(57)【要約】【課題】化学農薬とは異なる新規な青枯病菌関連病態の抑制剤、青枯病菌関連病態の抑制方法、及びその利用を提供すること。【解決手段】本発明の一形態に係る青枯病菌関連病態の抑制剤は、Tepidibacter属に属する菌を含んでいる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Tepidibacter属に属する菌を含む、青枯病菌関連病態の抑制剤。
【請求項２】
上記菌としてTepidibacter mesophilus又はその亜種を含む、請求項１に記載の抑制剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の抑制剤を、植物栽培用の媒体、又は植物に対して投与する工程を含む、青枯病菌関連病態の抑制方法。
【請求項４】
上記植物がナス科の植物である、請求項３に記載の抑制方法。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の抑制剤を植物栽培用の媒体に加える工程を含む、植物栽培用の媒体の改質又は製造方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法によって得られた、植物栽培用の媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、青枯病菌関連病態の抑制剤、青枯病菌関連病態の抑制方法、及び、植物栽培用の媒体の改質又は製造方法等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
青枯病菌（Ralstonia solanacearum)は、熱帯、亜熱帯、温帯地域を中心に世界各地に分布し、ナス科植物等を中心として２００種以上の植物に感染することが知られており（非特許文献１）、最終的には、植物の立ち枯れを引き起こす。青枯病菌を原因とするこの病害は、青枯れ病、又は、立ち枯れ病（タバコ植物の場合）等と称されている。
青枯病菌を原因とするこの病害は、感染対象となる植物の多さとともに、一旦発生すると根絶することが難しい難防除病害としても知られている。そのため、他の病害と比較をしても、防除対象としての重要性が高い。
青枯病菌の対策として、一般的には、１）土壌消毒を行う方法、２）間作、及び、３）抵抗性品種の導入等が行われている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Hayward A, C. (1991). Biology and epidemiology of bacteria wilt caused by Pseudomonas solanacearum.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、土壌消毒を行う方法では、例えば、クロロピクリン等の化学農薬を用いるが、土壌に化学農薬が残留することを回避することは困難である。間作は、一定期間、土壌を用いることができなくなり農作物の生産効率に影響を与えうる上に、どの程度の期間をおけば充分な対策となるかについて予測が困難である。抵抗性品種の導入は、品種開発の手間に手間とコストとを要する問題がある。
【０００５】
本発明の一態様は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、化学農薬とは異なる新規な青枯病菌関連病態の抑制剤、青枯病菌関連病態の抑制方法、及びその利用を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の課題を解決するために、本願発明者らは鋭意検討を行った。より具体的には、本願発明者らは、青枯病の発病抑止土壌の存在に着目し、当該土壌の中に、青枯病の発病抑止に有効な成分が含まれていないかを探索した。その結果、上記課題を解決できることを見出し、本願発明を成すに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の何れかのものを提供する。
１）  Tepidibacter属に属する菌を含む、青枯病菌関連病態の抑制剤。
２）  上記菌としてTepidibacter mesophilus又はその亜種を含む、１）に記載の抑制剤。
３）  １）又は２）に記載の抑制剤を、植物栽培用の媒体、又は植物に対して投与する工程を含む、青枯病菌関連病態の抑制方法。
４）  上記植物がナス科の植物である、３）に記載の抑制方法。
５）  １）又は２）に記載の抑制剤を植物栽培用の媒体に加える工程を含む、植物栽培用の媒体の改質又は製造方法。
６）  ５）に記載の方法によって得られた、植物栽培用の媒体。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の一態様によれば、化学農薬とは異なる新規な青枯病菌関連病態の抑制剤、青枯病菌関連病態の抑制方法、及びその利用を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】一実施例におけるトマト苗の生育状態の指標を示す図である。
【図２】他の実施例において、トマト苗を栽培後の、Tepidibacter mesophilusの１６ｓリボソームＲＮＡ遺伝子のコピー数を定量した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
〔実施形態１〕
以下、本発明の一実施形態について、詳細に説明する。
【００１１】
〔１．  青枯病菌関連病態の抑制剤の概要〕
本発明の一実施形態に係る青枯病菌関連病態の抑制剤は、その活性成分としてTepidibacter属に属する菌を含んでいる。
【００１２】
＜青枯病菌関連病態＞
本明細書において青枯れ病菌関連病態とは、青枯病菌（Ralstonia solanacearum)が植物に感染することに起因して引き起こされる、植物の病態を指す。病態の一例には、１）青枯病菌が産生する多糖類が植物の維管束内に蓄積する（病態として顕在化する前の状態も含む）、２）植物における萎凋の発生、又は、３）植物の枯死等が挙げられる。この病態が顕在化して２）や３）の状態となったものは、青枯病、又は、立枯病（タバコ植物の場合）と称される。
【００１３】
＜青枯病菌関連病態の抑制＞
本明細書において青枯病菌関連病態の抑制とは、何らの措置を講じない状態と比較して、青枯病菌関連病態の進行が抑制されることを指す。より具体的には例えば、何らの措置を講じない状態と比較して、１）青枯病菌の感染が抑止されること、２）青枯病菌関連病態の顕在化が抑止されること、３）青枯病菌関連病態の進行が抑制されること（進行のスピードが緩やかになることを含む）、４）青枯病菌関連病態の進行が停止すること、及び、５）青枯病菌関連病態が改善すること等のうちから選択される少なくとも一つが意図され、これらの中では１）又は２）が好ましい。
【００１４】
本明細書において青枯病菌関連病態の抑制剤とは、上述したような青枯病菌関連病態の抑制が可能な剤を意図する。
【００１５】
＜Tepidibacter属に属する菌＞
本発明の一実施形態に係る抑制剤の活性成分であるTepidibacter属に属する菌とは、T. mesophilus、T. tharassicus、T. formicigenes及びこれらの亜種や変種等からなる群より選択される少なくとも一種の菌を指す。Tepidibacter属に属する菌は、好ましくはTepidibacter mesophilus、その亜種、又はその変種である。新種の菌に関しては、１６ｓリボソームＲＮＡの塩基配列を用いた系統分類解析によって、Tepidibacter属に属する菌、より好ましくはTepidibacter mesophilusの亜種又は変種と位置づけられる菌が意図される（実施例の記載も参照のこと）。Tepidibacter mesophilusの亜種又は変種と位置づけられる菌とは、例えば、配列番号１に示す塩基配列と９２％以上、或いは９２％を超える同一性を示す１６ｓリボソームＲＮＡを有する菌を指す。この同一性は好ましくは９５％以上であり、より好ましくは９６％、９７％、９８％又は９９％以上である。なお、配列番号１に示す塩基配列は、アクセッション番号NR_108539.1としてNational Center of Biotechnology Informationに登録されている、Tepidibacter mesophilusの１６ｓリボソームＲＮＡの塩基配列である。Tepidibacter属に属する菌は、自然界から単離されたものであっても、その遺伝子に人工的に変異を導入したものであってもよい。
【００１６】
本発明に用いられるTepidibacter属に属する菌は、嫌気性菌である。よって、好気性菌による防除作用が十分に発揮されない栽培環境や土壌に対して使用してもよい。また、土壌栽培のみならず水耕栽培に使用してもよい。
【００１７】
＜剤型、および、抑制剤に含まれるその他の成分＞
本発明の一実施形態に係る抑制剤の剤型は特に限定されず、微生物製剤として機能する形態であればよい。剤型は、例えば、液剤、水和剤、顆粒状水和剤、乳剤、懸濁剤、粉剤、フロアブル剤、分散剤、粒剤、ペースト剤、およびエアゾール剤等が挙げられる。
【００１８】
本抑制剤は、活性成分であるTepidibacter属に属する菌のみを含有するものでもよいが、例えば、農薬上又は農業資材上許容される担体等のその他の成分をさらに含んで、上述の剤型に製剤化されていてもよい。
抑制剤は、Tepidibacter属に属する菌と、農薬上又は農業資材上許容される担体等のその他の成分とが別々に梱包された形態であってもよい。この場合、菌とその他の成分とは、抑制剤として使用をする直前に混合される。なお、Tepidibacter属に属する菌は、長期の保存が可能な形態、例えば、凍結乾燥等された形態であってもよい。
【００１９】
担体の一例として液体担体が挙げられる。液体担体として、具体的には例えば、水；大豆油、ナタネ油、綿実油、ヒマシ油等の植物油；メタノール、エタノール、プロパノール、またはイソプロパノール等の一価アルコール類；エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、ヘキシレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはグリセリン等の多価アルコール類；等を挙げることができ、これらの中では、水、又は植物油であることが好ましい。これらは単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２０】
上記のその他の成分として、例えば、各種の界面活性剤を使用してもよい。界面活性剤の種類は特に限定されず、ノニオン系界面活性剤、カチオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤、または両性界面活性剤等が挙げられる。
【００２１】
上記のその他の成分として、例えば、タルク等の粘土鉱物、または炭酸石灰等の固形担体；展着剤、または固着剤；等を用いることもできる。
【００２２】
また、本抑制剤は、さらに、例えば、忌避剤、殺虫剤、又は殺菌剤等の他の農薬；あるいは植物生長調整剤；等を、その他の成分として含有してもよい。なお、殺菌剤は、青枯病菌を対象とするものであってもよいし、青枯病菌以外の菌（Tepidibacter属に属する菌は除く）を対象とするものであってもよい。
【００２３】
＜抑制剤における活性成分の含有量＞
本発明の一実施形態に係る抑制剤において、含有される活性成分（Tepidibacter属に属する菌）の量は、その使用時において、青枯病菌関連病態の抑制という効果を奏する限りにおいて特に限定されるものではない。抑制剤が液剤の形態であれば、その使用時において、例えば、1010 cell/Ｌ以上で1012 cell/Ｌ以下の範囲内であり、好ましい一例では、1011 cell/Ｌ以上で1012 cell/Ｌ以下の範囲内である。なお、抑制剤の使用前の形態では、Tepidibacter属に属する菌が濃縮された状態で保持されていてもよい。
【００２４】
＜対象植物＞
本明細書において対象植物とは、青枯病菌が感染可能なあらゆる植物を指す。こられの植物は、例えば、農園芸用の植物である。特に限定されないが、具体的には例えば、ナス科植物；ウリ科植物；アブラナ科植物；ショウガ科植物；バラ科植物；シソ科植物；キク科植物；又は、マメ科植物；等が挙げられ、中でもナス科植物が好ましい対象植物である。ナス科植物としては、例えば、トマト、ナス、ピーマン、シシトウ、トウガラシ、パプリカ、ジャガイモ、又はタバコ等が挙げられる。ウリ科植物としては、例えば、キュウリ、カボチャ、ニガウリ、スイカ、メロン、又はズッキーニ等が挙げられる。アブラナ科植物としては、例えば、ダイコン、カブ、アブラナ、チンゲンサイ、こまつな、カリフラワー、ブロッコリー、又はケール等が挙げられる。ショウガ科植物としては、例えば、ショウガ、又はミョウガ等が挙げられる。バラ科植物としては、例えば、イチゴ等が挙げられる。シソ科植物としては、例えばシソ等が挙げられる。キク科植物としては、例えば、シュンギク、又はレタス等が挙げられる。マメ科植物としては、例えば、ラッカセイ、インゲンマメ、ソラマメ、エンドウマメ、又はダイズ等が挙げられる。なお、これら植物種の具体的な例示として、主に農作物用の植物を挙げたが、花卉用の植物であってもよい。
【００２５】
＜抑制剤の用途＞
本発明の一実施形態に係る抑制剤は、例えば、１）青枯病菌関連病態を抑制するために、又は、２）植物栽培用の媒体を改質又は製造するために、用いることが出来る。
【００２６】
〔２．  青枯病菌関連病態の抑制方法の概要〕
本発明の一実施形態にかかる青枯病菌関連病態の抑制方法は、上述した本発明の一実施形態に係る抑制剤を、植物栽培用の媒体、又は植物に対して投与する工程を含む。
【００２７】
＜植物栽培用の媒体＞
植物栽培用の媒体とは、土壌、又は、土壌代替物等の、植物を栽培するための媒体を指す。ここで、土壌代替物とは、例えば、人工土（ピートモス、バーミキュライト等）、水耕栽培用等の培地、等の、土壌の代わりに植物を生育させることが可能な媒体を指す。なお、土壌代替物は、一般に、土壌と比較して青枯病菌の混入は少ないものの、水耕栽培等でも青枯病菌関連病態の発生に関する報告はなされている。
【００２８】
＜投与する工程＞
青枯病菌は、主に、植物栽培用の媒体中に存在して、青枯病菌関連病態の発生に関与する。そのため、本発明の一実施形態に係る抑制剤の有効量の投与は、好ましくは、植物栽培用の媒体に対して行われる。植物栽培用の媒体に対して抑制剤が投与されるタイミングは、植物栽培用の媒体に植物を植え付ける前であってもよく、植物を植え付けた後（すなわち植物を栽培している最中）であってもよい。植物栽培用の媒体と、投与される抑制剤との量的関係は、青枯病菌関連病態の抑制効果が得られる限り特に限定されないが、一例では、媒体１グラムに対して、活性成分（Tepidibacter属に属する菌）が１０４個以上であり、好ましくは１０6個以上である。投与される抑制剤の量的な上限も、青枯病菌関連病態の抑制効果が得られる限り特に限定されないが、一例では、媒体１グラムに対して１０10個以下、好ましくは１０9個以下、又は１０8個以下である。
【００２９】
或いは、本発明の一実施形態に係る抑制剤の有効量の投与は、植物に対して行われる。好ましくは、抑制剤の投与が植物の根部に対して行われる。より具体的な方法として、例えば、植物の根部を、液体状の抑制剤にディップする等の方法が挙げられる。
【００３０】
〔３．  植物栽培用の媒体の改質又は製造方法の概要〕
本発明の一実施形態に係る植物栽培用の媒体の改質又は製造方法は、上述した本発明の一実施形態に係る抑制剤を、植物栽培用の媒体（〔２．青枯病菌関連病態の抑制方法の概要〕の欄で説明したものと同じ）に加える工程を含む。この抑制剤を有効量含有する、植物栽培用の媒体は、青枯病菌関連病態を抑制する機能を備えた媒体として用いることができる。植物栽培用の媒体と、加えられる抑制剤との量的関係は、青枯病菌関連病態の抑制効果が得られる限り特に限定されないが、一例では、媒体１グラムに対して、活性成分（Tepidibacter属に属する菌）が１０４個以上となるように加えられ、好ましくは１０6個以上となるように加えられる。加えられる抑制剤の量的な上限も、青枯病菌関連病態の抑制効果が得られる限り特に限定されないが、一例では、媒体１グラムに対して１０10個以下、好ましくは１０9個以下、又は１０8個以下である。
なお、本発明の一実施形態には、上記の改質方法又は製造方法によって得られる、植物栽培用の媒体も含まれる。
【００３１】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００３２】
本発明の一実施例について以下に説明する。
【００３３】
〔実施例１〕
日本国石川県、岐阜県及び和歌山県から青枯病の発病抑止土壌を採取し、当該土壌に含まれる菌叢の解析を行った。なお、青枯病の発病抑止土壌とは、青枯病が未発病でかつｐｈｃＡ（青枯病菌の発病に関連した遺伝子）が検出された土壌である。また、比較の対象として、青枯病の発病土壌（すなわち、ｐｈｃＡが検出され、かつ青枯病が発生した土壌）に含まれる菌叢の解析も行った。
【００３４】
はじめに土壌から、菌体破砕法および加熱抽出法（Isoil for Beads Beatingを使用）に従ってＤＮＡを抽出し、精製を行った。次いで、Takara Ex Taq (型番：TKR-RR001A）のＰＣＲプライマーミックスを用いたＰＣＲを行い、原核生物由来の１６ｓリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡ配列の増幅を網羅的に行った。
【００３５】
次いで、ＰＣＲによって得られた増幅断片を、次世代シーケンサー（ＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒベンチトップシステム（ロシュ））を用いてシーケンス解析した。青枯病の発病抑止土壌で得られた結果と、青枯病の発病土壌で得られた結果とを比較することによって、青枯病の発病抑止土壌で存在比が有意に高い菌として２４３菌群が検出された。
【００３６】
なお、石川県白山市から採取した青枯病の発病抑止土壌（５サンプル）においてTepidibacter属の菌の相対的存在割合は平均０．０２５％（Ｓ.Ｄ.＝０．０００１１６５６）であった。ここで該当菌の相対的存在割合とは、土壌サンプル中で検出された全菌の増幅断片量に対する、該当菌の増幅断片量を百分率表示したものを指す。
【００３７】
〔実施例２〕
実施例１で検出された２４３菌群に近縁な３２菌株（Tepidibacter mesophilusを含む）をＪＣＭ（理研ＢＲＣ）の保有株の中から選別し、これら菌株を候補菌として防除価を求めた。なお、実施例１で検出された２４３菌群の中には、配列番号１に示す塩基配列と１００％の同一性を示す１６ｓリボソームＲＮＡの部分配列を有する菌（Tepidibacter mesophilus又はその亜種でありうる菌）が含まれていた。
＜栽培条件＞
オートクレーブ済の減菌土壌に、青枯病菌を１０８ｃｅｌｌ/ｇ土壌で、候補菌を１０８ｃｅｌｌ/ｇ土壌で加え、ここにトマトの幼苗（ｎ＝９）を植え付け、３０℃で２１日間栽培した。２１日間栽培したトマト苗は、発病度０（健全）〜５（枯死）までの５段階でその成育状態を評価した。なお、発病度０（健全）は、オートクレーブ済の減菌土壌に、青枯病菌を加えずに、候補菌を１０８ｃｅｌｌ/ｇ土壌で加え、ここにトマトの幼苗を植え付け、３０℃で２１日間栽培したものと同等の成育状態に相当する。なお、ネガティブコントロールとして、オートクレーブ済の減菌土壌に、青枯病菌を１０８ｃｅｌｌ/ｇ土壌で加え、ここにトマトの幼苗を植え付け、３０℃で２１日間栽培したものを準備した。ネガティブコントロールでは、トマト苗は枯死した（発病度５）。図１に、本実施例での発病度０〜４の成育状態に相当するトマト苗を示す。
＜防除価の計算＞
防除価  ＝  １−（候補菌接種時の発病度の合計（ｎ＝９個体）／ネガティブコントロールの発病度の合計）
※  ネガティブコントロールの発病度の合計＝４５（発病度５×個体数９）
【００３８】
次いで、防除価が５０以上の候補菌について、オートクレーブを行わない未減菌土壌を用いた点以外は同じ条件で、前出の＜栽培条件＞での栽培と、前出の＜防除価の計算＞とを行った。そして、オートクレーブ済の減菌土壌でも、オートクレーブを行わない未減菌土壌でも高い防除価を示す候補菌としてTepidibacter mesophilusを選択した。なお、未減菌土壌を用いた３回の栽培試験で求められた防除価の平均値は５４（S.D.＝7.960307561）であった。
【００３９】
また、Tepidibacter mesophilusの菌体に代えてTepidibacter mesophilusの培養上清を用いた点以外は同じ条件で、前出の＜栽培条件＞での栽培と、前出の＜防除価の計算＞とを行った。未減菌土壌を用いた２回の栽培試験で求められた防除価の平均値は１４、減菌土壌を用いた２回の栽培試験で求められた防除価の平均値は０であった。すなわち、Tepidibacter mesophilusの菌体を用いる方が明らかに優れた防除価を示した。
【００４０】
〔実施例３〕
候補菌としてTepidibacter mesophilusのみを用い、１０4ｃｅｌｌ/ｇ土壌、１０6ｃｅｌｌ/ｇ土壌、又は１０８ｃｅｌｌ/ｇ土壌で未減菌土壌に加えた点以外は、実施例２と同じ条件で、トマト苗の栽培と防除価の計算とを行った。その結果、候補菌を１０4ｃｅｌｌ/ｇ土壌で加えた場合の防除価は約２０であったが、候補菌を、１０6ｃｅｌｌ/ｇ土壌又は１０８ｃｅｌｌ/ｇ土壌で加えた場合の防除価は何れも５０以上であった。
【００４１】
〔実施例４〕
オートクレーブ済の減菌土壌に、青枯病菌を１０８ｃｅｌｌ/ｇ土壌で、Tepidibacter mesophilusを１０８ｃｅｌｌ/ｇ土壌で加え、ここにトマトの幼苗（ｎ＝４）を植え付け、３０℃で２１日間栽培した。また、オートクレーブ済の減菌土壌に、青枯病菌もTepidibacter mesophilusも加えずに、トマトの幼苗（ｎ＝４）を植え付け、３０℃で２１日間栽培した。
【００４２】
２１日間栽培した後に、トマト植物体それぞれの地下部を採取した。そして、根面に付着した土壌を水洗で除去して得られた地下部（植物根）を植物根サンプルとした。また、水洗の際に、植物根から取り除いた土壌を土壌サンプルとした。土壌サンプル０．５ｇ、植物根サンプル０．２ｇをそれぞれ、実施例１に記載の方法で破砕し、ＤＮＡ抽出し、精製を行った。
【００４３】
次に、定量ＰＣＲの一種であるDigital ＰＣＲを用いて、Tepidibacter mesophilusの定量を行った。より具体的には、１）Tepidibacter mesophilusの16S rRNAに特異的なプライマーと、２）当該プライマーを用いて得られる増幅断片に特異的なTaqMan（登録商標）プローブとを用い、キットを用いて定量した。
【００４４】
定量の結果は図２に示す。図２から分かるように、Tepidibacter mesophilusを加えることで、植物根サンプルでのTepidibacter mesophilus量が有意に増加した。一方、土壌サンプルでのTepidibacter mesophilus量に有意な差は見られなかった。なお、土壌サンプルは４サンプル全てを用い、その平均のコピー数を、植物根サンプルは４サンプル中の３サンプルを用い、その平均のコピー数を示した。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明の一態様によれば、化学農薬とは異なる新規な青枯病菌関連病態の抑制剤、青枯病菌関連病態の抑制方法、及びその利用を提供することができる。
【図１】
2020019755.tif 000002
【図２】
2020019755.tif 000003
【配列表】
2020019755000001.app