(57)【要約】      （修正有）【課題】免疫グロブリン及び免疫グロブリンフラグメントのアフィニティークロマトグラフィーに有用な、アルカリ安定性の向上したポリペプチドの提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有する、ＰｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのプロテインＬの変異結合ドメインを含むκ軽鎖結合ポリペプチド。【選択図】図３
2020202855.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのプロテインＬの少なくとも１つの変異結合ドメインを含むκ軽鎖結合ポリペプチドであって、前記ドメインにおいて、配列番号２〜６若しくは１２によって定義されるか又は配列番号２〜６若しくは１２と少なくとも９５％若しくは９８％の配列同一性を有する親ドメインの少なくとも１つのアスパラギン残基が、アスパラギンでもプロリンでもシステインでもない別のアミノ酸残基に変異している、ポリペプチド。
【請求項２】
少なくとも変異Ｎ４５Ａ及び／又は変異Ｎ６０Ｑを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記変異、例えば各ドメインにおける前記変異が、Ｎ１０Ｑ；Ｎ４５Ａ；Ｎ６０Ｑ；Ｎ１０Ｑ、Ｎ４５Ａ；Ｎ４５Ａ、Ｎ６０Ｑ、Ｎ１０Ｑ、Ｎ６０Ｑ及びＮ１０Ｑ、Ｎ４５Ａ、Ｎ６０Ｑからなる群から、又はＮ４５Ａ；Ｎ１０Ｑ、Ｎ４５Ａ；Ｎ４５Ａ、Ｎ６０Ｑ、Ｎ１０Ｑ、Ｎ６０Ｑ及びＮ１０Ｑ、Ｎ４５Ａ、Ｎ６０Ｑからなる群から選択される、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
複数の変異結合ドメイン、例えば２、３、４、５又は６個のドメインを含むか又はそれらから本質的になり、各ドメインが、変異Ｎ４５Ａ及び／又はＮ６０Ｑを含み、前記ドメインが、場合により、最大１５個のアミノ酸を含む要素によって連結される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
０．１Ｍ  ＮａＯＨ水溶液中２２±２℃での９６〜１００回の１０分間のインキュベーションのサイクルの後のκ軽鎖含有タンパク質に対する残存結合容量によって測定されるアルカリ安定性が、親ポリペプチドと比較して改善される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記親ドメインが、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるか又は配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％若しくは９８％の配列同一性を有する、例えば、前記親ドメインが、配列番号４によって定義されるか又は配列番号４と少なくとも９５％若しくは９８％の配列同一性を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド又は多量体をコードする核酸又はベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸又はベクターを含む発現系。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の複数のポリペプチドが、固体支持体にカップリングされている、例えば、前記ポリペプチドが、多点結合によって前記固体支持体にカップリングされている、分離マトリックス。
【請求項１０】
０．１Ｍ  ＮａＯＨ中２２±２℃での１００回の１０分間のインキュベーションのサイクルの後のκ軽鎖含有タンパク質に対する前記マトリックスの結合容量が、前記インキュベーションの前の結合容量の少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、又は少なくとも５５％である、請求項９に記載の分離マトリックス。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の分離マトリックスが使用される、κ軽鎖含有タンパク質を単離する方法。
【請求項１２】
ａ）κ軽鎖含有タンパク質を含む液体試料を、請求項９又は１０に記載の分離マトリックスと接触させるステップ、
ｂ）前記分離マトリックスを、洗浄液で洗浄するステップ、
ｃ）前記κ軽鎖含有タンパク質を、溶出液を用いて前記分離マトリックスから溶出するステップ、及び
ｄ）前記分離マトリックスを、洗浄液で洗浄するステップ、
を含み、
場合により、ステップａ）〜ｄ）が、少なくとも１０回、例えば少なくとも５０回又は５０〜２００回繰り返される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記洗浄液が、例えばｐＨ１２〜１４を有するような、アルカリである、及び／又は、前記洗浄液が、０．０１〜１．０ＭのＮａＯＨ若しくはＫＯＨ、例えば０．０５〜１．０Ｍ若しくは０．０５〜０．１ＭのＮａＯＨ若しくはＫＯＨを含む、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アフィニティークロマトグラフィーの分野に関し、具体的には、プロテインＬのκ軽鎖結合ドメインを含むポリペプチドであって、様々な種類の免疫グロブリン及び免疫グロブリンフラグメントのアフィニティークロマトグラフィーに有用なポリペプチドに関する。本発明は、かかるポリペプチドを含む分離マトリックス及びかかる分離マトリックスを使用した分離方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリン及び免疫グロブリンフラグメントは、世界中で製造又は開発されている最も一般的なバイオ医薬製品である。この治療薬市場の高い商業的需要及びその価値のため、製薬会社は、付随するコストを抑制しながら、その生産プロセスの生産性を最大限にすることが重視されている。
【０００３】
典型的には、ブドウ球菌プロテインＡ又はその変異体を含むマトリックスによるアフィニティークロマトグラフィーは、インタクトな免疫グロブリン分子の精製における重要なステップの１つとして常用されている。免疫グロブリンのＦｃ鎖に対するプロテインＡの選択性の高い結合は、不純物及び夾雑物の除去率が非常に高い汎用ステップをもたらす。
【０００４】
Ｆｃ鎖を欠くが、κ軽鎖サブクラス１、３又は４を有する抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＢｉＴＥ；bispecific T-cell engager）、ドメイン抗体などに対しては、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｇｎｕｓ由来のプロテインＬを含むマトリックス（Ｂ  Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ，Ｌ  Ｂｊｏｒｃｋ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１９７４０−１９７４６，１９８９；Ｗ  Ｋａｓｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１２８２０−１２８２５，１９９２；ＢＨＫ  Ｎｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，２２３４−２２３９，１９９２及び米国特許第６８２２０７５号）が、所要の高い選択性をもたらす精製プラットフォームとして多大な有望性を示す。米国特許第６８２２０７５号に開示されたプロテインＬは、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端に追加のＡＶＥＮ配列を加えたものを含んでいる。
【０００５】
配列番号１（プロテインＬ）
KEETPETPETD  SEEEVTIKAN LIFANGSTQT AEFKGTFEKA TSEAYAYADT LKKDNGEYTV DVADKGYTLN IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAN LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADA LKKDNGEYTV DVADKGYTLN IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAN LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKENGKYTV DVADKGYTLN IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAN LIYADGKTQT AEFKGTFAEA TAEAYRYADL LAKENGKYTA DLEDGGYTIN IRFAGKKVDEKPEE。
【０００６】
プロテインＬマトリックスは、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン）からＣａｐｔｏ（商標）Ｌ（Ｃａｐｔｏ  Ｌデータファイル２９−０１００−０８  ＡＣ、２０１４）として市販されており、κ軽鎖含有タンパク質、例えば、インタクトな抗体、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、ドメイン抗体などの分離に使用することができる。健康なヒトによって産生される抗体の約７５％はκ軽鎖を有し、多くの治療用モノクローナル抗体及び抗体フラグメントはκ軽鎖を含む。
【０００７】
いずれのバイオプロセスクロマトグラフィー用途でも、夾雑物を確実に除去するための総合的な注意が必要である。かかる夾雑物は、例えば、クロマトグラフィー手順で固定相又はマトリックスに吸着される非溶出分子であることがあり、例えば、タンパク質、炭水化物、脂質、細菌及びウイルスを始めとする不要な生体分子又は微生物であることがある。マトリックスからのかかる夾雑物の除去は、通常、後で使用する前にマトリックスを再生しておくために、所望の生成物の最初の溶出後に行われる。かかる除去は、通常、定置洗浄（ＣＩＰ）として知られる手順を伴い、固定相から夾雑物を溶出させることのできる試薬が使用される。このような試薬としてクロマトグラフィー媒体で多用される部類のものは、マトリックスに流すアルカリ溶液である。現在最も広く使用されている洗浄剤及び消毒剤はＮａＯＨであり、夾雑の程度及び性状に応じて、０．０５Ｍ乃至１Ｍ程度の濃度で使用することが望ましい。しかし、プロテインＬは、プロテインＡなどと比べるとアルカリ感受性の高いタンパク質であり、多数のサイクルでは約１５ｍＭ以下のＮａＯＨにしか耐えられない。このことは、十分な洗浄を担保するには、あまり望ましくない追加の洗浄液（例えば尿素又はグアニジニウム塩）も使用しなくてはならないおそれがあることを意味する。
【０００８】
従前、アルカリｐＨ値に耐える改良された性質を示す改変プロテインＡリガンドの開発に向けた広範な研究が行われている。例えば、国際公開２００３／０８０６５５には、特定のアスパラギン変異を有するプロテインＡドメインが、天然タンパク質よりもかなりアルカリ安定性が高いと開示されている。
【０００９】
そこで、アルカリ洗浄手順に対して向上した安定性を有するプロテインＬ由来リガンドを含有する分離マトリックスを得ることが当技術分野で依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００５／０３３１３０号
【発明の概要】
【００１１】
本発明の一態様は、アルカリ安定性の向上したポリペプチドを提供することである。これは、請求項１に記載のポリペプチドによって達成される。
【００１２】
１つの利点は、プロテインＬ及び親ポリペプチドでアルカリ安定性が改善されることである。追加の利点は、プロテインＬで例証されるκ軽鎖含有タンパク質に対する選択性の高い結合が、本発明のポリペプチドで保持されることである。
【００１３】
本発明の第２の態様は、アルカリ安定性の向上したポリペプチド又は多量体をコードする核酸又はベクターを提供することである。これは、特許請求の範囲に記載の核酸又はベクターによって達成される。
【００１４】
本発明の第３の態様は、アルカリ安定性の向上したポリペプチド又は多量体を発現できる発現系を提供することである。これは、特許請求の範囲に記載の発現系によって達成さ
れる。
【００１５】
本発明の第４の態様は、κ軽鎖含有タンパク質と選択的に結合することができて、改善されたアルカリ安定性を示す分離マトリックスを提供することである。これは特許請求の範囲に記載の分離マトリックスによって達成される。
【００１６】
本発明の第５の態様は、κ軽鎖含有タンパク質を単離するための効率的かつ経済的な方法を提供することである。これは、特許請求の範囲に記載の方法によって達成される。
【００１７】
本発明の他の好適な実施形態は従属請求項に記載される。
【００１８】
定義
「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、本明細書では互換的に用いられ、抗体のフラグメント、抗体又は抗体フラグメントを含む融合タンパク質及び抗体又は抗体フラグメントを含むコンジュゲートも包含する。
【００１９】
本明細書において、「κ軽鎖結合ポリペプチド」及び「κ軽鎖結合タンパク質」という用語は、それぞれ、抗体のκ軽鎖サブクラス１、３又は４（ＢＨＫ  Ｎｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，２２３４−２２３９，１９９２などではＶκI、ＶκIII及びＶκIVとも呼ばれる）に結合できるポリペプチド又はタンパク質を意味し、例えばプロテインＬ、並びにその結合特性を保持した変異体、フラグメント又は融合タンパク質を包含する。
【００２０】
「κ軽鎖含有タンパク質」という用語は、「免疫グロブリンκ軽鎖含有タンパク質」の同義語として用いられ、本明細書では、抗体由来のκ軽鎖サブクラス１、３又は４（ＢＨＫ  Ｎｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，２２３４−２２３９，１９９２などではＶκI、ＶκIII及びＶκIVとも呼ばれる）を含むタンパク質を意味し、κ軽鎖サブクラス１、３又は４を含有する任意のインタクトな抗体、抗体フラグメント、融合タンパク質、コンジュゲート又は組換えタンパク質を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】米国特許第６８２２０７５号及びＷ  Ｋａｓｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１２８２０−１２８２５，１９９２に記載のプロテインＬの５つのκ軽鎖結合ドメインのアライメントを示す。
【図２】プロテインＬの様々なκ軽鎖結合ドメインのアルカリ安定性を示す。
【図３】プロテインＬの変異κ軽鎖結合ドメインのアルカリ安定性を示す。
【図４】４つのドメインを含むプロテインＬリガンドのアルカリ安定性を示す。
【図５】プロテインＬの変異二量体、四量体及び六量体κ軽鎖結合ドメインのアルカリ安定性を、プロテインＬと対比して、示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
一態様では、本発明は、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｇｎｕｓのプロテインＬの１以上の結合ドメインであって、各々、ドメイン２、ドメイン３及びドメイン４からなる群から選択される１以上の結合ドメインを含んでいるか或いはそれらから実質的になるκ軽鎖結合ポリペプチドについて開示する。ドメイン２は、配列番号３又は配列番号１２で定義されるアミノ酸配列を有していてもよいし、或いは配列番号３又は配列番号１２と９０％以上、例えば９５％以上の配列相同性を有していてもよい。配列番号１２は、３１位にアラニンを有する配列番号３の変異体である。ドメイン３は、配列番号４で定義されるアミノ酸配列を有していてもよいし、或いは配列番号４と９０％以上、例えば９５％以上の配列相同性を有していてもよい。ドメイン４は、配列番号５で定義されるア
ミノ酸配列を有していてもよいし、或いは配列番号５と９０％以上、例えば９５％以上の配列相同性を有していてもよい。
【００２３】
ポリペプチドのある実施形態では、各ドメインはドメイン３及びドメイン４からなる群から選択されるか、或いは各ドメインはドメイン３である。具体的には、ポリペプチドは、ドメイン３の多量体を含んでいるか或いはそれらから実質的になることができる。
【００２４】
特定の実施形態では、これらのドメインの２以上は、ドメイン２、ドメイン３及びドメイン４からなる群から選択されるか、或いはドメイン３及びドメイン４からなる群から選択される。
【００２５】
ある実施形態では、ポリペプチドは、ＰｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのプロテインＬのドメイン１を全く含まない。ドメイン１は、配列番号２で定義されるアミノ酸配列を有していてもよいし、或いは配列番号２と９０％以上、例えば９５％以上の配列相同性を有していてもよい。
【００２６】
ポリペプチドの特定の実施形態では、結合ドメインの１以上、例えばすべての結合ドメインで、少なくとも配列番号２〜５の４５位に対応する位置のアミノ酸（例えば、配列番号２〜５又は１２の４５位のアミノ酸）は、アスパラギンでも、プロリンでも、システインでもないアミノ酸に変異されている。４５位のアミノ酸は、例えば、アラニンに変異させることができる。
【００２７】
ポリペプチドのある実施形態では、結合ドメインの１以上、例えばすべての結合ドメインで、少なくとも配列番号２〜５の１０位に対応する位置のアミノ酸（例えば、配列番号２〜５又は１２の１０位のアミノ酸）は、アスパラギンでも、プロリンでも、システインでもないアミノ酸に変異されている。１０位のアミノ酸は、例えば、グルタミンに変異させることができる。
【００２８】
ポリペプチドの特定の実施形態では、結合ドメインの１以上、例えばすべての結合ドメインで、少なくとも配列番号２〜５の６０位に対応する位置のアミノ酸（例えば、配列番号２〜５又は１２の６０位のアミノ酸）は、アスパラギンでも、プロリンでも、システインでもないアミノ酸に変異されている。６０位のアミノ酸は、例えば、グルタミンにと変異させることができる。
【００２９】
具体的には、結合ドメインの１以上、例えばすべての結合ドメインは、Ｎ１０Ｑ；Ｎ４５Ａ；Ｎ６０Ｑ；Ｎ１０Ｑ、Ｎ４５Ａ；Ｎ４５Ａ、Ｎ６０Ｑ、Ｎ１０Ｑ、Ｎ６０Ｑ及びＮ１０Ｑ、Ｎ４５Ａ、Ｎ６０Ｑからなる群から選択される変異或いはＮ４５Ａ；Ｎ１０Ｑ、Ｎ４５Ａ；Ｎ４５Ａ、Ｎ６０Ｑ及びＮ１０Ｑ、Ｎ４５Ａ、Ｎ６０Ｑからなる群から選択される変異を有していてもよい。
【００３０】
ポリペプチドのある実施形態では、結合ドメインの１以上、例えばすべての結合ドメインで、少なくとも配列番号２〜５の１９位に対応する位置のアミノ酸（例えば、配列番号２〜５又は１２の１９位のアミノ酸）は、グルタミンでも、アスパラギンでも、プロリンでも、システインでもないアミノ酸に変異されている。１９位のアミノ酸は、例えば、グルタミン酸又はアラニンに変異させることができる。具体的には、結合ドメインの１以上、例えばすべての結合ドメインがＱ１９Ｅ及びＱ１９Ａからなる群から選択される変異を有していてもよい。
【００３１】
ポリペプチドの特定の実施形態では、結合ドメインの１以上、例えばすべての結合ドメインが、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号
１３及び配列番号１４で定義される配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。或いは、結合ドメインの１以上、例えばすべての結合ドメインは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１で定義される配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有していてもよい。ポリペプチドは、クローニングプロセスに由来する或いは切断されたシグナル配列由来の残基を構成する複数のアミノ酸残基を、Ｎ末端にさらに含んでいてもよい。追加のアミノ酸残基の数は、例えば１５以下、例えば１０以下又は５以下であってもよい。具体例として、ポリペプチドは、Ｎ末端にＡＱＶ配列を含んでいてもよい。
【００３２】
配列番号７（ドメイン３、Ｎ４５Ａ変異）
PKEEVTIKAN LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLN IKFAGKEKTPEE。
【００３３】
配列番号８（ドメイン３、Ｎ１０Ｑ、Ｎ４５Ａ変異）
PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLN IKFAGKEKTPEE。
【００３４】
配列番号９（ドメイン３、Ｎ４５Ａ、Ｎ６０Ｑ変異）
PKEEVTIKAN LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE。
【００３５】
配列番号１０（ドメイン３、Ｎ１０Ｑ、Ｎ６０Ｑ変異）
PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKENGKYTV DVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE。
【００３６】
配列番号１１（ドメイン３、Ｎ１０Ｑ、Ｎ４５Ａ、Ｎ６０Ｑ変異）
PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE。
【００３７】
配列番号１２（ドメイン２の変異体）
PKEEVTIKAN LIYADGKTQT AEFKGTFEEA AAEAYRYADA LKKDNGEYTV DVADKGYTLN IKFAGKEKTPEE。
【００３８】
配列番号１３（ドメイン３、Ｑ１９Ａ変異）
PKEEVTIKAN LIYADGKTAT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKENGKYTV DVADKGYTLN IKFAGKEKTPEE。
【００３９】
配列番号１４（ドメイン３、Ｑ１９Ｅ変異）
PKEEVTIKAN LIYADGKTET AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKENGKYTV DVADKGYTLN IKFAGKEKTPEE。
【００４０】
ある実施形態では、ポリペプチドは、上述の実施形態で定義される複数の変異又は非変異ドメインを含んでいるか或いはそれらから実質的になる多量体である。多量体は、例えば、二量体、三量体、四量体、五量体又は六量体であってよい。多量体は、多量体のすべてのユニットが同一であるホモ多量体であってもよいし、或いは１以上のユニットが他のユニットと異なるヘテロ多量体であってもよい。有利には、多量体中のすべてのユニットは、例えば、上述の変異を含むことによってアルカリ安定性である。ドメインは、これらドメインのＣ末端とＮ末端との間のペプチド結合によって直接相互に連結することができる。或いは、多量体中の２以上のユニットは、オリゴマー又はポリマー種を含むエレメント、例えば、１５又は３０以下のアミノ酸、例えば１〜５、１〜１０又は５〜１０のアミノ酸を含むエレメントなどによって連結することができる。かかる連結の性質は、好ましくは、ドメインの空間的立体配座を不安定化してはならない。これは、例えば、連結内のシステインの存在を回避することによって達成することができる。さらに、連結は、好ましくは、ドメインの特性を損なわないように、アルカリ環境において十分に安定でなければならない。この目的のために、連結がアスパラギンを含まない場合に有利である。連結がグルタミンを含まない場合、さらに有利であり得る。多量体は、クローニングプロセスに由来する或いは切断されたシグナル配列由来の残基を構成する複数のアミノ酸残基を、Ｎ末端にさらに含んでいてもよい。付加的なアミノ酸残基の数は、例えば１５以下、例え
ば１０以下又は５以下であってもよい。具体例として、多量体はＮ末端にＡＱＶ配列を含んでいてもよい。
【００４１】
特定の実施形態では、多量体は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択される配列、例えば配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８からなる群より選択される配列を含んでいるか或いはそれらから実質的になる。
【００４２】
配列番号１５（ドメイン３、四量体）
PKEEVTIKAN LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKENGKYTV DVADKGYTLN IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAN LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKENGKYTV DVADKGYTLN IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAN LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKENGKYTV DVADKGYTLN IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAN LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKENGKYTV DVADKGYTLN IKFAGKEKTPEE。
【００４３】
配列番号１６  ドメイン３（Ｎ１０Ｑ、Ｎ４５Ａ、Ｎ６０Ｑ）２
PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE。
【００４４】
配列番号１７  ドメイン３（Ｎ１０Ｑ、Ｎ４５Ａ、Ｎ６０Ｑ）４
PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE。
【００４５】
配列番号１８  ドメイン３（Ｎ１０Ｑ、Ｎ４５Ａ、Ｎ６０Ｑ）６
PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE。
【００４６】
ある実施形態では、上述のポリペプチド及び／又は多量体は、システイン残基、複数のリジン残基及び複数のヒスチジン残基からなる群から選択される１以上のカップリングエレメントをＣ末端又はＮ末端にさらに含む。カップリングエレメントは、例えば、Ｃ末端の単一システインであってよい。カップリングエレメントは、Ｃ末端又はＮ末端に直接連結していてもよく、又は１５個以下のアミノ酸、例えば１〜５、１〜１０又は５〜１０個のアミノ酸を含むリンカーを介して連結していてもよい。この延長部は、好ましくは、変異タンパク質の特性を損なわないように、アルカリ環境で十分に安定でなければならない。この目的のために、延長部がアスパラギンを含まない場合に有利である。延長部がグルタミンを含まない場合、さらに有利であり得る。Ｃ−又はＮ−末端システインを有することの利点は、システインチオールと支持体上の求電子基との反応を介してタンパク質の末端カップリングを達成できることである。これは、結合容量にとって重要な、カップリングタンパク質の優れた可動性を提供する。
【００４７】
ポリペプチド又は多量体のアルカリ安定性は、それをＳＰＲチップ、例えば実施例に記載のＢｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５センサーチップにカップリングさせ、所定の温度、例えば２２±２℃でアルカリ溶液中でインキュベーションする前後に、例えば特定のκ軽鎖含有タンパク質又は（ＩｇＧ分子の大部分がκ軽鎖を有する）ヒトポリクローナルＩｇＧを使用して、該チップのκ軽鎖結合容量を測定することによって評価することができる。インキュベーションは、例えば、０．１ＭのＮａＯＨ中で、１０分間のサイクルを多数、例えば
５０、９６又は１００サイクル実施することができる。０．１Ｍ  ＮａＯＨ中２２±２℃で１０分間のインキュベーションを９６〜１００回繰り返した後のマトリックスの結合容量は、インキュベーション前の結合容量の４０％以上、例えば５０％以上又は５５％以上であり得る。或いは、上記のように測定した特定の変異体の９６〜１００サイクル後の残存結合容量を、親ポリペプチド／多量体の残存結合容量と比較することができる。この場合、変異体の残存結合容量は、親ポリペプチド／多量体の１０５％以上、例えば１１０％以上、１２５％以上、１５０％以上又は２００％以上であり得る。
【００４８】
本発明はまた、ＰｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのプロテインＬの１以上の変異結合ドメインを含むκ軽鎖結合ポリペプチドを開示しており、このポリペプチドにおいて配列番号２〜６又は１２で定義されるか或いは配列番号２〜６又は１２と９５％以上又は９８％の配列相同性を有する親ドメインの１以上のアスパラギン残基は、アスパラギンでも、プロリンでも、システインでもない別のアミノ酸残基に変異されている。ポリペプチドは、少なくとも変異Ｎ４５Ａ及び／又は変異Ｎ６０Ｑを含んでよい。特定の実施形態では、変異は、Ｎ４５Ａ；Ｎ１０Ｑ、Ｎ４５Ａ；Ｎ４５Ａ、Ｎ６０Ｑ、Ｎ１０Ｑ、Ｎ６０Ｑ及びＮ１０Ｑ、Ｎ４５Ａ、Ｎ６０Ｑからなる群から選択されるか、或いはＮ４５Ａ；Ｎ１０Ｑ、Ｎ４５Ａ；Ｎ４５Ａ、Ｎ６０Ｑ及びＮ１０Ｑ、Ｎ４５Ａ、Ｎ６０Ｑからなる群から選択される。親ポリペプチドと比較したアルカリ安定性は改善され、上述の通り測定することができる。
【００４９】
ある実施形態では、ポリペプチドは、複数の変異結合ドメイン、例えば２、３、４、５又は６個のドメインを含むか、又はそれらから本質的になり、各ドメインは変異Ｎ１０Ｑ、Ｎ４５Ａ及びＮ６０Ｑの１以上、例えばＮ４５Ａ及び／又はＮ６０Ｑを含む。具体的には、各ドメインにおける変異は、Ｎ４５Ａ；Ｎ１０Ｑ、Ｎ４５Ａ；Ｎ４５Ａ、Ｎ６０Ｑ、Ｎ１０Ｑ、Ｎ６０Ｑ及びＮ１０Ｑ、Ｎ４５Ａ、Ｎ６０Ｑからなる群から選択することができるか、又はＮ４５Ａ；Ｎ１０Ｑ、Ｎ４５Ａ；Ｎ４５Ａ、Ｎ６０Ｑ及びＮ１０Ｑ、Ｎ４５Ａ、Ｎ６０Ｑからなる群から選択することができる。ドメインは、場合により、１５個以下のアミノ酸を含むエレメントによって互いに連結させることができる。
【００５０】
第２の態様では、本発明は、上述の実施形態によるポリペプチド又は多量体をコードする核酸について開示する。したがって、本発明は、ポリペプチド又は多量体をコードするＲＮＡ及びＤＮＡなどの本核酸配列のすべての形態を包含する。本発明は、コード配列に加えて、本発明によるポリペプチド又は多量体の発現に必要なシグナル配列を含む、プラスミドなどのベクターを包含する。一実施形態では、該ベクターは、本発明による多量体をコードする核酸を含み、各ユニットをコードする個別の核酸は、相同又は異種のＤＮＡ配列を有してよい。
【００５１】
第３の態様では、本発明は、上述のような核酸又はベクターを含む発現系について開示する。該発現系は、例えば、本ポリペプチド又は多量体を発現するように改変されたグラム陽性又はグラム陰性の原核宿主細胞系、例えば、バチルス属又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）であってよい。代替の実施形態では、発現系は、酵母、例えばＰｉｃｈｅａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの真核宿主細胞系である。
【００５２】
第４の態様では、本発明は、上述の任意の実施形態による複数のポリペプチド又は多量体が固体支持体にカップリングされている分離マトリックスについて開示する。かかるマトリックスは、κ軽鎖含有タンパク質の分離に有用であり、ポリペプチド／多量体の改善されたアルカリ安定性に起因して、該マトリックスは、洗浄中の高度なアルカリ条件に耐え、このことはバイオプロセスの分離設定における長期間の繰り返し使用に必須である。マトリックスのアルカリ安定性は、所定の温度、例えば２２±２℃でアルカリ溶液中でイ
ンキュベーションする前後に、例えば特定のκ軽鎖含有タンパク質又はヒトポリクローナルＩｇＧを使用して、κ軽鎖結合容量を測定することによって評価することができる。インキュベーションは、例えば、０．１ＭのＮａＯＨ中で、１５分間のサイクルを多数、例えば１００、２００又は３００サイクル実施することができる。０．１Ｍ  ＮａＯＨ中２２±２℃で１５分間のインキュベーションを１００回繰り返した後のマトリックスの結合容量は、インキュベーション前の結合容量の８０％以上、例えば８５％以上、９０％以上又は９５％以上であり得る。或いは、インキュベーションは０．１Ｍ  ＮａＯＨ中で４時間のサイクルを多数、例えば６サイクル実施して、総インキュベーション時間を２４時間にしてもよい。２２±２℃における０．１Ｍ  ＮａＯＨ中、総インキュベーション時間２４時間の後のマトリックスの結合容量は、インキュベーション前の結合容量の８０％以上、例えば８５％以上、９０％以上又は９５％以上であり得る。
【００５３】
当業者には理解されるように、発現されたポリペプチド又は多量体は、支持体に固定化する前に適度に精製しなければならない。かかる精製方法は当業界において周知であり、タンパク質ベースのリガンドの支持体への固定化は、標準的な方法を用いて容易に行われる。適切な方法及び支持体は、以下に具体的に述べる。
【００５４】
本発明によるマトリックスの固体支持体は、任意の適切な周知の種類であってよい。従来のアフィニティー分離マトリックスは、多くの場合有機性であり、親水性表面を使用する水性媒体に曝露している、すなわちヒドロキシ（−ＯＨ）、カルボキシ（−ＣＯＯＨ）、カルボキシアミド（−ＣＯＮＨ2、Ｎ−置換型であってもよい）、アミノ（−ＮＨ2、置換されていてもよい）、オリゴ−又はポリエチレンオキシ基をそれらの外部に曝露し、存在する場合にはその内部にも曝露しているポリマーに基づく。固体支持体は、適切には多孔質であり得る。空隙率は、Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９１，ｐｐ６−１３に記載の方法による逆サイズ排除クロマトグラフィーによって測定されたＫａｖ又はＫｄ値（特定のサイズのプローブ分子に利用可能な細孔容積の割合）として表すことができる。定義上、Ｋｄ及びＫａｖ値は両方とも常に０〜１の範囲内にある。有利には、分子量１１０ｋＤａのデキストランをプローブ分子として用いて測定した場合、Ｋａｖ値は０．６〜０．９５、例えば、０．７〜０．９０又は０．６〜０．８であり得る。この利点は、支持体が、本発明のポリペプチド／多量体及び該ポリペプチド／多量体に結合する免疫グロブリンの両方を収容することができ、結合部位への、及び結合部位からの免疫グロブリンの質量輸送を提供することができる細孔を大きな割合で有することである。
【００５５】
ポリペプチド又は多量体は、例えば、リガンド中に存在するチオール、アミノ及び／又はカルボキシ基を利用する従来のカップリング技術を介して支持体に結合させることができる。ビセポキシド、エピクロロヒドリン、ＣＮＢｒ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などは、周知のカップリング試薬である。支持体とポリペプチド／多量体との間に、スペーサとして知られる分子を導入することができ、これによりポリペプチド／多量体の利用可能性が改善され、ポリペプチド／多量体の支持体への化学的カップリングが促進される。適切なスペーサは、例えば、エピクロロヒドリン、ブタンジオールジエポキシド、アリルグリシジルエーテルなどを用いた支持体の活性化によって導入することができる。或いは、ポリペプチド／多量体は、非共有結合、例えば物理吸着又は生体特異的吸着よって支持体に結合させてもよい。
【００５６】
ある実施形態では、マトリックスは、支持体にカップリングされた、５〜２０、例えば５〜１５ｍｇ／ｍｌ、５〜１１ｍｇ／ｍｌ又は８〜１１ｍｇ／ｍｌのポリペプチド又は多量体を含む。カップリングされるポリペプチド／多量体の量は、カップリングプロセスに使用するポリペプチド／多量体の濃度、使用するカップリング条件及び／又は使用する支
持体の細孔構造によって制御することができる。概して、マトリックスの絶対結合容量は、カップリングされたポリペプチド／多量体の量に伴い、少なくとも細孔がカップリングされたポリペプチド／多量体によって著しく狭窄される点まで増加する。カップリングされたポリペプチド／多量体１ｍｇ当たりの相対結合容量はカップリングレベルが高くなると減少し、上記の範囲内で最適な費用便益をもたらす。
【００５７】
ある実施形態では、ポリペプチドは、多点結合を介して支持体にカップリングされる。これは、ポリペプチド中の複数の反応性基が支持体中の反応性基と反応するようなカップリング条件を使用することによって適切に行うことができる。典型的には、多点結合は、配列中のアミノ酸残基のいくつかの固有の反応基、例えばリジン中のアミンと、支持体上の反応基、例えばエポキシド、シアネートエステル（例えば、ＣＮＢｒ活性化由来）、スクシンイミジルエステル（例えば、ＮＨＳ活性化由来）との反応を伴うことができる。しかし、ポリペプチド中の異なる位置に反応性基を故意に導入して、カップリング特性に影響を及ぼすことも可能である。リジンを介した多点カップリングを提供するために、カップリング反応は、リジンの一級アミンのかなりの部分が非プロトン化求核状態であるｐＨにおいて、例えば、８．０より高い、例えば１０より高いｐＨにおいて適切に実施される。
【００５８】
特定の実施形態では、ポリペプチド又は多量体は、チオエーテル結合を介して支持体にカップリングされる。かかる結合を実施する方法は、この分野において周知であり、標準的な技術及び装置を使用して当業者によって容易に実施される。チオエーテル結合は、柔軟で安定であり、一般的にアフィニティークロマトグラフィーでの使用に適している。特に、チオエーテル結合が、ポリペプチド又は多量体上の末端又は近末端のシステイン残基を介している場合、カップリングされたポリペプチド／多量体の可動性が向上し、結合容量及び結合反応速度が改善される。ある実施形態では、ポリペプチド／多量体は、上記のタンパク質に提供されるＣ末端システインを介してカップリングされる。このことは、システインチオールと支持体上の求電子基、例えばエポキシド基、ハロヒドリン基との効率的なカップリングを可能にし、チオエーテル架橋カップリングをもたらす。ポリペプチド／多量体は、例えば、一点結合を介して、例えば、単一のシステインを介してカップリングされても、又は例えば、ポリペプチド／多量体の近末端の複数のリジン又は他のカップリング基を使用する指向性の多点結合によってカップリングされてもよい。
【００５９】
特定の実施形態では、支持体は、ポリヒドロキシポリマー、例えば多糖類を含む。多糖類の例としては、例えば、デキストラン、デンプン、セルロース、プルラン、寒天、アガロースなどが挙げられる。多糖類は本質的に親水性であり、非特異的相互作用の程度は低く、反応性（活性化可能な）ヒドロキシル基含量が高く、バイオプロセスに使用されるアルカリ性洗浄液に対して一般に安定である。
【００６０】
ある実施形態では、支持体は、寒天又はアガロースを含む。本発明で使用する支持体は、標準的な方法、例えば逆懸濁ゲル化（Ｓ  Ｈｊｅｒｔｅｎ：Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７９（２），３９３−３９８（１９６４））により容易に調製することができる。或いは、塩基性マトリクッスは、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の名称で販売されている架橋アガロースビーズなどの市販品である。大規模分離に特に有利な一実施形態では、支持体は、米国特許第６６０２９９０号又は米国特許第７３９６４６７号（当該特許は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている方法を使用して、その剛性を増加させるように適合され、それによってマトリックスは高い流量により適切となる。
【００６１】
特定の実施形態では、多糖類又はアガロース支持体などの支持体は、ヒドロキシアルキルエーテル架橋などで架橋される。かかる架橋を生成する架橋剤試薬は、例えば、エピク
ロロヒドリンのようなエピハロヒドリン、ブタンジオールジグリシジルエーテルのようなジエポキシド、アリルハライド又はアリルグリシジルエーテルのようなアリル化試薬であってよい。架橋は、支持体の剛性に有益であり、化学的安定性を改善する。ヒドロキシアルキルエーテル架橋はアルカリ安定性であり、著しい非特異的吸着を引き起こさない。
【００６２】
又は、固体支持体は、合成ポリマー、例えばポリビニルアルコール、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドなどに基づく。ジビニル及びモノビニル置換ベンゼンに基づくマトリックスなどの疎水性ポリマーの場合、マトリックス表面は、多くの場合親水化されて、上で定義した親水性基を周囲の水性液体に曝露する。かかるポリマーは、標準的な方法に従って容易に製造され、例えば、「Ｓｔｙｒｅｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｂｙ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ」（Ｒ  Ａｒｓｈａｄｙ：Ｃｈｉｍｉｃａ  ｅ  Ｌ’Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ  ７０（９），７０−７５（１９８８））を参照されたい。或いは、ＳＯＵＲＣＥ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの市販品が使用される。別の代替としては、本発明による固体支持体は、無機性の支持体、例えばシリカ、酸化ジルコニウムなどを含む。
【００６３】
さらに別の実施形態では、固体支持体は、表面、チップ、キャピラリー、又はフィルター（例えば、膜又は深層フィルターマトリックス）などの別の形態である。
【００６４】
本発明によるマトリックスの形状に関して、一実施形態では、マトリックスは多孔質モノリスの形態である。別の実施形態では、マトリックスは、多孔質又は非多孔質であり得るビーズ又は粒子の形態である。ビーズ又は粒子の形態のマトリックスは、充填床として、又は懸濁形態で使用することができる。懸濁形態には、粒子又はビーズが自由に移動する膨張床及び純粋な懸濁液として知られる形態が含まれる。モノリス、充填床及び膨張床の場合、分離手順は一般に、濃度勾配を用いた従来のクロマトグラフィーに従う。純粋な懸濁液の場合、バッチ様式が使用される。
【００６５】
第６の態様では、本発明は、上述の分離マトリックスを使用する、κ軽鎖含有タンパク質の単離方法について開示する。
【００６６】
特定の実施形態では、本方法は、
ａ）κ軽鎖含有タンパク質を含む液体試料と、上述の分離マトリックスとを接触させるステップ、
ｂ）分離マトリックスを洗浄液で洗浄するステップ、
ｃ）κ軽鎖含有タンパク質を、溶出液を用いて分離マトリックスから溶出するステップ、
ｄ）分離マトリックスを洗浄液で洗浄するステップ、
を含む。
【００６７】
本方法はまた、ステップａ）の前に、上述の実施形態のいずれかによるアフィニティー分離マトリックスを用意し、κ軽鎖含有タンパク質及び１以上の他の物質を液体試料として含む溶液を用意するステップ、及びステップｃ）の後に、溶出液を回収し、場合によりこの溶出液を、例えばアニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、マルチモーダルクロマトグラフィー及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィーによる追加の分離ステップに供するステップをさらに含む。液体試料、洗浄液及び溶出液の適切な組成並びに分離を実施するための一般的な条件は、アフィニティークロマトグラフィーの分野、特にプロテインＬクロマトグラフィーの分野において周知である。κ軽鎖含有タンパク質及び１以上の他の物質を含む液体試料は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、大腸菌又は酵母細胞のタンパク質を含み得る。ＣＨＯ細胞及び大腸菌のタンパク質の含量は、これらのタンパク質に対する免疫アッセイ、例えばＣ
ＨＯ  ＨＣＰ又は大腸菌ＨＣＰ用ＥＬＩＳＡキット、Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社により簡便に決定することができる。宿主細胞タンパク質又はＣＨＯ細胞／大腸菌／酵母タンパク質は、ステップｂ）の間に脱着させることができる。
【００６８】
溶出は、プロテインＬ媒体からの溶出に使用される任意の適切な溶液を使用して行うことができる。これは、例えば、ｐＨ４以下、例えばｐＨ２．５〜４又は２．８〜３．５の溶液又はバッファーであってよい。ある実施形態では、溶出バッファー又は溶出バッファー勾配は、少なくとも１種のモノ−、ジ−又はトリ−官能性カルボン酸又はかかるカルボン酸の塩を含む。特定の実施形態では、溶出バッファー又は溶出バッファー勾配は、酢酸塩、クエン酸塩、グリシン、コハク酸塩、リン酸塩及びギ酸塩からなる群から選択される少なくとも１種のアニオン種を含む。
【００６９】
ある実施形態では、洗浄液は、ｐＨ１２〜１４を有するようなアルカリである。かかる溶液は、特に間隔の上端において、マトリックスの効率的な洗浄を提供する
【００７０】
特定の実施形態では、洗浄液は、０．０１〜１．０ＭのＮａＯＨ又はＫＯＨ、例えば０．０５〜１．０又は０．０５〜０．１ＭのＮａＯＨ又はＫＯＨを含む。本発明のポリペプチドの高い安定性は、かかる比較的強いアルカリ溶液の使用を可能にする。
【００７１】
ある実施形態では、ステップａ）〜ｄ）は１０回以上、例えば５０回以上又は５０〜２００回繰り返される。これは、マトリックスが何度も再使用できるという点でプロセスの経済性にとって重要である。
【実施例】
【００７２】
タンパク質の変異導入
単量体構築物を、米国特許第６８２２０７５号（配列番号１）に開示された４つのκ軽鎖結合ドメインを含むプロテインＬから設計した。これらは、Ｎ末端から開始して１、２、３及び４と番号が付けられている（図１）。ＤＮＡフラグメントはＤＮＡ合成会社（ＤＮＡ２．０）から購入した。それぞれＮ末端システインを有する４つの単量体構築物を、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ２０１クローニングベクター中で調製した。構築物の概要については、配列番号２、４、５、１２を参照されたい。標的タンパク質をペリプラズムに局在化させるための大腸菌ＧＡＰプロモーター及びＯｍｐＡシグナルペプチド配列を含有する構築物を、発現ベクターｐＧＯにサブクローニングした。４つのドメインをコードする配列は、ＦｓｐＩ及びＰｓｔＩの制限酵素認識部位をそれぞれ５’側及び３’側に含むオリゴヌクレオチドで増幅することによって調製した。各ドメインをコードする調製されたＤＮＡフラグメントをＦｓｐＩ及びＰｓｔＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて消化した。それとは別に、ＦｓｐＩ及びＰｓｔＩを用いる消化により発現ベクターを調製し、アガロースゲル電気泳動により精製し、回収した。両方を混合し、Ｑｕｉｃｋライゲーションキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で連結した。各ドメインを発現する連結させたプラスミドにより、ヒートショック法を用いて化学的コンピテント大腸菌Ｋ１２株を形質転換させた。
【００７３】
ドメイン３のアミノ酸Ｎ１０、Ｎ４５、Ｑ１９、及びＮ６０の追加の変異を、ｌａｃオペロン制御機構（配列番号７−１１、１３−１４）の下でＴ５プロモーターを含む発現ベクターｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０１（ＤＮＡ２．０）において調製した。構築物は、Ｃ末端システインを含まずに、ＯｍｐＡシグナルペプチドを含むもの、及び含まないものを設計した。
【００７４】
ドメイン３の四量体、Ｎ４５、Ｎ１０及びＮ６０の変異を有するドメイン３の、二量体、四量体及び六量体も、Ｃ末端システイン（配列番号１５−１８）を有するもの、及び有
さないものをｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０１において調製した。
【００７５】
構築物の発現及び精製
大腸菌Ｋ１２組換え細胞を、２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを添加したＬＢ−ブロス（１０ｇのペプトン、５ｇの酵母エキス、５ｇのＮａＣｌ）を含む振盪フラスコ中で、３７℃で６００ｎｍの光学濃度が０．８に達するまで培養した。この時点で、タンパク質発現を、最終濃度１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて誘導した。誘導後、温度を３０℃に下げ、培養物を５時間インキュベートした。培養を停止し、細胞を４０００ｘｇで１５分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で培養体積の１／１０に再懸濁し、２分間の活性時間でパルス音波処理を使用して超音波処理した。超音波処理された試料を、６０００ｘｇで３０分間の遠心分離、続いて０．２μｍの細孔径を有する膜による精密濾過によって、細胞破片から清澄化した。
【００７６】
精製されたリガンドをＬＣ−ＭＳを用いて分析して、純度を決定し、分子量が（アミノ酸配列に基づいて）予測と一致することを確認した。
【００７７】
実施例１
非変異単一ドメインの場合にはＣ末端のシステイン及びＮ末端のＡＱＶ配列をさらに含む、表１に記載の精製された単量体リガンドを、（チップ上のカルボキシメチル基のアミンのカルボジイミドカップリング用）のＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅのアミンカップリングキットを使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（スウェーデン））において約１０００ＲＵのシグナル強度を得るために十分な量でＢｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（スウェーデン））に固定した。固定した表面のＩｇＧ結合容量を追跡するために、１ｍｇ／ｍｌのヒトポリクローナルＩｇＧ（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ）をチップ上に流し、シグナル強度を記録した。次いで、該表面を定置洗浄（ＣＩＰ）、すなわち室温（２２±２℃）において１００ｍＭのＮａＯＨで１０分間洗い流した。これを９６サイクル繰り返し、各サイクル後のＩｇＧ結合容量（シグナル強度）の相対的喪失として、固定リガンドのアルカリ安定性を追跡した。非変異ドメインの結果を図２に示し、この結果はドメイン１が他のドメインよりも明らかに低いアルカリ安定性を有し、ドメイン３が最も高いアルカリ安定性を有することを示している。ドメイン３の単一ドメインアスパラギン変異体についての結果を図３に示し、この結果は変異と並行して参照として使用した親ドメイン３と比較して、すべての変異体について改善されたアルカリ安定性を示している。
【００７８】
【表１】
2020202855.tif 000003
【００７９】
実施例２
表２に記載の精製されたマルチドメインリガンドを、（チップ上のカルボキシメチル基のアミンのカルボジイミドカップリング用）のＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅのアミンカッ
プリングキットを使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（スウェーデン））において約１０００ＲＵのシグナル強度を得るために十分な量でＢｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（スウェーデン））に固定した。プロテインＬは、Ｎ−末端に追加のＡＩＨＮＲＡ配列を有していた。固定した表面のＩｇＧ結合容量を追跡するために、１ｍｇ／ｍｌのヒトポリクローナルＩｇＧ（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ）をチップ上に流し、シグナル強度を記録した。次いで、該表面を定置洗浄（ＣＩＰ）、すなわち室温（２２±２℃）において１００ｍＭのＮａＯＨで１０分間洗い流した。これを９６サイクル繰り返し、各サイクル後のＩｇＧ結合容量（シグナル強度）の相対的喪失として、固定リガンドのアルカリ安定性を追跡した。結果を表２及び図４に示し、これらの結果は、四量体ドメイン３が、参照として並行して実施したプロテインＬと比較してアルカリ安定性の向上したことを示している。
【００８０】
【表２】
2020202855.tif 000004
【００８１】
実施例３
表３に記載の精製マルチドメインリガンドをＢｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５センサーチップに固定化し、実施例２で使用した方法により評価した。リガンドの記号表示の末尾にある−ｃｙｓは、リガンドが、配列番号１６〜１８で定義された配列に加えてＣ末端システインを有することを示している。結果を表３及び図５に示し、これらの結果は、すべての変異ドメイン３の二量体、四量体及び六量体が、参照として並行して実施したプロテインＬと比較してアルカリ安定性の向上したことを示す。
【００８２】
【表３】
2020202855.tif 000005
【００８３】
実施例４
表４の精製二量体、四量体及び六量体のリガンドを、下記の方法を用いてアガロースビーズに固定し、容量について評価した。結果を表４に示す。
【００８４】
【表４】
2020202855.tif 000006
【００８５】
活性化
使用したベースマトリックスは、米国特許第６６０２９９０号の方法に従って調製された、メジアン径８５μｍ（体積加重）の、Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ  １９９１，ｐｐ６−１３に記載されている方法にしたがって、逆ゲル濾過クロマトグラフィーのＫａｖ値が分子量１１０ｋＤａのデキストランに対して０．７０に相当する細孔サイズを有する硬質架橋アガロースビーズである。
【００８６】
２５ｍＬ（ｇ）の水切りしたベースマトリックス、１０．０ｍＬの蒸留水及び２．０２ｇのＮａＯＨを、１００ｍＬフラスコ中で機械的に撹拌しながら２５℃で１０分間混合した。４．０ｍＬのエピクロロヒドリンを加え、反応を２時間進行させた。活性化されたゲルを、１０ゲル沈殿物体積（ＧＶ）の水で洗浄した。
【００８７】
カップリング
活性化ゲルを５ＧＶの０．２Ｍリン酸塩／１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ１１．５（カップリングバッファー）で洗浄した。１５ｍｌのゲル＋１３ｍｇのリガンド／ゲル（５．０ｍｌ）＋５．５ｍｌのカップリングバッファー＋４．７ｇの硫酸ナトリウムを、５０ｍｌフラスコ中で混合し、３０℃で１８．５時間撹拌した。測定したｐＨは１０．８であった。
【００８８】
固定後、ゲルを３ｘＧＶの蒸留水で洗浄し、次に５ｘＧＶの０．１Ｍのリン酸／１ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ８．５で洗浄した。ゲル＋１ＧＶ｛０．１Ｍのリン酸塩／１ｍＭのＥＤＴＡ／７．５％のチオグリセロールｐＨ８．５｝を混合し、フラスコを４５℃で２時間２０分間撹拌した。次いで、ゲルを１ｘＧＶの０．１Ｍ  ＨＡｃ及び１ｘＧＶの｛０．１Ｍ  ＴＲＩＳ／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．５｝で交互に洗浄し、次いで６ｘＧＶの蒸留水で洗浄した。ゲル試料をアミノ酸分析のために外部研究室に送り、リガンド含量（ｍｇ／ｍｌゲル）を全アミノ酸含量から計算した。使用したカップリングプロトコルは、多点カップリングを提供し、各ドメインのいくつかのリジンがゲルに結合された。
【００８９】
２ｍｌの樹脂をＴＲＩＣＯＲＮ（商標）５  １００カラムに充填した。
【００９０】
タンパク質
ａ）パパイン消化したＩｇＧ  ｍＡｂから調製した精製Ｆａｂを、平衡化バッファー中で１ｍｇ／ｍｌに希釈した。
ｂ）熱処理した大腸菌上清から調製した精製Ｄａｂを、平衡バッファー中で１ｍｇ／ｍｌに希釈した。Ｄａｂは、κ軽鎖のみを含み、抗原結合部位を全く含まなかった。
【００９１】
平衡化バッファー
ＡＰＢリン酸バッファー２０ｍＭ＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）。
【００９２】
吸着バッファー
ＡＰＢリン酸バッファー２０ｍＭ＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）。
【００９３】
溶出バッファー
２５ｍＭクエン酸塩  ｐＨ２．５。
【００９４】
ブレークスルー容量は、ＡＫＴＡＥｘｐｌｏｒｅｒ１０システムを用いて滞留時間４分で測定した。安定したベースラインが得られるまで、バイパスカラムを通して平衡バッファーを流した。これは自動ゼロ化の前に行った。１００％ＵＶシグナルが得られるまで試料をカラムに適用した。その後、安定したベースラインが得られるまで、平衡バッファーを再度適用した。
【００９５】
ＵＶシグナルが最大吸光度の８５％に到達するまで試料をカラムに負荷した。次にカラ
ムを平衡化バッファーで洗浄し、ｐＨ２．５において流速０．５ｍｌ／分で溶出した。
【００９６】
１０％のブレークスルー容量を計算するために、下記の式を使用した。これは、カラム流出液中のＦａｂ／Ｄａｂの濃度が供給液中のＦａｂ／Ｄａｂ濃度の１０％になるまでにカラムに負荷されたＦａｂ／Ｄａｂの量である。
【００９７】
【数１】
2020202855.tif 000007
【００９８】
１０％ブレークスルーにおける動的結合容量（ＤＢＣ）を計算し、曲線の形状を研究した。この曲線をさらに、結合、溶出及びＣＩＰピークに関して研究した。動的結合容量（ＤＢＣ）は、１０％及び８０％のブレークスルーについて計算した。
【００９９】
本明細書では、本発明を最良の形態を含めて開示するとともに、装置又はシステムの製造・使用及び方法の実施を始め、本発明を当業者が実施できるようにするため、例を用いて説明してきた。本発明の特許性を有する範囲は、特許請求の範囲によって規定され、当業者に自明な他の例も包含する。かかる他の例は、特許請求の範囲の文言上の差のない構成要素を有しているか、或いは特許請求の範囲の文言と実質的な差のない均等な構成要素を有していれば、特許請求の範囲に記載された技術的範囲に属する。
［実施態様１］
ＰｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのプロテインＬの１以上の変異結合ドメインを含むκ軽鎖結合ポリペプチドであって、配列番号２〜６又は１２で定義される或いはそれらと９５％以上又は９８％の配列相同性を有する親ドメインの１以上のアスパラギン残基が、アスパラギンでもプロリンでもシステインでもない別のアミノ酸残基に変異している、ポリペプチド。
［実施態様２］
少なくとも変異Ｎ４５Ａを含む、実施態様１に記載のポリペプチド。
［実施態様３］
少なくとも変異Ｎ６０Ｑを含む、実施態様１又は２に記載のポリペプチド。
［実施態様４］
変異が、Ｎ１０Ｑ；Ｎ４５Ａ；Ｎ６０Ｑ；Ｎ１０Ｑ、Ｎ４５Ａ；Ｎ４５Ａ、Ｎ６０Ｑ、Ｎ１０Ｑ、Ｎ６０Ｑ及びＮ１０Ｑ、Ｎ４５Ａ、Ｎ６０Ｑからなる群から選択されるか、又はＮ４５Ａ；Ｎ１０Ｑ、Ｎ４５Ａ；Ｎ４５Ａ、Ｎ６０Ｑ、Ｎ１０Ｑ、Ｎ６０Ｑ及びＮ１０Ｑ、Ｎ４５Ａ、Ｎ６０Ｑからなる群から選択される、実施態様１乃至３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様５］
各ドメインが変異Ｎ４５Ａ及び／又はＮ６０Ｑを含む、複数の変異結合ドメイン、例えば２、３、４、５又は６個のドメインを含むか、又はそれらから本質的になる、実施態様１乃至４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様６］
各ドメインにおける変異が、Ｎ１０Ｑ；Ｎ４５Ａ；Ｎ６０Ｑ；Ｎ１０Ｑ、Ｎ４５Ａ；Ｎ４５Ａ、Ｎ６０Ｑ、Ｎ１０Ｑ、Ｎ６０Ｑ及びＮ１０Ｑ、Ｎ４５Ａ、Ｎ６０Ｑからなる群から選択されるか、又はＮ４５Ａ；Ｎ１０Ｑ、Ｎ４５Ａ；Ｎ４５Ａ、Ｎ６０Ｑ、Ｎ１０Ｑ、Ｎ６０Ｑ及びＮ１０Ｑ、Ｎ４５Ａ、Ｎ６０Ｑからなる群から選択される、実施態様５に記
載のポリペプチド。
［実施態様７］
ドメインが、１５個以下のアミノ酸を含む要素によって連結されている、実施態様５又は６に記載のポリペプチド。
［実施態様８］
０．１Ｍ  ＮａＯＨ水溶液中２２±２℃で１０分間のインキュベーションを９６〜１００回繰り返した後の、κ軽鎖含有タンパク質に対する残存結合容量によって測定されるアルカリ安定性が、親ポリペプチドと比較して改善される、実施態様１乃至７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様９］
親ドメインが、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列で定義されるか、又はそれらと９５％以上又は９８％の配列相同性を有する、実施態様１乃至８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様１０］
親ドメインが、配列番号４で定義されるか、又はそれと９５％以上又は９８％の配列相同性を有する、実施態様１乃至９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様１１］
実施態様１乃至１０のいずれか１項に記載のポリペプチド又は多量体をコードする核酸又はベクター。
［実施態様１２］
実施態様１１に記載の核酸又はベクターを含む発現系。
［実施態様１３］
実施態様１乃至１０のいずれか１項に記載の複数のポリペプチドが固体支持体にカップリングされている分離マトリックス。
［実施態様１４］
ポリペプチドが、多点結合によって固体支持体にカップリングされている、実施態様１３に記載の分離マトリックス。
［実施態様１５］
０．１Ｍ  ＮａＯＨ中２２±２℃で１０分間のインキュベーションを１００回繰り返した後の、κ軽鎖含有タンパク質に対するマトリックスの結合容量が、インキュベーションの前の結合容量の４０％以上、例えば５０％以上又は５５％以上である、実施態様１３乃至１４のいずれか１項に記載の分離マトリックス。
［実施態様１６］
実施態様１３乃至１５のいずれか１項に記載の分離マトリックスが使用される、κ軽鎖含有タンパク質を単離する方法。
［実施態様１７］
ａ）κ軽鎖含有タンパク質を含む液体試料と、実施態様１３乃至１５のいずれか１項に記載の分離マトリックスとを接触させるステップ、
ｂ）分離マトリックスを洗浄液で洗浄するステップ、
ｃ）κ軽鎖含有タンパク質を、溶出液を用いて分離マトリックスから溶出するステップ、
ｄ）分離マトリックスを洗浄液で洗浄するステップ、
を含む、実施態様１６に記載の方法。
［実施態様１８］
洗浄液が、ｐＨ１２〜１４を有するようなアルカリである、実施態様１７に記載の方法。
［実施態様１９］
洗浄液が０．０１〜１．０ＭのＮａＯＨ又はＫＯＨ、例えば０．０５〜１．０Ｍ又は０．０５〜０．１ＭのＮａＯＨ又はＫＯＨを含む、実施態様１７又は１８に記載の方法。
［実施態様２０］
ステップａ）〜ｄ）が１０回以上、例えば５０回以上又は５０〜２００回繰り返される
、実施態様１７乃至１９のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【外国語明細書】
2020202855000001.pdf