(57)【要約】【課題】β２ミクログロブリン欠損細胞を提供する。【解決手段】細胞は、β２ミクログロブリン（Ｂβ２Ｍ）遺伝子に遺伝子操作による破壊組換え改変を含む単離細胞であって、ヒト霊長類細胞であり、１本鎖融合非古典的ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩタンパク質をコードすることができる１つ以上のポリヌクレオチドをさらに含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
β２ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子に遺伝子操作による破壊を含む単離細胞であって、霊長類細胞であり、
前記細胞がさらに、１本鎖融合非古典的ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩタンパク質をコードすることができる１つ以上のポリヌクレオチドを含む、単離細胞。
【請求項２】
前記１本鎖融合非古典的ＨＬＡクラスＩタンパク質が、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、およびＨＬＡ−Ｇからなる群から選択されるＨＬＡクラスＩα鎖の少なくとも一部に共有結合したβ２Ｍタンパク質の少なくとも一部を含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記非古典的ＨＬＡクラスＩタンパク質が、ＨＬＡ−Ｅである、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
前記非古典的ＨＬＡクラスＩタンパク質が、ＨＬＡ−Ｆである、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項５】
前記非古典的ＨＬＡクラスＩタンパク質が、ＨＬＡ−Ｇである、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項６】
複数の異なる１本鎖融合非古典的ＨＬＡクラスＩタンパク質を含む、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項７】
前記細胞が、β２Ｍ遺伝子のすべてのコピーに、遺伝子操作された破壊を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８】
前記細胞が、前記１本鎖融合非古典的ＨＬＡクラスＩタンパク質によって前記細胞の表面に提示されるペプチドをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項９】
前記ペプチドが、前記１本鎖融合非古典的ＨＬＡクラスＩタンパク質に共有結合している、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
前記１本鎖融合非古典的ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩタンパク質のβ２Ｍタンパク質が、完全長のβ２Ｍタンパク質である、請求項２〜９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１１】
前記１本鎖融合非古典的ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩタンパク質の前記β２Ｍタンパク質と前記非古典的ＨＬＡクラス−Ｉα鎖とがリンカー配列を介して結合されている、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１２】
前記１本鎖融合非古典的ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩタンパク質の前記β２Ｍタンパク質が、リーダー配列を含んでいない、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１３】
前記ＨＬＡクラス−Ｉα鎖が、リーダー配列を含んでいない、請求項２〜１２のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１４】
前記細胞が、自殺遺伝子産物をコードすることができる１つ以上の組換え遺伝子をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１５】
前記自殺遺伝子産物が、チミジンキナーゼおよびアポトーシスシグナル伝達タンパク質からなる群から選択されるタンパク質を含む、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
前記細胞が、正常核型を有している、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１７】
前記細胞が、非形質転換細胞である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１８】
前記細胞が、幹細胞である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１９】
前記幹細胞が、多能性幹細胞、造血幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、成体幹細胞、肝幹細胞、神経幹細胞、膵幹細胞、および間葉幹細胞からなる群から選択される、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項１８または１９に記載の細胞。
【請求項２１】
前記細胞が、分化細胞である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２２】
前記分化細胞が、樹状細胞、膵島細胞、肝細胞、筋細胞、ケラチノサイト、神経細胞、造血細胞、リンパ球、赤血球、血小板、骨格筋細胞、眼細胞、間葉細胞、線維芽細胞、肺細胞、消化管細胞、血管細胞、内分泌細胞、脂肪細胞、骨髄間質細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、および心筋細胞からなる群から選択される、請求項２１に記載の細胞。
【請求項２３】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２４】
移植の必要な患者における移植に使用するための細胞であって、前記細胞の有効量が前記患者に投与される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２５】
前記患者が免疫適格である、請求項２４に記載の細胞。
【請求項２６】
前記細胞が分化細胞である、請求項２４または２５に記載の細胞。
【請求項２７】
前記患者がヒトであり、前記細胞がヒト細胞である、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２８】
病状の治療を必要とする患者における病状の治療に使用するための細胞であって、前記細胞の有効量が患者に投与されるものであり、前記病状が糖尿病、自己免疫疾患、癌、感染症、貧血、白血球減少症、心筋梗塞、心不全、骨格もしくは関節の症状、骨形成不全症、火傷、または遺伝的皮膚疾患である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２９】
ａ）前記患者が免疫適格である；
ｂ）前記細胞が分化細胞である；
ｃ）前記患者がヒトであり且つ前記細胞がヒト細胞である；および／または
ｄ）前記病状が糖尿病であり且つ前記細胞が膵島細胞であり、前記病状が心筋梗塞あるいは心不全であり且つ前記細胞が心筋細胞であり、もしくは前記病状が火傷あるいは遺伝的皮膚疾患であり且つ前記細胞がケラチノサイトである、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の細胞と、生理学的に適合した緩衝液とを含む、医薬組成物。
【請求項３１】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の細胞を含む、キット。
【請求項３２】
前記キットが、移植片をさらに含み、前記移植片が、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の細胞を含む、請求項３１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β２ミクログロブリン欠損細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト多能性幹細胞は、殆どすべての臓器系を侵す疾患を治療する潜在能力を有する。しかしながら、ヒト多能性幹細胞およびその派生物の臨床的使用には、大きな制約、すなわち主要組織適合遺伝子複合体の相違に起因するレシピエントによる移植細胞の拒絶反応の問題がある。
【０００３】
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）は、白血球と他の白血球または他の細胞との相互作用を仲介するすべての脊椎動物に見られる細胞表面多成分分子である。ＭＨＣ遺伝子ファミリーは、３つの群：クラスＩ、クラスＩＩ、およびクラスＩＩＩに分けられる。ヒトでは、ＭＨＣは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と呼ばれる。ＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ−Ｉ）タンパク質は、すべての有核細胞で発現され、ＨＬＡクラスＩ重鎖（またはα鎖）およびβ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）からなる。ＨＬＡクラスＩタンパク質は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞に対して細胞表面にペプチドを提示する。これまでに、３つの古典的（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃ）α鎖ならびに３つの非古典的（ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、およびＨＬＡ−Ｇ）α鎖を含む６つのＨＬＡクラスＩα鎖が同定されている。ＨＬＡクラスＩ分子ペプチド結合クレフトに結合するペプチドの特異性はα鎖によって決定される。ＨＬＡクラスＩ分子によって提示されるペプチドのＣＤ８＋Ｔ細胞による認識は、細胞性免疫を媒介する。
【０００４】
同種源由来のＨＬＡクラスＩタンパク質自体が、移植の状況において外来抗原を構成する。非自己ＨＬＡクラスＩタンパク質の認識が、移植療法または補充療法に多能性細胞を使用する際の大きな障害である。ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）の最初の２回の臨床試験が実施され、ＥＳＣが、異種細胞が残存する可能性がある免疫特権部位（例えば、脊髄および眼）に送達された。しかしながら、たとえこれらの免疫特権部位でも、最終的には異種細胞を拒絶するため、殆どの潜在的な臨床応用は、免疫特権部位に関与しない。あるいは、ＨＬＡ型幹細胞バンク由来のＨＬＡ一致細胞もしくはＨＬＡ部分一致細胞、または各患者に由来する多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）株を、移植のために作製することができる。しかしながら、１つ１つに一致した細胞株の作製には、多大なコスト、数ヶ月に及ぶ細胞培養、高度に訓練されたスタッフ、および最終産物の十分なバリデーションが必要であり、これらのすべては、監督官庁の承認を得てから行わなければならない。さらに、各細胞株は、遺伝子発現パターン、培養特性、分化能、および遺伝的変異においてやや異なって振舞う可能性が高い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、個々の幹細胞調製物または多様なＨＬＡの幹細胞バンクが、現在の移植の問題に対応することができるが、これらは、複数の細胞株を特徴付けて、治療細胞産物に分化させ、そしてヒトへの投与の承認を必要とする。この時間のかかる技術的に困難な費用の嵩むプロセスは、幹細胞をベースとする療法が臨床試験に入れない主な原因である。従って、拒絶によって妨げられないより効果的で低コストの細胞ベースの療法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によると、一態様では、本発明は、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子に遺伝子組換え改変（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）を含む単離された霊長類細胞を提供する。ある特定の実施形態では、この細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子のすべてのコピーの遺伝子組換え改変を含む。
【０００７】
他の一定の実施形態では、この細胞は、１つ以上の組換え免疫調節遺伝子をさらに含む。適切な免疫調節遺伝子は、限定されるものではないが、抗原提示を阻害するウイルスタンパク質をコードする遺伝子、ミクロＲＮＡ遺伝子、および以下に説明する１本鎖（ＳＣ）融合ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩタンパク質をコードする遺伝子を含む。好ましい一定の実施形態では、この霊長類細胞はヒト細胞である。
【０００８】
好ましい一定の実施形態では、１つ以上の免疫調節遺伝子は、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質をコードすることができるポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、およびＨＬＡ−Ｇからなる群から選択されるＨＬＡクラスＩα鎖の少なくとも一部に共有結合したＢ２Ｍの少なくとも一部を含む。好ましい一定の実施形態では、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質は、Ｂ２Ｍの少なくとも一部ならびにＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、およびＨＬＡ−Ｇからなる群から選択されるＨＬＡクラスＩα鎖の少なくとも一部を含む。他の好ましい一定の実施形態では、Ｂ２Ｍの少なくとも一部ならびにＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｅ、およびＨＬＡ−Ｇからなる群から選択されるＨＬＡクラスＩα鎖の少なくとも一部を含む。ある特定の実施形態では、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質は、Ｂ２Ｍの少なくとも一部およびＨＬＡ−Ａ０２０１（例えば、配列番号１６）の少なくとも一部を含む。他のある特定実施形態では、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質は、Ｂ２Ｍの少なくとも一部およびＨＬＡ−Ｅ（例えば、配列番号１８および２０）の少なくとも一部を含む。
【０００９】
なお他の特定の実施形態では、この細胞は正常核型を有する。他のある特定の実施形態では、この細胞は、非形質転換細胞である。特に、この細胞は、造血幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、肝幹細胞、神経幹細胞、膵幹細胞、および間葉幹細胞からなる群から選択される幹細胞である。さらなる一定の実施形態では、この細胞は、自殺遺伝子産物をコードすることができる１つ以上の組換え遺伝子をさらに含む。ある特定の実施形態では、自殺遺伝子産物は、チミジンキナーゼおよびアポトーシスシグナル伝達タンパク質からなる群から選択されるタンパク質を含む。
【００１０】
好ましい一定の実施形態では、この幹細胞は、Ｂ２Ｍの少なくとも一部ならびにＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、およびＨＬＡ−Ｇからなる群から選択されるＨＬＡクラスＩα鎖の少なくとも一部を含む１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現する多能性幹細胞である。ある特定の実施形態では、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質は、Ｂ２Ｍの少なくとも一部およびＨＬＡ−Ａ０２０１の少なくとも一部を含む。
【００１１】
他のある特定の実施形態では、この幹細胞は分化細胞である。一定の実施形態では、この分化細胞は、樹状細胞、膵島細胞、肝細胞、筋細胞、ケラチノサイト、神経細胞、造血細胞、リンパ球、赤血球、血小板、骨格筋細胞、眼細胞、間葉細胞、線維芽細胞、肺細胞、消化管細胞、血管細胞、内分泌細胞、脂肪細胞、および心筋細胞からなる群から選択される。好ましい一定の実施形態では、この分化細胞は、Ｂ２Ｍの少なくとも一部ならびにＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、およびＨＬＡ−Ｇからなる群から選択されるＨＬＡクラスＩα鎖の少なくとも一部を含む１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現するヒト細胞である。ある特定の実施形態では、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質は、Ｂ２Ｍの少なくとも一部およびＨＬＡ−Ａ０２０１の少なくとも一部を含む。
【００１２】
他の一定の実施形態では、この細胞は、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質によってこの細胞の表面に提示される標的ペプチド抗原をさらに発現する。ある特定の実施形態では、この標的ペプチド抗原は、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質に共有結合している。好ましい一定の実施形態では、この標的ペプチド抗原は、病原体または癌細胞のタンパク質に由来する。従って、関連する態様では、本発明は、本発明のＢ２Ｍ−／−細胞を含むワクチンを提供し、このワクチンは、標的ペプチド抗原に特異的な免疫応答を霊長類で誘発することができる。ある特定の実施形態では、このワクチンは、分化樹状細胞である本発明の細胞を含む。他の一定の実施形態では、この細胞は、本発明のヒト細胞であり、この細胞は、免疫応答をさらに強化するサイトカインを発現する。好ましい一定の実施形態では、このサイトカインはＩＬ２である。他の好ましい一定の実施形態では、このサイトカインはＩＦＮ−γである。一定の実施形態では、この免疫応答は、体液性免疫応答を含むが；他の実施形態では、この免疫応答は、細胞性免疫応答を含む。さらなる関連する態様では、本発明は、本発明の単離細胞および免疫アジュバントを含むワクチンを含むキットを提供する。一定の実施形態では、この細胞はヒト細胞である。
【００１３】
なお別の態様では、本発明は、移植を必要とする患者への移植方法を提供し、この方法は、本発明の単離された細胞の有効量を患者に投与するステップを含む。一定の実施形態では、この患者は免疫適格である。ある特定の実施形態では、この患者は、霊長類、好ましくはヒトである。好ましい一定の実施形態では、この患者はヒトであり、この細胞はヒト細胞である。さらなる実施形態では、この細胞は、任意選択で１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現する、幹細胞または分化細胞である。
【００１４】
なおさらなる態様では、本発明は、病状の治療を必要とする患者の病状を治療する方法を提供し、この方法は、本発明のＢ２Ｍ−／−細胞の有効量をこの患者に投与するステップを含み、この病状は、限定されるものではないが、内分泌障害、糖尿病、自己免疫疾患、癌、感染症、貧血、血小板障害、免疫不全、白血球減少症、心筋梗塞、心不全、肝不全、骨格もしくは関節の症状、神経学的疾患、脳卒中、麻痺、失明もしくは他の視覚障害、筋ジストロフィー、骨形成不全症、肺疾患、皮膚疾患、または火傷を含む。一定の実施形態では、この患者は免疫適格である。ある特定の実施形態では、この患者は、霊長類、好ましくはヒトである。好ましい一定の実施形態では、この患者はヒトであり、この細胞はヒト細胞である。さらなる実施形態では、この細胞は、任意選択で１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現する、幹細胞または分化細胞である。ある特定の実施形態では、この病状は糖尿病であり、この細胞は分化膵島細胞である。さらなる実施形態では、分化膵島細胞は、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、本発明の単離された霊長類細胞、好ましくはヒト細胞を含むキットを提供する。一定の実施形態では、このキットは、移植に使用される、または病状の治療に使用される。他の一定の実施形態では、このキットは、本発明の単離された霊長類細胞、好ましくはヒト細胞を含む移植片を含む。
【００１６】
本発明の特定の実施形態は、好ましい一定の実施形態および添付の特許請求の範囲の以下に示すより詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】Ｂ２Ｍ−／−ＥＳＣの作製を示す図である。図１のＡは、エキソンが大きいボックスで示されているＡＡＶ  Ｂ２Ｍターゲッティングベクターの例示である。図１のＢは、遺伝子ターゲッティングおよびＣｒｅ媒介導入遺伝子切除（Ｃｒｅ−ｏｕｔ）の結果を示すサザンブロットを示している。図１のＣは、遺伝子ターゲッティング後のＨＬＡクラスＩ発現の欠如を示すフローサイトメトリー（アイソタイプコントロールを使用）の結果を示している。
【図２】免疫不全マウスに移植されたＢ２Ｍ−／−Ｃｒｅ−ｏｕｔヒトＥＳＣから発生した奇形腫の組織切片を示す図である。この切片を、ＤＡＰＩ、ヘマトキシリン、およびエオシン、または外胚葉用の系列特異的マーカーＭＡＰ−２（微小管関連タンパク質２）、中胚葉用のα−ＳＡＭ（α−平滑筋アクチン）、または内胚葉用のＦｏｘＡ２（フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２）を用いて染色した。スケールバー＝１００マイクロン。
【図３】１本鎖融合ＨＬＡクラスＩ構築物を示す図である。図３のＡは、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現させるための泡沫状ウイルスベクターの設計を示す図である。図３のＢは、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質の線形タンパク質構造を例示している。例示的な１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質の配列は、ＨＬＡ−ｂＧＢＥ（配列番号１９および２０、それぞれＤＮＡ配列およびタンパク質配列）、ＨＬＡ−ｇＢＥ（配列番号１７および１８）、およびＨＬＡ−ｂＢＡ０２０１（配列番号１５および１６）に対して示されている。図３のＣは、Ｂ２Ｍ−／−ＥＳＣにおける１本鎖融合ＨＬＡ−Ｅ発現を示すフローサイトメトリー（アイソタイプコントロール）の結果を示している。図３のＤは、Ｂ２Ｍ−／−ＥＳＣにおける１本鎖融合ＨＬＡ−Ａ０２０１発現を示すフローサイトメトリー（アイソタイプコントロール）の結果を示している。
【図４】各分化細胞型の実験的設計の概要を示している。
【図５】Ｂ２Ｍ−／−ＥＳＣ由来のケラチノサイトの分化を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れられるものとする。
本出願において、別段の記載がない限り、利用される技術は、いくつかの周知の参考文献、例えば、「分子クローニング：実習マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら著、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年）および「ＰＣＲプロトコル：方法および応用へのガイド（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ
ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（イニス（Ｉｎｎｉｓ）ら著、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓ）、１９９０年、サンディエゴ、カリフォルニア州）のいずれでも確認することができる。
【００１９】
本明細書で使用される単数形「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、別段の記載がない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「ある単離された細胞」は、１つ以上の単離された細胞を意味する。
【００２０】
本明細書に開示されるすべての実施形態は、別段の記載がない限り、組み合わせることができる。
一態様では、本発明は、Ｂ２Ｍ欠損細胞を提供する。特に、本発明は、Ｂ２Ｍ遺伝子に遺伝子組換え改変を含む、単離された霊長類細胞、好ましくはヒト細胞を提供する。好ましい一定の実施形態では、この細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子に遺伝子組換え改変を含むヒト細胞である。関連する態様では、この細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子のすべてのコピーにおける遺伝子組換え改変を含む。一定の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子の遺伝子改変により、Ｂ２Ｍタンパク質の欠損、またはＢ２Ｍタンパク質が発現されなくなる。Ｂ２Ｍは、すべてのＨＬＡクラスＩタンパク質の共通の要素であるため、遺伝子組換え改変は、細胞表面でのすべての天然ＨＬＡクラスＩタンパク質の発現を防止する。Ｂ２Ｍをコードする配列は、配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４０４８）で示され、Ｂ２Ｍタンパク質配列は、配列番号２で示される。この遺伝子には多数の一塩基多型（ＳＮＰ）が存在する可能性があり；当業者には理解されるように、本発明のヒト細胞および方法は、このようなＢ２Ｍ遺伝子およびＳＮＰのいずれにも適用可能である。
【００２１】
本発明のこれらの実施形態の細胞は、例えば、移植を必要とするレシピエントの移植用ドナー細胞として使用することができる。Ｂ２Ｍ欠損細胞は、Ｂ２Ｍ−／−遺伝的背景を含む細胞（Ｂ２Ｍ−／−細胞）を包含する。用語「Ｂ２Ｍ−／−細胞」とは、Ｂ２Ｍ遺伝子のすべてのコピーにおける遺伝子組換え改変を含む霊長類細胞、好ましくはヒト細胞のことである。Ｂ２Ｍ−／−細胞は、集団におけるレシピエントのすべてまたは大部分に免疫学的に適合するという点で「万能ドナー細胞」として機能し得る。本明細書で使用されるレシピエントまたは患者とは、霊長類、好ましくはヒトのことである。ある特定の実施形態では、この細胞はヒト細胞であり、この患者はヒトである。
【００２２】
本発明の細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子を改変するように遺伝子組換えされて、改変された遺伝子座から機能的内因性Ｂ２Ｍタンパク質が産生されないようにすることができる。一定の実施形態では、この改変は、非機能的Ｂ２Ｍタンパク質の発現をもたらし、限定されるものではないが、切断、欠失、点突然変異、および挿入を含む。他の実施形態では、この改変により、Ｂ２Ｍ遺伝子からタンパク質が全く発現されなくなる。
【００２３】
Ｂ２Ｍ発現が欠損した細胞は、細胞表面にＨＬＡクラスＩタンパク質を発現させることができない。ＨＬＡクラスＩの欠損は、さらなる利点を提供する；例えば、ＨＬＡクラスＩを発現しない細胞は、自己免疫疾患、例えば、糖尿病および関節リウマチの細胞療法の成功を普通なら妨げる自己抗原を提示することができない。同様に、特定の遺伝病（例えば、筋ジストロフィー）の患者に欠損している、本発明の細胞療法によって導入される治療遺伝子産物（例えば、ジストロフィン）も、提示されず、補充療法における新抗原として認識されない。
【００２４】
Ｂ２Ｍ遺伝子の１つ、２つ、またはすべてのコピーを改変する任意の適切な技術を使用することができ；例示的な技術は、本出願を通して開示され、かつ本明細書の教示および当分野で既知の教示に基づいた当業者のレベルの範囲内である。例示的な他の技術も、例えば、参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、２００８年９月１１日公開の米国仮特許出願第２００８／０２１９９５６号明細書で確認することができる。これらの技術は、任意選択で、Ｂ２Ｍ遺伝子の改変後に細胞から非ヒトＤＮＡ配列を除去するステップを含み得る。
【００２５】
この方法の例示的な実施形態は、本出願を通して開示されるように、アデノ随伴ウイルス遺伝子ターゲッティングベクターを使用し、任意選択で、以下に説明されるような技術によってターゲッティングに使用される導入遺伝子を除去するステップ、あるいはＣｒｅ媒介ｌｏｘＰ組換えまたは他の適切な組換え技術によってターゲッティングに使用される導入遺伝子を除去するステップを含む。参照によりその全容が本明細書に組み入れられるカーン（Ｋｈａｎ）ら著、プロトコル（Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）、２０１１年、第６巻、ｐ．４８２〜５０１を参照されたい。例示的なターゲッティングベクターおよび例示的なベクターの図も本明細書に開示されている。本発明のＢ２Ｍ−／−細胞、好ましくはヒト細胞を作製するために様々な技術を利用することは、本明細書の教示および当分野で既知の教示に基づいた当業者の技術レベルの範囲内である。
【００２６】
一定の実施形態では、Ｂ２Ｍ−／−細胞の細胞ゲノムは、非ヒトＤＮＡ配列の１００未満、５０未満、または３０未満のヌクレオチドを含み得る。他の一定の実施形態では、細胞ゲノムは、非ヒトＤＮＡ配列の６個、５個、４個、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドを含み得る。Ｂ２Ｍ遺伝子の改変で導入されるあらゆる非ヒトＤＮＡを除去する例示的な技術が、図１のＡに示されている。非ヒトＤＮＡ配列は、第１のベクターにおけるＨｙＴＫまたはＴＫＮｅｏ導入遺伝子を除去する２回目のターゲッティングによって、またはＣｒｅ媒介ｌｏｘＰ組換えによって除去することができる。
【００２７】
他の実施形態では、細胞は、代わりに、Ｂ２Ｍ−／−遺伝的背景で１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を組換え発現するように操作することができる。従って、本明細書で使用されるＢ２Ｍ−／−細胞は、Ｂ２Ｍ−／−遺伝的背景で１つ以上の１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現する霊長類細胞、好ましくはヒト細胞も包含する。１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を組換え発現するＢ２Ｍ−／−細胞は、それでもなお、正常なＢ２Ｍ機能が欠落しているため、この細胞は、細胞表面の任意のＨＬＡクラスＩα鎖に非共有結合したへテロ二量体を形成する野生型Ｂ２Ｍタンパク質を発現しない。
【００２８】
用語「１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質」、「１本鎖融合ＨＬＡクラスＩ分子」、または「１本鎖融合ＨＬＡクラスＩ抗原」とは、直接またはリンカー配列を介してＨＬＡ−Ｉα鎖の少なくとも一部に共有結合されたＢ２Ｍタンパク質の少なくとも一部を含む融合タンパク質のことである。他方、用語「ＨＬＡクラスＩタンパク質」、「ＨＬＡクラスＩ分子」、または「ＨＬＡクラスＩ抗原」とは、野生型細胞の表面で発現される、Ｂ２ＭとＨＬＡα鎖の非共有結合されたヘテロ二量体のことである。
【００２９】
本明細書で使用される用語「ＨＬＡクラスＩα鎖」または「ＨＬＡ−Ｉ重鎖」とは、ＨＬＡクラスＩヘテロ二量体のα鎖のことである。ＨＬＡクラスＩ重鎖は、限定されるものではないが、ＨＬＡクラスＩα鎖ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、およびＨＬＡ−Ｇを含む。ＨＬＡ−Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｋ０２８８３．１、配列番号３；ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０１８９２、配列番号４）、ＨＬＡ−Ｂ（ＮＭ＿００５５１４、配列番号５；ＮＰ＿００５５０５；配列番号６）、ＨＬＡ−Ｃ（ＮＭ＿００２１１７、配列番号７；ＮＰ＿００２１０８、配列番号８）、ＨＬＡ−Ｅ（ＮＭ＿００５５１６、配列番号９；ＮＰ＿００５０７、配列番号１０）、ＨＬＡ−Ｆ（ＮＭ＿０１８９５０、配列番号１１；ＮＰ＿０６１８２３、配列番号１２）、およびＨＬＡ−Ｇ（ＮＭ＿００２１２７、配列番号１３；ＮＰ＿００２１１８、配列番号１４）の代表的なＤＮＡ配列およびタンパク質配列が示されている。
【００３０】
加えて、用語「ＨＬＡクラスＩタンパク質／分子」は、ヒトのＭＨＣクラスＩタンパク質／分子を指すことが知られており、用語ＨＬＡとＭＨＣは、本出願を通して時には互換的に使用される：例えば、用語ＨＬＡクラスＩタンパク質は、霊長類のＨＬＡクラスＩタンパク質に相当する霊長類のものを指すために使用することもできる。当業者であれば、内容に基づいて用語の意味を理解することができよう。
【００３１】
本明細書で使用される用語Ｂ２Ｍ−／−細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子のすべてのコピーにおける遺伝子組換え改変を有する細胞も包含し、１つのＢ２Ｍアレルは、野生型Ｂ２Ｍタンパク質の代わりに、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現するように遺伝子組換えされている（すなわち、１つのＢ２Ｍアレルにおける遺伝子標的ノックイン）。このような遺伝的背景を有するＢ２Ｍ−／−細胞は、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質の状況においてのみＢ２Ｍ遺伝子座からＢ２Ｍを発現する。一定の有利な実施形態では、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質の発現は、Ｂ２Ｍ遺伝子座に位置する内因性Ｂ２Ｍ調節配列によって調節される。
【００３２】
関連する実施形態では、Ｂ２Ｍ−／−細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子のすべてのコピーにおける遺伝子組換え改変を有する細胞もさらに包含し、すべてのＢ２Ｍアレルは、野生型Ｂ２Ｍタンパク質の代わりに、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現するように遺伝子組換えされている（すなわち、すべてのＢ２Ｍアレルにおける遺伝子標的ノックイン）。このような遺伝子改変を有するＢ２Ｍ−／−細胞は、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質の状況においてのみＢ２Ｍ遺伝子のすべてのアレルの遺伝子座からＢ２Ｍを発現する。一定の実施形態では、この細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子のすべてのアレルの遺伝子座から同じ型の１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現するように遺伝子組換えされるが；他の実施形態では、この細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子の異なるアレルの遺伝子座から異なる型の１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現するように遺伝子組換えされる。
【００３３】
本出願を通して、「本発明の細胞」、「本発明の単離された細胞」、「Ｂ２Ｍ−／−細胞」、「本発明のＢ２Ｍ−／−細胞」、または「本発明の幹細胞または分化細胞」は、時には互換的に使用され、本明細書に記載されるすべてのＢ２Ｍ−／−細胞を包含し得る。ある特定の実施形態では、本発明のＢ２Ｍ−／−細胞は、Ｂ２Ｍ−／−の背景において、本明細書で定義される１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現する。Ｂ２Ｍ−／−細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子座またはゲノムの他の位置から１本鎖ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現するように遺伝子組換えすることができる。ある特定の実施形態では、本発明の細胞は、野生型Ｂ２Ｍタンパク質の発現を防止するが、Ｂ２Ｍ遺伝子座から１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質は発現するＢ２Ｍ遺伝子のアレルにおける遺伝子組換え改変を含む。他のある特定の実施形態では、本発明の細胞は、野生型Ｂ２Ｍタンパク質の発現を防止するが、なおすべてのＢ２Ｍ遺伝子座から１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質は発現するＢ２Ｍ遺伝子のすべてのアレルにおける遺伝子組換え改変を含む。用語「遺伝子」、「アレル」、および「遺伝子座」は、本出願を通して互換的に使用することがある。
【００３４】
「単離された細胞」は、所与の目的に対して適切な任意の細胞型とすることができる。例えば、細胞は、多能性幹細胞または分化細胞とすることができる。「幹細胞」は、さらに分化することができるすべての細胞を広範に包含する。「多能性幹細胞」とは、３つの胚葉：内胚葉、中胚葉、または外胚葉のいずれにも分化する能力を有する幹細胞のことである。他方、「成熟幹細胞」は、制限された数の細胞型のみを産生できるという点で多能性である。「胚性幹（ＥＳ）細胞」とは、胚盤胞、初期胚の内細胞塊に由来する多能性幹細胞のことである。「人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）」とは、特定の遺伝子の発現を人工的に誘導することによって、非多能性細胞、典型的には成体の体細胞から人工的に作製された多能性幹細胞のことである。
【００３５】
一定の実施形態では、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質は、Ｂ２Ｍの少なくとも一部、およびＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、またはＨＬＡ−Ｇ（二量体構築物とも呼ばれる）の少なくとも一部を含む。好ましい一定の実施形態では、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質に含まれるＨＬＡα鎖は、ＨＬＡクラスＩα鎖（リーダーレスＨＬＡα鎖（ｌｅａｄｅｒｌｅｓｓ  ＨＬＡ  α  ｃｈａｉｎ））のリーダー配列（またはシグナル配列）を含んでいない。他の一定の実施形態では、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質は、Ｂ２Ｍの少なくとも一部、およびＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、またはＨＬＡ−Ｇの少なくとも一部を含む。さらなる一定の実施形態では、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質は、Ｂ２Ｍの少なくとも一部、およびＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｅ、またはＨＬＡ−Ｇの少なくとも一部を含む。好ましい一定の実施形態では、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質は、Ｂ２Ｍの少なくとも一部に共有結合したリーダー配列（またはシグナル配列）、および細胞表面における１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質の適切な折り畳みを確実にするＨＬＡα鎖の少なくとも一部を含む。このリーダー配列は、Ｂ２Ｍタンパク質のリーダー配列、ＨＬＡα鎖タンパク質のリーダー配列、または他の分泌タンパク質のリーダー配列とすることができる。ある特定の実施形態では、この１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質は、リーダー配列が除去されたＢ２Ｍタンパク質を含む。他のある特定の実施形態では、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質は、リーダー配列が除去されたＨＬＡα鎖タンパク質を含む。一定のＨＬＡクラスＩα鎖は、高度に多型性である。当業者には理解されるように、本発明のヒト細胞および方法は、このようなどのＨＬＡα鎖およびその多型に適用可能である。
【００３６】
配列変異体ならびにＢ２Ｍおよび／またはＨＬＡα鎖の断片を含む１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質は、本発明に包含され、このような１本鎖融合構築物は、なお正常なＨＬＡクラスＩ機能、例えば、細胞表面にヘテロ二量体の適切な二次構造を形成する機能、ペプチド結合クレフトにペプチドを提示する機能、および抑制性受容体をＮＫ細胞の表面に結合する機能を有する。一定の実施形態では、この配列変異体は、自然発生のＨＬＡ重鎖およびＢ２Ｍ配列と少なくとも７５％、８０％、８１％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または完全な配列相同性を有し、この配列変異体は、正常なＨＬＡクラスＩ機能を有する。特定の他の実施形態では、この配列変異体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４に示されているＢ２ＭまたはＨＬＡ重鎖の配列と少なくとも７５％、８０％、８１％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または完全な配列相同性を有する。
【００３７】
ある特定の実施形態では、ＨＬＡ−Ａ変異体は、配列番号４と少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または完全な配列相同性を有する。他のある特定の実施形態では、ＨＬＡ−Ｂ変異体は、配列番号６と少なくとも８１％、８３％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または完全な配列相同性を有する。さらなる一定の実施形態では、ＨＬＡ−Ｃ変異体は、配列番号８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または完全な配列相同性を有する。なお他の実施形態では、ＨＬＡ−Ｅ変異体は、配列番号１０と少なくとも９７％、９８％、９９％、または完全な配列相同性を有する。ある特定の実施形態では、ＨＬＡ−Ｆ変異体は、配列番号１２と少なくとも９９％または完全な配列相同性を有する。他の一定の実施形態では、ＨＬＡ−Ｇ変異体は、配列番号１４と少なくとも９８％、９９％、または完全な配列相同性を有する。
【００３８】
他の一定の実施形態では、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質は、完全長Ｂ２Ｍ（そのリーダー配列を含む）およびリーダー配列を含まないＨＬＡα鎖（リーダーレスＨＬＡα鎖）を含むが；他の一定の実施形態では、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質は、リーダー配列を含まないＢ２Ｍタンパク質を含む。２つ、３つ、またはそれ以上の異なる型の１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を任意の組み合わせで発現するＢ２Ｍ−／−細胞、例えば、ＨＬＡ−Ａ（またはリーダーレスＨＬＡ−Ａ）を含むＳＣ融合およびＨＬＡ−Ｃ（またはリーダーレスＨＬＡ−Ｃ）を含むＳＣ融合を発現するＢ２Ｍ−／−細胞、ＨＬＡ−Ａ（またはリーダーレスＨＬＡ−Ａ）を含むＳＣ融合およびＨＬＡ−Ｅ（またはリーダーレスＨＬＡ−Ｅ）を含むＳＣ融合を発現するＢ２Ｍ−／−細胞、またはＨＬＡ−Ｂ（またはリーダーレスＨＬＡ−Ｂ）を含むＳＣ融合、ＨＬＡ−Ｅ（またはリーダーレスＨＬＡ−Ｅ）を含むＳＣ融合、およびＨＬＡ−Ｇ（またはリーダーレスＨＬＡ−Ｇ）を含むＳＣ融合を発現するＢ２Ｍ−／−細胞などのＢ２Ｍ−／−細胞がすべて、本発明に包含されることを理解されたい。
【００３９】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、先天性免疫応答の一部である。いくつかの病原体が、感染細胞におけるＨＬＡクラスＩタンパク質の発現を下方制御し得る。ＮＫ細胞は、ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現しない細胞を認識してアポトーシスを誘導することによって感染を監視する。ＮＫ細胞表面の抑制性受容体は、ＨＬＡクラスＩα鎖アレルを認識し、これにより非感染の正常細胞のＮＫ誘導アポトーシスを防止する。従って、ある特定の実施形態では、１本鎖融合ＨＬＡ−Ｉタンパク質は、ＮＫ細胞上の抑制性受容体に結合することによって内因性ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現しない細胞のＮＫ細胞誘導死を阻害する。例えば、ＨＬＡ−Ｅは、ＮＫ細胞誘導アポトーシスを阻害するＮＫ細胞のＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体のリガンドである。従って、ある特定の実施形態では、Ｂ２Ｍ−／−細胞は、Ｂ２Ｍの少なくとも一部およびＨＬＡ−Ｅの少なくとも一部を含む１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現する。加えて、ＨＬＡ−Ｇは、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、またはＣを発現しない胎盤細胞栄養芽層の表面で正常に発現され、ＮＫ細胞上の抑制性ＩＬＴ２（ＬＩＲ１）受容体と相互作用することによってこれらの細胞をＮＫ細胞誘導溶解から保護する（パズマニー（Ｐａｚｍａｎｙ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９６年、第２７４巻、ｐ．７９２〜７９５）。従って、他の好ましい一定の実施形態では、Ｂ２Ｍ−／−細胞は、Ｂ２Ｍの少なくとも一部およびＨＬＡ−Ｇの少なくとも一部を含む１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現する。
【００４０】
ある特定の実施形態では、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質は、Ｂ２Ｍの少なくとも一部、およびＨＬＡ−Ａ０２０１、ＨＬＡ−Ａアレルの少なくとも一部を含む。ＨＬＡ−Ａ０２０１（配列番号４）は、米国の人口の大部分に見られる一般的なＨＬＡクラスＩアレルである。従って、有利な一定の実施形態では、単離細胞は、Ｂ２Ｍ−／−遺伝的背景において、Ｂ２Ｍの少なくとも一部およびＨＬＡ−Ａ０２０１の少なくとも一部を含む１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現し、該単離細胞は、米国の人口の大部分に対して免疫適合性である。使用できる他の適切な共通アレルには、限定されるものではないが、ＨＬＡ−Ａ０１０１、ＨＬＡ−Ａ０３０１、ＨＬＡ−Ｂ０７０２、ＨＬＡ−Ｂ０８０１、ＨＬＡ−Ｃ０４０１、ＨＬＡ−Ｃ０７０１、およびＨＬＡ−Ｃ０７０２が含まれる。好ましい一定の実施形態では、ＨＬＡアレルは、ＨＬＡ−Ａ０２０１（配列番号４）、ＨＬＡ−Ｂ０７０２（配列番号６）、またはＨＬＡ−Ｃ０４０１（配列番号８）を含む。
【００４１】
さらなる一定の実施形態では、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質は、そのペプチド結合クレフトを塞ぐ特異的ペプチド抗原も含み、このペプチド抗原は、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質に共有結合している（三量体構築物とも呼ばれる）。三量体構築物の一例が図３のＢに示されている。図３のＢのＨＬＡ−ｂＧＢＥ構築物は、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質のペプチド結合クレフトを塞ぐように設計されたペプチド抗原（例えば、限定されるものではないが、この図に例示されているＨＬＡ−Ｇペプチド抗原）（配列番号２３）に共有結合したＨＬＡ−ＥおよびＢ２Ｍを含む。他の一定の実施形態では、共有結合ペプチド抗原は、組み込みプロテアーゼ切断部位によって切断され、この切断ペプチド抗原は、提示のために１本鎖融合ＨＬＡ−Ｉタンパク質のクレフトに結合するペプチドに結合することができる。一定の代替の実施形態では、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質のペプチド結合クレフトを塞いでいるペプチド抗原は、細胞内抗原処理経路によって産生され、この処理経路では、このペプチド抗原は、プロテアソームによって産生され、小胞体内の１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質に輸送され、この１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質に付着する。ある特定の実施形態では、このペプチド抗原には、腫瘍抗原のペプチドが含まれる。他の一定の実施形態では、このペプチド抗原には、限定されるものではないが、細菌、ウイルス、真菌、および寄生虫を含む病原体由来のタンパク質のペプチドが含まれる。さらなる実施形態では、このペプチド抗原には、腫瘍抗原のペプチドが含まれる。ある特定の実施形態では、Ｂ２Ｍ−／−細胞は、患者の自己抗原または新抗原を含まないペプチドに共有結合した１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現する。１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質およびこの１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質に提示されるペプチド抗原を、レシピエントで誘発され得る免疫応答を調節するように設計することは当業者の能力の範囲内である。
【００４２】
１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質に共有結合または非共有結合した特異的ペプチド抗原を含む１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現する単離Ｂ２Ｍ−／−細胞を、例えば、レシピエントに投与して免疫応答を誘発するために使用することができる。従って、関連する態様では、本発明は、本発明の単離細胞を含むワクチンを提供し、このワクチンは、標的ペプチド抗原に特異的な免疫応答をレシピエントで誘発することができる。この免疫応答には、限定されるものではないが、細胞性免疫応答および／または体液性免疫応答が含まれる。このワクチンは、幹細胞または分化細胞を含んでも良く；ある特定の実施形態では、このような細胞は、分化樹状細胞である。他の一定の実施形態では、この細胞は、サイトカインをさらに発現する。任意の適切なサイトカインを使用することができ；ある特定の実施形態では、このようなサイトカインはＩＬ２またはＩＦＮ−γである。好ましい一定の実施形態では、この細胞はヒト細胞であり、このレシピエントはヒトである。
【００４３】
１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質は、Ｂ２Ｍ−／−細胞でのタンパク質の一過性の発現、より好ましくは安定した発現を可能にする発現ベクターから発現させることができる。例示的な適切な発現ベクターは、当分野で公知である。このような一例は、レトロウイルスベクターであり、レトロウイルスベクターは、細胞のゲノムに組み込まれて、外来性遺伝子を長期間安定して発現させる。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルス型のヒト泡沫状ウイルスに由来する。他の適切なウイルスベクターには、限定されるものではないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、およびポックスウイルスが含まれる。
【００４４】
一定の好ましい実施形態では、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質をコードできるポリヌクレオチドが、安定した発現のために、細胞の染色体、好ましくはＢ２ＭまたはＨＬＡ遺伝子座に組み込まれる。従って、好ましい一定の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子座は、内因性野生型Ｂ２Ｍタンパク質の発現の代わりとなるように１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質をコードすることができるポリヌクレオチドをこのＢ２Ｍ遺伝子座に挿入することによって改変される。このような遺伝子ターゲッティングの結果、正常なＢ２Ｍの発現が改変されて、野生型ＨＬＡクラスＩタンパク質の形成が防止されるが、普通ならＢ２Ｍが欠損する細胞の表面に最適な所定の１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質の発現は可能である。他の発現ベクターも考えられ、適切な発現ベクターの選択は、当業者の能力の範囲内である。
【００４５】
ベクターの設計によると、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現することができるポリヌクレオチドが、ウイルス感染（ウイルスベクターが使用される場合）によって、または限定されるものではないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、遺伝子ターゲッティング、またはリポソーム媒介ＤＮＡ送達を含む他の送達方法によって細胞に送達される。
【００４６】
１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現するＢ２Ｍ−／−細胞のあらゆる免疫効果を様々な手段によって試験することができる。例えば、ＳＣ融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現するＢ２Ｍ−／−細胞は、抗原提示樹状細胞（ｉＤＣ）に分化することができる。ＮＫ細胞誘導溶解の抑制を、正常なヒトＮＫ細胞およびＮＫＬ細胞株と共にｉＤＣをインキュベートした後にクロム放出アッセイによって測定することができる。様々なコントロール（非形質導入Ｂ２Ｍ−／−ｉＤＣ、Ｂ２Ｍ＋／＋ｉＤＣ、７２１．２２１クラスＩ陰性細胞株、ならびに抗受容体抗原および抗ＨＬＡ抗体）を使用して、相互作用の特異性を確立することができる。さらなる特徴付けは、細胞をＴ細胞と共にインキュベートすることによってＥｌｉｓｐｏｔアッセイで行うことができる。
【００４７】
関連する態様では、本発明は、ＨＬＡクラスＩ型Ｂ２Ｍ−／−細胞バンクを提供し、この細胞バンクの細胞は、Ｂ２Ｍ−／−遺伝的背景を含み、ＨＬＡα鎖がＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、およびＨＬＡ−Ｇからなる群から選択される１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質の１つ以上の型を発現するように組み換えられている。一定の実施形態では、この細胞バンクは、ＨＬＡα鎖がＨＬＡ−Ａを含む１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現する細胞集団を含む。他の一定の実施形態では、この細胞バンクは、ＨＬＡα鎖がＨＬＡ−Ｂを含む１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現する細胞集団を含む。さらなる一定の実施形態では、この細胞バンクは、ＨＬＡα鎖がＨＬＡ−Ｃを含む１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現する細胞集団を含む。なお他の実施形態では、この細胞バンクは、ＨＬＡα鎖がＨＬＡ−Ｅを含む１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現する細胞集団を含む。他の一定の実施形態では、この細胞バンクは、ＨＬＡα鎖がＨＬＡ−Ｆを含む１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現する細胞集団を含む。ある特定の実施形態では、この細胞バンクは、ＨＬＡα鎖がＨＬＡ−Ｇを含む１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現する細胞集団を含む。ある特定の実施形態では、この細胞バンクは、上記の１つ以上の細胞集団、好ましくはすべての細胞集団を含む。
【００４８】
細胞バンクの細胞は、多能性幹細胞または分化細胞とすることができる。ある特定の実施形態では、細胞バンクは、同じ１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現する異なる型の分化細胞、例えば、皮膚細胞、膵島β細胞などを含む。一方、他の実施形態では、細胞バンクは、それぞれが異なる１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現する異なる型の分化細胞、例えば、皮膚細胞、膵島β細胞などを含む。所与の患者に適したドナー細胞の細胞バンクからの選択を、熟練した研究者または臨床医によって決定することができる。他の一定の実施形態では、細胞バンクの一部の細胞は、細胞が投与される患者のＨＬＡクラスＩアレルに一致するＨＬＡクラスＩアレルを発現する。好ましい一定の実施形態では、この細胞はヒト細胞であり、この患者はヒトである。ある特定の実施形態では、細胞は、米国の人口の大部分のＨＬＡアレルに一致するＨＬＡ−Ａ０２０１およびＢ２Ｍを含む１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現する。
【００４９】
別の態様では、本発明は、有効量の本発明の細胞を移植のために患者に投与するステップを含む、移植を必要とする患者への移植の方法を提供する。Ｂ２Ｍ−／−細胞は、細胞表面に野生型ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現しないため、この細胞は、患者に投与されても、免疫応答を患者に殆どまたは全く誘発しない。従って、Ｂ２Ｍ−／−細胞を用いた移植では、免疫抑制療法を行う必要性が限られる。従って、好ましい一定の実施形態では、患者は、免疫適格である。他の一定の実施形態では、この細胞は、同質遺伝子細胞（同系細胞）（ｉｓｏｇｅｎｅｉｃ  ｃｅｌｌ）であるが；他の実施形態では、この細胞は、同種異系細胞（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｃｅｌｌ）である。
【００５０】
さらなる一定の実施形態では、本発明の細胞は多能性幹細胞であるが；他の実施形態では、本発明の細胞は分化細胞である。好ましい一定の実施形態では、この細胞はヒト細胞であり、この患者はヒト患者である。ある特定の実施形態では、移植の方法は、有効量の多能性幹細胞または分化細胞をヒトに投与するステップを含む。好ましい一定の実施形態では、本発明の細胞は、１つ以上の組換え１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質をさらに発現する。他の一定の実施形態では、細胞は、移植後にＮＫ細胞誘導死を回避することができ、かつ免疫応答をレシピエントに殆どまたは全く誘発しない。
【００５１】
移植療法、補充療法、または再生療法は、患者に細胞または組織を投与して、標的器官における細胞の機能不全を補うまたは置換することによる病状の療法を指す。ある特定の実施形態では、移植の必要性は、組織または器官の身体的または物理的障害の結果として生じる。他のある特定の実施形態では、移植の必要性は、患者における１つ以上の遺伝的欠陥または変異の結果として生じ、本発明の細胞の移植は、患者の原因となっている遺伝子変異を修正する遺伝子療法を必要とすることなく、患者の細胞の機能不全を補うまたは置換する。さらなる一定の実施形態では、移植は、限定されるものではないが、造血幹細胞移植、あるいは、器官、例えば、肝臓、腎臓、膵臓、肺、脳、筋肉、心臓、消化管、神経系、皮膚、骨、骨髄、脂肪、結合組織、免疫系、または血管に取り込まれる細胞の移植を含む。ある特定の実施形態では、標的器官は固形臓器である。
【００５２】
ある特定の実施形態では、レシピエントに投与される細胞は、このような療法を必要とする器官に取り込まれても良いし、または取り込まれなくても良い。一定の実施形態では、本発明の細胞は、移植の前または後に所望の細胞型に分化し、移植部位の組織に取り込まれなくても必要な細胞機能を果たす。例えば、糖尿病を治療する一定の実施形態では、本発明の細胞は、多能性幹細胞または分化膵島β細胞として、糖尿病患者に移植される。移植された細胞は、機能する膵臓を構成する必要はなく：これらの細胞は、血糖値に応答してインスリンを分泌するだけで良い。ある特定の実施形態では、この細胞は、異所性部位に移植され、膵臓に完全には取り込まれない。本発明の細胞集団、本発明の分化細胞、または本発明の細胞から生体外で分化して発生した組織はすべて、本発明によって企図される。好ましい一定の実施形態では、細胞はヒト細胞であり、この患者はヒト患者である。他の好ましい一定の実施形態では、本発明の細胞は、１つ以上の１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現する。
【００５３】
さらなる態様では、本発明は、有効量の本発明の細胞を患者に投与して病状を治療するステップを含む、病状の治療を必要とする患者の病状を治療する方法を提供し、この病状は、糖尿病、自己免疫疾患、癌、感染症、貧血、白血球減少症、心筋梗塞、心不全、骨格もしくは関節の症状、骨形成不全症、または火傷である。ある特定の実施形態では、病状は、組織または器官の生理的または物理的障害から生じる。一定の実施形態では、本発明の細胞は幹細胞であるが；他の実施形態では、本発明の細胞は分化細胞である。好ましい一定の実施形態では、この細胞はヒト細胞であり、この患者はヒト患者である。ある特定の実施形態では、ヒト細胞は分化細胞である。生体外で本発明の細胞から発生した組織の移植も本発明によって企図される。好ましい一定の実施形態では、本発明の細胞は、１つ以上の１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質をさらに発現する。一定の実施形態では、細胞は、同質遺伝子細胞であるが；他の実施形態では、細胞は、同種異系細胞である。
【００５４】
ある特定の実施形態では、この細胞は、限定されるものではないが、樹状細胞、リンパ球、赤血球、血小板、造血細胞、膵島細胞、肝細胞、筋細胞、ケラチノサイト、心筋細胞、神経細胞、骨格筋細胞、眼細胞、間葉細胞、線維芽細胞、肺細胞、消化管細胞、血管細胞、内分泌細胞、および脂肪細胞を含む分化細胞である。他のある特定の実施形態では、本発明は、固形臓器の病状を治療する方法を提供する。一定の実施形態では、病状の治療に使用される本発明の細胞は、１つ以上の１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現する。
【００５５】
疾患または障害を有する患者の「治療」とは、以下の１つ以上を達成することを意味する：（ａ）疾患の重症度を下げること；（ｂ）疾患または障害の進行を止めること；（ｃ）疾患または障害の悪化を抑制すること；（ｄ）以前に疾患または障害に罹患した患者の疾患または障害の再発を限定または防止すること；（ｅ）疾患または障害を退行させること；（ｆ）疾患または障害の症状を改善または取り除くこと；および（ｆ）生存率を改善すること。好ましい一定の実施形態では、疾患または障害は、組織または細胞の移植によって治療することができる疾患または障害である。
【００５６】
移植または病状の治療に対する本発明の単離細胞の有効量は、多数の因子、例えば、組織型、病状の重症度、移植反応、移植の理由、ならびに患者の年齢および全身の健康状態によって異なる。有効量は、熟練した研究者または臨床医が通常の業務で決定することができる。移植細胞の免疫原性が低下するため、所望の治療効果を達成するために比較的大量の細胞を患者が許容し得る。あるいは、所望の治療効果が達成されるまで細胞を周期的に繰り返し移植することができる。
【００５７】
本発明の細胞の投与経路は、特定の経路に限定されるものではない。例示的な投与経路には、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、経皮、皮内、および皮下経路が含まれる。本発明の細胞は、注射によって局所的に投与することもできる。例えば、損傷した関節、骨折した骨、梗塞部位、虚血部位、またはそれらの周辺に細胞を注射することができる。
【００５８】
ある特定の実施形態では、この細胞は、限定されるものではないが、シリンジを含む送達器具によって投与される。例えば、細胞は、このような送達器具内に収容された溶液または医薬組成物中に懸濁することができる。「溶液」または「医薬組成物」は、生理学的に適合した緩衝液、および任意選択で本発明の細胞が生き残る薬学的に許容され得る担体または希釈液を含む。このような担体および希釈液の使用は、当分野で周知である。このような溶液には、限定されるものではないが、生理学的に適合した緩衝液、例えば、ハンクス液、リンガー液、または生理緩衝食塩水が含まれる。細胞は、生存能力が低下することなく溶液または医薬組成物中に短期間保存することができる。ある特定の実施形態では、この細胞は、当分野で周知の冷凍保存法に従って、生存能力が低下することなく長期間保存される。
【００５９】
水性注射懸濁液は、その粘度を高める物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含み得るが、なお、シリンジ注入によって容易に送達できる程度の液体である。この溶液は、好ましくは、無菌であり、製造および保存の条件下で安定であり、かつ、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサールなどの使用によって微生物汚染されない。溶液中に含まれる細胞は、薬学的に許容され得る担体または希釈液、および必要に応じて上記の他の成分に含められた、本明細書に記載された幹細胞または分化細胞とすることができる。
【００６０】
この細胞は、全身投与（例えば、静脈内）または局所投与（例えば、エコー図の誘導下で心筋欠損部に直接的に投与、または観血手術中にアクセス可能な損傷組織または器官に直接適用によって投与）することができる。注射用の場合、細胞は、注射可能な液体懸濁調製物、または注射可能な液体形態であって損傷組織部位で半固体になる生体適合性媒体に含めることができる。送達中の細胞の物理的損傷を回避するように針の内腔が十分な直径（例えば、少なくとも３０ゲージ以上）であれば、シリンジ、制御可能な内視鏡送達器具、または他の同様の器具を使用することができる。
【００６１】
他の一定の実施形態では、この細胞は、固体支持体、例えば、平面体（ｐｌａｎａｒ  ｓｕｒｆａｃｅ）または３次元マトリックスによって移植することができる。マトリックスまたは平面体は、患者の適切な部位に外科手術によって移植される。例えば、膵臓移植を必要とする患者では、分化細胞が設けられた固体支持体を膵臓組織に外科手術によって移植することができる。例示的な固形支持体には、限定されるものではないが、パッチ、ゲルマトリックス（例えば、ファーマシア・アップジョン社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｕｐｊｏｈｎ）のＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標））、ポリビニルアルコールスポンジ（ＰＶＡ）−コラーゲンゲル移植片（例えば、イバロン（ＩＶＡＬＯＮ）、ユニポイント・インダストリーズ社（Ｕｎｉｐｏｉｎｔ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、ハイポイント（Ｈｉｇｈ  Ｐｏｉｎｔ）、ノースカロライナ州）、および他の同様もしくは同等の器具が含まれる。様々な他の被包技術を本発明の細胞に使用することができる。例えば、国際公開第９１／１０４７０号、同第９１／１０４２５号、米国特許第５，８３７，２３４号明細書；同第５，０１１，４７２号明細書：同第４，８９２，５３８号明細書）を参照されたい。
【００６２】
本発明の細胞は、限定されるものではないが、造血細胞、間葉細胞、膵臓内胚葉細胞、心臓細胞、およびケラチノサイト細胞を含め、３つすべての系列の様々な細胞型に分化することができる。一定の実施形態では、このような分化細胞は、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質をさらに発現する。一般に、各細胞型は、ＨＬＡクラスＩタンパク質発現、ヒトＴ細胞およびＮＫ細胞との反応性、適切な分化マーカー、およびｉｎ  ｖｉｖｏ発生能を検査するための免疫不全マウスにおける異種移植について分析することができる。図４を参照されたい。各分化細胞型の簡潔な説明を以下に示す。
【００６３】
一定の実施形態では、本発明の細胞は、現在は骨髄移植によって治療される様々な造血疾患の治療のために造血細胞に分化することができる。輸血を受ける患者は、ＨＬＡの不一致によって血小板輸血が効かなくなることがある。貧血または血小板減少患者は、出血または感染症を治療するために本発明の細胞由来の赤血球、血小板、または好中球を送達して治療することができる。
【００６４】
さらに、本発明の幹細胞由来の樹状細胞は、適切に組み換えられると細胞ワクチンとして使用できる抗原提示細胞である。一定の実施形態では、１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質および独特のペプチド抗原を発現するように組み換えられた本発明の細胞を使用して、特定の病原体または腫瘍抗原に対するワクチン接種をする。他の一定の実施形態では、特定の抗原に対してＨＬＡ制限反応性である分化Ｂ２Ｍ−／−細胞毒性リンパ球を使用して、感染細胞または腫瘍細胞を除去する。
【００６５】
造血細胞を得るために、多能性細胞が、先ず胚様体を形成するようにし、次いで非接着性細胞を造血サイトカインの存在下で培養して特定の細胞系統に成長させた。１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現する本発明の細胞由来の造血細胞の分化は、フローサイトメトリーおよびコロニーアッセイによって分析することができる。分化細胞集団を、その表面マーカーに基づいて保存し、これを使用して、ＨＬＡ遺伝子の発現、ならびにＥｌｉｓｐｏｔ、混合リンパ球反応、および細胞毒性アッセイによって測定されるヒトＮＫ細胞およびＴ細胞との反応性を監視する。１本鎖融合ＨＬＡ構築物のＮＫ細胞誘導死の抑制に対する有効性を、分化および移植の異なる段階で検査することができる。ビックス（Ｂｉｘ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９９１年、第３４９巻、ｐ．３２９〜３３１を参照されたい。造血幹細胞は、例えば、免疫不全マウス（ＳＣＩＤ再増殖細胞またはＳＲＣ）における異種移植モデルを用いてアッセイすることもできる。
【００６６】
本発明の細胞は、この細胞が患者に投与される前または後に造血細胞に分化することができる。好ましい一定の実施形態では、この細胞はヒト細胞であり、この患者はヒトである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの造血分化は、確立されたプロトコルに従って行うことができる。例えば、スラクビン（Ｓｌｕｋｖｉｎ）ら著、ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ）、２００６年、第１７６巻、ｐ．２９２４〜３２、およびチャン（Ｃｈａｎｇ）ら著、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、２００６年、第１０８巻、ｐ．１５１５〜２３を参照されたい。
【００６７】
他の一定の実施形態では、本発明の細胞は、間葉幹細胞に分化することができる。一定の実施形態では、本発明の細胞は、１つ以上の１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現する。ＭＳＣは、骨髄間質細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、および軟骨細胞を含むいくつかの分化細胞型を形成する能力を有する。従って、多能性幹細胞を誘導してＭＳＣ（ｉＭＳＣ）を形成することは、骨格および関節の症状の治療に有用である。ｉＭＳＣは、骨芽細胞にさらに分化して、ｉｎ  ｖｉｖｏで骨を形成することができる。デイル（Ｄｅｙｌｅ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２０１２年、第２０（１）巻、ｐ．２０４〜１３。Ｔ細胞およびＮＫ細胞のＥＳＣ、ｉＭＳＣ、およびこれらのさらに最終的に分化した派生物、例えば、骨芽細胞に対する細胞応答を検査することができる。
【００６８】
ある特定の実施形態では、間葉幹細胞は、限定されるものではないが、細胞型、例えば、骨髄間質細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、骨細胞、および軟骨細胞に分化することができる。本発明の細胞は、患者に投与される前または後に間葉幹細胞に分化される。好ましい一定の実施形態では、この細胞はヒト細胞であり、この患者はヒトである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの間葉分化は、確立されたプロトコルに従って行うことができる。例えば、デイル（Ｄｅｙｌｅ）ら著、上記を参照されたい。
【００６９】
なお他の特定の実施形態では、本発明の細胞は、インスリン産生膵島細胞に分化することができる。一定の実施形態では、本発明の細胞は、１つ以上の１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現する。本発明の細胞を使用して、インスリン依存性糖尿病を治療することができる。有利なことに、移植された細胞は、機能する膵臓を再構築する必要がなく：血糖値に応じてインスリンを分泌するだけで良い。従って、この治療は、異なる細胞用量でも、成熟細胞型に完全には分化していない細胞でも、そして細胞が異所性部位に移植されたときにも成功し得る。特定の自己抗原、例えば、ＧＡＤ６５またはインスリン由来の抗原は、糖尿病におけるβ細胞の自己免疫破壊を引き起こし得る（ディ・ロレンゾ（Ｄｉ  Ｌｏｒｅｎｚｏ）ら著、クリニカル・アンド・エクスペリメンタル・イムノロジー（Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ）、２００７年、第１４８巻、ｐ．１〜１６）。従って、Ｂ２Ｍ−／−細胞、または所定のペプチド抗原を提示する１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現するＢ２Ｍ−／−細胞は、これらの自己抗原を提示せず、かつ自己免疫拒絶を回避して移植後の糖尿病の再発を防止できるというさらなる利点を提供する。
【００７０】
本発明の細胞は、既に説明したように膵臓細胞に分化することができ、この分化は、細胞の様々なサイトカインおよび薬物への曝露を利用して、内胚葉系中胚葉、最終的内胚葉（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ）、および膵臓前駆体の連続的な形成を促進する（クルーン（Ｋｒｏｏｎ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２００８年、第２６巻、ｐ．４４３〜４５２）。これらの細胞は、免疫不全マウスにおける移植片でさらに培養することができる。１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現するまたは発現しない本発明の細胞および野生型細胞株を、様々な成長段階でＴ細胞およびＮＫ細胞との反応性について分析することができる。
【００７１】
本発明の細胞は、患者への投与の前または後に膵島細胞に分化する。好ましい一定の実施形態では、この細胞はヒト細胞であり、この患者はヒト患者である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの造血分化は、確立されたプロトコルに従って行うことができる。例えば、クルーン（Ｋｒｏｏｎ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２００８年、第２６巻、ｐ．４４３〜４５２を参照されたい。
【００７２】
他のある特定の実施形態では、本発明の細胞は、心筋細胞に分化することができる。一定の実施形態では、本発明の細胞は、１つ以上の１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質をさらに発現する。心筋梗塞および虚血性心不全の共通の臨床上の問題は、機能的心筋を移植および再建する健康な幹細胞由来心筋細胞を移植することによって対処することができる。本発明の細胞由来の心筋細胞により、これらの治療を事前にパッケージングされた細胞で行って、現在は同種心臓移植に必要な免疫抑制を回避することができる。生理学的に適切な試験、例えば、電気伝導および収縮試験を、本発明の細胞に由来する心筋細胞に対して行うことができる。１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現するまたは発現しないＢ２Ｍ−／−幹細胞または分化心筋細胞を試験して、心筋細胞遺伝子を発現するときのそれらの免疫学的反応性を決定して、どのＨＬＡの変更がそれらの免疫応答を最小限にするかを立証する。
【００７３】
本発明の細胞は、患者に投与される前または後に心筋細胞に分化することができる。好ましい一定の実施形態では、この細胞はヒト細胞であり、この患者はヒトである。一定の実施形態では、本発明の細胞は、限定されるものではないが、心筋梗塞および虚血性心不全を含む疾患を治療するために心筋細胞に分化する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの心筋細胞分化は、確立されたプロトコルに従って行うことができる。例えば、ラファイアム（Ｌａｆｉａｍｍｅ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２００７年、第２５巻、ｐ．１０１５〜１０２４を参照されたい。
【００７４】
なお他の特定の実施形態では、本発明の細胞は、ケラチノサイトに分化することができる。一定の実施形態では、ケラチノサイトへの分化に使用することができる本発明の細胞は、１つ以上の１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現する。重度の火傷および遺伝的皮膚疾患は、皮膚移植片を用いた治療を必要とし、この治療は現在、様々な細胞源、例えば、ブタ皮膚移植片および培養された自己ヒトケラチノサイトを用いて行われている。本発明の細胞に由来するケラチノサイトは、火傷を、予めパッケージングされた細胞で緊急事態として治療することができ、かつ遺伝的疾患、例えば、表皮水疱症を、原因である遺伝子変異の修正を必要としない正常細胞（細胞染色体のＢ２Ｍ−／−背景でも）で治療できるため、大きな臨床的進歩をもたらす。多くの場合、この細胞は、近傍の宿主細胞が患部で再増殖するのに十分な長さで移植するだけで良い。図５は、本発明の細胞由来のケラチン５＋およびケラチン１４＋ケラチノサイトコロニーのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化を示している。本発明の細胞は、マトリゲル培養で培養し、次いで既に説明したようにオールトランス型レチノイン酸およびＢＭＰ４を含む無血清ケラチノサイト培地で増殖させる（イトウ（Ｉｔｏｈ）ら、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ）、２０１１年、第１０８巻、ｐ．８７９７〜８８０２）。ｉｎ  ｖｉｖｏ分化の場合、本発明の細胞を、レシピエントに移植するためのポリビニルアルコールスポンジ（ＰＶＡ）−コラーゲンゲル移植片に埋め込むことができる。本発明の細胞は、移植の前または後にケラチノサイトに分化することができる。好ましい一定の実施形態では、この細胞はヒト細胞であり、患者はヒトである。
【００７５】
なお別の態様では、本発明は、移植用薬剤の調製における本発明の細胞の使用を提供する。関連する態様では、本発明は、病状の治療用薬剤の調製における本発明の細胞の使用を提供する。
【００７６】
さらに、本発明の細胞は、Ｂ２Ｍ−／−遺伝的背景における免疫調節タンパク質の機能を試験するシステムを提供する研究ツールとして機能し得る。一定の実施形態では、本発明の細胞は、１つ以上の１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質をさらに発現する。従って、関連する態様では、本発明は、免疫調節タンパク質の機能を決定する方法を提供し、この方法は、１つ以上の免疫調節遺伝子を本発明の本発明の細胞に導入するステップ、およびこの免疫調節遺伝子の活性についてアッセイするステップを含む。好ましい一定の実施形態では、この細胞はヒト細胞である。例えば、本発明の細胞を使用して、不所望のクラスＩ抗原の非存在下で、免疫調節遺伝子の機能を試験する、または免疫応答を試験することができる。一定の実施形態では、本発明の細胞は、ＨＬＡ−Ｆ、またはＢ２ＭおよびＨＬＡ−Ｆを含む１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を発現し、ＨＬＡ−Ｆの機能をＢ２Ｍ−／−背景で試験することができる。さらなる関連する態様では、本発明は、免疫調節タンパク質の機能を調節する化合物または分子を同定する方法を提供し、この方法は、１つ以上の免疫調節遺伝子を含むＢ２Ｍ−／−細胞を目的の化合物または分子に接触させるステップ、および免疫調節遺伝子の活性についてアッセイするステップを含む。好ましい一定の実施形態では、この細胞はヒト細胞である。
【００７７】
なお別の関連する態様では、本発明は、哺乳動物、特に非ヒト霊長類におけるｉｎ  ｖｉｖｏ研究ツールを提供し、この研究ツールは、免疫調節遺伝子の機能を試験するため、またはＢ２Ｍ−／−遺伝的背景において投与された細胞の免疫調節遺伝子の機能を調節する化合物を同定するために本発明の細胞を投与する。一定の実施形態では、本発明の細胞は、１つ以上の１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質をさらに発現する。
【００７８】
マウス、特に免疫不全マウスを、ヒト細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験するためのモデル系として使用した。ヒト幹細胞は、マウスにおいて異なって振舞い得る。加えて、マウスおよびヒト免疫系は、異なるＮＫ細胞受容体および非古典的ＨＬＡクラスＩ遺伝子（例えば、ＨＬＡ−Ｅ、Ｆ、およびＧ）を有する。従って、本発明の細胞を試験するために、ブタオザル（Ｍｎ，ｐｉｇｔａｉｌｅｄ  ｍａｃａｑｕｅ）モデルを作製することができる。アカゲザルのゲノムを配列決定すると、このゲノムは、ブタオザルゲノムのゲノムに対して高度に相同である。さらに、マカクＭＨＣ遺伝子座の構成は、非古典的遺伝子を含む、ヒトＨＬＡに類似している。ヒトＨＬＡ−ＥおよびＨＬＡ−Ｇ遺伝子の相同体がマカクで同定されている。マカクＭＨＣ遺伝子座は、多くのヒトＮＫ細胞受容体の相同体も含む。ヒトＢ２Ｍ−／−ＥＳＣおよびＭｎ  Ｂ２Ｍ−／−ＥＳＣを、マカクの移植に使用することができる。
【００７９】
ＭＨＣクラスＩ欠損（Ｂ２Ｍ−／−）マカクＥＳＣを、ヒト細胞について説明したものと同じＡＡＶ媒介遺伝子ターゲッティング戦略を用いて作製することができる。Ｍｎ版の１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質を、上記説明した類似のウイルスベクターを用いてＢ２Ｍ−／−マカクＥＳＣで発現させる。
【００８０】
細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させて、移植された細胞の後の同定のためにＧＦＰを発現するベクターで標識することができる。細胞は、ポリビニルアルコールスポンジ（ＰＶＡ）−コラーゲンゲル移植片に埋め込んで、マカクの皮下に配置することができる。この移植片を取り出して、薄片にし、そして染色して、存在する細胞型を決定することができる。特異的抗体を使用して、移植された細胞によって形成された分化細胞型を同定することができる。
【００８１】
上記説明したどの実施形態も、別段の記載がない限り、本発明のどの態様にも適用される。様々な態様の範囲内の実施形態および様々な態様間の実施形態はすべて、別段の記載がない限り、組み合わせることができる。
【００８２】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態およびその様々な使用の実例である。これらの実施例は、単に説明目的で示すものであり、本発明の限定と解釈されるべきものではない。
（実施例）
実施例１  Ｂ２Ｍ遺伝子におけるノックアウト変異を有するヒト多能性幹細胞の作製
ヒト多能性幹細胞を、すべてのＨＬＡクラスＩヘテロ二量体（ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧ）の表面発現に必要な共通のサブユニットをコードするβ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子の両方のアレルのノックアウト変異を用いて作製した。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子ターゲッティングベクターを用いて、Ｂ２Ｍ−／−（クラスＩ陰性）Ｈ１ヒトＥＳＣを作製した（ウィスコンシン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ））。ヒト多能性幹細胞をＡＡＶ遺伝子ターゲッティングベクターに感染させて、Ｂ２Ｍ遺伝子を、相同的組換えによって不活化させた。ＡＡＶ媒介遺伝子ターゲッティング法は、例えば、カーン（Ｋｈａｎ）ら著、プロトコル（Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）、２０１１年、第４８２巻、ｐ．４８２〜５０１、およびカーン（Ｋｈａｎ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９０年、第２４８巻、ｐ．１２２７〜３０に既に説明されている。これらの参考文献は、参照によりそれらの全容が本明細書に組み入れられるものとする。
【００８３】
図１は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子ターゲッティングベクターを用いたＨＬＡクラスＩ陰性ヒトＨ１  ＥＳＣ細胞の作製を示している。使用される２つのＡＡＶベクターは、ヒトＢ２Ｍ遺伝子のエキソン１を取り囲んでいる相同アームを含み、Ｇ４１８耐性またはハイグロマイシン耐性をそれぞれコードするＴＫＮｅｏまたはＨｙＴＫ融合遺伝子のいずれかをエキソン１に挿入するように設計されている（図１のＡ）。Ｈ１  ＥＳＣをＡＡＶ−Ｂ２Ｍ−ＥＴＫＮｐＡベクターに感染させ、Ｇ４１８耐性細胞の３０％が、サザンブロット分析に基づき一方のＢ２Ｍアレルにおける標的となった。次いで、これらのクローンの１つをＡＡＶ−Ｂ２Ｍ−ＥＨｙＴＫｐＡベクターに感染させ、ハイグロマイシン耐性細胞の１０％がＢ２Ｍにおける標的となった。両方のＢ２Ｍアレル（Ｂ２Ｍ−／−）に欠失を有する代表的なクローンのサザンブロット分析が、図１のＢに示されている（ＨｙＴＫ／ＴＫＮ）。分析された標的クローンのいずれも、ランダムな要素（ｒａｎｄｏｍ  ｉｎｔｅｇｒａｎｔ）を含んでいなかった。ターゲッティングベクタープラスミドｐＡ２−Ｂ２ＭＥＴＫＭｐＡおよびｐＡ２−Ｂ２ＭＥＨｕＴＫｐＡの配列をそれぞれ、配列番号２１および配列番号２２に示す。
【００８４】
次いで、Ｃｒｅリコンビナーゼを用いて、Ｂ２Ｍ遺伝子座から、ｌｏｘＰで挟まれた（ｆｌｏｘｅｄ）ＴＫＮｅｏおよびＨｙＴＫ導入遺伝子を除去した。Ｃｒｅは、非組み込み泡沫状ウイルスベクターによって一過性に送達され、この非組み込み泡沫状ウイルスベクターは、ヒトＥＳＣを効率的に感染させる既に説明されたレトロウイルスベクターの一種である。デイル（Ｄｅｙｌｅ）ら著、ジャーナル・オブ・バイオロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ）、２０１０年、第８４巻、ｐ．９３４１〜９、およびガーワン（Ｇｈａｒｗａｎ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ）、２００７年、第１５巻、ｐ．１８２７〜１８３３を参照されたい。ＴＫＮｅｏおよびＨｙＴＫ導入遺伝子が欠失した４つのクローンを、チミジンキナーゼ（ＴＫ）を発現する細胞を死滅させるガンシクロビル部分によって選択した。サザンブロット分析によって示された結果は、導入遺伝子を含まない二重ノックアウトを実証した（図１のＢ）。
【００８５】
これらのクローンの２つに対して核型をチェックして正常であることが分かり（データ不図示）、免疫不全マウスに対して行った奇形腫アッセイにより、これらの細胞が、３血球系発生能を有することが示された（図２）。Ｂ２Ｍに対する抗体（サンタルーズ・バイオテクノロジー社（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の抗Ｂ２Ｍ−０１−ＰＥ）およびｐａｎ−ＨＬＡクラスＩ抗原（（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のＷ６／３２）を用いたフローサイトメトリーにより、これらの細胞が、その表面上にＨＬＡクラスＩタンパク質を発現しないことが確認された（図１のＣ）。
【００８６】
実施例２  Ｂ２Ｍノックアウト細胞における１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質の発現
マウスにおいて、ＨＬＡクラスＩ陰性細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による「ミッシングセルフ（ｍｉｓｓｉｎｇ  ｓｅｌｆ）」機構を通じて破壊され得る。ビックス（Ｂｉｘ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９９１年、第３４９巻、ｐ．３２９〜３３１。ヒトＮＫ細胞は異なる受容体を有するが、ＮＫ細胞傷害の類似した抑制は、ＨＬＡ−Ｃ、Ｅ、およびＧとＮＫ細胞受容体との相互作用によって仲介される。「ミッシングセルフ」現象は、クラスＩ欠損造血細胞に関して詳しく説明されている。多くの型のＢ２Ｍ−／−器官がＢ２Ｍ＋／＋宿主で生き残ることを示す既報告のマウス移植データは、移植する細胞が固形臓器を形成する際に「ミッシングセルフ」現象がそれほど重要ではない可能性を示唆している。しかしながら、「ミッシングセルフ」現象が一部の状況でドナー細胞の生存に有意に影響を与え得ることを考慮し、ＮＫ細胞傷害を抑制する特定のＨＬＡクラスＩ遺伝子を１本鎖融合タンパク質としてＢ２Ｍ−／−細胞に導入した。
【００８７】
Ｂ２Ｍ−／−背景において特定のＨＬＡクラスＩ遺伝子を発現させる戦略が図３に示されている。Ｂ２Ｍ鎖が特定のＨＬＡクラスＩ重鎖に融合され、これにより、たとえＢ２Ｍ−／−細胞であってもこのクラスＩ鎖の表面発現が可能となった。組み込み泡沫状ウイルスベクターを用いて、これらの１本鎖融合タンパク質を発現させた。泡沫状ウイルスベクターは、ヒト多能性幹細胞に十分に感染することができる大きなパッケージング能力を有するレトロウイルスベクター型である（ガーワン（Ｇｈａｒｗａｎ）ら著、上記）。このような代表的な１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質泡沫状ウイルス構築物の１つが図３のＡに示されている。ΔΦ−ＥＧＰ−ＰＨＬＡ−ＳＣ泡沫状ベクターは、ＥＦ１αプロモータによって駆動されるＧＦＰ−Ｐｕｒｏ融合タンパク質遺伝子と、ＨＬＡ１本鎖融合（ＨＬＡ−ＳＣ）構築物を駆動する遍在的に発現されるＰＧＫプロモータを有する別個の発現カセットとを含んでおり（図３のＡ）、ＧＦＰ−Ｐｕｒｏ融合タンパク質遺伝子は、形質導入細胞でのピューロマイシン選択およびＧＦＰ発現を可能にする。このベクターの設計は、両方の導入遺伝子の構成的発現をもたらしたが、多くの他のベクターの設計および内部プロモータも使用することができる。例えば、ＧＦＰ−Ｐｕｒ遺伝子を、ｐＧＫプロモータによって駆動させることができ、ＥＦ１αプロモータが、ＳＣ  ＨＬＡ遺伝子の発現を制御する。
【００８８】
図３のＢに示されているように、ＨＬＡ−ｂＧＢＥ三量体１本鎖融合構築物は、ＨＬＡ−Ｅペプチド結合クレフトに共有結合したＨＬＡ−Ｇペプチド（配列番号２３）を含み、一方、ＨＬＡ−ｇＢＥ二量体構築物は、切断されているがなおＨＬＡ−Ｅ分子に非共有結合したＨＬＡ−Ｇシグナルペプチドを含んでいた。クルー（Ｃｒｅｗ）ら著、モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ）、２００５年、第４２巻、ｐ．１２０５〜１２１４を参照されたい。Ｂ２Ｍ−／−細胞に、これらのベクターを用いて形質導入した。ピューロマイシン耐性クローンを選択し、ＨＬＡ−Ｅ表面発現を、これらの構築物を発現する多能性細胞におけるフローサイトメトリーによって分析した（図３のＣ）。
【００８９】
さらに、特定の古典的ＨＬＡクラスＩアレル１本鎖融合タンパク質を作製して、Ｂ２Ｍ−／−Ｈ１  ＥＳＣで発現させて、レシピエントとの適合性が向上するように「準万能」ドナー細胞を作製した。例えば、米国では、ＨＬＡ−Ａ０２０１アレルは、白人の４８％、ヒスパニック系の４６％、アフリカ系米国人の２４％に存在し、これらの全てが、ＨＬＡ−Ａ０２０１＋幹細胞を許容するはずである。ｗｗｗ．ａｌｌｅｌｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ．ｎｅｔおよびストークス（Ｓｔｏｒｋｕｓ）ら著、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ）、１９８９年、第８６巻、ｐ．２３６１〜２３６４を参照されたい。ＨＬＡ−ｂＢＡ０２０１二量体１本鎖融合構築物を、泡沫状ウイルスベクターによってＢ２Ｍ−／−Ｈ１  ＥＳＣに導入し（図３のＢ）、１本鎖融合タンパク質の発現をフローサイトメトリーによって分析した（図３のＤ）。
【００９０】
前述の開示が本発明のある特定の実施形態を強調していること、ならびにこれらの実施形態と等価な全ての変更および代替が添付の特許請求の範囲に示される本発明の概念および範囲内であることを理解されたい。
（付記）
好ましい実施形態として、上記実施形態から把握できる技術的思想について、記載する。
［項目１］
β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子のすべてのコピーに遺伝子組換え改変を含む単離細胞であって、前記細胞がヒト細胞であり、
該細胞は、１本鎖融合ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩタンパク質をコードすることができるポリヌクレオチドを含む１つ以上の組換え免疫調節遺伝子をさらに含み、
前記１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質が、直接またはリンカー配列を介して少なくとも１つのＨＬＡクラス−Ｉα鎖に共有結合した外来性Ｂ２Ｍタンパク質を含み、
前記ＨＬＡクラス−Ｉα鎖はＨＬＡクラス−Ｉ鎖タンパク質のシグナル配列を含むかまたは含まず、前記外来性Ｂ２Ｍタンパク質はＢ２Ｍタンパク質のシグナル配列を含むかまたは含まず、
前記細胞は正常核型を有し且つ非形質転換細胞である、単離細胞。
［項目２］
前記１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、およびＨＬＡ−Ｇからなる群から選択されるＨＬＡクラスＩα鎖に共有結合した前記Ｂ２Ｍタンパク質を含み、前記選択されるＨＬＡクラスＩα鎖は、当該ＨＬＡクラス−Ｉ鎖タンパク質のシグナル配列を含むかまたは含まない、項目１に記載の細胞。
［項目３］
前記１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質が、前記Ｂ２Ｍタンパク質、ならびに、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、およびＨＬＡ−Ａからなる群から選択されるＨＬＡクラスＩα鎖を含み、前記選択されるＨＬＡクラスＩα鎖は、当該ＨＬＡクラス−Ｉ鎖タンパク質のシグナル配列を含むかまたは含まない、項目１に記載の細胞。
［項目４］
前記１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質が、前記Ｂ２Ｍタンパク質、および、ＨＬＡ−Ａタンパク質のシグナル配列を含むかまたは含まないＨＬＡ−Ａを含む、項目１〜３のいずれか１項に記載の細胞。
［項目５］
前記１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質が、前記Ｂ２Ｍタンパク質、および、ＨＬＡ−Ａ０２０１タンパク質のシグナル配列を含むかまたは含まないＨＬＡ−Ａ０２０１を含む、項目１〜４のいずれか１項に記載の細胞。
［項目６］
前記１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質が、前記Ｂ２Ｍタンパク質、および、ＨＬＡ−Ｅタンパク質のシグナル配列を含むかまたは含まないＨＬＡ−Ｅを含む、項目１〜３のいずれか１項に記載の細胞。
［項目７］
前記１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質が、前記Ｂ２Ｍタンパク質、および、ＨＬＡ−Ｇタンパク質のシグナル配列を含むかまたは含まないＨＬＡ−Ｇを含む、項目１〜３のいずれか１項に記載の細胞。
［項目８］
前記１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質が、前記Ｂ２Ｍタンパク質および、ＨＬＡ−Ｂタンパク質のシグナル配列を含むかまたは含まないＨＬＡ−Ｂを含む、項目１または２に記載の細胞。
［項目９］
前記１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質が、前記Ｂ２Ｍタンパク質および、ＨＬＡ−Ｃタンパク質のシグナル配列を含むかまたは含まないＨＬＡ−Ｃを含む、項目１または２に記載の細胞。
［項目１０］
前記１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質が、前記Ｂ２Ｍタンパク質および、ＨＬＡ−Ｆタンパク質のシグナル配列を含むかまたは含まないＨＬＡ−Ｆを含む、項目１または２に記載の細胞。
［項目１１］
前記細胞が、前記１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質によって前記細胞の表面に提示される標的ペプチド抗原をさらに発現する、項目１〜１０のいずれか１項に記載の細胞。
［項目１２］
前記標的ペプチド抗原が、前記１本鎖融合ＨＬＡクラスＩタンパク質に共有結合している、項目１１に記載の細胞。
［項目１３］
前記細胞が、自殺遺伝子産物をコードすることができる１つ以上の組換え遺伝子をさらに含む、項目１〜１２のいずれか１項に記載の細胞。
［項目１４］
前記自殺遺伝子産物が、チミジンキナーゼおよびアポトーシスシグナル伝達タンパク質からなる群から選択されるタンパク質を含む、項目１３に記載の細胞。
［項目１５］
前記細胞が幹細胞である、項目１〜１４のいずれか１項に記載の細胞。
［項目１６］
前記幹細胞が、造血幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、肝幹細胞、神経幹細胞、膵幹細胞、および間葉幹細胞からなる群から選択される、項目１５に記載の細胞。
［項目１７］
前記幹細胞が多能性幹細胞である、項目１５または１６に記載の細胞。
［項目１８］
前記幹細胞が分化している、項目１５〜１７のいずれか１項に記載の細胞。
［項目１９］
前記分化細胞が、樹状細胞、膵島細胞、肝細胞、筋細胞、ケラチノサイト、神経細胞、造血細胞、リンパ球、赤血球、血小板、骨格筋細胞、眼細胞、間葉細胞、線維芽細胞、肺細胞、消化管細胞、血管細胞、内分泌細胞、脂肪細胞、および心筋細胞からなる群から選択される、項目１８に記載の細胞。
［項目２０］
項目１１または１２に記載の細胞を含むワクチンであって、前記標的ペプチド抗原に特異的な免疫応答を霊長類で誘発することができる、ワクチン。
［項目２１］
前記霊長類がヒトである、項目２０に記載のワクチン。
［項目２２］
項目１〜１９のいずれか１項に記載の細胞を含むキット。
［項目２３］
移植片をさらに含み、前記移植片が、項目１〜１９のいずれか１項に記載の細胞を含む、項目２２に記載のキット。
［項目２４］
免疫アジュバントをさらに含む、項目２０に記載のワクチンを含むキット。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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