(57)【要約】【課題】  本発明は、イムノクロマトキットに使用可能な検体処理液に関するものであり、バックグラウンドの着色および非特異吸着が生じない検体処理液を提供することを目的とする。【手段】  金属−樹脂複合体粒子を備えた標識物質を用いたイムノクロマトキットの検体処理液であって、０．３〜５ｗｔ％のポリソルベート界面活性剤を含有する水溶液である検体処理液。【選択図】図２
2020052017.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属−樹脂複合体粒子を備えた標識物質を用いたイムノクロマトキットの検体処理液であって、０．３〜５ｗｔ％のポリソルベート界面活性剤を含有する水溶液であることを特徴とする、検体処理液。
【請求項２】
さらに、０．０１〜５ｗｔ％の乳由来ブロッキング剤を含有する、請求項１に記載の検体処理液。
【請求項３】
さらに、０．３〜１．０ｗｔ％の緩衝剤及び０．５〜２．０ｗｔ％の塩成分を含有する、請求項１又は２に記載の検体処理液。
【請求項４】
さらに、０．１〜３．０ｗｔ％の血清由来タンパク質を含有する、請求項１〜３の何れか１項に記載の検体処理液。
【請求項５】
ｐＨが７〜９である、請求項１〜４の何れか１項に記載の検体処理液。
【請求項６】
さらに、ポリオキシエチレン(アルキルフェニル)エーテル界面活性剤を０．２０ｗｔ％以下で含有する、請求項１〜５の何れか１項に記載の検体処理液。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか１項に記載の検体処理液を備えることを特徴とする、イムノクロマトキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属−樹脂複合体粒子を標識物質として備えたイムノクロマトキットに使用可能な検体処理液に関する。
【背景技術】
【０００２】
イムノクロマトグラフィー向けの標識物質としては、従来、金属コロイドや、色素で着色した樹脂粒子が使用されてきた。これらに代わる新しい標識物質として、近年、金属ナノ粒子が吸着した樹脂微粒子が提案されている。例えば、特許文献１では、ポリマー系ラテックス粒子の表面に結合した金ナノ粒子からなる着色ラテックスが提案されている。ポリマー系ラテックス粒子の表面に金ナノ粒子を結合させることにより、該金ナノ粒子自身が着色剤として目視判定性や検出感度の向上に役立つ一方、金ナノ粒子自身が抗原又は抗体に対する結合性にも優れることから、充分な濃色となる程度にまで金ナノ粒子を結合させても充分な量の抗原又は抗体を結合させ得るとされている。
【０００３】
また、本発明者らは、このような着色した微粒子として、先に、高感度な免疫学的測定を可能にする標識物質として、特定の構造の金属−樹脂複合体粒子を提案した（特許文献３及び４）。この金属−樹脂複合体粒子は、樹脂粒子の表層に複数の金属粒子が３次元的に固定化された構造を有するため、金属粒子の担持量が多く、また、金属粒子が樹脂粒子から脱離しにくいといった特性を有する。さらに、金属粒子は、局在型表面プラズモン共鳴に加え、電子遷移による光エネルギー吸収を発現するといった特性を有する。
【０００４】
しかし、この金属−樹脂複合体粒子を標識物質として用いたイムノクロマトキットは、高い感度を有する一方で、抗体の種類によっては、バックグラウンドの着色が生じる、非特異吸着が生じるといった問題があった。そのため、金属−樹脂複合体粒子をイムノクロマトキットの標識物質として使う場合に、抗体の種類によっては適用できないことがあった。
【０００５】
イムノクロマトキットに使用する、一般的な検体処理液は、緩衝剤、塩、水溶性タンパク質、および界面活性剤からなる水溶液である。検体処理液の最適な組成は、測定条件、検体採取法、標識物質、抗体等によって大きく異なる。例えば、標識物質として金属コロイドを使用する場合の検体処理液（特許文献５〜７）、色素で着色した樹脂粒子を使用した場合（特許文献８及び９）が開示されている。
しかし、これまで、標識物質として金属−樹脂複合体粒子を使用した場合の検体処理液については、検討されてこなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−１６８４９５号公報
【特許文献２】特開平３−２０６９５９号公報
【特許文献３】ＷＯ２０１６／００２７４２
【特許文献４】ＷＯ２０１６／００２７４３
【特許文献５】特開２０１４−２１０７６１号公報
【特許文献６】特許５５９７１９０号公報
【特許文献７】特願２０１０−２００７９３号公報
【特許文献８】特願平１０−２６８１８０号公報
【特許文献９】特願２０００−１５２９７４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
例えば、従来の色素で着色した樹脂粒子に適した組成の検体処理液を用いて評価すると、バックグラウンドの着色が生じる問題があった。そのため、界面活性剤を変更すると、バックグラウンドを低減できるが、非特異吸着が生じてしまう問題があった。
【０００８】
従って、本発明は、バックグラウンドの着色および非特異吸着が生じない検体処理液を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、特定の組成の検体処理液によって、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
本発明の検体処理液は、金属−樹脂複合体粒子を備えた標識物質を用いたイムノクロマトキットの検体処理液であって、０．３〜５ｗｔ％のポリソルベート界面活性剤を含有する水溶液であることを特徴とする。
【００１１】
本発明の検体処理液において、さらに、０．０１〜５ｗｔ％の乳由来ブロッキング剤を含有することが好適である。
【００１２】
本発明の検体処理液において、さらに、０．３〜１．０ｗｔ％の緩衝剤及び０．５〜２．０ｗｔ％の塩成分を含有することが好適である。
【００１３】
本発明の検体処理液において、さらに、０．１〜３．０ｗｔ％の血清由来タンパク質を含有することが好適である。
【００１４】
本発明の検体処理液において、ｐＨが７〜９であることが好適である。
【００１５】
本発明の検体処理液において、さらにポリオキシエチレン(アルキルフェニル)エーテル界面活性剤を０．２０ｗｔ％以下で含有することが好適である。
【００１６】
本発明のイムノクロマトキットは、前記、検体処理液を備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によって、バックグラウンドの着色および非特異吸着が生じない検体処理液が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の実施形態にかかる「金属−樹脂複合体粒子の断面模式図である。
【図２】本発明の検体処理液を用いた、イムノクロマトキットの構造を表す、断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
＜金属−樹脂複合体粒子＞
次に、本実施の形態の標識抗体の製造方法において標識物質として使用される金属−樹脂複合体粒子について詳細に説明する。
金属−樹脂複合体粒子は、樹脂粒子に金属粒子が固定化された構造を有する。また、金属−樹脂複合体粒子には、さらに有機色素が固定化されていてもよい。前記有機色素又は金属粒子の構造は限定しないが、樹脂粒子に固定化されることで、樹脂粒子が着色されるものであれば、イムノクロマトグラフィー等の免疫学的測定用途として、目視判定が容易になるので好ましい。
【００２０】
以下に、樹脂粒子に金属粒子が固定化された金属−樹脂複合体粒子の例について説明する。
図１は、本実施の形態において標識物質として好ましく使用可能な、樹脂粒子に複数の金属粒子が固定化された構造を有する金属−樹脂複合体粒子の断面模式図である。金属−樹脂複合体１００は、樹脂粒子１０と、金属粒子２０と、を備えている。
【００２１】
金属−樹脂複合体１００は、樹脂粒子１０に金属粒子２０が分散または固定化されている。また、金属−樹脂複合体１００は、金属粒子２０の一部が樹脂粒子１０の表層部６０において二次元的または三次元的に分布し、かつ前記二次元的または三次元的に分布した金属粒子２０の一部が部分的に樹脂粒子１０外に露出しており、残りの一部が樹脂粒子１０に内包されている。
【００２２】
ここで、金属粒子２０には、樹脂粒子１０に完全に内包された金属粒子（以下、「内包金属粒子３０」ともいう。）、樹脂粒子１０内に埋包された部位及び樹脂粒子１０外に露出した部位を有する金属粒子（以下、「一部露出金属粒子４０」ともいう。）及び樹脂粒子１０の表面に吸着している金属粒子（以下、「表面吸着金属粒子５０」ともいう。）が存在する。一部露出金属粒子４０及び表面吸着金属粒子５０は、本発明における「第１の粒子」に該当し、内包金属粒子３０は、本発明における「第２の粒子」に該当する。
【００２３】
例えば、金属−樹脂複合体１００を免疫学的測定に使用する場合、一部露出金属粒子４０または表面吸着金属粒子５０上に、抗体を固定化して使用する。その際、一部露出金属粒子４０及び表面吸着金属粒子５０には、前記抗体が固定化される一方で、内包金属粒子３０には、固定化されない。しかし、内包金属粒子３０を含む金属粒子２０の全てが局在型表面プラズモン吸収を発現することから、一部露出金属粒子４０及び表面吸着金属粒子５０のみならず、内包金属粒子３０も、免疫学的測定用標識としての視認性向上に寄与する。さらに、一部露出金属粒子４０及び内包金属粒子３０は、表面吸着金属粒子５０と比較して樹脂粒子１０との接触面積が大きいことに加え、埋包状態によるアンカー効果等の物理的吸着力が強く、樹脂粒子１０から脱離しにくい。そのため、金属−樹脂複合体１００を使用した免疫学的測定用標識としての耐久性、安定性を優れたものにすることができる。
【００２４】
内包金属粒子３０は、その表面の全てが、樹脂粒子１０を構成する樹脂に覆われているものである。また、一部露出金属粒子４０は、その表面積の５％以上１００％未満が、樹脂粒子１０を構成する樹脂に覆われているものである。また、表面吸着金属粒子５０は、その表面積の０％を超えて５％未満が、樹脂粒子１０を構成する樹脂に覆われているものである。
【００２５】
また、金属−樹脂複合体１００への金属粒子２０（内包金属粒子３０、一部露出金属粒子４０及び表面吸着金属粒子５０の合計）の担持量は、金属−樹脂複合体１００の重量に対して、５ｗｔ％〜７０ｗｔ％であることが好ましい。この範囲であれば、金属−樹脂複合体１００は、標識物質としての視認性、目視判定性及び検出感度に優れる。金属粒子２０の担持量が５ｗｔ％未満では、抗体の固定化量が少なくなり、検出感度が低下する傾向がある。金属粒子２０の担持量は、より好ましくは、１５ｗｔ％〜７０ｗｔ％である。
【００２６】
また、金属粒子２０の１０ｗｔ％〜９０ｗｔ％が、一部露出金属粒子４０及び表面吸着金属粒子５０であることが好ましい。この範囲であれば、金属粒子２０上への抗体の固定化量が充分確保できるため、標識物質としての感度が高い。金属粒子２０の２０ｗｔ％〜８０ｗｔ％が一部露出金属粒子４０及び表面吸着金属粒子５０であることがより好ましく、耐久性の観点から、表面吸着金属粒子５０が２０ｗｔ％以下であることがさらに好ましい。
【００２７】
また、金属粒子２０の６０ｗｔ％〜１００ｗｔ％が、表層部６０に存在し、表層部６０に存在する金属粒子２０の５ｗｔ％〜９０ｗｔ％が、一部露出金属粒子４０または表面吸着金属粒子５０であることが、金属粒子２０上への抗体の固定化量が充分確保できるため、標識物質としての感度が高くなり好ましい。換言すれば、表層部６０に存在する金属粒子２０の１０ｗｔ％〜９５ｗｔ％が内包金属粒子３０であることがよい。
【００２８】
ここで、前記「表層部」とは、樹脂粒子１０の表面から、深さ方向に粒子半径の５０％の範囲を意味する。また、前記「三次元的に分布」とは、金属粒子２０が、樹脂粒子１０の面方向だけでなく、深さ方向にも分散されていることを意味する。一方、前記「二次元的に分布」とは、金属粒子２０が、樹脂粒子１０の表面から深さ方向に等距離に分散されていることを意味する。なお、樹脂粒子１０の表面が曲面であるため、実際には金属粒子２０も二次元平面内にはとどまりえない。よって、樹脂粒子１０の表面に対して金属粒子２０が二次元「的」に分布と称するものである。樹脂粒子１０および金属粒子２０を投影した面内における金属粒子２０の投影の分布を意図するものではない。「二次元的に分布」の例としては、金属粒子２０の全てが表面吸着金属粒子５０である場合が挙げられる。
【００２９】
樹脂粒子１０は、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリ(ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム)、メラミン樹脂、尿素樹脂、アクリル樹脂、セルロース等、公知の樹脂粒子が適用できるが、金属イオンを吸着することが可能な置換基を構造に有するポリマー粒子であることが好ましい。特に、含窒素ポリマー粒子であることが好ましい。含窒素ポリマー中の窒素原子は、視認性に優れ、抗体の固定化が容易な銀、ニッケル、銅、金、白金、パラジウムなどの金属粒子の前駆体であるアニオン性金属錯イオンを化学吸着しやすいため、好ましい。本実施の形態では、含窒素ポリマー中に吸着した金属イオンを還元し、金属ナノ粒子を形成する為、生成した金属粒子２０の一部は、内包金属粒子３０または一部露出金属粒子４０となる。また、アクリル酸重合体のように、カルボン酸等はカチオン性金属イオンを吸着することができるため、銀、ニッケル、銅、金、白金、パラジウムなどの金属粒子の前駆体であるカチオン性金属イオンを吸着しやすく、銀、ニッケル、銅、金、白金、パラジウムなどの金属粒子２０を形成することが可能であり、上記のいずれかの金属との合金を作ることも可能である。
一方、金属イオンを吸着することが可能な置換基を構造に有する含窒素ポリマー以外の樹脂粒子、例えばポリスチレン等の場合、前記金属イオンを樹脂内部に吸着しにくい。その結果、生成した金属粒子２０の大部分は、表面吸着金属粒子５０となる。上記のとおり、表面吸着金属粒子５０は、樹脂粒子１０との接触面積が小さいため、樹脂と金属の接着力が小さく、樹脂粒子１０から金属粒子２０が脱離する影響が大きい傾向にある。
上記含窒素ポリマーは、主鎖または側鎖に窒素原子を有する樹脂であり、例えば、ポリアミン、ポリアミド、ポリペプチド、ポリウレタン、ポリ尿素、ポリイミド、ポリイミダゾール、ポリオキサゾール、ポリピロール、ポリアニリン等がある。好ましくは、ポリ−２−ビニルピリジン、ポリ−３−ビニルピリジン、ポリ−４−ビニルピリジン等のポリアミンである。また、側鎖に窒素原子を有する場合は、例えば、アクリル樹脂、フェノール樹脂、エポキシ樹脂等幅広く利用することが可能である。
【００３０】
金属粒子２０の材質としては、例えば、銀、ニッケル、銅、金、白金、パラジウムが適用できる。これらの金属は、単体もしくは合金等の複合体で使用することが可能である。好ましくは、視認性に優れ、抗体の固定化が容易な金、白金、パラジウムである。これらは、局在型表面プラズモン共鳴に由来する吸収を発現するため、好ましい。より好ましくは、保存安定性がよい金及び白金である。また、金属−樹脂複合体１００をｐＨ２〜９の範囲内の条件で抗体と結合させた場合に、優れた発色性が得られるという観点でも、金属粒子２０の材質として金、白金、金合金又は白金合金が最も好ましい金属種である。ここで金合金とは、例えば金と金以外の金属種からなり、金を１０重量％以上含有する合金を意味する。また、白金合金とは、例えば白金と白金以外の金属種からなり、白金を１０重量％以上含有する合金を意味する。
【００３１】
また、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察により測長される金属粒子２０の粒子径Ｄ３の平均値（平均粒子径）は、例えば１〜８０ｎｍであることが好ましい。金属粒子２０の平均粒子径が、１ｎｍ未満の場合や８０ｎｍを超える場合は、局在型表面プラズモンが発現しにくくなるため感度が低下する傾向がある。金属粒子２０の平均粒子径は、好ましくは、１ｎｍ以上７０ｎｍ未満であり、より好ましくは、１ｎｍ以上５０ｎｍ未満である。
【００３２】
また、金属−樹脂複合体１００の粒子径Ｄ１の平均値（平均粒子径）は、例えば１００〜１０００ｎｍである。金属−樹脂複合体１００の平均粒子径が１００ｎｍ未満では、例えば、金属粒子２０として金粒子又は白金粒子を使用する場合に、金属粒子の担持量が少なくなる傾向がある為、同サイズの金粒子より着色が弱くなる傾向にあり、１０００ｎｍを超えると、標識物質又は試薬とした際に、メンブランフィルター等のクロマトグラフ媒体の細孔内に詰まりやすい傾向や、分散性が低下する傾向がある。金属−樹脂複合体１００の平均粒子径は、好ましくは、１００ｎｍ以上７００ｎｍ未満であり、より好ましくは、１００ｎｍ以上６５０ｎｍ未満である。ここで、金属−樹脂複合体１００の粒子径Ｄ１は、樹脂粒子１０の粒子径Ｄ２に、一部露出金属粒子４０又は表面吸着金属粒子５０の突出部位の長さを加えた値を意味し、レーザー回折／散乱法、動的光散乱法、または遠心沈降法により測定することができる。
【００３３】
金属−樹脂複合体１００の製造方法は、特に限定されない。例えば、乳化重合法により製造した樹脂粒子１０の分散液に、金属イオンや金属錯イオンを含有する溶液を加えて、金属イオンや金属錯イオンを樹脂粒子１０に吸着させる（以下、「金属イオン吸着樹脂粒子」という。）。さらに、前記金属イオン吸着樹脂粒子を還元剤溶液中に加えることで、金属イオンを還元して金属粒子２０を生成させ、金属−樹脂複合体１００を得る。
【００３４】
また、例えば、金属粒子２０として、金粒子を使用する場合、金属錯イオンを含有する溶液としては、塩化金酸（ＨＡｕＣｌ４）水溶液等が挙げられる。また、白金粒子を使用する場合、塩化白金酸（Ｈ２ＰｔＣｌ６）水溶液等が挙げられる。また、金属イオンの代わりに金属錯体を用いても良い。
また、金属イオンまたは金属錯イオンを含有する溶液の溶媒として、水の代わりに、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔ−ブタノール等の含水アルコール又はアルコール、塩酸、硫酸、硝酸等の酸等を用いても良い。
【００３５】
また、前記溶液に、必要に応じて、例えば、ポリビニルアルコール等の水溶性高分子化合物、界面活性剤、アルコール類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類；アルキレングリコール、ポリアルキレングリコール、これらのモノアルキルエーテル又はジアルキルエーテル、グリセリン等のポリオール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類等の各種水混和性有機溶媒等の添加剤を添加してもよい。このような添加剤は、金属イオンの還元反応速度を促進し、また生成される金属粒子２０の大きさを制御するのに有効となる。
【００３６】
また、還元剤は、公知の物を用いることができる。例えば、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンボラン、クエン酸、次亜リン酸ナトリウム、抱水ヒドラジン、塩酸ヒドラジン、硫酸ヒドラジン、ホルムアルデヒド、ショ糖、ブドウ糖、アスコルビン酸、ホスフィン酸ナトリウム、ハイドロキノン、硫酸ヒドラジン、ホルムアルデヒド、ロッシェル塩等が挙げられる。このうち、水素化ホウ素ナトリウム又は、ジメチルアミンボラン、クエン酸が好ましい。還元剤溶液には、必要に応じて界面活性剤を添加したり、溶液のｐＨを調整したりすることが出来る。ｐＨ調整にはホウ酸やリン酸等の緩衝剤、塩酸や硫酸などの酸、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどのアルカリにより調整することが出来る。
さらに還元剤溶液の温度により、金属イオンの還元速度を調整することで、形成する金属粒子の粒径をコントロールすることが出来る。
【００３７】
また、前記金属イオン吸着樹脂粒子中の金属イオンを還元して金属粒子２０を生成させる際、前記金属イオン吸着樹脂粒子を還元剤溶液に添加してもよいし、還元剤を前記金属イオン吸着樹脂粒子に添加してもよいが、内包金属粒子３０及び一部露出金属粒子４０の生成しやすさの観点から、後者が好ましい。
【００３８】
以上のようにして得られる金属−樹脂複合体１００は、水への分散性を保持するために、例えば、クエン酸、ポリ−Ｌ−リシン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピリジン、ポリビニルアルコール、ＤＩＳＰＥＲＢＹＫ１９４、ＤＩＳＰＥＲＢＹＫ１８０、ＤＩＳＰＥＲＢＹＫ１８４（ビッグケミージャパン社製）等の分散剤を検体処理液に添加してもよい。さらにホウ酸やリン酸等の緩衝剤、塩酸や硫酸などの酸、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどのアルカリによりｐＨを調整し、分散性を保持することが出来る。
【００３９】
以上の構成を有する金属−樹脂複合体１００は、特に、樹脂粒子又は有機色素の表面に抗体を結合させることにより、例えばＥＩＡ：酵素免疫測定法、ＲＩＡ：放射免疫測定法、ＣＬＩＡ：化学発光免疫測定法、ＦＩＡ：蛍光免疫測定法、ＬＩＡ：ラテックス凝集免疫測定法、ＰＡ：粒子凝集法、ＩＣＡ：イムノクロマトグラフィー法、ＨＡ:赤血球凝集法、ＨＩ：赤血球凝集抑制法等の免疫学的測定法に好ましく適用できる。また、特に、低濃度域（高感度領域）での目視判定性に優れた免疫学的測定用標識物質又は免疫学的測定用試薬の材料として好ましく適用できる。また、免疫学的測定用標識物質又は免疫学的測定用試薬の形態に特に限定はないが、例えば、金属−樹脂複合体１００を水もしくは、ｐＨを調整した緩衝液中に分散させた分散液として使用できる。
【００４０】
なお、金属−樹脂複合体１００を備えた標識物質は、発色性が著しく強いため、従来の金コロイドや着色ラテックスを備えた標識物質を用いたイムノクロマトキットでは検知し得なかったメンブレンのバックグラウンドの着色と非特異吸着によるテストラインの発色が生じやすく、従来の検体処理液を用いることができなかった。本発明の検体処理液では、メンブレンのバックグラウンドの着色と非特異吸着によるテストラインの発色が抑制される
【００４１】
＜検体処理液＞
本発明の検体処理液は、主要成分として、緩衝剤、塩、血清由来タンパク質、０．３〜５ｗｔ％のポリソルベート界面活性剤および水から構成される。
また、緩衝剤は、例えば、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液、グリシンアミド緩衝液、アルギニン緩衝液、リン酸緩衝液などの公知の緩衝剤を用いることができる。ｐＨの安定のため、濃度０．３〜１．０ｗｔ％であることが好ましい。
また、塩は、生理食塩水と近い成分であることが好ましく、例えば０．５〜２．０ｗｔ％の塩化ナトリウムが好ましい。
また、血清由来タンパク質は、親水性の高い水溶性のタンパク質であって、抗体や抗原と反応しない血清タンパクであることが好ましい。たとえば、０．１〜３．０ｗｔ％のウシ血清アルブミンであることが好ましい。
また、０．３〜５ｗｔ％のポリソルベート界面活性剤は、バックグラウンドの着色を防ぐ十分な効果を得るために濃度０．５ｗｔ％以上がより好ましく、イムノクロマトキットの感度低下を防ぐため、濃度２ｗｔ％未満であることがより好ましい。ポリソルベート界面活性剤は、水溶性が高いものがより好ましく、例えば、ツイーン２０およびツイーン８０が良い。
また、本発明の検体処理液は、０．０１〜５ｗｔ％の乳由来ブロッキング剤をさらに加えることが好ましい。乳由来ブロッキング剤は、例えば、カゼイン、カゼインナトリウム、スキムミルク、ブロックエースが挙げられる。非特異吸着を抑制する十分な効果を得るため、濃度０．０５ｗｔ％以上がより好ましく、イムノクロマトキットの感度低下を防ぐため、さらに検体処理液の粘度の増大を避けるため、濃度２ｗｔ％未満であることがより好ましい。また、本発明の検体処理液のｐＨは、好ましくは７〜９である。この範囲であれば、免疫反応が正常に起こり、イムノクロマト法による検出が可能である。
【００４２】
また、本発明の検体処理液は、トリトンＸ１００に代表されるポリオキシエチレン(アルキルフェニル)エーテル界面活性剤の含有量が０．２０ｗｔ％以下であることが好ましい。この濃度範囲であれば、バックグラウンドの着色を防ぐことが可能である。
本発明の検体処理液は、必要に応じて、複数の緩衝剤、塩、血清由来タンパク、界面活性剤、ブロッキング剤および添加剤を加えてもよい。また、本発明の検体処理液は、必要に応じて、アジ化ナトリウム等の公知の防腐剤を加えてもよい。
【００４３】
次に、金属−樹脂複合体１００を標識物質として使用したアナライトの測定方法、ラテラルフロー型クロマト用テストストリップ及びアナライト検出・定量キットについて説明する。
【００４４】
［ラテラルフロー型クロマト用テストストリップ］
まず、図３を参照しながら、本発明の一実施の形態に係るラテラルフロー型クロマト用テストストリップ（以下、単に「テストストリップ」と記すことがある）について説明する。このテストストリップ２００は、後述するように、本発明の一実施の形態のアナライトの測定方法に好ましく使用できるものである。
【００４５】
テストストリップ２００は、メンブレン１１０を備えている。メンブレン１１０には、試料の展開方向において順に、試料添加部１２０、判定部１３０及び吸液部１４０が設けられている。
【００４６】
＜メンブレン＞
テストストリップ２００に使用されるメンブレン１１０としては、一般的なテストストリップにおいてメンブレン材料として使用されるものを適用可能である。メンブレン１１０は、例えば毛管現象を示し、試料を添加すると同時に、試料が展開するような微細多孔性物質からなる不活性物質（アナライト１６０、各種リガンドなどと反応しない物質）で形成されているものである。メンブレン１１０の具体例としては、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、セルロース誘導体等で構成される繊維状又は不織繊維状マトリクス、膜、濾紙、ガラス繊維濾紙、布、綿等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはセルロース誘導体やナイロンで構成される膜、濾紙、ガラス繊維濾紙等が用いられ、より好ましくはニトロセルロース膜、混合ニトロセルロースエステル（ニトロセルロースと酢酸セルロースの混合物）膜、ナイロン膜、濾紙が用いられる。
【００４７】
テストストリップ２００は、操作をより簡便にするため、メンブレン１１０を支持する支持体１９０を備えていることが好ましい。支持体としては、例えばプラスチック等を用いることができる。
【００４８】
＜試料添加部＞
テストストリップ２００は、アナライト１６０を含む試料を添加するための試料添加部１２０を有していてもよい。試料添加部１２０は、テストストリップ２００に、アナライト１６０を含む試料を受け入れるための部位である。試料添加部１２０は、試料が展開する方向において、判定部１３０よりも上流側のメンブレン１１０に形成されていてもよいし、あるいは、例えばセルロース濾紙、ガラス繊維、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、綿布などの材料で構成された試料添加パッドがメンブレン１１０に設けられて試料添加部１２０を構成していてもよい。
【００４９】
＜判定部＞
判定部１３０には、アナライト１６０と特異的に結合する捕捉リガンド１３１が固定されている。捕捉リガンド１３１は、アナライト１６０と特異的な結合を形成するものであれば特に制限なく使用でき、例えばアナライト１６０に対する抗体などを好ましく用いることができる。捕捉リガンド１３１は、テストストリップ２００に試料を提供した場合においても、判定部１３０から移動することがないように不動化している。捕捉リガンド１３１は、物理的又は化学的な結合や吸着等によって、メンブレン１１０に直接的又は間接的に固定されていればよい。
【００５０】
また、判定部１３０は、標識抗体１５０とアナライト１６０とを含む複合体１７０が、アナライト１６０と特異的に結合する捕捉リガンド１３１に接触するような構成である限り特に限定されない。例えば、メンブレン１１０に、直接、捕捉リガンド１３１が固定されていてもよいし、あるいは、メンブレン１１０に固定されたセルロース濾紙、グラスファイバー、不織布等からなるパッドに捕捉リガンド１３１が固定されていてもよい。
【００５１】
＜吸液部＞
吸液部１４０は、例えば、セルロ−ス濾紙、不織布、布、セルロースアセテート等の吸水性材料のパッドにより形成される。添加された試料の展開前線（フロントライン）が吸液部１４０に届いてからの試料の移動速度は、吸液部１４０の材質、大きさなどにより異なるものとなる。従って、吸液部１４０の材質、大きさなどの選定により、アナライト１６０の検出・定量に最適な速度を設定することができる。なお、吸液部１４０は任意の構成であり、省略してもよい。
【００５２】
テストストリップ２００は、必要に応じて、さらに、反応部、コントロール部等の任意の部位を含んでいてもよい。
【００５３】
＜反応部＞
テストストリップ２００には、メンブレン１１０に、標識抗体１５０を含む反応部１８０が形成されていてもよい。反応部１８０は、試料が流れる方向において、判定部１３０よりも上流側に設けることができる。なお、図２における試料添加部１２０を反応部として利用してもよい。テストストリップ２００が反応部１８０を有する場合、アナライト１６０を含む試料を、反応部１８０又は試料添加部１２０に供すると、反応部１８０において、試料に含まれるアナライト１６０と標識抗体１５０とを接触させることができる。この場合、試料を、単に反応部１８０又は試料添加部１２０に供することで、アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を形成させることができるので、いわゆる１ステップ型のイムノクロマトグラフが可能になる。
【００５４】
反応部１８０は、アナライト１６０と特異的に結合する標識抗体１５０を含む限り特に限定されないが、メンブレン１１０に、直接、標識抗体１５０が塗布されてなるものであってもよい。あるいは、反応部１８０は、例えばセルロース濾紙、グラスファイバー、不織布等からなるパッド（コンジュゲートパッド）に標識抗体１５０を含浸したものを、メンブレン１１０に固定してなるものであってもよい。
【００５５】
＜コントロール部＞
図示は省略するが、テストストリップ２００は、メンブレン１１０に、試料が展開する方向において、判定部１３０よりも下流側に、標識抗体１５０と特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなるコントロール部２１０が形成されていてもよい。判定部１３０とともに、コントロール部２１０でも発色強度が測定されることにより、テストストリップ２００に供した試料が展開して、反応部１８０及び判定部１３０に到達し、検査が正常に行われたことを確認することができる。なお、コントロール部２１０は、捕捉リガンド１３１の代わりに、標識抗体１５０と特異的に結合する別の種類の捕捉リガンドを用いることを除いては、上述の判定部１３０と同様にして作製され、同様の構成を採ることができる。
【００５６】
［アナライトの測定方法］
次に、テストストリップ２００を用いて行われる本発明の一実施の形態のアナライト１６０の測定方法について説明する。
【００５７】
本実施の形態のアナライト１６０の測定方法は、試料中に含まれるアナライト１６０を検出又は定量するアナライト１６０の測定方法である。本実施の形態のアナライト１６０の測定方法は、メンブレン１１０、及び当該メンブレン１１０にアナライト１６０と特異的に結合する捕捉リガンド１３１が固定されてなる判定部１３０を含むテストストリップ２００を用いる。そして、本実施の形態のアナライト１６０の測定方法は、下記工程(I)〜(III)；
工程(I)：試料に含まれる前記アナライト１６０と、該アナライト１６０に特異的に結合する抗体を樹脂粒子１０に複数の金属粒子２０が固定化された構造を有する金属−樹脂複合体１００で標識した標識抗体１５０と、を接触させる工程、
工程(II)：判定部１３０にて、工程(I)において形成された、アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を、捕捉リガンド１３１に接触させる工程、
工程(III)：金属−樹脂複合体１００の局在型表面プラズモン共鳴及び／又は電子遷移による光エネルギー吸収に由来する発色強度を測定する工程、
を含むことができる。
【００５８】
工程(I)：
工程(I)は、試料に含まれるアナライト１６０を、標識抗体１５０に接触させる工程である。アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を形成する限り、接触の態様は特に限定されるものではない。例えば、テストストリップ２００の試料添加部１２０又は反応部１８０（図示省略）に試料を供し、当該試料添加部１２０又は反応部１８０においてアナライト１６０を標識抗体１５０に接触させてもよいし、テストストリップ２００に試料を供する前に、試料中のアナライト１６０を標識抗体１５０に接触させてもよい。
【００５９】
工程(I)で形成された複合体１７０は、テストストリップ２００上で展開して移動し、判定部１３０に至る。
【００６０】
工程(II)：
工程(II)は、テストストリップ２００の判定部１３０において、工程(I)において形成された、アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を、捕捉リガンド１３１に接触させる。複合体１７０を、捕捉リガンド１３１に接触させると、捕捉リガンド１３１は、複合体１７０のアナライト１６０に特異的に結合する。その結果、複合体１７０が判定部１３０において捕捉される。
【００６１】
なお、捕捉リガンド１３１は、標識抗体１５０には特異的に結合しないために、アナライト１６０と未結合の標識抗体１５０が判定部１３０に到達した場合、当該アナライト１６０と未結合の標識抗体１５０は、判定部１３０を通過する。ここで、テストストリップ２００に、標識抗体１５０に特異的に結合する別の捕捉リガンドが固定されたコントロール部２１０（図示省略）が形成されている場合、判定部１３０を通過した標識抗体１５０は、展開を続け、コントロール部２１０で当該別の捕捉リガンドと結合する。その結果、アナライト１６０と複合体１７０を形成していない標識抗体１５０は、コントロール部２１０で捕捉される。
【００６２】
工程(II)の後、必要に応じて工程(III)の前に、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝液等の生化学検査で汎用される緩衝液で、テストストリップ２００を洗浄する洗浄工程を実施してもよい。洗浄工程によって、判定部１３０、又は、判定部１３０及びコントロール部２１０に捕捉されなかった標識抗体１５０（アナライト１６０と結合しておらず、複合体１７０を形成していない標識抗体１５０）を除去することができる。
【００６３】
洗浄工程を実施することで、工程(III)において、判定部１３０、又は、判定部１３０及びコントロール部における金属−樹脂複合体１００の局在型表面プラズモン共鳴及び／又は電子遷移による光エネルギー吸収による発色を測定する際に、バックグラウンドの発色強度を低減させることができ、シグナル／バックグラウンド比を高め、一層、検出感度や定量性を向上させることができる。
【００６４】
工程(III)：
工程(III)は、金属−樹脂複合体１００の局在型表面プラズモン共鳴及び／又は電子遷移による光エネルギー吸収に由来する発色強度を測定する工程である。上記工程(II)又は必要に応じて洗浄工程を実施した後、テストストリップ２００において、金属−樹脂複合体１００の局在型表面プラズモン共鳴及び／又は電子遷移による光エネルギー吸収に由来する発色強度を測定する。
【００６５】
なお、テストストリップ２００にコントロール部２１０が形成されている場合、工程(II)によって、コントロール部２１０にて、標識抗体１５０が別の捕捉リガンドによって捕捉され複合体が形成される。そのため、工程(III)では、テストストリップ２００おいて、判定部１３０だけでなく、コントロール部２１０においても局在型表面プラズモン共鳴及び／又は電子遷移による光エネルギー吸収による発色を生じさせることができる。このように、判定部１３０とともにコントロール部２１０においても発色強度を測定することで、テストストリップ２００に供した試料が正常に展開して、反応部及び判定部１３０に到達したか否かを確認できる。
【００６６】
＜試料及びアナライト＞
本実施の形態のアナライトの測定方法における試料は、アナライト１６０として、蛋白質などの抗原となり得る物質を含むものである限り特に限定されるものではない。例えば、目的のアナライト１６０を含む生体試料（すなわち、全血、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、鼻腔又は咽頭拭い液、髄液、羊水、乳頭分泌液、涙、汗、皮膚からの浸出液、組織や細胞及び便からの抽出液等）や食品の抽出液等が挙げられる。必要に応じて、標識抗体１５０及び捕捉リガンド１３１とアナライト１６０との特異的な結合反応が生じやすくするために、上記工程(I)に先立って、試料に含まれるアナライト１６０を前処理してもよい。ここで、前処理としては、酸、塩基、界面活性剤等の各種化学薬品等を用いた化学的処理や、加熱・撹拌・超音波等を用いた物理的処理が挙げられる。特に、アナライト１６０がインフルエンザウィルスＮＰ抗原等の、通常は表面に露出していない物質である場合、界面活性剤等による処理を行うことが好ましい。この目的に使用される界面活性剤として、特異的な結合反応、例えば、抗原抗体反応等の捕捉リガンド１３１とアナライト１６０との結合反応性を考慮して、非イオン性界面活性剤を用いることができる。
【００６７】
また、前記試料は、通常の免疫学的分析法で用いられる溶媒（水、生理食塩水、又は緩衝液等）や水混和有機溶媒で適宜希釈されていてもよい。
【００６８】
前記アナライト１６０としては、特に制限はなく公知のものが使用でき、アニオン性の性質が強いものや、カチオン性の性質が強いもの、それ以外のものも使用できる。アナライト１６０としては、例えば、腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモン等のタンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等を含む）、核酸（一本鎖又は二本鎖の、ＤＮＡ：デオキシリボ核酸、ＲＮＡ：リボ核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等を含む）又は核酸を有する物質、糖（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等を含む）又は糖鎖を有する物質、脂質などその他の分子が挙げられ、標識抗体１５０及び捕捉リガンド１３１に特異的に結合するものである限り特に限定されないが、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＨＥＲ２タンパク（ヒト上皮成長因子受容体２）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＣＡ１９−９、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、免疫抑制酸性タンパク（ＩＡＰ）、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、便潜血、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ＣＫ−ＭＢ、ＣＲＰ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、梅毒抗体、インフルエンザウィルスヒトヘモグロビン、クラミジア抗原、Ａ群β溶連菌抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｓ抗原、ロタウイルス、アデノウイルス、アルブミン、糖化アルブミン等が挙げられる。これらの中でも非イオン性界面活性剤により可溶化される抗原が好ましく、ウィルスの核タンパク質のように自己集合体を形成する抗原がより好ましい。
【００６９】
＜標識抗体＞
標識抗体１５０は、工程(I)において、試料に含まれるアナライト１６０に接触させて、アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を形成するために使用される。標識抗体１５０は、アナライト１６０に特異的に結合する抗体を、樹脂粒子１０に複数の金属粒子２０が固定化された構造を有する金属−樹脂複合体１００で標識化してなるものである。ここで、「標識化」とは、工程(I)〜(III)において、標識抗体１５０から金属−樹脂複合体１００が脱離しない程度に、抗体に金属−樹脂複合体１００が直接的に又は間接的に、化学的又は物理的な結合や吸着等で固定されていることを意味する。例えば、標識抗体１５０は、抗体に金属−樹脂複合体１００が直接結合してなるものであってもよいし、抗体と金属−樹脂複合体１００とが、任意のリンカー分子を介して結合してなるものや、それぞれが不溶性粒子に固定されてなるものであってもよい。
【００７０】
また、本実施の形態において、「抗体」としては、特に制限はなく公知のものが使用でき、アニオン性の性質が強いものや、カチオン性の性質が強いもの、それ以外のものも使用できる。例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、遺伝子組み換えにより得られた抗体のほか、抗原と結合能を有する抗体断片［例えば、Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等］などを用いることができる。また、免疫グロブリンとして、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれでもよい。抗体の産生動物種としては、ヒトをはじめ、ヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等）でもよい。抗体の具体例としては、抗ＰＳＡ抗体、抗ＡＦＰ抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗アデノウイルス抗体、抗インフルエンザウィルス抗体、抗ＨＣＶ抗体、抗ＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＥ抗体等が挙げられる。
【００７１】
＜標識抗体の好ましい作製方法＞
次に、標識抗体１５０の好ましい作製方法を挙げて説明する。標識抗体１５０の製造は、少なくとも、次の工程Ａ；
工程Ａ）金属−樹脂複合体１００を第１のｐＨ条件で抗体と混合して結合させることによって、標識抗体１５０を得る工程
を含み、好ましくは、さらに工程Ｂ； 
工程Ｂ）標識抗体１５０を第２のｐＨ条件で処理する工程
を含むことができる。
【００７２】
［工程Ａ］
工程Ａでは、金属−樹脂複合体１００を第１のｐＨ条件で抗体と混合して標識抗体１５０を得る。工程Ａは、固体状の金属−樹脂複合体１００を液相中に分散させた状態で抗体と接触させることが好ましい。
【００７３】
第１のｐＨ条件は、金属−樹脂複合体１００の分散と抗体の活性を維持したまま金属−樹脂複合体１００と抗体を均一に接触させる観点から、ｐＨ２〜１０の範囲内の条件が好ましく、さらに例えばｐＨ５〜９の範囲内がより好ましい。金属−樹脂複合体１００と抗体とを結合させるときの条件が、ｐＨ２未満では強酸性により抗体が変質し失活する場合があり、ｐＨ１０を超えると金属−樹脂複合体１００と抗体を混合した際に凝集し分散が困難となる。ただし、強酸性により抗体が失活しない場合はｐＨ２未満においても処理が可能である。
【００７４】
工程Ａは、第１のｐＨ条件に調整した結合用緩衝液（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ）中で行うことが好ましい。例えば、上記ｐＨに調整した結合用緩衝液に所定量の金属−樹脂複合体１００を混合し、十分に混和する。結合用緩衝液としては、例えば、所定濃度に調整したホウ酸溶液などを用いることができる。結合用緩衝液のｐＨの調整は、例えば塩酸、水酸化ナトリウムなどを用いて行うことができる。
【００７５】
次に、得られた混合液に、所定量の抗体を添加し、十分に撹拌、混合することによって、標識抗体含有液を得ることができる。このようにして得られた標識抗体含有液は、例えば遠心分離などの固液分離手段により、固形部分として標識抗体１５０のみを分取できる。
【００７６】
［工程Ｂ］
工程Ｂでは、工程Ａで得られた標識抗体１５０を第２のｐＨ条件で処理することによって、標識抗体１５０への非特異的な吸着を抑制するブロッキングを行う。この場合、固液分離手段によって分取しておいた標識抗体１５０を、第２のｐＨ条件で液相中に分散させる。
【００７７】
第２のｐＨ条件は、抗体の活性を保ちかつ標識抗体１５０の凝集を抑制する観点から、例えばｐＨ２〜１０の範囲内が好ましく、標識抗体１５０の非特異的な吸着を抑制する観点から、ｐＨ５〜９の範囲内がより好ましい。ブロッキングの条件が、ｐＨ２未満では強酸性により抗体が変質し失活する場合があり、ｐＨ１０を超えると標識抗体１５０が凝集してしまい分散が困難となる。
【００７８】
工程Ｂは、ブロッキング剤を第２のｐＨの条件に調製したブロック用緩衝液（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ）を用いて行うことが好ましい。例えば、所定量の標識抗体１５０に上記ｐＨに調整したブロック用緩衝液を添加し、ブロック用緩衝液中で標識抗体１５０を均一に分散させる。ブロック用緩衝液としては、例えば、被検出物と結合しない蛋白質の溶液を用いることが好ましい。ブロック用緩衝液に使用可能なブロッキング剤としては、特に制限はなく公知のものが使用でき、アニオン性の性質が強いものや、カチオン性の性質が強いもの、それ以外のものも使用できる。例えば、蛋白質であれば、牛血清アルブミン、卵白アルブミン、カゼイン、ゼラチン、乳清ホエイなどを挙げることができる。より具体的には、所定濃度に調整した牛血清アルブミン溶液などを用いることが好ましい。ブロック用緩衝液のｐＨの調整は、例えば塩酸、水酸化ナトリウムなどを用いて行うことができる。標識抗体１５０の分散には、例えば超音波処理などの分散手段を用いることが好ましい。このようにして標識抗体１５０が均一分散した分散液が得られる。
【００７９】
上記工程Ａおよび工程Ｂにおいて、金属−樹脂複合体１００は、ｐＨによる凝集が起こりにくく、酸性〜アルカリ性まで広い範囲のｐＨで処理が可能である。従って、本発明で用いる金属−樹脂複合体１００は、標識抗体の作製条件の制限を受けにくいという利点もある。
【００８０】
以上のようにして、標識抗体１５０の分散液が得られる。この分散液から、例えば遠心分離などの固液分離手段により、固形部分として標識抗体１５０のみを分取できる。また、必要に応じて、洗浄処理、保存処理などを実施することができる。以下、洗浄処理、保存処理について説明する。
【００８１】
（洗浄処理）
洗浄処理は、固液分離手段によって分取した標識抗体１５０に洗浄用緩衝液を添加し、洗浄用緩衝液中で標識抗体１５０を均一に分散させる。分散には、例えば超音波処理などの分散手段を用いることが好ましい。洗浄用緩衝液としては、特に限定されるものではないが、例えばｐＨ８〜９の範囲内に調整した所定濃度の、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液、グリシンアミド緩衝液、アルギニン緩衝液などを用いることができる。洗浄用緩衝液のｐＨの調整は、例えば塩酸、水酸化ナトリウムなどを用いて行うことができる。標識抗体１５０の洗浄処理は、必要に応じて複数回を繰り返し行うことができる。
【００８２】
（保存処理）
保存処理は、固液分離手段によって分取した標識抗体１５０に保存用緩衝液を添加し、保存用緩衝液中で標識抗体１５０を均一に分散させる。分散には、例えば超音波処理などの分散手段を用いることが好ましい。保存用緩衝液としては、例えば、洗浄用緩衝液に、所定濃度の凝集防止剤及び／又は安定剤を添加した溶液などを用いることができる。凝集防止剤としては、例えば、スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロースに代表される糖類や、グリセリン、ポリビニルアルコールに代表される多価アルコールなどを用いることができる。安定剤としては、特に限定されるものではないが、例えば牛血清アルブミン、卵白アルブミン、カゼイン、ゼラチンなどの蛋白質を用いることができる。このようにして標識抗体１５０の保存処理を行うことができる。
【００８３】
以上の各工程では、さらに必要に応じて、界面活性剤や、アジ化ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステルなどの防腐剤を用いることができる。
【００８４】
［アナライト測定用キット］
本発明の一実施の形態に係るアナライト測定用キットは、例えばテストストリップ２００を用いて、本実施の形態のアナライトの測定方法に基づき、試料中に含まれるアナライト１６０の検出又は定量するためのキットである。
【００８５】
本実施の形態のアナライト測定用キットは、
メンブレン１１０と、
メンブレン１１０に、前記アナライト１６０と特異的に結合する捕捉リガンド１３１が固定されてなる判定部１３０を含むテストストリップ２００と、
アナライト１６０に特異的に結合する抗体を樹脂粒子１０に複数の金属粒子２０が固定化された構造を有する金属−樹脂複合体１００で標識した標識抗体１５０を含む検出試薬と、
を含んでいる。本実施の形態のアナライト測定用キットは、必要に応じて、さらにその他の構成要素を含むものであってもよい。
【００８６】
本実施の形態に係るアナライト測定用キットを使用するにあたっては、試料中のアナライト１６０と検出試薬中の標識抗体１５０とを接触させて工程(I)を実施した後、テストストリップ２００の反応部１８０又は試料添加部１２０に試料を供して、工程(II)、工程(III)を順次実施してもよい。あるいは、テストストリップ２００の判定部１３０よりも上流側に、検出試薬を塗布して、適宜乾燥させて反応部１８０を形成した後、形成された反応部１８０あるいは該反応部１８０よりも上流側の位置（例えば、試料添加部１２０）に試料を添加して、工程(I)〜(III)を順次実施してもよい。
【００８７】
また、金属−樹脂複合体１００の免疫学的測定用標識物質又は免疫学的測定用試薬以外の用途としては、固体触媒、顔料、塗料、導電性材料、電極、センサー素子として好ましく適用できる。
【実施例１】
【００８８】
次に、実施例、比較例により、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに制約されるものではない。
【００８９】
［作製例１］
＜樹脂粒子の合成＞
トリオクチルアンモニウムクロリド（０．３９ｇ）及びポリエチレングリコールメチルエチルエーテルメタクリレート（１０．００ｇ）を３００ｇの純水に溶解した後、２−ビニルピリジン（４８．００ｇ）及びジビニルベンゼン（２．００ｇ）を加え、窒素気流下において３０℃で５０分、次いで６０℃で３０分間撹拌した。撹拌後、１８．００ｇの純水に溶解した２，２−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（０．５０ｇ）を滴下し、６０℃で３．５時間撹拌することで、平均粒子径４３９ｎｍの樹脂粒子Ａ−１を得た。遠心分離（９０００ｒｐｍ、４０分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させた後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い１０ｗｔ％の樹脂粒子分散液Ｂ−１を得た。
【００９０】
［実施例１］
＜金−樹脂複合体粒子の合成＞
Ｂ−１（９１．５ｇ）に純水２５５ｇを加えた後、４００ｍＭ塩化金酸水溶液（１４７ｇ）を加え、室温で３時間撹拌した。この混合液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、３０分）によりＡ−１を沈殿させ、上澄みを除去することで余分な塩化金酸を除去した。その後、濃度を調整して、２．５ｗｔ％の金イオン吸着樹脂粒子分散液Ｃ−１を得た。
【００９１】
次に、純水１５８０ｇにＣ−１（４３．３ｇ）を加え、３℃で撹拌しながら、５２８ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液（１０．０ｇ）を２分かけて滴下した後、３℃で１時間、室温で３時間撹拌することで、平均粒子径４５５ｎｍの金−樹脂複合体粒子Ｄ−１を得た。Ｄ−１を遠心分離により濃縮した後、透析処理により精製し、濃度を調整して、１ｗｔ％の金−樹脂複合体粒子分散液Ｅ−１を得た。Ｅ−１中の金−樹脂複合体粒子Ｆ−１の吸光度は、１．３６であった。また、Ｆ−１における金粒子の平均粒子径は２０ｎｍ、金の担持量は４８．３ｗｔ％であった。
【００９２】
（結合工程）
抗インフルエンザＡ型モノクローナル抗体１００μｇと１００ｍＭ  ホウ酸水溶液（ｐＨ８．５）０．９ｍＬを混合した後、１ｗｔ％の金−樹脂複合体粒子分散液Ｅ−１を０．１ｍＬ添加し、室温で３時間かけて転倒撹拌を行い、金−樹脂複合体粒子Ｆ−１で標識した抗インフルエンザＡ型モノクローナル抗体を含む標識抗体分散液Ｊ−１を得た。
【００９３】
（ブロック工程）
次に、標識抗体分散液Ｊ−１を氷冷後、３０００ｒｐｍで５分間かけて遠心分離を行い、上澄みを除去した後、沈降堆積物に１ｗｔ％ブロックエース（ＤＳバイオファーマ製）を含む５ｍＭのＴｒｉｓ水溶液（ｐＨ８．５）１ｍＬを添加し、１０〜２０秒間かけて超音波分散処理を行い、さらに、室温で２時間かけて転倒撹拌を行い、標識抗体分散液Ｋ−１を得た。
【００９４】
（洗浄処理）
次に、標識抗体分散液Ｋ−１を氷冷後、３０００ｒｐｍで５分間かけて遠心分離を行い、上澄みを除去した後、沈降堆積物に０．１ｗｔ％未満の界面活性剤を含む５ｍＭのＴｒｉｓ水溶液（ｐＨ８．５）１ｍＬを添加し、１０〜２０秒間かけて超音波分散処理を行った。この操作を３回繰り返し、洗浄処理とした。
【００９５】
（保存処理）
次に、氷冷後、３０００ｒｐｍで５分間かけて遠心分離を行い、上澄みを除去した後、沈降堆積物に０．１ｗｔ％未満の界面活性剤および、１０ｗｔ％のスクロースを含む５ｍＭのＴｒｉｓ水溶液（ｐＨ８．５）１ｍＬを添加し、１０〜２０秒間かけて超音波分散処理を行うことによって、標識抗体分散液Ｌ−１を得た。
【００９６】
（反応部の作製）
０．３ｍｌの標識抗体分散液Ｌ−１を３０００ｒｐｍで５分間かけて遠心分離を行い、上澄みを除去した後、沈降堆積物に５ｗｔ％のスクロースと２．５ｗｔ％の牛血清アルブミンを含む水溶液（ｐＨ８．０）０．８３３ｍＬを添加し、１０〜２０秒間かけて超音波分散処理を行うことによって、標識抗体分散液Ｍ−１を得た。ガラスファイバー不織布に標識抗体分散液Ｍ−１を均一に含浸させた後、−１０℃で２４時間かけて凍結乾燥を行い、反応部１８０；Ｎ−１を作製した。この時、反応部１８０；Ｎ−１における金−樹脂複合体粒子の含有量が、後述のイムノクロマト法による評価１テスト当たり９μｇとなるように標識抗体分散液Ｍ−１の液量を調節した。
【００９７】
（イムノクロマトストリップの作製）
幅２５ｍｍのニトロセルロースメンブレン１１０の中央に、抗インフルエンザＡ型モノクローナル抗体を塗布し判定部１３０を描画した。室温で乾燥した後、図２に示すイムノクロマトストリップ２００の断面図の通りに、支持体１９０、反応部１８０；Ｎ−１、試料添加部１２０（ガラスファイバー不織布）および吸液部１４０（コットン不織布）を積層した。最後に、５ｍｍ幅にカットしてイムノクロマトストリップＰ−１を作成した。
【００９８】
（検体処理液の調製）
０．６０ｗｔ％のトリスヒドロキシメチルアミノメタン（以下、Ｔｒｉｓ）、０．８８ｗｔ％の塩化ナトリウム（以下、ＮａＣｌ）、１．０ｗｔ％のウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡ）、１．０ｗｔ％のツイーン２０および０．０１ｗｔ％のカゼインナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．１）を調製し、検体処理液Ｑ−１とした。検体処理液の液組成を表１に示す。
【００９９】
（イムノクロマト法による評価）
検体処理液Ｑ−１を用いて抗原を希釈することにより、インフルエンザＡ型陽性コントロール（抗原濃度２５００ＦＦＵ／ｍｌ相当）及び陰性コントロール（抗原非含有）の検体液を調製し、検体液１００μｌをイムノクロマトストリップＰ−１の試料添加部１２０に滴下し、試料を展開させた。検体液を滴下してから１５分経過後のテストラインの発色レベルおよびバックグラウンドの有無を、金コロイド判定用色見本（アドテック株式会社製）を用いて評価した。バックグラウンドの有無は、１５分経過後のニトロセルロースメンブレン１１０の判定部１３０以外の部分が、色見本の０．５以上の着色を呈している場合は有とし、０．５未満の場合は無とした。また、陽性コントロールの発色レベルが３以上、かつ陰性コントロールの発色レベルが０．５未満、かつバックグラウンドが無である場合に、判定を良好とし、それ以外は不良とした。イムノクロマト法による評価結果を表２に示す。
【０１００】
［実施例２〜１０］
（検体処理液の調製）
表１の液組成となるように、検体処理液Ｑ−２〜Ｑ−１０を調製した。なお、０．６０ｗｔ％のトリスヒドロキシメチルアミノメタン（以下、Ｔｒｉｓ）、０．８８ｗｔ％の塩化ナトリウム（以下、ＮａＣｌ）、１．０ｗｔ％のウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡ）は、いずれもＱ−１と共通の組成である。
（イムノクロマト法による評価）
検体処理液Ｑ−１の代わりに、検体処理液Ｑ−２〜Ｑ−１０を用いること以外は、実施例１と同様にして、イムノクロマト法による評価をおこなった。評価結果を表２に示す。評価結果の判定はすべて良好であった。
【０１０１】
［実施例１１］
＜白金−樹脂複合体粒子の合成＞
Ｂ−１（９１．５ｇ）に純水５４ｇを加えた後、４００ｍＭ塩化白金酸水溶液（１００ｇ）を加え、３０℃で３時間撹拌した。この混合液を２４時間静置した後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、３０分）によりＡ−１を沈殿させ、上澄みを除去することで余分な塩化白金酸を除去した。その後、濃度を調整して、５ｗｔ％の白金イオン吸着樹脂粒子分散液Ｃ−１１を得た。
【０１０２】
次に、純水１３９２ｇにＣ−１１（２０．６ｇ）を加え、３℃で撹拌しながら、１３２ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液（４０ｇ）を２０分かけて滴下した後、３℃で１時間、室温で３時間撹拌することで、平均粒子径４６１ｎｍの白金−樹脂複合体粒子Ｄ−１１を得た。Ｄ−１１を遠心分離により濃縮した後、透析処理により精製し、濃度を調整して、１ｗｔ％の白金−樹脂複合体粒子分散液Ｅ−１１を得た。Ｅ−１１中の白金−樹脂複合体粒子Ｆ−１１の吸光度は１．７７であった。また、Ｆ−１１における白金粒子の平均粒子径は５．０ｎｍ、白金の担持量は３７．６ｗｔ％であった。
【０１０３】
（結合工程、ブロック工程、洗浄処理、保存処理、反応部作製、イムノクロマトストリップの作製）
１ｗｔ％の金−樹脂複合体粒子分散液Ｅ−１の代わりに、１ｗｔ％の白金−樹脂複合体粒子分散液Ｅ−１１を用いる以外は実施例１と同様にして、イムノクロマトストリップＰ−１１を作製した。
【０１０４】
（イムノクロマト法による評価）
イムノクロマトストリップＰ−１の代わりに、イムノクロマトストリップＰ−１１を用いること以外は、実施例１と同様にして、イムノクロマト法による評価をおこなった。評価結果を表２に示す。評価結果の判定は良好であった。
【０１０５】
［比較例１〜１３］
（検体処理液の調製）
表１の液組成となるように、検体処理液Ｒ−１〜Ｒ−１３を調製した。なお、０．６０ｗｔ％のトリスヒドロキシメチルアミノメタン（以下、Ｔｒｉｓ）、０．８８ｗｔ％の塩化ナトリウム（以下、ＮａＣｌ）、１．０ｗｔ％のウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡ）は、いずれもＱ−１と共通の組成である。
（イムノクロマト法による評価）
検体処理液Ｑ−１の代わりに、検体処理液Ｒ−１〜Ｒ−１３を用いること以外は、実施例１と同様にして、イムノクロマト法による評価をおこなった。評価結果を表２に示す。評価結果の判定はすべて不良であった。
【０１０６】
【表１】
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【０１０７】
（比較例２）ＰＶＡ：ポリビニルアルコール５００
（比較例３）ＰＥＧ：ポリエチレングリコール２００００
（比較例４）ＰＶＰ：ポリビニルピロリドンＫ９０
（比較例７）ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
（比較例８）ＴＢＡＢ：テトラブチルアンモニウムブロミド
（比較例９）ＴＥＡＢ：テトラエチルアンモニウムブロミド
【０１０８】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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