(57)【要約】【課題】効率性が改善されたＴＨＢ製造方法を提供する。【解決手段】デオキシシロイノソース（ＤＯＩ）を含む細菌培養液を、８０℃以上の高温で加熱して、トリヒドロキシベンゼン（ＴＨＢ）を含む産物溶液を取得する工程を含む、トリヒドロキシベンゼン（ＴＨＢ）の製造方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
デオキシシロイノソース（ＤＯＩ）を含む細菌培養液を、８０℃以上の高温で加熱して、トリヒドロキシベンゼン（ＴＨＢ）を含む産物溶液を取得する工程を含む、トリヒドロキシベンゼン（ＴＨＢ）の製造方法。
【請求項２】
前記細菌培養液は、ＤＯＩを合成する細菌の培養によって１ｇ／Ｌ以上のＤＯＩが蓄積したものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記加熱の前に、ＤＯＩを合成する前記細菌を液体培地中でＤＯＩ合成条件下で培養する工程をさらに含み、前記培養後の液体培地が前記細菌培養液を提供する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記加熱をする前に、前記細菌を前記細菌培養液から除去する工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記高温は９０〜３００℃である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記高温における加熱は、少なくとも３０秒間行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記産物溶液からトリヒドロキシベンゼン（ＴＨＢ）を分離する工程をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記分離する工程は、溶媒抽出を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記溶媒抽出における溶媒は酢酸エチルである、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリヒドロキシベンゼン（ＴＨＢ）を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
デオキシシロイノソース（２−ｄｅｏｘｙ−ｓｃｙｌｌｏ−ｉｎｏｓｏｓｅ。ＤＯＩと略記される。）は、様々な有用な化学物質へと誘導することができる化合物である。一般に、産業的に有用な化学物質、特に炭素六員環化合物は、化石資源、特に石油を原料として化学的に製造されることが多い。しかしながら、ＤＯＩは、特定の酵素を発現する細菌を用いたバイオプロセスにより糖類から合成できることが知られているため（特許文献１〜３）、化石資源依存からの脱却および地球環境保全の観点から、特に魅力的な化学物質である。
【０００３】
すなわち、例えば木材チップのような、セルロースを主成分とする植物材料を、公知の技術によってグルコース等の単糖類に分解し、その単糖類を、上述のバイオプロセスによりＤＯＩに変換することにより、非化石資源を有効利用した化学製品製造を実現することができる。
【０００４】
ＤＯＩから誘導され得るさらなる中間物質のうち、最も代表的な１つが、トリヒドロキシベンゼン（ＴＨＢ）である。ＴＨＢは、ＤＯＩからの脱水反応（１分子のＤＯＩから合計２分子の水が脱離する）により生成される化合物である。ＴＨＢはさらに、クエルシトール、カルバグルコース、カテコール、アジピン酸誘導体、ハイドロキノン、トリメトキシベンゼン、トリメトキシ安息香酸フェニルエステル、セサモール等の有用化合物へと誘導することができる。これらのＴＨＢ由来有用化合物は、例えば糖尿病治療薬、ナイロン、写真薬、重合抑制剤、Ｌｉ二次電池添加剤、セルロースフィルム添加剤、抗うつ薬等のアプリケーションに用いることができる（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００６／１０９４７９号
【特許文献２】国際公開第２０１０／０５３０５２号
【特許文献３】国際公開第２０１５／００５４５１号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】生物工学、第９３巻、５３３−５３５、２０１５年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
細菌を用いたバイオプロセスにより合成されたＤＯＩから、ＴＨＢを得るために、従来は、培養培地の酸性化、遠心分離、濾過、陽イオン交換、陰イオン交換、乾燥、濃縮、メタノール共沸、乾燥、晶析、および濾過乾燥を含む多数の工程を経て精製粉末ＤＯＩを取得し、それを水に溶解して、例えば１７０℃、２時間加熱することによって最終的に製品ＴＨＢを得るということが行なわれていた。しかしながら、このような多くの工程は、手間と時間がかかり、製造コストを著しく高くしてしまう。製造工程の簡略化、および／または収率の向上によって、ＴＨＢ製造の効率性を改善することが望まれる。
【０００８】
本発明は、効率性が改善されたＴＨＢ製造方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、ＤＯＩを合成した細菌の培養液を直接加熱することにより、高収率でＴＨＢが生成されることを発見した。本発明はこの発見に基づくものである。
【００１０】
本発明は、少なくとも以下の実施形態を含む。
［１］
デオキシシロイノソース（ＤＯＩ）を含む細菌培養液を、８０℃以上の高温で加熱して、トリヒドロキシベンゼン（ＴＨＢ）を含む産物溶液を取得する工程を含む、トリヒドロキシベンゼン（ＴＨＢ）の製造方法。
［２］
前記細菌培養液は、ＤＯＩを合成する細菌の培養によって１ｇ／Ｌ以上のＤＯＩが蓄積したものである、［１］に記載の方法。
［３］
前記加熱の前に、ＤＯＩを合成する前記細菌を液体培地中でＤＯＩ合成条件下で培養する工程をさらに含み、前記培養後の液体培地が前記細菌培養液を提供する、［２］に記載の方法。
［４］
前記加熱をする前に、前記細菌を前記細菌培養液から除去する工程をさらに含む、［３］に記載の方法。
［５］
前記高温は９０〜３００℃である、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
前記高温における加熱は、少なくとも３０秒間行われる、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
前記産物溶液からトリヒドロキシベンゼン（ＴＨＢ）を分離する工程をさらに含む、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］
前記分離する工程は、溶媒抽出を含む、［７］に記載の方法。
［９］
前記溶媒抽出における溶媒は酢酸エチルである、［８］に記載の方法。
【００１１】
本発明により、ＴＨＢを生産する効率が著しく改善される。すなわち、細菌によるＤＯＩの合成からＴＨＢ生産までのプロセスの工程数を減少させて著しく簡略化することができ、またそのプロセスの一部または全部を連続的に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、一実施形態に係るＴＨＢ製造システムの概略を示す。
【図２】図２は、別の実施形態に係るＴＨＢ製造システムの概略を示す。
【図３】図３は、ＤＯＩ発酵液（原液）およびそれを加熱したものの外観（ａ）およびＤＯＩ含有量（ｂ）を示す。
【図４】図４は、ＤＯＩ発酵液から得られたＴＨＢ産物溶液（下）、および溶媒抽出後のＴＨＢ試料（上）の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
一側面において、本開示は、デオキシシロイノソース（ＤＯＩ）を含む細菌培養液を、８０℃以上の高温で加熱して、トリヒドロキシベンゼン（ＴＨＢ）を含む産物溶液を取得する工程を含む、トリヒドロキシベンゼン（ＴＨＢ）の製造方法を提供する。
【００１４】
デオキシシロイノソース（ＤＯＩ）の構造を下記に示す。
【化１】
2020066604.tif 000002
【００１５】
トリヒドロキシベンゼン（ＴＨＢ）の構造を下記に示す。
【化２】
2020066604.tif 000003
【００１６】
上で示した構造は、１，２，４−トリヒドロキシベンゼンに相当するが、本実施形態で製造されるＴＨＢには、１，２，４−トリヒドロキシベンゼンに加えて、１，２，３−トリヒドロキシベンゼン（ピロガロール）も含まれ得る。また、産物溶液にはカテコールも含まれ得る。
【００１７】
加熱される細菌培養液中のＤＯＩの濃度、すなわち、加熱される前の段階の細菌培養液中のＤＯＩの濃度は、好ましくは１ｇ／Ｌ以上であり、より好ましくは１０ｇ／Ｌ以上であり、さらに好ましくは５０ｇ／Ｌ以上である。ＤＯＩの濃度の上限は特に限定されないが、通常は１００ｇ／Ｌ以下であり、例えば９０ｇ／Ｌ以下、または８０ｇ／Ｌ以下である。
【００１８】
細菌培養液は、ＤＯＩを合成する細菌を液体培地中でＤＯＩ合成条件下で培養した後に得られる、ＤＯＩを含有する馴化液体培地である。ＤＯＩを合成する細菌の培養に適した液体培地は当業者に知られているか、または当業者が通常の知識に基づいて調製することができ、典型的には、定常期（stationary phase）において１０７細胞／ｍＬ以上、好ましくは１０８細胞／ｍＬ以上の細胞密度での培養をサポートできるものである。当業者に知られるように、細菌培養用の液体培地は通常、炭素源（特に、糖類）、窒素源（アミノ酸など）、ビタミン類、無機塩類などを含む。本実施形態では、上記のように比較的高い細胞密度での培養とＤＯＩ合成をサポートできる液体培地でさえあれば、具体的な材料成分が異なっていても同様の結果が得られることが確認されている。グルコース以外の糖類もグルコースに代謝され得るものの、液体培地がグルコースそのものを含んでいると、ＤＯＩ合成のための基質が直接的に提供されることとなり効率がよいため、好ましい。
【００１９】
本実施形態の細菌培養液を得るために使用することができる典型的な液体培地の一例は、ＹＥ培地であり、これは、水６．５ＬあたりＢＤ  Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（カゼインの膵消化物）を５０〜２００ｇ（２×ＹＥ培地では１０４ｇ）、ＢＤ  Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ（酵母の水溶性抽出物）を６０〜２６０ｇ（２×ＹＥ培地では１３０ｇ）、ＮａＣｌを１５〜６０ｇ（２×ＹＥ培地では３２．５ｇ）、グルコースを２００〜８００ｇ（２×ＹＥ培地では３７７〜３９０ｇ）、マンニトールを１５０〜６５０ｇ（２×ＹＥ培地では３３５ｇ）含み、任意で、アンピシリン等の抗生物質、フィチン酸、消泡剤等の添加物を少量（例えば合計で５ｇ以下）含み得る。フィチン酸は細菌によるＤＯＩ生産量を向上させ得る添加成分であり、例えば５０％（ｗ／ｗ）フィチン酸水溶液を上記量のＹＥ培地あたり１〜２０ｇ添加し得る。
液体培地の別の具体例（ＣＳＬ培地）は、水５２．６ｋｇあたり、ＣＳＬ（コーンスティープリカー）を１５０〜７００ｇ（標準で３２５ｇ）、グルコースを１０００〜５０００ｇ（標準で２０１０ｇ）、フルクトースを１０００〜５０００ｇ（標準で２０１０ｇ）、キシロースを１００〜５００ｇ（標準で２００ｇ）、硫化アンモニウムを５０〜５００ｇ（標準で１７０ｇ）、塩化アンモニウムを２０〜２００ｇ（標準で７８．２ｇ）、硫酸マグネシウム７水和物を２０〜２００ｇ（標準で７８．２ｇ）、リン酸水素二カリウムを４０〜２００ｇ（標準で９１ｇ）、リン酸二水素カリウムを４０〜２００ｇ（標準で９１ｇ）、硫酸鉄（ＩＩ）７水和物を２〜１０ｇ（標準で４．５５ｇ）含むものである。ＣＳＬ培地は、水５２．６ｋｇあたり、５０％（ｗ／ｗ）フィチン酸を４０〜２００ｇ（標準で９１ｇ）さらに含んでもよい。ＣＳＬ培地は消泡剤を含んでもよい（例えば上記量のＣＳＬ培地あたり５〜３０ｇのアデカノール消泡剤）。
培養途中に、培地成分の一部または全部を随時補給してもよい。例えば、培養途中に糖成分を補給することが好ましい。
【００２０】
加熱される細菌培養液には、細菌細胞が含まれていてもよいし、含まれていなくてもよい。すなわち、一実施形態において、加熱される細菌培養液は、細菌を培養した後の液体培地であって、その細菌を含むもの、またはその細菌が除去された後のものである。なお、本明細書において、「溶液」という用語（「水溶液」を含む）は、溶媒とは異なる少なくとも１種の物質が溶解または懸濁された液を意味する。溶液には、不溶性物質や固形物質が懸濁されていてもよい。ここでいう不溶性物質および固形物質には、生物学的な細胞が含まれ得る。
【００２１】
つまり、加熱される細菌培養液、すなわち加熱される前の段階の細菌培養液には、ＤＯＩを合成した細菌の菌体が含まれていてもよい。例えば、液体培地中で細菌を培養して糖からＤＯＩを合成させた後に、細菌の除去とＤＯＩの精製を行うことなく、細菌およびＤＯＩを含むその液体培地（すなわち細菌培養液）をそのまま高温で加熱することにより、本実施形態の方法を実施することができる。このような実施態様により、ＴＨＢの製造と使用済み細菌の不活化／滅菌処理とを同時に行うことができるため、全体的な手順が大幅に簡略化されるだけでなく、バイオセーフティおよび衛生の観点からも有利となる。
【００２２】
一実施形態において、本方法は、細菌培養液を加熱する段階の前に、ＤＯＩを合成する細菌を上記液体培地中でＤＯＩ合成条件下で培養する工程をさらに含む。培養後の液体培地が、加熱されるための細菌培養液を提供する。
【００２３】
加熱される細菌培養液は、好ましくは１２時間以上、より好ましくは１６時間以上の培養を経たものであり得、例えば２４時間以上、または３２時間以上の培養を経たものであり得る。培養においては、１０４細胞／ｍＬ以下の細胞密度から２４時間以内に好ましくは１０７細胞／ｍＬ以上、より好ましくは１０８細胞／ｍＬ以上の細胞密度が達成され得る。ＤＯＩを合成する細菌の培養によって、好ましくは１ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１０ｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは５０ｇ／Ｌ以上のＤＯＩが細菌培養液中に蓄積する。培養温度は通常は２５〜３８℃であり、３０〜３７℃が好ましい。細菌にＤＯＩを合成させるための培養条件は、当業者が通常の知識に基づいて適宜調節することができる。
【００２４】
ＤＯＩを合成する細菌は、当業者に知られており、あるいは、公知の情報に基づいて当業者が同定または取得することができる。そのような細菌種の具体的な例として、大腸菌、バシラス・サーキュランス、バシラス・アミロリケファシエンス、バシラス・サチリス、コリネバクテリウム・グルタミカム、およびゲオバシラス・ステアロサーモフィラスが挙げられるが、これらに限定されない。大腸菌が特に好ましい。細菌は、好ましくは、２−デオキシシロイノソース合成酵素を発現するものである。最も好ましくは、ＤＯＩを合成する細菌は、２−デオキシシロイノソース合成酵素を発現する大腸菌である。２−デオキシシロイノソース合成酵素の好ましい例として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ由来のｂｔｒＣ遺伝子の産物が挙げられるが（特許文献１）、ＤＯＩ合成活性が維持されている限り、他の細菌由来の相同的遺伝子産物や、天然配列を改変したものも代用できることが当業者に理解される。そのような遺伝子は、内因的なものでもあり得るが、遺伝子工学的手法により外因的に導入されたものが好ましい。プラスミドベクターの選択、プロモータの選択、コドンの最適化等、遺伝子発現を増加および／または最適化するための手段は当業者に知られている。例えば、プロモータは、恒常的に発現するプロモータであってもよいし、発現誘導可能なプロモータであってもよい。
【００２５】
２−デオキシシロイノソース合成酵素が導入される宿主細菌は、その他の遺伝子が改変、追加、または削除されていてもよい。例えば、ＤＯＩ合成のための基質となるグルコース−６−リン酸を別化合物に代謝してしまう遺伝子であるｐｇｉ、ｚｗｆ、およびｐｇｍのうちの１つ以上もしくは全て、および／または、定常期におけるタンパク質合成抑制に関与する遺伝子であるｒｍｆを破壊した大腸菌を宿主として用いることにより、ＤＯＩの収率を増加させることができる（特許文献１）。その場合、マンニトール等、グルコース以外の炭素源を培地に添加することが必要になり得る。しかしながら、例えば、スクロース加水分解酵素の遺伝子（ｃｓｃＡ）を大腸菌に追加することにより、栄養源としては安価なスクロースを使用しながらグルコースからのＤＯＩ合成を効率よく行わせることができる（特許文献２）。これらの系により、培地１リットルあたり少なくとも数十グラムのＤＯＩを蓄積させることができることが示されている（特許文献１〜３）。
【００２６】
細菌がＤＯＩを合成した後の液体培地（細菌培養液）には、２−デオキシシロイノソース（ＤＯＩ）のほか、以下のものから選ばれる１つまたは複数の関連化合物が少量（例えば、合計で、２−デオキシシロイノソース（ＤＯＩ）の重量の２０％以下、１５％以下、１０％以下、または５％以下）含まれ得る：１−ｅｐｉ−ＤＯＩ、α，β−不飽和ケトン、（＋）ｖｉｂｏ−クエルシトール、およびｓｃｙｌｌｏ−クエルシトール。
【００２７】
細菌が含まれたままの状態で細菌培養液の加熱を行ってもよいが、加熱を行う前に細菌の菌体を細菌培養液から除去する工程を加えてもよい。この工程により、加熱された菌体から放出される多量の不溶物質が産物溶液の純度を低下させたり反応を阻害したりする可能性を回避することができる。細菌培養液から細菌の菌体を除去する工程において使用される技術は、当業者が公知のものから適宜選択することができ、例えばフィルター濾過および遠心分離が挙げられる。フィルター濾過は比較的単純な機構で行うことができるため好ましい。
【００２８】
菌体を除去するためには、カットオフが１μｍ以下の濾過フィルター、例えば０．２μｍ孔径の濾過フィルターを使用することができる。孔径の異なる複数の濾過フィルターを組み合わせてもよい。フィルターの孔径を選択することにより、加熱前の細菌培養液から菌体以外のものも除去することもできる。例えば、適切なフィルター濾過により、細菌培養液から、ＴＨＢ合成に不要な成分を除去しておくことによって、加熱後の産物溶液におけるＴＨＢ純度を改善させ得る。ＴＨＢ合成に不要な成分を、塩析によって除去することもできる。
【００２９】
細菌培養液を加熱する「高温」の温度は、８０℃以上である。８０℃未満であると、ＤＯＩの変換反応自体は起こり得るが十分な変換効率が得られないと考えられる。高温の温度は好ましくは９０℃以上、より好ましくは１００℃以上、より好ましくは１３０℃以上、さらに好ましくは１４０℃以上、特に好ましくは１６０℃以上、最も好ましくは１７０℃以上である。
【００３０】
上記高温について、上限は特に限定されないが、通常は３００℃以下、あるいは２００℃以下である。高温は、典型的には１３０〜１８０℃である。高温を、大気圧を超える高圧と組み合わせてもよい。そのような高圧は例えば１ＭＰａ以下、０．８ＭＰａ以下、０．５ＭＰａ以下、または０．２ＭＰａ以下である。
【００３１】
高温における細菌培養液の加熱の時間は、使用する温度や望まれるＴＨＢ収量によっても異なり得るが、通常は少なくとも３０秒間、好ましくは少なくとも１分間、より好ましくは少なくとも２分間、より好ましくは少なくとも５分間、より好ましくは少なくとも１０分間、さらに好ましくは少なくとも３０分間である。１時間以上、２時間以上、または４時間以上加熱を行ってもよい。加熱は、上記の時間に渡って連続してもよいし、断続的な加熱によって高温に達する累積時間が上記の時間であってもよい。加熱の時間の上限は特に限定されないが、例えば２４時間以下、４時間以下、２時間以下、１時間以下、３０分間以下、または１０分間以下である。
【００３２】
細菌培養液を高温で加熱することは、当業者に知られる技術を用いて達成することができ、例えば、細菌培養液中に熱気（蒸気）もしくは熱液を注入すること、細菌培養液を固体熱源に接触させること、細菌培養液を含む容器もしくは管の内壁を加熱すること、細菌培養液に通電すること、および／または細菌培養液にマイクロ波を適用することによって達成することができる。
【００３３】
細菌培養液の加熱時の雰囲気は、空気、窒素およびアルゴンのような不活性ガス、またはこれらの混合物であることが好ましい。細菌培養液の加熱時の雰囲気は、実質的な水素（Ｈ２）非含有雰囲気であることが好ましい。実質的な水素非含有雰囲気は、例えば水素体積濃度が１ｐｐｍ未満である。また、細菌培養液の加熱は、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、白金、イリジウム、ニッケル、コバルト、銅のような金属触媒ないし還元触媒の実質的な非存在下で行うことが好ましい。
【００３４】
「産物溶液」とは、細菌培養液の加熱後に得られる、ＴＨＢが溶解または懸濁された溶液を意味する。
【００３５】
産物溶液から不純物を除去するために、フィルター濾過処理または遠心分離処理を行ってもよい。特に、細菌の菌体を含んだ細菌培養液を加熱した場合には、変性した菌体に由来する不溶物が産物溶液に多量含まれ得るので、これらの処理が特に有意義になり得る。
【００３６】
本実施形態の方法は、産物溶液からＴＨＢを分離する工程をさらに含んでいてもよい。ＴＨＢの分離は、公知の手法を適宜使用することができる。好ましくは、溶媒抽出によって、産物溶液からＴＨＢが抽出される。溶媒抽出は１回以上繰り返してもよい。抽出溶媒としては酢酸エチルまたは酢酸メチルが好ましく、特に酢酸エチルが好ましいが、必ずしもこれらに限定されない。抽出に使用される抽出溶媒の体積は産物溶液の体積以上であることが好ましい。溶媒抽出は、当業者に理解されるように、産物溶液と有機溶媒を混合した後に有機層と水層とに分離し、ＴＨＢを含有する有機層を回収することにより行われ得る。水溶性の塩を産物溶液に加えて溶媒抽出を行ってもよい。例えば、飽和濃度未満の塩化ナトリウムを産物溶液に加えてから溶媒抽出を行うと収率が改善され得る。また、酸、例えば塩酸を産物溶液に加えてｐＨを低下させてから溶媒抽出を行うと収率が改善され得る。ｐＨは２未満とすることが好ましく、１．５未満とすることがより好ましく、１未満とすることがさらに好ましい。分離後のＴＨＢ試料に不溶物が含まれている場合には、例えばフィルター濾過により不溶物を除くことができる。
【００３７】
分離後のＴＨＢ試料は、不溶物と溶媒を除いた後の乾燥重量でＴＨＢ含量が好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上である。また、分離後のＴＨＢ試料は、不溶物と溶媒を除いた後の乾燥重量でカテコール含量が好ましくは５％以下、より好ましくは３％以下、より好ましくは２％以下、特に好ましくは１．５％以下である。
【００３８】
（ａ）細菌の培養によるＤＯＩの合成の段階から高温での加熱によるＴＨＢの生成の段階まで、および／または（ｂ）ＴＨＢの生成の段階からＴＨＢの分離の段階までは、連続的に実行され得る。これらの段階をバッチごとに実行してもよい。
【００３９】
別の側面において、本開示は、ＤＯＩを合成する細菌を含む液体培地を保持して前記細菌を培養して細菌培養液を生成する、培養槽と、前記培養槽に接続され、前記細菌培養液を８０℃以上の高温で加熱して、トリヒドロキシベンゼン（ＴＨＢ）を含む産物溶液を生成させる、加熱装置とを含む、トリヒドロキシベンゼン（ＴＨＢ）を製造するためのシステムを提供する。
【００４０】
このシステムは、本開示の前述の側面に係る方法を実施することに適したものである。すなわち、本明細書において、方法の実施形態についての説明内容が、システムの実施形態についても適用され得、その逆も然りである。例えば、液体培地は、上述したように典型的には定常期において１０７細胞／ｍＬ以上、好ましくは１０８細胞／ｍＬ以上の細胞密度での培養をサポートできるものである。細菌についても上述したとおりである。
【００４１】
培養槽には、細菌の培養に適した条件を提供するための付属設備が備えられていてもよい。例えば、培養槽は、培地を撹拌するための撹拌装置、培地を振とうするための振とう装置、培地を曝気するための曝気装置、および培地を加温するための加温装置のうちの１つ以上を有していてもよい。培養槽には、新鮮な液体培地の成分の一部または全部を培養槽内に供給する液体培地供給ラインが接続されていてもよい。一実施形態において、この液体培地供給ラインは、切換え弁を有しており、培養槽が液体培地供給ラインと後述する送液管との間で切り替わって接続できるようになっている。
【００４２】
培養槽は、送液管を介して加熱装置に接続され得る。この場合の加熱装置は、培養槽から送られてくる液を加熱装置の内部で加熱するものである。例えば、加熱装置は、内部に連続的な加熱通路が備えられており、この加熱通路を通過する細菌培養液が加熱されるという構造であってもよい。加熱通路は例えば、通過する細菌培養液に熱気もしくは熱液を注入すること、または、通路の内壁もしくは通路内に配置された固体熱源を熱することによって、液体培地を加熱し得るが、可能な加熱方法はこれらに限定されない。熱気は例えば加熱された空気、水蒸気、または窒素である。熱液は例えば加熱された水または新鮮な液体培地である。加熱通路中の加熱温度、保持時間、および流速は任意に調節することができる。加熱通路は、異なる温度に設定できる複数の加熱ゾーンを有していてもよい。加熱装置は、加熱されてＴＨＢが生成された産物溶液を回収するための取出し口が備えられていてもよい。
【００４３】
培養槽は、細菌培養液から細菌の菌体を除去する菌体除去装置を介して加熱装置に接続されていてもよい。菌体除去装置は、濾過フィルター、または遠心分離機を含み得る。菌体を除去するための濾過フィルターを含む菌体除去装置が好ましい。孔径の異なる複数の濾過フィルターを菌体除去装置に備えさせてもよく、菌体以外の不要成分をこの段階で除去することもできる。菌体除去装置は送液管の途中に備えられていてもよい。
【００４４】
送液管は、菌体除去装置、液を移送するためのポンプ、過剰な内部圧力（例えば１０ｂａｒ以上）を防ぐための安全弁、および流速を調節するための流速調節装置のうちの１つ以上を有し得る。これらの付属設備の種類および数ならびに液流の方向に対する配置順序は、当業者が適宜決定することができる。
【００４５】
あるいは、加熱装置は、培養槽そのものの内部で細菌培養液を加熱する、一体型加熱装置であってもよい。この場合の加熱は、例えば培養槽の内部に熱気もしくは熱液を注入すること、または、培養槽の内壁もしくは培養槽内に配置された固体熱源を熱することにより達成され得るが、可能な加熱方法はこれらに限定されない。熱気は例えば加熱された空気、水蒸気、または窒素である。熱液は例えば加熱された水または新鮮な液体培地である。
【００４６】
加熱装置による加熱温度および加熱時間については、上記ＴＨＢの製造方法の実施形態について説明したとおりである。
【００４７】
加熱装置（一体型加熱装置の場合は、それが備えられた培養槽を含む）には、産物溶液から固形物質および不溶物質を除去する浄化装置が接続されていてもよい。浄化装置は、例えば、濾過フィルターまたは遠心分離機を有し得る。加熱された細菌培養液が細菌の菌体を含んでいた場合には、変性した菌体に由来する不溶物が産物溶液に多量含まれ得るので、この浄化装置によって、その不溶物を除去することができる。孔径の異なる複数の濾過フィルターを浄化装置に備えさせてもよい。同様に、加熱装置は、液の温度を下げるための冷却装置に接続されていてもよい。高温での加熱後の液は例えば室温まで冷却され、冷却装置はこの冷却を促進することができる。
【００４８】
さらに、加熱装置（一体型加熱装置の場合は、それが備えられた培養槽を含む）は、産物溶液からＴＨＢ産物を分離する、分離装置に接続されていてもよい。分離装置は、上述した浄化装置の下流に接続されることが好ましい。分離装置は、例えば遠心抽出機、ミキサーセトラー、マイクロリアクター、フローリアクター、およびパルスカラム等の、公知の溶媒抽出装置を含み得る。溶媒抽出装置は、ＴＨＢを含有する有機層を排出する有機層排出口を有し得る。溶媒抽出装置は、さらに、水層を排出する水層排出口を有し得る。
【００４９】
加熱装置は送液管を介して分離装置に接続されていてもよい。この送液管も、上述したような、ポンプ、安全弁、冷却装置、浄化装置、流速調節装置等の付属設備を任意の数および配置順序で有し得る。
【００５０】
本実施形態のシステムは、全体が１つの装置として統合されていてもよい。
【００５１】
さらなる側面において、本開示は、本実施形態のＴＨＢ製造システムを用いてＴＨＢを製造する方法を提供する。
【００５２】
本実施形態に係るシステムの一例を図１に示す。この例のシステム１００では、ＤＯＩを合成する細菌１０１および液体培地１０２が培養槽１０３に保持されており、培養槽１０３中で培養が行われる。すなわち液体培地１０２は細菌培養液１０２’となる。培養槽１０３は、切換え弁１０４によって、液体培地供給ライン１０５または送液管１０６のいずれかに接続できるようになっている。送液管１０６は、濾過フィルターを有する菌体除去装置１０７、液（すなわちフィルター濾過後の細菌培養液１０２’）を移送するためのポンプ１０８、過剰な内部圧力（例えば１０ｂａｒ以上）を防ぐための安全弁１０９、および流速を調節するための流速調節装置１１０を備えており、加熱装置１１１に接続されている。加熱装置１１１の内部では、細菌培養液は加熱通路１１２を通過し、その際に加熱される。この例では、加熱装置１１１内には３つの加熱ゾーン１１３Ａ，Ｂ，Ｃが設けられ、それぞれ１つ以上の加熱通路を有して、互いに異なる温度で液体培地を加熱できるようになっている。高温での加熱を経た細菌培養液は、ＴＨＢを含む産物溶液となり、取出し口１１４から加熱装置１１１を出る。取出し口１１４は、産物溶液を冷却する冷却装置１１５と、濾過フィルターを有し産物溶液から固形物質および不溶物質を除去する浄化装置１１６とを介して、遠心抽出機を含む分離装置１１７に接続されている。分離装置１１７は、産物溶液に有機溶媒（例えば酢酸エチル）を加えて抽出を行って、有機層１１８および水層１１９を排出する。ＴＨＢは有機層１１８中に分離されている。
【００５３】
本実施形態に係るシステムの別の一例を図２に示す。この例のシステム２００でも、ＤＯＩを合成する細菌２０１および液体培地２０２が培養槽２０３に保持されており、培養槽２０３中で培養が行われる。すなわち液体培地２０２は細菌培養液２０２’となる。培養槽２０３には、一体型加熱装置２１１が備えられている。一体型加熱装置２１１は、培養槽２０３の内部に熱気２２０を注入することによって、培養後の液体培地２０２すなわち細菌培養液２０２’を高温に加熱する。従って、細菌培養液２０２’は、培養槽２０３の中で、ＴＨＢを含む産物溶液に変換される。培養槽２０３は、切換え弁２０４によって、液体培地供給ライン２０５または送液管２０６のいずれかに接続できるようになっている。送液管２０６は、産物溶液を移送するためのポンプ２０８、過剰な内部圧力を防ぐための安全弁２０９、産物溶液を冷却する冷却装置２１５、濾過フィルターを有し産物溶液から固形物質および不溶物質を除去する浄化装置２１６、および流速を調節するための流速調節装置２１０を備えており、遠心抽出機を含む分離装置２１７に接続されている。分離装置２１７は、産物溶液に有機溶媒（例えば酢酸エチル）を加えて抽出を行って、有機層２１８および水層２１９を排出する。ＴＨＢは有機層２１８中に分離されている。
【実施例】
【００５４】
２−デオキシシロイノソース合成酵素（ｂｔｒＣ遺伝子産物）を発現する大腸菌をＤＯＩ合成条件下で２×ＹＥ培地中で培養した後の細菌培養液（以下、ＤＯＩ発酵液という）を約８０℃で不活化処理する際に、ＤＯＩ発酵液の変色が見られ、発明者らは、このＤＯＩ発酵液中でＤＯＩからＴＨＢへの変換反応が起こった可能性を推測した。図３は、ｐＨ６またはｐＨ３におけるＤＯＩ発酵液（原液）、ならびに、それを９５℃で３０分間加熱したもの、１０５℃で３０分間加熱したもの、１３２℃で２０分間加熱したもの、および１３２℃で１分間加熱したものの外観（ａ）およびＤＯＩ含有量（ｂ）を示す。ＤＯＩ発酵液の変色に伴ってＤＯＩ含有量の減少が見られており、ＴＨＢの生成が示唆された。これらの加熱試料を、液体クロマトグラフィー（カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃ  ＯＤＳ−ＡＱ、溶出液：１０ｍＭ酢酸水溶液／アセトニトリル＝３／９７、検出器：蒸発光散乱型検出器）および質量分析で分析したところ、ＴＨＢが生成されていたことが確認された。例えば、ＤＯＩ発酵液を１３２℃で２０分間加熱した試料では、ＤＯＩの約３０％がＴＨＢに変換され、約５０％が他の脱水物に変換されていたことが明らかになった。
【００５５】
次に、図１に示されるものと本質的に同様の槽・加熱装置を用いて、異なる試験条件下で、精製ＤＯＩ水溶液（ＤＯＩ濃度７０ｇ／Ｌ）と、ＤＯＩ発酵液（０．２μｍＭＦ膜で濾過したもの；ＤＯＩ濃度５９．１ｇ／Ｌ）とを加熱し、加熱後の液に含まれる化合物を分析して、結果を比較した。このＤＯＩ発酵液は、上述のようにｂｔｒＣ遺伝子を発現する大腸菌を、ＣＳＬ培地中で３２〜４０時間培養して得たものである。分析結果を下記表１に示す。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
表１において、精製ＤＯＩ水溶液試料およびＤＯＩ発酵液試料に関して試験条件が同じものは、同じ行に示している。ＤＯＩ残率は、加熱前試料に含まれていたＤＯＩの何％が加熱後に残存していたかを表し、１，２，４−ＴＨＢ変換率は、加熱前試料に含まれていたＤＯＩの何％が１，２，４−ＴＨＢに変換されたかを表す（一脱水物変換率も同様）。なお、同様の実験で、１，２，３−ＴＨＢの生成も確認されている（データは示していない）。例えば「１６０℃３０秒  ５回繰り返し」という記載は、１６０℃において３０秒間の加熱を５回繰り返したことを意味し、すなわち試料が累積時間２．５分間に渡り１６０℃で加熱されたことを意味する。
【００５８】
表１の結果から、加熱の累積時間が長ければ長いほど変換量が増加すること（例えば、精製ＤＯＩ水溶液の試料２〜４を比較）、および、加熱温度が高い方が変換効率が向上すること（例えば、ＤＯＩ発酵液の試料２と５、試料３と６、または試料４と７を比較）が見て取れる。
【００５９】
重要なことに、同じ加熱条件下では、精製ＤＯＩ水溶液と比べてＤＯＩ発酵液において著しく高い効率でＤＯＩからＴＨＢへの変換が達成された。すなわち、精製ＤＯＩ水溶液試料２におけるＴＨＢ変換率は２．３３％であったのに対し、同じ加熱条件のＤＯＩ発酵液試料５におけるＴＨＢ変換率は２７．１９％であった。同様に、精製ＤＯＩ水溶液試料３のＴＨＢ変換率は５．２３％であったのに対しＤＯＩ発酵液試料６のＴＨＢ変換率は４３．４０％であり、精製ＤＯＩ水溶液試料４のＴＨＢ変換率は９．５５％であったのに対しＤＯＩ発酵液試料７のＴＨＢ変換率は５４．６６％であった。ＤＯＩ発酵液の試料７では、１６０℃の高温において、累積５分間という比較的短時間の加熱で５０％を超えるＴＨＢ変換率が達成された。材料成分が異なる液体培地を用いても同様の結果が得られることから、細菌の増殖をサポートできる液環境そのものがＴＨＢ変換反応について何らかの触媒作用を提供していると推測される。
【００６０】
フィルター濾過して細菌を除去したＤＯＩ発酵液を加熱した場合の方が、フィルター濾過していないＤＯＩ発酵液を加熱した場合よりもＴＨＢ収率が向上し、さらに塩析処理をフィルター濾過に組み合わせた場合にはＴＨＢ収率がさらに向上した（データは示していない）。
【００６１】
別の実験において、ＴＨＢ水溶液、ＤＯＩ水溶液の加熱によって得られたＴＨＢ産物含有溶液、またはＤＯＩ発酵液の加熱によって得られた産物溶液に対し、酢酸エチルを抽出溶媒として用いて、ＴＨＢの溶媒抽出を試験した。１回目の溶媒抽出で大部分のＴＨＢを回収できることが確認された。溶媒抽出前に、ＴＨＢ産物溶液に塩酸を加えてｐＨを２未満に低下させた場合、または、飽和濃度未満の塩化ナトリウムをＴＨＢ産物溶液に加えた場合には、ＴＨＢの回収率が向上することが観察された。抽出に先立つＴＨＢ生成反応の条件および程度によって、最終的に抽出されるＴＨＢの収率は異なってくる。ＤＯＩ水溶液を１７５℃の高温で少なくとも３時間加熱して反応を進行させて得たＴＨＢ産物含有溶液を用いた例では、抽出後の有機溶媒層に溶解していた有機化合物溶質の大部分（７０重量％以上、場合によっては９０重量％以上）がＴＨＢであり、不純物の大部分は水層に残ることが確認された。この結果は、溶媒抽出がＴＨＢ精製効果を有することを示すものである。マイクロリアクターを用いた抽出においても高い収率でＴＨＢが回収され、細菌培養液の加熱からＴＨＢの分離まで、あるいはＤＯＩ合成細菌の培養によるＤＯＩ合成から細菌培養液の加熱を経てＴＨＢの分離までを連続的に実施できることが原理的に証明された。
【００６２】
ＤＯＩ合成細菌の培養によるＤＯＩ合成から、細菌培養液（ＤＯＩ発酵液）の加熱を経て、溶媒抽出によるＴＨＢの分離までを連続的に行った一例を以下に記述する。
ＤＯＩ合成細菌を培養して得たＤＯＩ発酵液１５０ｍL（ＤＯＩ濃度：６０ｇ/Ｌ）を、１７０℃の条件下２時間反応させて、ＤＯＩをＴＨＢに変換させた。次いで、得られたＴＨＢ含有反応液をメンブレンフィルター（０．４５μｍ）で濾過し、ＴＨＢ産物溶液を調製した（図４下に１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す）。その後、ＹＭＣ社製ミキサ（Ｄｅｎｅｂ  Ｈｅｌｉｘ型）を用いて、ＴＨＢ産物溶液（１ｍＬ／ｍｉｎ）と酢酸エチル（１ｍＬ／ｍｉｎ、１．５ｍＬ／ｍｉｎ、２ｍＬ／ｍｉｎ、および３ｍＬ／ｍｉｎの４条件）を送液し、それぞれ溶出液を取り出した（溶出時間１分間）。得られた溶出液の酢酸エチル層を分液後、減圧濃縮しＴＨＢ収量を求めた（実験はすべて三連で実施した）。その結果を下記表２にまとめた。ＴＨＢ産物溶液と酢酸エチルの比が１：１の場合のＴＨＢ収率は平均７４．７％であった。酢酸エチルの比率が高くなるに連れて収率は向上する傾向を示し、ＴＨＢ産物溶液と酢酸エチルの比を１：３とした場合は平均８６．９％であった。得られたＴＨＢ抽出試料の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図４上に示す。
【００６３】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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