(57)【要約】【課題】エンドグリコシダーゼによる加水分解や糖転移等の酵素反応を停止する作用を示す薬剤であって、優れた阻害作用を有するとともに、エンドグリコシダーゼによる酵素反応の対象を変性させる等の問題を生じないエンドグリコシダーゼ阻害剤を提供する。【解決手段】イミダゾール環を有する糖イミダゾール誘導体であって、イミダゾール環に、塩基性アミノ酸から１つのアミノ基を除いてなる残基が結合し、この塩基性アミノ酸残基中のアミノ基が保護基で保護されている化合物からなるエンドグリコシダーゼ阻害剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表される糖イミダゾール誘導体からなるエンドグリコシダーゼ阻害剤。
【化１】
2020005547.tif 000020
［式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ３は、それぞれ独立に、水素又は酸素と共有結合可能な一価の有機基であり、Ｒ２は、２以上の単糖からなる糖鎖残基であり、Ｒａは、塩基性アミノ酸から１つのアミノ基を取り除いた残基であって、前記残基中に含まれるアミノ基が保護基により保護されている１価基であり、Ｒ４は、水素又は炭素数１〜２０のアルキル基であり、ｎは０又は１である。］
【請求項２】
Ｒ２が、３以上１１以下の単糖からなり分岐している糖鎖残基である請求項１に記載のエンドグリコシダーゼ阻害剤。
【請求項３】
Ｒ２が、下記式（II）で表される糖鎖残基である請求項２に記載のエンドグリコシダーゼ阻害剤。
【化２】
2020005547.tif 000021
［式中、Ｒ５及びＲ６は、水素又は下記式（IIａ）、（IIｂ）もしくは（IIｃ）で表される１価基である。］
【化３】
2020005547.tif 000022
【請求項４】
Ｒ２が、下記式（III）で表される糖鎖残基である請求項２に記載のエンドグリコシダーゼ阻害剤。
【化４】
2020005547.tif 000023
［式中、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２は、水素又は下記式（IIIａ）で表される１価基であるが、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９の中の１つ又は2つは水素であり、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２の中の少なくとも１つは水素であり、かつＲ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２の中の３〜５は水素である。］
【化５】
2020005547.tif 000024
【請求項５】
前記塩基性アミノ酸から１つのアミノ基を取り除いた残基が、リジンからその側鎖にあるアミノ基を取り除いた残基である請求項１ないし請求項４のいずれか１項に記載のエンドグリコシダーゼ阻害剤。
【請求項６】
前記保護基が、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）及び疎水性アミノ酸からそのカルボキシル基の水素を除いた残基からなる群より選ばれる請求項１ないし請求項５のいずれか１項に記載のエンドグリコシダーゼ阻害剤。
【請求項７】
下記式（IV）で表される糖イミダゾール誘導体からなるエンドグリコシダーゼ阻害剤。
【化６】
2020005547.tif 000025
【請求項８】
下記式（V）で表される糖イミダゾール誘導体からなるエンドグリコシダーゼ阻害剤。
【化７】
2020005547.tif 000026
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドグリコシダーゼ阻害剤に関する。より詳細には、エンドグリコシダーゼ（エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ）による酵素反応、例えば糖鎖の加水分解や糖転移を停止させるために用いられるエンドグリコシダーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドグリコシダーゼは、糖鎖のキトビオース結合を加水分解して遊離させる活性、糖鎖を転移させる活性を有する酵素であり、例えば、糖タンパク質の糖鎖の切断や糖転移のために使用され、種々の糖鎖の合成等に利用されている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、コプリナス・シネレウス由来であり、糖タンパク質が有するＮ−結合型糖鎖を切断し遊離させ、かつ糖鎖を転移させる活性を有し、基質特異性が広いエンドグリコシダーゼが開示されている。
又、特許文献２には、コプリナス・シネレウス由来であり、糖タンパク質が有するＮ−結合型糖鎖を切断し遊離させる活性を有さず、糖鎖を転移させる活性のみを有する酵素であるエンドグリコシダーゼが開示されている。そしてその酵素を、タンパク質及びオキサゾリン化糖鎖と接触させ、糖鎖をタンパク質に転移させる、糖タンパク質の作製方法が開示されている。
【０００４】
エンドグリコシダーゼを使用し、糖鎖の加水分解や糖転移により種々の糖鎖の合成を行う場合、例えば糖タンパク質の作製を行う場合、反応後、加水分解や糖転移等の酵素反応を停止させる必要がある。酵素反応の停止は、酵素反応を阻害する作用を有する阻害剤を反応系に添加することにより行うことができる。そして、非特許文献１には、糖鎖の末端にチアゾリン環が形成された糖鎖チアゾリンがエンドグリコシダーゼの酵素反応を阻害する作用を有することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１５−８０４５３号公報
【特許文献２】特開２０１７−１５８５９６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｉｏｏｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１６（２００８）４６７０−４６７５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、非特許文献１に記載の糖鎖チアゾリンは、エンドグリコシダーゼにより糖鎖の加水分解や糖転移をする酵素反応の阻害剤としては、満足できる阻害作用を有するものではなかった。そして他にも、満足できる阻害作用を有するエンドグリコシダーゼ阻害剤は知られていなかった。そこで、エンドグリコシダーゼによる加水分解や糖転移等の酵素反応の停止は、加熱による熱失活やｐＨによる酵素失活により行わざるを得なかった。
【０００８】
しかし、熱失活やｐＨによる酵素失活は、酵素反応の対象を変性させる問題がある。例えば、酵素反応の対象が糖タンパク質の場合、熱失活のための加熱や酵素失活のためのｐＨにより、糖タンパク質そのものが変性する。そこで、エンドグリコシダーゼによる酵素反応についての優れた阻害作用を有するとともに、前記の酵素反応の対象を変性させる等の問題を生じないエンドグリコシダーゼ阻害剤が望まれていた。
【０００９】
本発明は、エンドグリコシダーゼによる加水分解や糖転移等の酵素反応を停止する作用を示す薬剤であって、優れた阻害作用を有するとともに、エンドグリコシダーゼによる酵素反応の対象を変性させる等の問題を生じないエンドグリコシダーゼ阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、前記の課題を解決するため検討した結果、イミダゾール環を有する糖イミダゾール誘導体であって、イミダゾール環に、塩基性アミノ酸から１つのアミノ基を除いてなる残基が結合し、この塩基性アミノ酸残基中のアミノ基が保護基で保護されている化合物が、エンドグリコシダーゼの酵素反応に対する優れた阻害作用を有し、かつ酵素反応の対象を変性させる等の問題を生じないことを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
本発明の第１は、下記一般式（Ｉ）で表される糖イミダゾール誘導体からなるエンドグリコシダーゼ阻害剤である。
【００１２】
【化１】
2020005547.tif 000002
【００１３】
［式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ３は、それぞれ独立に、水素又は酸素と共有結合可能な一価の有機基であり、Ｒ２は、２以上の単糖からなる糖鎖残基であり、Ｒａは、塩基性アミノ酸から１つのアミノ基を取り除いた残基であって、前記残基中に含まれるアミノ基が保護基により保護されている１価基であり、Ｒ４は、水素又は炭素数１〜２０のアルキル基であり、ｎは０又は１である。］
【００１４】
本発明は、さらに、前記の第１の態様のより好ましい態様として以下に記載のエンドグリコシダーゼ阻害剤を提供する。
【００１５】
すなわち、本発明の第２は、Ｒ２が、３以上１１以下の単糖からなり分岐している糖鎖残基である本発明の第１のエンドグリコシダーゼ阻害剤である。
【００１６】
本発明の第３は、Ｒ２が、下記式（II）で表される糖鎖残基である本発明の第２のエンドグリコシダーゼ阻害剤である。
【００１７】
【化２】
2020005547.tif 000003
【００１８】
［式中、Ｒ５及びＲ６は、水素又は下記式（IIａ）、（IIｂ）もしくは（IIｃ）で表される１価基である。］なお、下記式（IIａ）、（IIｂ）又は（IIｃ）中、Ａｃはアセチル基を表す。以後に示す他の式中のＡｃも同じである。
【００１９】
【化３】
2020005547.tif 000004
【００２０】
本発明の第４は、Ｒ２が、下記式（III）で表される糖鎖残基である本発明の第２のエンドグリコシダーゼ阻害剤である。
【００２１】
【化４】
2020005547.tif 000005
【００２２】
［式中、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２は、水素又は下記式（IIIａ）で表される１価基であるが、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９の中の１つ又は２つは水素であり、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２の中の少なくとも１つは水素であり、かつＲ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２の中の３〜５は水素である。］
【００２３】
【化５】
2020005547.tif 000006
【００２４】
本発明の第５は、前記塩基性アミノ酸から１つのアミノ基を取り除いた残基が、リジンからその側鎖にあるアミノ基を取り除いた残基である本発明の第１ないし第４のいずれかのエンドグリコシダーゼ阻害剤である。
【００２５】
本発明の第６は、前記保護基が、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）及び疎水性アミノ酸からそのカルボキシル基の水素を除いた残基からなる群より選ばれる本発明の第１ないし第５のいずれかのエンドグリコシダーゼ阻害剤である。
【００２６】
本発明の第７は、下記式（IV）で表される糖イミダゾール誘導体からなるエンドグリコシダーゼ阻害剤である。
【００２７】
【化６】
2020005547.tif 000007
【００２８】
本発明の第８は、下記式（V）で表される糖イミダゾール誘導体からなるエンドグリコシダーゼ阻害剤である。
【００２９】
【化７】
2020005547.tif 000008
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、エンドグリコシダーゼによる加水分解や糖転移等の酵素反応を停止する作用を示す阻害剤であって、優れた阻害作用を有し、かつ酵素反応の対象を変性させる等の問題を生じないエンドグリコシダーゼ阻害剤が提供される。従って、例えば、エンドグリコシダーゼの酵素反応により糖タンパク質の合成を行う場合、熱失活やｐＨにより酵素反応を停止する場合とは異なり、糖タンパク質を変性させる等の問題を生じることなく酵素反応を効率よく停止させることができる。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本発明を実施するための形態についてより具体的に説明するが、本発明の範囲は、以下に述べる具体的形態や実施例により限定されず、課題を解決するための手段として述べた前記の範囲及びその均等の範囲が含まれると解されるべきである。
【００３２】
本発明のエンドグリコシダーゼ阻害剤は、前記一般式（Ｉ）で表される糖イミダゾール誘導体からなる。
式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ３は、それぞれ独立に、水素又は酸素と共有結合可能な一価の有機基であるが、酸素と共有結合可能な一価の有機基としては、アルキル基、アルケニル基、フェニル基等を挙げることができる。Ｒ１及びＲ３としては水素、炭素数１〜４の低級アルキル基が好ましい。
【００３３】
Ｒ２は、２以上の単糖からなる糖鎖残基である。糖鎖残基を構成する単糖としては、ＯＨ基が他の基で置換されたもの、例えばグルコースアミン、Ｎ−アセチルグルコースアミン（ＧｌｃＮＡｃ）でもよい。
前記の糖鎖残基の中でも、３以上１１以下の単糖からなり、分岐している糖鎖残基が好ましく、中でも３以上９以下の単糖からなり、分岐している糖鎖残基がより好ましい。
この糖鎖残基の具体例としては、前記式（II）又は式（III）で表される基を挙げることができる。
Ｒ２が、１つの単糖からなる糖鎖残基の場合、例えばＧｌｃＮａｃの場合は、優れた阻害活性を示さない。
【００３４】
Ｒ４は、水素又は炭素数１〜２０のアルキル基であり、好ましくは、水素又は炭素数１〜４のアルキル基であり、より好ましくは水素である。
【００３５】
Ｒａは、塩基性アミノ酸から１つのアミノ基を取り除いた残基であって、前記残基中に含まれるアミノ基が保護基により保護されている１価基である。例えば、塩基性アミノ酸の側鎖にあるアミノ基を取り除いた残基であって、α−アミノ基が保護基により保護されている基を挙げることができる。Ｒａより表される基のより具体な例としてはリジンからその側鎖にあるアミノ基を取り除いた残基であって、α−アミノ基が保護基により保護されている基を挙げることができる。
【００３６】
前記保護基としては、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、疎水性アミノ酸からそのカルボキシル基の水素を除いた残基等を挙げることができる。前記疎水性アミノ酸としては、トリプトファン、ヒスチジン等を挙げることができる。前記例示の保護基の中でも、Ｆｍｏｃが好ましい。
【００３７】
式（Ｉ）中のＲ４は、水素又は炭素数１〜２０のアルキル基であるが、好ましくは、水素又は炭素数１〜４のアルキル基であり、より好ましくは水素である。
【００３８】
本発明のエンドグリコシダーゼ阻害剤としては。前記式（IV）又は（V）で表される糖イミダゾール誘導体の他に、下記式（VI）、（VII）、（VIII）、（IX）、（X）、（XI）、（XII）、（XIII）又は（XIV）で表される糖イミダゾール誘導体を挙げることができる。中でも、前記式（IV）又は（V）で表される糖イミダゾール誘導体が好ましい。
【００３９】
【化８】
2020005547.tif 000009
【００４０】
【化９】
2020005547.tif 000010
【００４１】
【化１０】
2020005547.tif 000011
【００４２】
【化１１】
2020005547.tif 000012
【００４３】
【化１２】
2020005547.tif 000013
【００４４】
【化１３】
2020005547.tif 000014
【００４５】
式（Ｉ）で表される化合物は、例えば、特開２０１８−２１００１号公報に記載の製造方法により製造することができる。具体的には、下記一般式（XV）で表されるピラノシドオキサゾリン誘導体とＲａＮＨ２［式中、Ｒａは、塩基性アミノ酸から１つのアミノ基を取り除いた残基であって、前記残基中に含まれるアミノ基が保護基により保護されている１価基である。］で表される１級アミンを反応させて下記一般式（XVＩ）で表される糖イミダゾリン誘導体を合成した後、脱水することにより式（Ｉ）で表される糖イミダゾール誘導体を合成することができる。
【００４６】
【化１４】
2020005547.tif 000015
【００４７】
【化１５】
2020005547.tif 000016
【００４８】
［式（XV）及び式（XVＩ）中、Ｒ１及びＲ３は、それぞれ独立に、水素又は酸素と共有結合可能な一価の有機基であり、Ｒ２は、２以上の単糖からなる糖鎖残基であり、Ｒ４は、水素又は炭素数１〜２０のアルキル基であり、ｎは０又は１であり、Ｒａは前記の意味を表す。］
【００４９】
一般式（XV）で表されるピラノシドオキサゾリン誘導体の合成や糖イミダゾリン誘導体の脱水は、特開２０１８−２１００１号公報の段落００２０から段落００２４に記載されている方法、条件により行うことができる。
【００５０】
本発明のエンドグリコシダーゼ阻害剤は、エンドグリコシダーゼによる加水分解や糖転移等の酵素反応を停止する作用を示す阻害剤であるので、前記の酵素反応、例えばエンドグリコシダーゼの酵素反応により糖タンパク質の合成を行う場合等において、その反応を停止させるために用いられる。
【実施例】
【００５１】
合成例１（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＳＧイミダゾリン体、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＳＧイミダゾール体の合成）
特開２０１８−２１００１号公報に記載の実施例１２と同じ方法、条件により反応、精製を行い、同公報中に記載の構造式（ｆ１）で表される糖イミダゾリン誘導体（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＳＧイミダゾリン体）を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定を行ったところ、計算値とよく一致する測定値を得てＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＳＧイミダゾリン体が得られていることを確認した。
このようにして得られたＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＳＧイミダゾリン体を、１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．０）中で、５０℃の温度に３日間保つことにより脱水し、前記式（Ｖ）で表されるＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＳＧイミダゾ−ル体を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定を行ったところ、計算値とよく一致する測定値を得てＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＳＧイミダゾ−ル体が得られていることを確認した。
【００５２】
合成例２（Ｌｙｓ−ＳＧイミダゾール体の合成）
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ塩酸塩の代わりにＬｙｓ塩酸塩を用いた以外は、合成例１と同様な方法、条件にて反応を行ったところＬｙｓ−ＳＧイミダゾール体を得た。
【００５３】
合成例３（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＧｌｃＮＡｃイミダゾール体の合成）
特開２０１８−２１００１号公報に記載の実施例１５、１６と同じ方法、条件により反応、精製を行い、同公報中に記載の構造式（ｐ）で表される糖イミダゾ−ル誘導体（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＧｌｃＮＡｃイミダゾ−ル体）を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定を行ったところ、計算値とよく一致する測定値を得てＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＧｌｃＮＡｃイミダゾ−ル体が得られていることを確認した。
【００５４】
合成例４（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−Ｍ３イミダゾール体の合成）
http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0132848のMaterials and Methods中のPreparation of oligosaccharide oxazolines (M3-Oxa, G0-Oxa, G2-Oxa, and A2-Oxa)  に記載の方法により合成した下記構造式（XVII）で表される化合物（Ｍ３：２５．５ｍｇ、３６μｍｏｌ）に、０．５Ｍの２−クロロ−１，３−ジメチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−３−イムクロライド（ＣＤＭＢＩ）水溶液（３６０μＬ）を加えて撹拌した。０℃でトリエチルアミン（７５．４μＬ、５３８．６μｍｏｌ）を加えて、４℃、１０００ｒｐｍで３０分間振とうさせた。得られた反応液を、以下の条件で逆相ＨＰＬＣにかけ、分離精製を行った後、０．１Ｎ水酸化ナトリウム（１０μＬ）を加え凍結乾燥して、下記構造式（XVIII）で表されるＭ３オキサゾリン（Ｍ３Ｏ：１４．０ｍｇ、収率５４．９％）を得た。
【００５５】
【化１６】
2020005547.tif 000017
【００５６】
得られたＭ３Ｏ（１２．８ｍｇ、１８μｍｏｌ）を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）（５００μＬ）に溶解させた。その後、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド：蒸留水（１：１）に溶解した４０ｍＭのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ塩酸塩（５００μＬ、２０μｍｏｌ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基がリジンのα−アミノ基に結合した化合物の塩酸塩）を加え、３０℃で２４時間静置した。精製を行い、糖イミダゾリン誘導体（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−Ｍ３イミダゾリン体）を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定を行ったところ、計算値とよく一致する測定値を得てＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−Ｍ３イミダゾリン体が得られていることを確認した。
このようにして得られたＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−Ｍ３イミダゾリン体を、１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．０）中で、５０℃の温度に７日間保つことにより脱水し、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−Ｍ３イミダゾ−ル体を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定を行ったところ、計算値とよく一致する測定値を得て前記式（IV）で表されるＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−Ｍ３イミダゾ−ル体が得られていることを確認した。
【００５７】
［実施例  阻害活性の測定］
下記のエンドグリコシダーゼ阻害剤について、その阻害活性を測定した。
（測定対象のエンドグリコシダーゼ阻害剤）
・合成例１により得られた前記式（V）で表される糖イミダゾール誘導体（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＳＧイミダゾール体）。
・合成例１により得られた糖イミダゾリン誘導体（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＳＧイミダゾリン体）。
・合成例２により得られた糖イミダゾール誘導体（Ｌｙｓ−ＳＧイミダゾール体）。
・合成例３により得られた糖イミダゾール誘導体（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＧｌｃＮＡＣイミダゾール体）。
・合成例４により得られた前記式（IV）で表される糖イミダゾール誘導体（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−Ｍ３イミダゾール体）。
・キチンオリゴ糖（甲陽ケミカル社製）
・ランソプラゾール（富士フィルム和光純薬工業社製）
・オメプラゾール（富士フィルム和光純薬工業社製）
・ラベプラゾール（富士フィルム和光純薬工業社製）
【００５８】
（阻害活性の測定方法）
酵素としてＥｎｄｏ−ＣＣ（伏見製薬所社製のエンドグリコシダーゼ）を使用し、シアリルグリコペプチド（ＳＧＰ）をシアリル化糖鎖（ＳＧ）とグリコペプチド（ＧＰ）に加水分解する反応を、前記エンドグリコシダーゼ阻害剤の存在下及び非存在下で行い、エンドグリコシダーゼ阻害剤による前記加水分解する反応の阻害率を求めた。具体的な反応条件を以下に示す。
【００５９】
（酵素溶液の作製）
Ｅｎｄｏ−ＣＣを１０質量倍の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）に溶解して、酵素溶液を作製する。
（阻害基質溶液の作製）
前記エンドグリコシダーゼ阻害剤のそれぞれを以下に示す溶媒に溶解し、４ｍＭの阻害基質溶液を作成した。
水：阻害剤がＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＳＧイミダゾール体、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＳＧイミダゾリン体、Ｌｙｓ−ＳＧイミダゾール体、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＧｌｃＮＡＣイミダゾール体、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−Ｍ３イミダゾール体の場合
１％ＤＭＳＯ水溶液：阻害剤がキチンオリゴ糖、ラベプラゾール、オメプラゾールの場合
１０％ＤＭＳＯ水溶液：阻害剤がランソプラゾールの場合
【００６０】
実験１  Ｃｏ−ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎの場合
前記酵素溶液を２０μｌ、４ｍＭのＳＧＰ（基質）水溶液を４μｌ、４ｍＭの阻害基質溶液を４μｌ、反応ｂｕｆｆｅｒ（リン酸緩衝液：０．２Ｍｏｌ  ＮａＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４：ｐＨ８．０）を８μｌ、さらに水４μｌを加えて合計４０μｌとした後、サーマルサイキュラー（ＴａＫａＲａ社製：ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｔｏｕｃｈ）中に入れて３７℃で７０分反応させた後、５分間９９℃に加熱して反応を停止した。その後４℃に冷却して、ＨＰＬＣ測定用試料を調整した。
このようにして得られた試料について、下記の条件でＨＰＬＣの測定を行い、未反応ＳＧＰと生成されたＧＰのピーク面積の和に対する、加水分解により生成したＧＰのピーク面積の割合（ＧＰ／（未反応ＳＧＰ＋ＧＰ）：この割合をＰ１とする）を求めた。
【００６１】
［ＨＰＬＣの条件］
（１）分析機器：紫外可視検出器（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ１２６０社製）
（２）カラム：メルク社製  クロモリス  パフォーマンス  ＲＰ−１８ｅ１００−２
（３）移動相
Ａ液：０．１％  ＴＦＡ
Ｂ液：アセトニトリル
Ａ液とＢ液の混合液を用い、Ｂの比率（Ｖｏｌ％）を、０−７分は０％−７％に変化させ、７−８分は７％−１００％に変化させ、８−９分は１００％とし、９−１０分は１００％−０％に変化させた。
（４）流速０．４ｍｌ／ｍｉｎ  
（５）カラム温度：４０℃
（６）検出；ＵＶ２１４ｎｍ
【００６２】
４ｍＭの阻害基質溶液４μｌの代わりに、阻害剤を溶解していない溶媒（水、１％ＤＭＳＯ水溶液又は１０％ＤＭＳＯ水溶液）を４μｌ用いた以外は、前記と同様にして得られた試料について、前記の条件でＨＰＬＣの測定を行い、未反応ＳＧＰと生成されたＧＰのピーク面積の和に対する、加水分解により生成したＧＰのピーク面積の割合（ＧＰ／（未反応ＳＧＰ＋ＧＰ）：この割合をＰ２とする）を求めた。
上記で得られたＰ１及びＰ２から下記式により得られた結果を阻害率とする。各阻害剤についての阻害率を表１に示した。
１００−｛（Ｐ２／Ｐ１）×１００｝（％）
【００６３】
実験２  Ｐｒｅ−ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎの場合
サーマルサイキュラー中での７０分の反応を、４ｍＭのＳＧＰ（基質）水溶液を加えない合計３６μｌについて３７℃で６０分反応させた後、４ｍＭのＳＧＰ（基質）水溶液を４μｌ加えてさらに１０分間反応させて行った以外は、Ｃｏ−ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎの場合と同様にして、ＨＰＬＣ測定用試料を調整し、各阻害剤についての阻害率を求め、その結果を表２に示した。
【００６４】
【表１】
2020005547.tif 000018
【００６５】
【表２】
2020005547.tif 000019
【００６６】
表１、２に記載の結果より、以下が示されている。
実施例１、３で使用したＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−Ｍ３イミダゾール体は、３つの単糖からなり分岐している糖鎖が結合している糖イミダゾール体に、塩基性アミノ酸であるリジンのα−アミノ基が保護基（Ｆｍｏｃ）により保護されている残基が結合している化合物であり、
実施例２、４で使用したＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＳＧイミダゾール体は、９つの単糖からなり分岐している糖鎖が結合している糖イミダゾール体に、塩基性アミノ酸であるリジンのα−アミノ基が保護基（Ｆｍｏｃ）により保護されている残基が結合している化合物であるが、
これらをエンドグリコシダーゼ阻害剤として用いた場合は、いずれも５０％超える高い阻害率が得られている。
【００６７】
一方、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＳＧイミダゾール体の代わりに、
ＳＧイミダゾ−ル体をＳＧイミダゾリン体としたＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＳＧイミダゾリン体、
リジンのα−アミノ基が保護基（Ｆｍｏｃ）により保護されていないＬｙｓ−ＳＧイミダゾール体、又は
ＳＧを１つの単糖からなるＧｌｃＮＡｃに置き換えたＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＧｌｃＮＡｃイミダゾール体
をエンドグリコシダーゼ阻害剤として用いた場合は、実施例に比べてはるかに低い阻害率しか得られていない。
又、既存の文献報告等によりエンドグリコシダーゼによる酵素反応を停止する作用を有する可能性が考えられたキチンオリゴ糖、ランソプラゾール、オメプラゾール、ラベプラゾールをエンドグリコシダーゼ阻害剤として用いた場合も、実施例に比べてはるかに低い阻害率しか得られていない。
以上の結果より、２以上の単糖からなる糖鎖残基を有する糖イミダゾール誘導体に、塩基性アミノ酸の残基であってその中に含まれるアミノ基が保護基により保護されている１価基が結合している化合物が、エンドグリコシダーゼによる酵素反応に対する優れた阻害活性を有すること、
他の化合物、例えば糖イミダゾリン誘導体の場合、塩基性アミノ酸の残基中に含まれるアミノ基が保護基により保護されていない場合、糖鎖残基が１つの単糖からなる場合は、優れた阻害活性を有しないことが示されている。