(57)【要約】      （修正有）【課題】生体分子の回収及び細胞の破砕の分野に関し、特に、細胞懸濁液から細胞内生体分子（例えば、ポリペプチド又はポリヌクレオチド）を回収する方法を提供する。【解決手段】正に荷電した微粒子が粉砕したポリマー陰イオン交換樹脂を含み、負に荷電した微粒子が粉砕したポリマー陽イオン交換樹脂を含み、正に荷電した微粒子及び／又は負に荷電した微粒子を使用して、生体分子を回収する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子を回収するための正に荷電した微粒子及び／又は負に荷電した微粒子の使用であって、該正に荷電した微粒子が粉砕したポリマー陰イオン交換樹脂を含み、該負に荷電した微粒子が粉砕したポリマー陽イオン交換樹脂を含む、使用。
【請求項２】
生体分子がポリペプチド又はポリヌクレオチドである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
該正に荷電した微粒子及び／又は負に荷電した微粒子がフロックを形成する、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
細胞を破砕するための正に荷電した微粒子及び／又は負に荷電した微粒子の使用であって、該正に荷電した微粒子が粉砕したポリマー陰イオン交換樹脂を含み、該負に荷電した微粒子が粉砕したポリマー陽イオン交換樹脂を含む、使用。
【請求項５】
陰イオン交換樹脂及び陽イオン交換樹脂が、ポリスチレン系、ヒドロキシエチルメタクリラート（ＨＥＭＡ）系、ジメチルアミノエチルメタクリラート（ＤＭＡＥＭＡ）系、ジメチルアミノエチルメタクリラート（ｐＤＭＡＥＭＡ）、ポリアクリルアミド系、メタクリル酸（ＭＡＡ）系である、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂が、ジビニルベンゼンと架橋したポリスチレンである、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
微粒子が約５μm未満の平均粒子径を有する、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
正に荷電した微粒子又は負に荷電した微粒子が、ポリマー陰イオン交換及び／又は陽イオン交換樹脂を粉砕することによって得られ得る、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
陰イオン交換樹脂が、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４００、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４８５、Ｄｏｗｅｘ  １Ｘ２−１００、Ｄｏｗｅｘ  １−８−１００、Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ａ２又はＤＩＡＩＯＮ  ＳＡ  ２０Ａである、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
陽イオン交換樹脂が、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＣ−７４８、Ｄｏｗｅｘ  ５０  ＷＸ２−１００、Ｄｏｗｅｘ  ５０  ＷＸ８−１００、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ＭＳＣ又はＤＩＡＩＯＮ  ＳＫ  １１０である、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
細胞が真核細胞又は原核細胞である、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
生体液から生体分子を得る方法であって、ａ）請求項１〜１０のいずれか一項に定義される正に荷電した微粒子及び／又は負に荷電した微粒子を生体液に添加すること、並びに該生体液から該生体分子を回収することを含む、方法。
【請求項１３】
ｂ）前記微粒子にフロックを形成させること、ｃ）生体液から該フロックを除去すること、及びｄ）から生体分子を脱離することを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞を破砕する方法であって、正に荷電した微粒子及び／又は負に荷電した微粒子を細胞懸濁液に添加することを含む、方法。
【請求項１５】
細胞から生体分子を放出させることを更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
生体分子がポリペプチド又はポリヌクレオチドである、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
正に荷電した微粒子及び／又は負に荷電した微粒子を含む生体液であって、該正に荷電した微粒子が粉砕したポリマー陰イオン交換樹脂を含み、該負に荷電した微粒子が粉砕したポリマー陽イオン交換樹脂を含む、生体液。
【請求項１８】
フロックを更に含む、請求項１７における液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔発明の分野〕
本発明は、概して、生体分子の回収及び細胞の破砕の分野に関し、特に、細胞懸濁液からの細胞内生体分子（例えば、ポリペプチド又はポリヌクレオチド）の回収に関する。それは、生体液などの液体から生体分子を回収する方法を包含する。更なる局面では、本発明は、細胞培養、及び細胞培養物からの生体分子の精製の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
〔発明の背景〕
人工生産システムの開発に関するあらゆる過去の努力にもかかわらず、細胞などの生物学的実体は、抗生物質、タンパク質及び核酸などの複雑な物質を産生するそれらの能力の点で無類のものである。今日の工業的に生産されたほぼ全ての細胞起源の物質は、細胞内で産生された後に環境に排出される細胞外産物である。しかしながら、潜在的に有用な物質の大部分は、細胞内に残る。細胞内物質を放出させるために、典型的には、機械的、物理的、化学的又は酵素的な手段によって、細胞を分解する。価値ある細胞産物の回収効率は、生体系内におけるそれらの形成、位置及びそれらの相互作用に密接に関連している。過去数十年間において、分子構造及びこれらの細胞系内におけるそれらの機能の調査により、このような産物及びそれらの大規模処理の多様性が高まってきた。同時に、産物の品質に関する要求により、特に医療分野では、明確に定義された有効かつ高純度の物質を送達する必要性が生じた。
【０００３】
現在の細胞破砕方法としては、機械的方法及び非機械的方法が挙げられる。非機械的方法は、物理的（減圧、浸透圧ショック、熱分解、凍結乾燥、マイクロ波）、化学的（抗生物質、キレート剤、界面活性剤、溶媒、アルカリ、超臨界ＣＯ２）及び酵素的（溶解、自己融解、ファージ）な方法を含む。一方、細胞破砕のための機械的アプローチ及びデバイスは、ビーズミル、ホモジナイザー、キャビテーション（超音波、流体力学）及びマイクロフリュイダイザーを含む。工業規模では、（主に機械的な）いくつかの細胞破砕方法のみが実施されており、それらは一般的に、下流の（例えば、回収、精製）処理に統合されている。
【０００４】
大規模の場合、最も一般的な機械的方法はビーズミル及び高圧ホモジナイゼーションであり、これらは、典型的には、標準的な操作として実行される。高圧ホモジナイゼーションを使用する場合、細胞溶液は、高圧下で狭いバルブを通して押し出される。バルブを通過することにより、細胞は、排出時に乱流、キャビテーション、高剪断力及び急激な圧力低下に供されて、細胞がバラバラになる。構築では、バルブのストレス及び浸食を考慮しなければならず、ホモジナイゼーション圧力の上昇と共にこれらは増加する。更に、溶液の温度が圧力の増加と共に上昇することにより、この方法はエネルギーを消費するようになり、特に温度不安定性酵素が放出される場合に、必要なデバイス及び懸濁液が冷却される。ホモジナイザーによって消費される電力の約９０％超が熱として散逸し、冷却コストが、細胞破壊の総コストの大部分に相当する。更に、十分に高い収率を達成するためには、連続継代がしばしば必要とされる（非特許文献１）。
【０００５】
ビーズミルでは、ビーズを生体液に添加し、これを続いて撹拌又は振盪することによって高速撹拌に供する。ビーズとの衝突によって、細胞が破砕され、細胞内容物が放出される。ビーズミルは熱も発生し、冷却を必要とする。それは、ビーズミルの構築、動作パラメータ及び産物特異的な特性を含む様々なパラメータによって影響されるかなり複雑なプロセスである。ビーズミルの構築及び形状は、重要なプロセス変数である。しかしながら、より小さなバージョンは、工業規模のビーズミルとはしばしば幾何学的に似ておらず、このことが、実験室試験のデータからバッチパフォーマンスを推定することを困難にしている（非特許文献１）。
【０００６】
機械的破砕方法は、いくつかの欠点に悩まされている。細胞が完全に破砕されるので、全ての細胞内物質が放出され、それにより、中間産物の夾雑物含量が増加する。したがって、タンパク質、核酸及び細胞フラグメントの複雑な混合物から、目的の産物を分離しなければならない。加えて、放出された核酸は溶液の粘度を増加させ得るので、後の処理工程（例えば、クロマトグラフィー）を複雑にし得る。機械的破壊によって生成される細胞残屑は、しばしば小さな細胞フラグメントからなるので、溶液を清澄化することが困難になる。産物の完全な放出は、破砕デバイスに複数回通過させる必要がしばしばあり、フラグメントのサイズを更に減少させることにより問題を悪化させる。デバイスのスループットは粒子径の二乗に反比例するので、これらは、連続遠心分離によって除去することが困難である。ホモジネートの粘着性によって、及び膜を詰まらせるその傾向によって、ろ過は困難である。更に、機械的方法は、定期的なメンテナンス及び高価な装置を必要とし、エネルギーを消費する。それらは熱を発生し、温度感受性酵素で使用可能であるためには大規模な冷却を必要とする。更に、それらは、細胞を、したがって抽出産物を高い剪断応力に曝露する。デバイスが十分に冷却されていないと、ほとんどの産物は、発生した熱によって変性する。
【０００７】
上述のように、より選択的な放出方法は、物理的、化学的又は酵素的な処理を含む。化学的な処理は、ＥＤＴＡ、カオトロピック剤、有機溶媒、抗生物質、酸、アルカリ及び界面活性剤の使用を含む。過剰な化学物質の廃棄物処理の問題に加えて、これらの方法はかなり高価であるので、大規模な用途に適さない。所望の産物と化学物質との夾雑は、別の欠点である。いくつかの化学物質はあまり選択的ではなく、感受性タンパク質、酵素及び細胞壁を損傷する傾向がある。
【０００８】
酵素的細胞破砕はより特異的であるが、いくつかの別々の層を有する複雑な細胞構造（例えば、細菌細胞壁）に適用する場合にはしばしば限定される。更に、それは、酵素及び緩衝液のコストによって制限される。したがって、酵素処理は、大規模又は工業規模のいずれにおいても適用可能ではない。別の欠点は、所望の産物と酵素との潜在的な夾雑である。
【０００９】
物理的透過は、凍結融解又は浸透圧ショック処理によって達成され得る。凍結融解では、産物の効率的な放出のためには複数のサイクルが必要であり、このプロセスが非常に長期であり得る。一方、浸透圧ショック処理は、強固な細胞壁構造を有する細胞を破砕するために十分ではない場合がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Kula et al.,「Purification of Proteins and the Disruption of Microbial Cells.」 Biotechnology Progress 1987
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
要するに、これらの方法の欠点としては、コストが比較的高いこと、大規模では実用性が低いこと、効率及び再現性が低いこと、並びに添加した物質を放出後に除去する必要性があることが挙げられる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
細胞産生系の可能性を考慮すると、特に細胞懸濁液から生体分子を回収するための別の方法であって、取り扱いが容易で、コスト効率がよく、拡張性がある方法が必要である。更に、前記方法は、感受性生体分子産物にとって十分に穏やかでなければならず、夾雑が少ない産物をもたらす高選択的な生体分子の回収を可能にするものでなければならない。したがって、本発明の１つの目的は、上記欠点の１つ以上を克服する方法又はシステムを提供することである。
【００１３】
本明細書で使用される「a」、「an」及び「the」という単数形は、特に文脈上明確な指示がない限り、複数の言及を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「試薬」への言及は、そのような異なる試薬の１つ以上を含み、「方法」への言及は、本明細書に記載される方法に関して改変及び置換され得る、当業者に公知の同等の工程及び方法への言及を含む。
【００１４】
特に指示がない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、その一連におけるあらゆる要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、単なる慣用の実験を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施態様の多くの均等物を認識するか、又は確かめることができるであろう。そのような均等物は、本発明によって包含されることが意図される。
【００１５】
「及び／又は」という用語は、本明細書で使用される場合は常に、「及び」、「又は」及び「前記用語によって接続される要素の全て若しくは任意の他の組み合わせ」の意味を含む。
【００１６】
本明細書で使用される「約」又は「およそ」という用語は、所定の値又は範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。しかしながら、それはまた、具体的な数を含む（例えば、約２０は、２０を含む）。
【００１７】
「未満」又は「超」という用語は、具体的な数を含む。例えば、２０未満は、未満又は等しいことを意味する。同様に、超（more than）又は超（greater than）は、それぞれ、超又は等しいこと（more than or equal to）、或いは超又は等しいこと（greater than or equal to）を意味する。
【００１８】
本明細書及び以下の特許請求の範囲を通して、特に文脈上必要ない限り、「含む（comprise）」という語、並びに「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」等の変化形は、記述される整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群を含むことを意味するが、任意の他の整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群を除外することを意味しないと理解される。本明細書で使用される場合、「含む（comprising）」という用語は、「含有する（containing）」若しくは「含む（including）」という用語で置換し得るか、又は本明細書で使用される場合には「有する（having）」という用語で置換し得ることもある。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「からなる（consisting of）」は、請求項の事項で特定されていない任意の要素、工程及び成分を除外する。本明細書で使用される場合、「から本質的になる（consisting essentially of）」は、請求項の基本的及び新規な特徴に実質的に影響を与えない材料及び工程を除外しない。
【００２０】
本明細書における各事例において、「含む（comprising）」、「から本質的になる（consisting essentially of）」及び「からなる（consisting of）」という用語のいずれかは、他の２つの用語のいずれかで代替され得る。
【００２１】
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコール、材料、試薬及び物質などに限定されず、このようなものは変化し得ることを理解すべきである。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施態様を説明する目的のためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図せず、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ定義される。
【００２２】
本明細書の本文全体にわたり引用される全ての刊行物及び特許（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、説明書などを含む）は、上記又は下記にかかわらず、その全体が参照により本明細書に援用される。本明細書のいかなる記載事項も、本発明が、先行発明によるそのような開示に対する先行権を有しないという自認と解釈されるべきではない。参照により援用される事項が本明細書と矛盾又は相反するまで、本明細書は、いずれのそのような事項にも取って代わる。
【００２３】
〔要旨〕
本発明は、生体分子を得る（生体分子の回収とも称される）ための新規な方法であって、上記欠点の１つ以上を克服する新規な方法を提供する。前記方法は、液体及び流体、例えば細胞培養物、細胞ホモジネート、細胞溶解物、細胞懸濁液、発酵ブロス、培養ブロス、発酵上清、培養上清、細胞上清、例えばE. coli、Pichia pastoris及びＣＨＯ細胞上清から生体分子を得るために使用され得る。更に、本発明は、細胞に含まれる生体分子を放出させるために使用され得る細胞破砕方法を含む。本明細書に示されるように、本発明は、細胞の破砕及び細胞内生体分子の回収に特に有用である。本明細書に開示される方法は、簡便でコスト効率がよく、工業的適用のために容易に拡張可能である。前記方法は、生体分子を選択的に回収するための簡単な方法であって、複雑な装置も可溶性添加剤（緩衝剤及び塩を除く）も必要としない方法を提供する。前記のように、細胞懸濁液から生体分子を回収するための従来技術の方法は、機械的応力及び／又は化学的添加剤のいずれかを含む。今日では工業規模で適用される従来の方法とは対照的に、本発明の方法は穏やかであり、細胞及び／又は所望の生体分子産物を過酷な条件に供さない。したがって、本明細書に開示される方法は、夾雑残屑の量を減少させ、所望の生体分子に対する潜在的に有害な機械的応力及び物理的応力をより一層与えない。
【００２４】
本発明者らは、驚くべきことに、粉砕した樹脂を含む荷電した微粒子又は疎水性微粒子が、生体液から生体分子を回収する（本明細書では「抽出する」とも称される）ように作用し得ることを発見した。更に、いくつかの実施態様では、細胞懸濁液に添加した場合、荷電した微粒子は細胞を破砕し得ると同時に、細胞から放出された生体分子を吸着し得る。したがって、一局面では、前記微粒子は、簡便で拡張可能な態様で細胞を破砕し、生体分子を放出させ、生体分子を更に吸着するために使用され得る。いくつかの局面では、前記微粒子は、細胞及び／又は生体分子及び／又は逆電荷微粒子との相互作用によりフロックを形成することが見出され、生体液から容易に分離され得る。したがって、放出された生体分子は、生体分子が吸着したフロックを分離することによって容易に回収され得る。したがって、本発明は、下流処理における細胞破砕工程及び生体分子抽出工程を組み合わせた簡易な方法を更に提供する。この技術は、コロイド固相抽出（ＣＳＰＥ）と称される。理論に拘束されるものではないが、陰イオン交換樹脂由来の正に荷電した微粒子は、負に荷電した細胞表面に吸着し、それにより、特に細菌細胞の通常負に荷電した細胞表面に会合している陽イオン（特に、カルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオン）を置換することによって、細胞とフロックを構築すると想定される。その結果、細胞膜を構築する一連の分子がいくらか不安定になることによって、細胞が漏出性になる。
キレート陽イオン交換樹脂由来の負に荷電した粒子の場合、このような粒子は陽イオン（特に、カルシウム及び／又はマグネシウム）に結合し、それにより、細胞膜を構築する一連の分子を不安定化すると想定される。疎水性微粒子の場合、それらはフロックを形成することも見出された。
【００２５】
現在のところ、これは、細胞構造（例えば、細胞壁）のフラグメント化が少ない細胞を穏やかに「開放して」、夾雑物レベルの低下をもたらすことによる、細胞内生体分子の独特な抽出方法である。同時に、この新規技術は、生体分子の選択的抽出を可能にし、当技術分野で公知の機械的破砕方法（例えば、高圧ホモジナイゼーション及びビーズミル）と効率の点で同程度であるが、より高い選択性及びより低い夾雑レベルを提供する。同時に、本明細書に開示される新規な方法を使用して、所望の生体分子を回収しつつ、細胞の完全性を維持することが可能である。したがって、しかしながら好ましくは、細胞の「開放」は、細胞が完全には破砕されないことを意味する。したがって、「開放」は、好ましくは、細胞が漏出性になることにより、それらの細胞質内容物が漏出することを意味する。
【００２６】
第１の局面では、本発明は、生体分子を回収するための正に荷電した微粒子及び／又は負に荷電した微粒子の新規な使用であって、該正に荷電した微粒子が粉砕したポリマー陰イオン交換樹脂を含み、該負に荷電した微粒子が粉砕したポリマー陽イオン交換樹脂を含む新規な使用を提供する。一実施態様では、正に荷電した微粒子のみを使用する。別の実施態様では、負に荷電した微粒子のみを使用する。更なる実施態様では、正に荷電した微粒子及び負に荷電した微粒子の両方を使用する。
【００２７】
本発明の第２の局面では、前記組成物は、疎水性微粒子を含む。これらの疎水性微粒子は、特定のペプチド又はポリペプチドに吸着することができるが、他の生体分子にも吸着することができる。吸着機構は、吸着リガンド（例えば、ペプチド又はポリペプチド）の疎水性部分と、微粒子のポリマー表面との間の疎水性（ファンデルワールス、ロンドンタイプ）引力に主に基づくものであると考えられる。
【００２８】
微粒子は、本明細書に記載されるように樹脂を粉砕することによって、例えば、イオン交換樹脂を粉砕し、場合により粉砕した樹脂をコンディショニングすることによって得ることが可能である（得られ得る）。このような粒子は、本明細書では「微粒子」、「吸着剤粒子」、「吸着剤」、「粒子」、「粉砕した粒子」又は「粉砕した樹脂」と称される。これらの用語は、互換的に使用される。好ましくは、微粒子は、従来の大直径小孔粒子（これは通常、水の脱イオン化及び廃水処理を意図されるものである）を粉砕することによって得られる。
【００２９】
正に荷電した微粒子は、陰イオン交換樹脂を粉砕することによって調製され得る。陰イオン交換樹脂は、弱塩基性又は強塩基性であり得る。同様に、陽イオン交換樹脂は、負に荷電した微粒子を調製するために使用され得る。陽イオン交換樹脂は、弱強酸性又は強酸性であり得る。本発明のいくつかの実施態様では、陽イオン交換樹脂及び／又は陰イオン交換樹脂は、キレート樹脂であり得る。
【００３０】
本発明のイオン交換樹脂は、任意の適切な材料をベースとし得る。好ましくは、樹脂は、ポリスチレン系、ヒドロキシエチルメタクリラート（ＨＥＭＡ）系、ジメチルアミノエチルメタクリラート（ＤＭＡＥＭＡ）系、ジメチルアミノエチルメタクリラート（ｐＤＭＡＥＭＡ）系、ポリアクリルアミド系又はメタクリル酸（ＭＡＡ）系である。より好ましくは、樹脂は、ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）と架橋したポリスチレンである。
【００３１】
好ましくは、微粒子は、約１０μm未満、例えば約５μm未満の平均粒子径を有する粉砕した粒子の形態である。
【００３２】
本発明の微粒子は、陰イオン交換樹脂又は陽イオン交換樹脂を粉砕することによって得られ得る。陰イオン交換樹脂は、例えば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４００、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４８５、Ｄｏｗｅｘ  １Ｘ２−１００、Ｄｏｗｅｘ  １−８−１００、ＤＩＡＩＯＮ  ＳＡ  ２０Ａ、Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ａ２又は当技術分野で公知の他の陰イオン交換樹脂であり得る。陽イオン交換樹脂は、例えば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＣ−７４８、Ｄｏｗｅｘ  ５０  ＷＸ２−１００、Ｄｏｗｅｘ  ５０  ＷＸ８−１００、ＤＩＡＩＯＮ  ＳＫ  １１０、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ＭＳＣ又は当技術分野で公知の他の陽イオン交換樹脂であり得る。好ましい陰イオン交換樹脂としては、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４５８及びＭａｒａｔｈｏｎ  Ａ２が挙げられる。好ましい陽イオン交換樹脂としては、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＣ−７４８が挙げられる。
【００３３】
別の局面では、本発明は、流体から、生体分子、好ましくはタンパク質又はポリヌクレオチド、例えばＤＮＡ、例えばプラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、ＢＡＣ  ＤＮＡ、ＹＡＣ  ＤＮＡ、ミニサークルＤＮＡを吸着するための、本明細書に開示される正に荷電した微粒子及び／又は負に荷電した微粒子又は疎水性微粒子の使用を提供する。流体は、生体液、例えば細胞ホモジネート、発酵上清、発酵ブロス、培養ブロス、培養上清、細胞溶解物又は細胞懸濁液である。
【００３４】
更に、本発明は、細胞を破砕するための本明細書に開示される微粒子の使用を提供する。好ましくは、破砕した細胞は、微粒子に吸着する生体分子を放出する。破砕のための細胞としては、真核細胞及び原核細胞が挙げられる。一実施態様では、細胞は、原核細胞である。細胞は、限定されないが、Enterobacteriaceae、Pseudomonaceae、Lactobacteriacea又はBacillaceaeを含む群から選択され得る。好ましい一実施態様では、細胞は、E. coliである。
【００３５】
更なる局面では、本発明は、生体分子を得るための方法であって、本明細書に記載される正に荷電した微粒子及び／又は負に荷電した微粒子又は疎水性微粒子を生体液に添加すること、並びに該生体液から該生体分子を回収することを含む方法を提供する。いくつかの実施態様では、前記方法は、微粒子にフロックを形成させること、生体液から該フロックを除去すること、及び該フロックから生体分子を脱離することを更に含む。いくつかの場合では、回収すべき生体分子に応じて、微粒子を使用して、望ましくない細胞構造を有するフロックを形成し得、該フロックを除去した後に、生体分子を流体中に回収する。例えば、遠心分離又はろ過によって、生体液からフロックを除去し得る。一実施態様では、微粒子の添加中及び／若しくは添加後に、並びに／又はフロック若しくは生体液からの生体分子の脱離中に、生体液を撹拌する。
【００３６】
本発明は更に、細胞を破砕する方法であって、荷電した微粒子及び／又は疎水性微粒子を細胞懸濁液に添加することを含む方法を提供する。前記荷電した微粒子は、正に荷電した及び／又は負に荷電したものであり得る。いくつかの局面では、前記方法は、細胞から生体分子を放出させることを更に含む。加えて、本発明はまた、生体液及び正に荷電した微粒子及び／又は負に荷電した微粒子又は疎水性微粒子を提供する。
【００３７】
本発明の正確な性質及びその利点は、以下の説明及び実施例から当業者に明らかである。本発明は、開示される好ましい実施態様又は実施例に限定されない。当業者であれば、他の実施態様及び適用を生み出すために、本発明の教示を容易に適合し得る。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】Ｍａｒａｔｈｏｎ  ＭＳＣ（ＭＭＳＣ）、Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ａ２（ＭＡ２）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＣ７４８及びＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ４５８に関する、官能基及びそれらのポリマーマトリックスへの結合部位の概略的な化学構造。
【図２】１時間インキュベーション（５０mM ＴＲＩＳ、ｐＨ８．０）した時点における、ＧＦＰ発現E. coliからのＧＦＰ回収に対する、Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ａ２微粒子の体積細胞濃度及び樹脂：細胞の体積比の影響。
【図３】１時間インキュベーション（５０mM ＴＲＩＳ、ｐＨ８．０）した時点における、ＧＦＰ発現E. coli（１０％v/v）からのＧＦＰ回収に対する、Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ａ２微粒子の樹脂：細胞の体積比の影響。
【図４】Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ａ２微粒子（樹脂：細胞の体積比１００％、７０％、５０％、３０％、０％）及びｐＨ値（７．５、８．０、８．５）で０．２〜３時間静的インキュベーションした時点における、ＧＦＰ発現E. coli含有細胞ブロスからのＧＦＰ回収に対する、ｐＨ、インキュベーション時間及び樹脂：細胞の体積比の影響。
【図５】Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ａ２微粒子（樹脂：細胞の体積比１００％、７０％、５０％、３０％、０％）及び異なるＮａＣｌ濃度（５００mM、１００mM、５０mM、０mM）で１時間インキュベーション（５０mM ＴＲＩＳ、ｐＨ８．０）し、１M ＮａＣｌで溶出した後における、ＧＦＰ発現E. coli（１０％v/v）からのＧＦＰ回収に対する、塩濃度の影響。
【図６】異なるＮａＣｌ濃度（５００mM、１００mM、５０mM、０mM）で静的インキュベーション（５０mM ＴＲＩＳ、ｐＨ８．０）し、１M ＮａＣｌで溶出した後における、Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ａ２微粒子（樹脂：細胞の体積比１００％、７０％、５０％、３０％、０％）に対する吸着による、E. coli細胞（１０％v/v）から抽出したＧＦＰの平衡容量。１M ＮａＣｌ中の溶出の前後に蛍光によって、水相からのＧＦＰを定量した。ＧＦＰの量の差分が樹脂に吸着したとみなした。標準「ラングミュア」式を用いて、傾向をフィッティングした。
【図７】キレートＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＣ  ７４８微粒子（樹脂：細胞の体積比７０％、３０％）と共に撹拌（１〜２時間、５０mM ＴＲＩＳ、ｐＨ８．０）し、１M ＮａＣｌ中で溶出しなかった後における、ＧＦＰ発現E. coli（５％v/v）からのＧＦＰ回収に対する、インキュベーション条件の影響。
【図８】キレートＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＣ７４８微粒子（樹脂：細胞の体積比１００％、７０％、３０％）と共に２時間静的インキュベーション（５０mM ＴＲＩＳ、ｐＨ８．０）し、１M ＮａＣｌ中で溶出し又は溶出しなかった後における、ＧＦＰ発現E. coli（５％v/v）からのＧＦＰ回収に対する、樹脂：細胞の体積比及び溶出の影響。
【図９】キレートＡｍｂｅｒｌｉｔｅ微粒子（樹脂：細胞の体積比７０％）と共に２時間撹拌インキュベーション（５０mM ＴＲＩＳ、ｐＨ８．０）した後における、ＧＦＰ回収に対する、ＧＦＰ発現E. coliの体積細胞濃度（２０％、１５％、１０％、５％v/v）の影響。
【図１０】キレートＡｍｂｅｒｌｉｔｅ微粒子（樹脂：細胞の体積比７０％）と共に２時間撹拌インキュベーション（５０mM ＴＲＩＳ、ｐＨ８．０）した後における、異なる体積細胞濃度（２０％、１５％、１０％、５％v/v）のＧＦＰ発現E. coliのＧＦＰ抽出動態。
【図１１】アクリルＩＲＡ  ４５８微粒子比（樹脂：細胞の比１００％、７０％、５０％v/v）と共に１〜３時間静的インキュベーション（５０mM ＴＲＩＳ、ｐＨ８．０）し、異なるＮａＣｌ濃度（１．０M、０．５M、０M）で溶出した後における、ＳＯＤ発現E. coli（１０％v/v）からのＳＯＤ回収に対する、樹脂：細胞の体積比の影響。ＳＤＳ−Ｐａｇｅデンシトメトリーによって、ＳＯＤ量を決定した。
【図１２】短時間混合し、アクリルＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ  ４５８微粒子（樹脂：細胞の比１００％、７０％、５０％v/v）と共にインキュベーション（５０mM ＴＲＩＳ、ｐＨ７．７）し、異なるＮａＣｌ濃度（１．０M、０．５M、０M）で溶出した後における、１０％v/v細胞懸濁液から得られたE. coliホモジネートからのＳＯＤ回収。ＳＤＳ−Ｐａｇｅデンシトメトリーによって、ＳＯＤ量を決定した。
【図１３】ＳＤＳ−Ｐａｇｅ及びクーマシー染色によって決定した、E. coliホモジネート及びホモジネート上清と比較した、異なるＮａＣｌ濃度（２００〜１０００mM）で溶出した後における、Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ａ２微粒子（樹脂：細胞の体積比５０％）と共にＧＦＰ発現E. coliを３時間インキュベーション（５０mM ＴＲＩＳ、ｐＨ８．０）することによる、非ターゲットタンパク質の抽出。
【図１４】図１３からのＳＤＳ−Ｐａｇｅのデンシトメトリー分析。
【図１５】Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ａ２微粒子（樹脂：細胞の体積比５０％）と共に３時間静的インキュベーション（５０mM ＴＲＩＳ、ｐＨ８．０）し、３００mM ＮａＣｌで溶出することによる、E. coliから得られた溶出物と比較した、ＧＦＰ発現E. coliホモジネート上清のタンパク質プロファイル。
【図１６】Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ  ４５８及びＭａｒａｔｈｏｎ  Ａ２（樹脂：細胞の体積比５０、７０、１００％v/v）微粒子と共に静的インキュベーション（５０mM ＴＲＩＳ、ｐＨ８．０）し、続いてＮａＣｌで溶出した後における、E. coliホモジネート及び細胞懸濁液（１０％v/v）からのタンパク質（ＳＯＤ）の抽出の間のｄｓＤＮＡの減少動態。Invitrogenの「Pico Green QuantIt」アッセイを用いて、ＤＮＡ量を推定した。
【図１７】静的インキュベーション（５０mM ＴＲＩＳ、ｐＨ８．０）し、続いてＮａＣｌで溶出した後における、Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ａ２微粒子を用いたE. coliホモジネート及び細胞懸濁液（１０％v/v）からのタンパク質（ＳＯＤ）の抽出の間のエンドトキシン減少の動態。Lonzaから購入したPyroGene（商標）Recombinant Factor C Assayにより、エンドトキシン量を推定した。
【図１８】粉砕した樹脂の原子間力顕微鏡検査（ＡＦＭ）。Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ａ２（画像１）、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ＭＳＣ（画像２）及びＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＣ７４８（画像３）の高さ測定。
【図１９】E. coli細胞の原子間力顕微鏡検査（ＡＦＭ）。粉砕したＭａｒａｔｈｏｎ  Ａ２と共に１時間インキュベーションする前（左側）及び後の細胞の高さ測定。
【図２０】微粒子なし（写真１）、ｐＨ８．０、５０mM ＴＲＩＳ中で、粉砕したＭａｒａｔｈｏｎ  Ａ２と共に（写真２）及び粉砕したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＣ７４８と共に（写真３）１時間インキュベーションした後のE. coli  ＨＭＳ１７４（ＧＦＰｍｕｔ３．１）のオーバーレイ画像。
【図２１】Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ａ２微粒子（樹脂：細胞の体積比７０％）と共に２時間静的インキュベーション（５０mM ＴＲＩＳ、ｐＨ８．０）し、生理緩衝液中に１：１０希釈した後における、E. coli細胞（１０％v/v）の生存率。Invitrogenの「BacLite」蛍光染色キットを用いて、生（緑色）／死（赤色）細胞染色を実施した。
【図２２】ＳＤＳゲルは、細胞ホモジネート由来のＧＦＰを捕捉するために微粒子を使用した溶出プロファイルを示す。
【図２３】ＳＤＳゲルは、細胞ホモジネート由来のＩＦＮ−γを回収するために微粒子を使用した溶出プロファイルを示す。
【図２４】化学的破砕方法（４）を使用した最大ＧＦＰと比較した、捕捉上清（１）及び洗浄緩衝液（２）中のＧＦＰ量、実施例１３．２の溶出ＧＦＰ（３）を示す棒グラフ。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
〔発明の項目〕
本発明はまた、以下の項目によって特徴付けられ得る：
【００４０】
１．生体分子を回収するための正に荷電した微粒子及び／又は負に荷電した微粒子の使用であって、該正に荷電した微粒子が粉砕したポリマー陰イオン交換樹脂を含み、該負に荷電した微粒子が粉砕したポリマー陽イオン交換樹脂を含み、該生体分子が、好ましくはポリペプチド又はポリヌクレオチドである、使用。
【００４１】
２．細胞を破砕するための正に荷電した微粒子及び／又は負に荷電した微粒子の使用であって、該正に荷電した微粒子が粉砕したポリマー陰イオン交換樹脂を含み、該負に荷電した微粒子が粉砕したポリマー陽イオン交換樹脂を含む、使用。
【００４２】
３．生体分子を回収するための疎水性微粒子の使用。
【００４３】
４．陽イオン交換樹脂が弱酸性又は強酸性である、項目１又は２に記載の使用。
【００４４】
５．陰イオン交換樹脂が弱塩基性又は強塩基性である、項目１又は２に記載の使用。
【００４５】
６．陽イオン交換樹脂及び／又は陰イオン交換樹脂がキレート樹脂である、項目１又は２に記載の使用。
【００４６】
７．陰イオン交換樹脂及び陽イオン交換樹脂が、ポリスチレン系、ヒドロキシエチルメタクリラート（ＨＥＭＡ）系、ジメチルアミノエチルメタクリラート（ＤＭＡＥＭＡ）系、ジメチルアミノエチルメタクリラート（ｐＤＭＡＥＭＡ）、ポリアクリルアミド系、メタクリル酸（ＭＡＡ）系である、先行する項目のいずれか一項に記載の使用。
【００４７】
８．陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂が、ジビニルベンゼンと架橋したポリスチレンである、先行する項目のいずれか一項に記載の使用。
【００４８】
９．微粒子が約５μm未満の平均粒子径を有する、先行する項目のいずれか一項に記載の使用。
【００４９】
１０．正に荷電した微粒子又は負に荷電した微粒子が、ポリマー陰イオン交換及び／又は陽イオン交換樹脂を粉砕することによって得られ得る、先行する項目のいずれか一項に記載の使用。
【００５０】
１１．陰イオン交換樹脂が、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４００、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４８５、Ｄｏｗｅｘ  １Ｘ２−１００、Ｄｏｗｅｘ  １−８−１００、Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ａ２又はＤＩＡＩＯＮ  ＳＡ  ２０Ａである、先行する項目のいずれか一項に記載の使用。
【００５１】
１２．陽イオン交換樹脂が、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＣ−７４８、Ｄｏｗｅｘ  ５０  ＷＸ２−１００、Ｄｏｗｅｘ  ５０  ＷＸ８−１００、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ＭＳＣ又はＤＩＡＩＯＮ  ＳＫ  １１０である、先行する項目のいずれか一項に記載の使用。
【００５２】
１３．樹脂が非多孔性である、先行する項目のいずれか一項に記載の使用。
【００５３】
１４．細胞が真核細胞又は原核細胞である、先行する項目のいずれか一項に記載の使用。
【００５４】
１５．細胞がEnterobacteriaceae、Pseudomonaceae、Lactobacteriacea又はBacillaceaeから選択される、項目１〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【００５５】
１６．細胞がE. coliである、項目１４又は１５に記載の使用。
【００５６】
１７．生体分子がタンパク質又はポリヌクレオチドである、先行する項目のいずれか一項に記載の使用。
【００５７】
１８．生体液から生体分子を得る方法であって、ａ）項目１〜１３のいずれか一項に定義される正に荷電した微粒子及び／若しくは負に荷電した微粒子又は疎水性微粒子を生体液に添加すること、並びに該生体液から該生体分子を回収することを含む、方法。
【００５８】
１９．ｂ）微粒子にフロックを形成させること、ｃ）生体液から該フロックを除去すること、及びｄ）生体分子を脱離することを更に含む、項目１８に記載の方法。
【００５９】
２０．生体液が、細胞懸濁液、発酵ブロス、培養ブロス、細胞ホモジネート又は発酵上清である、項目１９に記載の方法。
【００６０】
２１．工程ａ）及び／又はｄ）の後に、生体液を撹拌することを更に含む、項目１８〜２０のいずれかに記載の方法。
【００６１】
２２．遠心分離又はろ過などの分離技術によって工程ｃ）を行う、項目１８〜２１のいずれかに記載の方法。
【００６２】
２３．陽イオン交換樹脂が弱酸性又は強酸性である、項目１８〜２２のいずれかに記載の方法。
【００６３】
２４．陰イオン交換樹脂が弱塩基性又は強塩基性である、項目１８〜２２のいずれかに記載の方法。
【００６４】
２５．陽イオン交換樹脂及び／又は陰イオン交換樹脂がキレート樹脂である、項目１８〜２２のいずれかに記載の方法。
【００６５】
２６．陰イオン交換樹脂及び陽イオン交換樹脂が、ポリスチレン系、ヒドロキシエチルメタクリラート（ＨＥＭＡ）系、ジメチルアミノエチルメタクリラート（ＤＭＡＥＭＡ）系、ジメチルアミノエチルメタクリラート（ｐＤＭＡＥＭＡ）、ポリアクリルアミド系、メタクリル酸（ＭＡＡ）系である、項目１８〜２５のいずれかに記載の方法。
【００６６】
２７．陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂が、ジビニルベンゼンと架橋したポリスチレンである、項目１８〜２６のいずれかに記載の方法。
【００６７】
２８．微粒子が約５μm未満の平均粒子径を有する、項目１８〜２８のいずれかに記載の方法。
【００６８】
２９．正に荷電した微粒子又は負に荷電した微粒子が、ポリマー陰イオン交換及び／又は陽イオン交換樹脂を粉砕することによって得られ得る、項目１８〜２８のいずれかに記載の方法。
【００６９】
３０．陰イオン交換樹脂が、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４００、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４８５、Ｄｏｗｅｘ  １Ｘ２−１００、Ｄｏｗｅｘ  １−８−１００、Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ａ２又はＤＩＡＩＯＮ  ＳＡ  ２０Ａである、項目１８〜２９のいずれかに記載の方法。
【００７０】
３１．陽イオン交換樹脂が、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＣ−７４８、Ｄｏｗｅｘ  ５０  ＷＸ２−１００、Ｄｏｗｅｘ  ５０  ＷＸ８−１００、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ＭＳＣ又はＤＩＡＩＯＮ  ＳＫ  １１０である、項目１８〜３０のいずれかに記載の方法。
【００７１】
３２．樹脂が非多孔性である、項目１８〜３１のいずれかに記載の方法。
【００７２】
３３．細胞が真核細胞又は原核細胞である、項目１８〜３２のいずれかに記載の方法。
【００７３】
３４．細胞がEnterobacteriaceae、Pseudomonaceae、Lactobacteriacea又はBacillaceaeから選択される、項目１８〜３３のいずれかに記載の方法。
【００７４】
３５．細胞がE. coliである、項目３４に記載の方法。
【００７５】
３６．生体分子がタンパク質又はポリヌクレオチドである、項目１８〜３５のいずれかに記載の方法。
【００７６】
３７．細胞を破砕する方法であって、正に荷電した微粒子及び／若しくは負に荷電した微粒子又は疎水性微粒子を細胞懸濁液に添加することを含む、方法。
【００７７】
３８．細胞から生体分子を放出させることを更に含む、項目３７に記載の方法。
【００７８】
３９．生体分子がポリペプチド又はポリヌクレオチドである、項目３７又は３８に記載の方法。
【００７９】
４０．正に荷電した微粒子及び／若しくは負に荷電した微粒子又は疎水性微粒子を含む生体液であって、該正に荷電した微粒子が粉砕したポリマー陰イオン交換樹脂を含み、該負に荷電した微粒子が粉砕したポリマー陽イオン交換樹脂を含む、生体液。
【００８０】
４１．フロックを更に含む、項目４０に記載の液。
【００８１】
４２．生体分子を回収するための正に荷電した微粒子の使用であって、該正に荷電した微粒子が粉砕したポリマー陰イオン交換樹脂を含み、該生体分子が酸性又は塩基性である、使用。
【００８２】
４３．細胞溶解物又は細胞ホモジネートから生体分子を回収するための、項目４２に記載の使用。
【００８３】
４４．細胞懸濁液から生体分子を回収するための、項目４２に記載の使用。
【００８４】
４５．生体分子を回収するための負に荷電した微粒子の使用であって、該負に荷電した微粒子が粉砕したポリマー陽イオン交換樹脂を含み、該生体分子が酸性又は塩基性である、使用。
【００８５】
４６．細胞溶解物又は細胞ホモジネートから生体分子を回収するための、項目４５に記載の使用。
【００８６】
４７．細胞懸濁液から生体分子を回収するための、項目４５に記載の使用。
【００８７】
４８．生体分子を回収するための正に荷電した微粒子及び負に荷電した微粒子の使用であって、該正に荷電した微粒子が粉砕したポリマー陰イオン交換樹脂を含み、負に荷電した微粒子が粉砕したポリマー陽イオン交換樹脂を含み、該生体分子が酸性又は塩基性である、使用。
【００８８】
４９．細胞溶解物又は細胞ホモジネートから生体分子を回収するための、項目４８に記載の使用。
【００８９】
５０．細胞懸濁液から生体分子を回収するための、項目４８に記載の使用。
【００９０】
５１．細胞を破砕して該細胞から生体分子を放出させるための正に荷電した微粒子の使用であって、該正に荷電した微粒子が粉砕したポリマー陰イオン交換樹脂を含み、該生体分子が酸性又は塩基性である、使用。
【００９１】
５２．細胞を破砕するための負に荷電した微粒子の使用であって、負に荷電した微粒子が粉砕したポリマー陽イオン交換樹脂を含み、該生体分子が酸性又は塩基性である、使用。
【００９２】
５３．生体液から生体分子を得る方法であって、ａ）正に荷電した微粒子及び／又は負に荷電した微粒子を生体液に添加すること、並びに該生体液から該生体分子を回収することを含み、該生体分子が酸性又は塩基性である、方法。
【００９３】
５４．生体液が、細胞懸濁液、細胞溶解物又は細胞ホモジネートである、項目５３に記載の方法。
【００９４】
５５．細胞から生体分子を得る方法であって、ａ）正に荷電した微粒子及び／又は負に荷電した微粒子を添加して細胞を破砕し、それにより、該細胞から該生体分子を放出させること、並びにｂ）該放出された生体分子を回収することを含む、方法。
【００９５】
５６．生体分子が酸性又は塩基性である、項目５５に記載の方法。
【００９６】
５７．正に荷電した微粒子を添加する、項目５５に記載の方法。
【００９７】
５８．負に荷電した微粒子を添加する、項目５５に記載の方法。
【００９８】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、生体分子を回収するための、及び／又は細胞を破砕するための方法であって、本明細書に記載される荷電した微粒子又は疎水性微粒子を使用する簡便かつ高速な方法を提供する。それは、微粒子、特に荷電した微粒子が細胞を破砕し得、更に、細胞から生体分子を放出させ及び吸着し得ることにより、生体分子の高速かつ効率的な回収を可能にするという驚くべき知見に部分的に基づくものである。更に、微粒子が細胞と相互作用し得／細胞に吸着し得、及び／又は生体分子を吸着し得るように生体液に添加した場合に、荷電した微粒子は、大直径（例えば、少なくとも５μm）のフロックを即座に形成することが見出されたが、これは、微粒子並びに／又は微粒子及び生体分子によって構築されたフロックに吸着した生体分子の容易な分離を可能にする。同じことが、疎水性微粒子の場合にも当てはまる。
【００９９】
当業者であれば認識するように、本発明は、本明細書に記載されるように、パイロット又は工業規模を含む大規模適用において、生体液（例えば、細胞懸濁液）からタンパク質又はプラスミドを分離するために特に有用である。荷電した微粒子及び／又は疎水性微粒子は、有利には、バッチプロセス（本明細書では「バッチ吸着」と称される）で使用され得る。
【０１００】
更に、本明細書に記載される新規な方法は、高い回収効率及び低い夾雑物レベルを提供する。特に、生体分子が温度感受性又は剪断感受性であり、従来の生体分子抽出方法を適用すると変性する傾向がある場合、本発明は、有利には、生体分子を回収するために適用され得る。
【０１０１】
細胞及び生体分子
上記のように、本発明は、生体液などの流体から生体分子を回収するための方法を提供する。いくつかの実施態様では、本発明の方法は、生体液中の細胞を破砕すること、及び該細胞から生体分子を放出させることを含む。生体分子は、好ましくは、細胞内生体分子、例えばタンパク質又はプラスミドである。続いて、放出された生体分子を生体液から回収し得る。
【０１０２】
本明細書で定義される「細胞内」という用語は、細胞内に見られる任意の物質を指す。本明細書で定義される「生体分子」は、通常、細胞内に見られるか、又は細胞によって合成される任意の分子（ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む）を含む。生体分子は、酸性又は塩基性の生体分子であり得る。生体分子の例としては、限定されないが、オリゴ糖、多糖、リポ多糖、オリゴペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、フラボノイド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ（ｄｓ又はｓｓＤＮＡ）、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ（ｄｓ又はｓｓＲＮＡ）、有機金属化合物、アミノ酸、脂質、ピリミジン、プリン、炭水化物、ペプチド模倣化合物、毒素、ステロイド及び酵素が挙げられる。
【０１０３】
本明細書で使用される場合の「細胞」は、生体分子を産生（発現）することができる細胞、好ましくは「宿主細胞」を指す。このような細胞を本発明の方法に適用し得る。生体分子を生産するために、外来ヌクレオチド配列を細胞に導入し得る。
【０１０４】
本発明の方法に使用され得る細胞又は宿主細胞は、原核細胞、真核細胞又はその両方のいずれかであり得る。より好ましくは、本発明の方法に使用される細胞は、哺乳類細胞、鳥類細胞、両生類細胞及び魚類細胞を含む脊椎動物細胞並びに昆虫細胞である。また、細胞又は宿主細胞には、真核細胞が含まれる。典型的には、真核細胞は、哺乳類細胞、鳥類細胞又は昆虫細胞である。細胞又は宿主細胞はまた、酵母細胞又は真菌細胞を含む。しかしながら、宿主細胞は、グラム陰性菌由来の細菌細胞、例えばEnterobacteriaceae（例えば、E. coli）若しくはPseudomonadaceae（例えば、P. putida）由来の細胞、又はグラム陽性菌由来の細菌細胞、例えばLactobacteriaceae若しくはBacillaceae由来の細胞を含む原核細胞であることが好ましい。しかしながら、最も好ましくは、宿主細胞は、E. coliである。
【０１０５】
微粒子
本明細書で定義される「荷電した微粒子」は、正に荷電した微粒子及び／又は負に荷電した微粒子である。「正に荷電した」微粒子は、中性ｐＨで、少なくとも１の（より典型的には、１より多い）陽子の電気素量を有する。「負に荷電した」微粒子は、中性ｐＨで、少なくとも１の（より典型的には、１より多い）電子の電気素量を有する。
【０１０６】
微粒子は、粉砕した樹脂を含み得る。本発明に有用な樹脂は、様々な要素と相互作用してそれに付着することができる固体不溶性ポリマー材料であって、混合物から該要素を捕捉することを可能にする固体不溶性ポリマー材料である。樹脂は、限定されないが、セファデックス、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリラート又は中性多糖を含む不活性化合物から一般に構成される。それらとしては、セルロース、デキストラン又はアガロースのような架橋した天然ポリマーも挙げられ得る。
【０１０７】
好ましい実施態様による微粒子は、イオン交換樹脂、より好ましくはポリマー陰イオン交換樹脂及び／又は陽イオン交換樹脂から調製される。イオン交換樹脂は、交換可能なイオンを有する固定された官能基又は部位を保有する電荷ポリマーの不溶性担体を含有する固体支持体を指す。微粒子を調製するために適切なイオン交換樹脂の具体例としては、陰イオン交換樹脂、陽イオン交換樹脂及び混合モードクロマトグラフィー樹脂（本明細書では、混合モードイオン交換樹脂とも称されることがある）が挙げられる。交換可能なイオン形態は、一般に、イオン交換樹脂の種類に応じて、Ｎａ＋、Ｈ＋、ＯＨ−又はＣｌ−イオンの１つ以上である。イオン交換樹脂としては、弱酸性及び強酸性の陽イオン交換樹脂、並びに弱塩基性及び強塩基性の陰イオン交換樹脂が挙げられる。適切なイオン交換樹脂としては更に、キレート樹脂が挙げられる。
【０１０８】
イオン交換樹脂は、様々な産業分野で広く使用されている。イオン交換樹脂は、一般的に、例えば、水処理の分野では水の脱塩のために、ボイラーのために、若しくは発電所における復水処理のために、食品の分野では糖溶液の精製のために、又は超純水の分野では半導体の調製のために使用されている。
【０１０９】
本発明の好ましい実施態様では、微粒子は、多孔性球状イオン交換樹脂から調製される。球状イオン交換樹脂は、単官能付加重合性モノマー及びラジカル重合開始剤を含むモノマー混合物を水性媒体に添加し、次いで撹拌して、モノマー混合物の懸濁液を調製する懸濁重合によって作製される。次いで、懸濁液を重合温度で一定時間維持して、球状架橋コポリマーを得る。水処理のためのイオン交換樹脂の直径は、典型的には、３００〜６００μmである。他の実施態様では、微粒子は、ゲル型及び／又はマクロ多孔性イオン交換樹脂から調製され得る。
【０１１０】
イオン交換樹脂のポリマーマトリックスとしては、ポリスチレン、ポリスチレンとスチレンとのコポリマー、ポリアクリラート、芳香族置換ビニルコポリマー、ポリメタクリラート、フェノール−ホルムアルデヒド、ポリアルキルアミン、それらの組み合わせなどが挙げられ得る。好ましい実施態様では、ポリマーマトリックスは、ポリスチレンとスチレンとのコポリマー、ポリアクリラート又はポリメタクリラートであり、別の実施態様では、ポリマーマトリックスは、スチレン−ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）コポリマーである。好ましくは、微粒子を調製するためのイオン交換樹脂は、ポリスチレン系、ヒドロキシエチルメタクリラート（ＨＥＭＡ）系、ジメチルアミノエチルメタクリラート（ＤＭＡＥＭＡ）系、ジメチルアミノエチルメタクリラート（ｐＤＭＡＥＭＡ）、メタクリル酸（ＭＡＡ）系である樹脂を使用する。最も好ましくは、樹脂は、ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）と架橋したポリスチレンから作製される。
【０１１１】
本明細書で使用される陽イオン交換樹脂は、弱酸性又は強酸性であり得る。本明細書で使用される「弱酸性陽イオン交換樹脂」という用語は、従来の方法（例えば、Fisher et al., 「Effect of Cross-linking on the Properties of Carboxylic Polymers. I. Apparent Dissociation Constants of Acrylic and Methacrylic Acid Polymers」 J. Phys. Chem., 60(8), 1030 (1956)）によって測定した場合に、約４．５超の見掛けの解離定数又はイオン化定数（ｐＫａ）を有する樹脂を指す。それは、交換基として、カルボン酸基、フェノール性水酸基、ホスホン酸基及びアルセノ基（arsono group）を有し得る。一方、「強酸性陽イオン交換樹脂」という用語は、約１．５未満のｐＫａを有する樹脂を指す。強酸性陽イオン交換樹脂は、スルホン酸基、例えばポリスチレンスルホン酸ナトリウム又はポリＡＭＰＳを有し得る。スルホン酸基（−ＨＳＯ３）は交換基であり、アルカリ性溶液中では、及び酸性溶液中であっても、強酸のように振る舞って、（−ＳＯ３）−及びＨ＋に解離する。
【０１１２】
本明細書で使用される陰イオン交換樹脂は、弱塩基性又は強塩基性であり得る。本明細書で使用される「弱塩基性陽イオン交換樹脂」という用語は、従来の方法（例えば、Fisher et al., 「Effect of Cross-linking on the Properties of Carboxylic Polymers. I. Apparent Dissociation Constants of Acrylic and Methacrylic Acid Polymers」 J. Phys. Chem., 60(8), 1030 (1956)）によって測定した場合に、約８．５超の見掛けの解離定数又はイオン化定数（ｐＫａ）を有する樹脂を指す。それは、交換基として第１級アミノ基、第２級アミノ基及び／又は第３級アミノ基、例えばポリエチレンアミンを有し得る。一方、「強塩基性陰イオン交換樹脂」という用語は、約１２未満のｐＫａを有する樹脂を指す。強塩基性陰イオン交換樹脂は、交換基として第４級アミノ基、例えばトリメチルアンモニウム基、例えばポリＡＰＴＡＣ又はジメチルエタノールアミンを有し得る。
【０１１３】
本明細書で使用される陰イオン交換樹脂及び陽イオン交換樹脂は、金属イオンとキレート（錯体）を形成することができる官能基を含むキレート樹脂を更に含む。キレート樹脂は、典型的には、特定の金属イオンに対する高い選択性を特徴とする。いくつかのキレート樹脂は、それらの官能基及びｐＨに応じて、塩基性及び／又は酸性であり得る。キレート樹脂の典型的な官能基としては、限定されないが、イミノ二酢酸、ポリアミン、メチルグルカミド、チオウロニウム及びアミノホスホン酸が挙げられる。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＣ  ７４８は、イミノ二酢酸の官能基を有する例示的なキレート陽イオン交換樹脂であり、例えば細胞懸濁液から、生体分子を回収するための微粒子を調製するために使用され得る。
【０１１４】
市販のイオン交換樹脂は、例えば、Rohm & Haas of Philadelphia, Pennsylvania USAによってＡｍｂｅｒｌｉｔｅ、Ａｍｂｅｒｊｅｔ、Ｄｕｏｌｉｔｅ及びＩｍａｃ樹脂として提供されており、Bayer of Leverkusen, GermanyからＬｅｗａｔｉｔ樹脂として提供されており、Dow Chemical of Midland, Michigan USAからＤｏｗ樹脂として提供されており、Mitsubishi Chemical of Tokyo, JapanからＤｉａｉｏｎ及びＲｅｌｉｔｅ樹脂として提供されており、Purolite of Bala Cynwyd, Pennsylvania USAからＰｕｒｏｌｉｔｅ樹脂として提供されており、Sybron of Birmingham, N.J. USAからＩｏｎａｃ樹脂として提供されており、Resintech of West Berlin, N.J. USAから提供されている。
【０１１５】
正に荷電した微粒子は、ポリマー陰イオン交換樹脂から調製され得る。市販の陰イオン交換樹脂は、典型的には、ＯＨ−型又はＣｌ−型のいずれかである。一実施態様では、陰イオン交換樹脂は、ＯＨ−型である。樹脂は、例えば、「Ｄｉａｉｏｎ」陰イオン交換樹脂、例えばＤｉａｉｏｎ  ＳＡ樹脂（ＤＩＡＩＯＮ  ＳＡ  ２０Ａを含む）及びＤｉａｉｏｎ  ＳＫ樹脂（ＤＩＡＩＯＮ  ＳＫ  １１０を含む）（Mitsubishi Chemical）、「Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ」樹脂、例えばＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４００、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４５８、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−７３４及びＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−９００（Rohm & Haas Co.）又は「Ｄｏｗｅｘ」樹脂、例えばＤｏｗｅｘ  １、Ｄｏｗｅｘ  ２、Ｄｏｗｅｘ  １１、Ｄｏｗｅｘ  ２１Ｋ、Ｄｏｗｅｘ  １ｘ２、Ｄｏｗｅｘ  １ｘ４、Ｄｏｗｅｘ  １ｘ８及びＤｏｗｅｘ、Ｍａｒａｔｈｏｎ樹脂、例えばＭａｒａｔｈｏｎ  Ａ２（Dow Chemical Co）であり得る。好ましい実施態様では、陰イオン交換樹脂は、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４５８又はＭａｒａｔｈｏｎ  Ａ２である。陰イオン交換樹脂中の官能基としては、第４級アンモニウム基、例えばベンジルトリメチルアンモニウム基（１型樹脂）、ベンジルジメチルエタノールアンモニウム基（２型樹脂）、トリアルキルベンジルアンモニウム基（１型樹脂）、ジメチルエタノールアミン（２型樹脂）又は第３アミン官能基が挙げられ得る。細胞破砕の場合、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ＭＡ２及びＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４５８は、正に荷電した微粒子を調製するための特に好ましい陰イオン交換樹脂である。
【０１１６】
負に荷電した微粒子は、ポリマー陽イオン交換樹脂から調製され得る。本明細書で使用されるポリマー材料は、ポリマー、ポリマーの混合物、架橋ポリマー、それらの混合物又はポリマーネットワークを指し得る。しばしば、ポリマー材料は、ポリマーと単に称される。市販の陽イオン交換樹脂は、典型的には、Ｈ＋型又はＮａ＋型のいずれかである。一実施態様では、陽イオン交換樹脂は、Ｈ＋型である。樹脂は、例えば、「Ｄｉａｉｏｎ」陽イオン交換樹脂、例えばＤｉａｉｏｎ  ＰＫ樹脂及びＤｉａｉｏｎ  ＳＫ樹脂（Mitsubishi Chemical）、「Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ」樹脂、例えばＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＣ−７４８（Rohm & Haas Co.）又は「Ｄｏｗｅｘ」樹脂、例えばＤｏｗｅｘ  ５０ＷＸ２、Ｄｏｗｅｘ  ５０ＷＸ８及びＤｏｗｅｘ、Ｍａｒａｔｈｏｎ樹脂、例えばＭａｒａｔｈｏｎ  Ｃ、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ＭＳＣ（Dow Chemical Co）であり得る。陽イオン交換樹脂の官能基としては、スルホン酸基（−ＳＯ３Ｈ）、ホスホン酸基（−ＰＯ３Ｈ）、ホスフィン酸基（−ＰＯ２Ｈ）、カルボン酸基（−ＣＯＯＨ又は−Ｃ（ＣＨ３）−ＣＯＯＨ）、それらの組み合わせが挙げられ得る。一実施態様では、陽イオン交換樹脂中の官能基は、−ＳＯ３Ｈ、−ＰＯ３Ｈ又は−ＣＯＯＨであり、最も好ましい実施態様では、陽イオン交換樹脂中の官能基は、−ＳＯ３Ｈである。細胞破砕の場合、キレート官能基を有する陽イオン交換樹脂、例えばＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＣ  ７４８は、負に荷電した微粒子を調製するために特に好ましい。
【０１１７】
本明細書で使用されるポリマー陽イオン交換樹脂は、１以上の陽子の電気素量を有するポリマー材料又はこのような高分子それ自体を指す。ポリマー陰イオン交換樹脂は、１以上の電子の電気素量を有する。
【０１１８】
本発明の正に荷電した微粒子は、中性ｐＨで、少なくとも１の（より典型的には、１より多い）陽子の電気素量を有する粒子であるのに対して、負に荷電した微粒子は、中性ｐＨで、少なくとも１の電子の基本電荷を有する。
【０１１９】
微粒子の構成成分の少なくとも一部がイオン的に帯電している場合、正に荷電した微粒子又は負に荷電した微粒子が得られる。
【０１２０】
本発明はまた、生体分子を捕捉するための新規な吸着材料として、固体で疎水性である微粒子を提供する。微粒子は粉砕された形態であり、疎水性吸着材料、例えばＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ４、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ７ＨＰ、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ７６１を粉砕することによって調製され得る。
【０１２１】
一実施態様では、正に荷電した微粒子のみを生体液に添加する。別の実施態様では、負に荷電した微粒子のみを生体液に添加する。更に別の実施態様では、正に荷電した微粒子及び負に荷電した微粒子の両方を生体液に添加する。正に荷電した微粒子及び負に荷電した微粒子の両方を生体液に添加する場合、正に荷電した微粒子と負に荷電した微粒子との比は、約０．１：９９．９（w/w）〜９９．９：０．１（w/w）であり得る。例えば、それは約５０：５０であり得るが、それはまた異なるものでもよい（例えば、９０：１０、８０：２０、７５：２５、６０：４０、４０：６０、２０：８０、２５：７５、１０：９０など）。更に別の実施態様では、疎水性微粒子を生体液に添加する。
【０１２２】
好ましい一実施態様では、微粒子は、約１０μm未満、例えば約９μm未満、８μm未満、７μm未満、６μm未満、５μm未満、４μm未満、３μm未満、２μm未満及び１μm未満の平均粒子径を有する粉砕した粒子の形態である。好ましくは、粉砕した粒子は、約５μm未満、より好ましくは２．５μm未満の平均粒子径を有する。好ましくは、粉砕した粒子は、０．５μm超の平均粒子径を有する。したがって、粉砕した粒子は、好ましくは、約１０μm〜０．５μm、約９μm〜約０．５μm、約８μm〜約０．５μm、約７μm〜約０．５μm、約６μm〜約０．５μm、約５μm〜約０．５μm、約４μm〜約０．５μm、約３μm〜約０．５μm又は約２．５μm〜約０．５μmの範囲内の平均粒子径を有し得る。しかしながら、粉砕した粒子は、１０μm超及び０．５μm未満の粒子径を有し得る。
【０１２３】
微粒子の調製
微粒子は、陰イオン交換樹脂及び／又は陽イオン交換樹脂を粉砕することによって得られ得るか、又は得られる。好ましくは、本発明の微粒子は、樹脂を粉砕し、樹脂をコンディショニングすることによって得られ得る（又は、によって得られる）。
【０１２４】
樹脂の製造プロセスでは、粉砕した粒子をコンディショニングして、残存副産物を除去することが好ましい。イオン交換樹脂の典型的なコンディショニング方法は当技術分野で周知であり、供給業者によって説明もされている。
【０１２５】
必要な場合、樹脂をＨ＋又はＯＨ−からＮａ＋又はＣｌ−型に転換するために、「コンディショニング」を実施し得る。一実施態様では、ＮａＣｌ及び水を使用する反復洗浄工程によって、コンディショニングを実施する。前記プロセスでは、樹脂を水中で粉砕し得、遠心分離することによって沈殿を行い得る。あるいは、既にＮａ＋又はＣｌ−型の樹脂が市販されており、供給業者から入手され得る。
【０１２６】
好ましい実施態様では、（ａ）イオン交換樹脂を粉砕し、（ｂ）前記粉砕した樹脂を水に再懸濁し、（ｃ）前記粉砕した樹脂を沈殿させ、（ｄ）沈殿した懸濁液の上清から粉砕した樹脂を収集し、（ｅ）収集した粉砕した樹脂を約２Ｍ塩化ナトリウムに再懸濁し、（ｆ）前記粉砕した樹脂を沈殿させ、（ｇ）（ｆ）の沈殿した懸濁液の上清から粉砕した樹脂を収集し、（ｈ）前記粉砕した樹脂を沈殿させ、（ｉ）（ｈ）の粉砕した樹脂の沈殿物を収集し、（ｊ）前記収集した粉砕した樹脂を洗浄することによって、微粒子を調製する。
【０１２７】
好ましくは、本発明の疎水性微粒子を一晩粉砕する。粉砕した樹脂を水に懸濁する。上清を遠心分離する。樹脂を塩溶液（例えば、２Ｍ塩化ナトリウム）に再懸濁し、遠心分離し、ペレットを廃棄する。上清を移し、再度遠心分離する。上清を廃棄する。粉砕した樹脂を水に再懸濁し、チューブに移す。樹脂を遠心分離し、上清を廃棄し、樹脂を水性洗浄溶液に再懸濁する。洗浄の順序は、以下のとおりである：
−１×５０％ＥｔＯＨ（有機残留物の希釈）
−３×脱イオン水（ＥｔＯＨの希釈）
【０１２８】
粉砕
限定されないが、粉砕デバイス、例えば粉砕ミル（ジェットミル、ボールミル、ハンマーミルなどを含む）による、又は例えば乳鉢及び乳棒を用いて手によることを含む、当技術分野で公知の任意の方法で粉砕を行い得る。本明細書で使用される「粉砕」は、粒子径の減少につながる操作を指す。当業者であれば、樹脂を調製するための粉砕方法を容易に選択し得る。例えば、一実施態様では、乳鉢内で１つ以上の乳棒を動かすことによって、樹脂を自動化された様式で湿式粉砕する。得られる粒子の大部分が約１０μm未満、例えば９μm未満、８μm未満、７μm未満、６μm未満、５μm未満、４μm未満、３μm未満、２μm未満、１μm未満、０．５μm未満のサイズを有するまで、粉砕プロセスを継続し得る。大部分とは、５０％超、例えば６０％超、７０％超、８０％超、９０％超又は９５％超を意味する。他の実施態様では、粒子の大部分は、少なくとも０．１μm、例えば０．２μm、０．３μm、０．４μm、０．５μm、０．６μm、０．７μm、０．８μm、０．９μm、１．０μm、１．１μm、１．２μm、１．３μm、１．４μm、１．５μm、１．６μm、１．７μm、１．８μm、１．９μm、２．０μm、３μm、４μm又は５μmの平均粒子径を有する。
【０１２９】
当業者であれば、当技術分野で公知の方法を用いて、粉砕した粒子のサイズを容易に決定し得る。そのことから、当技術分野で公知の手段及び方法によって、平均粒子径を決定し得る。例えば、ソフトウェアベースのサイズ決定（例えば、実施例で説明されているもの）を使用して光学顕微鏡検査によって、サイズを決定し得る。円相当径の推定によって、粉砕した樹脂の粒子径を倍率１０００倍で決定し得る。好ましくは、１％v/vにおける約１００〜５００個の粒子の直径サイズの比較によって、分布を計算する。粉砕は、表面積を劇的に増加させて、生体分子（特に、タンパク質又はポリペプチド）の結合能の有意な増加をもたらす効果を有する。好ましくは、技術的手段、例えば粒子を認識して直径を測定するソフトウェアを用いて、直径の決定を行う。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、「再懸濁」又は「懸濁」又はその任意の文法形は、微粒子を懸濁液にすることを意味する。
【０１３１】
本明細書で使用される場合、「沈殿させる」は、微粒子を、それらが取り込まれている流体から沈殿させて、障壁に寄りかからせるようにすることを意味する。沈殿は、粒子に対して作用する力に応答した、流体を介した粒子の運動に起因する。これらの力は、重力又は遠心加速度（例えば、遠心分離による）であり得、後者が好ましい。
【０１３２】
「収集」は、懸濁液から微粒子を採取することを意味する。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、「洗浄」は、微粒子の性能を阻害又はそれに干渉するであろう流体の残量を減少させることを意味する。例えば、５０％（v/v）エタノール（ＥｔＯＨ）及び二重脱イオン水（ｄｄＨ２Ｏ）で樹脂を洗浄し、上記のようにプレコンディショニングし、続いて、ｄｄＨ２Ｏで繰り返し洗浄し得る。これらの流体それぞれの容量は、微粒子の容量よりも過剰であり、好ましくは１０倍又は２０倍過剰である。
【０１３４】
粉砕プロセスの後、例えば、遠心分離、沈殿、ろ過又は当業者に公知の任意の他の方法によって、好ましい範囲外の粒子を場合により除去し得る。
【０１３５】
驚くべきことに、粉砕した粒子の粗表面は、高い結合能を有する従来のクロマトグラフ媒体（例えば、Bio-Rad Laboratories (USA)が開発したNuvia媒体）のような同程度のタンパク質吸着容量を提供することが見出された。
【０１３６】
微粒子の添加
第１の工程では、微粒子を生体液に添加する。開示される本微粒子は、実験室規模、パイロット規模又は工業規模で使用され得る。本明細書で使用される「実験室規模」は、流体約１又は１０mlから流体約１０００mlまでの生体分子のバッチ吸着を含む。本明細書で使用される「パイロット規模」は、流体約１リットルから流体約１０リットルまでの生体分子のバッチ吸着を含む。本明細書で使用される「工業規模」又は大規模は、流体約１０リットルから流体約１０００リットル又は更に１００００リットル又はそれ以上までの生体分子のバッチ吸着を含む。
【０１３７】
本明細書に記載される方法は、生体液中に、正に荷電した微粒子を添加すること、又は負に荷電した微粒子を添加すること、又は正に荷電した微粒子及び負に荷電した微粒子の両方若しくは疎水性微粒子を添加することを含む。正に荷電した微粒子及び負に荷電した微粒子の両方を添加する場合、それらを調製混合物として、又は別個に、同時に若しくは逐次に、添加し得る。したがって、正に荷電した微粒子及び負に荷電した微粒子を逐次に（すなわち、順々に）添加する場合、本発明は、第１に、正に荷電した微粒子又は負に荷電した微粒子のいずれかを生体液に添加し、第２に、逆に電荷した微粒子を生体液に添加することを包含する。当業者であれば、例えば、生体液及び生体液から回収すべき所望の生体分子を考慮して、正に荷電した微粒子のみ、又は負に荷電した微粒子のみ、又は正に荷電した微粒子及び負に荷電した微粒子の両方を使用するかどうかを決定することができる。
【０１３８】
あるいは、本発明による吸着剤は、粉砕した粒子の形態の疎水性樹脂を含む。このような疎水性微粒子の優れたタンパク質吸着容量は、低塩濃度において従来のクロマトグラフ媒体よりも優れており、例えば、ポリヌクレオチド又は親水性タンパク質の逆精製（negative purification）に特に有用である。したがって、本発明は、疎水性微粒子を適用することによって、ポリヌクレオチド又は親水性タンパク質を逆精製するための使用及び方法を提供する。その目的の場合、ホモジネート又は標準タンパク質溶液に、５０％（v/v）疎水性微粒子懸濁液をホモジネート又はタンパク質溶液に添加する。微粒子懸濁液を、例えば３０分間、インキュベーションする。その後、微粒子を遠心分離し、溶出緩衝液を添加し、混合し、例えば３０分間、インキュベーションすることによって、結合したタンパク質の溶出を実施する。場合により、溶出緩衝液による第２の洗浄工程を含め得る。溶出後、先のように、微粒子を再度遠心分離する。例えば、光分析によって、上清中のタンパク質の濃度を定量し得、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ターゲットタンパク質の純度をチェックし得る。
【０１３９】
生体分子をそこから分離すべき生体液中に、微粒子を添加し得る。「生体液」という用語は、広く理解されるべきである。それらは、生物に関連する（例えば、任意の生物から得られるか、又は任意の生物によって産生される）任意の流体を指す。生体液の例としては、細胞培養培地、発酵上清、発酵ブロス、細胞懸濁液、細胞溶解物が挙げられる。生体液の更なる例は、本明細書の上記に記載されている。他の実施態様では、生体液はまた、唾液、尿、リンパ液、前立腺液、精液、血液、血漿、血清、汗、粘液性分泌物、乳、乳清、腹水、器官抽出物、植物抽出物、動物抽出物であり得る。好ましい実施態様では、生体液は、本明細書に記載される任意の生体液、例えばポリペプチド又はポリヌクレオチド、例えばプラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、ＢＡＣ  ＤＮＡ、ミニサークルＤＮＡなどを含有する流体であって、様々なin vitro又はin vivoプロセスに由来する流体、特に、発酵ブロス、培養ブロス、発酵上清、培養上清、細胞ホモジネート、細胞溶解物又は細胞懸濁液物である。「細胞ホモジネート」は、一般に、破壊された細胞の混合物と理解される。細胞ホモジネートは、機械的方法又は化学的方法によって得られ得る。例えば、従来の方法（例えば、発酵ホモジネートにするためには、ホモジナイザー中の高圧）によって、又は溶解溶液（アルカリ溶解を含む）中で単に混合することによって、細胞をホモジナイズし得る。
【０１４０】
したがって、本発明はまた、生体分子と、正に荷電した微粒子及び負に荷電した微粒子とを含む流体を含む。好ましい実施態様では、本発明の方法の工程のいずれかの間及び／又は後に、生体液を撹拌するが、好ましくは、粒子にフロックを形成させる及び／又は生体液からフロックを除去する工程の間ではない。
【０１４１】
「細胞ホモジネート」は、一般に、破壊された細胞の混合物と理解される。細胞ホモジネートは、機械的方法又は化学的方法によって得られ得る。例えば、従来の方法（例えば、細胞ホモジネート／溶解物にするためには、ホモジナイザー中の高圧）によって、又は溶解溶液（アルカリ溶解を含む）中で細胞を単にボルテックスすることによって、細胞をホモジナイズし得る。
【０１４２】
生体液の例としては、細胞培養物、細胞ホモジネート並びに細胞溶解物及び発酵上清（例えばE. coli由来の及びＣＨＯ細胞培養物）が挙げられる。発酵上清又は細胞ホモジネートを更にろ過、濃縮、透析、コンディショニング又は別の方法で処理し得る。
【０１４３】
本発明の好ましい実施態様では、生体液は、細胞懸濁液である。本明細書で使用される「細胞懸濁液」という用語は、好ましくはインタクトな細胞を含む、液体、例えば細胞培養培地、緩衝液又は任意の他の適切な液体を指す。「インタクト」は、細胞の細胞内成分を囲む細胞膜の物理的連続性を指し、細胞の細胞内成分を放出させるであろう任意の様式で、従来の培養条件下における細胞膜の透過性を超える程度までは、細胞膜が破砕されていないことを意味する。
【０１４４】
微粒子を生体液中に添加する間及び／又は後、撹拌又は振盪（ＭＰの添加後のみ）することによってそれらを混合して、均質な混合物を得ることができる。いくつかの実施態様では、混合は、細胞及び／又は生体分子と微粒子との間の接触を容易にすることによって、凝集及び／又は細胞破砕を増強し得る。粒子を生体液と混合する間に、吸着が自然に起こる。しかしながら、いくつかの実施態様では、微粒子の添加後に、混合は全く必要ない（実施例では、静的インキュベーションと称される）。
【０１４５】
インキュベーションパラメータ
微粒子を生体液に添加する場合、細胞の最適な体積濃度（各体積割合の比を指す「％（v/v）」によって示される）を調整し得る。いくつかの実施態様では、体積細胞濃度は、３０％（v/v）未満、例えば約２５％（v/v）未満、約２０％（v/v）未満、約１５％（v/v）未満、約１０％（v/v）未満、約９％（v/v）未満、約８％（v/v）未満、約７％（v/v）未満、約６％（v/v）未満、約５％（v/v）未満、約４％（v/v）未満、約３％（v/v）未満、約２％（v/v）未満又は約１％（v/v）未満である。混合は、細胞及び微粒子の均質な混合物を得るために有用であり得る。
【０１４６】
本発明のいくつかの局面では、微粒子の濃度は、好ましくは、約３００％（v/v）未満、例えば約２００％未満、１００％（v/v）、８０％（v/v）、７０％（v/v）、６０％（v/v）、５０％（v/v）、４０％（v/v）、３０％（v/v）、２０％（v/v）、１０％（v/v）又はそれ以下である。樹脂：細胞の体積比の選択は、例えば、微粒子サイズ分布（有効表面積）及び電荷密度（アクセス可能な面積当たりの官能基）に依存し得る。
【０１４７】
凝集
いくつかの実施態様では、微粒子を生体液に添加した後の次の工程は、フロックの形成を可能にすることである。驚くべきことに、微粒子は、微粒子に対する細胞及び／又は生体分子の吸着により、生体液中の細胞及び／又は生体分子と大直径のフロックを迅速に形成し得ることが見出された。
【０１４８】
微粒子を細胞懸濁液に添加する場合、微粒子に対する吸着によって、細胞をフロック中に固定化し得る。いくつかの実施態様では、細胞は生体分子を放出し、依然として生存可能である。放出された生体分子は、微粒子に吸着してもよいし、又は吸着しなくてもよい。
【０１４９】
微粒子を生体液、例えば細胞溶解物又は細胞ホモジネート又は発酵上清に添加する場合、微粒子に対する生体分子の吸着により、フロックが形成し得る。いくつかの実施態様では、最初に、正に荷電した微粒子及び負に荷電した微粒子を混合し、次いで、生体液に添加すると、微粒子混合物と生体液との接触により、凝集が起こる。他の実施態様では、最初に、正に荷電した微粒子又は負に荷電した微粒子を生体液に添加し、続いて、逆に電荷した微粒子を別個に添加すると、フロックが形成される。
【０１５０】
一実施態様では、生体分子は、酸性である。この場合、吸着のために、正に荷電した微粒子を生体液、例えば細胞溶解物又は細胞ホモジネートに添加する。また、細胞を破砕して生体分子を放出させるのみに十分な量、又は細胞を破砕し生体分子を吸着するより多い量のいずれかで、正に荷電した微粒子を細胞懸濁液に添加し得る。当業者であれば、細胞を部分的に又は完全に破砕するために必要な量を決定することができる。その後、負に荷電した微粒子（これは架橋剤として機能して、フロックの粒子径及び安定性を増加させる）を添加し得る。あるいは、更なる精製のために、細胞を破砕して生体分子を放出させるために十分な量で、負に荷電した微粒子（例えば、キレート陽イオン交換樹脂から調製されたもの）も細胞懸濁液に添加し得る。場合により、その後、正に荷電した微粒子を添加して、凝集を増加させ得る。
【０１５１】
別の実施態様では、生体分子は、塩基性である。この場合、正に荷電した微粒子を生体液、例えば細胞溶解物又は細胞ホモジネートに添加して、細胞残屑又は他の不純物、例えばＤＮＡ、宿主細胞タンパク質及び細胞フラグメントを有するフロックを形成し得る。負に荷電した微粒子を添加して、フロックの粒子径及び安定性を増加させ得るので、フロックを容易に分離及び廃棄し得る。塩基性生体分子は正に荷電した微粒子に結合しないだろうから、次いで、上清から塩基性生体分子を回収し得る。あるいは、更なる精製のために、細胞を破砕して生体分子を放出させるために十分な量で、正に荷電した微粒子又は負に荷電した微粒子を細胞懸濁液に添加し得る。フロックは、典型的には、それらを視覚可能としそれらの分離を容易にする１００μm又は更にそれ以上のサイズを有する。これは、他の望ましくない材料、例えば細胞及び／又は細胞残屑をろ過によって容易に除去し得、遠心分離を不要とすることを意味する。したがって、本発明は、従来技術の方法よりも高速かつ簡便である。カラムクロマトグラフィーを使用した場合、他の方法で必要とされるであろう樹脂の再生は必ずしも必要ではないが、樹脂の再生を行うことも可能である。更に、微粒子は安価な材料であるので、使用後に廃棄され得る。
【０１５２】
好ましい実施態様では、、形成されるフロックは、少なくとも５μm、例えば少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００μm、２０００μm又はそれ以上の平均粒子径を有する。
【０１５３】
吸着容量
本明細書で使用される「吸着容量」は、平衡状態において、樹脂１ml当たりに吸着した生体分子の量（mg単位）と定義される。本明細書で使用される平衡は、吸着速度が脱離速度に等しい状態である。所望の生体分子（特に、可溶性のポリペプチド又はポリヌクレオチド）に対する微粒子の吸着容量は、例えば、生体分子の溶出の前後に、例えば蛍光又は分光光度法によって、上清中の前記ポリペプチド又はポリヌクレオチドを定量することによって決定され得る。次いで、生体分子の量の差分が微粒子に吸着されたとみなす。当業者であれば理解するように、吸着容量は、様々なパラメータ、例えば微粒子の特性、生体分子、ｐＨ、温度、塩濃度及び他のパラメータ又はそれらの組み合わせに依存し得る。いくつかの実施態様では、正に荷電した微粒子は、実施例３．１．５に記載されている条件下において、樹脂１ml当たりＧＦＰ少なくとも５mg、例えば少なくとも６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００mgを吸着し得る。他の実施態様では、正に荷電した微粒子は、実施例４．１．３に記載されている条件下において、樹脂１ml当たりＳＯＤ少なくとも５mg、例えば少なくとも６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００mgを吸着し得る。
【０１５４】
フロックの除去
一般に、液体（例えば、生体液又は緩衝液）からのフロックの除去は、ろ過、遠心分離、沈殿又は任意の他の適切な手段によって実施され得る。当業者であれば、流体からフロックを分離又は脱離するために使用され得る方法を容易に決定することができる。例えば、パイロット及び工業規模の操作の場合、バケット遠心分離機（実験室規模）、管状遠心機、デカンター又はディスクスタック遠心分離機のいずれかで、フロックの懸濁液を処理し得る。同様に、フロックを保持するろ過によって、又は沈殿若しくは抽出によって、フロックを除去することが可能である。向流抽出デカンター、ミキサーセトラー又はカラム抽出器によって、脱離を達成し得る。他の有用な除去方法は、タンジェンシャルフローろ過、深層ろ過、デッドエンドろ過であり得るか、又はフィルタープレス、ヌッチェフィルターの使用を含む方法であり得る。
【０１５５】
生体分子の脱離
当技術分野で公知の任意の方法を使用して、脱離を行い得る。例えば、タンパク質のような生体分子の脱離を可能にする緩衝液（脱離緩衝液）にフロックを再懸濁することによって、脱離を行い得る。管状（静的）ミキサー又は他の混合デバイス、例えば撹拌タンクを含む当技術分野で公知の任意の手段を使用することによって、これを達成し得る。また、向流抽出デカンター、ミキサーセトラー又はカラム抽出器によって、脱離を達成し得る。
【０１５６】
次いで、懸濁液を脱離に適切な条件に供する。当業者であれば、フロックに吸着した生体分子を脱離するための条件を容易に決定し得る。一般に、従来のイオン交換クロマトグラフィーで使用される脱離方法を用い得る。例えば、等電点未満の若しくは等電点を超えるｐＨにおける溶出によって、又は高い塩濃度によって、脱離を行い得る。
【０１５７】
当技術分野で公知の方法によって、生体分子を更に精製又は濃縮し得る。これらとしては、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、擬似アフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー若しくは陽イオン交換クロマトグラフィー及び／又はサイズ排除クロマトグラフィーからなる群より選択される沈殿、結晶化及び／又はクロマトグラフィーが挙げられる。したがって、好ましい実施態様では、本明細書に記載される方法は、沈殿及び／又はクロマトグラフィーを使用することによって、所望の生体分子（特に、タンパク質）を精製及び／又は濃縮する更なる工程を含む。
【０１５８】
しかしながら、いくつかの実施態様では、細胞は、微粒子に吸着せずに、前記微粒子との相互作用により、生体分子を放出し得ることが発見された。この場合、細胞は微粒子に吸着せず、凝集は起こらない。例えば、逆の表面正味電荷を有する細胞の細胞懸濁液に荷電した微粒子を添加する場合、細胞は微粒子に吸着せず、凝集は全く観察されない。細胞の「表面正味電荷」は、本明細書では、細胞表面に存在する全ての電荷の合計と定義され、周囲溶液のｐＨに依存し得る。
【０１５９】
放出された生体分子は、微粒子に吸着してもよいし、又は吸着しなくてもよい。生体分子が微粒子に吸着しない場合、生体分子の脱離は全く行われない。この場合、例えば遠心分離又はろ過又は任意の他の手段によって、流体から細胞及び微粒子を分離することによって、上清から生体分子を回収し得る。生体分子が微粒子に吸着する場合、微粒子の状態を変化させて、例えば脱離緩衝液による生体分子の溶出を可能にすることによって、脱離を行う。フロックのサイズにより、脱離緩衝液によって生体分子を脱離した後に、形成されたフロックを脱離緩衝液から分離することは容易である。
【０１６０】
当業者であれば、微粒子及び／又は細胞からの上清の分離を達成するためにどの方法を適用するかが容易に分かる。
【０１６１】
回収
本発明は、生体液及び／又は細胞から生体分子を回収するために使用され得る。生体分子の回収は、その全ての文法形において、生体分子を得、採取し、獲得し、受け取り、又は入手することを意味し得る。生体分子は、プラスミド、ポリヌクレオチド又は発現産物、例えばペプチド、タンパク質（グリコシル化又は翻訳後(post-transnationally)修飾されたタンパク質を含む）であり得る。当技術分野で公知の及び／又は本明細書に記載される手段及び方法によって、生体分子を単離及び／又は更に処理（例えば、更に精製）し得る。更に、回収は、細胞を破砕して細胞から生体分子を放出させ、細胞培養物からのその分離を可能にする実施態様も含む。後の工程として、生体分子の更なる精製及び／又は濃縮を行い得る。
【０１６２】
細胞破砕
本発明は更に、荷電した微粒子を細胞懸濁液に添加することによって、細胞を破砕するための方法を提供する。細胞から生体分子が放出される程度に細胞を透過性にするための方法又はプロセスに関して、「細胞破砕」又は「細胞の破砕」という用語は、本明細書では互換的に使用される。細胞破砕は、細胞死を伴うものでもよいし、又は細胞死を伴わないものでもよい。好ましくは、細胞破砕は、細胞構造、例えば細胞壁の完全なフラグメント化を伴わないので、細胞のフラグメント化が減少し、これは望ましくない夾雑物（細胞残屑を含む）のレベルを低下する。本発明のいくつかの実施態様では、本明細書に記載される方法によって破砕されている細胞は生体分子を放出し、依然として生存可能である。「生存可能な」という用語は、適切な成長条件下で増殖することができる細胞を指す。
【０１６３】
放出された生体分子は、細胞を破砕するために使用される微粒子に吸着してもよいし、又は吸着しなくてもよい。続いて、本明細書に記載される方法又は他の公知の技術を使用して、生体液から生体分子を回収し得る。したがって、本発明は、単純化された２段階プロセスで、細胞を破砕し、生体分子を放出させ、続いて生体分子を回収するための新規な方法を提供する。本発明の微粒子は、生体分子の酸性度にかかわらず（すなわち、生体分子は、酸性、塩基性又は中性であり得る）、細胞懸濁液中で生体分子を回収し得るように、細胞を開放して生体分子を放出させるために使用され得る。
【０１６４】
選択性
本発明の方法は、従来の細胞破砕方法によって得られる生体分子と比較して高い純度の生体分子を提供し得る。特に、本発明の方法は、回収される生体分子画分中の非ターゲット物質の量が少ないので、従来技術で使用される従来の方法よりも高い選択性を有する。回収される生体分子の高い純度は、更なる連続する精製工程の必要性を除去し得るので好ましい。好ましくは、本発明の方法は、非ターゲット生体分子に比較して３０％超、例えば４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超又は更に１００％濃縮された生体分子を提供する。非ターゲット生体分子と比較した所定の生体分子の純度を評価するための方法は、当業者に利用可能である。ポリペプチドの場合、例示的な方法は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐａｇｅ）による分離後にクーマシーブルーで染色されたタンパク質の定量的デンシトメトリーである。
【０１６５】
従来の細胞破砕方法を適用すると、細胞が破壊され、核酸、細胞壁成分及び他のフラグメントが放出される。したがって、夾雑物を除去するためには、回収された生体分子を更に精製しなければならない。しかしながら、本明細書に記載される方法は、高分子夾雑物の放出の減少を可能にする。このような夾雑物としては、限定されないが、ｄｓＤＮＡ、ＲＮＡ、宿主細胞タンパク質、宿主細胞残屑及びエンドトキシンが挙げられ得る。驚くべきことに、本発明の方法は、実施例２．２に記載されているように、標準的なＨＰＨプロトコールによって得られる細胞ホモジネート中のｄｓＤＮＡ含量と比較して、ｄｓＤＮＡ含量を最大２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍又は１０倍又は更にそれ以上著しく減少させることが見出された。当業者であれば、例えば市販の蛍光アッセイ又は比色アッセイによって、所定のサンプル中のｄｓＤＮＡ含量を決定し得る。好ましくは、本発明の方法を適用する場合、５倍少ないｄｓＤＮＡが細胞によって放出され、より好ましくは、１０倍少ないｄｓＤＮＡ又は更にそれ以下、例えば１００倍又は１０００倍少ないｄｓＤＮＡが放出される。
【０１６６】
本明細書で使用される「エンドトキシン」は、グラム陰性菌の外側細胞膜の主要な構成成分であるリポ多糖（ＬＰＳ）と互換的に使用される。エンドトキシンは、典型的には、細菌の外側細胞膜の破壊により放出される。本発明の方法は、驚くべきことに、実施例２．２におけるように、標準的なＨＰＨプロトコールによって得られる細胞ホモジネート中のエンドトキシン含量と比較して、放出されるエンドトキシンの量を減少させることが示された。好ましくは、本発明の方法を適用する場合、５倍少ないエンドトキシン、より好ましくは１０倍少ないエンドトキシン又は更にそれ以下、例えば１００倍、１０００倍、１０４倍、１０５又は１０６倍少ないエンドトキシンが細胞によって放出される。当業者であれば、例えばカブトガニ血球抽出成分（ＬＡＬ）ゲル凝固試験、ＬＡＬ発色試験及び市販の又は当技術分野で公知の他の発色試験を使用することによって、エンドトキシン含量を容易に決定し得る。
【０１６７】
生体分子（「産物」）を生産する細胞の培養
本発明の吸着剤を適用する前に、本明細書に定義及び記載される生体分子を得る方法は、生体分子（「産物」）、好ましくは発現産物、例えばタンパク質又はポリヌクレオチドを産生（例えば、発現）する（宿主）細胞を培養する工程を場合により含み得る。本発明の宿主細胞との関連では、培地（血清又は無血清のいずれか）中での「細胞の培養」又は「細胞を培養する」という用語は、それぞれ、細胞を培養容器に播種すること、接着培養の場合には単層が形成されるまで、若しくは懸濁培養の場合には十分な細胞密度が確立されるまで培地中で細胞を成長させること、及び／又は単層が形成されたら可能な限りすぐに培地中で細胞を維持すること、若しくは懸濁液中で細胞を維持することを指す。培地中での「細胞の培養」又は「細胞を培養する」という用語はまた、細胞の培養プロセス全体にわたって動物血清産物が全く存在しないように、又は本質的に存在しないように、無血清培地を用いて上記工程の全てを実施することを含む。指数的フィード又は直線的フィード又は一定フィード又は他の種類のフィード、フェドバッチ培養又は高密度培養によって、細胞を培養し得る。しかし、あるいは、血清含有培地を用いても、上記工程を実施もし得る。
【０１６８】
ヌクレオチド配列及び／又はコードされたポリペプチドは、細胞に関して異種でもよいし、又は異種でなくてもよい。「異種」によって、これは異なるゲノム背景を有する細胞若しくは生物に由来することを意味するか、又は（宿主）細胞に関して同種であるが、前記ヌクレオチド配列の天然に存在するカウンターパートとは異なるゲノム環境にあることを意味する。これは、ヌクレオチド配列が宿主に関して同種である場合、それが、前記宿主のゲノム中のその天然の位置にない（特に、それが異なる遺伝子によって囲まれている）ことを意味する。
【０１６９】
本発明の好ましい実施態様では、発現産物は、タンパク質産物(proteinaceous product)である。本明細書で使用される場合、「タンパク質(proteinaceous)」は、炭素、水素、酸素、窒素及び通常は硫黄を含有し、１本以上のアミノ酸鎖から構成される複雑な有機高分子の群のいずれかを指す。好ましいタンパク質発現産物は、ポリペプチドである。「タンパク質(proteinaceous)」という用語はまた、タンパク質に関係すること、タンパク質からなること、タンパク質に似ていること、又はタンパク質に関することを意味する。本発明のより好ましい実施態様では、産物は、産生される目的のポリペプチドである。産物は、生物学的に活性であることが好ましい。タンパク質産物は、酸性又は塩基性であり得る。
【０１７０】
発現産物は、ヌクレオチド配列（好ましくは、遺伝子工学的宿主細胞との関連で当技術分野で一般的に公知の手段及び方法によって、細胞に外因的に付加されるヌクレオチド配列）の転写及び／又は翻訳の産物であり得る。産物は、例えば、プラスミド、ミニサークルＤＮＡ、コスミド、ＢＡＣ、ｓｓＤＮＡ若しくはｄｓＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列（リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）（これらは全て、細胞中で産生可能である）を含むヌクレオチド配列であり得るか、又はそれは、転写されたＲＮＡの翻訳によって細胞中で生成されるペプチド若しくはポリペプチドであり得る。
【０１７１】
本明細書で使用される「ポリペプチド」は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド及びそれらのフラグメントを含み、前記「ポリペプチド」は全て、好ましくは生物学的に活性である。「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸、一般には約１０、２０又は３０よりも多いアミノ酸のポリマーを指すために互換的に使用される。これらの用語はまた、グリコシル化、アセチル化及びリン酸化を含む反応を介して翻訳後修飾されているタンパク質を含む。ポリペプチドは、半減期を延長するための融合パートナー（例えば、Ｆｃ融合物、アルブミン融合物）、又はアフィニティークロマトグラフィー用のアフィニティータグとしての融合パートナー、又は正しいＮ末端を提供するための若しくは目的のタンパク質の産生収量を増加させるための融合パートナー、に融合した融合ポリペプチドであり得る。「ペプチド」という用語は、より短いアミノ酸ストレッチ、一般には約３０未満のアミノ酸を指す。ポリペプチドは、アゴニスト若しくはアンタゴニストとして機能し得、及び／又は治療用途若しくは診断用途を有し得る。
【０１７２】
更に、本発明の細胞で発現されるポリペプチドは、哺乳類由来であり得るが、微生物産物及び酵母産物も産生され得る。
【０１７３】
哺乳類ポリペプチド又はタンパク質の例としては、ホルモン、サイトカイン及びリンフォカイン、抗体、例えばＦａｂ、ナノボディ、ｄＡｂ、ｓｃＦｖ、レセプター、接着分子、及び酵素、並びにそれらのフラグメントが挙げられる。所望の産物の非包括的なリストとしては、例えば、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン成長、黄体形成ホルモン；ホルモン放出因子；リポタンパク質；α−１−抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；カルシトニン；グルカゴン；レニンなどの分子；因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子、及びヴォン・ヴィレブランド因子などの凝固因子；Ｃタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、肺表面活性剤などの抗凝固因子；ウロキナーゼ又はヒト尿又は組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）などのプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子−α及び−β；エンケファリナーゼ；ランテス（正常なＴ細胞発現及び分泌の活性化を調節）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミュラー管抑制物質；レラキシンＡ鎖又はＢ鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；デオキシリボヌクレアーゼ；インヒビン；アクチビン；ホルモン又は成長因子のレセプター；インテグリン；Ａ又はＤタンパク質；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、若しくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、若しくはＮＴ−６）などの神経栄養因子、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＮＧＦ−などの神経成長因子を含む成長因子；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６などの線維芽成長因子；上皮成長因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−ｐ１、ＴＧＦ−ｐ２、ＴＧＦ−ｐ３、ＴＧＦ−ｐ４、又はＴＧＦ−ｐ５を含む、ＴＧＦ−α及び−βなどの形質転換成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉ及び−ＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−１１）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８、及びＣＤ−１９などのＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−α、−β、及び−γなどのインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；エリスロポエチン；Ｔ−細胞レセプター；表面膜タンパク質、例えば、ＨＥＲ２；崩壊促進因子；ウイルス抗原、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部分など；輸送タンパク；ホーミングレセプター；アドレシン；調節タンパク質；抗体；イムノアドヘシンなどのキメラタンパク質、並びに上記ポリペプチドのいずれかのフラグメントが挙げられる。
【０１７４】
本明細書における好ましいポリペプチド及びタンパク質は、治療用タンパク質、例えばＴＧＦ−β、ＴＧＦ−α、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、デオキシリボヌクレアーゼ、プラスミノーゲン活性化因子、例えばｔ−ＰＡ、凝固因子、例えば組織因子及び因子ＶＩＩＩ、ホルモン、例えばレラキシン及びインスリン、サイトカイン、例えばＩＦＮ−ｙ、キメラタンパク質、例えばＴＮＦレセプターＩｇＧイムノアドヘシン（ＴＮＦｒ−ＩｇＧ）又は抗体、例えば二重特異性抗体、ラクダ抗体及びそのフラグメント、ＶＨＨドメイン抗体、ドメイン抗体、免疫グロブリン、例えば抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＭ、抗ＩｇＤ又は抗ＩｇＥである。好ましい治療用タンパク質は、ヒト起源のもの、又は「ヒト化」タンパク質、例えば本明細書に記載されるヒト化抗体である。
【０１７５】
産物がポリペプチドである場合、ポリペプチドをタグ付けし得る（すなわち、好ましくは、前記ポリペプチドの単離及び／又は精製を可能にする異種ポリペプチドと融合し得る）。異種ポリペプチドは、例えば、ヒスチジンタグ、Ｆｌａｇタグ、ストレプトアビジンタグ、ｓｔｒｅｐ  ＩＩ  ｔａｇ、インテイン、マルトース結合タンパク質、ＩｇＡ又はＩｇＧ  Ｆｃ部分、Ａタンパク質又はＧタンパク質であり得る
【０１７６】
産物が、ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである場合、ヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列である前記発現産物の単離及び／又は精製を可能にする異種ヌクレオチド配列と融合し得る。例えば、異種ヌクレオチド配列は、相補的ヌクレオチド配列に結合し得、それにより前記ヌクレオチド配列の単離及び／又は精製が可能になる。異種ポリペプチド又はヌクレオチド配列との関連で使用される場合、「異種」は、ポリペプチド又はヌクレオチド配列が、所望の発現産物であるポリペプチド又はヌクレオチド配列と異なることを意味する。
【０１７７】
ポリヌクレオチドの一例として、産物がプラスミドである場合、前記プラスミドは、遺伝子治療若しくはＤＮＡワクチン接種に有用であるか、又は治療用タンパク質、例えば本明細書に記載されるものをコードし得る。
【０１７８】
一方、細胞は、ウイルスを発現し得る（すなわち、宿主細胞は、いわばウイルスが複製及び／又は増殖される適切な環境を提供する産生細胞株として機能する）。したがって、産物は、ウイルスであり得るだろう。実際的には、本発明の方法によって、ｄｓＤＮＡウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス）、ｓｓＤＮＡウイルス（例えば、パルボウイルス）、ｄｓＲＮＡウイルス（例えば、レオウイルス）（＋）ｓｓＲＮＡウイルス（例えば、ピコルナウイルス、トガウイルス）、（−）ｓｓＲＮＡ（例えば、オルトミクソウイルス、ラブドウイルス）、ｓｓＲＮＡ−ＲＴウイルス（例えば、レトロウイルス）、及びｄｓＤＮＡ−ＲＴウイルス（例えば、ヘパドナウイルス）などの任意のウイルスを回収し得る。ウイルス複製は、ターゲット細胞での感染及び増殖プロセスの間のウイルスの形成を説明するために使用される用語である。ウイルスの観点から、ウイルス複製の目的は、その種の産生及び生存を可能にすることである。そのゲノムの大量のコピーを生成し、これらのコピーをウイルス中にパッケージングすることによって、ウイルスは、新たな宿主に感染し続けることができる。本発明との関連では、適切な宿主細胞により産生されたウイルスは、例えば溶解又は出芽によって宿主細胞から出ることができないか、又は本質的に出ることができないことが好ましい。
【０１７９】
前述のように、産物はまた、ウイルスであり得る。「ウイルス」は、「ネイティブな」ウイルス及び「組換え」ウイルスを含み、「ネイティブ」は、天然から単離されたウイルスであって、遺伝子操作されていないウイルス（例えば、臨床分離株）、又は天然に見られ得る（すなわち、天然に存在する）ウイルス、又は例えば免疫目的で使用される典型的な樹立ウイルス株（例えば、弱毒化ウイルス）を意味する。
【０１８０】
要するに、本発明は、工業規模に容易に適用され得る高速で効率的で単純化され安価な方法を提供する。
【実施例】
【０１８１】
実施例１  イオン交換樹脂からの微粒子の調製
水処理のための樹脂ビーズは、DOWから購入した。試験した樹脂の概要を表１に示す。
【表１】
2020019799.tif 000002
表１
【０１８２】
それぞれ陽イオン交換体（Ｍａｒａｔｈｏｎ  ＭＳＣ、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＣ７４８）及び陰イオン交換体（Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ａ２、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ４５８）のために、全ての樹脂をそれらのナトリウム型又は塩化物型にプレコンディショニングした。その後、脱イオン水で粒子を繰り返し洗浄した（＜１mS/cm及び中性ｐＨ）。樹脂の官能基の概要を図１に示す。
【０１８３】
NETSCH社でLabstar LS1 millを用いて、又は乳棒及び乳鉢を用いて手動で、微粒子を湿式粉砕した。粉砕することによって得られた平均粒子径分布（ＰＳＤ）の概要を表２に示す。倍率１０００倍の光学顕微鏡によって粒子径を測定し、５００〜５００００個の個別の投影をカウントすることによって平均円相当径を推定した。
【表２】
2020019799.tif 000003
表２  粒子径分布
【０１８４】
光学投影から粉砕した粒子の形状は、不明確であると考えられた。懸濁液の濃度を、遠心分離によって調整し、脱イオン水中の充填層体積から推定した。湿潤樹脂及び乾燥樹脂の重量差から、水分含量を計算した。
【０１８５】
実施例２  ターゲットタンパク質の回収
実施例２．１：ＣＳＰＥによるターゲットタンパク質の回収
E. coli（ＨＭＳ１７４）細胞を３７℃（ＧＦＰｍｕｔ３．１）及び３０℃（ＳＯＤ）でフェドバッチ培養した。組換えタンパク質の発現をＩＰＴＧ誘導した。遠心分離によって、細胞を回収した。室温でアリコートを用いて、タンパク質抽出実験を実施した。最初、体積細胞濃度（湿潤充填層）は、約１０％v/vであった。懸濁液５０mlを４０００rcfで１０分間遠心分離することによって、これを決定した。様々な細胞及び塩濃度による実験の場合、各緩衝液中で激しく混合することによって、ペレットを懸濁した。１０×ストック溶液を５０％懸濁液に添加し、ｄｄＨ２Ｏで作業容量（２０ml）に希釈することによって、最終的な細胞、粒子、緩衝液及び塩の濃度を調整した。撹拌ビーカー（混合）中で、又はチューブ（静的）中で、インキュベーションを室温（約２３℃）で最大３時間実施した。両方とも、同様の高さ：直径の比を有していた。簡便なマグネチックスターラーを底に入れて、混合強度を８００rpmに調整した。放出されたタンパク質を定量するために、各緩衝液で１mlアリコートを１：２希釈した。その上で、サンプルを８０００rcfで最大１０分間（約２３℃）遠心分離し、更なる調査のために上清を収集した。
【０１８６】
実施例２．２  ＨＰＨによるターゲットタンパク質の抽出
E. coli（ＨＭＳ１７４）細胞を３７℃（ＧＦＰｍｕｔ３．１）及び３０℃（ＳＯＤ）でフェドバッチ培養した。細胞を緩衝液（５０mM Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１００mM ＮａＣｌ）に懸濁して２５％v/vにし、高圧ホモジナイゼーション（Niro-Soave Panda 2k、１００MPaで２回通過）によって破砕した。
【０１８７】
実施例３  蛍光によるターゲットタンパク質の定量
実施例３．１  蛍光
陰イオン交換（AIEX CaptoQ）、疎水性相互作用（ButylSepharose）及びゲルろ過（SuperdexG75 prep. grade）クロマトグラフィーを用いて、（１００００rcfで６０分間遠心分離し、０．２マイクロでろ過した）清澄化E. coliホモジネートから逐次精製することによって、ＧＦＰｍｕｔ３．１標準（＞９５％）を調製した。２８０nmの吸光度から、濃度を決定した（８M尿素によって１００℃で１０分間変性させた）。プレートリーダー（Tecan GENios Pro）によって、４８５nm（励起）及び５３５／２０nm（発光）の標準的なキャリブレーションから、同等の蛍光を決定した。
【０１８８】
ＨＰＨ細胞破砕と比べて、ＧＦＰの回収効率（％回収）を定量した（実施例２．２に記載されているように、１００MPaで２回通過）。
【０１８９】
実施例３．１．１  細胞濃度
粉砕したＭａｒａｔｈｏｎ  Ａ２（ＭＡ２）に吸着させ、ＮａＣｌで溶出することによって回収したＥ．ｃｏｌｉ細胞由来のＧＦＰの回収を決定した。遠心分離によって細胞ブロスから細胞を分離し、体積濃度２０％（v/v）、６％（v/v）及び１％（v/v）で５０mM ＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）に懸濁した。細胞懸濁液を様々な体積比２００％、１００％、５０％及び０％の樹脂と混合し、１時間静的インキュベーションした。２M ＮａＣｌで懸濁液アリコートを１：２希釈することによって、溶出を実施した。蛍光によって、水相中のＧＦＰを定量した。陽イオン性樹脂との比較のために、粉砕したＭａｒａｔｈｏｎ  ＭＳＣ（ＭＭＳＣ）を同じ条件で使用した。
【０１９０】
図２は、６％（v/v）の細胞濃度において、１００％のＧＦＰ回収が達成されたことを示している。２０％（v/v）の細胞濃度では、抽出されたタンパク質の量は、５０％未満に減少した。対照的に、より少量の微粒子を２０％（v/v）細胞懸濁液に添加すると、より多くの回収（最大４５％）がもたらされた。１％では、回収されたＧＦＰの量は、微粒子の量に比例して減少した。微粒子を添加しない場合、上清中のＧＦＰの量は２０％未満であった。同じ条件で細胞を粉砕したＭａｒａｔｈｏｎ  ＭＳＣ（陽イオン交換）と共にインキュベーションすることによっては、タンパク質抽出及び細胞破砕の効果を観察することはできなかった。
【０１９１】
実施例３．１．２  樹脂：細胞の体積比
異なる樹脂：細胞の体積比において、粉砕したＭａｒａｔｈｏｎ  Ａ２（ＭＡ２）に吸着させ、ＮａＣｌで溶出することによって回収したＥ．ｃｏｌｉ細胞由来の抽出ＧＦＰの回収を決定した。遠心分離によって細胞ブロスから細胞を分離し、１０％（v/v）で５０mM ＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）に懸濁した。細胞懸濁液を様々な体積比２００％、１００％、７０％、５０％、３０％及び０％の樹脂と混合し、１時間静的インキュベーションした。２M ＮａＣｌで懸濁液のアリコートを１：２希釈することによって、溶出を実施した。蛍光によって、水相中のＧＦＰを定量した。
【０１９２】
図３は、１時間のインキュベーション後において、粉砕したＭａｒａｔｈｏｎ  Ａ２から脱離することによって、ＧＦＰのほぼ１００％を回収したことを示している。Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ａ２なしの場合、総可溶性ＧＦＰの２０％未満を細胞から抽出した。
【０１９３】
実施例３．１．３  ｐＨ及びインキュベーション時間
異なるｐＨ値及び異なるインキュベーション時間において、粉砕したＭａｒａｔｈｏｎ  Ａ２（ＭＡ２）に吸着させ、ＮａＣｌで溶出することによって回収したＥ．ｃｏｌｉ細胞由来の抽出ＧＦＰの回収を決定した。ＮａＯＨを添加することによって、細胞ブロス懸濁液のｐＨを７．５、８．０及び８．５に調整した。細胞懸濁液を体積比１００％の樹脂と混合し、３時間静的インキュベーションした。２M ＮａＣｌで懸濁液のアリコートを１：２希釈することによって、定期的な（１０分間、６０分間、１２０分間、１８０分間）溶出を実施した。蛍光によって、水相中のＧＦＰを定量した。最大３時間のインキュベーション後において、ｐＨ７．５及び８．０では、総可溶性ＧＦＰの約４０％及び７０％を細胞ブロスから回収することができた。ｐＨ８．５においてのみ、１００％の回収が達成された。
【０１９４】
実施例３．１．４  ｐＨ、樹脂：細胞の体積比及びインキュベーション時間
０〜１００％の間での樹脂：細胞の体積比の影響を更に調査した。ＮａＯＨを添加することによって、細胞ブロス懸濁液のｐＨを７．５、８．０及び８．５に調整した。細胞懸濁液を様々な樹脂：細胞の体積比１００％、７０％、５０％、３０％及び０％で混合し、３時間静的インキュベーションした。２M ＮａＣｌで懸濁液のアリコートを１：２希釈することによって、定期的な（１０分間、６０分間、１２０分間、１８０分間）溶出を実施した。蛍光によって、水相中のＧＦＰを定量した。
【０１９５】
図４は、ｐＨは最大回収に対して有意な影響を有したが、添加した樹脂量の効果は無視できるものであったことを示している。１０％（v/v）の細胞懸濁液を破砕し、細胞ブロスからＧＦＰを直接回収する場合、ｐＨ８．５では、２時間の静的インキュベーション後において、７０％の樹脂：細胞の比（v/v）が効率的であると考えられた。
【０１９６】
実施例３．１．５  塩濃度及びＧＦＰ吸着容量
異なるＮａＣｌ濃度（０〜５００mM）において、粉砕したＭａｒａｔｈｏｎ  Ａ２（ＭＡ２）に吸着させ、ＮａＣｌで溶出することによって回収したＥ．ｃｏｌｉ細胞由来の抽出ＧＦＰの回収を決定した。遠心分離によって細胞ブロスから細胞を分離し、１０％v/vで５０mM ＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）に懸濁した。２M ＮａＣｌ緩衝液で懸濁液のＮａＣｌ濃度を調整した。細胞懸濁液を樹脂：細胞の様々な体積比１００％、７０％、５０％、３０％及び０％の樹脂と混合し、１時間静的インキュベーションした。２M ＮａＣｌで懸濁液のアリコートを１：２希釈することによって、溶出を実施した。蛍光によって、水相中のＧＦＰを定量した。
【０１９７】
図５は、０mM ＮａＣｌにおいて、最大１００％のＧＦＰ回収が達成されたことを示している。
【０１９８】
脱離前後の水相（上清）中の濃度を比較することによって、微粒子に結合したＧＦＰの量を調査した（図６）。ＧＦＰの量の差分が樹脂に吸着したとみなした。標準ラングミュア式を用いて、傾向をフィッティングした。
【０１９９】
実施例３．１．６  陰イオンキレート樹脂による抽出
また、E. coli細胞をキレート微粒子と共にインキュベーションして、タンパク質抽出も実証した（図７）。Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ａ２の強塩基性第４級基とは対照的に、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ  ７４８から自作した微粒子のイミノ二酢酸基は、多価陽イオンに対して高い親和性を有する陽イオン交換体である。その場合、懸濁液の凝集は観察されなかった。
【０２００】
５０mM ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ８．０）中、細胞（５％v/v）に対して体積比３０％及び７０％v/vの樹脂でインキュベーションし、続いて１M ＮａＣｌで溶出した後における、キレート（粉砕したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ  ７４８）及び陽イオン微粒子（粉砕したＭａｒａｔｈｏｎ  Ａ２）による細胞懸濁液（E. coli）からのＧＦＰ抽出を、塩で溶出しない以外は同じ条件下におけるＧＦＰ抽出と比較して決定した（図７ａ、ｂ）。更に、撹拌インキュベーション条件及び静的インキュベーション条件下におけるＧＦＰ抽出を決定した（図７ａ、ｂ）。脱離によってタンパク質を回収した粉砕したＭＡ２とは対照的に、ＧＦＰはキレート微粒子に吸着しなかった。実施した規模では、タンパク質の収量は、キレート微粒子とのインキュベーションの間の静的条件又は撹拌条件によって影響されないと思われる。
【０２０１】
実施例３．１．７  タンパク質抽出に対する溶出条件の影響
５０mM ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ８．０）中、細胞（５％v/v）に対して体積比３０％、７０％及び１００％v/vの樹脂で２時間インキュベーションし、続いて１M ＮａＣｌで溶出した後における、キレート（粉砕したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ  ７４８）及び陽イオン微粒子（粉砕したＭａｒａｔｈｏｎ  Ａ２）による細胞懸濁液（E. coli）からのＧＦＰ抽出を、塩で溶出しない以外は同じ条件下におけるＧＦＰ抽出と比較して決定した。５０mM ＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）中で、E. coli細胞を粉砕したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ  ７４８と共に２時間インキュベーションすることによって、最大１００％のＧＦＰ抽出収率が得られた（図８）。回収したＧＦＰの収量は、添加したキレート微粒子の体積比と共に増加した。
【０２０２】
実施例３．１．８  タンパク質抽出に対する細胞濃度の影響
塩で溶出せずに、攪拌ビーカー中の５０mM ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ８．０）中、２０％、１５％、１０％及び５％体積細胞濃度の細胞に対して体積比７０％v/vの樹脂でインキュベーションした後における、キレート樹脂（粉砕したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ  ７４８）による細胞懸濁液（E. coli）からのタンパク質（ＧＦＰ）抽出を決定した（図９）。懸濁液中のより高い細胞濃度は、キレート微粒子の抽出収率に好ましい影響を及ぼした。Ｅ．ｃｏｌｉの乾燥生物量(dry biomass)（ｄ．ｍ．）に関する抽出したタンパク質量のＧＦＰ抽出動態を決定した（図１０）。
【０２０３】
実施例４  ＳＤＳ  Ｐａｇｅによるターゲットタンパク質の定量
４０００rcfで１５分間遠心分離することによって、E. coliホモジネートの重い固体画分を分離した。上清を移し、４０００rcfで６０分間遠心分離した後に、軽い画分を集めた。ペレットを脱イオン水に懸濁し、先のように２回逐次洗浄した。１０M尿素（ｐＨ８．０）で細胞残屑及び粗ホモジネートの参照サンプルを１：５希釈し、ロータリーシェーカー上で１時間インキュベーションした。
【０２０４】
１：４  ＳＤＳサンプル緩衝液及び０，２M ＤＴＴ中で、全てのサンプルを１００℃で１０分間加熱した。ＭＥＳ−ＳＤＳランニング緩衝液中、８〜１２％ポリアクリルアミドゲル上で、電気泳動を２００Ｖ及び最大４００ｍＡで６０分間実施した。CoomassieR250及びBismarkBraunR (Choi et al. 1996)を用いて、染色を実施した。光学ゲルスキャニング（Epson Perfection Scan V770、６００ｄｐｉ、１６ｂｉｔグレースケール）及びLumiAnalyst (v3.0 Roche Diagnostics)ソフトウェアによる評価を用いて、デンシトメトリーを実施した。
【０２０５】
実施例４．１  ＳＯＤ抽出
Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ４５８から得られた陽イオン微粒子と共にE. coli細胞をインキュベーションすることにより、タンパク質抽出を実証した。Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ａ２のスチレンジビニルベンゼン（ＰＳ／ＤＶＢ）マトリックスとは対照的に、アクリル樹脂から得られた微粒子は、同じ充填層体積でより多くの水を含有していた。アクリル微粒子では、凝集が明らかにより強力であったが（より大きなフロック及びより早い沈殿）、これは詳細には調査しなかった。加えて、ターゲットタンパク質は、ＧＦＰではなくスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）であった。
【０２０６】
実施例４．１．１  様々なインキュベーション条件におけるタンパク質の収率
チューブ内において、５０mM ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ８．０）［示してください(please indicate)］中、細胞（１０％v/v）に対して体積比５０、７０及び１００％v/vの樹脂で静的インキュベーションし、続いてＮａＣｌで溶出した後に、アクリル樹脂（粉砕したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ４５８）によって、細胞懸濁液（E. coli）から、タンパク質（ＳＯＤ）の抽出収率を決定した。ＳＤＳ−Ｐａｇｅの標準的なキャリブレーションから、デンシトメトリーによってタンパク質の量を推定した（図１１）。アクリル樹脂と共に１時間静的インキュベーションした後に、ＳＯＤの放出動態がほぼ終了した。同量の０．５M及び１．０M ＮａＣｌを用いて、アクリル微粒子に吸着したＳＯＤを回収した。
【０２０７】
実施例４．１．２  Ｅ．ｃｏｌｉホモジネートからのＳＯＤ回収
短時間混合し、インキュベーション（５０mM ＴＲＩＳ、ｐＨ８．０）し、続いてＮａＣｌ（０．０M、０．５M、０．１M）で溶出した後、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ  ４５８微粒子（１００％、７０％、５０％v/vの樹脂：細胞の体積比）と共にインキュベーションした後に、１０％（v/v）細胞懸濁液から得られたE. coliホモジネートからのＳＯＤ回収を決定した。０．５M及び１．０Mによる溶出では、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ  ４５８微粒子に吸着したＳＯＤを同量で回収した（図１２）。
【０２０８】
実施例４．１．３  ＳＯＤ吸着容量
微粒子に結合したＳＯＤの量を調査した。
【０２０９】
Ａ２微粒子を用いてE. coli細胞から抽出し、０．２M ＮａＣｌを含む５０mM ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ８．０）中、７０％v/v（樹脂／細胞）で２時間インキュベーションした後に脱離することによって、ＳＯＤ標準（ＳＤＳ−Ｐａｇｅのクーマシー染色による評価では＞９５％）を調製し、続いて、ゲルろ過（GEのSuperdexG75 prep. grade）によって精製した。２８０nmの吸光度から、濃度を決定した（８M尿素中、１００℃で１０分間変性させた）。ＳＤＳ−ｐａｇｅの５点キャリブレーションから、デンシトメトリーによってサンプルの濃度を評価した。抽出及びホモジナイズによって得られたＳＯＤサンプルの濃度を、標準に対する積分によって比較した。
【０２１０】
実施例５：非ターゲットタンパク質の抽出
粉砕したＭａｒａｔｈｏｎ  Ａ２に吸着させることによって抽出したＧＦＰの純度を、ＳＤＳ−Ｐａｇｅによって、ホモジネートと比較してチェックした。ＨＰＨの後、E. coliホモジネートの（例えば、ＧＦＰ封入体を含有する）重い固体画分を、４０００rcfで１５分間遠心分離することによって分離した。上清を移し、４０００rcfで６０分間遠心分離した後に、軽いホモジネート画分を集めた。軽いホモジネートの画分は、細胞残屑及び膜タンパク質、例えば外膜Ａタンパク質（ＯｍｐＡ）を含有し、細胞破砕の指標として機能する。ペレットを脱イオン水に懸濁し、先のように２回逐次洗浄した。１０M尿素（ｐＨ８．０）で細胞残屑及び粗ホモジネートの参照サンプルを１：５希釈し、ロータリーシェーカー上で１時間インキュベーションした。粗ホモジネート、ホモジネート上清、及び５０mM ＴＲＩＳ中で細胞を５０％v/v粉砕したＭａｒａｔｈｏｎ  Ａ２と共にｐＨ８．０で３時間インキュベーションすることによって抽出した溶出タンパク質を用いて、ＳＤＳ−Ｐａｇｅを実施した。２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００及び１０００mM ＮａＣｌで１：２希釈することによって、懸濁液のアリコートを溶出した。全てのサンプルのＳＤＳ−Ｐａｇｅを同じ希釈率で実施し、タンパク質の量を評価するために、クーマシー染色のデンシトメトリーを使用した。約３９kDaの主要な膜タンパク質（ＯＭＰ）のために、洗浄した細胞残屑をレファレンスとして適用した。
【０２１１】
３００mM ＮａＣｌの脱離条件では、抽出後に、粗ホモジネート及び清澄化ホモジネートと比較して、非ターゲットタンパク質のそれぞれわずか１５％及び１７％が検出された。同じ条件において、軽いホモジネート画分由来のタンパク質の６％及び１２％が、それぞれ上清中に見られた。
【０２１２】
更に、５０mM ＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）中、静的条件で混合しながら、細胞をそれぞれ７０％v/v粉砕したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＣ  ７４８及び粉砕したＭａｒａｔｈｏｎ  Ａ２と共に２時間インキュベーションした後に、ホモジネート上清及び溶出タンパク質を比較した。５０mM ＴＲＩＳ緩衝液又は１M ＮａＣｌで、懸濁液のアリコートを１：２希釈した。全てのサンプルのＳＤＳ−Ｐａｇｅを同じ希釈率で実施し、タンパク質の量を評価するために、クーマシー染色のデンシトメトリーを使用した。
【０２１３】
ＳＤＳ−Ｐａｇｅ（クーマシー）のデンシトメトリーによってＧＦＰの回収を評価し、溶出した宿主細胞タンパク質（特に、膜タンパク質）と比較した（図１３、図１４、図１５）。５０mM ＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）中で、細胞を５０％v/v粉砕したＭａｒａｔｈｏｎ  Ａ２と共に３時間インキュベーションした後に、抽出したタンパク質を比較した。２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００及び１０００mM ＮａＣｌで１：２希釈することによって、懸濁液のアリコートを溶出した。全てのサンプルのＳＤＳ−Ｐａｇｅを同じ希釈率で実施し、タンパク質の量を評価するために、クーマシー染色のデンシトメトリーを使用した（図１３）。３００mM ＮａＣｌでは、Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ａ２からＧＦＰをほぼ１００％まで上清に回収した。より高い塩濃度で脱離すると、より多量の非ターゲットタンパク質及び軽画分タンパク質が回収された（図１４）。上清中での高圧ホモジナイゼーションと比較して、平均１５％の軽画分タンパク質及び２０％の非ターゲットタンパク質を、微粒子により、細胞からそれぞれ抽出した。
【０２１４】
クーマシー染色によって検出されたタンパク質のプロファイルにより、ＨＰＨによって破砕した細胞の上清と、微粒子による抽出によって破砕した細胞の上清との間の純度の差が示された。ホモジネート上清、及び５０mM ＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）中で細胞を５０％v/v粉砕したＭａｒａｔｈｏｎ  Ａ２と共に３時間インキュベーションした後に３００mM ＮａＣｌで溶出したタンパク質のタンパク質プロファイルを図１５に示す。サンプルのＳＤＳ−Ｐａｇｅを同じ希釈率で実施し、相対的なタンパク質の量を評価するために、クーマシー染色のデンシトメトリーを使用した。ＧＦＰの相対純度は、ホモジネートでは９．８％であり、３００mM ＮａＣｌの溶出液では３７．４％であり、抽出後の平均は３３．２％±２．９％であった。
【０２１５】
別のアプローチでは、５０mM ＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）中で、細胞を７０％粉砕したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ７４８と共に２時間インキュベーションした後に、ホモジネート上清及び抽出タンパク質のタンパク質プロファイルを決定した。サンプルのＳＤＳ−Ｐａｇｅを同じ希釈率で実施し、相対的なタンパク質の量を評価するために、クーマシー染色のデンシトメトリーを使用した。ＧＦＰの相対純度は、ホモジネートでは１２．４％であり、上清では３８．４％であり、抽出後の平均は４１．６％±２．７％であった。
【０２１６】
５０mM ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ８．０）中で静的インキュベーション（１０％v/v）し、続いてＮａＣｌで溶出した後に、陽イオン性樹脂（Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ａ２）による細胞懸濁液（E. coli）からのタンパク質（ＳＯＤ）の抽出動態中に、非ターゲットタンパク質の減少を決定した。ＳＤＳ−Ｐａｇｅからのデンシトメトリーによって、非ターゲットタンパク質の量を推定した。細胞から抽出したＳＯＤの純度は、スチレン微粒子によってホモジネートから捕捉したものよりも２倍高かった。
【０２１７】
実施例６：ＳＯＤ活性
５０mM ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ８．０）中、細胞（１０％v/v）に対して体積比７０％v/vの樹脂で静的インキュベーションし、続いて０．５M ＮａＣｌで溶出した後、細胞懸濁液（E. coli）及びホモジネートから抽出した後に、スチレン陽イオン微粒子Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ａ２（ＭＡ２）によって細胞から抽出したＳＯＤの酵素活性を決定した。上清を遠心分離（１ml、３０分間、２３℃及び１６０００rcf）し、ろ過（ＰＶＤＦ膜、０．２μm）し、各緩衝液で有効測定範囲まで１：１０の段階希釈をした。Sigmaから購入した19160 SOD determination kitによって、ＳＯＤ活性を決定した。ＭＡ２微粒子によって細胞から抽出したＳＯＤの酵素活性は、ホモジネートから捕捉したものと比較して平均で１ユニット増加した。
【０２１８】
実施例７：夾雑物
Invitrogenから購入したQuant-iT（商標）PicoGreen（登録商標）dsDNA Assay Kitを用いて、ＤＮＡを定量した。Lonzaから購入したPyroGene（商標）Recombinant Factor C Assayを用いて、エンドトキシンを定量した。全ての上清サンプルを遠心分離（１ml、３０分間、２３℃及び１６０００rcf）し、ろ過（ＰＶＤＦ膜、０．２μm）し、各緩衝液で有効測定範囲まで１：１０の段階希釈をした。各キットの説明表記にしたがってプレートリーダー（TecanのGENios Pro又はInfinite 200M）によって、測定を実施した。
【０２１９】
実施例７．１  ｄｓＤＮＡ
５０mM ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ８．０）中、細胞（１０％v/v）に対して体積比５０、７０、１００％v/vの樹脂で静的インキュベーションし、続いてＮａＣｌで溶出した後、アクリル（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ４５８）及び陽イオン性樹脂（ＭａｒａｔｈｏｎＡ２）による細胞懸濁液（E. coli）からのタンパク質（ＳＯＤ）の抽出中に、ｄｓＤＮＡの減少を決定した。上記のように、ＤＮＡを定量した。細胞を微粒子と共にインキュベーションすることによって、最大１０２より少ないｄｓＤＮＡを放出させた。タンパク質溶出条件（０．５M ＮａＣｌ）では、上清中のｄｓＤＮＡの減少は、１０２〜１０３であった（図１６）。
【０２２０】
実施例７．２  エンドトキシン
５０mM ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ８．０）中で静的インキュベーション（１０％v/v）し、続いてＮａＣｌで溶出した後、陽イオン性樹脂（Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ａ２）による細胞懸濁液（E. coli）からのタンパク質（ＳＯＤ）の抽出動態中に、エンドトキシンの減少を決定した。上記のように、エンドトキシンの量を定量した。
【０２２１】
抽出条件では、ホモジネートからの吸着と比較して、１０３より少ないエンドトキシンが上清に放出された（図１７）。０．５M ＮａＣｌ及び１．０M ＮａＣｌでは、エンドトキシンは約１０倍減少した。
【０２２２】
実施例８：顕微鏡検査
実施例８．１：原子間力顕微鏡検査（ＡＦＭ）
スクロース（５０mM）溶液、脱イオン水及び微粒子の希釈懸濁液で正に荷電した顕微鏡スライドを逐次処理した。各工程の後、乾燥を６５℃で２４時間実施した。Department of Nanobiotechnology, BOKU (Dr. Gerhard Sekhot)において、測定を行った。
【０２２３】
オープンソースソフトウェアのGwyddion (v2.60)をＡＦＭデータの可視化に使用した。元のビーズの機械的摩耗の結果として、端表面トポグラフィーが明確に生成された。粉砕した粒子は、類似の表面トポグラフィーを有していた（図１８）。
【０２２４】
粉砕したＭａｒａｔｈｏｎ  Ａ２と共にインキュベーションする前後のE. coliのＡＦＭによって生成された画像（図１９）により、細胞のフラグメント化を伴わずにタンパク質が抽出されたことが示された。
【０２２５】
実施例８．２：光学顕微鏡検査
Vienna Institute of Biotechnology (VIBT)において、Leica 「Live Cell」 wide-field microscopeによって、共焦点顕微鏡検査及び蛍光顕微鏡検査を実施した。各緩衝液でサンプルを約１％v/vの固体濃度に希釈し、倍率１０００倍（Leica HCX PL APO 100x 1.4 oil）で可視化した。
【０２２６】
明視野（ＢＦ）、微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）及び蛍光顕微鏡検査を倍率１０００倍で実施した。ＧＦＰのデフォルトの励起波長及び発光波長では、細胞は、移動性の明るい蛍光であった。微粒子に吸着させることによって、細胞は固定化された（図２０）。
【０２２７】
実施例９：細胞生存率
実施例９．１：BacLite
Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ａ２微粒子（７０％の樹脂：細胞の体積比）と共に２時間静的インキュベーション（５０mM ＴＲＩＳ、ｐＨ８．０）し、生理的緩衝液で１：１０希釈した後のE. coli細胞（１０％v/v）の生存率。「BacLite」(Invitrogen)で細胞を染色した。生細胞（緑色）及び死細胞（赤色）が図２１に示されている。
【０２２８】
実施例９．２：コッホのプレート
５０mM ＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）中で、E. coli細胞（１０％v/v）を、粉砕したＭａｒａｔｈｏｎ  Ａ２及びＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ  ４５８から得られた微粒子（７０％v/vの樹脂：細胞の比）と共に３時間静的インキュベーションした後に、細胞生存率を決定した。細胞（E. coli ＧＦＰ）及び細胞／樹脂懸濁液（１mlアリコート）を徐々に希釈し、滅菌０．９％w/w  ＮａＣｌ中で激しく１：１０で混合した。ｄｄＨ２Ｏ中の微生物Ｍｅｒｃｋ  ２０g/l用栄養寒天（ＮＡ）を、１２１℃の蒸気オートクレーブ内で１５分間加熱した。希釈した懸濁液のアリコート（１ml）を培養皿に注ぎ、５５℃でテンパリングしたＮＡ溶液と混合した。室温で３０分経過した後、ゲル形成が完了したと考え、オーバーヘッドでプレートを３７℃で３０時間インキュベーションした。
【０２２９】
陽イオン微粒子と共にインキュベーション後に、最大１０３超のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を決定した。生理的緩衝液で１０００倍希釈した後に、微粒子について関連するＣＦＵ値を求めたところ、吸着した細胞は増殖することができなかったことが示された。
【０２３０】
１０００倍希釈した細胞（樹脂なし）、及び陽イオン微粒子によるＧＦＰ抽出後に１０００倍希釈した細胞から、光学顕微鏡検査によって、細胞の同一性を決定した。サイズ、形状及び蛍光は、E. coli ＧＦＰに対応する。
【０２３１】
実施例１０  疎水性微粒子
疎水性微粒子の調製
【０２３２】
ＤＯＷが提供している吸着型樹脂：Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ４、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ７ＨＰ及びＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ７６１は、Sigma Aldrich, Vienna, Austria, 2011から購入した。
【０２３３】
電気モーター駆動式セラミックコーティング乳鉢を用いて、樹脂を一晩粉砕（２０ｇで約１２時間）した。粉砕した樹脂を水（約１０％v/v及びａｄ．５０ml）に懸濁した。上清を４０００×ｇ（相対遠心力と同等）で３０分間遠心分離した。樹脂を２Ｍ塩化ナトリウム（５０ml）に再懸濁し、１分間（４０００×ｇ）遠心分離した。１分間遠心分離のペレットを廃棄した。上清を移し、再度３０分間（４０００×ｇ）遠心分離した。上清を廃棄した。粉砕した樹脂を水に（１：２で）再懸濁し、チューブに移した。樹脂を４０００×ｇで遠心分離し、上清を廃棄し、樹脂を水性洗浄溶液５０mlに再懸濁した。
【０２３４】
洗浄手順は、以下のとおりであった：
１×５０％ＥｔＯＨ（有機残留物の希釈）
３×脱イオン水（ＥｔＯＨの希釈）
【０２３５】
疎水性微粒子の粒子径
【０２３６】
１％v/v及び倍率６００倍における約５００個の粒子の明視野顕微鏡の投影を測定することによって、微粒子の粒子径分布を円相当径から計算した。
【０２３７】
微粒子及び従来のクロマトグラフ媒体の吸着／脱離に関する一般的なプロトコール
【０２３８】
１mLバッチ（ホモジネート又は標準タンパク質溶液）で吸着・脱離研究を実施した。様々な量の５０％（v/v）微粒子懸濁液（μL単位）を、２mLチューブ内のタンパク質溶液に添加した。タンパク質濃度及び導電率に関する希釈係数を考慮した。
【０２３９】
微粒子懸濁液を３０分間インキュベーションし、従来のクロマトグラフ媒体懸濁液を１２時間インキュベーションした。その後、微粒子又は従来のクロマトグラフ媒体を７０００×ｇで１０分間遠心分離し、溶出緩衝液１mLを添加し、激しく混合し、インキュベーションすることによって、結合したタンパク質の溶出を実施した。いくつかの場合では、溶出緩衝液による第２の洗浄工程を含めた。溶出後、先のように、微粒子又は従来のクロマトグラフ媒体を再度遠心分離した。光分析によって、上清中のタンパク質の濃度を定量し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ターゲットタンパク質の純度をチェックした。
【０２４０】
実施例１１  酸性生体分子の回収
以下の工程によって、微粒子（ＭＰ）（粉砕したクロマトグラフィー樹脂ＭＡＲＡＴＨＯＮ  Ａ２（ＭＡ２））を使用して、E. coliの粗ホモジネート由来の組換えＧＦＰのバッチ吸着を実施した。本実施例では、酸性細胞内可溶性タンパク質としてＧＦＰを使用する。
【０２４１】
５Ｌスケールのフェドバッチプロセスで、E. coli株ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（ｐＥＴ１１ａＧＦＰｍｕｔ３．１）を発酵した。ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）を使用して、細胞内可溶性ターゲットタンパク質ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）の発現を誘導した。
【０２４２】
採取及びホモジナイゼーション：E. coli懸濁液（バイオマス含量約３０重量％）を４℃に冷却し、１５０００ｇで２０分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを更に処理した。細胞ペレットを５０mM Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）に再懸濁し、バイオマス含量２０重量％細胞／緩衝液に希釈した。２継代の１０００ｂａｒでの高圧ホモジナイゼーションによって細胞を破砕して、粗細胞溶解物を得た。
【０２４３】
E. coli溶解物からのバッチ吸着の場合、凍結されたバイオマスを使用することも可能である。この場合、バイオマス（２０％w/v）を５０mM Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）に再懸濁し、新鮮発酵E. coli細胞の場合と同じ破砕手順も適用し得る。
【０２４４】
ターゲットタンパク質の捕捉
【０２４５】
チューブでは１mL容量の小規模で、及びガラスビーカーでは最大１００mLスケールで、バッチ吸着を室温（ｒｔ）で実施した。ＭＡ２を粗細胞溶解物に添加し（細胞ペレット１μg当たり５０％v/v％ＭＡ２ １μLを添加した）、ラボボルテックスで約５秒間混合し、又はより大規模ではオーバーヘッドスターラーで約３０秒間混合した。混合中に、凝集が起こり、ＭＡ２は、ターゲットタンパク質、並びにＤＮＡ、ｈｃｐ（宿主細胞タンパク質）及び細胞フラグメントのような不純物に結合した。凝集後、サンプルを１３４００ｇで３分間遠心分離し、又はオーバーヘッド圧力のデッドエンドろ過において、１．５ｂａｒで０．２μmフィルタープレートを使用してろ過した。上清を廃棄し、洗浄工程のために、ペレット／フィルターケーキを更に処理した。
【０２４６】
凝集物の洗浄
７５mM ＮａＣｌを含む５０mM Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液（ｐＨ７．５）に、凝集物のペレットを再懸濁した。短時間インキュベーションした後、遠心分離（１３４００ｇで３分間）を使用して、凝集物を分離した。ろ過プロセスを使用して分離を行った際、フィルターケーキを再懸濁しなかったが、洗浄緩衝液をフィルターケーキ（０．２μmフィルタープレート、１．５ｂａｒ）に通してろ過することによって洗浄した。上清を廃棄し、溶出工程のために、ペレット／フィルターケーキを更に処理した。低い塩濃度は、結合強度が弱い不純物を溶出することができる。
【０２４７】
溶出：溶出工程では、４００mM ＮａＣｌを含有する５０mM Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に、洗浄した凝集物を再懸濁した。タンブラー内で、凝集物を５分間混合した。４００mM ＮａＣｌ濃度では、ＭＰからターゲットタンパク質が溶出して、上清中に存在している。遠心分離（１３４００ｇで３分間）を使用して又はデッドエンドろ過（０．２μmフィルタープレート、１．５ｂａｒ）により、凝集物から上清を分離した。不純物が結合したＭＰを含有するペレット／フィルターケーキを廃棄し、目的のタンパク質（ＧＦＰ）を含有する上清を更に処理した。
【０２４８】
ＧＦＰの溶出プロファイルを図２２に示す。溶解物サンプルは、レーン１に見られ得る（これは、精製プロセスの出発物質である）。レーン２は、マーカー（Ｍａｒｋ１２ＴＭ）である。レーン３は、捕捉後の上清を示す。ＧＦＰバンドの欠如は、全てのＧＦＰ分子がＭＰに結合していることを示す。レーン４は、洗浄工程である。溶出は、１００〜４００mM ＮａＣｌで起こる。ＧＦＰの場合、溶出サンプルのプールにより、９８％の収率及び約６０％のレーン純度が得られた。
【０２４９】
実施例１２  正に荷電した微粒子を使用した塩基性生体分子の回収
本実施例では、粉砕したＭＡＲＡＴＨＯＮ  Ａ２（ＭＡ２）樹脂由来のＭＰを使用した、細胞ホモジネートからの組換え発現塩基性タンパク質の回収を実証する。タンパク質インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）は、発現した細胞内可溶性塩基性タンパク質の例として機能する。本実施例では、望ましくない細胞構造及び細胞内物質に結合させることによって、正に荷電した交換樹脂を生体分子の回収に使用し得ることを示す（逆精製と称される）。
【０２５０】
フェドバッチ発酵によって、E. coliにおいてＩＦＮ−γを細胞内可溶性で発現させた。
【０２５１】
採取及びホモジナイゼーション
【０２５２】
インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）を発現する細胞の凍結バイオマス（２０％w/v）を使用し、溶解緩衝液（２０mM Ｔｒｉｓ、１０mM ＥＤＴＡ、１M尿素、０．１％β−メルカプトエタノール）に再懸濁した。３継代の９５０ｂａｒでの高圧ホモジナイゼーションによって、細胞を破砕して、粗細胞溶解物を得た。細胞破砕はまた、新鮮なバイオマスでも機能するであろう。
【０２５３】
ターゲットタンパク質の逆精製
【０２５４】
チューブ中、２mL容量の小規模で、バッチ吸着を室温（ｒｔ）で実施した。粗細胞溶解物をＭＡ２（５０％v/v）と混合し、ラボボルテックス内で約５秒間混合した（湿潤細胞ペレット１μg当たり５０％v/v％ＭＡ２ ０．７μLを添加した）。混合中に、凝集が起こり、ＭＡ２は、ＤＮＡ、ｈｃｐ（宿主細胞タンパク質）及び細胞フラグメントのような負に荷電した不純物に結合する。凝集後、サンプルを１３４００ｇで３分間遠心分離し、又はオーバーヘッド圧力のデッドエンドろ過において、１．５ｂａｒで０．２μmフィルタープレートを使用してろ過した。不純物が結合したＭＰを含有するペレット／フィルターケーキを廃棄し、目的のタンパク質（ＩＦＮ−γ）を含有する上清を更に処理した。
【０２５５】
インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）の溶出プロファイルを図２３に示す。定量のために、レーン１はマーカーＭａｒｋ１２ＴＭであり、その次のレーン２〜４はＢＳＡである。レーン５は、細胞ホモジネートである。レーン６は、ＨＣＰ、ＤＮＡ及び細胞フラグメントに結合する正に荷電した微粒子（Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ａ２）を添加した上清サンプルである。レーン７は、不純物を溶出するための１０００mM ＮａＣｌによる例示的なペレットの洗浄及びストリップを示す。収率は最大９９％であり、純度は３０％である。
【０２５６】
実施例１３  正に荷電した微粒子を使用した、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞からの酸性生体分子の回収
本実施例では、ＭＡ２から調製した正に荷電したＭＰを使用した、インタクトなE. coli細胞からの酸性細胞内可溶性タンパク質の抽出を示す。本実施例では、使用するターゲットタンパク質は、ＧＦＰである。異なるＧＦＰ分子（それぞれＧＦＰｍｕｔ３．１及びＧＦＰ．１）を有する２つの異なるE. coli株（ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）及びＢＬ２１）を使用して、タンパク質抽出を示した。タンパク質抽出のための２つの変異体を行った。
【０２５７】
実施例１３．１
５Ｌスケールのフェッドバッチプロセスで、E. coli株ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（ｐＥＴ１１ａＧＦＰｍｕｔ３．１）及びＢＬ２１（ｐＢＩ１ＫＴ７ｉｘ．１＿ＧＦＰ．１）を発酵した。ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）を使用して、細胞内可溶性ターゲットタンパク質ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）の発現を誘導した。
【０２５８】
細胞の採取及び洗浄
【０２５９】
細胞を採取し、Flexboy（登録商標）Bags内において４℃で一晩（約１２時間）保存した。E. coli懸濁液（バイオマス含量約３０重量％）を４℃に冷却し、１５０００ｇで２０分間遠心分離し、その後、同じバイオマス含量を含有する５０mM Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。
【０２６０】
細胞の凝集及びタンパク質の回収
【０２６１】
実施例１３．１では、E.coli細胞を結合及び凝集させるために、少量のＭＰ（３０％湿潤バイオマス含量において細胞懸濁液１mL当たりＭＡ２（５０％v/v） ８５μL）を使用する。ＭＰが細胞と接触している間に、抽出が起こり、ターゲットタンパク質（ここではＧＦＰ）が放出され、上清中に蓄積した。２〜３時間インキュベーションした後、抽出が完了し、デッドエンドろ過（０．２μmフィルタープレート、１．５ｂａｒ）又は遠心分離（１３０００ｇで３分間）を使用して、凝集した細胞を分離した。細胞ペレット／フィルターケーキを廃棄し、ターゲットタンパク質を含有する上清を更に処理した。
【０２６２】
実施例１３．２
本実施例では、より多くの微粒子を細胞懸濁液に添加した。より多量の微粒子は、直接的にターゲットタンパク質の結合及び抽出を可能にした。
【０２６３】
５Ｌスケールのフェッドバッチプロセスで、E. coli株ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（ｐＥＴ１１ａＧＦＰｍｕｔ３．１）及びＢＬ２１（ｐＢＩ１ＫＴ７ｉｘ．１＿ＧＦＰ．１）を発酵した。ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）を使用して、細胞内可溶性ターゲットタンパク質ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）の発現を誘導した。
【０２６４】
細胞の採取及び洗浄
【０２６５】
細胞を採取し、Flexboy（登録商標）Bags内において４℃で一晩（約１２時間）保存した。E. coli懸濁液（バイオマス含量約３０％湿潤）を４℃に冷却し、１５０００ｇで２０分間遠心分離し、その後、同じバイオマス含量を含有する５０mM Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。
【０２６６】
細胞の凝集及びタンパク質の回収
【０２６７】
実施例１３．２では、E.coli細胞を結合及び凝集させるために、実施例１３．１と比較して多量の微粒子（３０％湿潤バイオマス含量において細胞懸濁液１mL当たりＭＡ２（５０％v/v） ３５０μL）を使用する。微粒子が細胞と接触している間に、ターゲットタンパク質の抽出が起こり、ＭＰがタンパク質に直接結合した。１．５〜２．５時間インキュベーションした後、抽出が完了した。デッドエンドろ過（０．２μmフィルタープレート、１．５ｂａｒ）又は遠心分離（１３０００ｇで３分間）を使用して、上清を分離した。上清を廃棄し、凝集物のペレット（ターゲットタンパク質）を更に処理した。
【０２６８】
凝集物の洗浄
【０２６９】
７５mM ＮａＣｌを含む５０mM Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液（ｐＨ７．５）に、凝集物のペレットを再懸濁した。短時間インキュベーションした後、遠心分離（１３４００ｇで３分間）を使用して、凝集物を分離した。ろ過プロセスを使用して分離を行った際、フィルターケーキを再懸濁しなかったが、洗浄緩衝液をフィルターケーキ（０．２μmフィルタープレート、１．５ｂａｒ）に通してろ過することによって洗浄した。上清を廃棄し、溶出工程のために、ペレット／フィルターケーキを更に処理した。低い塩濃度は、結合強度が弱い不純物を溶出することができる。
【０２７０】
溶出
【０２７１】
溶出工程では、４００mM ＮａＣｌを含有する５０mM Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に、洗浄した凝集物を再懸濁した。タンブラー内で、凝集物を５分間混合した。４００mM ＮａＣｌ濃度では、ＭＰからターゲットタンパク質が溶出して、上清中に存在している。遠心分離（１３４００ｇで３分間）を使用して又はデッドエンドろ過（０．２μmフィルタープレート、１．５ｂａｒ）により、凝集物から上清を分離した。不純物が結合したＭＰを含有するペレット／フィルターケーキを廃棄し、目的のタンパク質（ＧＦＰ）を含有する上清を更に処理した。
【０２７２】
図２４は、２つの異なるインキュベーション時間（１時間及び２時間）に関する実施例１３．２のＧＦＰの収率を示す棒グラフである。１は、捕捉上清中のＧＦＰの量を示す。２は、凝集物の洗浄工程における洗浄緩衝液中のＧＦＰの量を示す。１及び２では、ＧＦＰの漏出は見られなかった。３は、５０mM Ｔｒｉｓ中の４００mM ＮａＣｌによる溶出を示しており、ＭＰからＧＦＰが溶出し、上清中に蓄積した。４は、化学的破砕方法を使用して溶解した細胞における最大ＧＦＰ量を示す。
【０２７３】
実施例１４  正に荷電した微粒子を使用した、細胞からの塩基性タンパク質の回収
実施例１に記載されているように、Ｄｏｗｅｘ  Ｍ−Ａ２陰イオン交換樹脂を粉砕して微粒子を得ることによって、正に荷電した微粒子を調製する。
【０２７４】
フェドバッチ発酵によって、E. coliにおいてＩＦＮ−γを細胞内可溶性で発現させた。
【０２７５】
細胞の採取及び洗浄
【０２７６】
細胞を採取し、Flexboy（登録商標）Bags内において４℃で一晩（約１２時間）保存した。E. coli懸濁液（バイオマス含量約３０重量％）を４℃に冷却し、１５０００ｇで２０分間遠心分離し、その後、同じバイオマス含量を含有する緩衝液（２０mM Ｔｒｉｓ、１０mM ＥＤＴＡ、１M尿素、０．１％β−メルカプトエタノール）に再懸濁した。
【０２７７】
細胞の凝集及びタンパク質の回収
【０２７８】
E.coli細胞を結合及び凝集させるために、（３０％湿潤バイオマス含量において）細胞懸濁液１mL当たりＭＰ（ＭＡ２（５０％v/v） ８５μL）を細胞懸濁液に添加する。ＭＰが細胞と接触している間に、抽出が起こり、ターゲットタンパク質（ここではＩＦＮ−γ）が放出され、上清中に蓄積した。２〜３時間インキュベーションした後、抽出が完了し、デッドエンドろ過（０．２μmフィルタープレート、１．５ｂａｒ）又は遠心分離（１３０００ｇで３分間）を使用して、凝集した細胞を分離した。細胞ペレット／フィルターケーキを廃棄し、ターゲットタンパク質を含有する上清を更に処理した。
【０２７９】
実施例１５  負に荷電したキレート微粒子を使用した、細胞からの塩基性タンパク質の回収
キレート陽イオン交換樹脂Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＣ７４８から、微粒子を調製する。
【０２８０】
フェドバッチ発酵によって、E. coliにおいてＩＦＮ−γを細胞内可溶性で発現させた。
【０２８１】
細胞の採取及び洗浄
【０２８２】
細胞を採取し、Flexboy（登録商標）Bags内において４℃で一晩（約１２時間）保存した。E. coli懸濁液（バイオマス含量約３０重量％）を４℃に冷却し、１５０００ｇで２０分間遠心分離し、その後、同じバイオマス含量を含有する緩衝液（２０mM Ｔｒｉｓ、１０mM ＥＤＴＡ、１M尿素、０．１％β−メルカプトエタノール）に再懸濁した。
【０２８３】
細胞の凝集及びタンパク質の回収
【０２８４】
E.coli細胞を結合及び凝集させるために、（３０％湿潤バイオマス含量において）細胞懸濁液１mL当たりＭＰ（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＣ７４８（５０％v/v） ８５μLを細胞懸濁液に添加する。ＭＰが細胞と接触している間に、抽出が起こり、ターゲットタンパク質（ここではＩＦＮ−γ）が放出され、上清中に蓄積した。２〜３時間インキュベーションした後、抽出が完了し、デッドエンドろ過（０．２μmフィルタープレート、１．５ｂａｒ）又は遠心分離（１３０００ｇで３分間）を使用して、凝集した細胞を分離した。細胞ペレット／フィルターケーキを廃棄し、ターゲットタンパク質を含有する上清を更に処理した。
【０２８５】
実施例１６  イオン交換樹脂からの微粒子の調製
異なるタイプのイオン交換樹脂をSigma Aldrich及びDIAIONから購入した。
【０２８６】
以下の陰イオン交換樹脂を使用した：Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４００、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−７４３、Ｄｏｗｅｘ  １Ｘ２−１００、Ｄｏｗｅｘ  １Ｘ２−４００、Ｄｏｗｅｘ  １Ｘ８−１００、Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ａ２、ＤＩＡＩＯＮ  ＳＡ２０Ａ、ＤＩＡＩＯＮ  ＳＡ１０Ａ、ＤＩＡＩＯＮ  ＳＡ３１２
【０２８７】
以下の陽イオン交換樹脂を使用した：Ｄｏｗｅｘ  ５０  ＷＸ２−１００、Ｄｏｗｅｘ  ５０  ＷＸ８−１００、Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ｃ、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ＭＳＣ、ＤＩＡＩＯＮ  ＰＫ２１６、ＤＩＡＩＯＮ  ＳＫ１１０。
【０２８８】
コーティングセラミック乳鉢において、樹脂を手動で約３０分間湿式粉砕（２０ｇで1/2時間）した。粉砕した樹脂を水（ａｄ  ５０ml）に懸濁した。一定期間（約９６時間）後、樹脂沈殿物の上清をチューブに移した。チューブ当たり樹脂約２００μlを収集するまで、上清を７０００rcf（相対遠心力）で区分的（１ml）に１５分間遠心分離した。樹脂を２Ｍ塩化ナトリウム（１．５ml）に再懸濁し、１分間遠心分離（７０００rcf）した。１分間遠心分離のペレットを廃棄した（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−７４３を除く）。上清を移し、再度１５分間遠心分離（７０００rcf）した。１５分間遠心分離の上清を廃棄した。また、２Ｍ塩化ナトリウム中で、微粒子(micro particle)（約２００μl）を遠心分離した。微粒子(micro particle)（約１５０μL）及び他の粉砕した樹脂（５０〜２００μl）を水に再懸濁（１：４）し、少しずつ（樹脂５０μl）チューブに移した。
【０２８９】
樹脂のアリコートを７０００rcfで遠心分離し、上清を廃棄し、樹脂を２０倍容量（約１ml）の水性洗浄溶液に再懸濁した。溶液中のインキュベーション時間は、３０分間であった。
【０２９０】
洗浄手順：
−  １×５０％ＥｔＯＨ（有機残留物の希釈）
−  ３×脱イオン水（ＥｔＯＨの希釈）
−  ほぼ中性ｐＨのチェック
−  微粒子(micro particle)及び粉砕した樹脂を脱イオン水に再懸濁（約７０％v/v）
−  特定の実験に使用した対応する緩衝液で樹脂を平衡化した。
【０２９１】
光学顕微鏡検査を使用した粒子径の決定
ソフトウェアベースのサイズ決定を使用して光学顕微鏡検査によって、調製した微粒子の粒子径を決定した。相対直径の推定によって、粉砕した材料及び微粒子(micro particle)の粒子径を倍率１０００倍で測定した。１％v/vにおける１０００〜５０００個の粒子の直径サイズの比較によって、分布を計算した。結果を表３に示す。
【表３】
2020019799.tif 000004
【図１】
2020019799.tif 000005
【図２】
2020019799.tif 000006
【図３】
2020019799.tif 000007
【図４ａ】
2020019799.tif 000008
【図４ｂ】
2020019799.tif 000009
【図４ｃ】
2020019799.tif 000010
【図５】
2020019799.tif 000011
【図６】
2020019799.tif 000012
【図７ａ】
2020019799.tif 000013
【図７ｂ】
2020019799.tif 000014
【図８】
2020019799.tif 000015
【図９】
2020019799.tif 000016
【図１０】
2020019799.tif 000017
【図１１ａ】
2020019799.tif 000018
【図１１ｂ】
2020019799.tif 000019
【図１１ｃ】
2020019799.tif 000020
【図１１ｄ】
2020019799.tif 000021
【図１２】
2020019799.tif 000022
【図１３】
2020019799.tif 000023
【図１４】
2020019799.tif 000024
【図１５】
2020019799.tif 000025
【図１６ａ】
2020019799.tif 000026
【図１６ｂ】
2020019799.tif 000027
【図１６ｃ】
2020019799.tif 000028
【図１６ｄ】
2020019799.tif 000029
【図１６ｅ】
2020019799.tif 000030
【図１６ｆ】
2020019799.tif 000031
【図１７】
2020019799.tif 000032
【図１８】
2020019799.tif 000033
【図１９】
2020019799.tif 000034
【図２０】
2020019799.tif 000035
【図２１】
2020019799.tif 000036
【図２２】
2020019799.tif 000037
【図２３】
2020019799.tif 000038
【図２４】
2020019799.tif 000039
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月31日(2019.10.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のポリペプチドを生産する宿主細胞を培養すること、及びａ）宿主細胞及び／又は生体液に、粉砕したポリマー陰イオン交換樹脂を含む正に荷電した微粒子、又は粉砕したポリマー陽イオン交換樹脂を含む負に荷電した微粒子を加えることにより、宿主細胞及び／又は目的のポリペプチドを生産する宿主細胞を培養することにより得られる生体液から目的のポリペプチドを回収することを含む、目的のポリペプチドの製造方法。
【請求項２】
目的のポリペプチドを生産する宿主細胞を培養すること、及びａ）宿主細胞及び／又は生体液に、粉砕したポリマー陰イオン交換樹脂を含む正に荷電した微粒子、又は粉砕したポリマー陽イオン交換樹脂を含む負に荷電した微粒子を加えることにより、宿主細胞及び／又は目的のポリペプチドを生産する宿主細胞を培養することにより得られる生体液から目的のポリペプチドを回収することを含む、目的のポリペプチドの製造方法であって、
ここで、微粒子は、混合ののち、細胞の破壊又は細胞から目的のポリペプチドの抽出を引き起こし、そして宿主細胞の破壊は、細胞から目的のポリペプチドを放出することを含む、
製造方法。
【請求項３】
さらに、ｂ）目的のポリペプチドを精製することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
さらに、目的のポリペプチドを修飾すること、目的のタンパク質を含む医薬製剤を調製すること、又はその両者を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
目的のポリペプチドが、異種ポリペプチドである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
宿主細胞が、目的のポリペプチドを遺伝子工学的に産生する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
陰イオン交換樹脂及び陽イオン交換樹脂が、ポリスチレン系、ヒドロキシエチルメタクリラート（ＨＥＭＡ）系、ジメチルアミノエチルメタクリラート（ＤＭＡＥＭＡ）系、ジメチルアミノエチルメタクリラート（ｐＤＭＡＥＭＡ）、ポリアクリルアミド系、メタクリル酸（ＭＡＡ）系である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂が、ジビニルベンゼンと架橋したポリスチレンである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
微粒子が、５μm未満の平均粒子径を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
正に荷電した微粒子又は負に荷電した微粒子が、ポリマー陰イオン交換及び／又は陽イオン交換樹脂を粉砕することによって得られ得る、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
細胞が真核細胞又は原核細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
生体液が、細胞培養液、細胞懸濁液、発酵ブロス、培養ブロス、発酵上清、培養上清、又は細胞上清である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
微粒子が、凝集を形成する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
目的のポリペプチドが、細胞構造の完全なフラグメント化を伴わない細胞破壊によって、細胞から放出される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【外国語明細書】
2020019799000001.pdf