(57)【要約】      （修正有）【課題】ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位とを含む二重特異性抗体の提供。【解決手段】ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、前記第一抗原結合部位が、特定のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと特定のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、ＴＩＭ３に特異的に結合する前記第二抗原結合部位が、特定のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、特定のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体であって、
ＰＤ１に特異的に結合する前記第一抗原結合部位が、
（ｉ）配列番号：３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号：３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメインと
（ｉ）配列番号：４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｉｉ）配列番号：４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメインを含み；
ＴＩＭ３に特異的に結合する前記第二抗原結合部位が、
（ａ）（ｉ）配列番号：１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号：２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメインと
（ｉ）配列番号：４又は配列番号：１１又は配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｉｉ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメインを含むか；又は
（ｂ）（ｉ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメインと
（ｉ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｉｉ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメインを含むか；又は
（ｃ）（ｉ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメインと
（ｉ）配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｉｉ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメインを含む、二重特異性抗体。
【請求項２】
ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、ＰＤ１への結合と比較した場合少なくとも５０倍低い結合親和性で、より特定的にはＰＤ１への結合と比較した場合少なくとも１００倍低い結合親和性で、ＴＩＭ３に結合する、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項３】
ＰＤ１に特異的に結合する前記第一抗原結合部位が、
（ａ）配列番号：４３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４４のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｃ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４７のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｄ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｅ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含み、ＴＩＭ３に特異的に結合する前記第二抗原結合部位が、
（ａ）配列番号：７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号：９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｃ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｄ）配列番号：１５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｅ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｆ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｇ）配列番号：２７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｈ）配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む、請求項１又は２に記載の二重特異性抗体。
【請求項４】
ＰＤ１に特異的に結合する前記第一抗原結合部位が、配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、
ＴＩＭ３に特異的に結合する前記第二抗原結合部位が、配列番号：１５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン又は配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、請求項１から３の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項５】
ＰＤ１に特異的に結合する前記第一抗原結合部位が、配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、
ＴＩＭ３に特異的に結合する前記第二抗原結合部位が、配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、請求項１から４の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項６】
二重特異性抗体がヒト、ヒト化又はキメラ抗体である、請求項１から５の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項７】
二重特異性抗体が、Ｆｃドメイン、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合部位を含む第一Ｆａｂ断片及びＴＩＭ３に特異的に結合する抗原結合部位を含む第二Ｆａｂ断片を含む、請求項１から６の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項８】
ＦｃドメインがＩｇＧ、特にＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである、請求項１から７の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項９】
Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体への結合を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含む、請求項１から８の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１０】
Ｆｃドメインが、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有するヒトＩｇＧ１サブクラスのものである、請求項１から９の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１１】
Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第一及び第二サブユニットの会合を促進する修飾を含む、請求項１から１０の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１２】
ノブ・イントゥ・ホール法に従って、Ｆｃドメインの第一サブユニットがノブを含み、Ｆｃドメインの第二サブユニットがホールを含む、請求項１から１１の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１３】
Ｆｃドメインの第一サブユニットがアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第二サブユニットがアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む、請求項１から１２の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１４】
Ｆａｂ断片の一つにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、ＶＨドメインが軽鎖の一部で、ＶＬドメインが重鎖の一部であるように、互いに置換されている、請求項１から１３の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１５】
ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合部位を含む第一Ｆａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されている、請求項１４に記載の二重特異性抗体。
【請求項１６】
定常ドメインＣＬ中のＦａｂ断片の一つにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換され（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において、１４７位及び２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）、請求項１から１４の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１７】
ＴＩＭ３に特異的に結合する抗原結合部位を含む第二Ｆａｂ断片において、定常ドメインＣＬの１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換され（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において、１４７位及び２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）、請求項１６に記載の二重特異性抗体。
【請求項１８】
（ａ）配列番号：５０の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：５２の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：５１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：５３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｂ）配列番号：５４の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：５６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：５５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：５７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｃ）配列番号：５８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：６０の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一軽鎖：配列番号：５９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：６１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｄ）配列番号：６２の配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：６４の配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：６３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：６５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｅ）配列番号：６６の配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：６８の配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：６７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：６９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二軽鎖
を含む、請求項１から１７の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１９】
（ａ）配列番号：５０のアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：５２のアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：５１のアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：５３のアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｂ）配列番号：５４のアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：５６のアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：５５のアミノ酸配列を含む第二重鎖、配列番号：５７のアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｃ）配列番号：５８のアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：６０のアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：５９のアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：６１のアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｄ）配列番号：６２のアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：６４のアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：６３のアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：６５のアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｅ）配列番号：６６のアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：６８のアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：６７のアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：６９のアミノ酸配列を含む第二軽鎖
を含む、請求項１から１８の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２０】
請求項１から１９の何れか一項に記載の二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項２０に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター、特に発現ベクター。
【請求項２２】
請求項２０に記載のポリヌクレオチド又は請求項２１に記載のベクターを含む、原核又は真核宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１から１９に記載の二重特異性抗体を製造する方法であって、ａ）前記二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで宿主細胞を形質転換する工程と、ｂ）二重特異性抗体の発現に適した条件下で、宿主細胞を培養する工程と、ｃ）培養物から二重特異性抗体を回収する工程を含む、方法。
【請求項２４】
請求項１から１９の何れか一項に記載の二重特異性抗体及び少なくとも一種の薬学的に許容可能な賦形剤を含有する薬学的組成物。
【請求項２５】
医薬として使用するための、請求項１から１９の何れか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２４に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
ｉ）Ｔ細胞活性の回復等の免疫応答の調節、
ｉｉ）免疫応答又は機能の刺激、
ｉｉｉ）感染症の治療、
ｉｖ）がんの治療、
ｖ）がんの進行の遅延化、
ｖｉ）がんに罹患している患者の生存の延長
に使用するための、請求項１から１９の何れか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２４に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
がんの予防又は治療に使用するための、請求項１から１９の何れか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２４に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
慢性ウイルス感染症の治療に使用するための、請求項１から１９の何れか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２４に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
二重特異性抗体が、化学療法剤、放射線及び／又はがん免疫療法に使用される他の薬剤と組み合わせて投与される、がんの予防又は治療に使用するための、請求項１から１９の何れか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２４に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
個体における腫瘍細胞の増殖を抑制する方法において、請求項１から１９の何れか一項に記載の二重特異性抗体の有効量を個体に投与して腫瘍細胞の増殖を抑制することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体、特にＰＤ１への結合と比較して、より低い結合親和性でＴＩＭ３に結合する二重特異性抗体に関する。本発明は更にこれら分子を製造する方法と同分子を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんに対する防御における免疫系の重要性は、異常細胞を検出し破壊するその能力に基づいている。しかし、一部の腫瘍細胞は、免疫抑制の状態を生み出すことによって免疫系を逃れることができる（Zitvogel等, Nature Reviews Immunology 6 (2006), 715-727）。担腫瘍宿主に存在する免疫抑制機構の一例は、Ｔ細胞の機能障害又は消耗の促進である。Ｔ細胞は、全ての細胞コンパートメント中のタンパク質由来のペプチドを選択的に認識するその能力；（細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）としても知られる、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞により）抗原発現細胞を直接認識し死滅させるその能力、並びに適応及び自然エフェクター機構を統合する、（ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞による）多様な免疫応答を編成するその能力のため、内因性抗腫瘍免疫を治療的に操作する努力の主要な焦点であった。消耗したＴ細胞は増殖し、抗原刺激に応答して細胞傷害性及びサイトカイン分泌などのエフェクター機能を発現することができない。更なる研究では、消耗したＴ細胞は抑制性分子ＰＤ−１（プログラム細胞死タンパク質１）の持続発現によって特徴付けられ、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１（ＰＤ−１リガンド）相互作用の遮断がＬＣＭＶ感染マウスにおいてＴ細胞消耗を逆転させ、抗原特異的Ｔ細胞応答を回復させうることが判明した（Barber等, Nature 439 (2006), 682-687）。しかし、ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１経路だけの標的化はＴ細胞消耗の逆転を必ずしももたらさず（Gehring等, Gastroenterology 137 (2009), 682-690）、これは、他の分子がＴ細胞消耗に関与している可能性が高いことを示している（Sakuishi, J. Experimental Med. 207 (2010), 2187-2194）。
【０００３】
ＴＩＭ−３は、元々はＩＦＮ−γ分泌Ｔｈ１及びＴｃ１細胞上で選択的に発現していると同定された分子である（Monney等, Nature 415 (2002), 536-541）。ＴＩＭ−３とそのリガンドであるガレクチン−９との相互作用は、ＴＩＭ−３＋Ｔ細胞において細胞死を誘発する。従って、ＴＩＭ−３とＰＤ−１は共に、Ｔ細胞応答の負の調節因子として機能しうる。ＴＩＭ−３は、固形及び血液悪性腫瘍双方の前臨床モデルにおいてＣＤ８＋Ｔ細胞の最も抑制された又は機能障害性の集団を特徴付けることが示されている（Sakuishi, J. Experimental Med. 207 (2010), 2187-2194；Zhou, Blood 117 (2011), 4501-4510；Majeti R等, PNAS, 106 (2009), 3396-3401）。これらのモデルにおいて、ＣＤ８＋ＴＩＭ−３＋Ｔ細胞の全てがＰＤ１を共発現し、これらの二重発現細胞は、ＰＤ１のみを発現する細胞よりも細胞周期進行及びエフェクターサイトカイン産生［インターロイキン（ＩＬ）−２、ＴＮＦ、及びＩＦＮ−γ］の双方においてより大きな欠陥を示す。よって、ＴＩＭ−３経路はＰＤ−１経路と協働し、がんにおいてＣＤ８＋Ｔ細胞の重度の機能障害表現型の発達を促進しうる。従って、ＴＩＭ−３経路とＰＤ１経路の組み合わせた標的化は、腫瘍増殖の制御において非常に効果的であることが期待される。
【０００４】
ＴＩＭ３は、免疫グロブリンスーパーファミリー及びＴＩＭタンパク質ファミリーに属するヒトタンパク質である。マウスと同様にヒトにおいて、ＴＩＭ−３はＴ細胞並びに貪食細胞、例えばマクロファージ及び樹状細胞に発現される。タンパク質リガンド（例えば、ガレクチン−９）へのＴＩＭ３の結合は、アポトーシス誘導機構を介してＴｈ１応答を抑制することができ、従って、末梢性免疫寛容の誘導等に至る。ｓｉＲＮＡによるヒトＴＩＭ３の発現の低下又は遮断抗体によるヒトＴＩＭ３の抑制は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞からのインターフェロンαの分泌を増加させ、ヒトＴ細胞におけるＴＩＭ３の抑制的役割を裏付けた。貪食細胞において、ＴＩＭ３はまたアポトーシス細胞を認識する受容体としても機能する。自己免疫疾患患者からの臨床試料の分析では、ＣＤ４陽性細胞においてＴＩＭ３の発現は示されなかった。特に、多発性硬化症の患者の脳脊髄液に由来するＴ細胞クローンでは、通常の健康人由来のクローンよりも、ＴＩＭ３の発現レベルは低く、ＩＦＮ−γの分泌レベルは高かった（Koguchi K等, J Exp Med. 203 (2006), 1413-1418）。ＴＩＭ−３とアレルギー性疾患又は喘息との関係についての報告がある（国際公開第９６／２７６０３号及び国際公開第２００３／０６３７９２号）。
【０００５】
抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体の例には、抗ヒトＴＩＭ３ラットモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製クローン３４４８２３）及び抗ヒトＴＩＭ−３マウスモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製クローンＦ３８−２Ｅ２）が含まれる。国際公開第２０１３／０６４９０号は、迅速な内部移行を示す抗ＴＩＭ３抗体と、がんの治療及び炎症の軽減のためのそのイムノコンジュゲートに関する。米国特許出願公開第２０１２／１８９６１７号は、ヒトＴＩＭ３発現細胞に関連する疾患のための抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ活性）等のより高いエフェクター活性を示す抗ＴＩＭ−３抗体に関する。
【０００６】
プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１又はＣＤ２７９）は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ及びＢＴＬＡをまた含むＣＤ２８受容体ファミリーの抑制性メンバーである。ＰＤ−１は細胞表面受容体であり、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞、及び骨髄系細胞に発現される（Okazaki等(2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82；Bennett等(2003) J Immunol 170:711-8）。ＰＤ−１の構造は、一つの免疫グロブリン可変様細胞外ドメインと免疫受容体チロシン依存性抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）及び免疫受容体チロシン依存性スイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含む細胞質ドメインからなる単量体１型膜貫通タンパク質である。活性化Ｔ細胞は一過性にＰＤ１を発現するが、ＰＤ１とそのリガンドＰＤＬ１の持続的高発現は免疫疲弊を促進し、ウイルス感染の持続、腫瘍回避、感染及び死亡率の増加につながる。ＰＤ１発現は、Ｔ細胞受容体を介した抗原認識によって誘導され、その発現は、主に持続性Ｔ細胞受容体シグナル伝達によって維持される。長期間の抗原曝露後、ＰＤ１遺伝子座は再メチル化されず、これが持続性高発現を促進する。ＰＤ１経路を遮断することにより、がん及び慢性ウイルス感染における消耗したＴ細胞機能性を回復させることができる（Sheridan, Nature Biotechnology 30 (2012), 729-730）。ＰＤ−１に対するモノクローナル抗体は、例えば、国際公開第２００３／０４２４０２号、国際公開第２００４／００４７７１号、国際公開第２００４／０５６８７５号、国際公開第２００４／０７２２８６号、国際公開第２００４／０８７１９６号、国際公開第２００６／１２１１６８号、国際公開第２００６／１３３３９６号、国際公開第２００７／００５８７４号、国際公開第２００８／０８３１７４号、国際公開第２００８／１５６７１２号、国際公開第２００９／０２４５３１号、国際公開第２００９／０１４７０８号、国際公開第２００９／１０１６１１号、国際公開第２００９／１１４３３５号、国際公開第２００９／１５４３３５号、国際公開第２０１０／０２７８２８号、国際公開第２０１０／０２７４２３号、国際公開第２０１０／０２９４３４号、国際公開第２０１０／０２９４３５号、国際公開第２０１０／０３６９５９号、国際公開第２０１０／０６３０１１号、国際公開第２０１０／０８９４１１号、国際公開第２０１１／０６６３４２号、国際公開第２０１１／１１０６０４号、国際公開第２０１１／１１０６２１号、国際公開第２０１２／１４５４９３号、国際公開第２０１３／０１４６６８号、国際公開第２０１４／１７９６６４号、及び国際公開第２０１５／１１２９００号に記載されている。
【０００７】
ＰＤ１とＴＩＭ３の双方を遮断することにより、例えば急性アルコール性肝炎（ＡＡＨ）患者において、抗菌免疫応答を回復させることができることもまた示されている。これらの患者由来のリンパ球は、高レベルの免疫抑制性受容体を発現し、低レベルのインターフェロンγを産生し、慢性内毒素曝露のためにＩＬ１０産生を増加させた。これらの効果は、ＰＤ１及びＴＩＭ３を遮断することによって逆転され得、これがＴ細胞及び好中球の抗菌活性を増加させる（Markwick等, Gastroenterology 148 (2015), 590-602）。
【０００８】
慢性免疫状態における免疫療法のためのＴＩＭ３及びＰＤ１に対する二重特異性抗体は、国際公開第２０１１／１５９８７７号に既に記載されている。しかし、ＰＤ１とＴＩＭ３に同時に結合し、よってＰＤ１とＴＩＭ３の両方を発現するＴ細胞を選択的に標的とするだけでなく、自然免疫細胞などの他の細胞、例えばナイーブ樹状細胞（ＤＣ）及び単球上のＴＩＭ３の遮断をまた回避する新しい二重特異性抗体を提供する必要性がある。本発明の二重特異性抗体は、ＰＤ１とＴＩＭ３の両方を過剰発現するＴ細胞上のＰＤ１とＴｉｍ３を効果的に遮断するだけでなく、これらの細胞に対して非常に選択的であり、よって高活性ＴＩＭ３抗体の投与による副作用を回避することができる。
【発明の概要】
【０００９】
一態様では、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体であって、
ＰＤ１に特異的に結合する前記第一抗原結合部位が、
（ｉ）配列番号：３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号：３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメインと
（ｉ）配列番号：４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｉｉ）配列番号：４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメイン
を含み；
ＴＩＭ３に特異的に結合する前記第二抗原結合部位が、
（ａ）（ｉ）配列番号：１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号：２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメインと
（ｉ）配列番号：４又は配列番号：１１又は配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｉｉ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメイン
を含むか；又は
（ｂ）（ｉ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメインと
（ｉ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｉｉ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメイン
を含むか；又は
（ｃ）（ｉ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメインと
（ｉ）配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｉｉ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメイン
を含む、二重特異性抗体を提供する。
【００１０】
一態様では、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体は二価である。
【００１１】
別の態様では、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体であって、低親和性でＴＩＭ３に結合し、高親和性でＰＤ１に結合する二重特異性抗体が提供される。特定の態様では、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体であって、ＰＤ１への結合と比較した場合少なくとも５０倍低い結合親和性で、より特定的にはＰＤ１への結合と比較した場合少なくとも１００倍低い結合親和性でＴＩＭ３に結合する二重特異性抗体を提供する。好ましい一実施態様では、結合親和性（ＫＤ）は（例えば実施例１２に記載されているように）表面プラズモン共鳴アッセイで決定される。
【００１２】
更なる態様では、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、
ＰＤ１に特異的に結合する前記第一抗原結合部位が、
（ａ）配列番号：４３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４４のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｃ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４７のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｄ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｅ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含み、ＴＩＭ３に特異的に結合する前記第二抗原結合部位が、
（ａ）配列番号：７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号：９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｃ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｄ）配列番号：１５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｅ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｆ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｇ）配列番号：２７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｈ）配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む、二重特異性抗体が提供される。
【００１３】
特定の態様では、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、
ＰＤ１に特異的に結合する前記第一抗原結合部位が、配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、
ＴＩＭ３に特異的に結合する前記第二抗原結合部位が、配列番号：１５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン又は配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、
二重特異性抗体が提供される。
【００１４】
特に、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、
ＰＤ１に特異的に結合する前記第一抗原結合部位が、
（ｉ）配列番号：３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号：３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメインと
（ｉ）配列番号：４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｉｉ）配列番号：４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメインを含み；
ＴＩＭ３に特異的に結合する前記第二抗原結合部位が、
（ｉ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメインと
（ｉ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｉｉ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメインを含む、二重特異性抗体を提供する。
【００１５】
より特定的には、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、ＰＤ１に特異的に結合する前記第一抗原結合部位が、配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、ＴＩＭ３に特異的に結合する前記第二抗原結合部位が、配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、二重特異性抗体が提供される。
【００１６】
特定の態様では、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体であって、ＰＤ１への結合と比較した場合、少なくとも５０倍低い結合親和性で、より特定的にはＰＤ１への結合と比較した場合、少なくとも１００倍低い結合親和性でＴＩＭ３に結合する二重特異性抗体を提供する。
【００１７】
更なる態様では、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体は、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体である。特に、それはヒト化又はキメラ抗体である。
【００１８】
別の態様では、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体であって、Ｆｃドメイン、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合部位を含む第一Ｆａｂ断片及びＴＩＭ３に特異的に結合する抗原結合部位を含む第二Ｆａｂ断片を含む二重特異性抗体に関する。
【００１９】
特に、ＦｃドメインはＩｇＧドメインであり、より特定的にはＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。
【００２０】
一態様では、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体への結合を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含む、二重特異性抗体に関する。特に、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有するヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。
【００２１】
別の態様では、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、ＦｃドメインがＦｃドメインの第一及び第二サブユニットの会合を促進する修飾を含む、二重特異性抗体に関する。
【００２２】
一態様では、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、ノブ−イントゥ−ホール法に従って、Ｆｃドメインの第一サブユニットがノブを含み、Ｆｃドメインの第二サブユニットがホールを含む、二重特異性抗体に関する。特定の態様では、Ｆｃドメインの第一サブユニットはアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第二サブユニットはアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【００２３】
更なる態様では、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、Ｆａｂ断片の一つにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、ＶＨドメインが軽鎖の一部で、ＶＬドメインが重鎖の一部であるように、互いに置換されている二重特異性抗体に関する。特定の態様では、二重特異性抗体は、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合部位を含む第一Ｆａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されているものである。
【００２４】
更なる態様では、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、定常ドメインＣＬ中のＦａｂ断片の一つにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換され（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において、１４７位及び２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）、二重特異性抗体に関する。特定の態様では、二重特異性抗体は、ＴＩＭ３に特異的に結合する抗原結合部位を含む第二Ｆａｂ断片において、定常ドメインＣＬの１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換され（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において、１４７位及び２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）ものである。
【００２５】
別の態様では、本発明は、
（ａ）配列番号：５０の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：５２の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：５１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：５３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｂ）配列番号：５４の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：５６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：５５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：５７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｃ）配列番号：５８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：６０の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一軽鎖：配列番号：５９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：６１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｄ）配列番号：６２の配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：６４の配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：６３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：６５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｅ）配列番号：６６の配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：６８の配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：６７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：６９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二軽鎖
を含む、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供する。
【００２６】
特定の態様では、本発明は、
（ａ）配列番号：５０のアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：５２のアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：５１のアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：５３のアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｂ）配列番号：５４のアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：５６のアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：５５のアミノ酸配列を含む第二重鎖、配列番号：５７のアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｃ）配列番号：５８のアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：６０のアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：５９のアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：６１のアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｄ）配列番号：６２のアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：６４のアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：６３のアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：６５のアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｅ）配列番号：６６のアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：６８のアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：６７のアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：６９のアミノ酸配列を含む第二軽鎖
を含む、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供する。
【００２７】
本発明の別の態様によれば、これまでに記載した二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドが提供される。本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクターと、本発明のポリヌクレオチド又はベクターを含む原核又は真核宿主細胞を更に提供する。幾つかの実施態様では、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物細胞である。
【００２８】
別の態様では、ここに記載したＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体を製造する方法であって、ａ）前記二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで宿主細胞を形質転換する工程と、ｂ）二重特異性抗体の発現に適した条件下で、宿主細胞を培養する工程と、ｃ）培養物から二重特異性抗体を回収する工程を含む、方法が提供される。本発明は本発明の方法によって産生される二重特異性抗体をまた包含する。
【００２９】
本発明は、ここに記載のＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体と少なくとも一種の薬学的に許容可能な賦形剤を含有する薬学的組成物を更に提供する。
【００３０】
本発明にまた包含されるものは、医薬として使用するための、ここに記載のＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体又は二重特異性抗体を含有する薬学的組成物である。
【００３１】
別の態様では、本発明は、
ｉ）Ｔ細胞活性の回復等の免疫応答の調節、
ｉｉ）免疫応答又は機能の刺激、
ｉｉｉ）感染症の治療、
ｉｖ）がんの治療、
ｖ）がんの進行の遅延化、
ｖｉ）がんに罹患している患者の生存の延長
に使用するための、ここに記載のＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体、又は二重特異性抗体を含有する薬学的組成物を提供する。
【００３２】
一態様では、それを必要とする個体の疾患の治療に使用するための、ここに記載のＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体、又は二重特異性抗体を含有する薬学的組成物が提供される。特定の態様では、本発明は、がんの治療に使用するための、ここに記載のＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体、又は二重特異性抗体を含有する薬学的組成物を提供する。更なる特定の態様では、免疫応答の調節に使用するための、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体、又は二重特異性抗体を含有する薬学的組成物が提供される。別の態様では、慢性ウイルス感染の治療に使用するための、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体、又は二重特異性抗体を含有する薬学的組成物が提供される。
【００３３】
また提供されるものは、治療を必要とする個体における疾患の治療のための医薬の製造のための、特にがんの治療のための医薬の製造のための、ここに記載のＰＩＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体の使用、並びにここに記載のＰＩＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体を含有する組成物の治療的有効量を薬学的に許容可能な形態で前記個体に投与することを含む個体の疾患を治療する方法である。特定の態様では、疾患はがんである。別の特定の態様では、疾患は慢性ウイルス感染である。別の態様では、個体における免疫応答の調節方法であって、薬学的に許容可能な形態でここに記載のＰＤＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する二重特異性抗体を含有する組成物の治療的有効量を前記個体に投与することを含む方法が提供される。上記態様の何れにおいても、個体は、好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
【００３４】
本発明は、二重特異性抗体が、化学療法剤、放射線及び／又はがん免疫療法に使用される他の薬剤と組み合わせて投与される、がんの予防又は治療に使用するための、ここに記載のＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体又は二重特異性抗体を含有する薬学的組成物をまた提供する。
【００３５】
更に提供されるものは、個体における腫瘍細胞の増殖を抑制する方法において、ここに記載のＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体の有効量を個体に投与して腫瘍細胞の増殖を抑制することを含む方法である。個体は好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】キメラＰＤ１−０１０３を用いたＰＤ１の遮断は、同種異系の刺激された初代ヒトＴ細胞によるＩＦＮ−γ分泌を強く促進する。
【図２】キメラＰＤ１−０１０３を用いたＰＤ１の遮断は、同種異系の刺激された初代ヒトＴ細胞によるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）分泌を強く増加させる。
【図３】キメラＰＤ１−０１０３を用いたＰＤ１の遮断は、同種異系の刺激された初代ヒトＴ細胞による腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ）分泌を強く増加させる。
【図４Ａ】グランザイムＢを産生するＣＤ４Ｔ細胞の頻度
【図４Ｂ】増加する濃度の異なる抗ＰＤ−１抗体の存在下でのＭＬＲの上清中の吸光度（光学密度，Ｏ．Ｄ．）によって検出されたＩＦＮ−γの量
【図５】５Ａ）異なる抗ＰＤ−１抗体の存在下での抑制されたＴ細胞受容体シグナル伝達の再活性化に対するＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１遮断の影響；５Ｂ）異なる抗ＰＤ−１抗体の存在下での抑制されたＴ細胞受容体シグナル伝達の再活性化に対するＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１遮断の影響
【図６】組換え細胞への抗ＰＤ１／Ｔｉｍ３二重特異性抗体の同時結合のためのＦＲＥＴアッセイのスキーム
【図７Ａ】図７：ＰＤ１及びＴＩＭ３発現細胞に対する異なる二重特異性ＰＤ１ＴＩＭ３抗体の処置／結合時のＦＲＥＴの誘導：ＰＤ１ ＳＮＡＰ Ｔｉｍ３ ＣＬＩＰで二重トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、Ｔａｇ−Ｌｉｔｅ緩衝液（Ｃｉｓｂｉｏ）中、３７℃で１時間、１００ｎＭのＳＮＡＰ−Ｌｕｍｉ４−Ｔｂ（Ｃｉｓｂｉｏ）及び１００ｎＭのＣｌｉｐ−Ｒｅｄ（Ｃｉｓｂｉｏ）で染色した。洗浄後、標識した細胞を、示された二重特異性抗ＰＤ１／Ｔｉｍ３抗体［０−１０ｎＭ］（図７Ｂに示すヒト化二重特異性変異体）と共に４℃で１時間インキュベートした後、時間分解蛍光を、ＢＭＧ Ｐｈｅｒａｓｔａｒリーダーを用いて６６５／６２０ｎｍで測定した（示されているのはＦＲＥＴシグナルの平均＋／−ＳＤ［比６６５／６２０ｎｍ*１００００］、ｎ＝３）。７Ａ：２＋２コンストラクト（ＰＤ１ＴＩＭ３＿０３５８＋ＰＤ１ＴＩＭ３＿０３５９）と比較した１＋１フォーマット（抗体ＰＤ１ＴＩＭ３＿０３８９及びＰＤ１ＴＩＭ３＿０１６８）
【図７Ｂ】ヒト化二重特異性変異体（ＰＤ１ＴＩＭ３＿０４７６及びＰＤ１ＴＩＭ３＿４７７）
【図８Ａ】図８：抗ＰＤ１／ＴＩＭ３二重特異性抗体１＋１ ＰＤ１ＴＩＭ３−０１６８の同時結合のためのＦＲＥＴアッセイ：ＳＮＡＰタグＰＤ１及びＣＬＩＰタグＴＩＭ３細胞（前に記載）を１００ｎＭのＳＮＡＰ−Ｌｕｍｉ４−Ｔｂ及び１００ｎＭのＣｌｉｐ−Ｒｅｄで標識した。洗浄後、標識した細胞を、二重特異性抗ＰＤ１／ＴＩＭ３抗体＃０１６８［示された濃度で］と共に４℃で１時間インキュベートした後、時間分解蛍光を、ＢＭＧ Ｐｈｅｒａｓｔａｒリーダーを用いて（黒線）を用いて６６５／６２０ｎｍで測定した。二重特異性抗体誘導ＦＲＥＴシグナルの特異性を強調するために、抗ＰＤ１モノクローナル抗体（＃０１６５；図８Ａ）を添加して競合させ、ＦＲＥＴシグナルのほぼ完全な防止をもたらした（灰色の曲線）。抗ＰＤ１抗体単独での処置はＦＲＥＴ誘導をもたらさなかった（点線、左図のみ）。
【図８Ｂ】二重特異性抗体誘導ＦＲＥＴシグナルの特異性を強調するために、抗ＴＩＭ３−遮断抗体（＃００１８，図８Ｂ）を添加して競合させ、ＦＲＥＴシグナルのほぼ完全な防止をもたらした（灰色の曲線）。抗ＰＤ１抗体単独での処置はＦＲＥＴ誘導をもたらさなかった（点線、左図のみ）。
【図９Ａ−９Ｄ】図９Ａ：二重特異性１＋１ ＰＤ１ＴＩＭ３−０３８９は、陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＰＤ１＋、ＴＩＭ３＋）に対してキメラＴＩＭ３＿００２８（ｃｈｉ００２８）及びヒト化ＴＩＭ３−０４３８（０４３８）と同じ結合比を示すが、単球、ＮＫ細胞及びＣＤ３＋Ｔ細胞への結合は低い。図９Ｂ：二重特異性１＋１ ＰＤ１ＴＩＭ３−０３８９は、陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＰＤ１＋、ＴＩＭ３＋）への結合に対してキメラＴＩＭ３＿００２８（ｃｈｉ００２８）及びヒト化Ｔｉｍ３−０４３８（０４３８）よりも有意に増加したＭＦＩを示す。図９Ｃ：二重特異性１＋１ ＰＤ１ＴＩＭ３−０１６８は、陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＰＤ１＋、ＴＩＭ３＋）への結合に関してキメラＴＩＭ３＿００１８（Ｔｉｍ３−ｃｈｉ００１８）及びヒト化ＴＩＭ３−０４３４（０４３４）と差異はない。図９Ｄ：二重特異性１＋１ ＰＤ１ＴＩＭ３−０１６８は、陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＰＤ１＋、Ｔｉｍ３＋）への結合に対してほんの僅かに増加したＭＦＩを示す。
【図９Ｅ−９Ｈ】図９Ｅ及び図９Ｆ：抗ＴＩＭ３抗体ＴＩＭ３−００３８は、単球及びＣＤ４＋Ｔ細胞の両方への結合を示す。図９Ｇ及び図９Ｈ：二重特異性１＋１ ＰＤ１ＴＩＭ３−０１６６（キメラＰＤ１−０１０３／／Ｔｉｍ３−００３８に基づく）は、ＣＤ４＋Ｔ細胞への強い結合を保持しながら（親抗ＴＩＭ３抗体ＴＩＭ３＿００３８との比較、図４Ｅ及び４Ｆ参照）単球への結合の強い減少を示す。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｄ：二重特異性１＋１ ＰＤ１ＴＩＭ３−０１６６（キメラＰＤ１−０１０３／／ＴＩＭ３−００３８に基づく）は、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞及び活性化ＮＫ細胞について二重特異性２＋２ＰＤ１ＴＩＭ３−０３２１（またキメラＰＤ１−０１０３／／ＴＩＭ３−００３８に基づくが、ＰＤに対して二つの、ＴＩＭ３に対して二つの抗原結合部位を有する）と比較して、また親ＴＩＭ３−００３８抗体と比較して、内部移行の減少を示した。
【図１１Ａ】経時的分析は、ＴＩＭ３抗体の細胞内クラスター化と比較した場合、二重特異性抗体及びＰＤ１抗体の両方において高い膜局在化を示す。図中の抗体の命名：ＴＩＭ３（ｃｈｉ１８−Ａ６４７＝ＡｌｅｘａＡ６４７で標識されたキメラＴＩＭ３＿００１８）、ａ−ＴＩＭ３（ｃｈｉ２８−Ａ６４７＝ＡｌｅｘａＡ６４７で標識されたキメラＴＩＭ３＿００２８）、Ｂｉｓｐｅｃ（０１６８−Ａ６４７＝Ａｌｅｘａ６４７で標識された１＋１ ＰＤ１ＴＩＭ３＿０１６８（キメラＰＤ１−０１０３／ＴＩＭ３−００１８に基づく））、Ｂｉｓｐｅｃ（０３８９−Ａ６４７＝ＡｌｅｘａＡ６４７で標識された１＋１ ＰＤ１ＴＩＭ３＿０３８９（キメラＰＤ１−０１０３／ＴＩＭ３−００２８に基づく））及びａ−ＰＤ１（０１６５−Ａ４８８＝Ａｌｅｘａ４８８で標識されたキメラＰＤ１−０１０３）。抗ＰＤ１及び二重特異性１＋１ ＰＤ１ＴＩＭ３＿０３８９（Ｂｉｓｐｅｃ０３８９）は３時間後であっても非常に遅い内部移行しか示さないが、他の二重特異性１＋１ ＰＤ１ＴＩＭ３＿０１６８（Ｂｉｓｐｅｃ０１６８）の内部移行はより強い。より強い内部移行はａＴＩＭ３ Ａｂ００２８で示され、最も強い内部移行はａＴＩＭ３−００１８によって示される。
【図１１Ｂ】キメラＰＤ１−０１０３（ａＰＤ１−０１６５）は乏しい内部移行しか示さないが、高アフィン（affine）キメラＴＩＭ３＿００１８（ａＴｉｍ３−ｃｈｉ１８）は１５分後でさえ、ＴＩＭ３結合の際に強く内部移行される。低親和性結合体キメラＴＩＭ３＿００２８（ａＴＩＭ３−ｃｈｉ２８）の内部移行は僅かに減少する。二重特異性１＋１ＡＢ０１６８（高アフィン結合体ａＰＤ１−０１６５及び高アフィンａＴＩＭ３−００１８からなる）はより少ない内部移行を示す。（高親和性結合体キメラＰＤ１−０１０３（ａＰＤ１−０１６５）及び低アフィンキメラＴＩＭ３＿００２８（ａＴＩＭ３−００２８）からなる）二重特異性１＋１ＡＢ０３８９は、非常に強く減少した内部移行を示す。これは、ＰＤ１及びＴＩＭ３への二価結合によるものであり得、ＰＤ１への高アフィン結合が細胞表面に抗体を保持する。
【図１２Ａ】キメラＰＤ１−０１０３（＝ＰＤ１−０１６５）及びキメラＴＩＭ３＿００１８（＝ＴＩＭ３−ｃｈｉ１８）及びそれらの組み合わせと比較したＰＤ１−ＴＩＭ３二重特異性抗体１＋１ ＰＤ１ＴＩＭ３＿０１６８（キメラＰＤ１−０１０３／ＴＩＭ３−００１８（＝ＡＢ０１６８）に基づく）の効力
【図１２Ｂ】キメラＰＤ１−０１０３（＝ＰＤ１−０１６５）及びキメラＴＩＭ３＿００２８（＝ＴＩＭ３−ｃｈｉ１８）及びそれらの組み合わせと比較したＰＤ１−ＴＩＭ３二重特異性抗体１＋１ ＰＤ１ＴＩＭ３＿０３８９（キメラＰＤ１−０１０３／ＴＩＭ３−００２８（＝ＢｉｓｐｅｃＡＢ０３８９）に基づく）の効力
【図１２Ｃ】キメラＰＤ１−０１０３（＝ＰＤ１−０１６５）及び抗ＴＩＭ３−Ｋｙ８２１３（米国特許出願公開第２０１２０１８９６１７号（抗体８２１３参照）、例えば実施例３３）及びそれらの組み合わせと比較したＰＤ１−ＴＩＭ３二重特異性抗体１＋１ ＰＤ１−０１０３／Ｋｙ８２１３（キメラＰＤ１−０１０３／及び１＋１ＣｒｏｓｓＭａｂとして実施例１に記載されたものと同様にして生産された米国特許出願公開第２０１２０１８９６１７号の抗ＴＩＭ３ Ｋｙ８２１３（抗体８２１３、例えば実施例３３参照）に基づく）の効力
【図１２Ｄ】キメラＰＤ１−０１０３／ＴＩＭ３−００２８（＝Ｂｉｓｐｅｃ ＡＢ０３５８（２＋２））に基づくＰＤ１−ＴＩＭ３二重特異性抗体２＋２ＰＤ１ＴＩＭ３＿０３５８、及びキメラＰＤ１−０１０３（＝ＰＤ１−０１６５）及びキメラＴＩＭ３＿００２８（＝ＴＩＩＭ３−ｃｈｉ２８）及びそれらの組み合わせと比較した、ＰＤ１−ＴＩＭ３二重特異性抗体１＋１ ＰＤ１ＴＩＭ３＿０３８９（キメラＰＤ１−０１０３／ＴＩＭ３−００２８（＝Ｂｉｓｐｅｃ ＡＢ０３８９（１＋１））に基づく）の効力
【図１３】ＰＤ１−ＴＩＭ３二重特異性抗体１＋１ ＰＤ１ＴＩＭ３＿０４７６での処置は、ＰＤ１又はＴＩＭ３抗体単独による処置と比較して、また親抗体ＰＤ１＿０３７６及び抗体ＴＩＭ３＿０４３８の組み合わせによる処置とさえ比較しても、ＩＦＮ−γを放出するＣＤ４Ｔ細胞の能力を有意に増加させた。ＣＤ４Ｔ細胞をＭＨＣＩＩ発現腫瘍細胞株と共培養した。ＰＤ１−Ｔｉｍ３二特異性抗体１＋１ ＰＤ１ＴＩＭ３＿０４７６を、ＰＤ１抗体のａＰＤ１＿０３７６、ＭＤＸ−１１０６（ニボルマブ）及びＭＫ−３４７５（ペンブロリズマブ）に対して、ＴＩＭ３抗体のａＴＩＭ３＿０４３８及びＫｙｏｗａ−８２１３（国際公開第２０１１／１５５６９７号に開示）に対して、及び抗ＰＤ１抗体ａＰＤ１−０３７６と抗ＴＩＭ３抗体ａＴＩＭ３＿０４３８の組み合わせに対して、試験した。
【図１４】図１４Ａ及び１４Ｂ：ＭＫＮ４５細胞を投与し、健康なヒトドナー由来のＰＢＭＣを与えた免疫抑制雌マウス（ＮＯＧ）においてＰＤ１−ＴＩＭ３二重特異性抗体１＋１（０４７６）をＰＤ１又はＴＩＭ３抗体単独と比較した有効性実験の結果が図１４Ａ及び１４Ｂに示される。プロットは、３０日の期間にわたる腫瘍サイズ平均値の標準誤差を含む（処置群内の）腫瘍サイズの測定平均値を表す。塗りつぶされた円を有する曲線は、処置なし（ビヒクル）の腫瘍サイズの成長に対応する。図１４Ａには、低用量処置による腫瘍増殖（１．５ｍｇ／ｋｇ抗体ＰＤ１＿０３７６、１．５ｍｇ／ｋｇニボルマブ、１．５ｍｇ／ｋｇ抗体ＴＩＭ３＿０４３８又は３ｍｇ／ｋｇ二重特異性抗体１＋１ ＰＤ１ＴＩＭ３＿０４７６）が示され、図１４Ｂには、高用量での腫瘍増殖（５ｍｇ／ｋｇ抗体ＰＤ１＿０３７６、５ｍｇ／ｋｇニボルマブ、５ｍｇ／ｋｇ抗体Ｔｉｍ３＿０４３８又は１０ｍｇ／ｋｇ二重特異性抗体１＋１ ＰＤ１ＴＩＭ３＿０４７６）が示される。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
［定義］
他に定義されない限り、ここで使用される技術及び科学用語は、本発明が属する分野において一般的に使用されるものと同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的で、次の定義が適用され、適宜、単数形で使用された用語は複数形をまた含み、その逆もしかりである。
【００３８】
ここで使用される場合、「抗原結合分子」という用語は、その最も広い意味では抗原決定基に特異的に結合する分子を意味する。抗原結合分子の例は、抗体、抗体断片及びスキャフォールド抗原結合タンパク質である。
【００３９】
ここでの「抗体」という用語は最も広義に使用され、限定されないがモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性及び多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及びそれらが所望の抗原結合活性を示す限り抗体断片を含む様々な抗体構造を包含する。
【００４０】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、例えば天然に生じる変異を含んでいるか又はモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる可能な変異抗体（かかる変異体は一般に少量で存在する）を除いて、集団を構成する個々の抗体が同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは異なり、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は抗原の単一決定基に対するものである。
【００４１】
ここで使用される「単一特異性」抗体という用語は、その各々が同じ抗原の同じエピトープに結合する一又は複数の結合部位を有する抗体を意味する。「二重特異性」という用語は、抗体が、少なくとも二つの別個の抗原決定基、例えば、異なる抗原に又は同じ抗原上の異なるエピトープに結合する一対の抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）によってそれぞれ形成された二つの結合部位に特異的に結合することができることを意味する。このような二重特異性抗体は１＋１フォーマットである。他の二重特異性抗体形式は、（第一抗原又はエピトープに対して二つの結合部位を、第二抗原又はエピトープに対して一つの結合部位を含む）２＋１フォーマット又は（第一抗原又はエピトープに対して二つの結合部位を、第二の抗原又はエピトープに対して二つの結合部位を含む）２＋２フォーマットである。典型的には、二重特異性抗体は二つの抗原結合部位を含み、その各々が異なる抗原決定基に特異的である。
【００４２】
本出願中で使用される「価」という用語は、抗原結合分子中に特定された数の結合部位が存在することを示す。而して、「二価」、「四価」、及び「六価」という用語は、抗原結合分子中に、それぞれ二つの結合部位、４つの結合部位、６つの結合部位が存在することを示す。本発明に係る二重特異性抗体は少なくとも「二価」であり、「三価」又は「多価」（例えば「四価」又は「六価」）でありうる。特定の態様では、本発明の抗体は二以上の結合部位を有し、二重特異性である。すなわち、抗体は、二より多い結合部位が存在する場合（すなわち、抗体が三価又は多価である場合）においてさえも、二重特異性でありうる。特に、本発明は、それらが特異的に結合する各抗原について一つの結合部位を有する二重特異性二価抗体に関する。
【００４３】
「全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、ここでは交換可能に使用され、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有する抗体を意味する。「天然抗体」とは、様々な構造を有する天然に生じる免疫グロブリン分子を意味する。例えば、天然ＩｇＧクラス抗体は、ジスルフィド結合した二本の軽鎖と二本の重鎖からなる約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端にかけて、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、重鎖定常領域とも呼ばれる三つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端にかけて、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、軽鎖定常領域とも呼ばれる軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）が続く。抗体の重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つのタイプのうちの一つに割り当てることができ、その幾つかは更にサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）に分けることができる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる二つのタイプのうちの一つに割り当てることができる。
【００４４】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、クロス−Ｆａｂ断片；直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；抗体断片から形成された多重特異性抗体及び単一ドメイン抗体が含まれる。所定の抗体断片の概説については、Hudson等, Nat Med 9, 129-134 (2003)を参照。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第１１３巻, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp269-315(1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の検討については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。ダイアボディは二価又は二重特異性でありうる二つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許出願公開第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson等, Nat Med 9, 129-134 (2003)；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448 (1993)を参照。トリアボディ及びテトラボディもまたHudson等, Nat. Med. 9, 129-134 (2003)に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部あるいは軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。所定の実施態様では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第６２４８５１６Ｂ１号を参照）。また、抗体断片は、ＶＨドメインの特徴、すなわちＶＬドメインと共に集合して機能的抗原結合部位を形成し、又はＶＬドメインの特徴、すなわちＶＨドメインと共に集合して機能的抗原結合部位を形成する特徴を有し、よって全長抗体の抗原結合特性を提供する単鎖ポリペプチドを含む。抗体断片は、ここに記載されるように、限定されないが、インタクトな抗体のタンパク質分解性消化、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による産生を含む、様々な技術によって作製することができる。
【００４５】
インタクトな抗体のパパイン消化は、重鎖及び軽鎖可変ドメイン並びに軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）をそれぞれ含む「Ｆａｂ」断片と呼ばれる二つの同一の抗原結合断片を産生する。ここで使用される場合、「Ｆａｂ断片」という用語は、よって、軽鎖（ＣＬ）のＶＬドメインと定常ドメインを含む軽鎖断片と、重鎖のＶＨドメインと第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に少しの残基が付加される点でＦａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片である。ペプシン処理により、二つの抗原結合部位（二つのＦａｂ断片）とＦｃ領域の一部を有するＦ（ａｂ’）２断片が得られる。
【００４６】
「クロス−Ｆａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」という用語は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換されているＦａｂ断片を指す。クロスオーバーＦａｂ分子の２通りの異なる鎖組成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる：一方では、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域が交換される、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖を含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも称される。他方では、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の定常領域が交換される場合、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖を含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも称される。
【００４７】
「単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端の方向で、次の順：ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１又はｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬの一つを有し；ここで、前記リンカーは少なくとも３０のアミノ酸、好ましくは３２〜５０のアミノ酸のポリペプチドである。前記単鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合により安定化されている。加えて、これら単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔの番号付けによる、可変重鎖の４４位と可変軽鎖の１００位）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって更に安定化されるかもしれない。
【００４８】
「クロスオーバー単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｘ−ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端の方向で、次の順：ａ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１及びｂ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬの一つを有し；ここで、ＶＨ及びＶＬは、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成し、前記リンカーは少なくとも３０個のアミノ酸のポリペプチドである。加えて、これらｘ−ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔの番号付けによる、可変重鎖の４４位と可変軽鎖の１００位）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって更に安定化されるかもしれない。
【００４９】
「単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、１０から約２５のアミノ酸の短いリンカーペプチドにより連結された、抗体の重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは通常は柔軟性のためにグリシンに、また溶解性のためにセリン又はスレオニンに富み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に連結するか、又はその逆の連結をなしうる。このタンパク質は、定常領域の除去とリンカーの導入にもかかわらず元の抗体の特異性を保持している。ｓｃＦｖ抗体は、例えばHouston, J.S., Methods in Enzymol. (1991) 46-96に記載されている。加えて、抗体断片は、ＶＨドメインの特徴、すなわちＶＬドメインと共に集合して機能的抗原結合部位を形成し、又はＶＬドメインの特徴、すなわちＶＨドメインと共に集合して機能的抗原結合部位を形成する特徴を有し、よって全長抗体の抗原結合特性を提供する単鎖ポリペプチドを含む。
【００５０】
「スキャフォールド抗原結合タンパク質」は、当該技術分野において知られており、例えば、フィブロネクチンとアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）が抗原結合ドメインのための代替的スキャフォールドとして使用されている。例えば、Gebauer及びSkerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009)及びStumpp等, Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008)参照。本発明の一態様では、スキャフォールド抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ−４（エビボディ（Evibody））、リポカリン（アンチカリン）、プロテインＡにより誘導された分子、例えばプロテインＡのＺ−ドメイン（アフィボディ（Affibody））、Ａ−ドメイン（アビマー（Avimer）／マキシボディ（Maxibody））、血清トランスフェリン（トランスボディ）；アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ、ＶＨ）、ＶＮＡＲ断片、フィブロネクチン（アドネクチン）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）；新規抗原受容体ベータ−ラクタマーゼの可変ドメイン（ＶＮＡＲ断片）、ヒトガンマ−クリスタリン又はユビキチン（アフィリン（Affilin）分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のｋｕｎｉｔｚ型ドメイン、ミクロボディ、例えばノッチンファミリー由来のタンパク質、ペプチドアプタマー及びフィブロネクチン（アドネクチン）からなる群から選択される。
【００５１】
ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４＋ Ｔ細胞上に発現されるＣＤ２８ファミリー受容体である。その細胞外ドメインは可変ドメイン様Ｉｇフォールドを有する。抗体のＣＤＲに対応するループは、異なる結合特性を付与するために、異種配列で置換されうる。異なる結合特異性を有するように操作されたＣＴＬＡ−４分子は、エビボディ（例えば米国特許第７１６６６９７号）としても知られる。エビボディは、抗体（例えばドメイン抗体）の単離された可変領域とほぼ同じ大きさである。更なる詳細については、Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)を参照のこと。リポカリンは、疎水性の小分子、例えばステロイド、ビリン、レチノイド及びリピドを輸送する細胞外タンパク質のファミリーである。リポカリンは、異なる標的抗原に結合するように操作されうる円錐構造の開放端に多くのループを持つ強固なベータシート二次構造を有する。アンチカリンは、１６０から１８０のアミノ酸の大きさであり、リポカリンから誘導される。更なる詳細については、Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)、米国特許第７２５０２９７号及び米国特許出願公開第２００７０２２４６３３号を参照のこと。アフィボディは、抗原に結合するように操作されうるブドウ球菌属のプロテインＡから誘導されたスキャフォールドである。ドメインは、およそ５８のアミノ酸の３ヘリックス束からなる。表面残基の無作為化によりライブラリーが作製された。更なる詳細については、Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462及び欧州特許出願公開第１６４１８１８Ａ１号を参照のこと。アビマーは、Ａ−ドメインスキャフォールドファミリーから誘導される多ドメインタンパク質である。およそ３５のアミノ酸の天然ドメインは、規定のジスルフィド結合構造をとる。Ａ−ドメインのファミリーが呈する自然変異のシャフリングにより、多様性が生じる。更なる詳細については、Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005)及びExpert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)を参照のこと。トランスフェリンは単量体血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、許容表面ループ内のペプチド配列の挿入により、異なる標的抗原に結合するように操作されうる。操作されたトランスフェリンスキャフォールドの例にはトランスボディが含まれる。更なる詳細については、J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)を参照のこと。アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、内在性膜タンパク質の細胞骨格への結合を媒介するタンパク質のファミリーであるアンキリンから誘導される。単一のアンキリンリピートは、二つのアルファヘリックスと一つのベータターンからなる３３の残基モチーフである。これらモチーフは、各リピートの１番目のアルファヘリックスとベータターン内の残基を無作為化することにより、異なる標的抗原に結合するように操作されうる。これらの結合面は、モジュールの数を増加させることにより増大させることができる（親和性成熟の方法）。更なる詳細については、J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003)及びJ. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007)及び米国特許出願公開第２００４０１３２０２８号を参照のこと。
【００５２】
単一ドメイン抗体は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。最初の単一ドメインは、ラクダ科由来の抗体重鎖の可変ドメインから誘導された（ナノボディ又はＶＨＨ断片）。更に、単一ドメイン抗体という用語は、サメ由来の自律性ヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）又はＶＮＡＲ断片を含む。フィブロネクチンは、抗原に結合するように操作されうるスキャフォールドである。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１５の反復単位の１０番目のドメインの天然アミノ酸配列の骨格からなる。ベータサンドイッチの一端の三つのループは、対象の治療標的をアドネクチンが特異的に認識することを可能にするように操作されうる。更なる詳細については、Protein Eng. Des. Sel. 18, 435- 444 (2005)、米国特許出願公開第２００８０１３９７９１号、国際公開第２００５０５６７６４号及び米国特許第６８１８４１８号を参照のこと。ペプチドアプタマーは、定常スキャフォールドタンパク質、典型的には活性部位に挿入された制限可変ペプチドループを含むチオレドキシン（ＴｒｘＡ）からなるコンビナトリアル認識分子である。更なる詳細については、Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)を参照のこと。ミクロボディは、３−４システイン架橋を含む、長さ２５〜５０のアミノ酸の天然に生じるミクロタンパク質から誘導される−ミクロタンパク質の例には、ＫａｌａｔａＢＩ及びコノトキシン及びノッチンが含まれる。ミクロタンパク質は、ミクロタンパク質のフォールド全体に影響を与えずに２５までのアミノ酸を含むように操作されうるループを有する。操作されたノッチンドメインの更なる詳細については、国際公開第２００８０９８７９６号を参照のこと。
【００５３】
参照分子と「同じエピトープに結合する抗原結合分子」とは、競合アッセイにおいて、参照分子のその抗原に対する結合を５０％以上遮断する抗原結合分子を指し、逆に参照分子は、競合アッセイにおいて、抗原結合分子のその抗原に対する結合を５０％以上遮断する。
【００５４】
ここで使用される場合、「抗原結合部位」という用語は、抗原決定基に特異的に結合する抗原結合分子の部分を指す。より詳細には、「抗原結合部位」という用語は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、それに相補的である領域を含む抗体の部分を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は抗原の特定の部分にのみ結合し得、その部分はエピトープと呼ばれる。抗原結合部位は、例えば、一又は複数の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）によって提供されうる。好ましくは、抗原結合部位は、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。一態様では、抗原結合部位はその抗原に結合し、その機能を遮断又は部分的に遮断することができる。ＰＤ１又はＴＩＭ−３に特異的に結合する抗原結合部位には、ここで更に定義される抗体とその断片が含まれる。更に、抗原結合部位は、スキャフォールド抗原結合タンパク質、例えば、デザインされた反復タンパク質又はデザインされた反復ドメインに基づく結合ドメインを含みうる（例えば、国際公開第２００２／０２０５６５号を参照）。
【００５５】
ここで使用される場合、「抗原決定基」という用語は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分−抗原複合体を形成するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、アミノ酸の近接する伸長又は非近接アミノ酸の異なる領域から形成された立体配座構造）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面、ウイルス感染細胞の表面、他の疾患細胞の表面、免疫細胞の表面に、血清中に遊離した状態で、及び／又は細胞外基質（ＥＣＭ）に見出すことができる。特に断らない限り、ここで抗原として有用なタンパク質は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来のタンパク質の任意の天然型でありうる。特定の実施態様では、抗原はヒトタンパク質である。ここで特定のタンパク質に言及される場合、その用語は「全長」の未処理タンパク質並びに細胞内でのプロセシングにより生じる任意の形態のタンパク質を包含する。その用語はまたタンパク質の天然に生じる変異体、例えば、スプライスバリアント又はアレルバリアントを包含する。
【００５６】
「特異的な結合」とは、結合が、抗原について選択的であり、望ましくない相互作用又は非特異的相互作用とは区別可能であることを意味する。抗原結合分子の特定の抗原への結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ機器での解析）（Liljeblad等, Glyco J 17, 323-329 (2000)）、及び伝統的結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）により測定することができる。一実施態様では、抗原結合分子の無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定した場合、抗原結合分子の抗原への結合の約１０％未満である。所定の実施態様では、抗原に結合する分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−７Ｍ以下、例えば１０−７Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００５７】
「親和性」又は「結合親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。ここで使用される場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができ、これは、解離速度定数と会合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。従って、等価な親和性は、速度定数の比が同じままである限り、異なる速度定数を含みうる。親和性は、ここに記載されたものを含む当該技術分野で知られた一般的な方法により測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【００５８】
ここで使用される場合、抗体の「高親和性」という用語は、標的抗原に対して１０−９Ｍ以下、更により特定的には１０−１０Ｍ以下のＫｄを有する抗体を指す。抗体の「低親和性」という用語は、１０−８以上のＫｄを有する抗体を指す。
【００５９】
「親和性成熟」抗体とは、改変を有していない親抗体と比較して一又は複数の改変を一又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）に有し、そのような改変が抗原に対する抗体の親和性に改良をもたらす、抗体を指す。
【００６０】
「ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ−３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体」、「ＰＤ１とＴＩＭ−３に特異的に結合する二重特異性抗体」、「ＰＤ１とＴＩＭ−３に特異的な二重特異性抗原結合分子」という用語は、ここでは互換的に使用され、抗体がＰＤ１とＴＩＭ−３のターゲティングにおいて診断及び／又は治療剤として有用であるような十分な親和性でＰＤ１とＴＩＭ−３に結合することができる二重特異性抗体を指す。
【００６１】
プログラム細胞死タンパク質１としても知られている「ＰＤ１」という用語は、１９９２年に最初に記載された２８８アミノ酸のＩ型膜タンパク質である（Ishida等, EMBO J., 11 (1992), 3887-3895）。ＰＤ−１は、Ｔ細胞調節因子の拡大ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ファミリーのメンバーであり、ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ２７４）とＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ２７３）の二つのリガンドを有する。このタンパク質の構造は、細胞外ＩｇＶドメインと、それに続く膜貫通領域及び細胞内テールを含む。細胞内テールは、免疫受容体チロシン依存性抑制モチーフと免疫受容体チロシン依存性スイッチモチーフに位置する二つのリン酸化部位を含んでおり、ＰＤ−１がＴＣＲシグナルをネガティブに調節することを示唆する。これは、リガンド結合時のＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２ホスファターゼのＰＤ−１の細胞質側末端への結合と一致する。ＰＤ−１はナイーブＴ細胞には発現されないが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）媒介活性化後にアップレギュレートされ、活性化Ｔ細胞及び消耗Ｔ細胞の双方で観察される（Agata等, Int. Immunology 8 (1996), 765-772）。これら消耗Ｔ細胞は、機能障害の表現型を有し、適切に応答することができない。ＰＤ−１は比較的広い発現パターンを有しているが、その最も重要な役割はＴ細胞上の共抑制性受容体である可能性が高い（Chinai等, Trends in Pharmacological Sciences 36 (2015), 587-595）。従って、現在の治療アプローチでは、ＰＤ−１のそのリガンドとの相互作用を遮断してＴ細胞応答を増強することに焦点が当てられている。「プログラム死１」、「プログラム細胞死１」、「タンパク質ＰＤ−１」「ＰＤ−１」、「ＰＤ１」、「ＰＤＣＤ１」、「ｈＰＤ−１」及び「ｈＰＤ−Ｉ」という用語は、互換的に使用することができ、ヒトＰＤ−１の変異体、アイソフォーム、種ホモログ、及びＰＤ−１との少なくとも一つの共通エピトープを有するアナログを含む。ヒトＰＤ１のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｑ１５１１６（配列番号：８９）に示されている。
【００６２】
「抗ＰＤ１抗体」及び「ＰＤ１に結合する抗原結合部位を含む抗体」という用語は、ＰＤ１、特に細胞表面上に発現されるＰＤ１ポリペプチドに、ＰＤ１のターゲティングにおいて診断及び／又は治療剤として抗体が有用であるような十分な親和性で結合することができる抗体を意味する。一実施態様では、抗ＰＤ１抗体の無関係な非ＰＤ１タンパク質への結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって又はＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムのようなバイオセンサーシステムを使用する表面プラズモン共鳴アッセイによって測定した場合、抗体のＰＤ１への結合の約１０％未満である。所定の実施態様では、ヒトＰＤ１に結合する抗原結合タンパク質は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）のヒトＰＤ１への結合に対する結合親和性のＫＤ値を有する。好ましい一実施態様では、結合親和性の各ＫＤ値は、ＰＤ１結合親和性についてはヒトＰＤ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ＰＤ１−ＥＣＤ）を使用する表面プラズモン共鳴アッセイで決定される。「抗ＰＤ１抗体」という用語は、ＰＤ１と第二の抗原に結合することができる二重特異性抗体もまた包含する。
【００６３】
「Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有分子３」の略語であり、ＴＩＭ−３、ＨＡＶＣＲ２、ＫＩＭ−３、ＴＩＭＤ３、及びＦＬＪ１４４２８としても知られている「ＴＩＭ３」という用語は、マクロファージ活性化と炎症状態の重篤度を調節するＴヘルパー細胞１型特異的細胞表面タンパク質を指す。ＴＩＭ３はまたがん、特にがん幹細胞と関連している。ＴＩＭ３のヌクレオチド及びタンパク質配列は、多くの種に対して知られている。例えば、ヒトアミノ酸配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ８ＴＤＱ０（配列番号：９３）の下で見出すことができる。ヒトタンパク質は、およそアミノ酸２２−２０２を含むＩｇ様ドメイン及びムチンドメイン（Ｏ結合及びＮ結合グリコシル化部位を更に含む）を含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン（アミノ酸２０３−２２３）、及び細胞内（細胞質）ドメイン（アミノ酸２２４−３０１）によって特徴付けられる。配列番号：９３として示されるヒトＴＩＭ３タンパク質では、細胞外ドメインはおよそアミノ酸２２−２０２を含み、膜貫通ドメインはおよそアミノ酸２０３−２２３を含み、細胞質ドメインはおよそアミノ酸２２４−３０１を含む。「ＴＩＭ３」という用語は、変異体、アイソフォーム、ヒトＴＩＭ３の種ホモログ、及びＴＩＭ３との少なくとも一つの共通エピトープを有するアナログを含む。
【００６４】
「抗ＴＩＭ３抗体」及び「ＴＩＭ３に結合する抗原結合部位を含む抗体」という用語は、ＴＩＭ３、特に細胞表面上に発現されるＴＩＭ３ポリペプチドに、ＴＩＭ３のターゲティングにおいて診断及び／又は治療剤として抗体が有用であるような十分な親和性で結合することができる抗体を意味する。一実施態様では、抗ＴＩＭ３抗体の無関係な非ＴＩＭ３タンパク質への結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって又はＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムのようなバイオセンサーシステムを使用する表面プラズモン共鳴アッセイによって測定した場合、抗体のＴＩＭ３への結合の約１０％未満である。所定の実施態様では、ヒトＴＩＭ３に結合する抗原結合タンパク質は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−７Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）のヒトＴＩＭ３への結合に対する結合親和性のＫｄ値を有する。好ましい一実施態様では、結合親和性の各ＫＤ値は、ＴＩＭ３結合親和性についてはヒトＴＩＭ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ＴＩＭ３−ＥＣＤ）を使用する表面プラズモン共鳴アッセイで決定される。「抗ＴＩＭ３抗体」という用語は、ＴＩＭ３と第二の抗原に結合することができる二重特異性抗体もまた包含する。
【００６５】
「遮断」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を抑制するか又は低減するものである。幾つかの実施態様では、遮断抗体又はアンタゴニスト抗体は抗原の生物学的活性を実質的に又は完全に抑制する。例えば、本発明の二重特異性抗体は、抗原刺激に対する機能障害状態からＴ細胞による機能的応答（例えば、増殖、サイトカイン産生、標的細胞死滅）を回復させるようにＰＤ−１及びＴＩＭ−３によるシグナル伝達を遮断する。
【００６６】
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗原結合分子の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は一般に類似構造を有しており、各ドメインが４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と三つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。例えば、Kindt等, Kuby Immunology, 6版, W.H. Freeman and Co., p91 (2007)を参照のこと。抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分でありうる。
【００６７】
ここで使用される「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変性であり、及び／又は構造的に定まったループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般に、天然４鎖抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般に超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最も高い配列可変性を有し、及び／又は抗原認識に関与している。例示的な超可変ループはアミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる（Chothia及びLesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２のアミノ酸残基に生じる。（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。超可変領域（ＨＶＲ）は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に言及してここでは交換可能に使用される。この特定の領域は、Kabat等, U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)及びChothia等, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)に記載されており、その定義は、互いに比較された場合のアミノ酸残基の重複又はサブセットを含む。それでも、抗体又はその変異体のＣＤＲに言及して何れかの定義が適用される場合、ここで定義され使用される用語の範囲に含まれることが意図される。上で引用した文献の各々により定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基は、比較として以下の表Ａに記載される。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及び大きさに応じて変化するであろう。当業者であれば、抗体の可変領域のアミノ酸配列を前提に、何れの残基が特定のＣＤＲを含むかを常套的に決定することができる。
【００６８】
2020058353.tif 000002
１ 表Ａにおける全てのＣＤＲの定義の番号付けは、Ｋａｂａｔ等（以下参照）によって規定された番号付けの規定に従う。
２ 表Ａで使用される小文字の「ｂ」を含む「ＡｂＭ」は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒの「ＡｂＭ」抗体モデル化ソフトウェアによって定義されたＣＤＲを指す。
【００６９】
Ｋａｂａｔ等は、あらゆる抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムもまた定めた。当業者であれば、配列自体を超える何らかの実験データに頼らなくとも、この「Ｋａｂａｔの番号付け」システムをあらゆる可変領域配列に明確に割り当てることができる。ここで使用される場合、「Ｋａｂａｔの番号付け」は、Kabat等, U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)によって規定された番号付けシステムを指す。特に断らない限り、抗体可変領域内における特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの言及は、Ｋａｂａｔの番号付けシステムによる。
【００７０】
ＶＨのＣＤＲ１を例外として、ＣＤＲは超可変ループを形成するアミノ酸残基を一般に含む。ＣＤＲはまた抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」も含む。ＳＤＲは、短縮型ＣＤＲ、又はａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含まれる。例示的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２のアミノ酸残基に生じる。（Almagro及びFransson, Front. Biosci.13:1619-1633 (2008)を参照。）特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、ここではＫａｂａｔ等に従って番号付けされる。
【００７１】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に４つのＦＲのドメイン、すなわちＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４から構成される。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の次の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００７２】
ここでの目的に対して「アクセプターヒトフレームワーク」とは、以下に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「から得られる」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでいてもよく、又はそれはアミノ酸配列変化を含んでいてもよい。幾つかの実施態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【００７３】
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の起源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分が異なる起源又は種に由来する抗体を指す。
【００７４】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体には５つの主要なクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に更に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００７５】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲのアミノ酸残基とヒトＦＲのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。所定の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、 非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、場合によってはヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化型」は、ヒト化を受けた抗体を指す。本発明が包含する「ヒト化抗体」の他の形態は、定常領域が、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、本発明に係る特性を生じるように元の抗体の定常領域から追加的に修飾又は変更されているものである。
【００７６】
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリーや他のヒト抗体コード化配列を利用する非ヒト起源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
【００７７】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる変異を含み、又はモノクローナル抗体調製物の製造中に生じる可能性のある変異抗体（かかる変異体は一般に少量で存在する）を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体の調製物とは異なり、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。よって、「モノクローナル」という修飾語句は、抗体が実質的に均一な抗体集団から得られているという特性を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないと解釈されるべきものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法や他の例示的な方法はここに記載されている。
【００７８】
ここでの「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含む抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異型Ｆｃ領域を含む。特に、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで延びる。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在していても存在していなくてもよい。重鎖のアミノ酸配列は常にＣ末端リジンで示されるが、Ｃ末端リジンを含まない変異型も本発明に含まれる。
【００７９】
ＩｇＧ Ｆｃ領域は、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３ドメインを含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、約２３１位のアミノ酸残基から約３４０位のアミノ酸残基まで延びる。一実施態様では、糖鎖がＣＨ２ドメインに結合している。ここでのＣＨ２ドメインは、天然配列ＣＨ２ドメイン又は変異型ＣＨ２ドメインでありうる。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域内においてＣＨ２ドメインのＣ末端に残基ストレッチを含む（すなわち、ＩｇＧの約３４１位のアミノ酸残基から約４４７のアミノ酸残基）。ここでのＣＨ３領域は、天然配列ＣＨ３ドメイン又は変異型ＣＨ３ドメイン（例えばその一方の鎖に「隆起」（「ノブ」）が導入され、その他方の鎖に「空洞」（「ホール」）が対応して導入されたＣＨ３ドメイン；米国特許第５８２１３３３号参照（出典明示によりここに明示的に援用する））でありうる。そのような変異型ＣＨ３ドメインは、ここに記載の二つの非同一抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進するために使用されうる。ここで特段の特定がなされない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されたＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【００８０】
「ノブ・イントゥ・ホール」技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；同第７６９５９３６号；Ridgway等, Prot Eng 9, 617-621 (1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載されている。一般に、この方法は、隆起を空洞に位置させ、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害することができるように第一のポリペプチドの界面に隆起（「ノブ」）を、第二のポリペプチドの界面に対応する空洞（「ホール」）を導入することを含む。隆起は、第１のポリペプチドの界面由来の小さなアミノ酸側鎖を大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起と同じか又は同様のサイズの相補的な空洞は、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、第二のポリペプチドの界面に作り出される。隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的突然変異誘発により、又はペプチド合成により、改変させることにより作り出すことができる。特定の実施態様では、ノブ修飾は、Ｆｃドメインの二つのサブユニットのうちの一方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール修飾は、Ｆｃドメインの二つのサブユニットのうちの他方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。更なる特定の実施態様では、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、加えてアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、加えてアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃを含む。これら二つのシステイン残基の導入により、Ｆｃ領域の二つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、従って二量体を更に安定させる（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【００８１】
「免疫グロブリンのＦｃ領域に等価な領域」は、免疫グロブリンのＦｃ領域の天然に生じるアレル変異体、並びに置換、付加又は欠失を生成するが、免疫グロブリンのエフェクター機能（例えば抗体依存性細胞傷害性）媒介能を実質的に低下させることのない改変を有する変異体を含めることを意図している。例えば、一又は複数のアミノ酸は、生物学的機能を実質的に失うことなく、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から欠失させることができる。このような変異体は、活性に対する影響が最小となるように、当該技術分野で知られた一般的規則に従って選択することができる（例えば、Bowie, J. U.等, Science 247:1306-10 (1990)参照）。
【００８２】
「エフェクター機能」という用語は、抗体のアイソタイプにより変わる抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、及びＢ細胞の活性化が含まれる。
【００８３】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域による結合に続いて、エフェクター機能を実行するように受容体保有細胞を刺激するシグナル伝達イベントを誘発するＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。特定の活性化Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６３７、バージョン１４１参照）。
【００８４】
「ペプチドリンカー」という用語は、一又は複数のアミノ酸、典型的には約２から２０のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは当該分野において知られているか、又はここに記載される。適切な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーであり、ここで「ｎ」は一般に１から１０の数、典型的には２から４の数、特に２である。
【００８５】
「融合された」又は「連結された」とは、構成要素（例えば、抗原結合部位及びＦｃドメイン）が、直接的にあるいは一又は複数のペプチドリンカーを介して、ペプチド結合によって連結されることを意味する。
【００８６】
本出願内で使用される「アミノ酸」という用語は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に生じるカルボキシα−アミノ酸の群を意味する。
【００８７】
参照ポリペプチド（タンパク質）配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを達成するように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の、如何なる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない、参照ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である候補配列内のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量内にある様々な方法で、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＳＡＷＩ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含め、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、ここでの目的に対して、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、ジェネンテック社によって著作され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類と共に提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ジェネンテック社（South San Francisco, California）から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルされうる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対するアミノ酸配列同一性％（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する所定のアミノ酸配列同一性％を有するか又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は、次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて完全な一致としてスコアされたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、ここで使用される全てのアミノ酸配列同一性％値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落に記載したようにして得られる。
【００８８】
所定の態様では、ここで提供される本発明の二重特異性抗体のアミノ酸配列変異体が考慮される。例えば、二重特異性抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を向上させることが望ましい場合がある。二重特異性抗体のアミノ酸配列変異体は、分子をコードするヌクレオチド配列中に適切な修飾を導入することにより、又はペプチド合成により、調製することができる。このような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は残基への挿入、及び／又は残基の置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合性を有していることを条件として、最終コンストラクトに到達するために、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを行うことができる。置換突然変異誘発の対象部位には、ＨＶＲ及びフレームワーク（ＦＲ）が含まれる。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表Ｂに示され、アミノ酸側鎖のクラス（１）から（６）を参照して以下に更に記載される。アミノ酸置換は対象の分子に導入され、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合性の保持／改善、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされうる。
【００８９】
2020058353.tif 000003
【００９０】
アミノ酸は以下の共通の側鎖特性に従ってグループ分けされうる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００９１】
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを別のクラスのものと交換することを伴う。
【００９２】
「アミノ酸配列変異体」という用語は、親抗原結合分子（例えばヒト化又はヒト抗体）の一又は複数の超可変領域残基にアミノ酸置換が存在する実質的な変異体を含む。一般には、更なる研究のために選択される得られた変異体は、親抗原結合分子と比較して、所定の生物学的特性（例えば、親和性の向上、免疫原性の低下）に修飾（例えば、改善）を有する、及び／又は親抗体結合分子の所定の生物学的特性を実質的に保持するであろう。例示的な置換型変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、ここに記載されるようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を使用して、簡便に作製されうる。簡潔に言えば、一又は複数のＨＶＲ残基が変異され、変異体抗原結合分子がファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。所定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、このような改変が抗原に対する抗原結合分子の結合能を実質的に低下させない限り、一又は複数のＨＶＲ内で生じうる。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変（例えばここで提供される保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham及びWells (1989) Science, 244:1081-1085により記載されているように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、残基又は標的残基群（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体の相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）により置き換えられる。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入されうる。代替的又は追加的には、抗原−抗原結合分子複合体の結晶構造が抗体と抗原の接点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされてもよいし、又は排除されてもよい。変異体は、所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされうる。
【００９３】
アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドの長さ範囲のアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する二重特異性抗体が含まれる。分子の他の挿入変異体は、二重特異性抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドのＮ又はＣ末端への融合を含む。
【００９４】
所定の態様では、ここに提供される二重特異性抗体は、抗体がグリコシル化される程度を上昇又は低下させるように改変される。分子のグリコシル化変異体は、一又は複数のグリコシル化部位が創出又は削除されるようにアミノ酸配列を改変することにより、簡便に得ることができ、例えば、Ｆｃドメインに結合した糖鎖を改変することができる。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合により一般に結合している分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Wright等 TIBTECH15:26-32 (1997)を参照のこと。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐糖鎖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含む。幾つかの実施態様では、所定の改善された特性を有する変異体を作製するために、本発明の二重特異性抗体のオリゴ糖の修飾がなされうる。一態様では、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）結合するフコースを欠く糖鎖構造を有する二重特異性抗体の変異体が提供される。このようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有している場合がある。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Presta, L.）又は同第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照のこと。本発明の二重特異性抗体の更なる変異体には、二分されたオリゴ糖を有するもの、例えば、Ｆｃ領域に結合する二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されているものが含まれる。このような変異体は、低減したフコシル化及び／又は改善したＡＤＣＣ機能を有している場合がある。例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Jean-Mairet等）；米国特許第６６０２６８４号（Umana等）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Umana等）を参照のこと。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖中に少なくとも一のガラクトース残基を持つ変異体もまた提供される。このような抗体変異体は、改善したＣＤＣ機能を有している場合があり、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Patel等）；同第１９９８／５８９６４号（Raju, S.）、及び同第１９９９／２２７６４号（Raju, S.）に記載されている。
【００９５】
所定の態様では、本発明の二重特異性抗体のシステイン改変変異体、例えば、分子の一又は複数の残基がシステイン残基で置換されている「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施態様では、置換される残基は分子の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基がそれにより抗体の接近可能部位に配置され、抗体を他の部分、例えば薬物部分又はリンカー−薬剤部分にコンジュゲートさせ、免疫コンジュゲートを作るために使用することができる。所定の実施態様では、次の残基の何れかの一又は複数がシステインで置換されうる：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗原結合分子は、例えば米国特許第７５２１５４１号に記載のように作製されうる。
【００９６】
所定の態様では、ここで提供される二重特異性抗体は、当該技術分野で知られ容易に利用可能な追加的非タンパク質様部分を含むように更に修飾されうる。抗体の誘導体化に適した部分は、限定されるものではないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーの何れか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにそれらの混合物を含む。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のために製造上の利点を有しうる。ポリマーは、任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合されるポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが結合される場合、それらは同じか又は異なる分子でありうる。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定されないが、改善されるべき抗体の特定の特性又は機能、二重特異性抗体誘導体が規定された条件下での治療法に使用されるかどうかなどを含む検討事項に基づいて決定されうる。
【００９７】
別の態様では、照射への曝露により選択的に加熱することのできる抗体と非タンパク質様部分のコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質様部分はカーボンナノチューブである（Kam, N.W.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605）。放射線は、任意の波長であってよく、限定されるものではないが、通常の細胞に害を与えないが抗体−非タンパク質様部分の近位細胞が死滅する温度に非タンパク質様部分を加熱する波長を含む。
【００９８】
「イムノコンジュゲート」とは、細胞傷害性剤を含むがそれに限定されない、一又は複数の異種分子にコンジュゲートした抗体である。
【００９９】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合又は非一般的結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含みうる。「核酸分子」という用語は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の一又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
【０１００】
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドは、その天然環境から除去された目的の核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡである。例えば、ベクターに含まれるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的では単離されたと考えられる。単離されたポリヌクレオチドの更なる例には、異種宿主細胞内に維持される組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の精製された（部分的に又は実質的に）ポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子は、インビボ又はインビトロの本発明のＲＮＡ転写物、並びにプラス及びマイナス鎖形態、及び二重鎖形態を含む。本発明に係る単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成により作製されたそのような分子を更に含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターのような調節エレメントであっても又はこれを含んでいてもよい。
【０１０１】
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも例えば９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照配列と、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列のそれぞれ１００のヌクレオチドにつき最大５ポイントの変異を含みうる点以外は同一であることを意図している。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが欠失され又は別のヌクレオチドで置換されうるか、又は参照配列中の全ヌクレオチドの最大５％の数のヌクレオチドが参照配列中に挿入されうる。参照配列のこれらの改変は、参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端の位置又はその末端間の何れかの位置で、参照配列の残基中に個々に又は参照配列内部の一又は複数の連続する群中に散在して、生じうる。実際問題として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて上で検討したもの（例えばＡＬＩＧＮ−２）などの既知のコンピュータプログラムを使用して常套的に決定することができる。
【０１０２】
「発現カセット」という用語は、標的細胞内の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸要素を用いて、組換えにより又は合成により作製されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片中に取り込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分には、他の配列の中でも、転写される核酸配列及びプロモーターが含まれる。所定の実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
【０１０３】
「ベクター」又は「発現ベクター」という用語は、「発現コンストラクト」と同義であり、標的細胞内においてそれが作用可能に結合する特定の遺伝子を導入しその発現を方向付けるために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは発現カセットを含む。発現ベクターは、多量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞転写及び／又は翻訳機構により作製される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
【０１０４】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」という用語は、互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、それには、初代形質転換細胞と継代の数に関係なくそれに由来する子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一でなくともよいが、突然変異を含みうる。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされ又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫がここには含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を作製するために使用することができる任意の種類の細胞系である。特に、宿主細胞は、原核又は真核宿主細胞である。宿主細胞は、培養細胞、例えば、哺乳動物の培養細胞、例えば、幾つか例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞を含み、また、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物もしくは動物組織内に含まれる細胞も含む。
【０１０５】
薬剤の「有効量」は、それが投与される細胞又は組織中に生理的変化をもたらすために必要な量を指す。
【０１０６】
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」は、所望の治療的又は予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。治療的有効量の薬剤は、疾患の有害作用を、例えば、排除し、低下させ、遅延させ、最小化し、又は防止する。
【０１０７】
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えばヒト及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特に、個体又は対象はヒトである。
【０１０８】
「薬学的組成物」という用語は、その中に含まれる活性成分の生物学的活性が有効であることを可能にする形態であって、製剤が投与されるであろう対象にとって許容できない毒性を有する更なる成分を含んでいない調製物を指す。
【０１０９】
「薬学的に許容可能な賦形剤」とは、対象に非毒性である、活性成分以外の薬学的組成物中の成分を指す。薬学的に許容可能な賦形剤は、限定されないが、緩衝液、安定剤又は保存料を含む。
【０１１０】
「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに使用され、適応症、用法、用量、投与、併用療法、禁忌及び／又はそのような治療製品の使用に関する注意事項についての情報を含む。
【０１１１】
ここで使用される場合、「治療」（及び「治療する」又は「治療すること」のようなその文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のため、又は臨床病理の過程中に実施されうる。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移の予防、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。幾つかの実施態様では、本発明の分子は、疾患の発症を遅延させるか、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
【０１１２】
ここで使用される「がん」という用語は、増殖性疾患、例えばリンパ腫、リンパ球性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、気管支肺胞細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部のがん、皮膚又は眼球内メラノーマ、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（stomach cancer）、胃がん（gastric cancer）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸部の癌、膣の癌、外陰部の癌、ホジキン病、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟部組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、前立腺がん、膀胱のがん、腎臓又は尿道のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮細胞癌、下垂体腺腫及びユーイング肉腫を指し、上記のがんの何れかの難治型、又は上記がんの一又は複数の組み合わせを含む。
【０１１３】
［本発明の二重特異性抗体］
本発明は、生産性、安定性、結合親和性、生物学的活性、所定のＴ細胞の特異的ターゲッティング、標的化効率及び毒性減少等の特に有利な特性を持つ、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ−３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む新規な二重特異性抗体を提供する。特に、これらはＰＤ１に高い親和性で結合し、ＴＩＭ３に低い親和性で結合する二重特異性抗体である。
【０１１４】
Ａ．ＰＤ１とＴＩＭ−３に結合する例示的二重特異性抗体
一態様では、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、
ＰＤ１に特異的に結合する前記第一抗原結合部位が、
（ｉ）配列番号：３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号：３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメインと
（ｉ）配列番号：４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｉｉ）配列番号：４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメインを含み；
ＴＩＭ３に特異的に結合する前記第二抗原結合部位が、
（ａ）（ｉ）配列番号：１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号：２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメインと
（ｉ）配列番号：４又は配列番号：１１又は配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｉｉ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメインを含むか；又は
（ｂ）（ｉ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメインと
（ｉ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｉｉ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメインを含むか；又は
（ｃ）（ｉ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメインと
（ｉ）配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｉｉ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメインを含む、二重特異性抗体を提供する。
【０１１５】
特定の態様において、提供されるものは、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、
ＰＤ１に特異的に結合する前記第一抗原結合部位が、
（ｉ）配列番号：３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号：３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメインと
（ｉ）配列番号：４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｉｉ）配列番号：４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメインを含み；
ＴＩＭ３に特異的に結合する前記第二抗原結合部位が、
（ｉ）配列番号：１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号：２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメインと
（ｉ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｉｉ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメインを含む、二重特異性抗体である。
【０１１６】
他の特定の態様において、提供されるものは、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、
ＰＤ１に特異的に結合する前記第一抗原結合部位が、
（ｉ）配列番号：３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号：３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメインと
（ｉ）配列番号：４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｉｉ）配列番号：４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメインを含み；
ＴＩＭ３に特異的に結合する前記第二抗原結合部位が、
（ｉ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメインと
（ｉ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｉｉ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメインを含む、二重特異性抗体である。
【０１１７】
更なる態様において、提供されるものは、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、
ＰＤ１に特異的に結合する前記第一抗原結合部位が、
（ａ）配列番号：４３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４４のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｃ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４７のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｄ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｅ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含み、ＴＩＭ３に特異的に結合する前記第二抗原結合部位が、
（ａ）配列番号：７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号：９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｃ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｄ）配列番号：１５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｅ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｆ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｇ）配列番号：２７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｈ）配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む、二重特異性抗体である。
【０１１８】
更なる態様では、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体は、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体である。特に、それはヒト化抗体である。
【０１１９】
一態様において、提供されるものは、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、
ＰＤ１に特異的に結合する前記第一抗原結合部位が、
（ａ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４７のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｃ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｄ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含み、ＴＩＭ３に特異的に結合する前記第二抗原結合部位が、
（ａ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号：１５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｃ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｄ）配列番号：２７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む、ヒト化二重特異性抗体である。
【０１２０】
特定の態様において、提供されるものは、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、
ＰＤ１に特異的に結合する前記第一抗原結合部位が、配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、
ＴＩＭ３に特異的に結合する前記第二抗原結合部位が、配列番号：１５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン又は配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、二重特異性抗体である。
【０１２１】
特に、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、
ＰＤ１に特異的に結合する前記第一抗原結合部位が、
（ｉ）配列番号：３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号：３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号：４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｉｉ）配列番号：４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメインを含み、
ＴＩＭ３に特異的に結合する前記第二抗原結合部位が、
（ｉ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｉｉ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメインを含む、二重特異性抗体を提供する。
【０１２２】
より特定的には、提供されるものは、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、ＰＤ１に特異的に結合する前記第一抗原結合部位が、配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８及び配列番号：４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、ＴＩＭ３に特異的に結合する前記第二抗原結合部位が、配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む二重特異性抗体である。
【０１２３】
より特定的には、提供されるものは、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、ＰＤ１に特異的に結合する前記第一抗原結合部位が、配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号：４６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、ＴＩＭ３に特異的に結合する前記第二抗原結合部位が、配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む二重特異性抗体である。
【０１２４】
更なる態様において、提供されるものは、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、ＰＤ１に特異的に結合する前記第一抗原結合部位が、配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８及び配列番号：４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、ＴＩＭ３に特異的に結合する前記第二抗原結合部位が、配列番号：２７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む二重特異性抗体である。
【０１２５】
一態様では、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体は二価である。これは、二重特異性抗体が、ＰＤ１に特異的に結合する一つの抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する一つの抗原結合部位を含む（１＋１フォーマット）ことを意味する。
【０１２６】
別の態様において、提供されるものは、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体であって、低親和性でＴＩＭ３に結合し、高親和性でＰＤ１に結合する二重特異性抗体である。特定の態様では、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体であって、ＰＤ１への結合と比較した場合、少なくとも５０倍低い結合親和性でＴＩＭ３に結合し、より特定的にはＰＤ１への結合と比較した場合、少なくとも１００倍低い結合親和性でＴＩＭ３に結合する二重特異性抗体を提供する。好ましい一実施態様では、結合親和性（ＫＤ）は、（例えば実施例１２に記載されたように）表面プラズモン共鳴アッセイで決定される。
【０１２７】
一態様では、よって、提供されるものは、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、
高親和性でＰＤ１に特異的に結合する前記第一抗原結合部位が、
（ａ）配列番号：４３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４４のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｃ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４７のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｄ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｄ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含み、低親和性でＴＩＭ３に特異的に結合する前記第二抗原結合部位が、
（ａ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｃ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｄ）配列番号：２７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む、二重特異性抗体である。
【０１２８】
特定の態様において、提供されるものは、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、高親和性でＰＤ１に特異的に結合する前記第一抗原結合部位が配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、低親和性でＴＩＭ３に特異的に結合する前記第二抗原結合部位が配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む二重特異性抗体である。
【０１２９】
別の態様では、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体であって、Ｆｃドメイン、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合部位を含む第一Ｆａｂ断片及びＴＩＭ３に特異的に結合する抗原結合部位を含む第二Ｆａｂ断片を含む二重特異性抗体に関する。
【０１３０】
特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧドメイン、より特定的にはＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。
【０１３１】
別の態様では、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、
（ａ）配列番号：５０の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：５２の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：５１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：５３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｂ）配列番号：５４の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：５６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：５５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：５７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｃ）配列番号：５８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：６０の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：５９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：６１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｄ）配列番号：６２の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：６４の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：６３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：６５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｅ）配列番号：６６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：６８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：６７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：６９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二軽鎖
を含む、二重特異性抗体を提供する。
【０１３２】
特定の態様では、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、
（ａ）配列番号：５０のアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：５２のアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：５１のアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：５３のアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｂ）配列番号：５４のアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：５６のアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：５５のアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：５７のアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｃ）配列番号：５８のアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：６０のアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：５９のアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：６１のアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｄ）配列番号：６２のアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：６４のアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：６３のアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：６５のアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｅ）配列番号：６６のアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：６８のアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：６７のアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：６９のアミノ酸配列を含む第二軽鎖
を含む、二重特異性抗体を提供する。
【０１３３】
より特定的には、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、配列番号：６２のアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：６４のアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：６３のアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：６５のアミノ酸配列を含む第二軽鎖を含む、二重特異性抗体を提供する。
【０１３４】
他の特定の態様において、提供されるものは、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、配列番号：６６のアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：６８のアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：６７のアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：６９のアミノ酸配列を含む第二軽鎖を含む、二重特異性抗体である。
【０１３５】
別の態様では、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体は四価である。一態様では、二重特異性抗体は、ＰＤ１に特異的に結合する二つの抗原結合部位と、ＴＩＭ３に特異的に結合する二つの抗原結合部位を含む（２＋２フォーマット）。
【０１３６】
一態様では、本発明の二重特異性抗体は、
（ａ）ＴＩＭ３に特異的に結合する抗原結合部位を含む二つのＦａｂ断片を含む抗体の二つの軽鎖及び二つの重鎖と、
（ｂ）ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合部位を含む二つの更なるＦａｂ断片を含み、前記更なるＦａｂ断片はそれぞれペプチドリンカーを介して（ａ）の重鎖のＣ末端に連結されている。
【０１３７】
特定の態様では、ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）４である。別の態様では、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合部位を含む二つの更なるＦａｂ断片は、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換され、ＶＬ−ＣＨ鎖がペプチドリンカーを介して（ａ）の重鎖のＣ末端にそれぞれ連結されているクロスオーバーＦａｂ断片である。
【０１３８】
特定の態様では、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、
（ａ）それぞれが配列番号：７０のアミノ酸配列を含む二つの重鎖、配列番号：７１のアミノ酸配列を含む第一軽鎖、及び配列番号：７２のアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｂ）それぞれが配列番号：７３のアミノ酸配列を含む二つの重鎖、配列番号：７４のアミノ酸配列を含む第一軽鎖、及び配列番号：７５のアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｃ）それぞれが配列番号：７６のアミノ酸配列を含む二つの重鎖、配列番号：７７のアミノ酸配列を含む第一軽鎖、及び配列番号：７８のアミノ酸配列を含む第二軽鎖
を含む二重特異性抗体を提供する。
【０１３９】
（Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメイン修飾）
所定の態様では、一又は複数のアミノ酸修飾を、ここに提供される抗体のＦｃ領域内に導入し、それによってＦｃ領域変異体を作製することができる。Ｆｃ領域変異体は、一又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含みうる。
【０１４０】
次のセクションは、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメイン修飾を含む、本発明の二重特異性抗原結合分子の好ましい態様を記載する。一態様では、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体への結合を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含む二重特異性抗体に関する。特に、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有するヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。
【０１４１】
Ｆｃドメインは、標的組織内での良好な蓄積と好ましい組織−血液分配比に寄与する長い血清半減期を含む、好ましい薬物動態学的特性を本発明の二重特異性抗体に付与する。しかしながら、同時に、好ましい抗原保有細胞よりもむしろＦｃ受容体を発現する細胞への本発明の二重特異性抗体の望まれない標的化が引き起こされうる。従って、特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインは、天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１ ＦＣドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を示す。より特定的には、ＦｃドメインはＩｇＧ１ ＦＣドメインである。
【０１４２】
そのような一態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）は、天然ＩｇＧ１のＦｃドメイン（又は天然ＩｇＧ１のＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）と比較して、Ｆｃ受容体に対する５０％未満の、好ましくは２０％未満の、より好ましくは１０％未満の、最も好ましくは５％未満の結合親和性を示し、及び／又は天然ＩｇＧ１のＦｃドメイン（又は天然ＩｇＧ１のＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％未満の、好ましくは２０％未満の、より好ましくは１０％未満の、最も好ましくは５％未満のエフェクター機能を示す。一態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合せず、及び／又はエフェクター機能を実質的に誘導しない。特定の態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より特定的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も特定的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、Ｆｃ受容体は抑制性Ｆｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は抑制性ヒトＦｃγ受容体であり、より特定的にはヒトＦｃγＲＩＩＢである。一態様では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びサイトカイン分泌の内の一又は複数である。特定の態様では、エフェクター機能はＡＤＣＣである。一態様では、Ｆｃドメインは、天然ＩｇＧ１のＦｃドメインと比較した場合、新生仔のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対して実質的に同様の結合親和性を示す。ＦｃＲｎへの実質的に同様の結合は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）が天然ＩｇＧ１のＦｃドメイン（又は天然ＩｇＧ１のＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）のＦｃＲｎに対する結合親和性の約７０％超を、特には約８０％超を、より特定的には約９０％超を示す場合に達成される。
【０１４３】
特定の態様では、Ｆｃドメインは、非改変Ｆｃドメインと比較した場合に、Ｆｃ受容体に対する結合親和性が低下しており及び／又はエフェクター機能が低下しているように改変される。特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＦｃドメインのＦｃ受容体への結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、同じ一又は複数のアミノ酸変異が、Ｆｃドメインの２個のサブユニットの各々に存在する。一態様では、アミノ酸変異は、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を低下させる。他の態様では、アミノ酸変異は、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍低下させる。一態様では、改変Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子は、非改変Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子と比較した場合に、Ｆｃ受容体に対して２０％未満、特に１０％未満、より特定的には５％未満の結合親和性を示す。特定の態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。他の態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は抑制性Ｆｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は抑制性Ｆｃγ受容体であり、より特定的にはヒトＦｃγＲＩＩＢである。幾つかの態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より特定的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も特定的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらの受容体の各々に対する結合が低下する。幾つかの態様では、補体成分に対する結合親和性、特にＣ１ｑに対する結合親和性もまた低下する。一態様では、新生仔のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は低下しない。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合、すなわちＦｃドメインの前記受容体に対する結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）が、非改変型Ｆｃドメイン（又は前記非改変型Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）のＦｃＲｎに対する結合親和性の約７０％超を示す場合に達成される。Ｆｃドメイン又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子は、そのような親和性の約８０％超を示し得、更に約９０％超を示しうる。所定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、非改変Ｆｃドメインと比較した場合にエフェクター機能が低下するように改変される。エフェクター機能の低下として、次の一又は複数を挙げることができるがこれらに限定されない：補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低下、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低下、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の低下、サイトカイン分泌の低下、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性の抗原取り込みの低下、ＮＫ細胞への結合の低下、マクロファージへの結合の低下、単球への結合の低下、多形核細胞への結合の低下、直接的シグナル伝達を誘導するアポトーシスの低下、樹状細胞成熟の低下、又はＴ細胞プライミングの低下。
【０１４４】
エフェクター機能が低下した抗体には、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の一又は複数の置換を含むものが含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体には、残基２６５及び２９７をアラニンに置換した、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２つ以上に置換を含むＦｃ変異体が含まれる（米国特許第７３３２５８１号）。ＦｃＲへの結合が改善又は減少した所定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields, R.L.等, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604）。
【０１４５】
本発明の一態様では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の位置にアミノ酸置換を含む。幾つかの態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（「ＬＡＬＡ」）を含む。そのような一実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメインであり、特にヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。一態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含む。より特定の態様では、アミノ酸置換はＰ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇであり、特にＰ３２９Ｇである。一実施態様では、ＦｃドメインはＰ３２９位にアミノ酸置換と、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓからなる群から選択される更なるアミノ酸置換を含む。より特定的な実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」）を含む。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組み合わせは、ＰＣＴ特許出願の国際公開第２００１／１３０８３１Ａ１号に記載されているように、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほぼ完全に無効にする。前記文献はまたそのような変異型Ｆｃドメインを調製する方法と、Ｆｃ受容体結合又はエフェクター機能などのその特性を決定する方法を記載する。そのような抗体は、変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するか又は変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを有するＩｇＧ１である（Ｋａｂａｔ等のＥＵインデックスによる番号付け，Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991）。
【０１４６】
一態様では、本発明の二重特異性抗体は、（ｉ）場合によっては変異Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１サブクラスのホモ二量体Ｆｃ領域、又は（ｉｉ）場合によっては変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅを有するヒトＩｇＧ４サブクラスのホモ二量体Ｆｃ領域、又は（ｉｉｉ）場合によっては変異Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａを有するか、又は場合によっては変異Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、及びＹ４３６Ａを有するヒトＩｇＧ１サブクラスのホモ二量体Ｆｃ領域、又は（ｉｖ）一つのＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗを含み、他のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含むか、又は一つのＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗ及びＹ３４９Ｃを含み、他のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＳ３５４Ｃを含むか、又は一つのＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、他のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含むヘテロ二量体Ｆｃ領域、又は（ｖ）両方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含み、一つのＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗを含み、他のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含むか、又は一つのＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗ及びＹ３４９Ｃを含み、他のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＳ３５４Ｃを含み、又は一つのＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、他のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含むヒトＩｇＧ１サブクラスのヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む（全ての位置はＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。
【０１４７】
一態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位（Ｋａｂａｔの番号付け）にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。このアミノ酸置換は、インビボでのＩｇＧ４抗体のＦａｂアーム交換を減少させる（Stubenrauch等, Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)参照）。従って、一態様では、ヒトＩｇＧ４サブクラスのヘテロ二量体Ｆｃ領域（全ての位置はＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）を含み、両方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅを含み、一方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含むか、又は一方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗ及びＹ３４９Ｃを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＳ３５４Ｃを含むか、又は一方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含む、二重特異性抗体が提供される。
【０１４８】
半減期が増加し、母体ＩｇＧの胎仔への移動を担う新生仔Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Guyer, R.L.等, J. Immunol. 117 (1976) 587-593, 及びKim, J.K.等, J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434）が米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号に記載されている。その抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一又は複数の置換を有するＦｃ領域を含む。そのようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の一又は複数に置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有するものを含む（米国特許第７３７１８２６号）。また、Ｆｃ領域変異体の他の例に関し、Duncan, A.R.及びWinter, G., Nature 322 (1988) 738-740；米国特許第５６４８２６０号；米国特許第５６２４８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号を参照のこと。
【０１４９】
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えばＥＬＩＳＡにより、又はＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準の機器類を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、容易に決定することができ、このようなＦｃ受容体は組換え発現により得ることができる。このような適切な結合アッセイはここに記載される。代替的に、Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃ受容体に対する結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を使用して評価されうる。Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体のエフェクター機能は、当該技術分野で既知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイはここに記載される。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの他の例は、米国特許第５５００３６２号；Hellstrom等 Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)及びHellstrom等, Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)；米国特許第５８２１３３７号；Bruggemann等, J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩTM非放射性細胞傷害性アッセイ（CellTechnology, Inc. Mountain View, CA）；及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Promega, Madison, WI））。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等, Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)に開示されたもののように、動物モデルにおいて、インビボで評価することができる。
【０１５０】
（ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン修飾）
本発明の二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの内の一方又は他方に融合している異なる抗原結合部位を含み、そのため、Ｆｃドメインの二つのサブユニットは二つの同一でないポリペプチド鎖に含まれうる。これらのポリペプチドの組換え共発現及びその後の二量体化により、２種のポリペプチドの幾つかの可能な組み合わせが生じる。よって、組換え産生における本発明の二重特異性抗体の収率及び純度を改善するために、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することが有利となるであろう。
【０１５１】
従って、特定の態様では、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、ＦｃドメインがＦｃドメインの第一サブユニットと第二サブユニットの会合を促進する修飾を含む、二重特異性抗体に関する。ヒトＩｇＧのＦｃドメインの二つのサブユニット間の最も広範囲のタンパク質−タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。よって、一態様では、前記修飾はＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。
【０１５２】
特定の態様では、前記修飾は、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方に「ノブ」修飾を含み、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの他方のものに「ホール」修飾を含む、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」修飾である。よって、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、ノブ・イントゥ・ホール法に従って、Ｆｃドメインの第一サブユニットがノブを含み、Ｆｃドメインの第二サブユニットがホールを含む、二重特異性抗体に関する。特定の態様では、Ｆｃドメインの第一サブユニットはアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第二サブユニットはアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０１５３】
「ノブ・イントゥ・ホール」技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；同第７６９５９３６号；Ridgway等, Prot Eng 9, 617-621 (1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載されている。一般に、この方法では、第一のポリペプチドの界面に隆起（「ノブ」）を、第二のポリペプチドの界面に対応する空洞（「ホール」）を、隆起が空洞内に位置できるように導入することにより、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害することが含まれる。隆起は、第一のポリペプチドの界面由来の小さなアミノ酸側鎖を大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起と同じか又は同様のサイズの相補的な空洞が、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、第二のポリペプチドの界面に作り出される。
【０１５４】
従って、一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第一サブユニットのＣＨ３ドメインでは、アミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基に置き換えられており、これにより、第一サブユニットのＣＨ３ドメイン内に、第二サブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞中に位置することができる突起が作られており、Ｆｃドメインの第二サブユニットのＣＨ３ドメインでは、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基に置き換えられており、これにより、第二サブユニットのＣＨ３ドメイン内に、第一サブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置することができる空洞が作られている。突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的突然変異誘発によって又はペプチド合成によって変えることにより、作製することができる。特定の態様では、Ｆｃドメインの第一サブユニットのＣＨ３ドメインでは、３６６位のトレオニン残基がトリプトファン残基に置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第二サブユニットのＣＨ３ドメインでは、４０７位のチロシン残基がバリン残基に置き換えられている（Ｙ４０７Ｖ）。一態様では、Ｆｃドメインの第二サブユニットでは、追加的に、３６６位のトレオニン残基がセリン残基に置き換えられており（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基に置き換えられている（Ｌ３６８Ａ）。
【０１５５】
他の更なる態様では、Ｆｃドメインの第一サブユニットにおいて、更に３５４位のセリン残基がシステイン残基に置き換えられており（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第二サブユニットにおいて、更に３４９位のチロシン残基がシステイン残基に置き換えられている（Ｙ３４９Ｃ）。これらの二つのシステイン残基の導入により、Ｆｃドメインの二つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、二量体を更に安定化する（Carter (2001), J Immunol Methods 248, 7-15）。特定の態様では、Ｆｃドメインの第一サブユニットはアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第二サブユニットはアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０１５６】
しかし、欧州特許出願公開第１８７０４５９号に記載されているような他のノブ・イン・ホール技術を代替的に又は追加的に使用することもできる。一実施態様では、多重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインに変異Ｒ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅを、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインに変異Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０１５７】
一態様では、二重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｗ変異を、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインに変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを、加えて、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインに変異Ｒ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅを、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインに変異Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋを含む（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１５８】
一態様では、二重特異性抗体は、二つのＣＨ３ドメインの一方に変異Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗを、二つのＣＨ３ドメインの他方に変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含むか、又は多重特異性抗体は、二つのＣＨ３ドメインの一方に変異Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗを、二つのＣＨ３ドメインの他方に変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを、加えて、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインに変異Ｒ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅを、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインに変異Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋを含む（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１５９】
別の態様では、Ｆｃドメインの第一及び第二サブユニットの会合を促進する修飾は、例えば、ＰＣＴ公報国際公開第２００９／０８９００４号に記載されるような静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般に、この方法は、二つのＦｃドメインサブユニットの界面の一又は複数のアミノ酸残基の荷電アミノ酸残基による置換を含み、その結果、ホモ二量体形成が静電気的に好ましくないものになるが、ヘテロ二量体化は静電気的に好ましくなる。
【０１６０】
「ノブ・イントゥ・ホール技術」とは別に、ヘテロ二量体化を強制するように多重特異性抗体の重鎖のＣＨ３ドメインを改変するための他の技術は、当該技術分野で知られている。これらの技術、特に、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、欧州特許出願公開第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号及び国際公開第２０１３／０９６２９１号に記載されているものは、二重特異性抗体と組み合わせて「ノブ・イントゥ・ホール技術」の代替としてここで考慮される。
【０１６１】
一態様では、二重特異性抗体において、欧州特許出願公開第１８７０４５９号に記載されているアプローチが、多重特異性抗体の第一重鎖及び第二重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。このアプローチは、逆電荷を持つ荷電アミノ酸を、第一及び第二重鎖の両方の間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン界面の特定のアミノ酸位置に導入することに基づく。
【０１６２】
従って、この態様では、多重特異性抗体の三次構造において、第一重鎖のＣＨ３ドメインと第二重鎖のＣＨ３ドメインが、各抗体ＣＨ３ドメイン間に位置する界面を形成し、第一重鎖のＣＨ３ドメインの各アミノ酸配列と第二重鎖のＣＨ３ドメインのアミノ酸配列がそれぞれ、抗体の三次構造において前記界面内に位置するアミノ酸のセットを含み、一方の重鎖のＣＨ３ドメイン中の界面に位置するアミノ酸のセットから、第一のアミノ酸が正電荷アミノ酸で置換され、他方の重鎖のＣＨ３ドメイン中の界面に位置するアミノ酸のセットから、第二のアミノ酸が負電荷アミノ酸で置換されている。この態様に係る二重特異性抗体は、ここでは「ＣＨ３（＋／−）改変二重特異性抗体」とも称される（「＋／−」という略語は、各ＣＨ３ドメインに導入された逆に荷電したアミノ酸を表す）。
【０１６３】
一態様では、ＣＨ３（＋／−）改変二重特異性抗体において、正電荷アミノ酸は、Ｋ、Ｒ及びＨから選択され、負電荷アミノ酸は、Ｅ又はＤから選択される。
【０１６４】
一態様では、ＣＨ３（＋／−）改変二重特異性抗体において、正電荷アミノ酸は、Ｋ及びＲから選択され、負電荷アミノ酸は、Ｅ又はＤから選択される。
【０１６５】
一態様では、ＣＨ３（＋／−）改変二重特異性抗体において、正電荷アミノ酸はＫであり、負電荷アミノ酸はＥである。
【０１６６】
一態様では、ＣＨ３（＋／−）改変二重特異性抗体において、一方の重鎖のＣＨ３ドメインで、４０９位のアミノ酸ＲがＤで置換され、位のアミノ酸ＫがＥで置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインで、３９９位のアミノ酸ＤはＫで置換されており、３５７位のアミノ酸ＥがＫで置換されている（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１６７】
一態様では、国際公開第２０１３／１５７９５３号に記載されているアプローチを使用して、多重特異性抗体の第一重鎖と第二重鎖のヘテロ二量体化が支援される。一実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸ＴがＫで置換され、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３５１位のアミノ酸ＬがＤで置換されている（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。別の実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸ＴがＫで置換され、３５１位のアミノ酸ＬがＫで置換され、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３５１位のアミノ酸ＬがＤで置換されている（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１６８】
別の態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸ＴがＫで置換され、３５１位のアミノ酸ＬがＫで置換され、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３５１位のアミノ酸ＬがＤで置換されている（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。加えて、次の置換の少なくとも一つが他方の重鎖のＣＨ３ドメインに含まれる：３４９位のアミノ酸ＹがＥで置換され、３４９位のアミノ酸ＹがＤで置換され、３６８位のアミノ酸ＬがＥで置換される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。一実施態様では、３６８位のアミノ酸ＬがＥで置換される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１６９】
一態様では、国際公開第２０１２／０５８７６８号に記載のアプローチが、多重特異性抗体の第一重鎖及び第二重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。一態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３５１位のアミノ酸ＬがＹで置換され、４０７位のアミノ酸ＹがＡで置換され、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸ＴがＡで置換され、４０９位のアミノ酸ＫがＦで置換される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。別の実施態様では、上記置換に加えて、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４１１位（元々はＴ）、３９９位（元々はＤ）、４００位（元々はＳ）、４０５位（元々はＦ）、３９０位（元々はＮ）及び３９２位（元々はＫ）のアミノ酸の少なくとも一つが置換される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。好ましい置換は、
−Ｎ、Ｒ、Ｑ、Ｋ、Ｄ、Ｅ及びＷから選択されるアミノ酸による、４１１位のアミノ酸Ｔの置換（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）、
−Ｒ、Ｗ、Ｙ、及びＫから選択されるアミノ酸による、３９９位のアミノ酸Ｄの置換（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）、
−Ｅ、Ｄ、Ｒ及びＫから選択されるアミノ酸による、４００位のアミノ酸Ｓの置換（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）、
−Ｉ、Ｍ、Ｔ、Ｓ、Ｖ及びＷから選択されるアミノ酸による、４０５位のアミノ酸Ｆの置換（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）、
−Ｒ、Ｋ及びＤから選択されるアミノ酸による、３９０位のアミノ酸Ｎの置換（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）、及び
−Ｖ、Ｍ、Ｒ、Ｌ、Ｆ及びＥから選択されるアミノ酸による、３９２位のアミノ酸Ｋの置換（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）
である。
【０１７０】
別の態様では、二重特異性抗体は国際公開第２０１２／０５８７６８号に従って改変される。すなわち、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３５１位のアミノ酸ＬがＹで置換され、４０７位のアミノ酸ＹがＡで置換され、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸ＴがＶで置換され、４０９位のアミノ酸ＫがＦで置換される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。多重特異性抗体の別の実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のアミノ酸ＹがＡで置換され、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸ＴがＡで置換され、４０９位のアミノ酸ＫがＦで置換される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。最後の前記実施態様では、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３９２位のアミノ酸ＫがＥで置換され、４１１位のアミノ酸ＴがＥで置換され、３９９位のアミノ酸ＤがＲで置換され、４００位のアミノ酸ＳがＲで置換される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１７１】
一態様では、国際公開第２０１１／１４３５４５号に記載されているアプローチが、多重特異性抗体の第一重鎖及び第二重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。一態様では、両重鎖のＣＨ３ドメイン中のアミノ酸修飾が、３６８位及び／又は４０９位に導入される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１７２】
一態様では、国際公開第２０１１／０９０７６２号に記載されているアプローチが、二重特異性抗体の第一重鎖及び第二重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。国際公開第２０１１／０９０７６２号は、「ノブ・イントゥ・ホール」（ＫｉＨ）技術によるアミノ酸修飾に関する。一実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸ＴがＷで置換され、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のアミノ酸ＹがＡで置換される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。別の実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のアミノ酸ＴがＹで置換され、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のアミノ酸ＹがＴで置換される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１７３】
一態様では、国際公開第２００９／０８９００４号に記載されているアプローチが二重特異性抗体の第一重鎖及び第二重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。一実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３９２位のアミノ酸Ｋ又はＮが負電荷アミノ酸で（一実施態様ではＥ又はＤで、好ましい一実施態様ではＤで）置換され、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３９９位のアミノ酸Ｄ、３５６位のアミノ酸ＥもしくはＤ、又は３５７位のアミノ酸Ｅが、正電荷アミノ酸（一実施態様ではＫ又はＲ、好ましい一実施態様ではＫで、好ましい一実施態様では３９９位又は３５６位のアミノ酸がＫで置換される）で置換される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。更なる一実施態様では、上記置換に加えて、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４０９位のアミノ酸Ｋ又はＲが、負電荷アミノ酸で（一実施態様ではＥ又はＤで、好ましい一実施態様ではＤで）置換される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。特に更なる一態様では、上記置換に加えて、又は上記置換に代えて、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、４３９位のアミノ酸Ｋ及び／又は３７０位のアミノ酸Ｋが、負電荷アミノ酸で（一実施態様ではＥ又はＤで、好ましい一実施態様ではＤで）互いに独立して置換される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１７４】
一態様では、国際公開第２００７／１４７９０１号に記載のアプローチが、多重特異性抗体の第一重鎖及び第二重鎖のヘテロ二量体化を支援するために使用される。一実施態様では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、２５３位のアミノ酸ＫがＥで置換され、２８２位のアミノ酸ＤがＫで置換され、３２２位のアミノ酸ＫがＤで置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、２３９位のアミノ酸ＤがＫで置換され、２４０位のアミノ酸ＥがＫで置換され、２９２位のアミノ酸ＫがＤで置換される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１７５】
ここに報告される二重特異性抗体の重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫで終わる完全なＣ末端でありうる。重鎖のＣ末端は、Ｃ末端アミノ酸残基の一つ又は二つが除去された短縮Ｃ末端でありうる。好ましい一態様では、重鎖のＣ末端は、ＰＧで終わる短縮Ｃ末端である。
【０１７６】
ここに報告される全ての態様の一態様では、ここで特定されるＣ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、Ｃ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。ここに報告される全ての態様の一実施態様では、ここで特定されるＣ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、Ｃ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０１７７】
（Ｆａｂドメインにおける修飾）
一態様では、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第一Ｆａｂ断片とＴＩＭ３に特異的に結合する第二Ｆａｂ断片を含み、Ｆａｂ断片の一方において、可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬの何れかが交換される二重特異性抗体に関する。該二重特異性抗体はＣｒｏｓｓｍａｂ技術によって調製される。
【０１７８】
一つの結合アームにドメイン置換／交換を有する多重特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂＶＨ−ＶＬ又はＣｒｏｓｓＭａｂＣＨ−ＣＬ）が、国際公開第２００９／０８０２５２号及びSchaefer, W.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108 (2011) 11187-11191に詳細に記載されている。これらは、（このようなドメイン交換を伴わないアプローチと比較して）第二の抗原に対して不適当な重鎖を伴った、第一の抗原に対する軽鎖のミスマッチにより生じる副産物を明らかに低減させる。
【０１７９】
特定の態様では、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第一Ｆａｂ断片とＴＩＭ３に特異的に結合する第二Ｆａｂ断片を含み、Ｆａｂ断片の一方において可変ドメインＶＬ及びＶＨが、ＶＨドメインが軽鎖の一部で、ＶＬドメインが重鎖の一部であるように、互いに置換される二重特異性抗体に関する。特定の態様では、二重特異性抗体は、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合部位を含む第一Ｆａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されるものである。
【０１８０】
別の態様では、正確な対合を更に向上させるために、ＰＤ１に特異的に結合する第一Ｆａｂ断片とＴＩＭ３に特異的に結合する第二Ｆａｂ断片を含む二重特異性抗体は、異なる荷電アミノ酸置換（いわゆる「荷電残基」）を含みうる。これら修飾は、交差又は非交差ＣＨ１及びＣＬドメインに導入される。
【０１８１】
特定の態様では、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第一Ｆａｂ断片とＴＩＭ３に特異的に結合する第二Ｆａｂ断片を含み、Ｆａｂ断片の一つでは、定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換され（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において、１４７位及び２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）二重特異性抗体に関する。特定の態様では、二重特異性抗体は、ＴＩＭ３に特異的に結合する抗原結合部位を含む第二Ｆａｂ断片では、定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換され（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において、１４７位及び２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）ものである。
【０１８２】
特定の態様では、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第一Ｆａｂ断片とＴＩＭ３に特異的に結合する第二Ｆａｂ断片を含み、ＣＬドメインの一つにおいて、１２３位のアミノ酸（ＥＵ番号付け）がアルギニン（Ｒ）によって置換され、１２４位のアミノ酸（ＥＵ番号付け）がリジン（Ｋ）によって置換されており、ＣＨ１ドメインの一つにおいて、１４７位（ＥＵ番号付け）及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）に置換されている二重特異性抗体に関する。特定の態様では、二重特異性抗体は、ＴＩＭ３に特異的に結合する抗原結合部位を含む第二Ｆａｂ断片では、１２３位のアミノ酸（ＥＵ番号付け）がアルギニン（Ｒ）によって置換され、１２４位のアミノ酸（ＥＵ番号付け）がリジン（Ｋ）によって置換されており、ＣＨ１ドメインの一つにおいて、１４７位（ＥＵ番号付け）及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されているものである。
【０１８３】
更なる態様では、二重特異性抗体は、
ａ）第一抗原に特異的に結合する抗体の第一軽鎖及び第一重鎖と、
ｂ）第二抗原に特異的に結合する抗体の第二軽鎖及び第二重鎖であって、第二軽鎖及び第二重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されているもの
を含む二価抗体である。
【０１８４】
ａ）の抗体は、ｂ）で報告されたような修飾を含まず、ａ）の重鎖及び軽鎖は単離された鎖である。
【０１８５】
ｂ）の抗体では、軽鎖内において、可変軽鎖ドメインＶＬが前記抗体の可変重鎖ドメインＶＨに置換され、重鎖内において、可変重鎖ドメインＶＨが前記抗体の可変軽鎖ドメインＶＬに置換される。
【０１８６】
一態様では、（ｉ）ａ）の第一軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸（Ｋａｂａｔによる番号付け）が正電荷アミノ酸によって置換され、ａ）の第一重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）が負電荷アミノ酸で置換されているか、又は（ｉｉ）ｂ）の第二軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸（Ｋａｂａｔによる番号付け）が正電荷アミノ酸によって置換されており、ｂ）の第二重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）が負電荷アミノ酸で置換されている。
【０１８７】
別の態様では、（ｉ）ａ）の第一軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して（好ましい一実施態様では、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により独立して）置換され（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）の第一重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸又は２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されているか（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）、又は（ｉｉ）ｂ）の第二軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して（好ましい一実施態様では、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により独立して）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ｂ）の第二重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸又は２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１８８】
一態様では、第二重鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４及び１２３位におけるアミノ酸がＫにより置換されている（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１８９】
一態様では、第二重鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２３位におけるアミノ酸がＲにより置換され、１２４位におけるアミノ酸がＫにより置換されている（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１９０】
一態様では、第二軽鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７及び２１３位におけるアミノ酸がＥにより置換されている（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１９１】
一態様では、第一軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４及び１２３位におけるアミノ酸がＫにより置換されており、第一重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７及び２１３位におけるアミノ酸がＥにより置換されている（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１９２】
一態様では、第一軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２３位におけるアミノ酸がＲにより置換され、１２４位におけるアミノ酸がＫにより置換されており、第一重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７及び２１３位におけるアミノ酸がＥにより共に置換されている（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１９３】
一態様では、第二重鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４及び１２３位におけるアミノ酸がＫにより置換され、第二軽鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７及び２１３位におけるアミノ酸がＥにより置換されており、第一軽鎖の可変ドメインＶＬにおいて、３８位におけるアミノ酸がＫにより置換され、第一重鎖の可変ドメインＶＨにおいて、３９位におけるアミノ酸がＥにより置換され、第二重鎖の可変ドメインＶＬにおいて、３８位におけるアミノ酸がＫにより置換され、第二軽鎖の可変ドメインＶＨにおいて、３９位におけるアミノ酸がＥにより置換されている（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１９４】
一態様では、二重特異性抗体は、
ａ）第一抗原に特異的に結合する抗体の第一軽鎖及び第一重鎖と、
ｂ）第二抗原に特異的に結合する抗体の第二軽鎖及び第二重鎖であって、第二軽鎖及び第二重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換えられ、第二軽鎖及び第二重鎖の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられている第二軽鎖及び第二重鎖とを含む、二価抗体である。
【０１９５】
ａ）の抗体は、ｂ）で報告された修飾を含まず、ａ）の重鎖及び軽鎖は単離鎖である。ｂ）の抗体では、軽鎖内において、可変軽鎖ドメインＶＬが、前記抗体の可変重鎖ドメインＶＨにより置き換えられ、定常軽鎖ドメインＣＬは、前記抗体の定常重鎖ドメインＣＨ１により置き換えられており；重鎖内において、可変重鎖ドメインＶＨは、前記抗体の可変軽鎖ドメインＶＬにより置き換えられ、定常重鎖ドメインＣＨ１は、前記抗体の定常軽鎖ドメインＣＬにより置き換えられている。
【０１９６】
一態様では、二重特異性抗体は、
ａ）第一抗原に特異的に結合する抗体の第一軽鎖及び第一重鎖と、
ｂ）第二抗原に特異的に結合する抗体の第二軽鎖及び第二重鎖であって、第二軽鎖及び第二重鎖の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換えられている第二軽鎖及び第二重鎖
を含む、二価抗体である。
【０１９７】
ａ）の抗体は、ｂ）で報告された修飾を含まず、ａ）の重鎖及び軽鎖は単離鎖である。ｂ）の抗体では、軽鎖内において、定常軽鎖ドメインＣＬが、前記抗体の定常重鎖ドメインＣＨ１により置き換えられており；重鎖内において、定常重鎖ドメインＣＨ１が、前記抗体の定常軽鎖ドメインＣＬにより置き換えられている。
【０１９８】
一態様では、多重特異性抗体は、
ａ）第一抗原に特異的に結合し、二つの抗体重鎖及び二つの抗体軽鎖からなる全長抗体と、
ｂ）１〜４の更なる抗原に特異的に結合する（すなわち、第二及び／又は第三及び／又は第四及び／又は第五抗原、好ましくは、一つの更なる抗原、すなわち、第二抗原に特異的に結合する）、１、２、３、又は４つの単鎖Ｆａｂ断片
を含み、
ｂ）の前記単鎖Ｆａｂ断片が、ａ）の前記全長抗体に、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端又はＮ末端で融合している、多重特異性抗体である。
【０１９９】
一態様では、第二抗原に結合する一つ又は二つの同一の単鎖Ｆａｂ断片が、全長抗体に、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端で融合している。
【０２００】
一態様では、第二抗原に結合する一つ又は二つの同一の単鎖Ｆａｂ断片が、全長抗体に、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の重鎖のＣ末端で融合している。
【０２０１】
一態様では、第二抗原に結合する一つ又は二つの同一の単鎖Ｆａｂ断片が、全長抗体に、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の軽鎖のＣ末端で融合している。
【０２０２】
一態様では、第二抗原に結合する二つの同一の単鎖Ｆａｂ断片が、全長抗体に、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の各重鎖又は軽鎖のＣ末端で融合している。
【０２０３】
一態様では、第二抗原に結合する二つの同一の単鎖Ｆａｂ断片が、全長抗体に、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の各重鎖のＣ末端で融合している。
【０２０４】
一態様では、第二抗原に結合する二つの同一の単鎖Ｆａｂ断片が、全長抗体に、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の各軽鎖のＣ末端で融合している。
【０２０５】
一態様では、二重特異性抗体は、
ａ）第一抗原に特異的に結合し、二つの抗体重鎖及び二つの抗体軽鎖からなる全長抗体と、
ｂ）
ｂａ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、又は
ｂｂ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）
からなる第一ポリペプチドであって、
そのＶＨドメインのＮ末端で、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の二つの重鎖の内の一方のＣ末端に融合している第一ポリペプチドと、
ｃ）
ｃａ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、又は
ｃｂ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）
からなる第二ポリペプチドであって、ＶＬドメインのＮ末端で、ペプチドリンカーを介して、前記全長抗体の二つの重鎖の内の他方のＣ末端に融合している第二ポリペプチドとを含み、
第一ポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と第二ポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が一緒に、第二抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成している、三価の二重特異性抗体である。
【０２０６】
一態様では、ｂ）のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、ｃ）のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が連結しており、次の位置：
（ｉ）重鎖可変ドメインの４４位と軽鎖可変ドメインの１００位、又は
（ｉｉ）重鎖可変ドメインの１０５位と軽鎖可変ドメインの４３位、又は
（ｉｉｉ）重鎖可変ドメインの１０１位と軽鎖可変ドメインの１００位（番号付けは常にＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）
の間へのジスルフィド結合の導入による鎖間ジスルフィド架橋により安定化されている。
【０２０７】
安定化のための非天然ジスルフィド架橋を導入するための技術は、例えば、国際公開第９４／０２９３５０号、Rajagopal, V.等, Prot. Eng. (1997) 1453-59；Kobayashi, H.等, Nucl. Med. Biol. 25 (1998) 387-393；及びSchmidt, M.等, Oncogene (1999) 18 1711-1721に記載されている。一実施態様では、ｂ）及びｃ）のポリペプチドの可変ドメイン間の任意のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメインの４４位と、軽鎖可変ドメインの１００位との間にある。一実施態様では、ｂ）及びｃ）のポリペプチドの可変ドメイン間の任意のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメインの１０５位と、軽鎖可変ドメインの４３位（番号付けは常にＫａｂａｔに従う）との間にある。一実施態様では、単鎖Ｆａｂ断片の可変ドメインＶＨとＶＬの間の前記任意のジスルフィド安定化を含まない三価の二重特異性抗体が好ましい。
【０２０８】
一態様では、二重特異性抗体は、
ａ）第一抗原に特異的に結合する全長抗体の第一軽鎖及び第一重鎖と、
ｂ）第二抗原に特異的に結合する全長抗体の第二（改変）軽鎖及び第二（改変）重鎖であって、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられており、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられている第二（改変）軽鎖及び第二（改変）重鎖と、
ｃ）１〜４の抗原結合ペプチドであって、一又は二の更なる抗原に（すなわち、第三及び／又は第四抗原に）特異的に結合し、ペプチドリンカーを介して、ａ）及び／又はｂ）の軽鎖又は重鎖のＣ末端又はＮ末端に融合している１〜４の抗原結合ペプチド
を含む、三重特異性又は四重特異性抗体である。
【０２０９】
ａ）の抗体は、ｂ）で報告された修飾を含まず、ａ）の重鎖及び軽鎖は単離鎖である。
【０２１０】
一態様では、三重特異性又は四重特異性抗体は、ｃ）において、一つ又は二つの更なる抗原に特異的に結合する一つ又は二つの抗原結合ペプチドを含む。
【０２１１】
一態様では、抗原結合ペプチドは、ｓｃＦｖ断片及びｓｃＦａｂ断片の群から選択される。
【０２１２】
一態様では、抗原結合ペプチドはｓｃＦｖ断片である。
【０２１３】
一態様では、抗原結合ペプチドはｓｃＦａｂ断片である。
【０２１４】
一態様では、抗原結合ペプチドは、ａ）及び／又はｂ）の重鎖のＣ末端に融合している。
【０２１５】
一態様では、三重特異性又は四重特異性抗体は、ｃ）において、一つの更なる抗原に特異的に結合する一又は二の抗原結合ペプチドを含む。
【０２１６】
一態様では、三重特異性又は四重特異性抗体は、ｃ）において、第三抗原に特異的に結合する二つの同一の抗原結合ペプチドを含む。好ましい一実施態様では、このような二つの抗原結合ペプチドは両方とも、同じペプチドリンカーを介して、ａ）及びｂ）の重鎖のＣ末端に融合している。好ましい一実施態様では、二つの同一の抗原結合ペプチドは、ｓｃＦｖ断片又はｓｃＦａｂ断片の何れかである。
【０２１７】
一態様では、三重特異性又は四重特異性抗体は、ｃ）において、第三及び第四抗原に特異的に結合する二つの抗原結合ペプチドを含む。一実施態様では、前記二つの抗原結合ペプチドは両方とも、同じペプチドコネクターを介して、ａ）及びｂ）の重鎖のＣ末端に融合している。好ましい一実施態様では、前記二つの抗原結合ペプチドは、ｓｃＦｖ断片又はｓｃＦａｂ断片の何れかである。
【０２１８】
一態様では、二重特異性抗体は、
ａ）抗体の二つの軽鎖及び二つの重鎖であって、第一抗原に特異的に結合する（かつ、二つのＦａｂ断片を含む）二つの軽鎖及び二つの重鎖と、
ｂ）第二抗原に特異的に結合する抗体の二つの更なるＦａｂ断片であって、ペプチドリンカーを介して、ａ）の重鎖のＣ末端又はＮ末端の何れかに両方とも融合している前記更なるＦａｂ断片を含み、
Ｆａｂ断片において、次の改変：
（ｉ）ａ）の両Ｆａｂ断片又はｂ）の両Ｆａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられ、及び／又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられており、又は
（ｉｉ）ａ）の両Ｆａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられ、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられており、かつｂ）の両Ｆａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられ、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられており、又は
（ｉｉｉ）ａ）の両Ｆａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられ、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられており、かつｂ）の両Ｆａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられ、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられており、又は
（ｉｖ）ａ）の両Ｆａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられ、ｂ）の両Ｆａｂ断片において、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられており、又は
（ｖ）ａ）の両Ｆａｂ断片において、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられ、ｂ）の両Ｆａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられている、二重特異性の四価抗体である。
【０２１９】
一態様では、前記更なるＦａｂ断片は両方とも、ペプチドリンカーを介して、ａ）の重鎖のＣ末端又はａ）の重鎖のＮ末端の何れかに融合している。
【０２２０】
一態様では、前記更なるＦａｂ断片は両方とも、ペプチドリンカーを介して、ａ）の重鎖のＣ末端の何れかに融合している。
【０２２１】
一態様では、前記更なるＦａｂ断片は両方とも、ペプチドコネクターを介して、ａ）の重鎖のＮ末端に融合している。
【０２２２】
一態様では、Ｆａｂ断片において、次の改変が実施される：ａ）の両Ｆａｂ断片、又はｂ）の両Ｆａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられ、及び／又は、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられている。
【０２２３】
一態様では、二重特異性抗体は、
ａ）第一抗原に特異的に結合し、第一のＶＨ−ＣＨ１ドメインペアを含む第一抗体の（改変）重鎖であって、前記重鎖のＣ末端に、前記第一抗体の第二のＶＨ−ＣＨ１ドメインペアのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して融合している第一抗体の（改変）重鎖と、
ｂ）ａ）の前記第一抗体の二つの軽鎖と、
ｃ）第二抗原に特異的に結合し、第一のＶＨ−ＣＬドメインペアを含む第二抗体の（改変）重鎖であって、前記重鎖のＣ末端に、前記第二抗体の第二のＶＨ−ＣＬドメインペアのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して融合している第二抗体の（改変）重鎖と、
ｄ）ｃ）の前記第二抗体の二つの（改変）軽鎖であって、それぞれが、ＣＬ−ＣＨ１ドメインペアを含む第二抗体の二つの（改変）軽鎖とを含む、四価抗体である。
【０２２４】
一態様では、二重特異性抗体は、
ａ）第一抗原に特異的に結合する第一の全長抗体の重鎖及び軽鎖と、
ｂ）第二抗原に特異的に結合する第二の全長抗体の重鎖及び軽鎖であって、重鎖のＮ末端が、軽鎖のＣ末端に、ペプチドリンカーを介して連結している第二の全長抗体の重鎖及び軽鎖とを含む。
【０２２５】
ａ）の抗体はｂ）で報告された改変を含まず、重鎖及び軽鎖は単離鎖である。
【０２２６】
一態様では、二重特異性抗体は、
ａ）第一抗原に特異的に結合し、二つの抗体重鎖及び二つの抗体軽鎖からなる全長抗体と、
ｂ）ＶＨ２ドメインとＶＬ２ドメインを含む第二抗原に特異的に結合するＦｖ断片であって、両ドメインがジスルフィド架橋を介して互いに連結しているＦｖ断片とを含み、
ＶＨ２ドメイン又はＶＬ２ドメインの何れかのみが、ペプチドリンカーを介して、第一抗原に特異的に結合する全長抗体の重鎖又は軽鎖に融合している。
【０２２７】
二重特異性抗体において、ａ）の重鎖及び軽鎖は、単離鎖である。
【０２２８】
一態様では、ＶＨ２ドメイン又はＶＬ２ドメインの他方は、ペプチドリンカーを介して、第一抗原に特異的に結合する全長抗体の重鎖又は軽鎖に融合していない。
【０２２９】
ここに報告された全ての態様では、第一軽鎖は、ＶＬドメイン及びＣＬドメインを含み、第一重鎖は、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。
【０２３０】
一態様では、二重特異性抗体は、
ａ）第一抗原に特異的に結合する二つのＦａｂ断片、
ｂ）ＣＨ１とＣＬドメインが互いに交換されている第二抗原に特異的に結合する一つのＣｒｏｓｓＦａｂ断片、
ｃ）第一のＦｃ領域重鎖及び第二のＦｃ領域重鎖を含む一つのＦｃ領域
を含み、二つのＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端が重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのＮ末端に連結され、ＣｒｏｓｓＦａｂ断片のＣＬドメインのＣ末端がＦａｂ断片の一つのＶＨドメインのＮ末端に連結されている、三価抗体である。
【０２３１】
一態様では、二重特異性抗体は、
ａ）第一抗原に特異的に結合する二つのＦａｂ断片、
ｂ）ＣＨ１とＣＬドメインが互いに交換されている第二抗原に特異的に結合する一つのＣｒｏｓｓＦａｂ断片、
ｃ）第一のＦｃ領域重鎖と第二のＦｃ領域重鎖を含む一つのＦｃ領域
を含み、
第一のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端が重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドの一つのＮ末端に連結され、ＣｒｏｓｓＦａｂ断片のＣＬドメインのＣ末端が他の重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのＮ末端に連結され、第二のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端が第一のＦａｂ断片のＶＨドメインのＮ末端又はＣｒｏｓｓＦａｂ断片のＶＨドメインのＮ末端に連結されている、三価抗体である。
【０２３２】
一態様では、二重特異性抗体は、
ａ）第一抗原に特異的に結合し、二つの抗体重鎖と二つの抗体軽鎖からなる全長抗体、及び
ｂ）重鎖断片と軽鎖断片を含むＶＨ２ドメインとＶＬ２ドメインを含む第二抗原に特異的に結合するＦａｂ断片を含み、軽鎖断片内で、可変軽鎖ドメインＶＬ２が前記抗体の可変重鎖ドメインＶＨ２によって置換され、重鎖断片内で、可変重鎖ドメインＶＨ２が前記抗体の可変軽鎖ドメインＶＬ２によって置換され、
重鎖Ｆａｂ断片が全長抗体の重鎖の一つのＣＨ１ドメインと全長抗体の各Ｆｃ領域との間に挿入され、軽鎖Ｆａｂ断片のＮ末端が、重鎖Ｆａｂ断片が挿入されている全長抗体の重鎖と対になる全長抗体の軽鎖のＣ末端にコンジュゲートされる。
【０２３３】
一態様では、二重特異性抗体は、
ａ）第一抗原に特異的に結合し、二つの抗体重鎖と二つの抗体軽鎖からなる全長抗体、及び
ｂ）重鎖断片と軽鎖断片を含むＶＨ２ドメインとＶＬ２ドメインを含む第二抗原に特異的に結合するＦａｂ断片を含み、軽鎖断片内で、可変軽鎖ドメインＶＬ２が前記抗体の可変重鎖ドメインＶＨ２によって置換され、重鎖断片内で、可変重鎖ドメインＶＨ２が前記抗体の可変軽鎖ドメインＶＬ２によって置換され、Ｆａｂ断片の重鎖断片のＣ末端が全長抗体の重鎖の一つのＮ末端にコンジュゲートされ、Ｆａｂ断片の軽鎖断片のＣ末端が、Ｆａｂ断片の重鎖断片がコンジュゲートされている全長抗体の重鎖と対をなす全長抗体の軽鎖のＮ末端にコンジュゲートされる。
【０２３４】
（ポリヌクレオチド）
本発明はここに記載の二重特異性抗体をコードする単離ポリヌクレオチド又はその断片を更に提供する。
【０２３５】
所定の実施態様では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、単鎖であっても二本鎖であってもよい。
【０２３６】
Ｂ．組換え法
ここに提供される二重特異性抗体は、例えば、米国特許第４８１６５６７号に記載されているような組換え法及び組成物を使用して産生することができる。一態様では、ここに記載の二重特異性抗体をコードする単離核酸が提供される。そのような核酸は、ＰＤ１及びＴＩＭ−３にそれぞれ特異的に結合する抗原結合部位のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又はＶＨを含むアミノ酸配列をコードしうる。更なる態様では、そのような核酸を含む一又は複数のベクター（例えば発現ベクター）が提供される。更なる態様では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような一態様では、宿主細胞は、以下のものを含む（例えば、以下のもので形質転換されている）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクターと、抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二ベクター。一態様では、宿主細胞は、真核細胞であり、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一態様では、二重特異性抗体を作製する方法が提供され、この方法は、上で提供された抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で培養し、場合によっては、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。
【０２３７】
ここに記載されたＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ−３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体を組換え産生するために、例えば上記したような、二重特異性抗体をコードする核酸を単離し、更なるクローニング及び／又は宿主細胞での発現のために、一又は複数のベクターに挿入する。そのような核酸は、一般的な手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用して）、容易に単離し、配列決定することができる。
【０２３８】
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現のための適切な宿主細胞としては、ここに記載の原核生物細胞又は真核生物細胞が挙げられる。例えば、抗体は、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要でない場合は、細菌中で産生することができる。抗体断片及びポリペプチドの細菌中での発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、同第５７８９１９９号及び同第５８４０５２３号を参照のこと。（大腸菌中での抗体断片の発現を記載する、Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (編), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254も参照のこと）。発現後、抗体を、可溶性画分の細菌細胞ペーストから単離することができ、更に精製することができる。
【０２３９】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物が、抗体をコードするベクターにとってクローニング又は発現の適切な宿主であり、これには、グリコシル化経路が「ヒト化され」、その結果、部分的に又は完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体を産生する真菌及び酵母株が含まれる。Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414；及びLi, H.等, Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215を参照のこと。
【０２４０】
グリコシル化抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物体（無脊椎動物及び脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞と併せて、特にヨトウガ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションのために使用することができる多数のバキュロウイルス株が同定されている。
【０２４１】
植物細胞培養物も宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、同第６０４０４９８号、同第６４２０５４８号、同第７１２５９７８号、及び同第６４１７４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（ＴＭ）技術を記載する）を参照のこと。
【０２４２】
脊椎動物細胞も宿主として使用することができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合化されている哺乳動物細胞株は有用でありうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胎児性腎臓株（例えば、Graham, F.L.等, J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74に記載されているような２９３又は２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252に記載されているようなＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えば、Mather, J.P.等, Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68に記載されているようなＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Urlaub, G.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体産生に適した所定の哺乳動物宿主細胞株の概説として、例えば、Yazaki, P.及びWu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (編), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268を参照のこと。
【０２４３】
Ｃ．アッセイ
ここに提供されるＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ−３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体は、当該技術分野で既知の様々なアッセイによって、同定され、その物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、又は特徴付けられる。
【０２４４】
１．アフィニティーアッセイ
対応する抗原に対するここに提供される二重特異性抗原結合分子、抗体及び抗体断片の親和性は、実施例に記載の方法に従い、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準的機器類と、組換え発現により得られうるもののような受容体又は標的タンパク質を使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定することができる。結合親和性を測定するための特定の例証的で例示的な実施態様を、実施例１ｂ、５又は１２に記載する。一態様によれば、ＫＤは、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００マシン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する表面プラズモン共鳴により測定される。
【０２４５】
２．結合アッセイとその他のアッセイ
一態様では、本発明の抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどの既知の方法によって、その抗原結合活性について試験される。ここで提供される二重特異性抗体の対応する組換え抗原又は抗原発現細胞への結合は、実施例１２に記載されるようにＥＬＩＳＡによって評価されうる。
【０２４６】
別の態様では、本発明は、一つの細胞上に存在する二つの異なる受容体に対する二重特異性抗体フォーマットの同時の結合を決定するための細胞ベースのＴＲ−ＦＲＥＴアッセイを提供する。選択されたＴａｇ−ｌｉｔｅ技術は、細胞表面上に存在する抗原を蛍光ドナー又はアクセプター色素で標識することを可能にする、古典的なＴＲ−ＦＲＥＴ（時間分解蛍光共鳴エネルギー移動）とＳＮＡＰタグ技術（例えばNew England Biolabs, CISBIO）の組み合わせである。アッセイは実施例１３に記載される。
【０２４７】
更なる態様では、新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が、単球、ＮＫ細胞及びＴ細胞などの異なった末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）への結合を示す結合アッセイに使用される。
【０２４８】
別の態様では、競合アッセイを使用して、それぞれ標的への結合について特定の抗体又は抗原結合部位と競合する抗体を同定することができる。所定の実施態様では、そのような競合抗体は、本発明に係るＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体が結合する同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に掲載のMorris (1996) “Epitope Mapping Protocols”に提供されている。
【０２４９】
例示的な競合アッセイでは、固定化したＰＤ１又はＴＩＭ３を、ＰＤ１又はＴＩＭ３に結合する第一の標識抗体と、ＰＤ１又はＴＩＭ３への結合について第一の抗体と競合するその能力について試験されている第二の未標識抗体を含む溶液中でインキュベートする。第二の抗体はハイブリドーマ上清中に存在していてもよい。対照として、固定化したＰＤ１又はＴＩＭ３を、第一の標識抗体を含むが第二の未標識抗体は含まない溶液中でインキュベートする。ＰＤ１又はＴＩＭ３への第一の抗体の結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な未結合抗体を除去し、固定化したＰＤ１又はＴＩＭ３に結合した標識の量を測定する。固定化したＰＤ１又はＴＩＭ３に結合した標識の量が対照試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第二の抗体がＰＤ１又はＴＩＭ３への結合に関して第一の抗体と競合していることを示している。Harlow及びLane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。
【０２５０】
３．活性アッセイ
一態様では、生物学的活性を有するＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を有する二重特異性抗体を同定するためのアッセイが提供される。生物学的活性には、例えば、異なる免疫細胞、特にＴ細胞の活性化及び／又は増殖を向上させる能力、ＩＦＮγ又はＴＮＦ−αなどの免疫調節サイトカインの分泌、ＰＤ１経路の遮断、ＴＩＭ３経路の遮断、腫瘍細胞の死滅が含まれうる。インビボ及び／又はインビトロでそのような生物学的活性を有する抗体もまた提供される。
【０２５１】
所定の態様では、本発明の抗体は、そのような生物学的活性について試験される。一態様において、提供されるものは、一つの個体（ドナーＸ）由来のリンパ球の別の個体（ドナーＹ）由来のリンパ球への活性化を測定する免疫細胞アッセイである。混合リンパ球反応（ＭＬＲ）は、リンパ球エフェクター細胞へのＰＤ１経路を遮断する効果を実証することができる。アッセイにおけるＴ細胞を、本発明の二重特異性抗体の存在下又は非存在下で、活性化及びそのＩＦＮ−γ分泌について試験した。このアッセイは実施例１６に更に詳細に記載される。
【０２５２】
Ｄ．イムノコンジュゲート
本発明はまた一又は複数の細胞傷害性剤、例えば化学療法剤もしくは薬物、増殖阻害剤、毒素（例えばタンパク質毒素、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素又はその断片）又は放射性同位体にコンジュゲートした本発明の二重特異性抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
【０２５３】
一態様では、イムノコンジュゲートは、抗体が、限定されないが、メイタンシノイド（米国特許第５２０８０２０号、同第５４１６０６４号及び欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号を参照）；アウリスタチン、例えばモノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５６３５４８３号及び同第５７８０５８８号、及び同第７４９８２９８号を参照）；ドラスタチン；カリケアマイシン又はその誘導体（米国
特許第５７１２３７４号、同第５７１４５８６号、同第５７３９１１６号、同第５７６７２８５号、同第５７７０７０１号、同第５７７０７１０号、同第５７７３００１号、及び同第５８７７２９６号；Hinman等, Cancer Res. 53:3336-3342(1993)；及びLode等, Cancer Res. 58:2925-2928(1998)を参照）；アントラサイクリン、例えばダウノマイシン又はドキソルビシン（Kratz等, Current Med. Chem. 13:477-523 (2006)；Jeffrey等, Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006)；Torgov等, Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005)；Nagy等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000)；Dubowchik等, Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002)；King等, J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)；及び米国特許第６６３０５７９号を参照）；メトトレキサート；ビンデシン；タキサン、例えばドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセル；トリコテセン；及びＣＣ１０６５を含む、一又は複数の薬物にコンジュゲートしている抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。
【０２５４】
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌由来）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリアコン阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）、及びトリコテセン（tricothecenes）を含む酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートしている、ここに記載の抗体を含む。
【０２５５】
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートしたここに記載の抗体を含み、放射性コンジュゲートを形成する。放射性コンジュゲートの製造には、様々な放射性同位体が利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。放射性コンジュゲートを検出に使用する場合、シンチグラフ検査用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ｍｒｉとしても知られている）用のスピン標識、例えば再びヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄である。
【０２５６】
抗体と細胞傷害性剤のコンジュゲートは、様々な二官能基タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣｌなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）、及びビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098 (1987)に記載のようにして調製することができる。炭素−１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドのコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと。リンカーは、細胞内での細胞傷害性薬物の放出を促進する「切断可能なリンカー」でありうる。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari等, Cancer Res. 52:127-131 (1992)；米国特許第５２０８０２０号）を使用することができる。
【０２５７】
ここでのイムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定されないが、（例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aから）市販されているＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を限定しないが含む架橋試薬を用いて調製されたコンジュゲートが明示的に考えられる。
【０２５８】
Ｅ．診断及び検出のための方法及び組成物
所定の態様では、ここで提供されるＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ−３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗の何れも、生物学的試料中のＰＤ１とＴＩＭ３双方の存在を検出するのに有用でありうる。ここで使用される「検出する」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。所定の実施態様では、生物学的試料は、ＡＭＬ幹がん細胞などの細胞又は組織を含む。
【０２５９】
一態様では、診断又は検出の方法で使用される二重特異性抗体が提供される。更なる態様では、生物学的試料中のＰＤ１とＴＩＭ３双方の存在を検出する方法が提供される。所定の実施態様では、この方法は、ＰＤ１とＴＩＭ３双方への二重特異性抗体の結合を許容する条件下で、ここに記載される二重特異性抗体に生物学的試料を接触させ、二重特異性抗体と両抗原との間で複合体が形成されるかどうか検出することを含む。そのような方法は、インビトロ又はインビボの方法でありうる。一実施態様では、二重特異性抗体は、例えばＰＤ１とＴＩＭ３が患者の選択のためのバイオマーカーである場合に、ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ−３抗体に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体を用いた治療法に適格な対象を選択するために使用される。
【０２６０】
所定の実施態様では、標識された二重特異性抗体が提供される。標識には、限定されないが、直接的に検出される標識又は部分（例えば、蛍光性、発色性、高電子密度、化学発光及び放射性標識）、並びに、例えば酵素反応又は分子相互作用を通して間接的に検出される酵素又はリガンドなどの部分が含まれる。例示的な標識には、限定されないが、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＨＲＰなどの色素前駆体を酸化するために過酸化水素を用いる酵素に結合した複素環式オキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、又はミクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識又は安定フリーラジカルが含まれる。
【０２６１】
Ｆ．薬学的組成物、製剤及び投与経路
更なる態様では、本発明は、例えば以下の治療法の何れかに使用される、ここで提供されるＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ−３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体の何れかを含有する薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、ここに提供される二重特異性抗体の何れかと、少なくとも一種の薬学的に許容可能な賦形剤を含有する。他の実施態様では、薬学的組成物は、ここで提供される二重特異性抗体の何れかと、例えば以下に記載されるような少なくとも一種の追加の治療剤を含有する。
【０２６２】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤に溶解され又は分散された、一又は複数の二重特異性抗体の治療的有効量を含有する。「薬学的に又は薬理学的に許容される」という語句は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに一般に非毒性であり、すなわち、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギー反応、又は他の望ましくない応答を生じさせない分子的実体及び組成物を指す。少なくとも一種の二重特異性抗体と、場合によっては追加的な活性成分とを含む薬学的組成物の調製は、出典明示によりここに援用されるRemington’s Pharmaceutical Sciences, 18版 Mack Printing Company, 1990によって例示されるように、本開示に鑑みて当業者には既知であろう。特に、組成物は凍結乾燥製剤又は水溶液である。ここで使用される場合、「薬学的に許容可能な賦形剤」には、当業者には既知であるように、任意の全ての溶媒、緩衝液、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存料（例えば抗細菌剤、抗真菌剤）、等張剤、塩、安定剤及びそれらの組み合わせが含まれる。
【０２６３】
非経口組成物には、注射による投与、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内への注射用に考案されたものが含まれる。注射の場合、本発明の二重特異性抗体は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水緩衝液といった生理的に適合性のある緩衝液中で製剤化されうる。溶液は、懸濁化剤、安定剤、及び／又は分散剤といった製剤関連薬剤を含みうる。代替的に、二重特異性抗体は、使用前は、適切なビヒクル、例えば滅菌済みの発熱物質を含まない水を用いた構成のための粉末形態でありうる。無菌の注射可能な溶液は、必要量の本発明の融合タンパク質を、必要に応じて以下に列挙する他の様々な成分と共に適切な溶媒中に取り込むことにより調製される。滅菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、容易に達成されうる。一般に、分散液は、塩基性分散媒及び／又は他の成分を含む滅菌ビヒクル中に、滅菌された様々な活性成分を取り込むことにより調製される。無菌の注射可能な溶液、懸濁液、又は乳濁液を調製するための無菌の粉末の場合、好ましい調製方法は、既に滅菌濾過されたその液体媒体から活性成分と任意の所望の追加的成分の粉末を生じる真空乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要であれば適切に緩衝されなければならず、液体希釈剤は注射前に十分な生理食塩水又はグルコースで先ず等張にされる。組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌のような微生物の汚染作用から保存されなければならない。エンドトキシンの汚染が安全レベル、例えばタンパク質１ｍｇ当たり０．５ｎｇ未満で最小限に保たれなければならない。薬学的に許容可能な適切な賦形剤には、限定されないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（例えば、塩化オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。水性注射懸濁液には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどの懸濁液の粘度を上昇させる化合物が含まれうる。場合によっては、懸濁液は、適切な安定剤、又は化合物の溶解度を上昇させて高濃度の溶液の調製を可能にする薬剤も含みうる。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ゴマ油のような脂肪油、又はエチルクリート（ethyl cleats）もしくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、又はリポソームが含まれる。
【０２６４】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合法によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート（methylmethacylate））マイクロカプセルに、コロイド薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに、封入することができる。このような技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences（18版 Mack Printing Company, 1990）に開示されている。徐放性調製物が調製されうる。徐放性調製物の適切な例は、ポリペプチドを含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、注射可能な組成物の吸収を、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はそれらの組合せといった吸収を遅延させる薬剤を組成物に使用することにより持続させることができる。
【０２６５】
ここでの例示的な薬学的に許容可能な賦形剤は、侵入型薬物分散剤、例えば、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）, Baxter International, Inc.）のようなヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む所定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰと使用法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの一又は複数の更なるグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【０２６６】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものを含み、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０２６７】
前に記載された組成物に加えて、二重特異性抗体はデポー製剤として製剤化することもできる。そのような長時間作用型の製剤は、インプラント術（例えば、皮下もしくは筋肉内）により、又は筋肉内注射により投与することができる。従って、例えば、二重特異性抗体は、適切な高分子もしくは疎水性材料（例えば、許容可能な油中のエマルジョンとして）又はイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性誘導体として、例えば難溶性塩として製剤化することができる。
【０２６８】
本発明の二重特異性抗体を含有する薬学的組成物は、一般的な混合、溶解、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥プロセスにより製造することができる。薬学的組成物は、一又は複数の生理学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤又は薬学的に使用可能な調製物中へのタンパク質の処理を容易にする補助剤を使用する一般的な方法で製剤化することができる。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。
【０２６９】
二重特異性抗体は、遊離酸又は塩基、中性又は塩形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容可能な塩は、遊離酸又は塩基の生物学的活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えばタンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、又は例えば塩酸もしくはリン酸といった無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸もしくはマンデル酸といった有機酸で形成されたものが含まれる。また、遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えば水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は第二鉄といった無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン又はプロカインといった有機塩基から誘導することができる。薬学的塩は、対応する遊離塩基形態より、水性及び他のプロトン性溶媒により可溶性である傾向がある。
【０２７０】
ここでの組成物はまた治療される特定の適応症に必要な一を超える活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含んでいてもよい。そのような活性成分は、適切には、意図した目的に有効な量で組み合わせて存在する。
【０２７１】
インビボ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌状態は、例えば滅菌濾過膜を通して濾過することにより、容易に達成されうる。
【０２７２】
Ｇ．治療方法及び組成物
ここで提供されるＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ−３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体の何れも治療方法に使用することができる。
治療方法に使用される場合、上に記載されたＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ−３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体は、優れた医療行為に合致した形で製剤化され、用量決定され、投与されうる。この点において考慮すべき要因は、治療される特定の疾患、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程、及び医療従事者に既知の他の要因を含む。
【０２７３】
一態様では、医薬として使用するためのここに記載のＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ−３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体が提供される。更なる態様では、疾患の治療における使用、特にがんの治療における使用のためのここに記載のＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ−３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体が提供される。所定の態様では、治療方法において使用するためのＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ−３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体が提供される。一実施態様では、本発明は、それを必要とする個体の疾患の治療に使用される、ここに記載のＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ−３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供する。所定の実施態様では、本発明は、二重特異性抗体の治療的有効量を個体に投与することを含む、疾患を有する個体を治療する方法において使用されるＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ−３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供する。所定の実施態様では、治療される疾患はがんである。他の態様では、治療される疾患は、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ１、ＣＭＶ、ＬＣＭＶ又はＥＢＶのような慢性ウイルス感染症である。治療を必要とする対象、患者、又は「個体」は、典型的には哺乳動物、より特定的にはヒトである。
【０２７４】
更なる態様では、本発明は、それを必要とする個体において疾患を治療するための医薬の製造又は調製における上に記載のＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ−３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体の使用を提供する。一実施態様では、医薬は、疾患を有する個体に治療的有効量の医薬を投与することを含む、疾患の治療方法において使用するためのものである。
【０２７５】
所定の態様では、治療される疾患は、増殖性疾患、特にがんである。がんの例には、膀胱がん、脳がん、頭頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨がん、及び腎臓がんが含まれる。本発明に係るＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ−３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体を使用して治療することができる他の細胞増殖性疾患には、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、及び泌尿生殖器系に位置する腫瘍が含まれる。前がん性の状態又は病変及びがん転移もまた含まれる。所定の態様では、がんは、腎細胞がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳がん、頭頸部がんからなる群から選択される。更なる態様では、がんは、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、及び白血病から選択される。別の態様では、治療されるがんは、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜がん、肝細胞がん、胃がん、膵臓がん、神経膠腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝細胞腫、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜又は子宮癌腫、唾液腺癌、腎臓がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝癌、白血病及び他のリンパ増殖性疾患、並びに様々なタイプの頭頸部がんから選択される。
【０２７６】
更なる態様では、治療される疾患は慢性ウイルス感染症である。「慢性ウイルス感染症」という用語は、慢性ウイルスに罹患し又は感染した対象を指す。慢性ウイルス感染症の例は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス感染（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス感染（ＨＣＶ）、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）又はエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）である。
【０２７７】
当業者であれば、多くの場合、二重特異性分子は治癒をもたらさない場合があり、部分的な利点しかもたらさない場合があることを容易に認識する。幾つかの実施態様では、い幾つかの利点を有する生理学的変化もまた治療的に有益であると考えられる。従って、幾つかの実施態様では、生理学的変化をもたらす二重特異性抗体の量は、「有効量」又は「治療的有効量」と考えられる。
【０２７８】
更なる態様では、本発明は、個体の疾患の治療方法であって、治療的有効量の本発明のＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ−３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体を前記個体に投与することを含む方法を提供する。一実施態様では、薬学的に許容可能な形態で本発明の二重特異性抗体を含有する組成物が、前記個体に投与される。所定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。特定の実施態様では、疾患はがんである。所定の実施態様では、方法は、少なくとも一種の追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんであれば抗がん剤の治療的有効量を個体に投与することを更に含む。別の態様では、疾患は慢性ウイルス感染症である。上記実施態様の何れにおいても、「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトでありうる。
【０２７９】
疾患の予防又は治療では、本発明のＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ−３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体の適切な用量は（単独で使用されるか、あるいは一又は複数の他の追加的治療剤との組み合わせで使用されるとき）、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、融合タンパク質の種類、疾患の重症度及び経過、二重特異性抗体が予防又は治療目的で投与されるかどうか、先に又は同時に行われる治療的介入、患者の臨床歴及び融合タンパク質に対する応答、並びに主治医の裁量に依存する。投与の責任を負う医師が、何れにしろ、組成物中の活性成分の濃度及び個別の対象に適切な用量を決定する。限定されないが、様々な時点にわたる単一又は複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含む様々な投与スケジュールがここで考慮される。
【０２８０】
ここに記載のＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ−３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体は、一回で又は一連の治療にわたって適切に患者に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一又は複数回の別個の投与によるか、又は連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の二重特異性抗体が患者への投与のための初期候補投薬量となりうる。一つの典型的な１日の投薬量は、上述の因子に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲であるかもしれない。数日以上にわたる反復投与では、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで一般に持続されるであろう。二重特異性抗体の一つの例示的投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。他の例では、用量は、一回の投与につき、約１μｇ／ｋｇ体重、約５μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ／ｋｇ体重、約２００μｇ／ｋｇ体重、約３５０μｇ／ｋｇ体重、約５００μｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約２００ｍｇ／ｋｇ体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５００ｍｇ／ｋｇ体重から、約１０００ｍｇ／ｋｇ体重以上までと、そこから導かれる任意の範囲を含みうる。ここに列挙される数字から導かれる範囲の例では、上述の数字に基づいて、約５ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５μｇ／ｋｇ体重〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重などの範囲が投与されうる。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一又は複数の用量（又はこれらの何れかの組み合わせ）が患者に投与されうる。このような用量は断続的に、例えば毎週又は三週毎（例えば患者が約２から約２０、例えば約６用量の融合タンパク質を受けるように）投与されうる。初期の高負荷用量の後、一又は複数回の低用量が投与されうる。しかしながら、他の投与計画も有用でありうる。この治療法の進行は、一般的な技術及びアッセイにより容易にモニターされる。
【０２８１】
ここに記載のＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ−３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体は、一般に、意図された目的を達成するのに有効な量で使用される。疾患状態を治療又は予防するための使用では、本発明の二重特異性抗体、又はその薬学的組成物が治療的有効量で投与され又は適用される。治療的有効量の決定は、特にここに提供される詳細な開示を踏まえると十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２８２】
全身投与の場合、治療的に有効な用量は、最初は細胞培養アッセイのようなインビトロアッセイから推定することができる。ついで、用量を動物モデルにおいて公式化して、細胞培養物において決定されるＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成することができる。このような情報を、ヒトにおける有用な用量を更に正確に決定するために使用することができる。
【０２８３】
初期投薬量は、インビボデータ、例えば動物モデルから、当該技術分野で周知の技術を使用して推定することもできる。当業者であれば、動物データに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化することができるであろう。
【０２８４】
投薬量及び間隔は、治療効果を維持するために十分な二重特異性抗体の血漿レベルを提供するために個別に調整されうる。注射による投与のための通常の患者への投薬量は、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５〜１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療的に有効な血漿レベルは、毎日複数回の用量を投与することにより達成することができる。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣにより測定することができる。
【０２８５】
局所投与又は選択的取り込みの場合、二重特異性抗体の有効な局所濃度は血漿濃度に関連していなくともよい。当業者であれば、過度の実験をしなくとも、治療的に有効な局所投薬量を最適化することができるであろう。
【０２８６】
ここに記載の二重特異性抗体の治療的に有効な用量は、一般に、実質的な毒性を生じさせないで治療的恩恵をもたらすであろう。融合タンパク質の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物における標準の薬学的手順により決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物研究は、ＬＤ５０（集団の５０％を死に至らしめる用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために使用することができる。毒性と治療効果との用量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０と表すことができる。大きな治療指数を示す二重特異性抗体が好ましい。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用に適した一定範囲の投薬量の公式化に使用することができる。投薬量は、好ましくは、毒性を殆ど又は全く伴わないＥＤ５０を含む一定範囲の循環濃度内にある。投薬量は、様々な要因、例えば、用いられる投薬形態、利用される投与経路、対象の状態などに応じてこの範囲内で変動しうる。正確な製剤、投与経路及び用量は、患者の状態を考慮して個々の医師により選択されうる（例えば、その全体が出典明示によりここに援用されるFingl等, 1975, in:ThePharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1を参照）。
【０２８７】
本発明の二重特異性抗体を用いて治療される患者の主治医には、毒性、臓器不全などにより、どのようにしていつ投与を終了し、中断し、又は調整するかが分かるであろう。逆に、主治医は、臨床応答が十分ではなかった場合には（毒性なしで）、治療をより高いレベルに調整することもまた分かっているであろう。対象となる疾患の管理において投与される用量の大きさは、治療される状態の重症度、投与経路などによって変動するであろう。例えば、状態の重症度は、部分的には標準の予後評価方法により評価されうる。更に、用量及び恐らくは投薬回数も、個々の患者の年齢、体重、及び応答により変動するであろう。
【０２８８】
（その他の薬剤及び治療）
ここに記載のＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ−３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体は、療法において、一又は複数の他の薬剤との組み合わせで投与されうる。例えば、本発明の融合タンパク質は、少なくとも一種の追加の治療剤と共投与されうる。「治療剤」という用語は、症状又は疾患を治療するために、そのような治療を必要とする個体に投与することのできるあらゆる薬剤を包含する。このような追加の治療剤は、治療されている特定の適応症に適したあらゆる活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つ活性成分を含みうる。所定の実施態様では、追加の治療剤は別の抗がん剤である。
【０２８９】
そのような他の薬剤は、適切には、意図した目的に有効な量で組み合わされて存在する。そのような他の薬剤の有効量は、使用される融合タンパク質の量、疾患又は治療の種類、及び上で検討された他の要因に依存する。ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、一般に、ここに記載されるものと同じ投薬量及び投与経路において、又はここに記載された投薬量の約１％〜９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の投薬量及び任意の経路により使用される。
【０２９０】
上記したような併用療法は、併用投与（二以上の治療剤が、同一又は別々の組成物に含まれている）と、二重特異性抗体の投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、投与と同時、及び／又は投与の後に起こりうる別個の投与とを包含する。
【０２９１】
Ｈ．製造品
本発明の別の態様では、上述された疾患の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と容器上又は容器に付随するラベル又は添付文書を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、それ自体であるか又は状態の治療、予防、及び／又は診断に有効な別の組成物と組み合わせられた組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内溶液バッグでありうる）。組成物中の少なくとも一種の活性剤は、上に記載のＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ−３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体である。
【０２９２】
ラベル又は添付文書は、組成物が選択される状態を治療するために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）本発明の二重特異性抗体を含有する組成物を中に含む第一容器；及び（ｂ）更なる細胞傷害性又はその他の治療剤を中に含む組成物を中に含む第二容器を含みうる。本発明のこの実施態様の製造品は、組成物が特定の状態を治療するために使用されうることを示す添付文書を更に含みうる。
【０２９３】
代替的に又は追加的に、製造品は、薬学的に許容可能な緩衝液、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器を更に含みうる。製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含め、商業的及び使用者の観点から望ましいその他の材料を更に含みうる。
【０２９４】
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【０２９５】
次に本発明の特定の実施態様を列挙する：
１．  ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、
ＰＤ１に特異的に結合する前記第一抗原結合部位が、
（ｉ）配列番号：３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号：３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメインと
（ｉ）配列番号：４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｉｉ）配列番号：４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメインを含み；
ＴＩＭ３に特異的に結合する前記第二抗原結合部位が、
（ａ）（ｉ）配列番号：１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号：２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメインと
（ｉ）配列番号：４又は配列番号：１１又は配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｉｉ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメインを含むか；又は
（ｂ）（ｉ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメインと
（ｉ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｉｉ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメインを含むか；又は
（ｃ）（ｉ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含むＶＨドメインと
（ｉ）配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｉｉ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含むＶＬドメインを含む、二重特異性抗体。
２．  ＰＤ１に特異的に結合する第一抗原結合部位とＴＩＭ３に特異的に結合する第二抗原結合部位を含み、ＰＤ１への結合と比較した場合少なくとも５０倍低い結合親和性で、より特定的にはＰＤ１への結合と比較した場合少なくとも１００倍低い結合親和性で、ＴＩＭ３に結合する、二重特異性抗体。
３．  ＰＤ１に特異的に結合する前記第一抗原結合部位が、
（ａ）配列番号：４３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４４のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｃ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４７のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｄ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｅ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含み、ＴＩＭ３に特異的に結合する前記第二抗原結合部位が、
（ａ）配列番号：７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号：９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｃ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｄ）配列番号：１５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｅ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｆ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｇ）配列番号：２７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｈ）配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む、上に記載の二重特異性抗体。
４．  ＰＤ１に特異的に結合する前記第一抗原結合部位が、配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、
ＴＩＭ３に特異的に結合する前記第二抗原結合部位が、配列番号：１５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン又は配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、上に記載の二重特異性抗体。
５．  ＰＤ１に特異的に結合する前記第一抗原結合部位が、配列番号：４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：４６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、
ＴＩＭ３に特異的に結合する前記第二抗原結合部位が、配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、上に記載の二重特異性抗体。
６．  二重特異性抗体がヒト、ヒト化又はキメラ抗体である、上に記載の二重特異性抗体。
７．  二重特異性抗体が、Ｆｃドメイン、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合部位を含む第一Ｆａｂ断片及びＴＩＭ３に特異的に結合する抗原結合部位を含む第二Ｆａｂ断片を含む、上に記載の二重特異性抗体。
８．  ＦｃドメインがＩｇＧ、特にＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである、上に記載の二重特異性抗体。
９．  Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への結合、特にＦｃγ受容体への結合を減少させる一又は複数のアミノ酸置換を含む、上に記載の二重特異性抗体。
１０．  Ｆｃドメインが、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有するヒトＩｇＧ１サブクラスのものである、上に記載の二重特異性抗体。
１１．  Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第一及び第二サブユニットの会合を促進する修飾を含む、上に記載の二重特異性抗体。
１２．  ノブ・イントゥ・ホール法に従って、Ｆｃドメインの第一サブユニットがノブを含み、Ｆｃドメインの第二サブユニットがホールを含む、上に記載の二重特異性抗体。
１３．  Ｆｃドメインの第一サブユニットがアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第二サブユニットがアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む、上に記載の二重特異性抗体。
１４．  Ｆａｂ断片の一つにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、ＶＨドメインが軽鎖の一部で、ＶＬドメインが重鎖の一部であるように、互いに置換されている、上に記載の二重特異性抗体。
１５．  ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合部位を含む第一Ｆａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換されている、上に記載の二重特異性抗体。
１６．  定常ドメインＣＬ中のＦａｂ断片の一つにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換され（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において、１４７位及び２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）、上に記載の二重特異性抗体。
１７．  ＴＩＭ３に特異的に結合する抗原結合部位を含む第二Ｆａｂ断片において、定常ドメインＣＬの１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換され（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において、１４７位及び２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）、上に記載の二重特異性抗体。
１８．  （ａ）配列番号：５０の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：５２の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：５１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：５３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｂ）配列番号：５４の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：５６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：５５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：５７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｃ）配列番号：５８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：６０の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一軽鎖：配列番号：５９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：６１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｄ）配列番号：６２の配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：６４の配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：６３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：６５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｅ）配列番号：６６の配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：６８の配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：６７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：６９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二軽鎖
を含む、上に記載の二重特異性抗体。
１９．  （ａ）配列番号：５０のアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：５２のアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：５１のアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：５３のアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｂ）配列番号：５４のアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：５６のアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：５５のアミノ酸配列を含む第二重鎖、配列番号：５７のアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｃ）配列番号：５８のアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：６０のアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：５９のアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：６１のアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｄ）配列番号：６２のアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：６４のアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：６３のアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：６５のアミノ酸配列を含む第二軽鎖、又は
（ｅ）配列番号：６６のアミノ酸配列を含む第一重鎖、配列番号：６８のアミノ酸配列を含む第一軽鎖、配列番号：６７のアミノ酸配列を含む第二重鎖、及び配列番号：６９のアミノ酸配列を含む第二軽鎖
を含む、上に記載の二重特異性抗体。
２０．  上に記載の二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド。
２１．  上に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター、特に発現ベクター。
２２．  上に記載のポリヌクレオチド又は上に記載のベクターを含む、原核又は真核宿主細胞。
２３．  上に記載の二重特異性抗体を製造する方法であって、ａ）前記二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで宿主細胞を形質転換する工程と、ｂ）二重特異性抗体の発現に適した条件下で、宿主細胞を培養する工程と、ｃ）培養物から二重特異性抗体を回収する工程を含む、方法。
２４．  上に記載の二重特異性抗体と少なくとも一種の薬学的に許容可能な賦形剤を含有する薬学的組成物。
２５．  医薬として使用するための、上に記載の二重特異性抗体又は上に記載の薬学的組成物。
２６．  ｉ）Ｔ細胞活性の回復等の免疫応答の調節、
ｉｉ）免疫応答又は機能の刺激、
ｉｉｉ）感染症の治療、
ｉｖ）がんの治療、
ｖ）がんの進行の遅延化、
ｖｉ）がんに罹患している患者の生存の延長
に使用するための、上に記載の二重特異性抗体又は上に記載の薬学的組成物。
２７．  がんの予防又は治療に使用するための、上に記載の二重特異性抗体又は上に記載の薬学的組成物。
２８．  慢性ウイルス感染症の治療に使用するための、上に記載の二重特異性抗体又は上に記載の薬学的組成物。
２９．  二重特異性抗体が、化学療法剤、放射線及び／又はがん免疫療法に使用される他の薬剤と組み合わせて投与される、がんの予防又は治療に使用するための、上に記載の二重特異性抗体又は上に記載の薬学的組成物。
３０．  個体における腫瘍細胞の増殖を抑制する方法において、上に記載の二重特異性抗体の有効量を個体に投与して腫瘍細胞の増殖を抑制することを含む、方法。
【実施例】
【０２９６】
次は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、様々な他の実施態様が実施されうることが理解される。
【０２９７】
（材料及び一般的方法）
ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、Kabat, E.A.等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)中に与えられている。抗体鎖のアミノ酸は、上に記載のＫａｂａｔ（Kabat, E.A.等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）による番号付けシステムに従って番号付けされ、参照される。
【０２９８】
（組換えＤＮＡ技術）
Sambrook, J.等, Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているように、標準的な方法を使用してＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は製造者の説明書に従って使用した。
【０２９９】
（遺伝子合成）
所望の遺伝子セグメントは、化学合成により作製されたオリゴヌクレオチドから調製した。特異的制限エンドヌクレオアーゼ切断部位に挟まれた６００〜１８００ｂｐ長の遺伝子セグメントを、ＰＣＲ増幅を含むオリゴヌクレオチドのアニーリング及びライゲーションによってアセンブルし、続いて、表示した制限部位、例えばＫｐｎＩ／ＳａｃＩ又はＡｓｃＩ／ＰａｃＩによって、ｐＰＣＲＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）系ｐＧＡ４クローニングベクターにクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定により確認した。遺伝子合成断片は、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に、与えられた仕様に従って発注された。
【０３００】
（ＤＮＡ配列決定）
ＤＮＡ配列は、ＭｅｄｉＧｅｎｏｍｉｘ ＧｍｂＨ（Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）又はＳｅｑｕｉｓｅｒｖｅ ＧｍｂＨ（Ｖａｔｅｒｓｔｅｔｔｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施された二本鎖配列決定により決定した。
【０３０１】
（ＤＮＡ及びタンパク質配列解析及び配列データ管理）
配列生成、マッピング、解析、アノテーション及び図解に、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のソフトウェアパッケージ・バージョン１０．２及びＩｎｆｏｍａｘのＶｅｃｔｏｒ ＮＴｌ Ａｄｖａｎｃｅスイート・バージョン８．０を使用した。
【０３０２】
（発現ベクター）
記載された抗体の発現には、ＣＭＶ−イントロンＡプロモーターを持つｃＤＮＡ編成又はＣＭＶ−イントロンＡプロモーターを持たないｃＤＮＡ編成に基づくか、ＣＭＶプロモーターを持つゲノム編成に基づく、一過性発現（例えばＨＥＫ２９３における）細胞用の発現プラスミドの変異体を適用した。
【０３０３】
抗体発現カセットの他にベクターは、
・大腸菌においてこのプラスミドの複製を可能にする複製起点、及び
・大腸菌においてアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子
を含んでいた。
【０３０４】
抗体遺伝子の転写単位は、次の要素から構成された：
・５’端のユニーク制限部位（一又は複数）
・ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期エンハンサー及びプロモーター、
・ｃＤＮＡ編成の場合は続くイントロンＡ配列、
・ヒト抗体遺伝子の５’−非翻訳領域、
・免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
・ｃＤＮＡとしての、又は免疫グロブリンエクソン−イントロン編成を持つゲノム編成としての、ヒト抗体鎖（野生型又はドメイン交換されたもの）
・ポリアデニル化シグナル配列を含む３’非翻訳領域、及び
・３’端のユニーク制限部位（一又は複数）。
【０３０５】
以下に記載される抗体鎖を含む融合遺伝子は、ＰＣＲ及び／又は遺伝子合成によって作製され、既知の組換え方法及び技術により、例えば各ベクター中のユニーク制限部位を使用して一致する核酸セグメントの連結によってアセンブルされた。サブクローニングされた核酸配列は、ＤＮＡ配列決定によって検証した。一過性トランスフェクション用に、形質転換大腸菌培養物からのプラスミド調製によって、多量のプラスミドを調製した（Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ ＡＸ，Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）。
【０３０６】
（細胞培養技術）
Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J.及びYamada, K.M. (編), John Wiley & Sons, Incに記載されているように、標準的細胞培養技術を使用した。
【０３０７】
多重特異性抗体は、後述するように、接着培養したＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞又は懸濁培養したＨＥＫ２９−Ｆ細胞において、各発現プラスミドの一過性共トランスフェクションによって発現させた。
【０３０８】
（ＨＥＫ２９３系における一過性トランスフェクション）
全ての抗体及び二重特異性抗体は、Ｆｒｅｅｓｙｌｅシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して２９３Ｆ細胞の一過性トランスフェクションによって作製した。ここで、２９３Ｆ細胞はＦ１７培地で培養し、２９３Ｆｒｅｅ（Ｎｏｖａｇｅｎｅ）でトランスフェクトし、４時間後にＶＰＡを４ｍＭとフィード７を与え、１６時間後に０．６％グルコースを与えた。更にＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ発現システムキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用した。ここで、Ｅｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞はＥｘｐｉ２９３ＴＭ発現培地で培養し、製造者の説明書に従ってＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３トランスフェクションキットを使用してトランスフェクトした。アミノ酸の荷電対がＣＨ１／ＣＬ界面（更なる詳細についてはそれぞれの配列の位置を参照）に付加的に導入されたＣｒｏｓｓＭＡｂＶｈ−ＶＬ二重特異性抗体の改善された安定性及び純度及び減少した凝集傾向のため、プラスミド比の調整は利用されなかった。従って、１＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂについては１：１：１：１又は２＋２ ＣｒｏｓｓＭａｂについては１：１：１の相対プラスミド比を、ＬＣ、ＨＣ、交差ＬＣ及び交差ＨＣプラスミドの同時トランスフェクションに使用した。細胞上清を７日後に収集し、標準的な方法で精製した。
【０３０９】
（タンパク質定量）
精製された抗体及び誘導体のタンパク質濃度を、Pace等, Protein Science, 1995, 4, 2411-1423に従ってアミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を使用して、２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を決定することにより決定した。
【０３１０】
（上清中の抗体濃度定量）
細胞培養上清中の抗体及び誘導体の濃度を、プロテインＡアガロースビーズ（Ｒｏｃｈｅ）を用いる免疫沈降法により推定した。６０μｌのプロテインＡアガロースビーズを、ＴＢＳ−ＮＰ４０（５０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭのＮａＣｌ，１％のＮｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０）で３回、洗浄した。続いて、１〜１５ｍＬの細胞培養上清を、ＴＢＳ−ＮＰ４０中で予め平衡化されたプロテインＡアガロースビーズに適用した。室温での１時間のインキュベーション後、ビーズを、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ−フィルターカラム（Ａｍｉｃｏｎ）上で、０．５ｍＬのＴＢＳ−ＮＰ４０により１回、０．５ｍＬの２×リン酸緩衝生理食塩水（２×ＰＢＳ，Ｒｏｃｈｅ）で２回、及び０．５ｍＬの１００ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）により、簡単に４回、洗浄した。結合した抗体を、３５μｌのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の添加により溶出させた。試料の半分を、それぞれＮｕＰＡＧＥ（登録商標）サンプル還元剤と組み合わせるか、又は末還元のままにし、７０℃で１０分間、加熱した。従って、５〜３０μｌを、４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにはＭＯＰＳ緩衝液、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥには、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）抗酸化ランニング緩衝液添加剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にＭＥＳ緩衝液を用いる）に適用し、クーマシーブルーにより染色した。
【０３１１】
細胞培養上清中の抗体及び誘導体の濃度は、アフィニティーＨＰＬＣクロマトグラフィーにより定量的に測定した。簡潔に述べると、プロテインＡに結合する抗体及び誘導体を含む細胞培養上清を、２００ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１００ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）中、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｏｒｏｓ Ａ／２０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ１１００システム上で、２００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのクエン酸（ｐＨ２．５）を用いてマトリックスから溶出させた。溶出されたタンパク質を、ＵＶ吸光度及びピーク面積の積分により定量した。精製された標準ＩｇＧ１抗体が標準となった。
【０３１２】
別法では、細胞培養上清中の抗体及び誘導体の濃度は、Ｓａｎｄｗｉｃｈ−ＩｇＧ−ＥＬＩＳＡにより測定した。簡潔に述べると、ＳｔｒｅｐｔａＷｅｌｌ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ Ｓｔｒｅｐａｔａｖｉｄｉｎ Ａ−９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｒｏｃｈｅ）を、１００μＬ／ウェルのビオチン化抗ヒトＩｇＧ捕捉分子Ｆ（ａｂ’）２＜ｈ−Ｆｃγ＞ＢＩ（Ｄｉａｎｏｖａ）を０．１μｇ／ｍＬ用いて、室温で１時間、又は代わりに４℃で一晩、コートし、続いて、２００μＬ／ウェルのＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ，Sigma）で３回洗浄した。それぞれの抗体含有細胞培養上清のＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）での１００μＬ／ウェルの希釈系列をウェルに添加し、室温でマイクロタイタープレートシェーカー上で１〜２時間インキュベートした。ウェルを、２００μＬ／ウェルのＰＢＳＴにより３回洗浄し、結合した抗体を、室温においてマイクロタイタープレートシェーカー上で１〜２時間、検出抗体として、０．１μｇ／ｍＬでの１００μｌのＦ（ａｂ’）２＜ｈＦｃγ＞ＰＯＤ（Ｄｉａｎｏｖａ）を用いて検出した。未結合検出抗体は、２００μＬ／ウェルのＰＢＳＴにより３回洗浄し、結合した検出抗体を、１００μＬのＡＢＴＳ／ウェルの添加により検出した。吸光度の決定を、４０５ｎｍの測定波長（参照波長４９２ｎｍ）でＴｅｃａｎ Ｆｌｕｏｒ分光計で実施した。
【０３１３】
（タンパク質精製）
タンパク質は、標準プロトコールを参照して、濾過された細胞培養上清から精製した。簡潔に述べると、抗体をプロテインＡセファロースカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶出をｐＨ２．８で達成した後、直ちに試料を中和させた。凝集したタンパク質を、ＰＢＳ又は２０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中でのサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅ２００，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により単量体抗体から分離した。単量体抗体の画分をプールし、例えばＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（３０ＭＷＣＯ）遠心濃縮機を使用して濃縮し（必要に応じて）、凍結させ、−２０℃又は−８０℃で貯蔵した。試料の一部は、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又は質量分析によるその後のタンパク質分析及び分析的特徴付けに提供された。
【０３１４】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲル系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造者の説明書に従って使用した。特に、１０％又は４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ビス−ＴＲＩＳ Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）抗酸化剤ランニング緩衝液添加剤を含む）又はＭＯＰＳ（非還元ゲル）ランニング緩衝液を使用した。
【０３１５】
（分析的サイズ排除クロマトグラフィー）
抗体の凝集及びオリゴマー状態の決定のためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）をＨＰＬＣクロマトグラフィーにより実施した。簡潔に述べると、プロテインＡ精製抗体を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ１１００システム上のＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラムに３００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）中で、又はＤｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣ−システム上のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に２×ＰＢＳ中で適用した。溶出したタンパク質を、ＵＶ吸光度及びピーク面積の積分により定量した。ＢｉｏＲａｄゲル濾過標準スタンダード１５１−１９０１が標準となった。
【０３１６】
（質量分析）
このセクションは、ＶＨ／ＶＬ交換（ＶＨ／ＶＬ ＣｒｏｓｓＭａｂｓ）を伴う多重特異性抗体の特徴付けについて、それらの正確な構築に重点を置いて記載する。予想される一次構造を、脱グリコシル化されたインタクトＣｒｏｓｓＭａｂ及び脱グリコシル化／プラスミン消化された又は代替的に脱グリコシル化／限定ＬｙｓＣ消化されたＣｒｏｓｓＭａｂのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）により分析した。
【０３１７】
ＶＨ／ＶＬ ＣｒｏｓｓＭａｂを、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で１７時間までの間、３７℃でリン酸又はＴｒｉｓ緩衝液中のＮ−グリコシダーゼＦを用いて脱グリコシル化した。プラスミン消化又は限定ＬｙｓＣ（Ｒｏｃｈｅ）消化を、それぞれ室温で１２０時間、３７℃で４０分間、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８）中の１００μｇの脱グリコシル化ＶＨ／ＶＬ ＣｒｏｓｓＭａｂを用いて実施した。質量分析に先立ち、試料を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でＨＰＬＣにより脱塩した。総質量を、ＴｒｉＶｅｒｓａ ＮａｎｏＭａｔｅソース（Ａｄｖｉｏｎ）を備えたｍａＸｉｓ ４Ｇ ＵＨＲ−ＱＴＯＦ ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ）上でＥＳＩ−ＭＳにより決定した。
【０３１８】
（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（ＢＩＡＣＯＲＥ）を使用する各抗原に対する多重特異性抗体の結合及び結合親和性の決定）
作製された抗体の各抗原に対する結合は、ＢＩＡＣＯＲＥ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用する表面プラズモン共鳴により調べる。簡潔に述べると、親和性測定のために、各抗原に対する抗体を提示するためにアミンカップリングを介してＣＭ５チップ上にヤギ抗ヒトＩｇＧ，ＪＩＲ１０９−００５−０９８抗体が固定化される。結合は、ＨＢＳ緩衝液（ＨＢＳ−Ｐ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０（ｐＨ７．４））中、２５℃（又は３７℃）で測定される。抗原（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ又は社内精製品）を様々な濃度で溶液に加えた。８０秒から３分間の抗原注入により結合を測定した；ＨＢＳ緩衝液を用いて３〜１０分間チップ表面を洗浄することにより解離を測定し、ラングミュア１：１結合モデルを使用してＫＤ値を推定した。陰性対照データ（例えば緩衝液曲線）は、システム固有のベースライン変動の修正のため、またノイズシグナル低減のために、試料曲線から差し引かれる。各Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアを、センサーグラムの解析のため、また親和性データの計算のために使用する。
【０３１９】
［ＴＩＭ３抗体］
実施例１ａ：抗ＴＩＭ３抗体の作製
（マウスの免疫化）
ＮＭＲＩマウスを、全長ヒトＴｉｍ−３をコードするプラスミド発現ベクターを使用して、１００ｕｇのベクターＤＮＡ（プラスミド１５３０４＿ｈＴＩＭ３−ｆｌ）を皮内適用し、続いてエレクトロポレーション（１０００Ｖ／ｃｍの２平方パルス、持続時間０．１ｍｓ、間隔０．１２５ｓ；続いて２８７．５Ｖ／ｃｍの４平方パルス、持続時間１０ｍｓ、間隔０．１２５ｓ）を行うことにより遺伝的に免疫化した。マウスは、０、１４、２８、４２、５６、７０、及び８４日目に何れか６回の連続した免疫化を受けた。血液を３６日目、７８日目及び９２日目に採取し、血清を調製し、これをＥＬＩＳＡによる力価決定のために使用した（以下を参照）。最も高い力価を有する動物を、５０ｕｇの組換えヒトＴｉｍ−３ヒトＦｃキメラの静脈内注射による９６日目の追加免疫のために選択し、追加免疫の３日後に脾臓細胞と骨髄腫細胞株との融合により、モノクローナル抗体をハイブリドーマ技術により単離した。
【０３２０】
（血清力価の決定（ＥＬＩＳＡ））
ヒト組換えＴｉｍ−３ヒトＦｃキメラを、ＰＢＳ中０．３ｕｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェルで９６ウェルＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに固定し、続いて、ＰＢＳ中２％Ｃｒｏｔｅｉｎ Ｃ、２００μｌ／ウェルを用いてプレートをブロッキングし；抗血清の段階希釈をＰＢＳ中０．５％Ｃｒｏｔｅｉｎ Ｃ、１００μｌ／ウェルで二通り適用し；ＨＲＰ結合ヤギ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ／Ｄｉａｎｏｖａ １１５−０３６−０７１；１／１６０００）により検出した。全ての工程について、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。全ての工程の間に、プレートをＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。ＢＭ Ｂｌｕｅ ＰＯＤ基質可溶性（Ｒｏｃｈｅ）、１００ｕｌ／ウェルの添加によりシグナルを発生させ；１ＭのＨＣｌ、１００ｕｌ／ウェルの添加により停止させた。吸光度は、４５０ｎｍにおいて、６９０ｎｍを参照として、読み取られた。力価は、最大値の半分のシグナルをもたらす抗血清の希釈として定義された。
【０３２１】
実施例１ｂ：抗Ｔｉｍ３抗体の特徴付け
（Ｔｉｍ３のＥＬＩＳＡ）
Ｎｕｎｃ−ＭａｘｉＳｏｒｐ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｅプレート（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ＃１１９７４９９８／ＭＣ１０９９）をＴｉｍ３−ＥＣＤ−Ｈｉｓ−Ｂｉｏｔｉｎ（ＢｉｒＡ Ｌｉｇａｓｅでビオチン化）により２５μｌ／ウェルでコーティングし、４００ｒｐｍ回転で振盪しながら室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌのａＴｉｍ３試料又は希釈した（１：２工程）参照抗体ａＴｉｍ３Ｆ３８−２Ｅ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのヒツジ抗マウスＰＯＤ（ＧＥ ＮＡ９３１０Ｖ）を１：９０００希釈で添加し、４００ｒｐｍ回転で振盪しながら室温で１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で４×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，＃ＣＬ０７）を添加し、ＯＤ１．５〜２．５までインキュベートした。次に、２５μｌ／ウェルの１ＮのＨＣＬ溶液の添加により反応を停止させた。測定は３７０／４９２ｎｍで行った。
【０３２２】
ＥＬＩＳＡの結果は、下記の概要の表１に、ＥＣ５０値［ｎｇ／ｍｌ］として列挙する。
【０３２３】
（Ｔｉｍ３の細胞ＥＬＩＳＡ）
全長ヒトＴｉｍ３をコードするプラスミド１５３１２＿ｈＴＩＭ３−ｆｌ＿ｐＵＣ＿Ｎｅｏで安定にトランスフェクトされ、Ｇ４１８（プラスミド上のネオマイシン耐性マーカー）により選択された接着性ＣＨＯ−Ｋ１細胞株を、３８４ウェル平底プレートに１．２×１０Ｅ６細胞／ｍｌの濃度で播種し、一晩増殖させた。
【０３２４】
翌日、２５μｌ／ウェルのＴｉｍ３試料又はａＴｉｍ３参照抗体Ｆ３８−２Ｅ２アジドフリー（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，３５４００４）を添加し、４℃で２時間インキュベートした（内部移行を避けるため）。洗浄後（３×９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴ（ＢＩＯＴＥＫ Ｗａｓｈｅｒ：Ｐｒｏｇ．２９，１×９０））細胞を、残留緩衝液をはじき出し、１×ＰＢＳ緩衝液中５０μｌ／ウェルの０．０５％グルタルアルデヒド：２５％グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ カタログ番号：Ｇ５８８２）の１：５００希釈液を添加することによって固定し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後（３×９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴ（ＢＩＯＴＥＫ Ｗａｓｈｅｒ：Ｐｒｏｇ．２１，３×９０ ＧｒｅｉｎＬｙｓｉｎ））、２５μｌ／ウェルの二次抗体を検出のために加え（ヒツジ抗マウスＰＯＤ；西洋ワサビＰＯＤ結合Ｆ（ａｂ’）２断片；ＧＥ ＮＡ９３１０）、４００ｒｐｍで振盪しながら室温で２時間インキュベートした。洗浄後（３×９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴ（ＢＩＯＴＥＫ Ｗａｓｈｅｒ：Ｐｒｏｇ．２１，３×９０ ＧｒｅｉｎＬｙｓｉｎ）２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（Ｒｏｃｈｅ １１８３５０３３００１）を添加し、ＯＤ１．５〜２．５までインキュベートした。次に、２５μｌ／ウェルの１ＮのＨＣＬ溶液の添加により反応を停止させた。測定は３７０／４９２ｎｍで行った。
【０３２５】
細胞ＥＬＩＳＡの結果は、以下の概要の表１に、「ＥＣ５０ ＣＨＯ−Ｔｉｍ３」値［ｎｇ／ｍｌ］として列挙する。
2020058353.tif 000015
【０３２６】
（ＴＩＭ３抗体のＢＩＡｃｏｒｅ特徴付け）
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースのアッセイが、幾つかのマウスＴｉｍ３結合剤並びに市販のヒトＴｉｍ３結合参照物間の結合の動態パラメーターを決定するために使用されている。従って、（ＢＩＡｃｏｒｅ）ＣＭ５センサーチップの表面にアミンカップリングにより抗マウスＩｇＧを固定した。ついで、試料を捕捉し、単量体ｈｕ／ｃｙＴｉｍ３−ＥＣＤ並びにＦｃ−タグ付きヒトＴｉｍ３−ＥＣＤ二量体をそれらに結合させた。センサーチップ表面は、各分析サイクルの後に再生された。平衡定数ＫＤは、データを１：１ラングミュア相互作用モデルに適合させることによって最終的に得られた。
【０３２７】
３０μｇ／ｍｌの抗マウスＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ＃ＢＲ−１００８−３８）の約１２０００応答単位（ＲＵ）を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅが提供するアミンカップリングキットを使用することにより、ｐＨ５．０で、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｂ４０００において、ＣＭ５センサーチップのフローセル１−４のスポット１、２、４及び５（スポット１、５が活性であり、スポット２、４が参照スポットである）に結合させた。
【０３２８】
試料及びランニング緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰ＋（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ，０．１５ＭのＮａＣｌ，３ｍＭのＥＤＴＡ，０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０，ｐＨ７．４）であった。フローセル温度は２５℃に、試料コンパートメント温度は１２℃に設定した。システムは、ランニング緩衝液でプライミングした。
【０３２９】
試料を２００μｇ／ｍｌの濃度で３０秒間注入し、各フローセルのスポット１及び５に結合させ、８つの試料の並行した測定を可能にした。ついで、各試料にわたって２４０ｓの間、完全なセットの異なる（単量体カニクイザル、単量体ヒト及びｈｕＦｃ融合二量体ヒトＴｉｍ３−ＥＣＤ）濃度が注入され、続いて３０／１８００ｓの解離時間が続いた。ついで、各分析サイクル（試料捕捉、スポット１及び５−Ｔｉｍ３ ＥＣＤ注入）を、グリシン−ＨＣｌ ｐＨ１．７の３０秒間の長い注入により再生した。流量は、全操作に対して３０μｌ／分に設定した。
【０３３０】
最後に、二重参照データを、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｂ４０００評価ソフトウェアを用いて１：１ラングミュア相互作用モデルに適合させた。単量体ヒト、カニクイザルＴｉｍ３及びｈｕＦｃ融合二量体ヒトＴｉｍ３に対して得られた親和性を表２ａに示す。ｈｕＴｉｍ３二量体に対する親和性は、結合活性によって影響される可能性が最も高く、従って、単量体ｈｕＴｉｍ３に対する親和性より明らかに強い。
2020058353.tif 000016
【０３３１】
（ＳＰＲによるＴｉｍ３への親和性の決定（キメラＴＩＭ３−００１６変異体（００１８）及びヒト化型））
プロテインＡを、（ＢＩＡｃｏｒｅ）ＣＭ５センサーチップの表面にアミンカップリングさせて固定した。ついで、試料を捕捉し、ｈｕＴｉｍ３−ＥＣＤをそれらに結合させた。センサーチップ表面は、各分析サイクルの後に再生させた。平衡定数及び速度定数は、データを１：１ラングミュア相互作用モデルに適合させることによって最終的に得られた。
【０３３２】
約２０００応答単位（ＲＵ）の２０μｇ／ｍｌのプロテインＡを、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されるアミンカップリングキットを使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｂ４０００機器においてＣＭ５センサーチップの全てのフローセルのスポット１、２、４及び５に結合させた。
【０３３３】
試料及びランニング緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰ＋（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０，ｐＨ７．４）であった。フローセル温度は２５℃に、試料コンパートメント温度は１２℃に設定した。システムは、ランニング緩衝液でプライミングした。
【０３３４】
異なる試料を１０ｎＭの濃度で３０秒間注入し、全てのフローセル中のスポット１及び５に連続的に結合させた。ついで、各試料にわたって、単量体ヒトＴｉｍ３−ＥＣＤ希釈物（６００ｎＭ、２００ｎＭ、６６．７ｎＭ、２×２２．２ｎＭ、７．４ｎＭ、２．５ｎＭ及び２×０ｎＭ）の完全なセットを３００ｓの間連続的に注入した。各抗原注入の後に、１２ｓ／１０００ｓの解離時間、及びグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ１．５）溶液を用いた２回の３０ｓの再生工程が続き、そのうちの最後の工程には２０秒の注入後に安定化期間を含めた。
【０３３５】
最後に、二重参照データを、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｂ４０００評価ソフトウェアを用いて１：１ラングミュア相互作用モデルに適合させた。得られたＫＤ値を表２ｂに示す。
【０３３６】
（ＳＰＲによるＴｉｍ３への親和性の決定（（キメラＴＩＭ３−００２８及びヒト化型）））
（Ｂｉａｃｏｒｅ）ＣＭ５センサーチップの表面にアミンカップリングによって抗ヒトＦｃ ＩｇＧを固定した。ついで、試料を捕捉し、ｈｕＴｉｍ３−ＥＣＤをそれらに結合させた。センサーチップ表面は、各分析サイクルの後に再生させた。平衡定数及び速度定数は、データを１：１ラングミュア相互作用モデルに適合させることによって最終的に得られた。
【０３３７】
約２５００応答単位（ＲＵ）の１０μｇ／ｍｌの抗ヒトＦｃ ＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ＃ＢＲ−１００８−３９）を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されるアミンカップリングキットを使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｂ４０００機器においてＣＭ５センサーチップの全てのフローセルのスポット１、２、４及び５に結合させた。
【０３３８】
試料及びランニング緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰ＋（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０，ｐＨ７．４）であった。フローセル温度は２５℃に、試料コンパートメント温度は１２℃に設定した。システムは、ランニング緩衝液でプライミングした。
【０３３９】
異なる試料を１０ｎＭの濃度で３０秒間注入し、全てのフローセル中のスポット１及び５に連続的に結合させた。ついで、各試料にわたって、単量体ヒトＴｉｍ３−ＥＣＤ希釈物（６００ｎＭ、２００ｎＭ、６６．７ｎＭ、２×２２．２ｎＭ、７．４ｎＭ、２．５ｎＭ及び２×０ｎＭ）の完全なセットを３００ｓの間連続的に注入した。各抗原注入の後に、１２ｓ／７００ｓの解離時間、及び３ＭのＭｇＣｌ２溶液を用いた２回の３０ｓの再生工程が続き、そのうちの最後の工程はランニング緩衝液を用いた「注入後の追加洗浄」を含めた。
【０３４０】
最後に、二重参照データを、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｂ４０００評価ソフトウェアを用いて１：１ラングミュア相互作用モデルに適合させた。得られたＫＤ値を表２ｂに示す。
2020058353.tif 000017
【０３４１】
実施例２：抗ＴＩＭ３抗体誘導体の作製
（キメラ抗体誘導体）
キメラＴｉｍ３抗体は、抗ＴＩＭ３マウス抗体Ｔｉｍ３−００１６、Ｔｉｍ３−００１６変異体（００１８）、Ｔｉｍ３−００２１、Ｔｉｍ３−００２２、Ｔｉｍ３−００２６、Ｔｉｍ３−００２８、Ｔｉｍ３−００３０、及びＴｉｍ３−００３３、Ｔｉｍ３−００
３８の可変重鎖及び軽鎖領域をＰＣＲを介して増幅し、エフェクター機能を抑止するＬＡＬＡ及びＰＧ変異（ロイシン２３４からアラニン、ロイシン２３５からアラニン、プロリン３２９からグリシン）を有するヒトＩｇＧ１骨格／ヒトＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３との融合タンパク質として重鎖発現ベクター中に、またヒトＣ−カッパに対する融合タンパク質として軽鎖発現ベクター中にそれらをクローニングすることによって作製された。ついで、ＬＣ及びＨＣプラスミドをＨＥＫ２９３にコトランスフェクトし、７日後に、抗体精製のための標準的な方法によって上清から精製した。
【０３４２】
（グリコシル化部位ＮＹＴの除去：Ｔｉｍ３＿００１６、Ｔｉｍ３＿００１６変異体（００１８又はＴｉｍ３＿００１８と命名）の１つのＨＶＲ−Ｌ１位置を、ＮをＱ又はＳによって置換することによって修飾）
Ｔｉｍ３＿００１６及びＴｉｍ３＿００１６変異体（００１８）の可変軽鎖領域内の変異は、Ａｇｉｌｅｎｔの「Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」を製造者の説明書に従って使用してインビトロ突然変異誘発によって作製した。この方法により、軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１（配列番号：４）のグリコシル化部位モチーフＮＹＴのアスパラギン（Ｎ）がグルタミン（Ｑ）により置換され（配列番号：１１＝Ｔｉｍ３＿００１６＿ＨＶＲ−Ｌ１変異体１＿ＮＱを得る）、又は代わりに、アスパラギン（Ｎ）がセリン（Ｓ）により置換される（配列番号：１２＝Ｔｉｍ３＿００１６＿ＨＶＲ−Ｌ１変異体２＿ＮＳを得る）。両方とも、グリコシル化部位モチーフＮＹＴは成功裡に改変された。ついで、変異体をコードするＬＣ及びＨＣプラスミドをＨＥＫ２９３にコトランスフェクトし、７日後に、抗体精製のための標準的な方法によって上清から精製した。
【０３４３】
作製された変異体を、ヒトＴｉｍ３に対するＥＬＩＳＡ、カニクイザルＴｉｍ３に対するＥＬＩＳＡ及び全長ヒトＴｉｍ３を発現する接着性ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対する細胞ＥＬＩＳＡによって試験した。
2020058353.tif 000018
【０３４４】
作製された全ての変異体は、親抗体Ｔｉｍ３＿００１６又はＴｉｍ３＿００１６抗体変異体Ｔｉｍ３＿００１８のそれぞれよりも、ＣＨＯ細胞上のヒトＴＩＭ３（ヒト）、ｃｙｎｏ ＴＩＭ３（ｃｙｎｏ）又はヒトＴＩＭＲに対して更に機能的な結合を示すことが見出された。
【０３４５】
（ヒト化抗体誘導体）
マウス抗Ｔｉｍ３−００１６変異体（００１８）及び抗Ｔｉｍ３＿００２８のＶＨ及びＶＬドメインのヒト化
ａ）抗Ｔｉｍ３抗体Ｔｉｍ３＿００１６変異体（００１８）（６つのＨＶＲのアミノ酸配列を有する；ここで軽鎖においてＨＶＲ−Ｌ１変異体２＿ＮＳ（ＮからＳへの変異によるグリコシル化部位の除去）が使用された）のＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列に基づいて、ヒト化抗Ｔｉｍ３抗体変異体Ｔｉｍ３−０４３３及びＴｉｍ３−０４３４を作製し、ｂ）抗Ｔｉｍ３抗体Ｔｉｍ３＿００２８のＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列に基づいて、ヒト化抗Ｔｉｍ３抗体変異体Ｔｉｍ３−０４３８及びＴｉｍ３−０４４３を作製した。
【０３４６】
重鎖及び軽鎖可変領域のヒト化アミノ酸配列をＤＮＡに逆翻訳し、得られたｃＮＤＡを合成し（ＧｅｎＡｒｔ）、ついでエフェクター機能を抑止するＬＡＬＡ及びＰＧ変異（ロイシン２３４からアラニン、ロイシン２３５からアラニン、プロリン３２９からグリシン）を有するヒトＩｇＧ１骨格／ヒトＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３との融合タンパク質として重鎖発現ベクター中に、またヒトＣ−カッパに対する融合タンパク質として軽鎖発現ベクター中にクローニングされた。ついで、ＬＣ及びＨＣプラスミドをＨＥＫ２９３にコトランスフェクトし、７日後に、抗体精製のための標準的な方法によって上清から精製した。得られたヒト化Ｔｉｍ３抗体は、以下のように命名される：
2020058353.tif 000019
2020058353.tif 000020
【０３４７】
実施例３：混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるサイトカイン産生に対するヒト抗ＴＩＭ−３抗体の効果
リンパ球エフェクター細胞へのＴＩＭ−３経路を遮断する効果を実証するために混合リンパ球反応を使用した。アッセイにおけるＴ細胞を、抗ＴＩＭ−３ｍＡｂの存在下又は非存在下における活性化及びＩＦＮ−ガンマ分泌について試験した。
【０３４８】
ヒトリンパ球をＬｅｕｋｏｓｅｐ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ，２２７ ２８８）を使用する密度勾配遠心分離によって健康なドナーの末梢血から単離した。簡潔に述べると、ヘパリン処理血液を３倍容量のＰＢＳで希釈し、希釈した血液の２５ｍｌアリコートを５０ｍｌのＬｅｕｋｏｓｅｐチューブに層化した。室温で８００×ｇで１５分間遠心分離した後（中断なし）、リンパ球含有画分を回収し、ＰＢＳで洗浄し、機能アッセイにおいて直接使用したか、又は１．０Ｅ＋０７細胞／ｍｌで凍結培地（１０％ＤＭＳＯ、９０％ＦＣＳ）に再懸濁し、液体窒素中で保存した。１：１の標的／応答細胞比をＭＬＲアッセイで使用した（すなわち、各ＭＬＲ培養物は、総量２００μｌ中に各ドナーからの２．０Ｅ＋０５のＰＢＭＣを含んでいた）。抗ＴＩＭ３モノクローナル抗体Ｔｉｍ３＿００１６、Ｔｉｍ３＿００１６変異体（Ｔｉｍ３＿００１８）、Ｔｉｍ３＿００２１、Ｔｉｍ３＿００２２、Ｔｉｍ３＿００２６、Ｔｉｍ３＿００２８、Ｔｉｍ３＿００３０、Ｔｉｍ３＿００３３、Ｔｉｍ３＿００３８及びＦ３８−２Ｅ２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を各培養物に対して異なる抗体濃度で添加した。抗体なしか又はアイソタイプ対照抗体を陰性対照として使用し、ｒｅｃ ｈｕＩＬ−２（２０ＥＵ／ｍｌ）を陽性対照として使用した。細胞を３７℃で６日間培養した。６日後、サイトカイン測定のために各培養物から１００μｌの培地を採取した。ＩＦＮ−ガンマのレベルは、ＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。
【０３４９】
結果を表６に示す（ＩＦＮ−ｇ分泌／放出）。抗ＴＩＭ−３モノクローナル抗体は、濃度依存的にＴ細胞活性化及びＩＦＮ−ガンマの分泌を促進した。抗ＴＩＭ３抗体Ｔｉｍ３＿００２１、Ｔｉｍ３＿００２２、Ｔｉｍ３＿００２８、及びＴｉｍ３＿００３８は、Ｆ３８−２Ｅ２抗体よりも炎症性サイトカインＩＦＮ−ガンマの放出を減少させる。Ｔｉｍ３＿００１６、Ｔｉｍ３＿００１６変異体（Ｔｉｍ３＿００１８）、Ｔｉｍ３＿００３３及びＴｉｍ３＿００３８は、Ｆ３８−２Ｅ２抗体と比較したとき同様の放出を示した。対照的に、アイソタイプ対照抗体を含む培養物は、ＩＦＮ−ガンマの分泌の増加を示さなかった。
2020058353.tif 000021
【０３５０】
更なる実験において、０．１μｇ／ｍｌの抗ＰＤ１ ｍＡｂと組み合わせた次のキメラ抗体及びヒト化抗体（上記のように作製）のＥＣ５０値を測定した：キメラｃｈｉ＿Ｔｉｍ３＿０１８抗体とそのヒト化型Ｔｉｍ３−４３３及びＴｉｍ３−４３４、キメラｃｈｉ＿Ｔｉｍ３＿０２８抗体とそのヒト化型Ｔｉｍ３−４３８及びＴｉｍ３−４４３を、異なるリンパ球ドナー混合物（それぞれＤ２とＤ３、又はＤ１とＤ５）で測定した。結果を表６ｂに示す。
2020058353.tif 000022
【０３５１】
［ＰＤ１抗体］
実施例４：抗ＰＤ−１抗体の作製
（マウスの免疫化）
ＮＭＲＩマウスを、全長ヒトＰＤ−１をコードするプラスミド発現ベクターを使用して、１００ｕｇのベクターＤＮＡ（プラスミド１５３００＿ｈＰＤ１−ｆｌ）を皮内適用し、続いてエレクトロポレーション（１０００Ｖ／ｃｍの２平方パルス、持続時間０．１ｍｓ、間隔０．１２５ｓ；続いて２８７．５Ｖ／ｃｍの４平方パルス、持続時間１０ｍｓ、間隔０．１２５ｓ）することにより遺伝的に免疫化した。マウスは、０、１４、２８、４２、５６、７０、及び８４日目に何れか６回の連続した免疫化を受けた。血液を３６日目、７８日目及び９２日目に採取し、血清を調製し、これをＥＬＩＳＡによる力価決定のために使用した（以下を参照）。最も高い力価を有する動物を、５０ｕｇの組換えヒトＰＤ１ヒトＦｃキメラの静脈内注射による９６日目の追加免疫のために選択し、追加免疫の３日後に脾臓細胞と骨髄腫細胞株との融合により、モノクローナル抗体をハイブリドーマ技術により単離した。
【０３５２】
（血清力価の決定（ＥＬＩＳＡ））
ヒト組換えＰＤ１ヒトＦｃキメラを、ＰＢＳ中０．３ｕｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェルで９６ウェルＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに固定し、続いて、ＰＢＳ中２％Ｃｒｏｔｅｉｎ Ｃ、２００ｕｌ／ウェルを用いてプレートをブロッキングし；抗血清の段階希釈をＰＢＳ中０．５％Ｃｒｏｔｅｉｎ Ｃ、１００ｕｌ／ウェルで二通り適用し；ＨＲＰ結合ヤギ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ／Ｄｉａｎｏｖａ １１５−０３６−０７１；１／１６０００）により検出した。全ての工程について、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。全ての工程の間に、プレートをＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。ＢＭ Ｂｌｕｅ ＰＯＤ基質可溶性（Ｒｏｃｈｅ）、１００ｕｌ／ウェルの添加によりシグナルを発生させ；１ＭのＨＣｌ、１００ｕｌ／ウェルの添加により停止させた。吸光度は４５０ｎｍにおいて、６９０ｎｍを参照として、読み取られた。力価は、最大値の半分のシグナルをもたらす抗血清の希釈として定義された。
【０３５３】
実施例５：抗ＰＤ１抗体の特徴付け／ヒトＰＤ１への抗ＰＤ１抗体の結合
（ｈｕＰＤ１のＥＬＩＳＡ）
Ｎｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐストレプトアビジン被覆プレート（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ＃１１９７４９９８００１）を２５μｌ／ウェルのビオチン化ＰＤ１−ＥＣＤ−ＡｖｉＨｉｓでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌの抗ＰＤ１試料又は参照抗体（ヒト抗ＰＤ１；Ｒｏｃｈｅ／マウス抗ＰＤ１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ：３２９９１２）を添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのヒツジ抗ヒトＨ＋Ｌ−ＰＯＤ（ＪＩＲ，ＪＩＲ１０９−０３６−０８８）／ヒツジ抗マウスＰＯＤ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；ＮＡ９３１０）を１：２０００／１：１０００希釈で添加し、振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１１８３５０３３００１）を添加し、ＯＤ２〜３までインキュベートした。測定は３７０／４９２ｎｍで行った。
【０３５４】
ＥＬＩＳＡの結果は、下記の概要の表７及び８に、ＥＣ５０値［ｎｇ／ｍｌ］として列挙する。
【０３５５】
（ＰＤ１の細胞ＥＬＩＳＡ）
全長ヒトＰＤ１をコードするプラスミド１５３１１＿ｈＰＤ１−ｆｌ＿ｐＵＣ＿Ｎｅｏで安定にトランスフェクトされ、Ｇ４１８（プラスミド上のネオマイシン耐性マーカー）により選択された接着性ＣＨＯ−Ｋ１細胞株を、３８４ウェル平底プレートに０．０１×１０Ｅ６細胞／ウェルの濃度で播種し、一晩増殖させた。
【０３５６】
翌日、２５μｌ／ウェルのＰＤ１試料又はヒト抗ＰＤ１（Ｒｏｃｈｅ）／マウス抗ＰＤ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ：３２９９１２）参照抗体を添加し、４℃で２時間インキュベートした（内部移行を避けるため）。注意深く洗浄した後（１×９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴ）細胞を、１×ＰＢＳ緩衝液で希釈した３０μｌ／ウェルの０．０５％グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号：Ｇ５８８２，２５％）を添加することにより固定し、室温で１０分間インキュベートした。洗浄後（３×９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴ）、２５μｌ／ウェルの二次抗体：ヒツジ抗ヒトＨ＋Ｌ−ＰＯＤ（ＪＩＲ，ＪＩＲ１０９−０３６−０８８）／ヒツジ抗マウスＰＯＤ（ＧＥ ＮＡ９３１０）を検出のために加え、振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（３×９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴ）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（Ｒｏｃｈｅ １１８３５０３３００１）を添加し、ＯＤ１．０−２．０までインキュベートした。測定は３７０／４９２ｎｍで行った。
【０３５７】
細胞ＥＬＩＳＡの結果は、下記の概要表の表８に、「ＥＣ５０ ＣＨＯ−ＰＤ１」値［ｎｇ／ｍｌ］として列挙する。
【０３５８】
（ｃｙｎｏＰＤ１のＥＬＩＳＡ）
Ｎｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐストレプトアビジン被覆プレート（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ＃１１９７４９９８００１）を２５μｌ／ウェルのビオチン化ｃｙｎｏＰＤ１−ＥＣＤ−Ｂｉｏｔｉｎでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌの抗ＰＤ１試料又は参照抗体（ヒト抗ＰＤ１；Ｒｏｃｈｅ）を添加し、振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのヒツジ抗ヒトＨ＋Ｌ−ＰＯＤ（ＪＩＲ，ＪＩＲ１０９−０３６−０８８）を１：１０００希釈で添加し、振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ，１１８３５０３３００１）を添加し、ＯＤ２〜３までインキュベートした。測定は３７０／４９２ｎｍで行った。
【０３５９】
ＥＬＩＳＡの結果は、下記の概要の表７及び８に、ＥＣ５０値［ｎｇ／ｍｌ］として列挙する。
【０３６０】
（ＰＤリガンド１置換アッセイ）
Ｎｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐストレプトアビジン被覆プレート（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ＃１１９７４９９８００１）を２５μｌ／ウェルのビオチン化ＰＤ１−ＥＣＤ−ＡｖｉＨｉｓでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌの抗ＰＤ１試料又は参照抗体（マウス抗ＰＤ１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ：３２９９１２）を添加し、振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＰＤ−Ｌ１（組換えヒトＢ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１ Ｆｃキメラ；１５６−Ｂ７，Ｒ＆Ｄ）を添加し、振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのヒツジ抗ヒトＨ＋Ｌ−ＰＯＤ（ＪＩＲ，１０９−０３６−０８８）を１：１０００希釈で添加し、振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ，１１８３５０３３００１）を添加し、ＯＤ２〜３までインキュベートした。測定は３７０／４９２ｎｍで行った。
【０３６１】
ＥＬＩＳＡの結果は、下記の概要の表７に、ＩＣ５０値［ｎｇ／ｍｌ］として列挙する。
【０３６２】
（ＰＤリガンド２置換アッセイ）
Ｎｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐストレプトアビジン被覆プレート（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ＃１１９７４９９８００１）を２５μｌ／ウェルのビオチン化ＰＤ１−ＥＣＤ−ＡｖｉＨｉｓでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌの抗ＰＤ１試料又は参照抗体（マウス抗ｈｕＰＤ１；Ｒｏｃｈｅ）を添加し、振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＰＤ−Ｌ２（組換えヒトＢ７−ＤＣ／ＰＤ−Ｌ２ Ｆｃキメラ；１２２４−ＰＬ−１００，Ｒ＆Ｄ）を添加し、振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのヒツジ抗ヒトＨ＋Ｌ−ＰＯＤ（ＪＩＲ，１０９−０３６−０８８）を１：２０００希釈で添加し、振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ，１１８３５０３３００１）を添加し、ＯＤ２〜３までインキュベートした。測定は３７０／４９２ｎｍで行った。
【０３６３】
ＥＬＩＳＡの結果は、下記の概要の表７に、ＩＣ５０値［ｎｇ／ｍｌ］として列挙する。
【０３６４】
（エピトープマッピングＥＬＩＳＡ／結合競合アッセイ）
Ｎｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ＃４６４７１８）を２５μｌ／ウェルの捕捉抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ；ＪＩＲ；１１５−００６−０７１）でコーティングし、振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、プレートを、振盪機上で室温において、２％のＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液で１時間ブロックした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌのマウス抗ＰＤ１試料を添加し、振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、捕獲抗体を３０μｌ／ウェルのマウスＩｇＧ（ＪＩＲ；０１５−０００−００３）により、振盪機上で室温において１時間ブロックした。同時に、ビオチン化ＰＤ１−ＥＣＤ−ＡｖｉＨｉｓを、振盪機上でＲＴで１時間、第二サンプル抗体と共にプレインキュベートした。アッセイプレートを洗浄した後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、ＰＤ１抗体混合物をアッセイプレートに移し、振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのストレプトアビジンＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ，＃１１０８９１５３００１）を１：４０００希釈で添加し、室温において１時間振盪機上でインキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ，＃１１０８９１５３００１）を添加し、ＯＤ１．５〜２．５までインキュベートした。測定は３７０／４９２ｎｍで行った。エピトープ群は、参照抗体に対する階層的クラスタリングによって定義された。
【０３６５】
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2020058353.tif 000024
【０３６６】
（ヒト化抗ＰＤ−１抗体のＢｉａｃｏｒｅ特徴付け）
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースのアッセイは、幾つかのマウスＰＤ１結合剤並びに市販のヒトＰＤ１結合参照物間の結合の動態パラメータを決定するために使用されている。従って、抗ヒトＩｇＧは、（Ｂｉａｃｏｒｅ）ＣＭ５センサーチップの表面にアミンカップリングによって固定された。ついで、試料を捕獲し、ｈｕＰＤ１−ＥＣＤをそれらに結合させた。センサーチップ表面は、各分析サイクルの後に再生された。１：１ラングミュア相互作用モデルにデータを適合させることによって、平衡定数及び速度定数が最終的に得られた。
【０３６７】
約２０００応答単位（ＲＵ）の２０μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ＃ＢＲ−１００８−３９）を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されるアミンカップリングキットを使用して、ｐＨ５．０でＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００においてＣＭ５センサーチップのフローセル１及び２（あるいは、３及び４）に結合させた。
【０３６８】
試料及びランニング緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰ＋（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０，ｐＨ７．４）であった。フローセル温度は２５℃に、試料コンパートメント温度は１２℃に設定した。システムは、ランニング緩衝液でプライミングした。
【０３６９】
試料を１０ｎＭの濃度で２０秒間注入し、第二のフローセルに結合させた。ついで、各試料にわたって、ヒトＰＤ１−ＥＣＤ濃度（１４４ｎＭ、４８ｎＭ、１６ｎＭ、５．３３ｎＭ、１．７８ｎＭ、０．５９ｎＭ、０．２０ｎＭ及び０ｎＭ）の完全なセットを１２０ｓ間注入した後、３０／３００ｓの解離時間及び３ＭのＭｇＣｌ２を用いた２回の２０ｓの再生工程を続け、その最後のものは、ランニング緩衝液を用いた「注入後の追加の洗浄」を含んでいた。
【０３７０】
最後に、二重参照データを、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを用いて１：１ラングミュア相互作用モデルに適合させた。得られたＫＤ、ｋａ及びｋｄ値を表９に示す。
【０３７１】
2020058353.tif 000025
表９に示されるように、キメラＰＤ１−０１０３の全てのヒト化型（作製は実施例６を参照）は、親抗体（キメラＰＤ１−０１０３）と同様の動態特性を示す。
【０３７２】
（動態）
ＣＭ５センサーシリーズＳをＢｉａｃｏｒｅ４０００システムに取り付け、検出スポットを製造者の説明書に従って流体力学的にアドレス指定した。
【０３７３】
ポリクローナルウサギＩｇＧ抗体＜ＩｇＧＦＣγＭ＞Ｒ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）をフローセル１、２、３及び４中の検出スポット１及び５に１００００Ｒｕで固定した。結合は、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学によって製造者の説明書に従ってなされた。フローセル中の残りのスポットは参照となった。試料緩衝液は、１ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルデキストランを補充したシステム緩衝液であった。
【０３７４】
一実施態様では、アッセイは２５℃でなされた。別の実施態様では、アッセイは３７℃でなされた。５０ｎＭの各マウスモノクローナル抗体を、１０μｌ／分で１分間の注入によってセンサー表面上に捕捉した。続いて、それぞれの抗原を、４分の結合相時間、１００ｎＭ、２×３３ｎＭ、１１ｎＭ、４ｎＭ、１ｎＭ及びシステム緩衝液０ｎＭの濃度系列で３０μｌ／分で注入した。解離を更に４分間モニターした。３０μｌ／分で１０ｍＭのグリシンｐＨ１．５を３分間注入して、捕捉系を再生した。関連する動態データは、製造者の説明書に従ってＢｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアを使用して、計算した。
【０３７５】
（エピトープマッピング）
Ｂｉａｃｏｒｅ４０００機器は、Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＡＰセンサーを取り付け、製造者により推奨されるようにして準備した。機器の緩衝液はＨＢＳ−ＥＴ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０）であった。機器は２５℃で操作した。
【０３７６】
全ての試料をシステム緩衝液で希釈した。３５ｋＤａのビオチン化抗原ＰＤ１−ＥＣＤ−ＡｖｉＨｉｓを、スポット１及び５のフローセル１、２、３及び４への３０μｌ／分での１分間の注入によってＣＡＰセンサー表面上２００ＲＵで捕捉した。スポット２、３及び４は参照となった。別の実施態様では、３５ｋＤａのビオチン化抗原ＰＤ１−ＥＣＤ−ＡｖｉＨｉｓをＣＡＰセンサー上に同じ様式で２００ＲＵで捕捉した。
【０３７７】
その後、一次抗体を１００ｎＭで３分間３０μｌ／分で注入し、続いて二次抗体を１００ｎＭで３分間３０μｌ／分で注入した。一次抗体は、表面提示抗原が完全に飽和するまで注入した。一次抗体及び二次抗体の注入段階の終わりに、各抗体の結合応答をモニターするために、レポート点「結合後期」（ＢＬ）を設定した。二次抗体結合応答「ＢＬ２」と一次抗体応答「ＢＬ１」との間の商であるモル比を計算した。抗原が既に一次抗体によって複合体化されている場合、モル比を二次抗体の抗原接近可能性の指標として使用した。
【０３７８】
製造者によって推奨されるように、３０μｌ／分の２Ｍのグアニジン−ＨＣＬ、２５０ｍＭのＮａＯＨ再生緩衝液を２分間注入し、その後、３０μｌ／分のシステム緩衝液を１分間注入することにより、複合体をセンサー表面から完全に除去した。
【０３７９】
実施例６：混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるサイトカイン産生に対する異なる抗ＰＤ−１抗体の効果
３Ａ）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）は、ある個体（ドナーＸ）由来のリンパ球の別の個体（ドナーＹ）由来のリンパ球への活性化を測定する免疫細胞アッセイである。混合リンパ球反応を使用して、リンパ球エフェクター細胞に対するＰＤ１経路を遮断する効果を実証した。アッセイにおけるＴ細胞を、抗ＰＤ１ ｍＡｂの存在下又は非存在下での活性化及びそれらのＩＦＮ−γ分泌について試験した。
【０３８０】
同種異系ＭＬＲを実施するために、Ｌｅｕｋｏｓｅｐ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ，２２７２８８）を使用する密度勾配遠心分離によって、未知のＨＬＡ型の少なくとも４人の健康なドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。簡潔に述べると、ヘパリン処理した血液試料を３倍容量のＰＢＳで希釈し、希釈した血液の２５ｍｌアリコートを５０ｍｌのＬｅｕｋｏｓｅｐチューブに層化した。室温で８００×ｇで１５分間遠心分離した後（中断なし）、リンパ球含有画分を回収し、ＰＢＳで洗浄し、機能アッセイで直接使用するか、又は１．０Ｅ＋０７細胞／ｍｌで凍結培地（１０％ＤＭＳＯ、９０％ＦＣＳ）中に再懸濁させ、液体窒素で保存した。個々の２方向ＭＬＲ反応を、１：１の刺激／応答細胞比で二つの異なるドナーからのＰＢＭＣを混合することによってセットアップし、異なる濃度範囲の精製された抗ＰＤ１モノクローナル抗体ＰＤ１−００５０、ＰＤ１−００６９、ＰＤ１−００７３、ＰＤ１−００７８、ＰＤ１−００９８、ＰＤ１−０１０２、ＰＤ１−０１０３の存在下又は非存在下、平底９６ウェルプレートで少なくとも２連で３７℃、５％ＣＯ２で６日間、共培養を行った。参照抗ＰＤ１抗体として、ニボルマブ（ＭＤＸ−５Ｃ４又はＭＤＸ−１１０６としても知られている）又はペンブロリズマブ（ＭＫ−３４７５又はＯｒｇ １．０９Ａとしても知られている）の何れかのＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体を合成し、ヒトＩｇＧ１（変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックス）を有する））の骨格でクローニングした。抗体なしか又はアイソタイプ対照抗体を陰性対照として使用し、ｒｅｃ ｈｕ ＩＬ−２（２０ＥＵ／ｍｌ）を陽性対照として使用した。６日後、サイトカイン測定のために各培養物から１００μｌの培地を採取した。ＩＦＮ−γのレベルを、ＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。
【０３８１】
結果を表１０に示す（ＩＦＮ−ｇ分泌／放出）。抗ＰＤ１モノクローナル抗体は、濃度依存的な形でＴ細胞活性化及びＩＦＮ−γ分泌を促進した。ＩＦＮｇ分泌の増加％値は、如何なる遮断ｍＡｂ（基底同種異系刺激誘発ＩＦＮｇ値をＥ−ｃとして）も添加しないＭＬＲ及び２０ＥＵ／ｍｌのｒｅｃ ｈｕ ＩＬ−２（陽性対照＝１００％ＩＦＮｇ値をＥ＋ｃとして）を添加したＭＬＲのＩＦＮ−ｇ産生に関して計算し、式：Ｒｅｌ.Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ［％］＝((Ｅｓａｍｐｅｌ−Ｅ-ｃ)／(Ｅ+ｃ−Ｅ-ｃ)×１００に従って計算した。
2020058353.tif 000026
【０３８２】
幾つかのＰＤ１遮断抗体ＰＤ１−００５０、ＰＤ１−００６９、ＰＤ１−００７３、ＰＤ１−００７８、ＰＤ１−００９８、ＰＤ１−０１０２、ＰＤ１−０１０３は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ｇ）の分泌を増強することによって強力な免疫調節活性を示した（データは全抗体については示さず）。
【０３８３】
３Ｂ）更なる実験では、キメラＰＤ１−０１０３（変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックス）を有するヒトＩｇＧ１アイソタイプ）を評価した。キメラＰＤ１−０１０３を用いたＰＤ１の遮断は、同種異系刺激初代ヒトＴ細胞によるＩＦＮ−γ分泌を強く増強する。キメラＰＤ１−０１０３は、参照抗ＰＤ１抗体よりも強力である（図１参照）。
【０３８４】
比較のために、ニボルマブ（ＭＤＸ５Ｃ４又はＭＤＸ−１１０６としても知られる）及びペンブロリズマブ（ＭＫ−３４７５又はＯｒｇ１．０９Ａとしても知られる）の何れかのＶＨ及びＶＬドメインを含む参照抗ＰＤ１抗体を合成し、ヒトＩｇＧ１の骨格（変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックス）を有する）でクローニングしたものを使用した。
【０３８５】
３Ｃ）更なる実験において、抗ＰＤ−１抗体ＰＤ１−０１０３のヒト化変異体（図２及び３のヒト化抗体ＰＤ１−０１０３−０３１２、ＰＤ１−０１０３−０３１４、以下の実施例９も参照のこと）の免疫調節活性、ａ）ＩＦＮ放出（分泌）ｂ）ＴＮＦ−α放出（分泌）を、上述のＭＬＲで評価した。キメラＰＤ１−０１０３抗体とそのヒト化型の効果を、ヒトＩｇＧ１の骨格（変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックス）を有する）ニボルマブ（ＭＤＸ５Ｃ４又はＭＤＸ−１１０６としても知られている）及びペンブロリズマブ（ＭＫ−３４７５又はＯｒｇ１．０９Ａとしても知られている）何れかのＶＨ及びＶＬドメインを含む参照抗ＰＤ１抗体と比較した。ＭＬＲ培養の６日後、５０μｌの上清を採取し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ ＰｒｏＴＭヒトサイトカインＴｈ１／Ｔｈ２アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して単一培養で複数のサイトカインを測定した。（データは全てのサイトカインについては示さず）。
【０３８６】
キメラＰＤ１−０１０３抗体とそのヒト化型（ＰＤ１−０１０３＿０３１２及びＰＤ１−０１０３＿０３１４）は、Ｔ細胞活性化及びＩＦＮ−γ分泌の増強において参照抗ＰＤ１抗体と比較してより強力であった（図２参照）。
【０３８７】
更に、キメラＰＤ１−０１０３抗体とそのヒト化変異体は、抗原提示細胞による腫瘍壊死因子α（ＴＮＦアルファ）（図３参照）及びＩＬ−１２（データは示さず）の分泌を増加させ、単球／マクロファージ又は抗原提示細胞のＴ細胞を刺激する能力を増強する。
【０３８８】
実施例７：同種異系成熟樹状細胞と共培養したヒトＣＤ４ Ｔ細胞による細胞傷害性グランザイムＢ放出及びＩＦＮ−γ分泌に対する抗ＰＤ−１遮断の効果
同種異系設定での抗ＰＤ−１処置の効果を更に調べるために、我々は、新しく精製したＣＤ４ Ｔ細胞を単球由来同種異系成熟樹状細胞（ｍＤＣ）の存在下で５日間共培養するアッセイを開発した。１週間前に新鮮なＰＢＭＣから単球をプラスチック付着により単離し、続いて非付着細胞を除去した。ついで、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−４（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む培地中で５日間それらを培養することにより、単球から未成熟ＤＣを作製した。ｉＤＣ成熟を誘導するために、我々は、更に２日間、培養培地にＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６（それぞれ５０ｎｇ／ｍｌ）を加えた。ついで、我々は、主要組織適合性複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）、ＣＤ８０、ＣＤ８３及びＣＤ８６のその表面発現をフローフローメトリーにより測定することによりＤＣ成熟を評価した（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【０３８９】
最小混合リンパ球反応（ｍＭＬＲ）の日に、無関係のドナーから得られた１０８個のＰＢＭＣから、マイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によってＣＤ４ Ｔ細胞を濃縮した。前培養では、ＣＤ４ Ｔ細胞を５ｍＭのカルボキシ−フルオレセイン−スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識した。ついで、１０５個のＣＤ４ Ｔ細胞を、遮断抗ＰＤ１抗体（ＰＤ１−０１０３、キメラＰＤ１−０１０３、又は図４Ａ及び４Ｂにおいて０３１２、０１３１３、０１４１、０３１５と略記されるヒト化抗体ＰＤ１−０１０３−０３１２、ＰＤ１−０１０３−０３１３、ＰＤ１−０１０３−０３１４、ＰＤ１−０１０３−０３１５の何れか）の存在下又は非存在下で、図に別の表示がなされていないならば１０μｇ／ｍｌの濃度で、成熟アロ−ＤＣ（５：１）と共に９６ウェルプレートに播種した。
【０３９０】
５日後、我々は、細胞培養上清を収集し、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）によりＩＦＮ−γレベルを測定するために後で使用し、ゴルジプラグ（ブレフェルジンＡ）及びゴルジストップ（モネンシン）の存在下で更に５時間３７℃に細胞を放置した。ついで、細胞を洗浄し、抗ヒトＣＤ４抗体及びＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ固定色素Ａｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で表面に染色した後、Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で固定／透過処理した。我々は、グランザイムＢ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２（双方ともｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）の細胞内染色を実施した。
【０３９１】
我々はまた異なる濃度のヒト化変異体ＰＤ１−０１０３（図において０３１２、０１３１３、０３１４、０３１５と略記されるヒト化抗体ＰＤ１−０１０３−０３１２、ＰＤ１−０１０３−０３１３、ＰＤ１−０１０３−０３１４、ＰＤ１−０１０３−０３１５、以下の実施例９もまた参照のこと）を試験し、それらがグランザイムＢ及びインターフェロンガンマの増強において等しく良好であることを見出した。ＤＰ４７は、ＦｃγＲによる認識を回避するためにＦｃ部分にＬＡＬＡ変異を有する非結合ヒトＩｇＧであり、陰性対照として使用した。結果を図４Ａ及び４Ｂに示す。
【０３９２】
実施例８：キメラ抗体誘導体
キメラＰＤ１抗体を、抗ＰＤ１マウス抗体ＰＤ１−００９８、ＰＤ１−０１０３の可変重鎖及び軽鎖領域をＰＣＲによって増幅し、エフェクター機能を抑止する変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックス））（ロイシン２３４からアラニン、ロイシン２３５からアラニン、プロリン３２９からグリシン）を有するヒトＩｇＧ１骨格／ヒトＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３との融合タンパク質として重鎖発現ベクター中に、またヒトＣ−カッパに対する融合タンパク質として軽鎖発現ベクター中にそれらをクローニングすることによって作製した。ついで、ＬＣ及びＨＣプラスミドをＨＥＫ２９３にコトランスフェクトし、７日後に、抗体精製のための標準的な方法によって上清から精製した。キメラＰＤ１抗体をキメラｃｈｉＰＤ１−００９８（ｃｈｉＰＤ１−００９８）及びキメラＰＤ１−０１０３（ｃｈｉＰＤ１−０１０３）と命名し直した。比較のために、ニボルマブ（ＭＤＸ−５Ｃ４又はＭＤＸ−１１０６としても知られている）及びペンブロリズマブ（ＭＫ−３４７５又はＯｒｇ１．０９Ａとしても知られている）の何れかのＶＨ及びＶＬドメインを含む参照抗ＰＤ１抗体を合成し、ヒトＩｇＧ１（変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックス）を有する）の骨格と共にクローニングしたものを使用した。
【０３９３】
実施例９：抗ＰＤ１抗体ＰＤ−０１０３のヒト化変異体（ｈｕＭａｂ ＰＤ−０１０３）の作製、発現及び精製と特徴付け
マウス抗ＰＤ１抗体０１０３のＶＨ及びＶＬドメインのヒト化
マウス抗ＰＤ１抗体ＰＤ１−０１０３のマウスＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号：４３及び４４）に基づいて、ヒト化抗抗ＰＤ１抗体変異体を作製した。
【０３９４】
ヒト化ＶＨ−変異体は、幾つかの変異を有するヒトＪ−エレメント生殖系列ＩＧＨＪ５−０１と組み合わせた、ヒト生殖系列ＩＭＧＴ＿ｈＶＨ＿３＿２３に基づいている。（配列番号：４５となる）。
【０３９５】
ＶＬのヒト化変異体は、ヒトＪ−生殖系列ＩＧＫＪ１−０１と組み合わせたヒト生殖系列ＩＭＧＴ＿ｈＶＫ＿４＿１、ＩＭＧＴ＿ｈＶＫ＿２＿３０、ＩＭＧＴ＿ｈＶＫ＿３＿１１及びＩＭＧＴ＿ｈＶＫ＿１＿３９に基づく。異なる変異により、配列番号：４６〜配列番号：４９のヒト化変異体が得られた。
【０３９６】
ＰＤ１−０１０３の重鎖及び軽鎖可変領域のヒト化アミノ酸配列をＤＮＡに逆翻訳し、得られたｃＮＤＡを合成し（ＧｅｎＡｒｔ）、ついでエフェクター機能を抑止するＬＡＬＡ及びＰＧ変異（ロイシン２３４からアラニン、ロイシン２３５からアラニン、プロリン３２９からグリシン）を有するヒトＩｇＧ１骨格／ヒトＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３との融合タンパク質として重鎖発現ベクター中に、またヒトＣ−カッパに対する融合タンパク質として軽鎖発現ベクター中にクローニングした。ついで、ＬＣ及びＨＣプラスミドをＨＥＫ２９３にコトランスフェクトし、７日後に、抗体精製のための標準的な方法によって上清から精製した。得られたヒト化ＰＤ１抗体は、以下のように命名される：
2020058353.tif 000027
2020058353.tif 000028
【０３９７】
ヒト化ＰＤ１−０１０３抗体変異体及び親キメラＰＤ１−０１０３を上に記載のようにして特徴付けた。結果を表１３に示す。
2020058353.tif 000029
【０３９８】
実施例１０：ＰＤ−１抗体の中和効力
インビトロでの抑制されたＴ細胞応答の回復の模倣において社内で作製したＰＤ−１抗体の中和効力を試験するために、市販のＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１レポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。このシステムはＰＤ１＋ＮＦＡＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞と、活性化シグナルをまた与えるＰＤ−Ｌ１＋ＣＨＯカウンターパートで構成される。原理的には、レポーター系は、（１）ＴＣＲ媒介ＮＦＡＴ活性化、（２）ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸による活性化時のＮＦＡＴシグナルの抑制、及び（３）ＰＤ−１遮断抗体によるＮＦＡＴシグナルの回復の３工程に基づく。
【０３９９】
材料と方法：
・ＰＤ−Ｌ１培地：ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ（＃Ｐ０４−０３６０９）；ＦＢＳ（１０％）及びＬ−Ｇｌｎ（４ｍＭ）
・アッセイ培地：ＲＰＭＩ１６４０（＃３１８７０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ−Ｇｌｎ、ＦＢＳ（２％）
・このアッセイに使用した細胞（両方ともＰｒｏｍｅｇａによる購入細胞型）：
ＰＤ−Ｌ１＋ＣＨＯ細胞（バッチ番号＃１３９１４７）：２−３×１０４細胞／９６ウェル
ＰＤ−１＋ＮＦＡＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞（バッチ番号＃１３３０２４：３．５×１０４細胞／ウェル
【０４００】
１日目に、ＰＤ−Ｌ１＋細胞を解凍し、上述した培地中の示された細胞濃度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で一晩培養した。次の日に、培地を除去し、ＰＤ−Ｌ１＋細胞を、指示された濃度（アッセイ培地中）で、調製した抗体と共にインキュベートした。並行して、ＰＤ−１＋ＮＦＡＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞を解凍し、上記の細胞数を移してＰＤ−Ｌ１＋細胞と共に共培養した。３７℃及び５％ＣＯ２で６時間インキュベートした後、Ｂｉｏ−Ｇｌｏ基質を室温まで温めた（添加前１−２時間）。細胞培養プレートをインキュベーターから取り出し、室温（１０分間）に調整した後、１ウェル当たり８０μｌのＢｉｏ−Ｇｌｏ溶液を添加し、５〜１０分間インキュベートした後、ルミネセンスをＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅリーダーでキットの製造者の推奨に従って測定した。結果は、図５Ａ及び５Ｂに見ることができ、ＴＣＲ刺激時の異なるＰＤ−１抗体によるＮＦＡＴシグナルのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１媒介抑制の回復が示されている：図５Ａ：キメラＰＤ１＿０１０３は、参照抗体と比較した場合、再現性良く優れた効果を示した。参照として、ＶＨ及びＶＬドメインを含む抗ＰＤ１抗体ニボルマブ（ＭＤＸ−５Ｃ４又はＭＤＸ−１１０６としても知られている）を合成し、ヒトＩｇＧ１の骨格（変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックス）を有する）を用いてクローン化した。図５Ｂ：ＰＤ１＿０１０３の４つのヒト化変異体は、リード抗体と同様のインビトロ効力を示し、また参照抗体より僅かに優れていた。
【０４０１】
［二重特異性ＰＤ１／ＴＩＭ３抗体］
実施例１１Ａ
一つの結合アームにＶＨ／ＶＬドメイン交換／置換（ＣｒｏｓｓＭＡｂＶｈ−ＶＬ）を有し、ＣＨ１／ＣＬ界面に単一荷電アミノ酸置換を有する、ＰＤ１及びＴＩＭ３に結合する多重特異性抗体の産生及び発現
一例では、ヒトＰＤ１とヒトＴＩＭ３に結合する多重特異性抗体は、古典的分子生物学技術によって一般方法のセクションに記載されたように作製され、上記のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の２９３Ｆに一過性に発現された。多重特異性１＋１ ＣｒｏｓｓＭＡｂＶｈ−Ｖｌ抗体は、国際公開第２００９／０８０２５２号にも記載されている。表１４ａに示されるアミノ酸配列をコードする核酸を含む発現プラスミドを使用して、多重特異性抗体を発現させた。
2020058353.tif 000030
【０４０２】
全てのコンストラクトに対して、典型的なノブ（Ｔ３６６Ｗ）置換を第一ＣＨ３ドメインに含み、対応するホール置換（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４１０Ｖ）を第二ＣＨ３ドメインに（並びに二つの追加導入されたシステイン残基Ｓ３５４Ｃ／Ｙ３４９’Ｃを（上に示したそれぞれの対応重鎖（ＨＣ）配列に含まれる））含むノブ・イントゥ・ホールヘテロ二量体化技術を使用した。
【０４０３】
実施例１１Ｂ
二つの結合アームにＶＨ／ＶＬドメイン交換／置換（２＋２ ＣｒｏｓｓＭＡｂＶｈ−ＶＬ）を有し、ＣＨ１／ＣＬ界面に単一荷電アミノ酸置換を有する、ＰＤ１とＴＩＭ３に結合する多重特異性抗体の産生及び発現
一例では、ヒトＰＤ１及びヒトＴＩＭ３に結合する多重特異性抗体は、古典的分子生物学技術によって一般方法のセクションに記載されたように作製され、上記のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の２９３Ｆに一過性に発現された。多重特異性２＋２ ＣｒｏｓｓＭＡｂＶＨ−ＶＬ抗体は、国際公開第２０１０／１４５７９２号にも記載されている。表１４ｂに示されるアミノ酸配列をコードする核酸を含む発現プラスミドを使用して、多重特異性抗体を発現させた。
2020058353.tif 000031
【０４０４】
実施例１１Ｃ
ＰＤ１とＴＩＭ３に結合する多重特異性抗体の精製と特徴付け
上で発現された多重特異性抗体を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせによって上清から精製した。全ての多重特異性抗体は、良好な収量で生産することができ、安定である。得られた生成物を、質量分析による同定並びに分析特性、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度、モノマー含量及び安定性について特徴付けをした。
【０４０５】
（質量分析）
予想された一次構造を、脱グリコシル化されたインタクトＣｒｏｓｓＭａｂ、及び脱グリコシル化／プラスミン消化された又は代替的な脱グリコシル化／限定ＬｙｓＣ消化されたＣｒｏｓｓＭａｂのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）によって分析した。
【０４０６】
ＶＨ／ＶＬ ＣｒｏｓｓＭａｂを、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で３７℃において最大１７時間、リン酸又はＴｒｉｓ緩衝液中のＮ−グリコシダーゼＦで脱グリコシル化した。プラスミン消化又は限定ＬｙｓＣ（Ｒｏｃｈｅ）消化を、それぞれ室温で１２０時間と、３７℃で４０分間、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８）中の１００μｇの脱グリコシル化ＶＨ／ＶＬＣｒｏｓｓＭａｂを用いて実施した。質量分析に先立ち、試料をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのＨＰＬＣにより脱塩した。ＴｒｉＶｅｒｓａ ＮａｎｏＭａｔｅ源（Ａｄｖｉｏｎ）を備えたｍａＸｉｓ４Ｇ ＵＨＲ−ＱＴＯＦ ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ）でのＥＳＩ−ＭＳによって全質量を決定した。
【０４０７】
（多重特異性抗体の安定性）
抗体コンストラクトの安定性を評価するために、熱安定性並びに凝集開始温度を次の手順に従って評価した。示された抗体の試料を、２０ｍＭのヒスチジン／塩化ヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ６．０中で１ｍｇ／ｍＬの濃度で調製し、１０μＬのマイクロキュベットアレイ中に移し、静的光散乱データ並びに２６６ｎｍレーザーによる励起時の蛍光データを、試料を２５℃から９０℃まで０．１℃／分の速度で加熱しながら、Ｏｐｔｉｍ１０００機器（Ａｖａｃｔａ Ｉｎｃ．）で記録した。
【０４０８】
凝集開始温度（Ｔａｇｇ）は、散乱光強度が増加し始める温度として定義される。融解温度（Ｔｍ）は、蛍光強度対波長のグラフにおける屈曲点として定義される。結果を表１５に示す。
2020058353.tif 000032
【０４０９】
実施例１２
抗ＰＤ１−ＴＩＭ３多重特異性抗体の特徴付け
（結合Ｅｌｉｓａ）
（ｈｕＰＤ１に対するＥＬＩＳＡ）
Ｎｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐストレプトアビジン被覆プレート（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ＃１１９７４９９８００１）を、５００ｎｇ／ｍｌの濃度で２５μｌ／ウェルのビオチン化ＰＤ１−ＥＣＤ−ＡｖｉＨｉｓで被覆し、４℃で一晩インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌの抗ＰＤ１抗体試料を増加濃度で添加し、室温において１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのヤギ抗ヒトＨ＋Ｌ−ＰＯＤ（ＪＩＲ，ＪＩＲ１０９−０３６−０９８）を１：５０００希釈で添加し、振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ，１１８３５０３３００１）を添加し、ＯＤ２〜３までインキュベートした。測定は３７０／４９２ｎｍで行った。
【０４１０】
（ｈｕＴＩＭ３に対するＥＬＩＳＡ）
Ｎｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐストレプトアビジン被覆プレート（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ＃１１９７４９９８００１）を、６０ｎｇ／ｍｌの濃度で２５μｌ／ウェルのビオチン化ＴＩＭ３−ＥＣＤ−ＡｖｉＨｉｓで被覆し、４℃で一晩インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌの抗ＰＤ１抗体試料を増加濃度で添加し、室温において１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのヤギ抗ヒトＨ＋Ｌ−ＰＯＤ（ＪＩＲ，ＪＩＲ１０９−０３６−０９８）を１：５０００希釈で添加し、振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ，１１８３５０３３００１）を添加し、ＯＤ２〜３までインキュベートした。測定は３７０／４９２ｎｍで行った。
【０４１１】
ＥＬＩＳＡの結果は、表１６にＥＣ５０値［ｎＭ］として列挙する。
2020058353.tif 000033
【０４１２】
Ｔｉｍ３に対して２価である抗体（キメラＴＩＭ３−００１８、２＋２ ＰＤ１ＴＩＭ３−０３５９、キメラＴＩＭ３−００２８、２＋２ ＰＤ１ＴＩＭ３−０３５８）についてＡｖｉｄ結合（すなわち、両アームとの結合）を検出することができる。１＋１ＣｒｏｓｓＭａｂに対する高いＥＣ５０値は、被覆抗原への一価（Ｔｉｍ３に対して）の非アビド結合から生じる。アビディティー効果は、ＰＤ１結合に対しては検出されなかった。ＥＣ５０値は、二価及び四価フォーマットに匹敵する。
【０４１３】
（結合Ｂｉａｃｏｒｅ）
（ＰＤ１及びＴＩＭ３に結合する多重特異性抗体の抗原結合特性）
それらの各標的抗原、すなわちＰＤ１及びＴＩＭ３に対する多重特異性抗体の結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）によって評価した。
【０４１４】
ＰＤ１結合を次の手順に従って評価した：
抗ヒトＦｃＩｇＧを、（Ｂｉａｃｏｒｅ）ＣＭ５センサーチップの表面にアミンカップリングによって固定した。ついで、試料を捕捉し、ｈｕＰＤ１−ＥＣＤをそれらに結合させた。センサーチップ表面を各分析サイクルの後に再生した。平衡定数と速度定数を、１：１ラングミュア相互作用モデルにデータを適合させることによって最終的に得た。
【０４１５】
２０μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ＃ＢＲ−１００８−３９）の約１００００応答単位（ＲＵ）を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅが提供するアミンカップリングキットを使用して、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００において、ＣＭ５センサーチップの全フローセル上に結合させた。試料及びランニング緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰ＋（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０，ｐＨ７．４）であった。フローセル温度は２５℃に、試料コンパートメント温度は１２℃に設定した。システムは、ランニング緩衝液でプライミングした。
【０４１６】
異なる試料を１０ｎＭの濃度で１５秒間注入し、フローセル２、３及び４に連続して結合させた。ついで、ヒトＰＤ１−ＥＣＤ濃度の完全なセット（３００ｎＭ、１００ｎＭ、２×３３．３ｎＭ、１１．１ｎＭ、３．７ｎＭ、１．２ｎＭ及び２×０ｎＭ）を３００ｓの間、各試料に注入し、続いて１０／６００ｓの解離時間及び３ＭのＭｇＣｌ２を用いた２回の３０ｓの再生工程を行い、その最後の工程はランニング緩衝液での「注入後の追加の洗浄」を含んでいた。最後に、二重参照データを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを用いて１：１ラングミュア相互作用モデルに適合させた。得られたＫＤ、ｋａ及びｋｄ値を表１７に示す。
【０４１７】
ＴＩＭ３結合を次の手順に従って評価した：
抗ヒトＦａｂＩｇＧを、（Ｂｉａｃｏｒｅ）ＣＭ５センサーチップの表面にアミンカップリングによって固定した。ついで、試料を捕捉し、ｈｕＴｉｍ３−ＥＣＤをそれらに結合させた。センサーチップ表面を各分析サイクルの後に再生した。平衡定数と速度定数を、１：１ラングミュア相互作用モデルにデータを適合させることによって最終的に得た。
【０４１８】
２０μｇ／ｍｌの抗ヒトＦａｂ ＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ＃２８−９５８３−２５）の約１００００応答単位（ＲＵ）を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅが提供するアミンカップリングキットを使用して、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００において、ＣＭ５センサーチップの全フローセル上に結合させた。試料及びランニング緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰ＋（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０，ｐＨ７．４）であった。フローセル温度は２５℃に、試料コンパートメント温度は１２℃に設定した。システムは、ランニング緩衝液でプライミングした。
【０４１９】
異なる試料を１０ｎＭの濃度で３０秒間注入し、フローセル２、３及び４に連続して結合させた。ついで、ヒトＴｉｍ３−ＥＣＤ濃度の完全なセット（６００ｎＭ、２００ｎＭ、２×６６．７ｎＭ、２２．２ｎＭ、７．４ｎＭ及び２×０ｎＭ）を２００ｓの間、各試料に注入し、続いて１０／６００ｓの解離時間及びグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．１）を用いた２回の３０ｓの再生工程を行い、その最後の工程はランニング緩衝液での「注入後の追加の洗浄」を含んでいた。最後に、二重参照データを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを用いて１：１ラングミュア相互作用モデルに適合させた。得られたＫＤ、ｋａ及びｋｄ値を表１７に示す。
【０４２０】
結果は表１７に示される。
2020058353.tif 000034
試験した全ての抗体は、双方の標的ＰＤ１及びＴＩＭ３に特異的に結合し、ナノモル範囲の抗原親和性を示す。
【０４２１】
実施例１３：組換え細胞への抗ＰＤ１／ＴＩＭ３二重特異性抗体の同時結合のためのＦＲＥＴアッセイ
この実施例は、一つの細胞上に存在する二つの異なる受容体への二重特異性抗体フォーマットの同時結合を決定するための細胞ベースのＴＲ−ＦＲＥＴアッセイの開発を記載する。選択されたＴａｇ−ｌｉｔｅ技術は、細胞表面上に存在する抗原を蛍光ドナー又はアクセプター色素で標識することを可能にする、古典的ＴＲ−ＦＲＥＴ（時間分解蛍光共鳴エネルギー移動）とＳＮＡＰタグ技術（例えばＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＣＩＳＢＩＯ）の組み合わせである。
【０４２２】
（この技術評価の目的）
このアッセイは、与えられた受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）と、蛍光染料が結合可能なタグとからなる組換え融合タンパク質としてＰＤ１及びＴｉｍ３受容体両方を発現する細胞への抗ＰＤ１／Ｔｉｍ３二重特異性抗体の同時結合を実証することを意図している。両方の標識受容体に結合することができるＰＤ１−Ｔｉｍ３二重特異性抗体の存在下で、タンパク質は近接してきて、二つのＦＲＥＴ色素間のエネルギー移動を可能にする（図６参照）。
【０４２３】
（組換えＰＤ１＋ＴＩＭ３＋ＨＥＫ細胞の作製）
Sambrook等, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているように、標準的な方法を使用してＤＮＡを作製した。ＰＤ１及びＴＩＭ３変異体のクローニングのために、ＳＮＡＰ又はＣＬＩＰを受容体のＴＭ領域の近位に挿入し、７ａａを除いて細胞質ドメインを除去し、Ｆｌａｇタグで置換した。
【０４２４】
（一過性トランスフェクション）
ＨＥＫ２９３細胞を、全量１５μｇのＤＮＡを含む二つのプラスミドを一回で使用して３０ｍｌの培養容量中、トランスフェクション試薬２９３ｆｒｅｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）及びＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ還元血清培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で同時トランスフェクトした。簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３細胞を、ＰＤ１又はＴｉｍ３ ＥＣＤと他の場所に記載したＳＮＡＰ又はＣＬＩＰタグからなる融合タンパク質をコードする次のプラスミドで一過性にトランスフェクトした：
プラスミドＩＤ及び参照、例えばＰＤ１−ＳＮＡＰ、Ｔｉｍ３−ＣＬＩＰ（ＰＤ１−ＣＬＩＰとＴｉｍ３−ＳＮＡＰの組み合わせをまた構築し発現させたが、低いＦＲＥＴシグナルしかもたらさなかった）。
【０４２５】
プラスミド：
ａ）ＰＤ１−ＳＮＡＰ（５’から３’方向）：
−  シグナルペプチドを含むヒトＰＤ１細胞外ドメインをコードする核酸（配列番号：８９（３０）の残基１−１７０）、
−  ＧＧＧＧＳスペーサーをコードする核酸（配列番号：９０）、
−  Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡ−アルキルトランスフェラーゼ（ｈＡＧＴ）のヒト遺伝子の変異型であるｐＳＮＡＰ−タグ（Ｔ７）２（Ｎ末端メチオニン残基なし）由来のＳＮＡＰをコードする核酸。（野生型ｈＡＧＴと比較して、ＳＮＡＰタグタンパク質は、変異Ｃ２６Ａ、Ｋ１２５Ａ、Ａ１２７Ｔ、Ｒ１２８Ａ、Ｇ１３１Ｋ、Ｇ１３２Ｔ、Ｍ１３４Ｌ、Ｒ１３５Ｓ、Ｃ１５０Ｓ、Ｎ１５７Ｇ、Ｓ１５９Ｅを含み、Ｇ１８２の後で切断される）（配列番号：９１）、
−  ＧＧＧＧＳスペーサーをコードする核酸（配列番号：９０）、
−  ヒトＰＤ１−膜貫通及び細胞質ドメインをコードする核酸（配列番号：８９の残基１７１−１９１）、
−  ＧＧＧＧＳスペーサーをコードする核酸（配列番号：９０）、
−  Ｆｌａｇタグをコードする核酸（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号：９２）。
【０４２６】
ｂ）Ｔｉｍ３−ＣＬＩＰ（５’から３’方向）：
−  シグナルペプチドを含むヒトＴｉｍ３−細胞外ドメインをコードする核酸（配列番号：９３の残基１−２０２）、
−  ＧＧＧＧＳスペーサーをコードする核酸（配列番号：９０）、
−  Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡ−アルキルトランスフェラーゼ（ｈＡＧＴ）のヒト遺伝子の変異型であるｐＣＬＩＰｆ（Ｎ末端メチオニン残基を有さない）由来のＣＬＩＰをコードする核酸（配列番号：９４）、
−  ＧＧＧＧＳスペーサーをコードする核酸（配列番号：９０）、
−  ヒトＴｉｍ３膜貫通及び細胞質ドメインをコードする核酸（配列番号：９３の残基２０３−２３０）
−  ＧＧＧＧＳスペーサーをコードする核酸（配列番号：９０）、
−  Ｆｌａｇタグをコードする核酸（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号：９２）。
【０４２７】
トランスフェクションの際、ＦＡＣＳ（トランスフェクション後２４〜４８時間）又はＦＲＥＴ実験（４８時間後）での最終使用まで、細胞を振盪フラスコ中でインキュベートした。
【０４２８】
（一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるＰＤ１及びＴｉｍ３発現の確認（ＦＡＣＳ））
Ｈｅｋ２９３細胞の一過性トランスフェクションの２４−４８時間後、細胞をＰＤ１及びＴｉｍ３発現について分析した：通常、１〜３×１０５の単一又は二重トランスフェクト細胞を氷上で１０μｇ／ｍｌで３０分間染色し、ＰＢＳ／２％ＦＣＳで２回洗浄し、ＦａｃｓＣａｎｔｏＩＩで、
・ＰＤ１−ＦＩＴＣ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３２９９０４、クローンＥＨ１２．２Ｈ７）又はＰＤ１−ＰＥ（Ｒ＆Ｄ＃ＦＡＢ１０８６Ｐ）及び／又は
・Ｔｉｍ３−ＰＥ（Ｒ＆Ｄ ＦＡＢ２３６５Ｐクローン３４４８２３）及び／又は
を使用して分析した。
【０４２９】
（抗ＰＤ１／ＴＩＭ３二重特異性抗体による細胞標識及びＦＲＥＴアッセイの説明）
抗ＰＤ１／ＴＩＭ３二重特異性抗体による細胞標識及びＦＲＥＴアッセイの説明：
トランスフェクションした細胞を沈降させ、Ｔａｇ−ｌｉｔｅ緩衝液（Ｃｉｓｂｉｏ）中に１×１０６細胞／ｍｌの密度で再懸濁させた。ついで、細胞を、Ｔａｇ−Ｌｉｔｅ緩衝液（Ｃｉｓｂｉｏ）中、３７℃で１時間、１００ｎＭのＳＮＡＰ−Ｌｕｍｉ４−Ｔｂ（Ｃｉｓｂｉｏ）及び１００ｎＭのＣｌｉｐ−Ｒｅｄ（Ｃｉｓｂｉｏ）を用いて染色した。洗浄しＰＢＳ／２％ＦＣＳ中に再懸濁した後、約５００００個の細胞（５０μｌ容量中）を９６ウェル平底白プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に播種した後、対照（例えば単一特異性、アイソタイプ参照）又は二重特異性抗体を細胞に最終濃度０．００１〜１０ｎＭで加えた。幾つかの実験では、親モノクローナル抗体をヤギ抗ヒトＦｃ（最終濃度２０ｎＭ、データは示さず）を介して架橋させた。４℃又は室温で１時間インキュベートした後、供給業者によって提供された標準設定を使用してＢＭＧ Ｐｈｅｒａｓｔａｒリーダー又はＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００Ｐｒｏで６６５／６２０ｎｍの比で時間分解蛍光を測定した。場合によっては、ＳＮＡＰ−Ｌｕｍｉ４−Ｔｂ及び１００ｎＭのＣｌｉｐ−Ｒｅｄ標識細胞を−８０℃又は液体窒素中で保存し、ＦＲＥＴ実験のために新たに解凍した。
【０４３０】
結果：
ＦＲＥＴ誘導によって実証される同時のレセプター結合及び架橋のための異なる二重特異性抗体及び抗体フォーマットの特徴付け
ＨＥＫ細胞を発現するＰＤ１及びＴＩＭ３を上記のように処置して、滴定量の異なる二重特異性抗体（０．１２−１０ｎＭ）とのインキュベーションによる同時レセプター結合時にＦＲＥＴシグナルを測定した。
全ての二重特異性抗体は、ＰＤ−１−ＴＩＭ３発現細胞において用量依存的にＦＲＥＴシグナルを誘導した。図７Ａに見られるように、２＋２コンストラクト（３５８＋３５９）と比較して、１＋１フォーマット（抗体＃３８９及び１６８）の間に劇的な差はなかった。
加えて、ヒト化ＰＤ１ＴＩＭ３抗体（＃４７６及び４７７）に基づく二つの二重特異性フォーマットもまた、処置時に細胞内でＦＲＥＴを誘導するその能力について評価した。図７Ｂに示されているように、両方のコンストラクトは、ＰＤ１＋ＴＩＭ３＋ＨＥＫ細胞において有意なＦＲＥＴシグナルを誘導し、機能的な形での同時結合の根底をなす。
【０４３１】
二重特異性抗体の同時結合によって誘導されるＦＲＥＴシグナルの特異性を示すために、一つの特異性のみのモノクローナルＩｇＧを競合のために加えた。
ＳＮＡＰタグＰＤ１及びＣＬＩＰタグＴＩＭ３細胞（上記の通り）を１００ｎＭのＳＮＡＰ−Ｌｕｍｉ４−Ｔｂ及び１００ｎＭのＣｌｉｐ−Ｒｅｄで標識した。洗浄後、標識した細胞を二重特異性抗ＰＤ１／ＴＩＭ３抗体＃０１６８［示された濃度で］と共に４℃で１時間インキュベートした後、時間分解蛍光を、ＢＭＧ Ｐｈｅｒａｓｔａｒリーダー（黒線）を用いて６６５／６２０ｎｍで測定した。二重特異性抗体処置後のＦＲＥＴシグナルの特異性を強調するために、抗ＰＤ１モノクローナル抗体（＃０１６５、図８Ａ、灰色の曲線）又は抗Ｔｉｍ−３モノクローナル抗体（＃００１８、図８Ｂ、灰色の曲線）を競合のために加え、ＦＲＥＴシグナルのほぼ完全な防止をもたらした。親（単一特異性）抗ＰＤ−１抗体単独はＦＲＥＴを誘導しなかった（点線）。
【０４３２】
ＦＲＥＴシグナルの誘導は、また、二重特異性抗体と並行して加えられたＴＩＭ３親抗体（００１８；灰色の曲線）の存在下でも防止された（図８Ｂ）。
【０４３３】
実施例１４：異なる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）への抗体の結合
結合アッセイ
新たに単離したＰＢＭＣ又は３日間ポリクローナル的に活性化させた（プレート結合抗ＣＤ３抗体及び可溶性抗ＣＤ２８抗体、各１ｕｇ／ｍｌ、双方ともＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製）ＣＤ４Ｔ細胞を、Ａｌｅｘａ６４７−直接結合抗ＴＩＭ−３又は抗ＴＩＭ−３／抗ＰＤ−１二重特異性抗体の何れかと共に４℃で１時間、染色した。ついで、細胞を洗浄して未結合抗体を除去し、単球（ＣＤ１４＋（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））、ＮＫ細胞（ＣＤ１６＋（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ５６＋（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びＣＤ３−）及びＴ細胞（ＣＤ３＋（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））を識別するために４℃で３０分間表面マーカーに対して染色した後、ＢＤ Ｃｅｌｌ Ｆｉｘで固定した。細胞は、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓで取得した。抗Ｔｉｍ３抗体と比較した二重特異性抗体の結果を図９Ａ〜９Ｈに示す。
【０４３４】
実施例１５：内部移行
実施例１５Ａ）  １ｍｇ／ｍｌのプレート結合抗ＣＤ３及び１ｍｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ２８抗体と共に予め培養した３日間のポリクローナル活性化ＣＤ４Ｔ細胞を、抗ＴＩＭ−３又は抗ＴＩＭ−３／抗ＰＤ−１二重特異性抗体（２連で）の存在下、４℃で３０分間インキュベートした。ついで、細胞を洗浄し、２群に分け、そのうちの一方を３７℃で更に３時間インキュベートし、他方を直ぐに標識化二次抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色してからＢＤ Ｃｅｌｌ Ｆｉｘで固定した。３時間のインキュベーション後、第２群の細胞をまた標識化二次抗体で染色してから固定した。
【０４３５】
細胞をＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得し、細胞表面上の検出可能な抗体の発現レベルを二つの群間で比較した。結果を図１０Ａ〜１０Ｄに示す。二重特異性１＋１ ＰＤ１ＴＩＭ３−０１６６（キメラＰＤ１−０１０３／ＴＩＭ３−００３８に基づく）は、二重特異性２＋２ ＰＤ１ＴＩＭ３−０３２１（またキメラＰＤ１−０１０３／ＴＩＭ３−００３８に基づくが、ＰＤに対して二つの抗原結合部位とＴＩＭ３に対して２つを有する）に比較して、また活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞及び活性化ＮＫ細胞上の親ＴＩＭ３−００３８抗体と比較して、減少した内部移行を示した。
【０４３６】
実施例１５Ｂ）  共焦点蛍光顕微鏡法による抗体の局在及び内在化の可視化
活性化ＣＤ４陽性細胞を、ａ−ＰＤ１抗体で染色した場合を除いて、ＣＭＦＤＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色し、ポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ）で処理した丸いカバースリップにプレーティングした。細胞を３７℃で３０分間接着させた後、蛍光タグ抗体（１μｇ／ｍＬ：ａ−ＴＩＭ３（ｃｈｉ１８−Ａ６４７＝ＡｌｅｘａＡ６４７で標識したキメラＴｉｍ３＿００１８）、ａ−ＴＩＭ３（ｃｈｉ２８−Ａ６４７＝ＡｌｅｘａＡ６４７で標識したキメラＴｉｍ３＿００２８）、Ｂｉｓｐｅｃ（０１６８−Ａ６４７＝１＋１ ＰＤ１ＴＩＭ３＿０１６８（ＡｌｅｘａＡ６４７で標識されたキメラＰＤ１−０１０３／Ｔｉｍ３−００１８に基づく）及びＢｉｓｐｅｃ（０３８９−Ａ６４７＝１＋１ ＰＤ１ＴＩＭ３＿０３８９（Ａｌｅｘａ６４７で標識したキメラＰＤ１−０１０３／Ｔｉｍ３−００２８に基づく）及びａ−ＰＤ１（０１６５−Ａ４８８＝Ａｌｅｘａ４８８で標識したキメラＰＤ１−０１０３に基づく）を異なる期間（１５分、１時間、２時間、３時間）増殖培地中に直接加えた。冷ＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ）を使用して反応をクエンチし、未結合抗体を洗い流した。ついで、細胞を２０分間固定し（ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ）、洗浄緩衝液（ＢＤ染色緩衝液）で２回洗浄した。カバースリップを乾燥した表面に移した後、それらをついでマウント培地（Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ Ｇ，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を伴うガラススライド上に載せ、イメージングまで４℃で暗所に保った。高度に標的化された細胞の膜ＲＯＩからの蛍光シグナルの強度を、同じ細胞の細胞質ＲＯＩからの蛍光シグナルの強度で割って、ボックスチャートに表示された比を得た。サンプルを比較するために、一元配置ＡＮＯＶＡ解析を使用した（＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．００１）。共焦点蛍光顕微鏡法を、６０倍の油対物レンズを備えたＺｅｉｓｓの倒立ＬＳＭ７００を用いて実施した。顕微鏡に連結したＺｅｎソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）を使用して画像を収集した。画像解析を、Ｉｍａｒｉｓソフトウェア（Ｂｉｔｐｌａｎｅ；Ｏｘｆｏｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を用いて実施し、統計解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）により実施した。ＴＩＭ３抗体の細胞内クラスター化と比較した場合の二重特異性抗体及びＰＤ１抗体両方において膜局在化を示す経時的な解析を図１１Ａ及び１１Ｂに示す。抗ＰＤ１及びＢｉｓｐｅｃ０３８９は、３時間後でさえ、非常に遅い内部移行しか示さず、他のＢｉｓｐｅｃ０１６８の内部移行はより強い。より強い内部移行がａＴｉｍ３ Ａｂ００２８によって示され、最も強い内部移行がａＴｉｍ３−００１８によって示される。
【０４３７】
実施例１６：混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイによるＴ細胞活性化
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）は、ある個体（ドナーＸ）由来のリンパ球の別の個体（ドナーＹ）由来のリンパ球への活性化を測定する免疫細胞アッセイである。混合リンパ球反応を使用して、リンパ球エフェクター細胞に対するＰＤ１経路を遮断する効果を実証した。アッセイにおけるＴ細胞を、抗ＰＤ１／ＴＩＭ３二重特異性ｍＡｂの存在下又は非存在下での活性化及びそれらのＩＦＮ−γ分泌について試験した。
【０４３８】
同種異系ＭＬＲを実施するために、Ｌｅｕｋｏｓｅｐ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ、２２７２８８）を使用する密度勾配遠心分離によって、未知のＨＬＡ型の少なくとも４人の健康なドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。簡潔に述べると、ヘパリン処理した血液試料を３倍容量のＰＢＳで希釈し、希釈した血液の２５ｍｌアリコートを５０ｍｌのＬｅｕｋｏｓｅｐチューブに層化した。室温で８００×ｇで１５分間遠心分離した後（中断なし）、リンパ球含有画分を回収し、ＰＢＳで洗浄し、機能アッセイで直接使用するか、又は１．０Ｅ＋０７細胞／ｍｌで凍結培地（１０％ＤＭＳＯ、９０％ＦＣＳ）中に再懸濁させ、液体窒素で保存した。個々の２方向ＭＬＲ反応を、１：１の刺激／応答細胞比で二つの異なるドナーからのＰＢＭＣを混合することによってセットアップし、異なる濃度範囲の精製された二重特異性ＰＤ１−ＴＩＭ３抗体又はその親単一特異性抗体（単独又は組み合わせの何れか）の存在下又は非存在下、平底９６ウェルプレートで少なくとも２連で３７℃、５％ＣＯ２で６日間、共培養を行った。抗体なしか又はアイソタイプ対照抗体を陰性対照として使用し、ｒｅｃ ｈｕ ＩＬ−２（２０ＥＵ／ｍｌ）を陽性対照として使用した。６日後、サイトカイン測定のために各培養物から１００μｌの培地を採取した。ＩＦＮ−γのレベルを、ＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。
【０４３９】
結果を表１８Ａ〜１８Ｄに示す（ＩＦＮ−γ分泌／放出）。二重特異性ＰＤ１ＴＩＭ３抗体は、濃度依存的にＴ細胞活性化及びＩＦＮ−γ分泌を促進した。ＩＦＮγ分泌の増加％値は、如何なる遮断ｍＡｂ（基底同種異系刺激誘発ＩＦＮγ値をＥ-ｃとして）も添加しないＭＬＲ及び２０ＥＵ／ｍｌのｒｅｃ ｈｕ ＩＬ−２（陽性対照＝１００％ＩＦＮγ値をＥ＋ｃとして）を添加したＭＬＲのＩＦＮγ産生に関して計算し、式：Ｒｅｌ.Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ［％］＝((Ｅｘａｍｐｌｅ−Ｅ-c)／(Ｅ+c−Ｅ-c)×１００に従って計算した。
【０４４０】
４通りの別々の実験を実施した：
実験１では、キメラＰＤ１−０１０３（＝ＰＤ１−０１６５）及びキメラＴＩＭ３＿００１８（＝ＴＩＭ３−ｃｈｉ１８）及びそれらの組み合わせと比較した、ＰＤ１−ＴＩＭ３二重特異性抗体１＋１ ＰＤ１ＴＩＭ３＿０１６８（キメラＰＤ１−０１０３／ＴＩＭ３−００１８（＝ＡＢ０１６８）に基づく）の効力を評価した。結果を図１２Ａ及び表１８Ａに示す。
2020058353.tif 000035
【０４４１】
実験２では、キメラＰＤ１−０１０３（＝ＰＤ１−０１６５）及びキメラＴＩＭ３＿００２８（＝ＴＩＭ３−ｃｈｉ２８）及びそれらの組み合わせと比較した、ＰＤ１−ＴＩＭ３二重特異性抗体１＋１ ＰＤ１ＴＩＭ３＿０３８９（キメラＰＤ１−０１０３／ＴＩＭ３−００２８（＝Ｂｉｓｐｅｃ ＡＢ０３８９）に基づく）の効力を評価した。結果を図１２Ｂ及び表１８Ｂに示す。
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【０４４２】
実験３では、キメラキメラＰＤ１−０１０３（＝ＰＤ１−０１６５）及び抗ＴＩＭ３−Ｋｙ８２１３（米国特許出願公開第２０１２／０１８９６１７号（抗体８２１３を参照）例えば実施例３３）及びそれらの組み合わせと比較した、（キメラＰＤ１−０１０３／及び（実施例１において１＋１ＣｒｏｓｓＭａｂとして記載されているのと同様にして製造された米国特許出願公開第２０１２／０１８９６１７号からの抗ＴＩＭ３−Ｋｙ８２１３（抗体８２１３、例えば実施例３３を参照）に基づく）ＰＤ１−ＴＩＭ３二重特異性抗体１＋１ ＰＤ１−０１０３／Ｋｙ８２１３の効力を評価した。結果を図１２Ｃ及び表１８Ｃに示す。
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【０４４３】
実験４では、キメラＰＤ１−０１０３／ＴＩＭ３−００２８（＝Ｂｉｓｐｅｃ ＡＢ０３５８（２＋２））、及びキメラＰＤ１−０１０３（＝ＰＤ１−０１６５）及びキメラＴＩＭ３＿００２８（＝ＴＩＭ３−ｃｈｉ２８）及びそれらの組み合わせに基づくＰＤ１−ＴＩＭ３二重特異性抗体２＋２ ＰＤ１ ＴＩＭ３＿０３５８と比較した（キメラＰＤ１−０１０３／ＴＩＭ３−００２８（＝Ｂｉｓｐｅｃ ＡＢ０３８９（１＋１））に基づく）ＰＤ１−ＴＩＭ３二重特異性抗体１＋１ ＰＤ１ ＴＩＭ３＿０３８９の効力を評価した。結果を図１２Ｄ及び表１８Ｄに示す。
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【０４４４】
実施例１７：抗原特異的ＣＤ４Ｔ細胞とＢ細胞−リンパ芽球様細胞株ＡＲＨ７７との共培養
ＭＨＣＩＩ発現腫瘍細胞株の存在下でのＣＤ４Ｔ細胞に対する抗ＰＤ−１の遮断効果を調べるために、我々は、新たに精製したＣＤ４Ｔ細胞をＥＢＶ不死化Ｂ細胞リンパ芽球細胞株（ＡＲＨ７７）の存在下で５日間共培養するアッセイを開発した。最小混合リンパ球反応（ｍＭＬＲ）の日に、健康なドナーから得た１０８個のＰＢＭＣからマイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によってＣＤ４Ｔ細胞を濃縮した。事前培養では、ＣＤ４Ｔ細胞を５ｍＭのカルボキシ−フルオレセイン−スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識した。ついで、１０５個のＣＤ４Ｔ細胞を、１０ｍｇ／ｍｌの濃度の遮断抗ＰＤ１抗体（ヒト化ＰＤ−１ ０３７６、ニボルマブ又はペンブロリズマブの何れか）、抗ＴＩＭ３抗体（ヒト化抗ＴＩＭ３ ０４３８又はＫｙｏｗａ−８２１３の何れか）又は抗ＰＤ−１／ＴＩＭ３二重特異性抗体（ヒト化０４７６）の存在下又は非存在下で９６ウェルプレートにＢ細胞株（５：１）と共に蒔いた。５日後、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）によりＩＦＮ−γレベルを測定するために使用される細胞培養上清を回収した。
【０４４５】
図１３に示されるように、我々は、抗ＰＤ−１での処置が、未処置のＣＤ４Ｔ細胞（破線）と比較した場合、ＩＦＮ−γを産生するＣＤ４Ｔ細胞の能力を有意に増加させたことを興味深く観察した。このアッセイにおいて、抗ＰＤ−１抗体０３７６は、ＣＤ４Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの分泌を誘導する際にベンチマーク抗体として等しく有効であったが、抗ＴＩＭ３抗体０４３８単独では、たとえベンチマーク抗体Ｋｙｏｗａ−８２１３よりも強くとも、僅かな効果しか持たない。
驚くべきことに、二重特異性抗体０４７６は、ＣＤ４Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌の促進において親抗体の組み合わせ、抗ＰＤ１抗体０３７６単独及びベンチマーク抗体よりも優れていた（Ｐ＜０．０１、一元配置ＡＮＯＶＡ）。
【０４４６】
実施例１８：インビボでのＰＤ１−ＴＩＭ３二重特異性抗体の有効性の増強
実験の開始時に６〜８週齢の免疫抑制された雌マウス（ＮＯＧ）に、１：１比のマトリゲルの存在下で０日目に１０６のＭＫＮ４５細胞（高レベルのＣＥＡを発現するヒト胃癌細胞株）を皮下接種した。７日目に、健康なヒトドナーからのＰＢＭＣを単離した：ヒトヘパリン処理血液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）で約２：１に希釈し、それぞれ１５ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む、調製された５０ｍｌのＬｅｕｃｏｓｅｐチューブに移した。遠心分離（３０分、４５０×ｇ、ＲＴ、中断なし）の後、ＰＢＭＣバンドを５ｍｌピペットで集めた。細胞を５０ｍｌチューブに移し、ＰＢＳで洗浄した（３５０×ｇ、１０分間の遠心分離）。洗浄工程を繰り返した（３００×ｇ、１０分間の遠心分離）。遠心分離（３０分、４５０×ｇ、ＲＴ、中断なし）後、ＰＢＭＣバンドを５ｍｌのピペットで集めた。細胞を５０ｍｌのチューブに移し、ＰＢＳで洗浄した（３５０×ｇ、１０分の遠心分離）。洗浄工程を繰り返した（３５０×ｇ、１０分の遠心分離）。遠心分離（１０分、３５０×ｇ）後、細胞をＲＰＭＩ培地に再懸濁させた。１０７個のＰＢＭＣをＮＯＧマウスに静脈内注射し、マウス−ヒトキメラモデルを作製した。１０日目に、週１回の予定された治療（ビヒクル又は抗ＰＤ１（０３７６）、ニボルマブ、抗ＴＩＭ３（０４３８）又は抗ＰＤ１−ＴＩＭ３（０４７６）から選択される化合物による治療）が開始され、腹腔内注射によって投与された。ＰＤ１−Ｔｉｍ３二重特異性抗体（３又は１０ｍｇ／ｋｇの何れか；白三角）での治療を、等モル（１．５又は５ｍｇ／Ｋｇ）濃度の単一剤ＰＤ１抗体（０３７６）、ニボルマブ及びＴｉｍ３抗体（０４３８）と比較した。腫瘍のサイズを、２〜３日毎に３０日の期間にわたって、Ｃａｌｉｐｅｒによってｍｍで測定した。図１４Ａ及び１４Ｂには、腫瘍体積の測定値が、マウス群内の平均体積として示されている。
【０４４７】
ビヒクル治療群と比較した場合、全ての治療が腫瘍増殖を制御する能力を示した。ＰＤ１のみ（ＰＤ１抗体（０３７６）又はベンチマークのニボルマブによる）とＴＩＭ３抗体（０４３８）のみの抑制は、腫瘍増殖の制御において同様の有効性をもたらす。これは、ＰＤ１又はＴＩＭ３の何れかを遮断することにより、抗腫瘍応答を増強することができることを示している。しかし、ＰＤ１とＴＩＭ３の双方がＰＤ１−ＴＩＭ３二重特異性抗体に結合している場合、腫瘍増殖阻害の増加を観察することができる。低濃度では、二重特異性抗体と他の治療との間の腫瘍増殖の差は観察できないが、高用量では、ＰＤ１−ＴＩＭ３二重特異性抗体での治療によるＰＤ１とＴＩＭ３の双方の阻害が腫瘍増殖の強い阻害をもたらす。
【図１】
2020058353.tif 000040
【図２】
2020058353.tif 000041
【図３】
2020058353.tif 000042
【図４Ａ】
2020058353.tif 000043
【図４Ｂ】
2020058353.tif 000044
【図５】
2020058353.tif 000045
【図６】
2020058353.tif 000046
【図７Ａ】
2020058353.tif 000047
【図７Ｂ】
2020058353.tif 000048
【図８Ａ】
2020058353.tif 000049
【図８Ｂ】
2020058353.tif 000050
【図９Ａ−９Ｄ】
2020058353.tif 000051
【図９Ｅ−９Ｈ】
2020058353.tif 000052
【図１０】
2020058353.tif 000053
【図１１Ａ】
2020058353.tif 000054
【図１１Ｂ】
2020058353.tif 000055
【図１２Ａ】
2020058353.tif 000056
【図１２Ｂ】
2020058353.tif 000057
【図１２Ｃ】
2020058353.tif 000058
【図１２Ｄ】
2020058353.tif 000059
【図１３】
2020058353.tif 000060
【図１４】
2020058353.tif 000061
【配列表】
2020058353000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月20日(2019.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
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