(57)【要約】      （修正有）【課題】既存のウシ乳脂肪球−ＥＧＦ因子８（ＭＦＧ−Ｅ８）タンパク質に比べて、組織線維化の予防又は治療機能を改善して組織線維化のレベルが正常的なレベルに非常に近付くように修復可能なほどの抗組織線維化機能を備えた組換えタンパク質及びこれを含む組成物の提供。【解決手段】ＭＦＧ−Ｅ８タンパク質を基に組換えされたタンパク質であって、特定のアミノ酸配列からなることを特徴とする、組織線維化の予防又は治療用の組換えタンパク質。【選択図】図１
2020005649.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシ乳脂肪球−ＥＧＦ因子８（ＭＦＧ−Ｅ８）タンパク質を基に組換えされたタンパク質であって、配列番号１のアミノ酸配列からなることを特徴とする、
組織線維化の予防又は治療用の組換えタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載の組換えタンパク質を含む組織線維化の予防又は治療用の組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組換えタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウシ乳脂肪球−ＥＧＦ因子８（Ｍｉｌｋ  ｆａｔ  ｇｌｏｂｕｌｅ−ＥＧＦ  ｆａｃｔｏｒ  ８；ＭＦＧ−Ｅ８）タンパク質を基に組換えされた組織線維化の予防又は治療用の組換えタンパク質及びこれを含む組織線維化の予防又は治療用の組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝線維化及び肝硬変をはじめとする慢性肝疾患に対する治療法は、肝移植が唯一の方法であると言われているが、肝移植のための供与者を探すことが困難であるのが現状である。この理由から、現在、肝移植を除く慢性肝疾患の治療にウルソデオキシコール酸（Ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ；ＵＤＣＡ）及びシリマリン（Ｓｉｌｙｍａｒｉｎ）を含む化合物を成分とする薬物が用いられている。
しかしながら、これらの化合物は、肝細胞の損傷を防ぐ効果を示す治療補助剤に過ぎず、肝疾患を治療する根本的な治療剤として適用することができないため、効果的な慢性肝疾患治療剤の開発が切望されているのが現状である。
また、近年、Ｓ−アデノシルメチオニン（Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、ロシグリタゾン（Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、ピオグリタゾン（Ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、ロサルタン（Ｌｏｓａｒｔａｎ）など抗線維化効果を示す化合物が臨床実験中にあるが、これらの化合物もまた、臨床試験においてはっきりとした疾病の改善効果を示していないのが現状であり、慢性肝疾患をはじめとする組織線維化を治癒することのできる薬物の開発が切望されているのが現状である。
これと関連して、本発明の出願人は、大韓民国公開特許公報１０−２０１７−００１３６２１号  「ウシ乳脂肪球−ＥＧＦ因子８（ＭＦＧ−Ｅ８）を用いた組織線維化の予防又は治療用の組成物」が開示されている先行文献を通じて、ＴＧＦβ／Ｓｍａｄ信号伝達経路を通じて誘導されたコラーゲンの発現の減少、肝性状細胞の活性の抑制を通じた肝線維化の好転、肝線維化疾患モデルにおける肝線維化度の減少及び体外培養された肝性状細胞活性化の抑制などの特性に基づく肝、肺、腎臓、脳、心臓又は横隔膜などにおける組織線維化の予防又は治療のための組成物を提示している。
このようなタンパク質治療剤は、既存の低分子化合物に比べて生体にやさしく、副作用が少なく、量産など及び品質管理が容易である他、臨床試験における新薬の成功率が２倍ほど高いというメリットがある。
しかしながら、本出願人は、既存のウシ乳脂肪球−ＥＧＦ因子８（ＭＦＧ−Ｅ８）を用いた組織線維化の予防又は治療用の組成物によって提供される組織線維化の予防又は治療機能のレベルに留まることなく、さらなる機能的な改善が行われるようにして組織線維化が起きていない正常に非常に近いレベルまで抗組織線維化機能が提供されるようにすることを目指している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】大韓民国公開特許公報１０−２０１７−００１３６２１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、上記の問題を解消するために創作されたものであって、本発明の目的は、既存のウシ乳脂肪球−ＥＧＦ因子８（ＭＦＧ−Ｅ８）タンパク質に比べて組織線維化の予防又は治療機能を改善して組織線維化のレベルが正常的なレベルに非常に近付くように修復可能なほどの抗組織線維化機能を備えた組換えタンパク質及びこれを含む組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の目的を達成するために、本発明に係る組織線維化の予防又は治療用の組換えタンパク質は、ウシ乳脂肪球−ＥＧＦ因子８（ＭＦＧ−Ｅ８）タンパク質を基に組換えされたタンパク質であって、下記の配列番号１のアミノ酸配列からなる。
併せて、上記の目的を達成するために、本発明に係る組織線維化の予防又は治療用の組成物は、ウシ乳脂肪球−ＥＧＦ因子８（ＭＦＧ−Ｅ８）タンパク質を基に組換えされたタンパク質であって、下記の配列番号１のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質を有効成分として含む。
また、上記の目的を達成するために、本発明は、ウシ乳脂肪球−ＥＧＦ因子８（ＭＦＧ−Ｅ８）タンパク質を基に下記の配列番号１のアミノ酸配列のように組換えされたタンパク質をコードする遺伝子を他の態様として提供する。
更に、上記の目的を達成するために、本発明は、ウシ乳脂肪球−ＥＧＦ因子８（ＭＦＧ−Ｅ８）タンパク質を基に下記の配列番号１のアミノ酸配列のように組換えされたタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターを更に他の態様として提供する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、次のような効果が得られる。
まず、第一に、既存のウシ乳脂肪球−ＥＧＦ因子８（ＭＦＧ−Ｅ８）タンパク質に比べて組織線維化の予防又は治療機能のレベルが格段に改善されて、組織線維化の予防及び治療を通じた修復のレベルが正常組織に非常に近付く。
第二に、低分子化合物タイプの従来の組織線維化の予防又は治療剤に比べて生体にやさしく、副作用が少ない組織線維化の予防又は治療用の組成物を提供することができる。
第三に、量産及び品質管理が容易である組織線維化の予防又は治療用の組成物を提供することができる。
第四に、上述した効果を通じて単なる組織線維化の予防又は治療用の補助剤ではなく、根本的な慢性肝疾患治療用途が提供可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明のＮＰ−０１１をコードする遺伝子がＡ部位に挿入可能であり、ＨＥＫ２９３への形質移入のためのバックボーンベクター（ｐＬＧＣＦベクター）の構造を示している。
【図２】図１に示すＡ部位に挿入可能であり、本発明のＮＰ−０１１をコードする遺伝子のＤＮＡ塩基配列を示している。
【図３】本発明のＮＰ−０１１をコードする遺伝子を含むｐＬＧＣＦベクターをＨＥＫ２９３に形質移入した後、分離精製されたＮＰ−０１１の電気泳動を通じてクマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ；ＣＢＢ）染色及びウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行った結果を示す図である。
【図４】本発明のＮＰ−０１１をなすアミノ酸配列を示している。
【図５】正常群、疾病対照群（Ｓｈａｍ）、ＭＦＧ−Ｅ８適用群、ＮＰ−０１１適用群の肝組織形態の染色結果を示す写真である。
【図６】正常群、疾病対照群（Ｓｈａｍ）、ＭＦＧ−Ｅ８適用群、ＮＰ−０１１適用群の肝組織内のＣＯＬ１Ａ１の発現様相を分析した結果を示す図である。
【図７】正常群、疾病対照群（Ｓｈａｍ）、ＭＦＧ−Ｅ８適用群、ＮＰ−０１１適用群の肝組織内のＣＯＬ１Ａ２の発現様相を分析した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の好適な実施形態について添付図面に基づいてより具体的に説明するが、周知の技術的な部分については、説明の簡潔さのために省略又は簡略化する。
【０００９】
１．ウシ乳脂肪球−ＥＧＦ因子８（ＭＦＧ−Ｅ８）タンパク質に基づく組換えタンパク質ＮＰ−０１１のクローニング（Ｃｌｏｎｉｎｇ）及び分離精製方法に関する説明
本発明のウシ乳脂肪球−ＥＧＦ因子８（ＭＦＧ−Ｅ８）タンパク質に基づく組換えタンパク質ＮＰ−０１１のクローニング（Ｃｌｏｎｉｎｇ）及び分離精製がどのような過程を経て行われるかについて、図１から図４に基づいて詳細に説明する。
まず、ＭＦＧ−Ｅ８タンパク質の構造を改良するために、オリジーン社製のＭＦＧ−Ｅ８（ＮＭ＿００５９２８）ヒトｃＤＮＡクローン（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＲＧ２１７１６３）を購入して鋳型（テンプレート）として用いてＰＣＲを行い、図２に示すＤＮＡ断片を生成した。
次いで、哺乳動物発現ベクター（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）であり、図１に示すような構造を備えたｐＬＧＣＦベクターのＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩ制限酵素サイト（図１におけるＡ部位）にＰＣＲ増幅を通じて得た図２のＤＮＡ断面を挿入するクローニングを行った。
次いで、プラスミドＤＮＡを抽出してＨＥＫ２９３細胞に形質移入（トランスフェクション）して２日後に培養液を集めてＦＬＡＧレジンで免疫沈降反応（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ；ＩＰ）を行ってウェスタンブロッティング（ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ）でＮＰ−０１１に相当するタンパク質の発現を確認した。
また、発現を確認したプラスミドＤＮＡをｍａｘｉ  ｐｒｅｐを通じて大量に確保した後、ＨＥＫ２９３細胞を用意して大量のプラスミドＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞に形質移入することにより、ＮＰ−０１１に相当するタンパク質の量産を行った。
具体的には、コーニング社製のＣｅｌｌＳＴＡＣＫ細胞培養チャンバー１０個を用意してＨＥＫ２９３細胞を塗布した後、１６００μｇのプラスミドＤＮＡ及び３２００μlのトランスフェクション試薬を混合して常温下で１５分間混合した後、形質移入を行い、形質移入を行ってから４時間が経過した後に培養液を交換し、６日間更に培養を行い、培養液は、２日ごとに合計で３回回収して回収された培養液においてアフィニティー方式を用いてタンパク質を精製した。
このようなタンパク質の精製では、それぞれのタンパク質のＣ末端にＦＬＡＧ遺伝子が発現されているため、ＦＬＡＧアフィニティーレジンを用いて標的タンパク質のみを結合した後、洗浄緩衝液（Ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）で洗浄して標的タンパク質を除くタンパク質は除去した。
次いで、溶出緩衝液（Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）を用いて純粋な標的タンパク質のみを抽出した後、最終的に得たタンパク質の確認のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って、クマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ）染色及びウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を用いて標的タンパク質の生産及び純度を確認した。
ここで、ウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）は、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて分析し、最終的に得たタンパク質は、サーモ社製のマイクロＢＣＡキットを用いて濃度を測定し、当該結果を図３に示す。
このように、クローニング及び分離精製過程を経て設けられたウシ乳脂肪球−ＥＧＦ因子８（ＭＦＧ−Ｅ８）タンパク質に基づく組換えタンパク質ＮＰ−０１１は、図４又は下記の配列目録の配列番号１に示す通りである。
【００１０】
２．ウシ乳脂肪球−ＥＧＦ因子８（ＭＦＧ−Ｅ８）タンパク質に基づく組換えタンパク質ＮＰ−０１１の組織抗線維化効果の検証実験結果に関する説明
次いで、本発明のウシ乳脂肪球−ＥＧＦ因子８（ＭＦＧ−Ｅ８）タンパク質を基に組換えされたタンパク質であって、下記の配列番号１のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質ＮＰ−０１１と関連して当該組換えタンパク質に起因する組織線維化の予防又は治療機能の発現有無及びＭＦＧ−Ｅ８と比較して改善されたレベルを試験を通じて確認し、当該試験は、当業界における技術者にとって自明な手段による性質などを定義する目的で下記の実験方法が用いられた。
【００１１】
（１）肝線維化動物モデルの製作及びタンパク質の注入
まず、肝線維化マウスモデルを確立するために、５週齢のＣ５７／ＢＬ６雄性マウスを用いた。具体的には、５週齢のＣ５７／ＢＬ６雄性マウスに２００ｍｇ／ｋｇ濃度のチオアセトアミド（Ｔｈｉｏａｃｅｔａｍｉｄｅ；ＴＡＡ）を注入して肝線維化モデルを製作した。より具体的には、２００ｍｇ／ｋｇ濃度のチオアセトアミド（Ｔｈｉｏａｃｅｔａｍｉｄｅ；ＴＡＡ）をマウスの腹腔に１週間当たりに３回、８週間注射して肝線維化モデルを製作した。
８週間チオアセトアミド（Ｔｈｉｏａｃｅｔａｍｉｄｅ；ＴＡＡ）を注入して肝線維化マウスモデルを製作した後、翌日、１６０μｇ／ｋｇ濃度のＮＰ−０１１を腹腔注射した。
正常対照群としては、チオアセトアミド（Ｔｈｉｏａｃｅｔａｍｉｄｅ；ＴＡＡ）を注射しなかったマウス（Ｎｏｒｍａｌ）を用い、疾患対照群としては、チオアセトアミド（Ｔｈｉｏａｃｅｔａｍｉｄｅ；ＴＡＡ）を８週間注入した後、タンパク質を注入しなかったマウス（Ｓｈａｍ）を用いた。
陽性対照群は、８週間チオアセトアミド（Ｔｈｉｏａｃｅｔａｍｉｄｅ；ＴＡＡ）を注入して肝線維化マウスモデルを製作した後、Ｒ＆Ｄシステムから購入したＭＦＧ−Ｅ８を１６０μｇ／ｋｇ濃度で注入した。
【００１２】
（２）肝線維化動物モデルの線維化度の分析試験
上述したようなタンパク質の注入が行われてから３日が経過した後に、全ての対照群及び実験群においてマウスの肝組織を回収して、マウス肝内の線維化度を分析した。
各動物モデルから摘出した肝組織の一部は、線維化関連指標遺伝子（ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２）の分析のためにＲＮＡを抽出し、残りの肝組織は、組織検査のために４％のＰＦＡに固定した後、パラフィンブロックを製造して４μｍの厚さに製作されたパラフィンブロックを切除してＨ＆Ｅ染色及びシリウスレッド染色を通じて肝組織の線維化度を分析した。
ここで、Ｈ＆Ｅ染色のためには、シグマ社から購入したヘマトキシリン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）及びエオシン（Ｅｏｓｉｎ）を用い、シリウスレッド染色のためには、シグマ社から購入したピクロシリウスレッド染色キットを用いた。
その結果は、図５に示すように、ＮＰ−０１１を注入した実験動物の肝組織の損傷度及びコラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ）の蓄積度が疾病対照群（Ｓｈａｍ）に比べて確然と改善され、その改善度が具体的に正常群（Ｎｏｒｍａｌ）と略同じレベルまで修復されていることを示している。
一方、各動物モデルから摘出された肝組織の線維化関連指標遺伝子の分析のためには、ＴＲＩｚｏｌ試薬を用いてＲＮＡを得、逆転写システム（米国プロメガ社製）を用いた逆転写過程を行った。ＰＣＲ増幅条件は、９４℃５分、３５サイクル（９４℃３０秒、５０〜５７℃３０秒及び７２℃３０秒）及び７２℃１０分に設定した。
具体的に、ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス（米国のアプライドバイオシステム社製）を用いて行った。ＰＣＲ反応物は、１２．５μlのＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス、それぞれ０．８μl  １０ｍＭのプライマー、１０．４μlの蒸留水及び０．５μlの鋳型ｃＤＮＡを含む２５μlに構成して各プライマーに合う条件下で増幅して確認した。各遺伝子の相対的な発現レベルは、ＧＡＰＤＨを用いて正規化させて測定した。用いられたプライマーの配列を下記表１に示す。
【００１３】
【表１】
2020005649.tif 000003
【００１４】
その結果、図６及び図７に示すように、摘出した肝組織からＲＮＡを抽出して、線維化指標であるＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２の発現様相を比較してみると、ＮＰ−０１１に相当する組換えタンパク質はいずれも疾病対照群（Ｓｈａｍ）に比べてコラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ）の蓄積を低減させる効果がある。
特に、図６に示すように、ＣＯＬ１Ａ１に関してはＮＰ−０１１が適用されることにより、ＭＦＧ−Ｅ８タンパク質が適用された群に比べて確然と正常群と略同じレベルに蓄積されたコラーゲンが分解されることが分かり、これは、ＭＦＧ−Ｅ８タンパク質が適用された群と比較して、約４倍ほど改善された効果を示すことが分かる。
併せて、図７に示すように、ＣＯＬ１Ａ２に関しても、ＮＰ−０１１が適用されることにより、ＭＦＧ−Ｅ８タンパク質が適用された群に比べて確然と正常群と略同じレベルに蓄積されたコラーゲンが分解されることが分かり、これは、ＭＦＧ−Ｅ８タンパク質が適用された群と比較して、約２．４倍ほど改善された効果を示すことが分かる。
このように、ウシ乳脂肪球−ＥＧＦ因子８（ＭＦＧ−Ｅ８）タンパク質を基に組換えされたタンパク質であって、図４又は下記の配列目録の配列番号１に示すようなアミノ酸配列を備えた組換えタンパク質ＮＰ−０１１は、組織線維化の予防及び治療効果（抗組織線維化能）の側面からみて、既存のウシ乳脂肪球−ＥＧＦ因子８（ＭＦＧ−Ｅ８）と比較して確然と区別される改善レベルを示す。
ここで、上述した組換えタンパク質ＮＰ−０１１を通じた組織線維化の予防及び治療効果（抗組織線維化能）が提供可能な組織は、特に、肝組織を代表とするが、これに限定されず、該組織としては、肺、唾液腺など生体内の組織線維化が発生可能な各種の組織が挙げられる。
より具体的に、このようなＮＰ−０１１の改善レベルの度合いが組織線維化の予防及び治療効果（抗組織線維化能）の提供を通じて正常組織のレベルまで修復可能であるということは、単なる組織線維化の予防又は治療用の補助剤ではなく、根本的な慢性肝疾患治療用途の活用に最適であるということが分かる。
【００１５】
本発明に開示された実施形態は、本発明の技術思想を限定するためのものではなく、単に説明するためのものであり、このような実施形態によって本発明の技術思想の範囲が限定されることはない。保護範囲は、下記の特許請求の範囲によって解釈されるべきであり、これと同等な範囲内にあるあらゆる技術思想は、本発明の権利範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2020005649.tif 000008
【図６】
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【図７】
2020005649.tif 000010
【配列表】
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