(57)【要約】      （修正有）【課題】プロタンパク質コンベルターゼスブチリシンケクシン９型（ＰＣＳＫ９）と相互作用する抗原結合タンパク質の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を含むＰＣＳＫ９タンパク質に結合し、ＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９のＬＤＬＲ低下効果を減少させる単離された中和抗原結合タンパク質。前記ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質の医薬として有効な量を投与することによって高コレステロール血症及び他の疾患を治療する方法。前記ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を用いて、試料中のＰＣＳＫ９の量を検出する方法。【選択図】図２６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を含むＰＣＳＫ９タンパク質に結合し、ＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９のＬＤＬＲ低下効果を減少させる単離された中和抗原結合タンパク質。
【請求項２】
抗原結合タンパク質がＬＤＬＲ非競合的中和抗原結合タンパク質である、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の単離された中和抗原結合タンパク質。
【請求項３】
抗原結合タンパク質がＬＤＬＲ競合的中和抗原結合タンパク質である、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の単離された中和抗原結合タンパク質。
【請求項４】
ＰＣＳＫ９に選択的に結合する抗原結合タンパク質であって、前記抗原結合タンパク質は１００ｐＭ未満であるＫｄでＰＣＳＫ９に結合する、抗原結合タンパク質。
【請求項５】
抗原結合タンパク質が１０ｐＭ未満であるＫｄで結合する、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。
【請求項６】
抗原結合タンパク質が５ｐＭ未満であるＫｄで結合する、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。
【請求項７】
配列番号１のＰＣＳＫ９タンパク質に結合する単離された抗原結合タンパク質であって、前記単離された抗原結合タンパク質とバリアントＰＣＳＫ９タンパク質の間の結合が単離された抗原結合タンパク質と配列番号１のＰＣＳＫ９タンパク質の間の結合の５０％未満である、抗原結合タンパク質。
【請求項８】
バリアントＰＣＳＫ９タンパク質が配列番号１に示される２０７、２０８、１８５、１８１、４３９、５１３、５３８、５３９、１３２、３５１、３９０、４１３、５８２、１６２、１６４、１６７、１２３、１２９、３１１、３１３、３３７、５１９、５２１及び５５４からなる群から選択される位置に残基の少なくとも１つの変異を含む、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の単離されたヒト抗原結合タンパク質。
【請求項９】
少なくとも１つの変異がＲ２０７Ｅ、Ｄ２０８Ｒ、Ｅ１８１Ｒ、Ｒ１８５Ｅ、Ｒ４３９Ｅ、Ｅ５１３Ｒ、Ｖ５３８Ｒ、Ｅ５３９Ｒ、Ｔ１３２Ｒ、Ｓ３５１Ｒ、Ａ３９０Ｒ、Ａ４１３Ｒ及びＥ５８２Ｒからなる群から選択される、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の単離されたヒト抗原結合タンパク質。
【請求項１０】
少なくとも１つの変異がＤ１６２Ｒ、Ｒ１６４Ｅ、Ｅ１６７Ｒ、Ｓ１２３Ｒ、Ｅ１２９Ｒ、Ａ３１１Ｒ、Ｄ３１３Ｒ、Ｄ３３７Ｒ、Ｒ５１９Ｅ、Ｈ５２１Ｒ及びＱ５５４Ｒからなる群から選択される、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の単離されたヒト抗原結合タンパク質。
【請求項１１】
第一の様式で配列番号３０３のＰＣＳＫ９タンパク質に結合する抗原結合タンパク質（該抗原結合タンパク質は、第二の様式でＰＣＳＫ９のバリアントに結合し、前記ＰＣＳＫ９バリアントは、配列番号３０３の２０７、２０８、１８５、１８１、４３９、５１３、５３８、５３９、１３２、３５１、３９０、４１３、５８２、１６２、１６４、１６７、１２３、１２９、３１１、３１３、３３７、５１９、５２１及び５５４からなる群から選択される位置に少なくとも１つの点変異を有し、前記第一の様式が第一のＥＣ５０、第一のＢｍａｘ又は第一のＥＣ５０及び第一のＢｍａｘを含み、前記第二の様式は第二のＥＣ５０、第二のＢｍａｘ又は第二のＥＣ５０及び第二のＢｍａｘを含み、並びに第一の様式に対する値は第二の様式に対する値と異なる。）。
【請求項１２】
第一の様式が第一のＥＣ５０を含み、第二の様式が第二のＥＣ５０を含み、並びに点変異がＲ２０７Ｅ、Ｄ２０８Ｒ、Ｅ１８１Ｒ、Ｒ１８５Ｅ、Ｒ４３９Ｅ、Ｅ５１３Ｒ、Ｖ５３８Ｒ、Ｅ５３９Ｒ、Ｔ１３２Ｒ、Ｓ３５１Ｒ、Ａ３９０Ｒ、Ａ４１３Ｒ及びＥ５８２Ｒからなる群から選択される、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。
【請求項１３】
第一のＥＣ５０が第二のＥＣ５０と少なくとも２０％異なる、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。
【請求項１４】
第一のＥＣ５０が第二のＥＣ５０と少なくとも５０％異なる、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。
【請求項１５】
第二のＥＣ５０が第一のＥＣ５０より大きな数値である、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。
【請求項１６】
第一のＥＣ５０が多重ビーズ結合アッセイによって測定される、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。
【請求項１７】
第二のＥＣ５０が１μＭより大きい、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。
【請求項１８】
抗原結合タンパク質が中和抗原結合タンパク質である、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。
【請求項１９】
中和抗原結合タンパク質が競合的中和抗原結合タンパク質である、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。
【請求項２０】
中和抗原結合タンパク質が非競合的中和抗原結合タンパク質である、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。
【請求項２１】
第一の様式が第一のＢｍａｘを含み、第二の様式が第一のＢｍａｘと異なる第二のＢｍａｘを含み、並びに前記ＰＣＳＫ９バリアントがＤ１６２Ｒ、Ｒ１６４Ｅ、Ｅ１６７Ｒ、Ｓ１２３Ｒ、Ｅ１２９Ｒ、Ａ３１１Ｒ、Ｄ３１３Ｒ、Ｄ３３７Ｒ、Ｒ５１９Ｅ、Ｈ５２１Ｒ及びＱ５５４Ｒからなる群から選択される少なくとも１つの点変異を有する、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。
【請求項２２】
第二のＢｍａｘが第一のＢｍａｘの約１０％である、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。
【請求項２３】
第一のＢｍａｘが第二のＢｍａｘと少なくとも２０％異なる、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。
【請求項２４】
第一のＢｍａｘが第二のＢｍａｘと少なくとも５０％異なる、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。
【請求項２５】
ＬＤＬＲがＰＣＳＫ９に結合する位置と重複する位置においてＰＣＳＫ９に結合する単離された抗体。
【請求項２６】
ＰＣＳＫ９に結合し、及びＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９の低密度リポタンパク質受容体
（ＬＤＬＲ）低下効果を低下させる中和抗体。
【請求項２７】
配列番号３の残基３１から４４７内の位置においてＰＣＳＫ９に結合する、ＰＣＳＫ９に結合する中和抗体。
【請求項２８】
配列番号３の残基３１から４４７内のエピトープに結合する、請求項２７に記載の抗体。
【請求項２９】
請求項１から２８の何れか一項に記載の少なくとも１つの抗原結合タンパク質及び医薬として許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項３０】
請求項１から２８の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項３１】
抗原結合タンパク質をコードする核酸配列を含む宿主細胞を準備すること；及び
抗原結合タンパク質が発現される条件下に宿主細胞を維持すること；
を含む、配列番号１のアミノ酸配列を含むＰＣＳＫ９タンパク質に結合する抗原結合タンパク質（該抗原結合タンパク質はＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９のＬＤＬＲ低下効果を減少させる。）を作製する方法。
【請求項３２】
配列番号１のアミノ酸配列を含むＰＣＳＫ９タンパク質に結合する単離された中和抗原結合タンパク質の有効量を対象に投与することを含み、前記中和抗原結合タンパク質がＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９のＬＤＬＲ低下効果を減少させる、対象中の血清コレステロールレベルを低下させる方法。
【請求項３３】
上昇した血清コレステロールレベルを伴う症状の治療又は予防を必要としている患者に、配列番号１のアミノ酸を含むＰＣＳＫ９タンパク質に結合する単離された中和抗原結合タンパク質の有効量を投与することを含む（前記中和抗原結合タンパク質は、ＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９のＬＤＬＲ低下効果を減少させる。）、患者中の上昇した血清コレステロールレベルを伴う症状を治療又は予防する方法。
【請求項３４】
上昇した血清コレステロールレベルを伴う症状の治療又は予防を必要としている対象に、ＬＤＬＲタンパク質の利用可能性を上昇させる薬剤と同時に又は順次に、単離された中和抗原結合タンパク質の有効量を投与することを含む（前記単離された抗原結合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＰＣＳＫ９タンパク質に結合し、前記中和抗原結合タンパク質は、ＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９のＬＤＬＲ低下効果を減少させる。）、対象中の上昇した血清コレステロールレベルを伴う症状を治療又は予防する方法。
【請求項３５】
ＬＤＬＲタンパク質の利用可能性を上昇させる薬剤がスタチンを含む、請求項３１から３４の一項の方法。
【請求項３６】
スタチンがアトロバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン及びこれらの幾つかの組み合わせからなる群から選択される、請求項３１から３５の一項の方法。
【請求項３７】
血清コレステロールを低下させるための医薬の調製における、請求項１から２２の抗原結合タンパク質の使用。
【請求項３８】
対象中の上昇した血清コレステロールレベルを伴う症状を治療又は予防するための医薬の調製における、請求項１から２２の抗原結合タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００７年８月２３日に出願された米国仮出願６０／９５７，６６８号、２００７年１２月２１日に出願された６１／００８，９６５号及び２００８年１月９日に出願された６１／０１０，６３０号（これらの全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、プロタンパク質コンベルターゼスブチリシンケクシン９型（ＰＣＳＫ９）に結合する抗原結合タンパク質並びに該抗原結合タンパク質を使用及び作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
プロタンパク質コンベルターゼスブチリシンケクシン９型（ＰＣＳＫ９）は、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）タンパク質のレベルの制御に関与するセリンプロテアーゼである（Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；Ｓｅｉｄａｈ  ａｎｄ  Ｐｒａｔ，  ２００７）。インビトロ実験は、ＨｅｐＧ２細胞へのＰＣＳＫ９の添加は細胞表面ＬＤＬＲのレベルを低下させることを示している（Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；Ｌａｇａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；Ｍａｘｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，
２００５；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。マウスを用いた実験は、ＰＣＳＫ９タンパク質レベルを増加させることが肝臓中のＬＤＬＲタンパク質のレベルを減少させる（Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；  Ｌａｇａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，
２００６；  Ｍａｘｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５；  Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）が、ＰＣＳＫ９ノックアウトマウスは肝臓中のＬＤＬＲの増加したレベルを有する（Ｒａｓｈｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）ことを示した。さらに、血漿ＬＤＬの増加又は減少したレベルの何れかをもたらす様々なヒトＰＣＳＫ９変異が同定されている  （Ｋｏｔｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。ＰＣＳＫ９は、ＬＤＬＲタンパク質と直接相互作用し、ＬＤＬＲとともに細胞内に取り込まれ、エンドソーム経路全体を通じてＬＤＬＲと同時に免疫蛍光を発する（Ｌａｇａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）ことが示されている。ＰＣＳＫ９によるＬＤＬＲの分解は観察されておらず、細胞外ＬＤＬＲタンパク質レベルを低下させる機序は不明である。
【０００４】
ＰＣＳＫ９は、セリンプロテアーゼのスブチリシン（Ｓ８）ファミリー中のプロホルモン−プロタンパク質コンベルターゼである（Ｓｅｉｄａｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。ヒトは、Ｓ８ＡとＳ８Ｂサブファミリーに分けることができる９つのプロホルモン−プロタンパク質コンベルターゼを有する（Ｒａｗｌｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ，  ２００６）。フューリン、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＡＣＥ４、ＰＣ４、ＰＣ５／ＰＣ６及びＰＣ７／ＰＣ８／ＬＰＣ／ＳＰＣ７は、サブファミリーＳ８Ｂに分類される。マウスフューリン及びＰＣ１由来の異なるドメインの結晶及びＮＭＲ構造は、スブチリシン様プロドメイン及び触媒ドメイン並びに触媒ドメインのすぐＣ末端のＰドメインを明らかにする（Ｈｅｎｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ，  ２００３；Ｔａｎｇｒｅａ  ｅｔ  ａｌ，  ２００２）。このサブファミリー内のアミノ酸配列の類似性に基づいて、７つのメンバー全てが類似の構造を有すると予想される（Ｈｅｎｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。ＳＫＩ−１／Ｓ１Ｐ及びＰＣＳＫ９は、サブファミリーＳ８Ａに分類される。これらのタンパク質との配列比較は、スブチリシン様プロドメイン及び触媒ドメインの存在も示唆する（Ｓａｋａｉ  
ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｓｅｉｄａｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３；  Ｓｅｉｄａｈ  ｅｔ  ａｌ，  １９９９）。これらのタンパク質では、触媒ドメインに対してＣ末端のアミノ酸配列は、より可変的であり、Ｐドメインの存在を示唆しない。
【０００５】
プロホルモン−プロタンパク質コンベルターゼはチモーゲンとして発現され、多段階工程を経て成熟する。この過程におけるプロドメインの機能は２つある。まず、プロドメインはシャペロンとして作用し、触媒ドメインの適切な折り畳みのために必要とされる（Ｉｋｅｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，  １９８７）。触媒ドメインが折り畳まれたら、プロドメインと触媒ドメインの間で自己触媒が起こる。この最初の切断反応の後に、プロドメインは触媒ドメインに結合された状態を保ち、次いで、触媒活性の阻害剤として作用する（Ｆｕ
ｅｔ  ａｌ，  ２０００）。状態が正しければ、プロドメイン内の部位において、成熟は、第二の自己触媒現象とともに進行する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９９７）。この第二の切断現象が起こった後に、プロドメインと触媒ドメインは解離し、活性なプロテアーゼを与える。
【０００６】
ＰＣＳＫ９チモーゲンの自己触媒がＧｌｎ１５２とＳｅｒ１５３の間で起こり（ＶＦＡＱ／ＳＩＰ）（Ｎａｕｒｅｃｋｉｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ，  ２００３）、細胞からのその分泌のために必要とされることが示された（Ｓｅｉｄａｈ  ｅｔ  ａｌ，２００３）。ＰＣＳＫ９のプロドメイン内の部位での第二の自己触媒現象は、観察されなかった。精製されたＰＣＳＫ９は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され得る２つの種（１７Ｋｄにプロドメイン及び６５Ｋｄに触媒＋Ｃ末端ドメイン）から構成される。ＰＣＳＫ９は、その阻害的プロドメインなしに単離されておらず、ＰＣＳＫ９の触媒活性の測定は変動する（Ｎａｕｒｅｃｋｉｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ，  ２００３；  Ｓｅｉｄａｈ  ｅｔ  ａｌ，  ２００３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７
【非特許文献２】Ｓｅｉｄａｈ  ａｎｄ  Ｐｒａｔ，  ２００７
【非特許文献３】Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４
【非特許文献４】Ｌａｇａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６
【非特許文献５】Ｍａｘｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５
【非特許文献６】Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４
【非特許文献７】Ｒａｓｈｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５
【非特許文献８】Ｋｏｔｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６
【非特許文献９】Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６
【非特許文献１０】Ｓｅｉｄａｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３
【非特許文献１１】Ｒａｗｌｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ，  ２００６
【非特許文献１２】Ｈｅｎｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ，  ２００３
【非特許文献１３】Ｔａｎｇｒｅａ  ｅｔ  ａｌ，  ２００２
【非特許文献１４】Ｈｅｎｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５
【非特許文献１５】Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８
【非特許文献１６】Ｓｅｉｄａｈ  ｅｔ  ａｌ，  １９９９
【非特許文献１７】Ｉｋｅｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，  １９８７
【非特許文献１８】Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ，２０００
【非特許文献１９】Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９９７
【非特許文献２０】Ｎａｕｒｅｃｋｉｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ，  ２００３
【発明の概要】
【０００８】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含む
。
【０００９】
幾つかの態様において、本発明は、Ａ）（ｉ）配列番号７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び６０からなる群から選択される配列中のＣＤＲＨ１から得られるＣＤＲＨ１；（ｉｉ）配列番号７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び６０からなる群から選択される配列中のＣＤＲＨ２から得られるＣＤＲＨ２；（ｉｉｉ）配列番号７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び６０からなる群から選択される配列中のＣＤＲＨ３から得られるＣＤＲＨ３；並びに、（ｉｖ）４以下のアミノ酸の１つ若しくはそれ以上のアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含有する（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のＣＤＲＨからなる群から選択される１つ若しくはそれ以上の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、Ｂ）（ｉ）配列番号５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４及び４６からなる群から選択される配列中のＣＤＲＬ１から得られるＣＤＲＬ１；（ｉｉ）配列番号５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４及び４６からなる群から選択される配列中のＣＤＲＬ２から得られるＣＤＲＬ２；（ｉｉｉ）配列番号５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４及び４６からなる群から選択される配列中のＣＤＲＬ３から得られるＣＤＲＬ３；並びに、（ｉｖ）４以下のアミノ酸の１つ若しくはそれ以上のアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含有する（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のＣＤＲＬからなる群から選択される１つ若しくはそれ以上の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）；又はＣ）Ａ）の１つ若しくはそれ以上の重鎖ＣＤＲＨ及びＢ）の１つ若しくはそれ以上の軽鎖ＣＤＲＬを含む、ＰＣＳＫ９を結合する単離された抗原結合タンパク質を含む。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、Ａ）の少なくとも１つのＣＤＲＨ及びＢ）の少なくとも１つのＣＤＲＬを含む。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、Ａ）の少なくとも２つのＣＤＲＨ及びＢ）の少なくとも２つのＣＤＲＬを含む。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、前記ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む。幾つかの実施形態において、Ａ）のＣＤＲＨは、（ｉ）配列番号６７、７８、８９及び４９からなる群から選択される配列中のＣＤＲＨ１から選択されるＣＤＲＨ１アミノ酸配列；（ｉｉ）配列番号６７、７９、８９及び４９からなる群から選択される配列中のＣＤＲＨ２から選択されるＣＤＲＨ２アミノ酸配列；（ｉｉｉ）配列番号６７、７９、８９及び４９からなる群から選択される配列中のＣＤＲＨ３から選択されるＣＤＲＨ３アミノ酸配列；並びに（ｉｖ）２以下のアミノ酸の１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含有する（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のＣＤＲＨからなる群の少なくとも１つから選択される。さらに、Ｂ）のＣＤＲＬは、（ｉ）配列番号１２、３５、３２及び２３からなる群から選択される配列中のＣＤＲＬ１から選択されるＣＤＲＬ１アミノ酸配列；（ｉｉ）配列番号１２、３５、３２及び２３からなる群から選択される配列中のＣＤＲＬ２から選択されるＣＤＲＬ２アミノ酸配列；（ｉｉｉ）配列番号１２、３５、３２及び２３からなる群から選択される配列中のＣＤＲＬ３から選択されるＣＤＲＬ３アミノ酸配列；並びに（ｉｖ）２以下のアミノ酸の１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含有する（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のＣＤＲＬ又はＣ）Ａ）の１つ若しくはそれ以上の重鎖ＣＤＲＨ及びＢの１つ若しくはそれ以上の軽鎖ＣＤＲＬからなる群の少なくとも１つから選択される。幾つか
の実施形態において、Ａ）のＣＤＲＨは、（ｉ）配列番号６７中のＣＤＲＨ１アミノ酸配列のＣＤＲＨ１アミノ酸配列；（ｉｉ）配列番号６７中のＣＤＲＨ２アミノ酸配列のＣＤＲＨ２アミノ酸配列；（ｉｉｉ）配列番号６７中のＣＤＲＨ３アミノ酸配列のＣＤＲＨ３アミノ酸配列；並びに、（ｉｖ）２以下のアミノ酸の１つ若しくはそれ以上のアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含有する（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のＣＤＲＨからなる群の少なくとも１つから選択され、Ｂ）の前記ＣＤＲＬは、（ｉ）配列番号１２中のＣＤＲＬ１アミノ酸配列のＣＤＲＬ１アミノ酸配列；（ｉｉ）配列番号１２中のＣＤＲＬ２アミノ酸配列のＣＤＲＬ２アミノ酸配列；（ｉｉｉ）配列番号１２中のＣＤＲＬ３アミノ酸配列のＣＤＲＬ３アミノ酸配列；並びに、（ｉｖ）２以下のアミノ酸の１つ若しくはそれ以上のアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含有する（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のＣＤＲＬ又はＣ）Ａ）の１つ若しくはそれ以上の重鎖ＣＤＲＨ及びＢ）の１つ若しくはそれ以上の軽鎖ＣＤＲＬからなる群の少なくとも１つから選択される。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、Ａ）配列番号６７中のＣＤＲＨ１配列のＣＤＲＨ１、配列番号６７中のＣＤＲＨ２配列のＣＤＲＨ２及び配列番号６７中のＣＤＲＨ３配列のＣＤＲＨ３、並びにＢ）配列番号１２中のＣＤＲＬ１配列のＣＤＲＬ１、配列番号１２中のＣＤＲＬ２配列のＣＤＲＬ２及び配列番号１２中のＣＤＲＬ３配列のＣＤＲＬ３を含む。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び６０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに／又は配列番号５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４及び４６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。幾つかの実施形態において、ＶＨは、配列番号７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び６０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、並びに／又はＶＬは、配列番号５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４及び４６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する。幾つかの実施形態において、ＶＨは、配列番号７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び６０からなる群から選択され、並びに／又はＶＬは、配列番号５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４及び４６からなる群から選択される。
【００１０】
幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に開示されているＡＢＰの何れかによって結合されるエピトープに特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質を含む。
【００１１】
幾つかの態様において、本発明は、Ａ）（ｉ）配列番号７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び６０からなる群から選択される配列の１つ中のＣＤＲＨ１と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ１；（ｉｉ）配列番号７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び６０からなる群から選択される配列の１つ中のＣＤＲＨ２と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ２；並び
に（ｉｉｉ）配列番号７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び６０からなる群から選択される配列の１つ中のＣＤＲＨ３と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ３からなる群の少なくとも１つから選択される１つ又はそれ以上の重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ）；Ｂ）（ｉ）配列番号５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４及び４６からなる群から選択される配列の１つ中のＣＤＲＬ１と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ１；（ｉｉ）配列番号５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４及び４６からなる群から選択される配列の１つ中のＣＤＲＬ２と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ２；並びに（ｉｉｉ）配列番号５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４及び４６からなる群から選択される配列の１つ中のＣＤＲＬ３と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ３からなる群の少なくとも１つから選択される１つ若しくはそれ以上の軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ）；又はＣ）Ａ）の１つ若しくはそれ以上の重鎖ＣＤＲＨ及びＢ）の１つ若しくはそれ以上の軽鎖ＣＤＲＬを含む、ＰＣＳＫ９を結合する単離された抗原結合タンパク質を含む。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、Ａ）（ｉ）配列番号７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び６０からなる群から選択される配列の１つ中のＣＤＲＨ１と少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ１；（ｉｉ）配列番号７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び６０からなる群から選択される配列の１つ中のＣＤＲＨ２と少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ２；並びに（ｉｉｉ）配列番号７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び６０からなる群から選択される配列の１つ中のＣＤＲＨ３と少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ３からなる群の少なくとも１つから選択される１つ若しくはそれ以上のＣＤＲＨ、Ｂ）（ｉ）配列番号５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４及び４６からなる群から選択される配列の１つ中のＣＤＲＬ１と少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ１；（ｉｉ）配列番号５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４及び４６からなる群から選択される配列の１つ中のＣＤＲＬ２と少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ２；並びに（ｉｉｉ）配列番号５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４及び４６からなる群から選択される配列の１つ中のＣＤＲＬ３と少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ３からなる群の少なくとも１つから選択される１つ若しくはそれ以上のＣＤＲＬ；又はＣ）Ａ）の１つ若しくはそれ以上の重鎖ＣＤＲＨ及びＢ）の１つ若しくはそれ以上の軽鎖ＣＤＲＬを含む。
【００１２】
幾つかの態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９を結合する単離された抗原結合タンパク質を含み、前記抗原結合タンパク質は、Ａ）（ｉ）配列番号６７、７９及び４９からなる群から選択される配列内のＣＤＲＨ３から選択されるＣＤＲＨ３、（ｉｉ）（ｉ）のＣＤ
ＲＨ３から得られるアミノ酸配列において、２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換が異なるＣＤＲＨ３、並びに（ｉｉｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４（配列番号４０４）（Ｘ１はＤ、Ａ、Ｒ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ２はＹ、Ｉ、Ｇ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ３はＤ、Ａ、Ｇ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ４はＦ、Ａ、Ｌ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ５はＷ、Ｌ、Ａ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ６はＳ、Ｙ、Ａ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ７はＡ、Ｙ、Ｒ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ８はＹ、Ｐ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ９はＹ、Ｇ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１０はＤ、Ｇ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１１はＡ、Ｍ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１２はＦ、Ｄ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１３はＤ、Ｖ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１４はＶ及びアミノ酸なしからなる群から選択される。）からなる群の少なくとも１つから選択される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、Ｂ）（ｉ）配列番号１２、３５及び２３からなる群から選択される配列内のＣＤＲＬ３から選択されるＣＤＲＬ３；（ｉｉ）（ｉ）のＣＤＲＬ３から得られるアミノ酸配列において、２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換が異なるＣＤＲＬ３、並びに（ｉｉｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１（配列番号４０５）（Ｘ１はＱ及びＧからなる群から選択され、Ｘ２はＳ、Ｔ、Ａ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ３はＹ、アミノ酸なし及びＷからなる群から選択され、Ｘ４はＤ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ５はＳ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ６はＳ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ７はＬ、Ｔ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ８はアミノ酸なし、Ａ及びＳからなる群から選択され、Ｘ９はアミノ酸なし、Ｇ、Ａ及びＶからなる群から選択され、Ｘ１０はアミノ酸なし、Ｓ、Ｙ及びＶからなる群から選択され、Ｘ１１はアミノ酸なし及びＶからなる群から選択される。）からなる群から選択されるＣＤＲＬ３アミノ酸配列からなる群の少なくとも１つから選択される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）を含む。
【００１３】
幾つかの態様において、本発明は、５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４、４６及びこれらの幾つかの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む単離された抗原結合タンパク質を含む。
【００１４】
幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、本明細書中に開示されている抗原結合タンパク質の少なくとも１つによって結合されるエピトープに特異的に結合する。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１、６０及びこれらの幾つかの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖をさらに含む。幾つかの実施形態において、ＡＢＰのアミノ酸配列は、配列番号１２、３５、２３及びこれらの幾つかの組み合わせからなる群から選択される。幾つかの実施形態において、ＡＢＰの重鎖は、配列番号６７のＣＤＲＨ３、配列番号６７のＣＤＲＨ２及び配列番号６７のＣＤＲＨ１を含み、並びに前記軽鎖は配列番号１２のＣＤＲＬ３、配列番号１２のＣＤＲＬ２及び配列番号１２のＣＤＲＬ１を含む。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異的抗体又はこれらの抗体断片である。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ又は一本鎖抗体分子である。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、ヒト抗体である。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体である。幾つかの実施
形態において、単離された抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４型である。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ４又はＩｇＧ２型である。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、標識基に結合される。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９への結合に関して、本明細書中に記載されている抗原結合タンパク質と競合する。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異的抗体又はこれらの抗体断片である。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ又は一本鎖抗体分子である。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、標識基に結合される。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を低下させる。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、対象に投与されたときに、対象中に存在するＬＤＬの量を減少させる。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、対象に投与されたときに、対象中に存在する血清コレステロールの量を減少させる。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、対象に投与されたときに、対象中に存在するＬＤＬＲの量を増加させる。
【００１５】
幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に記載されている核酸分子を含むベクターを含む。幾つかの実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されている核酸分子を含む宿主細胞を含む。
【００１６】
幾つかの態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９への結合に関して、本明細書中に記載されている抗原結合タンパク質と競合する単離された抗原結合タンパク質を含む。
【００１７】
幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に開示されている抗原結合タンパク質をコードする核酸分子を含む。
【００１８】
幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に記載されている少なくとも１つの抗原結合タンパク質を含む医薬組成物を含む。
【００１９】
幾つかの態様において、本発明は、上昇した血清コレステロールレベルを伴う症状の治療又は予防を必要としている患者に、本明細書中に開示されている少なくとも１つの単離された抗原結合タンパク質の有効量を投与することを含む、患者中の上昇した血清コレステロールレベルを伴う症状を治療又は予防する方法を含む。
【００２０】
幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に開示されている少なくとも１つの抗原結合タンパク質の有効量を投与することを含む、対象中のＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を阻害する方法を含む。
【００２１】
幾つかの態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９に選択的に結合する抗原結合タンパク質を含み、前記抗原結合タンパク質は１００ｐＭより小さなＫＤでＰＣＳＫ９に結合する。
【００２２】
幾つかの態様において、本発明は、上昇した血清コレステロールレベルを伴う症状の治療又は予防を必要としている対象に、ＬＤＬＲタンパク質の利用可能性を上昇させる薬剤と同時に又は順次に、本明細書中に開示されている少なくとも１つの単離された抗原結合タンパク質の有効量を投与することを含む、対象中の上昇した血清コレステロールレベルを伴う症状を治療又は予防する方法を含む。
【００２３】
幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に開示されている少なくとも１つの単離
された抗原結合タンパク質の有効量を対象に投与することを含む、対象中の血清コレステロールレベルを低下させる方法を含む。
【００２４】
幾つかの態様において、本発明は、ＬＤＬＲタンパク質の利用可能性を上昇させる薬剤と同時に又は順次に、本明細書中に開示されている少なくとも１つの単離された抗原結合タンパク質の有効量を対象に投与することを含む、対象中の血清コレステロールレベルを低下させる方法を含む。
【００２５】
幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に開示されている少なくとも１つの単離された抗原結合タンパク質の有効量を対象に投与することを含む、対象中のＬＤＬＲタンパク質を増加させる方法を含む。
【００２６】
幾つかの態様において、本発明は、ＬＤＬＲタンパク質の利用可能性を上昇させる薬剤と同時に又は順次に、本明細書中に開示されている少なくとも１つの単離された抗原結合タンパク質の有効量を対象に投与することを含む、対象中のＬＤＬＲタンパク質レベルを増加させる方法を含む。
【００２７】
幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に開示されているＡＢＰ及びＬＤＬＲタンパク質レベルの利用可能性を上昇させる薬剤を含む医薬組成物を含む。幾つかの実施形態において、ＬＤＬＲタンパク質の利用可能性を上昇させる薬剤はスタチンを含む。幾つかの実施形態において、スタチンは、アトロバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン及びこれらの幾つかの組み合わせからなる群から選択される。
【００２８】
幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に記載されている抗原結合タンパク質を分泌する宿主細胞から前記抗原結合タンパク質を調製する工程を含む、本明細書中に記載されている抗原結合タンパク質を作製する方法を含む。
【００２９】
幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に記載されている少なくとも１つの抗原結合タンパク質及び医薬として許容される賦形剤を含む医薬組成物を含む。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、さらなる活性因子をさらに含む。幾つかの実施形態において、前記さらなる活性因子は、放射性同位体、放射性核種、毒素又は治療基及び化学療法基からなる群から選択される。
【００３０】
幾つかの態様において、本発明は、患者中の上昇した血清コレステロールレベルと関連する症状を治療又は予防する方法を含む。この方法は、患者中の上昇した血清コレステロールレベルと関連する症状の治療又は予防を必要としている患者へ、本明細書中に開示されている少なくとも１つの単離された抗原結合タンパク質の有効量を投与することを含む。幾つかの実施形態において、症状は、高コレステロール血症である。
【００３１】
幾つかの態様において、本発明は、本明細書に記載されている少なくとも１つの抗原結合タンパク質の有効量を投与することを含む、患者中のＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を阻害する方法を含む。
【００３２】
幾つかの態様において、本発明は、１００ｐＭより小さいＫｄでＰＣＳＫ９に結合する抗原結合タンパク質を含む。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、１０ｐＭより小さいＫｄで結合する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、５ｐＭより小さいＫａで結合する。
【００３３】
幾つかの態様において、本発明は、上昇した血清コレステロールレベルを伴う症状の治
療又は予防を必要としている対象に、ＬＤＬＲタンパク質の利用可能性を上昇させる薬剤と同時に又は順次に、本明細書中に記載されている少なくとも１つの単離された抗原結合タンパク質の有効量を投与することを含む、対象中の上昇した血清コレステロールレベルを伴う症状を治療又は予防する方法を含む。幾つかの実施形態において、ＬＤＬＲタンパク質の利用可能性を上昇させる薬剤はスタチンを含む。幾つかの実施形態において、スタチンは、アトロバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン及びこれらの幾つかの組み合わせからなる群から選択される。
【００３４】
幾つかの態様において、本発明は、対象中の血清コレステロールレベルを低下させる方法を含む。この方法は、本明細書中に記載されている少なくとも１つの単離された抗原結合タンパク質の有効量を対象に投与することを含む。
【００３５】
幾つかの態様において、本発明は、ＬＤＬＲタンパク質の利用可能性を上昇させる薬剤と同時に又は順次に、本明細書中に記載されている少なくとも１つの単離された抗原結合タンパク質の有効量を対象に投与することを含む、対象中の血清コレステロールレベルを低下させる方法を含む。幾つかの実施形態において、ＬＤＬＲタンパク質の利用可能性を上昇させる薬剤はスタチンを含む。幾つかの実施形態において、スタチンは、アトロバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン及びこれらの幾つかの組み合わせからなる群から選択される。
【００３６】
幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に記載されている少なくとも１つの単離された抗原結合タンパク質の有効量を対象に投与することによって、対象中のＬＤＬＲタンパク質レベルを増加させる方法を含む。
【００３７】
幾つかの態様において、本発明は、ＬＤＬＲタンパク質の利用可能性を上昇させる薬剤と同時に又は順次に、本明細書中に記載されている少なくとも１つの単離された抗原結合タンパク質の有効量を対象に投与することによって、対象中のＬＤＬＲタンパク質レベルを増加させる方法を含む。幾つかの実施形態において、ＬＤＬＲタンパク質レベルの利用可能性を上昇させる薬剤はスタチンを含む。幾つかの実施形態において、スタチンは、アトロバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン及びこれらの幾つかの組み合わせからなる群から選択される。
【００３８】
幾つかの態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９に結合し、ＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９の低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）低下効果を低減させる中和抗体を含む。幾つかの実施形態において、抗体はＰＣＳＫ９に特異的に結合する。幾つかの実施形態において、抗体は、ＰＣＳＫ９の触媒ドメインに結合する。幾つかの実施形態において、抗体は、配列番号３の残基３１から４４７内のエピトープに結合する。幾つかの実施形態において、抗体は、配列番号３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するＰＣＳＫ９に結合する。
【００３９】
幾つかの態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９に結合する中和抗原結合タンパク質を含み、該抗原結合タンパク質は配列番号３の残基３１から４４７内の位置においてＰＣＳＫ９に結合する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質がＰＣＳＫ９に結合されている場合には、抗体は、ＰＣＳＫ９の以下の残基の少なくとも１つから８オングストローム又はそれ以下に位置している。Ｓ１５３、Ｉ１５４、Ｐ１５５、Ｒ１９４、Ｄ２３８、Ａ２３９、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｄ３７４、Ｃ３７５、Ｔ３７７、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｖ３８０、Ｓ３８１、Ｗ１５６、Ｎ１５７、Ｌ１５８、Ｅ１５９、Ｈ１９３、Ｅ１９５
、Ｈ２２９、Ｒ２３７、Ｇ２４０、Ｋ２４３、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｇ３７０、Ａ３７１、Ｓ３７３、Ｓ３７６、Ｑ３８２、Ｗ７２、Ｆ１５０、Ａ１５１、Ｑ１５２、Ｔ２１４、Ｒ２１５、Ｆ２１６、Ｈ２１７、Ａ２２０、Ｓ２２１、Ｋ２２２、Ｓ２２５、Ｈ２２６、Ｃ２５５、Ｑ２５６、Ｇ２５７、Ｋ２５８、Ｎ３１７、Ｆ３１８、Ｔ３４７、Ｌ３４８、Ｇ３４９、Ｔ３５０、Ｌ３５１、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｄ３７４、Ｖ３８０、Ｓ３８１、Ｑ３８２、Ｓ３８３、Ｇ３８４、Ｋ６９、Ｄ７０、Ｐ７１、Ｓ１４８、Ｖ１４９、Ｄ１８６、Ｔ１８７、Ｅ２１１、Ｄ２１２、Ｇ２１３、Ｒ２１８、Ｑ２１９、Ｃ２２３、Ｄ２２４、Ｇ２２７、Ｈ２２９、Ｌ２５３、Ｎ２５４、Ｇ２５９、Ｐ２８８、Ａ２９０、Ｇ２９１、Ｇ３１６、Ｒ３１９、Ｙ３２５、Ｖ３４６、Ｇ３５２、Ｔ３５３、Ｇ３６５、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｓ３７３、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｔ３８５、Ｓ３８６、Ｑ３８７、Ｓ１５３、Ｓ１８８、Ｉ１８９、Ｑ１９０、Ｓ１９１、Ｄ１９２、Ｒ１９４、Ｅ１９７、Ｇ１９８、Ｒ１９９、Ｖ２００、Ｄ２２４、Ｒ２３７、Ｄ２３８、Ｋ２４３、Ｓ３７３、Ｄ３７４、Ｓ３７６、Ｔ３７７、Ｆ３７９、Ｉ１５４、Ｔ１８７、Ｈ１９３、Ｅ１９５、Ｉ１９６、Ｍ２０１、Ｖ２０２、Ｃ２２３、Ｔ２２８、Ｓ２３５、Ｇ２３６、Ａ２３９、Ｇ２４４、Ｍ２４７、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｃ３７５又はＣ３７８。幾つかの実施形態において、抗体は、ＰＣＳＫ９の以下の残基の少なくとも１つから８オングストローム又はそれ以下に位置している。Ｓ１５３、Ｉ１５４、Ｐ１５５、Ｒ１９４、Ｄ２３８、Ａ２３９、１３６９、Ｓ３７２、Ｄ３７４、Ｃ３７５、Ｔ３７７、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｖ３８０、Ｓ３８１、Ｗ１５６、Ｎ１５７、Ｌ１５８、Ｅ１５９、Ｈ１９３、Ｅ１９５、Ｈ２２９、Ｒ２３７、Ｇ２４０、Ｋ２４３、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｇ３７０、Ａ３７１、Ｓ３７３、Ｓ３７６又はＱ３８２。幾つかの実施形態において、抗体は、ＰＣＳＫ９の以下の残基の少なくとも１つから５オングストローム又はそれ以下に位置している。Ｓ１５３、Ｉ１５４、Ｐ１５５、Ｒ１９４、Ｄ２３８、Ａ２３９、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｄ３７４、Ｃ３７５、Ｔ３７７、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｖ３８０又はＳ３８１。幾つかの実施形態において、抗体は、ＰＣＳＫ９の以下の残基の少なくとも２つから５オングストローム又はそれ以下に位置している。Ｓ１５３、Ｉ１５４、Ｐ１５５、Ｒ１９４、Ｄ２３８、Ａ２３９、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｄ３７４、Ｃ３７５、Ｔ３７７、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｖ３８０又はＳ３８１。幾つかの実施形態において、抗体は、ＰＣＳＫ９の以下の残基の少なくとも４つから５オングストローム又はそれ以下である。Ｓ１５３、Ｉ１５４、Ｐ１５５、Ｒ１９４、Ｄ２３８、Ａ２３９、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｄ３７４、Ｃ３７５、Ｔ３７７、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｖ３８０又はＳ３８１。幾つかの実施形態において、抗体は、ＰＣＳＫ９の以下の残基の少なくとも１つから８オングストローム又はそれ以下に位置している。Ｗ７２、Ｆ１５０、Ａ１５１、Ｑ１５２、Ｔ２１４、Ｒ２１５、Ｆ２１６、Ｈ２１７、Ａ２２０、Ｓ２２１、Ｋ２２２、Ｓ２２５、Ｈ２２６、Ｃ２５５、Ｑ２５６、Ｇ２５７、Ｋ２５８、Ｎ３１７、Ｆ３１８、Ｔ３４７、Ｌ３４８、Ｇ３４９、Ｔ３５０、Ｌ３５１、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｄ３７４、Ｖ３８０、Ｓ３８１、Ｑ３８２、Ｓ３８３、Ｇ３８４、Ｋ６９、Ｄ７０、Ｐ７１、Ｓ１４８、Ｖ１４９、Ｄ１８６、Ｔ１８７、Ｅ２１１、Ｄ２１２、Ｇ２１３、Ｒ２１８、Ｑ２１９、Ｃ２２３、Ｄ２２４、Ｇ２２７、Ｈ２２９、Ｌ２５３、Ｎ２５４、Ｇ２５９、Ｐ２８８、Ａ２９０、Ｇ２９１、Ｇ３１６、Ｒ３１９、Ｙ３２５、Ｖ３４６、Ｇ３５２、Ｔ３５３、Ｇ３６５、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｓ３７３、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｔ３８５、Ｓ３８６又はＱ３８７。幾つかの実施形態において、抗体は、ＰＣＳＫ９の以下の残基の少なくとも１つから５オングストローム又はそれ以下に位置している。Ｗ７２、Ｆ１５０、Ａ１５１、Ｑ１５２、Ｔ２１４、Ｒ２１５、Ｆ２１６、Ｈ２１７、Ａ２２０、Ｓ２２１、Ｋ２２２、Ｓ２２５、Ｈ２２６、Ｃ２５５、Ｑ２５６、Ｇ２５７、Ｋ２５８、Ｎ３１７、Ｆ３１８、Ｔ３４７、Ｌ３４８、Ｇ３４９、Ｔ３５０、Ｌ３５１、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｄ３７４、Ｖ３８０、Ｓ３８１、Ｑ３８２、Ｓ３８３又はＧ３８４。幾つかの実施形態において、抗体は、ＰＣＳＫ９の以下の残基の少なくとも２つから５オングストローム又はそれ以下に位置している。Ｗ７２、Ｆ１５０、Ａ１５１、Ｑ１５２、Ｔ２１４、Ｒ２１５、Ｆ２１６、Ｈ２１７、Ａ２２０、Ｓ２２１、Ｋ２２２、Ｓ２２５、Ｈ２２６、Ｃ２５５、Ｑ２５６、Ｇ２５７、Ｋ２５８、Ｎ３１７
、Ｆ３１８、Ｔ３４７、Ｌ３４８、Ｇ３４９、Ｔ３５０、Ｌ３５１、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｄ３７４、Ｖ３８０、Ｓ３８１、Ｑ３８２、Ｓ３８３又はＧ３８４。幾つかの実施形態において、抗体は、ＰＣＳＫ９の以下の残基の少なくとも４つから５オングストローム又はそれ以下に位置している。Ｗ７２、Ｆ１５０、Ａ１５１、Ｑ１５２、Ｔ２１４、Ｒ２１５、Ｆ２１６、Ｈ２１７、Ａ２２０、Ｓ２２１、Ｋ２２２、Ｓ２２５、Ｈ２２６、Ｃ２５５、Ｑ２５６、Ｇ２５７、Ｋ２５８、Ｎ３１７、Ｆ３１８、Ｔ３４７、Ｌ３４８、Ｇ３４９、Ｔ３５０、Ｌ３５１、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｄ３７４、Ｖ３８０、Ｓ３８１、Ｑ３８２、Ｓ３８３又はＧ３８４。幾つかの実施形態において、抗体は、ＰＣＳＫ９の以下の残基の少なくとも１つから８オングストローム又はそれ以下に位置している。Ｓ１５３、Ｓ１８８、Ｉ１８９、Ｑ１９０、Ｓ１９１、Ｄ１９２、Ｒ１９４、Ｅ１９７、Ｇ１９８、Ｒ１９９、Ｖ２００、Ｄ２２４、Ｒ２３７、Ｄ２３８、Ｋ２４３、Ｓ３７３、Ｄ３７４、Ｓ３７６、Ｔ３７７、Ｆ３７９、Ｉ１５４、Ｔ１８７、Ｈ１９３、Ｅ１９５、Ｉ１９６、Ｍ２０１、Ｖ２０２、Ｃ２２３、Ｔ２２８、Ｓ２３５、Ｇ２３６、Ａ２３９、Ｇ２４４、Ｍ２４７、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｃ３７５又はＣ３７８。幾つかの実施形態において、抗体は、ＰＣＳＫ９の以下の残基の少なくとも１つから５オングストローム又はそれ以下に位置している。Ｓ１５３、Ｓ１８８、Ｉ１８９、Ｑ１９０、Ｓ１９１、Ｄ１９２、Ｒ１９４、Ｅ１９７、Ｇ１９８、Ｒ１９９、Ｖ２００、Ｄ２２４、Ｒ２３７、Ｄ２３８、Ｋ２４３、Ｓ３７３、Ｄ３７４、Ｓ３７６、Ｔ３７７又はＦ３７９。幾つかの実施形態において、抗体は、ＰＣＳＫ９の以下の残基の少なくとも２つから５オングストローム又はそれ以下に位置している。Ｓ１５３、Ｓ１８８、Ｉ１８９、Ｑ１９０、Ｓ１９１、Ｄ１９２、Ｒ１９４、Ｅ１９７、Ｇ１９８、Ｒ１９９、Ｖ２００、Ｄ２２４、Ｒ２３７、Ｄ２３８、Ｋ２４３、Ｓ３７３、Ｄ３７４、Ｓ３７６、Ｔ３７７又はＦ３７９。幾つかの実施形態において、抗体は、ＰＣＳＫ９の以下の残基の少なくとも４つから５オングストローム又はそれ以下に位置している。Ｓ１５３、Ｓ１８８、Ｉ１８９、Ｑ１９０、Ｓ１９１、Ｄ１９２、Ｒ１９４、Ｅ１９７、Ｇ１９８、Ｒ１９９、Ｖ２００、Ｄ２２４、Ｒ２３７、Ｄ２３８、Ｋ２４３、Ｓ３７３、Ｄ３７４、Ｓ３７６、Ｔ３７７又はＦ３７９。
【００４０】
幾つかの態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９に結合する中和抗体を含み、該抗体はＰＣＳＫ９に結合し、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合する可能性を低下させる。
【００４１】
幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９に結合する抗体又は抗原結合分子が想定される。抗体は、配列番号３の残基３１から４４７内の位置において、ＰＣＳＫ９に結合する。幾つかの実施形態において、抗体又は抗原結合分子は、ＰＣＳＫ９に結合されたときに、ＰＣＳＫ９の以下の残基の少なくとも１つから８オングストローム又はそれ以下に位置している。Ｓ１５３、Ｉ１５４、Ｐ１５５、Ｒ１９４、Ｄ２３８、Ａ２３９、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｄ３７４、Ｃ３７５、Ｔ３７７、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｖ３８０、Ｓ３８１、Ｗ１５６、Ｎ１５７、Ｌ１５８、Ｅ１５９、Ｈ１９３、Ｅ１９５、Ｈ２２９、Ｒ２３７、Ｇ２４０、Ｋ２４３、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｇ３７０、Ａ３７１、Ｓ３７３、Ｓ３７６、Ｑ３８２、Ｗ７２、Ｆ１５０、Ａ１５１、Ｑ１５２、Ｔ２１４、Ｒ２１５、Ｆ２１６、Ｈ２１７、Ａ２２０、Ｓ２２１、Ｋ２２２、Ｓ２２５、Ｈ２２６、Ｃ２５５、Ｑ２５６、Ｇ２５７、Ｋ２５８、Ｎ３１７、Ｆ３１８、Ｔ３４７、Ｌ３４８、Ｇ３４９、Ｔ３５０、Ｌ３５１、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｄ３７４、Ｖ３８０、Ｓ３８１、Ｑ３８２、Ｓ３８３、Ｇ３８４、Ｋ６９、Ｄ７０、Ｐ７１、Ｓ１４８、Ｖ１４９、Ｄ１８６、Ｔ１８７、Ｅ２１１、Ｄ２１２、Ｇ２１３、Ｒ２１８、Ｑ２１９、Ｃ２２３、Ｄ２２４、Ｇ２２７、Ｈ２２９、Ｌ２５３、Ｎ２５４、Ｇ２５９、Ｐ２８８、Ａ２９０、Ｇ２９１、Ｇ３１６、Ｒ３１９、Ｙ３２５、Ｖ３４６、Ｇ３５２、Ｔ３５３、Ｇ３６５、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｓ３７３、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｔ３８５、Ｓ３８６、Ｑ３８７、Ｓ１５３、Ｓ１８８、Ｉ１８９、Ｑ１９０、Ｓ１９１、Ｄ１９２、Ｒ１９４、Ｅ１９７、Ｇ１９８、Ｒ１９９、Ｖ２００、Ｄ２２４、Ｒ２３７、Ｄ２３８、Ｋ２４３、Ｓ３７３、Ｄ３７４、Ｓ３７６、Ｔ３７７、Ｆ３７９、Ｉ１５４、Ｔ１８７、Ｈ１９３、Ｅ１９５、Ｉ１９６、Ｍ２０１、
Ｖ２０２、Ｃ２２３、Ｔ２２８、Ｓ２３５、Ｇ２３６、Ａ２３９、Ｇ２４４、Ｍ２４７、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｃ３７５又はＣ３７８。
【００４２】
幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９の残基の８オングストローム内で、ＰＣＳＫ９への抗体の結合を遮断する単離された抗体又は抗原結合分子が提供される。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９の残基は、以下のＰＣＳＫ９残基の少なくとも１つから選択される。Ｓ１５３、Ｉ１５４、Ｐ１５５、Ｒ１９４、Ｄ２３８、Ａ２３９、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｄ３７４、Ｃ３７５、Ｔ３７７、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｖ３８０、Ｓ３８１、Ｗ１５６、Ｎ１５７、Ｌ１５８、Ｅ１５９、Ｈ１９３、Ｅ１９５、Ｈ２２９、Ｒ２３７、Ｇ２４０、Ｋ２４３、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｇ３７０、Ａ３７１、Ｓ３７３、Ｓ３７６、Ｑ３８２、Ｗ７２、Ｆ１５０、Ａ１５１、Ｑ１５２、Ｔ２１４、Ｒ２１５、Ｆ２１６、Ｈ２１７、Ａ２２０、Ｓ２２１、Ｋ２２２、Ｓ２２５、Ｈ２２６、Ｃ２５５、Ｑ２５６、Ｇ２５７、Ｋ２５８、Ｎ３１７、Ｆ３１８、Ｔ３４７、Ｌ３４８、Ｇ３４９、Ｔ３５０、Ｌ３５１、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｄ３７４、Ｖ３８０、Ｓ３８１、Ｑ３８２、Ｓ３８３、Ｇ３８４、Ｋ６９、Ｄ７０、Ｐ７１、Ｓ１４８、Ｖ１４９、Ｄ１８６、Ｔ１８７、Ｅ２１１、Ｄ２１２、Ｇ２１３、Ｒ２１８、Ｑ２１９、Ｃ２２３、Ｄ２２４、Ｇ２２７、Ｈ２２９、Ｌ２５３、Ｎ２５４、Ｇ２５９、Ｐ２８８、Ａ２９０、Ｇ２９１、Ｇ３１６、Ｒ３１９、Ｙ３２５、Ｖ３４６、Ｇ３５２、Ｔ３５３、Ｇ３６５、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｓ３７３、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｔ３８５、Ｓ３８６、Ｑ３８７、Ｓ１５３、Ｓ１８８、Ｉ１８９、Ｑ１９０、Ｓ１９１、Ｄ１９２、Ｒ１９４、Ｅ１９７、Ｇ１９８、Ｒ１９９、Ｖ２００、Ｄ２２４、Ｒ２３７、Ｄ２３８、Ｋ２４３、Ｓ３７３、Ｄ３７４、Ｓ３７６、Ｔ３７７、Ｆ３７９、Ｉ１５４、Ｔ１８７、Ｈ１９３、Ｅ１９５、Ｉ１９６、Ｍ２０１、Ｖ２０２、Ｃ２２３、Ｔ２２８、Ｓ２３５、Ｇ２３６、Ａ２３９、Ｇ２４４、Ｍ２４７、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｃ３７５又はＣ３７８。
【００４３】
幾つかの実施形態において、ＬＤＬＲがＰＣＳＫ９に結合する位置と重複する位置において、ＰＣＳＫ９に結合する単離された抗体又は抗原結合分子が提供される。幾つかの実施形態において、ＬＤＬＲがＰＣＳＫ９に結合する位置には、Ｓ１５３、Ｉ１５４、Ｐ１５５、Ｒ１９４、Ｄ２３８、Ａ２３９、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｄ３７４、Ｃ３７５、Ｔ３７７、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｖ３８０及びＳ３８１からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が含まれる。
【００４４】
幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９に結合する単離された抗体又は抗原結合分子が提供される。幾つかの実施形態において、抗体又は抗原結合分子は、ＰＣＳＫ９上の以下の残基の少なくとも１つの８オングストローム以内で、ＥＧＦａがＰＣＳＫ９に結合する可能性を低下させる。Ｓ１５３、Ｉ１５４、Ｐ１５５、Ｒ１９４、Ｄ２３８、Ａ２３９、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｄ３７４、Ｃ３７５、Ｔ３７７、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｖ３８０、Ｓ３８１、Ｗ１５６、Ｎ１５７、Ｌ１５８、Ｅ１５９、Ｈ１９３、Ｅ１９５、Ｈ２２９、Ｒ２３７、Ｇ２４０、Ｋ２４３、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｇ３７０、Ａ３７１、Ｓ３７３、Ｓ３７６又はＱ３８２。
【００４５】
幾つかの実施形態において、ＥＧＦａが結合し、Ａｂ２１Ｂ１２が結合し、及び／又は３１Ｈ４が結合する表面と重複するＰＣＳＫ９の表面に結合する抗体、抗原結合タンパク質又は抗原結合分子が提供される。幾つかの実施形態において、図面に図示されているものと同様の様式でＰＣＳＫ９に結合する抗体、抗原結合タンパク質又は抗原結合分子が提供される。
【００４６】
幾つかの実施形態において、上記実施形態は、中和抗体又は抗原結合タンパク質である。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＬＤＬＲ又はその断片（ＥＧＦａなど）でない。
【００４７】
幾つかの態様において、本発明は、単離された中和抗体を含み、該抗体がＰＣＳＫ９に結合されたときに、抗体は、ＰＣＫＳ９の以下の残基の少なくとも１つから８オングストローム又はそれ以下に位置する。配列番号３のＴ４６８、Ｒ４６９、Ｍ４７０、Ａ４７１、Ｔ４７２、Ｒ４９６、Ｒ４９９、Ｅ５０１、Ａ５０２、Ｑ５０３、Ｒ５１０、Ｈ５１２、Ｆ５１５、Ｐ５４０、Ｐ５４１、Ａ５４２、Ｅ５４３、Ｈ５６５、Ｗ５６６、Ｅ５６７、Ｖ５６８、Ｅ５６９、Ｒ５９２、Ｅ５９３、Ｓ４６５、Ｇ４６６、Ｐ４６７、Ａ４７３、Ｉ４７４、Ｒ４７６、Ｇ４９７、Ｅ４９８、Ｍ５００、Ｇ５０４、Ｋ５０６、Ｌ５０７、Ｖ５０８、Ａ５１１、Ｎ５１３、Ａ５１４、Ｇ５１６、Ｖ５３６、Ｔ５３８、Ａ５３９、Ａ５４４、Ｔ５４８、Ｄ５７０、Ｌ５７１、Ｈ５９１、Ａ５９４、Ｓ５９５及びＨ５９７。幾つかの実施形態において、抗体は、ＰＣＳＫ９の以下の残基の少なくとも１つから５オングストローム又はそれ以下に位置する。配列番号３のＴ４６８、Ｒ４６９、Ｍ４７０、Ａ４７１、Ｔ４７２、Ｒ４９６、Ｒ４９９、Ｅ５０１、Ａ５０２、Ｑ５０３、Ｒ５１０、Ｈ５１２、Ｆ５１５、Ｐ５４０、Ｐ５４１、Ａ５４２、Ｅ５４３、Ｈ５６５、Ｗ５６６、Ｅ５６７、Ｖ５６８、Ｅ５６９、Ｒ５９２及びＥ５９３。
【００４８】
幾つかの態様において、本発明は、単離された抗原結合タンパク質を含む。抗原結合タンパク質は、Ａ）配列番号８９中のＣＤＲＨ１配列のＣＤＲＨ１、配列番号８９中のＣＤＲＨ２配列のＣＤＲＨ２及び配列番号８９中のＣＤＲＨ３配列のＣＤＲＨ３、並びにＢ）配列番号３２中のＣＤＲＬ１配列のＣＤＲＬ１、配列番号３２中のＣＤＲＬ２配列のＣＤＲＬ２及び配列番号３２中のＣＤＲＬ３配列のＣＤＲＬ３を含む。
【００４９】
幾つかの態様において、本発明は、配列番号１のＰＣＳＫ９タンパク質に結合する単離された抗原結合タンパク質を含み、前記単離された抗原結合タンパク質とバリアントＰＣＳＫ９タンパク質との間の結合は、単離された抗原結合タンパク質と配列番号１及び／又は配列番号３０３のＰＣＳＫ９タンパク質との間の結合の５０％未満である。幾つかの実施形態において、バリアントＰＣＳＫ９タンパク質は、配列番号１に示されている２０７、２０８、１８５、１８１、４３９、５１３、５３８、５３９、１３２、３５１、３９０、４１３、５８２、１６２、１６４、１６７、１２３、１２９、３１１、３１３、３３７、５１９、５２１及び５５４からなる又はこれらを含む群から選択される位置に、残基の少なくとも１つの変異を含む。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの変異は、Ｒ２０７Ｅ、Ｄ２０８Ｒ、Ｅ１８１Ｒ、Ｒ１８５Ｅ、Ｒ４３９Ｅ、Ｅ５１３Ｒ、Ｖ５３８Ｒ、Ｅ５３９Ｒ、Ｔ１３２Ｒ、Ｓ３５１Ｒ、Ａ３９０Ｒ、Ａ４１３Ｒ及びＥ５８２Ｒを含む又はこれらからなる群から選択される。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの変異は、Ｄ１６２Ｒ、Ｒ１６４Ｅ、Ｅ１６７Ｒ、Ｓ１２３Ｒ、Ｅ１２９Ｒ、Ａ３１１Ｒ、Ｄ３１３Ｒ、Ｄ３３７Ｒ、Ｒ５１９Ｅ、Ｈ５２１Ｒ及びＱ５５４Ｒからなる群から選択される。
【００５０】
幾つかの態様において、本発明は、配列番号３０３のＰＣＳＫ−９タンパク質に第一の様式で結合し、及びＰＣＳＫ９のバリアントに第二の様式で結合する抗原結合タンパク質を含む。ＰＣＳＫ９バリアントは、配列番号３０３及び／又は配列番号１の２０７、２０８、１８５、１８１、４３９、５１３、５３８、５３９、１３２、３５１、３９０、４１３、５８２、１６２、１６４、１６７、１２３、１２９、３１１、３１３、３３７、５１９、５２１及び５５４を含む又はこれらからなる群から選択される位置に、残基の少なくとも１つの点変異を有する。幾つかの実施形態において、第一の様式は第一のＥＣ５０、第一のＢｍａｘ又は第一のＥＣ５０と第一のＢｍａｘを含む。幾つかの実施形態において、第二の様式は第二のＥＣ５０、第二のＢｍａｘ又は第二のＥＣ５０と第二のＢｍａｘを含む。第一の様式に対する値は、第二の様式に対する値とは異なる。幾つかの実施形態において、第一の様式は第一のＥＣ５０を含み、第二の様式は第二のＥＣ５０を含み、及び点変異はＲ２０７Ｅ、Ｄ２０８Ｒ、Ｅ１８１Ｒ、Ｒ１８５Ｅ、Ｒ４３９Ｅ、Ｅ５１３Ｒ、
Ｖ５３８Ｒ、Ｅ５３９Ｒ、Ｔ１３２Ｒ、Ｓ３５１Ｒ、Ａ３９０Ｒ、Ａ４１３Ｒ及びＥ５８２Ｒからなる又はこれらを含む群から選択される。幾つかの実施形態において、第一のＥＣ５０は第二のＥＣ５０と少なくとも２０％異なる。幾つかの実施形態において、第一のＥＣ５０は第二のＥＣ５０と少なくとも５０％異なる。幾つかの実施形態において、第二のＥＣ５０は第一のＥＣ５０より大きな数値である。幾つかの実施形態において、第一のＥＣ５０は多重ビーズ結合アッセイによって測定される。幾つかの実施形態において、第二のＥＣ５０は１μｍより大きい。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は中和抗原結合タンパク質である。幾つかの実施形態において、中和抗原結合タンパク質は競合的中和抗原結合タンパク質である。幾つかの実施形態において、中和抗原結合タンパク質は非競合的中和抗原結合タンパク質である。幾つかの実施形態において、第一の様式は第一のＢｍａｘを含み、及び第二の様式は第一のＢｍａｘとは異なる第二のＢｍａｘを含む。ＰＣＳＫ９バリアントは、Ｄ１６２Ｒ、Ｒ１６４Ｅ、Ｅ１６７Ｒ、Ｓ１２３Ｒ、Ｅ１２９Ｒ、Ａ３１１Ｒ、Ｄ３１３Ｒ、Ｄ３３７Ｒ、Ｒ５１９Ｅ、Ｈ５２１Ｒ及びＱ５５４Ｒからなる又はこれらを含む群から選択される少なくとも１つの点変異を有する。幾つかの実施形態において、第二のＢｍａｘは第一のＢｍａｘの約１０％である。幾つかの実施形態において、第一のＢｍａｘは第二のＢｍａｘと少なくとも２０％異なる。幾つかの実施形態において、第一のＢｍａｘは第二のＢｍａｘと少なくとも５０％異なる。
【００５１】
幾つかの態様において、本発明は、配列番号３のＰＣＳＫ９タンパク質に結合する単離された抗原結合タンパク質を含み、抗原結合タンパク質のエピトープは、配列番号１の以下のアミノ酸の少なくとも１つを含む。２０７、２０８、１８１、１８５、４３９、５１３、５３８、５３９、１３２、３５１、３９０、４１３、５８２、１６２、１６４、１６７、１２３、１２９、３１１、３１３、３３７、５１９、５２１及び５５４。
【００５２】
幾つかの態様において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＰＣＳＫ９タンパク質に結合する単離された中和抗原結合タンパク質を含み、前記中和抗原結合タンパク質はＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９のＬＤＬＲ低下効果を減少させる。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質はＬＤＬＲ非競合的中和抗原結合タンパク質である。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質はＬＤＬＲ競合的中和抗原結合タンパク質である。
【００５３】
幾つかの態様において、本発明は単離された抗原結合タンパク質を含み、該抗原結合タンパク質は、Ａ）配列番号４９中のＣＤＲＨ１配列のＣＤＲＨ１、配列番号４９中のＣＤＲＨ２配列のＣＤＲＨ２及び配列番号４９中のＣＤＲＨ３配列のＣＤＲＨ３、並びにＢ）配列番号２３中のＣＤＲＬ１配列のＣＤＲＬ１、配列番号２３中のＣＤＲＬ２配列のＣＤＲＬ２及び配列番号２３中のＣＤＲＬ３配列のＣＤＲＬ３を含む。
【００５４】
幾つかの態様において、本発明は、結晶化されたＰＣＳＫ９タンパク質及びＰＣＳＫ９に結合する抗原結合タンパク質を含む組成物を含む。組成物は、約２．２オングストローム又はそれ以上の解像度になるように、ＰＣＳＫ９タンパク質の三次元構造を決定できるような結晶化されたＰＣＳＫ９タンパク質を含む。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、抗体又はその断片である。
【００５５】
幾つかの態様において、本発明は、結晶化されたＰＣＳＫ９タンパク質及びＬＤＬＲタンパク質の少なくともＥＧＦａ部分を含み、ＬＤＬＲタンパク質のＥＧＦａ部分はＰＣＳＫ９タンパク質によって結合され、前記結晶化されたＰＣＳＫ９タンパク質は、約２．２オングストローム又はそれ以上の解像度になるように、ＰＣＳＫ９タンパク質の三次元構造を決定できるような結晶化されたＰＣＳＫ９タンパク質である。幾つかの実施形態において、分子モデルは、コンピュータ読み取り可能な媒体上にある。
【００５６】
幾つかの態様において、本発明は、血清コレステロールを低下させるための医薬の調製における、本明細書中に記載されている抗原結合タンパク質の使用を含む。
【００５７】
幾つかの態様において、本発明は、対象中の上昇した血清コレステロールレベルと関連する症状を治療又は予防するための医薬の調製における、本明細書中に記載されている抗原結合タンパク質の使用を含む。
【００５８】
幾つかの態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９を結合する単離された抗原結合タンパク質を含み、該抗原結合タンパク質は、Ａ）（ｉ）配列番号６７、７９、８９及び４９からなる群から選択される配列内のＣＤＲＨ１から選択されるＣＤＲＨ１、（ｉｉ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換だけ、（ｉ）のＣＤＲＨ１とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＨ１、及び（ｉｉｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号４０６）（Ｘ１はＧからなる群から選択され、Ｘ２はＹ、Ｆ及びＧからなる群から選択され、Ｘ３はＴ及びＳからなる群から選択され、Ｘ４はＬ及びＦからなる群から選択され、Ｘ５はＴ、Ｓ及びＮからなる群から選択され、Ｘ６はＳ及びＡからなる群から選択され、Ｘ７はＹ及びＦからなる群から選択され、Ｘ８はＧ、Ｓ及びＹからなる群から選択され、Ｘ９はＩ、Ｍ及びＷからなる群から選択され、Ｘ１０はＳ、Ｎ及びＨからなる群から選択される。）からなる群から選択されるＣＤＲＨ１アミノ酸配列からなる群の少なくとも１つから選択される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、Ｂ）（ｉ）配列番号１２、３２、３５及び２３からなる群から選択される配列内のＣＤＲＬ１から選択されるＣＤＲＬ１、（ｉｉ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換だけ、（ｉ）のＣＤＲＬ３とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＬ１、及び（ｉｉｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４（配列番号４０７）（Ｘ１はＴ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ２はＧ及びＳからなる群から選択され、Ｘ３はＳ、Ｔ及びＧからなる群から選択され、Ｘ４はＳからなる群から選択され、Ｘ５はＳからなる群から選択され、Ｘ６はＮ、Ｄ及びＳからなる群から選択され、Ｘ７はＩ、Ｖ及びＮからなる群から選択され、Ｘ８はＧ及びＩからなる群から選択され、Ｘ９はＡ及びＧからなる群から選択され、Ｘ１０はＧ、Ｙ、Ｓ及びＮからなる群から選択され、Ｘ１１はＹ及びＮからなる群から選択され、Ｘ１２はＤ、Ｓ、Ｔ及びＦからなる群から選択され、Ｘ１３はＶからなる群から選択され、Ｘ１４はＳ、Ｎ及びＨからなる群から選択される。）からなる群の少なくとも１つから選択されるＣＤＲＬ１アミノ酸配列からなる群の少なくとも１つから選択される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）を含む。当業者は、単一のＡＢＰ又は抗体が上記選択肢の１つ又はそれ以上を充足することができ、この実施形態に対して記載された発明になお属することを理解する。
【００５９】
幾つかの態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９を結合する単離された抗原結合タンパク質を含み、該抗原結合タンパク質は、Ａ）以下のもの：（ｉ）配列番号６７、７９、８９及び４９からなる群から選択される配列内のＣＤＲＨ２から選択されるＣＤＲＨ２、（ｉｉ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換だけ、（ｉ）のＣＤＲＨ２とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＨ２、及び（ｉｉｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７（配列番号４０８）（Ｘ１はＷ、Ｓ、Ｌ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ２はＶ、Ｉ及びＥからなる群から選択され、Ｘ３はＳ、Ｗ及びＩからなる群から選択され、Ｘ４はＦ、Ｓ及びＮからなる群から選択され、Ｘ５はＹ、Ｓ、Ｄ及びＨからなる群から選択され、Ｘ６はＮ、Ｓ及びＧからなる群から選択され、Ｘ７はＳ及びＧからなる群から選択され、Ｘ８はＮ、Ｙ、Ｄ及びＲからなる群から選択され、Ｘ９はＴ、Ｉ及びＥからなる群から選択され、Ｘ１０はＮ、Ｓ、Ｙ及びＤからなる群から選択され、Ｘ１１はＹからなる群から選択され、Ｘ１２はＡ及びＮからなる群から選択され、Ｘ１３はＱ、Ｄ及びＰからなる群から選択され、Ｘ１４はＫ及びＳからなる群から選択され、Ｘ１５はＬ及びＶからなる群から選択され、Ｘ１６はＱ及びＫからなる群から選択され、Ｘ１７はＧ及びＳからなる群から選択される。）からなる群
から選択されるＣＤＲＨ２アミノ酸配列からなる群の少なくとも１つから選択される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、Ｂ）以下のもの：（ｉ）配列番号１２、３２、３５及び２３からなる群から選択される配列内のＣＤＲＬ３から選択されるＣＤＲＬ２、（ｉｉ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換だけ、（ｉ）のＣＤＲＬ３とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＬ２、及び（ｉｉｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号４０９）（Ｘ１はＧ、Ｅ、Ｓ及びＤからなる群から選択され、Ｘ２はＮ、Ｖ及びＹからなる群から選択され、Ｘ３はＳ及びＮからなる群から選択され、Ｘ４はＮ、Ｑ及びＫからなる群から選択され、Ｘ５はＲからなる群から選択され、Ｘ６はＰからなる群から選択され、Ｘ７はＳからなる群から選択される。）からなる群から選択されるＣＤＲＬ２アミノ酸配列からなる群の少なくとも１つから選択される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）を含む。
【００６０】
幾つかの態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９を結合する単離された抗原結合タンパク質を含み、前記抗原結合タンパク質は、Ａ）以下のもの：（ｉ）配列番号６７、７９、８９及び４９からなる群から選択される配列内のＣＤＲＨ３から選択されるＣＤＲＨ３、（ｉｉ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換だけ、（ｉ）のＣＤＲＨ３とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＨ３、並びに（ｉｉｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４（配列番号４１０）（Ｘ１はＤ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ２はＹ、Ａ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ３はＤ、Ｉ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ４はＦ、Ａ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ５はＷ、Ａ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ６はＳ、Ｌ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ７はＡ、Ｙ、Ｇ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ８はＹ、Ｑ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ９はＧ、Ｙ及びＬからなる群から選択され、Ｘ１０はＹ、Ｄ及びＶからなる群から選択され、Ｘ１１はＧ、Ａ及びＰからなる群から選択され、Ｘ１２はＭ及びＦからなる群から選択され、Ｘ１３はＤからなる群から選択され、Ｘ１４はＶ及びＹからなる群から選択される。）からなる群から選択されるＣＤＲＨ３アミノ酸配列からなる群の少なくとも１つから選択される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、Ｂ）以下のもの：（ｉ）配列番号１２、３２、３５及び２３からなる群から選択される配列内のＣＤＲＬ３から選択されるＣＤＲＬ３；（ｉｉ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換だけ、（ｉ）のＣＤＲＬ３とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＬ３、並びに（ｉｉｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１（配列番号４１１）（Ｘ１はＱ、Ａ、Ｇ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ２はＳ、Ｖ、Ｔ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ３はＹ、Ｎ及びＷからなる群から選択され、Ｘ４はＳ及びＤからなる群から選択され、Ｘ５はＳ、Ｙ及びＤからなる群から選択され、Ｘ６はＳ及びＴからなる群から選択され、Ｘ７はＬ及びＳからなる群から選択され、Ｘ８はＳ、Ｔ及びＮからなる群から選択され、Ｘ９はＧ、Ｓ及びＡからなる群から選択され、Ｘ１０は、Ｓ、Ｍ、Ｗ及びＹからなる群から選択され、並びにＸ１１はＶからなる群から選択される。）からなる群から選択されるＣＤＲＬ３アミノ酸配列からなる群の少なくとも１つから選択される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）を含む。幾つかの実施形態において、上記アミノ酸の何れもが、保存的アミノ酸置換によって置換され得る。
【００６１】
幾つかの態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９を結合する単離された抗原結合タンパク質を含み、前記抗原結合タンパク質は、Ａ）（ｉ）配列番号４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７及び５８からなる群から選択される配列内のＣＤＲＨ１から選択されるＣＤＲＨ１、（ｉｉ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換により、（ｉ）のＣＤＲＨ１とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＨ１、並びに（ｉｉｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号４１２）（Ｘ１はＧ、Ｐ及びＡからなる群から選択され、Ｘ２はＹ、Ｗ、Ｆ、Ｔ及びＳからなる群から選択され、Ｘ３はＴ、Ｐ、Ｓ及びＡ、Ｃ、Ｖ、Ｌ及びＩからなる群から選択され、Ｘ４はＬ、Ｆ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ及びＹからなる群から選択され、Ｘ５はＴ、Ｐ、Ｓ及びＡからなる群から選択さ
れ、Ｘ６はＳ、Ｔ、Ａ及びＣからなる群から選択され、Ｘ７はＹ、Ｗ、Ｆ、Ｔ及びＳからなる群から選択され、Ｘ８はＧ、Ｐ及びＡからなる群から選択され、Ｘ９はＩ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ａ及びＦからなる群から選択され、Ｘ１０はＳ、Ｔ、Ａ及びＣからなる群から選択される。）からなる群から選択されるＣＤＲＨ１アミノ酸配列からなる群の少なくとも１つから選択される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、Ｂ）（ｉ）配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３及び２４からなる群から選択される配列内のＣＤＲＬ１から選択されるＣＤＲＬ１；（ｉｉ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換により、（ｉ）のＣＤＲＬ３とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＬ１、並びに（ｉｉｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４（配列番号４１３）（Ｘ１はＴ及びＳからなる群から選択され、Ｘ２はＧ、Ｐ及びＡからなる群から選択され、Ｘ３はＴ及びＳからなる群から選択され、Ｘ４はＳ、Ｎ、Ｔ、Ａ、Ｃ及びＱからなる群から選択され、Ｘ５はＳ、Ｔ、Ａ及びＣからなる群から選択され、Ｘ６はＤ及びＥからなる群から選択され、Ｘ７はＶ、Ｉ、Ｍ、Ｌ、Ｆ及びＡからなる群から選択され、Ｘ８はＧ、Ｐ及びＡからなる群から選択され、Ｘ９はＧ、Ａ、Ｒ、Ｐ、Ｖ、Ｌ、Ｋ、Ｋ、Ｑ及びＮからなる群から選択され、Ｘ１０はＹ、Ｗ、Ｆ、Ｔ及びＳからなる群から選択され、Ｘ１１はＮ及びＱからなる群から選択され、Ｘ１２はＹ、Ｓ、Ｗ、Ｆ、Ｔ、Ａ及びＣからなる群から選択され、Ｘ１３はＶ、Ｉ、Ｍ、Ｌ、Ｆ及びＡからなる群から選択され、Ｘ１４はＳ、Ｔ、Ａ及びＣからなる群から選択される。）からなる群の少なくとも１つから選択されるＣＤＲＬ１アミノ酸配列からなる群の少なくとも１つから選択される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）を含む。
【００６２】
幾つかの態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９を結合する単離された抗原結合タンパク質を含み、前記抗原結合タンパク質は、Ａ）（ｉ）配列番号４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７及び５８からなる群から選択される配列内のＣＤＲＨ２から選択されるＣＤＲＨ２、（ｉｉ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換だけ、（ｉ）のＣＤＲＨ２とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＨ２、並びに（ｉｉｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７（配列番号４１４）（Ｘ１はＷ、Ｙ及びＦからなる群から選択され、Ｘ２はＶ、Ｉ、Ｍ、Ｌ、Ｆ及びＡからなる群から選択され、Ｘ３はＳ、Ｔ、Ａ及びＣからなる群から選択され、Ｘ４はＡ、Ｆ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｙ及びＭからなる群から選択され、Ｘ５はＹ、Ｗ、Ｆ、Ｔ及びＳからなる群から選択され、Ｘ６はＮ及びＱからなる群から選択され、Ｘ７はＧ、Ｐ及びＡからなる群から選択され、Ｘ８はＮ及びＱからなる群から選択され、Ｘ９はＴ及びＳからなる群から選択され、Ｘ１０はＮ及びＱからなる群から選択され、Ｘ１１はＹ、Ｗ、Ｆ、Ｔ及びＳからなる群から選択され、Ｘ１２はＡ、Ｖ、Ｌ及びＩからなる群から選択され、Ｘ１３はＱ、Ｅ、Ｎ及びＤからなる群から選択され、Ｘ１４はＫ、Ｒ、Ｑ及びＮからなる群から選択され、Ｘ１５はＬ、Ｆ、Ｖ、Ｉ、Ｍ、Ａ及びＹからなる群から選択され、Ｘ１６はＱ及びＮからなる群から選択され、Ｘ１７はＧ、Ｐ及びＡからなる群から選択される。）からなる群から選択されるＣＤＲＨ２アミノ酸配列からなる群の少なくとも１つから選択される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、Ｂ）（ｉ）配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３及び２４からなる群から選択される配列内のＣＤＲＬ３から選択されるＣＤＲＬ２；（ｉｉ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換だけ、（ｉ）のＣＤＲＬ３とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＬ２、並びに（ｉｉｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号４１５）（Ｘ１はＥ及びＤからなる群から選択され、Ｘ２はＶ、Ｉ、Ｍ、Ｌ、Ｆ及びＡからなる群から選択され、Ｘ３はＳ、Ｔ、Ａ及びＣからなる群から選択され、Ｘ４はＮ及びＱからなる群から選択され、Ｘ５はＲ、Ｋ、Ｑ及びＮからなる群から選択され、Ｘ６はＰ及びＡからなる群から選択され、Ｘ７はＳ、Ｔ、Ａ及びＣからなる群から選択される。）からなる群の少なくとも１つから選択されるＣＤＲＬ２アミノ酸配列からなる群の少なくとも１つから選択される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）を含む。
【００６３】
幾つかの態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９を結合する単離された抗原結合タンパク質を含み、前記抗原結合タンパク質は、Ａ）（ｉ）配列番号４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７及び５８からなる群から選択される配列内のＣＤＲＨ３から選択されるＣＤＲＨ３、（ｉｉ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換だけ、（ｉ）のＣＤＲＨ３とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＨ３、並びに（ｉｉｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６（配列番号４１６）（Ｘ１はＧ、Ｐ、Ａ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ２はＹ、Ｗ、Ｆ、Ｔ及びＳからなる群から選択され、Ｘ３はＧ、Ｖ、Ｐ、Ａ、Ｉ、Ｍ、Ｌ及びＦからなる群から選択され、Ｘ４はＭ、Ｌ、Ｆ及びＩからなる群から選択され、Ｘ５はＤ及びＥからなる群から選択され、Ｘ６はＶ、Ｉ、Ｍ、Ｌ、Ｆ及びＡからなる群から選択される。）からなる群から選択されるＣＤＲＨ３アミノ酸配列からなる群の少なくとも１つから選択される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、Ｂ）（ｉ）配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３及び２４からなる群から選択される配列内のＣＤＲＬ３から選択されるＣＤＲＬ３；（ｉｉ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換により、（ｉ）のＣＤＲＬ３とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＬ３、並びに（ｉｉｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９（配列番号４１７）（Ｘ１はＳ、Ｎ、Ｔ、Ａ、Ｃ及びＱからなる群から選択され、Ｘ２はＳ、Ｔ、Ａ及びＣからなる群から選択され、Ｘ３はＹ、Ｗ、Ｆ、Ｔ及びＳからなる群から選択され、Ｘ４はＴ及びＳからなる群から選択され、Ｘ５はＳ、Ｔ、Ａ及びＣからなる群から選択され、Ｘ６はＳ、Ｔ、Ａ及びＣからなる群から選択され、Ｘ７はＮ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ａ及びＣからなる群から選択され、Ｘ８はＭ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｉ及びＡからなる群から選択され、Ｘ９はＶ、Ｉ、Ｍ、Ｌ、Ｆ及びＡからなる群から選択される。）からなる群から選択されるＣＤＲＬ３アミノ酸配列からなる群の少なくとも１つから選択される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）を含む。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１Ａ】図１Ａは、ＰＣＳＫ９の成熟形態のアミノ酸配列を図示しており、プロドメインに下線が付されている。
【図１Ｂ１】図１Ｂ１は、ＰＣＳＫ９のアミノ酸及び核酸配列を図示しており、プロドメインには下線が付され、シグナル配列は太字で記載されている。
【図１Ｂ２】図１Ｂ２は、ＰＣＳＫ９のアミノ酸及び核酸配列を図示しており、プロドメインには下線が付され、シグナル配列は太字で記載されている。
【図１Ｂ３】図１Ｂ３は、ＰＣＳＫ９のアミノ酸及び核酸配列を図示しており、プロドメインには下線が付され、シグナル配列は太字で記載されている。
【図１Ｂ４】図１Ｂ４は、ＰＣＳＫ９のアミノ酸及び核酸配列を図示しており、プロドメインには下線が付され、シグナル配列は太字で記載されている。
【図２Ａ】図２Ａは、様々な抗原結合タンパク質の様々な軽鎖の配列比較表である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、様々な抗原結合タンパク質の様々な軽鎖の配列比較表である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、様々な抗原結合タンパク質の様々な軽鎖の配列比較表である。図２Ｃは、図２Ａから始まる配列の続きである。
【図２Ｄ】図２Ｄは、様々な抗原結合タンパク質の様々な軽鎖の配列比較表である。図２Ｄは、図２Ｂから始まる配列の続きである。
【図３Ａ】図３Ａは、様々な抗原結合タンパク質の様々な重鎖の配列比較表である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、様々な抗原結合タンパク質の様々な重鎖の配列比較表である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、様々な抗原結合タンパク質の様々な重鎖の配列比較表である。図３Ｃは、図３Ａから始まる配列の続きである。
【図３Ｄ】図３Ｄは、様々な抗原結合タンパク質の様々な重鎖の配列比較表である。図３Ｄは、図３Ｂから始まる配列の続きである。
【図３Ｅ】図３Ｅは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３Ｆ】図３Ｆは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３Ｇ】図３Ｇは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３Ｈ】図３Ｈは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３Ｉ】図３Ｉは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３Ｊ】図３Ｊは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３Ｋ】図３Ｋは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３Ｌ】図３Ｌは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３Ｍ】図３Ｍは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３Ｎ】図３Ｎは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３Ｏ】図３Ｏは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３Ｐ】図３Ｐは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３Ｑ】図３Ｑは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３Ｒ】図３Ｒは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３Ｓ】図３Ｓは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３Ｔ】図３Ｔは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３Ｕ】図３Ｕは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３Ｖ】図３Ｖは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３Ｗ】図３Ｗは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３Ｘ】図３Ｘは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３Ｙ】図３Ｙは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３Ｚ】図３Ｚは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３ＡＡ】図３ＡＡは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３ＢＢ】図３ＢＢは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３ＣＣ】図３ＣＣは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３ＤＤ】図３ＤＤは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３ＥＥ】図３ＥＥは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３ＦＦ】図３ＦＦは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３ＧＧ】図３ＧＧは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３ＨＨ】図３ＨＨは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３ＩＩ】図３ＩＩは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３ＪＪ】図３ＪＪは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３ＫＫ】図３ＫＫは、様々な定常ドメインに対するアミノ酸配列を図示する。
【図３ＬＬ】図３ＬＬは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３ＭＭ】図３ＭＭは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３ＮＮ】図３ＮＮは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３ＯＯ】図３ＯＯは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３ＰＰ】図３ＰＰは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３ＱＱ】図３ＱＱは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３ＲＲ】図３ＲＲは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３ＳＳ】図３ＳＳは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３ＴＴ】図３ＴＴは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３ＵＵ】図３ＵＵは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３ＶＶ】図３ＶＶは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３ＷＷ】図３ＷＷは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３ＸＸ】図３ＸＸは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３ＹＹ】図３ＹＹは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３ＺＺ】図３ＺＺは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３ＡＡＡ】図３ＡＡＡは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３ＢＢＢ】図３ＢＢＢは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
【図３ＣＣＣ】図３ＣＣＣは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖及び軽鎖の配列比較表である。
【図３ＤＤＤ】図３ＤＤＤは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖及び軽鎖の配列比較表である。
【図３ＥＥＥ】図３ＥＥＥは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖及び軽鎖の配列比較表である。
【図３ＦＦＦ】図３ＦＦＦは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖及び軽鎖の配列比較表である。
【図３ＧＧＧ】図３ＧＧＧは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖及び軽鎖の配列比較表である。
【図３ＨＨＨ】図３ＨＨＨは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖及び軽鎖の配列比較表である。
【図３ＩＩＩ】図３ＩＩＩは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖及び軽鎖の配列比較表である。
【図３ＪＪＪ】図３ＪＪＪは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖及び軽鎖の配列比較表である。
【図４Ａ】図４Ａは、ヒトＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質の結合曲線である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ヒトＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質の結合曲線である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、カニクイザルＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質の結合曲線である。
【図４Ｄ】図４Ｄは、カニクイザルＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質の結合曲線である。
【図４Ｅ】図４Ｅは、マウスＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質の結合曲線である。図４Ｆは、マウスＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質の結合曲線である。
【図４Ｆ】図４Ｆは、マウスＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質の結合曲線である。
【図５Ａ】図５Ａは、ＰＣＳＫ９及び様々な抗原結合タンパク質を用いたＳＤＳＰＡＧＥ実験の結果を図示しており、タンパク質の相対的純度及び濃度を示している。
【図５Ｂ】図５Ｂは、２１Ｂ１２に対するｂｉａｃｏｒｅ溶液平衡アッセイから得られたグラフを図示している。
【図５Ｃ】図５Ｃは、２１Ｂ１２に対するｂｉａｃｏｒｅ溶液平衡アッセイから得られたグラフを図示している。
【図５Ｄ】図５Ｄは、ｂｉａｃｏｒｅ捕捉アッセイから得られた速度論のグラフを図示している。
【図５Ｅ】図５Ｅは、３つのＡＢＰに対するビニングの結果を図示する棒グラフを図示している。
【図６Ａ】図６Ａは、インビトロＰＣＳＫ９：ＬＤＬＲ結合アッセイにおける、ＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質３１Ｈ４ＩｇＧ２の阻害曲線である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、インビトロＰＣＳＫ９：ＬＤＬＲ結合アッセイにおける、ＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質３１Ｈ４ＩｇＧ４の阻害曲線である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、インビトロＰＣＳＫ９：ＬＤＬＲ結合アッセイにおける、ＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質２１Ｂ１２ＩｇＧ２の阻害曲線である。
【図６Ｄ】図６Ｄは、インビトロＰＣＳＫ９：ＬＤＬＲ結合アッセイにおける、ＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質２１Ｂ１２ＩｇＧ４の阻害曲線である。
【図７Ａ】図７Ａは、ＰＣＳＫ９のＬＤＬ取り込み遮断効果を低下させるＡＢＰの効果を示す細胞ＬＤＬ取り込みアッセイにおける抗原結合タンパク質３１Ｈ４ＩｇＧ２の阻害曲線である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＰＣＳＫ９のＬＤＬ取り込み遮断効果を低下させるＡＢＰの効果を示す細胞ＬＤＬ取り込みアッセイにおける抗原結合タンパク質３１Ｈ４ＩｇＧ４の阻害曲線である。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＰＣＳＫ９のＬＤＬ取り込み遮断効果を低下させるＡＢＰの効果を示す細胞ＬＤＬ取り込みアッセイにおける抗原結合タンパク質２１Ｂ１２ＩｇＧ２の阻害曲線である。
【図７Ｄ】図７Ｄは、ＰＣＳＫ９のＬＤＬ取り込み遮断効果を低下させるＡＢＰの効果を示す細胞ＬＤＬ取り込みアッセイにおける抗原結合タンパク質２１Ｂ１２ＩｇＧ４の阻害曲線である。
【図８Ａ】図８Ａは、マウス中でのＡＢＰ３１Ｈ４の血清コレステロール低下能力を図示するグラフである（ＩｇＧ対照処理マウスと比較した変化）（＊ｐ＜０．０１）。
【図８Ｂ】図８Ｂは、マウス中でのＡＢＰ３１Ｈ４の血清コレステロール低下能力を図示するグラフである（時間＝ゼロ時と比較した変化）（＊ｐ＜０．０５）。
【図８Ｃ】図８Ｃは、Ｃ５７Ｂ１／６マウス中でのＨＤＬコレステロールレベルに対するＡＢＰ３１Ｈ４の効果を図示するグラフである（＊ｐ＜０．０１）。
【図８Ｄ】図８Ｄは、Ｃ５７Ｂ１／６マウス中でのＨＤＬコレステロールレベルに対するＡＢＰ３１Ｈ４の効果を図示するグラフである（＃ｐ＜０．０５）。
【図９】図９は、様々な時点後に存在する肝臓ＬＤＬＲタンパク質の量を増大させるＡＢＰ３１Ｈ４の能力のウェスタンブロット分析を図示している。
【図１０Ａ】図１０Ａは、野生型マウス中で、総血清コレステロールを低下させる抗原結合タンパク質３１Ｈ４の能力を図示するグラフである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、野生型マウス中で、ＨＤＬを低下させる抗原結合タンパク質３１Ｈ４の能力を図示するグラフである。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、様々な抗原結合タンパク質３１Ｈ４及び１６Ｆ１２の血清コレステロール低下能力を図示するグラフである。
【図１１Ａ】図１１Ａは、抗原結合タンパク質が血清コレステロールを低下させる期間及び能力を調べるための注射プロトコールを図示している。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、図１１Ａのプロトコールの結果を図示するグラフである。
【図１２Ａ】図１２Ａは、スタチンとＡＢＰ２１Ｂ１２の組み合わせに応答した、ＨｅｐＧ２細胞中のＬＤＬＲレベルを図示する。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、スタチンとＡＢＰ３１Ｈ４の組み合わせに応答した、ＨｅｐＧ２細胞中のＬＤＬＲレベルを図示する。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、スタチンと（中和抗体である「２５Ａ７」とは異なり）非中和抗体であるＡＢＰ２５Ａ７．１の組み合わせに応答した、ＨｅｐＧ２細胞中のＬＤＬＲレベルを図示する。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、スタチンとＡＢＰ２１Ｂ１２の組み合わせに応答した、ＰＣＳＫ９を過剰発現するＨｅｐＧ２細胞中のＬＤＬＲレベルを図示する。
【図１２Ｅ】図１２Ｅは、スタチンとＡＢＰ３１Ｈ４の組み合わせに応答した、ＰＣＳＫ９を過剰発現するＨｅｐＧ２細胞中のＬＤＬＲレベルを図示する。
【図１２Ｆ】図１２Ｆは、スタチンと（中和抗体である「２５Ａ７」とは異なり）非中和抗体であるＡＢＰ２５Ａ７．１の組み合わせに応答した、ＰＣＳＫ９を過剰発現するＨｅｐＧ２細胞中のＬＤＬＲレベルを図示する。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ＰＣＳＫ９に対する様々なＡＢＰの様々な軽鎖アミノ酸配列を図示する。点（．）は、アミノ酸が存在しないことを示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ＰＣＳＫ９に対する様々なＡＢＰに対する軽鎖分岐図を図示する。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、ＰＣＳＫ９に対する様々なＡＢＰの様々な重鎖アミノ酸配列を図示する。点（．）は、アミノ酸が存在しないことを示す。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、ＰＣＳＫ９に対する様々なＡＢＰに対する重鎖樹形図を図示する。
【図１３Ｅ】図１３Ｅは、軽鎖と重鎖ＣＤＲの比較及びコンセンサスを与える群の表記を示す。
【図１３Ｆ】図１３Ｆは、群１及び２に対するコンセンサス配列を図示する。
【図１３Ｇ】図１３Ｇは、群３及び４に対するコンセンサス配列を図示する。
【図１３Ｈ】図１３Ｈは、群１及び２に対するコンセンサス配列を図示する。点（．）は、同一の残基を示した。
【図１３Ｉ】図１３Ｉは、群２に対するコンセンサス配列を図示する。点（．）は、同一の残基を示した。
【図１３Ｊ】図１３Ｊは、群３及び４に対するコンセンサス配列を図示する。点（．）は、同一の残基を示した。
【図１４Ａ】図１４Ａは、（１０ｍｇ／ｋｇでの）様々なＡＢＰのインビボでのＬＤＬ低下能を図示するグラフである。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、（３０ｍｇ／ｋｇでの）様々なＡＢＰのインビボでのＬＤＬ低下能を図示するグラフである。
【図１５Ａ】図１５Ａは、抗原結合タンパク質の様々な実施形態の様々な軽鎖の配列比較表である。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、抗原結合タンパク質の様々な実施形態の様々な軽鎖の配列比較表である。図１５Ｂは、図１５Ａから始まる配列の続きである。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、抗原結合タンパク質の様々な実施形態の様々な軽鎖の配列比較表である。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、抗原結合タンパク質の様々な実施形態の様々な軽鎖の配列比較表である。図１５Ｄは、図１５Ｃから始まる配列の続きである。
【図１６Ａ】図１６Ａは、Ａｂ２１Ｂ１２がＰＣＳＫ９のＰｒｏＣａｔ又はＶＤ部分に結合する能力を調べるために使用されるゲルの図解である。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、Ａｂ３１Ｈ４がＰＣＳＫ９のＰｒｏＣａｔ又はＶＤ部分に結合する能力を調べるために使用されるゲルの図解である。
【図１７】図１７は、ＰＣＳＫ９及びＬＤＬＲのＥＧＦａ部分の構造の図解である。
【図１８Ａ】図１８Ａは、ＰＣＳＫ９及び３１Ｈ４Ａｂの構造の図解である。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、ＰＣＳＫ９及び３１Ｈ４Ａｂの構造の図解である。
【図１９Ａ】図１９Ａは、ＰＣＳＫ９、３１Ｈ４Ａｂ及び２１Ｂ１２Ａｂの構造の図解である。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、ＰＣＳＫ９及び２１Ｂ１２Ａｂの構造の図解である。
【図２０Ａ】図２０Ａは、ＰＣＳＫ９に結合された抗体３１Ｈ４及び２１Ｂ１２の構造と重ね合わせたＰＣＳＫ９及びＬＤＬＲ由来のＥＧＦａの構造の図解である。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、ＰＣＳＫ９及びＬＤＬＲの構造モデルの図解である。
【図２０Ｃ】図２０Ｃは、別の方向から得られたＰＣＳＫ９及びＬＤＬＲの構造モデルの図解である。
【図２０Ｄ】図２０Ｄは、３１Ｈ４及び２１Ｂ１２を含めた構造的表示とともに、ＰＣＳＫ９及びＬＤＬＲの構造モデルを図示したものである。
【図２０Ｅ】図２０Ｅは、表記の軸周りに９０°回転させた図２０Ｄの構造モデルの図解である。
【図２０Ｆ】図２０Ｆは、表記の軸周りに１８０°回転させた図２０Ｄの構造モデルの図解である。
【図２１Ａ】図２１Ａは、ＰＣＳＫ９及び３１Ａ４の構造の図解である。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、ＰＣＳＫ９及び３１Ａ４の構造の図解である。図２１Ｃは、ＰＣＳＫ９及び３１Ａ４の構造の図解である。
【図２１Ｃ】図２１Ｃは、ＰＣＳＫ９及び３１Ａ４の構造の図解である。
【図２１Ｄ】図２１Ｄは、完全長ＰＣＳＫ９及び３１Ａ４の構造モデルの図解である。
【図２２】図２２は、ヒトＡＢＰ配列とイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で産生され、結晶構造のために使用されたＡＢＰ配列との間での様々な差を同定する一群のＡＢＰ配列である。
【図２３】図２３は、様々なビニングの結果の表である。
【図２３Ａ】図２３Ａは、様々なビニングの結果を図示する表の第一の部分である。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、様々なビニングの結果を図示する表の第二の部分である。
【図２３Ｃ】図２３Ｃは、様々なビニングの結果を図示する表の第三の部分である。
【図２３Ｄ】図２３Ｄは、様々なビニングの結果を図示する表の第四の部分である。
【図２４Ａ】図２４Ａは、非還元条件下でのウェスタンブロットの図示である。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、還元条件下でのウェスタンブロットの図示である。
【図２５Ａ】図２５Ａは、ＰＣＳＫ９の表面の被覆の図解である。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、ＰＣＳＫ９の表面の被覆の図解である。
【図２５Ｃ】図２５Ｃは、ＰＣＳＫ９の表面の被覆の図解である。
【図２５Ｄ】図２５Ｄは、ＰＣＳＫ９の表面の被覆の図解である。
【図２５Ｅ】図２５Ｅは、ＰＣＳＫ９の表面の被覆の図解である。
【図２５Ｆ】図２５Ｆは、ＰＣＳＫ９の表面の被覆の図解である。
【図２６】図２６は、様々な抗体のエピトープを調べるための、ＰＣＳＫ９アミノ酸配列とＰＣＳＫ９バリアント中の変異された残基の全ての配列比較である。
【図２７Ａ】図２７Ａは、２１Ｂ１２とのＰＣＳＫ９の結晶構造上にマッピングされた、２１Ｂ１２エピトープのヒットを図示する。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、３１Ｈ４及び２１Ｂ１とのＰＣＳＫ９の結晶構造上にマッピングされた、３１Ｈ４エピトープのヒットを図示する。
【図２７Ｃ】図２７Ｃは、３１Ｈ４及び２１Ｂ１２とのＰＣＳＫ９の結晶構造上にマッピングされた、３１Ｈ４エピトープのヒットを図示する。
【図２７Ｄ】図２７Ｄは、３１Ｈ４及び２１Ｂ１２とのＰＣＳＫ９の結晶構造上にマッピングされた、１２Ｈ１１エピトープのヒットを図示する。
【図２７Ｅ】図２７Ｅは、３１Ｈ４及び２１Ｂ１２とのＰＣＳＫ９の結晶構造上にマッピングされた、３Ｃ４エピトープのヒットを図示する。
【図２８Ａ】図２８Ａは、様々なＡＢＰがＰＣＳＫ９の様々な部分に結合する能力を示すグラフである。
【図２８Ｂ】図２８Ｂは、様々なＡＢＰがＰＣＳＫ９の様々な部分に結合する能力を示すグラフである。
【図２８Ｃ】図２８Ｃは、２つのＡＢＰのＬＤＬＲ結合能力を比較するグラフである。
【図２８Ｄ】図２８Ｄは、２つのＡＢＰの細胞ＬＤＬ取り込み活性を比較するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
ＰＣＳＫ９に結合する抗原結合タンパク質（抗体及びその機能的結合断片など）が、本明細書に開示されている。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質はＰＣＳＫ９に結合し、様々な様式でＰＣＳＫ９が機能を発揮するのを妨げる。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９が他の物質と相互作用する能力を遮断し、又は低下させる。例えば、幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合する可能性を妨げ、又は低下させる様式で、ＰＣＳＫ９に結合する。他の実施形態において、抗原結合タンパク質はＰＣＳＫ９に結合するが、ＰＣＳＯがＬＤＬＲと相互作用する能力を遮断しない。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトモノクローナル抗体である。
【００６６】
当業者によって理解されるように、本発明の開示に照らせば、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲの間の相互作用を変化させることは、ＬＤＬへの結合に利用可能なＬＤＬＲの量を増加させ、続いて、これは、対象中の血清ＬＤＬの量を減少させ、対象の血清コレステロールレベルの低下をもたらす。従って、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、上昇した血清コレステロールレベルを有する対象、上昇した血清コレステロールレベルのリスクを有する対象又は血清コレステロールレベルの低下が有益であり得る対象を治療するための様々な方法及び組成物において使用することができる。従って、血清コレステロールの増加を低下させ、維持し、又は妨げるための様々な方法及び技術も、本明細書中に記載されている。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質はＰＣＳＫ９とＬＤＬＲの間の結合を可能とするが、抗原結合タンパク質はＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９の有害な活性を妨げ、又は低下させる。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＬＤＬＲへのＰ
ＣＳＫ９の結合を妨げ、又は低下させる。
【００６７】
便宜のため、以下の節は、本明細書において使用される用語の様々な意味を全般的に概観する。この論述の後に、抗原結合タンパク質に関する一般的な態様が論述されており、その後に、抗原結合タンパク質の様々な実施形態の特性及びそれらをどのように使用することができるかを示す具体例が続く。
【００６８】
定義及び実施形態
前記一般的な記述及び以下の詳細な説明は何れも例示的及び説明的なものに過ぎず、特許請求の範囲に記載されている本発明を限定するものではないことを理解しなければならない。本願において、単数形の使用は、特に別段の記載がなければ、複数形を含む。本願において、「又は」の使用は、別段の記載がなければ、「及び／又は」を意味する。さらに、「含んでいる」という用語並びに「含む」及び「含まれた」などのその他の形式の使用は、限定的なものではない。また、「要素」又は「成分」などの用語は、特に別段の記載がなければ、一つのユニットを含む要素及び成分並びに２以上のサブユニットを含む要素及び成分の両方を包含する。また、「部分」という用語の使用は、構成部分の一部又は構成部分の全体を含み得る。
【００６９】
本明細書に記載されている見出しは、整理を目的とするものに過ぎず、記載されている主題を限定するものと解釈すべきではない。特許、特許出願、論説、書物及び論文などの（但し、これらに限定されない。）、本願に引用されている全ての文献又は文献の一部は、あらゆる目的のために、その全体が、参照により、本明細書に明示的に組み込まれる。本開示において使用される場合、以下の用語は、別段の記載がなければ、以下の意味を有するものと理解しなければならない。
【００７０】
「プロタンパク質コンベルターゼスブチリシンケクシン９型」又は「ＰＣＳＫ９」という用語は、配列番号１及び／又は３に記載されているポリペプチド又はその断片、並びに対立遺伝子バリアント、スプライスバリアント、誘導体バリアント、置換バリアント、欠失バリアント及び／又は挿入バリアント（Ｎ末端メチオニンの付加を含む。）、融合ポリペプチド及び種間相同体を含む（但し、これらに限定されない。）関連ポリペプチドを表す。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９ポリペプチドは、リーダー配列残基、標的化残基、アミノ末端メチオニン残基、リジン残基、タグ残基及び／又は融合タンパク質残基などの（但し、これらに限定されない。）末端残基を含む。「ＰＣＳＫ９」は、ＦＨ３、ＮＡＲＣ１、ＨＣＨＯＬＡ３、プロタンパク質コンベルターゼスブチリシン／ケクシン９型及び神経アポトーシス制御コンベルターゼ１とも称されている。ＰＣＳＫ９遺伝子は、分泌性スブチラーゼファミリーのプロテイナーゼＫサブファミリーに属するプロタンパク質コンベルターゼタンパク質をコードする。「ＰＣＳＫ９」という用語は、プロタンパク質及びプロタンパク質の自己触媒後に生成される産物の両方を表す。（例えば、切断されたＰＣＳＫ９に選択的に結合する抗原結合タンパク質に対して）自己触媒された産物のみが引用されている場合には、タンパク質は、「成熟」、「切断された」、「プロセッシングされた」又は「活性な」ＰＣＳＫ９と称され得る。非活性形態のみが引用されている場合には、タンパク質は、ＰＣＳＫ９の「非活性」、「プロ型」又は「プロセッシングを受けていない」形態と称され得る。本明細書において使用されるＰＣＳＫ９という用語は、変異Ｄ３７４Ｙ、Ｓ１２７Ｒ及びＦ２１６Ｌなどの天然に存在する対立遺伝子も含む。ＰＣＳＫ９という用語は、グリコシル化、ＰＥＧ化されたＰＣＳＫ９配列、そのシグナル配列が切断されたＰＣＳＫ９配列、触媒ドメインからそのプロドメインから切断されているが、触媒ドメインから分離されていないＰＣＳＫ９配列（例えば、図１Ａ及び１Ｂ）など、ＰＣＳＫ９アミノ酸配列の翻訳後修飾を取り込んだＰＣＳＫ９分子も包含する。
【００７１】
「ＰＣＳＫ９活性」という用語は、ＰＣＳＫ９のあらゆる生物学的効果を含む。ある種
の実施形態において、ＰＣＳＫ９活性は、基質若しくは受容体と相互作用し、又は基質若しくは受容体に結合するＰＣＳＫ９の能力を含む。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９活性は、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）に結合するＰＣＳＫ９の能力によって表される。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９は、ＬＤＬＲを含む反応に結合し、触媒する。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９活性は、ＬＤＬＲの利用可能性を変化させる（例えば、低下させる）ＰＣＳＫ９の能力を含む。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９活性は、対象中のＬＤＬの量を増加させるＰＣＳＫ９の能力を含む。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９活性は、ＬＤＬへの結合に利用可能なＬＤＬＲの量を減少させるＰＣＳＫ９の能力を含む。幾つかの実施形態において、「ＰＣＳＫ９活性」は、ＰＣＳＫ９シグナル伝達から生じるあらゆる生物活性を含む。典型的な活性には、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合、ＬＤＬＲ又は他のタンパク質を切断するＰＣＳＫ９酵素活性、ＰＣＳＫ９作用を促進するＬＤＬＲ以外のタンパク質へのＰＣＳＫ９の結合、ＡＰＯＢ分泌を変化させるＰＣＳＫ９（Ｓｕｎ  Ｘ−Ｍ  ｅｔ  ａｌ，  “Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｔ  ＰＣＳＫ９  ｏｎ  ａｐｏｌｉｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｓ  ｔｈｅ  ｃａｕｓｅ  ｏｆ  ｕｎｕｓｕａｌｌｙ  ｓｅｖｅｒｅ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ”，  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４：１１６１−１１６９，  ２００５  ａｎｄ  Ｏｕｇｕｅｒｒａｍ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ，  “Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ１００  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ−ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＰＣＳＫ９，  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｅ  Ｂｉｏｌ．２４：１４４８−１４５３，  ２００４）、肝臓の再生及び神経細胞の分化におけるＰＣＳＫ９の役割（Ｓｅｉｄａｈ  ＮＧ  ｅｔ  ａｌ，  “Ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ  ｎｅｕｒａｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ  １（ＮＡＲＣ−Ｉ）：Ｌｉｖｅｒ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ”  ＰＮＡＳ  １００：９２８−９３３，  ２００３）及び肝臓のグルコース代謝におけるＰＣＳＫ９の役割（Ｃｏｓｔｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｈｅｐａｔｉｃ  ＰＣＳＫ９  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｓｔａｔｕｓ  ｖｉａ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎｄ  ｓｔｅｒｏｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １ｃ”  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（１０）：６２１１−１８，２００６）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７２】
本明細書において使用される「高コレステロール血症」という用語は、コレステロールレベルが所望のレベルを上回って上昇している症状を表す。幾つかの実施形態において、これは、血清コレステロールレベルが上昇していることを表す。幾つかの実施形態において、所望のレベルは、当業者に公知である（及び、本明細書に記載され、又は引用されている）様々な「リスク因子」を考慮に入れる。
【００７３】
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」という用語は、一本鎖及び二本鎖ヌクレオチドポリマーの両方を含む。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド又はヌクレオチドの何れかの種類の修飾された形態であり得る。前記修飾には、ブロモウリジン及びイノシン誘導体などの塩基修飾、２’，３’−ジデオキシリボースなどのリボース修飾並びにホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオアート、ホスホルアニラダート及びホスホロアミダートなどのヌクレオチド間結合修飾が含まれる。
【００７４】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、２００又はそれ以下のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１０から６０塩基の長さである。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１
４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０から４０ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、例えば、変異体遺伝子の構築において使用するために、一本鎖又は二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドは、検出アッセイのために、放射性標識、蛍光標識、ハプテン又は抗原性標識などの標識を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲプライマー、クローニングプライマー又はハイブリッド形成プローブとして使用することができる。
【００７５】
「単離された核酸分子」は、単離されたポリヌクレオチドがその中に本来見出されるポリヌクレオチドの全部若しくは一部を伴っていない、又は本来連結されていないポリヌクレオチドに連結されているゲノムのＤＮＡ又はＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又は合成起源又はこれらの幾つかの組み合わせを意味する。この開示において、あるヌクレオチド配列「を含む核酸分子」は完全な状態の染色体を包含しないことを理解すべきである。指定された核酸配列を「含む」単離された核酸分子は、指定された配列に加えて、最大１０個の若しくは最大２０個の他のタンパク質若しくはその一部に対するコード配列を含むことができ、又は引用されている核酸配列のコード領域の発現を調節する作用可能に連結された制御配列を含むことができ、及び／又はベクター配列を含むことができる。
【００７６】
別段の記載がなければ、本明細書中に論述されているあらゆる一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端が５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手の方向が５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写物の５‘から３’への付加の方向は、転写方向と称される。ＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’である、ＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と称される。ＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’である、ＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と称される。
【００７７】
「調節配列」という用語は、調節配列が連結されているコード配列の発現及びプロセッシングに影響を及ぼすことができるポリヌクレオチド配列を表す。このような調節配列の性質は、宿主生物に依存し得る。特定の実施形態において、原核生物に対する調節配列には、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列が含まれ得る。例えば、真核生物に対する調節配列には、転写因子に対する認識部位の１つ又は複数を含むプロモーター、転写強化配列及び転写終結配列が含まれ得る。「調節配列」には、リーダー配列及び／又は融合対配列が含まれ得る。
【００７８】
「ベクター」という用語は、宿主細胞中にタンパク質コード情報を伝達するために使用されるあらゆる分子又は実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ又はウイルス）を意味する。
【００７９】
「発現ベクター」又は「発現構築物」という用語は、宿主細胞の形質転換に適しており、並びに核酸配列に作用可能に連結された１つ又はそれ以上の異種のコード領域の発現を（宿主細胞と一緒に）誘導し、及び／又は調節する核酸配列を含有するベクターを表す。発現構築物には、転写、翻訳に影響を及ぼし又は調節し、イントロンが存在する場合には、作用可能に連結されているコード領域のＲＮＡスプライシングに影響を及ぼす配列が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００８０】
本明細書において使用される「作用可能に連結された」とは、この用語が適用される成分が、適切な条件下でその固有の機能を発揮できる関係にあることを意味する。例えば、タンパク質のコード配列に「作用可能に連結された」ベクター中の調節配列は、調節配列の転写活性と適合的な条件下で、タンパク質コード配列の発現が達成されるように、タンパク質コード配列に連結されている。
【００８１】
「宿主細胞」という用語は、核酸配列で形質転換されており、又は核酸配列で形質転換されることができ、これにより、目的の遺伝子を発現する細胞を意味する。この用語は、目的の遺伝子が存在する限り、子孫が元の親細胞と形態的に同一であるかどうか、又は元の親細胞と遺伝的組成が同一であるかどうかを問わず、親細胞の子孫を含む。
【００８２】
「形質移入」という用語は、細胞による外来又は外因性ＤＮＡの取り込みを意味し、外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入された場合に、細胞は「形質移入されている」。多数の形質移入技術が本分野において周知であり、本明細書中に開示されている。例えば、「Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７３，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、上記；  Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；  Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ，  １９８１，  Ｇｅｎｅ  １３：１９７」を参照されたい。このような技術は、適切な宿主細胞中に１つ又はそれ以上の外来ＤＮＡ部分を導入するために使用することができる。
【００８３】
「形質転換」という用語は、細胞の遺伝的特性の変化を表し、新しいＤＮＡ又はＲＮＡを含有するように修飾された場合に、細胞は形質転換されている。例えば、形質移入、形質導入又は他の技術を介して新しい遺伝物質を導入することによって、その固有状態から遺伝的に修飾されている場合に、細胞は形質転換されている。形質移入又は形質導入後に、細胞の染色体中に物理的に統合することによって、形質転換されているＤＮＡは細胞のＤＮＡと組み換えることができ、又は複製されずに、エピソーム要素として一過性に維持されることができ、又はプラスミドとして独立に複製することができる。形質転換されているＤＮＡが細胞分裂とともに複製されるときに、細胞は、「安定に形質転換された」と考えられる。
【００８４】
「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語は、原型のタンパク質、すなわち、天然に存在する非組換え細胞によって産生されたタンパク質のアミノ酸配列を有する高分子を意味し又は「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、遺伝子操作された細胞若しくは組換え細胞によって産生され、原型のタンパク質のアミノ酸配列を有する分子又は原型配列の１つ若しくはそれ以上のアミノ酸からの欠失、付加及び／又は置換を有する分子を含む。この用語は、１つ又はそれ以上のアミノ酸が天然に存在する対応するアミノ酸及びポリマーの化学的類縁体であるアミノ酸ポリマーも含む。具体的には、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、抗原結合タンパク質の１つ又はそれ以上のアミノ酸からの欠失、付加及び／又は置換を有するＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質、抗体又は配列を包含する。「ポリペプチド断片」という用語は、完全長の原型タンパク質と比べて、アミノ末端の欠失、カルボキシル末端の欠失及び／又は内部欠失を有するポリペプチドを表す。このような断片は、原型のタンパク質と比べて、修飾されたアミノ酸も含有する。ある種の実施形態において、断片は約５から５００アミノ酸長である。例えば、断片は、少なくとも５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００又は４５０アミノ酸長であり得る。有用なポリペプチド断片には、抗体の免疫学的に機能的な断片（結合ドメインを含む。）が含まれる。ＰＣＳＫ９結合抗体の場合、有用な断片には、ＣＤＲ領域、重鎖及び／又は軽鎖の可変ドメイン、抗体鎖の一部又は２つのＣＤＲを含むその可変領域のみなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００８５】
引用されている「単離されたタンパク質」という用語は、対象タンパク質が（１）通常一緒に見出される少なくとも幾つかの他のタンパク質を含まない、（２）同じ源からの（例えば、同じ種からの）他のタンパク質を実質的に含まない、（３）異なる種からの細胞によって発現されている、（４）自然の状態で一緒に存在するポリヌクレオチド、脂質、
炭水化物又は他の物質の少なくとも約５０％から分離されている、（５）自然の状態で一緒に存在しないポリペプチドと、（共有又は非共有的相互作用によって）作用可能に結合されている、又は（６）自然の状態で存在しないことを意味する。典型的には、「単離されたタンパク質」は、ある試料の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％又は少なくとも約５０％を占める。ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ若しくは合成起源の他のＲＮＡ又はこれらのあらゆる組み合わせが、このような単離されたタンパク質をコードし得る。好ましくは、単離されたタンパク質は、その治療的、診断的、予防的な研究又はその他の使用を妨害する、その天然環境中に見出されるタンパク質又はポリペプチド又は他のきょう雑物質を実質的に含まない。
【００８６】
「アミノ酸」という用語は、本分野におけるその通常の意味を含む。
【００８７】
ポリペプチド（例えば、抗原結合タンパク質又は抗体）の「バリアント」は、別のポリペプチド配列と比べて、アミノ酸配列中に１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が挿入され、欠失され、及び／又は置換されているアミノ酸配列を含む。バリアントは、融合タンパク質を含む。
【００８８】
「同一性」という用語は、配列を並置及び比較することによって決定された、２つ若しくはそれ以上のポリペプチド分子又は２つ若しくはそれ以上の核酸分子の配列間の関係を表す。「％同一性」とは、比較されている分子中のアミノ酸又はヌクレオチド間の同じ残基のパーセントを意味し、比較されている分子のうち最も小さなサイズに基づいて計算される。これらの計算のために、ある種の数学的モデル又はコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって、好ましくは、（ギャップが存在する場合）並置中のギャップが割り当てられる。並置された核酸又はポリペプチドの同一性を計算するために使用することができる方法には、「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．），１９８８，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．），１９９３，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．），１９９４，Ｎｅｗ
Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍ．  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；及びＣａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＳＩＡＭＪ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３」に記載されているものが含まれる。
【００８９】
％同一性を計算する際には、比較されている配列は、配列間で最大の合致を与えるように通例並置される。％同一性を測定するために使用することができるコンピュータプログラムの一例は、ＧＡＰを含むＧＣＧプログラムパッケージである（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＲｅｓ．１２：３８７；  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）。コンピュータアルゴリズムＧＡＰは、％配列同一性を測定すべき２つのポリペプチド又はポリヌクレオチドを併置するために使用される。配列は、それぞれのアミノ酸又はヌクレオチドの最適な合致が得られるように並置される（アルゴリズムによって決定される「合致したスパン」）。ギャップオープニングペナルティ（３×平均対角として計算される。「平均対角」は、使用されている比較行列の対角の平均である。「対角」は、この比較行列による各完全なアミノ酸の合致に対して割り当て
られるスコア又は数である。）及びギャップ伸長ペナルティー（通常、ギャップオープニングペナルティの１／１０である。）並びにＰＡＭ２５０又はＢＬＯＳＵＭ６２などの比較行列が、アルゴリズムとともに使用される。ある種の実施形態において、標準的な比較行列も、アルゴリズムによって使用される（ＰＡＭ２５０比較行列に関して、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５：３４５−３５；ＢＬＯＳＵＭ６２比較行列に関して、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）を参照）。
【００９０】
ＧＡＰプログラムを用いてポリペプチド又はヌクレオチド配列に対する％同一性を測定する際に使用することができるパラメータの例は、以下のとおりである。
【００９１】
・アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３
・比較行列：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，上記から得られるＢＬＯＳＵＭ６２
・ギャップペナルティー：１２（末端ギャップに対するペナルティーはなし）
・ギャップ長ペナルティー：４
・類似性の閾値：０
【００９２】
２つのアミノ酸配列を並置するためのある種の並置スキームは、２つの配列の短い領域の合致のみをもたらす場合があり得、２つの完全長配列の間には有意な関係が存在しなくても、この小さな並置された領域は極めて高い配列同一性を有し得る。従って、標的ポリペプチドの連続するアミノ酸の少なくとも５０又は他の数値を包含する並置をもたらすことが所望されるのであれば、選択された並置法（ＧＡＰプログラム）を調整することができる。
【００９３】
本明細書において使用される、２０の慣用（例えば、天然に存在する）アミノ酸及びそれらの略号は、慣用的な用法に従う。「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｓ．  Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｒ．  Ｇｒｅｎ，Ｅｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））」（あらゆる目的のために、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。２０の慣用アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、α、α−二置換されたアミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸及び他の非慣用アミノ酸などの非天然アミノ酸も、本発明のポリペプチドに対する適切な成分であり得る。非慣用アミノ酸の例には、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン並びに他の類似のアミノ酸及びイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。本明細書において使用されるポリペプチドの表記法では、標準的な用法と慣習に従って、左手方向がアミノ末端方向であり、右手方向がカルボキシ末端方向である。
【００９４】
同様に、別段の記載がなければ、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端が５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方法が５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写物の５‘から３’への方向の付加は、転写の方向と称される。ＲＮＡと同じ配列を有し、及びＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’であるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と称される。ＲＮＡと同じ配列を有し、及びＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’であるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と称される。
【００９５】
保存的アミノ酸置換は、生物系内での合成ではなく、通例、化学的なペプチド合成によ
って取り込まれる天然に存在しないアミノ酸を包含することができる。これらには、ペプチド模倣物及びアミノ酸部分の他の逆転又は反転された形態が含まれる。
【００９６】
天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて、クラスに分類され得る。
【００９７】
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、ＶａＩ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の方向性に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ及び
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００９８】
例えば、非保存的置換は、これらのクラスの１つの一員を別のクラスの一員で交換することを含み得る。このような置換された残基は、例えば、非ヒト抗体と相同であるヒト抗体の領域中に、又は分子の非相同領域中に導入することができる。
【００９９】
抗原結合タンパク質又はＰＣＳＫ９タンパク質に対して変化を施す上で、ある種の実施形態に従えば、アミノ酸のヒドロパチー指数を検討し得る。各アミノ酸は、その疎水性及び電荷特性に基づいて疎水性親水性指標を割り当てられている。疎水性親水性指標は、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、トレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）及びアルギニン（−４．５）である。
【０１００】
タンパク質に対する相互作用性生物機能を付与する上での疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、本分野において理解されている。Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３１（１９８２）。ある種のアミノ酸は、類似の疎水性親水性指標又はスコアを有する他のアミノ酸で置換することができ、それでもなお類似の生物活性を保持することが知られている。疎水性親水性指標に基づいて変化させる際には、ある実施形態において、疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換を含む。ある実施形態において、±１以内であるアミノ酸の置換を含み、ある実施形態においては±０．５以内であるアミノ酸の置換を含む。
【０１０１】
類似アミノ酸の置換は、本事例のように、それによって産生される生物学的に機能的なタンパク質又はペプチドを免疫学的実施形態に用いようとする場合には特に、親水性に基づいて効果的に実施することができることも当分野では理解されている。ある実施形態においては、その隣接アミノ酸の親水性によって支配される、タンパク質の局所的な最大平均親水性は、その免疫原性及び抗原性、すなわち、タンパク質の生物学的特性と相関がある。
【０１０２】
以下の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、トレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）及びトリプトファン（−３．４）。類似の親水性値
に基づいて変化させる際には、ある実施形態において、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれ、ある実施形態において、±１以内であるアミノ酸の置換が含まれ、ある実施形態において、±０．５以内であるアミノ酸の置換が含まれる。親水性に基づいて、一次アミノ酸配列からエピトープを特定することもできる。これらの領域は、「エピトープコア領域」とも称される。
【０１０３】
アミノ酸置換の例が表１に示されている。
【０１０４】
【表１】
2020058376.tif 000003
【０１０５】
「誘導体」という用語は、アミノ酸（又は核酸）の挿入、欠失又は置換以外の化学的修飾を含む分子を表す。ある種の実施形態において、誘導体は、ポリマー、脂質又は他の有機若しくは無機部分との化学的結合などの（但し、これらに限定されない。）共有修飾を含む。ある種の実施形態において、化学的に修飾された抗原結合タンパク質は、化学的に修飾されていない抗原結合タンパク質より大きな循環半減期を有することができる。ある種の実施形態において、化学的に修飾された抗原結合タンパク質は、所望の細胞、組織及
び／又は臓器に対する改善された標的誘導能力を有し得る。幾つかの実施形態において、誘導体抗原結合タンパク質は、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール又はポリプロピレングリコールなど（但し、これらに限定されない。）、１つ又はそれ以上の水溶性ポリマー付着を含むように共有的に修飾される。例えば、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号及び同第４，１７９，３３７号を参照されたい。ある種の実施形態において、誘導体抗原結合タンパク質は、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース又は他の炭水化物をベースとするポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化されたポリオール（例えば、グリセロール）及びポリビニルアルコール並びにこのようなポリマーの混合物などの（但し、これらに限定されない。）１つ又はそれ以上のポリマーを含む。
【０１０６】
ある種の実施形態において、誘導体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）サブユニットで共有的に修飾されている。ある種の実施形態において、１つ又はそれ以上の水溶性ポリマーは、１つ又はそれ以上の特定の位置で、例えば、誘導体のアミノ末端で結合されている。ある種の実施形態において、１つ又はそれ以上の水溶性ポリマーは、誘導体の１つ又はそれ以上の側鎖に無作為に付着されている。ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質に対して治療能力を向上させるためにＰＥＧが使用される。ある種の実施形態において、ヒト化抗体に対して治療能力を向上させるためにＰＥＧが使用される。ある種のこのような方法が、例えば、米国特許第６，１３３，４２６号（参照により、あらゆる目的のために組み込まれる。）に論述されている。
【０１０７】
ペプチド類縁体は、テンプレートペプチドの特性と類似の特性を有する非ペプチド薬として、医薬産業において一般的に使用されている。非ペプチド化合物のこれらの種類は、「ペプチド模倣物（“ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ”又は“ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｔｉｃｓ”」と称されている。「Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）；Ｖｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ  ＴＩＮＳ  ｐ．３９２（１９８５）；及びＥｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，３０：１２２９（１９８７）」（あらゆる目的のために、参照により、本明細書に組み込まれる。）。このような化合物は、しばしば、コンピュータ化された分子モデリングの助けを借りて開発される。治療的に有用なペプチドと構造的に類似するペプチド模倣物は、類似の治療効果又は予防効果を生じさせるために使用し得る。一般に、ペプチド模倣物は、ヒト抗体などの模範ポリペプチド（すなわち、生化学的特性又は薬理学的活性を有するポリペプチド）と構造的に類似するが、本分野で周知の方法によって、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−及び−ＣＨ２ＳＯ−から選択される結合によって必要に応じて置換された１つ又はそれ以上のペプチド結合を有する。コンセンサス配列の１つ又はそれ以上のアミノ酸を同種のＤアミノ酸で体系的に置換すること（例えば、Ｌ−リジンに代えてＤ−リジン）は、ある種の実施形態において、より安定なペプチドを作製するために使用し得る。さらに、コンセンサス配列又は実質的に同一なコンセンサス配列変異を含む拘束されたペプチドは、本分野で公知の方法によって、例えば、ペプチドを環状化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を付加することによって、作製され得る（Ｒｉｚｏ  ａｎｄ  Ｇｉｅｒａｓｃｈ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２）、参照により、あらゆる目的のために、本明細書に組み込まれる。）。
【０１０８】
ポリペプチド、核酸、宿主細胞などの生物学的物質に関連して本明細書を通じて使用される「天然に存在する」という用語は、自然の状態で見出される物質又は自然の状態で見
出される物質の形態を表す。
【０１０９】
本明細書において使用される「抗原結合タンパク質」（「ＡＢＰ」）は、特定された標的抗原を結合するあらゆるタンパク質を意味する。本願において、特定された標的抗原は、ＰＣＳＫ９タンパク質又はその断片である。「抗原結合タンパク質」には、抗体及びその結合部分（免疫学的に機能的な断片など）が含まれるが、これらに限定されない。ペプチボディは、抗原結合タンパク質の別の例である。本明細書において使用される抗体又は免疫グロブリン鎖（重鎖又は軽鎖）抗原結合タンパク質の「免疫学的に機能的な断片」（又は単に「断片」）という用語は、完全長の鎖中に存在するアミノ酸の少なくとも幾つかを欠如するが、抗原になお特異的に結合することができる抗体の部分（当該部分がどのようにして取得され、又は合成されたかを問わない。）を含む抗原結合タンパク質の種である。このような断片は、標的抗原に結合し、あるエピトープへの結合に関して、完全な状態の抗体を含む他の抗原結合タンパク質と競合し得るという点で生物学的に活性を有する。幾つかの実施形態において、断片は、中和断片である。幾つかの実施形態において、断片は、ＬＤＬＲとＰＣＳＫ９の間の相互作用の可能性を遮断し、又は低下させることができる。一態様において、このような断片は、完全長の軽鎖又は重鎖中に存在する少なくとも１つのＣＤＲを保持し、幾つかの実施形態において、単一の重鎖及び／又は軽鎖又はその一部を含む。これらの生物学的に活性な断片は、組換えＤＮＡ技術によって作製することが可能であり、又は完全な状態の抗体を含む抗原結合タンパク質の酵素的若しくは化学的切断によって作製することが可能である。免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片には、Ｆａｂ、ダイアボディ（同一鎖上の２つのドメイン間での対形成を可能にするには短すぎる短いペプチドリンカーを介して接続された、軽鎖可変ドメインと同一のポリペプチド上の重鎖可変ドメイン）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体及び一本鎖抗体が含まれるが、これらに限定されず、ヒト、マウス、ラット、ラクダ科の動物又はウサギなどの（但し、これらに限定されない）あらゆる哺乳動物源に由来し得る。本明細書中に開示されている抗原結合タンパク質の機能的部分、例えば、１つ又はそれ以上のＣＤＲは、体内の特定の標的に誘導され、二機能性治療特性を有し、又は延長された血清半減期を有する治療剤を作製するために、第二のタンパク質又は小分子に共有結合され得る。当業者によって理解されるように、抗原結合タンパク質は、非タンパク質成分を含むことができる。本開示の幾つかの節において、ＡＢＰの例は、「数字／文字／数字」（例えば、２５Ａ７）の形式で本明細書中に記載されている。これらの場合、正確な名前は特異的抗体を表す。すなわち、２５Ａ７という名前のＡＢＰは、（本明細書において、同じであることが明示的に教示されていなければ（例えば、２５Ａ７及び２５Ａ７．３））、必ずしも２５Ａ７．１という名前の抗体と同じであるとは限らない。当業者によって理解されるように、幾つかの実施形態において、ＬＤＬＲは抗原結合タンパク質ではない。幾つかの実施形態において、ＬＤＬＲの結合サブセクションは、抗原結合タンパク質ではない（例えば、ＥＧＦａ）。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９がそれを通じてインビボでシグナル伝達する他の分子は、抗原結合タンパク質でない。このような実施形態は、そのようなものとして明示的に特定される。
【０１１０】
本明細書に記載されているある種の抗原結合タンパク質は、抗体であり、又は抗体に由来する。ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質のポリペプチド構造は、モノクローナル抗体、二重特異的抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では、「抗体模倣物」と称される場合がある。）、キメラ抗体、ヒト化抗、ヒト抗体、抗体融合物（本明細書において、「抗体連結物」と称される場合がある。）及びそれぞれ、これらの断片を含む（但し、これらに限定されない。）抗体を基礎とする。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、アビマー（強固に結合するペプチド）を含み、又はアビマーからなる。これらの様々な抗原結合タンパク質は、本明細書中にさらに記載されている。
【０１１１】
「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ１及びＣＨ２ドメインを含む２つの重鎖断片を含む。２つ
の重鎖断片は、２つ又はそれ以上のジスルフィド結合によって、及びＣＨ３ドメインの疎水的相互作用によって一緒に固定される。
【０１１２】
「Ｆａｂ断片」は、１つの軽鎖並びに１つの重鎖のＣＨ１及び可変領域を含む。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
【０１１３】
「Ｆａｂ’断片」は、１つの軽鎖とＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含有し、並びに２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖間で鎖間ジスルフィド結合を形成して、Ｆ（ａｂ’）２分子を形成できるように、ＣＨ１及びＣＨ２ドメインの間の領域も含有する１つの重鎖の一部を含む。
【０１１４】
「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つの軽鎖及び鎖間ジスルフィド結合が２つの重鎖間で形成されるように、ＣＨ１とＣＨ２ドメインの間の定常領域の一部を含有する２つの重鎖を含有する。従って、Ｆ（ａｂ’）２断片は、２つの重鎖間のジスルフィド結合によって一緒に固定された２つのＦａｂ’断片から構成される。
【０１１５】
「Ｆｖ領域」は、重鎖及び軽鎖の両方に由来する可変領域を含むが、定常領域を欠如する。
【０１１６】
「一本鎖抗体」は、柔軟なリンカーによって重鎖及び軽鎖可変領域が接続されて、抗原結合領域を形成する単一のポリペプチド鎖を形成するＦｖ分子である。一本鎖抗体は、国際特許出願公開ＷＯ８８／０１６４９並びに米国特許第４，９４６，７７８号及び同第５，２６０，２０３号（これらの開示は、参照により組み込まれる。）に詳しく論述されている。
【０１１７】
「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域又は軽鎖の可変領域のみを含有する免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片である。幾つかの事例において、二価のドメイン抗体を作製するために、２つ又はそれ以上のＶＨ領域がペプチドリンカーを用いて共有結合される。二価のドメイン抗体の２つのＶＨ領域は、同一又は別異の抗原を標的とし得る。
【０１１８】
「二価の抗原結合タンパク質」又は「二価の抗体」は、２つの抗原結合部位を含む。幾つかの事例において、２つの結合部位は同じ抗原特異性を有する。二価の抗原結合タンパク質及び二価の抗体は、二重特異的であり得る。下記を参照。「多重特異的」又は「多重機能的」抗体以外の二価の抗体は、ある種の実施形態において、典型的には、同一のその結合部位の各々を有するものと理解される。
【０１１９】
「多重特異的抗原結合タンパク質」又は「多重特異的抗体」は、２以上の抗原又はエピトープを標的とするものである。
【０１２０】
「二重特異的」、「デュアル特異的」又は「二重機能的」抗原結合タンパク質又は抗体は、それぞれ、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗原結合タンパク質又は抗体である。二重特異的抗原結合タンパク質及び抗体は、多重特異的抗原結合タンパク質抗体の一種であり、ハイブリドーマの融合又はＦａｂ’断片の連結を含む（但し、これらに限定されない。）様々な方法によって作製することができる。例えば、「Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎｎ，  １９９０，  Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１；  Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ，  １９９２，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３」を参照されたい。二重特異的抗原結合タンパク質又は抗体の２つの結合部位は、同一又は別異のタンパク質標的上に存在し得る２つの異なるエピトープに結合する。
【０１２１】
抗原結合タンパク質は、解離定数（Ｋｄ）が１０−７Ｍ以下である場合に、その標的抗原を「特異的に結合する」と称される。ＡＢＰは、Ｋｄが５×１０−９Ｍ以下である場合に、「高い親和性」で抗原を特異的に結合し、Ｋｄが５×１０−１０Ｍ以下である場合に、「極めて高い親和性」で抗原を特異的に結合する。一実施形態において、ＡＢＰは、１０−９Ｍ以下のＫｄを有する。一実施形態において、オフ速度は、１×１０−５未満である。別の実施形態において、ＡＢＰは、約１０−９Ｍと１０−１３Ｍの間のＫｄでヒトＰＣＳＫ９に結合し、さらに別の実施形態において、ＡＢＰは５×１０−１０以下のＫｄで結合する。当業者によって理解されるように、幾つかの実施形態において、抗原結合断片の何れも又は全てが、ＰＣＳＫ９に特異的に結合し得る。
【０１２２】
第二の標的への結合より、ある標的により強固に結合する場合に、抗原結合タンパク質は「選択的」である。
【０１２３】
「抗原結合領域」は、特定の抗原（例えば、パラトープ）を特異的に結合するタンパク質又はタンパク質の一部を意味する。例えば、抗原と相互作用し、抗原に対するその特異性及び親和性を抗原結合タンパク質に対して付与するアミノ酸残基を含有する抗原結合タンパク質のその部分は、「抗原結合領域」と称される。抗原結合領域は、通例、１つ又はそれ以上の「相補性結合領域」（「ＣＤＲ」）を含む。ある種の抗原結合領域は、１つ又はそれ以上の「フレームワーク」領域も含む。「ＣＤＲ」は、抗原結合特異性及び親和性に寄与するアミノ酸配列である。「フレームワーク」領域は、ＣＤＲの適切な立体構造の維持を補助して、抗原結合領域と抗原の間の結合を促進することができる。構造的には、フレームワーク領域は、抗体中においてＣＤＲ間に位置することができる。フレームワーク及びＣＤＲ領域の例は、図２Ａから３Ｄ、３ＣＣＣ−ＪＪＪ及び１５Ａから１５Ｄに示されている。幾つかの実施形態において、抗体３Ｂ６の軽鎖に対するＣＤＲの配列は以下のとおりである。ＣＤＲ１  ＴＬＳＳＧＹＳＳＹＥＶＤ（配列番号２７９）；ＣＤＲ２  ＶＤＴＧＧＩＶＧＳＫＧＥ（配列番号２８０）；ＣＤＲ３  ＧＡＤＨＧＳＧＴＮＦＶＶＶ（配列番号２８１）、ＦＲは、以下のとおりである。ＦＲ１  ＱＰＶＬＴＱＰＬＦＡＳＡＳＬＧＡＳＶＴＬＴＣ（配列番号２８２）；ＦＲ２  ＷＹＱＱＲＰＧＫＧＰＲＦＶＭＲ（配列番号２８３）；ＦＲ３  ＧＩＰＤＲＦＳＶＬＧＳＧＬＮＲＹＬＴＩＫＮＩＱＥＥＤＥＳＤＹＨＣ（配列番号２８４）；及びＦＲ４  ＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号２８５）。
【０１２４】
ある態様において、ＰＣＳＫ９、例えば、ヒトＰＣＳＫ９を結合する組換え抗原結合タンパク質が提供される。この文脈において、「組換え抗原結合タンパク質」は、組換え技術を用いて、すなわち、本明細書中に記載されている組換え核酸の発現を通じて作製されたタンパク質である。組換えタンパク質を作製するための方法及び技術は、本分野において周知である。
【０１２５】
「抗体」という用語は、あらゆるイソタイプの完全な免疫グロブリン又は標的抗原への特異的結合に関して完全な状態の抗体と競合することができるその断片を表し、例えば、キメラ、ヒト化、完全ヒト及び二重特異的抗体が含まれる。「抗体」は、抗原結合タンパク質の一種である。完全な状態の抗体は、少なくとも２つの完全長重鎖及び２つの完全長軽鎖を一般に含むが、幾つかの事例では、重鎖のみを含み得る、ラクダ科の動物中に天然に存在する抗体などのように、より少ない鎖を含み得る。抗体は、単一の源からのみ得ることが可能であり、又は「キメラ」であり得る（すなわち、抗体の異なる部分が、以下でさらに記載されているように２つの異なる抗体に由来し得る。）。抗原結合タンパク質、抗体又は結合断片は、組換えＤＮＡ技術によって、又は完全な状態の抗体の酵素的若しくは化学的切断によって、ハイブリドーマ中で製造することができる。別段の記載がなければ、「抗体」という用語は、２つの完全長重鎖及び２つの完全長軽鎖を含む抗体の他に、その誘導体、バリアント、断片及び変異タンパク質を含み、その例は以下に記載されてい
る。さらに、明示的に除外されていなければ、抗体には、モノクローナル抗体、二重特異的抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書において、「抗体模倣物」と称される場合がある。）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合物（本明細書において、「抗体連結物」と称される場合がある。）及びそれぞれ、これらの断片が含まれる。幾つかの実施形態において、この用語は、ペプチボディも包含する。
【０１２６】
天然に存在する抗体構造単位は、典型的には、四量体を含む。このような四量体の各々は、ポリペプチド鎖の２つの同じ対から通例構成され、各対は、１つの完全長「軽」鎖（ある種の実施形態において、約２５ｋＤａ）及び１つの完全長「重」鎖（ある種の実施形態において、約５０から７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、通例、抗原認識に必要とされる約１００から１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を通例含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に必要とされ得る定常領域を通例規定する。ヒト軽鎖は、κ及びλ軽鎖として典型的に分類される。重鎖は、μ、δ、γ、α又はεとして典型的に分類され、抗体のイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥとして規定する。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４などの（但し、これらに限定されない。）幾つかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、ＩｇＭ１及びＩｇＭ２などの（但し、これらに限定されない。）サブクラスを有する。ＩｇＡは、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２などの（但し、これらに限定されない。）サブクラスへ同様に細分される。完全長の軽鎖及び重鎖内に、典型的には、可変及び定常領域は、約１２又はそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結されており、重鎖は約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。例えば、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，  Ｗ．，  ｅｄ．，  ２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８９））（参照により、全ての目的のために、その全体が組み込まれる。）」を参照されたい。各軽／重鎖対の可変領域は、通例、抗原結合部位を形成する。
【０１２７】
可変領域は、３つの超可変領域（相補性決定領域又はＣＤＲとも称される。）によって連結された、相対的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般的構造を典型的に呈する。各対の２つの鎖から得られるＣＤＲは、フレームワーク領域によって通例並列され、これにより、特異的なエピトープへの結合が可能となり得る。Ｎ末端からＣ末端へ、軽鎖及び重鎖可変領域は何れも、通例、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、通例、免疫学的に関心が持たれるタンパク質のＫａｂａｔ配列の定義（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．（１９８７  ａｎｄ  １９９１））、又は「Ｃｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７  （１９８７）；  Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４２：８７８−８８３  （１９８９）」に従う。
【０１２８】
ある種の実施形態において、抗体重鎖は、抗体軽鎖の不存在下で、抗原に結合する。ある種の実施形態において、抗体軽鎖は、抗体重鎖の不存在下で、抗原に結合する。ある種の実施形態において、抗体結合領域は、抗体軽鎖の不存在下で、抗原に結合する。ある種の実施形態において、抗体結合領域は、抗体重鎖の不存在下で、抗原に結合する。ある種の実施形態において、各可変領域は、他の可変領域の不存在下で、抗原へ特異的に結合する。
【０１２９】
ある種の実施形態において、ＣＤＲの確定的な描写及び抗体の結合部位を含む残基の同定は、抗体の構造を解明し、及び／又は抗体−リガンド複合体の構造を解明することによって達成される。ある種の実施形態において、これは、Ｘ線結晶学など、当業者に公知の様々な技術の何れによっても達成することができる。ある種の実施形態において、ＣＤＲ領域を同定し、又は概測するために、様々な分析の方法を使用することができる。このような方法の例には、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡｂＭ定義及び接触定義が含
まれるが、これらに限定されない。
【０１３０】
Ｋａｂａｔ定義は、抗体中の残基に付番するための標準であり、ＣＤＲ領域を同定するために典型的に使用される。例えば、「Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｗｕ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２８：２１４−８（２０００）」を参照されたい。Ｃｈｏｔｈｉａ定義はＫａｂａｔ定義に類似しているが、Ｃｈｏｔｈｉａ定義はある種の構造的ループ領域の位置を考慮に入れている。例えば、「Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，  １９６：９０１−１７  （１９８６）；  Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４２：８７７−８３  （１９８９）」を参照されたい。ＡｂＭ定義は、抗体構造をモデル化するＯｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐによって産生されるコンピュータプログラムの一体化されたパッケージを使用する。例えば、「Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  （ＵＳＡ），  ８６：９２６８−９２７２  （１９８９）；“ＡｂＭＴＭ，Ａ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”Ｏｘｆｏｒｄ，  ＵＫ；  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，
Ｌｔｄ」を参照されたい。ＡｂＭ定義は、公知のデータベースとＰＲＯＴＥＩＮＳ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌ．，
３：１９４−１９８  （１９９９）中の「Ｓａｍｕｄｒａｌａ  ｅｔ  ａｌ，“Ａｂ  Ｉｎｉｔｉｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，”によって記載されているようなアブイニシオ法の組み合わせを用いて、一次配列から抗体の四次構造をモデル化する。接触定義は、利用可能な複雑な結晶構造の解析を基礎とする。例えば、「ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，  ５：７３２−４５  （１９９６）」を参照されたい。
【０１３１】
慣例により、重鎖中のＣＤＲ領域は、通例、Ｈ１、Ｈ２及びＨ３と称され、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に順に付番される。軽鎖中のＣＤＲ領域は、通例、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３と称され、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に順に付番される。
【０１３２】
「軽鎖」という用語は、完全長の軽鎖及び結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有するその断片を含む。完全長軽鎖は、可変領域ドメイン、ＶＬ及び定常領域ドメイン、ＣＬを含む。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端に位置する。軽鎖は、κ鎖及びλ鎖を含む。
【０１３３】
「重鎖」という用語は、完全長の重鎖及び結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有するその断片を含む。完全長の重鎖は、可変領域ドメインＶＨ及び３つの定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。ＶＨドメインはポリペプチドのアミノ末端に、及びＣＨドメインはカルボキシル末端に位置し、ＣＨ３がポリペプチドのカルボキシ末端に最も近い。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４サブタイプを含む。）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２サブタイプを含む。）、ＩｇＭ及びＩｇＥなどのあらゆるイソタイプのものであり得る。
【０１３４】
二重特異的又は二重機能的抗体は、典型的には、２つの異なる重／軽鎖対及び２つの異なる結合部位を有する人工のハイブリッド抗体である。二重特異的抗体は、ハイブリドーマの融合又はＦａｂ’断片の連結などの（但し、これらに限定されない。）様々な方法によって産生され得る。例えば、「Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ７９：３１５−３２１  （１９９０）；  Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４８：１５４７−１５５３  （１９９２）」を参照されたい。
【０１３５】
哺乳動物の幾つかの種は、単一の重鎖のみを有する抗体も産生する。
【０１３６】
それぞれの各免疫グロブリン鎖は、それぞれ概ね９０から１１０のアミノ酸からなり、特徴的な折り畳みパターンを有する数個の「免疫グロブリンドメイン」から典型的に構成される。これらのドメインは、抗体ポリペプチドを構成する基本単位である。ヒトでは、ＩｇＡ及びＩｇＤイソタイプは４つの重鎖と４つの軽鎖を含有し、ＩｇＧ及びＩｇＥイソタイプは２つの重鎖と２つの軽鎖を含有し、並びにＩｇＭイソタイプは５つの重鎖と５つの軽鎖を含有する。重鎖Ｃ領域は、エフェクター機能に必要とされ得る１つ又はそれ以上のドメインを典型的に含む。重鎖定常領域ドメインの数は、イソタイプに依存する。ＩｇＧ重鎖は、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３として知られる３つのＣ領域ドメインを含有する。提供される抗体は、これらのイソタイプ及びサブタイプの何れをも有し得る。本発明のある種の実施形態において、抗ＰＣＳＫ９抗体はＩｇＧ２又はＩｇＧ４サブタイプの抗体である。
【０１３７】
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、重鎖中にアミノ末端の約１２０から１３０個のアミノ酸及び軽鎖中に約１００から１１０個のアミノ末端アミノ酸を通例含む、抗体の軽鎖及び／又は重鎖の一部を表す。ある種の実施形態において、異なる抗体の可変領域は、同じ種の抗体間でさえ、アミノ酸配列が大幅に異なる。抗体の可変領域は、ある抗体の標的に対する特異性を通例決定する。
【０１３８】
「中和抗原結合タンパク質」又は「中和抗体」という用語は、リガンドに結合し、そのリガンドの生物学的効果を妨げ、又は低下させる、それぞれ、抗原結合タンパク質又は抗体を表す。これは、例えば、リガンド上の結合部位を直接封鎖することによって、又はリガンドに結合し、間接的な手段（リガンド中の構造的又はエネルギー的変化など）を通じて、リガンドの結合能を変化させることによって行うことができる。幾つかの実施形態において、この用語は、それが結合しているタンパク質が生物学的機能を発揮するのを妨げる抗原結合タンパク質も表し得る。抗原結合タンパク質（例えば、抗体又は免疫学的に機能的なその断片）の結合及び／又は特異性を評価する際に、抗体の過剰が（インビトロ競合的結合アッセイで使用された場合に）少なくとも約１から２０、２０から３０％、３０から４０％、４０から５０％、５０から６０％、６０から７０％、７０から８０％、８０から８５％、８５から９０％、９０から９５％、９５から９７％、９７から９８％、９８から９９％又はそれ以上、リガンドに結合された結合対の量を低下させるときに、抗体又は断片はその結合対へのリガンドの結合を大幅に阻害することができる。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質の場合には、このような中和分子は、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲを結合する能力を低減させることができる。幾つかの実施形態において、競合アッセイを介して、中和能力を性質決定し、及び／又は記載する。幾つかの実施形態において、中和能力は、ＩＣ５０又はＥＣ５０値の観点で記載される。幾つかの実施形態において、ＡＢＰ２７Ｂ２、１３Ｈ１、１３Ｂ５及び３Ｃ４は、非中和ＡＢＰであり、３Ｂ６、９Ｃ９及び３１Ａ４は弱い中和物質であり、表２中の残りのＡＢＰは強い中和物質である。幾つかの実施形態において、抗体又は抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９へ結合し、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合するのを妨げる（又はＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合する能力を低下させる）ことによって中和する。幾つかの実施形態において、抗体又はＡＢＰは、ＰＣＳＫ９に結合し、ＰＣＳＫ９をＬＤＬＲへ結合させながら、ＬＤＬＲのＰＣＳＫ９媒介性分解を妨げ、又は低下させることによって中和する。従って、幾つかの実施形態において、中和ＡＢＰ又は抗体は、ＰＣＳＫ９／ＬＤＬＲ結合をなお可能にしながら、ＰＣＳＫ９が関与するＬＤＬＲのその後の分解を妨げる（又は低下させる）。
【０１３９】
「標的」という用語は、抗原結合タンパク質によって結合されることができる分子又は分子の一部を表す。ある実施形態において、標的は、１つ又はそれ以上のエピトープを有することができる。ある実施形態において、標的は抗原である。「抗原結合タンパク質」
という用語における「抗原」の使用は、抗原を含むタンパク質配列が抗体によって結合され得ることを単に表す。この文脈において、タンパク質は外来であること、又は免疫応答を誘導可能であることは必要とされない。
【０１４０】
同じエピトープに対して競合する抗原結合タンパク質（例えば、中和抗原結合タンパク質又は中和抗体）という文脈において使用される場合の「競合する」という用語は、検査されている抗原結合タンパク質（例えば、抗体又は免疫学的に機能的なその断片）が共通の抗原（例えば、ＰＣＳＫ９又はその断片）への参照抗原結合タンパク質（例えば、リガンド又は参照抗体）の特異的結合を妨げ、又は阻害する（例えば、低下させる）アッセイによって測定された抗原結合タンパク質間の競合を意味する。ある抗原結合タンパク質が別の抗原結合タンパク質と競合するかどうかを決定するために、競合的結合アッセイの多数の種類、例えば、固相直接又は間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接又は間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ，  １９８３，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９：２４２−２５３参照）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ｅｔ
ａｌ，  １９８６，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４−３６１９参照）、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ
Ｌａｎｅ，  １９８８，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｉ−１２５標識を用いた固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ，  １９８８，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７−１５）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｃｈｅｕｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６：５４６−５５２参照）；及び直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，
Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７−８２参照）を使用することができる。典型的には、このようなアッセイは、これらの何れかを有する固体表面又はセルに結合された精製抗原、標識されていない検査抗原結合タンパク質及び標識された基準抗原結合タンパク質を使用することを含む。競合的阻害は、検査抗原結合タンパク質の存在下で、固体表面又はセルに結合された標識の量を測定することによって測定される。通常、検査抗原結合タンパク質は過剰に存在する。競合アッセイによって同定される抗原結合タンパク質（競合抗原結合タンパク質）には、基準抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合タンパク質及び立体的妨害が生じるのに、基準抗原結合タンパク質によって結合されるエピトープに十分に近接した隣接エピトープに結合する抗原結合タンパク質が含まれる。競合結合を測定するための方法に関するさらなる詳細は、本明細書中の実施例に提供されている。通常、競合抗原結合タンパク質が過剰に存在する場合には、少なくとも４０から４５％、４５から５０％、５０から５５％、５５から６０％、６０から６５％、６５から７０％、７０から７５％又は７５％又はそれ以上、共通の抗原への基準抗原結合タンパク質の特異的結合を阻害する（例えば、低下させる）。幾つかの事例において、少なくとも８０から８５％、８５から９０％、９０から９５％、９５から９７％又は９７％又はそれ以上、結合が阻害される。
【０１４１】
「抗原」という用語は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその免疫学的機能断片など）などの選択的結合因子によって結合され得る分子又は分子の一部を表す。幾つかの実施形態において、抗原は、その抗原に結合することができる抗体を作製するために、動物内で使用することができる。抗原は、異なる抗原結合タンパク質（例えば、抗体）と相互作用することができる１つ又はそれ以上のエピトープを有することができる。
【０１４２】
「エピトープ」という用語は、抗体又はＴ細胞受容体などの抗原結合タンパク質によって結合され得るあらゆる決定基を含む。エピトープは、その抗原を標的とする抗原結合タンパク質によって結合される抗原の領域であり、抗原がタンパク質である場合、抗原結合タンパク質に直接接触する特定のアミノ酸を含む。最も頻繁には、エピトープはタンパク
質上に存在するが、幾つかの事例では、核酸などの分子の他の種類上に存在することができる。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面基を含むことができ、特異的な三次元構造の特徴及び／又は特異的な電荷的特長を有することができる。一般に、特定の標的抗原に対して特異的な抗体は、タンパク質及び／又は高分子の複雑な混合物中において、標的抗原上のエピトープを優先的に認識する。
【０１４３】
本明細書において使用される「実質的に純粋な」とは、分子の記載されている種が存在している主要な種であること、すなわち、モル濃度ベースで、同じ混合物中の他の何れの個別の種より豊富に存在することを意味する。ある種の実施形態において、実質的に純粋な分子は、対象種が存在する全ての高分子種の少なくとも５０％（モル濃度を基礎とする。）を占める組成物である。他の実施形態において、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全ての高分子種の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％を含む。他の実施形態において、慣用の検出法によって、きょう雑種を組成物中に検出することができず、従って、組成物が単一の検出可能な高分子種からなる実質的均一状態になるまで対象種が精製される。
【０１４４】
「因子」という用語は、本明細書において、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的高分子又は生物学的材料から作製された抽出物を表すために使用される。
【０１４５】
本明細書において使用される「標識」又は「標識された」という用語は、例えば、放射線標識されたアミノ酸の取り込み又は標識されたアビジン（例えば、蛍光マーカー又は光学的若しくは色素測定法によって検出可能な酵素活性を含有するストレプトアビジン）によって検出することが可能なビオチン部分のポリペプチドへの付着によって、検出可能マーカーを取り込むことを表す。ある実施形態において、標識又はマーカーは、治療用でもあり得る。ポリペプチド及び糖タンパク質を標識する様々な方法が本分野において公知であり、使用することが可能である。ポリペプチドに対する標識の例には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない。放射性同位体又は放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光性標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光物質）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。ある種の実施形態において、立体障害の可能性を低減するために、標識は、様々な長さのスペーサーアームによって付着される。
【０１４６】
本明細書において使用される「生物学的試料」という用語には、生物又は以前に生物であった物から得られる物質のあらゆる量が含まれるが、これらに限定されない。このような生物には、ヒト、マウス、サル、ラット、ウサギ及び他の動物が含まれるが、これらに限定されない。このような物質には、血液、血清、尿、細胞、臓器、組織、骨、骨髄、リンパ節及び皮膚が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４７】
本明細書において使用される「薬剤組成物」（又は薬剤又は薬物）という用語は、患者に適切に投与された場合に、所望の治療効果を誘導することができる、化学的化合物、組成物、組成物、薬剤又は薬物を表す。薬剤組成物は、成分の２以上の種類を必ずしも必要としない。
【０１４８】
「治療的有効量」という用語は、哺乳動物中の治療的応答を生じさせることが決定されたＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質の量を表す。このような治療的有効量は、当業者によって容易に確定される。
【０１４９】
本明細書において使用される「調節物質」という用語は、分子の活性又は機能を変化又は改変させる化合物である。例えば、調節物質は、調節物質の不存在下で観察される活性又は機能の規模と比べて、分子のある種の活性又は機能の規模の増加又は減少を引き起こすことができる。ある種の実施形態において、調節物質は、分子の少なくとも１つの活性又は機能の規模を減少させる阻害剤である。分子のある種の典型的な活性及び機能には、結合親和性、酵素活性及びシグナル伝達が含まれるが、これらに限定されない。ある種の典型的な阻害剤には、タンパク質、ペプチド、抗体、ペプチボディ、炭水化物又は小有機分子が含まれるが、これらに限定されない。ペプチボディは、例えば、米国特許第６，６６０，８４３号（ＰＣＴ出願ＷＯ０１／８３５２５に対応する。）に記載されている。
【０１５０】
「患者」と「対象」という用語は互換的に使用され、ヒト及び非ヒト動物対象並びに以前に診断された疾患を有する対象、以前に認識された疾患を持たない対象、医学的な治療を受けた対象、疾患を発症するリスクを有する対象などが含まれる。
【０１５１】
「治療する」及び「治療」という用語は、治療的処置、予防的処置及び対象が疾患又は他のリスク因子を発症するリスクを低減する適用が含まれる。治療は、疾患の完全な治癒を必要とするものではなく、症候又は伏在するリスク因子を低減させる実施形態を包含する。
【０１５２】
「予防する」という用語は、事象の確率を１００％除去することを必要とするものではない。むしろ、「予防する」という用語は、化合物又は方法の存在下で、事象の発生の確率が低下されることを表す。
【０１５３】
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド技術及び組織培養及び形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）のための標準的な技術を使用することができる。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様に従って、又は本分野で一般的に実施されるように、又は本明細書中に記載されているように実施することができる。前記技術及び手技は、本分野において周知の方法に従って、並びに本明細書を通じて引用及び論述されている様々な一般的な、及びより具体的な参考文献に記載されているように、一般に実施することができる。例えば、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．  Ｙ．  （１９８９））」（参照により、あらゆる目的のために本明細書中に組み込まれる。）を参照されたい。特別な定義が与えられていなければ、本明細書中に記載されている分析化学、合成有機化学並びに医学及び薬剤化学に関連して使用される命名法並びにこれらの研究手技及び技術は、本分野において周知であり、一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、医薬の調製、製剤化及び送達及び患者の治療のための標準的な技術を使用することができる。
【０１５４】
ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質
プロタンパク質コンベルターゼスブチリシンケクシン９型（ＰＣＳＫ９）は、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）タンパク質のレベルの制御に関与しているセリンプロテアーゼである（Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  ２００７；  Ｓｅｉｄａｈ  ａｎｄ  Ｐｒａｔ，  ２００７）。ＰＣＳＫ９は、セリンプロテアーゼのスブチリシン（Ｓ８）ファミリーのプロホルモン−プロタンパク質コンベルターゼである（Ｓｅｉｄａｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。典型的なヒトＰＣＳＫ９アミノ酸配列は、図１Ａ（下線が付されているタンパク質の「プロ」ドメインを図示する。）及び図１Ｂ（太字のシグナル配列及び下線が付されたプロドメインを図示する。）において、配列番号１及び３として表されている。典型的なヒトＰＣＳＫ９のコード配列が、配列番号２として表されている（図１Ｂ）。
本明細書に記載されているように、ＰＣＳＫ９タンパク質は、完全長ＰＣＳＫ９タンパク質の断片も含むことができる。ＰＣＳＫ９タンパク質の構造は、２つのグループによって最近解決された（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２００７，  ａｎｄ  Ｐｉｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  １５：１−８，  ２００７）（何れも、参照により、全体が本明細書に組み込まれる。）。ＰＣＳＫ９は、シグナル配列、Ｎ末端プロドメイン、スブチリシン様触媒ドメイン及びＣ末端ドメインを含む。
【０１５５】
ヒトＰＣＳＫ９を含むＰＣＳＫ９を結合する抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）は、本明細書中に記載されている。幾つかの実施形態において、提供される抗原結合タンパク質は、本明細書に記載されているように、１つ又はそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むポリペプチドである。同じ抗原結合タンパク質において、ＣＤＲは、ＣＤＲの適切な抗原結合特性が達成されるようにＣＤＲを方向付ける「フレームワーク」領域中に包埋されている。幾つかの実施形態において、本明細書中に提供されている抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲ間の相互作用を妨害し、遮断し、低下させ、又は調節することができる。このような抗原結合タンパク質は、「中和」と表される。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質が中和性であり、ＰＣＳＫ９に結合されている場合でさえ、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲ間の結合はなお起こり得る。例えば、幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９上のＬＤＬＲ結合部位を封鎖することなく、ＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９の悪影響を妨げ、又は低下させる。従って、幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲ間の結合相互作用を抑制する必要なしに、ＬＤＬＲの分解をもたらすＰＣＳＫ９の能力を調節し、又は変化させる。このようなＡＢＰは、「非競合的に中和する」ＡＢＰと特に記載することができる。幾つかの実施形態において、中和ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合するのを妨げる位置及び／又は様式で、ＰＣＳＫ９に結合する。このようなＡＢＰは、「競合的に中和する」ＡＢＰと特に記載することができる。上記中和物質は何れも、対象中に存在している遊離のＬＤＬＲのより大きな量をもたらすことができ、これにより、ＬＤＬに結合しているより多くのＬＤＬＲがもたらされる（これにより、対象中のＬＤＬの量を低下させる。）。続いて、これは、対象中に存在する血清コレステロールの量の低下をもたらす。
【０１５６】
幾つかの実施形態において、本明細書に提供されている抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９によって媒介される活性（結合を含む。）を阻害することができる。幾つかの実施形態において、これらのエピトープに結合する抗原結合タンパク質は、とりわけ、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲの間の相互作用及びＰＣＳＫ９によって媒介される他の生理学的効果を阻害する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫに対する完全ヒト抗体など、ヒトである。
【０１５７】
幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９の触媒ドメインに結合する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９の成熟形態に結合する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９のプロドメイン中に結合する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９の成熟形態に選択的に結合する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合できない様式で、又は効率的には結合できない様式で、触媒ドメインに結合する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、触媒ドメインのＣ末端に結合しない。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、触媒ドメインのＮ末端に結合しない。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９タンパク質のＮ末端又はＣ末端に結合しない。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、本明細書中に論述されている抗体によって結合されるエピトープの何れか１つに結合する。幾つかの実施形態において、これは、本明細書中に開示されている抗体と他の抗体の間の競合アッセイによって測定することができる。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、表２に記載されている抗体の１つによって結合されるエピトープに結合する。幾つかの実施形
態において、抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９の特異的な立体構造状態に結合して、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲと相互作用するのを妨げる。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９のＶドメインに結合する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９のＶドメインに結合し、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合するのを妨げる（低下させる）。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９のＶドメインに結合し、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を妨げずに（又は低下させずに）、ＰＣＳＫ９を通じて媒介されるＬＤＬＲに対する有害な活性を妨げ、又は低下させる。
【０１５８】
本明細書中に開示されている抗原結合タンパク質は、様々な用途を有する。抗原結合タンパク質の幾つかは、例えば、特異的結合アッセイ、ＰＣＳＫ９、特に、ヒトＰＣＳＫ９又はそのリガンドのアフィニティー精製において、及びＰＣＳＫ９活性の他のアンタゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイにおいて有用である。抗原結合タンパク質の幾つかは、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を阻害し、又はＰＣＳＫ９によって媒介される活性を阻害するのに有用である。
【０１５９】
抗原結合タンパク質は、本明細書中に説明されているように、様々な治療用途において使用することができる。例えば、幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質は、本明細書中にさらに記載されているように、高コレステロール血症などのコレステロール関連疾患（又は「血清コレステロール関連疾患」）など、ＰＣＳＫ９と関連する症状を治療するのに有用である。抗原結合タンパク質に対する他の使用には、例えば、ＰＣＳＫ９関連疾患又は症状の診断及びＰＣＳＫ９の存在又は不存在を決定するためのスクリーニングアッセイが含まれる。本明細書中に記載されている抗原結合タンパク質の幾つかは、ＰＣＳＫ９活性と関連する結果、症候及び／又は病変を治療する上で有用である。
【０１６０】
幾つかの実施形態において、提供される抗原結合タンパク質は、１つ又はそれ以上のＣＤＲ（例えば、１、２、３、４、５又は６個のＣＤＲ）を含む。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、（ａ）ポリペプチド構造及び（ｂ）ポリペプチド構造中に挿入され、及び／又は連結された１つ又はそれ以上のＣＤＲを含む。ポリペプチド構造は、様々な異なる形態を採ることができる。例えば、ポリペプチド構造は、天然に存在する抗体のフレームワーク又はその断片若しくはバリアントであり得、若しくはこれらを含むことができ、又は性質上、完全に合成であり得る。様々なポリペプチド構造の例は、以下にさらに記載されている。
【０１６１】
ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質のポリペプチド構造は、抗体であり、又はモノクローナル抗体、二重特異的抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では、「抗体模倣物」と称される場合がある。）、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融合物（本明細書において、「抗体連結物」と称される場合がある。）及びそれぞれ、各々の一部若しくは断片を含む（但し、これらに限定されない。）抗体に由来する。幾つかの事例において、抗原結合タンパク質は、抗体の免疫学的断片である（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又はｓｃＦｖ）。様々な構造は、本明細書中にさらに記載及び定義されている。
【０１６２】
本明細書中に提供されている抗原結合タンパク質の幾つかは、ヒトＰＣＳＫ９に特異的に及び／又は選択的に結合する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号３の残基１５３から６９２を有する及び／又はからなるヒトＰＣＳＫ９タンパク質に、特異的に及び／又は選択的に結合する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、配列番号３の残基３１から１５２を有する及び／又はからなるヒトＰＣＳＫ９に、特異的に及び／又は選択的に結合する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、図１Ａに図示されているヒトＰＣＳＫ９タンパク質（配列番号１）に選択的に結合する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９タンパク質の少なくとも断片及び／又はシグ
ナル配列あり若しくはなしの完全長ＰＣＳＫ９タンパク質に特異的に結合する。
【０１６３】
抗原結合タンパク質が治療用途のために使用される実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９の１つ又はそれ以上の生物学的活性を阻害し、妨害し、又は調節することができる。一実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトＰＣＳＫ９に特異的に結合し、及び／又は（例えば、インビトロ競合結合アッセイにおける結合を測定することによって）少なくとも約２０％から４０％、４０から６０％、６０から８０％、８０から８５％又はそれ以上、ＬＤＬＲへのヒトＰＣＳＫ９の結合を実質的に阻害する。本明細書において提供される抗原結合タンパク質の幾つかは、抗体である。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、１０−１２、１０−１３Ｍより小さいＫｄを有する（より強固に結合する）。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９へのＬＤＬＲの結合の遮断に関して、１μＭ未満、１０００ｎＭから１００ｎＭ、１００ｎＭから１０ｎＭ、１０ｎＭから１ｎＭ、１０００ｐＭから５００ｐＭ、５００ｐＭから２００ｐＭ、２００ｐＭ未満、２００ｐＭから１５０ｐＭ、２００ｐＭから１００ｐＭ、１００ｐＭから１０ｐＭ、１０ｐＭから１ｐＭのＩＣ５０を有する（Ｄ３４７Ｙ、高親和性バリアント）。
【０１６４】
本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体のＩｇＧ２重鎖定常ドメインの一例は、配列番号１５４、図３ＫＫに示されているアミノ酸配列を有する。
【０１６５】
本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体のＩｇＧ４重鎖定常ドメインの一例は、配列番号１５５、図３ＫＫに示されているアミノ酸配列を有する。
【０１６６】
抗ＰＣＳＫ９抗体のκ軽鎖定常ドメインの一例は、配列番号１５７、図３ＫＫに示されているアミノ酸配列を有する。
【０１６７】
抗ＰＣＳＫ９抗体のλ軽鎖定常ドメインの一例は、配列番号１５６、図３ＫＫに示されているアミノ酸配列を有する。
【０１６８】
免疫グロブリン鎖の可変領域は、３つの超可変領域（より頻繁には、「相補性決定領域」又はＣＤＲと称される。）によって連結された、相対的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む同一の全体構造を一般に呈する。上記各重鎖／軽鎖対の２つの鎖から得られたＣＤＲは、標的タンパク質（例えば、ＰＣＳＫ９）上の特異的エピトープと特異的に結合する構造を形成するために、フレームワーク領域によって典型的に並列される。Ｎ末端からＣ末端へ、天然に存在する軽鎖及び重鎖可変領域は何れも、これらの要素の以下の順序と通例合致する。ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４。これらの各ドメイン中の位置を占めるアミノ酸に番号を割り当てるために、付番システムが考案されている。この付番システムは、「Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  （１９８７  ａｎｄ  １９９１，  ＮＩＨ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ）」又は「Ｃｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ，  １９８７，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；
Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３」において定義されている。
【０１６９】
様々な重鎖及び軽鎖可変領域が本明細書中に提供されており、図２Ａから３ＪＪ及び３ＬＬから３ＢＢＢ中に図示されている。幾つかの実施形態において、これらの可変領域の各々は、それぞれ、完全な抗体重鎖及び軽鎖を形成するために、上記重鎖及び軽鎖定常領域に付着させることができる。さらに、完全な抗体構造を形成するために、このようにして作製された重鎖及び軽鎖配列の各々を組み合わせることが可能である。
【０１７０】
提供されている抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域の幾つかの具体例及びそれらの対応するアミノ酸配列は表２中に要約されている。
【０１７１】
【表２】
2020058376.tif 000004
【０１７２】
同じく、表２に列記されている典型的な可変重鎖の各々は、抗体を形成するために、表２に示されている典型的な可変軽鎖の何れとも組み合わせることができる。表２は、本明細書中に開示されている抗体の幾つかの中に見出される典型的な軽鎖及び重鎖の対を示している。幾つかの例では、抗体は、表２に列記されているものから得られる少なくとも１つの可変重鎖と１つの可変軽鎖を含む。他の例では、抗体は、２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖を含有する。一例として、抗体又は抗原結合タンパク質は、重鎖及び軽鎖、２つの重鎖又は２つの軽鎖を含むことができる。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、表２に列記されている配列の少なくとも１つから得られる１、２及び／又は３つの重及び／又は軽ＣＤＲ（これらの配列に対するＣＤＲは、図２Ａから３Ｄ並びに図３ＣＣＣから３ＪＪＪ及び１５Ａから１５Ｄ中の他の実施形態中に概説されている。）を含む（及び／又はからなる）。幾つかの実施形態において、６つのＣＤＲ（軽鎖からのＣＤＲ１から３（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）及び重鎖からのＣＤＲ１から３（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）は、ＡＢＰの一部である。幾つかの実施形態に
おいて、１、２、３、４、５又はそれ以上のＣＤＲが、ＡＢＰ中に含まれている。幾つかの実施形態において、表２中の配列中のＣＤＲから得られる１つの重及び１つの軽ＣＤＲが、ＡＢＰ中に含まれる（表２中の配列に対するＣＤＲは、図２Ａから３Ｄ中に概説されている。）。幾つかの実施形態において、（例えば、図２Ａから２Ｄ、３Ａから３Ｄ中に、並びに３ＣＣＣから３ＪＪＪ及び１５Ａから１５Ｄ中の他の実施形態中に図示されているような）さらなる区画も、ＡＢＰ中に含まれる。表２中に記載されている重鎖及び軽鎖に対するＣＤＲ及びＦＲの例は、図２Ａから３Ｄ（並びに図３ＣＣＣから３ＪＪＪ及び１５Ａから１５Ｄ中の他の実施形態）中に概説されている。場合によって存在する軽鎖可変配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４を含む。）は、以下から選択することができる。５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４及び４６。場合によって存在する重鎖可変配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４を含む。）は、以下から選択することができる。７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び６０。図２Ａから３Ｄ中のエントリーの幾つかでは、配列の変動又はＣＤＲ及びＦＲの別の境界が特定されている。これらの代替物は、ＡＢＰ名の後の「ｖｌ」によって同定されている。これらの代替物の殆どは本来僅かなので、相違を有する区画のみが表中に示されている。軽鎖又は重鎖の残りの区画は他のパネル中の基本ＡＢＰに対して示されているものと同じであることが理解される。従って、図２Ｃ中では、相違のみが記載されているので、例えば、図２Ｃ中の１９Ｈ９ｖｌは、図２Ａ中の１９Ｈ９と同じＦＲ１、ＣＤＲ１及びＦＲ２を有する。核酸配列の３つ（ＡＢＰ２６Ｅ１０、３０Ｂ９及び３１Ｂ１２）に対して、さらなる別の核酸配列が図中に提供されている。当業者によって理解されるように、抗体又はＡＢＰの作製において、実際には、このような配列の１つ以下を使用する必要がある。実際に、幾つかの実施形態において、特異的な重鎖又は軽鎖核酸の１つのみが存在する必要があり、又は全く存在する必要がない。
【０１７３】
幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、表２中のタンパク質配列の何れかをコードすることができる核酸配列によってコードされる。
【０１７４】
幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、ＬＤＬＲに結合するＰＣＳＫ９の形態（例えば、当該分子の自己触媒化された形態）へ選択的に結合する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、触媒ドメインのｃ末端（例えば、ｃ末端中の５、５から１０、１０から１５、１５から２０、２０から２５、２５から３０、３０から４０の多くのアミノ酸）に結合しない。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、触媒ドメインのｎ末端（例えば、ｎ末端中の５、５から１０、１０から１５、１５から２０、２０から２５、２５から３０、３０から４０の多くのアミノ酸）に結合しない。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９の成熟形態のアミノ酸１から１００内のアミノ酸に結合する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、アミノ酸３１から１００、１００から２００、３１から１５２、１５３から６９２、２００から３００、３００から４００、４５２から６８３、４００から５００、５００から６００、３１から６９２、３１から４４９及び／又は６００から６９２内のアミノ酸（及び／又はこれらからなるアミノ酸配列）に結合する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、触媒ドメインに結合する。幾つかの実施形態において、中和及び／又は非中和ＡＢＰは、プロドメインに結合する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、触媒及びプロドメインの両方に結合する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、触媒ドメインに結合して、プロドメインと相互作用する触媒ドメイン上の領域を塞ぐ。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、Ｐｉｐｅｒ他（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ１５：１から８（２００７）（その中の立体表示も含めて、その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に概説されているように、プロドメインが相互作用する位置
又は表面において触媒ドメインに結合する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは触媒ドメインに結合し、プロドメインの移動性を制約する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、プロドメインに結合することなしに、触媒ドメインに結合する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９をＬＤＬＲに結合させるようにプロドメインが再配向するのを妨げながら、プロドメインに結合することなしに、触媒ドメインに結合する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、Ｐｉｐｅｒ他中のプロドメインの周囲の残基１４９から１５２と同じエピトープ中に結合する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、Ｖドメイン上の（Ｐｉｐｅｒ他において概説されているような）溝に結合する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、Ｖドメイン上の溝に近いヒスチジンに富むパッチに結合する。幾つかの実施形態において、（Ｖドメインに結合する）このような抗体は、中和でない。幾つかの実施形態において、Ｖドメインに結合するこのような抗体は、中和である。幾つかの実施形態において、中和ＡＢＰは、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を妨げる。幾つかの実施形態において、中和ＡＢＰは、ＬＤＬＲのＰＣＳＫ９分解を妨げながら、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫの結合を妨げない（例えば、ＡＢＰ３１Ａ４）。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、Ｐｉｐｅｒ他の論文の図４に図示されているヒスチジンの少なくとも１つに結合し、又は遮断する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９中の触媒三連構造を遮断する。
【０１７５】
幾つかの実施形態において、抗体は、野生型ＰＣＳＫ９に比べて、バリアントＰＣＳＫ９タンパク質（例えば、Ｄ３７４Ｙ）へ選択的に結合する。幾つかの実施形態において、これらの抗体は、（Ｋｄを介して測定した場合に）野生型より少なくとも２倍強くバリアントに結合し、好ましくは、２から５、５から１０、１０から１００、１００から１０００、１０００から１０，０００倍又はそれ以上、野生型より変異体に強く結合する。幾つかの実施形態において、抗体は、野生型ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲと相互作用することを阻害する能力を上回って、バリアントＤ３７４ＹＰＣＳＫ９がＬＤＬＲと相互作用することを選択的に阻害する。幾つかの実施形態において、これらの抗体は、（ＩＣ５０を介して測定した場合に）野生型がＬＤＬＲに結合する能力より強く、バリアントがＬＤＬＲに結合する能力を遮断する（例えば、野生型より少なくとも２倍強く、好ましくは、野生型より２から５、５から１０、１０から１００、１００から１０００倍又はそれ以上強く変異体に）。幾つかの実施形態において、抗体は、野生型ＰＣＳＫ９及びＰＣＳＫ９のバリアント形態（Ｄ３７４Ｙなど）の両方に同様のレベルで結合し、中和する。幾つかの実施形態において、抗体はＰＣＳＫ９に結合して、ＬＤＬＲのバリアントがＰＣＳＫ９に結合するのを妨げる。幾つかの実施形態において、ＬＤＬＲのバリアントは、ヒトＬＤＬＲと少なくとも５０％同一である。ＬＤＬＲのバリアントは、当業者に公知であることが注目される（例えば、ＢｒｏｗｎＭＳ他、“Ｃａｌｃｉｕｍ  ｃａｇｅｓ，  ａｃｉｄ  ｂａｔｈｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ”  Ｎａｔｕｒｅ  ３８８：６２９−６３０，  １９９７）。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、ヘテロ接合の家族性高コレステロール血症（ＬＤＬＲの機能喪失バリアントが存在する。）中の有効ＬＤＬＲのレベルを上昇させることができる。
【０１７６】
幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、図１Ａ及び／又は図１Ｂ中に図示されているＰＣＳＫ９の形態に対して少なくとも５０％、５０から６０、６０から７０、７０から８０、８０から９０、９０から９５、９５から９９又はそれ以上の％同一性であるＰＣＳＫ９のバリアントに結合する（但し、遮断しない）。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、図１Ａ及び／又は図１Ｂ中に図示されているＰＣＳＫ９の成熟形態に対して少なくとも５０％、５０から６０、６０から７０、７０から８０、８０から９０、９０から９５、９５から９９又はそれ以上の％同一性であるＰＣＳＫ９のバリアントに結合する（但し、遮断しない）。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、図１Ａ及び／又は図１Ｂ中に図示されているＰＣＳＫ９の形態に対して少なくとも５０％、５０から６０、６０から７０、７０から８０、８０から９０、９０から９５、９５から９９又はそれ以上の％同一性であるＰ
ＣＳＫ９のバリアントに結合し、ＬＤＬＲと相互作用するのを妨げる。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、図１Ｂ中に図示されているＰＣＳＫ９の成熟形態に対して少なくとも５０、５０から６０、６０から７０、７０から８０、８０から９０、９０から９５、９５から９９又はそれ以上の％同一性であるＰＣＳＫ９のバリアントに結合し、ＬＤＬＲと相互作用するのを妨げる。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９のバリアントは、４７４位におけるバリアント、Ｅ６２０Ｇ及び／又はＥ６７０Ｇなどのヒトバリアントである。幾つかの実施形態において、４７４位のアミノ酸は（他のヒトにおけるように）バリン又は（カニクイザル及びマウスにおけるように）スレオニンである。本明細書中に提示されている交叉反応性のデータに鑑みれば、本抗体は上記バリアントへ容易に結合するものと考えられる。
【０１７７】
幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、表２に記載されている抗体の１つによって結合されるエピトープに結合する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９の特異的な立体構造状態に結合して、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲと相互作用するのを妨げる。
【０１７８】
ヒト化された抗原結合タンパク質（例えば、抗体）
本明細書において記載されているように、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、ヒト化抗体及び／又はその一部を含むことができる。このような戦略の重要な実用的用途は、マウス液性免疫系の「ヒト化」である。
【０１７９】
ある種の実施形態において、ヒト化抗体は、ヒトの中で実質的に非免疫原性である。ある種の実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト化抗体がそこから誘導された別の種由来の抗体と、標的に対する実質的に同一の親和性を有する。例えば、米国特許第５，５３０，１０１号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第５，６９３，７６２号、米国特許第５，５８５，０８９号を参照されたい。
【０１８０】
ある種の実施形態において、その免疫原性を低下させながら、抗原結合ドメインの固有の親和性を減弱させずに修飾可能な抗体可変ドメインのアミノ酸が同定される。例えば、米国特許第５，７６６，８８６号及び米国特許第５，８６９，６１９号を参照されたい。
【０１８１】
ある種の実施形態において、本分野において公知の方法による抗体の修飾は、標的に対する増加された結合親和性を達成するように、及び／又はレシピエント中での抗体の免疫原性を低下させるように典型的に設計される。ある種の実施形態において、その同族抗原に対する抗体の親和性を増加させるために、グリコシル化部位を除去するように、ヒト化抗体が修飾される。例えば、「Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ３０：１３６１−１３６７  （１９９３）」を参照されたい。ある種の実施形態において、「再形成（ｒｅｓｈａｐｉｎｇ）」、「超キメラ化」又は「ベニアリング／リサーフェシング」などの技術が、ヒト化抗体を作製するために使用される。例えば、「Ｖａｓｗａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ，  Ａｓｔｈｍａ，  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．８１：１０５（１９９８）；Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒ．，９：８９５−９０４（１９９６）」及び米国特許第６，０７２，０３５号を参照されたい。ある種のこのような実施形態において、このような技術は、外来残基の数を低下させることによって、抗体の免疫原性を典型的には低下させるが、抗体の反復投与後における抗イディオタイプ応答及び抗アロタイプ応答を妨げない。免疫原性を低下させるためのある種の他の方法が、例えば、「Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，
Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ６２（６）：３６６３−７１  （１９９９）」に記載されている。
【０１８２】
ある種の事例において、ヒト化抗体は、抗原結合能の低下をもたらす。ある種の実施形
態において、ヒト化抗体は、「逆変異」される。ある種のこのような実施形態において、ヒト化抗体は、ドナー抗体中に見出されるアミノ酸残基の１つ又はそれ以上を含むように変異される。例えば、「Ｓａｌｄａｎｈａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３６：７０９−１９  （１９９９）」を参照されたい。
【０１８３】
ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗体の軽鎖及び重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を同じ種又は別の種から得られるフレームワーク領域（ＦＲ）に移植することができる。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲは、コンセンサスヒトＦＲに移植することができる。コンセンサスヒトＦＲを作製するために、ある種の実施形態において、コンセンサスアミノ酸配列を同定するために、幾つかのヒト重鎖又は軽鎖アミノ酸配列から得られるＦＲが並置される。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９重鎖又は軽鎖に対する抗体のＦＲは、異なる重鎖又は軽鎖から得られるＦＲで置換される。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗体の重鎖及び軽鎖のＦＲ中の稀なアミノ酸は置換されないのに対して、ＦＲアミノ酸の残りが置換される。稀なアミノ酸は、ＦＲ中にそれらが通常見いだされない位置に存在する特定のアミノ酸である。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗体から得られる移植された可変領域は、ＰＣＳＫ９に対する抗体の定常領域と異なる定常領域とともに使用することができる。ある種の実施形態において、移植された可変領域は、一本鎖Ｆｖ抗体の一部である。ＣＤＲ移植は、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、米国特許第６，０５４，２９７号、米国特許第５，６９３，７６２号、米国特許第５，８５９，２０５号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第５，５６５，３３２号、米国特許第５，５８５，０８９号及び米国特許第５，５３０，１０１号中に、並びにＪｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２１：５２２−５２５  （１９８６）；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３２：３２３−３２７  （１９８８）；
Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３９：１５３４−１５３６  （１９８８），  Ｗｉｎｔｅｒ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ．，  ４３０：９２−９４
（１９９８）（あらゆる目的のために、参照により、本明細書に組み込まれる。）中に記載されている。
【０１８４】
ヒト抗原結合タンパク質（例えば、抗体）
本明細書に記載されているように、ＰＣＳＫ９に結合する抗原結合タンパク質は、ヒト（すなわち、完全ヒト）抗体及び／又はその一部を含むことができる。ある種の実施形態において、重鎖及び軽鎖免疫グロブリン分子をコードするヌクレオチド配列並びに重鎖及び軽鎖免疫グロブリン分子を含むアミノ酸配列、特に、可変領域に対応する配列が提供される。ある種の実施形態において、相補性決定領域（ＣＤＲ）、特に、ＣＤＲ１からＣＤＲ３に対応する配列が提供される。ある種の実施形態によれば、このような免疫グロブリン分子を発現するハイブリドーマ細胞株が提供される。ある種の実施形態によれば、このようなモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞株が提供される。ある種の実施形態において、ハイブリドーマ細胞株は、表２中に記載されている細胞株の少なくとも１つ、例えば、２１Ｂ１２、１６Ｆ１２及び３１Ｈ４から選択される。ある種の実施形態において、ヒトＰＣＳＫ９に対する精製されたヒトモノクローナル抗体が提供される。
【０１８５】
マウス抗体の不存在下でマウスがヒト抗体を産生することを期待して、ヒトＩｇ遺伝子座の巨大断片を用いて、マウス抗体産生が欠損するマウス株を改変することができる。巨大ヒトＩｇ断片は、巨大な可変遺伝子多様性並びに抗体産生及び発現の適切な制御を保存することができる。抗体の多様化及び選択並びにヒトタンパク質に対する免疫学的寛容性の欠如のためにマウスの機構を活用することによって、これらのマウス系統中の再生されたヒト抗体レパートリーは、目的とするあらゆる抗原（ヒト抗原を含む。）に対して、高親和性完全ヒト抗体を与えることができる。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトＭＡｂを作製し、選択することができる。ある種の典型的な方法
は、ＷＯ９８／２４８９３、米国特許第５，５４５，８０７号、ＥＰ５４６０７３及びＥＰ５４６０７３に記載されている。
【０１８６】
ある種の実施形態において、ヒト可変領域とともに、ヒト以外の種から得られる定常領域を使用することができる。
【０１８７】
酵母人工染色体（ＹＡＣ）中でメガ塩基サイズのヒト遺伝子座をクローニング及び再構築する能力、並びにマウス生殖系列中にそれらを導入する能力によって、極めて巨大な又は大まかにマッピングされた遺伝子座の機能的成分を解明し、及びヒト疾病の有用なモデルを作製するためのアプローチが与えられる。さらに、マウス遺伝子座をそれらのヒト均等物で置換するためのこのような技術の使用によって、発達中のヒト遺伝子産物の発現及び制御、他の系とのそれらのやり取り並びに疾病の誘導及び進行におけるそれらの関与に対する洞察が与えられ得る。
【０１８８】
ヒト抗体は、マウス又はラットの可変及び／又は定常領域を有する抗体に伴う問題の幾つかを回避する。このようなマウス又はラット由来のタンパク質の存在は、抗体の迅速な排除をもたらすことができ、又は患者による、抗体に対する免疫応答の生成をもたらすことができる。マウス又はラットに由来する抗体の使用を回避するために、げっ歯類、他の哺乳動物又は動物が完全ヒト抗体を産生するように、げっ歯類、他の哺乳動物又は動物中に機能的なヒト抗体遺伝子座の導入を通じて、完全ヒト抗体を作製することができる。
【０１８９】
ヒト化抗体は、まずヒトでない抗体アミノ酸配列を含有することから開始しながら、ヒト抗体配列で置換されたこれらの非ヒト抗体アミノ酸配列の少なくとも幾つかを有する抗体である。これは、ヒトを有する遺伝子によって抗体がコードされる（又はコードされることができる）ヒト抗体とは異なる。
【０１９０】
抗原結合タンパク質のバリアント
提供される他の抗体は、表２中に示されている可変重鎖及び可変軽鎖の組み合わせ又はサブパートによって形成され、表２中の配列（配列全体又は配列のサブパート（例えば、１つ又はそれ以上のＣＤＲ））のアミノ酸配列に対して、それぞれ、少なくとも５０％、５０から６０、６０から７０、７０から８０％、８０から８５％、８５から９０％、９０から９５％、９５から９７％、９７から９９％又は９９％超の同一性を有する可変軽鎖及び／又は可変重鎖を含む上掲のＡＢＰバリアントである。幾つかの事例において、このような抗体は、少なくとも１つの重鎖及び１つの軽鎖を含むのに対して、他の事例において、バリアント形態は、２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖（又はこれらのサブパート）を含有する。幾つかの実施形態において、結合に影響を及ぼす変動及び結合に影響を及ぼさないと思われる変動を観察することによって修飾することが可能な抗体の区画を同定するために、図２Ａから３Ｄ（並びに１３Ａから１３Ｊ及び１５Ａから１５Ｄ中の他の実施形態）中の配列比較を使用することができる。例えば、類似の配列を比較することによって、修飾可能な区画（例えば、特定のアミノ酸）を同定し、ＡＢＰの機能性をなお保持しながら（又は改善しながら）、それらをどのようにして修飾することができるかを同定することができる。幾つかの実施形態において、ＡＢＰのバリアントは、図１３Ａ、１３Ｃ、１３Ｆ、１３Ｇ、１３Ｈ、１３Ｉ及び／又は１３Ｊに図示されているコンセンサス基及び配列を含み、変動は、図中に可変として同定される位置において可能である。図１３Ａ、１３Ｃ、１３Ｆ及び１３Ｇに示されているＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ法（構造ループ領域の位置に基づく。例えば、“Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ”  Ｂｉｓｓａｎ  Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ，  Ａｒｔｈｕｒ  Ｍ．  Ｌｅｓｋ  ａｎｄ  Ｃｙｒｕｓ  Ｃｈｏｔｈｉａ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２７３（４）：９２７−９４８，  ７  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  （１
９９７）を参照されたい。）とＫａｂａｔ法（配列変動性に基づく。例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ９１−３２４２，  Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）を参照されたい。）のハイブリッド組み合わせに基づいて定義された。何れかの方法によって決定された各残基は、ＣＤＲ残基の最終リスト中に含まれた（図１３Ａ、１３Ｃ、１３Ｆ及び１３Ｇに記載されている。）。図１３Ｈ、１３Ｉ及び１３Ｊ中のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ法のみによって得られた。別段の記載がなければ、図１３Ｈから１３Ｊ中の定義されたコンセンサス配列、ＣＤＲ及びＦＲは、図１３中において参照されているＡＢＰに対する表記ＣＤＲ及びＦＲを定義し、調節する。
【０１９１】
ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び６０の配列の少なくとも１つから選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む可変領域を含む重鎖を含む。ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び６０の配列の少なくとも１つから選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む可変領域を含む重鎖を含む。ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び６０の配列の少なくとも１つから選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む可変領域を含む重鎖を含む。
【０１９２】
幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び６０の配列の少なくとも１つ中のＣＤＲから得られる１つ又はそれ以上のＣＤＲと少なくとも９０％、９０から９５％及び／又は９５から９９％同一である配列を含む。幾つかの実施形態において、１、２、３、４、５又は６つのＣＤＲ（それぞれ、上記配列と少なくとも９０％、９０から９５％及び／又は９５から９９％同一である。）が存在する。
【０１９３】
幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び６０の配列の少なくとも１つ中のＦＲから得られる１つ又はそれ以上のＦＲと少なくとも９０％、９０から９５％及び／又は９５から９９％同一である配列を含む。幾つかの実施形態において、１、２、３又は４つのＦＲ（それぞれ、上記配列と少なくとも９０％、９０から９５％及び／又は９５から９９％同一である。）が存在する。
【０１９４】
ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４及び４６の配列の少なくとも１つから選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む可変領域を含む軽鎖を含む。ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４及び４６の配列の少なくとも１つから選択されるアミノ酸配列と
少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む可変領域を含む軽鎖を含む。ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４及び４６の配列の少なくとも１つから選択されたアミノ酸配列と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む可変領域を含む軽鎖を含む。
【０１９５】
幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４及び４６の配列の少なくとも１つ中のＣＤＲから得られる１つ又はそれ以上のＣＤＲと少なくとも９０％、９０から９５％及び／又は９５から９９％同一である配列を含む。幾つかの実施形態において、１、２、３、４、５又は６つのＣＤＲ（それぞれ、上記配列と少なくとも９０％、９０から９５％及び／又は９５から９９％同一である。）が存在する。
【０１９６】
幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４及び４６の配列の少なくとも１つ中のＦＲから得られる１つ又はそれ以上のＦＲと少なくとも９０％、９０から９５％及び／又は９５から９９％同一である配列を含む。幾つかの実施形態において、１、２、３又は４つのＦＲ（それぞれ、上記配列と少なくとも９０％、９０から９５％及び／又は９５から９９％同一である。）が存在する。
【０１９７】
本開示に照らして、当業者は、周知の技術を用いて、本明細書中に記載されているように、ＡＢＰの適切なバリアントを決定することができる。ある種の実施形態において、当業者は、活性にとって重要でないと思われる領域を標的とすることによって、活性を破壊せずに変化させ得る分子の適切な領域を同定することができる。ある種の実施形態において、類似のポリペプチド間で保存されている分子の残基及び部分を同定することができる。ある種の実施形態において、生物活性にとって又は構造にとって重要であり得る領域でさえ、生物活性を破壊せずに、又はポリペプチド構造に悪影響を及ぼさずに、保存的アミノ酸置換に供することができる。
【０１９８】
さらに、当業者は、活性又は構造にとって重要である類似のポリペプチド中の残基を同定する構造−機能研究を検討することができる。このような比較に照らして、類似のタンパク質中の活性又は構造にとって重要であるアミノ酸残基に対応する、タンパク質中のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、このような予測された重要なアミノ酸残基に対する、化学的に類似のアミノ酸置換を選ぶことができる。
【０１９９】
当業者は、三次元構造及び類似のＡＢＰ中のその構造に関連するアミノ酸配列を分析することもできる。このような情報に照らして、当業者は、その三次元構造に関して、抗体のアミノ酸残基の並置を予測することができる。ある種の実施形態において、タンパク質の表面上に存在すると予想されるアミノ酸残基は他の分子との重要な相互作用に関連し得るので、当業者は、このような残基に対して急激な変化がおこらないように選択することができる。さらに、当業者は、それぞれの所望されるアミノ酸残基に単一のアミノ酸置換を含有する検査バリアントを作製することができる。次いで、バリアントは、当業者に公知の活性アッセイを用いてスクリーニングすることができる。このようなバリアントは、適切なバリアントについての情報を収集するために使用することができる。例えば、あるアミノ酸残基への変化が、破壊された活性、望ましくないように低下された活性又は不適切な活性をもたらすことを発見した場合には、このような変化を有するバリアントは避けることができる。換言すれば、このような定型的実験から収集された情報に基づいて、当
業者は、単独で、又は他の変異と組み合わせて、さらなる置換が回避されるべきアミノ酸を容易に決定することができる。
【０２００】
多数の科学文献が、二次構造の予測をテーマとしている。Ｍｏｕｌｔ  Ｊ．，  Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  ７（４）：４２２−４２７  （１９９６），  Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １３（２）：２２２−２４５
（１９７４）；  Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １１３（２）：２１１−２２２  （１９７４）；  Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．ＡｒｅａｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，  ４７：４５−１４８  （１９７８）；  Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ４７：２５１−２７６  ａｎｄ  Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，  ２６：３６７−３８４  （１９７９）を参照されたい。さらに、二次構造の予測を補助するために、現在、コンピュータプログラムが利用可能である。二次構造を予測する１つの方法は、相同性のモデル化に基づいている。例えば、３０％を上回る配列同一性を有する又は４０％を上回る類似性を有する２つのポリペプチド又はタンパク質は、しばしば、類似の構造的トポロジーを有する。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の発達は、ポリペプチド又はタンパク質の構造内に存在する可能性がある折り畳みの数など、二次構造の増大した予測可能性をもたらした。「Ｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，  ２７（１）：２４４−２４７  （１９９９）」を参照されたい。あるポリペプチド又はタンパク質中に、折り畳みの限定された数が存在すること、及び一旦、一定のレベルを超える数の構造が解明されたら、構造的な予測は、劇的により正確になることが示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，  ７（３）：３６９−３７６  （１９９７））。
【０２０１】
二次構造を予測するさらなる方法には、「スレディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ，  Ｄ．，  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，  ７（３）：３７７−８７  （１９９７）；  Ｓｉｐｐｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ４（１）：１５−１９  （１９９６））、「プロファイル分析」（Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ，
Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５３：１６４−１７０（１９９１）；  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ
ａｌ，  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，  １８３：１４６−１５９  （１９９０）；  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ８４（１３）：４３５５−４３５８  （１９８７））及び「進化的連関（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｌｍ，上記（１９９９），  ａｎｄ  Ｂｒｅｎｎｅｒ，
上記（１９９７）参照）が含まれる。
【０２０２】
ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質バリアントには、親ポリペプチドのアミノ酸配列と比べて、グリコシル化合部位の数及び／又は種類が変化を受けているグリコシル化バリアントが含まれる。ある種の実施形態において、タンパク質バリアントは、固有のタンパク質より多数の又は少数のＮ結合型グリコシル化部位を含む。Ｎ結合型グリコシル化部位は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（Ｘと表記されているアミノ酸残基は、プロリンを除くあらゆるアミノ酸残基であり得る。）によって特徴付けられる。この配列を作製するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ結合型炭水化物鎖を付加するための新たな候補部位を与える。あるいは、この配列を除去する置換は、既存のＮ結合型炭水化物鎖を除去する。１つ又はそれ以上のＮ結合型グリコシル化部位（典型的には、天然に存在するもの）が除去され、１つ又はそれ以上の新しいＮ結合型部位が作製されるＮ結合型炭水化物鎖の再構成も提供される。さらなる好ましい抗体バリアントには、親アミノ酸配列と比べて、１つ又はそれ以上のシステイン残基が欠失され、又は別のアミノ酸（例えば、セリン）に置換されているシステインバリアントが含まれる。可溶性封入体の単離後などに、生物学的に活性な立体構造へ抗体が再折り畳みされなければならない場合に、システインバリアントは有用であり得る。システインバリアントは、固有のタンパク
質より少ないシステイン残基を一般に有し、対を形成していないシステインから生じた相互作用を最大化するために、通例、偶数を有する。
【０２０３】
ある種の実施形態によれば、アミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させるアミノ酸置換、（２）酸化に対する感受性を低下させるアミノ酸置換、（３）タンパク質複合体を形成させるために結合親和性を変化させるアミノ酸置換、（４）結合親和性を変化させるアミノ酸置換及び／又は（４）このようなポリペプチドに対して他の物理化学的若しくは機能的特性を付与若しくは修飾するアミノ酸置換である。ある種の実施形態によれば、単一又は複数のアミノ酸置換（ある実施形態において、保存的なアミノ酸置換）は、天然に存在する配列中に（ある実施形態において、分子間接触を形成するドメイン外のポリペプチドの部分中に）作製され得る。ある種の実施形態において、保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を典型的には実質的に変化させない場合があり得る（例えば、置換アミノ酸は、親配列中に生じるヘリックスを切断する傾向がないはずであり、又は親配列を特徴付ける二次構造の他の種類を崩壊させる傾向がないはずである。）。本分野で認められるポリペプチド二次及び三次構造の例は、「Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  （Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｅｄ．，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８４））；  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  （Ｃ．  Ｂｒａｎｄｅｎ  ＆  Ｊ．  Ｔｏｏｚｅ，  ｅｄｓ．，
Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．  Ｙ．  （１９９１））；  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５４：１０５  （１９９１）」（それぞれ、参照により、本明細書中に組み込まれる。）中に記載されている。
【０２０４】
幾つかの実施形態において、バリアントは、本明細書中に開示されているＡＢＰの核酸配列のバリアントである。当業者は、ＡＢＰタンパク質バリアントを同定し、評価し、及び作製するために、また、これらのタンパク質バリアントをコードし得る核酸配列に対して、上記考察を使用できることを理解する。従って、タンパク質バリアントをコードする核酸配列（及び表２中のＡＢＰをコードするが、本明細書中に明示的に開示されている核酸配列とは異なる核酸配列）が想定される。例えば、ＡＢＰバリアントは、配列番号１５２、１５３、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１中に記載されている少なくとも１つの核酸配列又は配列番号１５２、１５３、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０及び１５１中の核酸配列によってコードされるＣＤＲの少なくとも１つから６つ（及びこれらの様々な組み合わせ）と少なくとも８０、８０から８５、８５から９０、９０から９５、９５から９７、９７から９９若しくはそれ以上の同一性を有することができる。
【０２０５】
幾つかの実施形態において、厳格な条件下で、特定のＡＢＰをコードする核酸配列（又は核酸配列そのもの）が表２中のタンパク質をコードする核酸配列の何れか（配列番号１５２、１５３、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１
０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０及び１５１など（但し、これらに限定されない。））に選択的にハイブリッド形成することができるのであれば、抗体（又は抗体をコードする核酸配列）はバリアントである。一実施形態において、適切な中度に厳格な条件は、５×ＳＳＣ；０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での事前洗浄、５０℃、−６５℃、５×ＳＳＣ、一晩でのハイブリッド形成、又は種間相同性の場合には、０．５×ＳＳＣでの４５℃のハイブリッド形成、次いで、０．１％ＳＤＳを含有する２×、０．５×及び０．２×ＳＳＣの各々とともに、２０分間、６５℃で２回の洗浄を含む。このようなハイブリッド形成ＤＮＡ配列も、コード縮重のために、ハイブリッド形成ＤＮＡ配列によってコードされる抗体ポリペプチド及びこれらの核酸配列によってコードされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と同様に、本発明の範囲に属する。幾つかの実施形態において、ＣＤＲのバリアントには、上記配列内のＣＤＲの１つ又はそれ以上（図２Ａから３Ｄ並びに図３ＣＣＣから３ＪＪＪ及び１５Ａから１５Ｄ中の他の実施形態に照らして、各ＣＤＲは容易に決定することができる。）にハイブリッド形成する核酸配列及び核酸配列によってコードされるアミノ酸配列が含まれる。この文脈において引用される「選択的にハイブリッド形成する」という用語は、検出可能に及び選択的に結合することを意味する。本発明に係るポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びこれらの断片は、非特異的な核酸への検出可能な結合の多量を最小化するハイブリッド形成及び洗浄条件下で、核酸鎖に選択的にハイブリッド形成する。本分野において公知であるように、及び本明細書に論述されているように、選択的なハイブリッド形成条件を達成するために、高い厳格度条件を使用することができる。一般に、本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及び断片と目的の核酸配列との間の核酸配列相同性は、少なくとも８０％であり、より典型的には、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％及び１００％の好ましく増大する相同性を有する。２つのアミノ酸配列の間に部分的な又は完全な同一性が存在する場合には、２つのアミノ酸配列は相同的である。例えば、８５％の相同性は、最大の合致が得られるように、２つの配列が並置される場合にアミノ酸の８５％が同一であることを意味する。合致を最大化する上で（合致されている２つの配列の何れかの中に）ギャップが許容される。５又はそれ以下のギャップ長が好ましく、２又はそれ以下がさらに好ましい。これに代えて及び好ましくは、本明細書においてこの用語が使用される場合には、変異データマトリックス及び６又はそれ以上のギャップペナルティーを使用するプログラムＡＬＩＧＮを用いて、（標準偏差単位で）５より多くの並置スコアを有すれば、２つのタンパク質配列（又は少なくとも３０アミノ酸長の、これらから得られるポリペプチド配列）は相同である。「Ｄａｙｈｏｆｆ，  Ｍ．
Ｏ．，  ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ｐｐ．１０１−１１０  （Ｖｏｌｕｍｅ  ５，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  （１９７２））及びこの巻に対する補遺２、ｐｐ．１から１０」を参照されたい。ＡＬＩＧＮプログラムを用いて最適に並置された場合に、２つの配列又はその一部のアミノ酸が５０％より大きい又は５０％に等しければ、２つの配列又はその一部は、より好ましく相同的である。本明細書において、「対応する」という用語は、参照ポリヌクレオチド配列の全て若しくは一部に対して、ポリヌクレオチド配列が相同的である（すなわち、同一であり、厳格に進化的に関連していない。）こと、又はポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列と同一であることを意味するために使用される。これに対して、「相補的な」という用語は、本明細書において、相補的配列が参照ポリヌクレオチド配列の全部又は一部に対して相同的であることを意味するために使用される。例として、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に対して相補的である。
【０２０６】
抗原結合タンパク質（例えば、抗体）の調製
ある種の実施形態において、（抗体などの）抗原結合タンパク質は、抗原（例えば、ＰＣＳＫ９）を用いた免疫化によって産生される。ある種の実施形態において、抗体は、完全長ＰＣＳＫ９、ＰＣＳＫ９の可溶性形態、触媒ドメインのみ、図１Ａ中に示されているＰＣＳＫ９の成熟形態、ＰＣＳＫ９のスプライスバリアント形態又はこれらの断片を用いた免疫化によって作製することができる。ある種の実施形態において、本発明の抗体は、ポリクローナル若しくはモノクローナルであり得、及び／又は組換え抗体であり得る。ある種の実施形態において、本発明の抗体は、例えば、ヒト抗体を産生することができるトランスジェニック動物の免疫化によって調製されたヒト抗体である（例えば、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９３／１２２２７参照）。
【０２０７】
ある種の実施形態において、その標的に対する抗体の親和性など、抗体の固有の特性を操作するために、ある種の戦略を使用することができる。このような戦略には、抗体バリアントを作製するために、抗体をコードするポリヌクレオチド分子の部位特異的な又は無作為の突然変異導入を使用することが含まれるが、これに限定されない。ある種の実施形態において、このような作製の後には、所望の変化（例えば、増加又は減少した親和性）を示す抗体バリアントのスクリーニングを行う。
【０２０８】
ある種の実施形態において、突然変導入戦略中で標的とされるアミノ酸残基は、ＣＤＲ中のアミノ酸残基である。ある種の実施形態において、可変ドメインのフレームワーク領域中のアミノ酸が標的とされる。ある種の実施形態において、このようなフレームワーク領域は、ある種の抗体の標的結合特性に寄与することが示されている。例えば、「Ｈｕｄｓｏｎ，  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  ９：３９５−４０２  （１９９９）」及びその中の参考文献を参照されたい。
【０２０９】
ある種の実施形態において、無作為の又は部位指定突然変異導入をＣＤＲ中の高頻度変異部位（体細胞親和性成熟プロセスの間に変異を受けやすい領域に対応する部位）に制限することによって、抗体バリアントのより小さく、より効果的にスクリーニングされるライブラリーが作製される。例えば、「Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ  ＆  Ｐａｓｔａｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  １７：５６８−５７２  （１９９９）」及びその中の参考文献を参照されたい。ある種の実施形態において、ある種の直接及び反転リピート、ある種のコンセンサス配列、ある種の二次構造及びある種のパリンドロームなど（但し、これらに限定されない。）の高頻度変異部位を同定するために、ＤＮＡ要素のある種類を使用することができる。例えば、高頻度変異部位を同定するために使用することができるこのようなＤＮＡ要素には、プリン（Ａ又はＧ）を含む四塩基配列に続くグアニン（Ｇ）に続くピリミジン（Ｃ又はＴ）に続くアデノシン又はチミジン（Ａ又はＴ）の何れか（すなわち、Ａ／Ｇ−Ｇ−Ｃ／Ｔ−Ａ／Ｔ）が含まれるが、これらに限定されない。高頻度変異部位を同定するために使用することができるＤＮＡ要素の別の例は、セリンコドンＡ−Ｇ−Ｃ／Ｔである。
【０２１０】
完全ヒトＡＢＰ（例えば、抗体）の調製
ある種の実施形態において、モノクローナル抗体を作製するために、ファージディスプレイ技術が使用される。ある種の実施形態において、このような技術は、完全ヒトモノクローナル抗体を作製する。ある種の実施形態において、単一のＦａｂ又はＦｖ抗体断片をコードするポリヌクレオチドは、ファージ粒子の表面上に発現される。例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，  ２２７：３８１  （１９９１）；  Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２２：５８１  （１９９１）；米国特許第５，８８５，７９３号を参照されたい。ある種の実施形態において、標的に対する親和性を有する抗体断片を同定するために、ファージが「スクリーニング」された。従って、ある種のこのようなプロセスは、糸状バクテリオファージの表面上へ
の抗体断片レパートリーのディスプレー及び標的への抗体断片レパートリーの結合によってファージのその後の選択を通じて免疫選択を模倣する。ある種のこのような手法では、高親和性機能的中和抗体断片が単離される。（以下により詳しく論述されている）ある種のこのような実施形態において、ヒト抗体遺伝子の完全なレパートリーは、末梢血リンパ球から天然に再配置されたヒトＶ遺伝子をクローニングすることによって作製される。例えば、「Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  （ＵＳＡ），  ８７：８０９５−８０９９  （１９９０）」を参照されたい。
【０２１１】
ある種の実施形態によれば、挿入されたヒト抗体産生ゲノムのかなりの部分を有するが、内在性マウス抗体の産生が欠失されたトランスジェニックマウスの使用を通じて、本発明の抗体が調製される。次いで、このようなマウスは、ヒト免疫グロブリン分子及び抗体を産生することができ、マウス免疫グロブリン分子及び抗体の産生を欠損している。この結果を達成するために使用される技術は、本明細書中に開示されている特許、出願及び参考文献中に開示されている。ある種の実施形態において、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９８／２４８９３又は「Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １５：１４６−１５６  （１９９７）」（あらゆる目的のために、参照により、本明細書に組み込まれる。）に開示される方法などの方法を使用することができる。
【０２１２】
一般に、ＰＣＳＫ９に対して特異的な完全ヒトモノクローナルＡＢＰ（例えば、抗体）は以下のように作製することができる。ヒト免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックマウスは、目的の抗原（例えば、ＰＣＳＫ９）で免疫化され、抗体を発現するマウスからのリンパ細胞（Ｂ細胞など）が得られる。不死化ハイブリドーマ細胞株を調製するために、このような回収された細胞は骨髄性細胞株と融合され、目的の抗原に対して特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定するために、このようなハイブリドーマ細胞株はスクリーニング及び選択される。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対して特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株の産生が提供される。
【０２１３】
ある種の実施形態において、完全ヒト抗体は、ヒト脾細胞（Ｂ又はＴ細胞）をインビトロで抗原に曝露させ、次いで、免疫不全化されたマウス（例えば、ＳＣＩＤ又はｎｏｄ／ＳＣＩＤ）中で曝露された細胞を再構成させることによって産生される。例えば、「Ｂｒａｍｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：２０５１−２０５８  （１９９８）；  Ｃａｒｂａｌｌｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，  ６：１０３−１０６  （２０００）」を参照されたい。ある種のこのようなアプローチにおいて、ＳＣＩＤマウス（ＳＣＩＤ−ｈｕ）中へのヒト胎児組織の移植は、長期造血及びヒトＴ細胞の成長をもたらす。例えば、「ＭｃＣｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４１：１５３２−１６３９  （１９８８）；  Ｉｆｖｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ８：２４３−２４８  （１９９６）」を参照されたい。ある種の事例において、このようなキメラマウス中での液性免疫応答は、動物内でのヒトＴ細胞の同時成長に依存する。例えば、「Ｍａｒｔｅｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，
８３：１２７１−１７９  （１９９４）」を参照されたい。ある種のアプローチにおいて、ヒト末梢血液リンパ球はＳＣＩＤマウス中に移植される。例えば、「Ｍｏｓｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３５：２５６−２５９  （１９８８）」を参照されたい。ある種のこのような実施形態において、ブドウ球菌のエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）などの刺激剤で、又は抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体の何れかで、このような移植された細胞が処理されると、Ｂ細胞産生のより高いレベルが検出される。例えば、「Ｍａｒｔｅｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ８４：２２４−２３０  （１９９５）；  Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｌｏｏｄ，  ８６：１９４６−１９５３  （１９９５）」を参照されたい。
【０２１４】
従って、ある種の実施形態において、完全ヒト抗体は、宿主細胞中での組換えＤＮＡの
発現によって、又はハイブリドーマ細胞中での発現によって産生され得る。他の実施形態において、抗体は、本明細書中に記載されているファージディスプレイ技術を用いて産生され得る。
【０２１５】
本明細書中に記載されている抗体は、本明細書中に記載されているように、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ｒ）技術の使用を通じて調製された。次いで、このようなマウスは、ヒト免疫グロブリン分子及び抗体を産生することができ、マウス免疫グロブリン分子及び抗体の産生を欠損している。同じことを達成するために使用される技術は、本明細書の背景技術の部に開示されている特許、出願及び参考文献中に開示されている。しかしながら、特に、マウスのトランスジェニック産生及びそこから得られる抗体の好ましい実施形態は、１９９６年１２月３日に出願された米国特許出願０８／７５９，６２０及び１９９８年６月１１日に公開された国際特許出願ＷＯ９８／２４８９３及び２０００年１２月２１日に公開されたＷＯ００／７６３１０（これらの開示は、参照により、本明細書に組み込まれている。）に開示されている。「Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １５：１４６−１５６（１９９７）」（その開示は、参照により、本明細書に組み込まれる。）も参照されたい。
【０２１６】
このような技術の使用を通じて、様々な抗原に対する完全ヒトモノクローナル抗体が産生されてきた。特に、マウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ｒ）系統は、目的の抗原（例えば、ＰＣＳＫ９）で免疫化され、リンパ細胞（Ｂ細胞など）は高度免疫化されたマウスから回収され、回収されたリンパ球は、不死化されたハイブリドーマ細胞株を調製するために、骨髄型細胞株と融合される。目的の抗原に対して特異的な抗体を産生されるハイブリドーマ細胞株を同定するために、これらのハイブリドーマ細胞株は、スクリーニング及び選択される。ＰＣＳＫ９に対して特異的な抗体を産生する複数のハイブリドーマ細胞株を作製するための方法が本明細書において提供される。さらに、このような抗体の重鎖及び軽鎖のヌクレオチド及びアミノ酸配列分析など、このような細胞株によって産生される抗体の性質決定が本明細書に提供される。
【０２１７】
マウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ｒ）系統の作製は、１９９０年１月１２日に出願された米国特許出願第０７／４６６，００８号、１９９０年１１月８日に出願された第０７／６１０，５１５号、１９９２年７月２４日に出願された第０７／９１９，２９７号、１９９２年６月３０日に出願された第０７／９２２，６４９号、１９９３年３月１５日に出願された第０８／０３１，８０１号、１９９３年８月２７日に出願された第０８／１１２，８４８号、１９９４年４月２８日に出願された第０８／２３４，１４５号、１９９５年１月２０日に出願された第０８／３７６，２７９号、１９９５年４月２７日に出願された第０８／４３０，９３８号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４６４，５８４号、１９９５年６月５日に出願された０８／４６４，５８２号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４６３，１９１号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４６２，８３７号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４８６，８５３号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４８６，８５７号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４８６，８５９号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４６２，５１３号、１９９６年１０月２日に出願された第０８／７２４，７５２号、１９９６年１２月３日に出願された第０８／７５９，６２０号、２００１年１１月３０日に出願された米国公開第２００３／００９３８２０号及び米国特許第６，１６２，９６３号、同第６，１５０，５８４号、同第６，１１４，５９８号、同第６，０７５，１８１号、同第５，９３９，５９８号及び日本国特許第３  ０６８  １８０  Ｂ２、３  ０６８  ５０６  Ｂ２及び３  ０６８  ５０７Ｂ２中に論述され、記載されている。１９９６年６月１２日に許諾公表された欧州特許ＥＰ０４６３１５１Ｂ１、１９９４年２月３日に公開された国際特許出願ＷＯ９４／０２６０２、１９９６年１０月３１日に公開された国際特許出願ＷＯ９６／３４０９６、１９９８年６月１１日に公開されたＷＯ９８／２４８９３、２０００年１２月２１日に公開され
たＷＯ００／７６３１０も参照されたい。上記特許、出願及び参考文献の各々の開示の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。
【０２１８】
別のアプローチにおいて、ＧｅｎＰｈａｒｍＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．などの他社は、「ミニローカス」アプローチを使用した。ミニローカスアプローチでは、Ｉｇ遺伝子座からの片（各遺伝子）を含めることを通じて、外来Ｉｇ遺伝子座が模倣される。従って、１つ又はそれ以上のＶＨ遺伝子、１つ又はそれ以上のＤＨ遺伝子、１つ又はそれ以上のＪＨ遺伝子、μ定常領域及び通常第二の定常領域（好ましくは、γ定常領域）が、動物中に挿入するための構築物中に形成される。このアプローチは、Ｓｕｒａｎｉ他に対する米国特許第５，５４５，８０７号並びにそれぞれＬｏｎｂｅｒｇ及びＫａｙに対する米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，６２５，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，７７０，４２９号、同第５，７８９，６５０号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８７７，３９７号、同第５，８７４，２９９号及び同第６，２５５，４５８号、Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ及びＢｅｒｎｓに対する米国特許第５，５９１，６６９号及び同第６，０２３．０１０号、Ｂｅｒｎｓ他に他する米国特許第５，６１２，２０５号、同第５，７２１，３６７号及び同第５，７８９，２１５号並びにＣｈｏｉ  ＆  Ｄｕｎｎ，  ａｎｄ  ＧｅｎＰｈａｒｍに対する米国特許第５，６４３，７６３号、１９９０年８月２９日に出願された国際米国特許出願第０７／５７４，７４８号、１９９０年８月３１日に出願された第０７／５７５，９６２号、１９９１年１２月１７日に出願された０７／８１０，２７９号、１９９２年３月１８日に出願された第０７／８５３，４０８号、１９９２年６月２３日に出願された第０７／９０４，０６８号、１９９２年１２月１６日に出願された第０７／９９０，８６０号、１９９３年４月２６日に出願された第０８／０５３，１３１号、１９９３年７月２２日に出願された第０８／０９６，７６２号、１９９３年１１月１８日に出願された第０８／１５５，３０１号、１９９３年１２月３日出願された第０８／１６１，７３９号、１９９３年１２月１０日に出願された第０８／１６５，６９９号、１９９４年３月９日に出願された第０８／２０９，７４１号（これらの開示は、参照により、本明細書に組み込まれる。）中に記載されている。欧州特許０  ５４６  ０７３  Ｂ１、国際特許出願ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９２／２２６４５、ＷＯ９２／２２６４７、ＷＯ９２／２２６７０、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／００５６９、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９６／１４４３６、ＷＯ９７／１３８５２及びＷＯ９８／２４８８４並びに米国特許第５，９８１，１７５号（これらの開示全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）も参照されたい。Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９９３．，  Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４），  Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）及びＴｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５），  Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）（これらの開示全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）をさらに参照されたい。
【０２１９】
Ｋｉｒｉｎは、微小細胞融合、染色体の大きな片又は染色体全体がその中に導入されたマウスからのヒト抗体の作製も示した。欧州特許出願第７７３２８８号及び第８４３９６１号（これらの開示は、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。さらに、ＫｉｒｉｎのＴｃマウスとＭｅｄａｒｅｘのミニローカス（Ｈｕｍａｂ）マウスとの交雑の結果であるＫＭＴＭマウスが作製されている。これらのマウスは、ＫｉｒｉｎマウスのヒトＩｇＨ導入染色体及びＧｅｎｐｈａｒｍマウスのκ鎖導入遺伝子を有する（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，  （２００２）  ４：９１−１０２）。
【０２２０】
ヒト抗体は、インビトロ法によっても誘導され得る。適切な例には、ファージディスプレイ（ＣＡＴ、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ、Ｄｙａｘ、Ｂｉｏｓｉｔｅ／Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｘｏ
ｍａ、Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ、Ａｌｅｘｉｏｎ（旧Ｐｒｏｌｉｆｅｒｏｎ）、Ａｆｆｉｍｅｄ）、リボソームディスプレー（ＣＡＴ）、酵母ディスプレーなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０２２１】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、ヒトＩｇＧ４重鎖及びＩｇＧ２重鎖を有する。抗体は、ＩｇＧ１を含む他のヒトイソタイプのものでもあり得る。様々な技術によって測定された場合に、抗体は、高い親和性を有しており、典型的には、約１０−６から約１０−１３Ｍ又はそれ以下のＫｄを有する。
【０２２２】
理解されているように、抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株中で発現させることができる。適切な哺乳動物宿主細胞を形質転換するために、特定の抗体をコードする配列を使用することができる。形質転換は、例えば、ポリヌクレオチドをウイルス中に（又はウイルスベクター中に）パッケージし、ウイルス（又はベクター）で又は米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号及び同第４，９５９，４５５号（これらの特許は、参照により、本明細書に組み込まれる。）によって例示されているような、本分野において公知の形質移入手法によって宿主細胞を形質導入することを含む、宿主細胞中にポリヌクレオチドを導入するためのあらゆる公知の方法により得る。使用される形質転換手法は、形質転換されるべき宿主に依存する。哺乳動物細胞中に異種のポリヌクレオチドを導入するための方法は本分野において周知であり、デキストランによって媒介された形質移入、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレンによって媒介される形質移入、プロトプラスト融合、電気穿孔、リポソーム中のポリヌクレオチドの封入化及びＤＮＡの核内への直接的微小注入を含む。
【０２２３】
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株が本分野において周知であり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）、ヒト上皮腎臓２９３細胞及び多数の他の細胞株など（但し、これらに限定されない。）、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化された細胞株が含まれる。特に好ましい細胞株は、何れの細胞が高い発現レベルを有し、恒常的なＰＣＳＫ９結合特性を有する抗体を産生するかの決定を通じて選択され得る。
【０２２４】
ある種の実施形態において、抗体及び／又はＡＢＰは、以下のハイブリドーマの少なくとも１つ：２１Ｂ１２、３１Ｈ４、１６Ｆ１２、表２中に列記されている又は実施例に開示されている他の何れかのハイブリドーマによって産生される。ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質は、約１ｎＭ未満、例えば、１０００ｐＭから１００ｐＭ、１００ｐＭから１０ｐＭ、１０ｐＭから１ｐＭ及び／又は１ｐＭから０．１ｐＭ又はそれ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＣＳＫ９に結合する。
【０２２５】
ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＭイソタイプの少なくとも１つの免疫グロブリン分子を含む。ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトκ軽鎖及び／又はヒト重鎖を含む。ある種の実施形態において、重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＭイソタイプのものである。ある種の実施形態において、哺乳動物細胞中での発現のために抗原結合タンパク質がクローニングされている。ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＭイソタイプの定常領域の何れか以外の定常領域を含む。
【０２２６】
ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトλ軽鎖及びヒトＩｇＧ２重鎖を含む。ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトλ軽鎖及びヒトＩｇＧ
４重鎖を含む。ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトλ軽鎖及びヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＭ重鎖を含む。他の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトκ軽鎖及びヒトＩｇＧ２重鎖を含む。ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトκ軽鎖及びヒトＩｇＧ４重鎖を含む。ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトκ軽鎖及びヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＭ重鎖を含む。ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ２イソタイプに対する定常領域でもなく、ＩｇＧ４イソタイプに対する定常領域でもない定常領域に連結された抗体の可変領域を含む。ある種の実施形態において、哺乳動物細胞中での発現のために抗原結合タンパク質がクローニングされている。
【０２２７】
ある種の実施形態において、ハイブリドーマ株：２１Ｂ１２、３１Ｈ４及び１６Ｆ１２の少なくとも１つから得られた抗体の重鎖及び軽鎖に対する保存的修飾（及びコードするヌクレオチドに対する対応する修飾）は、ハイブリドーマ株２１Ｂ１２、３１Ｈ４及び１６Ｆ１２から得られる抗体と類似の機能的及び化学的特徴を有するＰＣＳＫ９に対する抗体を産生する。これに対して、ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗体の機能的及び／又は化学的特徴の実質的な修飾は、（ａ）置換の領域中の分子骨格の構造、例えば、シート又はヘリックス立体構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷若しくは疎水性又は（ｃ）側鎖のサイズの維持に対する効果が大幅に異なる重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列中の置換を選択することによって達成され得る。
【０２２８】
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、当該位置のアミノ酸残基の極性又は電荷に対して殆ど又は全く効果が存在しないように、固有のアミノ酸残基を非固有の残基で置換することを含み得る。さらに、「アラニンスキャンニング突然変異導入」に対して以前に記載されているように、ポリペプチド中の何れの固有の残基もアラニンで置換され得る。
【０２２９】
所望のアミノ酸置換（保存的であるか、又は非保存的であるかを問わない。）は、このような置換が所望される時点で、当業者によって決定することができる。ある種の実施形態において、本明細書中に記載されているように、ＰＣＳＫ９に対する抗体の重要な残基を同定するために、又はＰＣＳＫ９に対する抗体の親和性を増加若しくは減少させるために、アミノ酸置換を使用することができる。
【０２３０】
ある種の実施形態において、本発明の抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株中で発現させることができる。ある種の実施形態において、適切な哺乳動物宿主細胞を形質転換するために、特定の抗体をコードする配列を使用することができる。ある種の実施形態によれば、形質転換は、例えば、ポリヌクレオチドをウイルス中に（又はウイルスベクター中に）パッケージし、ウイルス（又はベクター）で又は米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号及び同第４，９５９，４５５号（これらの特許は、あらゆる目的のために、参照により、本明細書に組み込まれる。）によって例示されているような、本分野において公知の形質移入手法によって宿主細胞を形質導入することを含む、宿主細胞中にポリヌクレオチドを導入するためのあらゆる公知の方法により得る。ある種の実施形態において、使用される形質転換手法は、形質転換されるべき宿主に依存し得る。哺乳動物細胞中に異種のポリヌクレオチドを導入するための方法は本分野において周知であり、デキストランによって媒介される形質移入、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレンによって媒介される形質移入、プロトプラスト融合、電気穿孔、リポソーム中のポリヌクレオチドの封入化及びＤＮＡの核内への直接的微小注入を含むが、これらに限定されない。
【０２３１】
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株が本分野において周知であり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）及び多数の
他の細胞株など（但し、これらに限定されない。）、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化された細胞株が含まれるが、これらに限定されない。ある種の実施形態において、細胞株は、何れの細胞が高い発現レベルを有し、恒常的なＨＧＦ結合特性を有する抗体を産生するかの決定を通じて選択され得る。哺乳動物宿主細胞に対する適切な発現ベクターは、周知である。
【０２３２】
ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質は、１つ又はそれ以上のポリペプチドを含む。ある種の実施形態において、１つ若しくはそれ以上のＡＢＰ成分又はＡＢＰそのものを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を発現させるために、様々な発現ベクター／宿主系の何れをも使用することができる。このような系には、組換えバクテリオファージ、プラスミド又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で形質移入された若しくは細菌発現ベクター（例えば、Ｔｉ又はｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系；又は動物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。
【０２３３】
ある種の実施形態において、１つ若しくはそれ以上のＡＢＰ成分又はＡＢＰそのものを含むポリペプチドは、酵母中で組換え的に発現される。ある種のこのような実施形態は、製造業者の指示書に従って、市販の発現系、例えば、Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を使用する。ある種の実施形態において、このような系は、分泌を誘導するために、プレプロα配列に依存する。ある種の実施形態において、挿入物の転写は、メタノールによる誘導時に、アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターによって駆動される。
【０２３４】
ある種の実施形態において、１つ若しくはそれ以上のＡＢＰ成分又はＡＢＰそのものを含む分泌されたポリペプチドは、酵母増殖培地から精製される。ある種の実施形態において、酵母増殖培地からポリペプチドを精製するために使用される方法は、細菌及び哺乳動物細胞上清からポリペプチドを精製するために使用される方法と同じである。
【０２３５】
ある種の実施形態において、１つ若しくはそれ以上のＡＢＰ成分又はＡＢＰそのものを含むポリペプチドをコードする核酸は、ｐＶＬ１３９３（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）などのバキュロウイルス発現ベクター中にクローニングされる。ある種の実施形態において、このようなベクターは、ｓＦ９無タンパク質培地中でスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞を感染させ、組換えポリペプチドを作製するために、製造業者の指示（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）に従って使用することができる。ある種の実施形態において、ポリペプチドは、ヘパリン−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、このような培地から精製及び濃縮される。
【０２３６】
ある種の実施形態において、１つ若しくはそれ以上のＡＢＰ成分又はＡＢＰそのものを含むポリペプチドは、昆虫系内で発現される。ポリペプチド発現のためのある種の昆虫系が当業者に周知である。１つのこのような系において、スポドプテラ・フルギペルダ細胞中又はトリコプルシア（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）の幼虫内で外来遺伝子を発現させるためのベクターとして、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が使用される。ある種の実施形態において、ポリペプチドをコードする核酸分子は、ウイルスの不可欠でない遺伝子中に、例えば、ポリヘドリン遺伝子内に挿入し、その遺伝子に対するプロモーターの制御下に置くことができる。ある種の実施形態において、核酸分子を首尾よく挿入することによって、不可欠でない遺伝子は不活性になる。ある種の実施形態において、その不活化は検出
可能な特徴をもたらす。例えば、ポリヘドリン遺伝子の不活化は、外被タンパク質を欠如したウイルスの産生をもたらす。
【０２３７】
ある種の実施形態において、Ｓ．フルギペルダ細胞又はトリコプルシアの幼虫を感染させるために、組換えウイルスを使用することができる。例えば、「Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ４６：５８４  （１９８３）；  Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），  ９１：３２２４−７  （１９９４）」を参照されたい。
【０２３８】
ある種の実施形態において、細菌細胞中で作製された１つ若しくはそれ以上のＡＢＰ成分又はＡＢＰそのものを含むポリペプチドは、細菌中で、不溶性封入体として産生される。ある種の実施形態において、このような封入体を含む宿主細胞は、遠心によって収集され、０．１５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８、１ｍＭＥＤＴＡ中で洗浄され、室温で１５分間、０．１ｍｇ／ｍＬリゾチーム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で処理される。ある種の実施形態において、可溶化液は音波処理によって清澄化され、細胞破砕物は、１２，０００×ｇでの１０分間の遠心によって沈降される。ある種の実施形態において、ポリペプチドを含有する沈降物は、５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８及び１０ｍＭＥＤＴＡ中に再懸濁され、５０％グリセロールに重層され、６０００×ｇで３０分間遠心される。ある種の実施形態において、その沈降物は、Ｍｇ＋＋及びＣａ＋＋を含まない標準的なリン酸緩衝化生理的食塩水溶液（ＰＢＳ）中に再懸濁され得る。ある種の実施形態において、変性ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中に再懸濁された沈降物を分画することによって、ポリペプチドはさらに精製される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照）。ある種の実施形態において、タンパク質を可視化するために、０．４ＭＫＣｌ中にこのようなゲルを浸漬させることが可能であり、タンパク質は切り出され、ＳＤＳを含まないゲル走行緩衝液中に電気溶出することができる。ある種の実施形態によれば、グルタチオン−Ｓ−転写酵素（ＧＳＴ）融合タンパク質は、細菌中で、可溶性タンパク質として産生される。ある種の実施形態において、このようなＧＳＴ融合タンパク質は、ＧＳＴＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて精製される。
【０２３９】
ある種の実施形態において、ある種のポリペプチド、例えば、１つ若しくはそれ以上のＡＢＰ成分又はＡＢＰそのものを含むポリペプチドを「再折り畳み」させることが望ましい。ある種の実施形態において、このようなポリペプチドは、本明細書中に論述されているある種の組換え系を用いて産生される。ある種の実施形態において、所望の三次構造を形成させるために、及び／又はジスルフィド結合を生成させるために、ポリペプチドは、「再折り畳みされ」及び／又は「酸化される」。ある種の実施形態において、このような構造及び／又は結合は、ポリペプチドのある種の生物活性に関連している。ある種の実施形態において、再折り畳みは、本分野において公知の多数の手法の何れを用いても達成される。典型的な方法には、カオトロピック剤の存在下で、典型的には７を上回るｐＨに、可溶化されたポリペプチド剤を曝露させることが含まれるがこれに限定されない。典型的なカオトロピック剤は、グアニジンである。ある種の実施形態において、再折り畳み／酸化溶液は、還元剤及びその還元剤の酸化された形態も含有する。ある種の実施形態において、還元剤及びその酸化された形態は、ジスルフィドシャフリングが起こる特定の酸化還元電位を生成する比で存在する。ある種の実施形態において、このようなシャフリングは、システイン架橋の形成を可能とする。典型的な酸化還元対には、システイン／シスタミン、グルタチオン／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオスレイトールＤＴＴ／ジチアンＤＴＴ及び２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂＭＥが含まれるが、これらに限定されない。ある種の実施形態において、再折り畳みの効率を増加させるために、共溶媒が使用される。典型的な共溶媒には、グリセロール、様々な分子量のポリエチレングリコール及びアルギニンが含まれるが、これらに限定されない。
【０２４０】
ある種の実施形態において、１つ若しくはそれ以上のＡＢＰ成分又はＡＢＰそのものを含むポリペプチドを実質的に精製する。ある種のタンパク質精製技術が、当業者に公知である。ある種の実施形態において、タンパク質精製は、非ポリペプチド画分からポリペプチド画分を粗分画することを含む。ある種の実施形態において、ポリペプチドは、クロマトグラフィー技術及び／又は電気泳動技術を用いて精製される。典型的な精製法には、硫酸アンモニウムを用いた沈殿；ＰＥＧを用いた沈殿；免疫沈降；熱変性後の遠心；アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ−セファロース）、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィー；ゲルろ過；ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの（但し、これらに限定されない。）クロマトグラフィー；等電点電気泳動；ポリアクリルアミドゲル電気泳動並びにこのような技術及び他の技術の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。ある種の実施形態において、ポリペプチドは、高速タンパク質質液体クロマトグラフィーによって、又は高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製される。ある種の実施形態において、精製工程を変化させ、又はある種の工程を省略することが可能であるが、実質的に精製されたポリペプチドを調製するための適切な方法をなおもたらす。
【０２４１】
ある種の実施形態において、ポリペプチド調製物の精製度を定量する。精製度を定量するためのある種の方法が、当業者に公知である。ある種の典型的な方法は、調製物の特異的結合活性を測定すること及びＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって調製物内のポリペプチドの量を評価することを含むが、これらに限定されない。ポリペプチド調製物の精製の量を評価するためのある種の典型的な方法は、調製物の結合活性を計算すること、調製物の結合活性を当初抽出物の結合活性と比較することを含む。ある種の実施形態において、このような計算の結果は、「精製倍数」と表現される。結合活性の量を表すために使用される単位は、実施されるアッセイに依存する。
【０２４２】
ある種の実施形態において、１つ若しくはそれ以上のＡＢＰ成分又はＡＢＰそのものを含むポリペプチドは、部分的に精製される。ある種の実施形態において、部分的精製は、より少ない精製工程を使用することによって、又は同じ一般的な精製スキームの異なる形態を使用することによって達成することができる。例えば、ある種の実施形態において、ＨＰＬＣ装置を用いて実施される陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、低圧クロマトグラフィー系を用いる同じ技術より大きな「精製倍数」を一般にもたらす。ある種の実施形態において、より低い精製度をもたらす方法は、ポリペプチドの総回収において、又はポリペプチドの結合活性の維持において利点を有し得る。
【０２４３】
ある種の事例では、ポリペプチドの電気泳動的移動は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥの異なる条件とともに、（時に著しく）変動し得る。例えば、「Ｃａｐａｌｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，７６：４２５（１９７７）」を参照されたい。異なる電気泳動条件下において、精製された又は部分的に精製されたポリペプチドの見かけの分子量は異なり得ることが理解される。
【０２４４】
典型的なエピトープ
抗ＰＣＳＫ９抗体が結合するエピトープが提供される。幾つかの実施形態において、本明細書に開示されている抗体によって結合されるエピトープは、特に有用である。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている抗体によって結合されるエピトープの何れかに結合する抗原結合タンパク質は有用である。幾つかの実施形態において、表２並びに図２及び３に列記されている抗体の何れかによって結合されるエピトープは特に有用である。幾つかの実施形態において、エピトープは、触媒ドメインＰＣＳＫ９上に存在する。
【０２４５】
ある種の実施形態において、抗ＰＣＳＫ９抗体又はＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質の結合を妨げる（例えば、低下させる）ために、ＰＣＳＫ９エピトープを使用することができる。ある種の実施形態において、抗ＰＣＳＫ９抗体又はＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質の結合を減少させるために、ＰＣＳＫ９エピトープを使用することができる。ある種の実施形態において、抗ＰＣＳＫ９抗体又はＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質の結合を実質的に阻害するために、ＰＣＳＫ９エピトープを使用することができる。
【０２４６】
ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に結合する抗体又は抗原結合タンパク質を単離するために、ＰＣＳＫ９エピトープを使用することができる。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に結合する抗体又は抗原結合タンパク質を作製するために、ＰＣＳＫ９エピトープを使用することができる。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に結合する抗体又は抗原結合タンパク質を作製するために、ＰＣＳＫ９エピトープ又はＰＣＳＫ９エピトープを含む配列を免疫原として使用することができる。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９エピトープを動物に投与することができ、ＰＣＳＫ９に結合する抗体を、その後動物から取得することができる。ある種の実施形態において、ＬＤＬＲとのＰＣＳＫ９の会合などの、正常なＰＣＳＫ９によって媒介される活性を妨害するために、ＰＣＳＫ９エピトープ又はＰＣＳＫ９エピトープを含む配列を使用することができる。
【０２４７】
幾つかの実施形態において、本明細書中に開示されている抗原結合タンパク質は、Ｎ末端プロドメイン、スブチリシン様触媒ドメイン及び／又はＣ末端ドメインに特異的に結合する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ−９の基質結合溝に結合する（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ他に記載されており、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）。
【０２４８】
幾つかの実施形態において、抗体と接触し、又は抗体によって埋没される残基を含有するドメイン／領域は、ＰＣＳＫ９（例えば、野生型抗原）中の特定の残基を変異させ、抗原結合タンパク質が変異された又はバリアントＰＣＳＫ９タンパク質を結合することができるかどうかを測定することによって同定することができる。多数の個別の変異を作製することによって、変異が抗原結合タンパク質と抗原間の結合に影響を及ぼし得るように、結合に直接的な役割を果たしている残基又は抗体と十分に近接している残基を同定することができる。これらのアミノ酸の知見から、抗原結合タンパク質と接触する残基又は抗体によって被覆されている残基を含有する抗原のドメイン又は領域を解明することができる。このようなドメインは、抗原結合タンパク質の結合エピトープを含むことができる。この一般的なアプローチの１つの具体例は、アルギニン／グルタミン酸スキャニングプロトコールを使用する（例えば、Ｎａｎｅｖｉｃｚ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，
Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２７０：３７，  ２１６１９−２１６２５  ａｎｄ  Ｚｕｐｎｉｃｋ，  Ａ．，  ｅｔ  ａ  ｌ，  ２００６，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２８Ｌ：２９，  ２０４６４−２０４７３）を参照されたい）。一般に、アルギニン及びグルタミン酸は帯電しており、嵩が大きく、従って、変異が導入されている抗原の領域中での抗原結合タンパク質と抗原との間の結合を崩壊させる可能性を有しているので、野生型ポリペプチド中のアミノ酸は、アルギニン及びグルタミン酸へ（典型的には、個別に）置換される。野生型抗原中に存在するアルギニンは、グルタミン酸と置換される。このような様々な個別の変異体が得られ、どの残基が結合に影響を及ぼすかを決定するために、収集された結合結果が分析される。
【０２４９】
実施例３９は、本明細書に提供されているＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質に対するＰＣＳＫ９の１つのこのようなアルギニン／グルタミン酸スキャニングを記載する。一連の変異体ＰＣＳＫ９抗原が作製され、各変異体抗原が単一の変異を有する。様々なＰＣＳＫ９ＡＢＰとの各変異体ＰＣＳＫ９抗原の結合を測定し、選択されたＡＢＰが野生型ＰＣＳＫ
９（配列番号３０３）を結合する能力と比較した。
【０２５０】
抗原結合タンパク質及び本明細書において使用されるバリアントＰＣＳＫ９の間の結合の変化（例えば、低下又は増加）は、（例えば、実施例中で以下に記載されているＢｉａｃｏｒｅ検査又はビーズをベースとしたアッセイなどの公知の方法によって測定した場合に）結合親和性、ＥＣ５０の変化及び／又は（例えば、抗原結合タンパク質濃度対抗原濃度のプロットにおけるＢｍａｘの減少によって明らかとなる）抗原結合タンパク質の総結合能力の変化（例えば、低下）が存在することを意味する。結合の著しい変化は、変異を受けた残基が抗原結合タンパク質への結合に直接関与しており、又は結合タンパク質が抗原に結合されたときに、結合タンパク質に近接していることを示唆する。
【０２５１】
幾つかの実施形態において、結合の著しい低下は、抗原結合タンパク質と変異体ＰＣＳＫ９抗原間での結合親和性、ＥＣ５０及び／又は能力が、抗原結合タンパク質と野生型ＰＣＳＫ９（例えば、配列番号１及び／又は配列番号３０３に示されている。）間での結合と比べて、１０％超、２０％超、４０％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超又は９５％超低下していることを意味する。ある種の実施形態において、結合は、検出可能な限界を下回って低下する。
【０２５２】
幾つかの実施形態において、バリアントＰＣＳＫ９タンパク質への抗原結合タンパク質の結合は、抗原結合タンパク質と野生型ＰＣＳＫ９タンパク質（例えば、配列番号１及び／又は配列番号３０３のタンパク質）間で観察される結合の５０％未満（例えば、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％又は１０％）である場合に、結合の著しい低下が証明される。このような結合の測定は、本分野において公知の様々な結合アッセイを用いて実施され得る。１つのこのようなアッセイの具体例は、実施例３９に記載されている。
【０２５３】
幾つかの実施形態において、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質（例えば、配列番号１又は配列番号３０３）中の残基がアルギニン又はグルタミン酸で置換されているバリアントＰＣＳＫ９タンパク質に対して著しくより低い結合を示す抗原結合タンパク質が提供される。幾つかの実施形態において、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質（例えば、配列番号１又は配列番号３０３）と比べて、以下の変異：Ｒ２０７Ｅ、Ｄ２０８Ｒ、Ｒ１８５Ｅ、Ｒ４３９Ｅ、Ｅ５１３Ｒ、Ｖ５３８Ｒ、Ｅ５３９Ｒ、Ｔ１３２Ｒ、Ｓ３５１Ｒ、Ａ３９０Ｒ、Ａ４１３Ｒ、Ｅ５８２Ｒ、Ｄ１６２Ｒ、Ｒ１６４Ｅ、Ｅ１６７Ｒ、Ｓ１２３Ｒ、Ｅ１２９Ｒ、Ａ３１１Ｒ、Ｄ３１３Ｒ、Ｄ３３７Ｒ、Ｒ５１９Ｅ、Ｈ５２１Ｒ及びＱ５５４Ｒの１つ又はそれ以上の何れか（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２４４）を有するバリアントＰＣＳＫ９タンパク質に対して、抗原結合タンパク質の結合が著しく低下又は増加する。本明細書において使用される省略型表記において、形式は、：野生型残基：ポリペプチド中の位置：変異体残基であり、配列番号１又は配列番号３０３に示されているように残基の付番が為されている。
【０２５４】
幾つかの実施形態において、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質（例えば、配列番号１又は配列番号３０３）と比べて、配列番号１に示されているような以下の位置：２０７、２０８、１８５、１８１、４３９、５１３、５３８、５３９、１３２、３５１、３９０、４１３、５８２、１６２、１６４、１６７、１２３、１２９、３１１、３１３、３３７、５１９、５２１及び５５４に１つ又はそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５又はそれ以上の）変異を有する変異体ＰＣＳＫ９タンパク質に対して、抗原結合タンパク質の結合が低下又は増加する。幾つかの実施形態において、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質（例えば、配列番号１又は配列番号３０３）と比べて、配列番号１に示されているような以下の位置：２０７、２０８、１８５、１８１、４３９、５１３、５３８、５３９、１３２、３５１、３９０、４１３、５８２、１６２、１６４、１６７、１２３、１２９、３１１、３１３、３
３７、５１９、５２１及び５５４に１つ又はそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５又はそれ以上の）変異を有する変異体ＰＣＳＫ９タンパク質に対して、抗原結合タンパク質の結合が低下又は増加する。幾つかの実施形態において、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質（例えば、配列番号１又は配列番号３０３）と比べて、配列番号１内の以下の位置：２０７、２０８、１８５、１８１、４３９、５１３、５３８、５３９、１３２、３５１、３９０、４１３、５８２、１６２、１６４、１６７、１２３、１２９、３１１、３１３、３３７、５１９、５２１及び５５４に１つ又はそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５又はそれ以上の）変異を有する変異体ＰＣＳＫ９タンパク質に対して、抗原結合タンパク質の結合が実質的に低下又は増加する。
【０２５５】
幾つかの実施形態において、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質（例えば、配列番号１又は配列番号３０３）と比べて、以下の変異：配列番号１又は配列番号３０３内のＲ２０７Ｅ、Ｄ２０８Ｒ、Ｒ１８５Ｅ、Ｒ４３９Ｅ、Ｅ５１３Ｒ、Ｖ５３８Ｒ、Ｅ５３９Ｒ、Ｔ１３２Ｒ、Ｓ３５１Ｒ、Ａ３９０Ｒ、Ａ４１３Ｒ、Ｅ５８２Ｒ、Ｄ１６２Ｒ、Ｒ１６４Ｅ、Ｅ１６７Ｒ、Ｓ１２３Ｒ、Ｅ１２９Ｒ、Ａ３１１Ｒ、Ｄ３１３Ｒ、Ｄ３３７Ｒ、Ｒ５１９Ｅ、Ｈ５２１Ｒ及びＱ５５４Ｒの１つ又はそれ以上（例えば、１、２、３、４、５など）を有する変異体ＰＣＳＫ９タンパク質に対して、ＡＢＰの結合が著しく低下又は増加する。
【０２５６】
幾つかの実施形態において、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質（例えば、配列番号１又は配列番号３０３）と比べて、以下の変異：配列番号１又は配列番号３０３内のＲ２０７Ｅ、Ｄ２０８Ｒ、Ｒ１８５Ｅ、Ｒ４３９Ｅ、Ｅ５１３Ｒ、Ｖ５３８Ｒ、Ｅ５３９Ｒ、Ｔ１３２Ｒ、Ｓ３５１Ｒ、Ａ３９０Ｒ、Ａ４１３Ｒ及びＥ５８２Ｒの１つ又はそれ以上（例えば、１、２、３、４、５など）を有する変異体ＰＣＳＫ９タンパク質に対して、ＡＢＰの結合が著しく低下又は増加する。幾つかの実施形態において、結合は低下する。幾つかの実施形態において、結合の低下は、ＥＣ５０の変化として観察される。幾つかの実施形態において、ＥＣ５０の変化は、ＥＣ５０の数値の増加（従って、結合の減少）である。
【０２５７】
幾つかの実施形態において、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質（例えば、配列番号１又は配列番号３０３）と比べて、以下の変異：配列番号１内のＤ１６２Ｒ、Ｒ１６４Ｅ、Ｅ１６７Ｒ、Ｓ１２３Ｒ、Ｅ１２９Ｒ、Ａ３１１Ｒ、Ｄ３１３Ｒ、Ｄ３３７Ｒ、Ｒ５１９Ｅ、Ｈ５２１Ｒ及びＱ５５４Ｒの１つ又はそれ以上（例えば、１、２、３、４、５など）を有する変異体ＰＣＳＫ９タンパク質に対して、ＡＢＰの結合が著しく低下又は増加する。幾つかの実施形態において、結合は低下する。幾つかの実施形態において、結合の低下は、Ｂｍａｘの変化として観察される。幾つかの実施形態において、Ｂｍａｘのシフトは、ＡＢＰによって生じた最大シグナルの低下である。幾つかの実施形態において、エピトープの一部であるアミノ酸に関して、Ｂｍａｘは、少なくとも１０％低下し、例えば、以下の量、すなわち、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、８５、９８、９９又は１００％の少なくとも何れかの低下は、幾つかの実施形態において、残基がエピトープの一部であることを示すことができる。
【０２５８】
直前に列記されているバリアント形態は、配列番号１又は配列番号３０３に示されている野生型配列に関して引用されているが、ＰＣＳＫ９の対立遺伝子バリアントにおいて、表記位置のアミノ酸が異なり得ることが理解される。ＰＣＳＫ９のこのような対立遺伝子形態に対して著しくより低い結合を示す抗原結合タンパク質も想定される。従って、幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れもが、図１Ａに示されている純粋に野生型の配列ではなく、対立遺伝子配列と比較され得る。
【０２５９】
幾つかの実施形態において、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質中の選択された位置における残基が他の何れかの残基へ変異されているバリアントＰＣＳＫ９タンパク質に関して、抗原結合タンパク質の結合は著しく低下している。幾つかの実施形態において、同定された
位置に対して、本明細書に記載されているアルギニン／グルタミン酸置換が使用される。幾つかの実施形態において、同定された位置に対して、アラニンが使用される。
【０２６０】
上述のように、結合に直接関与する残基又は抗原結合タンパク質によって覆われた残基は、スキャニングの結果から同定され得る。従って、これらの残基は、抗原結合タンパク質が結合する結合領域を含有する配列番号１（又は配列番号３０３又は配列番号３）のドメイン又は領域の指標を提供し得る。実施例３９に要約されている結果から明らかなように、幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号１又は配列番号３０３のアミノ酸：２０７、２０８、１８５、１８１、４３９、５１３、５３８、５３９、１３２、３５１、３９０、４１３、５８２、１６２、１６４、１６７、１２３、１２９、３１１、３１３、３３７、５１９、５２１及び５５４の少なくとも１つを含有するドメインに結合する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号１又は配列番号３０３のアミノ酸：２０７、２０８、１８５、１８１、４３９、５１３、５３８、５３９、１３２、３５１、３９０、４１３、５８２、１６２、１６４、１６７、１２３、１２９、３１１、３１３、３３７、５１９、５２１及び５５４の少なくとも１つを含有する領域に結合する。
【０２６１】
幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号１又は配列番号３０３のアミノ酸：１６２、１６４、１６７、２０７及び／又は２０８の少なくとも１つを含有する領域に結合する。幾つかの実施形態において、同定された残基の２以上（例えば、２、３、４又は５）がＡＢＰによって結合される領域の一部である。幾つかの実施形態において、ＡＢＰはＡＢＰ２１Ｂ１２と競合する。
【０２６２】
幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号１又は配列番号３０３のアミノ酸１８５の少なくとも１つを含有する領域に結合する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰはＡＢＰ３１Ｈ４と競合する。
【０２６３】
幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号１又は配列番号３０３のアミノ酸：４３９、５１３、５３８及び／又は５３９の少なくとも１つを含有する領域に結合する。幾つかの実施形態において、同定された残基の２以上（例えば、２、３又は４）がＡＢＰによって結合される領域の一部である。幾つかの実施形態において、ＡＢＰはＡＢＰ３１Ａ４と競合する。
【０２６４】
幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号１又は配列番号３０３のアミノ酸：１２３、１２９、３１１、３１３、３３７、１３２、３５１、３９０及び／又は４１３の少なくとも１つを含有する領域に結合する。幾つかの実施形態において、同定された残基の２以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８又は９）がＡＢＰによって結合される領域の一部である。幾つかの実施形態において、ＡＢＰはＡＢＰ１２Ｈ１１と競合する。
【０２６５】
幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号１又は配列番号３０３のアミノ酸：５８２、５１９、５２１及び／又は５５４の少なくとも１つを含有する領域に結合する。幾つかの実施形態において、同定された残基の２以上（例えば、２、３又は４）がＡＢＰによって結合される領域の一部である。幾つかの実施形態において、ＡＢＰはＡＢＰ３Ｃ４と競合する。
【０２６６】
幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号１又は配列番号３０３の断片又は完全長配列内の前記領域に結合する。他の実施形態において、抗原結合タンパク質は、これらの領域からなるポリペプチドに結合する。「配列番号１又は配列番号３０３」という表記は、これらの配列の一方又は両方が使用され得ること、又は関連し得ること
を表す。この用語は、一つのみが使用されるべきことを表さない。
【０２６７】
上述のように、上記記述は、配列番号１を参照して特定のアミノ酸位置を引用する。しかしながら、本明細書を通じて一般に、配列番号３に記載されている３１位で始まるＰｒｏ／Ｃａｔドメインが参照される。以下に記載されているように、配列番号１及び配列番号３０３はＰＣＳＫ９のシグナル配列を欠如する。従って、これらの様々な開示の間での何れの比較も、付番におけるこの差を考慮すべきである。特に、配列番号１中の何れのアミノ酸位置も、配列番号３のタンパク質中の３０位のアミノ酸に対応する。例えば、配列番号１の２０７位、配列番号３の２３７位に対応する（完全長配列及び一般に、本明細書中で使用されている付番系）。表３９．６は、配列番号１（及び／又は配列番号３０３）を参照する上記位置が、配列番号３（シグナル配列を含む。）にどのように対応するかを要約する。従って、配列番号１（及び／又は配列番号３０３）に関して記載されている上記実施形態の何れもが、記載されている対応する位置によって、配列番号３を参照して記載されている。
【０２６８】
幾つかの実施形態において、ＡＢＰ２１Ｂ１２は、残基１６２から１６７（例えば、配列番号１の残基Ｄ１６２−Ｅ１６７）を含むエピトープに結合する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰ１２Ｈ１１は、残基１２３から１３２（例えば、配列番号１のＳ１２３−Ｔ１３２）を含むエピトープに結合する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰ１２Ｈ１１は、残基３１１か３１３（例えば、配列番号１のＡ３１１−Ｄ３１３）を含むエピトープに結合する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、配列のこれらの鎖の何れか１つを含むエピトープに結合し得る。
【０２６９】
競合する抗原結合タンパク質
別の態様において、ＰＣＳＫ９への特異的結合に関して、本明細書中に記載されているエピトープに結合する例示された抗体又は機能的断片の１つと競合する抗原結合タンパク質が提供される。このような抗原結合タンパク質は、本明細書中に例示されている抗原結合タンパク質の１つと同じエピトープ又は重複するエピトープにも結合し得る。例示された抗原結合タンパク質と同じエピトープと競合し、又は結合する抗原結合タンパク質及び断片は、類似の機能的特性を示すと予想される。例示された抗原結合タンパク質及び断片は、重鎖及び軽鎖可変領域ドメイン並びに表２及び／又は図２から３及び１５に含まれるＣＤＲを有するものなど、上述されているものを含む。従って、具体例として、提供される抗原結合タンパク質には、
（ａ）図２から３及び１５に列記されている抗体に対して列記されているＣＤＲの６つ全て；
（ｂ）表２中に列記されている抗体に対して列記されているＶＨ及びＶＬ；又は
（ｃ）表２に列記されている抗体に対して明記されている２つの軽鎖及び２つの重鎖
を有する抗体又は抗原結合タンパク質と競合するものが含まれる。
【０２７０】
ある種の治療的用途及び医薬組成物
ある種の事例において、ＰＣＳＫ９活性は、多数のヒトの病状と相関する。例えば、ある種の事例において、高すぎる又は低すぎるＰＣＳＫ９活性は、高コレステロール血症などのある種の症状と相関する。従って、ある種の事例において、ＰＣＳＫ９活性を調節することは治療的に有用であり得る。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する中和的抗原結合タンパク質は、少なくとも１つのＰＣＳＫ９活性（例えば、ＬＤＬＲへの結合）を調節するために使用される。このような方法は、上昇した血清コレステロールレベルと関連する、又は上昇したコレステロールレベルが関連する疾患を治療し、及び／又は予防し、及び／又は疾患のリスクを低減することができる。
【０２７１】
当業者によって理解されるように、本開示に照らして、変動したコレステロール、ＬＤ
Ｌ又はＬＤＬＲレベルと関連し、変動したコレステロール、ＬＤＬ又はＬＤＬＲレベルを伴い、又は変動したコレステロール、ＬＤＬ又はＬＤＬＲレベルによって影響を受け得る疾患は、抗原結合タンパク質の様々な実施形態によって対処することができる。幾つかの実施形態において、（「血清コレステロール関連疾患」を含む）「コレステロール関連疾患」には、例えば、上昇した総血清コレステロール、上昇したＬＤＬ、上昇したトリグリセリド、上昇したＶＬＤＬ及び／又は低ＨＤＬを呈し得る以下のもの：高コレステロール血症、心臓病、メタボリックシンドローム、糖尿病、冠状動脈性心臓病、卒中、心血管疾患、アルツハイマー病及び脂質異常症全般の何れか１つ又はそれ以上が含まれる。単独での、又は１つ若しくはそれ以上の他の薬剤と組み合わせたＡＢＰを用いて治療することができる原発性及び続発性脂肪異常症の幾つかの非限定的な例には、メタボリックシンドローム、糖尿病、家族性複合型高脂血症、家族性高トリグリセリド血症、家族性高コレステロール血症（ヘテロ接合型高コレステロール血症、ホモ接合型高コレステロール血症、家族性アポリポタンパク質Ｂ−１００欠損、多遺伝子性高コレステロール血症）；レムナント除去病（ｒｅｍｎａｎｔ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）、肝リパーゼ欠乏症、以下のもの：暴食、甲状腺機能低下症、エストロゲン及びプロゲスチン療法を含む薬物、β遮断薬及びチアジド利尿薬；ネフローゼ症候群、慢性腎不全、クッシング症候群、原発性胆汁性肝硬変、糖原病、肝臓癌、胆汁鬱滞、末端肥大症、膵島細胞腫、成長ホルモン単独欠損症並びにアルコール誘発性高トリグリセリド血症の何れかに続発する脂肪異常症が含まれる。ＡＢＰは、例えば、冠動脈性心臓病、冠動脈疾患、末梢動脈疾患、卒中（虚血性及び出血性）、狭心症又は心血管疾患及び急性冠動脈症候群、心筋梗塞などのアテローム性動脈硬化疾患を予防又は治療する上でも有用であり得る。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、致命的でない心臓発作、致命的な及び致命的でない卒中、心臓手術のある種類、心不全のための入院、心臓病を有する患者における胸部痛及び／又は以前の心臓発作、以前の心臓手術など確立された心臓病のための心血管現象及び／又は閉塞した動脈の徴候を有する胸部痛のリスクを低下させる上で有用である。幾つかの実施形態において、ＡＢＰ及び方法は、再発性の心血管現象のリスクを低下させるために使用することができる。
【０２７２】
当業者に理解されるように、スタチンの使用を通じて一般に対処可能な（治療可能な又は予防可能な）疾病又は疾患にも、本発明の抗原結合タンパク質の適用が有益であり得る。さらに、幾つかの実施形態において、コレステロール合成の抑制又は増加したＬＤＬＲ発現が有益であり得る疾患又は疾病も、抗原結合タンパク質の様々な実施形態によって治療することができる。さらに、当業者によって理解されるように、抗ＰＣＳＫ９抗体の使用は、糖尿病の治療に特に有用であり得る。糖尿病は冠動脈性心疾患に対するリスク因子であるのみならず、インシュリンはＰＣＳＫ９の発現を増加させる。すなわち、糖尿病を有する人々は、（高いＰＣＳＫ９レベルと関連し得る）上昇した血漿脂質レベルを有し、血漿脂質レベルを低下させることが有益であり得る。これは、Ｃｏｓｔｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（“Ｈｅｐａｔｉｃ  ＰＣＳＫ９  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ
ｂｙ  Ｎｕｔｉｒｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｔｕｓ  ｖｉａ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｏｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｒｙ  Ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １Ｃ”，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２８１：６２１１−６２１８，  ２００６）（これらの全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）中にさらに詳しく、一般的に論述されている。
【０２７３】
幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、糖尿病、異常な大動脈瘤、アテローム性動脈硬化症及び／又は末梢血管疾患を有する者に、その血清コレステロールレベルをより安全な範囲まで低下させるために投与される。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、本明細書中に記載されている疾患の何れかを発症するリスクを有する患者に投与される。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、喫煙し、高血圧を有し、又は若年心臓発作の家族歴を有する喫煙対象に投与される。
【０２７４】
幾つかの実施形態において、対象が２００４ＮＣＥＰ治療目標において中度のリスク又はそれより高いリスクを有する場合に、対象にＡＢＰが投与される。幾つかの実施形態において、対象のＬＤＬコレステロールレベルが１６０ｍｇ／ｄＬより大きければ、ＡＢＰが対象に投与される。幾つかの実施形態において、対象のＬＤＬコレステロールレベルが１３０より大きければ（及び、２００４ＮＣＥＰ治療目標に従って、対象が、中度のリスク又はやや高いリスクを有すれば）、ＡＢＰが投与される。幾つかの実施形態において、対象のＬＤＬコレステロールレベルが１００より大きければ（及び、２００４ＮＣＥＰ治療目標に従って、対象が、高いリスク又は極めて高いリスクを有すれば）、ＡＢＰが投与される。
【０２７５】
ある患者の個別の特性に応じて、医師は、適切な治療指標及び標的脂質レベルを選択することができる。高脂血症の治療に指針を与えるための十分に受け入れられている１つの基準は、「成人の高い血液コレステロールの検出、評価及び治療に関する全米コレステロール教育プログラム（ＮＣＥＰ）専門部会の第三次報告」（成人治療パネルＩＩＩ）、最終報告、国立衛生研究所、ＮＩＨ公開番号０２−５２１５（２００２）（Ｔｈｉｒｄ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ  （ＮＣＥＰ）  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｉｇｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔｓ  （Ａｄｕｌｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｐａｎｅｌ  ＩＩＩ）  Ｆｉｎａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ
Ｎｏ．  ０２−５２１５  （２００２）」であり、その印刷された刊行物の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。
【０２７６】
幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、異常に高いレベル又は正常なレベルからＰＣＳＫ９活性の量を減少させるために使用される。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、高コレステロール血症を治療若しくは予防するために、並びに／又は高コレステロール血症及び／若しくは他のコレステロール関連疾患（本明細書中に記載されているものなど）に対する医薬の調製において使用される。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９活性が正常である高コレステロール血症などの症状を治療又は予防するために使用される。このような症状において、例えば、正常を下回るＰＣＳＫ９活性の低下は、治療効果を提供することができる。
【０２７７】
幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する２以上の抗原結合タンパク質が、ＰＣＳＫ９活性を調節するために使用される。
【０２７８】
ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する１つ又はそれ以上の抗原結合タンパク質の治療的有効量及び別の治療剤を投与することを含む、高コレステロール血症などのコレステロール関連疾患を治療する方法が提供される。
【０２７９】
ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、単独で投与される。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの他の治療剤の投与前に投与される。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの他の治療剤の投与と同時に投与される。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの他の治療剤の投与後に投与される。他の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの他の治療剤の投与前に投与される。（抗原結合タンパク質とは別の）治療剤は、少なくとも１つの他のコレステロール降下（血清及び／又は全身コレステロール）剤又は薬剤を含むが、これらに限定されない。幾つかの実施形態におい
て、薬剤は、ＬＤＬＲの発現を増加させ、血清ＨＤＬレベルを増加させ、ＬＤＬレベルを低下させ、又はトリグリセリドレベルを低下させることが観察されている。典型的な薬剤には、スタチン（アトロバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン）、ニコチン酸（ナイアシン）（ＮＩＡＣＯＲ，  ＮＩＡＳＰＡＮ  （徐放性ナイアシン）、ＳＬＯ−ＮＩＡＣＩＮ（徐放性ナイアシン））、フィブリン酸（ＬＯＰＩＤ  （ゲムフィブロジル）、ＴＲＩＣＯＲ（フェノフィブラート）、胆汁酸封鎖剤（ＱＵＥＳＴＲＡＮ（コレスチラミン）、コレセベラム（ＷＥＬＣＨＯＬ）、ＣＯＬＥＳＴＩＤ（コレスチポール））、コレステロール吸収阻害剤（ＺＥＴＩＡ（エゼチミブ））、スタチンとニコチン酸の組み合わせ（ＡＤＶＩＣＯＲ  （ＬＯＶＡＳＴＡＴＩＮ及びＮＩＡＳＰＡＮ）、吸収阻害剤とのスタチンの組み合わせ（ＶＹＴＯＲＩＮ（ＺＯＣＯＲ及びＺＥＴＩＡ）及び／又は脂質修飾剤が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、ＰＰＡＲγアゴニスト、ＰＰＡＲα／γアゴニスト、スクアレン合成酵素阻害剤、ＣＥＴＰ阻害剤、降圧剤、抗糖尿病薬（スルホニル尿素、インシュリン、ＧＬＰ−１類縁体、ＤＤＰＩＶ阻害剤など）、ＡｐｏＢ調節物質、ＭＴＰ阻害剤及び／又は閉塞性動脈硬化症治療と組み合わされる。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、スタチン、オンコスタチンＭのようなある種のサイトカイン、エストロゲン及び／又はベルベリンなどのある種の植物成分のような、対象中のＬＤＬＲタンパク質のレベルを増加させる薬剤と組み合わされる。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、（ある種の抗精神病薬、ある種のＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、高フルクトース、スクロース、コレステロール又はある種の脂肪酸などの食事要因並びにＲＸＲ、ＲＡＲ、ＬＸＲ、ＦＸＲに対するある種の核受容体アゴニスト及びアンタゴニストなど）、対象中の血清コレステロールレベルを増加させる薬剤と組み合わされる。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、スタチン及び／又はインシュリンなどの、対象中のＰＣＳＫ９のレベルを増加させる薬剤と組み合わされる。２つの組み合わせは、他の薬剤の望ましくない副作用をＡＢＰによって軽減させることを可能とし得る。当業者によって理解されるように、幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、他の薬剤／化合物と組み合わされる。幾つかの実施形態において、ＡＢＰ及び他の薬剤は、同時に投与される。幾つかの実施形態において、ＡＢＰと他の薬剤は同時に投与されず、ＡＢＰは薬剤が投与される前又は後に投与される。幾つかの実施形態において、対象は、予防の同じ期間、疾患の発症及び／又は治療の期間の間に、ＡＢＰ及び（ＬＤＬＲのレベルを増加させる）他の薬剤の何れをも服用する。
【０２８０】
本発明の医薬組成物は、組み合わせ療法において（すなわち、他の薬剤と組み合わせて）投与することができる。ある種の実施形態において、組み合わせ療法は、少なくとも１つの抗コレステロール剤と組み合わせた、ＰＣＳＫ９を結合することができる抗原結合タンパク質を含む。薬剤には、インビトロで合成的に調製された化学的組成物、抗体、抗原結合領域並びにこれらの組み合わせ及び連結物が含まれるが、これらに限定されない。ある種の実施形態において、薬剤は、アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリック調節物質又はトキシンとして作用することができる。ある種の実施形態において、薬剤は、その標的（例えば、受容体又は酵素の活性化又は阻害剤）を阻害又は刺激するように作用することにより、ＬＤＬＲの増加した発現を促進し、又は血清コレステロールレベルを減少させることができる。
【０２８１】
ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、コレステロール低下（血清及び／又は総コレステロール）剤を用いた治療前、同時に及び後に投与することができる。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、高コレステロール血症、心臓病、糖尿病及び／又はコレステロール関連疾患の何れかの開始を予防又は軽減するために、予防的に投与することができる。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、既存の高コレステロール血症症状の治療のために投与することができる。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、疾患及び／又は
疾患に伴う症候の開始を遅延させる。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、コレステロール関連疾患の何れか１つの何れかの症候又はその一部を欠如する対象に提供される。
【０２８２】
ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、高コレステロール血症などの様々なコレステロール関連疾患を治療するための治療剤とともに使用される。ある種の実施形態において、症状及び治療の所望されるレベルに照らして、２つ、３つ又はそれ以上の薬剤を投与することができる。ある種の実施形態において、同じ製剤中に含めることによって、このような薬剤を一緒に与えることができる。ある種の実施形態において、このような薬剤及びＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、同じ製剤中に含めることによって一緒に与えることができる。ある種の実施形態において、このような薬剤は、別々に製剤化し、治療キット中に含めることによって一緒に与えることができる。ある種の実施形態において、このような薬剤及びＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、別々に製剤化し、治療キット中に含めることによって一緒に与えることができる。ある種の実施形態において、このような薬剤は別々に与えることができる。ある種の実施形態において、遺伝子療法によって投与された場合に、タンパク質剤及び／又はＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質をコードする遺伝子を同じベクター中に含めることができる。ある種の実施形態において、タンパク質剤及び／又はＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質をコードする遺伝子は、同じプロモーター領域の調節下であり得る。ある種の実施形態において、タンパク質剤及び／又はＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質をコードする遺伝子は、別々のベクター中に存在し得る。
【０２８３】
ある種の実施形態において、本発明は、医薬として許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤及び／又は補助剤と一緒に、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。
【０２８４】
ある種の実施形態において、本発明は、医薬として許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤及び／又は補助剤と一緒に、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質及び少なくとも１つのさらなる治療剤の治療的有効量を含む医薬組成物を提供する。
【０２８５】
ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの炎症用治療剤とともに使用することができる。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの免疫疾患用治療剤とともに使用することができる。炎症及び免疫疾患用の典型的な治療剤には、シクロオキシゲナーゼ１型（ＣＯＸ−１）及びシクロオキシゲナーゼ２型（ＣＯＸ−２）阻害剤、３８ｋＤａ分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ｐ３８−ＭＡＰＫ）の小分子調節物質、炎症経路に関与している細胞内分子の小分子調節物質（このような細胞内分子が、ｊｎｋ、ＩＫＫ、ＮＦ−κＢ、ＺＡＰ７０及びｌｃｋが含まれるが、これらに限定されない。）が含まれるが、これらに限定されない。ある種の典型的な炎症用治療剤は、例えば、「ＣＡ．Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ  ＆  Ｌ．Ｌ．Ｍｏｌｄａｗｅｒ  Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：Ａ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （２００１）  Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃ．Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，  ＣＡ」中に記載されている。
【０２８６】
ある種の実施形態において、薬剤組成物は、２以上の異なる、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含む。ある種の実施形態において、医薬組成物は、２以上のエピトープを結合する、２以上のＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含む。幾つかの実施形態において、様々な抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９への結合に関して、互いと競合しない。幾つかの実施形態において、表２並びに図２及び／又は３に図示されている抗原結合タンパク質の何れもが、医薬組成物中で一緒に組み合わせることができる。
【０２８７】
ある種の実施形態において、許容される製剤材料は、好ましくは、使用される投薬量及び濃度で服用者に対して有毒でない。幾つかの実施形態において、製剤材料は、皮下及び静脈内投与用である。ある種の実施形態において、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解又は放出、吸着又は浸透の速度を修飾し、維持し、又は保持するための製剤材料を含有することができる。ある種の実施形態において、適切な製剤材料には、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンなど）；抗菌剤；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム）、緩衝液（ボラート、バイカーボナート、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、シトラート、ホスファート又は他の有機酸）；増量剤（マニトール又はグリシンなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなど）；充填剤；単糖；二糖；及び他の炭水化物（グルコース、マンノース又はデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなど）；着色剤、着香剤及び希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；防腐剤（ベンズアルコニウムクロリド、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、スルビン酸又は過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マニトール又はソルビトールなど）；懸濁剤；界面活性剤又は湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０などのポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパールなど）；安定性増強剤（スクロース又はソルビトールなど）；等張性増強剤（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは、塩化ナトリウム又はカリウム、マニトールソルビトールなど）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤及び／又は医薬補助剤が含まれるが、これらに限定されない。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，
１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａ．Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，  ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （１９９５）。幾つかの実施形態において、製剤は、ＰＢＳ、２０ｍＭＮａＯＡＣ、ｐＨ５．２、５０ｍＭＮａＣｌ；及び／又は１０ｍＭＮａＯＡＣ、ｐＨ５．２、９％スクロースを含む。
【０２８８】
ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質及び／又は治療分子は、本分野において公知の半減期延長ビヒクルに連結される。このようなビヒクルには、ポリエチレングリコール、グリコーゲン（例えば、ＡＢＰのグリコシル化）及びデキストランが含まれるが、これらに限定されない。このようなビヒクルは、例えば、米国特許出願第０９／４２８，０８２号（現在、米国特許第６，６６０，８４３号）及び公開ＰＣＴ出願ＷＯ９９／２５０４４号（これらは、あらゆる目的のために、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
【０２８９】
ある種の実施形態において、最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形式及び所望の投薬量に応じて、当業者により決定される。例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記」を参照されたい。ある種の実施形態において、このような組成物は、本発明の抗体の物理的状態、安定性、インビボ放出の速度及びインビボ除去の速度に影響を及ぼし得る。
【０２９０】
ある種の実施形態において、医薬組成物中の主要なビヒクル又は担体は、水性又は非水性であり得る。例えば、ある種の実施形態において、非経口投与用の組成物中で一般的な他の材料を補充することが可能な、適切なビヒクル又は担体は、注射用水、生理的食塩水溶液又は人工脳脊髄液であり得る。幾つかの実施形態において、生理的食塩水は、等張のリン酸緩衝化生理的食塩水を含む。ある種の実施形態において、中性の緩衝化された生理
的食塩水又は血清アルブミンと混合された生理的食塩水は、さらなる典型的なビヒクルである。ある種の実施形態において、医薬組成物は、約ｐＨ７．０から８．５のＴｒｉｓ緩衝液又は約ｐＨ４．０から５．５の酢酸緩衝液を含み、これらは、ソルビトール又は適切なその代替物を含み得る。ある種の実施形態において、所望の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥されたケーキ又は水溶液の形態の、場合によって使用される製剤化剤（Ｒｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記）と混合することによって、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えた又は加えない、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含む組成物を保存のために調製することができる。さらに、ある種の実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えた又は加えない、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含む組成物は、スクロースなどの適切な賦形剤を用いて、凍結乾燥物質として製剤化され得る。
【０２９１】
ある種の実施形態において、医薬組成物は、非経口送達のために選択することができる。ある種の実施形態において、組成物は、吸入又は経口などの消化管を通じた送達のために選択され得る。医薬として許容されるこのような組成物の調製は、当業者の能力の範疇に属する。
【０２９２】
ある種の実施形態において、製剤成分は、投与の部位に許容され得る濃度で存在する。ある種の実施形態において、生理的ｐＨに又は僅かにこれより低いｐＨに、典型的には、約５から約８のｐＨ範囲内に組成物を維持するために、緩衝液が使用される。
【０２９３】
ある種の実施形態において、非経口投与が想定されている場合には、治療的組成物は、医薬として許容されるビヒクル中に、さらなる治療剤を加えて又は加えずに、ＰＣＳＫ９に対する所望の抗原結合タンパク質を含む、非経口的に許容される無発熱物質水溶液の形態であり得る。ある種の実施形態において、非経口注射用ビヒクルは、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えて又は加えずに、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質が適切に防腐された無菌等張溶液として製剤化されている無菌蒸留水である。ある種の実施形態において、調製物は、注射可能な微小球体、生物腐食可能な粒子、ポリマー性化合物（ポリ乳酸又はポリグリコール酸など）、ビーズ又はリポソームなど、産物の徐放又は持続的放出（産物は、その後、デポ注射を介して送達され得る。）を与えることができる薬剤を加えた所望の分子の製剤を含むことができる。ある種の実施形態において、ヒアルロン酸を使用することも可能であり、循環中での持続的な期間を促進する効果を有し得る。ある種の実施形態において、所望の分子を導入するために、インプラント可能な薬物送達装置を使用することができる。
【０２９４】
ある種の実施形態において、医薬組成物は、吸入のために製剤化することができる。ある種の実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えた又は加えない、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、乾燥した吸入用粉末として製剤化することができる。ある種の実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えた又は加えない、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含む吸入溶液は、エアロゾル送達用の噴射剤とともに製剤化することが可能であり、ある種の実施形態において、溶液は噴霧され得る。経肺投与は、化学的に修飾されたタンパク質の経肺送達を記載するＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５中にさらに記載されている。
【０２９５】
ある種の実施形態において、製剤は経口的に投与できることが想定される。ある種の実施形態において、この様式で投与される、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えた又は加えない、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、錠剤及びカプセルなどの固体剤形の配合において慣用される担体とともに又は担体なしに製剤化され得る。ある種の実施形態において、カプセルは、生物学的利用可能性が最大化され、及び前全身分解が最小化されるときに、消化管中の点で製剤の活性な部分を放出するように設計することができる。
ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質及び／又はあらゆるさらなる治療剤の吸収を促進するために、少なくとも１つの更なる薬剤を含めることができる。ある種の実施形態において、希釈剤、着香剤、低融点の蝋、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤及び結合剤も使用し得る。
【０２９６】
ある種の実施形態において、医薬組成物は、錠剤の製造に適した無毒の賦形剤との混合物中に、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えて又は加えずに、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質の有効量を含むことができる。ある種の実施形態において、無菌水又は別の適切なビヒクル中に錠剤を溶解させることによって、単位投薬形態で溶液を調製することができる。ある種の実施形態において、適切な賦形剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム若しくは重炭酸ナトリウム、ラクトース若しくはリン酸カルシウムなどの不活性な希釈剤、又はデンプン、ゼラチン若しくはアラビアゴムなどの結合剤、又はステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸若しくはタルクなどの潤滑剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２９７】
持続的又は制御送達製剤中に、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えて又は加えずに、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含む製剤など、さらなる医薬組成物が当業者に自明である。ある種の実施形態において、リポソーム担体、生体内分解性微粒子又は多孔性ビーズ及びデポ注射などの様々な他の持続的又は制御送達手段を製剤化するための技術も当業者に公知である。例えば、医薬組成物の送達用の多孔性ポリマー微粒子の徐放について記載しているＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９を参照。ある種の実施形態において、徐放調製物は、成型された製品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態の半透過性ポリマーマトリックスを含み得る。持続的放出マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号及びＥＰ０５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリラート）（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）及びＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，上記）及びポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が含まれ得る。ある種の実施形態において、徐放組成物は、リポソームも含み得、これは、本分野で公知の方法の何れによっても調製することが可能である。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８−３６９２（１９８５）；ＥＰ０３６，６７６；ＥＰ０８８，０４６及びＥＰ１４３，９４９を参照されたい。
【０２９８】
インビボ投与のために使用されるべき医薬組成物は、通例、無菌である。ある種の実施形態において、これは、無菌ろ過膜を通じたろ過によって達成することができる。ある種の実施形態において、組成物が凍結乾燥される場合には、この方法を用いた無菌化は、凍結乾燥及び再構成の前又は後の何れかにおいて実施し得る。ある種の実施形態において、非経口投与用組成物は、凍結乾燥された形態で、又は溶液中に保存し得る。ある種の実施形態において、非経口組成物は、一般的に、無菌アクセスポートを有する容器中に、例えば、皮下注射針によって突き刺すことが可能なストッパーを有する静脈内溶液袋又は容器中に配置される。
【０２９９】
ある種の実施形態において、医薬組成物が調合された後、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体として、又は脱水若しくは凍結乾燥された粉末として、無菌容器中に保存され得る。ある種の実施形態において、このような製剤は、即時使用形態で、又は投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥された形態）の何れかで保存し得る。
【０３００】
ある種の実施形態において、単回投薬投与単位を製造するためのキットが提供される。ある種の実施形態において、キットは、乾燥されたタンパク質を有する第一の容器と、水性製剤を有する第二の容器の両方を含有し得る。ある種の実施形態において、単一及び／又は複数チャンバーの予め充填された注射器（例えば、液体注射器及び凍結乾燥注射器（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含有するキットが含まれる。
【０３０１】
ある種の実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えて又は加えずに、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含む医薬組成物の治療において使用されるべき有効量は、例えば、治療的な文脈及び目的に依存する。従って、当業者は、ある種の実施形態に従って、送達される分子、少なくとも１つの追加の治療剤とともに又は少なくとも１つの追加の治療剤なしに、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質が使用されている適応症、投与の経路及びサイズ（体重、体表面又は臓器サイズ）及び／又は患者の症状（年齢及び一般的な健康）に部分的に依存して、治療用の適切な投薬レベルが変動することを理解する。ある種の実施形態において、医師は、最適な治療効果を得るために、投薬量を滴定し、投与の経路を修飾し得る。ある種の実施形態において、典型的な投薬量は、上述の要因に応じて、約０．１μｇ／ｋｇから最大約１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲であり得る。ある種の実施形態において、投薬量は、０．１μｇ／ｋｇから最大約１００ｍｇ／ｋｇ又は１μｇ／ｋｇから最大約１００ｍｇ／ｋｇ又は５μｇ／ｋｇから最大約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
【０３０２】
ある種の実施形態において、投薬の頻度は、使用される製剤中のＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質及び／又は何れかのさらなる治療剤の薬物動態学的パラメータを考慮に入れる。ある種の実施形態において、臨床医は、所望の効果を達成する投薬量に到達するまで、組成物を投与する。ある種の実施形態において、組成物は、従って、単回用量として、又は経時的に２つ若しくはそれ以上の用量（所望の分子の同じ用量を含有してもよく、含有しなくてもよい。）として、又はインプラント装置若しくはカテーテルを介した連続注入として投与され得る。適切な投薬量をさらに精密化することは、当業者によって日常的に行われており、当業者によって日常的に行われる作業の範疇に属する。ある種の実施形態において、適切な投薬量は、適切な用量応答データの使用を通じて確認し得る。幾つかの実施形態において、投与の量及び頻度は、取得されるべき所望のコレステロールレベル（血清及び／又は総）及び対象の現在のコレステロールレベル、ＬＤＬレベル及び／又はＬＤＬＲレベルを考慮に入れることができ、これらの全ては当業者に周知の方法によって取得することができる。
【０３０３】
ある種の実施形態において、医薬組成物の投与経路は、公知の方法に従い、例えば、経口的に、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、皮下、眼内、動脈内、門脈内、又は病変内経路による注射を通じて、徐放システムによって又はインプラント装置によって行われる。ある種の実施形態において、組成物は、ボーラス注射によって、又は注入により連続的に、又はインプラント装置によって投与され得る。
【０３０４】
ある種の実施形態において、組成物は、その上に所望の分子が吸収又は封入されている膜、スポンジ又は別の適切な材料の移植を介して、局所的に投与することができる。ある種の実施形態において、インプラント装置が使用される場合、装置は、何れかの適切な組織又は臓器中に移植することができ、所望の分子の送達は、拡散、時間指定放出型大量瞬時投与又は継続的投与を介して行われ得る。
【０３０５】
ある種の実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えて又は加えずに、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含む医薬組成物をエキソビボ様式で使用することが望ましい場合があり得る。このような事例では、患者から採取された細胞、組織及び／又は臓器は、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えて又は加えずに、ＰＣＳＫ９に対
する抗原結合タンパク質を含む医薬組成物に曝露され、この後、細胞、組織及び／又は臓器は、続いて、患者中に戻されて移植される。
【０３０６】
ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質及び／又は何れかのさらなる治療剤は、ポリペプチドを発現及び／又は分泌するために、本明細書に記載されている方法などの方法を用いて、遺伝子操作されたある種の細胞を移植することによって送達することができる。ある種の実施形態において、このような細胞は、動物又はヒトの細胞であり得。自己、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）又は異種（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）であり得る。ある種の実施形態において、細胞は不死化され得る。ある種の実施形態において、免疫学的応答の確率を減少させるために、細胞を封入して、周囲組織の浸潤を回避することができる。ある種の実施形態において、典型的には、封入材料は、タンパク質産物の放出を可能にするが、患者の免疫系によって又は周囲組織由来の他の有害な因子によって、細胞の破壊を妨げる生態適合性の半透性ポリマー性封鎖又は膜である。
【０３０７】
（以下の実施例に示されているように）ＰＣＳＫ９活性を著しく中和するＡＢＰの能力に基づいて、これらのＡＢＰは、高コレステロール血症などのＰＣＳＫ９によって媒介される活性から生じる症候及び症状を治療及び予防する上で治療効果を有する。
【０３０８】
診断用途
幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、診断用ツールとして使用される。ＡＢＰは、試料及び／又は対象中に存在するＰＣＳＫ９の量をアッセイするために使用することができる。当業者によって理解されるように、このようなＡＢＰは中和ＡＢＰである必要はない。幾つかの実施形態において、診断用ＡＢＰは中和ＡＢＰでない。幾つかの実施形態において、診断用ＡＢＰは、中和ＡＢＰが結合するエピトープとは異なるエピトープに結合する。幾つかの実施形態において、２つのＡＢＰは互いに競合しない。
【０３０９】
幾つかの実施形態において、本明細書中に開示されているＡＢＰは、ＰＣＳＫ９のレベルの変化を伴う疾病又は疾患をスクリーニング／診断するために、哺乳動物組織又は細胞中のＰＣＳＫ９の検出用アッセイキット及び／又は方法において使用され、又は提供される。キットは、ＰＣＳＫ９を結合するＡＢＰ、存在する場合に、ＰＣＳＫ９とのＡＢＰの結合を示し、場合によってＰＣＳＫ９タンパク質レベルを示す手段を含む。ＡＢＰの存在を示すための様々な手段を使用することができる。例えば、蛍光色素、他の分子プローブ又は酵素をＡＢＰに連結することができ、ＡＢＰの存在は様々な様式で観察することができる。このような疾患をスクリーニングするための方法は、キットの使用、又は開示されているＡＢＰの１つの単に使用すること、及びＡＢＰが試料中のＰＣＳＫ９に結合するかどうかの測定を含み得る。当業者によって理解されるように、ＰＣＳＫ９の高い又は上昇したレベルは、試料中のＰＣＳＫ９へのＡＢＰ結合のより多い量をもたらす。従って、試料中にどの程度多くのＰＣＳＫ９が存在するかを測定するために、ＡＢＰ結合の程度を使用することができる。所定の量（例えば、ＰＣＳＫ９関連疾患を持たない者が有する量又は範囲）より多いＰＣＳＫ９の量を有する対象又は試料は、ＰＣＳＫ９によって媒介される疾患を有するものとして特徴付けることができる。幾つかの実施形態において、スタチンが対象中のＰＣＳＫ９の量を増大させたかどうかを決定するために、スタチンを服用している対象にＡＢＰが投与される。
【０３１０】
幾つかの実施形態において、ＡＢＰは非中和ＡＢＰであり、ＡＢＰ及び／又はスタチン治療を受けている対象中のＰＣＳＫ９の量を測定するために使用される。
【実施例】
【０３１１】
実施される実験及び達成された結果を含めて、以下の実施例は、例示の目的でのみ提供されるものであり、本発明を限定するものと解釈してはならない。
【０３１２】
（実施例１）
免疫化及び力価測定
抗ＰＣＫＳ９抗体及びハイブリドーマの作製
ＰＣＳＫ９の成熟形態に対する抗体（図１Ａ中の配列として図示されており、プロドメインに下線が付されている。）を、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含有するマウスであるＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ｒ）マウス（Ａｂｇｅｎｉｘ，  Ｆｒｅｍｏｎｔ，  ＣＡ）中で作製した。ＰＣＳＫ９に対する抗体を作製するために、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ｒ）マウスの２つのグループ（グループ１及び２）を使用した。グループ１は、完全ヒトＩｇＧ２κ及びＩｇＧ２λ抗体を産生するＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ｒ）系統ＸＭＧ２−ＫＬのマウスを含んだ。グループ１のマウスを、ヒトＰＣＳＫ９で免疫化した。ＧｅｎＢａｎｋ配列を参照として（ＮＭ １７４９３６）を使用する標準的組換え技術を用いて、ＰＣＳＫ９を調製した。グループ２は、完全ヒトＩｇＧ４κ及びＩｇＧ４λ抗体を産生するＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ｒ）系統ＸＭＧ４−ＫＬのマウスを含んだ。グループ２のマウスも、ヒトＰＣＳＫ９で免疫化した。
【０３１３】
表３中のスケジュールに従って、両グループのマウスに抗原を１１回注射した。最初の免疫化において、腹部中に腹腔内送達された抗原計１０μｇを各マウスに注射した。その後の強化免疫は５μｇの用量であり、注射法は、腹部内への腹腔内注射と尾の基部への皮下注射間でずらされる。腹腔内注射のために、ＴｉｔｅｒＭａｘ（Ｒ）Ｇｏｌｄ（Ｓｉｇｍａ，  Ｃａｔ  ＃  Ｔ２６８４）を加えたエマルジョンとして抗原を調製し、皮下注射のために、抗原をＡｌｕｍ（リン酸アルミニウム）及びＣｐＧオリゴと混合する。注射２から８及び１０において、アジュバントａｌｕｍゲル中の抗原計５μｇを各マウスに注射した。マウス当り抗原５μｇの最終注射をリン酸緩衝化された生理的食塩水中に送達し、２つの部位に送達する（腹部内へ５０％腹腔内及び尾の基部に５０％皮下）。免疫化プログラムは、以下に示されている表３中に要約されている。
【０３１４】
【表３】
2020058376.tif 000005
【０３１５】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ動物を滴定するために使用したプロトコールは、以下のとおりであった。Ｃｏｓｔａｒ３３６８培地結合プレートを８μｇ／ｍＬ（５０μＬ／ウェル）のニュートラビジンで被覆し、１×ＰＢＳ／０．０５％アジ化物中において、４℃で一晩温置する。ＲＯ水でのＴｉｔｅｒＴｅｋ３サイクル洗浄を用いて、プレートを洗浄した。１×
ＰＢＳ／１％ミルク２５０μＬを用いてプレートをブロックし、室温で少なくとも３０分間温置した。ＲＯ水でのＴｉｔｅｒＴｅｋ３サイクル洗浄を用いて、ブロックを洗浄除去した。次いで、１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋（アッセイ希釈液）５０μＬ／ウェル中に、２μｇ／ｍＬでｂ−ヒトＰＣＳＫ９を捕捉し、室温で１時間温置した。次いで、ＲＯ水を用い、ＴｉｔｅｒＴｅｋ３サイクル洗浄を使用して洗浄した。一次抗体に関しては、１：１００から二つ組みで、血清を１：３滴定した。アッセイ希釈液５０μＬ／ウェル中でこれを行い、室温で１時間温置した。次いで、ＲＯ水を用い、ＴｉｔｅｒＴｅｋ３サイクル洗浄を使用して洗浄した。二次抗体は、５０μＬ／ウェルのアッセイ希釈液中の４００ｎｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃＨＲＰであった。室温で１時間、これを温置した。次いで、ＲＯ水を用い、ＴｉｔｅｒＴｅｋ３サイクル洗浄を使用してこれを洗浄し、ペーパータオル上で叩いて乾燥させた。基質に関しては、一工程のＴＭＰ溶液（Ｎｅｏｇｅｎ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）を使用し（５０μＬ／ウェル）、室温で３０分間展開させた。
【０３１６】
ＥＬＩＳＡアッセイにおいて従ったプロトコールは、以下のとおりであった。Ｖ５Ｈｉｓタグを持たないｂ−ＰＣＳＫ９を含む試料に関して、以下のプロトコールを使用した。Ｃｏｓｔａｒ３３６８培地結合プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。１×ＰＢＳ／０．０５％アジ化物（５０μＬ／ウェル）中の８μｇ／ｍＬのニュートラビジンで、プレートを被覆した。４℃で一晩、プレートを温置した。次いで、ＴｉｔｅｒｔｅｋＭ３８４プレート洗浄装置（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を用いて、プレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。１×ＰＢＳ／１％ミルク２５０μＬでプレートをブロックし、室温で約３０分間温置した。次いで、Ｍ３８４プレート洗浄装置を用いてプレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。捕捉は、Ｖ５タグを持たないｂ−ｈｕＰＣＳＫ９であり、１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋（４０μＬ／ウェル）中に２μｇ／ｍＬで添加した。次いで、プレートを室温で１時間温置した。３サイクルの洗浄を行った。１：１００から２つ組みで、血清を１：３滴定し、列Ｈは血清のためのブランクとした。滴定は、５０μＬ／ウェルの容量で、アッセイ希釈液中において行った。プレートを室温で１時間温置した。次に、３サイクルの洗浄を行った。１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋（５０  μｌ／ウェル）中の１００ｎｇ／ｍＬ（１：４０００）のヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃＨＲＰをプレートに添加し、室温で１時間温置した。３サイクル洗浄を用いて、プレートをもう一度洗浄した。次いで、ペーパータオルで叩いて、プレートを乾燥させた。最後に、１工程ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ，
Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，  Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）（５０μＬ／ウェル）をプレートに添加し、室温で３０分後に、１Ｎ塩酸（５０μＬ／ウェル）を用いて消光した。Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍでＯＤを直ちに読み取った。
【０３１７】
ＰＣＳＫ９が結合したプレートを検出するための陽性対照は、アッセイ希釈液中で３μｇ／ｍＬから２つ組みで１：３滴定された、可溶性ＬＤＬ受容体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｃａｔ  ＃２１４８ＬＤ／ＣＦ）及びポリクローナルウサギ抗ＰＣＳＫ９抗体（Ｃａｙｍｅｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＃１０００７１８５）であった。４００ｎｇ／ｍＬの濃度でヤギ抗ＬＤＬＲ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｃａｔ  ＃ＡＦ２１４８）及びウサギ抗ヤギＩｇＧＦｃＨＲＰを用いて、ＬＤＬＲを検出した。アッセイ希釈液中の、４００ｎｇ／ｍＬの濃度のヤギ抗ウサギＩｇＧＦｃを用いて、ウサギポリクローナルを検出した。陰性対照は、アッセイ希釈液中において、１：１００から２つ組みで１：３滴定されたナイーブＸＭＧ２−ＫＬ及びＸＭＧ４−ＫＬ血清であった。
【０３１８】
Ｖ５Ｈｉｓタグを有するｂ−ＰＣＳＫ９を含む試料に関しては、以下のプロトコールを使用した。Ｃｏｓｔａｒ  ３３６８培地結合プレート（ＣｏｒｎｉｎｇＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。１×ＰＢＳ／０．０５％アジ化物（５０μＬ／ウェル）中の８μｇ／ｍＬのニュートラビジンで、プレートを被覆した。４℃で一晩、プレートを温置した
。次いで、ＴｉｔｅｒｔｅｋＭ３８４プレート洗浄装置（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を用いて、プレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。１×ＰＢＳ／１％ミルク２５０μＬでプレートをブロックし、室温で約３０分間温置した。次いで、Ｍ３８４プレート洗浄装置を用いてプレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。捕捉は、Ｖ５タグを有するｂ−ｈｕＰＣＳＫ９であり、１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋（４０μＬ／ウェル）中に２μｇ／ｍＬで添加した。次いで、プレートを室温で１時間温置した。３サイクルの洗浄を行った。１：１００から２つ組みで、血清を１：３滴定し、列Ｈは血清のためのブランクとした。滴定は、５０μＬ／ウェルの容量で、アッセイ希釈液中において行った。プレートを室温で１時間温置した。次に、３サイクル洗浄を用いて作動されるＭ３８４プレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋中の４００ｎｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃＨＲＰを５０μＬ／ウェルでプレートに添加し、プレートを室温で１時間温置した。３サイクル洗浄を用いて、プレートをもう一度洗浄した。次いで、ペーパータオルで叩いて、プレートを乾燥させた。最後に、１工程ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ，  Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，  Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）（５０μＬ／ウェル）をプレートに添加し、室温で３０分後に、１Ｎ塩酸（５０μＬ／ウェル）を用いてプレートを消光した。Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍでＯＤを直ちに読み取った。
【０３１９】
陽性対照は、ＬＤＬＲ、アッセイ希釈液中において、３μｇ／ｍＬから２つ組みで１：３滴定されたウサギ抗ＰＣＳＫ９であった。ヤギ抗ＬＤＬＲ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，
Ｃａｔ  ＃ＡＦ２１４８）及び４００ｎｇ／ｍＬの濃度のウサギ抗ヤギＩｇＧＦｃＨＲＰを用いて、ＬＤＬＲを検出する。ウサギｐｏｌｙは、アッセイ希釈液中、４００ｎｇ／ｍＬの濃度のヤギ抗ウサギＩｇＧＦｃを用いて検出された。アッセイ希釈液中で１μｇ／ｍＬから２つ組みで、ヒト抗Ｈｉｓ１．２．３及び抗Ｖ５１．７．１を１：３滴定した。何れも、アッセイ希釈液中、４００ｎｇ／ｍＬの濃度のヤギ抗ＩｇＧＦｃＨＲＰを用いて検出された。陰性対照は、アッセイ希釈液中において、１：１００から２つ組みで１：３滴定されたナイーブＸＭＧ２−ＫＬ及びＸＭＧ４−ＫＬ血清であった。
【０３２０】
ヒトＰＣＳＫ９に対する抗体の力価は、記載されている可溶性抗原を用いて免疫化されたマウスに対するＥＬＩＳＡアッセイによって検査した。表４は、ＥＬＩＳＡデータを要約し、ＰＣＳＫ９に対して特異的であるように見受けられる幾つかのマウスが存在したことを示す。例えば、表４を参照されたい。従って、免疫化プログラムの終わりに、１０匹のマウス（表４中の太字）を採集のために選択し、本明細書中に記載されているように、それぞれ、脾臓及びリンパ節から脾細胞及びリンパ球を単離した。
【０３２１】
【表４】
2020058376.tif 000006
【０３２２】
（実施例２）
リンパ球の回収、Ｂ細胞の単離、融合及びハイブリドーマの作製
この実施例は、免疫細胞がどのようにして回収され、ハイブリドーマがどのようにして作製されたかについて概説する。選択された免疫化マウスを頚椎脱臼によって屠殺し、各コホートから流入領域リンパ節を採集し、プールした。細胞を組織から放出させるために、ＤＭＥＭ中で磨り潰すことによって、リンパ系組織からＢ細胞を解離させ、細胞をＤＭＥＭ中に懸濁した。細胞を計数し、穏やかに、但し、完全に細胞を再懸濁させるために、１億のリンパ球当りＤＭＥＭ０．９ｍＬを細胞沈降物に添加した。
【０３２３】
１：４の比で、リンパ球をＡＴＣＣ、ｃａｔ．＃ＣＲ１１５８０から購入した非分泌性骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（Ｋｅａｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３，１５４８−１５５０）と混合した。４００×ｇで、４分の遠心によって、細胞混合物を穏やかに沈降させた。容器を傾けて上清を除去した後、１ｍＬピペットを用いて、細胞を穏やかに混合した。１分にわたって、穏やかに撹拌しながら、
Ｓｉｇｍａ（ｃａｔ＃Ｐ７３０６）から得た事前加熱されたＰＥＧ／ＤＭＳＯ溶液（Ｂ細胞１００万個当り１ｍＬ）をゆっくり添加した後、１分間混合した。次いで、穏やかに撹拌しながら、２分にわたって、事前加熱されたＩＤＭＥＭ（Ｂ細胞１００万個当り２ｍＬ）（グルタミン、Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、ＭＥＭ非必須アミノ酸なしのＤＭＥＭ）（全て、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た）を添加した。最後に、３分にわたって、事前加熱されたＩＤＭＥＭ（１０６個のＢ細胞当り８ｍＬ）を添加した。
【０３２４】
４００×ｇで６分、融合された細胞を遠心沈降させ、１００万個のＢ細胞当り選択培地２０ｍＬ（Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、ＭＥＭ非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール（全て、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手）、ＨＡ−アザセリンヒポキサンチン及びＯＰＩ（オキサロアセタート、ピルバート、ウシインシュリン）（何れも、Ｓｉｇｍａから入手）及びＩＬ−６（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ）が補充された、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中に再懸濁した。３７℃で２０から３０分間、細胞を温置し、次いで、選択培地２００ｍＬ中に再懸濁し、９６ウェルへの播種の前に、Ｔ１７５フラスコ中で３から４日間培養した。このようにして、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を産生するハイブリドーマを作製した。
【０３２５】
（実施例３）
ＰＣＳＫ９抗体の選択
本実施例は、様々なＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質をどのようにして性質決定し、選択したかについて概説する。（実施例１及び２で産生されたハイブリドーマから産生された）分泌された抗体のＰＣＳＫ９への結合を評価した。抗体の選択は、結合データ及びＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合の阻害及び親和性を基礎とした。以下に記載されているように、ＥＬＩＳＡによって、可溶性ＰＣＳＫ９への結合を分析した。結合親和性を定量するために、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｒ）（表面プラズモン共鳴）を使用した。
【０３２６】
一次スクリーニング
野生型ＰＣＳＫ９に結合する抗体に対する一次スクリーニングを行った。２つの採集物に対して、一次スクリーニングを行った。一次スクリーニングは、ＥＬＩＳＡアッセイを含み、以下のプロトコールを用いて行った。
【０３２７】
Ｃｏｓｔａｒ３７−２培地結合３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。４０μＬ／ウェルの容量で、１×ＰＢＳ／０．０５％アジ化物中、４μｇ／ｍＬの濃度のニュートラビジンでプレートを被覆した。４℃で一晩、プレートを温置した。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を用いて、プレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。１×ＰＢＳ／１％ミルク９０μＬでプレートをブロックし、室温で約３０分間温置した。次いで、プレートを洗浄した。再度、３サイクルの洗浄を行った。捕捉試料は、Ｖ５タグを持たないビオチン化合されたＰＣＳＫ９であり、４０μＬ／ウェルの容量で、１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋中に０．９μｇ／ｍＬで添加した。次いで、プレートを室温で１時間温置した。次に、３サイクル洗浄を用いて作動されるＴｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋４０μＬ中に、上清１０μＬを移し、室温で１．５時間温置した。再度、３サイクル洗浄を用いて作動されるＴｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋中、１００ｎｇ／ｍＬ（１：４０００）の濃度のヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃＰＯＤ４０μＬ／ウェルをプレートに添加し、室温で１時間温置した。３サイクル洗浄を用いて、プレートをもう一度洗浄した。最後に、１工程ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ，  Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，  Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）の４０μＬ／ウェルをプレートに添加し、室温で３０分後に、１Ｎ塩酸の４０μＬ／ウェルを用いて消光を
行った。Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍでＯＤを直ちに読み取った。
【０３２８】
一次スクリーニングによって、２つの採集物から同定された合計３１０４の抗原特異的ハイブリドーマが得られた。最高のＥＬＩＳＡＯＤに基づいて、合計３０００の陽性に対して、採集物当り１５００のハイブリドーマをさらなる操作に用いた。
【０３２９】
確認用スクリーニング
次いで、安定なハイブリドーマが確立されたことを確認するために、野生型ＰＣＳＫ９への結合に関して、３０００の陽性を再スクリーニングした。スクリーニングは、以下のように行った。Ｃｏｓｔａｒ３７０２培地結合３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。４０μＬ／ウェルの容量で、１×ＰＢＳ／０．０５％アジ化物中、３μｇ／ｍＬのニュートラビジンでプレートを被覆した。４℃で一晩、プレートを温置した。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を用いて、プレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。１×ＰＢＳ／１％ミルク９０μＬでプレートをブロックし、室温で約３０分間温置した。次いで、Ｍ３８４プレート洗浄装置を用いてプレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。捕捉試料は、Ｖ５タグを持たないｂ−ＰＣＳＫ９であり、４０μＬ／ウェルの容量で、１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋中に０．９μｇ／ｍＬで添加した。次いで、プレートを室温で１時間温置した。次に、３サイクル洗浄を用いて、プレートを洗浄した。１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋４０μＬ中に、上清１０μＬを移し、室温で１．５時間温置した。再度、３サイクル洗浄を用いて作動されるＴｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋中、１００ｎｇ／ｍＬ（１：４０００）の濃度のヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃＰＯＤ４０μＬ／ウェルをプレートに添加し、プレートを室温で１時間温置した。３サイクル洗浄を用いて作動されるＴｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、プレートをもう一度洗浄した。最後に、１工程ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ，  Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，  Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）の４０μＬ／ウェルをプレートに添加し、室温で３０分後に、１Ｎ塩酸の４０μＬ／ウェルを用いて消光した。Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍでＯＤを直ちに読み取った。合計２４４１の陽性を、第二のスクリーニングで反復した。次いで、その後のスクリーニングにおいて、これらの抗体を使用した。
【０３３０】
マウス交叉反応スクリーニング
次いで、抗体がヒト及びマウスＰＣＳＫ９の両方に結合できることを確認するために、マウスＰＣＳＫ９に対する交叉反応性に関して、ハイブリドーマのパネルをスクリーニングした。交叉反応性スクリーニングでは、以下のプロトコールを使用した。Ｃｏｓｔａｒ３７０２培地結合３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。４０μＬ／ウェルの容量で、１×ＰＢＳ／０．０５％アジ化物中、３μｇ／ｍＬのニュートラビジンでプレートを被覆した。４℃で一晩、プレートを温置した。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を用いて、プレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。１×ＰＢＳ／１％ミルク９０μＬでプレートをブロックし、室温で約３０分間温置した。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いてプレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。捕捉試料は、ビオチン化されたマウスＰＣＳＫ９であり、４０μＬ／ウェルの容量で、１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋中に１μｇ／ｍＬで添加した。次いで、プレートを室温で１時間温置した。次に、３サイクルの洗浄を用いて作動されるＴｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。上清５０μＬをプレートに移し、室温で１時間温置した。再度、３サイクル洗浄を用いて、プレートを洗浄した。１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋中、１００ｎｇ／ｍＬ（１：４０００）の濃度のヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃＰＯＤ４０μＬ／ウェルをプレートに添加し、プレートを室温で１時間温置し
た。３サイクル洗浄を用いて、プレートをもう一度洗浄した。最後に、１工程ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ，  Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，  Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）の４０μＬ／ウェルをプレートに添加し、室温で３０分後に、１Ｎ塩酸の４０μＬ／ウェルを用いて消光した。Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍでＯＤを直ちに読み取った。５７９抗体は、マウスＰＣＳＫ９と交叉反応することが観察された。次いで、その後のスクリーニングにおいて、これらの抗体を使用した。
【０３３１】
Ｄ３７４Ｙ変異体結合スクリーニング
ＰＣＳＫ９中のＤ３７４Ｙ変異は、ヒト集団中において文献に記載されている（例えば、Ｔｉｍｍｓ  ＫＭ  ｅｔ  ａｌ，  “Ａ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＰＣＳＫ９  ｃａｕｓｉｎｇ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ−ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ  ｉｎ  ａ  Ｕｔａｈ  ｐｅｄｉｇｒｅｅ”，  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１１４：３４９−３５３，  ２００４）。抗体が野生型に対して特異的であり、又はＰＣＳＫ９のＤ３７４Ｙ形態に結合されているかどうかを測定するために、次いで、変異Ｄ３７４Ｙを含む変異体ＰＣＳＫ９配列への結合に関して、試料をスクリーニングした。スクリーニングのためのプロトコールは、以下のとおりであった。スクリーニングでは、Ｃｏｓｔａｒ３７０２培地結合３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。４０μＬ／ウェルの容量で、１×ＰＢＳ／０．０５％アジ化物中、４μｇ／ｍＬのニュートラビジンでプレートを被覆した。４℃で一晩、プレートを温置した。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を用いて、プレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。１×ＰＢＳ／１％ミルク９０μＬでプレートをブロックし、室温で約３０分間温置した。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いてプレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋中、１μｇ／ｍＬの濃度のビオチン化されたヒトＰＣＳＫ９Ｄ３７４Ｙでプレートを被覆し、室温で１時間温置した。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いてプレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。後期枯渇ハイブリドーマ培養上清をＰＢＳ／ミルク／Ｃａ２＋中に１：５希釈し（１０ｍＬ＋４０ｍＬ）、室温で１時間温置した。次に、１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋中、１μｇ／ｍＬで、ウサギ抗ヒトＰＣＳＫ９（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）及びヒト抗Ｈｉｓ１．２．３（１：２）の４０μＬ／ウェルをプレート上に滴定し、次いで、室温で１時間温置した。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いてプレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋中、１００ｎｇ／ｍＬ（１：４０００）の濃度のヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃＨＲＰ４０μＬ／ウェルをプレートに添加し、プレートを室温で１時間温置した。１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋中、１００ｎｇ／ｍＬ（１：４０００）の濃度のヤギ抗ウサギＩｇＧＦｃＨＲＰ４０μＬ／ウェルをプレートに添加し、プレートを室温で１時間温置した。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いてプレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。最後に、１工程ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ，  Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，  Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）の４０μＬ／ウェルをプレートに添加し、室温で３０分後に、１Ｎ塩酸の４０μＬ／ウェルを用いて消光した。Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍでＯＤを直ちに読み取った。野生型ＰＣＳＫ９に対する陽性ヒットの９６％以上が、変異体ＰＣＳＫ９も結合した。
【０３３２】
大規模受容体リガンド遮断スクリーニング
ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９結合を遮断する抗体をスクリーニングするために、Ｄ３７４ＹＰＣＳＫ９変異体を用いたアッセイを開発した。ＬＤＬＲに対してより高い結合親和性を有するので、このアッセイに対して変異体を使用し、より感度が高い受容体リガンド遮断アッセイの開発を可能とした。受容体リガンド遮断スクリーニングでは、以下のプロトコールを使用した。スクリーニングでは、Ｃｏｓｔａｒ３７０２培地結合３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。４０μＬ／ウェルの
容量で、１×ＰＢＳ／０．０５％アジ化物中、２μｇ／ｍＬのヤギ抗ＬＤＬＲ（Ｒ＆ＤＣａｔ＃ＡＦ２１４８）でプレートを被覆した。４℃で一晩、プレートを温置した。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を用いて、プレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。１×ＰＢＳ／１％ミルク９０μＬでプレートをブロックし、室温で約３０分間温置した。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いてプレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。捕捉試料は、ＬＤＬＲ（Ｒ＆Ｄ、Ｃａｔ＃２１４８ＬＤ／ＣＦ）であり、４０μＬ／ウェルの容量で、１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋中に０．４μｇ／ｍＬで添加した。次いで、プレートを室温で１時間１０分間温置した。同時に、Ｎｕｎｃポリプロピレンプレート中のハイブリドーマ枯渇上清１５μＬとともに、ビオチン化されたヒトＤ３７４ＹＰＣＳＫ９の２０ｎｇ／ｍＬを温置し、枯渇上清濃度を１：５希釈した。次いで、プレートを室温で約１時間３０分間事前温置した。次に、３サイクル洗浄を用いて作動されるＴｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。事前温置された混合物５０μＬ／ウェルを、ＬＤＬＲで被覆されたＥＬＩＳＡプレート上に移し、室温で１時間温置した。ＬＤＬＲに結合されたｂ−ＰＣＳＫ９を検出するために、アッセイ希釈液中の５００ｎｇ／ｍＬのストレプトアビジンＨＲＰ４０μＬ／ウェルをプレートに添加した。プレートを室温で１時間温置した。再度、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いてプレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。最後に、１工程ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ，  Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，  Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）の４０μＬ／ウェルをプレートに添加し、室温で３０分後に、１Ｎ塩酸の４０μＬ／ウェルを用いて消光した。Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍでＯＤを直ちに読み取った。スクリーニングによって、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲウェル間での相互作用を遮断する３８４の抗体が同定され、１００の抗体は相互作用を強く遮断した（ＯＤ＜０．３）。これらの抗体は、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲの結合相互作用を９０％超阻害した（９０％超の阻害）。
【０３３３】
遮断物質のサブセットに対する受容体リガンド結合アッセイ
次いで、第一の大規模受容体リガンド阻害アッセイにおいて同定された中和物質の３８４にサブセットに対して、変異体酵素を用いて受容体リガンドアッセイを反復した。３８４の遮断物質サブセットアッセイのスクリーニングでは、大規模受容体リガンド遮断スクリーニングにおいて行われたものと同じプロトコールを使用した。この反復スクリーニングによって、最初のスクリーニングデータが確認された。
【０３３４】
この３８４メンバーのサブセットのスクリーニングによって、９０％を超えて、ＰＣＳＫ９変異体酵素とＬＤＬＲ間の相互作用を遮断する８５の抗体が同定された。
【０３３５】
野生型ＰＣＳＫ９を結合するが、Ｄ３７４Ｙ変異体を結合しない遮断物質の受容体リガンド結合アッセイ
３０００の上清の当初パネル中には、野生型ＰＣＳＫ９に特異的に結合するが、ｈｕＰＣＳＫ９（Ｄ３７４Ｙ）変異体に結合しないことが示された８６の抗体が存在していた。ＬＤＬＲ受容体への野生型ＰＣＳＫ９の結合を遮断する能力に関して、これらの８６の上清を検査した。スクリーニングでは、以下のプロトコールを使用した。Ｃｏｓｔａｒ３７０２培地結合３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。４０μＬ／ウェルの容量で、１×ＰＢＳ／０．０５％アジ化物中、１０μｇ／ｍＬの抗Ｈｉｓ１．２．３でプレートを被覆した。４℃で一晩、プレートを温置した。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を用いて、プレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。１×ＰＢＳ／１％ミルク９０μＬでプレートをブロックし、室温で約３０分間温置した。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いてプレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。ＬＤＬＲ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，＃２１４８ＬＤ／ＣＦ又はＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，＃２１４８ＬＤ）を、４０μＬ／ウェルの容量で、１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋
中に５μｇ／ｍＬで添加した。次いで、プレートを室温で１時間温置した。次に、３サイクル洗浄を用いて作動されるＴｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。同時に、Ｎｕｎｃポリプロピレンプレート中のハイブリドーマ枯渇上清とともに、ビオチン化されたヒト野生型ＰＣＳＫ９を事前温置した。１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋中、５８３ｎｇ／ｍＬの濃度でｂ−ＰＣＳＫ９の３３μＬ中にハイブリドーマ上清２２μＬを移し、最終のｂ−ＰＣＳＫ９濃度＝３５０ｎｇ／ｍＬ及び１：２．５の最終希釈で枯渇上清を得た。プレートを室温で約１時間３０分間事前温置した。事前温置された混合物５０μＬ／ウェルを、ＬＤＬＲが捕捉されたＥＬＩＳＡプレート上に移し、室温で１時間温置した。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いてプレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。アッセイ希釈液中の５００ｎｇ／ｍＬのストレプトアビジンＨＲＰ４０μＬ／ウェルをプレートに添加した。プレートを室温で１時間温置した。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いてプレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。最後に、１工程ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ，  Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，
Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）の４０μＬ／ウェルをプレートに添加し、室温で３０分後に、１Ｎ塩酸の４０μＬ／ウェルを用いて消光した。Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍでＯＤを直ちに読み取った。
【０３３６】
スクリーニングの結果
記載されているアッセイの結果に基づいて、ＰＣＳＫ９との所望の相互作用を有する抗体を産生するとして、幾つかのハイブリドーマ株が同定された。各株からクローンの管理可能な数を単離するために、限外希釈を使用した。ハイブリドーマ株の数字（例えば、２１Ｂ１２）及びクローン数（例えば、２１Ｂ１２．１）によって、クローンを表記した。一般に、特定の株の異なるクローン間の差は、本明細書中に記載されている機能的アッセイによって検出された。２、３の事例では、機能的アッセイにおいて異なる挙動を示した特定の株からクローンが同定された。例えば、２５Ａ７．１はＰＣＳＫ９／ＬＤＬＲを遮断しないが、２５Ａ７．３（本明細書において、２５Ａ７と称される。）は中和性であることが見出された。単離されたクローンを、ハイブリドーマ溶媒５０から１００ｍＬ中でそれぞれ増殖させ、枯渇するまで増殖させた（すなわち、約１０％未満の細胞生存率）。これらの培養物の上清中でのＰＣＳＫ９に対する抗体の濃度及び効力を、本明細書中に記載されているようなＥＬＩＳＡによって、及びインビトロ機能的検査によって測定した。本明細書に記載されているスクリーニングの結果として、ＰＣＳＫ９に対する抗体の最も高い力価を有するハイブリドーマを同定した。図２Ａから３Ｄ及び表２中に、選択されたハイブリドーマが示されている。
【０３３７】
（実施例４．１）
ハイブリドーマからのヒト３１Ｈ４ＩｇＧ４抗体の作製
この実施例は、ハイブリドーマ株から、抗原結合タンパク質の１つをどのようにして作製するかについて一般的に記載する。作製作業は、枯渇上清生成５０ｍＬを使用した後、プロテインＡ精製を行った。Ｉｎｔｅｇｒａ作製を大規模化し、その後実行した。ハイブリドーマ株３１Ｈ４を、培地２０ｍＬ中のＴ７５フラスコで増殖させた（ＩｎｔｅｇｒａＭｅｄｉａ、表５）。ハイブリドーマはＴ７５フラスコ中でほぼ集密状態になった時点で、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコに移した（Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｔｅｇｒａ  ＣＬ１０００，  ｃａｔ＃  ９０  ００５）。
【０３３８】
Ｉｎｔｅｇｒａフラスコは、２つのチャンバー（小さなチャンバー及び大きなチャンバー）へ膜によって分けられた細胞培養フラスコである。３１Ｈ４ハイブリドーマ株から得られた１×１０６細胞／ｍＬの最小細胞密度のハイブリドーマ細胞２０から３０ｍＬ容量を、Ｉｎｔｅｇｒａ培地中のＩｎｔｅｇｒａフラスコの小さなチャンバー中に配置した（Ｉｎｔｅｇｒａ培地の成分に関しては、表５参照）。Ｉｎｔｅｇｒａ培地のみ（１Ｌ）を、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコの大きなチャンバー中に配置した。２つのチャンバーを隔てる
膜は、小分子量栄養素に対して透過性であるが、ハイブリドーマ細胞及びハイブリドーマ細胞によって産生された抗体に対して非透過性である。従って、ハイブリドーマ細胞及びそのハイブリドーマ細胞によって産生された抗体を小さなチャンバー中に保持した。
【０３３９】
１週後、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコの両チャンバーから培地を除去し、新鮮なＩｎｔｅｇｒａ培地と交換した。小さなチャンバーから集められた培地は、別個に保持した。増殖の第２週後に、小さなチャンバーから得た培地を再度集めた。ハイブリドーマ株から１週目に集めた培地を、ハイブリドーマ株から２週目に集めた培地と合わせた。ハイブリドーマ株から得られた集められた培地試料を遠心して、細胞及び破砕物を除去して（３０００ｒｐｍで１５分）、得られた上清をろ過した（０．２２μｍ）。透明になった馴化培地をプロテインＡ−セファロースカラム上に搭載した。場合によって、培地をまず濃縮し、次いで、プロテインＡセファロースカラム上に搭載することができる。徹底的なＰＢＳ洗浄によって、非特異的結合を除去した。プロテインＡカラムからの標準的酸性抗体溶出（５０ｍＭシトラート、ｐＨ３．０など）によって、プロテインＡ上に結合された抗体タンパク質を回収した。プロテインＡセファロースプール中の凝集した抗体タンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィー又はＱセファロース樹脂などの陰イオン交換樹脂上の結合イオン交換クロマトグラフィーによって除去した。３１Ｈ４タンパク質に対する特異的なＩＥＸ条件は、ｐＨ７．８から８．０でＱ−セファロースＨＰである。２５カラム容量の１０ｍＭから５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いて、抗体を溶出した。
【０３４０】
【表５】
2020058376.tif 000007
【０３４１】
（実施例４．２）
形質移入された細胞からの組換え３１Ｈ４ヒトＩｇＧ２抗体の作製
本実施例は、３１Ｈ４ＩｇＧ２抗体が形質移入された細胞からどのようにして作製されるかを概説している。一過性発現のために２９３細胞及び安定な発現のためにＣＨＯ細胞を、３１Ｈ４重鎖及び軽鎖をコードするプラスミドで形質移入した。細胞及び細胞破砕物を除去することによって、形質移入された細胞からの馴化培地を回収した。透明になった馴化培地をプロテインＡ−セファロースカラム上に搭載した。場合によって、培地をまず濃縮し、次いで、プロテインＡセファロースカラム上に搭載することができる。徹底的なＰＢＳ洗浄によって、非特異的結合を除去した。プロテインＡカラムからの標準的酸性抗体溶出（５０ｍＭシトラート、ｐＨ３．０など）によって、プロテインＡ上の結合された抗体タンパク質を回収した。プロテインＡセファロースプール中の凝集した抗体タンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィー又はＱセファロース樹脂などの陰イオン交換樹脂上の結合イオン交換クロマトグラフィーによって除去した。３１Ｈ４タンパク質に対する特異的なＩＥＸ条件は、ｐＨ７．８から８．０でＱ−セファロースＨＰである。２５カラム容量の１０ｍＭから５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いて、抗体を溶出した。
【０３４２】
（実施例５）
ハイブリドーマからのヒト２１Ｂ１２ＩｇＧ４抗体の作製
本実施例は、ハイブリドーマから抗体２１Ｂ１２ＩｇＧ４がどのようにして作製されたかを概説する。ハイブリドーマ株２１Ｂ１２を、培地中のＴ７５フラスコで増殖させた（ＩｎｔｅｇｒａＭｅｄｉａ、表５）。ハイブリドーマはＴ７５フラスコ中でほぼ集密状態になった時点で、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコに移した（Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｔｅｇｒａ  ＣＬ１０００，  ｃａｔ＃  ９０  ００５）。
【０３４３】
Ｉｎｔｅｇｒａフラスコは、２つのチャンバー（小さなチャンバー及び大きなチャンバー）へ膜によって分けられた細胞培養フラスコである。３１Ｈ４ハイブリドーマ株から得られた１×１０６細胞／ｍＬの最小細胞密度のハイブリドーマ細胞２０から３０ｍＬの容量を、Ｉｎｔｅｇｒａ培地中のＩｎｔｅｇｒａフラスコの小さなチャンバー中に配置した（Ｉｎｔｅｇｒａ培地の成分に関しては、表５参照）。Ｉｎｔｅｇｒａ培地のみ（１Ｌ）を、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコの大きなチャンバー中に配置した。２つのチャンバーを隔てる膜は、小分子量栄養素に対して透過性であるが、ハイブリドーマ細胞及びハイブリドーマ細胞によって産生された抗体に対して非透過性である。従って、ハイブリドーマ細胞及びそのハイブリドーマ細胞によって産生された抗体を小さなチャンバー中に保持した。１週後、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコの両チャンバーから培地を除去し、新鮮なＩｎｔｅｇｒａ培地と交換した。小さなチャンバーから集められた培地は、別個に保持された。増殖の２週後に、小さなチャンバーから得た培地を再度集めた。ハイブリドーマ株から１週目に集めた培地を、ハイブリドーマ株から２週目に集めた培地と合わせた。ハイブリドーマ株から得られた集められた培地試料を遠心して、細胞及び破砕物を除去して（３０００ｒｐｍで１５分）、得られた上清をろ過した（０．２２μｍ）。透明になった馴化培地をプロテインＡ−セファロースカラム上に搭載した。場合によって、培地をまず濃縮し、次いで、プロテインＡセファロースカラム上に搭載する。徹底的なＰＢＳ洗浄によって、非特異的結合を除去した。プロテインＡカラムからの標準的酸性抗体溶出（５０ｍＭシトラート、ｐＨ３．０など）によって、プロテインＡ上に結合された抗体タンパク質を回収した。プロテインＡセファロースプール中の凝集した抗体タンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィー又はＱセファロース樹脂などの陰イオン交換樹脂上の結合イオン交換クロマトグラフィーによって除去した。２１Ｂ１２タンパク質に対する特異的なＩＥＸ条件は、ｐＨ７．８から８．０でＱ−セファロースＨＰである。２５カラム容量の１０ｍＭから５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いて、抗体を溶出した。
【０３４４】
（実施例６）
形質移入された細胞からのヒト２１Ｂ１２ＩｇＧ２抗体の作製
本実施例は、２１Ｂ１２ＩｇＧ２抗体が形質移入された細胞からどのようにして作製されるかを概説している。細胞（一過性発現のために２９３細胞及び安定な発現のためにＣＨＯ細胞）を、２１Ｂ１２重鎖及び軽鎖をコードするプラスミドで形質移入した。細胞及び細胞破砕物を除去することによって、ハイブリドーマ細胞からの馴化培地を回収した。透明になった馴化培地をプロテインＡ−セファロースカラム上に搭載した。場合によって、培地をまず濃縮し、次いで、プロテインＡセファロースカラム上に搭載することができる。徹底的なＰＢＳ洗浄によって、非特異的結合を除去した。プロテインＡカラムからの標準的酸性抗体溶出（５０ｍＭシトラート、ｐＨ３．０など）によって、プロテインＡ上の結合された抗体タンパク質を回収した。プロテインＡセファロースプール中の凝集した抗体タンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィー又はＳＰ−セファロース樹脂などの陽イオン交換樹脂上の結合イオン交換クロマトグラフィーによって除去した。２１Ｂ１２タンパク質に対する特異的なＩＥＸ条件は、ｐＨ５．２でＳＰ−セファロースＨＰである。２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中の１０ｍＭから５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を含有する緩衝液の２５カラム容積で抗体を溶出した。
【０３４５】
（実施例７）
ハイブリドーマからのヒト１６Ｆ１２ＩｇＧ４抗体の作製
本実施例は、ハイブリドーマから抗体１６Ｆ１２ＩｇＧ４がどのようにして作製されたかを概説する。ハイブリドーマ株１６Ｆ１２を、培地中のＴ７５フラスコで増殖させた（表５参照）。ハイブリドーマはＴ７５フラスコ中でほぼ集密状態になった時点で、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコ（Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｔｅｇｒａ  ＣＬ１０００，ｃａｔ＃９０  ００５）に移した。
【０３４６】
Ｉｎｔｅｇｒａフラスコは、２つのチャンバー（小さなチャンバー及び大きなチャンバー）へ膜によって分けられた細胞培養フラスコである。３１Ｈ４ハイブリドーマ株から得られた１×１０６細胞／ｍＬの最小細胞密度のハイブリドーマ細胞２０から３０ｍＬの容量を、Ｉｎｔｅｇｒａ培地中のＩｎｔｅｇｒａフラスコの小さなチャンバー中に配置した（Ｉｎｔｅｇｒａ培地の成分に関しては、表５参照）。Ｉｎｔｅｇｒａ培地のみ（１Ｌ）を、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコの大きなチャンバー中に配置した。２つのチャンバーを隔てる膜は、小分子量栄養素に対して透過性であるが、ハイブリドーマ細胞及びハイブリドーマ細胞によって産生された抗体に対して非透過性である。従って、ハイブリドーマ細胞及びそのハイブリドーマ細胞によって産生された抗体を小さなチャンバー中に保持した。
【０３４７】
１週後、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコの両チャンバーから培地を除去し、新鮮なＩｎｔｅｇｒａ培地と交換した。小さなチャンバーから集められた培地は、別個に保持された。増殖の２週後に、小さなチャンバーから得た培地を再度集めた。ハイブリドーマ株から１週目に集めた培地を、ハイブリドーマ株から２週目に集めた培地と合わせた。ハイブリドーマ株から得られた集められた培地試料を遠心して、細胞及び破砕物を除去して（３０００ｒｐｍで１５分）、得られた上清をろ過した（０．２２μｍ）。透明になった馴化培地をプロテインＡ−セファロースカラム上に搭載した。場合によって、培地をまず濃縮し、次いで、プロテインＡセファロースカラム上に搭載することができる。徹底的なＰＢＳ洗浄によって、非特異的結合を除去した。プロテインＡカラムからの標準的酸性抗体溶出（５０ｍＭシトラート、ｐＨ３．０）によって、プロテインＡカラム上の結合された抗体タンパク質を回収した。プロテインＡセファロースプール中の凝集した抗体タンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィー又はＱセファロース樹脂などの陰イオン交換樹脂上の結合イオン交換クロマトグラフィーによって除去した。１６Ｆ１２タンパク質に対する特異的なＩＥＸ条件は、ｐＨ７．８から８．０でＱ−セファロースＨＰである。２５カラム容量の１０ｍＭから５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いて、抗体を溶出した。
【０３４８】
（実施例８）
形質移入された細胞からのヒト１６Ｆ１２ＩｇＧ２抗体の作製
本実施例は、１６Ｆ１２ＩｇＧ２抗体が形質移入された細胞からどのようにして作製されるかを概説している。細胞（一過性発現のために２９３細胞及び安定な発現のためにＣＨＯ細胞）を、１６Ｆ１２重鎖及び軽鎖をコードするプラスミドで形質移入した。細胞及び細胞破砕物を除去することによって、ハイブリドーマ細胞からの馴化培地を回収した。透明になった馴化培地をプロテインＡ−セファロースカラム上に搭載した。場合によって、培地をまず濃縮し、次いで、プロテインＡセファロースカラム上に搭載することができる。徹底的なＰＢＳ洗浄によって、非特異的結合を除去した。プロテインＡカラムからの標準的酸性抗体溶出（５０ｍＭシトラート、ｐＨ３．０）によって、プロテインＡ上の結合された抗体タンパク質を回収した。プロテインＡセファロースプール中の凝集した抗体タンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィー又はＳＰ−セファロース樹脂などの陽イオン交換樹脂上の結合イオン交換クロマトグラフィーによって除去した。１６Ｆ１２タンパク質に対する特異的なＩＥＸ条件は、ｐＨ５．２でＳＰ−セファロースＨＰである。２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中の１０ｍＭから５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を含有する緩衝液の２５カラム容積で抗体を溶出する。
【０３４９】
（実施例９）
抗体重鎖及び軽鎖の配列分析
次いで、Ｓａｎｇｅｒ（ジデオキシ）ヌクレオチド配列決定によって、上記抗体の軽鎖及び重鎖に対する核酸及びアミノ酸配列を決定した。次いで、核酸配列に対してアミノ酸配列を推定した。可変ドメインに対する核酸配列が、図３Ｅから３ＪＪに図示されている。
【０３５０】
３１Ｈ４、２１２Ｂ１２及び１６Ｆ１２のλ軽鎖可変領域に対するｃＤＮＡ配列が決定され、それぞれ、配列１５３、９５及び１０５として開示されている。
【０３５１】
３１Ｈ４、２１２Ｂ１２及び１６Ｆ１２の重鎖可変領域に対するｃＤＮＡ配列が決定され、それぞれ、配列１５２、９４及び１０４として開示されている。
【０３５２】
λ軽鎖定常領域（配列番号１５６）並びにＩｇＧ２及びＩｇＧ４重鎖定常領域（配列番号１５４及び１５５）が、図３ＫＫに示されている。
【０３５３】
ｃＤＮＡ配列の各々から予想されたポリペプチド配列を決定した。３１Ｈ４、２１Ｂ１２及び１６Ｆ１２のλ軽鎖可変領域に対する予想ポリペプチド配列が予想され、それぞれ、配列番号１２、２３及び３５として開示されており、λ軽鎖定常領域（配列番号１５６）、３１Ｈ４、２１Ｂ１２及び１６Ｆ１２の重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号６７、４９及び７９として開示されている。ＩｇＧ２及びＩｇＧ４重鎖定常領域（配列番号１５４及び１５５）。
【０３５４】
ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４分類が、図２Ａから３Ｄに示されている。
【０３５５】
配列データに基づいて、それぞれの重鎖又は軽鎖可変領域が得られた生殖系列遺伝子を決定した。図２Ａから３Ｄにおいて、生殖系列遺伝子の種類は対応するハイブリドーマ株の隣に示されおり、それぞれ、一意的な配列番号によって表されている。図２Ａから３Ｄは、性質決定されたさらなる抗体に対する決定されたアミノ酸配列も図示している。
【０３５６】
（実施例８）
３つの抗体の等電点の測定
アミノ酸配列に基づく抗体の理論的ｐＩは、１６Ｆ１２に対して７．３６、２１Ｂ１２に対して８．４７及び３１Ｈ４に対して６．８４であることが決定された。
【０３５７】
（実施例９）
ＰＣＳＫ９に対する抗体の結合の性質決定
ＰＣＳＫ９に結合する多数の抗原が同定されたら、結合の性質を定量し、さらに性質決定するために、幾つかのアプローチを使用した。研究の一態様において、Ｂｉａｃｏｒｅアフィニティー分析を実施した。研究の別の態様において、ＫｉｎＥｘＡ（Ｒ）アフィニティー分析を実施した。これらの研究において使用された試料及び緩衝液が、下表６に示されている。
【０３５８】
【表６】
2020058376.tif 000008
【０３５９】
ＢＩＡｃｏｒｅ親和性測定
本実施例に記載されているＰＣＳＫ９に対する２１Ｂ１２抗体のＢＩＡｃｏｒｅ（Ｒ）（表面プラズモン共鳴装置、Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）親和性分析は、製造業者の指示書に従って行った。
【０３６０】
要約すれば、表面プラズモン共鳴実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００光学的バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ，  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）を用いて行った。２００以下の共鳴単位（ＲＵ）の最大分析物結合応答（Ｒｍａｘ）を与えるレベルで、アミン結合によって研究等級のＣＭ５バイオセンサーチップに、それぞれの個別の抗ＰＣＳＫ９抗体を固定化した。ＰＣＳＫ９タンパク質の濃度は２倍間隔で変動させ（分析物）、（１．５分間、１００μＬ／分の流速で）固定化された抗体表面上に注入した。０．０１％ＢＳＡが補充された新鮮なＨＢＳ−Ｐ緩衝液（ｐＨ７．４、０．０１ＭＨｅｐｅｓ、０．１５ＭＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ−２０、Ｂｉａｃｏｒｅ）を結合緩衝液として使用した。ｐＨ７．４のヒト、マウス及びカニクイザルＰＣＳＫ９タンパク質の各々に対する別個の実験において、各抗ＰＣＳＫ９抗体の結合親和性を測定した（使用した濃度は、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５及び０ｎＭ）。
【０３６１】
さらに、ヒトＰＣＳＫ９に対する抗体の結合親和性は、０．０１％ＢＳＡが補充されたｐＨ６．０ＨＢＳ−Ｐ緩衝液（ｐＨ６．０、０．０１ＭＨｅｐｅｓ、０．１５ＭＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ−２０、Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて、ｐＨ６．０でも測定した。得られた結合シグナルは、溶液中の遊離ＰＣＳＫ９に比例していた。解離平衡定数（ＫＤ）は、二重曲線一部位均一結合モデル（ＫｉｎＥｘＡ（Ｒ）ソフトウェア、Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｉｓｅ，ＩＤ）（６．０ｐＨの実行に対して、ｎ＝１）を用いて、競合曲線の非線形回帰分析から得た。興味深いことに、抗体は、より低いｐＨで、より強固な結合親和性を示すように見受けられた（Ｋｄは、それぞれ、３１Ｈ４、２１Ｂ１２及び１６Ｆ１２に対して、１２．５、７．３及び２９ｐＭであった。）。
【０３６２】
ｋａ（会合速度定数）、ｋｄ（解離速度定数）及びＫＤ（解離平衡定数）などの抗体結合速度論パラメータは、ＢＩＡ評価３．１コンピュータプログラム（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて測定した。より低い解離平衡定数は、ＰＣＳＫ９に対する抗体のより大きな親和性を示す。ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｒ）親和性分析によって測定されたＫＤ値は、以下に示されている表７．１に表されている。
【０３６３】
【表７】
2020058376.tif 000009
【０３６４】
表７．２は、ｋｏｎ及びｋｏｆｆ速度を図示する。
【０３６５】
【表８】
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【０３６６】
ＫｉｎＥｘＡ（Ｒ）親和性測定
１６Ｆ１２及び３１Ｈ４のＫｉｎＥｘＡ（Ｒ）（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｂｏｉｓｅ，  ＩＤ）親和性分析は、製造業者の指示書に従って行った。簡潔に述べれば、Ｒｅａｃｔｉ−ＧｅｌＴＭ（６ｘ）（Ｐｉｅｒｃｅ）を、ヒトＶ５タグ付加されたカニクイザル又はＨｉｓタグ付加されたマウスＰＣＳＫ９タンパク質の１つで予め被覆し、ＢＳＡでブロックした。次いで、抗体１６Ｆ１２又は抗体３１Ｈ４及びＰＣＳＫ９タンパク質の１つの何れかの１０又は１００ｐＭを、ＰＣＳＫ９が被覆されたビーズを通過させる前に、室温で８時間、ＰＣＳＫ９タンパク質の様々な濃度（０．１ｐＭから２５ｎＭ）とともに温置した。ビーズが結合された１６Ｆ１２又は３１Ｈ４の量を、蛍光的に（Ｃｙ５）標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ
Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって定量した。結合シグナルは、結合平衡での遊離の１６Ｆ１２又は３１Ｈ４の濃度に比例している。一部位均一結合モデルを用いて、競合曲線の２つの組の非線形回帰から、平衡解離定数（ＫＤ）を得た。ＫｉｎＥｘＡ（Ｒ）Ｐｒｏソフトウェアを分析で使用した。この分析において作製された結合曲線が、図４Ａから４Ｆとして表されている。
【０３６７】
１６Ｆ１２及び３１Ｈ４抗体は何れも、ヒト及びカニクイザルＰＣＳＫ９に対して類似
の親和性を示したが、マウスＰＣＳＫ９に対して約１０から２５０倍より低い親和性を示した。ＫｉｎＥｘＡ（Ｒ）システムを用いて検査された２つの抗体のうち、抗体３１Ｈ４は、それぞれ、３及び２ｐＭのＫＤで、ヒト及びカニクイザルＰＣＳＫ９の両方に対してより高い親和性を示した。１６Ｆ１２は、ヒトＰＣＳＫ９に対して１５ｐＭのＫＤで、及びカイニクイザルＰＣＳＫ９に対して１６ｐＭのＫＤで、若干より弱い親和性を示した。
【０３６８】
ＫｉｎＥｘＡ（Ｒ）親和性分析の結果が、以下に示されている表８．１に要約されている。
【０３６９】
【表９】
2020058376.tif 000011
【０３７０】
さらに、試料の質及び量をチェックするために、ＳＤＳＰＡＧＥを実施し、図５Ａに示されている。ｃＰＣＳＫ９は、ゲル上で約５０％未満を示し、ＫｉｎＥｘＡ（Ｒ）アッセイから計算された活性結合濃度からも示した。従って、ｃＰＣＳＫ９に対するｍＡＢのＫＤは、活性なｃＰＣＳＫ９の５０％として調整された。
【０３７１】
ＡＢＰ２１Ｂ１２に対するＫｄ値を測定するために、ＢＩＡｃｏｒｅ溶液平衡結合アッセイを使用した。２１Ｂ１２．１は、ＫｉｎＥｘＡアッセイを用いてほとんどシグナルを示さず、従って、ｂｉａｃｏｒｅ溶液平衡アッセイを用いた。固定化されたＰＣＳＫ９表面に対する抗体の結合に対して、有意な結合が観察されたので、約７０００ＲＵの密度でのアミン結合を用いて、ＣＭ５チップのフローセル４の上に、２１Ｂ１２抗体を固定化した。フローセル３は、バックグラウンド対照として使用した。ヒトＰＣＳＫ９又はカニクイザルＰＣＳＫ９の０．３、１及び３ｎＭを、０．１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ、０．００５％Ｐ２０を加えたＰＢＳ中の２１Ｂ１２．１抗体試料（０．００１から２５ｎＭの範囲）の系列希釈と混合した。混合された溶液中での遊離のＰＣＳＫ９の結合を、２１Ｂ１２．１抗体表面上に注入することによって測定した。２１Ｂ１２．１表面上の１００％のＰＣＳＫ９結合シグナルを、溶液中のｍＡｂの不存在下で測定した。ｍＡｂの増加する濃度につれて減少したＰＣＳＫ９の結合応答は、溶液中でのｍＡｂへのＰＣＳＫ９の結合を示し、これによって、固定化されたペプチボディ表面へのＰＣＳＫ９の結合を遮断した。ｍＡｂ濃度に対してＰＣＳＫ９結合シグナルをプロットして、ＫｉｎＥｘＡＰｒｏＴＭソフトウェア中の一部位均一結合モデルを用いて、曲線の３つの組（０．３、１及び３ｎＭの固定されたＰＣＳＫ９濃度）からＫＤを計算した。ｃＰＣＳＫ９はＫｉｎＥｘＡアッセイ及びＳＤＳ−ゲルから観察されたより低いタンパク質濃度を有するが、ｃＰＣＳＫ９の濃度はＫＤの計算のために使用されなかったので、ここでは、その濃度は調整しなかった。結果は、下表８．２及び図５Ｂから５Ｄ中に示されている。図５Ｂは、ｈＰＣＳＫ９に対する３つの異なるｈＰＣＳＫ９濃度での溶液平衡アッセイから得られた結果を図示している。図５Ｃは、ｍＰＣＳＫ９に対する一群の類似の結果を図示する。図５Ｄは、上記ｂｉａｃｏｒｅ捕捉アッセイから得られた結果を図示する。
【０３７２】
【表１０】
2020058376.tif 000012
【０３７３】
（実施例１０）
エピトープビニング
抗ＰＣＳＫ９抗体のビニングのために、競合ＥＬＩＳＡを使用した。要約すれば、２つの抗体が同じエピトープのビンに属するかどうかを決定するために、一晩の温置によって、２μｇ／ｍＬで、ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ）上に、まず抗体（ｍＡｂ１）の１つを被覆した。次いで、プレートを洗浄し、３％ＢＳＡでブロックした。一方、ビオチン化されたｈＰＣＳＫ９の３０ｎｇ／ｍＬを、室温で２時間、第二の抗体（ｍＡｂ２）とともに温置した。混合物を被覆されたｍＡｂ１に適用し、室温で１時間温置した。次いで、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、１：５０００の希釈で１時間、Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）とともに温置した。さらなる洗浄後、ＴＭＢ基質とともにプレートを温置し、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレートリーダーを用いて、シグナルを６５０ｎｍで検出した。同じ結合特性を有する抗体を、同じエピトープビンの中にグループ分けした。抗体ビニング研究の結果が、表８．３に示されている。
【０３７４】
【表１１】
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2020058376.tif 000014
【０３７５】
ＢＩＡｃｏｒｅを用いて、エピトープビニングのさらなる検査を行った。約８０００ＲＵの密度で、３つのｍＡｂ１６Ｆ１２、２１Ｂ１２及び３１Ｈ４を、フローセル２、３及び４の上に固定化した。約１００から５００ＲＵに到達させるために、ヒト、マウス及びカニクイザルから得られた５ｎＭＰＣＳＫ９を、ｍＡｂ表面上に注入した。次いで、ＰＣＳＫ９表面上に、１０ｎＭｍＡｂを注入した。次いで、３つのｍＡｂ上で、３つの異なるＰＣＳＫ９タンパク質への３つのｍＡｂの結合を記録した。
【０３７６】
２つのｍＡｂが抗原上の類似のエピトープを有するのであれば、ｍＡｂ１は、ｍＡｂ２に既に結合された抗原への結合を示さない。２つのｍＡｂが抗原上の異なるエピトープを
有するのであれば、ｍＡｂ１は、ｍＡｂ２に結合された抗原への結合を示す。図５Ｅは、ヒトＰＣＳｋ９に対する３つのｍＡｂに対して、グラフ形式でこれらのエピトープビニングの結果を図示している。ｍＰＣＳＫ９及びｃＰＣＳＫ９に対して、類似のパターンが観察された。グラフに示されているように、１６Ｆ１２及び３１Ｈ４は類似のエピトープを共有するように見受けられるが、２１Ｂ１２は異なるエピトープを有するように見受けられる。
【０３７７】
（実施例１１）
Ｄ３７４ＹＰＣＳＫ９／ＬＤＬＲ結合を遮断する３１Ｈ４及び２１Ｂ１２の効果
本実施例は、ＰＣＳＫ９Ｄ３７４ＹがＬＤＬＲに結合する能力を遮断する上での、抗体の２つに対するＩＣ５０値を提供する。緩衝液Ａ（１００ｍＭカコジル酸ナトリウム、ｐＨ７．４）中に希釈されたヤギ抗ＬＤＬ受容体抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）２μｇ／ｍＬで、透明な３８４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）を被覆した。緩衝液Ａでプレートを完全に洗浄した後、緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ中の１％ミルク）で２時間ブロックした。洗浄後、緩衝液Ｃ（１０ｍＭＣａＣｌ２が補充された緩衝液Ｂ）中に希釈されたＬＤＬ受容体（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）０．４μｇ／ｍＬとともに、プレートを１．５時間温置した。この温置と同時に、緩衝液Ａ中に希釈された３１Ｈ４ＩｇＧ２、３１Ｈ４ＩｇＧ４、２１Ｂ１２ＩｇＧ２又は２１Ｂ１２ＩｇＧ４抗体の様々な濃度又は緩衝液Ａのみ（対照）とともに、ビオチン化されたＤ３７４ＹＰＣＳＫ９の２０ｎｇ／ｍＬを温置した。ＬＤＬ受容体を含有するプレートを洗浄し、ビオチン化されたＤ３７４ＹＰＣＳＫ９／抗体混合物をプレートに移し、室温で１時間温置した。ＬＤＬ受容体へのビオチン化されたＤ３７４Ｙの結合は、緩衝液Ｃ中の５００ｎｇ／ｍＬのストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）とともに、次いで、ＴＭＢ基質（ＫＰＬ）とともに温置することによって検出した。１ＮＨＣｌを用いてシグナルを消光し、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
【０３７８】
この結合研究の結果が、図６Ａから６Ｄに示されている。要約すると、各抗体に対してＩＣ５０値を測定し、３１Ｈ４ＩｇＧ２に対して１９９ｐＭ（図６Ａ）、３１Ｈ４ＩｇＧ４に対して１５６ｐＭ（図６Ｂ）、２１Ｂ１２ＩｇＧ２に対して１７０ｐＭ（図６Ｃ）及び２１Ｂ１２ＩｇＧ４に対して１６９ｐＭ（図６Ｄ）であることが見出された。
【０３７９】
抗体は、このアッセイにおいて、ＬＤＬＲへの野生型ＰＣＳＫ９の結合も遮断した。
【０３８０】
（実施例１２）
細胞ＬＤＬ取り込みアッセイ
本実施例は、様々な抗原結合タンパク質が細胞によるＬＤＬの取り込みを低下させ得ることを示す。１０％ＦＢＳが補充されたＤＭＥＭ培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ）中に、５×１０５細胞／ウェルの濃度で、透明な底の黒い９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）中に、ヒトＨｅｐＧ２細胞を播種し、３７℃（５％ＣＯ２）で一晩温置した。ＰＣＳＫ９と抗体複合体を形成させるために、取り込み緩衝液（１％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ）中に希釈された抗体の様々な濃度又は取り込み緩衝液のみ（対照）とともに、室温で１時間、Ｄ３７４ＹヒトＰＣＳＫ９の２μｇ／ｍＬを温置した。ＰＢＳで細胞を洗浄した後、Ｄ３７４ＹＰＣＳＫ９／抗体混合物を細胞に移した後、６μｇ／ｍＬの最終濃度で、取り込み緩衝液中にＬＤＬ−ＢＯＤＩＰＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を希釈した。３７℃（５％ＣＯ２）で３時間の温置後、細胞をＰＢＳで完全に洗浄し、４８０から５２０ｎｍ（励起）及び５２０から６００ｎｍ（発光）で、ＳａｆｉｒｅＴＭ（ＴＥＣＡＮ）によって、細胞蛍光シグナルを検出した。
【０３８１】
細胞取り込みアッセイの結果が、図７Ａから７Ｄに示されている。要約すると、各抗体に対してＩＣ５０値を測定し、３１Ｈ４ＩｇＧ２に対して１６．７ｎＭ（図７Ａ）、３１Ｈ４ＩｇＧ４に対して１３．３ｎＭ（図７Ｂ）、２１Ｂ１２ＩｇＧ２に対して１３．３ｎ
Ｍ（図７Ｃ）及び２１Ｂ１２ＩｇＧ４に対して１８ｎＭ（図７Ｄ）であることが見出された。これらの結果は、適用された抗原結合タンパク質がＰＣＳＫ９（Ｄ３７４Ｙ）の効果を低下させて、細胞によるＬＤＬの取り込みを遮断できることを示している。抗体は、このアッセイにおいて、野生型ＰＣＳＫ９の効果も遮断した。
【０３８２】
（実施例１３）
６日の研究における３１Ｈ４抗体の血清コレステロール低下効果
ＰＣＳＫ９タンパク質に対する抗体治療を介した野生型（ＷＴ）マウスにおける総血清コレステロール（ＴＣ）低下を評価するために、以下の手順を行った。
【０３８３】
Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から得られた雄のＷＴマウス（Ｃ５７ＢＬ／６系統、９から１０週齢、１７−２７ｇ）には、実験の期間を通じて、通常の食餌（Ｈａｒｌａｎｄ−Ｔｅｋｌａｄ，  Ｄｉｅｔ２９１８）を与えた。ｔ＝０において、マウスの尾静脈を通じて、１０ｍｇ／ｋｇのレベルで、抗ＰＣＳＫ９抗体３１Ｈ４（ＰＢＳ中の２ｍｇ／ｍＬ）又は対照ＩｇＧ（ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬ）の何れかをマウスに投与した。ナイーブマウスも、ナイーブ対照群として別に分けた。投薬群及び屠殺の時間が、表９に示されている。
【０３８４】
【表１２】
2020058376.tif 000015
【０３８５】
表９に示されている所定の時点でのＣＯ２窒息を用いて、マウスを屠殺した。大静脈を介して、エッペンドルフチューブの中に血液を集め、室温で３０分間凝固させた。次いで、血清を分離するために、１０分間、１２，０００×ｇでの卓上遠心機中で、試料を遠心沈降させた。Ｈｉｔａｃｈｉ９１２臨床分析装置及びＲｏｃｈｅ／ＨｉｔａｃｈｉＴＣ及びＨＤＬ−Ｃキットを用いて、血清総コレステロール及びＨＤＬ−Ｃを測定した。
【０３８６】
実験の結果が、図８Ａから８Ｄに示されている。要約すると、抗体３１Ｈ４が投与されたマウスは、実験の間にわたって、減少した血清コレステロールレベルを示した（図８Ａ及び図８Ｂ）。さらに、マウスは減少したＨＤＬレベルを示すことも注目される（図８Ｃ及び図８Ｄ）。図８Ａ及び図８Ｃに関して、％変化は、同じ時点での対照ＩｇＧに対する（＊Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５）。図８Ｂ及び８Ｄに関して、％変化は、ｔ＝０時間で、ナイーブ動物中において測定された総血清コレステロール及びＨＤＬレベルに対する（＊Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５）。
【０３８７】
低下したＨＤＬレベルに関して、マウス中でのＨＤＬの減少はＨＤＬの減少がヒトで起きることを示唆せず、この生物中での血清コレステロールが減少したことをさらに反映するに過ぎないことが当業者に理解されることが注目される。マウスは高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）粒子中に血清コレステロールの大半を輸送し、これはＬＤＬ粒子上に殆どの血清コレステロールを有するヒトとは異なることが注目される。マウスでは、総血清コレステロールの測定は、血清ＨＤＬ−Ｃのレベルを最も近似する。マウスＨＤＬは、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）に対するリガンドであるアポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）を含有しており、ＬＤＬＲによるＨＤＬの排除を可能とする。従って、ＨＤＬを調べることは、マウスにおける、本実施例での適切な指標である（ＨＤＬの減少は、ヒトに対しては予測されないことが理解される。）。これに対して、例えば、ヒトＨＤＬは、ａｐｏＥを含有しておらず、ＬＤＬＲに対するリガンドではない。ＰＣＳＫ９抗体はマウス中でのＬＤＬＲ発現を増加させるので、肝臓はより多くのＨＤＬを排除させることができ、従って、血清ＨＤＬ−Ｃレベルを低下させる。
【０３８８】
（実施例１４）
６日の研究における、ＬＤＬＲレベルに対する抗体３１Ｈ４の効果
本実施例は、予想されたように、抗原結合タンパク質が、経時的に、対象中のＬＤＬＲのレベルを変化させることを示す。ＬＤＬＲレベルに対する抗体３１Ｈ４の効果を確認するために、ウェスタンブロット分析を行った。実施例１３で記載した屠殺されたマウスから得られた肝臓組織５０から１００ｍｇを、完全なプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）０．３ｍＬ中において均質化した。ホモゲネートを氷上で３０分間温置し、細胞破砕物を沈降させるために遠心した。ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイ試薬（Ｂｉｏ  Ｒａｄ
ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、上清中のタンパク質濃度を測定した。７０℃で１０分間、タンパク質１００μｇを変性させ、４から１２％Ｂｉｓ−ＴｒｉｓＳＤＳ勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離した。０．４５μｍＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にタンパク質を移し、室温で１時間、５％無脂肪ミルクを含有する洗浄緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ  ＰＨ７．５，  １５０ｍＭＮａＣｌ，  ２ｍＭＣａＣｌ２及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中でブロックした。次いで、室温で１時間、ヤギ抗マウスＬＤＬＲ抗体（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍ）１：２０００又は抗βアクチン（ｓｉｇｍａ）１：２０００を用いて、ブロットのプローブ検査を行った。ブロットを短時間洗浄し、ウシ抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）１：２０００又はヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｕｐｓｔａｔｅ）１：２０００とともに温置した。室温で１時間の温置後、ブロットを完全に洗浄し、ＥＣＬｐｌｕｓキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、免疫反応性バンドを検出した。ウェスタンブロットは、図９に図示されているように、抗体３１Ｈ４の存在下でのＬＤＬＲタンパク質レベルの増加を示した。
【０３８９】
（実施例１５）
１３日の研究における抗体３１Ｈ４の血清コレステロール低下効果
１３日の研究において、ＰＣＳＫ９タンパク質に対する抗体治療を介した野生型（ＷＴ）マウスにおける総血清コレステロール（ＴＣ）低下を評価するために、以下の手順を行った。
【０３９０】
Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＢａｒＨａｒｂｏｒ，ＭＥ）から得られた雄のＷＴマウス（Ｃ５７ＢＬ／６系統、９から１０週齢、１７−２７ｇ）には、実験の期間を通じて、通常の食餌（Ｈａｒｌａｎｄ−Ｔｅｋｌａｄ，  Ｄｉｅｔ  ２９１８）を与えた。ｔ＝０において、マウスの尾静脈を通じて、１０ｍｇ／ｋｇのレベルで、抗ＰＣＳＫ９抗体３１Ｈ４（ＰＢＳ中の２ｍｇ／ｍＬ）又は対照ＩｇＧ（ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬ）の
何れかをマウスに投与した。ナイーブマウスも、ナイーブ対照群として別に分けた。
【０３９１】
投薬群及び屠殺の時間が、表１０に示されている。動物を屠殺し、肝臓を摘出し、実施例１３のとおりに調製した。
【０３９２】
【表１３】
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【０３９３】
６日の実験を１３日の研究に延長すると、６日の研究において観察された同じ血清コレステロール低下効果が、１３日の研究においても観察された。より具体的には、１０ｍｇ／ｋｇで投薬された動物は、３日目に、血清コレステロールの３１％の減少を示し、１３日までに、投薬前レベルまで徐々に戻った。図１０Ａは、この実験の結果を図示する。図１０Ｃは、３１Ｈ４の１０ｍｇ／ｋｇ用量を用いた、及び同じく１０ｍｇ／ｋｇの別の抗体１６Ｆ１２を用いた上記手順を反復した結果を図示している。投薬群及び屠殺の時間が、表１１に示されている。
【０３９４】
【表１４】
2020058376.tif 000017
【０３９５】
図１０Ｃに示されているように、１６Ｆ１２及び３１Ｈ４は何れも、単回投薬のみの後に、総血清コレステロールの著しく、大幅な減少をもたらし、１週以上にわたって（１０日又はそれ以上）有益であった。反復された１３日の研究の結果は最初の１３日の研究の結果と合致しており、３日目における２６％の血清コレステロールレベルの減少が観察される。図１０Ａ及び図１０Ｂに関して、％変化は、同じ時点での対照ＩｇＧに対する（＊Ｐ＜０．０１）。図１０Ｃに関して、％変化は、同じ時点での対照ＩｇＧに対する（＊Ｐ＜０．０５）。
【０３９６】
（実施例１６）
１３日の研究における、ＨＤＬレベルに対する抗体３１Ｈ４の効果
実施例１５中の動物に対するＨＤＬレベルも調べた。ＨＤＬレベルは、マウスにおいて減少していた。より具体的には、１０ｍｇ／ｋｇで投薬された動物は、３日目に、ＨＤＬレベルの３３％の減少を示し、１３日までに、投薬前レベルまで徐々に復帰した。図１０Ｂは、この実験の結果を図示する。３日目に、３４％のＨＤＬレベルの減少が存在した。図１０Ｂは、反復された１３日の実験の結果を図示する。
【０３９７】
当業者に理解されるように、抗体はマウスＨＤＬを低下させるが、ヒト及び他の生物（マウスなど）でのＨＤＬの差のために、これは、ヒトで起こるとは予想されない。従って、マウスＨＤＬの減少はヒトＨＤＬの減少を示唆するものではない。
【０３９８】
（実施例１７）
抗体の反復投与は抗原結合ペプチドの継続的な有益性をもたらす
追加の投薬によるさらなる有益性に関して、上記実施例において得られた結果を延長することができるかを確認するために、実施例１５及び１６中の実験を反復した（投薬スケジュールは、図１１Ａに図示されている。）。結果は、図１１Ｂに示されている。図１１Ｂのグラフから明らかなように、全てのマウスが３１Ｈ４抗原結合タンパク質の最初の注射を受けたので、マウスの両群は総血清コレステロールの著しい減少を示し、３１Ｈ４ＡＢＰのさらなる注射を受けたマウスは、総血清コレステロールの継続した低下を示したのに対して、対照注射を受けただけのマウスは、最終的には、総血清コレステロールの増加を示した。図１１に関して、％変化は、ｔ＝０時間でのナイーブ動物に対する（＊Ｐ＜０．０１，  ＊＊Ｐ＜０．００１）。
【０３９９】
本実施例から得られる結果は、対象中での生物学的調整のために、反復適用が効力の低下をもたらす他のコレステロール治療法とは異なり、本発明のアプローチには、検査した時間においては、この問題が存在しないように見受けられることを示している。さらに、このことは、前実施例において観察された、ベースラインへの総血清コレステロール又はＨＤＬコレステロールレベルの復帰が、対象によって発達された治療に対する何らかの耐性によるものではなく、対象中での利用可能な抗体の枯渇によるものであることを示唆している。
【０４００】
（実施例１８）
ヒト抗ＰＣＳＫ９抗体のエピトープマッピング
本実施例は、ＰＣＳＫ９中の何れの残基が、ＰＣＳＫ９に対する本明細書中に開示されている抗原結合タンパク質に対するエピトープの形成に関与し、又はその一部であることを決定するための方法を概説する。
【０４０１】
本発明のＡＢＰの幾つかが結合するエピトープを決定するために、特異的ＰＣＳＫ９ペプチド配列に由来する合成ペプチドを用いて、ＡＢＰのエピトープをマッピングすることができる。
【０４０２】
ペプチドエピトープとのヒト抗ＰＣＳＫ９抗体の分子相互作用を研究するために、ＳＰＯＴｓペプチドアレイ（ＳｉｇｍａＧｅｎｏｓｙｓ）を使用することができる。ＳＰＯＴｓ技術は、抗体エピトープの系統的分析に適したフォーマットでのペプチドの固相合成を基礎としている。特注のアレイ化されたオリゴペプチドの合成は、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓから市販されている。ＰＣＳＫ９ペプチドのアミノ酸配列に由来する重複するオリゴペプチドのペプチドアレイを得ることができる。アレイは、ポリプロピレン膜シート上のスポットとして、一連の１２マーのペプチドを含むことができる。ペプチドアレイは、ＰＣＳＫ９成熟配列の完全長を包含し得る。各連続するペプチドは、前ペプチドからの１つの残基によって埋め合わされることができ、アレイ化されたオリゴペプチドの入れ子状の重複したライブラリーを与える。ペプチドを有する膜は、異なる抗ＰＣＳＫ９抗体（１μｇ／ｍＬ）と反応することができる。膜に結合されたペプチドへのｍＡｂの結合は、ＨＲＰ連結された二次抗体を用いた酵素結合免疫吸着検定法に続く、強化された化学発光（ＥＣＬ；ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）によって評価することができる。
【０４０３】
さらに、機能的なエピトープは、コンビナトリアルアラニンスキャニングによってマッピングすることができる。このプロセスにおいて、抗ＰＣＳＫ９ＡＢＰとの相互作用に必要なＰＣＳＫ９タンパク質中のアミノ酸を同定するために、コンビナトリアルアラニンスキャニング戦略を使用することができる。これを達成するために、アラニンスキャニングのために、ＳＰＯＴｓアレイの第二の組を使用することができる。１２残基の各々の中にアラニン置換を有するバリアントペプチドのパネルを上述のようにスキャンすることができる。これによって、ヒトＰＣＳＫ９へのＡＢＰに対するエピトープのマッピング及び同
定が可能となる。
【０４０４】
これに代えて、エピトープが立体構造であり得ることに鑑みれば、エピトープを同定するために、アラニンスキャニング及び／又はアルギニンスキャニング、抗体ＦＡＢ／ＰＣＳＫ９共結晶化及び限定的タンパク質分解／ＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー質量分析）の組み合わせを使用することができる。
【０４０５】
（実施例１９）
コレステロール関連疾患を治療するためのＰＣＳＫ９抗体の使用
（コレステロール（血清コレステロールなど）の低下が有益であり得る）コレステロール関連疾患を示すヒト患者に、ＰＣＳＫ９抗体３１Ｈ４（又は、例えば、２１Ｂ１２若しくは１６Ｆ１２）の治療的有効量が投与される。治療中の定期的な時点で、疾患の症候が沈静化したかどうかを測定するために、患者をモニターする。治療後に、ＰＣＳＫ９抗体を用いた治療を行っている患者は、治療されていない患者と比べて、低下した血清コレステロールレベルを有することが見出される。
【０４０６】
（実施例２０）
高コレステロール血症を治療するためのＰＣＳＫ９抗体の使用
高コレステロール血症の症候を呈するヒト患者に、３１Ｈ４（又は、例えば、２１Ｂ１２若しくは１６Ｆ１２）などのＰＣＳＫ９抗体の治療的有効量を投与する。治療中の定期的な時点で、血清コレステロールレベルが低下したかどうかを測定するために、ヒト患者をモニターする。治療後に、ＰＣＳＫ９抗体を用いた治療を受けている患者は、治療を受けていない関節炎患者と比べて、低下した血清コレステロールレベルを有することが見出される。
【０４０７】
（実施例２１）
冠動脈性心臓病及び／又は再発性心血管現象を予防するためのＰＣＳＫ９抗体の使用
冠動脈性心臓病を発症するリスクを有するヒト患者を同定する。単独で、スタチン（例えば、シンバスタチン）と同時に又は順次に、３１Ｈ４（又は、例えば、２１Ｂ１２若しくは１６Ｆ１２）などのＰＣＳＫ９抗体の治療的有効量を患者に投与する。治療中の定期的な時点で、患者の総血清コレステロールレベルが変化するかどうかを測定するために、ヒト患者をモニターする。予防的処置を通じて、ＰＣＳＫ９抗体を用いた治療を受けている患者は低下した血清コレステロールを有することにより、処置を受けていない患者と比べて、冠動脈性心臓病又は再発性心血管現象に対するリスクを低下させることが見出される。
【０４０８】
（実施例２２）
診断剤としてのＰＣＳＫ９抗体の使用
ＰＣＳＫ９産生の高いレベルを示す患者を診断するために、試料中のＰＣＳＫ９抗原を検出するための酵素連結免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用することができる。このアッセイでは、９６ウェルマイクロタイタープレート又は３８４ウェルマイクロタイタープレートなどのマイクロタイタープレートのウェルを、ＰＣＳＫ９に対して誘導された第一の完全ヒトモノクローナル抗体と数時間吸着させる。固定化された抗体は、検査試料中に存在し得るＰＣＳＫ９の何れかに対する捕捉抗体としての役割を果たす。ウェルを濯ぎ、分析物の非特異的吸着を防ぐために、ミルクタンパク質又はアルブミンなどのブロッキング剤で処理する。
【０４０９】
続いて、ＰＣＳＫ９を含有すると疑われる検査試料で、又は抗原の標準量を含有する溶液でウェルを処理する。例えば、このような試料は、病変を診断すると考えられる循環抗原のレベルを有すると疑われる対象から得られた血清試料であり得る。
【０４１０】
検査試料又は標準を濯いで除去した後、ビオチンでの連結によって標識された第二の完全ヒトモノクローナルＰＣＳＫ９抗体でウェルを処理する。モノクローナル又はマウス又は他の種起源も使用することができる。標識されたＰＣＳＫ９抗体は、検出抗体としての役割を果たす。過剰な第二の抗体を濯いで除去した後、アビジン連結された西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及び適切な発色性基質でウェルを処理する。検査試料中の抗原の濃度は、標準的な試料から作成された標準曲線との比較によって決定される。
【０４１１】
ＥＬＩＳＡアッセイは、検査試料中のＰＣＳＫ９抗原を検出するための高度に特異的で、極めて感度が高いアッセイを提供する。
【０４１２】
対象中のＰＣＳＫ９タンパク質濃度の測定
サンドイッチＥＬＩＳＡは、ヒト血清中のＰＣＳＫ９レベルを定量することができる。サンドイッチＥＬＩＳＡからの２つの完全ヒトモノクローナルＰＣＳＫ９抗体は、ＰＣＳＫ９分子上の異なるエピトープを認識する。あるいは、マウス又は他の種起源のモノクローナル抗体を使用し得る。ＥＬＩＳＡは、以下のように実施される。２μｇ／ｍＬの濃度のコーティング緩衝液（０．１ＭＮａＨＣＯ３，  ｐＨ  ９．６）中の捕捉ＰＣＳＫ９抗体５０μＬをＥＬＩＳＡプレート（Ｆｉｓｈｅｒ）上に被覆する。４℃で一晩の温置後、２５℃で１時間、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０１％Ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ）２００μＬでプレートを処理する。ＰＢＳ（洗浄緩衝液、ＷＢ）中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて、プレートを洗浄する（３回）。５０％ヒト血清を含有するブロッキング緩衝液中に、正常な血清又は患者の血清（Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓ，Ｂｉｏｒｅｃｌａｉｍａｔｉｏｎ）を希釈する。４℃で一晩、プレートを血清試料とともに温置し、ＷＢで洗浄し、次いで、２５℃で１時間、ビオチン化された検出ＰＣＳＫ９抗体の１００μＬ／ウェルとともに温置する。洗浄後、プレートをＨＲＰ−ストレプトアビジンとともに１５分間温置し、前述のとおり洗浄し、次いで、発色させるために、Ｈ２Ｏ２中のｏ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ発色溶液）の１００μＬ／ウェルで処理する。Ｈ２ＳＯ４（２Ｍ）の５０μＬ／ウェルで反応を停止させ、４９２ｎｍでのＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて分析する。血清試料中のＰＣＳＫ９抗原の濃度は、４パラメータ曲線フィッティングプログラムを用いて、精製されたＰＣＳＫ９抗原の希釈物との比較によって計算される。
【０４１３】
対象中のＰＣＳＫ９バリアントタンパク質濃度の測定
上に概説されている工程は、野生型ＰＣＳＫ９及びバリアントＰＣＳＫ９（Ｄ３７４Ｙ）の両方に結合する本明細書に記載されている抗体を用いて実施することができる。次に、対象中に存在するＰＣＳＫ９が野生型又はＤ３７４Ｙバリアントであるかどうかを決定するために、野生型に結合するが、変異体に結合しない抗体を使用することができる（同じく、上に概説されているような類似のプロトコールを使用する。）。当業者によって理解されるように、両ラウンドに対して陽性である結果は野生型であり、第一のラウンドに対して陽性であるが、抗体の第二のラウンドに対して陽性でない結果はＤ３７４Ｙ変異を含む。公知であり、本明細書中に開示されているＡＢＰなどの因子が特に有益である高頻度変異が集団中に存在する。
【０４１４】
（実施例２３）
高コレステロール血症を予防するためのＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質の使用
高コレステロール血症を発症するリスクを示すヒト患者は、家族歴の分析及び／又はライフスタイル及び／又は現在のコレステロールレベルを介して同定される。対象は、ＰＣＳＫ９抗体、３１Ｈ４（又は例えば、２１Ｂ１２若しくは１６Ｆ１２）の治療的有効量を定期的に投与される（例えば、週に１回）。治療中の定期的な時点で、血清コレステロールレベルが減少したかどうかを測定するために、患者をモニターする。治療後に、ＰＣＳ
Ｋ９抗体を用いた予防的処置を行っている対象は、治療されていない対象と比べて、低下した血清コレステロールレベルを有することが見出される。
【０４１５】
（実施例２４）
ＰＣＳＫ９ＡＢＰは、スタチンの存在下でＬＤＬＲをさらに上方制御した
本実施例は、スタチンの存在下で使用された場合、ＰＣＳＫ９に対するＡＢＰはＬＤＬＲの利用可能性のさらなる増加をもたらしたことを示し、２つの併用によってさらなる有益性を達成し得ることを示す。
【０４１６】
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えたＤＭＥＭ中でＨｅｐＧ２細胞を播種し、約９０％の集密度になるまで増殖させた。３％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ中のメビノリン（スタチン、Ｓｉｇｍａ）及びＰＣＳＫ９ＡＢＰ（図１２Ａから１２Ｃ）の表記量で細胞を４８時間処理した。全細胞可溶化液を調製した。ゲル電気泳動によって全タンパク質５０ｍｇを分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。ウサギ抗ヒトＬＤＬ受容体抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒｌａｄ）又はウサギ抗ヒトｂ−アクチン抗体を用いて、イムノブロットを行った。増強された化学発光の結果が、図１２Ａから１２Ｃの上部パネルに示されている。ＩｍａｇｅＪソフトウェアによって、バンドの強度を定量し、ｂ−アクチンによって標準化した。ＬＤＬＲの相対レベルが、図１２Ａから１２Ｃの下部パネル中に示されている。ＡＢＰ２１Ｂ１２及び３１Ｈ４はＰＣＳＫ９中和抗体であるのに対して、２５Ａ７．１は非中和抗体である。
【０４１７】
ＨｅｐＧ２−ＰＣＳＫ９細胞も作製した。これらは、ヒトＰＣＳＫ９で形質移入された安定なＨｅｐＧ２細胞株であった。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えたＤＭＥＭ中に細胞を播種し、約９０％の集密度になるまで増殖させた。３％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ中のメビノリン（Ｓｉｇｍａ）及びＰＣＳＫ９ＡＢＰ（図１２Ｄから１２Ｆ）の表記量で細胞を４８時間処理した。全細胞可溶化液を調製した。ゲル電気泳動によって全タンパク質５０ｍｇを分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。ウサギ抗ヒトＬＤＬ受容体抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒｌａｄ）又はウサギ抗ヒトｂ−アクチン抗体を用いて、イムノブロットを行った。増強された化学発光の結果が、上部パネルに示されている。ＩｍａｇｅＪソフトウェアによって、バンドの強度を定量し、ｂ−アクチンによって標準化した。
【０４１８】
図１２Ａから１２Ｆに図示されている結果から明らかなように、中和抗体の増加する量及びスタチンの増加する量は、ＬＤＬＲのレベルの増加を一般にもたらした。ＡＢＰの増加するレベルの有効性のこの増加は、細胞がＰＣＳＫ９でも形質移入されており、ＡＢＰがより大きな程度までその有効性を示すことができる図１２Ｄから１２Ｆにおいて特に明瞭である。
【０４１９】
興味深いことに、図１２Ｄから１２Ｆないし１２Ａから１２Ｃの比較の結果によって示されるように、ＬＤＬＲレベルに対するＡＢＰ濃度の影響は、ＰＣＳＫ９が細胞によって産生された場合に劇的に増加した。さらに、中和ＡＢＰ（２１Ｂ１２及び３１Ｈ４）が２５Ａ７．１ＡＢＰ（非中和物質）より、スタチンの存在下でさえ、ＬＤＬＲレベルのより大きな増加をもたらしたことは明瞭であり、スタチン及びＰＣＳＫ９に対するＡＢＰの両方を使用することによって、さらなる有益性が達成できることを示す。
【０４２０】
（実施例２５）
コンセンサス配列
抗ＰＣＳＫ９ＡＢＰのＶＨ及びＶＬに対応するＣＤＲの標準的な系統発生分析を用いて、コンセンサス配列を決定した。ＶＨ又はＶＬに対応する同じ配列内に隣接するＣＤＲを保持することによって、コンセンサス配列を決定した。要約すれば、比較併置の遂行及び系統発生の推定を容易にするために、ＶＨ又はＶＬの何れかの可変ドメイン全体に対応するアミノ酸配列をＦＡＳＴＡフォーマットに変換した。次に、ＶＨ又はＶＬに対応する同
じ配列内にＣＤＲをなお隣接させながら、偶発的現象（例えば、共通の生殖系列フレームワークの承継を偶発的に共有する無関係の抗体など）に起因するアミノ酸位置重み付けバイアスを一切導入することなく、ＣＤＲのみの検査を実施できるように、これらの配列のフレームワーク領域を、人工のリンカー配列（「ｂｂｂｂｂｂｂｂｂｂ」代用配列、非特異的な核酸構築物）で置き換えた。次いで、標準的なＣｌｕｔａｌＷ様アルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０参照）を使用するプログラムを用いて、配列類似性並置検査に、このフォーマットのＶＨ又はＶＬ配列を供した。２．０のギャップ伸長ペナルティーとともに、８．０のギャップ生成ペナルティーを使用した。同様に、このプログラムは、分岐長の比較及びグループ分けを介して配列群の類似性及び相違を構築し、図解するために、ＵＰＧＭＡ（ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｐａｉｒ  ｇｒｏｕｐ  ｍｅｔｈｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ａｒｉｔｈｍｅｔｉｃ  ａｖｅｒａｇｅｓ；非加重結合法）又は隣接結合法（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ−Ｊｏｉｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）（Ｓａｉｔｏｕ  ａｎｄ  Ｎｅｉ，  １９８７，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ４：４０６−４２５参照）を用いる配列類似性並置に基づくフィログラム（系統発生樹の図解）を作成した。何れの方法も、類似の結果をもたらしたが、ＵＰＧＭＡ法はより単純で、より保守的な一群の仮説を使用するので、ＵＰＧＭＡによって得られた系統樹を最終的に使用した。ＵＰＧＭＡによって得られた系統樹（グループ内の各配列のうち、１００残基当り１５未満の置換を有するとして、配列の類似のグループ（スケールに関して、系統樹の図解中の注釈参照）が定義された。）を作成し、コンセンサス配列集合を定義するために使用した。比較の結果は、図１３Ａから１３Ｊ中に図示されている。図１３Ｅでは、クレードを形成する軽鎖中の配列が、重鎖中でもクレードであり、１５未満の置換を有するように、グループを選択した。
【０４２１】
当業者に理解されるように、図１３Ａから１３Ｊ中に示されている結果は、あるアミノ酸（例えば、保存されているアミノ酸）の重要性及び何れのアミノ酸位置を変化させ得る可能性があるか（例えば、異なるＡＢＰに対して異なるアミノ酸を有する位置）ついて多くの指針を与える。
【０４２２】
（実施例２６）
インビボでＬＤＬを低下させるＰＣＳＫ９及びＡＢＰの能力に対するマウスモデル
ヒトＰＣＳＫ９を過剰発現するマウスを作製するために、マウス中のＬＤＬ−コレステロールの測定可能な増加を与える正しい力価を測定するためにヒトＰＣＳＫ９を発現するように組換え的に修飾されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の様々な濃度を、尾静脈投与を介して３週齢ＷＴＣ５７Ｂ１／６マウスに注射した。ヒトＰＣＳＫ９を発現するこのウイルスを用いて、ウイルスの４．５×１０Ｅ１２ｐｆｕは循環血液中の約４０ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ−コレステロールレベル（ＷＴマウス中のＬＤＬの正常レベルは、約１０ｍｇ／ｄＬである。）をもたらすことが決定された。これらの動物中のヒトＰＣＳＫ９レベルは、約１３μｇ／ｍＬであることが見出された。この注射基準を用いて、マウスのコロニーを作製した。
【０４２３】
注射から１週後に、ＬＤＬ−コレステロールレベルに関してマウスを評価し、異なる処理群へ無作為に振り分けた。次いで、尾静脈注射を介して、１６Ｆ１２、２１Ｂ１２又は３１Ｈ４抗原結合タンパク質の１０ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍ／ｋｇの何れかの単回大量瞬時注射を動物に投与した。投薬対照として、動物の別個の群にＩｇＧ２ＡＢＰを投与した。次いで、ＡＢＰ動物から２４及び４８時間後に、動物のサブグループ（ｎ＝６から７）を安楽死させた。何れの投薬量でも、ＩｇＧ２投与後に、ＬＤＬ−コレステロールレベルに対する影響は存在しなかった。３１Ｈ４及び２１Ｂ１２は何れも、ＩｇＧ２対照（２つの異なる投薬量で図１４Ａ及び１４Ｂに示されている。）と比べて、投与後最大４８時間まで（４８時間を含む。）著しいＬＤＬ−コレステロール低下を示した。１６Ｆ１２は、４
８時間の時点までに、約４０ｍｇ／ｄＬのベースラインに復帰するレベルで、中間のＬＤＬ−コレステロール低下応答を示す。このデータは、３１Ｈ４と２１Ｂ１２の間でヒトＰＣＳＫ９に対してほぼ等しい結合親和性を示し、ＰＣＳＫ９に対して１６Ｆ１２のより低い親和性を示すインビトロ結合データ（Ｂｉａｃｏｒｅ及びＫｉｎｅｘａ）と合致している。
【０４２４】
結果から明らかなように、モデル中のＰＣＳＫ９ＡＢＰによって、総コレステロール及びＨＤＬ−コレステロールは低下された（総コレステロール及びＨＤＬ−Ｃは何れも、ＰＣＳＫ９の過剰発現のために、ＷＴマウスを超えて上昇する。）。このモデルでのコレステロールの低下は、比較的短時間にわたって起こるように見受けられるが、これは、このモデルでの生理的状態を上回る高い、存在するヒトＰＣＳＫ９のレベルによるものであると思われる。さらに、発現がＡＡＶによって支配されることに鑑みれば、ＰＣＳＫ９発現の制御は存在しない。これらの図面において、（＊）は、同じ時点で、ＩｇＧ２対照が注射された動物中に観察されるＬＤＬ−コレステロールレベルと比べて、Ｐ＜０．０５を表し、（＊＊）はＰ＜０．００５を表す。マウス中の血清ヒトＰＣＳＫ９の１３μｇ／ｍＬレベルは、内在マウスＰＣＳＫ９レベル（約２５ｎｇ／ｍＬ）を上回る約５２０倍の増加に、及び平均ヒト血清レベル（約１７５ｎｇ／ｍＬ）を上回る約７５倍の増加に対応する。従って、抗原結合タンパク質は、ヒトにおいてより有効であるはずである。
【０４２５】
当業者によって理解されるように、上記結果は、対象中の血清コレステロールを変化させる抗原結合タンパク質の能力を調べるためのマウスモデルの妥当性を示す。当業者は、マウス血清コレステロールレベルをモニターするのに有用であるが、マウス中の血清コレステロールレベルをモニターするためのマウスＨＤＬの使用は、ヒト中でのヒトＨＤＬに対するＡＢＰの影響の指標とならないことも認識する。例えば、Ｃｏｈｅｎ他（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＰＣＳＫ９，  ｌｏｗ  ＬＤＬ，  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ”，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，  ３５４：１２６４−１２７２，  ２００６）は、ヒトＨＤＬレベルに対するＰＣＳＫ９機能喪失変異の効果が一切欠如することを示した（その全体が、参照により組み込まれる。）。従って、当業者は、マウスＨＤＬ（ＬＤＬを欠如する。）を低下させるＡＢＰの能力は、ヒトＨＤＬを低下させるＡＢＰの能力を示唆するものではないことを理解する。Ｃｏｈｅｎによって示されているように、実際に、これは、ヒト中の中和公知に対して起こらないと思われる。
【０４２６】
（実施例２７）
３１Ｈ４及び２１Ｂ１２は、ＰＣＳＫ９のＰｒｏＣａｔ領域に結合する
本実施例は、様々な抗体がＰＣＳＫ９のどこに結合するかを決定するための１つの方法を記載する。
【０４２７】
ＰＣＳＫ９タンパク質のＰｒｏＣａｔ（配列番号３の３１から４４９）又はＶドメイン（配列番号３の４５０から６９２）を、抗体３１Ｈ４又は２１Ｂ１２の何れかと組み合わせた。複合体の形成に関して、非変性ＰＡＧＥによって、試料を分析した。図１６Ａ及び図１６Ｂから明らかなように、ＰｒｏＣａｔ／３１Ｈ４及びＰｒｏＣａｔ／２１Ｂ１２試料に関してゲルシフトが存在し、抗体がＰｒｏＣａｔドメインに結合したことを示す。
【０４２８】
（実施例２８）
ＬＤＬＲＥＧＦａドメインは、ＰＣＳＫ９の触媒ドメインに結合する
本実施例は、２．９オングストロームの分解能で（以下の実施例に記載されている条件）、ＬＤＬＲＥＧＦａドメイン（２９３から３３４）に結合されたＰＣＳＫ９ＰｒｏＣａｔ（配列番号３の３１から４５４）の解明された結晶構造を表す。
【０４２９】
ＥＧＦａに結合されたＰＣＳＫ９の構造の図解が、図１７に示されている。結晶構造（及び図１７中のその図解）は、ＬＤＬＲのＥＧＦａドメインがＰＣＳＫ９の触媒ドメインに結合することを明らかにする。さらに、ＰＳＣＫ９とＥＧＦａの相互作用は、図１７に図示されている構造中の残基Ｄ３７４とＳ１５３の間にあるＰＣＳＫ９の表面を横切って起こるようである。
【０４３０】
ＬＤＬＲＥＧＦａドメインとの相互作用界面の特異的コアＰＣＳＫ９アミノ酸残基が、ＥＧＦａドメインの５オングストローム以内に存在するＰＣＳＫ９残基として定義された。コア残基は、以下のとおりである。Ｓ１５３、Ｉ１５４、Ｐ１５５、Ｒ１９４、Ｄ２３８、Ａ２３９、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｄ３７４、Ｃ３７５、Ｔ３７７、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｖ３８０及びＳ３８１。
【０４３１】
ＬＤＬＲＥＧＦａドメインとの相互作用界面の境界ＰＣＳＫ９アミノ酸残基は、ＥＧＦａドメインの５オングストロームから８オングストロームに存在するＰＣＳＫ９残基として定義された。境界残基は、以下のとおりである。Ｗ１５６、Ｎ１５７、Ｌ１５８、Ｅ１５９、Ｈ１９３、Ｅ１９５、Ｈ２２９、Ｒ２３７、Ｇ２４０、Ｋ２４３、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｇ３７０、Ａ３７１、Ｓ３７３、Ｓ３７６及びＱ３８２。下線が付された残基は、ＰＣＳＫ９内にほぼ埋没し、又は完全に埋没している。
【０４３２】
当業者に理解されるように、本実施例から得られた結果は、ＰＣＳＫ９とＥＧＦａが相互作用することを示している。従って、これらの残基の何れかと相互作用し、又は遮断する抗体は、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲのＥＧＦａドメイン（及び／又はＬＤＬＲ一般）との間の相互作用を阻害する抗体として有用であり得る。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９に結合された場合に、上記残基の何れかと相互作用し若しくは遮断する抗体、又は上記残基の１５から８、８、８から５若しくは５オングストロームにある抗体は、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９結合の有用な阻害を与えるものと想定される。
【０４３３】
（実施例２９）
３１Ｈ４は、ＰＣＳＫ９のプロドメイン及び触媒ドメインの両方に由来するアミノ酸残基と相互作用する
本実施例は、２．３オングストロームの分解能になるように測定された（以下の実施例に記載されている条件）、３１Ｈ４のＦａｂ断片に結合された完全長ＰＣＳＫ９（配列番号３のＮ５３３Ａ変異体）の結晶構造を表す。図１８Ａ及び１８Ｂに図示されているこの構造は、触媒部位の領域中において、３１Ｈ４がＰＣＳＫ９に結合し、プロドメイン及び触媒ドメインの両方に由来するアミノ酸残基と接触することを示す。
【０４３４】
図示されている構造によって、ＰＣＳＫ９との３１Ｈ４の相互作用界面のための特異的コアＰＣＳＫ９アミノ酸残基を同定することも可能である。これは、３１Ｈ４タンパク質の５オングストローム内に存在する残基として定義された。コア残基は、以下のとおりである。Ｗ７２、Ｆ１５０、Ａ１５１、Ｑ１５２、Ｔ２１４、Ｒ２１５、Ｆ２１６、Ｈ２１７、Ａ２２０、Ｓ２２１、Ｋ２２２、Ｓ２２５、Ｈ２２６、Ｃ２５５、Ｑ２５６、Ｇ２５７、Ｋ２５８、Ｎ３１７、Ｆ３１８、Ｔ３４７、Ｌ３４８、Ｇ３４９、Ｔ３５０、Ｌ３５１、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｄ３７４、Ｖ３８０、Ｓ３８１、Ｑ３８２、Ｓ３８３又はＧ３８４。
【０４３５】
構造は、３１Ｈ４との相互作用界面に対する境界ＰＣＳＫ９アミノ酸残基を同定するためにも使用された。これらの残基は、３１Ｈ４タンパク質から５ないし８オングストロームのＰＣＳＫ９残基であった。境界残基は以下のとおりであった。Ｋ６９、Ｄ７０、Ｐ７１、Ｓ１４８、Ｖ１４９、Ｄ１８６、Ｔ１８７、Ｅ２１１、Ｄ２１２、Ｇ２１３、Ｒ２１８、Ｑ２１９、Ｃ２２３、Ｄ２２４、Ｇ２２７、Ｈ２２９、Ｌ２５３、Ｎ２５４、Ｇ２５
９、Ｐ２８８、Ａ２９０、Ｇ２９１、Ｇ３１６、Ｒ３１９、Ｙ３２５、Ｖ３４６、Ｇ３５２、Ｔ３５３、Ｇ３６５、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｓ３７３、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｔ３８５、Ｓ３８６及びＱ３８７。ＰＣＳＫ９タンパク質内に完全に埋没されているアミノ酸残基に、下線が付されている。
【０４３６】
当業者によって理解されるように、図１８Ｂは、抗原結合タンパク質及びＰＣＳＫ９上のＣＤＲ間での相互作用を図示している。従って、このモデルによって、当業者は、パラトープ中の特に重要な残基及び／又はＣＤＲを同定し、何れの残基がパラトープにとって重要性が低いかを同定することが可能となる。図１８Ｂから明らかなように、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、エピトープへの抗原結合タンパク質の結合に最も直接に関与しており、軽鎖からのＣＤＲは相対的にエピトープから離れている。従って、ＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質の結合を過度に妨害することなく、軽鎖ＣＤＲ中のより大きな変動が可能であると思われる。幾つかの実施形態において、直接相互作用する構造中の残基は保存されている（あるいは、保存的に置換されている）のに対して、互いに直接相互作用しない残基はより大規模に変化させることができる。従って、当業者は、本明細書の教示が与えられれば、抗原結合タンパク質がＰＣＳＫ９に結合する能力を過度に妨害することなく、抗原結合タンパク質の何れの残基及び領域を変動させ得るかを予測することができる。例えば、抗原結合タンパク質がＰＣＳＫ９に結合されているときに、ＰＣＳＫ９に最も近接して位置する残基は、ＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質の結合においてより大きな役割を果たしている可能性がある残基である。上述のように、これらの残基は、ＰＣＳＫ９の５オングストローム以内の残基と、５オングストロームと８オングストロームの間にある残基に分けることができる。ＰＣＳＫ９との相互作用界面の特異的コア３１Ｈ４アミノ酸残基は、ＰＣＳＫ９タンパク質の５オングストローム内にある３１Ｈ４残基として定義された。重鎖に関して、５オングストローム以内に存在する残基には、以下のものが含まれる。Ｔ２８、Ｓ３０、Ｓ３１、Ｙ３２、Ｓ５４、Ｓ５５、Ｓ５６、Ｙ５７、１５８、Ｓ５９、Ｙ６０、Ｎ７４、Ａ７５、Ｒ９８、Ｙ１００、Ｆ１０２、Ｗ１０３、Ｓ１０４、Ａ１０５、Ｙ１０６、Ｙ１０７、Ｄ１０８、Ａ１０９及びＤ１１１。軽鎖に関して、５オングストローム以内の残基には、以下のものが含まれる。Ｌ４８、Ｓ５１、Ｙ９３及びＳ９８が含まれる。重鎖に関しては、ＰＣＳＫ９タンパク質から５ないし８オングストロームにある残基には、以下のものが含まれる。Ｇ２６、Ｆ２７、Ｆ２９、Ｗ４７、Ｓ５０、１５１、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｋ６５、Ｆ６８、Ｔ６９、１７０、Ｓ７１、Ｒ７２、Ｄ７３、Ｋ７６、Ｎ７７、Ｄ９９、Ｄ１０１、Ｆ１１０及びＶ１１２。軽鎖に関しては、ＰＣＳＫ９の５ないし８オングストロームにある残基には、Ａ３１、Ｇ３２、Ｙ３３、Ｄ３４、Ｈ３６、Ｙ３８、Ｉ５０、Ｇ５２、Ｎ５５、Ｒ５６、Ｐ５７、Ｓ５８、Ｄ９４、Ｓ９５、Ｓ９６、Ｌ９７、Ｇ９９及びＳ１００が含まれる。
【０４３７】
当業者によって理解されるように、実施例２９から得られる結果は、ＰＣＳＫ９に対する抗体はＰＣＳＫ９に対して相互作用できること、及びＥＧＦａとの（従って、ＬＤＬＲとの）相互作用からＰＣＳＫ９を遮断できることを示す。従って、これらのＰＣＳＫ９残基の何れかと相互作用し、又はこれらの残基の何れかを（例えば、これらの残基に結合する他の抗原結合タンパク質から）遮断する抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９とＥＧＦａ（従って、ＬＤＬＲ）の相互作用を阻害する抗体として有用であり得る。従って、幾つかの実施形態において、上記残基の何れかと相互作用し、又は上記残基の５オングストローム以内の残基と相互作用する抗原結合タンパク質は、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９結合の有用な阻害を与えるものと想定される。同様に、上記残基の何れかを遮断する抗原結合タンパク質（例えば、競合アッセイを介して測定することができる。）は、ＰＣＳＫ９／ＬＤＬＲ相互作用の阻害のためにも有用であり得る。
【０４３８】
（実施例３０）
２１Ｂ１２は、ＰＣＳＫ９の触媒ドメインに結合し、３１Ｈ４と異なる結合部位を有し
、３１Ｈ４と同時にＰＣＳＫ９に結合することができる。
【０４３９】
本実施例は、２．８オングストロームの分解能で測定された（以下の実施例に記載されている条件）、３１Ｈ４及び２１Ｂ１２のＦａｂ断片に結合されたＰＣＳＫ９ＰｒｏＣａｔ（配列番号３の３１から４４９）の結晶構造を表す。図１９Ａ及び１９Ｂに図示されているこの結晶構造は、３１Ｈ４及び２１Ｂ１２がＰＣＳＫ９上に異なる結合部位を有すること、両抗原結合タンパク質はＰＣＳＫ９に同時に結合できることを示す。構造は、２１Ｂ１２はＰＣＳＫ９の触媒ドメイン由来のアミノ酸残基と相互作用することを示す。この構造において、ＰＣＳＫ９と３１Ｈ４の間の相互作用は上に観察されたものと類似している。
【０４４０】
２１Ｂ１２との相互作用界面の特異的コアＰＣＳＫ９アミノ酸残基が、２１Ｂ１２タンパク質の５オングストローム以内に存在するＰＣＳＫ９残基として定義された。コア残基は、以下のとおりである。Ｓ１５３、Ｓ１８８、Ｉ１８９、Ｑ１９０、Ｓ１９１、Ｄ１９２、Ｒ１９４、Ｅ１９７、Ｇ１９８、Ｒ１９９、Ｖ２００、Ｄ２２４、Ｒ２３７、Ｄ２３８、Ｋ２４３、Ｓ３７３、Ｄ３７４、Ｓ３７６、Ｔ３７７及びＦ３７９。
【０４４１】
２１Ｂ１２との相互作用界面の境界ＰＣＳＫ９アミノ酸残基は、２１Ｂ１２タンパク質の５オングストロームから８オングストロームに存在するＰＣＳＫ９残基として定義された。境界残基は、以下のとおりである。Ｉ１５４、Ｔ１８７、Ｈ１９３、Ｅ１９５、Ｉ１９６、Ｍ２０１、Ｖ２０２、Ｃ２２３、Ｔ２２８、Ｓ２３５、Ｇ２３６、Ａ２３９、Ｇ２４４、Ｍ２４７、１３６９、Ｓ３７２、Ｃ３７５及びＣ３７８。ＰＣＳＫ９タンパク質内に殆ど又は完全に埋没されているアミノ酸残基に、下線が付されている。
【０４４２】
当業者によって理解されるように、図１９Ｂは、抗原結合タンパク質及びＰＣＳＫ９上のＣＤＲ間での相互作用を図示している。従って、このモデルによって、当業者は、パラトープにとって特に重要な残基及び／又はＣＤＲを同定し、何れの残基がパラトープにとって重要性が低いかを同定することが可能となる。構造から明らかなように、重鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ１はエピトープと密接に相互作用するように見受けられる。次に、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ３及び軽鎖ＣＤＲ３は、エピトープと近いが、ＣＤＲの第一の組ほど近くはないようである。最後に、軽鎖ＣＤＲ２はエピトープから幾らかの距離があるように見受けられる。従って、ＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質の結合を過度に妨害することなく、より遠くのＣＤＲ中のより大きな変動が可能であると思われる。幾つかの実施形態において、直接相互作用する構造中の残基は保存されている（あるいは、保存的に置換されている）のに対して、互いに直接相互作用しない残基はより大規模に変化させることができる。従って、当業者は、本明細書の教示が与えられれば、抗原結合タンパク質がＰＣＳＫ９に結合する能力を過度に妨害することなく、抗原結合タンパク質の何れの残基及び領域を変動させ得るかを予測することができる。例えば、抗原結合タンパク質がＰＣＳＫ９に結合されているときに、ＰＣＳＫ９に最も近接して位置する残基は、ＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質の結合においてより重要な役割を果たしている可能性がある残基である。上述のように、これらの残基は、ＰＣＳＫ９の５オングストローム以内の残基と、５オングストロームと８オングストロームの間にある残基に分けることができる。ＰＣＳＫ９との相互作用界面の特異的コア２１Ｂ１２アミノ酸残基が、ＰＣＳＫ９タンパク質の５オングストローム以内に存在する２１Ｂ１２残基として定義された。重鎖に関しては、５オングストローム以内の残基には、以下のものが含まれる。Ｔ３０、Ｓ３１、Ｙ３２、Ｇ３３、Ｗ５０、Ｓ５２、Ｆ５３、Ｙ５４、Ｎ５５、Ｎ５７、Ｎ５９、Ｒ９８、Ｇ９９、Ｙ１００及びＧ１０１。軽鎖に関しては、５オングストローム以内の残基には、以下のものが含まれる。Ｇ３０、Ｇ３１、Ｙ３２、Ｎ３３、Ｓ３４、Ｅ５２、Ｙ９３、Ｔ９４、Ｓ９５、Ｔ９６及びＳ９７。重鎖に関しては、ＰＣＳＫ９タンパク質から５ないし８オングストロームにある残基には、以下のものが含まれる。Ｔ２８、Ｌ２９、Ｉ３４、Ｓ３５
、Ｗ４７、Ｖ５１、Ｇ５６、Ｔ５８、Ｙ６０、Ｔ７２、Ｍ１０２及びＤ１０３。軽鎖に関しては、ＰＣＳＫ９の５ないし８オングストロームにある残基には、以下のものが含まれる。Ｓ２６、Ｖ２９、Ｖ３５、Ｙ５１、Ｎ５５、Ｓ９２、Ｍ９８及びＶ９９が含まれる。
【０４４３】
当業者によって理解されるように、実施例３０から得られる結果は、ＰＣＳＫ９に対する抗体結合タンパク質のどこがＰＣＳＫ９に対して相互作用できるか、及びＥＧＦａとの（従って、ＬＤＬＲとの）相互作用からＰＣＳＫ９をなお遮断できることを示す。従って、これらのＰＣＳＫ９残基の何れかと相互作用し、又はこれらの残基の何れかを遮断する抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９とＥＧＦａ（従って、ＬＤＬＲ）の相互作用を阻害する抗体として有用であり得る。従って、幾つかの実施形態において、上記残基の何れかと相互作用し、又は上記残基の５オングストローム以内の残基と相互作用する抗体は、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９結合の有用な阻害を提供するものと想定される。同様に、上記残基の何れかを遮断する抗原結合タンパク質（例えば、競合アッセイを介して測定することができる。）は、ＰＣＳＫ９／ＬＤＬＲ相互作用の阻害のためにも有用であり得る。
【０４４４】
（実施例３１）
ＥＧＦａ、ＰＣＳＫ９及び抗体の間の相互作用
上例から得られた三次複合体（ＰＣＳＫ９／３１Ｈ４／２１Ｂ１２）の構造をＰＣＳＫ９／ＥＧＦａ構造（実施例２８に記載されているとおりに決定された。）上に重ね合わせ、この組み合わせの結果が図２０Ａに図示されている。この図は、ＥＧＦａとのＰＣＳＫ９相互作用を阻害するように有用に標的化することができるＰＣＳＫ９上の領域を示す。図は、３１Ｈ４及び２１Ｂ１２が何れも、ＬＤＬＲのＥＧＦａドメインの位置と部分的に重複し、ＰＣＳＫ９へのその結合を立体的に妨害することを示している。さらに、構造から明らかなように、２１Ｂ１２は、ＬＤＬＲＥＧＦａドメインへの結合に特異的に関与しているアミノ酸残基のサブセットと直接相互作用する。
【０４４５】
上述のように、結晶構造の分析によって、ＰＣＳＫ９と対タンパク質（コア及びＰＣＳＫ９表面上の界面の境界領域）間の相互作用に関与している特異的アミノ酸及びこれらの対タンパク質がＰＣＳＫ９と相互作用する空間的必要条件が同定された。この構造は、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲ間の相互作用を阻害する方法を示唆する。第一に、上述のように、ＬＤＬＲのＥＧＦａドメインの結合部位と共通する残基を共有しているＰＣＳＫ９への因子の結合は、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲ間の相互作用を阻害する。第二に、共通の残基の外側に結合する因子は、ＥＧＦａドメインに対してＮ末端又はＣ末端にあるＬＤＬＲのＥＧＦａドメイン又は領域を立体的に妨害して、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲ間の相互作用を妨害することができる。
【０４４６】
幾つかの実施形態において、ＥＧＦａ結合に関与し、且つ上記抗原結合タンパク質が結合する領域に近い残基は、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を操作するのに特に有用である。例えば、異なる結合対に対してコア領域と境界領域の両領域中の共通する界面由来のアミノ酸残基が、下表１２に列記されている。ＰＣＳＫ９タンパク質内に完全に埋没されているアミノ酸残基に、下線が付されている。
【０４４７】
【表１５】
2020058376.tif 000018
【０４４８】
当業者によって理解されるように、幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、上記残基の少なくとも１つに結合し、及び／又は遮断する。
【０４４９】
（実施例３２）
ＬＤＬＲ及びＰＣＳＫ９の構造的相互作用
ＰＣＳＫ９ＰｒｏＣａｔ（配列番号３の３１から４５４）／ＥＧＦａ複合体構造を用いて、ＬＤＬＲの完全長状態に結合された完全長ＰＣＳＫ９のモデルを作製した。複合体からのＰＣＳＫ９ＰｒｏＣａｔ３１から４５４上に、完全長ＰＣＳＫ９１（Ｐｉｐｅｒ，  Ｄ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ＰＣＳＫ９：ａ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ＬＤＬ−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １５，  ５４５−５２  （２００７））の構造を重ね合わせ、複合体からのＥＧＦａドメイン上に、その低ｐＨ立体構造にあるＬＤＬＲの構造（Ｒｕｄｅｎｋｏ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ａｔ  ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｐＨ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８，  ２３５３−８  （２００２））を重ね合わせた。モデルの図解が、図２０Ｂ及び２０Ｃに示されている。ＥＧＦａドメインは、図中の枠によって示されている。図は、ＰＣＳＫ９に近接して存在する直前のＥＧＦａ結合ドメインの外側に存在するＬＤＬＲの領域を示している。図２０Ｄから２０Ｆは、３つの異なる角度からの抗体３１Ｈ４及び２１Ｂ１２の網目状表面表示とともに、上記相互作用を示している。図解から明らかなように、抗体は、実際の結合部位におけるＰＣＳＫ９とのＬＤＬＲの相互作用と相互作用し及び／又は妨害できるのみならず、他の立体的相互作用も起こるようである。
【０４５０】
上記結果に照らして、ＰＣＳＫ９に結合する抗原結合タンパク質は、ＬＤＬＲの様々な領域（ＬＤＬＲとＰＣＳＫ９が相互作用する部位に留まらない。）と衝突することによって、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲの間の相互作用も阻害することができる。例えば、ＰＣＳＫ９に結合する抗原結合タンパク質は、リピート７（Ｒ７）、ＥＧＦｂドメイン及び／又はβ
−プロペラドメインと衝突し得る。
【０４５１】
ＰＣＳＫ９とのＥＧＦａの相互作用に結合し、又は遮断する抗原結合分子の実施形態
当業者によって理解されるように、実施例２８から３２及び添付の図面は、ＥＧＦａがＰＣＳＫ９とどのように及びどこで相互作用するか、並びに２つの代表的な中和的抗原結合タンパク質である２１Ｂ１２及び３１Ｈ４がどのようにしてＰＣＳＫ９と相互作用し、それらの中和効果をもたらすかを詳細に記載している。従って、当業者は、ＰＣＳＫ９上の同じ位置の少なくとも１つに又はその付近に結合する他の抗原結合分子を同定することによって、ＥＧＦａ（ＬＤＬＲを含む。）とＰＣＳＫ９の間の結合を同様に低下させることができる抗原結合分子を容易に同定することができる。ＰＣＳＫ９上の関連する位置（又はエピトープ）が図面及び本明細書の記述中に特定されているが、ＥＧＦａ結合部位に近いとして同定された残基からの所定の距離内に存在するとしてこれらの部位を記述することも有利であり得る。幾つかの実施形態において、抗原結合分子は、以下の残基の１つ若しくはそれ以上の３０オングストロームに又はそれ以内に結合する（付番は、配列番号３を基準とする。）。Ｓ１５３、Ｉ１５４、Ｐ１５５、Ｒ１９４、Ｄ２３８、Ａ２３９、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｄ３７４、Ｃ３７５、Ｔ３７７、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｖ３８０、Ｓ３８１、Ｗ１５６、Ｎ１５７、Ｌ１５８、Ｅ１５９、Ｈ１９３、Ｅ１９５、Ｈ２２９、Ｒ２３７、Ｇ２４０、Ｋ２４３、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｇ３７０、Ａ３７１、Ｓ３７３、Ｓ３７６、Ｑ３８２、Ｗ７２、Ｆ１５０、Ａ１５１、Ｑ１５２、Ｔ２１４、Ｒ２１５、Ｆ２１６、Ｈ２１７、Ａ２２０、Ｓ２２１、Ｋ２２２、Ｓ２２５、Ｈ２２６、Ｃ２５５、Ｑ２５６、Ｇ２５７、Ｋ２５８、Ｎ３１７、Ｆ３１８、Ｔ３４７、Ｌ３４８、Ｇ３４９、Ｔ３５０、Ｌ３５１、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｄ３７４、Ｖ３８０、Ｓ３８１、Ｑ３８２、Ｓ３８３、Ｇ３８４、Ｋ６９、Ｄ７０、Ｐ７１、Ｓ１４８、Ｖ１４９、Ｄ１８６、Ｔ１８７、Ｅ２１１、Ｄ２１２、Ｇ２１３、Ｒ２１８、Ｑ２１９、Ｃ２２３、Ｄ２２４、Ｇ２２７、Ｈ２２９、Ｌ２５３、Ｎ２５４、Ｇ２５９、Ｐ２８８、Ａ２９０、Ｇ２９１、Ｇ３１６、Ｒ３１９、Ｙ３２５、Ｖ３４６、Ｇ３５２、Ｔ３５３、Ｇ３６５、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｓ３７３、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｔ３８５、Ｓ３８６、Ｑ３８７、Ｓ１５３、Ｓ１８８、Ｉ１８９、Ｑ１９０、Ｓ１９１、Ｄ１９２、Ｒ１９４、Ｅ１９７、Ｇ１９８、Ｒ１９９、Ｖ２００、Ｄ２２４、Ｒ２３７、Ｄ２３８、Ｋ２４３、Ｓ３７３、Ｄ３７４、Ｓ３７６、Ｔ３７７、Ｆ３７９、Ｉ１５４、Ｔ１８７、Ｈ１９３、Ｅ１９５、Ｉ１９６、Ｍ２０１、Ｖ２０２、Ｃ２２３、Ｔ２２８、Ｓ２３５、Ｇ２３６、Ａ２３９、Ｇ２４４、Ｍ２４７、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｃ３７５又はＣ３７８。幾つかの実施形態において、抗原結合分子は、以下の残基の１つ若しくはそれ以上の３０オングストローム以内に結合する（付番は、配列番号３に基づく。）。Ｓ１５３、Ｉ１５４、Ｐ１５５、Ｒ１９４、Ｄ２３８、Ａ２３９、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｄ３７４、Ｃ３７５、Ｔ３７７、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｖ３８０、Ｓ３８１、Ｗ１５６、Ｎ１５７、Ｌ１５８、Ｅ１５９、Ｈ１９３、Ｅ１９５、Ｈ２２９、Ｒ２３７、Ｇ２４０、Ｋ２４３、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｇ３７０、Ａ３７１、Ｓ３７３、Ｓ３７６又はＱ３８２。幾つかの実施形態において、抗原結合分子は、以下の残基の１つ若しくはそれ以上の３０オングストローム以内に結合する（付番は、配列番号３に基づく。）。Ｗ７２、Ｆ１５０、Ａ１５１、Ｑ１５２、Ｔ２１４、Ｒ２１５、Ｆ２１６、Ｈ２１７、Ａ２２０、Ｓ２２１、Ｋ２２２、Ｓ２２５、Ｈ２２６、Ｃ２５５、Ｑ２５６、Ｇ２５７、Ｋ２５８、Ｎ３１７、Ｆ３１８、Ｔ３４７、Ｌ３４８、Ｇ３４９、Ｔ３５０、Ｌ３５１、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｄ３７４、Ｖ３８０、Ｓ３８１、Ｑ３８２、Ｓ３８３、Ｇ３８４、Ｋ６９、Ｄ７０、Ｐ７１、Ｓ１４８、Ｖ１４９、Ｄ１８６、Ｔ１８７、Ｅ２１１、Ｄ２１２、Ｇ２１３、Ｒ２１８、Ｑ２１９、Ｃ２２３、Ｄ２２４、Ｇ２２７、Ｈ２２９、Ｌ２５３、Ｎ２５４、Ｇ２５９、Ｐ２８８、Ａ２９０、Ｇ２９１、Ｇ３１６、Ｒ３１９、Ｙ３２５、Ｖ３４６、Ｇ３５２、Ｔ３５３、Ｇ３６５、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｓ３７３、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｔ３８５、Ｓ３８６又はＱ３８７。幾つかの実施形態において、抗原結合分子は、以下の残基の１つ若しくはそれ以上の３０オングストローム以内に結合する（付番は、配列番号３に基づく。）。Ｓ１５３、Ｓ１８８
、Ｉ１８９、Ｑ１９０、Ｓ１９１、Ｄ１９２、Ｒ１９４、Ｅ１９７、Ｇ１９８、Ｒ１９９、Ｖ２００、Ｄ２２４、Ｒ２３７、Ｄ２３８、Ｋ２４３、Ｓ３７３、Ｄ３７４、Ｓ３７６、Ｔ３７７、Ｆ３７９、Ｉ１５４、Ｔ１８７、Ｈ１９３、Ｅ１９５、Ｉ１９６、Ｍ２０１、Ｖ２０２、Ｃ２２３、Ｔ２２８、Ｓ２３５、Ｇ２３６、Ａ２３９、Ｇ２４４、Ｍ２４７、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｃ３７５又はＣ３７８。
【０４５２】
幾つかの実施形態において、抗原結合分子は、上記残基の１つ又はそれ以上から３０、３０から２５、２５から２０、２０から１５、１５から８、８、８から５、５、５から４、４オングストローム又はそれ以下のオングストローム以内に結合する。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９に結合したときに、抗原結合分子は、上記残基の２以上に関して、上記距離の少なくとも１つ以内にある。例えば、幾つかの実施形態において、抗原結合分子は、上記残基の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２０から２５、２５から３０、３０から３５、３５から４０、４０から４５、４５から５０、５０から５５、５５から６０、６０から６５、６５から７０、７０から７５又はそれ以上に関して、上記距離の少なくとも１つ（例えば、３０、３０から２５、２５から２０、２０から１５、１５から８、８、８から５、５、５から４、４又はそれ以下）以内にある。幾つかの実施形態において、抗原結合分子は、そのサブグループ（群中の表面残基のみなど）の各群中に特定された残基の少なくとも１から１０、１０から２０、２０から３０、３０から４０、４０から５０、５０から６０、６０から７０、７０から８０、８０から９０、９０から９５、９５から９９、９９から１００％に関して、上記距離の１つ以内にある。別段の記載が具体的になければ、抗原結合分子とＰＣＳＫ９間の距離は、ＰＣＳＫ９上の共有結合された原子と、ＰＣＳＫ９と抗原結合分子の最も近い原子である抗原結合分子の共有結合された原子との間の最短距離である。同様に、具体的に別段の記載がなければ、（抗原結合分子又はＰＣＳＫ９上の）残基と別のタンパク質（それぞれ、ＰＣＳＫ９又は抗原結合分子の何れか）の間の距離は、特定された残基上の最も近い点から他のタンパク質の最も近接した共有結合部分までの距離である。幾つかの実施形態において、距離は、アミノ酸鎖の骨格から測定することができる。幾つかの実施形態において、距離は、パラトープの端とエピトープの（互いに最も近い）端の間で測定することができる。幾つかの実施形態において、パラトープの表面の中心とエピトープの表面の中心間で距離を測定することができる。当業者によって理解されるように、本記述は、本明細書中に列記されている残基の各組のそれぞれに対して適用可能である。例えば、上記範囲は、実施例２８から３２中に列記された８オングストロームの残基及び実施例２８から３２中に列記された５オングストロームの残基に対して、一般的及び具体的に想定される。
【０４５３】
幾つかの実施形態において、抗原結合分子は、ＥＧＦａ、２１Ｂ１２又は３１Ｈ４の少なくとも１つによって結合されているＰＣＳＫ９上の表面に結合する。幾つかの実施形態において、抗原結合分子は、（上記実施例及び図面に記載されているように）ＰＣＳＫ９とＥＧＦａ、Ａｂ３１Ｈ４及び／又はＡｂ２１Ｂ１２との間の相互作用位置と重複する位置においてＰＣＳＫ９に結合する。幾つかの実施形態において、抗原結合分子は、上記残基の１つからさらに離れた位置においてＰＣＳＫ９に結合する。幾つかの実施形態において、このような抗原結合分子は、なお有効な中和的抗原結合分子であり得る。
【０４５４】
幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９の触媒ドメインの構造は、一般に、（図１９Ａに示されているように）三角状として記載することができる。三角の第一の辺は、３１Ｈ４によって結合されているものとして示されている。三角の第二の辺は、２１Ｂ１２によって結合されているものとして示されており、三角の第三の辺は、ページの下方向、「図１９Ａ」という表示のすぐ上に位置している。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９の触媒ドメインの第一及び／又は第二の辺に結合する抗原結合分子は、ＰＣＳＫ９へのＥＧＦａの結合を直接又は立体的に妨害することができるので、中和抗体として有用であり得
る。当業者によって理解されるように、完全抗体など、抗原結合分子が十分に大きければ、ＰＣＳＫ９へのＥＧＦａの結合を妨害するために、抗原結合分子はＥＧＦａ結合部位に直接結合する必要はない。
【０４５５】
当業者によって理解されるように、ＬＤＬＲのＥＧＦａドメインが実施例の多くにおいて使用されているが、このモデル及び構造は、完全長ＬＤＬＲタンパク質がＰＣＳＫ９とどのようにして相互作用するかに対してもなお適用することができる。実際、完全長ＬＤＬＲタンパク質上に存在するさらなる構造は、抗原結合分子の１つによってさらに遮断され得るさらなるタンパク質スペースを与える。従って、抗原結合分子がＰＣＳＫ９へのＥＧＦａの結合を遮断又は阻害すれば、完全長ＬＤＬＲタンパク質を上回らないとしても、少なくとも同等の有効性である可能性がある。同様に、所定の距離内の抗原結合分子又はＥＧＦａ結合の阻害に関連する様々な残基を遮断する抗原結合分子は、さらに効果的ではないとしても、完全長ＬＤＬＲに対して有効であると思われる。
【０４５６】
当業者によって理解されるように、上記ＰＣＳＫ９残基を封鎖し、若しくは結合する（又は上記距離内にある）又は上記実施例及び図面中に記載されている相互作用の１つ若しくはそれ以上を阻害する何れの分子も、ＥＧＦａ（又は一般に、ＬＤＬＲ）及びＰＣＳＫ９の相互作用を阻害するために使用することができる。従って、何れの抗原結合分子も必要とされる目的を果たし得るので、分子は、抗原結合「タンパク質」に限定される必要はない。抗原結合分子の例には、アプタマーが含まれ、アプタマーはオリゴ核酸又はペプチド分子の何れかであり得る。抗原結合分子の他の例には、アビマー、ペプチボディ、小分子及びポリマー、並びにＰＣＳＫ９へのその親和性及び／又は半減期を増加させることができるＥＧＦａの修飾された様式（アミノ酸の変異、グリコシル化、ＰＥＧ化、Ｆｃ融合及びアビマー融合など）が含まれる。当業者によって理解されるように、幾つかの実施形態において、ＬＤＬＲは抗原結合分子ではない。幾つかの実施形態において、ＬＤＬＲの結合サブセクションは、抗原結合分子、例えば、ＥＧＦａではない。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９がそれを通じてインビボでシグナル伝達する他の分子は、抗原結合分子でない。このような実施形態は、それ自体明示的に同定される。
【０４５７】
（実施例３３）
タンパク質試料の発現及び精製
本実施例は、ＰＣＳＫ９タンパク質／バリアントの様々な実施形態（ＬＤＬＲＥＧＦａドメインを含む。）がどのようにして作製及び精製されるかに関する幾つかの実施形態を記載する。ＰＣＳＫ９タンパク質／バリアント（例えば、ＰＣＳＫ９３１から６９２Ｎ５３３Ａ、ＰＣＳＫ９４４９ＴＥＶ及びＰＣＳＫ９ＰｒｏＣａｔ３１から４５４）を、Ｎ末端の蜜蜂メリチンシグナルペプチドに続くＨｉｓ６タグともに、バキュロウイルスによって感染されたＨｉ−５昆虫細胞中で発現させた。ニッケルアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによって、ＰＣＳＫ９タンパク質を精製した。ＴＥＶプロテアーゼを用いた切断によって、精製の間にメリチンＨｉｓ６タグを除去した。ＰＣＳＫ９ＰｒｏＣａｔ（３１から４４９）及びＶドメイン（４５０から６９２）試料を作製するために、構築物ＰＣＳＫ９４４９ＴＥＶを使用した。この構築物は、ＰＣＳＫ９残基４４９と４５０の間に挿入されたＴＥＶプロテアーゼ切断部位を有していた。結晶学のための完全長Ｎ５５５Ａバリアント、ＰＣＳＫ９の３１から４５４断片及び結晶学のためのＰＣＳＫ９４４９ＴＥＶバリアント、ポストｒＴＥＶタンパク質産物は、開始ＧＡＭＧ配列も含んだ。従って、ｒＴＥＶ切断の後に、これらのタンパク質はＧＡＭＧ−ＰＣＳＫ９であった。さらに、ＰＣＳＫ９４４９ＴＥＶタンパク質は、配列番号３の位置Ｈ４４９とＧ４５０の間に挿入された配列「ＥＮＬＹＦＱ」（配列番号４０３）を含んでいた。ｒＴＥＶでの切断後、この構築物から作製されたＰＣＳＫ９ＰｒｏＣａｔタンパク質は、ＧＡＭＧ−ＰＣＳＫ９（３１−４４９）−ＥＮＬＹＦＱ及びこの構築物から作製されたＶドメインは、配列番号３のＰＣＳＫ９（４５０から６９
２）であった。
【０４５８】
２１Ｂ１２及び３１Ｈ４Ｆａｂ断片をイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させた。ニッケルアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーによって、これらのタンパク質を精製した。
【０４５９】
イー・コリ中において、ＬＤＬＲＥＧＦａドメイン（２９３から３３４）をＧＳＴ融合タンパク質として発現させた。イオン交換クロマトグラフィー、グルタチオンセファロースアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによって、ＥＧＦａドメインを精製した。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼを用いた切断によって、ＧＳＴタンパク質は精製の間に除去した。
【０４６０】
（実施例３４）
複合体形成及び結晶化
本実施例は、上記構造調査実施例において使用された複合体及び結晶をどのようにして作製するかについて記載する。
【０４６１】
３１Ｈ４Ｆａｂの１．５モル濃度過剰をＰＣＳＫ９と混合することによって、ＰＣＳＫ９３１−６９２Ｎ５３３Ａ／３１Ｈ４複合体を作製した。過剰な３１Ｈ４Ｆａｂを除去するために、サイズ排除クロマトグラフィーによって、複合体を精製した。ＰＣＳＫ９３１から６９２Ｎ５３３Ａ／３１Ｈ４複合体は、０．１ＭＴｒｉｓｐＨ８．３、０．２Ｍ酢酸ナトリウム、１５％ＰＥＧ４０００、６％デキストラン硫酸ナトリウム塩（分子量５０００）中で結晶化する。
【０４６２】
まず、３１Ｈ４Ｆａｂの１．５モル濃度過剰をＰＣＳＫ９３１−４４９と混合することによって、ＰＣＳＫ９ＰｒｏＣａｔ３１−４４９／３１Ｈ４／２１Ｂ１２複合体を作製した。サイズ排除クロマトグラフィーカラム上での精製によって、複合体を過剰な３１Ｈ４から分離した。次いで、２１Ｂ１２Ｆａｂの１．５モル濃度過剰を、ＰＣＳＫ９３１−４４９／３１Ｈ４複合体に添加した。サイズ排除クロマトグラフィーカラム上での精製によって、三重複合体を過剰な２１Ｂ１２から分離した。ＰＣＳＫ９ＰｒｏＣａｔ３１−４４９／３１Ｈ４／２１Ｂ１２複合体は、０．１ＭＴｒｉｓｐＨ８．５、０．２Ｍ第一リン酸アンモニウム、５０％ＭＰＤ中で結晶化する。
【０４６３】
ＥＧＦａドメインの１．２モル濃度過剰をＰＣＳＫ９３１−４５４と混合することによって、ＰＣＳＫ９ＰｒｏＣａｔ３１−４５４／ＥＧＦａ複合体を作製した。ＰＣＳＫ９ＰｒｏＣａｔ３１−４５４／ＥＧＦａドメイン複合体は、０．２Ｍギ酸カリウム、２０％ＰＥＧ３３５０中で結晶化する。
【０４６４】
（実施例３５）
データ収集及び構造の決定
本実施例は、データ群をどのようにして収集し、上記構造検査実施例に対してどのようにして構造を決定したかについて記載する。
【０４６５】
ＰＣＳＫ９３１−６９２Ｎ５３３Ａ／３１Ｈ４及びＰＣＳＫ９ＰｒｏＣａｔ３１−４４９／３１Ｈ４／２１Ｂ１２結晶に対する初期データ群を、ＲｉｇａｋｕＦＲ−ＥＸ線源上で集めた。ＰＣＳＫ９ＰｒｏＣａｔ３１−４５４／ＥＧＦａデータ群並びにＰＣＳＫ９３１−６９２Ｎ５３３Ａ／３１Ｈ４及びＰＣＳＫ９ＰｒｏＣａｔ３１−４４９／３１Ｈ４／２１Ｂ１２結晶に対するより高解像度のデータ群を、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ  ｂｅａｍｌｉｎｅ  ５．０．２で収集した。全てのデー
タ群は、ｄｅｎｚｏ／ｓｃａｌｅｐａｃｋ又はＨＫＬ２０００（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，
Ｚ．，  Ｂｏｒｅｋ，  Ｄ．，  Ｍａｊｅｗｓｋｉ，  Ｗ．  ＆  Ｍｉｎｏｒ，  Ｗ．
Ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ｓｃａｌｉｎｇ  ｏｆ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｉｅｓ．Ａｃｔａ  ＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒＡ５９，  ２２８−３４  （２００３））を用いて処理した。
【０４６６】
ＰＣＳＫ９／３１Ｈ４結晶は、単位セルサイズａ＝２６４．９、ｂ＝１３７．４、ｃ＝６９．９オングストローム、β＝１０２．８°を有するＣ２スペース群中で成長し、２．３オングストロームの解像度になるように回折する。最初の検索モデルとして、ＰＣＳＫ９構造（Ｐｉｐｅｒ，  Ｄ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ＰＣＳＫ９：ａ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ＬＤＬ−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １５，  ５４５−５２  （２００７））を使用するプログラムＭＯＬＲＥＰ（Ｔｈｅ  ＣＣＰ４  ｓｕｉｔｅ：ｐｒｏｇｒａｍｓ
ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｒｓｔａｌｌｏｇｒ  ５０，  ７６０−３  （１９９４））を用いた分子置換によって、ＰＣＳＫ９／３１Ｈ４構造を解明した。ＰＣＳＫ９３１−６９２溶液を固定し続けながら、抗体可変ドメインを検索モデルとして使用した。ＰＣＳＫ９３１−６９２／抗体可変ドメイン溶液を固定し続けながら、抗体定常ドメインを検索モデルとして使用した。Ｑｕａｎｔａを用いたモデル構築及びｃｎｘを用いた精緻化の複数ラウンドを用いて、完全な構造を改善した（Ｂｒｕｎｇｅｒ，  Ａ．Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ＆  ＮＭＲ  ｓｙｓｔｅｍ：Ａ  ｎｅｗ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｓｕｉｔｅ  ｆｏｒ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５４，  ９０５−２１  （１９９８））。
【０４６７】
ＰＣＳＫ９／３１Ｈ４／２１Ｂ１２結晶は、単位セルサイズａ＝１３８．７、ｂ＝２４６．２、ｃ＝５１．３オングストロームを有するＰ２１２１２スペース群中で成長し、２．８オングストロームの解像度になるように回折する。最初の検索モデルとして、ＰＣＫＳ９ＰｒｏＣａｔ／３１Ｈ４可変ドメインを用いるプログラムＭＯＬＲＥＰを用いた分子置換によって、ＰＣＳＫ９／３１Ｈ４／２１Ｂ１２構造を解明した。ＰＣＳＫ９ＰｒｏＣａｔ／３１Ｈ４可変ドメインを固定し続けながら、抗体定常ドメインに対する検索を行った。ＰＣＳＫ９ＰｒｏＣａｔ／３１Ｈ４／２１Ｂ１２定常ドメインを固定し続けながら、抗体変動ドメインを検索モデルとして使用した。Ｑｕａｎｔを用いたモデル構築及びｃｎｘを用いた精緻化の複数ラウンドを用いて、完全な構造を改善した。
【０４６８】
ＰＣＳＫ９／ＥＧＦａドメイン結晶は、単位セルサイズａ＝ｂ＝７０．６、ｃ＝３２１．８オングストロームを有するスペース群Ｐ６５２２中で成長し、２．９オングストロームの解像度になるように回折する。最初の検索モデルとして、ＰＣＫＳ９ＰｒｏＣａｔを使用し、プログラムＭＯＬＲＥＰを用いた分子置換によって、ＰＣＳＫ９／ＥＧＦａドメイン構造を解明した。電子密度マップの分析によって、ＥＧＦａドメインに対する明瞭な電子密度が示された。ＬＤＬＲＥＧＦａドメインを手動でフィッティングし、Ｑｕａｎｔａを用いるモデル構築及びｃｎｘを用いる精緻化の複数ラウンドによってモデルを改善した。
【０４６９】
コア相互作用界面アミノ酸は、ＰＣＳＫ９対タンパク質から５オングストローム未満又は５オングストロームに等しい少なくとも１つの原子を有する全てのアミノ酸残基であるものとして決定された。ファンデルワールス半径＋生じ得る水媒介性水素結合内の原子を考慮するために、５オングストロームをコア領域カットオフ距離として選択した。境界相互作用界面アミノ酸は、ＰＣＳＫ９対タンパク質から８オングストローム未満又は８オングストロームに等しい少なくとも１つの原子を有するが、コア相互作用リスト中に含まれ
ない全てのアミノ酸残基として決定された。伸長されたアルギニンアミノ酸の長さを考慮するために、８オングストローム未満又は８オングストロームを境界領域カットオフ距離として選択した。プログラムＰｙＭＯＬ．（ＤｅＬａｎｏ，  Ｗ．Ｌ．  Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，
２００２））を用いて、これらの距離基準を満たすアミノ酸を計算した。
【０４７０】
（実施例３６）
ＰＣＳＫ９及び３１Ａ４の結晶構造
３１Ａ４／ＰＣＳＫ９複合体の結晶構造を決定した。
【０４７１】
タンパク質試料の発現及び精製
Ｎ末端の蜜蜂メリチンシグナルペプチドに続くＨｉｓ６タグとともに、ＰＣＳＫ９４４９ＴＥＶ（残基４４９と４５０の間に挿入されたＴＥＶプロテアーゼ切断部位を有するＰＣＳＫ９構築物、付番は配列番号３を基準とする。）をバキュロウイルス感染されたＨｉ−５昆虫細胞中で発現させた。まず、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって、ＰＣＳＫ９タンパク質を精製した。メリチン−Ｈｉｓ６タグを除去し、触媒ドメインとＶドメインの間でＰＣＳＫ９タンパク質を切断するために、ＴＥＶプロテアーゼを使用した。イオン交換クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによって、Ｖドメインをさらに精製した。３１Ａ４Ｆａｂ断片をイー・コリ中で発現させた。ニッケルアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーによって、このタンパク質を精製した。
【０４７２】
複合体形成及び結晶化
ＰＣＳＫ９Ｖドメインの１．５モル濃度過剰を３１Ａ４Ｆａｂと混合することによって、ＰＣＳＫ９Ｖドメイン／３１Ａ４複合体を作製した。サイズ排除クロマトグラフィーカラム上での精製によって、複合体を過剰なＰＣＳＫ９Ｖドメインから分離した。ＰＣＳＫ９Ｖドメイン／３１Ａ４複合体を１．１Ｍコハク酸ｐＨ７、２％ＰＥＧＭＭＥ２０００中で結晶化させた。
【０４７３】
データ収集及び構造の決定
ＲｉｇａｋｕＦＲ−Ｅｘ線源上で、ＰＣＳＫ９Ｖドメイン／３１Ａ４結晶に対するデータ群を収集し、ｄｅｎｚｏ／ｓｃａｌｅｐａｃｋを用いて処理した（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，  Ｚ．，  Ｂｏｒｅｋ，  Ｄ．，  Ｍａｊｅｗｓｋｉ，  Ｗ．  ＆  Ｍｉｎｏｒ，  Ｗ．  Ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ｓｃａｌｉｎｇ  ｏｆ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｉｅｓ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ａ  ５９，  ２２８−３４  （２００３））。
【０４７４】
ＰＣＳＫ９Ｖドメイン／３１Ａ４結晶は、非対称単位当り２つの複合体分子を有し、単位セルサイズａ＝７４．６、ｂ＝１３１．１、ｃ＝１９７．９オングストロームを有するＰ２１２１２１スペース群中で成長し、２．２オングストロームの分解能になるように回折する。最初の検索モデルとして、ＰＣＳＫ９構造のＶドメイン（Ｐｉｐｅｒ，  Ｄ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ＰＣＳＫ９：ａ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ＬＤＬ−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １５，  ５４５−５２  （２００７））を使用するプログラムＭＯＬＲＥＰ（ＣＣＰ４．Ｔｈｅ  ＣＣＰ４  ｓｕｉｔｅ：ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｒｓｔａｌｌｏｇｒ  ５０，  ７６０−３  （１９９４））を用いた分子置換によって、ＰＣＳＫ９Ｖドメイン／３１Ａ４構造を解明した。ＰＣＳＫ９４５０−６９２溶液を固定し続けながら、抗体可変ドメインを検索モデルとして使用した。最初の精緻化の後、抗体定常ドメインを手動によってフィッティングした。Ｑｕａｎｔａを用いたモ
デル構築及びｃｎｘを用いた精緻化の複数ラウンドを用いて、完全な構造を改善した（Ｂｒｕｎｇｅｒ，  Ａ．Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ＆  ＮＭＲ
ｓｙｓｔｅｍ：Ａ  ｎｅｗ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｓｕｉｔｅ  ｆｏｒ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５４，  ９０５−２１  （１９９８））。
【０４７５】
コア相互作用界面アミノ酸は、ＰＣＳＫ９対タンパク質から５オングストローム未満又は５オングストロームに等しい少なくとも１つの原子を有する全てのアミノ酸残基であるものとして決定された。ファンデルワールス半径＋生じ得る水媒介性水素結合内の原子を考慮するために、５オングストロームをコア領域カットオフ距離として選択した。境界相互作用界面アミノ酸は、ＰＣＳＫ９対タンパク質から８オングストローム未満又は８オングストロームに等しい少なくとも１つの原子を有するが、コア相互作用リスト中に含まれない全てのアミノ酸残基として決定された。伸長されたアルギニンアミノ酸の長さを考慮するために、８オングストローム未満又は８オングストロームを境界領域カットオフ距離として選択した。プログラムＰｙＭＯＬ（ＤｅＬａｎｏ，  Ｗ．Ｌ．  Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ２００２））を用いて、これらの距離基準を満たすアミノ酸を計算した。距離は、Ｖドメイン「Ａ」及び３１Ａ４「Ｌ１，Ｈ１」複合体を用いて計算した。
【０４７６】
３１Ａ４の断片に結合されたＰＣＳＫ９Ｖドメインの結晶構造は、２．２オングストロームの解像度で決定された。結晶構造の図解は、図２１Ａから２１Ｄに提供されている。図２１Ａから２１Ｃは、３１Ａ４Ｆａｂがサブドメイン１及び２の領域中のＰＣＳＫ９Ｖドメインに結合することを示している。
【０４７７】
３１Ａ４Ｆａｂを結合した完全長ＰＣＳＫ９のモデルが作製された。完全長ＰＣＳＫ９の構造を、複合体からのＰＣＳＫ９Ｖドメイン上に重ね合わせた。このモデルの図は、図２１Ｄに示されている。ＬＤＬＲのＥＧＦａドメインとＰＣＳＫ９の間の相互作用の部位が強調表示されている。
【０４７８】
構造の分析は、この抗体がどこでＰＣＳＫ９と相互作用するかを示し、（以下の実施例４０及び４１と組み合わせて、結果を見た場合に）ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲ結合表面に結合していない抗体がＰＣＳＫ９を通じて媒介されるＬＤＬＲの分解をなお阻害できることを示した。さらに、結晶構造の分析によって、ＰＣＳＫ９と３１Ａ４抗体の間の相互作用に関与する特異的アミノ酸の同定が可能となる。さらに、ＰＣＳＫ９表面上の界面のコア及び境界領域も決定された。３１Ａ４との相互作用界面の特異的コアＰＣＳＫ９アミノ酸残基が、３１Ａ４タンパク質の５オングストローム以内に存在するＰＣＳＫ９残基として定義された。コア残基は、Ｔ４６８、Ｒ４６９、Ｍ４７０、Ａ４７１、Ｔ４７２、Ｒ４９６、Ｒ４９９、Ｅ５０１、Ａ５０２、Ｑ５０３、Ｒ５１０、Ｈ５１２、Ｆ５１５、Ｐ５４０、Ｐ５４１、Ａ５４２、Ｅ５４３、Ｈ５６５、Ｗ５６６、Ｅ５６７、Ｖ５６８、Ｅ５６９、Ｒ５９２及びＥ５９３である。
【０４７９】
３１Ａ４との相互作用界面の境界ＰＣＳＫ９アミノ酸残基が、３１Ａ４タンパク質から５ないし８オングストロームであるＰＣＳＫ９残基として定義された。境界残基は、以下のとおりである。Ｓ４６５、Ｇ４６６、Ｐ４６７、Ａ４７３、Ｉ４７４、Ｒ４７６、Ｇ４９７、Ｅ４９８、Ｍ５００、Ｇ５０４、Ｋ５０６、Ｌ５０７、Ｖ５０８、Ａ５１１、Ｎ５１３、Ａ５１４、Ｇ５１６、Ｖ５３６、Ｔ５３８、Ａ５３９、Ａ５４４、Ｔ５４８、Ｄ５７０、Ｌ５７１、Ｈ５９１、Ａ５９４、Ｓ５９５及びｂＨ５９７である。ＰＣＳＫ９タンパク質内に殆ど又は完全に埋没されているアミノ酸残基は、下線によって強調表示されている。本明細書に記載されているように、付番は、配列番号３のアミノ酸位置を基準とす
る（本明細書に記載されているように調整されている。）。
【０４８０】
ＰＣＳＫ９との相互作用界面の特異的コア３１Ａ４アミノ酸残基が、ＰＣＳＫ９タンパク質の５オングストローム以内に存在する３１Ａ４残基として定義された。３１Ａ４抗体に対するコア残基は、以下のとおりである。重鎖：Ｇ２７、Ｓ２８、Ｆ２９、Ｓ３０、Ａ３１、Ｙ３２、Ｙ３３、Ｅ５０、Ｎ５２、Ｈ５３、Ｒ５６、Ｄ５８、Ｋ７６、Ｇ９８、Ｑ９９、Ｌ１００及びＶ１０１；軽鎖：Ｓ３１、Ｎ３２、Ｔ３３、Ｙ５０、Ｓ５１、Ｎ５２、Ｎ５３、Ｑ５４、Ｗ９２及びＤ９４。ＰＣＳＫ９との相互作用界面の境界３１Ａ４アミノ酸残基が、ＰＣＳＫ９タンパク質から５ないし８オングストロームである３１Ａ４残基として定義された。３１Ａ４に対する境界残基は、以下のとおりである。重鎖：Ｖ２、Ｇ２６、Ｗ３４、Ｎ３５、Ｗ４７、Ｉ５１、Ｓ５４、Ｔ５７、Ｙ５９、Ａ９６、Ｒ９７、Ｐ１０２、Ｆ１０３及びＤ１０４；軽鎖：Ｓ２６、Ｓ２７、Ｎ２８、Ｇ３０、Ｖ３４、Ｎ３５、Ｒ５５、Ｐ５６、Ｋ６７、Ｖ９１、Ｄ９３、Ｓ９５、Ｎ９７、Ｇ９８及びＷ９９。
【０４８１】
結晶構造は、ＰＣＳＫ９との相互作用におけるこのＡＢＰの空間的必要条件も示した。この構造中に示されているように、驚くべきことに、ＬＤＬＲとのＰＣＳＫ９の相互作用を直接妨害することなくＰＣＳＫ９に結合する抗体は、ＰＣＳＫ９の機能をなお阻害することができる。
【０４８２】
幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９に結合し、又はＰＣＳＫ９を中和するために、３１Ａ４に結合し、３１Ａ４を覆い、３１Ａ４が上記残基の何れかと相互作用するのを妨害するあらゆる抗原結合タンパク質を使用することができる。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、以下のＰＣＳＫ９（配列番号３）残基の少なくとも１つに結合し、又はこれらと相互作用する。Ｔ４６８、Ｒ４６９、Ｍ４７０、Ａ４７１、Ｔ４７２、Ｒ４９６、Ｒ４９９、Ｅ５０１、Ａ５０２、Ｑ５０３、Ｒ５１０、Ｈ５１２、Ｆ５１５、Ｐ５４０、Ｐ５４１、Ａ５４２、Ｅ５４３、Ｈ５６５、Ｗ５６６、Ｅ５６７、Ｖ５６８、Ｅ５６９、Ｒ５９２及びＥ５９３。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、上記残基の１つ又はそれ以上の５オングストローム以内にある。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、以下のＰＣＳＫ９（配列番号３）残基の少なくとも１つに結合し、又はこれらと相互作用する。Ｓ４６５、Ｇ４６６、Ｐ４６７、Ａ４７３、Ｉ４７４、Ｒ４７６、Ｇ４９７、Ｅ４９８、Ｍ５００、Ｇ５０４、Ｋ５０６、Ｌ５０７、Ｖ５０８、Ａ５１１、Ｎ５１３、Ａ５１４、Ｇ５１６、Ｖ５３６、Ｔ５３８、Ａ５３９、Ａ５４４、Ｔ５４８、Ｄ５７０、Ｌ５７１、Ｈ５９１、Ａ５９４、Ｓ５９５及びＨ５９７。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、上記残基の１つ又はそれ以上から５ないし８オングストロームにある。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、上記残基の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０と相互作用し、これらを封鎖し、又はこれらの８オングストローム以内にある。
【０４８３】
上記実施例において論述されている結晶構造に対する座標が、表３５．１（完全長ＰＣＳＫ９及び３１Ｈ４）、表３５．２（ＰＣＳＫ９及びＥＧＦａ）、表３５．３（ＰＣＳＫ９、３１Ｈ４及び２１Ｂ１２）及び表３５．４（ＰＣＳＫ９及び３１Ａ４）に示されている。図面に図示されているＰＣＳＫ９の構造の関連する領域又は残基（ＥＧＦａ又は抗体がＰＣＳＫ９と相互作用する場所から１５、１５から８、８、８から５、５又はそれ以下のオングストローム以内の領域又は残基を含む。）と相互作用する抗原結合タンパク質及び分子並びに／又は座標からの構造上のそれらの対応する位置も想定される。
【０４８４】
座標中に記載されている抗体は、イー・コリ中で産生され、従って、完全ヒト抗体とは幾つか若干のアミノ酸の相違を有する。可変領域中の第一の残基は、２１Ｂ１２の重鎖及び軽鎖並びに３１Ｈ４の軽鎖に対するグルタミンの代わるグルタミン酸であった。可変領域の配列中の相違の他に、（同じく、抗体がイー・コリ中で産生されたという事実のため
に）座標によって記載されている抗体の定常領域中にも幾つかの相違が存在した。図２２は、配列番号１５６及び１５５と比べた場合の、（イー・コリ中で産生された）２１Ｂ１２、３１Ｈ４及び３１Ａ４Ｆａｂの定常領域間の相違を（下線付きの影又は太字によって）強調表示している。２１Ｂ１２、３１Ｈ４及び３１Ａ４に関して、軽鎖定常配列はヒトλ（配列番号１５６）と類似している。下線が付されたグリシン残基は挿入であり、この間で、２１Ｂ１２と３１Ｈ４可変領域が終結し、λ配列が開始する。
【０４８５】
２１Ｂ１２及び３１Ｈ４の両方に関して、重鎖定常は、ヒトＩｇＧ４（配列番号１５５）と類似している。図２２中の強調表示された相違が、表３６．１に示されている。
【０４８６】
【表１６】
2020058376.tif 000019
【０４８７】
３１Ａ４に関して、３１Ａ４は上記されている同じ相違を有するが、３つのさらなる相違が存在する。図２２に示されているように、先頭に２つの追加のアミノ酸が存在し、これは、イー・コリ発現中でのシグナルペプチドの不完全なプロセッシングに起因する。さらに、配列番号１５５と比べたときに、３１Ａ４重鎖定常領域中に１つの追加の置換が存在し、これは、（配列番号１５５中の）ＬのＨへの調整である。最後に、３１Ａ４は、２１Ｂ１２及び３１Ｈ４に対して上述されているグルタミン酸への調整ではなく、Ｆａｂの最初のアミノ酸としてグルタミンを有する。
【０４８８】
３つの抗体全てに関して、（濃い灰色の枠で囲まれている）重鎖の末端も異なるが、構造中でアミノ酸が整理されていないので、座標中には出現しない。当業者によって理解されるように、ヒスチジンタグを含む特定の配列番号への参照及びＡＢＰ配列が「ヒスチジンタグを含む」という記述によって明示的に言及されていなければ、ＨｉｓタグはＡＢＰの必要な一部でなく、ＡＢＰの配列の一部と考えるべきではない。
【０４８９】
（実施例３７）
エピトープマッピング−ビニング
実施例１０中の組に加えて、ビニング実験の別の組を実施した。実施例１０におけると同様に、互いに競合するＡＢＰは、標的上の同じ部位に結合するものと考えることができ、一般的な語法では、互いに「ビン」を形成していると言われる。
【０４９０】
Ｊｉａ他（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２８８  （２００４）  ９１−９８）によって記載された多重化ビニング法の改変を使用した。室温で１時間、暗所にて、０．５μｇ／ｍＬビオチン化一価マウス抗ヒトＩｇＧ捕捉抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，＃５５５７８５）１００μＬ中で、ストレプトアビジンによって被覆されたＬｕｍｉｎｅｘビーズの各ビーズコードを温置し、次いで、ＰＢＳＡ（１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えたリン酸緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ））で３回洗浄した。２μｇ／ｍＬ抗ＰＣＳＫ９抗体（ＣｏａｔｉｎｇＡｎｔｉｂｏｄｙ）１００μＬとと
もに、各ビーズコードを別々に１時間温置した後、ＰＢＳＡで３回洗浄した。ビーズをプールした後、９６ウェルフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，＃ＭＳＢＶＮ１２５０）に分配した。２μｇ／ｍＬの精製されたＰＣＳＫ９タンパク質１００μＬをウェルの半分に添加した。緩衝液を対照として他の半分に添加した。反応を１時間温置した後、洗浄した。２μｇ／ｍＬ抗ＰＣＳＫ９抗体（ＤｅｔｅｃｔｉｏｎＡｂ）１００μＬを全てのウェルに添加し、１時間温置し、次いで、洗浄した。別の対象として、無関係のヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ，＃００９−０００−００３）を走行させた。各ウェルに、ＰＥ連結された一価マウス抗ヒトＩｇＧ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，＃５５５７８７）２０μＬを添加し、１時間温置し、次いで、洗浄した。ＰＢＳＡ１００μＬ中にビーズを再懸濁し、最低１００事象／ビーズコードをＢｉｏＰｌｅｘ装置（ＢｉｏＲａｄ）上で収集した。
【０４９１】
ＰＣＳＫ９を含有する対応する反応のシグナルから、ＰＣＳＫ９なしでの抗体対の中央値蛍光強度（ＭＦＩ）を差し引いた。抗体対が同時に（従って、異なるビンに）結合したと考えられるためには、差し引かれたシグナルは、それ自身と競合する抗体のシグナルより３倍大きく、且つ無関係の抗体と競合する抗体のシグナルより３倍大きくなければならなかった。
【０４９２】
上記から得られたデータは、図２３Ａから２３Ｄに図示されている。ＡＢＰは、５つのビンに属した。影が付いた枠は、ＰＣＳＫ９へ同時に結合することができるＡＢＰを示している。影が付いていない枠は、結合に関して互いに競合するＡＢＰを示している。結果の要約が、表３７．１に示されている。
【０４９３】
【表１７】
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【０４９４】
ビン１（ＡＢＰ２１Ｂ１２と競合する。）及び３（３１Ｈ４と競合する）は、互いに排他的であり、ビン２はビン１及び３と競合し、並びにビン４はビン１及び３と競合しない
。この実施例において、ビン５は、他のビンに適合するＡＢＰを記載するために、「キャッチオール」ビンとして表される。従って、ビンのそれぞれの中の上記ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９上のエピトープ位置の異なる種類の代表であり、それらの幾つかは互いに重複する。
【０４９５】
当業者によって理解されるように、基準ＡＢＰがプローブＡＢＰの結合を妨げるのであれば、抗体は同じビン中にあると称される。ＡＢＰが使用される順序が重要であり得る。ＡＢＰＡが基準ＡＢＰとして使用され、ＡＢＰＢの結合を遮断すれば、逆は必ずしも真ではない。基準ＡＢＰとして使用されるＡＢＰＢは必ずしもＡＢＰＡを遮断しない。ここで役割を果たしている多数の因子が存在する。ＡＢＰの結合は、標的中の立体構造の変化を引き起こすことができ、これは、第二のＡＢＰの結合を妨げ、又は互いに重複するが、互いを完全に封鎖しないエピトープは、結合を可能とするのに十分な標的との高親和性相互作用を第二のＡＢＰがなお有することを可能にし得る。ずっと高い親和性を有するＡＢＰは、遮断するＡＢＰを押し出すより大きな能力を有し得る。一般に、何れの順序においても競合が観察されれば、ＡＢＰは互いにビンであると称され、両ＡＢＰが互いに遮断することができれば、エピトープはより完全に重複する可能性がある。
【０４９６】
（実施例３８）
エピトープマッピング−ウェスタンブロット
本実施例は、検査されたＡＢＰに対するエピトープが直鎖又は立体構造であるかどうかを示す。何れの抗体が立体構造的エピトープを有するかを決定するために、変性還元及び変性非還元ウェスタンブロットを実施した。変性還元ウェスタンブロットに結合する抗体は、直鎖エピトープを有しており、立体構造的ではない。結果が、図２４Ａ及び２４Ｂに示されている。ブロットに関して、４から１２％ＮｕＰＡＧＥＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル及びＭＥＳＳＤＳ走行緩衝液上に、精製された完全長ヒトＰＣＳＫ９の０．５μｇ／レーンを走行させた。ブロットを探査するために、０．５μｇ／ｍＬの３１Ｇ１１を除き、抗ＰＣＳＫ９抗体１μｇ／ｍＬを使用した。１：５０００のロバ抗ヒトＩＲ７００二次を使用し、ＬｉＣＯＲ装置上で読み取った。抗体１３Ｈ１は、ＰＣＳＫ９のプロドメイン上の直鎖エピトープに結合した。他の抗体全てが、立体構造的エピトープと合致する結果を示した。これらのゲルは、タンパク質の残りからプロドメインを分離し、プロドメインは約１５ｋＤａで走行した。さらに、３Ｃ４及び３１４は、ジスルフィド結合が保持されている変性条件下でＰＣＳＫ−９に結合するが（左）、試料を還元すると（右）結合が喪失したので、これらの抗体は、ジスルフィド結合によって保持される立体構造的エピトープに結合するものと思われた。
【０４９７】
（実施例３９）
エピトープマッピング−アルギニン／グルタミン酸スキャニング
（実施例３７から得られた）各ビンからの代表的ＡＢＰをさらなるエピトープ分析のために選択した。ＰＣＳＫ９へのＡＢＰ結合をマッピングするために、アルギニン／グルタミン酸スキャニング戦略を実施した。バックグラウンドとして、この方法は、ある残基が構造的エピトープの一部であるかどうかを決定し、抗原中の残基が抗体と接触し、又は抗体によって埋没されていることを意味する。アルギニン及びグルタミン酸側鎖は帯電しており、嵩が大きく、変異された残基が抗体結合に直接関与していなくても、抗体結合を破壊することができる。
【０４９８】
残基の選択
エピトープマッピングのために変異すべき残基を選択するために、ＰＣＳＫ９の結晶構造を使用した。変異させる残基を選択するために使用される方法は、数学的機序及び相互作用構造分析の両方を含んだ。ＰＣＳＫ９構造は、喪失した残基のギャップを含有し、Ｎ末端中の喪失した３０のアミノ酸（すなわち、シグナル配列）及びＣ末端中の１０のアミノ酸であった。内部の喪失した残基を構造上にモデル化されたが、Ｎ末端及びＣ末端の喪
失した残基はモデル化されなかった。各残基に対する溶媒曝露比を計算した。タンパク質に関連する各残基の表面積（ＳＡ１）を、保存された骨格構造とともに隣接するグリシンを有する三量体中の残基の表面積（ＳＡ２）によって除した。１０％を上回る溶媒曝露比（Ｒ１０）を有する残基並びに４０の喪失した末端残基を選択した。誤った折り畳みの可能性を低下させるために、正のΦ角度を有するプロリン及びグリシンはこれらから除外した。変異の総数を２８５とするために、タンパク質全体の視覚的検査とともに、３７％の溶媒曝露比を用いることによって、Ｖドメイン中の変異されるべき残基の数を減らした。これらの様々なクラスの種類とともに、ＰＣＳＫ９の表面の様々な配向が、図２５Ａから２５Ｆ中に示されている。これらの図面において、最も薄い灰色は、選択されなかった又は選択から除去された領域を表し、より濃い灰色は、選択された残基を表す。
【０４９９】
クローニング及び発現
変化させるべき残基が同定されたら、様々な残基を改変した。Ｃ末端のフラッグ−Ｈｉｓタグを有するｐＴＴ５ベクター中にヒトＰＣＳＫ９をクローニングした。ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＩＩキットを用いて、位置指定突然変異導入によって、この原構築物から変異体を作製した。ＡｍｇｅｎのＭｕｔａＧｅｎｉｅソフトウェアを用いて、突然変異導入のために使用されたセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計した。２４ウェルプレート中の一過性に形質移入された２９３−６Ｅ細胞中で全てのＰＣＳＫ９構築物を発現させ、各プレート中の非変異ＰＣＳＫ９対照（野生型、ＷＴ）とともに３つの９６ウェルプレート中に再度並べた。馴化培地中の組換えタンパク質の発現レベル及び完全性をウェスタンブロットによってチェックした。最初に選択された２８５の変異体のうち、４１がクローニング又は発現に失敗した。エピトープマッピングのために、２４４の変異体を使用した。２４４の変異された残基とのＰＣＳＫ９親配列及び代表的なＰＣＳＫ９配列の並置が、図２６に示されている。単一の変異を含有する別個の構築物を作製した。エピトープ配列及び結合の変化を伴うエピトープベースの発明のために、配列番号１及び／又は配列番号３０３を参照して配列が提供されている。図２６中の配列は、本結合エピトープ研究のために使用される配列であった。当業者は、本結果が本明細書中に開示されている他のＰＣＳＫ９バリアント（例えば、配列番号１及び並びに他の対立遺伝子バリアント）にも当てはまることを理解する。
【０５００】
優れたエピトープマッピングに関して、５つの抗体（各ビンの代表）を選択した。それらは、２１Ｂ１２、３１Ｈ４、１２Ｈ１１、３１Ａ４、３Ｃ４であった。全て、立体構造的エピトープ抗体である。また、３つ（２１Ｂ１２、３１Ｈ４及び３１Ａ４）は、上述のように、ＰＣＳＫ９と結晶化された。
【０５０１】
構造及び機能的エピトープ
エピトープは、さらに、構造的又は機能的として定義することができる。機能的エピトープは、一般に、構造的エピトープの亜群であり、相互作用（例えば、水素結合、イオン性相互作用）の親和性に直接寄与する残基を有する。構造的エピトープは、抗体によって覆われた標的のパッチと考えることができる。
【０５０２】
使用されるスキャニング突然変異導入は、アルギニン及びグルタミン酸スキャンであった。巨大な立体的な嵩及びそれらの電荷のために（これらにより、構造的エピトープ中に生じる変異は抗体結合に対してより大きな効果を有することが可能となる。）、これら２つの側鎖を選択した。ＷＴ残基がアルギニンである場合（これらの場合には、電荷を入れ替えるために、残基はグルタミン酸に変異させた。）を除いて、一般にアルギニンを使用した。
【０５０３】
エピトープマッピングの目的で、ＰＣＳＫ９及びＰＣＳＫ９変異体への抗体結合を同時に測定するために、ビーズをベースとした多重化アッセイを使用した。次いで、変異体へ
の抗体結合を、同じウェル中の野生型へのその結合と比較した。バリアントは、３つのグループに分けられた。グループ１：８１のバリアント＋２つのｗｔ対照＋１つの陰性対照＋１つの他のＰＣＳＫ９上清；グループ２：８１のバリアント＋２つのｗｔ対照＋２つの陰性対照；及びグループ３：８２のバリアント＋２つのｗｔ対照＋１つの陰性対照。
【０５０４】
アッセイは、以下のようにして行った。色によってコードされたストレプトアビジン被覆されたＬｕｍＡｖｉｄｉｎビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）の８５組にビオチン化された抗ペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ、＃１０１９２２５）を室温（ＲＴ）で１時間結合させ、次いで、ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中で３回洗浄した。次いで、色によってコードされたそれぞれのビーズの組を、４℃で一晩、上清１５０μＬ中のＰＣＳＫ９変異体、野生型又は陰性対照に結合させた。
【０５０５】
それぞれ特異的タンパク質に会合された、色によってコードされたビーズの組を洗浄し、プールした。この時点で、８５のビーズの組の３つのプール（変異体及び対照の各群に対して１つのプール）が存在した。各プールからのビーズを９６ウェルのフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  ＃ＭＳＢＶＮ１２５０）の２４ウェル（３列）に分注した。４倍希釈した抗ＰＣＳＫ９抗体１００μＬを、３つ組みの点に対して９つの列に添加し、室温で１時間温置し、洗浄した。１：２００希釈のフィコエリトリン（ＰＥ）連結された抗ヒトＩｇＧＦｃ１００μＬ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，＃１０９−１１６−１７０）を各ウェルに添加し、室温で１時間温置し、洗浄した。
【０５０６】
ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ中にビーズを再懸濁し、１０分間振盪し、ＢｉｏＰｌｅｘ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で読み取った。装置は、その色コードによって各ビーズを同定し、これにより、色コードに付随する特異的タンパク質を同定する。同時に、装置は、ＰＥ色素の蛍光強度によって、ビーズに結合された抗体の量を測定する。次いで、各変異体への抗体結合を同じプール中の野生型へのその結合と直接比較することができる。ＩＬ−１７ＲキメラＥを陰性対照として使用した。検査した変異体の全ての要約が（図１Ａ及び２６中で使用された配列付番を参照して）表３９．１に示されている。
【０５０７】
【表１８】
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【０５０８】
ビーズ変動研究
エピトープマッピング結合アッセイを実施する前に、「ビーズ領域」から「ビーズ領域」（Ｂ−Ｂ）の変動を評価するために、検証実験を行った。検証実験では、全てのビーズに同じ野生型対照タンパク質を連結した。従って、ビーズ領域間の差は、純粋にＢ−Ｂ変動によるものであり、野生型と変異体タンパク質間の差によって影響を受けない。抗体の滴定は、異なるウェル中で１２回反復して行った。
【０５０９】
この統計解析の目的は、結合曲線の推定ＥＣ５０のＢ−Ｂ変動性を推定することであった。次いで、曲線比較実験の間に、野生型及び変異体タンパク質のＥＣ５０信頼区間を構築するために、推定Ｂ−Ｂ標準偏差（ＳＤ）を使用した。
【０５１０】
各ビーズ領域に対する結合データに４パラメータのロジスティックモデルをフィッティングさせた。曲線品質管理（ＱＣ）の結果及び最上位（最大）、最下位（最低）、Ｈｉｌｌ勾配（勾配）に対するパラメータの推定及び曲線のＥＣ５０の自然対数（×ｍｉｄ）を含有する得られたファイルを、分析のための生データとして使用した。次いで、ＳＡＳＰＲＯＣＭＩＸＥＤ手法を使用するフィッティング混合効果モデルによって、各パラメータに対するＢ−Ｂ変動性を推定した。「優れた」ＱＣ状態を有する曲線のみを解析に含めた。最終の混合効果モデルは、ランダム効果として、残余（すなわち、それぞれのビーズ領域）のみを含んだ。各パラメータに対する最小二乗平均（ＬＳ−平均）も、混合効果モデルによって推定した。Ｂ−Ｂ分散の平方根を求めることによって、Ｂ−Ｂの標準偏差を計算した。ＬＳ−平均＋２ＳＤ及びＬＳ−平均−２ＳＤ間の変化倍数（概ね、集団の上位及び下位９７．５パーセンタイルを表す。）も計算した。結果は、表３９．２中に示されている。
【０５１１】
【表１９】
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【０５１２】
構造的エピトープ中の残基の同定
残基をアルギニン又はグルタミン酸に変異させたときに抗体結合を変化させる場合に、残基を構造的エピトープの一部と考えた（「ヒット」）。これは、野生型への抗体結合と比較したＥＣ５０のシフト又は最大シグナルの低下として観察される。統計的に有意なＥＣ５０のシフトを同定するために、野生型及び変異体への抗体結合曲線の統計解析を使用した。解析は、アッセイ及び曲線フィッティングにおける変動を考慮に入れている。
【０５１３】
ＥＣ５０の比較に基づくヒットの同定
ＶａｒＰｏｗｅｒソフトウェアを用いるＳ−ＰＬＵＳ（Ｉｎｓｉｇｈｔｆｕｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｓｅａｔｔｌｅ  ＷＡ）を用いて、結合データに対してフィッティングされた重み付けされた４パラメータロジスティックモデルからＥＣ５０及びＢｍａｘ値を求めた。変異体結合曲線と野生型結合曲線のＥＣ５０を比較した。さらなる検討のために、統計学的に有意な差をヒットとして同定した。「フィットなし」又は「不良なフィット」のフラッグが付いた曲線は、解析から除外した。
【０５１４】
ＥＣ５０推定値の変動
ＥＣ５０推定値の比較において、曲線のフィッティングからの変動及びビーズ−ビーズ変動という２つの変動源を考慮した。野生型及び変異体は異なるビーズに連結されたので、それらの差は、ビーズ−ビーズ差の影響を受ける（上記）。曲線フィッティングの変動は、ｌｏｇＥＣ５０推定値の標準誤差によって推定された。ビーズ−ビーズ変動は、野生型対照がビーズの各１つに連結されている実験を用いて、実験的に測定した（上記）。実際のエピトープマッピング実験におけるビーズ−ビーズ変動を推定するために、この実験から得られた野生型結合曲線のＥＣ５０推定値のビーズ変動を使用した。
【０５１５】
変異体及び野生型間でのＥＣ５０シフトの検査
Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて、（対数目盛りでの）２つのＥＣ５０の比較を行った。デルタ（ＥＣ５０推定値間の絶対差）とデルタの標準偏差間の比としてｔ統計量を計算した。３つの成分（非線形回帰における変異体及び野生型曲線に対するＥＣ５０の分散推定並びに別個の実験から推定されたビーズ−ビーズ分散の２倍）の合計によって、デルタの分散を推定した。ビーズ−ビーズ分散に対する２の乗数は、変異体及び野生型ビーズが何れも同じ分散を有するという仮定によるものであった。デルタの標準偏差の自由度は、Ｓａｔｔｅｒｔｈｗａｉｔｅの（１９４６）近似を用いて計算した。それぞれのｐ値及び信頼区間（９５％及び９９％）は、各比較のためのＳｔｕｄｅｎｔのｔ分布に基づいて得られた。複数の野生型対照の場合には、変異体と最も似通った野生型対照を選び取ることによって、すなわち、最大のｐ値を有するものを選び取ることによって、保守的アプローチを採用した。
【０５１６】
大量の検査を同時に実施しながら偽陽性を管理するために、多重度調整が重要であった。この解析のために、ファミリーワイズエラー（ＦＷＥ；ｆａｍｉｌｙ  ｗｉｓｅ  ｅｒｒｏｒ）調整及び偽発見率（ＦＤＲ；ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ）調整という多重性調整の２つの形態を実行した。ＦＷＥアプローチは、１つ又はそれ以上のヒットが本物でない確率を調節する。ＦＤＲアプローチは、選択されたヒット間での偽陽性の予想割合を調節する。前者のアプローチはより保守的であり、後者のアプローチより強力でない。この解析のために、両アプローチに対して利用可能な多くの方法が存在する。ＦＷＥ分析に関してはＨｏｃｈｂｅｒｇの（１９８８）方法を選択し、ＦＤＲ分析に関しては、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇの（１９９５）方法を選択した。両アプローチに対する調整されたｐ値を計算した。
【０５１７】
結果
ＥＣ５０のシフト
そのＥＣ５０が野生型と有意に異なる（例えば、全アッセイに対して０．０１又はそれ以下の偽発見率調整されたｐ値を有する）変異を構造的エピトープの一部と考えた。また、０．０１０９の抗体当りＦＷＥ調整されたｐ値を有していた抗体３１Ｈ４の残基Ｒ１８５Ｅを除いて、全てのヒットが、各抗体に対して、０．０１未満のファミリーワイズ第一種過誤率調整されたｐ値を有していた。ＥＣ５０のシフトによって決定された様々な抗体の構造的エピトープ中の残基が表３９．３に示されている（点変異は、配列番号１及び３０３を基準とする。）。
【０５１８】
【表２０】
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【０５１９】
最大シグナル減少
曲線フィッティング（ＢｍａｘＰｅｒＷＴ）及び生データ点（ＲａｗＭａｘＰｅｒＷＴ）から得られた最大シグナルを用いて、％最大シグナルを計算した。野生型シグナルと比べて抗体結合最大シグナルを７０％以上低下させた変異又は他の抗体全てが野生型の少なくとも４０％であるときに、他の抗体と比べて１つの抗体のシグナルを５０％超低下させる変異をヒット及びエピトープの一部と考えた。表３９．４は、最大シグナルの低下によって決定された構造エピトープ（斜字体）である残基を示している。
【０５２０】
【表２１】
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【０５２１】
表３９．５は、様々な抗体に対するヒットの全ての要約を示している。
【０５２２】
【表２２】
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【０５２３】
これらの残基が関連するエピトープの一部又は全部をどのようにして形成するかをさらに調べるために、上記位置を様々な結晶構造モデル上にマッピングし、結果が図２７Ａから２７Ｅに示されている。図２７Ａは、２１Ｂ１２抗体とのＰＣＳＫ９の結晶構造上にマ
ッピングされた、２１Ｂ１２エピトープのヒットを図示している。構造は、ＰＣＳＫ９残基を以下のように同定する。薄い灰色は、変異を受けていない残基を示し（構造上に明示されている残基を除く。）、より濃い灰色は変異を受けた残基を示す（それらの一部は発現できなかった。）。明示されている残基を検査し（図の上に示されている影に関わらず）、ＥＣ５０及び／又はＢｍａｘの著しい変化をもたらした。エピトープのヒットは、Ｂｍａｘのシフトに基づいた。この図において、３１Ｈ４は、２１Ｂ１２の後ろにある。
【０５２４】
図２７Ｂは、３１Ｈ４及び２１Ｂ１２抗体とのＰＣＳＫ９の結晶構造上にマッピングされた、３１Ｈ４エピトープヒットを図示する。構造は、ＰＣＳＫ９残基を以下のように同定する。薄い灰色は、変異を受けていない残基を示し（構造上に明示されている残基を除く。）、より濃い灰色は変異を受けた残基を示す（それらの一部は発現できなかった。）。（図の上に示されている影に関わらず）明示されている残基を検査し、ＥＣ５０及び／又はＢｍａｘの有意な変化を得た。エピトープのヒットは、ＥＣ５０のシフトに基づいた。
【０５２５】
図２７Ｃは、３１Ｈ４及び２１Ｂ１２抗体とのＰＣＳＫ９の結晶構造上にマッピングされた、３１Ａ４エピトープヒットを図示する。この構造は、ＰＣＳＫ９残基を以下のように同定する。薄い灰色は、変異を受けていない残基を示し（構造上に明示されている残基を除く。）、より濃い灰色は変異を受けた残基を示す（それらの一部は発現できなかった。）。（図の上に示されている影に関わらず）明示されている残基を検査し、ＥＣ５０及び／又はＢｍａｘの有意な変化を得た。エピトープのヒットは、ＥＣ５０のシフトに基づいた。３１Ａ４抗体は、ＰＣＳＫ９のＶドメインに結合することが知られており、これは、図２７Ｃ中に示されている結果と合致するように見受けられる。
【０５２６】
図２７Ｄは、３１Ｈ４及び２１Ｂ１２抗体とのＰＣＳＫ９の結晶構造上にマッピングされた、１２Ｈ１１エピトープヒットを図示する。構造は、ＰＣＳＫ９残基を以下のように同定する。薄い灰色は、変異を受けていない残基を示し（構造上に明示されている残基を除く。）、より濃い灰色は変異を受けた残基を示す（それらの一部は発現できなかった。）。（図の上に示されている影に関わらず）明示されている残基を検査し、ＥＣ５０及び／又はＢｍａｘの有意な変化を得た。１２Ｈ１１は、上に記載されているビニングアッセイにおいて、２１Ｂ１２及び３１Ｈ４と競合する。
【０５２７】
図２７Ｅは、３１Ｈ４及び２１Ｂ１２抗体とのＰＣＳＫ９の結晶構造上にマッピングされた、３Ｃ４エピトープヒットを図示する。構造は、ＰＣＳＫ９残基を以下のように同定する。薄い灰色は、変異を受けていない残基を示し（構造上に明示されている残基を除く。）、より濃い灰色は変異を受けた残基を示す（それらの一部は発現することができなかった。）。（図の上に示されている影に関わらず）明示されている残基を検査し、ＥＣ５０及び／又はＢｍａｘの著しい変化をもたらした。
【０５２８】
３Ｃ４はビニングアッセイにおいて、２１Ｂ１２及び３１Ｈ４と競合しない。３Ｃ４は、ドメイン結合アッセイ中のＶドメインに結合する（実施例４０、図２８Ａ及び２８Ｂから得られた結果を参照）。
【０５２９】
（結晶構造に基づいて）結合に対して影響を有すると予想できる約１２の変異体が存在したが、本実験は、驚くべきことに、結合に対して効果を有していないことを示した。当業者によって理解されるように、上記結果は、これらの抗体の結晶構造及びＰＣＳＫ−９の結合と良好に一致している。これは、提供されている構造及び対応する機能的データが中和ＡＢＰとＰＣＳＫ９の相互作用の中心的残基及び領域を十分に同定することを示している。従って、上記領域に結合する能力を有するＡＢＰのバリアントは、本記述によって十分に提供される。
【０５３０】
当業者によって理解されるように、Ｂ−ｍａｘの低下及びＥＣ５０シフトのヒットは、同じ現象の現れであると考えることができるが、厳密に言えば、Ｂｍａｘの低下単独では、それ自体、親和性の喪失を反映せず、むしろ、抗体のエピトープの幾らかのパーセントの破壊を反映する。Ｂ−ｍａｘ及びＥｃ５０によって決定されたヒットには重複は存在しないが、結合に対して強い影響を有する変異は、有用な結合曲線の作成を可能にしない場合があり得、従って、このようなバリアントに対しては、ＥＣ５０を決定することはできない。
【０５３１】
当業者によって理解されるように、（上述のように、一般的なキャチオールビンであるビン５を除き）同じビン中のＡＢＰは、標的タンパク質上の重複する部位へ結合する可能性がある。従って、上記エピトープ及び関連する残基は、同じビン中のこのような全てのＡＢＰへ一般に拡張することができる。
【０５３２】
ＡＢＰ３１Ｈ４に関する上記結果をさらに調べるために、上記結晶構造によれば、Ｒ１８５と相互作用して、ＡＢＰと相互作用する表面の一部を形成すると予想された位置Ｅ１８１Ｒも変化させた（Ｅ１８１Ｒ）。単独では統計的に有意ではないが、結晶構造と組み合わせた場合に、結果は、Ｅ１８１Ｒとの３１Ｈ４の相互作用を示す（データは図示せず。）。従って、位置１８１も、３１Ｈ４ＡＢＰに対するエピトープの一部を形成するようである。
【０５３３】
上述のように、上記結合データ及びエピトープの性質決定は、ＰＣＳＫ９の最初の３０アミノ酸を含まないＰＣＳＫ９配列（配列番号１）を参照する。従って、このタンパク質断片の付番系及びこの断片を参照する配列番号は、完全長ＰＣＳＫ９付番系（上記結晶研究データにおいて使用されるものなど）を使用するデータ及び実験と比べて、３０アミノ酸だけシフトする。従って、これらの結果を比較するためには、余分の３０アミノ酸を、上記エピトープマッピング結果の各々の中の位置に付加すべきである。例えば、配列番号１（又は配列番号３０３）の２０７位は、配列番号３の２３７位に相当する（完全長配列及び本明細書の残りを通じて使用される付番系）。表３９．６は、配列番号１（及び／又は配列番号３０３）を参照する上記位置が配列番号３（シグナル配列を含む。）とどのように相関するかを概説する。
【０５３４】
【表２３】
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【０５３５】
従って、配列番号１を参照して本明細書中に記載されている実施形態は、配列番号３を参照する上述の対応する位置によっても記載することができる。
【０５３６】
（実施例４０）
ＰＣＳＫ９ドメイン結合アッセイ
本実施例は、様々なＡＢＰがＰＣＳＫ９上のどこに結合するかを調べた。
【０５３７】
透明な９６ウェルｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）を、ＰＢＳ中に希釈された様々な抗ＰＣＳＫ９抗体２μｇ／ｍＬで一晩被覆した。ＰＢＳ／．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０でプレートを完全に洗浄し、次いで、３％ＢＳＡ／ＰＢＳで２時間ブロックした。洗浄後、一般的なアッセイ希釈液（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ＬＬＣ）中に希釈された完全長ＰＣＳＫ９（ａａ３１−６９２配列番号３、ｐｒｏｃａｔＰＣＳＫ９（ａａ３１−４４９配列番号３）又はｖ−ドメインＰＣＳＫ９（配列番号３のａａ４５０−６９２）の何れかとともに、プレートを２時間温置した。プレートを洗浄し、ｐｒｏｃａｔ及びｖ−ドメイン並びに完全長ＰＣＳＫ９を認識するウサギポリクローナルビオチン化抗ＰＣＳＫ９抗体（Ｄ８７７４）を１μｇ／ｍＬ（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中）で添加した。結合された完全長、ｐｒｏｃａｔ又はｖ−ドメインＰＣＳＫ９を、２００ｎｇ／ｍＬ（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中）ニュートラビジンーＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともに、続いて、ＴＭＢ基質（ＫＰＬ）とともに温置し、６５０ｎｍで吸光度を測定することによって検出した。図２８Ａ及び２８Ｂ中に示されている結果は、ＰＣＳＫ９の様々な部分に結合する様々なＡＢＳの能力を示している。図２８Ｂに示されているように、ＡＢＰ３１Ａ４は、ＰＣＳＫ９のＶドメインに結合する。
【０５３８】
（実施例４１）
中和非競合的抗原結合タンパク質
本実施例は、ＰＣＳＫ９との結合に関して、ＬＤＬＲと非競合的であるが、なおＰＣＳＫ９活性に対して中和的である抗原結合タンパク質をどのようにして同定及び性質決定するかを示す。換言すれば、このような抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合するのを遮断しないが、ＰＣＳＫ９によって媒介されるＬＤＬＲの分解を妨げ、又は低下させる。
【０５３９】
緩衝液Ａ（１００ｍＭカコジル酸ナトリウム、ｐＨ７．４）中に希釈されたヤギ抗ＬＤＬ受容体抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）２μｇ／ｍＬで、透明な３８４ウェルプレート（Ｃｓｔａｒ）を被覆した。緩衝液Ａでプレートを完全に洗浄し、次いで、緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ中の１％ミルク）で２時間ブロックした。洗浄後、緩衝液Ｃ（１０ｍＭＣａＣｌ２が補充された緩衝液Ｂ）中に希釈されたＬＤＬ受容体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）０．４μｇ／ｍＬとともに、プレートを１．５時間温置した。この温置と同時に、緩衝液Ａ中に希釈された抗体１００ｎｇ／ｍＬ又は緩衝液Ａのみ（対照）とともに、ビオチン化Ｄ３７４ＹＰＣＳＫ９の２０ｎｇ／ｍＬを温置した。ＬＤＬ受容体を含有するプレートを洗浄し、ビオチン化されたＤ３７４ＹＰＣＳＫ９／抗体混合物をプレートに移し、室温で１時間温置した。ＬＤＬ受容体へのビオチン化されたＤ３７４Ｙの結合は、緩衝液Ｃ中での５００ｎｇ／ｍＬのストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｂｉｏｓｃｏｕｒｃｅ）とともに温置した後、ＴＭＢ基質（ＫＰＬ）とともに温置することによって検出した。１ＮＨＣｌでシグナルを消光し、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。結果は、図２８Ｃに示されており、ＡＢＰ３１Ｈ４はＬＤＬＲ結合を阻害するのに対して、ＡＢＰ３１Ａ４はＰＣＳＫ９へのＬＤＬＲ結合を阻害しないことを示す。実施例４０から得られた結果並びに図２８Ａ及び２８Ｂに示されている結果と合わせると、３１Ａ４ＡＢＰはＰＣＳＫ９のＶドメインに結合し、ＬＤＬＲとのＰＣＳＫの相互作用を遮断しないことが明瞭である。
【０５４０】
次に、ＡＢＰ３１Ａ４が中和ＡＢＰとして役割を果たす能力は、（上記実施例に記載されているような）細胞ＬＤＬ取り込みアッセイを介してさらに確認された。このＬＤＬ取り込みアッセイの結果は、図２８Ｄに示されている。図２８Ｄに示されているように、ＡＢＰ３１Ａ４は、有意なＰＣＳＫ９中和能を示す。従って、実施例４０及び本結果に照らせば、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９及びＬＤＬＲ結合相互作用を遮断せずにＰＣＳＫ９に結合することができるが、中和ＰＣＳＫ９ＡＢＰとしてなお有用であることが明白である。
【０５４１】
参照による組み込み
特許、特許出願、論文、教科書など、本明細書中に引用されている全ての参考文献及びそれらの中に引用されている参考文献は、それらの全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれた参考文献中に与えられている定義又は用語の何れもが本明細書に与えられている用語及び論述と異なる程度まで、本発明の用語及び定義が優越する。
【０５４２】
均等物
前記明細書は、当業者が本発明の実施を可能にするのに十分であると考えられている。前述の記載及び実施例は、本発明のある種の好ましい実施形態を詳述し、本発明者らによって想定される最良の様式を記載する。しかしながら、前記述が本文中でどれほど詳細に記載されているとしても、本発明は、多くの様式で実施することができ、本発明は、添付の特許請求の範囲及びそのあらゆる均等物に従って解釈すべきであることが理解される。
【０５４３】
【表２４】
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【０５４４】
【表２５】
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【０５４５】
【表２６】
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【０５４６】
【表２７】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ１】
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【図１Ｂ２】
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【図１Ｂ３】
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【図１Ｂ４】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【図３Ｍ】
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【図３Ｎ】
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【図３Ｏ】
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【図３Ｐ】
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【図３Ｑ】
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【図３Ｒ】
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【図３Ｓ】
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【図３Ｔ】
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【図３Ｕ】
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【図３Ｖ】
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【図３Ｗ】
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【図３Ｘ】
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【図３Ｙ】
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【図３Ｚ】
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【図３ＡＡ】
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【図３ＢＢ】
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【図３ＣＣ】
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【図３ＤＤ】
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【図３ＥＥ】
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【図３ＦＦ】
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【図３ＧＧ】
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【図３ＨＨ】
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【図３ＩＩ】
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【図３ＪＪ】
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【図３ＫＫ】
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【図３ＬＬ】
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【図３ＭＭ】
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【図３ＮＮ】
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【図３ＯＯ】
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【図３ＰＰ】
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【図３ＱＱ】
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【図３ＲＲ】
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【図３ＳＳ】
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【図３ＴＴ】
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【図３ＵＵ】
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【図３ＶＶ】
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【図３ＷＷ】
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【図３ＸＸ】
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【図３ＹＹ】
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【図３ＺＺ】
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【図３ＡＡＡ】
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【図３ＢＢＢ】
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【図３ＣＣＣ】
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【図３ＤＤＤ】
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【図３ＥＥＥ】
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【図３ＦＦＦ】
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【図３ＧＧＧ】
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【図３ＨＨＨ】
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【図３ＩＩＩ】
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【図３ＪＪＪ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１３Ｉ】
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【図１３Ｊ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２５Ｅ】
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【図２５Ｆ】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２７Ｅ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２８Ｄ】
2020058376.tif 000516
【配列表】
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