(57)【要約】【課題】単位容量当たりの生菌数を増加させることが可能な培地を提供する。【解決手段】炭素源、窒素源およびマグネシウム源を含む酵母培養用培地であって、前記窒素源がグルタミン酸とグリシンとを含む、酵母培養用培地。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素源、窒素源およびマグネシウム源を含む酵母培養用培地であって、
前記窒素源がグルタミン酸とグリシンとを含む、酵母培養用培地。
【請求項２】
前記グルタミン酸および前記グリシンの配合量の合計が、前記炭素源１質量部に対して、０．０１〜５．０質量部である、請求項１に記載の酵母培養用培地。
【請求項３】
前記グルタミン酸の配合量が、前記グリシンの配合量を１質量部としたときに、０．０１〜５．０質量部である、請求項１または２に記載の酵母培養用培地。
【請求項４】
前記マグネシウム源が硫酸マグネシウムを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の酵母培養用培地。
【請求項５】
前記マグネシウム源の配合量が、前記炭素源１質量部に対して、０．０１〜０．５質量部である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵母培養用培地。
【請求項６】
前記酵母が、アステロトレメラ属、クリプトコッカス属、トリコスポロン属、サッカロマイセス属、キャンディダ属、ピキア属、ハンセヌラ属、クルイベロマイセス属、リポマイセス属、ロードトルラ属、シゾサッカロマイセス属、ラクトバシラス属およびエンテロコッカス属からなる群から選択される酵母である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の酵母培養用培地。
【請求項７】
前記酵母が、アステロトレメラ・ヒュミコラ（Ａｓｔｅｒｏｔｒｅｍｅｌｌａ  ｈｕｍｉｃｏｌａ）である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の酵母培養用培地。
【請求項８】
液体状の培地である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の酵母培養用培地。
【請求項９】
固形状の培地である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の酵母培養用培地。
【請求項１０】
請求項８に記載の酵母培養用培地で酵母を培養することを有する、酵母の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母培養用培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母は、発酵食品、アルコール、有機酸などの製造に利用されている。さらに、油脂分解能を有する酵母は、グリーストラップなどにおいて、排水中の油脂を分解するために利用されている。
【０００３】
食品工場の排水には多量の油脂が含まれており、これらの油脂を処理するために除害施設が設けられている。除害施設から排出される処理水には、下水道法または水質汚濁防止法により排水基準が設定されている。
【０００４】
排水中の油脂濃度が高い場合、処理水が排水基準に適合しないこと、加圧浮上などの処理に使用する薬剤、発生するオイルボール、スカムなどの廃棄にコストがかかること、油脂の付着による配管の閉塞、悪臭の発生といった様々な問題が発生する。
【０００５】
そこで、除害施設において、効率よく油脂を低減するため、高い油脂分解能を有する微生物を利用する方法が検討されている。例えば、特許文献１には、グリーストラップ内における油脂の低減効果に優れた酵母が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１５−１９２６１１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
酵母の培養では、栄養が豊富な培地であるＹＭ培地やＬＢ培地などが通常使用されている。本発明者の検討によれば、酵母をＹＭ培地やＬＢ培地などで培養すると、培地の単位容量当たりの集菌量が十分ではないという問題があることが判明した。そのため、より培養効率を向上させる、すなわち培地の単位容量当たりの生菌数を増加させる技術が望まれている。
【０００８】
したがって、本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、単位容量当たりの生菌数を増加させることが可能な培地を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく、鋭意研究を行った。その結果、炭素源、窒素源およびマグネシウム源を含む酵母培養用培地であって、前記窒素源がグルタミン酸とグリシンとを含む、酵母培養用培地によって上記課題が解決されることを見出し、本発明の完成に至った。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、単位容量当たりの生菌数を増加させることが可能な培地が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の一形態に係る実施の形態を説明する。本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。
【００１２】
本明細書において、範囲を示す「Ｘ〜Ｙ」は「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０〜２５℃）／相対湿度４０〜５０％ＲＨの条件で測定する。
【００１３】
＜酵母培養用培地＞
本発明の一形態によれば、炭素源、窒素源およびマグネシウム源を含む酵母培養用培地であって、前記窒素源がグルタミン酸とグリシンとを含む、酵母培養用培地が提供される。かかる構成により、酵母の培養効率を向上させて、培地の単位容量当たりの生菌数を増加させる（すなわち、培地の単位容量当たりの最大生菌数を増加させる）ことができる。
【００１４】
（炭素源）
本発明に係る酵母培養用培地は、炭素源を含む。
【００１５】
炭素源としては、特に制限されず、例えばグルコース、フルクトース、セロビオース、ラフィノース、キシロース、マルトース、ガラクトース、ソルボース、グルコサミン、リボース、アラビノース、ラムノース、スクロース、トレハロース、α−メチル−Ｄ−グルコシド、サリシン、メリビオース、ラクトース、メレジトース、イヌリン、エリスリトール、グルシトール、マンニトール、ガラクチトール、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、デンプン、デンプン加水分解物、糖蜜、廃糖蜜等の糖類、麦、米等の天然物、グリセロール、メタノール、エタノール等のアルコール類、ヘキサデカン等の炭化水素などが挙げられる。これらの炭素源は、培養する酵母による資化性を考慮して適宜選択される。また、上記炭素源を１種または２種以上選択して使用することができる。
【００１６】
酵母としてアステロトレメラ属を用いる場合、炭素源は、培養効率をより向上できるとの観点から、グルコースを含む。
【００１７】
（窒素源）
本発明に係る酵母培養用培地は、窒素源を含む。前記窒素源は、必須の成分として、グルタミン酸とグリシンとを含む。
【００１８】
本発明に係る酵母培養用培地は、グルタミン酸とグリシンとを含むことにより、グルタミン酸とグリシンとが優先的に酵母内に取り込まれ、またグルタミン酸およびグリシンは分岐アミノ酸のように窒素源カタボライト抑制を受けないため、酵母の培養効率をより向上できると考えられる。
【００１９】
グルタミン酸およびグリシンの配合量の合計は、酵母の培養効率をより向上できるとの観点から、炭素源１質量部に対して、好ましくは０．０１〜５．０質量部であり、より好ましくは０．１〜２．５質量部である。
【００２０】
また、グルタミン酸の配合量は、酵母の培養効率をより向上できるとの観点から、グリシンの配合量を１質量部としたときに、好ましくは０．０１〜５．０質量部であり、より好ましくは０．１〜２．５量部である。
【００２１】
本発明に係る酵母培養用培地は、窒素源として、グルタミン酸およびグリシン以外の物質をさらに含むことができる。
【００２２】
グルタミン酸およびグリシン以外の窒素源としては、無機窒素源でもよく、有機窒素源でもよい。
【００２３】
無機窒素源としては、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウムなどの硝酸塩；硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどのアンモニウム塩；亜硝酸ナトリウムなどの亜硝酸塩；アンモニア；尿素などが例示できる。
【００２４】
有機窒素源としては、酵母エキス、麦エキス、肉エキス、魚肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、麦芽エキス、大豆加水分解物、大豆粉末、カゼイン、ミルクカゼイン、カザミノ酸、アスパラギン酸等の各種アミノ酸、コーンスティープリカー、その他の動物、植物、微生物の加水分解物などが挙げられる。これらの有機窒素源は、培養する酵母による資化性を考慮して適宜選択される。
【００２５】
上記グルタミン酸およびグリシン以外の窒素源を１種または２種以上選択して使用することができる。
【００２６】
酵母としてアステロトレメラ属を用いる場合、グルタミン酸およびグリシン以外の窒素源は、培養効率をより向上できるとの観点から、好ましくは有機窒素源であり、より好ましくは酵母エキスおよび麦芽エキスの少なくとも一方を含み、さらに好ましくは酵母エキスおよび麦芽エキスを含む。
【００２７】
グルタミン酸およびグリシン以外の窒素源を使用する場合、当該窒素源の配合量（２種以上用いる場合はその合計量）は、炭素源１質量部に対して、例えば０．１〜３．０質量部であり、好ましくは０．３〜１．０質量部である。
【００２８】
（マグネシウム源）
本発明に係る酵母培養用培地は、マグネシウム源を含む。
【００２９】
本発明に係る酵母培養用培地は、マグネシウム源を含むことにより、アミノ酸の取り込み、すなわちグルタミン酸およびグリシンの取り込みを促進するため、酵母の培養効率をより向上できると考えられる。また、窒素源として、酵母エキス、麦芽エキスなどを用いる場合、これらの窒素源に含まれるアミノ酸の取り込みを促進することで、酵母の培養効率をより向上できると考えられる。
【００３０】
マグネシウム源としては、特に制限されないが、好ましくはマグネシウム塩である。マグネシウム塩は、例えば硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、塩化マグネシウム、亜硫酸マグネシウム、チオ硫酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、第一リン酸マグネシウム、第二リン酸マグネシウム、第三リン酸マグネシウム、ピロリン酸マグネシウム、亜硝酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウムおよびこれらの水和物などが挙げられる。マグネシウム塩は、好ましくは硫酸マグネシウムやその水和物（例えば硫酸マグネシウム七水和物）であり、より好ましくは硫酸マグネシウムである。上記マグネシウム源を１種または２種以上選択して使用することができる。
【００３１】
マグネシウム源の配合量（２種以上用いる場合はその合計量）は、炭素源１質量部に対して、マグネシウム源化合物の質量換算で、例えば０．０１〜０．５質量部であり、好ましくは０．１〜０．３質量部である。
【００３２】
（酵母培養用培地の形態）
本発明に係る酵母培養用培地の形態は、特に制限されず、液体状、固体状、固形状のいずれであってもよい。本明細書中、固体状の培地は、液体状の培地を固化させたものを意味する。また、固形状の培地は、本発明に係る酵母培養用培地の成分を含む粒状培地、粉末培地、顆粒状培地、ペレット状培地などを意味する。本発明に係る酵母培養用培地は、好ましくは液体状の培地または固形状の培地である。
【００３３】
（その他の成分）
本発明に係る酵母培養用培地は、炭素源、窒素源、マグネシウム源および溶媒に加えて、必要に応じて適宜その他の成分を含むことができる。
【００３４】
その他の成分としては、例えば溶媒、マグネシウム以外のミネラル、ｐＨ調整剤などが挙げられる。
【００３５】
溶媒としては、通常、水が用いられる。水は、純水、蒸留水、脱イオン水、ＲＯ水、などが挙げられるが、特に制限はない。
【００３６】
マグネシウム以外のミネラルとしては、例えばリン、硫黄、カリウム、カルシウム、鉄、ナトリウム、コバルト、銅、亜鉛、ニッケル、ホウ素などが挙げられる。これらのミネラルは、培養する酵母による資化性を考慮して適宜選択される。また、上記ミネラルを１種または２種以上選択して使用することができる。
【００３７】
ｐＨ調整剤としては、例えば硫酸、塩酸、硝酸、酢酸、クエン酸等の酸；水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等の塩基が挙げられる。
【００３８】
（ｐＨ）
本発明に係る酵母培養用培地のｐＨに特に制限はないが、一般的に酵母の培養は弱酸性条件下において行うことが好ましいことから、好ましくは３．０〜７．０であり、より好ましくは３．５〜６．５である。特に、後述する実施例において用いられている酵母であるアステロトレメラ・ヒュミコラ（Ａｓｔｅｒｏｔｒｅｍｅｌｌａ  ｈｕｍｉｃｏｌａ）等のアステロトレメラ属の培養に好適である。ここで、酵母培養用培地のｐＨは、ｐＨメーターを用いて測定することができる。
【００３９】
（酵母）
本発明に係る酵母培養用培地で培養される酵母としては、特に制限されないが、アステロトレメラ（Ａｓｔｅｒｏｔｒｅｍｅｌｌａ）属（現行名：Ｖａｎｒｉｊａ属）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｒａ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、リポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属等の酵母が好ましく用いられる。これらのうち、アステロトレメラ属、クリプトコッカス属、トリコスポロン属、サッカロマイセス属、キャンディダ属、ピキア属、ハンセヌラ属、クルイベロマイセス属、リポマイセス属、ロードトルラ属、シゾサッカロマイセス属、ラクトバシラス属、エンテロコッカス属などの酵母がより好ましく用いられる。
【００４０】
本発明に係る酵母培養用培地では、これらの酵母のうち、油分分解活性の高いアステロトレメラ属の培養効率をより向上させることができる。アステロトレメラ属の酵母としては、アステロトレメラ・ヒュミコラ（Ａｓｔｅｒｏｔｒｅｍｅｌｌａ  ｈｕｍｉｃｏｌａ）、アステロトレメラ・シュードロンガ（Ａｓｔｅｒｏｔｒｅｍｅｌｌａ  ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇａ）、アステロトレメラ・ロンガ（Ａｓｔｅｒｏｔｒｅｍｅｌｌａ  ｌｏｎｇａ）、アステロトレメラ・アルビダ（Ａｓｔｅｒｏｔｒｅｍｅｌｌａ  ａｌｂｉｄａ）、アステロトレメラ・ムッシ（Ａｓｔｅｒｏｔｒｅｍｅｌｌａ  ｍｕｓｃｉ）などが挙げられる。アステロトレメラ属の酵母は、好ましくはアステロトレメラ・ヒュミコラであり、より好ましくはアステロトレメラ・ヒュミコラ  ２−１４１−１（受託番号  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６４１）（以下、単に「２−１４１−１株」とも称する）である。
【００４１】
上述の酵母は、ＡＴＣＣ、ＮＢＲＣ、ＤＳＭＺ等のカルチャーコレクションから入手可能である。
【００４２】
（酵母培養用培地の調製方法）
本発明に係る酵母培養用培地の調製方法は、特に制限されず、従来公知の方法を用いることができる。
【００４３】
本発明に係る酵母培養用培地が固形状の培地である場合、例えば、炭素源、窒素源（グルタミン酸およびグリシンを必須に含む）およびマグネシウム源、ならびに必要に応じてグルタミン酸およびグリシン以外の窒素源およびマグネシウム以外のミネラルを混合することで調製することができる。混合後は、必要に応じて粉砕、乾燥などを行ってもよい。
【００４４】
また、本発明に係る酵母培養用培地が液体状の培地である場合、例えば、炭素源、窒素源（グルタミン酸およびグリシンを必須に含む）およびマグネシウム源、ならびに必要に応じてグルタミン酸およびグリシン以外の窒素源およびマグネシウム以外のミネラルを溶媒（例えば、水）に溶解することで調製することができる。また、上記固形状の培地を溶媒に溶解することで調製することもできる。酵母培養用培地のｐＨを調整する必要がある場合、ｐＨ調整剤として、上記酸やアルカリを用いればよい。また、必要に応じて消泡剤を添加してもよい。
【００４５】
本発明に係る酵母培養用培地が液体状の培地である場合、各成分の配合量は以下のとおりである。
【００４６】
炭素源の配合量（２種以上用いる場合はその合計量）は、酵母培養用培地全量に対して、例えば０．０１〜２０．０ｗ／ｖ％であり、好ましくは０．１〜１０．０ｗ／ｖ％であり、より好ましくは０．５〜３．０ｗ／ｖ％である。
【００４７】
グルタミン酸およびグリシンの配合量の合計は、酵母培養用培地全量に対して、例えば０．０１〜５．０ｗ／ｖ％であり、好ましくは０．１〜２．５ｗ／ｖ％である。
【００４８】
グルタミン酸およびグリシン以外の窒素源を使用する場合、当該窒素源の配合量（２種以上用いる場合はその合計量）は、酵母培養用培地全量に対して、例えば０．１〜３．０ｗ／ｖ％であり、好ましくは０．３〜１．０ｗ／ｖ％である。
【００４９】
マグネシウム源の配合量（２種以上用いる場合はその合計量）は、酵母培養用培地全量に対して、マグネシウム源化合物の質量換算で、例えば０．０１〜０．５ｗ／ｖ％であり、好ましくは０．１〜０．３ｗ／ｖ％である。
【００５０】
＜酵母の培養方法および増殖方法＞
本発明の一実施形態では、上記酵母培養用培地で酵母を培養することを有する、酵母の培養方法が提供される。本実施形態では、酵母培養用培地は液体状の培地である。
【００５１】
本発明に係る酵母の培養は、通常の方法によって行うことができる。酵母の種類によって、好気的条件下または嫌気的条件下で培養する。前者の場合には、酵母の培養は、振とうあるいは通気撹拌などによって行われる。また、酵母を連続的にまたはバッチで培養してもよい。培養条件は、適宜選択され、本発明に係る酵母が増殖できる条件であれば特に制限されず、培養する酵母の種類に応じて適宜選択されうる。また、酵母培養培地に添加する菌体量についても、特に制限されず、適宜調整することができる。
【００５２】
培養温度は、通常１５〜５０℃であり、好ましくは２５〜４０℃である。例えば、酵母として２−１４１−１株を用いる場合、培養温度は、通常１５〜３５℃であり、好ましくは２０〜３０℃である。
【００５３】
本発明の酵母培養用培地で酵母を培養する場合、様々な形態の酵母を用いることができる。例えば、酵母は、培養液中に懸濁された状態、培養液から固形分として回収された状態、乾燥された状態、担体に固定化された状態などでありうる。
【００５４】
培養液から固形分として回収した酵母を使用する場合、回収方法は当業者に公知のいずれの手段をも採用できる。例えば、上述の方法により培養した酵母の培養液を、遠心分離やろ過などにより固液分離し、固形分を回収して得ることができる。この固形分を乾燥（例えば、凍結乾燥）すれば、乾燥された状態の酵母を得ることができる。
【００５５】
担体に固定化された状態の酵母を使用する場合、酵母を固定化する担体としては、酵母を固定化することができるものであれば特に制限されず、一般的に微生物を固定化するのに使用される担体が同様にしてあるいは適宜修飾されて使用される。例えば、アルギン酸、ポリビニルアルコール、ゲランガム、アガロース、セルロース、デキストラン等のゲル状物質に包括固定する方法や、ガラス、活性炭、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、木材、シリカゲル等の表面に吸着固定する方法などが使用できる。
【００５６】
また、酵母を担体に固定化する方法もまた特に制限されず、一般的な微生物の固定化方法が同様にしてあるいは適宜修飾されて使用される。例えば、酵母の培養液を担体に流し込むことによる固定化法、アスピレーターを用いて担体を減圧下におき、酵母の培養液を担体に流し込むことによる固定化法、および酵母の培養液を滅菌した培地と担体との混合物に流し込み、振とう培養し、上記混合物から取り出した担体を自然乾燥する方法などが挙げられる。
【００５７】
本発明の好ましい形態において、保存中の酵母の生存性の観点から、酵母は、生菌製剤の形態で使用される。酵母としては、上記酵母を用いることができる。上記酵母を用いる場合、生菌製剤は、多孔質担体上に形成された酵母含有層を含み、前記酵母含有層が、乾燥菌体として１質量部の前記酵母に対して、０．８質量部以上１．５質量部未満のトレハロース、０．０１〜５質量部の乳タンパク質、０．０３〜１０質量部のアミノ酸、および０．０２〜１０質量部の金属塩を含むものである。トレハロースが、酵母含有層中に、乾燥菌体として１質量部の前記酵母に対して、０．８質量部以上含まれることで、製剤化をする際の酵母の生存率を向上させることができ、また、１．５質量部未満含まれることで、生菌製剤の保存期間中の酵母の生存率の低下を防止することができる。酵母の製剤化の際の生存率と保存期間中の生存率とのさらなる好適なバランスの観点から、酵母含有層のトレハロース含有量は、乾燥菌体換算で１質量部の酵母に対して、好ましくは０．９質量部を超えて１．５質量部未満であり、より好ましくは１質量部以上１．４質量部以下である。
【００５８】
なお、トレハロース以外の二糖類、たとえばスクロース、ラクトース、マルトース等のトレハロース以外の二糖類を、１種単独でまたは２種以上を混合して、トレハロースと併用してもよい。この場合、トレハロース以外の二糖類の含有量は、乾燥菌体として１質量部の無芽胞菌に対して、例えば０．０１質量部以上０．８質量部未満であり、好ましくは０．１質量部以上０．５質量部以下である。
【００５９】
酵母含有層中の乳タンパク質としては特に制限されず、従来公知の各種の乳タンパク質を含む材料を用いることができる。全脂粉乳のような乳脂肪分の多い原料を用いることもできるが、グリーストラップで使用するような油脂分解用生菌製剤を製造する場合は、製剤中の油分は少ない方が好ましいので、例えば、好ましい具体例としては、カゼイン、カゼインナトリウム、ホエイ、濃縮ホエイ、ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、ホエイタンパク質分離物（ＷＰＩ）、ホエイパウダー、スキムミルク、乳タンパク濃縮物（ＭＰＣ）、脱脂粉乳、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン等が例示でき、これらを１種単独でまたは２種以上を混合して用いることができる。乳タンパク質が、酵母含有層中に、乾燥菌体として１質量部の前記酵母に対して、０．０１〜５質量部、好ましくは０．０２〜１質量部、より好ましくは０．０５〜０．５質量部含まれることで、製剤化をする際の酵母の生存率を向上させることができる。
【００６０】
酵母含有層中のアミノ酸は、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、リジン、セリン、スレオニン、メチオニン、トリプトファン、ヒスチジン、アルギン、プロリン、チロシン、およびこれらの誘導体が例示できる。アミノ酸の誘導体としては、アミノ酸の塩（例えば、カリウム塩、ナトリウム塩）、エステル体、水和物、溶媒和物等が例示できる。上記のアミノ酸は、１種を単独で、または２種以上を混合して用いることができる。アミノ酸が、酵母含有層中に、乾燥菌体として１質量部の前記酵母に対して、０．０３〜１０質量部、好ましくは０．１〜５質量部、より好ましくは０．１〜３質量部含まれることで、製剤化をする際の酵母の生存率を向上させることができる。なお、油分分解層中に２種以上のアミノ酸が含まれる場合、上記数値は、２種以上の合計量を示す。
【００６１】
酵母含有層中の金属塩は、例えばナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、マグネシウム（Ｍｇ）、カルシウム（Ｃａ）、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）、ニッケル（Ｎｉ）、亜鉛（Ｚｎ）、銅（Ｃｕ）などの金属元素の、硫酸塩、亜硫酸塩、次亜硫酸塩、過硫酸塩、チオ硫酸塩、炭酸塩、リン酸塩、ピロリン酸、塩酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、ハロゲン化物（たとえば、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物）等が例示できるが、これらに限定されない。金属塩は、より具体的には、例えば、硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、次亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、過硫酸ナトリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸三ナトリウム、酢酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、シュウ酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸カリウム、亜硫酸カリウム、次亜硫酸カリウム、チオ硫酸カリウム、炭酸カリウム、過硫酸カリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸三カリウム、酢酸カリウム、硝酸カリウム、亜硝酸カリウム、酢酸カリウム、クエン酸カリウム、シュウ酸カリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、亜硫酸マグネシウム、チオ硫酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、第一リン酸マグネシウム、第二リン酸マグネシウム、第三リン酸マグネシウム、ピロリン酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、亜硝酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸カルシウム、亜硫酸カルシウム、チオ硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、硝酸カルシウム、亜硝酸カルシウム、酢酸カルシウム、クエン酸カルシウム、シュウ酸カルシウム、塩化カルシウム等が例示できる。上記の金属塩は、１種を単独で、または２種以上を混合して用いることができる。金属塩が、酵母含有層中に、乾燥菌体として１質量部の前記酵母に対して、０．０２〜１０質量部、好ましくは０．０５〜１．５質量部、より好ましくは０．１〜１質量部含まれることで、生菌製剤の保存期間中の酵母の生存率の低下を防止することができる。なお、酵母含有層が２種以上の金属塩を含む場合、上記数値は、２種以上の合計量を示す。
【００６２】
保存期間中における酵母の生存率が特に優れるという観点から、金属塩が、Ｎａ、Ｋ、ＭｇおよびＣａからなる群から選択される元素の、硫酸塩、炭酸塩、リン酸塩、またはそれらの組み合わせであることが好ましく、Ｍｇおよび／またはＣａの硫酸塩であることがより好ましい。なお、上記の「金属塩」には、金属塩の水和物や溶媒和物も含まれる。
【００６３】
酵母含有層には、上記の各成分のほか、任意に、例えばグルコース、フルクトース等の単糖類；スクロース、ラクトース、マルトース等のトレハロース以外の二糖類；シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、結晶セルロース、コーンスターチ等の多糖類；大豆タンパク等のタンパク質；大豆ペプチド、ゼラチン、ペプトン、トリプトン等のタンパク加水分解物やペプチド；大豆油、菜種油、パーム油、ゴマ油、オリーブ油等の油脂；アスコルビン酸やその塩、トコフェロール等のビタミン類；ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル等の界面活性剤；ポリエチエレングリコール、グリセリンなどが含まれてもよい。
【００６４】
生菌製剤に用いられうる多孔質担体の材料としては、特に制限されるものではないが、例えば、珪藻土、パーライト、バーミキュライト、タルク、クレー、ゼオライト、ベントナイト、カオリン、炭酸カルシウム、活性白土、二酸化チタン、珪砂、軽石、活性炭、カーボンブラック、グラファイト、ポリ乳酸、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル等が例示できるが、これらに限定されない。多孔質担体の材料は、製剤化をする際の酵母の生存率の観点から、好ましくは珪藻土である。
【００６５】
なお、上記生菌製剤に用いられうる多孔質担体における「多孔質」とは、担体の表面に多数の小さな気泡状の空隙を有する状態をいう。好ましくは、多孔質担体の嵩密度（タッピング嵩密度）が０．０１〜２ｇ／ｍｌである。上記のような嵩密度の多孔質担体を用いることにより、製剤化工程後の酵母の生存率をより一層向上できる。多孔質担体の嵩密度は、より好ましくは０．０５〜１．５ｇ／ｍｌであり、更に好ましくは０．２〜１ｇ／ｍｌである。なお、上記の嵩密度は、タッピング嵩密度測定法により測定した値である。
【００６６】
製剤化をする際の酵母の生存率の観点から、担体は、平均粒径（直径、体積基準）が１〜３００μｍの粒子状であることが好ましく、平均粒径（直径、体積基準）が１０〜２００μｍの粒子状であることがより好ましく、３０〜１５０μｍであることが更に好ましい。なお、担体の粒径は、レーザー回折法にて測定した値である。
【００６７】
生菌製剤は、上記生菌製剤に用いられうる多孔質担体に対して、噴霧液を噴霧して製剤化することができる。前記噴霧液は、上述した酵母とトレハロース、乳タンパク質、アミノ酸、金属塩および必要に応じてその他の成分とを、水に添加し、必要に応じて撹拌して調製することができる。噴霧液の調製に用いる水としては、例えば水道水、蒸留水、イオン交換水、純水、超純水など、いずれを使用してもよいが、不純物の少ない蒸留水、イオン交換水、純水、または超純水を用いることが好ましい。メタノール、エタノール、プロパノール等の低級アルコールや、アセトンなどの極性溶媒を、適宜水に添加した混合液を用いてもよい。
【００６８】
上記生菌製剤に用いられうる多孔質担体への噴霧液の噴霧は、例えば流動層造粒機を用いて行うことができる。流動層造粒法により製剤化することにより、酵母含有層を比較的低温で多孔質担体上に形成することができる。このため、製剤化をする際の生存率の向上の観点から有利である。また、流動層造粒法により製剤化することにより、上記の酵母含有層を均一に多孔質担体上に形成することができる、という点においても有利である。
【００６９】
多孔質担体に対する噴霧液の噴霧量は任意に設定でき、特に制限されるものではないが、１質量部の多孔質担体に対して、噴霧液の固形分として、例えば、０．１〜１０質量部となる割合であり、好ましくは０．５〜２質量部となる割合である。
【００７０】
噴霧液は、通常は５０〜３００ｇ／分程度の速度で多孔質担体へ噴霧される。
【００７１】
流動層造粒法により製剤化する場合は、温風の温度は酵母の耐熱性等を考慮して適宜設定すればよいが、例えば、入口温度３０〜６０℃であり、好ましくは３５〜５０℃である。流動層の温度も酵母の耐熱性等を考慮して適宜設定すればよいが、例えば、温度３０〜６０℃であり、好ましくは３５〜５０℃である。噴霧後、噴霧液を噴霧した多孔質担体を流動層造粒機内でそのまま乾燥してもよいし、別途乾燥機で乾燥してもよい。
【００７２】
粉末化した生菌製剤は、用途に応じて、公知のコーティング剤で表面の一部または全部を被覆してもよい。また、滑沢剤（例えば、タルク、マイカ、シリカ、ステアリン酸マグネシウム）、乾燥剤（酸化カルシウム、シリカゲル）、フィラーなどの粉末を、任意の割合で生菌製剤と混合し、混合製剤としてもよい。また、所望の粒度となるように製剤を粉砕したり、分級をしたりしてもよい。
【００７３】
保存期間中の酵母の生存率の観点から、製剤化後の生菌製剤の水分含量は、３〜８質量％であることが好ましく、４．５〜７．５質量％であることがより好ましい。
【００７４】
本発明の酵母培養用培地を用いることにより、酵母の培養効率を向上させて、培地の単位容量当たりの生菌数を増加させる（すなわち、培地の単位容量当たりの最大生菌数を増加させる）ことができる。例えば、後述する実施例に記載の方法で培養した場合、従来使用されているＹＭ培地では、アステロトレメラ・ヒュミコラ（Ａｓｔｅｒｏｔｒｅｍｅｌｌａ  ｈｕｍｉｃｏｌａ）を２４〜７２時間培養しても、その生菌数は、４．３×１０８〜４．８×１０８ＣＦＵ／ｍＬである。一方、本発明の酵母培養用培地を用いることで、２４時間程度培養すれば、アステロトレメラ・ヒュミコラ（Ａｓｔｅｒｏｔｒｅｍｅｌｌａ  ｈｕｍｉｃｏｌａ）を１．１×１０９ＣＦＵ／ｍＬまで増殖させることができる。
【００７５】
上述のとおり、本発明の酵母培養用培地は、従来の培地に比べて、酵母の培養効率を向上させて、培地の単位容量当たりの生菌数を増加させる（すなわち、培地の単位容量当たりの最大生菌数を増加させる）ことができる。そのため、本発明の一実施形態では、上記酵母培養用培地で酵母を培養することを有する、酵母の増殖を促進する方法が提供される。
【実施例】
【００７６】
本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。
【００７７】
（酵母培養用培地の調製）
下記表１の組成となるように、各成分を蒸留水に溶解し、実施例の酵母培養用培地を調製した。なお、実施例の酵母培養用培地のｐＨは、調整していない。
【００７８】
【表１】
2020202813.tif 000002
【００７９】
下記表２の組成となるように、各成分を蒸留水に溶解し、ＹＭ培地（比較例）を調製した。ＹＭ培地のｐＨは、調整していない。
【００８０】
【表２】
2020202813.tif 000003
【００８１】
（生菌製剤の調製）
アステロトレメラ・ヒュミコラ（Ａｓｔｅｒｏｔｒｅｍｅｌｌａ  ｈｕｍｉｃｏｌａ）２−１４１−１株（２０１８年２月２１日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されており、その受領番号は、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６４１である）を下記の液体培地に接種して、ジャーファーメンターにて３０℃で４８時間（撹拌速度：３００ｒｐｍ）培養し、培養液を得た。
【００８２】
液体培地の作製方法：終濃度が０．１８％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、０．１２％（ｗ／ｖ）肉エキス、０．０７％（ｗ／ｖ）ＮａＨＣＯ３、０．００５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０．００２％（ｗ／ｖ）ＫＣｌ、０．００２％（ｗ／ｖ）ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．００３％（ｗ／ｖ））ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏとなるように純水に溶解した。塩酸にてｐＨ５に調整後、オートクレーブ滅菌したものを液体培地とした。
【００８３】
得られた培養液を１０分間遠心分離（×１０，０００ｇ）し、菌体を回収した。得られた菌体に対して酵母を１１重量％、トレハロースを１４重量％、スキムミルクを３重量％（乳タンパク質としては１重量％）、グリシンを３重量％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを１重量％、ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏを１質量％となるように蒸留水に添加し、混合して噴霧液を調製した。なお、乳タンパク質としては、固形分中にタンパク質を３５重量％、乳糖を５２重量％の割合で含むスキムミルクを用いた。
【００８４】
流動層造粒機（ＦＡ−ＬＡＢ−１、株式会社パウレック社）に３００ｇの珪藻土（平均粒径７５μｍ、嵩密度０．３２ｇ／ｍｌ、ラヂオライト（登録商標）♯３０００、昭和化学工業株式会社）をセットした。珪藻土に対して、１０７７ｇの上記噴霧液を１４３ｇ／分の速度で噴霧するとともに、４０℃の温風を送風して内容物を流動させた状態で乾燥させた。噴霧後、引き続いて流動層造粒機内で４０℃の温風を４０分間送風して、造粒物を乾燥させた。これにより、生菌製剤を得た。生菌製剤の水分含量は５．５重量％であった。
【００８５】
（酵母の培養）
以下の方法により、酵母を培養した。
（１）５００ｍＬのトールビーカーに上記の酵母培養用培地またはＹＭ培地を２００ｍＬ分注した。
（２）（１）のトールビーカーに上記調製した生菌製剤を６ｍｇ（酵母：５．１×１０７ＣＦＵ／Ｌ）添加した。
（３）生菌製剤を添加した後、（２）のトールビーカーを３０℃、２４時間で好気培養して、培養液を得た。
【００８６】
（酵母の生菌数の算出）
実施例および比較例において、培養開始から２４時間ごとに培養液をサンプリングし、５％  Ｔｗｅｅｎ８０溶液で段階希釈し、寒天で固化させたＮＢ培地の表面に塗布した。塗布後３０℃で４８時間培養して培地上に形成された２−１４１−１株のコロニーを測定した。結果を表３に示す。
【００８７】
【表３】
2020202813.tif 000004
【００８８】
表３に示すように、実施例では、比較例と比べて、２−１４１−１株の培養効率を大幅に向上できることが分かる。