(57)【要約】      （修正有）【課題】個体のてんかんの発症を治療するまたはその可能性を減少させるための組成物および方法の提供。【解決手段】脳内のｍｉＲ−１２８の発現および／または活性を増加させることができる薬剤の治療上有効量を個体に投与することを含む、てんかんを有する危険があるまたは有する疑いがある個体のてんかんまたはてんかん重積状態の発症を治療するまたはその可能性を減少させる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳内のｍｉＲ−１２８の発現および／または活性を増加させることができる薬剤の治療上有効量を個体に投与することを含む、てんかんを有する危険があるまたは有する疑いがある個体のてんかんまたはてんかん重積状態の発症を治療するまたはその可能性を減少させる方法。
【請求項２】
ｍｉＲ−１２８の発現および／または活性を増加させることができる薬剤の治療上有効量を個体に投与することを含む、発作の危険があるまたは発作を有する個体の発作の発症もしくは発生を治療するまたはその可能性を減少させる方法であって、ここで、前記患者が、発作の発症を特徴とする脳関連障害を有するものとする、前記方法。
【請求項３】
ｍｉＲ−１２８の発現および／または活性を増加させることができる薬剤の治療上有効量を個体に投与することを含む、てんかんを発症する危険がある個体のてんかんの発症を治療するまたはその可能性を減少させる方法であって、ここで、前記個体が、前記個体のてんかんのリスクを増加させる脳損傷を以前に患っているものとする、前記方法。
【請求項４】
前記個体が、Ｄｒａｖｅｔ症候群を有する疑いがあるまたはＤｒａｖｅｔ症候群と診断されている、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記薬剤が、くも膜下腔内または鼻腔内投与される、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項６】
前記薬剤が、前記個体の中枢神経系に投与される、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項７】
前記薬剤が、海馬または皮質に投与される、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項８】
前記薬剤が、ｍｉＲ−１２８である、またはｍｉＲ−１２８と９０％以上の配列同一性を有する薬剤である、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項９】
ｍｉＲ−１２８の発現および／または活性を増加させることができる前記薬剤が、化学的に安定化されたｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１２８模倣物、ｍｉＲ−１２８をコードする核酸およびｍｉＲ−１２８をコードするウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１０】
ｍｉＲ−１２８が、ヌクレオチド配列：ＵＣＡＣＡＧＵＧＡＡＣＣＧＧＵＣＵＣＵＵＵを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ｍｉＲ−１２８の発現および／または活性を増加させることができる前記薬剤が、脳由来神経栄養因子である、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１２】
発作の発症を特徴とする前記脳関連障害が、脳卒中、低酸素症、外傷性脳損傷、感染症、腫瘍、神経変性障害、発作を引き起こす代謝および自己免疫障害からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記脳損傷が脳卒中によって引き起こされる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて、ｍｉＲ−１２８の発現または活性を増加させることができる薬剤を含む、発作を特徴とする神経病態の発症の治療またはその可能性の減少に使用するための医薬組成物。
【請求項１５】
ｍｉＲ−１２８の発現または活性を増加させることができる前記薬剤が、化学的に安定化されたｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１２８模倣物、ｍｉＲ−１２８をコードする核酸およびｍｉＲ−１２８をコードするウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
ｍｉＲ−１２８が、ヌクレオチド配列：ＵＣＡＣＡＧＵＧＡＡＣＣＧＧＵＣＵＣＵＵＵを有する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
発作の危険がある個体の発作の可能性の減少において、またはてんかんを誘発しそうな脳損傷を有する個体における抗てんかん発生薬として使用するためのｍｉＲ−１２８の発現または活性を増加させることができる薬剤であって、前記個体の脳に送達される薬剤。
【請求項１８】
ｍｉＲ−１２８発現細胞を候補化合物と接触させることと、前記細胞によって発現されている前記ｍｉＲ−１２８の発現および／または活性のレベルを測定することとを含む、発作を特徴とする病態の治療またはその可能性の減少に有用な化合物を同定する方法であって、ここで、前記候補化合物と接触していない細胞中のｍｉＲ−１２８の発現および／または活性の基準レベルに対する前記ｍｉＲ−１２８の発現および／または活性のレベルの増加が、前記候補化合物が発作を特徴とする病態の治療または予防に有用であることを示すものとする、前記方法。
【請求項１９】
発作を特徴とする前記病態が、てんかん、てんかん重積状態、脳卒中、低酸素症、外傷性脳損傷、感染症、腫瘍、神経変性障害、発作を引き起こす代謝および自己免疫障害を含む群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
長さが６〜３０ヌクレオチドの間のオリゴマーを含む薬剤を投与することを含む、哺乳動物細胞中のｍｉＲ−１２８の発現または活性を増加させる方法であって、ここで、前記オリゴマーが、ｍｉＲ−１２８の配列中に存在する少なくとも６個の隣接ヌクレオチドと同一である隣接ヌクレオチド配列を含むものとする、前記方法。
【請求項２１】
インビトロで行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
インビボで行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記オリゴマーが、ｍｉＲ−１２８のシード領域のヌクレオチド配列と同一である隣接ヌクレオチド配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記オリゴマーが、ｍｉＲ−１２８のシード領域の配列と同一である隣接ヌクレオチド配列からなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記オリゴマーの前記隣接ヌクレオチド配列が、ｍｉＲ−１２８の対応する領域の配列と同一である７〜２３個の間のヌクレオチドを含む、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、全開示が参照により本明細書に組み込まれる、２０１３年１０月２８日出願の米国仮特許出願第６１／８９６４６３号および２０１３年１１月１日出願の第６１／８９８９５２号の利益を請求している。
【州および連邦による資金提供を受けた研究】
【０００２】
本明細書に記載される本発明は、国立衛生研究所（ＤＡ０２５９６２）および米軍医学研究調達機関（Ｗ８１ＸＷＨ−０９−１−００９５）からの助成金を受けてなされた。米国政府は本発明に対する一定の権利を有することができる。
【技術分野】
【０００３】
本発明は、分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子に関する方法および組成物に関する。特に、本開示はまた、発作関連障害および神経傷害の発症を治療または予防するための治療的戦略に関する。
【背景技術】
【０００４】
発作は、中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンの集合体からの異常な、過度の、過同期性放電による発作性イベントであり、てんかんは人が慢性の根底にある過程により再発性発作を有する状態である。実験および臨床データは、繰り返される発作の発生がてんかん状態をもたらすことができることを示している。そのため、発作のための可能な薬理学的治療、およびこのような治療が有効である時間枠を同定することは大いに興味深い。
【０００５】
てんかんは、ニューロンの大群の律動的発火によって引き起こされる周期的および予測不可能な発作を特徴とする脳障害である。ヒト患者のてんかん性発作の行動的徴候は、四肢の軽度の単収縮から意識消失および制御不能の痙攣にまで及ぶ。人口の最大１％が罹患しており、てんかんを最も一般的な神経学的問題の１つとしている。てんかんに伴う異常な活動によって、疾患の病因において役割を果たす皮質回路の可塑的変化が生まれる。ある期間を過ぎると、最初は効果を及ぼさなかった弱い刺激が最終的には最も悪化した発作を引き起こす。この現象は本質的に永久であり、一年の間隔の後でさえ、同じ弱い刺激が再び発作を誘因する。
【０００６】
研究は、発作がどこに源を発するかおよび罹患した領域を過興奮性にする機構に焦点を当ててきた。大脳皮質病巣の異常な活動が発作を誘因し、次いで、これが他のシナプス性結合領域に広がることを示唆する証拠がある。てんかん性発作は、外傷からの皮質損傷、脳卒中、腫瘍、先天性皮質異形成および先天性血管奇形を含む種々の急性または先天性因子によって引き起こされる可能性がある。
【０００７】
てんかんのための有用な予防も治療も存在しない。発作をうまく阻害する薬理学的療法は、２つの一般的な戦略に基づくものである。１つの手法は、抑制性ＧＡＢＡ作動性シナプスの機能を強化するものであり、他方は電位依存性Ｎａ＋チャネルに作用することによって活動電位発火を制限するものである。一般的に使用されている抗発作薬には、カルバマゼピン、フェノバルビタール、フェニロインおよびバルプロ酸が含まれる。これらの薬剤は、毎日服用しなければならず、患者の６０〜７０％で発作を抑制するに過ぎない。したがって、現在有効な治療が存在しないてんかんを患っている患者の大きな群が存在する。
【０００８】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）は、ｍｉＲＮＡとその標的との間の相補性の程度に応じた翻訳抑制またはｍＲＮＡ分解を含む、配列特異的様式でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を標的化することによって遺伝子発現を調節する小さな非コードファミリーの１９〜２５ヌクレオチドＲＮＡである（Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．（２００４）Ｃｅｌｌ  １１６、２８１〜２９７）。多くのｍｉＲＮＡは遠縁生物間で配列が保存されており、これらの分子が本質的な過程に関与していることを示唆している。実際、ｍｉＲＮＡは、発達、細胞増殖、アポトーシス、グルコース代謝、ストレス耐性およびがんの間の遺伝子発現の調節に関与している。ｍｉＲＮＡの時間的、空間的および細胞発現レベルならびにｍｉＲＮＡの発現パターンを理解および特性評価して、正常な状態と疾患状態の両方での細胞発達および分化におけるその正確な役割を確認するために相当な努力がなされてきた。
【０００９】
ｍｉＲＮＡが異なる条件、例えば、がんまたはアポトーシス下での遺伝子発現の調節に関与していることが示されているが、てんかんおよび／または発作へのｍｉＲＮＡの関与に焦点を当てている技術はあるとしてもほとんどない。したがって、てんかんおよび関連障害、特に、既存の治療が患者に何ら救済をもたらさないもののための他の代替および有効な治療を提供する必要性が依然としてある。
【発明の概要】
【００１０】
本開示は、発作関連障害および神経傷害の発症を治療するまたはその可能性を減少させるための治療的戦略に関する。本出願の発明者らは、驚くべきことに、神経シグナル伝達におけるｍｉＲ−１２８の役割、ならびに特に、神経興奮性および運動活動を制御するシグナル伝達経路の調節におけるｍｉＲ−１２８の役割を発見した。
【００１１】
一態様では、本開示は、ｍｉＲ−１２８の発現および／または活性を増加させることができる薬剤の治療上有効量を、治療を必要とする個体に投与することを含む、発作を特徴とする状態を有する危険があるまたは有する疑いがある個体のてんかんまたはてんかん重積状態の発症を治療するまたはその可能性を減少させる方法に関する。一実施形態では、個体がＤｒａｖｅｔ症候群の症状を示すまたはＤｒａｖｅｔ症候群と診断されている。一実施形態では、薬剤がくも膜下腔内または鼻腔内投与される。別の実施形態では、薬剤が個体の中枢神経系に投与される。特定の実施形態では、投与が海馬および／または皮質に直接向けられる。
【００１２】
一実施形態では、薬剤がｍｉＲ−１２８である、またはｍｉＲ−１２８と９０％以上の配列相同性を有する薬剤である。特定の実施形態では、ｍｉＲ−１２８を増加させるおよび／または活性化することができる薬剤が、化学的に安定化されたｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１２９模倣物、ｍｉＲ−１２８をコードする核酸およびｍｉＲ−１２８をコードするウイルスベクターからなる群から選択される。一実施形態では、ｍｉＲ−１２８を増加させるおよび／または活性化することができる薬剤が、脳由来神経栄養因子である。
【００１３】
本開示の一態様は、ｍｉＲ−１２８の発現および／または活性を増加させることができる薬剤の治療上有効量を、治療を必要とする個体に投与することを含む、個体の発作の発症もしくは発生を治療するまたはその可能性を減少させる方法であって、前記患者は発作の発症を特徴とする脳関連障害を有する方法に関する。一実施形態では、個体がＤｒａｖｅｔ症候群と診断されている。薬剤はくも膜下腔内または鼻腔内投与されることができる。一実施形態では、薬剤が海馬および／または皮質に投与される。一実施形態では、発作の発症を特徴とする脳関連障害が、脳卒中、低酸素症、外傷性脳損傷、感染症、腫瘍、神経変性障害、発作を引き起こす代謝および自己免疫障害からなる群から選択される。
【００１４】
本開示の別の態様は、ｍｉＲ−１２８の発現および／または活性を増加させることができる薬剤の治療上有効量を、治療を必要とする個体に投与することを含む、個体のてんかんの発症を治療するまたはその可能性を減少させる方法であって、前記個体は前記個体のてんかんのリスクを増加させる脳損傷を以前に患っている方法に関する。一実施形態では、脳損傷が脳卒中によって引き起こされる。
【００１５】
一態様では、本開示は、薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて、ｍｉＲ−１２８の発現および／または活性を増加させることができる薬剤を含む、発作を特徴とする神経病態の発症の治療またはその可能性の減少に使用するための医薬組成物である。ｍｉＲ−１２８活性を増強することができる薬剤は、化学的に安定化されたｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１２８模倣物またはｍｉＲ−１２８をコードする核酸からなる群から選択されることができ、ｍｉＲ−１２８の発現を増強することができる薬剤には、例えば、ｍｉＲ−１２８をコードするウイルスベクターが含まれる。別の態様では、本開示は、個体の自発再発性発作の可能性の減少において、またはてんかんを誘発しそうな脳損傷を有する個体における抗てんかん発生薬として使用するためのｍｉＲ−１２８発現および／または活性を増加させることができる薬剤であって、個体の脳に送達される薬剤に関する。一実施形態では、治療薬（例えば、ｍｉＲ−１２８またはｍｉＲ−１２８と９０％以上の配列相同性を有する薬剤）が、例えば、注射によって、海馬および／または皮質を含む一定の脳領域に直接投与されることができる。
【００１６】
本開示の一態様は、ｍｉＲ−１２８発現細胞を候補化合物と接触させることと、ｍｉＲ−１２８発現細胞の活性のレベルを測定することとを含む、発作を特徴とする病態の治療またはその可能性の減少に有用な化合物を同定する方法であって、候補化合物と接触していないｍｉＲ−１２８発現細胞の活性の基準レベルに対する細胞の活性のレベルの増加は、候補化合物が発作を特徴とする病態の治療または予防に有用であることを示す方法に関する。
【００１７】
一実施形態では、ｍｉＲ−１２８がｍｉＲ−１２８発現細胞の形態で提供され、活性のレベルが細胞中のｍｉＲ−１２８の発現のレベルを分析することによって測定される。別の実施形態では、発作を特徴とする病態が、てんかん、てんかん重積状態、脳卒中、低酸素症、外傷性脳損傷、感染症、腫瘍、神経変性障害、発作を引き起こす代謝および自己免疫障害を含む群から選択される。
【００１８】
本開示の一態様は、哺乳動物細胞中のｍｉＲ−１２８の発現を増加させるまたは哺乳動物細胞中のｍｉＲ−１２８の活性を模倣することができる薬剤を投与することを含む、哺乳動物細胞中のｍｉＲ−１２８発現および／または活性を増加させる方法であって、前記薬剤は長さが６〜３０ヌクレオチドの間のオリゴマーを含み、前記オリゴマーはｍｉＲ−１２８の配列中に存在する少なくとも６個の隣接ヌクレオチドと同一である隣接ヌクレオチド配列を含む方法である。一実施形態では、哺乳動物細胞が、海馬、皮質、線条体および視床の細胞からなる群から選択される。一実施形態では、方法がインビトロで行われる。別の実施形態では、方法がインビボで行われる。
【００１９】
一実施形態では、オリゴマーが、ｍｉＲ−１２８のシード領域（ｓｅｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）の配列と同一である隣接ヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、オリゴマーが、ｍｉＲ−１２８のシード領域の配列と同一である隣接ヌクレオチド配列からなる。一実施形態では、オリゴマーの隣接ヌクレオチド配列が、ｍｉＲ−１２８の対応する領域の配列と同一である７〜２３個の間のヌクレオチドを含む。
【００２０】
一実施形態では、ｍｉＲ−１２８がヌクレオチド配列：ＵＣＡＣＡＧＵＧＡＡＣＣＧＧＵＣＵＣＵＵＵを有する。
【００２１】
本開示の一態様は、ｍｉＲ−１２８またはｍｉＲ−１２８の対応する領域と９０％以上の配列相同性を有する薬剤を対象の脳損傷部位に投与することを含む、対象の発作および／またはてんかんの発症を治療するまたはその可能性を減少させる方法に関する。一実施形態では、ｍｉＲ−１２８またはｍｉＲ−１２８の対応する領域と９０％以上の配列相同性を有する薬剤がくも膜下腔内または鼻腔内投与され、投与が海馬および／または皮質に向けられる。一実施形態では、ｍｉＲ−１２８が、ａ）ｍｉＲ−１２８をコードする核酸分子と作動可能に連結した（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ）プロモーターと；ｂ）転写終結配列とを含むベクターによってコードされている。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
図１は、ｍｉＲ−１２８がマウスにおいて運動行動を制御していることを示す。
（Ａ）ｍｉＲ−１２８−２の欠損が、マウスにおいて活動亢進および早発性死亡を引き起こす。（左側パネル）６０分オープンフィールドアッセイで全水平距離を測定することによって、運動活動を測定した（ｎ＝２３および１２）。（右側パネル）ｍｉＲ−１２８−２−／−マウスおよび同腹子対照の寿命を示す（ｎ＝２０および４６）。（Ｂ、Ｃ）ｍｉＲ−１２８欠損は、抗痙攣薬治療によって予防することができる致死的発作を引き起こす。
（Ｂ）２２日の観察期間中のｍｉＲ−１２８−２−／−（黒色）またはＣａｍｋ２ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌマウス（赤色）における自発強直間代発作エピソードの代表的表示。
（Ｃ）対照ｍｉＲ−１２８−２−／−（点線、Ａに示される通り）またはバルプロ酸ナトリウム処理（赤色、ｎ＝１１）ｍｉＲ−１２８−２−／−マウスの寿命を示す。
（Ｄ）生後ニューロンのｍｉＲ−１２８の欠損が、活動亢進および致死的てんかんを引き起こす。Ｃａｍｋ２ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌマウス（ｎ＝２１および２５）および同腹子（ｎ＝８および４７）の運動活動および生存率を示す。
（Ｅ）ｍｉＲ−１２８の異所性発現が、Ｃａｍｋ２ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌマウスの自発運動亢進を正常化し、死亡を防ぐことを示す。Ｃａｍｋ２ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌ；Ｒｏｓａ−ｍｉＲ−１２８（ｎ＝４、青色）および野生型マウス（ｎ＝１０、灰色）の運動活動を示す。異所性ｍｉＲ−１２８発現の存在下（ｎ＝４、青色）または非存在下（ｎ＝９、黒色）でのＣａｍｋ２ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌマウスの寿命を示す。
（Ｆ）Ｄ１−ニューロンのｍｉＲ−１２８欠損が、活動亢進および致死的てんかんを引き起こす。Ｄ１−ニューロン特異的ｍｉＲ−１２８欠損を有するマウスまたは対照マウスの運動活動（ｎ＝２６および４２）および寿命（ｎ＝１６および２８）を示す。エラーバーは平均値の標準誤差、ウェルチのｔ検定、非有意（ｎｓ）、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１を示す。カプラン・マイヤーグラフは、突然変異体および同腹子対照マウスの生存曲線、＊＊＊ｐ≦０．００１、対数順位検定を示す。
【００２３】
図２は、ｍｉＲ−１２８が、Ｄ１−ニューロン興奮性およびドーパミンに対する反応性を示す。
（Ａ、Ｂ）ｍｉＲ−１２８がＤ１−ニューロン樹状突起興奮性および棘の数を調節する。
（Ａ）シグナル活動電位を細胞体で産生させ、遠位カルシウムシグナルを細胞１個当たりの最大近位カルシウムシグナルで割ることによって、活動電位侵入を計算した（ｎ＝４個の細胞、１１〜２１個の軸／群）。マン・ホイットニーのノンパラメトリック検定、＊＊＊ｐ≦０．００１。
（Ｂ）対照および突然変異体Ｄ１−ニューロンの遠位樹状突起の代表的な最大強度投影像を示す。箱ひげ図は、集団棘密度（１群当たりｎ＝１０〜１１個の細胞）を示す。マン・ホイットニーのノンパラメトリック検定、エラーバーは、第９０パーセンタイル間隔、＊ｐ≦０．０５を示す。（Ｃ〜Ｅ）ｍｉＲ−１２８は、Ｄ１−ニューロンにおける運動反応、ＥＲＫ２リン酸化、およびドーパミンＤ１受容体（Ｄｒｄ１）活性化を受けた即時型遺伝子（ＩＥＧ）誘導を調節する。
（Ｃ）Ｄｒｄ１ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌおよび対照マウス（ｎ＝２５および３０）の運動活動をオープンフィールドチャンバーで評価した。生理食塩水および３ｍｇ／ｋｇ  Ｄｒｇ１アゴニストＳＫＦ８１２９７をそれぞれ１０分および２０分に腹腔内注射した。
（Ｄ）生理食塩水またはＤ１アゴニストＳＫＦ８１２９７注射を受けたＤｒｇ１ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌおよび対照マウス（それぞれｎ＝５）に由来する線条体溶解物のウエスタンブロット法によって、ＥＲＫ２リン酸化を定量化した。棒グラフは、ホスホＥＲＫ２と全ＥＲＫ２の発現の比を示す。
（Ｅ）生理食塩水またはＳＫＦ８１２９７で処理したＤｒｄ１ａ−ＴＲＡＰ；Ｄｒｄ１ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌおよび対照マウスから精製したＤ１−ニューロン特異的ポリリボソーム結合ｍＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲ（それぞれｎ＝５）によって、ＩＥＧおよびＤ１−ニューロン発現Ｄａｒｐｐ３２遺伝子発現レベルを測定した。エラーバーは平均値の標準誤差、ウェルチのｔ検定、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１を示す。
【００２４】
図３は、ｍｉＲ−１２８欠損によって引き起こされた異常な運動活動が、薬理学的ＥＲＫ阻害または異所性ｍｉＲ−１２８発現によって修正されることを示す。
（Ａ）Ｄｒｇ１ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌおよび同腹子対照マウスに、ビヒクルまたは１２ｍｇ／ｋｇのＭＥＫ１阻害剤ＳＬ３２７のいずれかを腹腔内注射した（ｎ＝５／群）。薬物注射３０分後のＥＲＫ２リン酸化のウエスタンブロット解析（左）およびビヒクルまたはＳＬ３２７注射後の運動活動（右）を示す。二元配置分散分析、引き続いてボンフェローニポストテスト。エラーバーは、平均値の標準誤差、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１を示す。
（Ｂ）ｍｉＲ−１２８の過剰発現が、ドーパミン枯渇線条体においてＤ１−ニューロン反応性亢進を抑制する。片側性６−ＯＨＤＡ損傷Ｃａｍｋ２ａ−ｃｒｅ；Ｒｏｓａ−ｍｉＲ−１２８または対照マウス（ｎ＝１１／群）におけるベースラインでのおよびコカイン（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＤ１−アゴニストＳＫＦ８１２９７（５ｍｇ／ｋｇ）に反応した反対側回転の数を示す。エラーバーは平均値の標準誤差、ウェルチのｔ検定、＊＊ｐ≦０．０１を示す。
（Ｄ）ｍｉＲ−１２８がマウスの化学的誘発発作に対する感受性を低下させる。痙攣誘発薬（ｐｒｏ−ｃｏｎｖｕｌｓｉｖｅ  ｄｒｕｇ）カイニン酸（３０ｍｇ／ｋｇ、ｐ値＝０．００５）またはピクロトキシン（３ｍｇ／ｋｇ、ｐ値＝０．０４）の腹腔内注射６０分後に強直間代発作を示すＣａｍｋ２ａ−ｃｒｅ；Ｒｏｓａ−ｍｉＲ−１２８または同腹子対照マウス（ｎ＝１２／群）の数を示す。ｐ値はフィッシャーの正確確率検定によって計算した。
【００２５】
図４は、ｍｉＲ−１２８が生後マウス脳内で高度に発現していることを示す。
（Ａ）ｍｉＲ−１２８がマウス脳内に豊富にある。８週齢成体マウスの脳、骨格筋、心臓、腎臓、肺および肝臓から精製したＲＮＡにおけるｑＲＴ−ＰＣＲ（ｎ＝３）によって、ｍｉＲ−１２８の発現レベルを測定した。ｍｉＲ−１２８の発現レベルをｓｎｏＲＮＡ１３５発現に正規化し、肝臓におけるそれぞれのｍｉＲＮＡ発現レベルに対する倍率増加として示した。脳対他の器官の比較のための、一元配置分散分析、引き続いてテューキーのポストテスト、ｐ＜０．０１。
（Ｂ）生後脳発達がｍｉＲ−１２８発現レベルの増加を伴う。ｍｉＲ−１２８およびニューロン富化ｍｉＲ−１２４ａの発現レベルを、胚発生の１２日目（Ｅ１２）、新生マウス（Ｐ０）または８週齢成体マウス（１齢群当たりｎ＝３）のマウス胚に由来する脳におけるｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。ｍｉＲＮＡの発現レベルをｓｎｏＲＮＡ１３５発現に正規化し、Ｅ１２胚性脳におけるそれぞれのｍｉＲＮＡ発現レベルに対する倍率増加として示した。
（Ｃ）ｍｉＲ−１２８が異なる脳領域中で発現している。成体マウスの示される脳領域中のｍｉＲ−１２８の発現を、（Ａ）のように定量化し、脳幹中の平均ｍｉＲ−１２８発現に対して示した（ｎ＝３／領域）。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。
【００２６】
図５は、ｍｉＲ−１２８−１およびｍｉＲ−１２８−２遺伝子が、脳内のｍｉＲ−１２８発現に異なって寄与することを示す。
（Ａ、Ｂ）マウスの条件遺伝子不活性化のための（Ａ）ｍｉＲ−１２８−１の生成（Ｂ）ｍｉＲ−１２８−２の生成。（左側パネル）ｍｉＲ−１２８遺伝子の遺伝子組換えおよび不活性化のための戦略を示す。ｍｉＲ−１２８保有遺伝子の両方のｍｉＲＮＡヘアピンを含有する領域を、マウスＥＳ細胞のｌｏｘＰ部位と隣接させ、引き続いてｍｉＲ−１２８−１ｆｌ／ｆｌおよびｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌマウスの作成のための日常的手順を行った。マイクロＲＮＡヘアピン、塗りつぶされた長方形；エクソン、空の長方形；ｌｏｘＰ部位、黒色三角形。ＦＲＴ配列（黒色円）が隣接したネオマイシン耐性遺伝子を、ＦＬＴリコンビナーゼを用いて標的化遺伝子座から除去した；ＤＴＡ、ジフテリア毒素遺伝子；ＴＫ、チミジンキナーゼ遺伝子；ＬＡＨ／ＳＡＨ、相同性の長腕および短腕。（右側パネル）ｍｉＲ−１２８−１ｆｌ／ｆｌおよびｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌマウスをそれぞれＣＭＶ−ｃｒｅマウスと交配することによって、ｍｉＲ−１２８−１（ｍｉＲ−１２８−１−／−）またはｍｉＲ−１２８−２（ｍｉＲ−１２８−２−／−）欠損マウスを作成した。示されるＤＮＡプローブ（黒色長方形）を用いるＥｃｏＲＩもしくはＳａｃＩにより消化したマウス尾ＤＮＡのサザンブロット法、またはスキームに示されるプライマーを用いるＰＣＲ遺伝子型判定によって、組換えｍｉＲ−１２８−１およびｍｉＲ−１２８−２対立遺伝子を同定した。ｍｉＲ−１２８−１（それぞれｎ＝７）またはｍｉＲ−１２８−２（ｎ＝５および３）遺伝子が欠損したマウスの線条体中のｍｉＲ−１２８の相対発現レベルを示す。
（Ｃ）ｍｉＲ−１２８−１遺伝子の不活性化は、マウスの運動活動にも生存にも影響を与えない。マウスの運動活動に対するｍｉＲ−１２８−１欠損の影響を、オープンフィールド分析を用いて測定した。オープンフィールドでの６０分以内の（左側パネル）全移動水平距離（ｍ）および（中央パネル）垂直立ち上がりエピソード数を示す（ｎ＝７および９）。（右側パネル）ｍｉＲ−１２８−１が欠損したマウス（ｎ＝６）およびそれぞれの野生型同腹子対照（ｎ＝２２）の寿命を示す。
（Ｄ）ｍｉＲ−１２８−２遺伝子の不活性化がマウスの探索を増加させる。ｍｉＲ−１２８−２−／−および同腹子対照の垂直立ち上がりエピソードの数を示す（ｎ＝２３および１２）。エラーバーは平均値の標準誤差、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、ウェルチのｔ検定および対数順位検定を示す。
【００２７】
図６（Ｓ３）は、マウスの生後Ｃａｍｋ２ａ−およびＤ１−ニューロン（ただし、Ｄ２−ニューロンは除く）の条件不活性化によるマウスの探索行動増加を示す。
（Ａ）生後Ｃａｍｋ２ａ−ニューロンにおけるｍｉＲ−１２８欠損が探索を増加させる。Ｃａｍｋ２ａ−ｃｒｅをｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌマウスと交配することによって、生後Ｃａｍｋ２ａ−ニューロンにおけるｍｉＲ−１２８欠損を達成した。（左側パネル）棒グラフは、Ｃａｍｋ２ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌマウスおよび対照同腹子（ｎ＝７および４）における相対ｍｉＲ−１２８発現レベルを示す。（右側パネル）Ｃａｍｋ２ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌマウスおよび対照同腹子（ｎ＝２１および８）によって行われた垂直立ち上がりエピソードの数を示す。
（Ｂ）Ｄ１−ニューロンにおけるｍｉＲ−１２８欠損が探索を増加させる。Ｄｒｄ１ａ−ｃｒｅをｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌマウスと交配することによって、Ｄ１−ニューロンにおけるｍｉＲ−１２８欠損を達成した。Ｄｒｄ１ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌマウスおよび対照同腹子（ｎ＝２２および２６）の相対線条体ｍｉＲ−１２８発現レベル（左側、それぞれｎ＝３）および垂直立ち上がりエピソード（右側）を示す。
（Ｃ）Ｄ２−ニューロンにおけるｍｉＲ−１２８欠損がマウスの運動活動にも生存にも影響を与えない。Ａ２Ａ−ｃｒｅをｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌマウスと交配することによって、Ｄ２−ニューロンにおけるｍｉＲ−１２８欠損を達成した。Ａ２Ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌマウスおよびそれぞれの同腹子（ｎ＝７）の線条体ｍｉＲ−１２８発現レベル（左側、それぞれｎ＝３）、水平運動活動および垂直立ち上がりエピソード（中央、ｎ＝９および７）ならびに生存期間（右側、ｎ＝８および７）を示す。エラーバーは平均値の標準誤差、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、ウェルチのｔ検定および対数順位検定を示す。
【００２８】
図７（Ｓ４）は、インビボでのｍｉＲ−１２８の異所性発現が、野生型マウスの運動活動を減弱し、Ｃａｍｋ２ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌマウスにおけるｍｉＲ−１２８発現レベルを正常化することを示す。
（Ａ）ｍｉＲ−１２８の条件付き過剰発現を有するマウスを作成するための標的化戦略。前記のノックイン戦略を用いて、外因性ｍｉＲ−１２８−２遺伝子をＥＳ細胞の内因性Ｒｏｓａ２６遺伝子座に挿入した。ｍｉＲ−１２８−２遺伝子（赤色長方形）を、ｆｌｏｘｅｄ−ＳＴＯＰ−ネオマイシンカセットによって強力なＣＡＧＧプロモーターから分離した。エクソン、灰色長方形。ＤＴＡ、ジフテリア毒素遺伝子。示されるＤＮＡプローブ（青色長方形）を用いるＥｃｏＰＩ消化ＤＮＡ（右上）のサザンブロット解析、またはＰＣＲ遺伝子型判定（右下、スキームに示されるプライマー位置）によって、組換えＲＯＳＡ−Ｓｔｏｐｆｌ／ｆｌ−ｍｉＲ−１２８対立遺伝子（単純化のために今からＲｏｓａ−ｍｉＲ−１２８と呼ぶ）を確認した。
（Ｂ）ｍｉＲ−１２８のニューロン特異的過剰発現を有するマウスにおける運動活動および探索の減少。（上部）Ｃａｍｋ２ａ−ｃｒｅをＲｏｓａ−ｍｉＲ−１２８マウスと交配することによって、ｍｉＲ−１２８の生後ニューロン特異的過剰発現を有するマウス（Ｃａｍｋ２ａ−ｃｒｅ；Ｒｏｓａ−ｍｉＲ−１２８）を作成した。（左側）線条体におけるｍｉＲ−１２８発現レベルを上記のように（図４）ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定し（それぞれｎ＝３）、野生型線条体における平均ｍｉＲ−１２８発現に対して示す。ウェルチのｔ検定。（中央および右側）Ｃａｍｋ２ａ−ｃｒｅ；Ｒｏｓａ−ｍｉＲ−１２８マウス（ｎ＝２１）および同腹子対照（野生型ｎ＝８、Ｃａｍｋ２ａ−ｃｒｅ  ｎ＝５、Ｒｏｓａ−ｍｉＲ−１２８  ｎ＝１７）についての６０分間にわたるオープンフィールドでの全水平距離および立ち上がり活動を示す。一元配置分散分析、引き続いてテューキーのポストテスト。
（Ｃ）Ｒｏｓａ２６遺伝子座からのｍｉＲ−１２８の異所性発現が、Ｃａｍｋ２ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌマウスにおけるｍｉＲ−１２８発現レベルを正常化する。（左側）Ｃａｍｋ２ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌをＲｏｓａ−ｍｉＲ−１２８マウスと交配することによって、ｍｉＲ−１２８−２の生後ニューロン特異的ノックアウトおよびＲｏｓａ２６遺伝子座からのｍｉＲ−１２８−２の異所性発現を有するマウス（Ｃａｍｋ２ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌ；Ｒｏｓａ−ｍｉＲ−１２８）を作成した。（右側）Ｃａｍｋ２ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌ；Ｒｏｓａ−ｍｉＲ−１２８マウス（ｎ＝４）の線条体におけるｍｉＲ−１２８発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって測定し、データを同腹子対照（ｎ＝３）における平均発現に対して示す。ウェルチのｔ検定。エラーバーは、平均値の標準誤差、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１を示す。
【００２９】
図８（Ｓ９）は、ｍｉＲ−１２８欠損線条体Ｄ１−ニューロンがＤ１−ニューロン特徴的体性興奮性を示す。
（Ａ、左側）体性電流注入に対する対照（Ｄｒｄ−１ａ−ＴＲＡＰ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌ、上部、黒色）およびｍｉＲ−１２８欠損（Ｄｒｄ１ａ−ＴＲＡＰ、Ｄｒｄ１ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８ｆｌ／ｆｌ、底部、赤色）Ｄ１−ニューロンの代表的なＤ１−ニューロン原型反応。Ｄ１−ニューロンを、ｅＧＦＰ−Ｌ１０発現によって同定し、電圧トレースは−１００、−５０、＋１００、＋１９０および＋２５０ｐＡに応じたものである。（Ａ、右側）体性電流注入に対するＤ１−ニューロン特徴的平均発火頻度を示す頻度−電流（Ｆ−Ｉ）プロット。野生型（黒色、ｎ＝６）Ｄ１ニューロンと突然変異（赤色、ｎ＝７）Ｄ１−ニューロンとの間に差は観察されなかった。マン・ホイットニーのノンパラメトリック検定、ｐ＞０．０５。
（Ｂ）ｍｉＲ−１２８がＤ１−ニューロン中の機能的棘の数を制御する。連続的な隣接棘頭に対するグルタミン酸の二光子アンケージングによって、対照とｍｉＲ−１２８欠損Ｄ１−ニューロン（ｎ＝５〜６個の細胞、１群当たり４０〜４８本の棘、左側）の体性ＥＰＳＣを生成する同様の成功率が明らかになり、（図３Ｂ）中の棘密度の増加が機能的グルタミン酸受容体を有する棘の数の増加となることを示唆している。グルタミン酸アンケージング誘導性体性ＥＰＳＣ振幅は両群で類似であった（右側）。
【００３０】
図９（Ｓ１０）は、ニューロンにおけるｍｉＲ−１２８発現増加が、ＥＲＫ２活性化を抑制し、化学的誘発パーキンソン病および発作に伴う異常な運動活動および発作から保護することを示している。
（Ａ）Ｃａｍｋ２ａ−ニューロンにおけるｍｉＲ−１２８過剰発現が、マウスにおけるＥＲＫ２リン酸化を抑制する。トランスジェニックＣａｍｋ２ａ−ｃｒｅ；Ｒｏｓａ−ｍｉＲ−１２８突然変異体および対照マウス（それぞれｎ＝４）の線条体中のＥＲＫ２リン酸化レベルを、ウエスタンブロット法によって定量化し、全ＥＲＫ２発現に正規化し、平均対照レベルに対して示した。代表的なブロットを示す。ウェルチのｔ検定、＊ｐ≦０．０５。
（Ｂ）ｍｉＲ−１２８過剰発現が、マウスにおける化学的誘発反応亢進運動行動を減弱する。このスキームは、片側性６−ＯＨＤＡ誘発損傷を有する野生型マウスの標準的な回転反応を示している。６−ＯＨＤＡおよびビヒクルをそれぞれ左線条体および右線条体に注射し、コカイン（ドーパミン作動性末端での内因性ドーパミン取り込みを阻害し、それによってシナプスドーパミンレベルを増加させる）またはＤｒｄ１−アゴニストＳＫＦ８１２９７（ドーパミンＤ１受容体（Ｄｒｄ１）の特異的活性化）のいずれかに対する回転反応を３週間の回復期間後に評価する。コカイン注射は、機能的ドーパミン作動性末端をまだ含有する非損傷反対側線条体の強力な活性化による同側性（損傷側に向けた）回転を誘発する。Ｄｒｄ１−アゴニストＳＫＦ８１２９７の注射は、損傷同側性線条体におけるドーパミン枯渇後のＤｒｄ１活性化に対するＤ１−ニューロンの異常な過敏性による反対側回転（損傷部位から離れる）を誘発する。
【００３１】
図１０は、生後ニューロンにおけるｍｉＲ−１２８枯渇が、運動活動の用量依存性増加を引き起こすことを示す。ｍｉＲ−１２８は、用量依存的様式でマウスにおいて運動行動を制御する。ｍｉＲ−１２８−２の欠損は、マウスにおいて活動亢進を引き起こす。（左側パネル）ｍｉＲ−１２８−２−／−、ｍｉＲ−１２８−２＋／−および野生型同腹子対照の運動活動を、６０分オープンフィールドアッセイで全移動水平距離（ｍ）および垂直立ち上がりエピソード数を測定することによって決定した。生後ニューロンにおけるｍｉＲ−１２８−２の欠損は、運動活動の用量依存的増加の原因である。（右側パネル）ｍｉＲ−１２８−２のホモ接合性（Ｃａｍｋ２ａ−Ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８ｆｌ／ｆｌ）またはヘテロ接合性（Ｃａｍｋ２ａ−Ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８＋／ｆｌ）枯渇を有するマウスおよび野生型同腹子対照の運動活動を、６０分オープンフィールドアッセイで全移動水平距離（ｍ）および垂直立ち上がりエピソード数を測定することによって決定した。
【００３２】
図１１は、異所性発現ｍｉＲ−１２８による致死的てんかんおよび活動亢進の用量依存的救済を示す。ｍｉＲ−１２８の異所性発現は、用量依存的様式で、Ｃａｍｋ２ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌマウスの自発運動亢進を正常化し、死亡を防ぐ。（左側パネル）異所性発現ｍｉＲ−１２８の１つ（淡青色）または２つ（濃青色）の対立遺伝子の存在の不在（黒色）下でのＣａｍｋ２ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌマウスの寿命を示す。（右側パネル）Ｃａｍｋ２ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌ；Ｒｏｓａ−ｍｉＲ−１２８（青色）、Ｃａｍｋ２ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌ（黒色）および野生型マウス（白色）の運動活動を示す。
【００３３】
図１２は、海馬ではなく成体の線条体中のｍｉＲ−１２８のウイルス媒介欠乏が、遺伝的ｍｉＲ−１２８枯渇と同様に運動活動の増加をもたらすことを示す。海馬ではなく線条体における成体マウスのｍｉＲ−１２８のＡＡＶ２−Ｃｒｅ媒介ニューロン特異的局所的欠乏が、基礎運動活動の増加を再現する。ＡＡＶ２−Ｃｒｅを、８〜１２週齢ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌマウスおよびそれぞれの野生型同腹子の２つの脳領域の１つに定位的に注射した。６０分オープンフィールドアッセイで全移動水平距離（ｍ）を測定することによって、運動活動を測定した。海馬注射マウスのほとんどはウイルス注射１〜２か月後に重度の発作で死亡したが、線条体注射マウスの大部分は６か月後に屠殺するまで生存した。
【００３４】
図１３は、海馬ではなく成体の線条体中のｍｉＲ−１２８のウイルス媒介欠乏が運動活動を増加させることを示す。海馬ではなく線条体における成体マウスのｍｉＲ−１２８のＡＡＶ２−Ｃｒｅ媒介ニューロン特異的局所的欠乏が、基礎運動活動の増加を再現する。ＡＡＶ２−Ｃｒｅを、８〜１２週齢ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌマウスおよびそれぞれの野生型同腹子の２つの脳領域の１つに定位的に注射した。外科手術２週間後（完全なウイルス発現前）および外科手術４週間後（完全なウイルス発現の時）の運動活動を、６０分オープンフィールドアッセイにおいて全移動水平距離（ｍ）を測定することによって決定した。データは、ＡＡＶ−Ｃｒｅウイルスが海馬ではなく線条体におけるｍｉＲ−１２８枯渇での運動活動の増加を誘導した明らかな効果を示している。まとめると、ＡＡＶ−Ｃｒｅデータは、基礎活動の制御因子としての線条体におけるｍｉＲ−１２８発現および自発発作活動の抑制因子としての海馬におけるｍｉＲ−１２８発現を示している。
【００３５】
図１４は、線条体Ｄ１特異的ｍｉＲ−１２８欠乏と反対に、皮質および海馬特異的ｍｉＲ−１２８欠乏が最初の２０分間のみ探索活動を増加させ、これにオープンフィールドでの正常な基礎活動が続くことを示す。（上部パネル）Ｄｒｄ１ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌマウスまたは（下部パネル）Ｅｍｘ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌおよびそれぞれの同腹子対照の運動活動を、６０分オープンフィールドアッセイで全移動水平距離（ｍ）および垂直立ち上がりエピソード数を測定することによって決定した。
【００３６】
図１５は、皮質および海馬特異的ｍｉＲ−１２８枯渇が、線条体Ｄ１ニューロン特異的枯渇よりもはるかに早いマウスにおける早発性発作誘発性死亡をもたらすことを示す。（左側パネル）Ｄｒｄ１ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌマウスおよび（右側パネル）Ｅｍｘ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌならびにそれぞれの同腹子対照の寿命を示す。
【００３７】
図１６は、活性誘導遺伝子ＢＤＮＦおよびＦｏｓと反対に、ｍｉＲ−１２８発現が成体Ｃ５７Ｂｌ６野生型マウスの皮質中で安定なままであり、カイニン酸誘発発作で増加しないことを示す。
【００３８】
図１７は、ＢＤＮＦが初代培養線条体ニューロンにおいてＡｒｐｐ２１およびｍｉＲ−１２８を誘導することを示す。Ｅ１８マウス脳から得た初代線条体ニューロン培養液を、インビトロで１０日目に水中０．０５ｎｇ／μｌ脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）で処理した。培養液からのＲＮＡを刺激後０、２、６および２４時間後で調製し、遺伝子発現変化をＴａｇｍａｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いて分析した。ＢＤＮＦは即時型遺伝子ＦｏｓＢ（左側に示される陽性対照）の強力であるが一過的な誘導物質であるが、ニューロン特異的ｍｉＲＮＡ  ｍｉＲ−１２４ａの発現には効果を有さない。しかしながら、示される結果の通り、ＢＤＮＦ処理は、ｍｉＲ−１２８およびｍｉＲ−１２８宿主遺伝子Ａｒｐｐ２１の安定な増加をもたらす。データは平均値として示し、エラーバーは平均値の標準誤差を表し、ｐ値は二元配置分散分析によって決定した、ＦｏｓＢ処理．００１４、時間＜．０００１．１２４ａ処理．１０９１、時間．０８６１、Ａｒｐｐ２１処理．００６４、時間．０１９０．ｍｉＲ−１２８−２処理．０１６０、時間．２０９７。
【発明の詳細な説明】
【００３９】
本発明は、発作関連障害および神経傷害の発症を治療するまたはその可能性を減少させるための治療的戦略に関する。特に、本発明は、哺乳動物の脳内のマイクロＲＮＡ−１２８の発現および／または活性を増加させて発作関連障害および神経傷害の発症を治療するまたはその可能性を減少させることに関する。
【００４０】
てんかんは、世界中の約５０００万人の人々が罹患している再発性自発発作を特徴とする重篤な慢性神経障害であり、てんかんの欧州および米国での社会経済的費用は１年当たり約３００億ドルになると考えられる。抗てんかん薬は、典型的には患者の３分の２で発作を制御するが、一般的には根底にある病態生理学を変えない。てんかんを有する人々の残りの３分の１は、薬物耐性であるか、または現在利用可能な薬物の容認できない副作用に悩まされ、発作を有し続けており、患者にはわずかな選択肢、例えば、発作を引き起こす脳の部分を除去するための脳外科手術しか残されていない。
【００４１】
てんかんは、一般的に発作と呼ばれる脳の散発性電気的ストームの発生である。これらのストームは、行動学的徴候（凝視など）および／または不随意運動（大発作など）を引き起こす。それぞれ異なる原因、症状および治療法を有する数種類のてんかんが存在する。４つの主要な型のてんかん、１）全般、２）部分、３）非てんかん性および４）てんかん重積状態が存在する。
【００４２】
１）全般発作は、発作の開始から両大脳半球（脳の両側）を冒す。これらは、短期間または長期間の意識消失をもたらし、数種類の主要な型に下位範疇化される：全般強直間代；ミオクロニー；欠神；および脱力。２）部分発作では、電気的じょう乱が一方の大脳半球（脳の片側）の特定の領域に限定される。部分発作は、単純部分発作（意識が保たれている）；および複雑部分発作（意識が損なわれているまたは消失している）に細分される。部分発作が広がって全般発作を引き起こす場合があり、その場合、分類範疇は部分発作から二次性全般化するものとされる。部分発作が、てんかんを有する人々が経験する最も一般的な型の発作である。複雑な幻覚または幻聴を含む、事実上どの運動、感覚または感情症状も部分発作の一部として起こる可能性がある。３）非てんかん性発作は、人の行動を簡単に変え、しばしばてんかん性発作のように見えるエピソードである。てんかん性発作は、脳、特に、皮質（脳の外層）における異常な電気的変化によって引き起こされる。非てんかん性発作は、脳の電気的混乱によって引き起こされるのではない。４）ほとんどの発作は、数秒または数分後には終わる。発作が長引く、または逐次起こる場合、てんかん重積状態、発作の連続状態のリスクが増加している。
【００４３】
症候性（後天性）てんかんの発症は、中でもイオンチャネルおよび神経伝達物質受容体の発現変化、シナプスリモデリング、炎症、神経膠症およびニューロン死を伴うと考えられている。しかしながら、インビボでの十分な有効性を示しているこれらの過程を標的化する抗てんかん発生介入はほとんどなく、細胞および分子機構の理解は不完全なままである。てんかんを引き起こす脳損傷後の予防的治療も、てんかん重積状態、または脳損傷もしくはてんかんを引き起こしそうな急性神経傷害、例えば、脳卒中、外傷に特異的な神経保護治療も現在存在しない。
【００４４】
熱性てんかんは、乳児の約８％という高い罹患率を有する。熱性発作の主な症状は、３８℃以上の熱にかかっている間の１〜５分間全身痙攣の継続として知られている。生後６か月〜約５歳の間に発症する熱性発作のほとんどのケースは、患者が６歳になる時までに治癒する。しかしながら、熱性発作の発症が１歳未満であった患者の中には、６歳になった後でさえ絶えず痙攣を患っている患者もおり、難治性てんかん疾患の患者であるＤｒａｖｅｔ症候群の患者もいる。
【００４５】
重症乳児ミオクロニーてんかん（ＳＭＥＩ）（または現在、Ｄｒａｖｅｔ症候群として知られている）は、乳児のころに始まる難治性てんかんのまれな破局的形態である。ｕｒｌ：ｗｗｗ．ｄｒａｖｅｔｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ．ｏｒｇの概説を参照されたい。Ｄｒａｖｅｔ症候群に伴う難治性てんかんの特徴には、１）高い発生率の部分発作、引き続いて全般発作（特に、側頭葉てんかん）；２）高い発生率の、脳の器質性損傷によって引き起こされる症候性てんかん；３）発症から専門家の相談までの長期の治療不在および高い発生率の発作；ならびに４）既往歴の高い発生率のてんかん重積状態が挙げられる。換言すれば、側頭葉がおそらく難治性てんかんの原因である脳の部分である。
【００４６】
後天性発作が繰り返されるにつれて、てんかんがその性質の変化および進化によってより難治性となることが示されている。難治性てんかんに伴う発作は、種々の型、例えば、強直発作、強直間代発作、非定型欠神発作、脱力発作、ミオクロニー発作、間代発作、単純部分発作、複雑部分発作および続発性全般発作に分類される。
【００４７】
例えば、てんかんの重症型であるＤｒａｖｅｔ症候群は、一般的に乳児および小児に発症する衰弱性状態である。これは、ナトリウムチャネルＳｃｎ１ａの突然変異によって引き起こされ、この疾患の小児は、頻繁な長期の強直間代発作および幼齢での突然の予期しない死に苦しむ。多数の強力な抗発作薬物療法が存在するにもかかわらず、てんかん患者、特にＤｒａｖｅｔ症候群と診断された患者の３０％超がいかなる治療にも反応せず、しばしば全ての既知のＦＤＡ承認抗発作薬物療法に対して耐性である。
【００４８】
これに関連して、本出願の発明者らは、驚くべきことに、マウスおよびヒトで保存されている単一の脳に豊富に存在するマイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−１２８の発現増加を使用して、インビボで病理学的神経興奮性、発作およびてんかんを制御することができることを発見した。
【００４９】
したがって、一態様では、本開示は、個体のてんかんまたはてんかん重積状態の発症を治療するまたはその可能性を減少させる方法に関する。方法は、ＭｉＲ−１２８の発現および／または活性を増加させることができる薬剤の治療上有効量を、このような治療を必要とする個体（対象）に投与することを含む。
【００５０】
全てのてんかん患者に適用するのと同時に、この新規な治療は、特に現在利用可能な治療が存在しないてんかんを患っている患者；すなわち、てんかんを患っている患者の約３分の１に命綱を提供することができる。例えば、本開示の文脈において、個体はＤｒａｖｅｔ症候群と診断された患者であることができる。本開示の治療薬は中枢神経系に作用するので、薬の投与経路にはくも膜下腔内または鼻腔内が含まれることができる。本発明者らは、海馬および／または皮質が治療薬にとって特に優れた標的であることを確認し、よって、薬が海馬および／または皮質に最も集中するまたはさらされるように薬を投与する手段が好ましい。
【００５１】
２００１年に、大きな群のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が単離および同定された。ｍｉＲＮＡは、その標的との正確なまたは不正確な塩基対形成を通して、遺伝子発現を調節し、翻訳を妨害することができる分子である。非コードＲＮＡ遺伝子が、遺伝子発現、発症時期、ウイルス監視および免疫の調節において重要な役割を有する機能性ＲＮＡ分子を産生することが明らかになっている。伝統的な転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）だけでなく、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小さなノンコーディングＲＮＡ（ｔｉｎｙ  ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ）（ｔｎｃＲＮＡ）、反復配列関連低分子干渉ＲＮＡ（ｒｅｐｅａｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）（ｒａｓｉＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）も現在では染色体維持、遺伝子インプリンティング、プレｍＲＮＡスプライシング、ガイドＲＮＡ修飾、転写調節およびｍＲＮＡ翻訳の制御などの多様な細胞過程で作用すると考えられている（ＫａｗａｓａｋｉおよびＴａｉｒａ、Ｎａｔｕｒｅ、２００３、４２３、８３８〜８４２）。
【００５２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、最初に長いＲＮＡ転写産物として転写される内因性遺伝子に由来する。ｍｉＲＮＡは、真核生物の長いヘアピン非コード転写産物に由来する小型の、一般的に１８〜２４個の間の残基のポリリボヌクレオチドである。ｍｉＲＮＡは、細胞発達および分化経路において重要な役割を果たす。結果として、ｍｉＲＮＡの時間的、空間的および細胞発現レベルならびにｍｉＲＮＡの発現パターンを理解および特性評価して、正常な状態と疾患状態の両方での細胞発達および分化におけるその正確な役割を確認するために相当な努力がなされてきた。
【００５３】
存在する数百のマイクロＲＮＡの中で、本発明者らは、１つのｍｉＲ−１２８がてんかんにおいて重要な役割を果たすことをここで発見した。ｍｉＲ−１２８は成体マウスおよびヒト脳中で最も豊富で、最高に富化されたｍｉＲＮＡの１つである（例えば、Ｈｅら、Ｎｅｕｒｏｎ  ７３、３５、２０１２年１月１２日および図４Ａ参照）。マウス脳内のｍｉＲ−１２８の発現は、生後発達中に徐々に増加し、成体期にピークになる（Ｍｉｓｋａら、Ｇｅｎｏｍｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ５、Ｒ６８（２００４）；およびＫｒｉｃｈｅｖｓｋｙら、ＲＮＡ  ９、１２７４（２００３年１０月））；および（図４Ｂ）。多様な脳領域中でのｍｉＲ−１２８の発現（図４Ｄ）は、本出願の発明者らに、ｍｉＲ−１２８が多くの神経細胞型に共通の過程で重要な役割を果たすことを示唆した。
【００５４】
本発明は、細胞に導入すると内因性ｍｉＲＮＡの活動を行う核酸に関する。これらの核酸は、いくつかの実施形態では合成ｍｉＲＮＡである。ｍｉＲＮＡを導入し、これを細胞から除去する方法が記載されてきた（Ｍｅｉｓｔｅｒら、２００４；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒら、２００４）。別の刊行物が、細胞にトランスフェクトすると、内因性ＲＮＡポリメラーゼによって転写され、特異的ｍｉＲＮＡを産するプラスミドの使用を記載している（Ｚｅｎｇら、２００２）。
【００５５】
本出願の発明者らは、成体ニューロン中で発現するマイクロＲＮＡ−１２８（ｍｉＲ−１２８）が、神経シグナル伝達ネットワークおよび興奮性を調節することによって運動行動を調節することを発見した。本発明者らは、ｍｉＲ−１２８が、神経興奮性を調節する細胞外シグナル調節キナーゼＥＲＫ２ネットワークの種々のイオンチャネルおよびシグナル伝達成分の発現を抑制することによって運動活動を支配していることを発見した。したがって、ｍｉＲ−１２８が、Ｄｒａｖｅｔ症候群の治療耐性てんかんを含む、てんかんおよび関連する状態を治療するための新規な治療薬となることがここで発見された。
【００５６】
特に、本開示の一態様は、治療を必要とする個体のてんかんの発症を治療するまたはその可能性を減少させる方法に関する。方法は、ＭｉＲ−１２８の発現および／または活性を増加させることができる薬剤の治療上有効量を、個体に投与することを含み、前記個体は前記個体のてんかんのリスクを増加させる脳損傷を以前に患っている。以前の脳損傷は脳卒中によって引き起こされたかもしれない。
【００５７】
治療薬は、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１２８と９０％以上の配列相同性を有する薬剤、あるいはｍｉＲ−１２８活性および／または発現の誘導物質、例えば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）であることができる。ｍｉＲ−１２８を増加および／または活性化することができる薬剤は、化学的に安定化されたｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１２８をコードする核酸および／またはｍｉＲ−１２８をコードするウイルスベクターであることができる。てんかんの治療としてのｍｉＲ−１２８の利点の１つは、神経興奮性を調節するシグナル伝達ネットワーク内のいくつかの遺伝子を標的化するその能力である。
【００５８】
動物およびヒトの運動行動の制御は、種々の型および強度のシグナルへの神経ネットワークの一定の適応を要する。マウスでは、生後ニューロンにおけるｍｉＲ−１２８発現の低下が運動活動および致死的てんかんを増加させることが示された。ｍｉＲ−１２８の過剰発現が、ニューロン反応性を減弱し、運動活動を抑制し、パーキンソン様疾患および発作に伴う運動異常を軽減することが示された。
【００５９】
したがって、本開示の一態様は、発作の発症または発生を治療するまたはその可能性を減少させる方法に関する。方法は、ＭｉＲ−１２８の発現および／または活性を増加させることができる薬剤の治療上有効量を、このような治療を必要とする個体に投与することを含み、前記患者は発作の発症を特徴とする脳関連障害を有する。発作の発症を特徴とする脳関連障害は、脳卒中、低酸素症、外傷性脳損傷、感染症、腫瘍、神経変性障害、発作を引き起こす代謝および／または自己免疫障害であることができる。個体はＤｒａｖｅｔ症候群と診断されたある人であることができる。
【００６０】
対象はいずれの年齢であってもよい。薬剤はくも膜下腔内または鼻腔内投与されることができる。投与の目標は、治療薬が中枢神経系のその標的に到達することを可能にすることである。例えば、好ましくは、薬剤を、薬剤が海馬および／または皮質と接触するように投与する。ｍｉＲ−１２８が脳形態学、線条体形態学または神経生存に影響を及ぼさないことが示されたことに留意する。
【００６１】
種々の送達システムが知られており、これらを使用して本発明の治療薬を例えば、鼻腔内に投与することができる。導入法としては、それだけに限らないが、鼻腔内、硬膜外および脳内が挙げられる。組成物は、任意の簡便な経路によって、例えば、点滴またはボーラス注射によって、上皮または粘膜皮膚裏層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜等）を通した吸収によって投与されることができ、他の生物活性剤と一緒に投与されることができる。さらに、本発明の組成物を、脳室内およびくも膜下腔内注射を含む任意の適当な経路によって中枢神経系に投与することができ；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバーなどのリザーバーと結合した脳室内カテーテルによって容易となることができる。
【００６２】
好ましくは、治療薬が中枢神経系に送達される。送達手段としては、くも膜下腔内送達および吸入送達が挙げられる。これらの送達手段を達成する方法は薬物送達の分野の当業者に周知であり、これらには、例えば、ミニ浸透圧ポンプによるくも膜下腔内送達または活性剤を放出するインプラント（例えば、小型シリコンインプラント）によるものが含まれる。例えば、てんかんエピソードおよび関連する発作の重症度および／または頻度が低下するように、このようなインプラントを使用してｍｉＲ−１２８またはｍｉＲ−１２８と９０％以上の配列相同性を有する薬剤を一定期間にわたって投与することができる。治療薬を、好ましくはより広範に分配されることなく、海馬および／または皮質中の細胞と接触するように送達する。
【００６３】
本開示の別の態様は、発作を特徴とする病態の治療またはその可能性の減少に有用な化合物を同定する方法に関する。化合物は、ｍｉＲ−１２８発現細胞を候補化合物と接触させ、細胞中のｍｉＲ−１２８の発現および／または活性のレベルを測定することによって同定されることができる。候補化合物と接触していないｍｉＲ−１２８発現細胞中のｍｉＲ−１２８の活性の基準レベルに対するｍｉＲ−１２８の発現および／または活性のレベルの増加は、候補化合物が発作を特徴とする病態の治療または予防に有用であることを示す。
【００６４】
一実施形態では、ｍｉＲ−１２８が、ｍｉＲ−１２８発現細胞の形態で提供されることができる。発作を特徴とする病態は、てんかん、てんかん重積状態、脳卒中、低酸素症、外傷性脳損傷、感染症、腫瘍、神経変性障害、発作を引き起こす代謝および／または自己免疫障害であることができる。
【００６５】
ヒト「ｍｉＲ−１２８」という用語は、任意のヒトｍｉＲ−１２８パラログを含むとみなされるべきである。ｍｉＲＮＡ遺伝子ファミリーは多くのメンバーを含む。いくつかのｍｉＲＮＡ遺伝子ファミリーメンバー（ｍｉｒ−１２８  ５０配列）を以下の表１に示す。
【００６６】
本開示では、本発明の発明者らが、ｍｉＲ−１２８が欠損したマウスにおいて早期発症致死的てんかんが存在するという発展性のある観察（図１Ａ）から、ｍｉＲ−１２８の脳機能における強力な調節的役割が存在すると推測した。
【００６７】
ｍｉＲ−１２８は、それぞれマウス染色体１および９（図５Ａ、Ｂ）またはヒト染色体２および３上の２つの別個の遺伝子、ｍｉＲ−１２８−１およびｍｉＲ−１２８−２によってコードされる。マウスでは、生殖細胞系ｍｉＲ−１２８−２欠損が前脳内のｍｉＲ−１２８発現の８０％低下をもたらすことが示された一方で、ｍｉＲ−１２８−１遺伝子の切除は、ｍｉＲ−１２８の２０％しか排除しなかった（図５Ａ、Ｂ）。
【００６８】
出願人らは、ｍｉＲ−１２８−２−／−（ただし、ｍｉＲ−１２８−１−／−を除く）マウスにおけるｍｉＲ−１２８発現レベルの顕著な低下が、４週齢での活動亢進および探索増加の発達と関連していることを発見した（図１Ａ、図５Ｃ、Ｄ）。ここで、本発明者らは、ｍｉＲ−１２８−２−／−マウスにおける若年性活動亢進が、２〜３月齢で重度の発作および死亡へと急速に進行したことを示している（図１Ａ、Ｂ）。さらに、マウスにおけるｍｉＲ−１２８欠損の致死的影響が、抗痙攣薬バルプロ酸による治療によって予防されることが示され（図１Ｃ）、したがって、動物の死亡における発作の原因となる役割を証明している。
【００６９】
ｍｉＲ−１２８−２欠損マウスにおける活動亢進および致死的てんかんの観察は、ｍｉＲ−１２８が生後ニューロンの興奮性を制御する能力を反映している。前脳ニューロンにおけるｍｉＲ−１２８−２遺伝子の選択的不活性化（Ｃａｍｋ２ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌ）は、ｍｉＲ−１２８−２−／−マウスで観察されるようなｍｉＲ−１２８発現の低下、引き続く早発性活動亢進、発作および死亡をもたらす（図１Ｂ、Ｄ、図６Ａ）。さらに、ニューロンにおける異所性ｍｉＲ−１２８−２発現によるｍｉＲ−１２８欠損の補正は、運動活動を正常化し、発作誘発死を防いだ（図１Ｅ、図７Ａ、Ｃ）。
【００７０】
本データは、発作が神経興奮性増加（カイニン酸モデル）またはニューロンの阻害活性低下（ピクロトキシンモデル）によって引き起こされても、ｍｉＲ−１２８が用量依存的様式で発作感受性を調節し、発作から保護する能力を有することを明らかにした。
【００７１】
一態様では、本開示は、薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて、ｍｉＲ−１２８を活性化することができる薬剤を含む、発作を特徴とする神経病態の発症の治療またはその可能性の減少に使用するための医薬組成物に関する。本発明の一実施形態では、発作を特徴とする病態が、てんかん、てんかん重積状態、脳卒中、低酸素症、外傷性脳損傷、感染症、腫瘍、神経変性障害、発作を引き起こす代謝および自己免疫障害を含む群から選択される。特定の例では、神経疾患が発作および／またはてんかんを伴うもの、特に、例えば、Ｄｒａｖｅｔ症候群である。本明細書で論じられている任意の実施形態を、本発明の任意の方法、キット、試薬または組成物に関して実施することができ、逆もまた同様であることが熟慮される。さらに、本発明の組成物を使用して本発明の方法を達成することができる。
【００７２】
本出願の発明者らは、運動活動のｍｉＲ−１２８依存性制御を媒介する機構を理解し、多様な神経細胞型におけるｍｉＲ−１２８の喪失によって引き起こされる表現型間の干渉を回避しようとした。マウスおよびヒトの運動行動を調節するドーパミン反応性ニューロンに対するｍｉＲ−１２８−２欠損の効果を調査することに限定した試験を発明および実施した。運動活動に異なった寄与をする、マウス前脳の２つの主要なドーパミン反応性Ｃａｍｋ２ａ発現ニューロン型が存在する。
【００７３】
ドーパミン１受容体発現ニューロン（Ｄ１−ニューロン）の活性化は自発運動を増加させるが、ドーパミン２受容体発現ニューロン（Ｄ２−ニューロン）の活性化はマウスの自発運動を低下させる。出願人らは、Ｄ１−ニューロンのｍｉＲ−１２８欠損（Ｄｒｄ１ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌ）（ただし、Ｄ２−ニューロンのｍｉＲ−１２８欠損（Ａ２ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌ）を除く）が、若年性活動亢進、引き続いて約５月齢での致死的発作をもたらすことを発見した（図１Ｆ、図６Ｂ、Ｃ）。
【００７４】
よって、本開示の一態様は、ｍｉＲ−１２８の活性を活性化または模倣することができる薬剤を哺乳動物細胞に投与することを含む、哺乳動物細胞中のｍｉＲ−１２８を活性化する方法であって、前記薬剤は長さが６〜３０ヌクレオチドの間のオリゴマーを含み、前記オリゴマーはｍｉＲ−１２８の配列中に存在する少なくとも６個の隣接ヌクレオチドと完全に相補性である隣接ヌクレオチド配列を含む方法である。使用されることができる哺乳動物細胞には、海馬、皮質、線条体および／または視床からの細胞、ＩＰＳＣ由来ニューロン、ならびに種々の細胞株が含まれる。方法をインビトロで行ってもインビボで行ってもよい。
【００７５】
オリゴマーは、ｍｉＲ−１２８のシード領域の配列と同一であるまたは完全に相補性である隣接ヌクレオチド配列を含むことができる。オリゴマーは、ｍｉＲ−１２８のシード領域の配列と同一であるまたは完全に相補性である隣接ヌクレオチド配列からなることができる。オリゴマーの隣接ヌクレオチド配列は、ｍｉＲ−１２８の対応する領域の配列と完全に相補性である７〜２３個の間のヌクレオチドを含むことができる。
【００７６】
Ｄｒｄ１ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌマウスの線条体切片における電気生理学的研究によって、Ｄ１−ニューロン興奮性の増加が明らかになった。ｍｉＲ−１２８欠損Ｄ１−ニューロンは細胞体で正常な膜興奮性を示した（図８Ａ）が、樹状突起興奮性増強（図３Ａ）ならびに機能的樹状突起棘の約２０％増加（図３Ｂ、８Ｂ）を示した。さらに、神経興奮性およびシナプス可塑性におけるＥＲＫ２ネットワーク。
【００７７】
ＥＲＫ２活性化増強は、マウスの運動活動および発作の増加と関連している。ＥＲＫ２の過剰活性化および付随するドーパミンに対するＤ１−ニューロン感受性の増加は、マウス線条体中のドーパミンの化学的誘発枯渇によって引き起こされるマウスのパーキンソン様疾患中にも起こる。ドーパミンレベル低下および付随するＤ１−ニューロン感受性増加は、ドーパミンの運動活動誘導効果に対する反応性亢進をもたらす。ヒトでは、Ｄ１−ニューロン反応性亢進が、ジスキネジア、パーキンソン病におけるＬ−Ｄｏｐａ治療の副作用の主な原因の１つである。
【００７８】
本開示の発明者らは、線条体Ｄ１−ニューロンにおけるｍｉＲ−１２８欠損が、パーキンソン様症候群を患っているマウスにおけるＤ１−ニューロンの過敏性を模倣することを発見した。発明者らはここで、Ｄ１−ニューロンにおけるｍｉＲ−１２８の欠損が、マウスにおいて、Ｄｒｄ１−特異的アゴニスト治療に反応して運動活動を増強することを示している（図３Ｃ）。Ｄｒｄ１−アゴニストに対するＤ１−ニューロン反応性亢進が、Ｄｒｄ１ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌマウスの線条体におけるＥＲＫ２リン酸化の増加と関連していることも示された（図３Ｄ）。パーキンソン様病のマウスにおけるドーパミン感受性増加およびＥＲＫ２活性化増強は、Ｄ１−ニューロンにおけるドーパミン誘導即時型遺伝子（ＩＥＧ）の発現増加を伴う。同様に、Ｄｒｄ１−アゴニスト治療は、対照マウスのＤ１−ニューロンと比べて、ｍｉＲ−１２８欠損Ｄ１−ニューロンにおけるＩＥＧ発現を増強させた（図３Ｅ）。
【００７９】
Ｄｒｄ１ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌマウスに特有の自発運動活動増加は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼＭＥＫ１、ニューロンにおけるＥＲＫ２の主要な活性化因子の薬理学的阻害によって正常化された。インビボで投与されたＭＥＫ１特異的阻害剤ＳＬ３２７は、野生型マウスの運動活動に影響を及ぼさないが、突然変異マウスのＥＲＫ２リン酸化および運動活動を正常化する（図４Ａ）。別の知見で、本発明者らは、成体ニューロンにおけるｍｉＲ−１２８発現増加の効果が、マウスを化学的誘発パーキンソン病（図４Ｂ）および発作（図４Ｃ）に関連する異常な運動活動から保護することであることを示した。
【００８０】
一態様では、本出願の発明者らは、神経興奮性および運動活動を制御するシグナル伝達経路の調節物質としてのｍｉＲ−１２８を発見した。ｍｉＲ−１２８−２をコードする染色体３ｐ上のヒト遺伝子が、突発性全般てんかんと関連付けられている。ｍｉＲ−１２８またはｍｉＲ−１２８標的遺伝子発現の変化は、ヒトにおける神経興奮性増加およびてんかんの潜在的な原因となる可能性がある。
【００８１】
したがって、本開示は、個体の自発再発性発作の可能性の減少において、またはてんかんを誘発しそうな脳損傷を有する個体における抗てんかん発生薬として使用するためのｍｉＲ−１２８を活性化することができる薬剤であって、個体の脳に送達される薬剤に関する。ｍｉＲ−１２８を活性化することができる薬剤は、化学的に安定化されたｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１２８をコードする核酸およびｍｉＲ−１２８をコードするウイルスベクターからなる群から選択されることができる。
【００８２】
一態様では、本開示は、対象の発作および／またはてんかんの発症を治療するまたはその可能性を減少させる方法に関する。この方法は、ｍｉＲ−１２８またはｍｉＲ−１２８と９０％以上の配列相同性を有する薬剤を、対象の脳損傷部位に投与することによって達成されることができる。ｍｉＲ−１２８またはｍｉＲ−１２８と９０％以上の配列相同性を有する薬剤は、好ましくは投与が海馬および／または皮質中への活性剤の蓄積をもたらすように、くも膜下腔内または鼻腔内投与されることができる。ｍｉＲ−１２８はベクターによってコードされることができる。特に、ｍｉＲ−１２８は、ａ）ｍｉＲ−１２８をコードする核酸分子と作動可能に連結したプロモーターと；ｂ）転写終結配列とを含むベクターによってコードされることができる。
【００８３】
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。実務家は特に、当技術分野の定義および用語について、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（補遺４７）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（１９９９）に向けられる。
【００８４】
「ａ」または「ａｎ」という単語の使用は、特許請求の範囲および／または明細書中含んでいる用語と合わせて使用される場合、「１つ」を意味することができるが、これは「１つまたは複数」、「少なくとも１つ」および「１つまたは２つ以上」の意味とも一致する。本開示は代替物のみを指す定義および「および／または」を支持するが、特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替物のみを指すことが明示的に示されていないまたは代替物が相互排他的でない限り、「および／または」を意味するために使用される。
【００８５】
本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）（ならびに含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）および含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）などの含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の任意の形態）、有している（ｈａｖｉｎｇ）（ならびに有する（ｈａｖｅ）および有する（ｈａｓ）などの有している（ｈａｖｉｎｇ）の任意の形態）、含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）（ならびに含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）および含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）などの含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の任意の形態）または含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）（ならびに含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）および含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）などの含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の任意の形態）は、包括的またはオープンエンドであり、追加の、列挙されていない要素も方法ことも排除しない。
【００８６】
本明細書で使用する場合、数に関連したおよそまたは約という用語は一般的に、特に明言しない限りまたは文脈上別異であることが自明でない限り、数の両方向の（超または未満）５％の範囲内にある数を含むとみなされる。範囲を述べる場合、特に明言しない限りまたは文脈上別異であることが自明でない限り、終点が範囲内に含まれる。
【００８７】
本発明の文脈において、調節および発現の調節とは、低分子ノンコーディングＲＮＡ、核酸標的、ＲＮＡもしくは低分子ノンコーディングＲＮＡに関連するタンパク質、または低分子ノンコーディングＲＮＡの下流標的（例えば、低分子ノンコーディングＲＮＡによって調節されるタンパク質コード核酸を表すｍＲＮＡ）の量またはレベルの増加（刺激）または低下（阻害）のいずれかを意味する。本発明の文脈において、機能の調節とは、低分子ノンコーディングＲＮＡの機能の変化または低分子ノンコーディングＲＮＡが結合もしくは下流効果を有する任意の細胞成分の機能の変化を意味する。
【００８８】
マイクロＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびＭｉＲという用語は互換的であり、遺伝子発現を調節することができる内因性または人工コンコーディングＲＮＡを指す。ｍｉＲＮＡはＲＮＡ干渉を介して機能すると考えられている。内因性（例えば、天然）ｍｉＲＮＡは、典型的にはＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターから発現し、大型転写産物から産生される。
【００８９】
ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸および核酸分子という用語は、本明細書において、任意の長さのヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの重合体型を含むために使用される。この用語は、分子の一次構造のみを指す。したがって、この用語は三本、二本および一本鎖ＤＮＡ、ならびに三本、二本および一本鎖ＲＮＡを含む。この用語はまた、例えば、メチル化および／またはキャップ形成による修飾、ならびにポリヌクレオチドの未修飾型も含む。さらに特に、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸および核酸分子という用語には、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有する）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有する）、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−またはＣ−グリコシドであるポリヌクレオチドの他の型、ならびに非ヌクレオチド骨格を含有する他のポリマー、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））およびポリモルホリノ（ＮｅｕｇｅｎｅとしてＡｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，Ｏｒｅｇ．、から商業的に入手可能）ポリマー、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡに見られるような塩基対形成および塩基の積み重ねを可能にする配置でポリマーが核酸塩基を含有することを提供する他の合成配列特異的核酸ポリマーが含まれる。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸および核酸分子という用語の間には長さの区別は意図されておらず、これらの用語は互換的に使用される。
【００９０】
相同ポリヌクレオチドは、例えば、（相同配列の）少なくとも５、１０、２０、４０個以上の隣接ヌクレオチドの領域にわたって、典型的には関連配列と少なくとも７０％相同性、好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％または９９％相同性を有する。相同性は、当技術分野の任意の方法に基づいて計算されることができる。例えば、ＵＷＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅは、相同性を計算するために使用することができるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して相同性を計算または配列を整列することができる（典型的にはそのデフォルト設定で）。ＢＬＳＡＴ解析を行うためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（ＵＰＬ：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を通して公的に入手可能である。
【００９１】
マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、アンチセンス核酸またはｌｎｃＲＮＡなどの核酸を細胞に投与することは、形質導入、トランスフェクト、電気穿孔、転位置、融合、貪食、発射または衝撃法等、すなわち、核酸を細胞膜を横切って輸送することができる任意の手段を含む。
【００９２】
本発明の治療薬の投与経路に関する限り、一例では、血液脳関門が懸念となる。すなわち、脳病態のためのＲＮＡに基づく治療手法の開発の障害が血液脳関門（ＢＢＢ）である。脳は、２つのバリアシステム：血液脳関門（ＢＢＢ）および血液脳脊髄液関門（ＢＣＳＦＢ）の存在によって潜在的毒性物質から保護されている。ＢＢＢは、その表面積がＢＣＳＦＢのおよそ５０００倍大きいので、血清リガンドの取り込みのための主要な経路であると考えられる。ＢＢＢを構成する脳内皮が、ＣＮＳの多くの障害に対する潜在的薬物の使用の主な障壁となる。一般に、小型の親油性分子のみがＢＢＢを、すなわち、循環全身血液から脳に通過することができる。
【００９３】
本発明はまた、医薬組成物を提供する。このような組成物は、治療上有効量の治療薬と、薬学的に許容される担体とを含む。具体的な実施形態では、薬学的に許容されるという用語は、連邦もしくは州政府の規制当局によって承認されている、または動物、さらに特にヒトへの使用について米国薬局方もしくは他の一般的に認められた薬局方に列挙されていることを意味する。本明細書では、治療上有効量という用語は、発作の発症または発生の臨床的に有意な阻害、改善または逆転をもたらす治療薬の量を意味するとみなされるべきである。
【００９４】
担体という用語は、治療薬と一緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤またはビヒクルを指す。このような医薬担体は、水および油（石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば、ラッカセイ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などを含む）などの無菌液体であることができる。医薬組成物を静脈内投与する場合、水が好ましい担体である。生理食塩水ならびにブドウ糖およびグリセロール水溶液も、特に注射液のための液体担体として使用することができる。適当な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、所望であれば、微量の湿潤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。適当な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。このような組成物は、患者への適当な投与のための形態を提供するために適量の担体と一緒に、好ましくは精製型の治療上有効量の治療薬を含有する。製剤は投与様式に適合すべきである。一般的に、成分は、別々のまたは単位剤形で一緒に混合して、例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密封された容器中のドライ凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給される。
【００９５】
本開示の文脈において、一定の実施形態では、治療薬が鼻腔内またはくも膜下腔内投与される。投与様式の目標は、治療薬がその標的部位、中枢神経系に到達することを可能にすることである。一実施形態では、本開示の治療薬の標的位置が皮質および／または海馬である。
【００９６】
血液脳関門を横切って中枢神経系の中に生物製剤を送達することは、当業者である薬物送達薬理学者に理解されるような投与および／または薬物製剤の一定の手段によってうまく達成される。本開示の組成物は、組成物の粘膜付着性、経鼻免疫寛容または流動特性を改善する薬剤、粘膜付着剤、吸収促進剤、着臭剤、湿潤剤および保存剤をさらに含むことができる。水性担体中にある場合の組成物の流動特性を増加させる適当な薬剤としては、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、ゼラチン、アルギン、カラゲナン、カルボマー、ガラクトマンナン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ナトリウムカルボキシメチルデキストランおよびキサンタンガムが挙げられる。適当な吸収促進剤としては、胆汁酸塩、リン脂質、グリチルレチン酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、酒石酸アンモニウム、γアミノレブリン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸およびオキサロ酢酸が挙げられる。水性組成物に適した湿潤剤としては、例えば、グリセリン、多糖およびポリエチレングリコールが挙げられる。適当な粘膜付着剤としては、例えば、ポリビニルピロリドンポリマーが挙げられる。
【００９７】
本発明の別の態様は、鼻腔内投与を介した薬剤の中枢神経系への送達を増強する透過促進剤をさらに含むことができる医薬組成物である。さらに、吸収促進剤は、粘液および上皮細胞膜を含む粘膜を通した分子の輸送を容易にする。粘膜付着剤、繊毛搏動阻害剤、粘液流動化剤、膜流動化剤および密着結合調節剤を含む種々の吸収促進剤クラスが記載されている。
【００９８】
トランスフェクションという用語は、細胞による外来性ＤＮＡまたはＲＮＡの取り込みを指すために使用される。外因性ＤＮＡまたはＲＮＡを細胞膜の内側に導入したら、細胞はトランスフェクトされている。いくつかのトランスフェクション技術が一般的に当技術分野で知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ニューヨークを参照されたい。このような技術を使用して１つまたは複数の外因性ＤＮＡまたはＲＮＡ部分を適当な宿主細胞に導入することができる。この用語は、遺伝物質の安定な取り込みと一過性の取り込みの両方を指し、例えば、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡまたはアンチセンス核酸の取り込みを含む。形質転換という用語は、挿入に使用される方法にかかわりなく、外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞に挿入することを指す。例えば、直接取り込み、形質導入またはｆ交配が含まれる。外因性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター、例えば、プラスミドとして維持されることができる、あるいは宿主ゲノムに組み込まれることができる。
【００９９】
組換え宿主細胞、宿主細胞、細胞、細胞株、細胞培養液および単細胞実体として培養された微生物または高等真核細胞株を表す他のこのような用語は、組換えベクターまたは他の転移ＤＮＡの受容体として使用されることができるまたは使用されている細胞を指し、トランスフェクトされた元の細胞の最初の子孫を含む。
【０１００】
薬学的に許容される賦形剤または担体は、本発明の組成物に場合により含まれてもよく、有意な有害毒物学的効果を患者に引き起こさない賦形剤を指す。薬学的に許容される塩としては、それだけに限らないが、アミノ酸塩、無機酸を用いて調製される塩、例えば、塩化物、硫酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、臭化物および硝酸塩、または前記のいずれかの対応する無機酸型から調製される塩、例えば、塩酸塩等、または有機酸を用いて調製される塩、例えば、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、エチルコハク酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、メタンスルホン酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、パラ−トルエンスルホン酸塩、パルモエート、サリチル酸塩およびステアリン酸塩、ならびにエストレート、グルセプテートおよびラクトビオン酸塩が挙げられる。同様に、薬学的に許容されるカチオンを含有する塩としては、それだけに限らないが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウム、リチウムおよびアンモニウム（置換アンモニウムを含む）が挙げられる。
【０１０１】
対象、個体および患者という用語は本明細書で互換的に使用され、診断、予後、治療または療法が望まれる任意の哺乳動物対象、特にヒトを指す。他の対象としてはウシ、イヌ、ネコ、ウマなどを挙げることができる。
【０１０２】
本発明のコード配列（例えば、ｍｉＲＮＡ前駆体コード配列またはより長い担体コード配列）は、プロモーターと作動可能に連結した構築物中に存在することができる。適当なプロモーターは、宿主細胞および求められる効果に基づいて選択されることができる。適当なプロモーターとしては、構成的および誘導性プロモーター、例えば、誘導性ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ）系プロモーターが挙げられる。プロモーターは組織特異的であってよく、このようなプロモーターは当技術分野で周知である。適当なプロモーターの例としては、テトラサイクリン誘導性または抑制性プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩまたはＩＩＩ系プロモーター、ｐｏｌＩＩ依存性ウイルスプロモーター（ＣＭＶ−ＩＥプロモーターなど）、ならびにｐｏｌＩＩＩ  Ｕ６およびＨ１プロモーターが挙げられる。バクテリオファージＴ７プロモーターを使用することもできる（この場合、Ｔ７ポリメラーゼも存在しなければならないことが認識される）。
【０１０３】
本発明の構築物は、種々の手法のいずれかを用いて宿主細胞に導入されることができる。構築物を含むウイルスベクターによる感染が行われることができる。適当なウイルスベクターの例としては、複製欠陥レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクターおよびレンチウイルスベクターが挙げられる。構築物を含むプラスミドによるトランスフェクションは、導入の代替様式である。プラスミドは裸のＤＮＡとして存在することができる、または例えば、リポソームと結合して存在することができる。送達ビヒクルの性質は宿主細胞によって変化することができる。
【０１０４】
構築物（例えば、ウイルスベクター中に存在する）のインビボ送達は、標的組織に応じて、種々の技術のいずれか１つを用いて行われることができる。送達は、適宜、直接注入、吸入、静脈内注射または他の物理的方法（（例えば、裸のＤＮＡにより）組織の目に見える、アクセス可能な領域を標的化する微粒子銃を介することを含む）によることができる。投与は、適宜、注射器針、トロカール、カニューレ、カテーテル等によることができる。
【０１０５】
本発明による宿主として適した培養細胞には、一次細胞と細胞株の両方が含まれる。細胞は、ヒト幹細胞を含むヒト細胞であることができる。ｍｉＲＮＡをコードする本発明の構築物を培養細胞に導入して未知の機能の特異的遺伝子を不活性化することができる。本発明の方法を用いて遺伝子をサイレンシングすることを、その機能を評価するための手法として使用することができる。あるいは、ｍｉＲＮＡをコードする構築物を、治療目的で細胞に導入してヒトまたはヒト以外の動物に埋め込むことができる。
【０１０６】
本文で引用される出願および特許の各々、ならびに出願および特許（各付与された特許の手続中を含む；「出願引用文献」）の各々で引用される各文献または参考文献、ならびにこれらの出願および特許のいずれかからの優先権に対応するおよび／またはこれを区切るＰＣＴおよび外国出願または特許の各々、ならびに出願引用文献の各々で引用または参照される文献の各々は、これにより明確に参照により本明細書に組み込まれる。より一般的には、文献または参考文献は、段落前の参考文献一覧または本文自体のいずれかにおいて、本文で引用され、これらの文献または参考文献（「本明細書で引用される参考文献」）の各々、ならびに本明細書で引用される参考文献（任意の製造業者の仕様書、指示等を含む）の各々で引用される各文献または参考文献は、これにより明確に参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１０７】
本発明は、一般的に記載されてきたが、以下の実施例を参照してより容易に理解され、この実施例は本発明の一定の態様および実施形態の例示の目的のみで含まれるものであり、本発明を限定することを何ら意図していない。
【０１０８】
材料および方法
【０１０９】
動物
【０１１０】
マウスを、食物および水に自由にアクセスできる状態で、一定温度（２３℃）で、１２時間明／暗周期（０７００〜１９００時間が明）を用いて１ケージ当たり２〜５匹の動物で収容した。全ての動物プロトコルは、Ｔｈｅ  Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｔｈｅ  Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙおよびＩｃａｈｎ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｔ  Ｍｏｕｎｔ  ＳｉｎａｉのＩＡＣＵＣによって承認された。
【０１１１】
マウスの作成
【０１１２】
ｍｉＲー１２８−１およびｍｉＲー１２８−２の条件付き欠失を有するマウスの作成：
【０１１３】
標的化ベクターのサブクローニング：相同性アームを含有するｍｉＲ−１２８−１またはｍｉＲ−１２８−２ゲノム遺伝子座の領域を、ＡｃｓＩ部位およびＸｈｏＩ部位を挿入してサブクローニング領域に隣接させるアンプリコンを用いて、ＢＡＣクローン（ｍｉＲ１２８−１：ＲＰ２４−５７４Ｇ１４、ｍｉＲ１２８−２：ＲＰ２４−２４２Ｆ１３、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ、ＣＨＯＲＩ、Ｏａｋｌａｎｄ  ＣＡ、米国）からｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋に組換え誘導的にサブクローニングした。
【０１１４】
サブクローニングに使用するＰＣＲプライマー：
【０１１５】
ｍｉｒ−１２８−１
【０１１６】
５’ｃｃｔｔｃａｔｇｔｔａｔｇｃｃｃｔｃａｔｃｃｃｔｔｔａｔｃａｃａｃａａａｔｃｔｇｔｇｔａｇｔｔｔｔｃｇｇｃｇｃｇｃｃａｔｔｃｇｃｃｃｔａｔａｇｔｇａｇｔｃｇ
【０１１７】
５’ａａｔｃｔｔｃｔａａａｔｔｔｃｃａｔｔｔｇａｇｃａｃｃｔａｇｔｔｃａｔａｔｇｔａａｔｔｔａｇａｔｔｃｃｔｃｇａｇｇｃｔｔｇｇｃｇｔａａｔｃａｔｇｇｔｃ
【０１１８】
ｍｉｒ−１２８−２
【０１１９】
５’ｃｇａａａａａｔａｔｔｔｔｃａｔｔｔａｔｔｃｔｔｃｇａａａｃｔｔｔｃａｔａｃａｔｔｃａｔａｃａａｔｇｔｇｇｃｇｃｇｃｃａｔｔｃｇｃｃｃｔａｔａｇｔｇａｇｔｃｇ
【０１２０】
５’ｔｃａｇｇｃｃｔｇｃｃａｇｃｃｔｔｃｔｇｔｃｔａｃｔｇｔｔｔａａｔｇａｃｔｇａｃａｇｃｃａｇｔｇａａｃｔｃｇａｇｇｃｔｔｇｇｃｇｔａａｔｃａｔｇｇｔｃ
【０１２１】
ｍｉＲー１２８−１のための標的化ベクターの修飾：
【０１２２】
ｐＺｅｒｏｌｏｘＰ−ＦＲＴ−ｎｅｏＲ−ＦＲＴ（−）を組換えて、ユニークＥｃｏＲＩ部位をユニークＳｍａＩ部位で置き換えた。以下のオリゴヌクレオチド断片をアニーリングし、ＥｃｏＲＩ部位に挿入した：
【０１２３】
５’ａａｔｔｇｃａｔｃｇｃａｔｇｇｇｔｃａｃｇａｃｇａｇａｔｃｃｃｇｇｇｃ
【０１２４】
５’ａａｔｔｇｃｃｃｇｇｇａｔｃｔｃｇｔｃｇｔｇａｃｃｃａｔｇｃｇａｔｇｃ
【０１２５】
組換えプラスミドをＮｓｉＩで消化し、単一ｌｏｘＰ部位およびＦＲＴ隣接ｎｅｏ遺伝子を含有する断片を標的化ベクターのユニークＮｓｉＩ部位に挿入し、適当な配向についてスクリーニングした。第２のｌｏｘＰ部位を挿入するために、以下のオリゴヌクレオチド断片をアニーリングし、ユニークＳｐｅＩ部位に挿入した：
【０１２６】
５’ｃｔａｇａａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａｇｃａｔａｃａｔｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔｇａａｔｔｃｔ
【０１２７】
５’ｃｔａｇａｇａａｔｔｃａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａａｔｇｔａｔｇｃｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔｔ
【０１２８】
ｍｉＲ−１２８−２のための標的化ベクターの組換え：
【０１２９】
プラスミドをＳａｃＩおよびＡｐａＩで消化し、アニーリングし、以下のオリゴヌクレオチド断片を挿入することによって、ｐＺｅｒｏｌｏｘＰ−ＦＲＴ−ｎｅｏＲ−ＦＲＴ（−）を組換えた：
【０１３０】
５’ｇｇａａｇｔｔｃｃｔａｔａｃｔｔｔｃｔａｇａｇａａｔａｇｇａａｃｔｔｃｇｇａａｔａｇｇａａｃｔｔｃａｇａｇｃｔｃａｔｃｇａｇｃｃｃｇｇｇｔａｇａｃｇｇｃｃｃ
【０１３１】
５’ｇｔｃｔａｃｃｃｇｇｇｃｔｃｇａｔｇａｇｃｔｃｔｇａａｇｔｔｃｃｔａｔｔｃｃｇａａｇｔｔｃｃｔａｔｔｃｔｃｔａｇａａａｇｔａｔａｇｇａａｃｔｔｃｃａｇｃｔ
【０１３２】
プラスミドをＡｃｃ６５Ｉでさらに消化し、以下のオリゴヌクレオチドをアニーリングおよび挿入した：
【０１３３】
５’ｇｔａｃｃｃｃｃｇｇｇａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａｇｃａｔａｃａｔｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔａａｇｃｔｔｃ
【０１３４】
５’ｇｔａｃｇａａｇｃｔｔａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａａｔｇｔａｔｇｃｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔｃｃｃｇｇｇｇ
【０１３５】
組換えプラスミドをＳｍａＩで消化し、単一ｌｏｘＰ部位およびＦＲＴ隣接ｎｅｏ遺伝子を含有する断片を標的化ベクターのユニークＳｍａＩ部位に挿入し、適当な配向についてスクリーニングした。第２のｌｏｘＰ部位を挿入するために、以下のオリゴヌクレオチドをアニーリングし、ユニークＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。
【０１３６】
５’ａｇｃｔａａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａｇｃａｔａｃａｔｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔｇｇａｔｃｃｔ
【０１３７】
５’ａｇｃｔａｇｇａｔｃｃａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａａｔｇｔａｔｇｃｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔｔ
【０１３８】
両標的化ベクターについて、相同性の組換え領域をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔからＸｈｏＩおよびＡｓｃＩ消化によって切り取り、同様に消化したｐＤＴＡ−ＴＫに挿入して最終的な標的化構築物を作成した。標的化構築物をＮｏｔＩで直線化し、Ｅ１４  ＣＹ２．４胚性幹細胞（チロシナーゼ遺伝子の自然突然変異を有するホモ接合性Ｃ５７Ｂｌａｃｋ／６ＪＴｙｒ−Ｃ−２Ｊバックグラウンド）をトランスフェクトし、サザンプローブを用いて組換え成功についてスクリーニングした。代替サザンプローブを用いて、および組換え領域のＰＣＲ配列決定によって、陽性クローンを確認した。陽性クローンを使用して、記載されるキメラマウスを作成した。キメラをＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスと交配し、毛色、ＰＣＲおよびサザンブロット解析によって生殖系列移行を評価した。標的化対立遺伝子を有するマウスをＦＬＰｅ−トランスジェニックマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）と交配することによって、ＦＲＴ隣接ｎｅＯ遺伝子の生殖系列欠失を達成した。ｆｌｏｘｅｄ−対立遺伝子を有するマウスを、普遍的発現ＣＭＶプロモーター（ＣＭＶ−ｃｒｅマウス、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって駆動されるＣｒｅ−リコンビナーゼを発現しているトランスジェニックマウスと交配することによって、ｍｉＲ−１２８−１およびｍｉＲ−１２８−２を生殖系列欠失してｍｉＲ−１２８−１−／−およびｍｉＲ−１２８−２−／−マウスを作成することを達成した。
【０１３９】
ｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子を有するマウス（ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌ）をＣａｍｋ２ａ−ｃｒｅマウス（３１）と交配してＣａｍｋ２ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌマウスを作成することによって、マウス前脳の生後ニューロン特異的欠失を達成した。Ｄｒｄ１ａ−ｃｒｅ（ＥＹ２６２）およびＡ２ａ−ｃｒｅ（ＫＧ１３９）トランスジェニックマウスをＧｅｎｓａｔ（３２）から得て、ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌと交配してＤｒｄ１ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌおよびＡ２ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌマウスを作成した。
【０１４０】
以下のプライマーを用いて、ｍｉＲ−１２８−１マウスの慣用的遺伝子型判定を行った：
【０１４１】
５’−ｔｃｔｇｇａｃｃａａａｔｇａａｃｃａａａｇ
【０１４２】
５’−ｃｃｇｃａａｔｇｃｔｇｃｃｔａｔａｔｔｃ
【０１４３】
５’−ｇｃｃｔｇａａｇａａｃｇａｇａｔｃａｇｃ
【０１４４】
５’−ｇｃａｇｔｃａｔｇｃａａｇｃａｇｃｔａｔ
【０１４５】
野生型対立遺伝子：１９４ｂｐ
【０１４６】
ヌル対立遺伝子：２８２ｂｐ
【０１４７】
Ｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子：３３６ｂｐ
【０１４８】
以下のプライマーを用いて、ｍｉＲ−１２８−２マウスの慣用的遺伝子型判定を行った：
【０１４９】
５’−ｃｇｃｃｔｔｔｔａｇｔｔｔｃｃｃａｃａｇ
【０１５０】
５’−ｇａｃｃａｃａｃａｇｃａａｇｃａｇｇｔａ
【０１５１】
５’−ａａａｇａｃｇｇｇａｃｃａｔｔｃａｃａｔ
【０１５２】
５’−ｔｃｔｃｔｃｇｔｇｇｇａｔｃａｔｔｇｔｔｔ
【０１５３】
野生型対立遺伝子：１８５ｂｐ
【０１５４】
ヌル対立遺伝子：５３１ｂｐ
【０１５５】
Ｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子：３０６ｂｐ
【０１５６】
ｍｉＲ−１２８−２のニューロン特異的過剰発現を有するマウスの作成。
【０１５７】
ＲＯＳＡ２６遺伝子座における相同組換え用の標的化ベクターは、Ｋ．Ｒａｊｅｗｓｋｙ（３０）によって十分に提供された。ｍｉＲ−１２８−２ヘアピンを含む１ｋｂ領域を、以下のプライマーを用いてゲノムＤＮＡから増幅し、標的化ベクターのユニークＸｈｏＩ部位にクローニングした。
【０１５８】
５’ａａａｇｇｃｇｃｇｃｃａｃｇｔｇＡＣＴＡＡＡＡＧＧＣＧＣＧＡＧＧＡＧＡＴ
【０１５９】
５’ａａａｇｇｃｇｃｇｃｃＴＡＣＧＣＡＴＴＣＣＴＧＴＡＣＧＧＴＴＧ
【０１６０】
組換え標的化ベクターをＮｏｔＩによって直線化し、これを使用して上記のキメラを作成した。生殖系列移行成功を毛色によって評価し、ＰＣＲおよびサザン解析によって確認した。以下のプライマーを用いて、Ｒｏｓａ−ｍｉＲ−１２８マウスの慣用的遺伝子型判定を行った：
【０１６１】
５’−ｇａｇｔｔｃｔｃｔｇｃｔｇｃｃｔｃｃｔｇ
【０１６２】
５’−ｇｇａａａｇｔｃｃｃｔａｔｔｇｇｃｇｔｔａ
【０１６３】
５’−ｔｇｃｔｇｃａｔａａａａｃｃｃｃａｇａｔ
【０１６４】
野生型対立遺伝子：２９２ｂｐ
【０１６５】
Ｒｏｓａ−ｍｉＲ−１２８標的化対立遺伝子：４０８ｂｐ
【０１６６】
ホモ接合性Ｒｏｓａ−ｍｉＲ−１２８マウスをＣａｍｋ２ａ−ｃｒｅマウス（３１）と交配してＣａｍｋ２ａ−ｃｒｅ；Ｒｏｓａ−ｍｉＲ−１２８マウスを作成することによって、マウス前脳内の生後ニューロン特異的ｍｉＲ−１２８−２過剰発現を達成した。Ｒｏｓａ−ｍｉＲ−１２８マウスをＣａｍｋ２ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌマウスと交配してＣａｍｋ２ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌ；Ｒｏｓａ−ｍｉＲ−１２８レスキューマウスを作成した。
【０１６７】
ニューロン特異的ＦＬＡＧタグ化Ａｇｏ２発現を有するマウスの作成：
【０１６８】
ＲＯＳＡ２６プロモーターの制御下でＣｒｅ誘導性ＦＬＡＧ−ＨＡ２タグ化Ａｇｏ２を発現しているトランスジェニックマウスを前記のように作成した（９、３０）。ＳＴＯＰ−ｅＧＦＰ−ＲＯＳＡ２６ＴＶベクターは、Ｋ．Ｒａｊｅｗｓｋｙ、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ、ボストン、ＭＡからの寄贈品であった。Ｒｏｓａ−Ｓｔｏｐｆｌ／ｆｌ−Ｆｌａｇ−Ａｇｏ２マウスをＣａｍｋ２ａ−ｃｒｅトランスジェニックマウス（Ｇ．Ｓｃｈｕｅｔｚ、Ｇｅｒｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ（３１）から親切にも提供された）と交配してＣａｍｋ２ａ−ｃｒｅ；Ｒｏｓａ−Ｓｔｏｐｆｌ／ｆｌ−Ｆｌａｇ−Ａｇｏ２マウスを作成した。
【０１６９】
ＲＮＡ調製
【０１７０】
マウスにＣＯ２で麻酔をかけ、それぞれの脳領域または末梢器官を迅速に解剖し、さらに処理するまで液体窒素中で凍結した。製造業者の指示（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にしたがってＴＲｌｚｏｌ／クロロホルム技術を用いて、凍結試料からのＲＮＡ抽出を行った。抽出後、ＲＮＡを０．１５Ｍ酢酸ナトリウムを含むイソプロパノール中−８０℃で一晩沈殿させ、７０％エタノールで２回洗浄し、風乾し、ＲＮアーゼを含まない水に再懸濁した。
【０１７１】
Ｄ１−ニューロン特異的ＴＲＡＰ分析
【０１７２】
ｍｉＲ−１２８−２のＤ１−ニューロン特異的喪失を有するマウス（Ｄｒｄ１ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌ）を、ｅＧＦＰタグ付きリボソームタンパク質Ｌ１０のＤ１−ＭＳＮ特異的発現を有するマウスと交配した（（１１）、Ｄ１−ＴＲＡＰ）。６週齢の齢および性別一致Ｄｒｄ１ａ−ｃｒｅ；Ｄｒｄ１ａ−ＴＲＡＰ；ｍｉＲ−１２８ｆｌ／ｆｌおよびＤｒｄ１ａ−ＴＲＡＰ；ｍｉＲ−１２８ｆｌ／ｆｌマウス（ｎ＝５／遺伝子型）からのポリリボソーム結合ｍＲＮＡを前記のように得た（１１）。２つのモノクローナル抗ＧＦＰ抗体（各ＩＰについてクローン＃１９Ｃ８および＃１９Ｆ７  ５０μｇ、Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで入手可能）の混合物を用いて、ｅＧＦＰ標識リボソームおよび結合ｍＲＮＡを免疫沈降した。精製ｍＲＮＡを増幅し、前記のように（１１）Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ２サイクルｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いてマイクロアレイおよびｑＰＣＲ分析のために処理した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ４３０  ２．０アレイを全ての実験に使用した。アレイ設計および特徴に関する情報は、ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍで見出すことができる。Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ４３０  ２．０アレイを、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いてスキャンし、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＣＯＳ  ｖ１．４）を用いて１５０に全体的に調整した。ＧｅｎｅＣｈｉｐファイル（．ｃｅｌ）をＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）にインポートし、ＲＭＡアルゴリズムで処理し、各チップ上の発現値を全て試料の中央値に正規化した。２つの独立した実験からのＤ１−ニューロン特異的リボソーム結合ｍＲＮＡを分析した。二元配置分散分析を用いて異なる発現およびｐ値≦０．０５を有する全てのプローブ（遺伝子型）をｍｉＲ−１２８−２の非存在下で有意に変化したとみなした。
【０１７３】
ＴＲＡＰ実験からのデータセットをＳＹＬＡＭＥＲアルゴリズムによって分析して、ｍｉＲ−１２８標的が、ｍｉＲ−１２８の非存在下で下方制御される遺伝子と比べて、ｍｉＲ−１２８の非存在下で上方制御される遺伝子の中で豊富であるかどうかを決定した。アレイ上の遺伝子を、倍率変化ｔ統計学により、Ｄｒｄ１ａ−ＴＲＡＰ；ｍｉＲ−１２８ｆｌ／ｆｌマウスと比べて、Ｄｒｄ１ａ−ｃｒｅ；Ｄｒｄ１ａ−ＴＲＡＰ；ｍｉＲ−１２８ｆｌ／ｆｌで最も上方制御された遺伝子から最も下方制御された遺伝子まで順位付けした。０．０５のボンフェローニの調整済みｐ値閾値でＳＹＬＡＭＥＲによって、エンリッチメント解析を得た（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｎｒｉｇｈｔ−ｓｒｖ／ｓｙｌａｒｒａｙ／）。
【０１７４】
ｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡ分析のためのＴａｑＭａｎ定量的ＲＴ−ＰＣＲ
【０１７５】
成熟ｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡの相対発現レベルを、製造業者のプロトコル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にしたがって、脳試料からの全抽出ＲＮＡを用いてＴａｑＭａｎアッセイによって測定した。精製ＲＮＡ試料を、製造業者によって推奨されるＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）からの事前設計ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイを用いて、相対遺伝子発現についてｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）からの以下の事前設計ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイを使用した：ｍｉＲ−１２８（Ａｓｓａｙ  ＩＤ００２２１６）、ｓｎｏ１３５（Ａｓｓａｙ  ＩＤ００１２３０）、ｍｉＲ−１２４ａ（Ａｓｓａｙ  ＩＤ００１１８２）、Ｆｏｓｂ  Ｍｍ００５００４０１＿ｍ１、ＦｏｓＩ２  Ｍｍ００４８４４４２＿ｍ１、Ａｒｃ  Ｍｍ００４７９６１９＿ｇ１、ＪｕｎＢ  Ｍｍ０４２４３５４６＿ｓ１、Ｄａｒｐｐ−３２  Ｍｍ００４５４８９２＿ｍ１、Ｂｔｇ２  Ｍｍ００４７６１６２＿ｍ１、Ｇａｄｄ４５ｇ  Ｍｍ０１３５２５５０＿ｇ１、Ｄｕｓｐ１  Ｍｍ００４５７２７４＿ｇ１、Ｎｒ４ａ１  Ｍｍ０１３００４０１＿ｍ１、Ｊｕｎ  Ｍｍ００４９５０６２＿ｓ１、Ａｃｔｂ  Ｍｍ００６０７９３９＿ｓ１、Ａｒｐｐ−２１  Ｍｍ００４７３６３０＿ｍ１（エクソンにまたがっているプローブが、全てのＡｒｐｐ−２１アイソフォームに共通のエクソンを検出する）、Ａｒｐｐ２１  Ｍｍ００４７３６４５＿ｍ１（Ａｒｐｐ−２１の長いＴＡＲＰＰアイソフォームを特異的に検出するエクソンにまたがっているプローブ）。ｍｉＲＮＡ定量化のサイクルカウントを、示されるｓｎｏＲＮＡ１３５またはｍｉＲ−１２４ａに正規化し、ｍＲＮＡ定量化のサイクルカウントをＡｃｔｂまたはＧａｐｄｈに正規化した。各ｍＲＮＡについての相対発現（  Ｃｔ）および定量化（ＲＱ＝２−    Ｃ）を、示唆されるＲＱ  Ｍａｎａｇｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅおよび    Ｃｔ法を用いて計算した。標準偏差（ＳＤΔＣｔ＝（ＳＤ標的２＋ＳＤｒｅｆ２）１／２）およびエラーバー（ＲＱ１＝２＾（−（ΔΔＣｔ＋ＳＤΔΔＣｔ））およびＲＱ２＝２＾（−（ΔΔＣｔ＋ＳＤΔΔＣｔ））の計算を、ＡＢＩ技術文献部番４３７１０９５Ｒｅｖ  Ｂによって計算した。
【０１７６】
経路分析
【０１７７】
ＩＰＡ（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）およびＤａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ，Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＤＡＶＩＤ）バージョン６．７（ｄａｖｉｄ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／）を用いて、１５４個のｍｉＲ−１２８標的遺伝子の生物情報学ネットワークおよび経路分析を行った。
【０１７８】
タンパク質調製および発現解析
【０１７９】
マウスにＣＯ２で麻酔をかけ、皮質、海馬および線条体を迅速に解剖し、さらに処理するまで液体窒素中で凍結した。試料を、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、スイス）およびホスファターゼ阻害剤を補足した１％ＳＤＳ溶液中氷上で超音波処理し、１０分間沸騰させた。製造業者の指示にしたがって、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を用いてタンパク質濃度を測定した。タンパク質試料を等体積の２×ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に希釈し、ＤＴＴを補足して最終濃度２００ｍＭとした（Ｓｉｇｍａ）。タンパク質試料２５μｇを４〜１２％ビス−トリスプレキャスト変性ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、室温で１時間ＴＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ）溶液中５％ミルクでブロッキングした。膜を、４℃で一晩、５％ミルク−ＴＢＳＴ溶液に希釈した一次抗体でプローブした。次いで、膜を洗浄し、室温で１時間、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウス（ＧＥ）または抗ウサギＩｇＧ二次抗体（ＧＥ）でプローブした。増強化学発光基質（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、米国）を用いて膜を現像し、ＢｉｏＭａｘフィルム（Ｋｏｄａｋ、米国）で露光した。露光フィルムをスキャンし、ＩｍａｇｅＪ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＮＩＨ、米国）を用いてタンパク質バンドを定量化した。β−アクチンを用いてタンパク質量を正規化し、リンタンパク質レベルを全非リン酸化タンパク質レベルに正規化し、全ての値を対照同腹子試料に対してプロットした。以下の一次抗体を使用した：全ＥＲＫ１／２（１３７Ｆ５）、ホスホＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、Ａｒｐｐ２１（マウスモノクローナル６Ａ、寄贈品Ａ．Ｎａｉｒｎ）、β−アクチン（Ａｂｃａｍ）、ＰＥＡ１５ａ（Ｈ８０）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，）、Ｄ４ｅｒｔｄ２２ｅ（Ａｔｌａｓ）。
【０１８０】
ＥＬＩＳＡアッセイ
【０１８１】
製造業者の指示にしたがって、ＰａｔｈＳｃａｎ  ＭＡＰキナーゼＭｕｌｔｉ−Ｔａｒｇｅｔ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  Ｅｌｉｓａキット（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いて、ＥＬＩＳＡ定量化を行った。手短に言えば、組織試料を解剖し、さらに処理する前に液体窒素中で急速凍結した。凍結試料を、氷上で短時間超音波処理しながら細胞溶解緩衝液に溶解した。細胞溶解液を１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を試料希釈液に１：１０希釈し、製造業者のプロトコルにしたがって抗体マイクロウェルでのインキュベーションに使用した。等割合の全対照試料を含有する混合物の希釈を用いて、標準曲線を作成した。Ｄｒｄ１ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌおよび対照線条体溶解物中の全またはリン酸化ＭＡＰキナーゼ経路タンパク質の相対量を、４５０ｎｍでの個々の吸光度値に基づいて定量化した。ウェルチの検定を用いて、ｐ値を計算した。
【０１８２】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
【０１８３】
ルシフェラーゼレポーターアッセイを行って、ｍｉＲ−１２８によるＲＣＳおよびＴＡＲＰＰ  ｍＲＮＡ発現の抑制を測定した。哺乳動物細胞中で発現させるためのＳＶ４０プロモーターによって駆動されるホタルルシフェラーゼ遺伝子の下流のＲＣＳおよびＴＡＲＰＰ  ３’ＵＴＲの完全長配列を含有するマイクロＲＮＡ  ３’ＵＴＲ標的レポータープラスミドを、ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ、ＭＤから購入した（ｐＥＺＸ−ＭＴ０１）。３’ＵＴＲ挿入物を含有しない対照プラスミドを比較に使用した。プラスミドは、トランスフェクションおよび発現効率を制御するためのウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ遺伝子を含有している。全プラスミドの配列を、配列決定および制限酵素消化によって確認した。レポーターまたは対照プラスミドを、２つの示される濃度でｍｉＲＮＡ模倣物無し、ｍｉＲ−１２４ａスクランブル対照模倣物またはｍｉＲー１２８模倣物（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を含む２４ウェル培養プレート中で成長させたコンフルエントなＮｅｕｒｏ２Ａ細胞中にウミシイタケルシフェラーゼプラスミドと共にコトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後に細胞を回収および溶解し、細胞溶解物を、製造業者の指示にしたがって、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、米国）を用いて、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性について分析した。ホタルルシフェラーゼ活性を各細胞培養ウェルについてウミシイタケルシフェラーゼ活性に正規化し、模倣物を添加していない対照トランスフェクションに対する活性としてプロットした。それぞれ３つの技術的複製からなる少なくとも３つの生物学的複製を行った。
【０１８４】
電気生理学的分析
【０１８５】
脳切片調製：
【０１８６】
傍矢状脳切片（２７５μｍ）を、Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された手順にしたがって、３〜５月齢雄および雌Ｄｒｄ１ａ−ＴＲＡＰ；Ｄｒｄ１ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８ｆｌ／ｆｌおよびＤｒｄ１ａ−ＴＲＡＰ；ｍｉＲ−１２８ｆｌ／ｆｌ同腹子対照マウスから得た。マウスにケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ−１）とキシラジン（４．５ｍｇ／ｋｇ−１）の混合物で麻酔をかけ、１２４ＮａＣｌ、３ＫＣｌ、１ＣａＣｌ２、１．５ＭｇＣｌ２、２６ＮａＨＣＯ３、１ＮａＨ２ＰＯ４および１６．６６グルコースを含有する（ｍＭ）氷冷人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）５〜１０ｍｌで経心的に灌流し、カルボゲン（９５％Ｏ２および５％ＣＯ２）で連続的に起泡した。次いで、切片を保持室に移し、そこで３５℃で６０分間、２ＣａＣｌ２、１ＭｇＣｌ２を含有する（ｍＭ）ＡＣＳＦ中でインキュベートし、その後、記録するまで切片を室温で保管した。
【０１８７】
電気生理学：
【０１８８】
パッチピペットを、Ｓｕｔｔｅｒ  Ｐ−９７プラーで厚壁ホウケイ酸ガラスから引き出した。ピペット抵抗は、記録液で満たした場合、典型的には３〜５Ｍ  であった。ｂＡＰ伝播を伴う試験のために、内部記録液は、１３５ＫＭｅＳＯ４、５ＫＣｌ、１０ＨＥＰＥＳ、２ＡＴＰ−Ｍｇ２＋、０．５ＧＴＰ−Ｎａ＋、５ホスホクレアチン−トリス；５ホスホクレアチン−Ｎａ＋および０．１スペルミンを含有していた（ｍＭ）。ｐＨをＮａＯＨで７．２５に調整し、モル浸透圧濃度を２７０〜２８０ｍＯｓｍｌ−１に調整した。Ｃａ２＋イメージング実験のために、記録液は２００μＭ  Ｆｌｕｏ−４ペンタカリウム塩および５０μＭ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８ヒドラジドＮａ＋塩（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）も含有していた。電圧固定試験のために、記録溶液は、１２０ＣｓＭｅＳＯ３、５ＮａＣｌ、１０ＴＥＡ−Ｃｌ（テトラエチルアンモニウムＣｌ）、１０ＨＥＰＥＳ、５Ｑｘ−３１４、４ＡＴＰ−Ｍｇ２、０．３ＧＴＰ−Ｎａ、０．２Ｆｌｕｏ  ４ペンタカリウム塩および０．０５Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８ヒドラジドＮａ＋塩（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＨ７．２５、２７０〜２８０ｍＯｓｍ−１を含有していた（ｍＭ）。切片を、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１直立固定ステージ顕微鏡にマウントした沈没型記録チャンバーに移し、カルボゲン−起泡ＡＣＳＦで連続的に灌流した。電気生理学的記録をＭｕｌｔｉｃｌａｍｐ  ７００Ｂ増幅器により得た。二光子イメージングおよび電気生理学的プロトコルを自動化および同期化するカスタムシェアウェアパッケージＷｉｎＦｌｕｏｒ（Ｊｏｈｎ  Ｄｅｍｐｓｔｅｒ、Ｓｔｒａｔｈｃｌｙｄｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｇｌａｓｇｏｗ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ、英国）を用いて、刺激およびディスプレイを前記のように（Ｄａｙら、２００８）得た。増幅器ブリッジ回路を調整して直列抵抗を補填し、記録中絶えず監視した。
【０１８９】
二光子レーザー走査顕微鏡（２ＰＬＳＭ）およびＣａ２＋イメージング：
【０１９０】
２ＰＬＳＭおよびＣａ２＋イメージングを前記のように（３７）行った。Ｕｌｔｉｍａ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅシステム（Ｐｒａｉｒｉｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、体性ｅＧＦＰ二光子励起蛍光によって、線条体黒質系有棘投射ニューロン（ｓｔｒｉａｔｏｎｉｇｒａｌ  ｓｐｉｎｙ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ  ｎｅｕｒｏｎ）を同定した。ＤＯＤＴコントラスト検出器システムを使用して、蛍光画像で記録する明視野透過画像を得た。８１０ｎｍ励起（Ｖｅｒｄｉ／Ｍｉｒａレーザー）を用いて、緑色ＧＦＰシグナル（４９０〜５６０ｎｍ）を取得した。Ｈｉｔａｃｈｉ  ＣＣＤカメラおよびＯｌｙｍｐｕｓ  ６０Ｘ／０．９ＮＡレンズによるビデオ顕微鏡を用いてＳＰＮをパッチした。細胞体、樹状突起および棘を可視化するためにＡｌｅｘａ  ５６８蛍光を使用した。パッチ破壊後、内部溶液をイメージング前に１５〜２０分間平衡化させた。樹状突起の高倍率最大投影像を、１０μｍピクセル静止時間で０．０７２μｍ２ピクセルで取得した。およそ２０枚の画像を０．５μｍ焦点可変量でとった。棘密度を、前記のように（３８）細胞体からの樹状突起部分約１００〜１２０μｍの最大投影像から計算した。棘を手動で数え、対応する樹状突起の長さに正規化した。
【０１９１】
体性電流パルス（２ｎＡ、２ｍｓ）を注入することによって、単一ｂＡＰを生成した。Ｃａ２＋の樹状突起変化をラインスキャンを介してΔＦ／Ｆｏとして測定した（ＦｏはｂＡＰ前の平均緑色蛍光である）。ピークΔＦ／Ｆｏ値を６回連続試験の平均から得て、Ｃａ２＋減衰の単一指数関数あてはめによって計算した。緑色蛍光ラインスキャンシグナルを、０．０８μｍピクセルおよび１０μｓピクセル静止時間で、６ｍｓ／ラインおよび５１２ピクセル／ラインにおいて取得した。レーザースキャン画像を９０ＭＨｚ（約２５０ｆｓパルス幅）でパルスした８１０ｎｍ光によって取得した。パワー減衰を２つのＰｏｃｋｅｌｓセル電気光学変調器（モデル３５０−８０および３５０−５０、Ｃｏｎ  Ｏｐｔｉｃｓ、Ｄａｎｂｕｒｙ、ＣＴ）で達成した。２つのセルを直列に整列して、励起線量の微調整のために調整範囲増強を提供した（４０年にわたって０．１％段階）。ラインスキャンを刺激プロトコル２００ｍｓ前に開始し、刺激後４秒継続して背景蛍光を得て、刺激後の光信号の崩壊を記録した。光損傷および光脱色を減らすために、ｂＡＰバーストに直接隣接する期間を除いて、スキャン中の全時間で第２のＰｏｃｋｅｌｓセルを用いてレーザーを完全に減弱した。樹状突起ラインスキャンを、各セルについて近位（細胞体から約５０μｍ）および遠位（細胞体から約１００〜１２０μｍ）樹状突起領域から取得した。遠位Ｃａ２＋一過性ピークを細胞１個当たりの最大近位Ｃａ２＋一過性に正規化することによって、ｂＡＰ減弱を計算した。
【０１９２】
Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ−ＸＲレーザーシステム（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ  Ｌａｓｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いて、グルタミン酸アンケージングを達成した。５ｍＭ  ＭＮＩ−グルタメート（Ｔｏｃｒｉｓ、Ｃｏｏｋｓｏｎ、Ｅｌｌｉｓｖｉｌｌｅ、ＭＯ）を、シリンジポンプおよび多筒式灌流多岐管（Ｃｅｌｌ  ＭｉｃｒｏＣｏｎｔｒｏｌｓ、Ｎｏｒｆｏｌｋ、ＶＡ）を用いて切片上に灌流した。試料面で典型的には１０〜２０ｍＷの出力の７２０ｎｍ光の１ｍｓパルスを用いて、グルタミン酸を個々の棘頭に隣接してアンケージングした。光分解パワーを第３のＰｏｃｋｅｌｓセル変調器（Ｃｏｎ  Ｏｐｔｉｃｓ、Ｄａｎｂｕｒｙ、ＣＴ）を介して調整して平均５〜１０ｐＡのアンケージドＥＰＳＣ（ｕＥＰＳＣ）を達成した。
【０１９３】
行動分析
【０１９４】
全ての行動実験について、実験を動物の遺伝子型について盲検化した。全ての行動試験を、４〜１６週齢突然変異体ならびにそのそれぞれの齢および性別一致同腹子対照で行った。全ての行動試験を午前７時〜午後７時の間に行った。遺伝子型は、データを処理および解析した後で解読した。少なくとも５匹の動物の標本サイズを行動分析に使用した。標本平均から２標準偏差超であるデータ点に相当する対象は分析から除外した。可能な場合、全ての同腹子動物を対象群として行動実験に含めた。無作為化プロトコルを使用しなかった。各群の齢および性別の均一な分布が確保されるように動物を処理群に割り当てた。２つの条件を比較する場合、両側ウェルチのｔ検定を使用した。複数の標本群を伴う比較については、一元または二元配置分散分析を使用した。因子が有意な効果を有した場合、一対比較のためにポストテストを行った。
【０１９５】
オープンフィールド分析：
【０１９６】
オープンフィールド（４０×４０×３０ｃｍ）を用いて、自発運動および探索行動を測定した。コンピュータ操作Ｐｈｏｔｏｂｅａｍ活動システム（Ａｃｃｕｓｃａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、コロンビア、ＯＨ）によって活動を定量化した。マウスを、全活動領域中での全移動距離および垂直エピソード（立ち上がり）の回数について記録した。オープンフィールド分析を、４週齢マウスならびにそのそれぞれの齢および性別一致同腹子対照で行った。実験マウスが分析時に発作を有していなかったことを保証するために、行動試験に使用するマウスを、試験前２時間、１時間の運動試験中、および試験後４時間、監視下に置いた。
【０１９７】
使用する薬物：
【０１９８】
マウスに、１０×体重（ｇ）のマイクロリットル体積当量を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。Ｄ１−受容体アゴニストＳＫＦ８１２９７（Ｔａｃｏｎｉｃ）をストック（ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍｌ）から０．９％生理食塩水で示される濃度まで希釈した。ＭＥＫ阻害剤ＳＬ３２７（Ｔａｃｏｎｉｃ）をストック（ＤＭＳＯ中希釈）から３０％ＤＭＳＯ／生理食塩水で示される濃度まで希釈した。コカイン（Ｓｉｇｍａ、Ｃ５７７６）を水中に１００ｍｇ／ｍｌストック溶液まで希釈した。バルプロ酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、Ｐ４５４３）を、経口投与用に飲料水中０．２６％ｗ／ｖで調製した。カイニン酸（Ｓｉｇｍａ、Ｋ０２５０）を、腹腔内注射用に、使用直前に生理食塩水中３０ｍｇ／ｋｇ濃度に溶解した。ピクロトキシン（Ｓｉｇｍａ、Ｐ１６７５）を、エタノール中２５ｍｇ／ｍｌストック溶液として調製し、生理食塩水にさらに希釈して、発作誘発のために３ｍｇ／ｋｇ濃度で注射した。
【０１９９】
ホームケージ発作モニタリング：
【０２００】
動物を、事前に設置されたカメラ（Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｒ、Ｎｏｌｄｕｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含む透明なプレキシガラスチャンバーに収容し、自由に食物および水を提供した。マウスの連続２４時間ビデオ録画をとった。ビデオ録画を、発作の重症度、持続期間および頻度について手動で点数化した。記録された強直間代発作を構成するためには、マウスは、歩行、嗅ぐ動作または毛づくろいなどの全ての正常な活動を停止し、背を曲げて硬直した姿勢をとり、立ち上がりと転倒の繰り返しに進行しなければならない。これは強直間代発作として含めるために要求されないが、強直間代発作エピソードの大部分は、速い走り回りおよび跳ね上がり行動をするさらなる段階に進行した。
【０２０１】
化学的誘発発作：
【０２０２】
マウスにカイニン酸（生理食塩水中３０ｍｇ／ｋｇ）またはピクロトキシン（生理食塩水中３ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、隔離して部屋に入れ、注射後６０分間観察した。全ての注射動物が急速に不動期間（段階１）に入る。動物を、立ち上がりと転倒の繰り返し、引き続く走り回りと跳ね上がり、または姿勢の制御が失われている場合には一定の脚運動を特徴とする強直間代発作の開始の時間について観察した。
【０２０３】
生存曲線：
【０２０４】
ホームケージでの屠殺または死亡のデータを突然変異体およびケージメイト対照について記録し、カプラン・マイヤー生存曲線としてプロットし、対数順位検定を用いて比較した。
【０２０５】
６−ＯＨＤＡ損傷：
【０２０６】
マウスにケタミン／キシラジンで麻酔をかけた。マウスに、６−ＯＨＤＡ（０．０２％アスコルビン酸中３．５ｍｇ／ｍｌ）２×２μｌを左線条体に（ＭＬ＝−２．１ＡＰ＝＋１．０ＤＶ＝−３．４；ＭＬ＝−２．３ＡＰ＝＋０．３ＤＶ＝−３．４）、またビヒクル注射２×２μｌを右線条体に（ＭＬ＝＋２．１ＡＰ＝＋１．０ＤＶ＝−３．４；ＭＬ＝＋２．３ＡＰ＝＋０．３ＤＶ＝−３．４）定位的に注射した。マウスを外科手術後３週間単一収容して行動分析前に回復させた。
【０２０７】
回転行動：
【０２０８】
損傷マウスの回転行動を、コカインの腹腔内注射５分後に２回連続２分間隔で、遺伝子型について盲検化した実験者によって分析した。正味の反対側回転は、全反対回転−同側性回転によって与えられる。データは、両読み取りの平均を示す。３日後、ＳＫＦ８１２９７に反応して同じ行動アッセイを記録した。
【０２０９】
領域特異性に関して、基礎運動活動の増加は線条体のｍｉＲ−１２８によって調節されているが、海馬または皮質における枯渇は運動活動にごくわずかな効果しかまたは全く効果を有さない（ＥＭＸ−ｃｒｅマウス系統で最初の２０分までに見られる探索の一時的増加を除く）。ｍｉＲ−１２８が海馬および皮質で枯渇している場合、発作および生存がより強力に発症する。そのため、出願人らは、皮質または海馬で特異的にｍｉＲ−１２８を過剰発現し、基礎運動活動を変化させることなく最強の発作抑制効果を見出す。
【０２１０】
一例では、使用したインビボ注射用改変ＲＮＡが、示されるように組換えられる以下の配列を有していた：ｍｍｕ−ｍｉＲ−１２８−３ｐ  ＭＩＭＡＴ００００１４０：ＵＣＡＣＡＧＵＧＡＡＣＣＧＧＵＣＵＣＵＵＵ：＊２’Ｏｍｅ  全塩基、ホスホチオエート２×５’および４×３’、３’−コレステロール。合成後処理としての、対イオン（Ｎａ＋）交換によるインビボＨＰＬＣ、滅菌濾過、および内毒素検査
【０２１１】
５’ｍＵ＊ｍＣ＊ｍＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＧｍＡｍＡｍＣｍＣｍＧｍＧｍＵｍＣｍＵｍＣ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊−３’−Ｃｈｌ
【０２１２】
マウスをインビボでの化学的誘発発作から保護することにおける異所性ｍｉＲ−１２８過剰発現の有効性
【０２１３】
別の例では、出願人らは、皮質、海馬、線条体および視床における異所性ｍｉＲ−１２８過剰発現の有効性を試験している。ｍｉＲ−１２８過剰発現の時間経過およびレベルを、インビボでマウスにおいて、ｉ）ｍｉＲ−１２８オリゴヌクレオチド、ｉｉ）ＡＡＶ送達ｍｉＲ−１２８の投与、ならびにｉｉｉ）ｍｉＲ−１２８の遺伝子過剰発現で確立する。定位的手法を用いて、マウス脳内のｍｉＲ−１２８発現の局所的増加を達成する。脳領域およびｍｉＲ−１２８過剰発現手法を研究して、どれがインビボにおいてマウスの化学的誘発発作に対する感受性を低下させるのに最大の効果を有するかを見出す。出願人らは、興奮性増加ならびにニューロンの抑制状態低下によって誘発される発作を模倣するためにピクロトキシン、カイニン酸およびポリカルピン（ｐｏｌｉｃａｒｐｉｎｅ）を含む異なる痙攣誘発薬を使用する。ＡＡＶ手法を用いた海馬におけるｍｉＲ−１２８過剰発現は最高の有効性を示す。
【０２１４】
ｍｉＲ−１２８の遺伝子または異所性過剰発現によるＤｒａｖｅｔ症候群などの重度のヒト全般小児てんかんのマウスモデルの治療
【０２１５】
本開示の発明者らは、Ｄｒａｖｅｔ症候群などの重度のヒト全般小児てんかんのマウスモデル（Ｓｃｎ１ａまたはＧａｂｒｇ２欠損マウス）においてｍｉＲ−１２８を異所性過剰発現して、これらのマウスでの発作の阻止におけるｍｉＲ−１２８の有効性を確立する。Ｓｃｎａ１およびＧａｂｒｇ２を喪失したマウスは、生後４週目に始まる自発発作および運動失調、引き続いて発作関連原因からの早発性死亡を示す。出願人らは、３〜４週齢Ｄｒａｖｅｔ症候群マウスにおいて、発作発症および生存に対するｍｉＲ−１２８過剰発現の効果を試験する。生後前脳ニューロン中の遺伝子ｍｉＲ−１２８過剰発現がマウスを自発発作発症から保護する能力も試験する。第２に、出願人らは、異なる脳領域（線条体、側頭皮質、海馬、視床背内側）におけるオリゴヌクレオチドまたはＡＡＶに基づくｍｉＲ−１２８過剰発現の発作抑制能力を試験して、局所的ｍｉＲ−１２８過剰発現による脳に広がる発作を妨げることができる特異的位置が存在するかどうかを決定する。海馬または視床のニューロンに異所性供給されたｍｉＲ−１２８は、Ｄｒａｖｅｔ様症候群を患っているマウスを自発再発性発作および早発性死亡から保護する。
【０２１６】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかも個々の刊行物または特許が参照により組み込まれることが具体的かつ個別的に示されているかのように、全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、本明細書のいずれの定義も含む本出願が優先する。本発明のいくつかの態様を本明細書において記載し、示してきたが、同じ目的を達成するために当業者が代わりの態様を行うこともできる。当業者であれば、ただの日常的実験に過ぎないものを用いて、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態との多くの同等物を認識するまたは確認することができるだろう。したがって、添付の特許請求の範囲によって、本発明の真の精神および範囲に入る全てのこのような代わりの態様を網羅することを意図している。
【０２１７】
種々の他の修正が明らかであり、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者によって容易になされることが理解される。したがって、これに添付される特許請求の範囲が本明細書に示される説明に限定されることを意図しておらず、むしろ特許請求の範囲が本発明が属する技術分野の当業者によってその同等物として扱われる全ての特徴を含む本発明に属する特許性のある新規性の全ての特徴を包含するものと解釈されることを意図している。
【表１】
2020158506.tif 000002
2020158506.tif 000003
2020158506.tif 000004
【０２１８】
参考文献：
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【０２１９】
２１．Ｇ．Ｍ．Ｔｈｏｍａｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５，１７３（Ｍａｒ，２００４）．２２．Ｅ．Ｖａｌｊｅｎｔ，ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ７，２０（２００６）．２３．Ａ．Ｓ．Ｎａｔｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  ｊｏｕｒｎａｌ  ２６，４８９１（Ｎｏｖ  ２８，２００７）．２４．Ｃ．Ｍａｚｚｕｃｃｈｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ３４，８０７（Ｍａｙ  ３０，２００２）．２５．Ｃ．Ｒ．Ｇｅｒｆｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：ｔｈｅ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２２，５０４２（Ｊｕｎ  １５，２００２）．２６．Ｍ．Ｆｅｙｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５，７１（２０１１）．２７．Ｍ．Ａ．Ｃｅｎｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｂｒａｉｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８３，２０９（２０１０）．２８．Ｄ．Ｓ．Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：ｔｈｅ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２０，４４０５（Ｊｕｎ  １５，２０００）．２９．Ｍ．Ａ．Ｂｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ  ５２，９９３（Ｍａｙ，２０１１）．３０．Ｂ．Ａ．Ｃｈｉｏｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｐｉｌｅｐｓｙ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８７，２４７（Ｄｅｃ，２００９）．３１．Ｙ．Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２４，７２９（Ｊｕｎ，２００６）．３２．Ｅ．Ｃａｓａｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓｉｓ  ３１，３７（Ｓｅｐ，２００１）．３３．Ｓ．Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４２５，９１７（Ｏｃｔ  ３０，２００３）．３４．Ｈ．Ｌｉ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５，１７５４（Ｊｕｌ  １５，２００９）．３５．Ｘ．Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３４，Ｗ５５１（Ｊｕｌ  １，２００６）．３６．Ｐ．Ｍａｃｈａｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２７，１６９６（Ｊｕｎ  １５，２０１１）．３７．Ｂ．Ｌａｎｇｍｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  １０，Ｒ２５（２００９）．３８．Ｍ．Ｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：ｔｈｅ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２８，１１６０３（Ｎｏｖ  ５，２００８）．３９．Ｃ．Ｓ．Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：ｔｈｅ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ３２，９１２４（Ｊｕｌ  ４，２０１２）．
【図１Ａ−Ｃ】
2020158506.tif 000005
【図１Ｄ−Ｅ】
2020158506.tif 000006
【図１Ｆ】
2020158506.tif 000007
【図２Ａ−Ｃ】
2020158506.tif 000008
【図２Ｄ−Ｅ】
2020158506.tif 000009
【図３Ａ】
2020158506.tif 000010
【図３Ｂ−Ｃ】
2020158506.tif 000011
【図４Ａ−Ｂ】
2020158506.tif 000012
【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
2020158506.tif 000014
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ−Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
2020158506.tif 000020
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
2020158506.tif 000023
【図８Ｂ】
2020158506.tif 000024
【図９Ａ−Ｂ】
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【図１０】
2020158506.tif 000026
【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
2020158506.tif 000030
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年7月16日(2020.7.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴマー、化学的に安定化されたオリゴマー、オリゴマーをコードする核酸、オリゴマーをコードするウイルスベクターからなる群から選択される薬剤の治療上有効量を含む、てんかんを有する危険があるまたは有する疑いがある個体のてんかんまたはてんかん重積状態の発症の治療またはその可能性の減少に使用するための医薬組成物であって、前記オリゴマーは、６〜３０ヌクレオチドの間のヌクレオチド配列を含み、そしてシード領域であるヌクレオチド配列：ＣＡＣＡＧＵを含む、医薬組成物。
【請求項２】
オリゴマー、化学的に安定化されたオリゴマー、オリゴマーをコードする核酸、オリゴマーをコードするウイルスベクターからなる群から選択される薬剤の治療上有効量を含む、発作の危険があるまたは発作を有する個体の発作の発症もしくは発生の治療またはその可能性の減少に使用するための医薬組成物であって、ここで、前記個体が、発作の発症を特徴とする脳関連障害を有し、そして前記オリゴマーは、６〜３０ヌクレオチドの間のヌクレオチド配列を含み、そしてシード領域であるヌクレオチド配列：ＣＡＣＡＧＵを含む、医薬組成物。
【請求項３】
オリゴマー、化学的に安定化されたオリゴマー、オリゴマーをコードする核酸、オリゴマーをコードするウイルスベクターからなる群から選択される薬剤の治療上有効量を含む、てんかんを発症する危険がある個体のてんかんの発症の治療またはその可能性の減少に使用するための医薬組成物であって、ここで、前記個体が、前記個体のてんかんのリスクを増加させる脳損傷を以前に患っており、そして前記オリゴマーは、６〜３０ヌクレオチドの間のヌクレオチド配列を含み、そしてシード領域であるヌクレオチド配列：ＣＡＣＡＧＵを含む、医薬組成物。
【請求項４】
前記個体が、Ｄｒａｖｅｔ症候群を有する疑いがあるまたはＤｒａｖｅｔ症候群と診断されている、請求項１、２または３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記医薬組成物が、くも膜下腔内または鼻腔内投与される、請求項１、２または３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記個体の中枢神経系への投与用である、請求項１、２または３に記載の医薬組成物。
【請求項７】
海馬または皮質への投与用である、請求項１、２または３に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記薬剤が、化学的に安定化されたオリゴマーを含む、請求項１、２または３に記載の医薬組成物。
【請求項９】
発作の発症を特徴とする前記脳関連障害が、脳卒中、低酸素症、外傷性脳損傷、感染症、腫瘍、神経変性障害、発作を引き起こす代謝および自己免疫障害からなる群から選択される、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記脳損傷が脳卒中によって引き起こされる、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて、薬剤を含む、発作を特徴とする神経病態の発症の治療またはその可能性の減少に使用するための医薬組成物であって、前記薬剤がオリゴマー、化学的に安定化されたオリゴマー、オリゴマーをコードする核酸、オリゴマーをコードするウイルスベクターからなる群から選択され、前記オリゴマーは、６〜３０ヌクレオチドの間のヌクレオチド配列を含み、そしてシード領域であるヌクレオチド配列：ＣＡＣＡＧＵを含む、医薬組成物。
【請求項１２】
前記薬剤が、化学的に安定化されたオリゴマー、オリゴマーをコードする核酸、およびオリゴマーをコードするウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ｍｉＲ−１２８発現細胞を候補化合物と接触させることと、前記細胞によって発現されている前記ｍｉＲ−１２８の発現および／または活性のレベルを測定することとを含む、発作を特徴とする病態の治療またはその可能性の減少に有用な化合物を同定する方法であって、ここで、前記候補化合物と接触していない細胞中のｍｉＲ−１２８の発現および／または活性の基準レベルに対する前記ｍｉＲ−１２８の発現および／または活性のレベルの増加が、前記候補化合物が発作を特徴とする病態の治療または予防に有用であることを示すものとする、前記方法。
【請求項１４】
発作を特徴とする前記病態が、てんかん、てんかん重積状態、脳卒中、低酸素症、外傷性脳損傷、感染症、腫瘍、神経変性障害、発作を引き起こす代謝および自己免疫障害を含む群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【外国語明細書】
2020158506000001.pdf