(57)【要約】      （修正有）【課題】アスパルトキナーゼ変異体、前記変異体を含む微生物、及び前記微生物を用いたアスパラギン酸由来Ｌ−アミノ酸又はホモセリン誘導体の生産方法の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列において３７７番目のアミノ酸がＬ−リシン又はＬ−メチオニンに置換されたアスパルトキナーゼ変異体、該変異体をコードするポリヌクレオチド、及び該変異体を含む、アスパラギン酸由来Ｌ−アミノ酸又はそのアミノ酸誘導体を生産するコリネバクテリウム属微生物であって、前記アスパラギン酸由来Ｌ−アミノ酸又はそのアミノ酸誘導体は、リシン、トレオニン、メチオニン、ホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリン、Ｏ−スクシニルホモセリン、イソロイシン及びカダベリンからなる群から選択されるものである、コリネバクテリウム属微生物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列において３７７番目のアミノ酸がＬ−リシン又はＬ−メチオニンに置換されたアスパルトキナーゼ変異体。
【請求項２】
請求項１に記載の変異体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１に記載のアスパルトキナーゼ変異体を含む、アスパラギン酸由来Ｌ−アミノ酸又はそのアミノ酸誘導体を生産するコリネバクテリウム属微生物であって、前記アスパラギン酸由来Ｌ−アミノ酸又はそのアミノ酸誘導体は、リシン、トレオニン、メチオニン、ホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリン、Ｏ−スクシニルホモセリン、イソロイシン及びカダベリンからなる群から選択されるものである、コリネバクテリウム属微生物。
【請求項４】
前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項３に記載の微生物。
【請求項５】
請求項３に記載の微生物を培地で培養するステップと、
前記培養した微生物又は培地からアスパラギン酸由来Ｌ−アミノ酸又はそのアミノ酸誘導体を回収するステップとを含む、
アスパラギン酸由来Ｌ−アミノ酸又はアミノ酸誘導体の生産方法であって、
前記アスパラギン酸由来Ｌ−アミノ酸又はそのアミノ酸誘導体は、リシン、トレオニン、メチオニン、ホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリン、Ｏ−スクシニルホモセリン、イソロイシン及びカダベリンからなる群から選択されるものである、生産方法。
【請求項６】
前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項５に記載の生産方法。
【請求項７】
請求項３に記載の微生物を培地で培養するステップと、
前記培養した微生物又は培地からＯ−アセチルホモセリン又はＯ−スクシニルホモセリンを生産するステップと、
前記Ｏ−アセチルホモセリン又はＯ−スクシニルホモセリンをＬ−メチオニンに変換するステップとを含む、Ｌ−メチオニンの生産方法。
【請求項８】
前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項７に記載の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、アスパルトキナーゼ変異体、前記変異体を含む微生物、及び前記微生物を用いたアスパラギン酸由来Ｌ−アミノ酸又はアミノ酸誘導体の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コリネバクテリウム（Corynebacterium sp.）属微生物、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）は、Ｌ−アミノ酸及びその他の有用物質の生産に多く用いられているグラム陽性微生物である。前記Ｌ−アミノ酸及びその他の有用物質を生産すべく、高効率生産微生物及び発酵工程技術の開発のために様々な研究が行われている。例えば、Ｌ−リシンの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を増加させたり、生合成に不要な遺伝子を除去するなどの標的物質特異的アプローチ方法が主に用いられている（特許文献１）。
【０００３】
一方、Ｌ−アミノ酸のうちＬ−リシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−グリシンは、アスパラギン酸（aspartate，以下、Ａｓｐ）由来アミノ酸であり、Ａｓｐからアスパルトキナーゼ（aspartokinase，以下、ＬｙｓＣ，Ｅ．Ｃ．２．７．２．４）により生成されたアスパルチルリン酸（Aspartyl phosphate，以下、Ａｐｐ）を共通して用いる（図１）。よって、前記アミノ酸を微生物発酵法により生産するために生合成経路で用いられる酵素の活性を一定レベル以上に維持することは必須であり、それについての集中的な研究が行われてきた。
【０００４】
特に、アスパラギン酸由来アミノ酸の生合成経路の最初の酵素として作用するＬｙｓＣは、Ｌ−リシン及びＬ−トレオニンによるフィードバック阻害を受けて活性が調節されることが知られている（非特許文献１）。よって、前記フィードバック阻害に関する出願があったが（特許文献２，３）、アスパラギン酸由来産物の生産能向上のために持続的な研究が依然として求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】韓国登録特許第１０−０８３８０３８号公報
【特許文献２】米国特許第８０６２８６９号明細書
【特許文献３】特許第３４７３０４２号公報
【特許文献４】国際公開第２０１０／０９８６２９号
【特許文献５】韓国登録特許第１０−０９２４０６５号公報
【特許文献６】韓国登録特許第１０−００５７６８４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J Mol Biol. 2007 Apr 27;368(2):521-36. Epub 2007 Feb 20
【非特許文献２】Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444
【非特許文献３】Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277
【非特許文献４】Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453
【非特許文献５】Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)
【非特許文献６】Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990)
【非特許文献７】Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994
【非特許文献８】[CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073
【非特許文献９】Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482
【非特許文献１０】Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)
【非特許文献１１】Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745
【非特許文献１２】Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8
【非特許文献１３】Appl. Microbiol. Biothcenol.(1999) 52:541-545
【非特許文献１４】Appl. Microbiol. Biotechnol. 45, 612-620 (1996)
【非特許文献１５】Appl. Enviro. Microbiol., Dec. 1996, p.4345-4351
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者は、新規なアスパルトキナーゼ変異体を用いると、アスパラギン酸由来Ｌ−アミノ酸又はアミノ酸誘導体の生産が向上することを確認し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本出願は、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアスパルトキナーゼ変異体であって、前記アミノ酸置換は、３７７番目のアミノ酸のＬ−リシン又はＬ−メチオニンへの置換を含むアスパルトキナーゼ変異体を提供することを目的とする。
【０００９】
また、本出願は、前記変異体をコードするポリヌクレオチドを提供することを目的とする。
【００１０】
さらに、本出願は、前記アスパルトキナーゼ変異体を含むか、その活性が強化された、アスパラギン酸由来Ｌ−アミノ酸又はアミノ酸誘導体を生産するコリネバクテリウム属微生物を提供することを目的とする。
【００１１】
さらに、本出願は、前記微生物を培地で培養するステップと、前記培養した微生物又は培地からアスパラギン酸由来Ｌ−アミノ酸又はアミノ酸誘導体を回収するステップとを含む、アスパラギン酸由来Ｌ−アミノ酸又はアミノ酸誘導体の生産方法を提供することを目的とする。
【００１２】
さらに、本出願は、前記微生物を培地で培養するステップと、前記培養した微生物又は培地からアセチルホモセリン又はスクシニルホモセリンを生産するステップと、前記アセチルホモセリン又はスクシニルホモセリンをメチオニンに変換するステップとを含む、メチオニンの生産方法を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００１３】
本出願によるアスパルトキナーゼ変異体を含む微生物は、野生型ＬｙｓＣポリペプチドを含む微生物に比べて、宿主細胞の成長を阻害することなくアスパラギン酸由来Ｌ−アミノ酸又はアスパラギン酸由来産物を高収率で得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】コリネバクテリウム・グルタミカムのアスパラギン酸由来アミノ酸及びアミノ酸誘導体生合成経路を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００１６】
なお、本出願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれの他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本出願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本発明に含まれる。また、以下の具体的な記述に本発明が限定されるものではない。
【００１７】
また、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本発明の特定の態様の多くの等価物を認識し、確認することができるであろう。さらに、このような等価物も本発明に含まれることが意図されている。
【００１８】
前記目的を達成するための本出願の一態様は、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアスパルトキナーゼ変異体であって、前記アミノ酸置換は、３７７番目のアミノ酸の他のアミノ酸への置換を含むアスパルトキナーゼ変異体を提供する。具体的には、本出願は、配列番号１のアミノ酸配列において３７７番目のアミノ酸がＬ−リシン又はＬ−メチオニンに置換されたアスパルトキナーゼ変異体を提供することを目的とする。
【００１９】
本出願における「アスパルトキナーゼ（aspartokinase, aspartic kinase）」とは、アミノ酸であるアスパラギン酸のリン酸化を触媒する酵素であり、「ａｓｐａｒｔａｔｅ ｆａｍｉｌｙ」として知られるＬ−メチオニン、Ｌ−リシン及びＬ−トレオニンの３つの必須アミノ酸の生合成の第１段階に作用する。
【００２０】
本出願におけるアスパルトキナーゼは、「ＬｙｓＣ」や「ＬｙｓＣタンパク質」と混用されてもよい。前記ＬｙｓＣタンパク質は、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋからその配列が得られる。前記ＬｙｓＣタンパク質は、コリネバクテリウム属由来のＬｙｓＣであり、より具体的にはコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであるが、これらに限定されるものではない。また、本出願におけるＬｙｓＣは、配列番号１のアミノ酸配列、又はそれと８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９７％以上の相同性もしくは同一性を有するアミノ酸配列で構成されるポリペプチドであってもよい。さらに、このような相同性又は同一性を有し、前記ポリペプチドに相当する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドも本出願に含まれることは言うまでもない。
【００２１】
本出願におけるＬｙｓＣ（aspartokinase）を確保する方法には、当該分野で周知の様々な方法を適用することができる。その方法の例として、酵素発現に通常広く用いられるコリネバクテリウム属微生物から酵素を高効率で確保できるようにするコドン最適化をはじめとする遺伝子合成技術や、微生物の大量ゲノム情報に基づいた生物情報学的方法による有用酵素資源のスクリーニング方法により確保することができるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
本出願における「変異体（variant）」とは、少なくとも１つのアミノ酸の保存的置換（conservative substitution）及び／又は改変（modification）により前記列挙した配列（the recited sequence）とは異なるが、前記ポリペプチドの機能（functions）又は特性（properties）が維持されるポリペプチドを意味する。変異型ポリペプチドは、数個のアミノ酸置換、欠失又は付加により識別される配列（identified sequence）とは異なる。このような変異型は、一般に前記ポリペプチド配列の１つを改変し、前記改変したポリペプチドの特性を評価することにより識別することができる。すなわち、変異型の能力は、本来のタンパク質（native protein）より増加するか、変わらないか又は減少する。このような変異型は、一般に前記ポリペプチド配列の１つを改変し、改変したポリペプチドの反応性を評価することにより識別することができる。また、一部の変異型には、Ｎ末端リーダー配列や膜貫通ドメイン（transmembrane domain）などの少なくとも１つの部分が除去された変異型も含まれる。他の変異型には、成熟タンパク質（mature protein）のＮ及び／又はＣ末端から一部分が除去された変異型も含まれる。
【００２３】
本出願における「保存的置換（conservative substitution）」とは、あるアミノ酸が類似した構造的及び／又は化学的性質を有する他のアミノ酸に置換されることを意味する。前記変異型は、少なくとも１つの生物学的活性を依然として有する状態で、例えば少なくとも１つの保存的置換を有する。このようなアミノ酸置換は、一般に残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性（amphipathic nature）における類似性に基づいて発生し得る。例えば、正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン及びヒスチジンが挙げられ、負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、グルタミン酸及びアスパラギン酸が挙げられ、芳香族アミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンが挙げられ、疎水性アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンが挙げられる。通常、保存性置換は、生成されたポリペプチドの活性にほとんど又は全く影響を及ぼさない。
【００２４】
また、変異型は、ポリペプチドの特性と二次構造に最小限の影響を及ぼすアミノ酸の欠失又は付加を含んでもよい。例えば、ポリペプチドは、翻訳と同時に（co-translationally）又は翻訳後に（post-translationally）タンパク質の転移（transfer）に関与するタンパク質のＮ末端のシグナル（又はリーダー）配列に結合されてもよい。また、前記ポリペプチドは、ポリペプチドを確認、精製又は合成できるように、他の配列又はリンカーに結合されてもよい。
【００２５】
例えば、本出願におけるアスパルトキナーゼ変異体とは、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）微生物由来の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するＬｙｓＣの変異型を意味し、配列番号１で表されるアミノ酸配列に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異体が含まれてもよい。具体的には、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から３７７番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されたものを含むポリペプチドであってもよい。前記「他のアミノ酸」は、３７７番目のアミノ酸であるＬ−ロイシンを除く他のアミノ酸であればいかなるものでもよい。具体的には、代表的な例として、前記３７７番目のアミノ酸残基は、リシン（lysine）又はメチオニン（methionine）に置換することができる。Ｌ−リシンは、塩基性アミノ酸の一例であり、塩基性アミノ酸は、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン及びＬ−ヒスチジンから選択されるいずれかであってもよい。Ｌ−メチオニンは、非極性アミノ酸の一例であり、非極性アミノ酸は、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−システイン、Ｌ−グリシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−トリプトファン及びＬ−バリンから選択されるいずれかであってもよい。しかし、これらに限定されるものではない。
【００２６】
本出願における「アスパルトキナーゼ変異体」は、「変異したアスパルトキナーゼ」や「変異したＬｙｓＣ」と混用されてもよい。
【００２７】
このようなアスパルトキナーゼ変異体は、配列番号１のアスパルトキナーゼの活性を有するポリペプチドに比べてアスパルトキナーゼ活性が強化された特徴を有する。
【００２８】
また、本出願に「特定配列番号で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質」と記載されていても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるペプチドと同一又は相当する活性を有するものであれば、一部の配列が欠失、改変、置換、保存的置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であっても本出願に用いられることは言うまでもない。具体的には、当該配列番号のアミノ酸配列の前後へのタンパク質の機能を変更しない配列の付加や、自然に発生し得る突然変異、保存的置換もしくはその同義突然変異（synonymous mutation）を除くものではなく、そのような配列の付加や突然変異を有するものも本願に含まれることは自明である。本出願における「相同性（homology）」又は「同一性（identity）」とは、２つの与えられたアミノ酸配列又は塩基配列が互いに関連する程度を意味し、百分率で表される。本出願における「相同性」及び「同一性」は、しばしば相互交換的に用いられる。
【００２９】
保存されている（conserved）ポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列相同性又は同一性は標準的な配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に用いられる。実質的には、相同性を有するか（homologous）又は同じ（identical）配列は、中程度又は高いストリンジェントな条件（stringent conditions）下において、一般に配列全体又は全長の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上ハイブリダイズする。そのハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドがコドンの代わりに縮退コドンを有するようにするものであってもよい。
【００３０】
任意の２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、例えば非特許文献２のようなデフォルトパラメータと「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの公知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定することができる。あるいは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite，非特許文献３）（バージョン５．０．０又はそれ以降のバージョンが好ましい）で行われるように、ニードルマン＝ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献４）を用いて決定することができる（ＧＣＧプログラムパッケージ（非特許文献５）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（非特許文献６，７，８）を含む）。例えば、国立生物工学情報センターのＢＬＡＳＴ又はＣｌｕｓｔａｌ Ｗを用いて相同性、類似性又は同一性を決定することができる。
【００３１】
ポリヌクレオチド又はポリペプチドの相同性、類似性又は同一性は、例えば非特許文献９に開示されているように、非特許文献４などのＧＡＰコンピュータプログラムを用いて、配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち短いものにおける記号の総数で、類似する配列記号（すなわち、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を割った値と定義している。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）一進法比較マトリクス（同一性は１、非同一性は０の値を含む）及び非特許文献１０に開示されているように、非特許文献１１の加重比較マトリクス（又はＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン)置換マトリクス）と、（２）各ギャップに３．０のペナルティ、及び各ギャップの各記号に追加の０．１０ペナルティ（又はギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）と、（３）末端ギャップに無ペナルティとを含んでもよい。よって、本願における「相同性」又は「同一性」は、配列間の関連性（relevance）を示す。
【００３２】
本出願の他の態様は、前記アスパルトキナーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００３３】
前記「アスパルトキナーゼ変異体」については前述した通りである。
【００３４】
本出願における「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単量体（monomer）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチド重合体（polymer）であり、所定の長さより長いＤＮＡ又はＲＮＡ鎖であり、より具体的には前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド断片を意味する。
【００３５】
前記アスパルトキナーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアスパルトキナーゼ変異体であって、前記アミノ酸置換は、３７７番目のアミノ酸残基の他のアミノ酸への置換を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってもよい。具体的には、代表的な例として、配列番号１のアミノ酸配列において３７７番目のアミノ酸残基がＬ−リシン又はＬ−メチオニンに置換されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってもよい。より具体的には、前記ポリヌクレオチドは、配列番号３又は５からなるアミノ酸配列を有するｌｙｓＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよい。例えば、配列番号４又は６の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。前記ポリヌクレオチドは、コドンの縮退（degeneracy）により、前記タンパク質を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮し、コード領域から発現するタンパク質のアミノ酸配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。よって、コドン縮退（codon degeneracy）により、配列番号３又は５のアミノ酸配列からなるポリペプチド又はそれと相同性又は同一性を有するポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチドも含まれることは言うまでもない。あるいは、公知の遺伝子配列から調製されるプローブ（probe）、例えば前記ポリヌクレオチド配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることにより、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の活性を有するタンパク質をコードする配列であればいかなるものでもよい。
【００３６】
前記「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献（例えば、J. Sambrook et al.，）に具体的に記載されている。例えば、相同性又は同一性の高い遺伝子同士、８０％以上、８５％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９７％以上、特に具体的には９９％以上の相同性又は同一性を有する遺伝子同士をハイブリダイズし、それより相同性又は同一性の低い遺伝子同士をハイブリダイズしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度において、１回、具体的には２回〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００３７】
ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションの厳格さに応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられる。例えば、ＤＮＡにおいて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。よって、本出願には、実質的に類似した核酸配列だけでなく、全配列に相補的な単離された核酸断片が含まれてもよい。
【００３８】
具体的には、相同性又は同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーションステップが行われるハイブリダイゼーション条件と前述した条件を用いて検知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃又は６５℃であってもよいが、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節される。
【００３９】
ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切な厳格さはポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野で公知である（非特許文献１２参照）。
【００４０】
本出願のさらに他の態様は、前記アスパルトキナーゼ変異体を含む宿主細胞、及び前記アスパルトキナーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された微生物を提供する。具体的には、本出願は、前記アスパルトキナーゼ変異体を含む、アスパラギン酸由来Ｌ−アミノ酸又はアミノ酸誘導体を生産するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
【００４１】
前記本出願のアスパルトキナーゼ変異体を含む微生物は、野生型又は非改変微生物に比べてアスパルトキナーゼの活性が強化された特徴を有する。
【００４２】
本出願における「活性の強化」とは、タンパク質の活性が導入されるか、微生物が有する内在性活性又は改変前の活性に比べて活性が向上することを意味する。前記活性の「導入」とは、微生物が本来持っていなかった特定タンパク質の活性が自然に又は人為的に現れるようにすることを意味する。「内在性活性」とは、自然要因又は人為的要因により遺伝的に変異して微生物の形質が変化する場合に、形質変化の前に親菌株が本来有していた特定タンパク質の活性を意味する。
【００４３】
本出願における「ベクター」とは、好適な宿主内で標的タンパク質を発現させることができるように、好適な調節配列に作動可能に連結された前記標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ産物を意味する。前記調節配列には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれる。ベクターは、好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製及び機能することができ、ゲノム自体に組み込まれる。
【００４４】
本出願に用いられるベクターは、宿主細胞内で発現可能なものであれば特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知の任意のベクターを用いることができる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４５】
本出願に使用可能なベクターは、特に限定されるものではなく、公知の発現ベクターを用いることができる。また、細胞内染色体挿入用ベクターにより、染色体内に標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば相同組換えにより行うことができるが、これに限定されるものではない。前記染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択、すなわち標的核酸分子が挿入されたか否かを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、表面タンパク質の発現などの選択可能表現型を付与するマーカーが用いられる。選択剤（selective agent）で処理した環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、異なる表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。
【００４６】
本出願における「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、それらが全て含まれるものである。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡやＲＮＡを含むものである。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含んでもよい。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクター形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。前記形質転換する方法は、核酸を細胞内に導入するいかなる方法であってもよく、当該分野において公知であるように、宿主細胞に適した標準技術を選択して行うことができる。例えば、エレクトロポレーション（electroporation）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ4）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）沈殿、微量注入法（microinjection）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、カチオン性リポソーム法、酢酸リチウム−ＤＭＳＯ法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
また、前記「作動可能に連結」されたものとは、本出願の標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するプロモーター配列と前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されたものを意味する。作動可能な連結は当該技術分野の公知の遺伝子組換え技術を用いて作製することができ、部位特異的ＤＮＡ切断及び連結は当該技術分野の切断及び連結酵素などを用いて作製することができるが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
本出願における「アスパラギン酸由来Ｌ−アミノ酸又はアミノ酸誘導体を生産する微生物」とは、自然にアスパラギン酸由来Ｌ−アミノ酸又はアミノ酸誘導体生産能を有する微生物、又はアスパラギン酸由来Ｌ−アミノ酸又はアミノ酸誘導体の生産能のない親菌株にアスパラギン酸由来Ｌ−アミノ酸又はアミノ酸誘導体の生産能が付与された微生物を意味する。
【００４９】
本出願における「アスパラギン酸由来Ｌ−アミノ酸又はアミノ酸誘導体」とは、アスパラギン酸（Aspartic acid）を前駆体として生合成される物質を意味し、「アスパラギン酸由来産物」と混用されてもよい。前記「アミノ酸誘導体」は、Ｌ−アミノ酸から生産される物質、及びＬ−アミノ酸の前駆体を含む意味で用いられ、アスパラギン酸を前駆体として生合成過程で生産される物質であればいかなるものでもよい。より具体的には、アセチルリン酸を共通して用いて合成される物質であればいかなるものでもよい。例えば、Ｌ−リシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−グリシン、ホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリン、Ｏ−スクシニルホモセリン、Ｏ−ホスホホモセリン、Ｌ−イソロイシン及びカダベリンであるが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
カダベリンは、アスパラギン酸を前駆体として直接生合成されてもよく、リシンデカルボキシラーゼによりリシンから生成されてもよい。前記Ｌ−メチオニンは、アスパラギン酸を前駆体として直接生合成されてもよく、Ｏ−アセチルホモセリン、Ｏ−スクシニルホモセリンから変換されて生成されてもよい。
【００５１】
本出願における「アスパラギン酸（Aspartic acid）」は、Ａｓｐ又はＤと略され、アスパテートともいい、タンパク質の生合成に用いられるα−アミノ酸である。他の全てのアミノ酸と同様に、アミノ基とカルボキシ基とを含む。一般に、アスパラギン酸は、アスパルトキナーゼ（ＬｙｓＣ）によりアスパルチルリン酸（Aspartyl phosphate）が生成され、その後生体内でＬ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシンなどに変換される。
【００５２】
前記アスパラギン酸由来産物の生合成を強化するために、本出願のアスパルトキナーゼ変異体を用いることができる。例えば、Ｌ−リシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−グリシン、ホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリン、Ｏ−スクシニルホモセリン、Ｏ−ホスホホモセリン、Ｌ−イソロイシン及びカダベリンの生合成を強化するために、本出願のアスパルトキナーゼ変異体を導入したり、その活性を強化することができる。さらに、特定タンパク質の活性を導入又は強化したり、特定タンパク質の活性を不活性化することにより、アスパラギン酸由来産物の生産能を一層向上させることができる。
【００５３】
前記特定タンパク質の活性を導入、強化、不活性化する方法は、微生物が有する特徴に応じて、当該分野で公知の好適な方法により行うことができる。
【００５４】
前記アスパラギン酸由来産物、Ｌ−アミノ酸又はアミノ酸誘導体を生産する微生物は、本出願のアスパラギン酸変異体をはじめとする、アスパラギン酸由来「アミノ酸」又はアミノ酸誘導体を生産する微生物であればいかなるものでもよい。具体的な例として、エシェリキア（Escherichia）属、セラチア（Serratia）属、エルウィニア（Erwinia）属、エンテロバクター（Enterobacteria）属、サルモネラ（Salmonella）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属などの微生物菌株が挙げられる。具体的には、コリネバクテリウム属微生物が挙げられ、より具体的な例としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５５】
本出願のさらに他の態様は、前記微生物を培養するステップと、培養した微生物又は培養培地からアスパラギン酸由来Ｌ−アミノ酸又はアミノ酸誘導体を回収するステップとを含む、アスパラギン酸由来Ｌ−アミノ酸又はアミノ酸誘導体を生産する方法を提供する。
【００５６】
前記アスパラギン酸由来Ｌ−アミノ酸又はアミノ酸誘導体を生産する方法は、当該技術分野で公知の最適化された培養条件及び酵素活性条件において当業者が容易に決定することができる。具体的には、前記微生物を培養するステップは、特に限定されるものではないが、公知の回分培養法、連続培養法、流加培養法などにより行うことができる。ここで、培養条件は、特にこれらに限定されるものではないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニア）又は酸性化合物（例えば、リン酸又は硫酸）を用いて適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜９、具体的にはｐＨ６〜８、最も具体的にはｐＨ６．８）に調節し、酸素又は酸素含有ガス混合物を培養物に導入して好気性条件を維持する。培養温度は２０〜４５℃、具体的には２５〜４０℃に維持し、約１０〜１６０時間培養するが、これらに限定されるものではない。前記培養により生産されたアスパラギン酸由来アミノ酸又はアミノ酸誘導体は、培地中に分泌されるか、又は細胞内に残留する。
【００５７】
また、用いられる培養用培地は、炭素供給源として糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラセス、デンプン及びセルロース）、油脂及び脂肪（例えば、大豆油、ヒマワリ油、落花生油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセリン及びエタノール）、有機酸（例えば、酢酸）などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粕及びウレア）、無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、それらに相当するナトリウム含有塩などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。また、培地は、その他金属塩（例えば、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄）、アミノ酸、ビタミンなどの必須成長促進物質を含んでもよい。
【００５８】
本出願の前記培養ステップで生産されたアスパラギン酸由来アミノ酸又はアミノ酸誘導体を回収する方法は、培養方法に応じて、当該分野で公知の好適な方法を用いて培養液から目的とするアミノ酸を回収することができる。例えば、遠心分離、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化、ＨＰＬＣなどが用いられ、当該分野で公知の好適な方法を用いて培地又は微生物から目的とするアスパラギン酸由来アミノ酸又はアミノ酸誘導体を回収することができる。
【００５９】
また、前記回収ステップは、精製工程をさらに含んでもよく、当該分野で公知の好適な方法を用いて行うことができる。
【００６０】
本出願のさらに他の態様は、前記微生物を培養するステップと、前記培養した微生物又は培養培地からＯ−アセチルホモセリン又はＯ−スクシニルホモセリンを生産するステップと、Ｏ−アセチルホモセリン又はＯ−スクシニルホモセリンをＬ−メチオニンに変換するステップとを含む、Ｌ−メチオニンを生産する方法を提供する。
【００６１】
具体的には、前記「Ｌ−メチオニンに変換するステップ」は、Ｏ−アセチルホモセリン又はＯ−スクシニルホモセリンとＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ又はＯ−スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼを硫化物の存在下で反応させるステップを含む。前記「Ｏ−アセチルホモセリン又はＯ−スクシニルホモセリン」は、本出願の前記微生物が生産したＯ−アセチルホモセリン又はＯ−スクシニルホモセリンを含有する発酵液又はそれを精製した形態であってもよい。また、前記「硫化物」としては、例えばメチルメルカプタンが挙げられ、前記メチルメルカプタンとは、液状のメチルメルカプタンナトリウム（sodium methyl mercaptan, ＣＨ３Ｓ−Ｎａ）の形態、ガス又は液状のメチルメルカプタン（ＣＨ３ＳＨ）だけでなく、特許文献４に開示された形態でジメチルスルフィド（DMS, Dimethylsulfide）を含むメチルメルカプタンなど、硫黄原子を提供できる形態を含むメチルメルカプタン誘導体の全てを意味する。また、前記「Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ又はＯ−スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼ」は、それを生産する微生物の発酵液又はそれを精製した形態であってもよい。
【００６２】
前記Ｌ−メチオニンを生産する方法は、当該技術分野で公知の最適化された培養条件及び酵素活性条件において当業者が容易に決定することができる。具体的な培養方法及び培地は前述した通りである。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例を挙げて本出願をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本出願を例示的に説明するためのものであり、本出願がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６４】
ｌｙｓＣ変異導入菌株の作製
アスパルトキナーゼタンパク質の構造モデリングを用いて野生型より活性が強化される変異を選択し、次のように前記変異を導入した菌株を作製した。
【００６５】
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２（以下、ＷＴ）由来のアスパルトキナーゼ（配列番号１）をコードするｌｙｓＣ遺伝子（配列番号２）を対象に、３７７番目のアミノ酸を変異位置に選定し、置換するための他のアミノ酸として代表的な塩基性アミノ酸であるＬ−リシンと、代表的な非極性アミノ酸であるＬ−メチオニンを選定した。
【００６６】
前記変異導入ベクターを作製するために、変異位置を中心に、５’上端部を増幅するためのプライマー対（配列番号７及び８、又は配列番号７及び１０）、及び３’下端部を増幅するためのプライマー対（配列番号９及び１２、又は配列番号１１及び１２）を考案した（表１）。配列番号７及び１２のプライマーは、各末端にＸｂａＩ制限酵素部位（下線表示）を挿入し、配列番号８及び９のプライマー対、又は配列番号１０及び１１のプライマー対は、交差するように考案した部位にヌクレオチド置換変異（下線表示）が位置するようにした。
【００６７】
【表１】
2020202834.tif 000002
【００６８】
ＷＴの染色体を鋳型とし、配列番号７及び８、配列番号７及び１０、配列番号９及び１２、又は配列番号１１及び１２のプライマーを用いてＰＣＲを行った。９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０回繰り返し、その後７２℃で７分間の重合反応を行った。その結果、ｌｙｓＣ遺伝子の変異を中心に、５’上端部の５０９ｂｐのＤＮＡ断片と、３’下端部の５２０ｂｐのＤＮＡ断片がそれぞれ得られた。
【００６９】
増幅された２つのＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号７及び１２のプライマーでＰＣＲを行った。９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０回繰り返し、その後７２℃で７分間の重合反応を行った。その結果、３７７番目のロイシンがリシンに置換されたアスパルトキナーゼ変異体（配列番号３）をコードするｌｙｓＣ遺伝子の変異（配列番号４）を含む１０１１ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。また、３７７番目のアミノ酸位置の重要性を確認するために、３７７番目のロイシンがメチオニンに置換されたアスパルトキナーゼ変異体（配列番号５）をコードするｌｙｓＣ遺伝子の変異（配列番号６）を含む１０１１ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
【００７０】
コリネバクテリウム・グルタミカム内で複製不可能なｐＤＺベクター（特許文献５）と１０１１ｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩで処理し、次にＤＮＡリガーゼを用いて連結し、その後クローニングすることによりプラスミドを得た。これをｐＤＺ−ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）及びｐＤＺ−ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｍ）と命名した。
【００７１】
ｐＤＺ−ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）及びｐＤＺ−ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｍ）ベクターをそれぞれＷＴに電気パルス法（非特許文献１３）で導入し、その後カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地から形質転換菌株を得た。２次組換え過程（cross-over）で染色体上に挿入されたＤＮＡ断片によりｌｙｓＣ遺伝子にヌクレオチド変異が導入された菌株であるＷＴ：：ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）及びＷＴ：：ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｍ）を得た。これをコリネバクテリウム・グルタミカムＣＡ０１−２３０７及びＣＡ０１−２３０８とそれぞれ命名した。ＣＡ０１−２３０７及びＣＡ０１−２３０８は、２０１７年３月２９日付けでブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１２０００Ｐ及びＫＣＣＭ１２００１Ｐが付与された。
【実施例２】
【００７２】
ｌｙｓＣ変異導入菌株のアスパラギン酸由来アミノ酸生産能の確認
前記実施例で得られたＣＡ０１−２３０７及びＣＡ０１−２３０８菌株並びにＷＴ菌株のアスパラギン酸由来主要アミノ酸生産能を比較するために、次の方法で培養して培養液成分を分析した。
【００７３】
種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３７℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３７℃、２００ｒｐｍで２４時間振盪培養した。ＨＰＬＣを用いてＬ−アスパラギン酸、アスパラギン酸由来の代表的なアミノ酸であるＬ−リシン及びＬ−トレオニンの濃度を分析した。分析した濃度を表２に示す。
【００７４】
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ2ＰＯ4 ４ｇ，Ｋ2ＨＰＯ4 ８ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース１００ｇ，（ＮＨ4）2ＳＯ4 ４０ｇ，大豆タンパク質２．５ｇ，コーンスティープソリッド（Corn Steep Solids）５ｇ，尿素３ｇ，ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド３０００μｇ，ＣａＣＯ3 ３０ｇ（蒸留水１リットル中）
【００７５】
【表２】
2020202834.tif 000003
【００７６】
アスパラギン酸由来アミノ酸濃度分析の結果、ｌｙｓＣ遺伝子変異を導入すると、ＷＴと比較して、特にＬ−リシン濃度が急激に増加し、Ｌ−アスパラギン酸及びＬ−トレオニン濃度が増加するパターンが確認された。これらの結果に基づいて、ＣＡ０１−２３０７及びＣＡ０１−２３０８菌株並びにＷＴ菌株のリシン生産能を詳細に比較するために、前記と同様に培養し、培養液中のＬ−リシン濃度を前記と同様に分析した（表３）。
【００７７】
【表３】
2020202834.tif 000004
【００７８】
Ｌ−リシン濃度分析の結果、従来の評価通り、ＷＴ菌株に比べて、ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）変異を含むＣＡ０１−２３０７のＬ−リシン生産能が大幅に向上することが確認された。また、ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｍ）変異を含むＣＡ０１−２３０８のＬ−リシン生産能も、ＷＴ菌株に比べて向上することが確認された。これらの結果から、本出願で選択した３７７番目のロイシンがリシンに置換されたアスパルトキナーゼ変異体（配列番号３）と３７７番目のロイシンがメチオニンに置換されたアスパルトキナーゼ変異体（配列番号５）により、アスパラギン酸由来アミノ酸のうちＬ−リシンの生産能が大幅に向上することが確認された。
【実施例３】
【００７９】
Ｌ−トレオニン強化菌株の作製及びＬ−トレオニン生産能の確認
実施例２の結果に基づいて、リシン生産能が相対的に高いｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）変異導入によるＬ−トレオニン生産能の変化を明確に確認するために、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン及びＨｏｍｏｓｅｒｉｎｅ誘導体生合成経路の共通の中間体であるホモセリン（homoserine）を生産するホモセリンデヒドロゲナーゼ（homoserin dehydrogenase）をコードする遺伝子に変異を導入した。具体的には、実施例１で作製したＣＡ０１−２３０７菌株に公知のｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）変異（非特許文献１４）が導入された菌株を作製した。また、その対照群として、ＷＴにｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）変異が導入された菌株も作製した。ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）を導入するベクターを作製するために、ＷＴ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１３及び１４、配列番号１５及び１６を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０回繰り返し、その後７２℃で７分間の重合反応を行った。
【００８０】
その結果、ｈｏｍ遺伝子の変異を中心に、５’上端部の２２０ｂｐのＤＮＡ断片と、３’下端部の２２０ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。この２つのＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔを鋳型とし、配列番号１３及び１６を用いてＰＣＲを行った。９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０回繰り返し、その後７２℃で７分間の重合反応を行った。その結果、ｈｏｍ遺伝子の変異を含む４４０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
【００８１】
【表４】
2020202834.tif 000005
【００８２】
実施例１において用いたｐＤＺベクターと４４０ｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩで処理し、次にＤＮＡリガーゼを用いて連結し、その後クローニングすることによりプラスミドを得た。これをｐＤＺ−ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）と命名した。
【００８３】
ｐＤＺ−ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）ベクターをＷＴ及びＣＡ０１−２３０７菌株に電気パルス法（非特許文献１３）で導入し、その後カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含む選択培地から形質転換菌株を得た。２次組換え過程（cross-over）で染色体上に挿入されたＤＮＡ断片によりｈｏｍ遺伝子にヌクレオチド変異が導入された菌株であるＷＴ：：ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）及びＣＡ０１−２３０７：：ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）を得た。得られたＷＴ：：ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）及びＣＡ０１−２３０７：：ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）のトレオニン生産能を比較するために、実施例２と同様に培養し、培養液中のトレオニン濃度を分析した。
【００８４】
【表５】
2020202834.tif 000006
【００８５】
Ｌ−トレオニン濃度分析の結果、ｌｙｓＣ変異を含む菌株において、Ｌ−トレオニン生産能が急激に向上することが確認された（表５）。
【実施例４】
【００８６】
Ｌ−イソロイシン強化菌株の作製及びＬ−イソロイシン生産能の比較
ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）変異導入によりＬ−イソロイシン生産能に及ぼす効果を確認するために、公知のトレオニンデヒドラターゼ（L-threonine dehydratase）をコードする遺伝子ｉｌｖＡ（Ｖ３２３Ａ）変異（非特許文献１５）発現を強化するベクターを作製した。
【００８７】
ｉｌｖＡ遺伝子を対象に、変異導入ベクターを作製するために、変異位置を中心に、５’上端部を増幅するためのプライマー対（配列番号１７及び１８）、及び３’下端部を増幅するためのプライマー対（配列番号１９及び２０）を考案した。配列番号１７及び２０のプライマーは、各末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位（下線表示）を挿入し、配列番号１８及び１９のプライマーは、交差するように考案した部位にヌクレオチド置換変異（下線表示）が位置するようにした。
【００８８】
【表６】
2020202834.tif 000007
【００８９】
ＷＴの染色体を鋳型とし、配列番号１７及び１８、配列番号１９及び２０のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０回繰り返し、その後７２℃で７分間の重合反応を行った。その結果、ｉｌｖＡ遺伝子の変異を中心に、５’上端部の６２７ｂｐのＤＮＡ断片と、３’下端部の６０８ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。
【００９０】
増幅された２つのＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号１７及び２０のプライマーでＰＣＲを行った。９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０回繰り返し、その後７２℃で７分間の重合反応を行った。その結果、３２３番目のバリンがアラニンに置換されたＩｌｖＡ変異体をコードするｉｌｖＡ遺伝子の変異を含む１２１７ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
【００９１】
ｐＥＣＣＧ１１７（特許文献６）ベクターと１０１１ｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで処理し、次にＤＮＡリガーゼを用いて連結し、その後クローニングすることによりプラスミドを得た。これをｐＥＣＣＧ１１７−ｉｌｖＡ（Ｖ３２３Ａ）と命名した。
【００９２】
ｐＥＣＣＧ１１７−ｉｌｖＡ（Ｖ３２３Ａ）ベクターを実施例３で作製したＷＴ：：ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）及びＣＡ０１−２３０７：：ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）菌株に電気パルス法で導入し、その後カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含む選択培地に塗抹して形質転換株を得た。
【００９３】
実施例２のフラスコ培養法と同様に培養し、培養液中のＬ−イソロイシン濃度を分析した（表７）。
【００９４】
【表７】
2020202834.tif 000008
【００９５】
Ｌ−イソロイシン濃度分析の結果、ｌｙｓＣ変異を含む菌株において、Ｌ−イソロイシン生産能が大幅に向上することが確認された。
【実施例５】
【００９６】
Ｏ−アセチル−ホモセリン強化菌株の作製及びＯ−アセチル−ホモセリン生産能の比較
ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）変異導入によりＯ−アセチル−ホモセリンの生産に及ぼす影響を把握するために、Ｏ−アセチル−ホモセリン分解経路であるシスタチオニンγ−シンターゼをコードするｍｅｔＢ遺伝子とＯ−アセチルホモセリン（チオール）−リアーゼをコードするｍｅｔＹ遺伝子を欠損させ、Ｏ−アセチル−ホモセリン生合成酵素であるホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードするｍｅｔＸ遺伝子を過剰発現させることにより、Ｏ−アセチル−ホモセリン生産菌株を作製した。まず、ｍｅｔＢ遺伝子を欠損させるために、ＷＴ由来のｍｅｔＢ遺伝子の塩基配列情報に基づいて、ｍｅｔＢ遺伝子の５’上端部を増幅するためのプライマー対（配列番号２１及び２２）、及び３’下端部を増幅するためのプライマー対（配列番号２３及び２４）を考案した。
【００９７】
【表８】
2020202834.tif 000009
【００９８】
ＷＴの染色体を鋳型とし、配列番号２１及び２２、配列番号２３及び２４のプライマーを用いてＰＣＲを行った。９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で９０秒間の重合を３０回繰り返し、その後７２℃で７分間の重合反応を行った。その結果、ｍｅｔＢ遺伝子の５’上端部の４５０ｂｐのＤＮＡ断片と、３’下端部の４６７ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。
【００９９】
増幅された２つのＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号２１及び２４のプライマーでＰＣＲを行った。９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３分間の重合を３０回繰り返し、その後７２℃で７分間の重合反応を行った。その結果、ｍｅｔＢ遺伝子の中央部分が欠損し、上端と下端のみ含む９１７ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
【０１００】
ｐＤＺベクターと９１７ｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩで処理し、次にＤＮＡリガーゼを用いて連結し、その後クローニングすることによりプラスミドを得た。これをｐＤＺ−△ｍｅｔＢと命名した。
【０１０１】
ｐＤＺ−△ｍｅｔＢベクターを実施例３で作製したＷＴ：：ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）及びＣＡ０１−２３０７：：ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）菌株に電気パルス法で導入し、その後カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含む選択培地から形質転換菌株を得た。２次組換え過程（cross-over）で染色体上に挿入されたＤＮＡ断片によりｍｅｔＢ遺伝子が欠損した菌株であるＷＴ：：ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）△ｍｅｔＢ及びＣＡ０１−２３０７：：ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）△ｍｅｔＢを得た。
【０１０２】
Ｏ−アセチル−ホモセリンの他の分解経路であるｍｅｔＹ遺伝子を欠損させるために、ＷＴ由来のｍｅｔＹ遺伝子の塩基配列情報に基づいて、ｍｅｔＹ遺伝子の５’上端部を増幅するためのプライマー対（配列番号２５及び２６）、及び３’下端部を増幅するためのプライマー対（配列番号２７及び２８）を考案した。
【０１０３】
【表９】
2020202834.tif 000010
【０１０４】
ＷＴの染色体を鋳型とし、配列番号２５及び２６、配列番号２７及び２８のプライマーを用いてＰＣＲを行った。９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で９０秒間の重合を３０回繰り返し、その後７２℃で７分間の重合反応を行った。その結果、ｍｅｔＹ遺伝子の５’上端部の５１２ｂｐのＤＮＡ断片と、３’下端部の５２０ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。
【０１０５】
増幅された２つのＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号２５及び２８のプライマーでＰＣＲを行った。９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３分間の重合を３０回繰り返し、その後７２℃で７分間の重合反応を行った。その結果、ｍｅｔＹ遺伝子の中央部分が欠損し、上端と下端のみ含む１０３２ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
【０１０６】
ｐＤＺベクターと１０３２ｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩで処理し、次にＤＮＡリガーゼを用いて連結し、その後クローニングすることによりプラスミドを得た。これをｐＤＺ−△ｍｅｔＹと命名した。
【０１０７】
ｐＤＺ−△ｍｅｔＹベクターを前述したように作製したＷＴ：：ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）△ｍｅｔＢ及びＣＡ０１−２３０７：：ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）△ｍｅｔＢ菌株にそれぞれ電気パルス法で導入し、その後カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含む選択培地から形質転換菌株を得た。２次組換え過程（cross-over）で染色体上に挿入されたＤＮＡ断片によりｍｅｔＹ遺伝子が欠損した菌株であるＷＴ：：ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ及びＣＡ０１−２３０７：：ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹを得た。
【０１０８】
Ｏ−アセチル−ホモセリン生成の最大化のために、ｍｅｔＸ遺伝子発現を強化するベクターを作製した。ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ（ＭｅｔＸ）をコードする遺伝子を増幅するために、ＷＴ由来の報告されている配列に基づいて、プロモーター部位（開始コドンの上端約３００ｂｐ）からターミネーター部位（終止コドンの下端約１００ｂｐ）までを増幅するためのプライマー（配列番号２９及び３０）の両末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位を挿入して考案した。
【０１０９】
【表１０】
2020202834.tif 000011
【０１１０】
ＷＴの染色体を鋳型とし、配列番号２５及び２６のプライマーを用いてＰＣＲを行った。９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で９０秒間の重合を３０回繰り返し、その後７２℃で７分間の重合反応を行った。その結果、ｍｅｔＸ遺伝子を含む１５４６ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。
【０１１１】
ｐＥＣＣＧ１１７（特許文献６）ベクターとｍｅｔＸ ＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで処理し、次にＤＮＡリガーゼを用いて連結し、その後クローニングすることによりプラスミドを得た。これをｐＥＣＣＧ１１７−ｍｅｔＸと命名した。
【０１１２】
ｐＥＣＣＧ１１７−ｍｅｔＸベクターを前述したように作製したＷＴ：：ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ及びＣＡ０１−２３０７：：ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹに電気パルス法で導入し、その後カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含む選択培地に塗抹してそれぞれの形質転換株を得た。
【０１１３】
前述したように作製した菌株のＯ−アセチル−ホモセリン（以下、Ｏ−ＡＨ）生産能を比較するために、次の方法で培養し、培養液中のＯ−アセチルホモセリン濃度を分析した。
【０１１４】
Ｏ−ＡＨ生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに菌株を１白金耳接種し、３７℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。ＨＰＬＣを用いてＯ−アセチル−ホモセリンの濃度を分析した。分析した濃度を表１１に示す。
【０１１５】
＜Ｏ−ＡＨ生産培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース１００ｇ，（ＮＨ4）2ＳＯ4 ４０ｇ，大豆タンパク質２．５ｇ，コーンスティープソリッド（Corn Steep Solids）５ｇ，尿素３ｇ，ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド３０００μｇ，ＣａＣＯ3 ３０ｇ，Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ０．３ｇ（蒸留水１リットル中）。
【０１１６】
【表１１】
2020202834.tif 000012
【０１１７】
表１１に示すように、Ｏ−アセチルホモセリン濃度分析の結果、ｌｙｓＣ変異によるＯ−アセチルホモセリン生産の増加が確認された。
【実施例６】
【０１１８】
Ｏ−スクシニルホモセリン強化菌株の作製及びＯ−スクシニルホモセリン生産能の比較
ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）変異導入によりＯ−スクシニルホモセリンの生産能に及ぼす影響を把握するために、Ｏ−スクシニルホモセリン生産菌株を作製した。コリネバクテリウム・グルタミカム野生型菌株は自然にＯ−スクシニルホモセリンを生産することができないので、実施例５で作製したＯ−アセチルトランスフェラーゼ（ＭｅｔＸ）酵素の基質結合部位アミノ酸置換によりＯ−スクシニルトランスフェラーゼ（ＭｅｔＡ）活性を有するように改変し、Ｏ−スクシニルホモセリンを生成させることにした。よって、ＷＴ由来のｍｅｔＸ遺伝子配列に基づいて、実施例のｍｅｔＸ変異を導入するベクターを作製するためのプライマー対（配列番号３１及び３２）を考案した。
【０１１９】
【表１２】
2020202834.tif 000013
【０１２０】
ＷＴの染色体を鋳型とし、配列番号２７及び２８のプライマーを用いてＰＣＲを行った。９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で９０秒間の重合を３０回繰り返し、その後７２℃で７分間の重合反応を行った。その結果、ｍｅｔＸ遺伝子のコード部位の１１４６ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。
【０１２１】
ｐＤＺベクターと１１４６ｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩで処理し、次にＤＮＡリガーゼを用いて連結し、その後クローニングすることによりプラスミドを得た。これをｐＤＺ−ｍｅｔＸと命名した。ｐＤＺ−ｍｅｔＸベクターに基づいて、１７６番目のアミノ酸がアスパラギンに置換され、３１３番目のアミノ酸がアルギニンに置換される変異ベクターを作製するために、１７６番目の変異導入プライマー対（配列番号３３及び３４）、及び３１３番目の変異導入プライマー対（配列番号３５及び３６）を考案した。
【０１２２】
【表１３】
2020202834.tif 000014
【０１２３】
前述した各プライマーと共に、部位特異的突然変異キット（site-directed mutagenesis kit, stratagene, 米国）を用いて、ｍｅｔＸ変異遺伝子を作製した。従来の野生型プラスミドｐＤＺ−ｍｅｔＸに基づいた変異型プラスミドをｐＤＺ−ｍｅｔＸ（Ｑ１７６Ｎ，Ｌ３１３Ｒ）と命名した。前述したように作製したｐＤＺ−ｍｅｔＸ（Ｑ１７６Ｎ，Ｌ３１３Ｒ）ベクターを実施例５で作製したＷＴ：：ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ及びＣＡ０１−２３０７：：ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ菌株に電気パルス法で導入し、その後カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含む選択培地から形質転換菌株を得た。２次組換え過程（cross-over）で染色体上に挿入されたＤＮＡ断片によりｍｅｔＸ遺伝子がｍｅｔＸ（Ｑ１７６Ｎ，Ｌ３１３Ｒ）に交換されたＷＴ：：ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）ｍｅｔＸ（（Ｑ１７６Ｎ，Ｌ３１３Ｒ）△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ及びＣＡ０１−２３０７：：ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）ｍｅｔＸ（（Ｑ１７６Ｎ，Ｌ３１３Ｒ）△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ菌株を得た。
【０１２４】
Ｏ−スクシニルホモセリン生成の最大化のために、ｍｅｔＸ（Ｑ１７６Ｎ，Ｌ３１３Ｒ）変異遺伝子発現を強化するベクターを作製した。実施例５で作製したｐＥＣＣＧ１１７−ｍｅｔＸに基づいて、Ｏ−スクシニルトランスフェラーゼ活性を有する変異、１７６番目のアミノ酸をアスパラギンに置換し、３１３番目のアミノ酸をアルギニンに置換するプライマーである配列番号３３〜３６を用いて、変異ｍｅｔＸ過剰発現ベクターを作製した。具体的には、各プライマーと共に、部位特異的突然変異キット（site-directed mutagenesis kit, stratagene, 米国）を用いてベクターを作製し、ｐＥＣＣＧ１１７−ｍｅｔＸ（Ｑ１７６Ｎ，Ｌ３１３Ｒ）と命名した。
【０１２５】
ｐＥＣＣＧ１１７−ｍｅｔＸ（Ｑ１７６Ｎ，Ｌ３１３Ｒ）及び空ベクターｐＥＣＣＧ１１７ベクターを前述したように作製したＯ−スクシニル−ホモセリン生産菌株であるＷＴ：：ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）ｍｅｔＸ（（Ｑ１７６Ｎ，Ｌ３１３Ｒ）△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ及びＣＡ０１−２３０７：：ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）ｍｅｔＸ（（Ｑ１７６Ｎ，Ｌ３１３Ｒ）△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹに電気パルス法で導入し、その後カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含む選択培地に塗抹して形質転換株を得た。
【０１２６】
前記菌株のＯ−スクシニルホモセリン生産能を比較するために、次の方法で培養し、培養液中のＯ−スクシニルホモセリン濃度を分析した。
【０１２７】
実施例５で用いたものと同じ組成のＯ−ＡＨ生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに菌株を１白金耳接種し、３７℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。ＨＰＬＣを用いてＯ−スクシニルホモセリン濃度を分析した。分析した濃度を表１４に示す。
【０１２８】
【表１４】
2020202834.tif 000015
【０１２９】
表１４に示すように、Ｏ−スクシニルホモセリン濃度分析の結果、ｌｙｓＣ変異によるＯ−スクシニルホモセリン生産の増加が確認された。
【０１３０】
これらの結果は、本発明の変異体がアスパラギン酸由来アミノ酸及び／又はその誘導体の生産を増加させることを示唆するものである。
【０１３１】
以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
【図１】
2020202834.tif 000016
【配列表】
2020202834000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年7月14日(2020.7.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2020202834000001.app