(57)【要約】【課題】単一のヒト可変セグメントに由来する重鎖を含有する抗原特異的抗体を含め、ウイルス性抗原中和することが可能な治療用抗体、ならびに治療用抗体の配列を選択するための、抗体の多様な供給源を生成させる系を提供する。【解決手段】本発明は、非ヒト免疫グロブリン定常領域に作動可能に連結された、単一のヒト非再配列ＶＨ遺伝子セグメント、１または複数のヒト非再配列ＤＨ遺伝子セグメントおよび１または複数のヒト非再配列ＪＨ遺伝子セグメントの存在によって特徴付けられる限定免疫グロブリン重鎖遺伝子座をその生殖細胞系ゲノム内に含む非ヒト動物由来のリンパ球を回収するステップ、を含むヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現する細胞を得る方法を提供し、ここで、該リンパ球は、該限定免疫グロブリン重鎖遺伝子座に由来する再配列されたヒト免疫グロブリンＶＨ領域遺伝子を発現することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
その生殖細胞系ゲノム内に、以下：
（ｉ）１つの再配列されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント、
（ｉｉ）１または複数の再配列されていないヒトＤＨ遺伝子セグメント、および
（ｉｉｉ）１または複数の再配列されていないヒトＪＨ遺伝子セグメント
の存在を特徴とする限定免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有する齧歯動物であって、該齧歯動物は、ラットまたはマウスであり、
ここで、（ｉ）１つの再配列されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント、（ｉｉ）１または複数の再配列されていないヒトＤＨ遺伝子セグメント、および（ｉｉｉ）１または複数の再配列されていないヒトＪＨ遺伝子セグメントは、少なくとも１つの内因性ＩｇＭ遺伝子を含む内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結され、
該齧歯動物はさらに、各々が該内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に連結され、該限定免疫グロブリン重鎖遺伝子座に由来する、再配列されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子の多様なレパートリーを含み、
該齧歯動物はさらに、その脾臓内に成熟ＩｇＭｉｎｔＩｇＤｈｉ  Ｂ細胞集団を含み、各Ｂ細胞が該再配列された免疫グロブリンヒト重鎖可変領域遺伝子のうちの１つを含む、
齧歯動物。
【請求項２】
前記齧歯動物が、
（ｉ）複数の内因性ＶＨ遺伝子セグメントの、前記１つの再配列されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントでの置き換え、
（ｉｉ）全ての内因性ＤＨ遺伝子セグメントの、前記１または複数の再配列されていないヒトＤＨ遺伝子セグメントでの置き換え、および
（ｉｉｉ）全ての内因性ＪＨ遺伝子セグメントの、前記１または複数の再配列されていないヒトＪＨ遺伝子セグメントでの置き換え
を含む、請求項１に記載の齧歯動物。
【請求項３】
前記１つの再配列されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントが、再配列して、１または複数のＤＨセグメントおよび１または複数のＪＨセグメントとともに再配列された重鎖可変ドメインを形成することが可能な、ＶＨ３セグメントファミリーメンバーまたはその多型変異体である、請求項１または請求項２に記載の齧歯動物。
【請求項４】
前記１つの再配列されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントがＶＨ３セグメントまたはその多型変異体であり、該ＶＨ３セグメントが、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３およびＶＨ３−７４から選択され、そして、該ＶＨ３セグメントまたはその多型変異体が、再配列して、１または複数のＤＨセグメントおよび１または複数のＪＨセグメントとともに再配列された重鎖可変ドメインを形成することが可能である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の齧歯動物。
【請求項５】
１または複数の再配列されていないヒトＪＬ遺伝子セグメントに作動可能に連結された１または複数の再配列されていないヒト免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメントをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の齧歯動物。
【請求項６】
前記１または複数の再配列されていないヒトＶＬ遺伝子セグメント、および／または、前記１または複数の再配列されていないヒトＪＬ遺伝子セグメントが、ヒトκおよびヒトλ遺伝子セグメントから選択される、請求項５に記載の齧歯動物。
【請求項７】
前記１または複数の再配列されていないヒト免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメントおよび１または複数の再配列されていないヒトＪＬ遺伝子セグメントが、内因性軽鎖定常遺伝子に作動可能に連結される、請求項５または請求項６に記載の齧歯動物。
【請求項８】
前記齧歯動物の軽鎖定常遺伝子が、齧歯動物またはラットのκまたはλ定常領域遺伝子から選択される、請求項７に記載の齧歯動物。
【請求項９】
内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における全てまたは実質的に全ての内因性ＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントが、前記１つの再配列されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント、前記１または複数の再配列されていないヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび前記１または複数の再配列されていないヒトＪＨ遺伝子セグメントの存在を特徴とする前記限定免疫グロブリン重鎖遺伝子座で置き換えられる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の齧歯動物。
【請求項１０】
内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座における全てまたは実質的に全ての内因性ＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントの、１または複数の再配列されていないヒトＶＬおよび１または複数の再配列されていないヒトＪＬ遺伝子セグメントでの置き換えをさらに含む、請求項９に記載の齧歯動物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の齧歯動物に由来する細胞または組織。
【請求項１２】
前記細胞が、リンパ球、または、該リンパ球から生成されたハイブリドーマである、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする核酸配列を作製する方法であって、
（ａ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の齧歯動物のリンパ球、または、該リンパ球から生成されたハイブリドーマから、再配列されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子を含む核酸を増幅するステップ
を含み、該リンパ球が、再配列されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子の前記多様なレパートリーのうちの１つを含む、方法。
【請求項１４】
前記核酸を増幅する前に、目的の抗原で前記齧歯動物を免疫化するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記再配列されたヒト免疫グロブリンＶＨ領域遺伝子配列が、少なくとも１つの体細胞超変異を含む、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記リンパ球が目的の抗原に特異的に結合する、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ヒト重鎖可変ドメインをコードする核酸配列を作製するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の齧歯動物の使用。
【請求項１８】
前記ヒト重鎖可変ドメインが、再配列して、１または複数のＤＨセグメントおよび１または複数のＪＨセグメントとともに再配列された重鎖可変ドメインを形成することが可能な多型ヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来するヒトＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３配列を有することを特徴とする、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記ヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ＶＨ３セグメントファミリーメンバーである、請求項１７または請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
ヒト抗体を作製するための請求項１〜１０のいずれか一項に記載の齧歯動物の使用であって、該ヒト抗体が、再配列されたヒトＶＨ３遺伝子セグメントまたはその多型変異体に由来する重鎖可変ドメインを含み、該ＶＨ３セグメントが、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３およびＶＨ３−７４から選択され、そして、該ＶＨ３遺伝子セグメントまたは多型変異体が、再配列して、前記１または複数のＤＨセグメントおよび前記１または複数のＪＨセグメントとともに再配列された重鎖可変ドメインを形成することが可能である、使用。
【請求項２１】
請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法に従って作製された核酸配列を含むベクター。
【請求項２２】
前記核酸配列が、ヒト重鎖定常ドメインをコードする配列に連結される、請求項２１に記載のベクター。
【請求項２３】
ヒト重鎖可変ドメインを生成する齧歯動物を作製するための全能性齧歯動物細胞であって、該齧歯動物は、ラットまたはマウスであり、該全能性齧歯動物細胞は、そのゲノム内に、以下：
（ｉ）ただ１つの再配列されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント、
（ｉｉ）１または複数の再配列されていないヒトＤＨ遺伝子セグメント、および
（ｉｉｉ）１または複数の再配列されていないヒトＪＨ遺伝子セグメント
の存在を特徴とする限定免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、
ここで、（ｉ）１つの再配列されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント、（ｉｉ）１または複数の再配列されていないヒトＤＨ遺伝子セグメント、および（ｉｉｉ）１または複数の再配列されていないヒトＪＨ遺伝子セグメントは、少なくとも１つの齧歯動物ＩｇＭ遺伝子を含む内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結され、
該齧歯動物全能性細胞で作製された齧歯動物は、各々が該内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に連結され、該限定免疫グロブリン重鎖遺伝子座に由来する、再配列されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子の多様なレパートリーを生成し、かつ、その脾臓内に成熟ＩｇＭｉｎｔＩｇＤｈｉ  Ｂ細胞集団を含み、各Ｂ細胞が該再配列された免疫グロブリンヒト重鎖可変領域遺伝子のうちの１つを含む、
全能性齧歯動物細胞。
【請求項２４】
胚性幹細胞である、請求項２３に記載の全能性齧歯動物細胞。
【請求項２５】
宿主細胞において、請求項１５〜１６のいずれか一項に記載の方法に従って作製された核酸、または、請求項２１もしくは請求項２２に記載のベクターを発現させるステップを含む、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを作製する方法。
【請求項２６】
請求項１５〜１６のいずれか一項に記載の方法に従って作製された核酸、または、請求項２１もしくは請求項２２に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２７】
哺乳動物細胞である、請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現する細胞を得る方法であって、
その生殖細胞系ゲノム内に、少なくとも１つの齧歯動物ＩｇＭ遺伝子を含む内因性免疫グロブリン重鎖定常領域に作動可能に連結された、１つの再配列されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント、１または複数の再配列されていないヒトＤＨ遺伝子セグメント、および１または複数の再配列されていないヒトＪＨ遺伝子セグメントの存在を特徴とする限定免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む齧歯動物からリンパ球を回収するステップ
を含み、該齧歯動物は、ラットまたはマウスであり、
該リンパ球が、該限定免疫グロブリン重鎖遺伝子座に由来する再配列されたヒト免疫グロブリンＶＨ領域遺伝子を発現する、方法。
【請求項２９】
最終ステップとして、
前記リンパ球、または、該リンパ球から生成されたハイブリドーマから、前記再配列されたヒト免疫グロブリンＶＨ領域遺伝子配列を含む第１のヌクレオチド配列を得るステップと；
宿主細胞において、該第１のヌクレオチド配列と同一または実質的に同一な配列を含む第１の核酸を発現させるステップと
をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１の核酸が、ヒト重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞において、ヒト軽鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結された第２の核酸を発現させるステップ
をさらに含む、請求項２８または請求項２９に記載の方法であって、
該第２の核酸が、前記ヒト免疫グロブリンＶＨドメインと同種のヒト軽鎖可変（ＶＬ）ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列と同一または実質的に同一な配列を含む、方法。
【請求項３２】
前記細胞において、ヒト重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結された第３の核酸を発現させるステップ
をさらに含む、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の方法であって、
該第３の核酸が、前記ヒト免疫グロブリンＶＬドメインと同種の第２のヒト免疫グロブリンＶＨドメインをコードする、方法。
【請求項３３】
前記宿主細胞が、ＨｅＬａ細胞、ＤＵ１４５細胞、Ｌｎｃａｐ細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３８細胞、ＰＣ３細胞、Ｔ４７Ｄ細胞、ＴＨＰ−１細胞、Ｕ８７細胞、ＳＨＳＹ５ｙ細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、ＧＨ３細胞、ＰＣ１２細胞、ヒト網膜細胞およびＭＣ３Ｔ３細胞から選択される、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記回収したリンパ球からハイブリドーマを生成するステップをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記齧歯動物がさらに、齧歯動物軽鎖定常領域に作動可能に連結された、１または複数のヒト免疫グロブリンＶＬおよび１または複数のヒト免疫グロブリンＪＬ遺伝子セグメントをさらに含む、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記齧歯動物が、
（ａ）内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の欠失と、内因性κ軽鎖可変遺伝子座の欠失、または
（ｂ）内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の欠失と、内因性λ軽鎖可変遺伝子座の欠失
を含む、請求項２８〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記齧歯動物がマウスである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の齧歯動物、請求項１１〜１２のいずれか一項に記載の細胞、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の使用、請求項２１もしくは請求項２２に記載のベクター、請求項２３〜２４のいずれか一項に記載の全能性齧歯動物細胞、または、請求項２８〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
限定数の免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ）セグメント（または単一のＶＨセグメント）および／またはその変異体から抗体を作製するために、免疫グロブリン重鎖可変（Ｖ）領域遺伝子座において（または導入遺伝子内で）遺伝子操作された非ヒト動物。単一の免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメント、例えば、ヒト免疫グロブリンＶＨ１−６９遺伝子セグメントまたはヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントに由来するヒト重鎖可変ドメインを有する非ヒト動物。ヒト病原体を含めた病原体に結合させるのに有用な抗体配列を、非ヒト動物において作製するための方法。
【背景技術】
【０００２】
非ヒト動物、例えば、マウスは、遺伝子操作されて、抗体ベースのヒト治療剤において用いられる抗体配列を作製するための方法において有用なツールとなっている。ヒト化可変領域遺伝子座（例えば、ＶＨ遺伝子、ＤＨ遺伝子、およびＪＨ遺伝子、ならびにＶＬ遺伝子およびＪＬ遺伝子）を伴うマウスを用いて、抗体治療剤において用いられる同種の（ｃｏｇｎａｔｅ）重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを生成させる。同種の重鎖および軽鎖を伴う完全ヒト抗体を生成させる他のマウスも利用可能である。
【０００３】
ヒト抗体治療剤は、特定のあらかじめ選択された抗原に関して所望される特徴に基づき操作される。ヒト化マウスを、あらかじめ選択された抗原で免疫化し、免疫化されたマウスを用いて、所望の結合特徴を伴う、高アフィニティーで同種の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを同定するための抗体集団を生成させる。内因性マウス遺伝子座において可変領域だけをヒト化させたヒト化マウスなど、一部のヒト化マウスは、特徴および数が野生型マウスのＢ細胞集団と類似するＢ細胞集団を生成させる。結果として、抗体をスクリーニングするためのこれらのマウスでは、極めて大きくかつ多様なＢ細胞集団が利用可能であり、最も所望される特徴を伴う重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを同定するための多数の異なる免疫グロブリン再配列を反映する。
【０００４】
しかし、全ての抗原が、広範な可変（Ｖ）セグメントの選択に由来する極めて多数の再配列を呈示する免疫反応を惹起するわけではない。すなわち、特定の抗原に対するヒト体液性免疫反応の見かけは限定的である。限定は、十分に高いアフィニティーおよび特異性により特定の抗原に結合する特定のＶセグメントのみを発現させるＢ細胞のクローン選択に反映される。一部のこのような抗原は、臨床的に有意義である、すなわち、それらの一部は、周知のヒト病原体である。ヒト免疫反応において発現するＶセグメントは、ヒトＤセグメントおよびヒトＪセグメントと組み合わせると、ランダムに選択されたＶセグメントであって、その抗原に対するヒト抗体応答において観察されたことのないＶセグメントより有用な高アフィニティー抗体を生成させる可能性が高いＶセグメントであるという仮説が提起されている。
【０００５】
数千年間にわたる自然の選択は、ヒト病原体を中和するための極めて有効な武器をデザインするのに最も効率的な基礎または基盤（クローン選択されたＶセグメント）を選択したと仮定されている。当技術分野では、上記で論じられた病原体などの抗原に結合し、かつ／またはこれらを中和する、より多くの優れた抗体が必要とされている。有用な配列を、多型のおよび／または体細胞変異させた選択Ｖセグメントを含めた選択Ｖセグメントからより迅速に生成させ、体細胞変異させたその変化形を含めた様々なＤセグメントおよびＪセグメントによるＶセグメントの再配列、特に、固有で有用なＣＤＲ３による再配列を有する有用なＢ細胞集団をより迅速に生成させることが必要とされている。治療的に有用な抗体可変領域の配列を、あらかじめ選択されたＶセグメントから、例えば、既存の改変動物において達成されうるものより数および多様性を増大させて生成させうる生物学的系、例えば、非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）が必要とされている。限定的な、あらかじめ選択されたＶセグメントであって、特定のヒト病原体を含め、選択された抗原に対するヒト抗体ベースの治療剤の製造において有用な同種のヒト重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインが含まれるがこれらに限定されないＶセグメントに由来する抗体の可変配列をクローン選択するために拘束された体液性免疫系を有するように操作された生物学的系が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
当技術分野では、単一のヒト可変セグメントに由来する重鎖を含有する抗原特異的抗体を含め、ウイルス性抗原、例えば、ＨＩＶおよびＨＣＶを中和することが可能な治療用抗体、ならびに治療用抗体の配列を選択するための、抗体の多様な供給源を生成させる系が必要とされている。また、単一のヒトＶＨセグメントに由来する重鎖のレパートリーを含む抗体であって、ＣＤＲ配列の多様なセットを有し、同種のヒト軽鎖可変ドメインと共に発現するこのような重鎖を含む抗体を含め、有用な抗体を作製するためのさらなる方法および非ヒト動物も必要とされている。免疫グロブリンベースの結合タンパク質のＣＤＲを選択するための方法であって、例えば、ヒト治療剤の作製における使用のために、体細胞変異し、かつ、クローン選択された免疫グロブリン可変ドメインを生成させるための組成物および方法を含め、選び出しのための結合タンパク質の多様性を増強し、免疫グロブリン可変ドメインの多様性を増強する方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
限定数の異なる重鎖可変領域遺伝子セグメント（すなわち、Ｖ遺伝子、ＶＨ遺伝子、ＶＨ遺伝子セグメント、またはＶ遺伝子セグメント）、例えば、１つだけ、２つ以下、もしくは３つ以下の異なるＶ遺伝子を含む遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座、あるいは、例えば、単一のコピーもしくは複数のコピーで存在し、かつ／または１もしくは複数の多型を含む、１つだけのＶ遺伝子セグメントのファミリーメンバーを含む遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座が提供される。
【０００８】
限定ＶＨ遺伝子セグメントであるＶＨ遺伝子レパートリー、例えば、単一のＶＨ遺伝子セグメントであるＶＨ遺伝子レパートリー、または単一のＶＨ遺伝子セグメントの複数の多型変異体から選択されるＶＨ遺伝子レパートリーに由来する重鎖可変ドメインをコードする遺伝子を再配列および形成することが可能な遺伝子座が提供される。ヒト免疫グロブリン配列を含む改変免疫グロブリン遺伝子座、例えば、ヒト免疫グロブリン定常配列または非ヒト（またはヒト／非ヒトキメラ）免疫グロブリン定常配列に作動可能に連結され（かつ、例えば、Ｄセグメントおよび／またはＪセグメントと作動可能に連結され）たヒトＶセグメントを含む改変免疫グロブリン遺伝子座が提供される。単一のＶＨ遺伝子セグメントの複数のコピーを含む改変遺伝子座であって、コピーのうちの１または複数が多型変異体を含む改変遺伝子座を含めた改変遺伝子座が提供される。非ヒト免疫グロブリン定常配列、例えば、マウス配列またはラット配列に作動可能に連結された、１または複数のＤセグメントおよび１または複数のＪセグメントと作動可能に連結された単一のＶＨセグメントの複数のコピーを含む改変遺伝子座が提供される。また、このようなヒト化遺伝子座を含む非ヒト動物も提供される。
【０００９】
免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントの複雑性を低減した（すなわち、重鎖可変遺伝子セグメント数を制限するか、または重鎖可変遺伝子レパートリーを制限した）非ヒト動物であって、免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントの複雑性の低減が、１つだけまたは２つ以下の重鎖可変遺伝子セグメントの存在を特徴とし、存在する重鎖可変遺伝子が、ヒト定常領域配列または非ヒト定常領域配列に作動可能に連結されている非ヒト動物が提供される。
【００１０】
免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントの複雑性を低減した（例えば、ＶＨ遺伝子セグメントが単一であるか、または単一のＶＨ遺伝子セグメントの多型変異体であるＶＨ遺伝子セグメントの数を制限した）非ヒト動物であって、免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントの複雑性の低減が、単一のＶＨ遺伝子セグメントまたは単一のＶＨ遺伝子セグメントの多型形態（例えば、ヒトにおける高コピー数および／または多型と関連するＶＨ遺伝子セグメント）である複数のＶＨ遺伝子セグメントの存在を特徴とし、存在する重鎖可変遺伝子が、ヒト定常領域配列または非ヒト定常領域配列に作動可能に連結されている非ヒト動物が提供される。様々な実施形態では、存在する重鎖可変遺伝子が、非ヒト動物の生殖細胞系内の１もしくは複数のＤ遺伝子セグメントおよび／または１もしくは複数のＪ遺伝子セグメントに作動可能に連結されている。
【００１１】
Ｄ遺伝子セグメントおよび／またはＪ遺伝子セグメントに作動可能に連結された単一のＶＨセグメントを含む免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座（例えば、導入遺伝子上の免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座、または内因性非ヒト動物重鎖可変遺伝子座における挿入もしくは置き換えとしての免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座）を含む非ヒト動物が提供される。様々な実施形態では、単一のＶＨ遺伝子セグメントが、非ヒト動物の内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子の遺伝子座において、１もしくは複数のＤ遺伝子セグメントおよび／または１もしくは複数のＪ遺伝子セグメントに作動可能に連結されている。
【００１２】
それらの免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座において、全てまたは実質的に全ての内因性免疫グロブリンＶＨセグメント（例えば、全ての機能的なセグメント、またはほぼ全ての機能的なセグメント）を欠失させるように改変され、非ヒト動物の内因性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座において、ＤセグメントおよびＪセグメントまたはＪセグメントに作動可能に連結されたヒトＶＨ１−６９セグメント（またはヒトＶＨ１−２セグメント）を含む非ヒト動物が提供される。
【００１３】
また、それらの免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座において、内因性可変領域遺伝子座が再配列されて内因性可変領域遺伝子セグメントを含む機能的な重鎖を形成できないように改変された非ヒト動物であって、非ヒト動物の内因性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座において、ＤセグメントおよびＪセグメントまたはＪセグメントに作動可能に連結された単一のヒト可変遺伝子セグメント（ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントまたはヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメント）を含む非ヒト動物も提供される。
【００１４】
ヒト定常領域配列または非ヒト定常領域配列に作動可能に連結された限定数の（例えば、１つだけまたは２つ以下の）重鎖遺伝子セグメントを含む非ヒト動物が提供される。一実施形態では、定常領域配列へと連結された１つだけまたは２つ以下の重鎖遺伝子セグメントが、導入遺伝子上、例えば、内因性重鎖遺伝子座以外の位置にある。
【００１５】
非ヒト動物においてヒト免疫グロブリン配列を作製するための方法が提供される。様々な実施形態では、ヒト免疫グロブリン配列が、単一のヒトＶセグメント、例えば、ＶＨ１−６９またはＶＨ１−２、ならびに１もしくは複数のＤセグメントおよびＪセグメントまたは１もしくは複数のＪセグメントから本質的になる免疫グロブリンＶ配列のレパートリーに由来する。非ヒト動物、非ヒト組織、および非ヒト細胞において、ヒト免疫グロブリン配列を作製するための方法であって、ヒト免疫グロブリン配列が病原体に結合する方法が提供される。
【００１６】
限定免疫グロブリン重鎖遺伝子座を特徴とするマウスを作製するための方法であって、限定が免疫グロブリンＶＨ遺伝子セグメントの数に関する方法が提供される。様々な態様では、限定が、１もしくは２つ以下、または単一のＶＨ遺伝子ファミリーメンバー（例えば、１または複数のＶＨ対立遺伝子、変異体、またはその多型変異体）への限定である。様々な態様では、重鎖遺伝子座が、１または複数のＤＨ遺伝子セグメントおよび１または複数のＪＨ遺伝子セグメントをさらに含む。様々な態様では、ＶＨ遺伝子セグメント、ＤＨ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントが、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤＨ遺伝子セグメント、およびヒトＪＨ遺伝子セグメントである。様々な態様では、ＶＨ遺伝子セグメント、ＤＨ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントが、非ヒト定常領域（例えば、ＩｇＭおよび／またはＩｇＧ）に作動可能に連結されている。様々な態様では、定常領域が、マウスまたはラットの定常領域である。
【００１７】
一態様では、限定免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するマウスを作製するための方法であって、本明細書で記載される核酸構築物を、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞へと導入するステップと、核酸構築物を含むマウスＥＳ細胞を単離または同定するステップとを含む方法が提供される。
【００１８】
一実施形態では、核酸構築物が、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１または複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および１または複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。一実施形態では、核酸構築物が、１または複数の部位特異的組換え部位（例えば、ｌｏｘＰ部位またはＦｒｔ部位）を含む。
【００１９】
一態様では、本明細書で記載されるターゲティングベクター、核酸配列、または細胞を用いて作製されるマウスが提供される。様々な実施形態では、ターゲティングベクター、核酸配列、または細胞が、非ヒト定常遺伝子に作動可能に連結された単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント（またはその多型変異体）、１または複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および１または複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含有するＤＮＡ配列を含む。
【００２０】
一態様では、限定免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むマウスを作製するための方法であって、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座を、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント（またはその多型変異体）、１または複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および１または複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含むヒトゲノム配列で置き換えるステップを含み、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤＨ遺伝子セグメント、およびヒトＪＨ遺伝子セグメントが再配列されて、非ヒト定常領域に作動可能に連結されたヒト可変ドメインを含有するキメラ重鎖を形成することが可能な方法が提供される。一実施形態では、非ヒト定常領域が、マウスまたはラットの定常領域である。
【００２１】
様々な態様では、非ヒト動物が、齧歯動物である。様々な態様では、齧歯動物が、マウスおよび／またはラットである。
【００２２】
一態様では、Ｖセグメントの正体に関して限定された重鎖Ｖセグメントのレパートリーを含み、１もしくは複数のＤセグメントおよび１もしくは複数のＪセグメント、または１もしくは複数のＪセグメントを含む、改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座が提供される。一実施形態では、重鎖Ｖセグメントが、ヒトセグメントである。一実施形態では、１または複数のＤセグメントが、ヒトＤセグメントである。一実施形態では、１または複数のＪセグメントが、ヒトＪセグメントである。一実施形態では、１または複数のＤセグメントおよび１または複数のＪセグメントが、ヒトＤセグメントおよびヒトＪセグメントである。
【００２３】
一実施形態では、改変遺伝子座が、非ヒト遺伝子座である。一実施形態では、非ヒト遺伝子座が、少なくとも１つのヒト免疫グロブリン配列で改変されている。
【００２４】
一実施形態では、限定が、１つのＶセグメントファミリーメンバーへの限定である。一実施形態では、１つのＶセグメントファミリーメンバーが、２つ以上のコピーで存在する。一実施形態では、１つのＶセグメントファミリーメンバーが、２つ以上の変異体（例えば、Ｖセグメントファミリーメンバーの２つ以上の多型形態）として存在する。一実施形態では、１つのＶセグメントが、ヒトＶセグメントファミリーメンバーである。一実施形態では、１つのＶセグメントファミリーメンバーが、その変異体に関してヒト集団内で観察される多数の変異体で存在する。一実施形態では、Ｖセグメントファミリーメンバーが、表１から選択される。一実施形態では、Ｖセグメントファミリーメンバーが、各Ｖセグメントについて、１つの対立遺伝子〜表１の右欄で示される数の対立遺伝子にわたる多数の対立遺伝子で示される多数の変異体で存在する。
【００２５】
一実施形態では、限定が、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントへの限定である。一実施形態では、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントが、２つ以上のコピーで存在する。一実施形態では、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントが、２つ以上の変異体（例えば、ヒトＶＨ１−６９遺伝子の２つ以上の多型形態）として存在する。一実施形態では、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントが、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントに関してヒト集団内で観察される多数の変異体で存在する。一実施形態では、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントが、表２から選択される。一実施形態では、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントが、各ＶＨ１−６９遺伝子セグメントについて、１つの対立遺伝子〜表２で示される数の対立遺伝子にわたる多数の対立遺伝子で示される多数の変異体で存在する。
【００２６】
一実施形態では、限定が、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントへの限定である。一実施形態では、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントが、２つ以上のコピーで存在する。一実施形態では、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントが、２つ以上の変異体（例えば、ヒトＶＨ１−２遺伝子の２つ以上の多型形態）として存在する。一実施形態では、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントが、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントに関してヒト集団内で観察される多数の変異体で存在する。一実施形態では、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントが、表３から選択される。一実施形態では、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントが、各ＶＨ１−２遺伝子セグメントについて、１つの対立遺伝子〜表３で示される数の対立遺伝子にわたる多数の対立遺伝子で示される多数の変異体で存在する。
【００２７】
一態様では、単一の機能的なヒトＶセグメントを含む重鎖免疫グロブリン遺伝子座が提供される。一実施形態では、単一の機能的なヒトＶセグメントが、ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−４−１、およびＶＨ７−８１セグメントから選択される。一実施形態では、単一の機能的なヒトＶセグメントが、ＶＨ１−６９セグメントであり、特定の実施形態では、単一の機能的なヒトＶセグメントが、ヒト集団内で見出される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、または１３の多型形態で存在する。一実施形態では、単一の機能的なヒトＶセグメントが、ＶＨ１−２セグメントであり、特定の実施形態では、単一の機能的なヒトＶセグメントが、ヒト集団内で見出される１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの多型形態で存在する。
【００２８】
一実施形態では、重鎖免疫グロブリン遺伝子座が、非ヒト動物の改変遺伝子座である。一実施形態では、改変非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、非ヒト動物のゲノム内の位置であって、対応する非改変非ヒト遺伝子座が野生型の非ヒト動物において見出される位置に存在する。一実施形態では、改変非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、非ヒト動物の導入遺伝子上に存在する。
【００２９】
一実施形態では、単一の機能的なヒトＶ遺伝子のセグメントが、ＶＨ１−６９遺伝子セグメントである。一実施形態では、ＶＨ１−６９遺伝子セグメントが、配列番号３４を含む。一実施形態では、ＶＨ１−６９遺伝子セグメントが、配列番号３４に由来する。一実施形態では、ＶＨ１−６９遺伝子セグメントが、配列番号３４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一である。
【００３０】
一実施形態では、単一の機能的なヒトＶ遺伝子のセグメントが、配列番号３４のヌクレオチド配列によりコードされる。
【００３１】
一実施形態では、単一の機能的なヒトＶ遺伝子のセグメントが、ＶＨ１−２遺伝子セグメントである。一実施形態では、ＶＨ１−２遺伝子セグメントが、配列番号６０を含む。一実施形態では、ＶＨ１−２遺伝子セグメントが、配列番号６０に由来する。一実施形態では、ＶＨ１−２遺伝子セグメントが、配列番号６０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一である。
【００３２】
一実施形態では、単一の機能的なヒトＶ遺伝子のセグメントが、配列番号６０のヌクレオチド配列によりコードされる。
【００３３】
一実施形態では、単一の機能的なヒトＶセグメントが、１もしくは複数のＤセグメントおよび１もしくは複数のＪセグメント、または１もしくは複数のＪセグメントに作動可能に連結されている。一実施形態では、Ｖセグメント、ならびに１または複数のＤセグメントおよび／またはＪセグメントが、免疫グロブリン重鎖定常領域配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、ＣＨ１配列、ヒンジ配列、ＣＨ２配列、ＣＨ３配列、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、またはこれらの組合せが、各々非ヒト内因性定常配列である。一実施形態では、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、またはこれらの組合せのうちの少なくとも１つが、ヒト配列である。特定の実施形態では、ＣＨ１および／またはヒンジが、ヒト配列である。
【００３４】
一態様では、全ての機能的なＶ遺伝子のセグメントの、単一のヒトＶ遺伝子のセグメント（または複数の多型形態もしくはコピー数で存在する単一のヒトＶ遺伝子のセグメント）による置き換えを含む改変内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座であって、単一のヒトＶ遺伝子のセグメント（または多型形態もしくはコピーのうちの１つ）以外のＶ遺伝子のセグメントに由来する重鎖可変遺伝子を形成する再配列が不可能な非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座が提供される。
【００３５】
一実施形態では、単一のヒトＶ遺伝子のセグメントが、ＶＨ１−６９である。一実施形態では、単一のヒトＶ遺伝子のセグメントが、ＶＨ１−２である。
【００３６】
一実施形態では、遺伝子座が、少なくとも１つのヒトＤＨ遺伝子セグメントまたは非ヒトＤＨ遺伝子セグメント、および１つのヒトＪＨ遺伝子セグメントまたは非ヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態では、遺伝子座が、ヒトＤＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態では、遺伝子座が、ヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。別の特定の実施形態では、遺伝子座が、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメント（異なる多型変異体の単一のコピーまたは複数のコピーとして存在する）、全ての機能的なヒトＤＨ遺伝子セグメント、および全ての機能的なヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。別の特定の実施形態では、遺伝子座が、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメント（異なる多型形態の単一のコピーまたは複数のコピーとして存在する）、全ての機能的なヒトＤＨ遺伝子セグメント、および全ての機能的なヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。一実施形態では、ヒトＶ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、およびヒトＪ遺伝子セグメント（またはヒトＶ遺伝子セグメントおよびヒトＪ遺伝子セグメント）が、内因性マウス重鎖遺伝子座において、マウス定常領域遺伝子に作動可能に連結されている。特定の実施形態では、マウス重鎖遺伝子座が、マウス免疫グロブリン定常領域配列の野生型のレパートリーを含む。
【００３７】
一態様では、非ヒト動物の機能的な免疫グロブリン重鎖Ｖ遺伝子のセグメントのみが、ヒトＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−４−１、およびＶＨ７−８１遺伝子セグメントから選択される、遺伝子改変非ヒト動物が提供される。一実施形態では、重鎖Ｖ遺伝子のセグメントが、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントである。一実施形態では、重鎖Ｖ遺伝子のセグメントが、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントである。
【００３８】
一態様では、単一の機能的なヒトＶＨ遺伝子セグメント（異なる多型形態の単一のコピーまたは複数のコピーとして存在する）を含み、かつ、再配列された免疫グロブリン重鎖可変ドメイン遺伝子であって、単一の機能的なヒトＶＨ遺伝子セグメント（または多型形態もしくはコピーのうちの１つ）を欠く重鎖可変ドメイン遺伝子を形成することが実質的に不可能な、遺伝子改変非ヒト動物が提供される。
【００３９】
一態様では、非ヒト動物において発現する免疫グロブリン重鎖可変領域のみが、ヒトＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−４−１、およびＶＨ７−８１遺伝子セグメントから選択されるヒトセグメントのうちの１つに由来する、遺伝子改変非ヒト動物が提供される。一実施形態では、ヒトセグメントが、ＶＨ１−６９セグメントである。一実施形態では、ヒトセグメントが、ＶＨ１−２セグメントである。一実施形態では、マウスに発現させる免疫グロブリン重鎖可変領域のみが、単一のＶセグメントファミリーメンバーに由来し、一実施形態では、免疫グロブリン重鎖可変領域のみが、単一のＶセグメントファミリーメンバーの多型変異体に由来する。
【００４０】
一態様では、限定免疫グロブリン重鎖Ｖ遺伝子セグメントのレパートリーを含む非ヒト動物であって、１または複数のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変セグメント（Ｖκ）をさらに含む非ヒト動物が提供される。一実施形態では、１または複数のＶκセグメントが、１または複数のヒトＪセグメントに作動可能に連結されている。特定の実施形態では、Ｊセグメントが、ヒトＪκセグメントである。別の特定の実施形態では、非ヒト動物が、免疫グロブリンλ軽鎖を発現させない。別の特定の実施形態では、非ヒト動物が、機能的なヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変遺伝子座も機能的な内因性免疫グロブリンλ軽鎖可変遺伝子座も含まない。
【００４１】
一実施形態では、非ヒト動物が、齧歯動物である。一実施形態では、齧歯動物が、マウスである。
【００４２】
一実施形態では、非ヒト動物が、内因性非ヒト免疫グロブリンＶκ遺伝子座において、全てまたは実質的に全ての機能的な内因性Ｖκセグメントの、１または複数の機能的なヒトＶκセグメントによる置き換えを含む。さらなる特定の実施形態では、置き換えが、全てまたは実質的に全ての機能的なヒト免疫グロブリンＶκセグメントによる置き換えである。
【００４３】
一実施形態では、非ヒト動物が、内因性非ヒト免疫グロブリンＶκ遺伝子座において、全てまたは実質的に全ての機能的な内因性Ｖκ遺伝子セグメントの、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ７−３、Ｖκ２−４、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ３−７、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ２−１０、Ｖκ３−１１、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ２−１４、Ｖκ３−１５、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ３−２０、Ｖκ６−２１、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ３−２５、Ｖκ２−２６、Ｖκ１−２７、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ３−３１、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ３−３４、Ｖκ１−３５、Ｖκ２−３６、Ｖκ１−３７、Ｖκ２−３８、Ｖκ１−３９、Ｖκ２−４０、およびこれらの組合せから選択されるヒトＶκ遺伝子セグメントによる置き換えを含む。
【００４４】
一実施形態では、非ヒト動物が、内因性非ヒト免疫グロブリンＪκ遺伝子座において、全てまたは実質的に全ての機能的な内因性非ヒト免疫グロブリンＪκセグメントの、１または複数の機能的なヒト免疫グロブリンＪκセグメントによる置き換えを含む。さらなる特定の実施形態では、置き換えが、全てまたは実質的に全ての機能的なヒト免疫グロブリンＪκセグメントによる置き換えである。
【００４５】
一実施形態では、非ヒト動物が、内因性非ヒト免疫グロブリンＪκ遺伝子座において、全てまたは実質的に全ての機能的な内因性非ヒト免疫グロブリンＪκ遺伝子セグメントの、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、Ｊκ５、およびこれらの組合せから選択されるヒトＪκ遺伝子セグメントによる置き換えを含む。
【００４６】
特定の実施形態では、非ヒト動物が、単一のＶセグメントおよび／またはその多型変異体から本質的になるＶセグメントのレパートリーを含む免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座を含む。一実施形態では、単一の免疫グロブリン重鎖Ｖセグメントが、ヒトＶＨ１−６９セグメントであり、非ヒト動物が、全ての機能的な非ヒトＤＨセグメントの、全ての機能的なヒトＤＨセグメントによる置き換えをさらに含み、全ての機能的な非ヒトＪＨセグメントの、全ての機能的なヒトＪＨセグメントによる置き換えをさらに含み、免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座が、ヒト定常領域または非ヒト定常領域の遺伝子配列に作動可能に連結されている。特定の実施形態では、定常領域の遺伝子配列が、内因性非ヒト定常領域の遺伝子配列である。特定の実施形態では、非ヒト動物が、非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるセグメントを再配列して、ヒトＶＨ１−６９配列、ヒトＤＨ配列、ヒトＪＨ配列、およびマウス定常領域配列を含む重鎖可変領域をコードする遺伝子を形成する。
【００４７】
特定の実施形態では、非ヒト動物が、単一のＶセグメントおよび／またはその多型変異体から本質的になるＶセグメントのレパートリーを含む免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座を含む。一実施形態では、単一の免疫グロブリン重鎖Ｖセグメントが、ヒトＶＨ１−２セグメントであり、非ヒト動物が、全ての機能的な非ヒトＤＨセグメントの、全ての機能的なヒトＤＨセグメントによる置き換えをさらに含み、全ての機能的な非ヒトＪＨセグメントの、全ての機能的なヒトＪＨセグメントによる置き換えをさらに含み、免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座が、ヒト定常領域または非ヒト定常領域の遺伝子配列に作動可能に連結されている。特定の実施形態では、定常領域の遺伝子配列が、内因性非ヒト定常領域の遺伝子配列である。特定の実施形態では、非ヒト動物が、非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるセグメントを再配列して、ヒトＶＨ１−２配列、ヒトＤＨ配列、ヒトＪＨ配列、およびマウス定常領域配列を含む重鎖可変領域をコードする遺伝子を形成する。
【００４８】
一実施形態では、再配列された遺伝子を含むＢ細胞が提供される。特定の実施形態では、Ｂ細胞が、目的の抗原で免疫化された、記載されるマウスに由来し、Ｂ細胞が、目的の抗原に特異的に結合する抗体をコードする。一実施形態では、目的の抗原が、病原体である。特定の実施形態では、病原体が、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルス）、およびヒト免疫不全ウイルスから選択される。特定の実施形態では、Ｂ細胞が、体細胞変異させた、高アフィニティーの（例えば、ＫＤが約１０−９以下の）抗体であって、目的の抗原に特異的に結合するヒト軽鎖可変領域（例えば、ヒトκ軽鎖可変領域）を含む抗体をコードする。
【００４９】
一態様では、限定免疫グロブリン重鎖Ｖセグメントのレパートリーを含む非ヒト動物であって、１または複数のヒトλ軽鎖可変（Ｖλ）セグメントを含む非ヒト動物が提供される。一実施形態では、１または複数のヒトＶλセグメントが、１または複数のヒトＪセグメントに作動可能に連結されている。特定の実施形態では、Ｊセグメントが、ヒトＪλセグメントである。別の特定の実施形態では、非ヒト動物が、κ軽鎖を発現させない。別の特定の実施形態では、非ヒト動物が、機能的なヒトκ軽鎖可変遺伝子座も非ヒトκ軽鎖可変遺伝子座も含まない。
【００５０】
一実施形態では、非ヒト動物が、全てまたは実質的に全ての機能的な非ヒト免疫グロブリンＶλセグメントの、１または複数の機能的なヒト免疫グロブリンＶλセグメントによる置き換えを含む。さらなる特定の実施形態では、置き換えが、全てまたは実質的に全ての機能的なヒト免疫グロブリンＶλセグメントによる置き換えである。
【００５１】
一実施形態では、非ヒト動物が、全てまたは実質的に全ての機能的な非ヒトＶλセグメントの、ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターＡの断片による置き換えを含む。特定の実施形態では、ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターＡの断片が、ヒトＶλ遺伝子セグメントのＶλ３−２７〜Ｖλ３−１を含む。
【００５２】
一実施形態では、非ヒト動物が、全てまたは実質的に全ての機能的な非ヒトＶλセグメントの、ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターＢの断片による置き換えを含む。特定の実施形態では、ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターＢの断片が、ヒトＶλ遺伝子セグメントのＶλ５−５２〜Ｖλ１−４０を含む。
【００５３】
一実施形態では、非ヒト動物が、全てまたは実質的に全ての機能的な非ヒトＶλセグメントの、ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターＡの断片およびクラスターＢの断片による置き換えを含み、置き換えの結果としてヒトＶλ遺伝子セグメントのＶλ５−５２〜Ｖλ３−１を含む。
【００５４】
一実施形態では、非ヒト動物が、全てまたは実質的に全ての機能的な非ヒトＶλセグメントの、少なくとも１２のヒトＶλ遺伝子セグメント、少なくとも２８のヒトＶλ遺伝子セグメント、または少なくとも４０のヒトＶλ遺伝子セグメントによる置き換えを含む。
【００５５】
一実施形態では、非ヒト動物が、全てまたは実質的に全ての機能的な非ヒト免疫グロブリンＪλ遺伝子セグメントの、１または複数の機能的なヒト免疫グロブリンＪλ遺伝子セグメントによる置き換えを含む。さらなる特定の実施形態では、置き換えが、全てまたは実質的に全ての機能的なヒト免疫グロブリンＪλ遺伝子セグメントによる置き換えである。様々な実施形態では、機能的なヒトＪλ遺伝子セグメントが、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、およびＪλ７を包含する。
【００５６】
特定の実施形態では、非ヒト動物が、単一のＶＨセグメントのみを含む免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ）領域遺伝子座であって、単一のＶＨセグメントが、ヒトＶＨ１−６９セグメントまたはヒトＶＨ１−２セグメントであり、全ての機能的な非ヒトＤＨセグメントの、全ての機能的なヒトＤＨセグメントによる置き換えをさらに含み、全ての機能的な非ヒトＪＨセグメントの、全ての機能的なヒトＪＨセグメントによる置き換えをさらに含み、ＶＨ領域遺伝子座が、ヒト定常領域または非ヒト定常領域の遺伝子配列に作動可能に連結されている免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ）領域遺伝子座を含む。特定の実施形態では、定常領域の遺伝子配列が、非ヒト定常領域の遺伝子配列、例えば、内因性非ヒト定常遺伝子配列である。特定の実施形態では、非ヒト動物が、非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるセグメントを再配列して、ヒトＶＨ１−６９配列（またはヒトＶＨ１−２配列）、ヒトＤＨ配列、ヒトＪＨ配列、および内因性非ヒト定常領域配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする遺伝子を形成する。
【００５７】
一実施形態では、再配列された遺伝子を含むＢ細胞が提供される。特定の実施形態では、Ｂ細胞が、目的の抗原で免疫化された、記載される非ヒト動物に由来し、Ｂ細胞が、目的の抗原に特異的に結合する抗体をコードする。一実施形態では、抗原が、リガンド、細胞表面受容体、および細胞内タンパク質から選択されるヒトタンパク質である。一実施形態では、目的の抗原が、病原体である。特定の実施形態では、病原体が、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルス）、およびヒト免疫不全ウイルスから選択される。特定の実施形態では、Ｂ細胞が、体細胞変異させた、高アフィニティーの（例えば、ＫＤが約１０−９以下の）抗体であって、目的の抗原に特異的に結合するヒト軽鎖可変領域（例えば、ヒトλ軽鎖可変領域）を含む抗体をコードする。
【００５８】
一態様では、限定免疫グロブリンＶＨセグメントのレパートリーを含む非ヒト動物であって、導入遺伝子上にヒトＶＨ１−６９セグメント（またはヒトＶＨ１−２セグメント）を含み、ヒトＶＨ１−６９セグメントが、導入遺伝子上で、ヒトＤＨセグメントもしくは非ヒトＤＨセグメントおよび／またはヒトＪセグメントもしくは非ヒトＪセグメントへと作動可能に連結され、導入遺伝子が、ヒト定常領域遺伝子もしくは非ヒト定常領域遺伝子、またはキメラヒト／非ヒト定常領域（例えば、少なくとも１つの配列が、非ヒトの、例えば、ヒンジ、ＣＨ２、ならびにＣＨ３および／またはヒンジから選択される、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、またはこれらの組合せ）をさらに含む非ヒト動物が提供される。一実施形態では、非ヒト動物が、マウスまたはラットであり、非ヒトＤ遺伝子、非ヒトＪ遺伝子、および／または非ヒト定常領域遺伝子が、マウス遺伝子もしくはラット遺伝子またはキメラヒト／マウスもしくはラット遺伝子である。
【００５９】
一実施形態では、導入遺伝子が、非ヒト動物において再配列されて、再配列された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子または免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子を形成するように、非ヒト動物が、１もしくは複数のヒト免疫グロブリンＶλ遺伝子セグメントおよびヒト免疫グロブリンＪλ遺伝子セグメント、または１もしくは複数のヒト免疫グロブリンＶκ遺伝子セグメントおよびヒト免疫グロブリンＪκ遺伝子セグメント、ならびにヒト免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子またはヒト免疫グロブリンλ軽鎖定常領域遺伝子を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座を含む導入遺伝子を含む。様々な実施形態では、ヒトＶκ遺伝子セグメントおよびＪκ遺伝子セグメントが、本明細書で記載されるヒトＶκ遺伝子セグメントおよびＪκ遺伝子セグメントである。様々な実施形態では、ヒトＶλ遺伝子セグメントおよびＪλ遺伝子セグメントが、本明細書で記載されるヒトＶλ遺伝子セグメントおよびＪλ遺伝子セグメントである。
【００６０】
特定の実施形態では、マウスが、導入遺伝子から、ＶＨ１−６９セグメント（またはＶＨ１−２セグメント）に由来する完全ヒト抗体を発現させるように、非ヒト動物が、ヒトＶＨ１−６９セグメント（またはヒトＶＨ１−２セグメント）である単一のＶセグメント、１または複数のヒトＤセグメント、１または複数のヒトＪセグメント、および重鎖可変遺伝子座に作動可能に連結されたヒト定常遺伝子を含む免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を有する導入遺伝子を含む。一実施形態では、非ヒト動物が、機能的な内因性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座を含まない。特定の実施形態では、非ヒト動物が、内因性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座を再配列して、再配列された非ヒト抗体遺伝子を形成できないように、非ヒト動物が、内因性非ヒトＤＨセグメントおよび／または内因性非ヒトＪＨセグメントの欠失を含む非機能的な内因性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座を含む。特定の実施形態では、非ヒト動物が、内因性マウス重鎖定常領域に作動可能に連結された切換え配列の欠失を含む。特定の実施形態では、切換え配列が、非ヒト（例えば、マウス）μ切換え配列である。別の実施形態では、非ヒト動物が、免疫グロブリンκ遺伝子座および免疫グロブリンλ遺伝子座から選択される機能的な内因性軽鎖可変遺伝子座の欠如をさらに含む。特定の実施形態では、非ヒト動物が、内因性非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖および／または内因性非ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を再配列して、再配列された内因性非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖および／または再配列された内因性非ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子を形成できないように、非ヒト動物が、Ｊκ配列および／またはＪλ配列の欠失を含む。
【００６１】
一実施形態では、非ヒト動物が、内因性非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖の機能的なノックアウトを結果としてもたらす、内因性非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖配列の欠失を含む。一実施形態では、非ヒト動物が、内因性非ヒト免疫グロブリンλ軽鎖の機能的なノックアウトを結果としてもたらす、内因性非ヒト免疫グロブリンλ軽鎖配列の欠失を含む。
【００６２】
一態様では、非ヒト動物が、機能的にサイレンシングされた内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子の遺伝子座を含み、ヒト重鎖可変遺伝子セグメントの限定的な（例えば、１つだけまたは２つ以下の）レパートリーを含む。一実施形態では、機能的なサイレンシングが、欠失、挿入、反転、およびこれらの組合せから選択される内因性非ヒト重鎖可変遺伝子の遺伝子座の修飾を含む。
【００６３】
一態様では、１つだけのヒトＶＨセグメントまたは１もしくは複数のそれらの多型、１または複数のＤセグメントのレパートリーから選択されるＤセグメント、および１または複数のＪセグメントのレパートリーに由来するＪセグメントに由来する免疫グロブリンＶＨレパートリーを含む齧歯動物が提供される。一実施形態では、齧歯動物が、ヒトＶＨセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントを再配列して、再配列されたヒト重鎖配列であって、ヒトまたは齧歯動物の定常領域配列に作動可能に連結されているヒト重鎖配列を形成する。一実施形態では、ヒトおよび／または齧歯動物の定常領域配列が、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、齧歯動物が、ヒト可変ドメインを含む免疫グロブリン軽鎖であって、再配列されたヒト重鎖配列に由来するヒト重鎖ドメインと同種である免疫グロブリン軽鎖を発現させる。一実施形態では、齧歯動物が、非ヒト重鎖可変ドメイン、非ヒト軽鎖可変ドメイン、およびこれらの組合せから選択されるポリペプチド配列を発現させない。
【００６４】
一実施形態では、各多型変異体が、重鎖可変ドメインを、１または複数のＤセグメントのうちのいずれかおよび１または複数のＪセグメントのうちのいずれかで再配列および形成することが可能であるように、ヒトＶＨセグメントが、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９以上の多型変異体であって、各多型変異体が、Ｄセグメントおよび／またはＪセグメントに作動可能に連結されている多型変異体で存在する。一実施形態では、齧歯動物が、マウスまたはラットである。一実施形態では、Ｄセグメントのレパートリーが、２つ以上のＤセグメントを含む。一実施形態では、Ｊセグメントのレパートリーが、２つ以上のＪセグメントを含む。一実施形態では、Ｄセグメントおよび／またはＪセグメントが、ヒトセグメントである。
【００６５】
一態様では、単一のヒト免疫グロブリンＶＨセグメントおよび／またはその多型変異体、ならびに１または複数のＤＨ配列および１または複数のＪ配列をコードする配列を含む核酸構築物であって、非ヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座と相同な少なくとも１つの相同性アーム、またはリコンビナーゼ認識部位（例えば、ｌｏｘ部位）を含む構築物が提供される。一実施形態では、Ｖセグメントが、ＶＨ１−６９セグメントまたはＶＨ１−２セグメントである。
【００６６】
一態様では、単一のヒト免疫グロブリン重鎖Ｖセグメントをコードする核酸配列を含む核酸構築物であって、単一のＶＨセグメントが、ＶＨ１−６９（またはＶＨ１−２）セグメントである構築物が提供される。一実施形態では、構築物が、部位特異的リコンビナーゼ認識部位を含む。一実施形態では、構築物が、ＶＨ１−６９（またはＶＨ１−２）セグメントの上流に第１のマウス相同性アーム、およびＶＨ１−６９（またはＶＨ１−２）セグメントの下流に第２のマウス相同性アームを含み、第１のマウス相同性アームが、マウス免疫グロブリン重鎖可変領域のすぐ上流のマウス染色体の領域と相同であるが、機能的なマウス免疫グロブリン重鎖可変セグメントを含まない。一実施形態では、構築物が、配列番号３を含む。一実施形態では、構築物が、配列番号７０を含む。
【００６７】
一態様では、限定的な単一のＶＨセグメントが、非ヒト動物内にあるか、または限定ＶＨセグメントが、非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座にあり（例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕにおけるか、または導入遺伝子における）、非ヒト動物または非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌牛、雄牛、野牛）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長動物（例えば、マーモセット、アカゲザル）の遺伝子座または動物から選択される。特定の実施形態では、非ヒト動物または非ヒト遺伝子座が、マウス遺伝子座またはラット遺伝子座である。
【００６８】
一態様では、本明細書で記載される非ヒト動物に由来し、限定ＶＨセグメントのレパートリー含む細胞または組織が提供される。一実施形態では、ＶＨセグメントのレパートリーが、単一のＶＨセグメントファミリーメンバーおよび／またはその多型変異体に限定される。特定の実施形態では、単一のＶＨセグメントが、ヒトＶＨ１−６９セグメントまたはヒトＶＨ１−２セグメントである。一実施形態では、細胞または組織が、非ヒト動物の脾臓、リンパ節、または骨髄に由来する。
【００６９】
一実施形態では、細胞が、ＥＳ細胞である。一実施形態では、細胞が、Ｂ細胞である。一実施形態では、細胞が、生殖細胞である。
【００７０】
一実施形態では、組織が、結合組織、筋肉組織、神経組織、および上皮組織から選択される。特定の実施形態では、組織が、生殖組織である。
【００７１】
一実施形態では、本明細書で記載されるマウスに由来する細胞および／または組織を単離し、１または複数のｅｘ  ｖｉｖｏアッセイにおいて用いる。様々な実施形態では、１または複数のｅｘ  ｖｉｖｏアッセイに、物理特性、熱特性、電気特性、機械的な特性、または光学特性の測定、手術手順、異なる組織型の相互作用の測定、造影法による現像、またはこれらの組合せが含まれる。
【００７２】
一実施形態では、非ヒト動物が、マウスである。
【００７３】
一態様では、本明細書で記載される限定重鎖ＶＨセグメントを含む非ヒト胚が提供される。一実施形態では、胚が、限定ＶＨセグメントを含むＥＳドナー細胞と、宿主胚細胞とを含む。
【００７４】
一実施形態では、非ヒト動物が、マウスである。
【００７５】
一態様では、非ヒト細胞が、本明細書で記載される非ヒト動物の染色体またはその断片を含む。一実施形態では、非ヒト細胞が、本明細書で記載される非ヒト動物の核を含む。一実施形態では、非ヒト細胞が、核移植の結果としての染色体またはその断片を含む。
【００７６】
一態様では、本明細書で記載される非ヒト動物に由来する核が提供される。一実施形態では、核が、Ｂ細胞ではない二倍体細胞に由来する。
【００７７】
一態様では、本明細書で記載される非ヒト動物に由来する多能性細胞、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ）、または全能性細胞が提供される。特定の実施形態では、細胞が、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞である。
【００７８】
一態様では、限定ＶＨセグメントのレパートリーを含む非ヒト人工多能性幹細胞が提供される。一実施形態では、人工多能性幹細胞が、本明細書で記載される非ヒト動物に由来する。
【００７９】
一態様では、本明細書で記載される非ヒト動物の細胞に由来するハイブリドーマまたはクァドローマが提供される。一実施形態では、非ヒト動物が、マウスまたはラットである。
【００８０】
一態様では、本明細書で記載される非ヒト動物のリンパ球が提供される。一実施形態では、リンパ球が、Ｂ細胞である。
【００８１】
一態様では、本明細書で記載される遺伝子修飾を含むＥＳ細胞、多能性細胞、および人工多能性幹細胞が含まれるがこれらに限定されない、マウス細胞およびマウス胚が提供される。ＸＸの細胞およびＸＹの細胞が提供される。また、本明細書で記載される修飾、例えば、前核注射により細胞へと導入された修飾を含有する核を含む細胞も提供される。
【００８２】
一態様では、本明細書で記載される非ヒト動物において作製される抗体可変ドメイン配列が提供される。
【００８３】
一態様では、本明細書で記載される非ヒト動物に由来する配列を含む抗体可変ドメインを含むヒト用治療剤が提供される。
【００８４】
一態様では、非ヒト動物に由来する抗体可変領域の配列を得る方法であって、抗体可変領域の配列が、ヒトＶＨ１−６９セグメントまたはＶＨ１−２セグメントに由来し、（ａ）非ヒト動物を目的の抗原で免疫化するステップであり、非ヒト動物が、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、全てまたは実質的に全ての非ヒト可変セグメントの、単一のヒト可変セグメントによる置き換えを含み、単一のヒト可変セグメントが、ＶＨ１−６９セグメントまたはＶＨ１−２セグメントであり、非ヒト動物が、ヒトＶＨ１−６９セグメントまたはＶＨ１−２セグメントに由来しない免疫グロブリン重鎖可変領域の配列を形成することが実質的に不可能である、ステップと、（ｂ）非ヒト動物に目的の抗原に対する免疫反応を開始させるステップと、（ｃ）非ヒト動物の免疫グロブリン重鎖可変領域の配列を同定または単離するステップであり、抗体が目的の抗原に結合する、ステップとを含む方法が提供される。
【００８５】
一実施形態では、単一のヒト可変セグメントが、ＶＨ１−６９セグメントである。
【００８６】
一実施形態では、抗体可変領域の配列が、配列番号３４に由来する。一実施形態では、抗体可変領域の配列が、配列番号３４と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一である。一実施形態では、抗体可変領域の配列が、配列番号３４を含む。
【００８７】
一実施形態では、単一のヒト可変セグメントが、ＶＨ１−２セグメントである。
【００８８】
一実施形態では、抗体可変領域の配列が、配列番号６０に由来する。一実施形態では、抗体可変領域の配列が、配列番号６０と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一である。一実施形態では、抗体可変領域の配列が、配列番号６０を含む。
【００８９】
一実施形態では、抗原に対する免疫反応が、ＥＬＩＳＡアッセイで決定されるバックグラウンドの２倍を超えるのに約６×１０４〜約５×１０５倍である抗体力価を特徴とする。特定の実施形態では、抗体力価が、ＥＬＩＳＡアッセイで決定されるバックグラウンドの２倍の約１×１０５〜約２×１０５倍である。特定の実施形態では、抗体力価が、ＥＬＩＳＡアッセイで決定されるバックグラウンドの２倍を超えるのに約１．５×１０５倍である。一実施形態では、抗原が、ヒト細胞表面受容体である。
【００９０】
一態様では、非ヒト動物において、ヒト抗体の可変領域のレパートリーを生成させるための方法であって、レパートリーのヒト重鎖可変領域が、同じＶＨ遺伝子ファミリーメンバーならびに複数のＤＨセグメントのうちの１つおよび複数のＪＨセグメントのうちの１つに由来し、レパートリーが、単一のＶＨ遺伝子ファミリーメンバーに由来する重鎖免疫グロブリンのＦＲ１（フレームワーク１）配列、ＣＤＲ１配列、ＦＲ２配列、ＣＤＲ２配列、およびＦＲ３配列を有することを特徴とする方法が提供される。一実施形態では、レパートリーが、複数の異なるＣＤＲ３＋ＦＲ４配列を有することをさらに特徴とする。
【００９１】
一実施形態では、単一のＶＨ遺伝子ファミリーが、ＶＨファミリー１、２、３、４、５、６、および７から選択される。特定の実施形態では、単一のＶＨ遺伝子ファミリーが、ＶＨファミリー１である。一実施形態では、単一のＶＨ遺伝子ファミリーメンバーが、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、およびＶＨ３−２３から選択される。特定の実施形態では、単一のＶＨ遺伝子ファミリーメンバーが、ＶＨ１−６９である。特定の実施形態では、単一のＶＨ遺伝子ファミリーメンバーが、ＶＨ１−２である。
【００９２】
一実施形態では、レパートリーが、ＶＨ１−６９セグメントに由来する重鎖ＦＲ１配列、重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＦＲ２配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＦＲ３配列を含む。特定の実施形態では、レパートリーが、配列番号３５に由来する重鎖ＦＲ１配列、重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＦＲ２配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＦＲ３配列を含む。特定の実施形態では、レパートリーが、配列番号３５の重鎖ＦＲ１配列、重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＦＲ２配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＦＲ３配列を含む。
【００９３】
一実施形態では、レパートリーが、ＶＨ１−２セグメントに由来する重鎖ＦＲ１配列、重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＦＲ２配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＦＲ３配列を含む。特定の実施形態では、レパートリーが、配列番号６１に由来する重鎖ＦＲ１配列、重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＦＲ２配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＦＲ３配列を含む。特定の実施形態では、レパートリーが、配列番号６１の重鎖ＦＲ１配列、重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＦＲ２配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＦＲ３配列を含む。
【００９４】
一態様では、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントの、複数のヒトＤセグメントおよびＪセグメントによる複数の再配列を反映する複数の異なるヒトＣＤＲ３配列を生成させるための生物学的（すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏ）系であって、この系は、体細胞超変異を除き同一なヒトＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３配列を有することを特徴とするヒト重鎖可変ドメインを生成させ、重鎖可変ドメインが、体細胞超変異し、かつ、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントならびに複数のヒトＤセグメントおよびヒトＪセグメントに由来することを特徴とし、この系は、本明細書で記載される遺伝子改変非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）を含む系が提供される。
【００９５】
一実施形態では、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、およびＶＨ３−２３から選択される。一実施形態では、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ＶＨ１−６９である。一実施形態では、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ＶＨ１−２である。一実施形態では、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントが、表１で同定される。一実施形態では、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントが、表２で同定される。一実施形態では、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントが、表３で同定される。
【００９６】
一態様では、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントの、複数のヒトＤセグメントおよびＪセグメントによる再配列に由来する複数の重鎖ＣＤＲ配列を生成させるためのｉｎ  ｖｉｖｏにおける方法であって、この方法は、体細胞超変異を除き同一なヒトＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３配列を有することを特徴とするヒト重鎖可変ドメインを生成させ、重鎖可変ドメインが、体細胞超変異し、かつ、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントならびに複数のヒトＤセグメントおよびヒトＪセグメントに由来することを特徴とし、系が本明細書で記載される遺伝子改変非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）を含む方法が提供される。
【００９７】
一実施形態では、方法が、本明細書で記載される非ヒト動物を目的の抗原へと曝露するステップと、非ヒト動物に抗原に対する免疫反応を発生させるステップであって、免疫反応が、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントの、ヒトＤセグメントのうちの１つおよびヒトＪセグメントのうちの１つによる再配列に由来する複数の重鎖ＣＤＲ配列を発生させる、ステップと、抗原に結合する重鎖ＣＤＲのセットを同定するステップとを含む。一実施形態では、方法が、重鎖ＣＤＲを含むヒトＶＨドメインをコードする核酸配列を、動物から単離するステップを含む。
【００９８】
一実施形態では、重鎖ＣＤＲ配列が、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントの再配列に由来する。一実施形態では、重鎖ＣＤＲ配列が、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントの再配列に由来する。
【００９９】
一態様では、非ヒト動物において、複数の異なるＣＤＲ３配列およびＦＲ４配列を生成させるための方法であって、単一のＶＨセグメントファミリーメンバーに限定的なＶＨセグメントのレパートリーを伴う免疫グロブリン重鎖可変遺伝子の遺伝子座を含む非ヒト動物を、目的の抗原へと曝露するステップと、非ヒト動物に抗原に対する免疫反応を発生させるステップとを含み、免疫反応が、それらの重鎖可変ドメインの各々が単一のＶＨセグメントファミリーメンバーに由来し、複数の異なるＣＤＲ３配列およびＦＲ４配列を含むＢ細胞レパートリーを発生させる方法が提供される。
【０１００】
一実施形態では、単一のＶＨセグメントファミリーメンバーが、ヒトのものである。一実施形態では、非ヒト動物が、マウス、ラット、およびウサギから選択される。一実施形態では、目的の抗原が、リガンド、受容体、細胞内タンパク質、および分泌タンパク質から選択される。一実施形態では、目的の抗原が、本明細書で記載されるヒト病原体である。
【０１０１】
一実施形態では、単一のヒトＶＨ遺伝子ファミリーメンバーが、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、およびＶＨ３−２３から選択される。一実施形態では、単一のヒトＶＨ遺伝子ファミリーメンバーが、ＶＨ１−６９である。一実施形態では、単一のヒトＶＨ遺伝子ファミリーメンバーが、ＶＨ１−２である。一実施形態では、単一のヒトＶＨ遺伝子ファミリーメンバーが、表１で同定される。一実施形態では、単一のヒトＶＨ遺伝子ファミリーメンバーが、表２で同定される。一実施形態では、単一のヒトＶＨ遺伝子ファミリーメンバーが、表３で同定される。
【０１０２】
一態様では、本明細書で記載される非ヒト動物において作製される免疫グロブリン可変領域をコードするヌクレオチド配列が提供される。
【０１０３】
一態様では、本明細書で記載される非ヒト動物において作製される抗体の免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域のアミノ酸配列が提供される。
【０１０４】
一態様では、本明細書で記載される非ヒトにおいて作製される抗体の可変領域をコードする、免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域のヌクレオチド配列が提供される。
【０１０５】
一態様では、本明細書で記載される非ヒト動物において作製される抗体またはその抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ）が提供される。
【０１０６】
一態様では、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１または複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および１または複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントの存在を特徴とする限定免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するマウスであって、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントが、内因性マウス遺伝子座にあり、ＶＨ遺伝子セグメントが、１または複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、１または複数のヒトＪＨ遺伝子セグメント、および内因性免疫グロブリン重鎖定常遺伝子に作動可能に連結されているマウスが提供される。
【０１０７】
一実施形態では、マウスが、１または複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび１または複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントを含むヒト化免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をさらに含み、ヒトＶＬ遺伝子セグメントおよびヒトＪＬ遺伝子セグメントが、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結されている。特定の実施形態では、ヒトＶＬ遺伝子セグメントおよびヒトＪＬ遺伝子セグメントが、内因性マウス軽鎖遺伝子座にあり、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子が、マウス遺伝子である。
【０１０８】
一実施形態では、ヒト化免疫グロブリン軽鎖遺伝子座が導入遺伝子上にあり、定常領域遺伝子が、マウス、ラット、およびヒトから選択される。
【０１０９】
一実施形態では、ヒトＶＬ遺伝子セグメントおよびヒトＪＬ遺伝子セグメントが、Ｖκ遺伝子セグメントおよびＪκ遺伝子セグメントである。一実施形態では、ヒトＶＬ遺伝子セグメントおよびヒトＪＬ遺伝子セグメントが、Ｖλ遺伝子セグメントおよびＪλ遺伝子セグメントである。
【０１１０】
一態様では、単一のＶセグメントファミリーメンバーに由来する免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現させるＢ細胞レパートリーを有する非ヒト動物が提供される。一実施形態では、Ｂ細胞レパートリーにおいて発現する非ヒト動物免疫グロブリン重鎖可変ドメインのうちの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が、同じＶセグメントファミリーメンバーに由来する。特定の実施形態では、百分率が、少なくとも９０％である。一実施形態では、Ｂ細胞レパートリーが、末梢（血）Ｂ細胞から本質的になる。一実施形態では、Ｂ細胞レパートリーが、脾臓Ｂ細胞から本質的になる。一実施形態では、Ｂ細胞レパートリーが、骨髄Ｂ細胞から本質的になる。一実施形態では、Ｂ細胞レパートリーが、末梢Ｂ細胞、脾臓Ｂ細胞、および骨髄Ｂ細胞から本質的になる。
【０１１１】
一態様では、重鎖免疫グロブリン可変ドメインを発現させる非ヒト動物のＢ細胞のうちの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％超または９０％超が、単一のＶＨ遺伝子セグメントファミリーメンバーに由来する重鎖免疫グロブリン可変ドメインを発現させる遺伝子改変非ヒト動物が提供される。一実施形態では、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現させる非ヒト動物のＢ細胞のうちの少なくとも７５％が、単一のＶＨ遺伝子セグメントファミリーメンバーに由来する免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現させる。特定の実施形態では、百分率が、少なくとも９０％である。一実施形態では、重鎖ドメインを発現させるＢ細胞の全てが、単一のＶＨ遺伝子ファミリーメンバーに由来する。
【０１１２】
一態様では、目的の抗原による免疫化に応答して、抗原特異的Ｂ細胞集団を作製する遺伝子改変マウスであって、前記抗原特異的Ｂ細胞集団のうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％超が、同じＶＨ遺伝子セグメントに全てが由来する免疫グロブリン重鎖を発現させるマウスが提供される。一実施形態では、抗原特異的Ｂ細胞集団のうちの少なくとも７５％が、同じＶＨ遺伝子セグメントに由来する免疫グロブリン重鎖を発現させる。一実施形態では、抗原特異的Ｂ細胞の全てが、同じＶＨ遺伝子セグメントに由来する重鎖を発現させる。
【０１１３】
一態様では、限定ＶＨ遺伝子セグメントのレパートリーを含む非ヒト動物であって、限定が、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントまたはＶＨ１−６９＊０１遺伝子セグメントと少なくとも約７５．５％、７６．５％、８６．７％、８７．８％、９４．９％、９６．９％、９８％、または９９％同一なＶＨ１−６９遺伝子セグメントへの限定である非ヒト動物が提供される。特定の実施形態では、限定レパートリーが、図１５のＶＨ１−６９変異体のうちの１または複数から選択される。
【０１１４】
一態様では、限定ＶＨ遺伝子セグメントのレパートリーを含む非ヒト動物であって、限定が、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントまたはＶＨ１−２遺伝子セグメントと少なくとも約９４．９％、９５．９％、９６．９％、９８％、または９９％同一なＶＨ１−２遺伝子セグメントへの限定である非ヒト動物が提供される。特定の実施形態では、限定レパートリーが、図１８のＶＨ１−２変異体のうちの１または複数から選択される。
【０１１５】
一実施形態では、非ヒト動物が、マウスである。
【０１１６】
一実施形態では、マウスが、野生型マウスと比較して未成熟Ｂ細胞に対する成熟Ｂ細胞の比率が高いことを特徴とする免疫表現型を呈示する。特定の実施形態では、比率を、脾臓から採取されたＢ細胞から計算する。一実施形態では、マウスが、約１×１０７個の成熟Ｂ細胞の集団を呈示する。一実施形態では、マウスが、約０．５×１０７個の未成熟Ｂ細胞の集団を呈示する。一実施形態では、マウスが、マウスの脾臓における未成熟Ｂ細胞に対する成熟Ｂ細胞の比率であって、野生型マウスにより呈示される比率の約１．５倍〜約２倍の比率を呈示する。
【０１１７】
一実施形態では、比率を、骨髄から採取されたＢ細胞から計算する。特定の実施形態では、マウスが、約３×１０５個の成熟Ｂ細胞の集団を呈示する。一実施形態では、マウスが、約７×１０５個の未成熟Ｂ細胞の集団を呈示する。一実施形態では、マウスが、マウスの骨髄中の未成熟Ｂ細胞に対する成熟Ｂ細胞の比率であって、野生型マウスにより呈示される比率の約３倍または約３．３倍の比率を呈示する。
【０１１８】
一実施形態では、マウスが、野生型マウスと比較して骨髄中のプロＢ細胞の数が大きいことを特徴とする免疫表現型を呈示する。特定の実施形態では、マウスが、マウスの骨髄中のプロＢ細胞の集団であって、野生型マウスの骨髄中で呈示される集団の約２．５倍〜約３倍の集団を呈示する。特定の実施形態では、マウスが、マウスの骨髄中のプロＢ細胞の集団であって、野生型マウスの骨髄中で呈示される集団の約２．７５倍の集団を呈示する。
【０１１９】
一実施形態では、マウスが、野生型Ｂ細胞の約８０％のＣＤ１９＋脾臓Ｂ細胞集団、野生型マウスとほぼ同じであるＣＤ３＋脾臓Ｔ細胞集団、およびこれらの組合せからなる群から選択される特徴を有する免疫表現型を呈示する。
【０１２０】
一実施形態では、マウスが、それらの脾臓内のＣＤ１９＋Ｂ細胞％が、野生型マウスとほぼ同じであるリンパ球集団を含む。一実施形態では、マウスの脾臓１つ当たりのＣＤ１９＋Ｂ細胞の数が、野生型マウスの脾臓１つ当たりのＣＤ１９＋Ｂ細胞の数の少なくとも約５０％である。
【０１２１】
一実施形態では、非ヒト動物が、骨髄中に、野生型マウスと比較して少なくとも約７５％〜約８０％のＣＤ１９＋Ｂ細胞を含む。
【０１２２】
一実施形態では、マウスの大腿骨１本当たりのＣＤ１９＋骨細胞の総数が、野生型マウスにおけるＣＤ１９＋骨髄細胞の総数の約３０％、４０％、５０％、６０％、または７５％以上である。
【０１２３】
一実施形態では、マウスが、ＩｇＤおよびＩｇＭを、野生型マウスにおいて観察されるレベルとほぼ同じレベルで発現させる。
【０１２４】
一態様では、限定ヒトＶＨセグメントのレパートリーを含むマウスであって、ヒト化免疫グロブリン軽鎖可変セグメント遺伝子座をさらに含み、マウスにおいて発現するκ軽鎖に対するλ軽鎖の比率が、野生型マウスにおける比率とほぼ同じであるマウスが提供される。
【０１２５】
一態様では、単一のＶＨ遺伝子セグメント、１または複数のＤＨ遺伝子セグメント、および１または複数のＪＨ遺伝子セグメントの存在を特徴とする限定免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むマウスであって、単一のＶＨ遺伝子セグメントが、多型のＶＨ遺伝子セグメントであるマウスが提供される。
【０１２６】
一実施形態では、多型のＶＨ遺伝子セグメントが、ヒト集団における高コピー数と関連するヒトＶＨ遺伝子セグメントである。一実施形態では、ヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−２３、またはこれらの多型変異体から選択される。特定の実施形態では、ヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ＶＨ１−６９遺伝子セグメントである。別の特定の実施形態では、ヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ＶＨ１−２遺伝子セグメントである。
【０１２７】
一実施形態では、単一のＶＨ遺伝子セグメントが、ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子、マウス免疫グロブリン定常領域遺伝子、またはキメラヒト／マウス免疫グロブリン定常領域遺伝子に作動可能に連結されている。特定の実施形態では、免疫グロブリン定常領域遺伝子が、マウス定常領域遺伝子である。一実施形態では、免疫グロブリン定常遺伝子が、ヒトＣＨ１配列、ヒトヒンジ配列、ヒトＣＨ２配列、ヒトＣＨ３配列、およびこれらの組合せから選択されるヒト配列を含む。一実施形態では、マウス定常遺伝子が、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある。
【０１２８】
一実施形態では、マウスが、Ｊ遺伝子セグメントおよび軽鎖定常遺伝子に作動可能に連結されたヒト免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメントをさらに含む。特定の実施形態では、ＶＬ遺伝子セグメントおよび／またはＪ遺伝子セグメントが、ヒトκ遺伝子セグメントおよびヒトλ遺伝子セグメントから選択される。一実施形態では、ＶＬ遺伝子セグメントおよび／またはＪ遺伝子セグメントが、ヒトκ遺伝子セグメントである。
【０１２９】
様々な実施形態では、マウスが、全てまたは実質的に全ての内因性ＶＨ遺伝子セグメントの欠失を含む。
【０１３０】
様々な実施形態では、非ヒト動物が、不活化内因性重鎖可変遺伝子の遺伝子座を含む。様々な実施形態では、不活化内因性重鎖可変遺伝子の遺伝子座が、内因性重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結されていない。
【０１３１】
一態様では、血清中免疫グロブリンの発現を特徴とし、血清中免疫グロブリンのうちの８０％超が、ヒト重鎖可変ドメインおよび同種のヒト軽鎖可変ドメインを含み、ヒト重鎖可変ドメインが、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントおよび／またはその多型変異体から本質的になるＶＨ遺伝子セグメントのレパートリーに由来するマウスが提供される。
【０１３２】
一実施形態では、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントおよび／またはその多型変異体である。一実施形態では、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントおよび／またはその多型変異体である。
【０１３３】
一態様では、その生殖細胞系内の内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、全てまたは実質的に全ての内因性ＶＨ遺伝子セグメントの、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントおよび／またはその多型変異体による置き換えを含むマウスが提供される。一実施形態では、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントおよび／またはその多型変異体である。一実施形態では、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントおよび／またはその多型変異体である。
【０１３４】
一実施形態では、マウスが、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座において、全てまたは実質的に全ての内因性ＶＬ遺伝子セグメントの、１または複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントによる置き換えをさらに含む。特定の実施形態では、マウスが、ヒトＶＬ遺伝子セグメントに作動可能に連結された１または複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントをさらに含む。
【０１３５】
一態様では、免疫グロブリン可変領域のヌクレオチド配列を作製するための、本明細書で記載されるマウスの使用が提供される。一実施形態では、配列が、再配列されたＶＨ１−６９遺伝子セグメントを含む。一実施形態では、配列が、再配列されたＶＨ１−２遺伝子セグメントを含む。
【０１３６】
一実施形態では、免疫グロブリン可変領域のヌクレオチド配列が、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一である。特定の実施形態では、免疫グロブリン可変領域のヌクレオチド配列が、配列番号３４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一である。様々な実施形態では、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントが、表２から同定される。
【０１３７】
一実施形態では、免疫グロブリン可変領域のヌクレオチド配列が、配列番号３５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一なアミノ酸配列をコードする。
【０１３８】
一実施形態では、免疫グロブリン可変領域のヌクレオチド配列が、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一である。特定の実施形態では、免疫グロブリン可変領域のヌクレオチド配列が、配列番号６０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一である。様々な実施形態では、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントが、表３から同定される。
【０１３９】
一実施形態では、免疫グロブリン可変領域のヌクレオチド配列が、配列番号６１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一なアミノ酸配列をコードする。
【０１４０】
一態様では、完全ヒトＦａｂまたは完全ヒトＦ（ａｂ）２を作製するための、本明細書で記載されるマウスの使用が提供される。一実施形態では、完全ヒトＦａｂまたは完全ヒトＦ（ａｂ）２が、再配列されたヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントを含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、完全ヒトＦａｂまたは完全ヒトＦ（ａｂ）２が、再配列されたヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントを含む重鎖可変領域を含む。
【０１４１】
一態様では、不死化細胞系を作製するための、本明細書で記載されるマウスの使用が提供される。
【０１４２】
一態様では、ハイブリドーマまたはクァドローマを作製するための、本明細書で記載されるマウスの使用が提供される。
【０１４３】
一態様では、ヒト重鎖可変領域およびヒト軽鎖可変領域を含有するファージライブラリーを作製するための、本明細書で記載されるマウスの使用が提供される。
【０１４４】
一実施形態では、ヒト重鎖可変領域が、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６および配列番号５８から選択される配列を含むヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントに由来する。
【０１４５】
一実施形態では、ヒト重鎖可変領域が、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７および配列番号５９から選択される配列を含むヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントに由来する。
【０１４６】
一実施形態では、ヒト重鎖可変領域の全てが、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６および配列番号６８から選択される配列を含むヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントに由来する。
【０１４７】
一実施形態では、ヒト重鎖可変領域が、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７および配列番号６９から選択される配列を含むヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントに由来する。
【０１４８】
一態様では、ヒト抗体を作製するために、可変領域の配列を生成させるための、本明細書で記載されるマウスの使用であって、（ａ）本明細書で記載されるマウスを、目的の抗原で免疫化するステップと、（ｂ）（ａ）の免疫化されたマウスからリンパ球を単離するステップと、（ｃ）リンパ球を、１または複数の標識された抗体へと曝露するステップと、（ｄ）目的の抗原に結合することが可能なリンパ球を同定するステップと、（ｅ）リンパ球に由来する１または複数の可変領域の核酸配列を増幅し、これにより、可変領域の配列を生成させるステップとを含む使用が提供される。
【０１４９】
一実施形態では、リンパ球が、マウスの脾臓に由来するかまたはこれから単離される。一実施形態では、リンパ球が、マウスのリンパ節に由来するかまたはこれから単離される。一実施形態では、リンパ球が、マウスの骨髄に由来するかまたはこれから単離される。一実施形態では、リンパ球が、マウスの血液に由来するかまたはこれから単離される。
【０１５０】
一実施形態では、標識された抗体が、フルオロフォアとコンジュゲートされた抗体である。一実施形態では、１または複数のフルオロフォアとコンジュゲートされた抗体が、ＩｇＭ、ＩｇＧ、および／またはこれらの組合せから選択される。
【０１５１】
一実施形態では、リンパ球が、Ｂ細胞である。
【０１５２】
一実施形態では、１または複数の可変領域の核酸配列が、重鎖可変領域の配列を含む。一実施形態では、１または複数の可変領域の核酸配列が、軽鎖可変領域の配列を含む。特定の実施形態では、軽鎖可変領域の配列が、免疫グロブリンκ軽鎖可変領域の配列である。一実施形態では、１または複数の可変領域の核酸配列が、重鎖可変領域およびκ軽鎖可変領域の配列を含む。
【０１５３】
一実施形態では、ヒト抗体を作製するために、重鎖可変領域およびκ軽鎖可変領域の配列を生成させるための、本明細書で記載されるマウスの使用であって、（ａ）本明細書で記載されるマウスを目的の抗原で免疫化するステップと、（ｂ）（ａ）の免疫化されたマウスから脾臓を単離するステップと、（ｃ）脾臓に由来するＢリンパ球を１または複数の標識された抗体へと曝露するステップと、（ｄ）目的の抗原に結合することが可能な（ｃ）のＢリンパ球を同定するステップと、（ｅ）Ｂリンパ球に由来する重鎖可変領域の核酸配列およびκ軽鎖可変領域の核酸配列を増幅し、これにより、重鎖可変領域およびκ軽鎖可変領域の配列を生成させるステップとを含む使用が提供される。
【０１５４】
一実施形態では、ヒト抗体を作製するために、重鎖可変領域およびκ軽鎖可変領域の配列を生成させるための、本明細書で記載されるマウスの使用であって、（ａ）本明細書で記載されるマウスを目的の抗原で免疫化するステップと、（ｂ）（ａ）の免疫化されたマウスから１または複数のリンパ節を単離するステップと、（ｃ）１または複数のリンパ節に由来するＢリンパ球を１または複数の標識された抗体へと曝露するステップと、（ｄ）目的の抗原に結合することが可能な（ｃ）のＢリンパ球を同定するステップと、（ｅ）Ｂリンパ球に由来する重鎖可変領域の核酸配列およびκ軽鎖可変領域の核酸配列を増幅し、これにより、重鎖可変領域およびκ軽鎖可変領域の配列を生成させるステップとを含む使用が提供される。
【０１５５】
一実施形態では、ヒト抗体を作製するために、重鎖可変領域およびκ軽鎖可変領域の配列を生成させるための、本明細書で記載されるマウスの使用であって、（ａ）本明細書で記載されるマウスを目的の抗原で免疫化するステップと、（ｂ）（ａ）の免疫化されたマウスから骨髄を単離するステップと、（ｃ）骨髄に由来するＢリンパ球を１または複数の標識された抗体へと曝露するステップと、（ｄ）目的の抗原に結合することが可能な（ｃ）のＢリンパ球を同定するステップと、（ｅ）Ｂリンパ球に由来する重鎖可変領域の核酸配列およびκ軽鎖可変領域の核酸配列を増幅し、これにより、重鎖可変領域およびκ軽鎖可変領域の配列を生成させるステップとを含む使用が提供される。様々な実施形態では、１または複数の標識された抗体が、ＩｇＭ、ＩｇＧ、および／またはこれらの組合せから選択される。
【０１５６】
様々な実施形態では、目的の抗原が、例えば、ウイルス性抗原を含め、ヒト被験体に罹患する病原体である。例示的なウイルス性病原体には、例えば、主に、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ科、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ（Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ）科、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ科、およびＴｏｇａｖｉｒｉｄａｅ科の病原体が含まれる。このような例示的なウイルスは典型的に、長さが２０〜３００ナノメートルの間の範囲にある。様々な実施形態では、目的の抗原が、肝炎ウイルス（例えば、ＨＣＶ、ＨＢＶなど）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、またはインフルエンザウイルス（例えば、Ｈ１Ｎ１）から選択されるウイルス性抗原である。
【０１５７】
様々な実施形態では、ヒト抗体を作製するために、重鎖可変領域およびκ軽鎖可変領域の配列を生成させるための、本明細書で記載されるマウスの使用であって、増幅された重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を、ヒト重鎖および軽鎖定常領域配列へと融合させるステップと、融合させた重鎖および軽鎖配列を、細胞内で発現させるステップと、発現させた重鎖および軽鎖配列を回収し、これにより、ヒト抗体を生成させるステップとをさらに含む使用が提供される。
【０１５８】
様々な実施形態では、ヒト重鎖定常領域が、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＧから選択される。様々な特定の実施形態では、ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４から選択される。様々な実施形態では、ヒト重鎖定常領域が、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、またはこれらの組合せを含む。様々な実施形態では、軽鎖定常領域が、免疫グロブリンκ定常領域である。様々な実施形態では、細胞が、ＨｅＬａ細胞、ＤＵ１４５細胞、Ｌｎｃａｐ細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３８細胞、ＰＣ３細胞、Ｔ４７Ｄ細胞、ＴＨＰ−１細胞、Ｕ８７細胞、ＳＨＳＹ５Ｙ（ヒト神経芽細胞腫）細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、ＧＨ３細胞、ＰＣ１２細胞、ヒト網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞）、およびＭＣ３Ｔ３細胞から選択される。特定の実施形態では、細胞が、ＣＨＯ細胞である。
【０１５９】
一態様では、目的の抗原に対して特異的なリバースキメラ齧歯動物−ヒト抗体を生成させるための方法であって、本明細書で記載されるマウスを抗原で免疫化するステップと、抗原に対して特異的なリバースキメラマウス−ヒト抗体を産生するマウスから少なくとも１つの細胞を単離するステップと、抗原に対して特異的なリバースキメラマウス−ヒト抗体を産生する少なくとも１つの細胞を培養するステップと、前記抗体を得るステップとを含む方法が提供される。
【０１６０】
一実施形態では、リバースキメラマウス−ヒト抗体が、マウス重鎖定常遺伝子またはラット重鎖定常遺伝子と融合させたヒト重鎖可変ドメイン、およびマウス軽鎖定常遺伝子またはラット軽鎖定常遺伝子またはヒト軽鎖定常遺伝子と融合させたヒト軽鎖可変ドメインを含む。特定の実施形態では、ヒト重鎖可変ドメインが、再配列されたヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントまたはヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントを含有する。
【０１６１】
一実施形態では、抗原に対して特異的なリバースキメラ齧歯動物−ヒト抗体を産生する少なくとも１つの細胞を培養するステップを、マウスから単離された少なくとも１つの細胞から生成させた少なくとも１つのハイブリドーマ細胞において実施する。
【０１６２】
一実施形態では、目的の抗原が、本明細書で記載される、ヒト被験体に罹患する病原体である。
【０１６３】
一態様では、目的の抗原に対して特異的な完全ヒト抗体を生成させるための方法であって、本明細書で記載されるマウスを、抗原で免疫化するステップと、抗原に対して特異的なリバースキメラ齧歯動物−ヒト抗体を産生するマウスから少なくとも１つの細胞を単離するステップと、抗原に対して特異的なリバースキメラ齧歯動物−ヒト抗体に由来する完全ヒト抗体を産生する少なくとも１つの細胞を発生させるステップと、完全ヒト抗体を産生する少なくとも１つの細胞を培養するステップと、前記完全ヒト抗体を得るステップとを含む方法が提供される。
【０１６４】
様々な実施形態では、抗原に対して特異的なリバースキメラ齧歯動物−ヒト抗体を産生するマウスから単離された少なくとも１つの細胞が、脾臓細胞またはＢ細胞である。
【０１６５】
様々な実施形態では、抗体が、モノクローナル抗体である。
【０１６６】
様々な実施形態では、抗体が、再配列されたヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントまたはヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントを含有する重鎖可変ドメインを含む。
【０１６７】
様々な実施形態では、目的の抗原による免疫化を、タンパク質、ＤＮＡ、ＤＮＡとタンパク質との組合せ、または抗原を発現させる細胞により実行する。一実施形態では、目的の抗原が、本明細書で記載される、ヒト被験体に罹患する病原体である。
【０１６８】
一態様では、免疫グロブリン可変領域またはその断片をコードする核酸配列を作製するための、本明細書で記載されるマウスの使用が提供される。一実施形態では、核酸配列を用いて、ヒト抗体またはその抗原結合断片を作製する。一実施形態では、マウスを用いて、抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ｓｃＦｖ、二重特異性ｓｃＦｖ、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、Ｖ−ＮＡＲ、ＶＨＨ、ＶＬ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２、ＤＶＤ（すなわち、二重可変ドメイン抗原結合タンパク質）、ＳＶＤ（すなわち、単一可変ドメイン抗原結合タンパク質）、または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒ）（ＢｉＴＥ）から選択される抗原結合タンパク質を作製する。
【０１６９】
一態様では、ヒト抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、本明細書で記載される遺伝子改変非ヒト動物を、目的の抗原へと曝露するステップと、遺伝子改変非ヒト動物に、抗原に対する免疫反応を開始させるステップと、遺伝子改変非ヒト動物から、目的の抗原に特異的に結合するヒト重鎖可変ドメインをコードする重鎖可変ドメインの核酸配列を得るステップと、重鎖可変ドメインの核酸配列を、ヒト定常領域配列へとクローニングするステップと、哺乳動物細胞内で、ヒト重鎖可変ドメイン配列およびヒト定常領域配列を含む抗体を発現させるステップとを含む方法が提供される。一実施形態では、哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞である。一実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物が、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントから本質的になるヒトＶＨ遺伝子セグメントのレパートリーであって、場合によって、１または複数のヒトＤセグメントおよび／またはヒトＪセグメントに作動可能に連結された、その２つ以上の多型の変異体で存在するレパートリーを含む。一実施形態では、ヒトＶＨ遺伝子セグメントのレパートリーが、内因性非ヒトＶＨセグメントの遺伝子座にある。一実施形態では、ヒトＶＨ遺伝子セグメントのレパートリーが、内因性ＶＨセグメントの遺伝子座ではない遺伝子座にある。一実施形態では、ヒト配列および齧歯動物配列（例えば、マウス配列またはラット配列またはハムスター配列）から選択される定常領域配列に作動可能に連結された、再配列されたヒトＶＤＪ遺伝子を形成するように、ヒトＶＨ遺伝子セグメントを、ヒトＤセグメントおよびヒトＪセグメントにより再配列する。一実施形態では、定常領域配列が、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せから選択される配列を含み、特定の実施形態では、定常領域配列が、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。一実施形態では、ヒト可変ドメインおよび定常配列を、同じマウスから得られる同種のヒト軽鎖可変ドメイン（例えば、ヒト可変ドメイン配列と同じＢ細胞から得られる配列）と共に、哺乳動物細胞内で発現させ、次いで、一実施形態では、マウスから得られる、ヒト軽鎖可変ドメインをコードする配列を、ヒト軽鎖定常配列をコードする配列と融合させ、軽鎖配列および重鎖配列を哺乳動物細胞内で発現させる。
【０１７０】
一実施形態では、目的の抗原が、本明細書で記載される、ヒト被験体に罹患する病原体である。
【０１７１】
一態様では、目的の抗原に結合する抗体の重鎖可変ドメインを作製するための方法であって、単一の細胞内で、（ａ）本明細書で記載される、免疫化された非ヒト動物の第１のＶＨ配列であり、ＣＨ遺伝子配列と融合させた第１のＶＨ配列、および（ｂ）本明細書で記載される、免疫化された非ヒト動物のＶＬ遺伝子配列であり、ヒトＣＬ遺伝子配列と融合させたＶＬ遺伝子配列を発現させるステップと；細胞を、抗体を発現させるのに十分な条件下で維持するステップと；抗体の重鎖可変ドメインを単離するステップとを含む方法が提供される。一実施形態では、ＶＬ遺伝子配列が、第１のＶＨ配列と同種である。
【０１７２】
一実施形態では、細胞が、本明細書で記載される、免疫化された非ヒト動物の第２のＶＨ遺伝子配列を含み、第２のＶＨ遺伝子配列が、ＣＨ遺伝子配列と融合し、第１のＶＨ遺伝子配列が、第１のエピトープに特異的に結合するＶＨドメインをコードし、第２のＶＨ遺伝子配列が、第２のエピトープに特異的に結合するＶＨドメインをコードし、第１のエピトープと第２のエピトープとが同一でない。
【０１７３】
一実施形態では、定常領域配列が、全てのヒト定常領域配列である。一実施形態では、目的の抗原が、本明細書で記載される、ヒト被験体に罹患する病原体である。
【０１７４】
一態様では、ヒト二重特異性抗体を作製するための方法であって、本明細書で記載される非ヒト動物のＢ細胞のヒト可変領域遺伝子配列を用いて二重特異性抗体を作製するステップを含む方法が提供される。
【０１７５】
一実施形態では、方法が、（ａ）非ヒト動物のクローン選択されたリンパ球を同定するステップであって、非ヒト動物を、目的の抗原へと曝露し、目的の抗原に対する免疫反応を発生させ、リンパ球が、目的の抗原に特異的に結合する抗体を発現させる、ステップと、（ｂ）リンパ球または抗体から、目的の抗原に特異的に結合するヒト重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を得るステップと、（ｃ）目的の抗原に特異的に結合するヒト重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を、二重特異性抗体の作製において使用するステップとを含む。特定の実施形態では、ヒト重鎖可変領域が、再配列されたＶＨ１−２またはＶＨ１−６９遺伝子セグメントを含む。
【０１７６】
一実施形態では、ステップ（ａ）〜（ｃ）を、１回目は、第１のヒト重鎖可変領域の配列を生成させるために、第１の目的の抗原に対して実施し、ステップ（ａ）〜（ｃ）を、２回目は、第２のヒト重鎖可変領域の配列を生成させるために、第２の目的の抗原に対して実施し、第１のヒト重鎖定常領域と融合させた第１のヒト重鎖可変領域の配列を発現させて、第１のヒト重鎖を形成し、第２のヒト重鎖定常領域と融合させた第２のヒト重鎖可変領域の配列を発現させて、第２のヒト重鎖を形成し、第１のヒト重鎖および第２のヒト重鎖を、再配列されたヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントから発現する単一のヒト軽鎖の存在下で発現させる。特定の実施形態では、単一のヒト軽鎖が、生殖細胞系配列を含む。
【０１７７】
一実施形態では、方法が、（ａ）重鎖可変領域を、第１の目的の抗原へと曝露された、本明細書で記載される非ヒト動物、ならびに遺伝子的に同じであり、第２の目的の抗原へと曝露された同じ非ヒト動物または異なる非ヒト動物のＢ細胞からクローニングするステップと、（ｂ）（ａ）の重鎖可変領域を、同じ重鎖定常領域および同じ軽鎖と共に細胞内で発現させて、二重特異性抗体を作製するステップとを含む。
【０１７８】
一態様では、ヒト重鎖可変ドメインをコードする核酸配列を得るための、本明細書で記載される非ヒト動物の使用が提供される。一実施形態では、重鎖可変ドメインが、ＶＨ１−２、およびＶＨ１−６９から選択される、再配列されたヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む。
【０１７９】
一態様では、ヒト重鎖可変ドメインをコードする細胞を得るための、本明細書で記載される非ヒト動物の使用が提供される。一実施形態では、重鎖可変ドメインが、ＶＨ１−２、およびＶＨ１−６９から選択される、再配列されたヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む。
【０１８０】
一態様では、ヒト抗体可変ドメインを作製するための、本明細書で記載される非ヒト動物の使用が提供される。一実施形態では、可変ドメインが、ＶＨ１−２、およびＶＨ１−６９から選択される、再配列されたヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む。
【０１８１】
一態様では、ヒト抗体を作製するための、本明細書で記載される非ヒト動物の使用であって、本明細書で記載される非ヒト動物のＢ細胞のヒト可変領域遺伝子配列を用いて、抗体を作製するステップを含む使用が提供される。一実施形態では、ヒト抗体が、ヒト二重特異性抗体である。特定の実施形態では、二重特異性抗体が、再配列されたヒトＶＨ１−２またはＶＨ１−６９遺伝子セグメントに由来する１つの重鎖可変ドメインを含む。一実施形態では、ヒト可変領域遺伝子配列が、再配列されたヒトＶＨ１−２またはＶＨ１−６９遺伝子セグメントを含む。
【０１８２】
一態様では、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを選択するための、本明細書で記載される非ヒト動物の使用が提供される。一実施形態では、重鎖可変ドメインが、ＶＨ１−２、およびＶＨ１−６９から選択される、再配列されたヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む。
【０１８３】
一態様では、ヒト疾患またはヒト障害を処置するために、医薬（例えば、抗原結合タンパク質）を製造するための、または医薬（例えば、抗原結合タンパク質）の可変配列をコードする配列を製造するための、本明細書で記載されるマウスの使用が提供される。一実施形態では、医薬の可変配列が、多型のヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む。一実施形態では、医薬の可変配列が、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントを含む。一実施形態では、医薬の可変配列が、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントを含む。
【０１８４】
一態様では、本明細書で記載されるマウスにおいて作製される免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸構築物が提供される。一実施形態では、可変ドメインが、重鎖可変ドメインである。特定の実施形態では、重鎖可変ドメインが、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、またはＶＨ３−２３から選択される、再配列されたヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む。別の特定の実施形態では、重鎖可変ドメインが、再配列されたヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントを含む。別の特定の実施形態では、重鎖可変ドメインが、再配列されたヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントを含む。
【０１８５】
一実施形態では、可変ドメインが、軽鎖可変ドメインである。特定の実施形態では、可変ドメインが、再配列されたヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントを含むヒト重鎖可変ドメインと同種であるκ軽鎖可変ドメインである。特定の実施形態では、可変ドメインが、再配列されたヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントを含むヒト重鎖可変ドメインと同種であるκ軽鎖可変ドメインである。
【０１８６】
一態様では、ヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸構築物を作製するための、本明細書で記載されるマウスの使用が提供される。一実施形態では、可変ドメインが、軽鎖可変ドメインである。一実施形態では、可変ドメインが、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ７−３、Ｖκ２−４、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ３−７、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ２−１０、Ｖκ３−１１、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ２−１４、Ｖκ３−１５、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ３−２０、Ｖκ６−２１、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ３−２５、Ｖκ２−２６、Ｖκ１−２７、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ３−３１、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ３−３４、Ｖκ１−３５、Ｖκ２−３６、Ｖκ１−３７、Ｖκ２−３８、Ｖκ１−３９、およびＶκ２−４０から選択される、再配列されたヒトＶκ遺伝子セグメントを含むκ軽鎖可変ドメインである。
【０１８７】
一実施形態では、可変ドメインが、重鎖可変ドメインである。特定の実施形態では、重鎖可変ドメインが、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、またはＶＨ３−２３から選択される、再配列されたヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態では、重鎖可変ドメインが、再配列されたヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態では、重鎖可変ドメインが、再配列されたヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントを含む。
【０１８８】
一態様では、ヒト免疫グロブリン可変ドメインを作製するための、本明細書で記載されるマウスの使用が提供される。一実施形態では、可変ドメインが、軽鎖可変ドメインである。一実施形態では、可変ドメインが、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ７−３、Ｖκ２−４、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ３−７、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ２−１０、Ｖκ３−１１、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ２−１４、Ｖκ３−１５、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ３−２０、Ｖκ６−２１、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ３−２５、Ｖκ２−２６、Ｖκ１−２７、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ３−３１、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ３−３４、Ｖκ１−３５、Ｖκ２−３６、Ｖκ１−３７、Ｖκ２−３８、Ｖκ１−３９、およびＶκ２−４０から選択される、再配列されたヒトＶκ遺伝子セグメントを含むκ軽鎖可変ドメインである。
【０１８９】
一実施形態では、可変ドメインが、重鎖可変ドメインである。特定の実施形態では、重鎖可変ドメインが、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、またはＶＨ３−２３から選択される、再配列されたヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態では、重鎖可変ドメインが、再配列されたヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態では、重鎖可変ドメインが、再配列されたヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントを含む。
【０１９０】
一態様では、ヒト重鎖可変ドメインをコードする核酸配列を作製するための、本明細書で記載される非ヒト動物の使用が提供される。一実施形態では、ヒト重鎖可変ドメインが、多型のヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来するヒトＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３配列を有することを特徴とする。特定の実施形態では、ヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメント、ＶＨ１−６９遺伝子セグメント、ＶＨ２−２６遺伝子セグメント、ＶＨ２−７０遺伝子セグメント、またはＶＨ３−２３遺伝子セグメントから選択される。一実施形態では、ヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントである。一実施形態では、ヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントである。
【０１９１】
一態様では、ヒトＶＨドメインをコードする核酸配列を作製するための方法であって、本明細書で記載される非ヒト動物を目的の抗原で免疫化するステップと、非ヒト動物に目的の抗原に対する免疫反応を開始させるステップと、非ヒト動物から、目的の抗原に結合するヒトＶＨドメインをコードする核酸配列を得るステップとを含む方法が提供される。一実施形態では、方法が、ヒトＶＨドメインと同種であるヒトＶＬドメインをコードする核酸配列を作製するステップであって、ヒトＶＨドメインおよびヒトＶＬドメインをコードするＢ細胞を単離することと、Ｂ細胞から重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの配列を得ることとを含むステップをさらに含む。様々な実施形態では、ヒトＶＨドメインが、再配列されたヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントまたはヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントに由来する。様々な実施形態では、ヒトＶＬドメインが、ヒトＶκドメインまたはヒトＶλドメインから選択される。
【０１９２】
一態様では、ヒト用治療剤を作製するための、本明細書で記載される非ヒト動物の使用であって、非ヒト動物を目的の抗原で免疫化するステップと、非ヒト動物に免疫反応を開始させるステップと、動物から、目的の抗原に結合する免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸配列を得るステップと、免疫グロブリン可変ドメインを、ヒト治療剤において使用するステップとを含む使用が提供される。一実施形態では、可変ドメインが、重鎖可変ドメインである。特定の実施形態では、重鎖可変ドメインが、再配列されたヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントまたはヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントに由来する。一実施形態では、可変ドメインが、軽鎖可変ドメインである。特定の実施形態では、軽鎖可変ドメインが、再配列されたヒトＶκ遺伝子セグメントまたはヒトＶλ遺伝子セグメントに由来する。
【０１９３】
一態様では、ヒト用治療剤を作製するための方法であって、本明細書で記載される非ヒト動物を目的の抗原で免疫化するステップと、非ヒト動物に免疫反応を開始させるステップと、動物から、目的の抗原に結合する免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸配列を得るステップと、免疫グロブリン可変ドメインを、ヒト治療剤において使用するステップとを含む方法が提供される。一実施形態では、可変ドメインが、重鎖可変ドメインである。特定の実施形態では、重鎖可変ドメインが、再配列されたヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントまたはヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントに由来する。一実施形態では、可変ドメインが、軽鎖可変ドメインである。特定の実施形態では、軽鎖可変ドメインが、再配列されたヒトＶκ遺伝子セグメントまたはヒトＶλ遺伝子セグメントに由来する。
【０１９４】
一態様では、ヒト抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、本明細書で記載される非ヒト動物を目的の抗原で免疫化するステップと、動物に免疫反応を開始させるステップと、マウスから、目的の抗原に特異的に結合する免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸配列を得るステップと、核酸を発現させるのに適するベクター内で核酸配列をクローニングするステップであり、核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域またはその機能的な断片をコードする核酸配列とインフレームでクローニングする、ステップと、ベクターを哺乳動物細胞内に挿入するステップと、免疫グロブリン可変ドメインおよび免疫グロブリン定常領域またはその機能的な断片を含む抗原結合タンパク質を発現させるのに適する条件下で細胞を維持するステップとを含む方法が提供される。一実施形態では、抗原結合タンパク質が、ヒト抗体である。特定の実施形態では、抗体が、本明細書で記載されるマウスから得られる重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。特定の実施形態では、抗体が、本明細書で記載されるマウスから得られる重鎖可変ドメインを含む。様々な実施形態では、重鎖可変ドメインが、再配列されたヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントまたはヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントに由来する。
【０１９５】
一態様では、本明細書で記載される非ヒト動物において作製されるヒト抗原結合ドメインをコードする核酸配列が提供される。一実施形態では、核酸配列が、ヒト免疫グロブリンＶＨドメインをコードする。一実施形態では、核酸配列が、ヒト免疫グロブリンＶＨドメインおよび同種のヒトＶＬドメインをコードする。様々な実施形態では、ヒトＶＨドメインが、再配列されたヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントまたはヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントに由来する。
【０１９６】
一態様では、ヒト抗体を調製するための方法であって、本明細書で記載される非ヒト動物を目的の抗原で免疫化するステップと、非ヒト動物に免疫反応を開始させるステップと、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）を、免疫化された動物から採取するステップと、リンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成するステップと、ハイブリドーマ細胞から、ヒトＶＨドメインおよびヒトＶＬドメインをコードする核酸配列を得るステップと、核酸配列を、ヒト定常領域配列とインフレームで（すなわち、作動可能に連結して）クローニングして、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を創出するステップと、完全ヒト抗体を発現させることが可能な細胞内で重鎖および軽鎖を発現させるステップとを含む方法が提供される。一実施形態では、細胞が、ＣＨＯ細胞である。様々な実施形態では、ヒトＶＨドメインが、再配列されたヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントまたはヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントに由来する。
【０１９７】
一態様では、ヒト抗体を調製するための方法であって、本明細書で記載される非ヒト動物を目的の抗原で免疫化するステップと、非ヒト動物に免疫反応を開始させるステップと、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）を、免疫化された動物から採取するステップと、リンパ球から、ヒトＶＨドメインおよびヒトＶＬドメインをコードする核酸配列を得るステップと、核酸配列を、ヒト定常領域配列とインフレームで（すなわち、作動可能に連結して）クローニングして、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を創出するステップと、完全ヒト抗体を発現させることが可能な細胞内で重鎖および軽鎖を発現させるステップとを含む方法が提供される。一実施形態では、リンパ球が、非ヒト動物の脾臓に由来する。一実施形態では、細胞が、ＣＨＯ細胞である。様々な実施形態では、ヒトＶＨドメインが、再配列されたヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントまたはヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントに由来する。
【０１９８】
様々な態様では、目的の抗原が、本明細書で記載される、ヒト被験体に罹患する病原体である。様々な態様では、目的の抗原が、ヒトに感染することが可能なウイルスである。本明細書で記載される方法および使用において使用されうる例示的な抗原には、ウイルス、細菌、プリオン、もしくは真菌、またはヒトにおいて疾患を引き起こす他の任意の病原体などの微生物（ｍｉｃｒｏｂｅまたはｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）が含まれる。本開示を読めば、当業者は、本明細書で記載される方法および使用に適用可能なヒト病原体を認識するであろう。別段に明示的に言及されるか、または文脈により、併用が明瞭に禁止されない限りにおいて、様々な態様および実施形態を併用することが可能である。
本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１または複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および１または複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントの存在を特徴とする限定免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するマウスであって、上記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントが、多型のＶＨ遺伝子セグメントである、マウス。
（項目２）
全てまたは実質的に全ての内因性ＶＨ遺伝子セグメント、内因性ＤＨ遺伝子セグメント、および内因性ＪＨ遺伝子セグメントの欠失を含む、項目１に記載のマウス。
（項目３）
上記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、およびＶＨ３−２３から選択される、項目１に記載のマウス。
（項目４）
上記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ＶＨ１−６９である、項目３に記載のマウス。
（項目５）
上記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ＶＨ１−２である、項目３に記載のマウス。（項目６）
上記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子または非ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子に作動可能に連結されている、項目１に記載のマウス。
（項目７）
上記免疫グロブリン定常領域遺伝子が、マウス、ラット、またはヒトの定常領域遺伝子である、項目６に記載のマウス。
（項目８）
１または複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントに作動可能に連結された１または複数のヒト免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメントをさらに含む、項目１に記載のマウス。
（項目９）
上記１もしくは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび／または上記１もしくは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントが、ヒトκ遺伝子セグメントおよびヒトλ遺伝子セグメントから選択される、項目８に記載のマウス。
（項目１０）
上記１または複数のヒト免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメントおよび上記１または複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントが、非ヒト軽鎖定常遺伝子に作動可能に連結されている、項目８に記載のマウス。
（項目１１）
上記非ヒト軽鎖定常遺伝子が、マウスまたはラットのκ定常領域遺伝子またはλ定常領域遺伝子から選択される、項目１０に記載のマウス。
（項目１２）
マウスであって、上記マウスの生殖細胞系内の内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、全てまたは実質的に全ての内因性ＶＨ遺伝子セグメント、内因性ＤＨ遺伝子セグメント、および内因性ＪＨ遺伝子セグメントの、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントおよび／またはその多型変異体、１または複数のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび１または複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントによる置き換えを含む、マウス。
（項目１３）
内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座において、全てまたは実質的に全ての内因性ＶＬ遺伝子セグメントおよび内因性ＪＬ遺伝子セグメントの、１または複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび１または複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントによる置き換えをさらに含む、項目１２に記載のマウス。
（項目１４）
上記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントおよびヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントから選択される、項目１２に記載のマウス。
（項目１５）
項目１または１２に記載のマウスに由来する細胞または組織。
（項目１６）
ヒトＶＨドメインをコードする核酸配列を作製する方法であって、上記方法は：
（ａ）項目１または１２に記載のマウスを目的の抗原で免疫化するステップと、
（ｂ）上記マウスに、上記目的の抗原に対する免疫反応を開始させるステップと、
（ｃ）上記マウスからヒトＶＨドメインをコードする核酸配列を得るステップと
を含む、方法。
（項目１７）
上記免疫グロブリンＶＨ領域の配列が、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６または配列番号５８と少なくとも７５％同一である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
上記免疫グロブリンＶＨ領域の配列が、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、またはこれらの多型変異体を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
上記免疫グロブリンＶＨ領域の配列が、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７または配列番号５９と少なくとも７５％同一なタンパク質をコードする、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
上記免疫グロブリンＶＨ領域の配列が、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、または配列番号６８と少なくとも９５％同一である、項目１６に記載の方法。
（項目２１）
上記免疫グロブリンＶＨ領域の配列が、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８またはこれらの多型変異体を含む、項目１６に記載の方法。（項目２２）
上記免疫グロブリンＶＨ領域の配列が、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、または配列番号６９と少なくとも９５％同一なタンパク質をコードする、項目１６に記載の方法。
（項目２３）
ヒト重鎖可変ドメインをコードする核酸配列を作製するための、項目１または１２に記載のマウスの使用。
（項目２４）
上記ヒト重鎖可変ドメインが、多型のヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来するヒトＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３配列を有することを特徴とする、項目２３に記載の使用。
（項目２５）
上記ヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメント、ＶＨ１−６９遺伝子セグメント、ＶＨ２−２６遺伝子セグメント、ＶＨ２−７０遺伝子セグメント、またはＶＨ３−２３遺伝子セグメントから選択される、項目２４に記載の使用。
（項目２６）
上記ヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ＶＨ１−２である、項目２５に記載の使用。
（項目２７）
上記ヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ＶＨ１−６９である、項目２５に記載の使用。
（項目２８）
ヒト抗体を作製するための、項目１または１２に記載のマウスの使用であって、上記ヒト抗体が、再配列されたヒトＶＨ１−２遺伝子セグメント、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメント、またはこれらの多型変異体に由来する重鎖可変ドメインを含む、使用。
（項目２９）
上記再配列されたヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントが、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６または配列番号５８と少なくとも７５％同一である、項目２８に記載の使用。
（項目３０）
上記再配列されたヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントが、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、または配列番号６８と少なくとも９５％同一である、項目２８に記載の使用。
【図面の簡単な説明】
【０１９９】
【図１】図１は、単一のヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および６つのヒトＪＨ遺伝子セグメントを、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において含有する改変重鎖遺伝子座を構築するためのターゲティングベクターを作製するために使用される、一連のターゲティングステップおよび分子操作ステップについての、一定の縮尺ではない一般的な例示を示す図である。
【図２】図２は、単一のヒトＶＨ１−２遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ、および６つのヒトＪＨ遺伝子セグメントを、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において含有する改変重鎖遺伝子座を構築するためのターゲティングベクターを作製するために使用される、一連のターゲティングステップおよび分子操作ステップについての、一定の縮尺ではない一般的な例示を示す図である。
【図３】図３は、単一のリンパ球に対してゲーティングされ、かつ、野生型マウス（ＷＴ）ならびに内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ、および６つのヒトＪＨ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（１ｈＶＨ  ＨＯ）に由来するＣＤ１９（Ｂ細胞）およびＣＤ３（Ｔ細胞）について染色された脾臓細胞についてのコンタープロットである。
【図４Ａ】図４Ａは、左図において、野生型マウス（ＷＴ）ならびに内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ、および６つのヒトＪＨ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（１ｈＶＨ  ＨＯ）から摘出された脾臓内のＣＤ１９＋Ｂ細胞のパーセントを示す図である。右図では、脾臓１つ当たりのＣＤ１９＋Ｂ細胞の数を、野生型マウス（ＷＴ）ならびに内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ、および６つのヒトＪＨ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（１ｈＶＨ  ＨＯ）の両方について示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、左図において、野生型マウス（ＷＴ）ならびに内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ、および６つのヒトＪＨ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（１ｈＶＨ  ＨＯ）の大腿骨から摘出された骨髄中のＣＤ１９＋Ｂ細胞のパーセントを示す図である。右図では、大腿骨１本当たりのＣＤ１９＋Ｂ細胞の数を、野生型マウス（ＷＴ）ならびに内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ、および６つのヒトＪＨ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（１ｈＶＨ  ＨＯ）の両方について示す。
【図５】図５は、ＣＤ１９＋Ｂ細胞に対してゲーティングされ、かつ、野生型マウス（ＷＴ）ならびに内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ、および６つのヒトＪＨ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（１ｈＶＨ  ＨＯ）からのＩｇλおよびＩｇκの発現について染色された脾臓細胞についてのコンタープロットである。
【図６】図６は、ＣＤ１９＋Ｂ細胞に対してゲーティングされ、かつ、野生型マウス（ＷＴ）ならびに内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ、および６つのヒトＪＨ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（１ｈＶＨ  ＨＯ）に由来する免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）および免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）について染色された脾臓細胞についてのコンタープロットである。
【図７】図７は、野生型マウス（ＷＴ）ならびに内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ、および６つのヒトＪＨ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（１ｈＶＨ  ＨＯ）から摘出された脾臓内の、移行期Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＭｈｉＩｇＤｉｎｔ）と成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＭｉｎｔＩｇＤｈｉ）との総数、および未成熟Ｂ細胞に対する成熟Ｂ細胞の比率を示す図である。
【図８】図８は、一重項に対してゲーティングされ、かつ、野生型マウス（ＷＴ）ならびに内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ、および６つのヒトＪＨ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（１ｈＶＨ  ＨＯ）に由来する免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）およびＢ２２０について染色された骨髄についてのコンタープロットである。
【図９】図９は、野生型マウス（ＷＴ）ならびに内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ、および６つのヒトＪＨ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（１ｈＶＨ  ＨＯ）の大腿骨から単離された骨髄中の未成熟（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭ＋）Ｂ細胞と成熟（Ｂ２２０ｈｉＩｇＭ＋）Ｂ細胞との総数を示す図である。
【図１０】図１０は、ＣＤ１９＋Ｂ細胞に対してゲーティングされ、かつ、野生型マウス（ＷＴ）ならびに内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ、および６つのヒトＪＨ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（１ｈＶＨ  ＨＯ）に由来するｃｋｉｔ＋およびＣＤ４３＋について染色された骨髄についてのコンタープロットである。
【図１１Ａ】図１１Ａは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ、および６つのヒトＪＨ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（１ｈＶＨ  ＨＯ）の大腿骨から摘出された骨髄中のプロＢ（ＣＤ１９＋ＣＤ４３＋ｃｋｉｔ＋）細胞集団内およびプレＢ（ＣＤ１９＋ＣＤ４３−ｃｋｉｔ−）細胞集団内のＣＤ１９＋細胞のパーセントを示す図である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ、および６つのヒトＪＨ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（１ｈＶＨ  ＨＯ）から摘出された骨髄中のプロＢ（ＣＤ１９＋ＣＤ４３＋ｃｋｉｔ＋）およびプレＢ（ＣＤ１９＋ＣＤ４３−ｃｋｉｔ−）細胞集団内の大腿骨１本当たりの細胞の絶対数を示す図である。
【図１２】図１２は、内因性重鎖ＶＨ、ＤＨ、ＪＨならびに内因性軽鎖Ｖκ遺伝子セグメントおよび内因性軽鎖Ｊκ遺伝子セグメントの、ヒトＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、Ｖκ、およびＪκ遺伝子セグメントによる置き換えについてホモ接合性のマウス（Ｈκ）、野生型マウス（ＷＴ）、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ、および６つのヒトＪＨ遺伝子セグメントについてヘテロ接合性のマウス（１ｈＶＨ  ＨＥＴ）、ならびに内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ、および６つのヒトＪＨ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（１ｈＶＨ  ＨＯ）において、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントに特異的なプローブを用いる、定量的ＰＣＲアッセイ下の精製脾臓Ｂ細胞における、ＶＨ１−６９に由来する重鎖の相対的なｍＲＮＡ発現（ｙ軸）を示す図である。シグナルは、マウスＣκの発現に照らして正規化する。
【図１３】図１３は、ヒトＶＨ１−６９遺伝子について報告される１３の対立遺伝子の各々について、第２のエクソンのヌクレオチドアライメントを示す図である。小文字の塩基は、生殖細胞系の対立遺伝子間のヌクレオチド差違を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列の周りのボックスで示す。ダッシュは、適正な配列アライメントのための人為的ギャップを示す。ＶＨ１−６９＊０１（配列番号３４）；ＶＨ１−６９＊０２（配列番号３６）；ＶＨ１−６９＊０３（配列番号３８）；ＶＨ１−６９＊０４（配列番号４０）；ＶＨ１−６９＊０５（配列番号４２）；ＶＨ１−６９＊０６（配列番号４４）；ＶＨ１−６９＊０７（配列番号４６）；ＶＨ１−６９＊０８（配列番号４８）；ＶＨ１−６９＊０９（配列番号５０）；ＶＨ１−６９＊１０（配列番号５２）；ＶＨ１−６９＊１１（配列番号５４）；ＶＨ１−６９＊１２（配列番号５６）；ＶＨ１−６９＊１３（配列番号５８）。
【図１４】図１４は、ヒトＶＨ１−６９遺伝子について報告される１３の対立遺伝子の各々について、成熟重鎖可変遺伝子配列のタンパク質アライメントを示す図である。小文字のアミノ酸は、生殖細胞系の対立遺伝子間の差違を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列の周りのボックスで示す。ダッシュは、適正な配列アライメントのための人為的ギャップを示す。ＶＨ１−６９＊０１（配列番号３５）；ＶＨ１−６９＊０２（配列番号３７）；ＶＨ１−６９＊０３（配列番号３９）；ＶＨ１−６９＊０４（配列番号４１）；ＶＨ１−６９＊０５（配列番号４３）；ＶＨ１−６９＊０６（配列番号４５）；ＶＨ１−６９＊０７（配列番号４７）；ＶＨ１−６９＊０８（配列番号４９）；ＶＨ１−６９＊０９（配列番号５１）；ＶＨ１−６９＊１０（配列番号５３）；ＶＨ１−６９＊１１（配列番号５５）；ＶＨ１−６９＊１２（配列番号５７）；ＶＨ１−６９＊１３（配列番号５９）。
【図１５】図１５は、ヒトＶＨ１−６９遺伝子について報告される１３の対立遺伝子の各々について、成熟可変遺伝子のアラインメントされたタンパク質配列のための、同一性パーセント／類似性パーセントマトリクスを示す図である。ＶＨ１−６９の対立遺伝子間の同一性パーセントは、影を付したボックスの上方に示し、類似性パーセントは、影を付したボックスの下方に示す。同一性パーセントおよび類似性パーセントのスコアは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒソフトウェア（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ）を用いるＣｌｕｓｔａｌＷ（ｖ１．８３）アライメントツールによりスコア付けした。
【図１６】図１６は、ヒトＶＨ１−２遺伝子について報告される５つの対立遺伝子の各々について、第２のエクソンのヌクレオチドアライメントを示す図である。小文字の塩基は、生殖細胞系の対立遺伝子間のヌクレオチド差違を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列の周りのボックスで示す。ダッシュは、適正な配列アライメントのための人為的ギャップを示す。ＶＨ１−２＊０１（配列番号６０）；ＶＨ１−２＊０２（配列番号６２）；ＶＨ１−２＊０３（配列番号６４）；ＶＨ１−２＊０４（配列番号６６）；ＶＨ１−２＊０５（配列番号６８）。
【図１７】図１７は、ヒトＶＨ１−２遺伝子について報告される５つの対立遺伝子の各々について、成熟重鎖可変遺伝子配列のタンパク質アライメントを示す図である。小文字のアミノ酸は、生殖細胞系の対立遺伝子間の差違を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列の周りのボックスで示す。ダッシュは、適正な配列アライメントのための人為的ギャップを示す。ＶＨ１−２＊０１（配列番号６１）；ＶＨ１−２＊０２（配列番号６３）；ＶＨ１−２＊０３（配列番号６５）；ＶＨ１−２＊０４（配列番号６７）；ＶＨ１−２＊０５（配列番号６９）。
【図１８】図１８は、ヒトＶＨ１−２遺伝子について報告される５つの対立遺伝子の各々について、成熟可変遺伝子のアラインメントされたタンパク質配列のための、同一性パーセント／類似性パーセントマトリクスを示す図である。ＶＨ１−２対立遺伝子間の同一性パーセントは、影を付したボックスの上方に示し、類似性パーセントは、影を付したボックスの下方に示す。同一性パーセントおよび類似性パーセントのスコアは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒソフトウェア（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ）を用いるＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｖ１．８３）アライメントツールによりスコア付けした。
【図１９】図１９は、ヒト細胞表面受容体（抗原Ａ）で免疫化された、ヒト重鎖可変遺伝子およびヒトκ軽鎖可変遺伝子の遺伝子座についてホモ接合性のマウス（Ｈκ；ｎ＝４）ならびに内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における、単一のヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ、および６つのヒトＪＨ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（１ｈＶＨＨＯ；ｎ＝１０）に由来する抗体力価を示す図である。
【図２０】図２０は、２つの異なるインフルエンザワクチンで免疫化された、ヒト重鎖可変遺伝子およびヒトκ軽鎖可変遺伝子の遺伝子座についてホモ接合性のマウス（Ｈκ；ｎ＝５）ならびに内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における、単一のヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ、および６つのヒトＪＨ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（１ｈＶＨＨＯ；ｎ＝５）に由来する抗体力価を示す図である。
【図２１】図２１は、ヒト細胞表面受容体（抗原Ａ）で免疫化された、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における、単一のヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ、および６つのヒトＪＨ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス、ならびに内因性κ軽鎖可変遺伝子座のヒトκ軽鎖可変遺伝子座による置き換えについてホモ接合性のマウスに由来するＶＨ  ＣＤＲ３領域（ｘ軸）について、指定されたアミノ酸長を有するＩｇＭプライミング重鎖の百分率（ｙ軸）を示す図である。
【図２２】図２２は、ヒト細胞表面受容体（抗原Ａ）で免疫化された、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における、単一のヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ、および６つのヒトＪＨ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス、ならびに内因性κ軽鎖可変遺伝子座のヒトκ軽鎖可変遺伝子座による置き換えについてホモ接合性のマウスに由来するＶＨ  ＣＤＲ３領域（ｘ軸）について、指定されたアミノ酸長を有するＩｇＧプライミング重鎖の百分率（ｙ軸）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０２００】
記載される特定の方法および実験条件は変化しうるので、本発明は、そのような方法および条件に限定されない。また、本発明の範囲は、特許請求の範囲により規定されるので、本明細書で用いられる用語法は、特定の実施形態について記載することのみを目的とするものであり、限定的であることを意図するものではないことも理解されたい。
【０２０１】
別段に規定されるのでない限り、本明細書で用いられる全ての用語および語句は、それに反することが、それらの用語または語句が用いられる文脈から明瞭に示されるかまたは明瞭に明らかでない限り、それらの用語および語句が当技術分野において獲得した意味を包含する。本発明の実施または試験では、本明細書で記載される方法および材料と類似するかまたは同等な任意の方法および材料を用いうるが、ここでは、特定の方法および材料が記載される。言及される全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０２】
遺伝子セグメントの量を指すのに用いられる場合の「実質的な」または「実質的に」という語句（例えば、「実質的に全ての」Ｖ遺伝子のセグメント）は、機能的な遺伝子セグメントおよび非機能的な遺伝子セグメントの両方を包含し、様々な実施形態では、例えば、全ての遺伝子セグメントのうちの８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上を包含し、様々な実施形態では、「実質的に全ての」遺伝子セグメントが、例えば、機能的な（すなわち、偽遺伝子ではない）遺伝子セグメントのうちの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を包含する。
【０２０３】
「置き換え」という用語は、ゲノム配列の遺伝子座において、ゲノム内の配列を異種配列（例えば、マウスにおけるヒト配列）で置き換えるような形で、ＤＮＡ配列が細胞のゲノム内に配置されていることを包含する。このように配置されたＤＮＡ配列には、１または複数の調節配列であって、このように配置された配列を得るのに用いられる供給源のＤＮＡ（例えば、プロモーター、エンハンサー、５’側非翻訳領域または３’側非翻訳領域、適切な組換えシグナル配列など）の一部である調節配列を組み入れることができる。例えば、様々な実施形態では、置き換えが、内因性配列の、このように配置されたＤＮＡ配列（異種配列を含む）からの遺伝子産物の産生を結果としてもたらすが、内因性配列の発現はもたらさない異種配列への置換であり、内因性ゲノム配列の、内因性ゲノム配列（例えば、内因性ゲノム配列は、免疫グロブリン遺伝子またはそのドメインをコードし、ＤＮＡ断片は、１または複数のヒト免疫グロブリン遺伝子またはそのドメインをコードする）によりコードされるタンパク質と同様の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列による置き換えである。様々な実施形態では、内因性遺伝子またはその断片を、対応するヒト遺伝子またはその断片で置き換える。対応するヒト遺伝子またはその断片とは、置き換えられる内因性遺伝子またはその断片のオルソログであるか、その相同体であるか、または構造および／または機能がそれと実質的に同一であるかもしくは同じであるヒト遺伝子またはその断片である。
【０２０４】
全てのマウス定常鎖遺伝子および遺伝子座の転写制御領域を含め、ハイブリッド遺伝子座内の隣接するマウス配列は無傷、かつ、機能的のままとしながら、６メガ塩基対にわたるマウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座（ＶＨ−ＤＨ−ＪＨ）可変領域の、ヒト免疫グロブリン限定重鎖遺伝子座による、ｉｎ  ｓｉｔｕにおける正確な置き換えを実施した（図１および図２）。とりわけ、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作法（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号、およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３年、「Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２１巻：６５２〜６５９頁を参照されたい）を用いて、キメラＢＡＣターゲティングベクターを介し、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および６つのヒトＪＨ遺伝子セグメントを、マウスＥＳ細胞へと導入した。
【０２０５】
免疫グロブリン限定ＶＨ遺伝子セグメントを有する非ヒト動物
それらを作製する方法およびそれらを用いる方法と同様に、限定数のＶＨ遺伝子、ならびに１または複数のＤ遺伝子および１または複数のＪ遺伝子を含む免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物が提供される。目的の抗原で免疫化されると、非ヒト動物は、あらかじめ選択された限定ＶＨ遺伝子または限定ＶＨ遺伝子のセット（例えば、あらかじめ選択されたＶＨ遺伝子およびその変異体）のみに由来する抗体の可変領域を伴うＢ細胞集団を生成させる。様々な実施形態では、ヒト重鎖可変ドメインであるヒト抗体可変ドメインを、同種のヒト軽鎖可変ドメインと共に発現させるＢ細胞集団を生成させる非ヒト動物が提供される。様々な実施形態では、非ヒト動物が、再配列されていない非ヒト可変領域の配列の、再配列されていないヒト可変領域の配列による置き換えまたは挿入を含む改変内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座に由来するヒト重鎖可変遺伝子セグメントおよびヒト軽鎖可変遺伝子セグメントを再配列する。
【０２０６】
免疫グロブリン遺伝子の組織化、構造、および機能についての初期の研究は、内因性遺伝子座を無効とされ、部分的なヒト免疫グロブリン遺伝子、例えば、ヒト定常遺伝子と連結されたヒト重鎖遺伝子の部分的なレパートリーであって、ヒト軽鎖導入遺伝子の存在下または非存在下で、ゲノムへとランダムに挿入されたレパートリーを伴うトランスジェニック遺伝子座（ランダムに配置された）を有するように操作されたマウスについて部分的になされた。これらのマウスは、有用な高アフィニティー抗体を作製するには何らかの点で最適に満たなかったが、免疫グロブリン遺伝子座についての特定の機能的な解析を容易とした。これらのマウスのうちの一部は、２つもしくは３つ程度、なおまたは単一の重鎖可変遺伝子だけという少数の重鎖可変遺伝子を有した。
【０２０７】
ヒトμ定常遺伝子およびヒトγ１定常遺伝子を伴う、単一のヒトＶＨ５−５１遺伝子ならびに１０のヒトＤＨ遺伝子および６つのヒトＪＨ遺伝子に由来する完全ヒト免疫グロブリン重鎖を、ランダムに挿入された導入遺伝子（および無効とされた内因性免疫グロブリン遺伝子座）において発現させるマウスが報告されている（ＸｕおよびＤａｖｉｓ、２０００年、「Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＣＤＲ３  Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ＶＨ  ｉｓ  Ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｍｏｓｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１３巻：３７〜４５頁）。これらのマウスの完全ヒト免疫グロブリン重鎖は大半が、内因性マウスλ軽鎖遺伝子座に由来する２つの完全マウスλ軽鎖だけのうちの１つ（Ｖλ１−Ｊλ１またはＶλ２−Ｊλ２のみ）と共に発現され、κ軽鎖を発現させることができない（これらのマウスは、Ｉｇκ−／−である）。これらのマウスは、Ｂ細胞の発生および抗体の発現において重度に異常な機能不全を呈示する。報告によれば、Ｂ細胞数が野生型の５〜１０％であり、ＩｇＭレベルが野生型の５〜１０％であり、ＩｇＧ１レベルは野生型の０．１〜１％に過ぎない。観察されたＩｇＭレパートリーは、高度に限定的な接合部の多様性を明らかにした。完全ヒト重鎖は、大部分が抗原をわたって同一なＣＤＲ３の長さ、抗原をわたって同じＪＨ（ＪＨ２）の使用、および最初の接合部のＱ残基を提示し、したがって、ＣＤＲ３の多様性のある程度の欠如を反映する。完全マウスλ軽鎖はほぼ全てが、Ｊλ１内に最初の接合部残基としてのＷ９６Ｌ置換を有した。報告によれば、マウスは、細菌性多糖に対するいかなる抗体を生成させることもできない。ヒト可変ドメインをマウス軽鎖とカップリングさせるため、ヒト可変領域の有用性は、大きく制限される。
【０２０８】
単一のヒトＶＨ３−２３遺伝子だけ、ヒトＤＨ遺伝子およびヒトＪＨ遺伝子、ならびにマウス軽鎖遺伝子を有する他のマウスが報告されているが、これらは、ヒトＶＨドメインとマウスＶＬドメインとの誤対合の可能性（例えば、Ｍａｇｅｅｄら、２００１年、「Ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｇｅｎｅ  Ｖ３−２３  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｗｉｔｈ  ａ
ｒａｎｇｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ＶＨＣＤＲ３  ａｎｄ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ」、Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２３巻：１〜５頁を参照されたい）に部分的に起因して、多様性の制限を呈示する（したがって、有用性の制限も呈示する）。同様に、ヒトμ定常遺伝子を含有する導入遺伝子内に、ヒトＤＨ遺伝子およびヒトＪＨ遺伝子と共に２つのＶＨ遺伝子（３−２３および６−１）を保有し（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、１９９１年、「Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ：  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  １００ｋｂ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＨ  ｌｏｃｕｓ」、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｍｕｎｏｌ．、２１巻：１３２３〜１３２６頁）、マウス軽鎖を伴うヒトＩｇＭ鎖においてそれらを発現させるマウスは、誤対合によるレパートリーの制限を呈示しうる（Ｍａｃｋｗｏｒｔｈ−Ｙｏｕｎｇら、２００３年、「Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ
ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｖ３−２３  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｇｅｎｅ」、Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３４巻：４２０〜４２５頁）。
【０２０９】
また、ゲノム内にランダムに挿入されたヒト導入遺伝子からＶＨが限定された完全ヒト重鎖を発現させる他のトランスジェニックマウスであって、ランダムに挿入された完全ヒト導入遺伝子から発現するヒトλレパートリーが制限されたトランスジェニックマウスも報告されている（例えば、Ｔａｙｌｏｒら、１９９２年、「Ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｔｈａｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ  ａ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０巻（２３号）：６２８７〜６２９５頁；  Ｗａｇｎｅｒら、１９９４年、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｍｉｎｉｌｏｃｉ
ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２２巻（８号）：１３８９〜１３９３頁を参照されたい）。しかし、マウスゲノムへとランダムに組み込まれた導入遺伝子から完全ヒト抗体を発現させ、内因性遺伝子座の損傷を含むトランスジェニックマウスは、野生型マウスと比較した免疫反応の実質的な差違であって、このようなマウスから得られる抗体可変ドメインの多様性に影響を及ぼす差違を呈示することが公知である。
【０２１０】
一部の実施形態では、ヒト抗体可変ドメインを、限定ＶＨ遺伝子レパートリーならびに１または複数のＤ遺伝子および１または複数のＪ遺伝子から発現させる、多様なＢ細胞集団を生成させる有用な非ヒト動物に、十分に多様な再配列された可変領域遺伝子のレパートリーを生成させることが可能であることが好ましい。様々な実施形態では、多様性が、接合部の多様性、体細胞超変異、およびＶＨ遺伝子配列内の多型的多様性（ＶＨ遺伝子が多型形態で存在する実施形態の場合）を包含する。組合せの多様性は、ＶＨ遺伝子が複数の同種のヒト軽鎖可変ドメイン（様々な実施形態では、接合部の多様性および／または体細胞超変異を含む）のうちの１つと対合するときに生じる。
【０２１１】
様々な実施形態では、限定ヒトＶＨ遺伝子レパートリーおよび完全または実質的に完全なヒトＶＬ遺伝子レパートリーを含む非ヒト動物が、接合部の多様性（例えば、ＶＤＪ、ＶＪ接合、Ｐ付加、Ｎ付加）、組合せの多様性（例えば、ＶＨが限定された同種のヒト重鎖、ヒト軽鎖）、および体細胞超変異など、多様性の様々な供給源を反映するＢ細胞集団を生成させる。ＶＨレパートリーの、１つのヒトＶＨ遺伝子への限定を含む実施形態では、この１つのヒトＶＨ遺伝子が、２つ以上の変異体において存在しうる。様々な実施形態では、ＶＨ遺伝子の２つ以上の多型形態が存在することにより、Ｂ細胞集団の可変ドメインの多様性が増大する。
【０２１２】
遺伝子セグメント（例えば、Ｖ遺伝子）の生殖細胞系配列における変異は、ヒトにおける抗体応答の多様性に寄与する。Ｖ遺伝子配列の差違に起因する多様性に対する相対的寄与は、Ｖ遺伝子間で変化する。多型の程度は、遺伝子ファミリーにわたって変化し、ヒト集団における近縁個体と非近縁個体とのＶＨハプロタイプの差違において観察されるさらなる多様性を生成させることが可能な複数のハプロタイプ（共遺伝性多型を伴う配列のストレッチ）に反映される（例えば、Ｓｏｕｒｏｕｊｏｎら、１９８９年、「Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｈ  Ｃｈａｉｎ  Ｖ  Ｒｅｇｉｏｎ  Ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＶＨＩＩＩ  Ｇｅｎｅ  Ｆａｍｉｌｙ」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３巻（２号）：７０６〜７１１頁を参照されたい）。特に、多型のヒトＶＨ遺伝子ファミリーに由来するデータに基づき、一部の研究者は、生殖細胞系におけるハプロタイプの多様性が、ヒト集団におけるＶＨ遺伝子の異質性に対する主要な寄与因子であり、これが、ヒト集団にわたる異なる生殖細胞系ＶＨ遺伝子の大きな多様性に反映されることを示唆している（Ｓａｓｓｏら、１９９０年、「Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ＶＨ３  Ｇｅｎｅｓ」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４５巻（８号）：２７５１〜２７５７頁を参照されたい）。
【０２１３】
ヒト集団は、広範な多型に起因して、ＶＨ遺伝子レパートリーに対して、ハプロタイプの大きな多様性を提示するが、ヒト集団内で観察される高頻度の（すなわち、保存的な）対立遺伝子には、特定の多型が反映される（Ｓａｓｓｏら、１９９０年）。ＶＨの多型は、２つの主要形態において記載されうる。第１の形態は、同じ遺伝子セグメントの対立遺伝子の間のヌクレオチド配列間における差違と関連する対立遺伝子変異から生じる変異である。第２の形態は、免疫グロブリン重鎖遺伝子座において生じた多数の複製、挿入、および／または欠失から生じる。これは、複製により同一な遺伝子から派生するＶＨ遺伝子が、それらの各々の対立遺伝子と、１または複数のヌクレオチド置換により異なる固有の状況を結果としてもたらしている。これはまた、重鎖遺伝子座におけるＶＨ遺伝子のコピー数にも直接影響する。
【０２１４】
ヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメント（ＶＨ遺伝子）の多型対立遺伝子は、大部分が遺伝子セグメントの挿入／欠失およびコード領域内の単一のヌクレオチド差違の結果であり、これらのいずれもが、免疫グロブリン分子に対して機能的結果を及ぼす可能性を有する。表１は、ヒトＶＨ遺伝子ファミリーにより列挙される機能的なＶＨ遺伝子およびヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座における各ＶＨ遺伝子について同定された対立遺伝子の数を示す。多型のＶＨ遺伝子が、例えば、関節リウマチなど、特定の疾患に対する感受性に関与していることを示唆する知見も存在するが、他の場合には、ＶＨと疾患との連関がそれほど明瞭ではない。この多義性は、異なるヒト集団における様々な対立遺伝子のコピー数および存在に帰せられている。実際、いくつかのヒトＶＨ遺伝子（例えば、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、およびＶＨ３−２３）が、コピー数の変動を示している。様々な実施形態では、本明細書で記載されるヒト化マウスであって、限定ＶＨレパートリーを伴うヒト化マウスは、個別のＶＨファミリーメンバーの複数の多型変異体を含む（例えば、内因性マウス遺伝子座における全てまたは実質的に全ての機能的なマウスＶＨセグメントを置き換える、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、またはＶＨ３−２３の２つ以上の多型変異体）。特定の実施形態では、本明細書で記載されるマウスの２つ以上の多型変異体が、表１の対応するＶＨファミリーメンバーについて示される数以下の数およびこの数を含めた数（例えば、ＶＨ１−６９には１３の変異体があり、ＶＨ１−２には５つの変異体があるなど）である。
【０２１５】
当技術分野では、特定のヒトＶＨ遺伝子の一般に観察される変異体が公知である。例えば、ＶＨ遺伝子座において最も複雑な多型のうちの１つは、ＶＨ１−６９遺伝子に属する。ヒトＶＨ１−６９遺伝子には、１３の対立遺伝子が報告されており（Ｓａｓｓｏら、１９９３年、「Ａ  ｆｅｔａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ
ＶＨ１  ｇｅｎｅ  ｂｅｌｏｎｇｓ  ｔｏ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｓｅｔ  ｏｆ  ａｌｌｅｌｅｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、９１巻：２３５８〜２３６７頁；  Ｓａｓｓｏら、１９９６年、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ＶＨ  ｇｅｎｅ  ５１ｐ１  ｉｓ  ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  ｔｏ  ｉｔｓ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｇｅｎｅ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、９７巻（９号）：２０７４〜２０８０頁）、ヒトＶＨ１−６９遺伝子は、ＶＨ１−６９遺伝子の複製を保有する少なくとも３つのハプロタイプであって、所与の遺伝子座においてこのＶＨ遺伝子の複数のコピーを結果としてもたらすハプロタイプで存在する。これらの多型対立遺伝子は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の差違を包含し、これは、抗原の特異性に劇的に影響しうる。表２は、ヒトＶＨ１−６９について報告される対立遺伝子ならびに成熟重鎖可変領域のＤＮＡ配列およびタンパク質配列の配列番号を示す。表３は、ヒトＶＨ１−２遺伝子について報告される対立遺伝子ならびに成熟重鎖可変領域のＤＮＡ配列およびタンパク質配列の配列番号を示す。
【０２１６】
ＶＨ１−６９遺伝子の代表的なゲノムＤＮＡ配列および全長タンパク質配列を、それぞれ、配列番号１および配列番号２に示す。図１３および図１４はそれぞれ、ＶＨ１−６９について報告される１３の対立遺伝子のＤＮＡアライメントおよびタンパク質アライメントを示す。ＶＨ１−２遺伝子の代表的なＤＮＡ配列およびタンパク質配列を、それぞれ、配列番号６０および配列番号６１に示す。図１６および図１７はそれぞれ、ＶＨ１−２について報告される５つの対立遺伝子のＤＮＡアライメントおよびタンパク質アライメントを示す。図１５および図１８はそれぞれ、ヒトＶＨ１−６９について報告される１３の対立遺伝子およびヒトＶＨ１−２について報告される５つの対立遺伝子に対応する、アラインメントされたタンパク質配列についての同一性パーセント／類似性マトリクスを示す。様々な実施形態では、本発明の改変遺伝子座が、表１から選択される、２つ以上のコピー数で存在するＶＨ遺伝子を含み、コピー数が、表１に示される対立遺伝子の数以下のコピー数および表１に示される対立遺伝子の数を含めたコピー数を包含する。一実施形態では、本発明の改変遺伝子座が、表２から選択される、２つ以上のコピー数で存在するＶＨ１−６９遺伝子を含み、コピー数が、表１に示される対立遺伝子の数以下のコピー数および表１に示される対立遺伝子の数を含めたコピー数を包含する。一実施形態では、本発明の改変遺伝子座が、表３から選択される、２つ以上のコピー数で存在するＶＨ１−２遺伝子を含み、コピー数が、表１に示される対立遺伝子の数以下のコピー数および表１に示される対立遺伝子の数を含めたコピー数を包含する。
【０２１７】
限定ヒトＶＨレパートリーをマウスにおいて使用する実施形態は広く論じられているが、また、限定ヒトＶＨレパートリーを発現させる他の非ヒト動物も提供される。このような非ヒト動物には、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌牛、雄牛、野牛）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長動物（例えば、マーモセット、アカゲザル）などを含め、遺伝子的に改変して、本明細書で開示される限定ヒトＶＨレパートリーを発現させうる非ヒト動物のうちのいずれかが含まれる。例えば、適切な遺伝子改変可能なＥＳ細胞が容易に利用可能ではない非ヒト動物には、他の方法を使用して、遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製する。このような方法は、例えば、ＥＳ細胞以外のゲノム（例えば、線維芽細胞または人工多能性幹細胞のゲノム）を改変するステップと、核移植を使用して、改変ゲノムを適切な細胞、例えば、卵母細胞へと移入させるステップと、改変細胞（例えば、改変卵母細胞）を、非ヒト動物において、適切な条件下で懐胎させて、胚を形成するステップとを包含する。非ヒト動物ゲノム（例えば、ブタ、雌牛、齧歯動物、ニワトリなどのゲノム）を改変するための方法は、例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を使用して、限定ヒトＶＨレパートリーを含むようにゲノムを改変するステップを包含する。したがって、一実施形態では、限定ヒトＶＨレパートリーを含むように非ヒト動物ゲノムを編集するための方法であって、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮを使用して、１つだけまたは２つ以下のヒトＶＨ遺伝子セグメント（またはその多型変異体）を含むようにゲノムを編集するステップを含み、これらの１つだけまたは２つ以下のヒトＶＨ遺伝子セグメントが、免疫グロブリン定常遺伝子配列に作動可能に連結される方法が提供される。一実施形態では、定常遺伝子配列が、ヒト重鎖定常配列および非ヒト重鎖定常配列から選択される。一実施形態では、定常配列が、非ヒト定常配列であり、これらの１つだけまたは２つ以下のヒトＶＨ遺伝子セグメントが、内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座において、非ヒト定常遺伝子配列に作動可能に連結される。
【０２１８】
一態様では、非ヒト動物が、小型の哺乳動物、例えば、Ｄｉｐｏｄｉｄａｅ（Ｄｉｐｏｄｏｉｄｅａ）上科またはＭｕｒｏｉｄｅａ上科である。一実施形態では、遺伝子改変動物が、齧歯動物である。一実施形態では、齧歯動物が、マウス、ラット、およびハムスターから選択される。一実施形態では、齧歯動物が、Ｍｕｒｏｉｄｅａ上科から選択される。一実施形態では、遺伝子改変動物が、Ｃａｌｏｍｙｓｃｉｄａｅ科（例えば、マウス様ハムスター）、Ｃｒｉｃｅｔｉｄａｅ科（例えば、ハムスター、新世界ラットおよびマウス、ハタネズミ）、Ｍｕｒｉｄａｅ科（旧世界マウスおよび旧世界ラット、アレチネズミ、トゲマウス、クレステッドラット（ｃｒｅｓｔｅｄ  ｒａｔ））、Ｎｅｓｏｍｙｉｄａｅ科（キノボリマウス、イワネズミ、オオハダカオネズミ（ｗｉｔｈ−ｔａｉｌｅｄ  ｒａｔｓ）、アシナガラット、およびアシナガマウス）、Ｐｌａｔａｃａｎｔｈｏｍｙｉｄａｅ科（例えば、トゲヤマネ）、およびＳｐａｌａｃｉｄａｅ科（例えば、ハダカデバネズミ、コタケネズミ、およびコウゲンモグラネズミ）から選択される科に由来する。特定の実施形態では、遺伝子改変齧歯動物が、旧世界マウスおよび旧世界ラット（Ｍｕｒｉｄａｅ科）、アレチネズミ、トゲマウス、およびクレステッドラットから選択される。一実施形態では、遺伝子改変マウスが、Ｍｕｒｉｄａｅ科のメンバーに由来する。
【０２１９】
一実施形態では、非ヒト動物が、Ｃ５７ＢＬ系統のマウスである齧歯動物である。一実施形態では、Ｃ５７ＢＬ系統が、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択される。別の実施形態では、マウスが、１２９系統である。一実施形態では、１２９系統が、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２からなる群から選択される（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇら（１９９９年）、「Ｒｅｖｉｓｅｄ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｓｔｒａｉｎ  １２９  ｍｉｃｅ」、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ、１０巻：８３６頁を参照し、また、Ａｕｅｒｂａｃｈら（２０００年）、「Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  １２９／ＳｖＥｖ−  ａｎｄ  Ｃ５７ＢＬ／６−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｍｏｕｓｅ
Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ」も参照されたい）。一実施形態では、遺伝子改変マウスが、前述の１２９系統と前述のＣ５７ＢＬ系統（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６系統）とのミックスである。別の実施形態では、マウスが、前述の１２９系統のミックスであるか、または前述のＣ５７ＢＬ／６系統のミックスである。一実施形態では、これらのミックスの１２９系統が、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。別の実施形態では、マウスが、１２９／ＳｖＥｖ由来系統とＣ５７ＢＬ／６由来系統とのミックスである。特定の実施形態では、マウスが、Ａｕｅｒｂａｃｈら、２０００年、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２９巻：１０２４〜１０３２頁において記載される通り、１２９／ＳｖＥｖ由来系統とＣ５７ＢＬ／６由来系統とのミックスである。別の実施形態では、マウスが、ＢＡＬＢ系統、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系統である。別の実施形態では、マウスが、ＢＡＬＢ系統（例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系統）と、別の前述の系統とのミックスである。
【０２２０】
一実施形態では、非ヒト動物が、ラットである。一実施形態では、ラットが、Ｗｉｓｔａｒラット、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統、Ｆ３４４系統、Ｆ６系統、およびＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ系統から選択される。一実施形態では、ラット系統が、Ｗｉｓｔａｒ、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉからなる群から選択される系統のうちの２つ以上のミックスである。
【０２２１】
【表１】
2020202873.tif 000002
【０２２２】
【表２】
2020202873.tif 000003
【０２２３】
【表３】
2020202873.tif 000004
【０２２４】
抗原依存性ＶＨ遺伝子の使用
ＶＨ遺伝子の抗原依存性の優先的使用を、臨床的に有意義な抗原を標的とするヒト治療剤を開発するのに利用することができる。特定のＶＨ遺伝子を用いて抗体可変ドメインのレパートリーを生成させることができれば、ヒト治療剤において用いるための高アフィニティーの抗体可変ドメインの探索に大きな利点をもたらすことができる。ナイーブマウスおよび抗体可変ドメインにおけるヒトＶＨ遺伝子の使用についての研究は、大半の重鎖可変ドメインが、特定の単一のＶＨ遺伝子にも、優性で用いられるＶＨ遺伝子にも由来しないことを明らかにする。他方、特定の抗原に対する抗体応答についての研究は、場合によって、特定の抗体応答が、免疫化後のＢ細胞レパートリーにおける特定のＶＨ遺伝子の偏った使用を提示することを明らかにする。
【０２２５】
ヒトＶＨレパートリーは、極めて多様であるが、ＶＨ遺伝子のランダムな選択を仮定するある推定値によれば、所与の任意のＶＨ遺伝子使用の予測される頻度は、約２％である（Ｂｒｅｚｉｎｓｃｈｅｋら、１９９５年、「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｅａｖｙ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂ  Ｃｅｌｌｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５巻：１９０〜２０２頁）。しかし、ヒトの末梢Ｂ細胞におけるＶＨの使用は、偏ったものである。一研究では、機能的なＶ遺伝子の存在度が、ＶＨ３＞ＶＨ４＞ＶＨ１＞ＶＨ２＞ＶＨ５＞ＶＨ６というパターンに従った（Ｄａｖｉｄｋｏｖａら、１９９７年、「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｕｓａｇｅ
ｏｆ  ＶＨ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｂ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ
Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ」、Ｓｃａｎｄ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４５巻：６２〜７３頁）。初期の一研究では、ＶＨ３ファミリーの使用頻度が約０．６５であるのに対し、ＶＨ１ファミリーの使用頻度は約０．１５であることが推定され、これらの観察および他の観察は、ヒトＶＨレパートリーの生殖細胞系の複雑性が、通常の生殖細胞系ＶＨレパートリーを有するヒトの末梢Ｂ細胞区画では正確には反映されないという、マウスにおいて観察される状況（すなわち、ＶＨ遺伝子発現は非確率論的であるという状況）と類似する状況を示唆する（ＺｏｕａｌｉおよびＴｈｅｓｅ、１９９１年、「Ｐｒｏｂｉｎｇ  ＶＨ  Ｇｅｎｅ−Ｆａｍｉｌｙ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４６巻（８号）：２８５５〜２８６４頁）。一報告によれば、ヒトにおけるＶＨ遺伝子使用は、最大から最小の順にＶＨ３＞ＶＨ４＞ＶＨ１＞ＶＨ５＞ＶＨ２＞ＶＨ６であり、末梢Ｂ細胞における再配列は、ＶＨ３ファミリーの使用が、生殖細胞系ＶＨ３遺伝子の相対数に基づき予測される使用より高度であることを明らかにする（Ｂｒｅｚｉｎｓｃｈｅｋら、１９９５年）。別の報告によれば、ヒトにおけるＶＨ使用は、ヨウシュヤマゴボウのマイトジェンにより活性化させた末梢の小型免疫応答性Ｂ細胞の解析（Ｄａｖｉｄｋｏｖａら、１９９７年、「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｕｓａｇｅ  ｏｆ  ＶＨ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｂ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ」、Ｓｃａｎｄ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４５巻：６２〜７３頁）に基づくパターンＶＨ３＞ＶＨ５＞ＶＨ２＞ＶＨ１＞ＶＨ４＞ＶＨ６に従う。一報告は、最も高頻度で用いられるＶＨ３ファミリーメンバーの中には、３−２３、３−３０、および３−５４があることを断言している（Ｂｒｅｚｉｎｓｃｈｅｋら、１９９５年）。ＶＨ４ファミリーでは、メンバー４−５９および４−４ｂ（同上）のほか、４−３９および４−３４（Ｂｒｅｚｉｎｓｃｈｅｃｋら、１９９７年、「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  ＶＨ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ」、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、９９巻（１０号）：２４８８〜２５０１頁）が比較的高頻度であることが見出された。他の報告は、活性化した重鎖レパートリーが、ＶＨ５の高度な発現およびＶＨ３の低度な発現を利するように偏っていることを主張している（Ｖａｎ  Ｄｉｊｋ−ＨａｒｄおよびＬｕｎｄｋｖｉｓｔ、２００２年、「Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ
ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１０７巻：１３６〜１４４頁）。他の研究は、成人ヒトレパートリーにおいて最も一般的に用いられるＶＨ遺伝子が、ＶＨ４−５９に続いて、ＶＨ３−２３およびＶＨ３−４８であることを断言している（Ａｒｎａｏｕｔら、２００１年、「Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｈｅａｖｙ−Ｃｈａｉｎ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ」、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、６巻（８号）：１０８頁）。使用についての研究は、比較的小さな試料数に基づき、したがって、大きな分散を呈示するが、まとめると、研究は、Ｖ遺伝子の発現が、純粋に確率論的ではないことを示唆する。実際、特定の抗原による研究は、ある場合には、発現の状況が、特定の使用には全く不利であり、他の使用には有利であることを確立している。
【０２２６】
徐々に、特定の抗原に応答して生成したヒト重鎖可変ドメインについて観察されるレパートリーは、高度に限定的であることが明らかとなった。一部の抗原は、有効な中和抗体は１つのＶＨ遺伝子のみに本質的に由来するという意味で、ほとんどもっぱらある特定のＶＨ遺伝子のみを有する中和抗体と会合する。臨床的に重要な多数のヒト病原体についても同じことが当てはまる。
【０２２７】
ＶＨ１−６９に由来する重鎖は、治療的に有意義である多様な抗原特異的抗体レパートリーにおいて観察されている。例えば、ＶＨ１−６９は、アトピー性疾患を伴う幼齢小児における末梢血リンパ球のＩｇＥレパートリーの重鎖転写物において高頻度で観察された（Ｂａｎｄｏら、２００４年、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＶＨεｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ＰＢＬ  ｆｒｏｍ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ａｔｏｐｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ＶＨ１−６９  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｒｅｅ  ｕｎｒｅｌａｔｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、９４巻：９９〜１０６頁）。Ｂ細胞リンパ腫ではまた、高度の体細胞超変異を伴うＶＨ１−６９に由来する重鎖が生じる（Ｐｅｒｅｚら、２００９年、「Ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｏｍａｔｉｃａｌｌｙ  ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ｕｓｅ  ｏｆ  ＶＨ１−６９
ａｎｄ  ＶＨ４−５９  ｓｅｇｍｅｎｔｓ」、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ
Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ、１６２巻：６１１〜６１８頁）一方、血液障害を伴う患者における自己抗体の中では、本質的に生殖細胞系配列を伴う（すなわち、体細胞超変異がわずかである〜体細胞超変異がみられない）一部のＶＨ１−６９に由来する重鎖が観察されている（Ｐｏｓら、２００８年、「ＶＨ１−６９  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｏｗａｒｄｓ  ＡＤＡＭＴＳ１３  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、７巻：４２１〜４２８頁）。
【０２２８】
さらに、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）などのウイルス性抗原に対する中和抗体であって、生殖細胞系のＶＨ１−６９に由来する配列および／または体細胞変異させたＶＨ１−６９に由来する配列を使用する中和抗体も見出されている（Ｍｉｋｌｏｓら、２０００年、「Ｓａｌｉｖａｒｙ  ｇｌａｎｄ  ｍｕｃｏｓａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ＶＨ  ｇｅｎｅｓ  ｓｈｏｗ  ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ｖ１−６９  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ  ＣＤＲ３  ｆｅａｔｕｒｅｓ」、Ｂｌｏｏｄ、９５巻（１２号）：３８７８〜３８８４頁；  Ｋｕｎｅｒｔら、２００４年、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｅａｔｕｒｅｓ，  ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ，  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ＩｇＧ  ａｎｄ  ＩｇＭ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  ４Ｅ１０，  ａｎ  ａｎｔｉ−ＨＩＶ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ」、Ａｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ、２０巻（７号）：７５５〜７６２頁；  Ｃｈａｎら、２００１年、「ＶＨ１−６９  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｕｓｅｄ  ｂｙ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ  ａｎｄ  ｂｙ  ｎｏｒｍａｌ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅ２  ｖｉｒａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ」、Ｂｌｏｏｄ、９７巻（４号）：１０２３〜１０２６頁；  Ｃａｒｂｏｎａｒｉら、２００５年、「Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｄｒｉｖｅｓ  ｔｈｅ  ｕｎｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ＶＨ１−６９−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｒｙｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ：  Ａ  ｍｏｄｅｌ
ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ−ｄｒｉｖｅｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７４巻：６５３２〜６５３９頁；  ＷａｎｇおよびＰａｌｅｓｅ、２００９年、「Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｓ？」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１６巻（３号）：２３３〜２３４頁；  Ｓｕｉら、２００９年、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｂａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｂｒｏａｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｖｉａｎ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓｅｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１６巻（３号）：２６５〜２７３頁；  Ｍａｒａｓｃａら、２００１年、「Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｆｒｅｑｕｅｎｔ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ＶＨ１−６９  ａｎｄ  ＶＨ４−３４  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｎｏｄａｌ  Ｍａｒｇｉｎａｌ  Ｚｏｎｅ  Ｂ−Ｃｅｌｌ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ」、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．、１５９巻（１号）：２５３〜２６１頁）。
【０２２９】
ＶＨ使用の偏向はまた、ヒトにおけるｂ型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（Ｈｉｂ  ＰＳ）に対する体液性免疫反応においても観察される。研究は、ＶＨＩＩＩファミリー（ＶＨＩＩＩｂサブファミリー、特に、ＶＨ９．１）が、多様なＤ遺伝子およびＪ遺伝子と共に、Ｈｉｂ  ＰＳに対するヒト体液性応答をもっぱら特徴づけることを示唆する（Ａｄｄｅｒｓｏｎら、１９９１年、「Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  Ｉｇ  Ｈ  Ｃｈａｉｎ  Ｖ  Ｇｅｎｅ  Ｕｓａｇｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｔｙｐｅ  ｂ
Ｃａｐｓｕｌａｒ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻（５号）：１６６７〜１６７４頁；  Ａｄｄｅｒｓｏｎら、１９９３年、「Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ＶＨ  Ｕｓａｇｅ  ａｎｄ  ＶＤＪ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｔｙｐｅ  ｂ  Ｃａｐｓｕｌａｒ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ」、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、９１巻：２７３４〜２７４３頁）。ヒトＪＨ遺伝子もまた、偏向性の使用を提示し、ＪＨ４およびＪＨ６は、ヒトの末梢Ｂ細胞中の約３８〜４１％で観察されている（Ｂｒｅｚｉｎｓｃｈｅｋら、１９９５年）。
【０２３０】
報告によれば、ＨＩＶ−１に感染したヒトにおけるＶＨ使用は、ＶＨ３使用に不利に偏向し、ＶＨ１およびＶＨ４遺伝子ファミリーに有利に偏向している（Ｗｉｓｎｅｗｓｋｉら、１９９６年、「Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｕｓａｇｅ  ｉｎ  ＨＩＶ−１  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」、Ｊ．  Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ  ＆  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｏｌｏｇｙ、１１巻（１号）：３１〜３８頁）。しかし、罹患した患者に由来する骨髄のｃＤＮＡ解析は、機能的なＢ細胞レパートリーでは発現しない著明なＶＨ３使用を明らかにし、そこでは、ＶＨ３使用を反映するＦａｂが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける有効なＨＩＶ−１の中和を呈示した（同上）。ＨＩＶ−１感染に対する体液性免疫反応はおそらくＶＨにおける限定に起因して減衰するので、本明細書で記載される改変非ヒト動物（ＨＩＶ−１により感染可能でない）は、本明細書で記載される遺伝子改変動物において存在する特定のＶＨ遺伝子に由来するが、罹患したヒトの限定レパートリーにおいて観察されるＶＨ遺伝子とは異なるＶＨ遺伝子に由来する中和抗体ドメインを生成させるのに有用となりうることを仮定しうるであろう。
【０２３１】
したがって、ＨＩＶ−１で免疫化された、ＶＨが限定されたマウス（例えば、ＶＨ３ファミリーメンバーおよびその（１または複数の）多型へと限定されたマウス）において、高アフィニティーヒト抗体可変ドメインを生成させることができれば、このような免疫化されたマウスの限定的（例えば、ＶＨ３ファミリーメンバーまたはその（１または複数の）変異体へと限定された）レパートリーを徹底的に調べることにより、ＨＩＶ−１を中和する有効なヒト治療剤をデザインするための豊富な資源を提供しうるであろう。
【０２３２】
ヒト抗体応答の、特定の病原体への限定は、抗体の可変領域であって、病原体に対する高アフィニティーの中和抗体をデザインするための足がかりとして用いられうる可変領域を、罹患したヒトから得る可能性を低減しうる。例えば、ＨＩＶ−１感染に対するヒト免疫反応は、ＨＩＶ−１感染を通じて、かつ、ＡＩＤＳの進行においてクローン的に限定される（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９３年、「Ｂ−ｃｅｌｌ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ＡＩＤＳ：  ｓｔａｂｌｅ  ａｎｄ  ｃｌｏｎａｌｌｙ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ＨＩＶ−１  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」、Ｓｃａｎｄ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３８巻：３２７〜３３４頁；  Ｗｉｓｎｅｗｓｋｉら、１９９６年）。さらに、ＶＨ遺伝子は一般に、いかなる特定の個体においても、全ての多型形態では存在せず、特定の集団内の特定の個体が１つの変異体を保有するのに対し、他の集団内の個体は異なる変異体を保有する。したがって、様々な実施形態では、単一のＶＨ遺伝子およびその変異体へと限定された生物学的系が利用可能であれば、限定ＶＨ遺伝子に基づき抗体の可変領域（例えば、同種のヒト重鎖ドメインおよびヒト軽鎖ドメイン）を生成させるための、これまで利用されなかった多様性の供給源がもたらされる。したがって、一態様では、１つだけまたは２つ以下のヒトＶＨ遺伝子セグメントファミリーメンバーの複数の多型変異体を含む遺伝子改変非ヒト動物が提供される。一実施形態では、１つだけまたは２つ以下のヒトＶＨ遺伝子セグメントが、１または複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、１または複数のヒトＪＨ遺伝子セグメント、およびヒト定常領域遺伝子セグメントまたは非ヒト定常領域遺伝子セグメントに作動可能に連結される。一実施形態では、定常領域が、内因性非ヒト免疫グロブリン定常遺伝子の遺伝子座に存在する。一実施形態では、非ヒト動物が、ヒトＶＬ配列、例えば、再配列されているかもしくは再配列されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントまたは再配列されたヒトＶＬ／ＪＬ配列に由来する核酸配列をさらに含む。一実施形態では、ヒトＶＬ配列に由来する核酸配列が、内因性非ヒトＶＬ遺伝子の遺伝子座に存在し、一実施形態では、ヒトＶＬ配列に由来する核酸配列が、導入遺伝子に存在する。特定の実施形態では、非ヒト動物が、それ自体が内因性ＶＬ遺伝子セグメントまたはＪＬ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを発現することが不可能であり、再配列されたヒトＶＬドメインをコードする１つだけまたは２つ以下の軽鎖遺伝子（すなわち、１つだけまたは２つ以下の再配列されたヒトＶＬ／ＪＬ配列に由来する）を含む。
【０２３３】
限定ＶＨ遺伝子セグメントの使用を伴うヒト重鎖可変領域を発現させる遺伝子改変マウスは、接合部が多様であり、組合せが多様であり、体細胞変異させた、高アフィニティーヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の比較的大きなレパートリーを、他の点では限定的なレパートリーから生成させるのに有用である。一実施形態では、限定レパートリーが、再配列された重鎖遺伝子であって、あらかじめ選択されたＶ遺伝子以外のいかなるＶ遺伝子に由来する重鎖遺伝子も形成することが不可能なマウスを結果としてもたらす、生殖細胞系遺伝子の数および／または正体における所定の制限を指す。あらかじめ選択されたＶ遺伝子は使用するが、あらかじめ選択されたＤ遺伝子および／またはＪ遺伝子は使用しない実施形態では、レパートリーが、Ｖ遺伝子の正体に関しては限定的であるが、Ｄ遺伝子および／またはＪ遺伝子の正体に関しては限定的でない（例えば、レパートリーは、１つだけまたは２つ以下のＶＨ遺伝子セグメント（および／またはそれらの多型）；ならびに複数のＤ遺伝子セグメントならびに複数のＪ遺伝子セグメントから本質的になる）。あらかじめ選択されたＶ遺伝子（ならびに任意のあらかじめ選択されたＤ遺伝子および／またはＪ遺伝子）の正体は、いかなる特定のＶ遺伝子にも限定されない。
【０２３４】
マウスが、単一のＶＨ遺伝子（単一のセグメントまたは変異体のセットとして存在する）を、多様なヒトＤ遺伝子およびＪ遺伝子セグメント（例えば、ＤＨセグメントおよびＪＨセグメント）により再配列するように、マウスをデザインすることにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、接合部多様性／組合せ多様性／体細胞超変異の並べ替え機構であって、結果として得られる再配列された重鎖可変領域の配列（場合によって、例えば、Ｖ／Ｄ／ＪまたはＶ／Ｊ）における変異を繰り返すのに用いられうる並べ替え機構がもたらされる。このようなマウスでは、単一のあらかじめ選択されたＶＨ遺伝子（またはその変異体）に基づくクローン選択工程を行って、目的の抗原に結合する適切な可変領域を選択する。マウスのクローン選択成分は、単一のあらかじめ選択されたＶＨ遺伝子セグメントに基づく選択に専従しているため、バックグラウンドノイズ（例えば、多くの生殖細胞系遺伝子セグメントに由来する、抗原に結合しない多種多様なＶＨドメイン）は大部分が根絶される。ＶＨ遺伝子セグメントを慎重に選択することにより、クローン的に選択される比較的多数の抗原特異的抗体を、Ｖセグメントの多様性が大きなマウスによる場合より短い時間でスクリーニングすることができる。
【０２３５】
様々な実施形態では、制限レパートリーをあらかじめ選択し、マウスを単一のＶセグメントへと限定することにより、Ｖ／Ｄ／Ｊ接合部を、Ｄ領域およびＪ領域と組み換えるためのＶセグメントが単一ではなくて４０以上あるマウスにおいて観察される速度より速い速度で並べ替えるための系がもたらされる。他のＶセグメントを除去することにより、遺伝子座は、あらかじめ選択されたＶセグメントに対して、他のＶセグメントを除去しない場合に観察されるＶ／Ｄ／Ｊの組合せより多くのＶ／Ｄ／Ｊの組合せを形成するように解放される。あらかじめ選択されたＶの、複数のＤセグメントのうちの１つおよび複数のＪセグメントのうちの１つとの組換えから生じる転写物数が増大すると、これらの転写物は、プレＢ細胞の形態にあるクローン選択系へと供給され、このため、クローン選択系は、あらかじめ選択されたＶ領域を発現させるＢ細胞の循環へと専従する。このようにして、あらかじめ選択されたＶセグメントに由来するＶ領域の再配列であって、所与の長さの時間において他の形で可能となるより固有性の高い再配列を、生物を介してスクリーニングすることができる。
【０２３６】
様々な態様では、免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の全てまたは実質的に全ての組換えが、このようなマウスにおいて配置される、あらかじめ選択されたＶセグメントならびにＤセグメントおよびＪセグメントの組換えであるため、あらかじめ選択されたＶ領域に対して、接合部におけるＶ／Ｄ／Ｊ組換えの多様性を増強するマウスについて記載される。したがって、マウスは、ベースのＶＨ遺伝子レパートリーまたは限定ＶＨ遺伝子レパートリーを用いて、ＣＤＲ３セグメントの多様性を生成させるための方法をもたらす。
【０２３７】
一態様では、非ヒト動物のＢ細胞集団が、１つだけまたは２つ以下のヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来する免疫グロブリン重鎖を発現させる非ヒト動物が提供される。一実施形態では、１つだけまたは２つ以下のヒトＶＨ遺伝子セグメントの各々が、２つ以上の多型形態で存在する。一実施形態では、ヒトＶＨ遺伝子セグメントが、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の多型形態で存在する。一実施形態では、非ヒト動物が、ヒトＶＬ遺伝子セグメントに由来するヒト軽鎖可変ドメインを発現させる。
【０２３８】
一態様では、Ｂ細胞集団であり、単一の生殖細胞系のヒトＶＨ遺伝子セグメントならびに２つ以上のヒトＤ遺伝子セグメントおよび２つ以上のヒトＪ遺伝子セグメントに由来するヒト重鎖を発現させるＢ細胞集団を、非ヒト動物において生成させるための方法であって、本明細書で記載される非ヒト動物を目的の抗原で免疫化するステップと、非ヒト動物に目的の抗原に対する免疫反応を開始させるステップとを含み、免疫反応が、Ｂ細胞集団内のＢ細胞の表面においてヒト重鎖を発現させることを含む方法が提供される。一実施形態では、非ヒト動物が、齧歯動物である（例えば、マウスまたはラット）。一実施形態では、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤＨセグメント、およびヒトＪＨセグメントが、非ヒト定常領域遺伝子に作動可能に連結されている。一実施形態では、非ヒト動物が、ヒトＶＬドメインをコードする核酸配列をさらに含む。一実施形態では、ヒトＶＬドメインをコードする核酸配列が、非ヒト軽鎖定常領域の遺伝子配列へと連結されている。
【０２３９】
一態様では、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント（または単一のヒトＶＨ遺伝子ファミリーメンバー）ならびに複数のＤＨ遺伝子セグメントのうちの１つおよび複数のＪＨ遺伝子セグメントのうちの１つによる、複数の再配列に由来する重鎖を有する免疫グロブリンを特徴とする免疫グロブリン集団を発現させる非ヒト動物を作製するための方法が提供される。一実施形態では、ヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントである。一実施形態では、ヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントである。
【０２４０】
一態様では、それらのＣＤＲ１とＣＤＲ２とが、同じ生殖細胞系ＶＨ遺伝子セグメントに由来し、それらのＣＤＲ３が、この生殖細胞系遺伝子セグメント、ならびに２つ以上のヒトＤセグメント、および２つ以上のヒトＪセグメントに由来する、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインの集団を生成させるための方法であって、本明細書で記載される非ヒト動物を目的の抗原で免疫化するステップと、非ヒト動物に目的の抗原に対する免疫反応を開始させるステップとを含み、免疫反応が、ヒト重鎖可変ドメインを、軽鎖可変ドメインとの関連で発現させることを含む方法が提供される。一実施形態では、非ヒト動物が、齧歯動物（例えば、マウスまたはラット）である。一実施形態では、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントが、非ヒト定常領域遺伝子に作動可能に連結されている。一実施形態では、非ヒト動物が、ヒトＶＬドメインをコードする核酸配列をさらに含む。一実施形態では、ヒトＶＬドメインをコードする核酸配列が、非ヒト軽鎖定常領域の遺伝子配列へと連結されている。
【０２４１】
一態様では、非ヒトＶＨドメインを発現することが不可能であり、この動物において発現させる重鎖集団の各免疫グロブリン重鎖が、１または複数の体細胞超変異を除き同一なＣＤＲ１およびＣＤＲ２を含むヒトＶＨドメインを含み、重鎖集団が、複数のＤ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントによる複数の再配列に由来する複数のＣＤＲ３配列を含む遺伝子改変非ヒト動物が提供される。
【０２４２】
一態様では、ＣＤＲ３の正体および長さにおいて変動を生成させるための生物学的系であって、本明細書で記載される遺伝子改変非ヒト動物を含み、非ヒト動物が、１つだけまたは２つ以下のヒトＶＨ遺伝子セグメント、ならびに２つ以上のＤ遺伝子セグメントおよび１または複数のＪ遺伝子セグメントを含み、非ヒト動物が、ヒト化免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をさらに含む生物学的系が提供される。様々な実施形態では、非ヒト動物が、目的の抗原による免疫化に応答して、体細胞超変異のみにより異なるＣＤＲ１およびＣＤＲ２ならびに再配列および体細胞超変異により異なるＣＤＲ３を有する各重鎖を特徴とする免疫グロブリン重鎖集団を発現させることを含む免疫反応を発生させる。一実施形態では、生物学的系が、本明細書で記載される通りに遺伝子改変されたマウスである。一実施形態では、ヒトＶＨ遺伝子セグメントおよびヒトＶＬ遺伝子セグメントが、それぞれ、内因性マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座および内因性マウス軽鎖免疫グロブリン遺伝子座にある。一実施形態では、ヒトＶＨ遺伝子セグメントおよびヒトＶＬ遺伝子セグメントのうちの１または複数が、導入遺伝子上にある（すなわち、内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の遺伝子座にある）。
【実施例】
【０２４３】
以下の例は、本発明の方法および組成物をいかにして作製して用いるかについて当業者に説明するために提供されるものであり、本発明者らが自らの発明と考えるものの範囲を限定することを意図するものではない。別段に示されない限り、温度は摂氏で示され、圧力は大気圧であるかまたは大気圧に近いものとする。前述の実施例において様々な販売元によるキットおよび／または試薬の使用が示される場合、全ての手順は、製造元の仕様書に従い実行した。
【０２４４】
実施例１  限定重鎖遺伝子座の構築
全てのヒトＤＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪＨ遺伝子セグメントの上流に配置された単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントを含有する、固有に操作されたヒト重鎖遺伝子座を、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡを用いる一連の細菌細胞内相同組換え反応（ＢＨＲ）により創出した。ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作法を用いて、単一のＶＨを含有する重鎖遺伝子座を創出するための複数のターゲティング構築物を構築した（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号、およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ，  Ｄ．Ｍ．ら（２００３年）、「Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１巻（６号）：６５２〜６５９頁を参照されたい）。
【０２４５】
ヒトＶＨ１−６９限定重鎖遺伝子座の構築：略述すると、ヒトＢＡＣ  ＤＮＡを用いて、４カ所の修飾を施し、全てのヒトＤＨセグメントおよびヒトＪＨセグメントと共にヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントを含有するターゲティング構築物を創出した（図１）。第１の修飾では、ＶＨ１−６９、上流のハイグロマイシン選択カセット、および５’側マウス相同性アームを含む複数の遠位側（５’側）ヒトＶＨ遺伝子セグメントを含有する改変ヒトＢＡＣを、これもまた改変組換えシグナル配列（ＲＳＳ；ＢＨＲ１、図１、上左）を含有する第２のスペクチノマイシンカセットでターゲティングした。この改変組換えシグナル配列（ＲＳＳ）には、ヒトＶＨ１−６９遺伝子の３’側ＲＳＳ領域内に２つの点変異（ＴからＡへの変異およびＧからＡへの変異）を導入し、ＲＳＳ九量体を最適のコンセンサス配列へと変化させた。したがって、第１の修飾（ＢＨＲ１）は、改変３’側ＲＳＳ、ＲＳＳおよびスペクチノマイシンカセットの約１８０ｂｐ下流にある固有のＡｓｉＳＩ制限部位を伴うヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントを含有するヒトゲノムの断片を創出した（図１、中左）。
【０２４６】
第２の修飾（ＢＨＲ２）には、ハイグロマイシンカセットおよびＶＨ１−６９遺伝子セグメントの上流の５’側ヒトＶＨ遺伝子セグメントを欠失させるために、Ｆｒｔ部位で挟まれたネオマイシン（Ｎｅｏ）カセットの使用を含んだ。この修飾は、ヒトＶＨ１−６９の約８．２ｋｂのプロモーター領域および５’側マウス相同性アームを無傷のまま残すために、５’側でヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントをターゲティングした（図１、下左）。
【０２４７】
第３の修飾（ＢＨＲ３）には、固有に操作された５’側ＰＩ−ＳｃｅＩ部位と３’側ＡｓｉＳＩ部位とで挟まれた別のスペクチノマイシンカセットであって、最初の３つの機能的なヒトＶＨ遺伝子セグメントならびに全てのヒトＤＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪＨ遺伝子セグメントを含有するヒトゲノム断片をターゲティングするスペクチノマイシンカセットを含んだ（図１、中右）。ヒトゲノム断片は、ネオマイシンカセットであらかじめターゲティングされ、３’側イントロンのエンハンサーおよびＩｇＭ遺伝子を含む内因性重鎖遺伝子座の５’側および３’側にマウスゲノム配列を含有する、５’側相同性アームおよび３’側相同性アームを含有した。この修飾は、５’側のマウスゲノム配列およびヒトＶＨ遺伝子セグメントを欠失させたが、ヒトＤＨ１−１遺伝子セグメント、ヒトＤＨセグメントおよびヒトＪＨセグメントの全て、ならびに３’側イントロンのエンハンサーおよびＩｇＭ遺伝子を含有する３’側のマウスゲノム断片の上流にある約３．３ｋｂのＶＨ−ＤＨ遺伝子間領域は残した（図１、下右）。
【０２４８】
第４の修飾は、固有のＰＩ−ＳｃｅＩ部位およびＡｓｉＳＩ部位（上記の）を使用して、ＢＨＲ２およびＢＨＲ３に由来する２つの改変ＢＡＣをライゲーションすることにより達成し（図１、下中央）、これにより、最終的なターゲティング構築物をもたらした。ＥＳ細胞内に単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントならびに全てのヒトＤＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪＨ遺伝子セグメントを含有する改変重鎖遺伝子座を創出するための最終的なターゲティング構築物は、５’側から３’側の順に、内因性重鎖遺伝子座の上流に約２０ｋｂのマウスゲノム配列を含有する５’側相同性アーム、５’側Ｆｒｔ部位、ネオマイシンカセット、３’側Ｆｒｔ部位、約８．２ｋｂのヒトＶＨ１−６９プロモーター、改変３’側ＲＳＳを伴うヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメント、６つのヒトＪＨセグメント、およびマウスＪＨ遺伝子セグメントの下流における約８ｋｂのマウスゲノム配列であって、３’側イントロンのエンハンサーおよびＩｇＭ遺伝子を含むマウスゲノム配列を含有する、３’側相同性アームを含有した（図１、下）。ヒトＶＨ１−６９ターゲティングベクター（配列番号３）は直鎖化し、内因性重鎖遺伝子座の欠失についてヘテロ接合性のマウスＥＳ細胞へと電気穿孔した。
【０２４９】
ヒトＶＨ１−２限定重鎖遺伝子座の構築：上記のステップを用いて、他の多型のＶＨ遺伝子セグメントを、マウス重鎖定常領域との関連で使用して、限定数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ）の免疫グロブリン重鎖Ｖセグメントを有する一連のマウスであって、ＶセグメントがＶ遺伝子のファミリーメンバーの多型変異体であるマウスを構築する。例示的な多型のＶＨ遺伝子セグメントは、例えば、ＶＨ１−２、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、およびＶＨ３−２３を含めたヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来する。このようなヒトＶＨ遺伝子セグメントは、例えば、公開されたデータベース上で利用可能な配列を用いるデノボ合成（例えば、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）により得られる。こうして、一部の実施形態では、本明細書で記載されるターゲティングベクターへと組み込むために、各ＶＨをコードする遺伝子ＤＮＡ断片を独立に生成させた。このようにして、限定数のＶＨ遺伝子セグメントを含む複数の改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座を、マウス重鎖定常領域との関連で操作した。ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および６つのヒトＪＨ遺伝子セグメントを含有する限定ヒト化重鎖遺伝子座を創出するための例示的なターゲティング戦略を、図２に示す。
【０２５０】
略述すると、３つのヒトＶＨ遺伝子セグメント（ＶＨ６−１、ＶＨ１−２、ＶＨ１−３）、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および６つのヒトＪＨ遺伝子セグメントを含有する改変ヒトＢＡＣクローン（参照により本明細書に組み込まれる、２０１２年２月２４日に出願されたＵＳＳＮ１３／４０４，０７５を参照されたい）を用いて、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントを含有する限定ヒト化重鎖遺伝子座を創出する。この改変ＢＡＣクローンは、前述のヒト重鎖遺伝子セグメントを、マウスイントロンのエンハンサーおよびＩｇＭ定常領域と機能的に連結する。限定ヒトＶＨ１−２ベースの重鎖遺伝子座は、上記の改変ヒトＢＡＣクローンを用いる２つの相同組換えにより達成する。
【０２５１】
第１の相同組換えのためには、改変ヒトＢＡＣクローン内の２０５ｂｐのヒトＶＨ６−１遺伝子セグメント（エクソン１内のＶＨ６−１開始コドンの約１０ｂｐ上流（５’側）からエクソン２の開始部の約６３ｂｐ下流（３’側）まで）を、固有のＰＩ−ＳｃｅＩ制限部位で挟まれたスペクチノマイシン（ａａｄＡ）カセットを用いる細菌性相同組換えにより欠失させる（図２、ＢＨＲ１）。これにより、限定重鎖遺伝子座内の他のヒト遺伝子セグメントを破壊せずに、後続のａａｄＡカセットを除去することが可能となる。
【０２５２】
第２の相同組換えのためには、ヒトＶＨ１−３遺伝子セグメントの全体およびこの遺伝子セグメントの約６０ｂｐ下流（３’側）を含む改変ヒトＢＡＣクローンの５’端を、隣接する５’側ＡｓｉＳＩ制限部位および３’側ＡｓｃＩ制限部位を含有するハイグロマイシンカセットを用いる相同組換えにより欠失させる（図２、ＢＨＲ２）。上記の通り、スペクチノマイシンカセットは、場合によって、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントに隣接する２つのヒトＶＨ遺伝子セグメントの欠失を含む最終的なターゲティングベクター（図２、下）を確認した後で除去する。例示的なヒトＶＨ１−２ターゲティングベクターを、配列番号７０に示す。
【０２５３】
限定免疫グロブリン重鎖遺伝子座において多型のＶＨ遺伝子セグメントを使用することは、抗体、抗体集団、および単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来する多様なＣＤＲを伴う重鎖を有する抗体を発現させるＢ細胞集団を生成させるための新規の手法を表す。宿主動物の体細胞超変異機構を、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインとの組合せによる関連と共に利用する結果として、遺伝子改変動物の免疫レパートリーを拡張し、ヒト病原体に特異的な中和抗体を作製するためのプラットフォームとしてとりわけ有用な、ヒト治療剤を作製するための次世代プラットフォームとしてのそれらの有用性を増強する固有の重鎖および固有のＶＨ／ＶＬ対の作出がもたらされる。
【０２５４】
したがって、さらなる多型ＶＨ遺伝子セグメントおよび／または他の多型ＶＨ遺伝子セグメントを、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座へと組み込むための、上記で概括された戦略を用いることにより、それ以外では宿主免疫系を事実上回避しうるヒト病原体を中和するのに用いられる、新規の抗体レパートリーの生成が可能となる。
【０２５５】
上記のターゲティングされるＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として用いて、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（前出）により、これらを８細胞期のマウス胚へと導入した。マウス免疫グロブリン定常領域遺伝子に作動可能に連結された単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、全てのヒトＤＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪＨ遺伝子セグメントを含有するヒト化重鎖遺伝子座を保有するマウスは、ネオマイシンカセット、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ならびにヒトＤＨ遺伝子セグメント内およびヒトＪＨ遺伝子セグメント内の領域の存在のほか、内因性重鎖配列の存在も検出する対立遺伝子修飾アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、前出）を用いる遺伝子型決定により同定した。表４は、単一のヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび６つのヒトＪＨ遺伝子セグメントを含有する限定重鎖遺伝子座を保有するマウスを確認するためにこのアッセイにおいて用いられるプライマーおよびプローブを示す。
【０２５６】
ターゲティングベクターにより導入されるＦｒｔを組み込んだあらゆるネオマイシンカセットであって、例えば、ＥＳ細胞期でも胚でも除去されないネオマイシンカセットを除去するために、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントを含有する、操作された重鎖遺伝子座を保有するマウスを、ＦＬＰｅ欠失用（ｄｅｌｅｔｏｒ）マウス系統へと育成することができる（例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，  Ｃ．Ｉ．ら（２０００年）、「Ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｄｅｌｅｔｅｒ  ｍｉｃｅ  ｓｈｏｗ  ｔｈａｔ  ＦＬＰｅ  ｉｓ  ａｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２５巻：１３９〜１４０頁を参照されたい）。場合によって、ネオマイシンカセットは、マウスにおいて保持される。
【０２５７】
仔マウスを遺伝子型決定し、免疫グロブリン重鎖レパートリーを特徴づけるために、内因性マウス免疫グロブリン定常遺伝子に作動可能に連結された単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、全てのヒトＤＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪＨ遺伝子セグメントを含有するヒト化重鎖遺伝子座についてヘテロ接合性の仔マウスを選択する。
【０２５８】
【表４】
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【０２５９】
実施例２  単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来する重鎖を発現させるマウスの特徴づけ
フローサイトメトリーを用いて、実施例１で記載された内因性重鎖遺伝子座における単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウスを、発現およびＢ細胞の発生について評価した。
【０２６０】
略述すると、野生型（１群当たりのｎ＝３；６週齢、雄および雌）ならびにマウス重鎖定常領域に作動可能に連結された単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、全てのヒトＤＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪＨ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウスから脾臓および骨髄を摘出した。脾臓に由来する赤血球をＡＣＫ溶解緩衝液（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）で溶解させた後、完全ＲＰＭＩ培地で洗浄した。
【０２６１】
フローサイトメトリー：細胞（１×１０６個）を、氷上で１０分間にわたり、抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２抗体（２．４Ｇ２、ＢＤ  ＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮ（商標））と共にインキュベートした後、氷上で３０分間にわたり、以下の抗体パネルで標識した。骨髄パネル：抗マウスＦＩＴＣ−ＣＤ４３（１Ｂ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰＥ−ｃｋｉｔ（２Ｂ８、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（登録商標））、ＰｅＣｙ７−ＩｇＭ（ＩＩ／４１、ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（登録商標））、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５−ＩｇＤ（１１−２６ｃ．２ａ、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（登録商標））、ＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ  ７８０−Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２、ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（登録商標））、ＡＰＣ−ＣＤ１９（ＭＢ１９−１、ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（登録商標））。骨髄脾臓パネル：抗マウスＦＩＴＣ−Ｉｇκ（１８７．１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＥ−Ｉｇλ（ＲＭＬ−４２、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（登録商標））、ＰｅＣｙ７−ＩｇＭ（ＩＩ／４１、ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（登録商標））、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５−ＩｇＤ（１１−２６ｃ．２ａ、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（登録商標））、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ−ＣＤ３（１７Ａ２、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（登録商標））、ＡＰＣ−Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２、ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（登録商標））、ＡＰＣ−Ｈ７−ＣＤ１９（ＩＤ３、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。骨髄：未成熟Ｂ細胞（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭ＋）、成熟Ｂ細胞（Ｂ２２０ｈｉＩｇＭ＋）、プロＢ細胞（ＣＤ１９＋ｃｋｉｔ＋ＣＤ４３＋）、プレＢ細胞（ＣＤ１９＋ｃｋｉｔ−ＣＤ４３−）、未成熟Ｉｇκ＋Ｂ細胞（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭ＋Ｉｇκ＋Ｉｇλ−）、未成熟Ｉｇλ＋Ｂ細胞（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭ＋Ｉｇκ−Ｉｇλ＋）、成熟Ｉｇκ＋Ｂ細胞（Ｂ２２０ｈｉＩｇＭ＋Ｉｇκ＋Ｉｇλ−）、成熟Ｉｇλ＋Ｂ細胞（Ｂ２２０ｈｉＩｇＭ＋Ｉｇκ−Ｉｇλ＋）。脾臓：Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）、成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＤｈｉＩｇＭｉｎｔ）、移行期／未成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＤｉｎｔＩｇＭｈｉ）。骨髄および脾臓：Ｉｇκ＋Ｂ細胞（ＣＤ１９＋Ｉｇκ＋Ｉｇλ−）、Ｉｇλ＋Ｂ細胞（ＣＤ１９＋Ｉｇκ−Ｉｇλ＋）。
【０２６２】
染色の後、細胞を洗浄し、２％のホルムアルデヒド中で固定した。ＬＳＲＩＩフローサイトメーターによりデータ収集を実施し、ＦＬＯＷＪＯ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ
Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）で解析した。脾臓区画についての結果を、図３、４Ａ、および５〜７に示す。骨髄区画についての結果を、図４Ｂおよび８〜１１Ｂに示す。
【０２６３】
ヒトＶＨの発現：ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントの発現を、マウス重鎖定常領域に作動可能に連結されたヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメント、全てのヒトＤＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪＨ遺伝子セグメントについてヘテロ接合性のマウスおよびこれらについてホモ接合性のマウスについて、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブを用いる定量的ＰＣＲアッセイにより決定した。
【０２６４】
略述すると、ＣＤ１９＋Ｂ細胞を、製造元の仕様書に従い、マウスＣＤ１９マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、マウスの群（１群当たりのｎ＝３）の脾臓から精製した。全ＲＮＡを、ＲＮＥＡＳＹ（商標）Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  ｏｎ−ｃｏｌｕｍｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲノムＲＮＡを除去した。Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔａｎｄ
ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、約２００ｎｇのｍＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写させた後、ＡＢＩ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）による増幅を行った。固有のプライマー／プローブの組合せを使用して、ヒトＶＨ１−６９に由来する重鎖の発現を特異的に決定した（表５）。相対発現は、マウスκ定常領域（ｍＣκ）に照らして正規化した。結果を、図１２に示す。
【０２６５】
【表５】
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【０２６６】
実施例３  単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来する重鎖を発現させるマウスにおける体液性免疫反応
ヒト細胞表面受容体（抗原Ａ）を用いる比較免疫化により、ヒト重鎖可変遺伝子およびヒトκ軽鎖可変遺伝子の遺伝子座についてホモ接合性のマウス（Ｈκ）、ならびにマウス重鎖定常領域に作動可能に連結された単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、全てのヒトＤＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪＨ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（１ｈＶＨＨＯ）について体液性免疫反応を決定した。
【０２６７】
免疫化：上記抗原による免疫化の前に、血清をマウスの群から回収した。初回のプライミング免疫化では、抗原（２．３５μｇずつ）を、１０μｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）およびアジュバントとしての２５μｇのＡｄｊｕ−ｐｈｏｓ（Ｂｒｅｎｎｔａｇ）と混合して投与した。免疫原は、マウス１匹当たり２５μｌずつの容量で、足蹠を介して（経足蹠）投与した。その後、計６回にわたる追加投与のために、３、６、１１、１３、１７、および２０日目に、マウスに経足蹠で、２．３μｇの抗原を、１０μｇのＣｐＧおよびアジュバントとしての２５μｇのＡｄｊｕ−ｐｈｏｓと共に追加投与した。４回目および６回目の追加投与の後、それぞれ、１５および２２日目にマウスから採血し、抗血清を抗原Ａに対する抗体力価についてアッセイした。
【０２６８】
ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、免疫化されたマウスの血清中の抗体力価を決定した。９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、抗原Ａ（１μｇ／ｍｌ）で、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、４℃で一晩にわたりコーティングした。翌日、プレート洗浄機（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、プレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳ−Ｔ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するリン酸緩衝食塩水で４回にわたり洗浄した。次いで、プレートを、ＰＢＳ中１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）２５０μｌでブロッキングし、室温で１時間にわたりインキュベートした。次いで、プレートを、ＰＢＳ−Ｔで４回にわたり洗浄した。免疫化されたマウスに由来する血清および免疫前血清を、０．１％のＢＳＡ  ＰＢＳ−Ｔ中で、１：１００から始めて１０倍に系列希釈し、ブロッキングされたプレートへと二連で添加し、室温で１時間にわたりインキュベートした。最後の２つのウェルは、二次抗体対照として用いるためにブランクのままにした。プレートを、プレート洗浄機内で、ＰＢＳ−Ｔで４回にわたり再度洗浄した。１：５０００希釈のヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）コンジュゲート二次抗体をプレートへと添加し、室温で１時間にわたりインキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔで８回にわたり再度洗浄し、基質としてのＴＭＢ／Ｈ２Ｏ２を用いて発色させた。基質を２０分間にわたりインキュベートし、１ＮのＨ２ＳＯ４（ＶＷＲ）で反応を停止させた。プレートを、４５０ｎｍの分光光度計（Ｖｉｃｔｏｒ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上で読み取った。ＧＲＡＰＨＰＡＤ  ＰＲＩＳＭ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）を用いて、抗体力価を計算した。
【０２６９】
血清力価は、バックグラウンドの２倍超と同等な抗原結合シグナルが発生したときの実験の滴定範囲内の血清希釈率として計算した。ヒト細胞表面受容体（抗原Ａ）に対する体液性免疫反応についての抗体力価を図１９に示す。
【０２７０】
同様な実験では、ヒト重鎖可変遺伝子およびヒトκ軽鎖可変遺伝子による遺伝子座についてホモ接合性のマウス（Ｈκ）、ならびにマウス重鎖定常領域に作動可能に連結された単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、全てのヒトＤＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪＨ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（１ｈＶＨ  ＨＯ）について、インフルエンザウイルスワクチンであるＦＬＵＶＩＲＩＮ（登録商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ）およびＦＬＵＭＩＳＴ（登録商標）（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ  ＬＬＣ）を用いる比較免疫化により体液性免疫反応を決定した。
【０２７１】
略述すると、上記抗原による免疫化の前に、血清をマウスの群から回収した（上記で記載した通り）。マウス重鎖定常領域に作動可能に連結された単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント（ＶＨ１−６９）、全てのヒトＤＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪＨ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ｎ＝５）（１ｈＶＨ  ＨＯ）を、マウス１匹当たり通常の１／３回分の用量のＦＬＵＭＩＳＴ（登録商標）（インフルエンザ弱毒化生ワクチン）で、鼻腔内（ｉ．ｎ．）免疫化した。通常の１回分の用量のＦＬＵＭＩＳＴ（登録商標）は、１０６．５〜７．５ＦＦＵ（蛍光焦点単位）のインフルエンザ弱毒化生ワクチンを含有する。したがって、１日目に、各マウスを、７０μｌのＦＬＵＭＩＳＴ（登録商標）でプライミングした後、計６回にわたる追加投与のために、３、６、１１、１３、１７、２０日目にｉ．ｎ．追加投与を行った。この免疫化では、アジュバントを使用しなかった。４および６回目の追加投与それぞれの後、１５および２２日目にマウスから採血し、ＦＬＵＭＩＳＴ（登録商標）に対する抗体力価について抗血清アッセイを行った（上記の通り）。
【０２７２】
ＦＬＵＶＩＲＩＮ（登録商標）による免疫化においても同様にして、免疫化を開始する前に、免疫前血清をマウスから回収した。マウス重鎖定常領域に作動可能に連結された単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント（ＶＨ１−６９）、全てのヒトＤＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪＨ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ｎ＝５）（１ｈＶＨ  ＨＯ）を、足蹠を介して（経足蹠）、追加投与１回当たりマウス１匹当たり０．７５μｇずつのヘマグルチニンを伴うＦＬＵＶＩＲＩＮ（登録商標）（三価の不活化インフルエンザワクチン）で免疫化した。１日目にマウスをプライミングした後、計６回にわたる追加投与のために、３、６、１１、１３、１７、２０日目に経足蹠追加投与を行った。この免疫化では、アジュバントを使用しなかった。４および６回目の追加投与それぞれの後、１５および２２日目にマウスから採血し、ＦＬＵＶＩＲＩＮ（登録商標）に対する抗体力価について抗血清アッセイを行った（上記の通り）。
【０２７３】
血清力価は、バックグラウンドの２倍超と同等な抗原結合シグナルが発生したときの実験の滴定範囲内の血清希釈率として計算した。ＦＬＵＭＩＳＴ（登録商標）およびＦＬＵＶＩＲＩＮ（登録商標）に対する体液性免疫反応についての抗体力価を図２０に示す。
【０２７４】
この例で示される通り、１ｈＶＨ  ＨＯマウスで生成させた抗体力価は、ヒト細胞表面受容体およびウイルス性抗原（例えば、インフルエンザ）の両方に対する複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントを有するマウス（Ｈκ）で生成させた抗体力価と同等であった。したがって、単一のＶＨ遺伝子セグメントに限定的な免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するマウスには、複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント（例えば、８０のＶＨ）を含有する免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するマウスと同等に、抗原に対して頑健な免疫反応を起こすことが可能である。
【０２７５】
実施例４  限定免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するマウスにおける抗体遺伝子使用およびＣＤＲ３の長さについての解析
ヒト細胞表面受容体（抗原Ａ）で免疫化された、内因性重鎖遺伝子座における単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス、および内因性κ軽鎖可変遺伝子座の、ヒトκ軽鎖可変遺伝子座による置き換えについてホモ接合性のマウスから採取された脾臓細胞を、重鎖遺伝子セグメントおよび軽鎖遺伝子セグメントの使用について、脾臓Ｂ細胞に由来するｍＲＮＡに対する逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により解析した。
【０２７６】
略述すると、脾臓を摘出し、１×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中で、スライドガラスを用いてホモジナイズした。細胞を遠心分離機（５００×ｇで５分間にわたる）によりペレットにし、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）中で３分間にわたり赤血球を溶解させた。細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、０．７μｍの細胞ストレーナーを用いて濾過した。ＣＤ１９についてのＭＡＣＳ磁気陽性選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、Ｂ細胞を脾臓細胞から単離した。ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、全ＲＮＡを、ペレットにされたＢ細胞から単離した。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（登録商標）Ｄｉｒｅｃｔ
ｍＲＮＡ  ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＰｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡを、全ＲＮＡから単離した。
【０２７７】
供給された逆転写酵素およびｄＮＴＰを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩおよびｄＮＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で代替したＳＭＡＲＴｅｒ（商標）Ｐｉｃｏ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いる５’側ＲＡＣＥにより、二本鎖ｃＤＮＡを、脾臓Ｂ細胞のｍＲＮＡから調製した。ＶＨ抗体レパートリーおよびＶκ抗体レパートリーは、ＩｇＭ定常領域、ＩｇＧ定常領域、またはＩｇκ定常領域に特異的なプライマーおよびＳＭＡＲＴｅｒ（商標）５’側ＲＡＣＥプライマーを用いて、ｃＤＮＡから増幅した（表６）。ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＰＣＲ産物を精製した。第２ラウンドのＰＣＲは、ＩｇＭ定常領域、ＩｇＧ定常領域、またはＩｇκ定常領域に特異的な同じ５’側ＲＡＣＥプライマーおよび３’側ネステッドプライマーを用いて行った（表７）。第２ラウンドのＰＣＲ産物は、ＳｉｚｅＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｅ−Ｇｅｌ（登録商標）システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて精製した。３回目のＰＣＲは、４５４のアダプターおよびバーコードを付加するプライマーにより実施した。第３ラウンドのＰＣＲ産物は、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ（登録商標）ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰ  Ｂｅａｄｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて精製した。精製されたＰＣＲ産物は、ＫＡＰＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＫＡＰＡ  ＢｉＳｙｓｔｅｍｓ）を用いるＳＹＢＲ（登録商標）ｑＰＣＲにより定量化した。プールされたライブラリーを、４５４  ＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｌｉｂ−Ａ  ｅｍＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いるエマルジョンＰＣＲ（ｅｍＰＣＲ）および製造元の仕様書に従いＲｏｃｈｅ  ４５４  ＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを用いる二方向配列決定に供した。
【０２７８】
バイオインフォマティクス解析：４５４の配列を、試料のバーコードとの完全なマッチに基づき分取し、品質のためにトリミングした。端末にインストールされたＩｇｂｌａｓｔ（ＮＣＢＩ、ｖ２．２．２５＋）を用いる、再配列された免疫グロブリン配列の、ヒト生殖細胞系Ｖ（Ｄ）Ｊセグメントデータベースに対するアライメントに基づき、配列に注記した。スコアが同一な複数のベストヒットが検出された場合は、配列に不明確とマークして解析から除去した。パールスクリプトのセットを開発して、結果を解析し、ＭｙＳＱＬデータベース内でデータを保存した。ＣＤＲ３領域は、軽鎖のＣコドンおよびＦＧＸＧモチーフと重鎖のＷＧＸＧモチーフとの間で保存的であると定義した。生産的抗体のみを用いて、ＣＤＲ３の長さを決定した。抗体の核酸配列および予測されるアミノ酸配列から、ＩｇＭプライミング（１５，６５０個の）配列、ＩｇＧプライミング（１８，９６７個の）配列、およびＩｇκプライミング（２６，８０４個の）配列のための遺伝子使用を同定した。結果を、表８、表９、図２１、および図２２に示す。
【０２７９】
表８は、ＶＨ１−６９に由来する重鎖可変領域のＩｇＭプライミング配列（１５，６５０個の配列）およびＶＨ１−６９に由来する重鎖可変領域のＩｇＧプライミング配列（１８，９６７個の配列）の間で用いられることが観察されたヒトＤＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪＨ遺伝子セグメントの百分率を示す。ＤＨ遺伝子セグメントのそれぞれの対の間で同一な配列の正体のために、ヒトＤＨ４−４／ＤＨ４−１１遺伝子セグメントおよびヒトＤＨ５−５／ＤＨ５−１８遺伝子セグメントを、表８に併せて示す。表９は、ＶＨ１−６９に由来する重鎖可変領域と同種である軽鎖（２６，８０４個の配列）の間で観察されたヒトＶκ遺伝子セグメントおよびＪκ遺伝子セグメントの百分率を示す。表８および９における百分率は概数値を表し、場合によっては、併せて足し合わせても１００％に等しくならない可能性がある。
【０２８０】
ＶＨ１−６９に由来するＩｇＭプライミング重鎖ＣＤＲ３領域のアミノ酸長を図２１に示す。ＶＨ１−６９に由来するＩｇＧプライミング重鎖ＣＤＲ３領域のアミノ酸長は、図２２に示す。
【０２８１】
表８および９において示される通り、本発明によるマウスは、ＶＨ１−６９に由来する重鎖を含有する抗原特異的抗体を生成させ、これは、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントの、多様なヒトＤＨセグメントおよびヒトＪＨセグメントによる多様な再配列を実証する。さらに、抗原特異的抗体は、ヒトＶκ遺伝子セグメントおよびＪκ遺伝子セグメントの多様な再配列から結果として得られるヒトＶκドメインを含有する同種のヒト軽鎖を含有する。
【０２８２】
【表６】
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【０２８３】
【表７】
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【０２８４】
【表８】
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【０２８５】
【表９】
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【０２８６】
【数１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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