(57)【要約】【課題】異なるサンプルに含まれる成分が重なって溶出することを許容するオーバーラップインジェクションにより、多数のサンプルに対する分析のスループットを向上させる。【解決手段】一つのサンプルを複数回連続的に移動相に注入する際のインジェクションパターンを予め適宜に定めて記憶部５３に記憶しておく。インジェクション制御部５３は、試料保持部４中の複数のサンプル保持容器５ａ〜５ｎに保持されている異なるサンプルを流路切替バルブ７により順次選択し、インジェクションパターンに従ってインジェクション３から移動相中にサンプルを注入する。検出器９で得られる検出データに基づいて作成される混合クロマトグラム波形は各サンプルの個別のクロマトグラム波形とインジェクションパターンの波形との畳み込み演算の総和となるため、個別クロマトグラム推定部３２はラッソ正則化付き近接勾配法を用いて逆問題を解くことで個別クロマトグラムを推定する。【選択図】図１
2020030065.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の成分を分離するカラムと、該カラムに試料を導入するための移動相を該カラムに送給する移動相供給部と、前記カラムを通過したあとの試料中の成分を検出する検出器と、を具備するクロマトグラフ装置であって、
複数の試料をそれぞれ保持する試料保持部と、
前記試料保持部に保持されている前記複数の試料を一つずつ順番に、前記移動相供給部から供給され前記カラムに導入される移動相中に注入するインジェクタと、
予め決められたインジェクションパターンに従って前記インジェクタの試料注入動作を制御するインジェクション制御部と、
前記検出器により検出される検出信号を処理することにより、前記複数の試料のそれぞれに対応する個別のクロマトグラムを推定するクロマトグラム推定部と、
を備え、
前記インジェクションパターンは、一つの試料を複数回続けてパルス的に移動相中に注入するときのその注入のタイミングを規定するものであり、同じインジェクションパターンに従って移動相中に注入された異なる試料に含まれる成分が後記一つの混合クロマトグラムの波形中に存在しないように予め定められ、
前記クロマトグラム推定部は、前記検出信号に基づいて作成される複数の試料に対応する一つの混合クロマトグラムが、該複数の試料のそれぞれに対応する個別のクロマトグラムの波形を表す関数と各試料がそれぞれ移動相に注入されるときのインジェクションパターンを表す関数との畳み込み演算の和で表されるものとして作成された前記混合クロマトグラムの波形を表す関数について、クロマトグラム波形の一般的な特徴に基づく所定の拘束条件の下で、非適切性逆問題を解く演算を行うことにより個別のクロマトグラムを推定することを特徴とするクロマトグラフ装置。
【請求項２】
請求項１に記載のクロマトグラフ装置であって、
前記カラムでの成分分離の途中段階の試料中の成分を非破壊で検出する一つ以上の中間検出器をさらに備え、
前記クロマトグラム推定部は、前記検出器により検出される検出信号に加え前記中間検出器により検出される中間検出信号も利用して、各試料にそれぞれ対応する個別のクロマトグラムを推定することを特徴とするクロマトグラフ装置。
【請求項３】
請求項１に記載のクロマトグラフ装置であって、
前記カラムでの成分分離の途中段階の試料中の成分を非破壊で検出する一つ以上の中間検出器をさらに備え、
前記クロマトグラム推定部は、前記中間検出器により検出される中間検出信号に基づいて作成される混合クロマトグラムを表す関数について非適切性逆問題を解くことにより、各試料にそれぞれ対応する仮の個別クロマトグラムを推定し、推定された仮の個別クロマトグラムを速報結果としてユーザに提供することを特徴とするクロマトグラフ装置。
【請求項４】
請求項２又は３に記載のクロマトグラフ装置であって、
前記中間検出器と前記検出器とは、試料中の成分に関する同じ物性を同じ検出原理に基づいて検出するものであることを特徴とするクロマトグラフ装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフ（ＬＣ）装置やガスクロマトグラフ（ＧＣ）装置などのクロマトグラフ装置に関する。ここでいう「クロマトグラフ装置」は検出器の種類や方式を問わず、質量分析計を検出器とする液体クロマトグラフ質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ）やガスクロマトグラフ質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ）も含む。
【背景技術】
【０００２】
ＬＣ装置やＧＣ装置などのクロマトグラフ装置は、様々な分野において試料中の物質の同定や定量に広く利用されている。クロマトグラフ装置にはフィールド分析での使用を想定して短時間での分析が可能であるものもあるが、一般的には、短くても数分程度の分析時間が必要である。これに対し、近年、クロマトグラフ装置における分析時間の短縮化の要望はますます高まっている。
【０００３】
例えば、異臭や大気汚染物質の発生源を特定する際には、化合物の種類の特定だけでなく、その化合物が空間的にどのように分布しているのかといった３次元的な情報が必要になる。そのためには、所定の空間内の多数の測定点で採取されるサンプルについての分析を実行することが必要である。その際に一つの測定点で採取されるサンプルの分析に時間が掛かると、異なる測定点についての分析を繰り返している間に目的化合物の分布状況が変化してしまい、正確な分布を推定できなくなる可能性がある。また、工場で生産される工業製品や集荷された農水産物の検査をクロマトグラフ装置で行う際に、本来であれば全数検査を行うのが理想である場合でも、分析時間が掛かるために抜き取り検査しか行えないという制約がある。こうした問題はいずれも、クロマトグラフ装置での分析に時間が掛かることに起因する。
【０００４】
従来、ＬＣ装置において複数のサンプルに対する分析時間を短縮するための一手法として、オーバーラップインジェクションと呼ばれる方法が知られている（特許文献１、非特許文献１など参照）。一般的なＬＣ装置では、複数のサンプルを順番に分析する場合に、一つのサンプルをインジェクタから移動相中に注入し、該サンプルに含まれる全ての化合物がカラムから溶出し終えたあとに、次のサンプルをインジェクタから移動相中に注入する。これに対しオーバーラップインジェクションでは、一つのサンプルをインジェクタから移動相中に注入し、該サンプルに含まれる少なくとも一部の化合物がカラムから溶出し終わるよりも前に、次のサンプルをインジェクタから移動相中に注入する。即ち、オーバーラップインジェクションでは、複数のサンプルに対するそれぞれの分析時間の少なくとも一部をオーバーラップさせることで総合的な分析時間の短縮を図ることができる。
【０００５】
オーバーラップインジェクションでは、サンプルの注入の時間間隔によっては、或る一つのサンプルに含まれる保持時間が長い化合物と次に分析するサンプルに含まれる保持時間が短い化合物とが重なってカラムから溶出する可能性がある。したがって、そうした重なる可能性がある化合物がそれぞれのサンプルに含まれないことが事前に分かっている場合や、重なる化合物が含まれていたとしてもそれが観測目的の化合物ではない不要な化合物であるような場合に、総合的な分析時間の短縮に特に効果的である。
【０００６】
一方、サンプル中の特定の成分を分取することを目的とした分取ＬＣ装置では、スタッキングインジェクションと呼ばれる方法が知られている（非特許文献２参照）。スタッキングインジェクションは、一つのサンプルに含まれる分取対象の目的化合物が重ならないように、換言すれば該サンプル中の不要な化合物についての重なりを許容するように、一つのサンプルを複数回パルス的に移動相中に注入し、その各インジェクションに対してカラムで分離された目的化合物をそれぞれ分取する手法である。異なるインジェクションに対応する分析時間（そのサンプル中の化合物がカラムから溶出している時間）がオーバーラップしているという点で、スタッキングインジェクションもオーバーラップインジェクションの一種であるとみなすことができる。
【０００７】
上述したように複数のサンプルを順次移動相中に注入するオーバーラップインジェクションでは、カラムから溶出する段階で異なるサンプルに含まれる目的化合物が重ならないようにする必要がある。そのため、サンプルに含まれる目的化合物の数が多い場合や複数の目的化合物の保持時間の範囲が広い場合には、異なるサンプルに対する分析時間のオーバーラップが少なく分析時間の短縮効果がかなり限られる。即ち、複数のサンプルに対する分析のスループットを上げることは難しい。また、保持時間が予め分かっていない未知の化合物が一つのサンプルに含まれていてこの未知の化合物が別のサンプルに含まれる化合物と重なってしまうと、該未知の化合物を検出することができないという問題もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００５−２５７５７５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】「Nexera UHPLC/HPLC System  超高速液体クロマトグラフ」、［２０１８年６月１９日検索］、株式会社島津製作所、インターネット＜URL: https://www.an.shimadzu.co.jp/hplc/nexera/nexera2.htm＞
【非特許文献２】「テクニカルインフォメーション  効率的な分取のテクニック」、［２０１８年６月１９日検索］、株式会社ワイエムシィ、インターネット＜URL: http://www.ymc.co.jp/tech/chromato/chromato_007.html＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は上記課題を解決するために成されたものであり、その主たる目的は、従来のオーバーラップインジェクションとは異なり、異なるサンプル中の観測対象である目的化合物が重なって溶出することを許容することができ、複数のサンプルについてのクロマトグラフ分析に要する時間を従来よりも大幅に短縮して多サンプルの分析のスループットを向上させることができるクロマトグラフ装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために成された本発明は、試料中の成分を分離するカラムと、該カラムに試料を導入するための移動相を該カラムに送給する移動相供給部と、前記カラムを通過したあとの試料中の成分を検出する検出器と、を具備するクロマトグラフ装置であって、
複数の試料をそれぞれ保持する試料保持部と、
前記試料保持部に保持されている前記複数の試料を一つずつ順番に、前記移動相供給部から供給され前記カラムに導入される移動相中に注入するインジェクタと、
予め決められたインジェクションパターンに従って前記インジェクタを制御するインジェクション制御部と、
前記検出器により検出される検出信号を処理することにより、前記複数の試料のそれぞれに対応する個別のクロマトグラムを推定するクロマトグラム推定部と、
を備え、
前記インジェクションパターンは、一つの試料を複数回続けてパルス的に移動相中に注入するときのその注入のタイミングを規定するものであり、同じインジェクションパターンに従って移動相中に注入された異なる試料に含まれる成分が後記一つの混合クロマトグラムの波形中に存在しないように試料毎に予め定められ、
前記クロマトグラム推定部は、前記検出信号に基づいて作成される複数の試料に対応する一つの混合クロマトグラムが、該複数の試料のそれぞれに対応する個別のクロマトグラムの波形を表す関数と各試料がそれぞれ移動相に注入されるときのインジェクションパターンを表す関数との畳み込み演算の和で表されるものとして作成された、前記混合クロマトグラムの波形を表す関数について、クロマトグラム波形の一般的な特徴に基づく所定の拘束条件の下で非適切性逆問題を解く演算を行うことにより個別のクロマトグラムを推定することを特徴としている。
【００１２】
本発明に係るクロマトグラフ装置はＬＣ装置又はＧＣ装置である。また、検出器は特にその方式や種類を問わないが、ＬＣ装置であれば、フォトダイオードアレイ検出器（ＰＤＡ検出器）、紫外可視分光検出器（ＵＶ検出器）、質量分析計などが有用である。但し、後述するように中間検出器を設ける場合、中間検出器と上記検出器とは、試料中の成分に関する同じ物性を同じ検出原理に基づいて検出するものであることが好ましい。また、中間検出器は試料中の成分を損なわない非破壊型の検出を行うものである必要があるため、ＬＣ装置では、ＰＤＡ検出器やＵＶ検出器などの光学的な検出を行うものが望ましい。
【００１３】
本発明において試料保持部は、分析対象である複数の試料をそれぞれ一時的に保持する。インジェクタにより移動相中に或る一つの試料が複数回注入されたあとには該試料は不要になるので、試料保持部は不要になった試料を廃棄して別の試料を保持するように、試料の入れ替えが可能であるものでもよい。インジェクション制御部は予め決められたインジェクションパターンに従って、試料保持部に保持されている複数の試料を順番に一つずつ、且つ一つの試料について複数回続けてパルス的に注入を行うようにインジェクタを制御する。インジェクタはこの制御に応じて動作し、順番に試料を移動相中に注入する。
【００１４】
インジェクションパターンは、主として、一つの試料を複数回続けて移動相中に注入する際のその注入の時間間隔を決めるものである。したがって、例えば３回続けて同じ試料を注入する場合のインジェクションパターンでは、その３回の試料注入の際の２回の時間間隔をそれぞれ設定することが可能である。また、異なる試料に対して同じインジェクションパターン（つまりは複数の時間間隔がそれぞれ同じインジェクションパターン）を利用することもできるが、少なくとも同じインジェクションパターンにより移動相中に注入された異なる試料に含まれる成分が一つの混合クロマトグラム波形（例えばその前後にゼロ値が連続する部分が存在するような孤立したひとまとまりの混合クロマトグラム波形）に存在しないように、インジェクションパターンの使用は制約される。
【００１５】
一つの試料に対応する個別クロマトグラム波形を表す関数をＣn（ｎは例えば試料番号）、その試料が移動相に注入されるときのインジェクションパターンの波形を表す関数をＩnとすると、観測される混合クロマトグラム波形Ｄは次の(1)式で表すことができる。
Ｄ＝ΣＣn＊Ｉn      …(1)
ここで＊は畳み込み演算子であり、Σは全ての試料番号についての総和である。
【００１６】
(1)式において、Ｄは観測結果、Ｉnは広い意味での分析条件の一つであって、いずれも既知である。即ち、(1)式において未知であるのは個別クロマトグラム波形Ｃnである。したがって、(1)式の逆問題を解くことで、個別のクロマトグラム波形Ｃnを求めることができる。この逆問題は求めるべき未知の値が式の数に比べて多く、そのために解の一意性が満たされないという点で非適切（ill-posed：不良設定と呼ばれることもある）な逆問題、つまりは非適切性逆問題（Ill-posed Inverse problem）である。但し、クロマトグラム波形は非負である、ピークの数は少なく多くの部分が０である、ピーク形状はガウス分布などに従う、などの様々な、一般的なクロマトグラム波形に関する先験情報を、逆問題を解く際の拘束条件とすることができる。
【００１７】
こうした拘束条件を正則化条件として課した様々な最適化手法を用いることで、非適切性逆問題を解くことが可能であることが一般に知られている。そこで、クロマトグラム推定部はラッソ（Lasso＝Least Absolute Shrinkage and Selection Operator）正則化付き近接勾配法（Proximal Gradient Method）などの適当なアルゴリズムを利用することで、上記の非適切性逆問題を解くことで各試料にそれぞれ対応する個別のクロマトグラムの波形を推定する。そして、その推定結果である個別のクロマトグラムを例えば表示部の画面上に表示する。
【００１８】
また、本発明に係るクロマトグラフ装置では好ましくは、前記カラムでの成分分離の途中段階の試料中の成分を非破壊で検出する一つ以上の中間検出器をさらに備え、
前記クロマトグラム推定部は、前記検出器により検出される検出信号に加え前記中間検出器により検出される中間検出信号も利用して、各試料にそれぞれ対応する個別のクロマトグラムを推定する構成とするとよい。
【００１９】
中間検出器による中間検出信号を用いることで、上記(1)式における個別のクロマトグラム波形Ｃnを求めるための式を増やすことができる。それにより、Ｃnの推定精度が向上し、より正解に近い個別のクロマトグラムを推定することができる。
【００２０】
また本発明に係るクロマトグラフ装置では、前記カラムでの成分分離の途中段階の試料中の成分を非破壊で検出する一つ以上の中間検出器をさらに備え、
前記クロマトグラム推定部は、前記中間検出器により検出される中間検出信号に基づいて作成される混合クロマトグラムを表す関数について非適切性逆問題を解くことにより、各試料にそれぞれ対応する仮の個別クロマトグラムを推定し、推定された仮の個別クロマトグラムを速報結果としてユーザに提供する構成としてもよい。
【００２１】
中間検出器による検出位置は成分分離の途中の段階であるので、最終的には十分に分離可能な成分であったとしても、中間検出器による中間検出信号ではそうした成分が十分に分離されているとは限らない。但し、その場合でも、例えば仮の個別クロマトグラム上でユーザが目的としている化合物由来のピークが十分に分離されていれば、ユーザに有用な情報を提供することができる。これにより、ユーザは例えば各試料に対応する最終的な個別クロマトグラムの結果が出るよりも前に必要な情報を取得したり、或いはそれ以上分析の続行することが不要であることが判明したときに分析動作や解析処理を中止させたりすることができる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明に係るクロマトグラフ装置によれば、異なる試料中の目的化合物がカラムの出口において重なった状態であることを許容するオーバーラップインジェクションを行うことができるので、複数の試料についてのクロマトグラフ分析に要する時間を従来よりも大幅に短縮することができる。それによって、複数の試料についての分析のスループットを向上させることができる。また移動相などの消費量を抑えて分析コストを引き下げることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の一実施例であるＬＣ装置の要部の構成図。
【図２】本実施例のＬＣ装置を用いた一つの実験例における各サンプルに対応する個別クロマトグラムの波形図。
【図３】上記実験例におけるインジェクションパターンの波形図。
【図４】上記実験例において観測される混合クロマトグラムの波形図。
【図５】図４に示した混合クロマトグラム波形に対するLasso正則化付き近接勾配法による演算処理により推定される、各サンプルに対応する個別クロマトグラムの波形図。
【図６】本実施例のＬＣ装置において、中間検出器によるデータに基づいて得られるクロマトグラムとカラム出口の検出器によるデータに基づいて得られるクロマトグラムとの比較の一例を示す概略図。
【図７】本発明の他の実施例であるＬＣ装置の要部の構成図。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明の一実施例であるＬＣ装置について、添付図面を参照して説明する。
図１は本実施例のＬＣ装置の要部の構成図である。
【００２５】
本実施例のＬＣ装置は、成分分離用のカラム８と、移動相容器１から移動相を吸引してカラム８に送給する送液ポンプ２と、送液ポンプ２によりカラム８に送られる移動相中にサンプルを注入するインジェクタ３と、該インジェクタ３から移動相中に注入される複数のサンプル（試料）を保持する試料保持部４と、カラム８の出口から溶出する溶出液中の成分を検出する検出器９と、カラム８の入口手前の流路上に配設され、カラム８に導入される移動相中の成分を非破壊で検出する第１中間検出器１０ａと、カラム８の長手方向の所定の位置において該カラム８内を通過する移動相中の成分を非破壊で検出する第２中間検出器１０ｂと、検出器９及び中間検出器１０ａ、１０ｂによる検出信号をそれぞれデジタル化するアナログデジタル変換器（ＡＤＣ）２０と、ＡＤＣ２０を通して得られる検出データを処理するデータ処理部３０と、データ処理結果を表示する表示部４０と、インジェクタ３、試料保持部４等を制御する制御部５０と、を備える。
【００２６】
試料保持部４は、それぞれ所定量のサンプルを保持することが可能な複数本（ｎ本）のサンプル保持容器５ａ〜５ｎと、サンプル保持容器５ａ〜５ｎの一つに選択的にサンプルを導入するための第１流路切替バルブ６と、サンプル保持容器５ａ〜５ｎの一つから選択的にサンプルをインジェクタ３に導入するための第２流路切替バルブ７と、を含む。なお、サンプル保持容器５ａ〜５ｎや流路におけるサンプルのコンタミネーションを回避するために、図示しないものの、適宜の洗浄機構が設けられている。
【００２７】
データ処理部３０は機能ブロックとして、混合クロマトグラムデータ記憶部３１、個別クロマトグラム推定部３２などを備える。制御部５０は機能ブロックとして、インジェクションパターン作成部５１、インジェクションパターン記憶部５２、インジェクション制御部５３などを含む。但し、インジェクションパターン作成部５１は必ずしも制御部５０に含まれる必要はなく、制御部５０とは別に設けられていてもよい。そのため、図１ではインジェクションパターン作成部５１を点線の枠で記載してある。
【００２８】
なお、データ処理部３０や制御部５０の機能の大部分は、パーソナルコンピュータにインストールされた専用のデータ処理・制御ソフトウェアを該コンピュータで実行することにより具現化するものとすることができる。上述したようにインジェクションパターン作成部が制御部５０とは別に設けられている場合とは、通常、制御部５０等とは別のコンピュータによりインジェクションパターンが作成される場合であり、この場合、作成された複数のインジェクションパターンを表現するコード等をインジェクションパターン記憶部５２に格納しておけばよい。
【００２９】
次に、本実施例のＬＣ装置における特徴的な分析動作とその分析によって収集されるデータに対するデータ処理について、一つの実験例を挙げて説明する。
ここでは、分析対象のサンプルの数は９（つまりはｎ＝９）であり、その９種類のサンプルには#0〜#8のサンプル番号が付されているものとする。図２はこの９種類のサンプル#0〜#8に対する本来のクロマトグラムを示す波形図である。図２から分かるように、各サンプルに対応するクロマトグラムには、濃度が相違し（つまりはピーク高さ又はピーク面積が相違し）同じ保持時間に観測される共通のピークと、各サンプルに固有である、つまりは或るサンプルでは観測されるものの他のサンプルでは観測されない小数の非共通ピークとが存在する。即ち、この９種類のサンプルは殆ど同じものであって主要な成分は共通しているが、サンプルによってはその共通の成分以外の他の成分を含んでいるもの、と解釈することができる。
【００３０】
本実施例のＬＣ装置では、サンプル毎に、インジェクタ３から移動相中に複数回、パルス的に同じ量のサンプルを（慣用的に「重ね打ち」或いは「重ね打ち注入」と呼ばれる場合がある）を注入する。この複数回のパルス的なサンプル注入のタイミングを示すのがインジェクションパターンである。図３は本実験例における９種類のインジェクションパターンの波形図である。
【００３１】
具体的には、本実施例のＬＣ装置では、同じサンプルを連続的に５回注入するが、その１回のサンプル注入に対応するピークの時間間隔（つまりは四つの時間間隔）を互いに異なる３種類の時間ｔ0、ｔ1、ｔ2から選択することでインジェクションパターンを形成している。ここでは、ｔ0、ｔ1、ｔ2の関係は、４×ｔ0＝２×ｔ1＝ｔ2である。図３ではｔ0、ｔ1、ｔ2を単に0、1、2の数字で示している。ここではインジェクションパターンは４桁の３進数の数値コード（例えば「0022」、「1002」）であるが、実質的な符号パターンは前半の２桁のみであり、それに続く後半の２桁の値は前半の２桁の値を、０→２、１→０、２→１という規則で以て書き換えたチェックパターンである。このようにチェックパターンを付加してインジェクションパターン自体を長くすることで、インジェクションパターンが偶然にクロマトグラムのピークパターンに一致してしまう可能性を低減している。なお、インジェクションパターンの作成方法については後述する。
【００３２】
本実施例のＬＣ装置では、上記インジェクションパターンがインジェクションパターン記憶部５２に格納され、インジェクション制御部５３はインジェクションパターンに従って各サンプルが順次移動相に注入されるようにインジェクタ３及び試料保持部４を制御する。即ち、例えば分析の実行に先立つ適宜のタイミングで、第１流路切替バルブ６を適宜切り替えながら異なるサンプルを供給することで、ｎ個（ここではｎ＝９）のサンプル保持容器５ａ〜５ｎにそれぞれサンプル番号が#0〜#8であるサンプルを保持させる。そして、送液ポンプ２が作動して一定流量の移動相がカラム８に供給されている状態で、第２流路切替バルブ７によりインジェクタ３に接続するサンプル保持容器５ａ〜５ｎを切り替えながら、インジェクタ３から一つのサンプルを複数回移動相中に注入する。
【００３３】
インジェクタ３から移動相中に注入されたサンプルは、その移動相の流れに乗ってカラム８に導入され、カラム８を通過する間にサンプル中の成分が時間方向（又はカラム８の長手方向）に分離される。検出器９はカラム８から溶出する溶出液中の成分を時々刻々と検出し、その成分の濃度に応じた信号強度の検出信号を出力する。図３から分かるように、複数のサンプルが順番にほぼ連続的に移動相中に注入されるため、複数のサンプルに含まれる成分がカラム８から溶出し終える前に別のサンプルがカラム８に導入されることになる。異なるサンプルに含まれる成分の中でそれらサンプルに共通する成分、つまり図２において共通ピークで示される成分同士はカラム８から溶出する段階で重なることはない。一方、異なるサンプルに含まれる成分で互いに異なる成分同士は、その保持時間とインジェクションパターンで決まるサンプル注入タイミングとによってはカラム８から溶出する段階で重なることがある。
【００３４】
図４は、本実験例において検出器９で得られる検出信号に基づいて作成される混合クロマトグラムの波形図の一例である。これは、９種類のサンプルについて、サンプル毎の５回のサンプル注入にそれぞれ対応するクロマトグラム、つまりは４５個のクロマトグラムが合成されたものである。
【００３５】
図２に示した各サンプルに対応する個別のクロマトグラムの波形はそれぞれ関数で表すことができる。また、図３に示したように各サンプルを移動相中に注入するインジェクションパターンを示す波形もそれぞれ関数で表すことができる。各サンプルに対するインジェクションパターンは全体としては（つまりは各インジェクションパターンのピーク間隔を除けば）時間方向に同じ時間幅ずつ平行移動されている。そこで、各サンプルの個別のクロマトグラム波形を表す関数をＣn（ただしｎはサンプル番号であり、ここではｎ＝０〜８）、各サンプルに対するインジェクションパターンの波形を表す関数をＩnとすると、混合クロマトグラム波形Ｄは既出の(1)式で表される。
Ｄ＝ΣＣn＊Ｉn      …(1)
即ち、(1)式は、サンプル毎の個別のクロマトグラムを表す関数とそのサンプルの注入に用いられるインジェクションパターンを表す関数との畳み込み演算である。
【００３６】
実際に観測される混合クロマトグラム波形Ｄは一つのみであり、この式の数よりも未知であるＣnの数が多いので、上記(1)式においてＣnを求める逆問題は一般には非適切性逆問題である。ただし、一般に、出力（結果）から入力（原因）を求める逆問題の多くは非適切であり、よく知られているように、適当な拘束条件を課すことで非適切性逆問題を解くことが可能であることが多い。また、非適切性逆問題を解くための様々な解法が従来から提案されている。こうした解法を用いることで、先験情報であるＬＣ（又はＧＣ）で得られるクロマトグラム波形の一般的な特徴を拘束条件として、上記の非適切性逆問題を解くことができる。ここでは、上記非適切性逆問題を解くための拘束条件として、クロマトグラム波形は非負であること、ピークの数は少なく波形上の多くの部分が０である（又は０であるとみなせる信号強度である）こと、ピークの形状はガウス分布で近似できること、などの条件を利用する。
【００３７】
具体的には、本実施例のＬＣ装置において個別クロマトグラム推定部３２は、上述した拘束条件を正則化条件とし、ラッソ正則化付き近接勾配法を用いて(1)式の逆問題を解くことでＣn、つまりはサンプル毎の個別のクロマトグラムを推定する。もちろん、ラッソ正則化付き近接勾配法に限らず、ニュートン法や最急降下法などの他の解法を用いてもよい。ここでラッソ正則化付き近接勾配法を用いたのは、多くの部分が０である信号において当該要素の解を０にするという正則化のうち、高速に実行可能な手法であるからである。なお、ここでは使用していないが、ラッソ正則化以外に、隣接データの連続性を仮定するＴＶ（Total Variation）正則化を用いてもよいし、クロマトグラムのピーク形状を微分しても滑らかな波形であることから、微分値に対する連続系を仮定する正則化を用いてもよい。
【００３８】
図５は本実験において上記手法により推定される各サンプルに対応する個別クロマトグラムの波形である。一部に、実際には存在しない小さな偽のピークが現れているものの、或る程度以上の強度の共通ピーク及び非共通ピークは全て再現されており、図２に示した本来のクロマトグラムがほぼ正確に推定されているということができる。
【００３９】
ここで、上述したように異なるサンプルに対応するクロマトグラムを分離するためのインジェクションパターンの条件とその決め方について説明する。インジェクションパターンは、分析対象である各サンプルについて想定される個別クロマトグラム波形に基づくシミュレーション計算によって決定される。
【００４０】
例えば一つの個別クロマトグラムの波形Ｃ1が偶然にインジェクションパターンＩ0と同一である場合、上述した逆問題を解く過程で、Ｉ1＊Ｃ1という正しい組み合わせの畳み込みパターンではなくＩ1＊Ｉ0という誤った畳み込みのパターンを導出する可能性がある。こうした誤った解を導出しないようにするには、或るインジェクションパターンが、他のインジェクションパターンとピークパターンとの組み合わせに対してユニークなパターンである必要がある。或るインジェクションパターンが十分にユニークであるか否かは、想定されるクロマトグラム上のピークパターンに対して上記逆問題を解けるか否かを実際にシミュレーションによって試すことで検討すればよい。正確性の点からは、想定されるピークパターン毎にインジェクションパターンを網羅的に探索することが望ましいが、通常、そうした網羅的な探索には膨大な時間が掛かる。そのため、入力パターンとインジェクションパターンとが相関を有しないことにを確認することによっても、インジェクションパターンがユニークであるかどうかを簡易的に判断することができる。
【００４１】
また同種の分析作業において過去に得られたクロマトグラムと類似した形状のクロマトグラムが求まる筈であるとの想定の下に、誤った解を採り得る可能性が小さいようなインジェクションパターンを用いることも好ましい。
【００４２】
複数の個別クロマトグラムを分離するうえでどのようなインジェクションパターンが最適であるのかの計算には膨大な計算量を要するため、この計算量を減らすには、予め複数のインジェクションパターンの候補を用意しておいて、その中から分離が最も良好になると推定されるパターンの組み合わせを選択すればよい。もちろん、インジェクションパターンは全てのサンプルについて異なるものである必要はなく、或る一つのサンプルに含まれる成分の全てがカラム８から溶出した以降であれば、そのサンプルの注入に用いられたインジェクションパターンを再び別のサンプルの注入に用いることができる。
【００４３】
なお、上述したように本実施例では、実質的な符号パターンにチェックパターンを付加してインジェクションパターンを長くしており、それによってユニーク性を高めている。しかしながら、ユニークなパターンにするためにパターンが長くなりすぎると、サンプル当たりの分析時間が長くなり、重ね打ちによる高スループット化のメリットがなくなってしまう。そこで、分析対象となるピークパターンを想定した上で、最適な長さのインジェクションパターンを検討することが必要である。
【００４４】
また、クロマトグラムのピークパターンを想定することができない場合には、Ｍ系列、Gold系列などの乱数列を用いてインジェクションパターンを生成してもよい。こうした手法は、通信分野における拡散符号化などにおいてしばしば利用されるものである。
【００４５】
また、クロマトグラム波形が非負であるという非負制限については、混合クロマトグラム波形にゼロ値の部分があると、そこにピークが立つようなクロマトグラムは存在しないという保証ができるので、解の候補を大きく絞り込むことができる。それにより、インジェクションパターンを畳み込んだ後になお、ゼロを示す値がいくつか残っている方が望ましいといった経験則を用いることができる。また、インジェクションパターンは畳み込みになるため、周波数フィルタとして考えると、クロマトピークがもつ周波数帯域に対して十分広い周波数帯域をもつ信号である必要がある、といった確認も行える。
【００４６】
上述のように本実施例のＬＣ装置によれば、異なる成分がカラム８から重なって溶出することを問題とすることなく複数のサンプルの注入の時間間隔を短くしたオーバーラップインジェクションを行うことができる。それにより、多数のサンプルに対するＬＣ分析のスループットを向上させることができる。
【００４７】
上記説明では、中間検出器１０ａ、１０ｂによる検出データをデータ処理に利用していなかったが、個別クロマトグラムを推定する際にこれらデータを利用することもできる。第１中間検出器１０ａによる検出位置はサンプルがカラム８に導入される前であるため、未だ何らの成分分離が行われていない。したがって、第１中間検出器１０ａによる検出データはインジェクタ３からのサンプル注入が目的のインジェクションパターンに従って適切に行われたか否かをチェックするために利用することができる。
【００４８】
一方、第２中間検出器１０ｂによる検出位置はカラム８の途中（図１の例ではほぼ中間位置）であるため、該中間検出器１０ｂにより得られる検出データは、最終的な検出データに対して時間軸を約１／２に縮小する関数ｆ（ｘ）で以て推定することができる。この関数は事前に用意しておくことができる場合もあるが、混合クロマトグラム波形Ｄと第２中間検出器１０ｂで得られた検出データにより作成される中間混合クロマトグラム波形Ｄmの関係から求めるのが一般的である。こうして求めた関数ｆ（ｘ）と、第２中間検出器１０ｂの設置位置でのそれぞれの成分由来の中間個別クロマトグラム波形ＣＭnとの関係は、ＣＭn＝ｆ（Ｃn）になる筈である。したがって、Ｄm＝ｆ（Ｃn）＊Ｉnの関係が成り立ち、逆畳み込みにより個別クロマトグラムＣnを推定する際に用いることができる計算式を増やすことができる。それによって、推定の精度を向上させることができ、推定結果である個別クロマトグラムＣnの波形精度が向上する。
【００４９】
上記観点から、カラム８の途中で非破壊で成分を検出する中間検出器の数をさらに増やし、それら複数の中間検出器でそれぞれ得られた検出データを個別クロマトグラムの推定に利用することで、個別クロマトグラムＣnを推定する際の計算式をさらに増やすこともできる。
【００５０】
なお、このような中間検出器における成分の検出方式は成分を破壊したり成分の通過に影響を与えたりしないものである必要があるが、そのほか、最終的な検出器９と同じような検出特性を有するために該検出器９で検出するのと同じ物性に着目した検出方式によるものであることが好ましい。例えば、検出器９が可視・紫外波長範囲の吸光度を検出するＰＤＡ検出器である場合、中間検出器も同様に、成分の可視・紫外波長範囲の吸光度を検出する検出器であることが好ましい。
【００５１】
カラム８での成分の分離特性によっては、中間検出器による検出データ上では、或るサンプル中の或る成分由来のピークは他のピークと十分に分離されているものの別の複数のピークは十分に分離されていないという場合が多々ある。図６はそうしたクロマトグラム上のピークの分離例を示したものである。この例では、最終的な検出器によるクロマトグラムでは図６（ｂ）に示すように三つのピークＰ1、Ｐ2、Ｐ3が十分に分離される場合でも、中間検出器によるクロマトグラムでは図６（ａ）に示すように二つのピークＰ2、Ｐ3が分離されていない。
【００５２】
但し、例えば着目しているピークがＰ1のみでピークＰ1が観測されるか否かが分かればよい場合などでは、第２中間検出器１０ｂの検出データに基づく中間個別クロマトグラムが得られた時点で分析の目的が達成されていることになり、検出器９の検出データに基づく個別クロマトグラムの推定は不要である。そこで、中間検出器で得られた検出データに基づいて概略的な中間個別クロマトグラムを推定したあと、それを速やかに例えば表示部４０に表示するようにしてもよい。この表示をユーザが見て、それ以上の分析の実行が不要であると判断したならば分析を中断できるようにしておくことで、無駄な分析の時間を減らすことができる。
【００５３】
図１に示した実施例のＬＣ装置では、サンプル保持容器は複数であるがインジェクタ３やカラム８は一つであるため、異なるサンプルについてのインジェクション区間が重なり合うことはないが、図７に示すように、複数（この例では二つ）のインジェクション３Ａ、３Ｂ、カラム８Ａ、８Ｂを含む送液系、を備えるＬＣ装置では、異なるサンプルについてのインジェクション区間が重なる、つまりは同時に複数のサンプルが移動相に注入されるようにすることができる。この場合、二つのインジェクション３Ａ、３Ｂはそれぞれ異なるインジェクションパターンでサンプルを注入することができる。
【００５４】
また上記実施例は本発明の一例にすぎず、上記記載以外の点において、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加等を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。
【符号の説明】
【００５５】
１…移動相容器
２、２Ａ、２Ｂ…送液ポンプ
３、３Ａ、３Ｂ…インジェクタ
４…試料保持部
５ａ〜５ｎ…サンプル保持容器
６…第１流路切替バルブ
７…第２流路切替バルブ
８、８Ａ、８Ｂ…カラム
９…検出器
１０ａ…第１中間検出器
１０ｂ…第２中間検出器
２０…アナログデジタル変換器（ＡＤＣ）
３０…データ処理部
３１…混合クロマトグラムデータ記憶部
３２…個別クロマトグラム推定部
４０…表示部
５０…制御部
５１…インジェクションパターン作成部
５２…インジェクションパターン記憶部
５３…インジェクション制御部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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