(57)【要約】      （修正有）【課題】メタン酸化細菌および従属栄養細菌を含んだ共培養による、農業における家畜飼料、高度な加工のための原料等に用いられるタンパク質バイオマスの提供。【解決手段】登録番号Ｖ-８４６５として「オボレンスク国家病原性細菌および病原性細胞培養集」に供託された従属栄養細菌Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  １−１７の菌株であって、微生物タンパク質を得るためのメタン酸化細菌との共培養成分としての細菌株。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
登録番号Ｖ-８４６５として「オボレンスク  国家病原性細菌および病原性細胞培養集」に供託された従属栄養細菌Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  １−１７の菌株であって、微生物タンパク質を得るためのメタン酸化細菌との共培養成分としての細菌株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物産業に関するものであって、とりわけメタン酸化細菌および従属栄養細菌を含んだ共培養によりタンパク質バイオマスを得るための従属栄養細菌Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  １−１７の菌株に関するものである。微生物タンパク質は、農業における家畜飼料として、また高度な加工のための原料としても利用できる。
【背景技術】
【０００２】
ロシアにおける今日の飼料用タンパク質の生産は、全体的に良い状況ではない。ロシア大統領が署名した、食料自給率を８０〜９０％にするためのドクトリンに従うと、飼料製品の不足は少なくとも年間二百万トンにおよぶ可能性がある。
【０００３】
タンパク質製品の主要な原料は大豆かすである。しかしながら、我が国の自然条件は、十分な量の大豆の栽培には向いていない。したがって、この分野に従事する者は飼料用タンパク質を生産するためのその他の方法を探さなければならない。
【０００４】
飼料バイオマスの生産者のうち、様々な基質において生育することができる様々な分類群の微生物は知られている。
【０００５】
酵母が質量の６０％以下のタンパク質しか蓄えない一方で、細菌は質量の７９％のタンパク質を蓄えるため、飼料用タンパク質の生産者として細菌を利用することは、酵母を利用することよりも効率がよい。
【０００６】
タンパク質およびバイオマスの生産者として、メタノールをもとにタンパク質を生産する細菌株およびアセトバクター属であるＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｍｅｔｈｙｌｉｃｕｍ  ＶＳＢ−９２４  ＣＭＰＭ  Ｖ−２９４２（ロシア国特許第１１６３６３号、Ｃ１２Ｎｏ．１５／００、１９８４年）（特許文献１）  、  Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｍｅｔｈｙｌｉｃｕｍ  ＶＳＢ−８６７  ＣＭＰＭ  Ｖ−１９４７（ロシア国特許第９２５１１２号、Ｃ１２Ｎｏ．１５／００、１９８２年）（特許文献２）、  Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒａｎｓ  ＶＳＢ−９１４  ＣＭＰＭ  Ｖ−２４７９（ロシア国特許第１０７０９１６号、Ｃ１２Ｎｏ．１５／００、１９８３年）（特許文献３）が利用されている。これらすべての菌株は、絶対乾燥物に対するタンパク質含有率が７６％までおよぶという特徴を持つ。
【０００７】
これらの菌株の典型的なファージに対する感度や耐熱性は様々に異なる。Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｍｅｔｈｙｌｉｃｕｍ  ＶＳＢ−８６７にとっての最適な成長温度は２８℃〜３０℃であり、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｍｅｔｈｙｌｉｃｕｍ  ＶＳＢ−９２４にとっては３０〜３６℃、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒａｎｓ  ＶＳＢ−９１４にとっては３６〜４０℃である。
【０００８】
しかし、小麦ふすまおよび／または小麦粉を用いた発酵槽内でのｐＨ６．０以下の酸性培養基による非滅菌培養においては、実験が示すとおり、酵母および菌類による汚染が素早く起こり、そして全細胞数の３０〜４０％以上において生産者の置換反応が起こった。その結果、得られた製品のタンパク質含有レベルに大幅な低下が起こる。
【０００９】
完全な飼料タンパク質製品を得る方法として見込みのあるものの一つに、メタン酸化細菌を利用する方法がある。メタン資化性細菌は、自身に適した条件下において天然ガスのメタンを活発に変換し、素早く増殖して、有用なタンパク質およびビタミンその他の生物活性化合物を豊富に含んだバイオマスを作る。
【００１０】
単細胞タンパク質を得るために天然ガスのメタンを利用することは、液体炭化水素およびその他の基質と比較していくつもの優位性を持つものであり、とりわけ天然ガスの埋蔵量の多さ、可搬性の高さ、基質からさらに精製することなく飼料用タンパク質が得られるといった優位性が挙げられる。
【００１１】
ロシアでは地中ガスの埋蔵量が多く、複数のデータによると世界の埋蔵量の４０％にもおよぶ量があるとされることを考慮すると、微生物を利用した単細胞タンパク質の生産を導入することは、ロシアの企業に経済効果をもたらすことができるだけでなく、国内の食糧の安定を確保することにも寄与する。
【００１２】
絶対メタン酸化細菌は基質特異性の高くない酵素メタンモノオキシゲナーゼを含んでおり、メタンだけでなく、天然ガスに含まれるメタンの同族体（たとえばエタン、プロパンおよびブタン）をも酸化することができる。
【００１３】
天然ガスの成分、メタン酸化細菌の種の特性および培養条件によっては、酸化が不完全なメタンおよびメタンの同族体の生産物の中に、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、エタノール、アセトアルデヒド、アセテート、プロピオンアルデヒド、プロピオン酸、オイルアルデヒドが様々な割合で培養基中に存在することがある。これらの生産物が特定の濃度で培養基内に蓄積されると、メタン酸化培養菌およびメタンの酸化に阻害作用を及ぼす。
【００１４】
天然ガスにおける安定的な連続培養は、メタン酸化微生物とそのコンパニオンたる従属栄養微生物の共培養によってのみ可能であり、前記従属栄養微生物はメタンの同族体の不完全酸化の生産物を利用し、また微生物細胞の自己分解による生産物を利用することもある。
【００１５】
現在では、たとえ単一基質を使用する場合あっても、培養基に不完全酸化の生産物が蓄積される場合には、純粋培養ではなく共棲培養をする方が適切であると確立されている。共培養の際に主培養菌の生育は目立って活発となり、いくつかの物理化学的指標のストレス作用に対する主培養菌の耐性も目立って上昇する。
【００１６】
デオキシリボヌクレアーゼ酵素の生産者であり、医薬品の主成分にすることのできる（ロシア国特許第２０５７１７８号）（特許文献４）Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＧＩＳＫ  Ｎｏ．２１４菌株は知られている。デオキシリボヌクレアーゼは、液体培養基または高濃度培養基での菌株の培養、バイオマスの沈殿、超音波破壊、遠心分離により得られる。デオキシリボヌクレアーゼは、上澄み液から抽出される。
【００１７】
制限エンドヌクレアーゼの生産者であるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ａｚｅａｎａｅ  ＶＫＭ  Ｖ−２００８Ｄ菌株（ロシア国特許第２０４４０５５号）（特許文献５）は知られている。この酵素はヌクレオチドの配列５−ＰｕＧＧＮＣ１ＣＰｙ−３を認識し、切断する。菌株により生産される制限酵素は、遺伝子工学の研究において利用することができる。
【００１８】
毒性および非毒性微生物の識別において、微生物のカタラーゼ活性を判定するための参考株として利用されるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＧＩＳＫ  Ｎｏ．２１５菌株（ロシア国特許第２０７０９２３号）（特許文献６）は知られている。
【００１９】
微生物群のヒ素化合物に対する耐性を決定する接合性プラスミドｐＶＫ１を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＶＫＰＭ  Ｖ−７００１菌株は知られている。前記の菌株を使用することにより、ヒ素を含んだ生体破壊細菌の組合せの菌株（ロシア国特許第２２６００４４号）（特許文献７）が得られる。
【００２０】
飼料用バイオマスの生産者であるＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＶＣＢ−８７４菌株は知られている。菌株は、「全ロシア遺伝学および産業微生物品種改良研究所」の培養コレクションの中に、コレクション番号「ＣＭＰＭ  Ｖ１７４３（Авт．  свид．誌  ソ連  第７７０２００号）（非特許文献１）」として保管されている。この菌株は炭素源およびエネルギー源としてメタンを利用しており、純粋なメタンであっても天然ガス中の成分としてのメタンであっても利用する。この菌株の欠点は、メタン同族体の共酸化において生成される生産物に対する感度が高いことであり、前記生産物は、大量なことも少量なこともあるが、必ず天然ガスの中に存在するものである。生成される生産物は、生産者の生育を阻害する。
【００２１】
技術的本質および達成される結果が最も近いものが、全ロシア産業微生物集登録番号ＶＫＰＭ  Ｖ−１２５４９の、微生物タンパク質を得るためのメタン酸化細菌Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＧＢＳ−１５の菌株（ロシア国特許第２６１３３６５号）（特許文献８）  である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】ロシア国特許第１１６３６３号明細書
【特許文献２】ロシア国特許第９２５１１２号明細書
【特許文献３】ロシア国特許第１０７０９１６号明細書
【特許文献４】ロシア国特許第２０５７１７８号明細書
【特許文献５】ロシア国特許第２０４４０５５号明細書
【特許文献６】ロシア国特許第２０７０９２３号明細書
【特許文献７】ロシア国特許第２２６００４４号明細書
【特許文献８】ロシア国特許第２６１３３６５号明細書
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】Авт．  свид．誌  ソ連  第７７０２００号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明の目的は、微生物タンパク質生産者の共棲菌として従属栄養細菌が存在する際の天然ガスにおけるメタン酸化細菌の培養について、生産効率を上げ、高い生産性を得ることである。
【００２５】
本発明の技術的結果は、メタン酸化細菌の共棲菌であり、天然ガス中にあるメタン同族体の共酸化による生産物を利用することができ、同様に細菌の溶解過程でできるタンパク質、アミノ酸、多糖類を利用することのできる、新しい菌株を明らかにすることである。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明の技術的結果は、登録番号Ｖ-８４６５として「オボレンスク  国家病原性細菌および病原性細胞培養集」に供託された従属栄養細菌Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  １−１７の菌株を、メタン酸化細菌との共培養成分として使用し、微生物タンパク質を得ることで達成される。
【００２７】
供託者が与えられた菌株の符号が１−１７である。
【００２８】
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  １−１７菌株は、天然ガスをもとに家畜飼料用飼料バイオマスを工業的に生産するためのメタン酸化細菌の共培養菌の一つとして、また高度な加工のための原料として利用できる。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
菌株の抽出源：本発明の従属栄養細菌Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  １−１７の細菌株は、メタン酸化細菌Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＧＢＳ−１５を含む共培養から抽出される。成長の早い混合培養細菌を得るために、ロシア連邦内の天然ガスおよび石油産出地域の地下水から抽出された活発な蓄積培養菌の混合物を使用した。このように混合培養細菌を得た結果、天然ガスにおける工業的なメタン酸化細菌の培養環境において、様々な共培養の成分として使用できる細菌株が得られた。細菌株は、鉱物培養基において発酵の際にメタン酸化細菌の主たる生産者の共培養菌として成長し、生産者にとって最適な物理化学的環境において、天然ガス中に存在するメタン同族体による共酸化の生産物、また主たる生産者の物質代謝による生産物を必要とする。
【００３０】
細菌株は、遺伝子の組み換えがなされていないものである。
【００３１】
細菌株の生物学的危険性（安全性）についての情報：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ種は、病原性分類第ＩＶグループ（衛生疫学規則  ＳＰ  １．３．２３２２−０８「病原性（危険性）分類第ＩＩＩ−ＩＶグループの微生物および寄生虫病の病原体を使用する作業の安全性」添付資料第１号「人間に対する伝染病をもたらす病原性微生物、原虫類、寄生虫、生物由来毒の病原性による分類」、２０１１年６月２９日付ロシア連邦国家衛生医師長認定第８６号  追加と改訂第２号）リストに載っている。
【００３２】
病原性または毒性に関するその他の情報：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  １−１７細菌株は、非病原性であり、毒素産生性がなく、毒性がなく、無害である。
【００３３】
特徴：供託者が与えられた菌株の符号はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  １−１７である。
【００３４】
同定方法とその結果：質量分析計ＭＡＬＤＩ  Ｂｉｏｔｙｐｅｒ（スコア値２．５６１）、ＶＩＴＥＫ  ２（同定確率９８％）、遺伝子配列決定１６Ｓ−ｒＲＮＡ系統解析（９９％）、全ゲノム配列決定。
【００３５】
形態学的特徴：大きさ０．５〜０．９×１．０〜１．２μｍのグラム陰性桿菌、非運動性、芽胞の形成なし。
【００３６】
培養特性：栄養寒天ＧＲＭ  Ｎｏ．１（国家予算学術施設  国家応用微生物学およびバイオテクノロジー研究センター）の培地において、直径３〜４ｍｍの平らで半透明の粘液状コロニーを形成。
【００３７】
生化学的特質：ＶＩＴＥＫ  ２システム：０６．０１（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）（表１）
【００３８】
【表１】
2020058339.tif 000002
【００３９】
実験動物に対する毒性：ＢＡＬＢ／ｃ−３．２×１０８ＫＯＥ系のマウスに対する毒性  ＬＤ５０  
【００４０】
抗菌薬に対する耐性（感受性）（表２）
【００４１】
【表２】
2020058339.tif 000003
【００４２】
遺伝子の特性：プラットフォームであるイルミナ社Ｍｉｓｅｑ上で完全なゲノム配列決定がなされた。取得リード数  ２，０８７，３２４、分析されたヌクレオチド数  ４６９，１８０，４２２、コンティグ数（プログラムＳＰＡｄｅｓ  ３．１１．１）  ５３１、得られたコンティグの全長  ヌクレオチドペア５，６２７，２７６、カバレッジ平均深度８８、ＧＣ組成５７．０１％
【００４３】
コンティグの組み立てにおいて１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が決定され、データベースＢＬＡＳＴ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ｎｒ／ｎｔ）  （ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）において分析された。調査対象菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と参考菌株であるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  ｓｕｂｓｐ．  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  ＨＳ１１２８６  （ＣＰ００３２００．１）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の相同性は、９９％（１５２６／１５２７）であった。
【００４４】
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  １−１７菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域の配列：
【００４５】
ＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＡＣＣＧＣＡＧＧＴＴＣＣＣＣＴＡＣＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＣＡＧＴＣＡＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＡＧＴＧＧＴＡＡＧＣＧＣＣＣＴＣＣＣＧＡＡＧＧＴＴＡＡＧＣＴＡＣＣＴＡＣＴＴＣＴＴＴＴＧＣＡＡＣＣＣＡＣＴＣＣＣＡＴＧＧＴＧＴＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡＧＧＣＣＣＧＧＧＡＡＣＧＴＡＴＴＣＡＣＣＧＴＡＧＣＡＴＴＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＴＴＡＣＴＡＧＣＧＡＴＴＣＣＧＡＣＴＴＣＡＴＧＧＡＧＴＣＧＡＧＴＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＡＡＴＣＣＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＣＴＴＴＡＴＧＡＧＧＴＣＣＧＣＴＴＧＣＴＣＴＣＧＣＧＡＧＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＴＴＴＧＴＡＴＡＴＧＣＣＡＴＴＧＴＡＧＣＡＣＧＴＧＴＧＴＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＧＴＡＡＧＧＧＣＣＡＴＧＡＴＧＡＣＴＴＧＡＣＧＴＣＡＴＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＴＣＣＡＧＴＴＴＡＴＣＡＣＴＧＧＣＡＧＴＣＴＣＣＴＴＴＧＡＧＴＴＣＣＣＧＧＣＣＧＡＡＣＣＧＣＴＧＧＣＡＡＣＡＡＡＧＧＡＴＡＡＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＧＣＧＧＧＡＣＴＴＡＡＣＣＣＡＡＣＡＴＴＴＣＡＣＡＡＣＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＧＡＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＧＣＡＣＣＴＧＴＣＴＣＡＣＡＧＴＴＣＣＣＧＡＡＧＧＣＡＣＣＡＡＴＣＣＡＴＣＴＣＴＧＧＡＡＡＧＴＴＣＴＧＴＧＧＡＴＧＴＣＡＡＧＡＣＣＡＧＧＴＡＡＧＧＴＴＣＴＴＣＧＣＧＴＴＧＣＡＴＣＧＡＡＴＴＡＡＡＣＣＡＣＡＴＧＣＴＣＣＡＣＣＧＣＴＴＧＴＧＣＧＧＧＣＣＣＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＡＴＴＴＧＡＧＴＴＴＴＡＡＣＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＴＡＣＴＣＣＣＣＡＧＧＣＧＧＴＣＧＡＴＴＴＡＡＣＧＣＧＴＴＡＧＣＴＣＣＧＧＡＡＧＣＣＡＣＧＣＣＴＣＡＡＧＧＧＣＡＣＡＡＣＣＴＣＣＡＡＡＴＣＧＡＣＡＴＣＧＴＴＴＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＣＣＡＣＧＣＴＴＴＣＧＣＡＣＣＴＧＡＧＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＴＧＴＣＣＡＧＧＧＧＧＣＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＧＧＴＡＴＴＣＣＴＣＣＡＧＡＴＣＴＣＴＡＣＧＣＡＴＴＴＣＡＣＣＧＣＴＡＣＡＣＣＴＧＧＡＡＴＴＣＴＡＣＣＣＣＣＣＴＣＴＡＣＡＡＧＡＣＴＣＴＡＧＣＣＴＧＣＣＡＧＴＴＴＣＧＡＡＴＧＣＡＧＴＴＣＣＣＡＧＧＴＴＧＡＧＣＣＣＧＧＧＧＡＴＴＴＣＡＣＡＴＣＣＧＡＣＴＴＧＡＣＡＧＡＣＣＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＧＣＴＴＴＡＣＧＣＣＣＡＧＴＡＡＴＴＣＣＧＡＴＴＡＡＣＧＣＴＴＧＣＡＣＣＣＴＣＣＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣＧＧＡＧＴＴＡＧＣＣＧＧＴＧＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣＧＧＧＴＡＡＣＧＴＣＡＡＴＣＧＡＴＧＡＧＧＴＴＡＴＴＡＡＣＣＴＴＡＣＧＣＣＴＴＣＣＴＣＣＣＣＧＣＴＧＡＡＡＧＴＧＣＴＴＴＡＣＡＡＣＣＣＧＡＡＧＧＣＣＴＴＣＴＴＣＡＣＡＣＡＣＧＣＧＧＣＡＴＧＧＣＴＧＣＡＴＣＡＧＧＣＴＴＧＣＧＣＣＣＡＴＴＧＴＧＣＡＡＴＡＴＴＣＣＣＣＡＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＧＴＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＧＴＧＴＣＴＣＡＧＴＴＣＣＡＧＴＧＴＧＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＣＴＣＴＣＡＧＡＣＣＡＧＣＴＡＧＧＧＡＴＣＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＴＧＡＧＣＣＧＴＴＡＣＣＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＧＣＴＡＡＴＣＣＣＡＴＣＴＧＧＧＣＡＣＡＴＣＴＧＡＴＧＧＣＡＴＧＡＧＧＣＣＣＧＡＡＧＧＴＣＣＣＣＣＡＣＴＴＴＧＧＴＣＴＴＧＣＧＡＣＡＴＴＡＴＧＣＧＧＴＡＴＴＡＧＣＴＡＣＣＧＴＴＴＣＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＣＣＣＣＣＴＣＣＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＴＴＣＣＣＡＧＡＣＡＴＴＡＣＴＣＡＣＣＣＧＴＣＣＧＣＣＧＣＴＣＧＴＣＡＣＣＣＧＡＧＡＧＣＡＡＧＣＴＣＴＣＴＧＴＧＣＴＡＣＣＧＣＴＣＧＡＣＴＴＧＣＡＴＧＴＧＴＴＡＧＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＴＴＣＡＡＴＣＴＧＡＧＣＣＡＴＧＡＴＣＡＡＡＣＴＣＴ
【００４６】
培養条件：高濃度または液体の栄養培地ＧＲＭ  Ｎｏ．１、ＧＲＭ培養液、栄養寒天または栄養液、３４℃、２４時間。炭素源としてメタノールまたはエタノールまたはプロパノールが加えられる鉱物培養基、４０℃、３６〜４８時間。
【００４７】
栄養寒天  成分（調合済み培地１リットル換算）：乾燥タンパク質酵素加水分解物  １０．５ｇ、発酵培地用乾燥ペプトン  １０．５ｇ、濾過ずみ自己消化酵母エキス  ２．０ｇ、塩化ナトリウム  ５．０ｇ、微生物培養寒天  １２．０ｇ。１２１℃で１５分間殺菌する。
【００４８】
栄養液  成分（調合済み培地１リットル換算）：乾燥タンパク質酵素加水分解物  ９．１ｇ、発酵培地用乾燥ペプトン  ９．９ｇ、濾過ずみ自己消化酵母エキス  ４．７ｇ、塩化ナトリウム  ５．０ｇ、炭酸ナトリウム  ０．３ｇ。１２１℃で１５分間殺菌する。
【００４９】
ＧＲＭ  Ｎｏ．１（培養基成分、ｇ／ｌ）：魚粉由来膵臓加水分解物  １５．０、カゼイン膵臓加水分解物  １０．０、酵母エキス  ２．０、塩化ナトリウム  ３．５、Ｄ−グルコース  １．０、寒天  １０．０±２。
【００５０】
ＧＲＭ栄養液（培養基成分、ｇ／ｌ）：魚粉由来膵臓加水分解物  ８．０、発酵培地用乾燥ペプトン  ８．０、塩化ナトリウム  ４．０。
【００５１】
鉱物培養基（培養基成分、ｇ／ｌ）：（ＮＨ４）２ＳＯ４  ０．５２、ＭｇＳＯ４  ０．０２、Ｋ２ＳＯ４  ０．０６、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４  １．５３。微量元素溶液（別途調合）（г／л）：ＺｎＳＯ４  ０．４３、ＭｎＳＯ４  ０．８８、ＣｕＳＯ４  ０．７８、Ｈ３ＢＯ３  ０．４、Ｎａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ  ０．２５、ＣｏＳＯ４×７Ｈ２Ｏ  ０．２５、ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ  ４．９７。
【００５２】
調合済みの微量元素溶液１ｍｌを１０００ｍｌの鉱物培養基に加える。１２１℃で１５分間殺菌する。ｐＨを６．０〜６．２にする。
【００５３】
基質（炭素源およびエネルギー源）としてメタノール（１．５体積％未満）、エタノール（２体積％未満）、プロパノール（１体積％未満）を使用することができる。培養温度  ４０℃、好気培養。
【００５４】
保管条件：菌株は栄養寒天上で保管（温度４±２℃）、三か月に一度移植を実施、菌株は凍結乾燥状態でも液体窒素内でも保存が可能。
【００５５】
上述のように、本発明の菌株は、様々な成分の培養基において安定的かつ生産的に成長し、凍結乾燥状態で長期間活性を保つことができ、非病原性かつ毒素産生性、毒性がなく無害であるという特徴を持つ。
【００５６】
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  １−１７菌株は、飼料用バイオマスの工業的生産を目的とした、天然ガスによるメタン酸化細菌の共培養において共棲菌として利用でき、また高度な加工のための原料としても利用できる。
【００５７】
従属栄養細菌Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  １−１７は、生成される生産物（メタノール、エタノール、プロパノール）を炭素源として利用し、それにより主たる生産者にかかる抑制作用を取り除く。この他にも、従属栄養体は細菌の溶解プロセスにおいてできるタンパク質、アミノ酸、および多糖類を利用することができる。
【００５８】
メタン酸化細菌は天然ガスのメタンによって増殖し、共培養の他方の要素は、天然ガス中のメタン同族体の共酸化生産物によって、またメタン資化性菌の細菌活動による生産物によって増殖する。
【００５９】
共培養の過程において、共培養菌の含有レベルは、最初の植え付け量に関係なく、ガス中にあるメタンのガス状同族体の共酸化の結果生み出され利用できる生産物の数により決まる。それは、鉱物培養基においては、メタンを利用しない共培養要素にとっての唯一の炭素源が、これらの生産物となるからである。培養菌がこのような自己調整を行うため、培養の最初の植え付けにおける培養細胞の割合は重大な意味を持たないが、加える非メタン酸化微生物の数は、全体の細胞数の０．１％以上１５％以内にすることを推奨する。この範囲を外れた場合、第一にメタン酸化細菌の生育の停滞へとつながり、第二に起こりやすいのが従属栄養細菌の成長の停滞へとつながる。メタンを資化しない細菌を選んで加えた混合培養では、メタン酸化細菌だけの純粋培養に比べてバイオマスの生産量が３〜５倍に増大した。このように、メタン同族体の共酸化の生産物によって生育し、メタンを資化しない従属栄養体を選んでメタン酸化細菌に加えることで、メタンにおけるバイオマス生産量を増大させることができる。たとえメタンを資化しない従属栄養体を高濃度で取り入れても、培養菌の成長において得られる炭素源すなわちメタン同族体の共酸化の生産物の数によりその含有量は制限を受け、通常では全体の細胞数の１〜１．５％を超えないため、メタンを酸化しない従属栄養細菌を加えることはバイオマスの質に影響を与えない。
【００６０】
本発明は、以下の例によって説明することができる。
【００６１】
例１  Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  １−１７菌株を培養する液体の鉱物培養基の成分（ｇ／ｌ）：（ＮＨ４）２ＳＯ４  ０．５２、ＭｇＳＯ４  ０．０２、Ｋ２ＳＯ４  ０．０６、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４  １．５３。
【００６２】
培養基を１２１℃で１５分間殺菌する。
【００６３】
微生物溶液（培養基とは別に調合し、殺菌する）（ｇ／ｌ）：ＺｎＳＯ４  ０．４３、  ＭｎＳＯ４  ０．８８、ＣｕＳＯ４  ０．７８、Ｈ３ＢＯ３  ０．４、Ｎａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ  ０．２５、ＣｏＳＯ４×７Ｈ２Ｏ  ０．２５、ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ  ４．９７。調合済みの微生物溶液１ｍｌを１０００ｍｌの鉱物培養基に加える。ｐＨを６．０〜６．２にする。基質（炭素源およびエネルギー源）として、メタノール１．０％を使用する。
【００６４】
菌株の培養は期間を定めた方法で、耐熱ガラス製のフラスコ内で、充填率０．３〜０．４の際に１リットルの容量で、恒温振とう培養機内で行われる。培養は３４℃およびｐＨ６．０において４８時間行われる。培養終了時の乾燥物濃度は、１リットル当たりの絶対乾燥物８．２ｇとなる。得られた培養菌は、容量１０リットル（実働容量７リットル）の自動発酵システムまたは容量４０リットル（実働容量２８リットル）の排出型発酵槽において、その後の細菌培養のための種菌として使用される。
【００６５】
例２  例１と同様に菌株の培養が行われるが、炭素源およびエネルギー源としてエタノール１．６％が使用される。物理化学的条件および培養時間は同じであり、乾燥物濃度は、１リットル当たりの絶対乾燥物３．０ｇとなる。
【００６６】
例３  例１と同様に菌株の培養が行われるが、炭素源およびエネルギー源としてプロパノール０．５％が使用される。物理化学的条件および培養時間は同じであり、乾燥物濃度は、１リットル当たりの絶対乾燥物３．０ｇとなる。
【００６７】
例４  メタン酸化細菌Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＧＢＳ−１５および従属栄養細菌Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  １−１７で構成される共培養を、容量１０リットル（実働容量７リットル）の自動発酵システムの中で、下記の構成の鉱物培養基において行う。（単位ｇ／ｌ）Ｈ３ＰＯ４（８０％）  １７．２、  Ｋ２ＳＯ４  ５．０、ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ  ４．０、ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ  ０．２１、ＣｕＳＯ４  ０．７８、ＭｎＳＯ４×４Ｈ２Ｏ  ０．３８、ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ  ０．０６、Ｈ３ＢＯ３  ０．２５、Ｎａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ  ０．００９、ＣｏＳＯ４×７Ｈ２Ｏ  ０．００９５
【００６８】
窒素源および滴定剤としてアンモニア水が供給される。培養プロセスは４０〜４５℃、ｐＨ５．４〜５．８において、メタンおよび酸素を含む混合気体を常時供給しながら進められる。バイオマス濃度が、１リットル当たりの絶対乾燥物９ｇに達したところで、培養基の希釈率Ｄ＝０．２５  ｈ−１の連続培養プロセスに移行する。バイオマス濃度が、１リットル当たりの絶対乾燥物１８．５ｇである際に、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＧＢＳ−１５の支配率は９３％となった。
【００６９】
例５  メタン酸化細菌Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＧＢＳ−１５および従属栄養細菌Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  １−１７で構成される共培養を、容量４０リットル（実働容量２８リットル）の排出型発酵槽の中で、下記の構成の鉱物培養基において行う。（単位ｇ／ｌ）Ｈ３ＰＯ２（８０％）  １７．２、  Ｋ２ＳＯ４  ５．０、ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ  ４．０、ＦｅＳＯ２×７Ｈ２Ｏ  ０．２１、ＣｕＳＯ４  ０．７８、ＭｎＳＯ４×４Ｈ２Ｏ  ０．３８、ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ  ０．０６、Ｈ３ＢＯ３  ０．２５、Ｎａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ  ０．００９、ＣｏＳＯ４×７Ｈ２Ｏ  ０．００９５
【００７０】
窒素源および滴定剤としてアンモニア水が供給される。培養プロセスは４１〜４５℃、ｐＨ５．４〜５．７において、メタンおよび酸素を含む混合気体を常時供給しながら進められる。バイオマス濃度が、１リットル当たりの絶対乾燥物９〜１０ｇに達したところで、少しずつ０．８ＭＰａまで気圧を上昇させる。気圧の上昇に伴って、微生物の栄養源である気体の供給を少しずつ増加させる。その際の培養プロセスの指標はＤ＝０．３０  ｈ−１、バイオマス濃度は１リットル当たりの絶対乾燥物３７ｇ、メタン酸化細菌Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓＧＢＳ  −１５の支配率は９３％であった。
【外国語明細書】
2020058339000001.pdf