(57)【要約】【課題】新たなＰＤＬ１発現誘導剤を提供すること、並びに従来の免疫抑制剤とは異なる作用機序を有する新たな免疫抑制剤を提供すること。【解決手段】エンテカビル、テノホビルまたはアデホビルを有効成分として含む、ＰＤＬ１発現誘導剤、並びにエンテカビル、テノホビルまたはアデホビルを有効成分として含む、免疫抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンテカビル、テノホビルまたはアデホビルを有効成分として含む、ＰＤＬ１発現誘導剤。
【請求項２】
リンパ球においてＰＤＬ１発現の誘導する、請求項１に記載のＰＤＬ１発現誘導剤。
【請求項３】
免疫抑制機能を有する、請求項１に記載のＰＤＬ１発現誘導剤。
【請求項４】
エンテカビル、テノホビルまたはアデホビルを有効成分として含む、免疫抑制剤。
【請求項５】
自己免疫疾患、臓器移植後の拒絶反応、アレルギー性疾患または炎症性疾患の予防および／または治療のために使用される、請求項４に記載の免疫抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンテカビル、テノホビルまたはアデホビルを有効成分として含む、ＰＤＬ１発現誘導剤に関する。さらに本発明は、エンテカビル、テノホビルまたはアデホビルを有効成分として含む、免疫抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫疾患やアレルギーにおいては、一般的に免疫の過活動が認められる。自己免疫疾患やアレルギーの治療薬としては、免疫抑制剤であるステロイド、ＦＫ５０４、メトトレキサート（ＭＴＸ）や、免疫活動性サイトカインであるＴＮＦαやＩＬ−６を阻害する抗体が用いられている。しかしながら、それぞれに副作用が存在し、新しい作用機序を持つ免疫抑制剤の開発が望まれている（非特許文献１）。
【０００３】
近年発展の目覚ましい移植医療においては、拒絶反応、および移植片宿主病の制御が成功の重要な鍵となる。しかし、使用できる免疫抑制剤はほぼ同じ作用機序をとり、耐性例が存在するため、十分な制御が困難となっている。また、免疫抑制剤は長期服用が必要であるため、副作用が高頻度に発症し、患者のクオリティオブライフを著しく減じる症例が存在する。更に免疫抑制剤はステロイドを除くと一般的に高価なものが多く、医療費経済においても問題である（非特許文献２）。
【０００４】
免疫チェックポイント分子であるＰＤ１／ＰＤＬ１は、免疫を抑制する機能を持つ。ＰＤ１やＰＤＬ１を欠損するマウスでは、拡張性心筋症、腎炎、肝炎モデルでの劇症化など、様々な自己免疫疾患を発症する。近年、オプシーボなどのＰＤ１／ＰＤＬ１を阻害する抗体が、免疫を活性化する働きを持つことが明らかとなり、癌免疫療法としてある種の癌に著効し注目を集めているが（非特許文献１）、ＰＤ１抗体を自己免疫疾患マウスに投与すると、更に免疫が活性かされ、病状が悪化する。逆にＰＤＬ１陽性リンパ球を移植すると自己免疫疾患の病状が軽快する（非特許文献３〜５）。従って、ＰＤ１／ＰＤＬ１の発現調節により免疫賦活、および抑制が起こるため、ＰＤＬ１の発現を増強すると、免疫が抑制され自己免疫疾患に効果を示すことが強く示唆される。移植変宿主病においてもＰＤＬ１の発現が臓器を移植免疫の攻撃から守ることが報告されている（非特許文献６）。
【０００５】
エンテカビル、テノホビルおよびアデホビルは核酸アナログ製剤であり、逆転写酵素を阻害する作用がある。エンテカビル、テノホビルおよびアデホビルは、逆転写をウイルス複製に必要とするＢ型肝炎ウイルス疾患において、抗ウイルス薬として広く用いられている。これらの抗ウイルス薬によってウイルスの複製が抑制されるため、新たなウイルスが産生されなくなるため、Ｂ型肝炎の活動性が抑制される。エンテカビルは、活動性Ｂ型肝炎によって引き起こされる肝硬変や肝がんの発生抑制、病勢制御にも効果的である（非特許文献７および８）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Okazaki T, Chikuma S, Iwai Y, Fagarasan S, Honjo T. 2013. A rheostat for immune responses: the unique properties of PD-1 and their advantages for clinical application. Nat Immunol 14:1212-8.
【非特許文献２】Baran T, Boratynska M. 2017. Immunoregulatory role of B lymphocytes in alloresponse to kidney transplant. Postepy Hig Med Dosw (Online) 71:254-266.
【非特許文献３】Guleria I, Gubbels Bupp M, Dada S, Fife B, Tang Q, Ansari MJ, Trikudanathan S, Vadivel N, Fiorina P, Yagita H, Azuma M, Atkinson M, Bluestone JA, Sayegh MH. 2007. Mechanisms of PDL1-mediated regulation of autoimmune diabetes. Clin Immunol 125:16-25.
【非特許文献４】Mfarrej B, Keir M, Dada S, Trikudanathan S, Sayegh MH, Sharpe AH, Guleria I. 2011. Anti-CD3 mAb treatment cures PDL1-/-.NOD mice of diabetes but precipitates fatal myocarditis. Clin Immunol 140:47-53.
【非特許文献５】Germanidis G, Argentou N, Hytiroglou P, Vassiliadis T, Patsiaoura K, Germenis AE, Speletas M. 2013. Liver FOXP3 and PD1/PDL1 Expression is Down-Regulated in Chronic HBV Hepatitis on Maintained Remission Related to the Degree of Inflammation. Front Immunol 4:207.
【非特許文献６】Fujiwara H, Maeda Y, Kobayashi K, Nishimori H, Matsuoka K, Fujii N, Kondo E, Tanaka T, Chen L, Azuma M, Yagita H, Tanimoto M. 2014. Programmed death-1 pathway in host tissues ameliorates Th17/Th1-mediated experimental chronic graft-versus-host disease. J Immunol 193:2565-73.
【非特許文献７】Clark DN, Hu J. 2015. Hepatitis B virus reverse transcriptase - Target of current antiviral therapy and future drug development. Antiviral Res 123:132-7.
【非特許文献８】Papatheodoridis GV, Idilman R, Dalekos GN, Buti M, Chi H, van Boemmel F, Calleja JL, Sypsa V, Goulis J, Manolakopoulos S, Loglio A, Siakavellas S, Keskin O, Gatselis N, Hansen BE, Lehretz M, de la Revilla J, Savvidou S, Kourikou A, Vlachogiannakos I, Galanis K, Yurdaydin C, Berg T, Colombo M, Esteban R, Janssen HLA, Lampertico P. 2017. The risk of hepatocellular carcinoma decreases after the first 5 years of entecavir or tenofovir in Caucasians with chronic hepatitis B. Hepatology 66:1444-1453.
【非特許文献９】Zhang X, Zeng Y, Qu Q, Zhu J, Liu Z, Ning W, Zeng H, Zhang N, Du W, Chen C, Huang JA. 2017. PD-L1 induced by IFN-γ from tumor-associated macrophages via the JAK/STAT3 and PI3K/AKT signaling pathways promoted progression of lung cancer. Int J Clin Oncol 22:1026-1033.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来の免疫抑制剤は、免疫の活動性をサイトカイン産生やリンパ球の増殖を抑制するなどの作用機序を持つ。これらは、免疫担当細胞であるT細胞の作用を個々に抑制するものとの共通点がある。この作用機序に対して、耐性を示す症例がある一定数存在することが知られている（非特許文献２）。
【０００８】
最も広く使用されているステロイドには、不眠や、精神異常、中心性肥満、糖尿病、胃腸障害など多様な副作用が認められる。また、投与中断による症状も軽症から重篤なものが存在する。ＦＫ５０６、ＭＴＸ、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）などの免疫抑制薬は、Ｔリンパ球の増殖を抑制することが主な作用であるが、同様に高血圧、異脂肪血症、高血糖、消化性潰瘍、肝臓や腎臓の機能障害が頻度高く起こり得る。よって、継続性にも影響を及ぼすことがある。
さらに、免疫抑制剤の多くは高価なものが多く医療経済上問題とされている。
【０００９】
本発明は、新たなＰＤＬ１発現誘導剤を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、従来の免疫抑制剤とは異なる作用機序を有する新たな免疫抑制剤を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、エンテカビル、テノホビルおよびアデホビルが、逆転写酵素を阻害する作用とは全く異なる作用を有することを見出した。即ち、本発明においては、エンテカビル、テノホビルおよびアデホビルが、免疫チェックポイント因子であり、免疫を抑制する機能を有するＰＤＬ１を、ＨＢＶの存在の有無に関係なく、リンパ球であるＢ細胞や肝臓細胞に発現させることを見出した。なお、上記の通り、エンテカビルはＨＢＶ関連肝がん発生を抑制することが知られているが、これは、ＰＤＬ１発現誘導効果によって免疫は抑制されているにもかかわらず、ＨＢＶの産生や炎症を抑制する効果が上回ったことによるものと考えられ、本発明とは無関係である。また、ＰＤＬ１の発現を誘導する物質としては、ＩＦＮγが知られているが（非特許文献９）、低分子化合物についての報告はない。本発明においては、ＰＤＬ１の発現を誘導する低分子化合物が世界で初めて見出されたものである。またエンテカビルは、長年Ｂ型肝炎に対して承認を得て投与されてきており、既にジェネリック医薬品が発売されていることから、副作用の少ない安全な医薬品である。本発明は上記の知見に基づいて完成したものである。
【００１１】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  エンテカビル、テノホビルまたはアデホビルを有効成分として含む、ＰＤＬ１発現誘導剤。
（２）  リンパ球においてＰＤＬ１発現の誘導する、（１）に記載のＰＤＬ１発現誘導剤。
（３）  免疫抑制機能を有する、（１）に記載のＰＤＬ１発現誘導剤。
（４）  エンテカビル、テノホビルまたはアデホビルを有効成分として含む、免疫抑制剤。
（５）  自己免疫疾患、臓器移植後の拒絶反応、アレルギー性疾患または炎症性疾患の予防および／または治療のために使用される、（４）に記載の免疫抑制剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、新たなＰＤＬ１発現誘導剤、並びに従来の免疫抑制剤とは異なる作用機序を有する新たな免疫抑制剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ＨＢＶ感染ありとなしの場合についてＨｅｐＡＤ３８細胞をエンテカビルで６日間処理した後のフローサイトメトリーからのＰＤＬ１発現のヒストグラム分析を示す。
【図２】図２は、図１の各ヒストグラム分析の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。
【図３】図３は、ＨＢＶ感染ありの場合についてＨｅｐＡＤ３８細胞をテノホビルで６日間処理した後のフローサイトメトリーからのＰＤＬ１発現のヒストグラム分析を示す。
【図４】図４は、図３の各ヒストグラム分析の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。
【図５】図５は、ＨＢＶ感染ありの場合についてＨｅｐＡＤ３８細胞をアデホビルで６日間処理した後のフローサイトメトリーからのＰＤＬ１発現のヒストグラム分析を示す。
【図６】図６は、ＨＢＶ感染ありの場合についてＨｅｐＡＤ３８細胞を他の核酸アナログで６日間処理した後のフローサイトメトリーからのＰＤＬ１発現のヒストグラム分析を示す。
【図７】図７は、未処理の原発性ＣＤ８細胞のＣＳＦＥ染色の結果を示す。エンテカビル処理肝細胞はＣＤ８細胞の細胞増殖を抑制し、ＰＤ１およびＰＤＬ１の遮断はそれを無効にした。（ａ）未処理の原発性ＣＤ８細胞のＣＳＦＥ染色；（ｂ）抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体による処理の３日後の初代ＣＤ８細胞；（ｃ）ＨＢＶ感染のないＨｅｐＡＤ３８細胞との３日間の共培養後の初代ＣＤ８細胞；（ｄ）ＨＢＶ感染したＨｅｐＡＤ３８細胞との３日間の共培養後の初代ＣＤ８細胞；；（ｅ）エンテカビル処理後の初代ＣＤ８細胞；（ｆ）ＨＢＶ感染およびＰＤ１抗体の投与を伴わないＨｅｐＡＤ３８細胞との３日間の共培養後の初代ＣＤ８細胞；（ｇ）ＨＢＶ感染したＨｅｐＡＤ３８細胞との３日間の共培養後の初代ＣＤ８細胞；（ｈ）ＨＢＶ感染したＨｅｐＡＤ３８細胞と３日間共培養し、ＥＴＶで処理し、ＰＤ１抗体を投与した初代ＣＤ８細胞。
【図８】図８は、骨髄におけるＰＤＬ１の発現をフローサイトメトリーで分析した結果を示す。
【図９】図９は、ＤＳＳ腸炎モデルにおいてエンテカビル２０ｍｇ／ｋｇを毎日７日間投与した際の、腸長の変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明について更に詳細に説明する。
本発明のＰＤＬ１発現誘導剤、並びに本発明の免疫抑制剤は、エンテカビル、テノホビルまたはアデホビルを有効成分として含む。
エンテカビル、テノホビルまたはアデホビルは、ＰＤＬ１の発現誘導という、従来の免疫抑制剤にはない全く新しい作用機序を示す。よって、従来の免疫抑制剤に耐性を示す症例に対しても効果を示し、従来の免疫抑制剤との併用で、相乗効果を得る可能性がある。また従来の免疫抑制剤には副作用が高頻度で起こるため、毒性が低いほぼ副作用のないエンテカビルの投与により、従来の免疫抑制剤の投与量の減量し、副作用の軽減が可能となる可能性がある。
【００１５】
エンテカビル、テノホビルまたはアデホビルは、ＨＢＶ肝炎患者に保険適用を受けて、副作用が少なく長期に投与されている実績があり、毒性が極めて低い継続性の高い薬剤である。よって、従来の免疫抑制剤と比較して、副作用の少ない継続性の高い薬剤となり得る。エンテカビルは、既にジェネリック医薬品が発売されており、医療経済上はメリットのある薬剤である。
【００１６】
エンテカビル、テノホビルおよびアデホビルは、核酸アナログ製剤であり、逆転写酵素を阻害する作用がある。逆転写をウイルス複製に必要とするＢ型肝炎ウイルス疾患において、抗ウイルス薬として広く用いられている。エンテカビルによってウイルスの複製が抑制されるため、新たなウイルスが産生されなくなるため、Ｂ型肝炎の活動性が抑制される。よって、活動性Ｂ型肝炎によって引き起こされる肝硬変や肝がんの発生抑制、病勢制御にも効果的である。
本発明では、上記の効果とは全く異なる効果をエンテカビル、テノホビルおよびアデホビルが有することを見出した。
【００１７】
エンテカビルは、2-アミノ-9-[(1S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-3-(ヒドロキシメチル)-2-メチリデンシクロペンチル]-6,9-ジヒドロ-3H-プリン-6-オンで示される抗ウイルス薬である。
テノホビルは、({[(2R)-1-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)プロパン-2-イル]オキシ}メチル)ホスホン酸で示される抗ウイルス薬である。テノホビルは、ジソプロキシルエステルまたはアラフェナミド（アラニンイソプロピルエステルとのアミド＋フェノールとのエステル）のフマル酸として販売されている。本発明で言うテノホビルとは、上記したエステルまたはアラファナミドでもよい。
アデホビルは、{[2-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)エトキシ]メチル}ホスホン酸で示される抗ウイルス薬である。
【００１８】
エンテカビル、テノホビルおよびアデホビルとしては、それぞれ上記した化合物の塩、水和物または溶媒和物を使用してもよい。
【００１９】
本発明のＰＤＬ１発現誘導剤は、免疫抑制機能を有することから、免疫抑制剤として使用することはできる。本発明の免疫抑制剤は、例えば、自己免疫疾患、臓器移植後の拒絶反応、アレルギー性疾患または炎症性疾患の予防および／または治療のために使用することができる。
【００２０】
自己免疫疾患としては、関節炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性糸球体腎炎、自己免疫性膵島炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性卵巣炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、クローン病、ベーチェット病、Ｗｅｇｅｎｅｒ肉芽腫症、過敏性血管炎、結節性動脈周囲炎、橋本病、粘液水腫、バセドウ病、アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、突発性血小板減少症、悪性貧血、重症筋無力症、脱髄疾患、大動脈炎症群、乾癬、天疱瘡、類天疱瘡、膠原病、ギラン・バレー症候群、多腺性自己免疫症候群II型、原発性胆汁性肝硬変、尋常性白斑、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、動脈血栓症、静脈血栓症、習慣性流産、血小板減少症および抗リン脂質抗体症候群などを挙げることができるが、特に限定されない。
【００２１】
臓器移植後の拒絶反応としては、腎移植、肝移植、心移植および／または肺移植後の拒絶反応、骨髄移植における拒絶反応、または移植片対宿主病などを挙げることができるが、特に限定されない。
【００２２】
アレルギー性疾患としては、喘息、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性胃腸炎、アナフィラキシーショックまたは食物アレルギーなどを挙げることができるが、特に限定されない。
【００２３】
炎症性疾患としては、接触性皮膚炎、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病など）、高安動脈炎、巨細胞動脈炎、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、チャーグ・ストラウス症候群、アレルギー性皮膚血管炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、過敏性血管炎、血管炎症候群、閉塞性血栓性血管炎、結節性血管炎、リウマチ関節炎、慢性関節リウマチ、変形性関節炎、結核性関節炎、化膿性関節炎、乾癬性関節炎、膝内症、特発性骨壊死症、骨関節炎、ウイルス性肝炎、自己免疫性肝炎、急性糸球体腎炎、慢性腎炎、急速進行性腎炎症候群、溶連菌感染後急性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ症候群、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、間質性腎炎、急性感染性胃炎、アレルギー性胃炎、慢性胃炎、膵炎、腸炎、喉頭炎および神経炎などを挙げることができるが、特に限定されない。
【００２４】
エンテカビル、テノホビルおよびアデホビルは、例えば、経口、経皮又は注射により投与することができるが、好ましくは経口により投与することができる。
【００２５】
経口投与用の製剤（医薬組成物）としては、特に限定されないが、錠剤、顆粒およびカプセル剤などを挙げることができ、好ましくは錠剤である。経口投与用の製剤（医薬組成物）は、慣用の添加剤、例えば、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤などを用いて常法により製造することができる。
【００２６】
結合剤として、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒプロメロース、ポビドンのいずれかを含有してもよい。
【００２７】
賦形剤としては、例えば、澱粉誘導体、セルロース誘導体、Ｄ−マンニトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、クロスポビドン、アラビアゴム、デキストラン、プルラン、珪酸塩誘導体、燐酸塩、炭酸塩および硫酸塩等から選択することができる。澱粉誘導体としては、例えば、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、α−澱粉、デキストリン等を挙げることができる。セルロース誘導体としては、例えば、結晶セルロース等を挙げることができる。また、珪酸塩誘導体としては、例えば、軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、珪酸カルシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム等を挙げることができる。燐酸塩としては、例えば、燐酸水素カルシウム等を挙げることができる。炭酸塩としては、例えば、炭酸カルシウム等を挙げることができる。硫酸塩としては、例えば、硫酸カルシウム等を挙げることができる。
【００２８】
崩壊剤としては、例えば、セルロース誘導体、架橋ポリビニルピロリドンおよび化学修飾されたデンプン・セルロース類から選択することができる。セルロース誘導体としては、例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム等を挙げることができる。架橋ポリビニルピロリドンとしては、例えば、クロスポビドン等を挙げることができる。また、化学修飾されたデンプン・セルロース類としては、例えば、カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム等を挙げることができる。
【００２９】
滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩（ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等）、タルク、コロイドシリカ、ワックス類（ビーズワックス、ゲイ蝋等）、硼酸、アジピン酸、硫酸塩（硫酸ナトリウム等）、グリコール、フマル酸、安息香酸ナトリウム、Ｄ，Ｌ−ロイシン、ラウリル硫酸塩（ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム等）、珪酸類（無水珪酸、珪酸水和物等）および上記に賦形剤として示した化合物等から選択することができる。
【００３０】
矯味矯臭剤は、例えば、甘味料、酸味料および香料等から選択することができる。甘味料としては、例えば、スクラロース、サッカリンナトリウム、アスパルテーム等を挙げることができる。酸味料としては、例えば、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸等を挙げることができる。また、香料としては、例えば、メントール、レモンエキス、オレンジエキス等を挙げることできる。
【００３１】
エンテカビル、テノホビルおよびアデホビルの投与量は、患者の年齢、体重、性別、投与時間、投与経路、疾患の重篤度をなどを考慮して適宜調整することができ、例えば、通常、成人１日あたり１μｇ〜５００ｍｇ程度、好ましくは５μｇ〜５０ｍｇ、より好ましくは５０μｇ〜５ｍｇ程度を１回〜５回に分けて投与することができる。
【００３２】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３３】
＜方法＞
（細胞培養）
ＨｅｐＡＤ３８細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ｇｉｂｃｏ）を含む２４ウェル培養プレート中で培養した。ＨＢＶのｐｇＲＮＡ転写を抑制するために、ドキシサイクリンを１μｇ／ｍｌで通常添加した。ＮＲＴＩは、培養細胞の播種時に開始され、培養培地の交換時に３日ごとに更新した。薬剤は水に溶解し、実験の過程で４℃で保存した。薬剤は所定の量で投与した。
【００３４】
（フローサイトメーター）
細胞膜の表面上のＰＤ−Ｌ１の発現レベルを調べるために、蛍光色素結合抗ＰＤ−Ｌ１（２９Ｅ．２Ａ３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で細胞を染色した。その後、細胞をＦＡＣＳ  Ｖｅｒｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に流した。データ分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｏｍｙ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて行った。
【００３５】
（Ｔ細胞増殖アッセイ）
ドキシサイクリン投与の有無にかかわらず、ＨｅｐＡＤ３８細胞を播種した。続いて、ドキシサイクリンを含まない細胞に３０μＭのＥＴＶを添加し、６日間培養した。
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）、ＡｘｉｓＳｈｉｅｌｄ  ＰｏＣ  ＡＳ、オスロ、ノルウェー）を用いた密度勾配遠心分離によって、健常人ボランティア血液から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。所望のＴ細胞集団（ＣＤ８  ＋）を、抗ＡＰＣ  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いた陽性選択（ＡｕｔｏＭＡＣＳ：プログラム可能；  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によって得た。ＣＤ８＋Ｔ細胞をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）で標識した。
【００３６】
ＨｅｐＡＤ３８細胞を６日間培養し、上記のＣＤ８＋Ｔ細胞を２４ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルの密度で播種し、１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｗａｋｏ）中で共培養した。培地は、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭのＮＥＡＡ、および０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（１．２５μｌ／ウェル；  ｇｉｂｃｏ）の添加によりＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激した。ＰＤＬ１のブロッキング効果を調べるために、抗ＰＤ−１抗体ｎｉｖｏｌｕｍａｂ（Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ、２０  ｍｇ、Ｏｎｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を適用ウェルに間欠的に投与した（最終濃度５０μｇ／  ｍｌ）。
７２時間後、細胞をＡＰＣ結合抗ＣＤ８抗体（ＨＩＴ８ａ）で染色し、死細胞をヨウ化プロピジウムで染色した。フローサイトメトリー分析を上記のように行った。
【００３７】
（統計解析）
有意差は、スチューデントのｔ検定によって決定した。一元配置分散分析を用いて複数の比較を行った後、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ−Ｄｕｎｎ検定を行った。
Ｐ＜０．０５は統計的に有意であると考えられた。データは平均±ＳＤまたは平均±ＳＥＭとして示した。
【００３８】
＜結果＞
実施例１：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの核酸アナログによるＰＤＬ１発現解析
ヒト肝臓がん由来細胞株であるＨｅｐＡＤ３８細胞に１０、３０、１００μＭのエンテカビルを投与し、６日培養したところＰＤＬ１の膜上への発現がフローサイトメトリーで観察された（図１および図２）。非投与群では、ＰＤＬ１の発現は認められなかった（図１）。
【００３９】
その他のＢ型肝炎に適応のあるテノホビル（３．２５、３２．５、３２５μＭ）、アデホビル（０．７９、７．９μＭ）においても同様条件下で検討を行いＰＤＬ１の膜上への発現がフローサイトメトリーで観察された（図３、図４および図５）。
【００４０】
比較例１：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの他の核酸アナログによるＰＤＬ１発現解析
ＨＩＶ感染症などにおいて適応を受けている他の核酸アナログについても同様の検討を行った。各核酸アナログの投与濃度は、各核酸アナログのＩＣ５０または、ＥＤ５０値の１０倍の濃度まで検討を行った。具体的には以下の通りである。
【００４１】
サニルブジン（４１μＭ）、エムトリシタビン（６．４μＭ）、アシクロビル（３４５μＭ）、ガンシクロビル（７０μＭ）、リバビリン（７１μＭ）、ジダノシン（１００μＭ）、ジドブジン（４．９μＭ）、ペンシクロビル（２０１μＭ）。
【００４２】
上記の核酸アナログにおいては、有効なＰＤＬ１誘導が認められなかった（図６）。
【００４３】
実施例２：ＰＤＬ１の機能解析
エンテカビルにより誘導されたＰＤＬ１が、ＰＤ−１発現細胞に影響しうるかを確認するためにＰＤＬ１が誘導されたＨｅｐＡＤ３８細胞と初代培養ＣＤ８＋Ｔ細胞とを共培養し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖アッセイを行った。エンテカビルを投与したＨＢＶ感染細胞では、非増殖細胞が３２．１％まで増加し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖が抑制されたことが確認された。
【００４４】
さらに、抗ＰＤ−１抗体ニボルマブの添加によリ、エンテカビルを投与した細胞では、非増殖細胞が２４．１％と低下し増殖能が回復した。これらの結果より、エンテカビルにより誘導されたＰＤＬ１はＰＤ１発現細胞に影響を与えうる機能を持ったものであることが確認された（図７）。なお、ＨＢＶ非感染細胞と共培養したＣＤ８＋Ｔ細胞は、２５．３％の非増殖細胞を有し、ＨＢＶ感染細胞では２４．９％となり、投与群の３２．１％と比較し、非増殖細胞の割合が低かった（図７）。
【００４５】
実施例３：Ｉｎ  ｖｉｖｏでの核酸アナログによるＰＤＬ１発現解析
Ｃ５７／Ｂ６マウスにエンテカビルを３．２mg／ｋｇ３０日間経口投与し、骨髄でのＰＤＬ１の発現をフローサイトメトリーで観察した。エンテカビルの投与によりＰＤＬ１の発現が誘導されることが確認された（図８）。なお、エンテカビ非投与群（ｃｏｎｔｒｏｌ）においても、骨髄細胞においては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球細胞、骨髄系細胞においてＰＤＬ１の発現は認められるが、その発現は中等度であった（図８）。
【００４６】
実施例４：ＤＳＳ腸炎マウスモデルでのエンテカビルの効果
Ｃ５７／Ｂ６マウスにエンテカビル２０ｍｇ／ｋｇを毎日（一日一回）一週間経口投与した後、エンテカビル２０ｍｇ／ｋｇに加えて、３．５質量％ＤＳＳ（デキストラン硫酸ナトリウム）溶液（４.３ｍｌ：１日）を一週間投与した（エンテカビル投与群：図９ではＥＴＶ２０ｍｇと表記）。Ｖｉｈｉｃｌｅ群（図９ではＶｉｈｉｃｌｅと表記）には、エンテカビル２０ｍｇ／ｋｇの代わりに、エンテカビルを含まない媒体を投与した。コントロール群（図９ではＣｏｎと表記）には、エンテカビルもＤＳＳも投与しなかった。
エンテカビル投与群、Ｖｉｈｉｃｌｅ群及びコントロール群のマウス（各群２匹）について、腸長を測定した結果を図９に示す。エンテカビル投与群において、腸長の短縮の軽減が、エンテカビ非投与群（ｃｏｎｔｒｏｌ）及びＶｉｈｉｃｌｅ群との比較により認められた（図９）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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