(57)【要約】      （修正有）【課題】哺乳動物個体のインビボイメージングに利用可能なタンパク質の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有し、ビリベルジン結合性であるタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、ビリベルジン結合性であるタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質に、配列番号１に記載のアミノ酸配列の９５番目又はそれに相当するシステイン残基を介してビリベルジンが結合した、複合体。
【請求項３】
請求項１に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸を含むベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養することを含む、請求項１に記載のタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビリベルジン結合性シアノバクテリオクロムに関する。
【背景技術】
【０００２】
光は時間・空間分解能が高く、また、波長及び強度という二つのパラメーターによって細かく制御することができる。そのため、細胞内におけるタンパク質の局在などの測定に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光分子による、光を利用する分子イメージング手法が近年利用されている。しかしながら、細胞に存在する様々な要因（ヘモグロビン、メラニン、水など）により、低波長領域の光の多くは吸収されてしまうことから、低波長領域の光を吸収して蛍光を発するＧＦＰなどの蛍光分子を生体内で利用しようとすると、励起光が蛍光分子まで届きにくく、また蛍光の検出も困難であった。そのため、生体内での分子イメージングには、吸収され難い長波長光吸収型の蛍光分子が望まれている。
【０００３】
近年、長波長領域の光を吸収するビリベルジン（ＢＶ）と結合するバクテリオフィトクロムという光受容体が注目されている。バクテリオフィトクロムは、ビリベルジンと共有結合することで、７００ｎｍ及び７５０ｎｍの波長により、可逆的に光変換する光受容体である。バクテリオフィトクロムを用いた蛍光プローブは、色素を結合するタンパク質領域の分子量が比較的大きく、また、タンパク質が二量体以上の多量体を形成するという問題がある。
【０００４】
この問題を解決するために、シアノバクテリオクロムを利用した蛍光プローブが提案されている。シアノバクテリオクロムは、フィコシアノビリン（ＰＣＢ）及びフィコビオロビリンなどの開環テトラピロールと結合し、紫−青／緑色光、紫／黄色光及び緑／赤色光の間で可逆的に光変換を示す。シアノバクテリオクロムは、２５ｋＤａ程度の発色団結合ドメイン（ＧＡＦドメイン）単量体で色素と結合することができるため、バクテリオフィトクロムを用いた蛍光プローブよりも低分子で利用できる。シアノバクテリオクロムの２番目のＧＡＦドメインであるＡＭ１＿１５５７ｇ２にＢＶが結合した蛍光プローブが提案されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第６４０４６６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本願発明は、哺乳動物個体のインビボイメージングに利用可能なタンパク質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、シアノバクテリオクロムＮｐＦ２１６４の５番目のＧＡＦドメインであるＮｐＦ２１６４ｇ５に、４つのアミノ酸残基に変異を導入することで、ＢＶ非結合性のＮｐＦ２１６４ｇ５がＢＶ結合性に変化することを見出し、この変異体タンパク質をＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４と名付けた。また、ＢＶが結合したＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４をマウス個体に導入することで、非侵襲的に肝臓をイメージングできることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［６］に関する。
［１］  配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、ビリベルジン結合性であるタンパク質。
［２］  上記［１］に記載のタンパク質に、配列番号１に記載のアミノ酸配列の９５番目又はそれに相当するシステイン残基を介してビリベルジンが結合した、複合体。
［３］  上記［１］に記載のタンパク質をコードする核酸。
［４］  上記［３］に記載の核酸を含むベクター。
［５］  上記［４］に記載のベクターを含む形質転換体。
［６］  上記［５］に記載の形質転換体を培養することを含む、上記［１］に記載のタンパク質の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のタンパク質は、哺乳動物個体のインビボイメージングへの利用可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】（ａ）ＢＶが結合したＡｎＰｉｘＪｇ２＿ＢＶ４の立体配置を示す図である。（ｂ）ＰＣＢが結合したＡｎＰｉｘＪｇ２の立体配置を示す図である。（ｃ）ＢＶとＰＣＢの構造を比較する図である。Ｃｙｓ３２１はスティックモデルで表し、βシートはリボンモデルで表す。（ｄ）Ｐｈｅ／Ｔｈｒ３０８及びＩｌｅ／Ｖａｌ３３６残基と発色団の空間充填モデルを表す図である。上段はＡｎＰｉｘＪｇ２＿ＢＶ４を、中段はＢＶをＡｎＰｉｘＪｇ２＿ＢＶ４に重ね合わせたものを、下段はＡｎＰｉｘＪｇ２を表す。
【図２】（ａ）ＮｐＦ２１６４ｇ５（破線）及びＢＶが結合したＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４（実線）の標準化した吸収スペクトルを表す図である。（ｂ）ＰＣＢが結合したＮｐＦ２１６４ｇ５及びＢＶが結合したＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４の標準化した蛍光励起スペクトル及び蛍光発光スペクトルを表す図である。
【図３】（ａ）ＧＦＰ−ＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４（左列）、ＧＦＰ（中央列）又はＧＦＰ−ｉＲＦＰ（右列）でトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の共焦点蛍光画像を示す図である。（ｂ）ＧＦＰ−ＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４、ＧＦＰ又はＧＦＰ−ｉＲＦＰでトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞のＮＩＲ蛍光強度を表す図である。発現レベルの変動を標準化するため、ＧＦＰ蛍光でＮＩＲ蛍光を除している。（Ｐ値：＊＜０．０５）
【図４】（ａ）生きたマウスの光画像及びＮＩＲ蛍光画像を重ね合わせた図を表す。左はＧＦＰ−ＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４でトランスフェクトしたマウスを表し、右は陰性対照のマウスを表す。（ｂ）ＧＦＰ−ＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４でトランスフェクトした生きたマウス又は未注射の生きたマウスの肝臓の蛍光強度を表す図である。（Ｐ値：＊＜０．０５）
【図５】（ａ）ＧＦＰ−ＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４でトランスフェクトしたマウス（上段）又は未注射のマウス（下段）から単離した肝臓の光画像（左列）及びＮＩＲ蛍光画像（右列）を表す図である。（ｂ）ＧＦＰ−ＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４でトランスフェクトしたマウス又は未注射のマウスから単離した肝臓の蛍光強度を示す図である。（Ｐ値：＊＜０．０５）
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１２】
本実施形態のタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、ビリベルジン結合性である。配列番号１に記載のアミノ酸配列は、シアノバクテリオクロムＮｐＦ２１６４の５番目のＧＡＦドメインであるＮｐＦ２１６４ｇ５の４つのアミノ酸残基に変異を導入したタンパク質「ＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４」のアミノ酸配列である（以下、配列番号１に記載のアミノ酸配列が示すタンパク質及びこれと９０％以上の同一性を有し、ビリベルジン結合性であるタンパク質を「ＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４等」と総称する場合もある。）。
【００１３】
ビリベルジン結合性とは、タンパク質のビリベルジン結合効率が３０％以上であることを意味する。結合効率は、タンパク質の濃度を測定し、ホロタンパク質を酸性条件で変性することで結合しているビリベルジンの濃度を測定し、タンパク質及びビリベルジンのモル濃度の比から算出することができる。具体的には、例えば、実施例に記載の方法に従って結合効率を測定することができる。ビリベルジン結合効率は好ましくは４０％以上であり、より好ましくは５０％以上である。ビリベルジン結合効率が高いタンパク質は、効率的なインビボイメージングが可能である。
【００１４】
本実施形態のタンパク質は、ビリベルジン結合性を損なわない範囲で、配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する。アミノ酸配列の同一性は、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％以上であってもよい。あるいは、本実施形態のタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して１７個以下のアミノ酸残基が変異してもよい。変異されるアミノ酸残基の個数は、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３又は２個以下であってもよく、１個であってもよい。アミノ酸残基の変異は、置換、欠失、挿入及び付加のいずれであってもよい。
【００１５】
アミノ酸の変異が置換である場合、置換の種類は保存的アミノ酸置換であってよい。保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の互換性を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、セリン及びスレオニンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン及びヒスチジンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸は、リジン、アルギニン及びヒスチジンであり；酸性側鎖を有するアミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸であり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸は、アスパラギン及びグルタミンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の基は、システイン及びメチオニンである。
【００１６】
配列番号１に記載のアミノ酸配列のＣｙｓ９５残基は、ビリベルジンのＣ３位のビニル基と結合する。したがって、本実施形態のタンパク質においてＣｙｓ９５は変異しない。また、配列番号１に記載のアミノ酸配列のＴｙｒ６７、Ｔｈｒ８２、Ｔｙｒ９２及びＶａｌ１１０の４つの残基は、ビリベルジン非結合性のＮｐＦ２１６４ｇ５をビリベルジン結合性へと変化させるのに重要な役割を果たす残基である。したがって、本実施形態のタンパク質においてＴｙｒ６７、Ｔｈｒ８２、Ｔｙｒ９２及びＶａｌ１１０は変異しない。また、Ｔｒｐ６３、Ａｓｐ６５、Ａｒｇ７５、Ｇｌｙ９１、Ｔｙｒ９６及びＴｙｒ１２６は、ビリベルジン結合性に大きな影響を与える位置に存在するアミノ酸であるため、これらのアミノ酸を変異させるとビリベルジン結合性が低下する可能性がある。したがって、本実施形態のタンパク質において、Ｔｒｐ６３、Ａｓｐ６５、Ａｒｇ７５、Ｇｌｙ９１、Ｔｙｒ９６及びＴｙｒ１２６も変異しない。逆に、ビリベルジンのＤ環周辺に位置するアミノ酸を変異させることで、蛍光強度を増強させることができる可能性があるため、これらのアミノ酸は変異していてもよい。
【００１７】
本実施形態の複合体は、上記タンパク質に、配列番号１のアミノ酸配列の９５番目又はそれに相当するシステイン残基を介してビリベルジンが結合している。「相当するシステイン」とは、アミノ酸配列を配列番号１に記載のアミノ酸配列と比較した際に、配列番号１に記載のアミノ酸配列の９５番目のシステインに対応するシステインを意味する。
【００１８】
本実施形態の複合体は、光変換を行うことなく、遠赤外光を安定的に吸収し、近赤外領域をカバーする蛍光を発する。例えば、励起スペクトルは６８０ｎｍ付近にピークを有し、発光スペクトルは７００ｎｍ付近にピークを有する。
【００１９】
本実施形態の複合体を哺乳動物に投与すると、非侵襲的に深部組織をインビボイメージングすることができる。すなわち、複合体を投与した哺乳動物に励起光を照射することで本実施形態の複合体が蓄積した部位が蛍光を発する。これを利用して、例えば、標的タンパク質及びＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４等が融合タンパク質として発現するベクターを設計し、これを宿主細胞に導入、発現後、ビリベルジンと結合させることで、標的タンパク質の局在、挙動などを、本実施形態の複合体が発する蛍光により観測することができる。この際のビリベルジンの添加方法については、特に限定されるものではなく、直接細胞に透過させて導入させてもよいし、ビリベルジンを発現するベクターを組み込んでもよい。本実施形態の複合体は、長波長領域の光を吸収し、遠赤色光の蛍光を発することができるため、励起光や発する蛍光が生体内の要因により吸収され難く、インビボ蛍光プローブとして好ましい特性を備えている。
【００２０】
ＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４等は、例えば、ＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４等をコードする核酸を含むベクターで宿主細胞を形質転換させ、得られた形質転換体を培養することで得られる。
【００２１】
本実施形態の核酸は、ＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４等をコードする。ＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４をコードする核酸配列を配列番号２に示す。したがって、ＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４等をコードする核酸として、例えば、配列番号２に記載の配列からなる核酸との相同性が９０％以上である核酸であって、ビリベルジン結合性であるタンパク質をコードする核酸が挙げられる。
【００２２】
本実施形態のベクターは、ＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４等をコードする核酸を含む。ここで、核酸を組込むプラスミドとしては遺伝子工学的に常用される宿主細胞（例えば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞宿主、酵母、等の真核細胞宿主）中で核酸にコードされているタンパク質が発現できるプラスミドであればどのようなプラスミドでもよい。こうした配列内には、例えば選択した宿主細胞で発現するのに好適なコドンを導入することや、制限酵素部位を設けることも可能である。また、目的とする遺伝子の発現を容易にするための制御配列、促進配列等、目的とする遺伝子を結合するのに役立つリンカー、アダプター等、さらには抗生物質耐性等の制御、代謝の制御、菌体の選別等に有用な配列等を含ませることが可能である。
【００２３】
本実施形態のベクターを宿主細胞に導入することにより、ＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４等を産生可能な形質転換体が得られる。このような形質転換体も本発明に包含される。
【実施例】
【００２４】
材料と方法
（細菌株及び増殖培地）
大腸菌株ＪＭ１０９（タカラバイオ社）は、プラスミドＤＮＡのクローニング用に用い、ＢＶ又はＰＣＢ系（それぞれ、ｐＫＴ２７０及びｐＫＴ２７１）を持つ大腸菌株Ｃ４１（コスモ・バイオ社）は、タンパク質発現（R. Narikawa et al., "A biliverdin-binding cyanobacteriochromefrom the chlorophyll d-bearing cyanobacterium Acaryochloris marina". Sci.Rep. 5, 7950 (2015)に記載の方法）に用いた。細菌細胞は、２０μｇ／ｍＬのカナマイシン及びクロラムフェニコールを含むＬＢ培地で増殖させた。タンパク質発現のため、６００ｎｍの光学密度が０．４−０．８になるまで細胞をＬＢ培地中３７℃にて増殖させた。その後、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度が０．１−０．２ｍＭとなるように加え、細胞を１８℃にて一晩培養した。
【００２５】
（バイオインフォマティクス）
ＭＥＧＡ７ソフトウェア（S. Kumar, G. Stecher, K.Tamura, "MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 forBigger Datasets". Mol. Biol. Evol. 33, 1870-1874 (2016).）により、多重整列を構築した。ＰＣＢが結合したＡｎＰｉｘＪｇ２（ＰＤＢ  ＩＤ：３Ｗ２Ｚ）の結晶構造を利用してＢＶ取り込みの鍵となるアミノ酸残基を評価し、ＢＶが結合したＡｎＰｉｘＪｇ２＿ＢＶ４（ＰＤＢ  ＩＤ：５ＺＯＨ）のアミノ酸残基と比較した。分子グラフィックス及びオミットマップはＵＳＣＦキメラソフトウェア（E. F. Pettersen et al., "UCSF Chimera--a visualization systemfor exploratory research and analysis". J Comput Chem. 25, 1605-1612(2004).）により作成した。
【００２６】
（プラスミド構築）
Ｈｉｓタグ化したＡｎＰｉｘＪｇ２（アミノ酸位置２２１−３９７）（R.Narikawa, Y. Fukushima, T. Ishizuka, S. Itoh, M. Ikeuchi, "A novelphotoactive GAF domain of cyanobacteriochrome AnPixJ that shows reversiblegreen/red photoconversion". J. Mol. Biol. 380, 844-855 (2008).）を発現するプラスミドは既知の方法により構築した。ＮｐＦ２１６４ｇ５（アミノ酸位置８６２−１０３３）（N. C. Rockwell, S. S. Martin, J. C. Lagarias, Red/greencyanobacteriochromes: sensors of color and power. Biochemistry. 51, 9667-9677(2012).）は、Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  ＰＣＣ  ７３１０２のゲノムＤＮＡから、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  Ｍａｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）及び適切なヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）を用いてクローン化したＤＮＡ断片をｐＥＴ２８ａベクターに融合した。ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｂａｓａｌ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット試薬（タカラバイオ社）及び適切なヌクレオチドプライマーを用いて、部位特異的変異導入を行った。ＮｐＦ２１６４ｇ５の多重変異は合成ＤＮＡ（ジェンスクリプト社）として作製し、その後、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、野生型の遺伝子を含むｐＥＴ２８ａベクターと融合した。発現構築物はヌクレオチド配列決定により確認した。
【００２７】
（タンパク質発現及び精製）
タンパク質は大腸菌Ｃ４１  ｐＫＴ２７０で発現させた。さらに、ＮｐＦ２１６４ｇ５は大腸菌Ｃ４１  ｐＫＴ２７１でも発現させた。培養容積は１−２．５Ｌであった。０．５ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）含有又は不含の、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−水酸化ナトリウム  ｐＨ７．５，０．１Ｍ塩化ナトリウム及び１０％（ｗ／ｖ）グリセロールからなる溶解バッファー中、１２，０００ｐｓｉにてＥｍｕｌｓｉｆｅｘ  Ｃ５  高圧ホモジナイザーにて細胞を破砕した。細胞破砕液を１６５，０００ｇにて３０分間遠心し、上清を０．２μｍのセルロースエステル膜でろ過し、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社）又はＮＧＣクロマトグラフィー（バイオ・ラッド社）システムを用いたニッケルアフィニティー  Ｈｉｓ−トラップカラム（ＧＥヘルスケア社）にロードした。カラムを１００ｍＭのイミダゾールを含む溶解バッファーにて洗浄し、その後、１００ｍＭ−４００ｍＭのイミダゾールを含む溶解バッファーのリニアグラジエント（１ｍＬ／分、合計１５分）にてＨｉｓタグ化したタンパク質を溶出させた。１ｍＭのＥＤＴＡにて１時間インキュベーションし、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）含有又は不含の溶解バッファーに対してタンパク質を透析し、ＥＤＴＡ及びイミダゾールを除去した。ウシ血清アルブミンを用いた検量線によるブラッドフォード法（バイオ・ラッド社）にて、タンパク質濃度を測定した。
【００２８】
（電気泳動及び亜鉛誘導蛍光アッセイ）
精製したタンパク質を６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸  ｐＨ８．０，２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び６０ｍＭ  ＤＴＴに溶解し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。試料を９５℃にて３分間変性させ、その後、１２％（ｗ／ｖ）のアクリルアミドゲルを用いて室温で電気泳動した。ゲルはクマシーブリリアントブルーＲ−２５０（ＣＢＢ）で染色した。
【００２９】
亜鉛誘導蛍光アッセイのため、電気泳動後のゲルを２０ｍＭ  酢酸亜鉛中に室温にて３０分間浸した。その後、青色光（λｍａｘ＝４７０ｎｍ）による励起を６００ｎｍのロングパスフィルターを通して蛍光を可視化するか、緑色光（λｍａｘ＝５２７ｎｍ）による励起を５６２ｎｍのショートパスフィルターを通して蛍光を可視化し、ＷＳＥ−６１００  ＬｕｍｉｎｏＧｒａｐｈ（アトー社）及びＷＳＥ−５５００  ＶａｒｉＲａｙｓ（アトー社）によりイメージングした。
【００３０】
（スペクトロスコピー）
タンパク質の紫外・可視の吸収スペクトルは、ＵＶ−２６００分光光度計（島津製作所）にて室温で測定した。Ｏｐｔｏ−Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（浜松ホトニクス社）を用いて様々な波長の単色光を発生させ、光変換に用いた。
【００３１】
タンパク質の蛍光励起スペクトル及び蛍光発光スペクトルは、ＲＦ−６０００分光蛍光高度計を用いて室温にて測定した。Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ−ＱＹ（浜松ホトニクス社）を用いて、蛍光量子収率を測定した。
【００３２】
（シアノバクテリオクロムの生化学的特性評価）
変性アッセイのため、天然のタンパク質の暗状態（１５Ｚ異性体）及び光産物（１５Ｅ異性体）の両方を７Ｍの塩化グアニジウム（ＧｄｍＣｌ）／１％（ｖ／ｖ）塩酸で５倍に希釈し、白色光による３分間の照射の前後で、室温にて吸収スペクトルを測定した。
【００３３】
光変換及び暗反転の過程をモニターするため、赤色光（７００ｎｍ）に対する６９８ｎｍの吸収を、２５℃にて５分間の暗間隔で２分間、ＡｎＰｉｘＪｇ２＿ＢＶ４に対して測定した。暗反転速度から半減期を算出した。
【００３４】
ＢＶ結合効率を計算するため、様々な濃度でのフリーのＢＶ（Ｆｒｏｎｔｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）のＺ異性体の吸収スペクトルを測定し、検量線を作成した。この検量線を用い、７Ｍ  ＧｄｍＣｌ／１％（ｖ／ｖ）塩酸で変性させたＺ異性体の７００ｎｍの吸光度に基づいて、様々なタンパク質のＢＶ結合効率を計算した。
【００３５】
大腸菌Ｃ４１  ｐＫＴ２７０で発現させたホロタンパク質（ＡｎＰｉｘＪｇ２及びその変異体）の相対的な発現増強を見積もるため、溶解液にオレンジ色光（６２０ｎｍ及び６００ｎｍ）を照射し、Ｐｆｒ型のホロタンパク質を暗条件下でＮＧＣクロマトグラフィーシステム（バイオ・ラッド社）にて精製した。クロマトグラフィー中の７００ｎｍの吸光度でモニターされ、生細胞の重量で標準化された、各ピークエリアに基づいて増強を見積もった。
【００３６】
天然のタンパク質の暗状態及び光産物のモル吸光係数は、ブラッドフォード法で測定したホロタンパク質のモル濃度あたりのピーク波長における吸光度から計算した。
【００３７】
（ＢＶ結合ＡｎＰｉｘＪｇ２＿ＢＶ４の結晶化及び構造決定）
ニッケルアフィニティー精製、濃縮及びろ過後、ＡｎＰｉｘＪｇ２＿ＢＶ４をさらに、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０Ｓ／１００システム（ＧＥヘルスケア社）を用いたゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００  ＧＬ；ＧＥヘルスケア社）にロードした。２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−水酸化ナトリウム  ｐＨ７．５，０．１Ｍ  塩化ナトリウム及び１０％（ｗ／ｖ）グリセロールにて試料を溶出させた。精製したＡｎＰｉｘＪｇ２＿ＢＶ４を限外ろ過（アミコン、ミリポア社）にて約１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。精製したＡｎＰｉｘＪｇ２＿ＢＶ４の均一性をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。
【００３８】
ＡｎＰｉｘＪｇ２＿ＢＶ４のＰｆｒ型の結晶化スクリーニングをＣｒｙｓｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  ２  ｋｉｔ（ハンプトン・リサーチ社）を用い、２０℃にてハンギングドロップ蒸気拡散法で行った。１μＬのタンパク質溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）と１μＬの各リザーバー溶液とを混合して、結晶化した小滴をシリコン化したカバーグラス上に調製し、その後、５００μＬの同じリザーバー溶液で平衡化した。試薬＃１５（０．２Ｍ  硫酸アンモニウム、０．１Ｍ  カコジル酸ナトリウム三水和物  ｐＨ６．５及び３０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８０００；Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  ｋｉｔから）を用いることで、ＡｎＰｉｘＪｇ２＿ＢＶ４の結晶化に成功した。スクリーニングに基づき最適化したリザーバー溶液（０．２Ｍ  硫酸アンモニウム、０．１Ｍ  カコジル酸ナトリウム三水和物  ｐＨ６．０−６．３及び２６−３４％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ３３５０）を用いることで、最終的に大きな緑色の結晶を得られた。結晶化の実験は、緑色光（５４０±２０ｎｍ）下で行った。
【００３９】
得られた結晶を２０％（ｖ／ｖ）のグリセロールを添加したリザーバー溶液中に入れて凍害を防ぎ、液体窒素で急速に凍結した。放射光科学研究施設（フォトンファクトリー；つくば市）のＰＦ−ＡＲ  ＮＷ１２Ａ  ビームラインを用いて、１００Ｋの回折データを収集した。ＨＫＬ２０００を使用してすべてのデータを処理した（Z. Otwinowski, W. Minor, [20] Processing of X-ray diffraction datacollected in oscillation mode. Meth. Enzymol. 276, 307-326 (1997).）。ＣＣＰ４  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｓｕｉｔ（Collaborative Computational Project, Number 4, The CCP4 suite:programs for protein crystallography. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr.50, 760-763 (1994).）のＭＯＬＲＥＰ（Z. Otwinowski, W. Minor,[20] Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Meth.Enzymol. 276, 307-326 (1997).）を使用した分子置換法により、ＡｎＰｉｘＪｇ２（ＰＤＢ  ＩＤ：３Ｗ２Ｚ）の座標をサーチモデルとすることで、ＢＶを含むＡｎＰｉｘＪｇ２＿ＢＶ４の構造を解いた。ＲＥＦＭＡＣ５ソフトウェアを用いて微調整を行い（G. N. Murshudov, A. A. Vagin, E. J. Dodson, Refinement ofmacromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr. DBiol. Crystallogr. 53, 240-255 (1997).）、ＣＯＯＴソフトウェアを用いてモデルの手動調製及び再構築を行った（P. Emsley, B. Lohkamp, W. G. Scott, K. Cowtan, Features anddevelopment of Coot. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 66, 486-501 (2010).）。ＡＲＰ／ｗＡＲＰソフトウェアを用いて溶媒分子を導入した（A. Perrakis, R. Morris, V. S. Lamzin, Automated protein modelbuilding combined with iterative structure refinement. Nat. Struct. Biol. 6,458-463 (1999).）。ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙソフトウェアを用いて、構造の検証を行った（V. B.Chen et al., MolProbity: all-atom structure validation for macromolecularcrystallography. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 66, 12-21 (2010).）。ＢＶを含むＡｎＰｉｘＪｇ２＿ＢＶ４の座標及び構造因子は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋに受入番号５ＺＯＨとして登録した。
【００４０】
（哺乳動物での発現用の構築物）
ＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４及びｉＲＦＰをエンコードする哺乳動物のコドンに最適化したｃＤＮＡを、それぞれＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社及びＥｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社により合成した。ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）及び適切なヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲにより、Ｎ末端で７アミノ酸からなるフレキシブルリンカーが付いたＧＦＰを融合させた。ＧＦＰ−ＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４及びＧＦＰ−ｉＲＦＰを、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ部位を使用してＣＡＧプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにクローン化した。ＧＦＰ−ＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４及びＧＦＰ−ｉＲＦＰの配列は、ＤＮＡ配列決定（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社）により確認した。
【００４１】
（哺乳動物細胞の培養及びトランスフェクション）
ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−１６５１）を、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ギブコ社）、１０％ウシ胎仔血清（ギブコ社）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（シグマ社）にて、３７℃、５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素雰囲気化で培養した。トランスフェクションの２４時間前に、ＣＯＳ−７細胞を３５ｍｍのガラスボトムディッシュ（松浪硝子工業）上に固定した。
【００４２】
リポフェクタミン３０００（ライフテクノロジーズ社）を用いてトランスフェクションを行った。トランスフェクションの１８時間後、ストック溶液から加えた２５μＭ  ＢＶ（Ｆｒｏｎｔｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含む培地に細胞を置き換えた。ＢＶのストック溶液は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、富士フィルム和光純薬）中の２５ｍＭとして調製した。トランスフェクションの４８時間後、共焦点蛍光イメージングのために、細胞をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ、ギブコ社）にて洗浄し、置換した。
【００４３】
（共焦点蛍光イメージング）
ＧＦＰ−ＮｐＦ２１６５ｇ５＿ＢＶ４、ＧＦＰ−ｉＲＦＰ又はＧＦＰでトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を、Ｐｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ６３×／１．４  油浸対物レンズを取り付けたＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社）を用いてイメージングした。トランスフェクトした細胞の近赤外（ＮＩＲ）蛍光を、Ｈｅ／Ｎｅレーザー（対物レンズの開口部で測定したとき６０μＷ）を用いて６３３ｎｍの励起により６４０−７５８ｎｍで検出した。トランスフェクトした細胞の緑色蛍光を、Ａｒレーザー（対物レンズの開口部で測定したとき３．５μＷ）を用いて４８８ｎｍの励起により５００−５５０ｎｍで検出した。ＮｐＦ２１６５ｇ５＿ＢＶ４及びｉＲＦＰのＮＩＲ蛍光を定量的に評価するため、これらのタンパク質をＧＦＰと融合し、ＮＩＲ蛍光をＧＦＰの蛍光で除して発現レベルの変動を標準化した。ＺＥＮ２００９ソフトウェア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社）、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ  ｏｆｆｌｉｎｅ  ７．８ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）及びＯｒｉｇｉｎＰｒｏ  ２０１８（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ社）を用いて、データ解析を行った。統計学的有意差は、両側ウェルチのｔ検定により決定した。０．０５未満のＰ値を有意とした。
【００４４】
（マウス）
５週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスをジャパンＳＬＣ社から入手し、消化管の自家蛍光を抑えるため、アルファルファフリーの飼料（ＡＩＮ−７６Ａ、リサーチダイエット社）で飼育した。
【００４５】
（生きたマウス及び単離した肝臓の蛍光イメージング）
ＴｒａｎｓＩＴ−ＥＥ  Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｍｉｒｕｓ社）を用いて、ハイドロダイナミック尾静脈（ＨＴＶ）注射により、マウスをＧＦＰ−ＮｐＦ２１６５ｇ５＿ＢＶ４でトランスフェクトした。陰性対象として、未注射のマウスを用いた。ＨＴＶ注射の２３時間後に、ＨＴＶ注射及び未注射のマウスの両方に、ＢＶ（５０ｎｍｏｌ／ｇマウス体重）を静脈注射し、腹部の毛を脱毛クリームで除去した。ＢＶ注射の１時間後、マウスをイソフルランで麻酔し、ＥＭＣＣＤカメラ（Ｅｖｏｌｖｅ  ５１２、ホトメリクス社）及び発光フィルターＥＴ７００／７５ｍ（クロマ社）を取り付けたＬｕｍａｚｏｎｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングシステム（ショーシンＥＭ社）でイメージングした。励起光源として、チューナブルフィルターチェンジャー（ＬＡＭＢＤＡ  ＶＦ−５、Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社）を付けた水冷式高出力ＬＥＤ光源（ＬＡＭＢＤＡ  ＨＰＸ、Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社）を用いた。蛍光画像を２つのチャンネルで得た。チャンネル１は、５７０±７ｎｍの励起（検体で１．０５Ｗ／ｍ２）で７００±３７．５ｎｍの発光にて取得し、チャンネル２は、６３０±６．５ｎｍの励起（検体で０．５３Ｗ／ｍ２）で７００±３７．５ｎｍの発光にて取得した。暴露時間は１００ミリ秒で、ゲイン及びインテンシフィケーションのカメラパラメーターをそれぞれ１及び１００に設定した。ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング後、標準的な外科手術によりマウスから肝臓を単離し、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングと同じイメージングチャンネル及び条件にてイメージングした。さらに、ＧＦＰ−ＮｐＦ２１６５ｇ５＿ＢＶ４の発現を確認するため、単離した肝臓のＧＦＰ蛍光を、ＧＦＰ用のフィルターセット（フィルターセット３８ＨＥ、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社）を取り付けた蛍光ステレオズーム顕微鏡（Ａｘｉｏ  Ｚｏｏｍ．Ｖ１６、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社）でも測定した。
【００４６】
（スペクトル分離及びデータ解析）
マウスの蛍光画像は主に消化管からの自家蛍光を含んでいた。自家蛍光からＧＦＰ−ＮｐＦ２１６５ｇ５＿ＢＶ４のＮＩＲ蛍光を抽出するため、Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｕｎｍｉｘｉｎｇ  ｆｏｒ  ＩｍａｇｅＪ（Ｊ．ＷａｌｔｅｒによりＩｍａｇｅＪプラグイン）によりスペクトル分離を行った。簡潔に説明すると、チャンネル１（Ｅｘ／Ｅｍ＝５７０／７００ｎｍ）及びチャンネル２（Ｅｘ／Ｅｍ＝６３０／７００ｎｍ）のＨＴＶ注射したマウスから単離した肝臓の画像をＧＦＰ−ＮｐＦ２１６５ｇ５＿ＢＶ４の参照画像とした。未注射のマウスのチャンネル１及び２の画像を自家蛍光の参照画像とした。説明書に従って、分離したマトリクスを構築しＨＴＶ注射及び未注射のマウスの蛍光画像に適用し、分離した画像を得た。単離した肝臓のＮＩＲ蛍光画像として、チャンネル２の画像を用いた。ＭｅｔａＭｏｒｐｈ  ｏｆｆｌｉｎｅ  ７．８ソフトウェア及びＯｒｉｇｉｎＰｒｏ  ２０１８を用いて、データ解析を行った。統計学的有意差は、両側ウェルチのｔ検定により決定した。０．０５未満のＰ値を有意とした。
【００４７】
（実験例１：ＢＶ取り込みに重要な残基の同定）
ＡｎＰｉｘＪｇ２がＢＶを取り込むことができるかを確認するため、Ｈｉｓタグ化ＡｎＰｉｘＪｇ２をＢＶ産生性大腸菌から精製した。ＡｎＰｉｘＪｇ２はＢＶに結合し、吸収極大が６９８ｎｍのＰｆｒ型と吸収極大が６１４ｎｍのＰｏ型との間で可逆的な光変換を示した。しかし、ＡＭ１＿Ｃ００２３ｇ２（７０％）及びＡＭ１＿１５５７ｇ２（４０％）と比較して、ＡｎＰｉｘＪｇ２の結合効率は３．９％と極めて低かった。ＡＭ１＿１８７０ｇ３のＢＶ結合効率がＡｎＰｉｘＪｇ２と同じくらい低いことも既に知られている。これらの配列比較をすると、Ｖａｌ２７３，Ｇｌｎ３０７，Ｔｙｒ３１０，Ｌｙｓ３１８，Ｔｈｒ３２５，Ｓｅｒ３３４，Ｔｙｒ３３５，Ａｓｐ３３７及びＶａｌ３５３（ＡＭ１＿Ｃ００２３ｇ２）の９つのアミノ酸残基がＡＭ１＿Ｃ００２３ｇ２とＡＭ１＿１５５７ｇ２の間で特異的に保存されていることが分かった。これらのアミノ酸残基は、ＡｎＰｉｘＪｇ２のＡｌａ２５６，Ｇｌｕ２９０，Ｈｉｓ２９３，Ａｒｇ３０１，Ｐｈｅ３０８，Ｇｌｙ３１７，Ｈｉｓ３１８，Ｓｅｒ３２０及びＩｌｅ３３６に相当する。これらのうち、Ｓｅｒ３４４／Ｇｌｙ３１７がＡＭ１＿Ｃ００２３ｇ２におけるＢＶ結合に重要であることは既に知られており、Ｓｅｒ３４４をＧｌｙに置換するとＢＶ結合ホロタンパク質の安定性が向上する。これは、ＡｎＰｉｘＪｇ２のＧｌｙ３１７はＢＶ結合能に重要であることを示唆する。そこで、ＡｎＰｉｘＪｇ２の残りの８つのアミノ酸残基に焦点を当てて、アミノ酸が１つだけ変異したＡｎＰｉｘＪｇ２の部位特異的変異体を８つ作製した：Ａ２５６Ｖ，Ｅ２９０Ｑ，Ｈ２９３Ｙ，Ｒ３０１Ｋ，Ｆ３０８Ｔ，Ｈ３１８Ｙ，Ｓ３２０Ｄ及びＩ３３６Ｖ。これらの変異体を発現する大腸菌細胞はいずれも、野生型タンパク質を発現する大腸菌細胞と同様の色を示し見た目では区別できなかった。
【００４８】
次に、ＡｎＰｉｘＪｇ２の８つのアミノ酸残基すべてが、ＡＭ１＿Ｃ００２３ｇ２及びＡＭ１＿１５５７ｇ２の間で保存されているアミノ酸残基に置換されている変異体を構築した。変異体ＡｎＰｉｘＪｇ２＿ＢＶ８（Ａ２５６Ｖ，Ｅ２９０Ｑ，Ｈ２９３Ｙ，Ｒ３０１Ｋ，Ｆ３０８Ｔ，Ｈ３１８Ｙ，Ｓ３２０Ｄ及びＩ３３６Ｖ）はＢＶ取り込み能が著しく改善され、遠赤／オレンジ可逆的光変換を保持していた。変異体タンパク質のＢＶ取り込み能を評価するために、精製したタンパク質のＢＶ結合効率及び野生型タンパク質に対するホロタンパク質の発現増強の２つのパラメーターを用いた。ＡｎＰｉｘＪｇ２＿ＢＶ８の結合効率及び発現増強は、それぞれ、５２．６±９．１％及び５２．６±１９．５倍であった。
【００４９】
ＰＣＢ結合ＡｎＰｉｘＪｇ２の構造に基づくと、Ａｌａ２５６，Ｇｌｕ２９０及びＳｅｒ３２０は発色団の結合には直接関与していない可能性が高い。さらに、別のＢＶ結合ＣＢＣＲ  ＧＡＦドメインであるＡＭ１＿６３０５ｇ２をシアノバクテリアＡ．ｍａｒｉａから同定されている。このドメインは、ＡＭ１＿Ｃ００２３ｇ２及びＡＭ１＿１５５７ｇ２のＬｙｓ３１８の代わりにＨｉｓを有しており、これはＡｎＰｉｘＪｇ２のＡｒｇ３０１に相当する。そこで、４つのアミノ酸残基が置換された変異体ＡｎＰｉｘＪｇ２＿ＢＶ４（Ｈ２９３Ｙ，Ｆ３０８Ｔ，Ｈ３１８Ｙ及びＩ３３６Ｖ；配列番号３に配列を示す。アミノ酸位置２９３，３０８，３１８及び３３６は、それぞれ、配列番号３の７３，８８，９８及び１１６に相当する。）を構築した。この変異体は、遠赤／オレンジの可逆的な光変換を示し、結合効率が７４．７±１３．０％であり、発現増強が７５．７±８．６倍であり、いずれの数値もＡｎＰｉｘＪｇ２＿ＢＶ８よりも高かった。このことは、残りの４つのアミノ酸残基はＢＶ結合に不要であるだけでなく、いくつかのアミノ酸残基は阻害的であることを示唆している。
【００５０】
変異残基の数を減らすため、ＡｎＰｉｘＪｇ２＿ＢＶ４から１つのアミノ酸残基置換を元に戻した変異体を作製したところ、いずれもＡｎＰｉｘＪｇ２＿ＢＶ４と比べて結合効率及び発現増強が低下した。以上の結果から、Ｔｙｒ２９３，Ｔｈｒ３０８，Ｔｙｒ３１８及びＶａｌ３３６がＢＶ結合に必須であることが分かった。
【００５１】
（実験例２：ＢＶ取り込みの構造的知見）
ＢＶ取り込みの分子機構を解明するため、ＡｎＰｉｘＪｇ２＿ＢＶ４のＰｆｒ型の結晶構造（１．６Å分解能）を決定した。ＢＶが結合したＡｎＰｉｘＪｇ２＿ＢＶ４の構造は、ＰＣＢが結合したＡｎＰｉｘＪｇ２＿ＢＶ４の構造と極めて類似していたが（残基２３３−３８８のＣα原子の平均二乗偏差は０．９０８Å）、Ｎ末端のαヘリックスが逆方向を向いていた。この相違は結晶充填の由来するアーティファクトの可能性がある。電子密度図（２｜Ｆｏ｜−｜Ｆｃ｜）は、ＡｎＰｉｘＪｇ２＿ＢＶ４のカノニカルなＣｙｓ残基（Ｃｙｓ３２１）がＢＶのビニル基のＣ３２位置に結合している一方、ＡｎＰｉｘＪｇ２のＣｙｓ残基はＰＣＢのエチリデン基のＣ３１位置に結合していることを明らかに示していた（図１（ａ）及び（ｂ））。Ａ環のＣ３とＣｙｓ３２１の硫黄原子の間の共有結合に追加の炭素（Ｃ３２）が挿入されているため、ＡｎＰｉｘＪｇ２＿ＢＶ４に取り込まれたＢＶは、ＡｎＰｉｘＪｇ２に取り込まれたＰＣＢと比べて、発色団が結合するポケットのβシートの方にシフトしていた（図１（ｃ））。それにもかかわらず、発色団の安定に重要だと報告されている５残基（Ｔｒｐ２８９，Ａｓｐ２９１，Ａｒｇ３０１，Ｈｉｓ３２２及びＴｙｒ３５２）は２つの構造間で高度に保存されていた（図１（ａ）及び（ｂ））。Ａｒｇ３０１は２つのタンパク質で異なった様式で発色団結合に関与していた。ＡｎＰｉｘＪｇ２＿ＢＶ４では、水分子を介した水素結合によりＢＶのＣ環のプロピオン酸を安定化しているのに対し、ＡｎＰｉｘＪｇ２では、ＰＣＢの同じプロピオン酸を水素結合により直接相互作用している。
【００５２】
４つの変異部位（Ｈｉｓ２９３，Ｐｈｅ３０８，Ｈｉｓ３１８及びＩｌｅ３３６）の側鎖は、両構造の発色団のＣ環の周囲に位置していたが、これらの側鎖のタンパク質−発色団相互作用は２つの構造で全く異なっていた（図１（ａ）及び（ｂ））。Ｐｈｅ／Ｔｈｒ３０８及びＩｌｅ／Ｖａｌ３３６の位置では、ＡｎＰｉｘＪｇ２の嵩高いＰｈｅ３０８及びＩｌｅ３３６が疎水性相互作用によってＣ環を支えていた（図１（ｄ）下段）。ＡｎＰｉｘＪｇ２は効率よくＢＶと結合できなかったという事実は、これらの嵩高い残基はＣ環の立体障害の原因となっていることを意味し、ＢＶのＣ環はＰＣＢとＣ環と比較してβシート方向に大きくシフトしている（図１（ｃ））。この解釈は、ＡｎＰｉｘＪｇ２構造へＢＶを重ね合わせることによっても支持される（図１（ｄ）中段）。逆に、ＡｎＰｉｘＪｇ２＿ＢＶ４のコンパクトなＴｈｒ３０８及びＶａｌ３３６残基は、Ｃ環の立体障害を避けていた（図１（ｄ）上段）。ＢＶのＣ環のプロピオン酸はＢ−Ｃ平面に対して垂直方向であったのに対して、ＰＣＢのＣ環のプロピオン酸はＢ−Ｃ平面と平行に並んでいる（図１（ａ）及び（ｂ））。このことは、コンパクトな残基への置換だけではなく、Ｃ環のプロピオン酸の自由な再編成もまた、ＢＶ取り込みに重要なことを示唆する（図１（ａ）及び（ｂ））。これに関連して、Ｈｉｓ／Ｔｙｒ２９３及びＨｉｓ／Ｔｙｒ３１８における他の置換も再編成に寄与している（図１（ａ）及び（ｂ））。ＡｎＰｉｘＪｇ２のＨｉｓ３１８はＰＣＢのＢ環のプロピオン酸と直接的な水素結合により相互作用しているのに対して、ＡｎＰｉｘＪｇ２＿ＢＶ４のＴｙｒ３１８はＢＶのＣ環のプロピオン酸と直接水素結合している。ＡｎＰｉｘＪｇ２のＨｉｓ２９３は水分子の水素結合を介してＰＣＢのＣ環のプロピオン酸安定化していたが、ＡｎＰｉｘＪｇ２＿ＢＶ４のＴｙｒ２９３は発色団と水素結合を形成していなかった。これらの独特な相互作用ネットワークがＣ環のプロピオン酸の「平行な」及び「垂直な」立体構造を助長しているようである。すなわち、Ｈｉｓ３１８をＴｙｒに置換すると、相互作用の相手がＢ環のプロピオン酸からＣ環のプロピオン酸へとスイッチし、「垂直な」立体構造に直接寄与するのに対し、Ｈｉｓ３１８をＴｙｒに置換すると、Ｃ環のプロピオン酸との水素結合がなくなり、「平行な」立体構造の不安定化へ寄与する。さらに、Ｔｈｒ３０８の水酸基は、水分子を介してＢＶのＣ環のプロピオン酸と間接的に水素結合しており、これもまた「垂直な」立体構造を助長している（図１（ａ））。これは、Ｐｈｅ３０８をＴｈｒに置換すると、立体障害の減少に影響するだけでなく、Ｃ環のプロピオン酸の再編成にも影響することを意味している。以上説明したように、ＡｎＰｉｘＪｇ２＿ＢＶ４の４つの残基は協調的に働いて、発色団シフトによって引き起こされる問題を解決し、安定なＢＶ取り込みをもたらしている。
【００５３】
（実験例３：ＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４の作製）
ＢＶをほとんど取り込まないＮｐＦ２１６４ｇ５（光変換を起こさない、強い遠赤蛍光）を、ＡｎＰｉｘＪｇ２＿ＢＶ４の配列に基づいてＢＶ取り込みができるよう操作した。４つのアミノ酸変異を導入したタンパク質であるＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４のアミノ酸配列を配列番号１に示す。変異を導入することで、ＮｐＦ２１６４ｇ５は、顕著にＢＶ結合効率が向上した（７０％）。ＮｐＦ２１６４ｇ５は光変換をせずに遠赤光を安定的に吸収し、４％の量子収率で近赤外領域をカバーする蛍光を示した。ＢＶに結合したＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４の励起及び発光スペクトルは、それぞれ６８０ｎｍ及び７００ｎｍにピークを有しており、ＰＣＢが結合したＮｐＦ２１６４ｇ５と比較してレッドシフトしていた（図２（ａ）及び（ｂ））。
【００５４】
（実験例３：ＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４を用いた生きたマウスでの蛍光イメージング）
コンパクトなＮＩＲ蛍光タンパク質であるＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４が、生きたマウスのインビボイメージングに適用できるか調べた。生きた哺乳動物細胞においてＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４のＮＩＲ蛍光が観察できるかをまず調べた。ＣＯＳ−７細胞をＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４でトランスフェクトし、共焦点顕微鏡でイメージングした。ＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４のＮＩＲ蛍光を定量的に評価するため、ＧＦＰを融合したＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４を作製し、ＧＦＰ蛍光でＮＩＲ蛍光を除して発現レベルの変動を標準化した。ＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４を発現する細胞は、陰性対照であるＧＦＰを発現する細胞と比較して、明るいＮＩＲ蛍光を示した（図３（ａ）及び（ｂ））。次に、ＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４のＮＩＲ蛍光が、生きたマウスでのインビボイメージングが可能かを調べた。ＨＴＶ注射によりＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４でマウスの肝臓を一過的にトランスフェクトした。ＨＴＶ注射の２４時間後、トランスフェクトしたマウスをインビボ蛍光イメージャーによりイメージングした。ＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４のＮＩＲ蛍光を生きたマウスの肝臓から観察することができた（図４（ａ）及び（ｂ））。さらに、トランスフェクトしたマウスから単離した肝臓は、未注射のマウスの肝臓と比較して、明るいＮＩＲ蛍光を示すことを確認した（図５（ａ）及び（ｂ））。これらの結果は、ＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４は生きたマウスの深部組織のインビボ蛍光イメージングに利用できることを示している。
【００５５】
インビボ蛍光イメージングに広く使用されているＮＩＲ蛍光タンパク質であるｉＲＦＰとＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４とを比較した。ｉＲＦＰは、ＢＶ結合バクテリオフィトクロムであるＲｐＢｐｈＰ２を広範な変異で操作しており、光変換を阻害するＤ２０２Ｈ変異などのほか、蛍光を大きく増強するＢＶのＤ環周囲を含む１３の変異がある。一方、ＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４はＢＶ結合特性を付与するＢ及びＣ環の周囲の変異を有するが、蛍光強度を改善するＤ環の周囲の変異はまだ行われていない。それにも関わらず、ＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４のＮＩＲ蛍光強度はｉＲＦＰの２０％に達しており（図３（ａ）及び（ｂ））、これは、ＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４はインビボ蛍光イメージングのための、強力かつコンパクトなＮＩＲ蛍光プローブを開発する有望なプラットフォームであることを示唆している。ｉＲＦＰの開発の場合と同じように追加の変異を適用することで、ＮｐＦ２１６４ｇ５＿ＢＶ４のＮＩＲ蛍光は大幅に増強し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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