(57)【要約】      （修正有）【課題】公共安全性や食品安全性を確保するための検査分野、さらには医療検査分野などにおける、環境や食品、生体材料などに存在するウイルスを濃縮するのに好適な方法ならびにそれに使用する試薬の提供。【解決手段】ウイルスを懸濁した液に、個別もしくは混合状態のポリエチレングリコール、塩、多糖類を含む液を加えた後、遠心操作でウイルスを濃縮することを特徴とするウイルス濃縮方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスを懸濁した液に、個別もしくは混合状態のポリエチレングリコール、塩、多糖類を含む液を加えた後、遠心操作でウイルスを濃縮することを特徴とするウイルス濃縮方法
【請求項２】
多糖類が、濃縮用の液中で懸濁状態になる多糖類である請求項１記載のウイルス濃縮方法
【請求項３】
濃縮用の液中で懸濁状態になる多糖類が、グリコーゲン、デキストリン、イヌリンの単独もしくはこれらの複合物からなることを特徴とする請求項２記載のウイルス濃縮方法
【請求項４】
濃縮用の液に添加するグリコーゲンの濃度が終濃度で0.01%以上である請求項３記載のウイルス濃縮方法
【請求項５】
濃縮用の液に添加するグリコーゲンの濃度が終濃度で0.02〜0.08%を特徴とする請求項４記載のウイルス濃縮方法
【請求項６】
濃縮用の液に添加する塩が塩化ナトリウム、塩化リチウム、硫酸アンモニウム、硫酸リチウムの単独もしくはこれらの複合物からなることを特徴とする請求項１記載のウイルス濃縮方法
【請求項７】
濃縮用の液に添加するグリコーゲンの終濃度を0.01〜0.08%に設定した場合、添加する塩化ナトリウム濃度が終濃度で0.021%以上6.6%未満であることを特徴とする請求項６記載のウイルス濃縮方法
【請求項８】
遠心前の静置と遠心を冷却することなく行う、請求項１記載のウイルス濃縮方法
【請求項９】
遠心操作が、10分以内の静置後、10分以内の遠心を行うことを特徴とする請求項１記載のウイルス濃縮方法
【請求項１０】
請求項１に記載した方法で濃縮した検体を核酸の精製なしにPCR反応液に添加して、ウイルス中の核酸を増幅して検出することを特徴とするウイルス検出方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、公共安全性や食品安全性を確保するための検査分野、さらには医療検査分野などにおける、環境や食品材料、生体材料などに存在するウイルス（特に病原性ウイルス）を濃縮して検出するのに好適なウイルス濃縮方法ならびにそれに使用する試薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトに下痢症を起こすウイルスには、ノロウイルス、ロタウイルス、アデノウイルス、アストロウイルス、コロナウイルス、A型肝炎ウイルスなど、種々存在している。
【０００３】
また、医療検査分野では、インフルエンザウイルスは毎年のように多数の感染者を発生させ、ヒト免疫不全ウイルスなどは世界中に蔓延しており、高病原性インフルエンザウイルスやエボラウイルスなど、今後大規模な感染の危険性が指摘されているウイルスも数多く、日々の観測や警戒が必要になっている。
【０００４】
食中毒を引き起こすウイルスのなかでも、ノロウイルス（以下、NV）は主に冬季から春先に掛けて多発する食中毒の原因ウイルスである。NVは７つの遺伝子群 (GI〜GVII)に分類されており、その内、人に感染し胃腸炎を引き起こすのはGI,GIIおよびGIVであるが、近年GII（特にGII.4型）が主要流行株となっている。NVは感染性食中毒原因全体の70%程度を占めていて、毎年１〜３万人の感染者が報告されているが、実際にはその100倍程度が感染していると推測されている。
【０００５】
NVの感染経路としては、(1)下水→貝類→人、(2)調理従事者→器具・食材→人、(3)人→人、人→施設環境→人が想定されており、従来は(1)経路が大半を占めていたが、近年は (2)、(3)の人を介した汚染による感染事例が大半を占めるようになってきている。
【０００６】
このようにNVが蔓延する原因としては、以下のNVが有している特徴が大きく関与していると考えられている。即ち、(1)NVの遺伝子本体がRNAで変異が生じ易く、かつNVに対する免疫防御が腸粘膜を介したものであるため、一度感染したとしても免疫が無効もしくは長続きしない。(2)糞便のみならず嘔吐物中にも大量のウイルスが排出される（患者便中105〜109ウイルス/g、患者嘔吐物中103〜107ウイルス/g）。(3)感染者は症状消失後も長期に渡ってNVを排出し続ける（成人で３週間、小児では1ヶ月間以上排出されたとの報告がある）。(4)症状の出ない感染者（不顕性感染者）が多数存在するが、彼らも人に感染させるに足る量のNVを糞便中に排出している。(5)100〜1,000 NVの曝露で半数の人が感染するほど感染力が強い。(6)環境中（特に低温での）生存期間が長い（乾燥状態の4℃保存で2ヶ月間、20℃保存で1ヶ月間程度と推定されている）。
【０００７】
そのような状況から、同一メニューを１回300食以上又は１日750食以上を提供する調理施設（大量調理施設）を対象とした「大量調理施設衛生管理マニュアル」（平成9年3月24日付け衛食第85号別添  最終改正：平成29年6月16日付け食安発0610第1号）の平成20年6月の改訂で、厚生労働省は「NV検便検査」や「NV感染者の調理作業控え」などの推奨を追記した。
【０００８】
しかしながら、食中毒発生原因として未だNVは全体の2/3程度を占めている。さらに
発生施設は、飲食店、仕出し屋、旅館、製造所などの食品を直接取り扱う施設に加えて、事業所、学校、病院、販売所、家庭など多岐に渡っている。
【０００９】
従って、NV感染を予防するには、従来のNV検便検査（個別検査）に加えて、食品        
取り扱い場所も含めたNV汚染が疑われる場所でのNVの検査さらにはモニタリングなどでの広域（環境）検査が極めて有効と考えられた。
【００１０】
NV感染予防のための検査においては、食品検査分野では、まな板、包丁などの食品加工に利用する器具や食品取扱者の被服、手指など食品取扱者自身さらには食材などが検査の対象として挙げられる。他方、環境検査分野においては、最も汚染度が高いと推測されるトイレ施設の便器、床、ドアノブ、手すり、内履きなどを初めとした種々施設内の設備や備品などが検査の対象として挙げられる。
【００１１】
食品検査分野や環境検査分野で迅速・簡便かつ高感度なNV検査法が確立できれば、その方法は、他のウイルスや医療分野への応用拡大が可能となる。その場合、医療分野では、医療器具や設備などの環境に関連するものの他、医療関係者や患者などに由来する検体も検査対象として挙げられる。
【００１２】
このようなウイルス検査の実際においては、まずは、ウイルス汚染が懸念される場所などをリン酸緩衝液などの緩衝液、生理食塩水、もしくは蒸留水を含浸させた綿棒などを用いて拭き取る。
【００１３】
拭き取ったウイルスは、拭き取り治具に包含した緩衝液、生理食塩水や蒸留水に懸濁した後、ポリエチレングリコール (以下、PEG)などを含んだ濃縮用の液と混合しての遠心、あるいは懸濁液から直接に超遠心を行うなどで濃縮される。
例えば、厚生労働省の「ノロウイルスの検出法」（食安監発第1105001号  平成１５年１１月５日 最終改正  平成１９年５月１４日食安監発第0514004号  www.mhlw.go.jp/topics/syokuchu/kanren/kansai/dl/031105-1a.pdf）によれば、
「ポリエチレングリコールによる濃縮方法
（1） ・・・・遠心上清にポリエチレングリコール 6,000を8%、NaClを2.1g/100mlになるように加え、軽く撹拌し、4℃の冷蔵庫に一晩置く、または室温で2時間撹拌する。
↓5,000〜12,000rpm. 20分間、冷却遠心する。
（2) 上清をアスピレーター、注射器等で吸引し、沈渣のみとし、管壁の周りの水分を滅菌した濾紙で吸い取る。さらにPBS(-)で管壁を軽く2回洗い、その後濾紙で水分を完全に取る。
（3） 沈渣を200μlのDDWに浮遊させる。これをウイルスRNAの抽出に用いる。浮遊液に不純物が多い場合には10,000rpm．20 分間の冷却遠心を行い、その上清をRNA抽出に用いる。」
と記載されている。
【００１４】
濃縮したウイルスは、ウイルス中の核酸（DNAもしくはRNA）を増幅・検出する方法、
もしくはウイルス表面の抗原量を検出する方法などで確認することができる。
【００１５】
ウイルス中の核酸を確認する場合には、ウイルス直接もしくは核酸（DNAもしくはRNA）を抽出・精製した後、検査対象がDNAの場合はPCRなどでそのDNAを増幅、RNAの場合は、RNAから、もしくは逆転写(RT)反応などでDNAに転換してから増幅し、解析は プローブ法などでリアルタイムに、もしくは増幅後、融解温度解析 (Melting Curve Analysis : MCA)やアガロース電気泳動などでの遺伝子検査が実施されている。
【００１６】
しかしながら、従来のPEG沈殿法では、ウイルスを安定かつ高い効率で回収することが難しく、かつ作業工程が煩雑で、行程時間も長く、大量の検体をスムーズに処理するのにも不向きであった。また、超遠心法は、装置が高価な上に、一度に処理できる検体数も少なく作業性に劣っていた。
【００１７】
最近は、PEGに牛エキスなどを添加して回収率の向上を図る試みもなされている（例えば、下記文献：IASR Vol. 32 p. 358-359: 2011年12月号）が、回収率は最大でも40%程度に留まり、回収安定性も低く、操作も煩雑、さらに、遠心前に冷蔵で一晩静置が必要など、作業性にも問題があった。
【００１８】
他方、NV検出にあたり、検出に用いる試料を超遠心やPEG沈殿法などによって濃縮する際に、試料中の夾雑物がPCR反応を阻害し、ノロウイルスの検出を防げる要因になるとして、粘液や腐植酸などの多糖類、タンパク質、色素、グリコーゲンが例示されている（特開２０１１−１５５９１９号公報）。
【００１９】
その結果、従来のPEG沈殿法での検出感度は、10,000 NV/拭取程度と言われており100〜1,000のウイルスで半数感染すると言われるほどに感染力が強いNVなどのウイルスの検査やさらには汚染状況のモニタリングでの使用には力不足と言わざるを得ない。    
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】特開２０１１−１５５９１９号公報
【非特許文献】
【００２１】
IASR (Infectious agents Surveillance Report) Vol. 32 p. 358-359: 2011年12月号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
綿棒などで拭き取ったウイルスは、拭き取り治具に包含した緩衝液、生理食塩水や蒸留水に懸濁した後、PEG溶液との混合による遠心や直接の超遠心などで濃縮される。従来のPEG沈殿法では、安定かつ高い回収率でウイルスを濃縮することが難しい上、作業工程が煩雑で、行程時間も長く、大量検体の処理にも不向きであった。また、超遠心法では、装置も高価な上に、一度に処理できる検体数も少ないなど作業性に問題があった。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
緩衝液、生理食塩水や蒸留水に懸濁したウイルスを簡便・迅速に、安定かつ高い回収率で濃縮するためのPEGを基盤とした濃縮用の液を提供することを目的としている。それによって、環境や食品材料、生体材料などに存在するウイルスを簡便・迅速、安定的かつ高効率に濃縮することが可能となる。
【００２４】
濃縮したウイルスの遺伝子（核酸：DNA or RNA）はPCRやRT-PCR法などで高度に増幅することができる。増幅されたDNAやRNAは蛍光プローブなどを使用することで、高感度かつ定量的に検出することも可能となる。ウイルス中の遺伝子の検出は、ウイルスから核酸を抽出・精製してからの遺伝子増幅により行うのが通例であるが、反応液に直接（精製なしに）添加して行うことができれば簡便性や迅速性の面で有利になる。
【００２５】
このようにして、環境や食品材料、生体材料などに存在するウイルス（特に病原性の）を簡便・迅速かつ高感度に検出やモニタリングができれば、ウイルス感染の伝播を効果的に防ぐことができ、防疫に大きく貢献できることは明らかである。
【００２６】
さて、細胞、真菌、細菌やそれらを含有する生物材料から抽出した核酸を濃縮して精製するために、核酸を含む水溶液に、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、塩化リチウム、塩化ナトリウムなどの塩とエタノールなどの有機溶媒を加えて沈殿させる方法（いわゆるエタ沈）が行われるが、その際に共沈剤として、グリコーゲンが添加される場合がある。
【００２７】
一般的にウイルスも核酸と同じく負の電荷を有しているので、PEGを使用したウイルスの濃縮においても、グリコーゲンの添加が有効ではないかと推測して試したところ一定の効果が認められた。
【００２８】
さらには、この効果はグリコーゲンのみならず他の多糖類にも見られること、ウイルス濃縮に適したグリコーゲン濃度は核酸をエタノール沈殿で回収する際に一般的に使用されている濃度より1000倍以上高いこと、PEGに添加する塩化ナトリウムなどの塩は、逆に従来のPEG沈殿法でNVを濃縮する際に一般的に添加されている濃度よりも低い濃度が適していることなども見出した。また、先に記載した文献では多糖類がPCR反応を阻害するとの報告がなされているが、多糖類を添加したPEG溶液を使用して濃縮したNV検体を直接(RNAの精製なしに)反応液に添加してRT-PCRを行っても、共存する塩濃度が至適範囲内であれば阻害は認められなかった。
すなわち、本発明は、ウイルスを懸濁した液に、個別もしくは混合状態のポリエチレングリコール、塩、多糖類を含む液を加えた後、遠心操作でウイルスを濃縮することを特徴とするウイルス濃縮方法である。
【００２９】
さらには、従来のPEG溶液を使用してNVを濃縮する際の遠心では、5,000-12,000rpmで20分の冷却遠心が必要とされている。しかしながら、多糖類を添加したPEG溶液（以下、多糖類PEG溶液）を使用することで、冷却することなく、10分以内（5〜10分間程度）の遠心で、蒸留水や生理食塩水中に存在するGI,GIIいずれの遺伝子タイプのノロウイルスをも、安定的かつ高率に回収できることを見出した。
【００３０】
さらには、従来のPEG溶液でNVを濃縮する際には、遠心前に冷蔵での一晩静置や室温での２時間撹拌が必要とされているが、多糖類PEG溶液を使用することで、NV懸濁液と混合してから冷却なしの10分以内の静置でもGI,GII遺伝子タイプいずれのノロウイルスをも安定的かつ高率に回収できることを見出したことで、本発明を完成することができた。
すなわち、本発明は、遠心前の静置と遠心を冷却することなく行う、ウイルス濃縮法をも提供する。さらには、本発明は、遠心操作が、10分以内の静置後、10分以内の遠心を行うウイルス濃縮方法を提供する。
【００３１】
PEG溶液に添加する多糖類としては、PEG溶液中で懸濁状態になるものであれば使用できる可能性が高い。
【００３２】
例として、グルコース由来のアミロペクチン、カードラン、グリコーゲン、セルロース、α-セルロース、デキストリン、N-アセチルグルコサミン由来のキチン、フルクトース由来のイヌリンが挙げられるがこれらに限定されるものではなく、またこれらを混合して使用することも可能である。
【００３３】
上記多糖類の内、グリコーゲン、デキストリン、イヌリンが推奨されるが、最も推奨されるのはグリコーゲンである。
【００３４】
グリコーゲンの添加量は、DNAをエタノール沈殿する場合に通常使用されている濃度（終濃度：0.000008%）よりはるかに高く、ウイルス懸濁液にPEG溶液を加えた液での終濃度で0.01%以上、特に、0.02-0.08%が最適である。
【００３５】
PEGは通常のPEG沈殿法と同様に分子量6,000のものを終濃度8%で使用しているが、特にこれに限定する必要はなく、適宜変更しての使用が可能である。
【００３６】
PEGを使用してたんぱく質などを結晶化する場合などにおいて、塩化ナトリウム、塩化リチウム、硫酸アンモニウム、硫酸リチウムが添加され、本件においては何れの使用も可能と思われるが、特にこれらに限定する必要はなく、適宜、他の塩に変更しての使用も可能である。
【００３７】
PEGへの塩化ナトリウムの添加量については、従来のPEG沈殿法でNVを濃縮する際は終濃度3%付近で使用されることが多いが、多糖類PEG溶液を使用する場合にはそれよりも少ない濃度が適しており、終濃度で0.021%以上6.6%未満（終濃度）の範囲で、特に、0.066〜2.1%（終濃度）の範囲での使用が好ましい。
【００３８】
ウイルス懸濁液と多糖類PEG溶液を混合した後直ちに遠心することも可能であるが、10分間程度静置することが望ましい。また、静置する温度は特に限定しないが、室温での静置が利便性に優れている。
【００３９】
遠心時の回転加速度、温度や時間は特に限定しないが、それぞれ、10,000G以上、室温以下、5分間以上10分以内が好ましい。
【００４０】
濃縮対象のウイルスは特に限定されず、全てのDNA及びRNAウイルスが含まれるが、食中毒を生じさせるノロウイルス、サポウイルス、ロタウイルス、アデノウイルス、アストロウイルスなどの下痢症ウイルスやエンテロウイルス、肝炎ウイルスなどのウイルスが含まれる。
【００４１】
検査材料としては、環境、食品材料、臨床材料などが見込めるが、特に環境中のNV検査に適している。
【００４２】
本発明のウイルス濃縮方法で濃縮した検体は、核酸の精製なしに直接PCR反応液に添加して、ウイルス中の核酸を増幅して検出することができる。
PCR反応液は、公知の反応液を使用することができる。例えば、厚生労働省が発行しているノロウイルス検出法で使用する試薬、プライマーを使用することができる。
（例えば、食安監発第1105001号  平成１５年１１月５日 最終改正  平成１９年５月１４日食安監発第0514004号  www.mhlw.go.jp/topics/syokuchu/kanren/kansai/dl/031105-1a.pdf）
【発明の効果】
【００４３】
本発明に係る多糖類PEG溶液を使用することで、環境や食品材料、生体材料に付着した微量のウイルスを簡便・迅速で高率かつ安定的に濃縮することができる。本方法で濃縮したウイルスから直接（核酸の精製なしに）その遺伝子を(RT)-PCR法などで増幅することで、簡便・迅速かつ高度に増幅することが可能となる。さらに対象とする増幅産物に特異的な蛍光probeなどを使用したリアルタイム検出法を併用することで、サンプル中に存在していたウイルスを高感度、特異的かつ定量的に検出することが可能となる。
【００４４】
このことから、特にノロウイルスやインフルエンザウイルスのような感染力が強く、人から人、もしくは人から環境を介して人へと、容易に人に感染し重篤な症状をもたらすウイルスを今回発明した方法で検出もしくはモニタリングすることで、安全衛生の確保（特に食品取り扱いや医療現場などにおける）に資することができる。
【００４５】
また、今回発明した方法は、抗ウイルス消毒薬の開発やその評価、消毒後の効果判定などへの応用も可能であり、有効な消毒薬と本方法を結び付けることで、ウイルス感染防御のさらなる向上が期待できる。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
［実施例１］
PEG試薬に添加する多糖類の種類別でのNV濃縮効果を検討した。即ち、400μlの蒸留水に1,000個程度のGIおよびGII遺伝子タイプのNVを添加した液に、0.025%の各種多糖類を添加した16% PEG 6,000溶液（塩化ナトリウムを含む）を同量添加して10分間室温で静置した後、20℃に設定した遠心機で14,000G 5分間の遠心を施した。遠心上清を吸引廃棄後、沈渣に自製の検体処理液を添加して、85℃, 3分間処理した。熱処理したサンプルに、GIおよびGII 検出用プライマーと3’端をGI,GII個別の蛍光で標識したプローブを添加した自製反応液を添加して、リアルタイムRT-PCRを行った。結果は、濃縮液に添加したのと同量のNVを直接検体処理液に添加してリアルタイムRT-PCRを行った際の標識プローブ由来の蛍光立上りcycle値（Ct値）と、各多糖類添加濃縮液にて回収したサンプルからのリアルタイムRT-PCRでのCt値の比較で算出した回収率を表１に示している。なお、回収率は各群２重で行った結果の平均値をもとに算出している。結果、グリコーゲンを添加した場合が最も回収率が高く、添加したGIおよびGII遺伝子タイプのNVを70%以上回収できたことを示している。次に回収率が良かったのは、デキストリン、イヌリンで30%以上の回収率であった。また、アミロペクチン、カードラン、セルロース、α-セルロース、キチンでも10%内外の回収率が得られた。これらは、何れもPEG溶液中で懸濁状態になる多糖類であるが、リグニンのようなPEG溶液に完全溶解する多糖類を添加した場合には、多糖類無添加の場合と同様、GI,GIIに特異的な蛍光の立上りは認められなかった。
（表1）
「PEG溶液に添加した多糖類別に蒸留水中NVの回収効率を示した表」
2020005632.tif 000002
【００４７】
［実施例２］
PEG溶液に添加した多糖類の内、最もNVの回収効果が高かったグリコーゲンを使用して、実施例１と同様の実験系で最適な添加量を検討した。グリコーゲンの添加量は、DNAをエタノール沈殿する際の一般的な添加量である0.000008%（終濃度）を起点として10倍段階で増量添加して検討した結果、その1000倍濃度以上で濃縮効果が高かった。そこで、その周辺である0.0025-0.16%の間で最適濃度を求めた結果を示したのが表２である。結果は、各群５重で行った回収量の中央値をもとに、最大値群の回収量を１としたときの各群の回収量の比率で示している。結果、GIに比べてGII濃縮においてより高い濃度のグリコーゲンが必要であったが、両ウイルスの濃縮を考慮した場合、0.01%以上、特に0.02-0.08%（終濃度）が最適であった。
（表２）
「PEG溶液に添加する多糖類の一例として、各種濃度のグリコーゲンを添加して蒸留水中NVの濃縮を行ったときの回収比率を示した表」
2020005632.tif 000003
【００４８】
［実施例３］
実施例２で選定したグリコーゲン濃度（終濃度0.01-0.08%）を添加したPEG溶液の塩化ナトリウム量を変えて、最適な塩化ナトリウム量を検討した。実施例１と同様の実験系で、添加する塩化ナトリウム量を従来のPEG沈殿法でNVを濃縮する際に通常使用されている濃度(終濃度3%)の約２倍量を上限に、1/√10倍量ずつ漸減してグリコーゲン添加PEG溶液に添加しときの濃縮効果を示したのが表３および４である。結果は、各群４〜６重で行った回収量の中央値をもとに、最大値群の回収量を１とした時の各群の回収量の比率で示している。結果、GI（表３）に比べてGII（表４）が塩濃度の影響を受けやすく、かつグリコーゲンの濃度が高くなるほど塩の適応濃度範囲が狭くなる傾向にあったが、両ウイルスの濃縮を考慮すると0.021%以上6.6%未満（終濃度）の範囲で、特に、0.066〜2.1%（終濃度）が最適であった。
（表３）
「グリコーゲンを添加したPEG溶液中の塩化ナトリウムの濃度を変化させたときの蒸留水中NVG1回収比率を示した表」
2020005632.tif 000004
（表４）
「グリコーゲンを添加したPEG溶液中の塩化ナトリウムの濃度を変化させたときの蒸留水中NVGII回収効率を示した表」
2020005632.tif 000005
【００４９】
［実施例４］
0.025%のグリコーゲンと1.2%の塩化ナトリウムを添加した16% PEG 6,000溶液をNV懸濁液に等量添加して20℃または4℃に設定した高速微量遠心機で、14,000G、1, 5, 10または20分間遠心して回収した沈渣を使用して、実施例１と同様の実験系で濃縮効果を検討した結果を表５に示した。なお、回収率は各群４重で行った結果の中央値をもとに算出している。結果、通常のPEG溶液使用でのNV濃縮時の遠心条件（5,000〜12,000rpmで20分間の冷却遠心）と大きく異なり、遠心中の温度は20℃（室温での遠心を想定）でも4℃遠心と同程度の回収率が得られ、10分間の遠心でも20分間遠心と同等の回収率が得られた。
（表５）
「16%のPEG 6,000溶液に、最適濃度付近の塩化ナトリウムとグリコーゲンを添加した溶液（以下、GPEG溶液）とNVを懸濁した蒸留水を等量混合した後、4℃もしくは20℃で遠心（14,000G）して濃縮したときの遠心時の温度と時間が回収効率に及ぼす影響を示した表」
2020005632.tif 000006
【００５０】
［実施例５］
従来のPEG溶液使用でNVを濃縮する際には、PEG溶液とNV懸濁液を混合後、冷蔵庫で一晩静置、または室温での２時間撹拌が必要とされている。そこで、実施例４で使用したPEG溶液とNV懸濁液混合直後、および20℃で3,5,10,20分間静置後、20℃に設定した微量高速遠心機で、14,000G 5分間遠心したときの回収率を示したのが表６である。結果は各群８重で行った回収量の中央値をもとに各群の回収率を計算している。遠心後の沈渣を使用して、実施例１と同様の実験系で濃縮効果を検討した結果、GIでは静置なしでも充分な回収率が得られたが、GIIでは10分程度の静置で回収率が最大化した。
（表６）
「GPEG溶液とNVを懸濁した蒸留水を等量混合後、遠心前に20℃にて静置した時間が与える回収効率への影響を示した表」
2020005632.tif 000007
【００５１】
［実施例６］
本発明がNV以外のウイルスにも適用可能であることを示すために、B型肝炎ウイルス（HBV）が濃縮できるかどうかを検討した。即ち、実施例４で使用したPEG溶液と1000IUのHBVを懸濁した液を同量混合して20℃で10分間静置後、20℃に設定した微量高速遠心機で、14,000G 5分間遠心した。遠心後の沈渣を200μlのPBSに懸濁した後、さらにQIAamp MinElute Virus Spin Kit (QIAGEN)を用いた核酸抽出を行った。また検量線作成のため、100、1000、10000 IUと3段階の量のHBVを200 μlのPBSに加え、同様に核酸抽出を行った。検討検体の濃縮、検体の抽出とも、各検体について3点行った。得られた核酸抽出液についてReal-time PCRによるCt値の測定を行い、検量線からウイルス量を計算したところ、表７に示す通り平均回収率は59%を示し、本発明はNV以外のウイルスにも適用可能であることが示された。
（表７）
「B型肝炎ウィルス（HBV）の濃縮効果を示す表」
2020005632.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月11日(2019.6.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
［実施例３］
実施例２で選定したグリコーゲン濃度（終濃度0.01-0.08%）を添加したPEG溶液の塩化ナトリウム量を変えて、最適な塩化ナトリウム量を検討した。実施例１と同様の実験系で、添加する塩化ナトリウム量を従来のPEG沈殿法でNVを濃縮する際に通常使用されている濃度(終濃度3%)の約２倍量を上限に、1/√10倍量ずつ漸減してグリコーゲン添加PEG溶液に添加しときの濃縮効果を示したのが表３および４である。結果は、各群４〜６重で行った回収量の中央値をもとに、最大値群の回収量を１とした時の各群の回収量の比率で示している。結果、GI（表３）に比べてGII（表４）が塩濃度の影響を受けやすく、かつグリコーゲンの濃度が高くなるほど塩の適応濃度範囲が狭くなる傾向にあったが、両ウイルスの濃縮を考慮すると0.021%以上6.6%未満（終濃度）の範囲で、特に、0.066〜2.1%（終濃度）が最適であった。
（表３）
「グリコーゲンを添加したPEG溶液中の塩化ナトリウムの濃度を変化させたときの蒸留水中NVG1回収比率を示した表」
2020005632.tif 000009
（表４）
「グリコーゲンを添加したPEG溶液中の塩化ナトリウムの濃度を変化させたときの蒸留水中NVGII回収効率を示した表」
2020005632.tif 000010