(57)【要約】【課題】動物組織からプラズマローゲンを効率的に抽出し、特に脳神経炎症抑制に効果のある組成物を得ることができる方法を提供すること。【解決手段】プラズマローゲンを含む動物組織をプロテアーゼで処理する酵素処理工程と、プロテアーゼで処理した動物組織を、エタノールを含む抽出液で抽出するエタノール抽出工程とを有する脳神経炎症抑制組成物の製造方法である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラズマローゲンを含む動物組織をプロテアーゼで処理する酵素処理工程と、
前記プロテアーゼで処理した動物組織を、エタノールを含む抽出液で抽出するエタノール抽出工程と、
を有することを特徴とする脳神経炎症抑制組成物の製造方法。
【請求項２】
動物組織が、ホタテ類、ホヤ及び鳥類から選ばれる動物の組織であることを特徴とする請求項１記載の脳神経炎症抑制組成物の製造方法。
【請求項３】
プロテアーゼが、中性プロテアーゼであることを特徴とする請求項１又は２記載の脳神経炎症抑制組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物組織からプラズマローゲン等の有効成分を抽出して、脳神経炎症の抑制に有効な組成物を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リン脂質は、生体膜の構成成分として重要であるが、中でもエーテルリン脂質であるプラズマローゲンは、哺乳動物の生体膜のリン脂質の約１８％を占めている。このプラズマローゲンは、特に、脳神経、心筋、骨格筋、白血球、精子に多いことが知られている。
【０００３】
プラズマローゲンは、ドコサヘキサエン酸やアラキドン酸などの多価不飽和脂肪酸と多く結合しているため、これらの多価不飽和脂肪酸から産生するプロスタグランヂンやロイコトリエンなどの細胞間シグナルの２次メッセンジャーの貯留所となっているだけでなく、細胞融合、イオン移送など重要な働きをしている。
さらに、プラズマローゲンのビニルエーテル結合（アルケニル結合）が、特に酸化ストレスに敏感であるため細胞の抗酸化の機能も果たしている。
【０００４】
また、プラズマローゲンは、神経新生の促進作用や、リポポリサッカロイド（ＬＰＳ）による神経炎症の抑制作用、脳内アミロイドβ（Ａβ）タンパクの蓄積の抑制作用等が知られており、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、統合失調症などの脳神経病において効果があるといわれている。
【０００５】
従来より、このようなプラズマローゲンを動物組織から抽出する試みがなされている（特許文献１及び２）。例えば、特許文献１においては、レイヤーのムネ肉に対してエタノールを抽出溶媒として抽出処理し、抽出液を回収する方法が提案されている。
【０００６】
また、特許文献２においては、動物組織に対して、エタノール抽出処理を行い、エタノール抽出物を得、エタノール抽出物をホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）で処理し、ジアシル型グリセロリン脂質を加水分解し、さらに水溶性ケトン系溶剤で処理し、不溶部を回収し、不溶部を、脂肪族炭化水素溶剤と水溶性ケトン溶剤との混合有機溶剤、及び水で溶媒分配し、混合有機溶剤部を回収する方法が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第５４８３８４６号公報
【特許文献２】特許第５４８９４３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記のように、有用なプラズマローゲンを動物組織から得ようとする試みはされているものの、必ずしも効率よくプラズマローゲンを得ることができているとはいえない。
【０００９】
本発明の課題は、動物組織からプラズマローゲンを効率的に抽出し、特に脳神経炎症抑制に効果のある組成物を得ることができる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、動物組織からプラズマローゲンを効率的に抽出し、アルツハイマー病等の脳神経炎症に有効な組成物を得るべく鋭意検討した結果、プラズマローゲンを含む動物組織をプロテアーゼにより処理した後、エタノールで抽出することにより、多量のプラズマローゲンを抽出でき、しかも、脳神経炎症抑制に極めて有効な組成物を得ることができることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下のとおりのものである。
［１］プラズマローゲンを含む動物組織をプロテアーゼで処理する酵素処理工程と、前記プロテアーゼで処理した動物組織を、エタノールを含む抽出液で抽出するエタノール抽出工程と、を有することを特徴とする脳神経炎症抑制組成物の製造方法。
［２］動物組織が、ホタテ類、ホヤ及び鳥類から選ばれる動物の組織であることを特徴とする［１］記載の脳神経炎症抑制組成物の製造方法。
［３］プロテアーゼが、中性プロテアーゼであることを特徴とする［１］又は［２］記載の脳神経炎症抑制組成物の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、動物組織からプラズマローゲンを効率的に抽出することができ、脳神経炎症の抑制に極めて有効な組成物を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】マウス由来ミクログリア細胞（ＭＧ６及びＢＶ２）におけるＬＰＳ誘発性炎症シグナルに対する実施例で調製した本発明の組成物の炎症抑制効果を示す図である。
【図２】実施例２におけるリン脂質の分析条件を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の脳神経炎症抑制組成物の製造方法は、プラズマローゲンを含む動物組織をプロテアーゼで処理する酵素処理工程と、プロテアーゼで処理した動物組織を、エタノールを含む抽出液で抽出するエタノール抽出工程とを有することを特徴とする。
【００１５】
本発明の製造方法においては、酵素処理工程及びエタノール抽出工程の前後に他の工程を有していてもよい。ただし、エタノール抽出工程前（特にプロテアーゼで処理すると同時又は処理の後）に脂質分解酵素で処理する工程を有することは、脳神経炎症の抑制効果の減少のおそれがあるため、脂質分解酵素で処理する工程は有していないことが好ましい。
【００１６】
［酵素処理工程］
酵素処理工程は、プラズマローゲンを含む動物組織をプロテアーゼで処理する工程である。
動物組織としては、プラズマローゲンを含む動物組織であれば特に制限されるものではなく、ホタテ類、ホヤ、ナマコ、アワビ、サケ、サンマ、カツオ等の水産動物や鳥類等を挙げることができ、これらの中でも、ホタテ類、ホヤ、鳥類が好ましく、用いる部位としては、食用部位（可食部位）が好ましい。
【００１７】
本発明におけるホタテ類は、イタヤガイ科に属する食用の二枚貝をいい、例えば、Mizuhopecten属、Pecten属に属するものを挙げることができる。具体的には、日本で採取されるホタテガイ（学名：Mizuhopecten yessoensis）や、ヨーロッパで採取されるヨーロッパホタテ（学名：Pecten maximus（Linnaeus））等を挙げることができる。食用部位としては、貝柱、ひも等を挙げることができる。
【００１８】
本発明におけるホヤは、マボヤ科に属する食用の脊索動物をいい、マボヤ属、アカボヤ属に属するものを挙げることができる。具体的には、マボヤ（学名：Halocynthia roretzi）や、アカボヤ（学名：Halocynthia aurantium）等を挙げることができる。食用部位としては、身の部分（筋膜体）を挙げることができる。
【００１９】
本発明における鳥類は、食用の鳥類であれば特に制限されるものではなく、例えば、鶏、烏骨鶏、鴨等を挙げることができる。食用部位としては、プラズマローゲンを豊富に含むムネ肉が好ましい。
【００２０】
これらの動物組織は、切断物であってもよいが、より効率的にプラズマローゲンを抽出できることから、粉砕物を用いることが好ましい。
【００２１】
酵素処理に用いるプロテアーゼとしては、Aspergillus属、 Rhizopus属等の糸状菌由来のプロテアーゼや、Bacillus属等の細菌由来のプロテアーゼや、パパイヤ、パイナップル等の植物から抽出されたプロテアーゼを挙げることができ、市販のプロテアーゼ剤を用いることができる。これらの中でも、糸状菌由来のプロテアーゼが好ましく、麹菌由来のプロテアーゼが特に好ましい。また、プラズマローゲンは酸性、塩基性では不安定であることから、ｐＨ４〜１０程度の環境下で酵素処理することが好ましく、少なくとも中性プロテアーゼを含む酵素を用いることが好ましい。
【００２２】
プロテアーゼの使用量としては、例えば、動物組織１００ｇに対して、０．１〜１０．０ｇ程度であることが好ましく、０．２〜８．０ｇ程度であることがより好ましく、０．３〜５．０ｇ程度であることがさらに好ましい。
【００２３】
［エタノール抽出工程］
エタノール抽出工程においては、プロテアーゼで処理した動物組織を、エタノールを含む抽出液で抽出する。
【００２４】
エタノール抽出工程で用いるエタノールを含む抽出液としては、含水エタノールであってもよく、エタノールと他の有機溶媒との混合物であってもよい。エタノール濃度としては、５０質量％以上であることが好ましく、８０質量％以上であることがより好ましく、９５質量％以上であることがさらに好ましく、実質的に１００質量％であることが特に好ましい。
【００２５】
エタノールの使用量としては、例えば、動物組織１００ｇに対して、１００〜３０００ｍＬ程度であることが好ましく、２００〜２０００ｍＬ程度であることがより好ましく、２５０〜１０００ｍＬ程度であることがさらに好ましい。なお、エタノールを用いた抽出は複数回行ってもよい。
【００２６】
エタノール抽出処理を行った後、固形分を除去して抽出液を回収し、必要に応じて乾燥固化することにより、本発明のプラズマローゲンを含有した組成物を得ることができる。
【００２７】
また、このエタノール抽出物に対して、プラズマローゲンの濃度を高める濃縮処理を施してもよい。例えば、エタノール抽出工程後に、親油性溶媒を含む抽出液で抽出する親油性溶媒抽出工程を有することが好ましい。親油性溶媒としては、例えば、脂肪族炭化水素や芳香族炭化水素を挙げることができ、ヘキサン、イソプロパノール、又はこれらの混合物が特に好ましい。
【００２８】
本発明の製造方法により得られる組成物中に含まれるプラズマローゲンの量としては、０．００１〜１００ｍｇ／ｇ（wet重量換算）であることが好ましく、０．１〜１０ｍｇ／ｇであることがより好ましい。
【００２９】
本発明のプラズマローゲンを含有した組成物は、食品、医薬品等として、又はこれらに含有させて用いることができる。食品としては、一般食品の他、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品、サプリメント等を挙げることができる。本発明の組成物は、脳神経炎症の抑制に特に有効であることから、本発明の組成物又はこれを含む食品等は、アルツハイマー病等の認知症、パーキンソン病、うつ病、統合失調症などの脳神経病の予防又は改善に役立つ。
【００３０】
食品、医薬品の形態は特に制限されるものではなく、例えば、錠状、カプセル状、粉末状、顆粒状、液状、粒状、棒状、板状、ブロック状、固形状、丸状、ペースト状、クリーム状、カプレット状、ゲル状、チュアブル状、スティック状等を挙げることができる。
【実施例１】
【００３１】
［ホタテ抽出物の調製１」
次の手順により、ホタテガイ（学名：Mizuhopecten yessoensis）から本発明の組成物を得た。
【００３２】
１．素材（生ホタテヒモ）２００ｇを解凍し、ハサミで細かく切った。
２．コクラーゼ（登録商標）・Ｐ顆粒（起源Aspergillus oryzae）［三菱ケミカルフーズ株式会社製］１．０ｇを加えた。
３．ブレンダーで粉砕した（１０秒×２回）。
４．攪拌機を使用して５０℃で３０分反応させた。
５．エタノール８００ｍｌを加えた。
６．ブレンダーで粉砕した（１０秒×２回）。
７．５０℃で２０分攪拌した。
８．吸引ろ過した。
９．ろ液をロータリーエバポレーターで乾固した。
【００３３】
１０．ヘキサン／イソプロパノール（３：２）を５００ｍＬ加え混和した。
１１．水２５０ｍＬを加え混和した。
１２．分液ロートに移してよく混和した。
１３．１０分静置した。
１４．下層（水層）を取りＮ２ガスで乾固した。
→このステップで得られた組成物（アミノ酸+その他水溶性成分）を比較組成物（３）とした。
１５．上層（ヘキサン層）を取りＮ２ガスで乾固した。
→このステップで得られた組成物（pl-PE+その他脂質）を本発明の組成物（１）とした。
【００３４】
［ホタテ抽出物の調製２（プロテアーゼ及びホスホリパーゼを用い、かつエタノール抽出を行わない場合（比較例）」
１．０．１Ｍクエン酸溶液（ｐＨ４．５）５０ｍＬにコクラーゼＰ０．５ｇとホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）０．８ｇを加え混和した。
２．素材（生ホタテヒモ）２００ｇを解凍し、ハサミで細かく切った。
３．１．を加え混和し、ブレンダーで粉砕した（１０秒×３回）。
４．５０℃で１時間反応させた（１５分おきにガラス棒で混和した）。
５．ヘキサン／イソプロパノール（３：２）１０００ｍＬを加えた。
６．室温で１０分撹拌した。
７．上澄みを吸引ろ過した。
８．ヘキサン／イソプロパノール（３：２）２００ｍＬで洗い、再び吸引ろ過した。
９．ろ液を分液ロートに移した。
【００３５】
１０．硫酸ナトリウム水溶液８００ｍＬを加えてよく混和した。
１１．１０分静置した。
１２．下層を捨てた。
１３．上層をロータリーエバポレーターで乾固した。  
１４．ヘキサン４ｍＬを加え超音波しよく懸濁し、遠沈管に移した。
１５．アセトン（４℃）４０ｍＬを加え混和した。
１６．−３０℃に１時間から１晩放置した。
１７．３０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃で遠心した。
１８．上清を捨て、沈殿を回収した。  
１９．デシケータで一晩乾燥した。
→このステップで得られた組成物（pl-PE+pl-PC+CAEP+Cholesterol）を比較組成物（２）とした。なお、pl-PCは、コリンプラズマローゲンであり、CAEPは、セラミドアミノエチルホスホン酸である。
【００３６】
［本発明の組成物の炎症抑制作用の確認］
炎症時、主にミクログリア細胞において炎症因子ＮＦ−ｋＢのサブユニットであるｐ６５タンパク質が核内に移行し、ＩＬ−１ｂｅｔａやＴＮＦ−ａｌｐｈａなどの炎症性サイトカインを誘導する。リポポリサッカロイド（ＬＰＳ）は、核内のｐ６５発現を増加させることにより炎症性シグナルを誘発する。本実施例では、マウス由来ミクログリア細胞（ＭＧ６及びＢＶ２）におけるＬＰＳ誘発性炎症シグナルに対する本発明の組成物の効果を検証した。
具体的なプロトコールは、以下のとおりである。
【００３７】
１．組成物（１）〜（３）を水に溶解させた。
２．マウス由来ミクログリア細胞（ＭＧ６及びＢＶ２）を、組成物が添加又は無添加の状態の２％血清ＤＭＥＭメディアで一晩培養した。なお、組成物を添加したメディアについては、それぞれ同量（５μｇ／ｍＬ）の活性プラズマローゲンが含まれるように調製した。
３．その後、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を加え、６時間処理した。
なお、評価対象は、ＬＰＳ無添加の「コントロールＬＰＳ−」、ＬＰＳを添加した「コントロールＬＰＳ＋」、「本発明の組成物（１）ＬＰＳ＋」、「比較組成物（２）ＬＰＳ＋」、「比較組成物（３）ＬＰＳ＋」の５種とした。
【００３８】
４．６時間後、細胞採取、細胞分画により核を抽出した。
５．核抽出物を用いウエスタンブロットを行い、炎症マーカーであるｐ６５タンパク質を検出した。
６．このタンパク発現の確認により、ミクログリア細胞において、組成物（１）〜（３）がＬＰＳ誘発性炎症シグナル（核内のｐ６５発現）を軽減するかどうかを検証した。その結果を図１に示す。
【００３９】
図１に示すように、本発明の組成物（１）及び比較組成物（２）は、リポポリサッカロイド（ＬＰＳ）により誘発される炎症を顕著に抑制し、その抑制効果は、比較組成物（２）よりも本発明の組成物（１）の方が優れていた。
【実施例２】
【００４０】
次の手順により、各素材（ホタテ類の食用部位・鳥類の食用部位・ホヤの食用部位）からプラズマローゲンを含む組成物を抽出し、分析を行った。具体的に、ホタテ類としては、ホタテガイ（学名：Mizuhopecten yessoensis）のひもを用いた。鳥類としては、鶏の胸肉を用いた。ホヤとしては、マボヤ（学名：Halocynthia roretzi）の身（筋膜体）を用いた。
【００４１】
１．素材（ホタテ・鶏胸肉・ホヤ）５０ｇを解凍し、ハサミで細かく切った。
２．次の試験溶液を準備した。
ａ）０．１Ｍクエン酸溶液（ｐＨ４．５）５０ｍＬのみ
ｂ）０．１Ｍクエン酸溶液（ｐＨ４．５）５０ｍＬ＋コクラーゼ（登録商標）・Ｐ顆粒（起源Aspergillus oryzae）［三菱ケミカルフーズ株式会社製］０．２５ｇ
ｃ）１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）５０ｍＬ＋プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤ（起源Aspergillus 属）［天野エンザイム株式会社製］０．２５ｇ
ｄ）１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）５０ｍＬ＋プロチンＳＤ−ＮＹ１０（起源Bacillus 属）［天野エンザイム株式会社製］１．２５ｇ
【００４２】
３．素材と上記ａ）〜ｄ）の各試験溶液とを混合し、ブレンダー（WARING社製HGBSS）で粉砕した（１０秒×３回）。
４．５０℃で６０分間反応させた（約１５分おきにガラス棒で攪拌した）。
５．エタノール２５０ｍＬを加え、ブレンダーに入れ粉砕した（１０秒×２回）。
６．３０分放置した（約５分ごとにガラス棒で１０回転攪拌した）。
７．吸引ろ過し、ろ液を回収した。
【００４３】
８．ろ液を１ｍＬスピッツ管に取り、リン脂質の分析に用いた。
９．残りのろ液をエバポレーターで乾固させ、総脂質重量を測定した。
【００４４】
各分析結果を以下に示す。
（１）総脂質重量
上記ａ）〜ｄ）の試験溶液を用いた抽出物の総脂質重量（ｇ／素材５０ｇ当たり）を表１に示す。
【００４５】
【表１】
2020176086.tif 000003
【００４６】
（２）リン脂質の分析条件（図２参照）におけるプラズマローゲン（pl-PE＋pl-PC）の割合（ＨＰＬＣ面積値）を表２に示す。
【００４７】
【表２】
2020176086.tif 000004
【００４８】
（３）プロテアーゼ処理によるプラズマローゲン（pl-PE＋pl-PC）の増加率
上記（１）で求めた総脂質量に、上記（２）で求めたプラズマローゲン（pl-PE＋pl-PC）の割合をかけた数値を算出し、「ａ）プロテアーゼなし」を基準（１．０）として、プラズマローゲン（pl-PE＋pl-PC）の量を比較した。その結果を表３に示す。
なお、総脂質全体に占めるリン脂質の割合は、プロテアーゼ処理を施してもほぼ変化はなかった。
【００４９】
【表３】
2020176086.tif 000005
【００５０】
表３に示すように、プロテアーゼ処理を施すことにより、プラズマローゲンの抽出量が飛躍的に増加することがわかる。したがって、プロテアーゼ処理を施した組成物は、脳神経炎症抑制組成物として有用であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明の製法により製造される脳神経炎症抑制組成物は、健康食品等に用いることができることから、産業上有用である。
【図１】
2020176086.tif 000006
【図２】
2020176086.tif 000007