(57)【要約】      （修正有）【課題】細菌集団増殖阻害または混合細菌集団中の第一細菌および第二細菌の亜集団の相対比率の改変のための、方法、使用、システム、アレイ、改変されたヌクレオチド配列およびベクターの提供。【解決手段】細菌種の混合集団における第一および第二細菌種の亜集団の相対比率を変えることにより、ヒトまたは動物対象における細菌宿主細胞が介在する疾患または状態の処置または予防における使用のための宿主修飾（ＨＭ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム。【選択図】図１２
2020058369.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌種の混合集団における第一および第二細菌種の亜集団の相対比率を変えることにより、ヒトまたは動物対象における細菌宿主細胞が介在する疾患または状態の処置または予防における使用のための宿主修飾（ＨＭ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであって、該混合集団は該対象に含まれ、該宿主細胞は該第二細菌種の細胞であり、各宿主細胞について下記要素（ｉ）〜（ｉｉｉ）
（ｉ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列；
（ｉｉ）ＨＭ−ｃｒＲＮＡをコードするスペーサー配列（ＨＭ−スペーサー）および反復を含む宿主細胞標的配列および改変された宿主修飾（ＨＭ）ＣＲＩＳＰＲアレイであって、ＨＭ−ｃｒＲＮＡは該Ｃａｓを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主細胞標的配列とハイブリダイズする配列を含むもの；
（ｉｉｉ）ここで、システムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換できる少なくとも一つの核酸ベクターの間で分かれ、それによりＨＭ−ｃｒＲＮＡがＣａｓを標的にガイドし、宿主細胞における標的配列を修飾し；そして
ここで、第一の細菌種がエシェリキア・コリである、
を含む、システム。
【請求項２】
細菌種のエクスビボの混合集団における第一および第二細菌種の亜集団の相対比率を変えるための宿主修飾（ＨＭ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用であって、第二細菌種の細胞が宿主細胞を含み、各宿主細胞についてシステムが下記要素（ｉ）〜（ｉｉｉ）
（ｉ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列；
（ｉｉ）ＨＭ−ｃｒＲＮＡをコードするスペーサー配列（ＨＭ−スペーサー）および反復を含む宿主細胞標的配列および改変された宿主修飾（ＨＭ）ＣＲＩＳＰＲアレイであって、ＨＭ−ｃｒＲＮＡは該Ｃａｓを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主細胞標的配列とハイブリダイズする配列を含むもの；
（ｉｉｉ）ここで、システムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換できる少なくとも一つの核酸ベクターの間で分かれ、それによりＨＭ−ｃｒＲＮＡがＣａｓを標的にガイドし、宿主細胞における標的配列を修飾し；
ここで標的配列がＣａｓにより修飾され、それにより宿主細胞が死滅するかまたは宿主細胞増殖が抑制され、
ここで、第一の細菌種がエシェリキア・コリである、
を含む、使用。
【請求項３】
工業用またはエクスビボ医学的流体、表面、装置もしくはコンテナの処理または水路、水、飲料、食糧または化粧品の処理のためであって、ここで宿主細胞は、流体、表面、装置、コンテナ、水路、水、飲料、食糧または化粧品に含まれるまたはそれらの上にある、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
ヒトまたは動物における片利共生または相利共生であるバクテロイデス門を支持するためにヒトまたは動物に投与するための細菌培養を産生する、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
混合集団がエクスビボ腸内微生物相集団であり、所望により宿主細胞がファーミキューテスまたはクロストリジウム・ディフィシル細胞である、請求項２または４に記載の使用。
【請求項６】
（ａ）各宿主細胞がヒト微生物相に見られる株または種のものであり；
（ｂ）各宿主細胞がスタフィロコッカス、ストレプトコッカス、シュードモナス、サルモネラ、リステリア、デスルホビブリオまたはクロストリジウム宿主細胞であり；
（ｃ）第一細菌がヒトとプロバイオティク、片利共生または相利共生であり（例えば、ヒト腸における）；または
（ｄ）第一細菌が腸内細菌科であり、第二細菌がファーミキューテスである、
請求項２〜５の何れかに記載の使用。
【請求項７】
（ａ）各宿主細胞がヒト微生物相に見られる株または種のものであり；
（ｂ）各宿主細胞がスタフィロコッカス、ストレプトコッカス、シュードモナス、サルモネラ、リステリア、デスルホビブリオまたはクロストリジウム宿主細胞であり；
（ｃ）第一細菌がヒトとプロバイオティク、片利共生または相利共生であり（例えば、ヒト腸における）；または
（ｄ）第一細菌が腸内細菌科であり、第二細菌がファーミキューテスである、
請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
（ａ）混合細菌集団におけるバクテロイデス門細菌の比率の改変、（ｂ）混合細菌集団におけるファーミキューテス亜集団（宿主細胞）の比率の減少、（ｃ）混合集団における第一ファーミキューテス種（宿主細胞）の比率の減少であって、ここで混合集団が該ｃＲＮＡにより増殖が阻害されない第二ファーミキューテス種を含むもの、（ｄ）混合細菌集団における第一グラム陽性細菌種（宿主細胞）の比率の減少であって、ここで混合集団が該ｃＲＮＡにより増殖が阻害されない第二グラム陽性細菌種を含むもの、（ｅ）混合細菌集団におけるある細菌種（宿主細胞）の比率の減少であって、ここで混合集団が該ｃＲＮＡにより増殖が阻害されない異なる細菌種を含み、ここで第一種が他の種の１６ｓリボソームＲＮＡコード化ＤＮＡ配列と少なくとも８０％同一である１６ｓリボソームＲＮＡコード化ＤＮＡ配列を含むもの、（ｆ）混合細菌集団における第一細菌ヒト腸内微生物相種（宿主細胞、例えば、ファーミキューテス）の比率の減少であって、ここで混合集団は異なる細菌種を含み、ここで異なる種が該ｃＲＮＡにより増殖が阻害されないヒト腸プロバイオティク種であるものまたは（ｇ）混合細菌集団における細菌ヒト腸内微生物相種（宿主細胞、例えば、ファーミキューテス）の比率の減少であって、ここで混合集団が異なる細菌種を含み、ここで異なる種が該ｃＲＮＡにより増殖が阻害されないヒト腸片利共生種であるもののための、請求項２〜６の何れかに記載の使用。
【請求項９】
（ａ）混合細菌集団におけるバクテロイデス門細菌の比率の改変、（ｂ）混合細菌集団におけるファーミキューテス亜集団（宿主細胞）の比率の減少、（ｃ）混合集団における第一ファーミキューテス種（宿主細胞）の比率の減少であって、ここで混合集団が該ｃＲＮＡにより増殖が阻害されない第二ファーミキューテス種を含むもの、（ｄ）混合細菌集団における第一グラム陽性細菌種（宿主細胞）の比率の減少であって、ここで混合集団が該ｃＲＮＡにより増殖が阻害されない第二グラム陽性細菌種を含むもの、（ｅ）混合細菌集団におけるある細菌種（宿主細胞）の比率の減少であって、ここで混合集団が該ｃＲＮＡにより増殖が阻害されない異なる細菌種を含み、ここで第一種が他の種の１６ｓリボソームＲＮＡコード化ＤＮＡ配列と少なくとも８０％同一である１６ｓリボソームＲＮＡコード化ＤＮＡ配列を含むもの、（ｆ）混合細菌集団における第一細菌ヒト腸内微生物相種（宿主細胞、例えば、ファーミキューテス）の比率の減少であって、ここで混合集団が異なる細菌種を含み、ここで異なる種が該ｃＲＮＡにより増殖が阻害されないヒト腸プロバイオティク種であるものまたは（ｇ）混合細菌集団における細菌ヒト腸内微生物相種（宿主細胞、例えば、ファーミキューテス）の比率の減少であって、ここで混合集団が異なる細菌種を含み、ここで異なる種が該ｃＲＮＡにより増殖が阻害されないヒト腸片利共生種であるものであって、ここで（ａ）〜（ｇ）は、ヒトまたは動物対象における（ｉ）比率が減少される該細菌種による微生物相感染または（ｉｉ）比率が減少される該細菌種が介在する疾患または状態の処置または予防のためである、請求項１および７の何れかに記載のシステム。
【請求項１０】
（ａ）細菌の混合集団における第一および第二亜集団の相対比率を変えるためであって、ここで、第二細菌がファーミキューテスであるもの；
（ｂ）ファーミキューテスに対するバクテロイデス門の相対的比率を増加させるため；または
（ｃ）混合細菌集団におけるバクテロイデス門細菌の比率を変えるための、
請求項２〜６および８の何れかに記載の使用。
【請求項１１】
（ａ）細菌の混合集団における第一および第二亜集団の相対比率を変えるためであって、ここで、第二細菌がファーミキューテスであるもの；
（ｂ）ファーミキューテスに対するバクテロイデス門の相対的比率を増加させるため；または
（ｃ）混合細菌集団におけるバクテロイデス門細菌の比率を変えるための、
請求項１、７および９の何れかに記載のシステム。
【請求項１２】
あるいはＨＭ−ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが単一ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）からなる、例えばベクターにより提供される、請求項２〜６、８および１０の何れかに記載の使用。
【請求項１３】
あるいはＨＭ−ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが単一ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）からなる、例えばベクターにより提供される、請求項１、７、９および１１の何れかに記載のシステム。
【請求項１４】
宿主細胞集団増殖が、該ＨＭ−アレイまたは該ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列で形質転換されていない該宿主細胞の集団の増殖と比較して少なくとも５倍減少している、請求項２〜６、８、１０および１２の何れかに記載の使用。
【請求項１５】
宿主細胞集団増殖が、該ＨＭ−アレイまたは該ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列で形質転換されていない該宿主細胞の集団の増殖と比較して少なくとも５倍減少している、請求項１、７、９、１１および１３の何れかに記載のシステム。
【請求項１６】
表面上の宿主細胞集団増殖が阻害される、請求項２〜６、８、１０、１２および１４の何れかに記載の使用。
【請求項１７】
表面上の宿主細胞集団増殖が阻害される、請求項１、７、９、１１、１３および１５の何れかに記載のシステム。
【請求項１８】
ポイント（ｉ）において、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列が宿主細胞に内在性である、請求項２〜６、８、１０、１２、１４および１６の何れかに記載の使用。
【請求項１９】
ポイント（ｉ）において、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列が宿主細胞に内在性である、請求項１、７、９、１１、１３、１５および１７の何れかに記載のシステム。
【請求項２０】
ベクターが、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする配列を欠く、請求項２〜６、８、１０、１２、１４、１６および１８の何れかに記載の使用。
【請求項２１】
ベクターが、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする配列を欠く、請求項１、７、９、１１、１３、１５、１７および１９の何れかに記載のシステム。
【請求項２２】
ベクターがファージベクターである、請求項２〜６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０の何れかに記載の使用。
【請求項２３】
ベクターがファージベクターである、請求項１、７、９、１１、１３、１５、１７、１９および２１の何れかに記載のシステム。
【請求項２４】
各宿主細胞について、システムが、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するためのＤＮＡ配列をさらに含む、請求項２〜６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０および２２の何れかに記載の使用。
【請求項２５】
各宿主細胞について、システムが、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するためのＤＮＡ配列をさらに含む、請求項１、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３の何れかに記載のシステム。
【請求項２６】
混合集団が対象の腸内微生物相に含まれる、請求項１、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３および２５の何れかに記載のシステム。
【請求項２７】
請求項１、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５および２６の何れかに記載のシステムにおける使用のための改変された核酸ベクターを含む組成物であって、ベクターは、請求項１〜２６の何れかに記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおける使用または使用のための複数の異なるｃｒＲＮＡを発現するための核酸配列を含み（例えば、ｇＲＮＡに含まれる）；そして
ここで、該ｃｒＲＮＡの第一は該宿主細胞の第一核酸配列とハイブリダイズでき、そして
該ｃｒＲＮＡの第二は該宿主細胞の第二核酸配列とハイブリダイズでき、ここで該第二配
列は該第一配列と異なり；そして
（ａ）第一配列は抗生物質耐性遺伝子（またはそのＲＮＡ）を含み、第二配列は抗生物質耐性遺伝子（またはそのＲＮＡ）を含み、所望により、これらの遺伝子は異なり；
（ｂ）第一配列は抗生物質耐性遺伝子（またはそのＲＮＡ）を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子（またはそのＲＮＡ）を含み；
（ｃ）第一配列は必須遺伝子（またはそのＲＮＡ）を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子（またはそのＲＮＡ）を含むまたは
（ｄ）第一配列は病原性遺伝子（またはそのＲＮＡ）を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子（またはそのＲＮＡ）を含む、
組成物。
【請求項２８】
１．４ｋｂを超える外来性ＤＮＡ配列を含み、ここで外来性ＤＮＡはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの１以上の要素をコードし、宿主細胞におけるＨＭ−ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡの発現のための改変されたアレイを含み；外来性配列はｃＲＮＡまたはｇＲＮＡと同族であるＣａｓヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を欠き、ここで少なくとも２つの異なるｃＲＮＡまたはｇＲＮＡが外来性ＤＮＡによりコードされる（例えば、少なくとも２ＨＭ−ＣＲＩＳＰＲアレイにより）、請求項１〜２６の何れかに記載の使用またはシステムにおける使用のための核酸ベクター。
【請求項２９】
ベクターがファージベクターである、請求項２７または２８に記載の組成物またはベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、細菌集団の増殖阻害、混合細菌集団中の第一細菌および第二細菌の亜集団の相対比率の改変の方法、そのための核酸アレイおよび該アレイを含むベクターに関する。本発明は、宿主細胞核酸修飾のために改変されたシステム、該システムの要素および工業および製薬へのこれらの応用に関する。本発明は、例えば、環境、食品および飲料使用のための微生物の処理に特に有用である。本発明は、とりわけ産業用または家庭用システムにおける基質または流体の微生物学的影響下での腐食(ＭＩＣ)または生物付着の処理方法に関する。本発明はまた、本方法に使用するための処理された流体およびベクターにも関する。ある実施態様において、本方法は、アレイの水平伝播を使用する。本発明はまたこの目的のために可動遺伝要素(ＭＧＥ)により構成されるアレイおよび該アレイを含むベクターも提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
細菌集団増殖阻害および共存する細菌種の相対比率の改変は、広範な工場および他の施設における、水路、飲料水または他の環境施設での処理に応用される。またヒトおよび非ヒト動物、例えば、家畜における感染症の低減または腸内または口内微生物相のリバランスのための細菌改変にも応用される。近年、色々な体重または肥満プロファイルを有するヒトにおける腸内細菌の相対比率の分析またはクローン病のような疾患における細菌の影響の可能性の探索にも興味がもたれている。
【０００３】
ファージに対する細菌自然免疫機序は豊富であるが、広く報告されている細菌適応免疫システムはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである。改変されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、細菌から動物および植物細胞にわたる、種々のタイプの原核および真核細胞における核酸の正確な修飾に使用されている(例えば、Jiang W et al (2013)参照)。細菌および古細菌のような原核生物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ(規則的に短い正逆同義の反復(repeat)の挿入により形成／CRISPR associated)と呼ばれる適応免疫システムをコードして、ウイルス(例えば、バクテリオファージ)およびプラスミドのような移動性侵入物に対する耐性を提供する。バクテリオファージ(またはファージ)が地球上で最も多い生命体であり、その細菌餌食の１０倍を越えると推定される(Seed et al (2013)を参照)。ファージ捕食の不変の脅威は、広範囲の細菌免疫機序を発生させ、これが、続いて多様なファージ免疫回避戦略をもたらし、動的共進化的軍備拡張競争に至っている。
【０００４】
宿主免疫は、記憶座位(ＣＲＩＳＰＲアレイ)における侵入物ＤＮＡ配列の取り込み、この座位からのガイドＲＮＡの形成およびプロトスペーサー隣接モチーフ(ＰＡＭ)の隣に位置する同族侵入物ＤＮＡ(プロトスペーサー)の分解に基づく。例えばＷＯ２０１０／０７５４２４号参照。宿主ＣＲＩＳＰＲアレイは、種々の要素からなる：反復が同一であり、スペーサーが異なる１以上の反復−スペーサー−反復単位の直ぐ５’のリーダー(プロモーターを含む)。侵入ウイルスまたはプラスミド核酸からスペーサー配列を獲得することにより、宿主防御システムは、新規スペーサーをＣＲＩＳＰＲアレイ(各スペーサーは反復に隣接する)に取り込み、ウイルスまたはプラスミドによる将来の侵襲に対処するための記憶として作用することができる。最近獲得されたスペーサーは、宿主アレイのリーダー直後に挿入される傾向にあることが観察されている。
【０００５】
ＣＲＩＳＰＲ座位およびその関連遺伝子(Ｃａｓ)が、細菌および古細菌にファージおよび他の侵入遺伝要素に対して適応免疫を与えることが報告されている(Heler et al (2014)を参照)。あらゆる免疫系の基本的要件は、再発する感染に対してより効率的に対処するために過去の感染の記憶を構築する能力である。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ免疫システムの適応特性は、侵入分子のＤＮＡ配列を記憶し、それを‘スペーサー’の形でＣＲＩＳＰＲアレイの反復配列間に統合する能力に依存する。スペーサーの転写は、小アンチセンスＲＮＡを産生し、これは、ＲＮＡガイドＣａｓヌクレアーゼにより細胞を感染から保護するための侵入核酸の開裂に使用される。新規スペーサーの獲得により、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ免疫システムは、新規脅威に対して迅速に適応し、それ故に‘適応’(すなわち、ベクター配列スペーサー獲得)と呼ばれる。
【０００６】
Seed et al (2013)は、ファージコード化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが細菌宿主のファージ阻害性染色体島の相殺に使用された、注目すべき事象の転換を報告した。ファージによる溶解性感染の成功は、ＣＲＩＳＰＲスペーサーと標的染色体島の間の配列同一性に依存すると報告された。このようなターゲティングの非存在下、ファージコード化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ファージ複製回復のための染色体島の効率的ターゲティングを迅速にに進化させ、確実にする新規スペーサーを獲得できた。Bondy-Denomy et al (2012)は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの阻害に介在する遺伝子の早期に観察された例を記載する。５つの異なる‘抗ＣＲＩＳＰＲ’遺伝子が、バクテリオファージ感染シュードモナス・エルジノーサのゲノムで発見された。ファージの抗ＣＲＩＳＰＲ遺伝子の変異は、機能的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムで細菌の感染を不可能とし、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ標的化ファージのゲノムへの同一遺伝子の付加は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの回避を可能とする。
【０００７】
未成熟ＲＮＡはＣＲＩＳＰＲアレイから転写され、その後成熟してｃｒＲＮＡを形成する。あるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムはまたトランス活性化ＲＮＡ(ｔｒａｃｒＲＮＡ)をコードする配列も含み、これは、未成熟ｃｒＲＮＡにおける反復をハイブリダイズしてプレｃｒＲＮＡを形成でき、それによりさらなるプロセシングが成熟またはｃｒＲＮＡを産生する。ｃＲＮＡの構造は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが関与するタイプ(タイプＩ、IIまたはIII)により変わる。
【０００８】
ＣＲＩＳＰＲ関連(ｃａｓ)遺伝子は、しばしばＣＲＩＳＰＲアレイと関連する。大規模な比較ゲノム解析は、多くの異なるｃａｓ遺伝子を同定しており、４０の細菌および古細菌のゲノムの初期の解析は、４５ｃａｓ遺伝子ファミリーが存在し、２遺伝子、ｃａｓ１およびｃａｓ２のみが普遍的に存在する可能性を示唆した。Ｃａｓ１およびＣａｓ２は、アレイへの新規スペーサー獲得に必須であると考えられ、故に、ファージまたはプラスミドからの侵入物核酸に対する抵抗性の発達に重要な機構である。Nunez et al (2015)は、Ｃａｓ１−Ｃａｓ２複合体が、スペーサーＤＮＡ獲得を触媒する最小機構であり、Ｃａｓ１−Ｃａｓ２介在適応免疫の配列および構造特異性の提供におけるＣＲＩＳＰＲ反復の重要性を説明していると報告した。
【０００９】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムはまた、侵入物ヌクレオチド配列における侵入物核酸隣接同族認識モチーフ(ＰＡＭ)切断のために、ヌクレアーゼ(例えば、Ｃａｓ９)を発現する配列も含む。ヌクレアーゼのＰＡＭ認識は、各タイプのＣａｓヌクレアーゼに特異的である。侵入物配列のＰＡＭは、プロトスペーサー配列直ぐ３’に位置でき、ヌクレアーゼは、一般にＰＡＭの３〜４ヌクレオチド上流(５’)を切断する。ＰＡＭ配列の保存は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム間で異なり、ｃａｓ１およびリーダー配列と進化的に関連するように見える。Fineran et al (2014)は、侵入物が、プロトスペーサーまたはその隣接ＰＡＭの領域(“シード領域”)に点変異を作ることにより、エシェリキア・コリＫ１２のタイプＩ−Ｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ免疫を逃れることができるが、宿主は獲得(“プライミング”)を含むポジティブフィードバック過程において新規スペーサーを統合することにより、免疫を迅速に回復することを観察した。今日まで、ＰＡＭは、多数のタイプＩおよびタイプIIシステムで十分特徴づけされており、プロトスペーサーにおける変異の影響は、考証されている(Fineran et al (2014)の引用文献５、１４、２３、４６、４７参照)。Fineran et al (2014)は、彼らの結果が、先の研究に一致して、ＰＡＭおよびシード配列の重要な役割を示したと結論付けた。
【００１０】
Semenova et al (2011)はシード配列の役割を探索し、エシェリキア・コリサブタイプＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの場合、ｃｒＲＮＡマッチングの要件は、ＰＡＭ直後のシード領域で厳格であると結論付けた。シード領域における変異が、ｃｒＲＮＡガイドＣａｓｃａｄｅ複合体のプロトスペーサーＤＮＡへの結合親和性を減少させることにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ介在免疫を無くすことが観察された。
【００１１】
適応免疫の３つの主要なタイプの各々におけるＣＲＩＳＰＲ免疫の段階は次のとおりである。
(１)獲得がＣａｓ１およびＣａｓ２による侵入ＤＮＡの認識およびプロトスペーサーの開裂により開始する；
(２)プロトスペーサー配列が、リーダー配列に隣接する直接反復にライゲートされる；および
(３)一本鎖伸張がＣＲＩＳＰＲを修復し、直接反復を二本化する。
【００１２】
ｃｒＲＮＡプロセシングおよび干渉段階は、３つの主要なＣＲＩＳＰＲシステムタイプの各々において異なって生じる。一次ＣＲＩＳＰＲ転写物はＣａｓにより開裂されて、ｃｒＲＮＡを産生する。タイプＩシステムにおいて、Ｃａｓ６ｅ／Ｃａｓ６ｆは、直接反復におけるヘアピンループにより形成されたｓｓＲＮＡおよびｄｓＲＮＡの接合部で開裂される。タイプIIシステムは、トランス活性化(ｔｒａｃｒ)ＲＮＡを使用してｄｓＲＮＡを形成し、これはＣａｓ９およびＲＮａｓｅIIIにより開裂される。タイプIIIシステムは、開裂に直接反復におけるヘアピンループを必要としないＣａｓ６ホモログを使用する。タイプIIおよびタイプIIIシステムにおいて、二次トリミングが５’末端または３’末端で行われ、成熟ｃｒＲＮＡが産生される。成熟ｃｒＲＮＡはＣａｓタンパク質と結合して、干渉複合体を形成する。タイプＩおよびタイプIIシステムにおいて、ｃｒＲＮＡとＰＡＭ間の塩基対形成が侵入ＤＮＡの分解を引き起こす。タイプIIIシステムは、分解の成功にＰＡＭを必要とせず、タイプIII−Ａシステムにおいて、塩基対形成は、タイプIII−Ｂシステムにより標的化されるＤＮＡではなく、むしろｃｒＲＮＡとｍＲＮＡの間で生じる。
【発明の概要】
【００１３】
発明の記載
本発明の第一形態
本発明者らは、次の１以上の特性を用いる、微生物相(ヒト、動物または環境微生物相)で天然に一緒に生ずる細菌の混合共同体における特定の細菌株の集団増殖の阻害を始めて示したと確信する。
・野生型細胞のターゲティング；
・野生型内在性Ｃａｓヌクレアーゼ活性の利用；
・必須である抗生物質耐性遺伝子のターゲティング；
・ここで標的は野生型配列である
による集団増殖阻害。
【００１４】
本発明者らは、これを、次の特性を有する混合細菌集団で示した。
・ヒト微生物相(例えば腸内微生物相)種の混合集団における混合集団のターゲティング；
・ここで集団は３種含み；
・これらの種の中の１種の選択的死滅と、他種の細胞の温存を含み；
・このような阻害により温存される系統的に近い他の種の存在下での細胞増殖阻害のターゲティング；
・標的ファーミキューテス種および非ファーミキューテス種を含む混合集団における細胞増殖阻害のターゲティング；
・混合集団中の異なるファーミキューテス種を温存しながら特定のファーミキューテス株の細胞増殖阻害のターゲティング；
・混合集団における異なるグラム陽性菌種を温存しながら特定のグラム陽性細菌株の細胞増殖阻害のターゲティング；
・片利共生ヒト腸内細菌種を温存しながら病原性(ヒトにおける)細菌種のターゲティング；
・プロバイオティクヒト腸内細菌種を温存しながら病原性細菌種のターゲティング；
・表面の混合細菌集団における細胞増殖阻害のターゲティング；
・特定の細菌種単独でのまたは共同体で複数の他の細菌種と混合されているときの少なくとも１０倍増殖阻害の達成；および
・特定の細菌種の２つの異なる株の少なくとも１０倍増殖阻害の達成。
【００１５】
野生型細胞において内在性Ｃａｓ活性を利用する能力は、生物(例えば、ヒトおよび動物)および環境における宿主細胞感染のその場での処理に極めて有用である。ヒト、動物または植物微生物相のような野生型(すなわち、操作されていないまたは予め改変された)細菌集団の処理は、本発明を使用してまた取り組むことができる。混合集団において選択的増殖阻害を発揮する能力は、ヒト、動物または植物微生物相のような細菌集団に取り組むのにまたは環境マイクロバイオームに取り組むのに有用である。この特性はまた医薬(例えば、ここに開示する何らかの処置または予防のためにヒトまたは動物対象に投与するための細菌細胞移植または本発明の製品細菌集団を含む除草剤または殺虫剤組成物の産生のため)の産生にも有用であり、ここで、選択的死滅を、混合集団における種々の細菌の比率を選択的に変えて、医薬、除草剤または殺虫剤であるか、またはそこから医薬、除草剤または殺虫剤が産生される改変細菌集団を産生することができる。例えば、医薬をヒトまたは動物レシピエントに鼻腔内的に移植して、このような処置または予防を行い得る。
【００１６】
下記作業実施例において、増殖阻害を、固体表面における細菌集団(グラム陽性ファーミキューテス集団)で取り組んだ。＞１０倍集団増殖阻害が達成された。ターゲティングは抗生物質耐性遺伝子に対して指向された。本発明は、抗生物質耐性細菌の増殖阻害に有効であり、ここで標的配列は抗生物質耐性遺伝子の配列である。例えば、改変されたヌクレオチド配列と抗生物質の共投与が有効であり得る。これは、より完全なヒトまたは動物対象における宿主細胞感染の処置または予防を提供しおよび／またはヒトまたは動物に投与する治療有効抗生物質用量の減少を可能にすることができる。これは、ヒトおよび動物集団における抗生物質の過剰投与に関する懸念の増加および耐性発現の観点から有用である。本発明はまた、工業用または医学的流体、表面、装置もしくはコンテナ(例えば、食品、消費財、化粧品、パーソナルヘルスケア製品、石油または石油製品)の処理または水路、水、飲料、食糧または化粧品の処理のためのエクスビボおよびインビトロ適用も見出し、ここで宿主細胞は、流体、表面、装置、コンテナ、水路、水、飲料、食糧または化粧品に含まれるまたはそれらの上にある。本発明はまた腐食、バイオフィルムおよび生物付着の制御にも適用が見出される。第一形態は、それ故に、次のコンセプトを提供する。
【００１７】
混合細菌集団中の第一細菌および第二細菌の亜集団の相対比率を変えるための宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用であって、第二細菌は宿主細胞を含み、
各宿主細胞について、システムは(ｉ)〜(iv)の要素を含む。
(ｉ)Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列；
(ii)ＨＭ−ｃｒＲＮＡをコードするスペーサー配列(ＨＭ−スペーサー)および反復を含む宿主細胞標的配列および改変された宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイであって、ＨＭ−ｃｒＲＮＡは該Ｃａｓを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主細胞標的配列とハイブリダイズする配列を含むもの；
(iii)任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮＡ配列；
(iv)ここで、システムの該要素は、宿主細胞と宿主細胞を形質転換する少なくとも一つの核酸ベクターの間で分かれ、それによりＨＭ−ｃｒＲＮＡがＣａｓを標的にガイドし、宿主細胞における宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを修飾し；そして
ここで標的配列がＣａｓにより修飾され、それにより宿主細胞が殺されるかまたは宿主細胞増殖が抑制される。
【００１８】
細菌宿主細胞の標的ヌクレオチド配列修飾のための請求項１の発明の使用のための宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであって、
(ｉ)Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列；
(ii)ＨＭ−ｃｒＲＮＡをコードするスペーサー配列(ＨＭ−スペーサー)および反復を含む宿主細胞標的配列および改変された宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイであって、ＨＭ−ｃｒＲＮＡは該Ｃａｓを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主細胞標的配列とハイブリダイズする配列を含むもの；
(iii)任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するためのＤＮＡ配列；
(iv)ここで、システムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換できる少なくとも一つの核酸ベクターの間で分かれ、それによりＨＭ−ｃｒＲＮＡがＣａｓを標的にガイドし、宿主細胞における宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを修飾するものである、
(ｉ)〜(iv)の要素を含む、システム。
【００１９】
これは、我々が、混合および非混合細胞集団における少なくとも１０倍の選択的宿主細胞増殖阻害を示す、実施例により例示される。混合物は、ヒト微生物相に見られる種および株の組み合わせを模倣する。
【００２０】
集団の増殖阻害のための細菌宿主細胞集団の野生型内在性Ｃａｓヌクレアーゼ活性の使用であって、ここで各宿主細胞は野生型Ｃａｓヌクレアーゼ活性を有する内在性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを有し、使用は集団の宿主細胞の形質転換を含み、ここで各形質転換宿主細胞は、宿主細胞における宿主修飾(ＨＭ)ｃＲＮＡまたはガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)の提供のために改変されたヌクレオチド配列で形質転換され、ＨＭ−ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、内在性Ｃａｓを標的にガイドするための宿主細胞標的プロトスペーサー配列とハイブリダイズ可能な配列を含み、ここでｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、該野生型ヌクレアーゼ活性を有する宿主細胞の内在性Ｃａｓヌクレアーゼと同属であり、宿主細胞形質転換後、集団の増殖が阻害される。
【００２１】
細菌宿主細胞の死滅または増殖減少のための宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用(所望であれば使用は直前の段落の使用に従う)であって、各宿主細胞について、システムは
(ｉ)Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列；
(ii)ＨＭ−ｃｒＲＮＡをコードするスペーサー配列(ＨＭ−スペーサー)および反復を含む改変された宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイであって、ＨＭ−ｃｒＲＮＡは該Ｃａｓを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主細胞標的配列とハイブリダイズする配列を含むもの；
(iii)任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮＡ配列；
(iv)ここで、システムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換する少なくとも一つの核酸ベクターの間で分かれ、それによりＨＭ−ｃｒＲＮＡがＣａｓを標的にガイドし、宿主細胞における標的配列を修飾し；
ここでＣａｓヌクレアーゼは宿主細胞に内在性であり、そしてここで標的配列がＣａｓにより修飾され、それにより宿主細胞が死滅するかまたは宿主細胞増殖を減少させるものである
(ｉ)〜(iv)の要素を含む。
【００２２】
それ故に、ＨＭ−ｃＲＮＡは、該Ｃａｓを宿主細胞における標的にガイドし、標的配列を修飾するために、宿主細胞標的配列とハイブリダイズできる。
別法において、ＨＭ−ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは単一ガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)からなる。
【００２３】
内在性Ｃａｓヌクレアーゼの利用により、本発明の実施態様は、内在性Ｃａｓヌクレアーゼ活性を使用する(ヌクレアーゼ活性を活性化または増強するための、宿主細胞の事前遺伝子修飾を要しない)。それ故に、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼは宿主細胞の野生型遺伝子によりコードされている。例えば、ヌクレアーゼは、宿主細胞の内在性Ｃａｓヌクレアーゼ(またはＣａｓヌクレアーゼ遺伝子)のリプレッサーを不活性化せずに、細胞死滅または増殖阻害を活性化するために作用する。それ故に、本発明は、効率的Ｃａｓ介在細胞死滅または増殖減少をもたらすために、先の操作を必要とせずに野生型細菌集団に対処できる。それ故に、集団を、該集団がその野生型環境(例えば水路またはヒトまたは動物マイクロバイオームからなる)にあるとき、ｃＲＮＡに曝すことができる。
【００２４】
例えば、第一細菌は、バクテロイデス門(例えば、バクテロイデス)細胞である。例えば、第二細菌はファーミキューテス細胞である。方法は、例えば、腸内微生物相集団(例えば、エクスビボまたはインビボ)の比率を変えるために使用され、これは、例えば体重増加または肥満の処置または予防用である(例えば、ここで第一細菌はファーミキューテス細胞である)。
【００２５】
第一形態はまた次のものを提供する。第一細菌および第二細菌の亜集団を含む混合細菌集団中の該亜集団の相対比率を改変する方法であって、ここで第一細菌はファージにより感染された宿主細胞(例えば、バクテロイデス門細胞)であり、第二細菌は該ファージに感染されておらず(またはバクテロイデス門細菌ではない)、方法は、ベクター核酸を宿主細胞に導入し、混合集団における細菌増殖を可能とするために１以上の工程で混合集団と複数のベクターを合わせることを含み、ここで該第一細菌と第二細菌の相対比率が改変され、
ここで各ベクターは、細胞における該ファージの標的ヌクレオチド配列を修飾するためにファージ感染宿主細胞に導入するための改変されたファージ修飾(ＰＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイを含み、
(ａ)ここでＰＭ−ＣＲＩＳＰＲアレイは、ＰＭ−ｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列およびファージ感染宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み；そして
(ｂ)ここでＰＭ−ｃｒＲＮＡは感染宿主細胞にＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)をガイドして、標的配列を修飾するために、ファージ標的配列とハイブリダイズできる。
【００２６】
第二形態において、本発明は次のものを
宿主細胞の標的ヌクレオチド配列の修飾のための宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム(例えば、第一形態の使用のため)であって、
(ｉ)Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列；
(ii)ＨＭ−ｃｒＲＮＡをコードするスペーサー配列(ＨＭ−スペーサー)および反復を含む改変された宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイであって、ＨＭ−ｃｒＲＮＡは該Ｃａｓを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主標的配列とハイブリダイズ可能な配列を含むもの；
(iii)任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはＴｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するためのＤＮＡ配列；
(iv)ここでシステムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換できる少なくとも一つの核酸ベクターの間で分かれ、それによりＨＭ−ｃｒＲＮＡがＣａｓを標的にガイドし、宿主細胞における標的配列を修飾するものである
(ｉ)〜(iv)の要素を含み、
ここで、所望により、要素(ｉ)は宿主細胞に内在性である。
【００２７】
第二形態はまた次のものを提供する。ファージのゲノム修飾のための第一形態の方法で使用するための改変されたファージ修飾(ＰＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイであって、
(ａ)ここでＰＭ−ＣＲＩＳＰＲアレイは、ＰＭ−ｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列およびファージ感染宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み；そして
(ｂ)ここでＰＭ−ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)を感染宿主細胞にガイドして、標的配列を修飾するためにファージゲノム標的配列にハイブリダイズできる。
【００２８】
例えば、ファージはバクテロイデス門(例えば、バクテロイデス)ファージ、例えば、ｃｒＡｓｓファージである。
例えば、アレイは宿主細胞ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムで機能的であるＣＲＩＳＰＲ反復を含む。これは、細菌混合物における所望の細胞へのアレイの選択性増加に有益である。これはまた宿主細胞におけるアレイの機能に必要な１以上のＣａｓタンパク質(および／またはｔｒａｃｒＲＮＡ)をコードする嵩高いヌクレオチド配列を包含する必要がない可能性があるため、アレイおよび本発明のアレイを含むベクターの産生を単純化する。別法において、アレイは同族Ｃａｓ９コード化配列および所望により同族ｔｒａｃｒＲＮＡコード化配列と提供される。
【００２９】
第三形態において、本発明は次のものを提供する。
内在性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む細菌宿主細胞修飾のための改変された核酸ベクターであって、ベクターは
(ａ)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムで使用するためのまたは本発明に従い使用するための複数の異なるｃｒＲＮＡ(例えば、単一ガイドＲＮＡ、すなわち、ｇＲＮＡ)の発現のための核酸配列を含み；そして
(ｂ)Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸配列を欠き、
ここで、該ｃｒＲＮＡの第一は該宿主細胞の第一核酸配列とハイブリダイズでき、そして該ｃｒＲＮＡの第二は該宿主細胞の第二核酸配列とハイブリダイズでき、ここで該第二配列は該第一配列と異なり；そして
(ｃ)第一配列は抗生物質耐性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は抗抗生物質耐性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、所望により、これらの遺伝子は異なり；
(ｄ)第一配列は抗生物質耐性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み；
(ｅ)第一配列は必須遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含むまたは
(ｆ)第一配列は病原性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含む。
【００３０】
第三形態はまた次のものを提供する。本発明の方法において使用するための核酸ベクター(例えば、プラスミド、ファージまたはファージミド)であって、ベクターは本発明のＣＲＩＳＰＲアレイを含む。
【００３１】
第四形態において、本発明は次のものを提供する。
宿主細菌細胞(例えば、上記したような病原性細菌細胞)のゲノムまたは宿主細胞におけるウイルス(例えば、ファージ)のゲノムの標的配列を修飾するための改変されたＣＲＩＳＰＲアレイを含む核酸ベクター(例えば、プラスミド、ウイルス、ファージまたはファージミド)であって、
(ａ)ここでＣＲＩＳＰＲアレイはｃｒＲＮＡ(例えば、ｇＲＮＡとして提供される)の発現のための１以上の配列および宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み；
(ｂ)ここでｃｒＲＮＡは宿主細胞におけるＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)をガイドし、標的配列を修飾するために標的配列とハイブリダイズできる；
(ｃ)ここでアレイは第一細菌と、異なる種の第二細菌細胞の間で水平伝播できるトランスポゾンからなる。
【００３２】
第五形態において、本発明は次のものを提供する。
可動遺伝要素(ＭＧＥ)を含むまたはこれからなる改変されたＣＲＩＳＰＲ核酸ベクターであって、ここでＭＧＥは宿主細胞(例えば、病原性細菌細胞)のゲノムまたは宿主細胞におけるウイルス(例えば、プロファージ)のゲノムの標的配列修飾のための伝達起点(ｏｒｉＴ)およびＣＲＩＳＰＲアレイを含み、
(ａ)ここでＣＲＩＳＰＲアレイは、ｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列および宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み；
(ｂ)ここでｃｒＲＮＡは宿主細胞におけるＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)をガイドし、標的配列を修飾するために標的配列とハイブリダイズでき；
(ｃ)ここでベクターは(ｉ)第一宿主細胞の第一核酸と第二核酸位置間(ここで各位置は染色体またはプラスミドの位置であり、標的配列は宿主細胞に含まれる)または(ii)第一宿主細胞と第二宿主細胞間(ここで標的配列は第一および／または第二宿主細胞に含まれる)で伝達可能である。
【００３３】
第六形態において、本発明は次のものを提供する。
産業用または家庭用システムにおける基質の微生物腐食(ＭＩＣ)または生物付着を制御する方法であって、ここで基質の表面は基質のＭＩＣまたは生物付着に介在する第一微生物種の第一宿主細胞の集団と接触し、方法は
(ｉ)該集団と、細胞の形質転換または形質導入が可能な複数のベクターを接触させ、各ベクターはＣＲＩＳＰＲアレイを含み、それによりＣＲＩＳＰＲアレイが宿主細胞に導入され、ここで
(ａ)各ＣＲＩＳＰＲアレイはｃｒＲＮＡの発現のための１以上のヌクレオチド配列および宿主細胞の配列の転写のためのプロモーターを含み；そして
(ｂ)各ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)を宿主細胞にガイドし、標的配列を修飾する(例えば、標的配列を切断する)ために、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズでき、標的配列は宿主細胞生存能に介在する遺伝子配列であり；そして
(ii)宿主細胞においてＣａｓ存在下該ｃＲＮＡを発現させ、それにより宿主細胞において標的配列を修飾し、宿主細胞生存能の低下および該基質のＭＩＣまたは生物付着の制御をもたらす
ことを含む。
【００３４】
他の実施態様において、次のことが提供される。
原油、ガスまたは石油化学製品回収、加工、保存または輸送装置に含まれる基質の微生物腐食(ＭＩＣ)または生物付着を制御する方法であって、ここで基質の表面は第一宿主細胞の集団と接触し、ここで第一宿主細胞は、基質のＭＩＣまたは生物付着に介在する第一種の硫黄または硫酸還元細菌(ＳＲＢ)、細胞外重合物質産生細菌(ＥＰＳＢ)、酸産生細菌(ＡＰＢ)、硫黄または硫化物酸化細菌(ＳＯＢ)、鉄酸化細菌(ＩＯＢ)、マンガン酸化細菌(ＭＯＢ)、アンモニア産生細菌(ＡｍＰＢ)または酢酸産生細菌(ＡｃＰＢ)であり、ここで表面および細胞集団は海水、淡水、フラッキング液体または井戸中の液体からなる群から選択され、方法は
(ｉ)細胞集団とベクターを、液体と第一宿主細胞の形質転換または形質導入が可能な複数のベクターを混合することにより接触させ、各ベクターはＣＲＩＳＰＲアレイを含み、それによりＣＲＩＳＰＲアレイが宿主細胞に導入され、ここで
(ａ)各ＣＲＩＳＰＲアレイはｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列および宿主細胞の配列の転写のためのプロモーターを含み；
(ｂ)各ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)を宿主細胞にガイドし、標的配列を修飾する(例えば、標的配列を切断する)ために、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズでき、標的配列は宿主細胞生存能に介在する遺伝子配列であり；
(ｃ)ここで(ａ)の各々の配列は、第一宿主細胞において各ｃｒＲＮＡの発現および産生のために配列Ｒ１−Ｓ１−Ｒ１’を含み、ここでＲ１は第一ＣＲＩＳＰＲ反復であり、Ｒ１’は第二ＣＲＩＳＰＲ反復であり、Ｒ１またはＲ１’は任意であり、Ｓ１は該第一宿主細胞の標的配列と８０％以上同一であるヌクレオチド配列を含むかまたはこれからなる第一ＣＲＩＳＰＲスペーサーであり、そして
(ii)宿主細胞においてＣａｓ存在下該ｃＲＮＡを発現させ、それにより宿主細胞において標的配列を修飾し、宿主細胞生存能の低下および該基質のＭＩＣまたは生物付着の制御をもたらす
ことを含む。
【００３５】
他の実施態様は、次のものを提供する。
本方法に使用するためのベクターであって、ここで第一細胞は硫酸還元細菌(ＳＲＢ)細胞、例えば、デスルホビブリオまたはデスルホトマキュラム細胞であり、ベクターはＳＲＢターゲティングのための１以上のＣＲＩＳＰＲアレイを含み、ここで各アレイは(ａ)〜(ｃ)に定義したとおりである。
【００３６】
他の実施態様において、次のものが提供される。産業用または家庭用システムにおける流体の微生物の生物付着を制御する方法であって、ここで流体は該生物付着に介在する第一微生物種の第一宿主細胞の集団を含み、方法は
(ｉ)該集団と、細胞の形質転換または形質導入が可能な複数のベクターを接触させ、各ベクターはＣＲＩＳＰＲアレイを含み、それによりＣＲＩＳＰＲアレイが宿主細胞に導入され、ここで
(ａ)各ＣＲＩＳＰＲアレイはｃｒＲＮＡの発現のための１以上のヌクレオチド配列および宿主細胞の配列の転写のためのプロモーターを含み；そして
(ｂ)各ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)を宿主細胞にガイドし、標的配列を修飾する(例えば、標的配列を切断する)ために、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズででき、標的配列は宿主細胞生存能に介在する遺伝子配列であり；そして
(ii)宿主細胞においてＣａｓ存在下該ｃＲＮＡを発現させ、それにより宿主細胞において標的配列を修飾し、宿主細胞生存能の低下および該生物付着の制御をもたらす
ことを含む。
【００３７】
例えば、次のものが提供される。船または船舶のバラスト水における細菌生物付着を制御する方法であって、ここで水は該生物付着に介在する第一微生物種の第一宿主細胞の集団を含み、方法は
(ｉ)該集団と、細胞の形質転換または形質導入が可能な複数のベクターを接触させ、各ベクターはＣＲＩＳＰＲアレイを含み、それによりＣＲＩＳＰＲアレイが宿主細胞に導入され、ここで
(ａ)各ＣＲＩＳＰＲアレイはｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列および宿主細胞の配列の転写のためのプロモーターを含み；そして
(ｂ)各ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)を宿主細胞にガイドし、標的配列を修飾する(例えば、標的配列を切断する)ために、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズでき、標的配列は宿主細胞生存能に介在する遺伝子配列であり；そして
(ii)宿主細胞においてＣａｓ存在下該ｃＲＮＡを発現させ、それにより宿主細胞において標的配列を修飾し、宿主細胞生存能の低下および該生物付着の制御をもたらす
ことを含む。
【００３８】
他の実施態様は、ＣＲＩＳＰＲアレイを含むバラスト海水(例えば、海水サンプルまたはコンテナ中の海水)を提供し、ここでバラスト水は本方法により得るまたは得られる。バラスト海水は、船、船舶、海上コンテナまたは掘削装置に含まれる。本方法において使用するベクターであって、ここで第一細胞はコレラ(例えば、ビブリオ、例えば、Ｏ１またはＯ１３９)、エシェリキア・コリまたはエンテロコッカス細胞であり、ベクターは細胞ターゲティングのための１以上のＣＲＩＳＰＲアレイを含み、ここで各アレイは方法の(ａ)および(ｂ)において定義したとおりである。
【００３９】
本発明はまたこの第六形態または医学的使用または食品もしくは飲料処理のような他の適用に使用するのに適するベクターおよびＣＲＩＳＰＲアレイも提供する。この目的で、次のものが提供される。細菌宿主細胞へのＣＲＩＳＰＲアレイ導入のためのベクターであって、ここで細菌は水系伝染が可能であり、ここで
(ａ)ＣＲＩＳＰＲアレイはｃｒＲＮＡの発現のための配列および該宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み；
(ｂ)ｃｒＲＮＡは、宿主細胞にＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)をガイドし、標的配列の修飾(例えば、標的配列の切断)のために宿主細胞標的配列とハイブリダイズでき、標的配列は宿主細胞生存能に介在するヌクレオチド配列であり；
(ｃ)ここで(ａ)の配列はｃｒＲＮＡの発現および産生のために配列Ｒ１−Ｓ１−Ｒ１’を含み、ここでＲ１は第一ＣＲＩＳＰＲ反復であり、Ｒ１’は第二ＣＲＩＳＰＲ反復であり、Ｒ１またはＲ１’は任意であり、Ｓ１は宿主細胞標的配列と８０％以上同一であるヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる第一ＣＲＩＳＰＲスペーサーである。
【００４０】
また提供されるのは、複数のこのようなベクターを含む水または食品処理組成物である。ヒトにおける細菌感染(例えば、ビブリオ・コレラエ感染)の処置または予防用医薬であって、複数のこのようなベクターを含む医薬である。本発明はまた、細菌集団、組成物、食糧および飲料も提供する。例えば、食糧または飲料は乳製品である。
【００４１】
第七形態において、本発明は次のものを提供する。
第一の態様において、
第一Ｃａｓをコードする発現可能な遺伝子を修飾する方法であって、方法は
(ａ)ガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ１)とＣａｓ遺伝子を、該遺伝子から発現される第一Ｃａｓの存在下で合わせ、そして
(ｂ)ｇＲＮＡ１を該Ｃａｓ遺伝子の配列(例えば、そのプロモーターまたは第一Ｃａｓコード化ＤＮＡ配列)とハイブリダイズさせて、第一Ｃａｓを遺伝子にガイドさせ、それによりＣａｓがＣａｓ遺伝子を修飾する
ことを含む。
【００４２】
例えば、本方法で使用するための第一核酸ベクターまたは複数ベクターの組み合わせであって、ここで
(ａ)第一ベクターまたは該組み合わせのベクターは、第一Ｃａｓをガイドして、第一部位(ＣＳ１)で予定したプロトスペーサー配列(ＰＳ１)を修飾するためにＰＳ１と相補性であるガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ１、例えば、単一ｇＲＮＡ)を含み、ここでＰＳ１は第一Ｃａｓと同族であるＰＡＭ(Ｐ１)に隣接するかまたは発現可能な配列はｔｒａｃｒＲＮＡとｇＲＮＡ１を形成するｃｒＲＮＡをコードし；そして
(ｂ)ＰＳ１およびＰ１は発現可能な第一Ｃａｓコード化遺伝子の配列であり、ＰＳ１は第一ＣａｓによりＣＳ１で修飾され得る。
【００４３】
本発明のこれらの態様は、例えば、細胞またはインビトロで、Ｃａｓ活性を制御するのに有用である。本発明は、Ｃａｓコード化遺伝子のＣａｓ活性を制限するためのターゲティングを含み、これは、Ｃａｓの一過性制御に有益である。本発明はまた、例えば、細胞の修飾ゲノムにおける標的外Ｃａｓ切断の機会を減らすための、高いストリンジェンシーが望ましい設定にも有用であり得る。適用は、例えば、細胞または細胞を含む組織または生物の遺伝子治療または遺伝子ターゲティングのために、標的外効果が最小化または排除されなければならない、例えば、ヒト、動物または植物細胞の修飾における。例えば、Ｃａｓ修飾をヒトにおける遺伝子治療または疾患もしくは状態の処置もしくは予防のために患者に投与されるヒト細胞(例えば、ｉＰＳ細胞)の所望の変更に使用されるとき、極めて高いストリンジェンシーが必要である。本開示は、本発明の方法および製品の一部としてこれらの適用を提供する。
【００４４】
本発明はまた、ベクター、特にウイルスベクターの制限された挿入容量の課題に取り組む。
【００４５】
それ故に、本発明の第八形態は次のものを提供する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの要素をコードする１.４kbを超える外来性ＤＮＡ配列を含む核酸ベクターであって、ここで配列は、宿主細胞(ここでのあらゆる細胞、例えば、ヒト、動物または細菌または古細菌宿主細胞)における１以上のＨＭ−またはＰＭ−ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡの発現のための改変されたアレイまたは改変された配列(所望によりここに記載されるとおり)を含み、ここでアレイまたは改変された配列はｃＲＮＡまたはｇＲＮＡと同族であるＣａｓヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含まず、所望により、少なくとも２個、３個または４個のｃＲＮＡまたはｇＲＮＡが外来性ＤＮＡによりコードされる。
【００４６】
１.４kbを超えるまたは４.２kbを超える外来性ＤＮＡ配列を含む核酸ベクターであって、ここで外来性ＤＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの１以上の要素をコードし、宿主細胞において１以上のＨＭ−ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡを発現するための改変されたアレイまたは配列(例えば、ここに記載する任意のこのようなもの)を含み、ここで外来性配列は、ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡと同族であるＣａｓヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を欠き、所望により少なくとも２つの異なるｃＲＮＡまたはｇＲＮＡが外来性ＤＮＡによりコードされる。
【００４７】
ここで、あらゆる形態において、例えばｃＲＮＡは１以上の単一ガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)により提供され、この場合“ＣＲＩＳＰＲアレイ”は、該ｇＲＮＡをコードする１以上の発現可能なヌクレオチド配列を指し得る。それ故に、配列は、細胞内部でｇＲＮＡを発現するために宿主細胞において発現され得る。
【００４８】
本発明は主に細菌について記載しているが、変更すべきところは変更して古細菌に適用可能である。
【００４９】
ここでの一つの形態のあらゆる特性を、例えば、本発明の異なる形態と組み合わせて、このような組み合わせが本願の１以上の請求項に包含されることを可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】キシロース誘導可能システム。
【００５１】
【図２】ＳＴ１−ＣＲＩＳＰＲアレイ。
【００５２】
【図３】本実験で使用した株のＴＨ寒天でのスポットアッセイ。全株を、ＴＨ寒天上で、３７℃で２０時間増殖させた。一夜培養物の連続希釈を、エシェリキア・コリ、ラクトコッカス・ラクティスおよびストレプトコッカス・ミュータンスはデュプリケートで行い、個々のコロニーを計数するためにストレプトコッカス・サーモフィルスの両株はトリプリケートで行った。
【００５３】
【図４】ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ラクトコッカス・ラクティスおよびエシェリキア・コリの種々の培養条件下での選択的増殖。テトラサイクリンは、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ−９の選択的増殖に使用できなかった。しかしながら、３ｇ・ｌ−１のＰＥＡが、エシェリキア・コリの増殖を制限しながら、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ−９を選択的増殖させることが証明された。
【００５４】
【図５】野生型バチルス・メガテリウムオペロン(左)に基づく２つのキシロース誘導カセット(中央、右)の構築。(Xie et al. 2013)
【００５５】
【図６】プラスミドｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｐｌｄｈａでのストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ−９におけるキシロース誘導可能カセットの特徴づけ。キシロースの量を増やすと共に、蛍光の明確な応答が観察できる。
【００５６】
【図７】ｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｐｌｄｈａ＋ＸｙｌＡにおけるＣＲＩＳＰＲアレイの操作。アレイは、誘導可能キシロースプロモーター下にストレプトコッカス・サーモフィルス遺伝子を標的とする２スペーサー配列および強構成的プロモーターＰ３Ａ下にｔｒａｃｒＲＮＡを含む。
【００５７】
【図８】プラスミドｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−Ｐｌｄｈ＋ＸｙｌＡ(左)およびｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰＸｙｌＡ(右)でのストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ−９の形質転換効率。
【００５８】
【図９】キシロース誘導可能ＣＲＩＳＰＲデバイスの模式図。キシロースの誘導により、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ−９ゲノムのｐｏｌIIIおよびｔｅｔＡをターゲティングするＣＲＩＳＰＲアレイが発現される。構成的に発現されるｔｒａｃｒＲＮＡと共に、複合体がＣａｓ９と形成される。この複合体は、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ−９ゲノムにおけるｔｅｔＡおよびｐｏｌIII遺伝子に二本鎖中断を導入し、細胞生存能の制限をもたらす。
【００５９】
【図１０】プラスミドｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰＸｙｌＡ(左)またはｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−Ｐｌｄｈａ＋ＸｙｌＡ(右)でのストレプトコッカス・サーモフィルスＤＳＭ  ２０６１７(Ｔ)の増殖阻害。誘導されない(上部パネル)および誘導(下部パネル)。写真は６３時間インキュベーション後に撮った。下左隅のコロニー数(上列：＞１０００、＞１０００、下列：３３６、１１３)。
【００６０】
【図１１】ストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトコッカス・ラクティスおよびエシェリキア・コリからの１６Ｓ配列の最尤推定系統樹。
【００６１】
【図１２】ｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰｘｙｌＡまたはｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰｌｄｈＡ＋Ｘｙｌプラスミドを担持するエシェリキア・コリ、ラクトコッカス・ラクティスおよびストレプトコッカス・サーモフィルスの共培養における選択的ストレプトコッカス・サーモフィルス増殖阻害を示す。ｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰｘｙｌＡまたはｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰｌｄｈＡ＋Ｘｙｌプラスミドを担持するエシェリキア・コリで増殖の差は観察されなかった(中央カラム)。しかしながら、ストレプトコッカス・サーモフィルス(２.５ｇ・ｌ−１  ＰＥＡ添加ＴＨ寒天上で選択的増殖、最後のカラム)は、我々の予想どおり、ｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰｘｙｌＡ(強)またはｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰｌｄｈＡ  ＋ＸｙｌＡ(弱)プラスミドの間の形質転換効率を示す。我々は、こうして、細胞の混合集団における標的ストレプトコッカス・サーモフィルス亜集団の選択的増殖阻害を示す。コロニー数は下左隅(上列：＞１０００、＞１０００、６８、下列：＞１０００、＞１０００、３２)。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
詳細な記載
微生物集団増殖阻害および微生物比率改変
本発明は、ヒトの微生物相におけるバクテロイデス門(例えば、バクテロイデス)、ファーミキューテスおよび／またはグラム陽性または陰性細菌の比率の改変のような、細菌集団増殖阻害または混合細菌集団中の第一細菌および第二細菌の亜集団の相対比率の改変、例えば、ヒトまたは動物マイクロバイオームの改変のための方法、使用、システム、アレイ、ｃＲＮＡ、ｇＲＮＡおよびベクターに関する。例えば、ここに記載する第一〜第三形態参照。本発明は、例えば、宿主細菌細胞、例えば、バクテロイデス門細胞またはファーミキューテス細胞の１以上の標的ヌクレオチド配列の修飾を含む。
【００６３】
ヒトおよび無菌マウス両者で、二つの主要な腸内門、バクテロイデス門およびファーミキューテスの各レベルが肥満と関連することを指摘する多数の論文がある。これらの論文の著者らは、炭水化物代謝が重要な因子であろうと推定している。彼らは、肥満個体の微生物相が、ファーミキューテス門細菌がより重度に富化され、バクテロイデス門に少ないことを観察しており、恐らく、この細菌混合物が、痩せた個体(逆の比率を有する)の微生物相よりも、ある食餌からより効率的にエネルギーを抽出していると推測した。いくつかの研究において、肥満個体が減量するに連れてバクテロイデス門の相対的豊富さが増加し、さらに、肥満マウスの微生物相を無菌マウスに移したとき、これらのマウスは、痩せたマウスから微生物相を受けた対照より脂肪を獲得することが判明した。例えば、Turnbaugh, P. J., R. E. Ley, M. A. Mahowald, V. Magrini, E. R. Mardis, and J. I. Gordon. 2006, “An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest”, Nature 444:1027-1131参照。
【００６４】
コンセプト
本発明は、宿主細胞標的を含む次のコンセプトを提供する。
１. 細菌宿主細胞の死滅または増殖減少のための宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用であって、各宿主細胞について、システムは
(ｉ)Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列；
(ii)ＨＭ−ｃｒＲＮＡをコードするスペーサー配列(ＨＭ−スペーサー)および反復を含む改変された宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイであって、ＨＭ−ｃｒＲＮＡは該Ｃａｓを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主細胞標的配列とハイブリダイズする配列を含むもの；
(iii)任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮＡ配列；
(iv)ここで、システムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換する少なくとも一つの核酸ベクターの間で分かれ、それによりＨＭ−ｃｒＲＮＡがＣａｓを標的にガイドし、宿主細胞における標的配列を修飾する
(ｉ)〜(iv)の要素を含み、
ここでＣａｓヌクレアーゼは宿主細胞に内在性であり、そしてここで標的配列がＣａｓにより修飾され、それにより宿主細胞を死滅させるかまたは宿主細胞増殖を減少させる。
【００６５】
コンセプト１は、別に次のものを提供する。
混合細菌集団中の第一細菌および第二細菌の亜集団の相対比率を変えるための宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用であって、第二細菌は宿主細胞に含まれ、各宿主細胞について、システムは
(ｉ)Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列；
(ii)ＨＭ−ｃｒＲＮＡをコードするスペーサー配列(ＨＭ−スペーサー)および反復を含む改変された宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイであって、ＨＭ−ｃｒＲＮＡは該Ｃａｓを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主細胞標的配列とハイブリダイズする配列を含むもの；
(iii)任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮＡ配列；
(iv)ここで、システムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換する少なくとも一つの核酸ベクターの間で分かれ、それによりＨＭ−ｃｒＲＮＡがＣａｓを標的にガイドし、宿主細胞における標的配列を修飾する
(ｉ)〜(iv)の要素を含み、
ここで、所望によりＣａｓヌクレアーゼは宿主細胞に内在性であり、そして
ここで標的配列がＣａｓにより修飾され、それにより宿主細胞が死滅するかまたは宿主細胞増殖が減少する。
【００６６】
コンセプト１はまた混合細菌集団中の第一細菌および第二細菌の亜集団の相対比率を改変する方法であって、第二細菌は宿主細胞を含み、方法は、混合集団と宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを合わせ、それにより第二細菌宿主細胞を死滅させるかまたは該細胞の増殖を減少させ、それにより該比率が変えられ、
ここで各宿主細胞について、システムは
(ｉ)Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列；
(ii)ＨＭ−ｃｒＲＮＡをコードするスペーサー配列(ＨＭ−スペーサー)および反復を含む改変された宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイであって、ＨＭ−ｃｒＲＮＡは該Ｃａｓを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主細胞標的配列とハイブリダイズする配列を含むもの；
(iii)任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮＡ配列；
(iv)ここで、システムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換する少なくとも一つの核酸ベクターの間で分かれ、それによりＨＭ−ｃｒＲＮＡがＣａｓを標的にガイドし、宿主細胞における標的配列を修飾する
(ｉ)〜(iv)の要素を含み、
ここで、所望によりＣａｓヌクレアーゼは宿主細胞に内在性であり、そして
ここで標的配列がＣａｓにより修飾され、それにより宿主細胞が死滅するかまたは宿主細胞増殖が減少する。
【００６７】
コンセプト１はまた次のものを提供する。
混合細菌集団中の第一細菌および第二細菌の亜集団の相対比率を変えるための宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用であって、第二細菌は各々標的プロトスペーサー配列を含む複数の宿主細胞を含み、各宿主細胞について、システムは上に定義した要素(ii)および(iii)を含み、システムはさらにＣａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列を含み、ここで該要素(ii)および該Ｃａｓコード化配列は宿主細胞を形質転換する少なくとも一つの核酸ベクターに含まれ、それにより(ｉ)によりコードされるＨＭ−ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓを標的にガイドして宿主細胞における標的配列を修飾し；
ここでＣａｓヌクレアーゼは宿主細胞に内在性であり、そしてここで標的配列がＣａｓにより修飾され、それにより宿主細胞が死滅するかまたは宿主細胞増殖が減少する。
【００６８】
ある実施態様において、第一細菌の増殖は阻害されないまたは該宿主細胞の増殖阻害は、第一細胞の増殖阻害の少なくとも２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、１０ｘ、５０ｘ、１００ｘまたは１０００ｘである。増殖阻害は、阻害倍率または阻害パーセンテージとして計算できる(ここに記載するとおり)。他の例において、阻害を培養サンプルにおいて分光光度計により測定し、ここで光吸光度(例えば、ＯＤ６００)を、予定したｃｒＲＮＡ／ｇＲＮＡ処理期間の開始時および終了時に測定する(阻害を倍率またはパーセンテージで決定するときのこのような期間の本明細書における記載を参照)。例えば、宿主細胞サンプルの吸光度の増加(予定された期間の開始時の吸光度と該期間の終了時の吸光度の比較)が対照サンプル(該ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡに曝されていない)より少ない、例えば、前者の増加が後者の少なくとも１０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍または１０００００倍少ない(例えば、ＯＤ６００として決定)。例えば、増殖阻害の決定(すなわち、予定された期間の最後)は、各サンプルの対数増殖中期に行う(例えば、予定された期間の開始６〜７時間後)。
【００６９】
例えば、宿主細胞は、生物または環境(例えば、水路微生物相、水微生物相、ヒトまたは動物腸内微生物相、ヒトまたは動物口腔微生物相、ヒトまたは動物膣微生物相、ヒトまたは動物皮膚または毛微生物相またはヒトまたは動物腋窩微生物相)に含まれる微生物相集団に含まれ、集団は、生物または環境と相利共生または片利共生である第一細菌を含み、第二細菌は該宿主細胞を含み、ここで宿主細胞は、生物または環境に有害(例えば、病原性)である。ある実施態様において、集団はエクスビボである。
【００７０】
第一細菌亜集団対第二細菌亜集団の比率は増加する。
【００７１】
コンセプト１はまたさらに下に記載する宿主細胞増殖阻害の使用を提供する。
【００７２】
２. 宿主細胞の標的ヌクレオチド配列の修飾のため(例えば、コンセプト１の使用のため)の宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであって、システムは
(ｉ)Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列；
(ii)ＨＭ−ｃｒＲＮＡをコードするスペーサー配列(ＨＭ−スペーサー)および反復を含む改変された宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイであって、ＨＭ−ｃｒＲＮＡは該Ｃａｓを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主標的配列とハイブリダイズ可能な配列を含むもの；
(iii)任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するためのＤＮＡ配列；
(iv)ここで、システムの該要素は、宿主細胞と、宿主細胞を形質転換できる少なくとも一つの核酸ベクターに分けられ、それによりＨＭ−ｃｒＲＮＡがＣａｓを標的にガイドし、宿主細胞における標的配列を修飾する；
(ｉ)〜(iv)の要素を含み、
ここで、所望により、要素(ｉ)は宿主細胞に内在性である。
【００７３】
別法において、ＨＭ−ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは単一ガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)からなる。
【００７４】
内在性Ｃａｓヌクレアーゼの利用により、本発明の実施態様は、内在性Ｃａｓヌクレアーゼ活性を使用する(すなわち、ヌクレアーゼ活性を活性化または増強するために、宿主細胞の予めの遺伝子修飾を必要とせずに)。それ故に、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼは宿主細胞の野生型遺伝子によりコードされる。例えば、ヌクレアーゼは、宿主細胞における内在性Ｃａｓヌクレアーゼ(またはＣａｓヌクレアーゼ遺伝子)リプレッサーを阻害せずに、細胞死滅または増殖減少を達成するために活性である。それ故に、本発明は、効率的Ｃａｓ介在細胞死滅または増殖減少をもたらすために前もっての操作の必要なく、野生型細菌集団に取り組むことができる。それ故に、集団を、集団がその野生型環境(例えば水路またはヒトまたは動物マイクロバイオームからなる)にあるとき、ｃＲＮＡに曝すことができる。
【００７５】
例えば、第二細菌はバクテロイデス門(例えば、バクテロイデス)細胞である。例えば、第二細菌はファーミキューテス細胞である。使用、システムまたは方法は、例えば、腸内微生物相集団(例えば、エクスビボまたはインビボ)の比率を変えるために使用され、これは、例えば体重増加または肥満の処置または予防用である(例えば、ここで第二細菌はファーミキューテス細胞である)。
【００７６】
例えば、使用、方法、システム、ベクター、改変されたヌクレオチド配列、ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、例えば、肥満、糖尿病、ＩＢＤ、ＧＩ管状態または口腔状態の処置または予防のための、混合集団を含むヒトまたは非ヒト動物の微生物相の治療的または予防的リバランスのためである。
【００７７】
例えば、ここに記載する微生物相はヒトまたは動物マイクロバイオーム(例えば、腸、膣、頭皮、腋窩、皮膚、血流、咽頭または口腔マイクロバイオーム)の微生物相である。
【００７８】
例えば、ここに記載する微生物相は腋窩微生物相であり、使用、方法、システム、ベクター、改変されたヌクレオチド配列、ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、ヒトの体臭の予防または軽減のためである。
【００７９】
例えば、宿主細胞集団または混合集団は、ヒト消費のための飲料または水(例えば、水路または飲料水)に含まれる。
【００８０】
例えば、使用、方法、システム、ベクター、改変されたヌクレオチド配列、ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、病原性感染の減少または腸内または口内微生物相リバランス、例えば、ヒトまたは動物における肥満または疾患の処置または予防用である。例えば、使用、方法、システム、ベクター、改変されたヌクレオチド配列、ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、腸内微生物相におけるクロストリジウム・ディフィシル細菌ノックダウンのためである。
【００８１】
例えば、第一細菌はバクテロイデス細菌であり、第二細菌はファーミキューテスまたは病原性細菌、例えば、腸内細菌である。例えば、宿主細胞または第二細菌は例えば、ストレプトコッカス(例えば、サーモフィルスおよび／またはピオゲネス)、バチルス、ラクトバチルス、リステリア、クロストリジウム、ヘリコバクターおよびスタフィロコッカス細胞から選択されるファーミキューテス細胞である。例えば、混合集団はバクテロイデスおよびメトロニダゾール(ＭＴＺ)耐性クロストリジウム・ディフィシル株６３０亜集団を含み、ここで宿主細胞は該クロストリジウム・ディフィシル細胞を含む。
【００８２】
例えば、宿主細胞集団、混合集団またはシステムは、その腸内または口内微生物相の定植またはリバランスのためにヒトまたは非ヒト動物に投与するための組成物(例えば、飲料、口腔洗浄剤または食糧)に含まれる。
【００８３】
例えば、使用または方法のための製品またはシステム、ベクター、改変されたヌクレオチド配列、ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、粘膜、腸、経口、鼻腔内、直腸内、膣内、眼またはバッカル投与によりヒトまたは非ヒト動物に投与するためである。
【００８４】
ここに記載するあらゆる形態の例えば、混合集団(アレイ、ｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡまたは改変された配列と合わせる前)は、ヒトまたは動物対象の微生物相、例えば、ここに開示する腸または任意の他の微生物相またはここに開示する任意のマイクロバイオームの微生物相のサンプルである。例えば、この場合、本発明使用の製品は、ここに開示するヒトまたは動物対象の処置または治療に有用な修飾微生物相集団である。
【００８５】
３. １個または複数個のベクターがＣａｓ(例えば、Ｃａｓ９)ヌクレアーゼコード化配列を欠く、コンセプト２のシステム。
【００８６】
４. 各宿主細胞がヒト微生物相に見られる株または種のものであり、所望によりここで宿主細胞は細胞と異なる株または種の混合であり、ここで異なる細胞はヒト(例えば、ヒト腸における)とプロバイオティク、片利共生または相利共生である腸内細菌科または細菌である、前記コンセプトの何れかの使用、方法またはシステム。例えば、宿主細胞はファーミキューテス細胞、例えば、ストレプトコッカス細胞である。
【００８７】
５. 混合細菌集団(例えば、ヒト微生物相におけるようなヒトにおける)におけるバクテロイデス門(例えば、バクテロイデス)細菌の比率の改変のための、前記コンセプトの何れかの使用、方法またはシステム。
【００８８】
６. ファーミキューテスに対するバクテロイデス門の相対的比率を増加させるための、コンセプト５の使用、方法またはシステム。
【００８９】
７. 該Ｃａｓヌクレアーゼが該細胞の内在性タイプII  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより提供される、前記コンセプトの何れかの使用、方法またはシステム。
【００９０】
８. 要素(iii)が宿主細胞に内在性である、前記コンセプトの何れかの使用、方法またはシステム。
【００９１】
９. 標的配列が宿主細胞の抗生物質耐性遺伝子、病原性遺伝子または必須遺伝子に含まれる、前記コンセプトの何れかの使用、方法またはシステム。
【００９２】
１０. アレイが抗生物質組成物に含まれ、ここでアレイが抗生物質と組み合わされる、前記コンセプトの何れかの使用、方法またはシステム。
【００９３】
１１. あるいはＨＭ−ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが単一ガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)からなる、例えばベクターにより提供される、前記コンセプトの何れかの使用、方法またはシステム。
【００９４】
１２. 宿主細胞が目的のＨＭ配列をコードする遊離末端(ＨＭ−ＤＮＡ)を有するデオキシリボ核酸鎖を含むおよび／またはシステムがＨＭ−ＤＮＡをコードする配列を含み、ここでＨＭ−ＤＮＡは、ＨＭ−ＤＮＡを宿主ゲノム(例えば、染色体またはエピソーム部位)に挿入するために標的配列内にあるまたは隣接する１個以上の配列にそれぞれ相同である１個以上の配列を含む、前記コンセプトの何れかの使用、方法またはシステム。
【００９５】
１３. 内在性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む細菌宿主細胞修飾のための改変された核酸ベクターであって、ベクターは
(ａ)前記何れかのコンセプトに記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、方法または使用において使用するための複数の異なるｃｒＲＮＡ(例えば、ｇＲＮＡ)を発現する核酸配列を含み；そして
(ｂ)所望によりＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸配列を欠き、
ここで、該ｃｒＲＮＡの第一は該宿主細胞の第一核酸配列とハイブリダイズでき、そして該ｃｒＲＮＡの第二は該宿主細胞の第二核酸配列とハイブリダイズでき、ここで該第二配列は該第一配列と異なり；そして
(ｃ)第一配列は抗生物質耐性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は抗抗生物質耐性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、所望により、これらの遺伝子は異なり；
(ｄ)第一配列は抗生物質耐性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み；
(ｅ)第一配列は必須遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含むまたは
(ｆ)第一配列は病原性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含む。
【００９６】
１４. ベクターによりコードされるｃＲＮＡ(例えば、単一ガイドＲＮＡ)と共に動作可能(operable)である１以上のＣａｓを含む宿主細胞内の、コンセプト１３のベクター。
【００９７】
１５. ＨＭ−ＣＲＩＳＰＲアレイが同じスペーサーの複数コピーを含む、前記コンセプトの何れかの使用、方法、システムまたはベクター。
【００９８】
１６. ベクターが複数のＨＭ−ＣＲＩＳＰＲアレイを含む、前記コンセプトの何れかの使用、方法、システムまたはベクター。
【００９９】
１７. 各ベクターがプラスミド、コスミド、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミドまたはプロファージである、前記コンセプトの何れかの使用、方法、システムまたはベクター。
【０１００】
１８. システムまたはベクターがｃｒＲＮＡ(例えば、ｇＲＮＡ)をコードする核酸配列の２、３またはそれ以上のコピーを含み、ここでコピーが宿主細胞配列(例えば、病原性、耐性または必須遺伝子配列)のターゲティングのための同じスペーサー配列を含む、前記コンセプトの何れかの使用、方法、システムまたはベクター。
【０１０１】
１９. コピーが２以上のベクターＣＲＩＳＰＲアレイ間に別れる、コンセプト１８の使用、方法、システムまたはベクター。
【０１０２】
２０. 前記コンセプトの何れかに記載のシステムまたはベクターを含む、細菌宿主細胞。
【０１０３】
２１. 抗生物質(例えば、ベータ−ラクタム抗生物質)と組み合わせられる、コンセプト２〜２０の何れかのシステム、ベクターまたは細胞。
【０１０４】
２２.各宿主細胞がスタフィロコッカス、ストレプトコッカス、シュードモナス、サルモネラ、リステリア、エシェリキア・コリ、デスルホビブリオまたはクロストリジウム宿主細胞である、前記コンセプトの何れかの使用、方法、システム、ベクターまたは細胞。例えば、各宿主細胞はファーミキューテス細胞、例えば、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、リステリアまたはクロストリジウム細胞である。
【０１０５】
例えば、各ＣＲＩＳＰＲアレイは宿主細胞における各ｃｒＲＮＡの発現および産生のための配列Ｒ１−Ｓ１−Ｒ１’を含み(例えば、単一ガイドＲＮＡに含まれる)、(ｉ)ここでＲ１は第一ＣＲＩＳＰＲ反復であり、Ｒ１’は第二ＣＲＩＳＰＲ反復であり、Ｒ１またはＲ１’は任意であり、(ii)Ｓ１は該標的配列に９５％以上同一であるヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる第一ＣＲＩＳＰＲスペーサーである。
【０１０６】
例えば、Ｒ１およびＲ１’は、それぞれ第二宿主細胞種のＣＲＩＳＰＲアレイの第一および第二反復配列と少なくとも９５％同一である。例えば、Ｒ１およびＲ１’は、該種、例えば、該種の該宿主細胞のＣＲＩＳＰＲアレイの第一(最も５’)および第二(第一反復の直ぐ３’の反復)反復配列とそれぞれ少なくとも９５％(例えば、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％)同一である。例えば、Ｒ１およびＲ１’は、該宿主細胞における標的を修飾するために、タイプII  Ｃａｓ９ヌクレアーゼ(例えば、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトコッカス・ピオゲネスまたはスタフィロコッカス・アウレウスＣａｓ９)を用いて機能的である。
【０１０７】
本発明の代替的コンセプト１使用は、作業実験実施例におり示されるとおり、次のものを提供する。
集団の増殖阻害のための細菌宿主細胞集団の野生型内在性Ｃａｓヌクレアーゼ活性の使用であって、ここで各宿主細胞は野生型Ｃａｓヌクレアーゼ活性を有する内在性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを有し、使用は集団の宿主細胞の形質転換を含み、ここで各形質転換宿主細胞は、宿主細胞における宿主修飾(ＨＭ)ｃＲＮＡまたはガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)の提供のために改変されたヌクレオチド配列で形質転換され、ＨＭ−ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、内在性Ｃａｓを標的にガイドするための宿主細胞標的プロトスペーサー配列とハイブリダイズ可能な配列を含み、ここでｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、該野生型ヌクレアーゼ活性を有する宿主細胞の内在性Ｃａｓヌクレアーゼと同属であり、宿主細胞形質転換後、集団の増殖が阻害される。
【０１０８】
下記作業実施例において、阻害を固体表面上の細菌集団(グラム陽性ファーミキューテス)で取り組んだ。宿主細胞集団増殖の＞１０倍阻害が達成された。ターゲティングは抗生物質耐性遺伝子および必須遺伝子に指向させた。本発明は抗生物質耐性細菌の増殖阻害に有用であり、ここで標的配列は抗生物質耐性遺伝子の配列である。例えば、改変されたヌクレオチド配列と抗生物質の共投与が有効であり得る。これは、より完全なヒトまたは動物対象における宿主細胞感染の処置または予防を提供するおよび／またはヒトまたは動物に投与する治療有効抗生物質用量の減少を可能にする可能性がある。ヒトおよび動物集団における抗生物質の過剰投与に関する懸念の増加および耐性発現の観点から有用である。
【０１０９】
表面上の宿主細胞増殖を阻害する本発明の能力の証明は、本発明がヒトまたは動物対象におけるここに開示する微生物相により介在されるまたは引き起こされる疾患または状態の処置または予防のためである実施態様において重要かつ望ましい。このような微生物相は、一般に対象の組織(例えば、腸、口腔、肺、腋窩、眼、膣、肛門、耳、鼻または咽頭組織)と接触しており、故に我々は、表面上の微生物相細菌種(ストレプトコッカスにより例示される)の増殖阻害の活性の証明は、この有用性を支持すると考える。
【０１１０】
例えば、野生型宿主細胞内在性Ｃａｓ９またはｃｆｐ１活性を使用する。改変されたヌクレオチド配列は、外来性Ｃａｓヌクレアーゼコード化配列と組み合わせなくてよい。
【０１１１】
例えば、宿主細胞は野生型(例えば、操作されていない)細菌細胞である。他の例において、宿主細胞は、操作されており(例えば外来性ヌクレオチド配列を染色体性に導入するためにまたは、例えば、宿主細胞の染色体またはプラスミド上の内在性ヌクレオチド配列を修飾するために)、ここで宿主細胞は、ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡと共に動作可能な野生型Ｃａｓヌクレアーゼ活性を有する内在性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む。例えば、該宿主細胞の細菌コロニーの形成は、該形質転換後阻害される。例えば、宿主細胞の増殖は、該形質転換後阻害される。例えば、宿主細胞は、該形質転換後殺される。
【０１１２】
“同族”により、内在性Ｃａｓが、宿主細胞における標的にガイドされるのにｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡ配列と共に動作可能であることを意図する。当業者である対象者は、このようなＣａｓガイドが一般に細菌細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性例えば、内在性活性野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを有する細菌細胞における野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性の特性であることを理解する。
【０１１３】
“野生型”Ｃａｓ活性により、当業者である対象者には明らかなとおり、内在性Ｃａｓが改変されたＣａｓではないかまたは細胞が内在性Ｃａｓ活性の抑制解除のために操作されていないことを意図する。これは、Ｃａｓヌクレアーゼ活性が天然に抑制されるある細菌と対照的である(すなわち、野生型Ｃａｓヌクレアーゼ活性がないかまたは何れも本発明で有用ではなく、これは、対照的に、例えば内在性Ｃａｓ活性が細胞集団増殖阻害実施に使用できるインサイチュでの野生型宿主細胞の取り組みに適用可能である)。
【０１１４】
例えば、宿主細胞集団増殖阻害は、該改変されたヌクレオチド配列に曝されていない該宿主細胞の増殖と比較して、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍である。例えば、増殖阻害は、宿主細胞の第二サンプル(単独または混合細菌集団)のコロニー数と比較して、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍宿主細胞の第一サンプル(単独または混合細菌集団)の低細菌コロニー数により示され、ここで第一細胞は該改変されたヌクレオチド配列により形質転換されているが、第二サンプルは該改変されたヌクレオチド配列に曝されていない。ある実施態様において、コロニー数は、第一サンプルが改変された配列に曝された１２時間、２４時間、３６時間または４８時間後に決定する。ある実施態様において、コロニーは、インビトロで、固形寒天で増殖させる(例えば、ペトリ皿)。従って、増殖阻害が、標的配列を含む細胞または集団の増殖の減少(非処理、すなわち、対照サンプル増殖と比較して＜１００％増殖)により示すことができるまたはこのような増殖の完全排除であり得ることは理解される。例えば、宿主細胞集団の増殖は、予定した期間にわたり(例えば、宿主細胞においてｃＲＮＡまたはｇＲＮＡを合わせた後２４時間または４８時間)少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％減少され、すなわち、宿主細胞集団の増殖は、該ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡに曝されていないが、それ以外は該予定期間、同じ条件下に維持されている対照宿主細胞集団の増殖より、少なくともこのようなパーセント少ない。例えば、増殖のパーセント減少は、該期間の最後(例えば、対照サンプルの対数増殖中期の時点)に各集団のサンプルにおけるコロニー数の比較により決定する。例えば、試験集団を０時にｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡに曝した後、試験および対照集団のサンプルを採り、各サンプルを寒天プレートに播種し、該予定された期間同一条件下でインキュベートする。期間の最後に、各サンプルのコロニー数を計数し、差異パーセンテージを得る(すなわち、試験コロニー数を対照コロニー数で除し、それを１００倍し、その結果を１００から減じてパーセンテージ増殖減少を得る)。差異倍率を、対照コロニー数を試験コロニー数で除して計算する。
【０１１５】
集団増殖の阻害は、それ故に、集団における宿主細胞数の増殖の減少により示され得る。これは、ヌクレアーゼによる細胞死滅および／または標的プロトスペーサー配列上のヌクレアーゼの作用による宿主細胞増殖(分裂および／または細胞増殖)の下方制御によるものであり得る。ここに開示する処置または予防の実施態様において、ヒトまたは動物対象の宿主細胞負荷が減少され、それにより疾患または状態が処置(例えば、軽減または排除)または予防(すなわち、対象が疾患または状態を発症するリスクが軽減または排除)される。
【０１１６】
本発明は、飲料および食糧(またはこれらを製造、加工または保存する装置)に含まれる環境(例えば、水または水路、冷却または加熱装置における)に天然に見られる野生型細菌集団またはヒトまたは動物微生物相に含まれる野生型細菌集団のターゲティングに有用である。それ故に、本発明は、宿主細胞の前修飾により死滅または増殖阻害に感受性とすることが不可能であるまたは望ましくない状況で有用である(例えば、対象における腸または他の位置の微生物相のインサイチュでの処理が望まれるとき)。他の適用において、本発明は、宿主細胞が原因であるまたは介在する疾患または状態の処置または予防のためにヒトまたは動物対象に投与する医薬のエクスビボの産生に有用であり、ここで医薬は、修飾混合細菌集団(例えば、１以上のヒトドナーの糞便または腸内微生物相から得た)を含み、これは本発明の使用または方法のための製品であり、ここで集団は、宿主細胞の種または株と異なる種または株の細菌の亜集団を含む。この亜集団細胞は標的を含まず、故に本使用または方法により修飾されない。それ故に、例えば、方法は、例えば、ここに開示する代謝またはＧＩ状態または疾患の処置または予防のための医薬の産生のために、混合集団における特定のファーミキューテス亜集団の比率を下げ、バクテロイデス門を温存できる。この方法で、本発明は、このような使用またはヒトまたは動物における該処置または予防のための修飾細菌移植(例えば、修飾糞便移植)医薬を提供できる。例えば、方法は、医学的使用(例えば、代謝状態(例えば肥満または糖尿病)またはＧＩ管状態(例えば、ここに記載する任意のこのような状態)または癌(例えば、ＧＩ管癌)の処置または予防)または化粧品または個人衛生使用(例えば、ヒトの腋窩またはヒトの他の関連位置に局所適用することによる腋窩または他の体臭の軽減のための、例えば、ヒトの局所使用)ためにヒトまたは動物に投与するための細菌の修飾収集物のインビトロでの１以上の微生物相の修飾に使用され得る。他の例において、アレイ、ｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡまたは改変されたヌクレオチド配列をヒトまたは動物に投与し、宿主細胞はヒトまたは動物に保持され、例えば、ヒトまたは動物の微生物相(例えば腸内微生物相またはここに開示する任意の他のタイプの微生物相)に含まれる。この方法で、宿主細胞により介在されるまたは引き起こされる疾患または状態を処置または予防できる。例えば、形質転換をインビトロで実施し、所望によりアレイ、ｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡまたは改変されたヌクレオチド配列は、宿主細胞に電気穿孔される核酸に含まれる。例えば、核酸はＲＮＡ(例えば、ｇＲＮＡのコピー)である。他の例において、核酸は、宿主細胞での発現のためのｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードするＤＮＡである。
【０１１７】
それ故に、例えば、本発明は、対象の微生物相の宿主細胞により介在されるまたは引き起こされる疾患または状態の処置または予防のためのヒトまたは動物対象の微生物相に含まれる野生型細菌宿主細胞の集団における宿主細胞修飾(ＨＭ)ｃＲＮＡまたはガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)を提供するための改変されたヌクレオチド配列であって、ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは標的にＣａｓをガイドするために宿主細胞標的プロトスペーサー配列とハイブリダイズ可能な配列を含み、ここでｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは野生型ヌクレアーゼ活性を有する内在性宿主細胞Ｃａｓヌクレアーゼと同族であり、ここで集団の宿主細胞の形質転換後、集団の増殖は阻害され、疾患または状態が処置または予防される。
【０１１８】
例えば、改変されたヌクレオチド配列は、ここに定義するＨＭ−ＣＲＩＳＰＲアレイを含む。例えば、改変されたヌクレオチド配列は単一ガイドＲＮＡをコードする。例えば、改変されたヌクレオチド配列は、ガイドＲＮＡ(例えば、単一ガイドＲＮＡ)またはｃｒＲＮＡである。例えば、改変された配列は宿主細胞に感染できるバクテリオファージに含まれ、ここで形質転換は、バクテリオファージによる宿主細胞の形質導入を含む。バクテリオファージは、ここに記載するバクテリオファージであり得る。例えば、改変されたヌクレオチド配列は、宿主細胞を形質転換できるプラスミド(例えば、接合性プラスミド)に含まれる。プラスミドここに記載するプラスミドであり得る。例えば、改変されたヌクレオチド配列は宿主細胞内および／または間を伝達できるトランスポゾンに含まれる。トランスポゾンはここに記載するトランスポゾンであり得る。
【０１１９】
本発明の任意の使用または方法は、細胞においてｃＲＮＡまたはｇＲＮＡを産生するために宿主細胞を核酸ベクターで形質転換することを含む。例えば、改変されたヌクレオチド配列を含むベクターまたは核酸を、混合細菌集団(例えば、ヒトまたは動物の微生物相の一部として)を含むヒトまたは動物に経口、静脈内、局所的、眼、鼻腔内、吸入、直腸投与、耳、膣投与または任意の他のここに開示する投与経路またはその他で投与し、ここで投与は、ベクターまたは核酸で宿主細胞を形質転換する。
【０１２０】
例えば、宿主細胞集団はエクスビボである。例えば、混合集団はヒトまたは動物対象およびに含まれ、対象における宿主細胞感染が処置または予防される。
【０１２１】
例えば、第一細菌および第二細菌は微生物共同体に含まれ、ここで該細菌は相利共生的に生存する例えば、共同体はヒトまたは動物微生物相であり、例えば共同体はヒトまたは動物に含まれる(例えば、ここで使用、システム、改変された配列、ベクターまたは細胞は、ヒトまたは動物における共同体の宿主細胞の感染処置であり、例えば、ここで宿主細胞は、ヒトまたは動物における抗生物質耐性または有害な疾患もしくは状態に介在するまたは引き起こす)。下記作業実施例において使用される種(エシェリキア・コリ、ラクトコッカス・ラクティスおよびストレプトコッカス・サーモフィルス)は、ヒトおよび動物腸内微生物相において相利共生的に共存する株である。実施例はまた混合グラム陽性およびグラム陰性細菌集団におけるターゲティングにも取り組む。さらに、実施例はまたファーミキューテス(ストレプトコッカス・サーモフィルス)の集団および腸内細菌科(エシェリキア・コリ)の集団にも取り組み、この両者はヒト微生物相に見られる。腸内細菌科の他の例は、サルモネラ、エルシニア・ペスチス、クレブシエラ、シゲラ、プロテウス、エンテロバクター、セラチアおよびシトロバクターである。
【０１２２】
例えば、方法、使用、改変されたヌクレオチド配列、アレイ、ｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ベクターまたはシステムはヒト腸内微生物相集団における宿主細胞感染の処置のためであり、所望により集団はまたヒト片利共生腸内細菌および／または腸内細菌科である第一細菌も含み、例えば、ここで宿主細胞および片利共生細胞(第一細菌および第二細菌)はヒト腸内微生物相で相利共生的に生存する。
【０１２３】
例えば、使用またはシステムは、バクテロイデス門細菌および他の細菌を含む混合細菌集団におけるバクテロイデス門細菌の比率を変えるためである。例えば、ｓｙ通段における１、それ以上または全ファーミキューテス(例えば、対ストレプトコッカス)に対してバクテロイデス門の相対比率を上げるためである。この場合、宿主細胞は、標的を含むファーミキューテス細胞であり得る。例えば、集団は、ヒトまたは動物対象に含まれる微生物相の細菌集団であり、方法、使用、改変されたヌクレオチド配列、ベクターまたはシステムは、(ｉ)含まれる該宿主細胞(例えば、混合集団に含まれる)による対照の感染の処置；(ii)対象における該宿主細胞が介在する状態または疾患の処置または予防；(iii)該宿主細胞により引き起こされるまたは介在されるヒト体臭の軽減または(iv)ヒトの個人衛生のためである。例えば、本発明の改変されたヌクレオチド配列、アレイ、ｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡまたはベクターは、本発明のこのようなシステムまたは使用における使用のためである。
【０１２４】
例えば、状態または疾患は、代謝または消化器疾患または状態、例えば、肥満、ＩＢＤ、ＩＢＳ、クローン病または潰瘍性大腸炎である。例えば、状態または疾患は、癌、例えば、固形腫瘍またはＧＩ癌(例えば、胃癌)、肝臓癌または膵臓癌である。例えば、状態は抗生物質への耐性または応答低下である(例えば、ここに開示する何れかの抗生物質)。
【０１２５】
例えば、細胞は、細胞における該ＨＭ−ｃｒＲＮＡの産生における要素(ii)と共に動作可能な内在性ＲＮａｓｅ  IIIを含む。別法において、ベクターの１以上は、宿主細胞におけるＲＮａｓｅ  III発現のためのこのようなＲＮａｓｅ  IIIをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１２６】
例えば、必須遺伝子(標的を含む)は、細胞のＤＮＡポリメラーゼをコードする。これを下に例示する。
【０１２７】
使用、システム、ベクターまたは細胞の例えば、アレイ、ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、ＮＧＧ、ＮＡＧ、ＮＧＡ、ＮＧＣ、ＮＧＧＮＧ、ＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＡＧＡＡＷプロトスペーサー隣接モチーフ(ＰＡＭ)、例えば、ＡＡＡＧＡＡＡまたはＴＡＡＧＡＡＡ  ＰＡＭに隣接する宿主細胞標的プロトスペーサー配列にハイブリダイズ可能な配列を含む(これらの配列は５’から３’で示す)。ある実施態様において、ＰＡＭは、プロトスペーサー配列の３’末端の直ぐ隣にある。例えば、Ｃａｓは、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・サーモフィルスまたはストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓである。例えば、ＣａｓはＣｐｆ１であるおよび／またはＰＡＭはＴＴＮまたはＣＴＡである。
【０１２８】
例えば、改変されたヌクレオチド配列、ｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡまたはアレイは抗生物質と組み合わされ、例えば、ここで標的は抗生物質耐性遺伝子に含まれ、ここで抗生物質が該薬剤である。ある実施態様において、宿主細胞は抗生物質に感受性である。例えば、宿主細胞(例えば、集団を含むヒトまたは製造コンテナ／装置において)存在下で感染を排除するための抗生物質の使用に感受性が不十分であるかもしれないが、抗生物質は、本発明に従いさらに死滅または増殖阻害をＣａｓ修飾(例えば、標的切断)を使用して実施しながら、宿主細胞亜集団サイズまたは増殖を鎮静または減少できる。
【０１２９】
本発明は、ヒトまたは動物対象の宿主細胞の感染の抗生物質(第一抗生物質)処置の方法のための使用、システム、アレイ、ｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ、改変されたヌクレオチド配列、ベクターまたは細胞を提供し、ここで抗生物質耐性遺伝子(第一抗生物質への耐性のための)が宿主細胞におけるシステムまたはベクターによりＣａｓ標的化され、ここで方法は、対象にシステム、アレイ、ｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ、改変されたヌクレオチド配列、ベクターまたは細胞および抗生物質を投与することを含む。遺伝子は下方制御される、すなわち、遺伝子によりコードされるタンパク質産物の発現が宿主細胞で減少または排除され、それにより抗生物質耐性が下方制御される。対象において感染が軽減または予防される。例えば、抗生物質を、システム、アレイ、ｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ、改変されたヌクレオチド配列、ベクターまたは細胞と同時に投与する；他の例において、投与は逐次的である(例えば、システム、アレイ、ｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ、改変されたヌクレオチド配列、ベクターまたは細胞の前に抗生物質)。本発明のこの特性は、例えば、抗生物質単独がこのような宿主細胞感染の処置に十分効率的でないとき、対象における抗生物質処置の増強に有用であり得る。抗生物質は、ここに開示する何れかの抗生物質、例えば、テトラサイクリンであり得る。
【０１３０】
例えば、各改変されたヌクレオチド配列またはベクターは該ＣＲＩＳＰＲアレイまたは該ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする配列を含み、さらに抗生物質耐性遺伝子(例えば、カナマイシン耐性)を含み、ここでＨＭ−ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡは抗生物質耐性遺伝子を標的としない。例えば、標的配列は宿主細胞の抗生物質耐性遺伝子に含まれ、ここで抗生物質は第一抗生物質(例えば、カナマイシン)と異なる。この方法で、システム、改変された配列またはベクターは、宿主を、それ自体ターゲティングすることなく標的とできる。宿主細胞を第一抗生物質に曝すことにより、第一抗生物質耐性遺伝子を含む細胞が、第一抗生物質存在下で生存優位性を有するため、改変された配列またはベクターのその中への保持を、正の選択圧により促進できる(改変された配列またはベクターにより形質転換されていない宿主細胞が第一抗生物質に耐性でないとき)。それ故に、例えば、宿主細胞におけるｃＲＮＡまたはｇＲＮＡコード化配列の維持を促進するための、宿主細胞または混合集団を抗生物質(例えば、カナマイシン)および該改変された配列またはベクターに曝すことを含む、または本発明のシステム、改変された配列、アレイまたはベクターが該抗生物質と組み合わせである本発明の使用が提供される。
【０１３１】
例えば、ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする配列または要素(ii)は、宿主細胞種で動作可能な構成的プロモーター(例えば、強プロモーター)下または誘導可能プロモーター下にある。例えば、要素(iii)は、宿主細胞種で動作可能な構成的プロモーターまたは誘導可能プロモーター下にある。
【０１３２】
例えば、各宿主細胞はグラム陽性細胞である。他の例において、各宿主細胞はグラム陰性細胞である。
【０１３３】
例えば、方法、使用、システム、改変された配列またはベクターはヒト腸内微生物相集団における宿主細胞感染の処置のためであり、所望により集団はヒト片利共生腸内細菌を含む(すなわち、ヒトと片利共生である腸内細菌)。
【０１３４】
方法、使用、システム、アレイ、ｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ、改変された配列またはベクターの例えば、宿主細胞はヒトまたは動物対象に含まれる混合細菌集団に含まれ、方法、使用、システム、アレイ、ｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ、改変された配列またはベクターは、(ｉ)混合集団に含まれる宿主細胞による対象における感染の処置；(ii)対象における該宿主細胞が介在する状態または疾患の処置または予防；(iii)該宿主細胞により引き起こされるまたは介在されるヒト体臭の軽減または(iv)ヒトの個人衛生のためである。
【０１３５】
方法、使用、システム、アレイ、ｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ、改変された配列またはベクターの例えば、工業用または医学的流体、固体表面、装置またはコンテナのインビトロ処理(例えば、食品、消費財、化粧品、パーソナルヘルスケア製品、石油または石油製品)または水路、水、飲料、食糧または化粧品の処理、ここで宿主細胞は、流体、表面、装置、コンテナ、水路、水、飲料、食糧または化粧品に含まれるまたはこの上にある。
【０１３６】
本発明はまた、ここでのコンセプトの何れかの使用または方法により得ることができる細菌のエクスビボ混合集団を提供する。
【０１３７】
例えば、混合集団または使用または方法の製品は、医学的または栄養学的使用のためのコンテナにある。例えば、コンテナは、例えば、吸入器またはシリンジもしくはＩＶ針に連結された滅菌容器である。
【０１３８】
例えば、使用または方法の製品集団はヒトまたは動物に、そのマイクロバイオームを定植させるために投与するのに有用である。
【０１３９】
本発明は、使用または方法のための集団製品を含む、ヒトまたは非ヒト動物消費用の食糧または飲料を提供する。
【０１４０】
ここで、形態、コンセプトまたは態様の何れかの例えば、バクテロイデスは、カッカエ、カピロスス、セルロシリティカス、コプロコラ、コプロフィルス、コプロスイス、ディスタソニス、ドレイ、エガーシイ、ファエシス、ファインゴールディー、フルクサス、フラジリス、インテスティナリス、メラニノゲニカス、ノルディイ、オレイシプレヌス、オラーリス、オバータス、ペクチノフィルス、プレビウス、スターコリス、シータイオタオミクロン、ユニフォルミス、ブルガタスおよびキシラニソルベンスから選択される種である。例えば、バクテロイデスはシータイオタオミクロンであり、例えば、ここで宿主細胞または混合集団は、エクスビボまたはインビトロの腸内微生物相集団である。例えば、宿主細胞、第一または第二細菌亜集団は、複数の異なるバクテロイデス門種または複数のバクテロイデス種(例えば、バクテロイデス・シータイオタオミクロンおよびバクテロイデス・フラジリスを含む)またはバクテロイデスおよびプレボテラ種を含む。ここで、例えば、プレボテラは、ベルゲンシス、ビビア、ブッカエ、ブッカリス、コプリ、メラニノジェニカ、オリス、ルミニコラ、タネラエ、チモネンシスおよびベルオラーリスから選択される種である。別法において、宿主細胞、第一または第二細菌はファーミキューテス細胞である。例えば、宿主細胞、第一または第二亜集団は、アナエロツルンカス、アセトアナエロバクテリウム、アセチトマクラム、アセチビブリオ、アナエロコッカス、アナエロフィルム、アナエロシヌス、アナエロスティペス、アナエロボラックス、ブチリビブリオ、クロストリジウム、カプラコッカス、デハロバクター、ディアリスター、ドレア、エンテロコッカス、エタノリゲネンス、フィーカリバクテリウム、フソバクテリウム、ラシリバクター、グッゲンハイメラ、ヘスペリア、ラクノバクテリウム、ラクノスピラ、ラクトバチルス、リューコノストック、メガモナス、モリエ、ミツオケラ、オリバクテリウム、オキソバクター、パピリバクター、プロプリオニスピラ、シュードブチリビブリオ、シュードラミバクター、ロゼブリア、ルミノコッカス、サルチナ、セイノネラ、シャトレワーシア、スポロバクター、スピロバクテリウム、ストレプトコッカス、サブドリグラヌラム、シントロフォコッカス、サーモバチルス、ツリシバクターおよびワイセラから選択される１以上のファーミキューテスを含むまたはこれからなる。例えば、宿主細胞または第一または第二亜集団はクロストリジウム細胞からなる(および所望により他の亜集団はバクテロイデス(例えば、シータイオタオミクロン)細胞からなる)。例えば、宿主細胞または第一または第二亜集団はエンテロコッカス細胞からなる(および所望により他の亜集団はバクテロイデス(例えば、シータイオタオミクロン)細胞からなる)。例えば、宿主細胞または第一または第二亜集団はルミノコッカス細胞からなる(および所望により他の亜集団はバクテロイデス(例えば、シータイオタオミクロン)細胞からなる)。例えば、宿主細胞または第一または第二亜集団はストレプトコッカス細胞からなる(および所望により他の亜集団はバクテロイデス(例えば、シータイオタオミクロン)細胞からなる)。例えば、宿主細胞または第一または第二亜集団はフィーカリバクテリウム細胞からなる(および所望により他の亜集団はバクテロイデス(例えば、シータイオタオミクロン)細胞からなる)。例えば、フィーカリバクテリウムはフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ(例えば、Ａ２−１６５、Ｌ２−６、Ｍ２１／２またはＳＬ３／３)である。
【０１４１】
例えば、宿主細胞または第一または第二亜集団は、アナエロツルンカス、アセトアナエロバクテリウム、アセチトマクラム、アセチビブリオ、アナエロコッカス、アナエロフィルム、アナエロシヌス、アナエロスティペス、アナエロボラックス、ブチリビブリオ、クロストリジウム、カプラコッカス、デハロバクター、ディアリスター、ドレア、エンテロコッカス、エタノリゲネンス、フィーカリバクテリウム、フソバクテリウム、ラシリバクター、グッゲンハイメラ、ヘスペリア、ラクノバクテリウム、ラクノスピラ、ラクトバチルス、リューコノストック、メガモナス、モリエ、ミツオケラ、オリバクテリウム、オキソバクター、パピリバクター、プロプリオニスピラ、シュードブチリビブリオ、シュードラミバクター、ロゼブリア、ルミノコッカス、サルチナ、セイノネラ、シャトレワーシア、スポロバクター、スピロバクテリウム、ストレプトコッカス、サブドリグラヌラム、シントロフォコッカス、サーモバチルス、ツリシバクターおよびワイセラから選択される１以上のファーミキューテスを含むまたはこれからなる。例えば、宿主細胞または第一または第二亜集団はクロストリジウム(例えば、ディフィシル)細胞からなる(および所望により他の亜集団はバクテロイデス(例えば、シータイオタオミクロン)細胞からなる)。例えば、宿主細胞または第一または第二亜集団はエンテロコッカス細胞からなる(および所望により他の亜集団はバクテロイデス(例えば、シータイオタオミクロン)細胞からなる)。例えば、宿主細胞または第一または第二亜集団はルミノコッカス細胞からなる(および所望により他の亜集団はバクテロイデス(例えば、シータイオタオミクロン)細胞からなる)。例えば、宿主細胞または第一または第二亜集団はストレプトコッカス細胞からなる(および所望によりの亜集団はバクテロイデス(例えば、シータイオタオミクロン)および／または腸内細菌科(例えば、エシェリキア・コリ)細胞からなる)。例えば、宿主細胞または第一または第二亜集団はフィーカリバクテリウム細胞からなる(および所望により他の亜集団はバクテロイデス(例えば、シータイオタオミクロン)細胞からなる)。例えば、宿主細胞または第一または第二亜集団はストレプトコッカス細胞(所望によりストレプトコッカス・サーモフィルスおよび／またはピオゲネス細胞)からなり、他の亜集団はバクテロイデス(例えば、シータイオタオミクロン)および／または腸内細菌科(例えば、エシェリキア・コリ)細胞からなる。
【０１４２】
集団本発明の使用または方法のための製品は、ある実施態様において、粘膜、腸、経口、鼻腔内、直腸内、膣内、眼またはバッカル投与によりヒトまたは非ヒト動物に投与するためである。
【０１４３】
所望により、宿主細胞または第一または第二亜集団細菌はバクテロイデス・フラジリス細菌であり、集団は水に含まれる。
【０１４４】
本発明のアレイ、システム、改変された配列、ベクターまたはｇＲＮＡを含む適当な飲料は、例えば、プロバイオティク飲料、例えば、適合させたYakult(商標)、Actimel(商標)、Kevita(商標)、Activia(商標)、Jarrow(商標)またはヒト消費のための類似飲料である。
【０１４５】
ファージ配列標的
本発明のある態様において、標的配列は、宿主細菌細胞に感染するファージの配列である。本発明により達成されるファージゲノムの所望の修飾は、ファージ死滅またはノックダウンに関するだけでなく、むしろ宿主細胞における所望のファージ遺伝子または調節要素活性化であり得る(例えば、ファージが、宿主細胞生存能または増殖の増加と関連する所望のタンパク質または他の産物を発現するとき)。あるいは、修飾は、例えば、本発明によりファージ標的部位に標的化される誘導可能Ｃａｓの使用により、誘導可能ファージ遺伝子発現制御であり得る。ある実施態様において、本発明は、宿主細胞におけるＣａｓヌクレアーゼでの切断によるファージ標的部位の修飾のために提供される。これは、例えば、以下の種々の理由により有用であり得る。
Ａ. 標的部位を、それを活性化または不活性化するための変異のため(例えば、抗宿主遺伝子の遺伝子ノックダウンまたは不活性化のためまたはファージ標的が宿主染色体に統合されているとき宿主細胞死滅のため)；
Ｂ. 標的配列または標的配列を含む大型配列欠失のため(例えば、本発明をファージゲノムの空間部位を標的とする第一および第二ＰＭ−ｃｒＲＮＡと使用するとき、ここで各部位の切断は、切断間のファージ核酸の欠失をもたらす)；
Ｃ. 宿主細胞ゲノムに所望のＰＭ−ＤＮＡ配列を挿入するため(例えば所望のＰＭ−ＤＮＡの相同組換え挿入のために宿主核酸において１以上のＰＭ−ｃｒＮＡガイド切断を提供することにより)。
【０１４６】
本発明は次の態様を提供する。
１. 第一細菌および第二細菌の亜集団を含む混合細菌集団中の該亜集団の相対比率を改変する方法であって、ここで第一細菌は宿主細胞(例えば、バクテロイデス門宿主細胞)であり(ここで第一細菌は所望によりファージにより感染され、第二細菌は該ファージにより感染されない(またはバクテロイデス門ではない))、方法は、ベクター核酸(例えば、そのＰＭ含有トランスポゾン)の宿主細胞への導入のために１以上の工程で混合集団と複数のベクターを合わせ、混合集団において細菌増殖をさせることを含み、ここで該第一細菌と第二細菌の相対比率が改変され；
ここで各ベクターは、細胞における標的ヌクレオチド配列(例えば、該ファージの)の修飾のために宿主細胞に導入するための改変されたファージ修飾(ＰＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイを含む、
(ａ)ここでＰＭ−ＣＲＩＳＰＲアレイはそれぞれＰＭ−ｃｒＲＮＡの１以上の発現のための配列および宿主細胞の配列の転写のためのプロモーターを含み；そして
(ｂ)ここでＰＭ−ｃｒＲＮＡは宿主細胞におけるＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)をガイドし、標的配列を修飾するために標的配列とハイブリダイズできる。
【０１４７】
ファージ生存能、増殖または感染性に必要な遺伝子の不活性化のためにファージ配列をターゲティングすることにより、ある態様において、本発明は、ファージに感染された宿主細胞いよる取り込みおよび保持が促進され得る陽性選択的優位性を有するアレイを提供する。宿主細胞が殺されるか増殖が低減するとき、集団おける第一細菌対第二細菌の相対的比率が減少する。本発明は、例えば、ヒトまたは動物対象における疾患または状態の処置または予防(リスク軽減)のための医薬として使用するための、このような製品集団を提供し、ここで医薬は対象に投与される。疾患または状態は、ここに開示する疾患または状態の何れであってもよい。例えば、単一ガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)はｃｒＲＮＡを提供するように宿主細胞で発現され、各ベクターは、このようなｇＲＮＡをコードする発現可能な改変されたヌクレオチド配列を含む。
【０１４８】
ＰＭ−アレイを使用する例において、標的配列はバクテロイデス・シータイオタオミクロン配列である。所望により標的配列はバクテロイデス・フラジリスに含まれない。これは、例えば、修飾が標的配列を切断するか他の態様で非機能的とするとき有利であり、それによりバクテロイデス・シータイオタオミクロン宿主細胞の比率は、例えば、混合集団がここに記載する腸内微生物相集団であるとき、バクテロイデス・フラジリスをターゲティングすることなく増加する。バクテロイデス・フラジリスは、ある設定において膿瘍と関連し、それ故に、例えば、肥満または糖尿病またはＩＢＤの処置または予防のために、例えば、腸内微生物相のリバランスに有用である本発明により、この例はこのリスクを軽減し、同時に比率の改変を可能とする(バクテロイデス・シータイオタオミクロン細胞比率の増加)。
【０１４９】
プロモーター(またはＨＭ−またはＰＭ−アレイ)は、宿主細胞において動作可能である。例えば、プロモーターは、ウイルスまたはファージプロモーター、例えば、Ｔ７プロモーターである。他の例において、プロモーターは細菌プロモーター(例えば、宿主細胞種のプロモーター)である。
【０１５０】
２. 第一細菌がバクテロイデス(例えば、シータイオタオミクロンまたはフラジリス)、アリスティペス、アルカリフレックス、パラバクテロイデス、タンネレラ、キシラニバクターおよび／またはプレボテラ細菌である、態様１の方法。
【０１５１】
３. 第二細菌がファーミキューテス細菌である(例えば、第一細菌がバクテロイデス門またはバクテロイデスであるとき)、態様１または２の方法。
【０１５２】
４. 第一細菌亜集団対第二細菌亜集団の比率が増加する、すなわち、該方法を適用した後、前より大きい、前記態様の何れかの方法。
【０１５３】
５. 混合集団がヒトまたは非ヒト動物にその腸内または口内微生物相の定植またはリバランスのために投与するための組成物(例えば、飲料、口腔洗浄剤または食糧)からなり、例えば、ここで混合集団がヒトまたは非ヒト動物におけるインビトロまたはインビボである、態様４の方法。
【０１５４】
６. 第一細菌亜集団対第二細菌亜集団の比率が減少する、すなわち、該方法を適用した後、前より小さい、態様１、２または３の方法。
【０１５５】
７. 混合集団がヒト消費のための飲料または水(例えば、水路または飲料水)に含まれる、態様６の方法。
【０１５６】
８. 各ベクターがプラスミド、ファージ(例えば、パッケージ化ファージ)またはファージミドである、前記態様の何れかの方法。
【０１５７】
９. 各ベクターがファージ(例えば、パッケージ化ファージ)であり、ベクター核酸が宿主細胞へのファージベクター核酸形質導入により、すなわち、ファージベクターによる宿主細胞の感染により宿主細胞に導入される、態様８の方法。例えば、ファージはここに記載する１以上のトランスポゾンを含む。
【０１５８】
１０. 各ベクターがプラスミドであり、ベクター核酸がベクターを含む細菌からの形質転換または水平プラスミド伝達により宿主細胞に導入される、態様８の方法。例えば、プラスミドはここに記載する１以上のトランスポゾンを含む。例えば、ベクターを含む細菌は非バクテロイデス門または非バクテロイデス種である。
【０１５９】
これに加えてまたはこれとは別に、ベクターを含む細菌は非ファーミキューテス種である。例えば、ベクターを含む細菌は、ラクトバチルス種(例えば、アシドフィルス(例えば、Ｌａ−５、Ｌａ−１４またはＮＣＦＭ)、ブレビス、ブルガリクス、プランタルム、ラムノサス、ファーメンタム、コーカシクス、ヘルベティカス、ラクティス、ロイテリまたはカゼイ、例えば、カゼイ・シロタ)、ビフィドバクテリウム種(例えば、ビフィドゥム、ブレベ、ロングムまたはインファンティス)、ストレプトコッカス・サーモフィルスおよびエンテロコッカス・フェシウムからなる群から選択される１以上の種の細菌である。例えば、細菌はラクトバチルス・アシドフィルスまたはラクティス細菌である。
【０１６０】
１１. 該バクテロイデス門ファージのゲノム修飾のために前記態様の何れかの方法において使用するための改変されたバクテロイデス門ファージ修飾(ＰＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイであって、
(ａ)ここでＰＭ−ＣＲＩＳＰＲアレイは、ＰＭ−ｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列およびバクテロイデス門ファージ感染宿主細胞における該配列の転写のためのプロモーターを含み；そして
(ｂ)ここでＰＭ−ｃｒＲＮＡは感染宿主細胞においてＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼをガイドし、標的配列を修飾するためにバクテロイデス門ファージゲノム標的配列とハイブリダイズできる。
【０１６１】
１２. 態様１１のＰＭ−ＣＲＩＳＰＲアレイを含む、態様１〜１０の何れかの方法おいて使用するための核酸ベクター(例えば、プラスミド、ファージまたはファージミド)。
【０１６２】
本発明の一般的な実施態様において、別に提供される態様１２がある。
宿主細菌細胞(例えば、上記したような病原性細菌細胞)のゲノムまたは宿主細胞におけるウイルス(例えば、ファージ)のゲノムの標的配列を修飾するために改変されたＨＭ−ＣＲＩＳＰＲアレイを含む核酸ベクター(例えば、プラスミド、ウイルス、ファージまたはファージミド)であって、
(ａ)ここでＣＲＩＳＰＲアレイは、ｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列および宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み；そして
(ｂ)ここでｃｒＲＮＡは宿主細胞におけるＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)をガイドし、標的配列を修飾するために標的配列とハイブリダイズできる。
【０１６３】
プロモーターは宿主細胞において動作可能である。例えば、プロモーターは、ウイルスまたはファージプロモーター、例えば、Ｔ７プロモーターである。他の例において、プロモーターは細菌プロモーター(例えば、宿主細胞種のプロモーター)である。
【０１６４】
例えば、アレイは、ここに記載するトランスポゾンに含まれる。例えば、アレイはここに記載する運搬体細菌に含まれる。例えば、複数のアレイはファージまたは宿主細胞の１以上の標的ヌクレオチド配列のターゲティングのために提供され、ここで複数のアレイは、ここに記載する細菌細胞、例えば、運搬体、第一レシピエントまたは第二レシピエント細胞に含まれる。例えば、運搬体細胞は、ここに記載する飲料(例えば、ヒト消費用のプロバイオティク飲料)または食糧に含まれる。例えば、アレイまたは運搬体細菌は、ヒトまたは動物の感染の処置または予防のためにヒトまたは非ヒト動物に投与するためであり、例えばここで宿主細胞は病原性である。例えば、アレイまたは運搬体細菌は、ヒトまたは動物の肥満、糖尿病またはＩＢＤの処置または予防のためにヒトまたは非ヒト動物の腸に投与するためである。
【０１６５】
１３. アレイまたはベクターがヒトまたは非ヒト動物消費のための細菌細胞、例えば、プロバイオティク細胞に含まれる、態様１１または１２のアレイまたはベクター。
【０１６６】
１４. ベクターが、混合集団との該組み合わせに使用されるまたは混合集団と組み合わせるためであり、それによりベクター核酸は、形質転換(例えば、第三細菌から第一細菌宿主細胞への水平プラスミドベクターまたはトランスポゾン伝達による)または形質導入(例えば、第一細菌宿主細胞のファージベクター感染による)により宿主細胞に導入される、前記態様の何れかの方法、アレイまたはベクター。
【０１６７】
１５. 本または各アレイまたはベクターがヒトまたは非ヒト動物腸片利共生または相利共生細菌細胞(例えば、ここに記載する運搬体細菌細胞)に含まれる、前記態様の何れかの方法、アレイまたはベクター。それ故に、細胞は、ヒトまたは非ヒト動物と片利共生または相利共生する腸内細菌種のものである。
【０１６８】
１６. 各ベクターが、ファーミキューテス宿主細胞またはバクテロイデス門ファージ感染宿主細胞(例えば、バクテロイデス細胞)と共に動作可能である複製起点を含むプラスミド、ファージまたはファージミドであり、所望により態様１５に定義したとおり片利共生または相利共生細菌細胞において動作可能である、態様１２〜１５の何れかの方法またはベクター。例えば、複製起点は、ｏｒｉＴまたはここに記載する任意の他の複製起点である。
【０１６９】
１７. 各ベクターが(１)バクテロイデス細胞ではないヒトまたは非ヒト動物片利共生または相利共生細菌細胞と(２)バクテロイデス細胞であるファージ感染細胞の間または(３)ファーミキューテス細胞ではないヒトまたは非ヒト動物片利共生または相利共生細菌細胞と(４)標的配列含有ファーミキューテス細胞の間の水平伝播ができる配列(例えば、ここに記載するトランスポゾン)を含むプラスミドまたはファージミドである、態様１２〜１６の何れかの方法またはベクター。
【０１７０】
１８. 各ベクターが(１)バクテロイデス細胞であるファージ感染細胞と(２)ヒトまたは非ヒト動物腸へのプロバイオティク投与に適する細菌細胞の間または(３)標的配列含有ファーミキューテス細胞および(４)ヒトまたは非ヒト動物腸へのプロバイオティク投与に適する細菌細胞の間の水平伝播が可能なプラスミドまたはファージミド配列(例えば、ここに記載するトランスポゾン)である、態様１２〜１７の何れかの方法またはベクター。
【０１７１】
１９. 片利共生、相利共生またはプロバイオティク種がラクトバチルス種(例えば、アシドフィルス(例えば、Ｌａ−５、Ｌａ−１４またはＮＣＦＭ)、ブレビス、ブルガリクス、プランタルム、ラムノサス、ファーメンタム、コーカシクス、ヘルベティカス、ラクティス、ロイテリまたはカゼイ、例えば、カゼイ・シロタ)、ビフィドバクテリウム種(例えば、ビフィドゥム、ブレベ、ロングムまたはインファンティス)、ストレプトコッカス・サーモフィルスおよびエンテロコッカス・フェシウムからなる群から選択される、態様１５〜１８の何れかの方法またはベクター。
【０１７２】
プロモーターが該ファージ感染バクテロイデス門宿主細胞および態様１５〜１９の何れかに定義の片利共生、相利共生またはプロバイオティク細菌細胞または態様１５〜１９の何れかに定義の標的配列含有ファーミキューテス細胞および片利共生、相利共生またはプロバイオティク細菌細胞において該配列の転写が可能である、前記態様の何れかの方法、アレイまたはベクター。例えば、プロモーターはウイルスまたは細菌プロモーター、例えば、Ｔ７プロモーターである。例えば、プロモーターは宿主細胞プロモーター、例えば、宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓアレイのプロモーターである。
【０１７３】
２０. 修飾が(ｉ)標的配列の切断、(ii)標的配列含有遺伝子の転写下方制御、(iii)標的配列含有遺伝子の転写上方制御または(iv)標的での核酸配列の付加、欠失または置換である、前記態様の何れかの方法、アレイまたはベクターまたはここでのあらゆる使用。
【０１７４】
２１. バクテロイデス門ファージがｃｒＡｓｓファージ、ＧＢ−１２４ファージ、ＧＡ−１７ファージ、ＨＢ−１３ファージ、Ｈ１６−１０ファージ、Ｂ４０−８ファージおよびバクテロイデス・フラジリスファージＡＴＣＣ５１４７７−Ｂ１から選択される、前記態様の何れかの方法、アレイまたはベクター。Nat Commun. 2014 Jul 24;5:4498. doi: 10.1038/ncomms5498, &#34;A highly abundant bacteriophage discovered in the unknown sequences of human faecal metagenomes&#34;, Dutilh BE et al.を参照のこと。ｃｒＡｓｓファージ約９７kbpゲノムは、全ての他の既知ファージをあわせたよりも、公的に利用可能なメタゲノムで６倍豊富であり、ウイルス様粒子(ＶＬＰ)由来メタゲノムおよび総合コミュニティメタゲノムの全読取のそれぞれ最大９０％および２２％を構成し、公的データベースにおける全ヒト糞便メタゲノム配列の配列決定読取の１.６８％に上る。新規共発生プロファイリングアプローチの使用により、Dutilh et alは、バクテロイデス関連タンパク質ホモログおよびファージゲノムにおいてコードされる独特な炭水化物結合ドメインと一致する、このファージのバクテロイデス宿主を予測した。
【０１７５】
２２. 標的配列が宿主細胞感染性、ファージ溶原性または溶解性サイクルまたはファージ生存能、例えば、必須遺伝子またはコートタンパク質遺伝子に必要なファージ遺伝子に含まれる、前記態様の何れかの方法、アレイまたはベクター、またはここでのあらゆる使用。
【０１７６】
２３. 標的配列がＢＡＣＯＮ(バクテロイデス門関連炭水化物結合)ドメインコード化配列(例えば、ここで宿主はバクテロイデス宿主である)またはエンドリシンコード化配列に含まれる、前記態様の何れかの方法、アレイまたはベクター。FEBS Lett. 2010 Jun 3;584(11):2421-6, doi:10.1016/j.febslet.2010.04.045. Epub 2010 Apr 21, “Mining metagenomic data for novel domains: BACON, a new carbohydrate-binding module”, Mello L et al.を参照のこと。ファージ構造タンパク質へのＢＡＣＯＮドメインの存在は、粘液モデルへの提唱されるバクテリオファージ粘着性を説明するはずである。このモデルによると、ファージは、カプシド提示炭水化物結合ドメイン(例えば免疫グロブリン様折りたたみまたはＢＡＣＯＮドメイン)を経て腸管粘液層を構成するムチン糖タンパク質に結合し、ファージが感染する細菌のより頻繁な相互作用を促進する。
【０１７７】
２５. ＣＲＩＳＰＲアレイが宿主細胞でのｃｒＲＮＡ発現および産生のために配列Ｒ１−Ｓ１−Ｒ１’を含み、
(ｉ)ここでＲ１は第一ＣＲＩＳＰＲ反復であり、Ｒ１’は第二ＣＲＩＳＰＲ反復であり、Ｒ１またはＲ１’は任意であり、
(ii)Ｓ１は該標的配列に９５％以上同一であるヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる第一ＣＲＩＳＰＲスペーサーである、
前記態様の何れかの方法、アレイまたはベクターまたはここでのあらゆる使用。例えば、標的配列はプロトスペーサーを含むかまたは本発明のアレイが宿主細胞にあるときＣａｓと同族プロトスペーサー隣接モチーフ(ＰＡＭ)に直ぐに隣接したプロトスペーサー配列に含まれ、ここでＣａｓはまた該アレイから発現されるｃｒＲＮＡとも同族である。ある実施態様において、Ｃａｓは細胞に内在性である。他の例において、Ｃａｓは細胞に外来性である、例えば、本発明のベクターにより提供される。
【０１７８】
２６. Ｒ１およびＲ１’が、宿主細胞と同種の細胞のＣＲＩＳＰＲアレイの反復配列と少なくとも９５％(例えば、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％)同一である、態様２５の方法、アレイまたはベクター。
【０１７９】
２７. Ｒ１およびＲ１’がシータイオタオミクロンおよびフラジリス(例えば、バクテロイデス・フラジリスＮＣＴＣ  ９３４３)から選択されるバクテロイデス種のＣＲＩＳＰＲアレイ(例えば、タイプII−Ｃアレイ)の反復配列と各少なくとも９５％(例えば、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％)同一であり、ここで宿主細胞が反復配列と機能的であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含み、例えば、該種、バクテロイデス細胞である、態様２５の方法、アレイまたはベクター。
【０１８０】
２８. Ｒ１およびＲ１’は、該種、例えば、該種の該宿主細胞のＣＲＩＳＰＲアレイの第一(最も５’)および第二(第一反復の直ぐ３’の反復)反復配列とそれぞれ少なくとも９５％(例えば、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％)同一である、態様２７の方法、アレイ、使用またはベクター。例えば、アレイはタイプII−Ｃアレイである。例えば、アレイまたはベクターはさらにＲ２−Ｓ２−Ｒ２’を含み、ここでスペーサーＳ２はスペーサーＳ１と同一または異なり(例えば、宿主細胞またはファージゲノムにおける異なる標的部位のターゲティングのため)、ここでＲ２およびＲ２’は宿主細胞において機能的であり、所望によりＲ１と同一である。例えば、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２およびＲ２’の各々はバクテロイデス・フラジリスＣＲＩＳＰＲ反復である。
【０１８１】
２９. (iii)Ｒ１およびＲ１’の各々はバクテロイデス種細胞のＣＲＩＳＰＲアレイ(例えば、タイプII−Ｃアレイ)の反復配列と同一であり、ここで種はカッカエ、カピロスス、セルロシリティカス、コプロコラ、コプロフィルス、コプロスイス、ディスタソニス、ドレイ、エガーシイ、ファエシス、ファインゴールディー、フルクサス、フラジリス(例えば、フラジリスＮＣＴＣ  ９３４３)、インテスティナリス、メラニノゲニカス、ノルディイ、オレイシプレヌス、オラーリス、オバータス、ペクチノフィルス、プレビウス、スターコリス、シータイオタオミクロン、ユニフォルミス、ブルガタスおよびキシラニソルベンスからなる群から選択され、そして(iv)ここで宿主細胞は反復配列と機能的であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含み、該群から選択される種のバクテロイデス細胞(例えば、(iii)の選択種と同じ種)である、態様２５の方法、アレイ、使用またはベクター。
【０１８２】
３０. Ｒ１およびＲ１’が標的配列修飾のために宿主バクテロイデス門またはファーミキューテス細胞のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと共に機能的である、態様２５の方法、アレイ、使用またはベクター。例えば、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２およびＲ２’は、同じ細菌種、例えば、シータイオタオミクロンまたはフラジリスのようなバクテロイデスまたはストレプトコッカス・サーモフィルスまたはピオゲネスのようなストレプトコッカスのタイプII(例えば、タイプII−Ｃ)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム反復である。
【０１８３】
３１. Ｒ１およびＲ１’がバクテロイデス門(例えば、バクテロイデスまたはプレボテラ)またはファーミキューテス(例えば、ストレプトコッカス)細胞のＣＲＩＳＰＲアレイ(例えば、タイプII−Ｃアレイ)の反復配列と少なくとも９５％(例えば、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％)同一である、態様２５の方法、アレイ、使用またはベクター。
【０１８４】
３２. Ｒ１およびＲ１’の各々が表２の配列番号１〜５から選択される配列と少なくとも９５％(例えば、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％)同一であり、所望により第一細菌細胞が、例えば、表２における種または株(例えば、種または選択配列に対して列記した株)のバクテロイデス細胞である、態様２５の方法、アレイ、使用またはベクター。
【０１８５】
３３. Ｒ１およびＲ１’の各々が表２の配列番号６〜１１から選択される配列と少なくとも９５％(例えば、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％)同一であり、所望により第一細菌細胞が、例えば、表２における種または株(例えば、種または選択配列に対して列記した株)のプレボテラ細胞である、態様２５の方法、アレイ、使用またはベクター。
【０１８６】
３４. 各アレイが宿主細胞でｃｒＲＮＡと機能的であり、標的配列を修飾する１以上のＣａｓヌクレアーゼとの組み合わせである、前記態様の何れかの方法、アレイまたはベクター。例えば、標的配列はプロトスペーサー隣接モチーフ(ＰＡＭ)に直ぐ隣接してプロトスペーサー配列を含み、所望によりここでＰＡＭはバクテロイデス門宿主細胞に含まれるＣａｓヌクレアーゼと同族である。例えば、ＣａｓはタイプII−Ｃ  Ｃａｓヌクレアーゼである。
【０１８７】
３５. 各アレイが、宿主細胞におけるｃｒＲＮＡと機能的であり、標的配列を修飾する１以上のＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸配列との組み合わせである、前記態様の何れかの方法、アレイまたはベクター。
【０１８８】
３６. Ｒ１およびＲ１’が宿主細胞における標的を修飾するためにタイプII  Ｃａｓ９ヌクレアーゼ(例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・サーモフィルスまたはスタフィロコッカス・アウレウスＣａｓ９)と共に機能的である、態様２５の方法、アレイ、使用またはベクターであって、所望によりここで方法、アレイまたはベクターはさらに態様３４または３５に従い、ここでＣａｓは該Ｃａｓ９である。
【０１８９】
３７. 態様１〜１０または１４〜３６の方法により得られる細菌のエキソビボ混合集団またはここでの使用。例えば、混合集団は医学的または栄養学的使用のための容器にある。例えば、コンテナは滅菌容器である。
【０１９０】
３８. ヒトまたは非ヒト動物に治療的、予防的、美容的ヒトまたは非ヒト動物体重減少(例えば、美容的減少)または栄養学的使用のために投与する組成物であって、態様３７の混合集団を含む組成物。例えば、組成物は、経口、全身、吸入、直腸内、眼、バッカルまたは膣内投与用である。例えば、組成物は、ヒトまたは非ヒト動物の腸または口腔への投与用である。
【０１９１】
３９. 態様３７の混合集団または態様３８の組成物を含む、ヒトまたは非ヒト動物消費のための食糧または飲料。
【０１９２】
４０. 栄養補助またはプロバイオティク飲料または食糧である、態様３９の食糧または飲料。
【０１９３】
４１. ヒトまたは非ヒト動物または飲料水におけるバクテロイデス門感染の処置または予防のための抗生物質組成物であって、ここで組成物は態様１１〜３６の何れかのアレイまたはベクターを含み、所望によりここで修飾は態様２１(iii)または(iv)に従う。
【０１９４】
４２. ヒトまたは非ヒト動物における腸バクテロイデス門の比率を上げるためのプロバイオティク組成物(例えば、肥満、糖尿病(例えば、Ｉ型)またはＧＩ炎症状態の処置または予防のため)であって、ここで組成物は態様１１〜３６の何れかのアレイまたはベクターを含み、所望によりここで修飾は態様２１(iii)または(iv)に従う。
【０１９５】
４３. ヒトまたは動物における腸バクテロイデス対ファーミキューテスの相対的比率を上げるため、例えば肥満、糖尿病(例えば、Ｉ型糖尿病)またはＧＩ状態(例えば、クローン病、ＩＢＤ、ＩＢＳまたは潰瘍性大腸炎)の処置または予防のための、態様３８、４１または４２の組成物。
【０１９６】
別法において、本発明のあらゆる形態における“アレイ”は、宿主細胞における発現のためのＨＭ−ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする改変されたヌクレオチド配列が代わりとなり得る。アレイに関するここでの態様の何れかの特性は、それ故に、このような改変された配列に変更すべきところは変更して代替的に適用され得る。
【０１９７】
可動遺伝要素およびＣＲＩＳＰＲシステム
４４. 宿主細菌細胞(例えば、ファーミキューテスまたは上記したような病原性細菌細胞)のゲノムまたは宿主細胞におけるウイルス(例えば、ファージ)のゲノムの標的配列修飾のための改変されたＣＲＩＳＰＲアレイを含む核酸ベクター(例えば、プラスミド、ウイルス、ファージまたはファージミド)であって、
(ａ)ここでＣＲＩＳＰＲアレイは、ｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列(例えば、ｇＲＮＡに含まれる)および宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み；
(ｂ)ここでｃｒＲＮＡは宿主細胞におけるＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)をガイドし、標的配列を修飾するために標的配列とハイブリダイズでき；
(ｃ)ここでアレイは第一細菌と、異なる種の第二細菌細胞の間で水平伝播できるトランスポゾンからなる。
【０１９８】
所望により、Ｃａｓヌクレアーゼは、宿主細胞の野生型内在性Ｃａｓヌクレアーゼである。
【０１９９】
４５. アレイはヒトまたは非ヒト動物への投与のためであり、第一細胞種がヒトまたは動物に非病原性であり、第二細胞種がヒトまたは動物に病原性であり、ここでアレイは第一細胞に含まれる、態様４４のベクター。
【０２００】
４６. 第一細胞種がヒトまたは動物と片利共生または相利共である種、例えば、腸内微生物相種である、態様４５のベクター。
【０２０１】
４７. 第一細胞種がラクトバチルス種(例えば、アシドフィルス(例えば、Ｌａ−５、Ｌａ−１４またはＮＣＦＭ)、ブレビス、ブルガリクス、プランタルム、ラムノサス、ファーメンタム、コーカシクス、ヘルベティカス、ラクティス、ロイテリまたはカゼイ、例えば、カゼイ・シロタ)、ビフィドバクテリウム種(例えば、ビフィドゥム、ブレベ、ロングムまたはインファンティス)、ストレプトコッカス・サーモフィルスおよびエンテロコッカス・フェシウムからなる群から選択される、態様４５または４６のベクター。
【０２０２】
４８. ベクターがヒトまたは動物消費用の飲料(例えば、プロバイオティク飲料)または食糧に含まれる、態様４４〜４７の何れかのベクター。
【０２０３】
４９. ベクターが標的配列ターゲティングのための少なくとも一つの反復−スペーサー−反復単位を含み、ここで、反復が宿主細胞のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの反復と少なくとも９５％(例えば、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％)同一であり、それによりベクターの反復が宿主システムのＣａｓをガイドし、標的ヌクレオチド配列を修飾するために宿主細胞において動作可能である、態様４４〜４８の何れかのベクター。
【０２０４】
５０. ベクターがＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)コード化配列を欠く、態様４９のベクター。
【０２０５】
本発明による宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのヌクレオチド配列のターゲティングは、宿主細胞耐性のベクターへの移動(例えば、侵入ウイルス)または耐性発現もしくは増加の減少に有用である。例えば、本発明は、それにより、新規ベクター(例えば、ファージ)スペーサー獲得阻害されるように、内在性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの活性のターゲティングおよびノックダウンの利点を提供する。
【０２０６】
可動化の特性は、伝達に必要なシス作用性領域(ｏｒｉＴ)の存在である。この領域は、ＤＮＡプロセシングの開始部位であり、そこで、部位および鎖特異的ニックが、伝達事象開始のためにプラスミドで作られる。本発明は、次のとおり可動遺伝要素(ＭＧＥ)を用いるさらなる実施態様を提供する。
【０２０７】
１. 可動遺伝要素(ＭＧＥ)を含むまたはこれからなる改変されたＣＲＩＳＰＲ核酸ベクターであって、ここでＭＧＥは宿主細胞(例えば、病原性細菌細胞)のゲノムまたは宿主細胞におけるウイルス(例えば、プロファージ)のゲノムの標的配列修飾のための伝達起点(ｏｒｉＴ)およびＣＲＩＳＰＲアレイを含み、
(ａ)ここでＣＲＩＳＰＲアレイは、ｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列および宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み；
(ｂ)ここでｃｒＲＮＡは宿主細胞におけるＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)をガイドし、標的配列を修飾するために標的配列とハイブリダイズでき；
(ｃ)ここでベクターは(ｉ)第一宿主細胞の第一核酸と第二核酸位置間(ここで各位置は染色体またはプラスミドの位置であり、標的配列は宿主細胞に含まれる)または(ii)第一宿主細胞と第二宿主細胞間(ここで標的配列は第一および／または第二宿主細胞に含まれる)で伝達される。
【０２０８】
ＭＧＥの例は、ＩＣＥ、トランスポゾン、プラスミドおよびバクテリオファージである。伝達起点(ｏｒｉＴ)は、コンジュゲーション中、ＤＮＡのそれを含む細菌宿主からレシピエントへの伝達に必要である短配列(例えば、最大５００bp)である。ｏｒｉＴはシス作用性である  −  伝達される同じＤＮＡ上に見られ該ＤＮＡと共に伝達される。典型的伝達起点は、ニッキングドメイン、伝達ドメインおよび終結ドメインの３つの機能的に定義されたドメインを含む。
【０２０９】
所望により、プロモーターは、第一および第二(および所望により第三)細胞における該配列の転写に動作可能である。
【０２１０】
所望により標的配列は第二細胞に含まれる。所望により標的配列は第二細胞に含まれない。
【０２１１】
例えば、第一および第二細胞は異なる細菌種のものである(例えば、例えば、腸、腋窩、膣または口腔のヒトマイクロバイオーム集団に見られる種)。例えば、第一および第二細胞はエクスビボである。他の例において、第一および第二細胞は、インビボまたはエクスビボでヒト腸、膣、腋窩または口腔マイクロバイオームに含まれる。
【０２１２】
２. ＭＧＥが組込みおよび接合性要素(ＩＣＥ)であるまたはそれを含む、実施態様１のベクター。あるいは、ＭＧＥは、可動性ＭＧＥである(すなわち、可動のためにＭＧＥに担持される遺伝子によりコードされる因子を使用できる)。ＭＧＥに関する用語“可動性”および“接合性”は、業者である対象者には容易に明らかである。
【０２１３】
本発明の適するＩＣＥおよび適当なｏｒｉＴの源の例を提供する、ＩＣＥｂｅｒｇデータベース(http://db-mml.sjtu.edu.cn/ICEberg/)を参照のこと。例えば、ＩＣＥは、群１〜２８から選択されるＩＣＥを含むＩＣＥファミリーのメンバーであるかまたはｏｒｉＴは、このようなファミリーのメンバーのｏｒｉＴである：１＝ＳＸＴ／Ｒ３９１；２＝Ｔｎ９１６；３＝Ｔｎ４３７１；４＝ＣＴｎＤＯＴ／ＥＲＬ；５＝ＩＣＥｃｌｃ；６＝ＩＣＥＢｓ１；７＝ＩＣＥＨｉｎ１０５６；８＝ＰＡＰＩ−１；９＝ＩＣＥＭｌＳｙｍ(Ｒ７Ａ)；１０＝ＩＣＥＳｔ１；１１＝ＳＰＩ−７；１２＝ＩＣＥ６０１３；１３＝ＩＣＥＫｐ１；１４＝ＴｎＧＢＳ１；１５＝Ｔｎ５２５３；１６＝ＩＣＥＳａ２６０３；１７＝ＩＣＥＹｅ１；１８＝１０２７０−ＲＤ.２；１９＝Ｔｎ１２０７.３；２０＝Ｔｎ１８０６；２１＝ＩＣＥＡ５６３２；２２＝ＩＣＥＦ−Ｉ／II；２３＝ＩＣＥＡＰＧ２；２４＝ＩＣＥＭ；２５＝１０２７０−ＲＤ.１；２６＝Ｔｎ５８０１；２７＝ＰＰＩ−１；２８＝ＩＣＥＦ−III。ファミリー記述はＩＣＥｂｅｒｇデータベースにある。例えば、Ｔｎ９１６ファミリーは、Roberts et al (2009) (Trends Microbiol. 2009 Jun;17(6):251-8. doi: 10.1016/j.tim.2009.03.002. Epub 2009 May 20; “A modular master on the move: the Tn916 family of mobile genetic elements”, Roberts A, Mullany P)により定義された。Ｔｎ９１６ファミリーに属する要素は次の基準により定義される：Roberts et alに示される一般的組織化を有さなければならず、ＤＮＡレベルで元のＴｎ９１６と配列および構造が類似するコア領域(コンジュゲーションおよび制御モジュール)を有しなければならない。このファミリーに以前に分類されたＴｎ１５４９および対応する対照と記載したとおりの高い程度のタンパク質相同性を有するもののようないくつかの接合性トランスポゾンは例外である。
【０２１４】
３. ＩＣＥがトランスポゾン、例えば、接合性トランスポゾンである、実施態様２のベクター。例えば、ＭＧＥは機能的ヘルパー要素存在下で可動性である可動性トランスポゾンであり、所望によりここでトランスポゾンは該ヘルパー要素と組み合わされる。
【０２１５】
４. ベクターがプラスミドであり、所望によりここでＭＧＥがプラスミドに含まれるトランスポゾンである、前記の実施態様の何れかのベクター。例えば、トランスポゾンは接合性トランスポゾンである。例えば、トランスポゾンは可動性トランスポゾンである(例えば、プラスミド、例えば、プラスミドのトランスポゾン配列の外側の遺伝子によりコードされる１以上の因子を使用して可動性)。所望により、トランスポゾンはタイプＩトランスポゾンである。所望により、トランスポゾンはタイプIIトランスポゾンである。
【０２１６】
５. ｏｒｉＴが第一および第二宿主細胞で機能的である、前記の実施態様の何れかのベクター。これは、例えば、第一細胞と第二細胞が異なる種のものであるとき、細菌集団の細菌にわたり拡散および増殖を促進するのに有用である。
【０２１７】
６. 第一細胞に含まれるときの実施態様５のベクターであって、ここで第一細胞は第二細胞にＭＧＥを伝達するために動作可能なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで配列はＭＧＥに含まれない。これは、このような配列のためのＭＧＥにおける空間の使用を避けるために有用である。例えば、これは細胞間の伝達のためのより小型のＭＧＥの構築を可能にするまたは大型のまたはより多いＣＲＩＳＰＲアレイの挿入を可能にする、例えば、宿主細胞における各配列を標的とするための複数のスペーサーを含むためまたは第一および第二宿主細胞における異なる配列を標的とするため、より多いＣＲＩＳＰＲアレイの挿入を可能にする。
【０２１８】
７. 配列がベクターに含まれない、実施態様６のベクター。これは、このような配列のためのベクターまたはＭＧＥにおける空間の使用を避けるために有用である。例えば、これは、細胞間の伝達のためのより小型のベクターまたはＭＧＥの構築を可能にする細胞または大型のまたはより多いＣＲＩＳＰＲアレイの挿入を可能にする、例えば、宿主細胞における各配列を標的とするための複数のスペーサーを含むためまたは第一および第二宿主細胞における異なる配列を標的とするためおよび／またはＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９をコードする１以上の配列を含むため、より多いＣＲＩＳＰＲアレイの挿入を可能にする。
【０２１９】
８. 配列が第一細胞の接合性トランスポゾンに含まれる、実施態様６または７のベクター。これは、本発明のＭＧＥの第一および第二宿主細胞(例えば、ヒトマイクロバイオームにおける異なる細菌種の)間の水平伝播のための、接合性転位を行うためにＭＧＥの外側の因子の利用を可能とするため、有用である。
【０２２０】
９. トランスポゾンが第二細胞にＭＧＥを伝達するためにトランスで動作可能である、実施態様８のベクター。これは、本発明のＭＧＥの第一および第二宿主細胞(例えば、ヒトマイクロバイオームにおける異なる細菌種の)間の水平伝播のための、接合性転位を行うためにＭＧＥの外側の因子の利用を可能とするため、有用である。例えば、本発明のＭＧＥのｏｒｉＴは、宿主細胞の接合性トランスポゾンに含まれるｏｒｉＴと同じである。これは、本発明のＭＧＥがＭＧＥの第一および第二宿主細胞(例えば、異なる種、例えば、ヒトマイクロバイオーム種の細菌細胞)間の水平伝播を行うのに宿主細胞によりコードされる因子と共に動作可能とするのに有用である。これは、上記のとおりＭＧＥをより小型化しまたはＣＲＩＳＰＲアレイおよび／またはＣａｓ遺伝子の空間を解放することを可能とする。
【０２２１】
用語“トランスで動作可能”は、ＭＧＥ(ＩＣＥ)が、ＭＧＥ(またはＭＧＥを含むプラスミドのようなベクター全体)の第二細胞への伝達のために、ベクターヌクレオチド配列の外の宿主ヌクレオチド配列から発現されるタンパク質(例えば、宿主細胞の接合性トランスポゾンにより発現されるタンパク質)を使用して水平伝播に動作可能であることを意味する。
【０２２２】
１０. 第一細胞に含まれるときの、前記の実施態様の何れかのベクターであって、ここでＭＧＥのｏｒｉＴは第一細胞のＩＣＥに含まれるｏｒｉＴと同一であり、ここでＩＣＥが第二細胞にＭＧＥを伝達するためにトランスで動作可能である。
【０２２３】
１１. ベクターｏｒｉＴがバクテロイデス門(例えば、バクテロイデス科またはバクテロイデス)またはプレボテラトランスポゾンのｏｒｉＴである、前記の実施態様の何れかのベクター。これは、第一および／または第二宿主細胞がそれぞれバクテロイデス門(例えば、バクテロイデス科またはバクテロイデス)またはプレボテラ細胞であるとき、有用である。例えば、第一細胞はこのような種の細胞であり、第二細胞はファーミキューテス細胞であり、標的配列は第二細胞に含まれるが第一細胞に含まれず、それによりＣＲＩＳＰＲアレイは第二細胞におけるＣａｓを指向し、標的配列を切断する。例えば、標的配列は第二細胞の必須遺伝子または抗生物質耐性遺伝子に含まれる(および後者に関して、所望によりベクターは抗生物質と組み合わされまたは抗生物質と組み合わせてヒトまたは非ヒト動物に投与される)。所望により、トランスポゾンはＣＴｎＤｏｔであるかまたはＣＴｎＥＲＬトランスポゾンおよびベクターはテトラサイクリンと組み合わされるかまたはテトラサイクリンと組み合わせてヒトまたは非ヒト動物に投与される。
【０２２４】
１２. ベクターｏｒｉＴがＣＴｎＤｏｔ、ＣＴｎＥＲＬ  ＳＸＴ／Ｒ３９１、Ｔｎ９１６またはＴｎ４３７１ファミリートランスポゾンｏｒｉＴである、前記の実施態様の何れかのベクター。
【０２２５】
１３. ＭＧＥが第一および第二末端反復配列および反復配列間のＣＲＩＳＰＲアレイを含む、前記の実施態様の何れかのベクター。
【０２２６】
１４. ＭＧＥがトランスポゾンコピーを(１)第二位置に伝達されているとき第一核酸位置にまたは(２)第二細胞に伝達されているとき第一細胞に残す、前記の実施態様の何れかのベクター。これは、宿主細胞を含む細菌集団におけるＭＧＥの増殖および維持の促進に有用である。別法において、ＭＧＥは、トランスポゾンコピーを(ｉ)第二位置に伝達されているとき第一核酸位置にまたは(ii)第二細胞に伝達されているとき第一細胞に残さない。
【０２２７】
１５. 第一および／または第二細胞に含まれているときの(例えば、第一および第二細胞に含まれるベクターの第一および第二コピー)、前記の実施態様の何れかのベクター。
【０２２８】
１６. 第一および第二細胞が異なる種の細胞である、実施態様１５のベクター。例えば、第一細胞がラクトバチルス細胞(例えば、ここに記載するとおり)および／または第二細胞がバクテロイデス門(例えば、バクテロイデス細胞、例えば、例えばここに記載するような細胞)またはファーミキューテス細胞(例えば、例えばここに記載するような細胞)である。例えば、例えば、ＧＩ状態または糖尿病の処置または予防のためのまたは肥満の処置または予防のためのヒトの腸マイクロバイオームの投与のため、第一細胞がバクテロイデス門(例えば、バクテロイデス細胞、例えば、例えばここに記載するような細胞)および第二細胞がファーミキューテス細胞(例えば、例えばここに記載するような細胞)である。
【０２２９】
１７. 第一および第二細胞が細菌または古細菌細胞である、実施態様１５または１６のベクター。
【０２３０】
１８. 第一細胞がヒトに非病原性であり(例えば、片利共生または相利共生細菌細胞)、所望により第二細胞がヒトに病原性細胞である、実施態様１６または１７のベクター。別法において、第二細胞はヒトに非病原性細胞である。用語“ヒトに非病原性”は、ヒトのマイクロバイオーム(例えば、腸、膣、腋窩または口腔マイクロバイオーム)に病原性なくまたは実質的に病原性なく存在できるが、ヒトの他の環境において病原性である、ある細菌種(例えば、バクテロイデス種、例えばフラジリス)のような細胞を含む。当業者は、第一細胞型がヒトにおいてまたはヒト上で保持でき、第二細胞型がヒトにおいてまたはヒト上で低減すべきであることを理解する。例えば、ＣＲＩＳＰＲアレイは、ヒトにおいてまたはヒト上で第二細胞のゲノムを、死滅させまたは細胞生存能もしくは増殖を低減させるように修飾する。例えば、標的部位は第二細胞に含まれ、部位はＣａｓヌクレアーゼにより切断され、それにより標的部位に含まれる遺伝子を不活性化または下方制御する。例えば、遺伝子は第二細胞の必須遺伝子または抗生物質耐性遺伝子である。例えば、遺伝子は病原性遺伝子である。
【０２３１】
１９. 第二細胞(各宿主細胞)が、(ｉ)例えば、メチシリン、バンコマイシン耐性およびテイコプラニンから選択される抗生物質に耐性のスタフィロコッカス・アウレウス細胞、(ii)例えば、セファロスポリン類(例えば、セフタジジム)、カルバペネム類(例えば、イミペネムまたはメロペネム)、フルオロキノロン類、アミノグリコシド類(例えば、ゲンタマイシンまたはトブラマイシン)およびコリスチンから選択される抗生物質に耐性のシュードモナス・エルギノーサ細胞、(iii)例えば、カルバペネムに耐性のクレブシエラ(例えば、ニューモニエ)細胞、(iv)例えば、エリスロマイシン、クリンダマイシン、ベータ−ラクタム、マクロライド、アモキシシリン、アジスロマイシンおよびペニシリンから選択される抗生物質に耐性のストレプトコッカス(例えば、ニューモニエまたはピオゲネス)細胞、(ｖ)例えば、セフトリアキソン、アジスロマイシンおよびシプロフロキサシンから選択される抗生物質に耐性のサルモネラ(例えば、血清型チフィ)細胞、(vi)例えば、シプロフロキサシンおよびアジスロマイシンから選択される抗生物質に耐性のシゲラ細胞、(vii)例えば、イソニアジド(ＩＮＨ)、リファンピシン(ＲＭＰ)、フルオロキノロン、アミカシン、カナマイシンおよびカプレオマイシンから選択される抗生物質に耐性のマイコバクテリウム・ツベルクローシス細胞、(viii)例えば、バンコマイシンに耐性のエンテロコッカス細胞、(ix)例えば、セファロスポリンおよびカルバペネムから選択される抗生物質に耐性の腸内細菌科細胞、(ｘ)例えば、トリメトプリム、ニトロフラントイン、セファレキシンおよびアモキシシリンから選択される抗生物質に耐性のエシェリキア・コリ細胞、(xi)例えば、フルオロキノロン抗生物質およびカルバペネムムから選択される抗生物質に耐性のクロストリジウム(例えば、ディフィシル)細胞、(xii)例えば、セフィキシム(例えば、経口セファロスポリン)、セフトリアキソン(注射可能セファロスポリン)、アジスロマイシンおよびテトラサイクリンから選択される抗生物質に耐性のナイセリア・ゴノレー細胞、(xiii)例えば、ベータ−ラクタム、メロペネムおよびカルバペネムから選択される抗生物質に耐性のアシネトバクター・バウマンニ細胞または(xiv)例えば、シプロフロキサシンおよびアジスロマイシンから選択される抗生物質に耐性のカンピロバクター細胞から選択される細胞である、前記の実施態様の何れかのベクターまたはここでのあらゆる使用。このような種はヒトに病原性であり得る。
【０２３２】
２０. 標的部位が第二細胞の抗生物質耐性遺伝子に含まれており、ここで抗生物質が実施態様１９に記載する各抗生物質である、実施態様１９のベクターまたは使用。
【０２３３】
２１. 第一細胞がバクテロイデス門(例えば、バクテロイデス科またはバクテロイデス)細胞、ラクトバチルス(例えば、アシドフィルス(例えば、Ｌａ−５、Ｌａ−１４またはＮＣＦＭ)、ブレビス、ブルガリクス、プランタルム、ラムノサス、ファーメンタム、コーカシクス、ヘルベティカス、ラクティス、ロイテリまたはカゼイ、例えば、カゼイ・シロタ)、ビフィドバクテリウム(例えば、ビフィドゥム、ブレベ、ロングムまたはインファンティス)、ストレプトコッカス・サーモフィルス、エンテロコッカス・フェシウム、アリスティペス、アルカリフレックス、パラバクテロイデス、タンネレラまたはキシラニバクター細胞である、実施態様１５〜２０の何れかのベクター。
【０２３４】
２２. (ｉ)の第一および／または第二核酸位置がバクテロイデス門(例えば、バクテロイデス科またはバクテロイデス)細胞に含まれるまたは(ii)の第一および／または第二宿主細胞がバクテロイデス門(例えば、バクテロイデス科またはバクテロイデス)またはプレボテラ細胞である、前記の実施態様の何れかのベクター。
【０２３５】
２３. 第一細胞がバクテロイデス門(例えば、バクテロイデス科またはバクテロイデス)細胞であり、第二細胞がファーミキューテス(例えば、クロストリジウムまたはスタフィロコッカス)細胞であり、例えば、ここでベクターがＧＩ状態または糖尿病の処置または予防のためのまたは肥満の処置または予防のためのヒトの腸マイクロバイオームに投与するためである、実施態様２２のベクター。
【０２３６】
２４. 第一細胞(各第一細胞)が環境(例えば、水または土壌環境中)において環境的に許容され、所望により第二細胞(各宿主細胞)が環境において許容されない、実施態様１６または１７のベクター(またはここでのあらゆる使用)。水環境は当業者には容易に明らかであり、例えば、海または水路(例えば、湖、運河、川または貯留槽)環境であり得る。例えば、水環境はヒト消費が意図される飲料水または汚水である。例えば、土壌環境は耕地の土壌または採鉱場所(例えば、鉱物または金属採鉱場所)の土壌である。
【０２３７】
“許容される”および“許容されない”により、当業者は、第一細胞型を環境で保持でき、第二細胞型を環境で減少させるべきであることを容易に理解する。例えば、ＣＲＩＳＰＲアレイは、第二細胞のゲノムを、環境において死滅させるかまたは細胞生存能もしくは増殖を低減させるように修飾する。例えば、標的部位は第二細胞に含まれ、部位はＣａｓヌクレアーゼにより切断され、それにより標的部位に含まれる遺伝子を不活性化または下方制御する。例えば、遺伝子は第二細胞の必須遺伝子または抗生物質耐性遺伝子である。例えば、遺伝子は病原性遺伝子である。
【０２３８】
例えば、環境はヒトのマイクロバイオーム、例えば、口腔マイクロバイオームまたは腸マイクロバイオームまたは血流である。例えば、環境はヒトに関する環境ではない。例えば、環境は非ヒト動物に関する環境ではない。ある実施態様において、環境は空気環境である。ある実施態様において、環境は農業環境である。ある実施態様において、環境は石油または石油回収環境、例えば、油または石油採掘場または井戸である。例えば、環境は、ヒトまたは非ヒト動物消費のための食糧または飲料に関する環境である。
【０２３９】
例えば、ベクター、システム、ベクター、アレイ、ｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ、方法またはここでのあらゆる使用が産業における使用であるかまたは環境が産業用環境であり、ここで産業は、医療および健康管理、薬剤、ヒト食品、動物食品、植物肥料、飲料、乳製品、食肉加工、農業、家畜飼育、家禽飼育、魚介類飼育、獣医、石油、ガス、石油化学製品、水処理、汚水処理、包装、電子機器およびコンピューター、パーソナルヘルスケアおよびトイレタリー、化粧品、歯科、非医学的歯科、眼、非医学的眼、鉱物採鉱および加工、金属採鉱および加工、採石、航空、自動車、鉄道、船舶、宇宙、環境、土壌処理、パルプおよび紙、衣料品製造、染料、印刷、接着剤、空気処理、溶媒、生物兵器防衛、ビタミンサプリメント、低温保存、繊維浸漬および製造、生命工学、化学、産業用洗浄製品、家庭用洗浄製品、石鹸および洗剤、消費財、林業、漁業、娯楽、リサイクリング、プラスチック、皮革、革製品およびスエード、廃棄物管理、葬儀および葬儀業、燃料、建築、エネルギー、鋼、およびタバコ産業分野からなる群から選択される分野の産業である。
【０２４０】
２５. 修飾標的部位での取り込みのために核酸(例えば、ＤＮＡ)と組み合わされた、前記の実施態様の何れかのベクター。
【０２４１】
例えば、修飾が標的部位の切断であり、核酸(例えばＤＮＡ)が宿主細胞に相同組換えにより取り込まれる。これは、本発明のベクターを使用して宿主細胞ゲノムの正確な標的化修飾を行うのに有用である。
【０２４２】
２６. 取り込みのための核酸が調節要素またはエクソン配列、例えばヒト配列であるまたはそれを含む、実施態様２５のベクター。
【０２４３】
２７. ＭＧＥの可動化のためにトランスポザーゼと組み合わされる、前記の実施態様の何れかのベクター。
【０２４４】
２８. ベクターまたはＭＧＥが第一宿主細胞と共に動作可能な毒素−抗毒素モジュールを含み、所望によりここで毒素−抗毒素モジュールが第一細胞以外の細胞と共に動作可能ではないまたは動作性が減少している抗毒素遺伝子を含む、前記の実施態様の何れかのベクター。
【０２４５】
２９. ベクターまたはＭＧＥが第二宿主細胞と共に動作可能な毒素−抗毒素モジュールを含み、所望によりここで毒素−抗毒素モジュールが第二細胞以外の細胞と共に動作可能ではないまたは動作性が減少している抗毒素遺伝子を含む、前記の実施態様の何れかのベクター。
【０２４６】
３０. ベクターまたはＭＧＥが第一および第二宿主細胞と共に動作可能な毒素−抗毒素モジュールを含み、所望によりここで毒素−抗毒素モジュールが第一および第二細胞以外の細胞と共に動作可能ではないまたは動作性が減少している抗毒素遺伝子を含む、前記の実施態様の何れかのベクター。毒素−抗毒素モジュールの使用は、選択的優位性の提供、故に、ＭＧＥ保持および拡散に有用である。例えば、モジュールはタイプＩモジュール、例えば、Ｈｏｋ−Ｓｏｋモジュールである。例えば、モジュールはタイプIIモジュール、例えば、ＨｉＣａ−ＨｉｃＢモジュールである。例えば、モジュールはｔａｄ−ａｔａタイプ毒素−抗毒素モジュールである。例えば、モジュールはプラスミドアディクションモジュールである。例えば、第一および／または第二細胞はバクテロイデス細胞であり、モジュールは、バクテロイデス種のモジュール、例えば、Ｔｘｅ／ＹｏｅＢファミリーアディクションモジュール(例えば、http://www.uniprot.org/uniprot/F0R9D1参照)、ＲｅｌＥ／ＳｔｂＥファミリーアディクションモジュール(例えば、http://www.uniprot.org/uniprot/F0R9A0参照)、ＨｉｇＡファミリーアディクションモジュール(例えば、http://www.uniprot.org/uniprot/D7J8V2またはhttp://www.uniprot.org/uniprot/D2ESD0参照)、ＲｅｌＥ／ＳｔｂＥファミリーアディクションモジュール(例えば、http://www.uniprot.org/uniprot/F0R5F4参照)である。ベクターまたはＭＧＥにおける毒素−抗毒素の使用は、所望の細胞(例えば、第一および第二および／または第三細菌細胞)以外のベクター担持細胞の破壊を可能とするのに有用であり得る。この例において、ＭＧＥまたはベクターは細菌毒素−抗毒素モジュールの毒素遺伝子および同族抗毒素遺伝子を含み、ここで毒素および抗毒素遺伝子の発現は、例えば、異なるプロモーターにより、別々に制御される。例えば、毒素遺伝子は、毒素が常に産生されるように、第一、第二(および第三)細胞において構成的に活性であるプロモーターを含み得る。抗毒素遺伝子は、第一および／または第二細胞における１以上の因子(例えば、発現されたタンパク質)により誘導可能であるが、異なる株または種の非標的細胞では誘導可能ではない、プロモーターを含むことができる。既知のとおり、抗毒素は、本質的に細菌毒素／抗毒素システムにおいて毒素より安定が低く、故に、標的細胞ではない(例えば、第一および／または第二細胞ではない)細胞へのベクターまたはＭＧＥの伝達は、抗毒素発現非存在下または低抗毒素活性下の毒素発現をもたらし、故に非標的細胞の細胞死に至る。これは、それ故に、標的細胞(第一、第二および第三細胞)に本発明のベクターを取り込み、保持するための選択圧を作り、そうして、それらは所望のＣＲＩＳＰＲアレイ活性をその中に含み、集団(例えば腸内微生物相)における標的細胞にわたり増殖できる。これはまたアレイの効果が集団内で制御されるように、ベクターまたはＭＧＥの非標的細胞への拡散も制御する  −  この点に関し、非標的細胞にベクターを取り込まないよう圧がかかり、もし取り込めば、レシピエント細胞は集団で生存せず、それによりＭＧＥおよびアレイを有する非標的細胞の複製が制限される。
【０２４７】
３１. 第一および第二細胞が同じ門のものであり(例えば、両細菌細胞)、ベクターが、(ｄ)同じ門の他の細胞ではなく、第一細胞および／または第二細胞で、(ｅ)同じ目の他の細胞においてではなく、第一細胞および／または第二細胞で、(ｆ)同じ綱の他の細胞においてではなく、第一細胞および／または第二細胞で、(ｇ)同じ目の他の細胞においてではなく、第一細胞および／または第二細胞で、(ｈ)同じ科の他の細胞においてではなく、第一細胞および／または第二細胞で、(ｉ)同じ属の他の細胞においてではなく、第一細胞および／または第二細胞で、(ｊ)同じ種の他の細胞においてではなく、第一細胞および／または第二細胞で、(ｋ)同じ株の他の細胞においてではなく、第一細胞および／または第二細胞で複製可能または動作可能である、前記の実施態様の何れかのベクター。
【０２４８】
これは、マイクロバイオームにおいて本発明のベクターの選択性を提供する(例えば、混合細菌集団における第二宿主細胞型の選択的死滅のため)。こでは、例えば、複製または動作(例えば、ｃｒＲＮＡを産生するための発現)のために特定のタンパク質の発現を必要とするように、ＭＧＥまたはアレイ(例えば、そのプロモーター)を操作することにより達成できる。例えば、プロモーターは、第一および／または第二細胞と共に動作可能であるが、他の細胞では可能ではないプロモーターから選択されるかまたはここでＭＧＥは、その複製開始部位の１以上が第一および／または第二細胞において産生されるが他の細胞では産生されないタンパク質または他の因子に依存するように操作される。
【０２４９】
３２. 細胞の混合集団における、前記の実施態様の何れかのベクターの第一および第二コピーであって、ここで第一ベクターは第一細胞に含まれ、第二ベクターは第二細胞に含まれ、細胞が異なる種(例えば、異なる細菌種)の細胞であり、ベクターＭＧＥの一方または両方が第三細胞(例えば、細菌細胞)へ伝達可能であり、ここで第三細胞種は第一または第二細胞と同じ種であるかまたは第一および第二細胞種と異なる種である。これは、第一細胞が運搬体(例えば、それが非病原性であるとき、ヒトまたは動物で、マイクロバイオームのように定植するように、ヒトまたは動物に投与できる)として作用できるため、有用である。水平伝播により、運搬体は、第三細胞に本発明のＣＲＩＳＰＲアレイを伝達し、増殖できる(直接的にまたは第二細胞を経て、後者はアレイの貯蔵所として作用する)。その後、アレイは第三細胞における標的配列のＣａｓ修飾(例えば、切断)に介在し、例えば、第三細胞の必須または抗生物質耐性遺伝子を不活性化または下方制御することができる。
【０２５０】
ここで一般に、標的配列が細胞の抗生物質耐性遺伝子に含まれるとき、本発明のベクター、改変された配列またはアレイを、ヒトまたは動物に、抗生物質と共に(同時にまたは逐次的に)投与できる。これは、標的配列を含む細胞を死滅させるまたは増殖を低減させるのに有用である。この点に関し、ベクター、改変された配列またはアレイは抗生物質を含む組成物に含まれ、ここで標的配列は該抗生物質への耐性をコードする遺伝子の配列である。
【０２５１】
所望により、混合集団は第三細胞を含む。
【０２５２】
例えば、各々本発明のベクターを含む、複数の第一細胞が提供される。例えば、各々本発明のベクターを含む、複数の第二細胞が提供される。例えば、各々本発明のベクターを含む、複数の第二細胞と組み合わせた複数の第一細胞が提供される。例えば、複数の第二細胞および複数の第三細胞と組み合わせた複数の第一細胞が提供され、該複数の細胞の少なくとも２(または全て)が本発明のベクターを含む。
【０２５３】
３３. ベクターまたはＭＧＥが第一、第二および第三宿主細胞と共に動作可能である毒素−抗毒素モジュールを含み、所望によりここで毒素−抗毒素モジュールが第一、第二および第三細胞以外の細胞で動作不可能であるまたは動作性が低下した(すなわち、低い)抗毒素遺伝子を含む、実施態様３２のベクター。
【０２５４】
３４. ＭＧＥが接合性トランスポゾンであり、ｏｒｉＴが第一および第二宿主細胞で機能的であり、ＭＧＥが第一および第二末端反復配列および反復配列間のＣＲＩＳＰＲアレイを含み、ここで第一および第二細胞が細菌細胞であり、第二細胞はヒト微生物相細胞種(例えば、病原性種)のものであり、ここで標的部位は第二細胞に含まれるが、第一細胞に含まれず、ここで該修飾が、第二細胞における標的を含む遺伝子または制御配列を不活性化または下方制御する、前記の実施態様の何れかのベクター。
【０２５５】
有用なことに、それにより第一細胞が本発明のアレイの運搬体および貯蔵庫として作用でき、これは、ＭＧＥの水平伝播により伝達され得る。
【０２５６】
例えば、ＭＧＥは接合性バクテロイデス門トランスポゾンであり、ｏｒｉＴは第一および第二宿主細胞で機能的なバクテロイデス門ｏｒｉＴであり、ＭＧＥが第一および第二末端反復配列および反復配列間のＣＲＩＳＰＲアレイを含み、ここで第一および第二細胞が細菌細胞であり、第一細胞はバクテロイデス門細胞であり、第二細胞はファーミキューテス細胞(例えば、クロストリジウムまたはスタフィロコッカス細胞)であり、ここで標的部位は第二細胞に含まれるが、第一細胞に含まれず、ここで該修飾が、第二細胞における標的を含む遺伝子または制御配列を不活性化または下方制御する。
【０２５７】
３５. 第一または第二細胞に含まれるときの、実施態様３４のベクター。
【０２５８】
３６. 第一および第二細胞が混合細菌細胞集団、例えば、ヒトまたは非ヒト動物(例えば、イヌ、ネコまたはウマ)腸、膣、腋窩または口内微生物相種の細胞の集団に含まれる、前記の実施態様の何れかのベクター。上に説明したとおり、集団は、ヒトまたは動物に、そのマイクロバイオームを定植させるために投与するのに有用である。
【０２５９】
３７. 実施態様２２に規定する複数の細胞を含む、エクスビボ組成物であって、ここで各細胞は実施態様１〜３６の何れかのベクターを含む。あるいは、組成物は、インビボ、例えば、非ヒト動物内にある。
【０２６０】
３８. 実施態様１〜３６の何れかのベクターまたは実施態様３７の組成物を含む、ヒトまたは非ヒト動物消費用飲料または食糧。飲料は、例えば、ヒトまたは動物における肥満またはＧＩ状態を処置または予防するために、例えば、ヒトまたは動物により連日、２日毎または毎週消費されるための、例えば、プロバイオティク飲料であり得る。
【０２６１】
３９. 複数のバクテロイデス細胞を含む、組成物であって、ここで各細胞は実施態様１〜３６の何れかのベクターを含む。
【０２６２】
有用なことに、細胞は、例えば、ヒトまたは動物における肥満またはＧＩ状態を処置または予防するために、ヒトまたは動物のマイクロバイオーム(例えば、腸マイクロバイオーム)に投与するための本発明のアレイの運搬体および貯蔵庫として作用できる。
【０２６３】
４０. 第一細胞の亜集団および第二細胞の亜集団を含む、細菌細胞の混合集団であって、ここで第一細胞は実施態様１〜３６の何れかのベクターを含み、ここでベクターは、第一および第二細胞亜集団間の水平伝播が可能である。このような集団は、細菌がヒトまたは動物の１以上のマイクロバイオーム(例えば、腸マイクロバイオーム)で定植するようにヒトまたは動物に投与(例えば、鼻腔内)できるため、有用である。第一(および所望によりまた第二)細胞は、特にこれらの細胞がヒトまたは動物(例えば、腸マイクロバイオームにおいて非病原性)に非病原性であるとき、本発明のＣＲＩＳＰＲアレイの運搬体として作用できる。マイクロバイオームは、ここに開示する任意の他のマイクロバイオームまたは微生物相集団であり得る。
【０２６４】
４１. 第一細菌および第二細菌種の一方または両方がヒトまたは非ヒト動物の腸内微生物相で定植でき、所望により第一細菌がヒトまたは動物と片利共生または相利共生である、実施態様４０の集団。有用なことに、第一細菌をヒトまたは動物に安全に投与でき、その後微生物相の他の細胞への伝達のための本発明のアレイの運搬体として作用できる。
【０２６５】
４２. 混合集団が飲料または水(例えば、水路またはヒト消費用の飲料水)または土壌に含まれる、実施態様４０の集団。水または土壌における集団の提供は、環境または(水について)加熱、冷却または工業用システムにおいてまたは飲料水保存コンテナにおいてこれらを処理するのに有用である。
【０２６６】
実施態様の何れかの例えば、第二細胞は、標的配列を含むコレラ細胞であり、ここで標的配列が修飾されたとき、細胞は殺されるかまたは細胞増殖が減少する。例えば、第二細胞はヒト消費のための水(例えば、ヒト消費用に加工する前または後のこのような水)に含まれる。例えば、ベクターは、ヒトにおけるコレラの処置または予防のためにヒトに投与する医薬組成物に含まれる。
【０２６７】
４３. インビトロで実施態様１〜３６の何れかの複数のベクターを含む、組成物。例えば、組成物を、工業用装置またはコンテナ中で多種細菌集団と混合する(例えば、食品、消費財、化粧品、パーソナルヘルスケア製品、石油または石油製品のため)。
【０２６８】
４４. ヒトまたは非ヒト動物にそのマイクロバイオームを治療的または予防的に定植およびリバランスするためまたはヒトまたは動物を美容的に変化させるための(例えば、美容的減量)に投与するための、前記実施態様の何れかのベクター、組成物、食糧、飲料または集団。
【０２６９】
４５. 宿主細胞における標的ヌクレオチド配列を修飾する方法であって、
(１)宿主細胞と運搬体細胞を合わせ、
(ａ)ここで運搬体細胞は、標的修飾のためのＣＲＩＳＰＲアレイを含むＣＲＩＳＰＲ核酸ベクターを含み、
(ｂ)ここでＣＲＩＳＰＲアレイは、ｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列および宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み；
(ｃ)ここでｃｒＲＮＡは宿主細胞におけるＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)をガイドし、標的配列を修飾するために標的配列とハイブリダイズでき；そして
(２)これらの細胞を一緒に培養し、ここでベクターが運搬体細胞から宿主細胞に伝達され、それによりｃｒＲＮＡが宿主細胞におけるＣａｓをガイドするために標的配列とハイブリダイズし、標的が修飾される
ことを含む、方法。
【０２７０】
例えば、方法はエクスビボで実施される。例えば、方法は美容的方法であって、治療的または予防的医学的方法ではない。
【０２７１】
４６. ベクターが実施態様１〜３６の何れかに従う、実施態様４５の方法。
【０２７２】
４７. 宿主細胞がヒトまたは非ヒト動物マイクロバイオーム細菌種の細胞であり、所望によりここで宿主細胞が病原性細菌種の細胞である、実施態様４５または４６の方法。例えば、ここでのあらゆるマイクロバイオームは、腸、膣、腋窩、頭皮、皮膚または口腔マイクロバイオームから選択される。
【０２７３】
４８. 運搬体細胞が、片利共生または相利共生ヒトまたは非ヒト動物マイクロバイオーム細菌種である種のものである、実施態様４５〜４７の何れかの方法。例えば、運搬体細胞は、例えば、鼻腔内、局所的または経口で投与したとき、ヒトに非病原性である。
【０２７４】
ここでのあらゆる形態、コンセプト、態様、実施態様または例等において、本発明のベクター、組成物、アレイまたは集団はヒトまたは非ヒト動物に鼻腔内、局所的または経口で投与するまたはそのような投与のためである。ヒトまたは動物のマイクロバイオームの処置を目的とする当業者は、目的のマイクロバイオームにより、最良の投与経路を決定できる。例えば、マイクロバイオームが腸マイクロバイオームであるとき、投与は鼻腔内または経口であり得る。マイクロバイオームが頭皮または腋窩マイクロバイオームであるとき、投与は局所的であり得る。マイクロバイオームが口腔または咽頭にあるとき、投与は経口であり得る。
【０２７５】
４９. 宿主細胞がヒトまたは非ヒト動物の腸マイクロバイオーム細菌種のものである、実施態様４５〜４８の何れかの方法。
【０２７６】
５０. 第一細菌および第二細菌宿主細胞種の亜集団の比率を、該該亜集団を含む細菌の混合集団において改変する方法であって、
Ａ：該第一細菌を宿主細胞に提供し；
Ｂ：該第二細菌を宿主細胞に提供し、ここで第二細胞は第一細胞と異なる種または株の細胞であり；
Ｃ：改変されたＣＲＩＳＰＲアレイを第一細菌宿主細胞に導入し、ここで各ＣＲＩＳＰＲアレイは、ｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列および該第二宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、ここでｃｒＲＮＡは宿主細胞におけるＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)をガイドし、標的配列を修飾するために第二細胞に含まれる標的配列とハイブリダイズでき；
Ｄ：混合細菌集団を産生するために第一細菌および第二細菌細胞を一緒に合わせ；そして
Ｅ：ＣＲＩＳＰＲアレイの第一細菌細胞から第二細菌細胞への水平伝播が生じるように混合集団において細菌を増殖させ、ここで第二細胞における標的配列がＣａｓ修飾され、それにより該第一細菌と第二細菌の相対比率が変えられる
ことを含む、方法。
【０２７７】
５１. 各ＣＲＩＳＰＲアレイが実施態様１〜２６の何れかに従う、実施態様５０の方法。
【０２７８】
５２. さらに工程Ｅの混合集団の第一サンプルを得て、所望により第一サンプル中の第二細胞の比率と、細胞の第二サンプルにおける第二細胞の比率を比較することを含み、ここで第二サンプルは、工程Ｂにおいて第二細胞を提供するのに使用した細菌細胞の混合集団のサンプルであり、比較は、工程Ｅの後第二細胞の比率が増加または減少していることを示す、実施態様５０または５１の方法。
【０２７９】
５３. 第二サンプルがヒトまたは動物マイクロバイオーム(例えば、腸、膣、頭皮、腋窩、皮膚または口腔細胞)のサンプルである、実施態様５２の方法。
【０２８０】
５４. ヒトまたは動物マイクロバイオーム(例えば、腸、膣、頭皮、腋窩、皮膚または口腔細胞)のサンプルが工程Ｂの第二細胞の提供に使用される、実施態様５０〜５３の何れかの方法。
【０２８１】
５５. 第一細胞の組み換え、培養集団が工程Ａのために使用される、実施態様５０〜５４の何れかに記載の方法。
【０２８２】
５６. プラスミド、ＩＣＥまたはトランスポゾン水平伝播が工程Ｅに使用され、ここで各プラスミド、ＩＣＥまたはトランスポゾンがＣＲＩＳＰＲアレイを含む、実施態様５０〜５５の何れかの方法。
【０２８３】
５７. ヒトまたは非ヒト動物の微生物相の治療的または予防的リバランスのための、例えば、肥満、糖尿病、ＩＢＤ、ＧＩ管状態または口腔状態の処置または予防のための、実施態様５０〜５６の何れかの方法。糖尿病はＩ型でもII型でもよい。例えば、予防が医学的である。例えば、ここでの予防は非医学的、例えば、美容または衛生目的である。例えば、微生物相は腋窩微生物相であり、方法はヒトの体臭の予防または軽減のためである。例えば、この場合、方法は、ヒト体臭の発生および／または持続に介在する宿主細菌細胞の増殖または生存能を下方制御する。
【０２８４】
５８. 運搬体および宿主細胞と異なる種または株の第三細菌宿主細胞を提供することを含み、ここで第三細胞は工程Ｅにおける混合集団に含まれるかまたは工程Ｅ後外集団と合わせられ、ここでＣＲＩＳＰＲアレイの第三宿主細胞への水平伝播が起こる、実施態様５０〜５７の何れかの方法。
【０２８５】
５９. 第三細胞が標的配列を含まない、実施態様５８の方法。
【０２８６】
この方法で、第三細胞がアレイの運搬体として作用でき、標的配列を含む宿主細胞にアレイを水平に伝達できる。
【０２８７】
６０. 第三細胞がＣａｓ修飾のための標的配列を含まない、実施態様５８の方法。
【０２８８】
６１. 運搬体(および所望によりまた第三)細胞が実施態様２１に記載する種のもの、例えば、バクテロイデス門細胞である、実施態様５０〜６０の何れかの方法。
【０２８９】
６２. 宿主細胞が実施態様１９に記載の種のものまたはファーミキューテス細胞である、実施態様５０〜６０の何れかの方法。
【０２９０】
６３. 各ベクターがプラスミド、ファージ(例えば、パッケージ化ファージ)またはファージミドであるまたはこれに含まれる、前記実施態様の何れかのベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法。
【０２９１】
６４. 修飾が(ｉ)標的配列の切断、(ii)標的配列を含む遺伝子の転写下方制御、(iii)標的配列を含む遺伝子の転写上方制御または(iv)標的での核酸配列の付加、欠失または置換である、前記実施態様の何れかのベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法。
【０２９２】
６５. 各標的配列が宿主細胞の調節要素または遺伝子に含まれる配列であり、ここで遺伝子が必須遺伝子、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子または抗生物質耐性遺伝子であり、所望によりここで調節要素がこのような遺伝子の要素である、前記実施態様の何れかのベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法。別法において、遺伝子は病原性遺伝子である。
【０２９３】
６６. 各標的配列がファージゲノムに含まれる配列であり、ここでファージは宿主細胞に含まれる、前記実施態様の何れかのベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法。例えば、標的配列が宿主細胞感染性、ファージ溶原性または溶解性サイクルまたはファージ生存能、例えば、必須遺伝子またはコートタンパク質遺伝子に必要なファージ遺伝子に含まれる。
【０２９４】
例えば、バクテロイデス門ファージがｃｒＡｓｓファージ、ＧＢ−１２４ファージ、ＧＡ−１７ファージ、ＨＢ−１３ファージ、Ｈ１６−１０ファージ、Ｂ４０−８ファージおよびバクテロイデス・フラジリスファージＡＴＣＣ５１４７７−Ｂ１から選択される。これは、例えば、ヒトまたは動物の腸マイクロバイオームにおけるバクテロイデス門への生存優位性の提供のために、有用である。この方法で、バクテロイデス門対ファーミキューテスの比率を、前者対後者の比率が増加するように改変することができる(例えば、肥満の処置または予防のため)。例えば、標的配列がＢＡＣＯＮ(バクテロイデス門関連炭水化物結合)ドメインコード化配列(例えば、ここで宿主はバクテロイデス宿主である)またはエンドリシンコード化配列に含まれる。
【０２９５】
６７. 各ＣＲＩＳＰＲアレイが宿主細胞における各ｃｒＲＮＡの発現および製造のために配列Ｒ１−Ｓ１−Ｒ１’を含み、
(ｉ)ここでＲ１は第一ＣＲＩＳＰＲ反復であり、Ｒ１’は第二ＣＲＩＳＰＲ反復であり、Ｒ１またはＲ１’は任意であり、
(ii)Ｓ１は該標的配列に９５％以上同一であるヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる第一ＣＲＩＳＰＲスペーサーである、
前記実施態様の何れかのベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法。
【０２９６】
６８. Ｒ１およびＲ１’が、それぞれ第二宿主細胞種のＣＲＩＳＰＲアレイの第一および第二反復配列と少なくとも９５％同一である、実施態様６７のベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法。
【０２９７】
６９. Ｒ１およびＲ１’が標的配列の修飾のために宿主細胞のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムで機能的である、実施態様６７または６８のベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法。
【０２９８】
７０. 各アレイが、標的配列を修飾するために宿主細胞における各ｃｒＲＮＡと機能する１以上のＣａｓヌクレアーゼと組み合わされる、前記実施態様の何れかのベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法。標的配列はプロトスペーサー隣接モチーフ(ＰＡＭ)に直ぐ隣接してプロトスペーサー配列を含む。
【０２９９】
７１. 各アレイが、標的配列を修飾するために宿主細胞における各ｃｒＲＮＡ機能する１以上のＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸配列と組み合わされる、組成物、食糧、飲料、集団または方法。
【０３００】
７２. Ｒ１およびＲ１’が、該宿主細胞における標的の修飾のためにタイプII  Ｃａｓ９ヌクレアーゼ(例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネスまたはスタフィロコッカス・アウレウスＣａｓ９)と共に機能的であり、所望によりここでベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法がさらに実施態様７０または７１に従い、ここでＣａｓが該Ｃａｓ９である、実施態様６７〜７１の何れかのベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法。
【０３０１】
７３. 実施態様５０〜７２の方法により得られる細菌のエキソビボ混合集団。
【０３０２】
７４. 実施態様７３の混合集団を含む、ヒトまたは非ヒト動物に治療的、予防的、美容的ヒトまたは非ヒト動物体重減少(例えば、美容的減少)または栄養学的使用のために投与する組成物。
【０３０３】
７５. 実施態様７３の混合集団または実施態様７４の組成物を含む、ヒトまたは非ヒト動物消費のための食糧または飲料。
【０３０４】
７６. 栄養補助またはプロバイオティク飲料または食糧である、実施態様７５の食糧または飲料。
【０３０５】
７７. 実施態様１〜３６および６３〜７２の何れかのベクターを含む、ヒトもしくは非ヒト動物または飲料水または土壌における細菌感染を処置または予防するための抗生物質組成物。
【０３０６】
７８. 実施態様１〜３６および６３〜７２の何れかのベクターを含む、ヒトまたは非ヒト動物における腸バクテロイデス門の比率を上げるため(例えば、肥満、糖尿病またはＧＩ炎症状態を処置または予防するため)のプロバイオティク組成物。
【０３０７】
７９. 例えば肥満、糖尿病またはＧＩ状態の処置または予防のために、ヒトまたは動物における腸バクテロイデス対フィルミクテス門の相対的比率を上げるための、実施態様７４、７７または７８の組成物。
【０３０８】
８０. ベクターがアレイと共に動作可能なＣａｓヌクレアーゼコード化配列を含まない、前記実施態様の何れかのベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法。これは、ベクターにおける空間を確保するために有用である(例えば、宿主細胞ターゲティングのために大型アレイまたはより多くのアレイの挿入を可能とするため  −  これは、本発明のアレイに対する耐性の発生の可能性を軽減するために複数ゲノム位置を標的とするのに有用である)。
【０３０９】
８１. ＭＧＥがアレイと共に動作可能なＣａｓヌクレアーゼコード化配列を含まない、前記実施態様の何れかのベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法。これは、ＭＧＥにおける空間を確保するために有用である(例えば、宿主細胞ターゲティングのために大型アレイまたはより多くのアレイの挿入を可能とするため  −  これは、本発明のアレイに対する耐性の発生の可能性を軽減するために複数ゲノム位置を標的とするのに有用である)。例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードする大配列を含むことを避けることが可能である。
【０３１０】
８２. アレイが、第一および／または第二細胞と同じ種または株の細胞で見られるＣａｓエンドヌクレアーゼと共に動作可能である、実施態様８０または８１のベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法。例えば、アレイは、宿主細胞または第三細胞と同じ種または株の細胞で見られるＣａｓエンドヌクレアーゼと共に動作可能である。これは、ベクターにおける空間を確保するために有用であるまたはＭＧＥ(例えば、宿主細胞ターゲティングのために大型アレイまたはより多くのアレイの挿入を可能とするため  −  これは、本発明のアレイに対する耐性の発生の可能性を軽減するために複数ゲノム位置を標的とするのに有用である)。
【０３１１】
８３. 第一および第二細胞が異なる種の細菌細胞であり、ここで第二細胞がヒト微生物相種のものであり、第一細胞がヒト微生物相における非病原性である種のものであり、ここで標的配列が第一細胞のゲノムに含まれず、ＭＧＥは第一および第二細胞で動作可能なｏｒｉＴを含み、ここでＭＧＥが第一細胞から第二細胞への水平伝播が可能である、前記実施態様の何れかのベクター、組成物、食糧、飲料または集団。
【０３１２】
別法において、次のことが提供される。
運搬体および宿主細胞が異なる種の細菌細胞であり、ここで宿主細胞がヒト微生物相種のものであり、運搬体細胞がヒト微生物相における非病原性である種のものであり、ここで標的配列が運搬体細胞のゲノムに含まれず、ＭＧＥが運搬体および宿主細胞において動作可能であるｏｒｉＴを含み、ここでＭＧＥが運搬体細胞から宿主細胞に水平伝播可能である、前記の実施態様の何れかの方法。
【０３１３】
８４. ベクターがバクテリオファージに含まれ、バクテリオファージが第一細胞(運搬体)に感染してＭＥＧを第一(運搬体)細胞に導入することが可能である、請求項８３のベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法。
【０３１４】
８５. 標的配列が第二(宿主)細胞のゲノムに含まれる(例えばゲノムの必須または抗生物質耐性遺伝子に含まれる)、実施態様８３または８４のベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法。
【０３１５】
８６. 第二(宿主)細胞種がヒト微生物相において病原性であり、ここで標的配列が標的配列の切断または標的配列を含む遺伝子の下方制御により修飾される、実施態様８５のベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法。例えば、第二(宿主)細胞は実施態様１９の特性(ｉ)〜(xiv)の何れかに従う細胞である。例えば、第二(宿主)細胞はファーミキューテス細胞であり、例えば、ここでベクターは、ヒトにおける肥満の処置または予防のためである。
【０３１６】
８７. 第二(宿主)細胞種がヒト微生物相において非病原性である、実施態様８３、８４または８５のベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法。
【０３１７】
８８. 第二(宿主)細胞がバクテロイデス門またはプレボテラ細胞であり、所望によりここでＭＧＥが第二(宿主)細胞種からヒト微生物相のファーミキューテス種に水平伝播可能である、実施態様８３〜８７の何れかのベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法。後者は、標的配列がファーミキューテスに含まれるが、第一(運搬体)または第二(宿主)細胞に含まれないとき、例えば、ヒトにおける肥満の処置または予防のために有用である。
【０３１８】
８９. ＭＧＥが第二(宿主)細胞種からヒト微生物相の第三細菌細胞種に水平伝播可能であり、ここで第三細胞種がヒト微生物相において病原性であり、標的配列を含む、実施態様８３〜８８の何れかのベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法。例えば、第一(運搬体)および第二(宿主)細胞は標的配列を含まない。
【０３１９】
９０. ここで第三細胞が請求項１９の特性(ｉ)〜(xiv)の何れかに従う細胞である、実施態様８９のベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法。
【０３２０】
９１. ＭＧＥがアレイの反復配列と共に動作可能であるＣａｓエンドヌクレアーゼをコードする配列を欠き、ここでベクターがＭＧＥ外にこのような配列(例えば、Ｃａｓ９をコードする)を含む、前記実施態様の何れかのベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法。
【０３２１】
一般的特性の何れも本形態にも適用可能である。ここでの他の形態、態様、段落、例、実施態様またはコンセプトの何らかの特性を、ＭＧＥを用いる本形態と組み合わせてもよい。
【０３２２】
それ故に、本発明は、段落として番号を付した次の特性を提供し、これらの段落は引用する態様または実施態様１〜９１の何れかまたはここのあらゆる他の態様に適用される。
１. 標的配列が宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのヌクレオチド配列であり、それによりｃｒＲＮＡが宿主細胞における宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを修飾するようにＣａｓを標的にガイドする、態様４４〜５０の何れかのベクター。
【０３２３】
２. 宿主ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムがタイプＩ、IIまたはIIIシステムであり、標的配列が少なくとも１、２または３のさらなる宿主株または種における該タイプのシステムで保存されたヌクレオチド配列であり、ここで該さらなる株または種が宿主と異なる、段落１のベクター。
【０３２４】
３. 標的配列がストレプトコッカス種(例えば、ストレプトコッカス・サーモフィルスまたはストレプトコッカス・ピオゲネス)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム配列と同一である、前記段落の何れかのベクター。
【０３２５】
４. 前記段落の何れかのベクター、ここで宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの標的配列が
ｉ. 第一反復の最も５’ヌクレオチドと隣接するＣＲＩＳＰＲアレイリーダーまたはリーダープロモーター配列(および所望により反復の該最も５’ヌクレオチドを含む、例えば、第一反復の５’末端に最初の３ヌクレオチドを含む)；
ii. 第一反復の直ぐ５’の最大２０(例えば、３、５、７、９、１０、１２、１５、２０、３０または３２)ヌクレオチド連続ヌクレオチドの配列；
iii. 第一反復の最も５’ヌクレオチドの最大２０(例えば、３、５、７、９、１０、１２、１５、２０、３０または３２)連続ヌクレオチドの配列または
iv. 第一スペーサー反復の直ぐ３’の最大２０(例えば、３、５、７、９、１０、１２、１５、２０、３０または３２)連続ヌクレオチドの配列(および所望によりここで配列は第一スペーサー最も３’ヌクレオチドを含む、例えば、第一反復の３’末端３’末端に最後の３ヌクレオチドを含む)。
【０３２６】
５. アレイが核酸ベクター(例えば、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミドまたはプロファージ)に含まれ、そして
ｉ. ｃｒＲＮＡが構造Ｒ−Ｓ−Ｒを含むかまたはこれからなり、ここでＲ＝ＣＲＩＳＰＲ反復およびＳ＝ＣＲＩＳＰＲスペーサーであり、ここでＳは(５’から３’方向で)Ｖ−ＨＲまたはＨＲ−Ｖを含みまたは、ここでＶ＝ベクターのＤＮＡ配列と同一の配列およびＨＲ＝宿主細胞ＣＲＩＳＰＲアレイのＣＲＩＳＰＲアレイの反復のＤＮＡ配列であり；
ii. ここでＨＲの配列は宿主ＣＲＩＳＰＲアレイのＶの配列と直ぐ隣接し；そして
iii. ここでが細胞における宿主ＣＲＩＳＰＲアレイの修飾のためにＣａｓを宿主標的にガイドするために宿主ＣＲＩＳＰＲアレイのスペーサーとハイブリダイズできる、
段落１、２または３のベクター。
【０３２７】
例えば、Ｖはファージベクターコートタンパク質コード化配列の配列である。この点に関し、Heler et alは、細菌耐性の研究において、３ＣＲＩＳＰＲ非依存的、バクテリオファージ耐性変異体がファージ吸着の顕著な欠損を示し(約５０％)、これらがエンベロープ耐性変異を運搬する可能性が最も高いことを示した。
【０３２８】
６. 第一ｃｒＲＮＡがベクターに存在する核酸とハイブリダイズしないまたは実質的にしない、段落５のベクター。例えば、第一ｃｒＲＮＡは、ベクターにおけるＶとハイブリダイズしないか、宿主アレイのスペーサーとハイブリダイズするより低強度でハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション試験は、当業者にとって日常的なことである。例えば、インビトロでベクターＤＮＡを単離または合成し、それとｃｒＲＮＡをインキュベートすることにより決定できる。例えば、ＰＣＲを使用する、標準技術を、ハイブリダイゼーションが起こるか否かの検出に使用できる(例えば、宿主細胞に見られるｐＨおよび温度条件下で試験)。
【０３２９】
７. Ｖ＝ベクターＤＮＡの１または最大４０(例えば、最大１５)連続ヌクレオチドである、段落５または６のベクター。標的配列に見られるプロトスペーサーにおけるＰＡＭの直ぐ５’のシード配列は、ｃｒＲＮＡ対形成およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの切断のための機能に重要である。このシード配列は、ＰＡＭの直ぐ５’の約１５または１２連続ヌクレオチドを含む。
【０３３０】
８. アレイがベクターに含まれ、(５’から３’方向で)第一反復配列、第一スペーサー配列および第二反復配列を含み、ここでスペーサー配列が宿主細胞における標的配列とハイブリダイズでき(例えば、同一であるまたは９０％を超える同一性を有する)、アレイがさらなる宿主細胞における反復およびスペーサーの転写のためのプロモーターを含み、所望によりベクターが宿主細胞における機能的Ｃａｓおよび／またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列をコードするためのＣａｓヌクレアーゼコード化配列および／またはｔｒａｃｒＲＮＡコード化配列を含み、ここでｔｒａｃｒＲＮＡ配列が第一または第二反復と相補的である配列を含む、前記態様または段落の何れかの方法、アレイまたはベクター。
【０３３１】
９. ＣＲＩＳＰＲアレイがベクターに含まれ、(５’から３’方向で)第一反復配列、第一スペーサー配列および第二反復配列を含み、ここでスペーサー配列が宿主細胞における標的配列とハイブリダイズでき(例えば、同一であるまたは９０％を超える同一性を有する)、アレイがさらなる宿主細胞における反復およびスペーサーの転写のためのプロモーターを含み、ここでベクターが宿主細胞におけるｔｒａｃｒＲＮＡ配列をコードするためのＣａｓヌクレアーゼコード化配列および／またはｔｒａｃｒＲＮＡコード化配列を含まず、ここでｔｒａｃｒＲＮＡ配列が第一または第二反復と相補的である配列を含み、ここでＨＭ−ＣＲＩＳＰＲアレイが宿主標的部位にＣａｓ(例えば、内在性宿主Ｃａｓヌクレアーゼ)をガイドするために宿主細胞において、所望により宿主ｔｒａｃｒＲＮＡを使用して、機能的である、前記態様または段落の何れかの方法、アレイまたはベクター。
【０３３２】
１０. 反復が宿主アレイにおける反復と同一であり、ここで本発明のＣＲＩＳＰＲアレイが宿主ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９)により認識されるＰＡＭを含まない、段落８または９の方法、アレイまたはベクター。Ｃａｓ配列を省く能力は、本発明のアレイの空間を解放する。
【０３３３】
“必須遺伝子”は、存在または発現が宿主細胞増殖または細胞生存能促進または持続のために必要である、宿主における遺伝子である。耐性遺伝子は、存在または発現が抗宿主剤、例えば、抗生物質、例えば、ベータ−ラクタム抗生物質の完全なまたは部分的な耐性の提供に必要である、宿主における遺伝子である。病原性遺伝子は、存在または発現が、宿主細胞が感染可能である生物の感染性に必要である宿主における遺伝子であり、例えば、ここで宿主は病原体である(例えば、植物、動物、ヒト、家畜、ペット、植物、鳥類、魚類または昆虫の)。
【０３３４】
１１. ＣＲＩＳＰＲアレイが非宿主細胞Ｃａｓ(例えば、宿主システムはタイプIIまたはIIIであるときタイプＩシステムＣａｓ、宿主システムがタイプＩまたはIIIであるときタイプIIシステムＣａｓまたは宿主システムがタイプＩまたはIIであるときタイプIIIシステムＣａｓ)と組み合わされ、所望によりここで宿主細胞が非宿主Ｃａｓと同じタイプのＣａｓを含まないかまたは発現しない、前記態様または段落の何れかの方法、アレイまたはベクター。これは、ＣＲＩＳＰＲアレイがそれ自体(例えばベクター内)または宿主におけるベクターコード化Ｃａｓの配列を標的としないため有用である。
【０３３５】
１２. ＣＲＩＳＰＲアレイがｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列をコードする配列と組み合わされ(例えば、アレイと同じ核酸上)、所望によりここでｔｒａｃｒＲＮＡ配列およびＨＭ−ｃｒＲＮＡが単一ガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)からなる、前記態様または段落の何れかの方法、アレイまたはベクター。
【０３３６】
１３. ＣＲＩＳＰＲアレイがＣａｓまたはＣａｓをコードする配列と組み合わされ、所望によりここでアレイが宿主細胞ゲノムに統合され、Ｃａｓが宿主細胞に内在性であるかまたは外来性配列によりコードされる、前記態様または段落の何れかの方法、アレイまたはベクター。例えば、Ｃａｓコード化配列は、例えば、プラスミドまたはウイルス、例えばファージから、宿主に導入されている外来性配列である。
【０３３７】
１４. ＣＲＩＳＰＲアレイがプラスミド、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミドまたはプロファージのヌクレオチド配列に含まれる、前記態様または段落の何れかの方法。ファージミドはパッケージ化ファージ、アレイまたはベクターである。プロファージは、細胞における宿主染色体またはエピソームに統合されたファージである。
【０３３８】
１５. ＣＲＩＳＰＲアレイが宿主細胞ゲノム、例えば、染色体またはエピソーム核酸に統合される、前記態様または段落の何れかの方法、アレイまたはベクター。
【０３３９】
一例において、アレイは、標的配列または標的配列を含む遺伝子で作用する転写または翻訳アクティベーターとコンジュゲートしたdead Ｃａｓ(例えば、ｄＣａｓ９)と組み合わされる。これは、例えば、宿主細胞における遺伝子(例えば、宿主が微生物であるとき抗生物質をコードするためまたは、例えば、食品、飲料、医薬またはここに開示する本発明の他の任意の適用のために、宿主培養において製造するための所望の外来性タンパク質をーコードするため、例えば、所望の遺伝子、例えば、宿主細胞内において予め操作されている外来性遺伝子配列の)発現のスイッチングに有用である。
【０３４０】
１６. 例えば、細胞、例えば、微生物を感染させるためまたは医療または歯科で使用するための、前記態様または段落の何れかのＣＲＩＳＰＲアレイを含む、ウイルス(例えば、ビリオン、ファージ、ファージミドまたはプロファージ)。
【０３４１】
１７. 段落１６のビリオンの集団であって、その第一および第二ビリオンが異なるアレイリーダーまたはプロモーターを含むおよび／または該宿主細胞または異なる宿主株における異なる標的配列のターゲティングのためのもの。
【０３４２】
１８. ＣＲＩＳＰＲアレイの収集物であって、各アレイは前記態様または段落の何れかに従い、ここで第一アレイはｃｒＲＮＡ転写のための第一プロモーターを含み、第二アレイは第一プロモーターと異なるｃｒＲＮＡ転写のための第二プロモーターを含み、ここで各プロモーターは宿主プロモーターと同一であるかまたはそのホモログであり、所望によりここで第一または両プロモーターが宿主Ｃａｓ(例えば、Ｃａｓ１、２、９またはＣｓｎ２)プロモーターまたは宿主ＣＲＩＳＰＲアレイプロモーターと同一であるもの。例えば、第一プロモーターは、内在性Ｃａｓヌクレアーゼプロモーターまたは内在性Ｃａｓ１またはＣａｓ２プロモーターまたは宿主細胞で高度にまたは構成的に発現されるまたは必須、病原性もしくは耐性遺伝子である内在性遺伝子のプロモーターである。内在性プロモーターの使用により、宿主の進化中に宿主プロモーターを保存するような圧力がかかり、これにより、宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ防御システムがアレイの１以上のプロモーターをターゲティングする可能性が低下する。
【０３４３】
１９. 本発明のＣＲＩＳＰＲアレイの収集物であって、ここで、第一アレイは１以上のスペーサー(例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０以上のスペーサー)を含み、第二アレイは１を超えるスペーサー(例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０以上のスペーサー)を含み、ここで第二アレイのスペーサーは第一アレイの１以上のスペーサーと同一である。これは、ＨＭ−アレイ(またはさらに複数のアレイにわたるスペーサーの分配)への多くのこのようなスペーサーの提供が、宿主細胞がスペーサーのいくつかを削除したとしても、一部のＨＭ−アレイスペーサーが宿主細胞に残る機会を増やすため、ＨＭ−アレイスペーサーの相同指向組換えにより宿主耐性を回避するのに有用である。削除に対する防御はまた、異なるアレイにおけるスペーサーの同一コピーに隣接する異なる反復の使用によっても増強される。
【０３４４】
それ故に、本発明は次のものを提供する。
２０. 第一アレイのスペーサー(または該スペーサー)が同一である第一反復に隣接し、第二アレイのスペーサー(または該スペーサー)が同一である第二反復に隣接し、ここで第一反復が第二反復と異なる、段落１８または１９の収集物。
【０３４５】
２１. 第一反復が宿主細胞ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおける反復と同一である、段落２０の収集物。
【０３４６】
２２. 第一反復が宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおける反復と異なる、段落２０の収集物。
【０３４７】
２３. 第一および第二アレイが同じ宿主細胞または同じベクター(例えば、プラスミド、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミドまたはプロファージ)に含まれる、段落１８〜２２の何れかの収集物。
【０３４８】
２４. 第一アレイが第一ベクターに含まれ、第二アレイが第一アレイを含まない第二ベクターに含まれる(例えば、ここでベクターはプラスミドまたはビリオン(例えば、同じウイルスタイプの)またはパッケージ化ファージ(例えば、同じファージタイプの)である)、段落１８〜２２の何れかの収集物。
【０３４９】
ある実施態様において、本発明の方法において使用されるベクターは、段落１８〜２４の何れかのアレイに含まれるベクターである。
【０３５０】
２５. 前記段落の何れかのアレイ、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージ、集団または収集物を含む、宿主細胞。
【０３５１】
一般的特性の何れか(下記参照)も、本形態に適用し得る。
【０３５２】
本発明の１例は、アレイに対する宿主適応および耐性のリスクを低減するために次のものを提供する。
宿主細胞の標的ヌクレオチド配列を修飾するための本発明のＣＲＩＳＰＲアレイまたはベクターであって、
ａ. ここで宿主細胞は標的配列転写のための第一内在性プロモーター(第一宿主プロモーター)を含み；
ｂ. ここでＣＲＩＳＰＲアレイはｃｒＲＮＡをコードする配列およびｃｒＲＮＡ転写のための第一プロモーターを含み、ｃｒＲＮＡは所望により単一ガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)に含まれ、Ｃａｓを、標的配列を修飾するために宿主細胞における標的にガイドするために宿主標的配列とハイブリダイズでき；
ｃ. ここで第一プロモーターの配列は、第一宿主プロモーターの配列と異なる第二内在性宿主プロモーターの配列である。
【０３５３】
例えば、プロモーターは、宿主における必須遺伝子のプロモーターである各ベクター(例えば、ファージ)ＣＲＩＳＰＲ単位のために使用される  −  この方法で、宿主はｃｒＲＮＡを十分発現する(およびプロモーターが常にまたは頻繁にスイッチオンにされなければならない宿主遺伝子由来であるならば、構成的に)。宿主はプロモーターから離れて用意に適合されず、よって、耐性を容易に発現しない。所望により宿主適応(耐性)の機会を減らすために、異なるベクターＣＲＩＳＰＲ単位のための異なる必須プロモーターを使用することが可能である。アレイ(または異なるアレイ)により宿主において標的化される病原性または必須または耐性遺伝子のプロモーターを使用できる。ファージに対する耐性を発現するために、宿主は内在性遺伝子プロモーターおよび遺伝子ターゲティング部位を範囲させる必要があり(これは、例えば、細胞増殖、生存能または抗宿主剤(例えば、抗生物質)耐性に必須のコード配列内であり得る)、この方法で遺伝子を不活性化するリスクもある。
【０３５４】
本発明に従うｃｒＲＮＡをコードする核酸配列の複数コピーの提供であって、ここでコピーは本発明に従う宿主細胞配列のターゲティングのための同じスペーサー配列を含むものは、ベクターからの有用ターゲティングスペーサーの宿主除去(例えば、宿主細胞相同指向組換えによる)の機会を減らすために有利である。複数ターゲティングスペーサーは、耐性を回避する代替法を提供するために本発明の同じまたは複数ＨＭ−アレイに、柔軟に提供できる。
【０３５５】
それ故に、本発明は次のコンセプトを提供する。
１. 宿主細胞の標的ヌクレオチド配列を修飾するための宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム(例えば、タイプＩ、IIまたはIII)であって、(ｉ)〜(iv)
(ｉ)Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列(例えば、Ｃａｓ９)；
(ii)スペーサー配列(ＨＭ−スペーサー)およびＨＭ−ｃｒＲＮＡをコードする反復を含む改変された宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイ(例えば、上記アレイ)であって、ＨＭ−ｃｒＲＮＡは、標的配列を修飾するためにＣａｓを宿主細胞にガイドするために宿主標的配列とハイブリダイズ可能な配列を含むもの；
(iii)任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するためのＤＮＡ配列；
(iv)ここで、システムの該要素は、２、３以上ー(例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０以上)のｃｒＲＮＡをコードする核酸配列のコピーを含み、ここでコピーは、宿主細胞配列をターゲティングための同じスペーサー配列を含む(例えば、宿主病原性、耐性または必須遺伝子配列またはベクター適応に介在する宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム要素の配列)
の要素を含む、システム。
【０３５６】
例えば、システムは、同じスペーサーを含む４以上または５以上のｃｒＲＮＡをコードする核酸配列のコピーを含む。これは、宿主における所望のｃＲＮＡの発現増加に有利である。さらに、これは、１を超える配列が標的化に必要であるため、宿主耐性を回避する大きな機会を提供する(特に５、１０、１５、２０、３０、４０、５０または１００以上のような多くのコピーが存在するならば)。異なるアレイにわたるコピー、例えば、同じＤＮＡ鎖に分けられた、これらを含むベクターの分配は、所望のｃＲＮＡコード化配列の削除にいたり得る、スペーサー間またはフランキング反復間の組換えの機会の減少に有用である。宿主が全コピーを削除する機会は、多くのベクターアレイにわたり分配されたコピーの提供により減少し、これはまた所望のスペーサーの多くのコピーの包含によっても減少する(例えば、第一ベクターアレイにおける多くのコピーおよび第二ベクターアレイにおける多くのコピー  −  少なくとも２、３、４、５、６、１０以上のこのようなアレイを含むことが可能であり、各々所望のスペーサーの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０または１００以上のコピーを含む)。
【０３５７】
２. システムの要素が、同じスペーサーを含むｃｒＲＮＡをコードする核酸配列の４、５、１０、１５または２０以上のコピーを含む、コンセプト１のシステム。
【０３５８】
３. コピーが２以上の核酸ベクターＣＲＩＳＰＲアレイに分けられる、コンセプト１または２のシステム。
【０３５９】
４. システムが第一および第二ＨＭ−アレイを含み、ここで第一および第二ベクターＣＲＩＳＰＲアレイが同じ宿主細胞または同じベクター(例えば、プラスミド、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミドまたはプロファージ)に含まれる、コンセプト３のシステム。
【０３６０】
５. 第一アレイが第一ベクターに含まれ、第二アレイが第一アレイを含まない第二ベクター(例えば、ここでベクターは、プラスミドまたはビリオン(例えば、同じウイルスタイプの)またはファージミド(例えば、同じファージタイプの)である)に含まれる、コンセプト３または４のシステム。
【０３６１】
６. 反復が宿主ＣＲＩＳＰＲアレイにおける反復と同一である、前記コンセプトの何れかのシステム。
【０３６２】
７. 反復が宿主ＣＲＩＳＰＲアレイにおける反復と同一ではない、コンセプト１〜５の何れかのシステム。
【０３６３】
８. 前記コンセプトの何れかのシステム、ベクター、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミドまたはプロファージを含む、宿主細胞。
【０３６４】
９. コンセプト１〜８の何れかのシステム、ベクター、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミドまたはプロファージを含む、抗微生物組成物(例えば、抗生物質、例えば、医薬、殺菌剤または口腔洗浄剤)。
【０３６５】
一般的特性の何れか(下記参照)はまた本コンセプトにも適用される。
【０３６６】
スプリットＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システム
この形態は、外来性配列運搬のための限定的な容量しか有しない標的ベクター、例えばウイルスまたはファージにおける空間を解放するのに有利である。空間の解放により、宿主耐性回避に有用である多くのターゲティングスペーサーまたはアレイを含むことができる。これは、例えば、ベクターにおいてコードするよりむしろ内在性Ｃａｓエンドヌクレアーゼの利用に有利である  −  特にｓｐまたはｓａＣａｓ９のようなかさ高いＣａｓ配列について。さらに、非宿主源由来のいくつかの外来性Ｃａｓで見られ得るような、適合性が劣る機会はない。ウイルス、例えば、ファージゲノムサイズを減少させる能力は、また宿主細胞取り込み(宿主細胞におけるウイルス感染および／または維持)にも有利であり得る。いくつかの例において、ベクター(例えば、ファージ)による宿主の侵襲は、宿主Ｃａｓヌクレアーゼの発現の増加を含み、宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性を情報制御し得ることが利点である  −  宿主が侵入核酸を退治する試みにおいて。しかしながら、これはまた、この発明形態のアレイ、ベクター、システムおよび他の態様での使用のために、これらが、宿主Ｃａｓにより認識される１以上の反復を含むとき、内在性Ｃａｓを提供するのに有利である。本発明が宿主ＣＲＩＳＰＲアレイをターゲティングする１以上のスペーサーを含む場合(また本発明の第一形態のとおり)、これは、宿主ＣＲＩＳＰＲアレイ自体の不活性化を促進し、“自殺”宿主細胞と同類であり、次いで、これがそれ自体のＣＲＩＳＰＲシステムの不活性化のためにそれ自体のＣａｓヌクレアーゼを使用する。
【０３６７】
それ故に、本発明は、例として番号付けする次の特性を提供する。
１. 宿主細胞の標的ヌクレオチド配列を修飾するための宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム(例えば、タイプＩ、IIまたはIII)であって、(ｉ)〜(iv)
(ｉ)Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列(例えば、Ｃａｓ９)；
(ii)スペーサー配列(ＨＭ−スペーサー)およびＨＭ−ｃｒＲＮＡをコードする反復を含む改変された宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイ(例えば、上記の本発明のアレイ)であって、ＨＭ−ｃｒＲＮＡは該Ｃａｓを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主標的配列とハイブリダイズ可能な配列を含むもの；
(iii)任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはＴｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するためのＤＮＡ配列；
(iv)ここでシステムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換できる少なくとも一つの核酸ベクターの間で分かれ、それによりＨＭ−ｃｒＲＮＡがＣａｓを標的にガイドし、宿主細胞における標的配列を修飾する、
の要素を含む、システム。
【０３６８】
ここでの“スプリット”は、ベクターがシステムの要素の１以上の(しかし全てではない)を含み、宿主細胞が要素の１以上の(しかし全てではない)を含み、ベクターが宿主細胞に含まれない１以上の要素を含むことを意味する。ある実施態様において、ベクターおよび宿主細胞は要素の何れも共有せず、例えば、宿主細胞は要素(ｉ)を含み、ベクターは要素(ii)を含み、ベクターが要素(iii)を含むおよび／または宿主細胞が要素(iii)を含む何れかである。ベクターが宿主細胞内にあるとき(例えば、統合されたまたはエピソームベクター、例えば、プロファージのように)、ベクターが、宿主細胞を形質転換しているベクターにより提供されている核酸であることが意図される(およびこのような核酸を提供するシステムの要素は、この場合、宿主細胞要素として解釈されない)。これは、形質転換宿主の核酸(例えば、染色体およびエピソーム核酸)を配列決定し、これを同じタイプの非形質転換宿主(例えば、宿主が微生物、例えば、細菌または古細菌であるとき、例えば、同じ宿主親コロニーまたはクローン)からの配列と比較することにより容易に決定できる。
【０３６９】
所望により、システムはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである。所望により、(ａ)のヌクレアーゼはタイプＩ  Ｃａｓヌクレアーゼである。所望により、(ａ)のヌクレアーゼはタイプII  Ｃａｓヌクレアーゼ(例えば、Ｃａｓ９)である。所望により、(ａ)のヌクレアーゼはタイプIII  Ｃａｓヌクレアーゼである。
【０３７０】
２. 要素の少なくとも一つが宿主細胞に内在性である、例１のシステム。
【０３７１】
３. 要素(ｉ)が宿主細胞に内在性である、例１または２のシステム。
【０３７２】
４. 要素(iii)が宿主細胞に内在性である、例１〜３の何れかのシステム。
【０３７３】
５. 宿主細胞の標的ヌクレオチド配列を修飾するための、宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム(例えば、タイプＩ、IIまたはIII)であって、(ａ)〜(ｅ)
ａ. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列(例えば、Ｃａｓ９)；
ｂ. スペーサー配列(ＨＭ−スペーサー)およびＨＭ−ｃｒＲＮＡをコードする反復を含む改変された宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイであって、ＨＭ−ｃｒＲＮＡは、該Ｃａｓを宿主細胞における標的にガイドするために宿主標的配列とハイブリダイズ可能な配列を含むもの；
ｃ. 任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはＴｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するためのＤＮＡ配列；
ｄ. ここでシステムの要素は少なくとも第一および第二核酸ベクターに分けられ、ここで第一ベクターは要素(ａ)を含むが、第二ベクターは要素(ａ)を欠き；そして
ｅ. ここでベクターは宿主細胞に同時にまたは逐次的に共形質転換でき、それによりＨＭ−ｃｒＲＮＡがＣａｓを標的にガイドし、宿主細胞における標的配列を修飾する
に従う要素を含む、システム。
【０３７４】
上記の“スプリット”の定義は、変更すべきところは変更して第一および第二ベクターを含む本例に適用される。
【０３７５】
ある実施態様において、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列はベクターにより提供されないが、内在性宿主細胞ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｔｒａｃｒＲＮＡ配列であり、ここでｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓを宿主細胞における標的にガイドするために成熟ｃｒＲＮＡにその後プロセシングされるために、細胞におけるＨＭ−ｃｒＲＮＡとハイブリダイズできる。
【０３７６】
６. 第一ベクターが要素(ａ)を含み、第二ベクターが要素(ｂ)および(ｃ)を含む、例５のシステム。
【０３７７】
７. 第一および／または第二ベクターが、各々１、２、３以上のさらに改変されたＨＭ−ＣＲＩＳＰＲ−アレイを含む、例５または６のシステム。
【０３７８】
８. 第一および第二ベクターの一方がファージミドであり、他方のベクターがヘルパーファージである、例５〜７の何れかのシステム。
【０３７９】
９. ｃｒＲＮＡ配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列が、例えば、ベクターにより提供される、単一ガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)に含まれる、前記例の何れかのシステム(例えば、例３または６)。
【０３８０】
１０. 各ベクターが、外来性核酸を挿入する容量が限定されている、前記例の何れかのシステム。
【０３８１】
１１. １個または複数個のベクターがウイルス(例えば、ビリオン、パッケージ化ファージ、ファージミドまたはプロファージ)である、前記例の何れかのシステム。
【０３８２】
１２. 宿主細胞が目的のＨＭ配列をコードする遊離末端を備えたデオキシリボ核酸鎖(ＨＭ−ＤＮＡ)および／またはここでシステムがＨＭ−ＤＮＡをコードする配列を含み(例えば、ベクターまたは宿主細胞ゲノムもしくはそのエピソームに統合されている)、ここでＨＭ−ＤＮＡが、標的配列におけるまたは隣接する配列または複数配列とそれぞれ相同である配列または複数配列を含む、前記例の何れかのシステム。
【０３８３】
鎖は遊離末端、すなわち、鎖が１または２遊離末端を有するように宿主またはベクターＤＮＡに統合されていない末端を有し、すなわち、ＤＮＡは、それぞれ直ぐ５’およびまたは３’の隣接ヌクレオチドと結合していない。
【０３８４】
１３. 標的部位が宿主細胞においてＣａｓにより切断され(例えば、ＣａｓヌクレアーゼがＣａｓ９であるとき、Ｃａｓ９により)、ＨＭ−ＤＮＡ宿主ゲノム(例えば、染色体またはエピソーム部位に)にＨＭ−ＤＮＡを挿入するために、切断部分に隣接するそれぞれ５’および３’と相同である第一および第二配列を含む、例１２のシステム。
【０３８５】
１４. 挿入が相同指向組換え(ＨＤＲ)による、例１３の方法。
【０３８６】
１５. 挿入が非相同末端連結(ＮＨＥＪ)による、例１３のシステム。
【０３８７】
１６. ＨＭ配列が調節要素(例えば、プロモーター、例えば、内在性プロモーターに置き換わる誘導可能プロモーター)、転写阻害配列、転写増強配列、標識または外来性タンパク質もしくはドメインをコードする配列であるまたはこれをコードする、例１２〜１５の何れかのシステム。
【０３８８】
１７. システムが第一および第二ＨＭ−ＤＮＡを含み、ここで第一ＨＭ−ＤＮＡの配列が第二ＤＮＡの配列と相補性であり、それによりＤＮＡが宿主細胞ゲノム(例えば、染色体またはエピソーム部位に)への挿入のために組み合わせＨＭ−ＤＮＡを形成するために相同指向組換えにより宿主細胞内で組み合わされ得る、例１２〜１６の何れかのシステム。
【０３８９】
１８. １個または複数個のベクターが細胞内へシステム要素を含むベクター核酸を導入するために宿主細胞に感染できる、前記例の何れかのシステム。
【０３９０】
１９. Ｃａｓヌクレアーゼがニッカーゼである、前記例の何れかのシステム。
【０３９１】
２０. 細胞が細菌または古細菌であり、Ｃａｓヌクレアーゼが細菌または古細菌の内在性タイプII  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより提供される、前記例の何れかのシステム。
【０３９２】
２１. １個または複数個のベクターが宿主細胞内であり、所望により宿主ＤＮＡに統合されている、前記例の何れかのシステム。
【０３９３】
２２. １個または複数個のベクターがＣａｓヌクレアーゼ(例えば、ａＣａｓ９)コード化配列を欠く、前記例の何れかのシステム。
【０３９４】
２３. 内在性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む微生物宿主細胞感染のための改変された核酸ウイルスベクター(例えば、上記ベクター、ビリオンまたはパッケージ化ファージ)であって、
(ａ)先の例の何れかに従うＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて使用するための複数の異なるｃｒＲＮＡを発現するための核酸配列を含み；そして
(ｂ)Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸配列を欠き(例えば、Ｃａｓ９)、
ここで、該ｃｒＲＮＡの第一は該宿主細胞の第一核酸配列とハイブリダイズでき、そして該ｃｒＲＮＡの第二は該宿主細胞の第二核酸配列とハイブリダイズでき、ここで該第二配列は該第一配列と異なり；そして
(ｃ)第一配列は抗微生物(例えば、抗生物質)耐性遺伝子(またはそのＲＮＡ)に含まれ、第二配列は抗微生物耐性遺伝子(またはそのＲＮＡ)に含まれ、所望により、これらの遺伝子は異なり；
(ｄ)第一配列は抗微生物耐性遺伝子(またはそのＲＮＡ)に含まれ、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み；
(ｅ)第一配列は必須遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含むまたは
(ｆ)第一配列は病原性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含む、
ベクター。
【０３９５】
２４. 内在性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む宿主細胞を形質転換するための改変された(ベクターが宿主を形質転換する改変されたベクターに由来するとき、直接的に改変されたまたは宿主細胞におけるベクターから単離された)核酸ベクターであって、所望により上記のベクターであり、そして
(ａ’)先の例の何れかに従うＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて使用するための複数の異なるｃｒＲＮＡを発現するための核酸配列を含み；そして
(ｂ’)Ｃａｓヌクレアーゼ(例えば、Ｃａｓ９)をコードする核酸配列を欠き、
ここで、該ｃｒＲＮＡの第一は該宿主細胞の第一核酸配列とハイブリダイズでき、そして該ｃｒＲＮＡの第二は該宿主細胞の第二核酸配列とハイブリダイズでき、ここで該第二配列は該第一配列と異なり；そして
第一および／または第二配列が宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの標的配列であり、この配列は
(ｃ’)宿主ＣＲＩＳＰＲアレイにおける反復ＤＮＡまたはＲＮＡ配列(例えば、ここで反復は最も５’反復である(第一反復))；
(ｄ’)ｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡコード化ＤＮＡ配列；
(ｅ’)ＣＲＩＳＰＲアレイリーダー配列；
(ｆ’)Ｃａｓ遺伝子プロモーター(例えば、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２またはＣｓｎ２プロモーター)；
(ｇ’)ＣＲＩＳＰＲアレイリーダープロモーター配列または
(ｈ’)Ｃａｓコード化ＤＮＡまたはＲＮＡ配列((例えば、ここでＣａｓはＣａｓ９、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２またはＣｓｎ２である)、例えば、ここで第一のｃｒＲＮＡは宿主Ｃａｓ１遺伝子配列(またはそのＲＮＡの配列)をターゲティングでき、第二のｃｒＲＮＡは宿主Ｃａｓ２遺伝子配列(またはそのＲＮＡの配列)をターゲティングできる)
であるまたはこれを含む、
ベクター。
【０３９６】
２５. 第一および／または第二標的配列が
ｉ. 第一反復の最も５’ヌクレオチドと隣接するＣＲＩＳＰＲアレイリーダーまたはリーダープロモーター配列(および所望により反復の該最も５’ヌクレオチドを含む)、例えば、第一反復の５’末端に最初の３ヌクレオチドを含み；
ii. 第一反復の直ぐ５’の最大２０(例えば、３、５、７、９、１０、１２、１５、２０、３０または３２)連続ヌクレオチドの配列；
iii. 第一反復の最も５’ヌクレオチドの最大２０(例えば、３、５、７、９、１０、１２、１５、２０、３０または３２)連続ヌクレオチドの配列または
iv. 第一スペーサーの直ぐ３’の最大２０(例えば、３、５、７、９、１０、１２、１５、２０、３０または３２)連続ヌクレオチドの配列(および所望によりここで配列は第一スペーサー最も３’ヌクレオチドを含む)、例えば、第一反復の３’末端３’末端に最後の３ヌクレオチドを含むもの
であるまたはこれを含む、
例２４のベクター。
【０３９７】
２６. 各標的配列が配列番号１〜４４からなる群から選択される配列に含まれるまたはその相補体である、例２４または２５のベクター。
【０３９８】
２７. 第一ｃｒＲＮＡが構造Ｒ−Ｓ−Ｒを含みまたはこれからなり、ここでＲ＝ＣＲＩＳＰＲ反復およびＳ＝ＣＲＩＳＰＲスペーサーであり、ここでＳは(５’から３’方向で)Ｖ−ＨＲまたはＨＲ−Ｖを含みまたは、ここでＶ＝ベクターのＤＮＡ配列と同一の配列およびＨＲ＝宿主細胞ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＣＲＩＳＰＲアレイの反復のＤＮＡ配列であり、ここで第一ｃｒＲＮＡは、細胞における宿主ＣＲＩＳＰＲアレイの修飾のためにＣａｓをｃｒＲＮＡにガイドするために宿主ＣＲＩＳＰＲアレイのスペーサーとハイブリダイズできる、例２４〜２６の何れかのベクター。
【０３９９】
２８. 第一ｃｒＲＮＡがベクターに存在する核酸と実質的にハイブリダイズしない、例えば、ここで第一ｃｒＲＮＡは、ベクターにおけるＶとハイブリダイズしないか、宿主アレイのスペーサーとハイブリダイズするより低強度でハイブリダイズする、例２７のベクター。これを決定することについての上の記載はこの例にも適用される。
【０４００】
２９. Ｖ＝ベクターＤＮＡの１または最大４０(例えば、最大１５)連続ヌクレオチドである、例２７または２８のベクター。例えば、Ｖ＝ベクターＤＮＡの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０連続ヌクレオチドである。
【０４０１】
３０.
ｉ. 宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが同族ＰＡＭを認識できる；
ｊ. ここでベクターＤＮＡがこのようなＰＡＭをプロトスペーサー配列の直ぐ３’に含み；
ｋ. ここでＶ＝プロトスペーサーの１または最大４０(例えば、最大１５)ヌクレオチドであり；そして
ｌ. ここでＨＲ＝宿主ＣＲＩＳＰＲアレイの反復の連続配列と同一の配列である、
例２９のベクター。
【０４０２】
３１. 宿主アレイの反復の連続配列が宿主反復の配列の少なくとも５０％である(例えば、宿主反復の最も５’または最も３’ヌクレオチドを含む)、例３０のベクター。
【０４０３】
３２. Ｖ＝最も３’プロトスペーサー連続ヌクレオチドの１〜４０(例えば、最大１５)であり、そして所望により反復の連続配列は宿主反復の最も５’ヌクレオチドを含む、例３０または３１のベクター。
【０４０４】
３３. Ｖ＝最も５’プロトスペーサー連続ヌクレオチドの１〜４０(例えば、最大１５)であり、所望により反復の連続配列は宿主反復の最も３’ヌクレオチドを含む、例３０または３１のベクター。
【０４０５】
３４. Ｒ＝宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより認識される反復である、例２７〜３３の何れかのベクター。あるいは、Ｒ＝宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより認識されない反復である。この場合、好ましくは、ベクターはＲと同族である、すなわち、宿主細胞においてＲと共に機能できる、Ｃａｓヌクレアーゼ(および所望によりｔｒａｃｒＲＮＡ)のヌクレオチド配列を含む。
【０４０６】
３５. 第一配列が(ｃ’)〜(ｈ’)の何れかに従い、第二配列が宿主必須遺伝子、病原性遺伝子または耐性遺伝子から選択される、例２４〜３４の何れかのベクター。
【０４０７】
３６. 内在性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む微生物宿主細胞を感染するために、例１〜２２の何れかのシステムにおいて使用するための改変された核酸ウイルスベクター(例えば、ビリオンまたはパッケージ化ファージ)であって、ここで、
ａ. ベクターは宿主における第一ｃｒＲＮＡを発現するための第一核酸配列を含み；そして
ｂ. ここで第一配列は(５’から３’方向で)Ｒ１ａ−Ｓ１−Ｒ１ｂを含み、ここでＲ１ａ＝第一ＣＲＩＳＰＲ反復であり、ここでＲ１ａは任意であり；Ｒ１ｂ＝第二ＣＲＩＳＰＲ反復であり、Ｓ１＝宿主配列に相補的なＣＲＩＳＰＲスペーサー(例えば、例２３または２４に記載する宿主配列)であり、ここでＲ１ａおよびＲ１ｂは宿主Ｃａｓヌクレアーゼ(例えば、タイプIIヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９)により認識され；
ｃ. ここでベクターは、(ｉ)(ｂ)の反復を認識するＣａｓヌクレアーゼ(例えば、Ｃａｓ９)をコードする核酸配列および／または(ii)第一配列によりコードされるｃｒＲＮＡ配列に相補的であるｔｒａｃｒＲＮＡ配列をコードする核酸配列を欠く。
【０４０８】
例えば、ベクターはファージに含まれる核酸ベクターである。
【０４０９】
３７.
ｄ. ベクターが宿主における第二ｃｒＲＮＡを発現するための第二核酸配列を含み、ここで第二ｃｒＲＮＡは第一ｃｒＲＮＡと異なり；
ｅ. ここで第二配列が(５’から３’方向で)Ｒ２ａ−Ｓ２−Ｒ２ｂを含み、ここでＲ２ａ＝第一ＣＲＩＳＰＲ反復であり、ここでＲ２ａは任意であり；Ｒ２ｂ＝第二ＣＲＩＳＰＲ反復およびＳ２＝宿主配列に相補的なＣＲＩＳＰＲスペーサー(例えば、例２３または２４に記載する宿主配列)、ここでＲ２ａおよびＲ２ｂが宿主Ｃａｓヌクレアーゼ(例えば、タイプＩまたはIIヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ６)により認識される、
例３６のベクター。
【０４１０】
それ故に、例えば、第一および第二核酸配列は、同じパッケージ化ファージミドに含まれる、例えば、同じまたは異なるＣＲＩＳＰＲアレイにある。
【０４１１】
３８. ベクターが、(iii)(ｅ)の反復を認識するＣａｓ(例えば、Ｃａｓ６)をコードする核酸配列および／または(iv)第二配列によりコードされるｃｒＲＮＡ配列に相補的であるｔｒａｃｒＲＮＡ配列をコードする核酸配列を欠く、例３７のベクター。
【０４１２】
３９. 内在性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む微生物宿主細胞を共感染するための、例１〜２２の何れかのシステムに従い使用するための改変された核酸ウイルスベクター(例えば、上記ベクター、ビリオンまたはパッケージ化ファージ)の収集物であって、収集物は第一ベクターおよび第二ベクターを含み、
ｆ. ここで第一ベクターは例３６に従う；
ｇ. ここで第二ベクターは宿主における第二ｃｒＲＮＡを発現するための第二核酸配列を含み、ここで第二ｃｒＲＮＡは第一ｃｒＲＮＡと異なり；
ｈ. ここで第二配列は(５’から３’方向で)Ｒ２ａ−Ｓ２−Ｒ２ｂを含み、ここでＲ２ａ＝第一ＣＲＩＳＰＲ反復であり、ここでＲ２ａは任意であり；Ｒ２ｂ＝第二ＣＲＩＳＰＲ反復およびＳ２＝宿主配列に相補的なＣＲＩＳＰＲスペーサー、ここでＲ２ａおよびＲ２ｂは宿主Ｃａｓヌクレアーゼ(例えば、タイプＩまたはIIヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ６)により認識される。
【０４１３】
例えば、第一ベクターは第一パッケージ化ファージミドに含まれ、第二ベクターは第二パッケージ化ファージミドに含まれる。
【０４１４】
４０. 第二ベクターが、(ｖ)(ｂ)の反復を認識するＣａｓ(例えば、Ｃａｓ９)をコードする核酸配列および／または(vi)第一配列によりコードされるｃｒＲＮＡ配列に相補的であるｔｒａｃｒＲＮＡ配列をコードする核酸配列を含む、例３９の収集物。
【０４１５】
例えば、この場合、Ｃａｓ機能は内在性宿主システムにより提供される。これはベクター空間を確保し(例えば、より多くの宿主ターゲティングＨＭ−アレイスペーサーの挿入のため)、ベクターおよびアレイ構築を単純化する。
【０４１６】
４１. 第二ベクターが(vii)(ｈ)の反復を認識するＣａｓ(例えば、Ｃａｓ６)をコードする核酸配列および／または(viii)第二配列によりコードされるｃｒＲＮＡ配列に相補的であるｔｒａｃｒＲＮＡ配列をコードする核酸配列を欠く、例３９または４０の収集物。
【０４１７】
例えば、この場合、Ｃａｓ機能は内在性宿主システムにより提供される。
【０４１８】
４２. 第一および第二ベクターが各々(ix)(ｂ)の反復を認識するＣａｓ(例えば、Ｃａｓ９)をコードする核酸配列および(ｘ)(ｈ)の反復を認識するＣａｓ(例えば、Ｃａｓ６)をコードする核酸配列を欠き、所望によりここで収集物が(ｂ)および(ｈ)の反復を認識する１以上のＣａｓを含む宿主細胞に含まれる、例３９の収集物。
【０４１９】
４３. さらに(ix)および／または(ｘ)に従う核酸配列を含む第三ベクター(例えば、ビリオンまたはファージ)を含む、例４２の収集物。
【０４２０】
４４. 各ベクターが各パッケージ化ビリオンまたはファージミドまたは各ビリオンまたはファージ核酸に含まれる、例３９〜４３の何れかの収集物。
【０４２１】
４５. Ｒ１ａおよびＲ１ｂが同じ反復配列に含まれる、例３６〜４４の何れかのベクターまたは収集物。
【０４２２】
４６. Ｒ２ａおよびＲ２ｂが同じ反復配列に含まれる、例３７〜４５の何れかのベクターまたは収集物。
【０４２３】
４７. (ｂ)の反復が、(ｅ)の反復を認識するＣａｓヌクレアーゼと異なるＣａｓヌクレアーゼにより認識される、例３７〜４６の何れかのベクターまたは収集物。
【０４２４】
４８. 宿主が種々のタイプのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム(例えば、タイプＩおよびタイプIIシステム；タイプＩおよびタイプIIIシステム；タイプIIおよびタイプIIIシステムまたはタイプＩ、IIおよびIIIシステム)を含む、例３７〜４７の何れかのベクターまたは収集物。
【０４２５】
４９. (ｂ)の反復がタイプII  Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９により認識される、例３６〜４８の何れかのベクターまたは収集物。
【０４２６】
５０. (ｅ)の反復がタイプＩまたはIII  Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ６により認識される、例３７〜４９の何れかのベクターまたは収集物。
【０４２７】
５１. ベクターがウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミドまたはプロファージである、例２３〜５０の何れかのベクターまたは収集物。
【０４２８】
５２. ベクターによりコードされるｃＲＮＡと共に動作可能である１以上のＣａｓを含む宿主細胞内の、例２３〜５１の何れかのベクターまたは収集物。
【０４２９】
５３. Ｃａｓ９を含む宿主細胞内の、例２３〜５２の何れかのベクターまたは収集物。
【０４３０】
５４. ＨＭ−ＤＮＡと組み合わされており(例えば、ベクター、プラスミドまたは宿主細胞ゲノムもしくはそのエピソームに統合されている)、ここでＨＭ−ＤＮＡが例１２〜１７の何れかに記載するとおりである、例２３〜５３の何れかのベクターまたは収集物。
【０４３１】
５５. 複数の異なるｃｒＲＮＡを発現するための核酸配列を含み、ここで該ｃｒＲＮＡが宿主細胞における少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、５０個または１００個のＤＮＡ配列をターゲティングできる、前記例の何れかのシステム、ベクターまたは収集物。
【０４３２】
５６. 該Ｃａｓヌクレアーゼ(例えば、Ｃａｓ９)ではないが、宿主ベクター適応に介在するＣａｓヌクレアーゼ(またはそのＲＮＡの配列)のＤＮＡ配列をターゲティングできる第一ｃＲＮＡをコードする第一ｃｒＲＮＡまたは核酸配列を含み、所望により宿主における耐性、病原性または必須宿主遺伝子の配列(またはそのＲＮＡ)をターゲティングできる第二ｃＲＮＡをコードする第二ｃｒＲＮＡまたは核酸配列を含む、前記例の何れかのシステム、ベクターまたは収集物。
【０４３３】
５７. ２、３またはそれ以上のコピーのｃｒＲＮＡをコードする核酸配列を含み、ここでコピーは、宿主細胞配列をターゲティングための同じスペーサー配列を含む(例えば、病原性、耐性または必須遺伝子配列またはベクター適応に介在するが、該Ｃａｓヌクレアーゼではない宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム要素の配列)、前記例の何れかのシステム、ベクターまたは収集物。
【０４３４】
５８. コピーが２以上のベクターＣＲＩＳＰＲアレイ間に別れる、例５７のシステム、ベクターまたは収集物。
【０４３５】
５９. ベクター反復がまたは宿主ＣＲＩＳＰＲアレイ中のまたはそれと同一である(例えば、各ベクター反復は、宿主反復に少なくとも９５％配列同一性を有する)、前記例の何れかのシステム、ベクターまたは収集物。
【０４３６】
６０. ベクター反復が宿主ＣＲＩＳＰＲアレイにおける反復またはそれと同一ではない、例１〜５８の何れかのシステム、ベクターまたは収集物。
【０４３７】
６１. 同じ宿主細胞または同じベクター(例えば、プラスミドまたはウイルスまたはビリオンまたはファージまたはプロファージまたはファージミド)に含まれる第一および第二ベクターＣＲＩＳＰＲアレイを含む、前記例の何れかのシステム、ベクターまたは収集物。
【０４３８】
６２. 第一アレイが第一ベクターに含まれ、第二アレイが第一アレイを含まない第二ベクターに含まれる(例えば、ここでベクターは、プラスミドまたはビリオン(例えば、同じウイルスタイプの)またはファージミド(例えば、同じファージタイプの)である、例６１のシステム、ベクターまたは収集物。
【０４３９】
６３. 前記例の何れかに従うシステム、ベクター、収集物、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミドまたはプロファージを含む、宿主細胞。
【０４４０】
６４. 例１〜６２の何れかに従うシステム、ベクター、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミドまたはプロファージを含む、抗微生物組成物(例えば、抗生物質、例えば、医薬、殺菌剤または口腔洗浄剤)。
【０４４１】
複数微生物の一括コンディショニング
本発明は、共進化を促進するための宿主およびウイルスの一括コンディショニングおよびそれゆえに宿主のウイルス(例えば、ファージ)へのコンディショニングおよびその逆を含む、微生物(例えば、ファージおよび／または細菌集団)を産生する方法を提供する。発現または活性のｃｒＲＮＡの抑制可能制御を使用して、本発明は、所望のスペーサー活性が、宿主におけるスペーサガイドＣａｓ作用により課せられる負荷存在下または非存在下、例えば、抗生物質耐性遺伝子ターゲティング存在下または非存在下で生じるのをコンディショニングすることを可能にするためにオンまたはオフに切り替えできる、意図的に共進化を制御可能な方法で調節する。この方法で、細菌集団を、所望の遺伝子のファージ不活性化に遭遇し得る状況(例えば、乳製品または食品製造発酵物)における使用または細菌を死滅させまたは調整する、例えば、抗生物質耐性ノックダウンのために使用するファージの調整における使用において、調整できる。この形態は、さらに、ある実施態様において、本方法が意図的に宿主との培養中にのアレイ抗生物質耐性遺伝子不活性化の活性を抑制するため、抗生物質耐性細菌宿主と、宿主の抗生物質耐性遺伝子を標的とする１以上の本発明のＣＲＩＳＰＲアレイを含むウイルス、例えば、ファージの培養を可能とする。それ故に、耐性細菌宿主集団を培養においてファージの増殖に使用でき(例えば、工業用培養コンテナまたはプラント中)、ファージおよび宿主が共進化し、増殖、故に、宿主細胞の培養能力(これはそうしなければファージ拡大を最小化する)を妨害する抗生物質耐性不活性化効果なしに相互に調整されることを可能とし、一方所望のファージの他の全ての要素が培養宿主集団に対して調整されることをなお可能とする。得られたファージ集団のサンプルの試験を、例えば、実験室規模で、抗生物質耐性宿主細胞集団を使用して、しかし、宿主細胞の抗生物質耐性遺伝子をターゲティングするアレイが抑制解除された試験ファージを用いて、実施できる。原核細胞およびファージ設定における遺伝子発現の天然に存在するおよび合成の抑制、例えば、ｔｅｔシステムまたは光誘発可能システムは当業者に周知である。
【０４４２】
それ故に、本発明は、段落として番号付けする次の特性を提供する。
１. 微生物の製造方法であって、
(ａ)宿主細胞においてヌクレオチド配列ターゲティングのための宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む宿主細胞を提供し；
(ｂ)宿主細胞に感染可能であるウィルスを提供し、ここで
(ｉ)ウイルスは宿主細胞の標的ヌクレオチド配列修飾のための１以上の改変された宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイ(例えば、上記アレイ)を含み；
(ii)第一該ＨＭ−アレイは、Ｃａｓを宿主細胞における標的にガイドし、標的配列を修飾するように第一宿主標的配列とハイブリダイズできるスペーサー配列(ＨＭ−スペーサー)を含む第一ＨＭ−ｃｒＲＮＡをコードし、所望によりここで第一標的配列の修飾が宿主細胞増殖または生存能を低下させ；そして
(iii)第一ＨＭ−アレイが第一ＨＭ−ｃｒＲＮＡの転写について可逆性に抑制可能であるおよび／または第一ＨＭ−ｃｒＲＮＡ活性が抑制可能であり；
(ｃ)１以上のＨＭ−ＣＲＩＳＰＲアレイを細胞に導入するために宿主細胞をウイルスで感染させ；
(ｄ)細胞における第一ＨＭ−ｃｒＲＮＡの転写および／または第一ＨＭ−ｃｒＲＮＡ活性を抑制し；
(ｅ)ウイルスの集団(ＰＶ１)を含む宿主細胞の集団(ＰＨ１)を産生するために感染宿主細胞を培養し；そして
(ｆ)ウイルス集団ＰＶ１および／または培養宿主細胞集団を得る
ことを含む、方法。
【０４４３】
例えば、第一ＨＭ−ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓを宿主細胞における標的にガイドし、標的配列を修飾するために第一宿主標的配列とハイブリダイズできるＨＭ−スペーサーを含み、ここで標的配列は宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのヌクレオチド配列であり、それにより第一ＨＭ−ｃｒＲＮＡが宿主細胞における宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを修飾するようにＣａｓを標的にガイドし、ここで標的配列の修飾は宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの機能を低下または排除する。
【０４４４】
別法として、修飾は、宿主における遺伝子を増強するまたは抑制を阻止する。ある実施態様において、遺伝子は必須遺伝子、病原性遺伝子または耐性遺伝子(例えば、抗生物質耐性遺伝子)である。ある実施態様において、修飾は、宿主に内在性または外来性である遺伝子産物の発現を増強する。例えば、宿主は、外来性ヌクレオチド配列(例えば、所望のタンパク質産生のため)を含む改変された宿主であり、修飾は宿主細胞における所望のタンパク質の発現を増強または阻害する。例えば、所望のタンパク質は抗生物質であり、宿主細胞は微生物、例えば、細菌または古細菌細胞である。それ故に、方法は、宿主細胞を、ウイルス集団を産生するために培養することを可能とし、ここで抗生物質は発現されず、これは、そうでなければ宿主細胞集団の増殖に有害である。その後、単離ウイルス集団の１以上のウイルスを、第一ＨＭ−ｃｒＲＮＡ抑制を単離後に除去でき、それにより能動的抗生物質ウイルス組成物を提供するため、宿主細胞増殖または生存能の低下のために抗微生物組成物において使用できる。本発明は、それ故にまた、宿主細胞において抗生物質を発現できるウイルスを含む、このような方法およびこのような抗生物質組成物も提供する。発現を活性化するための修飾は、例えば、転写アクティベーターにコンジュゲートしたＣａｓ(例えば、Ｃａｓ９)の提供により実施でき、ここでＣａｓは第一ＨＭ−ｃｒＲＮＡに対して同族Ｃａｓであり、アクティベーターは所望の外来性または内在性遺伝子の転写を活性化する。発現を阻害するための修飾は、例えば、死Ｃａｓ(例えば、ｄＣａｓ９)の提供により実施でき、ここでＣＡｓは第一ＨＭ−ｃｒＲＮＡに対して同族Ｃａｓであり、所望の外来性または内在性遺伝子の転写を阻害する。
【０４４５】
ｃｒＲＮＡ転写または活性の抑制は、部分的でも完全(すなわち、宿主におけるアレイからのｃｒＲＮＡの活性がないまたは転写がない)でもよい。活性は、Ｃａｓを修飾のための第一宿主標的部位にガイドするために同族宿主配列とハイブリダイズする、ｃｒＲＮＡの能力をいう。
【０４４６】
例えば、ウイルスは細胞に導入されたときそのように抑制されず、方法は、ウイルスが細胞に感染した後に、例えば、抑制を引き起こすために化学、物理的、機械的、磁力、光または他の薬剤の使用により、工程(ｄ)を実施することを含む。ある実施態様において、第一ＨＭ−アレイは、第一ＨＭｃｒＲＮＡの転写の抑制可能プロモーター(ＨＭ−プロモーター)を含み、プロモーターは、第一ＨＭ−アレイが細胞に導入された後抑制される(例えば、リプレッサー剤、例えば、化学またはタンパク質のプロモーターへの結合により)。
【０４４７】
他の例において、ウイルスは、例えば、抑制を引き起こすために化学的、物理的、機械的、磁気的、光学的または他の抑制因子の使用により、工程(ｃ)の前にそのように抑制される。ある実施態様において、第一ＨＭ−アレイは、第一ＨＭｃｒＲＮＡの転写の抑制可能プロモーター(ＨＭ−プロモーター)を含み、プロモーターは、第一ＨＭ−アレイが細胞に導入される前に抑制され(例えば、リプレッサー剤、例えば、化学またはタンパク質のプロモーターへの結合により)、ここでその後抑制された第一ＨＭ−アレイが細胞に導入される。
【０４４８】
ある実施態様において、工程(ｆ)は、ＰＶ１の単離を含む。ある実施態様において、工程は、ＰＨ１の宿主細胞からＰＶ１またはそのウイルスを分離することを含んだ。
【０４４９】
２. さらに工程(ｅ)または(ｆ)の後ウイルス集団における第一ＨＭ−ｃｒＲＮＡの転写および／または第一ＨＭ−ｃｒＲＮＡ活性の抑制解除し、所望によりその後さらなる宿主細胞を培養することを含む、段落１の方法。
【０４５０】
３.
Ａ. 所望により(ａ)、(ｆ)の宿主細胞または段落２のさらに培養した細胞と同一である宿主細胞の集団(ＰＨ２)を得て；
Ｂ. Ａの宿主細胞を集団ＰＶ１からのウイルスで感染させ；
Ｃ. 細胞における第一ＨＭ−ｃｒＲＮＡの転写および／または第一ＨＭ−ｃｒＲＮＡ活性を抑制し；
Ｄ. 感染宿主細胞を培養してウイルスの集団(ＰＶ２)を含む宿主細胞の集団(ＰＨ３)を産生し；そして
Ｅ. ウイルス集団ＰＶ２(またはそのウイルス)および／または培養宿主細胞集団を得る
ことを含む、前段落の何れかの方法。
【０４５１】
４. さらに工程(Ｄ)または(Ｅ)の後ウイルス集団における第一ＨＭ−ｃｒＲＮＡの転写および／または第一ＨＭ−ｃｒＲＮＡ活性を抑制解除し、所望によりその後さらなる宿主細胞を培養することを含む、段落３の方法。
【０４５２】
５. 宿主細胞のさらなる宿主細胞または集団(ＰＨ４)上でウイルス集団ＰＶ１またはＰＶ２の単離サンプルを試験することを含み、所望によりここでさらなる細胞または集団ＰＨ４は(ａ)の細胞と同一であり、試験はさらなる細胞または集団ＰＨ４をサンプルのウイルスで感染させ、何らかの宿主細胞増殖を可能とする期間待機し、さらなる細胞または集団ＰＨ４の予め決定した活性(例えば、細胞増殖または生存能)が修飾されているか(例えば、宿主細胞増殖またはその生存能の低下のような抑制*)または生じているかを決定し、ここでウイルスは細胞内にあるかまたは細胞は該期間中第一ＨＭ−ｃｒＲＮＡの転写および／または第一ＨＭ−ｃｒＲＮＡ活性が抑制解除されている、前段落の何れかの方法。
*  これは、サンプルのウイルスが観点上に播種された細胞またはＰＨ４に添加されるとき、プラーク形成の標準アッセイを使用して試験できる。
【０４５３】
６. 宿主細胞の全てが微生物細胞(例えば、細菌または古細菌細胞)であり、第一標的配列の修飾が宿主細胞増殖または生存能を低下させ、その決定が抗微生物活性**が生じることを決定する、前段落５の何れかの方法。
**  これは、標準プラークアッセイを使用して決定できる。
【０４５４】
７. 期間が少なくとも１分、５分、１０分、３０分、６０分または１２０分である、段落５または６の方法。
【０４５５】
８. (ａ)の細胞および所望によりＰＨ１、ＰＨ２および／またはＰＨ３細胞が第一標的配列を含まず、ここでさらなる細胞または集団ＰＨ４細胞が第一標的配列を含む、段落５〜７の何れかの方法。
【０４５６】
９. (ａ)の細胞および所望によりＰＨ１、ＰＨ２および／またはＰＨ３細胞が第一抗生物質への耐性を付与する遺伝子を含まず、ここで第一標的配列がこのような遺伝子の標的配列であり、所望によりここでさらなる細胞または集団ＰＨ４細胞が該遺伝子を含む、段落１〜８の何れかの方法。
【０４５７】
１０. (ａ)の細胞および所望によりＰＨ１、ＰＨ２および／またはＰＨ３細胞が第一抗生物質への耐性を付与する遺伝子を含み、ここで第一標的配列がこのような遺伝子の標的配列である、段落１〜７の何れかの方法。
【０４５８】
１１. 宿主細胞の全てが微生物細胞(例えば、細菌または古細菌細胞)であり、第一標的配列の修飾が宿主細胞増殖または生存能を低下させまたは抗生物質に対する宿主細胞耐性を低減させる、前段落の何れかの方法。
【０４５９】
１２. 宿主細胞の全てがヒト、動物(例えば、非ヒト動物)または植物の感染性疾患病原体である、前段落の何れかの方法。
【０４６０】
１３. 宿主細胞の全てが、例えば、エシェリキア(例えば、エシェリキア・コリＯ１５７：Ｈ７またはＯ１０４：Ｈ４)、シゲラ(例えば、ディセンテリアエ)、サルモネラ(例えば、チフィまたはエンテリカ、例えば、血清型チフィリウム、例えば、ＤＴ１０４)、エルウィニア、エルシニア(例えば、ペスティス)、バチルス、ビブリオ、レジオネラ(例えば、ニューモフィラ)、シュードモナス(例えば、エルギノーサ)、ナイセリア(例えば、ゴノレーまたはメニンギティディス)、ボルデテラ(例えば、パータシス)、ヘリコバクター(例えば、ピロリ)、リステリア(例えば、モノサイトゲネス)、アグロバクテリウム、スタフィロコッカス(例えば、アウレウス、例えば、ＭＲＳＡ)、ストレプトコッカス(例えば、ピオゲネスまたはサーモフィルス)、エンテロコッカス、クロストリジウム(例えば、ディフィシルまたはボツリヌム)、コリネバクテリウム(例えば、アミコラツム)、マイコバクテリウム(例えば、ツベルクローシス)、トレポネーマ、ボレリア(例えば、ブルグドルフェリ)、フランシセラ、ブルセラ、カンピロバクター(例えば、ジェジュニ)、クレブシエラ(例えば、ニューモニエ)、フランキア、バルトネラ、リケッチア、シュワネラ、セラチア、エンテロバクター、プロテウス、プロビデンシア、ブロコトリックス、ビフィドバクテリウム、ブレビバクテリウム、プロピオニバクテリウム、ラクトコッカス、ラクトバチルス、ペディオコッカス、リューコノストック、ビブリオ(例えば、コレラ、例えば、Ｏ１３９またはバルニフィカス)、ヘモフィルス(例えば、インフルエンザエ)、ブルセラ(例えば、アボルタス)、フランシセラ、キサントモナス、エーリキア(例えば、シャフェンシス)、クラミジア(例えば、ニューモニエ)、パラクラミジア、エンテロコッカス(例えば、フェカーリスまたはフェシウム、例えば、リネゾリド耐性)、オエノコッカスおよびアシネトバクター(例えば、バウマンニ、例えば、複数薬物耐性)の種から選択される、同じ種である、前段落の何れかの方法。
【０４６１】
１４. 宿主細胞の全が例えば、メチシリン、バンコマイシン耐性およびテイコプラニンから選択される抗生物質に耐性のスタフィロコッカス・アウレウス細胞である、請求項１３の方法。
【０４６２】
１５. 宿主細胞の全てが例えば、セファロスポリン類(例えば、セフタジジム)、カルバペネム類(例えば、イミペネムまたはメロペネム)、フルオロキノロン類、アミノグリコシド類(例えば、ゲンタマイシンまたはトブラマイシン)およびコリスチンから選択される抗生物質に耐性のシュードモナス・エルギノーサ細胞である、請求項１３の方法。
【０４６３】
１６. 宿主細胞の全てが例えば、カルバペネムに耐性のクレブシエラ(例えば、ニューモニエ)細胞である、請求項１３の方法。
【０４６４】
１７. 宿主細胞の全てが例えば、エリスロマイシン、クリンダマイシン、ベータ−ラクタム、マクロライド、アモキシシリン、アジスロマイシンおよびペニシリンから選択される抗生物質に耐性のストレプトコッカス(例えば、ニューモニエまたはピオゲネス)細胞である、請求項１３の方法。
【０４６５】
１８. 宿主細胞の全てが例えば、セフトリアキソン、アジスロマイシンおよびシプロフロキサシンから選択される抗生物質に耐性のサルモネラ(例えば、血清型チフィ)細胞である、請求項１３の方法。
【０４６６】
１９. 宿主細胞の全てが例えば、シプロフロキサシンおよびアジスロマイシンから選択される抗生物質に耐性のシゲラ細胞である、請求項１３の方法。
【０４６７】
２０. 宿主細胞の全てが例えば、イソニアジド(ＩＮＨ)、リファンピシン(ＲＭＰ)、フルオロキノロン、アミカシン、カナマイシンおよびカプレオマイシンから選択される抗生物質に耐性のマイコバクテリウム・ツベルクローシス細胞である、請求項１３の方法。
【０４６８】
２１. 宿主細胞の全てが例えば、バンコマイシンに耐性のエンテロコッカス細胞である、請求項１３の方法。
【０４６９】
２２. 宿主細胞の全てが例えば、セファロスポリンおよびカルバペネムから選択される抗生物質に耐性の腸内細菌科細胞である、請求項１３の方法。
【０４７０】
２３. 宿主細胞の全てが例えば、トリメトプリム、ニトロフラントイン、セファレキシンおよびアモキシシリンから選択される抗生物質に耐性のエシェリキア・コリ細胞である、請求項１３の方法。
【０４７１】
２４. 宿主細胞の全てが例えば、フルオロキノロン抗生物質およびカルバペネムムから選択される抗生物質に耐性のクロストリジウム(例えば、ディフィシル)細胞である、請求項１３の方法。
【０４７２】
２５. 宿主細胞の全てが例えば、セフィキシム(例えば、経口セファロスポリン)、セフトリアキソン(注射可能セファロスポリン)、アジスロマイシンおよびテトラサイクリンから選択される抗生物質に耐性のナイセリア・ゴノレー細胞である、請求項１３の方法。
【０４７３】
２６. 宿主細胞の全てが例えば、ベータ−ラクタム、メロペネムおよびカルバペネムから選択される抗生物質に耐性のアシネトバクター・バウマンニ細胞である、請求項１３の方法。
【０４７４】
２７. 宿主細胞の全てが例えば、シプロフロキサシンおよびアジスロマイシンから選択される抗生物質に耐性のカンピロバクター細胞である、請求項１３の方法。
【０４７５】
２８. 宿主細胞がベータ(β)−ラクタマーゼを産生する、前段落の何れかの方法。
【０４７６】
２９. 宿主細胞が段落１４〜２７の何れかに記載の抗生物質に対する耐性である、前段落の何れかの方法。
【０４７７】
３０. 第一標的配列が該抗生物質に対する宿主細胞耐性を付与する産物をコードする遺伝子の配列である、段落２９の方法。
【０４７８】
３１. 第一標的配列が抗生物質耐性遺伝子の配列(すなわち、抗生物質に対する宿主細胞耐性、例えば、メチシリン耐性を付与するため)および／または集団ＰＨ１、集団ＰＨ２、集団ＰＨ３および集団ＰＨ４の一つ、複数または全てが抗生物質または該抗生物質に耐性である(例えば、段落１３〜２７の何れかに記載の抗生物質)、前段落の何れかの方法。
【０４７９】
３２. ウイルス集団ＰＶ１またはＰＶ２の抑制解除されたウイルスが抗微生物活性を有し(例えば、ウイルスがファージであるときのような抗細菌活性)、所望によりここで宿主細胞または細胞が段落３０に記載する第一標的配列を含み、ここで第一標的の修飾が該抗微生物活性を提供する、前段落の何れかの方法。
【０４８０】
３３. ＰＨ４の細胞が抗生物質(例えば、段落１３〜２７の何れかに記載の抗生物質)に耐性であり、(ａ)の細胞およびＰＨ２が該抗生物質に耐性ではない、段落５に従属するときの前段落の何れかの方法。これは、培養および拡大が抗生物質耐性宿主細胞を扱うリスクなしに比較的に安全に実施できるため、薬物使用のためのウイルスの製造を助ける(および、例えばこれらの不適切な汚染および薬物製造プラントからの回避の危険)。それにも係らず、ＰＨ４に対する試験は、抗生物質耐性宿主株の使用が設定されている併設研究室または他の施設で実施できる。ＰＨ４に対して試験するとき、第一ＨＭ−ｃｒＲＮＡは、宿主細胞における耐性遺伝子の修飾が本発明のＨＭ−アレイにより可能であるように抑制解除される。
【０４８１】
３４. 宿主ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムがタイプＩ、IIまたはIIIシステムであり、標的配列が(ａ)の宿主細胞と同じ属の少なくとも１、２または３のさらなる宿主株または種における該タイプのシステムで保存されたヌクレオチド配列である、前段落の何れかの方法。
【０４８２】
３５. ウイルスがファージまたはファージミドである、前段落の何れかの方法。
【０４８３】
３６. (ｂ)のウイルスがコルチコウイルス科、シストウイルス科、イノウイルス科、レビウイルス科、ミクロウイルス科、ミオウイルス科、ポドウイルス科、シホウイルス科またはテクティウイルス科ウイルスである、段落３５の方法。
【０４８４】
３７. (ｂ)のウイルスが、ファージ、例えば、(ａ)の細胞と同じ株のものである細胞から誘発されたファージで自然に生じる、段落３５または３６の方法。
【０４８５】
３８. (ｂ)のファージが、ファージ耐性細菌を使用する選択圧を経て得られた変異ファージである、段落３５、３６または３７の方法。
【０４８６】
３９. (ｂ)において
(iv)該１以上のＨＭ−アレイが、Ｃａｓを宿主細胞における第二標的にガイドし、標的配列を修飾するように第二宿主標的配列とハイブリダイズできるＨＭ−スペーサーを含む第二ＨＭ−ｃｒＲＮＡをコードするＨＭ−アレイを含み、ここで第二標的配列は宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのヌクレオチド配列であり、それにより第二ＨＭ−ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓを第二標的にガイドして、宿主細胞における宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを修飾し、ここで第二標的配列の修飾は宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの機能を低減または排除し；そして
(ｖ)ここで(iv)のＨＭ−アレイは、第二宿主標的配列とハイブリダイズできる第二ＨＭ−ｃｒＲＮＡの転写のために(ａ)の細胞で活性である、
前段落の何れかの方法。
【０４８７】
ある実施態様において、(ii)および(iv)のＨＭ−アレイは同じＨＭ−アレイである。他の実施態様において、それらは異なるＨＭ−アレイである(例えば、異なるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタイプのアレイ、例えば、タイプＩおよびIIまたはタイプIIおよびIIIまたはタイプＩおよびIIIまたは異なるタイプIIアレイ)。
【０４８８】
４０. ＰＨ１〜４の何れか一つまたは全ての細胞が該第二標的配列を含む、段落３９の方法。
【０４８９】
４１. 第二標的配列が、段落１１〜２４の何れかに記載する細胞の属または種(例えば、ストレプトコッカス・サーモフィルスまたはストレプトコッカス・ピオゲネスまたはスタフィロコッカス・アウレウス)のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム配列と同一である、段落３９または４０の方法。
【０４９０】
４２. 第二標的配列が配列番号１〜４４からなる群から選択される配列に含まれるまたはその相補体である、段落３９〜４１の何れかの方法。
【０４９１】
４３. 第二標的配列が
Ａ. 宿主ＣＲＩＳＰＲアレイにおける反復ＤＮＡまたはＲＮＡ配列(例えば、ここで反復は最も５’反復である(第一反復))；
Ｂ. ｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡコード化ＤＮＡ配列；ＣＲＩＳＰＲアレイリーダー配列；
Ｃ. Ｃａｓ遺伝子プロモーター(例えば、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２またはＣｓｎ２プロモーター)；
Ｄ. ＣＲＩＳＰＲアレイリーダープロモーター配列または
Ｅ. Ｃａｓコード化ＤＮＡまたはＲＮＡ配列(例えば、ここでＣａｓはＣａｓ９、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２またはＣｓｎ２である)
を含む、段落３９〜４２の何れかの方法。
【０４９２】
４４. 第二標的配列が
Ｆ. 第一反復の最も５’ヌクレオチドと隣接するＣＲＩＳＰＲアレイリーダーまたはリーダープロモーター配列(および所望により反復の該最も５’ヌクレオチドを含む)；
Ｇ. 第一反復の直ぐ５’の最大２０連続ヌクレオチドの配列；
Ｈ. 第一反復の最も５’ヌクレオチドの最大２０連続ヌクレオチドの配列または
Ｉ. 第一スペーサー反復の直ぐ３’の最大２０連続ヌクレオチドの配列(および所望によりここで配列は第一スペーサー最も３’ヌクレオチドを含む)
を含む、段落３９〜４３の何れかの方法。
【０４９３】
４５.
Ｊ. 第二ＨＭ−ｃｒＲＮＡが構造Ｒ−Ｓ−Ｒを含みまたはこれからなり、ここでＲ＝ＣＲＩＳＰＲ反復およびＳ＝ＣＲＩＳＰＲスペーサーであり、ここでＳは(５’から３’方向で)Ｖ−ＨＲまたはＨＲ−Ｖを含みまたは、ここでＶ＝(ｂ)のウイルスのＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列であり、ＨＲ＝該宿主細胞ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＣＲＩＳＰＲ反復のＤＮＡ配列であり；
Ｋ. ここでＨＲの配列は、宿主ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムにおけるＶの配列に直ぐ隣接し；そして
Ｌ. ここで第二ＨＭ−ｃｒＲＮＡは、細胞における宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを修飾(例えば、開裂または不活性化)するためにＣａｓをスペーサーにガイドするために宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのスペーサーとハイブリダイズできる、
段落３９〜４４の何れかの方法。
【０４９４】
４６. Ｖ＝ウイルスＤＮＡの１または最大４０(例えば、最大１５)連続ヌクレオチドである、段落４５の方法。
【０４９５】
４７. 第二ＨＭ−ｃｒＲＮＡが(ｂ)のウイルスの核酸に実質的にハイブリダイズしない、段落３９〜４６の何れかの方法。
【０４９６】
４８.
ａ. 宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが同族ＰＡＭを認識でき；
ｂ. ここで(ｂ)のウイルスの核酸がこのようなＰＡＭをプロトスペーサー配列の直ぐ３’に含み；
ｃ. ここでＶ＝プロトスペーサーの１または最大４０(例えば、最大１５)ヌクレオチドであり；そして
ｄ. ここでＨＲ＝宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの反復の連続配列と同一の配列である、
段落４５〜４７の何れかの方法。
【０４９７】
４９. 宿主システムの反復の連続配列が宿主反復の少なくとも５０％の配列である(例えば、宿主反復の５’または３’ヌクレオチドを含む)、段落４８の方法。
【０４９８】
５０. Ｖ＝３’プロトスペーサー連続ヌクレオチドの１〜４０(例えば、最大１５)であり；そして所望により反復の連続配列は宿主反復の５’ヌクレオチドを含む、段落４５または４６の方法。
【０４９９】
５１. Ｖ＝５’プロトスペーサー連続ヌクレオチドの１〜４０(例えば、最大１５)であり、所望により反復の連続配列は宿主反復の３’ヌクレオチドを含む、段落４８または４９の方法。
【０５００】
５２. Ｒ＝宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより認識される反復である、段落４５〜５１の何れかの方法。
【０５０１】
５３. 各ＨＭ−ＣＲＩＳＰＲが(５’から３’方向で)第一反復配列、第一スペーサー配列および第二反復配列を含み、ここでスペーサー配列ｃが宿主細胞における各標的配列とハイブリダイズ可能な配列を含み、アレイはさらなる宿主細胞における反復およびスペーサーの転写のためのプロモーターを含み、所望によりｔｈｅ(ｂ)のウイルスの核酸が宿主細胞における機能的Ｃａｓおよび／またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列をコードするためのＣａｓヌクレアーゼコード化配列および／またはｔｒａｃｒＲＮＡコード化配列を含み、ここでｔｒａｃｒＲＮＡ配列が第一または第二反復と相補的である配列を含む、前段落の何れかの方法。
【０５０２】
５４. 各ＨＭ−ＣＲＩＳＰＲアレイが(５’から３’方向で)第一反復配列、第一スペーサー配列および第二反復配列を含み、ここでスペーサー配列ｃが宿主細胞における各標的配列とハイブリダイズ可能な配列を含み、アレイはさらなる宿主細胞における反復およびスペーサーの転写のためのプロモーターを含み、ここでベクターが宿主細胞におけるｔｒａｃｒＲＮＡ配列をコードするためのＣａｓヌクレアーゼコード化配列および／またはｔｒａｃｒＲＮＡコード化配列を含まず、ここでｔｒａｃｒＲＮＡ配列が第一または第二反復と相補的である配列を含み、ここでＨＭ−ＣＲＩＳＰＲアレイが、所望により宿主ｔｒａｃｒＲＮＡを使用して、Ｃａｓ(例えば、内在性宿主Ｃａｓヌクレアーゼ)を各宿主標的部位にガイドするために宿主細胞において機能的である、前段落の何れかの方法。
【０５０３】
５５. 反復が宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおける反復と同一であり、ここで各ＨＭ−ＣＲＩＳＰＲアレイが宿主ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９)により認識されるＰＡＭを含まない、段落５３または５４の方法。
【０５０４】
５６. 各ＨＭ−ＣＲＩＳＰＲアレイが１を超えるコピーのＨＭ−スペーサーを含む(例えば、少なくとも２、３または４コピー)、前段落の何れかの方法。
【０５０５】
５７. 第二または第三ＨＭ−ｃｒＲＮＡ(さらなるＨＭ−ｃｒＲＮＡ)をコードし、ここでさらなるＨＭ−ｃｒＲＮＡがＣａｓを宿主細胞における標的にガイドするために宿主標的配列とハイブリダイズできるヌクレオチド配列を含み、所望により標的配列が宿主細胞の必須、病原性または耐性遺伝子または宿主細胞のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの必須要素のヌクレオチド配列である、前段落の何れかの方法。
【０５０６】
５８. 各ＨＭ−ＣＲＩＳＰＲアレイが宿主細胞における各ＨＭ−ｃｒＲＮＡ産生のための宿主細胞の内在性ＣＲＩＳＰＲ反復配列と同一であるＣＲＩＳＰＲ反復配列を含む、前段落の何れかの方法。
【０５０７】
５９. (ｂ)のウイルスが(ａ)の宿主細胞において機能的であるＣａｓ(非宿主Ｃａｓ)をコードするヌクレオチド配列を含み(例えば、ここで非宿主ＣａｓはタイプＩシステムＣａｓであり、ここで宿主システムはタイプIIもしくはIIIである、非宿主ＣａｓはタイプIIシステムＣａｓであり、ここで宿主システムはタイプＩもしくはIIIである、または非宿主ＣａｓはタイプIIIシステムＣａｓであり、ここで宿主システムはタイプＩもしくはIIである)、所望によりここで宿主細胞は非宿主Ｃａｓと同じタイプのＣａｓを含まないかまたは発現しない、前段落の何れかの方法。
【０５０８】
６０. (ｂ)のウイルスがｔｒａｃｒＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列を含み、所望によりここでｔｒａｃｒＲＮＡ配列および第一ＨＭ−ｃｒＲＮＡは単一ガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)からなる、前段落の何れかの方法。
【０５０９】
６１. 各ＨＭ−ｃｒＲＮＡが各単一ガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)に含まれる、前段落の何れかの方法で。
【０５１０】
６２. 第一ＨＭ−アレイが第一標的配列においてＣａｓ開裂、第一標的配列(または第一標的配列の遺伝子)の活性化、第一標的配列(または第一標的配列の遺伝子)のノックダウンまたは第一標的配列の変異を引き起こすために動作可能である、前段落の何れかの方法。
【０５１１】
６３. 前段落の何れかの方法により得られるウイルス、宿主細胞またはウイルス集団であって、所望によりここで集団はＰＶ１またはＰＶ２と同一であるかまたはウイルスはこのような集団から得られる。
【０５１２】
６４. 前段落の何れかの方法により得られる宿主細胞(例えば、細菌細胞)集団であって、所望によりここで集団はＰＨ１、ＰＨ２、ＰＨ３もしくはＰＨ４または先の段落の何れかに記載した培養細胞集団と同一である。
【０５１３】
６５. 集団が(ｂ)のウイルスの核酸を含まないかまたは該第一ＨＭ−アレイまたは該第二ＨＭ−アレイを含まない(例えば、ＰＣＲで決定して)、段落６４の宿主細胞集団。
【０５１４】
６６. 医薬または歯科または眼科使用のため(例えば、生物における感染の処置もしくは予防または生物における感染拡大制限のため)の、段落６３〜６５の何れかのウイルス、宿主細胞または集団。
【０５１５】
６７. 食品、飲料、乳製品または化粧品における使用(例えば、化粧品製品、例えば、化粧品における使用)または衛生用品における使用(例えば、衛生製品、例えば、石鹸におけ使用)のための、段落６３〜６６の何れかに従うウイルス、宿主細胞または集団を含む、組成物。
【０５１６】
６８. 医薬におけるまたは歯科治療または予防使用のための、段落６３〜６７の何れかに従う組成物、ウイルス、宿主細胞または集団の使用。
【０５１７】
６９. 化粧品における使用(例えば、化粧品製品、例えば、化粧品における使用)または衛生用品における使用(例えば、衛生製品、例えば、石鹸における使用)のための、段落６３〜６８の何れかに従う組成物、ウイルス、宿主細胞または集団の使用。
【０５１８】
７０. 微生物宿主細胞修飾のための(例えば、細胞または微生物細胞の培養の死滅または増殖減少のため)の、段落６３〜６９の何れかの使用、ウイルス、宿主細胞または集団。
【０５１９】
７１. ウイルスまたは該集団におけるウイルスが宿主細胞溶解のためのホリンおよび／またはエンドリシンを発現し、所望によりここでエンドリシンがファージファイ１１、ファージＴｗｏｒｔ、ファージＰ６８、ファージファイＷＭＹまたはファージＫエンドリシン(例えば、ＭＶ−ＬエンドリシンまたはＰ−２７／ＨＰエンドリシン)である、段落１〜６３および６６〜７０の何れかの方法、ウイルスまたはウイルス集団。
【０５２０】
７２. ウイルスまたは該集団におけるウイルスが宿主細胞溶解のためのホリンおよび／またはエンドリシンを発現しない、段落１〜６３および６６〜７０の何れかの方法、ウイルスまたはウイルス集団。
【０５２１】
７３. ウイルス(例えば、(ｂ)のウイルス)または各該集団におけるウイルスが(ａ)の宿主細胞における抗微生物機能性、例えば、抗生物質、例えば、ベータ−ラクタム抗生物質(例えば、段落１３〜２７の何れかに記載の抗生物質)と組み合わされる、段落１〜６３および６６〜７０の何れかの方法、ウイルスまたはウイルス集団。
【０５２２】
腐食、バイオフィルムおよび生物付着の制御
本発明は、とりわけ産業用または家庭用システムにおける基質または流体の微生物腐食(ＭＩＣ)または生物付着を制御する方法に関する。本発明はまた本方法に使用するための処理流体およびベクターに関する。
【０５２３】
腐食は、金属(例えば、鋼または鉄)、プラスチックおよび石のような物質の劣化に至る一連の化学的、物理的および(微)生物学的過程である。これは、大きな社会的および経済的意義がある世界的問題である。現在の化学製造製品に基づく腐食制御戦略は、厳しい環境規制の増え続ける圧力下にある。さらに、それらはむしろ非効率的であり、使用する薬剤に対する微生物(例えば、細菌)耐性により妨害され得る。それ故に、環境にやさしいおよび持続可能腐食制御戦略の火急の必要性がある。腐食は、異なる電気化学反応を行い、二次効果を有し得るタンパク質および代謝物を分泌する種々の微生物の複合工程に影響される。
【０５２４】
微生物腐食過程の重大性は、工業でおよび家庭で使用されるステンレス鋼、ニッケルおよびアルミニウム含有合金のような金属および合金ならびにコンクリート、アスファルトおよびポリマーのような物質の多くが、微生物により容易に分解される事実から明らかである。保護コーティング、阻害剤、油およびエマルジョンも微生物分解の対象である。
【０５２５】
微生物腐食(ＭＩＣ)は、炭化水素製造および加工装置、水分配システム、船舶、鉄道、自動車および他のタイプの金属製および非金属製工業用および家庭用システムに影響する費用の問題である。特に、ＭＩＣは、製造、輸送および保存システムを含む炭化水素燃料基盤の相当な損傷の原因として知られ、しばしば破局的環境汚染結果となる。石油産業のパイプ腐食の約４０％が微生物学的腐食に起因し、毎年石油の製造、輸送および保存における莫大な経済損失をもたらす。パイプバイオフィルムが、壁へのインクラステーションの過程のため、装置における流体速度の減少をもたらし得る。さらに、パイプ漏出が腐食の結果として生じ、環境および生産性に結果的に影響を与える。
【０５２６】
ＭＩＣは、土壌、淡水および海水のような環境で起こり、全腐食損傷の３０パーセント超を担うと推定される。ＭＩＣは、細菌のような微生物の固定、代謝物の放出および通常腐食過程を誘発または加速するバイオフィルムの形成により生じる。腐食過程に関与する多数の細菌群は、硫黄または硫酸還元細菌(ＳＲＢ)、細胞外重合物質産生細菌(ＥＰＳＢ)、酸産生細菌(ＡＰＢ)、硫黄または硫化物酸化細菌(ＳＯＢ)；鉄またはマンガン酸化細菌(ＩＯＢ)、アンモニア産生細菌(ＡｍＰＢ)および酢酸産生細菌(ＡｃＰＢ)である。小サブユニットリボソームＲＮＡ遺伝子ピロシーケンス調査は、酢酸産生細菌(アセトバクター属およびグルコンアセトバクター属)が、燃料グレードエタノールおよび水に曝された環境において蔓延していることを示す。
【０５２７】
環境条件下での微生物増殖は、直接的または間接的に電気化学反応に影響する。微生物−基質相互作用は、最初の接着およびバイオフィルム形成に至る。細菌のような微生物の基質への結合、代謝物の放出およびバイオフィルムの形成は、基質表面で電気化学状態に影響し、腐食過程を誘発または加速し、それによりＭＩＣの過程に介在する。金属製基質上の細菌バイオフィルム形成は次の段階を含む：Ｉ  −  金属上の有機および無機分子の吸着を介するフィルムの形成、これは金属製表面上の荷重分配を修飾し、そして、また細菌の栄養源として働き、液体に存在する浮遊性微生物の粘着性を促進する；II  −  微小コロニーを形成する好気性細菌の接着および増殖；III  −  ある固着細菌による細胞外重合物質(ＥＰＳ)の製造；IV  −  厳密な嫌気性細菌に必要とされるバイオフィルムにおける局所嫌気性環境を作る、呼吸により酸素を消費する好気性浮遊性微生物細胞によるコロニー形成および；Ｖ  −  外部層の遮蔽に好ましいものであり得るバイオフィルム厚の増加。細菌により産生されたＥＰＳは、増殖のためのバイオフィルム補足必須イオンに接着し、それらは結合の手段として使用され、細菌を差次的通気領域の発生を助けることにより腐食機構を妨害する殺生物剤から保護し、それ以外に、低栄養可用性の場合、栄養源として働く。差次的通気による腐食の過程は、通気領域(バイオフィルム周囲)および非通気領域(バイオフィルムの下)を備える金属基質上のバイオフィルムの不均一な分配におより生じる。金属表面上のバイオフィルム形成は酸素含量を減らし、ほぼ完全嫌気状態のレベルに達する。シュードモナスが主ＥＰＳ生産体属である。
【０５２８】
腐食性細菌が介在するＭＩＣ生物腐食過程がの例は次のとおりである。(Ａ)淡水、海水、工業用／家庭用システムまたは貯蔵タンクからの好気性腐食性細菌が、表面上にコンディショニングフィルムを有する産業用または家庭用システムの装置およびパイプラインに到達する。(Ｂ)ＥＰＳ産生細菌が装置／パイプライン壁に付着し、ＥＰＳを産生し、これが他の微生物による接着に好ましい環境を作る。(Ｃ)パイプライン壁への他の群の腐食性細菌の接着が起こり、これがその代謝物を放出し、細胞分裂により微小コロニーに発展し、利用可能な酸素を消費する。鉄酸化細菌の作用は、三価鉄沈殿の多量の蓄積をもたらし、装置／パイプラインの遮断にいたる；硫黄酸化細菌により放出される硫酸は、環境の酸性化を促進する。(Ｄ)低酸素濃度および酸産生細菌により放出される有機酸は、硫化水素(Ｈ２Ｓ)を産生する硫酸還元細菌の接着および発展に好ましく、それにより腐食過程を加速し、局所ｐＨを下げる。(Ｅ)腐食装置／パイプラインが生じ、これは、微小漏出を伴う鉄沈殿により部分的に遮蔽され、細菌バイオフィルムを含む。Ｈ２Ｓは、侵されたシステムを操作する者に重篤な健康リスクを与える。さらに、厚いバイオフィルムおよびスラッジの製造は、生物付着に至り、システムの機能を妨害する。
【０５２９】
同様に、細菌集団水貯蔵所または貯留槽のような流体(例えば、飲料水または冷却システム中の水)でも繁殖でき、それにより流体の生物付着に介在する。これはまた流体の酸性化とも称される。例は、水路または飲料水貯留槽酸性化である。
【０５３０】
本発明は、次の態様１以下の提供により、ＭＩＣおよび生物付着の課題に取り組む。
１. 産業用または家庭用システムにおける基質の微生物腐食(ＭＩＣ)または生物付着を制御する方法であって、ここで基質の表面は基質のＭＩＣまたは生物付着に介在する第一微生物種の第一宿主細胞の集団と接触しており、
(ｉ)該集団と、細胞の形質転換または形質導入が可能な複数のベクターを接触させ、各ベクターはＣＲＩＳＰＲアレイを含み、それによりＣＲＩＳＰＲアレイが宿主細胞に導入され、ここで
(ａ)各ＣＲＩＳＰＲアレイはｃｒＲＮＡの発現のための１以上のヌクレオチド配列および宿主細胞の配列の転写のためのプロモーターを含み；そして
(ｂ)各ｃｒＲＮＡはＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１)を宿主細胞にガイドし、標的配列を修飾(例えば、標的配列を切断)するために宿主細胞における標的配列とハイブリダイズでき；標的配列は宿主細胞生存能に介在する遺伝子配列であり；そして
(ii)宿主細胞においてＣａｓ存在下該ｃＲＮＡを発現させ、それにより宿主細胞において標的配列を修飾し、宿主細胞生存能の低下および該基質のＭＩＣまたは生物付着の制御をもたらす
ことを含む、方法。
【０５３１】
例えば、システムは装置(例えば、工業工程において使用するため)を含み、表面は該装置の表面である。例えば、各アレイは、改変されたアレイ、例えば、ここに開示する任意の改変されたアレイである。ある実施態様において、ベクターは、ここに記載する改変されたＣＲＩＳＰＲ核酸ベクターである。例えば、生物付着は微生物バイオフィルムおよび／またはスラッジ形成、増殖または維持を含む。例えば、第一宿主細胞は固着である。態様１または４(下記)の例えば、“制御”は、システムにおける該ＭＩＣまたは生物付着の阻止、減少または排除または該ＭＩＣまたは生物付着の拡散減少を含む。細菌がどのようにＭＩＣまたは生物付着に介在するかの非限定的例は上に記載する。細胞増殖または増殖または維持は、例えば、細胞生存能の特徴である。それ故に、例えば、方法は宿主細胞増殖および／または維持を減少させる。例えば、方法は宿主細胞を死滅させる。
【０５３２】
２. 該宿主細胞が該基質と接触する微生物バイオフィルムに含まれる、態様１の方法。
【０５３３】
３. 該表面および宿主細胞が水溶液のような流体(例えば、海水、淡水、貯蔵された水または飲用水)と接触している、前記態様の何れかの方法。
【０５３４】
淡水は、氷床、氷冠、氷河、氷山、沼地、池、湖、川および小川として地表に、そして帯水層および地下小川において地下水として地下に自然に存在する水である。淡水は、一般に溶解している塩および他の総溶解固体の濃度が低いことにより特徴付けられる。本用語は、特に海水および半鹹水を除くが、鉄泉のような鉱物に富む水は含む。例えば、該淡水はこれらのタイプの淡水の何れかである。飲用水は、ヒトまたは動物(例えば、家畜)消費用の水である。例えば、流体は、工業用冷却水(ここでシステムは冷却システムである)、汚水(ここでシステムは汚水処理または保存システムである)、飲料水(ここでシステムは飲料水処理、保存、輸送または配送システムである)、製紙用水(ここでシステムは、紙製造または加工システムである)、スイミングプール水(ここでシステムはスイミングプールまたはスイミングプール水処理または保存システムである)、消火器水(ここでシステムは消火システムである)またはパイプ、タンク、穴、池または溝の何れかにおける工業工程水から選択される。
【０５３５】
４. 産業用または家庭用システムにおける流体の微生物の生物付着を制御する方法であって(例えば、貯留槽またはコンテナにおける液体の細菌酸性化制御のため)、ここで流体は該生物付着に介在する第一微生物種の第一宿主細胞の集団を含み、方法は
(ｉ)該集団と、細胞の形質転換または形質導入が可能な複数のベクターを接触させることを含み、各ベクターはＣＲＩＳＰＲアレイを含み、それによりＣＲＩＳＰＲアレイが宿主細胞に導入され、ここで
(ａ)各ＣＲＩＳＰＲアレイはｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列および宿主細胞の配列の転写のためのプロモーターを含み；そして
(ｂ)各ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)を宿主細胞にガイドし、標的配列を修飾する(例えば、標的配列を切断する)ために、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズでき、標的配列は宿主細胞生存能に介在する遺伝子配列であり；そして
ここで方法は、宿主細胞においてＣａｓ存在下該ｃＲＮＡを発現させ、それにより宿主細胞において標的配列を修飾し、宿主細胞生存能の低下および該生物付着の制御をもたらすことを含む。
【０５３６】
例えば、流体は液体である。例えば、流体はガス状流体である。
【０５３７】
システム：何れかの態様のためのシステムの例は次のものからなる群から選択される。
石油化学製品回収、加工、保存または輸送システム、炭化水素回収、加工、保存または輸送システム、原油回収、加工、保存または輸送システム、天然ガス回収、加工、保存または輸送システム(例えば、油井、石油掘削装置、石油採掘装置、石油ポンプ輸送システム、石油パイプライン、ガス掘削装置、ガス抽出装置、ガスポンプ輸送装置、ガスパイプライン、石油タンカー、ガスタンカー、石油貯蔵装置またはガス貯蔵装置)、水プロセシングまたは貯蔵装置、水貯留槽(例えば、飲用水貯留槽)、空気または水コンディショニング(例えば、冷却または加熱)装置、例えば、冷媒管、凝縮装置または熱交換機、医療または外科的装置、環境(例えば、土壌、水路または空気)処理装置、製紙またはリサイクリング装置、発電装置、例えば、火力または核発電装置、燃料(例えば、炭化水素燃料、例えば、石油、ディーゼルまたはＬＰＧ)貯蔵装置、採鉱または冶金、鉱物または燃料回収システム、例えば、採掘または採鉱装置、工学系、船舶装置、貨物または物品貯蔵装置(例えば、輸送コンテナ)、食品または飲料製造、加工または包装装置、洗浄装置(例えば、洗濯装置、例えば、洗濯機または食器洗浄機)、配膳(例えば、家庭用または商業的配膳)装置、飼育装置、構築(例えば、建築、公共施設基盤または道路構築)装置、航空装置、航空宇宙装置、輸送装置(例えば、動力車(例えば、自動車、大型トラックまたは小型トラック)、列車、航空機(例えば、飛行機)または海または水路輸送媒体(例えば、船舶または船、潜水艦またはホバークラフト))、包装装置、例えば、消費財包装装置または食品または飲料包装装置、電子機器(例えば、コンピューターまたは携帯電話またはその電子機器要素)または電子機器製造または包装装置、歯科装置、産業用または家庭用配管(例えば、海中パイプ)または保存コンテナ(例えば、水タンクまたは燃料タンク(例えば、ガソリンタンク、例えば、輸送媒体用ガソリンタンク))、地下装置、建築(例えば、住居または会社または商業的施設または工場または発電所)、車道、橋、農業装置、工場システム、原油または天然ガス探査装置、会社システム、および家庭用システム。
【０５３８】
例えば、システムは、農業、石油または石油産業、食品または飲料産業、衣料品産業、包装産業、電子機器産業、コンピューター産業、環境産業、化学産業、航空宇宙産業、自動車産業、生命工学産業、医療産業、健康管理産業、歯科産業、エネルギー産業、消費財産業、製薬産業、採鉱産業、清掃産業、林業、漁業産業、娯楽産業、リサイクリング産業、化粧品産業、プラスチック産業、パルプまたは紙産業、繊維製品産業、衣料品産業、革製品またはスエードまたは動物の皮革産業、タバコ産業および鋼産業からなる群から選択される産業または業界で使用される。例えば、表面または流体は、該選択産業において使用する装置の表面または流体の処理のためである。例えば、システムは粗製石油産業において使用される。例えば、システムは天然ガス産業において使用される。例えば、システムは石油産業において使用される。例えば、システムは海上コンテナ、プラットフォームまたは掘削装置(例えば、海で使用するための石油またはガスプラットフォームまたは掘削装置)、船または船舶である。ある実施態様において、このようなシステムは海に固定される、例えば、海に一時的でなく固定される、例えば、海に１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２４ヶ月以上(例えば、連続した月数)固定される。ある実施態様において、このようなシステムは国または州の海に固定され、例えば、このような海水中に一時的でなく固定され、例えば、該国の水中に１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２４ヶ月以上(例えば、連続した月数)ある。
【０５３９】
例えば、処理すべき基質表面は、ステンレス鋼、炭素鋼、銅、ニッケル、真鍮、アルミニウム、コンクリート、プラスチックまたは木材を含む。例えば、基質は金属溶接または接合である。例えば、表面は金属製(例えば、鋼または鉄)または非金属製(例えば、プラスチック、コンクリート、アスファルト、木材、ゴムまたは石)表面である。例えば、金属は合金(例えば、ステンレス鋼、真鍮またはニッケル合金、亜鉛合金、銅合金、ニッケル合金またはアルミニウム合金)である。例えば、表面は、人工ポリマー表面である。例えば、表面は基質コーティングである。例えば、基質は土壌、淡水または海水と接触している。
【０５４０】
例えば、流体は、飲用水、水路、半鹹水または液体燃料、例えば、ガソリンまたはディーゼル(例えば、自動車または電動輸送媒体用)、ＬＰＧ、灯油、アルコール(例えば、エタノール、メタノールまたはブタノール)、液体水素または液体アンモニア)であり、例えば、燃料は貯蔵液体燃料である。例えば、流体は油または非水溶液である。例えば、流体は、水路または水塊、例えば、海水、淡水、飲用水、川、小川、池、湖、貯留槽、貯蔵された水(例えば、貯水タンクまたは冷却装置)、地下水、井戸水、岩石層中の水、土壌水または雨水に含まれる液体である。例えば、液体は海水である。例えば、基質は本段落に記載する液体と接触している。例えば、流体または液体は、油、水溶液、水圧破砕流体、燃料、二酸化炭素、天然ガス、油／水混合物、燃料／水混合物、塩含有水、大洋または海水、半鹹水、水源、湖、川、小川、沼地、池、沼地、雪または氷が解けた水、泉、地下水、帯水層、沈殿、環境温度(例えば、ｒｔｐで)で液体であるあらゆる物質からなる群から選択され、疎水性であるが、有機溶媒、ヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロホルム、ジエチルエーテル、植物油、石油化学油、原油、精錬石油化学製品、揮発性必須油、化石燃料、ガソリン、炭化水素混合物、ジェット燃料、ロケット燃料、生物燃料に可溶性である。例えば、流体は油／水混合物である。
【０５４１】
ここで使用する用語“微生物腐食“または”ＭＩＣ”は、特に断らない限り、システムの何らかの要素(基質)が微生物集団、例えば、細菌または古細菌集団の少なくとも一員の作用により構造的に傷つけられる過程をいう。ここで使用する用語“生物付着”は、特に断らない限り、流体(例えば、水または水溶液または炭化水素または石油化学)と接触している基質表面に微生物(例えば細菌および／または古細菌)が蓄積する過程をいう。流体(例えば、水または水溶液または炭化水素または石油化学)中の微生物(例えば細菌および／または古細菌)の望ましくない蓄積および増殖、すなわち、流体の“酸性化”も含まれる。例えば、細菌は船または船舶バラスト水に含まれ、細菌は環境的に望ましくない。ここで使用する用語“基質”は、細胞が接着でき、バイオフィルムが形成および増殖できるかまたは生物付着(例えば軟泥またはスラッジ形成)が生じ得るあらゆるタイプの表面をいう。基質は、石油化学製品、燃料、原油またはガス配管システムにおける装置表面のような“産業用”基質または調理台またはシャワー基質または庭基質のような“非産業用”(例えば、家庭用、例えば、家庭用または会社)基質であり得る。
【０５４２】
これらの態様の何れかの別法において、宿主細菌細胞の集団の代わりに、集団は第一種の古細菌細胞の集団である。
【０５４３】
５. 該流体が水溶液(例えば、海水、淡水、貯蔵された水または飲用水)である、態様４の方法。
【０５４４】
６. 方法が流体とベクターを混合し、それにより宿主細胞とベクターを接触させることを含む、態様３〜５の何れかの方法。例えば、ベクターを液体(所望により抗生物質または殺生物剤とも)と前混合し、次いで混合物を表面(態様１)または態様４の流体と接触している流体に添加してよい。
【０５４５】
７. 各標的配列が宿主細胞病原性、耐性または必須遺伝子配列、例えば、そのエクソンまたは制御配列である、態様１〜６の何れかの方法。耐性は抗生物質耐性であり得る。例えば、宿主細胞を、宿主細胞生存能を低下させるために該抗生物質および該ベクターと接触させる。
【０５４６】
８. 標的配列の修飾が宿主細胞死滅および／または宿主細胞増殖減少をもたらす、態様１〜７の何れかの方法。増殖は、例えば、表面と接触している細胞の拡張または拡散である。
【０５４７】
９. ベクターが同一ＣＲＩＳＰＲアレイを含む、態様１〜８の何れかの方法。
【０５４８】
１０. 宿主細胞が細菌または古細菌細胞である、態様１〜９の何れかの方法。代替的に、その代わり第一細胞は藻類細胞である。
【０５４９】
１１. 第一宿主細胞が硫酸還元細菌(ＳＲＢ)細胞(例えば、デスルホビブリオまたはデスルホトマキュラム細胞)である、態様１〜１０の何れかの方法。例えば、細胞はデスルホトマキュラム・ニグリフィカンス、デスルファシナム・インフェルナム、サーモデスルフォバクテリア・モバイル、サーモデスルフォラブダス・ノルベジカス、アーキオグロブス・フルジダス、デスルホミクロビウム・アピスヘロナム、デスルホビブリオ・ガボネンシス、デスルホビブリオ・ロンガス、デスルホビブリオ・ベトナメンシス、デスルホバクテリウム・セトニクム、デスルホマクラム・ハロフィルム、出スルホバクター・ビブリオフォルミスおよびデスルホトマキュラム・サーモシステルナム細胞からなる群から選択される。例えば、集団はこれら細胞種の２以上の混合物を含む。
【０５５０】
１２. 表面または流体が原油、ガスまたは石油化学製品回収、加工、保存または輸送装置に含まれる、態様１１の方法。原油は世界中で最も重要なエネルギー資源の一つである。原油がガソリン、石油、パラフィン油、滑沢剤、アスファルト、家庭用燃料油、ワセリンおよびポリマーのような消費財に種々の技術的過程を経て精錬される、石油精製化学工業を含む多数の工業で原料として使用される。石油由来製品も多くの他の化学過程で一般に使用される。別法において、流体は、該消費製品であるかまたは表面がこのような消費製品と接触している。
【０５５１】
１３. 表面が海水、フラッキング液体または井戸の液体と接触しているかまたはここで流体が海水、フラッキング液体または井戸の液体である、態様１１または１２の方法。
【０５５２】
１４. 方法の工程(ｉ)が第二種の微生物細胞の集団(第二宿主細胞)を提供し、第二細胞が該ベクターを含み、ここでベクターが第二宿主細胞から第一宿主細胞に伝達可能であり、そして第二宿主細胞と第一宿主細胞を合わせ、それによりベクターが第一宿主細胞に導入されることを含む、態様１〜１３の何れかの方法。例えば、第二細胞は、環境(例えば、水または土壌環境中)において環境的に、産業的にまたは家庭的に許容され、第一宿主細胞は環境において許容されない。
【０５５３】
１５. 第一宿主細胞が該ベクターとの接触前に微生物細胞の混合物に含まれ(例えば、微生物バイオフィルムに含まれ)、ここで混合物が該第二種の細胞を含む、１４の方法。
【０５５４】
１６. 該第二種がバチルスまたは硝酸還元細菌または硝酸還元硫化物酸化細菌(ＮＲＢ)の種である、態様１４または１５の方法。
【０５５５】
１７. ＮＲＢがカンピロバクター属、ニトロバクター属、ニトロソモナス属、チオミクロスピラ属、スルフロスピリラム属、サウエラ属、パラコッカス属、シュードモナス属、ロドバクター属およびデスルホビブリオ属からなる群から選択されるかまたは該種の少なくとも２種を含む、態様１６の方法。
【０５５６】
１８. ＮＲＢがニトロバクター・ブルガリス、ニトロソモナス・ヨーロペア、シュードモナス・スツッツェリ、シュードモナス・エルジノーサ、パラコッカス・デニトリフィカンス、スルフロスピリラム・デレイアナムおよびロドバクター・スフェロイデスからなる群から選択される、態様１７の方法。
【０５５７】
１９. 方法が、該第一種の宿主細胞と殺生物剤を、該ベクターと同時にまたは逐次的に接触させることを含む、態様１〜１８の何れかの方法。例えば、ベクターおよび殺生物剤は、宿主細胞と接触する組成物に予め混合されて提供される。
【０５５８】
２０. 殺生物剤がテトラキスヒドロキシメチルホスホニウムスルフェート(ＴＨＰＳ)、グルタラルデヒド、一酸化塩素、二酸化塩素、次亜塩素酸カルシウム、次亜塩素酸カリウム、次亜塩素酸ナトリウム、ジブロモニトリロプロプリオンアミド(ＤＢＮＰＡ)、メチレンビス(チオシアネート)(ＭＢＴ)、２−(チオシアノメチルチオ)ベンゾチアゾール(ＴＣＭＴＢ)、ブロノポール、２−ブロモ−２−ニトロ−１,３−プロパンジオール(ＢＮＰＤ)、トリブチルテトラデシルホスホニウムクロライド(ＴＴＰＣ)、タウリンアミドおよびその誘導体、フェノール、４級アンモニウム塩、塩素含有剤、キノアクリジニウム塩、ラクトン、有機染料、チオセミカルバゾン、キノン、カルバメート、尿素、サリチルアミド、カルバニリド、グアニド、アミジン、イミダゾリン、酢酸、安息香酸、ソルビン酸、プロピオン酸、ホウ酸、デヒドロ酢酸、亜硫酸、バニリン酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、イソプロパノール、プロピレングリコール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェニルエチルアルコール、ホルムアルデヒド、ヨウ素およびその溶液、ポビドン−ヨウ素、ヘキサメチレンテトラミン、ノキシチオリン、１−(３−クロロアリル)−３,５,７−トリアゾ−１−アゾニアアダマンタンクロライド、タウロリジン、タウラルタム、Ｎ−(５−ニトロ−２−フルフリリデン)−１−アミノ−ヒダントイン、５−ニトロ−２−フラルデヒドセミカルバゾン、３,４,４’−トリクロロカルバニリド、３,４’,５−トリブロモサリチルアニリド、３−トリフルオロメチル−４,４’−ジクロロカルバニリド、８−ヒドロキシキノリン、１−シクロプロピル−６−フルオロ−１,４−ジヒドロ−４−オキソ−７−(１−ピペラジニル)−３−キノリンカルボン酸、１,４−ジヒドロ−１−エチル−６−フルオロ−４−オキソ−７−(１−ピペラジニル)−３−キノリンカルボン酸、過酸化水素、過酢酸、ナトリウムオキシクロロセン、パラクロロメタキシレノール、２,４,４’−トリクロロ−２’−ヒドロキシジフェノール、チモール、クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、セチルピリジニウムクロライド、銀スルファジアジン、硝酸銀、臭素、オゾン、イソチアゾロン、ポリオキシエチレン(ジメチルイミノ)エチレン(ジメチルイミノ)エチレンジクロライド、２−(ｔｅｒｔ−ブチルアミノ)−４−クロロ−６−エチルアミノ−５’−トリアジン(テルブチラジン)およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、態様１９の方法。例えば、殺生物剤はテトラキスヒドロキシメチルホスホニウムスルフェート(ＴＨＰＳ)である。例えば、殺生物剤は４級アンモニウム化合物である。
【０５５９】
２１. システムが採鉱、船舶、原油、ガスまたは石油化学製品回収または加工、水圧破砕、空気または水加熱または冷却、飲用水製造、保存または配送、炭化水素輸送、および廃水処理からなる群から選択される産業手段で利用される、態様１〜２０の何れかの方法。
【０５６０】
２２. 表面が該選択産業における装置の表面であるかまたはここで流体が該選択産業において使用される装置に含まれる流体である、態様２１の方法。
【０５６１】
２３. 表面が台所、入浴または園芸装置の表面であるまたはここで流体が台所、入浴または園芸装置に含まれる、態様１〜２２の何れかの方法。例えば、装置は家庭用設定で使用される。
【０５６２】
２４. 流体がコンテナ(例えば、水タンクまたはビン)に含まれる携行液体であり、表面が液体と接触しているコンテナの表面である、態様３に従属しているときの、態様１〜２３の何れかの方法。
【０５６３】
２５. 各ベクターが可動遺伝要素(ＭＧＥ)を含み、ここでＭＧＥが伝達起点(ｏｒｉＴ)および該ＣＲＩＳＰＲアレイを含み、ここでＭＧＥが該第一種の宿主細胞と該産業用または家庭用システムにおけるさらなる微生物宿主細胞で伝達可能である、態様１〜２４の何れかの方法。例えば、さらなる細胞は環境(例えば、水または土壌環境中)において環境的に、産業的にまたは家庭的に許容され、第一宿主細胞は環境において許容されない。
【０５６４】
２６. ｏｒｉＴが第一およびさらなる宿主細胞において機能的である、態様２５の方法。
【０５６５】
２７. 該第一およびさらなる宿主細胞が該表面と接触している流体のバイオフィルムに含まれるかまたはここで該細胞が該流体に含まれる、態様２５または２６の方法。
【０５６６】
２８. 該さらなる細胞が態様１６〜１８の何れかに記載する種の細胞である、態様２５、２６または２７の方法。例えば、ＭＧＥはさらなる細胞から第一宿主細胞および／またはその逆に伝達可能である。
【０５６７】
２９. さらなる細胞が該第一種の細胞である、態様２５〜２７の何れかの方法。
【０５６８】
例えば、この実施態様において、ＭＧＥは該システムにおける集団の第一細胞間で伝達可能である。ＭＧＥが他の細胞への伝達過程でそれ自体のコピーを残したら、その後これがＭＧＥ、故に、システムにおける細胞集団にわたるＣＲＩＳＰＲアレイの増殖および拡散の手段を提供し、それによりアレイの標的配列修飾効果が拡散される。これは、例えば、表面と接触しているまたは流体中のバイオフィルムにおけるアレイの拡散を起こすために有効であり、バイオフィルムの浸透として有用であり、これにより慣用の殺生物剤は最適量以下に減量できる。
【０５６９】
３０. 各ＭＧＥは組込みおよび接合性要素(ＩＣＥ)であるまたはそれを含むかまたはここで各ベクターが該第一種の宿主細胞に感染可能であるファージであり、各ＭＧＥが細胞間の該伝達が可能であるファージ核酸である、態様２５〜２９の何れかの方法。
【０５７０】
３１. 各ＩＣＥがトランスポゾン、例えば、接合性トランスポゾンである、態様３０の方法。
【０５７１】
３２. 各ベクターがプラスミドであり、所望により態様２５〜３１の何れかに従うＭＧＥを含む、態様１〜３１の何れかの方法。
【０５７２】
３３. 第一および／またはさらなる細胞がＭＧＥの他の細胞への伝達のために動作可能であるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで配列がＭＧＥに含まれない、態様２５〜３２の何れかの方法。
【０５７３】
３４. 配列がベクターに含まれない、態様３３の方法。
【０５７４】
３５. 配列が第一細胞および／またはさらなる細胞の接合性トランスポゾンに含まれる、態様３３の方法。
【０５７５】
３６. トランスポゾンが第一およびさらなる細胞間でのＭＧＥの伝達のためにトランスで動作可能である、態様３５の方法。
【０５７６】
３７. ＭＧＥのｏｒｉＴが第一細胞および／またはさらなる細胞のＩＣＥに含まれるｏｒｉＴと同一であり、ここでＩＣＥが第一およびさらなる細胞間でのＭＧＥの伝達のためにトランスで動作可能である、態様２５〜３６何れかの方法。
【０５７７】
３８. ベクターｏｒｉＴがＳＲＢまたはＮＲＢトランスポゾンのｏｒｉＴである、態様２５〜３７の何れかの方法。
【０５７８】
３９. 各ＭＧＥが反復配列間に一および第二末端反復配列および該ＣＲＩＳＰＲアレイを含む、態様２５〜３８の何れかの方法。
【０５７９】
４０. ＭＧＥがＣＲＩＳＰＲアレイコピーを(１)該さらなる宿主細胞に伝達されているとき第一宿主細胞のゲノムまたは(２)第一宿主細胞に伝達されているとき該さらなる宿主細胞に残す、態様２５〜３９の何れかの方法。例えば、コピーは細胞のゲノムに残されたトランスポゾンまたはプロファージに含まれ、そこから伝達が起こる。
【０５８０】
４１. 第一およびさらなる細胞が異なる種の細菌細胞である(例えば、それぞれＳＲＢおよびＮＲＢまたはＳＲＢおよびバチルス細胞)、態様２５〜４０の何れかの方法。
【０５８１】
４２. ＭＧＥの可動化のためにトランスポザーゼと組み合わされる、態様３０に従属するときの態様２５〜４１の何れかの方法。
【０５８２】
４３. ベクターまたはＭＧＥが該第一種の宿主細胞において動作可能である毒素−抗毒素モジュールを含み、所望によりここで毒素−抗毒素モジュールは他の種で動作不可能であるまたは動作性が低減している抗毒素遺伝子を含む、態様１〜４２の何れかの方法。これらの実施態様は、標的配列を含む第一宿主細胞におけるベクター／ＭＧＥ(および故にＣＲＩＳＰＲアレイ)の保持に好ましい選択圧を作るのに有用である。
【０５８３】
４４. ベクターまたはＭＧＥが該第二またはさらなる細胞において動作可能である毒素−抗毒素モジュールを含み、所望によりここで毒素−抗毒素モジュールが第二またはさらなる細胞で動作不可能であるまたは動作性が低減している抗毒素遺伝子を含む、態様１〜４３の何れかの方法。これは、第二またはさらなる細胞におけるＣＲＩＳＰＲアレイの集団を維持するが(例えば、このような細胞が第一細胞も含むバイオフィルムに存在するとき)、ここで毒素−抗毒素モジュールが第一宿主細胞におけるさらなる死滅(標的配列修飾の作用にわたりおよびそれを越えて)を提供するのに有用である。例えば、ベクターまたはＭＧＥは、第一宿主細胞および該第二またはさらなる細胞で動作可能である毒素−抗毒素モジュールを含む。
【０５８４】
４５. 毒素−抗毒素モジュールが第一および第二またはさらなる細胞以外の細胞で動作不可能であるまたは動作性が低減している、態様４３または４４の方法。それ故に、ＣＲＩＳＰＲアレイを維持するために第一および第二(またはさらなる)細胞両者における選択圧が存在し得る。有用なことに、これは、次いで、混合集団における細胞間のＭＧＥにおけるアレイの水平伝播のための貯留槽を提供する(例えば、表面と接触するバイオフィルムまたは流体に含まれる集団)。
【０５８５】
４６. 第一および第二細胞(または第一およびさらなる細胞)が同じ門のものであり(例えば、両細菌細胞)、ベクターが(Ａ)同じ門の他の細胞においてではなく第一細胞および／または第二(またはさらなる)細胞において、(Ｂ)同じ目の他の細胞においてではなく、第一細胞および／または第二(またはさらなる)細胞において、(Ｃ)同じ綱の他の細胞においてではなく、第一細胞および／または第二(またはさらなる)細胞において、(Ｄ)同じ目の他の細胞においてではなく、第一細胞および／または第二(またはさらなる)細胞において、(Ｅ)同じ科の他の細胞においてではなく、第一細胞および／または第二(またはさらなる)細胞において、(Ｆ)同じ属の他の細胞においてではなく、第一細胞および／または第二(またはさらなる)細胞において、または(Ｇ)同じ種の他の細胞においてではなく、第一細胞および／または第二(またはさらなる)細胞において、複製可能または動作可能である、態様２５〜４５の何れかの方法。
【０５８６】
４７. 各ＭＧＥが接合性トランスポゾンであり、ｏｒｉＴが第一およびさらなる(または第二)宿主細胞において機能的であり、ＭＧＥが反復配列間に一および第二末端反復配列および該ＣＲＩＳＰＲアレイを含み、ここで第一およびさらなる(または第二)細胞が細菌細胞であり、ここで標的部位は第一細胞に含まれるがさらなる(または第二)細胞には含まれず、ここで該修飾は第一細胞における該標的に含まれる遺伝子または制御配列を不活性化または下方制御し、第一宿主細胞生存能の低下および該ＭＩＣまたは生物付着の制御をもたらす、態様２５または態様２５に従属するときの態様２６〜４６の何れかの方法。
【０５８７】
４８. 各ＣＲＩＳＰＲアレイが第一宿主細胞における各ｃｒＲＮＡの発現および製造のために配列Ｒ１−Ｓ１−Ｒ１’を含み、
(ｉ)ここでＲ１は第一ＣＲＩＳＰＲ反復であり、Ｒ１’は第二ＣＲＩＳＰＲ反復であり、Ｒ１またはＲ１’は任意であり、
(ii)Ｓ１は該第一宿主細胞の標的配列と９５％以上同一であるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる第一ＣＲＩＳＰＲスペーサーである、
態様１〜４７の何れかの方法。
【０５８８】
４９. Ｒ１およびＲ１’が、第一宿主細胞種のＣＲＩＳＰＲアレイの第一および第二反復配列にそれぞれ少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である、態様４８の方法。ある実施態様において、Ｒ１およびＲ１’の両者が存在する。
【０５８９】
５０. Ｒ１およびＲ１’が、標的配列の修飾のために該第一種の宿主細胞のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと共に機能的である、態様４８または４９の方法。
【０５９０】
５１. 第一宿主細胞が、第一宿主細胞種のＣＲＩＳＰＲアレイの反復配列(例えば、第一反復)とそれぞれ少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である、態様４８〜５０の何れかの方法。
【０５９１】
５２. Ｒ１およびＲ１’が、配列番号５０〜７４からなる群から選択される反復配列とそれぞれ少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である、態様５１の方法。表１参照。ある実施態様において、Ｒ１およびＲ１’の両者が存在する。
【０５９２】
５３. Ｒ１およびＲ１’が、配列番号５１、５４および６９からなる群から選択される反復配列とそれぞれ少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である、態様５１の方法。配列番号５１、５４および６９は１種を超えるＳＲＢ種に見られる。これは、特に本発明のＣＲＩＳＰＲアレイで１種を超えるＳＲＢタイプをターゲティングするのに、例えば、ＳＲＢタイプが処理する産業用または家庭用システムにおいて共存するとき、例えば基質と接触させる集団またはバイオフィルムまたは処理する流体に共存するとき、有用である。ある実施態様において、Ｒ１およびＲ１’の両者が存在する。
【０５９３】
５４. Ｒ１およびＲ１’の配列が同一である、態様４８〜５３の何れかの方法。
【０５９４】
５５. 第一宿主細胞に導入された各アレイが、宿主細胞において各ｃｒＲＮＡと機能し、その標的配列を修飾する、１以上のＣａｓヌクレアーゼ(例えば、Ｃａｓ９および／またはＣｆｐ１)と組み合わせて導入される、態様１〜５４の何れかの方法。
【０５９５】
例えば、任意の形態のここでのＣａｓはヌクレアーゼ活性について脱活性化され、所望により標的配列アクティベーターまたはデプレッサーを含む。ここでのＣａｓ９は、例えばストレプトコッカス・ピオゲネスまたはスタフィロコッカス・アウレウスＣａｓ９である。
【０５９６】
５６. 第一宿主細胞に導入された各アレイが宿主細胞における各ｃｒＲＮＡと機能し、標的配列を修飾する１以上のＣａｓヌクレアーゼ(例えば、Ｃａｓ９および／またはＣｆｐ１)をコードする核酸配列と組み合わせて導入される、態様１〜５５の何れかの方法。
【０５９７】
５７. Ｒ１およびＲ１’が該第一宿主細胞における標的配列を修飾するのにタイプII  Ｃａｓ９ヌクレアーゼと機能的であり、所望によりここで方法はさらに態様５５または５６に従い、ここでＣａｓは該Ｃａｓ９である、態様４８〜５６の何れかの方法。
【０５９８】
５８. 該ベクターまたはＭＧＥの全てまたは一部が、各アレイと共に動作可能であるＣａｓヌクレアーゼコード化配列を含まない、態様１〜５７の何れかの方法。
【０５９９】
５９. 各該各アレイが第一種の細胞に見られるＣａｓエンドヌクレアーゼと共に動作可能である、態様５８の方法。
【０６００】
６０. 各ＭＧＥがアレイの反復配列と共に動作可能であるＣａｓエンドヌクレアーゼをコードする配列を欠き、ここで各ベクターがＭＧＥの外にこのような配列(例えば、Ｃａｓ９またはＣｆｐ１をコードする)を含む、態様２５または態様２５に従属するときの態様２６〜５９の何れかの方法。
【０６０１】
６１. 原油、ガスまたは石油化学製品回収、加工、保存または輸送装置(例えば、粗製石油タンカー、石油掘削装置または石油採掘装置)に含まれる基質の微生物腐食(ＭＩＣ)または生物付着を制御する方法であって、ここで基質の表面は第一宿主細胞の集団と接触し、ここで第一宿主細胞は、基質のＭＩＣまたは生物付着に介在する第一種の硫黄または硫酸還元細菌(ＳＲＢ)、細胞外重合物質産生細菌(ＥＰＳＢ)、酸産生細菌(ＡＰＢ)、硫黄または硫化物酸化細菌(ＳＯＢ)、鉄酸化細菌(ＩＯＢ)、マンガン酸化細菌(ＭＯＢ)、アンモニア産生細菌(ＡｍＰＢ)または酢酸産生細菌(ＡｃＰＢ)であり、ここで表面および細胞集団は海水、淡水、フラッキング液体または井戸中の液体からなる群から選択され(例えば、石油または天然ガス井戸)、方法は
(ｉ)細胞集団とベクターを、液体と第一宿主細胞の形質転換または形質導入が可能な複数のベクターを混合することにより接触させ、各ベクターはＣＲＩＳＰＲアレイを含み、それによりＣＲＩＳＰＲアレイが宿主細胞に導入され、ここで
(ａ)各ＣＲＩＳＰＲアレイはｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列および宿主細胞の配列の転写のためのプロモーターを含み；
(ｂ)各ｃｒＲＮＡは宿主細胞におけるＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９またはＣｆｐ１)ををガイドして標的配列を修飾する(例えば、標的配列を切断する)ために宿主細胞の標的配列とハイブリダイズ可能であり；標的配列は宿主細胞生存能に介在する遺伝子配列であり；
(ｃ)ここで(ａ)の各々の配列は、第一宿主細胞において各ｃｒＲＮＡの発現および産生のために配列Ｒ１−Ｓ１−Ｒ１’を含み、ここでＲ１は第一ＣＲＩＳＰＲ反復であり、Ｒ１’は第二ＣＲＩＳＰＲ反復であり、Ｒ１またはＲ１’は任意であり、Ｓ１は該第一宿主細胞の標的配列に７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上同一であるヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる第一ＣＲＩＳＰＲスペーサーであり、そして
(ii)宿主細胞においてＣａｓ存在下該ｃＲＮＡを発現させ、それにより宿主細胞において標的配列を修飾し、宿主細胞生存能の低下および該基質のＭＩＣまたは生物付着の制御をもたらす
ことを含む。ある実施態様において、Ｒ１およびＲ１’の両者が存在する。
【０６０２】
６２. 態様１または態様１に従属するときの前態様の何れかに従う、態様６１の方法。
【０６０３】
６３. 各ベクターが第一宿主細胞を含むファージであるかまたはＣＲＩＳＰＲアレイを含むＭＧＥ(例えば、トランスポゾン)を含むベクターであり、ここでＭＧＥが第一宿主細胞への伝達が可能である、態様６１または６２の方法。
【０６０４】
６４. 第一細胞が硫酸還元細菌(ＳＲＢ)細胞、例えば、デスルホビブリオまたはデスルホトマキュラム細胞である、態様６１、６２または６３の方法。
【０６０５】
６５. Ｒ１およびＲ１’が第一宿主細胞種のＣＲＩＳＰＲアレイの反復配列(例えば、第一反復)とそれぞれ少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり、ベクターアレイが第一種の細胞に見られるＣａｓエンドヌクレアーゼと共に動作可能である、態様６４の方法。例えば、Ｒ１およびＲ１’は同一配列である。
【０６０６】
６６. Ｒ１およびＲ１’が配列番号５０〜７４からなる群から選択される反復配列とそれぞれ少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である、態様６５の方法。例えば、Ｒ１およびＲ１’は同一配列である。
【０６０７】
６７. Ｒ１およびＲ１’が、配列番号５１、５４および６９からなる群から選択される反復配列とそれぞれ少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である、態様６６の方法。表１参照。これは、特に本発明のＣＲＩＳＰＲアレイで１を超えるＳＲＢタイプをターゲティンするとき、例えば、ＳＲＢタイプが処理する産業用または家庭用システムにおいて共存するとき、例えば基質と接触させる集団またはバイオフィルムまたは処理する流体に共存するとき、有用である。例えば、Ｒ１およびＲ１’は同一配列である。
【０６０８】
６８. 該複数のベクターがさらなるベクターを含み、ここで各さらなるベクターが該集団に含まれるさらなる宿主細胞をターゲティングするために１以上のＣＲＩＳＰＲアレイを含み、ここでさらなる宿主細胞種が第一宿主細胞種と異なり、ここで工程(ｉ)において、集団の該さらなる細胞はさらなる細胞を形質転換またはトランスデュース可能な複数の該さらなるベクターと接触しており、各ベクターはＣＲＩＳＰＲアレイを含み、それによりＣＲＩＳＰＲアレイがさらなる宿主細胞に導入され、ここで
(ａ)各ＣＲＩＳＰＲアレイはｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列および宿主細胞の配列の転写のためのプロモーターを含み；そして
(ｂ)各ｃｒＲＮＡが宿主細胞におけるＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)をガイドし、標的配列を修飾(例えば、標的配列を切断)するために該さらなる宿主細胞の標的配列とハイブリダイズ可能であり；標的配列は宿主細胞生存能に介在する遺伝子配列であり；そして
工程(ii)は該さらなる宿主細胞においてＣａｓ存在下該ｃＲＮＡの発現を可能にすることを含み、それによりさらなる宿主細胞における標的配列を修飾する、
態様１〜６７の何れかの方法。
【０６０９】
６９. さらなる宿主細胞が該基質または流体のＭＩＣまたは生物付着に介在し、ここで工程(ii)がさらなる宿主細胞生存能の低下および該基質または流体のＭＩＣまたは生物付着の制御をもたらす、態様６８の方法。
【０６１０】
７０. 船または船舶のバラスト水における細菌生物付着を制御する方法であって、ここで水が該生物付着に介在する第一微生物種の第一宿主細胞の集団を含み、方法は
(ｉ)該集団と、細胞の形質転換または形質導入が可能な複数のベクターを接触させ、各ベクターはＣＲＩＳＰＲアレイを含み、それによりＣＲＩＳＰＲアレイが宿主細胞に導入され、ここで
(ａ)各ＣＲＩＳＰＲアレイはｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列および宿主細胞の配列の転写のためのプロモーターを含み；そして
(ｂ)各ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)を宿主細胞にガイドし、標的配列を修飾する(例えば、標的配列を切断する)ために、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズでき、標的配列は宿主細胞生存能に介在する遺伝子配列であり；そして
(ii)宿主細胞においてＣａｓ存在下該ｃＲＮＡを発現させ、それにより宿主細胞において標的配列を修飾し、宿主細胞生存能の低下および該生物付着の制御をもたらす
ことを含む。
【０６１１】
７１. 第一宿主細胞がビブリオ・コレラエ、エシェリキア・コリまたはエンテロコッカス細胞である、態様７０の方法。
【０６１２】
７２. 工程(ｉ)が、例えば、船または船舶の船体において、バラスト水とベクターを混合することを含む、態様７０または７１の方法。
【０６１３】
７３. 船または船舶が海上輸送媒体であり、水が海水である、態様７０〜７２の何れかの方法。
【０６１４】
７４. 船または船舶の代わりに、バラスト水が海でのコンテナまたは掘削プラットフォーム、例えば、石油プラットフォームまたは石油掘削装置に含まれる、態様７０〜７２の何れかの方法。例えば、船、船舶、コンテナ、プラットフォームまたは掘削装置が海で固定されている(すなわち、その場所に一時的にではない)。
【０６１５】
７５. 船または船舶からバラスト水を放出する方法であって、ここで放出バラスト水が態様７０〜７４の何れかの方法による水処理を含む、方法。
【０６１６】
７６. 水が水塊、例えば、海、大洋または水路(例えば、川、運河、湖または貯留槽)またはコンテナに放出される、態様７５の方法。
【０６１７】
７７. ＣＲＩＳＰＲアレイを含むバラスト海水であって、ここでバラスト水は態様７０〜７６の何れかの方法により得るまたは得られる。
【０６１８】
７８. 態様７７のバラスト海水を含む、船、船舶、コンテナまたは掘削装置。
【０６１９】
７９. 態様６１〜６９の何れかの方法において使用するベクターであって、ここで第一細胞が硫酸還元細菌(ＳＲＢ)細胞、例えば、デスルホビブリオまたはデスルホトマキュラム細胞である、各ベクターはＳＲＢターゲティングのための１以上のＣＲＩＳＰＲアレイを含み、ここで各アレイが態様６１の(ａ)〜(ｃ)において定義されている。
【０６２０】
８０. Ｒ１およびＲ１’が態様６５〜６７の何れかに従う、態様７９のベクター。
【０６２１】
８１. 態様７０〜７６の何れかの方法において使用するベクターであって、ここで第一細胞はコレラ(例えば、ビブリオ、例えば、Ｏ１またはＯ１３９)、エシェリキア・コリまたはエンテロコッカス細胞であり、ベクターは細胞のターゲティングのために１以上のＣＲＩＳＰＲアレイを含み、ここで各アレイが態様７０の(ａ)および(ｂ)において定義される。
【０６２２】
８２. ベクターが該細胞に感染できるバクテリオファージである、態様７９〜８１の何れかのベクター。
【０６２３】
８３. ベクターが該細胞に伝達可能なトランスポゾンまたはＭＧＥである、態様７９〜８１の何れかのベクター。
【０６２４】
８４. 複数のベクターであって、ここで各ベクターが態様８２または８３に従い、所望により該細胞の生存能を低下できる殺生物剤または抗生物質と組み合わされる。
【０６２５】
ＭＩＣまたは生物付着に介在する細菌：例えば、第一宿主細胞は、硫黄または硫酸還元細菌(ＳＲＢ)、細胞外重合物質産生細菌(ＥＰＳＢ、例えば、シュードモナス)、酸産生細菌(ＡＰＢ)、硫黄または硫化物酸化細菌(ＳＯＢ)、鉄またはマンガン酸化細菌(ＩＯＢ)、アンモニア産生細菌(ＡｍＰＢ)および酢酸産生細菌(ＡｃＰＢ)からなる群から選択される。例えば、第一宿主細胞は、ＡｃＰＢ(例えば、アセトバクター属および／またはグルコナセトバクター属)であり、表面は炭化水素燃料(例えば、燃料グレードエタノール)および／または水と接触している。
【０６２６】
次は、本発明のために関連する細菌の例である(例えば、第一宿主細胞は次の種の何れかである)。アシドチオバシラス細菌は硫酸を産生する。アシドチオバシラス細菌の亜属であるアシディチオバシラス・チオオキシダンスは、しばしば管路パイプを損傷させる。フェロバチルス・フェロオキシダンスは、鉄を酸化鉄および水酸化鉄に直接酸化する。他の細菌は、種々の有機および無機両方の酸またはアンモニアを産生する。酸素存在下、チオバチルス・チオオキシダンス、チオバシラス・チオパルスおよびチオバシラス・コンクレチボラスのような好気性細菌(全３種とも環境に広く存在する)は、生物起源硫化物腐食をもたらす一般的腐食原因因子である。酸素非存在下では、嫌気性細菌、特にデスルホビブリオおよびデスルホトマクルムが一般的である。デスルホビブリオ・サレキシゲンスは少なくとも２.５％濃度の塩化ナトリウムを必要とするが、デスルホビブリオ・ブルガリスおよびデスルホビブリオ・デスルフリカンスは淡水および塩水両者で生存できる。デスルホビブリオ・アフリカヌスは、他の一般的腐食原因微生物である。デスルホトマクルム属は、硫酸還元胞子形成細菌である。デスルホトマクルム・オリエンティスおよびニグリフィカンスは腐食過程に関与する。硫酸還元因子は還元環境を必要とし、少なくとも−１００mVの電極電位がそれらの繁殖に必要である。しかしながら、産生される硫化水素が小量でも、この転換が達成され、故に増殖が、開始されたら、加速される傾向にある。
【０６２７】
例えば、第一宿主細胞は、セラチア・マルセッセンス、ガリオネラ属、シュードモナス属、バチルス属(例えば、バチルス・スブチリス、バチルス・セレウス、バチルス・プミルスまたはバチルス・メガテリウム)、チオバチルス属、スルフォロブス属、クレブシエラ・オキシトカ、シュードモナス・エルジノーサ、シュードモナス・スツッツェリ、ミクロコッカス、エンテロコッカス、スタフィロコッカス(例えば、スタフィロコッカス・アウレウス)、エンテロコッカス・フェカーリスまたはミクロコッカス・ルテウス細胞である。例えば、第一宿主細胞は該種の２以上の混合物を含む。これらの種は、インドの北西および南西領域に位置するディーゼルおよびナフサ輸送パイプラインから単離されており、これらのコンソーシアム存在下のパイプライン鋼のが実証された。種々の欧州航空機製造業者の共同事業は、航空機構築に一般に使用されるアルミニウム合金における強腐食損傷へのミクロコッカス属、エンテロコッカス属、スタフィロコッカス属およびバチルス属の単離体の関与を確認した。これらの細菌は、微小酸性環境(酸産生細菌)を作り得て、これは他の細菌に好ましいかまたはＥＰＳを産生し、バイオフィルムの形成(ＥＰＳ産生細菌)を支持する。それ故に、本発明の実施態様において、処理するシステムの表面(例えば、鋼表面)は、ディーゼルまたはナフサと接触しているかまたは処理する流体はディーゼルまたはナフサである(および所望により第一宿主細胞は、この段落で定義した１以上の種のものである)。本発明の実施態様において、処理するシステムの表面(例えば、アルミニウム含有表面、例えば、航空機表面)は、ミクロコッカス、エンテロコッカス、スタフィロコッカスおよびバチルス(第一宿主細胞)の１属、２属、３属または全属と接触する。本段落の実施態様の何れかの例えば、表面は、システムの鋼またはアルミニウム要素の表面である。
【０６２８】
酸産生細菌：好気性細菌は、酢酸、ギ酸、乳酸、プロピオン酸および酪酸のような短鎖有機酸を、有機物質の発酵性代謝からの代謝産物として産生できる。それらはまた好気性代謝により最初の生着菌である。これらの微生物は、ガススタンドおよび石油を含む多様な環境に存在する。有機酸は、ＳＲＢの基質として働き、腐食過程を加速し、それ加えて周辺媒体のｐＨを下げる。さらに、大量の産生された有機酸は金属脱分極に作用し、局所腐食性過程を開始する。
【０６２９】
硫黄酸化細菌：硫黄酸化細菌は、硫化物、亜硫酸、チオ硫酸およびある場合硫黄のような無機硫黄化合物の酸化から増殖に必要なエネルギーを得る好気性および通性嫌気性微生物である。酸化的代謝は、硫酸の産生に至り、これは環境酸性化を促進する。この群は多くの属を含み、アシドチオバシラス属が最も研究されている。この群はまたスルフォロブス属、チオミクロスピラ属、ベギアトア属、アシドチオバシラス属およびチオトリクス属から選択される細菌種ならびにチオスフェラ・パントトロファ種およびパラコッカス・デニトリフィカンス種を含む。例えば、第一宿主細胞はこれらの種の何れか一つの細胞である。
【０６３０】
鉄酸化細菌：鉄酸化細菌は、代謝に必要なエネルギーを鉄酸化により得る、大きくかつ多様な群に属する好気性微生物である。結果として、一般に基質表面に不溶性沈殿を形成する水酸化鉄の形成があり、種々の酸素レベルを有する領域を促進する。川、湖からの水および石油製品に広く発見されている。大部分自発運動鞘を有し、その存在は、腐食産物としての沈殿三価鉄の大量の蓄積により検出される。この蓄積または無機付着物は、石油パイプラインの遮断のような工業用装置に問題を起こす。最も一般的なのは、チオバチルス・フェロオキシダンスおよびクレノスリクス属、ガリオネラ属、レプトスリックス属およびスフェロチルス属である。例えば、第一宿主細胞はこれらの種の何れか一つの細胞である。
【０６３１】
硫黄または硫酸還元細菌(ＳＲＢ)：ＳＲＢは、細菌および限定嫌気性古細菌を含む形態学的および系統学的に異質の群を形成するが、いくつかの種は、酸素に相当耐容性である。それらは主にグラム陰性細菌であり、中温性およびいくつかは好熱性の、一般に胞子形成性である。これらの微生物は、電子受容体として硫酸イオンまたは他の硫黄化合物(チオ硫酸、亜硫酸など)を使用する、モノまたはジカルボン酸脂肪族酸、アルコール、炭化水素および芳香族化合物のような種々の低分子量有機化合物の酸化が可能である。アセテート、ラクテート、ピルベートおよびエタノールがＳＲＢにより使用されるとりわけ基質である。ＳＲＢ増殖の刺激は、微生物と組み合わさった腐食産物の沈着により説明されるバイオフィルムにおける、および、硫酸に富む海水のような水性媒体の注入がある石油回収中による嫌気性状態の存在のためである。大量の生物起源硫化水素が産生でき、パイプラインおよび他の石油、ガスまたは石油化学製品回収、加工、保存または輸送装置または掘削装置で形成される大量のＨ２ＳはＳＲＢの代謝活性に端を発する。石油産業における他の経済的影響は、Ｈ２Ｓによる石油およびガスの酸性化である。
【０６３２】
ＳＲＢの代謝活性と関連する多くの経済的損失を考慮して、モリブデート、ニトレートおよびニトライトのような環境的に有害かつ毒性の代謝阻害剤の使用およびＳＲＢの代謝活性制御およびその後の生物起源Ｈ２Ｓ産生の阻害を助ける殺生物剤の制御に労力が向けられている。
【０６３３】
いくつかの機構が代謝阻害剤を使用する生物起源Ｈ２Ｓの形成過程に関与する：Ｉ  −  競合的ＳＲＢ排除に至る、ＳＲＢと通常の電子供与体によるニトライトまたはニトレートの還元因子である従属栄養性細菌の間の競合；II  −  Ｈ２Ｓの生物学的産生は低酸化還元能(−１００mV未満)でのみ生じるため、ニトレート還元(亜酸化窒素および一酸化窒素)の中間体の存在による酸化還元能増加；III  −  硫酸ではなくニトレートを還元する、いくつかのＳＲＢのエネルギー代謝変化；IV  −  Ｈ２Ｓ除去に至るＨ２Ｓ再酸化にニトレートまたはニトライトを使用する硫化物酸化細菌およびニトレートまたはニトライト還元細菌；Ｖ  −  ＳＲＢにおける硫酸減少を経て最終酵素工程を阻害するニトライトによる異化性亜硫酸レダクターゼの阻害。
【０６３４】
本発明のある実施態様において、処理する基質と接触しているまたは処理する流体に含まれる宿主細胞集団はまた、本発明のベクター存在下で１以上のニトレートおよび／または１以上のニトライトと接触している。例えば、工程(ｉ)において、同時にまたは逐次的にベクター、ニトレート／ニトライトおよびベクターが、産業用または家庭用システムに含まれる石油、ガス、石油化学製品、水または他の流体と合わせられる(例えば、注入される)。同様に、これに加えてまたはこれとは別に、モリブデートも、ＳＲＢの機構の制御としてシステムで使用してよい。それ故に、ある実施態様において、処理する基質と接触しているまたは処理する流体に含まれる宿主細胞集団はまた本発明のベクター存在下で１以上のモリブデートと接触する。例えば、工程(ｉ)において、同時にまたは逐次的にベクター、モリブデートおよびベクターが、産業用または家庭用システムに含まれる石油、ガス、石油化学製品、水または他の流体と合わせられる(例えば、注入される)。
【０６３５】
他の実施態様において、集団は、本発明のベクター存在下、硝酸還元細菌および／またはニトレート還元硫化物酸化細菌(ＮＲＳＯＢ)(ここでは集合的に、“ＮＲＢ”)と接触される。例えば、同時にまたは逐次的に、ベクター、ＮＲＢは、産業用または家庭用システムに含まれる石油、ガス、石油化学製品、水または他の流体と合わせられる(例えば、注入される)。例えば、ＮＲＢは本発明のベクターを含み、ここでベクターは、ＮＲＢ細胞から第一宿主細胞(ＳＲＢ細胞)に伝達可能であり、ＮＲＢおよびＳＲＢ細胞を組み合わせた後、ベクターはＳＲＢ細胞に導入される。例えば、該ベクターとの接触前にＳＲＢ細胞が微生物細胞の混合物に含まれ(例えば、微生物バイオフィルムに含まれ)、ここで混合物はＮＲＢ種の細胞を含む。それ故に、この場合、本発明は、ＳＲＢ細胞とＮＲＢ細胞(ベクター含有)の接触を含み、ここで、ＮＲＢ細胞種は標的とするバイオフィルムにおいてＳＲＢと既に共存しており、これは、故に、ベクター含有ＮＲＢのバイオフィルム細胞集団への取り込みの適合性および機会を増やす。これは、ベクターがバイオフィルムに含まれる機会を増やし、それによりＳＲＢ細胞修飾のための有効性の機会およびバイオフィルム内の本発明のＣＲＩＳＰＲアレイの増殖の機会を増やすのに有用である(特にここに記載するとおり、アレイがトランスポゾンのような可動遺伝要素に含まれているまたはファージに含まれているとき)。
【０６３６】
ＳＲＢおよびＮＲＢは、一般に細菌増殖に必要なある油田および工業用水システムに存在する同じ非ポリマー炭素源(例えばアセテート)について競合する。ＳＲＢに対してＮＲＢの増殖速度を上げることにより、ＮＲＢは、利用可能な非ポリマー炭素源の消費においてＳＲＢと競合して排除でき、ＳＲＢの増殖し、望ましくない硫化物を産生する能力を奪い、腐食速度を減少させる。さらにＳＲＢの増殖率を下げることにより、ＮＲＢが優勢となることができ、同様にシステム、例えば、油田または工業用水システムにおける利用可能な非ポリマー炭素についてＳＲＢと競合して排除し得る。それ故に、集団におけるＳＲＢ細胞とＮＲＢの接触は、集団におけるＮＲＢ対ＳＲＢの比率の増加により、ＳＲＢ細胞生存能を低下させることを助ける。
【０６３７】
ある実施態様において、本発明は、第一宿主細胞(例えば、ＳＲＢ)を含む集団と、有機および／または無機ニトレートおよびニトライトの接触を含む。これらは、存在するＮＲＢの増殖の刺激に働き、故に、ＮＲＢがＳＲＢを負かすことを助ける。有機および無機ニトレートまたは無機ニトライトは、ある油田および工業用水システムへの注入により使用し得る。本発明における使用に利用可能な無機ニトレートおよび無機ニトライトは、例えば、硝酸カリウム、亜硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウムおよびこれらの混合物である。これらの有機および無機ニトレートおよび無機ニトライトは一般的に利用可能であるが、非限定的であり、あらゆる適切なニトレートまたはニトライトが使用され得る。
【０６３８】
使用する有機または無機ニトレートまたはニトライトの量は、システムの集団に存在する硫酸および／または有機酸の量およびＳＲＢに対抗するのに必要なＮＲＢの予測量を含む、多数の因子による。ある実施態様において、液体と接触している基質のＭＩＣの処理のためにまたは本発明に従う液体の生物付着の処理のために、使用する有機または無機ニトレートまたはニトライトの濃度は、バッチ適用法により適用したとき液体重量で２０００ppm未満、あるいは重量で５００〜１６００ppmあるいは重量で約９００〜１１００ppmであり得る。連続操作により適用したとき、有機または無機ニトレートまたはニトライトの濃度は、重量で液体の５００ppm未満、あるいは１０〜５００ppmあるいは１０〜１００ppmであり得る。
【０６３９】
ある実施態様において、集団は、本発明のベクターおよび同時にまたは逐次的にＮＲＢ(例えば、ベクターを含むもの)およびニトレートおよび／またはニトライトと接触される。
【０６４０】
適当なＮＲＢは、従属栄養性硝酸還元細菌および硝酸還元硫化物酸化細菌のような嫌気性ニトレート還元の実施ができるあらゆるタイプの細菌を含む。例えば、ＮＲＢは、カンピロバクター属、ニトロバクター属、チオバチルス属、ニトロソモナス属、チオミクロスピラ属、スルフロスピリラム属、サウエラ属、パラコッカス属、シュードモナス属およびロドバクター属からなる群から選択される１、２、３以上(例えば、１以上)のＮＲＢを含み、例えば、ＮＲＢはニトロバクター・ブルガリス、ニトロソモナス・ヨーロペア、シュードモナス・スツッツェリ、シュードモナス・エルジノーサ、パラコッカス・デニトリフィカンス、スルフロスピリラム・デレイアナムおよびロドバクター・スフェロイデスの１以上から選択される。
【０６４１】
ある実施態様において、ＮＲＢは、原油、ガス、石油化学製品または水回収、加工、輸送または貯蔵システム(例えば、その装置における)において見られるＮＲＢ株であるかまたは水井戸または油井のような地下層において見られる。ＮＲＢは、システム条件下で代謝するよう最適化され得る。ＮＲＢは、例えば、ＮＲＢ株のライブラリーから選択されるかまたは処理するシステムまたは類似システムから培養され得る。
【０６４２】
システムにおいてＳＲＢ細胞と接触させるＮＲＢの量は、予測されるＳＲＢの量、ならびに存在し得る何らかの殺生物剤を含む多数の因子により得る。地下層に注入されるとき、地下層の透過性および空隙率も同様に考慮し得る。本発明のある実施態様において、液体に注入するＮＲＢの量は、１〜１０８細菌数／液体mlまたはあるいは１０〜１０４細菌数／液体mlである。
【０６４３】
ＮＲＢのＳＲＢとの競合を刺激することに加えて、本発明のある実施態様においてさらなるＳＲＢ阻害剤をニトレートと共に導入することが望ましい場合がある。例えば、ＳＲＢを、９,１０−アントラキノン、モリブデート(例えばモリブデン酸ナトリウムおよび／またはモリブデン酸リチウム)およびこれらの混合物からなる群から選択される１以上のＳＲＢ阻害剤と接触させる。本発明のある実施態様において、モリブデートを、液体に液体の重量の５〜１００ppmの範囲で添加する。
【０６４４】
例えば、本発明のベクターおよび１以上の殺生物剤(すなわち、ＳＲＢ殺生物剤のような第一宿主細胞の殺生物剤)を、第一細胞と混合物の混合前に、例えば、混合物の処理する表面と接触している液体に注入することによりまたは混合物の処理する流体への注入により混合する。
【０６４５】
ベクター含有ＮＲＢ細胞に加えてまたはこれとは別に、本発明は、本発明のベクターを含むバチルス細胞の種の使用を企図する。
【０６４６】
ある実施態様において、ベクターは、ＳＲＢに感染可能なバクテリオファージであり、ファージは第一宿主細胞(例えば、ＳＲＢ)と接触され、それによりファージに含まれるＣＲＩＳＰＲアレイが、本発明に従うその修飾のために第一宿主細胞に導入される。ある実施態様において、第一細胞がＳＲＢであるとき、ＳＲＢはまた本発明のファージベクターおよび同時にまたは逐次的にＮＲＢと接触する。ＮＲＢとの接触の代わりにまたはそれに加えて、ＳＲＢをニトレートおよび／またはニトライトと接触させる。
【０６４７】
ＭＩＣに含まれる例示機構は次のとおりであり、ある実施態様において、方法を使用する“制御”は、
・金属表面上の水酸化鉄堆積によるバイオミネラル化の微生物(例えば、細菌)促進、界面金属／溶液の電気化学過程を修飾し、腐食を誘発する；
・バイオフィルムの形成を支持するＥＰＳの製造；
・金属の腐食に作用する、酵素アリール炭化水素ヒドロキシラーゼ(ＡＨＨ)の放出による石油製品の分解の微生物(例えば、細菌)促進；
・腐食過程を増加させる硫酸の製造；および
・硫黄の酸化
から選択される、機構の減少を含む。
【０６４８】
ある実施態様において、方法は、
・金属製表面表面上への水酸化鉄の堆積によるバイオミネラル化の細菌促進；
・ＥＰＳの製造；
・金属製表面である酵素アリール炭化水素ヒドロキシラーゼ(ＡＨＨ)の放出によるシステムにおける石油製品の分解の細菌促進；
・硫酸の製造；および
・硫黄の酸化
から選択される機構を減少させる。
【０６４９】
ＭＩＣまたは生物付着制御のための適応例
細菌と関連した腐食および／または生物付着の減少のための、本発明により企図される具体的適応例がある。下記適応は、本発明のコンセプトを限定する意図はなく、本発明が細菌誘導腐食の制御または環境汚染減少にどのように使用できるかを単に説明するものである。
【０６５０】
酸採掘抗排水：酸採掘抗排水において、細菌増殖は環境における酸性度を増加させ得る。反応スキームが酸産生のために存在し、それ故に、環境を毀損する可能性がある。酸採掘抗排水の問題は、重大な環境問題として世界的に認識されている。酸採掘抗排水の起源は、黄鉄鉱および他の硫化物含有鉱物の風化および酸化である。採掘抗排水は、黄鉄鉱、硫化鉄が空気および水に曝され、反応して硫酸を形成し、鉄を溶解するとき形成される。この鉄の一部または全てが沈殿して、採掘抗排水を含む小川の底に赤色、橙色または黄色の沈殿物を形成し得る。酸排水はさらに底または表面水に銅、鉛、水銀のような重金属を溶解させる。酸採掘抗排水が進む割合および程度は、ある種の細菌の作用により増加され得る。
【０６５１】
例えば、システムは、それ故に採掘抗であるかまたは採掘抗に含まれる。流体は採掘抗排水流体であり、本方法は採掘抗排水が原因の硫酸を減少させる。例えば、表面は採掘抗排水流体と接触する。
【０６５２】
例えば、第一宿主細胞は、アシドチオバシラス・フェロオキシダンス、アシディチオバシラス・チオオキシダンス、アシドチオバシラス・デニトリフィカンス、レプトスピリラム・フェロオキシダンスまたはスルホバチルス・サーモサルフィドオキシダンス細胞またはこれらの２以上の混合物である。
【０６５３】
水圧破砕：水圧破砕は、ガスおよび他の炭化水素の抽出を容易にするために岩層を破壊する方法である。本質的に、ガス担持層が特定されたら、ガスに近づくために、井戸が地中で垂直および水平両方向に掘削される。その後、井戸は高圧水、砂および大量の化学物質を使用して頁岩破壊に使用され、裂け目および亀裂が、水圧破砕完了後過負荷の強烈な重荷により閉じられないように維持する。何百万ガロンもの水が井戸の水圧破砕に使用される。水圧破砕流体の３０％〜７０％が表面に“逆流”して戻る。逆流は、塩を含む、水圧破砕水に溶解されている何らかの物質を含む。何が溶解されているかは土地による。逆流は、廃棄前に輸送および処理されるまで、井戸部位でプラスチック補強坑道に保持される。ある時点で大流量および比較的低い塩分濃度水が、“逆流”水から区別される、小流量であるが、はるかに高塩分濃度の“生産水”に変換される。
【０６５４】
何れの場合も微生物誘起腐食(ＭＩＣ)の問題が存在する。特に興味深いのはＳＲＢである。例えば、それ故に、システムは、水圧破砕系であり、流体は水圧破砕液体(例えば、逆流水または生産水)であるかまたは処理する表面がこのような液体と接触している。方法は、例えば、ＳＲＢ生存能を減少させ(例えば、液体中のＳＲＢを殺すおよび／またはＳＲＢ増殖を減少させる)、第一宿主細胞はＳＲＢである。
【０６５５】
例えば、第一宿主細胞は、アシドチオバシラス細菌、アシディチオバシラス・チオオキシダンス、フェロバチルス・フェロオキシダンス、チオバチルス・チオオキシダンス、チオバシラス・チオパルス、チオバシラス・コンクレチボラス、デスルフォビブリオ(例えば、サレキシゲンス、ブルガリス、デスルフリカンスまたはアフリカヌス)またはデスルホトマクルム(例えば、オリエンティスまたはニグリフィカンス)細胞またはこれらの２以上の混合物種である。
【０６５６】
冷却装置(例えば、冷却塔)：冷却塔のような冷却装置における細菌の存在は、いくつかの経過で冷却機能に悪影響を与え得る。例えば、ＳＲＢは冷却塔、熱交換機などの壁に酸性条件が形成されること促し、修復可能とはいえ、これが腐食および冷却システムのシャットダウンの可能性を導く。さらに、例えば、熱交換機の壁のバイオフィルムは、熱交換機の熱伝達係数を低下させ、冷却システムの動作効率低下をもたらす。
【０６５７】
さらに、鉄含有要素の腐食は特に有害であり得る。鉄から鉄(II)への酸化および硫酸塩から硫化物への還元とそれに続く鉄硫化物の沈殿およびその場での腐食性水素イオンの発生がＳＲＢを経て起こり得る。硫酸還元細菌による鉄の腐食は急速であり、通常の錆付きと異なり、自然制御的ではない。デスルフォビブリオにより産生される小瘤は二価鉄硫化物の軟い黒色中心部を含み、黒色磁性酸化鉄と混合された赤色酸化三価鉄の外殻部からなる。
【０６５８】
例えば、それ故に、システムは冷却システムであり、流体はシステムに含まれる流体(例えば、水または水溶液)であるかまたは処理する表面はこのような流体と接触している冷却装置の表面である。例えば、第一宿主細胞はＳＲＢである(例えば、ここに開示する何れかのＳＲＢ)。例えば、表面は鉄含有表面である。
【０６５９】
例えば、第一宿主細胞はレジオネラ細胞である。このような種は、ヒト健康に有害であり、水冷却、加熱、加工または貯蔵装置で増殖する。例えば、それ故に、システムはこのような装置である。
【０６６０】
パイプライン腐食：炭化水素および石油化学製品パイプラインは、しばしば細菌増殖を可能とするのに十分な湿気を含み、例えば、ＳＲＢによるＭＩＣがもたらされる。ＭＩＣはしばしば好気性細菌のバイオフィルムにより生じ、これは、嫌気性であって、パイプライン内部表面と直接接触しているＳＲＢを保護する。これは酸条件および他の金属腐食条件を形成し、パイプの局在化腐食および最終的故障に至る。
【０６６１】
例えば、システムは、第一宿主細胞(例えば、ＳＲＢ)と接触している表面に含まれる装置表面(例えば、パイプラインまたは掘削装置)を含む。例えば、システムは、原油、炭化水素、石油化学製品(例えば、ディーゼルまたは石油)、ガスまたは水回収、加工、保存または輸送システムである。例えば、パイプラインは石油化学製品パイプラインである。例えば、パイプラインは石油またはガス掘削装置である。例えば、パイプライン表面は海水と接触する。例えば、パイプライン表面は石油化学流体、原油または天然ガスと接触する。
【０６６２】
廃水処理：廃水処理は、有機汚染物質除去のための廃水処理プラント下流への活性化スラッジの添加を含む。それ故に、水が廃棄物処理施設で処理された後、多くの有機汚染物質が存在し、これが細菌により“消化”され得る。それ故に、活性化スラッジを、廃水処理施設からの廃水処理のためにタンク／コンテナの処理水に添加する。
【０６６３】
しかしながら、タンク／コンテナ(活性化スラッジ、廃水自体または周囲環境何れに由来するものであれ)における細菌は、極めて急速に支配し、増殖することがある。このような急速な増殖は、繊維状形態細菌増殖をもたらし得る。繊維は、タンクまたはコンテナの細菌集団の最大２０〜３０％を構成でき、浮遊する。この繊維状増殖は、バルキングスラッジとして知られるものをもたらす。本発明は、廃水処理における重要な態様であるバルキングスラッジ制御のために使用できる。
【０６６４】
それ故に、例えば、システムは水処理システムであり、表面はシステムのコンテナの表面であり、ここで表面は水と接触し、第一宿主細胞または処理する流体は該水および細胞を含む。例えば、本方法は、廃水システムのスラッジにおける細菌増殖を制御する。
【０６６５】
船舶および輸送：船および船舶は、海水または水路(例えば、川、湖、池または淡水)と接触している外表面(例えば、船体)でＭＩＣを経験し得る。内部船体表面も、ＭＩＣ介在細菌のような微生物を含み得る湿気または液体と接触している、例えば、バラスト水と接触しているため、ＭＩＣの対象であり得る。例えば、海水はしばしば海での安定性を得るために、船舶(例えば石油タンカー)の船体で運ばれ、このような海水はＳＲＢに介在できる細菌を含む。原動機駆動輸送媒体(自動車、トラック、小型トラックまたは大型トラック)、列車、航空機および航空機のような他の輸送媒体も感受性であり得る。
【０６６６】
それ故に、例えば、システムは輸送媒体(例えば、物品および／または人間または家畜輸送用、例えば、自動車、トラック、小型トラックまたは大型トラック、列車、航空機または航空機)である。例えば、媒体は船または船舶、例えば、石油、ガスまたは石油化学製品船舶(例えば、石油タンカー)である。例えば、処理する表面は海水と接触する。例えば、表面は、船または船舶の外部表面である。例えば、表面は船または船舶の内部表面である。
【０６６７】
バラスト水における細菌持続または増殖(生物付着)：本発明の特定の適用は、ビブリオ・コレラエ、エシェリキア・コリおよび／またはエンテロコッカスのような望ましくない細菌を減少させるための海上輸送媒体(例えば、船または船舶)バラスト水の処理である。
【０６６８】
船舶は、世界中の商品の９０％超を輸送し、約２０〜３０億トンのバラスト水の世界的輸送を担い、このバラスト水は船舶により安定性を維持するために日常的に輸送されている。同等量のバラスト水がまた国内的に国の内でおよび地域内で毎年輸送されている(GloBallast Partnerships, www.globallast.imo.org)。バラスト水は、自然に進化した生物多様性(その重要性の認識は高まっている)を脅かす侵略的海生物の主要な供給源として認識されている(Anil et al. 2002)。発生場所から輸送されるか輸送中に形成された意図的ではない疾患原因病原性細菌の導入は、社会およびヒト健康に直接の影響を有し得る。船舶バラストタンクは、種々の非土着脊椎動物、無脊椎動物、植物、微細藻類、細菌などを維持する(Williams et al. 1988; Carlton and Geller 1993; Smith et al. 1996; Ruiz et al. 2000; Drake et al. 2002, 2005, 2007; Mimura et al. 2005)。細菌のような微生物が、外来環境に、高天然存在度、休止段階を形成する能力および広範な環境条件に耐える能力により他の生物より多数で導入される。バラストタンクに搭載された全ての生物が生存するわけではないが、細菌および微細藻類は、嚢胞、胞子または他の生理学的休止段階の形成により、好ましくない条件で長期間十分生存できる(Roszak et al. 1983; Hallegraeff and Bolch 1992; Anil et al. 2002; Carney et al. 2011)。放出されたら、これらの微生物は受動的散布を容易にする小サイズおよび後生動物より単純な生存要件により、侵略的であるのに適する(Deming 1997)。シンガポール港の船舶で試験されたバラストサンプルにおけるビブリオ種の細胞濃度は、１.１〜３.９×１０４ml-１の範囲であった(Joachimsthal et al. 2004)。意図的ではない疾患原因病原性細菌の導入は、ヒト健康に対する影響を含め、直接の社会的影響を有し得る。先の研究において、チェサピーク湾に導入された病原体の大部分は、水柱自体よりむしろプランクトンと関連する細菌に由来することが判明した(Ruiz et al. 2000)。それ故に、細菌および古細菌のようなバラスト水微生物が、バラスト水処理／管理プログラムにおける主要な懸念である。
【０６６９】
国際海事機関(ＩＭＯ)は、２００４年の船舶のバラスト水および沈殿物の規制および管理のための国際条約(バラスト水管理条約)に適合する、これらの有害な効果の帽子を目的とした会議おｗ行った。米国において、米国水域におけるバラスト水排水に適用されるアメリカ沿岸警備隊のバラスト水管理に対する最終規則が２０１２年７月に施行された。
【０６７０】
海でのバラスト水交換は、バラスト水管理の理想的方法とは考えられておらず、処理方法の開発に相当な努力がなされている。これらの方法は、ＩＭＯのバラスト水管理条約のスタンダードＤ−２に従わなければならない。スタンダードＤ２は、処理および放出されるバラスト水は
・最小寸法５０マイクロメートルの立方メートル以上あたり１０未満の生存可能生物
・最小寸法５０マイクロメートル未満または最小寸法１０マイクロメートルのミリリットル以上あたり１０未満の生存可能生物
でなければならないことを特定する。
【０６７１】
さらに、スタンダードＤ２は、指標微生物の放出が次の特定濃度を超えてはならないことを特定する。
・１００ミリリットルあたり１コロニー形成単位(cfu)未満または１グラム(湿重量)動物プランクトンサンプルあたり１cfu未満の毒素性ビブリオ・コレラエ(Ｏ１およびＯ１３９)
・１００ミリリットルあたり２５０cfu未満のエシェリキア・コリ
・１００ミリリットルあたり１００cfu未満の腸管腸球菌。
【０６７２】
これらは、ヒト健康標準としての指標微生物であるが、これらのタイプに限定されない。実際、事実上、ある場合使用するバラスト水処理使用は、事態を悪化させ得ることが示唆されている。細菌を食する小生物の除去により、ある処理システムは、バラストタンクを細菌インキュベーターに変え、それにより処理放出物が、一貫して高濃度の、ある試験においては、未処理であった放出物より１０００倍高い、細菌を放出する。増加した細菌にはヒト病原体が含まれ得る。
【０６７３】
本発明の例えば(例えば態様７０または態様７０に従属する態様による)、それ故に、システムは船または船舶または海上輸送媒体である(例えば、船または船舶、例えば、港、ドックまたは海での石油タンカー)。例えば、第一宿主細胞を含む流体は船または船舶海上輸送媒体のバラスト水である(例えば、船または船舶バラスト水、例えば、石油タンカーバラスト水)。例えば、システムは、例えば、海での海上コンテナまたはプラットフォームまたは掘削装置(例えば、石油またはガス掘削装置)である。例えば、流体は、このようなコンテナ、プラットフォームまたは掘削装置のバラスト水である。
【０６７４】
ある実施態様において、有害細菌(本発明、例えば、態様７０または態様７０に従属する態様による第一宿主細胞)は、ビブリオ・コレラエ、ビブリオ・ルモイエンシス、ビブリオ属、エシェリキア・コリ、エンテロコッカス属、シュードモナス・シンキサンタ、シュードモナス・スツッツェリ、ビブリオ・レンタス、シュードアルテロモナス・マリナ、シュードアルテロモナス・テトラオドニス、シュードアルテロモナス属、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・オレオボランス、ビブリオ・スプレンディドゥス、ビブリオ・サイクリトロフィカス、エンテロコッカス・ヒラエ、エンテロコッカス・フェシウム、ビブリオ・ロティフェリ アヌス、シュードアルテロモナス・ウンディナ、セラチア・プリムシカ、シュードモナス・フルバ、シュードモナス・トラシー、シュードモナス・スツッツェリ、シュードモナス・スツッツェリ、ビブリオ・ツビアシイ、ハロモナス・ベヌスタ、イディオマリナ・ロイヒエンシス、ビブリオ・サイクリトロフィカス、ビブリオ・ツビアシイ、セラチア・プリムシカ、シュードアルテロモナス属、シュードアルテロモナス・アトランティカ、シュードモナス・シンキサンタ、シュードモナス・スツッツェリ、シュードアルテロモナス・カーラゲーノボラ、テナシバキュラム属、バチルス・ミコイデス、ビブリオ・ナトリージェンス、バチルス・ベキュリュンゲンシス、エンテロコッカス・ヒラエ、ラクトバチルス・ペントーサス、シュードアルテロモナス・カーラゲーノボラおよびシュードモナス・エルジノーサからなる群から選択される種のものである。
【０６７５】
例えば、第一宿主細胞は好気性従属栄養性細菌である。例えば、第一宿主細胞はビブリオ・コレラエ細胞(例えば、株Ｏ１および／またはＯ１３９)である。例えば、第一宿主細胞はエシェリキア・コリ細胞である。例えば、第一宿主細胞はエンテロコッカス属細胞である。
【０６７６】
“Characterization of Bacteria in Ballast Water Using MALDI-TOF Mass Spectrometry”, Kaveh E et al, PLoS One. 2012; 7(6): e38515; Published online 2012 Jun 7. doi:  10.1371/journal.pone.0038515(引用によりここに包含させる)は、バラスト水中の細菌のモニタリングのための適当な迅速かつ費用効果の高い方法を開示する。
【０６７７】
本発明の特定の例は次のとおりである。
船または船舶のバラスト水における細菌生物付着を制御する方法であって、ここで水は該生物付着に介在する第一微生物種(例えばコレラ、エシェリキア・コリまたはエンテロコッカス)の第一宿主細胞の集団を含み、方法は
(ｉ)該集団と、細胞の形質転換または形質導入が可能な複数のベクターを接触させ、各ベクターはＣＲＩＳＰＲアレイを含み、それによりＣＲＩＳＰＲアレイが宿主細胞に導入され、ここで
(ａ)各ＣＲＩＳＰＲアレイはｃｒＲＮＡの発現のための１以上の配列および宿主細胞の配列の転写のためのプロモーターを含み；そして
(ｂ)各ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)を宿主細胞にガイドし、標的配列を修飾する(例えば、標的配列を切断する)ために、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズでき、標的配列は宿主細胞生存能に介在する遺伝子配列であり；そして
(ii)宿主細胞においてＣａｓ存在下該ｃＲＮＡを発現させ、それにより宿主細胞において標的配列を修飾し、宿主細胞生存能の減少および該生物付着の制御をもたらす
ことを含む。
【０６７８】
例えば、工程(ｉ)が、例えば、船または船舶の船体において、バラスト水とベクターを混合することを含む。
【０６７９】
例えば、船または船舶が海上輸送媒体であり、水が海水である。船または船舶の代わりに、代替法において、バラスト水が海でのコンテナまたは掘削プラットフォーム、例えば、石油プラットフォームまたは石油掘削装置に含まれる。
【０６８０】
本発明はまた船または船舶からバラスト水を放出する方法であって、ここで放出バラスト水が上記具体例の方法により処理された水を含む。例えば、水は、水塊、例えば、海、大洋または水路(例えば、川、運河、湖または貯水池)に放出される。
【０６８１】
本発明はまたＣＲＩＳＰＲアレイを含む船または船舶バラスト水も含み、ここでバラスト水は、上記具体例により得るまたは得られる。本発明はまたＣＲＩＳＰＲアレイを含む海上コンテナバラスト水も含み、ここでバラスト水は、上記具体例により得るまたは得られる。本発明はまた海のプラットフォームまたは掘削装置(例えば、石油またはガス掘削装置)のバラスト水であって、ＣＲＩＳＰＲアレイを含む水も含み、ここでバラスト水は、上記具体例により得るまたは得られる。アレイは、具体例の(ａ)および(ｂ)に記載のとおりである。
【０６８２】
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【０６８３】
本発明はまた次のベクターおよびＣＲＩＳＰＲアレイも提供する。
８５. 細菌宿主細胞へのＣＲＩＳＰＲアレイ導入のためのベクターであって、ここで細菌は水系伝染が可能であり、ここで
(ａ)ＣＲＩＳＰＲアレイはｃｒＲＮＡの発現のための配列および該宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み；
(ｂ)ｃｒＲＮＡは、宿主細胞にＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ)をガイドし、標的配列の修飾(例えば、標的配列の切断)のために宿主細胞標的配列とハイブリダイズでき、標的配列は宿主細胞生存能介在のためのヌクレオチド配列(例えば、遺伝子または制御配列)であり；
(ｃ)ここで(ａ)の配列はｃｒＲＮＡの発現および産生のために配列Ｒ１−Ｓ１−Ｒ１’を含み、ここでＲ１は第一ＣＲＩＳＰＲ反復であり、Ｒ１’は第二ＣＲＩＳＰＲ反復であり、Ｒ１またはＲ１’は任意であり、Ｓ１は宿主細胞標的配列と８０％以上同一(例えば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一)であるヌクレオチド配列を含むまたはこれからなる第一ＣＲＩＳＰＲスペーサーである、
ベクター。
【０６８４】
“水系伝染”は、該細菌の細胞が、水または水溶液中で、異なる生物間、生物内、異なる環境間または生物と環境間で拡散できることをいう。例は、ビブリオ・コレラエ、エンテロコッカス属およびエシェリキア・コリである。ビブリオ・コレラエは、極性鞭毛を有するグラム陰性コンマ形細菌である。ガンマプロテオバクテリアの綱に属する。主要な２生物型のビブリオ・コレラエ、古典的およびＥｌ  Ｔｏｒおよび多数の血清型がある。ビブリオ・コレラエは、小腸の重篤な細菌感染であり、開発途上国での主要な死亡原因であるコレラの病原学的因子である。ビブリオ・コレラエの病原性遺伝子は、ビブリオ・コレラエ感染の検出および研究のための興味深い標的である。これらの遺伝子の大部分は、プロファージ１,２として組織かされる、ＴＣＰ(毒素同時制御線毛)およびＣＴＸ(コレラ毒素)と名づけられる二つの病原性島に位置する。ＴＣＰは、線毛を経る宿主接着に関与する遺伝子の集合を含み、一方ＣＴＸ遺伝子はコレラ毒素３の合成に関与する。
【０６８５】
ある実施態様において、ベクターは単離ベクター(すなわち、該宿主細胞中にないベクター)である。例えば、ベクターは改変されたまたは合成ベクター(すなわち、天然に存在しないベクター)である。
【０６８６】
例えば、アレイはＩＣＰ１アレイ、すなわち、ＩＣＰ１ビブリオ・コレラエファージのアレイであり、例えば、ここでファージはＩＣＰ１＿２００３＿Ａ、ＩＣＰ１＿２００４＿Ａ、ＩＣＰ１＿２００５＿Ａ、ＩＣＰ１＿２００６＿ＥまたはＩＣＰ１＿２００１１＿Ａである。例えば、アレイはＣＲ１またはＣＲ２  ＩＣＰ１ファージアレイ、例えば、このようなアレイの改変されたまたは天然に存在しない誘導体である。
【０６８７】
例えば、ＣＲＩＳＰＲアレイおよびＣａｓはタイプ１−Ｅまたはタイプ１−Ｆ、例えば、サブタイプシステム１７である。
【０６８８】
例えば、ＣＲＩＳＰＲアレイは、各々が各ｃｒＲＮＡの発言のためであり、該宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターと結合している複数の配列を含む。
【０６８９】
例えば、ベクターまたは各ベクターは、複数(例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上)の該ＣＲＩＳＰＲアレイを含む。
【０６９０】
例えば、ベクターは該Ｃａｓをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０６９１】
他の例において、ベクターはこのような配列を欠く。例えば、この場合、アレイは宿主細胞により産生される１以上のＣａｓと共に動作可能である。
【０６９２】
８６. 該細胞がビブリオ・コレラエ、エンテロコッカスまたはエシェリキア・コリ細胞である、態様８５のベクター。
【０６９３】
８７. ベクターが該Ｃａｓ発現可能なヌクレオチド配列を欠く、態様８５または８６のベクター。
【０６９４】
例えば、それ故に、ベクターはＣａｓヌクレアーゼをコードしない。別法では、ベクターは該Ｃａｓをコードする。
【０６９５】
８８. 標的配列が１７〜４５連続ヌクレオチド、例えば、１８、１９、２０または２１連続ヌクレオチドのプロトスペーサー配列である、態様８５、８６または８７のベクター。
【０６９６】
例えば、各スペーサー(Ｓ１)は１７〜４５連続ヌクレオチド、例えば、１８、１９、２０、２１、３０、３１、３２または３３連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列である。ビブリオ・コレラエＰＬＥのプロトスペーサー配列は、例えば、３２連続ヌクレオチドであり、これをターゲティングするベクターは、例えば、３２ヌクレオチドＰＬＥ配列と１００％または少なくとも８０％、９０％または９５％同一である３２連続ヌクレオチドのスペーサー配列を有する。ベクターが複数のスペーサーを含むとき、スペーサーは異なるスペーサーの混合物であっても同一スペーサーであってもよい。例えば、アレイは複数のスペーサーを含み、ここでスペーサーのサブセットは同一である。同一スペーサーは、例えば、宿主細胞の病原性因子をコードする遺伝子のプロトスペーサー配列と相同であり得る。複数スペーサーの使用は、宿主が、ベクターが細胞内にあれば、スペーサーの１以上を切断するならば有利であり得る  −  未切断スペーサーはなおｃｒＲＮＡを形成し、標的配列に誘導されることが可能である。ベクターまたはアレイにおける異なるスペーサーの混合物の使用は、宿主の侵入ベクターへの適応のリスクを最小化し、それにより耐性を最小化するために有利である。
【０６９７】
８９. 標的配列が病原性、耐性または必須遺伝子配列である、態様８５〜８８の何れかのベクター。例えば、標的配列はＰＩＣＩ様要素(ＰＬＥ)、例えば、ビブリオ・コレラエＰＬＥの配列である。例えば、ＰＬＥ１。
【０６９８】
９０. 標的配列が病原性島配列であり、所望によりここで宿主細胞がビブリオ・コレラエ細胞であり、標的配列がＴＣＰ、ＣＴＸまたはＶＰＩ配列である、態様８５〜８９の何れかのベクター。例えば(例えば、ここで宿主はビブリオである)病原性島は、ＴＣＰ(毒素同時制御線毛)またはＣＴＸ(コレラ毒素)である。ビブリオ病原性島(ＶＰＩ)は、毒素同時制御線毛(ＴＣＰ)の製造に主に含まれる遺伝子を含む。これは、２反復領域(ａｔｔ様部位)に隣接された大遺伝要素(約４０kb)であり、構造はファージゲノムを模倣する。ＶＰＩは２遺伝子クラスター、ＴＣＰクラスターおよびＡＣＦクラスターを、いくつかの他の遺伝子と共に含む。ａｃｆクラスターはａｃｆＡＢＣＤの４遺伝子からなる。ｔｃｐクラスターはｔｃｐＡＢＣＤＥＦＨＩＪＰＱＲＳＴおよび制御遺伝子ｔｏｘＴの１５遺伝子からなる。
【０６９９】
９１. 宿主細胞がビブリオ・コレラエであり、標的配列がＣＴＸφ遺伝子配列である、態様８５〜９０の何れかのベクター。コレラ毒素の遺伝子は、ビブリオ・コレラエゲノムに挿入された溶原バクテリオファージであるＣＴＸファイ(ＣＴＸφ)により運搬される。ＣＴＸφは、コレラ毒素遺伝子をあるビブリオ・コレラエ株から別の株に伝達でき、水平遺伝子伝達の一つの形態である。毒素同時制御線毛の遺伝子はＶＰＩ病原性島(ＶＰＩ)によりコードされる。
【０７００】
９２. 宿主細胞がビブリオ・コレラエであり、標的配列がｃｔｘＢ、ｔｃｐＡ、ｃｔｘＡ、ｔｃｐＢ、ｗｂｅｔ、ｈｌｙＡ、ｈａｐＲ、ｒｓｔＲ、ｍｓｈＡまたはｔｃｐＰ配列である、態様８５〜９０の何れかのベクター。
【０７０１】
９３. 標的配列が１７〜４５連続ヌクレオチド(例えば、１８、１９、２０または２１連続ヌクレオチド)であり、グラム陽性細菌のファージ誘導可能染色体島(ＰＩＣＩ)、例えば、スタフィロコッカス・アウレウス病原性島(ＳａＰＩ)の配列と少なくとも８０％(例えば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一)同一である、態様８５〜９２の何れかのベクター。ＩＣＰ１ファージ(別名ＩＣＰ１関連ファージ)スペーサー配列の例を下に提供する。これらのスペーサー配列は、ビブリオ・コレラエにおける標的配列(プロトスペーサー配列)と相同である。
【０７０２】
９４. 宿主細胞がビブリオ・コレラエであり、ｃｒＲＮＡがビブリオ・コレラエ細胞におけるプロトスペーサー隣接モチーフ(ＰＡＭ)の５、４または３ヌクレオチド内の標的配列とハイブリダイズ可能であり、ここでＰＡＭがＧＡである、態様８５〜９３の何れかのベクター。
【０７０３】
９５. 宿主細胞がビブリオ・コレラエであり、細胞がＥｌ  Ｔｏｒ、Ｏ１またはＯ１３９ビブリオ・コレラエ細胞である、態様８５〜９４の何れかのベクター。例えば、ビブリオ・コレラエは血清型Ｏ１  Ｅｌ  Ｔｏｒ  Ｎ１６９６１、Ｅｌ  Ｔｏｒ生物型１８またはＥｌ  Ｔｏｒ株ＭＪ−１２３６である。例えば、宿主細胞はエシェリキア・コリＯ１５７：Ｈ７細胞である。
【０７０４】
９６. ベクターが該宿主細胞に感染可能であるバクテリオファージである、態様８５〜９５の何れかのベクター。例えば、宿主細胞はエシェリキア・コリであり、ファージはラムダまたはＴ４ファージである。例えば、宿主細胞はエンテロコッカス細胞であり、ファージはエンテロコッカスファージＩＭＥ−ＥＦ１、ファイＥＦ２４Ｃ、ψＥｆ１またはＥＦＤＧ１である(Appl Environ Microbiol. 2015 Apr;81(8):2696-705. doi: 10.1128/AEM.00096-15. Epub 2015 Feb 6, “Targeting Enterococcus faecalis biofilms with phage therapy”, Khalifa L et al参照)。
【０７０５】
９７. 宿主細胞がビブリオ・コレラエであり、ベクターがビブリオ・コレラエ細胞に感染できるバクテリオファージである、態様９６のベクター。
【０７０６】
９８. バクテリオファージがＣＴＸφ、ＩＣＰＩファージおよびミオウイルスから選択され、例えば、ここでファージがＩＣＰ１＿２００３＿Ａ、ＩＣＰ１＿２００４＿Ａ、ＩＣＰ１＿２００５＿Ａ、ＩＣＰ１＿２００６＿ＥまたはＩＣＰ１＿２００１１＿Ａであり、所望により改変されたおよび天然に存在しないファージ、態様９７のベクター。
【０７０７】
９９. ベクターがＩＣＥであるまたはそれを含む、例えば、トランスポゾンである、態様８５〜９８の何れかのベクター。ＩＣＥは、ここに記載するＩＣＥの特性の何れかを含み得る。
【０７０８】
１００. トランスポゾンが第一から第二該宿主細胞に伝達可能である接合性トランスポゾンである、態様９９のベクター。
【０７０９】
１０１. トランスポゾンが第一細胞にＣＲＩＳＰＲアレイのコピーを残す、態様９９または１００のベクター。
【０７１０】
１０２. 本または各アレイが各可動遺伝要素(ＭＧＥ)に含まれ、ここでＭＧＥが宿主細胞において動作可能な伝達起点(ｏｒｉＴ)を含む、態様８５〜１０１の何れかのベクター。ＭＧＥは、ここに記載する任意のＭＧＥに従い得る。
【０７１１】
１０３. ベクターが改変されたベクターである、態様８５〜１０２の何れかのベクター。
【０７１２】
１０４. 態様８５〜１０３の何れかの複数のベクターを含む、水または食品処理組成物。
【０７１３】
例えば、水はバラスト水、海水、半鹹水、淡水、飲料水、水路水(例えば、河口半塩水)または工業用水である。例えば、水は、ヒトＧＩ管流体における水である。
【０７１４】
例えば、宿主細胞は甲殻類、魚類、米または穀物に含まれる。例えば、組成物は食品処理のためであり、宿主細胞はエシェリキア・コリＯ１５７：Ｈ７細胞である。例えば、標的配列は、エシェリキア・コリ(例えば、Ｏ１５７：Ｈ７)宿主細胞における志賀毒素をコードする配列である。ここまで記載してきた水系種の代替として、宿主細胞はサルモネラまたはリステリア細胞である。
【０７１５】
１０５. 態様８５〜１０３の何れかの複数のベクターを含む、ヒトにおけるビブリオ・コレラエ感染の処置または予防用医薬。代替として、本発明は、複数の本発明のベクターを含む、ヒトにおけるエシェリキア・コリ感染の処置または予防用医薬を提供する。代替として、本発明は、複数の本発明のベクターを含む、ヒトにおけるエンテロコッカス感染の処置または予防用医薬を提供する。
【０７１６】
１０６. さらに抗宿主細胞抗生物質または抗宿主細胞殺生物剤を含む、態様１０４または１０５の組成物または医薬。
【０７１７】
下記例５はコレラに関する例である。
【０７１８】
一般的特性の何れか(下記参照)も、本形態に適用し得る(第六形態)。下記のあらゆる形態を本形態と組み合わせ、例えば、ここに請求する１以上の特性の組み合わせを提供することができる。
【０７１９】
ＣＡＳ活性制御
本発明のこれらの態様は、例えば、細胞またはインビトロで、Ｃａｓ活性を制御するのに有用である。本発明は、Ｃａｓコード化遺伝子のＣａｓ活性を制限するためのターゲティングに関し、これは、Ｃａｓの一過性制御に有益である。本発明はまた、例えば、細胞の修飾ゲノムにおける標的外Ｃａｓ切断の機会を減らすための、高いストリンジェンシーが望ましい設定でも有用であり得る。適用は、例えば、細胞または細胞を含む組織または生物の遺伝子治療または遺伝子ターゲティングのために、標的外効果が最小化または排除されなければならない、例えば、ヒト、動物または植物細胞の修飾における。例えば、極めて高いストリンジェンシーが、Ｃａｓ修飾をヒトにおける遺伝子治療または疾患もしくは状態の処置もしくは予防のために患者に投与されるヒト細胞(例えば、ｉＰＳ細胞)の所望の変更に使用されるとき、必要である。本開示は、本発明の方法および製品の一部としてこれらの適用を提供する。
【０７２０】
本発明は、故に、次の各項を提供する。
１. 第一Ｃａｓをコードする発現可能な遺伝子を修飾する方法であって、
(ａ)ガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ１)とＣａｓ遺伝子を、該遺伝子から発現される第一Ｃａｓの存在下で合わせ、そして
(ｂ)ｇＲＮＡ１を該Ｃａｓ遺伝子の配列(例えば、そのプロモーターまたは第一Ｃａｓコード化ＤＮＡ配列)とハイブリダイズさせて、第一Ｃａｓを遺伝子にガイドさせ、それによりＣａｓがＣａｓ遺伝子を修飾する
ことを含む、方法。
【０７２１】
例えば、方法はインビトロでの無細胞方法(例えば、リコンビニアリング方法)である。他の例において、方法は細胞で実施され、例えば、ここで遺伝子はそれ自体コードするＣａｓにより切断される(すなわち、内在性Ｃａｓが遺伝子切断に使用される)。
【０７２２】
２. Ｃａｓがヌクレアーゼであり、Ｃａｓ遺伝子が切断される、項１の方法。
【０７２３】
３. Ｃａｓ遺伝子が変異、下方制御または不活性化されている、項１または２の方法。
【０７２４】
４. 第一ＣａｓがＣａｓ９である、項１〜３の何れかの方法。
【０７２５】
５. ｇＲＮＡ１が単一ガイドＲＮＡである、項１〜４の何れかの方法。
【０７２６】
６. 方法が宿主細胞内で実施される、項１〜５の何れかの方法。
【０７２７】
７. 該細胞が原核細胞、例えば、細菌または古細菌細胞(例えば、エシェリキア・コリ細胞)である、項６の方法。
【０７２８】
８. 方法がリコンビニアリング方法である、項６の方法。
【０７２９】
９. 該細胞がヒトまたは非ヒト動物病原体種または株(例えば、スタフィロコッカス・アウレウス)である、項６、７または８の方法。
【０７３０】
１０. 該細胞がヒトマイクロバイオーム種、例えば、ヒト腸マイクロバイオーム種の細胞である、項６〜９の何れかの方法。
【０７３１】
１１. Ｃａｓ遺伝子が宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに含まれる、項６〜１０の何れかの方法。
【０７３２】
所望により外来性第一Ｃａｓコード化配列は、例えば宿主細胞がｇＲＮＡ１と同族である野生型内在性Ｃａｓヌクレアーゼを含むとき、方法において使用されない。
【０７３３】
１２. 該細胞が真核細胞(例えば、ヒト、非ヒト動物、酵母または植物細胞)である、項６の方法。
【０７３４】
１３. 方法が非ヒト胚、非ヒト接合体、非ヒト生殖細胞またはヒトまたは動物(例えば、ここで方法は美容的方法)で実施され、所望によりここで方法が手術または治療によりヒトまたは動物を処置するもしくは診断のための方法ではない、項１２の方法。
【０７３５】
１４. Ｃａｓ遺伝子が工程(ａ)において細胞に導入される核酸に含まれる、項６〜３の何れかの方法。
【０７３６】
１５. 核酸ベクターによる形質転換に対する宿主細胞耐性発現の減少または宿主細胞における核酸ベクターの維持のための、項６〜４の何れかの方法。
【０７３７】
１６. ヒトまたは動物の治療、予防または診断のための、項１〜１５の何れかの方法またはその核酸または細胞産物(例えば、方法をヒトまたは動物細胞実施するときヒトまたは動物、ヒトまたは動物細胞の遺伝子治療のためまたは方法を細菌細胞で実施するときヒトまたは動物における細菌感染処置または予防のため)。
【０７３８】
１７. 方法がインビトロで実施される、項１〜６の何れかの方法。
【０７３９】
１８. 方法がインビボで実施され、所望によりヒト胚においてではなく、所望によりここで方法が手術または治療によりヒトまたは動物を処置するもしくは診断のための方法ではない、項１〜１６の何れかの方法。
【０７４０】
１９. ｇＲＮＡ１が工程(ａ)におけるＣａｓ遺伝子と組み合わさった第一核酸からの転写により産生される、項１〜１８の何れかの方法。
【０７４１】
２０. 方法が細胞で実施され、ｇＲＮＡ１をコードする第一核酸が工程(ａ)において細胞に導入されるかまたはｃｒＲＮＡをコードする第一核酸が工程(ａ)において細胞に導入され、ここでｃｒＲＮＡが細胞におけるｔｒａｃｒＲＮＡとｇＲＮＡ１を形成する、項１９の方法。
【０７４２】
２１. Ｃａｓ遺伝子が第一Ｃａｓにより修飾される標的部位(ＣＳ−ｔ)を含む標的核酸と組み合わされ、ここで
Ｉ. Ｃａｓ遺伝子が第一Ｃａｓと同族であるＰＡＭ(Ｐ１)に隣接する第一プロトスペーサー(ＰＳ１)を含み、ここでＰＳ１が第一Ｃａｓにより第一部位(ＣＳ１)で修飾(例えば、切断)され；
II. ｇＲＮＡ１が第一ＣａｓのガイドのためにＰＳ１と相補性である配列を含み、ここでＰＳ１が工程(ｂ)においてＣＳ１で修飾され；
III. 標的核酸がＰＡＭ(Ｐ−ｔ)に隣接するプロトスペーサー配列(ＰＳ−ｔ)を含み、ここでＰ−ｔは第一Ｃａｓと同族であり；
IV. 工程(ｂ)の前または間に、方法はガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ−ｔ)と標的核酸および該遺伝子により発現される第一Ｃａｓを接触させることを含み、ここでｇＲＮＡ−ｔはＰＳ−ｔとハイブリダイズし、第一ＣａｓをＣＳ−ｔの修飾のためにガイドし；そして
Ｖ. 方法は、所望により修飾標的核酸の単離または配列決定を含む、
項１９または２０の方法。
【０７４３】
２２. ｇＲＮＡ−ｔが工程IVにおいてＣａｓと組み合わされる核酸(例えば、該第一核酸)からの転写により産生される、項２１の方法。
【０７４４】
２３. 方法が細胞で実施され、核酸がｃｒＲＮＡをコードし、ここでｃｒＲＮＡが細胞においてｔｒａｃｒＲＮＡを有するｇＲＮＡ−ｔを形成する、項２２の方法。
【０７４５】
２４. ｇＲＮＡ１の製造がｇＲＮＡ−ｔの製造後に開始され、それによりＰＳ１が第一Ｃａｓ発現の下方制御または不活性化のために修飾(例えば、切断)される前に、ＰＳ−ｔが標的核酸のコピーにおいて修飾(例えば、切断)される、項２１〜２３の何れかの方法。
【０７４６】
２５. さらに切断標的核酸とさらなる核酸を合わせることを含み、それにより核酸間の相同指向組換えが起こり、そして
(ｉ)標的核酸のヌクレオチド配列が削除され；
(ii)さらなる核酸のヌクレオチド配列が削除され；
(iii)標的核酸のヌクレオチド配列がさらなる核酸に挿入され；および／または
(iv)さらなる核酸のヌクレオチド配列が標的核酸に挿入される、
項１〜２４の何れかの方法。
【０７４７】
２６. (ｉ)が起こり、それにより標的核酸のヌクレオチド配列または調節要素が不活性化される、項２５の方法。
【０７４８】
２７. (ｉ)が起こり、それにより標的核酸のヌクレオチド配列または調節要素が活性化される、項２５の方法。
【０７４９】
２８. (ii)が起こり、それによりさらなる核酸のヌクレオチド配列または調節要素が不活性化される、項２５、２６または２７の方法。
【０７５０】
２９. (ii)が起こり、それによりさらなる核酸のヌクレオチド配列または調節要素が活性化される、項２５、２６または２７の方法。
【０７５１】
３０. (iii)が起こり、所望により挿入配列をさらなる核酸の調節要素と機能的相関させおよび／または新規マーカー配列を作る、項２５〜２９の何れかの方法。
【０７５２】
３１. (iv)が起こり、所望により挿入配列を標的核酸の調節要素と機能的相関させおよび／または新規マーカー配列を作る、項２５〜３０の何れかの方法。
【０７５３】
３２. さらに相同指向組換えが生じていることを決定するために新規マーカー配列またはその発現産物を検出することを含む、項３０または３１の方法。
【０７５４】
３３. さらに標的核酸産物、さらなる核酸産物および／または第一ベクター産物の単離または配列決定を含む、項２１〜３２の何れかの方法。
【０７５５】
３４. 第一ベクターが項３５〜５５の何れかに定義されている、項１〜３３の何れかの方法。
【０７５６】
３５. 例えば、項１の方法における使用のための、第一(例えば、単離)核酸ベクターまたはベクターの組み合わせであって、ここで
(ａ)第一ベクターまたは該組み合わせのベクターは、第一Ｃａｓをガイドして、第一部位(ＣＳ１)で予定したプロトスペーサー配列(ＰＳ１)を修飾するためにＰＳ１と相補性であるガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ１、例えば、単一ｇＲＮＡ)を含み、ここでＰＳ１は第一Ｃａｓと同族であるＰＡＭ(Ｐ１)に隣接するかまたは発現可能な配列はｔｒａｃｒＲＮＡとｇＲＮＡ１を形成するｃｒＲＮＡをコードし；そして
(ｂ)ＰＳ１およびＰ１は発現可能な第一Ｃａｓコード化遺伝子の配列であり、ＰＳ１は第一ＣａｓによりＣＳ１で修飾され得る。
【０７５７】
何れかの形態におけるここでの各ベクターは、特定の配列を運搬する直線状または環状(例えば、閉鎖環状、所望によりスーパーコイル)ＤＮＡであり得る。
【０７５８】
３６. 第一Ｃａｓがヌクレアーゼであり、ここでＣＳ１がヌクレアーゼにより切断可能である、項３５のベクターまたは組み合わせ。
【０７５９】
３７. 第一ＣａｓがＣａｓ９である、項３５または３６のベクターまたは組み合わせ。
【０７６０】
３８. ｇＲＮＡ１が単一ガイドＲＮＡである、項３５〜３７の何れかのベクターまたは組み合わせ。
【０７６１】
３９. ヌクレオチド配列が、ｇＲＮＡ１産生のために原核細胞(例えば、細菌または古細菌細胞)において発現可能である、項３５〜３８の何れかのベクターまたは組み合わせ。
【０７６２】
４０. 項３９のベクターまたは組み合わせを含む、リコンビニアリングキット(例えば、ここで該細胞はリコンビニアリング許容エシェリキア・コリ細胞である)。
【０７６３】
４１. ヌクレオチド配列がｇＲＮＡ１産生のために真核細胞(例えば、ヒト、動物、植物または酵母細胞)で発現可能である、項３５〜３８の何れかのベクターまたは組み合わせ。
【０７６４】
４２. 第一ベクターまたは該組み合わせのベクター(例えば、第二ベクター)が第一Ｃａｓをガイドし、ＰＳ−ｔを修飾(例えば、切断)するために標的核酸の予定したプロトスペーサー配列(ＰＳ−ｔ)と相補的であるガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ−ｔ、例えば、単一ｇＲＮＡ)をコードする発現可能なヌクレオチド配列を含むまたは発現可能な配列がｔｒａｃｒＲＮＡと共にｇＲＮＡ−ｔを形成するｃｒＲＮＡをコードし、標的核酸がＰＡＭ(Ｐ−ｔ)に隣接するＰＳ−ｔをコードし、ここでＰ−ｔはＰＳ−ｔ修飾のために第一Ｃａｓと同族である、項３５〜４１の何れかのベクターまたは組み合わせ。
【０７６５】
４３. さらに該標的核酸と組み合わされる、項４２のベクターまたは組み合わせ。
【０７６６】
４４. 該標的核酸が細胞の染色体またはエピソーム核酸である、項４３のベクターまたは組み合わせ。
【０７６７】
４５. 該細胞がヒトまたは非ヒト動物病原体種または株の細胞(例えば、スタフィロコッカス・アウレウス)である、項４４のベクターまたは組み合わせ。
【０７６８】
４６. 該細胞がヒトマイクロバイオーム種、例えば、ヒト腸マイクロバイオーム種の細胞である、項４４または４５のベクターまたは組み合わせ。
【０７６９】
４７. ＰＳ−ｔが細胞(例えば、原核細胞)の必須遺伝子、病原性遺伝子または抗生物質耐性遺伝子配列に含まれる、項４４〜４６の何れかのベクターまたは組み合わせ。
【０７７０】
４８. 遺伝子が、第一ＣａｓがＰＳ−ｔを修飾(例えば、切断)したとき、下方制御または不活性化される、項４７のベクターまたは組み合わせ。
【０７７１】
４９. 遺伝子が、第一ＣａｓがＰＳ−ｔを修飾したとき上方制御または活性化される、項４７のベクターまたは組み合わせ。
【０７７２】
５０. 第一Ｃａｓをコードする該遺伝子と組み合わされる(例えば、第一ベクターに含まれる)、項３５〜４９の何れかのベクターまたは組み合わせ。
【０７７３】
５１. 細胞内にあるときの項３５〜５０の何れかのベクターまたは組み合わせであって、ここで該細胞が第一Ｃａｓをコードする該遺伝子を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む。
【０７７４】
５２. ヒトまたは非ヒト動物における疾患または状態の処置、予防または診断のための、例えば、方法をヒトまたは動物細胞で実施するときヒトまたは動物、ヒトまたは動物細胞の遺伝子治療のためまたは方法を細菌細胞で実施するときヒトまたは動物における細菌感染処置または予防のための、項３５〜５１の何れかのベクターまたは組み合わせ。
【０７７５】
５３. 項３５〜５２の何れかの第一ベクターまたは組み合わせを含む、食糧、食品成分または前駆体成分、飲料、水(例えば、ヒト消費用が意図される)、工業用または環境物質(例えば、石油、石油製品、土壌または水路または貯留槽または石油、石油製品、土壌、水、食糧、食糧成分または前駆体または飲料または飲料成分の前駆体回収または加工用装置)。
【０７７６】
５４. 項３５〜５２の何れかの第一ベクターまたは組み合わせを含む、抗生物質(例えば、抗細菌または抗古細菌)組成物。
【０７７７】
５５. 項３５〜５２の何れかの第一ベクターまたは組み合わせを含む、ヒトまたは動物における疾患または状態(例えば、細菌感染または肥満)処置または予防のための医薬。
【０７７８】
例えば、ベクター、組み合わせ、医薬または抗生物質は医薬デバイスまたは医薬容器(例えば、シリンジ、吸入器またはIVバッグ)に含まれる。
【０７７９】
一般的特性の何れか(下記参照)も、本形態に適用し得る。下記のあらゆる形態は、本形態と組み合わせ可能であり、例えば、ここで請求する１以上のものに包含させるための特性の組み合わせを提供する。
【０７８０】
一般に適用可能な特性
次の特性を、本発明のあらゆる形態(例えば、その態様、実施態様、コンセプト、段落または例の何れか)に適用する。
例えば、標的配列は染色体配列、内在性宿主細胞配列、野生型宿主細胞配列、非ウイルス染色体宿主細胞配列であり、外来性配列および／または非ファージ配列ではなく(すなわち、これらの１以上または全て)、例えば、配列は宿主細胞染色体に含まれる抗生物質耐性遺伝子または必須遺伝子配列のような野生型宿主染色体細胞配列である。例えば、配列は宿主細胞プラスミド配列、例えば、抗生物質耐性遺伝子配列である。
【０７８１】
例えば、少なくとも２標的配列、例えば抗生物質耐性遺伝子および必須遺伝子がＣａｓにより修飾される。この方法での複数ターゲティングは、回避変異体宿主細胞の進化を減らすのに有用であり得る。
【０７８２】
例えば、Ｃａｓは野生型内在性宿主細胞Ｃａｓヌクレアーゼであり、／または各宿主細胞は野生型宿主細胞である。それ故に、ある実施態様において、本発明は、関連するＣａｓ活性を提供するために、まず内在性Ｃａｓを抑制解除する必要なく、宿主細胞を使用する。例えば、各宿主細胞は構成的Ｃａｓヌクレアーゼ活性、例えば、構成的野生型Ｃａｓヌクレアーゼ活性を有する。例えば、宿主細胞は細菌細胞であり、他の例において、宿主細胞は古細菌細胞である。内在性Ｃａｓの使用は、ＨＭ−またはＰＭ−ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードするベクターのための空間の解放を可能とするため、有利である。例えば、タイプII  Ｃａｓ９ヌクレオチド配列は大きく、代わりの宿主細胞の内在性Ｃａｓの使用は、タイプII  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが本発明において宿主細胞修飾のために使用されるとき、有利である。４.２キロベース(kb)の寸法である、最も一般的に用いられるＣａｓ９はストレプトコッカス・ピオゲネス由来である。効率的なヌクレアーゼではあるが、分子の長さにより、どの程度の遺伝子材料をベクターが収容できるかの制限が付され、生存動物の組織およびここに記載する他の設定におけるＣＲＩＳＰＲの使用の障壁を作る(F.A. Ran et al., “In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9,” Nature, doi:10.1038/nature14299, 2015参照)。それ故に、ある実施態様において、本発明のベクターはＡＡＶベクターであるかまたはＡＡＶベクターを超えない外来性ＤＮＡ挿入容量を有し、Ｃａｓは宿主細胞の内在性Ｃａｓであり、ここで該細胞は細菌または古細菌細胞である。
【０７８３】
ストレプトコッカス・サーモフィルスＣａｓ９(UniProtKB - G3ECR1(CAS9_STRTR))ヌクレオチド配列は１.４kbのサイズを有する。
【０７８４】
ある実施態様において、それ故に、本発明は
１.４kbを超えるまたは４.２kbを超えるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの要素をコードする外来性ＤＮＡ配列を含む核酸ベクターを提供し、ここで配列は、宿主細胞(ここでのあらゆる細胞、例えば、ヒト、動物または細菌または古細菌宿主細胞)における１以上のＨＭ−またはＰＭ−ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡの発現のための改変されたアレイまたは改変された配列(所望によりここに記載されるとおり)を含み、ここでアレイまたは改変された配列はｃＲＮＡまたはｇＲＮＡと同族であるＣａｓヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含まない、所望によりここで少なくとも２、３または４ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡが外来性ＤＮＡによりコードされる。ある実施態様において、宿主細胞は、ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡと同族であるＣａｓヌクレアーゼを発現する細菌または古細菌細胞である。ヒトまたは動物(例えば、齧歯類、ラットまたはマウス)細胞での使用のためのような他の例において、Ｃａｓヌクレアーゼは異なる核酸ベクターによりコードされる。例えば、ここで該細胞はヒトまたは動物細胞であり、ベクターはＡＡＶまたはレンチウイルスベクターである。例えば、本発明は、このようなベクターを含む宿主細胞を含み、ここで宿主細胞は該Ｃａｓを発現する。例えば、宿主細胞はエクスビボでのヒトまたは動物細胞である。
【０７８５】
本発明はまた
１.４kbを超えるまたは４.２kbを超える外来性ＤＮＡ配列を含む核酸ベクターを提供し、ここで外来性ＤＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの１以上の要素をコードし、宿主細胞において１以上のＨＭ−ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡを発現するための改変されたアレイまたは配列(例えば、ここに記載する任意のこのようなもの)を含み、ここで外来性配列は、ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡと同族であるＣａｓヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を欠き、所望により少なくとも２つの異なるｃＲＮＡまたはｇＲＮＡが外来性ＤＮＡによりコードされる。例えば、本発明はこのようなベクターを含む宿主細胞を含み、ここで宿主細胞は該Ｃａｓを発現する。例えば、ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは各標的プロトスペーサー配列に対して宿主細胞においてハイブリダイズでき、ここで各プロトスペーサー配列は抗生物質耐性または必須宿主遺伝子に含まれる。これは、我々が、混合および非混合細胞集団における少なくとも１０倍の選択的宿主細胞増殖阻害を示す、実施例により例示される。混合物は、ヒト微生物相に見られる種および株の組み合わせを模倣する。
【０７８６】
“ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの要素をコードする外来性ＤＮＡ配列”は、ベクター主鎖に挿入されたＤＮＡまたは該挿入が先に行われているベクターの子孫におけるこのようなＤＮＡを意味する(例えば、リコンビニアリングのような組み換えＤＮＡ技術を使用して)。例えば、外来性ＤＮＡは、ベクターの挿入容量の９５％、９０％、８０％、８５％、７０％または６０％である。
【０７８７】
例えば、ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターは外来性ＤＮＡ挿入について特に容量が制限されており、故にウイルス包装容量を考慮する必要がある。コートタンパク質およびポリメラーゼ発現のためのような、重要なウイルス機能をコードする配列のための余地を残しておく必要がある。例えば、ベクターはファージベクターまたはＡＡＶまたはレンチウイルスベクターである。ファージベクターは、宿主が細菌細胞であるとき有用である。
【０７８８】
本発明は、組み合わせ製品キット(例えば、ここに記載するヒトまたは動物対象における疾患または状態の処置または予防のため)を提供し、ここでキットはアレイ、ベクター、システム、細胞、改変されたｃＲＮＡまたはｇＲＮＡコード化配列またはｃＲＮＡまたはｇＲＮＡを含み、これは抗生物質(第一抗生物質)と組み合わされ、ここでｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは細菌宿主細胞抗生物質耐性遺伝子に含まれるプロトスペーサー配列とハイブリダイズ可能であり、ここで抗生物質は該第一抗生物質である。抗生物質はここに開示する何れかの抗生物質であり得る。ある実施態様において、抗生物質は、製剤中、アレイ、ベクター、システム、細胞、改変されたｃＲＮＡまたはｇＲＮＡコード化配列またはｃＲＮＡまたはｇＲＮＡと組み合わされる。例えば、キットは、アレイ、ベクター、システム、細胞、改変されたｃＲＮＡまたはｇＲＮＡコード化配列またはｃＲＮＡまたはｇＲＮＡを含む容器と別の容器に抗生物質を含む。
【０７８９】
ある実施態様において、特に断らない限り、本または各細胞は細菌細胞、古細菌細胞、藻類細胞、真菌細胞、原生動物細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、魚類細胞、鳥類細胞、哺乳動物細胞、コンパニオン・アニマル細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ウマ細胞、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、真核細胞、原核細胞、ヒト細胞、動物細胞、齧歯類細胞、昆虫細胞または植物細胞である。さらに、この場合好ましくは細胞が同じ門、目、科または属のものである。
【０７９０】
用語“改変された”の使用により、当業者である対象者には、本発明のアレイ、配列、ベクター、ＭＧＥまたは任意の他の形態、コンセプト、態様、実施態様、段落または例等が天然に存在しないことは容易に明らかである。例えば、１以上の配列または要素を含むＭＧＥ、ベクターまたはアレイは、ＭＧＥ、ベクターまたはアレイの他の配列または要素と一緒には天然で見られない。例えば、アレイは、本または各宿主細胞にとって組み換え、人工、合成または外来性(すなわち、非内在性または野生型ではない)である。
【０７９１】
例えば、アレイまたは本発明のベクターは、単離され、例えば宿主細胞から単離される。例えば、アレイまたはベクターは、アレイの反復配列の反復と共に細胞において天然で見られるＣａｓエンドヌクレアーゼコード化配列と組み合わされていない。
【０７９２】
例えば、ベクター、ＭＧＥまたはアレイは、宿主細胞にないとき、Ｃａｓエンドヌクレアーゼコード化配列と組み合わされていない。例えば、ベクターまたはＭＧＥはＣａｓエンドヌクレアーゼコード化配列を含まない。
【０７９３】
例えば、標的修飾または切断はｄｓＤＮＡ  Ｃａｓヌクレアーゼ(例えば、Ｃａｓ９、例えば、ｓｐＣａｓ９またはｓａＣａｓ９)により実施され、それにより切断の修復が非相同末端連結(ＮＨＥＪ)による。これは、一般に修復部位に変異(インデル)を導入し、これは、標的部位の不活性化に有用である(例えば、必須遺伝子またはその調節要素のようなファージ遺伝子または調節要素)。他の例において、切断は、一本鎖(二本鎖ＤＮＡ切断を行わない)に切断するｓｓＤＮＡ  Ｃａｓヌクレアーゼ(例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ)により行われる。これは、インデルの機会を減少させる、切断のＨＤＲ修復の支持に有用である。これは、標的部位(または遺伝子またはそれを含む調節要素)が望ましいとき、例えば、ＨＭ−ＤＮＡまたはＰＭ−ＤＮＡが所望の修飾部位のための標的部位に挿入されるとき、有用である。例えば、この場合、修飾遺伝子は、宿主ＤＮＡコード化配列に融合したＨＭ−ＤＮＡコード化アミノ酸またはファージＤＮＡコード化配列に融合したＰＭ−ＤＮＡコード化アミノ酸配列を含む融合タンパク質を産生する。本発明はまた、このような方法により得られたまたは得ることができる融合タンパク質をコードする配列を提供する。他の例において、ＨＭ−ＤＮＡまたはＰＭ−ＤＮＡは、融合産物が宿主またはファージ遺伝子または調節要素ＤＮＡに融合した該ＤＮＡを含み、それにより融合遺伝子を産生するように、調節要素(例えば遺伝子発現を制御するためのプロモーター、エンハンサー、リプレッサーまたは誘導可能スイッチ)を含む。本発明はまた、このような方法により得たまたは得ることができる融合遺伝子を提供する。ある実施態様において、本発明は、このような融合遺伝子を含むベクター(例えば、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージまたはプラスミド)を提供し、所望によりここでベクターは細菌細胞(例えば、原核、真核、細菌、古細菌または酵母細胞)に含まれる。例えば、細胞はインビトロである。
【０７９４】
例えば、ＨＭ−ＤＮＡまたはＰＭ−ＤＮＡは、細胞内のベクターＤＮＡである。例えば、ベクター内のＨＭ−ＤＮＡまたはＰＭ−ＤＮＡは、部位特異的組換え部位(例えば、ｆｒｔまたはｌｏｘ部位)により隣接され得て、これは宿主細胞またはベクター配列によりコードされる部位特異的リコンビナーゼの作用により切断される。他の例において、ベクターは、ＲＮＡからのＨＭ−ＤＮＡまたはＰＭ−ＤＮＡ産生のためにＨＭ−ＤＮＡまたはＰＭ−ＤＮＡのＲＮＡコピーに転写されるＤＮＡおよび逆転写酵素(例えば、ベクター核酸配列によりコードされる)である。これは、標的部位の１以上での能率的および効率的導入の機会を増やすために所望のＨＭ−ＤＮＡまたはＰＭ−ＤＮＡの多コピーを産生するのに有用である。他の実施態様において、ＨＭ−ＤＮＡまたはＰＭ−ＤＮＡは、宿主細胞を形質導入または形質転換する第二ベクターの核酸(例えば、第二ファージまたはプラスミド)であるかまたはこれによりコードされる。例えば、これは、ヘルパーファージである(これはまた第一ファージベクターの包装に必要な１以上のコートタンパク質もコードし得る)。他の例において、ＤＮＡはベクターＤＮＡに提供され、アームに隣接され、ここで５’アームは、ベクターが宿主細胞にあるときＣａｓヌクレアーゼにより認識されるＰＡＭを含み、３’アームは、このようなＰＡＭが直ぐ下流(３’)に隣接し、それにより宿主細胞においてＣａｓ開裂は、ＨＭ−ＤＮＡまたはＰＭ−ＤＮＡをその隣接アームと共に有利し、これは、宿主標的配列における切断に隣接する宿主配列と相同であり、それによりＨＭ−ＤＮＡが宿主ゲノムに統合されるようにまたはＰＭ−ＤＮＡがファージゲノムに統合されるように設計できる。ある態様において、本発明は、このようなＨＭ−ＤＮＡまたはＰＭ−ＤＮＡおよびアームを含む核酸またはこのような核酸を含むベクター(例えば、ファージまたはパッケージ化ファージ)を提供し、所望によりここでベクターは宿主細胞に含まれる。所望により、ＨＭ−ＤＮＡは、ここに記載するＨＭ−アレイと組み合わされる。所望により、ＰＭ−ＤＮＡは、ここに定義するＰＭ−アレイと組み合わされる。
【０７９５】
本発明の特定の適用は、エクスビボまたはインビボで混合細菌集団におけるバクテロイデス門(例えば、バクテロイデス)細菌の比率を変えることである。上記のとおり、これは、望ましくないバクテロイデス門に感染した水路または飲料水処理のような環境処理または、例えば、細菌培養産生のために、このような目的でヒトまたは動物に投与するためのヒトまたは動物における有用な片利共生または相利共生バクテロイデス門を支持するために有用であり得る。後者の例えば、本発明は、ファーミキューテスに対するバクテロイデス門の相対的比率を増加させるために有用であり、これは体重減少と関連しており、故に医学的または美容目的での肥満処置または予防に有用性が見られる。
【０７９６】
バクテロイデスがクロストリジウム・ディフィシル感染予防に役割を有することを示唆する試験がある。潜在的病原体の侵入および増殖を制限する免疫応答の発達は、大いにバクテロイデス・フラジリスに依存する。また、パネート細胞タンパク質は、バクテロイデス・シータイオタオミクロンによる刺激に応答して抗細菌ペプチドを産生でき、これらの分子は病原体が腸でコロニー形成するのを妨げる。さらに、バクテロイデス・シータイオタオミクロンは、パネート細胞の殺菌性レクチン、ＲｅｇIII産生を誘発でき、これはその抗微生物効果を、グラム陽性生物のペプチドグリカンとの結合により発揮する。それ故に、腸内細菌の混合集団におけるバクテロイデス(例えば、シータイオタオミクロンおよび／またはフラジリス)の比率増加のためのその何れかの形態での本発明の使用は、集団またはヒトまたは非ヒト動物の腸の病原性細菌コロニー形成の限定に有用である。
【０７９７】
Hooper et alは、バクテロイデス・シータイオタオミクロンが、フコースリプレッサー遺伝子およびシグナル伝達システムが介在する複雑な相互作用において腸フコシル化を修飾できることを示した。転写分析を使用して、バクテロイデス・シータイオタオミクロンは、栄養素吸収、粘膜バリア強化および血管新生因子産生に関与するものを含む、多様な宿主遺伝子の発現を調節できることが示された。
【０７９８】
ある実施態様において、混合集団は第一細菌および第二細菌からなる(すなわち、さらなる細菌集団はいない)。
【０７９９】
例えば、本または各アレイは、ベクターにおける組み換えアレイおよび／またはベクターにおける単離アレイである。例えば、アレイは宿主細胞(例えば、微生物、細菌または古細菌細胞)に含まれる。
【０８００】
例えば、該Ｃａｓは、宿主細胞の内在性Ｃａｓヌクレアーゼ(例えばＣａｓ９)である。宿主のＣａｓを利用することにより、アレイにおける宿主タイプ反復の能率的使用および内在性ｃｒＲＮＡを使用する可能性も可能とする  −  ウイルスまたはファージのようなベクターにおいてそうでなければ制限される容量を解放する(タイプII  Ｃａｓ９のようなＣａｓ遺伝子配列は大きいのとは違う)。
【０８０１】
例えば、宿主ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムはタイプＩシステムである。例えば、宿主ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムはタイプIIシステムである。例えば、宿主ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムはタイプIIIシステムである。
【０８０２】
本発明のＨＭ−ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡによりガイドされるｃａｓは、標的配列におけるＰＡＭと適合性である宿主内在性Ｃａｓまたはベクターコード化Ｃａｓである。
【０８０３】
所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はグラム陰性細菌(例えば、スピリルムまたはビブリオ)である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はグラム陽性細菌である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はマイコプラズマ、クラミジア、スピロヘータまたはマイコバクテリウムである。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はストレプトコッカス(例えば、ピオゲネスまたはサーモフィルス)宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はスタフィロコッカス(例えば、アウレウス、例えば、ＭＲＳＡ)宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はエシェリキア・コリ(例えば、Ｏ１５７：Ｈ７)宿主であり、例えば、ここでＣａｓはベクターによりコードされるかまたは内在性宿主Ｃａｓヌクレアーゼ活性は抑制解除される。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はシュードモナス(例えば、エルギノーサ)宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はビブリオ(例えば、コレラエ(例えば、Ｏ１３９)またはバルニフィカス)宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はナイセリア(例えば、ゴノレーまたはメニンギティディス)宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はボルデテラ(例えば、パータシス)宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はヘモフィルス(例えば、インフルエンザエ)宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はシゲラ(例えば、ディセンテリアエ)宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はブルセラ(例えば、アボルタス)宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はフランシセラ宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はキサントモナス宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はアグロバクテリウム宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はエルウィニア宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はレジオネラ(例えば、ニューモフィラ)宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はリステリア(例えば、モノサイトゲネス)宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はカンピロバクター(例えば、ジェジュニ)宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はエルシニア(例えば、ペスティス)宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はボレリア(例えば、ブルグドルフェリ)宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はヘリコバクター(例えば、ピロリ)宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はクロストリジウム(例えば、ディフィシルまたはボツリヌム)宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はエーリキア(例えば、シャフェンシス)宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はサルモネラ(例えば、チフィまたはエンテリカ、例えば、血清型チフィリウム、例えば、ＤＴ１０４)宿主である。所望に��り、宿主(または第一および／または第二細菌)はクラミジア(例えば、ニューモニエ)宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はパラクラミジア宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はコリネバクテリウム(例えば、アミコラツム)宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はクレブシエラ(例えば、ニューモニエ)宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はエンテロコッカス(例えば、フェカーリスまたはフェシウム、例えば、リネゾリド耐性)宿主である。所望により、宿主(または第一および／または第二細菌)はアシネトバクター(例えば、バウマンニ、例えば、複数薬物耐性)宿主である。
【０８０４】
例えば、細胞は原核細胞である。例えば、細胞は細菌細胞である。例えば、細胞は古細菌細胞である。例えば、細胞は微生物細胞である。例えば、細胞は原生動物細胞である。例えば、細胞は魚類細胞である。例えば、細胞は鳥類細胞である。例えば、細胞は爬虫類細胞である。例えば、細胞はクモ類細胞である。例えば、細胞は酵母細胞(例えば、サッカロミセス細胞)である。例えば、宿主細胞は植物細胞である。例えば、宿主細胞は動物細胞(例えば、ヒト細胞ではない、例えば、齧歯類細胞ではない)である。例えば、宿主細胞はヒト細胞(例えば、胚またはヒトにおける細胞ではない)である、例えばインビトロ宿主細胞である。例えば、細胞は家畜またはペット動物細胞(例えば、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコまたはウサギ細胞)である。例えば、宿主細胞は昆虫細胞(その生活環の任意の期、例えば、卵、幼虫または蛹の昆虫)である。例えば、宿主細胞は原生動物細胞である。例えば、細胞は頭足類細胞である。
【０８０５】
所望により、アレイ、システム、改変されたヌクレオチド配列またはベクター核酸は、さらに、例えば、宿主細胞が真核細胞、例えば、植物または動物であるとき、核へのターゲティングのために、(例えば、１、２以上)核移行シグナル(ＮＬＳ)を含む。例えば、ＮＬＳは、本発明のＣａｓコード化核酸配列および／または本発明のアレイの各末端が隣接する  −  特に真核宿主細胞におけるターゲティングに使用するため。
【０８０６】
ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、例えばｔｒａｃｒＲＮＡを使用しないタイプのＣａｓシステムについて、本発明のアレイまたはベクターから除去できる。
【０８０７】
例えば、標的にガイドされたＣａｓはエキソヌクレアーゼである。所望によりここで記載するニッカーゼは、ダブル・ニッカーゼである。
【０８０８】
ニッカーゼの例はＣａｓ９ニッカーゼ、すなわち、２ヌクレアーゼドメインの一方が不活性化されているＣａｓ９である  −  ＲｕｖＣおよび／またはＨＮＨドメイン何れか。
【０８０９】
所望により宿主システムはタイプＩシステムである(および所望によりアレイ、ＨＭ−ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡは異なるＣＲＩＳＰＲシステム、例えば、タイプIIまたはIIIのものである)。所望によりアレイまたは改変された配列は、例えば、Ｃａｓが宿主システムと共に動作しないかまたは能率的に動作しないとき、アレイと同じシステムのＣａｓをコードするヌクレオチド配列、ＨＭ−ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡを有するウイルスまたはプラスミドと組み合わされる。所望により宿主システムはタイプIIシステムである(および所望によりアレイ、ＨＭ−ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡは異なるＣＲＩＳＰＲシステム、例えば、タイプＩまたはIIIのものである)。所望によりアレイまたは改変された配列ｉは、例えば、Ｃａｓが宿主システムと共に動作しないかまたは能率的に動作しないとき、アレイと同じシステムのＣａｓをコードするヌクレオチド配列、ＨＭ−ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡを有するウイルスまたはプラスミドと組み合わされる。所望により宿主システムはタイプIIIシステムである(および所望によりアレイ、ＨＭ−ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡは異なるＣＲＩＳＰＲシステム、例えば、タイプＩまたはIIのものである)。所望により改変された配列のアレイは、例えば、Ｃａｓが宿主システムと共に動作しないかまたは能率的に動作しないとき、アレイと同じシステムのＣａｓをコードするヌクレオチド配列とウイルスまたはプラスミドにおいて組み合わされる。
【０８１０】
ベクターＤＮＡを使用するここでの記載は、代替的実施態様において、変更すべきところは変更して、状況が許すならば、ベクターＲＮＡに適用される。例えば、ベクターがＲＮＡベクターであるときである。本発明の全特性は、それ故に別法において、状況が許すならば、ベクターＤＮＡに言及するとき“ＤＮＡ”の代わりに“ＲＮＡ”として開示され、解釈される。例えば、各ベクターはまた逆転写酵素も含む。
【０８１１】
例えば、本または各アレイまたは改変されたヌクレオチド配列はナノ粒子ベクターまたはリポソームに提供される。
【０８１２】
例えば、Ｃａｓは切断のためのＣａｓヌクレアーゼ、妨害のためのdeadＣａｓ(ｄＣａｓ)または標的活性化のための転写アクティベーターとコンジュゲートしたｄＣａｓである。
【０８１３】
例えば、宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、宿主ＣＲＩＳＰＲアレイおよび宿主におけるヌクレオチド配列ターゲティングのための同族宿主Ｃａｓを含む。例えば、宿主標的配列は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、２０、３０または４０連続ヌクレオチド含む。例えば、標的配列はＣａｓ、例えば、Ｃａｓ９により切断される。ある実施態様において、配列はスペーサーにない。
【０８１４】
例えば、本または各アレイまたは改変された配列は、宿主におけるｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡ転写に機能的な外来性プロモーターを含む。
【０８１５】
例えば、本または各アレイ反復は宿主アレイにおける反復と同一であり、ここでＣＲＩＳＰＲアレイが宿主ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＣａｓ(例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９)により認識されるＰＡＭを含まない。これは、変更すべきところは変更して、ＨＭ−ｃｒＲＮＡおよびｇＲＮＡの反復配列に適用される。この実施態様は、ＣＲＩＳＰＲアレイが、宿主標的配列標的のために単純に内在性宿主Ｃａｓを使用することを可能とするため、有利である。次いで、これは、アレイが宿主機構による使用のために合わせられ、故に、宿主細胞における機能を助けるため、能率的である。これに加えてまたはこれとは別に(例えばアレイが外来性(非宿主内在性)Ｃａｓコード化配列と組み合わされるとき)、この実施態様は、ＣＲＩＳＰＲアレイ反復がプレｃｒＲＮＡ製造のために内在性ｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズし、宿主標的配列とハイブリダイズする成熟ｃｒＲＮＡに加工されるため、ＣＲＩＳＰＲアレイが内在性コード化ｔｒａｃｒＲＮＡを使用することを可能とする。後者の複合体は、その後、内在性Ｃａｓヌクレアーゼ(例えば、Ｃａｓ９)をガイドするまたはＣＲＩＳＰＲアレイに含まれる配列から産生されたＣａｓをガイドする。この実施態様は、それ故に、ＣＲＩＳＰＲアレイを含むが、ｔｒａｃｒＲＮＡ−および／またはＣａｓヌクレアーゼコード化配列を含まないベクター(例えば、パッケージ化ウイルスまたはファージ)の単純な構築の柔軟性を提供する。これは、ベクター構築についてより簡単であり、またベクター、特にウイルスベクター(例えば、ファージ)の容量制限を考慮して有用である、ベクター(例えば、ウイルスまたはファージ)における有用な空間も解放する。さらなる空間は、宿主遺伝子不活性化または宿主における発現のための所望の非宿主配列における取り込みのためのような、例えば、修飾のために宿主ゲノムを標的とするために、例えば、アレイにおいてさらに多くのスペーサーを挿入するために、有用である。これに加えてまたはこれとは別に、空間を、ベクターにおける複数のＣＲＩＳＰＲアレイの包含に使用できる。これらは、例えば、第一アレイが第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタイプ(例えば、タイプIIまたはタイプII−Ａ)のものであり、第二アレイが第二タイプ(例えば、タイプＩまたはIIIまたはタイプII−Ｂ)であるときの配置であり得る。これに加えてまたはこれとは別に、アレイは、宿主における異なるＣａｓヌクレアーゼを使用できる(例えば、一方のアレイは宿主Ｃａｓヌクレアーと共に動作可能であり、第二アレイは外来性Ｃａｓヌクレアーゼ(すなわち、ベクターコード化ヌクレアーゼ)と共に動作可能である)。これらの態様は、ベクターが導入されたら宿主におけるターゲティングのための機構を提供し、これは、宿主がその後要素の広範囲を標的とする必要があるため、ベクターの宿主耐性減少に有利であり得る。例えば、宿主が第一ＣＲＩＳＰＲアレイ配列に基づく新規スペーサーを獲得したとしても、第二ＣＲＩＳＰＲアレイはなお宿主において宿主細胞における各標的配列の標的として機能できる。それ故に、この実施態様は、ベクターへの宿主適応の減少に有用である。
【０８１６】
他の利点は、(例えば、この配置で)ＣＲＩＳＰＲアレイ(またはベクターにおける複数ののこのようなアレイにわたり分散される)に、複数コピーの同じスペーサー(例えば、宿主細胞において標的部位標的に使用されるスペーサー)を包含することが可能であることである。これは、細菌および古細菌のような宿主の適応は、スペーサーが有利な宿主ＤＮＡを標的とするときのアレイからのスペーサーの喪失が関与し得ることが提唱されるため、有利である(PLoS Genet. 2013;9(9):e1003844. doi: 10.1371/journal.pgen.1003844. Epub 2013 Sep 26, “Dealing with the evolutionary downside of CRISPR immunity: bacteria and beneficial plasmids”, Jiang W et al)。スペーサー−反復単位の除去は、反復配列の組換えを介して起こると考えられる。それ故に、本発明のこの態様により、宿主標的配列にハイブリダイズするための複数の(例えば、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００以上)コピーのスペーサーを含む、１、２、３、４、５、６以上の本発明のＣＲＩＳＰＲアレイまたは改変された配列が提供される。これは、これらのスペーサー全部が宿主細胞において組換えにより喪失される機会を減少させる。この態様のさらなる適用において、ＣＲＩＳＰＲアレイは、１以上の(例えば、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０以上)のスペーサーコピーを含む第一アレイおよび１以上の(例えば、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０以上)の同一スペーサーコピーを含む第二アレイを含み、ここで第一アレイにおけるスペーサーコピーは、各第一反復に隣接しており、第二アレイにおける同一スペーサーコピーは、各第二反復に隣接しており、ここで第一反復が第二反復と異なる。これは、第一および第二反復の少なくとも一つが、１を超えるアレイが関与する宿主適応の機会を減少するために、宿主Ｃａｓヌクレアーゼ(または同じ宿主Ｃａｓヌクレアーゼ)に認識されないように選択できる利点を有する。例えば、第一アレイは、宿主細胞によりコードされず、第一反復と同族ＣａｓであるＣａｓヌクレアーゼ配列と組み合わされる。所望により、また第二アレイは、宿主細胞によりコードされず、第二反復と同族ＣａｓであるＣａｓヌクレアーゼ配列(例えば、第一アレイのものと同一または異なる)と組み合わされる。
【０８１７】
ある実施態様は、第一ベクターに含まれる第一アレイおよび第一アレイに含まれない第二ベクターに含まれる第二アレイ(例えば、ここでベクターはプラスミドまたはビリオン(例えば、同じウイルスタイプの)またはパッケージ化ファージ(例えば、同じファージタイプの)を提供する。これは、ベクターが同時にまたは逐次的に同じ宿主細胞に導入できるため、有用である。それ故に、宿主が第一アレイに対する耐性を発現したとき、第二を導入して、耐性宿主(例えば、細菌または古細菌)が先に共進化していない第二アレイを提供し、それにより宿主細胞に対し第二修飾(例えば、ノックダウン)波を提供する。これはまた、第一および第二アレイおよびスペーサーと異なるスペーサーまたはアレイを含む第三のこのようなベクターを、宿主細胞に第二ベクターと同時にまたは逐次的に導入でき、第一アレイにおけるスペーサーに耐性である宿主の進化中に先に存在していない宿主細胞修飾へのさらなる経路を提供するため、柔軟性を提供する。アレイの代わりに、本発明の改変されたヌクレオチド配列が使用され得る。
【０８１８】
それ故に、ある実施態様において、本発明は、宿主細胞の修飾のための組成物を提供し、ここで組成物は、ここに記載する任意のアレイまたは改変された配列を提供する。それ故に、ある実施態様において、本発明は宿主細胞の修飾のための組成物を提供し、ここで組成物は、第一ベクター(例えば、ビリオンまたはパッケージ化ファージ)におけるここに記載する第一アレイおよび第二ベクター(例えば、それぞれビリオンまたはパッケージ化ファージ)におけるここに記載する第二のこのようなアレイを提供し、ここで第二アレイは１以上の宿主標的配列を標的とし、第一アレイに含まれない１以上のスペーサーを含む。アレイの代わりに、本発明の改変されたヌクレオチド配列が使用され得る。
【０８１９】
ある実施態様において、アレイまたは改変された配列は、ヴィロファージベクターに含まれ、宿主は、あるいは細胞に感染できるウイルスである。例えば、宿主は、アメーバ細胞が感染されているかもしれない大ウイルスである。例えば、宿主は、スプートニクウイルス、ピソウイルス、ミミウイルス、ママウイルス、メガウイルスまたはパンドラウイルスであり、例えば、ここで宿主ウイルスは水中にある。この実施態様の例えば、本発明は水または汚水処理のためである(例えば、精製、例えば、水路、川、湖、池または海処理)。
【０８２０】
ある実施態様において、本または各ベクターまたは改変された配列はΦΝΜ１ファージであるかまたはこれに含まれ、例えば、ここで宿主細胞はスタフィロコッカス・アウレウス(例えば、ＭＲＳＡ)細胞である。
【０８２１】
一般的特性はまた次の各項も提供する
１. 本発明の態様の何れかによるアレイ、改変された配列、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージ、集団または収集物を含む、抗微生物組成物(例えば、抗生物質、例えば、医薬、殺菌剤または口腔洗浄剤)。
【０８２２】
２. 医薬または歯科または眼科使用のための(例えば、生物における感染の処置もしくは予防または生物における感染拡大制限のための、項１の組成物。
【０８２３】
例えば、生物は、植物または動物、例えば、脊椎動物(例えば、ここに開示する任意の哺乳動物またはヒト)または作物または食品植物である。
【０８２４】
３. 本発明のアレイ、改変された配列、システム、収集物、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージ、組成物、集団、収集物、使用または方法を含む、化粧品使用(例えば、化粧品製品、例えば、化粧品における使用)または衛生使用(例えば、衛生製品、例えば、石鹸における使用)のための組成物。
【０８２５】
４. 医薬におけるまたは歯科治療または予防使用のための、項１〜３５の何れかのアレイ、改変された配列、収集物、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージ、集団または収集物を含む組成物の使用。
【０８２６】
５. 化粧品使用(例えば、化粧品製品、例えば、化粧品における使用)または衛生使用(例えば、衛生製品、例えば、石鹸における使用)のための、本発明のアレイ、改変された配列、収集物、システム、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージ、組成物、集団、収集物、使用または方法を含む組成物の使用。
【０８２７】
６. 宿主細胞の標的ヌクレオチド配列の修飾が可能である宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム(例えば、タイプＩ、IIまたはIII)における本発明のアレイ、改変された配列、システム、収集物、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージ、組成物、集団または収集物の使用であって、ここでアレイ、改変された配列、システム、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージ、集団または収集物は本発明のものである。
【０８２８】
７. アレイ、改変された配列、システム、収集物、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージ、集団または収集物が宿主細胞にない、項４、５または６の使用。
【０８２９】
８. アレイ、改変された配列、収集物、システム、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージ、集団または収集物が宿主細胞(例えば、微生物、細菌または古細菌細胞)にある、項５または６の使用。
【０８３０】
９. 微生物細胞修飾のための(例えば、細胞または微生物細胞の培養の死滅または増殖減少のため)、項４〜６の何れかの使用。
【０８３１】
１０. 宿主細胞(例えば微生物、細菌または古細菌)における標的ヌクレオチド配列を修飾する方法であって、宿主細胞を本発明のアレイ、改変された配列、システム、収集物、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、集団または収集物で形質転換することを含み、それにより標的ヌクレオチド配列がＣａｓ修飾され、ここで宿主標的配列が細胞の宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのヌクレオチド配列である、方法。
【０８３２】
１１. 核酸ベクターによる形質転換に対する宿主細胞耐性の発現を減少するまたは宿主細胞における核酸ベクターを維持する方法であって、ここで宿主細胞は標的ヌクレオチド配列を含み、宿主細胞を本発明のアレイ、改変された配列、収集物、システム、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、集団または収集物で形質転換することを含み、それにより標的ヌクレオチド配列がＣａｓ修飾(例えば、切断、変異またはノックダウン)される、方法。
【０８３３】
１２. ベクターが宿主細胞に感染可能であるウイルスであり、形質転換工程が宿主細胞のベクターでの感染を含む、項１１の方法。
【０８３４】
１３. 宿主細胞が細菌または古細菌細胞であり、ベクターがファージまたはファージミドである、項１１または１２の方法。
【０８３５】
１４. 宿主標的配列がベクター配列スペーサーの宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ介在獲得に必須である、項１１〜１３の何れかの方法。
【０８３６】
１５. 少なくとも要素(ii)が宿主細胞溶解のためのエンドリシンを発現できるウイルス(例えば、ファージ)に含まれ、所望によりここでエンドリシンがファージファイ１１、ファージＴｗｏｒｔ、ファージＰ６８、ファージファイＷＭＹまたはファージＫエンドリシン(例えば、ＭＶ−ＬエンドリシンまたはＰ−２７／ＨＰエンドリシン)である、先の項の何れかのアレイ、改変された配列、システム、ベクター、細胞、収集物、組成物、使用または方法。
【０８３７】
１６. 宿主細胞溶解のためのエンドリシンと組み合わされる、例えば、ＭＶ−ＬエンドリシンまたはＰ−２７／ＨＰエンドリシンまたはその機能的ホモログと組み合わされた、項１５のアレイ、改変された配列、システム、ベクター、収集物、細胞、組成物、使用または方法。
【０８３８】
１７. 抗微生物、例えば、抗生物質薬剤、例えば、ベータ−ラクタム抗生物質と組み合わされる、先の項の何れかのアレイ、改変された配列、システム、ベクター、収集物、細胞、組成物、使用または方法。
【０８３９】
１８. 宿主細胞がスタフィロコッカス、ストレプトコッカス、シュードモナス、サルモネラ、リステリア、エシェリキア・コリ、デスルホビブリオまたはクロストリジウム宿主細胞である、先の項の何れかのアレイ、改変された配列、システム、ベクター、収集物、細胞、組成物、使用または方法。
【０８４０】
１９. 宿主細胞がスタフィロコッカス(例えば、スタフィロコッカス・アウレウス)宿主細胞であり、少なくとも要素(ii)がクラスＩ、IIまたはIIIスタフィロコッカスファージ(例えば、パッケージ化ファージ)、所望によりカウドウイルス目またはミオウイルス科ファージに含まれる、先の項の何れかのアレイ、改変された配列、システム、ベクター、収集物、細胞、組成物、使用または方法。
【０８４１】
２０. 宿主細胞がベータ−ラクタム抗生物質耐性ストレプトコッカスアウレウス、メチシリン耐性ストレプトコッカスアウレウス(ＭＲＳＡ)、バンコマイシン耐性ストレプトコッカスアウレウスまたはテイコプラニン耐性ストレプトコッカスアウレウスであり、所望により標的配列がそれぞれ宿主ベータ−ラクタム抗生物質耐性遺伝子、メチシリン耐性遺伝子、バンコマイシン耐性遺伝子またはテイコプラニン耐性遺伝子の配列である、先の項の何れかのアレイ、改変された配列、システム、ベクター、細胞、収集物、組成物、使用または方法。
【０８４２】
本発明のファージベクターの産生および試験に適する適当な方法は、例えば、ＷＯ２０１４／１２４２２６号に開示の一般的方法である。
【０８４３】
可動遺伝要素、トランスポゾンおよび運搬体(本発明のあらゆる形態のための)
プラスミドはバクテロイデス種で極めて一般的であり、株の２０〜５０％に見られる。多くのプラスミドがｏｒｉＴおよびトランス作用性可動化遺伝子を有し、これによりコンジュゲーションによる伝達が可能となる。それ故に、例えば、ベクターは、ｏｒｉＴおよび／または可動化遺伝子を含むプラスミドであり、例えば、ここで第一または第二細菌はバクテロイデスである。例えば、改変された配列はこのようなベクターに含まれる。
【０８４４】
例えば、宿主細胞または第一もしくは第二細菌は、天然にトランスポゾンを含む。トランスポゾンは、可動性および接合性の両者とも、独立して複製せず、むしろ、切り取られ、そして染色体ＤＮＡに統合されて、染色体ＤＮＡと共に複製される。接合性トランスポゾンは、プラスミドおよびバクテリオファージの両者のいくつかの特性を模倣する切除および組込みの機序を有する。接合性トランスポゾンは、実際にバクテロイデスで偏在性であり、８０％を超えるバクテロイデス株が少なくとも一つの接合性トランスポゾンを含む。バクテロイデスの接合性トランスポゾンは、少なくとも２つのファミリーに属し、ＣＴｎＤｏｔは最も良く記載されている。しばしば、それらが発見される株の名前が命名に加えられる(例えば、ＣＴｎＤｏｔは、バクテロイデス・シータイオタオミクロンのＤＯＴ株で発見)。染色体に挿入することが可能であることに加えて、バクテロイデス接合性トランスポゾンは共在プラスミドに挿入でき、プラスミドにそれら自体統合することによりそれらをシスで可動化し(すなわち、物理的に隣接する物に対して作用できる)、プラスミド−接合性トランスポゾンハイブリッドの他の細胞への伝達を促進する。それらはまた共在プラスミドを、プラスミドから物理的に離れたままで、プラスミドの伝達の促進に必要な因子の提供により“トランスで”も可動化できる。
【０８４５】
接合性トランスポゾンは、プラスミドのように互いに排除せず、従って、株は１を超える接合性トランスポゾンを蓄積できる。さらに、株における１を超えるコピーの接合性トランスポゾンの存在が転位(トランス活性化)を刺激するいくつかの証拠がある。理論的に、これは、接合性トランスポゾンが環境で蓄積されればされるほど、他の細菌へのトランスポゾン遺伝子の伝達も増加し、遺伝子の分配の顕著な上向きのスパイラルがあることを示唆する。バクテロイデストランスポゾンの多くはｔｅｔＱ遺伝子を運搬し、故にテトラサイクリン耐性を与える。さらに、自己伝達および他の活性が、ｔｅｔＱ−ｒｔｅＡ−ｒｔｅＢオペロンで制御される、低レベルのテトラサイクリンで顕著に刺激される。テトラサイクリンは、２要素制御システムのセンサーおよびアクティベーター要素をコードする、ｒｔｅＡおよび−Ｂの転写を増加させる。その後、ＲｔｅＢが自己伝達に必要なｒｔｅＣの発現を活性化する。
【０８４６】
例えば、ベクター(例えば、改変された配列を含むベクター)はトランスポゾンを含み、ここでトランスポゾンは本発明の改変された配列、ＨＭ−またはＰＭ−アレイを含み、ここでトランスポゾンは宿主細胞または第一もしくは第二細菌宿主細胞種において動作可能である。ある実施態様において、トランスポゾンは、バクテロイデストランスポゾン(例えば、ＣＴｎＤｏｔトランスポゾン、例えば、バクテロイデス・シータイオタオミクロンまたはバクテロイデス・フラジリスＣＴｎＤｏｔトランスポゾン)であり、宿主細胞または第一もしくは第二細菌はバクテロイデスであるかこれを含む(例えば、該ＣＴｎＤｏｔトランスポゾンと同じ種のもの)。例えば、トランスポゾンは接合性トランスポゾンである。例えば、トランスポゾンは可動性トランスポゾンである。例えば、トランスポゾンはバクテロイデス細胞間で伝達可能である。例えば、トランスポゾンはｉｎｔＤＯＴ配列を含む。例えば、トランスポゾンはｏｒｉＴを含む。例えば、トランスポゾンは、宿主細胞間のトランスポゾン接合性伝達のための１以上の接合細孔タンパク質をコードする。
【０８４７】
例えば、本発明は、バクテロイデスｔｅｔＱ遺伝子を含むトランスポゾンを提供する。例えば、トランスポゾンは、さらにバクテロイデスｔｅｔＱ−ｒｔｅＡ−ｒｔｅＢオペロンを含む。例えば、第一または第二細菌はバクテロイデスである。例えば、トランスポゾンは、宿主細胞間のトランスポゾン接合性伝達のための１以上の接合細孔タンパク質をコードするバクテロイデスＣＴｎＤｏｔトランスポゾンであり、本発明の１以上のアレイまたは改変された配列、ｏｒｉＴ、ｉｎｔＤＯＴ配列およびｔｅｔＱ−ｒｔｅＡ−ｒｔｅＢオペロンを含み、所望によりテトラサイクリンと組み合わせてここに記載する該ヒトまたは非ヒト動物に投与するためであるかまたは投与される。大部分のバクテロイデスＣＴｎｓの伝達はテトラサイクリンにより刺激される。トランスポゾンは、宿主細胞におけるインテグラーゼと共に動作可能であるかまたはトランスポゾンと同じもしくは異なるベクターに担持される外来性インテグラーゼと共に動作可能である。ある実施態様において、ベクターは、トランスポゾンおよび同族インテグラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むファージ(例えば、パッケージ化ファージ)である。ファージは、トランスポゾンの複製および切除のために、例えば、混合細菌集団(例えば、腸内微生物相集団)における隣接宿主細胞への接合性伝達のために、宿主細菌細胞に感染可能である。
【０８４８】
ある実施態様において、トランスポゾンは、宿主細胞間のトランスポゾン伝達に必要な１以上の遺伝子配列を運搬するベクターに含まれ、ここで該遺伝子配列は、ベクター核酸上のトランスポゾンの外側である。例えば、ベクターは、宿主細胞(例えば、バクテロイデス宿主細胞)に感染可能であるパッケージ化ファージであり、ここでファージ核酸は、本発明のアレイおよびトランスポゾンの上流または下流にトランスポゾンの接合性伝達のために動作可能な１以上の遺伝子(例えば、トランスポゾン接合性伝達のためのリラクサーゼ、共役タンパク質および／または接合橋タンパク質をコードする１以上の遺伝子；および／またはｍｏｂおよびｔｒａオペロンの一方または両方)を含む該トランスポゾンを含む、ここでこれらの遺伝子の一つ、複数または全てはトランスポゾンに含まれない。例えば、これらの遺伝子は、第一宿主細胞内の染色体ＤＮＡからのトランスポゾン切除のための遺伝子である。それ故に、トランスポゾンは、その細胞内で可動化でき、それと共にその後の第二宿主細胞への接合性伝達に必要な遺伝子を運搬する。トランスポゾン外側のベクターにこの方法でトランスポゾン遺伝子のいくつかを提供することにより、本発明の改変された配列またはアレイＤＮＡの挿入のためのトランスポゾンの空間を解放し、それにより、可動化トランスポゾンにより収容および運搬され得る。本発明は、本発明の方法、使用またはシステムにおいて使用するためのまたは一般に細菌細胞への導入のための(この場合ファージ配列ターゲティングの代わりに、トランスポゾンに含まれるアレイは、配列を修飾するために、例えば、トランスポゾンを有する細胞におけるＣａｓを使用してそれを切断するために、細菌標的配列を標的とする)１以上のこのようなトランスポゾンを含むこのようなベクターを提供する。
【０８４９】
ＣＴｎＤｏｔ切除および組込みの分子機構は、転位よりむしろバクテリオファージのものを模倣する。ＣＴｎＤＯＴインテグラーゼおよび切除タンパク質自体、バクテリオファージからのものに極めて類似する。それ故に、ある実施態様において、本発明のトランスポゾンの１以上のインテグラーゼおよび／または切除タンパク質の機能は、それぞれファージインテグラーゼおよび／または切除タンパク質により提供され、トランスポゾンは機能がファージタンパク質により提供されるこのようなインテグラーゼまたは切除タンパク質をコードする対応する遺伝子を含まない。
【０８５０】
例えば、トランスポゾンはｒｔｅＣおよびオペロンｘｉｓ２ｃ−ｘｉｓ２ｄ−ｏｒｆ３−ｅｘｃを含む。所望により、さらにベクターは、トランスポゾン外側(例えば、ベクター核酸におけるトランスポゾンの上流または下流)にｍｏｂおよびｔｒａオペロンを含む。それ故に、これは、本発明のＣＲＩＳＰＲアレイ配列または改変された配列を提供するためにトランスポゾンにおける空間を解放する。
【０８５１】
多くの接合性トランスポゾンが他の要素を可動化できる。例えば、多くの共在プラスミドは、接合性トランスポゾンによりトランスで可動化される。これは、ｏｒｉＴを含むプラスミドが、レシピエント細胞への伝達のためにＣＴｎ提供接合細孔タンパク質を利用するとき生じる。バクテロイデスＣＴｎｓはまたＣＴｎｓでは典型的ではない特性である、シスのときも、要素を可動化できることが示されている。例えば、ＣＴｎＤＯＴが染色体から切除され、プラスミドに統合されたとしても、接合細孔、ｏｒｉＴおよび可動化(リラクサーゼ／共役)タンパク質を提供でき、“シスで”作動することによりプラスミド全体を伝達することを可能とする。可動化のトランスおよびシス機構両者を使用する能力は珍しく、バクテロイデスＣＴｎｓが他の要素の可動化のための大きな容量を有することを示唆する。
【０８５２】
例えば、本発明のベクターは、１以上の本発明の改変された配列またはアレイおよび接合細孔タンパク質をコードする宿主細胞種ＣＴｎＤｏｔトランスポゾンと同族であるｏｒｉＴを含むプラスミドであり、それによりプラスミドは、該ＣＴｎＤｏｔトランスポゾンを含む宿主細胞において可動性である。それ故に、プラスミドは宿主細胞間で水平伝播可能であり、それによりこのような宿主細胞(例えば、バクテロイデス細胞)集団で本発明のアレイを拡散する。例えば、本発明は、運搬体細菌の集団を含む組成物を提供し、ここで運搬体細菌はこのような本発明のプラスミドベクターと適合性であり、それによりベクターは、運搬体とレシピエント細菌が混合されたとき、同族ＣＴｎＤｏｔトランスポゾンを含むレシピエント宿主細菌細胞(例えば、バクテロイデスまたはファーミキューテス、例えば、ストレプトコッカス細胞)に水平伝播され得る。例えば、運搬体細菌はヒトまたは非ヒト動物消費用の飲料(例えば、ここに記載するもののようなプロバイオティク飲料)または食糧に含まれ、それにより運搬体細菌は、ヒトまたは動物が有する(例えば、口腔または腸に)レシピエント細菌と混合され得る。ＣＴｎＤＯＴ様ファミリー内の他のトランスポゾンはＣＴｎＥＲＬおよびＣＴｎ３４１を含むが、これらの要素はＣＴｎＤＯＴと異なり、故にＣＴｎＤｏｔトランスポゾンの代わりに、本発明の一般的態様のトランスポゾンは、トランスポゾンが細菌または古細菌宿主細胞に含まれるとき、１以上の細菌またはファージヌクレオチド標的部位のターゲティングのための１以上の所望のＣＲＩＳＰＲアレイまたは改変された配列を運搬するＣＴｎＥＲＬまたはＣＴｎ３４１トランスポゾンであり得る。
【０８５３】
接合性トランスポゾンの伝達を生じさせるために、行われるべき主３工程がある。第一工程は、共有結合で閉鎖された環状中間体を形成させるための染色体からの切除である。第二に、一本鎖コピーが、続いて、レシピエント細胞に接合細孔を介して伝達され、その後、コピーが二本鎖となる。第三に、インタクト二本鎖ＣＴｎがレシピエントの染色体に統合される。接合性転位は、ＣＴｎのコピーがドナー細胞に残されているため、反復的である。要素が染色体内に存在するため、子孫細胞に垂直にも伝達される。これは、所望のＣＲＩＳＰＲアレイまたは改変された配列(および所望によりＣａｓ配列)がＣＴｎｓに存在するとき、集団内で容易に伝達されるだけでなく、次世代へと極めて安定にも維持されるため、重要である。これは、例えば、保持抗生物質耐性決定因子で見られるとおりである。さらに、バクテロイデスは、抗生物質耐性決定因子の貯留槽であり、これらの遺伝子をバクテロイデス属以外の他の生物に散在し、一過性に腸を通る生物にさえ、これらの要素を伝達すると考えられる。同様に、本発明のアレイまたは改変された配列の貯留槽を、例えば、肥満、糖尿病またはＩＢＤまたはここに開示する他の何らかの疾患または状態の処置または予防のため、ヒトまたは非ヒト動物に投与される本発明のベクターに作ることができる。
【０８５４】
例えば、バクテロイデス細胞(例えば、ヒトまたは非ヒト動物の腸または口腔において)に含まれることが可能なトランスポゾン(例えば、ＣＴｎＤｏｔ)に含まれる１以上のアレイまたは配列の使用により、所望のＣＲＩＳＰＲアレイまたは改変された配列の貯留槽を利用でき、ここでアレイ／配列は、宿主バクテロイデス細胞の配列を標的とせず、異なる種(例えば、ファーミキューテス細胞または病原性細菌細胞、例えば、ストレプトコッカス、クロストリジウム・ディフィシル、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ、リステリア、エルシニア、シゲラまたはカンピロバクター細胞)の腸内微生物相細胞(例えば、細菌細胞)に含まれるヌクレオチド配列を標的とする。それ故に、この方法で、本発明のアレイまたは配列の隣接するレシピエントである病原性または望ましくない細菌への伝達を実施でき、レシピエント細胞の中に入ったら、本発明のアレイは、宿主細胞における各標的部位にＣａｓをガイドし、その部位を修飾(例えば、切断)するのに動作可能である。この場合、アレイ／配列は、アレイ／配列がレシピエント細胞内の内在性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと共に動作可能であり得るように、目的のレシピエント細胞に見られる反復配列を含み得る。これは、本発明のベクター、改変された配列またはトランスポゾンにＣａｓおよび／またはｔｒａｃｒＲＮＡコード化配列を包含させる必要性をなくし、それにより空間を解放し、構築を単純化する。空間の増加は、より多くのスペーサーを、レシピエント細胞におけるより多くの標的部位を標的とするために挿入することを可能とするのに有用である。代替として、トランスポゾンアレイまたは配列は、タイプII  Ｃａｓ９コード化配列および同族反復配列を含む。例えば、Ｃａｓ９(ここに記載する任意のＣａｓ９)はストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・サーモフィルスまたはスタフィロコッカス・アウレウスＣａｓ９であり、所望によりニッカーゼまたはｄＣａｓ９(“死Ｃａｓ９”)であり得る。バクテロイデスが偏性嫌気性菌(または嫌気性環境を強く好む)であり、一般に腸環境外で病原性であるため、例えば、ヒトまたは動物の腸または口腔に投与するとき、本発明のベクターまたはトランスポゾンの運搬体としてバクテロイデス細胞を使用することは望ましくないかもしれない。これに取り組むため、本発明は、本発明のベクター、改変された配列またはトランスポゾンを有する細菌の運搬体集団を提供し、ここで運搬体細菌はこのようなベクター、配列またはトランスポゾンと適合性であり、それによりベクター、配列またはトランスポゾンが、運搬体とレシピエント細菌が混合されたとき、腸内微生物相におけるレシピエント宿主細菌細胞(例えば、バクテロイデス)に水平伝播可能である。例えば、運搬体細菌は、ヒトまたは非ヒト動物消費用飲料(例えば、ここに記載するもののようなプロバイオティク飲料)または食糧に含まれ、それにより運搬体細菌は、ヒトまたは動物が有する(例えば、口腔または腸に)レシピエント細菌と混合され得る。ある実施態様において、ベクター、配列またはトランスポゾンは本発明のＣＲＩＳＰＲアレイを含み、ここでアレイ標的ヌクレオチド配列は、標的配列を、例えば、配列を切断して、標的配列を���む遺伝子を不活性化することにより、修飾するために、レシピエント細胞に含まれる。代替として、ベクター、配列またはトランスポゾンは、第一レシピエント細菌と異なる種である細菌の第二レシピエント集団に水平伝播(例えば、接合性トランスポゾン伝達)可能であり、ここでヌクレオチド配列標的部位は第二レシピエント細菌に含まれるが、第一レシピエント細菌に含まれず、それにより標的部位が第二レシピエント細菌(宿主細胞)におけるＣａｓにより修飾される。
【０８５５】
例えば、第一レシピエント細菌はバクテロイデス細菌であり、第二レシピエント細菌はファーミキューテスまたは病原性細菌、例えば、腸内細菌である。例えば、運搬体細菌は、運搬体細菌、第一細菌および第二細菌に含まれることができる１以上の接合性トランスポゾン(例えば、ＣＴｎＤｏｔトランスポゾン)を含む本発明のベクター(例えば、ファージまたはプラスミド)を含み、例えば、ここでトランスポゾンはｏｒｉＴおよび運搬体細菌を含み、第一細菌および第二細菌はｏｒｉＴと適合性である。
【０８５６】
代替として、運搬体細菌は、例えば、動物または非ヒト動物、例えば、腸、口腔または全身(例えば、血中)のファーミキューテスまたは病原性細菌に、本発明のベクター、改変された配列またはトランスポゾンを直接伝達できる。例えば、病原性細菌は、クロストリジウム・ディフィシル、ヘリコバクター・ピロリ、病原性エシェリキア・コリ、サルモネラ、リステリア、エルシニア、シゲラ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカスまたはカンピロバクター細菌である。
【０８５７】
例えば、運搬体細菌は、ラクトバチルス種(例えば、アシドフィルス(例えば、Ｌａ−５、Ｌａ−１４またはＮＣＦＭ)、ブレビス、ブルガリクス、プランタルム、ラムノサス、ファーメンタム、コーカシクス、ヘルベティカス、ラクティス、ロイテリまたはカゼイ、例えば、カゼイ・シロタ)、ビフィドバクテリウム種(例えば、ビフィドゥム、ブレベ、ロングムまたはインファンティス)、ストレプトコッカス・サーモフィルスおよびエンテロコッカス・フェシウムからなる群から選択される１以上の種の細菌である。例えば、細菌はラクトバチルス・アシドフィルス細菌である。
【０８５８】
可動性トランスポゾンは、可動性プラスミドと同様、自己伝達できないが、ＴｃＲヘルパー要素存在間、細胞間で伝達され得る。最も一般的に検討されているこのクラスのバクテロイデストランスポゾンは、Ｔｎ４３９９、Ｔｎ４５５５および非複製的バクテロイデス単位を含む。可動性トランスポゾンＴｎ４５５５は、例えば、臨床単離バクテロイデス・ブルガタスにおける伝播性セフォキシチン耐性の研究中に最初に検出された。ある実施態様において、それ故に、本発明のトランスポゾンは、１以上の本発明のアレイまたは配列を含む、可動性トランスポゾン(例えば、バクテロイデス可動性トランスポゾン)、例えば、Ｔｎ４３９９またはＴｎ４５５５である。トランスポゾンはＴｃＲヘルパー要素と組み合わされる。
【０８５９】
例えば、本発明のトランスポゾンは、エンテロコッカスＴｎ９１６またはグラム陽性Ｔｎ１５４６トランスポゾンである。トランスポゾン(例えば、ＣＴｎＤｏｔ、Ｔｎ４３９９またはＴｎ４５５５トランスポゾンに関して)は、例えばその末端反復および／またはトランスポザーゼまたはリゾルバーゼコード化配列により特徴付けできる。別の例において、ベクターまたはトランスポゾンは、ｐＭＢ１、ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、Ｒ６Ｋ(ｐｉｒ遺伝子との組み合わせ)、ｐ１５Ａ、ｐＳＣ１０１、Ｆ１およびｐＵＣから選択される複製起点を含む。例えば、トランスポゾンは、トランスポゾン可動化または伝達に必要な因子(例えば、抗生物質、例えば、テトラサイクリン)と組み合わされる。例えば、トランスポゾンは抗生物質耐性遺伝子(例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子)を含み、トランスポゾンは該抗生物質と組み合わされる(例えば、ヒトに該抗生物質と同時にまたは逐次的に投与される)。例えば、トランスポゾンは同族トランスポザーゼと組み合わされたｐｉｇｇｙＢａｃ、ＭａｒｉｎｅｒまたはＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。例えば、トランスポゾンはクラスＩトランスポゾンである。例えば、トランスポゾンはクラスIIトランスポゾンである。例えば、トランスポゾンはＴｎファミリートランスポゾンである。
【０８６０】
細菌宿主における抗生物質耐性ターゲティング
抗生物質耐性は、世界的な問題である。抗生物質耐性の新規形態は国境を越え、大陸間を容易に拡散できる。多くの形態の耐性が、相当な速度で拡散した。世界保健リーダーは、抗生物質耐性微生物を“悪夢細菌”であり、世界の全ての国の人々に“壊滅的脅威をもたらす”と述べている。米国で、毎年少なくとも２百万人が、感染処置が企図される抗生物質の１以上に耐性である細菌による重度感染を獲得する。少なくとも２３,０００人がこれらの抗生物質耐性感染の直接の結果として毎年死亡する。さらに多くが、抗生物質耐性感染に合併する他の状態により死亡する。さらに、毎年約２５０,０００人が、クロストリジウム・ディフィシル(C. difficile)感染による入院加療を必要とする。これらの感染の大部分で、抗生物質の使用が、病気に至る主要因である。米国で少なくとも１４,０００名が、C. difficile感染により毎年死亡する。これらの感染の多くが予防できたはずである。抗生物質耐性感染は、既に負担が掛かりすぎている米国および他の健康管理システムに相当なかつ不可避の費用を加える。大部分、抗生物質で用意に処置可能な感染と比較して、抗生物質耐性感染は長期および／または高価な処置を必要とし、長期入院、さらなる通院および健康管理使用を必要とし、大きな身体障害および死亡にいたる。米国経済への抗生物質耐性の総経済的費用は計算が困難である。見積もりは多様であるが、２００億ドル超もの高額が直接健康管理費用であり、これに加えて生産性喪失による社会へのさらなる費用は年間３５０億ドルもの高額である(２００８ドル)とされる。抗生物質の使用は、世界中で抗生物質耐性に至る唯一の最も重要な因子である。抗生物質は、ヒト医薬で使用される最も一般的に処方されている薬物の一つである。しかしながら、人々に処方される全抗生物質の最大５０％が不要であるかまたは処方するには最適に効果的ではない。抗生物質は、疾患の管理および処置のために、さらに食糧生産動物の成長を促すために、食用動物にでも一般的に使用されている。成長を促すための抗生物質の使用は必要ではなく、この実施は減らすべきである。米国食品医薬品局(ＦＤＡ)の最近のガイドラインは、この目標に向けた行程を記載している。食用動物で使用されている薬物の量とヒトで使用されている量を直接比較するのは困難であるが、食品生産において使用される抗生物質が多いとの証拠がある。
【０８６１】
抗生物質耐性増加の他の主要因子は、細菌の耐性株の人から人へのまたは環境における食品を含む非ヒト源から人への拡散である。これらのこれらの致命的感染との戦いを助ける次の４つの中心的活動がある。１. 感染予防および耐性拡散予防、２. 耐性細菌追跡、３. 現在の抗生物質使用の改善および４. 新規抗生物質開発の促進および耐性細菌の新規診断の開発。細菌は、必然的に我々が開発した抗生物質に耐性となる方法を見つけ、これが、なぜ新規耐性の出現を抑制し、既に拡散している耐性を阻止するために積極的活動が現在必要であるかという理由である。
【０８６２】
本発明は、抗生物質耐性宿主をターゲティングするおよび宿主が本発明の組成物にさらなる耐性を発現する可能性を減らす改善された手段を提供する。
【０８６３】
宿主細胞および本発明を使用するこのような細胞における抗生物質耐性のターゲティングのさらなる例は次のとおりである。
１. 所望により宿主細胞が、例えば、メチシリン、バンコマイシン、リネゾリド、ダプトマイシン、キヌプリスチン、ダルホプリスチンおよびテイコプラニンから選択される抗生物質に耐性であるスタフィロコッカス・アウレウス細胞であり、宿主標的部位(または標的部位の１以上)が該抗生物質に対する宿主耐性を付与する遺伝子に含まれる。
【０８６４】
２. 所望により宿主細胞が、例えば、セファロスポリン類(例えば、セフタジジム)、カルバペネム類(例えば、イミペネムまたはメロペネム)、フルオロキノロン類、アミノグリコシド類(例えば、ゲンタマイシンまたはトブラマイシン)およびコリスチンから選択される抗生物質に耐性のシュードモナス・エルギノーサ細胞であり、宿主標的部位(または標的部位の１以上)が該抗生物質に対する宿主耐性を付与する遺伝子に含まれる。
【０８６５】
３. 所望により宿主細胞が、例えば、カルバペネムに耐性のクレブシエラ(例えば、ニューモニエ)細胞であり、宿主標的部位(または標的部位の１以上)が該抗生物質に対する宿主耐性を付与する遺伝子に含まれる。
【０８６６】
４. 所望により宿主細胞が、例えば、エリスロマイシン、クリンダマイシン、ベータ−ラクタム、マクロライド、アモキシシリン、アジスロマイシンおよびペニシリンから選択される抗生物質に耐性に耐性であるストレプトコッカス(例えば、サーモフィルス、ニューモニエまたはピオゲネス)細胞であり、宿主標的部位(または標的部位の１以上)が該抗生物質に対する宿主耐性を付与する遺伝子に含まれる。
【０８６７】
５. 所望により宿主細胞が、例えば、セフトリアキソン、アジスロマイシンおよびシプロフロキサシンから選択される抗生物質に耐性のサルモネラ(例えば、血清型チフィ)細胞であり、宿主標的部位(または標的部位の１以上)が該抗生物質に対する宿主耐性を付与する遺伝子に含まれる。
【０８６８】
６. 所望により宿主細胞が、例えば、シプロフロキサシンおよびアジスロマイシンから選択される抗生物質に耐性のシゲラ細胞であり、宿主標的部位(または標的部位の１以上)が該抗生物質に対する宿主耐性を付与する遺伝子に含まれる。
【０８６９】
７. 所望により宿主細胞が、例えば、イソニアジド(ＩＮＨ)、リファンピシン(ＲＭＰ)、フルオロキノロン、アミカシン、カナマイシンおよびカプレオマイシンから選択される抗生物質に耐性のマイコバクテリウム・ツベルクローシス細胞であり、アジスロマイシンおよび宿主標的部位(または標的部位の１以上)が該抗生物質に対する宿主耐性を付与する遺伝子に含まれる。
【０８７０】
８. 所望により宿主細胞が、例えば、バンコマイシンに耐性のエンテロコッカス細胞であり、宿主標的部位(または標的部位の１以上)が該抗生物質に対する宿主耐性を付与する遺伝子に含まれる。
【０８７１】
９. 所望により宿主細胞が、例えば、セファロスポリンおよびカルバペネムから選択される抗生物質に耐性の腸内細菌科細胞であり、宿主標的部位(または標的部位の１以上)が該抗生物質に対する宿主耐性を付与する遺伝子に含まれる。
【０８７２】
１０. 所望により宿主細胞が、例えば、トリメトプリム、ニトロフラントイン、セファレキシンおよびアモキシシリンから選択される抗生物質に耐性のエシェリキア・コリ細胞であり、宿主標的部位(または標的部位の１以上)が該抗生物質に対する宿主耐性を付与する遺伝子に含まれる。
【０８７３】
１１. 所望により宿主細胞が、例えば、フルオロキノロン抗生物質およびカルバペネムムから選択される抗生物質に耐性のクロストリジウム(例えば、ディフィシル)細胞であり、宿主標的部位(または標的部位の１以上)が該抗生物質に対する宿主耐性を付与する遺伝子に含まれる。
【０８７４】
１２. 所望により宿主細胞が、例えば、セフィキシム(例えば、経口セファロスポリン)、セフトリアキソン(注射可能セファロスポリン)、アジスロマイシンおよびテトラサイクリンから選択される抗生物質に耐性のナイセリア・ゴノレー細胞であり、宿主標的部位(または標的部位の１以上)が該抗生物質に対する宿主耐性を付与する遺伝子に含まれる。
【０８７５】
１３. 所望により宿主細胞が、例えば、ベータ−ラクタム、メロペネムおよびカルバペネムから選択される抗生物質に耐性のアシネトバクター・バウマンニ細胞であり、宿主標的部位(または標的部位の１以上)が該抗生物質に対する宿主耐性を付与する遺伝子に含まれる。
【０８７６】
１４. 所望により宿主細胞が、例えば、シプロフロキサシンおよびアジスロマイシンから選択される抗生物質に耐性のカンピロバクター細胞であり、宿主標的部位(または標的部位の１以上)が該抗生物質に対する宿主耐性を付与する遺伝子に含まれる。
【０８７７】
１５. 所望により、宿主細胞がベータ(β)−ラクタマーゼを産生する。
【０８７８】
１６. 所望により、宿主細胞が、例１〜１４の何れかに記載の抗生物質に耐性である細菌宿主細胞である。
【０８７９】
ある実施態様において、宿主細胞はＵＳＡ３００スタフィロコッカス・アウレウス株細胞である。
【０８８０】
例えば、本または各宿主標的配列は、宿主細胞、例えば、スタフィロコッカス・アウレウスプラスミド(例えば、ＵＳＡ３００株)のプラスミドに含まれる、例えば、スタフィロコッカス・アウレウス細胞のｐＵＳＡ０１、ｐＵＳＡ０２またはｐＵＳＡ０３プラスミドに含まれる標的である。例えば、第一および／または第二標的は宿主ｍｅｃＡ、ｍｅｃＡ２またはｓｅｋ遺伝子配列(例えば、スタフィロコッカス・アウレウス株細胞の)に含まれる。例えば、第一および／または第二標的は宿主病原性島ヌクレオチド(例えば、ＤＮＡ)配列に含まれる。例として、本発明のスペーサーは、ＷＯ２０１４／１２４２２６号の２６頁の表１に開示されたスペーサーを含むかまたはこれからなり、このスペーサー配列を引用によりここに包含させる。例えば、改変された配列、ＨＭ−ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡはこのようなスペーサーを含む。
【０８８１】
マウス皮膚コロニー形成アッセイにおいて抗生物質耐性細菌宿主を減らすまたは殺すまたは増殖を阻害するのに有効である本発明の組成物、使用、方法システム、ベクター、収集物、アレイ、改変された配列、ウイルス、ファージ、ファージミド、プロファージまたはビリオン(例えば、ＷＯ２０１４／１２４２２６号、Kugelberg E, et al. Establishment of a superficial skin infection model in mice by using Staphylococcus aureus and Streptococcus pyogenes. Antimicrob Agents Chemother. 2005;49:3435-3441またはPastagia M, et al. A novel chimeric lysin shows superiority to mupirocin for skin decolonization of methicillin-resistant and -sensitive Staphylococcus aureus strains. Antimicrob Agents Chemother. 2011;55:738-744に開示のとおり)であり、ここで第一および／または第二標的は該抗生物質に耐性を与える宿主遺伝子に含まれ、例えば、ここで宿主はスタフィロコッカス・アウレウス(例えば、ＵＳＡ３００株)宿主である。
【０８８２】
対照ストレプトコッカス・ピオゲネス配列は、Genbank accession number NC_002737下利用可能であり、ｃａｓ９遺伝子は８５４７５７〜８５８８６３位である。ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９アミノ酸配列は番号NP_269215の下入手可能である。これらの配列は、本発明における使用のために、引用によりここに包含させる。２０１５００７９６８０号に、明示的であれ、その中での引用により包含されるものであれ、開示されているさらなる配列も、本発明における使用のために引用によりここに包含させる。引用によりここに包含させるＷＯ２０１３／１７６７７２号の配列および方法もまた参照のこと。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列例は、本発明における使用のために引用によりここに包含させるＷＯ２０１４／１２４２２６号の１５頁に開示のものである。
【０８８３】
例えば、本および各反復は、２０〜５０(例えば、２４〜４７、例えば、３０、２９、２８、２７、２６、２５または２４)連続ヌクレオチド長を含むまたはこれからなる。
【０８８４】
例えば、本および各スペーサーは、１８〜５０(例えば、２４〜４７または２０〜４０、例えば、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８)、例えば、１９または２０連続ヌクレオチド長を含むまたはこれからなる。
【０８８５】
例えば、第一反復(本発明のＨＭ−アレイにおける最も５’)は、第一宿主標的を含む配列に相補的であるスペーサー配列に直ぐ５’である。これは、新たに獲得されたスペーサー(例えば侵入ファージ配列の)が、細菌のこの位置に一般に取り込まれるために有用であり、故に本発明の第一スペーサーのこの方法での配置は、その使用の促進に有用である。
【０８８６】
例えば、ウイルス(例えば、ファージ)核酸は複製起点(ｏｒｉ)および包装部位を含む。例えば、ウイルスの核酸は、必須カプシドタンパク質をコードする一つ、複数または全遺伝子、例えば、ｒｉｎＡ、ｔｅｒＳおよびｔｅｒＬ遺伝子も含む。例えば、これらの一つ、複数または全ては、代わりに、本発明のウイルスと共感染させるためであるコンパニオンヘルパーウイルス(例えば、ヘルパーファージ)に含まれる  −  これは、宿主で動作可能な多くのＨＭ−アレイ核酸および／多くのＣａｓコード化核酸を包含させるために、本発明ウイルスの空間を解放する。例えば、ウイルス核酸は野生型ファージゲノムのフラグメントを含み、ここでフラグメントは少なくともｒｉｎＡ、ｔｅｒＳおよびｔｅｒＬ遺伝子またはファージタンパク質をコードする同等遺伝子を含むゲノムの連続的ヌクレオチドからなる。
【０８８７】
例えば、宿主細胞は、ヒト微生物相に見られる株または種のものである。
【０８８８】
例えば、本または各標的部位は、宿主病原性接着、コロニー形成、侵襲、免疫応答阻害、病原性、必須タンパク質もしくは機能発現または毒素産生に介在する遺伝子に含まれる。例えば、遺伝子は、細胞毒、アルファ−ヘモリシン、ベータ−ヘモリシン、ガンマ−ヘモリシン、ロイコシジン、Panton-Valentineロイコシジン(ＰＶＬ)、外毒素、ＴＳＳＴ−１、エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣｎ、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ＳＥＧ、ＳＥＨ、ＳＥＩ、表皮剥脱毒素、ＥＴＡまたはＥＴＢをコードする遺伝子であり、所望によりここで宿主はスタフィロコッカス・アウレウス、例えば、ＭＲＳＡである。
【０８８９】
例えば、本または各ＣＲＩＳＰＲアレイは、ここに開示する形態、実施態様、例、コンセプト、態様、段落または項の何れかのアレイである。例えば、本または各改変されたヌクレオチド配列は、ここに開示する形態、実施態様、例、コンセプト、態様、段落または項の何れかの改変されたヌクレオチド配列である。
【０８９０】
例えば、本または各ベクターは、ここに開示する形態、実施態様、例、コンセプト、態様、段落または項の何れかのベクターである。
【０８９１】
ここに開示する形態、実施態様、例、態様、段落または項による例えば、ベクターまたはＭＧＥはｃａｓｐｏｓｏｎであるまたはこれを含む。ＭＧＥはさらに下に記載する。例えば、ｃａｓｐｏｓｏｎは、ファミリー１、２または３のｃａｓｐｏｓｏｎである。例えば、本発明のＭＧＥは、ｃａｓｐｏｓｏｎ末端逆向き反復および所望によりｃａｓｐｏｓｏｎ  Ｃａｓ１コード化配列を含む。例えば、本発明のＭＧＥは、ｃａｓｐｏｓｏｎマイナスＣａｓ１であるかまたはこれを含み、宿主細胞のＣａｓ１と共に可動化のために動作可能である。MC Biol. 2014 May 19;12:36. doi: 10.1186/1741-7007-12-36, “Casposons: a new superfamily of self-synthesizing DNA transposons at the origin of prokaryotic CRISPR-Cas immunity”, Krupovic M et al for details of casposons参照。
【０８９２】
本発明のさらなる適用例
例えば、組成物(例えば、抗生物質と組み合わされたＨＭ−組成物または改変された配列)は次の何れかである。例えば、組成物は、医科、眼科、歯科または医薬組成物(例えば、抗宿主ワクチンに含まれる)である。例えば、組成物は抗微生物組成物、例えば、抗生物質または抗ウイルス、例えば、医薬、殺菌剤または口腔洗浄剤である。例えば、組成物は、化粧品組成物(例えば、顔または体のメイクアップ組成物)である。例えば、組成物は除草剤である。例えば、組成物は殺虫剤(例えば、宿主がバチルス(例えば、チューリンゲンシス)宿主であるとき)である。例えば、組成物は飲料(例えば、ビール、ワインまたはアルコール飲料)添加物である。例えば、組成物は食品添加物(例えば、宿主がエシェリキア・コリ、サルモネラ、リステリアまたはクロストリジウム(例えば、ボツリヌム)宿主であるとき)である。例えば、組成物は水添加物である。例えば、組成物は、水生動物環境(例えば、魚用水槽における)添加物である。例えば、組成物は石油または石油化学工業組成物であるかまたはこのような組成物に含まれる(例えば、宿主が硫酸還元細菌、例えば、デスルホビブリオ宿主であるとき)。例えば、組成物は石油または石油化学添加物である。例えば、組成物は化学添加物である。例えば、組成物は殺菌剤(例えば、ヒトまたは動物使用のため、例えば、外科的または医学的使用または赤ちゃんの食餌のための装置の殺菌)である。例えば、組成物は、ヒトまたは動物使用のための個人衛生組成物である。例えば、組成物は環境使用、例えば、土壌処理または環境除染のための組成物(例えば、汚水または石油、石油化学または化学から、例えば、宿主が硫酸還元細菌、例えば、デスルホビブリオ宿主であるとき)である。例えば、組成物は植物成長刺激因子である。例えば、組成物は、石油、石油化学、金属または鉱物抽出において使用するための組成物である。例えば、組成物は布処理または添加物である。例えば、組成物は動物皮革、革製品またはスエード処理または添加物である。例えば、組成物は染料添加物である。例えば、組成物は飲料(例えば、ビールまたはワイン)醸造または発酵添加物(例えば、宿主がラクトバチルス宿主であるとき)である。例えば、組成物は紙添加物である。例えば、組成物はインク添加物である。例えば、組成物は接着剤添加物である。例えば、組成物は抗ヒトまたは動物または植物寄生虫組成物である。例えば、組成物は空気添加物(例えば、エアコンディショニング装置におけるまたはそれにより産生される空気のための、例えば、宿主がレジオネラ宿主)である。例えば、組成物は凍結防止添加物(例えば、宿主がレジオネラ宿主であるとき)である。例えば、組成物は洗眼または眼科組成物(例えば、コンタクトレンズ流体)である。例えば、組成物は乳製品食品(例えば、組成物はミルクまたは乳製品であるまたはこれに含まれる；例えば、ここで宿主はラクトバチルス、ストレプトコッカス、ラクトコッカスまたはリステリア宿主である)に含まれる。例えば、組成物は家庭用または工業用洗浄製品(例えば、宿主がエシェリキア・コリ、サルモネラ、リステリアまたはクロストリジウム(例えば、ボツリヌム)宿主であるとき)であるまたはこれに含まれる。例えば、組成物は燃料に含まれる。例えば��組成物は溶媒(例えば、水以外)に含まれる。例えば、組成物はベーキング添加物(例えば、食品ベーキング添加物)である。例えば、組成物は研究室試薬(例えば、生命工学または組み換えＤＮＡまたはＲＮＡ技術において使用)である。例えば、組成物は、繊維浸漬剤に含まれる。例えば、組成物は、ビタミン合成過程に使用するためであるる。例えば、組成物は抗作物または植物腐敗組成物(例えば、宿主が腐生栄養性細菌であるとき)である。例えば、組成物は、例えば、金属腐食を阻止または減少するための、抗腐食化合物(例えば、宿主が硫酸還元細菌、例えば、デスルホビブリオ宿主であるとき、例えば石油抽出、処理または封じ込め装置、金属抽出、処理または封じ込め装置または鉱物抽出、処理または封じ込め装置の腐食の減少または阻止に使用するため)である。例えば、組成物は農業または畜産組成物であるかまたはこのような組成物に含まれる。例えば、組成物は貯蔵牧草添加物である。本発明は、この段落に記載する組成物の何れかの使用またはこの段落に記載する適用の何れかにおける使用のための、ここに記載するＨＭ−ＣＲＩＳＰＲアレイ、ＨＭ−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＨＭ−ｃｒＲＮＡ、ＨＭ−スペーサー、ＨＭ−ＤＮＡ、ＨＭ−Ｃａｓ、ＨＭ−組成物またはｇＲＮＡを提供し、例えば、ここで宿主細胞は微生物細胞または細菌もしくは古細菌細胞である。本発明は、この段落に記載した適用の何れかのための方法を提供し、ここで方法は、本発明のＨＭ−ＣＲＩＳＰＲアレイ、ＨＭ−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＨＭ−ｃｒＲＮＡ、ＨＭ−スペーサー、ＨＭ−ＤＮＡ、ＨＭ−Ｃａｓ、ｇＲＮＡまたはＨＭ−組成物と、宿主細胞(例えば、微生物、細菌または古細菌細胞)をあわせることを含む。ある実施態様において、宿主細胞はヒト(またはヒト胚)または動物中または上に存在しない。
【０８９３】
本発明の態様の何れも、産業用または家庭用使用のためであるかまたはこのような使用のための方法に利用される。例えば、農業、石油または石油産業、食品または飲料産業、衣料品産業、包装産業、電子機器産業、コンピューター産業、環境産業、化成品産業、航空宇宙産業、自動車産業、生命工学産業、医療産業、健康産業、歯科産業、エネルギー産業、消費財産業、製薬産業、採鉱産業、清掃産業、林業、漁業、娯楽産業、リサイクリング産業、化粧品産業、プラスチック産業、パルプまたは紙産業、繊維産業、衣料品産業、革製品またはスエードまたは動物皮革の産業、タバコ産業または製鋼産業用であるかまたはこれらで使用される。
【０８９４】
ここで、デスルホビブリオ宿主が記載されているとき、宿主は、代わりにデスルフォバルブス、デスルフォバクター、デスルフォバクテリウム、デスルフォコッカス、デスルホモニレ、デスルフォネーマ、デススルホボトラスまたはデススルホアルクラス宿主であるかまたはここに開示する任意の他の硫黄還元細菌である。ある実施態様において、油、水、汚水または環境適用のために、宿主はデスルホビブリオ・キャピラタス宿主である。
【０８９５】
大規模な微生物学的分析および１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列決定は、デスルホビブリオ属が、環境から単離され得る約８つの異なる硫酸還元性真正細菌群のうちの１つに過ぎないことを示している。これらの群の７種はグラム陰性であるが、１種はグラム陽性細菌(デスルホトマキュラム)である。デスルホビブリオ属は、むしろ小さいゲノムを有する。最初の推定はデスルホビブリオ・ブルガリスおよびデスルホビブリオ・ギガス(これは本発明の宿主であり得る)のゲノムについてそれぞれ１.７Mbpおよび１.６Mbpであった。これは、本発明において使用するための所望の標的配列(例えば、必須または耐性遺伝子における配列)の同定を助ける。デスルホビブリオ・デスルフリカンス(これは本発明の宿主であり得る)Ｇ２００の常在性プラスミドの特徴づけは、シャトルベクターの構築を可能とし(Wall 1993、このベクターは本発明のベクターとして使用し得る)、デスルホビブリオ・ブルガリス・ヒルデンバラ(これは本発明の宿主であり得る)からの２バクテリオファージの単離および特徴づけ(Seyedirashti, 1992)は、デスルホビブリオ属の能率的遺伝子操作の他の方法を提供し得る。例えば、ベクターはミューまたはミュー様バクテリオファージである。
【０８９６】
宿主の例はデスルホビブリオ・ブルガリス亜種ブルガリス・ポストゲイトおよびキャンベル(ＡＴＣＣ(登録商標)２９５７９TM)株命名：NCIB 8303[DSM 644、ヒルデンバラ]である。
【０８９７】
細菌のマイトマイシンＣまたはＵＶでの処理が、以前、細菌からのファージの誘発に使用されており(Driggers &#38; Schmidt)、これは、本発明の例または態様の何れかにおける使用のためのベクターを産生するために適当な宿主適合ファージを得るための適当な方法である。
【０８９８】
本発明の適用は、乳製品産業(例えば、チーズまたはバターまたは乳製品製造)または発酵(例えば、ワインまたは酢または大豆)またはビール醸造または製パン産業における。例えば、乳製品産業適用のために、本発明の方法は、培養から乳酸を産生するために一定期間乳酸産生細菌(例えば、ラクトバチルス宿主細胞)の培養を発酵させ、その後細菌と混合した１以上の本発明のアレイ、システム、ベクター、集団または収集物からｃｒＲＮＡを発現させることにより細菌の増殖を阻止し、それにより細菌による乳酸製造を減少または阻止することを含む、乳製品食品の製造方法である。これは、食品／飲料の腐敗または望ましくない食品／飲料の味および／または香りの抑制に有用である。一例において、細菌に誘導可能ＨＭ−アレイが含まれ、ここで方法は、最初の期間の後誘発剤を添加することを含む。
【０８９９】
引用文献
Wall, J. D., B. J. Rapp-Giles, and M. Rousset. 1993. “Characterization of a small plasmid from Desulfovibrio desulfuricans and its use for shuttle vector construction”. J. Bacteriol. 175:4121-4128;
Seyedirashti S et al; J Gen Microbiol. 1992 Jul;138(7):1393-7, “Molecular characterization of two bacteriophages isolated from Desulfovibrio vulgaris NCIMB 8303 (Hildenborough)”;
Driggers &#38; Schmidt, J. gen. Virol. (I97O), 6, 421-427, “Induction of Defective and Temperate Bacteriophages in Caulobacter”
【０９００】
コンセプト：
混合細菌集団中の第一細菌および第二細菌の亜集団の相対比率の改変、例えば、ｉｎ微生物相
１. 混合細菌集団中の第一細菌および第二細菌の亜集団の相対比率を変えるための宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用であって、第二細菌は宿主細胞に含まれ、
各宿主細胞について、システムは(ｉ)〜(iv)
(ｉ)Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列；
(ii)ＨＭ−ｃｒＲＮＡをコードするスペーサー配列(ＨＭ−スペーサー)および反復を含む宿主細胞標的配列および改変された宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイであって、ＨＭ−ｃｒＲＮＡは該Ｃａｓを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主細胞標的配列とハイブリダイズする配列を含むもの；
(iii)任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮＡ配列；
(iv)ここで、システムの該要素は、宿主細胞と宿主細胞を形質転換する少なくとも一つの核酸ベクターの間で分かれ、それによりＨＭ−ｃｒＲＮＡがＣａｓを標的にガイドし、宿主細胞における宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを修飾し；そして
ここで標的配列がＣａｓにより修飾され、それにより宿主細胞を死滅させるかまたは宿主細胞増殖を減少させる
の要素を含む。
【０９０１】
２. 細菌宿主細胞の標的ヌクレオチド配列修飾のためのコンセプト１の使用のための宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであって、ｉ)〜(iv)
(ｉ)Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列；
(ii)ＨＭ−ｃｒＲＮＡをコードするスペーサー配列(ＨＭ−スペーサー)および反復を含む宿主細胞標的配列および改変された宿主修飾(ＨＭ)ＣＲＩＳＰＲアレイであって、ＨＭ−ｃｒＲＮＡは該Ｃａｓを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主細胞標的配列とハイブリダイズする配列を含むもの；
(iii)任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するためのＤＮＡ配列；
(iv)ここで、システムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換できる少なくとも一つの核酸ベクターの間で分かれ、それによりＨＭ−ｃｒＲＮＡがＣａｓを標的にガイドし、宿主細胞における宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを修飾する
の要素を含む、システム。
【０９０２】
３. ベクターまたはベクターがＣａｓ(例えば、Ｃａｓ９)ヌクレアーゼコード化配列を欠、コンセプト２のシステム。
【０９０３】
４. 各宿主細胞がヒト微生物相に見られる株または種のものである、先のコンセプトの何れかの使用またはシステム。
【０９０４】
５. (ａ)混合細菌集団におけるバクテロイデス門細菌の比率の改変、(ｂ)混合細菌集団におけるファーミキューテス亜集団(宿主細胞)の比率の減少、(ｃ)混合集団における第一ファーミキューテス種(宿主細胞)の比率の減少であって、ここで混合集団は該ｃＲＮＡにより増殖が阻害されない第二ファーミキューテス種を含むもの、(ｄ)混合細菌集団における第一グラム陽性細菌種(宿主細胞)の比率の減少であって、ここで混合集団は該ｃＲＮＡにより増殖が阻害されない第二グラム陽性細菌種を含むもの、(ｅ)混合細菌集団におけるある細菌種(宿主細胞)の比率の減少であって、ここで混合集団は該ｃＲＮＡにより増殖が阻害されない異なる細菌種を含み、ここで第一種は、他の種の１６ｓリボソームＲＮＡコード化ＤＮＡ配列と少なくとも８０％、８２％、８３％、８４％、８５％、９０％または９５％同一である１６ｓリボソームＲＮＡコード化ＤＮＡ配列を有するもの、(ｆ)混合細菌集団における第一細菌ヒト腸内微生物相種(宿主細胞、例えば、ファーミキューテス)の比率の減少であって、ここで混合集団は異なる細菌種を含み、ここで異なる種は該ｃＲＮＡにより増殖が阻害されないヒト腸プロバイオティク種であるものまたは(ｇ)混合細菌集団における細菌ヒト腸内微生物相種(宿主細胞、例えば、ファーミキューテス)の比率の減少であって、ここで混合集団は異なる細菌種を含み、ここで異なる種は該ｃＲＮＡにより増殖が阻害されないヒト腸片利共生種であるもののためである、コンセプト１または４の使用。
【０９０５】
６. (ａ)混合細菌集団におけるバクテロイデス門細菌の比率の改変、(ｂ)混合細菌集団におけるファーミキューテス亜集団(宿主細胞)の比率の減少、(ｃ)混合集団における第一ファーミキューテス種(宿主細胞)の比率の減少であって、ここで混合集団は該ｃＲＮＡにより増殖が阻害されない第二ファーミキューテス種を含むもの、(ｄ)混合細菌集団における第一グラム陽性細菌種(宿主細胞)の比率の減少であって、ここで混合集団は該ｃＲＮＡにより増殖が阻害されない第二グラム陽性細菌種を含むもの、(ｅ)混合細菌集団におけるある細菌種(宿主細胞)の比率の減少であって、ここで混合集団は該ｃＲＮＡにより増殖が阻害されない異なる細菌種を含み、ここで第一種は、他の種の１６ｓリボソームＲＮＡコード化ＤＮＡ配列と少なくとも８０％、８２％、８３％、８４％、８５％、９０％または９５％同一である１６ｓリボソームＲＮＡコード化ＤＮＡ配列を有するもの、(ｆ)混合細菌集団における第一細菌ヒト腸内微生物相種(宿主細胞、例えば、ファーミキューテス)の比率の減少であって、ここで混合集団は異なる細菌種を含み、ここで異なる種は該ｃＲＮＡにより増殖が阻害されないヒト腸プロバイオティク種であるものまたは(ｇ)混合細菌集団における細菌ヒト腸内微生物相種(宿主細胞、例えば、ファーミキューテス)の比率の減少であって、ここで混合集団は異なる細菌種を含み、ここで異なる種は該ｃＲＮＡにより増殖が阻害されないヒト腸片利共生種であるもののための、コンセプト２または３のシステムであって、ここで(ａ)〜(ｇ)は、ヒトまたは動物対象における(ｉ)比率が減少される該細菌種による微生物相感染または(ii)比率が減少される該細菌種が介在する疾患または状態の処置または予防のためである。
【０９０６】
７. ファーミキューテスに対するバクテロイデス門の相対的比率を増加させるための、コンセプト５または６の使用またはシステム。
【０９０７】
８. 該Ｃａｓヌクレアーゼが該細胞の内在性タイプII  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより提供される、先のコンセプトの何れかの使用またはシステム。
【０９０８】
９. 要素(ｉ)が宿主細胞に内在性である、先のコンセプトの何れかの使用またはシステム。
【０９０９】
１０. 標的配列が宿主細胞の抗生物質耐性遺伝子、病原性遺伝子または必須遺伝子に含まれる、先のコンセプトの何れかの使用またはシステム。
【０９１０】
１１. 標的配列が宿主染色体配列である、先のコンセプトの何れかの使用またはシステム。
【０９１１】
１２. 代替的にＨＭ−ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが単一ガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)からなる、例えばベクターにより提供される、先のコンセプトの何れかの使用またはシステム。
【０９１２】
１３. 宿主細胞が目的のＨＭ配列をコードする遊離末端(ＨＭ−ＤＮＡ)を有するデオキシリボ核酸鎖を含むおよび／またはここでシステムがＨＭ−ＤＮＡをコードする配列を含み、ここでＨＭ−ＤＮＡは、ＨＭ−ＤＮＡを宿主ゲノム(例えば、染色体またはエピソーム部位)に挿入するために標的配列内にあるまたは隣接する１個以上の配列にそれぞれ相同である１個以上の配列を含む、先のコンセプトの何れかの使用またはシステム。
【０９１３】
１４. 内在性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む細菌宿主細胞の修飾のためのコンセプト１の使用のための改変された核酸ベクターであって、
(ｇ)前記コンセプトの何れかのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムまたは使用における使用のための複数の異なるｃｒＲＮＡを発現するための核酸配列を含み(例えば、ｇＲＮＡに含まれる)；そして
(ｈ)所望によりＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸配列を欠き、
ここで、該ｃｒＲＮＡの第一は該宿主細胞の第一核酸配列とハイブリダイズでき、そして該ｃｒＲＮＡの第二は該宿主細胞の第二核酸配列とハイブリダイズでき、ここで該第二配列は該第一配列と異なり；そして
(ｉ)第一配列は抗生物質耐性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は抗抗生物質耐性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、所望により、これらの遺伝子は異なり；
(ｊ)第一配列は抗生物質耐性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み；
(ｋ)第一配列は必須遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含むかまたは
(ｌ)第一配列は病原性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含む、
ベクター。
【０９１４】
１５. ベクターによりコードされるｃＲＮＡ(例えば、単一ガイドＲＮＡ)により動作可能である１以上のＣａｓを含む宿主細胞内にある、コンセプト１４のベクター。
【０９１５】
１６. ＨＭ−ＣＲＩＳＰＲアレイが同じスペーサーの複数コピーを含む、前記コンセプトの何れかの使用、システムまたはベクター。
【０９１６】
１７. ベクターが複数のＨＭ−ＣＲＩＳＰＲアレイを含む、前記コンセプトの何れかの使用、システムまたはベクター。
【０９１７】
１８. 各ベクターがウイルスまたはファージである、前記コンセプトの何れかの使用、システムまたはベクター。
【０９１８】
１９. システムまたはベクターがｃｒＲＮＡ(例えば、ｇＲＮＡ)をコードする核酸配列の２、３またはそれ以上のコピーを含み、ここでコピーが宿主細胞配列(例えば、病原性、耐性または必須遺伝子配列)のターゲティングのための同じスペーサー配列を含む、前記コンセプトの何れかの使用、システムまたはベクター。
【０９１９】
２０. コピーが２以上のベクターＣＲＩＳＰＲアレイ間に別れる、コンセプト２０の使用、システムまたはベクター。
【０９２０】
２１. 前記コンセプトの何れかに記載のシステムまたはベクターを含む、細菌宿主細胞。
【０９２１】
２２. アレイが抗生物質薬剤と組み合わされるまたは使用が宿主細胞の第一抗生物質への暴露を含み、ここで標的配列が該第一抗生物質への耐性のために抗生物質耐性遺伝子に含まれる、前記コンセプトの何れかの使用、システム、ベクターまたは細胞。
【０９２２】
２３. 宿主細胞がスタフィロコッカス、ストレプトコッカス、シュードモナス、サルモネラ、リステリア、エシェリキア・コリ、デスルホビブリオまたはクロストリジウム宿主細胞である、前記コンセプトの何れかの使用、システム、ベクターまたは細胞。
【０９２３】
２４. 各ベクターがコンセプト１４または１５に従う、コンセプト１〜１３または１６〜２３の何れかの使用、システムまたは細胞。
【０９２４】
２５. 宿主細胞集団増殖が、該ＨＭ−アレイまたは該ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列で形質転換されていない該宿主細胞の集団の増殖と比較して少なくとも５倍減少している、前記コンセプトの何れかの使用、システム、ベクターまたは細胞。
【０９２５】
２６. 表面上の宿主細胞集団増殖が阻害される、前記コンセプトの何れかの使用、システム、ベクターまたは細胞。例えば、集団はヒト組織表面と接触している(例えば、腸組織表面、例えば、インビボまたはエクスビボ)。
【０９２６】
２７. 第一細菌がヒトとプロバイオティク、片利共生または相利共生である(例えば、ヒト腸における)、前記コンセプトの何れかの使用、システム、ベクターまたは細胞。
【０９２７】
２８. 第一細菌および第二細菌が何れもファーミキューテスであり、異なる種または株の細菌であるかまたはここで第一細菌が腸内細菌科であり、第二細菌がファーミキューテスである、前記コンセプトの何れかの使用、システム、ベクターまたは細胞。
【０９２８】
２９. 宿主細胞が細菌細胞ではなくて古細菌細胞であるかまたは各集団が細菌集団ではなくて古細菌集団である、前記コンセプトの何れかの使用、システム、ベクターまたは細胞。
【０９２９】
３０. 工業用またはエクスビボ医学的流体、表面、装置またはコンテナまたは水路、水、飲料、食糧または化粧品の処理のための、コンセプト１、４、５、７〜１３、１６〜２０および２２〜２９の使用であって、ここで宿主細胞が流体、表面、装置、コンテナ、水路、水、飲料、食糧または化粧品に含まれるまたは上にある。
【０９３０】
３１. ＨＭ−ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡがＮＮＡＧＡＡＷまたはＮＧＧＮＧプロトスペーサー隣接モチーフ(ＰＡＭ)に隣接する宿主細胞標的プロトスペーサー配列とハイブリダイズ可能な配列を含む、前記コンセプトの何れかの使用、システム、ベクターまたは細胞。
【０９３１】
３２. 前記コンセプトの何れかの使用、システムまたは細胞に従うまたはそれにおいて使用するための核酸ベクターであって、１.４kbを超える外来性ＤＮＡ配列を含み、ここで外来性ＤＮＡはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの１以上の要素をコードし、宿主細胞におけるＨＭ−ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡの発現のための改変されたアレイを含み、ここで外来性配列は、ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡと同族であるＣａｓヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を欠き、ここで少なくとも２つの異なるｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは外来性ＤＮＡにより(例えば、少なくとも２ＨＭ−ＣＲＩＳＰＲアレイにより)コードされるもの。
【０９３２】
３３. ここでベクターが宿主細胞を形質転換できるウイルスベクターである、コンセプト３２のベクター。
【０９３３】
３４. ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは各標的プロトスペーサー配列に対して宿主細胞においてハイブリダイズでき、ここで各プロトスペーサー配列は抗生物質耐性または必須宿主遺伝子に含まれる、コンセプト３２または３３のベクター。
【０９３４】
３５. 宿主細胞がヒト微生物相種の細胞である、コンセプト３４〜３６の何れかのベクター。
【０９３５】
実施態様：
表面の細菌の集団増殖阻害および処理のための野生型内在性Ｃａｓの利用
１. 集団の増殖阻害のための細菌宿主細胞集団の野生型内在性Ｃａｓヌクレアーゼ活性の使用であって、ここで集団は複数の宿主細胞を含み、各宿主細胞は野生型Ｃａｓヌクレアーゼ活性を有する内在性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを有し、使用は集団の宿主細胞の形質転換を含み、ここで各形質転換宿主細胞は、宿主細胞における宿主修飾(ＨＭ)ｃＲＮＡまたはガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)の提供のために改変されたヌクレオチド配列で形質転換され、ＨＭ−ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、内在性Ｃａｓを標的にガイドするための宿主細胞標的プロトスペーサー配列とハイブリダイズ可能な配列を含み、ここでｃＲＮＡまたはｇＲＮＡが該野生型ヌクレアーゼ活性を有する宿主細胞の内在性Ｃａｓヌクレアーゼと同族であり、宿主細胞の該形質転換後、集団の増殖が阻害されるもの。
【０９３６】
宿主細胞は同じ種または株のものでよい。
【０９３７】
２. 宿主細胞集団増殖阻害が、該改変されたヌクレオチド配列で形質転換されていない該宿主細胞の集団の増殖と比較して、増殖が少なくとも５倍減少している、実施態様１の使用。
【０９３８】
３. 表面上の集団増殖が阻害される、実施態様１の使用。
【０９３９】
４. 表面上の集団増殖が阻害される、実施態様２の使用。
【０９４０】
５. 該阻害が該宿主細胞の死滅または増殖減少のためのＨＭ−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用を含み、各宿主細胞について、システムは(ｉ)〜(iv)
(ｉ)該Ｃａｓヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列；
(ii)スペーサー配列(ＨＭ−スペーサー)および該ＨＭ−ｃｒＲＮＡをコードする反復を含む改変された宿主修飾ＨＭ−ＣＲＩＳＰＲアレイ；
(iii)任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮＡ配列；
(iv)ここで、システムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換する少なくとも一つの核酸ベクターの間で分かれ、それによりＨＭ−ｃｒＲＮＡは該Ｃａｓを標的にガイドして、標的配列を修飾するもの；
の要素を含む、実施態様１の使用であって、ここで標的配列はＣａｓにより宿主細胞において修飾され、それにより宿主細胞が死滅するかまたは宿主細胞増殖が減少する
に従う要素を含む。
【０９４１】
６. 混合細菌集団中の第一細菌および第二細菌の亜集団の相対比率の改変のための、先の実施態様の何れかの使用であって、第二細菌は該宿主細胞を含む。
【０９４２】
７. 宿主細胞がヒト微生物相に見られる株または種のものである、実施態様６の使用。
【０９４３】
８. 宿主細胞が異なる株または種の細胞と混合され、ここで異なる細胞はヒト(例えば、ヒト腸における)とプロバイオティク、片利共生または相利共生である腸内細菌科または細菌である)、実施態様６または７の使用。
【０９４４】
９. バクテロイデス門細菌および他の細菌を含む混合細菌集団におけるバクテロイデス門細菌の比率を変えるための、所望により集団におけるバクテロイデス門の一つ、複数または全ファーミキューテス種(例えば、対ストレプトコッカス)に対する比率を増加するための、先の実施態様の何れかの使用。
【０９４５】
１０. 混合集団における第一細菌対第二細菌の相対比率を変えるための、先の実施態様の何れかの使用であって、ここで第一細菌および第二細菌が何れもファーミキューテスであり、異なる種または株の細菌であり、第二細菌は宿主細胞を含む。例えば、使用は第一対第二細菌の比率を増加させる。
【０９４６】
１１. 改変されたヌクレオチド配列が外来性Ｃａｓヌクレアーゼコード化配列と組み合わされない、実施態様１の使用。
【０９４７】
１２. １個または複数のベクターがＣａｓヌクレアーゼコード化配列を欠く、実施態様５の使用。
【０９４８】
１３. 各宿主細胞がヒト微生物相に見られる株または種のものである、実施態様１の使用。
【０９４９】
１４. 各宿主細胞がヒト微生物相に見られる株または種のものである、実施態様６の使用。
【０９５０】
１５. 各宿主細胞が異なる株または種の細胞と混合され、ここで異なる細胞はヒト(例えば、ヒト腸における)とプロバイオティク、片利共生または相利共生である腸内細菌科または細菌である)、実施態様１３の使用。
【０９５１】
１６. 使用がバクテロイデス門細菌および他の細菌を含む混合細菌集団におけるバクテロイデス門細菌の比率を変え、所望によりここで使用が集団におけるバクテロイデス門対一つ、複数または全ファーミキューテス(例えば、ストレプトコッカス)種の相対比率を変える、実施態様１の使用。
【０９５２】
１７. 第一細菌および第二細菌が両者ともファーミキューテスであり、使用が混合集団における第一対第二細菌の相対比率を変える、実施態様１の使用。例えば、使用は第一対第二細菌の比率を増加させる。
【０９５３】
１８. 該Ｃａｓヌクレアーゼが宿主細胞内在性タイプII  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムおよび／またはＨＭ−ｃＲＮＡにより提供されるかまたはｇＲＮＡが５’−ＮＮＡＧＡＡＷ−３’プロトスペーサー隣接モチーフ(ＰＡＭ)に隣接する宿主細胞標的プロトスペーサー配列とハイブリダイズ可能な配列を含む、実施態様１の使用。
【０９５４】
１９. 該Ｃａｓヌクレアーゼが宿主細胞内在性タイプII  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより提供される、実施態様５の使用。
【０９５５】
２０. 要素(iii)が宿主細胞に内在性である、実施態様５の使用。
【０９５６】
２１. 各形質転換宿主細胞が細胞における該ＨＭ−ｃｒＲＮＡの産生における要素(ii)と共に動作可能な内在性ＲＮａｓｅ  IIIを含む、実施態様５の使用。
【０９５７】
２２. 標的配列が宿主細胞の抗生物質耐性遺伝子、病原性遺伝子または必須遺伝子に含まれる、実施態様１の使用。
【０９５８】
２３. 改変されたヌクレオチド配列が抗生物質薬剤と組み合わされる、実施態様１の使用。
【０９５９】
２４. ＨＭ−ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが単一ガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)からなる、実施態様５の使用。
【０９６０】
２５. 形質転換が各々目的のＨＭ配列をコードする遊離末端(ＨＭ−ＤＮＡ)を含むデオキシリボ核酸鎖を含み、ここでＨＭ−ＤＮＡが、ＨＭ−ＤＮＡの宿主ゲノムへの挿入のために標的配列におけるまたは隣接する配列または複数配列とそれぞれ相同である配列または複数配列を含み、ここでＨＭ−ＤＮＡ配列が宿主細胞ゲノムに挿入される、実施態様１の使用。
【０９６１】
２６. 宿主細胞プロトスペーサー標的配列とのハイブリダイズのために宿主細胞複数の異なるｃｒＲＮＡ(またはｇＲＮＡ)での発現を含み、ここで、該ｃｒＲＮＡ(またはｇＲＮＡ)の第一は第一プロトスペーサー核酸配列とハイブリダイズでき、そして該ｃｒＲＮＡ(またはｇＲＮＡ)の第二は第二プロトスペーサー核酸配列とハイブリダイズでき、ここで該第二配列は該第一配列と異なり；そして
(ａ)第一配列は抗生物質耐性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は抗抗生物質耐性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、所望により、これらの遺伝子は異なり；
(ｂ)第一配列は抗生物質耐性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み；
(ｃ)第一配列は必須遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含むかまたは
(ｄ)第一配列は病原性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのＲＮＡ)を含む、
実施態様１の使用。
【０９６２】
２７. 宿主細胞がヒトまたは動物対象に含まれる混合細菌集団に含まれ、使用が(ｉ)混合集団に含まれる該宿主細胞による対象における感染を処置する；(ii)対象における該宿主細胞が介在する状態または疾患を処置するまたはリスクを減少させる；(iii)該宿主細胞が原因であるまたは介在するヒトの体臭を減少させるまたは(iv)ヒトの個人衛生である、実施態様６の使用。
【０９６３】
２８. 使用がヒトまたは動物対象における該宿主細胞による感染を処置するかまたはリスクを減少させ、ここで宿主細胞が各々該標的プロトスペーサー配列を含む抗生物質耐性遺伝子(第一抗生物質への耐性のため)を含み、ここで使用が改変されたヌクレオチド配列および第一抗生物質の対象への投与を含み、ここで対象において感染が軽減または予防される、実施態様１の使用。
【０９６４】
２９. 各改変されたヌクレオチド配列がさらに抗生物質耐性遺伝子を含み、ここでＨＭ−ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡは抗生物質耐性遺伝子を標的とせず、使用が該抗生物質および複数の該改変された配列に集団を曝すことを含み、それにより宿主細胞におけるＨＭ−ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡコード化配列の維持が促進される、実施態様１の使用。
【０９６５】
３０. 宿主細胞がグラム陽性細胞またはストレプトコッカス、スタフィロコッカス、シュードモナス、サルモネラ、リステリア、エシェリキア・コリ、デスルホビブリオ、ビブリオ・コレラエまたはクロストリジウム細胞である、実施態様１の使用。
【０９６６】
３１. 工業用または医学的流体、表面、装置またはコンテナの処理または水路、水、飲料、食糧または化粧品の処理のためであり、ここで宿主細胞が流体、表面、装置、コンテナ、水路、水、飲料、食糧または化粧品に含まれるかまたはその上にあり、ここで宿主細胞集団の増殖が阻害され、それにより該処理が実施される、実施態様１の使用。
【０９６７】
代替として、任意の実施態様は、任意の先の実施態様に従属する。
【０９６８】
態様：
混合集団における運搬体と宿主細胞間の水平伝播
１. 運搬体細菌を含む混合細菌集団を産生する方法であって、ここではそれぞれ第一細菌および第二細菌の第一および第二亜集団を含み、ここで亜集団は互いに異なる第一および第二種の細菌であり、第二細菌は複数の宿主細胞を含み、ここで運搬体細菌は、各々宿主細胞における宿主細胞修飾(ＨＭ)ｃＲＮＡまたはガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)を提供するための改変されたヌクレオチド配列を含む第一細菌細胞であり、ＨＭ−ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、第一Ｃａｓヌクレアーゼを標的にガイドし、標的を修飾するために宿主細胞標的プロトスペーサー配列とハイブリダイズ可能な配列を含み、ここで運搬体細菌は標的配列を含まず、方法は
ａ. 各々該改変されたヌクレオチド配列を含む複数の核酸を提供し；
ｂ. 該複数の核酸と、それぞれ第一細菌および第二細菌種の第一および第二亜集団を含む第一混合集団を合わせ、第二亜集団は宿主細胞を含み；
ｃ. 宿主細胞の存在下該第一亜集団の細胞を核酸で形質転換させ、それにより該運搬体細胞および該宿主細胞を含む第二混合集団を産生することを含み、ここで運搬体細胞に含まれる該改変されたヌクレオチド配列は形質転換宿主細胞における該ＨＭ−ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡの産生のために宿主細胞を形質転換するために宿主細胞に水平伝播可能である、
方法。
【０９６９】
２. さらに第二混合集団を得ることを含む、態様１の方法。
【０９７０】
３. さらに第二混合集団から複数の運搬体細胞を単離することを含む、態様１の方法。
【０９７１】
４. さらに形質転換宿主細胞における該ＨＭ−ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡの産生を含み、ここで該ＨＭ−ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡ配列が該形質転換宿主細胞における標的プロトスペーサー配列とハイブリダイズして第一Ｃａｓヌクレアーゼを標的にガイドし、それにより標的が第一Ｃａｓヌクレアーゼで修飾される、態様１の方法。
【０９７２】
５. さらに該標的修飾を含む宿主細胞を得ることを含む(例えば、ここで宿主細胞は該第一細菌種を含む混合集団に含まれる)、態様４の方法。
【０９７３】
６. ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡが宿主細胞の内在性Ｃａｓヌクレアーゼと同族であり、ここでヌクレアーゼが該第一Ｃａｓヌクレアーゼである、態様１の方法。
【０９７４】
７. ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡが運搬体細胞の内在性Ｃａｓヌクレアーゼと同族であり、ここでヌクレアーゼが該第一Ｃａｓヌクレアーゼである、態様１の方法。
【０９７５】
８. ヌクレアーゼが野生型ヌクレアーゼ活性を有する、態様７の方法。
【０９７６】
９. 第一ＣａｓヌクレアーゼがＣａｓ９である、態様１、６、７または８の方法。
【０９７７】
１０. Ｃａｓ９がストレプトコッカスＣａｓ９である、態様９の方法。
【０９７８】
１１. 各改変されたヌクレオチド配列が各核酸ベクターに含まれ、ここでベクターが運搬体と宿主細胞間で水平伝播可能である、態様１の方法。
【０９７９】
１２. 各改変された配列が各可動遺伝要素、例えば、トランスポゾンまたはプラスミドを含む、態様１または１１の方法。
【０９８０】
１３. 宿主細胞の該形質転換後、宿主細胞亜集団の増殖が阻害される、態様１の方法。
【０９８１】
１４. 宿主細胞集団増殖阻害が、該改変されたヌクレオチド配列で形質転換されていない該宿主細胞の集団の増殖と比較して少なくとも５倍である、態様１３の方法。
【０９８２】
１５. 表面上の宿主細胞集団増殖が阻害される、態様１３または１４の方法。
【０９８３】
代替として、任意の態様は先の態様の何れかに従属する。
【０９８４】
例えば、方法は、例えば、ここに記載する、ヒト、動物または植物対象における疾患または状態の処置または予防の方法であって、ここで方法は該処置または予防に有効である。本発明は、処置または予防のこのような方法により得たまたは得ることができる混合細菌集団を提供する。
【０９８５】
例えば、方法は、例えば、ここに記載する、環境、装置、装置、コンテナ、水路、水、流体、食糧、飲料、微生物相、マイクロバイオームまたは化粧品の混合細菌集団で実施し、ここで方法は、第一細胞と比較して、宿主細胞の比率を減少させる。
【０９８６】
例えば、方法の製品はヒトまたは動物の肥満、糖尿病またはＩＢＤの処置または予防のため、ヒトまたは非ヒト動物の腸に投与するためである。
【０９８７】
例えば、第一および第二種は、ヒトまたは非ヒト動物腸片利共生または相利共生細菌の種である。
【０９８８】
方法の製品は、細菌がヒトまたは動物の１以上のマイクロバイオーム(例えば、腸マイクロバイオーム)で定植するように、ヒトまたは動物に投与(例えば、鼻腔内)できるため、有用である。第一細胞は、特にこれらの細胞がヒトまたは動物(例えば、腸マイクロバイオームにおいて非病原性)に非病原性であるとき、運搬体として働く。マイクロバイオームは、ここに開示する任意の他のマイクロバイオームまたは微生物相集団であり得る。
【０９８９】
例えば、第一第二細菌種がヒトまたは非ヒト動物の腸内微生物相で定植でき、第一細菌がヒトまたは動物と片利共生または相利共生である。有用なことに、第一細菌をヒトまたは動物に安全に投与でき、微生物相の宿主細胞にその後改変された配列を伝達するための運搬体として働くことができる。
【０９９０】
例えば、改変された配列はここに開示する任意のアレイまたはベクターに含まれる。例えば、方法は、ここに開示する任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用する。
【０９９１】
例えば、第一細胞は、バクテロイデス門(例えば、バクテロイデス科またはバクテロイデス)細胞、ラクトバチルス(例えば、アシドフィルス(例えば、Ｌａ−５、Ｌａ−１４またはＮＣＦＭ)、ブレビス、ブルガリクス、プランタルム、ラムノサス、ファーメンタム、コーカシクス、ヘルベティカス、ラクティス、ロイテリまたはカゼイ、例えば、カゼイ・シロタ)、ビフィドバクテリウム(例えば、ビフィドゥム、ブレベ、ロングムまたはインファンティス)、ストレプトコッカス・サーモフィルス、エンテロコッカス・フェシウム、アリスティペス、アルカリフレックス、パラバクテロイデス、タンネレラ、エシェリキア・コリまたはキシラニバクター細胞である。
【０９９２】
例えば、宿主細胞はヒト微生物相種のものであり、運搬体細胞はヒト微生物相において非病原性である種の細胞であり、ここで標的配列が運搬体細胞のゲノムに含まれず、改変された配列は、運搬体および宿主細胞において動作可能であるｏｒｉＴを含むＭＧＥに含まれ、ここでＭＧＥが運搬体細胞から宿主細胞に水平伝播可能である。例えば、改変された配列、ＭＧＥまたはベクターがバクテリオファージに含まれ、バクテリオファージが第一細胞(運搬体)に感染してＭＥＧを第一(運搬体)細胞に導入することが可能である。その後、ＭＧＥは宿主細胞に水平伝播可能である。
【０９９３】
例えば、第一細胞はバクテロイデス門またはプレボテラ細胞であり、所望によりここでＭＧＥは該ヒト微生物相の第一細胞種からファーミキューテス種(宿主細胞)に水平伝播可能である。後者は、標的配列がファーミキューテスに含まれるが、第一(運搬体)細胞に含まれないとき、例えば、ヒトにおける肥満の処置または予防のために有用である。
【０９９４】
さらなる例
実施例１：環境処理または除染
石油、金属および鉱物工業
ある実施態様において、宿主細胞は鉱物採掘抗または地域、金属採掘抗または地域、油田または石油または石油化学産業(例えば、宿主が嫌気性硫酸還元細菌、例えば、デスルホビブリオ細菌であるときの、これらの何れかのため)に存在する。例えば、本組成物は、酸化剤(例えば、次亜塩素酸ナトリウム)、４級アンモニウム化合物またはイソチアゾロンを含むかまたは次亜塩素酸ナトリウム、４級アンモニウム化合物またはイソチアゾロンと同時にまたは逐次的に施用される。デスルホビブリオ細菌宿主修飾のための本発明における使用に適当なベクターの例はバクテリオファージである。下記引用文献は、デスルホビブリオに感染するファージの単離のための適当な方法を記載する。本発明におけるベクターとしての使用のために、引用文献の何れかに記載されるバクテリオファージが使用され得る。あるいは、ベクターはナノ粒子により提供される。
Heidelberg et alは、２コピーのほぼ同一のミュー様バクテリオファージＤＶＵＯ１８９−２２１、ＤＶＵ２８４７−７９、ＤＶＵ２６８８−７３３およびバクテリオファージの残遺物(remnants)がデスルホビブリオ・ブルガリス・ヒルデンバラのゲノムに存在することを記載している。このようなファージは、本発明における使用のためのファージベクター改変の基礎となり得る。
【０９９５】
引用文献：
Seyedirashti S et al, J Gen Microbiol. 1991 Jul;137(7):1545-9, “Induction and partial purification of bacteriophages from Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough) and Desulfovibrio desulfuricans ATCC 13541;
Seyedirashti S et al, J Gen Microbiol. 1992 Jul;138(7):1393-7, “Molecular characterization of two bacteriophages isolated from Desulfovibrio vulgaris NCIMB 8303 (Hildenborough)”;
*Walker CB et al; Environ Microbiol. 2006 Nov;8(11):1950-9, “Recovery of temperate Desulfovibrio vulgaris bacteriophage using a novel host strain”;
Miranda et al, Corrosion Science 48 (2006) 2417-2431, “Biocorrosion of carbon steel alloys by an hydrogenotrophic sulfate-reducing bacterium Desulfovibrio capillatus isolated from a Mexican oil field separator”;
Eydal et al, The ISME Journal (2009) 3, 1139-1147; doi:10.1038/ismej.2009.66; published online 11 June 2009, “Bacteriophage lytic to Desulfovibrio aespoeensis isolated from deep groundwater”;
Walker CB et al; Environ Microbiol. 2009 Sep;11(9):2244-52. doi: 10.1111/j.1462-2920.2009.01946.x, “Contribution of mobile genetic elements to Desulfovibrio vulgaris genome plasticity”
*[この文献に記載される配列は、Accession No. DQ826728-DQ826732の下にGenBankに寄託されており、引用によりここに包含させる]
【０９９６】
実施例２：水または汚水処理または環境(例えば、土壌)金属除染
本発明の代替的適用は、水または汚水処理のためのここに記載するＨＭ−ＣＲＩＳＰＲアレイ、ＨＭ−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＨＭ−ｃｒＲＮＡ、ＨＭ−スペーサー、ＨＭ−ＤＮＡ、ＨＭ−ＣａｓまたはＨＭ−組成物を提供し、例えばここで宿主は硫酸還元細菌、例えば、デスルホビブリオ細菌である。
例えば、宿主における標的ヌクレオチド配列は、重金属耐性遺伝子の配列である。所望によりまた宿主はデスルホビブリオ細菌、例えば、デスルホビブリオ・ブルガリスである。
【０９９７】
実施例３：医学的使用
本発明の別の適用は、ヒトまたは動物における細菌感染の処置、予防または減少(例えば、拡散または拡大の減少)のための、ここに記載するＨＭ−ＣＲＩＳＰＲアレイ、ＨＭ−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＨＭ−ｃｒＲＮＡ、ＨＭ−スペーサー、ＨＭ−ＤＮＡ、ＨＭ−ＣａｓまたはＨＭ−組成物を提供する。
第一の例において、感染は、ヒトにおけるＭＲＳＡ宿主細胞が原因である。宿主細胞はスタフィロコッカス・アウレウス宿主細胞であり、本発明のＨＭ−アレイは、クラスＩ、IIまたはIIIスタフィロコッカスパッケージ化ファージ(カウドウイルス目またはミオウイルス科ファージ)の集団に含まれる。ファージ集団を、メチシリンまたはバンコマイシンと併用してまたは併用せずにＭＲＳＡ感染患者に投与する。一つの治験で、ファージＨＭ−アレイは、(ｉ)内在性スタフィロコッカス・アウレウスＣＲＩＳＰＲアレイのリーダープロモーターの３’の２０ヌクレオチドの領域および(ii)メチシリン宿主細胞における耐性遺伝子を標的とする。バンコマイシンを投与するとき、常用量より低用量が患者に投与される。宿主細胞感染がノックダウンされ、ファージ医薬に対する耐性が確立されないか通常より低い割合または重度で確立されると考えられる。他の治験において、これらの治験におけるファージがまた必須スタフィロコッカス・アウレウス遺伝子ｆｔｓＺを標的とする以外、設計は同一である(Liang et al, Int J Infect Dis. 2015 Jan;30:1-6. doi: 10.1016/j.ijid.2014.09.015. Epub 2014 Nov 5, “Inhibiting the growth of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in vitro with antisense peptide nucleic acid conjugates targeting the ftsZ gene”)。
さらなる治験は、ファージＫエンドリシンをメチシリンに加えてまたはその代わりに投与した以外、上記の治験を反復した。
【０９９８】
引用文献
1. Jiang W et al, Nucleic Acids Res. 2013 Nov;41(20):e188. doi: 10.1093/nar/gkt780. Epub 2013 Sep 2, “Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice”;
2. Seed KD et al, Nature. 2013 Feb 28;494(7438):489-91. doi: 10.1038/nature11927, “A bacteriophage encodes its own CRISPR/Cas adaptive response to evade host innate immunity”;
3. Semenova E et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jun 21;108(25):10098-103. doi: 10.1073/pnas.1104144108. Epub 2011 Jun 6, “Interference by clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) RNA is governed by a seed sequence”;
4. Heler R et al, Mol Microbiol. 2014 Jul;93(1):1-9. doi: 10.1111/mmi.12640. Epub 2014 Jun 4, “Adapting to new threats: the generation of memory by CRISPR-Cas immune systems”;
5. Gomaa A et al, MBio. 2014 Jan 28;5(1):e00928-13. doi: 10.1128/mBio.00928-13, “Programmable removal of bacterial strains by use of genome-targeting CRISPR-Cas systems”;
6. Fineran PC et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Apr 22;111(16):E1629-38. doi: 10.1073/pnas.1400071111. Epub 2014 Apr 7, “Degenerate target sites mediate rapid primed CRISPR adaptation”;
7. Wiedenheft et al, Nature. 2011 Sep 21;477(7365):486-9. doi: 10.1038/nature10402, “Structures of the RNA-guided surveillance complex from a bacterial immune system;
8. Bondy-Denomy et al, Nature 493, 429-432 (17 January 2013) doi:10.1038/nature11723, “Bacteriophage genes that inactivate the CRISPR/Cas bacterial immune system”;
9. Nunez JK et al, Nature. 2015 Mar 12;519(7542):193-8. doi: 10.1038/nature14237. Epub 2015 Feb 18, “Integrase-mediated spacer acquisition during CRISPR-Cas adaptive immunity”
【０９９９】
実施例４：混合腸内微生物相集団における細菌の比率の改変
細菌の比率の改変を、混合腸内微生物相サンプルにおけるクロストリジウム・ディフィシル細菌のノックダウンを参照して記載する本例に従い実施する。サンプルは、バクテロイデスおよびメトロニダゾール(ＭＴＺ)耐性クロストリジウム・ディフィシル株６３０亜集団を含む。エクスビボで、混合集団を、ＣＲＩＳＰＲアレイを含むように本発明により改変されている運搬体細菌(ラクトバチルスアシドフィルスＬａ−１４および／またはＬａ−５)の集団と合わせる。
各ＣＲＩＳＰＲアレイは、運搬体細菌およびクロストリジウム・ディフィシル細胞と適合性であるプラスミドに含まれる。アレイは、ｏｒｉＴ、ｉｎｔＤＯＴ配列、ｔｅｔＱ−ｒｔｅＡ−ｒｔｅＢオペロン、ｒｔｅＣおよびオペロンｘｉｓ２ｃ−ｘｉｓ２ｄ−ｏｒｆ３−ｅｘｃも含む、バクテロイデスシータイオタオミクロンＣＴｎＤｏｔトランスポゾンに含まれる。一つの実験において、ｍｏｂおよびｔｒａオペロンを除外する(代わりにトランスポゾンが運搬体細菌と組み合わされた混合物において伝達されるバクテロイデス細胞により供給されるこれらに依存する)。他の実験において、ｍｏｂおよびｔｒａオペロンはトランスポゾンに含まれる。
細胞質膜を超えるタンパク質転座が全細菌において必須過程である。コアにＡＴＰａｓｅ、ＳｅｃＡおよび膜溝、ＳｅｃＹＥＧを含むＳｅｃシステムは、このタンパク質輸送の大部分を担う。第二並行Ｓｅｃシステムは、多数のグラム陽性種において報告されている。このアクセサリーＳｅｃシステムは、活性化させるＡＴＰａｓｅ、ＳｅｃＡ２の第二コピーの存在により特徴付けられ、そこで、試験されており、ＳｅｃＡ２はＳｅｃ基質のサブセットの転座を担う。多くの病原性グラム陽性種と共通して、クロストリジウム・ディフィシルは２コピーのＳｅｃＡを有する。Ｓ層タンパク質(ＳＬＰ)およびさらなる細胞壁タンパク質(ＣｗｐＶ)の輸出はＳｅｃＡ２に依存する。細胞壁における成熟ＳＬＰレベルの減少に一致する、ＳＬＰの細胞質前駆体ＳｌｐＡおよび他の細胞壁タンパク質の蓄積が、ドミナントネガティブｓｅｃＡ１またはｓｅｃＡ２アレルを発現する細胞で観察される。さらに、ＳｅｃＡ１またはＳｅｃＡ２のドミナントネガティブアレル発現またはアンチセンスＲＮＡノックダウンが増殖を劇的に遮断し、両Ｓｅｃシステムがクロストリジウム・ディフィシルで必須であることを示す。
【１０００】
クロストリジウム・ディフィシル株６３０(伝染性タイプＸ)は、４,２９０,２５２bp(Ｇ＋Ｃ含量＝２９.０６％)の単一環状染色体および７,８８１bp(Ｇ＋Ｃ含量＝２７.９％)の環状プラスミドを有する。全ゲノムが配列決定されており、ゲノムの１１％が接合性トランスポゾンのような可動遺伝要素からなることが判明している。これらの要素は、クロストリジウム・ディフィシルにその抗微生物耐性、病原性、宿主相互作用および表面構造製造を担う遺伝子を提供する。例えば、クロストリジウム・ディフィシルのｃｄｅＡ遺伝子は、多剤および毒性化合物放出(ＭＡＴＥ)ファミリーにおける既知排出輸送体と相同であることが示された多剤排出ポンプを産生する。タンパク質は、細胞からの薬物のエネルギー依存性およびナトリウム共役排出を促進する。さらに、クロストリジウム・ディフィシルにおけるｃｍｅ遺伝子は、他の細菌における多剤耐性を提供することが示されている。
アレイは、クロストリジウム・ディフィシル細胞の必須遺伝子(ＳｅｃＡ２)における配列のターゲティングのためのＲ１−Ｓ１−Ｒ１’  ＣＲＩＳＰＲ単位を含む。他の実験において、ターゲティングは、ＭＴＺおよび所望により１以上の他の抗クロストリジウム・ディフィシル抗生物質存在下、ｃｄｅＡ遺伝子に対する。各スペーサー(Ｓ)は、ＳｅｃＡまたはｃｄｅＡ遺伝子の２０量体ヌクレオチド配列を含み、ここで配列は反復配列と同族であるクロストリジウム・ディフィシル株６３０  ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＰＡＭを含む。各反復は、クロストリジウム・ディフィシル株６３０反復と同一であり、配列
5’-ATTTACATACCACTTAGTTAATATAAAAC-3’  (配列番号１１８)
を有する。
別のセットの実験において、次の配列を反復用に使用する。
5’-GTTTTATATTAACTAAGTGGTATGTAAAT-3’  (配列番号１１９)
【１００１】
反復は、混合集団におけるクロストリジウム・ディフィシル細胞に内在性であるＣａｓと共に機能する。細菌の混合集団は、クロストリジウム・ディフィシル感染を有するヒト患者の便サンプルからエクスビボサンプルとして回収する。混合集団を運搬体細菌とインビトロで混合し、３７℃で嫌気性条件下インキュベートして、テトラサイクリン存在下腸条件を模倣する。ＣＲＩＳＰＲアレイを含むトランスポゾンが混合物中のバクテロイデスおよびクロストリジウム・ディフィシル細胞に伝達されることが予測される。さらに、後者の細胞における標的部位がＣａｓヌクレアーゼ作用により切断され、故に混合集団におけるクロストリジウム・ディフィシルの比率を減少する(およびバクテロイデス対クロストリジウム・ディフィシルの比率を増加する)と予測される。
後続実験において、運搬体細菌を含む飲料を産生し、これを数日間連続してヒト患者に１回または２回消費させる。患者に処置期間中テトラサイクリンも投与する。便分析が、便サンプル中のクロストリジウム・ディフィシルの比率が減少する(およびバクテロイデス対クロストリジウム・ディフィシルの比率が増加する)ことを確認すると予測される。
【１００２】
実施例５：コレラ処置または予防
世界保健機構(ＷＨＯ)コレラファクトシート１０７番(２０１５年７月更新)を参照する。コレラは、細菌ビブリオ・コレラエに汚染された食品または水の摂取により引き起こされる急性下痢性感染である。研究者らは、毎年凡そ１４０〜４３０万症例があり、世界的に毎年２８０００〜１４２０００名がコレラにより死亡すると推定している。２時間〜５日間の短潜伏期間が、大流行の爆発的パターンの可能性を誘発する因子である。コレラは、極めて病原性の疾患である。小児および成人の両方を襲い、数時間以内に死亡し得る。ビブリオ・コレラエに感染した人の約８０％は何の症状も発症しないが、細菌は糞便中に感染後１〜１０日残り、環境に排出されて戻り、他の人に感染する可能性がある。症状を発症した人の中で、８０％は軽度または中程度の症状であるが、約２０％が急性水様下痢と重度脱水を発症する。これは、未処置だと死をもたらし得る。
ビブリオ・コレラエの２つの血清型  −  Ｏ１およびＯ１３９  −  が大流行し得る。ビブリオ・コレラエＯ１は大流行の大部分の原因であり、一方Ｏ１３９  −  １９９２年にバングラデシュで初めて同定された  −  は、東南アジアに限局性である。非Ｏ１および非Ｏ１３９ビブリオ・コレラエは、軽度下痢を引き起こしうるが、伝染病とはならない。近年、新規バリアント株がアジアおよびアフリカの数箇所で検出されている。所見は、これらの株が、致死率が高いより重度のコレラをもたらすことを示唆する。ビブリオ・コレラエの主貯留槽はヒトおよび半鹹水および河口半塩水のような水系源であり、藻類異常発生としばしば関連する。
【１００３】
Nature. 2013 Feb 28;494(7438):489-91. doi: 10.1038/nature11927, “A bacteriophage encodes its own CRISPR/Cas adaptive response to evade host innate immunity”, Seed KD et al(引用によりここに包含させる)を参照し、これはビブリオ・コレラエ血清型Ｏ１が重度下痢性疾患コレラの主要原因因子であることを記載し、溶解性ビブリオ・コレラエファージが特にベンガル湾周囲の流行地における疾患負荷への影響と関連付けられている。著者らは、その刊行物に記載された試験において、２００１〜２０１１１４年に回収したコレラ患者の米とぎ汁様便サンプルに遍在するＩＣＰ１(国際下痢疾患研究センターについて、バングラデシュコレラファージ１)関連ビブリオ・コレラエＯ１特異的病原性ミオウイルスの単離を記載した。
著者らは、ＩＣＰ１  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが２ＣＲＩＳＰＲ座位(ＣＲ１およびＣＲ２と命名)および６ｃａｓ遺伝子からなり、その組織およびタンパク質産物がタイプ１−Ｆ(エルシニア・ペスチス)サブタイプシステム１７のＣａｓタンパク質と最も相同であると説明する。ビブリオ・コレラエは、２つの生物型、古典的およびＥｌ  Ｔｏｒに分類され、前者は早期の大流行と関連しており、その後Ｅｌ  Ｔｏｒ生物型１８に置き換わっている。古典的株、ビブリオ・コレラエＯ３９５は、タイプＩ−Ｅ(エシェリキア・コリ)サブタイプ１７に属するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを有し、今日までＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを有するＥｌ  Ｔｏｒ株に関する記載は何もない。それ故に、ＩＣＰ１ファージにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの起源は未知である。
ｃｒＲＮＡにおける予測幹を形成する部分的パリンドローム配列に下線を付したＣＲ１およびＣＲ２コンセンサス直接反復のＲＮＡ配列は次のとおりである。
GUUAGCAGCCGCAUAGGCUGCUUAAAUA  [配列番号７５]
本発明の例えば、アレイの本および各反復は、配列番号７５と少なくとも８０、９０、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一(または配列番号７５と同一)である配列を含むまたはこれからなる。
【１００４】
ＩＣＰ１  ＣＲＩＳＰＲにおけるスペーサーの大部分は、インドで１９６４に単離された古典的株Ｏ３９５、バングラデシュで１９９４に単離されたＥｌ  Ｔｏｒ株ＭＪ−１２３６および２００１〜２０１１年にＩＣＤＤＲ,Ｂで採取された数Ｅｌ  Ｔｏｒ株を含む、ビブリオ・コレラエ株のサブセットに見られる１８kb島内の配列と１００％同一性を示す。１８kb島は、プロトタイプスタフィロコッカス・アウレウス病原性島(ＳａＰＩｓ)を含むグラム陽性細菌のファージ誘導可能染色体島(ＰＩＣＩｓ)を模倣する。ＳａＰＩｓは、あるファージによる感染後、切除され、環状化し、複製するように誘発される。これらは、自身の無差別の拡散を可能とするためにファージ繁殖サイクルを妨害する種々の機構を使用し、これが周囲の細菌集団をさらなるファージ捕食から保護し得る。ＩＣＰ１  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより標的化されるビブリオ・コレラエ１８kb島の組織は長さ、塩基組成および組織がＰＩＣＩｓのＳａＰＩｓサブセットで見られるものに類似し、１端にインテグラーゼホモログを有し、ＧＣ含量が宿主種より少ない(３７％対４７.５％)。１８kb要素は、それ故にビブリオ・コレラエＰＩＣＩ様要素(ＰＬＥ)と称される。
【化１】
2020058369.tif 000003
[ヌクレオチド配列＝配列番号７６(３２bpプロトスペーサー配列(配列番号７７)は灰色を付し、本開示は灰色の最初のＴから開始し、灰色の最後のＣで終わる配列を含む；およびアミノ酸配列＝配列番号７８]
【１００５】
Seed et alは、ＣＲ１およびＣＲ２アレイがＧＡ  ＰＡＭ配列の認識により作動することを決定した。Seed et alらはまた試験したＩＣＰ１関連ファージＣＲＩＳＰＲアレイにおけるスペーサーの大部分が、ビブリオ・コレラエＰＬＥと同一性を示すことも発見した。スペーサーを次の表３に示し、本発明のアレイにおけるＳ１は、例えば、これらの配列の何れか一つから選択される。ある実施態様において、Ｓ１は、下線を付した配列の何れか一つから選択される。
例えば、本発明のアレイ(または各アレイ)は、下線を付したスペーサー配列の一つ、複数または全てを含む改変されたアレイである。アレイスペーサーは、次のとおり、天然に存在しない配置を含み得る。
例えば、アレイは、タイプ８ａおよび／または９ａのスペーサーおよびタイプ１ａ〜７ａの０、１、２、３、４、５または６(しかし７ではない)を含む。例えば、アレイは、タイプ４ｂのスペーサーおよび１ｂ〜３ｂの０、１または２、３(しかし３以上ではない)を含むを含む。例えば、アレイは、タイプ８ａのスペーサーおよび９ａ、４ｂ、１ｃ、３ｄ、１ｅおよび３ｅの一つ、複数または全てを含む。例えば、アレイは、タイプ９ａのスペーサーおよび８ａ、４ｂ、１ｃ、３ｄ、１ｅおよび３ｅの一つ、複数または全てを含む。例えば、アレイは、タイプ４ｂのスペーサーおよび８ａ、９ａ、１ｃ、３ｄ、１ｅおよび３ｅの一つ、複数または全てを含む。例えば、アレイは、タイプ１ｃのスペーサーおよび８ａ、９ａ、４ｂ、３ｄ、１ｅおよび３ｅの一つ、複数または全てを含む。例えば、アレイは、タイプ３ｄのスペーサーおよび８ａ、９ａ、４ｂ、１ｃ、１ｅおよび３ｅの一つ、複数または全てを含む。例えば、アレイは、タイプ１ｅのスペーサーおよび８ａ、９ａ、４ｂ、１ｃ、３ｄおよび３ｅの一つ、複数または全てを含む。例えば、アレイは、タイプ３ｅのスペーサーおよび８ａ、９ａ、４ｂ、１ｃ、３ｄおよび１ｅの一つ、複数または全てを含む。
【１００６】
他の天然に存在しない配置において、ベクターは本発明の第一および第二アレイを含み、ここでアレイは、１ａ〜１ｇから選択される少なくとも２スペーサー(例えば、８ａ、９ａ、４ｂ、１ｃ、３ｄ、１ｅおよび３ｅから選択される少なくとも２スペーサー)を含み、ここでスペーサー同じＩＣＰ１ファージゲノムのスペーサーではなく、例えば、ＩＣＰ１＿  ２０１１＿ＡまたはＩＣＰ１＿  ２００６＿ＥまたはＩＣＰ１＿  ２００５＿ＡまたはＩＣＰ１＿  ２００４＿Ａの全スペーサーではない(上記表のスペーサー参照)。それ故に、ある実施態様において、
第一アレイはＩＣＰ１＿  ２０１１＿Ａスペーサー配列(例えば、８ａおよび／または９ａ)を含み、第二アレイはＩＣＰ１＿  ２００６＿Ｅ、ＩＣＰ１＿  ２００５＿ＡまたはＩＣＰ１＿  ２００４＿Ａのスペーサー配列(例えば、４ｂ、１ｃ、３ｄ、１ｅおよび３ｅから選択される１以上のスペーサー)を含む。
例えば、ベクターは、８ａ、９ａ、４ｂ、１ｃ、３ｄ、１ｅおよび３ｅから選択される１、２、３、４、５、６または全７スペーサータイプを含む。例えば、ベクターは、該選択タイプの１以上の複数コピーを含む。例えば、ベクターにおけるこの、いくつかのまたは各アレイは、第一スペーサー(アレイのプロモーターの最近接)を含み、ここで第一スペーサーは８ａ、９ａ、４ｂ、１ｃ、３ｄ、１ｅおよび３ｅから選択される。この方法での位置決めは、天然アレイが第一スペーサーを最も頻繁に使用するため、有利である。
【１００７】
Nucleic Acids Res. 2013 Oct;41(19):9033-48. doi: 10.1093/nar/gkt654. Epub 2013 Jul 30, “High-resolution definition of the Vibrio cholerae essential gene set with hidden Markov model-based analyses of transposon-insertion sequencing data”, Chao MC et al(引用により包含させる)を参照し、これは、高密度トランスポゾン変異誘発のハイスループットＤＮＡ配列決定(トランスポゾン−挿入配列決定)への連結が、細菌増殖および生存に対する個々の座位の寄与の同時かつゲノムワイド評価を可能にすることを開示する。ＨＭＭ結果は、１２８遺伝子がＬＢにおけるビブリオ・コレラエの最適増殖に必要であることを示す。本発明の標的配列は、これらの遺伝子の何れか一つの配列であり得る(この遺伝子名および配列は、本発明のベクターの標的配列の提供における使用およびここでの特許請求の範囲への包含が可能であるものとして、引用によりここに包含させる)。
例えば、それぞれ平均読み取り５.６および４.７を有したｖｃ０３０９およびｖｃ０７５３における挿入変異体は、増殖が激しく減弱した。同様に、ｖｃ０２３７およびｖｃ１７７３変異体は、インビトロ競合実験において野生型細胞より適切でなかった。リストはまたｖｃａ０３６０、ｖｃａ０４７７、ｖｃａ０４８６およびｖｃａ０４８８を含む推定毒素／抗毒素アディクション座位からの多数の抗毒素遺伝子も含む。このような遺伝子は、活性毒素と関連するとき、必須であると推定される。
著者らは、表４における必須ビブリオ・コレラエ遺伝子を発見した。著者らは、必須であると考えられる２００を超える遺伝子間領域を同定した。
それ故に、本発明の例えば、宿主細胞がビブリオ・コレラエ細胞であるとき、標的配列はｖｃ０６３１、ｖｃ２０２４、ｖｃ２６２６、ｖｃ２７６３−ｖｃ２７６７またはｖｃ２７６８−ｖｃ２７７０配列である。本発明の例えば、宿主細胞がビブリオ・コレラエ細胞であるとき、標的配列はｖｃ０３０９およびｖｃ０７５３、ｖｃ０２３７およびｖｃ１７７３、ｖｃａ０３６０、ｖｃａ０４７７、ｖｃａ０４８６またはｖｃａ０４８８配列である。
【１００８】
Infect Immun. 2015 Sep;83(9):3381-95. doi: 10.1128/IAI.00411-15. Epub 2015 Jun 8, “A Genome-Wide Screen Reveals that the Vibrio cholerae Phosphoenolpyruvate Phosphotransferase System Modulates Virulence Gene Expression”, Wang Q et alを参照する(引用により包含させる)。著者らは、トランスポゾン挿入部位(ＴＩＳ)配列決定ベースの戦略を使用して、生物の主要な腸管定着因子である、ＴＣＰの主要サブユニットをコードするｔｃｐＡの発現に必要な新規因子を同定した。ｔｃｐＡ発現を調節することが知られる遺伝子の大部分の同定以外に、スクリーニングはｐｔｓＩおよびｐｔｓＨを生じ、これは、酵素Ｉ(ＥＩ)およびビブリオ・コレラエホスホエノールピルベートホスホトランスフェラーゼシステム(ＰＴＳ)のＨｐｒ要素を生じた。ＴｃｐＡの発現減少に加えて、ＥＩ、Ｈｐｒまたは関連ＥIIＡ(Ｇｌｃ)タンパク質を欠く株で産生されるコレラ毒素(ＣＴ)は少なく、マウス仔腸でコロニー形成する能力が減少している。ＰＴＳは、ｔｃｐＰＨおよびａｐｈＡＢの発現制御により病原性遺伝子発現を発現制御し、ｔｃｐＰＨおよびａｐｈＡＢ自体、病原性遺伝子発現の中心的アクティベーターであるｔｏｘＴの発現を制御する。
それ故に、本発明の例えば、宿主細胞がビブリオ・コレラエ細胞であるとき、標的配列はｔｃｐＡ配列またはｔｃｐＡモジュレーター配列(すなわち、ｔｃｐＡ自体またはその発現産物を介して調節するヌクレオチド配列)である。例えば、配列はｐｔｓＩまたはｐｔｓＨ配列である。例えば、標的配列は、ホスホエノールピルベートホスホトランスフェラーゼシステム(ＰＴＳ)の配列またはｔｃｐＰＨ、ａｐｈＡＢまたはｔｏｘＴ配列である。例えば、標的配列はＥIIＡ(Ｇｌｃ)タンパク質をコードする遺伝子である。
本発明のための適当な標的配列はまた表５にも示す  −  次の何れか一つの配列(病原性遺伝子は下線を付す)。
ある実施態様において、細胞はビブリオ(例えば、コレラ)細胞であり、標的配列はこれらの遺伝子の何れかの配列である。
病原性遺伝子を表６に示す。
ある実施態様において、細胞はビブリオ(例えば、コレラ)細胞であり、標的配列はこれらの遺伝子の何れかの配列である。
【１００９】
ＴＣＰおよびＣＴＸ病原性島からの遺伝子
ある実施態様において、細胞はビブリオ(例えば、コレラ)細胞であり、標的配列はａｃｅ、ｃｅｐ、ｃｔｘＡ、ｃｔｘＢ、ｏｒｆＵ、ｚｏｔ、ｒｓｔＡ、ｒｓｔＢ、ｒｓｔＲ、ａｃｆＡ、ａｃｆＢ、ａｃｆＣ、ｔａｇＥ、ａｌｄＡ、ｉｎｔ、ｔａｇＡ、ｔａｇＤ、ｔｃｐＡ、ｔｃｐＢ、ｔｃｐＣ、ｔｃｐＤ、ｔｃｐＥ、ｔｃｐＦ、ｔｃｐＨ、ｔｃｐＩ、ｔｃｐＪ、ｔｃｐＰ、ｔｃｐＱ、ｔｃｐＲ、ｔｃｐＳ、ｔｃｐＴまたはｔｏｘＴ配列である。
【１０１０】
実施例６：野生型内在性Ｃａｓを利用する特異的微生物相細菌集団増殖阻害
１. 材料および方法
１.１. 株
次の株を、この実施例および実施例７および８の過程で使用した：エシェリキア・コリMG1655、エシェリキア・コリTOP10、ストレプトコッカス・サーモフィルスLMD-9(ATCC BAA-491, Manassas, Virginia)、ストレプトコッカス・サーモフィルスDSM 20617(T)(DSMZ, Braunschweig, Germany)、ラクトコッカス・ラクティスMG1363およびストレプトコッカス・ミュータンスClarke 1924DSM 20523(DSMZ, Braunschweig, Germany)。
培地選択および遺伝子構築物の試験の経過中、種々のストレプトコッカス株を使用した。ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ−９(ATCC BAA-491)およびエシェリキア・コリＴＯＰ１０を、その適合性増殖要件のために考慮した。全株をトッドヘヴィットブロス(ＴＨ)(T1438 Sigma-Aldrich)で、特に断らない限り、好気性条件および３７℃で培養した。株を２５％グリセロール中、−８０℃で保存した。
【１０１１】
１.２. 差次的増殖培地
全株を、ＴＨ培地で３７℃で２０時間増殖させた。ストレプトコッカス・サーモフィルスの選択培地は、３ｇ・ｌ−１の２−フェニルエタノール(ＰＥＡ)を添加したＴＨ培地であった。ＰＥＡを培地に添加し、１２１℃で１５分、１５psiでオートクレーブに付した。寒天プレートを、１.５％(wt／vol)寒天を対応する培地に添加することにより調製した。選択またはプラスミド維持に必要であるとき、３０μg ml−１カナマイシンを両ストレプトコッカス・サーモフィルス株およびエシェリキア・コリおよび５００μg ml−１をストレプトコッカス・ミュータンスに使用した。
ある場合、株およびプラスミドによって、４８時間までの長いインキュベーションが、ＰＥＡ添加培地での増殖を見るために必要である可能性がある。使用する生物の生存能の対照として、対照ＴＨ寒天を並行して実施すべきである。
【１０１２】
１.３. クローニング
エシェリキア・コリ(One Shot(登録商標)ThermoFischer TOP10 Chemically Competent細胞)を全サブクローニング手順において使用した。ＰＣＲを、Phusionポリメラーゼを使用して実施した。全ＰＣＲ産物を、製造業者のプロトコールに従い、Nucleospin GelおよびMacherey-NagelによるPCR Clean-upで精製した。精製フラグメントを３４μl総体積で、１μl酵素添加１×ＦＤ緩衝液中制限酵素ＤｐｎＩで消化させた。消化反応物を再び製造業者のプロトコールに従い、Nucleospin GelおよびMacherey-NagelによるPCR Clean-upで精製した。Gibsonアセンブリーを、製造業者(NewEngland Biolab)のプロトコールに従い、１０μl反応物中で実施した。
プラスミドＤＮＡを、製造業者の指示に従いQiagenキットを使用して調製した。グラム陽性株についての修飾は、細胞溶解を促進するため細菌の０.５％グリシンおよびリゾチーム添加培地での増殖を含んだ。
【１０１３】
１.４. 形質転換
１.４.１  エレクトロコンピテントエシェリキア・コリ細胞および形質転換
市販のエレクトロコンピテント細胞をクローニングおよび実験に使用した(One Shot(登録商標)ThermoFischer TOP10 Chemically Competentエシェリキア・コリ)。エレクトロポレーションを標準設定を使用して実施した：Electro Cell Manipulator(BTX Harvard Apparatus ECM630)を使用する１８００Ｖ、２５μFおよび２００Ω。パルス後、１ml  ＬＢ−ＳＯＣ培地を添加し、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。形質転換細胞を、５０μg ml−１のカナマイシン含有ＬＢ寒天に播種した。
【１０１４】
１.４.２  エレクトロコンピテントストレプトコッカス・サーモフィルス細胞の調製
エレクトロポレーションプロトコールは、Somkuti and Steinberg, 1988を改変した。４０mM  ＤＬ−スレオニン(T8375 Sigma-Aldrich)添加ＴＨブロス中のストレプトコッカス・サーモフィルスの一夜培養を同じ培地５ml中、１００倍に希釈し、ＯＤ６０００.３〜０.５まで増殖させた(接種約２.５時間後)。細胞を１０,０００×ｇで１０分の４℃での遠心分離により採取し、５mlの氷冷洗浄緩衝液(０.５Ｍスクロース＋１０％グリセロール)で３回洗浄した。細胞洗浄後、ＯＤ６００１５〜３０でエレクトロポレーション緩衝液(０.５Ｍ  スクロース、１０％グリセロールおよび１mM  ＭｇＣｌ２)中に懸濁させた。エレクトロポレーション緩衝液中の細胞は、使用するまで４℃に維持しても(１時間以内)または後に使用するためにエッペンドルフチューブに５０μlで等分し、液体窒素で冷凍し、−８０℃で保存してもよい。
【１０１５】
１.４.３  エレクトロポレーションストレプトコッカス・サーモフィルス細胞
１μlの精製プラスミドＤＮＡを５０μlの細胞懸濁液に添加し、エレクトロポレーションを予め冷やした２mm−ギャップエレクトロポレーションキュベットで実施した。エレクトロポレーション設定は、Electro Cell Manipulator(BTX Harvard Apparatus ECM630)を使用して２５００Ｖ、２５μFおよび２００Ωであった。電気パルス直後、１mlのＴＨブロスを細胞に添加し、懸濁液を１０分氷上に維持し、その後細胞を３時間、３７℃でインキュベートした。耐性遺伝子を発現させるための時間の後、細胞を３０μg ml−１のカナマイシン含有ＴＨ寒天プレートに播種した。構築物により、コロニーは３７℃でインキュベーション１２〜４８時間後可視化した。
【１０１６】
１.５. ＸｙｌＳプラスミドの構築
本試験で使用した全プラスミドは、ストレプトコッカス・クレモリスからの潜在性プラスミドｐＷＶ０１に由来する広宿主範囲発現ベクターであるｐＢＡＶ１Ｋ−Ｔ５に基づき(Bryksin &#38; Matsumura, 2010)、主鎖をGibson法を使用して他のフラグメントとアセンブリーするためのオーバーハングを有するものを使用して増幅した。
キシロース誘導可能システムを、ＸｙｌＲリプレッサーの前にプロモーターｇｙｒＡをクローニングすることにより構築した(図１)。ＸｙｌＲリプレッサーは、バチルス・スブチリス株ＳＣＫ６(Zhang et al. 2011)から、Gibsonアセンブリーのためのオーバーハングを含むリバースプライマーおよびｇｙｒＡプロモーターを導入するために使用するウルトラマーであるフォワードプライマー(Xie et al. 2013)およびｐＢＡＶ１ＫＴ５主鎖へのアセンブリーのための対応するオーバーハングを用いて増幅した。得られたフラグメントは、Ｐｌｄｈａ＋ＰｘｙｌＡハイブリッドプロモーター(Xie et al. 2013)を含むウルトラマーを用いてｐＣＬ００２(未公開研究)から増幅させたｍＣｈｅｒｒｙを隣接させた。３つの得られたＰＣＲ産物を、製造業者の指示に従いGibson Master Mix(登録商標)(NewEngland Biolab)で構築した。産物を最後にエシェリキア・コリＴＯＰ１０エレクトロコンピテント細胞に形質転換した。図１参照。
【１０１７】
１.６. ＣＲＩＳＰＲアレイプラスミドの設計および構築
ストレプトコッカス・サーモフィルスは、４つの異なるＣＲＩＳＰＲシステムを有し(Sapranauskas, et al. 2011)、この研究のために、タイプII  ＣＲＩＳＰＲ１  (ＳＴ１−ＣＲＩＳＰＲ)システムを選択した。標的配列の設計は、ＬＭＤ−９の利用可能なゲノム配列(GenBank: CP000419.1)に基づいた。ＳＴ１−ＣＲＩＳＰＲアレイを、ＣＲＩＳＰＲアレイ反復およびスペーサーのみを、キシロース誘導可能プロモーター下に含み(Xie et al. 2013)、続いてストレプトコッカス種の強構成的プロモーター下の対応するｔｒａｃｒＲＮＡがあるように設計した(Sorg et al. 2014)(図２、配列番号)。
ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの成熟に役割を有し、ストレプトコッカス・サーモフィルス内在性ＲＮａｓｅ  IIIにより支持され、ｃｒＲＮＡと複合体を形成する。この複合体は、エンドヌクレアーゼＳＴ１−Ｃａｓ９のガイドとして働く(Horvath &#38; Barrangou, 2010)。キシロース誘導可能プロモーターからの合成アレイの転写後、内在性Ｃａｓ９およびＲＮＡｅは、それを機能的ｇＲＮＡに処理する。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体は、標的位置での二本鎖中断をもたらす。
アレイの設計は、高ＧＣ含量およびｃｒＲＮＡの適切な成熟に必要ではないことが示唆されているｔｒａｃｒＲＮＡ部分を減少した(すなわち、完全ｔｒａｃｒＲＮＡ配列)２つの特異的標的配列を使用した(Horvath &#38; Barrangou, 2010)。
２標的は、必須遺伝子(ＤＮＡポリメラーゼIIIサブユニットアルファ)および抗生物質耐性遺伝子(ｔｅｔＡ様遺伝子)(配列番号)であった。
プライマーをｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＰｌｄｈＡ主鎖増幅に使用した。ＣＲＩＳＰＲアレイｇＢｌｏｃｋおよびオーバーハングを有する主鎖を、製造業者(NewEngland Biolabs)の指示に従いGibson Master Mix(登録商標)で混合した。産物を最後にエシェリキア・コリＴＯＰ１０エレクトロコンピテント細胞に形質転換した。
【１０１８】
１.７. ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ−９におけるキシロース誘導可能の特徴づけ
一夜固定相培養物を、対応する抗生物質含有ＴＨブロスで１：１００に希釈した。対数中期細胞を、種々の濃度のＤ−(＋)−キシロース(０％wt／vol、０.００１％wt／vol、０.０１％wt／vol、０.１％wt／vol、０.５％wt／volおよび１％wt／vol)で誘発させ、細胞培養を培地の自己蛍光の程度を評価するために培地で直接、細胞懸濁液または懸濁液緩衝液(ＰＢＳ緩衝液)で測定した。細胞培養物の２０μlサンプルを平底９６ウェルプレートで、ＰＢＳ緩衝液で１／１０希釈した。細胞懸濁液または培地の蛍光をプレートリーダーで読んだ。ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を、励起波長５５８nmおよび放出波長６１２nmを使用して測定した。再懸濁細胞の吸光度をＯＤ６００nmで測定した。最低３回の独立した生物学的反復を各実験で行った。
【１０１９】
１.８. ストレプトコッカス・サーモフィルスにおけるＣＲＩＳＰＲアレイの活性化
両方ともＤＮＡポリメラーゼIIIをターゲティングするＣＲＩＳＰＲアレイおよびストレプトコッカス・サーモフィルスのｔｅｔＡを含むプラスミドを備えたストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ−９およびエシェリキア・コリＴＯＰ１０を、一夜、プラスミド維持のために３０μg ml−１のカナマイシンを添加した３ml培養で増殖させた。翌日、９６ウェル深ウェルプレートで、５００μlの一夜培養物の１／１００を、３０μg ml−１カナマイシン添加新鮮ＴＨ培地に接種した。対数中期細胞培養を１％キシロースで誘発した。死滅効果をストレプトコッカス・サーモフィルスおよびエシェリキア・コリ単独で試験した。試験した各株および条件について、陰性対照をキシロース非存在下に維持した。細胞をＯＤ約０.５まで増殖させ、次にＴＨ培地で１０倍連続希釈し、９６ウェルレプリケーター(Mettler Toledo LiquidatorTM 96)を使用して、５μL体積滴をＴＨ寒天に維持し、ＴＨ寒天をｇ・ｌ−１  ＰＥＡプレートで添加した。プレートを２４時間、３７℃でインキュベートし、コロニー形成単位(ＣＦＵ)をトリプリケート測定から計算した。
【１０２０】
２. 結果
２.１ 増殖条件および選択培地
我々は、まず、最初に細菌株および我々が共培養実験に使用することを意図していた全株の増殖を支持する培養プロトコールの確立に着手した。我々は、３７℃でＴＨブロスにおけるエシェリキア・コリと類似した増殖を支持できたストレプトコッカス・サーモフィルス株ＬＭＤ−９を使用した(図３)。
混合培養からの種々の細菌の鑑別は、それぞれの種の細胞数を決定するために重要である。マッコンキー寒天を用いてエシェリキア・コリを選択的に増殖させることは可能であるが、ストレプトコッカス・サーモフィルスの選択的増殖のための特定の培地はない。ＰＥＡ寒天は、グラム陰性菌(エシェリキア・コリ)からグラム陽性菌(ストレプトコッカス・サーモフィルス)を単離するのに使用される選択培地である。さらに、我々は、種々の濃度のＰＥＡが他のグラム陽性菌の増殖を一部阻害し、これが本実験で使用する他のグラム陽性細菌間の選択を可能とすることを発見した(図４)。３ｇ・ｌ−１のＰＥＡが、エシェリキア・コリの増殖を制限しながら、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ−９を選択的増殖させることが証明された。
【１０２１】
２. ２  誘導可能システムの設計および検証
ストレプトコッカス種のための誘導システムは、先に、異種性キシロース誘導カセット(Ｘｙｌ−Ｓ)を作ることによりバチルス・メガテリウムキシロースオペロン(図５)に基づき開発された。ｘｙｌＲおよびｘｙｌＡプロモーターを、それぞれ、ストレプトコッカス・ミュータンスの構成的に発現されるｇｙｒＡおよびｌｄｈプロモーターと置き換えた。ストレプトコッカス種のためのこの発現カセットは、様々な種間で感度および発現レベルの差を示従、しかしながらシステムはストレプトコッカス・サーモフィルスで試験されなかった(Xie et al. 2013)。それ故に我々は、まずストレプトコッカス・サーモフィルスにおけるキシロース誘導カセットの検証に着手した。
誘導カセットの別バージョンを、ｘｙｌＲプロモーターのみをストレプトコッカス・ミュータンスのｇｙｒＡプロモーターで置換し、内在性バチルス・メガテリウムｘｙｌＡプロモーターをそのままにすることにより構築した。キシロース誘導可能システムの設計中、我々は、両バージョンの誘導可能プロモーター、バチルス・メガテリウムに見られる天然ＰＸｙｌＡプロモーターおよびＰＸｙｌＡプロモーターのリプレッサー結合部位に融合した高度に保存されたプロモーターＰｌｄｈａのハイブリッドプロモーターを考慮した(図５)。数ストレプトコッカス種のみがキシロースを代謝すると報告されており、故に他のストレプトコッカス種におけるｘｙｌＡプロモーターを認識するための制御機構の存在の可能性はない。それ故に我々は両キシロース誘導システムを構築従、ｍＣｈｅｒｒｙのＰｌｄｈａ＋ＸｙｌＡシステムでの誘導性のみ試験した。
キシロースでのｍＣｈｅｒｒｙ誘導可能発現を決定するために、プラスミド(ｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｐｌｄｈａ＋ＸｙｌＡ)との細胞の対数中期培養物を、種々の濃度のキシロースで誘発した。誘導６時間後、我々はｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を培養物で測定し、我々は、プラスミド担持細胞での実質的に高い全体的発現レベルを観察した(図６)。残念ながらシステムが、キシロースを添加していない培養物でも相当レベルの基底発現を示したことが見られた。これは、システムが‘漏出性’であり、死滅−アレイでは、システムがキシロースで誘導される前から細胞死をもたらし得ることを意味する。しかしながら、その後の研究で、我々は両バージョンのプラスミド(ｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｐｌｄｈａ＋ＸｙｌＡおよびｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＰｘｙｌＡ)を使用した。
【１０２２】
２.３  ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９アレイの設計
ＣＲＩＳＰＲアレイにおけるゲノムターゲティングスペーサーが、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ−９の死滅を誘発できるかを決定するために、我々は、先に構築した２キシロース誘導可能システム(ｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｐｌｄｈａ＋ＸｙｌＡおよびｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＰｘｙｌＡ)にＣＲＩＳＰＲアレイを挿入した。これらのプラスミドで、我々はｍＣｈｅｒｒｙを、ＣＲＩＳＰＲアレイ含有ｇＢｌｏｃｋと置き換えた(図７)。Ｐｌｄｈａ＋ＸｙｌＡプロモーターを有するバリアントは、ＰｘｙｌＡより強力であり、高い基底活性を有することが予測された(Xie et al. 2013)。
【１０２３】
２.４ 内在性Ｃａｓ９を使用する細菌集団増殖阻害
エシェリキア・コリにおいてプラスミドを構築後、我々は、プラスミドをストレプトコッカス・サーモフィルスに形質転換した。これは、我々が特定の細菌種の細胞死を誘発できたかどうかの決定を可能とする。興味深いことに、強Ｐｌｄｈ＋ＸｙｌＡハイブリッドプロモーター含有プラスミドに曝したストレプトコッカス・サーモフィルスの細菌宿主集団サイズ(増殖細菌および寒天プレート上のコロニー数計数により示す)は、弱い、通常のＰｘｙｌＡプロモーターを含むプラスミドに曝したストレプトコッカス・サーモフィルスと比較して１０倍低く(図８；強アレイ発現での５２コロニー対弱アレイ発現での５５６コロニー、１０.７倍差)、２株は、同じバッチのエレクトロコンピテントストレプトコッカス・サーモフィルス細胞を使用して並行して形質転換されている。これは、我々に、ＣＲＩＳＰＲアレイターゲティングストレプトコッカス・サーモフィルス遺伝子担持プラスミドが、内在性ＣａｓヌクレアーゼおよびＲＮａｓｅ  IIIを使用して細胞を殺し、それにより集団増殖を１０倍阻害することを示唆した。
我々は、ＰｘｙｌＡプロモーター含有プラスミドで形質転換した宿主細胞における弱アレイ発現が、強プロモータープラスミドよりはるかに低くても、ある程度の細胞死をもたらすと予測した。我々は、観察された１０倍阻害より大きな集団増殖阻害が、強アレイ発現の活性の比較を、何れのアレイコード化プラスミドにも曝していないストレプトコッカス・サーモフィルス(例えば腸内微生物相から直接単離された細菌)と行ったときに見られることを予測した。それ故に、我々は、内在性Ｃａｓヌクレアーゼを利用するための宿主細胞におけるアレイ(または単一ガイドＲＮＡ)発現は、ここに記載する環境、医薬および他の設定における標的宿主細胞の効率的増殖阻害提供に有用であることを確信する。抗生物質の共投与も、、特に１以上の抗生物質耐性遺伝子が標的であるとき、増殖阻害の増強に有用である。
【１０２４】
３. 考察および展望
この研究において、我々は、内在性Ｃａｓ９システムを使用してストレプトコッカス・サーモフィルスを特異的に死滅させるＣＲＩＳＰＲ−アレイの設計に着手した。死滅シグナルの制御を獲得するために、我々は、ストレプトコッカス・サーモフィルスで適用できる誘導可能システムを探索した。バチルス・メガテリウムからのキシロース誘導可能ＸｙｌＲシステムは先にストレプトコッカス・ミュータンスで適用されていたが(Xie, 2013)、ストレプトコッカス・サーモフィルスではなかった。この研究において、我々は、ストレプトコッカス・サーモフィルスでのＸｙｌＲ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｐｌｄｈａ回路設計を使用して、ｘｙｌＲ誘導システムの機能性を示した。我々は、０.１％wt／volがストレプトコッカス・サーモフィルスでＸｙｌＲシステムを完全に誘発するのに十分であることを発見した(図６)。
共培養ストレプトコッカス・サーモフィルスおよびエシェリキア・コリの存在比を観察するために、我々は、培養培地への３ｇ・ｌ−１のＰＥＡの添加が、エシェリキア・コリの増殖を制限しながら、ストレプトコッカス・サーモフィルスの選択的増殖を可能とすることを確立した(図４)。
ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ−９ゲノムにおけるＤＮＡポリメラーゼIIIサブユニットアルファおよびｔｅｔＡ様遺伝子をターゲティングするＳＴ１−ＣＲＩＳＰＲアレイを、キシロース誘導可能プロモーター(Xie et al. 2013)下においた。これらの領域のターゲティングは、二本鎖中断をもたらし、故にストレプトコッカス・サーモフィルス生存能を制限するはずである(図９)。改変されたアレイを、コード化ＣＲＩＳＰＲアレイ加工のために内在性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ機構を使用してストレプトコッカス・サーモフィルスゲノムを標的とするよう設計したため、アレイは、エシェリキア・コリのような無関係株の増殖に、そのゲノムに類似する標的が見られるとしても、影響がないことが予測される。これは、実施例８に記載するとおり、混合細菌集団(ヒト微生物相の態様を模倣)で試験して、成功した。
表面上の宿主細胞増殖を阻害する本発明の能力の証明は、本発明がヒトまたは動物対象におけるここに開示する微生物相が介在するまたは引き起こされる疾患または状態の処置または予防のためである実施態様において重要かつ望ましい。このような微生物相は、一般に対象の組織(例えば、腸、口腔、肺、腋窩、眼、膣、肛門、耳、鼻または咽頭組織)と接触しており、故に我々は、表面上の微生物相細菌種(ストレプトコッカスにより例示される)の増殖阻害の活性の証明は、この有用性を支持すると考える。
【１０２５】
実施例７：種々の株における特異的微生物相細菌集団増殖阻害
実施例６は、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ−９の特異的増殖阻害を示した。ここで、我々は、増殖阻害が、また第二株：ストレプトコッカス・サーモフィルスＤＳＭ  ２０６１７でも得ることができることを示す。実施例６に記載した方法を(ストレプトコッカス・サーモフィルスＤＳＭ  ２０６１７の選択培地は、２.５ｇ・ｌ−１の２−フェニルエタノール(ＰＥＡ)添加ＴＨ培地であった以外)、それ故に、後者の株に適用した。
ＣＲＩＳＰＲアレイプラスミドで形質転換したストレプトコッカス・サーモフィルスＤＳＭ  ２０６１７を、回復のために液体培地で３時間、３７℃でインキュベートし、これはカナマイシン耐性の発現を可能とした。回復期間後、細胞死を誘発するための１％キシロース存在下および対照としてキシロース非存在下で、細胞を種々の選択培地に播種した(図１０)。(１)キシロース誘導により、ストレプトコッカス・サーモフィルスの増殖が阻害できる(‘強’プロモータープラスミド対対照で約１０倍)、(２)‘強’システム(ｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰｌｄｈＡ)が‘弱’システム(ｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰｘｙｌＡ)より多い増殖減少をもたらすことが示される。
【１０２６】
実施例８：種々の微生物相種の混合共同体における選択的細菌集団増殖阻害
我々は、次に、３種の混合集団における特定の細菌種の選択的増殖阻害を示した。我々は、ヒトおよび動物の腸内微生物相に見られる種を選択した(ストレプトコッカス・サーモフィルスＤＳＭ  ２０６１７(Ｔ)、ラクトバチルス・ラクティスおよびエシェリキア・コリ)。我々は２グラム陽性種(ストレプトコッカス・サーモフィルスおよびラクトコッカス・ラクティス)を包含させ、これが前者の種の選択的死滅に対する能力に影響するかを調べ、さらに困難性を上げるために(および微生物相をより密接に模倣するために)、ストレプトコッカス・サーモフィルスと系統的に関連する種であるためラクトコッカス・ラクティスを選択した(２種間の高１６ｓリボソームＲＮＡ配列同一性により示される)。ストレプトコッカス・サーモフィルスおよびラクトコッカス・ラクティスは、両者ともファーミキューテスである。さらに、微生物相を模倣するため、ヒト片利共生腸種(エシェリキア・コリ)を包含させた。
【１０２７】
１. 材料および方法
実施例６に示す方法を株に使用した(選択培地が２.５ｇ・ｌ−１の２−フェニルエタノール(ＰＥＡ)添加ＴＨ培地であった以外)。
【１０２８】
１. １  エレクトロコンピテントラクトコッカス・ラクティス細胞の調製
０.５Ｍスクロースおよび１％グリシン添加ＴＨ培地でのラクトコッカス・ラクティスの一夜培養物を５mlの同じ培地で１００倍希釈し、３０℃でＯＤ６０００.２〜０.７まで増殖させた(接種約２時間後)。細胞を７０００×ｇで５分、４℃で回収し、５mlの氷冷洗浄緩衝液(０.５Ｍスクロース＋１０％グリセロール)で３回洗浄した。細胞洗浄後、ＯＤ６００１５〜３０でエレクトロポレーション緩衝液(０.５Ｍスクロース、１０％グリセロールおよび１mM  ＭｇＣｌ２)に懸濁した。エレクトロポレーション緩衝液中の細胞を使用するまで４℃に維持するか(１時間以内)または後に使用するためにエッペンドルフチューブに５０μlで等分し、液体窒素で冷凍し、−８０℃で保存した。
全種のエレクトロポレーション条件は実施例６に記載のとおりであった。
【１０２９】
１.２ ＣＲＩＳＰＲアレイの活性化：共同体実験
ストレプトコッカス・サーモフィルスＤＳＭ  ２０６１７、ラクトコッカス・ラクティスＭＧ１３６３およびエシェリキア・コリＴＯＰ１０を、ＤＮＡポリメラーゼIIIをターゲティングするＣＲＩＳＰＲアレイおよびストレプトコッカス・サーモフィルスのｔｅｔＡを含むプラスミドで遺伝学的に形質転換した。形質転換後、全細胞を単独および共培養で３時間、３７℃で培養し、プラスミドによりコードされる抗生物質耐性発現のための回復をさせた。我々は、ＣＲＩＳＰＲコード化増殖阻害の読み出し情報として形質転換効率を使用することを決定した。そして、細胞を回復させた後、培養物を、全てカナマイシンが添加されたＴＨ培地、ＰＥＡ添加ＴＨおよびマッコンキー寒天に播種し、１％キシロースで誘導した。
【１０３０】
２. 結果
２.０  ラクトコッカス・ラクティス、エシェリキア・コリおよびストレプトコッカス・サーモフィルスの系統的距離
ストレプトコッカス・サーモフィルスおよびラクトコッカス・ラクティスの１６Ｓ  ｒｒＮＡコード化ＤＮＡ配列における計算された配列類似性は８３.３％と決定された。次の１６Ｓ配列を使用した：エシェリキア・コリ：ＡＢ０３０９１８.１、ストレプトコッカス・サーモフィルス：ＡＹ１８８３５４.１、ラクトコッカス・ラクティス：ＡＢ０３０９１８。配列を次のパラメータを用いてニードルでアラインした(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html)：−gapopen 10.0 -gapextend 0.5  -endopen 10.0 -endextend 0.5 -aformat3 pair -snucleotide1 -snucleotide2。図１１は、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトコッカス・ラクティスおよびエシェリキア・コリからの１６Ｓ配列の最尤推定系統樹を示す。
【１０３１】
２.１ 増殖条件および選択培地
ストレプトコッカス・サーモフィルスおよびラクトコッカス・ラクティスは、多くの発酵食品およびヨーグルトで一般に組み合わせで使用される。我々は、宿主と密接に関係する腸微生物として一般に知られ、ストレプトコッカス・サーモフィルスおよびラクトコッカス・ラクティスの１６ＳリボソームＲＮＡ領域の先の特徴づけがこれらの生物が系統学的に密接に関係することを示していたため、これらの株を選択した(Ludwig et al., 1995)。並行して、我々はまたエシェリキア・コリがまた腸微生物共同体で一般に見られるため、我々の混合集団共培養実験においてこの生物の増殖も評価した。我々はまず細菌株および我々が共培養実験に使用することを意図していた全株の増殖を支持する培養プロトコールの確立に着手した。我々は、全株がＴＨブロスで３７℃で増殖が支持され得ることを発見した(図３)。
混合培養からの種々の細菌の鑑別は、様々な種の細胞数を決定するために重要である。マッコンキー寒天を用いてエシェリキア・コリを選択的に増殖させることは可能であるが、ストレプトコッカス・サーモフィルスの選択的増殖のための特定の培地はない。ＰＥＡ寒天は、グラム陰性菌(エシェリキア・コリ)からグラム陽性菌(ストレプトコッカス・サーモフィルス)を単離するのに使用される選択培地である。さらに、種々の濃度のＰＥＡが他のグラム陽性菌の増殖を一部阻害し、これが本実験で使用する他のグラム陽性細菌間の選択を可能とする。２.５ｇ・ｌ−１のＰＥＡの使用が、ラクトコッカス・ラクティスおよびエシェリキア・コリの増殖を制限しながら、ストレプトコッカス・サーモフィルスを選択的増殖させることを確実とした。
全株をカナマイシン選択マーカーを有するｐＢＡＶ１ＫＴ５のベクター主鎖を使用したプラスミドで形質転換し、我々は、３０μg ml−１のカナマイシン添加培地が、プラスミドを維持しながら細胞を増殖させるのに十分であることを発見した。
【１０３２】
２.３  混合集団における形質転換および選択的増殖阻害
我々は、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトコッカス・ラクティスおよびエシェリキア・コリをＣＲＩＳＰＲアレイを含むプラスミドで形質転換し、当量部で合わせた全細菌種の共同体でこれらを培養し、これはまた我々がストレプトコッカス・サーモフィルスに特異的に細胞死をもたらすことができたかを決定することも可能とした。我々は、全種をｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰＸｙｌＡまたはｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−Ｐｌｄｈａ＋Ｘｙｌプラスミドで形質転換した。
図１２は、ｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰｘｙｌＡまたはｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰｌｄｈＡ＋Ｘｙｌプラスミドを担持するエシェリキア・コリ、ラクトコッカス・ラクティスおよびストレプトコッカス・サーモフィルスの共培養における選択的ストレプトコッカス・サーモフィルス増殖阻害を示す。ｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰｘｙｌＡまたはｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰｌｄｈＡ＋Ｘｙｌプラスミドを担持するエシェリキア・コリで増殖差異は観察されない(中央カラム)。しかしながら、ストレプトコッカス・サーモフィルス(２.５ｇ・ｌ−１  ＰＥＡ添加ＴＨ寒天上で選択的増殖、最後のカラム)は、我々が予想したとおり、ｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰｘｙｌＡ(強)またはｐＢＡＶ１ＫＴ５−ＸｙｌＲ−ＣＲＩＳＰＲ−ＰｌｄｈＡ＋ＸｙｌＡ(弱)プラスミドで形質転換効率の減少を示した。こうして、我々は、細胞の混合集団における標的ストレプトコッカス・サーモフィルス亜集団の選択的増殖阻害を示した。
【１０３３】
引用文献
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【１０３４】
表
【表１】
2020058369.tif 000004
【表２】
2020058369.tif 000005
【表３】
2020058369.tif 000006
【表４】
2020058369.tif 000007
【１０３５】
エントリーは次の例に説明されるとおり解釈する。
【表５】
2020058369.tif 000008
ＣＲＩＳＰＲアレイは、デスルホビブリオ・デスルフリカンスＮＤ１３２で３４９１６５３位から開始して、３４９８１９１位で終わり、見られ、ここでアレイは９８スペーサー配列を有し、各々反復が隣接し、ここで、反復は各々配列番号５１の配列を有する。このような反復はまた備考番号１(表の最後の列)の他の細菌のアレイでも見られる。
【１０３６】
【表６】
2020058369.tif 000009
【１０３７】
【表７】
2020058369.tif 000010
【表８】
2020058369.tif 000011
【１０３８】
【表９】
2020058369.tif 000012
【１０３９】
【表１０】
2020058369.tif 000013
【１０４０】
【表１１】
2020058369.tif 000014
【１０４１】
配列：
例えば、本発明の１以上のスペーサーは、この配列表における各配列を標的とする。配列番号１−４４は、タイプII  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム配列、例えば、ストレプトコッカス配列である。
【表１２】
2020058369.tif 000015
【表１３】
2020058369.tif 000016
【１０４２】
【表１４】
2020058369.tif 000017
【表１５】
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【１０４３】
【表１６】
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【表１７】
2020058369.tif 000020
【１０４４】
【表１８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2020058369.tif 000029
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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