(57)【要約】【課題】光増感物質からの一重項酸素の発生を良好に抑制する光増感物質からの一重項酸素の生成抑制方法、及び、光増感物質からの一重項酸素の生成抑制評価方法を提供する。【解決手段】基底状態の光増感物質と基底状態の抑制剤との混合溶液において、基底状態の光増感物質が光吸収により励起一重項状態へ遷移するステップ１と、光増感物質の励起一重項状態から基底状態の抑制剤へエネルギー移動することにより、光増感物質の励起一重項状態から項間交差によって光増感物質の励起三重項状態になることを抑制するステップ２と、光増感物質が励起三重項状態になった場合には、光増感物質の励起三重項状態から基底状態の抑制剤へエネルギー移動することで、光増感物質の励起三重項状態から混合溶液中の基底状態の酸素分子へエネルギー移動し、一重項酸素が生成することを抑制するステップ３とを備えた光増感物質からの一重項酸素の生成抑制方法。【選択図】図１
2020030060.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基底状態の光増感物質と基底状態の抑制剤との混合溶液において、前記基底状態の光増感物質が光吸収により励起一重項状態へ遷移するステップ１と、
前記光増感物質の励起一重項状態から前記基底状態の抑制剤へエネルギー移動することにより、前記光増感物質の励起一重項状態から項間交差によって前記光増感物質の励起三重項状態になることを抑制するステップ２と、
前記光増感物質が励起三重項状態になった場合には、前記光増感物質の励起三重項状態から基底状態の抑制剤へエネルギー移動することで、前記光増感物質の励起三重項状態から前記混合溶液中の基底状態の酸素分子へエネルギー移動し、一重項酸素が生成することを抑制するステップ３と、
を備えた光増感物質からの一重項酸素の生成抑制方法。
【請求項２】
前記光増感物質が、リボフラビン、クロロプロマジン、６−チオグアニン、アントラニル酸メチル誘導体とナフタレン誘導体、及び、メチレンブルーからなる群から選択される一種以上である請求項１に記載の光増感物質からの一重項酸素の生成抑制方法。
【請求項３】
前記抑制剤が、ビタミン誘導体、ヒスチジン誘導体、アスピリン誘導体、及び、トリプトファン誘導体からなる群から選択される一種以上である請求項１又は２に記載の光増感物質からの一重項酸素の生成抑制方法。
【請求項４】
光増感物質をパルスレーザー励起することで、一重項酸素に特異的な近赤外発光である1274 nmを観測するステップと、
前記光増感物質の溶液と、前記光増感物質と抑制剤とを含み、互いに前記抑制剤の濃度が異なる複数の混合溶液とを準備し、前記溶液及び前記複数の混合溶液に対し、前記観測波長1274 nmにおける発光強度の減衰曲線を作成するステップと、
前記発光強度の減衰曲線から前記一重項酸素の寿命を求め、前記一重項酸素の寿命に基づいて一重項酸素の消光速度定数（１）を求めるステップと、
前記光増感物質の溶液と、前記光増感物質と抑制剤とを含み、互いに前記抑制剤の濃度が異なる複数の混合溶液とを準備し、前記溶液及び前記複数の混合溶液に対し、蛍光スペクトル測定を行うステップと、
前記蛍光スペクトル測定で得られた蛍光強度に基づき前記光増感物質の励起一重項状態の蛍光寿命を算出し、前記励起一重項状態の蛍光寿命に基づいて前記光増感物質の励起一重項状態の消光速度定数（２）を求めるステップと、
前記光増感物質の過渡吸収測定で得られた過渡吸収強度に基づき前記光増感物質の励起三重項状態の過渡吸収寿命を算出し、前記光増感物質の励起三重項状態の過渡吸収寿命に基づいて前記光増感物質の励起三重項状態の消光速度定数（３）を求めるステップと、
前記一重項酸素の消光速度定数（１）と、前記光増感物質の励起一重項状態の消光速度定数（２）と、前記光増感物質の励起三重項状態の消光速度定数（３）とを比較するステップと、
を備えた光増感物質からの一重項酸素の生成抑制評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光増感物質からの一重項酸素の生成抑制方法、及び、光増感物質からの一重項酸素の生成抑制評価方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
リボフラビン（ビタミンＢ２）は水溶性ビタミンの一つであり、日常生活において紫外線にさらされる皮膚や眼に存在することが知られている。リボフラビンに光が照射されると、光増感作用によって一重項酸素が発生する。このようにリボフラビン等の光増感作用を有する物質は、光増感物質とも称されている。
【０００３】
光増感物質が光を吸収し、光増感剤として作用することで発生する一重項酸素は、酸化力が強く細胞を劣化させる。一重項酸素は様々な皮膚トラブルの原因となる皮脂の過酸化を引き起していることも明らかとなってきている。
【０００４】
このような問題に対し、例えば、非特許文献１では、光増感物質の光増感剤作用により発生した一重項酸素を、特定の反応剤を添加することで消去する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Journal of Physical and Chemical Reference Data 22, 113-262 (1993)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
光増感物質が光を吸収し、光増感剤として作用することで一重項酸素が発生する問題に対しては、上述のように、従来、発生した一重項酸素を消去する方法ばかりが開示されており、さらなる開発の余地があった。
【０００７】
本発明はこのような問題に鑑み、光増感物質の光増感剤作用による一重項酸素の発生を良好に抑制する光増感物質からの一重項酸素の生成抑制方法、及び、光増感物質からの一重項酸素の生成抑制評価方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前述のように、従来、光増感物質から発生した一重項酸素を消去する方法は知られているが、一重項酸素の発生そのものを抑制する方法の提案はされていない。一重項酸素は体内で発生すれば、その高い酸化力により直ちに酸化反応が進行し、細胞の損傷といったダメージを引き起こす。このため、生体内物質が一重項酸素の光増感剤として作用した場合、生成した一重項酸素を速やかに消去するとともに，一重項酸素の発生そのものを抑制することが重要である。このような観点から、本発明者らは、励起状態の光増感物質から基底状態の酸素分子へのエネルギー移動により一重項酸素が発生するメカニズムに基づき、一重項酸素の発生そのものを抑制することができることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明の一実施形態は、基底状態の光増感物質と基底状態の抑制剤との混合溶液において、前記基底状態の光増感物質が光吸収により励起一重項状態へ遷移するステップ１と、前記光増感物質の励起一重項状態から前記基底状態の抑制剤へエネルギー移動することにより、前記光増感物質の励起一重項状態から項間交差によって前記光増感物質の励起三重項状態になることを抑制するステップ２と、前記光増感物質が励起三重項状態になった場合には、前記光増感物質の励起三重項状態から基底状態の抑制剤へエネルギー移動することで、前記光増感物質の励起三重項状態から前記混合溶液中の基底状態の酸素分子へエネルギー移動し、一重項酸素が生成することを抑制するステップ３とを備えた光増感物質からの一重項酸素の生成抑制方法である。
【００１０】
本発明の生成抑制方法は別の一実施形態において、前記光増感物質が、リボフラビン、クロロプロマジン（神経弛緩薬類）、６−チオグアニン（核酸類）、アントラニル酸メチル誘導体とナフタレン誘導体（紫外線吸収剤関連分子類）、及び、メチレンブルー（有機色素類）からなる群から選択される一種以上である。
【００１１】
本発明の生成抑制方法は更に別の一実施形態において、前記抑制剤が、ビタミン誘導体（ビタミンＣ誘導体、ビタミンＥ誘導体）、ヒスチジン誘導体、アスピリン誘導体、及び、トリプトファン誘導体からなる群から選択される一種以上である。
【００１２】
本発明は別の実施形態において、光増感物質をパルスレーザー励起することで、一重項酸素に特異的な近赤外発光である1274 nmを観測するステップと、前記光増感物質の溶液と、前記光増感物質と抑制剤とを含み、互いに前記抑制剤の濃度が異なる複数の混合溶液とを準備し、前記溶液及び前記複数の混合溶液に対し、前記観測波長1274 nmにおける発光強度の減衰曲線を作成するステップと、前記発光強度の減衰曲線から前記一重項酸素の寿命を求め、前記一重項酸素の寿命に基づいて一重項酸素の消光速度定数（１）を求めるステップと、前記光増感物質の溶液と、前記光増感物質と抑制剤とを含み、互いに前記抑制剤の濃度が異なる複数の混合溶液とを準備し、前記溶液及び前記複数の混合溶液に対し、蛍光スペクトル測定を行うステップと、前記蛍光スペクトル測定で得られた蛍光強度に基づき前記光増感物質の励起一重項状態の蛍光寿命を算出し、前記励起一重項状態の蛍光寿命に基づいて前記光増感物質の励起一重項状態の消光速度定数（２）を求めるステップと、前記光増感物質の過渡吸収測定で得られた過渡吸収強度に基づき前記光増感物質の励起三重項状態の過渡吸収寿命を算出し、前記光増感物質の励起三重項状態の過渡吸収寿命に基づいて前記光増感物質の励起三重項状態の消光速度定数（３）を求めるステップと、前記一重項酸素の消光速度定数（１）と、前記光増感物質の励起一重項状態の消光速度定数（２）と、前記光増感物質の励起三重項状態の消光速度定数（３）とを比較するステップとを備えた光増感物質からの一重項酸素の生成抑制評価方法である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、光増感物質からの一重項酸素の発生を良好に抑制する光増感物質からの一重項酸素の生成抑制方法、及び、光増感物質からの一重項酸素の生成抑制評価方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の実施形態に係る光増感物質からの一重項酸素の生成抑制方法に関する一重項酸素の生成抑制機構の模式図である。
【図２】従来の発生した一重項酸素の消光機構の模式図である
【図３】実施例に係るリボフラビンの吸収スペクトルを示すグラフである。（Absorbance：吸光度、Wavelength：波長）
【図４】実施例に係るリボフラビンを光増感物質として生成した一重項酸素の近赤外発光スペクトルを示すグラフである。（Phosphorescence intensity：リン光強度、Wavelength：波長）
【図５】実施例に係る発光強度（リボフラビン＋ビタミンＣ誘導体）の減衰曲線を示すグラフである。（Phosphorescence intensity：リン光強度、Time：時間、Vitamin C derivative：ビタミンＣ誘導体）
【図６】実施例に係る発光強度（リボフラビン＋ビタミンＥ誘導体）の減衰曲線を示すグラフである。（Phosphorescence intensity：リン光強度、Time：時間、Vitamin E derivative：ビタミンＥ誘導体）
【図７】実施例に係る一重項酸素の寿命から作成したシュテルン−ホルマープロットである。（Vitamin E derivative：ビタミンＥ誘導体）
【図８】実施例に係る蛍光スペクトル（リボフラビン＋ビタミンＣ誘導体）のグラフを示す。（Fluorescence intensity：蛍光強度、Wavelength：波長、Vitamin C derivative：ビタミンＣ誘導体）
【図９】実施例に係る励起一重項状態（リボフラビン＋ビタミンＣ誘導体）の蛍光寿命τに基づいて作成したシュテルン−ホルマープロットである。（Vitamin C derivative：ビタミンＣ誘導体）
【図１０】実施例に係る蛍光スペクトル（リボフラビン＋ビタミンＥ誘導体）のグラフを示す。（Fluorescence intensity：蛍光強度、Wavelength：波長、Vitamin E derivative：ビタミンＥ誘導体）
【図１１】実施例に係る励起一重項状態（リボフラビン＋ビタミンＥ誘導体）の蛍光寿命τに基づいて作成したシュテルン−ホルマープロットである。（Vitamin E derivative：ビタミンＥ誘導体）
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（光増感物質からの一重項酸素の生成抑制方法）
図１に、本発明の実施形態に係る光増感物質からの一重項酸素の生成抑制方法に関する一重項酸素の生成抑制機構の模式図を示す。また、図２に、従来の発生した一重項酸素の消光機構の模式図を示す。
【００１６】
本発明の実施形態に係る光増感物質からの一重項酸素の生成抑制方法は、基底状態の光増感物質と基底状態の抑制剤との混合溶液において、基底状態の光増感物質が光吸収により励起一重項状態へ遷移するステップ１と、光増感物質の励起一重項状態から基底状態の抑制剤へエネルギー移動することにより、光増感物質の励起一重項状態から項間交差によって光増感物質の励起三重項状態になることを抑制するステップ２と、光増感物質が励起三重項状態になった場合には、光増感物質の励起三重項状態から基底状態の抑制剤へエネルギー移動することで、光増感物質の励起三重項状態から混合溶液中の基底状態の酸素分子へエネルギー移動し、一重項酸素が生成することを抑制するステップ３とを備える。
【００１７】
図１に示す一重項酸素生成機構のように、一重項酸素の光増感生成機構では、一重項酸素は光増感物質の励起三重項状態から基底状態の酸素分子へのエネルギー移動により生成する。光増感物質の励起三重項状態は、光増感物質が光吸収により励起一重項状態となったのち、項間交差を経て励起三重項状態となる。一重項酸素の光増感生成の抑制には二つのルートがあり、一つは光増感物質の励起一重項状態を速やかに消去し、項間交差により光増感物質の励起三重項状態が生成することを抑制するルート、もう一つは光増感物質の励起三重項状態を速やかに消去し、基底状態の酸素分子へのエネルギー移動をブロックするルートである。本発明の実施形態に係る光増感物質からの一重項酸素の生成抑制方法は、この二つのルートにより一重項酸素生成抑制を可能にしている。すなわち、前述の一重項酸素生成抑制機構に基づき、光増感物質の励起一重項状態を速やかに消去し、光増感物質の励起三重項状態への項間交差を抑制するルート、および、光増感物質の励起三重項状態を速やかに消去し、光増感物質の励起三重項状態から混合溶液中の基底状態の酸素分子へのエネルギー移動過程を抑制するルートにより、従来のように発生した一重項酸素を消去するのではなく、一重項酸素の発生そのものを抑制することを可能にしている。
【００１８】
本発明の実施形態で用いることができる光増感物質は、光が照射されると光増感作用を示して一重項酸素を発生するものであり、例えば、リボフラビン（ビタミン類）、クロロプロマジン（神経弛緩薬類）、６−チオグアニン（核酸類）、アントラニル酸メチル誘導体とナフタレン誘導体（紫外線吸収剤関連分子類）、及び、メチレンブルー（有機色素類）からなる群から選択される一種以上である。
【００１９】
本発明の実施形態で用いることができる抑制剤は、添加した当該抑制剤が、光増感物質の励起一重項状態を速やかに消去することで、項間交差により光増感物質の励起一重項状態から光増感物質の励起三重項状態になることを抑制（スッテプ２）し、さらに、光増感物質の励起三重項状態を速やかに消去することで、光増感物質の励起三重項状態から基底状態の酸素分子へエネルギー移動することを抑制（スッテプ３）することができるものであり、例えば、抗酸化作用を有するビタミン誘導体（ビタミンＣ誘導体、ビタミンＥ誘導体）、ヒスチジン誘導体、アスピリン誘導体、及び、トリプトファン誘導体からなる群から選択される一種以上である。
【００２０】
本発明の実施形態に係る光増感物質からの一重項酸素の生成抑制方法で用いる、基底状態の光増感物質と基底状態の抑制剤との混合溶液は、当該光増感物質及び抑制剤がエタノール、アセトン、アセトニトリル、重水、リン酸緩衝液等の溶媒に溶解した液である。
【００２１】
また、図２に示す一重項酸素消去機構としては、一重項酸素と消光剤との化学反応により一重項酸素を消去する化学消光と一重項酸素と消光剤とのエネルギー移動を主とする物理消光が知られており、一重項酸素消去を主とする従来法では、化学消光による消光剤の化学変化は避けられず、消光剤の消費される結果となる。これに対し、本発明の実施形態に係る光増感物質（図１では光増感剤と記載）からの一重項酸素の生成抑制方法では、図１に示すように、抑制剤（図１では生成抑制剤と記載）が、光増感物質の励起一重項状態を速やかに消去することで、励起一重項状態から励起三重項状態への項間交差、及び、光増感物質の励起三重項状態を速やかに消去することで、光増感物質の励起三重項状態から基底状態の酸素分子へのエネルギーの移動をそれぞれ抑制しており、抑制剤自身は化学反応しない。このため、当該一重項酸素の生成抑制方法においては、抑制剤は繰返し使用することができるため効率及びコストの面で優れている。
【００２２】
（光増感物質からの一重項酸素の生成抑制評価方法）
本発明の実施形態に係る光増感物質からの一重項酸素の生成抑制評価方法は、光増感物質をパルスレーザー励起することで、一重項酸素に特異的な近赤外発光である1274 nmを観測するステップと、光増感物質の溶液と、光増感物質と抑制剤とを含み、互いに抑制剤の濃度が異なる複数の混合溶液とを準備し、溶液及び複数の混合溶液に対し、観測波長1274 nmにおける発光強度の減衰曲線を作成するステップと、観測波長1274 nmにおける発光強度の減衰曲線から一重項酸素の寿命を求め、一重項酸素の寿命に基づいて一重項酸素の消光速度定数（１）を求めるステップと、光増感物質の溶液と、光増感物質と抑制剤とを含み、互いに抑制剤の濃度が異なる複数の混合溶液とを準備し、溶液及び複数の混合溶液に対し、蛍光スペクトル測定を行うステップと、蛍光スペクトル測定で得られた蛍光強度に基づき光増感物質の励起一重項状態の蛍光寿命を算出し、励起一重項状態の蛍光寿命に基づいて光増感物質の励起一重項状態の消光速度定数（２）を求めるステップと、光増感物質の過渡吸収測定で得られた過渡吸収強度に基づき光増感物質の励起三重項状態の過渡吸収寿命を算出し、光増感物質の励起三重項状態の過渡吸収寿命に基づいて光増感物質の励起三重項状態の消光速度定数（３）を求めるステップと、一重項酸素の消光速度定数（１）と、光増感物質の励起一重項状態の消光速度定数（２）と、光増感物質の励起三重項状態の消光速度定数（３）とを比較するステップとを備える。
【００２３】
本発明の実施形態に係る光増感物質からの一重項酸素の生成抑制評価方法についてより具体的に説明する。まず、光増感物質の溶液を作製する。光増感物質をパルスレーザー励起し、一重項酸素に特異的な近赤外発光1274 nmを観測することにより、光増感物質の光増感作用による一重項酸素の発生を確認する。次に、光増感物質と抑制剤とを含み、互いに抑制剤の濃度が異なる複数の混合溶液を作製する。次に、当該光増感物質の溶液及び複数の混合溶液に対し、パルスレーザー励起後の観測波長1274 nmにおける発光強度を測定し、発光強度の減衰曲線を作成する。次に、この一重項酸素の発光強度の減衰曲線から一重項酸素の寿命を求める。ここで、詳細は後述するが、一重項酸素消去剤の一重項酸素消去能は、一重項酸素消光速度定数により評価することができる。次に、上記光増感物質を一重項酸素光増感剤、上記抑制剤を一重項酸素消光剤とし、これらの溶液中における一重項酸素の寿命から一重項酸素の消光速度定数（１）を求める。
【００２４】
次に、上記の抑制剤による一重項酸素の初期生成量の抑制（生成量子収量減少）について明らかにするために、光増感物質の蛍光寿命測定を以下の通り行う。まず、光増感物質の溶液を準備する。また、光増感物質と抑制剤との混合溶液をそれぞれ準備する。光増感物質と抑制剤との溶液については、抑制剤の溶液中の濃度が互いに異なる複数のものを準備する。次にこれらの溶液に対し、以下の通り蛍光スペクトル測定を行い、蛍光強度を測定する。まず、光増感物質の溶液と互いに異なる濃度の抑制剤の溶液を準備する。次に、光増感物質の溶液と抑制剤の溶液を体積比1対1で混合した溶液を準備し、蛍光スペクトル測定を行う。また、当該蛍光スペクトルの蛍光強度に基づき光増感物質の励起一重項状態の蛍光寿命τを算出し、詳細は後述するが、光増感物質の蛍光寿命τに基づいて光増感物質の励起一重項状態の消光速度定数（２）を求める。
【００２５】
次に、上記の抑制剤による一重項酸素の初期生成量の抑制（生成量子収量減少）について明らかにするために、光増感物質の過渡吸収測定を行う。光増感物質の過渡吸収測定で得られた過渡吸収強度に基づき過渡吸収寿命を算出し、過渡吸収寿命に基づいて光増感物質の励起三重項状態の消光速度定数（３）を求める。
【００２６】
以上により求めた一重項酸素の消光速度定数（１）と、光増感物質の励起一重項状態の消光速度定数（２）と、光増感物質の励起三重項状態の消光速度定数（３）とを比較する。
【００２７】
このような構成によれば、例えば光増感物質の励起一重項状態の消光速度定数（２）と光増感物質の励起三重項状態の消光速度定数（３）とを比較することで、光増感物質の励起一重項状態を速やかに消去する抑制機構と光増感物質の励起三重項状態を速やかに消去し、基底状態の酸素分子へのエネルギー移動をブロックする抑制機構のどちらが主な抑制ルートかを確認することができる。このため、一重項酸素の発生の抑制がより良好となるように抑制剤の選択や抑制剤の濃度等を適宜調整することができる。さらに、発生した一重項酸素の消去能については、一重項酸素の消光速度定数として評価できる。
【００２８】
また、例えば一重項酸素の消光速度定数（１）と、光増感物質の励起三重項状態の消光速度定数（３）とを用いることで、発生した一重項酸素の消光あるいは一重項酸素の初期生成量の抑制がどの程度有効であるのかを確認することができる。このため、一重項酸素の発生の抑制がより良好となるように抑制剤の選択や抑制剤の濃度等を適宜調整することができる。
【００２９】
本発明の実施形態に係る光増感物質からの一重項酸素の生成抑制方法、及び、光増感物質からの一重項酸素の生成抑制評価方法は、例えば生体内における一重項酸素発生による細胞のがん化や酸化の防止に利用することができる。
【実施例】
【００３０】
以下に本発明を実施例でさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３１】
まず、光増感物質としてリボフラビンを準備した。リボフラビンは紫外光（ＵＶ−Ａ）及び可視光領域（300-500 nm）に幅広の吸収帯を有し、370 nm及び445 nmにおけるモル吸収係数はそれぞれ8700 mol-1dm3cm-1及び1000 mol-1dm3cm-1であった（図３）。リボフラビンに由来する蛍光発光は490-640 nmに観測された。リボフラビンを355 nmパルスレーザー励起すると、一重項酸素に特異的な近赤外発光（1274 nm）が観測され、リボフラビンの光増感作用による一重項酸素の発生が確認された（図４）。
【００３２】
次に、リボフラビンのリン酸緩衝溶液を準備した。また、リボフラビンと抑制剤としてのビタミンＣ誘導体またはビタミンＥ誘導体とのリン酸緩衝溶液をそれぞれ準備した。当該抑制剤としてのビタミンＣ誘導体のリン酸緩衝溶液中の濃度は、0.5、1、2、3、4 mmol dm-3のものをそれぞれ準備した。また、当該抑制剤としてのビタミンＥ誘導体のリン酸緩衝溶液中の濃度は、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mmol dm-3のものをそれぞれ準備した。次にこれらのリン酸緩衝溶液に対し、観測波長1274 nmにおいて、発光強度をパルスレーザーによる励起から時間とともに減衰していく様子を測定し、発光強度の減衰曲線を作成した（図５、図６）。
ここで、当該レーザーとして、Nd:YAGレーザー（イットリウム・アルミニウム・ガーネット単結晶にNd3+イオンをドープした構造体、Continuum（コンティニュアム社、アメリカ）、型式：Surelite I））からの波長355 nm光を用いた。
また、発光強度の減衰曲線については、リン酸緩衝溶液から発する光を小型分光器（（株）島津製作所、型式：SPG-120IR、波長範囲：700-2500 nm）で分光し、一重項酸素固有の1274 nmの近赤外りん光を近赤外光電子増倍管モジュール（浜松ホトニクス(株)、型式:H10330A-45、波長範囲:950-1400 nm）で検出し、デジタルオシロスコープ（Tektronix（テクトロニクス社、アメリカ）、型式：TDS 3012C、周波数帯域：100 MHz）上に記録させ、得られた一重項酸素からの近赤外りん光発光強度の減衰曲線を解析した。
【００３３】
図５、図６に示すように、各リン酸緩衝溶液における一重項酸素の初期発光強度は、抑制剤（ビタミンＣ誘導体、ビタミンＥ誘導体）の添加濃度の増加とともに減少することがわかる。すなわち、抑制剤（ビタミンＣ誘導体、ビタミンＥ誘導体）の添加濃度が大きいほど一重項酸素の初期生成量が抑制（生成量子収量減少）されることがわかる。また、図５、図６を比較すると、ビタミンＥ誘導体はビタミンＣ誘導体よりも一重項酸素の初期生成量の抑制効果が高いことがわかる。
【００３４】
次に、一重項酸素の発光強度の減衰曲線からリン酸緩衝溶液中における一重項酸素の寿命を求めたところ、3-4 μsであった。
一重項酸素消去剤の一重項酸素消去能は、一重項酸素消光速度定数により評価することができる。一重項酸素消光速度定数をkq、抑制剤の濃度を[Q]、抑制剤無添加および添加溶液での一重項酸素の寿命をそれぞれτ0およびτとすると、シュテルン−ホルマー式（Stern-Volmer equation）は次式となる。
τ0/τ = 1 + τ0 kq [Q]
[Q]に対してτ0/τをプロット（シュテルン−ホルマープロット、Stern-Volmer plot）すると直線が得られ，その傾きとτ0の値からkqを求めることができる。
リボフラビンを一重項酸素光増感剤、ビタミンＥ誘導体を一重項酸素消光剤とし、これらのリン酸緩衝溶液中における一重項酸素の寿命からシュテルン−ホルマープロット（図７）により、一重項酸素の消光速度定数kqを求めると、7.9×107 mol-1dm3s-1であった。
【００３５】
次に、上記のビタミン誘導体による一重項酸素の初期生成量の抑制（生成量子収量減少）について明らかにするために、堀場製作所時間分解フォトルミネッセンス・蛍光分光光度計NAES-700を用いてリボフラビンの蛍光寿命測定を以下の通り行った。まず、リボフラビンのリン酸緩衝溶液を準備した。また、リボフラビンと抑制剤としてのビタミンＣ誘導体またはビタミンＥ誘導体とのリン酸緩衝溶液をそれぞれ準備した。当該抑制剤としてのビタミンＣ誘導体のリン酸緩衝溶液中の濃度は、3、6、12、18、24 mmol dm-3のものをそれぞれ準備した。また、当該抑制剤としてのビタミンＥ誘導体のリン酸緩衝溶液中の濃度は、2、4、6、8、10 mmol dm-3のものをそれぞれ準備した。
【００３６】
次にこれらのリン酸緩衝溶液に対し、以下の通り蛍光スペクトル測定を行い、蛍光強度を測定した。まず、リボフラビンの0.1 mmol dm-3リン酸緩衝溶液と抑制剤としてのビタミンＣ誘導体またはビタミンＥ誘導体の各濃度のリン酸緩衝溶液を準備した。次に、リボフラビンの0.1 mmol dm-3リン酸緩衝溶液と抑制剤としてのビタミンＣ誘導体またはビタミンＥ誘導体のリン酸緩衝溶液を体積比1対1で混合した溶液を準備し、日本分光FP-6500分光蛍光光度計を用いて室温にて測定した。当該蛍光スペクトルのグラフを図８、図１０に示す。また、当該蛍光スペクトルの蛍光強度に基づきリボフラビンの励起一重項状態の蛍光寿命τを算出し、リボフラビンの励起一重項状態の蛍光寿命τに基づいてシュテルン−ホルマープロット（図９、１１）により、リボフラビンの励起一重項状態の消光速度定数1kqを求めると、それぞれ2.4×109 mol-1dm3s-1(ビタミンＣ誘導体添加)、5.5×109 mol-1dm3s-1(ビタミンＥ誘導体添加)であった。
【００３７】
ビタミン誘導体による一重項酸素の初期生成量の抑制（生成量子収量減少）について明らかにするために、リボフラビンの過渡吸収測定を行った。光増感物質の過渡吸収測定で得られた過渡吸収強度に基づき過渡吸収寿命を算出し、過渡吸収寿命に基づいて光増感物質の励起三重項状態の消光速度定数3kqを求めると、それぞれ5.7×108 mol-1 dm3 s-1(ビタミンＣ誘導体添加)、9.7×109 mol-1 dm3 s-1(ビタミンＥ誘導体添加)であった。
【００３８】
このようにして求めた各消光速度定数を評価することで、上記試験の一重項酸素の生成抑制機構を理解することができる。本試験の場合、リボフラビンの励起一重項状態の消光速度定数とリボフラビンの励起三重項状態の消光速度定数とを比較すると、リボフラビンの励起一重項状態の消光速度定数の方が大きかった。本試験のリン酸緩衝溶液中における抑制剤の添加濃度では、リボフラビンの励起一重項状態の消光による抑制ルートよりリボフラビンの励起三重項状態から基底状態酸素分子へのエネルギー移動の抑制ルートが、有効に作用し、一重項酸素の初期生成量が抑制されることが分かった。さらに、本試験のリン酸緩衝溶液中のような水溶液系では、抑制剤による一重項酸素の生成抑制が、一重項酸素の消光能より有効に機能することが分かった。水溶液ではもともとの一重項酸素の寿命が3.3 μsと短いため、消光剤の添加による消光能（消光剤がないときの寿命と比較して、消光剤の添加により、寿命が何分の一になったか）の効果は小さい。一方、光増感剤の励起三重項状態の寿命はもともと長いため（リボフラビンの励起三重項状態の寿命は120 μs）、励起三重項状態そのものを消光すると、一重項酸素の生成抑制に非常に効果を発揮する。光増感剤の励起三重項状態の量子収量は水溶液でも有機溶媒系でもあまり変わらないが、一重項酸素の寿命は水溶液では短く、有機溶媒中では長い。このようなことから、水溶液では、消光能より抑制能が有効になると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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