(57)【要約】      （修正有）【課題】一本鎖配列との平衡状態にあり、複製や転写などの生体イベントのタイミングで動的に形成されると考えられており生物学的プロセスにおいて重要な役割を担うグアニン四重鎖形成ＤＮＡ配列と相互作用した時のみ蛍光を発する蛍光リガンドの提供。【解決手段】下記構造式で示される化合物を代表的な例とする、化合物又はその塩からなるグアニン四重鎖結合性リガンド及びこれを用いたグアニン四重鎖形成ＤＮＡ配列の検出方法を提供する。2020176108.tif 000117【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（Ｉ）：
【化１】
2020176108.tif 000098
［式中、Ｒ１は置換されていても良い２〜４個の共役した平面環からなる芳香族縮合環であり、
Ｒ２はＨであるか、又は
【化２】
2020176108.tif 000099
であり、この場合、Ｒ２中のＲ１は上記のＲ１と同じでも異なっていても良く、
Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して
【化３】
2020176108.tif 000100
【化４】
2020176108.tif 000101
であるが、但し、Ｒ１が
【化５】
2020176108.tif 000102
であり、ＸがＨであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ３及びＲ４がいずれも
【化６】
2020176108.tif 000103
であるものを除く。］
を有する化合物又はその塩。
【請求項２】
Ｒ１が、非置換であるか、又は１個の置換基で置換されていても良い、ナフチル基、アントラセニル基、ピレニル基、キノリル基、イソキノリル基、1-メチルキノリニウム基、アクリジニル基、インドリル基、イソインドリル基、ベンゾチオフェニル基、ベンゾフラニル基、イソベンゾフラニル基、ベンゾイミダゾリル基、ベンゾオキサゾリル基、ベンゾイソオキサゾリル基、及びベンゾチアゾリル基からなる群より選択される芳香族縮合環である、請求項１記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
Ｒ１が、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、メトキシ基（−ＯＭｅ）、アセトキシ基（−ＯＡｃ）、メシルオキシ基（−ＯＭｓ）、トリフルオロメチルスルホニルオキシ基（−ＯＴｆ）、アミノ基（−ＮＨ２）、ジメチルアミノ基（−ＮＭｅ２）、及びジエチルアミノ基（−ＮＥｔ２）からなる群より選択される１個の置換基で置換された芳香族縮合環である、請求項１もしくは２記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
以下の一般式（Ｉ）：
【化７】
2020176108.tif 000104
［式中、Ｒ１は
【化８】
2020176108.tif 000105
【化９】
2020176108.tif 000106
【化１０】
2020176108.tif 000107
であり、ＸはＨ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＡｃ、又はＮＭｅ２であり、
Ｒ２はＨであるか、又は
【化１１】
2020176108.tif 000108
であり、この場合、Ｒ２中のＲ１は上記のＲ１と同じでも異なっていても良く、
Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して
【化１２】
2020176108.tif 000109
【化１３】
2020176108.tif 000110
であるが、但し、Ｒ１が
【化１４】
2020176108.tif 000111
であり、ＸがＨであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ３及びＲ４がいずれも
【化１５】
2020176108.tif 000112
であるものを除く。］
を有する化合物又はその塩。
【請求項５】
Ｒ１が
【化１６】
2020176108.tif 000113
であり、
ＸがＯＨ、ＯＭｅ、ＯＡｃ、又はＮＭｅ２であり、
Ｒ２がＨである、
請求項４記載の化合物又はその塩。
【請求項６】
以下の構造：
【化１７】
2020176108.tif 000114
を有する、化合物又はその塩。
【請求項７】
以下の構造：
【化１８】
2020176108.tif 000115
を有する、化合物又はその塩。
【請求項８】
以下の構造：
【化１９】
2020176108.tif 000116
を有する、化合物又はその塩。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項記載の化合物又はその塩からなる、グアニン四重鎖結合性リガンド。
【請求項１０】
以下のステップ：
(i)請求項９記載のグアニン四重鎖結合性リガンドと、サンプルとを接触させた場合に生じる蛍光を測定し、
(ii)サンプル非存在下における蛍光と比較する
ことを含む、サンプル中のグアニン四重鎖形成DNA配列の検出方法であって、該DNA配列と結合していないリガンドの分離ステップを含まない、上記方法。
【請求項１１】
目視によるか、又は特定波長での蛍光強度若しくは特定波長範囲での蛍光スペクトルを測定する、請求項１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グアニン四重鎖と選択的に相互作用し得る新規化合物及びその塩に関する。本発明はまた、上記化合物又はその塩からなるグアニン四重鎖結合性リガンド、並びに上記化合物又はその塩を用いた、グアニン四重鎖形成DNA配列の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グアニン四重鎖（G-quadruplex、以下、本明細書中においてG4と記載することがある）は、グアニン残基が豊富な核酸配列で形成されるDNAの高次構造の一つである。G4は、4つのグアニンの水素結合を介して構成されるG-カルテット平面がπ-π相互作用によって積み重なった構造をとることが知られている。
【０００３】
G4を形成し得る配列は、テロメア領域や、がん関連遺伝子のプロモータ領域を中心に、数十万種見出されている。これらのうち、数十種の配列では、G4が形成されることで、DNAの複製やがん遺伝子の転写抑制、がん細胞のアポトーシス誘導などの生命現象が直接的に制御されることが報告されている。G4は、一本鎖配列との平衡状態にあり、複製や転写などの生体イベントのタイミングで動的に形成されると考えられており、生物学的プロセスにおいて重要な役割を担うG4を生体内において検出する分子ツールの開発が求められている。
【０００４】
現在、G4を検出する分子ツールとして、蛍光標識した低分子化合物が報告されている。本発明者らは、G4を選択的に認識する低分子化合物として、大環状ポリオキサゾール構造を有する種々の誘導体（OTD）の創製研究を行ってきている。OTDは、極めて高い選択性でG4形成配列と相互作用し、これを強力に安定化することを見出している。この知見に基づき、OTD骨格に対して、蛍光基としてCy5又はBODIPYを導入した下記のようなプローブを開発し（非特許文献１及び２）、これらのリガンドをDNAマイクロアレイと組み合わせることで、新規G4形成配列の探索への応用に成功している（特許文献１）。
【０００５】
【化１】
2020176108.tif 000002
【０００６】
また、他の研究グループも、G4結合性のリガンドに蛍光基を導入した、蛍光G4リガンドの開発を報告している。Balasubramanianらは、彼らが開発したG4リガンドであるピリドスタチンに対して、Alexa Fluor 594を導入した蛍光G4リガンドを創製し、この蛍光リガンドを用いて、G4を形成する可能性のある配列が、ゲノム上に多数存在することを明らかにしている（非特許文献３）。また、Teulade-Fichouらは、自身で開発したG4リガンドであるPhen-DC3に対して、蛍光官能基であるCy5を導入し、この蛍光リガンドを固定細胞内に添加することで、細胞内におけるG4構造の検出に成功している（非特許文献４）。
【０００７】
一方、蛍光化合物が発する蛍光を検出する際、バックグラウンドを考慮すると当該化合物の励起光を切り離して観察する必要があるため、一般的に、ストークスシフト（最大励起波長と最大蛍光波長との差）が大きい蛍光化合物の方が標的の蛍光検出が容易である。例えば、上記のL1Cy5-7OTDやL1BOD-7OTDは、それぞれ蛍光基由来の励起蛍光波長を持つが、Cy5は励起波長640 nm／蛍光波長660 nm前後であり、BODIPYは励起波長500 nm／蛍光波長520 nm前後であり、それぞれのストークスシフトは20 nm前後である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第6249436号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Angew. Chem. Int. Ed., 2013, 52, 12052-12055
【非特許文献２】Org. Biomol. Chem., 2010, 8, 2749-2755
【非特許文献３】Nat. Chem. Biol., 2012, 8, 301-310
【非特許文献４】Angew. Chem. Int. Ed., 2017, 56, 11365-11369
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来報告されている蛍光リガンドは、いずれもG4を安定化する低分子化合物に対して、蛍光官能基を導入しており、リガンド単体でも蛍光基に由来した蛍光を発するものであった。この場合、検出のためにはG4非存在下と存在下との区別、すなわち、B/F（Bound/Free）の分離が必要とされるが、分離しきれないためにバックグラウンド蛍光が高くなったり、また蛍光感度が低下するといった問題が生じ、特に生細胞におけるイメージングは困難であった。
【００１１】
G4非存在下と存在下との区別ができるようなリガンドの創製研究もわずかに行われてきたが、それらはDNAのG4と相互作用することで蛍光特性が変化するのみであった。G4構造の検出を目的とする場合、蛍光特性が変化するだけでは、検出感度が不十分である。
そこで、常時蛍光を発する従来の蛍光リガンドに代わり、G4と相互作用した時のみ蛍光を発する蛍光リガンドの開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
このような背景のもと、本発明者らは、G4の検出に関して、迅速かつ簡便に、高感度で検出可能な蛍光によるG4の検出を試みた。その結果、G4構造と相互作用した時にのみ蛍光を発する蛍光G4リガンドを見出した。本明細書において、このようなリガンドを「ライトアップ型リガンド」と称することとする。
【００１３】
同一分子中で、互いにねじれ関係にある芳香族ユニットは、構造変化により平面になることで、蛍光を発する場合があることが知られている。そこで、本発明者等は、先に開発した大環状ポリオキサゾール構造を有するオキサゾールテロメスタチン誘導体（Oxazole Telomestatin Derivatives、OTD）にビニル基を介してナフチル基等を導入した種々の化合物を設計し、合成した。
【００１４】
その結果、得られた化合物は、G4と結合することで、その蛍光特性が変化することが認められた。これは、化合物単体では大環状ポリオキサゾールとナフチル基等との連結部における回転が可能であるのに対して、G4構造の存在下ではGカルテット平面とのπ-π相互作用によって大環状ポリオキサゾールとナフチル基等とが同一平面上に固定され、その結果、G4構造の不存在下とは異なる蛍光を発することができるためと考えられる。
【００１５】
特に、ナフチル基の4位にOAc基を有する化合物（本明細書において化合物１と記載する）は、化合物のみでは蛍光が観察されないが、G4と相互作用することで蛍光を発することを見出した。更に、この化合物は、G4構造と極めて選択的に相互作用し、G4形成配列が変異してG4を含まない配列、及びG4構造を有さない２本鎖DNAとも全く相互作用せず、蛍光を発することもなかった。
【００１６】
また、上記の通り、従来のG4結合性の蛍光リガンドでは、ストークスシフトが小さい場合があり、検出のためにバックグラウンドの影響を考慮する必要性が高かったのに対して、本発明で開発したライトアップ型リガンドは、100〜200nmものストークスシフトを有するものであり、検出をより容易にすることができることが見出された。
【００１７】
本発明者等は上記の知見に基づき、更に検討を重ねた結果、本発明を完成するに到った。すなわち、本発明は以下を提供するものである。
１．  以下の一般式（Ｉ）：
【化２】
2020176108.tif 000003
［式中、Ｒ１は置換されていても良い２〜４個の共役した平面環からなる芳香族縮合環であり、
Ｒ２はＨであるか、又は
【化３】
2020176108.tif 000004
であり、この場合、Ｒ２中のＲ１は上記のＲ１と同じでも異なっていても良く、
Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して
【化４】
2020176108.tif 000005
【化５】
2020176108.tif 000006
であるが、但し、Ｒ１が
【化６】
2020176108.tif 000007
であり、ＸがＨであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ３及びＲ４がいずれも
【化７】
2020176108.tif 000008
であるものを除く。］
を有する化合物又はその塩。
２．  Ｒ１が、非置換であるか、又は１個の置換基で置換されていても良い、ナフチル基、アントラセニル基、ピレニル基、キノリル基、イソキノリル基、1-メチルキノリニウム基、アクリジニル基、インドリル基、イソインドリル基、ベンゾチオフェニル基、ベンゾフラニル基、イソベンゾフラニル基、ベンゾイミダゾリル基、ベンゾオキサゾリル基、ベンゾイソオキサゾリル基、及びベンゾチアゾリル基からなる群より選択される芳香族縮合環である、上記１記載の化合物又はその塩。
３．  Ｒ１が、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、メトキシ基（−ＯＭｅ）、アセトキシ基（−ＯＡｃ）、メシルオキシ基（−ＯＭｓ）、トリフルオロメチルスルホニルオキシ基（−ＯＴｆ）、アミノ基（−ＮＨ２）、ジメチルアミノ基（−ＮＭｅ２）、及びジエチルアミノ基（−ＮＥｔ２）からなる群より選択される１個の置換基で置換された芳香族縮合環である、上記１もしくは２記載の化合物又はその塩。
４．  以下の一般式（Ｉ）：
【化８】
2020176108.tif 000009
［式中、Ｒ１は
【化９】
2020176108.tif 000010
【化１０】
2020176108.tif 000011
【化１１】
2020176108.tif 000012
であり、ＸはＨ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＡｃ又はＮＭｅ２であり、
Ｒ２はＨであるか、又は
【化１２】
2020176108.tif 000013
であり、この場合、Ｒ２中のＲ１は上記のＲ１と同じでも異なっていても良く、
Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して
【化１３】
2020176108.tif 000014
【化１４】
2020176108.tif 000015
であるが、但し、Ｒ１が
【化１５】
2020176108.tif 000016
であり、ＸがＨであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ３及びＲ４がいずれも
【化１６】
2020176108.tif 000017
であるものを除く。］
を有する化合物又はその塩。
５．  Ｒ１が
【化１７】
2020176108.tif 000018
であり、
ＸがＯＨ、ＯＭｅ、ＯＡｃ又はＮＭｅ２であり、
Ｒ２がＨである、
上記４記載の化合物又はその塩。
６．  以下の構造：
【化１８】
2020176108.tif 000019
を有する、化合物又はその塩。
７．  以下の構造：
【化１９】
2020176108.tif 000020
を有する、化合物又はその塩。
８．  以下の構造：
【化２０】
2020176108.tif 000021
を有する、化合物又はその塩。
９．  上記１〜８のいずれか記載の化合物又はその塩からなる、グアニン四重鎖結合性リガンド。
１０．  以下のステップ：
(i)上記９記載のグアニン四重鎖結合性リガンドと、サンプルとを接触させた場合に生じる蛍光を測定し、
(ii)サンプル非存在下における蛍光と比較する
ことを含む、サンプル中のグアニン四重鎖形成DNA配列の検出方法であって、該DNA配列と結合していないリガンドの分離ステップを含まない、上記方法。
１１．  目視によるか、又は特定波長での蛍光強度若しくは特定波長範囲での蛍光スペクトルを測定する、上記１０記載の方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、測定対象のサンプル中のDNAにおけるG4の形成／非形成が迅速かつ感度良く検出可能となり、リガンドベースでの疾患マーカー検出のための基盤を構築することができる。本発明のリガンドは、DNA配列と結合していないリガンドの分離ステップを必要としないため、生細胞におけるイメージングにも好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】化合物１と、G4形成配列（telo24）及びG4非形成配列（dsDNA）とを用いたゲルシフトアッセイ（EMSA）の結果を示す。
【図２】化合物１（Ａ）、２−Ｈ（Ｂ）、２−ＯＭｅ（Ｃ）、２−ＯＨ（Ｄ）のG4形成配列（telo24）及びG4非形成配列（dsDNA）共存下における蛍光を示す写真である。
【図３−１】G4形成配列である（ａ）c-myc22（配列番号３）、（ｂ）telo22（配列番号４）、（ｃ）telo24（配列番号１）を共存させた場合の化合物１の蛍光スペクトル（励起波長365nm）を示す。
【図３−２】G4非形成配列である（ｄ）dsDNA（配列番号２）及び（ｅ）mut telo24（配列番号５）を共存させた場合の化合物１の蛍光スペクトル（励起波長365nm）を示す。
【図４−１】G4形成配列である（ａ）c-myc22（配列番号３）、（ｂ）telo22（配列番号４）、（ｃ）telo24（配列番号１）を共存させた場合の化合物２−Ｈの蛍光スペクトル（励起波長365nm）を示す。
【図４−２】G4非形成配列である（ｄ）dsDNA（配列番号２）及び（ｅ）mut telo24（配列番号５）を共存させた場合の化合物２−Ｈの蛍光スペクトル（励起波長365nm）を示す。
【図５−１】G4形成配列である（ａ）c-myc22（配列番号３）、（ｂ）telo22（配列番号４）、（ｃ）telo24（配列番号１）を共存させた場合の化合物２−ＯＭｅの蛍光スペクトル（励起波長365nm）を示す。
【図５−２】G4非形成配列である（ｄ）dsDNA（配列番号２）及び（ｅ）mut telo24（配列番号５）を共存させた場合の化合物２−ＯＭｅの蛍光スペクトル（励起波長365nm）を示す。
【図６−１】G4形成配列である（ａ）c-myc22（配列番号３）、（ｂ）telo22（配列番号４）、（ｃ）telo24（配列番号１）を共存させた場合の化合物２−ＯＨの蛍光スペクトル（励起波長365nm）を示す。
【図６−２】G4非形成配列である（ｄ）dsDNA（配列番号２）及び（ｅ）mut telo24（配列番号５）を共存させた場合の化合物２−ＯＨの蛍光スペクトル（励起波長365nm）を示す。
【図７】化合物２−ＮＭｅ２のG4形成配列（telo24）及びG4非形成配列（dsDNA）共存下における蛍光を示す写真である。
【図８】（ａ）G4形成配列であるtelo24（配列番号１）及び（ｂ）G4非形成配列であるdsDNA（配列番号２）を共存させた場合の化合物２−ＮＭｅ２の蛍光スペクトル（励起波長399nm）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、以下の一般式（Ｉ）：
【化２１】
2020176108.tif 000022
［式中、Ｒ１は置換されていても良い２〜４個の共役した平面環からなる芳香族縮合環であり、
Ｒ２はＨであるか、又は
【化２２】
2020176108.tif 000023
であり、この場合、Ｒ２中のＲ１は上記のＲ１と同じでも異なっていても良く、
Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して
【化２３】
2020176108.tif 000024
【化２４】
2020176108.tif 000025
であるが、但し、Ｒ１が
【化２５】
2020176108.tif 000026
であり、ＸがＨであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ３及びＲ４がいずれも
【化２６】
2020176108.tif 000027
であるものを除く。］
を有する化合物又はその塩を提供する。
【００２１】
上記化合物又はその塩は、G4に選択的に結合し、G4の濃度に依存した蛍光の増大を示すため、サンプル中のDNAにG4が存在するか否かを蛍光によって検出するために好適に使用することができる。当業者であれば、本願明細書の記載及び当分野における技術常識に基づいて、上記の構造の化合物が、実施例で具体的に示された化合物と同様に、G4の検出のためのリガンドとして好適に使用できることを理解することができる。
【００２２】
一般式（Ｉ）におけるＲ１は、限定するものではないが、非置換であるか、又は１個の置換基で置換されていても良い、ナフチル基、アントラセニル基、ピレニル基、キノリル基、イソキノリル基、1-メチルキノリニウム基、アクリジニル基、インドリル基、イソインドリル基、ベンゾチオフェニル基、ベンゾフラニル基、イソベンゾフラニル基、ベンゾイミダゾリル基、ベンゾオキサゾリル基、ベンゾイソオキサゾリル基、及びベンゾチアゾリル基からなる群より選択される芳香族縮合環の基であり得る。これらの芳香族縮合環は、いずれも２〜４個の共役した平面環からなり、縮合環を形成する各環は、炭素（Ｃ）、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）及び硫黄（Ｓ）から選択される原子を環原子として有する５員又は６員の環構造を有する。これらの芳香族縮合環は、共役した環構造を有し、その平面状構造がG4との相互作用において有利に作用することが見出された。
【００２３】
Ｒ１が置換基を有する場合、置換基は好ましくはヒドロキシル基（−ＯＨ）、メトキシ基（−ＯＭｅ）、アセトキシ基（−ＯＡｃ）、メシルオキシ基（−ＯＭｓ）、トリフルオロメチルスルホニルオキシ基（−ＯＴｆ）、アミノ基（−ＮＨ２）、ジメチルアミノ基（−ＮＭｅ２）、及びジエチルアミノ基（−ＮＥｔ２）からなる群より選択される。置換基は、２個以上であり得るが、特に１個の置換基で置換された場合が好適であり得る。
【００２４】
より具体的には、一般式（Ｉ）におけるＲ１は、限定するものではないが、例えば下記の表１に示す構造を有するものであり得る。
【００２５】
【表１】
2020176108.tif 000028
【００２６】
一態様において、一般式（Ｉ）の化合物は、上記のＲ１の芳香族縮合環を分子中に１個有するものである。別の態様において、一般式（Ｉ）の化合物は、同じか若しくは異なる上記のＲ１の芳香族縮合環を分子中に２個有するものである。例えば、一般式（Ｉ）の化合物は、Ｒ１の同じ芳香族縮合環を分子中に２個有するものである。
【００２７】
上記化合物の塩としては、特に限定するものではないが、例えば塩酸塩、トリフルオロ酢酸塩等を挙げることができる。また、上記化合物は、例えばG4検出のためにサンプルと接触させた場合に、サンプル中に含まれる生体若しくはバッファー等に由来する物質と塩若しくは溶媒和物を形成することもあり得る。
【００２８】
一実施形態において、本発明の化合物は、以下の一般式（Ｉ）：
【化２７】
2020176108.tif 000029
［式中、Ｒ１は
【化２８】
2020176108.tif 000030
【化２９】
2020176108.tif 000031
【化３０】
2020176108.tif 000032
であり、ＸはＨ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＡｃ又はＮＭｅ２であり、
Ｒ２はＨであるか、又は
【化３１】
2020176108.tif 000033
であり、この場合、Ｒ２中のＲ１は上記のＲ１と同じでも異なっていても良く、
Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して
【化３２】
2020176108.tif 000034
【化３３】
2020176108.tif 000035
であるが、但し、Ｒ１が
【化３４】
2020176108.tif 000036
であり、ＸがＨであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ３及びＲ４がいずれも
【化３５】
2020176108.tif 000037
であるものを除く。］
を有する化合物又はその塩を提供する。
【００２９】
一態様において、一般式（Ｉ）の化合物は、上記のＲ１の芳香族縮合環を分子中に１個有するものである。別の態様において、一般式（Ｉ）の化合物は、同じか若しくは異なる上記のＲ１の芳香族縮合環を分子中に２個有するものである。例えば、一般式（Ｉ）の化合物は、Ｒ１の同じ芳香族縮合環を分子中に２個有するものである。
【００３０】
上記の化合物の一態様では、化合物はＲ１が置換基を有するナフチル基
【化３６】
2020176108.tif 000038
であり、
置換基ＸがＯＨ（ヒドロキシル基）、ＯＭｅ（メトキシ基）、ＯＡｃ（アセトキシ基）又はＮＭｅ２（ジメチルアミノ基）であり、
Ｒ２がＨのものであり得る。
【００３１】
例えば、置換基ＸはＯＨ、ＯＭｅ又はＯＡｃであり得る。あるいはまた、ＸはＮＭｅ２であり得る。
【００３２】
また、特に限定するものではないが、上記構造において、Ｒ３及びＲ４は、
【化３７】
2020176108.tif 000039
とすることができる。
【００３３】
例えば、化合物は、以下の構造：
【化３８】
2020176108.tif 000040
を有するものであり得る。本明細書において、この化合物を「化合物１」と記載する。化合物１は、一般式（Ｉ）におけるＲ１が１個のアセトキシ基で置換されたナフチル基である。
【００３４】
あるいは、化合物は、以下の構造：
【化３９】
2020176108.tif 000041
を有するものであり得る。本明細書において、この化合物を「化合物２−ＯＨ」と記載する。化合物２−ＯＨは、一般式（Ｉ）におけるＲ１が１個のヒドロキシル基で置換されたナフチル基である。
【００３５】
あるいは、化合物は、以下の構造：
【化４０】
2020176108.tif 000042
を有するものであり得る。本明細書において、この化合物を「化合物２−ＯＭｅ」と記載する。化合物２−ＯＭｅは、一般式（Ｉ）におけるＲ１が１個のメトキシ基で置換されたナフチル基である。
【００３６】
あるいは、化合物は、以下の構造：
【化４１】
2020176108.tif 000043
を有するものであり得る。本明細書において、この化合物を「化合物２−ＮＭｅ２」と記載する。化合物２−ＮＭｅ２は、一般式（Ｉ）におけるＲ１が１個のジメチルアミノ基で置換されたナフチル基である。
【００３７】
あるいはまた、化合物は、Ｒ１がアントラセニル基
【化４２】
2020176108.tif 000044
であり、Ｒ２がＨであり、Ｒ３及びＲ４が
【化４３】
2020176108.tif 000045
である化合物であり得る。具体的には、この化合物は、以下の構造：
【化４４】
2020176108.tif 000046
を有する。
【００３８】
あるいは、化合物は、Ｒ１がベンゾチアゾリル基
【化４５】
2020176108.tif 000047
であり、Ｒ２がＨであり、Ｒ３及びＲ４が
【化４６】
2020176108.tif 000048
である化合物であり得る。具体的には、この化合物は、以下の構造：
【化４７】
2020176108.tif 000049
を有する。
【００３９】
あるいは、化合物は、Ｒ１が
【化４８】
2020176108.tif 000050
であり、ＸがＯＡｃであり、Ｒ２が
【化４９】
2020176108.tif 000051
であり、Ｒ３及びＲ４が
【化５０】
2020176108.tif 000052
である化合物であり得る。具体的には、この化合物は、以下の構造：
【化５１】
2020176108.tif 000053
を有する。この化合物は、分子中に１個のアセトキシ基で置換されたナフチル基を２個有する。
【００４０】
あるいは、化合物は、Ｒ１が上記した通りの置換されていても良い２〜４個の共役した平面環からなる芳香族縮合環、例えば限定するものではないが
【化５２】
2020176108.tif 000054
【化５３】
2020176108.tif 000055
であり、ＸがＨ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＡｃ又はＮＭｅ２であり、Ｒ２がＨであり、Ｒ３が
【化５４】
2020176108.tif 000056
であり、Ｒ４が
【化５５】
2020176108.tif 000057
である化合物であり得る。具体的には、この化合物は、例えば以下の構造：
【化５６】
2020176108.tif 000058
［式中、Ｒは
【化５７】
2020176108.tif 000059
である。］
を有する。
【００４１】
上記の本発明の化合物又はその塩は、下記の実施例を含む本願明細書の記載、及び当分野における技術常識に従って、好適に合成することができる。
【００４２】
本発明はまた、上記の本発明の化合物又はその塩からなる、グアニン四重鎖結合性リガンドを提供する。
本発明のグアニン四重鎖結合性リガンドは、サンプル中にグアニン四重鎖を形成したDNAが存在する場合に、該四重鎖に選択的に結合して、その蛍光特性の変化を指標としてそのようなDNAの存在及び量を検出することができる。
【００４３】
好ましくは、本発明のグアニン四重鎖結合性リガンドは、単独（すなわちグアニン四重鎖と結合していない場合）では蛍光を発しない化合物又はその塩であり得る。例えば、本発明のリガンドとして、化合物１、化合物２−ＯＨ又は化合物２−ＮＭｅ２を好適に使用することができる。
【００４４】
従って、本発明はまた、上記の本発明のグアニン四重鎖結合性リガンドを用いた、サンプル中の四重鎖形成DNA配列の存在を検出する方法を提供する。
より具体的には、本発明の方法は、以下のステップ：
(i)上記の本発明のグアニン四重鎖結合性リガンドと、サンプルとを接触させた場合に生じる蛍光を測定し、
(ii)サンプル非存在下における蛍光と比較する
ことを含む、サンプル中のグアニン四重鎖形成DNA配列の検出方法であって、該DNA配列と結合していないリガンドの分離ステップを含まない、上記方法であり得る。
【００４５】
好ましくは、グアニン四重鎖結合性リガンドは、単独では蛍光を発しない化合物又はその塩からなる「ライトアップ型リガンド」である。この場合、上記ステップ(ii)におけるサンプル非存在下における蛍光は、ほとんど又は全く検出されないため、上記の方法において無視することができ、すなわち、ステップ(ii)を含まず、単にステップ(i)を実施する方法とすることができる。従って、この場合、本発明の方法は、サンプル存在下で蛍光が生じれば、サンプル中にグアニン四重鎖形成DNA配列が存在することを示し得る。
【００４６】
本発明の方法は、目視によって蛍光の増大又は変化を確認するものとすることができる。単独では蛍光を発しない化合物又はその塩を用いる場合、蛍光が生じることがサンプル中のグアニン四重鎖形成DNA配列の存在を示す。
【００４７】
あるいはまた、本発明の方法は、特定波長での蛍光強度を測定するものとすることができる。また、本発明の方法は、特定波長範囲での蛍光スペクトルを測定するものとすることができる。測定すべき特定波長又は特定波長範囲は、リガンドとして用いる化合物又はその塩により、適宜決定することができる。
【００４８】
本発明で開発したライトアップ型リガンドは、365〜380 nmで励起した際に470〜500 nmの蛍光スペクトルを示すことから、ストークスシフトは100 nmを超え、グアニン四重鎖形成DNA配列の存在をより容易に検出することができる。
【００４９】
例えば、化合物１を用いてサンプル中のグアニン四重鎖形成DNA配列の存在を検出することを意図する場合には、限定するものではないが、365nmの励起波長を用いて、470〜480nmの範囲の波長での蛍光強度を測定することが好ましい。また、例えば化合物２−ＯＨを用いてサンプル中のグアニン四重鎖形成DNA配列の存在を検出することを意図する場合には、限定するものではないが、365nmの励起波長を用いて、440〜450nmの範囲の波長での蛍光強度を測定することが好ましい。あるいは、化合物１若しくは化合物２−ＯＨを用いてサンプル中のグアニン四重鎖形成DNA配列の存在を検出することを意図する場合、365nmの励起波長を用いて、400〜600nm、あるいは430〜630nmの波長範囲の蛍光スペクトルを測定することが好ましい。
【００５０】
化合物２−ＮＭｅ２をG4形成配列存在下で添加した際、600 nm付近に最大蛍光波長が得られる。この時の最大励起波長は396 nmであり、ストークスシフト（最大励起と最大蛍光とのバンド間の差）は200 nmと更に大きいものとなる。化合物２−ＮＭｅ２を用いてサンプル中のグアニン四重鎖形成DNA配列の存在を検出することを意図する場合、399nmの励起波長を用いて、550〜650nm、例えば570〜630nmの波長範囲の蛍光スペクトルを測定することが好ましい。
【００５１】
検出に用いるリガンドの濃度は、測定対象のサンプル中に含まれ得るDNAの濃度に依存して適宜調整することができる。蛍光測定のために最適なリガンド濃度は、特に限定するものではないが、DNAに対して約0.1：1〜約10：1の比率、好ましくは約0.2：1〜約5：1の比率であり得る。また、蛍光測定サンプル中のリガンドの濃度は、特に限定するものではないが、0.1μM〜50μM、好ましくは0.5μM〜25μMの範囲内であれば好適に測定することができる。
【００５２】
本発明の方法における蛍光強度の測定は、特に限定するものではないが、例えばpH 7.0〜8.0、好ましくはpH 7.3〜7.7の範囲のpH条件において、室温下で実施することができる。また、サンプル中の塩濃度は、G4が形成できる条件下であれば良く、特に限定するものではないが、10〜150 mM、好ましくは20〜100 mMの範囲内に調整することが好適である。
【００５３】
本発明のグアニン四重鎖結合性リガンドは、グアニン四重鎖を形成しないDNA配列とは有意な結合を示さず、従って、グアニン四重鎖形成DNA配列の存在を特異的に検出することができる。また、本発明のリガンドによって得られる蛍光は、グアニン四重鎖形成DNAの濃度に依存して増大するため、サンプル（DNA）非存在下における蛍光と比較することで、サンプル中のグアニン四重鎖形成DNAの定量に用いることもできる。この場合、リガンドとして用いる化合物毎に、グアニン四重鎖形成DNA濃度による蛍光強度を予め測定し、検量線を作成しておくことができる。
【００５４】
上記の通り、単独では蛍光を発しない化合物（例えば化合物１、化合物２−ＯＨ又は２−ＮＭｅ２）又はその塩を「ライトアップ型リガンド」として用いる場合、蛍光が生じることがそのままサンプル中のグアニン四重鎖形成DNA配列の存在を示すことになるため、DNA濃度の定量においてもより迅速で正確な測定結果をもたらすことができる。ライトアップ型リガンドによって得られる蛍光は、グアニン四重鎖形成DNAと結合することでのみ生じるものであり、かつその濃度に依存して増大するため、サンプル（DNA）非存在下における蛍光と比較すること（ステップ(ii)）なく、サンプル中のグアニン四重鎖形成DNAの定量に用いることができる。
【実施例】
【００５５】
以下に本発明を実施例によって更に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５６】
尚、以下の合成実施例において、フラッシュクロマトグラフィーは、Silica gel 60（球形, 粒径40〜100 μm, 関東化学）を用いた。旋光度は、ナトリウムD線を用いてJASCO P-2200偏光計で測定した。1H 及び 13C NMRスペクトルは、JEOL JNM-AL 300又はJNM-ECX 400で測定し、溶媒として用いたCDCl3（1H NMR; δ= 7.26 ppm, 13C NMR; δ= 77.0 ppm）又はDMSO-d6（1H NMR; δ= 2.50 ppm, 13C NMR; δ= 39.5 ppm）のシグナルを基準とした。1H NMRのデータは以下のように報告する［化学シフト (δ, ppm), multiplicity (s, singlet; d, doublet; t, triplet; m, multiplet; br, broad)、積分値、カップリング定数 (Hz)］13C NMRのデータは、化学シフト (δ, ppm) に関して報告する。質量スペクトルは、JEOL JMS-T100LC分光計を用い、ESI-MSモードにてメタノール溶媒で測定した。
【００５７】
［実施例１  化合物１の合成］
以下のスキーム１及び２に従って化合物１（L2H2-1Np-4OAc）を合成した。
【化５８】
2020176108.tif 000060
【００５８】
【化５９】
2020176108.tif 000061
【００５９】
１−１．モノオキサゾール５の合成
【化６０】
2020176108.tif 000062
【００６０】
アルゴン雰囲気下、アミド3（9.43 g, 19.6 mmol）の脱水ジクロロメタン溶液（200 mL）に、0℃下、炭酸ナトリウム（6.23 g, 58.8 mmol）、（ジエチルアミノ）サルファートリフルオリド（3.10 mL, 23.5 mmol）を加え、1時間撹拌した。飽和重曹水を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過後溶媒留去した。残渣をアルゴン雰囲気下、脱水ジクロロメタン溶液（130 mL）に溶解させ、0℃下、1,8-ジアザビシクロ[5, 4, 0]-7-ウンデセン（4.40 mL, 29.4 mmol）、ブロモトリクロロメタン（3.89 mL, 39.2 mmol）を加え、12時間撹拌した。1.2 N塩酸を加え、クロロホルムで抽出し、有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過後溶媒留去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル = 3:1）にて精製し、モノオキサゾール5（8.17 g, 91%, 2工程）を無色液体として得た。
2020176108.tif 000063
【００６１】
１−２．モノオキサゾール６の合成
【化６１】
2020176108.tif 000064
【００６２】
水素雰囲気下、モノオキサゾール5（8.17 g, 17.7 mmol）のメタノール-酢酸エチルの混合溶液（1:1, 180 mL）に、水酸化パラジウム（817 mg）を加え、室温で1時間撹拌した。反応液をセライトろ過（メタノール）した後に溶媒留去した。残渣をアルゴン雰囲気下、脱水ジクロロメタン溶液（200 mL）に溶解させ、0℃下、トリエチルアミン（7.46 mL, 53.1 mmol）、メタンスルホニルクロリド（2.74 mL, 35.4 mmol）を加え、12時間撹拌した。1.2 N塩酸を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過後溶媒留去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル = 3:2）にて精製し、モノオキサゾール6（7.57 g, 96%, 2工程）を白色粉末として得た。
2020176108.tif 000065
【００６３】
１−３．モノオキサゾール７の合成
【化６２】
2020176108.tif 000066
【００６４】
アルゴン雰囲気下、モノオキサゾール6（8.10 g, 18.1 mmol）の脱水ジメチルアミド溶液（120 mL）に、アジ化ナトリウム（3.53 g）を加え、室温で16時間撹拌した。蒸留水を加え、酢酸エチルで抽出し、有機相を飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過後溶媒留去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル = 1:1）にて精製し、モノオキサゾール7（6.15 g, 92%）を無色液体として得た。
2020176108.tif 000067
【００６５】
１−４．アミド１０の合成
【化６３】
2020176108.tif 000068
【００６６】
モノオキサゾール7（6.15 g, 15.6 mmol）をメタノール（20 mL）に溶解させ、1.2 N塩酸（20 mL）を加え、室温で30分撹拌した後に、溶媒留去し、アミン8を得た。また、別途合成したカルボン酸9のテトラヒドロフラン-水の混合溶液（3:1, 160 mL）に、4-メチルモルフォリン（6.90 mL, 62.4 mmol）、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド（9.20 g, 31.2 mmol）、アミン8を加え、室温で17時間撹拌した。1.2 N塩酸を加え、クロロホルムで抽出し、有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過後溶媒留去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（クロロホルム/メタノール = 150:1）にて精製し、アミド10（7.82 g, 65%, 2工程）を褐色アモルファスとして得た。
2020176108.tif 000069
【００６７】
１−５．トリオキサゾール１１の合成
【化６４】
2020176108.tif 000070
【００６８】
アルゴン雰囲気下、アミド10（7.82 g, 12.1 mmol）の脱水ジクロロメタン溶液（120 mL）に、0℃下、炭酸ナトリウム（3.85 g, 36.3 mmol）、（ジエチルアミノ）サルファートリフルオリド（2.34 mL, 14.5 mmol）を加え、30分撹拌した。飽和重曹水を加え、クロロホルムで抽出し、有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過後溶媒留去した。残渣をアルゴン雰囲気下、脱水ジクロロメタン溶液（60 mL）に溶解させ、0℃下、1,8-ジアザビシクロ[5, 4, 0]-7-ウンデセン（9.05 mL, 60.5 mmol）、ブロモトリクロロメタン（6.00 mL, 60.5 mmol）を加え、15時間撹拌した。1.2 N塩酸を加え、クロロホルムで抽出し、有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過後溶媒留去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（クロロホルム/メタノール = 200:1）にて精製し、トリオキサゾール11（4.88 g, 69%, 2工程）を黄色アモルファスとして得た。
2020176108.tif 000071
【００６９】
１−６．ビストリオキサゾール１４の合成
【化６５】
2020176108.tif 000072
【００７０】
トリオキサゾール11（4.88 g, 8.33 mmol）のテトラヒドロフラン-水の混合溶液（3:1, 80 mL）に、水酸化リチウム一水和物（701 mg, 16.7 mmol）を加え、室温で1時間撹拌した。0℃下、1.2 N塩酸にて中性に調整し、カルボン酸12を得た。得られたカルボン酸12の混合溶液に、4-メチルモルフォリン（3.68 mL, 33.3 mmol）、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド（4.92 g, 16.7 mmol）、アミン13（5.07 g, 10.1 mmol）を加え、室温で18時間撹拌した。1.2 N塩酸を加え、クロロホルムで抽出し、有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過後溶媒留去した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（クロロホルム/メタノール = 150:1）にて精製し、ビストリオキサゾール14（7.22 g, 85%, 2工程）を黄色アモルファスとして得た。
2020176108.tif 000073
【００７１】
１−７．アミン１５の合成
【化６６】
2020176108.tif 000074
【００７２】
アルゴン雰囲気下、ビストリオキサゾール14（7.22 g, 7.11 mmol）を脱水テトラヒドロフラン（250 mL）に溶解させ、モルフォリン（6.19 mL, 71.1 mmol）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（1.64 g, 1.42 mmol）を加え、室温で2時間撹拌した後に、溶媒留去した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（クロロホルム/メタノール = 50:1）にて精製し、アミン15（4.24 g, 64%）を黄色アモルファスとして得た。
2020176108.tif 000075
【００７３】
１−８．大環状体１６の合成
【化６７】
2020176108.tif 000076
【００７４】
アミン15（757 mg, 813μmol）のテトラヒドロフラン-水の混合溶液（3:1, 40 mL）に、水酸化リチウム一水和物（68.4 mg, 1.63 mmol）を加え、室温で1時間撹拌した。0℃下、3 N塩酸にて中性に調整した後に、溶媒留去し、カルボン酸を得た。残渣をアルゴン雰囲気下、脱水ジメチルホルムアミド（270 mL）に溶解させ、N, N-ジイソプロピルエチルアミン（554μL, 3.26 mmol）、4-（ジメチルアミノ）ピリジン（199 mg, 1.63 mmol）、ジフェニルホスホリルアジド（1.76 mL, 8.13 mmol）を室温で加え、70℃まで昇温させ21時間撹拌した。0℃下、1.2 N塩酸を加え、酢酸エチルで抽出し、有機相を飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過後溶媒留去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（クロロホルム/メタノール = 200:1）にて精製し、大環状体16（230 mg, 32%, 2工程）を無色アモルファスとして得た。
2020176108.tif 000077
【００７５】
１−９．OTD-ナフチル１８の合成
【化６８】
2020176108.tif 000078
【００７６】
アルゴン雰囲気下、大環状体16（20.9 mg, 23.2μmol）を脱水テトラヒドロフラン（580μL）に溶解させ、ビニルナフチル17（49.2 mg, 232μmol）、グラブス第二世代触媒（2.02 mg, 2.32μmol）を室温で加え、90℃まで昇温させ31時間撹拌した後に、溶媒留去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（クロロホルム/メタノール = 200:1）にて精製し、OTD-ナフチル18（20.6 mg, 82%）を黄色アモルファスとして得た。
2020176108.tif 000079
【００７７】
１−１０．化合物１の合成
【化６９】
2020176108.tif 000080
【００７８】
OTD-ナフチル18 (4.30 mg, 3.96μmol) をテトラヒドロフラン-ジクロロメタンの混合溶液（2:1, 3 mL）に溶解させ、室温で20分攪拌した後に、溶媒留去し、化合物1（3.00 mg, 86%）を黄色アモルファスとして得た。
2020176108.tif 000081
【００７９】
［実施例２  化合物２−Ｈの合成］
２−１．OTD-ナフチル２０の合成
【化７０】
2020176108.tif 000082
【００８０】
アルゴン雰囲気下、実施例１で合成した大環状体16（13.5 mg, 15.0μmol）を脱水テトラヒドロフラン（400μL）に溶解させ、ビニルナフチル19（23.1 mg, 150μmol）、グラブス第二世代触媒（652μg, 0.750μmol）を室温で加え、90℃まで昇温させ28時間撹拌した後に、溶媒留去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（クロロホルム/メタノール = 100:1）にて精製し、OTD-ナフチル20（13.2 mg, 86%）を黄色アモルファスとして得た。
2020176108.tif 000083
【００８１】
２−２．化合物２−Ｈの合成
【化７１】
2020176108.tif 000084
【００８２】
OTD-ナフチル20 (5.70 mg, 5.56μmol) をテトラヒドロフラン-ジクロロメタンの混合溶液（2:1, 3 mL）に溶解させ、室温で20分攪拌した後に、溶媒留去し、上記構造を有する化合物2-H（3.50 mg, 76%）を黄色アモルファスとして得た。
2020176108.tif 000085
【００８３】
［実施例３  化合物２−ＯＭｅの合成］
３−１．OTD-ナフチル２２の合成
【化７２】
2020176108.tif 000086
【００８４】
アルゴン雰囲気下、実施例１で合成した大環状体16（14.8 mg, 16.5μmol）を脱水テトラヒドロフラン（400μL）に溶解させ、ビニルナフチル21（21.2 mg, 115μmol）、グラブス第二世代触媒（717μg, 0.825μmol）を室温で加え、90℃まで昇温させ25時間撹拌した後に、溶媒留去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（クロロホルム/メタノール = 100:1）にて精製し、OTD-ナフチル22（13.5 mg, 78%）を黄色アモルファスとして得た。
2020176108.tif 000087
【００８５】
３−２．化合物２−ＯＭｅの合成
【化７３】
2020176108.tif 000088
【００８６】
OTD-ナフチル22 (10.9 mg, 10.3μmol) をテトラヒドロフラン-ジクロロメタンの混合溶液（2:1, 3 mL）に溶解させ、室温で10分攪拌した後に、溶媒留去し、化合物2-OMe（L2H2-1Np-4OMe、7.00 mg, 79%）を黄色アモルファスとして得た。
2020176108.tif 000089
【００８７】
［実施例４  化合物２−ＯＨの合成］
４−１．OTD-ナフチル２３の合成
【化７４】
2020176108.tif 000090
【００８８】
実施例１で合成したOTD-ナフチル18（14.4 mg, 13.3μmol）をクロロホルム（1 mL）に溶解させ、NHシリカゲルを加え、室温で30分撹拌した後に、ろ過後溶媒留去し、OTD-ナフチル23（4.00 mg, 29%）を橙色アモルファスとして得た。
2020176108.tif 000091
【００８９】
４−２．化合物２−ＯＨの合成
【化７５】
2020176108.tif 000092
【００９０】
OTD-ナフチル23 (4.00 mg, 3.84μmol) をテトラヒドロフラン-ジクロロメタンの混合溶液（2:1, 3 mL）に溶解させ、室温で20分攪拌した後に、溶媒留去し、化合物2-OH（L2H2-1Np-4OH、3.00 mg, 93%）を橙色アモルファスとして得た。
2020176108.tif 000093
【００９１】
［実施例５  G4との相互作用評価］
実施例１で合成した化合物１と、G4形成配列との相互作用をゲルシフトアッセイ（EMSA）により確認した。
具体的には、G4形成配列としてtelo24（5'-d(TTAGGG)4-3、配列番号１）、G4非形成配列としてdsDNA（5'-d(TTAAGCTATATTTTTTTATAGCTATA)-3'、配列番号２）を用い、50 mM Tris-HCl（100mM KClを含む）中それぞれ5μMのDNAに対し、化合物１を5μM（1eq）、10μM（2eq）、又は25μM（5eq）添加したサンプルを電気泳動した後、GelStar（登録商標、ロンザジャパン株式会社）で染色し、526nmで検出した。
【００９２】
その結果、図１に示すように、G4形成配列（telo24）と一緒に泳動した場合には、リガンドの濃度依存的なバンドのシフトが観察された。一方、G4非形成配列（dsDNA）を添加した場合には、バンドのシフトは観察されず、合成した化合物１は、G4形成配列と選択的に相互作用することがわかった。
【００９３】
また、5eqの化合物をtelo24に添加したサンプルでCD融解実験を行った結果、化合物１はtelo24と相互作用した場合にその融解温度を顕著に上昇させ、従ってG4安定化能を有することが確認された（データは示さない）。
【００９４】
［実施例６  蛍光特性評価］
実施例１〜４で合成した化合物１、２−Ｈ、２−ＯＭｅ、２−ＯＨについて、G4形成配列及びG4非形成配列共存下における蛍光特性を調べた。
具体的には、G4形成配列としてtelo24（配列番号１）、G4非形成配列としてdsDNA（配列番号２）を用い、これらをそれぞれ50 mM Tris-HCl（100mM KClを含む）中でDNA 10μM、リガンド50μM（5eq）の割合で各化合物と混合し、励起波長365nmで蛍光特性を目視で観察した。
【００９５】
その結果、図２に示すように、化合物１（Ａ）及び化合物２−ＯＨ（Ｄ）は、リガンド単独での蛍光はなく、かつG4形成配列であるtelo24の非存在下では蛍光が観察されず、telo24を添加した時のみ蛍光を発することがわかった。また、G4非形成配列であるdsDNAを添加した場合には蛍光を発しないことから、化合物１及び化合物２−ＯＨは、G4存在下のみ、すなわちG4が形成された時にのみ、選択的に蛍光を発するライトアップ型蛍光リガンドであることがわかった。
【００９６】
化合物２−Ｈ（Ｂ）及び２−ＯＭｅ（Ｃ）は、リガンド単独でも蛍光を発するが、G4非形成配列（dsDNA）の存在下では蛍光特性の変化は認められず、G4形成配列（telo24）の存在下で蛍光特性が変化することが認められた。
【００９７】
［実施例７  蛍光スペクトル測定］
実施例６で観察された化合物１、２−Ｈ、２−ＯＭｅ、２−ＯＨの蛍光特性について、蛍光スペクトルを測定することにより更に確認した。
50 mM Tris-HCl（100mM KClを含む）中それぞれ0.5μMの化合物１、２−Ｈ、２−ＯＭｅ、又は２−ＯＨに対し、0〜2.5μM（0〜5eq）のG4形成配列又はG4非形成配列を添加し、励起波長365nmを照射して、蛍光スペクトルを測定した。化合物１の結果を図３−１及び３−２、化合物２−Ｈの結果を図４−１及び４−２、化合物２−ＯＭｅの結果を図５−１及び５−２、化合物２−ＯＨの結果を図６−１及び６−２に示す。
【００９８】
その結果、図３−１及び３−２に示すように、化合物１は、DNAの非存在下では蛍光がほとんど観察されず、G4形成配列として用いたc-myc22（5'-d(GAGGGTGGGGAGGGTGGGGAAG)-3'、配列番号３）、telo22（5'-d(GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGT)-3'、配列番号４）、telo24（配列番号１）を添加した場合には、その添加量に依存して蛍光強度の増大が確認された。一方、G4非形成配列であるdsDNA（配列番号２）及びmut telo24（5'-d(TTAGAGTTAGAGTTAGAGTTAGAG)-3'、配列番号５）を添加した場合は、蛍光強度の増大はほとんど観察されなかった。
【００９９】
同様の傾向は、図６−１及び６−２に示す化合物２−ＯＨでも確認され、G4形成配列（c-myc22、telo22及びtelo24）の存在下でその添加量に依存して蛍光強度が増大し、G4非形成配列（dsDNA及びmut telo24）の存在下では蛍光特性が変化しなかった。
【０１００】
図４−１及び図４−２に示す化合物２−Ｈ、並びに図５−１及び５−２に示す化合物２−ＯＭｅでは、リガンド単独でも蛍光が観察されたが、G4形成配列（c-myc22、telo22及びtelo24）の存在下では濃度依存的に蛍光強度が増大し、また蛍光特性の変化（低波長側へのピークシフト等）も示された。
【０１０１】
［実施例８  化合物２−ＮＭｅ２の合成］
８−１．OTD-ナフチル２４の合成
【化７６】
2020176108.tif 000094
【０１０２】
アルゴン雰囲気下、実施例１で合成した大環状体16（15.0 mg, 16.6μmol）を脱水テトラヒドロフラン（400μL）に溶解させ、ビニルナフチル23（32.7 mg, 166μmol）、グラブス第二世代触媒（1.44 mg, 1.66μmol）を室温で加え、90℃まで昇温させ24時間撹拌した後に、溶媒留去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（クロロホルム/メタノール = 100:1）にて精製し、OTD-ナフチル24（14.5 mg, 80%）を橙色固体として得た。
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【０１０３】
８−２．化合物２−ＮＭｅ２の合成
【化７７】
2020176108.tif 000096
【０１０４】
OTD-ナフチル24 (9.30 mg, 8.71μmol) をテトラヒドロフラン-ジクロロメタンの混合溶液（1:1, 2 mL）に溶解させ、室温で30分攪拌した後に、溶媒留去し、化合物２−ＮＭｅ２（7.56 mg, 99%）を橙色固体として得た。
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【０１０５】
［実施例９  蛍光特性評価］
実施例８で合成した化合物２−ＮＭｅ２について、G4形成配列及びG4非形成配列共存下における蛍光特性を調べた。
具体的には、G4形成配列としてtelo24（配列番号１）、G4非形成配列としてdsDNA（配列番号２）を用い、これらをそれぞれ50 mM Tris-HCl（100mM KClを含む）中でDNA 10μM、リガンド50μM（5eq）の割合で各化合物と混合し、励起波長399nmで蛍光特性を目視で観察した。
【０１０６】
その結果、図７に示すように、化合物２−ＮＭｅ２は、リガンド単独での蛍光はなく、かつG4形成配列であるtelo24の非存在下では蛍光が観察されず、telo24を添加した時のみ蛍光を発することがわかった。また、G4非形成配列であるdsDNAを添加した場合には蛍光を発しないことから、化合物２−ＮＭｅ２は、G4存在下のみ、すなわちG4が形成された時にのみ、選択的に蛍光を発するライトアップ型蛍光リガンドであることがわかった。
【０１０７】
［実施例１０  蛍光スペクトル測定］
実施例９で観察された化合物２−ＮＭｅ２の蛍光特性について、蛍光スペクトルを測定することにより更に確認した。
50 mM Tris-HCl（100mM KClを含む）中それぞれ0.5μMの化合物２−ＮＭｅ２に対し、0〜2.5μM（0〜5eq）のG4形成配列又はG4非形成配列を添加し、励起波長399nmを照射して、蛍光スペクトルを測定した。
【０１０８】
その結果、図８に示すように、化合物２−ＮＭｅ２は、DNAの非存在下では蛍光がほとんど観察されず、G4形成配列として用いたtelo24（配列番号１）を添加した場合には、その添加量に依存して蛍光強度の増大が確認された。一方、G4非形成配列であるdsDNA（配列番号２）を添加した場合は、蛍光強度の増大はほとんど観察されなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
グアニン四重鎖（G4）は、様々な生命現象に関わる核酸の高次構造であるが、近年、疾患との関係から疾患マーカーとしての可能性が検討されている。従って、本発明は、疾患に関連するG4の迅速検出のためのリガンドベースでの疾患マーカー検出のための方法及び装置の開発につながり得る。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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