(57)【要約】【課題】非ヒト動物のＩＬ−４および／もしくはＩＬ−４Ｒα遺伝子が全体的または部分的にヒト化した、あるいはヒトまたはヒト化ＩＬ−４および／もしくはＩＬ−４Ｒαタンパク質をそれぞれコードする配列を含むヒトＩＬ−４および／もしくはＩＬ−４Ｒα遺伝子で置換された非ヒト動物（例えば齧歯類、例えばネズミ科の動物、例えばマウスまたはラット）を提供する。【解決手段】ヒト配列を含むＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードする核酸配列を含む非ヒト動物；全体的または部分的にヒト型であるＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒα遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト動物；ヒトまたはヒト化ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する非ヒト動物；内因性非ヒト動物ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒα遺伝子の置換（全体的または部分的）を有する非ヒト動物が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
三重にヒト化したマウスであって、
（ｉ）ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子を形成するための、内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座における、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子のヒトゲノムＤＮＡによる、マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子のゲノムＤＮＡの置換であって、前記マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子の前記ゲノムＤＮＡが、前記マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子のエクソン１のＡＴＧ開始コドンからエクソン５までを含み、前記ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子の前記ヒトゲノムＤＮＡが、前記ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子のエクソン１のＡＴＧ開始コドンからエクソン５までを含み、前記ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子が、前記ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子のエクソン１のＡＴＧ開始コドンからエクソン５までと、前記マウスＩＬ−４α遺伝子のエクソン６から９までを含み、前記ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子の発現が、前記内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座におけるマウスＩＬ−４Ｒαプロモーターの制御下にある、置換；
（ｉｉ）ヒト化ＩＬ−４遺伝子を形成するための、内因性マウスＩＬ−４遺伝子座における、ヒトＩＬ−４遺伝子のゲノムＤＮＡによる、マウスＩＬ−４遺伝子のゲノムＤＮＡの置換であって、前記マウスＩＬ−４遺伝子の前記ゲノムＤＮＡが、前記マウスＩＬ−４遺伝子のエクソン１のＡＴＧ開始コドンからエクソン４までを含み、前記ヒトＩＬ−４遺伝子の前記ゲノムＤＮＡが、前記ヒトＩＬ−４遺伝子のエクソン１のＡＴＧ開始コドンからエクソン４までを含み、前記ヒト化ＩＬ−４遺伝子の発現が、前記内因性マウスＩＬ−４遺伝子座におけるマウスＩＬ−４プロモーターの制御下にある、置換；および
（ｉｉｉ）内因性マウスＩＬ−３３遺伝子座における、前記遺伝子座がマウスＩＬ−３３ではなくヒトＩＬ−３３をコードするようになる、ヒトＩＬ−３３遺伝子のゲノムＤＮＡによる、マウスＩＬ−３３遺伝子のゲノムＤＮＡの置換
を含む、マウス。
【請求項２】
置き換わる前記内因性マウスＩＬ−３３遺伝子座において、前記マウスＩＬ−３３遺伝子の前記ゲノムＤＮＡが、前記マウスＩＬ−３３遺伝子のエクソン２のＡＴＧ開始コドンからエクソン８の終止コドンまでを含み、前記ヒトＩＬ−３３遺伝子の前記ゲノムＤＮＡが、前記ヒトＩＬ−３３遺伝子のエクソン２のＡＴＧ開始コドンからエクソン８までを含む、請求項１に記載のマウス。
【請求項３】
前記マウスが、マウスＩＬ−４Ｒαタンパク質、マウスＩＬ−４タンパク質およびマウスＩＬ−３３タンパク質を発現する能力を有しないマウスである、請求項１に記載のマウス。
【請求項４】
前記マウスが、マウスＩＬ−４Ｒαタンパク質、マウスＩＬ−４タンパク質およびマウスＩＬ−３３タンパク質を発現する能力を有しないマウスである、請求項２に記載のマウス。
【請求項５】
マウス胚性幹細胞であって、
（ｉ）ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子を形成するための、内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座における、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子のヒトゲノムＤＮＡによる、マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子のゲノムＤＮＡの置換であって、前記マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子の前記ゲノムＤＮＡが、前記マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子のエクソン１のＡＴＧ開始コドンからエクソン５までを含み、前記ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子の前記ヒトゲノムＤＮＡが、前記ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子のエクソン１のＡＴＧ開始コドンからエクソン５までを含み、前記ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子が、前記ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子のエクソン１のＡＴＧ開始コドンからエクソン５までと、前記マウスＩＬ−４α遺伝子のエクソン６から９までを含み、前記ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子の発現が、前記内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座におけるマウスＩＬ−４Ｒαプロモーターの制御下にある、置換；
（ｉｉ）ヒト化ＩＬ−４遺伝子を形成するための、内因性マウスＩＬ−４遺伝子座における、ヒトＩＬ−４遺伝子のゲノムＤＮＡによる、マウスＩＬ−４遺伝子のゲノムＤＮＡの置換であって、前記マウスＩＬ−４遺伝子の前記ゲノムＤＮＡが、前記マウスＩＬ−４遺伝子のエクソン１のＡＴＧ開始コドンからエクソン４までを含み、前記ヒトＩＬ−４遺伝子の前記ゲノムＤＮＡが、前記ヒトＩＬ−４遺伝子のエクソン１のＡＴＧ開始コドンからエクソン４までを含み、前記ヒト化ＩＬ−４遺伝子の発現が、前記内因性マウスＩＬ−４遺伝子座におけるマウスＩＬ−４プロモーターの制御下にある、置換；および
（ｉｉｉ）内因性マウスＩＬ−３３遺伝子座における、前記遺伝子座がマウスＩＬ−３３ではなくヒトＩＬ−３３をコードするようになる、ヒトＩＬ−３３遺伝子のゲノムＤＮＡによる、マウスＩＬ−３３遺伝子のゲノムＤＮＡの置換
を含む、マウス胚性幹細胞。
【請求項６】
請求項５に記載のマウス胚性幹細胞を含む、マウス胚。
【請求項７】
請求項１に記載のマウスを提供することと、
前記マウスに、候補ヒトＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬と、候補ヒトＩＬ−３３拮抗薬とを投与することと、
前記候補ヒトＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬、および、前記候補ヒトＩＬ−３３拮抗薬の薬力学プロファイルを評価することと
を含む、方法。
【請求項８】
置き換わる前記内因性マウスＩＬ−３３遺伝子座において、前記マウスＩＬ−３３遺伝子の前記ゲノムＤＮＡが、前記マウスＩＬ−３３遺伝子のエクソン２のＡＴＧ開始コドンからエクソン８の終止コドンまでを含み、前記ヒトＩＬ−３３遺伝子の前記ゲノムＤＮＡが、前記ヒトＩＬ−３３遺伝子のエクソン２のＡＴＧ開始コドンからエクソン８までを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記マウスが、マウスＩＬ−４Ｒαタンパク質、マウスＩＬ−４タンパク質およびマウスＩＬ−３３タンパク質を発現する能力を有しないマウスである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記候補ヒトＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬が、ヒトＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒαに特異的な抗体であり、前記候補ヒトＩＬ−３３拮抗薬が、ヒトＩＬ−３３に特異的な抗体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のマウスを提供することと、
前記マウスにおいて炎症状態を誘発することと、
前記マウスに、候補ヒトＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬と、候補ヒトＩＬ−３３拮抗薬とを投与することと、
前記投与によって前記炎症状態が低減するかどうかを判定することと
を含む、方法。
【請求項１２】
置換される前記内因性マウスＩＬ−３３遺伝子座において、前記マウスＩＬ−３３遺伝子の前記ゲノムＤＮＡが、前記マウスＩＬ−３３遺伝子のエクソン２のＡＴＧ開始コドンからエクソン８の終止コドンまでを含み、前記ヒトＩＬ−３３遺伝子の前記ゲノムＤＮＡが、前記ヒトＩＬ−３３遺伝子のエクソン２のＡＴＧ開始コドンからエクソン８までを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記マウスが、マウスＩＬ−４Ｒαタンパク質、マウスＩＬ−４タンパク質およびマウスＩＬ−３３タンパク質を発現する能力を有しないマウスである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記候補ヒトＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬が、ヒトＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒαに特異的な抗体であり、前記候補ヒトＩＬ−３３拮抗薬が、ヒトＩＬ−３３に特異的な抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
誘発される前記炎症状態が肺の炎症である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記肺の炎症の程度が、（ａ）気道内の粘液貯留、（ｂ）気管支肺胞洗浄液中の好酸球性浸潤細胞、（ｃ）総循環ＩｇＥ、または、（ｄ）これらの任意の組み合わせを測定することによって判定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
誘発される前記炎症状態が皮膚炎症である、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年５月７日出願の米国仮特許出願第６１／９８９，７５７号の優先権の利益を主張するものであり、当該仮特許出願の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の参照による組み込み
２０１５年５月７日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して米国特許商標庁に提出された３１２６０＿ＳＥＱ．ｔｘｔという名称の１６ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルの形態をとる配列表が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
ヒト配列を含むＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードする核酸配列を含む非ヒト動物が本明細書に開示されている。全体的または部分的にヒト型であるＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒα遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト動物も本明細書に開示されている。ヒトまたはヒト化ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する非ヒト動物も開示されている。さらに、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒα核酸配列を含む非ヒト動物を作成・使用するための方法が開示されている。
【背景技術】
【０００４】
ＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒαは、異常な２型ヘルパーＴ（Ｔｈ２）細胞と関連する様々なヒトの疾患、障害、および状態を処置するための治療標的である。ヒトＩＬ−４またはヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質を特異的に標的とする治療用分子の薬物動態学（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）の評価は、非ヒト動物、例えば、齧歯類（例えば、マウスまたはラット）で日常的に遂行されている。しかしながら、ある特定の非ヒト動物では、これらの治療用分子は内因性ＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒαタンパク質を標的としないため、かかる治療用分子のＰＤを適正に判定することができない。
【０００５】
さらに、異常なＴｈ２細胞と関連する疾患の様々な非ヒト動物モデルを使用する、ヒト特異的なＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒαタンパク質拮抗薬の治療有効性の評価は、かかる種特異的な拮抗薬が内因性ＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒαタンパク質と相互作用しない非ヒト動物では問題がある。
【０００６】
したがって、非ヒト動物のＩＬ−４および／もしくはＩＬ−４Ｒα遺伝子が全体的または部分的にヒト化した、あるいはヒトまたはヒト化ＩＬ−４および／もしくはＩＬ−４Ｒαタンパク質をそれぞれコードする配列を含むヒトＩＬ−４および／もしくはＩＬ−４Ｒα遺伝子で（例えば、内因性非ヒト遺伝子座において）置換された非ヒト動物（例えば齧歯類、例えばネズミ科の動物、例えばマウスまたはラット）に対するニーズがある。
【０００７】
ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒ遺伝子が非ヒト調節エレメント（例えば、内因性調節エレメント）の制御下にある、ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒα遺伝子（例えば、ヒト化したもの、またはヒトのもの）を含む非ヒト動物に対するニーズもある。
【０００８】
機能性ＩＬ−４タンパク質を発現するがヒトまたはヒト化ＩＬ−４遺伝子を含まない同齢の非ヒト動物の血液、血漿、または血清中に存在するＩＬ−４タンパク質の濃度と類似した濃度にてヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を血液、血漿、または血清中に発現する、かつ／あるいは、機能性ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現するがヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子を含まない同齢の非ヒト動物の免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）上のＩＬ−４Ｒαタンパク質のレベルと類似したレベルにてヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）上に発現する、ヒト化した非ヒト動物に対するニーズもある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ヒト配列を含むＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードする核酸配列を含む非ヒト動物が提供される。
【００１０】
全体的または部分的にヒト型であるＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒα遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト動物が提供される。
【００１１】
ヒトまたはヒト化ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する非ヒト動物が提供される。
【００１２】
内因性非ヒト動物ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒα遺伝子の置換（全体的または部分的）を有する非ヒト動物が提供される。
【００１３】
ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαのヒト化（全体的または部分的）を内因性非ヒトＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒα遺伝子座において含む非ヒト動物が提供される。
【００１４】
ヒトまたはヒト化ＩＬ−４遺伝子を有する非ヒト動物が提供され、この非ヒト動物は内因性ＩＬ−４タンパク質を発現せず、かつこの非ヒト動物は、機能性内因性ＩＬ−４タンパク質を発現するがヒトまたはヒト化ＩＬ−４遺伝子を含まない同齢の非ヒト動物の血液、血漿、または血清中に存在するＩＬ−４タンパク質の濃度と類似した濃度にてヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を血液、血漿、または血清中に発現する。
【００１５】
ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子を有する非ヒト動物が提供され、この非ヒト動物は内因性ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現せず、かつこの非ヒト動物は、機能性内因性ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現するがヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子を含まない同齢の非ヒト動物の免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）上に存在するＩＬ−４Ｒαタンパク質のレベルと類似したレベルにてヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）上に発現する。
【００１６】
一態様では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒα核酸配列を含む非ヒト動物が提供される。
【００１７】
一態様では、内因性ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒα遺伝子座における内因性ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαをコードする遺伝子の、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードする遺伝子による置換を含む遺伝子改変非ヒト動物が提供される。内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子座における内因性ＩＬ−４遺伝子の、ヒトＩＬ−４遺伝子による置換を含む、および／または内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座における内因性ＩＬ−４Ｒα遺伝子の、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子による置換を含む、齧歯類（例えば、マウスまたはラット）が提供される。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００１８】
一態様では、内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子のヒト化を含む遺伝子改変齧歯類（例えば、マウスまたはラット）が提供され、このヒト化は、改変されたＩＬ−４遺伝子を形成するための、内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子座における、ヒトＩＬ−４遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含む核酸配列による齧歯類ＩＬ−４遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含む齧歯類核酸の置換を含み、改変されたＩＬ−４遺伝子の発現は内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子座の齧歯類調節エレメントの制御下にある。
【００１９】
一実施形態では、齧歯類はマウスまたはラットである。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００２０】
一実施形態では、改変されたＩＬ−４遺伝子は、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質をコードし、ヒトＩＬ−４遺伝子のＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン４までを含む。
【００２１】
一実施形態では、齧歯類は、マウスＩＬ−４タンパク質を発現する能力を有しないマウスである。
【００２２】
一実施形態では、齧歯類は、内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子によってコードされたマウスＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現するマウスである。
【００２３】
一実施形態では、齧歯類は、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現するマウスである。
【００２４】
一実施形態では、ヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質はヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質の細胞外ドメインを含む。
【００２５】
一実施形態では、ヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質はマウスＩＬ−４Ｒαタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。
【００２６】
一実施形態では、齧歯類は、改変されたＩＬ−４Ｒα遺伝子を形成するための、内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座における、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含む核酸配列によるマウスＩＬ−４Ｒα遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含むマウス核酸の置換を含むマウスであり、改変されたＩＬ−４Ｒα遺伝子の発現は内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座のマウス調節エレメントの制御下にある。
【００２７】
一実施形態では、齧歯類はマウスであり、マウスＩＬ−４のＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン４までを含むマウスＩＬ−４配列の連続ゲノム断片（contiguous  genomic  fragment）が、ヒトＩＬ−４のＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン４までを含むヒトＩＬ−４配列の連続ゲノム断片で置換されている。
【００２８】
一実施形態では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードする改変されたＩＬ−４Ｒα遺伝子の発現は、内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座のマウス調節エレメントの制御下にある。
【００２９】
一態様では、内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子のヒト化を含む遺伝子改変齧歯類（例えば、マウスまたはラット）が提供され、このヒト化は、改変された（すなわち、ヒト化した）ＩＬ−４Ｒα遺伝子を形成するための、内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座における、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子の少なくとも１つのエクソンをコードする核酸配列による齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子のエクソンを含む齧歯類核酸の置換を含み、改変されたヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子の発現は、内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座の齧歯類調節エレメントの制御下にある。
【００３０】
一実施形態では、齧歯類はマウスまたはラットである。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００３１】
一実施形態では、改変されたＩＬ−４Ｒα遺伝子は、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードし、かつヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子のＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン５までを含む。
【００３２】
一実施形態では、齧歯類は、マウスＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する能力を有しないマウスである。
【００３３】
一実施形態では、齧歯類は、内因性マウスＩＬ−４遺伝子によってコードされたマウスＩＬ−４タンパク質を発現するマウスである。
【００３４】
一実施形態では、齧歯類はヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を発現するマウスである。
【００３５】
一実施形態では、齧歯類は、改変されたＩＬ−４遺伝子を形成するための、内因性マウスＩＬ−４遺伝子座における、ヒトＩＬ−４遺伝子の少なくとも１つのエクソンをコードする核酸配列によるマウスＩＬ−４遺伝子のエクソンを含むマウス核酸の置換を含むマウスであり、改変されたＩＬ−４遺伝子の発現は、内因性マウスＩＬ−４遺伝子座のマウス調節エレメントの制御下にある。
【００３６】
一実施形態では、齧歯類はマウスであり、かつＩＬ−４ＲαのＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン５までを含むマウスＩＬ−４Ｒα配列の連続ゲノム断片が、ヒトＩＬ−４ＲαのＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン５までを含むヒトＩＬ−４Ｒα配列の連続ゲノム断片で置換されている。
【００３７】
一態様では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を発現する遺伝子改変齧歯類（例えば、マウスまたはラット）が提供され、ここで、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を発現する齧歯類は正常な免疫系を含む、すなわちヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を発現する齧歯類の血液、血漿、または血清中の免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）の数が、機能性内因性ＩＬ−４タンパク質を発現する齧歯類の血液、血漿、または血清中の免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）の数と類似している。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００３８】
一態様では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４遺伝子由来のＩＬ−４タンパク質を発現する遺伝子改変齧歯類（例えば、マウスまたはラット）が提供され、齧歯類はその血清中にヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を発現する。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００３９】
一実施形態では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を発現する齧歯類の血清は、機能性内因性ＩＬ−４タンパク質を発現する齧歯類（例えば、野生型のマウスまたはラット）とほぼ同じレベルのＩＬ−４タンパク質を有する。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００４０】
一実施形態では、マウスは血清中にヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を、機能性内因性ＩＬ−４タンパク質を発現するが内因性マウスＩＬ−４遺伝子座における内因性ＩＬ−４遺伝子のヒトＩＬ−４遺伝子による置換を含まない同齢のマウスの血清中に存在するＩＬ−４タンパク質のレベルの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、または２００％の濃度で発現する。
【００４１】
一実施形態では、マウスは血清中にヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を、機能性内因性ＩＬ−４タンパク質を発現するが内因性マウスＩＬ−４遺伝子座における内因性ＩＬ−４遺伝子のヒトＩＬ−４遺伝子による置換を含まない同齢のマウスの血清中に存在するマウスＩＬ−４タンパク質のレベルの約１０％〜約２００％、約２０％〜約１５０％、または約３０％〜約１００％の濃度で発現する。
【００４２】
一態様では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する遺伝子改変齧歯類（例えば、マウスまたはラット）が提供され、齧歯類は、機能性内因性ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する同齢の齧歯類の免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）上に存在するＩＬ−４Ｒαタンパク質のレベルと類似したレベルで、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）上にヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００４３】
一態様では、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子由来のＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する遺伝子改変齧歯類（例えば、マウスまたはラット）が提供され、齧歯類はヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）上に発現する。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００４４】
一実施形態では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する齧歯類の免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）は、ほぼ同じレベルのＩＬ−４Ｒαタンパク質を、機能性内因性ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する齧歯類（例えば、野生型のマウスまたはラット）の免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）上に有する。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００４５】
一実施形態では、マウスはヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）上に、機能性内因性ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現するが内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座における内因性ＩＬ−４Ｒα遺伝子のヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子による置換を含まない同齢のマウスの免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）上のＩＬ−４Ｒαタンパク質の量の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、または２００％の量で発現する。
【００４６】
一実施形態では、マウスはヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）上に、機能性内因性ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現するが内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座における内因性ＩＬ−４Ｒα遺伝子のヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子による置換を含まない同齢のマウスの免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）上に存在するマウスＩＬ−４Ｒαタンパク質の量の約１０％〜約２００％、約２０％〜約１５０％、または約３０％〜約１００％の量で発現する。
【００４７】
一態様では、齧歯類ＩＬ−４Ｒα細胞外ドメインコード配列のヒトＩＬ−４Ｒα細胞外ドメインコード配列による置換を含むヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子を含む遺伝子改変齧歯類が提供され、ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子は齧歯類ＩＬ−４Ｒα膜貫通配列および齧歯類ＩＬ−４Ｒα細胞質配列を含み、ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子は内因性ＩＬ−４Ｒα遺伝子座の内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα調節エレメントの制御下にあり、かつ齧歯類は、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質をコードするヒト化ＩＬ−４遺伝子をさらに含み、ヒト化ＩＬ−４遺伝子は内因性ＩＬ−４遺伝子座の内因性齧歯類ＩＬ−４調節エレメントの制御下にある。
【００４８】
一実施形態では、齧歯類はマウスまたはラットである。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００４９】
一実施形態では、マウスは、マウスＩＬ−４タンパク質を発現する能力を有さず、かつマウスＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する能力を有しない。
【００５０】
一実施形態では、内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子座および／または齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座の齧歯類調節エレメントまたは配列は、マウスまたはラット由来である。
【００５１】
一実施形態では、齧歯類調節エレメントまたは配列は、齧歯類ＩＬ−４遺伝子座および／または齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座の内因性齧歯類調節エレメントまたは配列である。
【００５２】
一態様では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラット）が提供され、非ヒト動物は内因性非ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子座および／または内因性非ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子座からヒトまたはヒト化ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する。一実施形態では、非ヒト動物は齧歯類である。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００５３】
一態様では、内因性マウスＩＬ−４遺伝子座からヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を発現する遺伝子改変マウスが提供され、内因性マウスＩＬ−４遺伝子は全体的または部分的に、ヒトＩＬ−４遺伝子で置換されている。
【００５４】
一実施形態では、ＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン４まで（３’非翻訳領域を含む）およびエクソン４の下流の３’領域の一部分を含む、内因性マウスＩＬ−４遺伝子座の約６．３ｋｂの連続マウスゲノム核酸が除去され、ヒトＩＬ−４遺伝子のＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン４まで（３’非翻訳領域を含む）およびエクソン４の下流の３’領域の一部分を含む約８．８ｋｂのヒトＩＬ−４核酸配列で置換される。特定の実施形態では、マウスゲノム核酸と置き換わるヒトＩＬ−４核酸配列は、ヒトＢＡＣ  ＲＰ１１−１７Ｋ１９のヒトＩＬ−４遺伝子のＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン４までおよびエクソン４の下流の３’領域の一部分を含む。特定の実施形態では、改変されたＩＬ−４遺伝子は、マウスＩＬ−４  ５’調節エレメント、およびＡＴＧ開始コドンから開始するヒトＩＬ−４エクソン１からエクソン４まで（すなわち、ＩＬ−４タンパク質コード配列）を含む。
【００５５】
一態様では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変マウスが提供され、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質をコードするヌクレオチド配列は全体的または部分的に、内因性マウスＩＬ−４タンパク質をコードする内因性ヌクレオチド配列と置き換わる。
【００５６】
一態様では、内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座からヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する遺伝子改変マウスが提供され、内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子は全体的または部分的に、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子で置換されている。
【００５７】
一実施形態では、ＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン５までおよびイントロン５の一部分を含む、内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座の約７．１ｋｂの連続マウスゲノム核酸が除去され、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子のＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン５までおよびイントロン５の一部分を含む約１５．６ｋｂのヒトＩＬ−４Ｒα核酸配列で置換される。特定の実施形態では、マウスゲノム核酸と置き換わるヒトＩＬ−４α核酸は、ヒトＢＡＣ  ＲＰ１１−１６Ｅ２４のヒトＩＬ−４α遺伝子のＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン５までおよびイントロン５の一部分を含む。特定の実施形態では、マウスゲノム核酸と置き換わるヒトＩＬ−４Ｒα核酸は、ヒトＩＬ−４Ｒα細胞外ドメインコード配列全体を含む。
【００５８】
一態様では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質をコードする改変されたヒト化ＩＬ−４遺伝子を形成するために、齧歯類ＩＬ−４タンパク質をコードする齧歯類ＩＬ−４遺伝子配列をヒトＩＬ−４遺伝子配列の１つ以上のエクソンを含むヒトＩＬ−４核酸配列で置換することを含む、ヒト化ＩＬ−４齧歯類を作製するための方法が提供され、ここで、置換は内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子座においてなされ、ヒトＩＬ−４遺伝子配列の１つ以上のエクソンを含むヒト化ＩＬ−４遺伝子配列であってヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質をコードするヒト化ＩＬ−４遺伝子配列は、内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子座の齧歯類調節エレメントまたは配列（例えば、５’および／または３’調節エレメント）に作動可能に連結される。
【００５９】
一実施形態では、齧歯類はマウスまたはラットである。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００６０】
一実施形態では、齧歯類調節エレメントまたは配列はマウス由来である。一実施形態では、齧歯類調節エレメントまたは配列はラット由来である。
【００６１】
一実施形態では、齧歯類調節エレメントまたは配列は、齧歯類ＩＬ−４遺伝子座の内因性齧歯類調節エレメントまたは配列である。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００６２】
一実施形態では、齧歯類ＩＬ−４遺伝子配列と置き換わるヒトＩＬ−４核酸配列は、ヒトＩＬ−４遺伝子配列の少なくとも１つのエクソンを含む。他の実施形態では、齧歯類ＩＬ−４遺伝子配列と置き換わるヒトＩＬ−４核酸配列は、ヒトＩＬ−４遺伝子配列の少なくとも２つまたは少なくとも３つのエクソンを含む。一実施形態では、齧歯類ＩＬ−４遺伝子配列と置き換わるヒトＩＬ−４核酸配列は、ヒトＩＬ−４遺伝子配列の４つのエクソンを全て含む。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００６３】
一実施形態では、齧歯類ＩＬ−４遺伝子配列と置き換わるヒトＩＬ−４核酸配列は、ヒトＩＬ−４（例えば、GenBank  Accession  No.  NM_000589.3sで示される核酸によってコードされるヒトＩＬ−４タンパク質）と約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または約９９％同一であるタンパク質をコードする。
【００６４】
一実施形態では、置換は内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子座においてなされ、ヒトＩＬ−４遺伝子配列の１つ以上のエクソンを含むヒト化ＩＬ−４遺伝子配列であってヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質をコードするヒト化ＩＬ−４遺伝子配列は、内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子座の内因性齧歯類調節エレメントまたは配列（例えば、５’および／または３’調節エレメント）に作動可能に連結される。
【００６５】
一態様では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質をコードする改変されたヒト化ＩＬ−４遺伝子を形成するために、マウスＩＬ−４タンパク質をコードするマウスＩＬ−４遺伝子配列をヒトＩＬ−４遺伝子配列で置換することを含む、ヒト化ＩＬ−４マウスを作製するための方法が提供される。
【００６６】
一実施形態では、置換は内因性マウスＩＬ−４遺伝子座においてなされ、その結果得られるヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質をコードするヒト化ＩＬ−４遺伝子は、内因性マウスＩＬ−４遺伝子座のマウス調節エレメントまたは配列（例えば、５’および／または３’調節エレメント）に作動可能に連結される。
【００６７】
一実施形態では、置換は内因性マウスＩＬ−４遺伝子座においてなされ、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質をコードするヒト化ＩＬ−４遺伝子は、内因性マウスＩＬ−４遺伝子座の内因性マウス調節エレメントまたは配列（例えば、５’および／または３’調節エレメント）に作動可能に連結される。
【００６８】
一態様では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードする改変されたヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子を形成するために、齧歯類ＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードする齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子配列をヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子配列の１つ以上のエクソンを含むヒトＩＬ−４Ｒα核酸配列で置換することを含む、ヒト化ＩＬ−４Ｒα齧歯類を作製するための方法が提供され、ここで、置換は内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座においてなされ、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子配列の１つ以上のエクソンを含むヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子配列であってヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードするヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子配列は、内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座の齧歯類調節エレメントまたは配列（例えば、５’および／または３’調節エレメント）に作動可能に連結される。
【００６９】
一実施形態では、齧歯類はマウスまたはラットである。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００７０】
一実施形態では、齧歯類調節エレメントまたは配列はマウス由来である。一実施形態では、齧歯類調節エレメントまたは配列はラット由来である。
【００７１】
一実施形態では、齧歯類調節エレメントまたは配列は、齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座の内因性齧歯類調節エレメントまたは配列である。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００７２】
一実施形態では、齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子配列と置き換わるヒトＩＬ−４Ｒα核酸配列は、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子配列の少なくとも１つのエクソンを含む。他の実施形態では、齧歯類ＩＬ−４αＲ遺伝子配列と置き換わるヒトＩＬ−４Ｒα核酸配列は、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子配列の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つのエクソンを含む。一実施形態では、齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子配列と置き換わるヒトＩＬ−４Ｒα核酸配列は、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子配列の９つのエクソンを全て含む。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００７３】
一実施形態では、齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子配列と置き換わるヒトＩＬ−４Ｒα核酸配列は、ヒトＩＬ−４Ｒα（例えば、GenBank  Accession  No.  NM_000418.3で示される核酸によってコードされるヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質）と約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または約９９％同一であるタンパク質をコードする。
【００７４】
一実施形態では、齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子配列と置き換わるヒトＩＬ−４Ｒα核酸配列は、ヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質の細胞外ドメインをコードするヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子配列の少なくとも１つのエクソンを含む。他の実施形態では、齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子配列と置き換わるヒトＩＬ−４Ｒα核酸配列は、ヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質の細胞外ドメインをコードするヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子配列の少なくとも２つ、３つ、または４つのエクソンを含む。一実施形態では、齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子配列と置き換わるヒトＩＬ−４Ｒα核酸配列は、ヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質の細胞外ドメインをコードするヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子配列の５つのエクソンを全て含む。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００７５】
一実施形態では、齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子配列と置き換わるヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子配列は、ヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質（例えば、GenBank  Accession  No.  NM_000418.3で示される核酸によってコードされるヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質）の細胞外ドメインと約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または約９９％同一であるＩＬ−４Ｒαタンパク質の細胞外ドメインをコードする。
【００７６】
一実施形態では、置換は内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座においてなされ、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子配列の１つ以上のエクソンを含むヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子配列であってヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードするヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子配列は、内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座の内因性齧歯類調節エレメントまたは配列（例えば、５’および／または３’調節エレメント）に作動可能に連結される。
【００７７】
一態様では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードする改変されたヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子を形成するために、マウスＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードするマウスＩＬ−４Ｒα遺伝子配列をヒトＩＬ−４Ｒα核酸配列で置換することを含む、ヒト化ＩＬ−４Ｒαマウスを作製するための方法が提供される。
【００７８】
一実施形態では、置換は内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座においてなされ、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードするヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子は、内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座のマウス調節エレメントまたは配列（例えば、５’および／または３’調節エレメント）に作動可能に連結される。
【００７９】
一実施形態では、置換は内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座においてなされ、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードするヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子は、内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座の内因性マウス調節エレメントまたは配列（例えば、５’および／または３’調節エレメント）に作動可能に連結される。
【００８０】
様々な態様では、本明細書に記載される遺伝子改変非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラット）は、それらの生殖系列に遺伝子改変を含む。
【００８１】
一態様では、本明細書に記載されるような遺伝子改変を含む、非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラット）の胚が提供される。
【００８２】
一態様では、本明細書に記載されるような遺伝子改変を含むドナー細胞を含む非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラット）の宿主胚が提供される。
【００８３】
一態様では、本明細書に記載されるような遺伝子改変を含む多能性または全能性の非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラット）の細胞が提供される。一実施形態では、細胞は齧歯類細胞である。一実施形態では、細胞はマウス細胞である。一実施形態では、細胞は齧歯類ＥＳ細胞である。一実施形態では、細胞はマウスＥＳ細胞である。
【００８４】
一態様では、非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラット）の卵子が提供され、非ヒト動物の卵子は異所性非ヒト動物染色体を含み、異所性非ヒト動物染色体は本明細書に記載されるような遺伝子改変を含む。一実施形態では、非ヒト動物は齧歯類である。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。
【００８５】
一態様では、ヒトＩＬ−４遺伝子またはヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子を含むように遺伝子改変されたマウスの胚、卵子、または細胞は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスのものである。別の実施形態では、マウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である系統からなる群から選択される１２９系統である（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｒｅｖｉｓｅｄ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｓｔｒａｉｎ  １２９  ｍｉｃｅ，Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  １０：８３６を参照のこと。また、Ａｕｅｒｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  １２９／ＳｖＥｖ−  ａｎｄ  Ｃ５７ＢＬ／６−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓも参照のこと）。特定の実施形態では、遺伝子改変マウスは、前述の１２９系統と前述のＣ５７ＢＬ／６系統との混合である。別の特定の実施形態では、マウスは前述の１２９系統の混合、または前述のＢＬ／６系統の混合である。特定の実施形態では、上記混合の１２９系統は１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。別の実施形態では、マウスはＢＡＬＢ系統、例えばＢＡＬＢ／ｃ系統、である。さらに別の実施形態では、マウスはＢＡＬＢ系統と別の前述の系統との混合である。一実施形態では、マウスはスイスマウスまたはスイスウェブスターマウスである。
【００８６】
様々な態様では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒおよび／またはＩＬ−４核酸配列を含む非ヒト動物は、哺乳類および鳥類から選択される。一実施形態では、非ヒト動物は哺乳類である。一実施形態では、哺乳類はネズミ科である。
【００８７】
一態様では、ヒト特異的なＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬をスクリーニングする方法が提供される。方法は、治療薬候補の同定および治療有効性の評価に有用である。方法は、本明細書に記載されるようにＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒαを二重にヒト化した遺伝子改変齧歯類に薬剤を投与することと、ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαシグナル伝達経路によって媒介される生物学的機能に対する薬剤の効果を判定することと、薬剤が遺伝子改変齧歯類においてＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαシグナル伝達経路によって媒介される機能と拮抗する場合に薬剤をヒト特異的なＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬として同定することと、を含む。
【００８８】
一実施形態では、薬剤は、ＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒαと結合する免疫グロブリン可変ドメインを含む。一実施形態では、薬剤は、ヒトＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒαに特異的に結合するが、齧歯類ＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒαには結合しない。一実施形態では、薬剤は抗体である。特定の実施形態では、薬剤は、ヒトＩＬ−４Ｒαと特異的に結合するが齧歯類ＩＬ−４Ｒαとは結合しない抗体である。
【００８９】
一実施形態では、スクリーニング方法は、ヒトＩＬ−４タンパク質およびヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する二重にヒト化したマウスを利用し、ヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質は、内因性マウスＩＬ−４Ｒαタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに連結されたヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質の細胞外ドメインを含み、上記マウスはネズミのＩＬ−４またはネズミのＩＬ−４Ｒαを発現しない。
【００９０】
一部の実施形態では、スクリーニングの方法は、本明細書に記載されるように二重にヒト化した齧歯類においてＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαシグナル伝達と関連する疾患を誘発することと、薬剤を齧歯類に投与することと、薬剤が疾患を軽快させるかどうかを判定することと、薬剤が疾患を軽快させる場合に薬剤を、疾患を処置するために好適なヒト特異的なＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬として同定することと、を含む。
【００９１】
一部の実施形態では、ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαシグナル伝達と関連する疾患は気道炎症であり、これは、齧歯類において、アレルゲン（例えば、チリダニ類抽出物）を一定期間、１回以上、鼻腔内投与することによって誘発できる。薬剤の投与の結果として気道炎症の程度（例えば、粘液貯留、気管支肺胞洗浄液中の浸潤性細胞、および／または総循環ＩｇＥのレベルによって表される）が低減するかどうかを測定することによって薬剤の効果を判定できる。
【００９２】
一部の実施形態では、ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαシグナル伝達と関連する疾患は、皮膚炎症またはアトピー性皮膚炎であり、これらは、齧歯類に皮膚損傷を生じさせ、損傷した皮膚をアレルゲン（例えば、細菌毒素またはチリダニ類抽出物）に一定期間、１回以上、曝露することによって誘発できる。薬剤の投与の結果として皮膚炎症が低減するかどうかを測定することによって薬剤の効果を判定できる。
【００９３】
さらなる態様では、そのＩＬ−４、ＩＬ−４Ｒα、およびＩＬ−３３遺伝子が本明細書に記載されるようにヒト化されている三重にヒト化した非ヒト動物が、化合物または化合物の組み合わせの薬力学（ＰＤ）および治療有効性を評価するために使用される。
【００９４】
実施形態または態様の状況から明示的に、あるいは明らかに、除外されない限り、本明細書に記載される態様および実施形態の各々を一緒に使用できる。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒ遺伝子のヒト化を含む齧歯類であって、前記ヒト化が、改変されたＩＬ−４遺伝子を形成するための、内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子座における、ヒトＩＬ−４遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含む核酸配列によるＩＬ−４遺伝子のエクソンを含む齧歯類核酸の置換を含み、前記改変されたＩＬ−４遺伝子の発現が、前記内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子座の齧歯類調節エレメントの制御下にある、齧歯類。
（項目２）
前記齧歯類がマウスまたはラットである、項目１に記載の齧歯類。
（項目３）
前記改変されたＩＬ−４遺伝子が、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質をコードし、前記ヒトＩＬ−４遺伝子のＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン４までを含む、項目１に記載の齧歯類。
（項目４）
前記齧歯類が、マウスＩＬ−４タンパク質を発現する能力を有しないマウスである、項目１に記載の齧歯類。
（項目５）
前記齧歯類が、内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子によってコードされたマウスＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現するマウスである、項目１に記載の齧歯類。
（項目６）
前記齧歯類が、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現するマウスである、項目１に記載の齧歯類。
（項目７）
前記ヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質が、前記ヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質の細胞外ドメインを含む、項目６に記載のマウス。
（項目８）
前記ヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質が、前記マウスＩＬ−４Ｒαタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、項目７に記載のマウス。
（項目９）
前記マウスが、改変されたＩＬ−４Ｒα遺伝子を形成するための、内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座における、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子の少なくとも１つのエクソンをコードする核酸配列によるマウスＩＬ−４Ｒα遺伝子のエクソンを含むマウス核酸の置換を含み、前記改変されたＩＬ−４Ｒα遺伝子の発現が、前記内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座のマウス調節エレメントの制御下にある、項目６に記載のマウス。
（項目１０）
前記齧歯類がマウスであり、マウスＩＬ−４のＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン４までを含むマウスＩＬ−４配列の連続ゲノム断片が、ヒトＩＬ−４のＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン４までを含むヒトＩＬ−４配列の連続ゲノム断片で置換されている、項目１に記載の齧歯類。
（項目１１）
前記齧歯類が、機能性内因性マウスＩＬ−４タンパク質を発現するが前記置換を含まない同齢のマウスの血清中に存在するマウスＩＬ−４タンパク質のレベルの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、または２００％の濃度にてヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を血清中に発現するマウスである、項目１に記載の齧歯類。
（項目１２）
前記齧歯類が、機能性内因性マウスＩＬ−４タンパク質を発現するが前記置換を含まない同齢のマウスの血清中に存在するマウスＩＬ−４タンパク質のレベルの約１０％〜約２００％、約２０％〜約１５０％、または約３０％〜約１００％の濃度にてヒトＩＬ−４タンパク質を血清中に発現するマウスである、項目１に記載の齧歯類。
（項目１３）
内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子のヒト化を含む齧歯類であって、前記ヒト化が、ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子を形成するための、内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座における、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含む核酸配列による齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子のエクソンを含む齧歯類核酸の置換を含み、前記ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子の発現が、前記内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座の齧歯類調節エレメントの制御下にある、齧歯類。
（項目１４）
前記齧歯類がマウスまたはラットである、項目１３に記載の齧歯類。
（項目１５）
前記ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子が、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードし、前記ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子のＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン５までを含む、項目１３に記載の齧歯類。
（項目１６）
前記齧歯類が、マウスＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する能力を有しないマウスである、項目１３に記載の齧歯類。
（項目１７）
前記齧歯類が、内因性マウスＩＬ−４遺伝子によってコードされたマウスＩＬ−４タンパク質を発現するマウスである、項目１３に記載の齧歯類。
（項目１８）
前記齧歯類が、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を発現するマウスである、項目１７に記載のマウス。
（項目１９）
前記マウスが、改変されたＩＬ−４遺伝子を形成するための、内因性マウスＩＬ−４遺伝子座における、ヒトＩＬ−４遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含む核酸配列によるマウスＩＬ−４遺伝子のエクソンを含むマウス核酸の置換を含み、前記改変されたＩＬ−４遺伝子の発現が、前記内因性マウスＩＬ−４遺伝子座のマウス調節エレメントの制御下にある、項目１８に記載のマウス。
（項目２０）
前記齧歯類がマウスであり、マウスＩＬ−４ＲαのＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン５までを含むマウスＩＬ−４Ｒα配列の連続ゲノム断片が、ヒトＩＬ−４ＲαのＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン５までを含むヒトＩＬ−４Ｒα配列の連続ゲノム断片で置換されている、項目１３に記載の齧歯類。
（項目２１）
前記齧歯類が、機能性内因性マウスＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現するが前記置換を含まない同齢のマウスのＢ細胞および／またはＴ細胞のいずれかの免疫細胞上に存在するマウスＩＬ−４Ｒαタンパク質のレベルの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、または２００％の量にて、Ｂ細胞および／またはＴ細胞のいずれかの免疫細胞上にヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現するマウスである、項目１３に記載の齧歯類。
（項目２２）
前記齧歯類が、機能性内因性マウスＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現するが前記置換を含まない同齢のマウスのＢ細胞および／またはＴ細胞のいずれかの免疫細胞上に存在するマウスＩＬ−４Ｒαタンパク質のレベルの約１０％〜約２００％、約２０％〜約１５０％、または約３０％〜約１００％の量にて、Ｂ細胞および／またはＴ細胞のいずれかの免疫細胞上にヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現するマウスである、項目１３に記載の齧歯類。
（項目２３）
ヒト化した齧歯類を作製するための方法であって、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質をコードする改変されたＩＬ−４遺伝子を形成するために、ヒトＩＬ−４遺伝子の１つ以上のエクソンを含むヒトＩＬ−４核酸配列で齧歯類ＩＬ−４核酸配列を置換することを含み、前記置換が、内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子座にあり、ヒトＩＬ−４遺伝子配列の１つ以上のエクソンを含む前記改変されたＩＬ−４遺伝子配列が、内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子座の齧歯類調節エレメントまたは配列に作動可能に連結される、方法。
（項目２４）
前記齧歯類がマウスまたはラットである、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記齧歯類調節エレメントまたは配列がマウスまたはラットに由来する、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記齧歯類調節エレメントまたは配列が、前記齧歯類ＩＬ−４遺伝子座の内因性齧歯類調節エレメントまたは配列である、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
前記齧歯類ＩＬ−４核酸配列と置き換わる前記ヒトＩＬ−４核酸配列が、前記ヒトＩＬ−４遺伝子配列の少なくとも１つのエクソンを含む、項目２３に記載の方法。
（項目２８）
前記齧歯類ＩＬ−４核酸配列と置き換わる前記ヒトＩＬ−４核酸配列が、前記ヒトＩＬ−４遺伝子配列の少なくとも２つまたは少なくとも３つのエクソンを含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記齧歯類ＩＬ−４核酸配列と置き換わる前記ヒトＩＬ−４核酸配列が、前記ヒトＩＬ−４遺伝子配列の４つのエクソンを全て含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記置換が内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子座にあり、前記ヒトＩＬ−４遺伝子配列の１つ以上のエクソンを含む前記ヒトＩＬ−４核酸配列が、前記内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子座の内因性齧歯類調節エレメントまたは配列に作動可能に連結される、項目２３に記載の方法。
（項目３１）
ヒト化ＩＬ−４マウスを作製するための方法であって、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質をコードする改変されたＩＬ−４遺伝子を形成するために、マウスＩＬ−４核酸配列をヒトＩＬ−４核酸で置換することを含む、方法。
（項目３２）
前記置換が内因性マウスＩＬ−４遺伝子座にあり、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質をコードする前記改変された遺伝子が、内因性マウス調節配列に作動可能に連結される、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記置換が内因性マウスＩＬ−４遺伝子座にあり、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質をコードする前記改変された遺伝子が、内因性マウス調節配列に作動可能に連結される、項目３１に記載の方法。
（項目３４）
ヒト化した齧歯類を作製するための方法であって、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードする改変されたＩＬ−４Ｒα遺伝子を形成するために、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子配列の１つ以上のエクソンを含むヒトＩＬ−４Ｒα核酸配列で齧歯類ＩＬ−４Ｒα核酸配列を置換することを含み、前記置換が、内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座にあり、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードする前記改変されたＩＬ−４Ｒα遺伝子が、前記内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座の齧歯類調節エレメントまたは配列に作動可能に連結される、方法。
（項目３５）
前記齧歯類がマウスまたはラットである、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記齧歯類調節エレメントまたは配列がマウスまたはラットに由来する、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
前記齧歯類調節エレメントまたは配列が、前記齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座の内因性齧歯類調節エレメントまたは配列である、項目３４に記載の方法。
（項目３８）
前記齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子配列と置き換わる前記ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子配列が、前記ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子配列の少なくとも１つのエクソンを含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記齧歯類ＩＬ−４Ｒα核酸配列と置き換わる前記ヒトＩＬ−４Ｒα核酸配列が、前記ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子配列の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つのエクソンを含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記齧歯類ＩＬ−４Ｒα核酸配列と置き換わる前記ヒトＩＬ−４Ｒα核酸配列が、前記ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子配列の９つのエクソンを全て含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記置換が内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座にあり、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードする前記改変されたＩＬ−４Ｒα遺伝子が、前記内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座の内因性齧歯類調節エレメントまたは配列に作動可能に連結される、項目３４に記載の方法。
（項目４２）
ヒト化したマウスを作製するための方法であって、ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子を形成するために、ヒトＩＬ−４Ｒαの細胞外ドメインをコードするヒトゲノム断片によりマウスＩＬ−４Ｒαの細胞外ドメインをコードするマウスエクソンを置換することを含む、方法。
（項目４３）
前記置換が内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座にあり、前記ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子がマウス調節配列に作動可能に連結される、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記置換が内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座にあり、前記ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子が内因性マウス調節配列に作動可能に連結される、項目４２に記載の方法。
（項目４５）
ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子およびヒト化ＩＬ−４遺伝子を含む齧歯類であって、前記ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子は、ヒトＩＬ−４Ｒα細胞外ドメインをコードする配列による齧歯類ＩＬ−４Ｒα細胞外ドメインをコードする配列の置換から結果として得られ、前記ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子は、齧歯類ＩＬ−４Ｒα膜貫通ドメインをコードする配列と齧歯類ＩＬ−４Ｒα細胞質ドメインをコードする配列とを含み、前記ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子は、内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座の内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα調節エレメントの制御下にあり、前記ヒト化ＩＬ−４遺伝子は、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質をコードし、前記ヒト化ＩＬ−４遺伝子は、内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒ遺伝子座の内因性齧歯類ＩＬ−４調節エレメントの制御下にある、齧歯類。
（項目４６）
前記齧歯類がマウスまたはラットである、項目４５に記載の齧歯類。
（項目４７）
前記齧歯類が、マウスＩＬ−４タンパク質を発現する能力を有しないマウスであってマウスＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する能力を有しないマウスである、項目４５に記載の齧歯類。
（項目４８）
前記内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子座および／または内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座の前記齧歯類調節エレメントまたは配列が、マウスまたはラット由来である、項目４５に記載の齧歯類。
（項目４９）
前記齧歯類調節エレメントまたは配列が、前記齧歯類ＩＬ−４遺伝子座および／または齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座の内因性齧歯類調節エレメントまたは配列である、項目４５に記載の齧歯類。
（項目５０）
ヒト特異的なＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬をスクリーニングする方法であって、
二重にヒト化したＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒαマウスを提供することと、
前記マウスにおいて肺の炎症を誘発することと、
薬剤を前記マウスに投与することと、
前記薬剤によって肺の炎症が低減するかどうかを判定することと、
前記薬剤を、肺の炎症を低減するその能力に基づいてヒト特異的なＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬として同定することと、
を含む方法。
（項目５１）
気道内の粘液貯留、気管支肺胞洗浄液中の好酸球性浸潤細胞、および／または総循環ＩｇＥを測定することによって肺の炎症の程度が判定される、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
ヒト特異的なＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬をスクリーニングする方法であって、
二重にヒト化したＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒαマウスを提供することと、
前記マウスにおいて皮膚炎症を誘発することと、
薬剤を前記マウスに投与することと、
前記薬剤によって皮膚炎症が低減するかどうかを判定することと、
前記薬剤を、皮膚炎症を低減するその能力に基づいてヒト特異的なＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬として同定することと、
を含む方法。
（項目５３）
ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子が、ヒトＩＬ−４Ｒα細胞外ドメインをコードする配列によるネズミのＩＬ−４Ｒα細胞外ドメインをコードする配列の置換から結果として得られ、前記ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子が内因性のネズミのＩＬ−４Ｒα遺伝子座の内因性のネズミのＩＬ−４Ｒα調節エレメントの制御下にあり、ヒト化ＩＬ−４遺伝子がヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質をコードし、前記ヒト化ＩＬ−４遺伝子は、内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒ遺伝子座の内因性齧歯類ＩＬ−４調節エレメントの制御下にある、項目５０または５２に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１は、ＩＬ−４およびＩＬ−１３のシグナル伝達のための受容体、ならびに、ヒトＩＬ−４受容体α鎖（ＩＬ−４Ｒα）に特異的に結合する中和性完全ヒトモノクローナル抗体であるデュピルマブ（dupilumab）の作用機序を図示したものである（実寸に比例していない）。
【図２Ａ】図２Ａ〜図２Ｂは、ＩＬ−４（Ｉｌ４）およびＩＬ−４Ｒα（Ｉｌ４ｒａ）遺伝子座のヒト化のための戦略を図示したものである（実寸に比例していない）。（２Ａ）図示されるように、ＡＴＧ開始コドンにおいて開始するエクソン１からエクソン４（３’非翻訳領域を含む）までコード領域が広がるマウスＩＬ−４遺伝子（上方）およびエクソン４の下流の３’領域の一部分が除去され、ｌｏｘＰ導入ｈｙｇｒｏ選択カセットｌｏｘＰ、ならびにヒトＩＬ−４遺伝子（下方）のＡＴＧコドンにおいて開始するエクソン１からエクソン４（３’非翻訳領域を含む）までのコード領域およびエクソン４の下流の３’領域の一部分によって置換される。
【図２Ｂ】図２Ａ〜図２Ｂは、ＩＬ−４（Ｉｌ４）およびＩＬ−４Ｒα（Ｉｌ４ｒａ）遺伝子座のヒト化のための戦略を図示したものである（実寸に比例していない）。（２Ｂ）図示されるように、ＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン５までコード領域が広がるマウスＩＬ−４Ｒα遺伝子（上方）およびイントロン５の一部分が削除され、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子（下方）のＡＴＧ開始コードから開始するエクソン１からエクソン５までのコード領域およびイントロン５の一部分、ならびにｌｏｘＰ導入ｎｅｏ選択カセットによって置換される。
【図３】図３は、二重にヒト化したＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒα（Ｉｌ４ｈｕ／ｈｕ／Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕ）マウス由来のＢ細胞およびＴ細胞上のヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質の発現を示す。
【図４】図４は、ヒト化ＩＬ４Ｒα（Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕ）マウス由来の初代細胞を使用してＩＬ−４およびＩＬ−１３のリガンド特異性および受容体機能性を示す。
【図５】図５は、野生型マウスにおけるインビボでのＩＬ−４依存的なＩｇＥ産生を示すが、ヒト化したＩＬ４Ｒα（Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕ）マウスでは示されない。
【図６】図６は、エクスビボにおけるマウスＢ細胞での用量依存的なＩＬ−４によるｍＩｇＥ産生の誘発（左パネル）がデュピルマブによって用量依存的な様式で遮断される（右パネル）ことを示す。
【図７】図７は、デュピルマブが用量依存的な様式で、ヒト化ＩＬ４Ｒα（Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕ）マウスにおいてインビボで、ＩＬ−２５が誘発する肺疾患を防止することを示す。
【図８】図８は、チリダニ類抽出物（ＨＤＭ）によって誘発された肺炎症モデルにおいて、二重にヒト化したＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒα（ＩＬ−４ｈｕ／ｈｕ／ＩＬ−４Ｒｈｕ／ｈｕ）マウスを使用してデュピルマブの治療有効性を評価するための実験計画を示す。「ＲＥＧＮ６６８」は、ヒトＩＬ−４Ｒαを対象とするヒトモノクローナル抗体を指し、これはデュピルマブとしても知られる。「ＲＥＧＮ１２９」は、マウスｓｏｌ  ＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃを指し、これはマウスＩＬ−１３Ｒ２αの細胞外ドメインとＦｃとの間の融合タンパク質である。
【図９】図９は、ＨＤＭによって誘発された肺炎症モデルにおいて、二重にヒト化したＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒα（ＩＬ−４ｈｕ／ｈｕ／ＩＬ−４Ｒｈｕ／ｈｕ）マウスおよびアイソタイプ対照抗体を使用してデュピルマブの治療有効性を評価するための実験計画を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜図１０ＣはマウスＩＬ−３３遺伝子座のヒト化のための戦略を図示する。図１０Ａは、ＡＴＧ開始コドンにおいて開始するエクソン２からエクソン８の終止コドンまでコード領域が広がるマウスＩＬ−３３遺伝子（上方）が削除され、ヒトＩＬ−３３遺伝子（下方）のＡＴＧコドンにおいて開始するエクソン２からエクソン８（３’非翻訳領域を含む）までのコード領域によって置換されることを図示する。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜図１０ＣはマウスＩＬ−３３遺伝子座のヒト化のための戦略を図示する。図１０Ｂは、マウスＥＳ細胞クローンＭＡＩＤ  ７０６０のヒト化ＩＬ−３３対立遺伝子を示し、これはｌｏｘＰネオマイシン選択カセットを含有する。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜図１０ＣはマウスＩＬ−３３遺伝子座のヒト化のための戦略を図示する。図１０Ｃは、マウスＥＳ細胞クローンＭＡＩＤ  ７０６１のヒト化ＩＬ−３３対立遺伝子を示し、ここで、ネオマイシン選択カセットは除去されており、ｌｏｘＰおよびクローニング部位（７７ｂｐ）はヒトＩＬ−３３配列の下流に残っており、マウス３’ＵＴＲはｌｏｘＰ部位の下流に保持されている。
【発明を実施するための形態】
【００９６】
治療標的としてのＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒα
アレルギー性疾患は、特に先進国において、加速度的に増加して発生する、ある範囲の疾患である。アトピー性皮膚炎、喘息、およびアレルギー性鼻炎は、アレルギーを有する患者の中でも最も一般的な炎症状態であり、これらの患者はしばしば多重の臨床症状の発症を患う。アレルギーの病因は、外因性抗原に対する異常な免疫応答に関連付けられる（Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｂｉｎｄｉｎｇ，ａｎｄ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＩＬ−４／ＩＬ−１３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １５９２：２３７−２５０を参照のこと）。
【００９７】
抗原特異的なＩｇＥの過剰産生は、アレルギー性炎症を引き起こすために不可欠な要素である。異常な２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）の極性化はＩｇＥ応答の増加に寄与する。
【００９８】
元々は活性化Ｔ細胞から同定されたインターロイキン−４（ＩＬ−４）およびインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）は、アレルギーにおける免疫反応および炎症反応の開始および維持において中心的な役割を果たす主要なＴｈ２サイトカインである。
【００９９】
ＩＬ−４およびＩＬ−１３シグナル伝達は、共通のサブユニットであるＩＬ−４受容体アルファ（ＩＬ−４Ｒα）を有する２種類の別個の受容体複合体によって媒介され、ＩＬ−４受容体アルファは、これら２種のサイトカインの間で重複する生物学的応答に寄与する可能性がある。図１を参照のこと。
【０１００】
インターロイキン−４／１３シグナル伝達のための受容体およびデュピルマブの作用機序。ＩＬ−４Ｒαは、組織特異的および応答特異的な様式でＩＬ−４およびＩＬ−１３の生物学的機能を媒介する２種類の別個のヘテロ二量体受容体複合体を形成する。ＩＬ−４Ｒαおよび一般的なサイトカイン受容体ガンマ鎖（γＣ）からなるＩ型受容体は、ＩＬ−４にとって一意的である。ＩＬ−４ＲαとＩＬ−１３Ｒα１との間で形成されるＩＩ型受容体は、ＩＬ−１３の主要な受容体であるが、これはＩＬ−４に対しても機能する。さらに、ＩＬ−１３は、２番目に親和性の高い受容体であるＩＬ−１３Ｒα２に結合することになり、ＩＬ−１３Ｒα２は一般的に、デコイ受容体として、または全長形態で線維化促進効果を有する可能性のあるものとして、認識される。
【０１０１】
デュピルマブは、ヒトＩＬ−４Ｒαに対する拮抗性モノクローナル抗体であり、これはＩＬ−４およびＩＬ−１３から誘発される生物学的活性を阻害する。デュピルマブは、受容体サブユニットへのＩＬ−４の結合を妨げることによってＩＬ−４シグナル伝達を遮断するが、一方で、ＩＬ−１３シグナル伝達に対する阻害効果は、二量体の受容体の相互作用に干渉することによって媒介される可能性がある。
【０１０２】
共通のＩＬ−４Ｒαサブユニットに対して向けられた完全ヒトモノクローナル抗体であるデュピルマブは、ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ（登録商標）マウスを使用してＲｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．にて開発された。デュピルマブについては、中程度から重度の喘息の処置、および中程度から重度のアトピー性皮膚炎の処置のための臨床試験が実施中である。
【０１０３】
ネズミモデルにおけるデュピルマブの有効性の評価は、複数の課題を提起する：（ａ）デュピルマブは同起源のマウスＩＬ−４受容体を認識しない、および（ｂ）マウスＩＬ−４タンパク質とヒトＩＬ−４受容体との間に機能的相互作用の欠如がある。
【０１０４】
ＩＬ−４遺伝子およびタンパク質
ＩＬ−４遺伝子は、Ｂ細胞ならびに他の細胞タイプの活性化において重要な役割を果たす、分泌されるＩＬ−４タンパク質をコードする（図１を参照のこと）。
【０１０５】
ヒトＩＬ−４。ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３５６５；一次ソース：ＨＧＮＣ：６０１４；ＲｅｆＳｅｑ転写物：ＮＭ＿０００５８９．３；ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ：Ｐ０５１１２；ゲノムアセンブリ：ＧＲＣｈ３７；場所：ｃｈｒ５：１３２，００９，７４３−１３２，０１８，５７６  ＋ストランド。
【０１０６】
ヒトＩＬ−４遺伝子は、染色体５上で５ｑ３１．１に位置する。ヒトＩＬ−４遺伝子は４つのエクソンを有し、２４アミノ酸のシグナルペプチドおよび１２９アミノ酸の成熟ＩＬ−４タンパク質を含む、長さ１５３アミノ酸の前駆体ポリペプチドをコードする。
【０１０７】
マウスＩＬ−４。ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１６１８９；一次ソース：ＭＧＩ：９６５５６；ＲｅｆＳｅｑ転写物：ＮＭ＿０２１２８３．２；ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ：Ｐ０７７５０；ゲノムアセンブリ：ＧＲＣｍ３８；場所：ｃｈｒ１１：５３，６１２，３５０−５３，６１８，６０６  −ストランド。
【０１０８】
マウスＩＬ−４遺伝子は、染色体１１上で１１  ３１．９７  ｃＭに位置する。マウスＩＬ−４遺伝子は４つのエクソンを有し、２０アミノ酸のシグナルペプチドおよび１２０アミノ酸の成熟ＩＬ−４タンパク質を含む、長さ１４０アミノ酸の前駆体ポリペプチドをコードする。
【０１０９】
ＩＬ−４Ｒα遺伝子およびタンパク質
ＩＬ−４Ｒα遺伝子は膜貫通受容体ＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードし、ＩＬ−４Ｒαタンパク質は、主にＢ細胞およびＴ細胞上に発現し、ＩＬ−４タンパク質およびＩＬ−１３タンパク質に対する受容体である（図１を参照のこと）。
【０１１０】
ヒトＩＬ−４Ｒα。ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３５６６；一次ソース：ＭＧＩ：６０１５；ＲｅｆＳｅｑ転写物：ＮＭ＿０００４１８．３；ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ：Ｐ２４３９４；ゲノムアセンブリ：ＧＲＣｈ３７；場所：ｃｈｒ１６：２７，３５１，５２５−２７，３６７，１１１  ＋ストランド。
【０１１１】
ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子は、染色体１６上で１６ｐ１２．１−ｐ１１．２に位置する。ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子は９つのコーディングエクソンを有し、２５アミノ酸のシグナルペプチドおよび８００アミノ酸の成熟ＩＬ−４Ｒαタンパク質を含む８２５アミノ酸の前駆体ポリペプチドをコードし、成熟タンパク質の最初の２０７個のアミノ酸残基は細胞外領域を構成する。ヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質の細胞外領域（すなわち、細胞外ドメイン）は、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子のコーディングエクソン１から５までによってコードされる。
【０１１２】
マウスＩＬ−４Ｒα。ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１６１９０；一次ソース：ＭＧＩ：１０５３６７；ＲｅｆＳｅｑ転写物：ＮＭ＿００１００８７００．３；ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ：Ｐ１６３８２；ゲノムアセンブリ：ＧＲＣｍ３８；場所：ｃｈｒ１１：１２５，５６５，６５５−１２５，５７２，７４５  ＋ストランド。
【０１１３】
マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子は、染色体７上で７  ６８．９４  ｃＭに位置する。マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子は９つのコーディングエクソンを有し、２５アミノ酸のシグナルペプチドおよび７８５アミノ酸の成熟ＩＬ−４Ｒαタンパク質を含む８１０アミノ酸の前駆体ポリペプチドをコードし、成熟タンパク質の最初の２０８個のアミノ酸残基は細胞外領域を構成する。マウスＩＬ−４Ｒαタンパク質の細胞外領域（すなわち、細胞外ドメイン）は、マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子のコーディングエクソン１から５までによってコードされる。
【０１１４】
ＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒαタンパク質の種特異性
本明細書に示すように、野生型マウスではマウスＩＬ−４は機能するが、ヒトＩＬ−４は機能せず、また逆に、ヒト化ＩＬ−４Ｒα（Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕ）マウスではヒトＩＬ−４は機能するが、マウスＩＬ−４は機能しない。（例えば、Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｕｍａｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ＩＬ−４／ＩＬ−１３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ：ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：１７１６−１７２２も参照のこと）。
【０１１５】
ヒトＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒα阻害剤の種特異性
ＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒαタンパク質を標的とする治療用分子の候補は典型的には薬物動態学（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）について非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラット）で評価される。かかる治療用分子は、異常なＴｈ２細胞に関連するヒトの疾患、障害、および状態のモデルである非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラット）においてインビボでの治療有効性についても試験される。
【０１１６】
しかしながら、ヒトＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒαタンパク質に特異的な治療用分子（例えば、ヒト特異的なＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα阻害剤）を齧歯類では、特にマウスでは、ＰＤまたはインビボでの治療有効性について適切に評価することができない。これは、これらの治療用分子の標的が無いためである。上述のＩＬ−４タンパク質の種特異性のために、ヒトＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現するトランスジェニック非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラット）を使用しても、この問題は克服されない。
【０１１７】
したがって、様々な実施形態では、ヒト特異的なＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒαタンパク質拮抗薬または阻害剤のＰＤおよびインビボでの治療有効性を非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラット）において評価するために、ヒトＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαタンパク質で内因性ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαタンパク質を置換するのが望ましい。
【０１１８】
さらに、様々な実施形態では、ヒトＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαタンパク質の過剰発現または過少発現という潜在的な問題を避けるために、内因性ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒα遺伝子の遺伝子座においてヒトＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒα遺伝子を非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラット）のゲノム内に挿入すること、および少なくとも部分的に内因性ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒα調節エレメントの制御下でヒトＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαタンパク質を非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラット）において発現させることが望ましい。
【０１１９】
遺伝子改変非ヒト動物
本明細書では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４および／またはヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードする改変されたＩＬ−４遺伝子および／または改変されたＩＬ−４Ｒα遺伝子を形成するために、内因性ＩＬ−４遺伝子座および／またはＩＬ−４Ｒα遺伝子座において、ヒトＩＬ−４核酸および／またはヒトＩＬ−４Ｒα核酸により、その内因性ＩＬ−４遺伝子および／またはＩＬ−４Ｒα遺伝子が全体的または部分的に置換されている遺伝子改変非ヒト動物が提供される。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「非ヒト動物」という句は、ヒトではない任意の脊椎のある生物体を指す。一部の実施形態では、非ヒト動物は哺乳類である。特定の実施形態では、非ヒト動物はラットまたはマウスなどの齧歯類である。
【０１２１】
一態様では、内因性ＩＬ−４遺伝子座において、ヒトＩＬ−４核酸により、その内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子が全体的または部分的に置換されている遺伝子改変齧歯類（例えば、マウスまたはラット）が提供される。
【０１２２】
置換は、ヒトＩＬ−４遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含むヒト核酸による齧歯類ＩＬ−４遺伝子の少なくとも１つのエクソン、すなわち１つ以上のエクソン、の置換を伴う。一部の実施形態では、齧歯類ＩＬ−４遺伝子のＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン４までを含む連続齧歯類ゲノム断片が、ヒトＩＬ−４遺伝子のＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン４までを含む連続ヒトゲノム断片で置換されている。特定の実施形態では、齧歯類はマウスであり、ＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン４まで（３’非翻訳領域を含む）およびエクソン４の下流の３’領域の一部分を含む内因性マウスＩＬ−４遺伝子座における約６．３ｋｂの連続マウスゲノム断片が削除され、ヒトＩＬ−４遺伝子のＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン４まで（３’非翻訳領域を含む）およびエクソン４の下流の３’領域の一部分を含む約８．８ｋｂのヒトＩＬ−４核酸配列で置換される。
【０１２３】
一部の実施形態では、置換は内因性ＩＬ−４遺伝子遺伝子座に、改変されたヒト化ＩＬ−４遺伝子を生じさせ、改変されたＩＬ−４遺伝子の発現は内因性ＩＬ−４遺伝子座の内因性調節エレメントの制御下にある。本明細書で使用される場合、「調節エレメント」という用語は、プロモーター、エンハンサー、および抑制エレメントなどの５’転写調節配列および転写終結配列などの３’転写調節配列の両方を含む転写調節配列を指す。一部の実施形態では、改変されたＩＬ−４遺伝子の発現は、内因性の５’調節エレメントの制御下にある。他の実施形態では、改変されたＩＬ−４遺伝子の発現は、内因性の３’調節エレメントの制御下にある。ある特定の実施形態では、改変されたＩＬ−４遺伝子の発現は、内因性の５’調節エレメントおよび３’調節エレメントの制御下にある。
【０１２４】
内因性ＩＬ−４遺伝子座において形成された、改変されたヒト化ＩＬ−４遺伝子は、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質をコードする。「ヒト化」という用語は、非ヒト動物（例えば、マウスまたはラットなどの齧歯類）に見出される遺伝子またはタンパク質の部分または配列を含む核酸またはタンパク質であって、非ヒト動物に見出されるものとは異なるが、代わりに、対応するヒト遺伝子またはタンパク質の部分または配列に該当する（それと同一である）部分または配列も含む、核酸またはタンパク質を指す。改変された、ヒト化ＩＬ−４遺伝子は、ヒトＩＬ−４タンパク質（例えば、GenBank  Accession  No.  NM_000589.3で示される核酸によってコードされるヒトＩＬ−４タンパク質）と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または１００％同一であるＩＬ−４タンパク質をコードしてよい。
【０１２５】
内因性ＩＬ−４遺伝子座における内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子のヒトＩＬ−４核酸による全体的または部分的な置換を有する遺伝子改変齧歯類を、置換に関してホモ接合性またはヘテロ接合性とすることができる。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は置換に関してヘテロ接合性である、すなわち、内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子の２つのコピーのうち１つのみがヒトＩＬ−４核酸で置換されている。他の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は置換に関してホモ接合性、すなわち、内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子の両方のコピーがヒトＩＬ−４核酸で置換されている。
【０１２６】
遺伝子改変齧歯類は、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を血清中に発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、内因性齧歯類ＩＬ−４タンパク質を発現しない。一実施形態では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を発現する齧歯類の血清は、機能性内因性ＩＬ−４タンパク質を発現する齧歯類、例えば、野生型齧歯類（例えば、機能性内因性ＩＬ−４タンパク質を発現するが、内因性ＩＬ−４遺伝子座における内因性ＩＬ−４遺伝子のヒトＩＬ−４核酸による全体的または部分的な置換を含まない齧歯類）、とほぼ同一のレベルのＩＬ−４タンパク質を有する。「ほぼ同一のレベル」とは、何れかの方向へ（すなわち、より大きいまたはより小さい）野生型齧歯類におけるレベルの２５％、２０％、１５％、１０％、５％以下以内に含まれるレベルを意味する。他の実施形態では、齧歯類は、機能性内因性ＩＬ−４タンパク質を発現するが内因性ＩＬ−４遺伝子座における内因性ＩＬ−４遺伝子のヒトＩＬ−４核酸による全体的または部分的な置換を含まない同齢の齧歯類の血清中に存在するＩＬ−４タンパク質のレベルの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、または２００％の濃度にてヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を血清中に発現する。
【０１２７】
一部の実施形態では、ヒトＩＬ−４核酸による内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子の全体的または部分的な置換を有し、かつヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を血清中に発現する遺伝子改変齧歯類は、正常な免疫系を有する。すなわち、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を発現する齧歯類の血液、血漿、または血清中の免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）の数が、機能性内因性ＩＬ−４タンパク質を発現する齧歯類であってヒトＩＬ−４核酸による内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子の全体的または部分的な置換を有しない齧歯類の血液、血漿、または血清中の免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）の数と類似である。
【０１２８】
さらなる実施形態では、ヒトＩＬ−４核酸による内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子の全体的または部分的な置換を有し、かつヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質を発現する、遺伝子改変齧歯類は、内因性ＩＬ−４Ｒα遺伝子座における内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子のヒトＩＬ−４Ｒα核酸による全体的または部分的な置換も含み、結果として、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質も発現する。
【０１２９】
別の態様では、その内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子が内因性ＩＬ−４Ｒα遺伝子座においてヒトＩＬ−４Ｒα核酸で全体的または部分的に置換されている遺伝子改変齧歯類（例えば、マウスまたはラット）が提供される。
【０１３０】
置換は、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含むヒト核酸による、齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子の少なくとも１つのエクソン、すなわち１つ以上のエクソン、の置換を伴う。一部の実施形態では、置換は、ヒト細胞外ドメインをコードするヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子のエクソンのうちの少なくとも１つによる齧歯類細胞外ドメインをコードする齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子のエクソンのうちの少なくとも１つの置換を伴う。一部の実施形態では、置換は、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子の細胞外ドメインをコードする５つのエクソンのうちの少なくとも２つ、３つ、または４つを含むヒト核酸による置換を伴う。他の実施形態では、齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子のＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン５までを含む連続齧歯類ゲノム断片が、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子のＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン５までを含むゲノム断片で置換されている。特定の実施形態では、齧歯類はマウスであり、ＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン５までおよびイントロン５の一部分を含む、内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子座の約７．１ｋｂの連続マウスゲノム断片が除去され、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子のＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン５までおよびイントロン５の一部分を含む、約１５．６ｋｂのヒトＩＬ−４Ｒα核酸配列で置換される。
【０１３１】
一部の実施形態では、置換は内因性ＩＬ−４Ｒα遺伝子遺伝子座に、改変されたヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子を生じさせ、改変されたＩＬ−４Ｒα遺伝子の発現は、内因性ＩＬ−４Ｒα遺伝子座の内因性調節エレメントの制御下にある。
【０１３２】
内因性ＩＬ−４Ｒα遺伝子座において形成された、改変されたヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子は、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードする。一部の実施形態では、改変されたヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子は、ヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質（例えば、GenBank  Accession  No.  NM_000418.3で示される核酸によってコードされるヒトＩＬ−４タンパク質）と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または１００％同一であるＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードする。他の実施形態では、改変されたＩＬ−４Ｒα遺伝子は、ヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質（例えば、GenBank  Accession  No.  NM_000418.3で示される核酸によってコードされるヒトＩＬ−４タンパク質）の細胞外ドメインと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である細胞外ドメインを含むヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質をコードする。特定の実施形態では、ヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは、内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒαタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインと同一である。
【０１３３】
内因性ＩＬ−４Ｒα遺伝子座における内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子のヒトＩＬ−４Ｒα核酸による全体的または部分的な置換を有する遺伝子改変齧歯類は、置換に関してホモ接合性またはヘテロ接合性とすることができる。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は置換に関してヘテロ接合性である、すなわち、内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子の２つのコピーのうち１つのみがヒトＩＬ−４Ｒα核酸で置換されている。他の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は置換に関してホモ接合性である、すなわち、内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子の両方のコピーがヒトＩＬ−４Ｒα核酸で置換されている。
【０１３４】
本明細書に開示される遺伝子改変齧歯類は、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）上にヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現しない。一実施形態では、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する齧歯類の免疫細胞は、機能性内因性ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する野生型齧歯類であってヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現しない野生型齧歯類の免疫細胞上に機能性内因性ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する齧歯類とほぼ同一のレベルのＩＬ−４Ｒαタンパク質を免疫細胞上に有する。他の実施形態では、齧歯類は、機能性内因性ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現するがヒトＩＬ−４Ｒα核酸による内因性ＩＬ−４Ｒα遺伝子の全体的または部分的な置換を含まない同齢の齧歯類の免疫細胞上に存在するＩＬ−４Ｒαタンパク質の量の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、または２００％の量で、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を免疫細胞上に発現する。
【０１３５】
一部の実施形態では、ヒトＩＬ−４Ｒα核酸による内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子の全体的または部分的な置換を有し、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する遺伝子改変齧歯類は、正常な免疫系を有する。すなわち、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する齧歯類の血液、血漿、または血清中の免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）の数が、野生型齧歯類（例えば、機能性内因性ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現し、かつヒトＩＬ−４Ｒα核酸による内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子の全体的または部分的な置換を有しない齧歯類）の血液、血漿、または血清中の免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）の数と類似である。
【０１３６】
一部の実施形態では、ヒトＩＬ−４Ｒα核酸による内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子の全体的または部分的な置換を有し、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する遺伝子改変齧歯類は、ＩＬ−４依存的シグナル伝達およびＩＬ−１３依存的シグナル伝達を媒介する能力を有し、かつＩＬ−４依存的シグナル伝達およびＩＬ−１３依存的シグナル伝達を媒介する上で機能する。例えば、遺伝子改変齧歯類の免疫細胞上に発現されたヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質の細胞外ドメインを有するヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質は、ヒトＩＬ−４と相互作用し、Ｉ型受容体の形成を介してヒトＩＬ−４依存的シグナル伝達を媒介する（図１を参照のこと）。ヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質の細胞外ドメインを有するかかるヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質はまた、ヒトおよびマウスのＩＬ−１３と相互作用し、ＩＩ型受容体の形成を介してＩＬ−１３依存的シグナル伝達を媒介する（図１を参照のこと）。遺伝子改変齧歯類において発現されたヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質の機能性は、遺伝子改変齧歯類に由来する一次Ｂ細胞（primary  B  cells）を使用してＩＬ−４が誘発したＩｇＥクラススイッチングを測定するアッセイなどの、以下の実施例で具体的に記載されるものを含む、当該技術分野で既知の様々なアッセイで評価することができる。
【０１３７】
さらなる実施形態では、ヒトＩＬ−４Ｒα核酸による内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子の全体的または部分的な置換を有し、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する遺伝子改変齧歯類は、内因性ＩＬ−４遺伝子座における内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子のヒトＩＬ−４核酸による全体的または部分的な置換も含み、結果として、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質も発現する。
【０１３８】
さらなる態様では、その内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子が内因性ＩＬ−４遺伝子座においてヒトＩＬ−４核酸で全体的または部分的に置換されており、かつその内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子が内因性ＩＬ−４Ｒα遺伝子座においてヒトＩＬ−４Ｒα核酸で全体的または部分的に置換されてもいる、二重にヒト化した齧歯類（例えば、マウスまたはラット）が提供される。かかる二重にヒト化した齧歯類は、各々のヒト化置換に関してホモ接合性またはヘテロ接合性とすることができる。特定の実施形態では、二重にヒト化した齧歯類は、ヒト化ＩＬ−４およびヒト化ＩＬ−４Ｒαの両方に関してホモ接合性である。
【０１３９】
二重にヒト化した齧歯類における内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子に対する遺伝子改変は、ヒトＩＬ−４核酸による内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子の全体的または部分的な置換を有する遺伝子改変齧歯類について本明細書で上述される改変または置換を含む。同様に、二重にヒト化した齧歯類における内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子に対する遺伝子改変は、ヒトＩＬ−４Ｒα核酸による内因性齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子の全体的または部分的な置換を有する遺伝子改変齧歯類について本明細書で上述される改変または置換を含む。従って、本明細書では、齧歯類ＩＬ−４遺伝子のヒト化に関しておよび齧歯類遺伝子のヒト化に関して上記で開示される特徴はそれぞれ、二重にヒト化した齧歯類に対して明確に組み込まれる。
【０１４０】
特定の実施形態では、ヒトＩＬ−４タンパク質およびヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する二重にヒト化した齧歯類（例えば、マウスまたはラット）が提供され、ヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質は、ヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質の細胞外ドメインを含み、齧歯類の内因性ＩＬ−４Ｒαタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。特定の実施形態では、ヒトＩＬ−４タンパク質およびヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質の発現は、それぞれ、内因性齧歯類ＩＬ−４遺伝子座および齧歯類ＩＬ−４Ｒα遺伝子座の内因性齧歯類調節配列の制御下にある。
【０１４１】
一部の実施形態では、二重にヒト化した齧歯類は正常な免疫系（すなわち、免疫細胞の数が野生型齧歯類とほぼ同一である）を有し、血清中に野生型齧歯類とほぼ同一のレベルのＩＬ−４タンパク質を有し、野生型齧歯類とほぼ同一の量のＩＬ−４Ｒαタンパク質を免疫細胞上に発現し、ここで野生型齧歯類は、機能性内因性ＩＬ−４タンパク質およびＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する齧歯類であってヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質またはＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現しない齧歯類である。
【０１４２】
特定の実施形態では、二重にヒト化した齧歯類は、機能性ＩＬ−４シグナル伝達経路を提示する。「機能性ＩＬ−４シグナル伝達経路」とは、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４タンパク質およびヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質の両方が、二重にヒト化した齧歯類において発現し、かつ二重にヒト化した齧歯類において互いに相互作用して、これにより下流のシグナル伝達を有効に媒介し、正常なＩＬ−４シグナル伝達経路の生物学的活性を達成することを意味する。正常なＩＬ−４シグナル伝達経路の生物学的活性が本明細書において上述され、図１に図示されており、これらはＴｈ２分化の開始および維持、Ｂ細胞の活性化および成長、ＩｇＥおよびＩｇＧ４へのクラススイッチングなどのＩ型受容体を介して媒介されるもの、および杯細胞過形成、上皮下線維症、および組織リモデリングなどのＩＩ型受容体シグナル伝達を介して媒介されるものを含む。例えば、二重にヒト化した齧歯類における機能性ＩＬ−４シグナル伝達経路は、例えば、チリダニへの曝露に応答した循環器におけるＩｇＥの増加、気道炎症、および／または好酸球性浸潤細胞（eosinophilic  infiltrating  cells）により特徴付けられる炎症表現型によって表され、この表現型は二重のヒト化を有しない野生型齧歯類内でも観察される。
【０１４３】
遺伝子改変非ヒト動物を作成する方法
齧歯類などの遺伝子改変非ヒト動物を当該技術分野で既知の方法を使用して作製できる。例えば、非ヒト動物と相同性の上流領域および下流領域に隣接したヒト核酸（ヒトＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα遺伝子などの全体または部分）を含有する標的化ベクターを作製できる。標的化構築物は、ヒト核酸に対して３’側に位置する薬剤選択カセット（例えば、一過性Ｃｒｅ発現ベクターによって後で除去できるｌｏｘＰ導入ｈｙｇｒｏ選択カセット）も含む可能性がある。標的化ベクターを、例えば、電気穿孔法によって非ヒト動物細胞、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞（マウスＥＳ細胞などの）、のゲノム中に導入できる。次いで、適正に標的化されたＥＳ細胞クローンを初期胚（例えば、８細胞期のマウス胚）に導入できる。適正に標的化されたＥＳ細胞に完全に由来する非ヒト動物は、例えば対立遺伝子解析に基づいて同定される。好適な遺伝子改変可能ＥＳ細胞が直ちに利用可能でない非ヒト動物については、本明細書に記載されるような遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製するために他の方法を採用できる。かかる方法としては、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞または誘発された多能性細胞）を改変すること、および核移植を利用して好適な細胞、例えば卵母細胞、に改変されたゲノムを導入すること、および改変された細胞（例えば、改変された卵母細胞）を胚の形成に好適な条件下で非ヒト動物に懐胎させることが挙げられる。
【０１４４】
遺伝子改変非ヒト動物を利用する方法
一態様では、本明細書に開示される遺伝子改変ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒα非ヒト動物は、以下の実施例でさらに例示されるように、ヒト特異的なＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬、例えば中和性の抗ＩＬ−４抗体および／または抗ＩＬ−４Ｒα抗体（例えば、デュピルマブ）、の薬力学（ＰＤ）および治療有効性を様々な疾患モデルにおいて評価するために使用される。
【０１４５】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に開示される二重にヒト化したＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒαマウスを使用してヒト特異的なＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬をスクリーニングする方法を提供する。
【０１４６】
「ＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬」とは、ＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒαによって媒介される１つ以上の生物学的機能を遮断、抑制、または阻害する分子（例えば、抗体）を意味する。「ヒト特異的なＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬」は、ヒトＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒαに特異的な拮抗薬であって齧歯類ＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒαに対しては実質的に作用しない拮抗薬を指す。
【０１４７】
特定の実施形態では、スクリーニング方法は、ヒトＩＬ−４タンパク質およびヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する二重にヒト化したマウスを利用し、ここでヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質は、内因性マウスＩＬ−４Ｒαタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに連結されたヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質の細胞外ドメインを含み、このマウスは、マウスＩＬ−４またはマウスＩＬ−４Ｒαを発現しない。
【０１４８】
一部の実施形態では、ヒト特異的なＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬のスクリーニング方法は、本明細書に記載されるようにＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒαについて二重にヒト化した遺伝子改変齧歯類に薬剤を投与することと、ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαシグナル伝達経路によって媒介される生物学的な機能に対する薬剤の効果を判定することと、薬剤が遺伝子改変齧歯類においてＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαシグナル伝達経路によって媒介される機能と拮抗する場合に、薬剤をヒト特異的なＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬として同定することと、を含む。
【０１４９】
一実施形態では、薬剤は、ＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒαと結合する免疫グロブリン可変ドメインを含む。一実施形態では、薬剤は、ヒトＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒαと特異的に結合するが、齧歯類ＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒαとは結合しない。一実施形態では、薬剤は抗体である。特定の実施形態では、薬剤は、ヒトＩＬ−４Ｒαと特異的に結合するが齧歯類ＩＬ−４Ｒαとは結合しない抗体である。
【０１５０】
一実施形態では、スクリーニング方法は、ヒトＩＬ−４タンパク質およびヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質を発現する二重にヒト化したマウスを利用し、ここでヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質は、内因性マウスＩＬ−４Ｒαタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに連結されたヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質の細胞外ドメインを含み、このマウスは、ネズミのＩＬ−４またはネズミのＩＬ−４Ｒαを発現しない。
【０１５１】
一部の実施形態では、スクリーニングの方法は、本明細書に記載されるように二重にヒト化した齧歯類においてＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαシグナル伝達と関連する疾患を誘発することと、当該齧歯類に薬剤を投与することと、薬剤が疾患を軽快させるかどうかを判定することと、薬剤が疾患を軽快させる場合に薬剤を、疾患を処置するために好適なヒト特異的なＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬として同定することと、を含む。
【０１５２】
「ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαシグナル伝達と関連する疾患」とは、ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαシグナル伝達によって媒介される生物学的機能が関係している疾患を意味する。ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαシグナル伝達と関連する疾患の例としては、例えば、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）（タバコの煙に少なくとも部分的に起因する場合がある）、炎症性腸疾患、多発性硬化症、関節炎、アレルギー性鼻炎、好酸球性食道炎、および乾癬などの炎症疾患または障害が挙げられる。喘息は、好酸球性または非好酸球性の喘息である可能性があり、またステロイド感受性喘息またはステロイド抵抗性喘息である可能性がある。
【０１５３】
一部の実施形態では、ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαシグナル伝達と関連する疾患は気道炎症であり、これは、齧歯類において、アレルゲン（例えば、チリダニ類抽出物）を一定期間、１回以上、鼻腔内投与することによって誘発できる。薬剤の投与の結果として、気道炎症の程度（例えば、粘液貯留、気管支肺胞洗浄液中の好酸球性浸潤細胞、総循環ＩｇＥのレベル、および／またはマイクロアレイ発現解析によって測定可能な発現プロファイルの変化によって表される）が低減したかどうかを測定することによって薬剤の効果を判定できる。気道炎症を誘発するために使用されるアレルゲンおよび試験される薬剤を同時または異なる時期に投与できる。一部の実施形態では、アレルゲンは１回投与または複数回投与で齧歯類に与えられ、試験される薬剤は、少なくとも１回のアレルゲン投与が齧歯類になされた後に齧歯類に投与される。
【０１５４】
一部の実施形態では、ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαシグナル伝達と関連する疾患は、皮膚炎症またはアトピー性皮膚炎であり、これらは、齧歯類に皮膚損傷を生じさせ、損傷した皮膚をアレルゲン（例えば、細菌毒素またはチリダニ類抽出物）に一定期間、１回以上、曝露することによって誘発できる。薬剤の投与の結果として皮膚炎症が低減するかどうかを測定することによって薬剤の効果を判定できる。
【０１５５】
更なる態様では、三重にヒト化した非ヒト動物（すなわち、そのＩＬ−４、ＩＬ−４Ｒα、およびＩＬ−３３遺伝子がヒト化された非ヒト動物）が、例えば、ヒト特異的なＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬、およびヒト特異的なＩＬ−３３拮抗薬などの候補化合物の薬力学（ＰＤ）および治療有効性を評価するために使用される。
【０１５６】
「ＩＬ−３３拮抗薬」とは、ＩＬ−３３によって媒介される１つ以上の生物学的機能またはシグナル伝達を遮断、抑制、または阻害する分子（例えば、抗体）を意味する。「ヒト特異的なＩＬ−３３拮抗薬」は、ヒトＩＬ−３３に特異的である拮抗薬であって齧歯類ＩＬ−３３に対しては実質的に作用しない拮抗薬を指す。ＩＬ−３３は、ＩＬ−３３抗体などの拮抗薬の存在下で減退するＳＴ２およびＩＬ−１  ＲＡｃＰを介したシグナル伝達を刺激することが知られている。米国特許出願公開第２０１４／０２７１６５８  Ａ１号（その全内容が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものなどのインビトロまたはインビボのアッセイでＩＬ−３３シグナル伝達をアッセイすることによってＳＴ２およびＩＬ−１  ＲＡｃＰを介したＩＬ−３３シグナル伝達の阻害を判定できる。例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２７１６５８  Ａ１号に記載されるものなどのアッセイを、ヒトＩＬ−３３の発現についてホモ接合性であるアレルゲン感受性を高めた動物においてＩＬ−３３に対する抗体の肺の炎症に対する効果を評価するために使用できる。ＩＬ−３３拮抗薬として効果的であるＩＬ−３３抗体は、肺の炎症細胞の減少に向かう傾向ならびにＩＬ−４およびＩＬ−５などのサイトカインの減少に向かう傾向を示すはずである。
【０１５７】
特定の実施形態では、三重にヒト化した非ヒト動物が、候補化合物を評価するために本明細書において使用され、ここで、三重にヒト化した動物は、ヒトＩＬ−４タンパク質、マウスＩＬ−４Ｒαタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに連結されたヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質の細胞外ドメインを含むヒト化ＩＬ−４Ｒαタンパク質、およびヒトＩＬ−３３タンパク質を発現する三重にヒト化したマウスであり、当該マウスは、マウスＩＬ−４、マウスＩＬ−４Ｒα、またはマウスＩＬ−３３を発現しない。
【０１５８】
一部の実施形態では、例えば、ヒト特異的なＩＬ−４および／もしくはＩＬ−４Ｒα拮抗薬、またはヒト特異的なＩＬ−３３拮抗薬などの候補化合物の薬力学（ＰＤ）および治療有効性を評価するために、三重にヒト化した非ヒト動物が使用される。例えば、ヒト特異的なＩＬ−４抗体、ヒト特異的なＩＬ−４Ｒα抗体、およびヒト特異的なＩＬ−３３抗体を、三重にヒト化した動物（齧歯類（例えば、マウスまたはラット）など）で個別に試験することができ、これらのＰＤプロファイルおよび治療有効性を評価および比較することができる。
【０１５９】
他の実施形態では、例えば、化合物の組み合わせが相乗的な治療効果を示すかどうかを判定するために、化合物の組み合わせ（例えば、ヒト特異的なＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬抗体とヒト特異的なＩＬ−３３拮抗薬抗体との組み合わせ）の有効性を、個別に使用されたときの化合物の有効性と比較して評価するために、三重にヒト化した非ヒト動物が使用される。特定の実施形態では、ヒト特異的なＩＬ−４抗体とヒト特異的なＩＬ−３３抗体との組み合わせが、三重にヒト化した非ヒト動物で試験される。他の特定の実施形態では、ヒト特異的なＩＬ−４Ｒα抗体とヒト特異的なＩＬ−３３抗体との組み合わせが、三重にヒト化した非ヒト動物で試験される。
【０１６０】
候補化合物または化合物の組み合わせを評価するために、ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαシグナル伝達およびＩＬ−３３シグナル伝達と関連する疾患を、三重にヒト化した動物において誘発できる。ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαシグナル伝達およびＩＬ−３３シグナル伝達と関連する疾患の例としては、例えば、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）（タバコの煙に少なくとも部分的に起因する場合がある）、炎症性腸疾患、多発性硬化症、関節炎、アレルギー性鼻炎、好酸球性食道炎、および乾癬などの炎症疾患または障害が挙げられる。喘息は好酸球性または非好酸球性の喘息である可能性があり、またステロイド感受性喘息またはステロイド抵抗性喘息である可能性がある。化合物または化合物の組み合わせの効果を、本明細書で上述されたようなＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒα二重ヒト化動物と同様に評価できる。
【０１６１】
本発明は以下の非限定的な実施例によってさらに例示される。
【実施例】
【０１６２】
実施例１
ヒトＩＬ−４遺伝子による内因性マウスＩＬ−４遺伝子の置換
ヒトＩＬ−４遺伝子のＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン４まで（３’非翻訳領域を含む）のコーディング部分およびエクソン４の下流の３’領域の一部分を含有する８．８ｋｂのヒトＩＬ−４遺伝子により、ＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン４まで（３’非翻訳領域を含む）のコーディング部分およびエクソン４下流の３’領域の一部分に広がる６．３ｋｂのネズミのＩＬ−４遺伝子遺伝子座を置換した。図２Ａを参照のこと。
【０１６３】
単一の標的化工程でマウスＩＬ−４遺伝子をヒトＩＬ−４遺伝子で置換するための標的化構築物は、ＶｅｌｏｃｉＧｅｎｅ（登録商標）遺伝子工学技術（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，２１（６）：６５２−６５９を参照のこと）を使用して構築した。マウスＩＬ−４ＤＮＡおよびヒトＩＬ−４ＤＮＡは、それぞれ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンｂＭＱ−４１Ａ１２およびＲＰ１１−１７Ｋ１９から得た。簡潔に述べると、エクソン１のＡＴＧコドンからエクソン４（３’非翻訳領域を含む）およびエクソン４の下流の３’領域の一部分まで広がる８．８ｋｂのヒトＩＬ−４配列（ゲノム座標：ＧＲＣｈ３７：ｃｈｒ５：１３２，００９，７４３−１３２，０１８，５７６（＋ストランド））およびｌｏｘＰ導入ｈｙｇｒｏ選択カセットに隣接したマウスＩＬ−４の上流相同性アームおよび下流相同性アームを含有する、ギャップ修復クローニングによって生成され、ＳｂｆＩで直線化された標的化構築物をＦ１Ｈ４マウス胚性幹（ＥＳ）細胞（Ｃ５７ＢＬ／６×１２９Ｆ１雑種）に電気穿孔した。適正に標的化されたＥＳ細胞（ＭＡＩＤ  ８７９）を、薬剤選択カセットを除去するために一過性Ｃｒｅ発現ベクターを用いてさらに電気穿孔した。薬剤カセット（ＭＡＩＤ  １５５３）を有しない標的化されたＥＳ細胞クローンを、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）法によって８細胞期のＳＷマウス胚に導入した（米国特許第７，２９４，７５４号、同第７，５７６，２５９号、同第７，６５９，４４２号、およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）  Ｆ０  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｍｉｃｅ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｆｕｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｄｏｎｏｒ  ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ  ａｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１−９９を参照のこと）。ヒト化ＩＬ−４遺伝子を有するＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅ（登録商標）（ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウス）を、対立遺伝子アッセイの改変を用いてマウス対立遺伝子の消失およびヒト対立遺伝子の獲得について遺伝子型を決定することによって同定した（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）を参照のこと）。
【０１６４】
適正に標的化されたＥＳ細胞クローンをロスオブネイティブアレル（ＬＯＮＡ）アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．２００３）によって同定した。上記アッセイでは、除去の対象となったマウスＩＬ−４遺伝子内の配列に対して特異的な２つのＴａｑＭａｎ（商標）定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって、天然の改変されていないＩＬ−４遺伝子のコピー数を決定した。ｑＰＣＲアッセイは、以下のプライマー−プローブのセット（５’から３’へと記載される）を含んだ：上流フォワードプライマー、ＣＡＴＧＣＡＣＧＧＡ  ＧＡＴＧＧＡＴＧＴＧ（配列番号：１）；上流リバースプライマー、ＧＡＣＣＣＣＴＣＡＧ  ＧＴＣＣＡＣＴＴＡＣ  Ｃ（配列番号：２）；上流プローブ、ＦＡＭ−ＡＡＣＧＴＣＣＴＣＡ  ＣＡＧＣＡＡＣＧＡ−ＭＧＢ（配列番号：３）；下流フォワードプライマー、ＧＴＧＣＣＣＡＧＧＴ  ＧＴＧＣＴＣＡＴＧ（配列番号：４）；下流リバースプライマー、ＣＧＣＣＴＧＣＣＴＣ  ＣＴＣＡＣＴＴＴＡＴ  Ｃ（配列番号：５）；下流プローブ、ＦＡＭ−ＡＴＣＴＧＣＴＴＣＡ  ＣＣＡＴＣＣＡＣＴ−ＭＧＢ（配列番号：６）；ここでＦＡＭは５−カルボキシフルオレセイン蛍光プローブを指し、ＢＨＱはブラックホール消光剤型の蛍光消光剤を指す（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。標的化ベクターを取り込み、そのゲノムに組み込んだＥＳ細胞クローンから精製されたＤＮＡを、３８４ウェルＰＣＲプレート（ＭｉｃｒｏＡｍｐ（商標）Ｏｐｔｉｃａｌ  ３８４−Ｗｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で製造業者の推奨に従ってＴａｑＭａｎ（商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と組み合わせて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ（これはＰＣＲ過程の間に蛍光データを収集し、蓄積した蛍光が予め設定された閾値に達するフラクショナルＰＣＲサイクル（fractional  PCR  cycle）である閾値サイクル（Ｃｔ）を決定する）においてサイクルさせた。上流および下流ＩＬ−４特異的ｑＰＣＲおよび標的ではない参照遺伝子に対する２つのｑＰＣＲが、各ＤＮＡサンプルについて実行された。各ＩＬ−４特異的ｑＰＣＲと各参照遺伝子ｑＰＣＲとの間のＣｔ値（ΔＣｔ）の差を算出し、次いで各ΔＣｔとアッセイされたサンプル全てについてのメジアンΔＣｔとの間の差を算出して、各サンプルについてのΔΔＣｔ値を得た。各サンプルにおけるＩＬ−４遺伝子のコピー数を以下の式から算出した：コピー数＝２×２−ΔΔＣｔ。そのネイティブコピーのうちの１つを失った、適正に標的化されたクローンは、１と等しいＩＬ−４遺伝子コピー数を有することになる。ヒトＩＬ−４遺伝子配列が、ヒト化した対立遺伝子において除去されたマウスＩＬ−４遺伝子配列と置き換わったことの確認は、以下のプライマー−プローブのセット（５’から３’へと記載される）を含むＴａｑＭａｎ（商標）ｑＰＣＲアッセイによって確認された：ヒトフォワードプライマー、ＧＣＣＴＧＧＡＣＣＡ  ＡＧＡＣＴＣＴＧＴ（配列番号：７）；ヒトリバースプライマー、ＡＣＣＧＴＧＧＧＡＣ  ＧＧＣＴＴＣＴＴＡＣ（配列番号：８）；ヒト上流プ���ーブ、ＦＡＭ−ＣＡＣＣＧＡＧＴＴＧ  ＡＣＣＧＴＡＡＣＡＧ  ＡＣＡＴＣ−ＢＨＱ（配列番号：９）。ｈｙｇｒｏ選択カセットがヒトＩＬ−４遺伝子配列と共に、ヒト化した対立遺伝子に挿入されたことの確認は、以下のプライマー−プローブのセット（５’から３’へと記載される）を含むＴａｑＭａｎ（商標）ｑＰＣＲアッセイによって確認された：ｈｙｇｒｏフォワードプライマー、ＴＧＣＧＧＣＣＧＡＴ  ＣＴＴＡＧＣＣ（配列番号：１０）；ｈｙｇｒｏリバースプライマー、ＴＴＧＡＣＣＧＡＴＴ  ＣＣＴＴＧＣＧＧ（配列番号：１１）；ｈｙｇｒｏプローブ、ＦＡＭ−ＡＣＧＡＧＣＧＧＧＴ  ＴＣＧＧＣＣＣＡＴＴ  Ｃ−ＢＨＱ（配列番号：１２）。
【０１６５】
標的化されたＥＳ細胞に由来するマウスについて、尾部の生検から精製されたＤＮＡをアッセイして、それらのＩＬ−４遺伝子型を決定し、ヒト化ＩＬ−４対立遺伝子が生殖系列を通じて伝達されたことを確認するために、同一のＬＯＮＡアッセイを使用した。置換についてヘテロ接合性の２匹の子を交配して、ヒトＩＬ−４遺伝子による内因性マウスＩＬ−４遺伝子の置換についてホモ接合性であるマウスを生じさせる。表現型の決定のために、置換についてホモ接合性である子を使用する。
【０１６６】
ネズミのＩＬ−４遺伝子座とヒトＩＬ−４遺伝子を含む配列との上流ジャンクションは、
【化１】
2020058379.tif 000002
内となるように設計され、ここで、ヒトＩＬ−４配列は斜字体で示され、ＩＬ−４コード配列は括弧付きで示される。ヒトＩＬ−４遺伝子を含有する配列とｌｏｘＰ導入ｈｙｇｒｏ選択カセットとの下流ジャンクションは、
【化２】
2020058379.tif 000003
内となるように設計され、ここで、ヒトＩＬ−４配列は斜字体で示され、ＩＬ−４コード配列は括弧付きで示される。ｌｏｘＰ導入ｈｙｇｒｏ選択カセットの配列とネズミのＩＬ−４遺伝子座との下流ジャンクションは、
【化３】
2020058379.tif 000004
内となるように設計され、ここで、ｈｙｇｒｏカセット配列は斜字体で示される。
【０１６７】
実施例２
ヒトＩＬ−４Ｒα細胞外ドメイン遺伝子配列による内因性マウスＩＬ−４Ｒα細胞外ドメイン遺伝子配列の置換
ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子の、ＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン１からエクソン５まで、およびイントロン５の一部分、を含む１５．６ｋｂのヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子により、ＡＴＧ開始コドンから開始するコーディングエクソン１からエクソン５およびイントロン５の一部分まで広がる７．１ｋｂのネズミＩＬ−４Ｒα遺伝子遺伝子座を置換した。マウスのエクソン６から９は保持され、エクソン１から５（すなわち、細胞外ドメイン）のみがヒト化された。図２Ｂを参照のこと。
【０１６８】
単一の標的化工程でマウスＩＬ−４Ｒα遺伝子をヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子で置換するための標的化構築物は、ＶｅｌｏｃｉＧｅｎｅ（登録商標）遺伝子工学技術（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，２１（６）：６５２−６５９を参照のこと）を使用して構築した。マウスＩＬ−４ＲαＤＮＡおよびヒトＩＬ−４ＲαＤＮＡは、それぞれ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンＲＰ２３−１３６Ｇ１４およびＲＰ１１−１６６Ｅ２４から得た。簡潔に述べると、エクソン１のＡＴＧコドンからエクソン５およびイントロン５の一部分まで広がる１５．６ｋｂのヒトＩＬ−４Ｒα配列（ゲノム座標：ＧＲＣｈ３７：ｃｈｒ１６：２７，３５１，５２５−２７，３６７，１１１（＋ストランド））およびｌｏｘＰ導入ｎｅｏ選択カセットに隣接したマウスＩＬ−４Ｒα遺伝子の上流相同性アームおよび下流相同性アームを含有する、ギャップ修復クローニングによって生成され、ＮｏｔＩで直線化された標的化構築物を、Ｆ１Ｈ４マウス胚性幹（ＥＳ）細胞（Ｃ５７ＢＬ／６×１２９Ｆ１雑種）に電気穿孔した。適正に標的化されたＥＳ細胞（ＭＡＩＤ  ８０３）を、薬剤選択カセットを除去するために一過性Ｃｒｅ発現ベクターを用いてさらに電気穿孔した。薬剤カセット（ＭＡＩＤ  １４４４）を有しない標的化されたＥＳ細胞クローンを、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）法によって８細胞期のＳＷマウス胚に導入した（米国特許第７，２９４，７５４号、同第７，５７６，２５９号、同第７，６５９，４４２号、およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）  Ｆ０  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｍｉｃｅ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｆｕｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｄｏｎｏｒ  ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ  ａｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１−９９を参照のこと）。ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子を有するＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅ（登録商標）（ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウス）を、対立遺伝子アッセイの改変を用いてマウス対立遺伝子の消失およびヒト対立遺伝子の獲得について遺伝子型を決定することによって同定した（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）を参照のこと）。
【０１６９】
適正に標的化されたＥＳ細胞クローンを、ロスオブネイティブアレル（ＬＯＮＡ）アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．２００３）によって同定した。上記アッセイでは、除去の対象となったマウスＩＬ−４Ｒα遺伝子内の配列に対して特異的な２つのＴａｑＭａｎ（商標）定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって、天然の、改変されていないＩＬ−４Ｒα遺伝子のコピー数を決定した。ｑＰＣＲアッセイは、以下のプライマー−プローブのセット（５’から３’へと記載される）を含んだ：上流フォワードプライマー、ＣＣＧＣＴＧＧＣＡＴ  ＧＴＧＴＡＴＴＧＴＧ（配列番号：１６）；上流リバースプライマー、ＴＧＡＧＴＧＴＧＧＧ  ＡＣＣＣＴＣＡＡＧＡ  Ｇ（配列番号：１７）；上流プローブ、ＦＡＭ−ＴＧＡＣＣＣＡＡＧＣ  ＣＣＴＡＣＡＴＧＧＣ  ＣＡＣＴ−ＢＨＱ（配列番号：１８）；下流フォワードプライマー、ＴＧＡＧＧＡＧＡＧＣ  ＴＣＡＣＧＧＧＡＡＴ  Ｃ（配列番号：１９）；下流リバースプライマー、ＡＣＣＣＡＴＣＴＣＣ  ＴＧＣＧＴＴＴＣＴＧ（配列番号：２０）；下流プローブ、ＦＡＭ−ＴＴＧＡＣＡＣＧＣＣ  ＡＧＣＴＡＣＡＣＴＧ  ＣＴＣＣＡ−ＢＨＱ（配列番号：２１）；ここでＦＡＭは５−カルボキシフルオレセイン蛍光プローブを指し、ＢＨＱはブラックホール消光剤型の蛍光消光剤を指す（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。標的化ベクターを取り込み、そのゲノムに組み込んだＥＳ細胞クローンから精製されたＤＮＡを、３８４ウェルＰＣＲプレート（ＭｉｃｒｏＡｍｐ（商標）Ｏｐｔｉｃａｌ  ３８４−Ｗｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で製造業者の推奨に従ってＴａｑＭａｎ（商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と組み合わせて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ（これはＰＣＲ過程の間に蛍光データを収集し、蓄積した蛍光が予め設定された閾値に達するフラクショナルＰＣＲサイクルである閾値サイクル（Ｃｔ）を決定する）においてサイクルさせた。上流および下流ＩＬ−４Ｒα特異的ｑＰＣＲおよび標的ではない参照遺伝子に対する２つのｑＰＣＲが、各ＤＮＡサンプルについて実行された。各ＩＬ−４Ｒα特異的ｑＰＣＲと各参照遺伝子ｑＰＣＲとの間のＣｔ値（ΔＣｔ）の差を算出し、次いで各ΔＣｔとアッセイされたサンプル全てについてのメジアンΔＣｔとの間の差を算出して、各サンプルについてのΔΔＣｔ値を得た。各サンプルにおけるＩＬ−４Ｒα遺伝子のコピー数を以下の式から算出した：コピー数＝２×２−ΔΔＣｔ。そのネイティブコピーのうちの１つを失った、適正に標的化されたクローンは、１と等しいＩＬ−４Ｒα遺伝子コピー数を有することになる。ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子配列が、ヒト化した対立遺伝子において除去されたマウスＩＬ−４Ｒα遺伝子配列と置き換わったことの確認は、以下のプライマー−プローブのセット（５’から３’へと記載される）を含むＴａｑＭａｎ（商標）ｑＰＣＲアッセイによって確認された：ヒトフォワードプライマー、ＡＣＣＴＧＣＧＴＣＴ  ＣＣＧＡＣＴＡＣＡＴ  Ｇ（配列番号：２２）；ヒトリバースプライマー、ＧＡＧＣＴＣＧＧＴＧ  ＣＴＧＣＡＡＴＴＧ（配列番号：２３）；ヒトプローブ、ＦＡＭ−ＴＧＧＧＡＣＣＡＴＴ  ＣＡＴＣＴＴＣＣＡＣ  ＴＣＧＣＡ−ＢＨＱ（配列番号：２４）。ｎｅｏ選択カセットがヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子配列と共に、ヒト化した対立遺伝子に挿入されたことの確認は、以下のプライマー−プローブのセット（５’から３’へと記載される）を含むＴａｑＭａｎ（商標）ｑＰＣＲアッセイによって確認された：ｎｅｏフォワードプライマー、ＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧ  ＣＴＡＴＴＣＧＧＣ（配列番号：２５）；ｎｅｏリバースプライマー、ＧＡＡＣＡＣＧＧＣＧ  ＧＣＡＴＣＡＧ（配列番号：２６）；ｎｅｏプローブ、ＦＡＭ−ＴＧＧＧＣＡＣＡＡＣ  ＡＧＡＣＡＡＴＣＧＧ  ＣＴＧ−ＢＨＱ（配列番号：２７）。
【０１７０】
標的化されたＥＳ細胞に由来するマウスについて、尾部の生検から精製されたＤＮＡをアッセイして、それらのＩＬ−４Ｒα遺伝子型を決定し、ヒト化ＩＬ−４Ｒα対立遺伝子が生殖系列を通じて伝達されたことを確認するために、同一のＬＯＮＡアッセイを使用した。置換についてヘテロ接合性の２匹の子を交配して、ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子による内因性マウスＩＬ−４Ｒα遺伝子の置換についてホモ接合性であるマウスを生じさせる。表現型決定のために、置換についてホモ接合性である子を使用する。
【０１７１】
ネズミのＩＬ−４Ｒα遺伝子座とヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子を含有する配列との上流ジャンクションは、
【化４】
2020058379.tif 000005
内となるように設計され、ここで、ヒトＩＬ−４Ｒα配列は斜字体で示され、ＩＬ−４Ｒαコード配列は下線付きで示される。ヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子を含有する配列とｌｏｘＰ導入ｎｅｏ選択カセットとの下流ジャンクションは、
【化５】
2020058379.tif 000006
内となるように設計され、ここで、ヒトＩＬ−４Ｒα配列は斜字体で示され、カセット配列は小文字で示される。ｌｏｘＰ導入ｎｅｏ選択カセットの配列とネズミのＩＬ−４Ｒα遺伝子座との下流ジャンクションは、５’−  ｔａｔｔｇｔｔｔｔｇ  ｃｃａａｇｔｔｃｔａ  ａｔｔｃｃａｔｃａｇ  ａｃｃｔｃｇａｃｃｔ  ｇｃａｇｃｃｃｃｔａ  ｇａｔａａｃｔｔｃｇ  ｔａｔａａｔｇｔａｔ  ｇｃｔａｔａｃｇａａ  ｇｔｔａｔｃｃｔａｇ  ｇｔｔｇｇａｇｃｔｃ  ＴＣＴＧＴＡＧＣＣＡ  ＧＧＴＡＡＣＣＡＡＧ  ＧＧＴＣＣＣＡＧＧＧ  ＧＡＡＣＣＣＣＣＡＧ  ＴＧＴＧＧＡＣＧＣＧ  ＧＡＣＴＧＣＡＣＡＴ  ＧＡＣＡＣＡＧＧＧＣ  ＧＧＣＣＴＣＣＣＣＡ  ＴＴＣＡＴＧＡＣＴＧ  ＴＴＴＴＴＣＴＣＣＴ  ＴＧＣＡＧ（ＡＣＴＴＣ  ＣＡＧＣＴＧＣＣＣＣ  ＴＧＡＴＡＣＡＧＣＧ  ＣＣＴＴＣＣＡＣＴＧ  ＧＧＧＧＴＣＡＣＣＡ  ＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴ  ＣＴＧＣＡＴＣＣＣＧ  ＴＴＧＴＴＴＴＧＣＣ  ＴＧＴＴＣＴＧＴＴＡ  ＣＴＴＣＡＧＣＡＴＴ  ＡＣＣＡＡ）ＧＴＧＡＧ  ＴＴＣＣＴＧＣＴＴＴ  ＧＧＣＴＧＧＴＧＴＣ  ＴＣＴＧＧＣＴＧＧＣ  ＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧ  ＴＧＣＴＣＴＣＡＧＡ  ＧＧＴＣＡＣＡＧＴＣ  ＡＴＴＧＴＧＣＴＧＧ  ＣＴＧＡＧＡＡＡＡＧ（配列番号：３０）内となるように設計され、ここで、マウスＩＬ−４Ｒαコード配列は括弧付きで示され、ｎｅｏカセット配列は小文字で示される。
【０１７２】
実施例３
二重にヒト化したＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαマウスの生成
二重にヒト化したＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒa（Ｉｌ４ｈｕ／ｈｕ／Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕ）マウスを以下のように生成した。ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子およびｌｏｘＰ導入ｎｅｏカセットを含むＥＳ細胞クローンＭＡＩＤ  ８０３を、Ｃｒｅ発現ベクターを用いて電気穿孔し、ｌｏｘＰ導入ｎｅｏカセットを除去して、薬剤選択カセット無しでヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子を含むＥＳ細胞クローンＭＡＩＤ  １４４４を生成した（実施例２を参照のこと）。ヒト化ＩＬ−４遺伝子およびｌｏｘＰ導入ｈｙｇｒｏカセットを含む、ＥＳ細胞クローンＭＡＩＤ  ８７９を生成するために使用された同一の標的化構築物（実施例１を参照のこと）を、ＥＳ細胞クローンＭＡＩＤ  １４４４に電気穿孔して、８７９  Ｈｅｔ／１４４４  Ｈｅｔ（Ｉｌ４＋／ｈｕ／Ｉｌ４ｒａ＋／ｈｕ）ＥＳ細胞を生成し、続いてこれを、Ｃｒｅ発現ベクターを用いて電気穿孔して、ｌｏｘＰ導入ｈｙｇｒｏカセットを除去し、ヒト化ＩＬ−４遺伝子およびヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子を含むＥＳ細胞クローン（ＭＡＩＤ  １５５３／１４４４）を生成した。二重にヒト化したＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαマウスを生成するために、薬剤カセットを有しないＥＳ細胞クローンＭＡＩＤ  １５５３／１４４４を８細胞期のＳＷマウス胚に導入した。
【０１７３】
実施例４
ヒトＩＬ−４遺伝子置換およびヒトＩＬ４Ｒα遺伝子置換を有するマウスにおける、完全ヒトＩＬ−４Ｒα  ｍＡｂであるデュピルマブの有効性評価
方法
８．８ｋｂのヒトＩＬ−４ゲノム配列によるマウス全長ＩＬ−４遺伝子座の置換（実施例１および図２Ａを参照のこと）、および対応するヒトＩＬ−４ＲαゲノムＤＮＡの１５．６ｋｂの断片によるマウスＩＬ−４Ｒα（ＣＤ１２４）遺伝子の細胞外領域（すなわち、細胞外ドメイン）の置換（実施例２および図２Ｂを参照のこと）の両方のために、ＶｅｌｏｃｉＧｅｎｅ（登録商標）技術を使用して、遺伝子改変マウスを生成した。
【０１７４】
ホモ接合性ヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子を有するマウスを、ヒト遺伝子の発現および機能について検証した。ヒト化したマウスによるヒトＩＬ−４Ｒαの発現を判定するために、野生型およびヒト化したマウスの脾臓細胞を収集し、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）解析のためにマウスＣＤ３、マウスＣＤ１９、ヒトＣＤ１２４、およびマウスＣＤ１２４に対する蛍光標識抗体で処理した。（例えば、Ｂｌａｅｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＬ−４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａ  ｃｈａｉｎ  Ｉ４Ｒ  ｍｏｔｉｆ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ａｉｒｗａｙ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９８（８）：１１８９−１２００を参照のこと）。
【０１７５】
リガンドの特異性および受容体の機能性を実証するために、ヒト化ＩＬ−４Ｒαマウスに由来する初代細胞を使用した。野生型およびヒト化ＩＬ−４Ｒαマウス由来の大腿骨骨髄細胞を使用して骨髄由来マクロファージを、１０％のウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭに２０％のＬ−細胞ならし培地を加えたものの中で７日間培養した。
【０１７６】
次いで細胞を、培地中で希釈した２０ｎｇ／ｍＬのマウスＩＬ−４、マウスＩＬ−１３、ヒトＩＬ−４、ヒトＩＬ−１３、またはビヒクルで個別に２０時間処理した。各条件由来の４連のサンプルを遺伝子発現解析のために採取した。
【０１７７】
これらのサンプル由来の全ＲＮＡを抽出し、Ｃｙ３−ＣＴＰを組み込むことによってｃＲＮＡへと増幅した。次いで、各サンプル由来のＣｙ３標識ｃＲＮＡを、マウスのトランスクリプトームをカバーする４３，５３８個の６０塩基長のオリゴからなるカスタム仕様のＡｇｉｌｅｎｔアレイにハイブリダイズさせた。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ９．５を使用して、スキャンしたアレイ画像からデータを抽出した。
【０１７８】
実験群間で差を示すように発現した遺伝子を、スチューデントのｔ検定（ｐ＜０．０５、変動比≧１．５）を使用して同定した。これらの遺伝子の発現クラスターを、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸ７．３由来のピアソン相関クラスタリングアルゴリズムを使用して生成した。
【０１７９】
ヒト化ＩＬ−４Ｒα（Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕ）マウスから単離された一次Ｂ細胞を用いたインビトロＩｇＥクラススイッチングアッセイを使用して、ＩＬ−４に対するデュピルマブの中和効果を評価した。
【０１８０】
インビボでのマウスＩＬ−２５の発現のために、野生型（ＷＴ）およびヒト化ＩＬ−４Ｒα（Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕ）マウスに、裸プラスミドＤＮＡ溶液の大容積（ハイドロダイナミック）駆動遺伝子送達を受容させた（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃｓ−ｂａｓｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌｓ  ｂｙ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：１２５８−１２６６を参照のこと）。８日後に末梢血液を回収して、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、米国ミネソタ州）を使用して血清ネズミＩｇＥ（ｍＩｇＥ）レベルを測定した。
【０１８１】
７日間培養で、ヒト化マウス脾臓細胞由来精製一次Ｂ細胞を、細菌性ＬＰＳで活性化すると共に、増加する量の組み換え型ヒトＩＬ−４と混合して、免疫グロブリンのクラススイッチングを誘発した。抗体遮断実験のために、精製したＢ細胞を、増加する用量のデュピルマブと共に３０分間インキュベートした後、０．１６７ｎＭの組み換え型ヒトＩＬ−４を添加して７日間培養した。ＩＬ−４非存在下でのＩｇＥ産生またはアイソタイプ対照ｍＡｂを用いた場合のＩｇＥ産生が、それぞれ、（◇）および（△）で示される。市販のＥＬＩＳＡキットを使用して培養上清中のネズミのＩｇＥのレベルを測定した（例えば、Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩｇＧ１  ａｎｄ  ＩｇＥ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ４  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ，Ｓｃａｎｄ  Ｉ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３０：３５５−３６１を参照のこと）。
【０１８２】
インターロイキン−２５（ＩＬ−２５）は、Ｔｈ２細胞によって産生されるサイトカインであり、その主な活性はＩＬ−４およびＩＬ−１３の産生を介して媒介され、肺の粘液産生の増加および杯細胞過形成などの組織特異的な症状を誘発する（Ｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）ＩＬ−２５  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＩＬ−４，ＩＬ−５，ａｎｄ  ＩＬ−１３  ａｎｄ  Ｔｈ２−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １５（６）：９８５−９９５を参照のこと）。
【０１８３】
ＩＬ−１３の欠如は、標的器官におけるＩＬ−２５が誘発する症状から動物を保護する。したがって、ヒト化ＩＬ−４遺伝子および／またはヒト化ＩＬ−４Ｒα遺伝子を含むマウスにおいて、インビボでのデュピルマブの薬力学特性（ＰＤ）を評価するために、ＩＬ−２５駆動性肺炎症モデルを使用した。
【０１８４】
ヒト化ＩＬ−４Ｒα（Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕ）マウスにおいて、肺の粘液貯留を測定することにより、ＩＬ−２５−誘発性炎症法（IL-25-induced  inflammation  method）を使用して、ＩＩ型受容体に対するデュピルマブのＰＤ応答の特性を明らかにした。
【０１８５】
０日目に、ＷＴおよびヒト化ＩＬ−４Ｒα（Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕ）マウスにマウスＩＬ−２５発現ベクターのハイドロダイナミック送達を受容させ、その後、示された用量でデュピルマブまたはアイソタイプ対照ｍＡｂを注射した。一日おきに合計４投与、追加的な抗体投与がなされた。８日目に、安楽死させたマウスから肺組織を回収し、処理した肺切片を過ヨウ素酸シッフによって染色した後、病理学的変化について盲検法によりスコア化した。
【０１８６】
結果
ヒト化ＩＬ−４Ｒαマウスは以下を示すように特徴付けられた。（ａ）二重にヒト化したＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒα（Ｉｌ４ｈｕ／ｈｕ／Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕ）マウス由来の初代細胞上のヒトＩＬ−４Ｒαの発現（図３を参照のこと）、（ｂ）ヒト化ＩＬ−４Ｒα（Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕ）マウスにおけるＩＬ−４リガンド特異性の変化（図４を参照のこと）、および（ｃ）ヒト化ＩＬ−４Ｒα（Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕ）マウスにおけるＩＬ−１３経路の機能性（図４を参照のこと）。
【０１８７】
ゲーテッドＢ細胞およびＴ細胞の集団（gated  B  and  T  cell  populations）上のＩＬ−４Ｒα（ＣＤ１２４）の標識化プロファイルが示され、陰影を付けた区域で対応する染色されていない細胞集団の分布が示される図３に示すように、野生型およびヒト化ＩＬ−４Ｒα（Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕ）マウスは類似した量のＩＬ−４Ｒαタンパク質をＢ細胞（ＣＤ１９＋、ＣＤ３−）およびＴ細胞（ＣＤ１９−、ＣＤ３＋）上に発現する。
【０１８８】
図４（左側）に示すように、野生型（Ｉｌ４ｒａ＋／＋）マウスは、ヒトＩＬ−４ではなくマウスＩＬ−４に応答し、マウスＩＬ−１３およびヒトＩＬ−１３の両方に応答する。図４（右側）に示すように、ヒト化ＩＬ−４Ｒα（Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕ）マウスは、マウスＩＬ−４ではなくヒトＩＬ−４に応答し、マウスＩＬ−１３およびヒトＩＬ−１３の両方に応答する。
【０１８９】
このデータは、ＩＬ−１３ではなくＩＬ−４が野生型およびヒト化ＩＬ−４Ｒα（Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕ）マウスにおいて種特異性を呈することを示す。
【０１９０】
図５に示すように、ＩＬ−４のＩｇＥクラススイッチングを媒介する主要な因子としての役割が、ヒト化ＩＬ−４Ｒα（Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕ）マウスにおけるマウスＩＬ−２５遺伝子送達の後の循環ＩｇＥレベルの上昇の欠如によって支持された。
【０１９１】
デュピルマブモノクローナル抗体は、インビトロおよびインビボで研究された。
【０１９２】
図６に示すように、デュピルマブは、ヒト化ＩＬ−４Ｒα（Ｉｌ４ｒａｈｕ／ｈｕ）マウス由来の一次Ｂ細胞の培養液において、ヒトＩＬ−４に誘発されたＩｇＥ産生を妨げる。
【０１９３】
図７に示すように、デュピルマブは、１０ｍｇ／ｋｇ以上で、ＩＬ−２５に誘発された肺の症状を用量依存的に低減した（２５ｍｇ／ｋｇで粘液に関する症状を低減した）。
【０１９４】
結論
上記結果は、サイトカインに誘発された炎症を有する遺伝子改変マウスモデルにおける、完全ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒαモノクローナル抗体であるデュピルマブの薬理活性を実証している。
【０１９５】
ヒトＩＬ−４遺伝子および／またはヒトＩＬ−４Ｒα遺伝子による置換を有する遺伝子改変マウスの生成は、異種間での交差反応性が制限された状態で遺伝子オルソログの機能および抗体候補のインビボでの有効性を評価するための強力なツールを提供する。
【０１９６】
実施例５
チリダニ類抽出物（ＨＤＭ）に誘発された肺炎症モデル
チリダニ類（ＨＤＭ）抽出物（Ｇｒｅｅｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の鼻腔内曝露によって、二重にヒト化したＩＬ−４およびＩＬ−Ｒ４αマウスにおいて慢性気道炎症を誘発した。簡潔に述べると、先ず、１０日間のＨＤＭ懸濁液（２．５μｇ／ｍＬの濃度にて２０μｌ）の鼻腔内滴下によってマウスの感受性を高めた。２週間の回復期間後、５週目と１２週目との間に週３回、鼻腔内ＨＤＭ適用によってマウスは再曝露された。皮下注射によるデュピルマブ（抗ＩＬ４Ｒα抗体）の処置を、週に２回の頻度で７週目から開始し、１２週目の実験終了まで行った。さらなる解析のために、組織サンプルを回収した。図８に実験計画を図示する。
【０１９７】
二重にヒト化したＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒαマウスを使用した、ＨＤＭに誘発された気道炎症モデルにおけるデュピルマブの治療有効性の実証
上述のプロトコルを使用して、二重にヒト化したＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒα（ＩＬ−４ｈｕ／ｈｕ／ＩＬ−４Ｒｈｕ／ｈｕ）マウスにおいて気道疾患を誘発した。肺組織の組織学的解析により、鼻腔内へのＨＤＭ滴下が気道における粘液産生の増加を引き起こしたことが示された。デュピルマブの処置は、ＨＤＭに曝露されたマウスにおける粘液貯留を低減した。気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の浸潤細胞の解析により、好酸球数が、ＨＤＭ滴下によって増加し、デュピルマブの処置によって減少したことが示される。ヒト化したマウスにおけるＨＤＭの処置によって総循環ＩｇＥが上昇したが、これは有能なＩＬ−４シグナル伝達経路を示唆する。デュピルマブの使用により、ＩｇＥのレベルを低減できた。対照的に、ＩＬ−４シグナル伝達に干渉することなくＩＬ−１３とのみ拮抗するコンパレーター分子であるＩＬ１３Ｒ２α−Ｆｃは、粘液貯留の低減および好酸球浸潤の防止において同等の活性を有した。にもかかわらず、循環ＩｇＥレベルでは、デュピルマブとＩＬ−１３拮抗薬であるＩＬ１３Ｒ２α−Ｆｃとの間で差を示す効果が検出された。ＩＬ−１３経路単独の遮断は、ＨＤＭに誘発されたＩｇＥレベルを低減するには不十分であったが、一方で、デュピルマブは、ＩＬ−４経路およびＩＬ−１３経路の両方を遮断することによって、アレルギーの主たる病原性媒介物であるＩｇＥの産生を低減した。
【０１９８】
別個の実験の組では、異なる対照を使用したことを除いて上述のものと同一のプロトコルを使用して、二重にヒト化したＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒα（ＩＬ−４ｈｕ／ｈｕ／ＩＬ−４Ｒｈｕ／ｈｕ）マウスにおいて気道疾患を誘発した。これらの実験では、デュピルマブと同一のＩｇＧアイソタイプのアイソタイプ対照抗体を使用した。図９に実験計画を図示する。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ｍＲＮＡキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ）を使用して全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製し、Ｓｃｒｉｐｔｓｅｑ  ＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してｍＲＮＡからストランド特異的なＲＮＡ配列ライブラリを調製した。３３ｂｐの読み取り長さでＨｉＳｅｑ  ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してライブラリをシーケンシングし、Ｃｌｃｂｉｏ（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＮＡ−Ｓｅｑワークフローを使用して未加工の読み取りから遺伝子発現レベルを抽出した。実験群間で差を示すように発現された遺伝子を、スチューデントのｔ検定（ｐ＜０．０５、変動比≧１．５）を使用して同定した。これらの遺伝子の発現クラスターをＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸ７．３由来のピアソン相関クラスタリングアルゴリズムを使用して生成した。二重にヒト化したＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒαマウスにおいて、ＨＤＭが肺の遺伝子発現の変動を誘発することが見出され、かかる変動は、デュピルマブによって遮断された。処置期間の終了時に安楽死させたマウスから血清サンプルを回収した。血清のネズミＩｇＥレベルを市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して測定した。通常の一元配置ＡＮＯＶＡ法を使用して統計解析をおこなった。
【０１９９】
実施例６
抗原に誘発された皮膚炎症モデル
二重にヒト化したＩｌ−４およびＩｌ−４Ｒαマウスにおける慢性皮膚炎を、以下の手順で誘発できる。ヒト化したマウスの背中の毛を電気バリカンで剃り、次いで粘着テープで剥いで軽い傷を負わせ、皮膚バリアを破壊した。アレルゲン（オボアルブミンに細菌毒素またはチリダニ類抽出物を加えたものなど）の溶液に浸したガーゼパッチを１週間、皮膚に取り付け、これに続く２週間を回復期間とした。合計で７週間の間に、この手順を３回繰り返し、アトピー性皮膚炎様の皮膚病巣を誘発する。処置したマウスは、ＩｇＥレベルの増加、掻痒、上皮の肥厚、アトピー性皮膚炎の典型的な症状を有することになる。
【０２００】
実施例７
ヒト化ＩＬ−４Ｒαを発現するマウスにおける抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体のＰＫプロファイルの特徴付け
この実施例は、ＲＥＧＮ６６８（ヒトＩＬ−４Ｒαを対象とするヒトモノクローナル抗体、「デュピルマブ」としても知られる）および対照抗体ＲＥＧＮ６４６（サル代用、抗ｍｆＩＬ−４Ｒ非結合対照抗体）のＰＫプロファイルを評価するために実施される実験を記載する。
【０２０１】
これらの実験で使用されたマウスは、ＭＡＩＤ  １４４４（ヒト化ＩＬ−４Ｒα、または「ＩＬ−４ＲαＨｕｍＩｎ」についてホモ接合性であり、ＩＬ−４Ｒα細胞外ドメインはヒトのものであり、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインはマウスのものである）および系統を一致させた（７５％がＣ５７ＢＬ／６、２５％が１２９Ｓｖ）野生型（「ＷＴ」）の２０〜２３週齢のマウスであった。研究群は、薬剤当たり／投与当たりのコホートサイズが５匹のホモ接合性および５匹の系統を一致させたＷＴである、オスおよびメスの、合計４０匹のマウスを含んだ。抗体（ＰＢＳ緩衝液中）を、皮下注射により１０ｍｇ／ｋｇにてマウスに与えた。解析のために、注射した日（タイムポイント「０」または０日目）、注射の６時間後、ならびに１日目、３日目、７日目、１０日目、１４日目、２１日目、および３０日目にそれぞれ血液サンプルを採取した。
【０２０２】
循環する薬剤（すなわち、ＲＥＧＮ６６８またはＲＥＧＮ６４６）のレベルは、ＥＬＩＳＡイムノアッセイを使用する全ヒト抗体解析によって決定した。簡潔に述べると、ヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃１０９−００５−０９８）を９６ウェルプレート上にコーティングして、試験される血清中のヒト抗体を捕捉し、次いでプレートに結合した抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃１０９−０３５−０９８）およびＴＭＢ基質（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて検出した。血清サンプルを、１：１００〜１：２４３，０００の範囲でサンプルごとに６段階に段階希釈し、それぞれの抗体の参照標準を１２段階に段階希釈した。血清中の薬剤抗体濃度を、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して作成した参照標準曲線に基づいて算出した。
【０２０３】
マウスＩＬ−４Ｒαタンパク質のみを有する野生型マウスと比較して、ＩＬ−４Ｒα  ＨｕｍＩｎマウスでは、ＲＥＧＮ  ６６８の半減期が短くなることが見出された。ＰＫプロファイルにおけるこの差異は、モノクローナル抗体とヒトＩＬ−４α受容体との間の、標的により媒介される相互作用および排除によって説明できる。したがって、ヒトまたはヒト化ＩＬ−４Ｒαを発現するマウスは、前臨床マウスモデルにおいて抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体（例えば、デュピルマブ）のＰＫ特性を特徴付けるために好適なシミュレーションを提供する。
【０２０４】
ヒト化ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαマウスの用途
ヒト化ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαは、ヒト特異的なＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬（例えば、中和性の抗ＩＬ−４抗体および／または抗ＩＬ−４Ｒα抗体、例えば、デュピルマブ）の薬力学（ＰＤ）を評価するために有用である。
【０２０５】
ヒト化ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαマウスにおける薬物動態学（ＰＫ）アッセイおよびＰＤアッセイは、当該技術分野で既知の標準的な手順に従って遂行される。
【０２０６】
ヒト化ＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒαマウスは、ヒト特異的なＩＬ−４および／またはＩＬ−４Ｒα拮抗薬（例えば、中和性の抗ＩＬ−４抗体および／または抗ＩＬ−４Ｒα抗体、例えば、デュピルマブ）のインビボでの治療有効性を、例えば本明細書の上記に示したような、当該技術分野で既知の様々な疾患モデルにおいて試験するために有用である。
【０２０７】
実施例８
ヒトＩＬ−３３遺伝子による内因性マウスＩＬ−３３遺伝子の置換
マウスＩＬ−３３遺伝子（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：７７１２５、一次ソース：ＭＧＩ：１９２４３７５；ＲｅｆＳｅｑ転写物：ＮＭ＿００１１６４７２４．１；ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ：Ｑ８ＢＶＺ５；ゲノムアセンブリ：ＮＣＢＩ３７／ｍｍ９；場所：ｃｈｒ１９：２９，９９９，６０４−３０，０３５，２０５  ＋ストランド）は、８個のエクソンを有し、２６６アミノ酸のタンパク質をコードする（GenBank  Accession  No.  NP_001158196.1）。
【０２０８】
ヒトＩＬ−３３遺伝子（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：９０８６５、一次ソース：ＨＧＮＣ：１６０２８；ＲｅｆＳｅｑ転写物：ＮＭ＿０３３４３９．３；ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ：Ｏ９５７６０；ゲノムアセンブリ：ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９；場所：ｃｈｒ９：６，２１５，１４９−６，２５７，９８３  ＋ストランド）も、８個のエクソンを有し、２７０アミノ酸のタンパク質をコードする（GenBank  Accession  No.  NP_254274.1）。
【０２０９】
ヒトＩＬ−３３遺伝子のＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン２からエクソン８まで（３’非翻訳領域を含む）を含有する１６３３３ｂｐのヒトゲノムセグメントにより、ＡＴＧ開始コドンから開始するエクソン２から終止コドンを含むエクソン８のコーディング部分まで広がる９３８１ｂｐのマウスＩＬ−３３遺伝子遺伝子座を置換した。図１０Ａを参照のこと。
【０２１０】
単一の標的化工程で、ヒトＩＬ−３３ゲノムセグメントによりマウスＩＬ−３３遺伝子を置換するための標的化構築物は、ＶｅｌｏｃｉＧｅｎｅ（登録商標）遺伝子工学技術（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，２１（６）：６５２−６５９を参照のこと）を使用して構築した。これは、マウスおよびヒトのＩＬ−３３  ＤＮＡを、それぞれ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンであるｂＭＱ−３５０Ｉ１８およびＣＴＤ−３０１５Ｍ１５から得たこと、ならびに標的化ベクターがｌｏｘＰネオマイシン選択カセットを含んでいたことを除いて、ヒトＩＬ−４ゲノムセグメントによりマウスＩＬ−４遺伝子を置換するための上記の実施例１に記載された手順と類似である（図１０Ｂ）。
【０２１１】
適正に標的化されたＥＳ細胞クローン（ＭＡＩＤ  ７０６０）を、ロスオブネイティブアレル（ＬＯＮＡ）アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．２００３）によって同定した。上記アッセイでは、除去の対象となったマウスＩＬ−３３遺伝子内の配列に対して特異的な２つのＴａｑＭａｎ（商標）定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって、天然の、改変されていないＩＬ−３３遺伝子のコピーの数を決定した。ｑＰＣＲアッセイは、以下のプライマー−プローブのセットを含んだ（５’から３’へと記載される）：
上流（「ｍＴＵ」）：
フォワードプライマー、ＴＴＧＧＡＣＴＡＧＴＡＡＣＡＡＧＡＡＧＧＧＴＡＧＣＡ（配列番号：３１）；
リバースプライマー、ＣＣＴＴＴＣＣＣＡＴＣＡＣＣＣＴＣＴＡＡＣＴＴ（配列番号：３２）；
プローブ（ＭＧＢ）、ＡＧＣＴＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＡ（配列番号：３３）；
下流（「ｍＴＤ」）：
フォワードプライマー、ＴＣＴＣＴＧＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＴＡＴＣＣ（配列番号：３４）；
リバースプライマー、ＧＧＣＴＧＣＡＴＧＧＡＡＧＡＧＧＴＧＡＡ（配列番号：３５）；
プローブ（ＭＧＢ）、ＣＴＣＴＣＣＡＣＡＡＡＴＣＧ（配列番号：３６）。
【０２１２】
ヒトＩＬ−３３遺伝子の配列が、ヒト化した対立遺伝子においてマウスＩＬ−３３遺伝子配列と置き換わったことの確認は、以下のプライマー−プローブのセットを含むＴａｑＭａｎ（商標）ｑＰＣＲアッセイによって確認された（５’から３’へと記載される）：
上流（「ｈＴＵ」）
フォワードプライマー、ＣＡＧＧＣＡＧＧＡＡＴＡＧＣＴＧＡＧＡＴＡＡＴＣＴ（配列番号：３７）；
リバースプライマー、ＴＧＴＧＧＡＧＣＡＡＡＡＡＧＴＧＧＴＴＧＡＴ（配列番号：３８）；
プローブ（ＭＧＢ）、ＣＣＴＧＴＧＡＡＴＡＧＴＧＡＴＡＡＡＣ（配列番号：３９）；
下流（「ｈＴＤ」）：
フォワードプライマー、ＣＡＧＴＴＣＣＡＡＡＣＧＡＴＡＧＧＣＴＣＡＡ（配列番号：４０）；
リバースプライマー、ＡＴＡＡＴＴＣＴＧＴＧＡＡＧＣＡＴＣＴＧＧＴＣＴＴＣ（配列番号：４１）；
プローブ（ＭＧＢ）、ＣＴＡＧＡＧＣＴＧＣＴＡＧＴＡＡＡＡ（配列番号：４２）。
【０２１３】
ネズミのＩＬ−３３遺伝子座とヒトＩＬ−３３遺伝子を含有する配列との上流ジャンクション（図１０Ｂでは「Ｉ」で示される）は、
【化６】
2020058379.tif 000007
内となるように設計され、ここで、ヒトＩＬ−３３配列は斜字体で示され、ヒト開始コドンＡＴＧは下線付きで示される。ヒトＩＬ−３３ゲノム配列を含む配列とｌｏｘＰネオマイシン選択カセットとの下流ジャンクション（図１０Ｂでは「ＩＩ」で示される）は、
【化７】
2020058379.tif 000008
内となるように設計され、ここで、ヒトＩＬ−３３配列は斜字体で示され、ジャンクションは「／」記号で示され、ｌｏｘ  Ｐ部位は下線付きで示される。ｌｏｘＰｎｅｏ選択カセットの配列とネズミのＩＬ−３３遺伝子座との下流ジャンクション（図１０Ｃでは「ＩＩＩ」で示される）は、５’−ＡＧＣＣＣＣＴＡＧＡ  ＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡ  ＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣ  ＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴ  ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＡ  ＡＣＴＡＴＡＡＣＧＧ  ＴＣＣＴＡＡＧＧＴＡ  ＧＣＧＡＧＣＴＡＧＣ／ＣＧＣＣＴＧＴＧＣＧ  ＴＴＣＴＧＧＧＴＴＧ  ＡＡＴＧＡＣＴＴＡＡ  ＴＧＣＴＴＣＣＡＡＣ  ＴＧＡＡＧＡＡＡＧＧ  ＧＴＡＡＣＡＧＡＧＡ  ＧＡＡＡＧＡＡＡＧＣ  ＣＡＴＴＣＴＴＧＧＣ−３’（配列番号：４５）内となるように設計され、ここで、ジャンクションは「／」記号によって示され、ｌｏｘＰ部位は下線付きで示される。
【０２１４】
適正に標的化されたＥＳ細胞（ＭＡＩＤ  ７０６０）を、一過性Ｃｒｅ発現ベクターを用いてさらに電気穿孔して、薬剤選択カセットを除去し、薬剤カセットを有さないＥＳ細胞クローン（ＭＡＩＤ  ７０６１）を得た。これらのＭＡＩＤ  ７０６１  ＥＳ細胞内の上流ジャンクション（図１８Ｃでは「Ｉ」で示される）は、ＭＡＩＤ  ７０６０  ＥＳ細胞内のものと同一である。下流ジャンクション（図１８Ｃでは「ＩＩ」で示される）は、
【化８】
2020058379.tif 000009
内となるように設計され、ここで、３’ヒトＩＬ−３３配列は、最初の「／」記号の前まで斜字体で示され、マウスＩＬ−３３  ３’配列は、２番目の「／」記号の後ろから斜字体で示され、ｌｏｘＰ部位は下線付きで示される。
【０２１５】
適正に標的化されたＥＳ細胞（ＭＡＩＤ  ７０６０またはＭＡＩＤ  ７０６１）を、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）法によって８細胞期のＳＷマウス胚に導入した（米国特許第７，２９４，７５４号、同第７，５７６，２５９号、同第７，６５９，４４２号、およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）  Ｆ０  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｍｉｃｅ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｆｕｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｄｏｎｏｒ  ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ  ａｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１−９９を参照のこと）。ヒト化ＩＬ−３３遺伝子を有するＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅ（登録商標）（ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウス）を、対立遺伝子アッセイの改変を用いてマウス対立遺伝子の消失およびヒト対立遺伝子の獲得について遺伝子型を決定することによって同定した（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）を参照のこと）。標的化されたＥＳ細胞に由来するマウスついて、尾部の生検から精製されたＤＮＡをアッセイして、それらのＩＬ−３３遺伝子型を決定し、ヒト化ＩＬ−３３対立遺伝子が生殖系列を通じて伝達されたことを確認するために、同一のＬＯＮＡアッセイを使用した。置換についてヘテロ接合性の２匹の子を交配して、内因性マウスＩＬ−３３遺伝子のヒトＩＬ−３３遺伝子による置換についてホモ接合性であるマウスを生成した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【配列表】
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