(57)【要約】      （修正有）【課題】基礎培地に添加物を添加して培養速度を向上することができる細胞培養用培地を提供する。【解決手段】細胞を培養するときに、前記細胞を配置する細胞培養用培地であって、紅茶から浸出した紅茶浸出エキスを基礎培地に添加した、ことを特徴とする。さらに、細胞培養方法で培養した細胞、細胞を含有する化粧品、細胞を含有する医薬品または医薬部外品、細胞を含有する飲食品にも関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を培養するときに、前記細胞を配置する細胞培養用培地であって、
紅茶から浸出した紅茶浸出エキスを基礎培地に添加した、ことを特徴とする細胞培養用培地。
【請求項２】
前記紅茶浸出エキスを０．０１重量パーセント添加した、ことを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養用培地。
【請求項３】
摂氏２０度から２５度の水で浸出した前記紅茶浸出エキスを添加した、ことを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の細胞培養用培地。
【請求項４】
細胞を培養する細胞培養方法であって、
紅茶を浸出して紅茶浸出エキスを生成する紅茶浸出エキス生成ステップと、
前記紅茶浸出エキス生成ステップで生成した前記紅茶浸出エキスを基礎培地に添加する紅茶浸出エキス添加ステップと、
前記紅茶浸出エキス添加ステップで前記紅茶浸出エキスを添加した前記基礎培地に細胞を配置する細胞配置ステップと、
前記細胞配置ステップで配置した前記細胞を培養する細胞培養ステップと
を含む、
ことを特徴とする細胞培養方法。
【請求項５】
請求項４に記載の細胞培養方法で培養した細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の細胞を含有する化粧品。
【請求項７】
請求項５に記載の細胞を含有する医薬品または医薬部外品。
【請求項８】
請求項５に記載の細胞を含有する飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を培養するときに用いる細胞培養用培地および細胞を培養する細胞培養方法に関する。また、本発明は、培養した細胞、並びに、その細胞を含む化粧品（スキンケア組成物）、医薬品、医薬部外品および飲食品に関するものであってもよい。
【背景技術】
【０００２】
医薬品の生産、遺伝子治療、再生医療、免疫療法などの医薬学・生化学分野において、細胞（組織、微生物、ウイルスなどを含む）を人工的な環境下で培養する方法が提案されている。特許文献１では、培地成分の少なくとも１種が、刺激応答性高分子との結合体で構成されている細胞培養培地を貯留して細胞を培養する培養槽と、前記結合体に所定の刺激を付与して前記刺激応答性高分子に所定の応答変化を生じさせる刺激付与機構と、前記応答変化によって前記刺激応答性高分子に現れる性状に基づいて前記結合体を前記細胞培養培地に留めて前記結合体を除く他の前記培地成分のうちの少なくとも一部を前記細胞培養培地から分離する分離機構と、を備えることを特徴とする細胞培養培地に関する技術を開示している。特許文献２では、基礎培地に、ポリビニルアルコールとアルブミンとを添加する工程を含む、幹細胞培養用培地の製造方法であって、アルブミンの脂肪酸担持量を測定してアルブミン１ｇに対して９ｍｇよりも多い場合にアルブミンに対して脂肪酸低減処理を施す工程を含む方法と、ポリビニルアルコールの臨界ミセル濃度が０．１〜５ｍｇ／ｍｌであり、加水分解率が６０〜９５％である方法と、アルブミンとポリビニルアルコールとの培地中の含有量の比が、１：１．１〜１００である、方法に関する技術を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１８−８２６６４号公報
【特許文献２】特開２０１８−１１５９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
被験者（や患者、提供者）の負担を考慮した必要最低限の細胞を抽出し、大量に培養することが求められている。また、基礎培地（細胞培養に使われる培地で、細胞の維持と増殖に必要な最低限の成分を含んだもの）に比較的低価格で容易に入手可能な成分を添加して、培養効率（増殖速度）を向上する方法が求められている。
【０００５】
本発明は、細胞を効率的または大量に培養するために、基礎培地に添加物を添加して培養速度を向上する細胞培養用培地または細胞培養方法を提供することを目的とする。また、本発明は、培養速度を向上した細胞培養用培地を用いて培養した細胞またはその培養した細胞を含有する化粧品、医薬品、医薬部外品若しくは飲食品を提供することを目的としてもよい。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために、本発明の一つの実施形態は、細胞を培養するときに、前記細胞を配置する細胞培養用培地であって、紅茶から浸出した紅茶浸出エキスを基礎培地に添加した、ことを特徴とする細胞培養用培地を提供する。本発明の他の実施形態は、上記の細胞培養用培地であって、前記紅茶浸出エキスを０．０１重量パーセント添加した、ことを特徴とする細胞培養用培地であってもよい。本発明の他の実施形態は、上記のいずれかの細胞培養用培地であって、摂氏２０度から２５度の水で浸出した前記紅茶浸出エキスを添加した、ことを特徴とする細胞培養用培地であってもよい。
【０００７】
本発明の他の実施形態は、細胞を培養する細胞培養方法であって、紅茶を浸出して紅茶浸出エキスを生成する紅茶浸出エキス生成ステップと、前記紅茶浸出エキス生成ステップで生成した前記紅茶浸出エキスを基礎培地に添加する紅茶浸出エキス添加ステップと、前記紅茶浸出エキス添加ステップで前記紅茶浸出エキスを添加した前記基礎培地に細胞を配置する細胞配置ステップと、前記細胞配置ステップで配置した前記細胞を培養する細胞培養ステップとを含む、ことを特徴とする細胞培養方法を提供する。
【０００８】
本発明の他の実施形態は、上記の細胞培養方法で培養した細胞であってもよい。本発明の他の実施形態は、上記の培養した細胞を含有する化粧品であってもよい。本発明の他の実施形態は、上記の培養した細胞を含有する医薬品または医薬部外品であってもよい。本発明の他の実施形態は、上記の培養した細胞を含有する飲食品であってもよい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係る細胞培養用培地によれば、基礎培地に添加物を添加して培養速度を向上することができる。本発明に係る細胞培養方法によれば、基礎培地に添加物を添加して培養速度を向上することができる。また、本発明は、培養速度を向上した細胞培養用培地を用いて培養した細胞またはその培養した細胞を含有する化粧品、医薬品、医薬部外品若しくは飲食品を提供することができる。さらに、本発明によれば、細胞を効率的に培養することができるので、医療や美容、健康、再生医療などの医薬学分野、生化学分野において大きく貢献できるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の実施形態に係る細胞の培養結果の一例を説明する説明図である。
【図２】本発明の実施形態に係る細胞の培養結果の一例を説明する説明図である。
【図３】培養した細胞の一例を説明する説明図である。
【図４】本発明の実施形態に係る細胞培養方法の一例を説明する説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
実施形態に係る細胞培養用培地および細胞培養方法の例を用いて、本発明を説明する。なお、本発明は、以後に説明する細胞培養用培地および細胞培養方法以外でも、細胞を培養する液体培地であれば、いずれのものにも用いることができる。なお、添加物を添加する前の基礎培地（細胞培養に使われる培地で、細胞の維持と増殖に必要な最低限の成分を含んだもの）は、特に限定されない。
【００１２】
下記に示す順序で、本発明を説明する。
１．細胞培養用培地の構成
２．細胞培養方法
３．培養した細胞および化粧品、医薬品、医薬部外品、飲食品
【００１３】
（１．細胞培養用培地の構成）
図１乃至図３を用いて、本発明の実施形態に係る細胞培養用培地の構成を説明する。ここで、図１は、本発明の実施形態に係る細胞の培養結果の一例を説明する説明図である。図２は、本発明の実施形態に係る細胞の培養結果の一例を説明する説明図である。図３は、培養した細胞の一例を説明する説明図である。なお、図１等に示す例は一例であり、本発明は図１等に示す例に限定されるものではない。
【００１４】
本発明に係る細胞培養用培地は、細胞を培養するときに、細胞を配置、支持する液体である。本発明に係る細胞培養用培地は、紅茶から浸出した紅茶浸出エキスを基礎培地（細胞培養に使われる培地で、細胞の維持と増殖に必要な最低限の成分を含んだもの）に添加して生成する。
【００１５】
紅茶浸出エキスは、本実施形態では、摂氏２０度から２５度の水に紅茶の茶葉を浸出したときの浸出液とする。本発明に係る細胞培養用培地は、基礎培地に紅茶浸出エキスを好ましくは０．０１重量パーセント〜０．００１重量パーセント添加して生成する。これにより、本発明に係る細胞培養用培地は、熱湯で浸出した場合と比較して、渋み成分となるタンニンなどの浸出を低減し、高濃度の渋み成分が影響する細胞への障害を低減することができる。また、本発明に係る細胞培養用培地は、熱湯で浸出した場合と比較して、常温水出しにおける浸出によって、渋み成分の浸出が抑えられ、紅茶のうま味として称されるテアニンを多く含む紅茶浸出エキスを浸出することができる。
【００１６】
本発明に係る細胞培養用培地に添加する紅茶浸出エキスは、たとえば（１）クリーンベンチ（クリーンルーム）内にて、常温（摂氏２０度から２５度）の精製水に茶葉を６時間漬け置き（静置）する方法（以下、「静置浸出」という）、（２）クリーンベンチ内にて、常温（摂氏２０度から２５度）の精製水に茶葉を入れたビーカー内を６時間回転させながら浸出する方法（以下、「回転浸出」という）、などを利用することができる。また、本発明に係る細胞培養用培地に添加する紅茶浸出エキスにおいて、浸出させる茶葉と水の量は、茶葉１ｇに対し水１０ｍＬとしてもよい。なお、通常、飲料用としては１〜２ｇに対し１００ｍＬの熱水で抽出されることが多い。茶葉は、たとえば雲南紅茶の茶葉を利用することができる。浸出した紅茶浸出エキスは、０．２２マイクロメータのフィルターを通して濾過滅菌をしてもよい。浸出した紅茶浸出エキスは、短期間の保存の場合は冷蔵庫（摂氏４度以下）で保存をしてもよいし、長期間の保存の場合は凍結保存（摂氏マイナス２０度からマイナス８０度）で保存をしてもよい。
【００１７】
紅茶には植物ポリフェノールが多く含まれる。ポリフェノールには、動脈硬化のリスク低減などの生活習慣病を防ぐといった効果も発見されている。ポリフェノールは、種類によっては癌細胞の増殖抑制効果もあることが報告されている。また、茶葉内に含まれるカテキン、テアフラビンには活性酸素除去効果があることが報告されている。紅茶浸出エキス（生薬由来成分として）は、生体に対する安全性が確立されていることもあり、今までに食料・飲料品、飼料など多くの分野で（経口摂取という利用法で）利用されてきた。本発明は、紅茶由来（つまりは生薬由来成分）を添加した培地で  細胞培養した場合において、脂肪由来間葉系幹細胞に対する増殖促進、分化促進又は分化抑制することを発見し、その効果を利用するものである。本発明に係る細胞培養用培地によれば、紅茶浸出エキス（環境に優しい生薬由来成分であり、環境に優しいアニマルフリー）を用いて、特定の細胞に対する増殖促進することができ、それらの細胞種に与えるための添加剤として紅茶浸出エキスを使用することができる。
【００１８】
熱湯浸出による浸出液を添加した培地による幹細胞培養では、細胞増殖が抑制される。これは浸出温度が高いほど、浸出液における旨味成分（アミノ酸類など）の含有量は多くなり、同様に渋み・苦味成分（タンニンやカフェインなどのポリフェノール群）の含有量も多くなるためである。一方で、常温浸出においては、渋み・苦味成分の旨味成分に対する含有比率は、熱湯浸出に比べ小さい。本発明に係る細胞培養用培地に添加する紅茶浸出エキスは、常温（たとえば摂氏２０度から２５度）で浸出することができ、茶葉の破砕をせず、仕入れた茶葉の状態のまま使用することができるので、必要以上の複雑な工程を要さない。また、本発明に係る細胞培養用培地に添加する紅茶浸出エキスは、細胞培養における培地に生薬由来成分として紅茶の浸出液（紅茶浸出エキス）を添加して培養を行う。これにより、本発明に係る細胞培養用培地は、細胞（たとえば脂肪由来間葉系幹細胞）の増殖を促進させることができる。
【００１９】
本発明によれば、患者（消費者）に対して親しみのある資源（紅茶）で効果を得られることができ、商業利用に向けて（親しみのあるもの、嗜好性飲料であること、知られた名前・商品であるので）アピールし易く、使用し易く、販売し易い可能性が見いだすことができた。また、本発明によれば、細胞培養における培養効率を向上することができ、分化促進や抑制に寄与することができる。また、本発明によれば、今まで行われてこなかった種類の細胞に対して紅茶浸出エキスを使用することができ、実際にその効果を確認できた。
【００２０】
図１に、本発明の実施形態に係る細胞の培養結果（直径１０ｃｍのディッシュでの４日経過時の細胞数を測定した結果）の一例を示す。図２に、本発明の実施形態に係る細胞の培養結果（直径１０ｃｍのディッシュでの４日経過後の細胞数を測定した結果）の一例を示す。図１および図２の「Ｌｏ」は、紅茶浸出エキスを添加しない場合の培養結果（細胞数）の例である。図１および図２の「Ｌ１」は、回転浸出した紅茶浸出エキスを０．０１重量パーセント添加した場合の培養結果（細胞数）の例である。図２の「Ｌ１ａ」は、回転浸出した紅茶浸出エキスを０．００１重量パーセント添加した場合の培養結果（細胞数）の例である。図１および図２の「Ｌ２」は、静置浸出した紅茶浸出エキスを０．０１重量パーセント添加した場合の培養結果（細胞数）の例である。図２の「Ｌ２ａ」は、静置浸出した紅茶浸出エキスを０．００１重量パーセント添加した場合の培養結果（細胞数）の例である。なお、培養時の環境は、たとえば細胞培養用ペトリ皿またはフラスコに、細切したワルトンゼリーを移動し、培地を加え、インキューベータ内(摂氏３７度、５％ＣＯ２)で培養する環境であってもよい。
【００２１】
図１および図２に示すように、紅茶浸出エキスを添加しない場合（Ｌｏ）と比較して、培養開始から４日経過の時点で、回転浸出した紅茶浸出エキスを０．０１重量パーセント添加した場合（図中のＬ１）の細胞数が多くなった。また、紅茶浸出エキスを添加しない場合（Ｌｏ）と比較して、培養開始から４日経過の時点で、静置浸出した紅茶浸出エキスを０．０１重量パーセント添加した場合（図中のＬ２）の細胞数が多くなった。これにより、本発明に係る紅茶浸出エキスを添加した細胞培養用培地において、培養効率（培養さえる細胞の数の増加率）の向上が確認された。すなわち、本発明に係る紅茶浸出エキスを添加した細胞培養用培地において、紅茶成分が細胞（幹細胞など）の増殖促進および分化抑制することを確認した。
【００２２】
以上のとおり、本発明に係る細胞培養用培地によれば、基礎培地に添加物を添加して培養速度を向上することができる。また、本発明によれば、細胞を効率的に培養することができるので、医療や美容、健康、再生医療などの医薬学分野、生化学分野において大きく貢献できるものである。
【００２３】
図３に、培養した細胞の一例を示す。図３は、脂肪組織由来間葉系幹細胞の例である。脂肪組織由来間葉系幹細胞は多分化能を有し、たとえば骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、神経細胞に分化する。脂肪組織由来間葉系幹細胞は、培養容器底面に生着すると線維芽細胞の形態をとり、増殖する。再生医療では、間葉系幹細胞による治療を目的に、患者から得られた組織片を細胞に単離し、それを拡大培養し、幹細胞移植などに利用されている。培養工程においては、培養効率向上や間葉系幹細胞の分化抑制又は特定の細胞種への分化促進などが求められている。
【００２４】
基礎培地（培養液）は、特に制限されず、あらゆる培地を適用することができる。具体的には、哺乳動物細胞用の基本培地、市販品の幹細胞維持用培養液、昆虫細胞用の基本培地、酵母用培地、細菌用培地、等の液体培地である。基礎培地には、成長を促進させるために血清（添加濃度０．２から１０重量パーセント）を添加しても良い。また、基礎培地は、細胞を継続的に浮遊させる目的及び／又は細胞同士の過度の密着を防ぐ目的で、細胞毒性を有しない高分子化合物が添加されていてもよい。上記目的で基礎培地に添加される高分子化合物は、例えば、培養液の比重を調整する高分子化合物、培養液の粘度を調整する高分子化合物、培養液中で三次元ネットワーク構造を形成する高分子、等である。具体的には、高分子としては、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム、ヒアルロン酸、アルギン酸、カラギーナン、キサンタンガム、ダイユータンガム、デンプン、ペクチン等の多糖類、コラーゲン、ゼラチン等のタンパク質、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン等の合成高分子などである。なお、基礎培地は、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン等の抗生物質；アスコルビン酸、レチノイン酸等のビタミン又はビタミン誘導体；グルコース等の糖源；アミノ酸；無機塩；血清、血清代替物；トランスフェリン等のタンパク質；インスリン等のホルモン；増殖因子；分化抑制因子；２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール等の抗酸化剤；カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン、銅イオン等の金属イオン；などが添加されていてもよい。
【００２５】
本発明において、培養の対象となる細胞は、特に制限されず、幹細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、プロトプラスト、樹立された細胞株、人為的に遺伝子改変が施された細胞、等のあらゆる細胞が対象となり得る。幹細胞は、自己複製能と分化能とを有する細胞であれば特に制限されず、多能性幹細胞でもよく、体性幹細胞でもよい。多能性幹細胞は、自己複製能と、外胚葉、中胚葉および内胚葉のいずれにも分化し得る多分化能とを有する細胞である。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性生殖細胞、胚性癌細胞、多能性成体前駆細胞、成体多能性幹細胞、Ｍｕｓｅ細胞などが挙げられる。体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞などが挙げられる。
【００２６】
培養の対象となる細胞の他の例は、生体を構成する体細胞である。具体的には、リンパ球、好中球、単球、巨核球、マクロファージ、線維芽細胞、基底細胞、ケラチノサイト、上皮前駆細胞、周皮細胞、内皮細胞、脂肪前駆細胞、筋芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、肝実質細胞、膵β細胞、グリア細胞、等が挙げられる。
【００２７】
（２．細胞培養方法）
図４を用いて、本発明に係る細胞培養方法を説明する。ここで、図４は、本発明の実施形態に係る細胞培養方法の一例を説明する説明図である。なお、図４に示す細胞培養方法は一例であり、本発明は図４に示す細胞培養方法に限定されるものではない。
【００２８】
図４に示すように、本発明の実施形態に係る細胞培養方法は、ステップＳ４０１において、先ず、細胞を培養する動作を開始する。細胞培養方法は、例えば培養者、使用者の都合のよいタイミングで、細胞を培養する動作を開始することができる。本発明に係る細胞培養方法は、上記の（１．細胞培養用培地の構成）に記載の細胞培養用培地を用いて、所望の細胞を培養する動作を開始する。その後、本発明に係る細胞培養方法は、ステップＳ４０２に進む。
【００２９】
次に、本発明に係る細胞培養方法は、ステップＳ４０２において、紅茶を浸出して紅茶浸出エキスを生成する（紅茶浸出エキス生成ステップ）。紅茶浸出エキスの生成方法は、上記の（１．細胞培養用培地の構成）に記載の方法を利用することができる。その後、本発明に係る細胞培養方法は、ステップＳ４０３に進む。
【００３０】
次いで、本発明に係る細胞培養方法は、ステップＳ４０３において、例えば培養者、使用者によって、ステップＳ４０２で生成した紅茶浸出エキスを基礎培地に添加する（紅茶浸出エキス添加ステップ）。紅茶浸出エキスの添加方法は、上記の（１．細胞培養用培地の構成）に記載の方法を利用することができる。その後、本発明に係る細胞培養方法は、ステップＳ４０４に進む。
【００３１】
ステップＳ４０４において、本発明に係る細胞培養方法は、ステップＳ４０３で紅茶浸出エキスを添加した基礎培地内に所望の細胞（培養する細胞）を配置する（細胞配置ステップ）。また、本発明に係る細胞培養方法は、配置した細胞を、所定の環境（温度、ＣＯ２濃度、培養時間など）で培養する。なお、所定の環境は、公知の技術を利用することができ、実験、設計、計画などで予め定められた環境とすることができる。なお、細胞の培養は、例えば数日おきに培地の交換を行い、細胞の遊走・成長を促し、細胞の増殖が十分に確認されたら継代を行い、さらに細胞数を増やしてもよい。その後、本発明に係る細胞培養方法は、ステップＳ４０５に進む。
【００３２】
ステップＳ４０５において、本発明に係る細胞培養方法は、細胞を培養する動作を繰り返すか否かを判断する。これにより、本発明に係る細胞培養方法は、所望の個数の細胞を培養することができる。その後、細胞を培養する動作を繰り返すと判断した場合には、本発明に係る細胞培養方法は、ステップＳ４０２またはステップＳ４０３に戻る。細胞を培養する動作を終了すると判断した場合には、本発明に係る細胞培養方法は、図中の「ＥＮＤ」に進み、動作を終了する。
【００３３】
以上のとおり、本発明に係る細胞培養方法によれば、上記の（１．細胞培養用培地の構成）と同様の効果を得ることができる。
【００３４】
（３．培養した細胞および化粧品、医薬品、医薬部外品、飲食品）
本発明は、上記の（１．細胞培養用培地の構成）の細胞培養用培地を用いて培養した細胞、または、上記の（２．細胞培養方法）で培養した細胞であってもよい。また、その細胞を含有する化粧品、医薬品若しくは医薬部外品、飲食品であってもよい。なお、培養した細胞を化粧品、医薬品若しくは医薬部外品または飲食品に加工する方法は、公知の技術を利用することができる。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明は、細胞を培養する医薬品の生産、遺伝子治療、再生医療、免疫療法などの医薬学・生化学分野などにおいて好適に利用することが可能である。
【００３６】
以上のとおり、本発明に係る実施形態について説明したが、本発明は上記の実施形態に限定されるものではない。すなわち、本発明は、請求の範囲に記載の内容に基づいて、様々に変形、変更又はその他任意に改変され得る。
【符号の説明】
【００３７】
Ｌｏ  ：  紅茶浸出エキスを添加していない培養結果
Ｌ１  ：  漬け置きで浸出した紅茶浸出エキスを０．０１重量パーセント添加した培養結果
Ｌ１ａ：  漬け置きで浸出した紅茶浸出エキスを０．００１重量パーセント添加した培養結果
Ｌ２  ：  回転して浸出した紅茶浸出エキスを０．０１重量パーセント添加した培養結果
Ｌ２ａ：  回転して浸出した紅茶浸出エキスを０．００１重量パーセント添加した培養結果
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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