(57)【要約】      （修正有）【課題】腫瘍形成はシグナル伝達経路であるＰＩ３Ｋ経路の機能不全を起こす。過剰発現され、異常に活性化されたＰ１３Ｋを阻害化する、インヒビターを予想する方法が必要とされている。又、特定の標的のインヒビター単独及び／又はインヒビター−組合せ治療に対する臨床的な感受性を決定するのに用いることができる、複数の主要なシグナリング経路を調べる、予測的な生物マーカーアッセイが必要である。【解決手段】腫瘍細胞などの細胞におけるＰ１３Ｋ経路を含むシグナル伝達分析物の発現及び活性化の状態を、検出、測定、及び定量化するための方法を提供する。治療を選択するため、治療を最適化するため、治療有効性をモニタリングするため、及び／又は治療抵抗性を検出するための方法も提供する。したがって、本方法は、癌治療の選択及び疾患のモニタリングを改善するのに有用である。【選択図】図３Ａ
2020024210.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺癌と診断された対象のための処置を選択するための方法であって、
（ａ）近接アッセイを用いて、対象から採取した試料におけるホスホＰＩ３Ｋ、ホスホＡＫＴ、ホスホＥＲＫ、ホスホＭＥＫ、ホスホＲＳＫ、ホスホＰＲＡＳ４０及びホスホＲＰＳ６のレベルを測定し、経路プロファイルを決定するためのすステップであって、
近接アッセイが協同的酵素増強反応性イムノアッセイ（ＣＥＥＲ）であるステップと、
（ｂ）対象の経路プロファイルを基準経路プロファイルと比べるステップであって、
基準経路プロファイルが、癌細胞株からの試料又は特定のタイプの癌を有する対象からの試料を用いて決定されるステップと、
（ｃ）対象の経路プロファイルに基づいて、対象が標的のインヒビター治療に応答する可能性があるか否かを決定することにより、標的のＰＩ３Ｋインヒビター治療、ＭＥＫインヒビター治療、又はＰＩ３Ｋインヒビター及びＭＥＫインヒビターの組み合わせの治療を推奨するステップとを含む、方法。
【請求項２】
肺癌を有する対象のために、治療を最適化するか、又は標的のインヒビターの治療有効性をモニタリングするための方法であって、
（ａ）ＰＩ３Ｋインヒビター、ＭＥＫインヒビター及びこれらの組み合わせからなる群から選択される標的のインヒビターでの治療クールにわたって複数の時点で、近接アッセイを用いて、対象から採取した試料における、ホスホＰＩ３Ｋ、ホスホＡＫＴ、ホスホＥＲＫ、ホスホＭＥＫ、ホスホＲＳＫ、ホスホＰＲＡＳ４０及びホスホＲＰＳ６のレベルを測定し、経路プロファイルを決定するステップであって、
近接アッセイが協同的酵素増強反応性イムノアッセイ（ＣＥＥＲ）であるステップと、
（ｂ）対象の経路プロファイルに基づいて、対象が標的のインヒビターに応答性であるか否かを決定するステップと、
（ｃ）対象の経路プロファイルを基準経路プロファイルと比べるステップであって、
基準経路プロファイルが、癌細胞株からの試料又は特定のタイプの癌を有する対象からの試料を用いて決定されるステップと、
（ｄ）対象が応答性である場合、標的のインヒビターの投与を継続することを推奨するステップとを含む方法。
【請求項３】
対象が非応答性である場合、標的のインヒビターの投与を改変すること、又は少なくとも２つの標的のインヒビターの投与を推奨することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
複数の時点における第１の時点が、標的のインヒビターでの治療クール前である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
複数の時点における１つ又は複数の後の時点が、標的のインヒビターでの治療クールの間にある、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
試料が、細針吸引物、腫瘍組織生検、腫瘍細胞、又は循環腫瘍細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
ＰＩ３Ｋインヒビターが、ＢＹＬ７１９、ＢＡＹ８４１２３６、ＢＡＹ８０６９４６、ＳＦ１１２６、ＸＬ１４７、ＸＬ７６５、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＮＶＰ−ＢＧＴ２２６、ＮＶＰ−ＢＫＭ１２０、ＧＤＣ−０９４１、ＰＸ−８６６、ＧＳＫ１０５９６１５、ＣＡＬ−１０１、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＭＥＫインヒビターが、ＢＡＹ８６９７６６、ＭＥＫ１６２、ＧＤＣ−０９７３／ＲＧ７４２０、ＧＤＣ−０６２３／ＲＧ７４２１、ＲＧ７１６７、ＲＧ７３０４、ＸＬ５１８、ＰＤ−３２５９０１、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
[0002]腫瘍形成は機能不全のシグナル伝達経路をしばしば伴うため、細胞の成長及び生存を媒介するシグナル伝達経路は癌治療の標的である。シグナリング異常は、癌細胞に、成長能の増大をもたらし、ＤＮＡ損傷性薬剤によって誘発されるアポトーシスを回避する能力をもたらす。
【０００２】
[0003]例えば、十分に特徴付けられたシグナル伝達経路の一つに、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路がある。これは、悪性転換、成長因子のシグナリング、炎症、及び免疫などの様々な細胞の過程に関連付けられている。この経路の活性化は、成長因子又はリガンドが同族の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）に結合したときに開始する。これら受容体には、ヒト上皮成長因子受容体ファミリーのメンバー（ＨＥＲ、ＥＧＦＲ、又はＥｒｂＢ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体のメンバー、インスリン及びインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）受容体のメンバーが含まれる。その後ＲＴＫが二量体化し、リン酸化することで、ＰＩ３Ｋヘテロ二量体は、活性化したＲＴＫ及び／又はアダプタータンパク質に直接結合できるようになる。活性化したＰＩ３Ｋは、ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸（ＰＩ（４，５）Ｐ２又はＰＩＰ２）の、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸（Ｐ（３，４，５）Ｐ３又はＰＩＰ３）へのリン酸化を触媒する。ＰＩＰ３は、ＰＩ３Ｋ経路の中心的エフェクターであるＡＫＴのリン酸化を促進する。ＡＫＴは、シグナルを下流の基質のホストに伝達し、このようにして成長、代謝、増殖、及び生存を含めた様々な中心的な細胞機能を制御する。
【０００３】
[0004]ＰＩ３Ｋ経路の不適切な選択（ｃｏ−ｏｐｔｉｎｇ）は、通例、ヒトの癌において生じる。ＰＩ３Ｋ経路は、乳癌、及び他の腫瘍タイプにおいて活性化過剰であることが頻繁にある。乳癌の７０％にＰＩ３Ｋ経路の調節不全があることが示されている（Ｌｏｐｅｚ−Ｋｎｏｗｌｅｓら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１２６巻、１１２１〜１１３１頁（２０１０年））。ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子（ＰＩ３Ｋ  ｐ１１０サブユニットをコードする）における変異は、乳癌、結腸癌、及び子宮体癌を含めた腫瘍、並びに神経膠芽腫腫瘍には一般的であることが十分に確立されている。さらに、多くの癌において、ＲＴＫはしばしば変異し、増幅され、又は過剰発現され、それにより異常なＰＩ３Ｋ活性化を引き起こす。まとめると、これらの知見により、ＲＴＫ及びＰＩ３Ｋシグナリングは、癌治療に魅力的な標的となっている。
【０００４】
[0005]現在、いくつかのＰＩ３Ｋ経路インヒビターが前臨床試験において調査中であり、結果は有望であると思われる（Ｍａｒｋｍａｎら、Ａｎｎｌｓ．Ｏｎｃｏｌ．、２１巻（４）、６８３〜６９１頁（２０１０年））。癌細胞増殖の阻害は、ＰＩ３Ｋインヒビターを受けている幾名かの患者に見られた（Ｃｏｕｒｔｎｅｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２８巻（６）、１０７５〜１０８３頁（２０１０年））。これらＰＩ３Ｋ治療は癌の処置において成功を実証している一方（Ｍａｒｋｍａｎら、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２３巻（９）：２３９９〜２４０８頁、（２０１２年）；Ｂｅｎｄｅｌｌら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、３０巻（３）：２８２〜２９０頁、（２０１２年））、処置した対象の全てが応答し、又は良好に応答しているわけではないことを認めるのが重要である。標的のインヒビター治療に良好に応答する可能性がある対象を予想する方法が必要とされている。このように、特定の標的のインヒビター単独及び／又はインヒビター−組合せ治療に対する臨床的な感受性を決定するのに用いることができる、複数の主要なシグナリング経路を調べる、予測的な生物マーカーアッセイが必要とされている。本発明は、これら及びその他の必要性を満たすものである。
【発明の概要】
【０００５】
[0006]ＰＩ３Ｋ、ＭＥＫ、及びＨＥＲファミリーの経路を含めた複数のシグナリング経路は、乳癌、肺癌、胃癌、直腸結腸癌、膵臓癌、及び前立腺癌などの多くの癌に関係づけられており、既存の抗癌治療にもはや応答性でない患者にとっても、癌に対する有用な治療標的である。経路を目的とするインヒビターは開発中であり、いくつかの患者の研究において幾分の見込みを示している。本発明は、癌又は固形腫瘍を有する患者における複数のシグナリング経路をモニタリングし、次いで有効な治療レジメンを推奨するためのアッセイ方法を提供する。
【０００６】
[0007]したがって、本発明は、活性化したシグナリング経路構成成分及び／又は近接のシグナリング経路に付随するタンパク質を、検出及び定量するための方法を提供する。方法はまた、現存の治療によって直接標的とならない、付随する又は近接の経路に、活性化及び／又は発現をそらすなど、腫瘍適応を評価するのにも有用である。この方法は、特定の標的のインヒビター、又は複数の標的のインヒビターの組合せ治療からの患者の臨床上の恩恵を予想するのに用いられる。本発明を実践することに由来する情報を、癌の診断、予後に、及び癌処置又はレジメンのデザインにおいて用いることができる。
【０００７】
[0008]一態様において、本発明は、癌と診断された対象に処置を選択するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）経路プロファイル又はシグネチャーを決定するために、近接アッセイ（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ）を用いて、対象から採取した試料におけるＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭＥＴ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＥＲＫ、ＭＥＫ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＤＫ１、ＰＲＡＳ４０、ＰＴＥＮ、ＲＰＳ６、ＳＨＣ及びこれらの組合せの群から選択される１つ又は複数のシグナル伝達分析物の発現（例えば、合計量）及び／又は活性化（例えば、リン酸化若しくは複合体形成）のレベルを測定するステップ、並びに（ｂ）対象の経路プロファイル又はシグネチャーに基づいて、対象が標的のインヒビター治療に応答する可能性があるか否かを決定することにより、標的のインヒビター治療を推奨するステップを含む。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）は、対象の経路プロファイルを、基準経路プロファイルと比較することをさらに含む。
【０００８】
[0009]いくつかの態様において、基準経路プロファイルは、癌細胞株からの試料、又は特定のタイプの癌（例えば、乳癌、直腸結腸癌、胃癌、肺癌、膵臓癌、若しくは前立腺癌）を有する対象からの試料を用いて決定される。
【０００９】
[0010]別の一態様において、本発明は、癌を有する対象に対して、治療を最適化し、又は標的のインヒビターの治療有効性をモニタリングするための方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）標的のインヒビターでの治療クール（ｃｏｕｒｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｙ）にわたって複数の時点で対象から採取した試料における、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭＥＴ、ＩＧＦ−１Ｒ，ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＥＲＫ、ＭＥＫ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＤＫ１、ＰＲＡＳ４０、ＰＴＥＮ、ＲＰＳ６、ＳＨＣ、及びこれらの組合せの群から選択される１つ又は複数のシグナル伝達分析物の発現及び／又は活性化レベルを測定して、経路プロファイルを決定するステップ、（ｂ）対象の経路プロファイルに基づいて、対象が標的のインヒビターに応答性であるか否かを決定するステップ、並びに（ｃ）対象が応答性である場合、標的のインヒビターの投与を継続することを推奨するステップを含む。いくつかの場合において、方法は、対象が非応答性である場合、標的のインヒビターの投与を改変し、低減し、又は排除することを推奨することをさらに含む。いくつかの場合において、治療クールにわたる複数の時点における第１の時点は、標的のインヒビターでの治療クール前である。いくつかの場合において、治療クールにわたる複数の時点における１つ又は複数の後の時点は、標的のインヒビターでの治療クールの間にある。
【００１０】
[0011]いくつかの実施形態において、方法は、乳癌、直腸結腸癌、胃癌、肺癌、膵臓癌、又は前立腺癌を含めた癌を有する患者からの試料に対して行われる。他の実施形態において、方法は、乳癌、直腸結腸癌、胃癌、肺癌、膵臓癌、又は前立腺癌などの固形腫瘍タイプの癌を、発症する危険性があり、有することが疑われ、診断され、又は処置のための治療中である患者からの試料に対して行われる。いくつかの実施形態において、方法は、癌細胞株からの腫瘍細胞など、腫瘍細胞からの試料に対して行われる。
【００１１】
[0012]いくつかの実施形態において、患者から採取した試料は、細針吸引物（ＦＮＡ）、腫瘍組織生検、腫瘍細胞、又は循環腫瘍細胞である。好ましい実施形態において、試料は、循環腫瘍細胞又はＦＮＡである。
【００１２】
[0013]いくつかの実施形態において、近接アッセイは協同的酵素増強反応性（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ）イムノアッセイ（ＣＥＥＲ）である。
【００１３】
[0014]いくつかの態様において、本発明の方法は、標的のインヒビターの処置を選択するのに有用である。いくつかの実施形態において、標的のインヒビターは、チロシンキナーゼインヒビター、ＰＩ３Ｋインヒビター、ＭＥＫインヒビター、ＨＥＲ２インヒビター、ＨＥＲ３インヒビター、又はこれらの組合せの群から選択される。
【００１４】
[0015]いくつかの場合において、ＰＩ３Ｋインヒビターは、ＢＡＹ８４１２３６、ＢＡＹ８０６９４６、ＢＹＬ７１９、ＳＦ１１２６、ＸＬ１４７、ＸＬ７６５、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＮＶＰ−ＢＧＴ２２６、ＮＶＰ−ＢＫＭ１２０、ＧＤＣ−０９４１、ＰＸ−８６６、ＧＳＫ１０５９６１５、ＣＡＬ−１０１、及びこれらの組合せの群から選択される。いくつかの場合において、ＭＥＫインヒビターは、ＢＡＹ８６９７６６、ＭＥＫ１６２、ＧＤＣ−０９７３／ＲＧ７４２０、ＧＤＣ−０６２３／ＲＧ７４２１、ＲＧ７１６７、ＲＧ７３０４、ＸＬ５１８、ＰＤ−３２５９０１、及びこれらの組合せの群から選択される。いくつかの場合において、ＨＥＲ２インヒビターは、トラスツズマブ、トラスツズマブ−ＤＭ１、エルツマクソマブ（ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ペリチニブ、ＣＰ−６５４５７７、ＣＰ−７２４７１４、カネルチニブ／ＣＩ１０３３／ＰＤ１８３８０５、ＨＫＩ−２７２、ラパチニブ、ネラチニブ、ＰＫＩ−１６６／ＣＧＰ−７５１６６、ＡＥＥ７８８、ＢＭＳ−５９９６２６、ＨＫＩ−７２７、ＨＫＩ−３５７、ＢＩＢＷ２９９２、ＡＧ１４７８、Ａｒｒｙ−３８０、ＡＲＲＹ−３３４５４３、Ｂａｙ８４６、Ｄ６９４９１、ＤＸＬ−７０２、ＪＮＪ−２６４８３３２７、及びこれらの組合せの群から選択される。いくつかの場合において、ＨＥＲ３インヒビターは、ＭＭ−１２１、ＡＭＧ−８８８、トラスツズマブ、ペルツズマブ、セツキシマブ、ＭＥＨＤ７９４５Ａ／ＲＧ７５９７、ＲＧ７１１６、ゲフィチニブ、エルロチニブ、カネルチニブ、ラパチニブ、ＭＰ−４７０、ＡＺＤ８９３１、ＰＦ００２９９８０４、及びこれらの組合せの群から選択される。
【００１５】
[0016]一態様において、本発明は、癌を有する対象に対して、インヒビター処置に対する応答をモニタリングするための方法であって、（ａ）対象から採取した第１の試料において、近接アッセイを用いてシグナル伝達分析物を測定して、第１の経路プロファイルを決定するステップと、（ｂ）治療を受けている対象から採取した第２の試料において近接アッセイを用いて、ステップ（ａ）の特定の癌の経路のマーカーを測定して、第２の経路プロファイルを決定するステップ、並びに（ｃ）第１及び第２の経路プロファイルにおける変化に基づいて、対象が、インヒビター処置に対して応答性であるか又は非応答性であるかを決定するステップを含む方法を提供する。
【００１６】
[0017]いくつかの実施形態において、方法は、対象が非応答性である場合、標的のインヒビター処置の投与を改変することを推奨することをさらに含む。他の実施形態において、方法は、対象が非応答性である場合、少なくとも２つの標的のインヒビターの投与を推奨することをさらに含む。
【００１７】
[0018]いくつかの実施形態において、対象がインヒビター処置を受ける前に第１の試料を採取する。いくつかの実施形態において、対象がインヒビター処置を受けるときに第１の試料を採取する。いくつかの場合において、インヒビター処置は、チロシンキナーゼインヒビター、ＰＩ３Ｋインヒビター、ＭＥＫインヒビター、ＨＥＲ２インヒビター、ＨＥＲ３インヒビター、又はこれらの組合せからなる群から選択される。
【００１８】
[0019]いくつかの実施形態において、本発明の方法を、１つ又は複数の発癌性のシグナル伝達タンパク質を発現すること、治療を最適化すること、毒性を低減すること、治療的処置の有効性をモニタリングすること、及び／又は治療に対する適応性の非応答性（例えば、標的の薬剤に対する適応性の抵抗性）を検出することがすでに決定されている患者に対して行う。
【００１９】
[0020]これら及び他の態様、目的、特徴、利点、及び実施形態は、当業者には、詳細な説明及び以下の図面でより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＣＥＥＲを用いて分析することができる、例示のシグナル伝達経路を示す図である。経路の構成成分は、検出可能なシグナル伝達分析物を含む。
【図２】ＣＥＥＲを用いた、２つの癌細胞株であるＴ４７Ｄ及びＢＴ４７４におけるＰＩ３Ｋ活性化（例えば、複合体形成）の検出を示す図である。「％ＣＶ」は、変動係数のパーセント値を意味する。「Ｓ／Ｂ比」はシグナル対バックグラウンド比を意味する。
【図３Ａ】成長因子での刺激した後の、Ｔ４７Ｄ及びＢＴ４７４の２つの癌細胞株におけるＰＩ３Ｋ活性化（例えば、複合体形成）の検出を示す図である。ＰＩ３Ｋ活性化を非刺激のＴ４７Ｄ細胞、及びＥＧＦ又はＨＲＧで刺激した細胞において測定したことを示す。「％ＣＶ」は、変動係数のパーセント値を意味する。「Ｓ／Ｂ比」はシグナル対バックグラウンド比を意味する。
【図３Ｂ】成長因子での刺激した後の、Ｔ４７Ｄ及びＢＴ４７４の２つの癌細胞株におけるＰＩ３Ｋ活性化（例えば、複合体形成）の検出を示す図である。ＰＩ３Ｋ活性化が、非刺激のＢＴ４７４細胞、及びヘレグリン（ＨＧＲ）で刺激した細胞において検出されたことを示す。「％ＣＶ」は、変動係数のパーセント値を意味する。「Ｓ／Ｂ比」はシグナル対バックグラウンド比を意味する。
【図４Ａ】癌細胞株の経路プロファイリングを示す図である。様々な癌細胞株におけるホスホ−ＰＩ３Ｋ（ｐ−ＰＩ３Ｋ）レベルの棒グラフを示す。
【図４Ｂ】癌細胞株の経路プロファイリングを示す図である。全（ｔ−ＰＩ３Ｋ）レベルの棒グラフを示す。
【図４Ｃ】癌細胞株の経路プロファイリングを示す図である。成長因子で刺激する前及び後の癌細胞株における、ホスホＰＩ３Ｋ（ｐ−ＰＩ３Ｋ）レベルの棒グラフを示す。
【図４Ｄ】癌細胞株の経路プロファイリングを示す図である。全ＰＩ３Ｋ（ｔ−ＰＩ３Ｋ）レベルの棒グラフを示す。
【図４Ｅ】癌細胞株の経路プロファイリングを示す図である。成長因子で刺激する前及び後の癌細胞株における、ホスホ−ＰＩ３Ｋの全ＰＩ３Ｋレベルに対する比のグラフを示す。
【図５Ａ】癌細胞株の経路プロファイリングを示す図である。細胞株におけるホスホ−ＰＩ３Ｋレベルの棒グラフを示す。
【図５Ｂ】癌細胞株の経路プロファイリングを示す図である。全ＰＩ３Ｋレベルの棒グラフを示す。
【図５Ｃ】癌細胞株の経路プロファイリングを示す図である。ホスホＡＫＴレベルの棒グラフを示す。
【図５Ｄ】癌細胞株の経路プロファイリングを示す図である。ホスホＲＰＳ６レベルの棒グラフを示す。
【図５Ｅ】癌細胞株の経路プロファイリングを示す図である。癌細胞株における、ホスホ−ＰＩ３Ｋの全ＰＩ３Ｋレベルに対する比のグラフを示す。
【図６Ａ】ＰＩ３Ｋインヒビター治療、ＭＥＫインヒビター治療、又はこれらの組合せの後のＮＣＩ−Ｈ１１５５細胞におけるシグナル伝達分析物の活性化を示す図である。分析物を、処置４時間後又は２４時間後（＊）のいずれかに測定した。
【図６Ｂ】ＰＩ３Ｋインヒビター治療、ＭＥＫインヒビター治療、又はこれらの組合せの後のＮＣＩ−Ｈ１１５５細胞におけるシグナル伝達分析物の活性化を示す図である。分析物を、処置４時間後又は２４時間後（＊）のいずれかに測定した。
【図７Ａ】ＰＩ３Ｋインヒビター治療、ＭＥＫインヒビター治療、又はこれらの組合せの後のＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞におけるシグナル伝達分析物の活性化を示す図である。分析物を、処置４時間後又は２４時間後（＊）のいずれかに測定した。
【図７Ｂ】ＰＩ３Ｋインヒビター治療、ＭＥＫインヒビター治療、又はこれらの組合せの後のＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞におけるシグナル伝達分析物の活性化を示す図である。分析物を、処置４時間後又は２４時間後（＊）のいずれかに測定した。
【図８Ａ】ＰＩ３Ｋインヒビター治療、ＭＥＫインヒビター治療、又はこれらの組合せの後のＮＣＩ−Ｈ２２２８細胞におけるシグナル伝達分析物の活性化を示す図である。分析物を、処置４時間後又は２４時間後（＊）のいずれかに測定した。
【図８Ｂ】ＰＩ３Ｋインヒビター治療、ＭＥＫインヒビター治療、又はこれらの組合せの後のＮＣＩ−Ｈ２２２８細胞におけるシグナル伝達分析物の活性化を示す図である。分析物を、処置４時間後又は２４時間後（＊）のいずれかに測定した。
【図９Ａ】ＰＩ３Ｋインヒビター治療、ＭＥＫインヒビター治療、又はこれらの組合せの後のＮＣＩ−Ｈ６６１細胞におけるシグナル伝達分析物の活性化を示す図である。分析物を、処置４時間後又は２４時間後（＊）のいずれかに測定した。
【図９Ｂ】ＰＩ３Ｋインヒビター治療、ＭＥＫインヒビター治療、又はこれらの組合せの後のＮＣＩ−Ｈ６６１細胞におけるシグナル伝達分析物の活性化を示す図である。分析物を、処置４時間後又は２４時間後（＊）のいずれかに測定した。
【図１０Ａ】ＰＩ３Ｋインヒビター治療、ＭＥＫインヒビター治療、又はこれらの組合せの後のＮＣＩ−Ｈ６４７細胞におけるシグナル伝達分析物の活性化を示す図である。分析物を、処置４時間後又は２４時間後のいずれかに測定した。
【図１０Ｂ】ＰＩ３Ｋインヒビター治療、ＭＥＫインヒビター治療、又はこれらの組合せの後のＮＣＩ−Ｈ６４７細胞におけるシグナル伝達分析物の活性化を示す図である。分析物を、処置４時間後又は２４時間後のいずれかに測定した。
【図１１】ＰＩ３Ｋインヒビター（例えば、ＢＡＹ８４１２３６）治療、ＭＥＫインヒビター（例えば、ＢＡＹ８６９７６６）治療、又はこれらの組合せの後のＮＣＩ−Ｈ４６０細胞におけるシグナル伝達分析物の活性化を示す図である。分析物を、処置４時間後又は２４時間後のいずれかに測定した。
【図１２】ＰＩ３Ｋインヒビター（例えば、ＢＡＹ８４１２３６）治療、ＭＥＫインヒビター（例えば、ＢＡＹ８６９７６６）治療、又はこれらの組合せの後のＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞におけるシグナル伝達分析物の活性化を示す図である。分析物を、処置４時間後又は２４時間後のいずれかに測定した。
【図１３】様々な癌細胞株におけるＰＩ３ＫインヒビターのＩＣ５０での、ｐ−ＡＫＴ阻害、ｐ−ＰＲＡＳ４０阻害、及びｐＲＰＳ６阻害のレベルを強調する図である。表は、細胞株におけるＰＩ３ＫインヒビターＧＤＣ０９４１のＩＣ５０を示す。
【図１４】ＰＩ３Ｋ活性化を有する細胞株は、ＰＩ３Ｋインヒビターに対するＩＣ５０が低いことを示す図である。ＩＣ５０値は、１つ又は複数のシグナル伝達経路における変更を２つ以上有する細胞株（例えば、Ｃａｌｕ−６）で増大した。グラフは、ホスホ−ＰＩ３Ｋは、ＰＩ３Ｋインヒビターに対する感受性のマーカーであることを示す。
【図１５】患者＃１からの試料（ＳＧ１、ＳＧ２、及びＳＧ３）における、シグナル伝達分析物の発現及び活性化のレベルを示す図である。試料は、治療の間、１クールの治療を受ける前（ＳＧ１）、及び８日目（ＳＧ２）、及び２８日目（ＳＧ３）に患者から得た。分析物のレベルを、対照のタンパク質であるサイトケラチン（ＣＫ）の発現に対して標準化した。
【図１６】患者＃２からの２試料（ＤＰ１及びＤＰ２）における、シグナル伝達分析物の発現及び活性化のレベルを示す図である。試料は、１クールの治療を受ける前（ＤＰ１）及び治療の間（ＤＰ２）に患者から得た。分析物のレベルを、対照のタンパク質であるサイトケラチン（ＣＫ）の発現に対して標準化した。
【図１７】患者＃３に対するシグナル伝達分析物の発現及び活性化のレベルを表す表である。患者にＰＩＫ３ＣＡ又はＢＲＡＦ変異はない。１単位あたりの活性化した分析物及び１単位あたりの全分析物のレベルを、測定した各分析物のＣＵの決定値に基づいて算出した。
【図１８】患者＃４からの２つの生検試料におけるシグナル伝達分析物の発現及び活性化のレベルを示す図である。
【図１９】１クールの治療を受ける前、及び治療の間に採取した、患者＃５からの試料におけるシグナル伝達分析物の発現及び活性化のレベルを示す図である。
【図２０Ａ】患者＃６からの２つの生検試料におけるシグナル伝達分析物の発現及び活性化のレベルを示す図である。
【図２０Ｂ】患者＃６からの２つの生検試料におけるシグナル伝達分析物の発現及び活性化のレベルを示す図である。
【図２１】１クールの治療を受ける前、及び治療の間の、直腸結腸癌患者からの試料におけるシグナル伝達分析物の発現及び活性化のレベルを示す図である。
【図２２】１クールの治療を受ける前、及び治療の間の、非小細胞肺癌患者からの試料におけるシグナル伝達分析物の発現及び活性化のレベルを示す図である。
【図２３】乳癌患者６０人からのＦＮＡ試料における、活性化したＰＩ３Ｋ（左の棒）及び活性化したＡＫＴ（右の棒）のレベルを示す図である。
【図２４】図２３のデータの統計学的分析を示す図である。特に、ｐ−ＰＩ３Ｋ及びｐ−ＡＫＴに対するカットオフ値を調べて、統計的に関連ある相関を同定した。
【図２５】試料における様々なカットオフ値でのｐ−ＰＩ３Ｋレベルの分布を示す図である。
【図２６】試料における様々なカットオフ値でのｐ−ＡＫＴレベルの分布を示す図である。
【図２７】配列表に記載された抗原（配列番号：１）、及び他のＰＩ３Ｋ抗原に対して産生させた抗体のイムノブロット分析を示す図である。ブロットは、抗体ＴＹ−１２４６６、ＹＫ−１２４６９、及び４Ｇ１０は、ヘレグリンで刺激した細胞におけるＰＩ３Ｋのｐ８５サブユニットを検出することができることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
Ｉ．序文
[0048]上記に記載した通り、細胞の増殖に関与するシグナル伝達経路の活性化は、多くの異なるタイプの癌に特徴的である分子上の特色である。多くの場合、特定のシグナル伝達経路及びその構成成分の活性は、所与のタイプの癌に対する分子シグネチャーとして働き得る。このような活性化した構成成分は、治療的介入に有用な標的をさらに提供し得る。したがって、処置前、処置間、及び処置後の癌細胞内の特定のシグナル伝達システムの活性レベルの知識は、医師に、適用すべき好適な処置コース（ｃｏｕｒｓｅ  ｏｆ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を選択するのに用いることができる高度に関連のある情報を提供する。さらに、処置が進行するにつれ癌細胞において活性であるシグナル伝達経路を絶えずモニタリングすることにより、処置の有効性に対するさらなる情報を医師に提供することができ、例えば、同じ又は別のいずれかのシグナル伝達経路を活性化するさらなる異常によって、癌細胞が処置に抵抗性になっている場合に、特定の処置コースを継続するか、又は別の系統の処置に切り替えるか否かのいずれかを医師に促す。
【００２２】
[0049]したがって、本発明は、腫瘍細胞（例えば、循環細胞、細針吸引物、又は組織生検）における、複数のシグナル伝達経路の構成成分の状態（例えば、発現及び／又は活性化のレベル）を検出するための方法を提供する。本発明を実践することに由来する、シグナル伝達経路の構成成分の発現及び／又は活性化の状態に対する情報を、癌の診断、予後に、及び患者特異的な癌の処置のデザインにおいて用いることができる。本発明は、制御解除されたシグナリング経路を下方制御し、又は停止するのに好適な治療（単一の薬物又は薬物の組合せ）を選択するための方法も提供する。このように、本発明は、癌患者に個別化された治療のデザインを促進するのに用いることができる。
【００２３】
[0050]腫瘍の治療を開発する上での一手法は、活性化したシグナル伝達経路により細胞内シグナリングを阻止することである。前臨床モデルにより、ＰＩ３Ｋ経路インヒビターを使用すると、ＰＩ３Ｋ活性化を有する乳癌患者における劇的な抗癌性の応答を誘発することができることが実証されていた。最も興味深いのは、ＰＩＫ３ＣＡ変異の存在がＰＩ３Ｋ治療に応答した患者と相関しなかったことである。本発明の方法は、ＰＩ３Ｋ経路の活性化、及びＰＩ３Ｋシグナリングを収束し、又はＰＩ３Ｋシグナル伝達を代償する他のシグナリング経路を測定する（例えば、検出及び定量化する）のに用いられる。これらの方法は、ＰＩ３Ｋインヒビター及びＰＩ３Ｋインヒビター−組合せ治療に対して臨床的に感受性である癌患者を選択するのに有用である。処置が進行するにつれ癌細胞において活性であるシグナル伝達経路を絶えずモニタリングすることで、処置の有効性に対するさらなる情報を医師に提供することができ、例えば、同じ又は別のいずれかのシグナル伝達経路を活性化するさらなる異常によって癌細胞が処置に対して抵抗性になった場合、医師に、特定の処置コースを継続し、又は別のラインの処置に切り替えることを促す。
【００２４】
[0051]本明細書の方法は、腫瘍細胞が、抗癌治療に応答して、１つ又は複数の代償性のシグナリング経路を活性化することができることを確かめるのに用いられている。いかなる特定の理論に拘泥しようとするものではないが、腫瘍細胞は、インヒビターの直接的な標的ではない、関連のシグナリング経路を活性化することにより、特定の経路のインヒビターに適応すると考えられている。このように、経路特異的（ｐａｔｈｗａｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）インヒビターとの組合せ治療は、いくつかの癌の処置に対する最適な応答を実現するのに必要とされ得る。さらに、これらの所見は、臨床上の設定において、活性化したシグナリング経路をモニタリングするための方法に対する必要性を強調するものである。
【００２５】
ＩＩ．定義
[0052]「癌」の語は、異常な細胞の非制御の成長によって特徴付けられる一クラスの疾患の任意のメンバーを含むことが意図される。この語は、悪性、良性、軟組織、又は固形と特徴付けられても、いなくても、全ての知られている癌及び新生物性の状態を含み、転移前及び転移後の癌を含めた全ての病期及び進行度の癌を含む。様々なタイプの癌の例には、それだけには限定されないが、消化性及び胃腸の癌、例えば、胃癌（例えば、胃の癌）、直腸結腸癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、消化管カルチノイド腫瘍、結腸癌、直腸癌、肛門癌、胆管癌、小腸癌、及び食道癌；乳癌；肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））；胆嚢癌；肝臓癌；膵臓癌；虫垂癌；前立腺癌、卵巣癌；腎臓癌（例えば、腎細胞癌）；中枢神経系の癌；皮膚癌；リンパ腫；神経膠腫；絨毛癌；頭部及び頸部の癌；骨原性肉腫；並びに血液の癌が含まれる。非小細胞肺癌の例には、それだけには限定されないが、扁平上皮癌、大細胞癌、及び腺癌が含まれる。本明細書で用いられる「腫瘍」は、１つ又は複数の癌性細胞を含む。
【００２６】
[0053]「分析物」の語は、その存在、量（発現レベル）、活性化状態、及び／又は同一性が決定される、対象の任意の分子、典型的にはポリペプチドなどの巨大分子を含む。ある場合において、分析物は、シグナル伝達分子、例えば、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭｅｔ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＭＥＫ、又はＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナリング経路の成分などである。他のシグナル伝達分子は以下に列挙するものである。
【００２７】
[0054]「シグナル伝達分子」又は「シグナル伝達物質」の語は、それにより細胞が細胞外シグナル又は細胞外刺激を応答に変換するプロセスを実行するタンパク質及びその他の分子を含み、細胞の内側の順序づけられた配列の生化学反応を伴うのが典型的である。シグナル伝達分子の例には、それだけには限定されないが、受容体チロシンキナーゼ、例えば、ＥＧＦＲ（例えば、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１／ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ４／ＥｒｂＢ４）、ＶＥＧＦＲ１／ＦＬＴ１、ＶＥＧＦＲ２／ＦＬＫ１／ＫＤＲ、ＶＥＧＦＲ３／ＦＬＴ４、ＦＬＴ３／ＦＬＫ２、ＰＤＧＦＲ（例えば、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ）、ｃ−ＫＩＴ／ＳＣＦＲ、ＩＮＳＲ（インスリン受容体）、ＩＧＦ−ＩＲ、ＩＧＦ−ＩＩＲ、ＩＲＲ（インスリン受容体−関連受容体）、ＣＳＦ−１Ｒ、ＦＧＦＲ１〜４、ＨＧＦＲ１〜２、ＣＣＫ４、ＴＲＫ  Ａ〜Ｃ、ｃ−ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＥＰＨＡ１〜８、ＥＰＨＢ１〜６、ＡＸＬ、ＭＥＲ、ＴＹＲＯ３、ＴＩＥ１〜２、ＴＥＫ、ＲＹＫ、ＤＤＲ１〜２、ＲＥＴ、ｃ−ＲＯＳ、Ｖ−カドヘリン、ＬＴＫ（白血球チロシンキナーゼ）、ＡＬＫ（未分化リンパ腫キナーゼ）、ＲＯＲ１〜２、ＭＵＳＫ、ＡＡＴＹＫ１〜３、及びＲＴＫ１０６；切断型の受容体チロシンキナーゼ、例えば、欠損したアミノ末端細胞外ドメインを有する切断されたＨＥＲ２受容体（例えば、ｐ９５ＥｒｂＢ２（ｐ９５ｍ）、ｐ１１０、ｐ９５ｃ、ｐ９５ｎなど）、欠損したアミノ末端細胞外ドメインを有する切断されたｃＭＥＴ受容体、及び欠損したアミノ末端細胞外ドメインを有する切断されたＨＥＲ３受容体；受容体チロシンキナーゼ二量体（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３；ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ２；ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、又はＨＥＲ４を有する切断されたＨＥＲ３受容体；ＨＥＲ２／ＨＥＲ２；ＨＥＲ３／ＨＥＲ３；ＨＥＲ２／ＨＥＲ３；ＨＥＲ１／ＨＥＲ２；ＨＥＲ１／ＨＥＲ３；ＨＥＲ２／ＨＥＲ４；ＨＥＲ３／ＨＥＲ４など）；非受容体チロシンキナーゼ、例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｓｒｃ、Ｆｒｋ、Ｂｔｋ、Ｃｓｋ、Ａｂｌ、Ｚａｐ７０、Ｆｅｓ／Ｆｐｓ、Ｆａｋ、Ｊａｋ、Ａｃｋ、及びＬＩＭＫ；チロシンキナーゼシグナリングカスケード構成成分、例えば、ＡＫＴ（例えば、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３）、ＭＥＫ（ＭＡＰ２Ｋ１）、ＥＲＫ２（ＭＡＰＫ１）、ＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３）、ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ１１０）、ＰＩＫ３Ｒ１（ｐ８５））、ＰＤＫ１、ＰＤＫ２、ホスファターゼ及びテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、ＳＧＫ３、４Ｅ−ＢＰ１、Ｐ７０Ｓ６Ｋ（例えば、ｐ７０  Ｓ６キナーゼスプライスバリアントアルファＩ）、タンパク質チロシンホスファターゼ（例えば、ＰＴＰ１Ｂ、ＰＴＰＮ１３、ＢＤＰ１など）、ＲＡＦ、ＰＬＡ２、ＭＥＫＫ、ＪＮＫＫ、ＪＮＫ、ｐ３８、Ｓｈｃ（ｐ６６）、Ｒａｓ（例えば、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ）、Ｒｈｏ、Ｒａｃ１、Ｃｄｃ４２、ＰＬＣ、ＰＫＣ、ｐ５３、サイクリンＤ１、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸（ＰＩＰ３）、ｍＴＯＲ、ＢＡＤ、ｐ２１、ｐ２７、��ＯＣＫ、ＩＰ３、ＴＳＰ−１、ＮＯＳ、ＧＳＫ−３β、ＲＳＫ１〜３、ＪＮＫ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｒｂ、ＣＲＥＢ、Ｋｉ６７、及びパキシリン；核ホルモン受容体、例えば、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、アンドロゲン受容体、糖質コルチコイド受容体、鉱質コルチコイド受容体、ビタミンＡ受容体、ビタミンＤ受容体、レチノイド受容体、甲状腺ホルモン受容体、及びオーファン受容体；核受容体コアクチベーター及びリプレッサー、例えば、それぞれ、乳癌における増幅−１（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ−１）（ＡＩＢ１）及び核内受容体コリプレッサー１（ＮＣＯＲ）；並びにこれらの組合せが含まれる。
【００２８】
[0055]「活性化状態」の語は、特定のシグナル伝達分子、又はＰＩ３Ｋシグナリング経路構成成分などの分析物が活性化されているか否かを意味する。同様に、「活性化レベル」の語は、ＰＩ３Ｋシグナリング構成成分などの特定のシグナル伝達分子が活性化されている度合いを意味する。活性化状態は、１つ又は複数のシグナル伝達分子の、リン酸化、ユビキチン化、及び／又は複合体形成の状態に相当するのが典型的である。活性化状態の非限定的な例（カッコ内に列挙する）には、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ、リン酸化（ｐ−）ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ：Ｓｈｃ、ユビキチン化（ｕ−）ＥＧＦＲ、ｐ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ＥｒｂＢ２（ｐ−ＥｒｂＢ２、ｐ９５ＨＥＲ２（切断されたＥｒｂＢ２）、ｐ−ｐ９５ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ２：Ｓｈｃ、ＥｒｂＢ２：ＰＩ３Ｋ、ＥｒｂＢ２：ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ４）；ＥｒｂＢ３（ｐ−ＥｒｂＢ３、切断されたＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ３：ＰＩ３Ｋ、ｐ−ＥｒｂＢ３：ＰＩ３Ｋ、ＥｒｂＢ３：Ｓｈｃ）；ＥｒｂＢ４（ｐ−ＥｒｂＢ４、ＥｒｂＢ４：Ｓｈｃ）；ｃ−ＭＥＴ（ｐ−ｃ−ＭＥＴ、切断されたｃ−ＭＥＴ、ｃ−Ｍｅｔ：ＨＧＦ複合体）；ＡＫＴ１（ｐ−ＡＫＴ１）；ＡＫＴ２（ｐ−ＡＫＴ２）；ＡＫＴ３（ｐ−ＡＫＴ３）；ＰＴＥＮ（ｐ−ＰＴＥＮ）；Ｐ７０Ｓ６Ｋ（ｐ−Ｐ７０Ｓ６Ｋ）；ＭＥＫ（ｐ−ＭＥＫ）；ＥＲＫ１（ｐ−ＥＲＫ１）；ＥＲＫ２（ｐ−ＥＲＫ２）；ＰＤＫ１（ｐ−ＰＤＫ１）；ＰＤＫ２（ｐ−ＰＤＫ２）；ＳＧＫ３（ｐ−ＳＧＫ３）；４Ｅ−ＢＰ１（ｐ−４Ｅ−ＢＰ１）；ＰＩＫ３Ｒ１（ｐ−ＰＩＫ３Ｒ１）；ｃ−ＫＩＴ（ｐ−ｃ−ＫＩＴ）；ＥＲ（ｐ−ＥＲ）；ＩＧＦ−１Ｒ（ｐ−ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦ−１Ｒ：ＩＲＳ、ＩＲＳ：ＰＩ３Ｋ、ｐ−ＩＲＳ、ＩＧＦ−１Ｒ：ＰＩ３Ｋ）；ＩＮＳＲ（ｐ−ＩＮＳＲ）；ＦＬＴ３（ｐ−ＦＬＴ３）；ＨＧＦＲ１（ｐ−ＨＧＦＲ１）；ＨＧＦＲ２（ｐ−ＨＧＦＲ２）；ＲＥＴ（ｐ−ＲＥＴ）；ＰＤＧＦＲＡ（ｐ−ＰＤＧＦＲＡ）；ＰＤＧＦＲＢ（ｐ−ＰＤＧＦＲＢ）；ＶＥＧＦＲ１（ｐ−ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ１：ＰＬＣγ、ＶＥＧＦＲ１：Ｓｒｃ）；ＶＥＧＦＲ２（ｐ−ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ２：ＰＬＣγ、ＶＥＧＦＲ２：Ｓｒｃ、ＶＥＧＦＲ２：ヘパリン硫酸、ＶＥＧＦＲ２：ＶＥ−カドヘリン）；ＶＥＧＦＲ３（ｐ−ＶＥＧＦＲ３）；ＦＧＦＲ１（ｐ−ＦＧＦＲ１）；ＦＧＦＲ２（ｐ−ＦＧＦＲ２）；ＦＧＦＲ３（ｐ−ＦＧＦＲ３）；ＦＧＦＲ４（ｐ−ＦＧＦＲ４）；ＴＩＥｌ（ｐ−ＴＩＥｌ）；ＴＩＥ２（ｐ−ＴＩＥ２）；ＥＰＨＡ（ｐ−ＥＰＨＡ）；ＥＰＨＢ（ｐ−ＥＰＨＢ）；ＧＳＫ−３β（ｐ−ＧＳＫ−３β）；ＮＦＫＢ（ｐ−ＮＦＫＢ）、ＩＫＢ（ｐ−ＩＫＢ、ｐ−Ｐ６５：ＩＫＢ）；ＢＡＤ（ｐ−ＢＡＤ、ＢＡＤ：１４−３−３）；ｍＴＯＲ（ｐ−ｍＴＯＲ）；Ｒｓｋ−１（ｐ−Ｒｓｋ−１）；Ｊｎｋ（ｐ−Ｊｎｋ）；Ｐ３８（ｐ−Ｐ３８）；ＳＴＡＴ１（ｐ−ＳＴＡＴ１）；ＳＴＡＴ３（ｐ−ＳＴＡＴ３）；ＦＡＫ（ｐ−ＦＡＫ）；ＲＢ（ｐ−ＲＢ）；Ｋｉ６７；ｐ５３（ｐ−ｐ５３）；ＣＲＥＢ（ｐ−ＣＲＥＢ）；ｃ−Ｊｕｎ（ｐ−ｃ−Ｊｕｎ）；ｃ−Ｓｒｃ（ｐ−ｃ−Ｓｒｃ）；パキシリン（ｐ−パキシリン）；ＧＲＢ２（ｐ−ＧＲＢ���）、Ｓｈｃ（ｐ−Ｓｈｃ）、Ｒａｓ（ｐ−Ｒａｓ）、ＧＡＢ１（ｐ−ＧＡＢ１）、ＳＨＰ２（ｐ−ＳＨＰ２）、ＧＲＢ２（ｐ−ＧＲＢ２）、ＣＲＫＬ（ｐ−ＣＲＫＬ）、ＰＬＣγ（ｐ−ＰＬＣγ）、ＰＫＣ（例えば、ｐ−ＰＫＣα、ｐ−ＰＫＣβ、ｐ−ＰＫＣδ）、アデュシン（ｐ−アデュシン）、ＲＢ１（ｐ−ＲＢ１）、及びＰＹＫ２（ｐ−ＰＹＫ２）が含まれる。
【００２９】
[0056]「シグナリング」又は「経路」の語は、この語が言及するシグナル伝達経路の任意の構成成分を含む。例えば、ＰＩ３Ｋシグナリング経路のメンバーは、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＰＴＥＮ、ＰＩＰ３、ＰＤＫ１、ＰＫＢ、４Ｅ−８Ｐ１、ｍＴＯＲ、Ｐ７０Ｓ６Ｋ、及びＲＰＳ６を含めた、ＰＩ３Ｋシグナリング経路の任意のメンバーを意味する。ＭＥＫシグナリング経路のメンバーには、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＭＥＫ、ＥＲＫ（ＭＡＰＫ）、ＥＬＫ１、ＦＯＳ、ＭＮＫ１、ＲＳＫ、及びｅｌＦ４３が含まれる。
【００３０】
[0057]「標的の治療」又は「経路特異的治療」の語は、疾患状態において制御解除されるタンパク質又は分子の、発現及び／又は活性化の状態を変更することができる治療薬剤の使用を含む。
【００３１】
[0058]「腫瘍適応」の語は、腫瘍が、治療介入後に進行する能力を含む。例えば、腫瘍適応は、腫瘍が、抗癌治療に抵抗性になると生じる。腫瘍適応は、腫瘍細胞におけるシグナリング経路がインヒビター処置によって阻止され、別のシグナリング経路が活性化され、このようにして腫瘍細胞がインヒビター処置に抵抗性になる場合に生じ得る。
【００３２】
[0059]「疾患進行」の語は、癌のさらなる徴候又は症状をもたらし得る、成長又は伝播を続ける癌の分類を含む。例えば、ＮＳＣＬＣを有する患者の肺組織における腫瘍の再発を、本明細書において疾患進行と記述する。
【００３３】
[0060]「フィードバック阻害」又は「ネガティブフィードバックループ」の語は、シグナル伝達経路の特定の構成成分があるレベルに蓄積すると、特定のシグナル伝達経路が阻害され（例えば、阻止される、不活性化される）、それによって経路の活性が制御される、シグナル伝達のメカニズムを含む。
【００３４】
[0061]「疾患進行」の語は、癌のさらなる徴候又は症状をもたらし得る、成長又は伝播を続ける癌の分類を含む。例えば、ＮＳＣＬＣを有する患者の肺組織における腫瘍の再発を、本明細書において疾患進行と記述する。
【００３５】
[0062]本明細書で用いられる「応答性」の語は、発癌性のシグナリング経路を抑止し、又は疾患状態を軽減する治療に対して、腫瘍細胞又は対象が応答する（例えば、反応する、変化する、改変する）能力を含む。例えば、薬物処置に応答性である対象は、疾患進行若しくは腫瘍適応における低減、又は疾患の寛解を経験し得る。「非応答性」の語は、腫瘍細胞又は対象が治療に反応する能力がないことを含む。
【００３６】
[0063]「経路プロファイル」又は「経路のシグネチャー」の語は、細胞株又は患者の癌からの腫瘍細胞における１つ又は複数のシグナル伝達分子の、活性化状態の決定（例えば、測定、カテゴリー化、分析、又は分類）を含む。いくつかの場合において、プロファイル又はシグネチャーは、任意の抗癌薬の非存在下又は存在下で、腫瘍細胞を用いて産生される。
【００３７】
[0064]「系列変化」の語は、異なる時点で対象から採取した試料における、タンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルにおける変化をアッセイが検出する能力を含む。例えば、ＰＩ３Ｋタンパク質の発現レベル及び／又は活性化レベルを、治療を開始する前の時間を含めた治療クールの間、患者においてモニタリングすることができる。
【００３８】
[0065]本明細書で用いられる「希釈系列」の語は、特定の試料（例えば、細胞可溶化物）又は試薬（例えば、抗体）の一連の下降性の濃度を含むことが意図される。希釈系列は、測定した量の出発濃度の試料又は試薬を希釈剤（例えば、希釈バッファー）と混合してより低濃度の試料又は試薬を作り出し、このプロセスを所望の数の系列希釈を得るのに十分な回数繰り返す一プロセスによって作成されるのが典型的である。試料又は試薬を、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、５００、又は１０００倍連続的に希釈して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０の下降性の濃度の試料又は試薬を含む希釈系列を作成することができる。例えば、出発濃度１ｍｇ／ｍｌの捕獲抗体試薬の２倍系列希釈を含む希釈系列は、ある量の出発濃度の捕獲抗体を等量の希釈バッファーと混合して、０．５ｍｇ／ｍｌ濃度の捕獲抗体を作り出し、このプロセスを繰り返して、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．１２５ｍｇ／ｍｌ、０．０６２５ｍｇ／ｍｌ、０．０３２５ｍｇ／ｍｌなどの捕獲抗体の濃度を得ることにより作成することができる。
【００３９】
[0066]本明細書で用いられる「優れたダイナミックレンジ」の語は、アッセイが、１個ほどの少数の細胞において、又は何千もの多数の細胞において、特定の分析物を検出する能力を意味する。例えば、希釈系列の捕獲抗体濃度を用いて約１〜１０，０００細胞（例えば、約１、５、１０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００、７５０、１０００、２５００、５０００、７５００、又は１０，０００細胞）における、特定の対象のシグナル伝達分子を検出するのが有利であるという理由で、本明細書に記載するイムノアッセイは優れたダイナミックレンジを有する。
【００４０】
[0067]本明細書で用いられる「循環細胞」の語は、固形腫瘍から転移又は微小転移のいずれかをした腫瘍外の（ｅｘｔｒａｔｕｍｏｒａｌ）細胞を含む。循環細胞の例には、それだけには限定されないが、循環腫瘍細胞、癌幹細胞、及び／又は腫瘍に向かって遊走する細胞（例えば、循環内皮前駆細胞、循環内皮細胞、循環プロ血管新生骨髄細胞、循環樹状細胞など）が含まれる。循環細胞を含む患者試料は、任意の入手可能な生物学的液体（例えば、全血、血清、血漿、痰、気管支洗浄液、尿、乳頭吸引液、リンパ、唾液、細針吸引物など）から得ることができる。ある場合において、全血試料は、血漿又は血清の分画と、細胞分画（すなわち、細胞ペレット）に分離される。細胞分画は、赤血球、白血球、及び／又は固形腫瘍の循環細胞、例えば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、循環内皮細胞（ＣＥＣ）、循環内皮前駆細胞（ＣＥＰＣ）、癌幹細胞（ＣＳＣ）、リンパ節の播種された腫瘍細胞、及びこれらの組合せを含むのが典型的である。血漿又は血清の分画は通常、とりわけ、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、及び固形腫瘍の循環細胞によって放出されるタンパク質を含む。
【００４１】
[0068]循環細胞は、例えば、免疫磁気分離法（例えば、Ｒａｃｉｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５巻、４５８９〜４５９４頁（１９９８年）；Ｂｉｌｋｅｎｒｏｔｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、９２巻、５７７〜５８２頁（２００１年）を参照されたい）、Ｉｍｍｕｎｉｃｏｎ（Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ  Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ）によるＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ、マイクロ流体分離（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）（例えば、Ｍｏｈａｍｅｄら、ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ．Ｎａｎｏｂｉｏｓｃｉ．、３巻、２５１〜２５６頁（２００４年）；Ｌｉｎら、第９７回ＡＡＣＲ年次会合、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．（２００６年）抄録第５１４７号を参照されたい）、ＦＡＣＳ（例えば、Ｍａｎｃｕｓｏら、Ｂｌｏｏｄ、９７巻、３６５８〜３６６１頁（２００１年）を参照されたい）、密度勾配遠心分離（例えば、Ｂａｋｅｒら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１３巻、４８６５〜４８７１頁（２００３年）を参照されたい）、及び枯渇法（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）（例えば、Ｍｅｙｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．、２１巻、５２１〜５３０頁（２００２年）を参照されたい）を含めた１つ又は複数の分離方法を用いて、患者試料から単離されるのが典型的である。
【００４２】
[0069]本明細書で用いる「試料」の語は、患者から得た任意の生物学的検体を含む。試料は、制限なく、全血、血漿、血清、赤血球、白血球（例えば、末梢血単核細胞）、管洗浄液、乳頭吸引液、リンパ（例えば、播種されたリンパ節の腫瘍細胞）、骨髄吸引液、唾液、尿、糞便（すなわち、大便）、痰、気管支洗浄液、涙液、細針吸引物（例えば、ランダム乳輪周囲細針吸入（ｒａｎｄｏｍ  ｐｅｒｉａｒｅｏｌａｒ  ｆｉｎｅ  ｎｅｅｄｌｅ  ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）によって収集したもの）、任意の他の体液、組織試料（例えば、腫瘍組織）、例えば、腫瘍（例えば、針生検）又はリンパ節（例えば、センチネルリンパ節生検）の生検、組織試料（例えば、腫瘍組織）、例えば、腫瘍の外科切除、並びにこれらの細胞抽出物が含まれる。いくつかの実施形態において、試料は全血又はその分画構成成分、例えば、血漿、血清、若しくは細胞ペレットである。好ましい実施形態において、試料は、固形腫瘍の循環細胞を、全血又はその細胞分画から、当技術分野において知られている任意の技術を用いて単離することによって得られる。他の実施形態において、試料は、例えば、胃又は消化管の他の部分の固形腫瘍からの、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織試料である。
【００４３】
[0070]「生検」は、診断又は予後の評価のために組織試料を除去するプロセス、及び組織検体自体を意味する。当技術分野において知られている任意の生検技術を、本発明の方法及び組成物に適用することができる。適用される生検技術は、一般的に、他の要因の中で、評価しようとする組織のタイプ、並びに腫瘍のサイズ及びタイプ（すなわち、固形又は懸濁（すなわち、血液若しくは腹水））に依存する。代表的な生検技術には、切除生検、切開生検、針生検（例えば、コア針生検、細針吸引生検など）、外科生検、及び骨髄生検が含まれる。生検技術は、例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｋａｓｐｅｒら編集、第１６版、２００５年、チャプター７０に、及びＰａｒｔＶを通して論じられる。当業者であれば、生検技術は、所与の組織試料において、癌細胞及び／又は前癌細胞を同定するのに行うことができることを理解されよう。
【００４４】
[0071]本明細書で用いられる「循環細胞」の語は、固形腫瘍から転移又は微小転移のいずれかをした腫瘍外の細胞を含む。循環細胞の例には、それだけには限定されないが、循環腫瘍細胞、癌幹細胞、及び／又は腫瘍に向かって遊走する細胞（例えば、循環内皮前駆細胞、循環内皮細胞、循環プロ血管新生骨髄細胞、循環樹状細胞など）が含まれる。
【００４５】
[0072]「対象」又は「患者」又は「個体」の語はヒトを含むのが典型的であるが、例えば、他の霊長動物、齧歯動物、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ブタなどの他の動物も含むことができる。
【００４６】
[0073]前立腺癌に対する「グリーソングレード」の語は、１〜１０のグレードと規定される。第１のグレードに対する１つのスコア及び第２のグレードに対する１つのスコアの、２つのグリーソングレード数を実際に決定し、次いで加算して最終のグリーソンスコアを得る。グリーソンスコアは、病理学者により生検された組織試料の、第１のグレードと第２のグレードの和である。グリーソングレードスケール上の最低数は１であり、最高は５である。その結果、合計スコアは２（１＋１）〜１０（５＋５）であり得る。２〜４のスコアは、癌の侵襲スケール上、非常に低い。５〜６のスコアは、軽度の侵襲性である。スコア７は、癌が中程度に侵襲性であることを示す。８〜１０のスコアは、癌が高度に侵襲性であることを示す。
【００４７】
ＩＩＩ．実施形態の説明
[0074]一実施形態において、本発明は、患者からの腫瘍試料における、シグナル伝達分析物の発現のレベル及び／又は活性化（例えば、リン酸化）の度合いを測定（例えば、検出及び定量化）するための方法を提供する。別の一態様において、方法は患者に特異的な経路プロファイルを提供し、プロファイルは、基準経路プロファイルに対する、シグナル伝達分析物の発現及び／又は活性化の状態を表す。いくつかの実施形態において、基準プロファイルは、健常対象又は癌を有することが疑われない対象の経路プロファイルを表す。他の実施形態において、基準プロファイルは、癌細胞株の経路プロファイルを表す。
【００４８】
[0075]したがって、本発明は、乳癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、及び直腸結腸癌などの固形腫瘍を有する患者に利益を提供するのが有利である。いくつかの実施形態において、方法は、抗癌薬（例えば、ＨＥＲファミリーインヒビター、ＰＩ３Ｋインヒビター、ＡＫＴインヒビター、ＭＥＫインヒビター、ｍＴＯＲインヒビター、アロマターゼインヒビター、ＰＴＥＮインヒビター、ｃＭＥＴインヒビターなど）及びこれらの組合せに対して臨床的に感受性である癌患者を選択するのに有用である。いくつかの実施形態において、方法は、患者に対して第一線の治療を選択するのに用いられる。他の実施形態において、方法は、進行性の、再発性の、又は再燃性の癌を有する患者に対して治療を選択するために行われる。本明細書の方法は、組合せ治療を選択するのに、又は適切な投与量及び処置レジメンを選択するのに、やはり有用である。
【００４９】
[0076]いくつかの実施形態において、基準経路プロファイルは、抗癌薬処置の前に、特定のタイプの癌（例えば、乳房腫瘍、肺腫瘍、直腸結腸腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍など）を有する患者から得た試料を用いて産生される。
【００５０】
[0077]別の一実施形態において、本発明は、癌細胞株に由来する試料における、シグナル伝達分析物の発現のレベル及び／又は活性化（例えば、リン酸化又は複合体形成）の度合いを測定（例えば、検出及び定量化）することによる、基準経路プロファイルを決定するための方法を提供する。いくつかの場合において、癌細胞株を、成長因子（例えば、ヘレグリン、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−αなど）、及び／又は標的のインヒビターで刺激する。別の一態様において、方法は、細胞株及び／又は標的のインヒビターに特異的な経路プロファイルを提供し、プロファイルは、標的のインヒビター又はその組合せでの処置の前、間、及び／又は後の、細胞株のシグナル伝達分析物の発現及び／又は活性化の状態を表す。
【００５１】
[0078]いくつかの実施形態において、細胞株は、それだけには限定されないが、乳癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、胃癌、皮膚癌、膵臓癌、前立腺癌、及び直腸結腸癌などの癌を有する患者に由来する。他の実施形態において、細胞株は、膀胱、乳房、肺、膵臓、胃、皮膚などのヒトの組織に由来する。さらに他の実施形態において、細胞株は癌細胞株である。いくつかの実施形態において、方法は、抗癌薬で処置した癌細胞株において、１つ又は複数のシグナル伝達分析物における変化を測定するのに有用である。
【００５２】
[0079]別の一実施形態において、本発明は、抗癌薬の存在下又は非存在下のいずれかで、腫瘍試料におけるシグナル伝達タンパク質の活性化状態の検出及び／又は定量化を比較することによる、固形腫瘍癌を有する患者に抗癌薬の処置を選択するための方法を提供する。例えば、患者からの試料を様々な抗癌薬に暴露し、特定のセットのシグナル伝達分析物の活性化状態によって決定される通り、細胞に対して最も深刻な抗癌効果を誘発する抗癌薬が、最適の治療として患者に選択される。本発明の方法を用いて、癌に対して患者特異的な個別化治療をデザインすることができる。他の実施形態において、方法を用いて、新たな治療を開発するための、新薬の開発につながる（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）標的を同定することができる。
【００５３】
[0080]本発明は、癌に伴う１つ又は複数の制御解除されたシグナル伝達経路を下方制御（例えば、不活性化又は停止）するのに好適な治療を選択するための方法も提供する。このように、本発明を用いて、所与の患者の腫瘍又は試料における、全ての及び／又は活性化したシグナル伝達タンパク質の収集によって提供される特定の分子シグネチャーに基づく、個別化治療のデザインを促進することができる。
【００５４】
[0081]別の一実施形態において、本発明は、治療クールの間に採取した、患者からの腫瘍試料におけるシグナル伝達分析物の、発現のレベル及び／又は活性化（例えば、リン酸化）の度合いを測定（例えば、検出及び定量化）することにより、疾患進行をモニタリングするための方法を提供する。処置の進行とともに癌細胞において活性であるシグナル伝達経路を絶えずモニタリングすることで、医師に、処置の有効性に対するさらなる情報がもたらされ、例えば、癌細胞が、同じ又は別のいずれかのシグナル伝達経路の活性化によって処置に対して抵抗性になった場合に、医師に、特定の処置コースを続け、又は別の処置のラインに切り替えるかのいずれかを促す。本明細書に記載する方法は、患者における腫瘍細胞が、抗癌治療に応答して１つ又は複数の代償性のシグナル経路を活性化したのを確認するのに用いられる。
【００５５】
[0082]いくつかの実施形態において、疾患をモニタリングするための方法を周期的に行って、経時の腫瘍細胞における変化を追跡する。経路の分析物の変化の長期的な分析は、治療応答又は疾患進行の予後マーカーであり得る。さらに別の一実施形態において、本発明の組成物及び方法は、標的のプロテインキナーゼにおける変異のため抗癌治療に対して抵抗性である患者、治療薬に対する抵抗性を獲得している患者、シグナル伝達分子により治療に適応している患者、治療レジメンに不服従である患者、及び／又は最適以下の薬物の投薬量を投与されている患者を同定するのに有利である。いくつかの実施形態において、方法は、特定の抗癌治療に対する患者の応答を予想することを含む。例えば、本発明の方法を、特定の経路プロファイル（例えば、活性化したＰＩ３Ｋ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、及び／又はＨＥＲ３）を有する患者は、患者が以前にトリプルネガティブ乳癌（例えば、ＥＲ−、ＰＲ−、ＨＥＲ２−）と診断されたとしても、組合せ治療（例えば、ＨＥＲ２調節性薬物及びＴＫＩ）の恩恵を受ける可能性があることを予想するのに用いることができる。
【００５６】
[0083]いくつかの実施形態において、本発明の方法は、１つ又は複数の標的の治療を受けている患者からの試料に対して、治療クールにわたって試料をスクリーニング及びモニタリングし、患者が代替の標的の治療又は組合せ治療に切り替えるか否かを評価することにより行われる。ある態様において、本発明は、癌又は腫瘍が現存する抗癌治療に適応しているか否かを決定するための方法を提供する。ある場合において、治療に対する腫瘍適応は、代償性のシグナル伝達経路の活性化をもたらし、この活性化は本発明の方法を用いて検出することができる。他の場合において、患者における腫瘍適応の決定により、患者の処置を代替の標的の治療又は組合せ治療に切り替えることが指摘される。
【００５７】
[0084]ある態様において、本明細書に記載する方法は、癌又は腫瘍の現存する抗癌治療に対する適応をモニタリング及び追跡することである。ある場合において、ＣＥＥＲ技術を用いて経路の分析物の活性化を追跡及びモニタリングすることにより、例えば、活性化及び／又は発現を関連する経路にそらすことにより、現存する治療に対する経路の代償が存在するか否かを確認することができる。これらの技術により、治療の有効性の評価が可能になる。オリジナルの経路の活性化が停止又は低減した場合、関連の経路を調査して、別の経路に経路の代償が存在するか否かを確認することが重要である。これらの場合には、組合せ治療のレジメンを推奨してもよく、又は治療を完全に切り替えることを推奨してもよい。例えば、本明細書に記載する実施例３、４、及び６において説明する通り、本発明の方法を用いて、抗癌治療時に再発した患者からの腫瘍細胞における、活性化したＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭＥＴ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＥＲＫ、ＭＥＫ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＤＫ１、ＰＲＡＳ４０、ＰＴＥＮ、ＲＰＳ６、ＳＨＣのレベルをモニタリングする。これらの患者の腫瘍において、治療によって直接標的とならない代償性のシグナリング経路が活性化された。有利なことに、本明細書の方法を用いて、経路プロファイリング分析は、患者がＰＩ３Ｋインヒビター治療、ＭＥＫインヒビター治療、又は組合せ治療の臨床的恩恵を受け得ることを指摘する。
【００５８】
[0085]標的のタンパク質又は遺伝子変異単独の発現の分析には、癌を有する対象、又は癌を有すると疑われる対象に対して臨床的有効性が最大である好適な治療レジメンを選択するのに限界がある。シグナル伝達分析物の包括的な経路プロファイリングにより、特定の抗癌剤の意図する標的のタンパク質に対する、これら抗癌剤の有効性に対する見識ある情報がもたらされる。本発明の方法は、代償性の経路の活性化など、潜在的な薬物抵抗性のメカニズムに関する価値ある情報も提供し、効果的な治療的処置に対する指針、及び癌を有する患者に対するレジメンを提供する。
【００５９】
Ａ．抗体アレイ
[0086]ある態様において、乳癌、肺癌、膵臓癌、直腸結腸癌、胃癌、皮膚癌、又は他の癌の細胞などの癌細胞の細胞抽出物における、１つ又は複数の（例えば、複数の）シグナル伝達分子（例えば、受容体チロシンキナーゼ、例えば、ＨＥＲ２、若しくはＥｒｂＢファミリーの他のメンバー、若しくはＰＩ３Ｋなどのシグナリング経路構成成分）の発現レベル及び／又は活性化状態を、支持体上に固定されている希釈系列の捕獲抗体を含む抗体ベースのアレイを用いて検出する。アレイは、様々なアドレス指定できる（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）位置において固体支持体の表面にカップリングされている、ある範囲の捕獲抗体濃度の、複数の様々な捕獲抗体を含むのが典型的である。
【００６０】
[0087]いくつかの特定の実施形態において、本発明のシグナル伝達経路プロファイリングは、少なくとも１つ又は複数のＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ｃＭＥＴ、ｃＫＩＴ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＥＲＫ、及び／又はＣＫ（すなわち、サイトケラチン）の発現レベル（例えば、合計量）を決定すること、並びに／或いは少なくとも１つ又は複数のＨＥＲ１（例えば、ｐＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（例えば、ｐＨＥＲ２）、ＨＥＲ３（例えば、ｐＨＥＲ３）、ｃＭＥＴ（例えば、ｐｃＭＥＴ）、ｃＫＩＴ（例えば、ｐｃＫＩＴ）、ＩＧＦ−１Ｒ（例えば、ｐＩＧＦ−１Ｒ）、ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩ３Ｋ複合体）、ＡＫＴ（例えば、ｐＡＫＴ）、ＥＲＫ（例えば、ｐＥＲＫ）、ＳＨＣ（例えば、ｐＳＨＣ）、ＰＲＡＳ４０（例えば、ｐＰＲＡＳ４０）、ｐ７０Ｓ６Ｋ（例えば、ｐ−ｐ７０Ｓ６Ｋ）、ＲＰＳ６（例えば、ｐＲＰＳ６）、ＭＥＫ（例えば、ｐＭＥＫ）、ＰＤＫ１（例えば、ｐＰＤＫ１）、及び／又はＰＴＥＮ（例えば、ｐＰＴＥＮ）の活性化レベル（例えば、リン酸化（「ｐ」）若しくは複合体形成のレベル）を決定することを含む。
【００６１】
[0088]特定の一実施形態において、本発明は、固体支持体上に固定されている複数の希釈系列の捕獲抗体を含む、優れたダイナミックレンジを有するアドレス指定できるアレイを提供するものであり、固体支持体では、各希釈系列の捕獲抗体は、シグナル伝達経路の構成成分及び他の標的タンパク質に対応する１つ又は複数の分析物に特異的である。様々な態様において、この実施形態は、特定の腫瘍に特徴的なシグナル伝達経路、例えば、腫瘍細胞において活性であるシグナル伝達経路（例えば、ＨＥＲ経路、ｃＭＥＴ経路、ＩＧＦ１Ｒ経路、ＭＥＫ経路、ＰＩ３Ｋ経路）の構成成分を含むアレイを含む。このように、本発明は実践すると有利であり得、各シグナル伝達分子、又は癌を引き起こす潜在的な発現若しくは活性化の欠損を有する対象の他のタンパク質が単一のアレイ又はチップ上に表される。いくつかの態様において、特定の癌細胞において活性である所与のシグナル伝達経路の構成成分は、情報が細胞内のシグナル伝達経路によって中継される配列に対応する直線状の配列で整列している。特定の癌細胞において活性である所与のシグナル伝達経路の１つ又は複数の構成成分に特異的な捕獲抗体は、表面に関連する任意のアーチファクトを最小にするようにランダム化された様式でプリントすることもできる。このような多重化されたイムノアレイの例には、協同的近接イムノアッセイ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）（ＣＯＰＩＡ）としても知られる、協同的酵素増強反応性イムノアッセイ（ＣＥＥＲ）が含まれる。ＣＥＥＲは、その開示の全文が全ての目的で参照によって本明細書に組み入れられる、以下の特許文書である、米国特許第８，１６３，４９９号；国際公開第２００８／０３６８０２号パンフレット、国際公開第２００９／０１２１４０号パンフレット、国際公開第２００９／１０８６３７号パンフレット、国際公開第２０１０／１３２７２３号パンフレット、国際公開第２０１１／００８９９０号パンフレット、国際公開第２０１１／０５００６９号パンフレット、及び２０１１年１２月２１日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／６６６２４、２０１２年３月２日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１２／２７５７４、及び２０１２年８月３１日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／５３５０５に記載されている。
【００６２】
[0089]他の実施形態において、癌細胞の細胞抽出物における、シグナル伝達分析物（複数可）の１つ又は複数の（例えば、複数の）発現レベル及び／又は活性化状態を、ＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイを用いて検出する。シグナル伝達分析物の存在又はレベルを決定するのに適するＥＬＩＳＡキットには、例えば、Ａｎｔｉｇｅｎｉｘ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＹ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）、ＣＨＥＭＩＣＯＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）、Ｎｅｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＫＹ）、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）、Ａｌｐｃｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓａｌｅｍ、ＮＨ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、及び／又はＡｂａｚｙｍｅ（Ｎｅｅｄｈａｍ、ＭＡ）がある。
【００６３】
１．単一検出アッセイ
[0090]いくつかの実施形態において、腫瘍細胞などの細胞の細胞抽出物における、対象の特定の分析物（例えば、ＰＩ３Ｋシグナリング経路、ＭＥＫシグナリング経路、ＨＥＲ２シグナリング経路、ＨＥＲ３シグナリング経路、及び／又は他の受容体チロシンキナーゼシグナリング経路の構成成分などのシグナル伝達分子）の発現及び／又は活性化のレベルを検出するためのアッセイは、優れたダイナミックレンジを有する、多重化された、ハイスループット２抗体アッセイである。非限定的な例として、アッセイにおいて用いられる２つの抗体は、（１）分析物に特異的な捕獲抗体、及び（２）活性化形態の分析物に特異的な検出抗体（すなわち、活性化状態依存的抗体）を含むことができる。活性化状態依存的抗体は、例えば、リン酸化、ユビキチン化、及び／又は複合体形成の状態の分析物を検出することができる。或いは、検出抗体は、細胞抽出物における分析物の合計量を検出する、活性化状態依存的抗体を含む。
【００６４】
[0091]特定の一実施形態において、対象の分析物の発現又は活性化のレベルを検出するための２抗体のアッセイは、
（ｉ）細胞抽出物を、１つ又は複数の希釈系列の捕獲抗体とインキュベートして、複数の捕獲された分析物を形成させるステップと、
（ｉｉ）複数の捕獲された分析物を、対応する分析物に特異的な検出抗体とインキュベートして、複数の検出可能な捕獲された分析物を形成させるステップであって、検出抗体が、分析物の活性化（例えば、リン酸化）のレベルを検出するための活性化状態依存的抗体、又は分析物の発現レベル（例えば、合計量）を検出するための活性化状態非依存的抗体を含むステップと、
（ｉｉｉ）複数の検出可能な捕獲された分析物を、シグナル増幅対の第１のメンバー及び第２のメンバーとインキュベートして、増幅したシグナルを産生させるステップと、
（ｉｖ）シグナル増幅対の第１のメンバー及び第２のメンバーから産生された、増幅したシグナルを検出するステップと
を含む。
【００６５】
[0092]捕獲抗体及び検出抗体が、分析物の結合に関して、抗体間の競合を最小にするように選択されるのが好ましい（すなわち、捕獲抗体及び検出抗体の両方が、対応するシグナル伝達分子に同時に結合することができる）。
【００６６】
[0093]一実施形態において、検出抗体は、スルフヒドリルが活性化するデキストラン分子にコンジュゲートしている。いくつかの態様において、スルフヒドリルが活性化するデキストラン分子の分子量は５００ｋＤａである。
【００６７】
[0094]一実施形態において、検出抗体は、結合対の第１のメンバー（例えば、ビオチン）を含み、シグナル増幅対の第１のメンバーは、結合対の第２のメンバー（例えば、ストレプトアビジン）を含む。結合対のメンバーは、当技術分野においてよく知られている方法を用いて、検出抗体に、又はシグナル増幅対の第１のメンバーに、直接的又は間接的にカップリングしていてもよい。ある場合において、シグナル増幅対の第１のメンバーはペルオキシダーゼ（例えば、セイヨウワサビのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、カタラーゼ、クロロペルオキシダーゼ、シトクロムｃペルオキシダーゼ、好酸球ペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、甲状腺ペルオキシダーゼ、脱ヨウ素酵素など）であり、シグナル増幅対の第２のメンバーはチラミド試薬（例えば、ビオチンチラミド）である。これらの場合において、増幅したシグナルをチラミド試薬のペルオキシダーゼ酸化によって産生して、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の存在下で活性化したチラミドを生成する。
【００６８】
[0095]活性化したチラミドは、直接検出される、又は、例えば、ストレプトアビジン標識したフルオロフォア、若しくはストレプトアビジン標識したペルオキシダーゼと色素産生性試薬との組合せなどのシグナル検出試薬を添加したときに検出される。本発明において使用するのに適するフルオロフォアの例には、それだけには限定されないが、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、テトラローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ＣｙＤｙｅ（商標）蛍光（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５）などが含まれる。ストレプトアビジン標識は、当技術分野においてよく知られている方法を用いて、フルオロフォア又はペルオキシダーゼに、直接的又は間接的にカップリングしていてもよい。本発明における使用に適する色素産生性試薬の非限定的な例には、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）、３，３’−ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、４−クロロ−１−ナフトール（４ＣＮ）、及び／又はポルフィリノーゲンが含まれる。
【００６９】
[0096]本明細書に記載する２抗体アッセイを行うための例示のプロトコールは、その開示の全文が全ての目的で参照によって本明細書に組み入れられる、国際公開第２００９／１０８６３７号パンフレットにおいて提供される。
【００７０】
[0097]２抗体の手法の別の一実施形態において、本発明は、切断された受容体の発現又は活性化のレベルを検出するための方法を提供し、方法は、
（ｉ）細胞抽出物を、全長の受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズとインキュベートするステップと、
（ｉｉ）複数のビーズを細胞抽出物から除去し、それによって全長の受容体を除去して、全長の受容体のない細胞抽出物を形成させるステップと、
（ｉｉｉ）全長の受容体のない細胞抽出物を、全長の受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域に特異的な希釈系列の１つ又は複数の捕獲抗体とインキュベートして、捕獲され切断された複数の受容体を形成させるステップと、
（ｉｖ）捕獲された切断された複数の受容体を、全長の受容体のＩＣＤ結合領域に特異的な検出抗体とインキュベートして、複数の検出可能な捕獲され切断された受容体を形成させるステップであって、検出抗体が、切断された受容体の発現レベル（例えば、全量）を検出するための、切断された受容体又は活性化状態非依存的抗体の活性化（例えば、リン酸化）レベルを検出するための、活性化状態依存的抗体を含むステップと、
（ｖ）複数の検出可能な捕獲され切断された受容体を、シグナル増幅対の第１のメンバー及び第２のメンバーとインキュベートして、増幅したシグナルを産生するステップと、
（ｖｉ）シグナル増幅対の第１のメンバー及び第２のメンバーから産生された増幅したシグナルを検出するステップと
を含む。
【００７１】
[0098]ある実施形態において、切断された受容体はｐ９５ＨＥＲ２であり、全長の受容体はＨＥＲ２である。他のある実施形態において、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズは、ストレプトアビジン−ビオチン対を含み、ビオチンはビーズに付着しており、ビオチンは抗体に付着している（例えば、抗体は、全長の受容体のＥＣＤ結合領域に特異的である）。
【００７２】
[0099]その開示の全文が全ての目的で参照によって本明細書に組み入れられる、国際公開第２００９／１０８６３７号パンフレットは、対象の受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する抗体でコーティングされているビーズは、全長の受容体（例えば、ＨＥＲ２）に結合して、アッセイからいかなる全長の受容体を除去するが、切断された受容体（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２）には結合しないことを示している。国際公開第２００９／１０８６３７号パンフレットは、切断された受容体（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２）は、捕獲抗体にひとたび結合すると、次いで全長の受容体（例えば、ＨＥＲ２）の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）に特異的な検出抗体によって検出され得ることを示している。検出抗体は、セイヨウワサビのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に直接コンジュゲートし得る。次いで、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）を行って、検出しようとするシグナルを産生してもよい。切断された受容体（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２）の発現レベル又は活性化状態を調べて、例えば、その合計濃度、又はそのリン酸化状態、ユビキチン化状態、及び／又は複合体形成状態を決定することができる。
【００７３】
２．二重検出アッセイ
[0100]一実施形態において、本発明は、それだけには限定されないが、ＨＥＲ１／ＨＥＲ２二量体、ＨＥＲ１／ＨＥＲ３二量体、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３二量体、ＨＥＲ２／ＨＥＲ２二量体、ＨＥＲ２／ＨＥＲ４二量体、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３二量体、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ２二量体などを含めた、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のホモ二量体化又はヘテロ二量体化を、検出及び／又は定量化するための方法を提供する。ホモ二量体は、ホモ二量体化と呼ばれるプロセスにおいて、ＨＥＲ２／ＨＥＲ２などの２つの同一の分子によって形成され、ヘテロ二量体は、ヘテロ二量体化と呼ばれるプロセスにおいて、ＨＥＲ１／ＨＥＲ３などの２つの異なる巨大分子によって形成される。この態様において、近接アッセイは、（１）二量体対の１メンバーに特異的な捕獲抗体、（２）二量体対の第１のメンバーに特異的な第１の検出抗体（第１の検出抗体は、捕獲抗体と異なるドメインに特異的である）、及び（３）二量体対の第２のメンバーに特異的な第２の検出抗体の３つの抗体を含む。癌細胞におけるＲＴＫ二量体化の検出に関するＣＥＥＲ技術は、その開示の全文が全ての目的で参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許公開第２００８／０２６１８２９号、第２００９／００３５７９２号、第２０１０／０１６７９４５号、第２０１１／００７１０４２号、及び第２０１１／０２８１７４８号に記載されている。
【００７４】
[0101]別の一実施形態において、本発明は、ＰＩ３Ｋ複合体の量、並びにＰＩ３Ｋ複合体の活性化及び／又はリン酸化の量を、検出及び／又は定量化するための方法を提供する。ＰＩ３Ｋ複合体は、ｉ）二量体化した受容体チロシンキナーゼ対、ｉｉ）ＰＩ３Ｋ  ｐ８５サブユニット及びＰＩ３Ｋ  ｐ１１０（例えば、α又はβ）サブユニットを含む。アッセイは、（１）ＰＩ３Ｋ  ｐ８５又はＰＩ３Ｋ  ｐ１１０のいずれかのサブユニットに特異的な捕獲抗体、（２）二量体対の第１のメンバー又はＰＩ３Ｋサブユニットに特異的な第１の検出抗体であって、第１の検出抗体が捕獲抗体と異なるドメインに特異的であり、ＰＩ３Ｋサブユニットが活性化していてもよい、第１の検出抗体、及び（３）二量体対の第２のメンバー又はＰＩ３Ｋサブユニットに特異的な第２の検出抗体の３つの抗体を含む。
【００７５】
[0102]特定の一実施形態において、ａ）二量体化した受容体チロシンキナーゼ対、ｂ）ＰＩ３Ｋ  ｐ８５サブユニット及びＰＩ３Ｋ  ｐ１１０サブユニットを含むＰＩ３Ｋ複合体のレベルを測定（例えば、検出及び定量化）するための近接アッセイは、
（ｉ）細胞抽出物を、１つ又は複数の希釈系列の捕獲抗体とインキュベートして、複数の捕獲された分析物を形成させるステップと、
（ｉｉ）複数の捕獲された分析物を、ａ）二量体化した受容体チロシンキナーゼ対の１メンバーに特異的な、第１の若しくは複数の第１の活性化状態非依存的抗体、又はｂ）ＰＩ３Ｋ  ｐ１１０サブユニットのいずれかを含む第１の検出抗体、並びにａ）二量体化した受容体チロシンキナーゼ対、ＰＩ３Ｋ  ｐ８５、若しくはＰＩ３Ｋ  ｐ１１０サブユニットの１メンバーに特異的な、ａ）第２の若しくは複数の第２の活性化状態非依存的抗体、又はｂ）ＰＩ３Ｋ  ｐ８５サブユニット及び／若しくはＰＩ３Ｋ  ｐ１１０サブユニットに特異的な活性化状態依存的抗体のいずれかを含む第２の検出抗体とインキュベートして、複数の検出可能な、捕獲され、二量体化され、複合体化された分析物を形成するステップであって、
第１の検出抗体が、促進性部分で標識されており、第２の検出抗体がシグナル増幅対の第１のメンバーで標識されており、促進性部分が、シグナル増幅対の第１のメンバーに向けて流れ、第１のメンバーと反応する酸化剤を産生するステップと、
（ｉｉｉ）複数の検出可能な、捕獲され、二量体化された分析物を、シグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして、増幅したシグナルを産生するステップと、
（ｉｖ）シグナル増幅対の第１のメンバー及び第２のメンバーから産生された増幅したシグナルを検出するステップであって、増幅したシグナルの量が細胞抽出物におけるＰＩ３Ｋ複合体の量に相関的であるステップと
を含む。
【００７６】
[0103]いくつかの実施形態において、ＰＩ３Ｋ複合体のレベルを、ｉ）少なくとも２つの受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の二量体化、ｉｉ）ＰＩ３Ｋ  ｐ８５サブユニット及びＰＩ３Ｋ  ｐ１１０サブユニットを含む前記ＰＩ３Ｋ複合体に対して産生された検量線に対して較正する。
【００７７】
[0104]いくつかの実施形態において、ＰＩ３Ｋ複合体活性化のレベルを、ａ）ホスホ−ＰＩ３Ｋの量を、試料中に存在するＰＩ３Ｋの合計レベルと比べること、及びｂ）活性化したＰＩ３Ｋ複合体の全ＰＩ３Ｋに対する比を確立することにより決定する。ＰＩ３Ｋ複合体活性化のレベルは、比に基づいて決定される。いくつかの場合において、ＰＩ３Ｋ複合体活性化のレベルはカットオフ閾値未満であり、これは対象がＰＩ３Ｋインヒビター処置の恩恵を受けないことを指摘する。いくつかの場合において、ＰＩ３Ｋ複合体活性化のレベルはカットオフ閾値を超え、これは対象がＰＩ３Ｋインヒビター処置の恩恵を受けることを指摘する。
【００７８】
[0105]いくつかの実施形態において、ＰＩ３Ｋ複合体活性化（例えば、リン酸化したＰＩ３Ｋ複合体）のレベルは、ＰＩ３Ｋインヒビター単独を対象に選択しなければならないことを指摘する。他の実施形態において、ＰＩ３Ｋ複合体活性化のレベルは、ＰＩ３Ｋインヒビター及び別の抗癌薬を含む組合せ治療を対象に選択しなければならないことを指摘する。
【００７９】
[0106]腫瘍細胞におけるＰＩ３Ｋ複合体形成の検出に関するＣＥＥＲ技術は、その開示の全文が全ての目的で参照によって本明細書に組み入れられる、２０１２年８月３１日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５３５０５に記載されている。
【００８０】
[0107]いくつかの実施形態において、特定のシグナル伝達分析物の活性化状態の決定は、活性化した分析物の量の、分析物合計の量に対する比を産生することを含む。例えば、活性化したＰＩ３Ｋの全ＰＩ３Ｋに対する比は、試料中のＰＩ３Ｋの活性化状態を表す。対象の活性化した分析物の全分析物に対する比により、対象の分析物の様々な発現を有する試料間の比較が可能になる。
【００８１】
[0108]いくつかの実施形態において、患者試料からの１セットのシグナル伝達分析物の活性化状態は、１つ又は複数の統計上のアルゴリズムによって、経路プロファイルに変換される。
【００８２】
[0109]いくつかの実施形態において、腫瘍細胞などの細胞の細胞抽出物における、対象の特定の分析物（例えば、ＨＥＲ２シグナリング経路、ＨＥＲ３シグナリング経路、及び／又は他の受容体チロシンキナーゼシグナリング経路の構成成分などのシグナル伝達分子）の、発現及び／又は活性化レベルを検出するためのアッセイは、複合の、ハイスループットの、優れたダイナミックレンジを有する近接（すなわち、３抗体）アッセイを含む。非限定的な例として、近接アッセイにおいて用いられる３抗体は、（１）分析物に特異的な捕獲抗体、（２）活性化型の分析物に特異的な検出抗体（すなわち、活性化状態依存的抗体）、及び（３）全量の分析物を検出する検出抗体（すなわち、活性化状態非依存的抗体）を含むことができる。活性化状態依存的抗体は、分析物の、例えば、リン酸化、ユビキチン化、及び／又は複合体形成状態を検出することができる。活性化状態非依存的抗体は、全量の分析物を検出することができる。特定の実施形態において、本明細書に記載する近接アッセイを協同的酵素増強反応性イムノアッセイ（ＣＥＥＲ）と呼ぶ。
【００８３】
[0110]特定の一実施形態において、対象の分析物の活性化レベル又は状態を検出するための近接アッセイ（例えば、ＣＥＥＲ）は、
（ｉ）細胞抽出物を、１つ又は複数の希釈系列の捕獲抗体とインキュベートして、複数の捕獲された分析物を形成させるステップと、
（ｉｉ）複数の捕獲された分析物を、１つ又は複数の活性化状態非依存的抗体、及び対応する分析物に特異的な活性化状態依存的抗体の１つ又は複数を含む検出抗体とインキュベートして、複数の検出可能な捕獲された分析物を形成するステップであって、
活性化状態非依存的抗体が促進性部分で標識されており、活性化状態依存的抗体がシグナル増幅対の第１のメンバーで標識されており、促進性部分が、シグナル増幅対の第１のメンバーに向けて流れ、第１のメンバーと反応する酸化剤を産生するステップと、
（ｉｉｉ）複数の検出可能な捕獲された分析物を、シグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして増幅したシグナルを産生するステップと、
（ｉｖ）シグナル増幅対の第１のメンバー及び第２のメンバーから産生された増幅したシグナルを検出するステップと
を含む。
【００８４】
[0111]別の特定の一実施形態において、切断された受容体である対象の分析物の活性化レベル又は状態を検出するための近接アッセイ（例えば、ＣＥＥＲ）は、
（ｉ）細胞抽出物を、全長の受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＲ）結合領域に特異的な複数のビーズとインキュベートするステップと、
（ｉｉ）複数のビーズを細胞抽出物から除去し、それによって全長の受容体を除去して、全長の受容体のない細胞抽出物を形成させるステップと、
（ｉｉｉ）全長の受容体のない細胞抽出物を、全長の受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域に特異的な捕獲抗体の１つ又は複数とインキュベートして、捕獲され切断された複数の受容体を形成させるステップと、
（ｉｖ）捕獲され切断された複数の受容体を、１つ又は複数の活性化状態非依存的抗体、及び全長の受容体のＩＣＤ結合領域に特異的な１つ又は複数の活性化状態依存的抗体を含む検出抗体とインキュベートして、検出可能な捕獲され切断された複数の受容体を形成させるステップであって、
活性化状態非依存的抗体が促進性部分で標識され、活性化状態依存的抗体がシグナル増幅対の第１のメンバーで標識され、促進性部分はシグナル増幅対の第１のメンバーに向けて流れ、第１のメンバーと反応する酸化剤を産生するステップと、
（ｖ）検出可能な捕獲され切断された複数の受容体を、シグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして増幅したシグナルを産生させるステップと、
（ｖｉ）シグナル増幅対の第１のメンバー及び第２のメンバーから産生された増幅したシグナルを検出するステップと
を含む。
【００８５】
[0112]ある実施形態において、切断された受容体はｐ９５ＨＥＲ２であり、全長の受容体はＨＥＲ２である。他のある実施形態において、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズはストレプトアビジン−ビオチン対を含み、ビオチンはビーズに付着しており、ビオチンは抗体に付着している（例えば、抗体は全長の受容体のＥＣＤ結合領域に特異的である）。
【００８６】
[0113]一実施形態において、検出抗体は、スルフヒドリルが活性化するデキストラン分子にコンジュゲートしている。スルフヒドリルが活性化するデキストラン分子の分子量は約５００ｋＤａ（例えば、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、又は７５０ｋＤａ）であるのが典型的である。
【００８７】
[0114]代替の実施形態において、活性化状態依存的抗体を促進性部分で標識してもよく、活性化状態非依存性抗体をシグナル増幅対の第１のメンバーで標識してもよい。
【００８８】
[0115]別の非限定的な一例として、本明細書に記載する近接アッセイ（例えば、ＣＥＥＲ）において用いる３抗体は、（１）分析物に特異的な捕獲抗体、（２）全量の分析物を検出する特異的な第１の検出抗体（すなわち、第１の活性化状態非依存的抗体）、及び（３）全量の分析物を検出する第２の検出抗体（すなわち、第２の活性化状態非依存的抗体）を含むことができる。好ましい実施形態において、第１及び第２の活性化状態非依存的抗体は、分析物上の異なる（例えば、個々の）エピトープを認識する。
【００８９】
[0116]特定の一実施形態において、対象の分析物の発現レベルを検出するための近接アッセイ（例えば、ＣＥＥＲ）は、
（ｉ）細胞抽出物を、１つ又は複数の希釈系列の捕獲抗体とインキュベートして、複数の捕獲された分析物を形成させるステップと、
（ｉｉ）複数の捕獲された分析物を、相当する分析物に特異的な１つ又は複数の、第１及び第２の活性化状態非依存的抗体を含む検出抗体とインキュベートして、複数の検出可能な捕獲された分析物を形成させるステップであって、
第１の活性化状態非依存的抗体が促進性部分で標識されており、第２の活性化状態非依存的抗体がシグナル増幅対の第１のメンバーで標識されており、促進性部分がシグナル増幅対の第１のメンバーに向けて流れ、第１のメンバーと反応する酸化剤を産生するステップと、
（ｉｉｉ）複数の検出可能な捕獲された分析物を、シグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして増幅したシグナルを産生するステップと、
（ｉｖ）シグナル増幅対の第１のメンバー及び第２のメンバーから産生された、増幅したシグナルを検出するステップと
を含む。
【００９０】
[0117]特定の別の一実施形態において、切断された受容体である対象の分析物の発現レベルを検出するための近接アッセイ（例えば、ＣＥＥＲ）は、
（ｉ）細胞抽出物を、全長の受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズとインキュベートするステップと、
（ｉｉ）複数のビーズを細胞抽出物から除去し、それにより全長の受容体を除去して全長の受容体のない細胞抽出物を形成させるステップと、
（ｉｉｉ）全長の受容体のない細胞抽出物を、全長の受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域に特異的な１つ又は複数の捕獲抗体とインキュベートして、捕獲され切断された複数の受容体を形成させるステップと、
（ｉｖ）捕獲され切断された複数の受容体を、全長の受容体のＩＣＤ結合領域に特異的な第１及び第２の活性化状態非依存的抗体の１つ又は複数を含む検出抗体とインキュベートして、複数の検出可能な捕獲され切断された受容体を形成させるステップであって、
第１の活性化状態非依存的抗体が促進性部分で標識されており、第２の活性化状態非依存的抗体がシグナル増幅対の第１のメンバーで標識されており、促進性部分がシグナル増幅対の第１のメンバーに向けて流れ、第１のメンバーと反応する酸化剤を産生するステップと、
（ｖ）複数の検出可能な捕獲され切断された受容体を、シグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして、増幅したシグナルを産生させるステップと、
（ｉｖ）シグナル増幅対の第１のメンバー及び第２のメンバーから産生された、増幅したシグナルを検出するステップと
を含む。
【００９１】
[0118]ある実施形態において、切断された受容体はｐ９５ＨＥＲ２であり、全長の受容体はＨＥＲ２である。他のある実施形態において、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズはストレプトアビジン−ビオチン対を含み、ビオチンはビーズに付着しており、ビオチンは抗体に付着している（例えば、抗体は全長の受容体のＥＣＤ結合領域に特異的である）。
【００９２】
[0119]代替の実施形態において、第１の活性化状態非依存的抗体は、シグナル増幅対の第１のメンバーで標識されていてよく、第２の活性化状態非依存的抗体は促進性部分で標識されていてもよい。
【００９３】
[0120]本明細書に記載する近接アッセイは、様々なアドレス指定できる位置で固体支持体の表面にカップリングしている、ある範囲の捕獲抗体濃度の１つ又は複数の様々な捕獲抗体を含む、抗体ベースのアレイであるのが典型的である。本発明において用いるのに適する固体支持体の例を上記に記載する。
【００９４】
[0121]捕獲抗体、活性化状態非依存的抗体、及び活性化状態依存的抗体は、分析物の結合に関して抗体間の競合を最小にするように選択されるのが好ましい（すなわち、全ての抗体が、これらの対応するシグナル伝達分子に同時に結合することができる）。
【００９５】
[0122]いくつかの実施形態において、１つ又は複数の分析物の活性化レベルを検出するための活性化状態非依存的抗体、又は代替的に、１つ又は複数の分析物の発現レベルを検出するための第１の活性化状態非依存的抗体は、検出可能な部分をさらに含んでいる。このような場合には、検出可能な部分の量は、細胞抽出物における１つ又は複数の分析物の量に相関的である。検出可能な部分の例には、それだけには限定されないが、蛍光標識、化学反応性標識、酵素標識、放射性標識などが含まれる。検出可能な部分が、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）；ローダミン、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、テトラローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ＣｙＤｙｅ（商標）蛍光（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５）などのフルオロフォアであるのが好ましい。検出可能な部分は、当技術分野においてよく知られている方法を用いて、活性化状態非依存的抗体に、直接的又は間接的にカップリングしてもよい。
【００９６】
[0123]ある場合において、１つ又は複数の分析物の活性化レベルを検出するための活性化状態非依存的抗体、又は代替的に、１つ又は複数の分析物の発現レベルを検出するための第１の活性化状態非依存的抗体は、促進性部分で直接標識されている。促進性部分は、当技術分野においてよく知られている方法を用いて、活性化状態非依存的抗体にカップリングしていてもよい。本発明において用いるのに適する促進性部分には、促進性部分に対して近接の（すなわち、空間的に近く、又は密接した）別の分子に向けて流れ（すなわち、それに向かい）、別の分子と反応する（すなわち、結合し、それにより結合され、若しくはそれと複合体を形成する）酸化剤を産生することができる任意の分子が含まれる。促進性部分の例には、制限なく、電子受容体として分子酸素（Ｏ２）を伴う酸化／還元反応を触媒するグルコースオキシダーゼ又は任意の他の酵素などの酵素、及びメチレンブルー、ローズベンガル、ポルフィリン、スクアレート（ｓｑｕａｒａｔｅ）色素、フタロシアニンなどの光増感剤が含まれる。酸化剤の非限定的な例には、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、一重項酸素、及び酸化／還元反応において酸素原子を輸送し、又は電子を獲得する任意の他の化合物が含まれる。適切な基質（例えば、グルコース、光など）の存在下で、促進性部分（例えば、グルコースオキシダーゼ、光増感剤など）が、２つの部分が相互に近接している場合にシグナル増幅対の第１のメンバー（例えば、セイヨウワサビのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、保護基によって保護されているハプテン、酵素インヒビターに対するチオエーテル連結によって不活化されている酵素など）に向けて流れ、第１のメンバーと反応する酸化剤（例えば、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、一重項酸素など）を産生するのが好ましい。
【００９７】
[0124]ある場合において、促進性部分及び活性化状態非依存的抗体は、スルフヒドリルが活性化するデキストラン分子にコンジュゲートしていてもよい。スルフヒドリルが活性化するデキストラン分子の分子量は、約５００ｋＤａ（例えば、約２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、又は７５０ｋＤａ）であるのが典型的である。
【００９８】
[0125]他のある場合において、１つ又は複数の分析物の活性化レベルを検出するための活性化状態非依存的抗体、又は代替的に、１つ又は複数の分析物の発現レベルを検出するための第１の活性化状態非依存的抗体は、活性化状態依存的抗体にコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドリンカーと促進性部分にコンジュゲートしている相補的なオリゴヌクレオチドリンカーとの間のハイブリダイゼーションによって、促進性部分で間接的に標識されている。オリゴヌクレオチドリンカーは、当技術分野においてよく知られている方法を用いて、促進性部分又は活性化状態非依存的抗体にカップリングしていてもよい。いくつかの実施形態において、促進性部分にコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドリンカーは、活性化状態非依存的抗体にコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドリンカーに対して１００％の相補性を有する。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドリンカー対は、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーション時に、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又はそれを超えるミスマッチ領域を含む。当業者であれば、様々な分析物に特異的な活性化状態非依存的抗体は、同じオリゴヌクレオチドリンカー又は異なるオリゴヌクレオチドリンカーのいずれかにコンジュゲートしていてもよいことを理解されよう。
【００９９】
[0126]促進性部分又は活性化状態非依存的抗体にコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドリンカーの長さは変動することができる。一般的に、リンカー配列は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、又は１００ヌクレオチドの長さであってよい。ランダムな核酸配列がカップリングのために産生されるのが典型的である。非限定的な一例として、一ライブラリーのオリゴヌクレオチドリンカーを、スペーサードメイン、シグネチャードメイン、及びコンジュゲーションドメインの、３つの別々の隣接するドメインを有するようにデザインすることができる。オリゴヌクレオチドリンカーが、それに対してリンカーがコンジュゲートしている、促進性部分又は活性化状態非依存的抗体の機能を損なわずに、効率的にカップリングするようにデザインされるのが好ましい。
【０１００】
[0127]オリゴヌクレオチドリンカー配列は、様々なアッセイ条件下で、任意の２次構造の形成を防ぎ、又は最小にするようにデザインすることができる。融解温度は、全体的なアッセイ手順にリンカーが関与できるように、リンカー内の各セグメントに対して注意深くモニタリングされるのが典型的である。一般的に、リンカー配列のセグメントの融解温度の範囲は、１〜１０℃の間である。規定されたイオン濃度下で融解温度、二次構造、及びヘアピン構造を決定するためのコンピュータアルゴリズム（例えば、ＯＬＩＧＯ６．０）を用いて、各リンカー内の３つの異なるドメイン各々を分析することができる。全体的な組み合わされた配列を、その構造の特徴付け、及び他のコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドリンカー配列に対するその互換性、例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、相補的なオリゴヌクレオチドリンカーにハイブリダイズするか否かについて分析することもできる。
【０１０１】
[0128]オリゴヌクレオチドリンカーのスペーサー領域により、コンジュゲーションドメインの、オリゴヌクレオチド架橋部位からの十分な分離がもたらされる。コンジュゲーションドメインは、相補的なオリゴヌクレオチドリンカー配列で標識された分子を、核酸ハイブリダイゼーションによりコンジュゲーションドメインに連結するように機能する。核酸媒介性ハイブリダイゼーションを、抗体−分析物（すなわち、抗原）複合体形成の前又は後のいずれかに行うことができ、より柔軟なアッセイフォーマットが提供される。直接的抗体コンジュゲーション法の多くと異なり、比較的小型のオリゴヌクレオチドの、抗体又は他の分子への連結は、抗体の、その標的の分析物に対する特異的な親和性に対して、又はコンジュゲートした分子の機能に対して影響が最小である。
【０１０２】
[0129]いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドリンカーのシグネチャー配列ドメインを、複合の多重化されたタンパク質アッセイにおいて用いることができる。複数の抗体を、様々なシグネチャー配列を有するオリゴヌクレオチドリンカーとコンジュゲートすることができる。多重化されたイムノアッセイにおいて、好適なプローブで標識されたレポーターオリゴヌクレオチド配列を、多重化されたアッセイフォーマットにおける抗体と抗原との間の交差反応性を検出するのに用いることができる。
【０１０３】
[0130]オリゴヌクレオチドリンカーは、いくつかの異なる方法を用いて、抗体又は他の分子にコンジュゲートしていてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドリンカーは、５’末端又は３’末端のいずれか上のチオール基と合成することができる。チオール基は還元剤（例えば、ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）を用いて脱保護することができ、得られたリンカーは脱塩スピンカラムを用いて精製することができる。得られた脱保護されたオリゴヌクレオチドリンカーは、ＳＭＣＣなどのヘテロ二官能基架橋剤を用いて、抗体の一級アミン又は他のタイプのタンパク質にコンジュゲートしていてもよい。或いは、オリゴヌクレオチド上の５’−リン酸基を、水溶性のカルボジイミドＥＤＣで処理してリン酸エステルを形成させ、引き続きアミン含有分子にカップリングさせてもよい。ある場合において、３’−リボース残基上のジオールを酸化してアルデヒド基にし、次いで還元的アミノ化を用いて抗体のアミン基又は他のタイプのタンパク質にコンジュゲートしてもよい。他のある場合において、オリゴヌクレオチドリンカーを、３’又は５’末端いずれかにビオチン修飾をして合成し、ストレプトアビジン標識した分子にコンジュゲートしてもよい。
【０１０４】
[0131]オリゴヌクレオチドリンカーは、Ｕｓｍａｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０９巻、７８４５頁（１９８７年）；Ｓｃａｒｉｎｇｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１８巻、５４３３頁（１９９０年）；Ｗｉｎｃｏｔｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２３巻、２６７７〜２６８４頁（１９９５年）；及びＷｉｎｃｏｔｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．、７４巻、５９頁（１９９７年）に記載されているものなど、当技術分野において知られている任意の様々な技術を用いて合成することができる。一般的に、オリゴヌクレオチドの合成は、５’−末端のジメトキシトリチル及び３’−末端のホスホラミダイトなど、通常の核酸保護基及びカップリング基を使用する。オリゴヌクレオチド合成に適する試薬、核酸の脱保護に適する方法、及び核酸の精製に適する方法は、当業者には知られている。
【０１０５】
[0132]ある場合において、１つ又は複数の分析物の活性化レベルを検出するための活性化状態依存的抗体、又は代替的に、１つ又は複数の分析物の発現レベルを検出するための第２の活性化状態非依存的抗体を、シグナル増幅対の第１のメンバーで直接標識する。シグナル増幅対のメンバーを、当技術分野においてよく知られている方法を用いて、活性化状態依存的抗体とカップリングさせて活性化レベルを検出することができ、又は第２の活性化状態非依存的抗体とカップリングさせて発現レベルを検出することができる。他のある場合において、活性化状態依存的抗体又は第２の活性化状態非依存的抗体にコンジュゲートしている結合対の第１のメンバーと、シグナル増幅対の第１のメンバーにコンジュゲートしている結合対の第２のメンバーとの間の結合によって、活性化状態依存的抗体又は第２の活性化状態非依存的抗体を、シグナル増幅対の第１のメンバーで間接的に標識する。結合対のメンバー（例えば、ビオチン／ストレプトアビジン）を、当技術分野においてよく知られている方法を用いて、シグナル増幅対のメンバーに、又は活性化状態依存的抗体若しくは第２の活性化状態非依存的抗体にカップリングさせてもよい。シグナル増幅対メンバーの例には、それだけには限定されないが、セイヨウワサビのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、カタラーゼ、クロロペルオキシダーゼ、シトクロムｃペルオキシダーゼ、好酸球ペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、甲状腺ペルオキシダーゼ、脱ヨウ素酵素などのペルオキシダーゼが含まれる。シグナル増幅対のメンバーの他の例には、保護基によって保護されているハプテン、及び酵素インヒビターに対するチオエーテル連結によって不活性化されている酵素が含まれる。
【０１０６】
[0133]近接チャネリング（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ）の一例において、促進性部分はグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）であり、シグナル増幅対の第１のメンバーはセイヨウワサビのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。ＧＯがグルコースなどの基質と接触すると、酸化剤（すなわち、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２））を産生する。ＨＲＰがＧＯに対してチャネリング近接内にある場合、ＧＯによって産生されたＨ２Ｏ２がＨＲＰに向けて流れ、ＨＲＰと複合体形成してＨＲＰ−Ｈ２Ｏ２複合体を形成し、これが、シグナル増幅対の第２のメンバー（例えば、ルミノール若しくはイソルミノールなどの化学発光基質、又はチラミド（例えば、ビオチン−チラミド）、ホモバニリン酸、若しくは４−ヒドロキシフェニル酢酸などの蛍光発生的基質）の存在下で、増幅したシグナルを産生する。近接アッセイにおいてＧＯ及びＨＲＰを用いる方法は、例えば、Ｌａｎｇｒｙら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｎｏ．ＵＣＲＬ−ＩＤ−１３６７９７（１９９９年）に記載されている。ビオチン−チラミドをシグナル増幅対の第２のメンバーとして用いる場合、ＨＲＰ−Ｈ２Ｏ２複合体がチラミドを酸化して反応性チラミドラジカルを産生し、これが近くの求核性残基に共有結合する。活性化したチラミドは、直接検出され、又は、例えば、ストレプトアビジン標識したフルオロフォア若しくはストレプトアビジン標識したペルオキシダーゼと色素産生性試薬との組合せなどのシグナル検出試薬を添加したときに検出される。本発明において用いるのに適するフルオロフォアの例には、それだけには限定されないが、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）；ローダミン、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、テトラローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ＣｙＤｙｅ（商標）蛍光（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５）などが含まれる。ストレプトアビジン標識を、当技術分野においてよく知られている方法を用いて、フルオロフォア又はペルオキシダーゼに直接的又は間接的にカップリングしてもよい。本発明における使用に適する色素産生性試薬の非限定的な例には、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）、３，３’−ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、４−クロロ−１−ナフトール（４ＣＮ）、及び／又はポルフィリノーゲンが含まれる。
【０１０７】
[0134]近接チャネリングの別の一例において、促進性部分は光増感剤であり、シグナル増幅対の第１のメンバーは、ハプテンの特異的な結合パートナー（例えば、リガンド、抗体など）に対する結合を妨げる保護基で保護されている、複数のハプテンで標識されている大型分子である。例えば、シグナル増幅対のメンバーは、保護されているビオチン、クマリン、及び／又はフルオレセイン分子で標識されているデキストラン分子であってよい。適切な保護基には、それだけには限定されないが、フェノキシ−、アナリノ−（ａｎａｌｉｎｏ−）、オレフィン−、チオエーテル−、及びセレノエーテル保護基が含まれる。本発明の近接アッセイにおいて用いるのに適するさらなる光増感剤及び保護されているハプテン分子は、米国特許第５，８０７，６７５号に記載されている。光増感剤を光で励起させると酸化剤（すなわち、一重項酸素）を産生する。ハプテン分子が光増感剤に対してチャネリング近接内にある場合、光増感剤によって産生された一重項酸素は、ハプテンの保護基上のチオエーテルに向けて流れ、チオエーテルと反応してカルボニル基（ケトン又はアルデヒド）及びスルフィン酸を産生し、ハプテンから保護基を放出する。次いで、非保護のハプテンは、シグナル増幅対の第２のメンバー（例えば、検出可能なシグナルを産生することができる特異的な結合パートナー）に特異的に結合するのに利用可能である。例えば、ハプテンがビオチンである場合、特異的な結合パートナーは酵素標識されているストレプトアビジンであってよい。例示の酵素には、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＨＲＰなどが含まれる。非結合の試薬を洗浄して除去した後、酵素の検出可能な（例えば、蛍光、化学発光性、色素産生性などの）基質を加えることによって、検出可能なシグナルを産生し、当技術分野において知られている適切な方法及び計測手段（ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を用いて検出してもよい。或いは、検出可能なシグナルを、チラミドシグナルの増幅を用いて増幅してもよく、活性化したチラミドを、直接検出し、又は上記に記載したシグナル検出試薬の添加時に検出してもよい。
【０１０８】
[0135]近接チャネリングのさらに別の一例において、促進性部分は光増感剤であり、シグナル増幅対の第１のメンバーは酵素−インヒビター複合体である。酵素及びインヒビター（例えば、リン酸で標識したデキストラン）は、切断可能なリンカー（例えば、チオエーテル）によって一緒に連結されている。光増感剤が光で励起されると、酸化剤（すなわち、一重項酸素）を産生する。酵素−インヒビター複合体が、光増感剤に対してチャネリング近接内にある場合、光増感剤によって産生された一重項酸素は切断可能なリンカーに向けて流れ、切断可能なリンカーと反応し、酵素からインヒビターを放出し、それによって酵素が活性化する。酵素の基質を加えて検出可能なシグナルを産生し、又は代替的に、増幅試薬を加えて増幅したシグナルを産生する。
【０１０９】
[0136]近接チャネリングのさらなる一例において、促進性部分はＨＲＰであり、シグナル増幅対の第１のメンバーは上記に記載した通り、保護されているハプテン又は酵素−インヒビター複合体であり、保護基はｐ−アルコキシフェノールを含む。フェニレンジアミン及びＨ２Ｏ２を加えると反応性フェニレンジイミンが産生され、これが保護されたハプテン又は酵素−インヒビター複合体を流れ、ｐ−アルコキシフェノール保護基と反応して、暴露されたハプテン又は反応性酵素を産生する。増幅したシグナルを、上記に記載した通りに産生及び検出する（例えば、米国特許第５，５３２，１３８号及び第５，４４５，９４４号を参照されたい）。
【０１１０】
[0137]本明細書に記載する近接アッセイを行うための例示のプロトコールは、その開示の全文が全ての目的で参照によって本明細書に組み入れられる、国際公開第２００９／１０８６３７号パンフレットに提供されている。
【０１１１】
[0138]別の一実施形態において、本発明は、上記に記載した近接アッセイを行うためのキットであって、（ａ）固体支持体上に固定されている、希釈系列の１つ又は複数の捕獲抗体、並びに（ｂ）１つ又は複数の検出抗体（例えば、活性化レベルを検出するための活性化状態非依存的抗体と活性化状態依存的抗体との組合せ、並びに／又は発現レベルを検出するための第１及び第２の活性化状態非依存的抗体の組合せ）を含むキットを提供する。いくつかの場合において、キットは、腫瘍細胞などの細胞の１つ又は複数のシグナル伝達分子の発現及び／又は活性化状態を検出するための、キットを用いた方法に対する指示書をさらに含むことができる。キットはまた、例えば、シグナル増幅対の第１のメンバー及び第２のメンバー、チラミドシグナル増幅試薬、促進性部分のための基質、洗浄バッファーなど、本発明の特定の方法を行うことに関して、上記に記載した任意のさらなる試薬を含むことができる。
【０１１２】
３．抗体
[0139]本明細書に記載する方法は、シグナル伝達分析物（例えば、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭＥＴ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＥＲＫ、ＭＥＫ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＤＫ１、ＰＲＡＳ４０、ＰＴＥＮ、ＲＰＳ６、及びＳＨＣ）の、発現のレベル及び／又は活性化の度合い（例えば、リン酸化若しくは複合体生成）を、検出し、測定し、定量化するための抗体を利用するものである。本発明において使用するための抗体は、例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ＣＨＥＭＩＣＯＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、及びＬａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ（Ｋａｌａｍａｚｏｏ、ＭＩ）から市販されている。
【０１１３】
[0140]いくつかの実施形態において、シグナル伝達分析物の活性化状態を検出するのに有用な抗体には、それだけには限定されないが、ｐ−ＨＥＲ２（例えば、Ｙ１２４８）、ｐ−ＥＲＫ（例えば、Ｔ２０２／Ｙ２０４）、ｐ−ＡＫＴ（例えば、Ｔ３０８、Ｓ４７３）、ｐ−ＭＥＫ（例えば、Ｓ２１７／２２１）、ｐ−ＳＨＣ、ｐ−ＰＤＫ１、ｐ−ＰＴＥＮ、ｐ−Ｐ７０Ｓ６Ｋ（例えば、Ｔ３８９（Ｔ２２９））、ｐ−ＰＩ３Ｋ（例えば、ｐ８５サブユニットＹ６８８）、ｐ−ＰＲＡＳ４０（例えば、Ｔ２４６）、及びｐ−ＲＰＳ６（例えば、Ｓ２３５／２３６）を含めた、活性化したシグナル伝達分析物（例えば、分析物のリン酸化されたアミノ酸残基）を認識する（例えば、結合し、又はそれと複合体を形成することができる）抗体が含まれる。
【０１１４】
[0141]ＰＩ３Ｋ又は活性化したＰＩ３Ｋを検出するのに有用な抗体には、ｐ８５アルファサブユニット、ｐ８５のＮ−ＳＨ２エピトープ、Ｎ−ＳＨ３エピトープ若しくはｐ８５、ｐ１１０アルファ触媒性サブユニット、及び／又はＰＩ３Ｋのヒトｐ１１０サブユニットのアミノ酸１０５２〜１０６８に対応するペプチドを認識する抗体が含まれる。いくつかの実施形態において、活性化したＰＩ３Ｋに対する抗体は、ペプチドＣＧＦＡＥＰＹＮＬ−ｐＹ−ＳＳＬＫＥＬＶ（配列番号：１）に結合する。
【０１１５】
[0142]受容体チロシンキナーゼのＨＥＲファミリーを検出するための抗体には、受容体の細胞外ドメイン、受容体のｃ−末端、受容体の細胞質内ドメイン、及びＨＥＲ３のアミノ酸１２９５〜１３２３又は１２４２〜１２５５に相当するペプチドを認識する抗体が含まれる。ＨＥＲファミリーのメンバーを検出するための抗体には、Ｔ４７Ｄ、ＳＫＢＲ３、及びＭＡＤ１０９などの細胞株に結合する抗体が含まれる。
【０１１６】
[0143]ｃ−ＭＥＴ又は活性化したｃ−ＭＥＴを認識する抗体には、ｃ−ＭＥＴの細胞外ドメイン（例えば、Ｎ−末端）、タンパク質の細胞質体ドメイン（例えば、Ｃ−末端）、ｃ−ＭＥＴのＹ１２３４周囲のアミノ酸残基に対応する非リンペプチド、及びｃ−ＭＥＴのホスホＹ１００３周囲のアミノ酸残基に対応するリンペプチドに結合する抗体が含まれる。
【０１１７】
[0144]ＩＧＦ−１Ｒ及び活性化したＩＧＦ−１Ｒを検出するのに有用な抗体には、ＩＧＦ−１Ｒのαサブユニット、ＩＧＦ−１Ｒのβサブユニット、ＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸３１〜９３２間のエピトープ、タンパク質の細胞外ドメイン、及びホスホＹ１１５８、ホスホＹ１１５８／Ｙ１１６２／Ｙ１１６３、ホスホＹ１１６２／Ｙ１１６３、又はホスホＹ１１６１／Ｙ１１６５／Ｙ１１６６周囲のアミノ酸残基に対応するリンペプチドを認識する抗体が含まれる。
【０１１８】
[0145]ＡＫＴ又は活性化したＡＫＴを検出するのに有用な抗体には、Ｓ４７３、Ｔ３０８、タンパク質のＮ−末端領域（例えば、アミノ酸１〜１４９及び２〜４８０）を認識する抗体が含まれる。
【０１１９】
[0146]ＥＲＫ又はｐ−ＥＲＫを検出するための抗体には、ホスホＴ２０２／Ｙ２０４、ホスホＴ１８５／Ｙ１８７、及びＥＲＫ２のアミノ酸１〜３６０間のエピトープに結合する抗体が含まれる。
【０１２０】
[0147]ｐ７０Ｓ６Ｋ又は活性化したｐ７０Ｓ６Ｋを検出するのに有用な抗体には、ｐ７０Ｓ６ＫのホスホＴ２２９又はホスホＴ３８９、及びｐ７０Ｓ６Ｋのアミノ酸２６〜４３間のエピトープを認識する抗体が含まれる。
【０１２１】
[0148]ＰＲＡＳ４０又はｐ−ＰＲＡＳ４０を検出するのに有用な抗体には、ＰＲＡＳ４０のホスホＴ２４６、全長のタンパク質、及びＰＲＡＳ４０のアミノ酸１１９〜２５６間のエピトープを認識する抗体が含まれる。
【０１２２】
[0149]ＰＤＫ１又はｐ−ＰＤＫ１を検出するのに有用な抗体には、ＰＤＫ１のホスホＳ２４１及びアミノ酸１〜５５６又は４１１〜５５６間のＰＤＫ１のエピトープを認識する抗体が含まれる。
【０１２３】
[0150]ＲＰＳ６又は活性化したＲＰＳ６を検出するのに有用な抗体には、ＲＰＳ６の１〜２４９間のエピトープ、及びＲＰＳ６のホスホＳ２３５／Ｓ２３６を認識する抗体が含まれる。
【０１２４】
[0151]ＳＨＣ又はｐ−ＳＨＣを検出するのに有用な抗体には、ＳＨＣのホスホＳ３６、ホスホＹ２３９、又はホスホＹ３１７、タンパク質のＳＨ２ドメイン、及びＳＨＣのアミノ酸３７９〜４７０、４８８〜５７９間のエピトープを認識する抗体が含まれる。
【０１２５】
[0152]ＰＴＥＮ又はｐ−ＰＴＥＮを検出するのに用いることができる抗体には、ＰＴＥＮのホスホＳ３７０、ホスホＳ３８０、又はホスホＳ３８５、全長のタンパク質、ＰＴＥＮのＣ−末端ドメイン、及びＰＴＥＮのアミノ酸２〜４０３、２３９〜４０３、３８５〜４０３間のエピトープを認識する抗体が含まれる。
【０１２６】
[0153]ＭＥＫ又はｐ−ＭＥＫを検出するのに有用な抗体には、ＭＥＫ１のアミノ酸２〜３９３間のエピトープ、ＭＥＫのホスホＳ２１８／２２２、及びタンパク質のＮ−末端を認識する抗体が含まれる。
【０１２７】
Ｂ．経路プロファイリング
[0154]いくつかの実施形態において、方法は、基準経路プロファイル及び試験経路プロファイルの１つ又は複数の経路プロファイルを産生し、次いでこれらを比較して特定の処置レジメンの効果を決定することを含む。乳房腫瘍を処置するための抗癌薬を選択するために経路プロファイルを産生する詳細な説明は、その開示の全文が全ての目的で参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許第８，１６３，４９９号に見出される。
【０１２８】
[0155]いくつかの実施形態において、基準経路プロファイルは、抗癌薬処置の前に、特定のタイプの癌（例えば、乳房腫瘍、肺腫瘍、直腸結腸腫瘍など）を有する患者から得た試料を用いて産生される。癌性腫瘍に由来する稀な循環細胞を、例えば、当業者には知られている、免疫磁気分離技術、又は２０１２年２月１６日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２５４９に記載されているものなどのろ過分離技術を用いて試料から単離する。単離した循環細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、１つ又は複数の成長因子で刺激する。次いで、刺激した細胞を溶解して、細胞抽出物を生成する。細胞抽出物を、患者の癌のタイプにおいて変更され得る対象の各シグナル伝達分析物の活性化状態を検出するアッセイ（例えば、ＣＥＥＲアッセイ）に適用する。基準経路プロファイルをこのように産生し、任意の抗癌薬の非存在下で、患者におけるシグナル伝達分子の活性化状態が提供される。
【０１２９】
[0156]いくつかの実施形態において、試験経路プロファイルを、抗癌薬処置の前又は抗癌薬の投与の後のいずれかに（例えば、癌処置コースにわたる任意のときに）、特定のタイプの癌（例えば、乳房腫瘍、肺腫瘍、直腸結腸腫瘍など）を有する患者から得た第２の試料を用いて産生する。癌性腫瘍に由来する稀な循環細胞を、試料から単離する。単離した細胞を抗癌薬での処置を受けていなかった患者から得る場合、単離した細胞を、上記に記載した基準経路プロファイルから決定した活性化したシグナル伝達分子の１つ又は複数を標的とする抗癌薬とインキュベートする。例えば、ＰＩ３Ｋが活性化されていることが基準経路プロファイルから決定される場合は、細胞をＰＩ３Ｋインヒビター単独と、又は別の抗癌薬と組み合わせてインキュベートしてもよい。次いで、単離した細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、１つ又は複数の成長因子で刺激してもよい。次いで、単離した細胞を溶解して、細胞抽出物を生成する。細胞抽出物を、対象の各シグナル伝達分析物の活性化状態を検出するアッセイ（例えば、ＣＥＥＲアッセイ）に適用する。患者に対する試験経路プロファイルをこのように産生し、特定の抗癌薬の存在下で患者の癌におけるシグナル伝達分子の活性化状態が提供される。
【０１３０】
[0157]試験経路プロファイルを基準経路プロファイルと比べることにより、抗癌薬が、患者の癌の処置に適するか、又は不適であるかを決定する。例えば、薬物処置により、殆ど又は全てのシグナル伝達分子が、薬物の非存在下におけるよりも活性化が実質的に低くなった場合（例えば、薬物のないときは強力であった活性化から、薬物で活性化が弱く、非常に弱く、又はほとんどなくなる変化）、処置は患者の癌に適すると決定する。このような場合において、薬物治療を受けなかった患者には適切な抗癌薬で処置を開始し、又は薬物をすでに投与していた患者には適切な抗癌薬でその後の処置を継続する。しかし、薬物処置が、患者の癌の処置に不適切であると思われる場合、異なる薬物が選択され、使用されて新たな試験経路プロファイルを産生し、次いでこれを基準活性化プロファイルと比較する。このような場合において、薬物治療を受けなかった患者には適切な抗癌薬で処置を開始し、又は現在不適切な薬物を投与している患者にはその後の処置を適切な抗癌薬に変更する。
【０１３１】
[0158]一実施形態において、基準経路プロファイル及び試験経路プロファイルは、癌細胞株の細胞を用いて産生される。基準経路プロファイルに対して、細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、１つ又は複数の成長因子で刺激する。次いで、刺激した細胞を溶解して、細胞抽出物を生成する。細胞抽出物を、任意の抗癌薬の非存在下の細胞株で変更され得る対象の各シグナル伝達分析物の活性化状態を検出するアッセイ（例えば、ＣＥＥＲアッセイ）に適用する。試験経路プロファイルを、同じ細胞株からの第２の試料を用いて産生する。細胞を、１つ又は複数の抗癌薬とインキュベートする。いくつかの実施形態において、薬物は、上記に記載した基準経路プロファイルから決定した活性化したシグナル伝達分子の１つ又は複数を標的とする。例えば、ＰＩ３Ｋが活性化されたことが基準経路プロファイルから決定される場合、細胞をＰＩ３Ｋインヒビター単独と、又は別の抗癌薬との組合せでインキュベートしてもよい。次いで、単離した細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、１つ又は複数の成長因子で刺激し、次いで溶解して細胞抽出物を生成する。細胞抽出物を、対象の各シグナル伝達分析物の活性化状態を検出するアッセイ（例えば、ＣＥＥＲアッセイ）に適用する。細胞株に対する試験経路プロファイルを、このように産生し、特定の抗癌薬の存在下で、シグナル伝達分子の活性化状態が提供される。基準経路プロファイルと試験経路プロファイルとの間の活性化状態における変化を比べることにより、抗癌薬が、特定の分析物の活性化を阻害するか否かを決定することができる。薬物が代償性のシグナル伝達経路を誘発するか否かも決定することができる。
【０１３２】
[0159]いくつかの実施形態において、基準経路プロファイルを癌細胞株の細胞を用いて産生し、試験経路プロファイルを、抗癌薬処置の前又は抗癌薬の投与の後のいずれかに（例えば、癌処置コースにわたる任意のときに）、特定のタイプの癌（例えば、乳房腫瘍、肺腫瘍、直腸結腸腫瘍、前立腺腫瘍、胃腫瘍、膵臓腫瘍など）を有する患者から得た試料を用いて産生する。基準経路プロファイルと試験経路プロファイルとの間の活性化状態における変化を比較することにより、抗癌薬が特定の分析物の活性化を阻害するか否かを決定することができる。
【０１３３】
[0160]いくつかの態様において、本発明は、統計学的アルゴリズムを１つ又は複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、若しくはそれを超える組合せ）の経路の分析物に適用して経路プロファイルを産生することにより、抗癌薬治療を選択するための方法、抗癌薬治療を最適化するための方法、及び／又は抗癌薬処置の有効性をモニタリングするための方法を提供する。特定の実施形態において、四分位数分析を、１つ又は複数のマーカーの発現又は活性化の状態に適用して、抗癌薬治療を受けている患者に対して処置の決定を指導する。他の実施形態において、学習統計分類子（ｌｅａｒｎｉｎｇ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）システムの１つ、又は２つ以上の組合せを、１つ又は複数のマーカーの発現又は活性化の状態に適用して、抗癌薬治療を受けている患者に対して処置の決定を指導する。本発明の方法の統計学的分析により、有利にも、初期の抗癌薬治療を選択するための、並びに抗癌薬のその後の投与量をいつ若しくはどのように調整若しくは改変（例えば、増大若しくは低減）するか、いつ若しくはどのように１つ若しくは複数の抗癌薬（例えば、増大、低減、若しくは同じ投与量の）と組み合わせるか、及び／又はいつ若しくはどのように現在の治療クールを変更するか（例えば、異なる抗癌薬に切り替えるか）を決定するための、改善された感度、特異性、負の予測値、正の予測値、並びに／或いは全体的な正確さが提供される。
【０１３４】
[0161]「統計学的分析」又は「統計学的アルゴリズム」又は「統計学的プロセス」の語には、変数間の関係を決定するのに用いられる、任意の様々な統計学的な方法及びモデルが含まれる。本発明において、変数は、少なくとも１つの対象のマーカーの存在、レベル、又は遺伝子型である。本明細書に記載する統計学的分析を用いて、任意の数のマーカーを分析することができる。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、又はそれを超えるマーカーの存在又はレベルが、統計学的分析に含まれ得る。一実施形態において、ロジスティック回帰分析が用いられる。別の実施形態において、直線回帰が用いられる。さらに別の実施形態において、普通の最小二乗回帰又は無条件ロジスティック回帰が用いられる。好ましいある実施形態において、本発明の統計学的分析は、変数として、所与の集団内などの、１つ又は複数のマーカーの四分位数測定を含む。四分位数は、試料のデータを、等数の観察を（できる限り）含んでいる群に分割する、１セットの「カットポイント」である。例えば、四分位数は、試料のデータを、等数の観察を（できる限り）含んでいる４群に分割する値である。四分位数が低いほどデータ値は指令されたデータセットによって４分の１上がり、四分位数が高いほどデータ値は指令されたデータセットによって４分の１下がる。四分位数は、試料のデータを、等数の観察を（できる限り）含んでいる５群に分割する値である。本発明は、統計学的分析における変数として（連続的な変数と一緒に）、百分位範囲のマーカーレベル（例えば、三分位値、四分位値、五分位値など）、又はこれらの累積指数（例えば、四分位数和スコア（ＱＳＳ）を得るためのマーカーレベルの四分位値の和など）の使用も含むことができる。
【０１３５】
[0162]ある実施形態において、本発明は、四分位値分析を用いて、１つ又は複数の対象のマーカーの、存在、レベル（例えば、規模）、及び／又は遺伝子型を、検出又は決定することを伴う。このタイプの統計学的分析において、対象のマーカーのレベルは、基準試料のデータベースに関して、第１の四分位値（＜２５％）、第２の四分位値（２５〜５０％）、第３の四分位値（５１〜＜７５％）、又は第４の四分位値（７５〜１００％）にあると規定される。これらの四分位値はそれぞれ、１、２、３、及び４の四分位値スコアに割り当てることができる。ある場合において、試料において検出されないマーカーには四分位値スコア０又は１が割り当てられ、試料（例えば、試料はマーカーに対してポジティブである）において検出される（例えば、存在する）マーカーには四分位値スコア４が割り当てられる。いくつかの実施形態において、四分位値１はマーカーレベルが最も低い試料を表し、四分位値４はマーカーレベルが最も高い試料を表す。他の実施形態において、四分位値１は特定のマーカーの遺伝子型（例えば、野生型アレル）を有する試料を表し、四分位値４は別の特定のマーカーの遺伝子型（例えば、アレルバリアント）を有する試料を表す。試料の基準データベースは、固形腫瘍癌を有する大スペクトラムの患者を含むことができる。このようなデータベースより、四分位値のカットオフを確立することができる。
【０１３６】
[0163]いくつかの実施形態において、本発明の統計学的分析は、１つ又は複数の学習統計分類子システムを含む。本明細書で用いられる「学習統計分類子システム」の語は、複雑なデータセット（例えば、対象のマーカーのパネル）を適用し、このようなデータセットに基づいて決定を行うことができる機械学習アルゴリズム技術を含む。いくつかの実施形態において、単一学習統計分類子システム、例えば、決定／分類木（例えば、ランダムフォレスト（ＲＦ）、又は分類及び回帰木（Ｃ＆ＲＴ））が用いられる。他の実施形態において、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれを超える組合せの学習統計分類子システムが用いられ、直列におけるのが好ましい。学習統計分類子システムの例には、それだけには限定されないが、帰納学習（例えば、決定／分類木、例えば、ランダムフォレスト、分類及び回帰木（Ｃ＆ＲＴ）、増幅木（ｂｏｏｓｔｅｄ  ｔｒｅｅ）など）、計算機的学習理論（Ｐｒｏｂａｂｌｙ  Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ  Ｃｏｒｒｅｃｔ）（ＰＡＣ）学習、コネクショニスト学習（例えば、ニューラルネットワーク（ＮＮ）、人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）、ニューロファジーネットワーク（ｎｅｕｒｏ  ｆｕｚｚｙ  ｎｅｔｗｏｒｋ）（ＮＦＮ）、ネットワーク構造（ｎｅｔｗｏｒｋ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、コックス比例ハザードモデル（Ｃｏｘ  Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ−Ｈａｚａｒｄｓ  Ｍｏｄｅｌ）（ＣＰＨＭ）、パーセプトロン、例えば、多層パーセプトロン、多層フィードフォワードネットワーク、ニューラルネットワークのアプリケーション、ビリーフネットワーク（ｂｅｌｉｅｆ  ｎｅｔｗｏｒｋ）におけるベイジアン学習など）、強化学習（例えば、既知の環境における受動学習、例えば、ナイーブ学習（ｎａｉｖｅ  ｌｅａｒｎｉｎｇ）、適応型ダイナミック学習（ａｄａｐｔｉｖｅ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｌｅａｒｎｉｎｇ）、及び時間差学習（ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｌｅａｒｎｉｎｇ）、未知の環境における受動学習、未知の環境における能動学習、学習行動価値関数（ｌｅａｒｎｉｎｇ  ａｃｔｉｏｎ−ｖａｌｕｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）、強化学習のアプリケーションなど）、並びに遺伝的アルゴリズム、及び進化的プログラミングを用いるものが含まれる。他の学習統計分類子システムには、サポートベクターマシン（例えば、カーネル法）、多変量適応型回帰スプライン（ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｐｌｉｎｅｓ）（ＭＡＲＳ）、レーベンバーグ−マーカートアルゴリズム、ガウス−ニュートンアルゴリズム、ゴーシャン（Ｇａｕｓｓｉａｎｓ）の混合、勾配降下アルゴリズム、及び学習ベクトル量子化（ＬＶＱ）が含まれる。
【０１３７】
[0164]ランダムフォレストは、Ｌｅｏ  Ｂｒｅｉｍａｎ及びＡｄｅｌｅ  Ｃｕｔｌｅｒによって開発されたアルゴリズムを用いて構築される、学習統計分類子システムである。ランダムフォレストは、多数の個々の決定木を用い、個々の木によって決定されるクラスのモード（すなわち、最も頻繁に生じるもの）を選択することによってクラスを決定する。ランダムフォレスト分析は、Ｓａｌｆｏｒｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手可能なＲａｎｄｏｍ  Ｆｏｒｅｓｔｓソフトウエアなどを用いて行うことができる。例えば、ランダムフォレストの説明には、Ｂｒｅｉｍａｎ、Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ、４５：５〜３２頁（２００１年）；及びｈｔｔｐ：／／ｓｔａｔ−ｗｗｗ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕ／ｕｓｅｒｓ／ｂｒｅｉｍａｎ／ＲａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔｓ／ｃｃ＿ｈｏｍｅ．ｈｔｍを参照されたい。
【０１３８】
[0165]分類及び回帰木は、古典的な回帰モデルの適合に対するコンピュータ集中的な代替を代表し、１つ又は複数の前兆に基づいて、対象の分類上の応答又は継続的な応答に対する最良の可能なモデルを決定するのに用いられるのが典型的である。分類及び回帰木分析は、例えば、Ｓａｌｆｏｒｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なＣ＆ＲＴソフトウエア、又はＳｔａｔＳｏｆｔ，Ｉｎｃ．（Ｔｕｌｓａ、ＯＫ）から入手可能なＳｔａｔｉｓｔｉｃａデータ分析ソフトウエアを用いて行うことができる。分類及び回帰木の説明は、例えば、Ｂｒｅｉｍａｎら、「Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｒｅｅｓ」、Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４年）；及びＳｔｅｉｎｂｅｒｇら、「ＣＡＲＴ：Ｔｒｅｅ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  Ｎｏｎ−Ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｓａｌｆｏｒｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、（１９９５年）に見出される。
【０１３９】
[0166]ニューラルネットワークは、計算に対するコネクショニスト手法に基づいたインフォメーションプロセシングに対する数学的又は計算的なモデルを用いる、相互接続されたグループの人工ニューロンである。ニューラルネットワークは、ネットワークを通じて流れる外部的又は内部的な情報に基づいてその構造を変更する、適応性のあるシステムであるのが典型的である。ニューラルネットワークの特定の例には、フィードフォワードニューラルネットワーク、例えば、パーセプトロン、単層パーセプトロン、多層パーセプトロン、バックプロパゲーションネットワーク、ＡＤＡＬＩＮＥネットワーク、ＭＡＤＡＬＩＮＥネットワーク、Ｌｅａｒｎｍａｔｒｉｘネットワーク、ラジアル基底関数（ＲＢＦ）ネットワーク、及び自己組織化マップ又はＫｏｈｏｎｅｎ自己組織化ネットワーク；リカレントニューラルネットワーク、例えば、シンプルリカレントネットワーク及びＨｏｐｆｉｅｌｄネットワーク；確率的ニューラルネットワーク、例えば、ボルツマンマシン；モジュラーニューラルネットワーク、例えば、コミッティーオブマシンズ（ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｍａｃｈｉｎｅｓ）及びアソシアティブニューラルネットワーク；並びに他のタイプのネットワーク、例えば、即時訓練型（ｉｎｓｔａｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｔｒａｉｎｅｄ）ニューラルネットワーク、スパイキングニューラルネットワーク、ダイナミックニューラルネットワーク、及びカスケーディングニューラルネットワークが含まれる。ニューラルネットワーク分析は、例えば、ＳｔａｔＳｏｆｔ，Ｉｎｃ．から入手可能なＳｔａｔｉｓｔｉｃａデータ分析ソフトウエアを用いて行うことができる。例えば、ニューラルネットワークの説明には、Ｆｒｅｅｍａｎら、「Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ：Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９１年）；Ｚａｄｅｈ、Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、８巻、３３８〜３５３頁（１９６５年）；Ｚａｄｅｈ、「ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ．ｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ」、３：２８〜４４頁（１９７３年）；Ｇｅｒｓｈｏら、「Ｖｅｃｔｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ」、Ｋｌｕｙｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ、Ｌｏｎｄｏｎ（１９９２年）；及びＨａｓｓｏｕｎ、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ」、ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、Ｌｏｎｄｏｎ（１９９５年）を参照されたい。
【０１４０】
[0167]サポートベクターマシンは、分類及び回帰に用いられる１セットの関連の教師あり学習技術であり、例えば、Ｃｒｉｓｔｉａｎｉｎｉら、「Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｋｅｒｎｅｌ−Ｂａｓｅｄ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０００年）に記載されている。サポートベクターマシン分析は、例えば、Ｔｈｏｒｓｔｅｎ  Ｊｏａｃｈｉｍｓ（Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）によって開発されたＳＶＭｌｉｇｈｔソフトウエアを用いて、又はＣｈｉｈ−Ｃｈｕｎｇ  Ｃｈａｎｇ及びＣｈｉｈ−Ｊｅｎ  Ｌｉｎ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔａｉｗａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）によって開発されたＬＩＢＳＶＭソフトウエアを用いて行うことができる。
【０１４１】
[0168]本明細書に記載する様々な統計学的方法及びモデルを、健常個体及び癌を有する患者からのコホートの試料（例えば、循環腫瘍細胞、ＦＮＡ、及び生検）を用いて、訓練及び試験することができる。例えば、医師によって、好ましくは腫瘍学者によって、細胞診などを用いて、癌又はその臨床上のサブタイプを有すると診断された患者からの試料は、本発明の統計学的方法及びモデルを訓練及び試験する上で用いるのに適する。健常個体からの試料は、癌の試料と同定されなかったものを含むことができる。当業者であれば、本発明の統計学的な方法及びモデルを訓練及び試験する上で用いることができるコホートの患者試料を得るためのさらなる技術及び診断基準を知っている。
【０１４２】
Ｃ．治療抵抗性の検出
[0169]単一薬剤標的治療は、１つ又は複数の平行する／補償性のシグナリング経路のフィードバックの阻害又は活性化のために、無効であることがある。いくつかの場合において、１つのシグナリング経路の阻害は、別の関連の、又は非関連のシグナリング経路の活性化をもたらす。本発明の方法は、単剤薬物治療のため、フィードバックの阻害の存在及び／又は代償性のシグナリング経路の活性化を検出するのに、並びに癌の処置のための組合せの薬物治療の選択を推奨するのに用いられる。例えば、薬物処置により、第１のシグナリング経路における殆ど又は全てのシグナル伝達分子が薬物の非存在下におけるよりも実質的に活性化が低くなる場合（例えば、薬物のないときは強力であった活性化から、薬物で活性化が弱く、非常に弱く、又はほとんどなくなる変化）、及び第２のシグナリング経路における殆ど又は全てのシグナル伝達分子が薬物の非存在下におけるよりも実質的に活性化される場合（例えば、薬物がないときは弱かった活性化から、薬物で活性化が強く、又は非常に強くなる変化）、薬物処置は組合せの薬物治療を含まなければならない。例えば、患者は、第１のシグナリング経路に対する標的の薬物治療、及び第２のシグナリング経路に対する標的の薬物治療を受けなければならない。いくつかの場合において、複数のシグナリング経路を標的とする単剤薬物を用いることができる（例えば、マルチ−キナーゼ又はパン−キナーゼ（ｐａｎ−ｋｉｎａｓｅ）インヒビター）。治療クールの間、薬物処置が患者の癌の処置に不適切であると思われる場合、産生するのに、異なる薬物が選択され、用いられ、次いで新たな試験経路プロファイルを基準活性化プロファイルと比較する。
【０１４３】
[0170]いくつかの実施形態において、方法は、対象からの試料における活性化したＰＩ３Ｋ及びＡＫＴのレベルの増大を検出し、対象が、癌を回復するのにＰＩ３Ｋインヒビター単独又はＰＩ３Ｋインヒビターの組合せ治療に応答する可能性があることを予想するのに有用である。
【０１４４】
[0171]いくつかの実施形態において、方法は、活性化したＰＩ３Ｋシグナリングのレベルの増大、及び単一薬剤のＭＥＫインヒビターを投与している患者からの試料におけるＨＥＲ３シグナリングのレベルの上昇を検出し、患者にＭＥＫ及びＰＩ３Ｋインヒビター治療の組合せを投与することを推奨するのに有用である。いくつかの実施形態において、ＭＥＫインヒビターは、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に対するＥＲＫ媒介性の負のフィードバックメカニズム、特に、ＥＧＦＲ（Ｔ６６９）及びＨＥＲ２（Ｔ６７７）の膜近接ドメインのスレオニンリン酸化を軽減し、それによってＰＩ３Ｋシグナリング経路を活性化し、ＨＥＲ３ヘテロ二量体（例えば、ＥＧＦＲ：ＨＥＲ３及びＨＥＲ２：ＨＥＲ３）の形成を増大し、ＨＥＲ３のリン酸化を駆動する。
【０１４５】
[0172]いくつかの実施形態において、方法は、ＰＩ３Ｋインヒビターを投与している患者からの試料における、活性化したＭＥＫシグナリングのレベルの増大及び活性化したＰＩ３Ｋシグナリングのレベルの低減を検出し、患者にＰＩ３Ｋ及びＭＥＫインヒビター治療の組合せを投与することを推奨するのに用いられる。
【０１４６】
[0173]別の実施形態において、方法は、ＰＩ３Ｋインヒビターを投与している患者からの試料における活性化したＨＥＲ２シグナル伝達のレベルの増大及び活性化したＰＩ３Ｋシグナル伝達のレベルの低減を検出し、患者にＰＩ３Ｋ及びＨＥＲ２インヒビター治療の組合せを投与することを推奨するのに用いられる。
【０１４７】
[0174]別の実施形態において、方法は、ＰＩ３Ｋインヒビターを投与している患者からの試料における活性化したＨＥＲ３シグナリングのレベルの増大及び活性化したＰＩ３Ｋシグナリングのレベルの低減を検出し、患者にＰＩ３Ｋ及びＨＥＲ３インヒビター治療の組合せを投与することを推奨するのに用いられる。
【０１４８】
[0175]いくつかの実施形態において、方法は、ＭＥＫインヒビターを投与している患者からの試料における活性化したＰＩ３Ｋシグナリングのレベルの増大及び活性化したＭＥＫシグナリングのレベルの低減を検出し、患者にＭＥＫ及びＰＩ３Ｋインヒビター治療の組合せを投与することを推奨するのに用いられる。
【０１４９】
[0176]いくつかの実施形態において、方法は、ＭＥＫインヒビターを投与している患者からの試料における活性化したＨＥＲ２シグナリングのレベルの増大及び活性化したＭＥＫシグナリングのレベルの低減を検出し、患者にＭＥＫ及びＨＥＲ２インヒビター治療の組合せを投与することを推奨するのに用いられる。
【０１５０】
[0177]いくつかの実施形態において、方法は、ＭＥＫインヒビターを投与している患者からの試料における活性化したＨＥＲ３シグナリングのレベルの増大及び活性化したＭＥＫシグナリングのレベルの低減を検出し、患者にＭＥＫ及びＨＥＲ３インヒビター治療の組合せを投与することを推奨するのに用いられる。
【０１５１】
[0178]他の実施形態において、方法は、ＨＥＲ２インヒビターを投与している患者からの試料における活性化したＭＥＫシグナリングのレベルの増大及び活性化したＨＥＲ２シグナリングのレベルの低減を検出し、患者にＨＥＲ２及びＭＥＫインヒビター治療の組合せを投与することを推奨するのに用いられる。
【０１５２】
[0179]さらに別の実施形態において、方法は、ＨＥＲ２インヒビターを投与している患者からの試料における活性化したＰＩ３Ｋシグナリングのレベルの増大及び活性化したＨＥＲ２シグナリングのレベルの低減を検出し、患者にＨＥＲ２及びＰＩ３Ｋインヒビター治療の組合せを投与することを推奨するのに用いられる。
【０１５３】
[0180]他の実施形態において、方法は、ＨＥＲ３インヒビターを投与している患者からの試料における活性化したＭＥＫシグナリングのレベルの増大及び活性化したＨＥＲ３シグナリングのレベルの低減を検出し、患者にＨＥＲ３及びＭＥＫインヒビター治療の組合せを投与することを推奨するのに用いられる。
【０１５４】
[0181]さらに別の実施形態において、方法は、ＨＥＲ３インヒビターを投与している患者からの試料における活性化したＰＩ３Ｋシグナリングのレベルの増大及び活性化したＨＥＲ３シグナリングのレベルの低減を検出し、患者にＨＥＲ３及びＰＩ３Ｋインヒビター治療の組合せを投与することを推奨するのに用いられる。
【０１５５】
Ｄ．投与の方法
[0182]本発明の方法にしたがい、本明細書に記載する抗癌薬は、当技術分野において知られている任意の便利な手段によって対象に投与される。本発明の方法を用いて、腫瘍（例えば、原発又は転移性の乳房腫瘍）の、１つ又は複数の抗癌薬での処置に対する応答を決定、予想、同定、及び／又はモニタリングすることができる。本発明の方法を用いて、対象における腫瘍（例えば、原発又は転移性の乳房腫瘍）の処置に適する１つ又は複数の抗癌薬を選択することもできる。当業者であれば、抗癌薬（複数可）を単独で、又は従来の化学療法、放射線療法、ホルモン療法、免疫療法、及び／若しくは外科手術と組み合わせた治療的手法の一部として投与することができることを理解されよう。
【０１５６】
[0183]ある実施形態において、抗癌薬は、抗シグナリング剤（ａｎｔｉ−ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（すなわち、細胞分裂阻害剤）例えば、モノクローナル抗体又はチロシンキナーゼインヒビター；抗増殖剤；化学療法剤（すなわち、細胞毒性薬）；ホルモン療法剤；放射線療法剤；ワクチン；及び／又は癌性細胞などの異常な細胞の非制御の成長を低減若しくは抑止する能力のある任意の他の化合物を含む。いくつかの実施形態において、対象を、少なくとも１つの化学療法剤と組み合わせて、１つ又は複数の抗シグナリング剤、抗増殖剤、及び／又はホルモン療法剤で処置する。例示のモノクローナル抗体、チロシンキナーゼインヒビター、抗増殖剤、化学療法剤、ホルモン療法剤、放射線療法剤、及びワクチンを本明細書に記載する。
【０１５７】
[0184]特定の実施形態において、抗癌薬は、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼインヒビター、及びこれらの組合せを含めた、ＨＥＲ２活性を調節する１つ又は複数の化合物を含む。ＨＥＲ２調節性化合物の非限定的な例には、モノクローナル抗体、例えば、トラスツズマブ、（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、トラスツズマブ−ＤＭ１（トラスツズマブエムタンシン）、エルツマクソマブ及びペルツズマブ（２Ｃ４；Ｏｍｎｉｔａｒｇ（商標））；小分子チロシンキナーゼインヒビター、例えば、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、ペリチニブ（Ｗｙｅｔｈ）、ＣＰ−６５４５７７（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＣＰ−７２４７１４（Ｐｆｉｚｅｒ）、カネルチニブ／ＣＩ１０３３／ＰＤ１８３８０５（Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ／Ｐｆｉｚｅｒ）、ＨＫＩ−２７２（Ｗｈｙｅｔｈ）、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６；Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標））、ネラチニブ（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＰＫＩ−１６６／ＣＧＰ−７５１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＡＥＥ７８８（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＢＭＳ−５９９６２６（Ｂｒｉｓｔａｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ＨＫＩ−７２７（Ｗｙｅｔｈ）、ＨＫＩ−３５７（Ｗｙｅｔｈ）、ＢＩＢＷ２９９２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、ＡＧ１４７８、Ａｒｒｙ−３８０（Ａｒｒａｙ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）、ＡＲＲＹ−３３４５４３（Ａｒｒａｙ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）、Ｂａｙ８４６、Ｄ６９４９１（Ｓｕｇｅｎ）、ＤＸＬ−７０２（ＩｎＮｅｘｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＪＮＪ−２６４８３３２７；（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ）、及びこれらの組合せが含まれる。ある実施形態において、ＨＥＲ２調節性化合物は、本明細書に記載する、又は当業者には知られている１つ又は複数の他の抗癌薬と組み合わせて用いることができる。
【０１５８】
[0185]他の実施形態において、抗癌薬は、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼインヒビター、及びこれらの組合せを含めた、ＨＥＲ３及び他のＥｒｂＢファミリーメンバーの活性を調節する１つ又は複数の化合物を含む。これらの化合物の非限定的な例には、モノクローナル抗体、例えば、ＭＭ−１２１、ＡＭＧ−８８８（Ｕ３−１２８７）、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、ペルツズマブ（２Ｃ４；Ｏｍｎｉｔａｒｇ（商標））、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、ＭＥＨＤ７９４５Ａ／ＲＧ７５９７（Ｒｏｃｈｅ）、ＲＧ７１１６（Ｒｏｃｈｅ）；小分子チロシンキナーゼインヒビター、例えば、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６；Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標））、ＭＰ−４７０、ＡＺＤ８９３１、ＰＦ００２９９８０４、及びこれらの組合せが含まれる。ある実施形態において、ＨＥＲ１−、ＨＥＲ２−、及びＨＥＲ３−調節性化合物は、本明細書に記載する、又は当業者には知られている１つ又は複数の他の抗癌薬と組み合わせて用いることができる。
【０１５９】
[0186]他の実施形態において、抗癌薬は、モノクローナル抗体、インヒビター、及びこれらの組合せを含めた、ＰＩ３Ｋ活性を調節する１つ又は複数の化合物を含む。これらの化合物の非限定的な例には、ＳＦ１１２６（Ｓｅｍａｆｏｒｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＬＹ２９４００２、ＸＬ１４７（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ／Ｓａｎｏｆｉ）、ＸＬ７６５（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ／Ｓａｎｏｆｉ）、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＮＶＰ−ＢＧＴ２２６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＮＶＰ−ＢＫＭ１２０（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＮＶＰ−ＢＹＬ７１９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＢＡＹ８０９４６（Ｂａｙｅｒ）、ＢＡＹ８４１２３６（Ｂａｙｅｒ）、ＧＤＣ−０９４１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｐｉｒａｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ）、ＧＤＣ−００３２／ＲＧ７６０４（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）、ＧＤＣ−０９８０／ＲＧ７４２２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）、ＧＤＣ−０９４１／ＲＧ７３２１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）、ＰＸ−８６６（ＰｒｏＩＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＧＳＫ１０５９６１５（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＧＳＫ２１２６４５８（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）ＣＡＬ−１０１（Ｃａｌｉｓｔｏｇａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＩＮＫ１１１７（Ｉｎｔｅｌｌｉｋｉｎｅ）、ＺＳＴＫ４７４（全薬工業株式会社）、ＰＷＴ３３５９７（Ｐａｔｈｗａｙ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＡＥＺＳ−１３６（Ａｅｔｅｒｎａ  Ｚｅｎｔａｒｉｓ）、ＰＫＩ−５８７（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＰＦ−４６９１５０２  （Ｐｆｉｚｅｒ）、ＰＦ−０５２１２３８４（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＩＰＩ−１４５（Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）及びこれらの組合せが含まれる。
【０１６０】
[0187]本発明における使用に適する抗シグナリング剤の例には、制限なく、モノクローナル抗体、例えば、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、ペルツズマブ（２Ｃ４；Ｏｍｎｉｔａｒｇ（商標））、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標））、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、ゲムツズマブ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標））、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（商標））、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、及びトシツモマブ（ＢＥＸＸＡＲ（登録商標））；チロシンキナーゼインヒビター、例えば、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６；Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標））、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６；Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標））、イマチニブメシレート（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標））、レフルノミド（ＳＵ１０１）、バンデタニブ（ＺＡＣＴＩＭＡ（商標）；ＺＤ６４７４）、ピリチニブ（ｐｉｌｉｔｉｎｉｂ）、ＣＰ−６５４５７７、ＣＰ−７２４７１４、ＨＫＩ−２７２、ＰＫＩ−１６６、ＡＥＥ７８８、ＢＭＳ−５９９６２６、ＨＫＩ−３５７、ＢＩＢＷ２９９２、ＡＲＲＹ−３３４５４３、ＪＮＪ−２６４８３３２７、及びＪＮＪ−２６４８３３２７、並びにこれらの組合せが含まれる。
【０１６１】
[0188]本発明における使用に適するＭＥＫインヒビターの例には、制限なく、トラメチニブ（ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ）、ＢＡＹ８６９７６６（Ｂａｙｅｒ）、ＭＥＫ１６２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＧＤＣ−０９７３／ＲＧ７４２０（Ｒｏｃｈｅ）、ＧＤＣ−０６２３／ＲＧ７４２１（Ｒｏｃｈｅ）、ＲＧ７１６７（Ｒｏｃｈｅ）、ＲＧ７３０４（Ｒｏｃｈｅ）、ＸＬ５１８（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＰＤ−３２５９０１（Ｐｆｉｚｅｒ）、及びこれらの組合せが含まれる。
【０１６２】
[0189]例示の抗増殖剤には、ｍＴＯＲインヒビター、例えば、ＧＤＣ−０９８０（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＯＳＩ−０２７（ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＡＺＤ８０５５（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＩＮＫ−１２８（Ｉｎｔｅｌｌｉｋｉｎｅ）、シロリムス（ラパマイシン）、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９）、及びエベロリムス（ＲＡＤ００１）；ＡＫＴインヒビター、例えば、ＭＫ−２２０６（Ｍｅｒｃｋ）、ＧＤＣ−００６８／ＲＧ７４４０（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ａｒｒａｙ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ）、ＧＤＣ−０９８０／ＲＧ７４２２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）、ＧＳＫ２１１０１８３（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＳＲ１３６６８、ペリフォシン（ｐｅｒｉｆｏｓｉｎｅ）、１Ｌ６−ヒドロキシメチル−カイロ−イノシトール−２−（Ｒ）−２−Ｏ−メチル−３−Ｏ−オクタデシル−ｓｎ−グリセロカーボネート、９−メトキシ−２−メチルエリプチシニウム（ｍｅｔｈｙｌｅｌｌｉｐｔｉｃｉｎｉｕｍ）アセテート、１，３−ジヒドロー１−（１−（（４−（６−フェニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｇ］キノキサリン−７−イル）フェニル）メチル）−４−ピペリジニル）−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン、１０−（４’−（Ｎ−ジエチルアミノ）ブチル）−２−クロロフェノキサジン、３−ホルミルクロモンチオセミカルバゾン（ｆｏｒｍｙｌｃｈｒｏｍｏｎｅ  ｔｈｉｏｓｅｍｉｃａｒｂａｚｏｎｅ）（Ｃｕ（ＩＩ）Ｃｌ２複合体）、ＡＰＩ−２、プロトオンコジーンＴＣＬ１のアミノ酸１０〜２４に由来する１５−ｍｅｒペプチド（Ｈｉｒｏｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７９巻、５３４０７〜５３４１８頁（２００４年）、ＫＰ３７２−１、並びにＫｏｚｉｋｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２５巻、１１４４〜１１４５頁（２００３年）及びＫａｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、４巻、４６３〜４７６頁（２００３年）に記載されている化合物、並びにそれらの組合せが含まれる。
【０１６３】
[0190]化学療法剤の非限定的な例には、白金ベースの薬物（例えば、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、スピロプラチン、イプロプラチン、サトラプラチンなど）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファラン、メクロレタミン、ウラムスチン、チオテパ、ニトロソ尿素など）、代謝拮抗剤（例えば、５−フルオロウラシル、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキセート、ロイコボリン、カペシタビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、ペメトレキセド（ＡＬＩＭＴＡ（登録商標））、ラルチトレキセドなど）、植物アルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、ポドフィトロキシン、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））など）、トポイソメラーゼインヒビター（例えば、イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドホスフェート、テニポシドなど）、抗腫瘍抗生物質（例えば、ドキソルビシン、アドリアマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシンなど）、薬学的に許容されるその塩、その立体異性体、その誘導体、その類似体、並びにそれらの組合せが含まれる。
【０１６４】
[0191]ホルモン療法剤の例には、制限なく、アロマターゼインヒビター（例えば、アミノグルテチミド、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））、レトロゾール（Ｆｅｍａｒａ（登録商標））、ボロゾール、エキセメスタン（Ａｒｏｍａｓｉｎ（登録商標））、４−アンドロステン−３，６，１７−トリオン（６−ＯＸＯ）、１，４，６−アンドロスタトリエン−３，１７−ジオン（ＡＴＤ）、フォルメスタン（Ｌｅｎｔａｒｏｎ（登録商標））など）、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（例えば、バゼドキシフェン、クロミフェン、フルベストラント、ラソフォキシフェン、ラロキシフェン、タモキシフェン、トレミフェンなど）、ステロイド（例えば、デキサメタゾン）、フィナステリド、及びゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト（ＧｎＲＨ）、例えば、ゴセレリン、薬学的に許容されるその塩、その立体異性体、その誘導体、その類似体、及びそれらの組合せが含まれる。
【０１６５】
[0192]本発明において有用な癌ワクチンの非限定的な例には、Ａｃｔｉｖｅ  ＢｉｏｔｅｃｈからのＡＮＹＡＲＡ、Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ  ＢｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓからのＤＣＶａｘ−ＬＢ、ＩＤＭ  ＰｈａｒｍａからのＥＰ−２１０１、ＰｈａｒｍｅｘａからのＧＶ１００１、Ｉｄｅｒａ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからのＩＯ−２０５５、Ｉｎｔｒｏｇｅｎ  ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓからのＩＮＧＮ２２５、及びＢｉｏｍｉｒａ／ＭｅｒｃｋからのＳｔｉｍｕｖａｘが含まれる。
【０１６６】
[0193]放射線療法剤の例には、それだけには限定されないが、腫瘍抗原に対する抗体に場合によりコンジュゲートしている、放射性核種、例えば、４７Ｓｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、８９Ｓｒ、８６Ｙ、８７Ｙ、９０Ｙ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１１７ｍＳｎ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、及び２１２Ｂｉが含まれる。
【０１６７】
[0194]いくつかの実施形態において、本明細書に記載する抗癌薬を、それだけには限定されないが、免疫賦活薬（例えば、カルメットゲラン桿菌（ＢＣＧ）、レバミゾール、インターロイキン−２、アルファ−インターフェロンなど）、免疫毒素（例えば、抗−ＣＤ３３モノクローナル抗体−カリケアマイシンコンジュゲート、抗−ＣＤ２２モノクローナル抗体−シュードモナス外毒素コンジュゲートなど）、及び放射免疫療法（例えば、１１１Ｉｎ、９０Ｙ、又は１３１Ｉにコンジュゲートしている抗−ＣＤ２０モノクローナル抗体など）を含めた従来の免疫療法剤と同時投与することができる。
【０１６８】
[0195]抗癌薬は、必要に応じて適切な製薬上の賦形剤と一緒に投与することができ、投与の任意の許容される様式によって行うことができる。このように、投与は、例えば、経口、頬側、舌下、歯肉、口蓋、静脈内、局所、皮下、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、筋肉内、関節内（ｉｎｔｒａ−ｊｏｉｎｔ）、非経口、細動脈内（ｉｎｔｒａ−ａｒｔｅｒｉｏｌｅ）、皮内、脳室内、頭蓋内、腹腔内、膀胱内（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ）、くも膜下腔内、病巣内、鼻腔内、直腸内、膣内、又は吸入によるものであってよい。「同時投与」は、抗癌薬を、第２の薬物（例えば、別の抗癌薬、抗癌薬治療に付随する副作用を低減するのに有用な薬物、放射線療法剤、ホルモン療法剤、免疫療法剤など）の投与と同時に、直前に、又は直後に投与することを意味する。
【０１６９】
[0196]治療有効量の抗癌薬を、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８回又はそれを超えて繰り返して投与してもよく、又は投薬を持続的な注入によって投与してもよい。投薬は、固体、半固体、凍結乾燥粉末、又は液体剤形、例えば、錠剤、丸剤、ペレット剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、坐剤、保持浣腸剤（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｅｎｅｍａ）、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、ゲル剤、エアロゾル剤、泡沫剤など、好ましくは正確な投与量を簡単に投与するのに適する単位剤形の形態をとることができる。
【０１７０】
[0197]本明細書で用いられる「単位剤形」の語は、ヒト対象及び他の哺乳動物に対する単位の投与量として適する物理的に別個の単位を意味し、各単位は、適切な製薬上の賦形剤と会合している、所望のオンセット、認容性、及び／又は治療効果を生成するように計算された、あらかじめ決定された量の抗癌薬を含む（例えば、アンプル）。さらに、より濃縮された剤形を調製してもよく、それからより薄い単位剤形を次いで生成してもよい。このように、より濃縮された剤形は、実質的に、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍を超え、又はそれを超える量の抗癌薬を含む。
【０１７１】
[0198]このような剤形を調製するための方法は当業者には知られている（例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９９０年）を参照されたい）。剤形は、慣例的な製薬上の担体又は賦形剤を含むのが典型的であり、他の薬用の薬剤、担体、補助剤、希釈剤、組織浸透増強剤、可溶化剤などをさらに含むことができる。好適な賦形剤を、当技術分野においてよく知られている方法によって、特定の剤形及び投与経路に誂えてもよい（例えば、上記ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳを参照されたい）。
【０１７２】
[0199]適切な賦形剤の例には、それだけには限定されないが、ラクトース、デキストロース、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、食塩水、シロップ、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びポリアクリル酸、例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ、例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ９４１、Ｃａｒｂｏｐｏｌ９８０、Ｃａｒｂｏｐｏｌ９８１などが含まれる。剤形は、滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱油；湿潤剤；乳化剤；懸濁化剤；保存剤、例えば、メチル−、エチル−、及びプロピル−ヒドロキシ安息香酸（すなわち、パラベン）；ｐＨ調整剤、例えば、無機及び有機の酸及び塩基；甘味剤；並びに香味剤をさらに含むことができる。剤形は、生分解性のポリマービーズ、デキストラン、及びシクロデキストリン包接複合体も含んでいてもよい。
【０１７３】
[0200]経口投与には、治療上有効な投薬は、錠剤、カプセル剤、乳剤、懸濁剤、液剤、シロップ剤、噴霧剤、ロゼンジ剤、散剤、及び徐放製剤の形態であってよい。経口投与に適する賦形剤には、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム（ｔａｌｃｕｍ）、セルロース、グルコース、ゼラチン、ショ糖、炭酸マグネシウムなどが含まれる。
【０１７４】
[0201]いくつかの実施形態において、治療上有効な投薬は、丸剤、錠剤、又はカプセル剤の形態をとり、したがって剤形は、抗癌薬の他に任意の以下のもの：希釈剤、例えば、ラクトース、ショ糖、リン酸二カルシウムなど；崩壊剤、例えば、デンプン又はその誘導体；滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムなど；並びに結合剤、例えば、デンプン、アラビアゴム、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、セルロース、及びこれらの誘導体を含んでいてもよい。抗癌薬は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）担体などにおいて処理されている、坐剤に調合してもよい。
【０１７５】
[0202]液体剤形は、抗癌薬、及び場合により１つ又は複数の薬学的に許容される補助剤を、例えば食塩水溶液（例えば、０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム）、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどの担体中に溶解又は分散して、液剤又は懸濁液剤（例えば、経口、局所、又は静脈内投与用の）を形成することにより調製することができる。抗癌薬を、保持浣腸剤に調合することもできる。
【０１７６】
[0203]局所投与に対して、治療上有効な投薬は、乳剤、ローション剤、ゲル剤、泡沫剤、クリーム剤、ゼリー剤、液剤、懸濁剤、軟膏剤、及び経皮パッチ剤の形態であってよい。吸入による投与に対して、抗癌薬は乾燥粉末として、又はネブライザーによる液体形態において送達することができる。非経口投与に対して、治療上有効な投薬は、無菌の注射用液剤及び無菌の包装された粉末の形態であってよい。注射用液剤が、約４．５〜約７．５のｐＨで調合されるのが好ましい。
【０１７７】
[0204]治療上有効な投薬は、凍結乾燥形態において提供することもできる。このような剤形は、投与前に再構成するための重炭酸塩などのバッファーを含むことができ、又はバッファーは、水などで再構成するための凍結乾燥剤形に含まれていてもよい。凍結乾燥剤形は、エピネフリンなどの適切な血管収縮剤をさらに含むことができる。凍結乾燥剤形は、再構成された剤形を対象にすぐに投与することができるように、場合により再構成用のバッファーと組み合わせて包装されている、シリンジにおいて提供することができる。
【０１７８】
[0205]対象を、周期的な時間間隔でモニタリングして、ある治療レジメンの有効性を評価することもできる。例えば、あるシグナル伝達分子の活性化状態は、本明細書に記載する１つ又は複数の抗癌薬での処置の治療効果に基づいて変化し得る。対象をモニタリングして応答を評価することができ、個別化された手法におけるある薬物又は処置の効果を理解することができる。さらに、特定の抗癌薬又は抗癌薬の組合せに最初応答した対象が、薬物又は薬物の組合せに対して不応性になることがあり、これらの対象が後天性の薬物抵抗性を発生したことが指摘される。これらの対象は、現在の治療、及び本発明の方法にしたがって処方された代替の処置を中断してもよい。
【０１７９】
[0206]ある態様において、本明細書に記載する方法は、リンパ節転移陰性の疾患などを有する女性の様々な集団において、乳癌の予後及び／又は再発の可能性を予想する遺伝子発現マーカーのパネルと組み合わせて用いることができる。これらの遺伝子のパネルは、再発を経験する見込みのない、したがって補助的な化学療法の恩恵を受ける見込みのない、女性を同定するのに有用であり得る。発現パネルは、無病（ｄｉｓｅａｓｅ−ｆｒｅｅ）及び全体的な生存の結果にネガティブに影響を及ぼさずに、補助的な化学療法を安全に避けることができる女性を同定するのに用いることができる。適切なシステムには、それだけには限定されないが、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｉｎｃからの２１遺伝子のパネルであるＯｎｃｏｔｙｐｅ  ＤＸ（商標）、Ａｇｅｎｄｉａからの７０遺伝子のパネルであるＭａｍｍａＰｒｉｎｔ（登録商標）、及びＶｅｒｉｄｅｘからの７６遺伝子のパネルが含まれる。
【０１８０】
[0207]さらに、他のある態様において、本明細書に記載する方法を、原発が知られていない癌（ＣＵＰ）に対するオリジナルの腫瘍を同定する遺伝子発現マーカーのパネルと併用して用いることができる。これらの遺伝子パネルは、最初に乳癌と診断された女性に投与したものと一致する治療の恩恵を受ける、転移癌を有する女性を同定するのに有用であり得る。適切なシステムには、それだけには限定されないが、Ａｖｉａｒａ  ＣａｎｃｅｒＴＹＰＥ  ＩＤアッセイ、３９の腫瘍タイプに対する起源の原発部位を同定するために９２の遺伝子を測定するＲＴ−ＰＣＲ−ベースの発現アッセイ、及びマイクロアレイ上の１６００を超える遺伝子の発現を測定し、これらの１５の既知の組織タイプに対して腫瘍の遺伝子発現「シグネチャー」を比較するＰａｔｈｗｏｒｋ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅ  ｏｆ  Ｏｒｉｇｉｎ  Ｔｅｓｔが含まれる。
【実施例】
【０１８１】
[0208]以下の実施例は、請求項に係る本発明を限定するためでなく、説明のために提供するものである。
【０１８２】
実施例１：成長因子で刺激した癌細胞株においてシグナル伝達分析物をプロファイリングするためのＣＥＥＲの使用
[0209]この実施例は、様々な細胞株において、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ｃＭＥＴ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＥＲＫ、ＰＴＥＮ、ＭＥＫ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＲＡＳ４０、ＲＰＳ６、及びＰＤＫ１（図１）を含めた癌経路の生物マーカーをプロファイリングするためにＣＥＥＲを用いる方法を説明する。ＣＥＥＲの詳細な記載は、その開示の全文が全ての目的で参照によって本明細書に組み入れられる、２０１２年４月２４日発行の米国特許第８，１６３，４９９号に見出される。
【０１８３】
[0210]ＣＥＥＲでは、多数のシグナル伝達分析物の発現及び／又は活性化のレベルを、限られた量又は限られた入手可能性の試料から決定することができる。例えば、活性化したタンパク質のレベルを、単一の毛嚢から検出することができる。アッセイの分析感度は、いくつかのシグナル伝達分析物に対して１０細胞未満（例えば、≦１０ｐｇ）である（表１）。
【表１】
2020024210.tif 000003
【０１８４】
[0211]ＣＥＥＲは超高感度及び超高特異性を有する。示す通り、ＣＥＥＲは、単一細胞のレベルで多数のシグナル伝達タンパク質の活性化状態を同時に検出することができる。アッセイは、多数の細胞株において、対象の分析物の活性化状態を比較するのに用いることができる。例えば、活性化したＰＩ３Ｋ複合体が、Ｔ４７Ｄ及びＢＴ４７４の２つの乳癌細胞株において検出された。成長因子刺激前のベースライン時のレベルを図２に示す。刺激後のレベルを図３に示す。両方の細胞株とも、ＰＩ３Ｋを活性化することにより、ヘレグリン（ＨＲＧ）に応答した（図３）。
【０１８５】
[0212]肺癌、乳癌、皮膚癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、及びミエローマに由来する癌細胞株を含めた様々な癌細胞株における、シグナル伝達分析物の発現及び／又は活性化を分析した。表２は、実験に用いた細胞株のいくつかを示すものである。ＰＩ３Ｋの状態、ＰＴＥＮの状態、ホスホ−ＡＫＴの存在、及び体細胞変異（例えば、ＥＧＦＲ又はＢＲＡＦ／ＫＲＡＳ変異）の存在は、細胞株間で変動した。
【表２】
2020024210.tif 000004
【０１８６】
[0213]ＣＥＥＲによって検出されたホスホ−ＰＩ３Ｋ（図４Ａ）及び全ＰＩ３Ｋ（図４Ｂ）のレベルは、各細胞株に対して異なっていた。細胞の成長因子刺激の、ホスホ−ＰＩ３Ｋ（図４Ｃ）、全ＰＩ３Ｋタンパク質（図４Ｄ）、及び全ＰＩ３Ｋに対するホスホ−ＰＩ３Ｋの比（図４Ｅ）に対する効果を比べた。ＨＣＣ８２７のｐ−ＰＩ３Ｋ／全ＰＩ３Ｋ比は高く、ＡＫＴの活性化を表したが、ＰＩ３Ｋ変異は保有しない。データは、ある細胞におけるＰＴＥＮ状態はＰＩ３Ｋ活性化に相関しないことも示していた。
【０１８７】
[0214]ＣＥＥＲを用いた癌細胞株の分析は、Ｃａｌｕ−３、Ｃａｌｕ−６、ＥＫＶＸ、Ｈ５２２、Ｈ６６１、Ｈ１３９５、Ｈ１６５１、Ｈ１７７０、Ｈ２０３０、Ｈ２０８７、Ｈ２３４７、ＮＣＩ−Ｈ１３３８、ＮＣＩ−Ｈ１３７３、ＮＣＩ−Ｈ２００９、ＮＣＩ−Ｈ２２２８、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＮＣＩ−Ｈ５２０、ＮＣＩ−Ｈ６４７、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ１１５５、及びＮＣＩ−Ｈ１６５０を含むように拡大した。ホスホ−ＰＩ３Ｋ（図５Ａ）、全ＰＩ３Ｋ（図５Ｂ）、ホスホ−ＡＫＴ（図５Ｃ）、及びホスホ−ＲＰＳ６（図５Ｄ）のレベルを比べた。実験により、ＮＣＩ−Ｈ２００９は、他の細胞株に比べてホスホ−ＰＩ３Ｋ／全ＰＩ３Ｋ比が最も高かったことが示された（図５Ｅ）。ＰＩ３ＫＣＡ増幅変異を有するＣａｌｕ−３細胞株は、ＰＩ３Ｋ変異のない他の細胞株（例えば、ＮＣＩ−Ｈ２００９）に比べてホスホ−ＰＩ３Ｋ／全ＰＩ３Ｋ比がより低かった。これは、ＰＩ３Ｋ変異の分析は、高レベルのホスホ−ＰＩ３Ｋの単一の予測因子として用いることができないことを示していた。データは、ＣＥＥＲは、活性化したシグナル伝達分析物の存在を決定するのに有用であることを示している。
【０１８８】
実施例２：インヒビター処理した癌細胞株においてシグナル伝達分析物をプロファイリングするためのＣＥＥＲの使用
[0215]本実施例は、本明細書に記載する方法を用いて、特定の細胞が単一のインヒビター治療に応答する可能性があるか、又は代替的に組合せのインヒビター治療に応答する可能性があるかを決定することができることを説明するものである。ＣＥＥＲ技術を用いて、ＰＩ３Ｋ経路及び他の下流のシグナル伝達タンパク質を、様々な癌細胞株においてプロファイリングした。
【０１８９】
[0216]肺癌細胞株を、様々なインヒビター治療で処理し（例えば、ＰＩ３Ｋインヒビター、ＭＥＫインヒビター、及びそれらの組合せでの、様々なインヒビターの量及び処理時間）、ＰＩ３Ｋ活性化のレベルは細胞株及び特定のインヒビター治療に依存することが示された。ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ｃＭＥＴ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＥＲＫ、ＰＴＥＮ、ＭＥＫ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＲＡＳ４０、ＲＰＳ６、及びＰＤＫを含めた、経路の他の下流のシグナリング構成成分のレベルを測定した。ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ６４７、ＮＣＩ−Ｈ１１５５、ＮＣＩ−１２９９、ＮＣＩ−１９７５、ＮＣＩ−Ｈ２２２８、及びＮＣＩ−Ｈ６６１など、非小細胞肺癌に由来する細胞株も用いた。試験した様々な治療には、低投薬量又は高投薬量のＰＩ３Ｋインヒビター単独、低投薬量又は高投薬量のＭＥＫインヒビター単独、共に低投薬量又は高投薬量のＰＩ３ＫインヒビタープラスＭＥＫインヒビターが含まれた。細胞は、処理４時間後又は２４時間後のいずれかにアッセイした（図６〜１０における＊を参照されたい）。
【０１９０】
[0217]図６Ａ、Ｂは、細胞株Ｈ１１５５において、ホスホ−ＭＥＫ（例えば、リン酸化したＳ２１７、Ｓ２２１）、ホスホ−ＰＩ３Ｋ、ホスホ−ＲＳＫ、全ＰＩ３Ｋ、ホスホ−ＡＫＴ（例えば、リン酸化したＳ４７３）、ホスホ−ＰＲＡＳ４０（例えば、リン酸化したＴ２４６）、ホスホ−ＥＲＫ（例えば、リン酸化したＴ２０２、Ｙ２０４）、及びホスホ−ＲＰＳ６（例えば、リン酸化したＳ２３５、Ｓ２３６）のレベルは、ＰＩ３Ｋインヒビター単独、ＭＥＫインヒビター単独、及びＭＥＫインヒビターと組み合わせたＰＩ３Ｋインヒビターの処理後に変動することを示す。図６は、これらの生物マーカーの活性化状態は、処理４時間後及び２４時間後に変化したことも示す。
【０１９１】
[0218]図７Ａ、Ｂは、細胞株Ｈ１２９９における、ホスホ−ＭＥＫ、ホスホ−ＰＩ３Ｋ、ホスホ−ＲＳＫ、全ＰＩ３Ｋ、ホスホ−ＡＫＴ、ホスホ−ＰＲＡＳ４０、ホスホ−ＥＲＫ、及びホスホ−ＲＰＳ６のレベルは、与えた処理及び試験した時点に依存することを示す。
【０１９２】
[0219]図８Ａ、Ｂは、様々な処理後の細胞株Ｈ２２２８における、ホスホ−ＭＥＫ、ホスホ−ＰＩ３Ｋ、ホスホ−ＲＳＫ、ホスホ−ＡＫＴ、ホスホ−ＰＲＡＳ４０、ホスホ−ＥＲＫ、及びホスホ−ＲＰＳ６のレベルを示す。ホスホ−ＰＩ３Ｋのレベルが低いほど、Ｈ２２２８細胞は、高投薬量の組合せ処理よりも低投薬量の組合せ処理に応答性であったことが指摘された。細胞はまた、高投薬量のＭＥＫインヒビター単独に応答し、ホスホ−ＰＩ３Ｋ、ホスホ−ＲＳＫ、及びホスホ−ＥＲＫのレベルはより低かった。
【０１９３】
[0220]図９Ａ、Ｂは、様々な処理をした後の細胞株Ｈ６６１における、ホスホ−ＭＥＫ、ホスホ−ＰＩ３Ｋ、ホスホ−ＲＳＫ、ホスホ−ＡＫＴ、ホスホ−ＰＲＡＳ４０、ホスホ−ＥＲＫ、及びホスホ−ＲＰＳ６のレベルを示す。
【０１９４】
[0221]図１０Ａ、Ｂは、様々な処理をした後の細胞株Ｈ６４７における、ホスホ−ＰＩ３Ｋ、ホスホ−ＲＳＫ、ホスホ−ＡＫＴ、ホスホ−ＰＲＡＳ４０、ホスホ−ＥＲＫ、及びホスホ−ＲＰＳ６のレベルを示す。
【０１９５】
[0222]図１１は、ＰＩ３Ｋインヒビター（例えば、ＢＡＹ８４１２３６）、ＭＥＫインヒビター（例えば、ＢＡＹ８６９７６６）、及びそれらの組合せを含めた、様々な処理レジメンに対する細胞株Ｈ４６０の応答を示す。ＣＥＥＲ分析により、ＨＥＲ１／ＨＥＲ２／ｃＭＥＴ経路の活性化したタンパク質（ｐ−ＰＩ３Ｋ、ｐ−ＡＫＴ、ｐ−ＰＲＡＳ４０、ｐ−７０Ｓ６Ｋ、及びｐ−ＲＰＳ６）は、ＰＩ３Ｋインヒビター単独又はＭＥＫインヒビターと組み合わせたＰＩ３Ｋインヒビターに応答して下方制御されることが明らかになった。経路プロファイルを、８日目、９日目、１２日目、及び１３日目を含めた処置コースの間のいくつかの時点、並びに薬物暴露４時間又は２４時間のいずれかに決定した。
【０１９６】
[0223]図１２は、活性化したＰＩ３Ｋのレベルは、ＰＩ３Ｋインヒビター（例えば、ＢＡＹ８４１２３６）、ＭＥＫインヒビター（例えば、ＢＡＹ８６９７６６）、又はそれらの組合せのいずれかで処理したＨ１９７５細胞において比較的同様であることを示す。ＣＥＥＲ分析は、他の活性化したタンパク質（ｐ−ＭＥＫ、ｐ−ＥＲＫ、ｐ−ＡＫＴ、ｐ−ＰＲＡＳ４０、ｐ−７０Ｓ６Ｋ、及びｐ−ＲＰＳ６）のレベルは、処理に応答して大幅に低いことを示した。
【０１９７】
[0224]図１３は、ＣＥＥＲアッセイを用いて、活性化したＰＩ３Ｋ及びＨＥＲ１／ＨＥＲ２／ｃＭＥＴ経路の他の下流の構成成分のレベルに対して、抗癌薬のＩＣ５０を算出することができることを示す。図１３は、いくつかの細胞株において、ＰＩ３Ｋ阻害は、ＡＫＴ、ＰＲＡＳ４０、及びＲＰＳ６などの下流のタンパク質の阻害に相関し得ることも示す。いくつかの癌細胞において、ＰＩ３Ｋ活性化の阻害は、下流のタンパク質の活性化の阻害に相当する。さらに、阻害の度合いは、細胞株及びインヒビター処理に特異的である。
【０１９８】
[0225]ＰＩ３Ｋインヒビター薬物（ＧＤＣ０９４１）のＩＣ５０と活性化したＰＩ３Ｋレベルとの間の関係を、いくつかの細胞株において分析した。ＰＩ３Ｋ活性化を有する細胞株（例えば、Ｈ１６５１又はＨ２０８７）のＩＣ５０は低いことが決定された。Ｈ１６５１細胞は既知の遺伝子変異を保有しないが、ＥＧＦＲ発現が高い。Ｈ２０８７はＮＲＡＳ変異及びＢＲＡＦ変異を有する。多重変異（例えば、ＭＡＰＫ変異）及びＰＩ３Ｋの活性化などの変更をさらに２つ有する細胞株（例えば、Ｃａｌｕ−６）のＩＣ５０値は高かった。したがって、ホスホ−ＰＩ３Ｋは、ＰＩ３Ｋインヒビターの感受性の指標又は予測因子であり得る。図１４は、不活性なＰＴＥＮ（例えば、点変異又は無発現変異）を有する細胞株は、ＰＴＥＮ野生型状態を有する細胞株よりもＩＣ５０値が高かったことも示す。
【０１９９】
[0226]この実施例は、特定の癌細胞におけるシグナル伝達分析物は、特定の発現及び活性化を有することを示すものである。さらに、分析物の発現及び活性化の状態は、細胞が抗癌薬又はその組合せに暴露されると変化する。したがって、シグナル伝達分析物をモニタリングして、抗癌薬の腫瘍細胞に対する有効性を決定することができる。経路をプロファイリングする方法を用いて、新たな抗癌薬を開発するための代替の標的を同定することもできる。
【０２００】
実施例３：インヒビター治療に対する患者の応答を予想するためのＰＩ３Ｋ  ＣＥＥＲの使用
[0227]この実施例は、ＣＥＥＲによって検出されるＰＩ３Ｋの活性化を用いて、患者がＰＩ３Ｋインヒビター治療に応答する可能性を決定することができることを示す。本実施例は、本明細書の方法が、処置コースの間、長期的な薬物のモニタリングに有用であることも示す。
【０２０１】
[0228]遡及研究において、癌を有する患者から採取した一連の試料を評価して、ＣＥＥＲアッセイを用いた経路のプロファイリングが、ＰＩ３Ｋ処置の応答性を予測するものであるかを決定した。分析した試料には、治療を受ける前、治療を開始した後、及び治療クールの間など、治療の時間経過上の患者からの試料が含まれていた。結果は、シグナル伝達分析物の測定及び患者の経路のプロファイリングの決定は、患者が特定の薬物治療の恩恵を受ける可能性があるか否かを決定するのに効果的であることを明らかに示していた。さらに、癌を有する患者に対して薬物治療を選択する方法、及び長期的な薬物のモニタリング及び処置のための方法を実証した。
【０２０２】
[0229]この実施例は、癌に対するＣＥＥＲを用いて、患者の生物学的試料（例えば、ＦＮＡ）における癌の経路をプロファイリングすることができ、そのため臨床家が治療クールの間、疾患進行をモニタリングできるようになることを実証する。この方法により、臨床家はまた、特定の処置の治療有効性を決定できるようになり、この方法は展開する疾患状態に特異的な処置を調整又は改変することができる。
【０２０３】
[0230]患者＃１からの試料は、スクリーニング段階の間に治療を受ける前、並びにＰＩ３Ｋインヒビター処置段階の８日目及び２８日目に採取した。スクリーニング段階からの試料を用いて、患者に対するベースラインの経路プロファイルを確立した。アッセイにおいて、ＨＥＲ１／ＨＥＲ２／ｃＭＥＴ経路における活性化したタンパク質及び全タンパク質のレベルを測定し、サイトケラチン（ＣＫ）のレベルに対して標準化した。患者＃１はＳＧ１の処置前にＰＩ３Ｋの活性化を示したことが決定された（図１５）。しかし、インヒビター処置の８日目（ＳＧ１）、患者＃１は、より低レベルの活性化したＰＩ３Ｋを有した。ｐ−ＰＤＫ、ｐ−ＡＫＴ、ｐＰＲＡＳ、及びｐ−ＭＥＫなどの下流の分析物も、８日目に下方制御されていた。この分析により、患者＃１は処置に応答したことが指摘され、ＰＥＴによりさらに確認された。ＰＩ３ＫのＣＥＥＲを用いた長期間の薬物モニタリングは、ホスホ−ＨＥＲ３によるＰＩ３Ｋ経路の活性化によって指摘される通り、患者＃１は２８日目（ＳＧ２）までの処置時に再発したことを示した（図１５）。結果は、シグナリング経路の他の構成成分（図１）は、インヒビター治療によって作り出される任意の妨害物を代償し得ることを示していた。
【０２０４】
[0231]患者＃２は、ＰＩ３Ｋインヒビター治療を受け、処置時に再発した。ＰＩ３ＫのＣＥＥＲを用いた分析により、ＨＥＲ１／ＨＥＲ２／ｃＭＥＴ経路の構成成分は、ＰＩ３Ｋインヒビターで処置した癌において上方制御されることが示された。治療を開始した後に採取した試料（ＤＰ１）により、患者＃２はＰＩ３Ｋ治療に応答したことが示された（図１６）。再発後に採取した第２の試料（ＤＰ２）は、ＨＥＲ１／ＨＥＲ２／ｃＭＥＴ経路の構成成分が増大したことを示していた。特に、活性化したタンパク質及び全てのタンパク質が、スクリーニングしたマーカーの殆どに対して、ＤＰ１試料に比べてＤＰ２試料においてより高かった。ＰＩ３Ｋインヒビターはｐ−ＰＩ３Ｋを低減するのに効果的だった（図１６）が、他の活性化したシグナル伝達分子が増大し、それゆえＰＩ３Ｋ阻害を代償した。患者＃２の経路プロファイルは、腫瘍適応後、組合せ治療が推奨されることを示す。
【０２０５】
[0232]患者＃３は、治療前に採取した試料において高いＰＩ３Ｋ活性を示した。活性化したＰＩ３ＫはＰＩ３ＫＣＡ変異によって起こったものではなかったのは注目すべきである。ＰＩ３Ｋインヒビター薬物であるＢＡＹ８０６９４６で処置した後、別の試料を採取し、分析した。このＦＮＡ試料は、ＰＩ３Ｋが駆動する細胞の増殖がＰＩ３Ｋインヒビター処置によって上首尾に阻害されたことを示した。この知見はＣＴスキャンによって確認された。図１７は、患者＃３のＣＥＥＲプロファイルを示す。
【０２０６】
[0233]この実施例は、患者の試料におけるシグナル伝達分析物の測定は、抗癌薬（例えば、ＰＩ３Ｋインヒビター）に対する患者の応答を予想することを実証するものである。この実施例はまた、治療クールの間に分析物をモニタリングすることで、患者が薬物にもはや応答せず、及び／又は再発していることを示し得ることも示す。本明細書に記載する方法を用いて、治療に対する腫瘍適応をモニタリングすることができる。
【０２０７】
実施例４：癌を有する患者からの試料においてＰＩ３Ｋ活性化を評価するためのＰＩ３Ｋ  ＣＥＥＲの使用
[0234]この実施例は、患者からの腫瘍試料の経路のプロファイリングは、癌の進行、処置の応答、及び疾患の状態に関する有用な情報を提供することを示すものである。
【０２０８】
[0235]患者＃４は、ステージＩＩＩのトリプルネガティブ乳癌（例えば、ＥＲ−、ＰＲ−、ＨＥＲ２−）と診断された３５歳の患者を表す。患者は根治的乳房切断を受けた。ルーチンのフォローアップ検査により、患者の肝臓及び肺に多数の転移性病巣が明らかになった。患者＃４は、ＨＥＲ２インヒビター（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）及びＴＫＩ（Ｌａｐａｔｉｎｉｂ）の組合せ治療を受けた。患者＃４は処置に応答し、７か月を超えて良好な状態にあった。
【０２０９】
[0236]ＣＥＥＲ分析が処置の応答を予測するか否かを決定するために、患者＃４が治療を受ける前に採取した（図１８）、生検試料２検体（生検＃１及び生検＃２）を分析した。両方の生検に、ＨＥＲ３とｃＭＥＴの同時発現に加えて、ＨＥＲ２の過剰発現及び活性化のエビデンスが存在した。ＨＥＲ２及びＨＥＲ３の低レベルのリン酸化が観察された。ＡＫＴ及びＭＡＰＫの両経路の下流の活性化が検出された。ＰＩ３ＫＣＡ変異であるＨ１０４７Ｒが生検中に存在した。試料の経路のプロファイリングにより、患者＃４はＨＥＲ２インヒビター治療の恩恵を受けることが予想された。
【０２１０】
[0237]患者＃５は、ステージＩＩＩのトリプルネガティブ乳癌（例えば、ＥＲ−、ＰＲ−、ＨＥＲ２−）と診断された７５歳の患者を表す。患者は根治的乳房切断を受けた。フォローアップ評価により、脳及び骨における腫瘍を含めた多数の転移性病巣の存在が明らかになった。患者＃５は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎのラパチニブ又はペルツズマブとの組合せ治療を受け、６か月を超えて治療に対する応答を示した。
【０２１１】
[0238]処置の開始前（例えば、ベースライン）及び処置後（図１９）に患者＃５から採取した、いくつかの試料の経路プロファイルを分析した。試料は、脳脊髄液（ＣＳＦ）、細針吸引物（ＦＮＡ）、及び生検であった。ＣＥＥＲ分析により、ＰＩ３Ｋ活性化、並びにＨＥＲ２及びＩＧＦ１Ｒの活性化が処置後に低減することが示され、患者＃５はラパチニブの処置に応答することが予想された。
【０２１２】
[0239]患者＃６は前立腺癌を有する患者を表す。２つの別々の腫瘍部位からのＦＮＡ試料を、ＣＥＥＲ分析によってプロファイリングした。分析により、患者の試料においてＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭＥＴ、ＩＧＦ−１Ｒ、及びＰＩ３Ｋのシグナリング経路が活性であることが示された。ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＰＩ３Ｋの過剰活性化が検出された。ｐ−ＡＫＴ及びｐ−ＥＲＫの活性化が腫瘍の増殖と相関した。経路プロファイル（図２０Ａ、Ｂ）は、癌の進行が高悪性度の性質であったことをさらに指摘し、これは患者＃６のグリーソンスコアが９であることと一致する。患者の経路プロファイル及びグリーソンスコアの両方とも、患者＃６が、疾患進行の可能性のある（例えば、転移）高悪性度の癌を有することを指摘するものである。
【０２１３】
[0240]ＰＩ３ＫのＣＥＥＲを用いて、トリプルネガティブ乳癌の処置に対する可能な、新薬の開発につながるような標的を同定した。特に、患者＃７（トリプルネガティブＢＣＡ患者）は低レベルの活性化したＨＥＲ２並びに高レベルのｐ−ＡＫＴ及びｐ−ＥＲＫを、活性化したＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＣＲＫＬ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、及びＦＡＫに加えて有していた。腫瘍試料がＰＩ３ＫＣＡ変異誘発遺伝子であるＨ１０４７Ｒを保有していたことも決定された。
【０２１４】
[0241]直腸結腸癌又は非小細胞肺癌を有する患者の、処置前及び処置後の経路プロファイルを比較した。図２１及び２２は、腫瘍細胞が、処置前及び処置後に異なる経路プロファイルを有することを示し、癌患者は、特定の、差示的な経路又はシグネチャーを有することを指摘するものである。経路プロファイル又はシグネチャーは患者間で変動するが、頑強な経路の活性化パターンが癌を有する患者において観察された。結果は、機能的な経路のプロファイリングが、潜在的な治療の応答を予想し、癌患者を処置するための治療を選択するのに決定的であることを示している。本明細書に記載する方法は、治療を開始し、治療中の患者をモニタリングして癌細胞の経路プロファイルにおける変化を測定する前に患者を選択するのに用いることができる。
【０２１５】
実施例５：ＰＩ３Ｋ調節性化合物に対して患者を選択するためのＰＩ３Ｋ活性化の定量分析
[0242]この実施例は、それだけには限定されないが、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ｃＭＥＴ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＲＰＳ６、ＭＥＫ、ＥＲＫ、ＰＤＫ１、及びＰＴＥＮを含めた、全てのＰＩ３Ｋ複合体及び活性化したＰＩ３Ｋ複合体の経路の構成成分の存在に相関する、活性化した（リン酸化された）ＰＩ３Ｋ複合体の存在を実証するものである。この実施例は、いくつかの場合において、ＰＩ３Ｋ活性化のレベルの上昇した乳癌患者は、活性化した（リン酸化された）ＡＫＴをやはり発現することを示す。
【０２１６】
[0243]経路プロファイリング分析を、乳癌患者から収集した６０個のＦＮＡ試料に対して行った。ＣＥＥＲアッセイを利用して、経路のタンパク質の発現及びリン酸化のレベルを決定した。検出されたシグナル伝達分析物には、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭＥＴ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＥＲＫ、ＭＥＫ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＤＫ１、ＰＲＡＳ４０、ＰＴＥＮ、ＲＰＳ６、ＳＨＣ及び関連の下流タンパク質が含まれた。
【０２１７】
[0244]ＣＥＥＲ分析には、統計学的アルゴリズムを用いて、標準の対照に対して、シグナル伝達分析物の発現／活性化レベルの測定値を標準化することが含まれる。特に、相対蛍光単位（ＲＦＵ）値を、分析物の発現レベルが分かっている細胞株の対照に基づいて、標準の測定の機能単位である計算単位（Ｃｏｍｐｕｔｅｄ  Ｕｎｉｔ）（ＣＵ）に変換する。ＣＥＥＲアッセイの各スライドに対して、系列希釈した細胞可溶化物の標準曲線を、特定の分析物にポジティブな細胞株に対して調製する（例えば、ＨＥＲ１ポジティブ細胞株はＭＤＡ−ＭＢ−４６８であり、ＨＥＲ２ポジティブ細胞株はＳＫＢｒ３である）。したがって、特定の各分析物の標準化レベル、及び各試料におけるリン酸化の度合いを、標準の細胞株に対して得ることができる。
【０２１８】
[0245]例えば、ＨＥＲ１の発現が１ＣＵである試料は、標準対照のＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞のＲＦＵ値１に等しいＲＦＵ値を有する。基準細胞は、細胞１個あたりＨＥＲ１又はＨＥＲ２受容体を約１〜２×１０６個有し、リン酸化されている受容体は約１０％であるので、１ＣＵはＲＴＫ１〜２×１０６又はリン酸化されているＲＴＫ１〜２×１０５個を表す。ＣＵによる検出限界（ＬＯＤ）値を、ＣＥＥＲアッセイにおいて各分析物に対して実験的に決定する。
【０２１９】
[0246]活性化したＰＩ３Ｋを有する患者２１人中、殆ど（ｎ＝２０）でホスホ−ＡＫＴのレベルが上昇した。これは、ホスホ−ＡＫＴは下流のＰＩ３Ｋに作用し、ＰＩ３Ｋの活性化がＡＫＴの活性化をもたらし得るという発見を支持するものである。乳癌患者の試料におけるＰＩ３Ｋ活性化とリン酸化したＡＫＴとの間に高度の相関があること（ｐ値＝０．０２２２、図２３及び２４）は、ＰＩ３Ｋ経路の活性化が腫瘍原性に生物学的に関連があることを確証するものである。ｐ値を、帰無仮説の棄却、及びＰＩ３ＫとＡＫＴとの間のポジティブの相関の代替に対して計算した。
【０２２０】
[0247]試験した乳癌試料におけるｐ−ＰＩ３Ｋレベル及びｐ−ＡＫＴレベルの分布を、それぞれ図２５及び２６に示す。図において、レベルを、高ＣＵから低ＣＵに並べ替え、ＣＵカットオフを表示する。ＣＥＥＲの感度は、ＰＩ３Ｋに対して３〜１０ＣＵ、及びｐ−ＡＫＴに対して１〜３ＣＵであった。
【０２２１】
[0248]結果は、ＡＫＴ誘発性の細胞増殖は、一つには、活性化したＰＩ３Ｋによることも示す。図２３は、活性化したＰＩ３Ｋを有する患者２１人中５人だけがＰＩ３ＫＣＡ変異を保有していたことも示す。したがって、ＰＩ３ＫＣＡの変異分析はＰＩ３Ｋ活性化の唯一の尺度であるべきではなく、ＰＩ３Ｋインヒビター治療に応答する可能性のある患者（例えば、活性化したＰＩ３Ｋを有する患者）を同定するには、ＣＥＥＲなど、タンパク質ベースの分析が必要とされる。データは、ＰＩ３ＫＣＡ変異のない癌患者は、ＰＩ３Ｋインヒビター治療の恩恵を受け得ることを指摘する。
【０２２２】
[0249]ｐ−ＰＩ３Ｋを測定するためのＣＥＥＲにおいて用いることができる抗体には、図２７において図示する抗原に対して産生されたモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体が含まれる。抗原のアミノ酸配列（配列番号：１）はＣＧＦＡＥＰＹＮＬ−ｐＹ−ＳＳＬＫＥＬＶであり、ｐＹはリン酸化されたチロシン残基を表す。
【０２２３】
実施例６：乳癌（ＢＣＡ）臨床試料の分析及びＰＩ３Ｋインヒビターで処置したときのシグナリング経路プロファイルにおける変化の同定
[0250]この実施例は、ＰＩ３ＫインヒビターであるＢＹＬ７１９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）で処置した患者からの、ＢＣＡ臨床試料のＣＥＥＲベースの分析を示す。特に、個々の患者からのシグナリング経路プロファイルは、ＢＹＬ７１９処置コースの間に移行することが示されている。したがって、ＰＩ３Ｋ関連経路のＣＥＥＲベースの分析により、臨床成績を改善するためのＢＹＬ７１９処置の、応答性の、個別化されたマネージメントが可能になる。発癌性受容体チロシンキナーゼ（ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭＥＴ、ＩＧＦ−１Ｒ、及びｃＫＩＴ）、並びにＰＩ３Ｋ、並びにＳＨＣ、ＡＫＴ、ＥＲＫ、ＭＥＫ、ＲＳＫ、ｐＲＡＳ４０、ＲＰＳ６、Ｐ７０Ｓ６Ｋ、及びＰＴＥＮを含めた他のチロシンキナーゼシグナリングカスケード構成成分を定量化した。全タンパク質及び活性化したタンパク質のレベルを測定した。
【０２２４】
[0251]全般的に、経路プロファイルの移行は患者間で変動することが観察された。例えば、処置前、患者１はＨＥＲ２の過剰発現、ＨＥＲ３及びＰＩ３Ｋの活性化、並びにｐ−ＡＫＴ、ｐ−ＰＲＡＳ、ｐ−Ｐ７０Ｓ６、ｐ−ＲＰＳ６、ｐ−ＭＥＫ、ｐ−ＥＲＫ、及びｐ−ＲＳＫの上方制御を示した。またこの時点で、ＨＥＲ２は高度に活性化し、患者１はＰＴＥＮポジティブであった。患者１をＢＹＬ７１９で処置すると、ＨＥＲ３、ＥＲＫ、ＭＥＫ、及びＲＳＫの活性化の増大、並びにＡＫＴの活性化の低減がもたらされた。処置８日目、活性化したＨＥＲ３のレベルの増大、並びにｐ−ＡＫＴ、ｐ−ｐＰＲＡＳ、ｐ−Ｐ７０Ｓ６、及びｐ−ＲＰＳ６の下方制御と一致して、全ＨＥＲ３発現が増大した。ＰＲＡＳ４０の活性化における初期の低減が観察され、処置の進行とともに活性化における増大が続いた。処置２８日目、ｐ−ＡＫＴ、ｐ−ＰＲＡＳ、ｐ−Ｐ７０Ｓ６、及びｐ−ＲＰＳ６のレベル、並びにＨＥＲ３の発現及び活性化は、８日目よりも高かった。
【０２２５】
[0252]処置の前、患者２はＰＴＥＮポジティブであり、ｐ−ＡＫＴ、ｐ−ＰＲＡＳ、ｐ−ＭＥＫ、ｐ−ＥＲＫ、及びｐ−ＲＳＫの活性化を示した。患者２をＢＹＬ７１９で処置すると、ＡＫＴ及びＰＲＡＳ４０の活性化における低減がもたらされた。ＥＲＫ、ＭＥＫ、及びＲＳＫの活性化における、初期の増大、その後、処置の進行とともに低減が観察された。処置８日目、ｐ−ＡＫＴ及びｐ−ＰＲＡＳは下方制御され、ｐ−ＭＥＫ、ｐ−ＥＲＫ、及びｐ−ＲＳＫは上方制御された。２８日目、ｐ−ＡＫＴ、ｐ−ＰＲＡＳ、ｐ−ＭＥＫ、ｐ−ＥＲＫ、及びｐ−ＲＳＫは下方制御された。
【０２２６】
[0253]患者３の経路プロファイルは、前処置時、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びｃＭＥＴが発現され、ＨＥＲ２及びｃＭＥＴが高度に活性化していたことを示した。ＨＥＲ１、ＨＥＲ３、及びＰＩ３Ｋも活性化していたことが見てとれた。分析により、患者３はＰＴＥＮポジティブであることが明らかになり、高レベルの活性化したｐ−ＡＫＴ及びｐ−ＲＡＳが示された。活性化したｐ−ＭＥＫ、ｐ−ＥＲＫ、及びｐ−ＲＳＫも、前処置時の患者３に検出された。８日目、活性化したＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びｃＭＥＴは全て下方制御され、活性化したＨＥＲ１は上方制御された。またこの時点で、患者３は、ｐ−ＡＫＴ、ｐ−ＰＲＡＳ、ｐ−ＭＥＫ、ｐ−ＥＲＫ、及びｐ−ＲＳＫのレベルの下方制御を示した。ＲＴＫ活性化における全体的な低減が、患者３をＢＹＬ７１９で処置したときに観察された。
【０２２７】
[0254]前処置の間、患者４はＰＴＥＮポジティブであり、活性化したｐ−ＡＫＴ、ｐ−ＰＲＡＳ、ｐ−ＭＥＫ、ｐ−ＥＲＫ、及びｐ−ＲＳＫを表した。８日目、患者は、ｐ−ＡＫＴ、ｐ−ＰＲＡＳ、ｐ−ＭＥＫ、ｐ−ＥＲＫ、及びｐ−ＲＳＫの下方制御を示した。ＢＹＬ７１９治療は、患者４のＰＲＡＳ４０活性化における低減をもたらした。
【０２２８】
[0255]患者５の経路プロファイルにより、活性化したＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＰＩ３Ｋ、ｐ−ＡＫＴ、ｐ−ＰＲＡＳ、ＲＰＳ６、ｐ−ＭＥＫ、ｐ−ＥＲＫ、及びｐ−ＲＳＫに加えて、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びｃＭＥＴが処置の間に発現されたことが明らかになった。患者５はまた、前処置の間、ＰＴＥＮポジティブであった。ＢＹＬ７１９治療は、患者５のＰＲＡＳ４０活性化における低減をもたらした。Ｐ−ＡＫＴ及びｐ−ＲＡＳはわずかに上方制御され、ｐ−ＲＰＳ６は高度に上方制御された。治療８日目に、ｐ−ＭＥＫ、ｐ−ＥＲＫ、及びｐ−ＲＳＫレベルに対する変化は殆ど検出されなかった。
【０２２９】
[0256]本明細書に引用する出版物及び特許出願は全て、個々の各出版物又は特許出願が特に、及び個々に参照によって組み入れられることが指摘される如く、参照によって本明細書に組み入れられる。前述の発明を、理解を明確にする目的で図及び例により幾分詳しく記載してきたが、当業者であれば、本発明の教示に鑑みて、添付の特許請求の範囲の精神及び範囲から逸脱せずに、ある種の変更及び改変をそれに対して行うことができることは、容易に明らかであろう。
【０２３０】
[0001]本出願は、２０１１年１２月５日出願の米国仮特許出願第６１／５６７，０８５号、及び２０１２年１１月２０日出願の第６１／７２８，７４８号の優先権を主張するものであり、これらの開示はその全文が全ての目的で参照によって本明細書に組み入れられる。
【０２３１】
本発明の好適な実施形態は以下のとおりである。
〔１〕
癌と診断された対象に処置を選択するための方法であって、
（ａ）経路プロファイルを決定するための近接アッセイを用いて、対象から採取した試料におけるＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭＥＴ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＥＲＫ、ＭＥＫ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＤＫ１、ＰＲＡＳ４０、ＰＴＥＮ、ＲＰＳ６、ＳＨＣ及びこれらの組合せからなる群から選択される１つ又は複数のシグナル伝達分析物の発現及び／又は活性化レベルを測定するステップと、
（ｂ）対象の経路プロファイルに基づいて、対象が標的のインヒビター治療に応答する可能性があるか否かを決定することにより、標的のインヒビター治療を推奨するステップと
を含む方法。
〔２〕
癌が、乳癌、直腸結腸癌、胃癌、肺癌、膵臓癌、及び前立腺癌からなる群から選択される、〔１〕に記載の方法。
〔３〕
ステップ（ａ）が、対象の経路プロファイルを基準経路プロファイルと比べることをさらに含む、〔１〕に記載の方法。
〔４〕
基準経路プロファイルが、癌細胞株からの試料を用いて決定される、〔３〕に記載の方法。
〔５〕
基準経路プロファイルが、特定のタイプの癌を有する対象からの試料を用いて決定される、〔３〕に記載の方法。
〔６〕
近接アッセイが協同的酵素増強反応性イムノアッセイ（ＣＥＥＲ）である、〔１〕に記載の方法。
〔７〕
標的のインヒビターが、チロシンキナーゼインヒビター、ＰＩ３Ｋインヒビター、ＭＥＫインヒビター、ＨＥＲ２インヒビター、ＨＥＲ３インヒビター、及びそれらの組合せからなる群から選択される、〔１〕に記載の方法。
〔８〕
ＰＩ３Ｋインヒビターが、ＢＹＬ７１９、ＢＡＹ８４１２３６、ＢＡＹ８０６９４６、ＳＦ１１２６、ＸＬ１４７、ＸＬ７６５、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＮＶＰ−ＢＧＴ２２６、ＮＶＰ−ＢＫＭ１２０、ＧＤＣ−０９４１、ＰＸ−８６６、ＧＳＫ１０５９６１５、ＣＡＬ−１０１、及びそれらの組合せからなる群から選択される、〔７〕に記載の方法。
〔９〕
ＭＥＫインヒビターが、ＢＡＹ８６９７６６、ＭＥＫ１６２、ＧＤＣ−０９７３／ＲＧ７４２０、ＧＤＣ−０６２３／ＲＧ７４２１、ＲＧ７１６７、ＲＧ７３０４、ＸＬ５１８、ＰＤ−３２５９０１、及びそれらの組合せからなる群から選択される、〔７〕に記載の方法。
〔１０〕
ＨＥＲ２インヒビターが、トラスツズマブ、トラスツズマブ−ＤＭ１、エルツマクソマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ペリチニブ、ＣＰ−６５４５７７、ＣＰ−７２４７１４、カネルチニブ／ＣＩ１０３３／ＰＤ１８３８０５、ＨＫＩ−２７２、ラパチニブ、ネラチニブ、ＰＫＩ−１６６／ＣＧＰ−７５１６６、ＡＥＥ７８８、ＢＭＳ−５９９６２６、ＨＫＩ−７２７、ＨＫＩ−３５７、ＢＩＢＷ２９９２、ＡＧ１４７８、Ａｒｒｙ−３８０、ＡＲＲＹ−３３４５４３、Ｂａｙ８４６、Ｄ６９４９１、ＤＸＬ−７０２、ＪＮＪ−２６４８３３２７、及びそれらの組合せからなる群から選択される、〔７〕に記載の方法。
〔１１〕
ＨＥＲ３インヒビターが、ＭＭ−１２１、ＡＭＧ−８８８、トラスツズマブ、ペルツズマブ、セツキシマブ、ＭＥＨＤ７９４５Ａ／ＲＧ７５９７、ＲＧ７１１６、ゲフィチニブ、エルロチニブ、カネルチニブ、ラパチニブ、ＭＰ−４７０、ＡＺＤ８９３１、ＰＦ００２９９８０４、及びそれらの組合せからなる群から選択される、〔７〕に記載の方法。
〔１２〕
試料が、細針吸引物、腫瘍組織生検、腫瘍細胞、又は循環腫瘍細胞である、〔１〕に記載の方法。
〔１３〕
癌を有する対象に対して、治療を最適化し、又は標的のインヒビターの治療有効性をモニタリングするための方法であって、
（ａ）標的のインヒビターでの治療クールにわたって複数の時点で対象から採取した試料における、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭＥＴ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＥＲＫ、ＭＥＫ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＤＫ１、ＰＲＡＳ４０、ＰＴＥＮ、ＲＰＳ６、ＳＨＣ、及びそれらの組合せからなる群から選択される１つ又は複数のシグナル伝達分析物の発現及び／又は活性化レベルを測定して、経路プロファイルを決定するステップと、
（ｂ）対象の経路プロファイルに基づいて、対象が標的のインヒビターに応答性であるか否かを決定するステップと、
（ｃ）対象が応答性である場合、標的のインヒビターの投与を継続することを推奨するステップと
を含む方法。
〔１４〕
対象が非応答性である場合、標的のインヒビターの投与を改変することを推奨することをさらに含む、〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕
対象が非応答性である場合、少なくとも２つの標的のインヒビターの投与を推奨することをさらに含む、〔１４〕に記載の方法。
〔１６〕
複数の時点における第１の時点が、標的のインヒビターでの治療クール前である、〔１３〕に記載の方法。
〔１７〕
複数の時点における１つ又は複数の後の時点が、標的のインヒビターでの治療クールの間にある、〔１３〕に記載の方法。
〔１８〕
癌が、乳癌、直腸結腸癌、胃癌、肺癌、膵臓癌、及び前立腺癌からなる群から選択される、〔１３に記載の方法。
〔１９〕
試料が、細針吸引物、腫瘍組織生検、腫瘍細胞、又は循環腫瘍細胞である、〔１３〕に記載の方法。
〔２０〕
標的のインヒビターが、チロシンキナーゼインヒビター、ＰＩ３Ｋインヒビター、ＭＥＫインヒビター、ＨＥＲ２インヒビター、ＨＥＲ３インヒビター、及びそれらの組合せからなる群から選択される、〔１３〕に記載の方法。
〔２１〕
ＰＩ３Ｋインヒビターが、ＢＹＬ７１９、ＢＡＹ８４１２３６、ＢＡＹ８０６９４６、ＳＦ１１２６、ＸＬ１４７、ＸＬ７６５、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＮＶＰ−ＢＧＴ２２６、ＮＶＰ−ＢＫＭ１２０、ＧＤＣ−０９４１、ＰＸ−８６６、ＧＳＫ１０５９６１５、ＣＡＬ−１０１、及びそれらの組合せからなる群から選択される、〔２０〕に記載の方法。
〔２２〕
ＭＥＫインヒビターが、ＢＡＹ８６９７６６、ＭＥＫ１６２、ＧＤＣ−０９７３／ＲＧ７４２０、ＧＤＣ−０６２３／ＲＧ７４２１、ＲＧ７１６７、ＲＧ７３０４、ＸＬ５１８、ＰＤ−３２５９０１、及びそれらの組合せからなる群から選択される、〔２０〕に記載の方法。
〔２３〕
ＨＥＲ２インヒビターが、トラスツズマブ、トラスツズマブ−ＤＭ１、エルツマクソマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ペリチニブ、ＣＰ−６５４５７７、ＣＰ−７２４７１４、カネルチニブ／ＣＩ１０３３／ＰＤ１８３８０５、ＨＫＩ−２７２、ラパチニブ、ネラチニブ、ＰＫＩ−１６６／ＣＧＰ−７５１６６、ＡＥＥ７８８、ＢＭＳ−５９９６２６、ＨＫＩ−７２７、ＨＫＩ−３５７、ＢＩＢＷ２９９２、ＡＧ１４７８、Ａｒｒｙ−３８０、ＡＲＲＹ−３３４５４３、Ｂａｙ８４６、Ｄ６９４９１、ＤＸＬ−７０２、ＪＮＪ−２６４８３３２７、及びそれらの組合せからなる群から選択される、〔２０〕に記載の方法。
〔２４〕
ＨＥＲ３インヒビターが、ＭＭ−１２１、ＡＭＧ−８８８、トラスツズマブ、ペルツズマブ、セツキシマブ、ＭＥＨＤ７９４５Ａ／ＲＧ７５９７、ＲＧ７１１６、ゲフィチニブ、エルロチニブ、カネルチニブ、ラパチニブ、ＭＰ−４７０、ＡＺＤ８９３１、ＰＦ００２９９８０４、及びそれらの組合せからなる群から選択される、〔２０〕に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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