(57)【要約】【課題】一群の標的核酸分子の定量的ランドスケープを確立するための方法を提供すること。【解決手段】上記方法は、一群の標的核酸分子のそれぞれの標的核酸分子を定量化するための複数のハイブリダイゼーション反応を実施して、複数の定量的シグナルを生成するステップと、２つの定量的シグナル間の比を生成するステップと、一群の標的核酸分子の定量的ランドスケープを構築するために、比を併合するステップとを含む。本発明に従う方法により、多数の標的核酸分子をプロファイリングして、多様な適用例のために、高感度で広いダイナミックレンジを有するビッグデータ標準化手段を提供することが可能になる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子を検出する技法に関する。より具体的には、本発明は、核酸分子を定量的にプロファイリングするための方法、およびそれによる生物学的および臨床的適用のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子の検出は、臨床診断および分子生物学的研究において重要な役割を果たす。いくつかのシステムが、試料中の標的分子を検出および／または同定するための分子検出を実施するために開発されてきた。一般に、生物体中の分子事象は、単一の分子の代わりに多数の分子により引き起こされ、したがって、一群の分子をプロファイリングすることは、生物学的試料内の単一分子を検出および／または同定することよりもはるかに重要であるはずである。
【０００３】
一群の分子をプロファイリングするためのいくつかの検出手順が開発されており、それらのほとんどが、マイクロアレイと一般に呼ばれる方法にしばしば基づく。従来のマイクロアレイの方法は、標識された分子を必要とする。しかし、マイクロアレイは、標識化を必要とすることに関する欠点により、一群の分子をプロファイリングするための最も用途の広くかつ好都合な定量的な方法になっていない。さらに、そのように複雑であることに起因して、多くの適用例において、偽陽性および偽陰性の結果も、共通の問題になっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
さらに、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の場合等の、サブセットの分子の希少性に起因して、特定の試料中に存在する全ての分子を定量化することは難しい。その典型例が、「Ｄｉｒｅｃｔ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｍｉＲＮＡｓ  ｉｎ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｓｔａｇｅｓ  ｏｆ  Ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  Ｃａｎｃｅｒｏｕｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓａｍｐｌｅｓ  ｉｎ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｌｅｖｅｌ  ｗｉｔｈ  Ｔｏｔａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、Ｓｅｅ−Ｌｏｋ  Ｈｏ、Ｈｏ−Ｍａｎ  Ｃｈａｎ、Ａｍｂｅｒ  Ｗａｉ−Ｙａｎ  Ｈａ、Ｒｉｃｋｙ  Ｎｇｏｋ−Ｓｈｕｎ  ＷｏｎｇおよびＨｕｎｇ−Ｗｉｎｇ  Ｌｉ、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．、２０１４年、８６巻（１９号）、９８８０〜９８８６頁」に示されている。これらの希少分子の定量化のための方法が開発されているにもかかわらず、それらの方法は、酵素的／化学的な標識化または酵素による増幅を必要とする（Ｄｉｒｅｃｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ、Ｅｒｉｃ  Ａ．  Ｈｕｎｔ、Ａｎｎ  Ｍ．  ＧｏｕｌｄｉｎｇおよびＳａｐｎａ  Ｋ．  Ｄｅｏ、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００９年４月１日、３８７巻（１号）：１〜１２頁；Ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、Ｕｔｅ  Ｂｉｓｓｅｌｓ、Ｓｔｅｆａｎ  Ｗｉｌｄ、Ｓｔｅｆａｎ  Ｔｏｍｉｕｋ、Ａｎｇｅｌａ  Ｈｏｌｓｔｅ、Ｍａｒｋｕｓ  Ｈａｆｎｅｒ、Ｔｈｏｍａｓ  ＴｕｓｃｈｌおよびＡｎｄｒｅａｓ  Ｂｏｓｉｏ、ＲＮＡ、２００９年１２月、１５巻（１２号）：２３７５〜２３８４頁；Ｄｉｒｅｃｔ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ａｔ  ｌｏｗ  ｐｉｃｏｍｏｌａｒ  ｌｅｖｅｌ  ｉｎ  ｓｅｒａ  ｏｆ  ｇｌｉｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、Ｊｉａｎｘｉｕ  Ｗａｎｇ、Ｘｉｎｙａｏ  Ｙｉ、Ｈａｉｌｉｎ  Ｔａｎｇ、Ｈｏｎｇｘｉｎｇ  Ｈａｎ、Ｍｉｎｇｈｕａ  ＷｕおよびＦｅｉｍｅｎｇ  Ｚｈｏｕ、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．、２０１２年、８４巻（１５号）、６４００〜６４０６頁；Ｄｉｒｅｃｔ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｍｉＲＮＡｓ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｔａｇｅｓ  ｏｆ  ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｎｃｅｒｏｕｓ  ｓｅｒｕｍ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｌｅｖｅｌ  ｗｉｔｈ  ｔｏｔａｌ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、Ｓｅｅ−Ｌｏｋ  Ｈｏ、Ｈｏ−Ｍａｎ  Ｃｈａｎ、Ａｍｂｅｒ  Ｗａｉ−Ｙａｎ  Ｈａ、Ｒｉｃｋｙ  Ｎｇｏｋ−Ｓｈｕｎ  ＷｏｎｇおよびＨｕｎｇ−Ｗｉｎｇ  Ｌｉ、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．、２０１４年、８６巻（１９号）、９８８０〜９８８６頁；Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｆ  ｅｘｏｓｏｍｅｓ、Ｊｏｈｎ  Ｒ．  Ｃｈｅｖｉｌｌｅｔ、Ｑｉｎｇ  Ｋａｎｇ、Ｉｎｇｒｉｄ  Ｋ．  Ｒｕｆ、Ｈｉｌａｒｙ  Ａ．  Ｂｒｉｇｇｓ、Ｌｕｃｉａ  Ｎ．  Ｖｏｊｔｅｃｈ、Ｓｅａｎ  Ｍ．  Ｈｕｇｈｅｓ、Ｈｅａｔｈｅｒ  Ｈ．  Ｃｈｅｎｇ、Ｊａｓｏｎ  Ｄ．  Ａｒｒｏｙｏ、Ｅｍｉｌｙ  Ｋ．  Ｍｅｒｅｄｉｔｈ、Ｅｍｉｌｙ  Ｎ．  Ｇａｌｌｉｃｈｏｔｔｅ、Ｅｒａ  Ｌ．  Ｐｏｇｏｓｏｖａ−Ａｇａｄｊａｎｙａｎ、Ｃｏｌｍ  Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ、Ｄｅｒｅｋ  Ｌ．  Ｓｔｉｒｅｗａｌｔ、Ｆｌｏｒｉａｎ  Ｈｌａｄｉｋ、Ｅｖａｎ  Ｙ．  Ｙｕ、Ｃｅｌｅｓｔｉａ  Ｓ．  ＨｉｇａｎｏおよびＭｕｎｅｅｓｈ  Ｔｅｗａｒｉ、ＰＮＡＳ、２０１４年、１１１巻（４号）、１４８８８〜１４８９３頁）。増幅ステップがアーティファクトの源であることはよく理解されている。全てのプライマーが等しく利用されることはなく、増幅サイクルの数が増えるにしたがって、偏りがますます顕著になる。化学的な標識化または酵素による増幅ステップは手間のかかる作業であり、時間もコストもかかる。さらに、化学的な標識化または酵素による増幅のシグナルの変換は、検出における誤差の原因になる。これらの欠点は、単一またはわずか数種のｍｉＲＮＡ分子を定量化する場合には許容され得るが、ｍｉＲＮＡ分子、または一般に、核酸分子のより大きな群をプロファイリングするためには、従来のプロセスを適用することは不可能である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、一群の標的核酸分子の定量的ランドスケープを確立するための方法であって、
一群の標的核酸分子のそれぞれの標的核酸分子を定量化するための複数のハイブリダイゼーション反応を実施して、複数の定量的シグナルを生成するステップであって、複数のハイブリダイゼーション反応が、約１ｆＭよりも低い定量化の限界を有する、ステップと、
任意の２つの定量的シグナル間の複数の比を生成するステップと、
一群の標的核酸分子の定量的ランドスケープを構築するために、比を併合するステップと
を含む方法を提供するものである。
【０００６】
本発明に従う方法により、多数の標的核酸分子の定量的ランドスケープを動的にモニタリングして、多様な適用例のためにビッグデータ標準化手段を提供することが可能になる。方法により、自己参照による内部標準化のアプローチを提供し、少なくとも２つの異なる試料から、核酸分子、例として、ｍｉＲＮＡの比を決定することが可能になる。
【０００７】
本発明は、上記で言及した通りの方法を用いて確立される、一群の標的核酸分子の定量的ランドスケープを提供するものである。
【０００８】
本発明を、以下のセクションで詳細に記載する。本発明のその他の特徴、目的および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲において見出すことができる。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する。
（項目１）
一群の標的核酸分子の定量的ランドスケープを確立するための方法であって、
上記一群の標的核酸分子のそれぞれの標的核酸分子を定量化するための複数のハイブリダイゼーション反応を実施して、複数の定量的シグナルを生成するステップであって、上記複数のハイブリダイゼーション反応が、約１ｆＭよりも低い定量化の限界を有する、ステップと、
任意の２つの定量的シグナル間の複数の比を生成するステップと、
上記一群の標的核酸分子の上記定量的ランドスケープを構築するために、上記比を併合するステップと
を含む、方法。
（項目２）
上記一群の標的核酸分子中の上記標的核酸分子の数がｎであり、相関させようとする比の数が［ｎ×（ｎ−１）／２］（式中、ｎは整数である）である、項目１に記載の方法。
（項目３）
標識化が行われない、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目４）
酵素による増幅が行われない、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
上記標的核酸分子が、ＤＮＡ、ｃｆＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＬｎｃＲＮＡおよびリボソームＲＮＡからなる群より選択される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
上記一群の標的核酸分子が、少なくとも３つの標的核酸分子を含有する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
上記複数のハイブリダイゼーション反応が、同時に実施される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
上記標的核酸分子が、１つのチップまたはマイクロアレイ中に統合される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
上記複数の定量的シグナルが、電気的な変化、重量の変化、吸光度波長の変化、吸光度強度の変化、蛍光および蛍光強度の変化、ならびに屈折率の変化からなる群より選択される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
上記電気的な変化が、電荷の変化、電流の変化、電気抵抗の変化、閾値電圧シフトの変化、電気伝導度の変化、電場の変化、電気容量の変化、電流の変化、電子の変化および電子空孔の変化からなる群より選択される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
上記複数のハイブリダイゼーション反応が、固体表面に付着している認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子、または上記固体表面から所定の距離だけ間隔をあけている上記認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子を用いて実施される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
上記固体表面が、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）の半導体に基づく電気的検知チップ、または表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の金属表面である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
上記固体表面の材料が、多結晶ケイ素または単結晶ケイ素である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
上記固体表面が、上記電気的な変化を検出するための電気的な変化を検出する要素とカップリングされている、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
上記電気的な変化を検出する要素が、電界効果トランジスタまたは表面プラズモン共鳴である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
上記認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子が、少なくとも１つの電気的に中性のヌクレオチドおよび少なくとも１つの負に荷電しているヌクレオチドを含む部分的に中性の一本鎖オリゴヌクレオチドである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
上記電気的に中性のヌクレオチドが、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基により置換されているリン酸基を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
上記負に荷電しているヌクレオチドが、非置換のリン酸基を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
上記認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子が、固体表面に付着しており、上記部分的に中性の一本鎖オリゴヌクレオチドが、上記固体表面に付着している第１の部分を含み、上記第１の部分の長さが、上記部分的に中性の一本鎖オリゴヌクレオチドの全長の約５０％であり、上記第１の部分が、少なくとも１つの電気的に中性のヌクレオチドおよび少なくとも１つの負に荷電しているヌクレオチドを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
上記定量的シグナルの最も小さなシグナルと最も大きなシグナルとの間の差が、少なくとも２桁の大きさである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
上記項目のいずれか一項に記載の方法を用いて確立される、一群の標的核酸分子の定量的ランドスケープ。
開示の要約
本発明は、一群の標的核酸分子の定量的ランドスケープを確立するための方法に関する。上記方法は、一群の標的核酸分子のそれぞれの標的核酸分子を定量化するための複数のハイブリダイゼーション反応を実施して、複数の定量的シグナルを生成するステップと、２つの定量的シグナル間の比を生成するステップと、一群の標的核酸分子の定量的ランドスケープを構築するために、比を併合するステップとを含む。本発明に従う方法により、多数の標的核酸分子をプロファイリングして、多様な適用例のために、高感度で広いダイナミックレンジを有するビッグデータ標準化手段を提供することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明に従う、部分的に中性の一本鎖オリゴヌクレオチド中の電気的に中性のヌクレオチドの好ましい一実施形態を示す。
【００１０】
【図２】図２は、（Ａ）プローブ−８８５−５ｐ；（Ｂ）プローブ−５７９−３ｐ；および（Ｃ）プローブ−１０７を用いた、ｍｉＲ−８８５−５ｐのＩｄ−Ｖｇ曲線を示す。
【００１１】
【図３】図３は、（Ａ）プローブ−８８５−５ｐ；（Ｂ）プローブ−５７９−３ｐ；および（Ｃ）プローブ−１０７を用いた、ｍｉＲ−５７９−３ｐのＩｄ−Ｖｇ曲線を示す。
【００１２】
【図４】図４は、（Ａ）プローブ−８８５−５ｐ；（Ｂ）プローブ−５７９−３ｐ；および（Ｃ）プローブ−１０７を用いた、ｍｉＲ−１０７のＩｄ−Ｖｇ曲線を示す。
【００１３】
【図５】図５は、種々の標的およびプローブにより誘発されたＮＷＦＥＴの閾値電圧シフトを示す。
【００１４】
【図６】図６は、ＮＷＦＥＴを電子バイオセンサーとして使用して、ＰＣ３細胞内の多様なｍｉＲＮＡの絶対量を定量化した検量線を示す。
【００１５】
【図７】図７は、ＮＷＦＥＴを電子バイオセンサーとして使用して、ＣＷＲ細胞内の多様なｍｉＲＮＡの絶対量を定量化した検量線を示す。
【００１６】
【図８】図８は、ｍｉＲ−３０１ａの、ＮＷＦＥＴを電子バイオセンサーとして使用するダイナミックレンジが、０．０１７９ｆＭ〜１７９０００ｆＭの７桁に及んだことを示す。
【００１７】
【図９】図９は、０．０１７９ｆＭ〜１７９０００ｆＭのｍｉＲ−３０１ａの、ｑ−ＰＣＲによるＣｔ値を示す。
【００１８】
【図１０】図１０は、ＰＣ３細胞中の、ｍｉＲ−２１の別の６つのｍｉＲＮＡに対する濃度の比を示す。
【００１９】
【図１１】図１１は、ＰＣ３細胞中の、ｍｉＲ−３３の別の６つのｍｉＲＮＡに対する濃度の比を示す。
【００２０】
【図１２】図１２は、ＰＣ３細胞中の、ｍｉＲ−３０１ａの別の６つのｍｉＲＮＡに対する濃度の比を示す。
【００２１】
【図１３】図１３は、ＣＷＲ細胞中の、ｍｉＲ−２１の別の６つのｍｉＲＮＡに対する濃度の比を示す。
【００２２】
【図１４】図１４は、ＣＷＲ細胞中の、ｍｉＲ−３３の別の６つのｍｉＲＮＡに対する濃度の比を示す。
【００２３】
【図１５】図１５は、ＣＷＲ細胞中の、ｍｉＲ−３０１ａの別の６つのｍｉＲＮＡに対する濃度の比を示す。
【００２４】
【図１６】図１６は、ｍｉＲ−２１、３０１ａ、３３、３４ａ、１０７、３７５、１４１についての比の３Ｄプロットを示す；ＰＣ３細胞中のこれら７つのｍｉＲＮＡから、２つのｍｉＲＮＡをランダムに選択した。
【００２５】
【図１７】図１７は、ｍｉＲ−２１、３０１ａ、３３、３４ａ、１０７、３７５、１４１についての比の３Ｄプロットを示す；ＣＷＲ細胞中のこれら７つのｍｉＲＮＡから、２つのｍｉＲＮＡをランダムに選択した。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、一群の標的核酸分子の定量的ランドスケープを確立するための方法であって、
一群の標的核酸分子のそれぞれの標的核酸分子を定量化するための複数のハイブリダイゼーション反応を実施して、複数の定量的シグナルを生成するステップであって、複数のハイブリダイゼーション反応が、約１ｆＭよりも低い定量化の限界を有する、ステップと、
任意の２つの定量的シグナル間の複数の比を生成するステップと、
一群の標的核酸分子の定量的ランドスケープを構築するために、比を併合するステップと
を含む方法を提供するものである。
【００２７】
本発明の一実施形態では、定量的ランドスケープが、一群の標的核酸分子中のメンバー間または一群の標的核酸分子中のメンバーとその他の関連する生物学的分子との間の関係を直接的または間接的に示す。定量的ランドスケープは、必要に応じて、さらに処理または分析することができる。本発明に従う定量的ランドスケープは、対象の特定の状態、例として、疾患を示すためのマーカーとして用いることができる。好ましくは、いくつかの特定の状態のいくつかの定量的ランドスケープをそれぞれ確立し、診断のために、それぞれの定量的ランドスケープを、対応する特定の状態の指標として保存する。
【００２８】
好ましくは、本発明に従う方法では、ハイブリダイゼーション反応における標識化が行われず、すなわち本発明に従う方法は、標識化を利用しない。本発明に従う標識化は、標的核酸分子の存在を同定または定量化するための要素を付加するためのプロセスを指す。本発明の一実施形態では、要素を、標的核酸分子に付着させ、本発明の別の実施形態では、要素を、標的核酸分子にハイブリダイズさせるためのプローブに付着させる。標識化のための要素は、標的核酸分子の存在を同定するためのシグナルを発生させることが可能である。シグナルの例として、これらに限定されないが、蛍光シグナル、発光シグナル、可視光シグナルおよび同位体シグナルが挙げられる。要素の例として、これらに限定されないが、化学物質、蛍光色素、発光色素、生体分子および同位体色素が挙げられる。
【００２９】
好ましくは、本発明に従う方法では、ハイブリダイゼーション反応における酵素による増幅が行われず、すなわち本発明に従う方法は、増幅を利用しない。本発明に従う酵素による増幅は、標的核酸分子の存在量を酵素により増幅するためのプロセスを指す。本発明の一実施形態では、酵素を、標的核酸分子に付着させ、酵素により、ポリメラーゼ連鎖反応などにおいて標的核酸分子を増幅することが可能になる。
【００３０】
本明細書で使用する場合、用語「オリゴヌクレオチド」または「核酸」は、ヌクレオチドのオリゴマーまたはポリマーを指す。用語「ヌクレオチド」は、窒素性塩基、糖、および１つまたは複数のリン酸基、好ましくは、１つのリン酸基で構成される有機分子を指す。窒素性塩基は、プリンまたはピリミジンの誘導体を含む。プリンは、置換または非置換のアデニン、および置換または非置換のグアニンを含み、ピリミジンは、置換または非置換のチミン、置換または非置換のシトシン、および置換または非置換のウラシルを含む。糖は、好ましくは、五炭糖であり、より好ましくは、置換もしくは非置換のリボース、または置換もしくは非置換のデオキシリボースである。リン酸基は、糖の２、３または５−炭素、好ましくは、５−炭素の部位と結合を形成する。オリゴヌクレオチドを形成するために、１つのヌクレオチドの糖が、ホスホジエステル架橋により、隣接する糖に接続する。好ましくは、核酸は、ＤＮＡ、ｃｆＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＬｎｃＲＮＡおよびリボソームＲＮＡであり、より好ましくは、ｍｉＲＮＡである。
【００３１】
本明細書で使用する場合、用語「標的核酸分子」は、天然に存在する分子または人工的な分子を指す。別の態様では、標的核酸分子は、精製されるか、またはその他の内容物と混合されている。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態では、標的核酸分子は、ＤＮＡ、ｃｆＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＬｎｃＲＮＡおよびリボソームＲＮＡ、より好ましくは、ｍｉＲＮＡを含むことができる。
【００３３】
本発明の一実施形態では、標的核酸分子は、生体分子に連結している。本明細書で使用する場合、用語「生体分子」は、標的核酸分子に連結する特定の小分子または高分子を指す。好ましくは、生体分子は、高分子、例として、タンパク質、ペプチドまたは多糖、より好ましくは、タンパク質である。生体分子は、天然に存在するか、または人工のものである。本発明の好ましい一実施形態では、生体分子の発現パターンが、正常な状態においてと、異常な状態、例として、疾患においてとでは異なる。本発明の別の好ましい実施形態では、生体分子の発現パターンが、異なる細胞型においては異なる。本発明のさらに別の好ましい実施形態では、生体分子は、抗体、抗原、酵素、基質、リガンド、受容体、細胞膜関連タンパク質または細胞表面マーカーである。
【００３４】
標的核酸分子は、一本鎖分子または二本鎖分子であり得る。二本鎖の標的核酸分子のうちの一本鎖を得る様式は、例えば、二本鎖の標的核酸分子を加熱すること、または二本鎖の標的核酸分子の環境のイオン強度を変化させることであり得る。
【００３５】
好ましくは、一群の標的核酸分子は、少なくとも３種の標的核酸分子、好ましくは、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００種の標的核酸分子を含有する。本発明の好ましい一実施形態では、一群の標的核酸分子の定量的ランドスケープが、正常な状態においてと、異常な状態、例として、疾患においてとでは異なる。本発明の別の好ましい実施形態では、一群の標的核酸分子の定量的ランドスケープが、異なる細胞型においては異なる。
【００３６】
本明細書で使用する場合、用語「一群の標的核酸分子の定量的ランドスケープ」は、一群の標的核酸分子の定量的なプロファイルまたはパターンを指し、それらとして、これらに限定されないが、一群中のそれぞれの標的核酸分子の含量／濃度の組合せ、または一群中のそれぞれの標的核酸分子の含量／濃度の比の組合せが挙げられる。好ましくは、定量的ランドスケープは、一群の標的核酸分子の個々の量ではなく、一群の標的核酸分子の量の全体像に注目する。
【００３７】
本発明に従う方法は、一群の標的核酸分子のそれぞれの標的核酸分子を定量化するために、複数のハイブリダイゼーション反応を実施するステップを含み、好ましくは、複数のハイブリダイゼーション反応が、同時に実施される。本発明の好ましい一実施形態では、標的核酸分子が、１つのチップまたはマイクロアレイ中に統合される。
【００３８】
本発明に従うハイブリダイゼーション反応は、超高感度である。好ましくは、複数のハイブリダイゼーション反応は、約１ｆＭよりも低い定量化の限界を有する。ハイブリダイゼーション反応により、試料中の標的核酸分子を、約１ｆＭよりも低い、好ましくは、約０．０１ｆＭよりも低い、より好ましくは、約０．００１ｆＭよりも低い濃度で定量化することが可能になる。そのような超高感度のハイブリダイゼーション反応に依存して、超低濃度を有する標的核酸分子、例として、ｍｉＲＮＡが首尾よく定量化される。
【００３９】
本発明の一実施形態では、定量的シグナルの最も小さなシグナルと最も大きなシグナルとの間の差（これは、ダイナミックレンジとしてもまた公知である）が、少なくとも２桁の大きさ、より好ましくは、少なくとも４桁の大きさ、さらにより好ましくは、少なくとも７桁の大きさである。
【００４０】
本発明に従う方法は、一群中のそれぞれの標的核酸分子を同定するために、ハイブリダイゼーション反応に起因して発生するシグナルの変化を得るステップを含む。本発明によれば、標的核酸分子が存在する場合には、ハイブリダイゼーション反応が生じる。ハイブリダイゼーション反応により、オリゴヌクレオチド分子プローブの標的核酸分子との二重鎖が塩基の相補性に従って形成される。
【００４１】
本発明に従うハイブリダイゼーション反応において、いくつかのタイプの定量的シグナルを生成することができる。好ましくは、複数の定量的シグナルが、電気的な変化、重量の変化、吸光度波長の変化、吸光度強度の変化、蛍光および蛍光強度の変化、ならびに屈折率の変化からなる群、より好ましくは、電気的な変化から選択される。オリゴヌクレオチド分子は電荷を担持するので、一本鎖の核酸分子を導入することによるハイブリダイゼーション反応に起因して、電気的な変化が生じる。電気的な変化をモニタリングすることによって、標的核酸分子の存在および含量が検出される。
【００４２】
本発明に従う電気的な変化として、これに限定されないが、電荷の増加が挙げられる。電気的な変化は、電気シグナルとして検出することができる。電気シグナルとして、これらに限定されないが、電荷の変化、電流の変化、電気抵抗の変化、閾値電圧シフトの変化、電気伝導度の変化、電場の変化、電気容量の変化、電流の変化、電子の変化および電子空孔の変化が挙げられる。本発明の好ましい一実施形態では、電気的な変化は、閾値電圧シフトの変化である。
【００４３】
本発明の一実施形態では、本発明に従う定量的シグナルは、検出器を用いて検出される。定量的シグナルの異なるタイプに従って、検出器の異なるタイプが提供される。例えば、検出器は、電気的な変化、重量の変化、吸光度波長の変化、吸光度強度の変化、蛍光および蛍光強度の変化、または屈折率の変化を検出するための手段である。好ましくは、本発明に従う検出器は、変化の存在を検出することのみならず、また、変化を、変化の大きさを示す値に変換することも可能である。検出器の例として、これらに限定されないが、トランジスタ、共鳴装置または分光計が挙げられる。
【００４４】
好ましくは、標的核酸分子のうちの一本鎖が、認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子によりハイブリダイズされて、塩基の相補性に従って、二重鎖が形成される。
【００４５】
本明細書で使用する場合、用語「認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子」は、標的核酸分子と、塩基の相補性に従って、二重鎖を形成することが可能な一本鎖のオリゴヌクレオチド分子を指す。換言すると、認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子は、プローブとして作用して、標的核酸分子にハイブリダイズする。二重鎖は、好ましくは、二本鎖構造を指し、この場合、一方の鎖が、標的核酸分子のうちの一本鎖であり、他方の鎖が、プローブとしての認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子である。認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子は、好ましくは、標的核酸分子の配列に一致する配列を有し、より好ましくは、標的核酸分子の配列に完全に一致する配列を有する。標的核酸分子は、二重鎖を形成させることによって、試料中の混合物から捕捉することができる。捕捉のステップはまた、標的核酸分子を特異的に選択し、二重鎖中の標的核酸分子を提示する精製のステップも指す。
【００４６】
本発明によれば、方法は、試料中の一群の標的核酸分子の定量的ランドスケープを確立するための方法である。本発明に従う試料は、天然に存在する起源に由来するか、または人工的な操作に由来する。好ましくは、試料は、天然に存在する起源、例として、抽出物、体液、組織生検材料、液体生検材料または細胞培養物に由来する。別の態様では、試料は、検出反応に従って処理される。例えば、試料のｐＨの値またはイオン強度を調整することができる。
【００４７】
本発明に従う認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子は、溶液中に存在させるか、または固体表面に付着させることができる。好ましくは、認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子は、固体表面に付着しているか、または認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子は、固体表面から所定の距離だけ間隔をあけている。
【００４８】
本明細書で使用する場合、用語「固体表面」は、これらに限定されないが、ケイ素、酸化ケイ素、ポリマー、紙、布またはガラスを含む、固体の支持体を指す。好ましくは、利用しようとする固体表面は、電気的な変化を検出する要素に依存して変化し、このことは、下記に言及する。例えば、方法が、電界効果トランジスタを採用して、電気的な変化を検出する場合には、固体表面は、電界効果トランジスタのトランジスタ表面であり、方法が、表面プラズモン共鳴を採用する場合には、固体表面は、表面プラズモン共鳴の金属表面である。
【００４９】
好ましくは、固体表面が、電気的な変化を検出するための電気的な変化を検出する要素とカップリングされている。電気的な変化を検出する要素を適用して、電気的な変化が生じるかどうかを検出する。好ましくは、電気的な変化を検出する要素は、電界効果トランジスタまたは表面プラズモン共鳴である。
【００５０】
本発明の好ましい実施形態では、固体表面の材料は、ケイ素、好ましくは、多結晶ケイ素または単結晶ケイ素、より好ましくは、多結晶ケイ素である。多結晶ケイ素は、単結晶ケイ素よりも安価であるが、多結晶ケイ素は、より多くの粒界を有することから、通常、欠陥が粒界において生じ、電子の伝達を妨害する。そのような現象により、固体表面が平坦でなくなり、定量化を困難にする。さらに、溶液中では、イオンが、多結晶ケイ素の粒界中を貫通し、検出の失敗を引き起こす恐れもある。さらに、多結晶ケイ素は、空気中では安定でない。しかし、上記で言及した欠点が、本発明に従う方法の機能を妨げることはないであろう。
【００５１】
認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子と固体表面とを付着させる様式は、固体表面の材料、および認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子のタイプに依存する。本発明の一実施形態では、認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子を、共有結合を通して、固体表面に連結する。共有結合の例として、これらに限定されないが、以下の方法が挙げられ、これらは、固体表面の化学的性質およびオリゴヌクレオチドの改変に依存する。本発明の一実施形態では、酸化ケイ素を、固体表面として使用する場合には、固体表面を、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を使用することによって改変する。ＡＰＴＥＳ分子中のケイ素原子を、ヒドロキシル基の酸素原子と共有結合させ、表面のシラノール基（ＳｉＯＨ）をアミンに変換し、次いで、認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子の５’−アミノ基を、グルタルアルデヒドにより、固体表面のアミン基と共有結合させる（Ｒｏｅｙ  Ｅｌｎａｔｈａｎ、Ｍｏｒｉａ  Ｋｗｉａｔ、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｐｅｖｚｎｅｒ、Ｙｏｎｉ  Ｅｎｇｅｌ、Ｌａｒｉｓａ  Ｂｕｒｓｔｅｉｎ  Ａｒｔｉｕｍ  Ｋｈａｔｃｈｔｏｕｒｉｎｔｓ、Ａｍｉｒ  Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ、Ｒａｉｓａ  ＫａｎｔａｅｖおよびＦｅｒｎａｎｄｏ  Ｐａｔｏｌｓｋｙ、Ｂｉｏｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｌａｙｅｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｎａｎｏｗｉｒｅ−Ｂａｓｅｄ  ＦＥＴ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｎａｎｏ  ｌｅｔｔｅｒｓ、２０１２年、１２巻、５２４５〜５２５４頁）。本発明の別の実施形態では、固体表面を改変して、表面に物理的かつ化学的に付着させる自己集合単層分子を得る；これには、認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子の異なる官能基に、多様な化学反応により、共有結合的に連結するために、異なる官能基を用いるが、これに限定されない（Ｓｒｉｖａｔｓａ  Ｖｅｎｋａｔａｓｕｂｂａｒａｏ、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  −  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ、ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２２巻１２号、２００４年１２月；Ｋｉ  Ｓｕ  Ｋｉｍ、Ｈｙｕｎ−Ｓｅｕｎｇ  Ｌｅｅ、Ｊｅｏｎｇ−Ａ  Ｙａｎｇ、Ｍｏｏｎ−Ｈｏ  ＪｏおよびＳｅｉ  Ｋｗａｎｇ  Ｈａｈｎ、Ｔｈｅ  ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｔａｍｅｒ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｓｉ−ｎａｎｏｗｉｒｅ  ＦＥＴ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ、Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０巻（２００９年））。
【００５２】
本発明の別の好ましい実施形態では、認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子は、固体表面から所定の距離だけ間隔をあけている。電気的な変化を検出する要素は、電気的な変化を検出するために適用されるので、認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子と固体表面との間の距離が、電気的な変化を検出する要素による、電気的な変化の検出を可能にするのに十分に小さいという条件で、必ずしも認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子が、固体表面に直接結合する必要はない。固体表面と認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子との間の距離は、好ましくは、約０〜約１０ｎｍであり、より好ましくは、ハイブリダイゼーション効率を妨げない場合には、約０〜約５ｎｍである。
【００５３】
本発明の好ましい一実施形態では、認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子が、少なくとも１つの電気的に中性のヌクレオチドおよび少なくとも１つの負に荷電しているヌクレオチドを含む部分的に中性の一本鎖オリゴヌクレオチドである。ヌクレオチドを電気的に中性にする様式は、限定されない。本発明の一実施形態では、電気的に中性のヌクレオチドは、リン酸基のアルキル基による置換を含む。好ましくは、アルキル基はＣ１〜Ｃ６アルキル基であり、より好ましくは、アルキル基はＣ１〜Ｃ３アルキル基である。Ｃ１〜Ｃ３アルキル基の例として、これらに限定されないが、メチル、エチルおよびプロピルが挙げられる。図１は、本発明に従う、部分的に中性の一本鎖オリゴヌクレオチドの電気的に中性のヌクレオチドの好ましい一実施形態を示す。リン酸基中の負に荷電している酸素原子が、電荷を有さない中性の原子に変化している。リン酸基をアルキル基で置換するための方法を、一般的な化学反応から選択することができる。
【００５４】
本発明に従う負に荷電しているヌクレオチドは、少なくとも１つの負の電荷を有するリン酸基を含む。未改変のヌクレオチドは、好ましくは、改変も置換も有さない、天然に存在するヌクレオチドである。本発明の好ましい一実施形態では、負に荷電しているヌクレオチドは、非置換のリン酸基を含む。
【００５５】
本発明に従う部分的に中性の一本鎖オリゴヌクレオチドは、電気的に中性に部分的になされている。配列または長さは、限定されず、本発明の本開示に基づいて、標的核酸分子に従って設計することができる。
【００５６】
電気的に中性のヌクレオチドおよび負に荷電しているヌクレオチドの数は、部分的に中性の一本鎖オリゴヌクレオチドの配列、および二重鎖の形成における条件に依存する。また、電気的に中性のヌクレオチドおよび負に荷電しているヌクレオチドの位置も、部分的に中性の一本鎖オリゴヌクレオチドの配列および二重鎖の形成における条件に依存する。電気的に中性のヌクレオチドおよび負に荷電しているヌクレオチドの数および位置は、本発明の本開示に基づいて、入手可能な情報に従って設計することができる。例えば、電気的に中性のヌクレオチドの数および位置は、二本鎖（ｄｓ）の構造エネルギーに基づいて、分子モデリング計算によって設計することができ、次いで、ｄｓＤＮＡ／ＤＮＡまたはｄｓＤＮＡ／ＲＮＡの融解温度（Ｔｍ）を、構造エネルギーを参照することによって決定することができる。
【００５７】
本発明の好ましい一実施形態では、部分的に中性の一本鎖オリゴヌクレオチドは、複数の電気的に中性のヌクレオチドを含み、少なくとも１つの負に荷電しているヌクレオチドが、電気的に中性のヌクレオチドのうちの２つの間に位置し、より好ましくは、少なくとも２つの負に荷電しているヌクレオチドが、電気的に中性のヌクレオチドのうちの２つの間に位置する。
【００５８】
電気的に中性のヌクレオチドを導入することによって、本発明に従う、部分的に中性の一本鎖オリゴヌクレオチドの、完全に一致する二本鎖オリゴヌクレオチドと、一致しない二本鎖オリゴヌクレオチドとの間の融解温度の差が、従来のＤＮＡプローブの場合の差と比較してより大きくなる。理論により拘束されることなく、中性のオリゴヌクレオチドを導入することによって、２つの鎖の間の静電反発力が低下し、それにより、融解温度が高まることが推測される。電気的に中性のヌクレオチドの数および位置を制御することによって、融解温度の差を所望の点に調整し、より良好な作業温度または作業温度範囲をもたらして、完全なオリゴヌクレオチドと一致しないオリゴヌクレオチドとを区別し、それにより、捕捉の特異性を改善する。そのような設計は、１つのチップまたはアレイ中に統合される種々の、部分的に中性の一本鎖オリゴヌクレオチドの融解温度の一貫性に利する。検出しようとする反応の数を、高い特異性を伴わせて劇的に高めることができ、より多くの検出単位を、単一の検出系中に組み込むことができる。この設計は、マイクロアレイのより良好な作動条件を提供する。
【００５９】
本発明の好ましい一実施形態では、部分的に中性の一本鎖オリゴヌクレオチドが、固体表面に付着している第１の部分を含み、第１の部分の長さが、部分的に中性の一本鎖オリゴヌクレオチドの全長の約５０％であり、第１の部分が、少なくとも１つの電気的に中性のヌクレオチドおよび少なくとも１つの負に荷電しているヌクレオチドを含み、より好ましくは、第１の部分の長さが、部分的に中性の一本鎖オリゴヌクレオチドの全長の約４０％であり、さらにより好ましくは、第１の部分の長さが、部分的に中性の一本鎖オリゴヌクレオチドの全長の約３０％である。
【００６０】
本発明の好ましい一実施形態では、部分的に一本鎖オリゴヌクレオチドが、第１の部分に隣接する第２の部分をさらに含む。第２の部分は、固体表面の遠位末端において位置する。第２の部分は、少なくとも１つの電気的に中性のヌクレオチドおよび少なくとも１つの負に荷電しているヌクレオチドを含む。電気的に中性のヌクレオチドおよび負に荷電しているヌクレオチドについての説明は、第１の部分についての説明と同じであり、本明細書では繰り返さない。
【００６１】
本発明の好ましい一実施形態では、方法を、約１００ｍＭよりも低い緩衝液、より好ましくは、約８０ｍＭ、５０ｍＭ、４０ｍＭ、３０ｍＭ、２０ｍＭまたは１０ｍＭよりも低い緩衝液中で実施する。理論により拘束されることなく、部分的に中性の一本鎖オリゴヌクレオチドを適用することによって、部分的に荷電した半中性の一本鎖オリゴヌクレオチドとその標的との間の静電反発力を抑制することを必要とせずに、部分的に中性の一本鎖オリゴヌクレオチドと標的核酸分子との間で形成される二重鎖をもたらすことができることが推測される。次いで、ハイブリダイゼーションが、塩基対形成およびそれぞれの鎖のスタッキング力により推進される。結果として、二重鎖が、低塩条件において形成され得る。ＦＥＴの場合、より低いイオン強度により、検出の長さ（デバイ距離）が増加し、続いて、検出感度が増強される。
【００６２】
本発明の一実施形態では、二重鎖の形成についてのハイブリダイゼーションの特異性の改善を、従来の検出と比較して、ＦＥＴによる検出の主として２つの面において認めることができる。第１に、融解温度の差がより大きい。第２に、緩衝液が低塩条件を有し、ＦＥＴによる検出の長さ（デバイ距離）がより長い。これらの差の両方により、検出感度の改善がもたらされる。
【００６３】
本発明の好ましい実施形態では、いくつかの認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子を１つの系中に含有させて、１回の操作でいくつかの検出を実施する。例えば、複数の認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子を、検出系中に組み込むことができる。好ましくは、検出系は、マイクロアレイまたはチップである。
【００６４】
本発明に従う方法は、任意の２つの定量的シグナル間の比を生成するステップを含む。本発明に従う一実施形態では、一群の標的核酸分子中の標的核酸分子の数はｎであり、相関させようとする比の数は［ｎ×（ｎ−１）／２］（式中、ｎは整数である）である。理論により制限される意図はないが、本開示の発明者らは、ｎがより大きい場合、定量的ランドスケープは、注目している条件についてのより正確な情報を提供することができると考えている。
【００６５】
２つの定量的シグナル間の比を生成する様式として、これに限定されないが、定量的シグナルを伝送し、比を計算することが挙げられる。本発明の一実施形態では、定量的シグナルを検出器からコンピュータに伝送して、定量的シグナルを保存し、計算を実施する。好ましくは、定量的シグナルは、上記で言及した通りの検出器により、値に変換されている。別の態様では、定量的シグナルの比を、１つの定量的シグナルを別の１つの定量的シグナルで除算することによって決定する。好ましくは、１つの定量的シグナルを、全てのその他の定量的シグナルで除算し、全ての定量的シグナルを、そのような除算を通して処理して、比の群を得る。
【００６６】
本発明によれば、方法は、一群の標的核酸分子の定量的ランドスケープを構築するために、比を併合するステップを含む。併合および構築の様式として、これに限定されないが、比の群をプロットして、比の群中のあらゆる比を示す１つの図表を得ることが挙げられる。そのような併合および構築は、コンピュータにより、市販のソフトウエアを用いて実施することができる。例えば、比を、３−Ｄプロットとして併合する。
【００６７】
比の組合せが、多様な適用例のためにビッグデータ標準化手段を提供するための一群中の標的核酸分子の定量的ランドスケープとして提供される。
【００６８】
本発明は、上記で言及した通りの方法を用いて確立される、一群の標的核酸分子の定量的ランドスケープを提供するものである。
【００６９】
好ましくは、異なる条件間の異なる定量的ランドスケープを比較するために、本発明に従う定量的ランドスケープは、異なる条件下で確立される。
【００７０】
当業者が本発明を実行するのを援助するために、以下の実施例を提供する。
【実施例】
【００７１】
認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子としての、部分的に中性の一本鎖オリゴヌクレオチドの合成
デオキシシチジン（ｎ−ａｃ）ｐ−メトキシホスホラミダイト、チミジンｐ−メトキシホスホラミダイト、デオキシグアノシン（ｎ−ｉｂｕ）ｐ−メトキシホスホラミダイト、およびデオキシアデノシン（ｎ−ｂｚ）ｐ−メトキシホスホラミダイト（全て、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国から購入した）を使用して、固相ホスホトリエステル合成に基づいてか、またはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３９００  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（登録商標）Ｂｉｏｓｃｉ  ＆  Ｔｅｃｈ、またはＭｉｓｓｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈにより提供された）により、所与の配列に従うオリゴヌクレオチドを合成した。
【００７２】
合成されたオリゴヌクレオチドを、トルエン中で弱いアルカリと室温で２４時間反応させ、この試料をイオン交換クロマトグラフィーに付して、ｐＨの値を７に調節した。試料を濃縮および乾燥すると、部分的に中性の一本鎖オリゴヌクレオチドが得られた。
【００７３】
認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子の付着
ＳｉＮＷ表面層（ＳｉＯ２）の官能基化により、認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子を付着させた。最初に、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を使用して、表面を改変した。ＡＰＴＥＳ分子中のケイ素原子を、ヒドロキシル基の酸素と共有結合させ、表面のシラノール基（ＳｉＯＨ）をアミンに変換した。試料を、２％のＡＰＴＥＳ（９９％ＥｔＯＨ）中に３０分間浸漬し、次いで、１２０℃で１０分間加熱した。このステップの後、アミノ基（ＮＨ２）が、表面からの末端の単位となった。
【００７４】
次に、グルタルアルデヒドをグラフト化剤として使用して、ＤＮＡの固定化を行った。グルタルアルデヒドによる結合を、そのアルデヒド基（ＣＯＨ）を通して達成して、ＡＰＴＥＳのアミノ基との共有結合を確実にした。このステップのために、試料を、液体中の２．５％のグルタルアルデヒド（１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液）に室温で１時間浸漬した。プローブを固定化するために、ＤＮＡ鎖の５’−アミノ基を、リンカーのアルデヒド基に連結した。１μｍｏｌのＤＮＡプローブの５００μＬの液滴を、ＮＷ上に１８時間蒸着させた。
【００７５】
複数の定量的シグナルの生成
認識性一本鎖オリゴヌクレオチド分子（プローブ）および標的オリゴヌクレオチド分子（標的）の配列を、表１に列挙する。
【表１】
2020024217.tif 000002
【００７６】
一本鎖オリゴヌクレオチド分子の付着が認められた後、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）流体系を展開し、ＤＮＡ標的を、ナノワイヤー表面にポンプで送って、ＤＮＡプローブにハイブリダイズさせた。ビス−トリスプロパン［１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン］溶液を用いて希釈した多様な濃度を有する相補的標的および非相補的標的を使用した。３０分間のハイブリダイゼーションの後に、試料を、ビス−トリス緩衝液を用いて１０分間洗浄して、過剰量の標的を除去した。最後に、Ｋｅｉｔｈｌｅｙ２４００を使用して、ＮＷＦＥＴの電気的特徴を検出した（Ｉｄ対Ｖｇの曲線）。
【００７７】
電気的な変化としてのＩｄ−Ｖｇ曲線の結果を、図２〜図５に示す。
【００７８】
代替的に、中性のＤＮＡを含む一本鎖オリゴヌクレオチド分子を固定化した後、細胞抽出物中のｍｉＲＮＡ標的３０ｎｇをナノワイヤー表面上に直接添加して、プローブとハイブリダイズさせ、緩衝液を用いて洗浄して、過剰量の標的、およびプローブに対する非特異的結合を除去した。電気的な検出デバイスを使用して、ＮＷＦＥＴの電気的特徴を検出した（Ｉｄ対Ｖｇの曲線）。Ｉｄ−Ｖｇ曲線の結果、および相対的な電気シグナルを分析した。
【００７９】
検量線を確立し、ＰＣ３細胞およびＣＷＲ細胞それぞれからの、３０ｎｇの全ＲＮＡ抽出物を含む、同じ量の細胞抽出物について、科学界が信頼できる標準として一般に許容しているもの、すなわち、ｑ−ＰＣＲと比較した。検量線を、図６および図７に示す。
【００８０】
かなりの存在量の分子がある場合には、ＮＷＦＥＴデバイスにより生成した検量線は、ｑ−ＰＣＲの結果と見事に一致した。分子種が希少になると、大きな逸脱が出現した。極めて希少な分子種についてのＱ−ＰＣＲの結果は一般に、疑わしいとみなされている。一方、少なくとも、ＮＷＦＥＴシグナルの直線性は、少なくとも４桁に及ぶと予想される。図８および図９では、ＮＷＦＥＴのダイナミックレンジは、ＲＮＡ試料を直接添加することによって、０．０１７９ｆＭ〜１７９０００ｆＭの７桁に及んだ一方、ｑ−ＰＣＲのダイナミックレンジは限定的である。さらに、逆転写および微量のｍｉＲＮＡのためのｑ−ＰＣＲの最適化を含む、余分な手順も必要である。したがって、本発明者らの現行の方法は、増幅および標識化を回避することができるのみならず、はるかにより高感度の検出方法を提供し、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓＲＮＡ、ＬｎｃＲＮＡ等であり得る希少な分子種の間の微妙な変化をモニタリングするのに特に適切であると予想される。
【００８１】
定量的シグナル間の比の併合
電気的な変化の比を、表２〜表７に示す。さらに、それぞれのｍｉＲＮＡの細胞内濃度を、検量線に対して較正することによって定量化することができる。同様に、任意の細胞について、任意の２つのｍｉＲＮＡ間の濃度の比を計算し、したがって、ｍｉＲＮＡ発現の複合ランドスケープを作り出すことも、容易かつ実用的である。図１０〜図１５のデータは、２つの腫瘍細胞株、すなわち、ＰＣ３細胞およびＣＷＲ細胞（両方がヒト前立腺がんに由来する）について、７つのｍｉＲＮＡ標的から得られた少なくとも１８セットの比のデータを示し、この場合、定量化の限界はｆＭを下回り、ダイナミックレンジは４桁であった。０．０１アトモルのｍｉＲＮＡが、このダイナミックレンジ内で検出された。２つのがん細胞株から得られたｍｉＲＮＡの比の比較により、ｍｉＲＮＡのランドスケープの３Ｄプロットが、同じ疾患についてでさえも同じでないことが示された（図１６および図１７）。ランドスケープはまた、異なる治療剤の負荷を受ければさらなる変化を経ると専ら想定され得る。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【００８２】
上記に記載した特定の実施形態と併せて本発明を説明したが、それらに対する代替形態、ならびにそれらの改変形態および変更形態の多くが、当業者には明らかであると予想される。そのような代替形態、改変形態および変更形態は全て、本発明の範囲に属するとみなされる。
【図１】
2020024217.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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