(57)【要約】【課題】  骨格成長遅延障害、特に線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）の構成的に活性化された変異体の発現により、ＦＧＦＲ３の異常に増加した活性化を示す患者が発症した骨系統疾患、とりわけ軟骨無形成症の予防または処置における使用のための、可溶性線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）ポリペプチドおよび該ポリペプチドを含む組成物を提供すること。【解決手段】  天然ヒトＦＧＦＲ３の細胞外領域またはその変異体もしくはフラグメント、およびそれに隣接する天然ヒトＦＧＦＲ３の細胞内領域の一部を含み、天然ヒトＦＧＦＲ３の膜貫通ドメインを欠く、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨格成長遅延障害の予防または処置における使用のための、単離された可溶性線維芽細胞増殖因子受容体３（ｓＦＧＦＲ３）ポリペプチドまたはその機能的等価体。
【請求項２】
骨格成長遅延障害が、特発性発育遅延障害である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
骨格成長遅延障害が、ＦＧＦＲ３関連骨系統疾患である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ＦＧＦＲ３関連骨系統疾患が、タナトフォリック骨異形成症Ｉ型、タナトフォリック骨異形成症ＩＩ型、発育遅延および黒色表皮症を伴う重度の軟骨無形成症、軟骨低形成症、軟骨無形成症およびＦＧＦＲ３関連頭蓋骨縫合早期癒合症、例えばミュエンク症候群（Muenke syndrome）および黒色表皮症を伴うクルーゾン症候群、からなる群より選択される、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ＦＧＦＲ３関連骨系統疾患が軟骨無形成症である、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ＦＧＦＲ３関連骨系統疾患が、対象における構成的に活性化されたＦＧＦＲ３受容体変異体の発現に起因する、請求項３〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ＦＧＦＲ３関連骨系統疾患が軟骨無形成症であり、構成的に活性化されたＦＧＦＲ３受容体変異体が、３８０位のグリシン残基がアルギニンで置換されている（すなわち、Ｇ３８０Ｒである）変異体である、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
ポリペプチドが、配列番号１で定義されるポリペプチド配列によりコードされる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
ポリペプチドが、配列番号２で定義されるポリペプチド配列によりコードされる、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
単離されたｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはその機能的等価体および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
単離されたｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはその機能的等価体および薬学的に許容される担体を含む、骨格成長遅延障害の予防または処置における使用のための、医薬組成物。
【請求項１２】
治療的有効量のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはかかるポリペプチドを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、骨格成長遅延障害の予防または処置のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、骨格成長遅延障害(skeletal growth retardation disorder)、特に線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）の構成的に活性化された変異体の発現により、ＦＧＦＲ３の異常に増加した活性化を示す患者が発症した骨系統疾患および頭蓋骨縫合早期癒合症の予防または処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒトにおける骨格の発育は、多数の増殖因子により調節されている。
これらのうち、線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）は、軟骨内骨化の負および正の両方の調節因子として記載されている。ＦＧＦＲ３をコードする遺伝子における変異は、種々の骨系統の軟骨形成異常症（chondrodysplasia）（１）の表現型に関与することが示されており、これは致死性骨異形成（ＴＤＩおよびＴＤＩＩ）（２）および軟骨無形成症（３）、最も一般的には四肢短縮症を含む。軟骨無形成症を発症している小児は、頭蓋骨および脊椎の形態異常ならびに異常に長い骨の発達を示し、結果として、低身長ならびに重度の神経科的および整形外科的合併症を発症する（４、５）。既存の治療は、いくつかの合併症を軽減するためにのみ設計されており、侵襲的であり、極端である（６、７）。
【０００３】
軟骨無形成症は、ＦＧＦＲ３の遺伝子（Ｆｇｆｒ３ａｃｈ）における点変異によって引き起こされる常染色体優性遺伝性疾患である（８）。発症患者の〜９７％で、軟骨無形成症は、受容体の膜貫通ドメインにおけるＧ３８０Ｒ置換によって引き起こされる（９、１０）。ＦＧＦＲ３におけるこの変異は、機能の獲得をもたらし（１１）、受容体のチロシンキナーゼ活性の活性化を延長する（１２、１３）。Ｇ３８０Ｒ変異型ＦＧＦＲ３は、その二量体化および活性化についてリガンド依存性である（１２、１４）。しかしながら、変異の存在は、リガンド／受容体複合体を安定化し（１５）、受容体内在化を減速させ（１２）、それ故に、その後の細胞内Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路シグナル伝達を延長させる（１２）。結果として、ＦＧＦＲ３シグナル伝達が延長され、成長板における軟骨細胞の増殖および分化を確実に阻害する（１６）。変異受容体を発現する細胞は成熟せず、石灰化した骨マトリックスによって置き換えられず、軟骨内骨化によって形成された全ての骨の伸張を損なう（１７，１８）。これらは、付属肢骨格の長骨、ならびに脊椎、胸骨、頭蓋底、および骨成長が軟骨結合で発生する頭蓋骨の幾つかの骨であって、静止軟骨細胞層(resting chondrocyte)の共通部位を含む２つの対向する成長板からなる軟骨構造である骨を含む。長骨の軟骨内成長板と同様に、軟骨結合もまた骨により置き換えられるようになる。
【０００４】
骨の発達障害に関連する機序を解析する多くの研究にも関わらず、利用可能な治療法は未だ存在しない。いくつかの治療戦略は、変異型ＦＧＦＲ３およびその下流のシグナル伝達を標的とすると考えられている（１６）。最近、Ｊｉｎらは、ＴＤＩＩのマウスモデルにおいてＦＧＦＲ３シグナル伝達を阻害する新規ペプチドを試験した（１９）。この研究は、子宮内での治療の後にＴＤＩＩマウスの新生仔の死亡率の低下を示し、細胞外分画におけるＦＧＦＲ３の標的化が、ＦＧＦＲ３関連骨格形成異常を処置するのに有効な治療法であり得ることを概念的に実証する。
【０００５】
軟骨無形成症の現在の治療には、脚延長術などの整形外科手術および成長ホルモン療法が含まれる。しかしながら、脚延長術は患者に大きな苦痛を与え、成長ホルモン療法は、身長を伸ばす定期的な成長ホルモン注射を幼児期から始める必要がある。さらに、注射を止めると成長が止まる。従って、新しい軟骨無形成症、ならびにＦＧＦＲ３関連骨系統疾患を含む他の骨格成長遅延障害の治療法の開発が望まれる。
【０００６】
本特許中、種々の参考文献が本発明に関連する技術を記載している。これらの文献の開示内容は、引用により本明細書中に引用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許番号第７，０２９，８７２号公報
【特許文献２】米国特許番号第７，４４９，３０８号公報
【特許文献３】米国特許出願公開第２００４０２３００４２号
【特許文献４】米国特許出願公開第２００５０２０８６１７号
【特許文献５】米国特許出願公開第２００４０１７１８２６号
【特許文献６】米国特許出願公開第２００５０２０８６１７号
【特許文献７】米国特許出願公開第２００６０２８６６３７号
【非特許文献】
【０００８】
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【非特許文献２】M. L. Martinez-Frias, C. A. de Frutos, E. Bermejo, M. A. Nieto, Review of the recently defined molecular mechanisms underlying thanatophoric dysplasia and their potential therapeutic implications for achondroplasia. Am J Med Genet A 152A, 245 (Jan, 2010).
【非特許文献３】W. A. Horton, G. P. Lunstrum, Fibroblast growth factor receptor 3 mutations in achondroplasia and related forms of dwarfism. Rev Endocr Metab Disord 3, 381 (Dec, 2002).
【非特許文献４】M. J. Wright, M. D. Irving, Clinical management of achondroplasia. Arch Dis Child 97, 129 (Feb, 2012).
【非特許文献５】W. A. Horton, J. G. Hall, J. T. Hecht, achondroplasia. Lancet 370, 162 (Jul 14, 2007).
【非特許文献６】E. D. Shirley, M. C. Ain, achondroplasia: manifestations and treatment. J Am Acad Orthop Surg 17, 231 (Apr, 2009).
【非特許文献７】P. Richette, T. Bardin, C. Stheneur, achondroplasia: from genotype to phenotype. Joint Bone Spine 75, 125 (Mar, 2008).
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【非特許文献２３】T. D. Papakostas et al., Development of an efficiently cleaved, bioactive, highly pure FLAG-tagged recombinant human Mullerian Inhibiting Substance. Protein Expr Purif 70, 32 (Mar, 2010).
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【発明の概要】
【０００９】
発明の概要
第一の面において、本発明は、骨格成長遅延障害の予防または処置における使用のための、単離された可溶性の線維芽細胞増殖因子受容体３（ｓＦＧＦＲ３）ポリペプチドまたはその機能的等価体に関する。
【００１０】
第二の面において、本発明はまた、単離されたｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはその機能的等価体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【００１１】
第三の面において、本発明はさらに、単離されたｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはその機能的等価体および薬学的に許容される担体を含む、骨格成長遅延障害であるＦＧＦＲ３関連骨系統疾患の予防または処置における使用のための医薬組成物に関する。
【００１２】
別の面において、本発明は、治療的有効量のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはかかるポリペプチドを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、骨格成長遅延障害であるＦＧＦＲ３関連骨系統疾患の予防または処置のための方法に関する。
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明者らは、骨格成長を回復することによる軟骨無形成症の効果的な治療法を設計した。本明細書に記載の通り、Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウス（軟骨内骨化によって形成される全ての骨の短縮を有する、ヒト病理と本質的に同一の表現型を表す軟骨無形成症のマウスモデル）への、デコイ受容体として作用する組み換え可溶性線維芽細胞増殖因子受容体３（ｓＦＧＦＲ３）の出生後投与は、軟骨無形成症の症状および合併症の発症を予防する正常な骨格の成長をもたらす。
【００１４】
本明細書に記載の通り、成長期間を通して組み換えｓＦＧＦＲ３の皮下注射を繰り返すことにより、正常な骨格成長がトランスジェニックＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスで回復し得て、正常な体長、および関連する合併症の顕著な減少をもたらし得る。成長板軟骨細胞の効果的な成熟は、処置マウスの骨において回復し、Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスにおける骨格成長の用量依存的増強をもたらした。この処置は、合併症の数および強度の有意な減少と共に正常な身長をもたらし、毒性の如何なる証拠も示さなかった。これらの結果は、骨格成長を回復するための可溶性ＦＧＦＲ３の使用を裏付けし、軟骨無形成症および関連する骨系統疾患のための有望な治療法としての可能性を示す。
【００１５】
治療法および使用：
本発明は、骨格成長遅延障害を予防または処置するための方法および組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。
【００１６】
従って、本発明は、骨格成長遅延障害の予防または処置における使用のための、単離された可溶性線維芽細胞増殖因子受容体３（ｓＦＧＦＲ３）ポリペプチドまたはその機能的等価体に関する。
【００１７】
一態様において、骨格成長遅延障害は、特発性骨格成長遅延障害である。
別の態様において、骨格成長遅延障害はＦＧＦＲ３関連骨系統疾患である。
【００１８】
本明細書で用いる用語“線維芽細胞増殖因子受容体３”（“ＦＧＦＲ３”）または“ＦＧＦＲ３受容体”は、天然または変異ＦＧＦＲ３ポリペプチドを意味する。第４染色体の短腕末端に位置しているＦＧＦＲ３遺伝子は、８０６アミノ酸のタンパク質前駆体（線維芽細胞増殖因子受容体３アイソフォーム１前駆体）をコードしている。天然に存在するヒトＦＧＦＲ３遺伝子は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００１４２．４で示されるヌクレオチド配列を有し、天然に存在するヒトＦＧＦＲ３タンパク質は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００１３３で示されるアミノ酸配列を有する。
【００１９】
用語“ポリペプチド”は、本明細書中、長さの決まっていないアミノ酸のポリマーを意味する。従って、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は“ポリペプチド”の定義に含まれ、これらの用語は、本明細書中、ならびに特許請求の範囲において互換的に用いられる。用語“ポリペプチド”は、リン酸化、アセチル化、グリコシル化などを含むが、これらに限定されない、翻訳後修飾を排除するものではない。
【００２０】
“単離された”ポリペプチドとは、ポリペプチドが、生体内、例えばヒト体内に存在しないことが意図される。しかしながら、単離されたポリペプチドは、組成物またはキットの一部であってもよい。単離されたポリペプチドは、好ましくは、精製されている。
【００２１】
“天然配列”ポリペプチドは、天然由来のポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。従って、天然配列ポリペプチドは、（ヒトを含む）哺乳動物由来の天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列を有し得る。このような天然配列ポリペプチドは天然から単離することもできるし、組み換えまたは合成手段により製造することもできる。用語“天然配列”ポリペプチドは、具体的には、ポリペプチドの天然に存在する切断または分泌形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に存在する変異形態（例えば、選択的スプライシング型）およびポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変異体を包含する。
【００２２】
ポリペプチド“変異体”は、天然配列ポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチドを意味する。このような変異体には、例えば、一つ以上のアミノ酸残基がポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に、付加または欠失されているポリペプチドが含まれる。通常、変異体は、天然配列ポリペプチドと、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有し、さらにより好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有し得る。
【００２３】
例えば、本発明において、問題アミノ酸配列（クエリーアミノ酸配列）に対して少なくとも９５％“同一”のアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、目的のポリペプチド配列が、問題アミノ酸配列の各１００アミノ酸当たり５個までのアミノ酸変化を含み得ることを除き、問題配列と同一であることを意図する。言い換えれば、問題アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、対象配列中に５％（１００のうち５個）までのアミノ酸残基を挿入、欠失または別のアミノ酸での置換がされていてもよい。
【００２４】
本明細書においては、同一性の割合は、グローバルアラインメントを用いて計算される（すなわち、２つの配列がそれらの全長に亘って比較される）。２以上の配列の同一性および相同性を比較する方法は、当技術分野において周知である。２つの配列の最適なアラインメント（ギャップを含む）を見つけるために、それらの全体の長さを考慮したとき、Needleman −Wunschグローバルアライメントアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443-453）を用いる“ｎｅｅｄｌｅ”プログラムが、例えば、使用可能である。ｎｅｅｄｌｅプログラムは、例えば、ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋのワールドワイドウェブサイトで入手できる。本発明による同一性の割合は、好ましく１０．０に等しい“ギャップオープン”パラメータ、０．５に等しい“ギャップ拡張”パラメータ、およびＢｌｏｓｕｍ６２マトリックスを用いるＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ（グローバル）プログラムを用いて計算される。
【００２５】
対照配列と“少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一”のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、対照配列と比較して、欠失、挿入および／または置換などの変異を含んでいてよい。対照配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、対照配列の対立遺伝子変異体に相当し得る。これは、例えば、対照配列と比較して、唯一の置換を含んでいてよい。置換は、好ましくは、以下の表に示されているような保存的置換に対応するものである。
【００２６】
【表１】
2020015733.tif 000002
【００２７】
可溶性ＦＧＦＲ３ポリペプチドは、ＦＧＦタンパク質に結合し、それにより、それらが標的細胞の表面上に存在するＦＧＦＲ３に結合するのを阻止することにより、ＦＧＦタンパク質の生物学的活性に対して阻害効果を発揮する。可溶性ＦＧＦＲ３ポリペプチドが、細胞膜と結合するようにならないことは望ましくない。好ましい態様において、可溶性ＦＧＦＲ３ポリペプチドは、それらが由来するＦＧＦＲ３ポリペプチドの膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインに対応するアミノ酸配列を欠く。
【００２８】
本明細書で用いる用語“ＦＧＦＲ３の可溶性ポリペプチド”または“ｓＦＧＦＲ３”は、ＦＧＦＲ３の細胞外領域を含むか、またはそれからなるポリペプチド、またはそのフラグメントを意味する。例えば、ｓＦＧＦＲ３は、ヒトＦＧＦＲ３の全ての細胞外ドメインを含み得る、すなわち、以下の配列番号１で示されるヒトＦＧＦＲ３の１−６９４の範囲のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなるポリペプチドである。
【００２９】
ＭＧＡＰＡＣＡＬＡＬＣＶＡＶＡＩＶＡＧＡＳＳＥＳＬＧＴＥＱＲＶＶＧＲＡＡＥＶＰＧＰＥＰＧＱＱＥＱＬＶＦＧＳＧＤＡＶＥＬＳＣＰＰＰＧＧＧＰＭＧＰＴＶＷＶＫＤＧＴＧＬＶＰＳＥＲＶＬＶＧＰＱＲＬＱＶＬＮＡＳＨＥＤＳＧＡＹＳＣＲＱＲＬＴＱＲＶＬＣＨＦＳＶＲＶＴＤＡＰＳＳＧＤＤＥＤＧＥＤＥＡＥＤＴＧＶＤＴＧＡＰＹＷＴＲＰＥＲＭＤＫＫＬＬＡＶＰＡＡＮＴＶＲＦＲＣＰＡＡＧＮＰＴＰＳＩＳＷＬＫＮＧＲＥＦＲＧＥＨＲＩＧＧＩＫＬＲＨＱＱＷＳＬＶＭＥＳＶＶＰＳＤＲＧＮＹＴＣＶＶＥＮＫＦＧＳＩＲＱＴＹＴＬＤＶＬＥＲＳＰＨＲＰＩＬＱＡＧＬＰＡＮＱＴＡＶＬＧＳＤＶＥＦＨＣＫＶＹＳＤＡＱＰＨＩＱＷＬＫＨＶＥＶＮＧＳＫＶＧＰＤＧＴＰＹＶＴＶＬＫＶＳＬＥＳＮＡＳＭＳＳＮＴＰＬＶＲＩＡＲＬＳＳＧＥＧＰＴＬＡＮＶＳＥＬＥＬＰＡＤＰＫＷＥＬＳＲＡＲＬＴＬＧＫＰＬＧＥＧＣＦＧＱＶＶＭＡＥＡＩＧＩＤＫＤＲＡＡＫＰＶＴＶＡＶＫＭＬＫＤＤＡＴＤＫＤＬＳＤＬＶＳＥＭＥＭＭＫＭＩＧＫＨＫＮＩＩＮＬＬＧＡＣＴＱＧＧＰＬＹＶＬＶＥＹＡＡＫＧＮＬＲＥＦＬＲＡＲＲＰＰＧＬＤＹＳＦＤＴＣＫＰＰＥＥＱＬＴＦＫＤＬＶＳＣＡＹＱＶＡＲＧＭＥＹＬＡＳＱＫＣＩＨＲＤＬＡＡＲＮＶＬＶＴＥＤＮＶＭＫＩＡＤＦＧＬＡＲＤＶＨＮＬＤＹＹＫＫＴＴＮＧＲＬＰＶＫＷＭＡＰＥＡＬＦＤＲＶＹＴＨＱＳＤＶＷＳＦＧＶＬＬＷＥＩＦＴＬＧＧＳＰＹＰＧＩＰＶＥＥＬＦＫＬＬＫＥＧＨＲＭＤＫＰＡＮＣＴＨＤＬＹＭＩＭＲＥＣＷＨＡＡＰＳＱＲＰＴＦＫＱＬＶＥＤＬＤＲＶＬＴＶＴＳＴＤＥＹＬＤＬＳＡＰＦＥＱＹＳＰＧＧＱＤＴＰＳＳＳＳＳＧＤＤＳＶＦＡＨＤＬＬＰＰＡＰＰＳＳＧＧＳＲＴ（配列番号１）。
【００３０】
１つの特定の態様において、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、配列番号２（以下）で示される核酸でコードされる。
【００３１】
ＡＴＧＧＧＣＧＣＣＣＣＴＧＣＣＴＧＣＧＣＣＣＴＣＧＣＧＣＴＣＴＧＣＧＴＧＧＣＣＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＴＧＧＣＣＧＧＣＧＣＣＴＣＣＴＣＧＧＡＧＴＣＣＴＴＧＧＧＧＡＣＧＧＡＧＣＡＧＣＧＣＧＴＣＧＴＧＧＧＧＣＧＡＧＣＧＧＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＧＧＧＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＧＧＴＣＴＴＣＧＧＣＡＧＣＧＧＧＧＡＴＧＣＴＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＴＣＣＣＣＣＧＣＣＣＧＧＧＧＧＴＧＧＴＣＣＣＡＴＧＧＧＧＣＣＣＡＣＴＧＴＣＴＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＴＧＧＣＡＣＡＧＧＧＣＴＧＧＴＧＣＣＣＴＣＧＧＡＧＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＴＧＧＧＧＣＣＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＴＧＣＣＴＣＣＣＡＣＧＡＧＧＡＣＴＣＣＧＧＧＧＣＣＴＡＣＡＧＣＴＧＣＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＡＣＧＣＡＧＣＧＣＧＴＡＣＴＧＴＧＣＣＡＣＴＴＣＡＧＴＧＴＧＣＧＧＧＴＧＡＣＡＧＡＣＧＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＧＧＧＡＧＡＴＧＡＣＧＡＡＧＡＣＧＧＧＧＡＧＧＡＣＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＧＴＧＴＧＧＡＣＡＣＡＧＧＧＧＣＣＣＣＴＴＡＣＴＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＣＧＡＧＣＧＧＡＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＧＴＧＣＣＧＧＣＣＧＣＣＡＡＣＡＣＣＧＴＣＣＧＣＴＴＣＣＧＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＧＣＴＧＧＣＡＡＣＣＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＧＣＴＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＧＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＡＣＣＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＣＡＴＣＡＡＧＣＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＣＣＴＧＧＴＣＡＴＧＧＡＡＡＧＣＧＴＧＧＴＧＣＣＣＴＣＧＧＡＣＣＧＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＧＴＣＧＴＧＧＡＧＡＡＣＡＡＧＴＴＴＧＧＣＡＧＣＡＴＣＣＧＧＣＡＧＡＣＧＴＡＣＡＣＧＣＴＧＧＡＣＧＴＧＣＴＧＧＡＧＣＧＣＴＣＣＣＣＧＣＡＣＣＧＧＣＣＣＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＴＧＣＣＧＧＣＣＡＡＣＣＡＧＡＣＧＧＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＧＡＧＴＴＣＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣＡＧＴＧＡＣＧＣＡＣＡＧＣＣＣＣＡＣＡＴＣＣＡＧＴＧＧＣＴＣＡＡＧＣＡＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＡＴＧＧＣＡＧＣＡＡＧＧＴＧＧＧＣＣＣＧＧＡＣＧＧＣＡＣＡＣＣＣＴＡＣＧＴＴＡＣＣＧＴＧＣＴＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＧＣＧＴＣＣＡＴＧＡＧＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＣＣＡＣＴＧＧＴＧＣＧＣＡＴＣＧＣＡＡＧＧＣＴＧＴＣＣＴＣＡＧＧＧＧＡＧＧＧＣＣＣＣＡＣＧＣＴＧＧＣＣＡＡＴＧＴＣＴＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＣＧＡＣＣＣＣＡＡＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＴＣＴＣＧＧＧＣＣＣＧＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＧＧＣＡＡＧＣＣＣＣＴＴＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴＧＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＴＧＧＴＣＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＡＴＣＧＧＣＡＴＴＧＡＣＡＡＧＧＡＣＣＧＧＧＣＣＧＣＣＡＡＧＣＣＴＧＴＣＡＣＣＧＴＡＧＣＣＧＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＣＣＡＣＴＧＡＣＡＡＧＧＡＣＣＴＧＴＣＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＡＧＡＴＧＧＡＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＣＧＧＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＡＡＣＡＴＣＡＴＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＧＣＣＴＧＣＡＣＧＣＡＧＧＧＣＧＧＧＣＣＣＣＴＧＴＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＣＧＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＴＡＡＣＣＴＧＣＧＧＧＡＧＴＴＴＣＴＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＣＣＧＧＧＣＣＴＧＧＡＣＴＡＣＴＣＣＴＴＣＧＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＣＣＧＣＣＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＣＴＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＴＣＣＴＧＴＧＣＣＴＡＣＣＡＧＧＴＧＧＣＣＣＧＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＴＡＣＴＴＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＡＡＧＴＧＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＣＡＡＴＧＴＧＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＡＧＧＡＣＡＡＣＧＴＧＡＴＧＡＡＧＡＴＣＧＣＡＧＡＣＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＣＣＧＧＧＡＣＧＴＧＣＡＣＡＡＣＣＴＣＧＡＣＴＡＣＴＡＣＡＡＧＡＡＧＡＣＡＡＣＣＡＡＣＧＧＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＡＡＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＣＣＴＧＡＧＧＣＣＴＴＧＴＴＴＧＡＣＣＧＡＧＴＣＴＡＣＡＣＴＣＡＣＣＡＧＡＧＴＧＡＣＧＴＣＴＧＧＴＣＣＴＴＴＧＧＧＧＴＣＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＡＧＡＴＣＴＴＣＡＣＧＣＴＧＧＧＧＧＧＣＴＣＣＣＣＧＴＡＣＣＣＣＧＧＣＡＴＣＣＣＴＧＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＣＴＴＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＧＣＣＡＣＣＧＣＡＴＧＧＡＣＡＡＧＣＣＣＧＣＣＡＡＣＴＧＣＡＣＡＣＡＣＧＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＧＡＴＣＡＴＧＣＧＧＧＡＧＴＧＣＴＧＧＣＡＴＧＣＣＧＣＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＴＡＣＣＧＴＧＡＣＧＴＣＣＡＣＣＧＡＣＧＡＧＴＡＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＴＣＧＧＣＧＣＣＴＴＴＣＧＡＧＣＡＧＴＡＣＴＣＣＣＣＧＧＧＴＧＧＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＡＧＧＧＧＡＣＧＡＣＴＣＣＧＴＧＴＴＴＧＣＣＣＡＣＧＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣＡＣＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧＧＣＴＣＧＣＧＧＡＣＧ（配列番号２）。
【００３２】
かかる核酸配列は、ｍＲＮＡの半減期を延長するためにＧＣ含量を減少させて（天然ポリペプチド配列をコードしているが）最適化されている。
【００３３】
“機能的等価体”は、親ポリペプチドの生物学的活性および特異性を保持する分子（例えば、組換えポリペプチド）である。従って、用語“ｓＦＧＦＲ３の機能的等価体”とは、機能的等価体が引用ポリペプチドの生物学的活性の少なくとも１つ、好ましくは全てを示す、例えば、ＦＧＦタンパク質に結合する能力を保持する限り、それが引用するポリペプチド（すなわち、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチド）の変異体およびフラグメントを含む。本明細書で用いる“結合特異性”は、生物学的に活性なフラグメントが、ＦＧＦに高い親和性を有するが、制御タンパク質には親和性を有さないことを意味する。特異的結合は、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング、または免疫沈降のような多数の技術により測定され得る。好ましくは、機能的等価体は、ＦＧＦにナノモルまたはピコモルレベルで特異的に結合する。
【００３４】
従って、本発明のポリペプチドは、ＦＧＦＲ３の細胞外領域のフラグメントからなるかこれを含むポリペプチドを包含し、該フラグメントは生物学的に活性である。本発明においては、生物学的に活性なフラグメントは、例えば、ＦＧＦＲ３受容体の細胞外領域の少なくとも３００、４００、５００、６００または６５０の連続するアミノ酸を含んでもよい。
【００３５】
ＦＧＦＲ３受容体の細胞外領域の機能的等価体の“生物活性”は、（ｉ）ＦＧＦに結合する能力、および／または（ｉｉ）ＦＧＦ細胞内シグナル伝達（例えば、それがＦＧＦと結合することにより、Ｅｒｋリン酸化、その後のＦＧＦＲ３受容体活性化）を低減する能力および／または（ｉｉｉ）インビボで（例えば、Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスにおいて）骨格成長を回復する能力を意味する。
【００３６】
当業者は、ＦＧＦＲ３の細胞外領域の機能的等価体が生物学的に活性であるかどうかを容易に判断できる。ポリペプチドＦＧＦＲ３（配列番号１で示される配列からなるポリペプチド）を最初に特徴付けした方法と同様に、新たに製造されたポリペプチドがＦＧＦに結合するかどうか、および／またはＦＧＦ細胞内シグナル伝達を低減するかどうかを検定するために、結合アッセイ、ＦＧＦ活性アッセイまたはＥＲＫ活性化アッセイ（実施例参照のこと）を各ポリペプチドに実施してよい。さらに、インビトロまたはインビボで行われる経時応答および用量応答試験（例えば、実施例に記載の通り、Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスを用いて行う）は、各ポリペプチドのための最適条件を決定する。
【００３７】
さらに、ＧＦＲ３受容体の機能的活性化は、公知の方法に従って当業者により容易に評価され得ることが理解されるべきである。実際に、活性化されたＦＧＦＲ３受容体は、細胞質ドメイン側に位置するチロシン残基、すなわちＴｙｒ６４８およびＴｙｒ６４７がリン酸化されているため、ＦＧＦＲ３受容体の機能的活性化は、例えば、そのリン酸化を測定することにより評価され得る。
【００３８】
例えば、リガンド誘導性のＦＧＦＲ３受容体のリン酸化の分析は、Le Corre et al. (Org. Biomol. Chem., 8: 2164-2173, 2010)に記載の通りに行われ得る。
【００３９】
あるいは、細胞における受容体リン酸化は、この修飾を特異的に認識する抗体を用いて、免疫細胞化学、免疫組織化学および／またはフローサイトメトリーにより容易に検出可能である。例えば、ＦＧＦＲ３のＴｙｒ６４８およびＴｙｒ６４７残基におけるリン酸化は、リン酸化Ｔｙｒ６４８およびＴｙｒ６４７−ＦＧＦＲ３に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて、免疫細胞化学、免疫組織化学および／またはフローサイトメトリーにより検出可能である。
【００４０】
さらに、ＦＧＦＲ３はそのリガンドと結合したとき、ＥＲＫおよびｐ３８ＭＡＰキナーゼ経路、ならびにＳＴＡＴ経路を活性化することによってシグナル伝達を仲介する。従って、ＦＧＦＲ３受容体の活性化はまた、Ｈｏｒｔｏｎら（Lancet, 370: 162-172, 2007）が記載しているように、これらの特定の経路の活性化を測定することによって評価することができる。
【００４１】
一態様では、本発明のポリペプチドは、タグを含んでもよい。タグは、ポリペプチドの精製のために有用となり得るエピトープ含有配列である。タグは、種々の技術により、例えば親和性クロマトグラフィーにより、免疫標識技術を用いて細胞または組織サンプル内の該ペプチドまたはポリペプチドの所在位置を特定するため、免疫ブロッティングなどによる該ポリペプチドの検出のために、結合されている。当技術分野で一般に用いられるタグの例は、ＧＳＴ（グルタチオンチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）−タグ、ＦＬＡＧ（商標）−タグ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ（商標）、Ｖ５タグ、ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ（典型的には６つのヒスチジン残基からなる）などである。
【００４２】
別の態様では、本発明のポリペプチドは、それらの安定性および／または生物学的利用能（biodisponibility）を改善する化学修飾を含んでもよい。かかる化学修飾は、インビボでの酵素分解に対するポリペプチドの増加した保護、および／または膜障壁を通過する増加した能力を有し、それ故にその半減期を増大させ、その生物学的活性を維持または改善するポリペプチドを得ることを目的とする。当該技術分野で公知の化学修飾は、本発明に従って使用することができる。かかる化学修飾には、以下が含まれるがこれらに限定されない。
−  修飾および／または特殊アミノ酸によるアミノ酸の置換（複数可）、例えば、Ｎｌｅ、ＮｖａまたはＯｒｎのような特殊なアミノ酸によるアミノ酸の置換；および／または
−  例えば、Ｎ−末端アシル化（好ましくは、アセチル化）または脱アミノ化のような、ペプチドのＮ−末端および／またはＣ−末端の修飾、またはＣ−末端カルボキシル基のアミド基またはアルコール基への修飾；
−  ２つのアミノ酸間のアミド結合における修飾：窒素原子または２つのアミノ酸を連結するアミド結合のα炭素でのアシル化（好ましくは、アセチル化）またはアルキル化（好ましくは、メチル化）；
−  例えば、２つのアミノ酸を連結するアミド結合の窒素原子またはα炭素でのアシル化（好ましくは、アセチル化）またはアルキル化（好ましくは、メチル化）のような、２つのアミノ酸間のアミド結合の窒素原子またはα炭素における修飾；
−  例えば、１つ以上の天然に存在するアミノ酸（Ｌ−エナンチオマー）の対応するＤ−エナンチオマーでの置換のような、キラリティーの変化；
−  １つ以上の天然に存在するアミノ酸（Ｌ−エナンチオマー）が、アミノ酸鎖の（Ｃ−末端からＮ−末端への）反転を伴って、対応するＤ−エナンチオマーで置換されている、レトロ反転；
−  １つ以上のα炭素が窒素原子で置換されているアザペプチド；および／または
−  １つ以上のアミノ酸のアミノ基が、α炭素ではなく、β炭素に結合している、ベータペプチド。
【００４３】
別の態様において、ジペプチドの付加は、内因性のトランスポーターを用いて、血液網膜関門を通して眼循環させる薬剤の浸透性を向上させ得る。
【００４４】
薬剤の有効性を改善するための別の方法は、水溶性ポリマーの利用である。種々の水溶性ポリマーは、生体内分布を変え、細胞の取り込み方法を改善し、生理的バリアーを通過する浸透性を変化させ、かつ体内からの排出率を変えることが示されている。標的化または持続放出効果のいずれかを達成するために、末端基として、主鎖の一部として、またはポリマー鎖上のペンダント基として薬物部分を含む水溶性ポリマーが合成されている。
【００４５】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、高度の生体適合性および修飾の容易さにより、薬物担体として広く使用されている。種々の薬物、タンパク質、およびリポソームへの結合は、滞留時間を改善し、毒性を低減させることが示されている。ＰＥＧは、鎖の末端でヒドロキシル基を介して、および他の化学的方法によって、活性薬剤に結合され得る。しかしながら、ＰＥＧ自体は、１分子当たり最大で２つの活性薬剤に限定されている。別の方法では、ＰＥＧおよびアミノ酸の共重合体は、ＰＥＧの生体適合性特性を保持し得て、１分子当たりの多数の結合点の追加の利点を有し（より高い薬物負荷を提供する）、そして種々の用途に合わせて合成的に設計され得る、新規の生体材料として検討されている。
【００４６】
薬物の効果の修飾のためのＰＥＧ化技術は当業者に知られている。例えば、ＰＥＧの交互ポリマーおよびリシンのような三官能性モノマーからなる薬物送達ポリマーは、ＶｅｃｔｒａＭｅｄ（Plainsboro, N.J.）により使用されている。ＰＥＧ鎖（典型的には、２０００ダルトン以下）は、安定したウレタン結合を介してリシンのａ−およびｅ−アミノ基と結合されている。かかる共重合体は、ＰＥＧの望ましい特性を保持し、ポリマー鎖に沿って厳密に制御され、所定の間隔で反応性ペンダント基（リジンのカルボン酸基）を提供する。反応性ペンダント基を誘導体化、架橋、または他の分子との結合のために使用することができる。これらのポリマーは、ポリマーの分子量、ＰＥＧセグメントの分子量、および薬物とポリマーとの間の切断可能な結合を変化させることにより、安定な長時間循環型のプロドラッグを製造するのに有用である。ＰＥＧセグメントの分子量は、薬物／結合基複合体の間隔および複合体の分子量当たりの薬物の量（より小さなＰＥＧセグメントは、より大きな薬物負荷を提供する）に影響を与える。一般的に、ブロック共重合体複合体の全分子量を増加させると、複合体の循環半減期を増加させ得る。それでも、複合体は、易分解性であるか、または糸球体濾過の閾値限界値以下（例えば、６０ｋＤａ未満）の分子量を有する必要がある。
【００４７】
加えて、循環半減期および生体内分布を維持するのに重要であるポリマー主鎖に対して、リンカーは、特定のトリガー、典型的には標的組織における酵素活性によって骨格ポリマーから放出されるまでプロドラッグの形態で治療薬を維持するために使用され得る。例えば、組織活性化薬物送達のこのタイプは、生体内分布の特定の部位への送達が必要とされ、治療薬が病状の部位またはその近辺で放出される場合に、特に有用である。活性化された薬物送達に使用するための連結基ライブラリは、当業者に公知であり、酵素反応速度、活性酵素の保有率、および選択された疾患に特異的な酵素の切断特異性に基づき得る。かかるリンカーは、治療的送達のために本明細書に記載のタンパク質または該タンパク質のフラグメントを改変して用いてもよい。
【００４８】
さらに別の態様において、本発明のポリペプチドは、異種ポリペプチド（すなわち、無関係のタンパク質、例えば、免疫グロブリンタンパク質に由来するポリペプチド）に融合されていてよい。
【００４９】
本明細書で用いる用語“融合した”および“融合”は、互換的に用いられる。これらの用語は、化学的結合または組換え手段を含む何らかの手段による、２以上の要素または成分の結合を意味する。“インフレーム融合”は、元のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の正しい翻訳リーディングフレームを維持する方法で、２つ以上のポリヌクレオチド ＯＲＦを連結して連続したより長いＯＲＦを形成することを意味する。例えば、組み換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによりコードされたポリペプチドに対応する２以上のセグメントを含む（セグメントは、通常、天然ではそのように連結されていない）単一のタンパク質であってよい。従って、リーディングフレームは、融合されたセグメント全体に亘って連続しているが、該セグメントは、例えば、インフレームリンカー配列により、物理的または空間的に分離されていてよい。
【００５０】
本明細書で用いる用語“ｓＦＧＦＲ３融合タンパク質”は、異種ポリペプチドに融合されたＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはその機能的等価体を含むポリペプチドを意味する。ＦＧＦＲ３融合タンパク質は、一般に、ＦＧＦＲ３ポリペプチドと共通する少なくとも１つ以上の生物学的特性を共有する（上記の通り）。
【００５１】
ｓＦＧＦＲ３融合タンパク質の例は、ｓＦＧＦＲ３イムノアドヘシンである。
【００５２】
本明細書で用いる用語“イムノアドヘシン”は、異種タンパク質（“アドヘシン”）の結合特異性と免疫グロブリンの定常ドメインのエフェクター機能を組み合わせた、抗体様分子を意味する。構造的には、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識および結合部位以外の所望の結合特異性を有するアミノ酸配列の融合（すなわち、“異種”）、および免疫グロブリンの定常ドメイン配列を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的に、少なくとも受容体またはリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリンの定常ドメイン配列は、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、またはＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭのような何れかの免疫グロブリンから得ることができる。
【００５３】
免疫グロブリン配列は、常にそうではないが、好ましくは、免疫グロブリンの定常ドメイン（Ｆｃ領域）である。イムノアドヘシンは、ヒト抗体の有用な化学的および生物学的特性の多くを有し得る。イムノアドヘシンは、適当なヒト免疫グロブリンヒンジ領域および定常ドメイン（Ｆｃ）配列に連結された所望の特異性を有するヒトタンパク質配列から構築され得るため、目的の結合特異性は、完全にヒトの成分を用いて達成され得る。かかるイムノアドヘシンは、患者に対して免疫原性が最小限であり、慢性または反復使用において安全である。一態様において、Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域である。別の態様において、Ｆｃ領域は、変異型Ｆｃ領域である。さらに別の態様において、Ｆｃ領域は機能的Ｆｃ領域である。ｓＦＧＦＲ３イムノアドヘシンのｓＦＧＦＲ３部分およびの免疫グロブリン配列部分は、最小のリンカーによって連結されていてよい。免疫グロブリン配列は、好ましくは、必ずしも必要ではないが、免疫グロブリンの定常ドメインである。本発明のキメラにおける免疫グロブリン部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭから得られ得て、好ましくは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３である。
【００５４】
本明細書で用いる用語“Ｆｃ領域”は、天然配列のＦｃ領域および変異型Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ−末端領域を定義するために用いられる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は可変であり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６位、またはＰｒｏ２３０位のアミノ酸残基から、そのカルボキシル末端まで伸長すると定義される。
【００５５】
ｓＦＧＦＲ３融合タンパク質の別の例は、Konterman et al. 2012 AlbudAb（商標） Technology Platform-Versatile Albukmin Binding Domains for the Development of Therapeutics with Tunable Half-Livesに記載の通り、ＡｌｂｕｄＡｂ（商標）技術プラットフォームに従い、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドとヒト血清アルブミン結合ドメイン抗体（ＡｌｂｕｄＡｂｓ）との融合である。
【００５６】
本発明のポリペプチドは、当業者に明らかなように、好適な手段によって製造され得る。本発明で使用するための十分量のｓＦＧＦＲ３またはその機能的等価体、またはｓＦＧＦＲ３イムノアドヘシンのようなｓＦＧＦＲ３融合タンパク質を製造するために、発現は、都合よくは、本発明のポリペプチドを含む組み換え宿主細胞を適当な条件下で培養することにより達成され得る。好ましくは、ポリペプチドは、組み換え手段によって、それをコードする核酸分子から発現されることにより製造される。種々の異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のためのシステムは、周知である。
【００５７】
組換え形態で発現されるとき、ポリペプチドは、好ましくは、宿主細胞においてそれをコードする核酸から発現させることにより製造される。任意の宿主細胞が、特定のシステムの個々の要件に応じて、使用可能である。好適な宿主細胞には、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母およびバキュロウイルス系が含まれる。異種ポリペプチドの発現のために当技術分野で利用可能な哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞およびその他多くの細胞（例えば、ＨＥＫ ２９３細胞）が含まれる。細菌はまた、細菌を操作し、かつ増殖させることが容易なために、組換えタンパク質の生産のための宿主として好ましい。一般的な好ましい細菌宿主はＥ ｃｏｌｉ(大腸菌）である。
【００５８】
さらに、タンパク質ベースのバイオ医薬品の大部分は、それらの治療用途に関連するタンパク質特性に大きな影響を与え得る翻訳後修飾のいくつかの形態を有していることが理解されるべきである。タンパク質のグリコシル化は、最も一般的な修飾を示す（ヒトタンパク質の約５０％がグリコシル化されている）。グリコシル化は、組成物内のタンパク質上の異なるグリカン構造の生成を通してタンパク質組成にかなりの不均一性を導入することができる。このようなグリカン構造は、糖タンパク質が小胞体（ＥＲ）とゴルジ複合体（グリコシル化カスケード）を通過すると同時に、グリコシル化機構の多様な酵素の作用によって作製されている。タンパク質のグリカン構造の性質は、タンパク質の折り畳み、安定性、寿命、輸送、薬理動態、薬物動態学および免疫原性に影響を与える。グリカン構造は、タンパク質の主な機能的活性に大きな影響を与える。グリコシル化は、局所タンパク質構造に影響を与え、ポリペプチド鎖の折り畳みを導くのに役立ち得る。グリカン構造の１つの重要な種類は、所謂Ｎ−グリカンである。それらは、新生ポリペプチド鎖のコンセンサス配列ＮＸＳ／Ｔ中のアスパラギン残基のアミノ（Ｎ）基へのオリゴ糖の共有結合により作成される。Ｎ−グリカンはさらに、その最終的な標的に対するタンパク質の選別または指向に関与し得る。抗体のＮ−グリカンは、例えば、補体成分と相互作用することができる。Ｎ−グリカンはまた、例えば、その溶解性を増強し、その表面上の疎水性パッチを遮蔽し、タンパク質溶解から保護し、さらに鎖内安定化相互作用を誘導することにより、糖タンパク質を安定化するのに役立つ。グリコシル化は、タンパク質の半減期を調節することができ、例えば、ヒトにおいては、Ｎ−グリカン中の末端シアル酸の存在は、血流中に循環するタンパク質の半減期を増加させることができる。
【００５９】
本明細書で用いる用語“糖タンパク質”は、それに結合した１つまたはそれ以上のＮ−グリカンを有するタンパク質を意味する。従って、この用語は、糖タンパク質のような当技術分野で一般的に認識されているタンパク質、および１個またはそれ以上のＮ−結合型グリコシル化部位を含むように遺伝子操作されたタンパク質の両方を意味する。本明細書で用いる用語“Ｎ−グリカン”および“グリコフォーム”は、互換的に用いられ、Ｎ−結合型オリゴ糖、例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基へのアスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合により結合しているものを意味する。Ｎ−結合型糖タンパク質は、タンパク質中のアスパラギン残基のアミド窒素に結合したＮ−アセチルグルコサミン残基を含む。糖タンパク質上に見出される主な糖類は、グルコース、ガラクトース、マンノース、ｆｕｃｏｓｅ、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸（例えば、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（ＮＡＮＡ））である。糖基のプロセシングは、ＥＲの内腔において翻訳と同時に生じ、Ｎ−結合型糖タンパク質のためにゴルジ装置内で翻訳後プロセシングが続く。
【００６０】
多数の酵母、例えば、ピキア・パストリス、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)およびサッカロミセス・セレビシエは、そのようなシステムの利点を使用し、グリコシル化の点で不利な点を解消するために現在開発中である。いくつかの株は、タンパク質上で定義され、ヒト様グリカン構造を産生するために遺伝子組換え下で開発中である。ヒト様Ｎ−グリカンを生産するための遺伝的組換え酵母の方法は、米国特許番号第７，０２９，８７２号および同第７，４４９，３０８号、ならびに米国特許出願公開第２００４０２３００４２号、同第２００５０２０８６１７号、同第２００４０１７１８２６号、同第２００５０２０８６１７号、および同第２００６０２８６６３７号に記載されている。これらの方法は、酵母型Ｎ−グリカンの代わりに主にヒト様複合体またはハイブリッド型Ｎ−グリカンを有する治療的糖タンパク質を生産することができる遺伝子組換え酵母を構築するために使用されてきた。上記の通り、ヒト様グリコシル化は、主に、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、フコースおよび／またはＮ−アセチルノイラミン酸を含む“複合体”Ｎ−グリカン構造により特徴付けられる。従って、いくつかの酵母株は、１またはそれ以上のヒト様複合体またはＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２のようなヒト様ハイブリッドＮ−グリカンを含む糖タンパク質を生産するように遺伝子組換えされている。
【００６１】
本明細書で用いる用語“骨格成長遅延障害”は、骨の変形および／または奇形により特徴付けられる骨格疾患を意味する。
これらの障害には、成長板（骨端軟骨の）骨折による骨格成長遅延障害、特発性骨格成長遅延障害およびＦＧＦＲ３関連骨系統疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【００６２】
本明細書で用いる用語“特発性骨格成長遅延障害”は、その原因が不明であり、例えば、外因性の成長ホルモン（ＧＨ）、例えば組み換えヒトＧＨ（ｒｈＧＨ）での処置が無効であることが示されている、骨格疾患を意味する。
【００６３】
本明細書の文脈において、用語“ＦＧＦＲ３関連骨系統疾患”は、特にＦＧＦＲ３受容体の構成的に活性な変異体の発現によって、ＦＧＦＲ３の異常に増加した活性により引き起こされる骨格疾患を意味することを意図する。本明細書で用いる表現“構成的に活性なＦＧＦＲ３受容体変異体”、“ＦＧＦＲ３の構成的に活性な変異体”または“構成的活性を示す変異体ＦＧＦＲ３”は、互換的に用いられ、ＦＧＦリガンド刺激の不存在下で生物学的活性を示し（すなわち、下流のシグナル伝達を誘発する）、および／またはＦＧＦリガンドの存在下で対応する野生型受容体の生物学的活性よりも高い活性を示す、該受容体の変異体を意味する。
【００６４】
ＦＧＦＲ３関連骨格疾患は、好ましくは、ＦＧＦＲ３関連骨格形成異常およびＦＧＦＲ３関連頭蓋骨縫合早期癒合症である。
【００６５】
本発明のＦＧＦＲ３関連骨格形成異常は、遺伝性疾患または散発性疾患に対応し得る。
【００６６】
本明細書で用いる用語“ＦＧＦＲ３関連骨格異形成”には、タナトフォリック骨異形成症Ｉ型、タナトフォリック骨異形成症ＩＩ型、軟骨低形成症、軟骨無形成症およびＳＡＤＤＡＮ（発育遅延および黒色表皮症を伴う重度の軟骨無形成症）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６７】
好ましい態様において、ＦＧＦＲ３関連骨格異形成は、上記で定義したように、構成的に活性なＦＧＦＲ３受容体変異体の対象における発現により引き起こされる。
【００６８】
好ましい態様において、ＦＧＦＲ３関連骨格異形成は、ＦＧＦＲ３受容体の構成的に活性なＧ３８０Ｒ変異体の発現により引き起こされる軟骨無形成症である。
【００６９】
好ましい態様において、ＦＧＦＲ３関連骨格異形成は、ＦＧＦＲ３受容体の構成的に活性なＮ５４０Ｋ、Ｋ６５０Ｎ、Ｋ６５０Ｑ、Ｓ８４Ｌ、Ｒ２００Ｃ、Ｎ２６２Ｈ、Ｇ２６８Ｃ、Ｙ２７８Ｃ、Ｓ２７９Ｃ、Ｖ３８１Ｅ変異体の発現により引き起こされる軟骨低形成症である。
【００７０】
好ましい態様において、ＦＧＦＲ３関連骨格異形成は、Ｒ２４８Ｃ、Ｓ２４８Ｃ、Ｇ３７０Ｃ、Ｓ３７１Ｃ；Ｙ３７３Ｃ、Ｘ８０７Ｒ、Ｘ８０７Ｃ、Ｘ８０７Ｇ、Ｘ８０７Ｓ、Ｘ８０７ＷおよびＫ６５０Ｍ ＦＧＦＲ３受容体からなる群より選択される、ＦＧＦＲ３受容体の構成的活性変異体の発現により引き起こされるタナトフォリック骨異形成症Ｉ型である。
【００７１】
好ましい態様において、ＦＧＦＲ３関連骨格異形成は、ＦＧＦＲ３受容体の構成的に活性なＫ６５０Ｅ変異体の発現によって引き起こされるタナトフォリック骨異形成症ＩＩ型である。
【００７２】
好ましい態様において、ＦＧＦＲ３関連骨格異形成は、ＦＧＦＲ３受容体の構成的に活性なＫ６５０Ｍ変異体の発現によって引き起こされる発育遅延および黒色表皮症を伴う重度の軟骨無形成症である。
【００７３】
本発明はまた、治療的有効量の可溶性ＦＧＦＲ３（ｓＦＧＦＲ３）ポリペプチドをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、骨格成長遅延障害を予防または治療するための方法を提供する。
【００７４】
ｓＦＧＦＲ３の“治療的有効量”とは、上記の通り、ＦＧＦＲ３関連骨系統疾患（例えば、軟骨無形成症）を予防または治療するためのアンタゴニストの十分な量を意味する。しかしながら、本発明の化合物および組成物の総１日使用量は、医学的判断の範囲内で担当医によって決定され得る。ある特定の対象に対する具体的な治療的有効用量レベルは、処置される障害および障害の重症度、用いる特定の化合物の活性、用いる特定の組成物、対象の年齢、体重、一般的健康状態、性別および食事、用いる特定の化合物の投与時間、投与経路および排泄速度、処置期間、用いる特定のポリペプチドと組み合わせて、または同時に使用される薬物、ならびに医療分野で周知の要因などを含む種々の要因によって変わる。例えば、所望の治療的効果を達成するために必要とされるよりも低レベルの化合物用量で開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることも、当業者の技術範囲内である。しかしながら、医薬品の１日投与量は、１日当たり成人１人当たり、０．０１から１，０００ｍｇの広い範囲で変化し得る。好ましくは、組成物は、処置すべき対象への投与量の症候性調節のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０および５００ｍｇの活性成分を含む。薬剤は、典型的に、約０．０１ｍｇから約５００ｍｇの活性成分、好ましくは、１ｍｇから約１００ｍｇの活性成分を含む。薬物の有効量は、通常、１日当たり体重１ｋｇ当たり０．０００２ｍｇから約２０ｍｇ、とりわけ０．００１ｍｇから７ｍｇの投与量レベルで供給される。
【００７５】
本明細書で用いる用語“対象”は、げっ歯動物、ネコ、イヌ、または霊長動物などのヒトまたは非ヒト哺乳動物を意味する。好ましくは、対象は、ヒトであり、より好ましくは小児（すなわち、成長過程の小児）である。
【００７６】
一態様において、対象は、ＦＧＦＲ３関連骨系統疾患を発症していると診断されている。上記の通り、ＦＧＦＲ３関連骨系統疾患は、構成的に活性なＦＧＦＲ３受容体のＧ３８０Ｒ変異体のようなＦＧＦＲ３受容体変異体の対象における発現により引き起こされる。
【００７７】
本発明の文脈中、用語“処置する”は、本明細書中、（１）かかる用語が適用される疾患状態または病状の症状の進行、悪化または機能停止の減速または停止、（２）かかる用語が適用される疾患状態または病状の症状の緩和または改善、および／または（３）かかる用語が適用される疾患状態または病状の好転または治癒、を目的とする治療方法またはプロセスを特徴付けるために使用される。
【００７８】
本明細書で用いる用語“予防”は、かかる用語が適用される障害または病状の発症を遅延または予防することを目的とする予防的方法またはプロセスを特徴付けることを意図する。
【００７９】
本発明の医薬組成物
上記の通り、単離した可溶性ＦＧＦＲ３ポリペプチド（ｓＦＧＦＲ３）は、薬学的に許容される添加剤、および要すれば、生分解性ポリマーのような持続放出マトリックスと組み合わせて、治療的組成物を製造してよい。
【００８０】
従って、本発明はまた、単離されたｓＦＧＦＲ３ポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【００８１】
本発明はさらに、本発明のｓＦＧＦＲ３および薬学的に許容される担体を含む骨格成長遅延障害の予防または処置における使用のための医薬組成物に関する。
【００８２】
一態様において、骨格成長遅延障害は特発性発育遅延障害である。
別の態様において、骨格成長遅延障害はＦＧＦＲ３関連骨系統疾患である。
【００８３】
“薬学的に”または“薬学的に許容される”は、好適には、哺乳動物、とりわけヒトに投与されたとき、副作用、アレルギーまたは他の有害な反応を生じない化合物および組成物を意味する。薬学的に許容される担体または添加剤は、非毒性の固体、半固体または液体充填剤、希釈剤、封入材またはあらゆるタイプの製剤助剤を意味する。
【００８４】
医薬組成物の形態、投与経路、投与量およびレジメンは、処置されるべき病状、疾患の重篤度、患者の年齢、体重および性別などによって当然変わる。本発明の医薬組成物は、局所、経口、鼻腔内、眼内、静脈内、筋肉内または皮下投与などのために剤形化され得る。
【００８５】
好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤用に薬学的に許容されるビヒクルを含む。これらは、特に、等張性の滅菌生理食塩水溶液（一ナトリウムまたはリン酸二ナトリウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムまたは塩化マグネシウムなど、またはかかる塩の混合物）、または場合によって、滅菌水または生理的食塩水の添加により、注射用溶液の構成が可能となる、乾燥形態、とりわけ凍結乾燥形態であってよい。
【００８６】
投与のために使用される用量は、関連する病状、あるいは所望の処置期間の種々のパラメータに応じて、そして特に、使用される投与方法に応じて適合させてよい。例えば、それは、所望の治療効果を達成するために必要とされるよりも低レベルの化合物用量で開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に投与量を増加されることは、当業者の技術的範囲内である。しかしながら、医薬品の１日投与量は、１日当たり成人１人当たり、０．０１から１，０００ｍｇの広い範囲で変化し得る。好ましくは、組成物は、処置すべき対象への投与量の症候性調節のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０および５００ｍｇの活性成分を含む。薬剤は、典型的に、約０．０１ｍｇから約５００ｍｇの活性成分、好ましくは１ｍｇから約１００ｍｇの活性成分を含む。薬剤の有効量は、通常、１日当たり体重１ｋｇ当たり、０．０００２ｍｇから約２０ｍｇ、とりわけ約０．００１ｍｇから７ｍｇの投与量レベルで供給される。
【００８７】
医薬組成物を製造するために、本発明のポリペプチドの有効量を、薬学的に許容される担体または水性媒体に溶解または分散させ得る。
【００８８】
注射用途に適する医薬品形態には、滅菌水溶液または分散液；ゴマ油、ピーナッツ油または水性プロピレングリコールを含む製剤；ならびに、滅菌注射可能溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、形態は滅菌でなければならず、注射容易性が存在する程度に流動性でなければならない。製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染活動に対して保存的でなければならない。遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と水中で好適に混合することにより調製され得る。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、それらの混合物および油中で調製されてもよい。通常の貯蔵および使用の条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために防腐剤を含む。
【００８９】
本発明のポリペプチドは、中性または塩形態で組成物に剤形化され得る。薬学的に許容される塩は、（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）酸付加塩を含み、それは、無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸、または有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などと形成されている。遊離カルボキシル基と形成される塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導され得る。
【００９０】
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および野菜類の油を含む、溶媒または分散媒体を含有する。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用により、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。微生物作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって可能である。多くの場合、等張化剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に使用することにより可能である。
【００９１】
滅菌注射用溶液は、上記に列挙した他の成分のいくつかと共に、適当な溶媒中に必要量の活性化合物を添加することによって調製され、必要に応じて、その後に濾過滅菌される。一般に、分散液は、基本的な分散媒体および上記に列挙したもののうち必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中に種々の滅菌活性成分を添加することによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分に加えて、その予め滅菌濾過した溶液からの任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【００９２】
直接注入のためのより高濃度または高濃度の溶液の調製もまた企図され、ここで、溶媒としてのＤＭＳＯの使用が、極めて迅速な浸透をもたらし、高濃度の活性剤を小さな腫瘍領域に送達することが想定される。
【００９３】
製剤化に際し、溶液は、投与製剤に適合する方法、および治療的に有効な量で投与され得る。製剤は、上記の注射可能なタイプの溶液のような種々の投与量形態で容易に投与され得て、薬物放出カプセルなども使用可能である。
【００９４】
水溶液での非経腸投与のために、例えば、溶液は、適切に緩衝化されてもよく、液体希釈剤は最初に十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされていてよい。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与にとりわけ好適である。これに関連して、使用可能な滅菌水性媒体は、本明細書の記載に照らして当業者に公知であり得る。例えば、ある投与量は、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解され、１０００ｍｌの皮下注入液を添加するか、または注入予定部位に注射され得る（例えば、“Remington’s Pharmaceutical Sciences” 15th Edition, pages 1035-1038 および 1570-1580参照）。投与量におけるいくらかの変動は、必然的に、処置される対象の病状に応じて生じる。投与の責任者は、いずれにしても、対象に適当な用量を決定し得る。
【００９５】
本発明の別の面は、本発明の単離されたｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはその機能的等価体および薬学的に許容される担体を含む、骨格成長遅延障害の予防または処置における使用のための医薬組成物である。
【００９６】
一態様では、骨格成長遅延障害は特発性発育遅延障害である。
別の態様では、骨格成長遅延障害はＦＧＦＲ３関連骨系統疾患である。
【００９７】
本発明はまた、治療的有効量のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはその機能的等価体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、骨格成長遅延障害の予防または処置のための方法を提供する。
【００９８】
本発明はさらに、添付の図面および以下の実施例により説明される。しかしながら、これらの実施例および図面は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１：ＡＴＤＣ５細胞における、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３存在下での効果的ＦＧＦ結合および減少したＥｒｋリン酸化。（Ａ）固定量のヒトまたはマウスの塩基性ＦＧＦ（１００ｎｇ）を、漸増濃度のＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３と共にインキュベートした。２時間後、残りの非結合ＦＧＦをＥＬＩＳＡにより検出した。線形回帰分析は、２個の傾斜間に統計的な差異を示さなかった。ｈＦＧＦ、ヒトＦＧＦｂ；ｍＦＧＦ、マウスＦＧＦｂ。実験をトリプリケートで行い、５回繰り返した。（Ｂ）Ｅｒｋリン酸化は、ＡＴＤＣ５細胞にて免疫ブロッティングし、次いで漸増用量のＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３と共にインキュベートすることにより評価し。グラフは、未処置細胞におけるリン酸化レベルと比較したリン酸化の変化の割合を示す。実験は６回繰り返した。正規性の検定を行った後、統計的比較を、一方向ＡＮＯＶＡを用いて行った。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。値は、平均±ＳＤを示す。
【図２】図２：骨格成長全体に対するＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３処置の効果。（Ａ）Ｘ−線写真は、骨格成長に対する処置効果を示す。示した骨格は、ＰＢＳまたは５ｎｇのＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３を地下注射したｗｔおよびＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの代表例を示す。成長は、体重（Ｂ）、体長および尻尾の長さ（Ｃ）、ならびに長骨測定値（Ｄ）により特徴付けた。データは、正規分布に従い、スチューデントのｔ検定を用いて、未処置マウスで得られた測定値とデータ比較した。１群当たりのｎ数を表１に示す；未処置ｗｔマウスと比較して、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。未処置Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスと比較して、＃＃ｐ＜０．０１；＃＃＃ｐ＜０．００１。ｗｔ：野生型マウス；ａｃｈ：Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウス。
【図３】図３：脊椎の成熟に対するＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３処置の効果。（Ａ）後弯インデックス（ＫＩ）を、右側臥位に配置されたマウスのＸ線写真から測定した。Ｌａｗｓら（２８）に定義の通り、線ＡＢは、Ｃ７の後方端からＬ６の後方端へ引かれた線の長さである。線ＣＤは、線ＡＢから該線より最も遠い椎体の背側縁までの距離である。臨床的には、後弯はＫＩ＜４で特徴付けられる。（Ｂ）未処置ｗｔ、未処置Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスおよび５ｎｇのＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３を受容した形質転換マウス由来の椎骨の代表写真。表中、未成熟Ｃ７、Ｔ１１および腰椎で異なる処置群の動物の割合を示す。§腰椎圧迫は、麻痺や運動不足によって特徴付けられた。データを正規分布で処置した。スチューデントのｔ検定は、未処置マウスで得られた測定値のデータを比較した。１群あたりのｎ数を、表１に示す。未処置ｗｔマウスと比較して、＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１。未処置Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスと比較して＃＃ｐ＜０．０１；＃＃＃ｐ＜０．００１。ｗｔ：野生型マウス；ａｃｈ：Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウス。
【図４】図４：頭蓋骨発達に対するＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３処置の効果。（Ａ）頭骨長（Ｌ）および幅（Ｗ）を測定し、Ｌ／Ｗ比を計算した。統計分析を、スチューデントのｔ検定を用いて行い、その後の正規分布および分散の検証を行った。１群当たりのｎ数を表１に示す。未処置ｗｔマウスに対してｐ＜０．００１；未処置Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスに対して＃ｐ＜０．０５。（Ｂ）ＰＢＳまたは５ｎｇのＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３を受容したｗｔおよびＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスからの頭蓋骨の代表的なＸ線写真。それらは、一般的にＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスで観察された頭蓋の軟骨結合の早期閉鎖（空隙の）の予防処置を示す。これは、矢印で示される。ｗｔ：野生型マウス；ａｃｈ：Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウス。
【実施例】
【０１００】
実施例：
材料および方法
ｓＦＧＦＲ３のサブクローニングおよび組み換えタンパク質の生産：サブクローニングを容易にするために、京都産業大学の瀬尾（黒川）博士から提供された、ＦＧＦＲ３ΔＴＭをコードする完全長のｃＤＮＡ配列（２．１ｋｂ）（３５）を、ＧＣ含量を低下させながら、元のタンパク質配列をコードするように最適化した（ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）プロセス、ＧｅｎｅＡｒｔ）。合成したフラグメントを、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３＿Ｇ７２７（Sigma Aldrich）中にＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩクローニング部位を用いてサブクローニングした。プラスミドＤＮＡを形質転換された細菌から精製し、濃度をＵＶ分光学によって決定した。最終構築物は、配列決定により確認した。用いた制限部位内の配列相同性は、１００％であった。
【０１０１】
組換えＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３タンパク質を、全ての必要な翻訳後修飾を可能にするＨＥＫ２９３細胞におけるＧｅｎｅＪｕｉｃｅトランスフェクション試薬（Merck Millipore）を用いる一過性トランスフェクションによって作製した。各トランスフェクションは、フェノールレッド不含有の、グルタミン ２ｍＭ（Gibco, Life Technologies）および１％の抗生物質（Gibco, Life Technologies）を添加した１００ｍｌのＤＭＥＭ（Gibco, Life Technologies）中、８０％コンフルエントのＨＥＫ２９３を含むセルファクトリー（High flask T600, Merck Millipore）にて行った。６００μｌのＧｅｎｅＪｕｉｃｅおよび２４０μｇのｐＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３を、３０ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ（Gibco, Life Technologies）中に再懸濁し、室温にて３０分間インキュベートし、次いで、細胞を３７℃で５％ＣＯ２にて４時間インキュベートした。その後、培地を、フェノールレッド不含有の、グルタミン ２ｍＭおよび１％の抗生物質を添加したＤＭＥＭ １２０ｍｌに置き換えた。７２時間後、生産培地（production medium）を０．２２μｍフィルターを用いて濾過し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ ６０ｋＤａ（Merck Millipore）上で濃縮した。次いで、組換えタンパク質を、アフィニティーカラム（ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ Ｍ２ 親和性ゲル、Sigma Aldrich）で製造者の指示に従って精製した。ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３量を、特定のＥＬＩＳＡ（R＆D Systems）により製造者の指示に従って測定した。次いで、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３を、５０％グリセロール溶液中に０．５μｇ／ｍｌの濃度で貯蔵した。
【０１０２】
ＦＧＦとのＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３のインキュベーション：固定量のヒトまたはマウスＦＧＦ（１００ｐｇ）（R＆D Systems）を、３７℃にて２時間、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中、漸増用量のＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３（０から２５０ｎｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。特定の市販のＥＬＩＳＡキット（R＆D Systems）を、残りの非結合ＦＧＦを定量するために用いた。全ての実験をトリプリケートで行い、５回繰り返した。
【０１０３】
イムノブロッティング分析：免疫ブロッティングを、ＡＴＤＣ５細胞において数用量のＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３をインキュベーションした後に行った。このため、ＡＴＤＣ５細胞を、６ウェルプレート中、２ｘ１０６の密度で播種し、次いで、接着させ、１％抗生物質を含む、０．５％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ−Ｆ１２（Gibco, Life Technologies）中で４８時間培養した。その後、細胞を、３７℃にて２時間予めインキュベートした１００ｐｇ／ｍｌのマウスＦＧＦと、漸増用量のＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３（０、１２．５、１２５、１２５０、１２５００ｐｇ／ｍｌ）と共に、１０分間、培養した。インキュベーション期間の終わりに、残りの未結合のＦＧＦを、特定のＥＬＩＳＡ（R＆D Systems）により測定した。その後、細胞を、溶解緩衝液（２０ｍＭ トリス、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＦ、２ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウム、１０ｍＭ ピロリン酸、プロテアーゼ阻害剤、および１％トライトンＸ−１００）中、４℃にて４５分間、可溶化した。溶解物を取り除き（１４０００ｒｐｍ、１０分）、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離させ、既報の（３６）通りに免疫ブロットした。タンパク質を、抗ホスホ−ｐ４２／４４ ＭＡＰＫ（４３７０Ｓ、Cell Signaling）、抗−総ｐ４２／４４ ＭＡＰＫ（４６９６Ｓ、Cell Signaling）および抗−ｈｓｐ６０（ｓｃ１７２２、Santa Cruz Biotechnology）抗体（１μｇ／ｍｌ）でプローブした。全ての実験を６回行った。
【０１０４】
ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３の免疫組織化学：ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３の免疫組織化学を、３日齢のＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスおよびその野生型同腹仔の脛骨で行った。このため、新生マウスの断頭後に、脛骨を慎重に採取し、２４ウェルプレート中、５ｎｇ ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３の存在下で、３７℃で５％ＣＯ２にて、２４時間インキュベートした。その後、脛骨をＰＢＳで濯ぎ、１０％ホルマリンで２４時間固定した。ＥＤＴＡ中で２日間、骨の脱石灰化後、骨をパラフィン包埋し、５μｍ切片を、５μｇ／ｍｌ 抗−ＦＬＡＧ Ｍ２−ＦＩＴＣ モノクローナル抗体（Sigma Aldrich）と共にインキュベートした。切片をヘキスト溶液で対比染色し、蛍光顕微鏡下で可視化した。抗ＩｇＧ抗体を陰性対照として用いた。
【０１０５】
動物および処置：実験動物の管理の指針（NIH publication no. 85-23, revised 1985; http://grants1.nih.gov/grants/olaw/references/phspol.htm）および科学的目的に使用される脊椎動物の保護に関する欧州協定（http://ec.europa.eu/environment/chemicals/ lab_animals/legislation_en.htm）を常に遵守した。すべての手順は、実験動物を使用するための施設内倫理委員会によって承認された。（ＣＩＥＰＡＬ Ａｚｕｒ）（承認番号ＮＣＥ−２０１２−５２）。
【０１０６】
実験を、変異型ＦＧＦＲ３の発現がＣｏｌ２ａ１プロモーター／エンハンサーによりもたらされている（２２）、形質転換Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋動物で行った。マウスを、１２時間の明／暗サイクルに付し、標準的実験用食餌および水に自由にアクセス可能とした。全ての測定および分析は、盲検で行い、全ての分析を３６０ｂｐのＦＧＦＲ３導入遺伝子を増幅するゲノムＤＮＡのＰＣＲにより行った（２２）後に、遺伝子型を分析した。２つの用量のＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３（５０％グリセロール含有ＰＢＳ１０μｌ中、０．５ｎｇおよび５ｎｇ）を試験した。３日目に、同腹のすべての新生仔マウスは、同じ用量を受容した。対照（コントロール）は、５０％グリセロールを含む１０μｌのＰＢＳを受容した。その後、皮下注射を３週間の間、週に２回、背側の左右に交互に行った。マウスを、運動および排尿の変化に特に注意して毎日観察した。２２日目に、各群２匹以外の全ての動物をＣＯ２窒息により屠殺した。genusおよび遺伝子型を決定した。体重を測定した。血液を心臓穿刺によって採取し、５０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡと混合した。サンプルの半分を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＡＵ ２７００アナラーザー（電解質（Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃｌ−）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、コレステロール、クレアチニン、クレアチニンキナーゼ（ＣＫ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アミラーゼ、総ビリルビン（ＢＬＴ））を用いて生化学的評価のために遠心した、他方の半分を、血液計数のために遠心することなく分析した（Hemavet 950FS, Mascot Hematology）。死骸を慎重に皮膚と骨に分け、骨格測定（体長および尾の長さ）を、電子デジタルキャリパー（Fisher Scientific）を用いて得た。全身の長さを鼻から最後の尾椎骨の末端までで測定した。尾は最初の尾椎骨から測定した。臓器（心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓）を集め、重量を測定し、標準的パラフィン包埋技術を用いてさらなる組織学的分析のために、１０％ホルマリン中で貯蔵した。全ての骨格のＸ線写真をＦａｘｉｔｒｏｎ Ｘ線装置（Ｅｄｉｍｅｘ）を用いて撮影した。確立された方法（２８）を用いて、動物毎に後弯インデックスをＸ線写真上で測定した。その後、綺麗にした骨格を、標準的手法を用いて、アルシアンブルーおよびアリザリンレッドで同時に染色し、分析前にグリセロール中で貯蔵した。染色された長骨（脛骨、大腿骨、上腕骨）を解剖し、電子デジタルノギスを用いて測定した。椎骨および頭蓋骨もまた、解剖して分析した。
【０１０７】
繁殖は、理論的には半数の野生型および半数のヘテロ接合型Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの同腹仔が得られるように設定した。表現型の浸透率（ある表現型を取る確率）の変動によるバイアスを避けるために、実験を同じブリーダーから得られる少なくとも２つの同腹仔（１つは処置群、１つは対照群）で行った。１５、９および１１の同腹仔を合わせて全３１２匹を、ＰＢＳ、０．５ｎｇまたは５ｎｇのＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３でそれぞれ処置した。１群あたりの匹数を表１に示す。
【０１０８】
処置動物の生殖能力に対するＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３の効果：骨格測定のために使用されなかった同腹由来の動物は、繁殖年齢に達するまで維持した。その後、８週令で、それらをCharles River社から得た８週令のＦＶＢ／Ｎマウスと交配させた。新生仔マウスは、各処置群および対象群のメスおよびオスについて出生時に計数され、前世代の出生統計と比較した。２２日齢で、子孫を安楽死させ、上記の通りに成長を評価した。
【０１０９】
統計分析：全ての実験およびデータ測定は、常に盲検の実験者によって行われた。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウェアを用いて行った。使用する統計的検定を決定するために、必要な前提条件を確認した。正規分散および等分散性を確認するために、ダゴスティーノおよびピアソンのオムニバス正規性検定ならびにブラウン−フォーサイス検定をそれぞれ実施した。全ての骨格測定データセットは正規性および等分散性の要件が満たされたため、二つの独立したグループの比較のために両側スチューデントのｔ検定を、異なる統計分析に用いた。処置および対照群間の死亡率データの比較は、クラスカル・ワリス検定を用いて行った。ヒトおよびマウスのＦＧＦに結合するＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３の比較は、線形回帰によって行った。免疫ブロットデータは、正規分布に従ったので、ホルム−シダックの多重比較検定を用いた一方向ＡＮＯＶＡを用いて分析した。臓器重量の相関分析のため、データセットが、それぞれ、正規分布に従っているとき、または従っていないとき、ピアソンまたはスピアマン検定を使用した。すべての統計的検定は、ｐ＜０．０５の誤差で有意であると考えられた。すべての図中、ｐ値は以下を示している。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。データは平均±ＳＤを示す。
【０１１０】
結果
ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３はＦＧＦを効果的に結合し、ＡＴＤＣ５細胞におけるＭＡＰＫシグナル伝達を低減させる。組み換え可溶性ＦＧＦＲ３をインビボで検出するために、本発明者らは、可溶性形態のＦＬＡＧタグで標識したＦＧＦＲ３を用いた。このタグは、その精製および検出のための試薬の利用可能性のために使用した（２３、２４）。また、既に、免疫系によるタグ化されたタンパク質の早期の排出を引き起こすことなくインビボで使用されている（２５、２６）。本実験において、組み換えＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３は、一過性トランスフェクションによって作製され、アフィニティーカラムを用いて精製され、５０％グリセロール中、０．５μｇ／ｍｌの濃度で貯蔵した。
【０１１１】
ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３が遊離ＦＧＦを効果的に結合したことを確認するため、固定量のヒトＦＧＦを、漸増量のＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３と共にインキュベートした。図１Ａに示す通り、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３は、用量依存的にｈＦＧＦを効果的に結合した。用いたＦＧＦＲ３ΔＴＭ配列はヒト起源であり、本発明者らは、それがマウスＦＧＦにも結合し得ることを確認した。同様の結果が得られ、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３は、同様の量のマウスＦＧＦを結合可能であった。このことは、マウスＦＧＦＲ３とヒトＦＧＦＲ３とが９０％の配列相同性を有するために予期された。
【０１１２】
その後、本発明者らは、ＦＧＦとＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３の複合体が、Ｅｒｋリン酸化による細胞内のＦＧＦシグナル伝達を低減させることを確認した。ＡＴＤＣ５細胞は、軟骨細胞生物学を研究するために、マウス軟骨細胞株を用いた（２７）。図１Ｂに示す通り、Ｅｒｋリン酸化の顕著な減少は、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３の用量に相関して見られた。これは、図１Ａで観察されたものと同様の馴化培地中の遊離ＦＧＦの減少と相関していた。これらの結果は、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３が、ヒトおよびマウス起源のＦＧＦを効果的に結合し、それによりＦＧＦの細胞内シグナル伝達を減少させることを証明している。
【０１１３】
可溶性ＦＧＦＲ３は、Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスにおける骨格成長を効果的に回復させる。ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３処置のインビボでの効果を試験する前に、本発明者らは、それが成長板の高密度の軟骨マトリックスに浸透し、標的軟骨細胞に達し得ることを確認した。３日齢のｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスおよびその野生型（ｗｔ）同腹仔から単離された長骨を、５ｎｇのＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３の存在下で２４時間インキュベートした。図２に示す通り、組み換えタンパク質は、ｗｔ(野生型)およびＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの脛骨の成長板の軟骨細胞の近くに、マトリックス内で検出された。
【０１１４】
Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスにおける骨格成長に対するＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３処置の生物学的効果を評価するために、全ての同腹の新生仔マウスは、それらの表現型を知ることなく同じ処置を受けた。それらは、３週間の間に、週に２回、０．５または５ｎｇのＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３、または対照においてＰＢＳの皮下注射を受けた。最初の観察は、未処置の同腹仔と比較して処置マウスの死亡率の顕著な低下であった。処置期間の最後に、対照群は、生存している形質転換動物の約３分の１が含まれ、他のマウスは両処置群に含まれ、およそ５０％の野生型マウスおよび５０％のＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスが存在した（表１）。さらに、対照群の同腹仔において、３１％の動物が実験終了前に死亡し、０．５ｎｇおよび５ｎｇのＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３処置群にはそれぞれ１１．８％および６．７％であった。グループサイズの減少は、対麻痺動物の早期死亡または安楽死によるものであった。可能であったとき、解剖を実施し、肺内の血液の存在によって示されるように呼吸不全による死亡が確認された。２匹は、腸閉塞のために結果的に死亡した。遺伝子型決定によって確認されたように、これらの動物の全ては、Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋であった。野生型の動物は早期に死亡しなかった。対照群では、大部分の発症Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスは呼吸不全で死亡したが、５ｎｇのＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３処置群では、それらは、ほとんどが対麻痺を発症し、僅かなマウスが呼吸困難を有していたことに注目すべきである（表１）。これらのデータは、処置により、より少ない動物が死亡し、死亡したマウスがより低い重症度の表現型を有したことを示す。
【０１１５】
表１：３日目および２２日目での、異なる処置群の仔マウスの数。同腹仔は単一集団とみなされ、同じケージの全ての新生仔マウスは同じ処置を受けた。死亡および生存動物を毎日計数した。解剖は、２匹について呼吸不全および腸閉塞による死亡を明らかにした。対麻痺を有する動物は、発見時に安楽死させ、死んだ動物群に記録した。全ての死亡動物はＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋であった。対照群に対する統計学的比較は、クラスカル−ワリス検定を用いて行った。＊＊ｐ＜０．０１。ｗｔ：野生型マウス；ａｃｈ：Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウス。
【０１１６】
【表２】
2020015733.tif 000003
【０１１７】
２２日目の離乳時に、動物を屠殺し、それらの成長を評価した。本発明者らは、最初に、オスとメスの間の統計的差異がなかったことを確認し（表Ｓ１）、その後の全ての分析のためにそれらを再編成した。図２Ａに示す通り、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３処置は、全体的な骨格成長に影響を与えた。Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスは、野生型同腹仔よりも平均２０％体重が軽く、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３で処置したマウスは、それらの体重の用量依存的な増加を示し、未処置の形質転換マウスの重量の３３％増にまで達した（図２Ｂ）。用量依存的処置効果はまた、野生型動物の体重でも観察された。図２Ｃに示す通り、処置は、Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋および野生型動物の両方の体長および尾の長さの用量依存的増加をもたらした。処置された形質転換マウスは、形質転換マウスと野生型マウスの間の最初の不一致を訂正する高用量で、未処置のＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋動物の１０％長にまで達する、未処置の野生型対照の体長と有意差のない体長を有した。同様の結果が、長骨の長さで得られた。処置されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウス由来の上腕骨、大腿骨と脛骨は、未処置の形質転換マウスのものより長く、野生型の骨長と統計的に同一であった（図２Ｄ）。ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３処置はまた、野生型マウス由来の長骨の成長に対して用量依存的影響を有した。組織像により、軟骨細胞の成熟に対する処置効果を確認した。処置されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスは、野生型マウスと同様にそれらの成長板における組織化および肥大化軟骨細胞を示した。
【０１１８】
まとめると、これらの結果は、新生仔Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスにＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３を慢性的に皮下投与した後、正常な骨格成長が回復し、またＦＧＦＲ３活性化変異を誘発しない動物の骨格成長に有効であったことを示している。
【０１１９】
表Ｓ１：異なる処置群のオスとメスの間の体長測定の統計的比較。３週間の処置（ＰＢＳ、０．５ｎｇまたは５ｎｇのＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３）後、動物を２２日齢で屠殺した。体重、体長および尾の長さを測定した。属および遺伝子型を決定した。各データセット内の通常の変動の検証の後、測定値を、同じ処置群および遺伝子型群内でオスとメスの間で比較した。データは、正規分布に従った。スチューデントのｔ検定を用いて、未処置マウスで得られた測定値のデータを比較した。統計的な差異は、いずれの群間でも見出されなかった。ｎｓ＝有意でない。ｗｔ：野生型マウス；ａｃｈ：Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウス。
【０１２０】
【表３】
2020015733.tif 000004
【０１２１】
ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３処置は、Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスにおいて、軟骨無形成症に関連した脊髄および頭蓋変形を低減させる。Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスにおいて、脊髄の異常は、後弯インデックス（ＫＩ）を計算することにより特徴付けられ得る脊柱後弯症の存在によって特に認識される。Ｌａｗｓらによって確立されたこのスコアシステム（２８）において、ＫＩ＜４．０のマウスは、脊柱後弯症を有する（より詳しくは、図３中の説明を参照のこと）。本実験において、脊柱変形を有する野生型動物は存在せず、未処置Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの８０％が、３．４６±０．６５の平均ＫＩにて頚部後弯症を示した（図３Ａ）。ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３処置では、この割合は、０．５ｎｇおよび５ｎｇ処置群で、それぞれ１７％および６％に顕著に減少した。さらに椎骨成熟を特徴付けるために、本発明者らは、Ｃ７（第７頚椎）およびＴ１１（第１１胸椎）の骨化を分析した。図３Ｂに示す通り、未処置のＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスにおいて、第７頚椎および第１１胸椎が、それぞれ８８．９％および７０．１％、正中線で融合されていなかった。処置後、未成熟の椎骨数の減少によって示されるように、成熟が回復した。いずれの群でも野生型動物は未成熟の椎骨を示さなかった。
【０１２２】
典型的に頭囲拡大（enlarged head）を有する軟骨無形成症患者と同様に、Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスは、頭蓋奇形を有する。頭蓋骨の幅（Ｗ）は、形質転換マウスと野生型マウスで統計的に差異はないが（それぞれ、１０．３５±０．２８ｍｍ  対  １０．１７±０．３２ｍｍ）、長さ（Ｌ）は、Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスで顕著に短い（１８．１１±０．７５ｍｍ  対  ２０．０５±０．５１ｍｍ（野生型マウス））。このことは、未処置のＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスで１．７５±０．７７程度、対照野生型マウスで１．９４±０．０５程度（図４Ａ）のＬ／Ｗ比をもたらす。ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３処置は、頭蓋の長さの用量依存的訂正を誘導し、Ｌ／Ｗ比は、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３の最高用量での未処置野生型マウスのものと有意差はなかった。図４Ｂに示す通り、処置はまた、Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスで典型的に観察された頭蓋の軟骨結合部の早期閉鎖を防止した。
【０１２３】
まとめると、これらの結果は、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３処置が、軟骨無形成症に関連した骨格変形の発症を予防するのに有効であることを示す。
【０１２４】
処置動物において毒性効果は検出されない。本発明者らは、組み換え可溶性ＦＧＦＲ３を送達するために体系的な方法を用いているため、可能性のある望ましくない副作用に特に注意を払った。本発明者らは、全ての２５５匹の動物の臓器を分析し、生化学的試験および血液計数試験を行い、正常なその子孫を含む、処置動物（１群あたり２つの同腹仔）の生殖能力を検証した。
【０１２５】
可能性のある処置による副作用は、最初に、いくつかの臓器（肝臓、肺、心臓、脾臓、腎臓）について、屠殺時に評価した。臓器を、肉眼で観察し、重量を測定し、無作為に顕微鏡で組織学的に分析した。ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３またはＰＢＳを慢性的に皮下注射した２５５匹の動物はいずれも、肉眼で見える異常を示さなかった。組織学的検査を、全ての群で無作為に選択された臓器で行い、データを解剖病理学者により盲検的に分析した。毒性の徴候は、いずれの組織スライドでも観察されなかった。全ての対照群において、臓器重量は、マウスの体重と相関した（表２）。処置群において、臓器は、増大された骨格成長と共に増大した。一例として、未処置のＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの肺は、１５６．０±８８．７ｍｇであった。これらは、５ｎｇの処置群において１７２．５±６７．５ｍｇまで増加し、未処置の野生型マウスの肺の重量（１７０．５±３６．３ｍｇ）に達した。同様の結果が、全ての臓器に見られ、この重量増加は、全ての群で体重と相関して統計的に増加した（表２）。臓器の機能を評価するために、それらを、電解質滴定、肝臓、腎臓および脾臓酵素アッセイを含む生化学的血液検査を行った。全ての検査は、処置群および対照群におけるＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋と野生型動物との間で統計的に一致すること証明した（表Ｓ２）。血球数もまた分析し、同様に、血液間の差異は、処置群および対照群間で認められなかった（表Ｓ３）。
【０１２６】
表２：異なる処置群の臓器および体重の相関係数（ｒ）。ピアソンまたはスピアマンの検定を用いて、各処置群の臓器／体重の相関の統計的分析を行った。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。ｗｔ：野生型マウス；ａｃｈ：Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウス。
【０１２７】
【表４】
2020015733.tif 000005
【０１２８】
表Ｓ２．血液生化学的パラメータは、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３処置によって変わらなかった。処置の毒性を評価するために、屠殺時に、ＰＢＳおよび５ｎｇ ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３群からの血漿を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＡＵ ２７００アナライザーを用いて分析した。全体的な健康を、電解質（Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃｌ−）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）およびコレステロールの測定により評価した。腎機能を、クレアチニンおよびクレアチニンキナーゼ（ＣＫ）アッセイにより評価した。肝臓および膵臓機能を、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、総ビリルビン（ＢＬＴ）およびアミラーゼそれぞれにより評価した。統計的比較を、一方向ＡＮＯＶＡを用いて行った。いずれの群でも、統計的差異は見られなかった。ｗｔ：野生型マウス；ａｃｈ：Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウス。
【０１２９】
【表５】
2020015733.tif 000006
【表６】
2020015733.tif 000007
【０１３０】
表Ｓ３．血球数は、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３処置によって変わらなかった。ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３処置の血球数に対する効果は、屠殺時に血漿サンプルで評価した。分析は、ヘモグロビン（Ｈｂ）、ヘマトクリット（Ｈｔ）、白血球（ＷＢＣ）、赤血球（ＲＢＣ）および血小板（ＰＬＴ）数を含む。異なる白血球集団の割合を評価した（ＮＥ：好中球；ＬＹ：リンパ球、ＭＯ：単球、ＥＯ：好酸球；ＢＡ：好塩基球）。統計的比較を、一方向ＡＮＯＶＡを用いて行った。統計的差異は、いずれの群でも見られなかった。ｗｔ：野生型マウス；ａｃｈ：Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウス。
【０１３１】
【表７】
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【表８】
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【０１３２】
繁殖力に対する望ましくない副作用を評価するために、処置の３週間後に、動物を離乳させ、チャールズリバー社からの野生型FVB オスまたはメスと８週令で交配させた。表３に示す通り、全ての処置された動物は繁殖力を有し、それらの子孫は、およそ５０％ ｗｔ ／ ５０％ Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋ 子孫であり、通常のサイズ（匹数）であった。Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋メスは、通常、野生型のメスの最初の仔マウス数と比較してわずかに少ないが、初産の処置した形質転換マウス（メス）は、野生型の初産のメスと同一匹数である同腹仔を有したことは興味深く、処置後の骨盤の拡張が確認された（表３）。
【０１３３】
表３：ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３処置は、処置マウスの生殖能力に影響を及ぼさなかった。各群当たり２つの同腹仔からの仔マウスを、３週間の処置後に離乳させた。これらを、チャールズリバー社の野生型動物と８週令で交配させた。第一の同腹仔の仔マウスの数を、初産の各メスについて計数した。２２日齢で、動物を安楽死させた。それらの体の成長を、上記の通りに評価した。スチューデントのｔ検定を用いて、対照の親由来の未処置野生型動物の重量を測定しデータを比較した。
＊＊＊ｐ＜０．００１  対  未処置野生型。Ｎ／Ａ：適用不可。ｗｔ：野生型マウス；ａｃｈ：Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウス。
【０１３４】
【表９】
2020015733.tif 000010
【０１３５】
これらの実験は、ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３処置自体による合併症を、処置された動物の血液、臓器機能および発生ならびに生殖能力の何れについても示さなかったが、ＦＧＦＲ３の可溶性形態の使用は、臨床応用のための実行可能な治療アプローチであり得ることを示唆している。
【０１３６】
結論：
本実験は、ＦＧＦＲ３の可溶性形態の使用に基づく治療戦略が、軟骨無形成症の変異を有するマウスにおける異常な骨格成長を抑制可能であるという概念の証明を検証する。処置は、成長期間を通して動物に皮下注射により週２回投与した。この３週間の処置期間後、軟骨内骨格成長は、正常な調和のとれた体長をもたらした。重要なことには、これらの効果は、用量依存的であった。０．５ｎｇ ＦＬＡＧ−ｓＦＧＦＲ３の用量は、体重および体長を未処置の野生型マウスのそれと同一にするのに十分であり、５ｎｇの用量で処置されたｄｗａｒｆマウスは、未処置の野生型動物よりも重たく、より長い骨を有していた。今回の結果は、軟骨無形成症の変異が、活性化されるべきリガンド結合を必要とするという考えを強調している。実際に、Ｇ３８０Ｒ変異の場合において、ＦＧＦＲ３活性化は、リガンド依存的であることが証明されており（１２）、参考文献２９〜３１には明確なコンセンサスが存在しないが、１つではなく、複数の機序が、延長された細胞内シグナル伝達をもたらすことが示唆されている。
【０１３７】
処置が有効であるためには、長骨の成長が回復することが必須であったが、骨格奇形に起因する合併症の発症に顕著な効果を有することも重要であった。本発明者らにとって、臨床のための処置法を開発することを望む場合に、このことが不可欠である。処置されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスにおける椎骨の成熟および頭蓋軟骨結合の正常な閉鎖の回復は、これらの動物に対して顕著な効果を有していた。最初の結果は、トランスジェニック集団間の死亡率の低下であった。結果の部分で記載した通り、解剖の結果、殆どの場合で呼吸不全が明らかとなった。ｄｗａｒｆマウスの頭蓋骨と脊椎の解剖学的特性に基づいて、本発明者らは、これらが、結果として、軟骨無形成症患者で観察され得るのと同様の、脳幹圧迫に至ると考えている。
【０１３８】
処置効果の第二の結果は、表現型の浸透度の変化であった。測定値は、治療効果が、完全に用量依存的ではなく、より重要なことには、体重に基づいて予期され得る程度に効果的ではなかったことを明らかにし得るが、本発明者らは、最高用量の処置により、Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋  マウスを最小限の脳幹圧迫および呼吸不全に救ったと確信している。これらの未処置動物は、１週または２週間生存できないであろう。この処置群において、本発明者らは、これらの動物は、あまり重篤ではない合併症を有しているにもかかわらず、顕著に小さいままであるという仮説を立てている。
【０１３９】
軟骨無形成症および関連する骨格異形成の機序を研究する多数の報告があるにもかかわらず、たった３つの研究のみが、軟骨異形成を有するマウスにおいて試験された効果的治療戦略を示して公開されている。Ｘｉｅらは、最近、間欠性ＰＴＨの治療は、軟骨無形成症を有するマウスにおいて骨格成長を部分的に救済するとの報告を発表した（３２）。彼らの研究において、ＰＴＨは、生後４週間に亘り、１００μｇ／ｋｇ体重の用量で皮下投与された。ＰＴＨがＦＧＦＲ３ 細胞内シグナル伝達に影響を与える機序は明確に確立されていないが、骨格成長は、処置された形質転換マウスで部分的に救済された。ＰＴＨ処置した形質転換マウスは、それらの野生型同腹仔よりも小さかった。この研究において、頭蓋軟骨結合の部分的な救済を除き、軟骨無形成症合併症に関してほとんど情報が記載されていない。ＴＤＩＩマウスの致死表現型はまた、妊娠中のメスの慢性ＰＴＨ処置で救済された。ＦＧＦＲ３シグナル伝達の別の可能性のある治療的アンタゴニストがＣ−ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）である（３３）。本明細書中、本発明者らは、４週令で開始し３週間の合成ＣＮＰの連続静脈内注入によって、軟骨無形成症を有する形質転換マウスを処置した。ＣＮＰが、成長板の活性を促進し、成長板の幅を増大させると考えられる。ヒトにおける使用についての主な障壁は、ＣＮＰの非常に短い半減期であり、それは血漿中で２．６分であると推定されている（３４）。
【０１４０】
研究は、新規のＦＧＦＲ３結合ペプチドの使用が、１２匹の仔マウスで観察された、致死表現型を救済し、ＴＤＩＩマウスの成長板の構造的な歪みを部分的に回復することを記載する、ごく最近の文献である（１９）。本研究において、ＭＡＰＫシグナル伝達および骨格成長補正に対する影響は、部分的でしかなく、ペプチドの短い半減期のために毎日の投与がおそらく必要とされた。ここでは、ｓＦＧＦＲ３の効果は、体重を重くし、通常の体長（身長）の完全な回復をもたらした。本発明者らは、ＩｇＧ様ドメインを含むＦＧＦＲ３の可溶性形態の半減期が顕著に延長されていることを確信する。実際に、（誕生から離乳まで）のみの６回の注射は、８６匹の処置されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスにおける骨格成長を完全に回復するために必要であった。それらは、わずか数回の注射が、思春期までの最初の年の間に開始し、外来患者としての軟骨無形成症の小児を治療するために必要であろうことを想像することができる。このことは、実質的に、毎日の注入レジメンで典型的に見出される注入の副作用の発生に影響を与え得る。可溶性組み換えタンパク質の使用はまた、安全性の問題が発生したとき、および骨の成長が停止したときに思春期にしている場合、処置期間を迅速に終了することが可能である。必要であれば、治療および休息期間を交互に行うことも可能である。合併症を防止することにより、ｓＦＧＦＲ３処置は、外科的介入の必要性を回避し、また、入院によるストレスを減少させ得る。さらに、本発明者らの研究は、処置された動物の血液または生殖能力および子孫に何らの毒性の影響を明らかにしなかった。現在の研究は、３週間のｓＦＧＦＲ３処置が、処置マウスの長期的な健康に影響を与えたかどうかを評価するために進行中である。今日の時点で、処置したマウスは、６月齢であり、明らかな副作用は見られず、血液検査は正常である。
【０１４１】
結論として、本研究は、成長板の成熟を回復し、軟骨無形成症における正常な骨の成長を誘導するのに有効な治療法として、細胞外区画における標的ＦＧＦＲ３の利用可能性（viability）を示している。望ましくない副作用の不存在は、ＦＧＦ受容体における突然変異を活性化することにより引き起こされる、軟骨異形成および関連する軟骨異形成のための可能性のある治療法としてのその使用を検証する。さらに、本研究において、本発明者らはまた、野生型動物の成長へのｓＦＧＦＲ３処置の正の作用を報告している。これは、特発性低身長症の処置のため、または低ホスファターゼ血症のような他の希な疾患における深刻な合併症の予防のために、その可能な関心を示唆するのに重要である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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