(57)【要約】【課題】HBVの感染を十分に阻害することができるHBV感染阻害剤を提供する。【解決手段】HBVの細胞侵入に必要な侵入共因子であるEGFRあるいはその関連分子に対して結合親和性を持つ結合物質を有するHBV感染阻害剤である。上記結合物質がEGFRあるいはその関連分子に結合することでNTCPのエンドサイトーシス(endocytosis)を阻害してHBVの細胞への感染を阻害する。【選択図】図１
2020138910.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
HBVの細胞侵入に必要な侵入共因子であるEGFRあるいはその関連分子に対して結合親和性を持つ結合物質を有するHBV感染阻害剤であって、前記結合物質がEGFRあるいはその関連分子に結合することでNTCPのエンドサイトーシス(endocytosis)を阻害してHBVの細胞への感染を阻害することを特徴とする、HBV感染阻害剤。
【請求項２】
前記EGFRあるいはその関連分子への結合物質は、配列番号１乃至５の何れかに記載されるペプチドであることを特徴とする請求項１に記載のHBV感染阻害剤。
【請求項３】
前記EGFRあるいはその関連分子への結合物質は、EGFR阻害薬である請求項１に記載のHBV感染阻害剤。
【請求項４】
前記EGFRあるいはその関連分子への阻害薬は、Gefitinib、Lapatinib又はAfatinibの何れかである請求項３に記載のHBV感染阻害剤。
【請求項５】
前記EGFRあるいはその関連分子への結合物質は、HER2阻害薬である請求項１に記載のHBV感染阻害剤。
【請求項６】
前記EGFRあるいはその関連分子への結合物質は、FGFR阻害薬である請求項１に記載のHBV感染阻害剤。
【請求項７】
前記EGFRあるいはその関連分子への結合物質は、VEGFR阻害薬である請求項１に記載のHBV感染阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、HBV感染阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルス(HBV)は不完全２本鎖DNAウイルスで、ヘパドナウイルスに属する。2002年の世界保健機関(WHO)の推計では、HBV感染者は世界中で20億人、HBV持続感染者は3.5億人、年間50-70万人の人々がHBV関連疾患で死亡していると報告している。HBVキャリアが人口の8%以上のいわゆる高頻度国は、アジアとアフリカに集中している。これに対し、日本、ヨーロッパ、北米等は感染頻度2%以下の低頻度国である。
【０００３】
B型急性肝炎は、多くの場合自然治癒するが、稀に劇症肝炎を引き起こす。一旦慢性化すると、慢性肝炎から肝硬変、肝細胞癌へと進展していく。HBV感染はほとんどの場合が母児感染によるものであったが、HBs抗原陽性の妊婦からの出生児にはワクチン投与が行われており、新たな母児感染例は稀である。しかしながら若年者の性行為感染症としてのB型急性肝炎が増加し、一部の症例で慢性化し肝機能異常が持続し、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞癌へと移行する。
【０００４】
HBV感染症に対する治療法は、インターフェロン(IFN)療法と核酸アナログ製剤が主体である。HBe抗原陽性症例に対するIFNの著効率は1/3以下である。核酸アナログ製剤LMVのHBe抗原陰性化率は投与期間を伸ばすことで増加するが、投与中止により肝炎の再燃を起す可能性が高い。このようなことから、既存の薬剤に加えて、新たな抗HBV薬の開発が望まれている。
【０００５】
これまでHBV増殖過程を標的として様々な薬剤の開発が試みられている（非特許文献1：肝臓(2017), 58, 4, 217-227）。このうちウイルスの細胞への侵入過程は感染の開始、広がり、維持に必須であるため魅力的な創薬標的と考えられ、感染の治療だけでなく予防にも有効であると期待されている（非特許文献2）。HBVの細胞への侵入は、HBVが細胞表面のヘパラン硫酸プロテオグリカンと非特異的かつ低親和性に吸着したのち、HBV「受容体」であるナトリウムータウロコール酸共輸送体(sodium taurocholate cotransportingpolypeptide: NTCP)との特異的高親和性結合によって開始される（非特許文献2： Urban S et al. Gastroenterology 2014, 147: 48-64）。またHBV感染症を増悪させるD型肝炎ウイルス(HDV)も同様にNTCPを受容体として細胞へ侵入する（非特許文献2）。しかしながらウイルス受容体NTCPによるウイルス侵入開始機構はほとんど明らかになっていなかった。
【０００６】
これまでNTCPを標的としたウイルス侵入阻害剤としてmyrcludex-B、シクロスポリン、イルベサルタン、エゼチミブ、バニタラシンAなどが報告されてきた（非特許文献3: Gripon P et al. J Virol2006, 79: 1613-22; 非特許文献4: Ngonkolo et al. J Hepatol2014, 60: 723-31; 非特許文献5: Watashi et al. Hepatology 2014, 59: 1726-37; 非特許文献5: Wang J et al. Antiviral Res 2015, 120: 140-46; 非特許文献6: LuciforaJ et al. Antiviral Res 2013, 97: 195-97; 非特許文献7: Kaneko et al. J Virol 2015, 89: 11945-11953）。特にmyrcludex-Bは臨床試験においてHBV/HDV感染患者への抗ウイルス効果が試験されている唯一の侵入阻害剤である。この薬剤はHDVウイルス量を下げる効果はある程度認められるものの、HBVウイルス量を下げる効果は今のところ認められず、さらに薬効を高める必要がある（非特許文献8: Bogomolov P et al. J Hepatol 2016, 65: 490-498）。またmyrcludex-Bは注射剤であり、またNTCP本来の機能を阻害することによる血中胆汁酸上昇副作用、さらに免疫原性を有することによる体内での抗体産生など、薬効以外にも解決しなければならない問題も有する（非特許文献9: Blank A et al. Clin PharmacolTher 2018, 103: 341-48）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０１３−５１０９０４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、HBVの感染を十分に阻害するHBV感染阻害剤を提供することを目的とする。またNTCPを標的とする感染阻害剤が有する副作用の観点において、これよりも優れたHBV感染阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一般にある種のウイルスは「受容体」以外にも異なる宿主因子を「侵入共因子」として利用しており、双方が協調的に働くことで初めてウイルス感染が可能になる場合がある。例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)の細胞侵入には受容体としてCD4が働くが、これ以外にもCCR5/CXCR4を侵入共受容体として必要とする（非特許文献10: Wilen CB et al. Cold Spring Harb Perspect Med 2012,2）。またC型肝炎ウイルス(HCV)の細胞侵入には受容体CD81, scavenger receptor class B type I (SR-BI)だけでなく、claudin-1, occludinが必須である（非特許文献11: Feneant L et al. Viruses 2014, 6: 535-572）。重要なこととして、感染阻害剤としては受容体自身よりもむしろ侵入共因子／共受容体の方が創薬には重要であり、HIVにおいてはCD4阻害薬ではなくCCR5阻害薬（マラビロク）が治療に用いられており、HCV感染阻害薬としてもclaudin-1抗体が薬剤候補として挙げられている（非特許文献12: Dorr P et al: Antimicrob Agents Chemother 2005, 49: 4721-4732; 非特許文献13: Krieger SE et al. Hepatology 2010, 51: 1144-1157）。しかしながらHBVにおいてはそのような受容体機能を制御する共侵入因子が全く明らかでないため、そのようなアプローチを取ることができなかった。
【００１０】
本発明者らはHBV侵入阻害に着目し鋭意検討をおこなった結果、HBVの細胞侵入[エンドサイトーシス(endocytosis)]には受容体NTCPに加え、epidermal growth factor receptor (EGFR)が侵入共因子としてNTCPのウイルス受容体機能を制御しており、感染に重要であることを見出した。すなわち本発明は、EGFRあるいはその関連分子に対して結合親和性を持つ結合物質を有するHBV感染阻害剤であって、この結合物質がEGFRあるいはその関連分子に結合することでNTCPのエンドサイトーシス(endocytosis)を阻害してHBVの細胞への感染を阻害することを特徴とする。本明細書において、EGFRあるいはその関連分子とは、EGFR, HER2, HER3, HER4のEGFRファミリーおよびFGFR (Fibroblast Growth Factor Receptor)、VEGFR (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor)等の成長因子受容体として機能する受容体チロシンキナーゼを指す。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、HBVの感染を十分に阻害することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ペプチドによるendocytosis阻害の実験手順を説明する図である。
【図２】感染後13日目においてELISA法によりウイルス感染を検討した図である。
【図３】感染後13日目において免疫蛍光染色(IF)によりウイルス感染を検討した写真図である。
【図４】分子標的薬剤によるHepG2-hNTCP-C4細胞へのendocytosis阻害の実験手順を説明する図である。
【図５】感染後10日目においてELISA法によりウイルス感染を検討した図である。
【図６】分子標的薬剤による初代ヒト肝細胞(PHH)へのendocytosis阻害の実験手順を説明する図である。
【図７】感染後13日目においてELISA法によりウイルス感染を検討した図である。
【図８】分子標的薬剤によるHepG2-hNTCP-C4細胞へのendocytosis阻害の実験手順を説明する図である。
【図９】感染後13日目においてELISA法によりウイルス感染を検討した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００１４】
前述の如く、HBVの細胞への吸着には細胞側受容体であるNTCPが必須であることがすでに知られているが、HBVの内在化にはNTCPのみでは十分でなく、EGFRが必要であり、EGFRはHBVの細胞侵入に重要なentry co-factor（侵入共因子）である。本発明者は、EGFRは受容体NTCPと分子結合し、この結合がHBV-NTCP複合体の内在化に必要であり、EGFR-NTCPのエンドサイトーシス(endocytosis)を阻害すればHBVの細胞への感染を阻害できることを新知見として見出しかかる事実に基づいて本件発明を完成させた。
【００１５】
即ち、本実施形態にかかる発明は、HBVの細胞侵入に必要な侵入共因子であるEGFRあるいはその関連分子に対して結合親和性を持つ結合物質を有するHBV感染阻害剤であって、この結合物質がEGFRあるいはその関連分子に結合することでNTCPのエンドサイトーシス(endocytosis)を阻害してHBVの細胞への感染を阻害する。  EGFR結合物質は、特に限定されるものではないが、例えばペプチドであり、具体的には、配列番号１乃至５の何れかに記載されるペプチドである。
【００１６】
dNTCP(131-150)   : Ac-LGMMPLLLYIYSRGIYDGDL-NH2(配列番号1)
dNTCP(131-150,5A): Ac-LGMMPLLLYIYSRAAAAADL-NH2(配列番号2)
dNTCP(131-150,2A): Ac-LGMMPLLLYIYSRAIYDADL-NH2(配列番号3)
dNTCP(136-150)   : Ac-LLLYIYSRGIYDGDL-NH2(配列番号4)
dNTCP(131-146)   : Ac-LGMMPLLLYIYSRGI-NH2(配列番号5)
【００１７】
上記のペプチドには、配列番号1、2、3、4及び5に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、EGFRに対して結合親和性を持つペプチドが含まれる。
【００１８】
また、EGFR結合物質は、ペプチドに限定されるものではなく、例えばEGFRに結合する化合物又は抗体であり、具体的には、ゲフィチニブ(Gefitinib)、ラパチニブ(Lapatinib)又はアファチニブ(Afatinib)である。
【００１９】
ゲフィチニブは、下記化学式で表され、上皮成長因子受容体(EGFR)のチロシンキナーゼを選択的に阻害する。
【００２０】
【化１】
2020138910.tif 000003
【００２１】
ラパチニブは、下記化学式で表され、上皮成長因子受容体（EGFR）とHer2/neuの双方を阻害する二重チロシンキナーゼ阻害剤である。
【００２２】
【化２】
2020138910.tif 000004
【００２３】
アファチニブは、下記化学式で表され、EGFR及びerbB-2(HER2)を非可逆的に阻害する。
【００２４】
【化３】
2020138910.tif 000005
【００２５】
また、EGFRファミリー分子結合物質としての化合物は、具体的には、HER2阻害薬、FGFR阻害薬又はVEGFR阻害薬である。
【００２６】
HER2阻害薬はヒト上皮成長因子受容体２型（HER2）に対するヒト化抗体製剤である。HER2阻害薬は、特に限定されるものではないが例えば、CP-724714(CAS:383432-38-0)、AC480(BMS-599626)、AEE788(NVP-AEE788)、トラスツズマブ、ペルツズマブ、T-DM1等が挙げられる。
【００２７】
FGFR阻害薬は線維芽細胞増殖因子受容体に対する阻害剤である。FGFR阻害薬は、特に限定されるものではないが例えば、PD173074(CAS:219580-11-7)、BIBF1120(Nintedanib)、AZD4547(CAS:1035270-39-3)、FIIN(N-(4-((3-(3,5-dimethoxyphenyl)-7-((4-(4-methylpiperazin-1-yl)phenyl)amino)-2-oxo-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-1(2H)-yl)methyl)phenyl)acrylamide)、Erdafitinib等が挙げられる。
【００２８】
VEGFR阻害薬は例えばVEGFR-2阻害薬である。VEGFR-2阻害薬は血管内皮増殖因子受容体2に対する阻害剤である。VEGFR-2阻害薬は、特に限定されるものではないが例えば、Semaxanib(CAS:204005-46-9)、ラムシルマブ等が挙げられる。
【実施例】
【００２９】
1.実施例１(ペプチドによるendocytosis阻害)
実施例１ではペプチドによるendocytosis阻害を試験した。実験手順は図１に示されたものである。
【００３０】
1)まず、HepG2-hNTCP-C4細胞をコラーゲンコートした96 wellプレートへ播種し24時間培養した。
【００３１】
2)次に、化合物(1% DMSO, 100μM NTCP (11-30), 100μM NTCP (131-150), 100, 10, 1μM dNTCP(131-150), 100, 10, 1μM dNTCP(131-150,5A), 100, 10, 1μM dNTCP(131-150,2A), 100, 10, 1μM dNTCP(136-150), 100, 10, 1μM dNTCP(131-146))を細胞に処理し、３時間培養した。
【００３２】
ここでペプチドの配列は下記であった。またNTCP (11-30)はネガティブコントロールである。
【００３３】
dNTCP(131-150)   : Ac-LGMMPLLLYIYSRGIYDGDL-NH2(配列番号1)
dNTCP(131-150,5A): Ac-LGMMPLLLYIYSRAAAAADL-NH2(配列番号2)
dNTCP(131-150,2A): Ac-LGMMPLLLYIYSRAIYDADL-NH2(配列番号3)
dNTCP(136-150)   : Ac-LLLYIYSRGIYDGDL-NH2(配列番号4)
dNTCP(131-146)   : Ac-LGMMPLLLYIYSRGI-NH2(配列番号5)
【００３４】
3)2)で処理した化合物と共にHBVを12000 GEq/cellの濃度で加えて、さらに16時間培養した。
【００３５】
4)10% FBS培地で3回洗浄したのちに、新しい10% FBS培地に置換し培養した。
【００３６】
5)3日に一度10% FBS培地で3回洗浄した後に培地交換を行い、感染後13日目の培養上精中のHBs抗原をELISAで検出することでウイルス感染を評価した(図２)。また感染後13日目の細胞内のHBs抗原を免疫蛍光染色(IF)で検出することでウイルス感染を評価した(図３)。
【００３７】
dNTCP(131-150)、dNTCP(131-150,5A)、dNTCP(131-150,2A)、dNTCP(136-150)、及び、dNTCP(131-146)はいずれもEGFR-NTCPのエンドサイトーシス(endocytosis)を阻害してHBVの細胞への感染を阻害することが示唆された。特にdNTCP(131-150)はHBVの細胞への感染阻害効率に優れることが示唆された。
【００３８】
2.実施例２(化合物によるendocytosis阻害)
実施例２では化合物によるendocytosis阻害を試験した。
【００３９】
2-1. 分子標的薬剤によるHepG2-hNTCP-C4細胞への感染阻害
実験手順は図４に示されたものである。
【００４０】
1)HepG2-hNTCP-C4細胞をコラーゲンコートした96 wellプレートへ播種し24時間培養した。
【００４１】
2)FBSを含まない培地(0% FBS)に置換し、24時間培養した。
【００４２】
3)試験対象の化合物(200 nM preS1 peptide, 0.5% DMSO, 50, 25, 12.5μM Gefitinib, 50, 25, 12.5μM Lapatinib)を細胞に処理し、３時間培養した。
【００４３】
4)3)で処理した化合物と共にHBVを12000 GEq/cellの濃度で加えて、さらに16時間培養した。
【００４４】
5)0% FBS培地で2回、10% FBS培地で1回洗浄した後に、新しい10% FBS培地に置換し培養した。
【００４５】
6)3日に一度10% FBS培地で3回洗浄した後に培地交換を行い、感染後10日目の培養上精中のHBs抗原をELISAにより検出することでウイルス感染を評価した(図５)。Gefitinib及びLapatinibはいずれもEGFR-NTCPのエンドサイトーシス(endocytosis)を阻害してHBVの細胞への感染を阻害することが示唆された。特にGefitinibはHBVの細胞への感染阻害効率に優れることが示唆された。
【００４６】
2-2. 分子標的薬剤による初代ヒト肝細胞(PHH)への感染阻害
実験手順は図６に示されたものである。
【００４７】
1)PHHへ化合物(200 nM preS1 peptide, 100, 50, 25μM Gefitinib, 100, 50, 25μM Lapatinib)を処理し、３時間培養した。
【００４８】
2)1)で処理した化合物と共にHBVを500 GEq/cellの濃度で加えて、さらに16時間培養した。
【００４９】
3)PHH用培地(TRL社製Clonetics(登録商標))で3回洗浄したのちに、新しいPHH用培地に置換し培養した。
【００５０】
4)４日に一度PHH用培地で3回洗浄した後に培地交換を行い、感染後13日目の培養上精中のHBs抗原をELISAにより検出することでウイルス感染を評価した(図７)。Gefitinib及びLapatinibはいずれもEGFR-NTCPのエンドサイトーシス(endocytosis)を阻害してHBVの細胞への感染を阻害することが示唆された。特にGefitinibはHBVの細胞への感染阻害効率に優れることが示唆された。
【００５１】
2-3. その他薬剤によるHepG2-hNTCP-C4細胞への感染阻害
実験手順は図８に示されたものである。
【００５２】
1)HepG2-hNTCP-C4細胞をコラーゲンコートした96 wellプレートへ播種し24時間培養した。
【００５３】
2)化合物 (100 nM preS1 peptide, 20, 10, 5μM Lapatinib, 25, 12.6, 6.3 μM BIBW2992, 25, 10, 2μM CP-724714, 25, 10, 2μM AC480, 25, 10, 2μM AEE788, 25, 10, 2μM PD173074, 25, 10, 2μM BIBF1120, 25, 10, 2μM AZD4547, 25, 10, 2μM FIIN-2, 25, 10, 2μM Semaxanib)を細胞に処理し、２時間培養した。
【００５４】
3)2)で処理した化合物と共にHBVを12000 GEq/cellの濃度で加えて、さらに16時間培養した。
【００５５】
4)10% FBS培地で3回洗浄したのちに、新しい10% FBS培地に置換し培養した。
【００５６】
5)3日に一度10% FBS培地で3回洗浄した後に培地交換を行い、感染後13日目の培養上精中のHBs抗原をELISAにより検出することでウイルス感染を評価した(図９)。
【００５７】
LapatinibはEGFRとHER2の両方を阻害する低分子化合物であるが、HBVの細胞への感染阻害効果があることが示唆された。
【００５８】
BIBW2992(Afatinib)は、EGFR遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌(NSCLC)の治療に用いられるチロシンキナーゼ阻害薬の一つであり、EGFRおよびerbB-2(HER2)を非可逆的に阻害するが、HBVの細胞への感染阻害効果があることが示唆された。
【００５９】
CP-724714(CAS:383432-38-0)は、HER-2チロシンキナーゼ阻害薬の一つであるが、HBVの細胞への感染阻害効果があることが示唆された。
【００６０】
AC480(BMS-599626)は、HER-2チロシンキナーゼ阻害薬の一つであるが、HBVの細胞への感染阻害効果があることが示唆された。
【００６１】
AEE788(NVP-AEE788)は、EGFR及びHER2/ErbB2阻害薬の一つであるが、HBVの細胞への感染阻害効果があることが示唆された。
【００６２】
PD173074(CAS:219580-11-7)は、FGFR1及びFGFR3阻害薬の一つであるが、HBVの細胞への感染阻害効果があることが示唆された。
【００６３】
BIBF1120(Nintedanib)は特発性肺線維症（IPF）の治療薬として用いられるインドリノン誘導体であり、VEGFR、FGFR及びPDGFR阻害薬の一つであるが、HBVの細胞への感染阻害効果があることが示唆された。
【００６４】
AZD4547(CAS:1035270-39-3)は、FGFR阻害薬の一つであるが、HBVの細胞への感染阻害効果があることが示唆された。
【００６５】
FIIN(N-(4-((3-(3,5-dimethoxyphenyl)-7-((4-(4-methylpiperazin-1-yl)phenyl)amino)-2-oxo-3,4-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-1(2H)-yl)methyl)phenyl)acrylamide)は、FGFR阻害薬の一つであるが、HBVの細胞への感染阻害効果があることが示唆された。
【００６６】
Semaxanib(CAS:204005-46-9)は、VEGFR-2阻害薬の一つであるが、HBVの細胞への感染阻害効果があることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
HBV治療及び／又は予防薬として利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００６８】
配列番号１〜５：合成ペプチド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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