(57)【要約】【課題】皮膚試料に投与した非標識被験物質の分析方法と非標識被験物質の動態、濃度分布、貯留性を分析する方法を提供する。【解決手段】皮膚試料に非標識被験物質を投与した後、一定時間浸透させ、凍結処理を行う。凍結処理した皮膚試料を用いて切片サンプルを調整し、そのサンプルをイメージング質量分析装置で測定することを特徴とする皮膚試料における非標識被験物質の分析方法及び／または測定データ及び／または測定データを基に可視化したイメージ画像。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚試料に含まれる、外因性の被験物質を測定する分析方法
【請求項２】
被験物質を非標識で分析する請求項１に該当する分析方法
【請求項３】
質量分析システムを用いる請求項１〜２に該当する分析方法
【請求項４】
請求項１〜３で得られた測定データ
【請求項５】
請求項１〜４で得られた測定データを基に可視化したイメージ画像
【請求項６】
被験物質がベシクルである請求項１〜５にかかる分析方法及び／または測定データ及び／または測定データを基に可視化したイメージ画像
【請求項７】
被験物質の分布や動態を表示することを特徴とする、請求項１〜６にかかる分析方法及び／または測定データ及び／または測定データを基に可視化したイメージ画像
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は皮膚試料に含まれる被験物質を分析する方法に関するものである。【０００２】皮膚試料の被験物質を非標識で分析する技術に関するものである。【０００３】被験物質が物質キャリアーとなる複合体を含む。
【背景技術】
【０００４】皮膚試料に含まれる被験物質を分析する為には、蛍光標識や放射性同位体ラベルを付与する、もしくは特異的な分子構造を指標とすることにより分析を行うことが主流である。【０００５】例えば、皮膚試料に浸透した放射性核種を含む被験物質を測定すること（特許文献１参照）や、被験物質を蛍光標識することにより、測定する方法（特許文献２参照）が挙げられる。【０００６】これらの分析方法は被験物質の分布を効率的に可視化する目的で有効に利用されてきたが、被験物質に標識を付与することにより分子量や分子構造が変化し、浸透性や貯留性に変化をもたらすことが懸念されている。【０００７】このことから、被験物質に対して何らかの標識を付与した分析では標識を分析しているに過ぎず、被験物質その物の分析とは言い難い。【０００８】一方、被験物質に標識を付与しない非標識被験物質を測定している例として、Ｘ線による分析（例えば、非特許文献１参照）や、ラットの脳を用いたＭＡＬＤＩ−ＭＳＩ（例えば、非特許文献２参照）が実施されている。【０００９】これまでにも非標識被験物質を分析する技術は進歩を遂げてきたが、分析の対象物の多くが、動物の肝臓や脳であり、皮膚を対象とした報告は少ない。【００１０】皮膚に浸透した非標識被験物質をイメージング質量分析装置で分析し、さらに非標識被験物質が物質キャリアーとなる複合体である分析例はこれまでにない。【００１１】イメージング質量分析に使用する質量分析計としては、ＭＡＬＤＩを搭載した飛行時間型質量分析計（ＴＯＦ  ＭＳ）、らせん軌道飛行時間質量分析計（Ｓｐｉｒａｌ  ＴＯＦ  ＭＳ）などが用いられ、イメージ画像の作成方法としては、質量分析計から得られた測定データから二次元画像を取得する手法であるＭＡＬＤＩ−ＭＳＩが使用されている（非特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２０１４−０８５２９２号公報
【特許文献２】特開２００９−１１５８１３号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２４２，６４−７０（２００８）
【非特許文献２】Ｍｕｎｙｅｚａ  ＣＦ，ｅｔ  ａｌ．，Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ，４６，３８５−３９２（２０１６）
【非特許文献３】韮澤崇ら、「イメージング質量分析」、日本農薬学誌４２（１），２１６−２２２（２０１７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】従って、本発明が解決しようとする課題は、皮膚試料に投与した非標識被験物質の分析方法を提供することと、皮膚試料に投与した非標識被験物質の動態、濃度分布、貯留性を分析する手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】本発明者らは、皮膚試料に非標識被験物質を投与及び浸透させた後、非標識被験物質を浸透させた皮膚試料を凍結処理することで皮膚サンプルを作成し、この皮膚サンプルから切片サンプルを作成し、この切片サンプルにマトリックス溶液を吹き付け、イメージング質量分析装置で測定することにより、上記課題が解決できることを見出し、本発明を完成させた。
【発明の効果】
【００１６】本発明によれば、皮膚試料における非標識被験物質の分析方法を提供することができ、被験物質に標識をしなくても皮膚試料に投与した非標識被験物質の動態、濃度分布、貯留性を分析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】Ｅｃｔｏｉｎ水溶液を浸透させた皮膚試料内のＥｃｔｏｉｎ濃度を測定したピークチャートである。
【図２】図１で得られたピークチャートから皮膚試料内の被験物質濃度分布を示したイメージ画像である。
【図３】リン脂質及びステロール類で構成されたベシクル内にＥｃｔｏｉｎを内包した複合体を浸透させた皮膚試料内のＥｃｔｏｉｎ濃度を測定したピークチャートである。
【図４】図３で得られたピークチャートから皮膚試料内の被験物質濃度分布を示したイメージ画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】発明の皮膚試料における被験物質の分析方法（以下、「本発明方法」という）は、皮膚試料に被験物質を投与した後、凍結、包埋、固定、切片作成後、マトリックス溶液の吹き付けをしてサンプルを調製し、そのサンプルをイメージング質量分析装置で測定するものである。
【００１９】本発明方法に用いられる皮膚試料は、特に限定されないが、例えば、ヒト、サル、イヌ、ブタ、ウマ、ウシ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ等から採取した皮膚や、皮膚モデルが挙げられる。これらの皮膚試料の中でも、皮膚モデルが好ましく、汎用性と試験再現性があるヒト皮膚をモデルとした三次元培養皮膚モデルがより好ましい。三次元培養皮膚モデルとしては、Ｅｐｉｄｅｒｍ（クラボウ社，日本）、ＬａｂＣｙｔｅ  ＥＰＩ−ＭＯＤＥＬ（Ｊ−ＴＥＣ社製、日本）、Ｔｅｓｔ  ＳｋｉｎＬＳＥ，Ｔｅｓｔ  Ｓｋｉｎ  ＬＳＥ  ｈｉｇｈ（東洋紡社製，日本）、ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製，フランス）、Ｅｐｉｓｋｉｎ（Ｅｐｉｓｋｉｎ  ＳＮＣ社製，フランス）、三次元培養ヒト皮膚モデル（ローマン工業社製，日本）等が市販されていて、これらを用いることができる。
【００２０】本発明方法において、皮膚試料に投与される被験物質は特に限定されないが、生体内に浸透する物質が好適に使用できる。例えば、水溶性物質、油溶性物質、難溶性物質、リポソーム、ベシクル、リン脂質、ビタミン類、ホルモン類、ステロイド類、ステロール類、レチノール、トラネキサム酸、グリチルリチン酸ジカリウム、硫黄化合物、メチオニン化合物、ハロゲン化合物、医薬組成物、およびその代謝物等が挙げられるがその限りではない。
【００２１】水溶性物質としてはＥｃｔｏｉｎが好適に使用できるが、その他にも水溶性ビタミン類、ビタミン誘導体、アミノ酸、糖類等を用いることができる。
【００２２】本発明方法に用いる被験物質の溶媒および分散媒として、通常、化粧料や医薬部外品、外用医薬品等の製剤に使用される成分、すなわち水（精製水、温泉水、深層水等）、界面活性剤、油剤、金属セッケン、ゲル化剤、アルコール類、皮膜形成剤、水溶性高分子、保湿剤、清涼剤、植物抽出物、ビタミン類、アミノ酸類、ペプタイド類、浸透促進剤、無機粉体、防腐剤、ｐＨ調整剤、キレート剤、賦香剤、ＰＢＳ等がそれぞれ任意の量で単独または組み合わせで配合できる。
【００２３】本発明方法に用いる非標識被験物質の浸透促進剤として、リン脂質とステロール類で構成されたベシクルが好適に使用できる。それ以外にも、界面活性剤、アルコール類等を使用することができるが、その限りではない。
【００２４】皮膚試料への非標識被験物質の投与方法は、ウォーターバスにて皮膚試料をインキュベートし、皮膚試料に一定量の非標識被験物質溶液を投与する。
【００２５】皮膚試料に非標識被験物質を投与した後、一定時間で皮膚試料を採取し、凍結処理を行う。
【００２６】凍結処理後の皮膚サンプルから切片を作成し、真空下で乾燥させた後、マトリックス溶液を吹き付け、切片サンプルを作成し、イメージング質量分析装置で測定する。このイメージング質量分析装置は特に限定されない。
【００２７】イメージング質量分析装置のイオン化法としては、特に限定されず、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）、電子イオン化（ＥＩ）、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、高速原子衝撃（ＦＡＢ）、イオン化法以外にも、加熱、粒子衝撃、エネルギー照射などを用いることができるが、好ましくはマトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）を用いることである。
【００２８】イメージング質量分析に使用する質量分析計としては、ＭＡＬＤＩを搭載した飛行時間型質量分析計（ＴＯＦ  ＭＳ）、らせん軌道飛行時間質量分析計（Ｓｐｉｒａｌ  ＴＯＦ  ＭＳ）、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計（ＦＴ−ＩＣＲ  ＭＳ）などを用いることができる。
【００２９】イメージ画像の作成方法としては、質量分析計から得られた測定データから二次元画像を取得する手法であるＭＡＬＤＩ−ＭＳＩが好適に使用できる。
【００３０】このようなイメージ画像まで取得できるイメージング質量分析装置としては、例えば、ｕｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ（ブルカー・ダルトニクス社製）、Ｘｅｖｏ  Ｇ２−ＸＳ（日本ウォーターズ社製）が市販されており、これらを用いることができるが、特に限定されない。
【００３１】上記で得られる二次元画像から、被験物質の動態、濃度分布、貯留性を分析することができる。
【実施例】
【００３２】以下、本発明方法を実施例として挙げて詳細に説明するが、本発明方法はこれら実施例に何ら限定されるものではない。【００３３】
【実施例１】皮膚試料における被験物質の分析
皮膚試料としてＥＰＩ−６０６Ｘヒト皮膚３次元モデル（正常ヒト表皮角化細胞）（クラボウ社）を用い、Ｅｃｔｏｉｎ（メルク社製）を被験物質として投与した。Ｅｃｔｏｉｎは１重量％の水溶液とし、これを被験物質溶液とした。【００３４】皮膚試料が培養されたカップにシリコーングリースを用いて外径２０ｍｍ，内径１４．２ｍｍ，厚さ４ｍｍのアッセイリングを接着させた。【００３５】皮膚試料を３４℃のウォーターバスでインキュベートし、カップ内の皮膚試料に置いたアッセイリング内に１００μｌの被験物質溶液を投与した。２時間、４時間、６時間後に皮膚試料を採取し、−８０℃で凍結処理を行った。【００３６】凍結処理した皮膚試料を４重量％のＣＭＣ（Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｓａｌｔ）で包埋、固定、面出を行い、ＬＥＩＣＡ  ＣＭ１８５０で皮膚試料の深さ方向に幅約１０μｍの切片を作成した。切片を真空下で乾燥させた後、切片にＩｍａｇｅＰｒｅｐ（ブルカー・ダルトニクス社製）でマトリックス溶液を吹き付けて測定を行った。【００３７】マトリックス溶液として５０重量％のアセトニトリルと０．２重量％のトリフルオロ酢酸と４９．８重量％の蒸留水を含む溶液を用いて調製した０．７重量体積％のα−Ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ（ＨＣＣＡ，ＭＷ＝１８９．１７）溶液を用いた。【００３８】イメージング質量分析装置としてｕｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ（ブルカー・ダルトニクス社製）を用い、測定範囲をｍ／ｚ  ２０−１０４０とし、測定モードをＲｅｆｌｅｃｔｏｒ  ｍｏｄｅとし、解像度を２０μｍとし、測定を行った。【００３９】図１に質量分析結果の一例を示し、図２にイメージング質量分析装置で分析した結果を基に可視化したイメージ画像を示した。【００４０】
【実施例２】皮膚試料における被験物質の分析
皮膚試料としてＥＰＩ−６０６Ｘヒト皮膚３次元モデル（正常ヒト表皮角化細胞）（クラボウ社）を用い、リン脂質及びステロール類で構成されたベシクル内にＥｃｔｏｉｎ（メルク社製）を内包した複合体を被験物質として投与した。Ｅｃｔｏｉｎは１重量％となるように調整し、これを被験物質溶液とした。【００４１】皮膚試料が培養されたカップにシリコーングリースを用いて外径２０ｍｍ，内径１４．２ｍｍ，厚さ４ｍｍのアッセイリングを接着させた。【００４２】皮膚試料を３４℃のウォーターバスでインキュベートし、カップ内の皮膚試料に置いたアッセイリング内に１００μｌの被験物質溶液を投与した。２時間、４時間、６時間後に皮膚試料を採取し、−８０℃で凍結処理を行った。【００４３】凍結処理した皮膚試料を４重量％のＣＭＣ（Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｓａｌｔ）で包埋、固定、面出を行い、ＬＥＩＣＡ  ＣＭ１８５０で皮膚試料の深さ方向に幅約１０μｍの切片を作成した。切片を真空下で乾燥させた後、切片にＩｍａｇｅＰｒｅｐ（ブルカー・ダルトニクス社製）でマトリックス溶液を吹き付けて測定を行った。【００４４】マトリックス溶液として５０重量％のアセトニトリルと０．２重量％のトリフルオロ酢酸と４９．８重量％の蒸留水を含む溶液を用いて調製した０．７重量体積％のα−Ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ（ＨＣＣＡ，ＭＷ＝１８９．１７）溶液を用いた。【００４５】イメージング質量分析装置としてｕｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ（ブルカー・ダルトニクス社製）を用い、測定範囲をｍ／ｚ  ２０−１０４０とし、測定モードをＲｅｆｌｅｃｔｏｒ  ｍｏｄｅとし、解像度を２０μｍとし、測定を行った。【００４６】図３に質量分析結果の一例を示し、図４にイメージング質量分析装置で分析した結果を基に可視化したイメージ画像を示した。【００４７】これらの結果より、Ｅｃｔｏｉｎとリン脂質及びステロール類で構成されたベシクル内にＥｃｔｏｉｎを内包した複合体では皮膚試料内での動態、濃度分布、貯留性が異なることが分った。
【産業上の利用可能性】本発明の皮膚試料における非標識被験物質の分析方法であれば、皮膚試料に投与した非標識被験物質の動態、濃度分布、貯留性等を分析することができ、化粧品、医薬品、医薬部外品等の開発に利用できる。
【符号の説明】
【００４８】▲１▼  Ｅｃｔｏｉｎの特異ピーク
▲２▼  検量線から得られる濃度レンジ
▲３▼  測定範囲
▲４▼  皮膚試料に付属するメンブレン（下層側）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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