(57)【要約】【課題】マクロファージ活性化剤等の免疫賦活剤を提供すること。【解決手段】ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ−1,3−グルカンからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、マクロファージ活性化剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ−1,3−グルカンからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、マクロファージ活性化剤。
【請求項２】
前記パラミロン加工物を含有する、請求項１に記載のマクロファージ活性化剤。
【請求項３】
前記パラミロン加工物が繊維化パラミロンである、請求項２に記載のマクロファージ活性化剤。
【請求項４】
前記パラミロン加工物がユーグレナ・グラシリス由来のパラミロンの加工物である、請求項２又は３に記載のマクロファージ活性化剤。
【請求項５】
前記パラミロン加工物がユーグレナ・グラシリスEOD-1株（受託番号FERM BP-11530）由来のパラミロンの加工物である、請求項２〜４のいずれかに記載のマクロファージ活性化剤。
【請求項６】
食品組成物、食品添加剤、化粧品、化粧品添加剤、又は医薬である、請求項１〜５のいずれかに記載のマクロファージ活性化剤。
【請求項７】
経口組成物である、請求項１〜６のいずれかに記載のマクロファージ活性化剤。
【請求項８】
繊維化パラミロンを含有する、免疫賦活剤。
【請求項９】
食品組成物、食品添加剤、化粧品、化粧品添加剤、又は医薬である、請求項８に記載の免疫賦活剤。
【請求項１０】
経口組成物である、請求項８又は９に記載の免疫賦活剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マクロファージ活性化剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
マクロファージは、生体に進入した病原体や異物の除去、抗原提示等を担っている。マクロファージが活性化すると、例えばTNF-αを始めとしたサイトカイン、一酸化窒素等を産生し、抗菌効果、抗ウイルス効果、抗腫瘍効果等を発揮することが知られている。このため、これらの効果の発現を計るために、各種のマクロファージ活性化剤が提案されている。例えば、特許文献１には、カツオ削粉の熱水抽出物又はその乾燥物を有効成分とするマクロファージ活性化剤が記載されている。
【０００３】
ユーグレナは、ミドリムシ属（＝ユーグレナ属）に属する微細藻類であり、食品材料として利用されている。また、ユーグレナ抽出物を皮膚に適用することも行われている。また、パラミロンは、ミドリムシが産生するβ−1,3−グルカンであり、創傷治療やアレルギー抑制などに有用であることが報告されている。しかしながら、ユーグレナやβ−1,3−グルカンとマクロファージ活性化との関連については未だしられていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2017−075105号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、マクロファージ活性化剤等の免疫賦活剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ−1,3−グルカンからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、マクロファージ活性化剤であれば、上記課題を解決できることを見出した。この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。  即ち、本発明は、下記の態様を包含する：
項１．  ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ−1,3−グルカンからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、マクロファージ活性化剤。
項２．  前記パラミロン加工物を含有する、項１に記載のマクロファージ活性化剤。
項３．  前記パラミロン加工物が繊維化パラミロンである、項２に記載のマクロファージ活性化剤。
項４．  前記パラミロン加工物がユーグレナ・グラシリス由来のパラミロンの加工物である、項２又は３に記載のマクロファージ活性化剤。
項５．  前記パラミロン加工物がユーグレナ・グラシリスEOD-1株（受託番号FERM BP-11530）由来のパラミロンの加工物である、項２〜４のいずれかに記載のマクロファージ活性化剤。
項６．  食品組成物、食品添加剤、化粧品、化粧品添加剤、又は医薬である、項１〜５のいずれかに記載のマクロファージ活性化剤。
項７．  経口組成物である、項１〜６のいずれかに記載のマクロファージ活性化剤。
項８．  繊維化パラミロンを含有する、免疫賦活剤。
項９．  食品組成物、食品添加剤、化粧品、化粧品添加剤、又は医薬である、項８に記載の免疫賦活剤。
項１０．  経口組成物である、項８又は９に記載の免疫賦活剤。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、マクロファージ活性化剤等の免疫賦活剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】繊維化パラミロン（参考例3）の電子顕微鏡写真を示す。図の右下のスケールの１目盛の長さは1μmを示す。
【図２】繊維化パラミロン（参考例4）の電子顕微鏡写真を示す。図の右下のスケールの１目盛の長さは1μmを示す。
【図３】試験例1の一酸化窒素産生量測定試験の結果を示す。縦軸は、被験物質を入れない場合からの一酸化窒素濃度増加量を示す。横軸は、被検物質濃度を示す。凡例は被検物質の種類を示す。エラーバーは標準偏差を示す。
【図４】試験例2のTNF-α産生量測定試験の結果を示す。縦軸は、被験物質を入れない場合からのTNF-α濃度を示す。横軸は、被検物質濃度を示す。凡例は被検物質の種類を示す。エラーバーは標準偏差を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００１０】
本明細書中において、「及び／又は」なる表現については、「及び」と「又は」のいずれを選択した場合の意味も包含する。すなわち、「A及び／又はB」なる表現には、「A又はB」と「A及びB」のいずれの意味も包含される。
【００１１】
本発明は、その一態様において、ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ−1,3−グルカンからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、マクロファージ活性化剤に関する。また、本発明は、その一態様において、繊維化パラミロンを含有する、免疫賦活剤に関する。以下、これらを総称して、「本発明の剤」と示すこともある。以下に、これらについて説明する。
【００１２】
1．ユーグレナ
ユーグレナは、ミドリムシ属（＝ユーグレナ属）に属する微細藻類であり、その限りにおいて特に制限されない。ユーグレナとして、具体的には、例えばEuglena gracilis（ユーグレナ・グラシリス）、Euglena longa、Euglena caudata、Euglena oxyuris、Euglena tripteris、Euglena proxima、Euglena viridis、Euglena sociabilis、Euglena ehrenbergii、Euglena deses、Euglena pisciformis、Euglena spirogyra、Euglena acus、Euglena geniculata、Euglena intermedia、Euglena mutabilis、Euglena sanguinea、Euglena stellata、Euglena terricola、Euglena klebsi、Euglena rubra、Euglena cyclopicolaなどが挙げられる。これらの中でも、本発明の効果の観点から、好ましくはユーグレナ・グラシリスが挙げられ、より好ましくはユーグレナ・グラシリスEOD-1株［2013年6月28日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター｛NITE-IPOD（郵便番号292-0818  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8  120号室）｝にブダペスト条約の規定下で、受託番号FERM BP-11530として国際寄託済み］が挙げられる。
【００１３】
ユーグレナの形態は、ユーグレナの細胞体又はその成分の大半を含むものである限り、特に制限されない。ユーグレナの形態としては、例えばユーグレナの乾燥粉末形態、ユーグレナの懸濁液、ユーグレナエキス等が挙げられ、中でも、好ましくはユーグレナの乾燥粉末形態が挙げられる。
【００１４】
ユーグレナの乾燥状態におけるパラミロン含有率は、特に制限されるものではない。該含有率は、例えば20％以上、好ましくは30％以上、より好ましくは40％以上、さらに好ましくは50％以上、よりさらに好ましくは60％以上、特に好ましくは70％以上である。
【００１５】
ユーグレナは、1種単独であってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【００１６】
2．β−1,3−グルカン、パラミロン
β−1,3−グルカンは、グルコースがβ1,3結合のみで連結してなる1本の糖鎖（又は糖鎖構造）を主鎖として有するものであれば特に制限されない。β−1,3−グルカンは、直鎖状のものに限らず、分枝鎖を有するものも包含する。
【００１７】
β−1,3−グルカン誘導体の重量平均分子量は、特に限定されないが、例えば1×104〜2×106、好ましくは5×104〜1×106、更に好ましくは1×105〜1×106ある。なお、重量平均分子量は、GPC法により測定することができる。
【００１８】
β−1,3−グルカンは、化学合成により得られたものであってもよいが、入手容易性等の観点から、各種生物が産生する天然β−1,3−グルカンが好ましい。天然β−1,3−グルカンとしては、例えばパラミロン、カードラン、ラミナラン、カロース、レンチナン、シゾフィラン等が挙げられる。これらの中でも、本発明の効果の観点から、好ましくはパラミロンが挙げられる。以下、パラミロンについて説明する。
【００１９】
パラミロンは、ユーグレナ由来のβ−1,3−グルカンであり、その限りにおいて特に制限されない。
【００２０】
パラミロンが由来するユーグレナについては、上記「1．ユーグレナ」における説明と同様である。
【００２１】
パラミロンの質量平均分子量は、特に限定されないが、例えば1×104〜5×106、好ましくは2×104〜1×106、より好ましくは5×104〜1×106、さらに好ましくは1×105〜5×105である。
【００２２】
なお、質量平均分子量は、SEC-MALS分析により、以下の条件で測定 することができる：
SEC装置：LC−10AVP system（Shimadzu Co．、日本）、
使用カラム：KD-806M（shodex．、日本）、
MALS検出器：DAWN HELEOSII（wyatt Technologies．、U．S．A．）、
溶離液：1%LiCl/DMI、
流速：0.5 mL/分。
【００２３】
パラミロンは、ユーグレナの細胞内において、通常、β−1,3−グルカン鎖が形成する3重螺旋構造体が一定の規則性の基に高度に集積してなるパラミロン粒子として存在している。
【００２４】
パラミロン粒子の形状は、特に制限されないが、通常は、偏平な回転楕円体状である。
【００２５】
パラミロン粒子の粒子径分布は、特に制限されないが、例えば0.5〜15μm、好ましくは1〜6μmである。また、パラミロン粒子の平均粒子径も特に制限されないが、例えば1〜10μm、好ましくは2〜4μmである。
【００２６】
パラミロンの形態は、パラミロンを含むものである限り、特に制限されない。ユーグレナの形態としては、例えばパラミロンの乾燥粉末形態、パラミロンの懸濁液等が挙げられ、中でも、好ましくはパラミロンの乾燥粉末形態が挙げられる。
【００２７】
パラミロンは、1種単独であってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【００２８】
3．ユーグレナ及びパラミロンの製造方法
ユーグレナは、液体に含まれたユーグレナを培養する工程（培養工程）を含む方法により、大量に調製することが可能である。培養工程は、例えば公知の方法（例えば、特許第5883532号公報に記載の方法）に従って行うことができる。該培養工程では、典型的には、水と、ユーグレナと、ユーグレナが利用できる栄養素とを含む液体（培養液）を撹拌しつつ好気条件でユーグレナ属微細藻類を培養する。
【００２９】
栄養素としては、糖類（グルコース（ブドウ糖）、フルクトース（果糖）などの単糖類）、ミネラル類（例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、鉄、亜鉛、モリブデン、銅、リン、窒素、硫黄、又は、ホウ素など）、ビタミンB類（例えばビタミンB1（チアミン）、ビタミンB2（リボフラビン）、ナイアシン、パントテン酸、ビタミンB6（ピリドキシン、ピリドキサール、又はピリドキサミン）、ビタミンB12（シアノコバラミン）、葉酸、ビオチンなど）などが挙げられる。培養液中の栄養素の濃度は、ユーグレナの生存、増殖等が可能な濃度である限り特に制限されない。
【００３０】
培養工程の光条件は特に制限されず、培養工程は明条件と暗条件のいずれで行われてもよい。従属栄養培養にて培養する際には暗条件で培養される。明条件としては、藻類を増殖させるための通常の光強度を採用することができる。暗条件としては、例えば10μmol/m2/s未満、好ましくは光が全く当たらない完全な暗所条件が挙げられる。
【００３１】
培養工程における培養温度は、ユーグレナが増殖できる温度であれば、特に限定されない。該培養温度（培養液の温度）としては、例えば、20℃〜35℃が採用される。
【００３２】
培養工程における液体のpHは、ユーグレナが増殖できるpHであれば、特に限定されない。ユーグレナが増殖できるpHとしては、例えば3.0〜5.5が採用される。
【００３３】
培養工程の後に、液体の遠心分離や重力分離などによってユーグレナを濃縮することが好ましい。得られたユーグレナは、所望の形態に応じて、追加の処理（例えば、液体への懸濁、水中又は油中への分散、エキス抽出、乾燥粉末化等）に供することができる。
【００３４】
パラミロン粒子は、公知の方法（例えば特許第5883532号公報に記載の方法）に従って又は準じて、ミドリムシから分離、単離、又は精製することによって製造することができる。パラミロン粒子は、例えばミドリムシの細胞膜を破壊することによって得られる細胞内容成分を回収することによって、容易に得ることができる。また、必要に応じて、パラミロン粒子を精製してもよい。パラミロン粒子の精製については各種知られており（例えば、特許第5883532号公報）、それらの方法に従って行うことができる。精製工程としては、例えば、界面活性剤処理工程、洗浄工程などが挙げられる。得られたユーグレナは、所望の形態に応じて、追加の処理（例えば、液体への懸濁、水中又は油中への分散、乾燥粉末化等）に供することができる。
【００３５】
4．パラミロン加工物
パラミロン加工物は、パラミロンに対して加工処理、例えば物理処理、化学処理等することによって得られるものであり、その限りにおいて特に制限されない。パラミロン化合物としては、例えば、繊維化パラミロン、アモルファスパラミロン等が挙げられる。アモルファルパラミロンは、公知の方法に従って又は準じて、例えば特開2011−184592号公報に記載の方法を用いて化学的に処理することにより、得ることができる。
【００３６】
パラミロン化合物としては、繊維化パラミロンが好ましい。以下に、繊維化パラミロンについて説明する。
【００３７】
繊維化パラミロンは、ユーグレナ由来のβ−1,3−グルカンであり、繊維状の形態のものである限りにおいて特に制限されない。これまで、パラミロン粒子を化学処理（アルカリ処理等）して得られたアモルファスパラミロンが報告されているが、これは、電子顕微鏡で観察すると繊維化であるとは認められず、形や大きさが不定形の塊であるため、繊維化パラミロンには包含されない。
【００３８】
繊維化パラミロンの重量平均分子量は、特に限定されないが、例えば1×104〜2×107、好ましくは1×105〜5×105である。
【００３９】
なお、重量平均分子量は、SEC-MALS分析により、以下の方法で測定することができる：SEC装置：LC−10ADvp system（Shimadzu Co．、日本）、
使用カラム：KD-806M（shodex．、日本）、
MALS検出器：DAWN HELEOSII（wyatt Technologies．、U．S．A．）、
溶離液：1%LiCl/DMI、
流速：0.5 mL/分。
【００４０】
繊維化パラミロンの繊維の直径は、特に制限されないが、例えば10〜500 nm、好ましくは20〜300 nm、より好ましくは50〜200 nmである。繊維化パラミロンの繊維の直径は、通常、繊維化パラミロンの電子顕微鏡像に基づいて測定することができる。
【００４１】
繊維化パラミロンの水中沈定体積は、特に制限されないが、例えば30〜300 mL/g、好ましくは50〜250 mL/g、より好ましくは70〜200 mL/gである。
【００４２】
水中沈定体積は以下の方法に従って又は準じて測定することができる：
「日本食物繊維学会監修、日本食物繊維学会編集委員会編（２００８）食物繊維  ‐基礎と応用‐  第３版, ｐ．１１１  第一出版, 東京」に記載されている方法に準じて測定を行う。具体的には、次の通りである。サンプルのスラリー状の試験試料を、25 mL容積のプラスチックチューブに、乾燥質量換算で125 mg計り取り、プラスチックチューブを手で激しく振って、内容物を撹拌する。その後、25 mL容積のメスシリンダーに内容物を移し、25 mLになるまで純水を加える。メスシリンダー内の液体を撹拌した後、37℃で24時間静置する。これによりサンプルが沈殿し、界面を介して分けられる2つの層（沈殿したサンプルを主に含む層（下層）、及び水を主に含む層（上層））が生じる。下層の体積をメスシリンダーの目盛から求め、得られた体積をサンプル質量（乾燥質量）で除して、水中沈定体積（mL/g）を算出する。
【００４３】
繊維化パラミロンは、酵素による分解に対して、比較的高い耐性を有する。例えば、βグルカナーゼの分解により生成されるモノマー（グルコース）の量は、繊維化パラミロン1 g当たり、例えば0.1〜50 mg、好ましくは1〜10 mgである。
【００４４】
この量は以下の方法に従って又は準じて測定することができる：
反応液［被検物質30 mg（乾燥重量）、緩衝液（東京化成工業社製 B0156、フタル酸水素カリウム-水酸化ナトリウムバッファー (pH4.0)）5 mL、酵素液（日本バイオコン社製  endo-1,3-β-Glucanase (酵素含有量：50 units/mL)）0.1 mL、純水、反応液量 10 mL］を調製し、40℃で24時間、45 rpmで水平振盪する。振盪後、直ちに凍結保存し、濃縮のために凍結乾燥する。凍結乾燥後、各試料に純水を0.5 mLずつ加え、攪拌する（20倍濃縮）。遠心分離（10000G、5分間、4℃）し、上澄を回収する作業を2回繰り返す。回収した上澄中のグルコース濃度を、測定キット（富士フィルム和光純薬工業社製、グルコースCII-テストワコー）を用いて測定する。測定値に基づいて、被検物質1 g当たりのグルコース生成量（mg）を算出する。
【００４５】
繊維化パラミロンは、アルカリ溶液への溶解性が、比較的低い。例えば、繊維化パラミロンは、0.1〜0.3Mの水酸化ナトリウム水溶液に対して溶解しない。ここで、「溶解しない」とは、例えば、当該水溶液に繊維化パラミロンを懸濁した後（例えば、直後〜1時間経過後）の溶液の吸光度（660 nm）が、例えば0.1以上、好ましくは1.0以上であることを意味する。
【００４６】
溶解性は以下の方法に従って又は準じて測定することができる：
被検物質250 mg（乾燥重量）をバイアル中の試験液（0.1M NaOH水溶液、0.3M NaOH水溶液）10 mLに懸濁する。バイアルを20秒間、手で激しく振った後、およびシェーカーで80 rpmで1時間振盪した後に、それぞれバイアル中の液の660 nmにおける吸光度を測定する。なお、吸光度の測定は、日本分光株式会社製分光光度計 V-730を用いて行う。
【００４７】
繊維化パラミロンの結晶化度の粒状パラミロンに対する相対値（繊維化パラミロンの結晶化度／粒状パラミロンの結晶化度）は、例えば0.60〜0.90、好ましくは0.65〜0.80である。
【００４８】
結晶化度は以下の方法に従って又は準じて測定することができる：
被検物質について、XRD測定する。条件は次のとおりである。機器：PANalytical X’Pert3 Powder、管電圧：45kV、管電流：40mA、測定範囲：5.005〜50.018°、測定間隔：0.013°、解析ソフト：HighScore。結晶化度は2θ=5〜80°における非晶質部の強度と結晶部の強度の比により解析する。解析は各測定テ一夕から装置によるバックグラウンドを除去（バックグラウンド設定Auto、ベンティングファクター0、粒状度100）した後に実施し、非晶質部は2θ=14、29°を通る接線で決定する。それぞれの非晶質部を決定するペンディングファクターと粒状度の条件は、0/20とする。
【００４９】
繊維化パラミロンは、水などの溶媒に分散した形態であってもよいし、乾燥形態であってもよい。繊維化パラミロンは、乾燥形態であっても、水に再分散することが可能である。
【００５０】
なお、本明細書において、「乾燥形態」とは、水分含量が15質量％以下、好ましくは10質量％以下、より好ましくは5質量％以下であることを示す。
【００５１】
繊維化パラミロンとしては、好ましくはこのパラミロン粒子を物理的に解繊処理して得られる、パラミロン粒子の解繊物を用いることができる。また、この解繊処理をユーグレナに適用することによって得られる、ユーグレナの解繊処理物を、繊維化パラミロンとして用いることもできる。
【００５２】
解繊処理は、パラミロン粒子中に存在するβ-1,3グルカンの水素結合をほとんど切断せずに（例えば、β−1,3−グルカンの水素結合の10％以下、5％以下、2％以下、1％以下しか切断せずに）解繊することができる処理、又はパラミロン粒子中に存在するβ−1,3−グルカン鎖又はこれが形成する3重螺旋構造体の一部又は全部を解くことができる処理である限り特に制限されない。好ましくはパラミロン粒子中に存在するβ−1,3−グルカンの水素結合をほとんど切断せずに解繊処理し、繊維状とすることが好ましい。パラミロン粒子の様な微粒子を摩砕（せん断）又は粉砕（好ましくは摩砕（せん断））することができる公知の処理を、解繊処理として採用することができる。
【００５３】
解繊処理は、公知の摩砕機（せん断機）、粉砕機などの装置を用いて行うことができる。解繊処理に用いる装置としては、例えば石臼式摩砕機、ジェットミル、二軸混練機、高圧ホモジナイザー、高圧乳化機、二軸押し出し機、ビーズミルなどが挙げられる。これらの中でも、好ましくは石臼式摩砕機やビーズミルが挙げられる。
【００５４】
解繊処理は、湿式で行うことも、乾式で行うこともできる。湿式で解繊処理を行う方が、繊維化パラミロンをより効率的に溶液中に分散させることが可能となり、好ましい。湿式で行う場合の溶媒としては、繊維化パラミロンを分散可能な溶媒である限り特に制限されず、水を好適に用いることができる。
【００５５】
解繊処理は、1種単独であってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。また、一部が解繊処理されたパラミロンであってもよく、解繊処理されたパラミロンを含む限り本発明の意図するものである。
【００５６】
5．用途
ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ−1,3−グルカンは、マクロファージ活性化作用等の免疫賦活作用を有するので、ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ−1,3−グルカンからなる群より選択される少なくとも1種は、マクロファージ活性化剤、並びに免疫賦活剤の有効成分として利用することができる。
【００５７】
有効成分としては、本発明の効果の観点から、パラミロン加工物が好ましい。中でも、繊維化パラミロンは、特に高いマクロファージ活性化作用等の免疫賦活作用を有するので、有効成分として特に好ましい。
【００５８】
本発明の有効成分又は本発明の剤は、TNF-α、一酸化窒素等の活性化マーカー等の産生を促進することから、M1マクロファージ誘導促進剤として使用することも可能である。
【００５９】
本発明の有効成分又は本発明の剤は、TNF-α、一酸化窒素等の活性化マーカー等の産生を促進することから、これらに基づいた用途、例えば抗菌効果、抗ウイルス効果、抗腫瘍効果等に基づいた各種用途（例えば抗菌能向上化剤、抗ウイルス能向上化剤、抗腫瘍能恒常化剤等）としても使用することが可能である。本発明の一態様においては、これらの用途の内の複数（2つ以上、3つ以上）の用途を含む包括的な用途に利用することができる。
【００６０】
さらには、以下に列挙する用途、目的、対象、：
（a）免疫増強
（b）自然治癒力向上
（c）感染症予防
等に利用することもできる。
【００６１】
適用対象菌は、特に制限されず、種類を問わず、例えばグラム陽性菌、グラム陰性菌等が挙げられる。適用対象のグラム陽性菌としては、例えば、ブドウ球菌属菌（例えば黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌）、腸球菌（例えばエンテロコッカス属菌）、レンサ球菌属菌（例えば双球菌、4連、8連球菌等、肺炎球菌、溶血連鎖球菌）、バシラス属菌（例えば炭疽菌、枯草菌）、クロストリジウム属菌（例えば破傷風菌、ボツリヌス菌）、コリネバクテリウム属菌（例えばジフテリア菌）、リステリア属菌、ラクトバシラス属菌、ビフィドバクテリウム属菌、プロピオニバクテリウム属菌（例えばニキビの原因となるアクネ菌）、及び放線菌が挙げられる。適用対象のグラム陰性菌としては、例えば、エシェリヒア属菌（例えば大腸菌）、サルモネラ属菌、シュードモナス属菌（例えば緑膿菌）、ヘリコバクター属菌、インフルエンザ菌、ナイセリア属菌（例えば淋菌、髄膜炎菌）が挙げられる。
【００６２】
対象ウイルスとしては、特に制限されないが、例えばインフルエンザウイルス（例えばA型、B型等）、風疹ウイルス、エボラウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ムンプスウイルス、アルボウイルス、RSウイルス、SARSウイルス、肝炎ウイルス（例えば、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス等）、黄熱ウイルス、エイズウイルス、狂犬病ウイルス、ハンタウイルス、デングウイルス、ニパウイルス、リッサウイルス等のエンベロープウイルス（エンベロープを有するウイルス）；  アデノウイルス、ノロウイルス、ロタウイルス、ヒトパピローマウイルス、ポリオウイルス、エンテロウイルス、コクサッキーウイルス、ヒトパルボウイルス、脳心筋炎ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス等の非エンベロープウイルス（エンベロープを有さないウイルス）等が挙げられる。
【００６３】
対象腫瘍としては、特に制限されず、例えば肺がん、胃がん、肝臓がん、食道がん、すい臓がん、大腸がん、胆道がん、腎がん、膀胱がん、子宮がん、卵巣がん、乳がん、前立腺がん、精巣がん、皮膚がん、白血病、骨腫瘍、骨肉種、軟部腫瘍、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫、咽頭がん、頭頸部のがん、小児がん等が挙げられる。
【００６４】
本発明の剤は、各種分野において、例えば食品組成物（健康食品、健康増進剤、栄養補助食品（サプリメントなど）を包含する）、食品添加剤、化粧品、化粧品添加剤、医薬、試薬、飼料などとして用いることができる。本発明の剤は、好ましくは経口組成物である。
【００６５】
本発明の剤の形態は、特に限定されず、用途に応じて、各用途において通常使用される形態をとることができる。
【００６６】
本発明の剤の形態としては、用途が食品組成物の場合は、液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳などの飲料、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキミックス、乳製品（例えば、粉末状、液状、ゲル状、固形状等）、パン、菓子（例えば、クッキー等）などが挙げられる。
【００６７】
本発明の剤の形態としては、用途が化粧品である場合は、例えば乳液、化粧液、フェイスクリーム、ハンドクリーム、ローション、ボディソープ、シャンプー、リンス、化粧用ゲル、パック、ファンデーション、リップクリーム、洗顔剤等が挙げられる。
【００６８】
本発明の剤の形態としては、用途が医薬である場合は、例えば軟膏剤、外用液剤（リニメント剤、ローション剤等）、スプレー剤（外用エアゾール剤、ポンプスプレー剤等）、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤（プラスター剤、硬膏剤等のテープ剤（リザーバー型、マトリックス型等）、パップ剤、パッチ剤、マイクロニードル等）、点眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、坐剤、直腸用半固形剤、注腸剤等の非経口摂取に適した製剤形態（特に、外用製剤形態）；  錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などの経口摂取に適した製剤形態（経口製剤形態）が挙げられる。
【００６９】
本発明の剤の形態としては、用途が添加剤、健康増進剤、栄養補助食品（サプリメントなど）などである場合は、例えば錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などが挙げられる。
【００７０】
本発明の剤は、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、食品組成物（健康食品、健康増進剤、栄養補助食品（サプリメントなど）を包含する）、食品添加剤、化粧品、化粧品添加剤、医薬、試薬、飼料などに配合され得る成分である限り特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、着色料、香料、キレート剤などが挙げられる。
【００７１】
本発明の剤における有効成分の含有量は、用途、使用態様、適用対象の状態などに左右されるものであり、限定はされないが、例えば0.0001〜100質量％、好ましくは0.001〜50質量％とすることができる。
【００７２】
本発明の剤の適用（例えば、投与、摂取、接種など）量は、マクロファージ活性化作用等の免疫賦活作用を発現する有効量であれば特に限定されず、通常は、有効成分の乾燥重量として、一般に一日あたり0.1〜10000 mg/kg体重である。上記適用量は1日1回以上（例えば1〜3回）に分けて適用するのが好ましく、年齢、病態、症状により適宜増減することもできる。
【実施例】
【００７３】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００７４】
参考例1
ユーグレナとして、ユーグレナ・グラシリスEOD-1株（独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（NITE-IPOD）の乾燥粉末（神鋼環境ソリューション製、パラミロン含有率70％以上）を準備した。
【００７５】
参考例2
パラミロンを以下のようにして調製した。
【００７６】
準備したユーグレナ・グラシリスEOD-1株（培養後、乾燥前の状態のもの）を、5フラスコ分の液体を集め、集めた液体を遠心管内で遠心分離（500×g、4分間、室温）した。遠心管内の上澄み液をいったん取り除いて回収した。回収した上澄み液を遠心管に入れて遠心管内の沈殿物を分散させ、100 mL容積のメスシリンダーに全て移した。さらに、メスシリンダーに、回収した上澄み液を加えて、90 mLにメスアップした。
【００７７】
［酵素処理工程］
90 mLにメスアップした液体を200 mLビーカーに移し、撹拌しながら塩酸水溶液を添加することによって液体のpHを3に調整した。タンパク質分解酵素（酸性プロテアーゼ 製品名「プロテアーゼYP−SS」ヤクルト薬品工業社製 至適pH2.5~3.0）を5 g／L濃度となるように液体に添加した。液体を撹拌しつつ50℃にて2時間、酵素処理を施した。
【００７８】
［界面活性剤処理工程］
ドデシル硫酸ナトリウムの濃度が3.0質量／容量（w／v）％となるように、酵素処理工程を経た液体に、ドデシル硫酸ナトリウムの水溶液を加えた。ドデシル硫酸ナトリウムを含む液体を撹拌しつつ、塩酸水溶液の添加によって液体のpHを3に調整した。さらに、液体をプロペラ撹拌機（回転速度200 rpm）で60℃にて30分間撹拌した。
【００７９】
［分離工程］
遠心分離（1000×g、2分間、室温）によってパラミロンを沈殿させ、界面活性剤処理工程を経た液体から、パラミロンを分離した。ドデシル硫酸ナトリウムの濃度が1.0質量／容量％となるように変更した点、pHを調整しなかった点以外は、同様にしてさらに界面活性剤処理工程を行った。その後、上記と同様にして分離工程を行った。このようにして、界面活性剤処理工程及び分離工程をそれぞれ3回ずつ行った。
【００８０】
［洗浄工程］
分離工程において遠心分離によって沈殿したパラミロンを、純水によって懸濁させ、40℃にて10分間静置した。次に、遠心分離（1000×g、2分間、室温）によってパラミロンを沈殿させた。このような操作を合計3回行った。
【００８１】
［乾燥工程］
洗浄工程において遠心分離によって沈殿したパラミロンを、50℃にて乾燥させて、パラミロン粒子を得た。得られたパラミロン粒子に2倍量の賦形剤（日澱化学：アミコールNo-3L）を加えて、以下の試験例でパラミロンとして用いた。
【００８２】
参考例3
繊維化パラミロンを以下のようにして調製した。
【００８３】
参考例2で得られたパラミロン粒子に対して、ビーズミルによってせん断力を加え、パラミロン粒子を繊維化し、繊維化パラミロンを含むスラリー（液状）を製造した。ビーズミルによる解繊処理は、サブミクロン粉砕に使用される一般的な運転条件でおこなった。パラミロン粒子を10質量％含む原材料液に対してビーズミルによる解繊処理を行った。
【００８４】
得られたスラリーに原料パラミロン粒子の乾燥重量に対して2倍量の賦形剤（日澱化学：アミコールNo-3L）を加えてよく混ぜ、得られた混合物を乾燥させて水分を蒸発させて、以下の試験例で繊維化パラミロンとして用いた。
【００８５】
得られた繊維化パラミロンについて、電子顕微鏡で観察した。観察像を図１に示す。図１に示されるように、枝分かれした構造であること、多数の繊維状物が網目状構造となったものであること、複数の繊維状物が絡み合うように寄り集まった状態であることが分かった。
【００８６】
参考例4
繊維化パラミロンを以下のようにして調製した。
【００８７】
参考例2で得られたパラミロン粒子を出発材料として使用した。パラミロン粒子の濃度が5質量％となるように、パラミロン粒子と水とを混合して、パラミロン粒子を含む原材料液を調製した。石臼式摩砕機（増幸産業社製、製品名「スーパーマスコロイダー」）を用いて、第1部材（砥石）と第2部材（砥石）との間に原材料液を入れて、第1部材と第2部材とを互いに摺動させることによって、パラミロン粒子にせん断力を加え、パラミロン粒子を繊維化し、繊維化パラミロンを含むスラリーを製造した。
【００８８】
石臼式摩砕機を用いたせん断工程における上記した湿式解繊処理は、下記条件にて行った。
［解繊処理］
・グラインダー種類：MKGCタイプ
・クリアランス（砥石の隙間）：  −100μm
・砥石回転数  ：  1200 rpm
石臼式摩砕機で得られるスラリーを回収し、回収したスラリーに再度解繊処理を施すことによりスラリーを得て、同様な操作を合計20回繰り返すこと（20パス）によって、繊維化パラミロンを含むスラリーを得た。
【００８９】
得られたスラリーに原料パラミロン粒子の乾燥重量に対して2倍量の賦形剤（日澱化学：アミコールNo-3L）を加えてよく混ぜ、得られた混合物を乾燥させて水分を蒸発させて、以下の試験例で繊維化パラミロンとして用いた。
【００９０】
得られた繊維化パラミロンについて、電子顕微鏡で観察した。観察像を図２に示す。図２に示されるように、枝分かれした構造であること、多数の繊維状物が網目状構造となったものであること、複数の繊維状物が絡み合うように寄り集まった状態であることが分かった。
【００９１】
試験例1．マクロファージ活性化の評価試験1
活性化したマクロファージは、一酸化窒素（NO）を産生することが知られている。本試験では、マクロファージに対して被検物質を作用させて、一酸化窒素産生量を測定することにより、マクロファージ活性化を評価した。具体的には以下のようにして行った。
【００９２】
細胞として、ラット肺胞由来マクロファージ（NR8383、ATCC CRL-2192）を使用した。また、培地として、HAM’s F12K (Thirmo Fisher) + 15％FBS（Gibco パフォーマンスグレード、56℃30分で非働化処理済）を使用した。細胞は、この培地で培養し、1週間に2回の目安で継代を行った。培地交換は2日に1回を目安に行った。なお、培養は、37℃、5％CO2にしたインキュベーターで行った。以下の試験時には、上記培地に、抗生物質（100×Antibiotic Antimycotic Solution シグマ）を1×になるように加えたものを使用した。
【００９３】
培養していた細胞をピペッティングとセルスクレイパーを用いて剥がして、遠心（300×g, 5分）して細胞を沈め、上澄みを除去した。抗生物質を含む培地に細胞を懸濁し、懸濁液の一部を取り、トリパンブルー（#207-17081、和光純薬工業株式会社）で死細胞を染色した上で、血球計数板を用いて生細胞濃度を測定した。細胞濃度を1.6×106cell/mlに調製し、96ウェルプレートに100μlずつ播種して、3時間培養した。被検物質（パラミロン（参考例2）又は繊維化パラミロン（参考例3又は4））を均一に懸濁した培地を100μl加えた。混合後の濃度がパラミロン又は繊維化パラミロンとして0, 10, 30, 90μg/mlとなるようにした。また、エンドトキシンのコンタミネーションによるマクロファージ細胞の活性化を防ぐために、ポリミキシンBを終濃度10μg/mlになるように加えた。被検物質及びポリミキシンBの添加後、さらに24時間培養した。
【００９４】
上澄み80μlをNOアッセイ用のプレートへ移した。希釈する場合は後述するキットのバッファーで適宜希釈した。NO濃度の測定は、Nitrate/Nitrite Assay Kit, Colorimetric (2×96 well, 3 plates)  フナコシ  780001を使用した。使用方法は添付の説明書に従った。測定したNO濃度について被験物質を入れないときを基準としてどれだけ増加したかを算出した。試験はn=3で行い平均値をグラフにした。
【００９５】
結果を図３に示す。パラミロン及び繊維化パラミロンにより、一酸化窒素濃度が増加しており、これらがマクロファージ活性化作用を有することが分かった。中でも、繊維化パラミロンは、パラミロンに比べて極めて高いマクロファージ活性化作用を有することが分かった。なお、試験は独立に3回行い、同様の結果が得られることを確認した（図３はその内の1回の結果である）。
【００９６】
試験例2．マクロファージ活性化の評価試験2
活性化したマクロファージは、TNF-αを産生することが知られている。本試験では、マクロファージに対して被検物質を作用させて、TNF-α産生量を測定することにより、マクロファージ活性化を評価した。具体的には以下のようにして行った。
【００９７】
細胞として、ラット肺胞由来マクロファージ（NR8383、ATCC CRL-2192）を使用した。また、培地として、F-12K nutrient mixture 培地（#21127-022、ライフテクノロジーズ・ジャパン社製 + 15％FBS（Batch no.70301115、MOREGATE、56℃30分で非働化処理済）に、ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン（100×、液体：#10378-01、ライフテクノロジーズ・ジャパン社製）を1×になるように加えたものを使用した。
【００９８】
T25培養フラスコ 15本にて前培養した細胞をピペッティングにより壁から剥がし、得られた細胞の懸濁液を50mLコニカルチューブに移した。チューブを室温で遠心分離し（1000rpm、5分間）、上清をデカンテーションで捨て、細胞を回収した。タッピングにより細胞をほぐした後、培養液5mLを加え、ピペッティングによって細胞を均一に懸濁した。11μLを別のチューブに移し0.5%トリパンブルー11μLを添加した後、血液計算板に細胞懸濁液を移して細胞数と生存率を測定した。生存率は93.6%で90%以上（細胞の生存率が90％以上であることを試験に使用可能な細胞の基準としている）であったので、残液を試験に用いた。
【００９９】
測定した細胞数に基づいて、残液に培養液を加えて希釈し1.6×105cells/mLになるよう細胞数を調製した。この細胞懸濁液を100μLずつ96well平底プレートの各ウェルに加えた。インキュベーターに移して、細胞がウェルの底に接着して伸展するまで5時間前培養を行った。
【０１００】
前培養が終了した時点でプレートを取り出し、ウェルに100μLずつ2倍濃度の被験液を加えた。各検体を添加後、48時間インキュベーター内で培養した。培養後、上清50μLを96穴平底プレートに回収し、TNF-α測定に供した。
【０１０１】
ELISA測定キット（ELISA MAX（登録商標） Deluxe Sets Rat TNF-α:#438204、BioLegend）の説明書に記載されている操作手順に従って測定した。各サンプルについてn=1で測定した。Assay Diluentにて20倍希釈した培養上清液を測定に供した。
【０１０２】
結果を図４に示す。パラミロン及び繊維化パラミロンにより、TNF-α濃度が増加しており、これらがマクロファージ活性化作用を有することが分かった。中でも、繊維化パラミロンは、パラミロンに比べて極めて高いマクロファージ活性化作用を有することが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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