(57)【要約】【課題】皮膚の角化細胞に投与するための組成物を提供する。【解決手段】皮膚の角化細胞の細胞老化を防止する組成物であって、単離された組換え全長ＣＬＳＰポリペプチドを有効成分として含み、ＣＬＳＰポリペプチドが５〜１００ｎＭの濃度において基底層の角化細胞に送達される組成物が提供される。フキタンポポ花抽出物、カノコソウ根抽出物、ベニバナ花・茎抽出物、イタドリ根抽出物、ホーリーバジル葉抽出物、およびホッカイトウキ根抽出物からなる群より選択される１種以上の植物抽出物、または８−シネオール、酢酸ヘキシル、リナロール、酢酸リナリル、および酪酸エチルからなる群より選択される１種以上の化合物を有効成分として含む、基底層の角化細胞におけるＣＬＳＰ発現促進用の組成物も提供される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚の角化細胞の細胞老化を防止するための組成物であって、単離された組換え全長ＣＬＳＰポリペプチドを有効成分として含み、前記ＣＬＳＰポリペプチドは、５〜１００ｎＭの濃度において基底層の角化細胞に送達される、組成物。
【請求項２】
前記ＣＬＳＰポリペプチド以外のポリペプチドを含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記細胞老化は、ｐＨ６におけるβ−ガラクトシダーゼ活性によって示される細胞老化である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＣＬＳＰポリペプチドは大腸菌組換えポリペプチドである、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
角化細胞と、単離された組換え全長ＣＬＳＰポリペプチドと、細胞老化マーカーであるｐＨ６におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の基質であるＸ−ｇａｌまたはＣ１２ＦＤＧとを含んでなるインビトロ組成物。
【請求項６】
皮膚の基底層の角化細胞においてＣＬＳＰの発現を促進させるための組成物であって、フキタンポポ花抽出物、カノコソウ根抽出物、ベニバナ花・茎抽出物、イタドリ根抽出物、ホーリーバジル葉抽出物、およびホッカイトウキ根抽出物からなる群より選択される１種以上の植物抽出物を有効成分として含む、組成物。
【請求項７】
前記植物抽出物のうちの２種以上の組合せを有効成分として含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
フキタンポポ花抽出物とカノコソウ根抽出物、フキタンポポ花抽出物とベニバナ花・茎抽出物、またはカノコソウ根抽出物とベニバナ花・茎抽出物の組合せを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
皮膚の基底層の角化細胞においてＣＬＳＰの発現を促進させるための組成物であって、１，８−シネオール、酢酸ヘキシル、リナロール、酢酸リナリル、および酪酸エチルからなる群より選択される１種以上の化合物を有効成分として含む、組成物。
【請求項１０】
前記化合物のうちの２種以上の組合せを有効成分として含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
１，８−シネオールと酢酸ヘキシル、１，８−シネオールとリナロール、または酢酸ヘキシルとリナロールの組合せを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
皮膚の基底層の角化細胞においてＣＬＳＰの発現を促進させるための多成分組成物であって、請求項６〜８のいずれかに記載の組成物と、請求項９〜１１のいずれかに記載の組成物とを含む、多成分組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚の角化細胞およびＣＬＳＰタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の表皮はおもに角化細胞と呼ばれる細胞から構成されている。表皮の最内層である基底層で増殖した角化細胞は外側（皮膚表面側）に押し出されるように移動してゆき、その移動に伴って有棘層、顆粒層、および角質層へと順に分化していく。すなわち表皮は、分化の程度が異なる角化細胞の複数の層から構成されている。角化細胞の増殖すなわち細胞分裂は、通常は基底層（表皮の最深部にある単層およびそれに隣接する基底上層を含む）においてのみ起こり、有棘層より外側では細胞分裂は起こらずに細胞分化のみが進行する。
【０００３】
Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−Ｌｉｋｅ  Ｓｋｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＬＳＰ）は、主に皮膚で産生されるカルシウム結合タンパク質である。非特許文献１は、ＣＬＳＰは増殖中の角化細胞においては発現が検出されないが、角化細胞分化の後期、すなわちロリクリンの発現が既に開始された時点以降である分化６〜７日目以降において発現されることを記載している。ロリクリンは角化細胞が顆粒層まで移動した段階で発現が開始される遺伝子である。同様に、非特許文献２も、ＣＬＳＰタンパク質は基底層には不在であって、分化が進んだ表皮外層に多く存在することを記載している。非特許文献２はまた、ｓｈＲＮＡによりＣＬＳＰを欠如させても基底層の細胞増殖には影響がなかったことを記載している。従って、ＣＬＳＰは角化細胞の最終分化（角化）に関与していると考えられている。
【０００４】
日光照射で損傷を受けた皮膚、および乾癬の皮膚においては、ＣＬＳＰ量が上昇することが報告されている（非特許文献３、４）。
【０００５】
特許文献１は、β‐エンドルフィンまたはβ‐エンドルフィン模倣剤（ココア豆抽出物）を表皮に投与すると、ＣＬＳＰ、ロリクリン、およびＩ型トランスグルタミナーゼという３つの因子の発現が同時に増強されることを記載している。これら３つの因子はいずれも角化細胞の分化／角化に関与する因子であるため、特許文献１はこの発見に基づいて、皮膚の障壁機能を増強させる化粧品用組成物におけるβ‐エンドルフィンまたはβ‐エンドルフィン模倣剤の使用を提案している。
【０００６】
特許文献２は、ＣＬＳＰの全長ポリペプチドを記載している。特許文献２はさらに、「例えば、化粧品では、老化の治療、特に、皮膚の老化の治療における、紫外線への暴露に関連した皮膚のダメージの治療における、通常、あるいは、病理的な上皮の増殖の機能不全、あるいは、上皮の分化不全（乾燥肌、角質増殖症、錯角化症、乾癬、魚鱗癬、新生組織形成等々）を調整するために、本発明のタンパク質を利用することができる」と言及している。しかしながら、「皮膚の老化」等は曖昧な概念であるところ、その「治療」とはどういう具体的症状をどう治すことを意味するのか、そしてどのような具体的形態でそのタンパク質を利用すればその治療が達成されるのかは明らかにされていない。
【０００７】
特許文献３は、「若い個体の皮膚と比較して、老いた個体の皮膚におけるＣＬＳＰタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現における増加を観察する」という従来の知見を記載した上で、「本発明者らは予想外に、老いたヒトの表皮の角質層中のＣＬＳＰの特定の形の発現における減少に気づいた。きわめて明らかに、本発明者らにより特徴付けされた該形は、今まで考えられていたＣＬＳＰの形のそれら及び特には上記言及されたＣＬＳＰの形のそれらと異なるタンパク質の成熟の段階に対応する。」と記載している（下線は引用者による）。つまり、ＣＬＳＰ全般は老化と共に表皮で発現増加することが知られていたところ、特許文献３は、特定の形の発現だけは老化と共に減少することを発見し、その発見に基づいて、その「特定の形」を経時的老化の状態のマーカーとして使用することを教示している。
【０００８】
特許文献３の発明におけるそのＣＬＳＰの「特定の形」とは、「ＣＬＳＰの複合形」である。これは、「完全ＣＬＳＰと、それ自身、またはその断片、または少なくとも１つの標的タンパク質との会合からもたらされる多量体」であって、「クローンＤＢ１５Ｃ９を捕捉抗体として及びクローンＤＢ７Ｇ１２を検出抗体として実行する酵素連結イムノソルベントアッセイにより同定」される「ＣＬＳＰの複合形」である。
【０００９】
特許文献３はさらに、「本発明に従う複合形の有効量を、皮膚老化の兆候を防ぎ及び／又は処置する為に有用な剤として、化粧的に使用する方法」にも言及している。しかしながら、ＣＬＳＰ全般とは区別される概念でありしかも特定のモノクローナル抗体を用いた特定のアッセイによる検出によって特定されるこのＣＬＳＰ複合形を、化粧的に使用するということは、具体的にどのような操作を意味するのかは明らかにされていない。
【００１０】
皮膚以外では、特許文献４が、アルツハイマー病に関連する神経細胞の機能障害または神経細胞死を抑制するための有効成分としてＣＬＳＰを含む医薬組成物を記載している。これは、ＣＬＳＰが、アルツハイマー病に関連する神経細胞死を抑制する因子であるヒューマニンの受容体のアゴニストとして作用できるという発見に基づく医薬組成物である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００５−４７９１４号公報
【特許文献２】特許第３８５１８１８号公報
【特許文献３】特許第５９８０４６９号公報
【特許文献４】特開２０１２−１３１７１１号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】The Journal Of Biological Chemistry, Vol. 275, No. 17, April 28, pp. 12841-12847, 2000
【非特許文献２】Genes & Development, 2015, 29:2225-2230
【非特許文献３】The Journal Of Investigative Dermatology, 119:3-13, July 2002
【非特許文献４】Experimental Dermatology 2006: 15: 469-477
【発明の概要】
【００１３】
本発明者らは、増殖段階にある角化細胞に、単離された組換え全長ＣＬＳＰポリペプチドを投与すると、細胞老化（セネッセンス）が防止されることを見出した。これは予測できなかった発見である。なぜならば、従来、ＣＬＳＰは角化細胞の増殖段階（物理的には基底層に相当する）ではなく最終分化の段階（物理的には顆粒層〜角質層に相当する）で発現し機能すると考えられており、また、ある特定の複合形態のみが皮膚老化の兆候を防ぎ及び／又は処置する為に有用であると考えられていたからである。発明者らはさらに、増殖段階にある角化細胞においてＣＬＳＰの発現を促進させることができる複数の成分を見出した。本発明の実施形態はこれらの発見に基づくものである。
【００１４】
すなわち、本開示は以下の実施形態を含む。
［１］
皮膚の角化細胞の細胞老化を防止するための組成物であって、単離された組換え全長ＣＬＳＰポリペプチドを有効成分として含み、前記ＣＬＳＰポリペプチドは、５〜１００ｎＭの濃度において基底層の角化細胞に送達される、組成物。
［２］
前記ＣＬＳＰポリペプチド以外のポリペプチドを含まない、［１］に記載の組成物。
［３］
前記細胞老化は、ｐＨ６におけるβ−ガラクトシダーゼ活性によって示される細胞老化である、［１］または［２］に記載の組成物。
［４］
前記ＣＬＳＰポリペプチドは大腸菌組換えポリペプチドである、［１］〜［３］のいずれかに記載の組成物。
［５］
角化細胞と、単離された組換え全長ＣＬＳＰポリペプチドと、細胞老化マーカーであるｐＨ６におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の基質であるＸ−ｇａｌまたはＣ１２ＦＤＧとを含んでなるインビトロ組成物。
［６］
皮膚の基底層の角化細胞においてＣＬＳＰの発現を促進させるための組成物であって、フキタンポポ花抽出物、カノコソウ根抽出物、ベニバナ花・茎抽出物、イタドリ根抽出物、ホーリーバジル葉抽出物、およびホッカイトウキ根抽出物からなる群より選択される１種以上の植物抽出物を有効成分として含む、組成物。
［７］
前記植物抽出物のうちの２種以上の組合せを有効成分として含む、［６］に記載の組成物。
［８］
フキタンポポ花抽出物とカノコソウ根抽出物、フキタンポポ花抽出物とベニバナ花・茎抽出物、またはカノコソウ根抽出物とベニバナ花・茎抽出物の組合せを含む、［７］に記載の組成物。
［９］
皮膚の基底層の角化細胞においてＣＬＳＰの発現を促進させるための組成物であって、１，８−シネオール、酢酸ヘキシル、リナロール、酢酸リナリル、および酪酸エチルからなる群より選択される１種以上の化合物を有効成分として含む、組成物。
［１０］
前記化合物のうちの２種以上の組合せを有効成分として含む、［９］に記載の組成物。
［１１］
１，８−シネオールと酢酸ヘキシル、１，８−シネオールとリナロール、または酢酸ヘキシルとリナロールの組合せを含む、［１０］に記載の組成物。
［１２］
皮膚の基底層の角化細胞においてＣＬＳＰの発現を促進させるための多成分組成物であって、［６］〜［８］のいずれかに記載の組成物と、［９］〜［１１］のいずれかに記載の組成物とを含む、多成分組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａは、正常ヒト表皮角化細胞の播種６日後、９日後、および１３日後における内因性ＣＬＳＰタンパク質の発現を示す。図１Ｂは、播種の２４時間後および７２時間後に過酸化水素に曝露された正常ヒト表皮角化細胞（＋）では、過酸化水素未処置の細胞（−）と比べて、播種１５日後のＣＬＳＰ発現量が増加していたことを示す。図１Ｃは、播種の２日後および４日後に紫外線を照射された正常ヒト表皮角化細胞（＋）では、紫外線照射なしの細胞（−）と比べて、数日後のＣＬＳＰ発現量が増加していたことを示す。
【図２】図２は、ＳＡ−βｇａｌ活性で表される角化細胞の細胞老化に対する、単離された組換え全長ＣＬＳＰポリペプチドの効果を示す。過酸化水素未処置の細胞（−）と比べて、過酸化水素処置細胞（＋）では著しい細胞老化が誘導されたが、単離された組換え全長ＣＬＳＰポリペプチド（ＣＬＳＰ）の投与はその細胞老化を抑制したことが示されている。
【図３】図３は、図２と同様の実験であり、組換え全長ＣＬＳＰポリペプチド（ＣＬＳＰ）の他にＮ末端欠損ＣＬＳＰポリペプチドΔＮ２および１４−３−３σの影響を試験した結果を示している。
【図４】図４も図２と同様の実験であり、組換え全長ＣＬＳＰポリペプチド（ＣＬＳＰ）を１４−３−３σと混ぜて投与した場合の結果を示している。
【図５】図５も図２と同様の実験であり、組換え全長ＣＬＳＰポリペプチド（ＣＬＳＰ）投与前に抗ｇｐ１３０抗体（Ａｎｔｉｇｐ１３０）でｇｐ１３０をブロックすることの影響を試験した結果を示している。
【図６】図６は、過酸化水素ではなく紫外線によって細胞老化を誘導して、図３と同様の実験を行った結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
一側面において、本開示は、皮膚の角化細胞の細胞老化を防止するための組成物を提供する。細胞老化とは、それまで増殖能を有していた正常細胞に起こる不可逆的な増殖停止状態である。
【００１７】
細胞老化に入った細胞の特徴の１つとして、ｐＨ依存的なβ−ガラクトシダーゼ活性の発現が挙げられる。すなわち、細胞老化に入った細胞は、非老化細胞もしくは単に一時的に静止している細胞または不死化細胞には見られない、ｐＨ６でのβ−ガラクトシダーゼ活性を発現する。これは細胞老化関連β−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−βｇａｌ：senescence-associated beta-galactosidase）活性と呼ばれる。ＳＡ−βｇａｌは、最も典型的には、β−ガラクトシダーゼの基質であるＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）によって検出される。Ｘ−ｇａｌは、ＳＡ−βｇａｌ活性により分解されると青色を呈するため、顕微鏡的に細胞老化を検出することができる。ＳＡ−βｇａｌ活性を検出または測定するために使用される基質のもう１つの例は、５−ドデカノイルアミノフルオレセイン  ジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｃ１２ＦＤＧ）である。Ｃ１２ＦＤＧは、ＳＡ−βｇａｌ活性により分解されると蛍光を発する。細胞老化の現象ならびにＳＡ−βｇａｌ活性およびそのアッセイ方法は当業者によく知られており、例えばNature Protocols, 2009, Vol. 4, No. 12, 1798-1806に詳しく記述されている。
【００１８】
従って、一実施形態において細胞老化は、ｐＨ６におけるβガラクトシダーゼ活性によって示される細胞老化である。本実施形態の組成物の投与は、その組成物が投与されない場合と比べて、ＳＡ−βｇａｌ活性の防止を達成することができる。防止とは、ＳＡ−βｇａｌ活性発現の消失または低減を意味する。なお、本開示における投与とは、組成物の有効成分を生細胞に送達することを意味し、例えば化粧的に皮膚組織に適用する行為も投与に含まれ得る。
【００１９】
本実施形態の組成物は、単離された組換え全長ＣＬＳＰポリペプチドを有効成分として含む。ポリペプチドはタンパク質およびタンパク質断片を包含する。ヒト由来の全長ＣＬＳＰポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１に示されており、ＧｅｎＢａｎｋデータベースの参照番号NM_017422.4においても参照することができる。本実施形態におけるＣＬＳＰポリペプチドは、当業者に知られる遺伝子工学的技術によって、細菌、特に大腸菌において発現させたＣＬＳＰポリペプチドを精製して単離することにより取得することができる、組換えＣＬＳＰポリペプチドである。組換えＣＬＳＰポリペプチドは、内因性ポリペプチドと区別される外因性のポリペプチドである。単離とは、実質的に他のポリペプチドを含まない状態まで精製されたことを意味する。例えば、単離されたＣＬＳＰポリペプチドの試料は、乾燥重量でポリペプチド成分の９９％以上がそのＣＬＳＰポリペプチドからなり、より好ましくは９９．９％以上がそのＣＬＳＰポリペプチドからなる。
【００２０】
そのように単離された組換え全長ＣＬＳＰポリペプチドは単量体の形態で存在すると考えられる。ＣＬＳＰポリペプチドが単量体であることは、例えば、変性条件でのポリアクリルアミドゲル電気泳動で一本のバンドとして検出されることに加えて、未変性条件でのポリアクリルアミドゲル電気泳動またはゲル濾過クロマトグラフィーにおいて、単量体に相当する単一の分子種が検出されることにより確認することができる。他種類のポリペプチドとの混合物において結合、会合、あるいは複合体が形成していないことも同様の手法で確認され得る。
【００２１】
ＣＬＳＰポリペプチド分子が溶液中で他のポリペプチド分子と共存すると、分子同士が衝突し一時的に接触する可能性は避けられないが、これは通常の意味での「結合」、「会合」、あるいは「複合体」には該当しないことが当業者に理解される。従って本実施形態の組成物は他のポリペプチドを必ずしも排除しない。しかしいずれにせよ、本実施形態の組成物は、組換え全長ＣＬＳＰポリペプチド以外のポリペプチドを含まないことが好ましい。特に、本実施形態の組成物は、１４−３−３σタンパク質を含まないことが好ましい。組換え全長ＣＬＳＰポリペプチド以外のポリペプチドが組成物に含まれている場合であっても、その合計モル数は組換え全長ＣＬＳＰポリペプチドの合計モル数の１０分の１以下であることが好ましく、１００分の１以下であることがより好ましく、１０００分の１以下であることがさらに好ましい。
【００２２】
本実施形態におけるＣＬＳＰポリペプチドは、５〜１００ｎＭの濃度において基底層の角化細胞に送達される。この濃度は好ましくは５〜５０ｎＭであり、より好ましくは５〜１５ｎＭである。これらの濃度におけるＣＬＳＰポリペプチドを基底層の角化細胞に送達することを達成できる投与態様は、当業者が通常の知識に基づいて適宜選択することができる。例えば、皮内注射またはマイクロニードルにより組成物を直接的に基底層に送達することができる。
【００２３】
本実施形態の組成物は、ＣＬＳＰポリペプチドの他に、薬学的に許容される担体を含み得る。そのような担体の特に好ましい例は水である。本実施形態の組成物は、薬学的に許容されるさらなる添加成分を含み得る。その例としては、緩衝剤、無機塩、グリセロール、動物性または植物性の油脂、界面活性剤、着色剤、および香料が挙げられるが、これらに限定されない。他の例としては、ヒアルロン酸、コラーゲン、セラミド、ローヤルゼリー、アミノ酸、ビタミン、植物脂質、および植物エキスが挙げられるが、これらに限定されない。本開示の下記の実施形態に記述される植物抽出物または化合物も、本実施形態の組成物における添加成分として好適である。一実施形態において、組成物は、植物脂質を含まない。
【００２４】
別の側面において、本開示は、上記実施形態の組成物を製造する方法を提供する。この方法は、大腸菌において全長ＣＬＳＰポリペプチドを発現させること、その大腸菌細胞を溶解して全長ＣＬＳＰポリペプチドを放出させること、および、放出された全長ＣＬＳＰポリペプチドを精製して、単離された全長ＣＬＳＰポリペプチドを含む水溶液を取得することを含む。大腸菌溶解物から目的のポリペプチドを精製する技術は当業者に多数知られており、本実施形態においても適宜選択することができる。例えば、ＣＬＳＰ特異的抗体を利用する精製、親和性タグを介した精製、各種親和性カラム上の結合・溶解特性を利用した精製、電気泳動ゲルからバンドを切り出すことによる精製、およびこれらの手法の任意の組合せなどが利用され得る。
【００２５】
別の側面において、本開示は、角化細胞と、単離された組換え全長ＣＬＳＰポリペプチドと、細胞老化マーカーであるｐＨ６におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の基質であるＸ−ｇａｌまたはＣ１２ＦＤＧとを含んでなるインビトロ組成物を提供する。この組成物は、例えば細胞老化促進因子を同定すること、細胞老化抑制因子を同定すること、およびそれらの相互作用を分析することなどにおいて有用となり得る。この組成物におけるＣＬＳＰポリペプチドの濃度は例えば５〜１００ｎＭ、５〜５０ｎＭ、または５〜１５ｎＭであり得るがこれらに必ずしも限定されない。この組成物のｐＨは６．０±０．５であることが好ましく、６．０±０．１であることがより好ましい。この組成物における角化細胞は、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドまたはその組合せのような、顕微鏡の技術において知られる固定剤で固定されていてもよい。
【００２６】
例えば、本インビトロ組成物を複数の候補化合物とそれぞれ混合するスクリーニングを行うことにより、増殖段階の角化細胞における全長ＣＬＳＰポリペプチドによる抗細胞老化作用を阻害する化合物、あるいは増強する化合物を同定することが可能になり得る。
【００２７】
上記実施形態により、増殖段階の角化細胞、すなわち基底層の角化細胞においては、特定の複合形を調製するまでもなく、単量体の全長ＣＬＳＰポリペプチドを導入すれば細胞老化防止という作用が得られることが示された。
【００２８】
別の側面において、本開示は、皮膚の角化細胞においてＣＬＳＰの発現を促進させるための組成物を提供する。本実施形態の組成物は、フキタンポポ花抽出物、カノコソウ根抽出物、ベニバナ花・茎抽出物、イタドリ根抽出物、ホーリーバジル葉抽出物、およびホッカイトウキ根抽出物からなる群より選択される１種以上の植物抽出物を有効成分として含む。本実施形態の角化細胞は、増殖段階または分化段階のいずれの角化細胞でもあり得るが、特に増殖段階の角化細胞、すなわち基底層の角化細胞が好適である。
【００２９】
フキタンポポ花抽出物は、エタノール水溶液を抽出溶媒としてフキタンポポの花から抽出を行い、その得られた抽出液を乾燥して得られる固形分である。このエタノール水溶液のエタノール濃度は例えば２０〜８０重量％、好ましくは３０〜７０重量％、より好ましくは４０〜６０重量％であり得る。５０重量％のエタノールを含むエタノール水溶液が特に好適である。
【００３０】
ベニバナ花・茎抽出物、イタドリ根抽出物、ホーリーバジル葉抽出物、およびホッカイトウキ根抽出物は、それぞれ、上述したエタノール水溶液を抽出溶媒として、ベニバナの花・茎、イタドリの根、ホーリーバジルの葉、およびホッカイトウキの根から抽出を行い、その得られた抽出液を乾燥して得られる固形分である。カノコソウ根抽出物は、熱水を抽出溶媒として、カノコソウの根から抽出を行い、その得られた抽出液を乾燥して得られる固形分である。この熱水の温度は例えば８０℃以上であり、好ましくは９０℃以上であり、より好ましくは１００℃以上である。
【００３１】
フキタンポポ花抽出物は、好ましくは０．００５〜０．０４重量％、より好ましくは０．０１〜０．０３重量％、さらに好ましくは０．０１５〜０．０２重量％の濃度で組成物に含まれ得る。
【００３２】
カノコソウ根抽出物は、好ましくは０．００１〜０．０１重量％、より好ましくは０．００２〜０．００７重量％、さらに好ましくは０．００３〜０．００５重量％の濃度で組成物に含まれ得る。
【００３３】
ベニバナ花・茎抽出物は、好ましくは０．００５〜０．０４重量％、より好ましくは０．０１〜０．０３重量％、さらに好ましくは０．０１５〜０．０２重量％の濃度で組成物に含まれ得る。
【００３４】
イタドリ根抽出物は、好ましくは０．００１〜０．０１重量％、より好ましくは０．００２〜０．００７重量％、さらに好ましくは０．００３〜０．００５重量％の濃度で組成物に含まれ得る。
【００３５】
ホーリーバジル葉抽出物は、好ましくは０．００２〜０．０２重量％、より好ましくは０．００５〜０．０１５重量％、さらに好ましくは０．００７〜０．０１重量％の濃度で組成物に含まれ得る。
【００３６】
ホッカイトウキ根抽出物は、好ましくは０．０１〜０．１重量％、より好ましくは０．０２〜０．０７重量％、さらに好ましくは０．０３〜０．０５重量％の濃度で組成物に含まれ得る。
【００３７】
上記植物抽出物のうちの２種類以上の組合せが組成物に含まれていると、個々の抽出物単独の効果の合計から期待される結果を上回る相乗効果が奏され得るため、特に好ましい。特に、本実施形態の組成物は、フキタンポポ花抽出物とカノコソウ根抽出物、フキタンポポ花抽出物とベニバナ花・茎抽出物、またはカノコソウ根抽出物とベニバナ花・茎抽出物の組合せを含むことが好ましい。２種類以上の植物抽出物の組合せが組成物に含まれる場合には、この相乗効果のため、各抽出物の含有量を低減させてもよい。例えば、上述した濃度の半分以下にし得る。
【００３８】
別の側面において、本開示は、皮膚の角化細胞においてＣＬＳＰの発現を促進させるための組成物であって、１，８−シネオール、酢酸ヘキシル、リナロール、酢酸リナリル、および酪酸エチルからなる群より選択される１種以上の化合物を有効成分として含む組成物を提供する。本実施形態の角化細胞は、増殖段階または分化段階のいずれの角化細胞でもあり得るが、特に増殖段階の角化細胞、すなわち基底層の角化細胞が好適である。
【００３９】
１，８−シネオールは、好ましくは１〜１０ｍＭ、より好ましくは２〜７ｍＭ、さらに好ましくは３〜５ｍＭの濃度で組成物に含まれ得る。
【００４０】
酢酸ヘキシルは、好ましくは０．５〜５ｍＭ、より好ましくは１〜３ｍＭ、さらに好ましくは２〜２．５ｍＭの濃度で組成物に含まれ得る。
【００４１】
リナロールは、好ましくは０．５〜５ｍＭ、より好ましくは１〜３ｍＭ、さらに好ましくは２〜２．５ｍＭの濃度で組成物に含まれ得る。
【００４２】
酢酸リナリルは、好ましくは０．１〜１ｍＭ，より好ましくは０．２〜０．７ｍＭ、さらに好ましくは０．３〜０．５ｍＭの濃度で組成物に含まれ得る。
【００４３】
酪酸エチルは、好ましくは１〜１０ｍＭ、より好ましくは２〜７ｍＭ、さらに好ましくは３〜５ｍＭの濃度で組成物に含まれ得る。
【００４４】
上記化合物のうちの２種類以上の組合せが組成物に含まれていると、個々の化合物単独の効果の合計から期待される結果を上回る相乗効果が奏され得るため、特に好ましい。特に、本実施形態の組成物は、１，８−シネオールと酢酸ヘキシル、１，８−シネオールとリナロール、または酢酸ヘキシルとリナロールの組合せを含むことが好ましい。２種類以上のこれら化合物の組合せが組成物に含まれる場合には、この相乗効果のため、各化合物の含有量を低減させてもよい。例えば、上述した濃度の半分以下にし得る。
【００４５】
上述した１種以上の植物抽出物と、上述した１種以上の化合物とを組み合わせて含む多成分組成物は、角化細胞においてＣＬＳＰの発現を促進させるうえで特に効果的である。例えば、フキタンポポ花抽出物と、１，８−シネオール、酢酸ヘキシル、および／またはリナロールを含む組成物が好ましい。１，８−シネオールと、フキタンポポ花抽出物、カノコソウ根抽出物、および／またはベニバナ花・茎抽出物を含む組成物も好ましい。
【００４６】
上述した１種以上の植物抽出物および／または上述した１種以上の化合物を含む組成物の実施形態は、これらの成分の他に、薬学的に許容される担体を含み得る。そのような担体の特に好ましい例は水である。本実施形態の組成物は、薬学的に許容されるさらなる添加成分を含み得る。その例としては、緩衝剤、無機塩、グリセロール、動物性または植物性の油脂、界面活性剤、着色剤、および香料が挙げられるが、これらに限定されない。他の例としては、ヒアルロン酸、コラーゲン、セラミド、ローヤルゼリー、アミノ酸、タンパク質、ビタミン、植物脂質、および植物エキスが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、組成物は、植物脂質を含まない。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例を示して実施形態をさらに具体的に説明するが、本開示はこれらの実施形態に限定されない。
【００４８】
［細胞培養全般］
正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）はＫＵＲＡＢＯ ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳから入手した（製品番号ＫＫ−４００９）。培養培地として、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２（クラボウ製増殖用培地、製品番号ＫＫ２１５０−Ｓ）を使用した。ポリペプチド試料を添加する実験においては、その添加時にＨｕＭｅｄｉａ−ＫＢ２（増殖添加剤非含有のもの、製品番号ＫＫ２３５０−Ｓ）を使用した。培養は５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃の温度において行った。細胞を継代培養するためには、細胞密度が６０〜７０％飽和に達した段階で７５ｃｍ２フラスコあたり２５×１０４細胞の密度に薄めて直して植え継いだ。細胞の分化を進行させるためには、細胞密度が飽和（コンフルエンシー）に達するに任せてそのまま培養を続けた。いずれの場合も２日おきに新鮮な培地で培地交換を行った。
【００４９】
［正常角化細胞における内因性ＣＬＳＰの発現］
ＮＨＥＫを１０×１０４細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに播き、２日おきに培地交換した。細胞播種の６日、９日および１３日後に、細胞を１×ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で１回洗浄した後ＩＰバッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ｃＯｍｐｌｅｔｅ（登録商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル）に懸濁させ、スクレーパーで回収した。回収した細胞懸濁液をソニケーション処理して細胞を溶解した後、溶解液を遠心分離して上清を回収し、ウエスタンブロッティング用試料とした。
【００５０】
ＣＬＳＰ（ｈＣＬＳＰ）を標識するための一次抗体として、Ｎ末端を認識するウサギポリクローナル抗体を使用した。β−アクチンを標識するための一次抗体として、シグマアルドリッチ社のウサギ抗アクチン（２０−３３）ポリクローナル抗体（カタログ番号Ａ５０６０）を使用した。両者に共通の二次抗体としては、ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を使用した。ＨＲＰ基質を含むＥＣＬ（商標）Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して、ウエスタンブロット上の特異的抗原・抗体結合を検出した。
【００５１】
図１Ａに示す結果は、播種後第６日の角化細胞ではＣＬＳＰが検出されないのに対し、９日目以降には角化細胞の分化が進んでＣＬＳＰの発現が検出され上昇していくことを示している。この結果は非特許文献１、２の記述と合致している。なお、β−アクチンの検出量は、各レーンにほぼ同量の細胞がロードされたことを確認するものである。
【００５２】
［過酸化水素曝露および紫外線照射の影響］
（過酸化水素処置）
ＮＨＥＫ細胞播種の２４時間後および７２時間後に、細胞をＫＢ２培地中１００μＭの過酸化水素で２時間処置した。いずれも処置後は１×ＰＢＳで２回洗浄し、ＫＧ２培地で培養を続けた。培地交換を２日おきに実施した。細胞播種の１５日後に、細胞を１×ＰＢＳで１回洗浄した後、ＩＰバッファーで懸濁させスクレーパーで回収した。回収した細胞懸濁液をソニケーション処理して細胞を溶解した後、溶解液を遠心分離して上清を回収し、ウエスタンブロッティング用試料とした。
【００５３】
（紫外線照射）
ＵＶＡ（波長３１５〜３８０ｎｍ）試験では、細胞播種の２日後にＵＶＡを３０ｋＪ／ｍ２で照射した。ＵＶＢ（波長２８０〜３１５ｎｍ）試験では、細胞播種の２日後および４日後にＵＶＢを５ｋＪ／ｍ２で照射した。培地交換を２日おきに実施した。細胞播種の８日、１１日、および１４日後に、細胞を１×ＰＢＳで１回洗浄した後、ＩＰバッファーで懸濁させスクレーパーで回収した。回収した細胞懸濁液をソニケーション処理して細胞を溶解した後、溶解液を遠心分離して上清を回収し、ウエスタンブロッティング用試料とした。
【００５４】
図１Ｂに示されるように、未処置（−）試料と比較して過酸化水素処置試料（＋）では内因性ＣＬＳＰの発現が増加した。また、図１Ｃに示されるように、ＵＶＡおよびＵＶＢの照射はいずれも内因性ＣＬＳＰの発現を著しく増加させた。
【００５５】
［組換えＣＬＳＰポリペプチドの発現と単離］
配列番号１のアミノ酸配列を有する全長ＣＬＳＰポリペプチド、および配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＬＳＰΔＮ２ポリペプチドをそれぞれコードするＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドベクターにクローニングした。ＣＬＳＰΔＮ２は、全長ＣＬＳＰポリペプチドの第２〜６０アミノ酸残基を削除したもの、すなわち、最初のメチオニン残基を除くＮ末端領域を欠損させたものである。これらのプラスミド構築物を大腸菌で増殖させて精製した。さらに、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）融合タンパク質を作製するべく、これらのコードＤＮＡをｐＧＸ４Ｔプラスミドベクターにサブクローニングした。ｐＧＸ４Ｔ構築物から発現された融合ポリペプチドは、スロンビンで処理することにより、ＧＳＴ部分をＣＬＳＰ部分から切り離すことができる。ｐＧＸ４Ｔ構築物で形質転換された大腸菌を一日培養した後、大腸菌細胞を溶解して、ＧＳＴ融合全長ＣＬＳＰポリペプチドまたはＧＳＴ融合ＣＬＳＰΔＮ２ポリペプチドを含む細胞溶解物を回収した。
【００５６】
回収した細胞溶解物にグルタチオンビーズを加えて結合させた。カラム上でビーズ・ポリペプチド複合体を洗浄することにより大腸菌の他成分を除去した後、スロンビンで処理をして、ＧＳＴとＣＬＳＰポリペプチドとを切り離した。その後、カラム精製によりＧＳＴ結合グルタチオンビーズを除去し、溶出画分を精製組換えＣＬＳＰポリペプチドとして回収した。その試料を電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）したゲルをクマシー染色したところ、組換えＣＬＳＰポリペプチドが単離されたことが確認された。単離された組換えＣＬＳＰポリペプチドはさらに０．２μｍのフィルターで滅菌処理して、後述する細胞試験に使用した。
【００５７】
上記のように単離された組換え全長ＣＬＳＰポリペプチドの試料を、変性剤を添加しないアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＣＬＳＰのＮ末端に対するポリクローナル抗体およびヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ二次抗体を用いてウェスタンブロッティングにて標識したところ、単一のバンドが検出された。上記と同じポリペプチドを９５℃で３分間熱変性処理した試料を、同じ未変性ゲル上で並行して電気泳動させたところ、未変性試料と変性試料はどちらも、１７ｋＤａのサイズマーカー付近の同じ位置にそれぞれ一本のバンドとして検出された。これらの結果から、単離された組換え全長ＣＬＳＰポリペプチドは単量体の形態で存在していると理解される。
【００５８】
［細胞老化に対する組換え全長ＣＬＳＰポリペプチドの効果］
正常ヒト表皮角化細胞を３×１０５細胞／３５ｍｍディッシュの密度で播種した。２４時間後に、培地を無血清正常ヒト表皮角化細胞基礎培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＢ２）に交換し、その培地に、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、または単離された組換え全長ＣＬＳＰポリペプチドを、終濃度１０ｎＭになるように添加し、１時間培養した。その後、過酸化水素を含まないＰＢＳ（−）または過酸化水素を含むＰＢＳ（＋）を添加した。過酸化水素は終濃度１００μＭとなるようにした。過酸化水素添加の２時間後に、細胞を１×ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、再びＢＳＡまたは組換え全長ＣＬＳＰを終濃度１０ｎＭで含む増殖用培地に培地交換を行い、５２〜５６時間培養した。
【００５９】
その後、１×ＰＢＳ（−）で細胞を１回洗浄し、それから、Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  β Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊａｐａｎ）のＦｉｘａｔｉｖｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（固定液）を加えて、細胞を室温で１５分間固定した。さらに１×ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、同キットのＳｔａｉｎｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｘ−ｇａｌを含む）を加えて、３７℃で一晩染色を実施した。各々のディッシュについて、倍率を２００倍とした蛍光顕微鏡（ＢＺ−８０００，ＫＥＹＥＮＣＥ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）を用いランダムに３視野撮影を行って、ＳＡ−βｇａｌ染色された細胞の割合を計測した。有意差検定はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７を用いて行った（ｎ＝３）。
【００６０】
結果を図２に示す。この結果は、過酸化水素未処置試料（−）と比べて過酸化水素処置試料（＋）では著しく細胞老化が促進されたことを示している。そして、この結果は、組換え全長ＣＬＳＰポリペプチドの投与が、対照であるＢＳＡ投与と比較して、ＳＡ−βｇａｌ活性を示す細胞の割合を有意に減少させたことを示している。従って、単離された組換え全長ＣＬＳＰポリペプチドの投与によって、細胞老化を抑制すなわち防止できることが見出された。
【００６１】
図３に示す実験は、上記と同じ実験において、組換え全長ＣＬＳＰポリペプチド（ＣＬＳＰ）と同濃度のＣＬＳＰΔＮ２および１４−３−３σを試験したものである。１４−３−３σは、ＣＬＳＰと結合して角化細胞の分化の後期段階を制御するタンパク質である（非特許文献２）。しかしながら、本実験では、１４−３−３σは、増殖段階にある角化細胞の細胞老化を防止する効果は示さなかった（図３）。ＣＬＳＰΔＮ２はわずかに細胞老化を防止する傾向を示したが、全長ＣＬＳＰポリペプチドのような明確な効果は示さなかった（図３）。
【００６２】
図４に示す実験では、タンパク質同士の相互作用の影響の可能性を試験した。単離された組換え全長ＣＬＳＰをＢＳＡと混ぜて投与（各１０ｎＭ；以下同じ）した場合（ＣＬＳＰ／ＢＳＡ）にも、上記と同様に明確な細胞老化防止効果が観察された。ＢＳＡと１４−３−３σの混合物（ＢＳＡ／１４−３−３σ）ではそのような効果は得られなかった。組換え全長ＣＬＳＰに１４−３−３σを組み合わせた場合（ＣＬＳＰ／１４−３−３σ）には、細胞老化を示す細胞の割合がＣＬＳＰ／ＢＳＡと比べてやや増加したため、１４−３−３σは、増殖角化細胞の細胞老化防止に関してはＣＬＳＰを抑制する活性を有する可能性が示唆された。
【００６３】
図５に示す実験では、抗ｇｐ１３０抗体の効果を試験した。ｇｐ１３０は、ヒューマニンの受容体を構成する３つのサブユニットのうちの１つである。特許文献４は、ＣＬＳＰもヒューマニンと同様にこの受容体に結合することを記載している。正常ヒト表皮角化細胞を３×１０５細胞／３５ｍｍディッシュの密度で播種した。細胞播種の２３時間後に、マウス抗ヒトｇｐ１３０モノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ｇｐ１３０  ＭＡｂ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）または正常マウスＩｇＧを６０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む無血清正常ヒト表皮角化細胞基礎培地へと培地交換を行い、１時間培養した。細胞播種から２４時間目以降は、上述したＣＬＳＰ投与実験と同じ手順で実験を行った。
【００６４】
図５の実験でも、上述した実験と同様に、過酸化水素による処置は細胞老化を促進させ（（＋）を（−）と比較）、組換え全長ＣＬＳＰはその細胞老化を防止した（ＣＬＳＰ（＋）をＢＳＡ（＋）と比較）。そして、抗ｇｐ１３０抗体で細胞を事前処理した場合には、組換え全長ＣＬＳＰによる細胞老化防止効果が阻害されると見られた（ＣＬＳＰ（＋）とＣＬＳＰ／Ａｎｔｉｇｐ１３０（＋）を比較）。抗ｇｐ１３０抗体の代わりに正常ＩｇＧを用いた場合にはこの阻害は見られなかったため、この阻害は抗ｇｐ１３０抗体に特異的である（ＣＬＳＰ／Ａｎｔｉｇｐ１３０（＋）とＣＬＳＰ／ＩｇＧ（＋）を比較）。これらの結果は、増殖角化細胞において組換え全長ＣＬＳＰが有する細胞老化防止能力はｇｐ１３０を含む受容体を介して発揮され、抗ｇｐ１３０抗体によって受容体をブロックすると細胞老化防止効果が失われるという解釈を支持するものである。
【００６５】
図６に示す実験では、過酸化水素曝露ではなく紫外線照射によって細胞老化を誘導し、組換え全長ＣＬＳＰの効果を調べた。まず、正常ヒト表皮角化細胞を２×１０５細胞／３５ｍｍディッシュの細胞密度で播種し、２４時間後に培地を無血清正常ヒト表皮角化細胞基礎培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＢ２）に交換し、そこへＢＳＡ、組換え全長ＣＬＳＰポリペプチド（ＣＬＳＰ）またはΔＮ２（ｄｅｌｔａＮ２）を、終濃度１０ｎＭになるように添加し、１時間培養した。その後、終濃度１０ｎＭのＢＳＡ、組換え全長ＣＬＳＰまたはΔＮ２を含むＨａｎｋ’ｓ Ｂｕｆｆｅｒに培地を交換し、ＵＶＢを５ｋＪ／ｍ２にて照射した。照射後、１×ＰＢＳで細胞を洗浄し、ＢＳＡ、組換え全長ＣＬＳＰまたはΔＮ２を終濃度１０ｎＭで含む増殖用培地へと培地交換を行い、５２〜５６時間培養した。それから細胞を１×ＰＢＳで１回洗浄した後、Ｆｉｘａｔｉｖｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えて細胞を室温で１５分間固定した。さらに１×ＰＢＳで２回洗浄後、Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えて、３７℃で一晩染色を行った。各々のディッシュについて、倍率を２００倍とした蛍光顕微鏡（ＢＺ−８０００，ＫＥＹＥＮＣＥ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）を用いてランダムに３視野撮影を行って、ＳＡ−βｇａｌ染色された細胞の割合を計測した。
【００６６】
図６において、「−」はＵＶ照射なしの試料を表し、「＋」はＵＶ照射ありの試料を表す。図３の実験と本質的に同じ結果が得られた。従って、組換え全長ＣＬＳＰの細胞老化防止効果は、過酸化水素による細胞老化に特異的なものではないことが示された。
【００６７】
図２〜６において、データは平均±標準誤差として表示されており、これらは、エクセル統計、ＡＮＯＶＡ４ソフトウェア、またはＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、スチューデントのｔ検定、一元配置分散分析、または反復測定分散分析により分析した。一元配置分散分析に続いてダネットまたはテューキーの検定を行った。
【００６８】
［ＣＬＳＰ発現促進物質の同定］
角化細胞においてＣＬＳＰの発現を上昇させる潜在的能力について、多数の化合物および植物抽出物のスクリーニングを行った。そのスクリーニングによって見出された特定の化合物および植物抽出物の検証実験を以下に記述する。
【００６９】
ヒト表皮角化細胞を３×１０５細胞／ウェルの細胞密度にて６ウェルプレートに播種し、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地中で一晩培養した。１．８−シネオールを５ｍＭ、リナロールを２．５ｍＭ、酢酸リナリルを０．５ｍＭ、酢酸ヘキシルを２．５ｍＭ、酪酸エチルを５ｍＭ、ベニバナエキス末を０．２ｍｇ／ｍＬ、ホッカイトウキエキス末を０．５ｍｇ／ｍＬ、ホーリーバジルエキス末を０．１ｍｇ／ｍＬ、フキタンポポエキス末を０．２ｍｇ／ｍＬ、カノコソウエキス末を５０μｇ／ｍＬ、もしくはイタドリエキス末を５０μｇ／ｍＬとなるように添加・溶解した新鮮培地、またはこれらの物質を添加しない新鮮培地で、培地交換を行い、さらに２４時間培養した。その後採取した細胞から、市販のＲＮＡ抽出キットを使用して全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成を行った。ＣＬＳＰ遺伝子またはＧＡＰＤＨ遺伝子に特異的な下記のプライマーを使用して、サイバーグリーン法によるリアルタイムＰＣＲにより遺伝子発現レベルを定量化した。ＧＡＰＤＨは内部標準として使用した。
【００７０】
ＰＣＲプライマー配列
ＣＬＳＰフォワード：GTTGACACGGATGGAAACG（配列番号３）
ＣＬＳＰリバース：ACTCCTGGAAGCTGATTTCG（配列番号４）
ＧＡＰＤＨフォワード：CCACTCCTCCACCTTTGACG（配列番号５）
ＧＡＰＤＨリバース：CACCCTGTTGCTGTAGCCAA（配列番号６）
【００７１】
この実験に使用されたベニバナエキス末は、５０％エタノールを抽出溶媒としてベニバナの花・茎から抽出した抽出液を乾燥させて得られた固形分である。ホッカイトウキエキス末は、５０％エタノールを抽出溶媒としてホッカイトウキの根から抽出した抽出液を乾燥させて得られた固形分である。ホーリーバジルエキス末は、５０％エタノールを抽出溶媒としてホーリーバジルの葉から抽出した抽出液を乾燥させて得られた固形分である。フキタンポポエキス末は、５０％エタノールを抽出溶媒としてフキタンポポの花から抽出した抽出液を乾燥させて得られた固形分である。カノコソウエキス末は、熱水を抽出溶媒としてカノコソウの根から抽出した抽出液を乾燥させて得られた固形分である。イタドリエキス末は、５０％エタノールを抽出溶媒としてイタドリの根から抽出した抽出液を乾燥させて得られた固形分である。
【００７２】
結果を下記表１に示す。これらの化合物または植物抽出物の投与によりＣＬＳＰの発現が促進されたことが確認された。
【００７３】
【表１】
2020015668.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明は、皮膚の美容、化粧、および健康に関する産業分野、ならびに皮膚老化の研究に関する産業分野において利用され得る。
【図１】
2020015668.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
2020015668.tif 000007
【図５】
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【図６】
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【配列表】
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