(57)【要約】【課題】  細胞表面抗原に特異的に結合する結合ポリペプチド（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を同定するための方法および組成物を提供すること。新規の治療上有用な細胞型特異的抗原またはエピトープの同定を可能にすること。【解決手段】  結合ポリペプチドの多様な核酸提示ライブラリーを、細胞の外部表面上に提示される細胞表面抗原と接触させて、このライブラリーから、細胞の外部表面上の細胞表面抗原に特異的に結合する少なくとも１つのライブラリーメンバーを単離する方法を提供する。また、本発明の方法において有用である新規の結合ポリペプチドを選別するために用いられ得る核酸提示ライブラリー（例えば、ＤＮＡ提示ライブラリー）を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表面抗原に特異的に結合する結合ポリペプチドを同定する方法であって、
ａ．外部表面上に細胞表面抗原を提示する第１の細胞型を結合ポリペプチドの多様な核酸提示ライブラリーと接触させること、および
ｂ．前記ライブラリーから、前記第１の細胞型の前記外部表面上の前記細胞表面抗原に特異的に結合する少なくとも１つのライブラリーメンバーを単離し、それによって、前記細胞表面抗原に特異的に結合する結合ポリペプチドを同定すること
を含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）の前に、前記結合ポリペプチドの多様な核酸提示ライブラリーを、前記外部表面上に前記細胞表面抗原を提示しない第２の細胞型と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞表面抗原に特異的に結合する結合ポリペプチドを同定する方法であって、
ａ．前記外部表面上に細胞表面抗原を提示する第１の細胞型を結合ポリペプチドの多様な核酸提示ライブラリーと接触させて、前記ライブラリーから前記第１の細胞型に特異的に結合する少なくとも１つのライブラリーメンバーを単離すること、
ｂ．前記外部表面上に前記細胞表面抗原を提示しない第２の細胞型を前記結合ポリペプチドの多様な核酸提示ライブラリーと接触させて、前記ライブラリーから前記第２の細胞型に特異的に結合する少なくとも１つのライブラリーメンバーを単離すること、および
ｃ．前記第１の細胞型に特異的に結合するが、前記第２の細胞型には結合しないライブラリーメンバーを選択し、それによって、前記細胞表面抗原に特異的に結合する結合ポリペプチドを同定すること
を含む、方法。
【請求項４】
ステップ（ａ）および（ｂ）が、前記ライブラリーの別個のアリコートを使用して、並行して行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
細胞表面抗原に特異的に結合する結合ポリペプチドを同定する方法であって、
ａ．結合ポリペプチド／抗原複合体の集団が形成されるように、その外部表面上に細胞表面抗原を提示する第１の細胞型を結合ポリペプチドの多様な核酸提示ライブラリーと接触させること、
ｂ．結合ポリペプチド／抗原複合体の前記集団が可溶化されるように、前記第１の細胞型を界面活性剤と接触させること、および
ｃ．結合ポリペプチド／抗原複合体の前記可溶化された集団を単離し、それによって、前記細胞表面抗原に特異的に結合する結合ポリペプチドを同定すること
を含む、方法。
【請求項６】
結合ポリペプチド／抗原複合体の前記可溶化された集団が、前記結合ポリペプチドの一部分に特異的な結合作用物質を使用して単離される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記界面活性剤が、前記抗原の立体構造を破壊しない、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
細胞表面抗原に特異的に結合する内部移行結合ポリペプチドを同定する方法であって、
ａ．内部移行化結合ポリペプチド／抗原複合体の集団が形成されるように、細胞表面抗原の内部移行を可能にする条件下で、その外部表面上に細胞表面抗原を提示する第１の細胞型を結合ポリペプチドの多様な核酸提示ライブラリーと接触させること、
ｂ．前記第１の細胞型を洗浄して、前記外部表面に結合されたライブラリーメンバーを除去すること、および
ｃ．前記内部移行化結合ポリペプチド／抗原複合体を単離し、それによって、前記細胞表面抗原に特異的に結合する内部移行結合ポリペプチドを同定すること
を含む、方法。
【請求項９】
ステップ（ｂ）において、洗浄工程が、約３未満のｐＨである溶液を使用して行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｃ）において、内部移行化結合ポリペプチド／抗原複合体が、界面活性剤抽出によって単離される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記内部移行化結合ポリペプチド／抗原複合体が、前記結合ポリペプチドまたは前記抗原の一部分に特異的な結合作用物質を使用して更に単離される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記内部移行化結合ポリペプチドが、前記結合ポリペプチドをコードする核酸の沈降により更に単離される、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
対照結合作用物質によって認識されるものとは異なるエピトープにて抗原に特異的に結合する結合ポリペプチドを同定する方法であって、
ａ．抗原および対照結合作用物質の複合体が形成されるような条件下で、前記抗原を対照結合作用物質と接触させること、
ｂ．前記抗原および対照結合作用物質の前記複合体を、少なくとも１つの結合ポリペプチド／抗原複合体が形成されるように、結合ポリペプチドの多様な核酸提示ライブラリーと接触させること、および
ｃ．前記ライブラリーから、前記抗原に特異的に結合する少なくとも１つのライブラリーメンバーを単離し、それによって、前記対照抗体によって認識されるものとは異なるエピトープにて前記抗原に特異的に結合する結合ポリペプチドを同定すること
を含む、方法。
【請求項１４】
前記抗原が、細胞の外部表面上に提示される細胞表面抗原である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記対照結合作用物質が抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
所望の活性化状態の細胞表面抗原に特異的に結合する結合ポリペプチドを同定する方法であって、
ａ．その外部表面上に前記細胞表面抗原を提示する第１の細胞型を、
ｉ．前記細胞表面抗原に特異的に結合し、前記細胞表面抗原の活性化状態を調節する結合作用物質、および
ｉｉ．結合ポリペプチドの多様な核酸提示ライブラリー
と接触させること、
ｂ．前記ライブラリーから、前記第１の細胞型の外部表面上の細胞表面抗原に特異的に結合する少なくとも１つのライブラリーメンバーを単離し、それによって、所望の活性化状態の細胞表面抗原に特異的に結合する結合ポリペプチドを同定すること
を含む、方法。
【請求項１７】
前記多様な核酸提示ライブラリーが、Ｖドメインライブラリーであり、前記ライブラリーの各メンバーが、第１の抗体由来のＦＲ１〜ＦＲ３領域配列および第２の抗体由来のＣＤＲ３−ＦＲ４領域配列を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＦＲ１〜ＦＲ３領域配列が、ヒトの天然免疫学的レパートリー由来である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＣＤＲ３−ＦＲ４領域配列が、ヒトの天然免疫学的レパートリー由来である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＶドメインがＶＨドメインである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記多様な核酸提示ライブラリーがＤＮＡ提示ライブラリーである、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＤＮＡ提示ライブラリーの各メンバーが、結合ポリペプチドをコードするＤＮＡコード配列に介在するＤＮＡリンカーを通して連結される前記結合ポリペプチドを含み、前記ＤＮＡリンカーが、制限エンドヌクレアーゼ部位を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記制限エンドヌクレアーゼ部位が、前記ＤＮＡ提示ライブラリーのメンバーのコード配列中に存在しない、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法が、前記単離されたライブラリーメンバーの前記ＤＮＡコード配列と前記連結された結合ポリペプチドとを物理的に分離することを更に含む、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記単離されたライブラリーメンバーの前記ＤＮＡコード配列と前記連結された結合ポリペプチドとが、制限酵素消化によって分離される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法が、無傷の単離されたライブラリーメンバーを前記第１または第２の細胞型から分離することを更に含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記単離されたライブラリーメンバーが、抗原のリガンドでの溶出によって、前記第１または第２の細胞型から分離される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記単離されたライブラリーメンバーが、細胞表面抗原の酵素的切断によって、前記第１または第２の細胞型から分離される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞表面抗原が、糖脂質アンカーによって前記細胞表面に結合し、前記単離されたライブラリーメンバーが、前記糖脂質アンカーのホスホリパーゼ切断によって、前記第１または第２の細胞型から分離される、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記方法が、前記単離されたライブラリーメンバーの少なくとも一部分のＤＮＡコード配列を決定することを更に含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＤＮＡコード配列が、パイロシーケンシングによって決定される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗原が、天然に存在するタンパク質、グリカン、または脂質である、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗原が、細胞表面タンパク質である、請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗原が、ＧＰＣＲまたはイオンチャネルタンパク質である、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗原が、ＧＣＧＲタンパク質、ＣＸＣＲ４タンパク質、またはＮａｖ１．７タンパク質である、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗原が、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカータンパク質である、請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗原が組換え抗原である、請求項１から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗原がキメラ抗原である、請求項１から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１の細胞型が、細胞表面抗原を天然に発現する細胞である、請求項１から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１の細胞型が、細胞表面抗原を異種発現するように操作された組換え細胞である、請求項１から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記第１の細胞型が、正常細胞の疾患関連変異体である、請求項１から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記第１の細胞型が腫瘍細胞である、請求項１から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記結合ポリペプチドが、抗体またはその断片である、請求項１から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記結合ポリペプチドが、抗体ＶＨまたはＶＬドメインである、請求項１から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
キメラＶドメインの多様な核酸提示ライブラリーであって、前記ライブラリーの各メンバーが、第１の抗体由来のＦＲ１〜ＦＲ３領域配列および第２の抗体由来のＣＤＲ３−ＦＲ４領域配列を含む、ライブラリー。
【請求項４６】
前記ＦＲ１〜ＦＲ３領域配列が、ヒトの天然免疫学的レパートリー由来である、請求項４５に記載のライブラリー。
【請求項４７】
前記ＣＤＲ３−ＦＲ４領域配列が、ヒトの天然免疫学的レパートリー由来である、請求項４５に記載のライブラリー。
【請求項４８】
前記ＶドメインがＶＨドメインである、請求項４５に記載のライブラリー。
【請求項４９】
前記ライブラリーが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、および１８からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを使用して作製される、請求項１から４８のいずれか一項に記載の方法またはライブラリー。
【請求項５０】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、および１８からなる群より選択される配列を有する、オリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１３年９月２３日出願の米国仮特許出願第６１／８８１，２０３号に基づく優先権の利益を主張し、その内容全体は、引用することにより本明細書中に包含される。
【背景技術】
【０００２】
結合ポリペプチド、例えば、抗体およびその断片は、治療薬および診断薬として商業上重要である。結合ポリペプチドを選別する従来の方法では概して、可溶性抗原が用いられる。しかし、ある特定の細胞表面抗原に関しては、これらの抗原が細胞膜から可溶化されるとき、抗原上の配座エピトープが変化し、結果として未変性（native）抗原を認識し得る結合ポリペプチドが生成されない。したがって、当技術分野において、抗原の未変性配座中で特異的に細胞表面抗原に結合し得る結合ポリペプチドを選別するための新規の方法が必要とされる。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合する結合ポリペプチド（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を識別するための方法および組成物を提供する。本発明の方法は概して、結合ポリペプチドの多様な核酸提示ライブラリーを、細胞の外部表面上に提示される細胞表面抗原と接触させることと、このライブラリーから、細胞の外部表面上の細胞表面抗原に特異的に結合する少なくとも１つのライブラリーメンバーを単離することを含む。本発明の方法および組成物は、標的細胞表面抗原の未変性形態に結合する結合ポリペプチド、ならびに新規のエピトープの特異性および機能特性（例えば、内部移行、受容体活性化作用、拮抗作用、またはアロステリック調節特性）を保持する結合ポリペプチドの迅速な識別を可能にするという点において特に有利である。これらの方法および組成物はまた、新規の、治療上有用な細胞型特異的抗原またはエピトープの識別を可能にする。さらに、新規の結合ポリペプチドを選別するために使用され得る新規のＶドメイン（例えば、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン）核酸提示ライブラリー（例えば、ＤＮＡ提示ライブラリー）も提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】図１は、本発明の典型的なＤＮＡ提示組成物および選別方法の概略図である。
【図２】図２は、本発明の典型的なＤＮＡ提示組成物および選別方法の概略図である。
【図３】図３は、本発明の方法で用いられる典型的な標的細胞選別戦略の概略図である。
【図４】図４は、本発明の方法で用いられる典型的な並行選択および大規模シーケンシング戦略の概略図である。
【図５】図５は、本発明の方法で用いられる典型的な並行選択および大規模シーケンシング戦略の概略図である。
【図６】図６は、本発明の方法で用いられる典型的な並行選択および大規模シーケンシング戦略の概略図である。
【図７】図７は、本発明の方法で用いられる典型的な並行選択戦略および大規模シーケンシング分析の結果の概略図である。
【図８】図８は、本発明の方法を使用して選択された高親和性ＶＨ分子のＦＡＣＳ性結合分析の結果を示すグラフを描写する。
【図９】図９は、本発明の方法を使用して選択されたＶＨ分子の差次的結合を示すグラフを描写する。
【図１０】図１０は、本発明の方法を使用して選択されたＶＨ分子の差次的結合を示すグラフを描写する。
【図１１】図１１は、本発明の方法で用いられる典型的な並行選別および大規模シーケンシング戦略の概略図であり、ここでは、特異的細胞表面タンパク質に結合し、それらを調節する抗体を濃縮するために、並行機能的選択的圧力での生細胞選択が繰り返し適用される。選択されたプールは、棒にタグ付けされ、大規模シーケンシングにかけられる。並行選択からの濃縮された配列の比較的生物情報学的分析は、主要な基準に適合する選択性および活性を保持する抗体の識別を可能にする。
【図１２】図１２は、抗グルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）ＶＨドメインを識別するための本明細書で開示される方法を使用した典型的な並行選別戦略の結果を描写する。生細胞ＧＣＧＲ（クラスＢのＧＰＣＲ）選択から濃縮されたプールは、（反時計回りに）競合的結合、ｃＡＭＰ、無標識接着性、細胞内部移行、およびβアレスチン分析を含む、結合および機能的分析にかけられた。多様な集合の活性調節抗ＧＣＧＲ  ＶＨドメインが単離され、複数の異なる仕組みの働きを通して別個の機能的活性を示した。
【図１３】図１３は、本明細書で開示される方法を使用して選択された抗ＧＣＧＲ  ＶＨドメインのｃＡＭＰおよびβアレスチン分析の結果を描写する。ＧＣＧＲを発現するＨＥＫ２９３細胞は、示されるＶＨドメインの存在または不在下で、１０ｎＭのグルカゴンを使って検証された。クローンＢ０７およびＢ０５は、ＧＣＧＲ誘発βアレスチン活性を阻害するが、受容体活性化ｃＡＭＰ生成にはほとんど影響がない。
【図１４】図１４は、本明細書で開示される方法を使用して選択された抗ＧＣＧＲ  ＶＨドメインのｃＡＭＰおよびグルコース放出分析の結果を描写する。初代ヒト肝細胞は、示されるＧＣＧＲ  ＶＨドメインの不在または存在下で、２ｎＭのグルカゴンで刺激を受けた。グルカゴン活性化ｃＡＭＰ生成およびグルコース放出は共に、ＶＨドメインによって阻害され、生体関連分析において、内因性受容体に対するこれらのクローンの機能的活性を示す。
【図１５】図１５は、多種多様であり、かつ機能的特徴を有する抗ＧＣＧＲ  ＶＨドメインを識別する、典型的な並行生細胞選択の概略図である。
【図１６】図１６は、本明細書で開示される方法を使用して選択された抗ＣＸＣＲ４  ＶＨドメインの結合、ｃＡＭＰ、および走化性分析の結果を描写する。ＣＸＣＲ４（クラスＡのケモカインＧＰＣＲ）に対する生細胞機能的選択は、内因発現されたＣＸＣＲ４を有するジャーカット細胞内で、ＣＸＣＲ４発現細胞への特異的結合、ＳＤＦ−ｌａ媒介ｃＡＭＰシグナル伝達の阻害、およびリガンド誘発走化性の阻害を示すＶＨドメインの多様な集合を生み出した。
【図１７】図１７は、ベラトリジンおよびサソリ毒によって刺激されるＮａｖｌ．７を発現するＨＥＫ２９３細胞のＢＩＮＤ無標識細胞性反応分析の結果を描写する。ＢＩＮＤは、光学バイオセンサの表面からの反射光のピーク波長値（ＰＷＶ）の変化を監視することによって実時間での無標識細胞反応測定を可能にする。組換えＮａｖ１．７／ＨＥＫ２９３細胞は、ベラトリジン（Ｖ）＋サソリ毒（ＳＶｑｑ）によって刺激を受けて、チャネルを活性化した。ＢＩＮＤは、刺激の後、１時間後にＰＷＶの低下を引き起こしたチャネル開放に対して、遅延の第２の反応を測定した。テトロドトキシン（ＴＴＸ）は、Ｎａｖ１．７チャネルを阻害し、マイナスへのＰＷＶの移行を親ＨＥＫ２９３細胞内で観察された反応に戻した。
【図１８】図１８は、ヒト疾患細胞に特異的に結合するＶＨドメインを識別する典型的な並行選別の概略図である。生細胞選択は、疾患患者細胞対正常なヒト細胞を含む区別可能な細胞性集団上で特異的に発現される標的またはエピトープを識別するために使用された。予測結合特殊プロファイルで濃縮されたＶＨドメインを識別するために、細胞型特異的選択戦略が適用され、大規模シーケンシングが使用された。高親和性（ｐＭ）結合体は単離され、これは、ＦＡＣＳによって測定されるように、疾患細胞特異的結合プロファイルを示した。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合する結合ポリペプチド（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を識別するための方法および組成物を提供する。本発明の方法は概して、結合ポリペプチドの多様な核酸提示ライブラリーを、細胞の外部表面上に提示される細胞表面抗原と接触させることと、このライブラリーから、細胞の外部表面上の細胞表面抗原に特異的に結合する少なくとも１つのライブラリーメンバーを単離することと、を含む。本発明の方法および組成物は、標的細胞表面抗原の未変性形態に結合する結合ポリペプチド、ならびに新規のエピトープの特殊性および機能特性（例えば、内部移行、受容体活性化作用、拮抗作用、またはアロステリック調節特性）を保持する結合ポリペプチドの迅速な識別を可能にするという点において特に有利である。これらの方法および組成物はまた、新規の、治療上有用な細胞型特異的抗原またはエピトープの識別を可能にする。さらに、新規の結合ポリペプチドを選別するために使用され得る新規のＶドメイン（例えば、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン）核酸提示ライブラリー（例えば、ＤＮＡ提示ライブラリー）も提供される。
【０００６】
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、用語「核酸提示ライブラリー」は、例えば、米国特許第７，１９５，８８０号、同第６，９５１，７２５号、同第７，０７８，１９７号、同第７，０２２，４７９号、同第６，５１８，０１８号、同第７，１２５，６６９号、同第６，８４６，６５５号、同第６，２８１，３４４号、同第６，２０７，４４６号、同第６，２１４，５５３号、同第６，２５８，５５８号、同第６，２６１，８０４号、同第６，４２９，３００号、同第６，４８９，１１６号、同第６，４３６，６６５号、同第６，５３７，７４９号、同第６，６０２，６８５号、同第６，６２３，９２６号、同第６，４１６，９５０号、同第６，６６０，４７３号、同第６，３１２，９２７号、同第５，９２２，５４５号、同第６，３４８，３１５号、国際公開ＷＯ２０１２１２５７３３、および国際公ＷＯ２０１０／０１１９４４号に記載されるものを限定されることなく含む、任意の当業者に認識されるインビトロ無細胞表現型−遺伝子型関連ディスプレイを指し、これらは全て、参照することによりそれらの全体が組み込まれる。
【０００７】
本明細書で使用される場合、用語「抗原」は、結合ポリペプチドによって認識される分子を指す。
【０００８】
本明細書で使用される場合、用語「に特異的に結合する」は、結合分子（例えば、ＶＨまたはＶＬドメイン）の、少なくとも約１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍ以上の親和性を有する抗原に結合する能力、および／または非特異的抗原に対して、抗原の少なくとも２倍の親和性を有する標的に結合する能力を指す。
【０００９】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、４本のポリペプチド鎖、ジスルフィド結合によって相互連結された２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子ならびにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨと省略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬと省略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼称されるより一定に保たれた領域にわたって点在される、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼称される超可変性の領域に更に細分され得る。
【００１０】
本明細書で使用される場合、用語、抗体の「抗原結合部分」には、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在する、酵素的に取得可能な、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質が含まれる。抗体の抗原結合断片は、例えば、抗体可変ドメインおよび選択的に抗体定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を伴う、タンパク質消化または組換え遺伝子工学技術などの任意の好適な標準技術を使用した完全な抗体分子由来であり得る。抗原結合部分の非限定的な例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ'）２断片、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片、（ｉｖ）Ｆｖ断片、（ｖ）単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂ断片、および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位が含まれる。二重特異性抗体（diabody）、三重特異性抗体（triabody）、四重特異性抗体（tetrabody）およびミニボディなどの他の操作された分子もまた、「抗原結合部分」の表現の範囲に包含される。
【００１１】
本明細書で使用される場合、用語「Ｖドメイン」は、ＶＨドメインまたはＶＬドメインを含む単一のポリペプチドを指し、このドメインは、上述のＶＨドメインまたはＶＬドメインとそれぞれ相補的ＶＬドメインまたはＶＨドメインとの共有結合的対合を促す定常領域配列を欠く。
【００１２】
本明細書で使用される場合、用語「ＶＨドメイン」および「ＶＬドメイン」は、単一の抗体可変重ドメインおよび軽ドメインを指し、それぞれが、ＦＲ（フレームワーク領域）１、２、３、および４、ならびにＣＤＲ（相補性決定領域）１、２、および３（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａを参照）を含む。
【００１３】
本明細書で使用される場合、用語「ＦＲ１〜ＦＲ３」は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、およびＦＲ３を包含するが、ＣＤＲ３およびＦＲ４領域を除外するＶＨの領域を指す。
【００１４】
本明細書で使用される場合、用語「ＣＤＲ３−ＦＲ４」は、ＣＤＲ３およびＦＲ４を包含するが、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、およびＦＲ３領域を除外するＶＨの領域を指す。
【００１５】
抗体可変ドメインについて本明細書で使用される場合、用語「キメラ」は、２つ以上の異なる抗体可変ドメインからのアミノ酸配列を含む抗体可変ドメイン、例えば、参照抗体からのＣＤＲ３配列および１つ以上の異なる抗体からのＦＲ１〜ＦＲ３配列を有する可変ドメインを指す。
【００１６】
ＩＩ．細胞表面抗原
特定の態様において、本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合する結合ポリペプチドを識別する方法を提供する。
【００１７】
細胞の表面上に提示されることが可能な、タンパク質、グリカン、および／または脂質抗原を限定されることなく含む抗原はいずれも、本発明の方法で用いられ得る。特定の実施形態において、抗原は、天然に存在する分子である。好適な、天然に存在する抗原の非限定的な例には、膜貫通型タンパク質（例えば、Ｇタンパク質共役受容体）およびＧＰＩアンカータンパク質が含まれる。特定の実施形態において、抗原は、天然に存在しない組換えまたは合成抗原である。好適な、天然に存在する抗原の非限定的な例には、異なる抗原分子からの部分を含むキメラ抗原が限定されることなく含まれる。特定の実施形態において、抗原の本質は、本発明の方法を予備策定する前から既知である。特定の実施形態において、抗原の同一性は、本発明の方法を実行する前に知られていない。
【００１８】
特定の実施形態において、抗原は、膜貫通型タンパク質である。特定の実施形態において、抗原は、多径間膜貫通型タンパク質（例えば、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）およびイオンチャネル）である。標的抗原の非限定的な例には、グルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、ＣＦＴＲ、ＣＩＣ−１、ＣＩＣ−２、ＣＩＣ−４、ＣＩＣ−５、ＣＩＣ−７、ＣＩＣ−Ｋａ、ＣＩＣ−Ｋｂ、ベストロフィン、ＴＭＥＭ１６Ａ、ＧＡＢＡ受容体、グリシン受容体、ＡＢＣ輸送体、ＮＡＶ１．１、ＮＡＶ１．２、ＮＡＶ１．３、ＮＡＶ１．４、ＮＡＶ１．５、ＮＡＶ１．６、ＮＡＶ１．７、ＮＡＶ１．８、ＮＡＶ１．９、スフィンゴシン−１−リン酸塩受容体（Ｓ１Ｐ１Ｒ）、およびＮＭＤＡチャネルが限定されることなく含まれる。特定の実施形態において、抗原は、ヒト抗原である。特定の実施形態において、抗原は、ＧＣＧＲ、ＣＸＣＲ４、またはＮＡＶ１．７（例えば、ヒトＧＣＧＲ、ＣＸＣＲ４、またはＮＡＶ１．７）である。
【００１９】
本発明の方法で用いられる細胞表面抗原は、いずれの細胞または細胞の類似粒子（例えば、脂質小胞）の上でも提示され得る。特定の実施形態において、細胞は、細胞表面抗原を自然発現する細胞型である。特定の実施形態において、細胞は、細胞表面抗原を異種発現するように操作された組換え細胞である。特定の実施形態において、細胞は、正常な細胞の疾患関連変異体（例えば、腫瘍細胞）である。
【００２０】
ＩＩＩ．結合ポリペプチド
特定の態様において、本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合する結合ポリペプチドを識別する方法を提供する。
【００２１】
結合ポリペプチドのいずれの型も、本発明の方法で用いられ得、それらには、抗体、またはその断片、および免疫グロブリンの類似ドメインが限定されることなく含まれる。好適な免疫グロブリンの類似ドメインには、フィブロネクチンドメイン（参照、例えば、Koide et al.(2007),Methods Mol. Biol. 352:95−109、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）、ＤＡＲＰｉｎ（参照、例えば、Stumpp et al.(2008)Drug Discov. Today 13(15−16):695−701、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）、タンパク質ＡのＺドメイン（参照、Nygren et al.(2008)FEBS J. 275(11):2668−76、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）、リポカリン（参照、例えば、Skerra et al.(2008)FEBS J.275(11):2677−83、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）、アフィリン（参照、例えば、Ebersbach et al.(2007)J.Mol. Biol. 372(1):172−85、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）、アフィチン（参照、例えば、Krehenbrink et al.(2008). J.Mol. Biol. 383(5):1058−68、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）、アビマー（参照、例えば、Silverman et al.(2005)Nat.Biotechnol. 23(12):1556−61、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）、フィノマー、（参照、例えば、Grabulovski et al.(2007)J Biol Chem 282(5):3196−3204、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）、およびクーニッツドメインペプチド（参照、例えば、Nixon et al.(2006)Curr Opin Drug Discov Devel 9(2):261−8、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）が限定されることなく含まれる。
【００２２】
特定の実施形態において、結合ポリペプチドは、抗体ＶＨまたはＶＬドメインである。
【００２３】
ＩＶ．核酸提示ライブラリー
特定の態様において、本発明の方法は、核酸提示ライブラリーを用いる。一態様において、本発明は、キメラＶドメイン（例えば、ＶＨまたはＶＬドメイン）の多様な核酸提示ライブラリーを提供し、ライブラリーの各メンバーが、第１の抗体からのＦＲ１〜ＦＲ３領域配列および第２の抗体からのＣＤＲ３−ＦＲ４領域配列を含む。典型的なライブラリーは、例えば、本明細書の実施例２で開示される。本明細書で開示されるライブラリーは、本明細書で開示されるいずれの方法で使用するのにも好適である。
【００２４】
本発明のライブラリーは、任意の源または種からのＶＨまたはＶＬドメイン配列を含み得る。特定の実施形態において、ＦＲ１〜ＦＲ３領域配列は、未処置のヒトの免疫学的レパートリーからのものである。特定の実施形態において、ＣＤＲ３−ＦＲ４領域配列は、未処置のヒトの免疫学的レパートリーからのものである。特定の実施形態において、Ｖドメインは、ＶＨドメイン（例えば、ヒトＶＨドメイン）である。
【００２５】
特定の実施形態において、ライブラリーは、ライブラリーの各メンバーが同じ抗原に結合するように、抗原への結合のために事前に選択される。特定の実施形態において、ライブラリーの各メンバーは、ＧＣＧＲ、ＣＸＣＲ４、またはＮＡＶ１．７（例えば、ヒトＧＣＧＲ、ＣＸＣＲ４、またはＮＡＶ１．７）に結合する。
【００２６】
特定の実施形態において、ライブラリーは、少なくとも１０２（例えば、少なくとも１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、または１０１５）個の固有のＶドメイン（例えば、ＶＨドメイン）を含む。
【００２７】
本発明のライブラリーは、任意の当業者に認識される方法を使用して作製され得る。特定の実施形態において、ライブラリーは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、および１８からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを使用して（例えば、ＰＣＲによって）生成される。
【００２８】
一態様において、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、および１８からなる群から選択される配列を有する１つ以上のオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡオリゴヌクレオチド）を提供する。
【００２９】
Ｖ．細胞表面提示方法
特定の態様において、本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合する結合ポリペプチドを識別する方法を提供する。本方法は概して、（ａ）結合ポリペプチドの多様な核酸提示ライブラリーを、第１の細胞型の外部表面上に提示される細胞表面抗原と接触させることと、（ｂ）このライブラリーから、第１の細胞型の外部表面上の細胞表面抗原に特異的に結合する少なくとも１つのライブラリーメンバーを単離することと、を含む。特定の実施形態において、抗原に特異的に結合しない結合ポリペプチドのライブラリーを事前に排除するために、ステップ（ａ）の前に、結合ポリペプチドの多様な核酸提示ライブラリーは、外部表面上に提示される抗原を提示しない第２の細胞型と接触させられる。
【００３０】
特定の態様において、本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合する結合ポリペプチドを識別する方法を提供する。本方法は、概して（ａ）結合ポリペプチドの多様な核酸提示ライブラリーを、細胞表面抗原を発現する第１の細胞型に接触させること、およびライブラリーから、第１の細胞型に特異的に結合する少なくとも１つのライブラリーメンバーを単離することと、（ｂ）結合ポリペプチドの多様な核酸提示ライブラリーを、細胞表面抗原を発現しない第２の細胞型に接触させること、およびライブラリーから、第２の細胞型に特異的に結合する少なくとも１つのライブラリーメンバーを単離することと、（ｃ）第１の細胞型に特異的に結合するが、第２の細胞型には結合しないライブラリーメンバーを選択することと、を含む。特定の実施形態において、ステップ（ａ）および（ｂ）は、両方の細胞型に対するＶＨ配列結合の頻度の大規模シーケンシング分析によって予測されるように、第１または第２の細胞型に対して選択的である結合体を識別するためにライブラリーの別個のアリコートを使用して並行して行われる。
【００３１】
第１および第２の細胞型は、同一または異なる種の密接にまたは離れて関連する細胞型であり得る。特定の実施形態において、第２の細胞型は、第１の細胞型と密接に関連する。例えば、第２の細胞型は、同一の種および同一の系列からの細胞であり得るが、第１の細胞型とは異なる成熟段階からのものであり得る。代替的に、第２の細胞型は、第１の細胞型と同質遺伝子的であり得、標的抗原の発現においてのみ異なる。特定の実施形態において、第２の細胞型は、第１の細胞型に対して同質遺伝子的であるが、第１の細胞型内で発現される標的抗原（例えば、異なる種からの同等の抗原）の相同分子種を発現する。このような密接に関連する細胞型を対抗選択として使用することは、関連する抗原相同分子種に対して交差反応することなく所望の標的に結合する結合ポリペプチド（例えば、Ｖドメイン）の選択を可能にする。代替的に、密接に関連する細胞型を共選択分析において使用することは、所望の標的に結合し、また関連する抗原相同分子種と交差反応もする結合ポリペプチド（例えば、Ｖドメイン）の選択を可能にする。この共選択手法は、ヒト標的抗原、およびマウスまたはサル相同分子種の全てに結合する結合ポリペプチド（例えば、Ｖドメイン）を生成する上で有用であり、このことにより動物研究用に代用結合ポリペプチド（例えば、Ｖドメイン）を生成する必要がなくなる。
【００３２】
本発明の方法で使用するための好適な核酸提示ライブラリーは、例えば、米国特許第７，１９５，８８０号、同第６，９５１，７２５号、同第７，０７８，１９７号、同第７，０２２，４７９号、同第６，５１８，０１８号、同第７，１２５，６６９号、同第６，８４６，６５５号、同第６，２８１，３４４号、同第６，２０７，４４６号、同第６，２１４，５５３号、同第６，２５８，５５８号、同第６，２６１，８０４号、同第６，４２９，３００号、同第６，４８９，１１６号、同第６，４３６，６６５号、同第６，５３７，７４９号、同第６，６０２，６８５号、同第６，６２３，９２６号、同第６，４１６，９５０号、同第６，６６０，４７３号、同第６，３１２，９２７号、同第５，９２２，５４５号、同第６，３４８，３１５号、国際公開ＷＯ２０１２１２５７３３、および国際公開ＷＯ２０１０／０１１９に記載され、これらの全てが、参照することによりそれらの全体が組み込まれる。特定の実施形態において、多様な核酸提示ライブラリーは、ＤＮＡ提示ライブラリーである。特定の実施形態において、核酸提示ライブラリーは、本明細書、または国際公開ＷＯ２０１２１２５７３３および／もしくは国際公開ＷＯ２０１０／０１１９４４中に記載されるＤＮＡ提示ライブラリーであり、これらは共に、参照することによりそれらの全体が組み込まれる。
【００３３】
特定の実施形態において、ＤＮＡ提示ライブラリーの各メンバーは、介在するＤＮＡリンカーを通して、結合ポリペプチドをコードするＤＮＡコード配列に連結された結合ポリペプチドを含み、このＤＮＡリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ部位（例えば、図１を参照）を含む。任意の制限エンドヌクレアーゼ部位が、用いられ得る。１つの具体的な実施形態において、制限エンドヌクレアーゼ部位は、ＤＮＡ提示ライブラリーのメンバーのＤＮＡコード配列中に存在せず、つまりは、ライブラリーメンバーの制限エンドヌクレアーゼ消化においてＤＮＡコード配列の切断を回避する。１つの具体的な実施形態において、制限エンドヌクレアーゼ部位は、ＮｏｔＩ部位である。
【００３４】
特定の実施形態において、連結された結合ポリペプチドからの単離されたライブラリーメンバーのＤＮＡコード配列を物理的に分離することが望ましい。任意の物理的分離方法が、用いられ得る。単離されたライブラリーメンバーが、制限エンドヌクレアーゼ部位を含むＤＮＡリンカーを含む場合（例えば、図１を参照）、物理的分離は、単離されたライブラリーメンバーの制限エンドヌクレアーゼ消化によって達成され得る。得られた遊離ＤＮＡコード配列は、細胞／結合ポリペプチド複合体から、任意の当技術分野で認識される方法、例えば、遠心分離法によって更に分離され得る。
【００３５】
特定の実施形態において、無傷の単離されたライブラリーメンバーを第１および／または第２の細胞型から物理的に分離することが望ましい。任意の物理的分離方法が、用いられ得る。特定の実施形態において、単離されたライブラリーメンバーは、標的抗原のリガンド（例えば、天然リガンド）での溶出によって、第１または第２の細胞型から分離される。特定の実施形態において、単離されたライブラリーメンバーは、細胞表面抗原の酵素的切断によって第１または第２の細胞型から分離される。任意の、抗原の酵素的切断方法、例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、および／またはグリコシダーゼ酵素的切断が用いられ得る。特定の実施形態において、細胞表面抗原が、糖脂質アンカーによって細胞表面に結合する場合、単離されたライブラリーメンバーは、糖脂質アンカーのホスホリパーゼ切断によって第１または第２の細胞型から分離される。得られた遊離ライブラリーメンバーは、第１または第２の細胞型から、任意の当業者に認識される方法、例えば、遠心分離法によって更に分離され得る。
【００３６】
第１および／または第２の細胞型に特異的に結合するライブラリーメンバーが単離されると、これらの分子のＤＮＡコード配列が決定され得る。したがって、特定の実施形態において、本発明の方法は、単離されたライブラリーメンバーの少なくとも一部分のＤＮＡコード配列を決定するステップを更に含む。任意の当業者に認識されるＤＮＡ配列の決定手段が、用いられ得る。１つの具体的な実施形態において、ＤＮＡコード配列は、単一分子、大規模シーケンシング技術（例えば、パイロシーケンシング）によって決定される。単一分子、大規模シーケンシング技術は、当技術分野において周知である（例えば、米国第６，２１０，８９１号に記載されるものを参照されたく、参照することによりその全体が組み込まれる）。特定の実施形態において、結合ポリペプチドが抗体またはその抗原結合断片である場合、ＣＤＲ３領域のＤＮＡコード配列が決定される。特定の実施形態において、第１および第２の細胞型に結合するライブラリーメンバーのＤＮＡコード配列が決定される。第１の細胞型に特異的に結合するが、第２の細胞型に結合しないライブラリーメンバーは、第１の細胞型に特異な抗原に特異的に結合する結合ポリペプチドを含むと考えられる。
【００３７】
細胞表面抗原に特異的に結合する結合ポリペプチドが識別されると、それは、インビトロ（例えば、細胞発現系または無細胞発現系において）またはインビボ（例えば、遺伝子導入動物）において、異種発現され得る。したがって、特定の実施形態において、本発明の方法は、インビトロ（例えば、細胞発現系または無細胞発現系において）またはインビボ（例えば、遺伝子導入動物）において、識別された結合ポリペプチドを異種発現するステップを含む。
【００３８】
特定の実施形態において、抗原の本質は、本発明の方法を予備策定する前から既知である。しかし、抗原の本質を知る必要はない。実際に、特定の実施形態において、抗原の本質は、本発明の方法を予備策定する前は不明である。つまりは、後者の場合、本発明の方法は、目的の細胞型（例えば、腫瘍細胞）の表面に存在する新規の抗原およびエピトープの識別を可能にする。
【００３９】
特定の実施形態において、本明細書で開示される方法は、細胞表面抗原への結合に際して機能的内部移行が可能である結合ポリペプチドの選択を含む。このような結合ポリペプチドは、標的細胞の内部に細胞障害性薬物を送達することが可能なため、薬物共役の生成において特に有用である。機能的内部移行のためのいずれの選択方法論が用いられてもよい。例えば、結合ポリペプチドの多様な核酸提示ライブラリーは、結合ポリペプチド内部移行を可能にする条件下（例えば、３７℃で約１〜２時間）で標的細胞と接触させることができ。次に、この細胞を、プロテアーゼ阻害物質の存在下で、細胞溶解緩衝液で洗浄および溶解することができる。次に、内部移行化ライブラリーメンバーをエタノール沈降させ、ＤＮＡコード配列をＰＣＲ増幅によって濃縮することができる。
【００４０】
本明細書で開示される方法は、任意の標的エピトープ発見手順に適用され得る。例えば、標的エピトープには、炎症に関するホーミングドメイン；治療に対する抵抗を有するまたは有さない原発腫瘍からの腫瘍特異的標的エピトープ、腫瘍細胞株、およびネオエピトープをもたらし得る任意の突然変異を抱える腫瘍；ならびに疾患特異的機能障害を媒介し、生物学的療法の標的になり得る他の疾患特異的エピトープが含まれ得る。
【００４１】
ＶＩ．抗原可溶化
特定の態様において、本発明の方法は、抗原の未変性配座を維持し得、結合ポリペプチド（例えば、ＶＨまたはＶＬドメイン）および抗原の複合体の回収を可能にし得る界面活性剤を使用する細胞からの抗原（例えば、細胞表面抗原、例えば、ＧＰＣＲ）の可溶化を伴う。これらの方法は、細胞表面抗原（例えば、ＧＰＣＲ）の未変性立体構造に結合する結合ポリペプチド（例えば、ＶＨドメイン）を選択する上で特に有用である。
【００４２】
一態様において、本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合する結合ポリペプチド（例えば、ＶＨまたはＶＬドメイン）を識別する方法を提供する。本方法は概して、結合ポリペプチド／抗原複合体の集団が形成されるように、外部表面上に細胞表面抗原を提示する第１の細胞型を結合ポリペプチドの多様な核酸提示ライブラリーと接触させることと、結合ポリペプチド／抗原複合体の集団が可溶化されるように、第１の細胞型を界面活性剤と接触させることと、可溶化された結合ポリペプチド／抗原複合体の集団を単離することと、を含む。
【００４３】
特定の実施形態において、結合ポリペプチド／抗原複合体の可溶化された集団は、結合ポリペプチドの一部分に特異的な結合作用物質を使用して単離される。未変性ポリペプチドに結合する任意の結合作用物質が、本方法において使用され得る。好適な結合作用物質には、ポリペプチド（または、ポリペプチドに遺伝子融合されるエピトープタグ）に特異的な抗体が限定されることなく含まれる。
【００４４】
特定の実施形態において、特異的活性化状態に特異的な結合作用物質は、結合ポリペプチド／抗原複合体の集団を単離するために使用され得る。好適な結合作用物質には、抗原（例えば、リン光体特異的抗体）の化学的に修正された（例えば、リン酸化された）変異体に特異的な抗体が限定されることなく含まれる。
【００４５】
特定の実施形態において、特異的活性化状態中に抗原に付随するアクセサリー分子（例えば、サイトゾルシグナル伝達分子または共受容体）に特異的な結合作用物質は、結合ポリペプチド／抗原複合体の集団を単離するために使用され得る。
【００４６】
細胞膜から抗原を抽出し得、抗原の未変性配座を維持し得る任意の界面活性剤は、本発明の方法で用いられ得る。好適な界面活性剤には、ｎ−ドデシル−β−ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）および３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）が限定されることなく含まれる。特定の実施形態において、抗原または結合ポリペプチド／抗原複合体の集団は、ＤＤＭおよびＣＨＡＰＳの混合物を使用して可溶化される。
【００４７】
当技術分野において既知である任意の細胞表面抗原（本明細書で開示されるものを含む）は、本方法を使用して単離され得る。当技術分野において既知である任意の細胞型（本明細書で開示されるものを含む）は、本方法で用いられ得る。当技術分野において既知である任意の核酸提示ライブラリー（本明細書で開示されるものを含む）は、本方法で用いられ得る。当技術分野において既知である任意の結合ポリペプチドまたは小分子（本明細書で開示されるものを含む）は、本方法の細胞表面抗原への結合のために選別され得る。
【００４８】
ＶＩＩ．内部移行
特定の態様において、本発明の方法は、所望の細胞表面抗原に特異的に結合し、抗原と共に内部移行化される結合ポリペプチドの選択を伴う。このような方法は、細胞中にペイロード（例えば、ケモトシキン）を送達し得る結合ポリペプチドを生成する上で特に有用である。
【００４９】
一態様において、本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合する内部移行結合ポリペプチド（例えば、ＶＨまたはＶＬドメイン）を識別する方法を提供する。本方法は概して、細胞表面抗原の内部移行を可能にし、かつ内部移行化結合ポリペプチド／抗原複合体の集団が形成されるような条件下で、外部表面上に細胞表面抗原を提示する第１の細胞型を、結合ポリペプチドの多様な核酸提示ライブラリーと接触させることと、第１の細胞型を洗浄して、外部表面に結合されたライブラリーメンバーを除去することと、内部移行化結合ポリペプチド／抗原複合体を単離することと、を含む。
【００５０】
特定の実施形態において、内部移行化結合ポリペプチド／抗原複合体は、界面活性剤抽出によって単離される。細胞膜から抗原を抽出し得、抗原の未変性配座を維持し得る任意の界面活性剤は、本発明の方法で用いられ得る。好適な界面活性剤には、ｎ−ドデシル−β−ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）および３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）が限定されることなく含まれる。特定の実施形態において、抗原または結合ポリペプチド／抗原複合体の集団は、ＤＤＭおよびＣＨＡＰＳの混合物を使用して可溶化される。
【００５１】
特定の実施形態において、内部移行化結合ポリペプチド／抗原複合体は、結合ポリペプチドの一部分に特異的な結合作用物質を使用して更に単離される。好適な結合作用物質には、抗原の化学的に修飾された（例えば、リン酸化された）変異体に特異的な抗体（例えば、リン酸化特異的抗体）が限定されることなく含まれる。特定の実施形態において、特異的活性化状態において抗原に付随するアクセサリー分子（例えば、サイトゾルのシグナル伝達分子または共受容体）に特異的な結合作用物質は、結合ポリペプチド／抗原複合体の集団を単離するために使用され得る。
【００５２】
特定の実施形態において、内部移行化結合ポリペプチドが、結合ポリペプチドをコードする核酸の沈降により（例えば、エタノール沈降によって）更に単離される。
【００５３】
第１の細胞型の外部表面に結合されたライブラリーメンバーは、任意の好適な洗浄緩衝液を使用して除去され得る。特定の実施形態において、第１の細胞型の外部表面に結合されたライブラリーメンバーは、低ｐＨ溶液（例えば、ｐＨが約５未満、例えば、約ｐＨ４未満、約ｐＨ３未満、または約ｐＨ２未満の溶液）で洗浄することによって除去され得る。好適な低ｐＨ溶液には、ｐＨ３未満のＨＣｌまたはグリシンが含まれる。特定の実施形態において、低ｐＨ溶液は、約ｐＨ２．７の０．１ＭのＨＣｌである。
【００５４】
特定の実施形態において、複数段階選別される場合、内部移行化結合ポリペプチドは、最初の複数回の選別において、結合ポリペプチドをコードする核酸の沈降によって（例えば、エタノール沈降によって）単離され、１以上の（さらに厳しい）後の選別において、結合ポリペプチドの一部分に特異的な結合作用物質を使用して単離される。
【００５５】
当技術分野において既知である任意の細胞表面抗原（本明細書で開示されるものを含む）は、本方法を使用して単離され得る。当技術分野において既知である任意の細胞型（本明細書で開示されるものを含む）は、本方法で用いられ得る。当技術分野において既知である任意の核酸提示ライブラリー（本明細書で開示されるものを含む）は、本方法で用いられ得る。当技術分野において既知である任意の結合ポリペプチドまたは小分子（本明細書で開示されるものを含む）は、本方法の未変性細胞表面抗原への結合のために選別され得る。
【００５６】
ＶＩＩＩ．抗原誘導
特定の態様において、本発明の方法は、対照結合作用物質（例えば、抗体）によって認識されるものとは異なるエピトープにて抗原に特異的に結合する結合ポリペプチドの選択を伴う。このような方法は、新規の機能特性を有する結合ポリペプチドを生成する上で特に有用である。
【００５７】
一態様において、本発明は、対照結合作用物質（例えば、抗体）によって認識されるものとは異なるエピトープにて抗原に特異的に結合する結合ポリペプチド（例えば、ＶＨまたはＶＬドメイン）を識別する方法を提供する。本方法は概して、抗原および対照結合作用物質（例えば、抗体）の複合体が形成されるような条件下で、抗原を対照結合作用物質と接触させることと、少なくとも１つの結合ポリペプチド／抗原複合体が形成されるように、抗原および参照抗体の複合体を結合ポリペプチドの多様な核酸提示ライブラリーと接触させることと、ライブラリーから、抗原に特異的に結合する少なくとも１つのライブラリーメンバーを単離することと、を含む。
【００５８】
当技術分野において既知である任意の細胞表面抗原（本明細書で開示されるものを含む）は、本方法を使用して単離され得る。当技術分野において既知である任意の細胞型（本明細書で開示されるものを含む）は、本方法で用いられ得る。当技術分野において既知である任意の核酸提示ライブラリー（本明細書で開示されるものを含む）は、本方法で用いられ得る。当技術分野において既知である任意の結合ポリペプチドまたは小分子（本明細書で開示されるものを含む）は、本方法の未変性細胞表面抗原への結合のために選別され得る。
【００５９】
特定の実施形態において、抗原は、細胞の外部表面上に提示される細胞表面抗原（例えば、ＧＰＣＲなどの細胞表面受容体）である。特定の実施形態において、抗原は、ＧＣＧＲ、ＣＸＣＲ４、またはＮＡＶ１．７（例えば、ヒトＧＣＧＲ、ＣＸＣＲ４、またはＮＡＶ１．７）である。
【００６０】
ＩＸ．抗原活性化状態への偏向
特定の態様において、本発明の方法は、所望の活性化状態の抗原（例えば、細胞表面抗原）に特異的に結合する結合ポリペプチドの選択を伴う。このような方法は、標的抗原をアロステリック調節する（例えば、阻害する）結合ポリペプチドを生成する上で特に有用である。
【００６１】
一態様において、本発明は、所望の活性化状態の細胞表面抗原に特異的に結合する内部移行結合ポリペプチド（例えば、ＶＨまたはＶＬドメイン）を識別する方法を提供する。本方法は概して、外部表面上に細胞表面抗原を提示する第１の細胞型を、ｉ）細胞表面抗原に特異的に結合し、細胞表面抗原の活性化状態を調節する結合作用物質、およびｉｉ）結合ポリペプチドの多様な核酸提示ライブラリーと接触させることと、ライブラリーから、第１の細胞型の外部表面上の細胞表面抗原に特異的に結合する少なくとも１つのライブラリーメンバーを単離することと、を含む。
【００６２】
受容体刺激薬、拮抗薬、部分的受容体刺激薬などを含む、抗原の任意の調節物質が、本発明の方法で用いられ得る。特定の実施形態において、調節物質は、抗原の天然リガンドである。特定の実施形態において、調節物質は、抗原を不活性配座に組み付ける。
【００６３】
当技術分野において既知である任意の細胞表面抗原（本明細書で開示されるものを含む）は、本方法を使用して単離され得る。当技術分野において既知である任意の細胞型（本明細書で開示されるものを含む）は、本方法で用いられ得る。当技術分野において既知である任意の核酸提示ライブラリー（本明細書で開示されるものを含む）は、本方法で用いられ得る。当技術分野において既知である任意の結合ポリペプチドまたは小分子（本明細書で開示されるものを含む）は、本方法の未変性細胞表面抗原への結合のために選別され得る。
【００６４】
Ｘ．抗体形式
本発明の方法で用いられるＶＨおよび／またはＶＬドメインは、単離する上で使用され得るか、または追加のアミノ酸（例えば、エピトープタグ）および／またはドメインに融合され得る。特定の実施形態において、ライブラリー中の少なくとも１つのＶＨドメインは、少なくとも１つのＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはそれらの組み合わせに融合される。具体的な実施形態において、ライブラリー中の少なくとも１つのＶＨドメインは、少なくとも１つのＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む、少なくとも１つの重鎖定常領域に融合される。特定の実施形態において、ライブラリー中の少なくとも１つのＶＨドメインは、少なくとも１つの軽鎖定常領域に融合される。
【００６５】
本明細書で開示される方法を使用して識別されるＶＨまたはＶＬドメインはまた、例えば、国際公開第ＷＯ２０１２１２５７３３号に記載の方法（参照することによりその全体が組み込まれる）を使用して、相補的ＶＨ／ＶＬの対を選択するために更なる選別方法にかけられ得る。
【００６６】
本発明の方法を使用して選択されたＶＨもしくはＶＬドメイン、および／またはＶＨ／ＶＬの対は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、および／または完全なる四量体抗体を限定することなく含む別の抗体形式に組み込まれ得る。
【実施例】
【００６７】
ＸＩ．実験例証
実施例１：生細胞選択および大規模シーケンシング分析を組み込んだ、ヒトＶＨライブラリーおよびｄｓＤＮＡ提示テクノロジーを使用した標的細胞特異的エピトープの識別。
Ａ．概要
ヒト供与体の骨髄、末梢血、および脾細胞から取得された完全なヒト抗体ＶＨライブラリーが作出され、ｄｓＤＮＡ提示テクノロジーを使用して、多数の高親和性結合体および複数の標的に対する特異的ＶＨ結合体を識別した。標的細胞特異的エピトープを、ヒトＶＨライブラリーおよびｄｓＤＮＡ提示テクノロジーを使用する生細胞選択および大規模シーケンシング分析によって識別した。並行、差次的選択、および標的細胞選択的選択の戦略を、これらの方法（図４、５、６を参照）において適用した。全ての段階に及ぶ全てのプールの大規模シーケンシングからのＣＤＲ３頻度の集計は、ＶＨクローンの選択性を予測した。高親和性ＶＨを標的細胞および関連細胞型に選択的に結合すると識別した。
【００６８】
Ｂ．生細胞エピトープ発見のためのライブラリー操作および選択方法
生細胞に結合されたライブラリーメンバーを効果的に回収するために、２つの方法が生み出された。
【００６９】
第１の方法は、結合された抗体に融合されたＤＮＡの制限酵素消化によって、結合体を生細胞から剥離することを伴った。本方法は、細胞上の全てのエピトープに結合されたＶＨの完全な回収を可能にする。ＶＨ  ＤＮＡライブラリーのＣ末端は、操作されて、ＮｏｔＩ制限部位を保因した（図１を参照）。未処置のＶＨフレームワークにおいてＮｏｔＩ部位は無く、よって、完全長のＶＨ結合体だけが後続の増幅のために細胞から溶出される。生細胞上で、ＮｏｔＩ制限酵素消化緩衝液を試験し、３７℃での最大２時間の培養を以って、細胞は生存可能であった。ＮｏｔＩ消化の効率は高かった。４℃で１時間、ライブラリーが細胞へ結合した後、３７℃で１時間、ＮｏｔＩ緩衝液で細胞を洗浄および消化し、次に、細胞を遠心沈降して、ＰＣＲ増幅用に（結合化ＶＨ  ＤＮＡを含有する）上澄部を集めた（図１を参照）。
【００７０】
第２の方法は、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）消化を使用してＶＨ結合体を生細胞から取り出すことである。本方法は、任意のＧＰＩアンカー膜タンパク質のエピトープに結合したＶＨ（つまり、エピトープの部分集合）の溶出を可能にする。ＰＬＣクリップ効率は、対照分子を用いるＦＡＣＳ上で確証されるように高い。４℃で１時間、ライブラリーの細胞との培養の後、この細胞を洗浄し、３７℃で１５分間ＰＬＣと培養した。続いて、細胞を遠心沈降し、ＧＰＩアンカー膜タンパク質の細胞外ドメインと複合体化された融合ＶＨを含有する上澄部をＰＣＲ増幅した（図２を参照）。
【００７１】
Ｃ．標的および関連した／所望されない細胞型上の並行選択、差次的選択、および標的細胞選択的選択
国際公開ＷＯ２０１０／０１１９４４に記載されるプロトコル（参照することによりその全体が組み込まれる）に従って、主な未処置の融合ライブラリーを生成した。第１段階の選択で、全ての選択分岐に対して同一の多様性を保因する複数のライブラリー中に、精製された融合ライブラリーを平等に分割した（図５を参照）。
【００７２】
正常な供与体または患者から取得された初代細胞を、標準細胞生物学プロトコルに従って、新たに解凍したか、または細胞培養フラスコから単離した。次に、細胞を３７℃で満杯の媒体中で１時間回収し、続いて氷上で３０分間、選択緩衝液中でブロッキングした。抗体および標的内部移行を妨げるために、全ての選択を氷上で実行した。
【００７３】
並行選択に関して、ライブラリーを２００ｕｌの事前にブロックされたストレプトアビジンビーズおよび２００ｕｌの事前にブロックされたｈＩｇＧエポキシビーズで、室温で３０分間事前に排除して、一切の異常な折り畳み構造のライブラリーメンバーおよび粘着性のライブラリーメンバーを順番に除去した。次いで、事前に排除されたライブラリーを氷上で冷却し、事前にブロックされた細胞にかけて、氷上で１時間培養した。
【００７４】
標的細胞選択的選択に関して、所望されない細胞型および密接に関連する細胞型について、氷上で１時間事前排除を行い、一切の非選択的結合体を除去して、次に標的細胞にかけた。
【００７５】
選択４段階において、標的細胞上の選択分岐に差次的選択方法を適用した（細胞の事前排除の有無を伴う）。この段階では、ライブラリーを複数の管に分割し、各細胞型および異なる疾患段階の患者の細胞に並行して結合した。この戦略は、大規模シーケンシング分析および疾患の進行に伴って上昇した異なるエピトープを認識する結合体の識別によって、標的細胞対他の細胞型の直接的な比較を可能にした（図６を参照）。
【００７６】
全ての選択分岐に関して、結合後、上述されるように１０ｍＬの結合緩衝液で細胞を洗浄し、膜タンパク質に対する全ての結合体を回収するようにＮｏｔＩ制限酵素消化、またはＧＰＩアンカー膜タンパク質に対する結合体を回収するようにＰＬＣクリップのどちらか一方にかけた。
【００７７】
Ｄ．標的細胞に対して選択的な結合体を予測するための大規模シーケンシング分析
各段階の選択の後、結合プールをＰＣＲ増幅した。各結合プールのＨＣＤＲ３を、ＶＨ断片のフレームワーク３のＣ末端およびＶＨ断片のフレームワーク４のＮ末端をプライミングするオリゴを用いたＰＣＲによって引き上げた。次に、これらの個別の選択段階および選択分岐から引き出されたＨＣＤＲ３断片に、ＰＣＲによってイルミナシーケンシングのために使用された特異的ＤＮＡバーコードをタグ付けした。タグ付けされたＨＣＤＲ３を集めて、Ｈｉ  Ｓｅｑテクノロジーでの高性能シーケンシングに送った。標的細胞からの段階４の結合プールもまたＤＮＡバーコードをタグ付けされ、完全長のＶＨ配列を得るために、４５４シーケンシングに提出した。
【００７８】
シーケンシング後、ＤＮＡバーコードに基づいてこの配列を解いた。各選択段階および選択分岐（selection branch）から引き出された何百万もの配列は、異なる段階および異なる選択分岐で存在する特定のＣＤＲ３配列の頻度を比較することによって集計された。選択的結合体の識別のために使用された基準は、１）対照または密接に関連する細胞型ではなく標的細胞の先の段階から後の段階へのＣＤＲ３配列の特異的濃縮、２）差次的選択段階での、標的特異的細胞型においてはより高く、対照または密接に関連する細胞型においては低い頻度（図７を参照）、および３）他の標的またはデータベースのほかのプログラムからの細胞選択中には存在しない配列、であった。次に、イルミナシーケンシングによって識別された選択的クローンを、４５４完全長配列情報に基づいて合成した。
【００７９】
Ｅ．生成、精製、およびＦＡＣＳ結合分析
次に、結合プールおよび合成ＶＨをｐＥＴ２２ｂ発現ベクターにサブクローンした。ＶＨをＢＬ−２１大腸菌細胞中で生成し、標準プロトコルを使用してＣ末端Ｈｉｓタグを通して精製した。異なる細胞型および結合体のＥＣ５０に対するＶＨの結合および選択性を査定するためにＦＡＣＳ分析を行った。生細胞選択方法によって、高親和性および選択的ＶＨ結合体を識別した（図８、９、および１０を参照）。
【００８０】
実施例２：増進された多様性ＶＨライブラリーの作出
存在するＶＨ未処置のライブラリー（例えば、国際公開ＷＯ２０１０／０１１９４４で開示されるもの）の多様性を拡大するため、ＣＤＲ３およびフレームワーク再組換え手法を採用した。端的には、ＶＨフレームワーク３のＣ末端領域およびフレームワーク４のＮ末端領域をプライミングするオリゴを使用してＰＣＲを行なった。未処置のＶＨライブラリー由来のＶＨ群の各々からの全ＣＤＲ３ループドメインを増幅するために、この戦略を考案した。同一の未処置のライブラリーからの群特異的変性Ｎ末端フレームワーク１およびＣ末端フレームワーク３オリゴでのＰＣＲによってＶＨフレームワーク１〜３を増幅した。ＣＤＲ３およびフレームワークを等モル比で混合したＴ７  ＵＴＲおよびフレームワーク４オリゴを使用して重複ＰＣＲを行った。再度組換えられたライブラリーを更に修正して、選択のためのｄｓＤＮＡ融合ライブラリーに関して精製タグを保因した。特異的に、未処置のライブラリーからのＨＣＤＲ３を、フレームワーク３およびフレームワーク４フォワードおよびリバースオリゴを有する各ＶＨ群から引き上げ、フレームワーク特異的ＳＳオリゴヌクレオチドを使用して、骨髄Ｂ細胞およびＰＢＭＣから増幅された未処置のヒトＶＨドメインのフレームワーク領域１〜３を含むライブラリー中に組み合わせた。５’ＶＨ群特異的および３’一般的ＦＲ３リバースプライマーを使用して、ヒトＶＨフレームワーク領域１〜３を増幅し、ＶＨ群フレームワーク領域の別個のライブラリーを作り出した。５’Ｔ７ＴＭＶおよび３’ＦＲ４オリゴを使用して、更にＰＣＲ増幅をすることにより、ＶＨ群フレームワークライブラリー、および同一のライブラリーから引き上げられたＨＣＤＲ３を組み換えた。このことはまた、インビトロ転写／翻訳について、５’端でＴ７ＴＭＶ促進配列を追加した。ＦＲ４  Ｃｕ３リバースおよびＹ１０９プライマーをそれぞれ５’Ｔ７ＴＭＶプライマーと共に使用したＰＣＲによって、Ｃ末端Ｃμ３配列およびＦＬＡＧタグ（翻訳後の精製）もまた追加した。ＨＣＤＲ３組換えＶＨライブラリーの調製のために使用されたオリゴヌクレオチドの核酸配列は、表１に記載される。
【００８１】
所望であれば、正常な個人および疾患患者から、さらに多くの供与体を包含していくことにより、ライブラリーの多様性を更に増進し得る。
【００８２】
【表１】
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【００８３】
増進された多様性ライブラリーは、本明細書に記載されるように、生細胞表面剥離選択方法論のために更に操作され得る。
【００８４】
実施例３：免疫沈降によるヒトＶＨライブラリーおよびｄｓＤＮＡ提示テクノロジー組み込みを使用した生細胞選択。
ＧＰＣＲを可溶化しつつ、未変性機能的配座を保護する能力について、種々の界面活性剤を評価した。特に、対照ＶＨ分子（Ｍｙｃ親和性タグを含む）およびＧＰＣＲ発現細胞株を使用して、３５Ｓ標識抗体結合分析を進めた。この分析において、等しい数のＧＰＣＲ標的発現細胞を、トリトンＸ１００、ＣＨＡＰＳ、ＤＤＭ、またはＢｒｉｊ３５界面活性剤で溶解し、続いて、抗Ｍｙｃタグ抗体で免疫沈降を行い、タンパク質Ｇ磁性ビーズにより捕獲した。標的細胞に結合する陽性対照ＶＨを、インビトロ翻訳反応中、３５Ｓで放射標識化した。この標識ＶＨを、ＧＰＣＲ標的と共に培養し、上述されるような異なる界面活性剤での細胞溶解後に抗Ｍｙｃ抗体によって捕獲した。シンチレーション計数器を使用して、ＧＰＣＲ標的に結合されるＶＨの量を定量化した。ＶＨ結合活性に基づいて、界面活性剤可溶化によって保護された機能的配座をランク付けした。並行して、ウェスタンブロット法によって、抗Ｍｙｃ抗体で免疫沈降されたＧＰＣＲの数量を評価した。陽性対照ＶＨは、細胞がＤＤＭまたはＣＨＡＰＳで溶解されるときにＧＰＣＲへのより良い結合活性を示した。ＤＤＭとＣＨＡＰＳとの組み合わせは、最大の機能的ＧＰＣＲ活性および最適なＧＰＣＲ数を、これらの２つの分析において示し、ＧＣＧＲ（グルカゴン受容体）結合ＶＨドメインの選択において使用するために選択された。
【００８５】
１つのＧＣＧＲ選択分岐において、精製され、事前に排除されたＶＨ  ＤＮＡ提示ライブラリーを、ＧＣＧＲ発現細胞と１時間接触させた。細胞を洗浄し、ＤＤＭ／ＣＨＡＰＳで溶解し、その後、抗Ｍｙｃタグ抗体で免疫沈降を行った。ＶＨ−ＧＣＧＲ−Ｍｙｃ  Ａｂ複合体を回収し、０．１ＮのＫＯＨを使用してＶＨ  ＤＮＡを溶出した。本方法を使用して、４回の選択の後、ＧＣＧＲ発現細胞に結合する高親和性ＶＨを識別した。
【００８６】
代替的に、ＤＤＭ／ＣＨＡＰＳで細胞を可溶化した後、抗Ｍｙｃ抗体で免疫沈降された、可溶化および高濃度ＧＰＣＲ標的（または別の目的の標的）を使用して、選択を行うことができる。次に、ビーズ上で捕獲されたこれらの標的で培養した後に、ＶＨライブラリーを溶出することができる。
【００８７】
上述される本方法に加えて、ＶＨライブラリーが生細胞発現機能的ＧＰＣＲ（または他の目的の標的）と結合すると、細胞は、抗Ｍｙｃ抗体に類似した抗細胞内ＮまたはＣ末端抗体で溶解および免疫沈降され得る。抗リン酸化特異的抗体は、捕獲された活性受容体に適用され得、不活性化受容体から分離し得る。免疫沈降はまた、種々の活性化および不活性化状態の標的特異的経路を調節するＶＨを捕獲するために活性化または不活性化標的に付随するアクセサリー分子に対する抗体でも行われ得る。次に、これらの結合プールにおけるＤＮＡ提示ライブラリーメンバーは、ＰＣＲ増幅の間、ＤＮＡバーコードをタグ付けされて、異なる作用機序を持つ機能的結合体を識別するために大規模シーケンシング提出することができる。
【００８８】
実施例４：内部移行選択
内部移行活性で受容体刺激薬抗体または拮抗薬抗体を識別するための選択方法論が生み出された。端的には、ＧＰＣＲ結合ＶＨを内部移行させるために、（上述されるような）未処置のヒトｄｓＤＮＡ提示ＶＨライブラリーを、５０ｍＭのＮＨ４Ｃ１の存在下で、生細胞発現ＧＰＣＲ（または他の目的の標的）を使って、３７℃で培養した。次に、細胞を緩衝液で洗浄し、低ｐＨ酸（例えば、ｐＨ２．７の０．１ＭのＨＣＬ）によって、細胞表面ＶＨを剥離した。低ｐＨ剥離後、上述されるように、ＣＨＡＰＳ／ＤＤＭの組み合わせで細胞を溶解し、ＤＮＡの沈降を行って、内部移行化ｄｓＤＮＡ提示ライブラリーメンバーのコード配列を回収した。代替的に、抗Ｃ末端または抗Ｍｙｃタグ抗体での免疫沈降は、行われ得る。これらの方法はともに、組み合わせることも可能である。例えば、ＧＣＧＲ結合ＶＨの選択において、内部移行化ライブラリーメンバーがＤＮＡ沈降によって回収された第４段階の選別の後、抗Ｍｙｃ抗体での内部移行化ライブラリーメンバーの免疫沈降が適用されて、選択的厳密さが増加した第５段階の選択が行われた。これらの実験において、５段階の内部移行選択の後、高親和性拮抗薬を識別した。これらのＧＣＧＲ結合ＶＨは、適用された選択的圧力と調和する内部移行活性を示した。
【００８９】
実施例５：活性化／非活性化状態の標的細胞上での生細胞選択
ＧＰＣＲ標的の標的機能的エピトープおよびアロステリック調節性ＶＨの識別を増進するために、活性化および非活性化標的細胞（例えば、生細胞中の受容体刺激薬活性化または拮抗薬不活性化ＧＰＣＲ）の選択を可能にするために、選択戦略を生み出した。内因性リガンド（またはリガンド類似体）の存在下での選択は、オルソステリック結合部位と区別可能な位置、またはリガンドおよび受容体の両方によって現される新規のエピトープに結合するＶＨの識別に有利に働く。端的には、受容体刺激薬（リガンド、類似体、または受容体刺激薬抗体）または拮抗薬（阻害物質または中和抗体）の存在下で、ＧＣＧＲ発現細胞は阻止され、（上述されるように）未処置のヒトｄｓＤＮＡ提示ＶＨライブラリーで培養した。例えば、ＧＣＧＲに対する選択において、グルカゴンの存在下で選択分岐を行った。別のＧＰＣＲ選択において、リガンド模倣物質および拮抗薬の存在下で、アロステリック調節物質を識別するためにいくつかの選択分岐を行った。所望の活性化状態において、ＧＰＣＲ標的に結合するＶＨを効果的に捕獲するために、活性化および非活性化標的細胞でのこれらの選択を、本明細書で開示される種々のライブラリー回収方法と組み合わせた。
【００９０】
実施例６：ＧＰＣＲのオルソステリックおよびアロステリック調節物質を識別するための生細胞におけるリガンド溶出およびエピトープ誘導
生細胞選択を使用して、ＧＰＣＲの特異的機能的エピトープ（または他の目的の標的）を標的とするための方法が生み出された。これらの方法は、ＧＰＣＲのオルソステリック（受容体刺激薬／拮抗薬）およびアロステリック調節物質の識別を可能にする。例えば、ＧＣＧＲ結合ＶＨの選択において、グルカゴンの存在下で１つの選択分岐を行った。ＧＣＧＲ選択の別の分岐に関して、抗体ライブラリーをＧＣＧＲ発現標的細胞で培養した後、細胞を洗浄し、４時間グルカゴンで溶出した。次に、本明細書で開示される方法を使用して、リガンド結合ドメインと区別可能なエピトープに結合した残りの結合体を細胞から剥離した。これらの実験から、複数の高親和性ＶＨドメインが、ＧＣＧＲへのグルカゴン結合およびＧＣＧＲによるリガンド誘発ｃＡＭＰ誘発を阻止すると識別された。識別されたＶＨドメインのうちの１つが、正アロステリック調節物質として機能した。別の標的に関して、拮抗薬抗体を使用して、拮抗薬抗体の存在下で選択された細胞上のエピトープを予備阻止した。この実験は、存在する拮抗薬参照抗体と区別可能なエピトープを認識する複数のＶＨドメインの識別をもたらした。
【００９１】
実施例７：齧歯動物、霊長動物の相同膜タンパク質に関する選択性
ＧＰＣＲ種相同体の抗ＧＰＣＲ抗体の選択性を増加させるために、これらの関連する相同体を発現する細胞株が、並行して生成されて、（異種間が所望されない場合）対抗選択手段としてか、あるいは標的細胞選択、次いで、選択的クローンを識別するための大規模シーケンシングおよび生物情報学集計と並行して使用されるかのいずれかで、本明細書に記載されるＤＮＡ提示選択方法において活用されてもよい。後の動物の有効性および毒性研究に関して、齧歯動物または霊長動物と交差反応性である抗体を生成するために、初回の選択でヒト標的細胞において選択を行い、次いで、齧歯動物標的発現細胞に対する交差選択を行った。代替的に、ヒトおよび齧歯動物細胞は、選択の別の回で使用され得る。識別されたＶＨドメインの多くが、細胞上でのヒト標的および齧歯動物標的の両方への結合を示し、動物研究のために代用抗体を生成する必要がなくなる。
【００９２】
実施例８：大規模シーケンシングの適用
大規模シーケンシングテクノロジーは、本明細書に記載されるＤＮＡ提示選択方法において広範囲に適用されてきた。特定の実験では、選択方法中に主要な基準が組み込まれ、多くの並行選択が行われた。個々の選択および選択分岐から引き出されたＨＣＤＲ３断片に、ＰＣＲによるイルミナシーケンシングのために使用された特異的ＤＮＡバーコードをタグ付けした。タグ付けされたＨＣＤＲ３を集めて、Ｈｉ  ＳｅｑまたはＭｙ  Ｓｅｑテクノロジーでの高性能シーケンシングに送った。シーケンシング後、ＤＮＡバーコードに基づいてこの配列を解いた。各選択段階および選択分岐から引き出された何百万もの配列は、異なる回および異なる選択分岐で存在する特定のＣＤＲ３配列の頻度を比較することによって集計され、組み込まれた選択的結合、エピトープの範囲、および機能的プロファイルでの主要な分子の選択を導いた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１２−６】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年10月9日(2019.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書または図面に記載の方法または組成物。
【外国語明細書】
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