおいて測定した。飽和トランスフェリン１レベルは全てのｈ５Ｆ９．２３用量において有意に増加した（有意性：＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図５】ラットにおいてｈ５Ｆ９．２３が飽和トランスフェリン２レベル（％）を増加させることを示すヒストグラムである。飽和トランスフェリン２レベルは、０、２０、６０または２００ｍｇ／ｋｇのｈ５Ｆ９．２３のＩＶ注射により１週間に１回処置したラットにおいて測定した。飽和トランスフェリン２レベルは全てのｈ５Ｆ９．２３用量において有意に増加した（有意性：＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図６】ラットにおいてｈ５Ｆ９．２３が不飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ）を減少させることを示すヒストグラムである。不飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ）もまた、０、２０、６０または２００ｍｇ／ｋｇのｈ５Ｆ９．２３のＩＶ注射により１週間に１回処置したラットにおいて測定された。ＵＩＢＣレベルは全てのｈ５Ｆ９．２３用量において有意に減少した（有意性：＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図７】プルシアンブルーで染色した固定したラット肝臓試料（対照）を示す（１００倍の倍率）。矢印は肝葉の門脈周辺領域に向けられている。
【図８】プルシアンブルーで染色した固定したラット肝臓試料（２００ｍｇ／ｋｇ／週のｈ５Ｆ９．２３で処置した）を示す（１００倍の倍率）。矢印は肝葉の門脈周辺領域に向けられている。黒色の顆粒が鉄を表す。
【図９】プルシアンブルーで染色した固定したラットの脾臓試料（対照）を示す（４０倍の倍率）。鉄負荷マクロファージはリンパ濾胞（Ｆ）の間の赤脾髄において示されている。
【図１０】プルシアンブルーで染色した固定したラットの脾臓試料（２００ｍｇ／ｋｇ／週のｈ５Ｆ９．２３で処置した）を示す（４０倍の倍率）。リンパ濾胞（Ｆ）の間の赤脾髄におけるマクロファージは鉄を血清中に放出した。
【図１１】ＲＧＭｃ機能を遮断するための選択したｈ５Ｆ９親和性成熟したＡｂｓを評価するための２９３ＨＥＫ細胞におけるＲＧＭｃ媒介性ＢＭＰレポーターアッセイを示す。（Ａ）ＲＧＭ媒介性ＢＭＰレポーターアッセイの概略図。（Ｂ）ラットハイブリドーマｍＡｂ  ５Ｆ９、ｈ５Ｆ９．２３およびこの親和性成熟したＡｂｓは、用量依存的にＲＧＭｃ媒介性ｌｕｃ活性を阻害した。ＩＣ５０値は凡例の隣に示している。Ｙ軸は相対発光単位（ＲＬＵ）としてルシフェラーゼ活性を表す。
【図１２】メスのカニクイザルを異なる用量のヒト化抗体５Ｆ９．２３（ｈ５Ｆ９．２３）で処置した実施例５の結果を示すヒストグラムである。サルは、４週間にわたって１週間に１回、６０ｍｇ／ｋｇで皮下注射（ｓｃ）されたまたは２０、６０、２００ｍｇ／ｋｇで静脈内注射（ｉｖ）された。２２日目に、抗体投与（４回目の投与）の０．５時間後、４時間後、２４時間後に霊長類の血清を採取した。質量分析法を使用してヘプシジンを測定した。＊＊＊ｐ＜０．００１：事前試験に対する有意性、＊ｐ＜０．０５：事前試験に対する有意性、＊ｐ＜０．０５：対照に対する有意性。
【図１３Ａ】メスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを異なる用量の抗体ｈ５Ｆ９２３．ＡＭ８で処置した実施例６の結果を示すヒストグラムである。ラットは、４週間にわたって１週間に１回、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇで静脈内注射された。４週目の終りに、血清を採取し、以下を測定した：（１）遊離血中鉄レベル（図１３Ａ）。＊＊＊リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（薄い灰色）に対する有意性、＊＊＊ｐ＜０．０１：モノクローナル抗体ヒトＩｇＧ（黒色）に対する有意性。対照は、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡから得たＩＬ−１８に対して誘導されたヒトＩｇＧ抗体である。対照はラットＩＬ−１８タンパク質と交差反応しなかった。
【図１３Ｂ】メスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを異なる用量の抗体ｈ５Ｆ９２３．ＡＭ８で処置した実施例６の結果を示すヒストグラムである。ラットは、４週間にわたって１週間に１回、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇで静脈内注射された。４週目の終りに、血清を採取し、以下を測定した：（２）不飽和鉄結合能（図１３Ｂ）。＊＊＊リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（薄い灰色）に対する有意性、＊＊＊ｐ＜０．０１：モノクローナル抗体ヒトＩｇＧ（黒色）に対する有意性。対照は、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡから得たＩＬ−１８に対して誘導されたヒトＩｇＧ抗体である。対照はラットＩＬ−１８タンパク質と交差反応しなかった。
【図１４Ａ】メスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを、異なる用量の抗体ｈ５Ｆ９２３．ＡＭ８で処置した実施例７の結果を示すヒストグラムである。ラットは、４週間にわたって１週間に１回、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇで静脈内注射された。４週目の終りに、血清を採取し、以下を測定した：（１）遊離血中鉄レベル（図１４Ａ）。＊＊＊ｐ＜０．００１、ビヒクル対照に対する有意性；＊＊ｐ＜０．０１、ビヒクル対照に対する有意性；＊ｐ＜０．０５、ビヒクル対照に対する有意性。ビヒクル対照は、３０ｍＭのヒスチジン、８％ｗ／ｖのスクロース、ｐＨ６．０プラス０．０２％のＴｗｅｅｎ８０の水中溶液を含む。
【図１４Ｂ】メスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを、異なる用量の抗体ｈ５Ｆ９２３．ＡＭ８で処置した実施例７の結果を示すヒストグラムである。ラットは、４週間にわたって１週間に１回、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇで静脈内注射された。４週目の終りに、血清を採取し、以下を測定した：（２）不飽和鉄結合能（図１４Ｂ）。＊＊＊ｐ＜０．００１、ビヒクル対照に対する有意性；＊＊ｐ＜０．０１、ビヒクル対照に対する有意性；＊ｐ＜０．０５、ビヒクル対照に対する有意性。ビヒクル対照は、３０ｍＭのヒスチジン、８％ｗ／ｖのスクロース、ｐＨ６．０プラス０．０２％のＴｗｅｅｎ８０の水中溶液を含む。
【図１５】実施例８に記載されている第１のセットの実験の結果を示すヒストグラムであり、ｈ５Ｆ９２３．ＡＭ８および１Ａ−２９８９が、ヘモグロビンレベルを増加させることによって３０日目でのＡＣＤラットの貧血を改善したことを実証している。また、この図に示しているように、ドルソモルフィンは不活性であった。
【図１６Ａ】実施例８に記載されている第２のシリーズの実験の結果を示すヒストグラムである。詳細には、図１６Ａは、対照抗体ｈＩｇＧが、４１日目、４７日目および５１日目において貧血性ラットの低いヘモグロビンレベルを有意に変化させないことを示す。＊ｐ＜０．０５：Ｄ０ヘモグロビンに対する有意性。
【図１６Ｂ】実施例８に記載されている第２のシリーズの実験の結果を示すヒストグラムである。図１６Ｂは、ＲＧＭ  Ａに選択的であったヒト化モノクローナル抗体が、４１日、４７日および５１日において貧血性ラットの低いヘモグロビンレベルを有意に変化させないことを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、Ｄ０ヘモグロビンレベルに対する有意性。
【図１６Ｃ】実施例８に記載されている第２のシリーズの実験の結果を示すヒストグラムである。図１６Ｃは、抗体ｈ５Ｆ９．ＡＭ８が、４１日目、４７日目および５１日目において貧血性ラットの低いヘモグロビンレベル（Ｄ２４）を有意に増加させることを示す。＊＊＊ｐ＜０．００１、０日目（Ｄ０）のヘモグロビンレベルに対する有意性。Ｄ４１：＊ｐ＜０．０５、Ｄ２４に対する有意性、Ｄ４７／５５：＊ｐ＜０．０５、Ｄ２４に対する有意性。
【図１６Ｄ】実施例８に記載されている第２のシリーズの実験の結果を示すヒストグラムである。図１６Ｄは、抗体ｈ５Ｆ９．２３が、４１日目、４７日目および５１日目において貧血性ラットの低いヘモグロビンレベル（２４日目（Ｄ２４）を増加させることを示す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１、４１日目におけるＤ０ヘモグロビンレベルに対する有意性：＊ｐ＜０．０５、２４日目、４７日目および５１日目に対する有意性：＊ｐ＜０．０５、日に対する有意性。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
ＲＧＭｃは、筋肉、網膜および門脈周囲肝細胞において発現されたグリコシルホスファチジルイノシトール（「ＧＰＩ」）アンカー膜タンパク質である。ＲＧＭｃは身体において鉄恒常性を維持するためにシグナル伝達タンパク質を介してヘプシジンと共に作用する。例えば、Ｓｅｖｅｒｙｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、４２２：３９３−４０３（２００９）およびＰｉｅｔｒａｎｇｅｌｏ、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、５４：１７３−１８１（２０１１）を参照されたい。細胞膜ＲＧＭｃはネオゲニンに結合し、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を介してシグナル伝達を促進し、この骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、ヘプシジン遺伝子発現を促進するために下流エフェクターを介して細胞内シグナル伝達を誘発する。再び、例えば、Ｐｉｅｔｒａｎｇｅｌｏ、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、５４：１７３−１８１（２０１１）を参照されたい。可溶性ＲＧＭｃは、セリンプロテアーゼ、マトリプターゼ−２（ＴＭＰＲＳＳ６）による膜結合ＲＧＭｃの切断により放出される。可溶性ＲＧＭｃの放出は鉄の細胞外濃度を減少させることにより誘発され、反対に、増加した鉄の細胞外濃度により阻害される。再び、例えば、Ｓｅｖｅｒｙｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、４２２：３９３−４０３（２００９）および図１を参照されたい。ＲＧＭｃの可溶性形態はＢＭＰ６を膜結合ＲＧＭｃから隔離し、それにより、ヘプシジン発現の誘導を防止する。図２を参照されたい。
【００３１】
ＢＭＰがＢＭＰ受容体ＩおよびＩＩに結合すると、膜結合複合体はネオゲニン、ＢＭＰ６およびＲＧＭｃと共に形成される。Ｓｍａｄｓ（Ｓｍａｄｓ１、５および８）と呼ばれる、細胞内タンパク質と一緒に、この複合体は細胞内シグナルを変換し、それにより、ヘプシジン発現および最終的に全身性鉄代謝を支配するシグナル伝達経路を開始する。再び、例えば、Ｐｉｅｔｒａｎｇｅｌｏ、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、５４：１７３−１８１（２０１１）および図１を参照されたい。ヘプシジンは、哺乳動物の排他的鉄輸送体である、フェロポーチンに結合する。ヘプシジンがフェロポーチンに結合すると、フェロポーチンはマクロファージにより内在化されるおよびフェロポーチンが分解される十二指腸細胞により内在化されるので、鉄輸送経路を遮断する。例えば、Ｈｅｎｔｚら、Ｃｅｌｌ、１４２：２４−３８（２０１０）およびＣｈｅｎｇら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１１：３３−４２（２０１１）を参照されたい。
【００３２】
マクロファージおよび十二指腸細胞の両方はフェロポーチンを発現し、高いヘプシジンレベルにおいて、フェロポーチンのヘプシジンにより誘導される分解は利用可能な鉄輸送経路のみを遮断する。結果として、マクロファージおよび十二指腸細胞の両方は大量の細胞内鉄を蓄積する。図１を参照されたい。これらの細胞はもはや鉄を血液中に放出できないので、慢性疾患の貧血（「ＡＣＤ」）は一般的な結果である。再び、例えば、Ｃｈｅｎｇら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１１：３３−４２（２０１１）を参照されたい。
【００３３】
ＲＧＭｃ特異的抗体は、血漿中の鉄濃度および種々の組織に対する鉄の分布を直接調節する、ヘプシジンの正常な発現を遮断する。この抗体はＢＭＰとＲＧＭｃとの間の結合を防ぐことができる。この抗体はＢＭＰとＲＧＭｃのＮ末端との間の結合を防ぐことができる。この作用の結果、ヘプシジンの発現が減少されるまたは阻害される。ヘプシジンレベルが減少するにつれて、鉄のフェロポーチン依存性輸送は増加する。なぜなら、ヘプシジンはもはやフェロポーチンに結合し、この内在化および分解を誘導するのに利用できないからである。図２を参照されたい。
【００３４】
本発明者らは、反発性ガイダンス分子ｃ（「ＲＧＭｃ」）に結合する抗体が鉄代謝を調節するために使用できるという驚くべき発見をした。血漿中の鉄濃度および種々の組織に対する鉄の分布を直接調節する、ヘプシジンの正常な発現を遮断する抗体が本発明において提供される。過剰なレベルのヘプシジンは鉄制限性貧血を引き起こす。例えば、ヘプシジンレベルの目立った増加が、ＡＣＤを有する患者および急性炎症（ＡＩ）を有する患者において報告されている。わずかに増加したヘプシジンレベルが、ＡＣＤおよび鉄欠乏性貧血（ＡＣＤ−ＩＤＡ）を有する患者において観察された。鉄欠乏性貧血（ＩＤＡ）のみを有する患者は低い血清ヘプシジンレベルの傾向を示した。例えば、血清ヘプシジンレベルは、健康な対照において１７７，５８μｇ／ｌ（＋／−１１９，８４）、ＡＣＤ患者において４３４，８３μｇ／ｌ（＋／−２１７）、ＡＩ患者において４１０，０８μｇ／ｌ（＋／−２９９，９６）、ＡＣＤ−ＩＤＡ患者において２３８，３２μｇ／ｌ（＋／−９３，８５）およびＩＤＡ患者においてわずかに減少した血清ヘプシジンレベル１１０，７９μｇ／ｌ（＋／−１９，２２）であると示されている。対照的に、ヘモクロマトーシスは低い血清ヘプシジンレベルにより特徴付けられている。さらに、β−サラセミア（ｔｈａｌａａｓｓａｅｍｉａ）は、ヘプシジンレベルが低くなり得る疾患である。
【００３５】
本明細書に開示されている抗体は鉄代謝疾患の治療に有用である。さらに、本明細書に開示されている抗体は、対象が鉄関連障害を有するかどうかを決定するための診断アッセイに有用である。
【００３６】
１．定義
本明細書に使用される専門用語は、特定の実施形態を説明する目的のためだけであり、限定することを意図していない。本明細書および添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形「一つの（ａ）」、「および（ａｎｄ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他に明確に記載していない限り、複数の参照も含む。
【００３７】
ａ．約
本明細書に使用されている場合、「約」とは、記載した値からおおよそ＋／−１０％の変動を指すことができる。このような変動は、特定の参照がなされているか否かに関わらず、本明細書に提供されている任意の所与の値に常に含まれることが理解される。
【００３８】
ｂ．親和性成熟した抗体
「親和性成熟した抗体」は、１つ以上のＣＤＲにおいて１つ以上の変化を有する抗体を指すために本明細書において使用され、変化を有さない親抗体と比較して標的抗原のための抗体の親和性（すなわちＫＤ、ｋｄまたはｋａ）の向上を生じる。例示的な親和性成熟した抗体は標的抗原に対してナノモル濃度またはさらにピコモル濃度の親和性を有する。親和性成熟した抗体を生産するための種々の手段は当該技術分野において公知であり、バイオディスプレイを使用して調製されている組合せ抗体ライブラリーのスクリーニングを含む。例えば、Ｍａｒｋｓら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏ１ｏｇｙ、１０：７７９−７８３（１９９２）は、ＶＨおよびＶＬドメインシャフリングによる親和性成熟を記載している。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム変異導入法は、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：３８０９−３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒら、Ｇｅｎｅ、１６９：１４７−１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５：１９９４−２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４（７）：３３１０−３３１９（１９９５）；およびＨａｗｋｉｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６：８８９−８９６（１９９２）に記載されている。活性増強アミノ酸残基を有する選択的変異誘発位置および接触または超変異位置における選択的変異は米国特許第６，９１４，１２８Ｂ１号に記載されている。
【００３９】
ｃ．抗体および複数の抗体
本明細書に使用されている場合、「抗体」および「複数の抗体」は、モノクローナル抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体（完全または部分的にヒト化された）、動物抗体（例えば、限定されないが、トリ（例えば、カモまたはガン）、サメ、クジラおよび非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウスなど）を含む哺乳動物または非ヒト霊長類（例えば、サル、チンパンジーなど）、組換え抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖｓ（「ｓｃＦｖ」）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド連結したＦｖｓ（「ｓｄＦｖ」）および抗イディオタイプ（「抗Ｉｄ」）抗体、二重ドメイン抗体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）または三重可変ドメイン（ＴＶＤ）抗体（二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびこれらを作製する方法は、Ｗｕ，Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５（１１）：１２９０−１２９７（２００７）およびＰＣＴ国際出願ＷＯ２００１／０５８９５６に記載されており、これらの各々の内容は参照により本明細書に組み込まれている。）ならびに上記のいずれかの機能的に活性なエピトープ結合断片を指す。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、すなわち、検体結合部位を含有する分子を含む。免疫グロブリン分子は、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであってもよい。簡潔化するために、検体に対する抗体は、本明細書において頻繁に、「抗検体抗体」または単に「検体抗体」（例えば、抗ＲＧＭｃ抗体またはＲＧＭｃ抗体）のいずれかであると称される。
【００４０】
ｄ．抗体断片
本明細書に使用されている場合、「抗体断片」は抗原結合部位または可変領域を含むインタクトな抗体の一部を指す。この一部は、インタクトな抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（すなわち、抗体アイソタイプに応じてＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４）を含まない。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、一本の軽鎖可変ドメインのみを含有する一本鎖ポリペプチド、軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有する一本鎖ポリペプチド、一本の重鎖可変領域のみを含有する一本鎖ポリペプチドおよび重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有する一本鎖ポリペプチドが含まれる。
【００４１】
ｅ．結合定数
「結合定数」は本明細書に記載されている。本明細書に使用されている場合、「会合速度定数」、「ｋｏｎ」または「ｋａ」という用語は、この標的抗原に対する抗体の結合速度または以下の式：
抗体（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）→Ａｂ−Ａｇ
により示されるような抗体と抗原との間の複合体形成の速度を示す値を指す。
【００４２】
本明細書において交換可能に使用されている、「解離速度定数」、「ｋｏｆｆ」または「ｋｄ」という用語は、抗体のこの標的抗原からの解離速度または以下の式：
抗体（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）←Ａｂ−Ａｇ
により示されるような遊離抗体および抗原へのＡｂ−Ａｇ複合体の経時的な分離を示す値を指す。
【００４３】
会合速度定数および解離速度定数を決定する方法は当該技術分野において周知である。蛍光ベースの技術を使用することにより、平衡状態で生理学的緩衝液中の試料を試験するための高い感度および能力が提供される。ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）（生体分子相互作用分析）アッセイなどの他の実験的アプローチおよび機器が使用されてもよい（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｃｏｍｐａｎｙ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎから入手可能な機器）。さらに、Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ、Ｉｄａｈｏ）から入手可能なＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）アッセイもまた、使用されてもよい。
【００４４】
本明細書において交換可能に使用されている、「平衡解離定数」または「ＫＤ」という用語は、解離速度（ｋｏｆｆ）を会合速度（ｋｏｎ）で割ることにより得られる値を指す。会合速度、解離速度および平衡解離定数は、抗原に対する抗体の結合親和性を表すために使用されている。
【００４５】
ｆ．結合タンパク質
「結合タンパク質」は、例えば、ポリペプチド、抗原、化学化合物もしくは他の分子または任意の種類の基質などの結合パートナーを有する複合体に結合し、これを形成する単量体タンパク質または多量体タンパク質を指すために本明細書において使用されている。結合タンパク質は結合パートナーに特異的に結合する。結合タンパク質には、抗体およびこの抗原結合断片ならびに当該技術分野において知られているおよび本明細書の以下に記載されている他の種々の形態およびこれらの誘導体ならびに抗原分子または抗原分子上の特定の部位（エピトープ）に結合する１つ以上の抗原結合ドメインを含む他の分子が含まれる。したがって、結合タンパク質には、限定されないが、抗体、四量体免疫グロブリン、ＩｇＧ分子、ＩｇＧ１分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、親和性成熟した抗体および抗原に結合する能力を保持している任意のこのような抗体の断片が含まれる。
【００４６】
ｇ．二特異性抗体
「二特異性抗体」は、クアドローマ技術（Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３０５（５９３４）：５３７−５４０（１９８３）を参照のこと）により生成される、２つの異なるモノクローナル抗体の化学的コンジュゲーション（Ｓｔａｅｒｚら、Ｎａｔｕｒｅ、３１４（６０１２）：６２８−６３１（１９８５））により生成されるまたはＦｃ領域において変異を導入し、複数の異なる免疫グロブリン種（このうちの１つのみが機能的二特異性抗体である）をもたらす「ノブイントゥホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」もしくは同様のアプローチ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０（１４）：６４４４−６４４８（１９９３）を参照のこと）により生成される完全長抗体を指すために本明細書において使用されている。二特異性抗体は、この２つの結合アームのうちの１つ（１対のＨＣ／ＬＣ）において１つの抗原（またはエピトープ）に結合し、この第２のアーム（異なる対のＨＣ／ＬＣ）において異なる抗原（またはエピトープ）に結合する。この定義により、二特異性抗体は、（特異性およびＣＤＲ配列の両方において）２つの別個の抗原結合アームを有し、これが結合する各抗原に対して一価である。
【００４７】
ｈ．ＣＤＲ
「ＣＤＲ」は、抗体可変配列内の「相補性決定領域」を指すために本明細書において使用されている。重鎖および軽鎖の可変領域の各々において３つのＣＤＲが存在し、これらは可変領域の各々について「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」および「ＣＤＲ３」と指定されている。本明細書に使用されている場合、「ＣＤＲセット」という用語は、抗原に結合する単一の可変領域において生じる３つのＣＤＲの群を指す。これらのＣＤＲの正確な境界は異なるシステムに従って異なって定義されている。Ｋａｂａｔにより記載されている系（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７）および（１９９１））は、抗体の任意の可変領域に適用可能な明白な残基番号付けシステムを提供するだけでなく、３つのＣＤＲを定義する正確な残基境界も提供する。これらのＣＤＲは、「Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ」と称されることもある。Ｃｈｏｔｈｉａおよび共同研究者（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１−９１７（１９８７）；ならびにＣｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７７−８８３（１９８９））は、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ内の特定の下位部分が、アミノ酸配列のレベルで大きな多様性を有するにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド骨格立体構造をとることを見出した。これらの下位部分は、「Ｌ１」、「Ｌ２」および「Ｌ３」または「Ｈ１」、「Ｈ２」および「Ｈ３」と指定され、ここで、「Ｌ」および「Ｈ」は、軽鎖領域および重鎖領域をそれぞれ指定する。これらの領域は、「Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ」と称されることもあり、これは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと重複する境界を有する。Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと重複するＣＤＲを定義する他の境界は、Ｐａｄｌａｎ、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、９：１３３−１３９（１９９５）およびＭａｃＣａｌｌｕｍ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６２（５）：７３２−７４５（１９９６）により記載されている。さらに他のＣＤＲ境界定義は、本明細書のシステムの１つを厳密にたどらない場合もあるが、それでも、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと重複するが、これらは、特定の残基または残基の群または全ＣＤＲでさえ、抗原結合に大幅に影響を与えないという予測または実験的知見を踏まえて、短くされる場合も、長くされる場合もある。本明細書において使用されている方法は、これらのシステムのいずれかに従って定義されたＣＤＲを利用し得るが、特定の実施形態は、ＫａｂａｔまたはＣｏｔｈｉａによって定義されているＣＤＲを使用する。
【００４８】
ｉ．成分または複数の成分
「成分」、「複数の成分」または「少なくとも１つの成分」は、概して、本明細書に記載されている方法および当技術分野で公知の他の方法に従って、試験試料、例えば、患者尿、血清または血漿試料をアッセイするためにキット中に含まれ得る、捕捉抗体、検出またはコンジュゲート較正物質、対照、感度パネル、容器、バッファー、希釈液、塩、酵素、酵素についての補因子、検出試薬、前処理試薬／溶液、基質（例えば、溶液として）、停止溶液などを指す。いくつかの成分は、溶液中にあるまたはアッセイにおいて使用するための再構成のために凍結乾燥され得る。
【００４９】
ｊ．コンセンサスまたはコンセンサス配列
本明細書に使用されている場合、「コンセンサス」または「コンセンサス配列」は、特定の抗原の複数のサブタイプのアラインメントの分析に基づいて構築される合成核酸配列または対応するポリペプチド配列を指す。この配列は特定の抗原の複数のサブタイプまたは血清型（ｓｅｒｔｙｐｅ）に対する広範な免疫力を誘導するために使用され得る。融合タンパク質などの合成抗原がコンセンサス配列（またはコンセンサス抗原）に操作されてもよい。
【００５０】
ｋ．対照
本明細書に使用されている場合、「対照」は、対象の検体、例えばＲＧＭｃ（膜結合性ＲＧＭｃ、可溶性ＲＧＭｃ、膜結合性ＲＧＭｃの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性ＲＧＭｃまたは可溶性ＲＧＭｃ）のバリアントまたはこれらの任意の組合せなど）を含有しないことが知られている組成物（「陰性」）または対象の検体、例えばＲＧＭｃ（膜結合性ＲＧＭｃ、可溶性ＲＧＭｃ、膜結合性ＲＧＭｃの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性ＲＧＭｃまたは可溶性ＲＧＭｃ）のバリアントまたはこれらの任意の組合せなど）を含有することが知られている組成物（「陽性対照」）を指す。陽性対照は既知の濃度のＲＧＭｃを含んでもよい。「対照」、「陽性対照」および「較正物質」は、本明細書において交換可能に使用されてもよく、既知の濃度のＲＧＭｃを含む組成物を指す。「陽性対照」はアッセイ性能特性を確立するために使用されてもよく、試薬（例えば検体）の完全性の有用な指標である。「正常な対照」は、鉄関連疾患または障害を含んでいない試料または対象を指すことができる。
【００５１】
ｌ．誘導体
本明細書に使用されている場合、抗体の「誘導体」は、純粋な抗体または親抗体と比較してこのアミノ酸配列に対する１つ以上の修飾を有する抗体を指すことができ、修飾されたドメイン構造を示す。誘導体は依然として、天然抗体およびアミノ酸配列に見られる典型的なドメイン配置をとることができ、特異性で標的（抗原）に結合できる。抗体誘導体の典型例は、他のポリペプチドに結合される抗体、再配列された抗体ドメインまたは抗体の断片である。誘導体はまた、少なくとも１つのさらなる化合物、例えばタンパク質ドメインを含んでもよく、前記タンパク質ドメインは共有結合または非供給結合により連結される。連結は当該技術分野における公知の方法に従った遺伝子融合に基づき得る。本発明に従って利用される抗体を含む融合タンパク質に存在する追加ドメインは、好ましくは、柔軟性のあるリンカー、有益にはペプチドリンカーにより連結されてもよく、前記ペプチドリンカーは、さらなるタンパク質ドメインのＣ末端と抗体のＮ末端またはその逆の間の距離に及ぶのに十分な長さの複数の親水性のペプチド結合アミノ酸を含む。抗体は、生物活性または例えば固体支持体、生物学的に活性な物質（例えばサイトカインまたは成長ホルモン）、化学剤、ペプチド、タンパク質または薬物との選択的結合に適した配置を有するエフェクター分子に連結されてもよい。
【００５２】
ｍ．二重特異性抗体
「二重特異性抗体」は、この２つの結合アームの各々（１対のＨＣ／ＬＣ）（ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０２７７３を参照のこと）における２つの異なる抗原（またはエピトープ）に結合できる完全長抗体を指すために本明細書において使用されている。したがって、二重特異性結合タンパク質は、同一の特異性および同一のＣＤＲ配列を有する、２つの同一の抗原結合アームを有し、これが結合する各抗原に対して二価である。
【００５３】
ｎ．二重可変ドメイン
「二重可変ドメイン」は、二価（２つの抗原結合部位）、四価（４つの抗原結合部位）または多価結合タンパク質であり得る、結合タンパク質における２つ以上の抗原結合部位を指すために本明細書に使用されている。ＤＶＤは、単一特異的であってもよい、すなわち、１つの抗原（または１つの特異的エピトープ）と結合できるまたは多特異的であってもよい、すなわち、２つ以上の抗原（すなわち、同じ標的抗原分子の２つ以上のエピトープまたは異なる標的抗原の２つ以上のエピトープ）と結合できる。好ましいＤＶＤ結合タンパク質は２つの重鎖ＤＶＤポリペプチドおよび２つの軽鎖ＤＶＤポリペプチドを含み、「ＤＶＤ免疫グロブリン」または「ＤＶＤ−Ｉｇ」と称される。したがって、このようなＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質は四量体であり、ＩｇＧ分子を連想させるが、ＩｇＧ分子より多くの抗原結合部位を提供する。したがって、四量体ＤＶＤ−Ｉｇ分子の各半分はＩｇＧ分子の半分を連想させ、重鎖ＤＶＤポリペプチドおよび軽鎖ＤＶＤポリペプチドを含むが、単一抗原結合ドメインを提供するＩｇＧ分子の１対の重鎖および軽鎖とは異なり、ＤＶＤ−Ｉｇの１対の重鎖および軽鎖は２つ以上の抗原結合部位を提供する。
【００５４】
ＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質の各抗原結合部位はドナー（「親」）モノクローナル抗体に由来し得るので、抗原結合部位ごとの抗原結合に関与する全部で６個のＣＤＲを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。したがって、２つの異なるエピトープ（すなわち、２つの異なる抗原分子の２つの異なるエピトープまたは同じ抗原分子の２つの異なるエピトープ）に結合するＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質は、第１の親モノクローナル抗体に由来する抗原結合部位および第２の親モノクローナル抗体の抗原結合部位を含む。
【００５５】
ＤＶＤ−Ｉｇ結合分子の設計、発現および特徴付けの説明は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００７／０２４７１５、米国特許第７，６１２，１８１号およびＷｕら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２５：１２９０−１２９７（２００７）に提供されている。このようなＤＶＤ−Ｉｇ分子の好ましい例は、構造式ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎ（式中、ＶＤ１は、第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであり（ただし、ＣＨ１ではない）、Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、ｎは、０または１であるが、好ましくは、１である）を含む重鎖および構造式ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎ（式中、ＶＤ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであり（ただし、ＣＨ１ではない）、Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まず、ｎは、０または１であるが、好ましくは、１である）を含む軽鎖を含む。このようなＤＶＤ−Ｉｇは、２つのこのような重鎖および２つのこのような軽鎖を含むことがあり、ここで、各鎖は、可変領域の間に介在する定常領域を有さず、タンデムに結合された可変ドメインを含み、重鎖および軽鎖は、会合して、タンデムの機能性抗原結合部位を形成し、１対の重鎖および軽鎖は、別の対の重鎖および軽鎖と会合して、４つの機能的抗原結合部位を有する四量体結合タンパク質を形成し得る。別の例では、ＤＶＤ−Ｉｇ分子は、可変領域の間に介在する定常領域を有さず、タンデムに連結された３つの可変ドメイン（ＶＤ１、ＶＤ２、ＶＤ３）を各々含む重鎖および軽鎖を含むことがあり、ここで、１対の重鎖および軽鎖は、会合して、３つの抗原結合部位を形成し得、１対の重鎖および軽鎖は、別の対の重鎖および軽鎖と会合して、６つの抗原結合部位を有する四量体結合タンパク質を形成し得る。
【００５６】
好ましい実施形態では、本発明に係るＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質は、この親モノクローナル抗体により結合された同じ標的分子に結合するだけでなく、１つ以上のこの親モノクローナル抗体の１つ以上の望ましい特性も有する。好ましくは、このようなさらなる特性は１つ以上の親モノクローナル抗体の抗体パラメータである。１つ以上のこの親モノクローナル抗体に由来するＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質に起因し得る抗体パラメータには、限定されないが、抗原特異性、抗原親和性、有効性、生物学的機能、エピトープ認識、タンパク質安定性、タンパク質溶解性、生産効率、免疫原性、薬物動態、生物学的利用能、組織交差反応性およびオルソログ抗原結合が含まれる。
【００５７】
ＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質はＲＧＭｃの少なくとも１つのエピトープに結合する。ＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質の非限定的な例には、ＲＧＭｃの１つ以上のエピトープに結合するＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質、ヒトＲＧＭｃのエピトープおよび別の種（例えば、マウス）のＲＧＭｃのエピトープに結合するＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質ならびにヒトＲＧＭｃのエピトープおよび別の標的分子（例えば、ＶＥＧＦＲ２またはＶＥＧＦＲ１）のエピトープに結合するＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質が含まれる。
【００５８】
ｏ．エピトープまたは複数のエピトープ
「エピトープ」または「複数のエピトープ」または「対象のエピトープ」は、認識され、この特異的結合パートナーにおける相補的部位に結合できる任意の分子における部位を指す。分子および特異的結合パートナーは特異的結合対の一部である。例えば、エピトープは、ポリペプチド、タンパク質、ハプテン、糖鎖抗原（限定されないが、糖脂質、糖タンパク質またはリポ多糖など）または多糖上にあってもよい。この特異的結合パートナーは、限定されないが、抗体であってもよい。
【００５９】
ｐ．フレームワークまたはフレームワーク配列
本明細書に使用されている場合、「フレームワーク」（ＦＲ）または「フレームワーク配列」は、可変領域からＣＤＲを引いた残りの配列を意味し得る。ＣＤＲ配列の正確な定義は異なるシステム（例えば、上記を参照のこと）により決定され得るので、フレームワーク配列の意味は、異なる解釈に対応して依存する。６つのＣＤＲ（軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２および−Ｌ３ならびに重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、−Ｈ２および−Ｈ３）はまた、軽鎖および重鎖におけるフレームワーク領域を各鎖における４つのサブ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）に分け、ＣＤＲ１はＦＲ１とＦＲ２との間に位置し、ＣＤＲ２はＦＲ２とＦＲ３との間に位置し、ＣＤＲ３はＦＲ３とＦＲ４との間に位置する。特定のサブ領域をＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４と特定せずに、他に称されるフレームワーク領域は、単一の天然に生じる免疫グロブリン鎖の可変領域内の組合わされたＦＲを表す。本明細書に使用されている場合、ＦＲは４つのサブ領域のうちの１つを表し、ＦＲｓはフレームワーク領域を構成する４つのサブ領域の２つ以上を表す。
【００６０】
ヒト重鎖および軽鎖ＦＲ配列は、当該技術分野において公知であり、当該技術分野において公知の技術を使用して非ヒト抗体をヒト化するために重鎖および軽鎖「アクセプター」フレームワーク配列（または単に「アクセプター」配列）として使用され得る。一実施形態では、ヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列は、Ｖ−ベース（ハイパーテキスト転送プロトコール：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）などの公表されているデータベースまたは国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（登録商標）（ＩＭＧＴ（登録商標））情報システム（ハイパーテキスト転送プロトコール：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／ｔｅｘｔｓ／ＩＭＧＴｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ／ＬｏｃｕｓＧｅｎｅｓ／）に記載されているフレームワーク配列から選択される。
【００６１】
ｑ．機能的抗原結合部位
本明細書に使用されている場合、「機能的抗原結合部位」は、標的抗原を結合できる結合タンパク質（例えば抗体）における部位を意味し得る。抗原結合部位の抗原結合親和性は、親結合タンパク質、例えばこの抗原結合部位が由来する親抗体ほど強力でなくてもよいが、抗原に結合する能力は、タンパク質、例えば抗原に結合する抗体を評価するために知られている種々の方法のいずれか１つを使用して測定可能でなければならない。さらに、本明細書における多価タンパク質、例えば多価抗体の抗原結合部位の各々の抗原結合親和性は定量的に同じである必要はない。
【００６２】
ｒ．ヒト化抗体
「ヒト化抗体」は、非ヒト種（例えばマウス）由来の重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体を示すために本明細書に使用されているが、ＶＨおよび／またはＶＬ配列の少なくとも一部は、十分に「ヒト様」である、すなわちヒト生殖細胞可変配列と十分に類似するように変化されている。「ヒト化抗体」は、抗体またはこのバリアント、誘導体、類似体もしくは断片であり、対象の抗原に免疫特異的に結合し、実質的にヒト抗体のアミノ酸配列を有するフレームワーク（ＦＲ）領域および実質的に非ヒト抗体のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。本明細書に使用されている場合、ＣＤＲに関して「実質的に」という用語は、非ヒト抗体ＣＤＲのアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有するＣＤＲを指す。ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的に２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂＣ、Ｆｖ）のうちの実質的に全てを含み、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全ては非ヒト免疫グロブリン（すなわちドナー抗体）のＣＤＲ領域に対応し、フレームワーク領域の全てまたは実質的に全てはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域である。一実施形態では、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にヒト免疫グロブリンの少なくとも一部も含む。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、軽鎖および重鎖の少なくとも可変ドメインを含有する。抗体はまた、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４領域を含んでもよい。一部の実施形態では、ヒト化抗体のみがヒト化軽鎖を含有する。一部の実施形態では、ヒト化抗体のみがヒト化重鎖を含有する。特定の実施形態では、ヒト化抗体のみが軽鎖および／またはヒト化重鎖のヒト化可変ドメインを含有する。
【００６３】
ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含む、免疫グロブリンの任意のクラスならびに限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む、任意のアイソタイプから選択されてもよい。ヒト化抗体は１つより多いクラスまたはアイソタイプに由来する配列を含んでもよく、特定の定常ドメインが、当該技術分野において周知の技術を使用して所望のエフェクター機能を最適化するために選択されてもよい。
【００６４】
ヒト化抗体のフレームワーク領域およびＣＤＲは、親配列、例えばドナー抗体ＣＤＲに正確に対応する必要はないまたはコンセンサスフレームワークは、少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、挿入および／または欠失により変異誘発され得るので、この部位におけるＣＤＲまたはフレームワーク残基はドナー抗体またはコンセンサスフレームワークのいずれにも対応しない。好ましい実施形態では、このような変異は、しかしながら、広範囲に及ばない。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％は、親ＦＲおよびＣＤＲ配列のヒト化抗体残基に対応する。本明細書に使用されている場合、「コンセンサスフレームワーク」という用語は、コンセンサス免疫グロブリン配列内のフレームワーク領域を指す。本明細書に使用されている場合、「コンセンサス免疫グロブリン配列」という用語は、関連する免疫グロブリン配列のファミリーにおいて最も頻繁に存在するアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成される配列を指す（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ、Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、１９８７）を参照のこと）。したがって、「コンセンサス免疫グロブリン配列」は、「コンセンサスフレームワーク領域」および／または「コンセンサスＣＤＲ」を含んでもよい。免疫グロブリンのファミリーにおいて、コンセンサス配列内の各位置は、ファミリーにおけるこの位置で最も頻繁に存在するアミノ酸により占められる。２つのアミノ酸が同等に頻繁に存在する場合、いずれかはコンセンサス配列内に含まれ得る。
【００６５】
ｓ．同一または同一性
２つ以上のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列に関して本明細書に使用されている場合、「同一」または「同一性」は、配列が特定の領域にわたって同じである特定のパーセンテージの残基を有することを意味し得る。パーセンテージは、２つの配列を最適に並べ、特定の領域にわたって２つの配列を比較し、一致した位置の数を得るために同一の残基が両方の配列において存在する位置の数を決定し、一致した位置の数を指定した領域における位置の総数で割り、この結果に１００を掛けることにより計算されて、配列同一性のパーセンテージを得ることができる。２つの配列が異なる長さを有するまたはアラインメントが１つ以上の交互の端部を生成し、比較の指定した領域が単一配列のみを含む場合、単一配列の残基は計算の分子ではなく、分母に含まれる。
【００６６】
ｔ．単離されたポリヌクレオチド
本明細書に使用されている場合、「単離されたポリヌクレオチド」は、この起源によって、（例えば、ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成起源またはこれらの組合せの）ポリヌクレオチドを意味することができ、単離されたポリヌクレオチドは、「単離されたポリヌクレオチド」がそれと共に天然に見られるポリヌクレオチドの全てまたは一部と会合していないか、天然では連結していないポリヌクレオチドに作動可能に連結されているか、またはより長い配列の一部として天然には存在していない。
【００６７】
ｕ．標識および検出可能な標識
本明細書に使用されている場合、「標識」および「検出可能な標識」は、抗体と検体との間の反応を検出可能にするために抗体または検体と結合している部分を指し、このように標識された抗体または検体は「検出可能に標識された」と称される。標識は、視覚による手段または機器による手段により検出可能であるシグナルを生成できる。種々の標識には、シグナル生成物質、例えば、色原体、蛍光化合物、化学発光化合物、放射性化合物などが含まれる。標識の代表的な例には、光を生成する部分、例えばアクリジニウム化合物および蛍光を生成する部分、例えばフルオレセインが含まれる。他の標識が本明細書に記載されている。これに関して、部分それ自体は検出可能でなくてもよいが、さらに別の部分と反応すると検出可能になってもよい。「検出可能に標識された」という用語の使用は、このような標識を包含することを目的とする。
【００６８】
当該技術分野において公知である任意の適切な検出可能な標識が使用されてもよい。例えば、検出可能な標識は、放射性標識（例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐおよび３３Ｐ）、酵素標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ペルオキシダーゼ、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼなど）、化学発光標識（例えばアクリジニウムエステル、チオエステルまたはスルホンアミド；ルミノール、イソルミノール、フェナントリジニウムエステルなど）、蛍光標識（例えばフルオレセイン（例えば、５−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、３’６−カルボキシフルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、６−ヘキサクロロ−フルオレセイン、６−テトラクロロフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートなど））、ローダミン、フィコビリタンパク質、Ｒ−フィコエリトリン、量子ドット（例えば、硫化亜鉛キャップドセレン化カドミウム（ｚｉｎｃ  ｓｕｌｆｉｄｅ−ｃａｐｐｅｄ  ｃａｄｍｉｕｍ  ｓｅｌｅｎｉｄｅ））、温度標識またはイムノ−ポリメラーゼ（ｉｍｍｕｎｏ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）連鎖反応標識であってもよい。標識の導入、標識化処理および標識の検出は、ＰｏｌａｋおよびＶａｎ  Ｎｏｏｒｄｅｎ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｌｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９９７）ならびにＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎにより公開されている組合わされたハンドブックおよびカタログである、Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（１９９６）に見出される。蛍光標識はＦＰＩＡにおいて使用されてもよい（例えば、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，５９３，８９６号、同第５，５７３，９０４号、同第５，４９６，９２５号、同第５，３５９，０９３号および同第５，３５２，８０３号を参照のこと）。アクリジニウム化合物は、均一化学発光アッセイにおいて検出可能な標識として使用され得る（例えば、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１６：１３２４−１３２８（２００６）；Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：２３１３−２３１７（２００４）；Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４：３９１７−３９２１（２００４）；およびＡｄａｍｃｚｙｋら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．５：３７７９−３７８２（２００３）を参照のこと）。
【００６９】
一態様では、アクリジニウム化合物はアクリジニウム−９−カルボキサミドである。アクリジニウム９−カルボキサミドを調製する方法は、Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ、Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．６：１０７−１１４（１９９１）；Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３：５６３６−５６３９（１９９８）；Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５５：１０８９９−１０９１４（１９９９）；Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．１：７７９−７８１（１９９９）；Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１１：７１４−７２４（２０００）；Ｍａｔｔｉｎｇｌｙら、Ｉｎ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｄｙｋｅ、Ｋ．Ｖ．Ｅｄ．；ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ｐｐ．７７−−１０５（２００２）；Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．５：３７７９−３７８２（２００３）；ならびに米国特許第５，４６８，６４６号、同第５，５４３，５２４号および同第５，７８３，６９９号（これらの各々は、これらに関する教示のために参照によりこの全体が本明細書に組み込まれている。）に記載されている。
【００７０】
アクリジニウム化合物の別の例は、アクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルである。式ＩＩのアクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルの例は、１０−メチル−９−（フェノキシカルボニル）アクリジニウムフルオロスルホネート（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩから入手可能である）である。アクリジニウム９−カルボキシレートアリールエステルを調製する方法は、ＭｃＣａｐｒａら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．４：１１１１−２１（１９６５）；Ｒａｚａｖｉら、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  １５：２４５−２４９（２０００）；Ｒａｚａｖｉら、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  １５：２３９−２４４（２０００）；および米国特許第５，２４１，０７０号（これらの各々は、これらに関する教示のために参照によりこの全体が本明細書に組み込まれている。）に記載されている。このようなアクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルは、シグナルの強度および／またはシグナルの速度に関して少なくとも１つのオキシダーゼによる検体の酸化において生成される過酸化水素のための効果的な化学発光指標である。アクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルについての化学発光の時間は急速、すなわち１秒足らずで完了するのに対して、アクリジニウム−９−カルボキサミド化学発光は２秒以上延びる。しかしながら、アクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルはタンパク質の存在下でこの化学発光特性を損失する。したがって、この使用は、シグナル生成および検出の間、タンパク質の非存在を必要とする。試料中のタンパク質を分離また除去する方法は当業者に周知であり、限定されないが、限外濾過、抽出、沈殿、透析、クロマトグラフィーおよび／または消化が含まれる（例えば、Ｗｅｌｌｓ、Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（２００３）を参照のこと）。試験試料から除去または分離されるタンパク質の量は、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％または約９５％であってもよい。アクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルおよびこの使用に関するさらなる詳細は、２００７年４月９日に出願された米国特許出願公開第１１／６９７，８３５号に記載されている。アクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルは、脱気した無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはコール酸ナトリウム水溶液   などの任意の適切な溶媒中に溶解され得る。
【００７１】
ｖ．連結配列および連結ペプチド配列
「連結配列」または「連結ペプチド配列」は、対象の１つ以上のポリペプチド配列（例えば、完全長、断片など）に接続される天然または人工ポリペプチド配列を指す。「接続される」という用語は、対象のポリペプチド配列に対する連結配列の結合を指す。このようなポリペプチド配列は好ましくは１つ以上のペプチド結合により結合される。連結配列は約４から約５０個のアミノ酸の長さを有してもよい。好ましくは、連結配列の長さは約６から約３０個のアミノ酸である。天然の連結配列は、人口連結配列を作製するためにアミノ酸の置換、付加または欠失により修飾されてもよい。例示的な連結配列には、限定されないが、（ｉ）対象のポリペプチドおよび抗体の単離および精製を容易にするための連結配列として有用である、ＨＨＨＨＨＨのアミノ酸配列（配列番号１９７）を有する、６Ｘ  Ｈｉｓタグ（配列番号１９７）などのヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ；（ｉｉ）対象のタンパク質および抗体の単離および精製に使用されているＨｉｓタグのようなエンテロキナーゼ切断部位が含まれる。多くの場合、エンテロキナーゼ切断部位は対象のタンパク質および抗体の単離および精製においてＨｉｓタグと一緒に使用されている。種々のエンテロキナーゼ切断部位は当該技術分野において公知である。エンテロキナーゼ切断部位の例には、限定されないが、ＤＤＤＤＫのアミノ酸配列（配列番号１９８）およびこの誘導体（例えば、ＡＤＤＤＤＫ（配列番号１９９）など）が含まれ；（ｉｉｉ）種々雑多な配列が、一本鎖可変領域断片の軽鎖および／または重鎖可変領域を連結または接続するために使用されてもよい。他の連結配列の例は、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）に見出され得る。連結配列はまた、薬物の付着または固体支持体への付着などのさらなる機能のために修飾されてもよい。本開示に関して、モノクローナル抗体は、例えば、Ｈｉｓタグ、エンテロキナーゼ切断部位またはこの両方などの連結配列を含有してもよい。
【００７２】
ｗ．多価結合タンパク質
「多価結合タンパク質」は、２つ以上の抗原結合部位（本明細書において「抗原結合ドメイン」とも称される）を含む結合タンパク質を指すために本明細書において使用されている。多価結合タンパク質は、好ましくは、３つ以上の抗原結合部位を有するように操作され、一般に天然に存在する抗体ではない。「多特異的結合タンパク質」という用語は、同じ標的分子の２つ以上の異なるエピトープに結合できる結合タンパク質を含む、２つ以上の関連するまたは関連しない標的に結合できる結合タンパク質を指す。
【００７３】
ｘ．所定のカットオフおよび所定のレベル
「所定のカットオフ」および「所定のレベル」は、一般に、所定のカットオフ／レベルに対するアッセイ結果を比較することによって診断／予後／治療効果の結果を評価するために使用されているアッセイカットオフ値を指し、所定のカットオフ／レベルは常に、種々の臨床パラメータ（例えば、疾患の重症度、進行／非進行／改善など）と関係または関連している。本開示は例示的な所定のレベルを提供する。しかしながら、カットオフ値はイムノアッセイの性質（例えば、利用される抗体など）に応じて変化し得ることは周知である。さらに、本開示に基づいてこれらの他のイムノアッセイについてのイムノアッセイ特異的カットオフ値を得るために他のイムノアッセイに本明細書の開示を適応させることは十分に当業者の範囲内である。所定のカットオフ／レベルの正確な値はアッセイ間で変化し得るが、本明細書に記載されている関係が全体的に適用可能であるはずである。
【００７４】
ｙ．前処理試薬
本明細書に記載されている診断アッセイに使用されている場合、「前処理試薬」、例えば、溶解、沈殿および／または可溶化試薬は、試験試料中に存在する任意の細胞を溶解するおよび／または任意の検体を可溶化する試薬である。前処理は、本明細書にさらに記載されている全ての試料について必要というわけではない。特に、検体（すなわち、ＲＧＭｃ（膜結合性ＲＧＭｃ、可溶性ＲＧＭｃ、膜結合性ＲＧＭｃの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性ＲＧＭｃまたは可溶性ＲＧＭｃ）のバリアントまたはこれらの任意の組合せなど））の可溶化は、試料中に存在する任意の内因性結合タンパク質由来の検体の放出を伴う。前処理試薬は均一（分離ステップを必要としない）または不均一（分離ステップを必要とする）であってもよい。不均一の前処理試薬を用いて、アッセイの次のステップに進む前に試験試料から任意の沈殿した検体結合タンパク質が除去される。前処理試薬は場合によって、（ａ）１種以上の溶媒および塩、（ｂ）１種以上の溶媒、塩および洗浄剤、（ｃ）洗浄剤、（ｄ）洗浄剤および塩または（ｅ）細胞溶解および／または検体の可溶化に適した任意の試薬または試薬の組み合わせを含んでもよい。
【００７５】
ｚ．品質管理試薬
本明細書に記載されているイムノアッセイおよびキットに関して「品質管理試薬」には、限定されないが、較正物質、対照および感度パネルが含まれる。「較正物質」または「標準物」（例えば、複数などの１つ以上）は典型的に、抗体または検体などの検体の濃度を補間するための較正（標準）曲線を確立するために使用されている。代替として、所定の陽性／陰性カットオフ近くの単一の較正物質が使用されてもよい。「感度パネル」を含むように、複数の較正物質（すなわち、１つより多い較正物質または種々の量の抗生物質）が一緒に使用されてもよい。
【００７６】
ａａ．組換え抗体および複数の組換え抗体
「組換え抗体」および「複数の組換え抗体」は、組換え技術により適切な発現ベクター内で１つ以上のモノクローナル抗体の全てまたは一部をコードする核酸配列をクローニングし、適切な宿主細胞内で抗体を後で発現するステップを含む、１つ以上のステップにより調製される抗体を指す。この用語には、限定されないが、（ｉ）本明細書に記載されている抗体断片、二価抗体、ヘテロコンジュゲートＡｂｓ、ＤＶＤ−Ｉｇ（登録商標）および他の抗体から形成された、組換え生産されたモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体（完全または部分的にヒト化された）、多特異的または多価構造が含まれる（二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびこれらを調製する方法は、Ｗｕ，Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５：１２９０−１２９７（２００７）に記載されている）。本明細書に使用されている場合、「二価抗体」という用語は、１つの抗原部位に対して特異性を有する第１のアームおよび異なる抗原部位に対して特異性を有する第２のアームを含む抗体を指す。すなわち、二価抗体は二重特異性を有する。
【００７７】
ｂｂ．試料、試験試料および患者試料
「試料」、「試験試料」および「患者試料」は、本明細書において交換可能に使用されてもよい。尿、血清、血漿、羊水、脳脊髄液、胎盤細胞または組織、内皮細胞、白血球または単球の試料などの試料は、患者から得た場合、直接使用されてもよいまたは濾過、蒸留、抽出、濃縮、遠心分離、干渉成分の不活性化、試薬の添加などにより前処理されて、本明細書に記載されているまたは別様で当該技術分野において公知であるいくつかの方法で試料の特徴を修飾させてもよい。
【００７８】
ｃｃ．一連の較正組成物
「一連の較正組成物」は、既知の濃度のＣｙｓ−ＲＧＭｃＣを含む複数の組成物を指し、この組成物の各々は、Ｃｙｓ−ＣＲＧＭｃの濃度により連続して他の組成物と異なる。
【００７９】
ｄｄ．固相
「固相」は、不溶性であるまたは後の反応により不溶性になり得る任意の物質を指す。固相は、捕捉剤を引きつけ、固定するこの固有の能力について選択されてもよい。代替として、固相は、捕捉剤を引きつけ、固定する能力を有する連結剤をこの固相に付着させることができる。連結剤は、例えば、捕捉剤自体または捕捉剤にコンジュゲートされた帯電物質に対して逆帯電されている帯電物質を含んでもよい。一般に、連結剤は、固相に固定（付着）され、結合反応を介して捕捉剤を固定する能力を有する任意の結合パートナー（好ましくは特異的）であってもよい。連結剤は、アッセイの実施の前またはアッセイの実施の間、固相物質に対する捕捉剤の間接結合を可能にする。固相は、例えば、プラスチック、誘導体化されたプラスチック、磁性金属または非磁性金属、ガラスまたはシリコンであってもよく、例えば、試験管、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップおよび当業者に公知の他の構造を含む。
【００８０】
ｅｅ．特異的結合
本明細書に使用されている場合、「特異的結合」または「特異的に結合する」は、第２の化学種との抗体、タンパク質またはペプチドの相互作用を指すことができ、この相互作用は、化学種における特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存し、例えば、抗体は、一般に、タンパク質以外の特異的タンパク質構造を認識し、これに結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識された「Ａ」および抗体を含有する反応において、エピトープＡ（または遊離の未標識Ａ）を含有する分子の存在は、抗体に結合された標識されたＡの量を減少させる。
【００８１】
ｆｆ．特異的結合パートナー
「特異的結合パートナー」は特異的結合対のメンバーである。特異的結合対は、化学的または物理的手段を介して互いに特異的に結合する２つの異なる分子を含む。したがって、一般的なイムノアッセイの抗原および抗体特異的結合対に加えて、他の特異的結合対は、ビオチンおよびアビジン（またはストレプトアビジン）、炭水化物およびレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクターおよび受容体分子、補因子および酵素、複数の酵素および酵素阻害剤などを含んでもよい。さらに、特異的結合対は、元の特異的結合メンバーの類似体、例えば検体類似体であるメンバーを含んでもよい。免疫反応性特異的結合メンバーには、単離されているか組換えにより生産されているかに関わらず、抗原、抗原断片ならびにモノクローナルおよびポリクローナル抗体を含む抗体ならびにこれらの複合体および断片が含まれる。
【００８２】
ｇｇ．ストリンジェントな条件
「ストリンジェントな条件」は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でフィルタが結合したＤＮＡとのハイブリダイゼーション、続いて、約５０−６５℃での０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中の１回以上の洗浄を示すために本明細書において使用されている。「高度にストリンジェントな条件下」という用語は、約４５℃での６×ＳＳＣ中のフィルタが結合した核酸とのハイブリダイゼーション、続いて、約６８℃での０．１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中の１回以上の洗浄または他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下を指す。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．Ｉ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、６．３．１−６．３．６および２．１０．３ページを参照されたい。
【００８３】
ｈｈ．治療する、治療しているまたは治療
「治療する」、「治療している」または「治療」は、各々、このような用語が適用される疾患またはこのような疾患の１つ以上の症状の進行を後退させる、軽減または阻害することを示すために本明細書において交換可能に使用されている。対象の状態に応じて、この用語はまた、疾患を予防することを指し、疾患の発症を予防することまたは疾患に関連する症状を予防していることを含む。治療は緊急または習慣的の様式のいずれかで実施されてもよい。この用語はまた、疾患による苦痛の前にこのような疾患に関連する疾患または症状の重症度を減少させることを指す。罹患の前の疾患の重症度のこのような予防または減少は、疾患に罹患している投与の時点ではない対象に対する本発明の抗体または医薬組成物の投与を指す。「予防している」はまた、疾患またはこのような疾患に関連する１つ以上の症状の再発を予防することを指す。「治療」および「治療的に」は、「治療している」が上記に定義されているように、治療の作用を指す。
【００８４】
ｉｉ．トレーサー
本明細書に使用されている場合、「トレーサー」は、フルオレセイン部分にコンジュゲートしたＣｙｓ−ＣＲＧＭｃなどの標識にコンジュゲートした検体または検体断片を指し、標識にコンジュゲートした検体は、検体に特異的な抗体における部位について検体と効果的に競合できる。
【００８５】
ｊｊ．バリアント
「バリアント」は、アミノ酸の挿入、欠失または保存的置換によってアミノ酸配列と異なるが、少なくとも１つの生物活性を保持しているペプチドまたはポリペプチドを示すために本明細書において使用されている。「生物活性」の代表的な例には、特異的抗体が結合する能力または免疫応答を促進する能力が含まれる。バリアントはまた、少なくとも１つの生物活性を保持しているアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を示すために本明細書において使用されている。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を類似した性質（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）の異なるアミノ酸に置換することは、典型的にわずかな変化を含むものとして当該技術分野において認識される。これらのわずかな変化は、当該技術分野において理解されているようにアミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することにより部分的に識別され得る。Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水性親水性指標は、この疎水性および帯電の考慮に基づく。類似した疎水性親水性指標のアミノ酸は置換されてもよく、タンパク質機能をさらに保持できることは当該技術分野において公知である。一態様では、±２の疎水性親水性指標を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性もまた、生物学的機能を保持しているタンパク質を生じる置換を明らかにするために使用されてもよい。ペプチドに関してアミノ酸の親水性の考慮により、抗原性および免疫原性と十分に相関すると報告されている有用な評価基準である、このペプチドの最も大きい局所平均親水性の算出が可能となる。米国特許第４，５５４，１０１号は参照により完全に本明細書に組み込まれている。類似した親水性値を有するアミノ酸の置換は、当該技術分野において理解されている、生物活性、例えば免疫原性を保持しているペプチドを生じ得る。置換は互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸を用いて実施されてもよい。アミノ酸の疎水性親水性指標および親水性値の両方はこのアミノ酸の特定の側鎖による影響を受ける。この観察と一致して、生物学的機能と適合するアミノ酸置換は、アミノ酸の相対的類似性、特に、疎水性、親水性、電荷、大きさおよび他の性質により表されるこれらのアミノ酸の側鎖に依存することが理解される。「バリアント」はまた、アミノ酸配列における抗ＲＧＭｃ抗体の対応する断片と異なるが、依然として抗原性反応であり、ＲＧＭｃとの結合について抗ＲＧＭｃ抗体の対応する断片と競合できる抗ＲＧＭｃ抗体の抗原性反応断片を指すために使用され得る。「バリアント」はまた、タンパク質分解、リン酸化または他の翻訳後修飾などにより異なって処理されているが、この抗原反応性をまだ保持しているポリペプチドまたはこの断片を示すために使用されてもよい。
【００８６】
ｋｋ．ベクター
「ベクター」は、これが連結されている別の核酸を輸送できる核酸分子を示すために本明細書に使用されている。１つの種類のベクターは「プラスミド」であり、これは環状二本鎖ＤＮＡループを指し、この中でさらなるＤＮＡセグメントがライゲーションされてもよい。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノム内でライゲーションされてもよい。特定のベクターは、これらが導入される宿主細胞内で自己複製できる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）が、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム内に組み込まれてもよく、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、これらが作動可能に連結した遺伝子の発現を誘導することができる。このようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。プラスミドがベクターの最も一般的に使用されている形態であるので、「プラスミド」および「ベクター」は交換可能に使用されてもよい。しかしながら、等価機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）などの発現ベクターの他の形態が使用されてもよい。これに関して、ベクターのＲＮＡ型（ＲＮＡウイルスベクターを含む）もまた、本開示の状況で使用されていることが見られ得る。
【００８７】
本明細書における数値範囲の列挙に関して、この間にある各々の数字が、同程度の正確さで明確に意図される。例えば、６−９の範囲に関して、数字７および８が６および９に加えて意図され、６．０−７．０の範囲に関して、数字６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９および７．０が明確に意図される。
【００８８】
２．抗ＲＧＭｃ抗体
血漿中の鉄濃度および種々の組織に対する鉄の分布を直接調節する、ＲＧＭｃに結合し、ヘプシジンの正常な発現を遮断する抗体が本明細書に提供されている。
【００８９】
ａ．ＲＧＭｃ
本明細書において以前に説明されているように、ＲＧＭｃは、筋肉、網膜および門脈周囲肝細胞において発現されたグリコシルホスファチジルイノシトール（「ＧＰＩ」）アンカー膜タンパク質である。ＲＧＭｃは、身体における鉄恒常性を維持するためにシグナル伝達タンパク質を介してヘプシジンと共に作用する。ヘプシジンは、哺乳動物の排他的鉄輸送体である、フェロポーチンに結合することによって全身の鉄代謝を調節する小さなペプチド（２０−２５個のアミノ酸）である。これらの細胞はもはや鉄を血液中に放出できないので、慢性疾患の貧血（「ＡＣＤ」）が一般的な結果である。フェロポーチンのヘプシジンにより誘導される分解は、３００ｍｇ／ｌ超のヘプシジン、３２５ｍｇ／ｌ超のヘプシジン、３５０ｍｇ／ｌ超のヘプシジン、３７５ｍｇ／ｌ超のヘプシジン、４００ｍｇ／ｌ超のヘプシジン、４２５ｍｇ／ｌ超のヘプシジン、４５０ｍｇ／ｌ超のヘプシジンまたは４７５ｍｇ／ｌ超のヘプシジンのレベルで起こり得る。
【００９０】
ヒト遺伝子における変異が重症の鉄過剰負荷障害、若年型ヘモクロマトーシスに関連する場合、予測される３１個のアミノ酸のＮ末端シグナルペプチドおよび４５個のアミノ酸のＣ末端ＧＰＩ付着シグナルを有する４２６個のアミノ酸タンパク質である、ヒトＲＧＭｃが全身の鉄代謝に関与すると最初に提案されている。ヘプシジン発現は、肝細胞の表面上で発現した膜結合ＲＧＭｃにより制御されるおよびヒト血液中に約１μｇ／ｍｌの濃度で存在する可溶性ＲＧＭｃにより制御される。可溶性ＲＧＭｃは、マトリプターゼ−２（ＴＭＰＲＳＳ６）による膜結合ＲＧＭｃの切断により生じる。ＲＧＭｃの可溶性形態はＢＭＰ−６に結合し、これを隔離するので、ヘプシジン発現の誘導を防ぐ。ＲＧＭｃの膜形態は反対の効果を有し、これはヘプシジン発現を増加させる。
【００９１】
ヒトＲＧＭｃは以下のアミノ酸配列を有し得る：
【００９２】
【化１】
2020058359.tif 000002
ヒトＲＧＭｃは配列番号１の断片またはバリアントであってもよい。
【００９３】
ＲＧＭｃの断片は、約５から約４２５個の間のアミノ酸、約１０から約４００個の間のアミノ酸、約５０から約３５０個の間のアミノ酸、約１００から約３００個の間のアミノ酸、約１５０から約２５０個の間のアミノ酸、約２００から約３００個の間のアミノ酸または約７５から約１５０個の間のアミノ酸の長さであってもよい。この断片はＲＧＭｃから連続した数のアミノ酸を含んでもよい。
【００９４】
ＲＧＭｃの断片は以下のアミノ酸配列を有し得る：
【００９５】
【化２】
2020058359.tif 000003
ＲＧＭｃ断片は配列番号２のバリアントであってもよい。
【００９６】
ｂ．ＲＧＭｃ−認識抗体
抗体は、ヒトＲＧＭｃ（膜結合性ＲＧＭｃ、可溶性ＲＧＭｃ、膜結合性ＲＧＭｃの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性ＲＧＭｃまたは可溶性ＲＧＭｃ）のバリアントまたはこれらの任意の組合せなど）に結合する抗体である。抗体は、抗ＲＧＭｃ抗体の断片またはこのバリアントもしくは誘導体であってもよい。抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよい。抗体は、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、完全なヒト抗体または抗体断片、例えばＦａｂ断片またはこれらの混合物であってもよい。抗体は、免疫グロブリン分子、ジスルフィド連結したＦｖ、親和性成熟した抗体、ｓｃＦｖ、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、ヒト化抗体、完全なヒト抗体、多特異的抗体、Ｆａｂ、二重特異性抗体、ＤＶＤ、Ｆａｂ’、二特異性抗体、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖであってもよい。抗体断片または誘導体はＦ（ａｂ’）２、ＦｖまたはｓｃＦｖ断片を含んでもよい。抗体誘導体はペプチド模倣薬により生産されてもよい。さらに、一本鎖抗体を生産するために記載されている技術が、一本鎖抗体を生産するために当該技術分野において公知の方法に従って適応されてもよい。また、トランスジェニック動物がヒト化抗体または完全なヒト抗体を発現するために使用されてもよい。
【００９７】
抗体は、上記のＲＧＭｃポリペプチドまたはバリアントに存在するエピトープ（例えば、配列番号１または配列番号１のバリアントに含まれるエピトープ）を認識でき、これを特異的に結合できる。エピトープは、配列番号２または配列番号２のバリアントに含まれるエピトープであってもよい。
【００９８】
抗体は、好ましくは、当該技術分野において公知である抗ＲＧＭｃ抗体由来の異なる生物学的機能の保有により既知の抗ＲＧＭｃ抗体と区別できる。例えば、膜結合ＲＧＭｃを認識し、これに結合することに加えて、抗体は、好ましくは、さらなる生物活性、例えば、ヘプシジン発現を増加または減少させる能力を有する。さらにまたは代替として、抗体は、ＲＧＭｃ−ネオゲニン相互作用および／またはＲＧＭｃ−ＢＭＰ−６（骨形成タンパク質６）相互作用を遮断する能力を有する。
【００９９】
（１）抗体結合特徴
抗体は、ＲＧＭｃ（膜結合性ＲＧＭｃ、可溶性ＲＧＭｃまたはこれらの組合せ）、この断片またはこのバリアントに免疫特異的に結合でき、少なくとも約１．０×１０−３ｓ−１、少なくとも約１．０×１０−４ｓ−１、少なくとも約１．０×１０−５ｓ−１、少なくとも約１．０×１０−６ｓ−１のｋｏｆｆ（またはｋｄ）を有するまたは約１．０×１０−３ｓ−１から約１．０×１０−６ｓ−１、約１．０×１０−３ｓ−１から約１．０×１０−５ｓ−１もしくは約１．０×１０−３ｓ−１から約１．０×１０−４ｓ−１の範囲であるｋｏｆｆ（またはｋｄ）を有する。断片は配列番号２であってもよい。
【０１００】
抗体は、ＲＧＭｃ（膜結合性ＲＧＭｃ、可溶性ＲＧＭｃまたはこれらの組合せ）、この断片またはこのバリアントに免疫特異的に結合でき、少なくとも約２．４×１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約２．５×１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約３．３×１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約５．０×１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１．２５×１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１．３５×１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１．０×１０８Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１．０×１０９Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎ（またはｋａ）を有するまたは約５．０×１０４Ｍ−１ｓ−１から約１．０×１０８Ｍ−１ｓ−１、約３．３×１０４Ｍ−１ｓ−１から約１．０×１０９Ｍ−１ｓ−１、約２．５×１０４Ｍ−１ｓ−１から約１．２５×１０７Ｍ−１ｓ−１、約２．４×１０４Ｍ−１ｓ−１から約１．３５×１０７Ｍ−１ｓ−１の範囲であるｆｋｏｎ（またはｋａ）を有する。断片は配列番号２であってもよい。
【０１０１】
（２）抗体構造
（ａ）可変重鎖および軽鎖領域ならびに重鎖および軽鎖ＣＤＲ
抗体は、ＲＧＭｃ、この断片またはこのバリアントに免疫特異的に結合でき、表１に示した可変重鎖および／または可変軽鎖を含む。抗体は、ＲＧＭｃ、この断片またはこのバリアントに免疫特異的に結合でき、表１および／または表２にも示した重鎖または軽鎖ＣＤＲ配列の１つ以上を含む。
【０１０２】
【表１】
2020058359.tif 000004
2020058359.tif 000005
2020058359.tif 000006
2020058359.tif 000007
【０１０３】
【表２】
2020058359.tif 000008
2020058359.tif 000009
2020058359.tif 000010
2020058359.tif 000011
2020058359.tif 000012
2020058359.tif 000013
2020058359.tif 000014
2020058359.tif 000015
2020058359.tif 000016
2020058359.tif 000017
【０１０４】
表２における上記のヒト化抗体およびこれらを作製する方法は、米国特許出願公開第２０１０／００２８３４０号に記載されており、この内容は参照により本明細書に組み込まれている。
【０１０５】
表２に示したように、可変領域（ＶＨおよびＶＬ）ＣＤＲ−Ｈ１ドメインは、配列が全て同一である。また、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３ドメインの各々は、それぞれ配列が同一である（すなわち、ＶＨ  ｈ５Ｆ９．１領域のＣＤＲ−Ｈ２ドメインは、ＶＨ  ｈ５Ｆ９．２領域のＣＤＲ−Ｈ２ドメインと同一であり、ＶＨ  ｈ５Ｆ９．２領域のＣＤＲ−Ｈ２ドメインはＶＨ  ｈ５Ｆ９．３領域のＣＤＲ−Ｈ２ドメインと同一であるなど。ＶＨ  ｈ５Ｆ９．１領域のＣＤＲ−Ｈ３ドメインはＶＨ  ｈ５Ｆ９．２領域のＣＤＲ−Ｈ３ドメインと同一であり、ＶＨ  ｈ５Ｆ９．２領域のＣＤＲ−Ｈ３ドメインはＶＨ  ｈ５Ｆ９．３領域のＣＤＲ−Ｈ３ドメインと同一であるなど）。
【０１０６】
本開示のＲＧＭｃ（またはこの断片）に特異的に結合する単離された抗体は、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｅ）配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｇ）配列番号９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｈ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｊ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｋ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｌ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｍ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｎ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｏ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｐ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｑ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１２のアミノ酸を含むＣＤＲ２および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｒ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｓ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｔ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖からなる群から選択される領域またはドメインを有し得る。
【０１０７】
抗体、この断片、このバリアントまたは誘導体は、配列番号３−３４の１つ以上と約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％または約５０％以上の同一性を有する１つ以上のアミノ酸配列を含有してもよい。抗体またはこのバリアントまたは誘導体は、配列番号３−３４の１つ以上をコードする１つ以上の核酸配列と約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％または約５０％以上の同一性を有する１つ以上の核酸配列によりコードされてもよい。ポリペプチド同一性および相同性は、例えば、報告書：Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０、７２６−７３０（１９８３）に記載されているアルゴリズムにより決定され得る。本明細書に記載されている抗体、この断片、このバリアントまたはこの誘導体は、配列番号３−３４の１つ以上をコードする核酸配列の１つ以上の相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされ得る。本明細書に記載されている抗体、この断片、このバリアントまたはこの誘導体は、配列番号３−３４の１つ以上をコードする核酸配列の１つ以上の相補体と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされ得る。
【０１０８】
ｃ．抗体調製／生産
抗体は種々の技術のいずれかにより調製され得る。一般に、抗体が組換え体であり得る抗体の生産を可能にするために、抗体は、従来技術によるまたは適切な細菌もしくは哺乳動物細胞宿主内への抗体遺伝子、重鎖および／もしくは軽鎖のトランスフェクションによるモノクローナル抗体の生成を含む、細胞培養技術により生産され得る。「トランスフェクション」という用語の種々の形態は、原核または真核宿主細胞内への外因性ＤＮＡの導入のために一般に使用されている多種多様の技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを包含することを意図する。原核または真核宿主細胞のいずれかにおいて本発明の抗体を発現することは可能であるが、真核細胞における抗体の発現が好ましく、哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が最も好ましい。なぜなら、このような真核細胞（特に哺乳動物細胞）が、適切に折り畳まれ、免疫学的に活性な抗体を構築し、分泌する可能性が原核細胞より高いからである。
【０１０９】
本発明の組換え抗体を発現するための例示的な哺乳動物宿主細胞には、例えば、ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５９：６０１−６２１（１９８２）に記載されているＤＨＦＲ選択可能マーカー、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞と共に使用されるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６−４２２０（１９８０に記載されているｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）が含まれる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞内に導入される場合、抗体は、宿主細胞内での抗体の発現またはより好ましくは宿主細胞が増殖する培養培地内での抗体の分泌を可能にするのに十分な時間、宿主細胞を培養することにより生産される。抗体は標準的なタンパク質精製方法を使用して培養培地から回収され得る。
【０１１０】
宿主細胞はまた、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖ分子などの機能的抗体断片を生産するために使用されてもよい。上記の手順に対する変更は本発明の範囲内であると理解される。例えば、本発明の抗体の軽鎖および／または重鎖のいずれかの機能的断片をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトすることが好適であり得る。組換えＤＮＡ技術もまた、必ずしも対象の抗原に結合することを必要としない軽鎖および重鎖のいずれかまたは両方をコードするＤＮＡの一部または全てを除去するために使用されてもよい。このような切断型ＤＮＡ分子から発現された分子もまた、本発明の抗体に包含される。さらに、一方の重鎖および一方の軽鎖が本発明の抗体（すなわちヒトＲＧＭｃに結合する）であり、他方の重鎖および軽鎖が、標準的な化学的架橋方法により本発明の抗体を第２の抗体に架橋することによってヒトＲＧＭｃ以外の抗原に特異的である、二価抗体が生産されてもよい。
【０１１１】
本発明の抗体またはこの抗原結合部分の組換え発現のための好ましい系において、抗体重鎖および抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターは、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクションによりｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞内に導入される。組換え発現ベクター内で、抗体重鎖および軽鎖遺伝子は各々、遺伝子の高レベルの転写を駆動するためにＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントに作動可能に連結される。組換え発現ベクターはまた、メトトレキサート選択／増幅を使用してベクターがトランスフェクトされているＣＨＯ細胞の選択を可能にする、ＤＨＦＲ遺伝子を保有する。選択された形質転換体宿主細胞は抗体重鎖および軽鎖の発現を可能にするように培養され、インタクトな抗体は培養培地から回収される。標準的な分子生物技術が、組換え発現ベクターを調製するため、宿主細胞をトランスフェクトするため、形質転換体を選択するため、宿主細胞を培養するためおよび培養培地から抗体を回収するために使用される。なおさらに、本発明は、本発明の組換え抗体が合成されるまで、適切な培養培地中で本発明の宿主細胞を培養することによって本発明の組換え抗体を合成する方法を提供する。この方法は、培養培地から組換え抗体を単離することをさらに含んでもよい。
【０１１２】
モノクローナル抗体を調製する方法は、所望の特異性を有する抗体を産生できる不死の細胞株の調製を含む。このような細胞株は免疫動物から得られた脾臓細胞から生産され得る。動物はＲＧＭｃまたはこの断片および／もしくはバリアントで免疫化され得る。例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号１もしくは配列番号２の断片または配列番号１もしくは配列番号２のバリアントのいずれかが動物を免疫化するために使用されてもよい。動物はＲＧＭａまたはこの断片および／もしくはバリアントで免疫化されてもよい。例えば、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３５もしくは配列番号３６の断片または配列番号３５もしくは配列番号３６のバリアントのいずれかが動物を免疫化するために使用されてもよい。ＲＧＭａは以下のアミノ酸配列を有し得る：
【０１１３】
【化３】
2020058359.tif 000018
ＲＧＭａは配列番号３５の断片またはバリアントであってもよい。
【０１１４】
断片は、５から４２５個の間のアミノ酸、１０から４００個の間のアミノ酸、５０から３５０個の間のアミノ酸、１００から３００個の間のアミノ酸、１５０から２５０個の間のアミノ酸、２００から３００個の間のアミノ酸または７５から１５０個の間のアミノ酸の長さであってもよい。断片は配列番号３５から連続した数のアミノ酸を含んでもよい。
【０１１５】
ＲＧＭａの断片は以下のアミノ酸配列を有し得る：
【０１１６】
【化４】
2020058359.tif 000019
ＲＧＭａ断片は配列番号３６の断片であってもよい。ＲＧＭａ断片は配列番号３６のバリアントであってもよい。
【０１１７】
動物を免疫化するために使用されるペプチドは、ヒトＦｃ、例えば、ヒト抗体の断片結晶性領域またはテール領域をコードするアミノ酸を含んでもよい。次いで脾臓細胞は、例えば、骨髄腫細胞融合パートナーとの融合により不死化されてもよい。種々の融合技術が利用されてもよい。例えば、脾臓細胞および骨髄腫細胞は、数分間、非イオン洗浄剤と混合されてもよく、次いで骨髄腫細胞ではなく、ハイブリッド細胞の増殖を支持する選択培地上に低密度で置かれてもよい。１つのこのような技術はヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン（ＨＡＴ）選択を使用する。十分な時間、通常約１から２週間の後、ハイブリッドのコロニーを観察する。単一コロニーを選択し、これらの培養上清をポリペプチドに対する結合親和性について試験した。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが使用されてもよい。
【０１１８】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマコロニーが増殖している上清から単離され得る。さらに、マウスなどの適切な脊椎動物宿主の腹腔内へのハイブリドーマ細胞株の注入などの種々の技術が収率を向上させるために利用されてもよい。次いでモノクローナル抗体は腹水または血液から収集され得る。汚染物質は、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈殿および抽出などの従来技術により抗体から除去され得る。アフィニティークロマトグラフィーが抗体を精製するプロセスに使用され得る方法の一例である。
【０１１９】
タンパク質分解酵素パパインはＩｇＧ分子を選択的に切断していくつかの断片を生じ、このうちの２つ（Ｆ（ａｂ）断片）の各々は、インタクトな抗原結合部位を含む共有結合ヘテロダイマーを含む。酵素ペプシンはＩｇＧ分子を切断して、両方の抗原結合部位を含む、Ｆ（ａｂ’）２断片を含むいくつかの断片を与えることができる。
【０１２０】
Ｆｖ断片は、ＩｇＭおよびまれにＩｇＧまたはＩｇＡ免疫グロブリン分子の選択的なタンパク質分解的切断により生じ得る。Ｆｖ断片は組換え技術を使用して誘導され得る。Ｆｖ断片は、天然抗体分子の多くの抗原認識および結合能力を保持する抗原結合部位を含む非共有結合性のＶＨ：ＶＬヘテロ二量体を含む。
【０１２１】
抗体、抗体断片または誘導体は、ＣＤＲに対する支持を与え、互いに対するＣＤＲの空間的関係を規定する重鎖および軽鎖フレームワーク（「ＦＲ」）セットの間にそれぞれ介入している重鎖および軽鎖相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含んでもよい。ＣＤＲセットは重鎖または軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域を含有してもよい。重鎖または軽鎖のＮ末端から開始して、これらの領域は、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」および「ＣＤＲ３」とそれぞれ示される。したがって、抗原結合部位は重鎖および軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲセットを含む、６個のＣＤＲを含んでもよい。単一のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３）を含むポリペプチドは、「分子認識単位」と称され得る。抗原−抗体複合体の結晶学的分析により、ＣＤＲのアミノ酸残基は結合抗原との広範囲な接触に由来し、最も広範囲の抗原接触は重鎖ＣＤＲ３とであることが実証されている。したがって、分子認識単位は主に抗原結合部位の特異性に関与し得る。一般に、ＣＤＲ残基は直接的および最も実質的に抗原結合部位に影響を与えることに関する。
【０１２２】
ヒト化抗体は、齧歯動物抗ヒト抗体に対する望ましくない免疫応答を最小化するように設計され得、ヒト受容者におけるこれらの部分の治療適用の持続時間および有効性を制限する。ヒト化抗体は、非ヒト源からこの中に導入される１つ以上のアミノ酸残基を有してもよい。これらの非ヒト残基は、多くの場合、典型的に可変ドメインからとられる「移入」残基と称される。ヒト化は、超可変領域配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施され得る。したがって、このような「ヒト化」抗体は、実質的にインタクトなヒト可変ドメインより少ないものが非ヒト種由来の対応する配列により置換されている、キメラ抗体である。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号（この内容は参照により本明細書に組み込まれている。）を参照されたい。ヒト化抗体は、一部の超可変領域残基および場合により一部のＦＲ残基が、齧歯動物抗体における類似部位からの残基により置換されるヒト抗体であってもよい。本発明の抗体のヒト化または操作は、限定されないが、米国特許第５，７２３，３２３号、同第５，９７６，８６２号、同第５，８２４，５１４号、同第５，８１７，４８３号、同第５，８１４，４７６号、同第５，７６３，１９２号、同第５，７２３，３２３号、同第５，７６６，８８６号、同第５，７１４，３５２号、同第６，２０４，０２３号、同第６，１８０，３７０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，２２５，５３９号および同第４，８１６，５６７号に記載されているものなどの任意の公知の方法を使用して実施されてもよい。
【０１２３】
ヒト化抗体は、ＲＧＭｃおよび他の有益な生物学的特性に対して高い親和性を保持し得る。ヒト化抗体は、親およびヒト化配列の三次元モデルを使用して親配列および種々の概念のヒト化産物の分析のプロセスにより調製されてもよい。三次元免疫グロブリンモデルは一般に入手可能である。選択された候補免疫グロブリン配列の起こりそうな三次元立体配座構造を示し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の調査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンのこの抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析が可能となる。このように、ＦＲ残基は、受容者および移入配列から選択され、組合わされてもよく、それにより、ＲＧＭｃに対する増加した親和性などの所望の抗体特徴が達成される。一般に、超可変領域残基は抗原結合に影響を与えることに直接的および最も実質的に関与し得る。
【０１２４】
ヒト化の代替として、ヒト抗体（本明細書において「完全にヒト抗体」とも称される）が生成されてもよい。例えば、トランスジェニック動物（例えば、免疫化すると、内因性免疫グロブリン産物の非存在下でヒト抗体の完全なレパートリーを産生できるマウス）を生産することが可能である。例えば、キメラおよび生殖細胞変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＩＩ）遺伝子のホモ接合体欠失は内因性抗体産物の完全阻害をもたらす。このような生殖細胞変異マウスにおけるヒト生殖細胞免疫グロブリン遺伝子アレイの転移は、抗原チャレンジ時にヒト抗体の産生をもたらす。ヒト化または完全にヒト抗体は、米国特許第５，７７０，４２９号、同第５，８３３，９８５号、同第５，８３７，２４３号、同第５，９２２，８４５号、同第６，０１７，５１７号、同第６，０９６，３１１号、同第６，１１１，１６６号、同第６，２７０，７６５号、同第６，３０３，７５５号、同第６，３６５，１１６号、同第６，４１０，６９０号、同第６，６８２，９２８号および同第６，９８４，７２０号（これらの各々の内容は参照により本明細書に組み込まれている。）に記載されている方法に従って調製され得る。
【０１２５】
当該技術分野において公知の方法を使用して、例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ、ＵＫ）、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ（Ｍａｒｔｉｎｓｒｅｉｄ／Ｐｌａｎｅｇｇ，Ｄｅｌ．）、Ｂｉｏｖａｔｉｏｎ（Ａｂｅｒｄｅｅｎ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ、ＵＫ）Ｂｉｏｌｎｖｅｎｔ（Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）などの様々な販売業者から入手できる、限定されないが、ペプチドまたはタンパク質ライブラリー（例えば、限定されないが、バクテリオファージ、リボソーム、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ｃＤＮＡなど、ディスプレイライブラリーから組換え抗体を選択する方法を含む、必要な特異性の抗体を生産または単離する他の適切な方法が使用されてもよい。米国特許第４，７０４，６９２号、同第５，７２３，３２３号、同第５，７６３，１９２号、同第５，８１４，４７６号、同第５，８１７，４８３号、同第５，８２４，５１４号、同第５，９７６，８６２号を参照されたい。代替の方法は、当該技術分野において公知であるおよび／または本明細書に記載されている、ヒト抗体のレパートリーを産生できるトランスジェニック動物の免疫化に依存する（例えば、ＳＣＩＤマウス、Ｎｇｕｙｅｎら（１９７７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：９０１−９０７（１９９７）；Ｓａｎｄｈｕら（１９９６）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：９５−１１８；Ｅｒｅｎら（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．９３：１５４−１６１。このような技術には、限定されないが、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：４９３７−４９４２；Ｈａｎｅｓら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：１４１３０−１４１３５）；単一細胞抗体産生技術（例えば、選択リンパ球抗体法（「ＳＬＡＭ」）（米国特許第５，６２７，０５２号、Ｗｅｎら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：８８７−８９２；Ｂａｂｃｏｏｋら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：７８４３−７８４８）；ゲル微小液滴およびフローサイトメトリー（Ｐｏｗｅｌｌら（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：３３３−３３７；Ｏｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ）；Ｇｒａｙら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．１８２：１５５−１６３；Ｋｅｎｎｙら（１９９５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３：７８７−７９０）；Ｂ細胞選択（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓら（１９９４）Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｓ  １９：１２５−１３４（１９９４）が含まれる。
【０１２６】
親和性成熟した抗体は、当該技術分野において公知である多くの手順のうちのいずれか１つにより生産され得る。例えば、ＶＨおよびＶＬドメインシャフリングによる親和性成熟を記載しているＭａｒｋｓら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９−７８３（１９９２）を参照されたい。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム変異誘発は、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：３８０９−３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒら、Ｇｅｎｅ、１６９：１４７−１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５：１９９４−２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４（７）：３３１０−３３１９（１９９５）；Ｈａｗｋｉｎｓら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６：８８９−８９６（１９９２）により記載されている。活性増強アミノ酸残基を用いた選択的変異誘発位置および接触または超変異位置における選択的変異は米国特許第６，９１４，１２８Ｂ１号に記載されている。
【０１２７】
本発明の抗体バリアントはまた、乳中にこのような抗体を産生するヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジなどのトランスジェニック動物または哺乳動物を提供するように本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを適切な宿主に送達することを使用して調製されてもよい。これらの方法は当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許第５，８２７，６９０号、同第５，８４９，９９２号、同第４，８７３，３１６号、同第５，８４９，９９２号、同第５，９９４，６１６号、同第５，５６５，３６２号および同第５，３０４，４８９号に記載されている。
【０１２８】
抗体バリアントはまた、植物部分またはこれから培養した細胞中にこのような抗体、特定の部分またはバリアントを産生するトランスジェニック植物および培養された植物細胞（例えば、限定されないが、タバコ、トウモロコシおよびウキクサ）を提供するために本発明のポリヌクレオチドを送達することにより調製されてもよい。例えば、Ｃｒａｍｅｒら（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４０：９５−１１８およびこれに引用されている参考文献は、例えば、誘導プロモーターを使用して大量の組換えタンパク質を発現するトランスジェニックタバコ葉の生産を記載している。トランスジェニックトウモロコシが、他の組換え系において生産されたまたは天然源から精製された生物活性と等価の生物活性を有する、商業的な生産レベルにおいて哺乳動物タンパク質を発現させるために使用されている。例えば、Ｈｏｏｄら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）４６４：１２７−１４７およびこれに引用されている参考文献を参照されたい。抗体バリアントはまた、タバコ種子およびジャガイモ塊茎を含む、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ’ｓ）などの抗体断片を含むトランスジェニック植物種子から大量に生産されている。例えば、Ｃｏｎｒａｄら（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８：１０１−１０９およびこれに引用されている参考文献を参照されたい。したがって、本発明の抗体はまた、公知の方法に従ってトランスジェニック植物を使用して生産されてもよい。
【０１２９】
抗体誘導体は、例えば、免疫原性を修飾するためまたは結合、親和性、オン速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）、オフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）、結合活性、特異性、半減期または任意の他の適切な特徴を減少、増強もしくは修飾するために外因性配列を付加することにより生産されてもよい。一般に、非ヒトまたはヒトＣＤＲ配列の一部または全ては維持されるが、可変および定常領域の非ヒト配列はヒトまたは他のアミノ酸と置換される。
【０１３０】
小さな抗体断片は２つの抗原結合部位を有するダイアボディであってもよく、断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨＶＬ）において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８を参照されたい。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインは別の鎖の相補的ドメインと対合を強いられ、２つの抗原結合部位を生成する。その全体が参照により本明細書に組み込まれており、親抗体の超可変領域内に挿入された１つ以上のアミノ酸および抗原に対する親抗体の結合親和性より少なくとも約２倍強い標的抗原に対する結合親和性を有する抗体バリアントを開示しているＣｈｅｎらによる米国特許第６，６３２，９２６号もまた参照のこと。
【０１３１】
抗体は線形抗体であってもよい。線形抗体を作製する手順は当該技術分野において公知であり、Ｚａｐａｔａら（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２に記載されている。簡潔に述べると、これらの抗体は１対の抗原結合領域を形成する１対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。線形抗体は二重特異性または単一特異性抗体であってもよい。
【０１３２】
抗体は、限定されないが、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む公知の方法により組換え細胞培養物から回収され、精製されてもよい。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）もまた、精製のために使用されてもよい。
【０１３３】
抗体を検出可能または治療的に標識するのが有用であり得る。抗体をこれらの作用物質にコンジュゲートする方法は当該技術分野において公知である。例示目的のみのために、抗体は、放射性原子、発色団、フルオロフォアなどの検出可能な部分で標識されてもよい。このような標識された抗体は、インビボまたは単離された試験試料のいずれかにおいて診断技術のために使用されてもよい。抗体はまた、例えば、化学療法剤などの医薬剤または毒素にコンジュゲートされてもよい。これらは、サイトカイン、リガンド、別の抗体に連結されてもよい。抗腫瘍効果を達成するために抗体に結合するのに適した作用物質には、インターロイキン２（ＩＬ−２）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカイン；アルミニウム（ＩＩＩ）フタロシアニンテトラスルホネート、ヘマトポルフィリンおよびフタロシアニンを含む、光線力学的治療に使用するための光増感剤；ヨウ素−１３１（１３１Ｉ）、イットリウム−９０（９０Ｙ）、ビスマス−２１２（２１２Ｂｉ）、ビスマス−２１３（２１３Ｂｉ）、テクネチウム−９９ｍ（９９ｍＴｃ）、レニウム−１８６（１８６Ｒｅ）およびレニウム−１８８（１８８Ｒｅ）などの放射性核種；ドキソルビシン、アドリアマイシン、ダウノルビシン、メトトレキサート、ダウノマイシン、ネオカルチノスタチンおよびカルボプラチンなどの抗生物質；ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素Ａ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ、アブリン−Ａ毒素、リシンＡ（脱グリコシル化したリシンＡおよび天然リシンＡ）、ＴＧＦ−アルファ毒素、中国コブラ（タイワンコブラ（ｎａｊａ  ｎａｊａ  ａｔｒａ））由来の細胞毒素およびゲロニン（植物毒素）などの細菌、植物および他の毒素；レストリクトシン（アスペルギウス・レストリクツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｕｓ）により産生されるリボソーム不活性化タンパク質）、サポリン（サポナリア・オフィシナリス（Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）由来のリボソーム不活性化タンパク質）およびＲＮａｓｅなどの植物、細菌および菌類由来のリボソーム不活性化タンパク質；チロシンキナーゼ阻害剤；ｌｙ２０７７０２（脱フッ素化プリンヌクレオシド）；抗嚢胞性剤（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、毒素をコードするプラスミド、メトトレキサートなど）を含有するリポソーム；ならびに他の抗体またはＦ（ａｂ）などの抗体断片が含まれる。
【０１３４】
抗体は、配列決定され、組換えまたは合成手段により複製されてもよい。これらはまた、これらをコードするヌクレオチドの線形配列に至るまでさらに配列決定されてもよい。したがって、本発明は、単独でまたは本発明の抗体の配列をコードする上記の担体、ベクターもしくは宿主細胞と組合せてこれらのポリヌクレオチドを提供する。
【０１３５】
ハイブリドーマ技術、選択リンパ球抗体法（ＳＬＡＭ）、トランスジェニック動物および組換え抗体ライブラリーの使用による抗体生産が以下により詳細に記載されている。
【０１３６】
（１）ハイブリドーマ技術を使用した抗ＲＧＭｃモノクローナル抗体
上記のように、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え体およびファージディスプレイ技術またはこれらの組合せの使用を含む当該技術分野において公知の多種多様な技術を使用して調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１）に教示されているものを含むハイブリドーマ技術を使用して生産されてもよい。また、本明細書に使用されている場合、「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術により生産された抗体に限定されないことに留意されたい。「モノクローナル抗体」という用語は、任意の真核生物、原核生物またはファージクローンを含む、単一クローンに由来する抗体を指し、これが生産される方法を指すわけではない。
【０１３７】
一実施形態では、モノクローナル抗体および抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養すること含む方法により生産される抗体を生成する方法が提供され、好ましくは、ハイブリドーマは、ＲＧＭｃで免疫化された動物、例えば、ラットまたはマウスから単離された脾細胞を骨髄腫細胞と融合し、次いでＲＧＭｃ（またはこの断片もしくはバリアント）に結合できる抗体を分泌するハイブリドーマクローンについての融合物から得られたハイブリドーマをスクリーニングすることにより生成される。簡潔に述べると、ラットはＲＧＭｃ抗原で免疫化され得る（例えば、以下の実施例を参照のこと）。好ましい実施形態では、ＲＧＭｃ抗原は免疫応答を刺激するためにアジュバントと共に投与される。このようなアジュバントには、完全または不完全フロイントアジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミールジペプチド）またはＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）が含まれる。このようなアジュバントは局所的沈着物中のポリペプチドを配列決定することによって急速な分散からポリペプチドを保護できるまたはこれらはマクロファージのための走化性である要因を分泌するために宿主を刺激する物質および免疫系の他の成分を含有してもよい。好ましくは、ポリペプチドが投与される場合、免疫化スケジュールは数週間にわたるポリペプチドの２回以上の投与を含むが、ポリペプチドの単回投与も使用されてもよい。
【０１３８】
ＲＧＭｃ抗原による動物の免疫化後、抗体および／または抗体産生細胞は動物から得られ得る。抗ＲＧＭｃ抗体を含有している血清は、動物を出血させるまたは屠殺することにより動物から得られる。血清は動物から得られたままで使用されてもよく、免疫グロブリン画分は血清から得られてもよいまたは抗ＲＧＭｃ抗体は血清から精製されてもよい。この方法で得られた血清または免疫グロブリンはポリクローナルであるので、不均一配列の性質を有する。
【０１３９】
一旦、免疫応答が検出されると、例えば、抗原ＲＧＭｃに対する抗体特異性がラット血清において検出され、ラット脾臓が収集され、脾細胞が単離される。次いで脾細胞が、周知の技術により任意の適切な骨髄腫細胞、例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．、ＵＳ）から入手可能な細胞株ＳＰ２０由来の細胞と融合される。ハイブリドーマが選択され、限界希釈によりクローニングされる。次いでハイブリドーマクローンは、ＲＧＭｃ（またはこの断片もしくはバリアント）に結合できる抗体を分泌する細胞について当該技術分野において公知の方法によりアッセイされる。一般に高レベルの抗体を含有する腹水は陽性ハイブリドーマクローンでラットを免疫化することにより生成され得る。
【０１４０】
別の実施形態では、抗体産生不死化ハイブリドーマは免疫化動物から調製されてもよい。免疫化後、動物を屠殺し、脾臓Ｂ細胞を当該技術分野において周知のように不死化骨髄腫細胞と融合する。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記を参照されたい。好ましい実施形態では、骨髄腫細胞は免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない（非分泌性細胞株）。融合および抗生物質選択後、ＲＧＭｃまたはこの断片もしくはバリアントまたはＲＧＭｃ（またはこの断片もしくはバリアント）を発現する細胞を使用してハイブリドーマをスクリーニングする。好ましい実施形態では、最初のスクリーニングは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、好ましくはＥＬＩＳＡを使用して実施される。ＥＬＩＳＡスクリーニングの例は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／３７５０４に提供されている。
【０１４１】
抗ＲＧＭｃ抗体産生ハイブリドーマが選択され、クローニングされ、強力なハイブリドーマ増殖、高抗体産生および以下にさらに説明されている所望の抗体特徴を含む、所望の特徴についてさらにスクリーニングされる。ハイブリドーマは、同系動物、免疫系を欠く動物、例えばヌードマウスにおいてインビボにてまたはインビトロにて細胞培養物中で培養および増殖されてもよい。ハイブリドーマを選択、クローニングおよび増殖する方法は当業者に周知である。
【０１４２】
好ましい実施形態では、ハイブリドーマは本明細書に記載されているラットハイブリドーマである。別の実施形態では、ハイブリドーマは、マウス、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシまたはウマなどの非ヒト、非ラット種において産生される。さらに別の好ましい実施形態では、ハイブリドーマは、ヒト非分泌骨髄腫が抗ＲＧＭｃ抗体を発現するヒト細胞と融合される、ヒトハイブリドーマである。
【０１４３】
特異的エピトープを認識する抗体断片は公知の技術により生成され得る。例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、パパイン（２つの同一のＦａｂ断片を生産するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を生産するため）などの酵素を使用した免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断により生産され得る。ＩｇＧ分子のＦ（ａｂ’）２断片は、両方の軽鎖（可変軽鎖および定常軽鎖領域を含有する）、重鎖のＣＨ１ドメインおよび親ＩｇＧ分子のジスルフィド形成ヒンジ領域を含む、より大きな（「親」）ＩｇＧ分子の２つの抗原結合部位を保持する。したがって、Ｆ（ａｂ’）２断片は親ＩｇＧ分子のような抗原分子を架橋できる。
【０１４４】
（２）ＳＬＡＭを使用した抗ＲＧＭｃモノクローナル抗体
組換え抗体は、米国特許第５，６２７，０５２号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０２５５１；およびＢａｂｃｏｏｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３；７８４３−７８４８（１９９６）に記載されているような選択リンパ球抗体法（ＳＬＡＭ）のような当該技術分野において参照される手順を使用して単一の単離されたリンパ球から生成され得る。この方法において、対象の抗体を分泌する単一細胞、例えば、Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｉ．Ａ．１（上記）に記載されている免疫化動物のいずれか１つに由来するリンパ球は、抗原ＲＧＭｃ、ＲＧＭｃのサブユニットまたはこの断片が、ビオチンなどのリンカーを使用してヒツジ赤血球に結合され、ＲＧＭｃに対して特異性を有する抗体を分泌する単細胞を同定するために使用される、抗原特異的溶血プラークアッセイを使用してスクリーニングされる。対象の抗体分泌細胞の同定後、重鎖および軽鎖可変領域ｃＤＮＡは逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により細胞から回収され、次いでこれらの可変領域は、ＣＯＳまたはＣＨＯ細胞などの哺乳動物宿主細胞中で適切な免疫グロブリン定常領域（例えば、ヒト定常領域）に関連して発現され得る。次いで、インビボで選択したリンパ球に由来する、増幅した免疫グロブリン配列をトランスフェクトした宿主細胞は、さらなる分析および例えば、ＲＧＭｃに対する抗体を発現する細胞を単離するためにトランスフェクトした細胞をパニングすることによるインビトロでの選択を受け得る。増幅した免疫グロブリン配列は、インビトロ親和性成熟法などにより、インビトロでさらに操作されてもよい。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／２９１３１およびＰＣＴ公開番号ＷＯ００／５６７７２を参照されたい。
【０１４５】
（３）トランスジェニック動物を使用した抗ＲＧＭｃモノクローナル抗体
抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の一部または全てを含む非ヒト動物をＲＧＭｃ抗原で免疫化することにより生産され得る。一実施形態では、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の大きな断片を含み、マウス抗体産生を欠いた操作したマウス株である、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）トランスジェニックマウスである。例えば、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、７：１３−２１（１９９４）ならびに米国特許第５，９１６，７７１号；同第５，９３９，５９８号；同第５，９８５，６１５号；同第５，９９８，２０９号；同第６，０７５，１８１号；同第６，０９１，００１号；同第６，１１４，５９８号；および同第６，１３０，３６４号を参照されたい。また、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１０７４１；ＷＯ９４／０２６０２；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；ＷＯ９８／１６６５４；ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９８／５０４３３；ＷＯ９９／４５０３１；ＷＯ９９／５３０４９；ＷＯ００／０９５６０；およびＷＯ００／３７５０４を参照されたい。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）トランスジェニックマウスは完全にヒト抗体の成体様ヒトレパートリーを産生し、抗原特異的ヒトモノクローナル抗体を生成する。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）トランスジェニックマウスは、ヒト重鎖遺伝子座およびｘ軽鎖遺伝子座のメガ塩基対サイズの生殖細胞構造ＹＡＣ断片の導入によりほぼ８０％のヒト抗体レパートリーを含有する。Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１５：１４６−１５６（１９９７）、ＧｒｅｅｎおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８８：４８３−４９５（１９９８）（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれている。）を参照されたい。
【０１４６】
（４）組換え抗体ライブラリーを使用した抗ＲＧＭｃモノクローナル抗体
インビトロ方法もまた、抗体を作製するために使用されてもよく、抗体ライブラリーは所望のＲＧＭｃ結合特異性を有する抗体を同定するためにスクリーニングされる。組換え抗体ライブラリーのこのようなスクリーニング方法は当該技術分野において周知であり、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号（Ｌａｄｎｅｒら）；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１８６１９（Ｋａｎｇら）；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１７２７１（Ｄｏｗｅｒら）；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／２０７９１（Ｗｉｎｔｅｒら）；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１５６７９（Ｍａｒｋｌａｎｄら）；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／０１２８８（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら）；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０１０４７（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら）；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０９６９０（Ｇａｒｒａｒｄら）；Ｆｕｃｈｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：１３６９−１３７２（１９９１）；Ｈａｙら、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、３：８１−８５（１９９２）；Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５−１２８１（１９８９）；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２−５５４（１９９０）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１２：７２５−７３４（１９９３）；Ｈａｗｋｉｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６：８８９−８９６（１９９２）；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｇｒａｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：３５７６−３５８０（１９９２）；Ｇａｒｒａｒｄら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：１３７３−１３７７（１９９１）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９：４１３３−４１３７（１９９１）；Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：７９７８−７９８２（１９９１）；米国特許出願公開第２００３／０１８６３７４号；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／２９１３１（これらの各々の内容は参照により本明細書に組み込まれている。）に記載されている方法を含む。
【０１４７】
組換え抗体ライブラリーはＲＧＭｃまたはＲＧＭｃの一部で免疫化した対象由来であってもよい。代替として、組換え抗体ライブラリーは、未処置の対象、すなわち、ヒトＲＧＭｃで免疫化されていないヒト対象由来のヒト抗体ライブラリーなどのＲＧＭｃで免疫化されていない対象由来であってもよい。抗体は、ＲＧＭｃを認識するこれらの抗体を選択するためにヒトＲＧＭｓを含むペプチドを用いて組換え抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより選択される。このようなスクリーニングおよび選択を行う方法は、以前の段落における参考文献に記載されているように当該技術分野において周知である。特定のＫｏｆｆ速度定数でヒトＲＧＭｃから解離する抗体などのＲＧＭｃに対する特定の結合親和性を有する抗体を選択するために、表面プラズモン共鳴の当該技術分野で公知の方法が所望のＫｏｆｆ速度定数を有する抗体を選択するために使用されてもよい。特定のＩＣ５０を有する抗体などのｈＲＧＭｃについての特定の中和活性を有する抗体を選択するために、ＲＧＭｃ活性の阻害を評価するための当該技術分野において公知の標準的な方法が使用されてもよい。
【０１４８】
一態様では、単離された抗体またはこの抗原結合部分はヒトＲＧＭｃに結合する。好ましくは、抗体は中和抗体である。種々の実施形態では、抗体は組換え抗体またはモノクローナル抗体である。
【０１４９】
例えば、抗体はまた、当該技術分野において公知の種々のファージディスプレイ法を使用して生成されてもよい。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインは、これらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面上で表示される。このようなファージは、レパートリーまたは組合せ抗体ライブラリー（例えばヒトまたはマウス）から発現された抗原結合ドメインを表示するために利用されてもよい。対象の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、例えば、標識された抗原または固体表面もしくはビーズに結合したもしくは捕捉された抗原を使用して、抗原により選択されてもよいまたは同定されてもよい。これらの方法に使用されるファージは典型的に、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかと組換えにより融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するファージから発現されたｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む繊維状ファージである。抗体を作製するために使用され得るファージディスプレイ法の例には、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ、１８７：９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号；および同第５，９６９，１０８号に開示されているものが含まれる。
【０１５０】
上記の参考文献に記載されているように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体コード領域は、ヒト抗体または任意の他の所望の抗原結合断片を含む全抗体を生成するために単離され、使用され、例えば、以下に詳細に記載されているように哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む任意の所望の宿主中で発現されてもよい。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片を組換えにより生産する技術はまた、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１２（６）：８６４−８６９（１９９２）；Ｓａｗａｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：１０４１−１０４３（１９８８）に開示されているものなどの当該技術分野において公知の方法を使用して利用されてもよい。一本鎖Ｆｖｓおよび抗体を生産するために使用され得る技術の例には、米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２０３：４６−８８（１９９１）；Ｓｈｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：７９９５−７９９９（１９９３）；ならびにＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：１０３８−１０４１（１９８８）に記載されているものが含まれる。
【０１５１】
ファージディスプレイによる組換え抗体ライブラリーのスクリーニングに対する代替として、大きな組合せライブラリーをスクリーニングするための当該技術分野において公知の他の方法が抗体の同定に適用されてもよい。１つの種類の代替発現系は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／３１７００（ＳｚｏｓｔａｋおよびＲｏｂｅｒｔｓ）ならびにＲｏｂｅｒｔｓおよびＳｚｏｓｔａｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：１２２９７−１２３０２（１９９７）に記載されているように、組換え抗体ライブラリーがＲＮＡ−タンパク質融合物として発現されたものである。この系において、共有結合性の融合物が、ｍＲＮＡと、これがこれらの３’末端にてピューロマイシン、ペプチジルアクセプター抗生物質を保有する合成ｍＲＮＡのインビトロ翻訳によりコードするペプチドまたはタンパク質との間で作製される。したがって、特異的ｍＲＮＡは、コードされたペプチドまたはタンパク質、例えば、二重特異性抗原に対する抗体またはこの部分の結合などの抗体またはこの断片の特性に基づいてｍＲＮＡ（例えば、組合せライブラリー）の複合混合物から濃縮されてもよい。このようなライブラリーのスクリーニングから回収された抗体またはこの部分をコードする核酸配列は、上記の組換え手段により（例えば、哺乳動物宿主細胞中で）発現されてもよく、さらに、変異が元の選択された配列内に導入されているｍＲＮＡ−ペプチド融合物のスクリーニングの追加ラウンドまたは上記の組換え抗体のインビトロでの親和性成熟に関する他の方法のいずれかによりさらなる親和性成熟に供されてもよい。この方法の好ましい例はＰＲＯ融合ディスプレイ技術である。
【０１５２】
別のアプローチにおいて、抗体はまた、当該技術分野において公知の酵母ディスプレイ法を使用して生成されてもよい。酵母ディスプレイ法において、遺伝学的法が抗体ドメインを酵母細胞壁に拘束するために使用され、酵母の表面上にこれらを表示する。特に、このような酵母は、レパートリーまたは組合せ抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現された抗原結合ドメインを表示するために利用されてもよい。抗体を作製するために使用され得る酵母ディスプレイ法の例には、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，６９９，６５８号（Ｗｉｔｔｒｕｐら）に開示されているものが含まれる。
【０１５３】
（５）合成産物
一旦配列決定されると、ＲＧＭｃに特異的に結合するモノクローナル抗体（またはこの断片）などのポリペプチドは、例えば、排他的固相合成、部分的固相合成、断片縮合および古典的溶液合成などの当該技術分野において公知の方法を使用して合成され得る。例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９（１９６３）を参照されたい。固相上で、合成は典型的にアルファ−アミノ保護樹脂を使用してペプチドのＣ末端端部から開始する。適切な出発物質は、例えば、必要とされるアルファ−アミノ酸をクロロメチル化樹脂、ヒドロキシメチル樹脂またはベンズヒドリルアミン樹脂に付着させることにより調製されてもよい。１つのこのようなクロロメチル化樹脂は、Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）によるＢＩＯ−ＢＥＡＤＳ  ＳＸ−１という商標名で販売されており、ヒドロキシメチル樹脂の調製は、Ｂｏｄｏｎｓｚｋｙら、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｄ．（Ｌｏｎｄｏｎ）３８：１５９７（１９６６）に記載されている。ベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂は、ＰｉｅｔｔａおよびＭａｒｓｈａｌｌ、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．６５０（１９７０）に記載されており、塩酸塩形態でＢｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）から商業的に利用可能である。注文に応じてペプチドを作製するサービスと同様に、自動化ペプチド合成が商業的に利用可能である。
【０１５４】
したがって、ポリペプチドは、例えば、Ｇｉｓｉｎ、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．５６：１４６７（１９７３）に記載されている方法に従って炭酸水素セシウム触媒を用いてアルファ−アミノ保護アミノ酸をクロロメチル化樹脂に結合することにより調製されてもよい。最初の結合後、アルファ−アミノ保護基は、室温にてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）または塩酸（ＨＣｌ）の有機溶媒中溶液を含む試薬の選択により除去される。
【０１５５】
適切なアルファ−アミノ保護基には、ペプチドの段階的合成の分野において有用であると知られているものが含まれる。アルファ−アミノ保護基の例は、アクリルタイプ保護基（例えば、ホルミル、トリフルオロアセチルおよびアセチル）、芳香族ウレタンタイプ保護基（例えば、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）および置換Ｃｂｚ）、脂肪族ウレタン保護基（例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、イソプロピルオキシカルボニルおよびシクロヘキシルオキシカルボニル）およびアルキルタイプ保護基（例えば、ベンジルおよびトリフェニルメチル）である。ＢｏｃおよびＦｍｏｃが好ましい保護基である。側鎖保護基は、結合の間、インタクトを保持し、アミノ末端保護基の脱保護の間または結合の間、分離しない。側鎖保護基は、最後のペプチドの合成の完了時および標的ペプチドを変化させない反応条件下で除去可能でなければならない。
【０１５６】
アルファ−アミノ保護基の除去後、残存している保護アミノ酸は所望の順序で段階的に結合される。過剰な各保護アミノ酸は一般に、溶液中、例えば、塩化メチレンおよびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）混合物中のジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）などの適切なカルボキシル基活性化因子と共に使用される。
【０１５７】
所望のアミノ酸配列が完了した後、所望のペプチドは、ペプチドを樹脂から切断するだけでなく、全ての残存側鎖保護基も切断する、ＴＦＡまたはフッ化水素（ＨＦ）などの試薬での処理により樹脂支持体から分離される。クロロメチル化樹脂が使用される場合、ＨＦ処理は遊離ペプチド酸の形成をもたらす。ベンズヒドリルアミン樹脂が使用される場合、ＨＦ処理は遊離ペプチドアミドを直接的にもたらす。代替として、クロロメチル化樹脂が利用される場合、側鎖保護ペプチドはアンモニアでのペプチド樹脂の処理により分離されて所望の側鎖保護アミドを得ることができるまたはアルキルアミンでのペプチド樹脂の処理により分離されて側鎖保護アルキルアミドもしくはジアルキルアミドを得ることができる。次いで側鎖保護はフッ化水素での処理により通常の様式で除去されて遊離アミド、アルキルアミドまたはジアルキルアミドを得ることができる。
【０１５８】
これらおよび他の固相ペプチド合成手順は当該技術分野において周知である。このような手順はまた、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ（第２版、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９８４）に記載されている。
【０１５９】
３．医薬組成物
抗体は、対象（例えば、ヒトまたは非ヒトであってもよい患者）への投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。典型的には、医薬組成物は、抗体および医薬として許容される担体を含む。本明細書で使用するとき、「医薬として許容される担体」には、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張性吸収遅延剤、および生理学的に匹敵するようなものが含まれる。医薬として許容される担体の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの１つ以上、およびこれらの組み合わせが挙げられる。多くの場合において、組成物中に等張剤、例えば、糖類、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトールまたは塩化カリウムを含むことが好ましい。医薬として許容される担体は、抗体の寿命または有効性を増大させる湿潤乳化剤、防腐剤または緩衝剤などの最小量の補助物質をさらに含んでもよい。
【０１６０】
さらなる実施形態において、医薬組成物は、本明細書に記載されている障害を治療し、予防し、調節しまたは軽減するための少なくとも１つの追加の治療剤を含む。追加の治療剤は、エリスロポエチンまたは他の赤血球生成促進剤（ＥＳＡ）とすることができる。追加の治療剤は、二重特異性抗体もしくは二重可変抗体などのＥＰＯ受容体を活性化する１つ以上の他の抗体、および／またはＩＬ−６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４および／もしくはＢＭＰ−６に結合する１つ以上の他の抗体であってもよい。このようなヘプシジン低下化合物などの他の治療剤を使用することができる。ヘプシジン低下化合物の例としては、スピーゲルマーＮＯＸ−Ｈ９４および／またはドルソモルフィンがある。
【０１６１】
様々な送達系が公知であり、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、抗体または抗体断片を発現することができる組換え細胞、受容体によって媒介されるエンドサイトーシス（例えば、ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２頁（１９８７）参照）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築物などに封入して、障害または１つ以上のその症候の治療もしくは改善に有用な１つ以上の抗体または１つ以上の抗体および予防剤もしくは治療剤の組み合わせを投与するために使用することができる。予防剤または治療剤を投与する方法には、限定されないが、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下）、硬膜外投与、腫瘍内投与および粘膜投与（例えば、鼻内および経口経路）が含まれる。さらに、例えば、吸入装置または噴霧器およびエアロゾル化剤を加えた製剤の使用によって、経肺投与を使用することができる。例えば、米国特許第６，０１９，９６８号、同第５，９８５，３２０号、同第５，９８５，３０９号、同第５，９３４，２７２号、同第５，８７４，０６４号、同第５，８５５，９１３号、同第５，２９０，５４０号および同第４，８８０，０７８号；ならびにＰＣＴ出願公開ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／４４０１３、ＷＯ９８／３１３４６およびＷＯ９９／６６９０３を参照されたい。これらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。一実施形態において、抗体、併用療法または組成物は、ＡｌｋｅｒｍｅｓＡＩＲ（登録商標）経肺薬物送達技術（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）を用いて投与される。特定の実施形態において、予防剤または治療剤は、筋肉内、静脈内、腫瘍内、経口、鼻内、経肺または皮下投与される。予防剤または治療剤は、いずれかの都合のよい経路によって、例えば、注入もしくはボーラス注射によって、上皮または粘膜皮下の裏打ち（例えば、口粘膜、直腸および腸粘膜など）を通じた吸収によって投与され得て、生物学的に活性な他の作用物質と一緒に投与され得る。投与は、全身または局所であってもよい。
【０１６２】
特定の実施形態において、治療を必要としている部位へ局所的に抗体を投与することが望ましい場合がある；これは、限定されるものではないが、例えば、局所的注入によって、注射によって、またはインプラントの手段によって達成され得るが、前記インプラントは、シアラスチック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）メンブレン、ポリマー、線維性マトリックス（例えば、Ｔｉｓｓｕｅｌ（登録商標））またはコラーゲンマトリックスなどのメンブレンおよびマトリックスを含む多孔性または非多孔性材料である。一実施形態において、１つ以上の抗体の有効量は、障害またはその症状を予防し、治療し、管理しおよび／または軽減するために対象の罹患した部位へ局所的に投与される。別の実施形態において、１つ以上の抗体の有効量は、障害または１つ以上のその症状を予防し、治療し、管理しおよび／または軽減するために、対象の本発明の抗体以外の１つ以上の治療薬（例えば、１つ以上の予防剤または治療剤）の有効量と組み合わせて、罹患した部位へ局所的に投与される。
【０１６３】
別の実施形態において、抗体は、調節された放出系または徐放系において送達することができる。一実施形態において、調節された放出または徐放を達成するためにポンプを使用することができる（Ｌａｎｇｅｒ、上述；Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、１９８０、Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋら、１９８９、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４参照）。別の実施形態において、治療薬の調節された放出または徐放を達成するために、ポリマー材料を使用することができる（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（編集）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ、Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（編集）、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ（１９８３）Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１；Ｌｅｖｙら、（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇら、（１９８９）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄら、（１９８９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５）；米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；ＰＣＴ出願公開ＷＯ９９／１５１５４；およびＰＣＴ出願公開ＷＯ９９／２０２５３を参照されたい。）。徐放製剤中で使用されるポリマーの例には、限定されないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルアセテート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）およびポリオルトエステルが含まれる。特定の実施形態において、徐放製剤中で使用されるポリマーは、不活性であり、溶脱可能な不純物を含まず、保存時に安定であり、無菌であり、生物分解性である。さらに別の実施形態において、調節された放出系または徐放系は、予防標的または治療標的の近くに配置されて、全身投薬量の一部のみを必要とするようにすることができる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、上述、２：１１５−１３８頁（１９８４）参照）。
【０１６４】
調節された放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３頁）による概説中に論述されている。１つ以上の抗体を含む徐放製剤を作製するために、当業者に公知の任意の技術を使用することができる。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９１／０５５４８、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９６／２０６９８、Ｎｉｎｇら、１９９６、「Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｈｙ  ｏｆ  ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｇｅｌ」、Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ＆  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３９：１７９−１８９頁、Ｓｏｎｇら、１９９５、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｌｕｎｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｌｏｎｇ−Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ」、ＰＤＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５０：３７２−３９７頁、Ｃｌｅｅｋら、１９９７、「Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｆｏｒ  ａ  ｂＦＧＦ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｐｒｏ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：８５３−８５４頁、およびＬａｍら、１９９７、「Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｌｏｃａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：７５９−７６０頁を参照されたい。これらのそれぞれは、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０１６５】
組成物が抗体をコードする核酸である特定の実施形態において、適切な核酸発現ベクターの一部として、核酸を構築し、例えば、レトロウイルスベクター（米国特許第４，９８０，２８６号）の使用によって、または直接の注射によって、または微粒子照射（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用によって、核酸が細胞内となるように核酸を投与し、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくは形質移入剤で被覆し、または核内に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドに連結して核酸を投与することによって（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８６４−１８６８頁参照）、核酸がコードしている抗体の発現を促進するために、核酸をインビボで投与することが可能である。あるいは、相同的組換えによる発現のために、核酸を細胞内に導入し、宿主細胞ＤＮＡ内に取り込むことが可能である。
【０１６６】
医薬組成物は、その意図された投与経路と適合的であるように製剤化される。投与経路の例には、限定されないが、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口、鼻内（例えば、吸入）、経皮（例えば、局所）、経粘膜および直腸投与が含まれる。特定の実施形態において、組成物は、ヒトへの静脈内、皮下、筋肉内、経口、鼻内または局所投与に適合された医薬組成物として、定型的な手法に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、無菌の等張水性緩衝液中の溶液である。必要な場合には、組成物は、可溶化剤および注射の部位における痛みを和らげるための局所麻酔剤、例えばリグノカインも含み得る。
【０１６７】
組成物が局所的に投与されるべき場合、組成物は、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、シャンプー、スプレー、エアロゾル、液剤、乳剤の形態でまたは当業者に周知の他の形態で製剤化することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．（１９９５）を参照されたい。噴霧不能な局所剤形について、局所適用に適合性のある担体または１つ以上の賦形剤を含み、水より大きな動粘性係数を有する粘性ないし半固体または固体の形態が典型的に使用される。適切な製剤は、限定されないが、所望であれば、滅菌され、または、例えば、浸透圧などの様々な特性に影響を及ぼすための補助剤（例えば、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、緩衝剤または塩）と混合された、液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム、軟膏、散剤、リニメント剤、膏薬（ｓａｌｖｅ）などを含む。他の適切な局所剤形には、例えば、固体または液体不活性担体と組み合わされた有効成分が、加圧された揮発性物質（例えば、フレオンなどの気体状噴射剤）との混合物中または搾り出し瓶中に梱包されている噴霧可能なエアロゾル調製物が含まれる。所望であれば、医薬組成物および剤形に、加湿剤または湿潤剤も添加することができる。このような追加の成分の例は、当該技術分野において周知である。
【０１６８】
方法が組成物の鼻内投与を含む場合、組成物は、エアロゾル形態、スプレー、ミスト中に、または点鼻薬の形態で製剤化することができる。特に、本発明による使用のための予防剤または治療剤は、適切な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素またはその他の適切な気体）を用いて、加圧されたパックまたは噴霧器からエアロゾルスプレー提示の形態で都合よく送達することができる。加圧されたエアロゾルの場合には、投薬単位は、定量された量を送達するためのバルブを付与することによって決定され得る。化合物とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物を含有する、吸入装置またはガス注入装置で使用するためのカプセルおよびカートリッジ（例えば、ゼラチンから構成される。）を製剤化することができる。
【０１６９】
方法が経口投与を含む場合、錠剤、カプセル剤、カシェ剤、ゲルキャップ、液剤、懸濁剤などの形態で、組成物を経口的に製剤化することができる。錠剤またはカプセル剤は、従来の手段によって、結合剤（例えば、予めゼラチン化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、イモデンプンまたはグリコール酸デンプンナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの、医薬として許容される賦形剤とともに調製することができる。錠剤は、当該技術分野において周知な方法によって被覆され得る。経口投与用の液体調製物は、限定されないが、液剤、シロップ剤もしくは懸濁剤の形態をとってもよく、または、使用前に、水もしくは他の適切なビヒクルを用いて構成するための乾燥製品として与えられてもよい。このような液体調製物は、慣用の手段によって、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油状エステル、エチルアルコールまたは分画された植物油）；および防腐剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピルまたはソルビン酸）などの医薬として許容される添加物とともに調製されてもよい。調製物は、適宜、緩衝塩、着香剤、着色剤および甘味剤も含有し得る。経口投与用調製物は、予防剤または治療剤の遅い放出、調節された放出または徐放のために、適切に製剤化され得る。
【０１７０】
方法は、例えば、吸入装置または噴霧器の使用、エアロゾル化剤とともに製剤化された組成物の使用によって、経肺投与を含み得る。例えば、米国特許第６，０１９，９６８号、同第５，９８５，３２０号、同第５，９８５，３０９号、同第５，９３４，２７２号、同第５，８７４，０６４号、同第５，８５５，９１３号、同第５，２９０，５４０号、および同第４，８８０，０７８号；ならびにＰＣＴ出願公開ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／４４０１３、ＷＯ９８／３１３４６、およびＷＯ９９／６６９０３を参照されたい。これらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。特定の実施形態において、抗体、併用療法および／または組成物は、Ａｌｋｅｒｍｅｓ  ＡＩＲ（登録商標）経肺薬物送達技術（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）を用いて投与される。
【０１７１】
方法は、注射による（例えば、ボーラス注射または連続的注入による）非経口投与のために製剤化された組成物の投与を含んでもよい。注射用製剤は、添加された防腐剤とともに、単位剤形で（例えば、アンプルまたはマルチドーズコンテナに入れて）与えてもよい。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンなどの形態をとり得、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの処方剤を含み得る。あるいは、活性成分は、使用前に適切なビヒクル（例えば、発熱物質を含まない無菌水）で構成するための粉末形態であってもよい。方法は、デポ調製物として製剤化された組成物の投与をさらに含んでもよい。このような長期作用製剤は、（例えば、皮下または筋肉内への）植え込みによって、または筋肉内注射によって投与されてもよい。したがって、例えば、組成物は、適切なポリマー材料もしくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂とともに、または難溶性誘導体として（例えば、難溶性塩として）調合されてもよい。
【０１７２】
方法は、中性または塩形態として製剤化された組成物の投与を包含する。医薬として許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどの陰イオンとともに形成された塩、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなど、陽イオンとともに形成された塩が含まれる。
【０１７３】
一般的には、組成物の成分は、別個に、または単位剤形中に、例えば、活性剤の量を示した注射器またはサシェなど、密閉された容器中の凍結乾燥された乾燥粉末または無水濃縮物として、一緒に混合されて供給される。投与の様式が注入である場合、組成物は、医薬等級の無菌水または生理食塩水を含有する注入瓶を用いて分配することができる。投与の様式が注射による場合、注射用の無菌水または生理食塩水の注射器は、投与前に成分が混合され得るように提供することが可能である。
【０１７４】
特に、抗体の１つ以上または医薬組成物は、抗体の量を示した注射器またはサシェなど、密閉された容器中に梱包することもできる。一実施形態において、抗体の１つ以上または医薬組成物は、密閉された容器中の凍結乾燥された乾燥無菌粉末または無水濃縮物として供給され、対象に投与するための適切な濃度になるように（例えば、水または生理食塩水で）再構成することができる。一実施形態において、抗体の１つ以上または医薬組成物は、少なくとも５ｍｇ、例えば、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも７５ｍｇまたは少なくとも１００ｍｇの単位投薬量で、密閉された容器中の凍結乾燥された乾燥無菌粉末として供給される。凍結乾燥された抗体または医薬組成物は、その元の容器中で、２℃から８℃の間で保存されるべきであり、抗体または医薬組成物は、再構成後、１週以内、例えば５日以内、７２時間以内、４８時間以内に、２４時間以内に、１２時間以内に、６時間以内に、５時間以内に、３時間以内に、または１時間以内に投与されるべきである。別の実施形態において、抗体の１つ以上または医薬組成物は、抗体の量および濃度を示す密閉された容器中に、液体形態で供給される。さらなる実施形態において、投与された組成物の液体形態は、少なくとも０．２５ｍｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌまたは少なくとも１００ｍｇ／ｍｌで、密閉された容器中に供給される。液体形態は、その元の容器中で、２℃から８℃の間で保存されるべきである。
【０１７５】
抗体は、非経口投与に適した医薬組成物中に取り込ませることができる。一態様において、抗体は、０．１−２５０ｍｇ／ｍＬの抗体を含有する注射可能溶液として調製される。注射可能溶液は、フリント容器または琥珀色の容器、注射器または予め充填されたシリンジ中の液体または凍結乾燥された剤形から構成され得る。緩衝液は、ｐＨ５．０から７．０（最適にはｐＨ６．０）のＬ−ヒスチジン（１−５０ｍＭ）、最適には５−１０ｍＭであり得る。他の適切な緩衝剤には、限定されないが、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムが含まれる。０−３００ｍＭの濃度に（最適には、液体剤形に対して１５０ｍＭ）の溶液の毒性を修飾するために、塩化ナトリウムを使用することが可能である。凍結乾燥された剤形に対して、凍結保護剤、主に、０−１０％のスクロース（最適には、０．５−１．０％）を含めることができる。他の適切な凍結保護剤には、トレハロースおよびラクトースが含まれる。凍結乾燥された剤形に対して、充填剤、主に、１−１０％のマニトール（最適には、２−４％）を含めることができる。液体と凍結乾燥された剤形の両方において、安定化剤、主に１−５０ｍＭのＬ−メチオニン（最適には、５−１０ｍＭ）を使用することができる。他の適切な充填剤は、グリシンおよびアルギニンを含み、０−０．０５％のポリソルベート−８０（最適には、０．００５−０．０１％）として含めることができる。さらなる界面活性化剤には、限定されないが、ポリソルベート２０およびＢＲＩＪ界面活性化剤が挙げられる。非経口投与用の注射可能な溶液として調製される抗体を含む医薬組成物は、抗体の吸収または分散を増加させるために使用されるものなど、アジュバントとして有用な作用物質をさらに含むことができる。特に有用なアジュバントは、Ｈｙｌｅｎｅｘ（登録商標）（組換えヒトヒアルロニダーゼ）などのヒアルロニダーゼである。注射可能な溶液中へのヒアルロニダーゼの添加は、非経口投与、特に皮下投与後に、ヒト生物学的利用可能性を改善する。痛みおよび不快感がより小さく、注射部位反応の発生を最小限に抑えながら、より大きな注射部位容量（すなわち、１ｍＬより大きい）も可能である（参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願公開ＷＯ０４／０７８１４０および米国特許出願第２００６１０４９６８号を参照されたい）。
【０１７６】
組成物は、様々な形態であり得る。これらには、例えば、液体液剤（例えば、注射可能な溶液および注入可能な溶液）など、分散剤または懸濁剤、錠剤、丸剤、散剤、リポソーム剤および坐剤などの、液体、半固体および固体剤形が含まれる。選択された形態は、意図される投与の様式および治療用途に依存する。組成物は、他の抗体を用いたヒトの受動免疫に対して使用される組成物と同様の組成物など、注射可能溶液または注入可能溶液の形態であり得る。一実施形態において、抗体は、静脈内注入または注射によって投与される。別の実施形態において、抗体は、筋肉内注入または皮下注射によって投与される。
【０１７７】
治療組成物は、典型的には、製造および保存の条件下で、無菌および安定でなければならない。組成物は、液剤、ミクロエマルジョン剤、分散剤、リポソーム剤または高薬物濃度に適したその他の秩序化された構造として製剤化することができる。無菌注射可能溶液は、上記で列記されている成分の１つまたは組み合わせを加えた適切な溶媒中に、必要な量で活性な化合物（すなわち、結合タンパク質、例えば抗体）を取り込ませた後、必要に応じて、濾過滅菌を行うことによって調製することが可能である。一般的に、分散剤は、塩基性分散溶媒および上記で列記されたものから得られる必要なその他の成分を含有する無菌ビヒクル中に活性化合物を取り込ませることによって調製される。無菌注射可能溶液の調製のための凍結乾燥された無菌粉末の場合には、調製の方法は、予め滅菌濾過されたその溶液から、任意の追加の所望される成分を加えた有効成分の粉末を与える真空乾燥および粉末乾燥を含む。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆材料を使用することによって、分散液の場合に必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。注射可能組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによって実現することができる。
【０１７８】
抗体は、当該技術分野で公知の様々な方法によって投与することができる。多くの治療用途において、投与経路／様式は皮下注射、静脈内注射または注入であってもよい。当業者によって理解されるように、投与の経路および／または様式は、所望される結果に応じて変動する。ある種の実施形態において、活性化合物は、インプラント、経皮パッチおよび微小封入された送達系を含む調節された放出製剤など、迅速な放出に対して化合物を保護する担体とともに調製されてもよい。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸など、生物分解可能な生物適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤の多くの調製方法は、特許が付与されているまたは一般的に当業者に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編集、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８を参照されたい。
【０１７９】
ある種の実施形態において、抗体は、例えば、不活性希釈剤または同化可能な食用担体とともに経口投与されてもよい。また、抗体（および、所望であれば、その他の成分）は、硬いもしくは軟い殻のゼラチンカプセル中に封入され、錠剤へと圧縮され、または患者の食事中に直接取り込ませてもよい。経口治療投与について、抗体は、賦形剤とともに取り込まれ、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウェハース剤などの形態で使用されてもよい。非経口投与以外によって抗体を投与するために、その不活化を妨げるための物質で抗体を被覆し、またはその不活化を妨げるための物質とともに抗体を同時投与することが必要である場合がある。
【０１８０】
補助的活性化合物も、組成物中に取り込ませることができる。ある種の実施形態において、抗体は、本明細書に記載されている障害または疾患を治療するのに有用である、１つ以上のさらなる治療剤とともに共製剤化され、および／または同時投与される。例えば、抗ＲＧＭグロブロマー（ｇｌｏｂｕｌｏｍｅｒ）抗体は、他の標的に結合する１つ以上のさらなる抗体（例えば、他の可溶性抗原に結合する抗体または細胞表面分子に結合する抗体）とともに共製剤化され、および／または同時投与されてもよい。さらに、１つ以上の抗体は、先述の治療剤の２つ以上と組み合わせて使用されてもよい。このような併用療法は、投与される治療剤のより低い投薬量を有利に使用し得るので、様々な単独療法と関連した可能性のある毒性または合併症が回避される。
【０１８１】
ある種の実施形態において、抗体は、当該技術分野で公知の半減期延長ビヒクルに連結される。このようなビヒクルには、限定されないが、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコールおよびデキストランが含まれる。このようなビヒクルは、例えば、米国特許出願第０９／４２８，０８２号およびＰＣＴ出願公開ＷＯ９９／２５０４４に記載され、これらは、この目的について参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８２】
特定の実施形態において、抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列は、遺伝子治療によって、障害または１つ以上のその症状を治療し、予防し、管理し、または軽減するために投与される。遺伝子治療は、発現された核酸または発現可能な核酸の、対象への投与によって実行される治療を指す。本実施形態において、核酸は、予防的効果または治療的効果を媒介する、コードされたその抗体を生産する。
【０１８３】
当該技術分野で利用可能な遺伝子治療のための方法のいずれかを、本発明において使用することができる。遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５頁、（１９９３）；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５頁、（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６頁、（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２頁、（１９９３）；およびＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７頁（１９９３）；Ｍａｙ、１９９３、ＴＩＢＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５頁を参照されたい。使用可能な組換えＤＮＡ技術の技術分野で一般的に知られている方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編集）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９０）に記載されている。遺伝子治療の様々な方法の詳細な記述は、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００５００４２６６４Ａ１に開示されている。
【０１８４】
組み合わせは、それらの意図される目的に対して有用な組み合わせであることをさらに理解すべきである。上述されている作用物質は、例示を目的とするものであって、限定を意図するものではない。組み合わせは、抗体および以下のリストから選択される少なくとも１つの追加の作用物質を含むことができる。また、組み合わせにおいて、形成された組成物がその意図される機能を実行することが可能であれば、組み合わせは、１種を超える追加の作用物質、例えば、２種または３種の追加の作用物質を含むこともできる。
【０１８５】
医薬組成物は、抗体の「治療的に有効な量」または「予防的に有効な量」を含み得る。「治療的に有効な量」とは、所望の治療的結果を達成するための投薬量で、および所望の治療的結果を達成するために必要な期間にわたって有効な量を指す。抗体の治療的に有効な量は、当業者によって決定され得、個体の疾患状態、年齢、性別および体重ならびに抗体が個体内で所望の応答を惹起する能力などの因子に従って変動し得る。治療的に有効な量は、もしあれば、抗体の毒性効果または有害効果よりも、治療的に有益な効果が上回る量でもある。「予防的に有効な量」とは、所望の予防的結果を達成するために必要な投薬量で、および所望の予防的結果を達成するために必要な期間にわたって有効な量を指す。典型的には、疾患のより初期段階の前にまたは疾病のより初期段階において、予防的投薬が対象において使用されるため、予防的に有効な量は、治療的に有効な量より少ない。
【０１８６】
投薬計画は、最適な所望の応答（例えば、治療的応答または予防的応答）を与えるように調整され得る。例えば、単一のボーラスを投与することができ、複数の分割された用量を経時的に投与することができ、または、治療状況の緊急性によって示されるように、用量を比例的に減少もしくは増加させてもよい。投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位形態で非経口組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書において使用される投薬単位形態は、治療されるべき哺乳動物対象に対する統一された投薬として適した、物理的に分離された単位を指す；それぞれの単位は、必要とされる医薬としての担体とともに、所望される治療効果を生じるように計算された活性化合物の所定量を含有する。投薬単位形態に対する規格は、（ａ）活性化合物の特有の特徴および達成されるべき具体的な治療効果または予防効果、ならびに（ｂ）個体における過敏症の治療用のこのような活性化合物を配合する技術分野に固有の制限によって規定され、これらに直接依存する。
【０１８７】
抗体の治療的または予防的に有効な量に対する典型的な非限定的範囲は、０．１から２００ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１から１０ｍｇ／ｋｇの用量である。抗体の治療的または予防的に有効な量は、１から２００ｍｇ／ｋｇ、１０から２００ｍｇ／ｋｇ、２０から２００ｍｇ／ｋｇ、５０から２００ｍｇ／ｋｇ、７５から２００ｍｇ／ｋｇ、１００から２００ｍｇ／ｋｇ、１５０から２００ｍｇ／ｋｇ、５０から１００ｍｇ／ｋｇ、５から１０ｍｇ／ｋｇ、または１から１０ｍｇ／ｋｇであってもよい。緩和されるべき状態の種類および重症度に応じて、投薬量の値が変化し得ることに留意すべきである。さらに、抗体の用量は当業者によって決定され得て、個体の疾患状態、年齢、性別および体重ならびに抗体が個体内で所望の応答を惹起する能力などの因子に従って変動し得る。用量は、もしあれば、抗体の毒性効果または有害効果よりも、治療的に有益な効果が上回る量でもある。いずれかの具体的な対象に対して、個体の要求に従って、組成物の投与を行いまたは監督している者の専門的判断に従って、特異的投薬計画を経時的に調整すべきこと、および、本明細書に記載されている投薬量の範囲は典型的なものに過ぎず、特許請求の範囲に記載されている組成物の範囲または実施に限定することを意図したものではないことをさらに理解すべきである。
【０１８８】
４．鉄代謝を治療、予防、調節または軽減するための方法
いずれかの対象において、対象が、当該技術分野において公知の定型的な技術を用いて、鉄代謝関連障害を有するかどうかについて評価されてもよい（例えば、このような評価には、ヘモグロビンレベル、赤血球カウント、網状赤血球カウント、血清フェリチン、血清鉄、飽和血清トランスフェリン、血清ヘプシジン、血清ＲＧＭなどを決定するために１つ以上の試験が含まれ得る。）。対象が鉄欠乏または鉄過剰負荷に関連する鉄関連障害を有するかどうかについて評価されてもよく、従って、この評価は、予防的療法、維持療法または調節療法などの適切な治療方針を示すことができる。参考として、血液専門医は、患者が、正常なレベルの対応するパラメータを有することを示すために、以下の参照番号を用いることができる。表２を参照されたい。
【０１８９】
【表３】
2020058359.tif 000020
【０１９０】
したがって、本明細書において、鉄代謝の疾患を治療、予防、調節または軽減するための方法が提供される。抗体は、それを必要とする対象に投与することができる。抗体は、対象に治療的に有効な量で投与されてもよく、前記量は当業者によって容易に決定することができる。疾患を治療、予防、調節または軽減する方法は、正常な対照または較正物質中のヘプシジンのレベルと比較して、細胞または組織中のヘプシジンタンパク質のレベルを上下に調節してもよい。疾患を治療、予防、調節または軽減する方法は、正常な対照または較正物質中のヘプシジンのレベルと比較して、細胞または組織中のヘプシジンタンパク質のレベルを軽減してもよい。
【０１９１】
ａ．鉄代謝の疾患
鉄代謝の疾患または障害は、鉄恒常性が対象においてひどく乱れている任意の疾患または障害であってもよい。この恒常性は、適切な血漿鉄レベルの適切な調節に依存している。鉄は、細胞への鉄送達のためのビヒクルであるトランスフェリンに結合し、血漿中を循環する。血漿トランスフェリンは、通常、鉄で約３０％飽和されている。したがって、トランスフェリン飽和は、鉄消費に関与する経路からの様々なシグナルに応じて、適切な生理学的レベルで維持されなければならない。
【０１９２】
ヘプシジンは、全身鉄フラックスを調整し、フェロポーチンに結合し、その分解を誘導することによって血漿鉄レベルを調節する。フェロポーチンが分解されるため、マクロファージおよび十二指腸腸細胞は、もはや血液中に鉄を放出することができず、結果として、トランスフェリンへの鉄輸送が減少する。したがって、正常なヘプシジン産生を乱す遺伝性障害および後天性障害は、鉄欠乏（高ヘプシジンレベル）または鉄過剰負荷（ヘプシジン欠乏）を引き起こす可能性がある。
【０１９３】
この混乱は、鉄欠乏、鉄過剰負荷または貧血を伴う鉄過剰負荷をもたらす場合がある。この混乱はまた、慢性疾患の貧血をもたらすこともあり、ここで、この疾患を有する対象は、高レベルの血液ヘプシジンを示す。対象は、疲労、関節痛、骨または関節疾患（変形性関節症、骨粗鬆症）、関節リウマチ、炎症性腸疾患、息切れ、不整脈、肝臓障害、糖尿病、不妊症、インポテンス、うつ病、気分または精神障害、低い認知技能または神経変性疾患、ＡＣＤ、鉄剤不応性鉄欠乏性貧血、慢性腎臓病の貧血、赤血球生成促進剤に対する耐性、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、鉄芽球性貧血、低形成貧血、発作性夜間血色素尿症、フォンヴィレブランド病、血友病遺伝性出血性毛細血管拡張症、赤血球酵素異常症；グルコース−６リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤ）またはピルビン酸キナーゼ欠損症（ＰＫＤ）、無トランスフェリン血症または低トランスフェリン血症、無セルロプラスミン血症または低セルロプラスミン血症、ＣＤＡＩＩ（先天性赤血球異形成貧血）（ＨＥＭＰＡＳ（酸溶血試験陽性の遺伝性多核赤芽球症）とも呼ばれる）などの疾患もしくは障害を有するまたはそのリスクがある場合がある。
【０１９４】
肝臓におけるヘプシジンの抑制は、腹腔マクロファージ内でのフェロポーチンの発現増加と、細胞内の鉄および酸化ストレスの減少を伴い、ＡＢＣトランスポーターであるマクロファージコレステロール流出タンパク質であるＡＢＣＡ１とＡＢＣＧ１の発現増加と関連している。２０１１年１１月５日にアクセプトされたＳａｅｅｄら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ、３２（２０１２年２月）を参照されたい。ヘプシジンの抑制は、脂質流出の増加および泡沫細胞形成の減少をもたらすことができるＡＢＣＡ１とＡＢＣＧ１の発現を増加させる。したがって、抗体は、それを必要とする対象に投与することができる。抗体は、治療的に有効な量で対象に投与されてもよく、ここで、泡沫細胞およびアテローム性動脈硬化症の形成を制限することができ、および／またはアテローム性動脈硬化症を治療、予防、調節または軽減することができる。抗体は、ＡＢＣトランスポーターの発現と脂質流出能力の増大をもたらすマクロファージ細胞内鉄を減少させることができる。
【０１９５】
毛包の周期的活動は、通常、皮膚のマクロ環境において発現されるシグナル分子によって制御することができる。例えば、米国特許出願第２０１１／０２９３５２６号を参照されたい。その内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。例えば、ＢＭＰ発現は、毛髪成長と負に相関され得る。抗体は、再び成長するために再活性化される静止毛包を刺激するために使用されてもよい。抗体は、通常、皮膚のマクロ環境において発現される分子のシグナル伝達を直接的または間接的に破壊することができる。
【０１９６】
（１）鉄欠乏
鉄代謝の疾患は、体内で鉄が非常に少ないものであり得る。例えば、血清鉄が６０μｇ／ｄｌ以下、５５μｇ／ｄｌ以下、５０μｇ／ｄｌ以下、４５μｇ／ｄｌ以下または４０μｇ／ｄｌ以下であると判明された場合、対象は、鉄欠乏であると診断される場合がある。対象の総鉄結合能（「ＴＩＢＣ」）が５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％または１０％よりも低い場合、鉄欠乏であると診断される場合がある。対象が、鉄欠乏でない対象と比較して、フェリチンレベルが増加している場合、鉄欠乏であると診断される場合がある。対象が、ヘモグロビンレベルが１５．５、１５、１４．５、１４、１３．５、１３、１２．５、１２、１１．５、１１、１０．５、１０、９．５、９、８．５、８、７．５、７、６．５または６ｇ／ｄｌよりも低い場合、鉄欠乏であると診断される場合がある。２５％未満、２０％未満、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％または７％未満のトランスフェリン飽和率は、鉄欠乏を指示することがある。対象は、上記される１つ以上の因子に基づいて、鉄欠乏症を有するものとして診断されてもよい。
【０１９７】
成長および発育の重要なタイミングでの鉄欠乏は、早産、低出生体重児、成長および発育遅延、ならびに正常な乳児の活動および運動の遅滞をもたらす可能性がある；鉄欠乏は、学校、仕事、軍隊またはレクリエーションにおける能力不足をもたらす記憶力低下または認知能力（精神機能）低下をもたらすことがある。低知能指数は、成長の重要な時期において生じる鉄欠乏に結びついている。
【０１９８】
鉄欠乏性貧血（「ＩＤＡ」）は、対象が身体の要求を満たすために不十分な量の鉄を有している状態である。ＩＤＡは、鉄が少なすぎる対象に関連する、血液中の赤血球量の減少に起因する。ＩＤＡは、鉄が不十分なダイエットによって、または失血から生じることがある。ＩＤＡは、貧血の最も一般的な形態である。女性の約２０％、妊婦の５０％、男性の３％が鉄欠乏である。
【０１９９】
鉄不応性鉄貧血（「ＩＲＩＤＡ」）を罹患した対象は、小球性貧血を患っており、不適切に高いヘプシジンレベルのため、経口療法に反応せず、部分的に、非経口鉄に対して難治性である。ＩＲＩＤＡは、膜結合性ＲＧＭｃを切断することによって、ヘプシジン発現を負に制御するセリンプロテアーゼをコードするマトリプターゼ−２遺伝子（ＴＭＰＲＳＳ６）における突然変異によって引き起こされる。
【０２００】
（２）鉄過剰負荷
鉄過剰負荷に関連する障害の例としては、慢性疲労、関節痛、腹痛、肝疾患（肝硬変、肝癌）、糖尿病、不規則な心臓リズム、心臓発作、または心不全、皮膚の色変化（青銅、灰色−灰色緑）、生理が止まる、セックスに対する関心の喪失、変形性関節症、骨粗鬆症、脱毛、肝肥大または脾臓肥大、インポテンス、不妊症、性腺機能低下症、甲状腺機能低下症、下垂体機能低下症、うつ病、副腎機能障害、早期発症神経変性疾患、高血糖、肝酵素の上昇、および鉄の上昇（血清鉄、血清フェリチン）が挙げられる。例えば、血清鉄が、１５０μｇ／ｄｌ超、１５５μｇ／ｄｌ超、１６０μｇ／ｄｌ超、１６５μｇ／ｄｌ超または１７０μｇ／ｄｌ超であると判断された場合、対象は鉄過剰負荷と診断されることがある。対象の総鉄結合能力（「ＴＩＢＣ」）が５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または８０％を超える場合、対象は鉄欠乏と診断されることがある。対象が、鉄欠乏症でない対象と比較して、フェリチンレベルが増加した場合、対象は鉄欠乏と診断されることがある。対象が、１８．５、１８、１７．５、１７、１６．５、１６、１５．５、１５、１４．５、１４、１３．５、１３、１２．５または１２ｇ／ｄｌを超えるヘモグロビンレベルを有する場合、対象は、鉄欠乏と診断されることがある。３５％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５５％、６０％、６５％または７０％を超えるトランスフェリン飽和率は、鉄過剰負荷を指示する場合がある。対象は、上記される１つ以上の因子に基づいて、鉄過剰負荷を有するものとして診断され得る。
【０２０１】
ヘモクロマトーシス（ＨＨ）は、生体における過剰量の鉄（鉄過剰負荷）に起因する別の疾患である。遺伝性（遺伝）ヘモクロマトーシス（ＨＨＣ）は、異常な鉄代謝の遺伝性疾患である。ＨＨＣを有する個人は、非常に多くの食事による鉄を吸収する。いったん吸収されると、生体は、鉄過剰負荷を排出する効率的な方法を有さない。経時的に、これらの過剰さは、細胞に対して毒性である鉄過剰負荷の状態をもたらす。過剰な鉄が負荷された、腺および臓器、例えば、肝臓、心臓、下垂体、甲状腺、膵臓、滑膜（関節）および骨髄は、正常に機能することができない。症状は発症し、疾患が進行する。
【０２０２】
ＨＨＣにはいくつかのタイプがある。これらには、Ｉ型またはクラシック（ＨＨＣ）；ＩＩ型ａ、ｂまたは若年性（ＪＨＣ）；ＩＩＩ型またはトランスフェリン受容体突然変異；およびＩＶ型またはフェロポーチン突然変異が含まれる。
【０２０３】
ＨＨＣは、肝臓および他の臓器の鉄過剰負荷をもたらす可能性がある、常染色体劣性疾患である。４つの遺伝子は、ヘモクロマトーシスに関与している：ＨＦＥ（Ｃ２８２Ｙ）、ＴｆＲ２、ヘモジュベリン（ＨＪＶ）、およびＨＡＭＰ遺伝子（ヘプシジン）。疾患の劣性形態は、不適切に低いヘプシジン発現の結果であり、それによって、疾患の重症度および発症年齢は、ヘプシジン発現の程度と相関がすることがある。
【０２０４】
遺伝性ヘモクロマトーシスの優性形態は、細胞の鉄エクスポーター、およびヘプシジン受容体であるフェロポーチンにおけるミスセンス突然変異によって引き起こされる。例えば、フェロポーチンの膜局在化または鉄をエクスポートする能力を低減させる突然変異は、正常から低い血漿鉄レベルに、マクロファージ鉄過剰負荷または保持をもたらし、いくつかの場合において鉄制限赤血球生成をもたらす。
【０２０５】
高い血漿鉄および肝細胞の鉄の蓄積があるヘモクロマトーシスに関連した障害は、ヘプシジン耐性フェロポーチンの突然変異によって引き起こされる場合があり、それによって、ヘプシジンはフェロポーチン（Ｃ３２６Ｓ）に結合せず、またはフェロポーチンの内在化と分解、続くヘプシジン結合が損なわれる。
【０２０６】
ヘプシジンレベルはまた、「鉄負荷貧血」において不適切に低い場合があり、それによって、全身の鉄が高い場合であっても、赤血球形成シグナルがヘプシジン転写を抑制する。中間型β−サラセミアは、このような貧血の一例であり、輸血非依存性の鉄過剰負荷および低いヘプシジンレベルから存在しないヘプシジンレベルによって特徴付けられる。
【０２０７】
（３）貧血を伴う鉄過剰負荷
貧血を伴う鉄過剰負荷（ＩＯＡ）は、無セルロプラスミン血症とも呼ばれ、劣性疾患であり、貧血、鉄過剰負荷および神経変性によって特徴付けることができる。障害は、銅含有フェロキシダーゼセルロプラスミンをコードする遺伝子の突然変異によって引き起こされる。無セルロプラスミン血症を患っている患者は、フェロポーチン上の変異型セルロプラスミンの安定化機能がないために、低血清ヘプシジンレベルと肝臓におけるフェロポーチン発現の減少を有する。
【０２０８】
鉄過剰負荷は、不良な赤血球生成を伴う貧血（例えば、β−サラセミアおよび先天性赤血球異形成貧血）における死亡率と罹患率の主な原因と考えられている。これらの障害では、高レベルのエリスロポエチンは、大規模であるが不良の赤血球生成を刺激する。若年性ヘモクロマトーシスに似た重度の鉄過剰負荷は、稀であるまたは全く輸血を受けていない対象において発症する可能性があり、食事に含まれる鉄が、これらの条件下で過度に吸収されていることを示す。輸血を受けていないこれらの患者は、通常、高い血清フェリチン濃度と高い肝臓鉄過剰負荷にもかかわらず、ヘプシジンレベルが低い。不良の赤血球生成が、肝臓ヘプシジン合成を抑制し得るＧＤＦ−１５のようなメディエーターを生じることが想定し得る。Ｇａｎｚ，Ｔ．、Ｂｌｏｏｄ、１１７：４４２５−３３頁、２０１１、Ｈｅｐｃｉｄｉｎ  ａｎｄ  Ｉｒｏｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：１０  Ｙｅａｒｓ  Ｌａｔｅｒを参照されたい。
【０２０９】
ＩＯＡは、多くの場合、環境によって引き起こされ、それによって、対象は、非常に高い生体鉄を有し、これは、慢性溶血性貧血（赤血球の早期代謝回転または破壊）を引き起こす全血輸血または血液細胞障害が原因である可能性がある。このプロセスは、ヘモクロマトーシス患者に見られるものと同様の生体鉄蓄積を引き起こすことがある。様々な環境（高い食物消費を含む）は、鉄の余剰を急速に構築させ得る。エリスロポエチン、ヘプシジンおよび／または増殖分化因子−１５（ＧＤＦ−１５）のレベルは、ＩＯＡを有する対象を区別するために使用されてもよい。β−サラセミアでは、例えば、対象は、ＧＤＦ−１５レベルが劇的に上昇している。β−サラセミアを有する対象は、４５，０００ｐｇ／ｍｌを超えるＧＤＦ−１５、５０，０００ｐｇ／ｍｌを超えるＧＤＦ−１５、５５，０００ｐｇ／ｍｌを超えるＧＤＦ−１５、６０，０００ｐｇ／ｍｌを超えるＧＤＦ−１５、６５，０００ｐｇ／ｍｌを超えるＧＤＦ−１５、６６，０００ｐｇ／ｍｌを超えるＧＤＦ−１５または７０，０００ｐｇ／ｍｌを超えるＧＤＦ−１５を有する場合がある。例えば、β−サラセミア対象は、健常な対象における４５０＋／−５０ｐｇ／ｍｌのレベルまたはその近傍のレベルと比較して６６，０００＋／−９，６００ｐｇ／ｍｌでまたはその近傍のＧＤＦ−１５の平均レベルを有する場合がある。ヘモグロビン中の赤血球が非常に少なく、生活を持続することができないことがあり、全血輸血は、対象が生存するために必要とされる場合がある。貧血を伴う鉄過剰負荷に関連する疾患の例としては、鎌状赤血球貧血、サラセミア、鉄芽球性貧血および酵素欠損が挙げられる。
【０２１０】
ｂ．対象
対象は、ヒトまたは非ヒトであってもよい哺乳動物であり得る。対象は、化学療法を受けている救急患者、外科手術から回復中の救急患者であってもよく、または感染症、癌、自己免疫疾患もしくは障害、慢性臓器疾患および／もしくは炎症、および／もしくは固形臓器移植後の臓器の慢性的拒絶のリスクがあるまたはそれらを有してもよい。感染は急性または慢性であってもよい。感染は、ウイルス性、細菌性、寄生虫性、または真菌性であってもよい。癌は、血液腫瘍または固形腫瘍などのいずれかの癌であってもよい。自己免疫疾患は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデスおよび結合組織疾患、血管炎、サルコイドーシスおよび炎症性腸疾患などのいずれかの自己免疫疾患であってもよい。慢性臓器疾患は、対象が透析を受けているまたは受けていなくてもよい、慢性腎疾患であってもよい。ウイルス感染は、Ｂ型もしくはＣ型肝炎ウイルス感染、またはヒト免疫不全ウイルス感染症であってもよい。疾患および障害のいずれかはＡＣＤの根本的な原因であり得る。外科的手術は、手術中または手術後であってもよい。外科手術は腫瘍外科手術であってもよい。
【０２１１】
５．診断方法
本明細書において、対象が鉄関連障害を有するかどうかを決定するための方法が提供される。膜結合性ＲＧＭｃまたは可溶性ＲＧＭｃのレベルは、対象由来の試料において測定することができ、対照試料中のＲＧＭｃレベルまたは較正物質、例えば一連の較正物質と比較してもよい。対照試料は、正常な組織または体液（例えば、全血、血清、血漿など）由来であってもよい。対照と比較してＲＧＭｃの変化したレベルは、対象が、鉄関連障害を有することを示すことができる。例えば、正常な対照中の膜結合性ＲＧＭｃのレベルと比較して、膜結合性ＲＧＭｃの減少したレベルは、対象が鉄過剰負荷に関連した鉄関連障害を有することを示すことができる。あるいは、正常な対照中の膜結合性ＲＧＭｃのレベルと比較して、膜結合性ＲＧＭｃの増加したレベルは、対象が鉄欠乏に関連した鉄関連障害を有することを示すことができる。さらに、可溶性ＲＧＭｃまたはその可溶性断片の増加したレベルは、対象が鉄過剰負荷に関連した鉄関連障害を有していることを示すことができる。可溶性ＲＧＭｃまたはその可溶性断片のレベルの低下は、対象が鉄欠乏に関連する鉄関連障害を有していることを示すことができる。ＲＧＭｃ（膜結合または可溶性）のレベルは、本明細書に記載されている抗体を用いて測定することができる。
【０２１２】
また、対象が、鉄関連障害を有するかどうかを決定するための方法は、対象から得られた１つ以上の試料中の膜結合性ＲＧＭｃまたは可溶性ＲＧＭｃのレベルを測定することに加えて、ヘプシジンのレベルを測定することを含めてもよい。詳細には、一態様において、対象由来の試料中の膜結合性ＲＧＭｃまたは可溶性ＲＧＭｃのレベルを測定し、対照試料中のＲＧＭｃのレベルまたは較正物質、例えば一連の較正物質と比較してもよい。膜結合性ＲＧＭｃまたは可溶性ＲＧＭｃについての対照試料は、正常な組織または体液（例えば、全血、血清、血漿など）由来であってもよい。この方法はまた、同一試料中のヘプシジンのレベルを測定し、対照試料中のヘプシジンのレベルまたは較正物質、例えば一連の較正物質を比較することを含んでもよい。ヘプシジンについての対照試料は、正常な組織または体液（例えば、全血、血清、血漿など）由来であり得る。対照中のＲＧＭｃのレベルと比較して、ＲＧＭｃの変更されたレベルは、対象が鉄関連障害を有することを示すことができる。例えば、正常対照における膜結合性ＲＧＭｃと比較して、膜結合性ＲＧＭｃの減少したレベルは、対象が鉄過剰負荷に関連する鉄関連障害を有することを示すことができる。あるいは、正常対照における膜結合性ＲＧＭｃのレベルと比較して、膜結合性ＲＧＭｃの増加したレベルは、対象が鉄欠乏に関連する鉄関連障害を有することを示すことができる。さらに、可溶性ＲＧＭｃまたはその可溶性断片の増加したレベルは、対象が鉄過剰負荷に関連する鉄関連障害を有することを示すことができる。可溶性ＲＧＭｃまたはその可溶性断片の減少したレベルは、対象が鉄欠乏に関連する鉄関連障害を有することを示すことができる。ＲＧＭｃのレベルは、本明細書に記載されている抗体を用いて測定することができる。正常対照におけるヘプシジンのレベルと比較して、ヘプシジンの改変したレベルは、対象が鉄関連障害を有することを示すことができる。例えば、正常対照におけるヘプシジンのレベルと比較して、ヘプシジンの減少したレベルは、対象が鉄過剰負荷に関連する鉄関連障害を有することを示すことができる。あるいは、正常対照におけるヘプシジンのレベルと比較して、ヘプシジンの増加したレベルは、対象が鉄欠乏に関連する鉄関連障害を有することを示すことができる。膜結合性ＲＧＭｃまたは可溶性ＲＧＭｃとヘプシジンのレベルを測定する順序は重要ではない。それらは、同時にまたは任意の順序で逐次的に測定することができる。さらに、膜結合性ＲＧＭｃまたは可溶性ＲＧＭｃおよびヘプシジンのレベルは、同じ反応容器中でまたは異なる反応容器内で測定することができる。別の態様において、膜結合性ＲＧＭｃまたは可溶性ＲＧＭｃおよびヘプシジンのレベルは、対象由来の同じ試料において決定されなくてもよい。例えば、膜結合性ＲＧＭｃまたは可溶性ＲＧＭｃのレベルは、対象において得られた第１の試料中で決定することができる。ヘプシジンのレベルは、対象において得られた第２の試料中で決定することができる。あるいは、ヘプシジンのレベルは、対象から得られた第１の試料中で決定することができ、膜結合性ＲＧＭｃまたは可溶性ＲＧＭｃのレベルは、対象から得られた第２の試料中で決定することができる。患者から得られた第１および第２の試料は、同時にまたは互いに異なる時間で得ることができる。ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性）のレベルは、本明細書に記載されている抗体を用いて測定されてもよい。
【０２１３】
この方法は、ヘプシジンの存在、量または濃度について、試験試料をアッセイすることをさらに含んでいてもよく、ここで、（ｉ）ヘプシジンについてアッセイされる試験試料は、ＲＧＭｃについてアッセイされる同じ試験試料であってもよく、または（ｉｉ）ヘプシジンについてアッセイされる試験試料は、ＲＧＭｃについてアッセイされる試験試料とは異なる試験試料であるが、ヘプシジンについてアッセイされる試験試料源とＲＧＭｃについてアッセイされる試験試料源は同じである。試験試料、または複数の試験試料は、本明細書に記載され、当該技術分野において公知の同じタイプの方法または異なるタイプの方法を用いて、同時にまたはいずれかの順番で逐次的にＲＧＭｃおよびヘプシジンについてアッセイされる。あるいは、この方法は、ヘプシジンの存在、量または濃度について試験試料のアッセイの結果を用いることをさらに含むことができ、ここで、（ｉ）ヘプシジンについてアッセイされる試験試料は、ＲＧＭｃについてアッセイされる同じ試験試料であり、または（ｉｉ）ヘプシジンについてアッセイされる試験試料は、ＲＧＭｃについてアッセイされる試験試料とは異なる試験試料であるが、ヘプシジンについてアッセイされる試験試料源とＲＧＭｃについてアッセイされる試験試料源は同じである。この点に関して、その結果が上記方法の状況で使用された、ヘプシジンについての試験試料のアッセイは、ＲＧＭｃについての試験試料のアッセイ時間の前後のいずれかにおいて、異なる時間点、例えば、数時間（例えば１２時間）、１日、２日、３日、１週間、２週間、３週間またはさらには１カ月で行われてもよいが、ただし、結果は、なおも典型的であり、信頼できるものとみなされることを条件とする。ヘプシジンについての試験試料のアッセイは、ヘプシジン−２５の存在、量または濃度の決定を可能にすることが好ましい場合がある。例えば、血漿試料、血清試料または尿試料などの試料は、例えば、ＴＯＦ−ＭＳと内部標準を用いて、ヘプシジン−２５についてアッセイすることができる。
【０２１４】
ヘプシジンのレベルは、当該技術分野において公知のヘプシジン抗体、例えば、ＡＢＣＡＭ（登録商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）およびＢＡＣＨＥＭ（登録商標）（Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）から市販されるもの、例えば、ヘプシジン−２５抗体を用いて測定されてもよい。試料中のヘプシジンのレベルは、本明細書に記載されている様々なフォーマット（例えば、イムノアッセイ）を用いて決定することができる。
【０２１５】
本明細書に記載されているいずれかの方法によって決定されるヘプシジンのレベルおよびＲＧＭｃのレベルは、鉄関連障害の存在を示すために比較されてもよい。例えば、正常対照における膜結合性ＲＧＭｃとヘプシジンの比率とは異なる試験試料における膜結合性ＲＧＭｃとヘプシジンの比率は、試験試料が由来する対象が、鉄関連障害を有することを示すことができる。例えば、正常対照における可溶性ＲＧＭｃとヘプシジンの比率と比較して、試験試料における可溶性ＲＧＭｃとヘプシジンの増加した比率は、試験試料が由来する対象が、鉄過剰負荷などの鉄関連障害を有することを示すことができる。正常対照における可溶性ＲＧＭｃとヘプシジンの比率と比較して、試験試料における膜結合性ＲＧＭｃとヘプシジンの減少した比率は、試験試料が由来する対象が、鉄欠乏などの鉄関連障害を有することを示すことができる。
【０２１６】
ａ．試料
試料は、対象の任意の組織試料であってもよい。試料は、対象のタンパク質を含んでもよい。
【０２１７】
任意の細胞型、組織または体液は、試料を得るために利用することができる。このような細胞型、組織および体液は、組織の切片、例えば、生検試料および剖検試料、組織学的な目的で採取された凍結切片、血液（例えば、全血）、血漿、血清、痰、便、涙、粘液、唾液、毛髪および皮膚を含んでもよい。細胞型および組織はまた、リンパ液、腹水液（ａｓｃｅｔｉｃ  ｆｌｕｉｄ）、婦人科液、尿、血清、血漿、腹水（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｆｌｕｉｄ）、脳脊髄液、膣リンスによって回収された流体または膣洗浄によって回収された流体を含むことができる。組織または細胞型は、動物由来の細胞の試料を除くことによって設けてもよいが、（例えば、別のヒトによって、別の時間に、および／または別の目的のために単離された）従前に単離された細胞を用いることによって達成されてもよい。保存（ａｒｃｈｉｖａｌ）組織、例えば処置または予後履歴を有する組織もまた使用されてもよい。タンパク質精製を必要としなくてもよい。
【０２１８】
尿、血液、血清および血漿ならびに他の体液を回収、取り扱いおよび処理するための当該技術分野において公知の方法は、本開示の実施において、例えば、免疫診断試薬としておよび／またはＲＧＭｃイムノアッセイキットにおいて、本明細書において提供されている抗体を使用する場合に用いられる。試験試料は、対象とするＲＧＭｃ分析物、例えば、抗体、抗原、ハプテン、ホルモン、薬物、酵素、受容体、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに加えて、さらなる構成成分を含むことができる。例えば、試料は、対象から得られた全血試料であり得る。試験サンプル、特に全血は、例えば前処理試薬を用いて、本明細書に記載されるイムノアッセイ前に処理されることが必要であるまたは望ましい場合がある。前処理を必要としない場合（例えば、大部分の尿試料）において、前処理は、場合により、単なる便宜のために（例えば、商用プラットフォーム上での処方の一部として）行われてもよい。試料の特性を修飾するために、対象から得られた試料または前処理後の試料を直接使用してもよい。前処理は、抽出、濃縮、干渉成分の不活性化および／または試薬の添加を含んでもよい。
【０２１９】
前処理試薬は、本明細書に記載されているアッセイ、例えばイムノアッセイおよびキットとの使用に適した任意の試薬であり得る。前処理は、場合により、（ａ）１つ以上の溶媒（例えば、メタノールおよびエチレングリコール）および塩、（ｂ）１つ以上の溶媒、塩および洗浄剤、（ｃ）洗浄剤、または（ｄ）洗浄剤および塩を含む。前処理試薬は、当該技術分野において公知であり、このような前処理は、例えば、Ａｂｂｏｔｔ  ＴＤｘ、ＡｘＳＹＭ（登録商標）およびＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）分析器（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）でのアッセイに使用されるように、文献中に記載されているように（例えば、Ｙａｔｓｃｏｆｆら、Ａｂｂｏｔｔ  ＴＤｘ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｓｓａｙ  Ｅｖａｌｕａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  ｉｎ  Ｗｈｏｌｅ  Ｂｌｏｏｄ、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３６：１９６９−１９７３頁（１９９０）およびＷａｌｌｅｍａｃｑら、Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  ＡｘＳＹＭ  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  Ａｓｓａｙ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ＴＤｘ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｗｈｏｌｅ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ＥＭＩＴ  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  Ａｓｓａｙｓ、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：４３２−４３５頁（１９９９）を参照）および／または市販されているものを使用することができる。さらに、前処理は、（前処理に関する教示について、参照により全体として組み込まれる）Ａｂｂｏｔｔの米国特許第５，１３５，８７５号、欧州特許公開第０４７１２９３号および米国特許出願公開第２００８／００２０４０１号に記載されているように行うことが可能である。前処理試薬は、不均一剤または均一剤であり得る。
【０２２０】
不均一前処理試薬を使用する場合、前処理試薬は、試料中に存在する分析物結合タンパク質（例えば、ＲＧＭｃ（膜結合性ＲＧＭｃまたは可溶性ＲＧＭｃ）またはその断片に結合することができるタンパク質）を沈殿させる。このような前処理ステップは、沈殿した分析物結合タンパク質から、前処理剤を試料に添加することによって形成された混合物の上清を分離することによって、いずれもの分析物結合タンパク質を除去することを含む。このようなアッセイにおいて、任意の結合タンパク質が存在しない混合物の上清はアッセイにおいて使用され、抗体捕捉ステップへと直接進行する。
【０２２１】
均一前処理試薬を用いる場合、このような分離ステップは存在しない。試験試料と前処理試薬の混合物全体は、ＲＧＭｃ（膜結合性ＲＧＭｃ、可溶性ＲＧＭｃ、膜結合性ＲＧＭｃの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）に対する標識された特異的結合パートナー、例えば、標識された抗ＲＧＭｃモノクローナル抗体（または抗原的に反応性のその断片）と接触される。このようなアッセイに用いられる前処理試薬は、典型的には、第１の特異的結合パートナーによる捕捉前または捕捉中のいずれかにおいて、前処理された試験試料混合物中で希釈される。このような希釈にもかかわらず、ある量の前処理試薬（例えば、５Ｍメタノールおよび／または０．６Ｍエチレングリコール）は、捕捉中の試験試料混合物に依然として存在（または残存）する。
【０２２２】
ｂ．ＲＧＭｃ検出
生体試料に存在するＲＧＭｃ（膜結合性ＲＧＭｃ、可溶性ＲＧＭｃ、膜結合性ＲＧＭｃの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）の存在または量は、当該技術分野において公知の任意の適切なアッセイを用いて容易に決定され得る。例としては、限定されないが、イムノアッセイ、例えば、サンドイッチイムノアッセイ（例えば、放射性同位体検出（ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を含むモノクローナル−ポリクローナルサンドイッチイムノアッセイ）および酵素検出（酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（例えば、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡアッセイ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ））、競合阻害イムノアッセイ（例えば、フォワードおよびリバース）、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、酵素増幅免疫測定法（ＥＭＩＴ）、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）および均一化学発光アッセイなどが挙げられる。ＳＥＬＤＩベースのイムノアッセイにおいて、対象とするＲＧＭｃ（またはその断片）に特異的に結合する捕捉試薬は、予め活性化されたタンパク質チップアレイなどの質量分析プローブの表面に付着される。ＲＧＭｃ（膜結合性ＲＧＭｃ、可溶性ＲＧＭｃ、膜結合性ＲＧＭｃの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）は、バイオチップ上に特異的に捕捉され、捕捉されたＲＧＭｃ（膜結合性ＲＧＭｃ、可溶性ＲＧＭｃ、膜結合性ＲＧＭｃの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）は、質量分析によって検出される。あるいは、ＲＧＭｃ（膜結合性ＲＧＭｃ、可溶性ＲＧＭｃ、膜結合性ＲＧＭｃの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）は、捕捉試薬から溶出され、従来のＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化）またはＳＥＬＤＩによって検出することができる。化学発光微粒子イムノアッセイ、特にＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）自動分析装置（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を使用するものは、好ましいイムノアッセイの一例である。他の方法には、例えば、本明細書に記載されているＲＧＭｃに対する抗体（モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、ヒト化、ヒトなど）またはその断片を用いる質量分析および免疫組織化学（例えば、組織生検からの切片を用いる）が含まれる。抗ＲＧＭｃ抗体およびその断片は、上記されるように製造することができる。検出の他の方法には、例えば、各々が全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，１４３，５７６号；同第６，１１３，８５５号；同第６，０１９，９４４号；同第５，９８５，５７９号；同第５，９４７，１２４号；同第５，９３９，２７２号；同第５，９２２，６１５号；同第５，８８５，５２７号；同第５，８５１，７７６号；同第５，８２４，７９９号；同第５，６７９，５２６号；同第５，５２５，５２４号；および同第５，４８０，７９２号に記載���れているものが挙げられる。
【０２２３】
（１）イムノアッセイ
ＲＧＭｃおよび／またはそのペプチドもしくは断片（例えば、膜結合性ＲＧＭｃ、可溶性ＲＧＭｃ、膜結合性ＲＧＭｃの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）は、イムノアッセイを用いて分析されてもよい。ＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃ、可溶性ＲＧＭｃ、膜結合性ＲＧＭｃの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）の存在または量は、本明細書に記載されている抗体を用いて、ＲＧＭｃへの特異的結合を検出することによって決定することができる。例えば、抗体またはその断片は、配列番号１を含むポリペプチドまたはその断片に特異的に結合し得る。抗体またはその断片は、配列番号２を含むポリペプチドまたはその断片に特異的に結合し得る。所望であれば、本明細書に記載されている１つ以上の抗体は、市販されている１つ以上のモノクローナル／ポリクローナル抗体と組み合わせて使用することができる。このような抗体は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）およびＥｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、ＰＡ）などの会社から入手可能である。
【０２２４】
任意のイムノアッセイを利用することができる。イムノアッセイは、例えば、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、競合阻害アッセイ、例えば、フォワードまたはリバース競合阻害アッセイ、蛍光偏光アッセイ、または競合結合アッセイであってもよい。ＥＬＩＳＡはサンドイッチＥＬＩＳＡであってもよい。
【０２２５】
不均一形式を使用してもよい。例えば、試験試料が対象から得られた後、第１の混合物を用意する。混合物は、ＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃ、可溶性ＲＧＭｃ、膜結合性ＲＧＭｃの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）について評価される試験試料および第１の特異的結合パートナーを含み、ここで、第１の特異的結合パートナーおよび試験試料に含まれる任意のＲＧＭｃは、第１の特異的結合パートナー−ＲＧＭｃ複合体を形成する。好ましくは、第１の特異的結合パートナーは、抗ＲＧＭｃ抗体またはその断片である。試験試料と第１の特異的結合パートナーが混合物を形成するために添加される順序は重要ではない。好ましくは、第１の特異的結合パートナーは固相上に固定される。（第１の特異的結合パートナーと、場合により第２の特異的結合パートナーについて）イムノアッセイにおいて使用される固相は、当該技術分野において公知の任意の固相であってもよく、限定されないが、磁性粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、足場分子、フィルム、ろ紙、ディスクおよびチップなどが挙げられる。
【０２２６】
第１の特異的結合パートナー−ＲＧＭｃ複合体を含む混合物が形成された後、いずれもの未結合ＲＧＭｃは、当該技術分野において公知の任意の技術を用いて複合体から除去される。例えば、未結合ＲＧＭｃは洗浄によって除去され得る。しかしながら、望ましくは、第１の特異的結合パートナーは、試験試料に存在する過剰な任意のＲＧＭｃに存在し、そのため、試験試料に存在する全てのＲＧＭｃは第１の特異的結合パートナーに結合する。
【０２２７】
いずれもの未結合ＲＧＭｃが除去された後、第２の特異的結合パートナーは、第１の特異的結合パートナー−ＲＧＭｃ−第２の特異的結合パートナー複合体を形成するために混合物に添加される。第２の特異的結合パートナーは、好ましくは、第１の特異結合パートナーによって結合されたＲＧＭｃ上のエピトープとは異なるＲＧＭｃ上のエピトープに結合する抗ＲＧＭｃ抗体である。また、さらに好ましくは、第２の特異的結合パートナーは、上記される検出可能な標識を用いて標識されるまたはそれを含む。
【０２２８】
固定化された抗体またはその断片の使用は、イムノアッセイに組み込むことができる。抗体は、様々な支持体、例えば、磁気またはクロマトグラフィーマトリックス粒子、アッセイプレートの表面（例えば、マイクロタイターウェル）、固体基板材料片などに固定化されてもよい。アッセイストリップは、固体支持体上のアレイ中の抗体または複数の抗体を被覆することによって調製することができる。次に、このストリップは、試験生物学的試料中に浸漬され、次に、色のついたスポットなどの測定可能なシグナルを生成させるために、洗浄ステップおよび検出ステップを通じて迅速に処理され得る。
【０２２９】
（ａ）サンドイッチＥＬＩＳＡ
サンドイッチＥＬＩＳＡは、抗体（すなわち、捕捉抗体（すなわち、少なくとも１つの捕捉抗体）と検出抗体（すなわち、少なくとも１つの検出抗体））の二層間の抗原量を測定する。捕捉抗体および検出抗体は、抗原、例えば、ＲＧＭｃ上の異なるエピトープに結合する。望ましくは、エピトープへの捕捉抗体の結合は、エピトープへの検出抗体の結合を妨害しない。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかは、サンドイッチＥＬＩＳＡにおける捕捉抗体および検出抗体として使用されてもよい。
【０２３０】
一般に、少なくとも２つの抗体が、試験試料中のＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃ、可溶性ＲＧＭｃ、膜結合性ＲＧＭｃの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）を分離し、定量するために使用される。詳細には、少なくとも２つの抗体は、「サンドイッチ」と呼ばれる免疫複合体を形成するＲＧＭｃまたはＲＧＭｃ断片の特定のエピトープに結合する。１つ以上の抗体は、試験試料におけるＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃ、可溶性ＲＧＭｃ、膜結合性ＲＧＭｃの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）を捕捉するために使用することができ（これらの抗体は、しばしば、「捕捉」抗体または複数の「捕捉」抗体と呼ばれる。）、１つ以上の抗体は、サンドイッチに検出可能な（すなわち、定量可能な）標識を結合するために使用される（これらの抗体は、しばしば、「検出」抗体または複数の「検出」抗体と呼ばれる。）。サンドイッチアッセイにおいて、エピトープへの抗体の結合は、望ましくは、それぞれのエピトープに対するアッセイにおいて、任意の他の抗体の結合によって低減されない。換言すると、抗体は、ＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃ、可溶性ＲＧＭｃ、膜結合性ＲＧＭｃの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）を含むと考えられる試験試料と接触された１つ以上の第１の抗体が、第２の抗体または後続の抗体によって認識されるエピトープの全てまたは一部に結合しないように選択され、それによって、ＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃ、可溶性ＲＧＭｃ、膜結合性ＲＧＭｃの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）に結合する１つ以上の第２の検出抗体の能力を妨害しない。
【０２３１】
抗体は、前記イムノアッセイにおける第１の抗体として使用することができる。好ましくは、抗体は、配列番号２の少なくとも３つの隣接するアミノ酸を含むエピトープに免疫特異的に結合し、ＫＤは４．２×１０−１１Ｍから７．４×１０−１３Ｍである。イムノアッセイは、配列番号２の少なくとも３つの隣接するアミノ酸を含むエピトープに免疫特異的に結合する第２の抗体を含んでもよく、ここで、第２の抗体が結合する隣接する３つのアミノ酸は、第１の抗体が結合する３つの隣接するアミノ酸と異なっている。
【０２３２】
好ましい実施形態において、ＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃ、可溶性ＲＧＭｃ、膜結合性ＲＧＭｃの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）を含むと考えられる試験試料は、同時にまたは逐次的に少なくとも１つの捕捉抗体（または複数の抗体）と少なくとも１つの検出抗体で接触され得る。サンドイッチアッセイフォーマットにおいて、ＲＧＭｃ（膜結合性ＲＧＭｃ、可溶性ＲＧＭｃ、膜結合性ＲＧＭｃの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）を含むと考えられる試験試料は、最初に、抗体−ＲＧＭｃ複合体の形成を可能にする条件下で、特定のエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの捕捉抗体と接触される。１つを超える捕捉抗体を用いる場合、複数の捕捉抗体−ＲＧＭｃ複合体が形成される。サンドイッチアッセイにおいて、抗体、好ましくは、少なくとも１つの捕捉抗体は、試験試料中に予期されるＲＧＭｃまたはＲＧＭｃ断片の最大量のモル過剰量で使用される。例えば、微粒子含有緩衝液１ｍＬあたり約５μｇ／ｍＬから約１ｍｇ／ｍＬ抗体を用いてもよい。
【０２３３】
場合により、試験試料と少なくとも１つの第１の捕捉抗体を接触させる前に、少なくとも１つの捕捉抗体は、試験試料からの抗体−ＲＧＭｃ複合体の分離を促進する固体支持体に結合させることができる。当該技術分野で公知の任意の使用することのできる固体支持体には、限定されないが、ウェル、チューブまたはビーズの形態でポリマー材料からなる固体支持体が含まれる。抗体（または複数の抗体）は、吸着によって、化学的カップリング剤を用いた共有結合によってまたは当該技術分野において公知の他の手段によって固体支持体に結合させることができ、ただし、このような結合はＲＧＭｃまたはＲＧＭｃ断片に結合する抗体の能力を干渉しないという条件による。さらに、必要に応じて、固体支持体は、抗体上の種々の官能基との反応を可能にするように誘導体化することができる。このような誘導体化は、特定のカップリング剤の使用を必要とし、限定されないが、例えば、無水マレイン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドが挙げられる。
【０２３４】
ＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃ、可溶性ＲＧＭｃ、膜結合性ＲＧＭｃの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）を含むと考えられる試験試料を少なくとも１つの捕捉抗体と接触させた後、試験試料は、捕捉抗体（または複数の捕捉抗体）−ＲＧＭｃ複合体の形成を可能にするためにインキュベートされる。インキュベーションは、約４．５から約１０．０のｐＨで、約２℃から約４５℃の温度で、少なくとも約１分から約１８時間の期間、約２から６分の期間または約３から４分の期間で行われてもよい。
【０２３５】
捕捉抗体−ＲＧＭｃ複合体の形成後、複合体は、（捕捉抗体−ＲＧＭｃ−検出抗体（複数の検出抗体）複合体の形成を可能にする条件下で）少なくとも１つの検出抗体と接触される。捕捉抗体−ＲＧＭｃ複合体が１つを超える検出抗体と接触される場合、捕捉抗体−ＲＧＭｃ−検出抗体（複数の検出抗体）検出複合体が形成される。捕捉抗体と同様に、少なくとも１つの検出（および後続の）抗体を捕捉抗体−ＲＧＭｃ複合体と接触させた場合、上記されるものと類似した条件下でのインキュベート期間が、捕捉抗体−ＲＧＭｃ−検出抗体（複数の検出抗体）複合体の形成に必要とされる。好ましくは、少なくとも１つの検出抗体は、検出可能な標識を含む。検出可能な標識は、捕捉抗体−ＲＧＭｃ−検出抗体（複数の検出抗体）複合体の形成前に、形成と同時にまたは形成後に少なくとも１つの検出抗体に結合されてもよい。当該技術分野において公知の任意の検出可能な標識は、本明細書において検討されるように使用することができ、当該技術分野で公知である。
【０２３６】
化学発光アッセイは、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ５７９（１）：６１−６７（２００６）に記載される方法に従って行うことができる。任意の適切なアッセイフォーマットを使用することができるが、マイクロプレートケミルミノメータ（Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ−９４０、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｕ．Ｓ．Ａ．、ＬＬＣ、Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ、ＴＮ）は、少量の複数の試料を迅速にアッセイすることができる。ケミルミノメータは、９６ウェルの黒のポリスチレン性マイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ＃３７９２）を使用する、複数の試薬インジェクターを装備することができる。それぞれの試料は、別々のウェルに添加され、続いて、使用されるアッセイのタイプによって決定される他の試薬を同時に／逐次的に添加することができる。望ましくは、アクリジニウムアリールエステルを用いた中性または塩基性溶液中での擬似塩基の形成は、例えば、酸性化によって回避される。次に、化学発光反応は、ウェルごとに記録される。この点に関して、化学発光反応を記録する時間は、部分的には、使用される試薬の添加と使用される特定のアクリジニウムとの間の遅延に依存する。
【０２３７】
化学発光アッセイのための混合物を形成するために試験試料と特異的結合パートナーを添加する順序は重要ではない。第１の特異的結合パートナーが、アクリジニウム化合物で検出可能に標識される場合、検出可能に標識された第１の特異的結合パートナー−ＲＧＭｃ複合体が形成する。あるいは、第２の特異的結合パートナーが使用され、第２の特異的結合パートナーがアクリジニウム化合物で検出可能に標識される場合、検出可能に標識された第１の特異的結合パートナー−ＲＧＭｃ−第２の特異的結合パートナー複合体が形成する。いずれもの未結合の特異的結合パートナーは、標識されているまたは標識されていないかにかかわらず、洗浄などの当該技術分野で公知の任意の技術を用いて混合物から除去することができる。
【０２３８】
過酸化水素は、上記されるアクリジニウム化合物の添加前に、添加と同時にまたは添加後に、混合物中においてその場で生成され、または混合物に提供もしくは供給され得る。過酸化水素は、当業者に明らかであるような多数の方法においてその場で生成され得る。
【０２３９】
あるいは、過酸化水素源を混合物に単に添加することができる。例えば、過酸化水素源は、１つ以上の緩衝剤または過酸化水素を含むことが知られている他の溶液であってもよい。この点で、過酸化水素の溶液を単に添加することができる。
【０２４０】
少なくとも１つの塩基溶液を試料に同時にまたは逐次的に添加すると、ＲＧＭｃまたはその断片の存在の指標となる検出可能なシグナル、すなわち、化学発光シグナルが発生する。塩基溶液は、少なくとも１つの塩基を含み、１０以上、好ましくは１２以上のｐＨを有する。塩基溶液の例には、限定されないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウムおよび炭酸水素カルシウムが含まれる。試料に添加される塩基溶液の量は、塩基溶液の濃度に依存する。使用される塩基溶液の濃度を基礎として、当業者は、試料に添加する塩基溶液の量を容易に決定することができる。
【０２４１】
発生した化学発光シグナルは、当業者に知られている定型的な技術を用いて検出することができる。発生したシグナルの強度を基礎として、試料中のＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃ、可溶性ＲＧＭｃ、膜結合性ＲＧＭｃの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）の量を定量することができる。詳細には、試料中のＲＧＭｃの量は、発生したシグナルの強度に比例する。存在するＲＧＭｃの量は、発生した光の量をＲＧＭｃの標準曲線と比較するまたは基準標準物質と比較することによって定量することができる。標準曲線は、既知の濃度のＲＧＭｃの連続希釈物または溶液を用いて、質量分析、重量測定法および当該技術分野において公知の他の技術によって作成することができる。
【０２４２】
ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）（またはその後継品）分析器を用いる化学発光微粒子アッセイにおいて、コンジュゲート希釈物のｐＨは約６．０＋／−０．２でなければならず、微粒子を含む緩衝液は室温（すなわち、約１７から約２７℃）に維持されなければならず、微粒子含有緩衝液のｐＨは約６．５＋／−０．２でなければならず、微粒子希釈物のｐＨは約７．８＋／−０．２でなければならない。固体は、好ましくは、約０．２％未満であり、例えば、約０．１５％未満、約０．１４％未満、約０．１３％未満、約０．１２％未満、または約０．１１％未満、例えば約０．１０％である。
【０２４３】
（ｂ）フォワード競合阻害
フォワード競争阻害フォーマットにおいて、既知濃度の標識されたＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）の分注液を用いて、ＲＧＭｃ抗体（例えば、抗体）への結合に対して試験試料中のＲＧＭｃと競合させる。
【０２４４】
フォワード競合アッセイにおいて、固定された抗体（例えば、抗体）は、逐次的にまたは同時に、試験試料および標識されたＲＧＭｃ、ＲＧＭｃ断片またはＲＧＭｃ改変体と接触することができる。ＲＧＭｃペプチド、ＲＧＭｃ断片またはＲＧＭｃ改変体は、抗ＲＧＭｃ抗体に関連して上記で検討した検出可能な標識を含む、任意の検出可能な標識で標識することができる。このアッセイにおいて、抗体は、固体支持体上に固定化することができる。あるいは、抗体は、例えば、微粒子などの固体支持体上に固定化された抗種抗体などの抗体に結合することができる。
【０２４５】
標識されたＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）、試験試料および抗体は、サンドイッチアッセイフォーマットと関連して上記されるものに類似した条件下でインキュベートされる。次に、２つの異なる種の抗体−ＲＧＭｃ複合体が生成されてもよい。詳細には、生成された抗体−ＲＧＭｃ複合体の１つは検出可能な標識を含み、一方、他方の抗体−ＲＧＭｃ複合体は検出可能な標識を含まない。抗体−ＲＧＭｃ複合体は、必要ではないが、検出可能な標識の定量化前に、試験試料の残り部分から分離することができる。次に、抗体−ＲＧＭｃ複合体が試験試料の残り部分から分離されるかどうかにかかわらず、抗体−ＲＧＭｃ複合体中の検出可能な標識の量が定量される。次に、試験試料中のＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃ、可溶性ＲＧＭｃ、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）の濃度は、抗体−ＲＧＭｃ複合体における検出可能な標識の定量値と標準曲線を比較することによって決定され得る。標準曲線は、既知の濃度のＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃ、可溶性ＲＧＭｃ、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）の連続希釈を用いて、質量分析によって、重量測定法によっておよび当該技術分野において公知の他の技術によって作成することができる。
【０２４６】
抗体−ＲＧＭｃ複合体は、固体支持体、例えば、サンドイッチアッセイフォーマットに関連して上記で検討された固体支持体に抗体を結合し、次に、固体支持体との接触から試験試料の残り部分を除去することによって試験試料から分離することができる。
【０２４７】
（ｃ）リバース競合アッセイ
リバース競合アッセイにおいて、固定されたＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）は、逐次的にまたは同時に、試験試料および少なくとも１つの標識された抗体と接触され得る。好ましくは、抗体は、配列番号２の少なくとも３つのアミノ酸を含むエピトープに、またはＲＧＭｃ（配列番号１）のアミノ酸５−１３、５−１２、５−１１、５−１０、５−９、５−８、５−７、６−１３、６−１２、６−１１、６−１０、６−９、６−８、７−１３、７−１３、７−１１、７−１０、７−９、８−１３、８−１２、８−１１、８−１０、９−１３、９−１２、９−１１、１０−１３、１０−１２もしくは１１−１３を含むエピトープに特異的に結合する。
【０２４８】
ＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）は、固体支持体、例えば、サンドイッチアッセイフォーマットと関連して上記で検討された固体支持体に結合され得る。好ましくは、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性）ペプチド断片は、ＲＧＭｃ（配列番号１）のアミノ酸５−１３、５−１２、５−１１、５−１０、５−９、５−８、５−７、６−１３、６−１２、６−１１、６−１０、６−９、６−８、７−１３、７−１３、７−１１、７−１０、７−９、８−１３、８−１２、８−１１、８−１０、９−１３、９−１２、９−１１、１０−１３、１０−１２もしくは１１−１３を含む。
【０２４９】
固定化されたＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）、試験試料および少なくとも１つの標識された抗体は、サンドイッチアッセイフォーマットに関連して上記されているものと類似した条件下でインキュベートされる。次に、２つの異なる種のＲＧＭｃ−抗体複合体を生成する。具体的に、生成されたＲＧＭｃ−抗体複合体の１つは固定され、検出可能な標識を含み、一方、他のＲＧＭｃ−抗体複合体は固定化されず、検出可能な標識を含む。固定されていないＲＧＭｃ−抗体複合体および試験試料の残り部分は、洗浄などの当該技術分野で公知の技術を介して固定されたＲＧＭｃ−抗体複合体の存在から除去される。固定されていないＲＧＭｃ−抗体複合体が除去されると、固定されたＲＧＭｃ−抗体複合体中の検出可能な標識の量が定量される。次に、試験試料中のＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃ、可溶性ＲＧＭｃ、膜結合性ＲＧＭｃの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）の濃度は、ＲＧＭｃ−複合体における検出可能な標識の定量値と標準曲線を比較することによって決定され得る。標準曲線は、既知の濃度のＲＧＭｃまたはＲＧＭｃ断片の連続希釈物を用いて、質量分析によって、重量測定法によっておよび当該技術分野において公知の他の技術によって作成することができる。
【０２５０】
（ｄ）蛍光偏光
蛍光偏光アッセイにおいて、抗体またはその機能的に活性な断片は、最初に、ＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）を含むと考えられる、標識されていない試験試料と接触されて、標識されていないＲＧＭｃ−抗体複合体を形成してもよい。次に、標識されていないＲＧＭｃ−抗体複合体は、蛍光標識されたＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体と接触される。標識されたＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）は、抗体またはその機能的に活性な断片への結合に対して、試験試料中の任意の標識されていないＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）と競合する。形成された標識されたＲＧＭｃ−抗体複合体の量が決定され、試験試料中のＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）の量が標準曲線を用いて決定される。
【０２５１】
蛍光偏光アッセイにおいて用いられる抗体は、配列番号２の少なくとも３つのアミノ酸を含むエピトープに、またはＲＧＭｃ（配列番号１）のアミノ酸５−１３、５−１２、５−１１、５−１０、５−９、５−８、５−７、６−１３、６−１２、６−１１、６−１０、６−９、６−８、７−１３、７−１３、７−１１、７−１０、７−９、８−１３、８−１２、８−１１、８−１０、９−１３、９−１２、９−１１、１０−１３、１０−１２もしくは１１−１３を含むエピトープに特異的に結合する。
【０２５２】
抗体、標識されたＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）および試験試料および少なくとも１つの標識された抗体は、サンドイッチイムノアッセイに関連して上記されたものと類似した条件下でインキュベートされてもよい。
【０２５３】
あるいは、抗体またはその機能的に活性な断片は、同時に、蛍光標識されたＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）およびＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）を含むと考えられる標識されていない試験試料と接触され、標識されたＲＧＭｃ−抗体複合体と標識されていないＲＧＭｃ−抗体複合体の両方を形成してもよい。形成された標識されたＲＧＭｃ−抗体複合体の量が決定され、試験試料中のＲＧＭｃの量は標準曲線を用いて決定される。このイムノアッセイにおいて使用される抗体は、配列番号１もしくは２のアミノ酸配列を有するエピトープにまたはＲＧＭｃ（配列番号１もしくは２）のアミノ酸５−１３、５−１２、５−１１、５−１０、５−９、５−８、５−７、６−１３、６−１２、６−１１、６−１０、６−９、６−８、７−１３、７−１３、７−１１、７−１０、７−９、８−１３、８−１２、８−１１、８−１０、９−１３、９−１２、９−１１、１０−１３、１０−１２もしくは１１−１３を含むアミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合してもよい。
【０２５４】
あるいは、抗体またはその機能的に活性な断片は、最初に、蛍光標識されたＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）と接触され、標識されたＲＧＭｃ−抗体複合体を形成する。次に、標識されたＲＧＭｃ−抗体複合体は、ＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）を含むと考えられる標識されていない試験試料と接触される。試験試料中のいずれもの標識されていないＲＧＭｃは、抗体またはその機能的に活性な断片への結合に対して、標識されたＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）と競合する。形成された、標識されたＲＧＭｃ−抗体複合体の量が決定され、試験試料中のＲＧＭｃの量は標準曲線を用いて決定される。このイムノアッセイにおいて使用される抗体は、ＲＧＭｃ（配列番号２）のアミノ酸５−１３の少なくとも３つのアミノ酸を含むエピトープにまたはＲＧＭｃ（配列番号１もしくは２）のアミノ酸１３−２０、１３−１９、１３−１８、１３−１７、１３−１６、１４−２０、１４−１９、１４−１８、１４−１７、１４−１６、１５−２０、１５−１９、１５−１８、１６−２０、１６−１９、１７−２４、１７−２３、１７−２２、１７−２１、１７−２０、１７−１９、１８−２４、１８−２３、１８−２２、１８−２１、１８−２０、１９−２４、１９−２３、１９−２２または１９−２１を含むエピトープに特異的に結合する。
【０２５５】
（ｅ）質量分析
質量分析（ＭＳ）は、単独でまたは他の方法と組み合わせて用いてもよい。他の方法には、イムノアッセイおよび特定のポリヌクレオチドを検出するために上記されるものが挙げられる。質量分析法は、１つ以上のバイオマーカーの存在および／または量を決定するために用いることができる。ＭＳ分析は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）飛行時間型（ＴＯＦ）ＭＳ分析、例えば、指向型スポットＭＡＬＤＩ−ＴＯＦまたは液体クロマトグラフィーＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＭＳ分析は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）ＥＳＩ−ＭＳなどのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ＭＳを含む。質量分析は、市販の分光計を使用して達成することができる。生体試料中のバイオマーカーペプチドの存在および量を検出するために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳおよびＥＳＩ−ＭＳを含むＭＳ分析を利用する方法を用いてもよい。例えば、ガイダンス用に米国特許第６，９２５，３８９号；同第６，９８９，１００号；および同第６，８９０，７６３号を参照されたい。これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる。
【０２５６】
ｃ．対照
対照試料または較正物質、例えば、一連の較正物質を含めることが望ましい場合がある。対照試料は、上記される対象由来の試料と同時に分析されてもよい。対象試料から得られた結果は、対照試料から得られた結果と比較することができる。標準曲線が提供され、それを用いて、生体試料についてのアッセイ結果が比較されてもよい。このような標準曲線は、アッセイユニットの関数として、すなわち、蛍光標識が用いられる場合、蛍光シグナル強度の関数としてレベルを提示する。複数のドナーから採取した試料を用いて、標準曲線は、正常組織におけるＲＧＭｃの対照レベルについて、ならびに、上述される特徴の１つ以上を有してもよいドナーから採取した組織中のＲＧＭｃの「危険に晒されている」レベルについて提供され得る。
【０２５７】
したがって、上記の観点から、試験試料中のＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）の存在、量または濃度を決定する方法が提供される。この方法は、イムノアッセイによって、例えば、少なくとも１つの抗体と少なくとも１つの検出可能な標識を用いるＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）について試験試料をアッセイすることを含み、試験試料中のＲＧＭｃの存在、量または濃度の直接的または間接的指標として検出可能な標識によって生成されたシグナルと、較正物質においてＲＧＭｃの存在、量または濃度の直接的または間接的指標として生成されたシグナルを比較することを含む。較正物質は、場合により、好ましくは、一連の較正物質の一部であり、ここで、較正物質のそれぞれは、ＲＧＭｃの濃度によって、シリーズにおける他の較正物質とは異なっている。少なくとも１つの抗体の１つは、ＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）に特異的に結合する単離された抗体であり、ここで、抗体は、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｅ）配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｇ）配列番号９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｈ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｊ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｋ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｌ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｍ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｎ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｏ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｐ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｑ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１２のアミノ酸を含むＣＤＲ２および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｒ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｓ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｔ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖から選択されるドメインまたは領域を有する。
【０２５８】
場合により、抗体は、表２に示されている配列から選択されるドメインまたは領域を有する。例えば、抗体は、（ａ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｂ）配列番号３８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｃ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｄ）配列番号４０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｅ）配列番号４１のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｆ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｇ）配列番号４３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｈ）配列番号４４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｊ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｋ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｌ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｍ）配列番号４９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｎ）配列番号５０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｏ）配列番号５１のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｐ）配列番号５２のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｑ）配列番号５３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｒ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｓ）配列番号５５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｔ）配列番号５６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｕ）配列番号５７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｖ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｗ）配列番号５９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｘ）配列番号６０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｙ）配列番号６１のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｚ）配列番号６２のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ａａ）配列番号６３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｂｂ）配列番号６４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｃｃ）配列番号６５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｄｄ）配列番号６６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｅｅ）配列番号６７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｆｆ）配列番号６８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｇｇ）配列番号６９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｈｈ）配列番号７０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｊｊ）配列番号７２のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｋｋ）配列番号７３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｌｌ）配列番号７４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｍｍ）配列番号７５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｎｎ）配列番号７６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｏｏ）配列番号７７のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｐｐ）配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、または（ｑｑ）配列番号７７のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖から選択されるドメインまたは領域を有する。
【０２５９】
この方法は、（ｉ）捕捉抗体／ＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）複合体を形成するように、試験試料と、ＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）上のエピトープに結合する少なくとも１つの捕捉抗体を接触させるステップ、（ｉｉ）捕捉抗体／ＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）／検出抗体複合体を形成させるために、捕捉抗体／ＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）複合体と、検出可能な標識を含み、捕捉抗体によって結合されないＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）上のエピトープに結合する少なくとも１つの検出抗体とを接触させるステップ、および（ｉｉｉ）（ｉｉ）において形成された捕捉抗体／ＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）／検出抗体複合体における検出可能な標識によって生成されたシグナルに基づいて、試験試料中のＲＧＭｃ（またはその断片）の量を決定するステップを含み得る。
【０２６０】
あるいは、この方法は、（ｉ）捕捉抗体／ＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）複合体を形成するように、試験試料と、ＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）上のエピトープに結合する少なくとも１つの捕捉抗体とを接触させ、同時または逐次的に、任意の順番で、試験試料と、少なくとも１つの捕捉抗体への結合に対して試験試料中の任意のＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）と競合し得る検出可能に標識されたＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）とを接触させるステップを含み得る。試験試料中に存在する任意のＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）と検出可能な標識されたＲＧＭｃは互いに競合し、捕捉抗体／ＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）複合体および捕捉抗体／検出可能に標識されたＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）複合体をそれぞれ形成する。この方法は、（ｉｉ）（ｉｉ）において形成された捕捉抗体／検出可能に標識されたＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）複合体における検出可能な標識によって生成されたシグナルに基づいて、試験試料におけるＲＧＭｃの存在、量または濃度を決定するステップをさらに含む。捕捉抗体／検出可能に標識されたＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）複合体における検出可能な標識によって生成されたシグナルは、試験試料におけるＲＧＭｃの量または濃度に反比例する。
【０２６１】
一実施形態において、マウス抗ＲＧＭｃ抗体は、固体支持体に、例えば、ヒツジ（または他の種）の抗マウスＡｂを介して、直接的または間接的に結合することができる。任意のＲＧＭｃは、試料中に存在し、固体支持体と接触され、マウス抗ＲＧＭｃ  Ａｂによって結合される。ビオチン標識ヤギ抗ＲＧＭｃ  ＡｂもまたＲＧＭｃに結合する。ストレプトアビジンは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）に連結され、ヤギ抗ＲＧＭｃ  Ａｂ上のビオチンに結合する。ｏ−フェニレンジアミンと接触されると、ＨＲＰＯは、ｏ−フェニレンジアミンを、橙褐色の色であり、４９２ｎｍで分光光度的に測定することができる２，３−ジアミノフェナジンに変換する。
【０２６２】
この方法は、試験試料が得られた患者の治療的／予防的処置の有効性を診断し、予測しまたは評価するステップをさらに含むことができる。この方法が、試験試料が得られた患者の治療的／予防的処置の有効性を評価するステップをさらに含む場合、該方法は、場合により、有効性を改善する必要がある患者の治療的／予防的処置を修飾するステップをさらに含む。この方法は、自動化システムまたは半自動化システムにおける使用に適合させることができる。
【０２６３】
一般に、所定のレベルは、ＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）について試験試料をアッセイして得られた結果をどちらに評価するかに対するベンチマークとして用いることができる。一般に、このような比較を行う際に、所定のレベルは、分析物の存在、量または濃度が疾患、障害もしくは状態（例えば、本明細書において検討されおよび／または当該技術分野において公知である鉄過剰負荷または鉄欠乏と関連したものなどの鉄関連障害）の特定の段階もしくはエンドポイントまたは特定の臨床徴候とつながり得るまたは関連し得るように、適切な条件下で十分な回数の特定のアッセイを実行することによって得られる。典型的に、所定のレベルは、基準対象（または対象の集団）のアッセイを用いて得られる。測定されたＲＧＭｃは、その断片、その分解産物および／またはその酵素的切断産物を含み得る。
【０２６４】
特に、疾患の進行および／または治療をモニタリングするために使用される所定のレベルに関して、ＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）の量または濃度は、「変化していない」、「好ましい」（または「好ましいように変化している」）または「好ましくない」（または「好ましくないように変化している」）可能性がある。「上昇している」または「増加している」は、典型的なもしくは正常なレベルもしくは範囲（例えば、所定のレベル）より高いまたは別の基準レベルもしくは範囲（例えば、初期のまたはベースライン試料）より高い、試験試料における量または濃度を表す。「低下している」または「低減している」という用語は、典型的なもしくは正常なレベルもしくは範囲（例えば、所定のレベル）より低いまたは別の基準レベルもしくは範囲（例えば、初期のまたはベースライン試料）より低い、試験試料における量または濃度を表す。用語「変化している」は、典型的なもしくは正常なレベルもしくは範囲（例えば、所定のレベル）を超えてまたは別の基準レベルもしくは範囲（例えば、初期のまたはベースライン試料）を超えて変化している（増加しているまたは減少している）、試料における量または濃度を表す。
【０２６５】
ＲＧＭｃの典型的なまたは正常なレベルまたは範囲は、標準的な慣習に従って定義される。いわゆる変化したレベルまたは変化は、典型的なもしくは正常なレベルもしくは範囲または基準レベルもしくは範囲と比較して（実験エラーまたは試料の変動によって説明することが不可能である）、いずれかの正味の変化が存在する場合に起こったと見なされ得る。したがって、特定の試料において測定されるレベルは、いわゆる正常な対象から得られた類似の試料において決定されたレベルまたはレベルの範囲と比較される。この状況において、「正常な対象」は、検出可能な疾患または障害を有さない個体であり、「正常な」（「対照」と称されることもある）患者または集団は、例えばそれぞれ検出可能な疾患または障害を示さないものである。「見かけ上正常な対象」は、ＲＧＭｃが評価されておらずまたは現在のところ評価中であるものである。分析物のレベルは、分析物が正常で検出不能である（例えば、正常レベルが０または正常集団の約２５から約７５パーセンタイルの範囲内である）が、試験試料において検出されるときならびに分析物が試験試料中に正常レベルより高く存在するときに「上昇している」と言われる。したがって、とりわけ、本開示は、本明細書において検討されおよび／または当該技術分野において公知である鉄過剰負荷または鉄欠乏と関連したものなどの鉄関連障害を有するまたは有するリスクがある対象に対してスクリーニングする方法を提供する。
【０２６６】
一般に、所定のレベルは、ヘプシジンについて試験試料をアッセイして得られた結果をどちらに評価するかに対するベンチマークとして用いることができる。一般に、このような比較を行う際に、所定のレベルは、分析物の存在、量または濃度が疾患、障害もしくは状態（例えば、本明細書において検討されおよび／または当該技術分野において公知である鉄過剰負荷または鉄欠乏と関連したものなどの鉄関連障害）の特定の段階もしくはエンドポイントまたは特定の臨床徴候とつながり得るまたは関連し得るように、適切な条件下で十分な回数の特定のアッセイを実行することによって得られる。典型的に、所定のレベルは、基準対象（または対象の集団）のアッセイを用いて得られる。測定されたヘプシジンは、その断片、その分解産物および／またはその酵素的切断産物を含み得る。
【０２６７】
特に、疾患の進行および／または治療をモニタリングするために使用される所定のレベルに関して、ヘプシジンの量または濃度は、「変化していない」、「好ましい」（または「好ましいように変化している」）または「好ましくない」（または「好ましくないように変化している」）可能性がある。「上昇している」または「増加している」は、典型的なもしくは正常なレベルもしくは範囲（例えば、所定のレベル）より高いまたは別の基準レベルもしくは範囲（例えば、初期のまたはベースライン試料）より高い、試験試料における量または濃度を表す。「低下している」または「低減している」という用語は、典型的なもしくは正常なレベルもしくは範囲（例えば、所定のレベル）より低いまたは別の基準レベルもしくは範囲（例えば、初期のまたはベースライン試料）より低い、試験試料における量または濃度を表す。用語「変化している」は、典型的なもしくは正常なレベルもしくは範囲（例えば、所定のレベル）を超えてまたは別の基準レベルもしくは範囲（例えば、初期のまたはベースライン試料）を超えて変化している（増加しているまたは減少している）、試料における量または濃度を表す。
【０２６８】
ヘプシジンの典型的なまたは正常なレベルまたは範囲は、標準的な慣習に従って定義される。いわゆる変化したレベルまたは変化は、典型的なもしくは正常なレベルもしくは範囲または基準レベルもしくは範囲と比較して（実験エラーまたは試料の変動によって説明することが不可能である）、いずれかの正味の変化が存在する場合に起こったと見なされ得る。したがって、特定の試料において測定されるレベルは、いわゆる正常な対象から得られた類似の試料において決定されたレベルまたはレベルの範囲と比較される。この状況において、「正常な対象」は、検出可能な疾患または障害を有さない個体であり、「正常な」（「対照」と称されることもある）患者または集団は、例えばそれぞれ検出可能な疾患または障害を示さないものである。「見かけ上正常な対象」は、ヘプシジンが評価されておらずまたは現在のところ評価中であるものである。分析物のレベルは、分析物が正常で検出不能である（例えば、正常レベルが０または正常集団の約２５から約７５パーセンタイルの範囲内である。）が、試験試料において検出されるときならびに分析物が試験試料中に正常レベルより高く存在するときに「上昇している」と言われる。したがって、とりわけ、本開示は、本明細書において検討されおよび／または当該技術分野において公知である鉄過剰負荷または鉄欠乏と関連したものなどの鉄関連障害を有するまたは有するリスクがある対象に対してスクリーニングする方法を提供する。
【０２６９】
アッセイの方法はまた、他のマーカーのアッセイおよび本明細書において検討されているものもしくは当該技術分野で公知のものを伴ってもよい。例えば、アッセイの方法は、例えば、ヘプシジン（上述される）、ネオゲニン、増殖分化因子１５（ＧＤＦ−１５）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）および／またはＢＭＰ−６のアッセイを含んでもよい。
【０２７０】
本明細書に記載されている方法はまた、対象が、本明細書において検討されて、当該技術分野において公知であるものなどの鉄関連障害を有するまたはそれを発症するリスクがあるか否かを決定するために使用することもできる。詳細には、このような方法は、
（ａ）本明細書に記載されている方法または当該技術分野において公知である方法を使用して、対象からの試験試料中のＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）の濃度または量を決定するステップ；および
（ｂ）ステップ（ａ）において決定されたＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）の濃度または量と所定のレベルとを比較するステップを含み、ここで、ステップ（ａ）において決定されたＲＧＭｃの濃度または量が所定のレベルに対して好ましい場合、対象は、本明細書において検討され、当該技術分野において公知である鉄関連障害を有さずまたはそのリスクがないと決定される。しかしながら、ステップ（ａ）において決定されたＲＧＭｃの濃度または量が所定のレベルに対して好ましくない場合、対象は、本明細書において検討され、当該技術分野において公知である鉄関連障害を有するまたはそのリスクがあると決定される。
【０２７１】
さらに、本明細書においては、対象における疾患の進行をモニタリングする方法が提供される。最適には、この方法は、
（ａ）対象からの試験試料中のＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）の濃度または量を決定するステップ；
（ｂ）対象から得られた後の試験試料におけるＲＧＭｃの濃度または量を決定するステップ；および
（ｃ）ステップ（ｂ）において決定されたＲＧＭｃの濃度または量をステップ（ａ）において決定されたＲＧＭｃの濃度または量と比較するステップを含み、ここで、ステップ（ｂ）において決定された濃度または量が、ステップ（ａ）において決定されたＲＧＭｃの濃度または量と比較して変化していないまたは好ましくない場合、対象における疾患は継続、進行または悪化していると決定される。比較すると、ステップ（ｂ）において決定されたＲＧＭｃの濃度または量が、ステップ（ａ）において決定されたＲＧＭｃの濃度または量と比較して好ましい場合、対象における疾患は消失、退行または改善していると決定される。
【０２７２】
場合により、この方法は、ステップ（ｂ）において決定されたＲＧＭｃの濃度または量を、例えば、所定のレベルと比較するステップをさらに含む。さらに、場合により、この方法は、比較が、ステップ（ｂ）において決定されたＲＧＭｃの濃度または量が、例えば、所定のレベルに対して好ましくないように変化していることを示す場合、１つ以上の医薬組成物で対象をある期間治療するステップを含む。
【０２７３】
なおさらに、この方法は、１つ以上の医薬組成物で治療を受けている対象において治療をモニタリングするために使用することができる。詳細には、このような方法は、対象が１つ以上の医薬組成物を投与される前に対象の第１の試験試料を提供することを含む。次に、対象からの第１の試験試料におけるＲＧＭｃの濃度または量は、（例えば、本明細書に記載されている方法または当該技術分野において公知の方法を用いて）決定される。ＲＧＭｃの濃度または量が決定された後、場合により、ＲＧＭｃの濃度または量は、次に所定のレベルと比較される。第１の試験試料において決定されたＲＧＭｃの濃度または量が所定のレベルより低い場合、対象は１つ以上の医薬組成物で治療されない。しかしながら、第１の試験試料において決定されたＲＧＭｃの濃度または量が所定のレベルより高い場合、対象は１つ以上の医薬組成物である期間治療される。対象が１つ以上の医薬組成物で治療される期間は、当業者によって決定され得る（例えば、その期間は約７日から約２年、好ましくは約１４日から約１年であってもよい。）。
【０２７４】
１つ以上の医薬組成物での治療の経過中、次に、第２およびその後の試験試料が対象から得られる。試験試料の番号および前記試験試料が対象から得られる時期は重要ではない。例えば、第２の試験試料は、対象が１つ以上の医薬組成物を最初に投与された７日後に得ることができ、第３の試験試料は、対象が１つ以上の医薬組成物を最初に投与された２週間後に得ることができ、第４の試験試料は、対象が１つ以上の医薬組成物を最初に投与された３週間後に得ることができ、第５の試験試料は、対象が１つ以上の医薬組成物を最初に投与された４週間後に得ることができるなどである。
【０２７５】
第２またはその後の試験試料のそれぞれが対象から得られた後、第２およびその後の試験試料において決定されるＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）の濃度または量が（例えば、本明細書に記載されている方法または当該技術分野において公知の方法を用いて）決定される。第２およびその後の試験試料のそれぞれにおいて決定されるＲＧＭｃの濃度または量は、次に、第１の試験試料（例えば、所定のレベルと元々場合により比較された試験試料）において決定されるＲＧＭｃの濃度または量と比較される。ステップ（ｃ）において決定されたＲＧＭｃの濃度または量が、ステップ（ａ）において決定されたＲＧＭｃの濃度または量と比較して好ましい場合、対象における疾患は消失、退行または改善していると決定され、対象はステップ（ｂ）の１つ以上の医薬組成物を投与され続けるべきである。しかしながら、ステップ（ｃ）において決定された濃度または量が、ステップ（ａ）において決定されたＲＧＭｃの濃度または量と比較して変化していないまたは好ましくない場合、対象における疾患は継続、進行または悪化していると決定され、対象はステップ（ｂ）において対象に投与されたより高い濃度の１つ以上の医薬組成物で治療されるべきでありまたは対象はステップ（ｂ）において対象に投与された１つ以上の医薬組成物と異なる１つ以上の医薬組成物で治療されるべきである。詳細には、対象は、対象が前記対象のＲＧＭｃレベルを減少または低下させるために以前に受けていた１つ以上の医薬組成物と異なる１つ以上の医薬組成物で治療することができる。
【０２７６】
一般に、反復試験が行われ得るアッセイ（例えば、疾患進行および／または治療に対する応答のモニタリング）の場合、第２およびその後の試験試料は、第１の試験試料が対象から得られた後のある時期に得られる。詳細には、対象の第２の試験試料は、第１の試験試料が対象から得られた数分、数時間、数日、数週間または数年後に得ることができる。例えば、第２の試験試料は、対象から第１の試験試料が得られた約１分、約５分、約１０分、約１５分、約３０分、約４５分、約６０分、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１１週間、約１２週間、約１３週間、約１４週間、約１５週間、約１６週間、約１７週間、約１８週間、約１９週間、約２０週間、約２１週間、約２２週間、約２３週間、約２４週間、約２５週間、約２６週間、約２７週間、約２８週間、約２９週間、約３０週間、約３１週間、約３２週間、約３３週間、約３４週間、約３５週間、約３６週間、約３７週間、約３８週間、約３９週間、約４０週間、約４１週間、約４２週間、約４３週間、約４４週間、約４５週間、約４６週間、約４７週間、約４８週間、約４９週間、約５０週間、約５１週間、約５２週間、約１．５年、約２年、約２．５年、約３．０年、約３．５年、約４．０年、約４．５年、約５．０年、約５．５年、約６．０年、約６．５年、約７．０年、約７．５年、約８．０年、約８．５年、約９．０年、約９．５年または約１０．０年後の時期に対象から得ることができる。疾患の進行をモニタリングするために使用するとき、上記のアッセイは、急性状態に罹患している対象における疾患の進行をモニタリングするために使用することができる。救急状態としても知られている急性状態は、例えば心血管系または排泄系が関与する、生命を脅かす急性の疾患または他の救急医学状態を指す。典型的に、救急状態は、病院を基礎とする設備（限定されないが、救急処置室、集中治療室、外傷センターまたは他の緊急医療設備が含まれる。）における急性の医学的介入または医療補助者もしくは他の分野を基礎とする医療関係者による管理を必要とする状態を指す。救急状態については、反復モニタリングは、一般に、短い時間枠内で、すなわち、数分、数時間または数日（例えば、約１分、約５分、約１０分、約１５分、約３０分、約４５分、約６０分、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、あるいは約７日）で行われ、同様に最初のアッセイは、一般に、短い時間枠内に、例えば、疾患または状態の発症の約数分、数時間または数日以内に行われる。
【０２７７】
アッセイはまた、慢性または非急性状態に罹患している対象における疾患の進行をモニタリングするために使用することもできる。非救急または非急性状態は、例えば心血管系および／または排泄系が関与する、生命を脅かす急性の疾患または他の救急医学状態以外の状態を指す。典型的に、非急性状態は、長期または慢性の持続期間の状態を含む。非救急状態については、反復モニタリングは、一般に、長い時間枠内で、例えば、数時間、数日、数週間、数カ月または数年（例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１１週間、約１２週間、約１３週間、約１４週間、約１５週間、約１６週間、約１７週間、約１８週間、約１９週間、約２０週間、約２１週間、約２２週間、約２３週間、約２４週間、約２５週間、約２６週間、約２７週間、約２８週間、約２９週間、約３０週間、約３１週間、約３２週間、約３３週間、約３４週間、約３５週間、約３６週間、約３７週間、約３８週間、約３９週間、約４０週間、約４１週間、約４２週間、約４３週間、約４４週間、約４５週間、約４６週間、約４７週間、約４８週間、約４９週間、約５０週間、約５１週間、約５２週間、約１．５年、約２年、約２．５年、約３．０年、約３．５年、約４．０年、約４．５年、約５．０年、約５．５年、約６．０年、約６．５年、約７．０年、約７．５年、約８．０年、約８．５年、約９．０年、約９．５年、あるいは約１０．０年）で行われ、同様に最初のアッセイは、一般に、長い時間枠内に、例えば、疾患または状態の発症の約数時間、数日、数週間、数カ月または数年以内に行われる。
【０２７８】
さらに、上記アッセイは、対象から得られた第１の試験試料を用いて行うことができ、第１の試験試料は、尿、血清または血漿などの１つの供給源から得られる。場合により、上記アッセイは、次に、対象から得られた第２の試験試料を用いて反復することができ、第２の試験試料は、別の供給源から得られる。例えば、第１の試験試料が尿から得られた場合、第２の試験試料は、血清または血漿から得ることができる。第１の試験試料および第２の試験試料を用いたアッセイから得られた結果は、比較することができる。この比較は、対象における疾患または状態の状況を評価するために使用することができる。
【０２７９】
さらに、本開示はまた、疾患（例えば、本明細書において検討され、当該技術分野において公知の鉄過剰負荷または鉄欠乏などの鉄関連障害）に罹患しやすいまたは罹患している対象にとって治療が有益であるかどうかを決定する方法に関する。特に、本開示は、ＲＧＭｃに伴う診断方法および製品に関する。従って、本明細書に記載されている「対象における疾患の治療をモニタリングする」ための方法はまた、さらに最適には、治療の候補、例えばエリスロポエチン（ＥＰＯ）を用いた治療を選択または同定することも包含し得る。
【０２８０】
従って、特定の実施形態において、本開示はまた、本明細書において検討され、当該技術分野において公知の鉄過剰負荷または鉄欠乏などの鉄関連障害を有するまたはこれらのリスクがある対象が治療の候補であるかどうかを決定する方法も提供する。一般に、対象は、該疾患のいくつかの症状を経験している者、またはこのような疾患を有するまたはそのリスクがあると現実に診断されている者および／または本明細書に記載されているＲＧＭｃもしくはその断片の好ましくない濃度もしくは量を示す者である。
【０２８１】
この方法は、場合により、本明細書に記載されているアッセイを含み、この場合、分析物は、１つ以上の医薬組成物を用いて（例えば、特にＲＧＭｃが関与する作用機序に関連する医薬品を用いて）、対象の治療の前後で評価され、または分析物は、このような治療後に評価され、分析物の濃度もしくは量が所定のレベルに対して比較される。治療後に観察される分析物の好ましくない濃度または量は、対象が、さらにまたは続けて治療を受けることが有益でないことを確認するが、一方、治療後に観察される分析物の好ましい濃度または量は、対象が、さらにまたは続けて治療を受けることが有益であることを確認する。この確認は、臨床研究の管理および改善された患者ケアの提供を支援する。
【０２８２】
鉄欠乏または鉄過剰負荷などの鉄関連障害を評価するために用いられるとき、本明細書における特定の実施形態は有利であるが、アッセイおよびキットはまた、場合により、必要に応じて、他の疾患、障害または状態においてＲＧＭｃを評価するために使用することができることは言うまでもない。
【０２８３】
アッセイの方法は、鉄欠乏または鉄過剰負荷などの鉄関連障害を軽減する化合物を同定するために使用することもできる。例えば、ＲＧＭｃを発現する細胞は、候補化合物と接触させることができる。化合物と接触した細胞におけるＲＧＭｃの発現のレベルは、本明細書に記載されているアッセイの方法を用いて、対照細胞におけるレベルと比較することができる。
【０２８４】
６．キット
本明細書において、先に本明細書に記載されている鉄関連障害を患っている対象を治療し、または鉄関連障害を有するものと対象を診断するために使用され得るキットが提供される。
【０２８５】
患者を治療するために使用されるキットは、ＲＧＭｃに特異的な抗体を含む。キットは、好ましくは、本明細書に記載されている抗体を用いて、対象を治療するための説明書を含む。キットに含まれる説明書は、梱包材に貼付されてもよく、または添付文書として含まれてもよい。説明書は、典型的には資料または印刷物であるが、それらに限定されない。このような説明書を保存し、エンドユーザーにこれらを伝えることができる任意の媒体は、この開示によって意図される。このような媒体には、限定されないが、電子記録媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ  ＲＯＭ）などが含まれる。本明細書で使用するとき、用語「説明書」は、指示を与えるインターネットサイトのアドレスを含むことができる。
【０２８６】
また、ＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）について試験試料をアッセイするためのキットが提供される。キットは、ＲＧＭｃについて試験試料をアッセイするための少なくとも１つの成分およびＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）について試験試料をアッセイするための説明書を含む。少なくとも１つの成分は、ＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）に特異的に結合する単離された抗体を含む少なくとも１つの組成物を含む。抗体は、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域および配列番号４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域および配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域および配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｉｖ）配列番号９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域および配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｖｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１２のアミノ酸を含むＣＤＲ２および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｒ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｓ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｔ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖を有してもよい。抗体は、場合により、検出可能に標識されている。
【０２８７】
場合により、抗体は、表２に示される配列から選択されるドメインまたは領域を有してもよい。例えば、抗体は、（ａ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｂ）配列番号３８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｃ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｄ）配列番号４０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｅ）配列番号４１のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｆ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｇ）配列番号４３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｈ）配列番号４４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｊ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｋ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｌ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｍ）配列番号４９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｎ）配列番号５０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｏ）配列番号５１のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｐ）配列番号５２のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｑ）配列番号５３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｒ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｓ）配列番号５５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｔ）配列番号５６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｕ）配列番号５７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｖ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｗ）配列番号５９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｘ）配列番号６０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｙ）配列番号６１のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｚ）配列番号６２のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ａａ）配列番号６３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｂｂ）配列番号６４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｃｃ）配列番号６５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｄｄ）配列番号６６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｅｅ）配列番号６７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｆｆ）配列番号６８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｇｇ）配列番号６９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｈｈ）配列番号７０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｊｊ）配列番号７２のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｋｋ）配列番号７３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｌｌ）配列番号７４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｍｍ）配列番号７５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｎｎ）配列番号７６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｏｏ）配列番号７７のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｐｐ）配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、または（ｑｑ）配列番号７７のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖を有してもよい。抗体は、場合により、検出可能に標識されている。
【０２８８】
例えば、キットは、イムノアッセイ、例えば、化学発光微粒子イムノアッセイによって、ＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）について試験試料をアッセイするための説明書を含むことができる。説明書は、紙形態またはディスク、ＣＤ、ＤＶＤなどのコンピュータ読み取り可能な形態であってもよい。抗体は、ＲＧＭｃ捕捉抗体および／またはＲＧＭｃ検出抗体であり得る。あるいはまたは加えて、キットは、較正物質または対照、例えば、精製され、場合により凍結乾燥されたＲＧＭｃ（例えば、膜結合性ＲＧＭｃペプチド、可溶性ＲＧＭｃペプチド、膜結合性ＲＧＭｃペプチドの断片、可溶性ＲＧＭｃの断片、ＲＧＭｃ（膜結合性または可溶性ＲＧＭｃ）の改変体またはこれらの任意の組み合わせ）を含むことができ、および／またはアッセイを行うための少なくとも１つの容器（例えば、管、マイクロタイタープレートまたはストリップを含むことができ、これらは、抗ＲＧＭｃモノクローナル抗体ですでに被覆され得て、および／またはアッセイ緩衝液もしくは洗浄緩衝液などの緩衝液を含むことができ、これらのいずれか１つは濃縮溶液として提供することができ、検出可能な標識（例えば、酵素標識）用の基質溶液または停止溶液を含み得る。好ましくは、キットは、アッセイを行うために必要なすべての成分、すなわち、試薬、標準物質、緩衝液、希釈液などを含む。また、説明書は、ＲＧＭｃを定量することを目的として、標準曲線または参考標準を生成するための指示を含むことができる。
【０２８９】
キットに提供される任意の抗体、例えば、ＲＧＭｃに特異的な組換え抗体は、蛍光体、放射性部分、酵素、ビオチン／アビジン標識、発色団、化学発光標識などの検出可能な標識を取り込むことができ、またはキットは、抗体を検出するための抗体または試薬（例えば、検出抗体）を標識するための試薬、および／または分析物を検出するための分析物または試薬を標識するための試薬を含むことができる。抗体、較正物質および／または対照は、別々の容器に入れて提供することができ、または適切なアッセイフォーマットに、例えば、マイクロタイタープレートに予め分注することができる。
【０２９０】
場合により、キットは、品質管理成分（例えば、感受性パネル、較正物質および陽性対照）を含む。品質管理試薬の調製は、当該技術分野において周知であり、様々な免疫診断製品のインサートシートに記載されている。感受性パネルのメンバーは、場合により、アッセイの性能特性を確立するために使用され、さらに場合により、イムノアッセイキット試薬の完全性およびアッセイの標準化の有用な指標となる。
【０２９１】
キットはまた、場合により、緩衝液、塩、酵素、酵素の補因子、基質、検出試薬などの、診断アッセイを行うまたは品質管理の評価を促進するために必要な他の試薬も含んでもよい。試験試料の単離および／または処理用の緩衝液および溶液（例えば、前処理試薬）などの他の成分もキットに含まれ得る。キットは１つ以上の他の対照をさらに含んでもよい。キットの１つ以上の成分は凍結乾燥させることができ、この場合、キットは、凍結乾燥された成分の再構成に適した試薬をさらに含み得る。
【０２９２】
キットの様々な成分は、場合により、必要に応じて適切な容器、例えばマイクロタイタープレートに入れて提供される。キットは、試料を保持または保存するための容器（例えば、血漿、血清または尿試料用の容器またはカートリッジ）をさらに含み得る。必要に応じて、キットはまた、場合により、試薬または試験試料の調製を促進する反応容器、混合容器および他の成分も含むことができる。キットはまた、シリンジ、ピペット、鉗子、計量スプーンなどの、試験試料を得ることを補助するための１つ以上の器具も含んでもよい。
【０２９３】
検出可能な標識が少なくとも１つのアクリジニウム化合物である場合、キットは、少なくとも１つのアクリジニウム−９−カルボキサミド、少なくとも１つのアクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルまたはこれらのいずれかの組み合わせを含んでもよい。検出可能な標識が少なくとも１つのアクリジニウム化合物である場合、キットはまた、過酸化水素源、例えば緩衝液、溶液および／または少なくとも１つの塩基性溶液も含み得る。所望により、キットは、磁気粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、足場分子、フィルム、ろ紙、ディスクまたはチップなどの固相を含むことができる。
【０２９４】
所望により、キットは、さらに、バイオマーカー、例えば、鉄欠乏または鉄過剰負荷などの鉄関連障害のバイオマーカーであり得る、別の分析物について試験試料をアッセイするために、１つ以上の成分を単独でまたはさらなる指示と併用して含むことができる。他の分析物の例として、限定されないが、ヘプシジン、ネオゲニン、増殖分化因子１５（ＧＤＦ−１５）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）および／またはＢＭＰ−６、ならびに本明細書において検討されている他の分析物およびバイオマーカーが挙げられる。ヘプシジンについて試験試料をアッセイするための１以上の成分は、ヘプシジン−２５の存在、量または濃度の決定を可能にすることが好ましい場合がある。試料、例えば、血清試料、血漿試料または尿試料は、ＴＯＦ−ＭＳおよび内部標準を用いてヘプシジン−２５についてアッセイされ得る。
【０２９５】
ａ．キットおよび方法の適合
本明細書に記載されているイムノアッセイによって試験試料におけるＲＧＭｃの濃度を決定するキット（またはその成分）ならびに方法は、例えば、米国特許第５，０８９，４２４号および第５，００６，３０９号に記載され、例えば、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）によってＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）として商業的に販売されている（固相が微粒子を含むものを含めて）様々な自動化システムおよび半自動化システムにおける使用に適合させることができる。
【０２９６】
非自動化システム（例えば、ＥＬＩＳＡ）と比較した自動化または半自動化システム間のいくつかの相違には、第１の特異的結合パートナー（例えば、分析物抗体または捕捉抗体）が付着している（サンドイッチ形成および分析物の反応性が影響され得る）基質、ならびに捕捉、検出および／または場合による任意の洗浄ステップの長さおよびタイミングが含まれる。ＥＬＩＳＡなどの非自動化フォーマットは、試料および捕捉試薬との比較的長いインキュベーション時間（例えば、約２時間）を必要とする場合があるが、自動化または半自動化フォーマット（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）およびいずれかの後継プラットフォーム、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、比較的短いインキュベーション時間（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）では約１８分）を有し得る。同様に、ＥＬＩＳＡなどの非自動化フォーマットは、比較的長いインキュベーション時間（例えば、約２時間）、連結試薬などの検出抗体をインキュベートし得るが、自動化または半自動化フォーマット（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）およびいずれかの後継プラットフォーム）は、比較的短いインキュベーション時間（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）およびいずれかの後継プラットフォームで約４分）を有し得る。
【０２９７】
Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能な他のプラットフォームには、限定されないが、ＡｘＳＹＭ（登録商標）、ＩＭｘ（登録商標）（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第５，２９４，４０４号を参照）、ＰＲＩＳＭ（登録商標）、ＥＩＡ（ビーズ）およびＱｕａｎｔｕｍ（商標）ＩＩならびに他のプラットフォームが含まれる。さらに、アッセイ、キットおよびキットの成分は、他のフォーマットにおいて、例えば、電気化学的または他の携帯もしくはポイントオブケアアッセイシステムで使用することが可能である。本開示は、例えば、サンドイッチイムノアッセイを行う商業的Ａｂｂｏｔｔ  Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）電気化学的イムノアッセイシステムに適用可能である。免疫センサーならびに単回使用試験装置におけるこれらの製造および操作方法は、例えば、米国特許第５，０６３，０８１号、米国特許出願公開第２００３／０１７０８８１号、米国特許出願公開第２００４／００１８５７７号、米国特許出願公開第２００５／００５４０７８号および米国特許出願公開第２００６／０１６０１６４号に記載され、これらは、それに関する教示について、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０２９８】
特に、Ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）システムへのアッセイの適合に関して、以下の構成が好ましい。金の電流測定用作用電極の対および銀−塩化銀基準電極を有する微細加工シリコンチップが製造される。作用電極の１つで、捕捉抗体が固定化されたポリスチレンビーズ（０．２ｍｍ径）が、電極上のパターン化されたポリビニルアルコールのポリマーコーティングに付着している。このチップは集まって、イムノアッセイに適した流体工学フォーマットを有するＩ−ＳＴＡＴ（登録商標）カートリッジになる。カートリッジの試料保持チャンバーの壁の一部に、アルカリホスファターゼ（または他の標識）で標識された検出抗体を含む層が存在する。ｐ−アミノフェノールリン酸を含む水性試薬がカートリッジの流体ポーチ内にある。
【０２９９】
操作の際に、ＲＧＭｃを含むと考えられる試料は、試験カートリッジの保持チャンバーに添加され、カートリッジはＩ−ＳＴＡＴ（登録商標）リーダーに挿入される。第２の抗体（検出抗体）を試料中に溶解した後、カートリッジ内のポンプエレメントが、チップを含む導管に試料を押し入れる。ここで、第１の捕捉抗体、ＲＧＭｃおよび標識された第２の検出抗体間のサンドイッチの形成を促進するために振動される。アッセイの最後から２番目のステップにおいて、流体がポーチから押し出され、導管に入ってチップの試料を洗浄し、廃棄チャンバーに入る。アッセイの最後のステップにおいて、アルカリホスファターゼ標識は、ｐ−アミノフェノールリン酸と反応してリン酸基を切断し、遊離したｐ−アミノフェノールを作用電極において電気化学的に酸化させる。測定された電流を基礎として、リーダーは、埋め込まれたアルゴリズムおよび工場で決定された較正曲線によって、試料における分析物ＲＧＭｃの量を計算することができる。
【０３００】
本明細書に記載されている方法およびキットは、イムノアッセイを実施するための他の試薬および方法を必然的に包含することはさらに言うまでもない。例えば、当該技術分野において公知であるような様々な緩衝液および／または例えば洗浄に、連結体希釈液、および／もしくは較正物質希釈液として使用されるように容易に調製されまたは最適化され得るような様々な緩衝液が包含される。例示的な連結体希釈液は、特定のキット（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）において使用され、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、塩、タンパク質遮断剤、抗微生物剤および洗浄剤を含むＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）連結体希釈液である。例示的な較正物質希釈液は、特定のキット（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）において使用され、ＭＥＳ、他の塩、タンパク質遮断剤および抗微生物剤を含む緩衝液を含むＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ヒト較正物質希釈液である。さらに、２００８年１２月３１日に出願された米国特許出願第６１／１４２，０４８号に記載されているように、改善されたシグナルの発生は、例えば、Ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）カートリッジフォーマットにおいて、シグナル増幅物質としてシグナル抗体に連結された核酸配列を使用して得ることができる。
【０３０１】
本発明は、以下の非限定的な実施例によって例証される複数の態様を有する。本明細書に記載された方法の他の適切な修飾および適合は明らかであり、本開示の範囲または本明細書に開示された実施形態から逸脱することなく、適切な均等物を用いて行われてもよいことは当業者に容易に明らかとなる。以下に本開示を詳細に説明したが、本開示は、以下の実施例を参照することによってより明確に理解される。実施例は、例証のためにだけ含まれ、請求される発明の範囲を限定することを意図しない。本明細書において言及されている全ての学術論文、米国特許および出願公開は、それぞれ個々の刊行物が参照により組み込まれ、具体的におよび個々に示されているのと同程度に、参照により全体として本明細書に組み込まれる。用いられた用語および表現は、説明の用語として用いられるものであって、限定の用語として用いられるものではない。この点に関して、特定の用語は、「定義」の下で定義され、それ以外の場合、「詳細な説明」における他の場所で定義、記載または検討され、全てのこのような定義、記載および検討は、このような用語に帰することが意図される。また、このような用語および表現の使用において、示されたおよび記載された特徴またはそれらの一部のいかなる均等物も除外することを意図するものでもない。さらに、小見出し、例えば「定義」が「詳細な説明」において使用されているが、このような使用は、参照を容易にするためのものに過ぎず、ある見出し内において行われた任意の開示をその見出しのみに限定することを意図するものではない；むしろ、１つの小見出しの下に為された任意の開示は、それぞれの全ての他の小見出し下における開示を構成することが意図される。
【実施例】
【０３０２】
［実施例１］
抗体の親和性成熟および結合特性を決定するための方法
配列アラインメントは、ＲＧＭＡ抗体ｈ５Ｆ９．２３は、ヒト生殖系列ＶＨ３−２３／ＪＨ３およびＡ１７／Ｊｋ２と最も高い同一性を共有することを示す（ｈ５Ｆ９親和性成熟設計文書の図を参照されたい）。ＲＧＭＡに対するｈ５Ｆ９．２３の親和性を改善させるために、超変異ＣＤＲ残基は、生殖系列ＶＨ３−２３およびＡ１７に対しても高い同一性を共有するＩｇＢＬＡＳＴデータベースにおける他のヒト抗体配列から同定された。次に、対応するｈ５Ｆ９．２３  ＣＤＲ残基は、表面提示に適したｓｃＦｖフォーマットにおける２つの抗体ライブラリーを作製するために、これらの位置での低い縮重を有するプライマーを用いたＰＣＲによって限定的突然変異誘発に供された。
【０３０３】
第１のライブラリーは、ＶＨ  ＣＤＲ１、２および３における残基３１、３５、５０、５２、５２ａ、５３、５５、５６、９５、９６、９７および１０２（カバット番号付け）での突然変異を含み；第２のライブラリーは、３つのＶＬ  ＣＤＲにおける残基２７ｃ、２７ｄ、３０、３４、５０、５３、８９、９１、９３、９４、９６および９７での突然変異を含んだ。さらに、ヒト生殖細胞系フレームワーク配列に対するｈＭＡＫ１９５の同一性を高めるために、ＶＨ位置３７（Ｖ／Ｉ）、４８（Ｖ／Ｉ）、４９（Ｓ／Ｇ）での二元縮重を第１のライブラリーに導入した。また、ＶＬ位置４（Ｍ／Ｌ）および４６（Ｒ／Ｌ）での二元縮重を第２のライブラリーに導入した。
【０３０４】
これらのｈ５Ｆ９．２３ライブラリーは細胞表面上に提示され、磁気、続く蛍光活性化細胞選別によって、低濃度のビオチン化されたＲＧＭＡに対して選択された。改善されたオン速度、オフ速度またはその両方について選択が行われ、親和性を調節したｈ５Ｆ９．２３クローンの抗体タンパク質配列は、さらなる特徴付けのためにｓｃＦｖからＩｇＧフォーマットに戻す変換のために回収された。これらは、親和性成熟したｈ５Ｆ９．２３抗体である。表１を参照されたい。
【０３０５】
１１個のｈ５Ｆ９．２３親和性成熟したクローンを２９３−６Ｅ細胞に発現させた。発現レベルを記録し、抗体をプロテインＡアフィニティーカラムによって精製した。Ｈ５Ｆ９親和性成熟した抗体は、ＳＥＣおよびＭＳ分析において良好な物理化学的性質を示した。
【０３０６】
親和性成熟したｈ５Ｆ９．２３親和性成熟した抗体の結合特性をｈＲＧＭａ間接ＥＬＩＳＡにおいて評価した。これは、抗ヒトＦｃを捕捉するＥＬＩＳＡである。簡潔には、０．２モル濃度の重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．４）中で抗ｈＦｃを希釈して０．５μｇ／ｍｌとし、ウェルあたり１００μｌで被覆し、室温にて２時間、プレートをインキュベートする。それぞれのウェルにＰＢＳ中の５％無脂肪乾燥乳の２００μｌを追加し、室温にて１時間ブロックする。プレートを洗浄後、二重にしてそれぞれのウェルに０．２μｇ／ｍｌの希釈した個々の抗体１００μｌを添加する。１時間室温にてインキュベートし、その後、プレートを洗浄する。１０ｎＭから０．００１ｎＭまでの６つの連続希釈したビオチンｈＲＧＭａの１００μｌをそれぞれのウェルに添加し、次に、室温にて１時間プレートをインキュベートした。洗浄後、１：１００００に希釈したＳＡ−ＨＲＰは、ウェルあたり１２０μｌであり、室温にて１５分間インキュベートした。最後に、プレートを洗浄後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カタログ番号００−２０２３  ロット番号４２５８２０Ａ）からのＴＭＢ基質の１２０μｌをそれぞれのウェルに添加し、発色のために５−１０分待った。２Ｎ硫酸の６０μｌを用いて反応を停止させる。４５０ｎｍでプレートを読み取り、データを回収して、データ分析を行う。本発明者らは、ＥＬＩＳＡのこのフォーマットにおいて、ヒトＲＧＭａに結合する親和性成熟したｈ５Ｆ９．２３抗体の結合をランク付けすることができた。ヒトＲＧＭｃの結合は、ヒトＲＧＭｃのフォーマットに起因したヒトＲＧＭｃダイレクトＥＬＩＳＡにおいて評価された。データは、ｈ５Ｆ９．２３  ＡＭ抗体が、ｈ５Ｆ９．２３親抗体と比較して、ヒトＲＧＭａとＲＧＭｃ結合を改善したことを結論付けた。
【０３０７】
［実施例２］
競合結合データ
表３と比較して、「（ａ）ＭＳＤ」は、ストレプトアビジン−スルホ−タグと複合化されたビオチン化ｈＲＧＭａ−Ｆｃの使用に対応し、細胞とともに室温にてインキュベートする。「ｂＨＣＳ」は、Ｃｙ３標識された抗Ｆｃ抗体と複合化されたｈＲＧＭａ−Ｆｃの使用に対応し、細胞とともに３７℃にてインキュベートする。
【０３０８】
【表４】
2020058359.tif 000021
2020058359.tif 000022
2020058359.tif 000023
【０３０９】
［実施例３］
ヒト化５Ｆ９．２３は健常ラットにおける鉄代謝に影響を与える
ラットにおける鉄代謝におけるｈ５Ｆ９．２３の影響を理解するために、様々なアッセイを行った。１用量あたり５匹の雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットが、４週間の期間、０、２０、６０または２００ｍｇ／ｋｇ／週のｈ５Ｆ９．２３で週１回、静脈内（ＩＶ）に処置された。最後の処置から７日後に動物を屠殺した。鉄代謝パラメータ（すなわち、遊離血清鉄、飽和トランスフェリン、不飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ））を含む臨床病理評価用の血液を採取し、病理組織学的検査のために臓器（肝臓、脾臓、脳、膵臓、心臓、腎臓）を固定した。具体的には、鉄代謝パラメータは（すなわち、遊離血清鉄、飽和トランスフェリン、不飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ））は、ＲＡＮＤＯＸ  Ｌａｂ、Ｌｔｄ．Ｃｒｕｍｌｉｎ、ＵＫから市販されている比色アッセイを用いて（鉄および総鉄結合能について）決定された。測定されたパラメータのイオンとＴＩＢＣを用いてＵＩＢＣを計算した。フェリチンは、コバスシステム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍＢＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に適合させた、社内の免疫濁度アッセイを用いて決定された。
【０３１０】
ラットは、動物行動、臨床徴候、食料消費、身体および臓器重量、血液学、血液凝固ならびに臨床化学のいずれの変化なしに、ｈ５Ｆ９による処置を寛容した。血清鉄レベル（図３）およびトランスフェリン飽和（図４および５）は用量依存的に増加し、不飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ）は用量依存的に減少した（図６）。
【０３１１】
ｈ５Ｆ９．２３は、０、２０、６０または２００ｍｇ／ｋｇのｉｖ注射によって、週１回処置されたラットの肝臓において、用量依存的な門脈周囲の鉄蓄積をもたらす。２００ｍｇ／ｋｇのｈ５Ｆ９を用いた４週ごとの処理後、肝細胞における鉄顆粒が蓄積し、プルシアンブルー染色を用いて実証することができる（図７と８を比較されたい）。これとは対照的に、脾臓におけるマクロファージの鉄貯蔵（図９、対照）は、２００ｍｇ／ｋｇの５Ｆ９を用いた４週ごとの処置後に軽減される。図１０を参照されたい。
【０３１２】
脾臓において、鉄を負荷したマクロファージは、リンパ濾胞間の赤い果肉に局在している（図９）。対照的に、２００ｍｇ／ｋｇ／週で処理された動物の脾臓におけるマクロファージは、ＲＧＭｃへの結合の結果として、血液中への鉄放出の増加に対して指示する、鉄蓄積の減少を示しまたは鉄蓄積を全く示さなかった（図１０）。
【０３１３】
［実施例４］
ＲＧＭｃを介したＢＭＰレポーターアッセイによるｈ５Ｆ９．２３親和性成熟したｍＡｂの特徴付け
ＲＧＭｃは、ＢＭＰ／Ｓｍａｄｌ／５／８シグナル伝達経路を介して、鉄調節ホルモンであるヘプシジンを制御する。ＢＭＰのための補助受容体として、膜結合ＲＧＭｃはＢＭＰシグナル伝達を強化する。ｈ５Ｆ９．２３親和性成熟したＡｂがＢＭＰ／Ｓｍａｄシグナル伝達をブロックするかどうかを試験するために、ＲＧＭｃを介したＢＭＰレポーターアッセイを開発した。
【０３１４】
ＢＭＰ反応性ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）レポーター構築物は、基本のレポーターベクターｐＧＬ４．２７［ｌｕｃ２Ｐ／ｍｉｎＰ／Ｈｙｇｒｏ］（Ｐｒｏｍｅｇａ）におけるｌｕｃ遺伝子の上流にＢＭＰ反応性エレメント（ＢＲＥ）（Ｋｏｒｃｈｙｎｓｋｙｉら、２００２）をクローニングすることによって構築された。ＲＧＭｃ  ＢＭＰレポーターアッセイにおいて、
２９３ＨＥＫ細胞は、１０ｃｍディッシュでＢＲＥ−ｌｕｃレポーターおよびｈＲＧＭｃを発現するベクターで一過性にトランスフェクトされ、２４時間後、ウェルあたり１０５個の細胞密度で９６ウェルプレートに播種された。２４時間のインキュベーション後、細胞は、６時間、１％ＦＢＳを含むＭＥＭ中で血清飢餓状態にし、続いて、連続希釈した試験Ａｂが添加された。さらに１６時間のインキュベーション後、細胞を溶解し、プロメガルシフェラーゼアッセイシステムを用いてｌｕｃ活性を測定した。
【０３１５】
結果を図１１に示す。ｈ５Ｆ９．２３親和性成熟したＡｂ（ＡＭ．４、８、９、１１）は、ｈ５Ｆ９．２３（ＩＣ５０＝１７ｎＭ）と比較して、ｈＲＧＭｃ活性のブロックにおいて非常に改善された効力を示した（ＩＣ５０＝０．３から１．４ｎＭの範囲の値）。効力データは親和性データと相関する（表５を参照されたい）。ヒトＲＧＭａ、ラットＲＧＭａおよびヒトＲＧＭｃに対するｈ５Ｆ９．２３親和性成熟したＡｂの親和性がＢＩＡｃｏｒｅ分析によって決定された（表５）。テストＡｂは、抗ｈＩｇＧ  Ｆｃ抗体を介してＣＭ５チップの表面に捕捉され、連続希釈された抗原を注射した。会合速度および解離速度は、それぞれ５および１０分間モニターされた。センサーグラムは、１：１のラングミュア結合モデルについて、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ４．０．１ソフトウェアを用いたグローバル分析によって適合された。平衡解離定数（ＫＤ）は、運動速度定数（オフ速度ｋｄとオン速度ｋａ）：ＫＤ＝ｋｄ／ｋａから計算された。
【０３１６】
【表５】
2020058359.tif 000024
【０３１７】
［実施例５］
サルにおける慢性疾患の貧血の治療におけるＲＧＭ  Ａ／ＣおよびＲＧＭ  Ｃ選択的抗体の使用
雌性カニクイザルは、４週間、週１回、静脈内に２０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇまたは皮下に６０ｍｇ／ｋｇのヒト化抗体５Ｆ９．２３（本明細書において先に検討されているように、米国特許出願公開第２０１０／００２８３４０号に開示され、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。）を投与された。２２日目、霊長類の血清は、抗体適用（４回目の投薬）後の０．５時間、４時間、２４時間で回収された。ヘプシジンレベルは、Ｋｒｏｏｔ，Ｊ．Ｊ．Ｃら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５７：１２：１６５０−１６６９（２０１１）およびＫｒｏｏｔ，Ｊ．Ｊ．Ｃら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、８７：９７７−９８３（２０１２）に記載されている飛行時間型質量分析法を用いて測定された。図１２に示されるように、ヒト化抗体５Ｆ９．２３（ｈ５Ｆ９．２３）は、用量依存的に血中ヘプシジンレベルを低下させる。
【０３１８】
［実施例６］
ラットにおける慢性疾患の貧血の治療におけるＲＧＭ  Ａ／ＣおよびＲＧＭ  Ｃ選択的抗体の使用
雌性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットは、４週間、週１回、静脈内に２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇのｈ５Ｆ９．ＡＭ８を投与された。４週間の処置期間後、血清が回収され、鉄パラメータ（すなわち、遊離血清鉄、飽和トランスフェリン、不飽和鉄結合能）が決定された。具体的には、鉄代謝パラメータは（すなわち、遊離血清鉄、飽和トランスフェリン、不飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ））は、ＲＡＮＤＯＸ  Ｌａｂ，Ｌｔｄ．Ｃｒｕｍｌｉｎ、ＵＫから市販されている比色アッセイを用いて（鉄および総鉄結合能について）決定された。測定されたパラメータのイオンとＴＩＢＣを用いてＵＩＢＣを計算した。トランスフェリンは、コバスシステム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍＢＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に適合させた、社内の免疫濁度アッセイを用いて決定された。図１３Ａおよび図１３Ｂに示されるように、抗体ＡＭ８は遊離鉄レベルを増加させ、不飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ）を減少させた。
【０３１９】
［実施例７］
ラットにおける慢性疾患の貧血の治療におけるＲＧＭ  Ａ／ＣおよびＲＧＭ  Ｃ選択的抗体の使用
雌性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットは、４週間、週１回、静脈内に０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇのｈ５Ｆ９．ＡＭ８を投与された。４週間の処置期間後、血清が回収され、鉄パラメータ（血清鉄、トランスフェリンおよびＵＩＢＣ）は、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙから市販されている比色アッセイを用いて（鉄およびＵＩＢＣについて）決定された。トランスフェリンは、コバスシステム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍＢＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上で免疫濁度アッセイを用いて決定された。０．２ｍｇ／ｋｇ／週で開始され、図１４Ａおよび図１４Ｂに示されるように、抗体ＡＭ８は遊離鉄レベルを増加させ、不飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ）を減少させた。０．０２ｍｇ／ｋｇ／週では、効果は観察されなかった。
【０３２０】
［実施例８］
ラットにおける慢性疾患の貧血（ＡＣＤ）の治療におけるＲＧＭ  Ａ／ＣおよびＲＧＭ  Ｃ選択的抗体の使用
本実施例において、Ｔｈｅｕｒｌら（Ｔｈｅｕｒｌら、Ｂｌｏｏｄ、１１８：４９７７−９４（２０１１））（その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。）に記載されているラット関節炎モデルが使用された。８−１０週齢の雌性Ｌｅｗｉｓラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｓｕｌｚｆｅｌｄから入手）は、標準的なげっ歯類の食餌（すなわち、Ａｌｔｒｏｍｉｎ、Ｌａｇｅ、Ｇｅｒｍａｎｙからの１８０ｍｇ鉄／ｋｇ、Ｃ１０００）で維持され、ペプチドグリカン−多糖断片（ＰＧ−ＡＰＳ）の腹腔内注射を受けた（Ｔｈｅｕｒｌら、上述、からの適用）。ラットは食物と水を自由に摂取し、制度および政府のガイドラインに従って、１２時間の明暗サイクルを行い、温度を２０℃±１℃で飼育された。雌性Ｌｅｗｉｓラットは、０．８５％生理食塩水に懸濁させたＡ群連鎖球菌ペプチドグリカン−多糖（ＰＧ−ＡＰＳ）（Ｌｅｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｒａｙｓｏｎ、ＧＡ）の単回腹腔内注射を用いて０日目に接種され、全投薬量は１５μｇラムノース／ｇ体重であった。ＰＧ−ＡＰＳ投与から３週間後、動物は、貧血の発症について試験され、同様のヘモグロブリンレベルを有する群に無作為化された。貧血を発症した（すなわち、基準値範囲から２ｇ／ｄＬ超の低下を示した）ラットは、貧血ＡＣＤラットとした。
【０３２１】
長期処置実験について、ＡＣＤラットは、下記を用いたＰＧ−ＡＰＳ投与後の２１日目に注射された：（ａ）２つの対照抗体のうちの１つは、すなわち、（ｉ）ＲＧＭ  Ａについて選択的であるヒト化モノクローナル抗体、または（ｉｉ）ヒトＩｇＧアイソタイプ（ｈＩｇＧ）対照抗体のいずれか；（ｂ）（ｉ）ヒト化抗体５Ｆ９．２３（ｈ５Ｆ９．２３；米国特許出願公開第２０１０／００２８３４０号に記載されている（その内容は参照により本明細書に組み込まれる。））；（ｉｉ）ＲＧＭ  ＡとＲＧＭ  Ｃの両方に選択的であるヒト化親和性成熟したモノクローナル抗体であるヒト化抗体５Ｆ９２３．ＡＭ８（ｈ５Ｆ９２３．ＡＭ８）；（ｉｉｉ）ＲＧＭ  Ｃに選択的であり、２０１１年１２月１４日に出願された米国特許出願第６１／５７０，４９９号および２０１１年１２月２０日に出願された米国特許出願第６１／５７８，１２２号（これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる。）に記載されているマウスモノクローナル抗体１Ａ−２９８９、のうちの１つの２０ｍｇ／ｋｇ（静脈内）２８日間（ｎ＝１０）；および（ｃ）ＢＭＰ受容体ＩおよびＩＩの小分子阻害剤であるドルソモルフィンの２ｍｇ／ｋｇ（腹腔内）２日毎（ｎ＝８）。
【０３２２】
処置期間を通じて、全５００μＬの血液は、全血球計算（ＣＢＣ）および血清鉄分析のために尾静脈の穿刺によって毎週回収された。ＣＢＣ分析は、Ｖｅｔ−ＡＢＣ動物血液カウンター（Ｓｃｉｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｖｉｅｒｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行われた。血清鉄は、市販の比色アッセイ（コバスシステム；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ）を用いて決定された。
【０３２３】
処置の２８日後（ＡＣＤ導入から４９日後）、全てのラットは安楽死され、組織は剖検、組織病理学、遺伝子発現およびタンパク質分析のために回収された。図１５に示すように、ｈ５Ｆ９２３．ＡＭ８および１Ａ−２９８９は、ヘモグロビンレベルを上げることによって、３０日目でＡＣＤ率において貧血を改善した。ドルソモルフィンは不活性であった。
【０３２４】
実験の第２セットにおいて、ｈＩｇＧ対照抗体、ｈ５Ｆ９．２３およびｈ５Ｆ９２３．ＡＭ８は、貧血ＡＣＤラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｓｕｌｚｆｅｌｄから入手）において試験された。ラットは、当該技術分野において公知であるヘプシジンアッセイ技術、例えば、Ｋｒｏｏｔ，Ｊ．Ｊ．Ｃら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５７：１２：１６５０−１６６９頁（２０１１）およびＫｒｏｏｔ，Ｊ．Ｊ．Ｃら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、８７：９７７−９８３頁（２０１２）において記載されているものを用いて決定された、２４日目の２ｇ／ｄＬ超でヘモグロビンレベルが減少した場合、貧血として分類された。２８週間、２０ｍｇ／ｋｇ抗体の週１回、静脈内処置から開始して、ヘモグロビンレベルは、４１日目、４７日目および５１日目に分析された。図１６Ａに示されるように、対照抗体ｈＩｇＧは、４１日目、４７日目および５１日目で貧血ラットの低ヘモグロビンレベルを有意に変化させない。図１６Ｂは、抗ＲＧＭａ１と呼ばれる、ＲＧＭ  Ａに選択的なヒト化モノクローナル抗体が、４１日目、４７日目および５１日目に貧血ラットの低ヘモグロビンレベルを有意に変化させないことを示す。図１６Ｃは、抗体ｈ５Ｆ９．ＡＭ８は、４１日目、４７日目および５１日目に貧血ラットの低ヘモグロビンレベル（Ｄ２４）を有意に増加させることを示す。図１６Ｄは、抗体ｈ５Ｆ９．２３は、４１日目、４７日目および５１日目に貧血ラットの低ヘモグロビンレベル（２４日目（Ｄ２４））を増加させることを示す。
【図１】
2020058359.tif 000025
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
2020058359.tif 000037
【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
2020058359.tif 000040
【図１５】
2020058359.tif 000041
【図１６Ａ】
2020058359.tif 000042
【図１６Ｂ】
2020058359.tif 000043
【図１６Ｃ】
2020058359.tif 000044
【図１６Ｄ】
2020058359.tif 000045
【配列表】
2020058359000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月27日(2019.12.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
反発性ガイダンス分子ｃ（Ｒｅｐｕｌｓｉｖｅ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃ）（「ＲＧＭｃ」）に結合する単離された抗体またはこの抗体断片であって、抗体が、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｅ）配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｇ）配列番号９のアミノ酸配列を含む可変重ドメイン領域、（ｈ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変軽ドメイン領域、（ｐ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｑ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｒ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｓ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｔ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｕ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｗ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｘ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸を含むＣＤＲ２および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｙ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｚ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖、ならびに（ａａ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変重鎖ならびに配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む可変軽鎖からなる群から選択されるドメインまたは領域を含む、単離された抗体またはこの抗体断片。