(57)【要約】      （修正有）【課題】ｍｉＲ−１３８の１つまたはそれ以上の活性を低減または阻害できる修飾オリゴヌクレオチドの提供。【解決手段】特定の配列を持ちロックド核酸修飾を含むオリゴヌクレオチドを提供する。ロックド核酸は、リボースの立体構造をロックする二環構造を生成する。さらに、このオリゴヌクレオチドはｍｉＲ−１３８のヌクレオチド配列に対して実質的に相補的である。加えて、このオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物、このオリゴヌクレオチドを使用する方法、およびその使用を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含むオリゴヌクレオチドであって、
前記オリゴヌクレオチドはｍｉＲ−１３８のヌクレオチド配列に対して実質的に相補的であり、
前記オリゴヌクレオチドは１つまたはそれ以上のｍｉＲ−１３８の活性を低減または阻害する、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記ロックド核酸は、リボースの立体構造をロックする二環構造を生成する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記二環構造は、２’酸素を４’炭素に接続する架橋を生成するリボース部分の修飾によって生成される、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記架橋は、エチレン、メチレン、またはオキシメチレン架橋である、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドは、細胞酵素による分解に抵抗する修飾をさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記修飾は、少なくとも１つのホスホロチオエート連結による修飾である、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドの５’末端および３’末端のみがホスホロチオエート連結によって修飾され、前記オリゴヌクレオチドの中間部分はホスホロチオエート連結によって修飾されない、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドは約１１ヌクレオチドから２３ヌクレオチドの長さである、請求項１から７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドは少なくとも２つのロックド核酸を含有する、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
非ロックド核酸は、２から４の連続した核酸として少なくとも２回含まれる、請求項１から９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドは、２または３または４以上の連続したロックド核酸を有する一続きの核酸を含有しない、請求項１から１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのホスホロチオエート連結を有する、請求項１から１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記ホスホロチオエート連結は、互いに独立に、前記オリゴヌクレオチドの３’末端および／または５’末端の少なくとも１に含まれる、請求項１２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドは、塩基加水分解およびヌクレアーゼに対する安定性を与える修飾をさらに含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
前記修飾は、非ロックド核酸のリボース部分の２−ヒドロキシル基に２’−Ｏ−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アルキル、２’−ハロ、または２’−フルオロを付加するステップを含む、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
配列５’−ＣＧＧＣＣＵＧＡＵＴＣＡＣＡＡＣＡＣＣＡＧＣＵ−３’（配列番号２；抗ｍＲＮＡ−１３８）、および５’−ＣＧＧＣＣＵＧＡＵＵＣＡＣＡＡＣＡＣＣＡＧＣＵ−３’（配列番号３；抗ｍＲＮＡ−１３８）を含み、配列番号２および配列番号３は独立に少なくとも１つのロックド核酸を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
前記ロックド核酸は、配列番号２の位置３、５、８、１０、１２、１５、１７、１９および２１にあり、ここで配列番号２の位置１は５’末端であり、配列番号２の位置２３は３’末端である、請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
前記ホスホロチオエート連結は、配列番号２の位置１から５、または１９から２３より独立に選択される、請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
前記ホスホロチオエート連結は、配列番号２の位置１、２、３、２０、２１、および２３にある、請求項１８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
前記修飾は、配列番号２の位置１、２、４、６、７、９、１１、１３、１４、１６、１８、２０、２２、２３における２’−Ｏ−メチル化である、請求項１９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
５’−ｍＣ＊ｍＧ＊Ｇ＊ｍＣＣｍＵｍＧＡｍＵＴｍＣＡｍＣｍＡＡｍＣＡｍＣＣｍＡ＊Ｇ＊ｍＣ＊ｍＵ−３’（配列番号１３）、５’−ｍＣ＊ｍＧ＊Ｇ＊ｍＣｍＣＴｍＧｍＡＴｍＵｍＣＡｍＣｍＡＡｍＣｍＡＣｍＣｍＡ＊Ｇ＊ｍＣ＊ｍＵ−３’（配列番号１２）、および５’−ｍＣ＊ｍＧ＊ｍＧ＊ｍＣｍＣＴｍＧＡｍＵＴｍＣＡｍＣＡｍＡＣｍＡＣｍＣｍＡ＊ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵ−３’（配列番号１０）からなる群より選択される配列の１つまたはそれ以上を含み、ここでｍは２’−Ｏ−メチル化であり、＊はホスホロチオエート結合であり、下線付きのヌクレオチドはロックド核酸修飾を表す、請求項１から２０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
配列５’−Ａ＊Ｃ＊ＡＡＣＡＣＣＡＧ＊Ｃ＊−３’（配列番号５）を含み、ここで＊はホスホロチオエート結合であり、下線付きのヌクレオチドはロックド核酸修飾を表す、請求項１から１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
有効量の、請求項１から２２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、またはその薬学的に許容できる塩と、薬学的に許容できる担体または希釈剤とを含む、医薬組成物。
【請求項２４】
処置を必要とする対象における増殖性疾患を処置する方法であって、請求項１から２２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項２５】
前記増殖性疾患は良性の腫瘍または癌である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記癌は、悪性神経膠腫および乳癌からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
処置を必要とする対象において増殖性疾患を処置するための薬物の製造における、請求項１から２２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２８】
細胞内のｍｉＲ−１３８の活性を低減または阻害する方法であって、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドに前記細胞を接触させるステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年７月３１日に提出されたシンガポール特許出願第１０２０１４０４５３５Ｓ号による優先権の利益を主張するものであり、本明細書においてその内容全体がすべての目的に対して引用により援用される。
【０００２】
本発明は生化学、特にバイオマーカーに関する。特に、本発明はバイオマーカーｍｉＲ−１３８の発現を制御できるオリゴヌクレオチド、ならびにその医薬組成物およびバイオマーカーの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ：ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ）とは、遺伝子サイレンシングを介して、たとえば細胞の分化および増殖などのさまざまな生理学的経路を制御する、内在性の小さな非コードＲＮＡである。マイクロＲＮＡは、さまざまな増殖性疾患の開始、進行および最終的な転移に寄与すると考えられている。たとえば、ｍｉＲＮＡの発現の制御不全によって、そのターゲットタンパク質の異常な発現がもたらされて、結果的に細胞の表現型が変わることがある。ｍｉＲＮＡ制御ネットワークの障害は、たとえば癌などの増殖性疾患の病原性の主要な機構の１つであることが公知である。よって、ｍｉＲＮＡの発現に影響する可能性を有する分子を提供することが必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
１つの局面において、少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ：ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を含むオリゴヌクレオチドが提供され、このオリゴヌクレオチドはｍｉＲ−１３８のヌクレオチド配列に対して実質的に相補的であり、このオリゴヌクレオチドは１つまたはそれ以上のｍｉＲ−１３８の活性を低減または阻害する。
【０００５】
別の局面において、有効量の本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド、またはその薬学的に許容できる塩と、薬学的に許容できる担体または希釈剤とを含む医薬組成物が提供される。
【０００６】
別の局面において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドを対象に投与するステップを含む、処置を必要とする対象において増殖性疾患を処置する方法が提供される。
【０００７】
別の局面において、処置を必要とする対象において増殖性疾患を処置するための薬物の製造における、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの使用が提供される。
【０００８】
別の局面において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドに細胞を接触させるステップを含む、細胞内のｍｉＲ−１３８の活性を低減または阻害する方法が提供される。
【０００９】
非限定的な例および添付の図面とともに考慮されるとき、詳細な説明を参照することによって本発明がよりよく理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例セクションに記載される、抗ｍｉＲ−１３８オリゴヌクレオチドでトランスフェクトしたＵ８７ＭＧ細胞（ヒト神経膠芽腫細胞系）の光学顕微鏡画像を示す図である。特に、図１は、４０ナノモルのアンチセンスオリゴ、抗ｍｉＲ−１３８−１（配列番号１０）、抗ｍｉＲ−１３８−２（配列番号１２）、抗ｍｉＲ−１３８−３（配列番号１３）、抗ｍｉＲ−１３８−４（配列番号７または「オリゴ−４」）、およびネガティブコントロール（抗ｍｉＲ−１３８−１、抗ｍｉＲ−１３８−２、および抗ｍｉＲ−１３８−３に対する「スクランブルコントロール」；オリゴ−４に対する「コントロール配列」）によるトランスフェクションの７日後のＵ８７ＭＧ細胞を示す。図１に用いられるアンチセンスオリゴの配列は、下の表１に提供されている。図１は、抗ｍｉＲ−１３８オリゴヌクレオチドがＵ８７ＭＧ細胞の増殖を阻害するのに対し、コントロールアンチセンスオリゴがＵ８７ＭＧ細胞の増殖を阻害することは見出されなかったことを示す。よって、抗ｍｉＲ−１３８オリゴヌクレオチドは悪性神経膠腫の増殖を防ぎ得ることを示す。
【図２】Ｕ８７ＭＧ細胞（ヒト神経膠芽腫細胞系）におけるｍｉＲ−１３８レベルのｍｉＲＮＡ定量化の結果の棒グラフを示す図である。図１において説明した抗ｍｉＲ−１３８オリゴヌクレオチドによるトランスフェクションの７日後に収集した細胞からＲＮＡを単離した。図２の左のパネルは、レンチウイルスのアンタゴｍｉｒによるｍｉＲ−１３８発現の制御を示す。図２の右のパネルは、修飾抗ｍｉＲ−１３８オリゴヌクレオチドが、Ｕ８７ＭＧ細胞におけるｍｉＲ１３８発現を阻害することを示す。よって図２は、修飾抗ｍｉＲ１３８−３（すなわち表１のＡＭＯ＿１３８＿２３＿３）オリゴヌクレオチドが、ｍｉＲ−１３８の発現の阻害においてｍｉＲ−１３８レンチウイルスのアンタゴｍｉｒと同様に有効であることを示す。
【図３】神経膠芽腫幹細胞（ＧＳＣ：ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）およびＵ８７ＭＧ（ヒト神経膠芽腫細胞系）の両方におけるｍｉＲ−１３８発現の制御を示す図である。特に、図３は、２つの非ターゲティングコントロール（すなわちスクランブルおよび抗ｍｉＲ−１０６）に比べて、抗ｍｉＲ−１３８−３（すなわち表１のＡＭＯ＿１３８＿２３＿３）オリゴヌクレオチドがｍｉＲ−１３８の発現を有意にダウンレギュレートすることを示す。＊＊ｐ＜０．００１。
【図４】抗ｍｉＲ−１３８オリゴヌクレオチドによるトランスフェクション後のＵ８７ＭＧ細胞（ヒト神経膠芽腫細胞系）におけるｍｉＲ−１３８の相対的発現レベルを示す図である。図４は、修飾オリゴヌクレオチドである抗ｍｉＲ−１３８−１（配列番号１０）、抗ｍｉＲ−１３８−２（配列番号１２）、抗ｍｉＲ−１３８−３（配列番号１３）、抗ｍｉＲ−１３８−４（配列番号７または「オリゴ−４」）、およびネガティブコントロール（抗ｍｉＲ−１３８−１、抗ｍｉＲ−１３８−２、および抗ｍｉＲ−１３８−３に対する「スクランブルコントロール」；オリゴ−４に対する「コントロール配列」）によるトランスフェクションを示す。よって図４は、実施例セクションに記載されるオリゴヌクレオチドが、ヒト神経膠芽腫細胞におけるｍｉＲ−１３８の発現をダウンレギュレートできることを示す。
【図５】抗ｍｉＲ−１３８オリゴヌクレオチドによるＴＸＮＩＰ遺伝子（チオレドキシン相互作用タンパク質（Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子）発現の制御を示す図である。２つの非ターゲティングコントロールに比べて、抗ｍｉＲ−１３８−１（配列番号１０）、抗ｍｉＲ−１３８−２（配列番号１２）、抗ｍｉＲ−１３８−３（配列番号１３）、および抗ｍｉＲ−１３８−４（配列番号７または「オリゴ−４」または「１３８−４」）は、ＴＸＮＩＰ遺伝子を有意にアップレギュレートする。図５は、使用した他のオリゴヌクレオチドに比べて、抗ｍｉＲ−１３８−３および抗ｍｉＲ−１３８−４オリゴヌクレオチドがより多くのＴＸＮＩＰをアップレギュレートするように見えることを示す。
【図６】抗ｍｉＲ−１３８オリゴヌクレオチドによるＰＡＮＸ２遺伝子（パネキシン２（ｐａｎｎｅｘｉｎ  ２））発現の制御を示す図である。２つの非ターゲティングコントロールに比べて、抗ｍｉＲ−１３８−１（配列番号１０）、抗ｍｉＲ−１３８−２（配列番号１２）、抗ｍｉＲ−１３８−３（配列番号１３）、および抗ｍｉＲ−１３８−４（配列番号７または「オリゴ−４」または「１３８−４」またはＡＭＯ＿１３８＿１１＿ｃａｐ＿ＰＳ）は、ＰＡＮＸ２遺伝子を有意にアップレギュレートする。図６は、抗ｍｉＲ−１３８−３および抗ｍｉＲ−１３８−４オリゴヌクレオチドがより良好にＰＡＮＸ２遺伝子をアップレギュレートするように見えることを示す。
【図７】抗ｍｉＲ−１３８オリゴヌクレオチドによるＣＡＳＰ３遺伝子（カスパーゼ３（ｃａｓｐａｓｅ−３））発現の制御を示す図である。２つの非ターゲティングコントロールに比べて、抗ｍｉＲ−１３８−１（配列番号１０）、抗ｍｉＲ−１３８−２（配列番号１２）、抗ｍｉＲ−１３８−３（配列番号１３）、および抗ｍｉＲ−１３８−４（配列番号７または「オリゴ−４」または「１３８−４」またはＡＭＯ＿１３８＿１１＿ｃａｐ＿ＰＳ）は、ＣＡＳＰ３遺伝子を有意にアップレギュレートする。図７は、抗ｍｉＲ１３８−２、抗ｍｉＲ１３８−３および抗ｍｉＲ１３８−４オリゴヌクレオチドが抗ｍｉＲ１３８−１よりも良好にＣＡＳＰ３をアップレギュレートするように見えることを示す。
【図８】抗ｍｉＲ−１３８オリゴヌクレオチドによるＭＸＤ１遺伝子（ＭＡＸ二量化タンパク質１（ＭＡＸ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １））発現の制御を示す図である。２つの非ターゲティングコントロールに比べて、抗ｍｉＲ−１３８−１（配列番号１０）、抗ｍｉＲ−１３８−２（配列番号１２）、抗ｍｉＲ−１３８−３（配列番号１３）、および抗ｍｉＲ−１３８−４（配列番号７または「オリゴ−４」または「１３８−４」またはＡＭＯ＿１３８＿１１＿ｃａｐ＿ＰＳ）は、ＭＸＤ１遺伝子を有意にアップレギュレートする。図８は、抗ｍｉＲ１３８−３および抗ｍｉＲ１３８−４オリゴヌクレオチドがどちらも抗ｍｉＲ１３８−１および抗ｍｉＲ１３８−２よりもＭＸＤ１遺伝子をアップレギュレートするように見えることを示す。
【図９】抗ｍｉＲ−１３８オリゴヌクレオチドによるｃＭＹＣ遺伝子（ｖ−ｍｙｃトリ骨髄細胞腫症ウイルス癌遺伝子相同遺伝子）発現の制御を示す図である。２つの非ターゲティングコントロールに比べて、抗ｍｉＲ−１３８−１（配列番号１０）、抗ｍｉＲ−１３８−２（配列番号１２）、抗ｍｉＲ−１３８−３（配列番号１３）、および抗ｍｉＲ−１３８−４（配列番号７または「オリゴ−４」または「１３８−４」またはＡＭＯ＿１３８＿１１＿ｃａｐ＿ＰＳ）は、ｃＭＹＣ遺伝子を有意にダウンレギュレートする。図９は、抗ｍｉＲ１３８−３オリゴヌクレオチドによるｃＭＹＣ制御の性能がより良好な傾向があることを示す。
【図１０】抗ｍｉＲ−１３８オリゴヌクレオチドによるＧＡＡＤ４５Ａ遺伝子（ＤＮＡ損傷誘導性遺伝子４５アルファ）発現の制御を示す図である。２つの非ターゲティングコントロールに比べて、抗ｍｉＲ−１３８−１（配列番号１０）、抗ｍｉＲ−１３８−２（配列番号１２）、抗ｍｉＲ−１３８−３（配列番号１３）、および抗ｍｉＲ−１３８−４（配列番号７または「オリゴ−４」または「１３８−４」またはＡＭＯ＿１３８＿１１＿ｃａｐ＿ＰＳ）は、ＧＡＡＤ４５Ａ遺伝子を有意にアップレギュレートする。図１０は、抗ｍｉＲ１３８−３および抗ｍｉＲ１３８−４オリゴヌクレオチドによるＧＡＡＤ４５Ａ制御の性能がより良好な傾向があることを示す。
【図１１】抗ｍｉＲ−１３８オリゴヌクレオチドによるＡＵＲＫＡ遺伝子（オーロラキナーゼＡ（ａｕｒｏｒａ  ｋｉｎａｓｅ  Ａ）遺伝子）発現の制御を示す図である。２つの非ターゲティングコントロールに比べて、抗ｍｉＲ−１３８−１（配列番号１０）、抗ｍｉＲ−１３８−２（配列番号１２）、抗ｍｉＲ−１３８−３（配列番号１３）、および抗ｍｉＲ−１３８−４（配列番号７または「オリゴ−４」または「１３８−４」またはＡＭＯ＿１３８＿１１＿ｃａｐ＿ＰＳ）は、ＡＵＲＫＡ遺伝子を有意にダウンレギュレートする。図１１は、抗ｍｉＲ１３８−２および抗ｍｉＲ１３８−３オリゴヌクレオチドによるＡＵＲＫＡ制御の性能がより良好な傾向があることを示す。
【図１２】抗ｍｉＲ−１３８オリゴヌクレオチドによるＢＬＣＡＰ遺伝子（膀胱癌関連タンパク質（ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子）発現の制御を示す図である。２つの非ターゲティングコントロールに比べて、抗ｍｉＲ−１３８−１（配列番号１０）、抗ｍｉＲ−１３８−２（配列番号１２）、抗ｍｉＲ−１３８−３（配列番号１３）、および抗ｍｉＲ−１３８−４（配列番号７または「オリゴ−４」または「１３８−４」またはＡＭＯ＿１３８＿１１＿ｃａｐ＿ＰＳ）は、ＢＬＣＡＰ遺伝子を有意にアップレギュレートする。図１２は、抗ｍｉＲ１３８−１、抗ｍｉＲ１３８−３および抗ｍｉＲ１３８−４オリゴヌクレオチドによるＢＬＣＡＰ制御の性能がより良好な傾向があることを示す。
【図１３】抗ｍｉＲ−１３８オリゴヌクレオチドによるＢＣＬ２遺伝子（Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫２（Ｂ−ｃｅｌｌ  ＣＬＬ／ｌｙｍｐｈｏｍａ  ２）遺伝子）発現の間接的な制御を示す図である。２つの非ターゲティングコントロールに比べて、抗ｍｉＲ−１３８−１（配列番号１０）、抗ｍｉＲ−１３８−２（配列番号１２）、抗ｍｉＲ−１３８−３（配列番号１３）、および抗ｍｉＲ−１３８−４（配列番号７または「オリゴ−４」または「１３８−４」またはＡＭＯ＿１３８＿１１＿ｃａｐ＿ＰＳ）は、ＢＣＬ２遺伝子を有意にダウンレギュレートする。図１３は、抗ｍｉＲ１３８−３および抗ｍｉＲ１３８−４オリゴヌクレオチドによるＢＣＬ２制御の性能がより良好な傾向があることを示す。
【図１４】抗ｍｉＲ−１３８オリゴヌクレオチドによるＨＩＦ１Ａ遺伝子（低酸素誘導因子１アルファ（ｈｙｐｏｘｉａ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ  １  ａｌｐｈａ）遺伝子）発現の間接的な制御を示す図である。２つの非ターゲティングコントロールに比べて、抗ｍｉＲ−１３８−１（配列番号１０）、抗ｍｉＲ−１３８−２（配列番号１２）、抗ｍｉＲ−１３８−３（配列番号１３）、および抗ｍｉＲ−１３８−４（配列番号７または「オリゴ−４」または「１３８−４」またはＡＭＯ＿１３８＿１１＿ｃａｐ＿ＰＳ）は、ＨＩＦ１Ａ遺伝子を有意にダウンレギュレートする。図１４は、抗ｍｉＲ１３８−１、抗ｍｉＲ１３８−２および抗ｍｉＲ１３８−３オリゴヌクレオチドによるＨＩＦ１Ａ制御の性能がより良好な傾向があることを示す。
【図１５】抗ｍｉＲ−１３８オリゴヌクレオチドによるＬＡＳＰ１遺伝子（ＬＩＭおよびＳＨ３ドメインタンパク質（ＬＩＭ  ａｎｄ  ＳＨ３  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子）発現の間接的な制御を示す図である。２つの非ターゲティングコントロールに比べて、抗ｍｉＲ−１３８−１（配列番号１０）、抗ｍｉＲ−１３８−２（配列番号１２）、抗ｍｉＲ−１３８−３（配列番号１３）、および抗ｍｉＲ−１３８−４（配列番号７または「オリゴ−４」または「１３８−４」またはＡＭＯ＿１３８＿１１＿ｃａｐ＿ＰＳ）は、ＬＡＳＰ１遺伝子を有意にダウンレギュレートする。図１５は、抗ｍｉＲ１３８−１および抗ｍｉＲ１３８−３オリゴヌクレオチドによるＬＡＳＰ１制御の性能がより良好な傾向があることを示す。
【図１６】抗ｍｉＲ−１３８−３オリゴヌクレオチドによる、さまざまな遺伝子の発現の制御を示す図である。抗ｍｉＲ−１３８−３オリゴヌクレオチドによって有意に制御される遺伝子は、ＭＸＤ１、ＣＡＳＰ３、ＢＬＣＡＰ、ＴＸＮＩＰ、ＴＵＳＣ２、ＰＡＮＸ２、ＧＡＤＤ４５α、ＨＩＦ１α、ＬＡＳＰ１、ｃＭＹＣ、ＢＣＬ２、およびＡＵＲＫＡである。抗ｍｉＲ−１３８−３オリゴヌクレオチド（すなわち配列番号１３）によるｍｉＲ−１３８発現の制御を、スクランブルコントロールと比較する。＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．００１。よって図１６は、抗ｍｉＲ−１３８−３オリゴヌクレオチドがｍｉＲ−１３８ターゲットレベルをアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることを示す。
【図１７】抗ｍｉＲ−１３８−３オリゴヌクレオチド（配列番号１３）または非ターゲティングコントロール（スクランブルまたは抗ｍｉＲ−１０６ａオリゴヌクレオチド）によるトランスフェクション後のＵ８７ＭＧ細胞（ヒト神経膠芽腫細胞）の顕微鏡画像を示す図である。図１７は、スクランブルまたは抗ｍｉＲ−１０６ａオリゴヌクレオチドのいずれかでトランスフェクトされたときに、Ｕ８７ＭＧ細胞がコンフルエンス密度まで増殖することを示す（一番左の列および中央の列）。これに対し、抗ｍｉＲ−１３８でトランスフェクトされた細胞（一番右の列）は増殖した様子がみられず、多くのアポトーシスブレブまたは細胞デブリが観察される。よって図１７は、抗ｍｉＲ−１３８−３オリゴヌクレオチドがＵ８７ＭＧ細胞の増殖を妨げてアポトーシス性の死をもたらすことを示す。
【図１８】移植の２、１０、１８または２６日（デイ）後の、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒγ（重症複合免疫不全非肥満糖尿病（ｓｅｖｅｒｅ−ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｎｏｎ−ｏｂｅｓｅ  ｄｉａｂｅｔｉｃ））マウスの前脳における、ルシフェラーゼを発現するＵ８７ＭＧグリオーマ（神経膠腫）細胞の生物発光イメージングを示す図である。ＮＯＤ−ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒγマウス（インターロイキン２受容体（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を有する重症複合免疫不全非肥満糖尿病マウス）の頭蓋に注射する前に、ルシフェラーゼを発現するＵ８７ＭＧグリオーマ細胞を非ターゲティングコントロールまたは抗ｍｉＲ−１３８−３（配列番号１３）オリゴヌクレオチドでトランスフェクトし、神経学的症状が現れるまで維持した。ＩＶＩＳスペクトル・イメージング・システム（ｓｐｅｃｔｒｕｍ・Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）（キセノゲン（Ｘｅｎｏｇｅｎ））を用いてイメージングのためのキセノゲン・システムを行い、リビング・イメージ（Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ）ソフトウェア（ＩＶＩＳリビング・イメージｖ３．０）を用いて分析した。図１８は、抗ｍｉＲ−１３８−３オリゴヌクレオチドでトランスフェクトしたＵ８７ＭＧ細胞が、頭蓋内腫瘍を形成しないことを示す。デイ２６までに、抗ｍｉＲ−１３８−３オリゴヌクレオチドで形質転換したＵ８７ＭＧを注射したマウスではルシフェラーゼポジティブ細胞が検出されなかった。これに対し、コントロール抗ｍｉＲでトランスフェクトしたＵ８７ＭＧ細胞は、注射後のデイ１０からデイ２６まで線形的に増殖した。よって図１８は、抗ｍｉＲ１３８のトランスフェクションによって、インビボでのグリオーマ細胞の増殖を阻害できることを示す。
【図１９】Ｕ８７ＭＧ細胞（ヒト神経膠芽腫細胞系）におけるｍｉＲ−１３８レベルのｍｉＲＮＡ定量化の結果の棒グラフを示す図である。抗ｍｉＲ−１３８（すなわちＡＭＯ）によるトランスフェクションの５日後に収集した細胞からＲＮＡを単離した。図１９は特に、ＡＭＯ＿１３８＿１１＿Ｃａｐ＿ＰＳ（すなわち、完全なロックド核酸修飾およびオリゴヌクレオチドの両端部におけるホスホロチオエート（ＰＳ）修飾を有する修飾オリゴヌクレオチド、表１の第３行）またはそのコントロール（すなわち、ＡＭＯ＿Ｃｏｎｔｒｏｌ＿１１＿ＰＳ端部、表１の第４行）によるトランスフェクション後のｍｉＲ−１３８のレベルの棒グラフを示す。細胞系におけるｍｉＲ−１３８のノックダウンが観察され、有意な毒性細胞死は観察されなかった。すべての実験において、４０ナノモルのオリゴヌクレオチドを用いた。よって図１９は、１１ヌクレオチドの修飾抗ｍｉＲ−１３８オリゴヌクレオチドが、細胞系においてｍｉＲ−１３８をノックダウンできることを示す。
【図２０】抗ｍｉＲ−１３８オリゴヌクレオチド（修飾された２３塩基長のオリゴヌクレオチド）によるトランスフェクション後のＵ８７ＭＧ細胞（ヒト神経膠芽腫細胞系）におけるｍｉＲ−１３８の相対的発現レベルを示す図である。Ａ）は、ロックド核酸、ホスホロチオエート結合、２’−Ｏ−メチル化修飾およびコレステロールキャップによって修飾された２３塩基長オリゴヌクレオチド（すなわちＡＭＯ＿１３８＿２３、表１の第７行）、またはコントロール（すなわち、ＡＭＯ＿Ｃｏｎｔｒｏｌ＿２３、表１の第８行）のいずれかによるトランスフェクション後のｍｉＲ−１３８発現の棒グラフを示す。トランスフェクションの際に、細胞系におけるｍｉＲ−１３８のレベルは有意にダウンレギュレートされ（Ａ、右パネル）、これはレンチウイルスの形質導入後のダウンレギュレーション（Ａ、左パネル）に匹敵する。Ｂ）は、ＡＭＯ＿１３８＿２３（表１の第７行）、ミスマッチコントロール（すなわちＡＭＯ＿Ｃｏｎｔｒｏｌ＿２３、表１の第８行）、またはネガティブコントロールＡＭＯ＿１０６＿２３（表１の第９行）によるトランスフェクションの際の細胞の光学顕微鏡画像を示す。毒性細胞死は観察されず、細胞は培養物または軟寒天のいずれにおいても増殖および生育し、コロニーを形成した。よって、２’Ｏ−メチル化、ロックド核酸、（オリゴヌクレオチドのいずれかの端部における）ホスホロチオエート連結、およびコレステロールキャップ修飾の混合は、修飾オリゴヌクレオチドを細胞に対して毒性にしないことが示される（ＢおよびＣ）。しかし、ＡＭＯ＿１３８＿２３でトランスフェクトされた細胞は、有意なアポトーシス細胞死を示し、コロニー形成は抑制されたことが示される。よって、細胞系におけるｍｉＲ−１３８の欠乏は増殖を妨げ、アポトーシス細胞死を誘導することが示される（ＢおよびＣ）。コントロールとして抗ｍｉＲ１０６オリゴヌクレオチド（ｍｉＲ−１０６ａをターゲティングするＡＭＯ）も導入した。Ｕ８７ＭＧ細胞（悪性グリオーマ細胞系）をＡＭＯ＿１０６ａ＿２３（コントロール、表１の第９行）でトランスフェクトしたとき、細胞は増殖してコロニーを形成した。よって、Ｂ（一番右のパネル）において観察される表現型はｍｉＲ−１３８のみに対する特異的なものであり、任意の短い二本鎖構造の形成は細胞死をもたらすことも増殖を妨げることもないことが示される（図２ｂ、２ｃ）。すべての実験において、４０ナノモルのオリゴヌクレオチドを用いた。よって図２０は、２３ヌクレオチド（塩基長）の修飾抗ｍｉＲ−１３８オリゴヌクレオチドが、細胞系においてｍｉＲ−１３８をノックダウンしてアポトーシス細胞死をもたらし得ることを示す。
【図２１】細胞系への抗ｍｉＲ−１３８オリゴヌクレオチド（修飾された２３塩基長のオリゴヌクレオチド）の形質導入の影響の分析を示す図である。図２１において使用される抗ｍｉＲ−１３８オリゴヌクレオチドは、ロックド核酸、ホスホロチオエート結合、および２’−Ｏ−メチル化修飾を有する。図２０とは異なり、どの修飾オリゴヌクレオチドもコレステロールキャップ修飾を有さない。これらのオリゴヌクレオチドは、ＡＭＯ＿１３８＿２３＿１、ＡＭＯ＿１３８＿２３＿２、ＡＭＯ＿１３８＿２３＿３、およびＡＭＯ＿Ｃｏｎｔｒｏｌ＿２３＿１（すなわち表１の第１０行、第１１行、第１２行、および第１３行）と呼ばれる。すべての実験において、４０ナノモルのオリゴヌクレオチドを用いた。Ａ）は、３つすべての修飾オリゴヌクレオチド（すなわち「ＡＭＯ」）およびコントロールでトランスフェクトされた細胞系におけるｍｉＲ−１３８発現の棒グラフを示す。修飾抗ｍｉＲ１３８オリゴヌクレオチドは、コントロールＡＭＯに比べて、ｍｉＲ−１３８のレベルを有意にダウンレギュレートすることが観察される。コントロールでトランスフェクトされた細胞は健全な増殖を示し、細胞は培養物中で増殖および生育することが観察された。毒性細胞死は観察されなかった。これに対し、ＡＭＯ＿１３８＿２３＿１、ＡＭＯ＿１３８＿２３＿２、またはＡＭＯ＿１３８＿２３＿３でトランスフェクトされた細胞は、有意なアポトーシス細胞死を示した。よって、ｍｉＲ−１３８の欠乏はアポトーシス細胞死をもたらすことが示される（データは示さず）。Ｂ）は、（複数の生物学的複製による）上の図１０に示される細胞系におけるＧＡＤＤ４５ａの発現の、更新された棒グラフを示す。細胞がｍｉＲ−１３８に対するＡＭＯでトランスフェクトされるとき、ｍｉＲ−１３８の直接のターゲットであるＧＡＡＤ４５ａ（左パネル）のアップレギュレーションが観察された。Ｃ）は、（複数の生物学的複製による）上の図５に示される細胞系におけるＴＸＮＩＰの発現の、更新された棒グラフを示す。同時に、ＡＵＲＫＡ（右パネル）のダウンレギュレーションも観察された。細胞にＡＭＯ−１３８を形質導入するとき、たとえばサイクリンＡ２の転写リプレッサーであるチオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）などの転移サプレッサーのアップレギュレーションが明瞭に観察される。よって図２１は、ｍｉＲ−１３８の欠乏が細胞増殖の阻害をもたらすことを示す。
【図２２】抗ｍｉＲ−１３８オリゴヌクレオチドによるＭＸＤ１遺伝子（ＭＡＸ二量化タンパク質１）発現の制御を示す図である。Ａ）は、図８および図９に示されるｍｉＲ−１３８によって制御される２つの遺伝子の相対的発現レベルの、更新された棒グラフを示す。左のパネルは、コントロールに比べて抗ｍｉＲ−１３８−１、抗ｍｉＲ−１３８−２、および抗ｍｉＲ−１３８−３がＭＸＤ１遺伝子をアップレギュレートすることを示す。よってＡ（左パネル）は、抗ｍｉＲ−１３８−３オリゴヌクレオチドがＭＸＤ１遺伝子をアップレギュレートすると考えられることを示す。右のパネルは、抗ｍｉＲ−１３８オリゴヌクレオチドによるｃＭＹＣ遺伝子（ｖ−ｍｙｃトリ骨髄細胞腫症ウイルス癌遺伝子相同遺伝子）発現の制御を示す。２つの非ターゲティングコントロールに比べて、抗ｍｉＲ−１３８−１、抗ｍｉＲ−１３８−２、および抗ｍｉＲ−１３８−３は、ｃＭＹＣ遺伝子を有意にダウンレギュレートする。よってＡ（右パネル）は、抗ｍｉＲ１３８−３オリゴヌクレオチドによるｃＭＹＣ制御の性能がより良好な傾向があることを示す。Ｂ）は、腫瘍サプレッサー機能を有する脳特異的ギャップ結合タンパク質であるパネキシン２（ＰＡＮＸ２）の相対的発現レベルの、（上の図６からの）更新された棒グラフを示す。２つの非ターゲティングコントロールに比べて、抗ｍｉＲ−１３８−１、抗ｍｉＲ−１３８−２、および抗ｍｉＲ−１３８−３は、ＰＡＮＸ２遺伝子を有意にアップレギュレートする。
【図２３】抗ｍｉＲ−１３８オリゴヌクレオチドによる、さまざまな遺伝子の発現の制御を示す図である。抗ｍｉＲ−１３８−３オリゴヌクレオチドによって有意に制御される遺伝子は、ＭＸＤ１、ＣＡＳＰ３、ＢＬＣＡＰ、ＴＸＮＩＰ、ＴＵＳＣ２、ＰＡＮＸ２、ＧＡＤＤ４５α、ＨＩＦ１α、ＬＡＳＰ１、ｃＭＹＣ、ＢＣＬ２、およびＡＵＲＫＡである。修飾抗ｍｉＲ−１３８−３オリゴヌクレオチドによるｍｉＲ−１３８発現の制御を、スクランブルコントロールと比較する。＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．００１。よって図２３は、抗ｍｉＲ−１３８−３オリゴヌクレオチドがｍｉＲ−１３８ターゲットレベルをアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることを示す。
【図２４】インビボでの修飾オリゴヌクレオチドの影響に対する研究の結果を示す図である。Ａ）は、細胞系の移植後のデイ２、１０、１８または２６における、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒγ（ＩＬ２ｒγ受容体を有する重症複合免疫不全非肥満糖尿病）マウスの前脳における、ルシフェラーゼを発現するＵ８７ＭＧグリオーマ細胞の生物発光イメージングを示す。頭蓋内注射の前に、ルシフェラーゼを発現するＵ８７ＭＧグリオーマ細胞を非ターゲティングコントロールまたは修飾抗ｍｉＲ−１３８−３オリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。ＩＶＩＳスペクトル・イメージング・システム（キセノゲン）を用いてイメージングのためのキセノゲン・システムを行い、リビング・イメージ・ソフトウェア（ＩＶＩＳリビング・イメージｖ３．０）を用いて分析した。図面の左のパネルは、修飾抗ｍｉＲ−１３８−３オリゴヌクレオチド（すなわち、表１のＡＭＯ＿１３８＿２３＿３）でトランスフェクトしたＵ８７ＭＧ細胞が、頭蓋内腫瘍を形成しないことを示す。デイ２６までに、抗ｍｉＲ−１３８−３オリゴヌクレオチド（すなわち、表１のＡＭＯ＿１３８＿２３＿３）で形質転換したＵ８７ＭＧを注射したマウスではルシフェラーゼポジティブ細胞が検出されなかった。これに対し、コントロール抗ｍｉＲでトランスフェクトしたＵ８７ＭＧ細胞は、注射後のデイ１０からデイ２６まで線形的に増殖した。よって図２４Ａ（左パネル）は、抗ｍｉＲ１３８（すなわち、表１のＡＭＯ＿１３８＿２３＿３）のトランスフェクションによって、インビボでのグリオーマ細胞の増殖を阻害できることを示す。図２４Ａ（右パネル）に、生物発光の定量化が表される。（＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．００１。）Ｂ）は、腫瘍にコントロールまたは抗ｍｉＲ１３８オリゴヌクレオチド（すなわち、表１のＡＭＯ＿１３８＿２３＿３）を注射したときの、皮下腫瘍量の写真画像を示す。ここでは、Ｕ８７ＭＧグリオーマ細胞を隣接領域のいずれかの側において皮下注射した。デイ２１に、抗ｍｉＲ１３８オリゴヌクレオチド（すなわち、表１のＡＭＯ＿１３８＿２３＿３）またはコントロールを腫瘍に直接注射した。抗ｍｉＲ１３８オリゴヌクレオチド（すなわち、表１のＡＭＯ＿１３８＿２３＿３）で処置した腫瘍においては、デイ３２に有意な増殖阻害および腫瘍量の低減が観察された。写真画像の下の線グラフに、生物発光の定量化が表される（＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図２５】抗ｍｉＲ−１３８を用いてｍｉＲ１３８を欠乏させた後の、Ｕ８７ＭＧ細胞（ヒト神経膠芽腫細胞系）、ＭＤＡＭＢ２３１細胞（乳癌細胞系）、およびＭＣＦ７細胞（乳癌細胞系）におけるｍｉＲ−１３８の相対的発現レベルを示す図である。左のパネルは、ノックダウンのためのレンチウイルスに基づく抗ｍｉＲを用いた、ＭＤＡＭＢ２３１におけるｍｉＲ−１３８欠乏を示す。よって図２５は、抗ｍｉＲ−１３８を用いて乳癌におけるｍｉＲ−１３８の発現を制御できることを示す。
【図２６】乳癌細胞系におけるｍｉＲ−１３８の欠乏の影響に対する調査のフローサイトメトリの結果を示す図である。左のパネルは、コントロールを発現するレンチウイルスでトランスフェクトした後のＭＤＡＭＢ２３１細胞（乳癌細胞系）の増殖プロファイルを示す。コントロールで処理した細胞は、細胞母集団の５．６％がサブＧ１期、２４．８％がＳ期、および１５．９％がＧ２／Ｍ期という増殖プロファイルを示す。右のパネルは、抗ｍｉＲ−１３８を発現するレンチウイルスでトランスフェクトした後のＭＤＡＭＢ２３１細胞の増殖プロファイルを示す。抗ｍｉＲ−１３８を発現するレンチウイルスで処理した細胞は、１３．９８％がサブＧ１期、８．０３％がＳ期、および２５％がＧ２／Ｍ期という増殖プロファイルを示す。よって図２６は、乳癌細胞系におけるｍｉＲ−１３８の欠乏がＳ期細胞の減少ならびにサブＧ１およびＧ２／Ｍ期細胞の増加をもたらすことを示し、乳癌細胞系におけるｍｉＲ−１３８の欠乏が老化をもたらすことを実証する。
【図２７】抗ｍｉＲ−１３８を発現するレンチウイルスを用いてｍｉＲ−１３８を欠乏させたＭＤＡＭＢ２３１細胞（乳癌細胞系）の光学顕微鏡画像を示す図である。特に、左のパネルはコントロールレンチウイルスでトランスフェクトした細胞を示し、右のパネルは抗ｍｉＲ−１３８を発現するレンチウイルスでトランスフェクトしたものである。左のパネルは、細胞がコンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に増殖することを示す。右のパネルは、アポトーシス細胞死および老化の徴候を示す。加えて右のパネルは、老化細胞において典型的に観察される内在性リソソームベータガラクトシダーゼの蓄積を示す暗い斑点を示す。よって、抗ｍｉＲ−１３８オリゴヌクレオチドは乳癌細胞系の増殖を防いで細胞の老化を促進できることが示される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
表の簡単な説明
非限定的な例および添付の表とともに考慮されるとき、詳細な説明を参照することによって本発明がよりよく理解されるだろう。
【００１２】
表１は、例示的な修飾抗ｍｉＲ１３８、それらのノックダウン効率、およびその修飾抗ｍｉＲ１３８オリゴヌクレオチドで処理した後の細胞表現型をリストにしたものである。
【００１３】
本発明の詳細な説明
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は長い間、多くの発生および細胞のプロセスにおける遺伝子発現の重要な転写後制御因子であると考えられてきた。加えていくつかのｍｉＲＮＡは、たとえば癌などの増殖性疾患の開始および進行に関連付けられている。よって、ｍｉＲＮＡ発現を制御できる分子は、増殖性疾患などの特定の疾患の制御に対して有利である。
【００１４】
疾患における役割を果たすことが公知であるｍｉＲＮＡの一例は、ｍｉＲ−１３８である。たとえば、ｍｉＲ−１３８の高発現は、増殖性疾患を有する対象の生存に対する予後の悪さに関連することが見出されている。よって、ｍｉＲ１３８の発現を制御できる分子は有用であると証明されることが予想される。よって、１つまたはそれ以上のｍｉＲ−１３８の活性を低減または阻害するオリゴヌクレオチドを提供することが必要とされている。
【００１５】
よって一例において、１つまたはそれ以上のｍｉＲ−１３８（たとえば成熟ｍｉＲ−１３８またはプレ−ｍｉＲ−１３８など）の活性を低減または阻害できるオリゴヌクレオチドが提供される。一例において、そのオリゴヌクレオチドは少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含み、かつそのオリゴヌクレオチドはｍｉＲ−１３８のヌクレオチド配列に対して実質的に相補的である。よって一例において、少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含むオリゴヌクレオチドが提供され、このオリゴヌクレオチドはｍｉＲ−１３８のヌクレオチド配列に対して実質的に相補的であり、かつこのオリゴヌクレオチドは１つまたはそれ以上のｍｉＲ−１３８の活性を低減または阻害する。
【００１６】
本明細書において用いられる「相補的」という用語は、オリゴヌクレオチド鎖間の塩基対形成の量を示す。一例において、２つのオリゴヌクレオチド間の相補性の量をパーセンテージで表すことができる。たとえば、第１および第２のオリゴヌクレオチド鎖に沿った各々の隣接ヌクレオチドの間に塩基対が形成されるとき、第１のオリゴヌクレオチド鎖は第２のヌクレオチド鎖と完全に相補的（すなわち１００％相補的）である。一例において、あるオリゴヌクレオチド鎖の全長または長さの一部が、別のオリゴヌクレオチド鎖と相補的（例、完全に相補的）であってもよい。相補的オリゴヌクレオチド鎖は異なる長さであっても、同じ長さであってもよい。
【００１７】
本明細書において用いられる「実質的に」という用語は、「相補的」という用語とともに用いられるとき、２つのオリゴヌクレオチドのほぼ完全または完全に近い塩基対形成を示す。たとえば、第２のオリゴヌクレオチドと「実質的に」相補的である第１のオリゴヌクレオチドとは、第１のオリゴヌクレオチドが第２のオリゴヌクレオチドと完全に相補的であるか、あるいは第２のオリゴヌクレオチドに対して少なくとも８５％、または少なくとも８６％、または少なくとも８７％、または少なくとも８８％、または少なくとも８９％、または少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または少なくとも９９％相補的であることを意味する。一例において、実質的に相補的のオリゴヌクレオチドは１、または２、または３のミスマッチ塩基対を有してもよい。相補性の量がｍｉＲ−１３８の生物活性を阻害するために十分であるとき、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは十分に相補的であることが予期される。
【００１８】
本明細書において用いられる「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」という用語は、遺伝子発現の転写後制御因子として働く、内在性遺伝子に由来する短い非コードＲＮＡを示す。「マイクロＲＮＡ−１３８」または「ｍｉＲＮＡ−１３８」または「ｍｉＲ−１３８」という用語は、たとえば増殖性疾患などのヒトの疾患における生物学的役割を有することが見出された、２３ヌクレオチドの長さからなるＲＮＡオリゴヌクレオチドを示す。ｍｉＲ−１３８は、増殖またはアポトーシスにおける役割を果たすことが公知であるさまざまな遺伝子を制御することによって、そのターゲットに対して影響を及ぼす。
【００１９】
よって、さまざまな遺伝子に対するｍｉＲ−１３８の影響を、本開示においては「ｍｉＲ−１３８の活性」と記載する。したがって、本明細書において用いられるｍｉＲ−１３８の「活性」という用語は、ｍｉＲ−１３８の発現レベルの変化に直接的または間接的に影響される遺伝子の制御に関する。たとえば、ｍｉＲ−１３８の活性は、ＭＡＸ二量化タンパク質１（ＭＸＤ１）遺伝子、カスパーゼ３遺伝子（ＣＡＳＰ３）、膀胱癌関連タンパク質遺伝子（ＢＬＣＡＰ）、チオレドキシン相互作用タンパク質遺伝子（ＴＸＮＩＰ）、腫瘍サプレッサー候補２遺伝子（ＴＵＳＣ２：ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ２）、パネキシン２遺伝子（ＰＡＮＸ２）、増殖停止およびＤＮＡ損傷誘導性遺伝子４５アルファ遺伝子（ＧＡＤＤ４５α：ｇｒｏｗｔｈ  ａｒｒｅｓｔ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ４５  ａｌｐｈａ）、低酸素誘導因子１アルファ遺伝子（ＨＩＦ１α）、ｖ−ｍｙｃトリ骨髄細胞腫症ウイルス癌遺伝子相同遺伝子（ｃＭＹＣ）、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫２遺伝子（ＢＣＬ２）、ＬＩＭおよびＳＨ３ドメインタンパク質１遺伝子（ＬＡＳＰ１）、およびオーロラキナーゼＡ遺伝子（ＡＵＲＫＡ）などを含むが、それらに限定されない遺伝子の制御に関する。一例において、成熟ｍｉＲ−１３８の配列は、ＡＧＣＴＧＧＴＧＴＴＧＴＧＡＡＴＣＡＧＧＣＣＧ（配列番号１）である。
【００２０】
本明細書において用いられる「低減する」または「阻害する」という用語は、ｍｉＲ−１３８の活性に関連して用いられるとき、細胞または対象におけるｍｉＲ１３８の影響を減少または低減または減らすことを示す。たとえば、この低減または阻害は、たとえば増殖性疾患などの疾患に関連する特定の遺伝子の発現を減らすことまたはそのダウンレギュレーションに関する。ｍｉＲ−１３８の活性または影響を減らすこと、阻害または低減は、ｍｉＲ−１３８によって制御される遺伝子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションによって、細胞または対象において提供されてもよい。よって一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、ＭＡＸ二量化タンパク質１（ＭＸＤ１）遺伝子、カスパーゼ３遺伝子（ＣＡＳＰ３）、膀胱癌関連タンパク質遺伝子（ＢＬＣＡＰ）、チオレドキシン相互作用タンパク質遺伝子（ＴＸＮＩＰ）、腫瘍サプレッサー候補２遺伝子（ＴＵＳＣ２）、パネキシン２遺伝子（ＰＡＮＸ２）、ならびに／または増殖停止およびＤＮＡ損傷誘導性遺伝子４５アルファ遺伝子（ＧＡＤＤ４５α）を含むが、それらに限定されない遺伝子の発現をアップレギュレートできてもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、低酸素誘導因子１アルファ遺伝子（ＨＩＦ１α）、ｖ−ｍｙｃトリ骨髄細胞腫症ウイルス癌遺伝子相同遺伝子（ｃＭＹＣ）、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫２遺伝子（ＢＣＬ２）、ＬＩＭおよびＳＨ３ドメインタンパク質１（ＬＡＳＰ１）、ならびに／またはオーロラキナーゼＡ遺伝子（ＡＵＲＫＡ）を含むが、それらに限定されない遺伝子の発現をダウンレギュレートできてもよい。
【００２１】
本明細書において用いられる「ポリヌクレオチド」、「核酸」、または「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシド間結合によって連結されたヌクレオシド（デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはそのアナログを含む）の直鎖ポリマーを示す。たとえばオリゴヌクレオチドなどのポリヌクレオチドが文字の配列、たとえば「ＡＴＧＣ」などによって表されるときは常に、別様に示されない限り、ヌクレオシドは左から右に５’→３’の順序であり、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」はデオキシチミジンを示すことが理解されるであろう。当該技術分野において標準的であるとおり、文字Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴは、塩基自体、ヌクレオシド、または塩基を含むヌクレオチドを示すために用いられ得る。この用語は、自然に発生する核酸塩基、糖、およびヌクレオシド間（骨格）結合で構成されるオリゴヌクレオチド、ならびに同様に機能するか、または特定の改善された機能を有する非自然発生的部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。自然発生ポリヌクレオチドにおいて、ヌクレオシド間結合は典型的にホスホジエステル結合であり、そのサブユニットは「ヌクレオチド」と呼ばれる。加えて「オリゴヌクレオチド」という用語は、たとえば塩基および／または糖などにおいて、完全または部分的に修飾または置換されたオリゴヌクレオチドを含んでもよい。
【００２２】
一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、抗ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドであってもよい。本明細書において用いられる「抗ｍｉＲ−１３８オリゴヌクレオチド」または「抗ｍｉＲＮＡ−１３８オリゴヌクレオチド」という用語は、ｍｉＲ−１３８またはそのアナログ、またはその対応する部分配列に対して実質的に相補的または本質的に相補的である（すなわち１つまたは２つのミスマッチを含んでもよい）オリゴヌクレオチドを示す。一例において、抗ｍｉＲ−１３８は、成熟ｍｉＲ−１３８（すなわち配列番号１）全体またはｍｉＲ１３８のシード配列に対して相補的または本質的に相補的な連続したヌクレオチド配列を含んでもよいし、抗ｍｉＲ−１３８は、成熟マイクロＲＮＡの部分配列またはプレマイクロＲＮＡのこうした部分配列（したがって対応する連続したヌクレオチド配列）に対して相補的または本質的に相補的な連続したヌクレオチド配列を含んでもよい。一例において、抗ｍｉＲ−１３８は、ｍｉＲ−１３８のシード配列に対して相補的または本質的に相補的な連続したヌクレオチド配列を含んでもよい。
【００２３】
本明細書において用いられる「シード配列」という用語は、ｍｉＲＮＡのｍＲＮＡへの結合における役割を有し得る配列を示す。一般的に、シード配列またはシード領域は、ほとんどがｍｉＲＮＡ５’末端からの位置２〜７に位置する、保存された７塩基長（ｈｅｐｔａｍｅｔｒｉｃａｌ）の配列であってもよい。たとえｍｉＲＮＡとそのターゲットｍＲＮＡとの塩基対形成が完全にマッチしなくても、「シード配列」は完全に相補的であり得る。
【００２４】
一例において、本明細書に記載される抗ｍｉＲ−１３８オリゴヌクレオチドは１１ヌクレオチドの長さであってもよく、たとえば８から２６ヌクレオチドなど、たとえば１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６ヌクレオチドの長さなど、たとえば１１から１６、１７から２０、または２１から２３ヌクレオチドなどの長さであってもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、８から２７ヌクレオチドを有してもよい。一例において、オリゴヌクレオチドは１１から２３ヌクレオチドの長さ、または１５から２３ヌクレオチドの長さ、または１７から２３ヌクレオチドの長さ、または８ヌクレオチドの長さ、または９ヌクレオチドの長さ、または１０ヌクレオチドの長さ、または１１ヌクレオチドの長さ、または１２ヌクレオチドの長さ、または１３ヌクレオチドの長さ、または１４ヌクレオチドの長さ、または１５ヌクレオチドの長さ、または１６ヌクレオチドの長さ、または１７ヌクレオチドの長さ、または１８ヌクレオチドの長さ、または１９ヌクレオチドの長さ、または２０ヌクレオチドの長さ、または２１ヌクレオチドの長さ、または２２ヌクレオチドの長さ、または２３ヌクレオチドの長さ、または２４ヌクレオチドの長さ、または２５ヌクレオチドの長さ、または２６ヌクレオチドの長さを有してもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、たとえば５’−ＡＣＡＡＣＡＣＣＡＧＣ−３’（配列番号４；抗ｍｉＲ−１３８のシード配列）、５’−ＣＧＧＣＣＵＧＡＵＴＣＡＣＡＡＣＡＣＣＡＧＣＵ−３’（配列番号２；抗ｍＲＮＡ−１３８）、および５’−ＣＧＧＣＣＵＧＡＵＵＣＡＣＡＡＣＡＣＣＡＧＣＵ−３’（配列番号３；抗ｍＲＮＡ−１３８）などであるがそれらに限定されない配列を含むか、またはこうした配列からなっていてもよい。
【００２５】
本明細書において用いられる「ロックド核酸」という用語は、ＲＮＡを接近できないＲＮＡにする、ＲＮＡヌクレオチドの修飾を示す。よって一例において、「ロックド核酸」とは、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドが２’酸素および４’炭素を接続する余分な架橋によって修飾された、接近できないＲＮＡを示す。ＬＮＡは、リボース環の２’および４’炭素の間にオキシメチレン架橋を含有する、ＲＮＡの修飾である。この架橋は、リボースの立体構造をロックする二環構造を生成する。よって一例において、ロックド核酸は、リボースの立体構造をロックする二環構造を生成する。この二環構造は、２’酸素を４’炭素に接続する架橋を生成するリボース部分の修飾によって生成されてもよい。一例において、２’酸素を４’炭素に接続する架橋はエチレン、メチレン、またはオキシメチレン架橋であってもよい。理論に結び付けられることを望むことなく、ＲＮＡにおけるリボースの立体構造をロックするロックド核酸修飾の二環構造は、ロックド核酸の高い安定性およびその相補的ヌクレオチド配列に対する高親和性に対して重要であると考えられる。
【００２６】
本開示の発明者は、特定のヌクレオチドの修飾によって、驚くべきことに全配列修飾よりも良好に作用する抗ｍｉＲ１３８が提供されることを見出している。よって一例において、オリゴヌクレオチドは少なくとも１、または少なくとも２、または少なくとも３、または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも６、または少なくとも７、または少なくとも８、または少なくとも９、または少なくとも１０、または少なくとも１１、または少なくとも１２、または少なくとも１３、または少なくとも１４、または少なくとも１５、または少なくとも１６、または少なくとも１７、または少なくとも１８、または少なくとも１９、または少なくとも２０、または少なくとも２１、または少なくとも２２、または少なくとも２３、または少なくとも２４、または少なくとも２５、または少なくとも２６、またはそれ以上のロックド核酸を含んでもよい。一例において、ロックド核酸修飾は、オリゴヌクレオチドの核酸の半分に存在してもよい。一例において、ロックド核酸修飾は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの核酸の２０〜１００％に存在してもよい。一例において、ロックド核酸は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの核酸のすべてにあってもよい。一例において、オリゴヌクレオチドは少なくとも５から１２のロックド核酸を含有してもよい。一例において、オリゴヌクレオチドは少なくとも１０から１２のロックド核酸を含有してもよい。一例において、オリゴヌクレオチドは６から１１のロックド核酸を含有してもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチドがロックド核酸修飾されていてもよい。一例において、本開示のオリゴヌクレオチドのすべてではないヌクレオチドがロックド核酸修飾によって修飾されるか、またはロックド核酸を含まないヌクレオチドである。よって一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは少なくとも１、または少なくとも２、または少なくとも３、または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも６、または少なくとも７、または少なくとも８、または少なくとも９、または少なくとも１０、または少なくとも１１、または少なくとも１２、または少なくとも１３、または少なくとも１４、または少なくとも１５、または少なくとも１６、または少なくとも１７、または少なくとも１８、または少なくとも１９、または少なくとも２０、または少なくとも２１の非ロックド核酸を含んでもよい。一例において、非ロックド核酸は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの０〜８０％に存在してもよい。一例において、オリゴヌクレオチドは約１１から１８の非ロックド核酸修飾ヌクレオチドを含有してもよい。一例において、オリゴヌクレオチドは約１１から１６の非ロックド核酸修飾ヌクレオチドを含有してもよい。一例において、非ロックド核酸は少なくとも１回、または少なくとも２回、または少なくとも３回、または少なくとも４回、または少なくとも５回、または少なくとも６回、または少なくとも７回、または少なくとも８回、または少なくとも９回、または少なくとも１０回、２から４、または２から３、または２つの連続した核酸として含まれてもよい。よって一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは２以上、または３以上、または４以上の連続したロックド核酸を有する一続きの核酸を含有しなくてもよい。
【００２７】
一例において、非ロックド核酸である連続した核酸がある限り、ロックド核酸修飾は任意の好適な位置に存在してもよい。よって一例において、ロックド核酸修飾は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２に存在してもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、配列５’−ＡＣＡＡＣＡＣＣＡＧＣ−３’（配列番号４；抗ｍｉＲ−１３８のシード配列）、５’−ＣＧＧＣＣＵＧＡＵＴＣＡＣＡＡＣＡＣＣＡＧＣＵ−３’（配列番号２；抗ｍＲＮＡ−１３８）、および５’−ＣＧＧＣＣＵＧＡＵＵＣＡＣＡＡＣＡＣＣＡＧＣＵ−３’（配列番号３；抗ｍＲＮＡ−１３８）を含むか、またはこうした配列からなっていてもよく、ここで配列番号２および配列番号３は独立に、少なくとも１つのロックド核酸修飾を含んでもよい。一例において、ロックド核酸修飾は、配列番号２または配列番号３のいずれかに存在してもよい。一例において、ロックド核酸修飾は、たとえば配列番号２などの抗ｍｉＲ１３８の位置３、５、８、１０、１２、１５、１７、１９および２１に存在してもよく、ここで配列番号２の位置１は５’末端であり、配列番号２の位置２３は３’末端である。
【００２８】
実施例セクションの特に図１、図２および図３に示されるとおり、本明細書に記載される例示的オリゴヌクレオチドが細胞に形質転換されるとき、オリゴヌクレオチドはｍｉＲ１３８の発現を制御できる。しかし、オリゴヌクレオチドの細胞への形質転換は、オリゴヌクレオチドを細胞の分解酵素に接触させる。よって一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、細胞酵素による分解に抵抗する修飾をさらに含んでもよい。たとえば、親ホスホジエステル結合を、リン酸基の非架橋酸素原子の１つを硫黄原子で置き換えたホスホロチオエート結合（ＰＳ）にする骨格修飾によって、ヌクレアーゼ耐性が改善される。よって一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホロチオエート連結によってさらに修飾されてもよい。
【００２９】
本明細書において用いられる「ホスホロチオエート連結（ｌｉｎｋ）」または「ホスホロチオエート結合（ｌｉｎｋａｇｅ）」という用語は、糖リン酸骨格のリン酸結合内の非架橋酸素原子の代わりに硫黄原子を含むヌクレオチド間結合を示す。「ホスホロチオエート連結」または「ホスホロチオエート結合」という用語は、ホスホロチオエートヌクレオチド内結合およびホスホロチオエートヌクレオチド間結合の両方を含む。ホスホロチオエート連結は、有利にはそのヌクレアーゼ耐性の特性をオリゴヌクレオチドに与える。本明細書において用いられる「ヌクレアーゼ耐性」という用語は、ヌクレアーゼによる３’から５’方向の分解に対する耐性を与える、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの性質を示す。こうしたヌクレアーゼ耐性をオリゴヌクレオチドに与え得る修飾は、ホスホロチオエートおよびボラノリン酸（ｂｏｒｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）結合の修飾を含むが、それに限定されない。
【００３０】
一例において、少なくとも１つのホスホロチオエート連結による修飾は、オリゴヌクレオチドを細胞に対して毒性にすることなく、ヌクレアーゼ耐性を維持し得る。一例において、オリゴヌクレオチドの５’末端および３’末端のみがホスホロチオエート連結によって修飾されてもよい。すなわち、ホスホロチオエート連結修飾は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの各端部に対するキャップとして提供されてもよい。よって一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの中央部分は、ホスホロチオエート連結によって修飾されなくてもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの中央部分は、ホスホロチオエート連結を含まなくてもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは１、または２、または３、または４、または５、または６のホスホロチオエート連結を有してもよい。一例において、ホスホロチオエート連結は、オリゴヌクレオチドの核酸のすべてに含まれていなくてもよい。一例において、オリゴヌクレオチドの核酸のいくつかは、ホスホロチオエート連結を含まなくてもよい。一例において、本明細書に記載される修飾オリゴヌクレオチドは、そのヌクレオチドのすべてにホスホロチオエート連結を有さなくてもよい。一例において、本明細書に記載される修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結修飾を含まない少なくとも６、または少なくとも７、または少なくとも８、または少なくとも９、または少なくとも１０、または少なくとも１１、または少なくとも１２、または少なくとも１３、または少なくとも１４、または少なくとも１５、または少なくとも１６、または少なくとも１７、または少なくとも１８のヌクレオチドを有してもよい。
【００３１】
一例において、ホスホロチオエート連結は互いに独立に、オリゴヌクレオチドの３’末端および／または５’末端の少なくとも１、および／または少なくとも２、および／または少なくとも３に含まれてもよい。一例において、ホスホロチオエート連結は互いに独立に、オリゴヌクレオチドの３’末端および／または５’末端の少なくとも１、および／または少なくとも２に含まれてもよい。一例において、ホスホロチオエート連結は、たとえば配列番号２などの２３ヌクレオチド長の抗ｍｉＲ１３８の位置１から５、または１９から２３より独立に選択されてもよい。すなわち、抗ｍｉＲ１３８が２３ヌクレオチドの長さであると想定すると、ホスホロチオエート連結は、たとえば配列番号２などの２３ヌクレオチド長の抗ｍｉＲ１３８の位置１、または２、または３、または４、または５、または１９、または２０、または２１、または２２、または２３より独立に選択されてもよい。抗ｍｉＲ１３８が２３ヌクレオチドの長さであるとき、一例において、ホスホロチオエート連結はオリゴヌクレオチドの位置１、２、３、２０、２１および２２にあってもよい。抗ｍｉＲ１３８が１６ヌクレオチドの長さであるとき、一例において、ホスホロチオエート連結はオリゴヌクレオチドの位置１、２、３、１３、１４および１５にあってもよい。抗ｍｉＲ１３８が１１ヌクレオチドの長さであるとき、一例において、ホスホロチオエート連結はオリゴヌクレオチドの位置１、２、１０および１１にあってもよい。抗ｍｉＲ１３８が配列番号２であるとき、一例において、ホスホロチオエート連結は配列番号２の位置１、２、３、２０、２１および２２にあってもよい。
【００３２】
同時に、本発明の発明者は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドが２３より少ないヌクレオチドを含んでもよいことを見出した。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドが１６ヌクレオチドを有する一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、すべてのヌクレオチドがロックド核酸修飾によって修飾されていてもよい。
【００３３】
本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドが１１ヌクレオチドを有する一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、すべてのヌクレオチドがロックド核酸修飾によって修飾されていてもよい。この例において、オリゴヌクレオチドは配列５’−Ａ＊Ｃ＊ＡＡＣＡＣＣＡＧ＊Ｃ＊−３’（配列番号５）を含むか、またはこの配列からなっていてもよく、ここで＊はホスホロチオエート結合であり、下線付きのヌクレオチドはロックド核酸修飾を表す。
【００３４】
一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、塩基加水分解およびヌクレアーゼに対する安定性を与える修飾をさらに含んでもよい。一例において、こうした修飾は、非ロックド核酸のリボース部分の２−ヒドロキシル基に２’−Ｏ−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アルキル、２’−ハロ、または２’−フルオロを付加することを含んでもよいが、それに限定されない。一例において、この修飾は、オリゴヌクレオチドの２’Ｏ−メチル（ｍｅｔｈｙｌ）（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾であってもよい。理論に結び付けられることを望むことなく、本開示の発明者は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの２’−Ｏ−Ｍｅおよびロックド核酸修飾は、ヌクレアーゼ耐性を与え、かつ抗ｍｉＲオリゴヌクレオチドの関連するｍｉＲＮＡへの結合親和性を増加させるものと考える。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾をさらに含む。一例において、２’Ｏ−メチル修飾は、２３ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドの位置１、および／または２、および／または３、および／または４、および／または５、および／または６、および／または７、および／または８、および／または９、および／または１０、および／または１１、および／または１２、および／または１３、および／または１４、および／または１５、および／または１６、および／または１７、および／または１８、および／または１９、および／または２０、および／または２１、および／または２２、および／または２３において行われてもよい。一例において、２’−Ｏ−メチル化修飾は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの核酸の少なくとも半分に存在してもよい。一例において、２’−Ｏ−メチル化修飾は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの核酸の少なくとも６０％に存在してもよい。一例において、２’−Ｏ−メチル化修飾は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの核酸のすべてに存在してもよい。一例において、２’−Ｏ−メチル化修飾は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの少なくとも１１からすべての核酸に存在してもよい。一例において、２’−Ｏ−メチル化修飾は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの少なくとも１１から１６の核酸に存在してもよい。一例において、２’−Ｏ−メチル化修飾は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの１２の核酸に存在してもよい。当業者に認識されるとおり、修飾の位置は、オリゴヌクレオチドの長さに関して変動し、さらにオリゴヌクレオチドに対して行われるその他の修飾の位置に依存して変動する。たとえば、あるヌクレオチドがロックド核酸修飾によって修飾されたとき、それは２’−Ｏ−メチル化によってさらに修飾されることはない。一例において、オリゴヌクレオチドの半分がロックド核酸修飾によって修飾され、もう半分が２’−Ｏ−メチル化によって修飾されてもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２の位置１、２、４、６、１１、１３、１４、１６、１８、２０、２２、および２３における２’−Ｏ−メチル修飾をさらに含む。
【００３５】
一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの細胞透過性を改善する修飾を含むことによってさらに修飾されてもよい。一例において、オリゴヌクレオチドの細胞透過性を改善する修飾は、コレステロールキャップ修飾であってもよい。一例において、コレステロールキャップ修飾は、オリゴヌクレオチドのいずれかの端部または両端部にあってもよい。一例において、コレステロールキャップ修飾は、オリゴヌクレオチドの５’末端にあってもよい。よって一例において、オリゴヌクレオチドはコレステロール修飾オリゴヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドをコレステロールキャップによって修飾する方法は、当該技術分野において公知である。
【００３６】
一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの置換を含むことによってさらに修飾されてもよい。本明細書において用いられる「置換」という用語は、少なくとも１つの残基配列の除去と、その除去残基の場所への異なる残基の挿入とを示す。たとえば、所与の部位における突然変異の実行を最適化するために、ターゲット領域においてランダム突然変異誘発を行って、発現された抗ｍｉＲ−１３８変異体を、所望の活性の最適な組み合わせに対してスクリーニングしてもよい。隣接対における削除または挿入が行われてもよい。すなわち、２残基の削除または２残基の挿入である。最終コンストラクトに到達するために、置換、削除、挿入、またはそれらの任意の組み合わせが組み合わされてもよい。ｍｉＲＮＡの活性を増加するため、その生物学的安定性または半減期を増加させるために、変更が行われてもよい。こうした抗ｍｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に対するすべてのこうした修飾が包含される。既知の配列を有するＤＮＡの予め定められた部位で置換変異を行うための技術は、周知である。
【００３７】
一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２または配列番号３に対する少なくとも７５％の配列同一性を有してもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２または配列番号３に対する少なくとも８０％の配列同一性を有してもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２または配列番号３に対する少なくとも８５％の配列同一性を有してもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２または配列番号３に対する少なくとも９０％の配列同一性を有してもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２または配列番号３に対する少なくとも９５％の配列同一性を有してもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２または配列番号３に対する少なくとも９７．５％の配列同一性を有してもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２または配列番号３に対する少なくとも９９％の配列同一性を有してもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２または配列番号３に対する少なくとも１００％の配列同一性を有してもよい。
【００３８】
一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２または配列番号３のシード／コア配列に対する少なくとも７５％の配列同一性を有してもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２または配列番号３のシード／コア配列に対する少なくとも８０％の配列同一性を有してもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２または配列番号３のシード／コア配列に対する少なくとも８５％の配列同一性を有してもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２または配列番号３のシード／コア配列に対する少なくとも９０％の配列同一性を有してもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２または配列番号３のシード／コア配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有してもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２または配列番号３のシード／コア配列に対する少なくとも９７．５％の配列同一性を有してもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２または配列番号３のシード／コア配列に対する少なくとも９９％の配列同一性を有してもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２または配列番号３のシード／コア配列に対する少なくとも１００％の配列同一性を有してもよい。
【００３９】
一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、少なくとも１、または少なくとも２、または少なくとも３、または少なくとも４、または少なくとも５、または６の置換を含んでもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、６の置換を含んでもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、６より多く、または７より多く、または８より多く、または９より多く、または１０より多く、または１１より多く、または１２より多く、または１３より多く、または１４より多く、または１５より多く、または１６より多く、または１７より多く、または１８より多く、または１９より多く、または２０より多く、または２１より多く、または２２より多く、または２３より多く、またはすべてのヌクレオチドが置換されていなくてもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、抗ｍｉＲＮＡ配列の完全なミスマッチをもたらす置換を有さなくてもよい。
【００４０】
発明者は、配列および記載される化学修飾の各々に対する変更が独立に変動され得ることを予期する。よって、本明細書に記載されるあらゆる特定の長さのオリゴヌクレオチドが、本開示において考察されるすべての関連化学修飾の１つまたはそれ以上とともに使用されてもよい。
【００４１】
一例において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの４０％から６０％（約４５％、または約５０％、または約５５％、または約６０％）がロックド核酸修飾によって修飾されてもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドの４０％から６０％（約４５％、または約５０％、または約５５％、または約６０％）が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾され、かつヌクレオチドの２０％から４０％（約２０％、または約２５％、または約３０％、または約３５％、または約４０％）がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドは約５、または６、または７、または８、または９、または１０、または１１、または１２、または１３のロックド核酸を含有してもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドの約５、または６、または７、または８、または９、または１０、または１１、または１２または１３が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾され、かつヌクレオチドの３、または４、または５、または６がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のヌクレオチドのみが、ホスホロチオエート連結修飾によって修飾されてもよい。
【００４２】
一例において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドのおよそ少なくとも半分がロックド核酸修飾によって修飾されてもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドの半分が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾され、かつヌクレオチドの約３０％がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドは約１３のロックド核酸を含有してもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドの約１３が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾され、かつヌクレオチドの６がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のヌクレオチドのみが、ホスホロチオエート連結修飾によって修飾されてもよい。
【００４３】
一例において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの約４０％がロックド核酸修飾によって修飾されてもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドの６０％が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾され、かつヌクレオチドの２０％から５０％（約２０％、または約２５％、または約３０％、または約３５％、または約４０％）がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドは約９、または１０、または１１のロックド核酸を含有してもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドの約１１、または１２または１３が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾され、かつヌクレオチドの３、または４、または５、または６がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のヌクレオチドのみが、ホスホロチオエート連結修飾によって修飾されてもよい。
【００４４】
一例において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの約６０％がロックド核酸修飾によって修飾されてもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドの４０％が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾され、かつヌクレオチドの２０％から５０％（約２０％、または約２５％、または約３０％、または約３５％、または約４０％）がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドは約１１、または１２、または１３のロックド核酸を含有してもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドの約９、または１０、または１１が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾され、かつヌクレオチドの３、または４、または５、または６がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のヌクレオチドのみが、ホスホロチオエート連結修飾によって修飾されてもよい。
【００４５】
一例において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの約４０％がロックド核酸修飾によって修飾されてもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドの６０％が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾され、かつヌクレオチドの約２６％がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドは約９、または１０、または１１のロックド核酸を含有してもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドの約１１、または１２、または１３が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾され、かつヌクレオチドの６がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のヌクレオチドのみが、ホスホロチオエート連結修飾によって修飾されてもよい。
【００４６】
一例において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの約６０％がロックド核酸修飾によって修飾されてもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドの４０％が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾され、かつヌクレオチドの約２６％がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドは約１１、または１２、または１３のロックド核酸を含有してもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドの約９、１０、または１１が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾され、かつヌクレオチドの６がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のヌクレオチドのみが、ホスホロチオエート連結修飾によって修飾されてもよい。
【００４７】
一例において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの約４０％がロックド核酸修飾によって修飾されてもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドの５２％が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾され、かつヌクレオチドの約２６％がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドは約９のロックド核酸を含有してもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドの約１２が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾され、かつヌクレオチドの６がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のヌクレオチドのみが、ホスホロチオエート連結修飾によって修飾されてもよい。
【００４８】
一例において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの８０％から１００％（約８０％、または約８５％、または約９０％、または約９５％、または約９７．５％、または約９９％、または約１００％）がロックド核酸修飾によって修飾されてもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドの０％から２０％（約０％、または約５％、または約１０％、または約１５％、または約２０％）が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾され、かつヌクレオチドの少なくとも１０％から５５％（約１０％、または約１５％、または約２０％、または約２５％、または約３０％、または約３５％、または約４０％、または約４５％、または約５０％、または約５５％）がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの約４５〜８１％（約４５％、または約５０％、または約５５％、または約６０％、または約６５％、または約７０％、または約７５％、または約８０％、または約８１％）がホスホロチオエート連結修飾を含まなくてもよい。一例において、オリゴヌクレオチドが１１ヌクレオチドの長さであるとき、オリゴヌクレオチドは約８、または９、または１０、または１１のロックド核酸を含有してもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドの約０、または１、または２、または３が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾され、かつヌクレオチドの１、または２、または３、または４、または５、または６がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のヌクレオチドのみが、ホスホロチオエート連結修飾によって修飾されてもよい。
【００４９】
一例において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの９０％から１００％（約９０％、または約９５％、または約９７．５％、または約９９％、または約１００％）がロックド核酸修飾によって修飾されてもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドの０％から１０％が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾され、かつヌクレオチドの少なくとも１５％から４０％（約１５％、または約２０％、または約２５％、または約３０％、または約３５％、または約４０％）がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの約５０％から６５％（約５０％、または約５５％、または約６０％、または約６５％）がホスホロチオエート連結修飾を含まなくてもよい。一例において、オリゴヌクレオチドが１１ヌクレオチドの長さであるとき、オリゴヌクレオチドは約１０または１１のロックド核酸を含有してもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドの約０または１が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾され、かつヌクレオチドの２、または３、または４がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のヌクレオチドのみが、ホスホロチオエート連結修飾によって修飾されてもよい。
【００５０】
一例において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの約１００％がロックド核酸修飾によって修飾されてもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドはなく、かつヌクレオチドの約３６％がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの約６３％がホスホロチオエート連結修飾を含まなくてもよい。一例において、オリゴヌクレオチドが１１ヌクレオチドの長さであるとき、オリゴヌクレオチドは約１１のロックド核酸を含有してもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドはなく、かつヌクレオチドの４がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のヌクレオチドのみが、ホスホロチオエート連結修飾によって修飾されてもよい。
【００５１】
一例において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの約１００％がロックド核酸修飾によって修飾されてもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドはなく、２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾されたヌクレオチドはなく、かつヌクレオチドの約３６％がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドが１１ヌクレオチドの長さであるとき、オリゴヌクレオチドは約１１のロックド核酸を含有してもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドはなく、２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾されたヌクレオチドはなく、かつヌクレオチドの４がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のヌクレオチドのみが、ホスホロチオエート連結修飾によって修飾されてもよい。
【００５２】
一例において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの５０％から１００％（約５０％、または約５５％、または約６０％、または約６５％、または約７０％、または約７５％、または約８０％、または約８５％、または約９０％、または約９５％、または約９７．５％、または約９９％、または約１００％）がロックド核酸修飾によって修飾されてもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドの０％から５０％（約０％、または約５％、または約１０％、または約１５％、または約２０％、または約２５％、または約３０％、または約３５％、または約４０％、または約４５％、または約５０％）が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾され、かつヌクレオチドの約６％から５０％（約６％、または約１０％、または約１５％、または約２０％、または約２５％、または約３０％、または約３５％、または約４０％、または約４５％、または約５０％）がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドが１６ヌクレオチドの長さであるとき、オリゴヌクレオチドは約８、または９、または１０、または１１、または１２、または１３、または１４、または１５、または１６のロックド核酸を含有してもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドの約０、または１、または２、または３、または４、または５、または６、または７、または８が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾され、かつヌクレオチドの１、または２、または３、または４、または５、または６、または７、または８がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のヌクレオチドのみが、ホスホロチオエート連結修飾によって修飾されてもよい。
【００５３】
一例において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの７５％から１００％（約７５％、または約８０％、または約８５％、または約９０％、または約９５％、または約９７．５％、または約９９％、または約１００％）がロックド核酸修飾によって修飾されてもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドの０％から２５％（約０％、または約５％、または約１０％、または約１５％、または約２０％、または約２５％）が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾され、かつヌクレオチドの少なくとも１０％から４０％（約１０％、または約１５％、または約２０％、または約２５％、または約３０％、または約３５％、または約４０％）がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドが１６ヌクレオチドの長さであるとき、オリゴヌクレオチドは約１２、または１３、または１４、または１５、または１６のロックド核酸を含有してもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドの約０、または１、または２、または３、または４が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾され、かつヌクレオチドの２、または３、または４、または６がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のヌクレオチドのみが、ホスホロチオエート連結修飾によって修飾されてもよい。
【００５４】
一例において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの約１００％がロックド核酸修飾によって修飾されてもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドはなく、かつヌクレオチドの約２５％がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドが１６ヌクレオチドの長さであるとき、オリゴヌクレオチドは約１６のロックド核酸を含有してもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドはなく、かつヌクレオチドの４がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のヌクレオチドのみが、ホスホロチオエート連結修飾によって修飾されてもよい。
【００５５】
一例において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの約１００％がロックド核酸修飾によって修飾されてもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドはなく、２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾されたヌクレオチドはなく、かつヌクレオチドの約２５％がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドが１６ヌクレオチドの長さであるとき、オリゴヌクレオチドは約１６のロックド核酸を含有してもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドはなく、２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾されたヌクレオチドはなく、かつヌクレオチドの４がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のヌクレオチドのみが、ホスホロチオエート連結修飾によって修飾されてもよい。
【００５６】
一例において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの２０％から５０％（約２０％、または約２５％、または約３０％、または約３５％、または約４０％、または約４５％、または約５０％）がロックド核酸修飾によって修飾されてもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドの５０％から８０％（約５０％、または約５５％、または約６０％、または約６５％、または約７０％、または約７５％、または約８０％）が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾され、かつヌクレオチドの５％から５０％（約５％、または約１０％、または約１５％、または約２０％、または約２５％、または約３０％、または約３５％、または約４０％、または約４５％、または約５０％）がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの約５０〜９５％（約５０％、または約５５％、または約６０％、または約６５％、または約７０％、または約７５％、または約８０％、または約８５％、または約９０％、または約９５％）がホスホロチオエート連結修飾を含まなくてもよい。一例において、オリゴヌクレオチドが２３ヌクレオチドの長さであるとき、オリゴヌクレオチドは約４、または５、または６、または７、または８、または９、または１０、または１１、または１２のロックド核酸を含有してもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドの約１１、または１２、または１３、または１４、または１５、または１６、または１７、または１８、または１９が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾され、かつヌクレオチドの１、または２、または３、または４、または５、または６、または７、または８、または９、または１０がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のヌクレオチドのみが、ホスホロチオエート連結修飾によって修飾されてもよい。
【００５７】
一例において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの２５％から４５％（約２５％、または約３０％、または約３５％、または約４０％、または約４５％）がロックド核酸修飾によって修飾されてもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドの５５％から７５％（約５０％、または約５５％、または約６０％、または約６５％、または約７０％、または約７５％）が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾され、かつヌクレオチドの少なくとも８％から３５％（約８％、または約１０％、または約１５％、または約２０％、または約２５％、または約３０％、または約３５％）がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの約６５〜９２％（約６５％、または約７０％、または約７５％、または約８０％、または約８５％、または約９０％、または約９２％）がホスホロチオエート連結修飾を含まなくてもよい。一例において、オリゴヌクレオチドが２３ヌクレオチドの長さであるとき、オリゴヌクレオチドは約５、または６、または７、または８、または９、または１０、または１１のロックド核酸を含有してもよく、非ロックド核酸修飾ヌクレオチドの約１２、または１３、または１４、または１５、または１６、または１７、または１８が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾され、かつヌクレオチドの２、または３、または４、または５、または６がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のヌクレオチドのみが、ホスホロチオエート連結修飾によって修飾されてもよい。
【００５８】
一例において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの約２６％から４０％（約２６％、または約３０％、または約３５％、または約４０％）がロックド核酸修飾によって修飾されてもよく、ヌクレオチドの約６０％から７０％（約６０％、または約６５％、または約７０％）が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾された非ロックド核酸であり、かつヌクレオチドの約２６％がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの約７４％がホスホロチオエート連結修飾を含まなくてもよい。一例において、オリゴヌクレオチドが２３ヌクレオチドの長さであるとき、オリゴヌクレオチドは約６、または７、または８、または９のロックド核酸を含有してもよく、１４、または１５、または１６の非ロックド核酸が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾され、かつヌクレオチドの６がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のヌクレオチドのみが、ホスホロチオエート連結修飾によって修飾されてもよい。
【００５９】
一例において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの約４０％がロックド核酸修飾によって修飾されてもよく、ヌクレオチドの約６０％が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾された非ロックド核酸であり、かつヌクレオチドの約２６％がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの約７４％がホスホロチオエート連結修飾を含まなくてもよい。一例において、オリゴヌクレオチドが２３ヌクレオチドの長さであるとき、オリゴヌクレオチドは９のロックド核酸を含有してもよく、１４の非ロックド核酸が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾され、かつヌクレオチドの６がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のヌクレオチドのみが、ホスホロチオエート連結修飾によって修飾されてもよい。
【００６０】
一例において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの約３０％がロックド核酸修飾によって修飾されてもよく、ヌクレオチドの約７０％が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾された非ロックド核酸であり、かつヌクレオチドの約２６％がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの約７４％がホスホロチオエート連結修飾を含まなくてもよい。一例において、オリゴヌクレオチドが２３ヌクレオチドの長さであるとき、オリゴヌクレオチドは７のロックド核酸を含有してもよく、１６の非ロックド核酸が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾され、かつヌクレオチドの６がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のヌクレオチドのみが、ホスホロチオエート連結修飾によって修飾されてもよい。
【００６１】
一例において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの約２６％がロックド核酸修飾によって修飾されてもよく、ヌクレオチドの約７０％が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾された非ロックド核酸であり、かつヌクレオチドの約２６％がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの約７４％がホスホロチオエート連結修飾を含まなくてもよい。一例において、オリゴヌクレオチドが２３ヌクレオチドの長さであるとき、オリゴヌクレオチドは６のロックド核酸を含有してもよく、１６の非ロックド核酸が２’−Ｏ−メチル化修飾によって修飾され、かつヌクレオチドの６がホスホロチオエート連結修飾によって修飾される。一例において、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のヌクレオチドのみが、ホスホロチオエート連結修飾によって修飾されてもよい。
【００６２】
本明細書において用いられる「約」という用語は、ヌクレオチド数の状況において、示される値の＋／−５％、または示される値の＋／−４％、または示される値の＋／−３％、または示される値の＋／−２％、または示される値の＋／−１％、または示される値の＋／−０．５％を意味する。当業者に認識されるとおり、パーセンテージはガイドラインとして提供されており、ヌクレオチド数を定めるときにはガイドラインとして解釈されるべきである。たとえば、２３ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドの約４０％は９．２ヌクレオチドである。９．２ヌクレオチドを有することは不可能であるため、２３ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドの約４０％は９ヌクレオチドであることを当業者は理解するだろう。
【００６３】
一例において、オリゴヌクレオチドは次の式に従う修飾を含んでもよい。［ｍｍ］ｎ［ｍｍＬ］ｎ［ｍＬ］ｎ［ｍｍＬ］ｎ［ｍＬ］ｎ［ｍｍＬ］ｎ［ｍＬ］ｎ［ｍｍ］ｎ、ここでｎは０、１、２、３または４であってもよく、ｍは塩基加水分解およびヌクレアーゼに対する安定性を与えるために修飾されるヌクレオチド（たとえば２’−Ｏ−メチル化による修飾など）であり、Ｌはロックド核酸修飾によって修飾されるヌクレオチドである。一例において、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’および５’末端にホスホロチオエート連結修飾をさらに含んでもよい。
【００６４】
一例において、オリゴヌクレオチドは次の式に従う修飾を含んでもよい。［ｍｍ］ｎ＝１，２［ｍｍＬ］ｎ＝１，２［ｍＬ］ｎ＝１，２，３［ｍｍＬ］ｎ＝０，１，２，３，４［ｍＬ］ｎ＝１，２［ｍｍＬ］ｎ＝１，２［ｍＬ］ｎ＝０，１［ｍｍ］ｎ＝０，１，２、ここでｍは塩基加水分解およびヌクレアーゼに対する安定性を与えるために修飾されるヌクレオチド（たとえば２’−Ｏ−メチル化による修飾など）であり、Ｌはロックド核酸修飾によって修飾されるヌクレオチドである。一例において、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’および５’末端にホスホロチオエート連結修飾をさらに含んでもよい。
【００６５】
一例において、オリゴヌクレオチドは次の式に従う修飾を含んでもよい。［ｍｍ］ｎ＝０，１，２［ｍｍＬ］ｎ＝１，２［ｍＬ］ｎ＝０，１，２［ｍｍＬ］ｎ＝１，２［ｍＬ］ｎ＝０，１，２，３，４［ｍｍＬ］ｎ＝１，２［ｍＬ］ｎ＝０，１，２，３，４［ｍｍ］ｎ＝１，２、ｍは塩基加水分解およびヌクレアーゼに対する安定性を与えるために修飾されるヌクレオチド（たとえば２’−Ｏ−メチル化による修飾など）であり、Ｌはロックド核酸修飾によって修飾されるヌクレオチドである。一例において、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’および５’末端にホスホロチオエート連結修飾をさらに含んでもよい。
【００６６】
一例において、オリゴヌクレオチドは次の式に従う修飾を含んでもよい。［ｍｍ］ｎ＝０，１，２［ｍｍＬ］ｎ＝１，２［ｍＬ］ｎ＝０，１，２［ｍｍＬ］ｎ＝１，２［ｍＬ］ｎ＝０，１，２，３，４［ｍｍＬ］ｎ＝１，２［ｍＬ］ｎ＝０，１，２，３，４［ｍｍ］ｎ＝１，２、ｍは塩基加水分解およびヌクレアーゼに対する安定性を与えるために修飾されるヌクレオチド（たとえば２’−Ｏ−メチル化による修飾など）であり、Ｌはロックド核酸修飾によって修飾されるヌクレオチドである。一例において、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’および５’末端にホスホロチオエート連結修飾をさらに含んでもよい。
【００６７】
上述した修飾をともに組み合わせるとき、本明細書に記載される修飾オリゴヌクレオチドは、５’−ｍＣ＊ｍＧ＊Ｇ＊ｍＣＣｍＵｍＧＡｍＵＴｍＣＡｍＣｍＡＡｍＣＡｍＣＣｍＡ＊Ｇ＊ｍＣ＊ｍＵ−３’（配列番号１３）、５’−ｍＣ＊ｍＧ＊Ｇ＊ｍＣｍＣＴｍＧｍＡＴｍＵｍＣＡｍＣｍＡＡｍＣｍＡＣｍＣｍＡ＊Ｇ＊ｍＣ＊ｍＵ−３’（配列番号１２）、および５’−ｍＣ＊ｍＧ＊ｍＧ＊ｍＣｍＣＴｍＧＡｍＵＴｍＣＡｍＣＡｍＡＣｍＡＣｍＣｍＡ＊ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵ−３’（配列番号１０）を含んでもよいがそれらに限定されず、ここでｍは２’−Ｏ−メチル化であり、＊はホスホロチオエート結合であり、下線付きのヌクレオチドはロックド核酸修飾を表す。
【００６８】
表１に示されるとおり、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または１００％のｍｉＲ１３８ノックダウン効率を有してもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、約５０％から１００％のｍｉＲ１３８ノックダウン効率を有してもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、約６０％から１００％のｍｉＲ１３８ノックダウン効率を有してもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、約６５％から１００％のｍｉＲ１３８ノックダウン効率を有してもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、約７０％から１００％のｍｉＲ１３８ノックダウン効率を有してもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、約７５％から１００％のｍｉＲ１３８ノックダウン効率を有してもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、約８０％から１００％のｍｉＲ１３８ノックダウン効率を有してもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、約８５％から１００％のｍｉＲ１３８ノックダウン効率を有してもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、約９０％から１００％のｍｉＲ１３８ノックダウン効率を有してもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、約９５％から１００％のｍｉＲ１３８ノックダウン効率を有してもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、約１００％のｍｉＲ１３８ノックダウン効率を有してもよい。
【００６９】
一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、異常な増殖の阻害、老化またはアポトーシスを促進してもよい。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、（非特異的な）毒性細胞死を引き起こすことなく、細胞におけるｍｉＲ１３８発現をノックダウンする。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、毒性細胞死またはネクローシスを引き起こすことなく、腫瘍または癌細胞において老化および／またはアポトーシスを促進する。
【００７０】
本明細書において用いられる「老化」という用語は、増殖因子による可逆性のない、ＤＮＡ複製および細胞増殖の永続的な停止を示す。この現象は典型的に、正常細胞の増殖寿命の最後に起こり、または腫瘍細胞おいて、この現象は抗腫瘍薬または抗癌薬に応答して起こり得る。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドによる処理の後に、この現象が起こり得る。老化は、サイズの増加、形態が平たくなること、粒度の増加、および老化関連リソソームベータガラクトシダーゼ活性（ＳＡ−β−ｇａｌ：ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）の検出を含むがそれらに限定されない特定の特徴によって特徴付けられてもよい。たとえば、図２６に示されるとおり、老化細胞はより多くのサブＧ１期細胞（静止期またはＤＮＡ複製が起こる前の段階）を有することが見出され得る。
【００７１】
本明細書において用いられる「アポトーシス」という用語は、細胞死として公知である生理的プロセスを示す。このプロセスは、正常な生理的条件下での細胞代謝回転を制御する、形態学的および生化学的に明瞭な形の細胞死である。形態学的な特徴は、組織化された一連の変化を含み、それは細胞の収縮、クロマチン凝縮、核分割、および「出芽」から別の膜結合アポトーシス小体への最終的な細胞の崩壊を含む。よって、アポトーシスを起こす細胞はその近隣を損傷することなく適切に死ぬ。生化学的な特徴は、たとえば細胞ＤＮＡのヌクレオソーム間切断、およびプロテアーゼのＩＣＥ／Ｃｅｄ−３ファミリーの活性化などを含む。この用語は、それが当業者によって知られて使用されるとおりの使用と一致することが意図される。
【００７２】
これに対し、本明細書において「毒性細胞死」または「ネクローシス」という用語は、外部因子（たとえば毒性薬剤または外傷など）または疾患（たとえば感染症など）によって引き起こされる細胞死を示すために用いられる。典型的に毒性細胞死は、本質的に非特異的である。形態学的な特徴は、細胞の膨張、細胞漏出性および小疱形成（および場合によっては破裂）の増加、ならびに炎症を引き起こし得る細胞および核溶解の形の最終的な崩壊を含むが、それらに限定されない。
【００７３】
実施例セクションの、たとえば図１、図１７および図１８に示されるとおり、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、腫瘍細胞の増殖を低減させるために用いられ得る。よって、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、医薬（治療用）調合物において用いられてもよいことが認識されるだろう。よって別の例において、医薬に使用するための、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドが提供される。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの設計は、たとえば親和性／特異性、生物学的流体における安定性、細胞の取り込み、作用のモード、薬物動態学的特性、および毒性などのさまざまなパラメータの微調整を必要とする。当然のことながら、こうした微調整は当業者の技術の範囲内である。
【００７４】
さらに別の例において、有効量の本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド、またはその薬学的に許容できる塩と、薬学的に許容できる担体または希釈剤とを含む医薬組成物が提供される。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは「そのままで」用いられてもよいし、さまざまな薬学的に許容できる塩の形で用いられてもよい。本明細書において用いられる「薬学的に許容できる塩」という用語は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの所望の生物活性を保持し、かつ最小限の望ましくない毒物学的影響を示す塩を示す。こうした塩の非限定的な例は、有機アミノ酸、ならびにたとえば亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム、ナトリウム、およびカリウムなどの金属カチオン、またはアンモニア、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレン−ジアミン、Ｄ−グルコサミン、テトラエチルアンモニウム、もしくはエチレンジアミンから形成されるカチオンによって形成される塩基付加塩によって形成され得る。一例において、オリゴヌクレオチドはプロドラッグの形であってもよい。オリゴヌクレオチドは負に帯電したイオンである。細胞膜の親油性の性質のために、細胞のオリゴヌクレオチドの取り込みは、中性または親油性の同等物よりも低減する。プロドラッグアプローチを用いることによって、この極性「障害」を回避できる。
【００７５】
一例において、医薬組成物は、溶液、エマルション、およびリポソーム含有調合物を含んでもよいが、それらに限定されない。これらの組成物は、予備形成された液体、自己乳化固体、および自己乳化半固体を含むがそれらに限定されないさまざまな構成要素から生成されてもよい。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物の腫瘍組織への送達は、カチオン性リポソーム、シクロデキストリン、ポルフィリン誘導体、分岐鎖デンドリマー、ポリエチレン−イミンポリマー、ナノ粒子およびミクロスフェアを含むがそれらに限定されない担体介在性送達によって高められてもよい。簡便には単位剤形で提供されてもよい、本明細書に記載される医薬調合物は、医薬品産業において周知の従来の技術に従って調製されてもよい。こうした技術は、活性成分を医薬担体または賦形剤と関連付けるステップを含む。一般的に、この調合物は、活性成分を液体担体もしくは微細に分割した固体担体またはその両方と均一かつ本質的に関連付けるステップと、次いで必要であれば生成物を成形するステップとによって調製される。本明細書に記載される組成物は、たとえば錠剤、カプセル、ジェルカプセル、液体シロップ、ソフトジェル、および坐剤などであるがそれらに限定されない多くの可能な剤形のいずれかに調合されてもよい。加えて、本明細書に記載される組成物は、水性、非水性、または混合媒体中の懸濁物として調合されてもよい。水性懸濁物は、たとえばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランなどを含む、懸濁物の粘度を増加させる物質をさらに含有してもよい。加えて、懸濁物は安定剤を含有してもよい。加えて、本明細書に記載される組成物は、たとえばアスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗菌薬、または抗生物質などの活性薬物質に結合されてもよい。一例において、医薬組成物は、薬学的に許容できるアジュバントをさらに含んでもよい。一例において、薬学的に許容できる担体は、コロイド分散系、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、またはリポソームを含んでもよいが、それに限定されない。一例において、薬学的に許容できる担体または希釈剤は、食塩水を含むか、または食塩水からなっていてもよい。
【００７６】
別の例において、処置を必要とする対象における増殖性疾患を処置する方法が提供される。この方法は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドを対象に投与するステップを含む。本明細書において用いられる、増殖性の状態、疾患、または症候群を「処置すること」または「処置」という用語は、（ｉ）増殖性疾患、障害、もしくは症候群を阻害すること、すなわちそれが腫瘍／癌を発生させるのを抑止すること、および／または（ｉｉ）増殖性疾患、障害、もしくは症候群を軽減すること、すなわち増殖性疾患、障害、もしくは症候群の退縮を引き起こすことを含む。
【００７７】
一例において、増殖性疾患は良性の腫瘍または癌を含んでもよいが、それに限定されない。一例において、増殖性疾患は癌であってもよい。一例において、癌は脳癌および／または乳癌であってもよい。一例において、癌は脳癌であってもよい。一例において、脳癌は未分化星状細胞腫、未分化混合膠腫、未分化乏突起星細胞腫、未分化乏突起神経膠腫、胚細胞腫、多形神経膠芽腫、膠肉腫、低悪性度星状細胞腫、低悪性度混合乏突起星状細胞腫、低悪性度乏突起神経膠腫、中枢神経系リンパ腫、髄芽細胞腫（ｍｅｄｕｌｏｂｌａｓｔｏｍａ）、髄膜腫、毛様細胞性星状細胞腫、聴神経腫、脊索腫、頭蓋咽頭腫、脳幹神経膠腫、脳室上衣腫、視神経膠腫、上衣下腫、転移性脳腫瘍、下垂体腫瘍、原始神経外胚葉性、およびシュワン腫（ｓｃｗａｎｎｏｍａ）を含んでもよいが、それらに限定されない。一例において、癌は、たとえば悪性神経膠腫および良性神経膠腫などの神経膠腫であってもよい。一例において、神経膠腫は星状細胞腫（多形神経膠芽腫）、脳幹神経膠腫、脳室上衣腫、混合膠腫、乏突起神経膠腫、および視神経膠腫などを含んでもよいが、それらに限定されない。
【００７８】
図２５から図２７に示されるとおり、乳癌細胞におけるｍｉＲ１３８の欠乏は、細胞増殖を防いで老化を促進する。よって一例において、乳癌を処置するために、乳癌におけるｍｉＲ−１３８発現を低減する薬剤が用いられてもよい。一例において、癌は乳癌であってもよい。一例において、乳癌は管腔乳癌、非浸潤性乳管癌、浸潤（ｉｎｖａｓｉｖｅ）（または浸潤性（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ））乳管癌（乳房の管状癌、乳房の髄様癌、乳房の乳頭癌、乳房の篩状癌を含む）、浸潤（または浸潤性）小葉癌、炎症性乳癌、乳頭のパジェット病、男性乳癌、葉状腫瘍、血管肉腫、腺様嚢胞癌、低悪性度腺扁平上皮癌、髄様癌、粘液性（または膠質）癌、乳頭癌、管状癌、異形成の癌（たとえば紡錘細胞および扁平上皮癌など）、微小乳頭癌、混合癌（浸潤性の腺管癌および小葉癌の両方の特徴を有する）、ならびに再発性および転移性乳癌などであってもよい。
【００７９】
本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、上に示したとおりのいくつかの治療的適用に対して有用である。一般的に、本明細書に記載される治療法は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの治療上有効な量を対象に投与することを含んでもよい。本明細書において用いられる「対象」という用語は、たとえばヒトなどの任意の哺乳動物を含んでもよい。本明細書において用いられる「投与すること」、「投与」、「投与された」という用語は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物を対象に投与する方法を示す。一例において、投与することまたは投与とは、局所、非経口、静脈内、皮内、筋肉内、結腸、直腸、または腹腔内を含む多くのやり方での投与を含んでもよい。一例において、投与は非経口投与であってもよい。一例において、非経口投与は静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内を含んでもよいが、それに限定されない。一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載される医薬組成物は、経口、経皮、徐放、放出制御、遅延放出、坐剤、カテーテル、または舌下投与によって投与されてもよい。
【００８０】
一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの投与を含む方法は、第２の治療薬剤（例、化学療法剤）を対象に投与するステップをさらに含んでもよい。
【００８１】
一例において、本明細書に記載される医薬組成物は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドを含んでもよい。一例において、医薬組成物は、第２の治療薬剤をさらに含んでもよい。
【００８２】
一例において、第２の治療薬剤は、たとえばトラスツズマブ、カペシタビン、ベバシズマブ、およびタキサンなどの抗癌剤であってもよい。一例において、第２の治療薬剤は、トラスツズマブ、カペシタビン、ベバシズマブ、パクリタキセル、およびドセタキセルなどを含んでもよいが、それらに限定されない。一例において、第２の薬剤は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの前に、または同時に、または別に、または後に投与されてもよい。
【００８３】
一例において、本明細書に記載される方法、または本明細書に記載される医薬組成物、または本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、癌（たとえば脳または乳癌など）の他の処置の前または後に提供されてもよい。一例において、癌（たとえば脳癌など）のその他の処置とは、手術、放射線療法、および化学療法、またはそれらの混合を含んでもよいが、それらに限定されない。
【００８４】
一例において、脳癌に対する前の処置は、手術、従来の外部放射線療法、三次元原体照射療法、強度変調放射線療法、定位放射線照射、分割定位放射線療法、プロトン放射線療法、内部またはインプラント放射線療法、テモゾロミド、ベバシズマブ、カルムスチン、ロムスチン、プロカルバジン、ビンクリスチン、腫瘍処置分野の療法、エベロリムス、プロカルバジン、ロムスチン、シスプラチン、カルボプラチン、およびメトトレキサート、またはそれらの混合物を含んでもよいが、それらに限定されない。
【００８５】
一例において、乳癌に対する前の処置は、手術、センチネルリンパ節生検に続く手術、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、および標的療法を含んでもよいが、それらに限定されない。一例において、乳癌に対する前の処置は、乳腺腫瘍摘出術、乳房部分切除術、乳房扇状部分切除術、全乳房切除術、根治的乳房切断術変法、外部放射線、内部放射線、ａｄｏ−トラスツズマブエムタンシン、アナストロゾール、ベバシズマブ、カペシタビン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ダルベポエチンアルファ、ダウノルビシン、デノスマブ、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エポエチンアルファ、エリブリン、エベロリムス、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルベストラント、ゲムシタビン、ゴセレリン、イクサベピロン、ラパチニブ、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、メゲストロール、メトトレキサート、ミトキサントロン、ムタマイシン、パクリタキセル、パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子調合物、パミドロネート、ペグフィルグラスチム、ペルツズマブ、ラロキシフェン、タモキシフェン、チオテパ、トレミフェン、トラスツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、トリプトレリン、ビンクリスチン、ビノレルビン、およびゾレドロン酸、またはそれらの混合物を含んでもよいが、それらに限定されない。特定の実施形態において、乳癌に対する前の処置は、ベバシズマブ、カペシタビン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エリブリン、エベロリムス、フルオロウラシル、ゲムシタビン、イクサベピロン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ムタマイシン、パクリタキセル、パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子調合物、タモキシフェン、トラスツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、ビンクリスチン、およびビノレルビン、またはそれらの混合物より選択される。
【００８６】
別の例において、処置を必要とする対象において増殖性疾患を処置するための薬物の製造における、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの使用が提供される。
【００８７】
加えて一例において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドに細胞を接触させるステップを含む、細胞内のｍｉＲ−１３８の活性を低減または阻害する方法が提供される。一例において、細胞は哺乳動物細胞であってもよい。一例において、細胞はグリア細胞であってもよい。一例において、細胞はインビトロ、インビボ、またはエクスビボであってもよい。
【００８８】
一例において、本明細書に記載される医薬組成物は、１つまたはそれ以上の化学療法剤をさらに含んでもよい。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物とともに使用されるとき、こうした化学療法剤は個別で、逐次、または１つもしくはそれ以上のその他のこうした化学療法剤と組み合わせて、または放射線療法と組み合わせて用いられてもよい。当業者に公知であるすべての化学療法剤は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物との併用処置としてここに取り入れられる。たとえば、非ステロイド性抗炎症薬および副腎皮質ステロイドを含むがそれらに限定されない抗炎症薬、抗ウイルス薬、および免疫調節薬などのその他の活性薬剤も、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物と組み合わされてもよい。
【００８９】
加えて、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、キットとして提供されてもよい。このキットは、疾患状態を処置および／または診断するために対象にオリゴヌクレオチドを投与するためのものであってもよい。一例において、キットは、たとえば癌性状態などの疾患状態を処置および／または診断するために必要な２つまたはそれ以上の構成要素を含んでもよい。構成要素は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド、本明細書に記載される医薬組成物、試薬、容器、および／または機器を含んでもよい。一例において、キット内の容器は、使用前に放射標識された放射性医薬品を含む、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドを含んでもよい。キットはさらに、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドを投与するために必要な任意の反応構成要素または緩衝剤を含んでもよい。さらに、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは凍結乾燥された形であってもよく、次いで投与の前に再構成されてもよい。
【００９０】
本明細書に例示的に記載される本発明は、本明細書に特定的に開示されていない任意の単数または複数の要素、単数または複数の限定が不在でも好適に実施され得る。よってたとえば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は、拡張的に限定なく読取られるべきである。加えて、本明細書において使用される用語および表現は、限定ではなく説明の用語として用いられており、こうした用語および表現の使用には、示されて記載された特徴またはその一部の任意の同等物を排除する意図はなく、むしろ請求される本発明の範囲内でさまざまな修正が可能であることが認識される。よって、好ましい実施形態および任意の特徴によって本発明が特定的に開示されているが、本明細書において具現化され開示される本発明の修正および変形が当業者によって行われてもよく、かつこうした修正および変形は本発明の範囲内と考えられることが理解されるべきである。
【００９１】
本明細書において、本発明を広く一般的に説明した。一般的な開示の範囲内のより狭い種および亜種の分類の各々も、本発明の一部を形成する。これは、削除される材料が本明細書に特定的に述べられているか否かに関わらず、属から任意の主題を除去する条件または負の限定を伴う本発明の一般的な説明を含む。
【００９２】
その他の実施形態は、添付の請求項および非限定的な例の範囲内にある。加えて、本発明の特徴または局面がマーカッシュグループによって記載されるとき、それによって本発明はマーカッシュグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関しても記載されるものであることを当業者は認識するだろう。
【００９３】
実験セクション
材料および方法
細胞培養：Ｕ８７ＭＧ細胞系を、１０％ＦＢＳ、ピルビン酸ナトリウム（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））、Ｌ−グルタミン酸（ギブコ）およびＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（ギブコ）を補ったＭＥＭ培地（ギブコ）中で、３７℃に維持した５％ＣＯ２インキュベーター内で培養する。０．２５％トリプシン（ギブコ）を用いて、細胞を７５％の集密度にて継代した。
【００９４】
アンチセンスオリゴ（ＡＳＯ：ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｓ）によるトランスフェクション：１００，０００のＵ８７ＭＧ細胞を６ウェルプレートに播種した後に、４０ナノモルのＡＳＯでトランスフェクトした。２つの非ターゲティングコントロールとともに、マイクロＲＮＡ−１３８をターゲティングするための複数の修飾を有するＡＳＯを開発し、それらを抗ｍｉＲ−１３８−１（配列番号１０）、抗ｍｉＲ−１３８−２（配列番号１２）、抗ｍｉＲ−１３８−３（配列番号１３）、または抗ｍｉＲ−１３８−４（配列番号５、または「オリゴ−４」）とも呼んだ。４０ナノモルのＡＳＯによるトランスフェクションの第２のラウンドの後に、細胞を６０ｍｍディッシュに分割した（２ウェルからの細胞を５つの６０ｍｍディッシュに分割する）。それらの表現型を調べるために、継続的に７日間にわたり毎日顕微鏡画像を取得した。後者の細胞をＲＮＡ単離のために採取した。
【００９５】
抗ｍｉＲ−１３８配列は、次のとおりである。
【００９６】
【表１】
2020202845.tif 000002
【００９７】
ＲＮＡ単離：エキシコン（Ｅｘｉｑｏｎ）ｍｉＲＣＵＲＹＴＭ  ＲＮＡアイソレーション・キット（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いて、製造者の指示に従って、ＲＮＡ単離を行った。キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＮアーゼフリーＤＮアーゼ酵素を用いてＤＮアーゼ処理を行い、最終的にＲＮＡを５０μｌの体積に懸濁した。
【００９８】
マイクロＲＮＡおよびｍＲＮＡの定量化：ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｍｉＲＮＡ逆転写キット（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、米国）に従い、ｍｉＲＮＡ特異的プライマー（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ライフ・テクノロジーズ、米国）を用いて、総ＲＮＡ（５０ｎｇ）を逆転写した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いて、ｍｉＲＮＡ発現のリアルタイム分析を行った。ｍｉＲＮＡのＣｔ値をＵ６  ｓｎＲＮＡ内部標準に対して正規化し、値を相対的転写物存在量としてプロットした。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ（ライフ・テクノロジーズ、米国）およびアンカーオリゴｄＴプライマーによって、製造者の指示に従って、総ＲＮＡ（５００ｎｇ）を逆転写した。遺伝子特異的プライマーを用いたＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス（アプライド・バイオシステムズ、ライフ・テクノロジーズ、米国）を用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、転写物レベルを測定した。内在性リボソーム大サブユニットＰ０（ＲＰＬＰ０）値に対して、Ｃｔ値を正規化した。すべての実験は３つの生物学的複製物において行ったものであり、代表的な図面を示す。
【００９９】
グリオーマ細胞の頭蓋内移植：ルシフェラーゼを発現するＵ８７ＭＧグリオーマ細胞を、非ターゲティングコントロールＡＳＯまたはｍｉＲ−１３８をターゲティングする特異的ＡＳＯでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に細胞をＰＢＳで洗浄し、頭蓋内注射に用いた。施設内動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）承認プロトコルに従って、８週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒγマウス（ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ））へのルシフェラーゼ発現Ｕ８７ＭＧ細胞の頭蓋内移植を行った。３μｌ中の５×１０４の細胞を免疫不全マウスの前脳に定位的に注射し、神経学的症状が現れるまで維持した。生物発光を追跡するか、またはマウスに磁気共鳴画像法（ＭＲＩ：ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ）を受けさせることによって、腫瘍の形成／増殖／退縮を測定する。
【０１００】
生物発光イメージング：ルシフェラーゼを発現するＵ８７ＭＧグリオーマ細胞は、ヒトＰＧＫプロモーター（アドジーン（Ａｄｄｇｅｎｅ））の下でルシフェラーゼを発現するレンチウイルスによる形質導入の後に、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）に対する選択を行うことによって確立した。生物発光イメージングのために、抗ｍｉＲ１３８オリゴヌクレオチド（すなわちＡＭＯ）でトランスフェクトしたルシフェラーゼ発現Ｕ８７ＭＧグリオーマ細胞を、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの右前脳に注射し、イメージングのためにキセノゲン・システムを用いた。１５０ｍｇ／ｋｇのＤ−ルシフェリンの腹腔内用量の後、マウスに麻酔をして、ＩＶＩＳスペクトル・イメージング・システム（キセノゲン）を用いてイメージングを行った。定量化は、生存可能細胞の相対数の尺度として、放射光の合計流束（フォトン／秒）に基づいた。リビング・イメージ・ソフトウェア（ＩＶＩＳリビング・イメージｖ３．０）を用いて、生物発光シグナルを分析した。
【０１０１】
β−ガラクトシダーゼ染色：老化β−ガラクトシダーゼ染色キット（Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ）（たとえば、セル・シグナリング・テクノロジー（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、キット＃９８６０、米国など）を用いて、ＭＤＡＭ２３１細胞（乳癌細胞系）の老化関連β−ガラクトシダーゼに対する細胞化学染色を行った。代表的な結果を示す。
【０１０２】
細胞周期分析：細胞周期進行を分析するための、ＤＮＡ含有量の定量化によるフローサイトメトリ分析。単一時点測定によって、Ｇ１（ギャップ（Ｇａｐ）１期、細胞のサイズが増加してＤＮＡ合成の準備をする）対Ｓ（合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）期、ＤＮＡ複製が起こる）対Ｇ２／Ｍ（ギャップ２／有糸分裂（Ｍｉｔｏｓｉｓ）期、Ｇ２は細胞が生育を続け、Ｍ（有糸分裂）期に入って分裂する準備をすべて確実にするときである；Ｍは細胞生育が停止し、細胞エネルギが２つの娘細胞への秩序ある分裂に焦点を合わせるときである）にある細胞のパーセンテージを明らかにする。加えて、抗ｍｉＲ−１３８またはコントロールを発現するレンチウイルスを形質導入したＭＤＡＭ２３１細胞（乳癌細胞系）を用いて、この分析を行った。
【図１】
2020202845.tif 000003
【図２】
2020202845.tif 000004
【図３】
2020202845.tif 000005
【図４】
2020202845.tif 000006
【図５】
2020202845.tif 000007
【図６】
2020202845.tif 000008
【図７】
2020202845.tif 000009
【図８】
2020202845.tif 000010
【図９】
2020202845.tif 000011
【図１０】
2020202845.tif 000012
【図１１】
2020202845.tif 000013
【図１２】
2020202845.tif 000014
【図１３】
2020202845.tif 000015
【図１４】
2020202845.tif 000016
【図１５】
2020202845.tif 000017
【図１６】
2020202845.tif 000018
【図１７】
2020202845.tif 000019
【図１８】
2020202845.tif 000020
【図１９】
2020202845.tif 000021
【図２０】
2020202845.tif 000022
【図２１】
2020202845.tif 000023
【図２２】
2020202845.tif 000024
【図２３】
2020202845.tif 000025
【図２４】
2020202845.tif 000026
【図２５】
2020202845.tif 000027
【図２６】
2020202845.tif 000028
【図２７】
2020202845.tif 000029
【配列表】
2020202845000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年9月7日(2020.9.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列５’−ｍＣ＊ｍＧ＊Ｇ＊ｍＣＣｍＵｍＧＡｍＵＴｍＣＡｍＣｍＡＡｍＣＡｍＣＣｍＡ＊Ｇ＊ｍＣ＊ｍＵ−３’（配列番号１３）、および５’−ｍＣ＊ｍＧ＊ｍＧ＊ｍＣｍＣＴｍＧＡｍＵＴｍＣＡｍＣＡｍＡＣｍＡＣｍＣｍＡ＊ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵ−３’（配列番号１０）からなる群より選択される配列の１つまたはそれ以上を含み、ここでｍは２’−Ｏ−メチル化であり、＊はホスホロチオエート結合であり、下線付きのヌクレオチドはロックド核酸修飾を表す、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記ロックド核酸は、リボースの立体構造をロックする二環構造を生成する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記二環構造は、２’酸素を４’炭素に接続する架橋を生成するリボース部分の修飾によって生成される、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記架橋は、エチレン、メチレン、またはオキシメチレン架橋である、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
有効量の、請求項１から４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、またはその薬学的に許容できる塩と、薬学的に許容できる担体または希釈剤とを含む、医薬組成物。
【請求項６】
請求項１から４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含む、増殖性疾患を処置するための医薬組成物。
【請求項７】
前記増殖性疾患は良性の腫瘍または癌である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記癌は、悪性神経膠腫および乳癌からなる群より選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
処置を必要とする対象において増殖性疾患を処置するための薬物の製造における、請求項１から４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１０】
細胞内のｍｉＲ−１３８の活性をイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒо）で低減または阻害する方法であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドに前記細胞を接触させるステップを含む、方法。
【外国語明細書】
2020202845000001.pdf