(57)【要約】【課題】希釈条件や生体内環境でもディスク状の構造体を維持することができ、調製が容易で、生体適合性及び皮膚透過力に優れるバイセルを提供する。【解決手段】  pH6〜8の領域において分子全体が負に帯電しているリン脂質を５０質量％以上含む、バイセル、並びに該バイセルを含む化粧料、キャリア材料、フォトニック材料及びＮＭＲ配向剤。【選択図】図２
2020138941.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
pH6〜8の領域において分子全体が負に帯電しているリン脂質を５０質量％以上含む、バイセル。
【請求項２】
前記リン脂質は、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、及びホスファチジルイノシトールから選ばれる一種以上のリン脂質である請求項１に記載のバイセル。
【請求項３】
平面部分の大きさが10nm〜10μmである請求項１又は２に記載のバイセル。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイセルを含む、化粧料。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイセルを含む、キャリア材料。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイセルを含む、フォトニック材料。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイセルを含む、ＮＭＲ配向剤。
【請求項８】
下記工程１及び工程２を有する方法により製造することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイセルの製造方法。
〈工程１〉
pH6〜8の領域において分子全体が負に帯電しているリン脂質を、2質量％以上の濃度で、前記リン脂質の相転移温度未満の温度で、水系分散液に分散する工程
〈工程２〉
前記リン脂質の水系分散液を、前記リン脂質の相転移温度以上の温度に加熱する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイセル及びバイセルを含む各種材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイセルは、リン脂質二分子膜のディスク状分子集合体である。バイセルの模式図を図１に示す。従来、（１）ディスク状の平面部分１を構成する疎水性基が長い長鎖リン脂質及び（２）ディスク状の屈曲部分２を構成する疎水性基が短い短鎖リン脂質又は界面活性剤、の少なくとも２成分から構成されるバイセルが知られている。
このようなバイセルは最小の脂質二分子膜モデルとして生体膜の研究に利用されている。バイセルは、磁場配向する性質からNMRを用いた膜タンパク質の解析に利用されたり、薬物送達システムのキャリア材料、化粧料及び皮膚外用剤等に利用されている（特許文献１−２、非特許文献１−７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１１−０８９９４６号公報
【特許文献２】国際公開第２０１７／０９０７４０号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Durr, U. H. N. Gildenberg, M.; Ramamoorthy, A. Chem. Rev. 2012, 112, 6054-6074
【非特許文献２】Lin, L. et al. RSC Adv. 2016, 6, 79811-79821
【非特許文献３】Marcotte, I.; Auger, M. Concepts Magn. Reson. Part A 2005, 24, 17-37
【非特許文献４】Isabettini, S. ACS Appl. Mater. Interfaces 2018, 10, 8926-8936
【非特許文献５】Barbosa-Barros, L. et al. Small 2012, 8, 807-818
【非特許文献６】Shapiro, R. A.; Brindley, A. J.; Martin, R. W. J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 11406-11407
【非特許文献７】Barbosa-Barros, L. et al. Langmuir 2008, 24, 5700-5706
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来のバイセルは、（１）長鎖リン脂質及び（２）短鎖リン脂質又は界面活性剤の種類に応じて、構成成分の配合量や配合割合などディスク状構造を形成する条件の検討が必要であった。
また、従来の少なくとも２成分で構成されるバイセルの分散液は、希釈すると、その構成成分である（２）短鎖リン脂質又は界面活性剤が乖離してしまい、ディスク状の構造体を維持することができないという問題があった。同様に、生体内の夾雑物が多い環境などでも（２）短鎖リン脂質又は界面活性剤が乖離してしまい、ディスク状の構造体を維持することができず、また乖離した界面活性剤は生体に有害なため、使用条件や使用環境に制限があった。
【０００６】
従って、本発明の目的は、希釈条件や生体内環境でもディスク状の構造体を維持することができ、調製が容易で、生体適合性及び皮膚透過力に優れるバイセルを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究した結果、下記のバイセルが上述した課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、次の発明を提供するものである。
＜１＞
pH6〜8の領域において分子全体が負に帯電しているリン脂質を５０質量％以上含む、バイセル。
＜２＞
前記リン脂質は、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、及びホスファチジルイノシトールから選ばれる一種以上のリン脂質である＜１＞に記載のバイセル。
＜３＞
平面部分の大きさが10nm〜10μmである＜１＞又は＜２＞に記載のバイセル。
＜４＞
＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載のバイセルを含む、化粧料。
＜５＞
＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載のバイセルを含む、キャリア材料。
＜６＞
＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載のバイセルを含む、フォトニック材料。
＜７＞
＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載のバイセルを含む、ＮＭＲ配向剤。
＜８＞
下記工程１及び工程２を有する方法により製造することを特徴とする、＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載のバイセルの製造方法。
〈工程１〉
pH6〜8の領域において分子全体が負に帯電しているリン脂質を、2質量％以上の濃度で、前記リン脂質の相転移温度未満の温度で、水系分散液に分散する工程
〈工程２〉
前記リン脂質の水系分散液を、前記リン脂質の相転移温度以上の温度に加熱する工程
【発明の効果】
【０００８】
本発明のバイセルは、希釈条件や生体内環境でもディスク状の構造体を維持することができ、調製が容易で、経皮透過力に優れる。また、本発明のバイセルは分散液中の濃度に応じて異なる構造色を呈する。従って、本発明のバイセルは、化粧料、フォトニック材料、キャリア材料及びNMR配向剤等に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】バイセルの模式図を表す。
【図２】実施例１のDPPGバイセル分散液の調製手順を表す図である。
【図３】実施例及び比較例で調製した各バイセルの31P NMRのスペクトルである。
【図４】実施例１のDPPGバイセルのTEM画像である。
【図５】実施例１のDPPGバイセルの濃度を変化した場合（図５Ａ）及び分散液中の食塩濃度を変化した場合（図５Ｂ）の31P NMRのスペクトルである。
【図６】実施例１のDPPGバイセルのSAXS解析結果を表す図である。
【図７】実施例１のDPPGバイセルに所定時間超音波処理した場合のDLS測定結果（図７Ａ）及びSAXS解析結果（図７Ｂ）を表す図である。
【図８】蛍光ラベルしたパクリタキセルを内包したDPPGバイセルの写真（図８Ａ）及びSAXS解析結果（図８Ｂ）を表す図である。
【図９】蛍光ラベルしたDPPGバイセルの経皮浸透試験における概念図（図９Ａ、Ｂ）及び投与時間に対する透過量を示したグラフ（図９Ｃ）である。
【図１０】蛍光ラベルしたDPPGバイセルの経皮浸透試験における皮膚組織中への集積量を示したグラフである。
【図１１】経皮浸透試験において皮膚組織を透過した透過物のSAXS解析結果を表す図である。
【図１２】実施例１のDPPGバイセル及び比較用のDMPGミセルのがん細胞に対する細胞毒性試験の結果を表す図である。
【図１３】実施例１のDPPGバイセルの各濃度における吸収スペクトル及び分散液の写真である。
【図１４】磁場配向後の実施例１のDPPGバイセルの各濃度における吸収スペクトル及び分散液の写真である。
【図１５】実施例１のDPPGバイセルの各温度における2D SAXS解析結果を表す図である。
【図１６】実施例１のDPPGバイセルの温度変化させた場合の吸収スペクトルの変化を表す図である。
【図１７】実施例１のDPPGバイセルをアクリルアミドゲルに包埋したゲルの写真である。
【図１８】実施例１のDPPGバイセルをアクリルアミドゲルに包埋したゲルの温度を変化させた場合のゲルの写真（図１８Ａ）及び吸収スペクトル（図１８Ｂ）である。
【図１９】実施例１のDPPGバイセルの写真（図１９Ｂ）及びDPPGベシクルの写真（図１９Ａ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下本発明のバイセルについて詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。また、本発明において「室温」とは周囲環境温度をいう。
［バイセル］
本発明のバイセルは、pH6〜8の領域で分子全体が負に帯電しているリン脂質を５０質量％以上含む。一実施形態においては、バイセルの平面部分及びバイセルの屈曲部分（周縁部）いずれも当該リン脂質を含んでいる。
前記リン脂質のバイセル中の含有量は５０質量％以上であり、７０〜１００質量％であることが好ましく、９０〜１００質量％であることがより好ましく、９５〜１００質量％であることが更に好ましく、１００質量％であることが特に好ましい。
バイセル中に含まれるリン脂質は１種類であってもよいし複数種類であってもよい。
本発明のバイセルは、前記リン脂質を主成分とするものであり、調製が容易であり、希釈した場合等でもディスク状の構造体を維持することができる。また、本発明のバイセルは、Ｎａ+、Ｋ+、ＮＨ4+、Ｌｉ+、Ｍｇ2+、Ｃａ2+、テトラメチルアンモニウム（Ｍｅ4Ｎ+）、テトラエチルアンモニウム（Ｅｔ4Ｎ+）、テトラプロピルアンモニウム（Ｐｒ4Ｎ+）、テトラブチルアンモニウム（Ｂｕ4Ｎ+）、トリスヒドロキシメチルアミノメタンイオン（Ｔｒｉｓ）等の対イオンを有していてもよい。
【００１１】
pH6〜8の領域で分子全体が負に帯電しているリン脂質は、pH6〜8の領域で陰イオン性の親水基を有するアニオン性のリン脂質であり、例えば、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、及びホスファチジルイノシトール等が挙げられ、これらを１種単独で用いても２種以上を用いてもよい。また、該リン脂質は、バイセルに所望の機能性を付与するため置換基（蛍光ラベル化剤、がん細胞表面等に存在する標的分子に対して結合するリガンド分子、薬剤分子等）を有していてもよい。前記リン脂質として、例えば、下記一般式（１）で表される化合物又はその塩（以下、塩も含めて「一般式（１）で表される化合物」という場合がある）が挙げられる。
【００１２】
【化１】
2020138941.tif 000003
【００１３】
一般式（１）中、Ｒ1は互いに独立にアルキル基を示す。Ｒ1としては、炭素数１０〜２０の直鎖のアルキル基が好ましく、具体的には、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基及びエイコシル基等が挙げられる。これらのうち、室温でバイセルを調製する場合、Ｒ1としては、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基及びエイコシル基が好ましく、さらに入手のしやすさの面から、ペンタデシル基及びヘプタデシル基がより好ましい。
【００１４】
一般式（１）中、Ｒ2は下記式（２−１）〜（２−４）で表される基から選ばれるいずれかの基を示す。
【化２】
2020138941.tif 000004
【００１５】
上記一般式（１）において、水素原子は置換基により置換されていてもよい。置換基としては、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルコキシ基や、蛍光分子や薬剤分子を有する基等が挙げられる。
【００１６】
一般式（１）で表される化合物の具体例として、以下の化合物が挙げられる。
ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（DPPG；相転移温度４１℃）
ジステアロイルホスファチジルグリセロール（DSPG；相転移温度５５℃）
ジパルミトイルホスファチジルセリン（DPPS；相転移温度５４℃）
ジパルミトイルホスファチジン酸（DPPA；相転移温度６５℃）
【００１７】
一般式（１）で表される化合物には、上記例示した化合物のナトリウム塩、カリウム塩などの金属塩、及びアンモニウム塩などの有機塩も含まれる。
一般式（１）で表される化合物は、１種でも単独で用いても、異なる２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００１８】
本発明のバイセルは、前記リン脂質以外の化合物を含んでもよい。前記リン脂質以外の化合物としては、前記リン脂質以外のリン脂質、コレステロールといった疎水性分子等が挙げられるが、これらのバイセル中の含有量は０〜５０質量％であり、好ましくは０〜３０質量％であり、より好ましくは０〜１０質量％であり、更に好ましくは０〜５質量％である。
また、本発明のバイセルに機能性を付与するため、前記リン脂質以外の化合物には、蛍光ラベル化剤、リガンド、薬剤分子等を結合したものを用いてもよい。
【００１９】
本発明において、バイセルの大きさとは、ディスク状の平面部分の長径をいい、透過型電子顕微鏡観察で測定される値をいう。本発明のバイセルの大きさは調製条件によっても異なるが、通常10nm〜10μm程である。また、動的光散乱法によって測定した粒径（体積基準の頻度分布において累積頻度が５０％となる粒径）から、バイセルの大きさを測定することもできる。例えば、バイセル分散液に、超音波処理を施した場合、超音波処理時間が長いほどバイセルの大きさが小さくなることが動的光散乱法によって測定した粒径から把握される。
また、本発明において、バイセルの厚さは通常2〜6nm程である。
【００２０】
［バイセルの製造方法］
本発明のバイセルは、以下の工程１及び工程２を有する方法により製造することができる。
【００２１】
〈工程１〉
工程１では、pH6〜8の領域において分子全体が負に帯電しているリン脂質を、２質量％以上の濃度で、前記リン脂質の相転移温度未満の温度で、水系分散液に分散する。
【００２２】
前記リン脂質の、工程１の水系分散液における濃度は、２〜１０質量％であり、好ましくは３〜７質量％、より好ましくは５質量％である。本発明のバイセルが前記リン脂質以外の化合物を含む場合も、工程１における水系分散液における混合物の濃度は、前記の範囲とすることが好ましい。
【００２３】
工程１において水分散媒を調製する際の温度は、前記リン脂質の相転移温度未満の温度であり、好ましくは、室温である。
【００２４】
工程１における分散媒は、水系分散液であり、例えば、水（脱イオン水、蒸留水、純水等）及びpH6〜8に調整可能な、リン酸緩衝液、クエン酸リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、トリスＥＤＴＡ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等の各種緩衝液が挙げられる。
【００２５】
〈工程２〉
工程２では、工程１で調製した水系分散液を、前記リン脂質の相転移温度以上の温度に加熱する。前記リン脂質を２種以上用いる場合は、加熱温度を最も相転移温度が高い化合物の相転移温度以上とする。加熱する温度は、前記リン脂質の相転移温度より２℃以上３０℃以下の温度であることが好ましい。加熱する方法は、分散液全体が所望とする温度以上になる方法であれば特に限定されず、例えば、容器に入れた分散液を湯浴に浸漬して温める方法、電子レンジでマイクロ波を照射する方法などが挙げられる。加熱する時間は、加熱する方法にもよるが、１５分程度であることが好ましい。
【００２６】
工程２の後、必要に応じて以下の工程３を行なってもよい。
〈工程３〉
工程３では、工程２で加熱した水系分散液を、前記リン脂質の相転移温度未満の温度に冷却する。冷却する温度は、前記リン脂質の相転移温度より好ましくは２℃以下の温度、より好ましくは１５℃以下の温度である。冷却する方法は、分散液全体が所望とする温度以下になる方法であれば特に限定されず、例えば、容器に入れた分散液を室温で静置する、氷浴に浸漬する方法が挙げられる。冷却する時間は、冷却する方法にもよるが、１時間程度であることが好ましい。
【００２７】
必要に応じて、工程３の後得られるバイセルの分散液を分散媒で希釈してもよい。本発明のバイセルは、その分散液中での前記リン脂質の濃度が１０〜０.２質量％であり、この濃度に応じて分散液は構造色を示す。特に、前記リン脂質の濃度が0.5〜1.5質量％の濃度範囲において、ＵＶ領域（350nm）から可視光領域（650nm）まで、幅広い波長の構造色を調整することができる。
【００２８】
また、本発明のバイセルの分散液は、分散液の温度変化に応じて可逆的に異なる色を呈する。この温度変化により生じる構造色の変化は、バイセルの第一の構造と第二の構造とに起因するものである。第一の構造は前記リン脂質が平面的な集合構造（ゲル相）であり、第二の構造は前記リン脂質が波状の集合構造（リップル相）であり、バイセルがいずれの構造となるかは、前記リン脂質の相転移温度によって決まる。
【００２９】
［用途］
本発明のバイセルは、生体に対する有害性が懸念される界面活性剤を必要とせず、生体適合性に優れるリン脂質を主成分とするものであり、生体適合性に優れる。また、本発明のバイセルは、希釈条件や生体内環境でもディスク状の構造体を維持することができ、皮膚透過力にも優れる。したがって、本発明のバイセルはスキンケア材料をはじめとする各種化粧料や薬物送達システム用のキャリア材料に有用である。
【００３０】
特に前記リン脂質がホスファチジルグリセロールである（一般式（１）で表される化合物においてＲ2が式（２−２）である）場合、該化合物は極性基に親水性に優れるヒドロキシル基を２つ有する。このようなジオール構造を有する化合物（例えば、セラミドなど）は、保湿剤として利用されており、本発明のバイセルはそれ自身が高い保湿力を有し、かつ皮膚透過力が高い化粧料として期待される。化粧料は、本発明のバイセル及び目的に応じて添加される各種成分を含む組成物として使用できる。目的に応じて添加される各種成分として、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、粘度調整剤、香料、顔料、消毒剤、抗菌活性剤、医薬活性剤等が挙げられる。
【００３１】
また、本発明のバイセルは、その構造中に疎水性物質を内包できる。したがって、例えば、調製時に疎水性物質を内包させることで、キャリア材料として利用できる。本発明のバイセルは、皮膚透過力に優れ、皮膚表面（表皮）のみならず、真皮及び皮下組織にまで透過するため、経皮吸収用の薬物等のキャリアに有用である。また、目的部位に結合するリガンドを配合したバイセルを作成することで標的指向性を付与させることが可能になる。
【００３２】
本発明のバイセルは、分散液中の濃度や温度に応じて構造色が変化するため、フォトニック材料に有用である。外部環境の変化に応じて色が変わることを生かして、センサーとしての利用も期待される。また、標的に対するリガンドを配合したバイセルを作成することで標的を認識するセンサーへの応用が期待される。
【００３３】
本発明のバイセルは、磁場中で一方向に配向するため、NMR配向剤に有用である。
【実施例】
【００３４】
［試験例１］バイセル分散液の調製
下記の例に示す方法で、バイセル分散液を調製した。
【００３５】
［実施例１］ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)バイセル分散液の調製
図２にDPPGバイセルの調製手順を示す。まず、室温（25℃）でDPPGの粉末を容器に入れ、DPPGの粉末が5wt%となるように水を添加し、DPPGの水分散液を調製した。次に、このDPPGの水分散液を60℃で15間加熱した後、室温（25℃）へと冷却することで積層したDPPGバイセル同士を剥離させ、水中にDPPGバイセルが分散したDPPGバイセル分散液を得た。得られた5wt%のDPPG分散液は、必要に応じて希釈して、下記試験例に示す試験に供した。
【００３６】
［実施例２］ジステアロイルホスファチジルグリセロール(DSPG)バイセル分散液の調製
DPPGの代わりにDSPGを用いた以外は実施例１と同様にしてDSPGバイセル分散液を得た。
【００３７】
［実施例３］ジパルミトイルホスファチジルセリン(DPPS)バイセル分散液の調製
DPPGの代わりにDPPSを用いた以外は実施例１と同様にしてDPPSバイセル分散液を得た。
【００３８】
［実施例４］ジパルミトイルホスファチジン酸(DPPA)バイセル分散液の調製
DPPGの代わりにDPPAを用い、工程２の加熱時間を70℃とした以外は実施例１と同様にしてDPPAバイセル分散液を得た。
【００３９】
［比較例１］ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)分散液の調製
DPPGの代わりにDPPCを用いた以外は実施例１と同様の手順で分散液の調製を行なった。
【００４０】
［試験例２］31P NMRスペクトル測定によるバイセル形成の確認
実施例又は比較例で調製した各バイセル分散液（リン脂質濃度0.9wt%）の31P NMRスペクトルを室温で測定し、分散液中にバイセルが形成されていることの確認を行なった。31P NMRスペクトルの測定結果を図３に示す。実施例１〜４ではディスク状の形状を示す負のピークが観察されたのに対し、比較例１〜２では負のピークが観察されずバイセルが形成されていないことがわかった。
【００４１】
［試験例３］TEMによるバイセルの構造確認
実施例１のDPPGバイセルの水分散液（リン脂質濃度0.2wt%）のTEM画像を図４に示す。図４から、DPPGが大きさ50〜2000nmのディスク状の集合体を形成していることが確認できた。
【００４２】
［試験例４］バイセル分散液の希釈安定性及び塩耐性
DPPG濃度が0.5wt%、1.0wt%、2.0wt%及び5.0wt%のバイセル分散液に対して上記と同様に、31P NMRスペクトル測定によるバイセル形成の確認を行なった。結果を図５Ａに示す。
また、DPPG濃度2.0wt%のバイセル分散液に対して、10mM又は100mMとなるように食塩を添加し、塩存在下でのバイセル形成の確認を31P NMRスペクトル測定により行なった。結果を図５Ｂに示す。
図５Ａと図５Ｂとから、DPPG濃度が0.5wt%と薄くても、また食塩添加後でも、31P NMRスペクトルにおける負のピークが観察され、DPPG濃度が低濃度であっても、また塩存在下でもバイセル構造が形成されていることが確認できた。
【００４３】
［試験例５］SAXSによるバイセル形成の確認
実施例１のDPPGバイセル水分散液（リン脂質濃度0.5wt%）のSAXS解析の結果を図６に示す。強度の傾きがディスク状の構造が形成されている場合に特徴的な「-2」の傾きを示しており、DPPGバイセルが確かにディスク状の構造体を形成していることが確認できた。
【００４４】
［試験例６］超音波処理によるDPPGバイセルのサイズ制御
実施例１のDPPGバイセル水分散液（リン脂質濃度5wt%）を超音波処理した際のサイズ変化を示したDLSデータを図７に示す。超音波処理を行わなかった場合の流体力学半径は1000nm程であり、超音波処理を15分行なった場合の流体力学半径は200nm程であり、超音波処理を3時間行なった場合の流体力学半径は30nm程であった。したがって、超音波処理時間に応じてバイセルのサイズが小さくなることがわかった。
また、超音波処理を3時間行なった後に、上記試験例５と同様にSAXSによりバイセルの形成確認を行なったところ（図７Ｂ）、ディスク形状が維持されていることが確認できた。
【００４５】
［試験例７］パクリタキセル内包型DPPGバイセルの作成
実施例１のDPPG水分散液（リン脂質濃度5wt%）の調製において、蛍光ラベルされたパクリタキセルを0.0025wt%となるように添加し、通常のバイセル作製と同様に昇温・冷却操作を行うことでバイセルの形成と共にパクリタキセル内包を行った際の、DPPGバイセル分散液の写真を図８Ａに示す。また、このパクリタキセル内包DPPGバイセル分散液のSAXS解析の測定結果を図８Ｂに示す。水に不溶性のパクリタキセルがDPPG膜に取り込まれることによって、分散液は透明であった。また、SAXS解析において小さなq領域においてディスク状の形状に特徴的な「-2」の傾きが観察され、DPPGバイセルはパクリタキセル内包後もディスク状の形状を維持していることがわかった。
【００４６】
［試験例８］蛍光ラベルDPPGバイセルの経皮浸透試験
蛍光性NBDでラベルされたジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE-NBD)：DPPG＝3：97（質量比）となるようにバイセルを調製し、DPPGを97％含む蛍光ラベルされたバイセルの分散液（リン脂質濃度2.0wt%）を得た。このバイセル分散液に対して、試験例６と同様に超音波処理を行ない、DLS測定において200nmの粒径を有するバイセル分散液及び30nmの粒径を有するバイセル分散液をそれぞれ得た。
ヘアレスラットから摘出した皮膚をフランツセルにセットし、皮下投与実験を行なった。フランツセルに対する初期の投与は2wt%のバイセル分散液を使用した。皮下投与実験の概要を図９Ａに、皮膚組織からの透過量を図９Ｂにそれぞれ示す。サイズが小さい30nmのバイセルの場合だけでなく、サイズが大きい200nmのバイセルの場合でも24時間後に皮膚組織を透過したバイセルからの蛍光が観察できた。
また、過去に報告されている界面活性剤とリン脂質の二成分から構成されるバイセルを用いた例においては20wt%のバイセルを用いて皮下投与を行っても皮膚を透過するバイセルは観察されていない（非特許文献５）。
【００４７】
［試験例９］蛍光ラベルDPPGバイセルの皮膚組織の集積量測定
試験例８のバイセルのうち、DLS測定において200nmの粒径のバイセルを皮膚組織へ投与して24時間後の皮下における各々の組織中への集積量を図１０に示す。DPPGバイセルは、最表層から20μm以内の角質だけでなく、それよりも深部である表皮や真皮、さらには皮膚組織を透過するバイセルを確認できた。
【００４８】
［試験例１０］皮下透過試験における透過サンプルのSAXS解析
試験例８におけるDPPGバイセルの皮下浸透試験において、投与して24時間後の皮膚組織からの透過物をSAXS解析した結果を図１１に示す。ディスク状の構造体が形成されている場合に特徴的な「-2」の傾きを示しており、皮膚組織透過後もDPPGバイセルはディスク状の形状を維持していることがわかった。
【００４９】
［試験例１１］DPPGバイセル及びDMPGミセルの細胞毒性試験
実施例１のDPPGバイセル（リン脂質濃度0.01-1wt%）をがん細胞（Hep3B細胞）に投与して24時間後の細胞生存率をCell Counting Kitにより評価した。
比較として、常法により調製したジミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG)ミセル（リン脂質濃度0.01-1wt%）も同様にがん細胞（Hep3B細胞）に投与して24時間後の細胞生存率をCell Counting Kitにより評価した。結果を図１２に示す。
DPPGバイセルを使用した場合、0.1wt%の濃度で添加した場合においても大部分の細胞が生存しており、DPPGバイセルはDMPGミセルと比較して細胞毒性が低いことがわかった。
【００５０】
［試験例１２］DPPGバイセルの構造色
DPPGバイセル分散液をリン脂質濃度5.0wt%から希釈（2.0~0.7wt%）した際の25℃における分散液の吸収スペクトル及び目視による観察結果を図１３に示す。分散液中のDPPGの重量を変化させることでUV光から可視光まで幅広い波長の構造色の溶液を調製することができることがわかった。
【００５１】
［試験例１３］磁場配向したDPPGバイセルの構造色
2.0wt%から0.7wt%のDPPGバイセル分散液を9Tの回転磁場中で静置させた際の25℃における分散液の吸収スペクトル及び目視による観察結果を図１４に示す。回転磁場を印加する前と比較してスペクトルが鋭くなるとともに均一な構造色へと変化することがわかった。
【００５２】
［試験例１４］DPPGフォトニック構造体のSAXS解析
リン脂質濃度1.2wt%のバイセル分散液における2D SAXS解析の結果を図１５に示す。フォトニック構造体の繰り返し構造に由来する円状のピークが室温から37℃までの温度領域で観察されることがわかった。
【００５３】
［試験例１５］DPPG構造色の温度応答性
リン脂質濃度0.9wt%のDPPGバイセル分散液を35℃から37℃の間で繰り返し温度変化させた際の外観及び吸収スペクトルの変化を図１６に示す。わずか2℃の温度変化にも関わらず、波長が鋭敏に変化し、この変化が可逆的であることがわかった。
【００５４】
［試験例１６］DPPGバイセル内包型ゲルの外観
DPPGバイセルの分散液（リン脂質濃度0.9、1.1、1.2wt％）を、5wt%のアクリルアミドゲルに包埋した際のゲルの外観を図１７に示す。全ての濃度において、ハイドロゲルからDPPGフォトニック構造体から生ずる構造色を観察することができた。
【００５５】
［試験例１７］DPPGバイセル内包型ゲルにおける温度応答性
リン脂質濃度0.8wt%のバイセル分散液を、2wt%のアクリルアミドゲルに包埋した際におけるゲルの温度に依存した色変化の外観及びスペクトル変化を図１８に示す。DPPGバイセルによる構造色はハイドロゲル中においても鋭敏な色変化を起こしていることがわかった。
【００５６】
［試験例１８］DPPGバイセルのみのゲル化挙動
DPPGバイセルの5.0wt%水分散液における目視観察画像を図１９に示す。
1wt%のDPPG分散液に対して加熱・冷却操作を行うことで調製したDPPGベシクル（リン脂質濃度5.0wt%）は溶液状態なのに対し、DPPGバイセルの溶液は高分子ネットワークを導入することなくゲル化していることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明のバイセルは、生体に対する有害性が懸念される界面活性剤を必要とせず、生体適合性に優れるリン脂質を主成分とするものであり、また希釈条件や生体内環境でもディスク状の構造体を維持することができ、皮膚浸透力に優れるため、スキンケア材料や薬物送達システム用のキャリア材料として期待される。また、本発明のバイセルは、その分散液の濃度や温度に応じて異なる構造色を呈するため、フォトニック材料やセンサーとしても期待される。さらに、本発明のバイセルは、磁場配向性を有するため、ＮＭＲ配向剤としても期待される。
【符号の説明】
【００５８】
１  バイセルの平面部分
２  バイセルの屈曲部分
【図１】
2020138941.tif 000005
【図２】
2020138941.tif 000006
【図３】
2020138941.tif 000007
【図４】
2020138941.tif 000008
【図５】
2020138941.tif 000009
【図６】
2020138941.tif 000010
【図７】
2020138941.tif 000011
【図８】
2020138941.tif 000012
【図９】
2020138941.tif 000013
【図１０】
2020138941.tif 000014
【図１１】
2020138941.tif 000015
【図１２】
2020138941.tif 000016
【図１３】
2020138941.tif 000017
【図１４】
2020138941.tif 000018
【図１５】
2020138941.tif 000019
【図１６】
2020138941.tif 000020
【図１７】
2020138941.tif 000021
【図１８】
2020138941.tif 000022
【図１９】
2020138941.tif 000023