(57)【要約】【課題】アグロバクテリウム法に代わるゴム産生植物の形質転換細胞を効率的に作製する方法を提供するを提供する。【解決手段】（ａ）〜（ｅ）の各工程を含むことを特徴とするゴム産生植物の形質転換細胞の作製方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（ａ）〜（ｅ）の各工程を含むことを特徴とするゴム産生植物の形質転換細胞の作製方法。
（ａ）ゴム産生植物の組織片を植物生長ホルモンを含む培地で培養し、５．０ｍｍ以下の培養細胞を得る工程
（ｂ）工程（ａ）で得られた培養細胞をウィスカと共に液体中に分散させた後、遠心処理により培養細胞にウィスカを付着させる工程
（ｃ）工程（ｂ）の後に、超音波処理を行い、ウィスカにより、培養細胞を損傷させ、細胞内に外来遺伝子を導入する工程
（ｄ）工程（ｃ）の後に、ウィスカの除去を行わずに、損傷した細胞を回復させる工程
（ｅ）工程（ｄ）の後に、抗生物質を用いて、形質転換細胞を選別する工程
【請求項２】
ウィスカの材質がチタン酸カリウムである請求項１記載のゴム産生植物の形質転換細胞の作製方法。
【請求項３】
工程（ｄ）を１２０時間以上行う請求項１又は２記載のゴム産生植物の形質転換細胞の作製方法。
【請求項４】
工程（ｅ）で用いる抗生物質がカナマイシンで、使用濃度が１０ｍｇ／Ｌ以下である請求項１〜３のいずれかに記載のゴム産生植物の形質転換細胞の作製方法。
【請求項５】
培養細胞がカルスである請求項１〜４のいずれかに記載のゴム産生植物の形質転換細胞の作製方法。
【請求項６】
前記ゴム産生植物が、Ｈｅｖｅａ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物である請求項１〜５のいずれかに記載のゴム産生植物の形質転換細胞の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゴム産生植物の形質転換細胞の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然ゴムは、トウダイグサ科のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）や桑科植物のインドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｌａｓｔｉｃａ）などのゴム産生植物を栽培し、その植物体が有する乳管細胞で天然ゴムを生合成させ、該天然ゴムを植物から手作業により採取することにより得られる。
【０００３】
現在、工業用ゴム製品に用いられている天然ゴムは、パラゴムノキを唯一の採取源としている。パラゴムノキは東南アジアや南米などの限られた地域でのみ生育可能な植物である。更に、パラゴムノキは、植樹からゴムの採取が可能な成木になるまでに７年程度を要し、また、天然ゴムを採取できる期間は２０〜３０年である。今後、開発途上国を中心に天然ゴムの需要の増大が見込まれているが、上述の理由によりパラゴムノキによる天然ゴムの大幅な増産は困難である。そのため、天然ゴム資源の枯渇が懸念されており、パラゴムノキでの収率の向上が望まれている。
【０００４】
パラゴムノキでの収率の向上方法として、従来の人工交配や突然変異を利用する方法も考えられるが、所望する性質を効率的に付与することが難しく、その実現性は低いものと考えられる。そのため、遺伝子組換え技術を用いたゴムノキの改良が今後利用されると考えられる。
【０００５】
パラゴムノキを含めたゴム産生植物の遺伝子組換え技術は、アグロバクテリウムを用いた手法が多い（例えば、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−１６１９８９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、アグロバクテリウム法は、微生物と植物の相性により遺伝子導入効率が変化し、形質転換方法としてアグロバクテリウム法が適切ではない植物種（イネやダイズなど）も存在することが本発明者らの検討の結果明らかとなった。
本発明は、前記課題を解決し、アグロバクテリウム法に代わるゴム産生植物の形質転換細胞を効率的に作製する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討した結果、アグロバクテリウム法の代わりにウィスカ法を用いてゴム産生植物の形質転換細胞を作製することに成功した。
そして、より効率的にゴム産生植物の形質転換細胞を作製するための条件の検討を行い、遺伝子導入効率を高めるためには、小さな培養細胞（培養細胞塊）を使用すること、遠心処理及び超音波処理を行うこと、ウィスカの除去を行わずに、損傷した細胞を回復させることが重要であることがわかった。この知見に基づいて、さらなる検討を行った結果、様々な知見を見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、次の（ａ）〜（ｅ）の各工程を含むことを特徴とするゴム産生植物の形質転換細胞の作製方法に関する。
（ａ）ゴム産生植物の組織片を植物生長ホルモンを含む培地で培養し、５．０ｍｍ以下の培養細胞を得る工程
（ｂ）工程（ａ）で得られた培養細胞をウィスカと共に液体中に分散させた後、遠心処理により培養細胞にウィスカを付着させる工程
（ｃ）工程（ｂ）の後に、超音波処理を行い、ウィスカにより、培養細胞を損傷させ、細胞内に外来遺伝子を導入する工程
（ｄ）工程（ｃ）の後に、ウィスカの除去を行わずに、損傷した細胞を回復させる工程
（ｅ）工程（ｄ）の後に、抗生物質を用いて、形質転換細胞を選別する工程
【０００９】
ウィスカの材質がチタン酸カリウムであることが好ましい。
【００１０】
工程（ｄ）を１２０時間以上行うことが好ましい。
【００１１】
工程（ｅ）で用いる抗生物質がカナマイシンで、使用濃度が１０ｍｇ／Ｌ以下であることが好ましい。
【００１２】
培養細胞がカルスであることが好ましい。
【００１３】
上記ゴム産生植物が、Ｈｅｖｅａ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のゴム産生植物の形質転換細胞の作製方法は、上記（ａ）〜（ｅ）の各工程を含むので、ゴム産生植物の形質転換細胞を効率的に作製できる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のゴム産生植物の形質転換細胞の作製方法（以下においては、本発明の方法ともいう）は、次の（ａ）〜（ｅ）の各工程を含むことを特徴とする。
（ａ）ゴム産生植物の組織片を植物生長ホルモンを含む培地で培養し、５．０ｍｍ以下の培養細胞を得る工程
（ｂ）工程（ａ）で得られた培養細胞をウィスカと共に液体中に分散させた後、遠心処理により培養細胞にウィスカを付着させる工程
（ｃ）工程（ｂ）の後に、超音波処理を行い、ウィスカにより、培養細胞を損傷させ、細胞内に外来遺伝子を導入する工程
（ｄ）工程（ｃ）の後に、ウィスカの除去を行わずに、損傷した細胞を回復させる工程
（ｅ）工程（ｄ）の後に、抗生物質を用いて、形質転換細胞を選別する工程
【００１６】
本明細書において、培養細胞（培養細胞塊）とは、植物の組織片（組織）を培養することにより得られる植物細胞（植物細胞塊）を意味し、より具体的にはカルスを意味する。
また、本明細書において、カルスとは、分化していない状態の植物細胞又は分化していない状態の植物細胞塊を意味する。
また、本明細書において、形質転換細胞とは、外来遺伝子が導入された細胞を意味する。
また、本明細書において、外来遺伝子とは、遺伝子移行によって宿主生物に導入された遺伝子を意味する。
【００１７】
ゴム産生植物としては、天然ゴムを産生可能な植物であれば特に限定されず、例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のＨｅｖｅａ属；ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、オニノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ａｓｐｅｒ）、ハチジョウナ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｏｔｕｓ）等のＳｏｎｃｈｕｓ属；セイタカアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、アキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ａｓｉａｔｉｃａ）、ミヤマアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｅｉｐｃａｒｐａ）、キリガミネアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｅｉｐｃａｒｐａ  ｆ．  ｐａｌｕｄｏｓａ）、オオアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｇｉｇａｎｔｅａ）、オオアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｇｉｇａｎｔｅａ  Ａｉｔ．  ｖａｒ．  ｌｅｉｏｐｈｙｌｌａ  Ｆｅｒｎａｌｄ）等のＳｏｌｉｄａｇｏ属；ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、シロタエヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｒｇｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ヘリアンサス・アトロルベンス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｔｒｏｒｕｂｅｎｓ）、ヒメヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｄｅｂｉｌｉｓ）、コヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｄｅｃａｐｅｔａｌｕｓ）、ジャイアントサンフラワー（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）等のＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ属；タンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）、エゾタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｖｅｎｕｓｔｕｍ  Ｈ．Ｋｏｉｄｚ）、シナノタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｈｏｎｄｏｅｎｓｅ  Ｎａｋａｉ）、カントウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｐｌａｔｙｃａｒｐｕｍ  Ｄａｈｌｓｔ）、カンサイタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、セイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ  Ｗｅｂｅｒ）、ロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｋｏｋｓａｇｈｙｚ）等のＴａｒａｘａｃｕｍ属；イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｒｉｃａ）、インドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｌａｓｔｉｃａ）、オオイタビ（Ｆｉｃｕｓ  ｐｕｍｉｌａ  Ｌ．）、イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｒｅｃｔａ  Ｔｈｕｍｂ．）、ホソバムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ａｍｐｅｌａｓ  Ｂｕｒｍ．ｆ．）、コウトウイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｂｅｎｇｕｅｔｅｎｓｉｓ  Ｍｅｒｒ．）、ムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｉｒｉｓａｎａ  Ｅｌｍ．）、ガジュマル（Ｆｉｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ  Ｌ．ｆ．）、オオバイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｓｅｐｔｉｃａ  Ｂｕｒｍ．ｆ．）、ベンガルボダイジュ（Ｆｉｃｕｓ  ｂｅｎｇｈａｌｅｎｓｉｓ）等のＦｉｃｕｓ属；グアユール（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、アメリカブクリョウサイ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）、ブタクサ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）等のＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属；レタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓｅｒｒｉｏｌａ）、ベンガルボダイジュ等が挙げられる。なかでも、Ｈｅｖｅａ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に���する植物であることが好ましく、パラゴムノキ、ロシアンタンポポ、及びグアユールからなる群より選択される少なくとも１種であることがより好ましい。なかでも、Ｈｅｖｅａ属（パラゴムノキ）が特に好ましい。
【００１８】
（工程（ａ））
工程（ａ）は、ゴム産生植物の組織片を植物生長ホルモンを含む培地で培養し、５．０ｍｍ以下の培養細胞を得る工程である。
工程（ａ）では、例えば、ゴム産生植物の組織片を植物生長ホルモンを含む培地で培養することにより培養細胞（好ましくはカルス）を調製する。すなわち、ゴム産生植物の組織片からカルスを誘導する。なお、ゴム産生植物の組織片からカルスを誘導する方法についてはよく知られているため、以下ではその１例として誘導工程の説明を行うが、カルスを誘導する方法は以下の説明に限定されるものではなく、当業者であれば、適宜、ゴム産生植物の組織片からカルスを誘導できる。
【００１９】
＜誘導工程＞
以下において、カルスの調製方法（誘導工程）について説明する。
誘導工程では、例えば、ゴム産生植物（以下、単に植物ともいう）の組織片（組織）を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することによりカルスを誘導する。
【００２０】
組織片としては、特に限定されないが、葉、茎、根、芽、花弁、子葉、胚軸、葯、及び種子からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。なかでも、葉、茎が好ましい。
【００２１】
誘導工程では、まず、植物の組織片の表面を洗浄する。組織片として植物の内部にある組織を利用する場合は、例えば、磨き粉で洗浄しても良いが、界面活性剤を約０．１％含む水で洗浄してもよい。葉などを利用する場合は、軟らかいスポンジで表面を洗浄することが好ましい。
【００２２】
次に、組織片を殺菌又は滅菌する。殺菌又は滅菌は、周知の殺菌剤、滅菌剤を用いて行うことができるが、エタノール、塩化ベンザルコニウム、次亜塩素酸ナトリウム水溶液が好ましい。
【００２３】
次に、殺菌又は滅菌した組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することにより、カルスの誘導を行う。なお、誘導培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地上に置床して培養することで、カルス化しやすいため、固体培養が好ましい。また、誘導培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
【００２４】
植物生長ホルモンとしては、例えば、オーキシン系植物ホルモン及び／又はサイトカイニン系植物ホルモンが挙げられる。
【００２５】
オーキシン系植物ホルモンとしては、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸、インドール酪酸、インドール酢酸、インドールプロピオン酸、クロロフェノキシ酢酸、ナフトキシ酢酸、フェニル酢酸、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸、パラクロロフェノキシ酢酸、２−メチル−４−クロロフェノキシ酢酸、４−フルオロフェノキシ酢酸、２−メトキシ−３，６−ジクロロ安息香酸、２−フェニル酸、ピクロラム、ピコリン酸等が挙げられる。なかでも、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸、インドール酪酸が好ましく、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸がより好ましく、Ｓｏｎｃｈｕｓ属に属する植物、特に、ノゲシの場合にはナフタレン酢酸が更に好ましく、Ｈｅｖｅａ属に属する植物、特に、パラゴムノキの場合には２，４−ジクロロフェノキシ酢酸が更に好ましい。
【００２６】
サイトカイニン系植物ホルモンとしては、ベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチン、ベンジルアミノプリン、イソペンチニルアミノプリン、チジアズロン、イソペンテニルアデニン、ゼアチンリポシド、ジヒドロゼアチン等が挙げられる。なかでも、ベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチンが好ましく、ベンジルアデニン、カイネチンがより好ましく、Ｓｏｎｃｈｕｓ属に属する植物、特に、ノゲシの場合にはベンジルアデニンが更に好ましく、Ｈｅｖｅａ属に属する植物、特に、パラゴムノキの場合にはカイネチン、ベンジルアデニンが更に好ましい。
【００２７】
炭素源としては、特に限定されず、スクロース、グルコース、トレハロース、フルクトース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アロース、タロース、グロース、アルトロース、マンノース、イドース、アラビノース、アピオース、マルトース等の糖類が挙げられる。なかでも、スクロース、グルコースが好ましく、スクロースがより好ましい。
【００２８】
誘導培地としては、Ｗｈｉｔｅの培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、Ｈｅｌｌｅｒの培地（Ｈｅｌｌｅｒ  Ｒ，  Ｂｏｔ．Ｂｉｏｌ．Ｖｅｇ．Ｐａｒｉｓ  １４  １−２２３（１９５３））、ＳＨ培地（ＳｃｈｅｎｋとＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔの培地）、ＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇの培地）（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、ＬＳ培地（ＬｉｎｓｍａｉｅｒとＳｋｏｏｇの培地）（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、Ｇａｍｂｏｒｇ培地、Ｂ５培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、ＭＢ培地、ＷＰ培地（Ｗｏｏｄｙ  Ｐｌａｎｔ：木本類用）等の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に植物生長ホルモンを加えたものを使用すればよい。なかでも、ＭＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地に植物生長ホルモンを加えたものが好ましい。また、カルスの維持および細胞分裂の促進に適しているという理由から、オーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを含むことが好ましい。
【００２９】
誘導培地は、ジャスモン酸、及びモノテルペン化合物からなる群より選択される少なくとも１種を含んでもよい。
モノテルペン化合物としては、Ｄ−リモネン、α−ピネン、β−ピネン、ｌ−メントール、ゲラニオール、カラン、ピナン、ミルセン、オシメン、コスメン等が挙げられる。なかでも、Ｄ−リモネン、α−ピネンが好ましい。
【００３０】
誘導培地を固体培地とする場合、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。固形化剤としては、特に限定されず、寒天、ゲランガム、アガロース、ゲルライト、ゼラチン、シリカゲル、アガー、フィタゲル等が挙げられる。
【００３１】
好適な誘導培地の組成及び培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は（特に、Ｓｏｎｃｈｕｓ属に属する植物（特に、ノゲシ）、Ｈｅｖｅａ属に属する植物（特に、パラゴムノキ）の場合は）以下の組成である。
【００３２】
誘導培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは３質量％以下である。なお、本明細書において、炭素源の濃度とは、糖類の濃度を意味する。
【００３３】
誘導培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．０５ｍｇ／ｌ以上、特に好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以上である。植物が、Ｈｅｖｅａ属に属する植物（特に、パラゴムノキ）の場合、最も好ましくは１．５ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは２．５ｍｇ／ｌ以下である。
【００３４】
誘導培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．１ｍｇ／ｌ以上、特に好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以上である。植物が、Ｈｅｖｅａ属に属する植物（特に、パラゴムノキ）の場合、最も好ましくは０．８ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは３ｍｇ／ｌ以下である。
【００３５】
誘導培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．６〜６．５がより好ましく、５．７〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２０〜３０℃がより好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましく、０〜０．１ｌｘがより好ましい。培養時間は、特に限定されないが、１〜１０週間培養することが好ましい。
なお、本明細書において、固体培地のｐＨは、固形化剤を除く全成分を添加した培地のｐＨを意味する。また、本明細書において、暗所とは、照度が０〜０．１ｌｘであることを意味し、明所とは、照度が０．１ｌｘを超えていることを意味する。
【００３６】
固体培地の場合、誘導培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下、更に好ましくは０．６質量％以下である。
【００３７】
上述の条件のなかでも、特に、植物が、Ｓｏｎｃｈｕｓ属に属する植物（特に、ノゲシ）の場合、オーキシン系植物ホルモンがナフタレン酢酸で、その濃度が０．５〜２．５ｍｇ／ｌで、サイトカイニン系植物ホルモンがベンジルアデニンで、培養温度が２０〜２６℃であることが特に好ましい。
【００３８】
上述の条件のなかでも、特に、植物が、Ｈｅｖｅａ属に属する植物（特に、パラゴムノキ）の場合、オーキシン系植物ホルモンが２，４−ジクロロフェノキシ酢酸で、その濃度が１．５〜２．５ｍｇ／ｌで、サイトカイニン系植物ホルモンがベンジルアデニンで、その濃度が０．８〜３ｍｇ／ｌであることが特に好ましい。
【００３９】
以上のように、殺菌又は滅菌した組織片を上記誘導培地中で培養することにより、カルスの誘導を行うことが可能である。
【００４０】
ここで、工程（ａ）は、ゴム産生植物の組織片を植物生長ホルモンを含む培地で培養し、５．０ｍｍ以下の培養細胞を得る工程であるため、誘導工程に沿って、ゴム産生植物の組織片を植物生長ホルモンを含む培地で培養してカルス（培養細胞）を調製するだけでは不十分な場合がある。
誘導工程により誘導されたカルスの大きさが所定の大きさ以下であれば、得られたカルスをそのまま、次工程である工程（ｂ）に使用すればよいが、誘導されたカルスの大きさが所定の大きさを超える場合は、誘導工程に続いて、以下のサイズ調整工程を行う必要がある。
【００４１】
＜サイズ調整工程＞
サイズ調整工程としては、カルスの大きさを所定の大きさ以下とすることができる限り特に限定されない。
例えば、ナイフなどによりカルスを切断してもよいし、粉砕機等によりカルスを粉砕してもよい。カルスに与えるダメージを小さくするという観点から、金属製のメッシュ上にカルスを静置し、静置されたカルスに力を加えることにより、メッシュ上に静置されたカルスをメッシュの網目の間を通過させ、所望の大きさとすることが好ましい。
【００４２】
工程（ａ）により得られる（工程（ｂ）に用いられる）培養細胞（培養細胞塊）の大きさは、５．０ｍｍ以下、好ましくは３．０ｍｍ以下、より好ましくは１．０ｍｍ以下である。本発明では、小さな培養細胞（培養細胞塊）を使用することにより、遺伝子導入効率を高めることが可能となるため、下限は特に限定されないが、取扱が容易なため、好ましくは０．１ｍｍ以上、より好ましくは０．２ｍｍ以上、更に好ましくは０．３ｍｍ以上、特に好ましくは０．４ｍｍ以上である。
ここで、培養細胞（培養細胞塊）の大きさは、培養細胞（培養細胞塊）の長径を意味し、該長径とは、投影面に対する培養細胞（培養細胞塊）の方向を種々変化させながら培養細胞（培養細胞塊）を投影面に投影したときの最長の長さであり、例えば、長角形状なら最長の辺の長さ、円盤状であれば直径となる。
なお、上記培養細胞（培養細胞塊）の大きさは、１００個の培養細胞（培養細胞塊）の大きさの平均値である。
【００４３】
（工程（ｂ））
工程（ｂ）は、工程（ａ）で得られた培養細胞をウィスカと共に液体中に分散させた後、遠心処理により培養細胞にウィスカを付着させる工程である。
工程（ｂ）は、小さな培養細胞（培養細胞塊）を使用すること、培養細胞をウィスカと共に遠心処理を行うことに特徴があり、これにより、遺伝子導入効率を高めることが可能となる。
【００４４】
本明細書において、ウィスカとは、ウィスカー、ウイスカ、ｗｈｉｓｋｅｒとも言い、針状単結晶（針状単結晶繊維）を意味する。
使用できるウィスカとしては、細胞を損傷させうることができるものであれば特に限定されない。
【００４５】
ウィスカの平均繊維径は、好ましくは０．０１μｍ以上、より好ましくは０．０５μｍ以上、更に好ましくは０．１μｍ以上であり、好ましくは１０μｍ以下、より好ましくは５μｍ以下、更に好ましくは１μｍ以下である。ウィスカの平均繊維径が上記範囲内であると、効果がより好適に得られる。
【００４６】
ウィスカの平均繊維長は、好ましくは１μｍ以上、より好ましくは３μｍ以上、更に好ましくは５μｍ以上であり、好ましくは１００μｍ以下、より好ましくは６０μｍ以下、更に好ましくは３０μｍ以下である。ウィスカの平均繊維長が上記範囲内であると、効果がより好適に得られる。
【００４７】
本明細書において、ウィスカの平均繊維径及び平均繊維長は、走査型電子顕微鏡写真による画像解析によって測定できる。
【００４８】
ウィスカの材質は、細胞を損傷させうることができるかぎり特に限定されないが、例えば、チタン酸カリウム、炭酸カルシウム、ホウ酸アルミニウム、窒化ケイ素、酸化亜鉛、塩基性硫酸マグネシウム、マグネシア、ホウ酸マグネシウム、二ホウ化チタン、カーボングラファイト、硫酸カルシウム、サファイア、シリコンカーバイドなどが挙げられる。なかでも、チタン酸カリウム、炭酸カルシウム、ホウ酸アルミニウム、シリコンカーバイドが好ましく、チタン酸カリウムがより好ましい。
【００４９】
ウィスカは、使用前に、エタノール、紫外線等により殺菌しておくことが好ましい。
【００５０】
工程（ｂ）では、工程（ａ）で得られた培養細胞をウィスカと共に液体中に分散させた培養細胞・ウィスカ分散液を調製する。
培養細胞・ウィスカ分散液の調製方法は、培養細胞、ウィスカが液体中に分散した分散液が調製できる限り特に限定されず、例えば、液体に培養細胞、ウィスカをそれぞれ投入、混合する方法、培養細胞が分散した液体にウィスカを投入、混合する方法、ウィスカが分散した液体に培養細胞を投入、混合する方法、培養細胞が分散した液体とウィスカが分散した液体を混合する方法等が挙げられる。なかでも、効果がより好適に得られるという理由から、培養細胞が分散した液体とウィスカが分散した液体を混合する方法が好ましい。
【００５１】
上記液体（工程（ｂ）における分散媒）としては、特に限定されないが、蒸留水、等張液、緩衝液、組織培養用培地などが挙げられる。等張液としては、例えばＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2などの無機塩を添加して０．０１〜７Ｍ、好ましくは、０．５〜２Ｍにした液体が挙げられる。緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＭＥＳ緩衝液などが挙げられる。組織培養用培地としては、上述の培地などが挙げられる。なかでも、植物の培養細胞の増殖（生育）に悪影響を与えず、効果がより好適に得られるという理由から、組織培養用培地が好ましい。
【００５２】
工程（ｂ）における分散媒としては、基本培地（好ましくはＭＳ培地）に炭素源、植物生長ホルモンを添加した液体が好ましい。炭素源、植物生長ホルモンとしては、上記誘導培地と同様のものが好適に使用できる。
特に、オーキシン系植物ホルモンが２，４−ジクロロフェノキシ酢酸で、工程（ｂ）における分散媒中の濃度が１〜３ｍｇ／ｌで、サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が０ｍｇ／ｌであることが特に好ましい。
工程（ｂ）における分散媒中の炭素源の濃度は、好ましくは１０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは２０ｍｇ／ｌ以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは５０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは４０ｍｇ／ｌ以下である。
【００５３】
工程（ｂ）では、培養細胞・ウィスカ分散液に、更に、外来遺伝子を導入するためのプラスミド（標的遺伝子又はそのフラグメント（以下、標的遺伝子等、と記載することがある。）を含むプラスミド）も混合することが好ましい。
【００５４】
本明細書において、標的遺伝子とは、ゴム産生植物に導入する目的の遺伝子を意味する。標的遺伝子としては、ゴム産生植物に導入された結果、当該ゴム産生植物の遺伝的形質を変化させ得るものであれば特に限定されるものではなく、導入されるゴム産生植物が本来有している遺伝子であってもよく、当該ゴム産生植物以外の生物由来の遺伝子であってもよく、人工的に作製した遺伝子であってもよい。人工的に作製した遺伝子としては、例えば、２種類以上の遺伝子をつなぎ合わせたキメラ遺伝子であってもよく、いずれかの生物が有する遺伝子を変異させた変異遺伝子であってもよい。変異遺伝子としては、例えば、遺伝子を構成するＤＮＡの塩基配列のうちの一部の塩基を欠損させたものであってもよく、置換させたものであってもよい。また、該塩基配列の途中に部分塩基配列を挿入したものであってもよい。
【００５５】
また、標的遺伝子は、構造遺伝子であってもよく、調節領域であってもよい。例えば、プロモーターやターミネーター等の転写や翻訳の制御領域を含む構造遺伝子であってもよい。なお、制御領域の遺伝子は、遺伝子が導入されるゴム産生植物中で機能し得るものであればよく、遺伝子が導入されるゴム産生植物と同種の生物由来の遺伝子であってもよく、異種の生物由来の遺伝子であってもよいことは言うまでもない。このような異種プロモーターとしては、例えば、ＣａＭＶ３５ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ＮＯＳ ｐｒｏｍｏｔｅｒ等の遺伝子組み換えに係る分野において汎用されているプロモーターを使用することができる。
【００５６】
ゴム産生植物に導入される標的遺伝子は、遺伝子の全長であってもよく、フラグメントであってもよい。例えば、構造遺伝子の機能ドメインのみからなるフラグメントを導入するものであってもよい。
【００５７】
ゴム産生植物に導入する標的遺伝子としては、例えば、ラテックスの生合成機構やポリイソプレン鎖延長反応に関与し、ラテックスの産生量や分子量に対して機能する遺伝子、並びに、ラテックス中に含まれる、タンパク質、イノシトール、ケブラキトールなどの糖類、ビタミンＥの一種であり天然の老化防止剤としても効果のあるトコトリエノールの生合成に関与し、その生産量に対して影響を与える遺伝子、さらには、これらのタンパク質、糖類、トコトリエノールの変異体を生ずる遺伝子等であることが好ましい。また、これらの遺伝子に組織特異的に機能するプロモーター等の調節領域を含ませることにより、標的遺伝子がコードしているタンパク質を、植物体の特定の組織において発現させることもできる。
【００５８】
標的遺伝子等は、好適には、マーカー遺伝子、場合により、レポーター遺伝子とともにベクターに組み込まれる。
マーカー遺伝子としては、カナマイシン耐性遺伝子（ｎｐｔＩＩ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｔＩ）、ブレオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。植物体での発現位置を確認するためのレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＵＳ（βグルクロニダーゼ）遺伝子、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）等を挙げることができる。
【００５９】
培養細胞・ウィスカ分散液中の培養細胞、ウィスカの量は、植物の種類や量、用いるプラスミドの量等を考慮して、適宜決定することができる。
例えば、培養細胞・ウィスカ分散液中の培養細胞、ウィスカの質量比（培養細胞の質量／ウィスカの質量）は、好ましくは１０〜１００、より好ましくは４０〜６０である。上記範囲内であると、効果がより好適に得られる。
また、培養細胞・ウィスカ分散液中のプラスミド、培養細胞の質量比（プラスミドの質量／培養細胞の質量）は、好ましくは１０００〜１０００００、より好ましくは１００００〜５００００であり、上限は更に好ましくは３００００、特に好ましくは２００００である。上記範囲内であると、効果がより好適に得られる。
また、培養細胞・ウィスカ分散液中の培養細胞、ウィスカの合計濃度は、好ましくは０．１〜１０質量％、より好ましくは０．５〜２質量％であり、上限は更に好ましくは１質量％である。上記範囲内であると、効果がより好適に得られる。
【００６０】
次に、工程（ｂ）では、培養細胞・ウィスカ分散液（好ましくは外来遺伝子を導入するためのプラスミドも含有）を遠心処理（遠心分離）することにより培養細胞にウィスカを付着させる。
本明細書において、遠心処理とは、遠心力を加える処理を意味する。
【００６１】
工程（ｂ）における遠心処理では、遠心力は、好ましくは３，０００×ｇ以上、より好ましくは１０，０００×ｇ以上、更に好ましくは１５，０００×ｇ以上であり、好ましくは５０，０００×ｇ以下、より好ましくは３０，０００×ｇ以下、更に好ましくは２１，０００×ｇ以下である。上記範囲内であると、効果がより好適に得られる。
【００６２】
工程（ｂ）における遠心処理を行う時間は特に限定されないが、好ましくは１分以上、より好ましくは２分以上、更に好ましくは４分以上であり、好ましくは１５分以下、より好ましくは１０分以下、更に好ましくは７分以下である。上記範囲内であると、効果がより好適に得られる。
【００６３】
工程（ｂ）における遠心処理を行う温度は特に限定されないが、好ましくは４〜１０℃である。上記範囲内であると、効果がより好適に得られる。
【００６４】
培養細胞へのウィスカの付着量を高めるために同様の遠心処理を１〜２０回、好ましくは２〜５回繰り返して行うのがよい。
【００６５】
上述の説明では、遠心処理前の培養細胞・ウィスカ分散液に、外来遺伝子を導入するためのプラスミドを混合したが、遠心処理後の培養細胞・ウィスカ分散液に、外来遺伝子を導入するためのプラスミドを混合してもよい。しかしながら、効果がより好適に得られるという理由から、遠心処理前の培養細胞・ウィスカ分散液に、外来遺伝子を導入するためのプラスミドを混合することが好ましい。
【００６６】
（工程（ｃ））
工程（ｃ）は、工程（ｂ）の後に、超音波処理を行い、ウィスカにより、培養細胞を損傷させ、細胞内に外来遺伝子を導入する工程である。
具体的には、遠心処理後の培養細胞・ウィスカ分散液に対して超音波処理を行い、ウィスカにより、培養細胞を損傷させ、細胞内に外来遺伝子を導入する。この工程では、工程（ｂ）の遠心処理により培養細胞に付着したウィスカを振動させ、ウィスカにより細胞を穿孔し、細胞を損傷させる。そして、培養細胞・ウィスカ分散液に含まれるプラスミドが、損傷した細胞に入り込むことにより、細胞内に外来遺伝子が導入され、形質転換細胞が得られる。
工程（ｂ）、工程（ｃ）において、遠心処理及び超音波処理を行うことにより、遺伝子導入効率を高めることが可能となる。
本明細書において、超音波処理とは、超音波を照射する処理を意味する。
【００６７】
超音波処理における周波数は、好ましくは１ｋＨｚ以上、より好ましくは１０ｋＨｚ以上、更に好ましくは２０ｋＨｚ以上であり、好ましくは１ＭＨｚ以下、より好ましくは５００ｋＨｚ以下、更に好ましくは１００ｋＨｚ以下、特に好ましくは６０ｋＨｚ以下である。上記範囲内であると、効果がより好適に得られる。
【００６８】
超音波処理における強度は、好ましくは０．０１Ｗ／ｃｍ２以上、より好ましくは０．１Ｗ／ｃｍ２以上、更に好ましくは０．１５Ｗ／ｃｍ２以上であり、好ましくは１０Ｗ／ｃｍ２以下、より好ましくは１Ｗ／ｃｍ２以下、更に好ましくは０．５Ｗ／ｃｍ２以下、特に好ましくは０．３５Ｗ／ｃｍ２以下である。上記範囲内であると、効果がより好適に得られる。
【００６９】
超音波処理における照射時間は、好ましくは０．２秒以上、より好ましくは３０秒以上、更に好ましくは５０秒以上であり、好ましくは２０分以下、より好ましくは１０分以下、更に好ましくは５分以下、特に好ましくは２分以下である。上記範囲内であると、効果がより好適に得られる。
【００７０】
超音波処理を行った後、外来遺伝子を細胞内に侵入させ拡散させるのに十分な時間、カルスを静置することが好ましい。その際の温度は好ましくは０〜２８℃、より好ましくは０〜６℃で、静置時間は、好ましくは１分〜３時間、より好ましくは５分〜２時間、更に好ましくは１０分〜１時間である。
【００７１】
（工程（ｄ））
工程（ｄ）は、工程（ｃ）の後に、ウィスカの除去を行わずに、損傷した細胞を回復させる工程である。具体的には、超音波処理を施した培養細胞は、損傷しているため、工程（ｄ）では、超音波処理を施した培養細胞（ウィスカが付着した培養細胞）を培養することにより、正常な（健康な）状態へ回復させる。これにより、自己治癒により細胞が回復すると共に、細胞内に導入された外来遺伝子（標的遺伝子等の遺伝子断片）が、植物細胞の遺伝子中に組み込まれ、安定した形質転換細胞を得ることができる。
通常、ウィスカ法により遺伝子組換えを行う場合は、ウィスカを除去してから損傷した細胞を回復させるが、工程（ｄ）では、ウィスカの除去を行わずに、損傷した細胞を回復させる。これにより、遺伝子導入効率を高めることが可能となる。
本明細書において、回復とは、ウィスカにより損傷した細胞を復元させ、分裂させることを意味する。
【００７２】
工程（ｄ）における培養では、基本培地（好ましくはＭＳ培地）で培養を行えばよい。
培地は、液体であっても固体であってもよいが、細胞全体に培地成分を供給しやすく、効果がより好適に得られるという理由から、液体培養が好ましい。また、誘導培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよいが、振とう培養が好ましい。
【００７３】
培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２０〜３５℃がより好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましく、０〜０．１ｌｘがより好ましい。
【００７４】
培養時間（工程（ｄ）を行う時間）は、特に限定されないが、好ましくは８０時間以上、より好ましくは１００時間以上、更に好ましくは１２０時間以上、特に好ましくは１４０時間以上、最も好ましくは１６０時間以上であり、上限は特に限定されない。工程（ｄ）の時間が通常（４８〜７２時間程度）より長いため、遺伝子導入効率をより高めることが可能となる。
【００７５】
工程（ｄ）では、ウィスカの除去を行わないため、工程（ｄ）におけるウィスカ、培養細胞の質量比（ウィスカの質量／培養細胞の質量）は、通常（０程度）に比べて大きく、好ましくは０．００５〜０．０５、より好ましくは０．０１〜０．０３である。上記範囲内であると、効果がより好適に得られる。
【００７６】
（工程（ｅ））
工程（ｅ）は、工程（ｄ）の後に、抗生物質を用いて、形質転換細胞を選別する工程である。具体的には、抗生物質を含有する選択培養培地で、工程（ｄ）により得られたカルスを培養する。これにより、形質転換されたカルスと、形質転換されていないカルスを選別できる。
【００７７】
工程（ｅ）は、遺伝子組換え法において一般的に行われている手法で行うことができる。
【００７８】
工程（ｅ）では、工程（ｄ）により得られたカルスは、抗生物質を含有する選択培養培地中で培養される。工程（ｅ）の培養条件は、形質転換細胞（標的遺伝子を獲得したカルス）が選択的に生育できる条件であれば、特に限定されない。
【００７９】
なお、選択培養培地は、液体であっても固体であってもよい。また、選択培養培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
【００８０】
選択培養培地としては、上述の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に、マーカー遺伝子（標的遺伝子と共に導入されたマーカー遺伝子）に対応する抗生物質を加えたものを使用すればよい。なかでも、ＭＳ培地、ＬＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地に上記マーカー遺伝子に対応する抗生物質を加えたものが好ましく、ＭＳ培地に上記マーカー遺伝子に対応する抗生物質を加えたものがより好ましい。また、必要に応じて植物生長ホルモンを加えてもよい。植物生長ホルモン、炭素源としては、上記誘導培地と同様のものが好適に使用できる。
【００８１】
上記マーカー遺伝子に対応する抗生物質としては、特に限定されないが、当業者であれば、使用したマーカー遺伝子に応じて適宜選択することができる。例えば、上記マーカー遺伝子として、カナマイシン耐性遺伝子を使用した場合には、カナマイシンを培地に添加してカルス（形質転換されたカルスと、形質転換されていないカルスの混合物）を培養することにより、形質転換されたカルスは、標的遺伝子と共にカナマイシン耐性遺伝子も導入されているため当該培地中で生育することができるが、形質転換されていないカルスは、当該培地中で生育することがない。このように、上記マーカー遺伝子に対応する抗生物質を加えた培地で、形質転換されたカルスと、形質転換されていないカルスの混合物を培養することにより、形質転換されたカルスを選択的に生育させることができる。
【００８２】
マーカー遺伝子として、カナマイシン耐性遺伝子（ｎｐｔＩＩ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｔＩ）、ブレオマイシン耐性遺伝子を使用した場合には、抗生物質として、それぞれ、カナマイシン、ハイグロマイシン、ブレオマイシンを使用すればよい。
【００８３】
上記方法では、外来遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子を含有し、工程（ｅ）で用いる抗生物質がカナマイシンである（選択培養培地がカナマイシンを含む）ことが好ましい。これにより、効果がより好適に得られる。
【００８４】
抗生物質の使用濃度（選択培養培地中の抗生物質の濃度）は、好ましくは１０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは８ｍｇ／Ｌ以下、更に好ましくは６ｍｇ／Ｌ以下であり、好ましくは１ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは２ｍｇ／Ｌ以上、更に好ましくは３ｍｇ／Ｌ以上である。上記範囲内であると、効果がより好適に得られる。
【００８５】
選択培養培地が固体培地の場合、上記誘導培地の場合と同様に、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。
【００８６】
培養温度は、０〜４０℃が好ましく、１０〜３６℃がより好ましく、２０〜２８℃が更に好ましく、２２〜２４℃が特に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましく、０〜０．１ｌｘがより好ましい。培養時間は、特に限定されないが、０．５〜１０週間培養することが好ましく、０．８〜２週間培養することがより好ましい。
【００８７】
固体培地の場合、選択培養培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下、更に好ましくは０．６質量％以下である。
【００８８】
以上のように、工程（ｅ）では、工程（ｄ）により得られたカルス（形質転換されたカルスと、形質転換されていないカルスの混合物）を、選択培養培地中で培養することにより、形質転換されたカルスを選択的に生育させることができ、形質転換されたカルスと、形質転換されていないカルスを選別できる。
【００８９】
遺伝子導入効率は、例えば、工程（ｅ）において、工程（ｄ）により得られたカルス（形質転換されたカルスと、形質転換されていないカルスの混合物）を培養し、該混合物のうち、生育したカルスの個数、すなわち、形質転換されたカルスの個数をカウントすることにより算出できる。具体的には、実施例に記載の方法により算出できる。
【００９０】
以上説明した方法により、ゴム産生植物の形質転換細胞（形質転換されたカルス）を効率的に作製できる。
【００９１】
（形質転換植物の作製）
次に、形質転換植物の作製方法について説明する。形質転換植物の作製は、上記方法により作製された形質転換細胞（形質転換されたカルス）を用いて、本願明細書の記載及び出願時の技術常識により当業者であれば適宜条件を変更して行うことができる。なお、通常よりも形質転換細胞が小さいため、必要であれば、形質転換細胞を増殖させて大きくしてから形質転換植物を作製してもよい。
【００９２】
簡単に説明すると、以下のように、上記方法により作製された形質転換細胞から、不定胚及びシュートを誘導し、シュートを伸長させ、発根させることにより植物体を再生すればよい。
【００９３】
（再生誘導工程）
再生誘導工程では、植物生長ホルモン及び炭素源を含む再生誘導培地中でカルス（形質転換されたカルス）を培養することにより不定胚及びシュートを形成させる。カルスから不定胚を誘導（形成）し、不定胚を培養することにより、安定的にシュートの形成を行うことができるため、再生誘導工程の培養条件は、カルスから不定胚を誘導できる条件であれば、特に限定されない。
【００９４】
再生誘導培地としては、上述の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に植物生長ホルモンを加えたものを使用すればよい。なかでも、ＭＳ培地、ＬＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地に植物生長ホルモンを加えたものが好ましく、ＭＳ培地に植物生長ホルモンを加えたものがより好ましい。植物生長ホルモン、炭素源としては、上記誘導培地と同様のものが好適に使用できる。また、不定胚の誘導に適しているという理由から、オーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを含むことが好ましい。
【００９５】
再生誘導培地のｐＨは、特に限定されないが、４．０〜１０．０が好ましく、５．６〜６．５がより好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２０〜３６℃がより好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、２４時間中１０〜１６時間明所で培養を行うことが好ましく、明所の照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましく、１０００〜５００００ｌｘがより好ましい。培養時間は、特に限定されないが、１〜５０週間培養することが好ましく、５〜１０週間培養することがより好ましい。
【００９６】
Ｓｏｎｃｈｕｓ属に属する植物（特に、ノゲシ）の場合、再生誘導培地は、ベースとなる培地としてＭＳ培地を使用し、再生誘導培地中のスクロースの濃度が２〜４質量％、ナフタレン酢酸の濃度が１×１０−３〜０．０３ｍｇ／ｌ、ベンジルアデニンの濃度が０．８〜１．２ｍｇ／ｌ、固形化剤（ゲランガム）の濃度が０．１〜０．３質量％であることが好ましい。
【００９７】
Ｈｅｖｅａ属に属する植物（特に、パラゴムノキ）の場合、再生誘導培地は、ベースとなる培地としてＭＳ培地を使用し、再生誘導培地中のナフタレン酢酸の濃度が０．０３〜０．５ｍｇ／ｌ、ベンジルアデニンの濃度が０．０１〜１．２ｍｇ／ｌ、固形化剤（ゲランガム）の濃度が０．１〜０．６質量％であることが好ましい。
【００９８】
以上のように、再生誘導工程では、カルス（形質転換されたカルス）を上記再生誘導培地中で培養することにより、不定胚及びシュートを形成させることが可能である。この再生誘導工程により形成されたシュートは、次の伸長工程に使用される。次の伸長工程に移るタイミングとしては、シュートから発芽が視認され、その後安定して成長していることが確認できた後が好ましい。
【００９９】
（伸長工程）
伸長工程では、形成されたシュートを伸長培地で培養することによりシュートを伸長させる。
【０１００】
伸長工程では、例えば、再生誘導工程により形成されたシュートを伸長培地中で培養してシュートを伸長させる。なお、伸長培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地上に置床して培養することで、シュートを伸長させやすいため、固体培養が好ましい。また、伸長培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
【０１０１】
伸長培地としては、上述の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等を使用すればよいが、シュートを好適に伸長できるという理由から、伸長培地が、植物生長ホルモンを含まない培地であることが好ましく、植物生長ホルモンを含まないＭＳ培地であることがより好ましい。なお、炭素源としては、上記誘導培地と同様のものが好適に使用できる。
【０１０２】
伸長培地のｐＨは、特に限定されないが、４．０〜１０．０が好ましく、５．６〜６．５がより好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２０〜３６℃がより好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、２４時間中１０〜１６時間明所で培養を行うことが好ましく、明所の照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましく、１０００〜５００００ｌｘがより好ましい。培養時間は、特に限定されないが、１〜１０週間培養することが好ましく、５〜１０週間培養することがより好ましい。
【０１０３】
以上のように、伸長工程では、形成されたシュートを上記伸長培地中で培養することにより、シュートを伸長させることが可能である。また、この伸長工程では、シュートが伸長するだけではなく、新たなシュートも形成される。この伸長工程により伸長させたシュートは、次の発根工程に使用される。次の発根工程に移るタイミングとしては、シュートが２〜３ｃｍ程度の大きさに伸長した後が好ましい。
【０１０４】
（発根工程）
発根工程では、伸長させたシュートを発根培地で培養することにより発根させる。
【０１０５】
発根工程では、例えば、伸長工程により伸長させたシュートを発根培地中で培養して発根させる。なお、発根培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地上に置床して培養することで、発根させやすいため、固体培養が好ましい。また、発根培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
【０１０６】
発根培地としては、上述の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等を使用すればよいが、好適に発根できるという理由から、発根培地が、植物生長ホルモンを含まない培地であることが好ましく、植物生長ホルモンを含まないＢ５培地がより好ましい。なお、炭素源としては、上記誘導培地と同様のものが好適に使用できる。なお、伸長培地と発根培地の組成が同一であってもよい。また、伸長工程において既に発根している場合には、この発根工程を省略してもよい。
【０１０７】
発根培地のｐＨは、特に限定されないが、４．０〜１０．０が好ましく、５．６〜６．５がより好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、１０〜３６℃がより好ましく、１０〜２５℃が更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、２４時間中１０〜１６時間明所で培養を行うことが好ましく、明所の照度は、２０００〜２５０００ｌｘが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、５〜１０週間培養することが好ましい。
【０１０８】
以上のように、発根工程では、伸長したシュートを上記発根培地中で培養することにより、発根させることが可能であり、発根させたシュート（幼植物（形質転換植物））が得られる。この幼植物は、直接土壌に移植してもよいが、バーキュライト等の人工土壌に移して馴化してから土壌に移植することが好ましい。
【０１０９】
以上の説明の通り、上記方法により、ゴム産生植物の形質転換細胞（形質転換されたカルス）を効率的に作製できる。また、カルス（形質転換されたカルス）から不定胚を誘導し、不定胚を培養することにより、安定的にシュートを形成させ、形成させたシュートを伸長させ、発根させることができ、カルス（形質転換されたカルス）を安定的に植物（形質転換植物）に再生できる。
【実施例】
【０１１０】
実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【０１１１】
（実施例１）
（工程（ａ））
＜パラゴムノキのカルスの調製（誘導工程）＞
パラゴムノキの葉を流水で１５分間洗浄し、７０％エタノールで１分間殺菌した。殺菌した葉は、１％次亜塩素酸ナトリウム溶液で１５分間撹拌しながら滅菌した。滅菌後、葉を滅菌水で３回洗浄し、水分を滅菌した紙でふき取った。
葉の葉脈部分にメスで、切れ目を入れた後ＣＩＭ培地（２ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）、２ｍｇ／Ｌ  ＢＡ（ベンジルアデニン）、３質量％  スクロース、０．２２質量％  ゲランガムを含むＭＳ培地）上に表面を密着させるように乗せた。２５℃、暗所下で培養し、２週間後得られたカルスを新しいＣＩＭ培地へと移し、カルス（培養細胞）を得た。
【０１１２】
（カルスの細分化（サイズ調整工程））
滅菌したビーカーの上に、穴の大きさが１．０ｍｍのステンレスメッシュを乗せ、カルスをメッシュ上に移動した。そして、カルスをスプーンで優しく撫で、カルスをメッシュに通し、小さい細胞塊を得た。この小さな細胞塊（培養細胞塊）を少量（２５ｍＬ程度）の液体培地１（３０ｍｇ／Ｌ  スクロース、２ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄを含むＭＳ培地）に懸濁し、培養細胞塊懸濁液（カルス懸濁液）を得た（培養細胞塊の大きさ：０．８ｍｍ）。
【０１１３】
（工程（ｂ））
＜ウィスカ懸濁液の調製＞
チタン酸カリウム製ウィスカ（チタン工業株式会社製品ＬＳ２０、平均繊維径：０．２〜０．６μｍ、平均繊維長：１０〜２０μｍ）５ｍｇを１．５ｍｌ容のチューブに入れ、エタノールを０．５ｍｌ加えて、一晩放置後、エタノールを完全に蒸発させ、殺菌されたウィスカを得た。このウィスカの入ったチューブに滅菌水１ｍｌを加え、よく撹拌した後、これを３０００ｒｐｍ／分、５分間遠心分離し、上清の水を捨てウィスカを洗浄した。この洗浄操作を３回行った後、同チューブ内に上記液体培地１を０．５ｍｌ加えてウィスカ懸濁液を得た。
【０１１４】
＜導入遺伝子の調製＞
導入遺伝子として、カナマイシン耐性遺伝子（ｎｐｔＩＩ）を保有するｐＵＣ１８を用いた。プラスミド（ｐＵＣ１８）は１ｍｇ／ｍｌの濃度でＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １０ｍＭ、ＥＤＴＡ  １ｍＭ、ｐＨ８．０）に溶解し、導入遺伝子溶液として、使用した。
【０１１５】
＜培養細胞とウィスカの混合＞
上記で得たウィスカ懸濁液の入ったチューブに、上記で得た培養細胞塊懸濁液を２５０μｌ入れて、撹拌後、１，０００ｒｐｍ／分で１０秒間遠心を行い、カルスとウィスカを沈殿させ、上清を捨てて、カルスとウィスカの混合物を得た。
【０１１６】
＜導入遺伝子の混合＞
上記で得た導入遺伝子溶液２０μｌ（プラスミド２０μｇ含有）に対して、上記液体培地１を１０μｌ加え、混合した後、上記のカルスとウィスカの混合物の入ったチューブに加え、カルス、ウィスカおよび導入遺伝子が添加された混合物を十分振り混ぜて混合物（培養細胞・ウィスカ分散液）を得た。
【０１１７】
＜培養細胞にウィスカを付着させる工程＞
次に、この混合物（培養細胞・ウィスカ分散液）の入ったチューブ（培養細胞・ウィスカ分散液中の培養細胞、ウィスカの質量比（培養細胞の質量／ウィスカの質量）：５０、培養細胞・ウィスカ分散液中のプラスミド、培養細胞の質量比（プラスミドの質量／培養細胞の質量）：１２５００、培養細胞・ウィスカ分散液中の培養細胞、ウィスカの合計濃度：０．５質量％）を１８，０００×ｇで５分間（温度：４℃）遠心分離し、遠心後、再度振り混ぜた。遠心分離し、再度振り混ぜる操作を３回行ない、培養細胞にウィスカを付着させた。
【０１１８】
（工程（ｃ）（遺伝子導入工程））
工程（ｂ）で得た混合物（遠心処理後の培養細胞・ウィスカ分散液）の入ったチューブを超音波発生機（浴槽型：媒体として水を使用）の浴槽にチューブが十分浸かるように設置し、周波数４０ｋＨｚ、強度０．２５Ｗ／ｃｍ２で１分間超音波を照射し、照射後、３０分間、４℃で静置することにより、ウィスカにより培養細胞を損傷させ、細胞内に外来遺伝子を導入した。
【０１１９】
（工程（ｄ）（細胞の回復工程））
遺伝子を導入したカルス（ウィスカ、培養細胞の質量比（ウィスカの質量／培養細胞の質量）：０．０２）を３．５ｃｍのシャーレに加え、ＭＳ培地を３ｍｌ加えて、２８℃、暗所にてローターリーシェーカー（５０ｒｐｍ／分）を用いて１週間（１６８時間）培養し、損傷した細胞を回復させ、分裂細胞を得た。この際に、洗浄等により、ウィスカの除去を行わなかった。
【０１２０】
（工程（ｅ）（形質転換細胞の選別））
得られた分裂細胞をカナマイシン（５ｍｇ／Ｌ）を含むＭＳ培地で、２３℃、暗所下で培養し、形質転換されたカルスと、形質転換されていないカルスを選別した。
なお、遺伝子導入効率の評価は、以下のように行った。
２〜３週間おきに上記抗生物質含有ＭＳ培地で２代に渡って継代培養を行い、生存カルスの個数をカウントし、遺伝子導入効率を算出した。
遺伝子導入効率（％）＝生存カルスの個数（個）／初期培養個数（個）×１００
初期培養個数＝６０個
【０１２１】
実施例１の遺伝子導入効率は、３０％であった。よって、（ａ）〜（ｅ）の各工程を含む方法により、ゴム産生植物の形質転換細胞を効率的に作製できることが分かった。