(57)【要約】      （修正有）【課題】再生医療のツールとなる胚性幹細胞（ES細胞）や人工多能性幹細胞（iPS細胞）を、未分化状態を維持しながら効率よく培養でき、安定に供給でき、製造コストがかからない低分子化された幹細胞培養基質の提供。【解決手段】ヒトラミニンー５１１Ｅ８に由来する特定のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を含む、ジストログリカンとの結合活性を有する幹細胞接着性ペプチド、該幹細胞接着性ペプチドの１種又は２種以上を含有する幹細胞培養基質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のいずれかに示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を含む、ジストログリカンとの結合活性を有する幹細胞接着性ペプチド。
【請求項２】
前記幹細胞が、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、又は体性幹細胞である、請求項１に記載の幹細胞接着性ペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の幹細胞接着性ペプチドの１種又は２種以上を含有する幹細胞培養基質。
【請求項４】
請求項３記載の幹細胞培養基質を含む、幹細胞培養用キット。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の幹細胞接着性ペプチドと遺伝子を含む、幹細胞への遺伝子導入用複合体。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の幹細胞接着性ペプチドと細胞傷害性物質を含む、幹細胞への細胞傷害性物質導入用複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジストログリカン（DG）との結合活性を有する幹細胞接着性ペプチド及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ES細胞）や人工多能性幹細胞（iPS細胞）に代表される多能性幹細胞は、体性幹細胞とともに、組織や臓器を生体内外で再構築し、失われた組織や臓器の代わりに移植をする再生医療を実現可能にする有用なツールである。また、多能性幹細胞は、疾患の機構解明や治療方法の選択、薬理試験への応用などの創薬研究における利用も期待されている。1998年のヒトES細胞の樹立以来、ヒトES細胞及びヒトiPS細胞(以下、「hESCs/hiPSCs」と記載する）は、フィーダー細胞との共培養が標準的な培養方法となっている。有糸分裂を不活性化されたマウス胚の線維芽細胞(mouse embryonic fibroblast、MEF、フィーダー細胞)は、hESCs/hiPSCsの生存・増殖・未分化能維持に必要な液性因子を供給するとともに、hESCs/hiPSCsの足場としての役割も担っている。しかしながら、均一なフィーダー細胞を調製するのが困難なことに加えて、フィーダー細胞との共培養系は未同定の成分が持ち込まれることなど、医療応用を目的としたhESCs/hiPSCsの培養では大きな問題となってきた。このようなフィーダー細胞に付随する問題を解決するためには、フィーダー細胞を使用しない培養方法の開発が不可欠になっている。浮遊系細胞及び癌化した細胞を除き、接着性の細胞は足場となる培養基質が必須になっており、細胞増殖の足場依存性と呼ばれる基本的な特性のひとつとなっている。接着性のhESCs/hiPSCsに対しても、増殖のために足場が求められるだけでなく、その特徴である未分化能を維持するのに必須である。
【０００３】
これまでに、様々な培養基質がhESCs/hiPSCsの培養に使用されてきた。培養基質には大きく天然由来の基質と合成由来の基質に大別される。天然由来の基質は生体内で細胞が足場としている細胞外マトリックスであり、ラミニンは、Matrigel、ビトロネクチンとともにその代表例である。ラミニンは、α鎖，β鎖，γ鎖の3つのサブユニットから構成される十字架構造をしたヘテロ三量体の糖タンパク質であり、α鎖で5種類、β鎖で3 種類、γ鎖で3 種類がそれぞれ同定されており、これらの異なる組み合わせから19 種類のラミニンアイソフォームが様々な細胞や組織に局在している。これらのアイソフォームは、細胞接着、増殖、移動及び分化といった様々な生物学的プロセスに関与することが報告されている。これまでに、ラミニン-111(α1β1γ1)、ラミニン-332(α3β3γ2)、ラミニン-511(α5β1γ1)の組換えタンパク質が、hESCsの未分化状態を維持し増殖させることが示された(非特許文献１）。このうち、ラミニン-511は、フィーダー細胞なしでの培養を可能にし、血清及び異種動物由来成分非存在下でhESCs/hiPSCsの未分化状態を維持することが報告されている(非特許文献２）。組換えタンパク質の作製では、哺乳動物細胞の発現系が用いられているが、全長のラミニンはα鎖、β鎖及びγ鎖から成る400-800kDaの巨大なヘテロ三量体タンパク質であることから、これらの組換えタンパク質の大量生産は非常に困難であった。これに対し、近年、ラミニン-511の断片であるラミニン-E8断片(LM511-E8)は、hESCs/hiPSCsに対して強い接着性を示し、未分化性を維持して増殖させることが明らかになった(非特許文献３）。LM511-E8の分子量は、完全長タンパク質のものよりも小さい分子であり従来よりも高い収率を有していることから、hESCs/hiPSCsの培養基質として利用されており、LM511-E8の開発は技術的に大きなブレークスルーとなった。しかしながら、LM511-E8は分子量150 kDaで未だヘテロ三量体であることから、さらなる低分子化が求められている。
【０００４】
一方、ラミニン-511の非インテグリン受容体のひとつであるジストログリカン(DG)は、生体における基底膜との細胞接着をユニークな糖鎖により担っている。DGは、豊富な糖鎖を持つα-ジストログリカン(α-DG)と一回膜貫通タンパク質であるβ-ジストログリカン(β-DG)の2つのサブユニットよりなっており、ラミニンとの結合にはα-DGのO型糖鎖が関与することが明らかになっている。DGはマウス初期胚に発現し、KOマウスによる解析から初期発生に関与することが知られており、マウスES細胞での発現や基底膜形成における役割が報告されている (非特許文献４、５）。しかしながら、DGのhESCs/hiPSCsの未分化性の維持や分化における役割はこれまで何ら知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Miyazaki et al., Recombinant human laminin isoforms can support the undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Biochem Biophys Commun, 375, 27-32, 2008
【非特許文献２】Rodin et al., Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotechnol, 28, 611-615, 2010
【非特許文献３】Miyazaki et al., Laminin E8 fragments support efficient adhesion and expansion of dissociated human pluripotent stem cells. Nat Commun, 3, 1236, 2012
【非特許文献４】William et al., Dystroglycan is essential for early embryonic development: disruption of Reichert's membrane in Dag1-null mice. Hum Mol Genet, 6, 831-841, 1997
【非特許文献５】Henry and Cambell, A role for dystroglycan in basement membrane assembly. Cell, 95, 859-857, 1998
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、再生医療のツールとなる胚性幹細胞（ES細胞）や人工多能性幹細胞（iPS細胞）を、未分化状態を維持しながら効率よく培養でき、安定に供給でき、製造コストがかからない低分子化された幹細胞培養基質を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべくラミニン-511の受容体のひとつであるジストログリカン(DG)に着目して鋭意研究を重ねた結果、DGがヒトiPS細胞において発現し、その未分化性に関与していること、当該DGは十分に糖鎖付加され、LM511-E8に対して結合活性を有するという新たな知見を得た。そこで、本発明者らは、LM511-E8のアミノ酸配列を網羅するペプチドライブラリーを作製し、その中から、DGとの結合活性を有するペプチド（DG結合ペプチド）を同定することに成功した。さらに、DG結合ペプチドはヒトiPS細胞に対して接着活性を有し、幹細胞の培養基質として利用できること、また、DG結合ペプチドを用いることによりヒトiPS細胞に遺伝子を導入できることを確認した。本発明はかかる知見により完成されたものである。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のいずれかに示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を含む、ジストログリカンとの結合活性を有する幹細胞接着性ペプチド。
（２）前記幹細胞が、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、又は体性幹細胞である、（１）に記載の幹細胞接着性ペプチド。
（３）（１）又は（２）に記載の幹細胞接着性ペプチドの１種又は２種以上を含有する幹細胞培養基質。
（４）（３）に記載の幹細胞培養基質を含む、幹細胞培養用キット。
（５）（１）又は（２）に記載の幹細胞接着性ペプチドと遺伝子を含む、幹細胞への遺伝子導入用複合体。
（６）（１）又は（２）に記載の幹細胞接着性ペプチドと細胞傷害性物質を含む、幹細胞への細胞傷害性物質導入用複合体。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の幹細胞接着性ペプチドは、幹細胞の表面に発現するジストログリカン(DG)との結合活性を有するため、幹細胞との接着性が高く、幹細胞の未分化性を維持しながら増殖させることのできる幹細胞培養基質として有効である。本発明の幹細胞培養基質は、ラミニン-511/-512、ラミニン-511E8といった組み換え体ラミニンより低分子であるため、操作性に優れるという優位性があり、また合成基質であるから、天然基質に比べて安定に供給でき、製造コストがかからない。また、本発明の幹細胞培養基質は、幹細胞の未分化性のメカニズム解明や、大量培養した幹細胞を目的の細胞や組織に分化誘導するための培養での培養基質としても使用できる。さらに、本発明の幹細胞接着性ペプチドは、幹細胞培養の足場を提供するだけでなく、ジストログリカン(DG)に対する結合を利用した幹細胞への遺伝子又は細胞傷害性物質導入にも利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１Ａは、フィーダー細胞及びLM511-E8上で培養したヒトiPS細胞（201B7細胞）のコロニーの免疫染色を示す（a,d:マウス抗DGモノクローナル抗体(VIA4）による染色、g,j:マウス抗DGモノクローナル抗体(IIH6）による染色、b,e,h,k:ウサギ抗Nanogポリクローナル抗体による染色、c,f,i,l:マージ）。図１Ｂは、LM511-E8上で培養した201B7細胞のフローサイトメトリーによる解析結果を示す（左のパネルの実線：マウス抗DGモノクローナル抗体(VIA4、IIH6）による染色、右のパネルの実線：マウス抗SSEA-4モノクローナル抗体及びTRA-1-81モノクローナル抗体(実線)による染色）。
【図２】図２Ａは、ヒトiPS細胞（201B7細胞、454E2細胞）のライセートに対するα-DG抗体(VIA4)とβ-DG抗体(7D11)によるイムノブロット及びマウス・ラミニン-111(MsLM111)によるオーバーレイアッセイの結果を示す。図２Ｂは、中胚葉への誘導条件で培養した分化細胞におけるDG(VIA4、IIH6)、SSEA-4、SSEA-1の発現解析結果、ならびに、201B7細胞のオリジナルとなるヒト皮膚線維芽細胞(HDFs)におけるDGの発現解析結果を示す。
【図３】図３は、DGとヒト組換えラミニン（ラミニン-111(LM111)、ラミニン-511(LM511)、ラミニン-521(LM521)、及びLM511-E8）の結合アッセイの結果を示す。
【図４】図４は、LM511-E8α5鎖の2534-3323位のアミノ酸配列（配列番号６）と、当該アミノ酸配列において網羅的に設計したペプチドを示す（矢印：合成したペプチドの範囲、下線部：LGモジュール）。
【図５】図５Ａは、DGと全合成ペプチドの結合アッセイ結果を示す。図５Ｂは、Fc（コントロール）と合成ペプチド（hE8A5-20、hA5G1、hA5G4、hA5G29、hA5G47）の結合アッセイの結果を示す。
【図６−１】各濃度でELISAプレートに吸着させた合成ペプチド（hE8A5-20、hA5G1、hA5G4、hA5G29、hA5G47）のDG結合活性（Ａ）及び幹細胞接着活性（Ｂ）を示す。
【図６−２】ペプチド-キトサン膜の作製の模式図（Ｃ）、及びペプチド-キトサン膜に対する幹細胞接着アッセイの結果（Ｄ）を示す。
【図７】図７Ａは、ビオチン化DG結合ペプチド(hE8A5-20、A2G80)を示す。図７Ｂは、フローサイトメトリーによるビオチン化DG結合ペプチド(b-hE8A5-20、b-A2G80；実線)のヒトiPS細胞に対する結合評価を示す。
【図８】図８Ａは、ポリアルギニン配列を付加したDG結合ペプチド(A2G80-R9)及びScrambleペプチド（Scramble-R9)を示す。図８Ｂは、GFP発現プラスミド（pEGF)とA2G80-R9の複合体（A2G80-R9ポリプレックス）、GFP発現プラスミド（pEGF)とScramble-R9の複合体（Scramble-R9ポリプレックス）と、それらの複合体によるヒトiPS細胞への遺伝子導入解析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（幹細胞接着性ペプチド）
本発明の幹細胞接着性ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５に示すアミノ酸配列を含み、ジストログリカン(以下、本明細書において「DG」と記載する場合がある)との結合活性を有するペプチドである。本発明の幹細胞接着性ペプチド（以下、本明細書において「DG結合ペプチド」と記載する場合がある）は、幹細胞を接着させ、その未分化性を維持しながら増殖培養させることが可能な幹細胞培養基質となるものである。
【００１２】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５に示すアミノ酸配列は、ヒトラミニン-511 E8のアミノ酸配列（配列番号６）に由来するアミノ酸配列であり、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５に示すアミノ酸配列からなる下記のペプチド（hE8A5-20、hA5G1、hA5G4、hA5G29、hA5G47）は、そのペプチド鎖がそれのみ独立して自然界に安定的に存在するものではなく、人為的な化学合成又は生合成（遺伝子工学的方法による生産）によって製造され、所定の組成物中で安定して存在し得るペプチド断片である。
【００１３】
hE8A5-20：Lys Thr Leu Pro Gln Leu Leu Ala Lys Leu Ser Ile (配列番号１）
hA5G1：Pro Met Lys Phe Asn Gly Arg Ser Gly Val Gln Leu (配列番号２）
hA5G4：Thr Ala Leu Lys Phe Tyr Leu Gln Gly Pro Glu Pro (配列番号３）
hA5G29：Leu Arg Leu Val Ser Tyr Ser Gly Val Leu Phe Phe (配列番号４）
hA5G47：Ala Met Thr Phe His Gly His Gly Phe Leu Arg Leu (配列番号５）
【００１４】
本発明の幹細胞接着性ペプチドは、DGとの結合活性を有する限り、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５に示すアミノ酸配列を含むペプチドの変異ペプチドであってもよい。このような変異ペプチドとしては、たとえば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。ここで、「１〜数個」の範囲は、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１又は２個をいう。アミノ酸の欠失とは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列の中から任意のアミノ酸を選択して欠失させることをいう。また、アミノ酸の付加とは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端側に、１〜数個のアミノを付加させることをいう。アミノ酸の置換としては、例えば保存的アミノ酸置換が挙げられる。また、本発明の幹細胞接着性ペプチドは、DGとの結合活性を維持している限り、他のペプチド又は糖鎖等によって修飾されていてもよい。
【００１５】
上記の保存的アミノ酸置換とは、疎水性アミノ酸、極性アミノ酸、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、分枝状側鎖を有するアミノ酸、芳香族アミノ酸などのように極性、電気的性質、構造的性質などの性質が類似したアミノ酸同士の置換を指す。疎水性（非極性）アミノ酸の例は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリンなど、極性アミノ酸の例は、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンなど、酸性アミノ酸の例は、アスパラギン酸とグルタミン酸、塩基性アミノ酸の例は、リジン、アルギニン及びヒスチジン、分枝状側鎖を有するアミノ酸の例は、バリン、イソロイシン及びロイシン、芳香族アミノ酸の例は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン及びヒスチジンである。
【００１６】
本発明の幹細胞接着性ペプチドは、そのアミノ酸配列に基づいて、公知のペプチド合成技術を用いて合成することができる。例えば、固相合成法又は液相合成法によって調製されるが、固相合成法が操作上簡便である。ペプチド合成法は、具体的には、アミノ酸保護基の種類によって、例えばBoc(t-ブトキシカルボニル）法、Fmoc（9-フルオレニルメトキシカルボニル）法などを使用することができる。Boc-アミノ酸又はFmoc-アミノ酸を樹脂に結合させたのち、Boc基又はFmoc基の脱保護と洗浄、Boc-アミノ酸又はFmoc-アミノ酸の縮合と洗浄を繰り返す。縮合は、Boc法の場合、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）/塩化メチレン（CH2Cl2）を用いて行なうことができ、また、Fmoc法の場合、N,N’-ジイソプロピルカルボジイミド（DIPCDI)/N-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）/ジメチルホルムアミド(DMF)を用いて行うことができる。このような縮合法は、混合酸無水物法、DCC−添加剤法などと呼ばれているが、その他の縮合法には、活性エステル化法、アジド法などを含む。また、脱保護は、Boc法の場合、50%トリフルオロ酢酸(TFA)/CH2Cl2による処理、Fmoc法の場合、20%ピペリジン/DMFによる処理によって行うことができる。結合するアミノ酸は、側鎖の官能基の種類に応じて、既知の保護基、例えばベンジルオキシ、ベンジル、トシル、2，6-ジクロロベンジル、2-ブロモベンジルオキシカルボニル、Boc、メシチレン-2-スルホニルなどの基で保護することができる。また、欠失、置換、挿入、又は付加は、ペプチド合成機を用いる場合には保護アミノ酸の種類を変えることにより容易に行うことができる。
【００１７】
（幹細胞培養基質）
本発明の幹細胞接着性ペプチドは、DGが発現している幹細胞を培養する際の培養基質として使用することができる。本発明の幹細胞培養基質に使用する幹細胞接着性ペプチドは、上記の幹細胞接着性ペプチドの１種であってもよいが、２種以上であってもよい。
【００１８】
本発明において、「幹細胞培養基質」とは、フィーダー細胞に代えて幹細胞を培養する際に足場となる培養基材（細胞支持用基質）をいう。本発明の幹細胞培養基質上に幹細胞を播種して培養すると、当該幹細胞を、未分化状態を維持した状態で増殖させることができる。ここで、幹細胞としては、DGが発現している哺乳動物の幹細胞であれば特に限定はされない。幹細胞は、多能性幹細胞であっても体性幹細胞であってもよいが、多能性幹細胞が好ましい。本発明において「多能性幹細胞」とは、外胚葉、中胚葉及び内胚葉に由来する生体に存在するすべての細胞に分化する能力（多分化能）を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞をいう。多能性幹細胞としては、人工多能性幹細胞（iPS細胞)、胚性幹細胞(ES細胞)、移植により得られるクローン胚由来の胚性幹細胞(ntES細胞）、多能性生殖幹細胞（mGS細胞）、精子幹細胞（GS細胞）、成人型多能性幹細胞（MAPC細胞）、ミューズ細胞（MUSE細胞）などが挙げられるが、iPS細胞、ES細胞が好ましい。体性幹細胞としては、神経幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、心臓幹細胞、肝臓幹細胞、小腸幹細胞などが挙げられる。幹細胞の由来となる哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシなどが挙げられるが、ヒトが好ましい。
【００１９】
本発明の幹細胞培養基質は、幹細胞の培養を行うに際し、培養容器（支持体、担体）の表面に結合して使用する。培養容器の表面に結合する方法としては、特に制限はなく、例えば物理学的結合を利用した方法と化学的結合を利用した方法又はこれらの併用等、公知の方法が挙げられる。物理的結合は、幹細胞培養基質を培養容器の表面に塗布又はコーティング、あるいは吸着し、これを乾燥することにより行う。例えば、幹細胞培養基質を適当な溶媒（例えば水、PBS、生理食塩水、エタノール等）で希釈した溶液を培養容器に添加し、静置して乾燥させることにより、幹細胞培養基質を培養容器の表面にコーティングさせることができる。一方、化学的結合は、幹細胞培養基質を培養容器表面の結合基を介して共有結合又は非共有結合（例えばイオン結合）させることにより行う。共有結合させる場合は、幹細胞培養基質である幹細胞接着性ペプチドのアミノ末端又はカルボキシル末端にスペーサーを結合し、このスペーサーを介して培養容器表面に結合することができる。スペーサーは、ペプチドの立体障害を小さくすることにより吸着効率を向上させるとともに、非特異的吸着を抑えるために親水性スペーサーが好ましく、例えば、両末端をアミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、エポキシ基等で置換したポリアルキレンオキサイドの誘導体が挙げられる。
【００２０】
本発明の一態様として、幹細胞培養基質を結合させる培養容器の表面は、ペプチドの配向性を制御できる他の細胞培養基材を培養容器の表面に予めコーティングした後に結合させることにより、幹細胞接着性ペプチドの配向性を高めることができる。本発明の幹細胞培養基質と併用することのできる、他の細胞培養基材としては、例えば、キトサン膜、アガロース、ヒアルロン酸、アルギン酸などの多糖類が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
培養容器は、幹細胞の培養が可能なものであれば材質や形状は特に限定されず、当分野で周知のものを使用することができる。材質としては、例えば、天然高分子、合成高分子、金属、セラミック、ガラス等が挙げられ、形状は、材質に応じて、例えば、フィルム、膜、プレート、ゲル、ビーズ等が挙げられる。培養容器の具体例としては、フラスコ、シャーレ、ディッシュ、ペトリディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バッグ、ローラーボトル等が含まれる。
【００２２】
本発明の幹細胞培養基質、幹細胞培養基質を結合（コーティング）した培養容器は、幹細胞の培養に必要な培地や試薬等と共にキット化してもよい。
【００２３】
本発明の幹細胞培養基質の使用量は、特に限定されないが、例えば、約0.01μg/ml以上、好ましくは約0.01〜10μg/ml、より好ましくは約0.01〜2μg/mlの幹細胞接着性ペプチド溶液で培養容器を処理することが挙げられる。約0.01〜10μg/ml、約0.01〜2μg/mlの幹細胞接着性ペプチドは、培養容器の面積あたりの幹細胞接着性ペプチドの量として、約0.0015〜1.5μg/cm2、約0.0015〜約0.3μg/cm2に相当する。
【００２４】
本発明の幹細胞培養基質を用いて幹細胞を培養する方法は、通常の幹細胞の培養の方法及び条件に従って行うことができる。培養に用いる培地は特に限定されず、幹細胞の未分化状態維持及び増殖のために一般的に使用されている培地を用いればよく、市販の培地であっても、自製した培地のいずれであってもよい。例えば、幹細胞の生存及び増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン、脂肪酸）を含む基本培地、具体的には、Dulbecco's Modified Eagle's Medium (D-MEM)培地、Dulbecco's Modified Eagle's Medium:Nutient Mixture F-12(D-MEM/F-12) 培地、Glasgow MEM（G-MEM)培地、Basal Medium Eagle (BME)培地、Minimum Essential Medium(MEM)培地、Eagle's minimal essential medium(EMEM)培地、Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)培地、RPMI 1640培地、Medium 199培地、αMEM培地、ハム培地、Fischer培地、及びこれらの混合培地などが挙げられる。また、培地には、増殖因子（FGF、EGF等）、腫瘍壊死因子（TNF）、インターロイキン類、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コラーゲン、フィブロネクチン、プロゲステロン、セレナイト、B27−サプリメント、N2−サプリメント、抗生物質等を含有してもよい。培地には、血清が添加されてもよいし無添加でもよい。
【００２５】
幹細胞の培養条件は、幹細胞の培養に用いられる通常の条件に従えばよく、特別な制御は必要ではない。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが約30〜40℃、好ましくは36〜37℃である。CO2ガス濃度は、例えば約1〜10％、好ましくは約2〜5％である。なお、培地の交換は2〜3日に１回行うことが好ましく、毎日行うことがより好ましい。前記培養条件は、幹細胞が生存及び増殖可能な範囲で適宜変動させて設定することもできる。
【００２６】
（幹細胞への遺伝子又は細胞傷害性物質導入用複合体）
本発明の別の態様として、上記幹細胞接着性ペプチドは、所望する遺伝子又は細胞傷害性物質を幹細胞内に効率的に導入するためのキャリアペプチドとして利用できる。よって、本発明によれば、上記の幹細胞接着性ペプチドと遺伝子又は細胞傷害性物質を含む、幹細胞への遺伝子導入又は細胞傷害性物質導入用複合体が提供される。
【００２７】
導入する遺伝子としては、特に限定はされず、例えば、DNA修復遺伝子、癌関連遺伝子、分化関連遺伝子、神経関連遺伝子、免疫関連遺伝子、遺伝子の導入効率又は発現安定性等を評価するためのマーカー遺伝子（例えば、GFP、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子）等が挙げられる。幹細胞接着性ペプチドと遺伝子の複合体形成（コンジュケーション）は、当技術分野において公知の任意の方法によって行うことができるが、遺伝子と安定した結合を形成させために幹細胞接着性ペプチドにカチオン性ポリアミノ酸を付加する方法が好ましい。カチオン性ポリアミノ酸としては、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリオルニチン、ポリシトルリン等が挙げられるが、好ましくはポリアルギニンである。また、カチオン性ポリアミノ酸の重合度は特に限定はされないが、３以上が好ましく、５以上がより好ましい。
【００２８】
導入する細胞傷害性物質としては、DGが発現している未分化状態の幹細胞に傷害性を示す物質であれば、特に限定はされないが、例えば、抗がん剤（エムタンシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、オーリスタチン、メイタンシン等）、毒素（ジフテリア毒素、サポリン毒素、緑膿菌毒素、アブリン毒素、リシンＡ毒素、リボゾーム不活性化タンパク質等）、放射性物質（90Y、186Re、212Bi、131I、111In、64Cu等）、細胞傷害性の核酸（RNAi、アンチセンス核酸、リボザイム等）が挙げられる。幹細胞接着性ペプチドと上記の細胞傷害性物質との複合体形成（コンジュケーション）もまた、技術分野において公知の任意の方法によって行うことができる。例えば、細胞傷害性物質が低分子化合物である場合、幹細胞接着性ペプチドと低分子化合物は、それら自身が有する官能基によって直接的に結合させてもよいが、架橋剤を介して間接的に結合させてもよい。架橋剤は、幹細胞接着性ペプチド及び細胞傷害性物質と反応する1種又は2種以上の官能基を有し、それらを結合させて安定な複合体を形成できるものであれば特に限定はされないが、一般的には、両末端に官能基を有する二官能性架橋剤が用いられる。二官能性架橋剤は、両末端に同一の官能基を有するホモ二官能性架橋剤、両末端に異なる官能基を有するヘテロ二官能性架橋剤のいずれであってもよい。官能基としては、幹細胞接着性ペプチドのアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基を標的とし、これらの基と結合できるN-スクシンイミジルエステル(NHSエステル)基、マレイミド基、アルデヒド基、チオール基、スルフドリル基、カルボジイミド基、メルカプト基、ピリジニル基等が挙げられる。具体的な架橋剤としては、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシサクシンイミドエステル（MBS）、グルタルアルデヒド（GA）、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDAC）、ジチオビス(スクシンイミジルプロピオナート)(DSP)、N,N'-ジクロロヘキシルカルボジイミド（DCC)等が挙げられ、これらの市販品を利用すればよい。また、siRNAを結合させる場合は、幹細胞接着性ペプチドに前記のカチオン性ポリアミノ酸を付加する方法、ビオチン−ストレプトアビジン結合による方法により行うことができる。毒素がタンパク質毒素である場合は、遺伝子レベルで結合させることが好ましく、その際には融合遺伝子として直接的に結合させる方法、一般的なDNAリンカーを用いて間接的に結合させる方法を用いることができる。
【００２９】
本発明の幹細胞への遺伝子導入用複合体は、特定の遺伝疾患の遺伝子治療等に利用できる。例えば、特定の遺伝子の異常や欠損に起因することが知られている疾患を有する患者から採取した体細胞や生体試料から製造したiPS細胞（疾患由来iPS細胞)に、その原因遺伝子を修復する遺伝子や正常遺伝子を、当該複合体を用いて導入し、それより分化誘導させた細胞や組織を患者に戻すという治療に使用することができる。
【００３０】
また、本発明の幹細胞への細胞傷害性物質導入用複合体は、目的の細胞に分化誘導した細胞集団から、移植後に癌化の恐れがある未分化状態の幹細胞を標的として除去し、安全な移植材料を提供することに利用することができる。具体的には、幹細胞を分化誘導した後の培地中に、本発明の細胞傷害性物質導入用複合体を添加する方法などにより、幹細胞から分化誘導した細胞と当該複合体とを接触させると、DGは分化誘導後の細胞においては発現が減少することから、当該複合体は、DGが発現している未分化細胞のみを認識し、細胞傷害性物質により未分化状態の幹細胞に傷害を与え、死滅させることができる。さらに、培養液中に未分化細胞が残っている可能性があれば、必要に応じて標識した本発明のDG結合ペプチドを処理後の培地に添加し、セルソーター等で完全に除去することもできる。また、浮遊細胞に本発明の幹細胞への細胞傷害性物質導入用複合体を作用させる場合には、死滅した幹細胞は密度勾配媒体を用いて分離除去することができる。その結果、本発明によれば、未分化状態の幹細胞の混入のない所望の分化誘導細胞を損傷することなく取得することができる。処理後の分化誘導細胞は、死滅した幹細胞を完全に除去するために、数回継代培養するか、あるいは、PBS等の緩衝液で数回洗浄することにより、そのまま再生治療用の移植細胞として用いることができる。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明する。ただし、これらの実施例は本発明を限定するものでない。
【００３２】
（実施例１）ヒトiPS細胞におけるジストログリカン（DG）の発現
ヒトiPS細胞として201B7細胞を用い、フィーダー細胞上又はLM511-E8上で培養し、ジストログリカン（DG）の発現を免疫蛍光染色にて観察した。フィーダー細胞を用いた場合はPrimate ES Cell Medium(ReproCELL, Yokohama, Japan)を、LM511-E8を用いた場合はStemFitAK02N(Ajinomoto, Tokyo, Japan)を培地として用いて、201B7細胞を培養し、7-8日間でコロニーを形成させた。免疫蛍光染色は、lumox 24 well plate(Sarstedt、Numbrecht、Germany)を使用した。コロニーは、一次抗体：マウス抗DGモノクローナル抗体(VIA4、IIH6)、未分化マーカーNanogに対する抗体（ウサギ抗Nanogポリクローナル抗体）、二次抗体：Alexa488標識抗マウスIgG抗体及びAlexa594標識抗ウサギIgG抗体により二重染色を行った。対比染色としてヘキストにより核を染色した。その結果、フィーダー細胞上又はLM511-E8上で培養したいずれの201B7細胞においても、DGが強く発現していることが確認された(図１Ａ)。
【００３３】
さらに、DGの発現をフローサイトメトリーにより解析した。LM511-E8上で培養した201B7細胞を、一次抗体：マウス抗DGモノクローナル抗体(VIA4、IIH6)及び未分化マーカーであるSSEA-4、TRA-1-81に対する抗体（マウス抗SSEA-4、TRA-1-81モノクローナル抗体）、二次抗体：Alexa488標識抗マウスIgG抗体で染色した。その結果、201B7細胞において、DGが強く発現していることが確認された(図１Ｂ、左のパネル)。また未分化マーカー（SSEA-4、TRA-1-81）の発現より、幹細胞は未分化状態であることも確認された（図１Ｂ、右のパネル）。また、抗DG(IIH6)抗体と反応することから、DGにラミニン結合能を持った糖鎖が付加されていることが示された。
【００３４】
(実施例２)ヒトiPS細胞に発現するジストログリカン（DG）の解析
ヒトiPS細胞として201B7細胞及び454E2細胞を用い、ヒトiPS細胞に発現するα-ジストログリカン(α-DG)を抗α-DG抗体（VIA4）、β-ジストログリカン(β-DG)を抗β-DG抗体（7D11）を用いてイムノブロッティング法により検出した。その結果、α-DG及びβ-DGはそれぞれ120〜200 kDa及び38 kDaに検出された（図２Ａ、左のパネルと真ん中のパネル）。α-DGは、SDS-PAGEによる分離の後、PVDF膜に転写されてもラミニン結合性を保持することが知られている(Ibraghimov-Beskrovnaya et al., Primary structure of dystrophin-associated glycoproteins linking dystrophin to the extracellular matrix. Nature, 355, 696-702,1992）。マウス・ラミニン-111(MsLM-111)によるオーバーレイアッセイを行った結果、MsLM-111がα-DGと同じ120〜200kDaで結合し、ヒトiPS細胞のα-DGがラミニン結合活性を持つことが示された（図２Ａ、右のパネル）。
【００３５】
既報（Miyazaki et al., Laminin E8 fragments support efficient adhesion and expansion of dissociated human pluripotent stem cells., Nat. Commun. 3, 1236,2012）に従い、ヒトiPS細胞（201B7細胞）を中胚葉へ分化誘導した。14日間の培養後フローサイトメトリーによる解析を行った。その結果、分化誘導後の細胞において、ヒトiPS細胞のマーカーであるSSEA-4の発現は減少し、一方で脱未分化マーカーであるSSEA-1の発現が上昇し、未分化状態から分化の方向にあることが示された(図２Ｂ、左のパネル)。同時に未分化性を失うと、ラミニン結合能を持つα-DGの発現が減少することが確認された(図２Ｂ、真ん中の下のパネル)。この結果は、DGがヒトiPS細胞の未分化状態と関連する分子である可能性を示した。また、201B7細胞のオリジナルとなるヒト皮膚線維芽細胞(HDFs)ではDGの発現は見られず、ヒトiPS細胞の未分化性との関連が示唆された(図２Ｂ、右のパネル)。
【００３６】
（実施例３）ジストログリカン（DG）のLM511-E8に対する結合の解析
LM511-E8に対するDGの結合を評価するため、マウスα-ジストログリカン(MsDG)とヒト免疫グロブリンのIgG1 Fcドメインを融合した組換えタンパク質(MsDG-Fc)を作製した。MsDG-FcをExpi293細胞において発現させ、MsDG-Fcを含む培養上清を結合アッセイに使用した。ELISAプレートには、ヒト組換えラミニン-111(LM111)、ラミニン-511(LM511)、ラミニン-521(LM521)及びLM511-E8をそれぞれ20nMコートした。結合したMsDG-Fcは、IgG1 Fcドメインに対する抗体により検出した。その結果、20nMでコートした LM111、LM511、LM521に対して、MsDG-Fcは同じレベルで結合した。一方、LM511-E8に対して有意な結合は見られなかったが、60nMでは有意な結合が見られた(図３)。このことから、LM511に比べて弱いが、LM511-E8領域にDG結合活性があること示された。
【００３７】
（実施例４）LM511-E8のジストログリカン（DG）結合アミノ酸配列の同定
(1)LM511-E8のα5鎖を網羅するペプチドライブラリーの構築
LM511-E8のDG結合アミノ酸配列を同定するためペプチドライブラリーの構築を行った。LM511-E8は、ヒトα5鎖のAla2534-Ala3323、β1鎖のLeu1561-Leu1786、γ1鎖のAsn1364-Pro1609によって構成されている(Ido et al., The requirement of the glutamic acid residue at the third position from the carboxyl termini of the laminin γ chains in integrin binding by laminins, J Biol Chem, 282, 11144-11154,2007)。受容体の結合は主にα鎖の関与が示唆されていることから、α5鎖のAla2534-Ala3323領域内を網羅するペプチドをデザインした(図４)。ペプチドは、12 残基のアミノ酸を長さの基本とし、隣接したペプチドと4 残基ずつオーバーラップするようにデザインした。ただし、配列中のCysは酸化によるジスルフィド結合の形成及び非特異的な細胞接着を考慮し、ペプチドのデザインから除外した。また、ペプチドのN末端がGlu又はGlnの場合、環化反応によるピログルタミン形成の影響を考慮し、N末端にGlyを付加した。ペプチド合成は、すべてFmoc固相合成法で行った。合成後のペプチド-レジンは、TFAで脱保護後、HPLCで精製し、凍結乾燥した。精製後、HPLCで純度を分析し、分子量は質量分析を用いて確認を行った。以上の方法により、LM511-E8のα5鎖を網羅するペプチド(合計96種類)を合成した。
【００３８】
(2) ジストログリカン（DG）に結合するペプチドのスクリーニング
(1)で構築したLM511-E8のα5鎖を網羅するペプチドライブラリーを用いて、DGに結合するペプチドのスクリーニングを行った。LM511-E8のα5鎖を網羅するペプチドをELISAプレートにコートし、MsDG-Fcを用いた結合アッセイにより評価を行った。その結果、以下の5種類のペプチド(hE8A5-20：KTLPQLLAKLSI（配列番号１）、hA5G1：PMKFNGRSGVQL（配列番号２）、hA5G4：TALKFYLQGPEP（配列番号３）、hA5G29：LRLVSYSGVLFF（配列番号４）、hA5G47：AMTFHGHGFLRL（配列番号５）)がMsDG-Fcに対して結合活性を示した(図５Ａ)。残りの91種類のペプチドは、MsDG-Fcに対して結合活性を示さなかった。
【００３９】
DG結合活性が見られた5種類のペプチドは、コントロールのFcとの結合が見られないことから、DGに特異的な結合であることが示された(図５Ｂ)。
【００４０】
（実施例５）ジストログリカン（DG）結合ペプチドのDG結合活性及び細胞接着活性
DG結合活性が見られた5種類のペプチドペプチド(hE8A5-20、hA5G1、hA5G4、hA5G29、hA5G47)の濃度依存性を評価した。その結果、5種類のペプチドは濃度依存的にMsDG-Fcに結合することが示された。なかでも、hE8A5-20及びhA5G29がDGとの強い結合活性を示した(図６−１、Ａ)。
【００４１】
さらに、DG結合ペプチドを、実施例４（２）の結合アッセイと同様にELISAプレートにコートし、ヒトiPS細胞（201B7細胞）を用いて細胞接着活性を評価した。その結果、hE8S5-20は濃度依存的にヒトiPS細胞に対する顕著な接着活性を示し、残りのペプチドは高濃度で当該接着活性を示した(図６−１、Ｂ)。
【００４２】
これまでに、細胞接着能をもつバイオマテリアルとして、高分子多糖マトリックスであるキトサンにペプチドを固定化させたペプチド-キトサン膜が報告されている(Mochizuki et al, Laminin-1 peptide-conjugated chitosan membranes as a novel approach for cell engineering. FASEB J. 17, 875-877, 2003)。ペプチド-キトサン膜は、ELISAのプレートのランダムなコーティングと異なり、ペプチドに配向性を持たせて吸着させることができる。そこで、DG結合ペプチド(hE8A5-20、hA5G1、hA5G4、hA5G29、hA5G47)のN末端にCys-Gly-Gly(CGG)を付加し、ペプチド-キトサンマトリックスを作製し（図６−２、Ｃ）、ヒトiPS細胞に対する細胞接着活性を評価した。その結果、CGG-hE8A5-20ペプチドにおいて、濃度依存的にヒトiPS細胞に対する強い接着活性がみられた(図６−２、Ｄ)。これらの結果から、DG結合ペプチドは幹細胞培養基質に利用できることが示された。
【００４３】
（実施例６）ビオチン化ジストログリカン（DG）結合ペプチドのヒトiPS細胞への結合の解析
DG結合ペプチドの物質導入への利用を検討するため、液相でのヒトiPS細胞に対する結合を評価した。本発明において同定されたhE8A5-20ペプチド及びこれまでの研究でDG結合活性が示されているA2G80ペプチド（VQLRNGFPYFSY）を、Biotin-OSu (Dojindo、Kumamoto、Japan)を用いてビオチン化し、HPLCにより精製した(図７Ａ)。LM511-E8上で培養したヒトiPS細胞（201B7細胞）を、Cell dissociation buffer(ThermoFisher Scientific)にて剥離し、ビオチン化したペプチドを100μg/mlで加え反応させた。次に、Alexa488で標識したストレプトアビジンを反応させ、FACScaliburフローサイトメータ(Becton Dickinson、San Jose、CA)を用いて解析を行った。その結果、hE8A5-20ペプチドは、ヒトiPS細胞に結合し、その結合活性はA2G80ペプチドに比べて高いことが示された (図７Ｂ)。
【００４４】
（実施例７）DG結合ペプチドによるヒトiPS細胞への遺伝子導入の解析
DG結合ペプチドを利用して、ヒトiPS細胞への遺伝子導入を試みた。DG結合ペプチドとして同定された上記5種類のペプチドと同じくDG結合ペプチドであるA2G80にプラスミドDNAを結合させるため9つのアルギニンをC末端側に2つのグリシンをリンカーとして付加したA2G80-R9を合成した(図８Ａ)。また対照としてA2G80に代えてスクランブル（Scramble）ペプチドに対して同様に9つのアルギニンをC末端側に２つのグリシンをリンカーとして付加したScramble-R9を合成した（図８Ａ）。
【００４５】
導入する遺伝子には、pEGFP-N3 (Takara Bio、Shiga、Japan)を用いた。ヒトiPS細胞（201B7細胞）をLM511-E8をコートしたlumox 24 well plate (Sarstedt、Numbrecht、Germany)に播種し、7-8日間の培養でコロニーを形成させた。各ウエルに上記プラスミドpEGFP-N3（4μg）とペプチドA2G80-R9（15.5μg）との複合体（A2G80-R9ポリプレックス）を添加し、48時間の培養後、キーエンスBZ-X700(Keyence、Osaka、Japan)により発現するEGFPの蛍光を観察した。その結果、A2G80-R9ペプチドではコロニーの辺縁部でEGFPの蛍光が観察され、遺伝子がDGを介してヒトiPS細胞に導入されることが明らかとなった(図８Ｂ、矢印)。これに対し、Scramble-R9ではEGFPの蛍光は観察されなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明は、再生医療材料の製造分野において利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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