(57)【要約】【課題】口腔内粘膜付着型の製剤で、口腔内粘膜に高濃度の薬物溶液を一定時間付着させることにより、粘膜面にワクチン抗原を安定的に暴露させ、所定時間内で完全に溶解させることのできる口腔内粘膜付着型ワクチン製剤を提供すること。【解決手段】ワクチン抗原を含む薬物層と、薬物カバー層とを有する口腔内粘膜付着型ワクチン製剤であって、上記薬物カバー層の厚みが、１５μｍ以上であって、３７℃の蒸留水に対する、上記薬物層の崩壊性（Ａ）及び上記薬物カバー層の崩壊性（Ｂ）が、（Ａ）＞（Ｂ）の関係を有し、面積２０ｃｍ２厚み５０μｍの上記薬物カバー層の試験片を、３７℃の蒸留水５００ｍＬに浸漬させ、浸漬開始から７分後の残存率（Ｃ）が、５０％以上９０％以下である口腔内粘膜付着型ワクチン製剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチン抗原を含む薬物層と、薬物カバー層とを有する口腔内粘膜付着型ワクチン製剤であって、
前記薬物カバー層の厚みが、１５μｍ以上であって、
３７℃の蒸留水に対する、前記薬物層の崩壊性（Ａ）及び前記薬物カバー層の崩壊性（Ｂ）が、（Ａ）＞（Ｂ）の関係を有し、
面積２０ｃｍ２厚み５０μｍの前記薬物カバー層の試験片を、３７℃の蒸留水５００ｍＬに浸漬させ、浸漬開始から７分後の残存率（Ｃ）が、５０％以上９０％以下である
ことを特徴とする口腔内粘膜付着型ワクチン製剤。
【請求項２】
薬物層は、３７℃の蒸留水１．０ｍＬに１回投与分を溶解させたときの溶液粘度（Ｄ）が、２０ｍＰａ・ｓ以下である請求項１に記載の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤。
【請求項３】
薬物層は、さらに高分子成分を含む請求項１又は２に記載の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤。
【請求項４】
高分子成分は、デキストラン、ペクチン及びアルギン酸ナトリウムからなる群より選択される少なくとも１種である請求項３に記載の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤。
【請求項５】
高分子成分は、デキストランである請求項４に記載の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤。
【請求項６】
薬物層は、さらに少なくとも１種の免疫誘導促進剤を含む請求項１、２、３、４又は５に記載の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤。
【請求項７】
ワクチン抗原は、ペプチド抗原、タンパク質抗原及び核酸からなる群より選択される少なくとも１種である請求項１、２、３、４、５又は６に記載の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、口腔内粘膜付着型ワクチン製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、口腔内への薬物の投与方法として液剤、軟膏剤、ゼリー剤、スプレー剤、トローチ剤、バッカル錠、舌下錠等を用いる方法が知られている。また近年、唾液などの水分で濡れた口腔粘膜に対しても良好な接着性を示す製剤として、水溶性あるいは水膨潤性の高分子を基剤とする口腔内粘膜付着型製剤が数多く開発ないし提案されている。
【０００３】
口腔内粘膜付着型製剤は、いわゆる口内炎のような口腔粘膜疾患を保護・治療する目的で用いられることが多い。そのため、貼付後に水分や唾液を含んだ場合にも貼付部位を物理的に保護し、長時間残存する特性を有することが望まれている。そのため、近年の口腔内粘膜付着型製剤の開発においては、薬物の徐放性を有し物理的に口腔内に長時間残存する口腔内粘膜付着型製剤が開発ないし提案されている。
【０００４】
また、口腔粘膜が疾患部位である場合以外に、口腔粘膜部位が比較的高い薬物吸収性を有することから、例えば、経口では吸収されにくい薬物の投与経路として利用する試みがなされている。このような口腔内粘膜付着型製剤としては、例えば、特許文献１に、セルロースの低級アルキル又は低級ヒドロキシアルキルエーテル、及び、アクリル酸重合体と薬物とから成る薬物層を有することにより、薬物の徐放性及び速効性を満たすことが教示されている。
しかしながら、口腔内粘膜付着型製剤における薬物層及びカバー層の崩壊性を制御することにより、口腔内粘膜に高濃度の薬物溶液を一定時間付着させるものは開示、示唆されていない。さらに、そのような薬物層にワクチン抗原を含む、口腔内粘膜付着型ワクチン製剤も開示、示唆されていない。
【０００５】
一方、口腔内粘膜付着型製剤による薬物投与は、注射による薬物投与と比較して、痛み、恐怖心、注射痕及びそれに続く瘢痕化等の患者の心身的負担がほとんどなく、医療従事者の針刺し感染事故のリスクもなく、注射針等の医療廃棄物が生じないため、注射に代わる投与方法としても注目されている。
特に、ワクチン投与による免疫の誘導には、皮下又は皮内注射、筋肉注射等の注射が一般的に利用されている。微生物やウイルスは、そのサイズの為に皮膚からの侵入が阻止されているため、ワクチンは、侵襲的に体内に投与される必要があるためである。
しかし、免疫効果の高い皮内注射は投与手技が難しく、筋肉注射は患者への痛みが強いことから、注射に代わるワクチン投与方法が望まれていた。
【０００６】
ここで、口腔内粘膜は、無害の抗原、例えば、食品及び吸入粒子に対する特異的な免疫応答の誘導を阻止するよう進化してきた。その結果、口腔内粘膜表面に導入される多くの抗原が、生産的なＴ細胞及びＢ細胞の応答ではなく、「寛容」を誘導する。従って、有効なワクチンを作成するためには、これらの自然プロセスを克服する必要がある。従って、口腔内粘膜ワクチンの製剤化においては、ワクチン抗原を効果的に免疫細胞に送達させること、すなわち、口腔内粘膜面にワクチン抗原を安定的に暴露させることが必須である。このようなワクチンの製剤化技術として、例えば、特許文献２には、経口投与可能な低粘度液体剤形が開示されており、低粘性で活性物質の吸収促進を図ることが教示されている。また、特許文献３には、免疫原性応答を誘発するための経口ワクチンが開示されており、ワクチンの送達のために、免疫応答強化マトリックス形成剤としてデンプンを利用すること、及び速溶性剤形であることが教示されている。
しかし、口腔内粘膜付着型のワクチン製剤で、粘膜面にワクチン抗原を一定時間、安定的に暴露させるものは開示、示唆されていない。
【０００７】
口腔粘膜付着型の製剤を用いて薬物を投与する際の最大の障害は、唾液などの分泌液或いは会話等に伴う粘膜部位の伸縮等により、配置した薬物が吸収されるまでに洗い流されること、及び、薬物量に比して充分な薬理効果が得られないことである。また、口腔内粘膜付着型の製剤が口腔内に維持されていても、製剤が多量の唾液に晒されることにより、製剤中の薬物が溶け出て嚥下される場合もあり、確実に粘膜経路で投与されているか不明な場合もあった。そのため、疾患の種類又は症状によって、投与する薬物の種類や量を調節することが困難であるとの欠点もあった。
【０００８】
また、医療機関においては、薬剤性のアナフィラキシー反応への対応として、通常、薬剤投与後３０分は、医師の観察が必要とされている。従って、医療機関では、薬剤投与後の患者に対しても時間管理及び体調管理を行っている。そのため、薬剤投与後の時間管理の負担を軽減する方法も望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開昭５８−０４３９１５号公報
【特許文献２】特開２０１１−２５１９８９号公報
【特許文献３】特開２０１３−５３９７６６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記現状に鑑み、口腔内粘膜にワクチン抗原を一定時間安定的に暴露させることのできる口腔内粘膜付着型ワクチン製剤を提供することを課題とする。
【００１１】
本発明者らは鋭意検討した結果、口腔内粘膜付着型ワクチン製剤を構成する薬物層及び薬物カバー層について、各層の水に対する崩壊性を特定の関係にすることで、高濃度の薬物溶液を口腔粘膜上に保持させ、粘膜面に薬物を暴露できることを見出した。さらに、薬物カバー層の崩壊性を示す特定条件下での残存率（Ｃ）を、特定の範囲とすることにより、薬物カバー層が一定時間崩壊することなく、高濃度の薬物溶液を一定時間安定して粘膜面に暴露でき、一定時間経過後には薬物カバー層が崩壊し、口腔内に残存せず、薬剤投与後の時間管理が簡便化されることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ワクチン抗原を含む薬物層と、薬物カバー層とを有する口腔内粘膜付着型ワクチン製剤であって、上記薬物カバー層の厚みが、１５μｍ以上であって、３７℃の蒸留水に対する、上記薬物層の崩壊性（Ａ）及び上記薬物カバー層の崩壊性（Ｂ）が、（Ａ）＞（Ｂ）の関係を有し、面積２０ｃｍ２厚み５０μｍの上記薬物カバー層の試験片を、３７℃の蒸留水５００ｍＬに浸漬させ、浸漬開始から７分後の残存率（Ｃ）が、５０％以上９０％以下であることを特徴とする口腔内粘膜付着型ワクチン製剤である。
【００１３】
また、上記薬物層は、３７℃の蒸留水１．０ｍＬに１回投与分を溶解させたときの溶液粘度（Ｄ）が、２０ｍＰａ・ｓ以下であることが好ましい。
また、上記薬物層は、さらに高分子成分を含むことが好ましい。
上記高分子成分は、デキストラン、ペクチン及びアルギン酸ナトリウムからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。
上記高分子成分は、デキストランであることが好ましい。
上記薬物層は、さらに少なくとも１種の免疫誘導促進剤を含むことが好ましい。
上記ワクチン抗原は、ペプチド抗原、タンパク質抗原及び核酸からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、ワクチン抗原を含む薬物層と、薬物カバー層とを有し、上記薬物カバー層の厚みが、１５μｍ以上であって、３７℃の蒸留水に対する、上記薬物層の崩壊性（Ａ）及び上記薬物カバー層の崩壊性（Ｂ）が、（Ａ）＞（Ｂ）の関係を有している。さらに、上記薬物カバー層は、面積２０ｃｍ２厚み５０μｍの上記薬物カバー層の試験片を、３７℃の蒸留水５００ｍＬに浸漬させ、浸漬開始から７分後の残存率（Ｃ）が、５０％以上９０％以下である。
上記構成を有することで、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、口腔内に配置された後にすぐに粘膜上の唾液により薬物層が崩壊する。一方、薬物カバー層は、一定時間崩壊しないため、高濃度の薬物溶液が、一定時間、安定的に粘膜上に保持されることができる。
【００１５】
すなわち、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、上記薬物カバー層の崩壊性（Ｂ）が、上記薬物層の崩壊性（Ａ）よりも小さいため、本発明のワクチン製剤が適用される粘膜上の唾液により上記薬物層が崩壊し、高濃度の薬物溶液が形成されると、上記薬物カバー層により必要量以上の口腔内唾液が上記薬物溶液に混入することが確実に防がれる。従って、一定時間にわたって上記薬物溶液が唾液により希釈化されることを防ぎ、高濃度の薬物溶液を粘膜上に保持できる。よって、口腔内経路であっても、唾液の影響を受けることなく確実に薬物を投与することができる。さらに、唾液の影響を受けないため、口腔内への投与であっても薬物投与量に応じた薬理効果を得ることができる。
なお、上記薬物層及び上記薬物カバー層の各崩壊性（Ａ）及び（Ｂ）の関係が、上記特定の関係を外れると、製剤が添付される粘膜上の唾液により薬物層が崩壊されるよりも速く口腔内の唾液により上記薬物カバー層が崩壊されることとなり、高濃度の薬物溶液を粘膜上に付着させることができなくなってしまう。
【００１６】
また、特定の大きさにおける上記薬物カバー層の残存率（Ｃ）が５０％以上であることにより、口腔内粘膜付着型ワクチン製剤における薬物カバー層の厚みが１５μｍ以上である場合に、例えば、口腔内環境で２分以上薬物カバー層の形状が保持される。
ここで、ワクチン製剤として免疫誘導効果を効率的に得るためには、薬物層が崩壊して形成される薬物溶液（ワクチン抗原溶液ともいう。）が、高濃度で一定時間（２分以上）、粘膜上に暴露されることが必要である。そのため、一定時間（２分）未満に、口腔内に投与された口腔内粘膜付着型ワクチン製剤の薬物層に、一定量（投与箇所となる粘膜上に存在する唾液）以上の唾液が混入すると、上記薬物溶液の濃度低下を招き、免疫誘導が効率的に行われない可能性が生じる。また、投与された薬物量に応じた薬理効果が確実に得られない可能性が生じる。
すなわち、上記薬物カバー層の残存率（Ｃ）が５０％よりも低いと、口腔内の唾液により薬物カバー層が崩壊されるまでの時間が、一定時間（２分）よりも短くなり、高濃度の薬物溶液を一定時間粘膜上に保持できなくなり、免疫誘導効果を充分に得られない可能性が生じる。
なお上記残存率（Ｃ）は、上記薬物カバー層を構成する組成物を用いて面積２０ｃｍ２厚み５０μｍの試験片を作製し、該試験片の重量（ｍｇ）を測定し、３７℃の蒸留水５００ｍＬに浸漬させ、浸漬開始から７分後の残存重量（ｍｇ）を浸漬前の上記試験片の重量に対して１００分率で表したものである。
【００１７】
また、医療機関においては、薬剤性のアナフィラキシー反応への対応として、薬剤の投与後に医師の観察が必要とされる観察時間が設定されている。該観察時間は、ワクチンの種類やワクチン投与対象者に応じて異なる場合もあるが、通常は３０分である。
本発明の口腔内付着型ワクチン製剤において、上記薬物カバー層は、面積２０ｃｍ２厚み５０μｍの上記薬物カバー層の試験片を、３７℃の蒸留水５００ｍＬに浸漬させ、浸漬開始から７分後の残存率（Ｃ）が、９０％以下であることにより、口腔内粘膜付着型ワクチン製剤における薬物カバー層の厚みが１５μｍ以上である場合に、薬物カバー層を、例えば口腔内環境において３０分程度で崩壊する構成とすることができる。上述の通り、ワクチンの投与後には観察時間が必要とされるため、所望の時間で崩壊する口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、医療機関関係者の時間管理の負担軽減に貢献する。また、投与対象者自身の時間管理負担の軽減にも合わせて貢献することができる。上記残存率（Ｃ）は、５０％以上９０％以下であればよい。
なお、上記残存率（Ｃ）は、５０％以上９０％以下であれば、製剤投与後に必要とされる観察時間に応じて決定されることが好ましい。
【００１８】
なお、上記薬物カバー層の、３７℃の蒸留水５００ｍＬに対する残存率と、口腔内の唾液に対する残存率とは、その成分が異なるために厳密には異なるが、唾液の９９．５％は水分であるため、３７℃の蒸留水に対する残存率は、例えば、ヒトの口腔内における唾液に対する残存率と同様の特性を示すものと考えられる。
【００１９】
また、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤における薬物カバー層の厚みは、１５μｍ以上であればよく、２０μｍ以上であることが好ましい。
また、口腔内粘膜付着型ワクチン製剤における薬物カバー層の厚みは、３０μｍ以下であることが好ましく、２５μｍ以下であることが好ましい。
口腔内粘膜付着型ワクチン製剤における薬物カバー層の厚みが、１５μｍ以上である場合、面積２０ｃｍ２厚み５０μｍの前記薬物カバー層の試験片を、３７℃の蒸留水５００ｍＬに浸漬させ、浸漬開始から７分後の残存率（Ｃ）が、５０％以上９０％以下の薬物カバー層は、口腔内環境でその形状が２分以上保持されるためである。
【００２０】
薬物カバー層の残存率（Ｃ）の測定方法は以下の通りである。
（薬物カバー層の残存率（Ｃ）の測定方法）
１．溶出試験器のベッセルに蒸留水５００ｍＬを入れて、３７℃に温めた。
２．時計皿（６ｃｍφ）の重量を測定した後、
３．面積２０ｃｍ２、厚み５０μｍの薬物カバー層を時計皿に両面テープで固定した。
４．５０ｒｐｍの速度でパドルを回転させている中に、時計皿に固定した薬物カバー層を入れ、７分後に取り出した。
５．取り出し薬物カバー層を１００℃で１時間乾燥させた後、重量を測定し、試験前の薬物カバー層の重量に対する割合を算出し、その値を残存率（Ｃ）とした。
【００２１】
本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤における薬物層は、該製剤が添付される粘膜上の唾液に対し、速崩壊性を有することが好ましい。本明細書においては、３７℃の蒸留水１．０ｍＬに１回投与分の薬物層を添加し、スターラーで攪拌して３０秒後の、蒸留水中に溶出した薬物の濃度が、３７℃の蒸留水１ｍＬに１回投与分の薬物を全量溶解させた場合の、蒸留水中に溶解した薬物の濃度に対して、８０％以上である場合、上記薬物層が粘膜上の唾液に対し速崩壊性を有するとする。具体的な測定方法は実施例にて詳述する。
なお、本発明における薬物層は、投与の簡便性、ハンドリング性及び免疫誘導の観点から、１回投与分の質量が５〜５００ｍｇであることが好ましい。
【００２２】
本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤における薬物層は、ワクチン抗原として、ペプチド抗原、タンパク質抗原及び核酸を含む群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。口腔粘膜は、一般的には、免疫が起こりにくく、これら抗原に対して免疫寛容を引き起こすことができても、免疫を活性化することは難しいと考えられていたが、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、口腔内粘膜上に薬物溶液を一定時間高濃度で保持することが可能であるため、口腔粘膜への投与であっても、唾液により希釈化されることなく安定的に粘膜上に高濃度薬物溶液を暴露させることができ、ワクチン抗原に対して、効果的に全身性免疫応答及び粘膜免疫応答を誘導することができる。中でもアナフィラキシーショックの誘発要因となり得るワクチン抗原であって、ワクチン投与後の時間管理が必要なワクチン抗原に対し好適に用いることができる。
【００２３】
上記ワクチン抗原は、本発明の属する技術分野においてワクチン抗原として用いられているものであれば特に限定されないが、ペプチド抗原、タンパク質抗原及び核酸からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。また、疾患の予防を目的とする場合は、製剤投与により予め患者の体内に抗体を形成させる必要があるため、上記ワクチン抗原として、感染症病原体由来抗原を利用することが好ましく、例えば、感染性病原体及び感染性病原体由来タンパク又はヒト内因性由来タンパク等が挙げられる。
【００２４】
上記感染症病原体由来抗原の感染症病原体から罹る疾患としては特に限定されず、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ−Ｉ、ＨＳＶ−ＩＩ、ＣＭＶ、又は、ＶＺＶ）、ポックスウイルス（例えば、痘瘡若しくはワクシニア、又は、伝染性軟属腫などのオルトポックスウイルス）、ピコルナウイルス（例えば、ライノウイルス又はエンテロウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザウイルス、おたふく風邪ウイルス、はしかウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ））、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ）、パポバウイルス（例えば、生殖器疣、尋常性胱贅、又は、足底疣費を引き起こすものなどのヒト乳頭腫（パピローマ）ウイルス）、ヘパドナウイルス（例えば、肝炎Ｂウイルス）、フラビウイルス（例えば、肝炎Ｃウイルス又はデングウイルス）、又は、レトロウイルス（例えば、ＨＩＶなどのレンチウイルス）などのウイルス感染から罹る疾患などのウイルス疾患、エシェリキア属、エンテロバクター、サルモネラ、ブドウ球菌、赤痢菌、リステリア、アエロバクター、ヘリコバクター、クレブシエラ、プロテウス、シュードモナス、連鎖球菌、クラミジア、マイコプラズマ、肺炎球菌、ナイセリア、クロストリジウム、バシラス、コリネバクテリウム、マイコバクテリウム、カンピロバクター、ビブリオ、セラチア、プロビデンシア、クロモバクテリウム、ブルセラ、エルシニア、ヘモフィルス、又は、ボルデテラなどの細菌感染から罹る疾患などの細菌疾患、クラミジア、カンジダ症、アスペルギルス症、ヒストプラスマ症、クリプトコックス髄膜炎をはじめとするがこれに限定されるものではない真菌疾患、マラリア、ニューモシスティスカリニ肺炎、レーシュマニア症、クリプトスポリジウム症、トキソプラズマ症、及び、トリパノソーマ感染等が挙げられる。
【００２５】
また、上記感染症病原体由来抗原は、インフルエンザウイルス由来抗原であってもよい。
ここで、上記インフルエンザウイルスとは、オルソミクソウイルス科に属する直径約１００ｎｍの粒子サイズを有するＲＮＡエンベロープウイルスであり、内部タンパクの抗原性に基づいて、Ａ、Ｂ及びＣ型に分けられる。
上記インフルエンザウイルスは、脂質二重層構造を有するウイルスエンベロープに取り囲まれた内部ヌクレオキャプシド又は核タンパク質と会合したリボ核酸（ＲＮＡ）のコアと、外部糖タンパク質とからなる。上記ウイルスエンベロープの内層は、主としてマトリックスタンパク質で構成され、外層は大部分が宿主由来脂質物質で構成される。
また、上記インフルエンザウイルスのＲＮＡは、分節構造をとる。なお、世界中で大流行するインフルエンザは、主にはＡ型インフルエンザウイルスによるものであり、このＡ型インフルエンザウイルスは、ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）の２種類のエンベロープ糖タンパク質を有し、抗原性の違いによってＨＡでは１６種、ＮＡでは９種の亜型に区別されている。
本発明においては、上記感染症病原体由来抗原としては、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルス由来抗原が好適に用いられる。なお、上述したＡ型及びＢ型インフルエンザウイルスの亜型としては特に限定されず、これまで単離された亜型であっても将来単離される亜型であってもよい。上記インフルエンザワクチン抗原に使用されるインフルエンザウイルスは、Ａ型１種類以上及びＢ型１種類以上の２種類以上のインフルエンザワクチン抗原を含むことが好ましい。なかでも、Ａ型インフルエンザワクチン抗原では、Ｈ１Ｎ１型及びＨ３Ｎ２型が好ましく、Ｂ型インフルエンザワクチン抗原では、山形系統及びビクトリア系統が好ましい。
【００２６】
本発明において、インフルエンザウイルス由来抗原としては、上記インフルエンザウイルスを構成する種々の成分の少なくとも一部であれば特に限定されるものではなく、例えば、生ウイルスや、精製ウイルス粒子が有機溶媒／界面活性剤若しくは他の試薬で不活化されたウイルス全粒子、又は、該ウイルス全粒子の中から不純物を取り除き、ＨＡ及び／若しくはＮＡを精製して作られたウイルスサブユニット等が挙げられる。免疫原性の観点から、ＨＡサブユニット又はウイルス全粒子が好ましい。上記ウイルス全粒子は、ホルマリン等により不活化されたものがより好ましい。また、不純物が少なく、免疫誘導促進剤などのアジュバントが必須となるＨＡサブユニット（スプリット）について特に有効である。
上記インフルエンザウイルス由来抗原の調製方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法が限定なく使用できる。例えば、インフルエンザ感染動物又はインフルエンザの患者から単離されたインフルエンザウイルス株をニワトリ卵等に感染させて常法により培養し、精製したウイルス原液から抗原を調製する方法が挙げられる。また、遺伝子工学的に培養細胞中で調製したウイルス由来の抗原を用いてもよい。
【００２７】
本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤において、上記薬物層には、上記ワクチン抗原が有効量含有されていれば良いが、例えば、ワクチン抗原の合計量として、上記薬物層中、０．００１μｇ〜１．０ｍｇの範囲で含有されていることが好ましい。０．００１μｇ未満であると、感染症の予防又は治療剤としての機能が不充分となることがあり、１．０ｍｇを超えると、安全性に関して問題となることがある。上記抗原含有量のより好ましい下限は０．０１μｇ、さらに好ましい下限は０．１μｇ、より好ましい上限は５００μｇ、さらに好ましい上限は１００μｇである。
なお、上記ワクチン抗原がインフルエンザウイルス由来抗原を除く抗原である場合、種類によっては、インフルエンザウイルス由来抗原と比較して口腔内投与で免疫を誘導することが比較的困難であり、ワクチン抗原の量の検討を要する。
なお、本明細書にいう「ワクチン抗原の質量」は、特記する場合を除き、上記薬物層に含まれる全ワクチン抗原タンパク質の合計質量のことである。したがって、抗原が、ウイルス等生体由来物質である場合は、その抗原に含まれる全タンパク質の質量を意味する。また、複数種類の抗原を含む場合は、その合計量を意味する。
【００２８】
なお、上記全身性免疫応答及び粘膜性免疫応答の誘導効果は、免疫評価用モデル動物を用いた免疫誘導実験およびＥＬＩＳＡ法（抗原特異的ＩｇＧ及びＩｇＡ抗体）により測定することができる。
上記免疫誘導効果を測定するためのサンプルは、免疫評価用モデル動物の血液及び鼻腔洗浄液等である。
【００２９】
また、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤における薬物層は、３７℃の蒸留水１．０ｍＬに１回投与分溶解させたときの溶液粘度（Ｄ）が２０ｍＰａ・ｓ以下であることが好ましい。本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤が口腔内に適用された際に、粘膜上の唾液により薬物層が溶解され薬物溶液となるが、溶液粘度が２０ｍＰａ・ｓ以下と低いことで、薬物溶液中のワクチン抗原の拡散性が向上し、より効果的に免疫応答及び粘膜免疫応答を誘導することができる。上記薬物溶液が低粘性溶液として口腔内粘膜に保持されることで、ワクチン抗原の粘膜への暴露が促進されると考えられる。
なお、本発明における薬物層は、投与の簡便性、ハンドリング性及び免疫誘導の観点から、１回投与分の質量が５〜５００ｍｇであることが好ましい。
【００３０】
なお、ヒトの唾液は、１分間に０．８〜１．２ ｍＬ程度分泌することから、本発明においては、精製水１．０ｍＬに溶解させて得られる溶液を、口腔内の粘度測定モデルとした。
３７℃の蒸留水に対する溶液粘度と、口腔内の唾液に対する溶液粘度とは、その成分が異なるために厳密には異なるが、唾液の９９．５％は水分であるため、３７℃の蒸留水に対する溶液粘度は、例えば、ヒトの口腔内における唾液に対する溶液粘度と同様の特性を示すものと考えられる。
なお、溶液粘度は一般的に用いられる方法及び装置により測定することができる。具体的には、例えば、粘度測定装置（ＲｈｅｏＳｔｒｅｓｓ  ６００、ＴＨｅｒｏｍｏ  ＨＡＡＫＥ社製）を用いて３７℃における溶液粘度を測定することができる。
【００３１】
上記薬物層は、高分子成分を含むことが好ましく、上記高分子成分は、水溶性の可食性高分子であることが好ましい。薬物層を水溶性とすることで、口腔内粘膜付着型ワクチン製剤を口腔内に配置した際に、粘膜上の唾液により薬物層が溶解し、高濃度の薬物溶液を粘膜上に付着させることができるためである。
上記水溶性の可食性高分子としては、特に限定されないが、具体的には、例えば、ポリビニルアルコール、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（以下“ＨＰＭＣ”と記す）、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルスターチナトリウム等の合成高分子、アルギン酸ソーダ、デキストラン、カゼイン、ゼラチン、プルラン、ペクチン、グァーガム、キサンタンガム、トラガンカントガム、アカシアガム、アラビアガム及び澱粉等の天然高分子類や多糖類とそれらの誘導体等が挙げられる。
【００３２】
また、上記薬物層は、高分子成分として、デキストラン、ペクチン及びアルギン酸ナトリウムからなる群より選択される少なくとも１種を含むことがより好ましい。このような成分を含むことで、３７℃の蒸留水に対する薬物層の崩壊性を向上させることができるためである。なお、上記特定の高分子成分の含有量としては、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤における薬物層が所望の崩壊性となるように適宜配合すればよく、当業者知識の範囲内である。
さらに、上記特定の高分子成分を含むことにより、唾液（３７℃の蒸留水）に薬物層が溶解した場合の溶液粘度が低くなり、口腔内粘膜経路でのワクチン製剤の投与に好適である。
【００３３】
上記デキストランは、一般的にＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  Ｖａｎ  Ｔｉｅｇｈｅｍ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）によるショ糖の発酵によって生産された多糖類を部分分解したものであり、主にＤ−グルコースより構成される。上記デキストランは、質量平均分子量が１万以上、より具体的には１万〜１０万であれば特に問題なく使用できるが、本発明が製剤である観点から、医薬品添加物規格に収載されているデキストラン４０（平均分子量４万）もしくはデキストラン７０（質量平均分子量７万）が好適に用いられる。
【００３４】
また、上記薬物層として凍結乾燥製剤を用いる場合、上記デキストランの含有量は、その凍結乾燥製剤の製造過程で、乾燥を行なう直前のワクチン含有製剤溶液の全質量に基づいて、合計量として、好ましくは１．０〜３５．０質量部であり、より好ましくは２．５〜２２．５質量部である。１．０質量部未満であると、乾燥後に医薬品として充分な剤形が形成されない可能性があり、一方、３５．０質量部を超えると、製造溶液中に均一に分散もしくは溶解せず、製造上問題となる恐れがある。
【００３５】
上記ペクチンは、一般的に柑橘類又はリンゴから水で抽出して得られた高分子多糖類であり、ガラクツロン酸及びそのメチルエステルより構成される。
上記ペクチンの質量平均分子量は３万〜１０万程度である。当該メチルエステル化の割合によりＬＭペクチン及びＨＭペクチンに分けられる。全ガラクツロン酸のうち、メチル化ガラクツロン酸の占める割合が５０％より多いものをＨＭペクチン、５０％以下のものをＬＭペクチンという。本発明においてはどちらのペクチンを用いても良いが、ＬＭペクチンはカルシウムイオンの存在下で熱不可逆性のゲルを形成するため、カルシウムイオンを含む有機酸塩との併用は検討を要する。
【００３６】
また、上記薬物層として凍結乾燥製剤を用いる場合、上記ＬＭペクチンの含有量は、その凍結乾燥製剤の製造過程で、乾燥を行なう直前のワクチン含有製剤溶液の全質量に基づいて、合計量として、好ましくは０．５〜１５．０質量部、より好ましくは１．０〜１０．０質量部である。０．５質量部未満であると、乾燥後に医薬品として充分な剤形が形成されない可能性があり、一方、１５．０質量部を超えると、免疫が充分に誘導されない恐れがある。
【００３７】
また、上記薬物層として凍結乾燥製剤を用いる場合、上記ＨＭペクチンの含有量は、その凍結乾燥製剤の製造過程で、乾燥を行なう直前のワクチン含有製剤溶液の全質量に基づいて、合計量として、好ましくは０．２５〜７．５０質量部である。０．２５質量部未満であると、乾燥後に医薬品として充分な剤形が形成されない可能性があり、一方、７．５０質量部を超えると、免疫が充分に誘導されない恐れがある。
【００３８】
また、上記薬物層として凍結乾燥製剤を用いる場合、上記アルギン酸ナトリウムの含有量は、その凍結乾燥製剤の製造過程で、乾燥を行なう直前のワクチン含有製剤溶液の全質量に基づいて、合計量として、好ましくは０．１〜１５．０質量部、より好ましくは０．２〜１０．０質量部である。０．１質量部未満であると、乾燥後に医薬品として充分な剤形が形成されない可能性があり、一方、１５．０質量部を超えると、免疫が充分に誘導されない恐れがある。
【００３９】
本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤の薬物層における高分子成分は、デキストランを含むことが好ましい。粘膜上に付着する少量の唾液（例えば、１ｍＬ）に対しての崩壊性が高く、薬物層が溶解して形成される薬物溶液の溶液粘度が低い為である。
【００４０】
本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤における薬物層は、上記特定の高分子成分（デキストラン、ペクチン及びアルギン酸ナトリウムからなる群より選択される少なくとも１種である）に加えて、本発明の効果を阻害しない範囲であれば、水及び／又は有機溶媒に可溶である可食性高分子を適量組み合わせて用いることもできる。
上記その他の可食性高分子の配合量は、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤における薬物層の全質量基準で、好ましくは０．１〜１０．０質量部である。
【００４１】
上記薬物層は、ワクチン抗原に加え、少なくとも１種の免疫誘導促進剤（アジュバント）を含むことが好ましい。上記免疫誘導促進剤は、抗原と共に投与され、免疫全体を活性化することによりワクチンの効果を高める作用があるが、本発明においては免疫活性化作用があるものであれば特に限定はされない。一例として、ＴＯＬＬ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト（例えば、ＴＬＲ２／６アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト）、及び、環状ジヌクレオチド又はこれらの塩若しくは誘導体からなる群より選択される少なくとも１種類を含有する。
【００４２】
上記ＴＬＲ２／６アゴニストとしては、マイコプラズマ細胞膜からの抽出物又はその改変体であってもよく、合成品であってもよい。
上記マイコプラズマとしては、例えば、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｏｖｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ等が挙げられる。
【００４３】
また、上記ＴＬＲ４アゴニストとしては、リポポリサッカライド又はその塩が好適に挙げられる。なお、本明細書にいうリポポリサッカライドは、リポポリサッカライドそれ自体のほか、その性質を有する限りその誘導体若しくは改変体を含む概念である。本明細書にいう塩とは、任意の有機酸又は無機酸の塩であってよいが、好ましくは薬学的に許容される塩である。
また、上記リポポリサッカライドは、グラム陰性菌細胞壁からの抽出物又はその改変体であってもよく、合成品であってもよい。
上記グラム陰性菌としては、例えば、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｃｉｄｉｃａｌｄｕｓ属、Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ属、Ａｃｉｄｉｓｐｈａｅｒａ属、Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ属、Ａｃｉｄｏｍｏｎａｓ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｓａｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｅｌｎａｐｉａ属、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｃｒａｕｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｋｏｚａｋｉａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｌｅａｈｉｂａｃｔｅｒ属、Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ属、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｕｒｉｃｏｃｃｕｓ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｎｅｏａｓａｉａ属、Ｏｌｅｏｍｏｎａｓ属、Ｐａｎｔｏｅａ属、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ属、Ｐａｒａｃｒａｕｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｐｒｏｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｒａｈｎｅｌｌａ属、Ｒｈｏｄｏｐｉｌａ属、Ｒｏｓｅｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｒｕｂｒｉｔｅｐｉｄａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｓｔｅｎｏｒｔｏｐｈｏｍｏｎａｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｓｔｅｌｌａ属、Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎｉａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｖｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ属、Ｔｅｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属、Ｚａｖａｒｚｉｎｉａ属等が挙げられる。上記グラム陰性菌としては、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｖｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ属、Ｐｒｏｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属、Ｐａｎｔｏｅａ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｔｅｎｏｒｔｏｐｈｏｍｏｎａｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属等が挙げられる。
なかでも、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属由来、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属由来、Ｐａｎｔｏｅａ属由来、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属由来、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属由来又はＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属由来のものであることが好ましい。これらは、古来より多くの食品、漢方薬に含まれ、生体への安全性が担保されており、特にＰａｎｔｏｅａ属由来は、現在健康食品として用いられており、より有効であるといえる。これらの菌由来の抽出物又はその改変体をそのまま用いることも可能である。
【００４４】
上記リポポリサッカライドとして、上記グラム陰性菌細胞壁からの抽出物又は精製したリポポリサッカライドを用いる場合には、一般的には生体への安全性を加味する必要があり、これらを解毒化した改変体として用いることもできる。一方、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ等）、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ等）、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ等）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ等）、Ｐａｎｔｏｅａ属（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ等）は、古来より多くの食品、漢方薬に含まれ、生体への安全性が担保されており、これらの菌由来の抽出物又は精製したリポポリサッカライドをそのまま用いることも可能である。
【００４５】
上記リポポリサッカライドの誘導体としては、例えば、その多糖部分を除去した誘導体、具体的には、リピドＡ、モノホスホリルリピッドＡ、３−脱−アシル化モノホスホリルリピッドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）、グルコピラノシルリピッド（Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ  ｌｉｐｉｄ、ＧＬＡ）、アルキルグルコサミニドフォスフェート（ＡＧＰ）等が挙げられる。
上記リポポリサッカライドの多糖部分を除去したリピドＡとしては、上記グラム陰性菌由来の単離物、あるいはこれらグラム陰性菌由来の単離物と同じ構造になるように合成した物を用いてもよい。
また、上記リピドＡの改変体としては、脱リン酸化を行ったモノホスホリルリピッド又はその塩も好適に用いられる。なお、本明細書にいうモノホスホリルリピッドの誘導体は、モノホスホリルリピッドの性質を有する限り本発明に用いられることができる。特に既に医療用途で免疫誘導促進剤として実績がある３−脱−アシル化モノホスホリルリピッドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）、又は、米国特許出願公開第２０１０／０３１０６０２号明細書で提案されている脱アシル化されていない、グルコピラノシルリピッド（Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ  ｌｉｐｉｄ）が生体への安全性の観点から好ましい。
また、上記モノホスホリルリピッドとしては、安全性及び使用前例のあるサルモネラ菌由来のものも好適に用いられる。
上記アルキルグルコサミニドフォスフェート（ＡＧＰ）としては、国際公開第９８５０３９９号若しくは米国特許第６３０３３４７号明細書（ＡＧＰを調製するための方法もまた開示される）に開示されるもの、及び、ＡＧＰの塩は、米国特許第６７６４８４０号明細書に開示されるような製薬上許容され得るものも好適に用いられる。
上記環状ジヌクレオチドとしては、環状ジプリンヌクレオチドが好ましく、その特性を有する限りその塩若しくは誘導体であってよい。環状ジプリンヌクレオチドとしては、例えば、安全性の面から、環状ジグアノシンモノフォスフェートであるｃ−ｄｉ−ＧＭＰ、環状ジアデノシンモノフォスフェートであるｃ−ｄｉ−ＡＭＰが好ましく用いられる。
【００４６】
上記薬物層における免疫誘導促進剤の量としては、例えば、１個体に１回投与のために、上記薬物層全量に対して、０．０１μｇ〜１００ｍｇの範囲で含有されていることが好ましい。０．０１μｇ未満であると、充分な感染症の予防又は治療剤としての機能が得られないことがあり、１００ｍｇを超えると、安全性に関して問題となることがある。上記免疫誘導促進剤含有量のより好ましい下限は０．０３μｇ、より好ましい上限は５０ｍｇである。
【００４７】
上記薬物カバー層は、薬物層の側部及び上部を被覆し、薬物層に積層されていることが好ましい。さらに、上記薬物カバー層は、薬物層の外周部より外側に外周縁を有することが好ましい。このような構成とすることで、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤が口腔内に適用された際に、口腔内粘膜への密着性が高まり、より確実に口腔内に保持されるためである。また、このような構成とすることで、必要量以上の口腔内の唾液が薬物層に接触することをより確実に防ぎ、上記薬物層が溶解した際の薬物溶液の濃度を高濃度に維持できるためである。
なお、上記薬物カバー層の上記外周縁の幅は、１ｍｍ以上であることが好ましく、２ｍｍ以上であることがより好ましい。また、薬物カバー層の上記外周縁の幅は、５ｍｍ以下であることが好ましく４ｍｍ以下であることがより好ましい。
【００４８】
なお、上記薬物カバー層は、薬物層に含まれるワクチン抗原を含まないものである。そのため、本願発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、速溶性薬物層と持続性薬物層とを含むような薬物層が二層以上の構成を有する粘膜貼付製剤とは異なるものである。
【００４９】
上記薬物カバー層は、水溶性高分子としてヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、カルボキシメチルエチルセルロース（ＣＭＥＣ）及びエチルセルロース（ＥＣ）からなる群より選択される少なくとも１種を含むことが好ましい。
このような水溶性高分子を含む薬物カバー層は、３７℃の蒸留水に対する溶解度を調整しやすく、面積２０ｃｍ２厚み５０μｍの前記薬物カバー層の試験片を３７℃の蒸留水５００ｍＬに浸漬させ、浸漬開始から７分後の残存率（Ｃ）を、５０％以上９０％以下に調整しやすい為である。
特に、上記薬物カバー層は、ＨＰＭＣＰ及びＨＰＭＣの組合せ、ＨＰＭＣ及びＣＭＥＣの組合せ、ＥＣ及びＨＰＭＣの組合せ、又は、ＣＭＥＣを単独で含むことがより好ましく、なかでも、ＨＰＭＣＰ及びＨＰＭＣの組合せ、又は、ＨＰＭＣ及びＣＭＥＣの組み合わせ含むことが更に好ましい。
【００５０】
上記カバー層におけるヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）の配合量は、６０：４０〜８７：１３であることが好ましい。
また、上記薬物カバー層におけるヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）及びカルボキシメチルエチルセルロース（ＣＭＥＣ）の配合量は、５０：５０〜０：１００であることが好ましい。
また、上記薬物カバー層におけるエチルセルロース（ＥＣ）及びＨＰＭＣの配合量は、４０：６０〜５０：５０であることが好ましい。  
【００５１】
上記薬物カバー層は、粘膜付着層を介して薬物層と積層されていることが好ましい。
図１は、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤の一形態を示す断面図であり、薬物層１、粘膜付着層２及び薬物カバー層３を有する。
上記粘膜付着層は、水溶性高分子であることが好ましい。本発明のワクチン製剤投与後の観察時間内に、ワクチン製剤が完全崩壊できるためである。
上記粘膜付着層に用いられる水溶性高分子としてヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒプロメロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、カルメロース、カルメロースナトリウム等のセルロース類、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルピロリドン及びポリビニルアルコール等のポリマー、アルギン酸ナトリウム、プルラン、グアーガム、グルコノ−δ−ラクトン、ペクチン、デキストリン、タマリンドガム及びキサンタンガム等の多糖類、アラビアゴム末、及び、トラガント末からなる群より選択される少なくとも１種を含むことが好ましい。粘膜に対する付着性及び水溶性を有するためである。
なお、上記粘膜付着層は、上記薬物カバー層と同様に、薬物層の外周部より外側に外周縁を有することが好ましい。このような構成とすることで、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤が口腔内に適用された際に、口腔内粘膜への密着性がより高まり、口腔内の保持をより確実にすることができる。上記粘膜付着層の上記外周縁の幅は、１ｍｍ以上であることが好ましく、２ｍｍ以上であることがより好ましい。また、上記粘膜付着層の上記外周縁の幅は、５ｍｍ以下であることが好ましく、４ｍｍ以下であることがより好ましい。
【００５２】
本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤における薬物層は、乾燥製剤の形態であることが好ましい。
なお、本明細書において、乾燥製剤とは、含水率が１５質量部以下であることを意味する。上記乾燥製剤のうち、含水率が１０質量部以下であるものを、特に、低含水率乾燥製剤という。
なお、ここにいう「含水率」は、第十六改正日本薬局方、一般試験法、乾燥減量試験法（以下、単に乾燥減量法ともいう）に従い求める。すなわち、乾燥製剤の形態である本発明における薬物層の試験片を１０５℃、３時間の条件で加熱したときの質量の減少割合により上記含水率を求める。
【００５３】
本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤において、使用する容器は特に限定されないが、密封可能なものが好ましく、例えば、アルミ包材、ブリスター容器や凍結乾燥用バイアルなどが挙げられる。
【００５４】
なお、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、ヒト又は動物（哺乳類、鳥類等）の口腔内粘膜へ投与されるものであり、舌上、舌下、頬側粘膜、咽頭粘膜及び歯肉粘膜への投与が挙げられる。本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤に含まれる薬物の種類により、投与部位を選択することができる。例えば、強い免疫誘導を目的とする場合は、舌下投与とすることが好ましい。
なお、口腔粘膜は、一般的には、免疫が起こりにくく、これら免疫寛容を引き起こすことができても、免疫を活性化することは難しいと考えられていたが、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、口腔内粘膜上に少なくとも一種類の抗原を含む薬物溶液を高濃度で保持することが可能であるため、口腔粘膜への投与であっても、効果的に全身性免疫応答及び粘膜免疫応答を誘導することができる。
【００５５】
なお、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、口腔内粘膜の投与部位に応じて適切な形状とすることができるが、例えば、図２に記載のように、直径φ又は一辺ｘが１０〜１５ｍｍの略円形又は略正方形とすることができる。
【発明の効果】
【００５６】
本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、優れたコンプライアンス、例えば、非侵襲的投与、無痛、注射の恐怖からの解放、投与が簡便なため患者が自ら投与可能であり、医療従事者の針刺し感染事故のリスクも回避でき、繰返し投与を行う場合の通院頻度の低減が可能となり患者の生活の質の向上に貢献でき、注射針のような特殊廃棄の必要な医療廃棄物が生じないという利点を有する。
また、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、粘膜上の唾液により薬物層が溶解し、高濃度の薬物溶液が一定時間口腔内に保持されるため、口腔内粘膜経路で効果的にワクチン抗原を投与することができ、ワクチン抗原量に対する薬理効果が予測されやすく、目的に応じてワクチン抗原の種類や量を適宜調節することができる。
さらに、薬物層にワクチン抗原を含む口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、注射投与と比較して強い免疫を誘導可能であるという利点も有する。
さらに、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、所定時間内で完全溶解するように制御可能であるため、投与後の時間管理が容易であり、特にアナフィラキシーショックの誘発要因となり得る薬剤の投与に対して好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤の一態様を示す断面概略図である。
【図２】本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤の一態様を示す下面概略図である。
【図３】実施例１〜２及び比較例１〜３に係る口腔内付着型ワクチン製剤の抗原特異的ＩｇＧ抗体誘導の効果を示すグラフである。
【図４】実験例１２〜１５及び比較実験例１４、１５に係る薬物層の抗原特異的ＩｇＡ抗体誘導の効果を示すグラフである。
【図５】実験例１２〜１５及び比較実験例１４、１５に係る薬物層の抗原特異的ＩｇＧ抗体誘導の効果を示すグラフである。
【図６】実験例１６〜１８及び比較実験例１６、１７に係る薬物層の抗原特異的ＩｇＡ抗体誘導の効果を示すグラフである。
【図７】実験例１６〜１８及び比較実験例１６、１７に係る薬物層の抗原特異的ＩｇＧ抗体誘導の効果を示すグラフである。
【図８】実験例１９〜２１及び比較実験例１８、１９に係る薬物層の抗原特異的ＩｇＡ抗体誘導の効果を示すグラフである。
【図９】実験例１９〜２１及び比較実験例１８、１９に係る薬物層の抗原特異的ＩｇＧ抗体誘導の効果を示すグラフである。
【図１０】実験例２２〜２４及び比較実験例２０、２１に係る薬物層の抗原特異的ＩｇＡ抗体誘導の効果を示すグラフである。
【図１１】実験例２２〜２４及び比較実験例２０、２１に係る薬物層の抗原特異的ＩｇＧ抗体誘導の効果を示すグラフである。
【図１２】実験例２５〜３２に係る薬物層の抗原特異的ＩｇＡ抗体誘導の効果を示すグラフである。
【図１３】実験例２５〜３２に係る薬物層の抗原特異的ＩｇＧ抗体誘導の効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
以下の実施例及び実験例により、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例及び実験例に限定されるものではない。
【００５９】
（実験例１〜４、比較実験例１〜３）
下記表１の組成を有する薬物層を調製した。具体的には、下記表１に示した配合量の高分子成分及び蒸留水を容器に加え、適宜攪拌して溶解させた。次に、得られた溶液に、ワクチン抗原として１．０ｍｇ／ｍＬ＿ＯＶＡ溶液（ＯＶＡ：卵白アルブミン蛋白、シグマアルドリッチ製）を５０重量部加え、攪拌して充分に混合した。さらに、得られた溶液に１．０ｍｇ／ｍＬアジュバント溶液（ＮＤ００２、Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ由来リポポリサッカライド、日東電工社製）を５重量部加え、充分に混合し、ワクチン含有製剤溶液を得た。
得られたワクチン含有製剤溶液をアルミ包材に１．０ｇずつ分注し、凍結乾燥させ、薬物層を得た。なお、得られた薬物層の含水率は５質量部以下であった。
【００６０】
表１に記載の高分子は下記の通りである。
ヒドロキシプロピルセルロース／ＨＰＣ−Ｌ：日本曹達社製
ヒドロキシプロピルメチルセルロース／ＨＰＭＣ（５Ｒ）：信越化学工業社製
デキストラン／（質量平均分子量７００００）：名糖産業社製
ＬＭペクチン／（ＬＭ−１０２ＡＳ−Ｊ）：ＣＰ  Ｋｅｌｃｏ社製
アルギン酸ナトリウム／（ＩＬ−２）：キミカ社製
【００６１】
（薬物層の崩壊性の測定）
バイアルに蒸留水１ｍＬを入れて、３７℃の恒温器の中で温める。本バイアル中の蒸留水をスターラーで攪拌（３００ｒｐｍ）しているところに、得られた薬物層を入れ、３０秒後に、フィルター（０．２２μｍ）をかけて、未溶解成分を除去し、溶液を回収した。
溶液中の薬物濃度（ｍｇ／ｍＬ）をＨＰＬＣで定量した。
上記薬物濃度が、薬物層に含まれる薬物量が蒸留水１ｍＬに全て溶解した時の濃度に対して８０％以上の場合、薬物層が速崩壊性を有すると判断した。
評価結果を下記表１に示す。
【００６２】
【表１】
2020158494.tif 000002
【００６３】
（実験例５〜１１、比較実験例４〜１３）
下記表２の組成を有する薬物カバー層を調製した。具体的には、下記表２に示した配合量のポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００、三洋化成工業製）、蒸留水、エタノールをガラス瓶に添加し、充分に混合した。次に、得られた溶液に、下記表２に示した配合量の基剤を添加し、充分に混合し、薬物カバー層用組成物を得た。得られた薬物カバー層用組成物を厚さ７５μｍのポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）の片面に、乾燥後の厚さが５０μｍとなるように塗布し、３０分間乾燥して薬物カバー層を作製した。
【００６４】
（用いた基剤）
ヒドロキシプロピルメチルセルロース／ＨＰＭＣ（５Ｒ）、（５Ｅ）：信越化学工業社製
カルボキシメチルエチルセルロース／ＣＭＥＣ：フロイント産業社製
エチルセルロースＥＣ（７Ｐ）、（１０Ｐ）：日新化成社製
ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート／ＨＰＭＣＰ（ＨＰ−５５）：信越化学工業社製
【００６５】
（薬物カバー層の崩壊性の測定）
溶出試験器（アジレント・テクノロジー社製）のベッセルに蒸留水５００ｍＬを入れて、３７℃に温めた。次に、時計皿（６ｃｍφ）の重量を測定した後、得られた薬物カバー層を、面積２０ｃｍ２、厚み５０ｕｍに切り取り、時計皿に両面テープで固定した。
５０ｒｐｍの速度でパドルを回転させている中に、時計皿に固定した薬物カバー層を入れ、７分後に取り出した。
取り出した薬物カバー層を１００℃で１時間乾燥させた後、重量を測定し、試験前の薬物カバー層の重量に対する割合を算出し、その値を該薬物カバー層の残存率とした。残存率を下記表２に示す。
【００６６】
（粘膜付着層の調製方法）
ガラス瓶にポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００、三洋化成工業製）１重量部と、エタノール９０重量部とを添加して充分に混合した。次に、得られた溶液に、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ−Ｍ、信越化学工業社製）４．５重量部と、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ＿Ｋ−９０Ｆ、信越化学工業社製）４．５重量部とを添加し、充分に混合し、粘膜付着層用組成物Ａを得た。
別のガラス瓶にポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００、三洋化成工業製）６重量部と、エタノール８０重量部とを添加して充分に混合した。次に、得られた溶液に、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ−Ｌ、日本曹達社製）７重量部と、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ＿Ｋ−９０Ｆ、ＢＡＳＦジャパン社製）７重量部とを添加し、充分に混合し、粘膜付着層用組成物Ｂを得た。
粘膜付着層組成物Ａを厚さ７５μｍのポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルムの片面に、乾燥後の厚さが２０μｍとなるように塗布し、３０分間乾燥して粘膜付着層Ａを複数枚得た。
次に、粘膜付着層用組成物Ｂを厚さ７５μｍのポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルムの片面に、乾燥後の厚さが５０μｍとなるように塗布し、３０分間乾燥して粘膜付着層Ｂを複数枚得た。
粘膜付着層Ａ、粘膜付着層Ｂ、粘膜付着層Ａ、粘膜付着層Ｂ及び粘膜付着層Ａの順に積層して、粘膜付着層を得た。
【００６７】
（粘膜付着薬物カバー層の調製方法）
得られた薬物カバー層と粘膜付着層とを積層して、粘膜付着層を有する薬物カバー層を得た。
次に得られた粘膜付着層を有する薬物カバー層を１ｃｍ２に打ち抜き、粘膜付着薬物カバー層を得た。
更に、以下に示す方法でパネリストに対し、得られた粘膜付着薬物カバー層の崩壊性試験を実施した。
【００６８】
（ヒトに対する粘膜付着薬物カバー層の崩壊性試験）
得られた粘膜付着薬物カバー層をパネリストの舌下に投与し、投与後２分及び３０分時点での粘膜付着薬物カバー層の崩壊性を目視により確認した。
また、残存面積が５０％未満であれば崩壊と判断した。結果を下記表２に示す。
【００６９】
【表２】
2020158494.tif 000003
【００７０】
以上より、表１の実験例１〜４に係る薬物層は、速崩壊性を示した。
一方、表２の実験例５〜１１及び比較実験例４〜１３では、いずれも面積２０ｃｍ２厚み５０μｍの薬物カバー層を３７℃の蒸留水５００ｍＬに浸漬させ浸漬開始から７分後の残存率が０％となっていないことから、速崩壊性は有していないことが確認された。従って、上記実験例１〜４に係る薬物層、及び、上記実験例５〜１１及び比較実験例４〜１３に係る薬物カバー層を用いた口腔内付着型ワクチン製剤は、３７℃の蒸留水に対する、薬物層の崩壊性（Ａ）＞薬物カバー層の崩壊性（Ｂ）の関係を満たす。
また、実験例５〜１１の薬物カバー層を有する粘膜付着薬物カバー層は、パネリストの舌下に投与された後、２分後において形状保持されているが、３０分後において粘膜付着薬物カバー層が崩壊していた。従って、実験例５〜１１の薬物カバー層は、一定時間は崩壊しないが一定時間経過後であって特定の時間内（３０分）に崩壊する薬物カバー層であることが確認された。
【００７１】
（実施例１及び２、比較例１〜３）
下記表３の組成を有する口腔内粘膜付着型ワクチン製剤を調製した。具体的には、下記の通り薬物層、粘膜付着層及び薬物カバー層を調製し、口腔内粘膜付着型ワクチン製剤を調製した。なお、実施例及び比較例に係る口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、被験動物（ウサギ）へ投与しやすいサイズを選定している。そのため、上述の試験例に記載のサイズと異なる場合がある。
【００７２】
（薬物層の調製方法）
下記表３に示した配合量の高分子成分及び蒸留水を容器に加え、適宜攪拌して溶解させた。次に、得られた溶液に、ワクチン抗原として１．０ｍｇ／ｍＬ＿ＯＶＡ溶液５０重量部と、１．０ｍｇ／ｍＬアジュバント溶液（ＮＤ００２、日東電工社製）５重量部と加え、充分に混合し、ワクチン含有製材溶液を得た。
得られたワクチン含有製剤溶液を容器（２ｍｍφ）に約２μＬ（２ｍｇ）ずつ分注し、凍結乾燥させ、薬物層を得た。なお、得られた薬物層の直径は１．５ｍｍφであり、含水率は薬物層全質量の１０％以下であった。また、得られた薬物層には、ワクチン抗原が１．０μｇアジュバントが０．１μｇ含まれていた。
【００７３】
（粘膜付着層の調製方法）
ガラス瓶にポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００、三洋化成工業製）１重量部と、エタノール９０重量部とを添加して充分に混合した。次に、得られた溶液に、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ−Ｍ、信越化学工業社製）４．５重量部と、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ＿Ｋ−９０Ｆ、信越化学工業社製）４．５重量部とを添加し、充分に混合し、粘膜付着層用組成物Ａを得た。
別のガラス瓶にポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００、三洋化成工業製）６重量部と、エタノール８０重量部とを添加して充分に混合した。次に、得られた溶液に、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ−Ｌ、日本曹達社製）７重量部と、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ＿Ｋ−９０Ｆ、ＢＡＳＦジャパン社製）７重量部とを添加し、充分に混合し、粘膜付着層用組成物Ｂを得た。
粘膜付着層組成物Ａを厚さ７５μｍのポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルムの片面に、乾燥後の厚さが２０μｍとなるように塗布し、３０分間乾燥して粘膜付着層Ａを複数枚得た。
次に、粘膜付着層用組成物Ｂを厚さ７５μｍのポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルムの片面に、乾燥後の厚さが５０μｍとなるように塗布し、３０分間乾燥して粘膜付着層Ｂを複数枚得た。
粘膜付着層Ａ、粘膜付着層Ｂ、粘膜付着層Ａ、粘膜付着層Ｂ及び粘膜付着層Ａの順に積層して、粘膜付着層を得た。
【００７４】
（薬物カバー層の調製方法）
ガラス瓶に、下記表３に示した配合量のポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００、三洋化成工業製）、蒸留水、エタノールを添加し、充分に混合した。次に、得られた溶液に、下記表３に示した配合量の基剤を添加し、充分に混合し、薬物カバー層用組成物を得た。得られた薬物カバー層用組成物を厚さ７５μｍのポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）の片面に、乾燥後の厚さが２０μｍとなるように塗布し、３０分間乾燥して薬物カバー層を作製した。
【００７５】
【表３】
2020158494.tif 000004
【００７６】
（ワクチン製剤の調製方法）
得られた薬物カバー層と粘膜付着層とを積層して、粘膜付着層を有する薬物カバー層を得た。
次に得られた粘膜付着層を有する薬物カバー層を直径３ｍｍφに打ち抜き、粘膜付着層を介して薬物カバー層と、得られた薬物層とを付着させて実施例及び比較例に係る口腔内粘膜付着型ワクチン製剤を得た。
更に、以下に示す方法で免疫評価用モデル動物に対し、得られた実施例及び比較例に係る口腔内粘膜付着型ワクチン製剤の崩壊性試験及び免疫誘導試験を実施した。
結果を、表４に示す。
【００７７】
（ウサギに対する口腔内粘膜付着型ワクチン製剤の崩壊性試験）
得られた口腔内付着型ワクチン製剤をウサギの舌下に投与し、投与後２分及び３０分時点での薬物層及び薬物カバー層の崩壊性を目視により確認した。
また、残存面積が５０％未満であれば崩壊と判断した。
崩壊性の結果は下記表４に示す。
【００７８】
（マウスに対する口腔内粘膜付着型ワクチン製剤の粘膜免疫評価）
マウス（Ｃ５７／ＢＬ６  ＮＣｒ  メス７週齢）の舌下に蒸留水２μＬを入れた後、得られた口腔内付着型ワクチン製剤（薬物層：直径１．５ｍｍφ、薬物カバー層  ３ｍｍφ）を貼付した。その上から、マウス唾液２０μＬを添加した。投与１週間後、同様にしてマウスの舌下に口腔内付着型ワクチン製剤を投与した。
２度目の投与から更に１週間後に、マウスの血清を採取し、血清中の抗原特異的ＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定した。
測定結果は下記表４及び図３に示す。
【００７９】
（マウス血清中抗原特異的ＩｇＧ力価測定方法（ＥＬＩＳＡ法））
ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに炭酸緩衝液にて希釈したＯＶＡ含有溶液（１００μｇ／ｍＬ）を１００μＬずつ別々のプレートに添加し、一晩放置する。
予め準備した洗浄液（Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で３回ウェルを洗浄し、ブロッキング剤（Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ、大日本住友製薬社製）を精製水で４ｇ／１００ｍＬに希釈したブロッキング溶液を２００μＬずつ添加し、２時間室温で放置した。その後、洗浄液で３回ウェルを洗浄した。
予めマウスから採取した血清を４℃、３０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収した。ブロッキング剤をリン酸緩衝液（ナカライテスク社製）で０．４ｇ／１００ｍＬに希釈した溶液を用いて、前述の上清もしくは鼻腔洗浄液を２倍ずつ段階希釈し、その溶液をそれぞれ５０μＬずつ添加し、２時間室温で放置した。
その後、洗浄液で３回ウェルを洗浄し、ブロッキング剤をリン酸緩衝液（ナカライテスク社製）で０．４ｇ／１００ｍＬに希釈した溶液でＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｇｏａｔ−ａｎｔｉ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ｆｃ  ＨＲＰ、ＢＥＴＨＹＬ社製）を１００００倍に希釈し、１００μＬずつ添加し、１時間室温で放置した。
その後、洗浄液で３回ウェルを洗浄し、ＴＭＢ溶液（ＥＬＩＳＡ  ＰＯＤ  ＴＭＢキット、ナカライテスク社製）を１００μＬずつ添加し、暗所にて３０分放置した。
その後、１Ｍ硫酸用液を１００μＬずつ添加し、当該９６ウェルプレートをマイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２ｅ、モレキュラーデバイス社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。段階希釈時の吸光度を基に、マウス血清中のＩｇＧ抗体力価をＬｏｇ２で求めた。
【００８０】
【表４】
2020158494.tif 000005
【００８１】
上記表４の結果から、薬物層として、上述の実験例１で調製した薬物層を用い、薬物カバー層として、上述の実験例６で調製した薬物カバー層（残存率（Ｃ）が５１％）を用いた実施例１に係る口腔内付着型ワクチン製剤は、ウサギの舌下に製剤が投与された後、２分後に目視で観察すると薬物層は崩壊していたが、薬物カバー層は形状が保持されていた。また、３０分後の製剤形状を確認すると、薬物カバー層が崩壊しウサギの口腔内から製剤がなくなっていた。また、実施例１によると、高濃度の薬液が一定時間保持されたため、マウスに対して充分な免疫誘導効果が確認された。
また、薬物層として、上述の実験例１で調製した薬物層を用い、薬物カバー層として、上述の実験例１０で調製した薬物カバー層（残存率（Ｃ）が６４％）を用いた実施例２に係る口腔内付着型ワクチン製剤は、ウサギの舌下に製剤が投与された後、２分後に目視で観察すると薬物層は崩壊していたが、薬物カバー層は形状が保持されていた。また、３０分後の製剤形状を確認すると、薬物カバー層が崩壊しウサギの口腔内から製剤がなくなっていた。また、実施例２によると、高濃度の薬液が一定時間保持されたため、マウスに対して充分な免疫誘導効果が確認された。
【００８２】
上記表４の結果から、薬物層として、上述の実験例１で調製した薬物層を用い、薬物カバー層として、上述の比較実験例７で調製した薬物カバー層（残存率（Ｃ）が３８％）を用いた比較例１に係る口腔内付着型ワクチン製剤は、ウサギの舌下に製剤が投与された後、２分後に目視で観察すると薬物層は崩壊していたが、薬物カバー層も崩壊していた。比較例１によると、高濃度の薬液が一定時間保持されなかったため、マウスに対する充分な免疫誘導効果が得られなかった。
また、薬物層として上述の実験例１で調製した薬物層を用い、薬物カバー層を有さない比較例３に係る口腔内付着型ワクチン製剤は、ウサギの舌下に製剤が投与された後、２分後に薬物層が崩壊していた。比較例３によると、高濃度の薬液が一定時間保持されなかったため、マウスに対する充分な免疫誘導効果が得られなかった。
一方、薬物層として、上述の実験例１で調製した薬物層を用い、薬物カバー層として、上述の比較実験例５で調製した薬物カバー層（残存率（Ｃ）が９５％）を用いた比較例２に係る口腔内付着型ワクチン製剤は、ウサギの舌下に製剤が投与された後、２分後に目視で観察すると薬物層は崩壊していたが、薬物カバー層は形状が保持されていた。また、３０分後の製剤形状を確認すると、薬物カバー層が形状を保っており、ウサギの口腔内に製剤が残存していた。比較例２によると、高濃度の薬液が一定時間保持されたため、マウスに対して充分な免疫誘導効果が確認されたが、ワクチン製剤投与後３０分の時点で薬物層の形状が保持されており、所望の時間において崩壊するワクチン製剤を得ることができなかった。
【００８３】
以上より、ワクチン製剤における薬物カバー層の厚みが１５μｍ以上あり、薬物層の崩壊性（Ａ）と薬物カバー層の崩壊性（Ｂ）とが、（Ａ）＞（Ｂ）の関係を有し、薬物カバー層の残存率（Ｃ）が、５０％以上９０％以下である実施例１及び２にかかる口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、該製剤における薬物カバー層が一定時間崩壊することなく、高濃度の薬物溶液を一定時間安定して粘膜面に暴露させることができた。これにより、高濃度の薬物溶液が口腔内の唾液に希釈されることなく、投与された薬物量に応じて充分な免疫誘導効果を得ることができた。さらに、所望の時間で薬物カバー層が崩壊し、時間管理の負担が軽減された。
一方、薬物カバー層の残存率（Ｃ）が、５０％未満である比較例１にかかる口腔内付着型ワクチン製剤は、口腔内に投与された後２分後に、薬物カバー層が崩壊し、高濃度の薬物溶液が口腔内に一定時間保持されなかった。そのため、マウスに対する充分な免疫誘導効果を得ることができなかった。薬物カバー層を有さない比較例３に係る粘膜付着型ワクチン製剤についても、同様にマウスに対する十分な免疫誘導効果は得られなかった。
また、薬物カバー層の残存率（Ｃ）が、９０％を超える比較例２にかかる口腔内付着型ワクチン製剤は、口腔内投与後、所望の時間が経過しても口腔内に残存していた。すなわち、時間管理の負担を軽減できる製剤とはならなかった。
【００８４】
（実験例１２）
表５に示す成分濃度及び配合で医薬組成物を調製した。すなわち、４０質量部の精製水に、賦形剤としてＤｅｘｔｒａｎ  ７０（名糖産業社製）を５質量部加え、適宜撹拌して溶解させた。
得られた溶液に１ｍｇ／ｍＬＯＶＡ溶液を５０質量部、１ｍｇ／ｍＬアジュバント（ＮＤ００２）溶液を５質量部加え、充分に混合した。
得られた抗原含有製剤溶液をアルミ包材に１．０ｇずつ分注し、凍結乾燥させ、医薬組成物を得た。なお、得られた医薬組成物の含水率は１０質量％以下であった。
得られた医薬組成物の質量を測定後、精製水１．０ｍＬに溶解させ、粘度測定装置（ＲｈｅｏＳｔｒｅｓｓ  ６００、ＴＨｅｒｏｍｏ  ＨＡＡＫＥ社製）を用いて３７℃における溶液粘度を測定した。
更に、以下に示す方法で免疫評価用モデル動物による免疫誘導試験を実施した。
結果を、図４、５に示した。
【００８５】
（舌下投与によるマウス免疫試験）
上記の通りに製造した医薬組成物を用いて、モデル動物であるマウスによる免疫誘導試験を行った。
まず、医薬組成物を精製水１ｍＬに溶解させ、ワクチン製剤溶液を得た。
次に、予め準備したマウス（ＢＡＬＢ／ｃマウス、メス７週齢）に麻酔処理を行った後、得られたワクチン製剤溶液をマウス舌下に２０μＬ投与した。また陽性比較例（ＰＣ）として、ワクチン製剤溶液と同様のＯＶＡ及びアジュバントＮＤ００２濃度の溶液を用事調製し、同様に投与を行った。
当該投与から１週間後、再度マウスに麻酔をかけ、それぞれ同様に投与した。２度目の投与から更に１週間後に、マウス血清及び鼻腔洗浄液を採取した。血液は４℃下３０００Ｇで１０分間遠心し、上清２０μＬにリン酸緩衝液（ナカライテスク社製）３００μＬを加えて血清サンプルとした。
鼻腔洗浄液は、マウスの気道下部に切れ込みを入れ、２００μＬのリン酸緩衝液（ナカライテスク社製）を流し込み、鼻腔に出てきたサンプルを回収し、鼻腔洗浄液サンプルとした。
マウス血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＧ抗体を測定することにより、全身性免疫応答を評価した。またマウス鼻腔洗浄液中の免疫抗原特異的ＩｇＡ力価を測定することにより、粘膜免疫応答を評価した。
【００８６】
（マウス血清中抗原特異的ＩｇＧ力価測定方法（ＥＬＩＳＡ法））
上述と同様の操作を行い、抗原特異的ＩｇＧ力価を測定した。
【００８７】
（マウス鼻腔洗浄液中抗原特異的ＩｇＡ力価測定方法（ＥＬＩＳＡ法））
基本的には抗原特異的ＩｇＧ力価測定方法と同様であるが、測定サンプルは鼻腔洗浄液であり、またＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体の代わりにＨＲＰ標識抗マウスＩｇＡ抗体（Ｇｏａｔ−ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＡ  α  ＨＲＰ、ＢＥＴＨＹＬ社製）を用いた。
それ以外の操作は全て抗原特異的ＩｇＧ力価測定方法と同様とした。
【００８８】
（実験例１３〜２４）
実験例１２と同様の手順で、下記表５〜８に示した成分濃度及び配合量にて溶液を調製し、凍結乾燥を行い、医薬組成物を得た。なお、賦形剤として、実験例１３〜１５ではＤｅｘｔｒａｎ  ７０（名糖産業社製）（質量平均分子量７００００）、実験例１６〜１８ではＬＭペクチン（ＧＥＮＵ  ＰＥＣＴＩＮ  Ｔｙｐｅ  ＬＭ−１０２ＡＳ−Ｊ、ＣＰ  Ｋｅｌｃｏ社製）、実験例１９〜２１ではＨＭペクチン（ＧＥＮＵ  ＰＥＣＴＩＮ  Ｔｙｐｅ  ＵＳＰ−Ｈ、ＣＰ  Ｋｅｌｃｏ社製）、実験例２２〜２４ではアルギン酸ナトリウム（キミカアルギン  ＩＬ−２、キミカ社製）を使用した。実験例１３〜２４で得られた医薬組成物の質量を測定後、精製水１．０ｍＬに溶解させ、上述した方法で３７℃における溶液粘度を測定した。なお、得られた医薬組成物の含水率は、いずれも１０質量％以下であった。
更に、上述した方法で免疫評価用モデル動物による免疫誘導試験を実施した。
結果を図４〜１１に示した。
【００８９】
（比較実験例１４〜２１）
実験例１２と同様の手順で、表５〜８に示した配合量にて溶液を調製し、凍結乾燥を行い、医薬組成物を得た。得られた医薬組成物の質量を測定後、精製水１．０ｍＬに溶解させ、上述した方法で３７℃における溶液粘度を測定した。なお、得られた医薬組成物の含水率は、いずれも１０質量％以下であった。
更に、上述した方法で免疫評価用モデル動物による免疫誘導試験を実施した。
結果を図４〜１１に示した。
【００９０】
（実験例２５〜３２）
実験例１２と同様の手順で、表９に示した成分濃度及び配合量にて溶液を調製し、アルミ包材に１．０ｇずつ分注し、凍結乾燥させ、医薬組成物を得た。なお、得られた医薬組成物の含水率は、いずれも１０質量％以下であった。
得られた医薬組成物の質量を測定後、精製水１．０ｍＬに溶解させ、上述の粘度測定装置を用いて３７℃時の溶液粘度を測定した。
さらに、上述した方法で免疫評価用モデル動物による免疫誘導試験を実施した。
結果を図１２、１３に示した。
【００９１】
【表５】
2020158494.tif 000006
【００９２】
【表６】
2020158494.tif 000007
【００９３】
【表７】
2020158494.tif 000008
【００９４】
【表８】
2020158494.tif 000009
【００９５】
【表９】
2020158494.tif 000010
【００９６】
表５〜８で示したように、賦形剤の配合量を増加させることにより、医薬組成物の溶液粘度が増大することがわかった。その結果、溶液粘度が２０ｍＰａ・ｓ以下を示す溶液で充分な免疫誘導が得られることがわかった。
表９で示したように、表５〜８において溶液粘度が２０ ｍＰａ・ｓを超える配合組成であっても、製剤の質量を減らすことで１回投与量の溶液粘度が２０ ｍＰａ・ｓ以下に減少し、充分な免疫誘導が得られることがわかった。
つまり、配合溶液や医薬組成物における賦形剤の比率ではなく、製剤のサイズや溶解させて得られた溶液粘度が重要なパラメータであることが示された。
【００９７】
以上の実験例１２〜３２及び比較実験例１４〜２１により、薬物層は、３７℃の蒸留水１．０ｍＬに１回投与分を溶解させたときの溶液粘度（Ｄ）が、２０ｍＰａ・ｓ以下であることが、ワクチン製剤を投与し口腔内粘膜経路で免疫を誘導するためには好適であることが確認された。
【符号の説明】
【００９８】
１  薬物層
２  粘膜付着層
３  薬物カバー層
【図１】
2020158494.tif 000011
【図２】
2020158494.tif 000012
【図３】
2020158494.tif 000013
【図４】
2020158494.tif 000014
【図５】
2020158494.tif 000015
【図６】
2020158494.tif 000016
【図７】
2020158494.tif 000017
【図８】
2020158494.tif 000018
【図９】
2020158494.tif 000019
【図１０】
2020158494.tif 000020
【図１１】
2020158494.tif 000021
【図１２】
2020158494.tif 000022
【図１３】
2020158494.tif 000023