(57)【要約】【課題】本発明は、生体関連物質を修飾する用途に使用される細胞内で分解する分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体を提供する。【解決手段】下式（１）：2020164855.tif 000054（式中、各記号は本明細書中で定義した通りである）で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式（１）：
【化１】
2020164855.tif 000050
（式中、ｎは４５〜９５０であり、Ｗはグルタミン酸を中心とした対称構造の５〜４７残基のオリゴペプチドであり、ａは２〜８であり、Ｘは生体関連物質と反応可能な官能基であり、ならびにＬ１およびＬ２はそれぞれ独立して、２価のスペーサーである。）で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体。
【請求項２】
Ｗのグルタミン酸を中心とした対称構造のオリゴペプチドが、以下のｗ１、ｗ２またはｗ３の構造を有するオリゴペプチドである請求項１に記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
【化２】
2020164855.tif 000051
【化３】
2020164855.tif 000052
【化４】
2020164855.tif 000053
（式中、Ｇｌｕはグルタミン酸の残基であり、およびＺはシステインを除く中性アミノ酸からなる２〜５残基の分解性オリゴペプチドである。）
【請求項３】
Ｚの分解性オリゴペプチドが、Ｃ末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである請求項２に記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
【請求項４】
Ｚの分解性オリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも１つ有するオリゴペプチドである請求項２または３に記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
【請求項５】
総分子量が２０，０００以上である請求項１〜４のいずれか１項に記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
【請求項６】
Ｌ１がカルボニル基、ウレタン結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、２級アミノ基、またはウレア結合；またはこれらの結合および／または基を含んでいてもよいアルキレン基である請求項１〜５のいずれか１項に記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
【請求項７】
Ｌ２がアルキレン基；またはカルボニル基、ウレタン結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、２級アミノ基、およびウレア結合から選択される少なくとも一つの結合および／または基を含むアルキレン基である請求項１〜６のいずれか１項に記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
【請求項８】
Ｘが活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシド基、マレイミド基、置換マレイミド基、ビニルスルホニル基、アクリル基、置換スルホネート基、スルホニルオキシ基、カルボキシル基、メルカプト基、ピリジルジチオ基、α−ハロアセチル基、アルキルカルボニル基、ヨードアセトアミド基、アルケニル基、アルキニル基、置換アルキニル基、アミノ基、オキシアミノ基、ヒドラジド基およびアジド基からなる群より選択される請求項１〜７のいずれか１項に記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体関連物質を修飾する用途に使用される細胞内で分解する分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
ホルモンやサイトカイン、抗体、酵素などの生体関連物質を用いた医薬品は、通常生体内へ投与されると腎臓における糸球体濾過や肝臓や脾臓などにおけるマクロファージによる取り込みによって、生体内から速やかに排出されてしまう。そのため血中半減期が短く、十分な薬理効果を得ることが困難であることが多い。この問題を解決するため、生体関連物質を糖鎖やポリエチレングリコールなどの親水性高分子やアルブミンなどによって化学修飾する試みが行われている。その結果、分子量の増大や水和層の形成などにより生体関連物質の血中半減期を延長することが可能となる。また、ポリエチレングリコールで修飾することで、生体関連物質の毒性や抗原性の低下、難水溶性薬剤の溶解性向上などの効果が得られることも良く知られている。
【０００３】
ポリエチレングリコールで修飾された生体関連物質は、ポリエチレングリコールのエーテル結合と水分子との水素結合で形成される水和層で覆われ、分子サイズが大きくなることから、腎臓における糸球体濾過を回避することができる。さらにオプソニンや各組織を構成する細胞表面との相互作用が低下し、各組織への移行が減少することが知られている。ポリエチレングリコールは生体関連物質の血中半減期を延長させる優れた素材であり、その性能は分子量が大きいほど効果が高いことが分かっている。これまで、分子量４万以上の高分子量のポリエチレングリコールで修飾した生体関連物質の研究が多数行なわれており、有意にその血中半減期を延長できる結果が得られている。
【０００４】
ポリエチレングリコールは生体関連物質の性能改善に用いられる修飾製剤の中で至適基準とされており、現在ではポリエチレングリコール修飾製剤が複数上市され、医療現場で使用されている。一方で、２０１２年に欧州医薬品庁（ＥＭＡ）から、分子量４万以上の高分子量のポリエチレングリコールで修飾した生体関連物質を一定の投与量以上で長期間動物に投与すると、一部の組織の細胞内に空胞が発生するとの現象が報告された（非特許文献１）。現時点において、空胞の発生自体が人体に悪影響を与えるとの報告はなく、また、先のＥＭＡの報告において用いられた投与量は、医療現場において一般的に適用される投与量と比べて極めて高用量であることなどを考慮すれば、現在製造販売されている分子量が４万以上のポリエチレングリコールで修飾された治療製剤の安全性は問題ないといえる。しかしながら、非常に特殊な疾患（例えば、小人症など）の治療においては、ポリエチレングリコール修飾製剤を高用量、且つ、長期間に患者へ投与する治療プロトコルが採用されることも想定され得る。従って、かかる特殊な状況においても適用可能な、細胞に空胞を発生させないポリエチレングリコール修飾製剤の開発には潜在的な需要があると予想される。
【０００５】
非特許文献２においては、通常のポリエチレングリコール修飾製剤の投与量に比べ、大過剰量のポリエチレングリコールを単独で動物に長期間投与したところ、分子量２万では空胞は見られず、分子量４万において空胞の発生が確認されている。空胞を抑制する手段の一つとして、ポリエチレングリコールの分子量を小さくすることが考えられるが、分子量を小さくすると生体関連物質の血中半減期を十分に改善することができないという問題が生じる。
【０００６】
高分子量のポリエチレングリコールを体内で低分子量のポリエチレングリコールに分解し、腎臓からの排出を促進する技術については報告例がある。特許文献１には、生体内で切断されるスルフィド結合やペプチド結合部位を有したポリエチレングリコール誘導体に関する記載がなされている。当該ポリエチレングリコール誘導体は、生体内で腎臓からの排出に適した分子量まで分解されるとの記載がある。しかし、具体的な分解に関するデータは全く示されておらず、腎臓からの排出が促進されたというデータもない。さらに細胞の空胞に関する記載はない。
【０００７】
特許文献２には、生体内の低ｐＨ環境下において加水分解可能なアセタール部位を有したポリエチレングリコール誘導体に関する記載がなされている。当該ポリエチレングリコール誘導体は、生体内で腎臓からの排出に適した分子量まで分解されるとの記載がある。しかし、具体的に腎臓からの排出が促進されたというデータは無く、さらに細胞の空胞に関する記載もない。また、これら加水分解が可能なアセタール部位は血中でも徐々に分解することが知られており、修飾した生体関連物質の血中半減期を十分に改善することができないと予想される。
【０００８】
一方で、薬物を効果的にリリースするために分解性のオリゴペプチドを導入したポリエチレングリコール誘導体や体内で分解するハイドロゲルなどの報告例はある。
【０００９】
非特許文献３には、酵素によって分解するオリゴペプチド部位を有したポリエチレングリコール誘導体に関する記載がなされている。ここではオリゴペプチドは、抗癌剤とポリエチレングリコールの間のリンカーとして導入されており、腫瘍周辺に特異的に発現している酵素によってオリゴペプチドが分解し、効率よく抗癌剤をリリースすることが報告されている。目的は抗癌剤のリリースであり、細胞の空胞を抑制する目的でポリエチレングリコールに分解性を付与するものではない。
【００１０】
非特許文献４には、酵素によって分解するオリゴペプチド部位を有した架橋分子と多分岐型のポリエチレングリコール誘導体を用いたハイドロゲルに関する記載がなされている。ここではオリゴペプチドは多分岐型のポリエチレングリコール誘導体を繋ぎ合わせる架橋分子として用いられ、さらに酵素による分解性をハイドロゲルに付与することができる。目的は分解性のハイドロゲルの調製であり、細胞の空胞を抑制する目的でポリエチレングリコールに分解性を付与するものではない。
【００１１】
特許文献３には、オリゴペプチドを骨格とした分岐型のポリエチレングリコール誘導体に関する記載がなされている。ここではオリゴペプチドは、ポリエチレングリコール誘導体の基本骨格として用いられており、酵素による分解性を付与するものではない。また、オリゴペプチドにリジンやアスパラギン酸など、側鎖にアミノ基やカルボキシル基を有したアミノ酸を含むことが特徴であり、それらを反応に利用した分岐型のポリエチレングリコール誘導体を合成することが目的である。細胞の空胞を抑制する目的のポリエチレングリコール誘導体ではない。
【００１２】
さらに生体関連物質を修飾する用途に用いられるポリエチレングリコール誘導体においては、一般的に直鎖型と分岐型があり、非特許文献５には、直鎖型よりも分岐型のほうが有意に生体関連物質の血中半減期を延長させるとの記載がある。近年、上市されたポリエチレングリコール修飾製剤のほとんどは分岐型が採用されている。しかし、これまで当該分野において、細胞の空胞を抑制する分岐型のポリエチレングリコール誘導体に関する報告はない。
【００１３】
以上のように、血中では安定で、修飾した生体関連物質の血中半減期を改善し、細胞に取り込まれた際に細胞内で特異的に分解して、細胞の空胞の発生を抑制することができる分岐型の高分子量のポリエチレングリコール誘導体が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特表２００９−５２７５８１号公報
【特許文献２】国際公開第２００５／１０８４６３号
【特許文献３】国際公開第２００６／０８８２４８号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】ＥＭＡ／ＣＨＭＰ／ＳＷＰ／６４７２５８／２０１２
【非特許文献２】Ｄａｎｉｅｌ  Ｇ．  Ｒｕｄｍａｎｎ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ．  Ｐａｔｈｏｌ．，  ４１，  ９７０−９８３（２０１３）
【非特許文献３】Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ  Ｍ  Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，  １６，  ７７５−７８４（２００５）
【非特許文献４】Ｊｉｙｕａｎ  Ｙａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｒｃｏｍｏｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．，  １０（４），  ４４５−４５４（２０１０）
【非特許文献５】Ｙｕｌｉａ  Ｖｕｇｍｅｙｓｔｅｒａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，  ２３，  １４５２−１４６２（２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の課題は、細胞の空胞を引き起こさない高分子量の分岐型ポリエチレングリコール誘導体を提供することにある。より具体的には、生体関連物質を修飾する用途に効果的に用いることができ、生体内の血中で安定であり、且つ細胞内で分解される分岐型分解性ポリエチレングリコール誘導体を、工業的に生産可能な製法にて提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、細胞内にて分解するオリゴペプチドを有した分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体を発明した。
【００１８】
即ち、本発明は以下に示すとおりである。
［１］下式（１）：
【００１９】
【化１】
2020164855.tif 000002
【００２０】
（式中、ｎは４５〜９５０であり、Ｗはグルタミン酸を中心とした対称構造の５〜４７残基のオリゴペプチドであり、ａは２〜８であり、Ｘは生体関連物質と反応可能な官能基であり、ならびにＬ１およびＬ２はそれぞれ独立して、２価のスペーサーである。）で示される分解性ポリエチレングリコール誘導体。
［２］Ｗのグルタミン酸を中心とした対称構造のオリゴペプチドが、以下のｗ１、ｗ２またはｗ３の構造を有するオリゴペプチドである［１］記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
【００２１】
【化２】
2020164855.tif 000003
【００２２】
【化３】
2020164855.tif 000004
【００２３】
【化４】
2020164855.tif 000005
【００２４】
（式中、Ｇｌｕはグルタミン酸の残基であり、およびＺはシステインを除く中性アミノ酸からなる２〜５残基の分解性オリゴペプチドである。）
［３］Ｚの分解性オリゴペプチドが、Ｃ末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである［２］記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
［４］Ｚの分解性オリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも１つ有するオリゴペプチドである［２］または［３］のいずれかに記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
［５］総分子量が２０，０００以上である［１］〜［４］のいずれかに記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
［６］Ｌ１がカルボニル基、ウレタン結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、２級アミノ基、またはウレア結合；またはこれらの結合および／または基を含んでいてもよいアルキレン基である［１］〜［５］のいずれかに記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
［７］Ｌ２がアルキレン基；またはカルボニル基、ウレタン結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、２級アミノ基、およびウレア結合から選択される少なくとも一つの結合および／または基を含むアルキレン基である［１］〜［６］のいずれかに記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
［８］Ｘが活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシド基、マレイミド基、置換マレイミド基、ビニルスルホニル基、アクリル基、置換スルホネート基、スルホニルオキシ基、カルボキシル基、メルカプト基、ピリジルジチオ基、α−ハロアセチル基、アルキルカルボニル基、ヨードアセトアミド基、アルケニル基、アルキニル基、置換アルキニル基、アミノ基、オキシアミノ基、ヒドラジド基およびアジド基からなる群より選択される、［１］〜［７］のいずれかに記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の分岐型分解性ポリエチレングリコール誘導体は、生体内の血中では安定であり、細胞内の酵素によって分解するオリゴペプチドを構造内に有している。そのため、当該分解性ポリエチレングリコール誘導体は、血中では安定であり、従来の分解性を有さないポリエチレングリコール誘導体と同等の血中半減期を生体関連物質に付与することができる。さらに、当該分解性ポリエチレングリコール誘導体は、細胞内に取り込まれた場合、オリゴペプチド部位が速やかに分解されるため、これまで課題とされていた細胞の空胞の発生を抑制することができる。また、分解性ポリエチレングリコール誘導体を構成するオリゴペプチドは、グルタミン酸を中心とした対称構造を有しており、すべてのポリエチレングリコール鎖の末端に同一の分解性オリゴペプチドＺが結合することになる。そのため細胞内での分解時に生じるポリエチレングリコール分解物は同一分子量、同一構造のものとなり、組織や細胞からの排出が均一になる特徴を有する。
ポリエチレングリコールによる細胞の空胞化は、ポリエチレングリコールの分子量が大きいほど発生する可能性が高くなるため、分解性ポリエチレングリコールは、細胞内でより小さい分子量に分解される分子設計が望ましい。しかし、分子量の小さいポリエチレングリコールを分解性オリゴペプチドで逐次的に繋ぎ合わせて高分子量の分解性ポリエチレングリコールを製造する場合、工程数が多くなる。また、２種類の異なる官能基を有したポリエチレングリコールを原料にする必要があり、副生する不純物も複雑になるため工業的な生産には不向きである。一方で、本発明の分岐型分解性ポリエチレングリコールは、安価で容易に入手可能なメトキシポリエチレングリコール誘導体を原料とし、それに分解性オリゴペプチドを結合させ、その後、グルタミン酸誘導体との反応で一度に２本のポリエチレングリコール鎖を構造に導入できることから、その製造において大きく工程数を削減することが可能である。また、オリゴペプチドのＣ末端のアミノ酸としてグリシンを用いることで、製造工程中で発生する不純物を低減させることができ、それにより、本発明の分岐型分解性ポリエチレングリコール誘導体を工業的に製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】実施例１の化合物（ｐ３）（ＮＨ２―Ｅ（ＦＧ−２００ＭＥ）２）のＧＰＣ分析結果を示す。
【図２】実施例８の細胞を用いた分解性試験において、細胞内から回収した化合物（ｐ３）（ＮＨ２―Ｅ（ＦＧ−２００ＭＥ）２）のＧＰＣ分析結果を示す。
【図３】実施例５の化合物（ｐ１３）（ＮＨ２―Ｅ｛Ｅ（ＦＧ−１００ＭＥ）２｝２）のＧＰＣ分析結果を示す。
【図４】実施例８の細胞を用いた分解性試験において、細胞内から回収した化合物（ｐ１３）（ＮＨ２―Ｅ｛Ｅ（ＦＧ−１００ＭＥ）２｝２）のＧＰＣ分析結果を示す。
【図５】実施例９のメトキシＰＥＧアミン４０ｋＤａを長期投与したマウスの脳脈絡叢の切片の画像（矢印は空胞を示す）を示す。
【図６】実施例９の化合物（ｐ３）（ＮＨ２―Ｅ（ＦＧ−２００ＭＥ）２）を長期投与したマウスの脳脈絡叢の切片の画像を示す。
【図７】実施例１０のＰＢＳ、メトキシＰＥＧアミン４０ｋＤａ、メトキシＰＥＧアミン２０ｋＤａ、化合物（ｐ３）（ＮＨ２―Ｅ（ＦＧ−２００ＭＥ）２）を長期投与したマウスの脳脈絡叢の切片の画像（染色された部分がＰＥＧの蓄積を示す）を示す。
【図８】実施例１１の放射性同位体をラベル化したＮＨ２―Ｅ(ＦＧ−２００ＭＥ）２、２分岐型ＰＥＧアミン４０ｋＤａ、２分岐型ＰＥＧアミン２０ｋＤａの体内動態結果(血中濃度)を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る分解性ポリエチレングリコール誘導体は、下式（１）で示される。
【００２８】
【化５】
2020164855.tif 000006
【００２９】
（式中、ｎは４５〜９５０であり、Ｗはグルタミン酸を中心とした対称構造の５〜４７残基のオリゴペプチドであり、ａは２〜８であり、Ｘは生体関連物質と反応可能な官能基であり、ならびにＬ１およびＬ２はそれぞれ独立して、２価のスペーサーである。）
【００３０】
本発明の式（１）のポリエチレングリコール誘導体の総分子量は、通常は４，０００〜１６０，０００であり、好ましくは１０，０００〜１２０，０００であり、更に好ましくは２０，０００〜８０，０００である。本発明の１つの好ましい実施形態では、本発明の式（１）のポリエチレングリコール誘導体の総分子量は２０，０００以上である。ここでいう分子量とは数平均分子量（Ｍｎ）である。
【００３１】
式（１）中のｎは、ポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であり、通常は４５〜９５０であり、好ましくは１１０〜６９０であり、更に好ましくは２２０〜４６０である。
【００３２】
式（１）中のａは、オリゴペプチドと結合しているポリエチレングリコール鎖の本数であり、通常は２〜８であり、好ましくは２または４または８であり、更に好ましくは２または４である。
【００３３】
式（１）中のＬ１およびＬ２は、それぞれ独立して、２価のスペーサーであり、これらのスペーサーは共有結合を形成し得る基であれば特に制限は無いが、Ｌ１は、好ましくはアミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、２級アミノ基、カルボニル基、またはウレア結合；またはこれらの結合および／または基を含んでいてもよいアルキレン基である。
また、Ｌ２は、好ましくはアルキレン基；またはアミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、２級アミノ基、カルボニル基、およびウレア結合から選択される少なくとも一つの結合および／または基を含むアルキレン基である。Ｌ２は、ポリエチレングリコールの繰り返しユニットに炭素原子で結合しているものが好ましい。
Ｌ１およびＬ２の特に好ましい態様は、下記の群（Ｉ）に示されるものである。また、群（Ｉ）のスペーサーを２つから５つ組み合わせても良い。２価のスペーサーとしてエステル結合とカーボネート結合は生体内の血中で徐々に分解するため適さない。
【００３４】
群（Ｉ）：
【００３５】
【化６】
2020164855.tif 000007
【００３６】
（ｚ１）〜（ｚ１１）において、式中のｓは０〜１０の整数を示し、好ましくは０〜６の整数、更に好ましくは０〜３の整数を示す。また、（ｚ２）〜（ｚ１１）において、式中のｓは同一でも、異なっていてもよい。Ｌ１が、非対称な２価のスペーサーの場合、隣接する他の基との結合位置は特に限定されず、上記群（Ｉ）の前記式で表されるスペーサーの右側がＷとの結合位置を示し、左側がＸとの結合位置を示す場合と、左側がＷとの結合位置を示し、右側がＸとの結合位置を示す場合の両結合位置を取り得る。同様に、Ｌ２が、非対称な２価のスペーサーの場合も、上記群（Ｉ）の前記式で表されるスペーサーの右側がＯＣＨ２ＣＨ２との結合位置を示し、左側がＷとの結合位置を示す場合と、左側がＯＣＨ２ＣＨ２との結合位置を示し、右側がＷとの結合位置を示す場合の両結合位置を取り得る。
【００３７】
式（１）中のＬ１としては、群（Ｉ）の（ｚ３）、（ｚ４）、（ｚ６）、（ｚ７）、（ｚ８）、（ｚ９）または（ｚ１０）で示される基が好ましく、（ｚ３）、（ｚ６）、（ｚ９）または（ｚ１０）で示される基がより好ましい。
式（１）中のＬ２としては、群（Ｉ）の（ｚ１）、（ｚ２）、（ｚ３）、（ｚ４）、（ｚ５）、（ｚ６）、（ｚ７）、（ｚ８）または（ｚ１１）で示される基が好ましく、（ｚ３）、（ｚ５）または（ｚ１１）で示される基がより好ましい。
【００３８】
式（１）中のＷは、グルタミン酸を中心とした対称構造の５〜４７残基のオリゴペプチドであり、生体内の血中で安定であり、かつ細胞内の酵素で分解するオリゴペプチドであれば特に制限はないが、オリゴペプチドを構成するアミノ酸としては、中心部分を構成するグルタミン酸以外は、システインを除く中性アミノ酸からなることが好ましい。ここでいうグルタミン酸を中心とした対称構造のオリゴペプチドとは、グルタミン酸のα位のカルボキシル基とγ位のカルボキシル基に同一のペプチドが結合した化合物を意味し、グルタミン酸を中心に対となるペプチドが対称構造をとるオリゴペプチドである。当該オリゴペプチド中の中性アミノ酸とグルタミン酸の数の構成比（中性アミノ酸の数／グルタミン酸の数）としては、通常は２〜１０であり、好ましくは２〜８であり、更に好ましくは２〜６である。Ｗを構成するアミノ酸は基本的にはＬ型である。
【００３９】
Ｗの特に好ましい態様は、下記の群（ＩＩ）に示されるものである。
【００４０】
群（ＩＩ）：
【００４１】
【化７】
2020164855.tif 000008
【００４２】
【化８】
2020164855.tif 000009
【００４３】
【化９】
2020164855.tif 000010
【００４４】
（式中、Ｇｌｕはグルタミン酸の残基であり、およびＺはシステインを除く中性アミノ酸からなる２〜５残基の分解性オリゴペプチドである。）
【００４５】
（ｗ１）〜（ｗ３）中のＺは、側鎖にアミノ基やカルボキシル基を持つアミノ酸、具体的には、リジン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸を含まない中性アミノ酸で構成されるオリゴペプチドであることが好ましい。本発明の式（１）の分岐型分解性ポリエチレングリコール誘導体の合成においては、原料であるポリエチレングリコール誘導体とオリゴペプチドを反応にて結合させる際、オリゴペプチドのＣ末端のカルボキシル基をポリエチレングリコール誘導体との縮合反応に利用する。しかし、当該オリゴペプチドが側鎖にアミノ基やカルボキシル基を持つアミノ酸を有する場合、縮合反応にてオリゴペプチド同士の副反応や、ポリエチレングリコール誘導体が目的であるＣ末端のカルボキシル基ではなく、側鎖のカルボキシル基にも導入した不純物が発生する。
この不純物は通常の抽出や晶析などの精製工程で除去することは難しいため、純度よく目的物を得るためには、側鎖にアミノ基やカルボキシル基を持たないアミノ酸からなるオリゴペプチドを用いることが望ましい。Ｚを構成するアミノ酸は、α−アミノ酸であり、また基本的にはＬ型である。
【００４６】
中性アミノ酸であるシステインはメルカプト基を有しており、他のメルカプト基とジスルフィド結合を形成するため、（ｗ１）〜（ｗ３）中のＺは、システインを含まない中性アミノ酸からなるオリゴペプチドであることが好ましい。
【００４７】
加えて、（ｗ１）〜（ｗ３）中のＺは、Ｃ末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドであることが好ましい。Ｃ末端のカルボキシル基とポリエチレングリコール誘導体を反応させる際は、基本的にＣ末端のカルボキシル基を縮合剤などで活性化する必要がある。この活性化の工程にて、グリシン以外のアミノ酸ではエピメリ化が起こりやすく、立体異性体が副生することが知られている。オリゴペプチドのＣ末端のアミノ酸をアキラルなグリシンとすることで、立体異性体の副生の無い、高純度な目的物を得ることができる。
【００４８】
さらに、（ｗ１）〜（ｗ３）中のＺは、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸、具体的には、フェニルアラニン、ロイシン、バリン、イソロイシンを少なくとも１つ有するオリゴペプチドであることが好ましく、フェニルアラニンを有するオリゴペプチドであることが更に好ましい。Ｋｙｔｅ  と  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅにより作成された、アミノ酸の疎水性を定量的に示すハイドロパシー指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ  ｉｎｄｅｘ）は、値が大きいほど疎水的なアミノ酸であることを示す（Ｋｙｔｅ  Ｊ  ＆
Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  ＲＦ，  １９８２，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  １５７：１０５−１３２．）。
【００４９】
（ｗ１）〜（ｗ３）中のＺは、生体内の血中で安定であり、かつ細胞内の酵素で分解する性能を有し、システインを除く中性アミノ酸からなる２〜５残基のオリゴペプチドであれば特に制限は無いが、具体的な例としては、グリシン−フェニルアラニン−ロイシン−グリシン、グリシン−グリシン−フェニルアラニン−グリシン、グリシン−フェニルアラニン−グリシン、グリシン−ロイシン−グリシン、バリン−シトルリン−グリシン、バリン−アラニン−グリシン、フェニルアラニン−グリシンなどであり、好ましくはグリシン−フェニルアラニン−ロイシン−グリシン、グリシン−グリシン−フェニルアラニン−グリシン、グリシン−フェニルアラニン−グリシン、バリン−シトルリン−グリシン、バリン−アラニン−グリシン、またはフェニルアラニン−グリシンであり、より好ましくはグリシン−フェニルアラニン−ロイシン−グリシン、グリシン−フェニルアラニン−グリシン、バリン−シトルリン−グリシン、またはフェニルアラニン−グリシンであり、さらにより好ましくはグリシン−フェニルアラニン−ロイシン−グリシン、またはフェニルアラニン−グリシンである。
【００５０】
式（１）中のＸは、化学修飾の対象となる生理活性タンパク質、ペプチド、抗体、核酸などの生体関連物質に存在する官能基と反応して共有結合を形成する官能基であれば特に制限されない。例えば、「Ｈａｒｒｉｓ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９２」、「Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，  Ｇ．  Ｔ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ２ｎｄ  ｅｄ．；  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ，  ２００８」および「ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇｓ：  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；  Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，  Ｆ．  Ｍ．，  Ｅｄ．；  Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：
Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，２００９」などに記載されている官能基が挙げられる。
【００５１】
式（１）中のＸで示される「生体関連物質と反応可能な官能基」は、生体関連物質が有するアミノ基、メルカプト基、アルデヒド基、カルボキシル基、不飽和結合またはアジド基などの官能基と化学結合可能な官能基であれば特に制限されない。
具体的には、活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシド基、カルボキシル基、メルカプト基、マレイミド基、置換マレイミド基、ヒドラジド基、ピリジルジチオ基、置換スルホネート基、ビニルスルホニル基、アミノ基、オキシアミノ基（Ｈ２Ｎ−Ｏ−基）、ヨードアセトアミド基、アルキルカルボニル基、アルケニル基（例えば、アリル基、ビニル基）、アルキニル基、置換アルキニル基（例えば、後記の炭素数１〜５の炭化水素基で置換されたアルキニル基）、アジド基、アクリル基、スルホニルオキシ基（例えば、アルキルスルホニルオキシ基）、α−ハロアセチル基などが挙げられ、好ましくは、活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシド基、マレイミド基、置換マレイミド基、ビニルスルホニル基、アクリル基、スルホニルオキシ基（例えば、炭素数１〜５のアルキル−スルホニルオキシ基）、置換スルホネート基、カルボキシル基、メルカプト基、ピリジルジチオ基、α−ハロアセチル基、アルキニル基、置換アルキニル基（例えば、後記の炭素数１〜５の炭化水素基で置換された炭素数２〜５のアルキニル基）、アリル基、ビニル基、アミノ基、オキシアミノ基、ヒドラジド基およびアジド基であり、より好ましくは活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、マレイミド基、オキシアミノ基およびアミノ基であり、特に好ましくはアルデヒド基、マレイミド基およびオキシアミノ基である。
【００５２】
別の好適な実施形態において、かかる官能基Ｘは、下記の群（ＩＩＩ）、群（ＩＶ）、群（Ｖ）、群（ＶＩ）、群（ＶＩＩ）および群（ＶＩＩＩ）に分類することができる。
【００５３】
群（ＩＩＩ）：生体関連物質が有するアミノ基と反応可能な官能基
下記の  （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｊ）、または（ｋ）で示される基が挙げられる。
【００５４】
群（ＩＶ）：生体関連物質が有するメルカプト基と反応可能な官能基
下記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、または（ｌ）で示される基が挙げられる。
【００５５】
群（Ｖ）：生体関連物質が有するアルデヒド基と反応可能な官能基
下記の（ｈ）、（ｍ）、（ｎ）、または（ｐ）で示される基が挙げられる。
【００５６】
群（ＶＩ）：生体関連物質が有するカルボキシル基と反応可能な官能基
下記の（ｈ）、（ｍ）、（ｎ）、または（ｐ）で示される基が挙げられる。
【００５７】
群（ＶＩＩ）：生体関連物質が有する不飽和結合と反応可能な官能基
下記の（ｈ）、（ｍ）、または（ｏ）で示される基が挙げられる。
【００５８】
群（ＶＩＩＩ）：生体関連物質が有するアジド基と反応可能な官能基
下記の（ｌ）で示される基が挙げられる。
【００５９】
【化１０】
2020164855.tif 000011
【００６０】
官能基（ｊ）において、式中のＷ１は塩素原子（Ｃｌ）、臭素原子（Ｂｒ）またはヨウ素原子（Ｉ）などのハロゲン原子を示し、好ましくはＢｒ、またはＩ、より好ましくはＩである。
【００６１】
また、官能基（ｅ）および官能基（ｌ）において、式中のＹ１およびＹ３は、それぞれ独立して、水素原子または炭素数１〜５の炭化水素基を示し、好ましくは炭素数１〜５の炭化水素基である。炭素数１〜５の炭化水素基としては、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、第三ブチル基などが挙げられ、好ましくはメチル基、またはエチル基である。
【００６２】
また、官能基（ｋ）において、式中のＹ２はフッ素原子を含んでいてもよい炭素数が１〜１０の炭化水素基を示し、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、第三ブチル基、ヘキシル基、ノニル基、ビニル基、フェニル基、ベンジル基、４−メチルフェニル基、トリフルオロメチル基、２，２，２−トリフルオロエチル基、４−（トリフルオロメトキシ）フェニル基などが挙げられ、好ましくはメチル基、ビニル基、４−メチルフェニル基、または２，２，２−トリフルオロエチル基である。
【００６３】
活性エステル基とは、脱離能の高いアルコキシ基を有したエステル基である。脱離能の高いアルコキシ基としては、ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ペンタフルオロフェノールなどから誘導されるアルコキシ基が挙げられる。活性エステル基は、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミドから誘導されるアルコキシ基を有したエステル基である。
【００６４】
活性カーボネート基とは、脱離能の高いアルコキシ基を有したカーボネート基である。脱離能の高いアルコキシ基としては、ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ペンタフルオロフェノールなどから誘導されるアルコキシ基が挙げられる。活性カーボネート基は、好ましくはニトロフェノールまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドから誘導されるアルコキシ基を有したカーボネート基である。
【００６５】
置換マレイミド基とは、マレイミド基の二重結合の片方の炭素原子に炭化水素基が結合しているマレイミド基である。炭化水素基は、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、第三ブチル基などが挙げられ、好ましくはメチル基、またはエチル基である。
【００６６】
置換スルホネート基とは、スルホネート基の硫黄原子にフッ素原子を含んでいてもよい炭化水素基が結合しているスルホネート基である。フッ素原子を含んでいてもよい炭化水素基としては、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、第三ブチル基、ヘキシル基、ノニル基、ビニル基、フェニル基、ベンジル基、４−メチルフェニル基、トリフルオロメチル基、２，２，２−トリフルオロエチル基、４−（トリフルオロメトキシ）フェニル基などが挙げられ、好ましくはメチル基、ビニル基、４−メチルフェニル基、または２，２，２−トリフルオロエチル基である。
【００６７】
式（１）の好ましい態様の１つは、Ｗがｗ１であり、およびａ＝２の下式（２）で示される２分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体である。
【００６８】
【化１１】
2020164855.tif 000012
【００６９】
（式中、Ｇｌｕ、Ｚ、ｎ、Ｘ、Ｌ１およびＬ２は、前記と同義である。）
【００７０】
式（１）の好ましい態様の１つは、Ｗがｗ２であり、およびａ＝４の下式（３）で示される４分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体である。
【００７１】
【化１２】
2020164855.tif 000013
【００７２】
（式中、Ｇｌｕ、Ｚ、ｎ、Ｘ、Ｌ１およびＬ２は、前記と同義である。）
【００７３】
式（１）の好ましい態様の１つは、Ｗがｗ３であり、およびａ＝８の下式（４）で示される８分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体である。
【００７４】
【化１３】
2020164855.tif 000014
【００７５】
（式中、Ｇｌｕ、Ｚ、ｎ、Ｘ、Ｌ１およびＬ２は、前記と同義である。）
【００７６】
本発明の分岐型分解性ポリエチレングリコール誘導体は、例えば、次のような工程を経て製造することができる。
【００７７】
【化１４】
2020164855.tif 000015
【００７８】
（工程中のＰＥＧはポリエチレングリコール鎖であり、Ｐｅｐｔｉｄｅはオリゴペプチドであり、Ｐｒｏは保護基であり、およびＬ３は２価のスペーサーである。）
【００７９】
工程中のＰＥＧは、ポリエチレングリコール鎖であり、分子量は、前記したポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であるｎで定義したとおりであり、つまりｎが４５〜９５０であることから、その分子量の範囲は、２０００〜４２０００である。
【００８０】
工程中のＰｅｐｔｉｄｅは、前記Ｚと同義のオリゴペプチドである。本工程ではＮ末端のアミノ基が保護基で保護されたオリゴペプチドを用いる。
【００８１】
工程中のＰｒｏは、保護基であり、ここで保護基とは、ある反応条件下で分子中の特定の化学反応可能な官能基の反応を防止または阻止する成分である。保護基は、保護される化学反応可能な官能基の種類、使用される条件および分子中の他の官能基もしくは保護基の存在により変化する。保護基の具体的な例は多くの一般的な成書に見出すことができるが、例えば「Ｗｕｔｓ，  Ｐ．  Ｇ．  Ｍ．；  Ｇｒｅｅｎｅ，  Ｔ．  Ｗ．  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ４ｔｈ  ｅｄ．；  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２００７」に記載されている。また、保護基で保護された官能基は、それぞれの保護基に適した反応条件を用いて脱保護、すなわち化学反応させることで、元の官能基を再生させることができる。保護基の代表的な脱保護条件は前述の文献に記載されている。
【００８２】
工程中のＬ３は、前記Ｌ１、およびＬ２と同義の２価のスペーサーである。
【００８３】
反応Ａは、Ｎ末端のアミノ基が保護基で保護されたオリゴペプチドのカルボキシル基と、片末端がメトキシ基であるポリエチレングリコール誘導体のアミノ基を縮合反応にて結合させ、ポリエチレングリコール誘導体（１）を得る工程である。
オリゴペプチドのＮ末端のアミノ基の保護基は、特に制限は無いが、例えばアシル系保護基およびカーバメート系保護基が挙げられ、具体的にはトリフルオロアセチル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基などが挙げられる。
縮合反応としては、特に制限は無いが、縮合剤を用いる反応が望ましい。縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）などのカルボジイミド系の縮合剤を単独で使用しても良く、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）などの試薬と併用しても良い。また、より反応性の高いＨＡＴＵやＨＢＴＵ、ＴＡＴＵ，ＴＢＴＵ、ＣＯＭＵ、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリドｎ水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）などの縮合剤を使用しても良い。また反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジンなどの塩基を用いても良い。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したオリゴペプチドや縮合剤などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
【００８４】
【化１５】
2020164855.tif 000016
【００８５】
脱保護Ｂは、反応Ａで得られたポリエチレングリコール誘導体（１）の保護基を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体（２）を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやＬ３の２価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。また、本工程は、反応Ａの工程の一環として実施することも可能である。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
【００８６】
【化１６】
2020164855.tif 000017
【００８７】
反応Ｃは、脱保護Ｂで得られたポリエチレングリコール誘導体（２）のアミノ基と、アミノ基が保護基で保護されたグルタミン酸誘導体の二つのカルボキシル基を縮合反応で結合させ、２本の分解性ポリエチレングリコール鎖がグルタミン酸残基で繋がれた構造である分岐型のポリエチレングリコール誘導体（３）を得る工程である。
前記反応Ａと同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジンなどの塩基を用いても良い。
グルタミン酸のアミノ基の保護基は、特に制限は無いが、例えばアシル系保護基およびカーバメート系保護基が挙げられ、具体的にはトリフルオロアセチル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基などが挙げられる。
反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
【００８８】
【化１７】
2020164855.tif 000018
【００８９】
脱保護Ｄは、反応Ｃで得られたポリエチレングリコール誘導体（３）の保護基を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体（４）を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやＬ３の２価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。また、本工程は、反応Ｃの工程の一環として実施することも可能である。
脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
【００９０】
【化１８】
2020164855.tif 000019
【００９１】
反応Ｅは、脱保護Ｄで得られたポリエチレングリコール誘導体（４）のアミノ基と、アミノ基が保護基で保護されたグルタミン酸誘導体の二つのカルボキシル基を縮合反応で結合させ、４本の分解性ポリエチレングリコール鎖がグルタミン酸残基で繋がれた構造である分岐型のポリエチレングリコール誘導体（５）を得る工程である。
前記反応Ｃと同条件で反応と精製が可能である。
ポリエチレングリコール誘導体（５）の中から、分子量や官能基の異なるポリエチレングリコール不純物を除去する手法としては、特開２０１４−２０８７８６号公報、または特開２０１１−７９９３４号公報に記載の精製技術を用いることができる。
【００９２】
【化１９】
2020164855.tif 000020
【００９３】
脱保護Ｆは、反応Ｅで得られたポリエチレングリコール誘導体（５）の保護基を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体（６）を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやＬ３の２価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。前記脱保護Ｄと同条件で反応と精製が可能である。また、本工程は、反応Ｅの工程の一環として実施することも可能である。
【００９４】
【化２０】
2020164855.tif 000021
【００９５】
反応Ｇは、脱保護Ｆで得られたポリエチレングリコール誘導体（６）のアミノ基と、アミノ基が保護基で保護されたグルタミン酸誘導体の二つのカルボキシル基を縮合反応で結合させ、８本の分解性ポリエチレングリコール鎖がグルタミン酸残基で繋がれた構造である分岐型のポリエチレングリコール誘導体（７）を得る工程である。
前記反応Ｃと同条件で反応と精製が可能である。
【００９６】
【化２１】
2020164855.tif 000022
【００９７】
脱保護Ｈは、反応Ｇで得られたポリエチレングリコール誘導体（７）の保護基を脱保護して、ポリエチレングリコール誘導体（８）を得る工程である。前記脱保護Ｆと同条件で反応と精製が可能である。また、本工程は、反応Ｇの工程の一環として実施することも可能である。
【００９８】
以上の反応Ａ、脱保護Ｂ、反応Ｃおよび脱保護Ｄを行うことにより、２分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体（４）が得られる。２分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体（４）を原料として、続けて反応Ｅおよび脱保護Ｆを行うことにより、４分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体（６）が得られる。さらに続けて反応Ｇおよび脱保護Ｈを行うことにより、８分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体（８）が得られる。
【００９９】
脱保護Ｄ、脱保護Ｆおよび脱保護Ｈで得られたポリエチレングリコール誘導体（４）、（６）および（８）は、いずれもアミノ基を１つ有しており、これを利用して様々な官能基に変換が可能である。
【０１００】
ポリエチレングリコール誘導体の末端のアミノ基を他の官能基に変換する工程については、特に制限は無いが、基本的には、アミノ基と反応可能な活性エステル基を有した化合物、または酸無水物、酸クロライドなどの一般的な反応試薬を用いることで、様々な官能基に容易に変換することが出来る。
【０１０１】
例えば、ポリエチレングリコール誘導体の末端のアミノ基をマレイミド基に変換したい場合は、以下のような試薬と反応させることで、目的物を得ることができる。
【０１０２】
【化２２】
2020164855.tif 000023
【０１０３】
例えば、ポリエチレングリコール誘導体の末端のアミノ基をカルボキシル基に変換したい場合は、無水コハク酸や無水グルタル酸と反応させることで、目的物を得ることができる。
【０１０４】
例えば、ポリエチレングリコール誘導体の末端のアミノ基を水酸基に変換したい場合は、カプロラクトンなどの環状エステルの開環物と縮合反応させることで、目的物を得ることができる。
【０１０５】
これら反応試薬は、低分子量の試薬であり、高分子量のポリマーであるポリエチレングリコール誘導体とは大きく溶解性が異なるため、抽出や晶析などの一般的な精製方法にて容易に除去が可能である。
【０１０６】
以上のような工程を経て、得られた分解性ポリエチレングリコールは、血中で安定であり、細胞内でのみ分解する性能を有することが求められる。その性能を適切に評価するため、例えば、以下に示すような試験を実施し、分解性ポリエチレングリコールの血中での安定性、そして細胞内での分解性を評価することができる。
なお、これらの評価においてポリエチレングリコール誘導体が有する官能基の種類による影響を考慮し、評価試料はすべて、アミノ基を１つ有したポリエチレングリコール誘導体に統一して試験を実施した。
【０１０７】
分解性ポリエチレングリコール誘導体の血中での安定性を評価するための試験方法については、特に制限は無いが、例えば、マウス、ラット、ヒトなどの血清を用いた試験などが挙げられる。具体的には、ポリエチレングリコール誘導体を１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように血清に溶解し、３７℃で９６時間インキュベート後、血清中に含まれるポリエチレングリコール誘導体を回収し、ＧＰＣを測定することで分解率を評価することができる。分解率は、安定性試験前のポリエチレングリコール誘導体のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％と、安定性試験後のポリエチレングリコール誘導体のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％から算出する。具体的には以下の式を用いる。
分解率  ＝  （試験前のピーク面積％  −  試験後のピーク面積％）  ÷  試験前のピーク面積％  ×  １００
例えば、安定性試験前の分解性ポリエチレングリコール誘導体のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％が９５％であり、試験後のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％が９０％だったとすると、分解率は以下のように算出される。
分解率  ＝  （９５−９０）÷９５×１００  ＝  ５．２６（％）
分解性ポリエチレングリコール誘導体は、血中で分解してしまうと、目的とする血中半減期を得ることができないため、安定性試験において、９６時間後の分解率は、１０％以下が好ましく、５％以下がさらに好ましい。
【０１０８】
分解性ポリエチレングリコール誘導体の細胞内での分解性を評価するための試験方法については、特に制限は無いが、例えば、分解性ポリエチレングリコール誘導体を含有した培地を用いて、細胞を培養させる試験などが挙げられる。ここで使用する細胞や培地については、特に制限は無いが、具体的には、ポリエチレングリコール誘導体を１〜２０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように培地であるＲＰＭＩ−１６４０に溶解し、この培地を用いて、マクロファージ細胞ＲＡＷ２６４．７を３７℃で９６時間培養後、細胞中のポリエチレングリコール誘導体を回収し、ＧＰＣを測定することで分解率を評価することができる。分解率は、安定性試験と同様に、試験前後のポリエチレングリコール誘導体のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％を用いて算出する。
例えば、細胞を用いた分解性試験前の分解性ポリエチレングリコール誘導体のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％が９５％であり、試験後のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％が５％だったとすると、分解率は以下のように算出される。
分解率  ＝  （９５−５）÷９５×１００  ＝  ９４．７（％）
分解性ポリエチレングリコール誘導体は、細胞内で効率よく分解されないと、目的とする細胞の空胞を抑制できないため、分解性試験において、９６時間後の分解率は、９０％以上が好ましく、９５％以上がさらに好ましい。
【０１０９】
分解性ポリエチレングリコール誘導体の血中半減期や体内分布を評価するための試験方法については、特に制限は無いが、例えば、放射性同位体や蛍光物質をラベル化し、マウスやラットに投与して、モニタリングする試験などが挙げられる。
ポリエチレングリコール誘導体に導入した分解性ペプチドは、ポリエチレングリコールに細胞内での分解性を付与するが、そのペプチド構造によってポリエチレングリコールの体内動態を変化させる可能性が考えられる。そこで、導入したペプチド構造の体内動態への影響を確認するため、血中半減期および、その体内分布について、分解性を持たない同分子量のポリエチレングリコール誘導体と比較する必要がある。具体的には、放射性同位体でラベル化した分解性を持たないポリエチレングリコール誘導体と、分解性ポリエチレングリコール誘導体を、マウスに投与し、複数のタイムポイントで、血液、各臓器の放射線量を測定し、定量測定を行うことができる。
【０１１０】
分解性ポリエチレングリコール誘導体の細胞の空胞抑制を評価するための試験方法については、特に制限は無いが、例えば、非特許文献２に記載があるように、長期間、高頻度、および高投与量でマウスやラットに投与を続け、空胞が発生しやすいといわれている臓器や器官の切片画像を確認する試験などが挙げられる。
具体的には、ポリエチレングリコール誘導体を１０〜２５０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように生理食塩水に溶解し、マウス尾静脈より週３回、４週間以上、２０〜１００μＬ投与を続け、空胞が発生しやすいといわれている器官である脳脈絡叢や脾臓などのパラフィン切片を作製して染色後、切片画像を病理学的手法により確認し、空胞抑制の評価を行うことができる。
なお、本評価においてポリエチレングリコールの投与量は、当該技術分野における一般的なポリエチレングリコールの投与量と比べ、大過剰のポリエチレングリコールを投与する必要がある。
【０１１１】
非特許文献２では、高分子量のポリエチレングリコールによる細胞の空胞化は、ポリエチレングリコールの組織への蓄積と関係があるとの記載がある。分解性ポリエチレングリコール誘導体の細胞への蓄積性を評価するための試験方法については、特に制限は無いが、上記の空胞の評価と同じ方法で作成した切片画像より評価することができる。ポリエチレングリコールが蓄積しやすいといわれている器官である脳脈絡叢や脾臓などの染色した切片画像を病理学的手法により確認し、ポリエチレングリコールの蓄積性の評価を行うことができる。
なお、本評価においてポリエチレングリコールの投与量は、当該技術分野における一般的なポリエチレングリコールの投与量と比べ、大過剰のポリエチレングリコールを投与する必要がある。
【実施例】
【０１１２】
下記実施例で得られた１Ｈ−ＮＭＲは、日本電子デ−タム（株）製ＪＮＭ−ＥＣＰ４００またはＪＮＭ−ＥＣＡ６００から得た。測定にはφ５ｍｍチュ−ブを用い、重水素化溶媒には、Ｄ２Ｏまたは内部標準物質としてテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を含有するＣＤＣｌ３およびｄ６−ＤＭＳＯを用いた。得られたポリエチレングリコール誘導体の分子量およびアミン純度は、液体クロマトグラフィー（ＧＰＣおよびＨＰＬＣ）を用いて算出した。液体クロマトグラフィーのシステムは、ＧＰＣには東ソー（株）製「ＨＬＣ−８３２０ＧＰＣ  ＥｃｏＳＥＣ」を用い、ＨＰＬＣにはＷＡＴＥＲＳ製「ＡＬＬＩＡＮＣＥ」を用いた。以下、ＧＰＣおよびＨＰＬＣの分析条件を示す。
ＧＰＣ分析（分子量測定）
標準ポリマー：分子量が、８，０００、２０，０００、５０，０００および１００，０００のポリエチレングリコールを標準ポリマーとして使用してＧＰＣ分析による分子量測定を行った。
検出器：示差屈折計
カラム：ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ５００およびｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ２５０（ＷＡＴＥＲＳ製）
移動相：１００ｍＭ  Ａｃｅｔａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ＋０．０２％ＮａＮ３（ｐＨ５．２）
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
サンプル量：５ｍｇ／ｍＬ、２０μＬ
カラム温度：３０℃
ＨＰＬＣ分析（アミン純度測定）
検出器：示差屈折計
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＳＰ−５ＰＷ（東ソー（株）製）
移動相：１ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：５ｍｇ／ｍＬ、２０μＬ
カラム温度：４０℃
【０１１３】
［実施例１］
化合物（ｐ３）（ＮＨ２―Ｅ（ＦＧ−２００ＭＥ）２）の合成
【０１１４】
【化２３】
2020164855.tif 000024
【０１１５】
［実施例１−１］
【０１１６】
【化２４】
2020164855.tif 000025
【０１１７】
Ｎ末端を９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）で保護したＬ−フェニルアラニル−グリシン（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）（０．２６７ｇ、６．０×１０−４モル、渡辺化学工業（株）製）と末端にプロピルアミノ基を有するメトキシＰＥＧ（６．０ｇ、２．８×１０−４モル、数平均分子量＝２１，１２０、日油株式会社製「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−２０Ｔ」）に脱水Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（６０ｇ）を添加し、３０℃で加温溶解した。その後、ジイソプロピルエチルアミン（１９２μＬ、１．２×１０−３モル、関東化学（株）製）と（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノ−モルホリノ−カルベニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＣＯＭＵ）（０．３２１ｇ、７．５×１０−４モル、シグマアルドリッチ社製）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で１時間反応させた。反応終了後、クロロホルム（６００ｇ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２４０ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌して洗浄を行った。水層と有機層を分離後、再度、有機層に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２４０ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌して洗浄を行い、有機層を回収した。得られた有機層（クロロホルム溶液）に硫酸マグネシウム（２．４ｇ）を添加し、３０分攪拌して脱水した後、５Ａろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロートを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液を４０℃にて濃縮し、濃縮物に酢酸エチル（２４０ｇ）を添加して均一になるように攪拌した後、ヘキサン（１２０ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度酢酸エチル（２４０ｇ）に溶解し、ヘキサン（１２０ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ヘキサン（１２０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ１）（ＭＥ−２００ＧＦ−Ｆｍｏｃ）を得た。収量５．１ｇ。
【０１１８】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：１．６２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、２．８０ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、３．０４ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、３．１０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、３．２４ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約１，９００Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、４．２０ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、７．３３ｐｐｍ（ｍ、９Ｈ）、７．６６ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、Ａｒ）、７．８８ｐｐｍ（ｄ、２Ｈ、Ａｒ）、８．２７ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ）
【０１１９】
［実施例１−２］
【０１２０】
【化２５】
2020164855.tif 000026
【０１２１】
実施例１−１で得られたＭＥ−２００ＧＦ−Ｆｍｏｃ（４．９ｇ、２．３×１０−４モル）にＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（２９．４ｇ）を添加し、３０℃で加温溶解した。ピペリジン（１．５５ｇ、１．８×１０−２モル、和光純薬工業（株）製）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で２時間反応させた。反応終了後、酢酸エチル（３００ｇ）を加えて均一になるまで攪拌し、ヘキサン（１５０ｇ）を添加して、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度酢酸エチル（３００ｇ）に溶解し、ヘキサン（１５０ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ヘキサン（１５０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ２）（ＭＥ−２００ＧＦ−ＮＨ２）を得た。収量３．９ｇ。
【０１２２】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：１．６２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、１．６４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、２．５９ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、２．９８ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、３．１０ｐｐｍ（ｑ、２Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、３．２４ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約１，９００Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、７．２４ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５、−ＮＨ−）、７．７３ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ）、８．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
【０１２３】
［実施例１−３］
【０１２４】
【化２６】
2020164855.tif 000027
【０１２５】
Ｎ末端をＦｍｏｃ基で保護したＬ−グルタミン酸（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯＨ）（１６．０ｍｇ、４．３×１０−５モル、渡辺化学工業（株）製）と実施例１−２で得られたＭＥ−２００ＧＦ−ＮＨ２（２．０ｇ、１．０×１０−４モル）に脱水Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（１０ｇ）を添加し、３０℃で加温溶解した。その後、ジイソプロピルエチルアミン（１９．２μＬ、１．１×１０−４モル、関東化学（株）製）と４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリドｎ水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）（３９．０ｍｇ、１．１×１０−４モル、和光純薬工業（株）製）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で１時間反応した。その後、ピペリジン（０．５ｇ、５．９×１０−３モル、和光純薬工業（株）製）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で２時間反応した。反応終了後、反応液をトルエン（８０ｇ）で希釈した後、ヘキサン（４０ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度トルエン（８０ｇ）に溶解し、ヘキサン（４０ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ヘキサン（４０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ３）（ＮＨ２―Ｅ（ＦＧ−２００ＭＥ）２）を得た。収量１．６ｇ。分子量を表１に示す。ＨＰＬＣ：アミン純度９２％。
【０１２６】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：１．５４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＨ２−ＣＨ２−）、１．６２ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）、１．９７ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＨ２−ＣＨ２−）、２．７４ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、２．８１ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、３．１１ｐｐｍ（ｍ、１１Ｈ）、３．２４ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、４．４９ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、４．５７ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、７．２５ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、７．７４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、８．４４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、８．６１ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）
【０１２７】
［実施例２］
化合物（ｐ４）（ＭＡ―Ｅ（ＦＧ−２００ＭＥ）２）の合成
【０１２８】
【化２７】
2020164855.tif 000028
【０１２９】
実施例１で得られた化合物（ｐ３）（２００ｍｇ、５．０×１０−６モル）をアセトニトリル（１６０ｍｇ）およびトルエン（１．０ｇ）に溶解した。その後、Ｎ−メチルモルホリン（１０ｍｇ、１．０×１０−５モル、関東化学（株）製）と３−マレイミドプロピオン酸  Ｎ−スクシンイミジル（８．０ｍｇ、３．０×１０−５モル、大阪合成有機化学研究所（株）製）を添加し、室温にて窒素雰囲気下および遮光下で６時間反応した。反応終了後、反応液を２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ｐ−クレゾ−ル（ＢＨＴ）（１０ｍｇ）含有の酢酸エチル（５０ｇ）で希釈した後、ヘキサン（２５ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（５ｍｇ）含有のヘキサン（２５ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ４）（ＭＡ―Ｅ（ＦＧ−２００ＭＥ）２）を得た。収量１３７ｍｇ。分子量を表１に示す。マレイミド純度は９０％（１Ｈ−ＮＭＲ）であった。
【０１３０】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：  １．６２ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ）、１．９９ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＨ２−ＣＨ２−）、２．３４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、２．７５ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、２．８２ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、３．１１ｐｐｍ（ｍ、１１Ｈ）、３．２４ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、４．０４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、４．４９ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、６．９８ｐｐｍ（ｓ、２Ｈ、−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ−ＣＯ−）、７．２５ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、７．６９ｐｐｍ（ｄｔ、２Ｈ）、８．０４ｐｐｍ（ｄ、１Ｈ）、８．２９ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ）、８．４１ｐｐｍ（ｄｔ、２Ｈ）
【０１３１】
［実施例３］
化合物（ｐ８）（ＡＬ―Ｅ（ＦＧ−２００ＭＥ）２）の合成
【０１３２】
【化２８】
2020164855.tif 000029
【０１３３】
［実施例３−１］
化合物（ｐ５）（ＨＯ―Ｅ（ＦＧ−２００ＭＥ）２）の合成
【０１３４】
【化２９】
2020164855.tif 000030
【０１３５】
ε−カプロラクトン（１１４ｍｇ、１．０×１０−３モル、東京化成工業（株）製）を１Ｎ  ＮａＯＨ（０．８ｍＬ、８．０×１０−４モル、関東化学（株）製）に溶解し２時間反応させ、６−ヒドロキシカプロン酸水溶液（０．８８Ｍ）を調製した。また、実施例１で得られた化合物（ｐ３）（２．０ｇ、５．０×１０−５モル）をアセトニトリル（８．０ｇ）に溶解した。その後、上記６−ヒドロキシカプロン酸水溶液（１１４μＬ、１．０×１０−４モル）とジイソプロピルエチルアミン（２０μＬ、１．２×１０−４モル、関東化学（株）製）とＤＭＴ−ＭＭ（２１ｍｇ、６．０×１０−５モル、和光純薬工業（株）製）を上記（ｐ３）のアセトニトリル溶液に添加し、室温にて窒素雰囲気下で１時間反応した。反応終了後、反応液を４０℃にて濃縮し、得られた濃縮物にクロロホルム（２４ｇ）を添加して溶解した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１０ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌して洗浄を行った。水層と有機層を分離後、再度、有機層に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１０ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌して洗浄を行い、有機層を回収した。得られた有機層（クロロホルム溶液）に硫酸マグネシウム（１．２ｇ）を添加し、３０分攪拌して脱水した後、５Ａろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロ−トを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液を４０℃にて濃縮し、濃縮物にトルエン（５０ｇ）を添加して均一になるように攪拌した後、ヘキサン（２５ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し、生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度トルエン（５０ｇ）に溶解し、ヘキサン（２５ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（２ｍｇ）含有のヘキサン（１０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ５）（ＨＯ―Ｅ（ＦＧ−２００ＭＥ）２）を得た。収量１．５ｇ。
【０１３６】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１．３７ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、ＨＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−）、１．５５ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、ＨＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−）、１．７７ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、１．８５ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、２．０１ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、ＨＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−）、３．０１ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、３．２４ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、３．３８ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、４．０３ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、４．１４ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、４．４８ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、６．９５ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．００ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２６ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、７．６６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、８．２９ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
【０１３７】
［実施例３−２］
化合物（ｐ６）（ＳＣ―Ｅ（ＦＧ−２００ＭＥ）２）の合成
【０１３８】
【化３０】
2020164855.tif 000031
【０１３９】
実施例３−１で得られた化合物（ｐ５）（５００ｍｇ、１．３×１０−５モル）をジクロロメタン（３．５ｇ）に溶解した。その後、炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（５１ｍｇ、２．０×１０−４モル、東京化成工業（株）製）とピリジン（２４μＬ、３．０×１０−４モル、関東化学（株）製）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で８時間反応した。反応終了後、５％食塩水で反応液を洗浄し硫酸マグネシウム（０．１ｇ）を加えて、２５℃で３０分攪拌した後、５Ａろ紙の上にオプライトを敷いた桐山ロ−トを用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液を濃縮後、濃縮物にトルエン（５０ｇ）を添加して溶解した後、ヘキサン（２５ｇ）を加えて室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度トルエン（５０ｇ）に溶解し、ヘキサン（２５ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（５ｍｇ）含有のヘキサン（２５ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ６）（ＳＣ―Ｅ（ＦＧ−２００ＭＥ）２）を得た。収量２８６ｍｇ。活性カーボネート純度は９２％（１Ｈ−ＮＭＲ）。
【０１４０】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１．３８ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ−ＯＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−）、１．５９ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ−ＯＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−）、１．７５ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ）、１．８５ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、２．１３ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ−ＯＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−）、２．８３ｐｐｍ（ｓ、４Ｈ、−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−）、３．０１ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、３．１９ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ）、３．３８ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、４．０３ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ）、４．１８ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、４．３１ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ−ＯＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−）、４．５０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、６．９８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．１５ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２６ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、７．８１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、８．３７ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
【０１４１】
［実施例３−３］
化合物（ｐ７）（ＤＥ―Ｅ（ＦＧ−２００ＭＥ）２）の合成
【０１４２】
【化３１】
2020164855.tif 000032
【０１４３】
実施例３−２で得られた化合物（ｐ６）（２５０ｍｇ、６．３×１０−６モル）をクロロホルム（２ｇ）に溶解した。その後、１−アミノ−３，３−ジエトキシプロパン（１０μＬ、６．３×１０−５モル、ＡＣＲＯＳ  ＯＲＧＡＮＩＣＳ製）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で３時間反応した。反応終了後、反応液をトルエン（２５ｇ）で希釈し、ヘキサン（１２．５ｇ）を加えて室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（２．５ｍｇ）含有のヘキサン（１２．５ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ４７）（ＤＥ―Ｅ（ＦＧ−２００ＭＥ）２）を得た。収量１８５ｍｇ。
【０１４４】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１．２０ｐｐｍ（ｔ、６Ｈ、（ＣＨ３−ＣＨ２−Ｏ）２−ＣＨ−）、１．３２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、（ＣＨ３−ＣＨ２−Ｏ）２−ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−）、１．５８ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、（ＣＨ３−ＣＨ２−Ｏ）２−ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−）、１．７６ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、１．８２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、（ＣＨ３−ＣＨ２−Ｏ）２−ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−）、２．１１ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、（ＣＨ３−ＣＨ２−Ｏ）２−ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−）、２．１６ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、２．７０ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、３．０６ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．２５ｐｐｍ（ｍ、１１Ｈ）、３．３８ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、４．０２ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、４．１７ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、４．５１ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、４．５５ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ、（ＣＨ３−ＣＨ２−Ｏ）２−ＣＨ−）、５．３６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．４７ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．９８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、７．２６ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、７．８１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、８．３６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
【０１４５】
［実施例３−４］
化合物（ｐ８）（ＡＬ―Ｅ（ＦＧ−２００ＭＥ）２）の合成
【０１４６】
【化３２】
2020164855.tif 000033
【０１４７】
実施例３−３で得られた化合物（ｐ７）（１５０ｍｇ、３．８×１０−６モル）をｐＨ１．９０に調整したりん酸緩衝液（２．２５ｇ）に溶解し、室温にて窒素雰囲気下で３時間反応した。反応後、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（０．８９ｇ）を添加し、ｐＨを６．４０に調整した後、塩化ナトリウム（０．５６ｇ）を添加し溶解した。得られた溶液に０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（０．６０ｇ）を滴下し、ｐＨを７．０６に調整した後、ＢＨＴ（０．６ｍｇ）含有のクロロホルム（３ｇ）を添加して、室温で２０分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。有機層と水層を分離し、有機層を回収した後、水層に再度ＢＨＴ（０．６ｍｇ）含有のクロロホルム（３ｇ）を添加して、室温で２０分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。抽出１回目と２回目で得られた有機層を合わせて４０℃で濃縮し、得られた濃縮物をトルエン（３０ｇ）に希釈し、ヘキサン（１５ｇ）を加えて室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（３．０ｍｇ）含有のヘキサン（１５ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ８）（ＡＬ―Ｅ（ＦＧ−２００ＭＥ）２）を得た。収量８４ｍｇ。分子量を表１に示す。アルデヒド純度は９２％（１Ｈ−ＮＭＲ）であった。
【０１４８】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１．３２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、ＣＨＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−）、１．５７ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、ＣＨＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−）、１．７６ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、１．８２ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、２．１０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、ＣＨＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−）、２．１６ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、２．７１ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、ＣＨＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−）、３．０２ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、３．２６ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、３．３８ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、４．０１ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、４．１６ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、４．４９ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、５．５９ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．３６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．９３ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、７．０８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２６ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、７．８０ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、８．３７ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、９．７９ｐｐｍ（ｓ、１Ｈ、ＣＨＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯＯ−）
【０１４９】
［実施例４］
化合物（ｐ９）（ＮＨ２Ｏ―Ｅ（ＦＧ−２００ＭＥ）２）の合成
【０１５０】
【化３３】
2020164855.tif 000034
【０１５１】
実施例３−１で得られた化合物（ｐ５）（３００ｍｇ、７．５×１０−６モル）をトルエン（２．４ｇ）に３０℃で加温溶解し、減圧にて共沸脱水した。その後、濃縮物をクロロホルム（２．４ｇ）に溶解し、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（７．３ｍｇ、４．５×１０−５モル、和光純薬工業（株）製）とトリフェニルホスフィン（３５ｍｇ、１．４×１０−４モル、関東化学（株）製）とアゾジカルボン酸ジイソプロピル（２２μＬ、１．１×１０−４モル、ＡＣＲＯＳ  ＯＲＧＡＮＩＣＳ製）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で４時間反応した。反応終了後、反応液にメタノール（９．１μＬ）を添加し２５℃で３０分攪拌し、４０℃で濃縮した。濃縮液をトルエン（３．０ｇ）に希釈し共沸後、濃縮物をトルエン（１．５ｇ）に溶解し、エチレンジアミン一水和物（２４μＬ、３．０×１０−４モル、関東化学（株）製）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で１時間反応した。反応終了後、反応液をトルエン（５０ｇ）で希釈した後、ヘキサン（２５ｇ）を加えて室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ヘキサン（２０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ９）（ＮＨ２Ｏ―Ｅ（ＦＧ−２００ＭＥ）２）を得た。収量１５６ｍｇ。分子量を表１に示す。ＨＰＬＣ：オキシアミン純度９１％。
【０１５２】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１．３２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、Ｈ２Ｎ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−）、１．５６ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、Ｈ２Ｎ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−）、１．７６ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、１．８５ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、２．１０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、Ｈ２Ｎ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−）、２．１７ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、３．０１ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、３．２４ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、３．３８ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、４．０３ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、４．１７ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、４．４９ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、５．３７ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、６．４０ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、６．９５ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、７．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２６ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、７．７４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、８．３１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
【０１５３】
［実施例５］
化合物（ｐ１３）（ＮＨ２―Ｅ｛Ｅ（ＦＧ−１００ＭＥ）２｝２）の合成
【０１５４】
【化３４】
2020164855.tif 000035
【０１５５】
［実施例５−１］
化合物（ｐ１０）（ＭＥ−１００ＧＦ−Ｆｍｏｃ）の合成
【０１５６】
【化３５】
2020164855.tif 000036
【０１５７】
実施例１−１と同製法にて、Ｎ末端をＦｍｏｃ基で保護したＬ−フェニルアラニル−グリシン（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）（５３３ｍｇ、１．２×１０−３モル、渡辺化学工業（株）製）と末端にプロピルアミノ基を有するメトキシＰＥＧ（９．９ｇ、１．０×１０−３モル、数平均分子量＝９，８９６、日油株式会社製「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−１０Ｔ」）を原料として用いて、上記化合物（ｐ１０）（ＭＥ−１００ＧＦ−Ｆｍｏｃ）を得た。収量９．２ｇ。
【０１５８】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：１．６２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、２．８０ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、３．０４ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、３．１０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、３．２４ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約９００Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、４．２０ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、７．３３ｐｐｍ（ｍ、９Ｈ）、７．６６ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、Ａｒ）、７．８８ｐｐｍ（ｄ、２Ｈ、Ａｒ）、８．２７ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ）
【０１５９】
［実施例５−２］
化合物（ｐ１１）（ＭＥ−１００ＧＦ−ＮＨ２）の合成
【０１６０】
【化３６】
2020164855.tif 000037
【０１６１】
実施例１−２と同製法にて、実施例５−１で得られた化合物（ｐ１０）（９．２ｇ、４．６×１０−４モル）用いて脱保護反応を行い、上記化合物（ｐ１１）（ＭＥ−１００ＧＦ−ＮＨ２）を得た。収量８．７ｇ。
【０１６２】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：１．６２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、１．６４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、２．５９ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、２．９８ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、３．１０ｐｐｍ（ｑ、２Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、３．２４ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約９００Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、７．２４ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５、−ＮＨ−）、７．７３ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ）、８．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
【０１６３】
［実施例５−３］
化合物（ｐ１２）（ＮＨ２―Ｅ（ＦＧ−１００ＭＥ）２）の合成
【０１６４】
【化３７】
2020164855.tif 000038
【０１６５】
実施例１−３と同製法にて、Ｎ末端をＦｍｏｃ基で保護したＬ−グルタミン酸（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯＨ）（１３５ｍｇ、３．７×１０−４モル、渡辺化学工業（株）製）と実施例５−２で得られた化合物（ｐ１１）（８．５ｇ、８．５×１０−４モル）を原料として用いて、反応と脱保護を連続して行い、上記化合物（ｐ１２）（ＮＨ２―Ｅ（ＦＧ−１００ＭＥ）２）を得た。収量６．６ｇ。ＨＰＬＣ：アミン純度９５％。
【０１６６】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：１．５４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＨ２−ＣＨ２−）、１．６２ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）、１．９７ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＨ２−ＣＨ２−）、２．７４ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、２．８１ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、３．１１ｐｐｍ（ｍ、１１Ｈ）、３．２４ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約１，８００Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、４．４９ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、４．５７ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、７．２５ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、７．７４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、８．４４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、８．６１ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）
【０１６７】
［実施例５−４］
化合物（ｐ１３）（ＮＨ２―Ｅ｛Ｅ（ＦＧ−１００ＭＥ）２｝２）の合成
【０１６８】
【化３８】
2020164855.tif 000039
【０１６９】
実施例１−３と同製法にて、Ｎ末端をＦｍｏｃ基で保護したＬ−グルタミン酸（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯＨ）（１５．２ｍｇ、４．１×１０−５モル、渡辺化学工業（株）製）と実施例５−３で得られた化合物（ｐ１２）（２．０ｇ、１．０×１０−４モル）を原料として用いて、反応と脱保護を連続して行い、上記化合物（ｐ１３）（ＮＨ２―Ｅ｛Ｅ（ＦＧ−１００ＭＥ）２｝２）を得た。収量１．２ｇ。分子量を表１に示す。ＨＰＬＣ：アミン純度９４％。
【０１７０】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：１．６２ｐｐｍ（ｍ、１４Ｈ）、２．００ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＨ２−ＣＨ２−）、２．７８ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、３．１１ｐｐｍ（ｍ、１４Ｈ）、３．２４ｐｐｍ（ｓ、１６Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，６００Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、４．１９ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、４．５１ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、７．２５ｐｐｍ（ｍ、２０Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、７．７１ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、７．８９ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、８．４５ｐｐｍ（ｍ、９Ｈ）
【０１７１】
［実施例６］
【０１７２】
化合物（ｐ１６）（ＮＨ２―Ｅ（ＧＦＬＧ−２００ＭＥ）２）の合成
【０１７３】
【化３９】
2020164855.tif 000040
【０１７４】
［実施例６−１］
化合物（ｐ１４）（ＭＥ−２００ＧＬＦＧ−Ｆｍｏｃ）の合成
【０１７５】
【化４０】
2020164855.tif 000041
【０１７６】
実施例１−１と同製法にて、Ｎ末端をＦｍｏｃ基で保護したＬ−グリシル−フェニルアラニル−ロイシル−グリシン（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ）（６６ｍｇ、１．１×１０−４モル、渡辺化学工業（株）製）と末端にプロピルアミノ基を有するメトキシＰＥＧ（１．５ｇ、７．１×１０−５モル、数平均分子量＝２１，１２０、日油株式会社製「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−２０Ｔ」）を原料として用いて、上記化合物（ｐ１４）（ＭＥ−２００ＧＬＦＧ−Ｆｍｏｃ）を得た。収量１．２ｇ。
【０１７７】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．８９ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２）、０．９１ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．５３ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２）、１，７０ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．８０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、３．１０ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、３．１８ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、３．３３ｐｐｍ（ｍ、７Ｈ）、３．７４ｐｐｍ（ｍ、約１，９００Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、４．３１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、４．５５ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、６．９１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．００ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２８ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、７．３３ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、Ａｒ）、７．４１ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ、Ａｒ）、７．７３ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ、Ａｒ）、７．８９ｐｐｍ（ｄ、２Ｈ、Ａｒ）、７．９８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
【０１７８】
［実施例６−２］
化合物（ｐ１５）（ＭＥ−２００ＧＬＦＧ−ＮＨ２）の合成
【０１７９】
【化４１】
2020164855.tif 000042
【０１８０】
実施例１−２と同製法にて、実施例６−１で得られた化合物（ｐ１４）（１．２ｇ、５．７×１０−５モル）用いて脱保護反応を行い、上記化合物（ｐ１５）（ＭＥ−２００ＧＬＦＧ−ＮＨ２）を得た。収量１．０ｇ。
【０１８１】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．８９ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２）、０．９１ｐｐｍ（ｄ、３Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．５３ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２）、１，７０ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．８０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、３．１０ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、３．１８ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、３．３３ｐｐｍ（ｍ、７Ｈ）、３．７４ｐｐｍ（ｍ、約１，９００Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、４．３１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、４．５５ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、６．９１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．００ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２８ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、７．９８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
【０１８２】
［実施例６−３］
化合物（ｐ１６）（ＮＨ２―Ｅ（ＧＦＬＧ−２００ＭＥ）２）の合成
【０１８３】
【化４２】
2020164855.tif 000043
【０１８４】
実施例１−３と同製法にて、Ｎ末端をＦｍｏｃ基で保護したＬ−グルタミン酸（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯＨ）（８．３ｍｇ、２．３×１０−５モル、渡辺化学工業（株）製）と実施例６−２で得られた化合物（ｐ１５）（１．０ｇ、４．８×１０−５モル）を原料に用いて、反応と脱保護を連続して行い、上記化合物（ｐ１６）（ＮＨ２―Ｅ（ＧＦＬＧ−２００ＭＥ）２）を得た。収量０．５ｇ。分子量を表１に示す。ＨＰＬＣ：アミン純度９０％。
【０１８５】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．８９ｐｐｍ（ｄ、６Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２）、０．９１ｐｐｍ（ｄ、６Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．５３ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２）、１，７０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２）、１．７７ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、１．８５ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、３．０１ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、３．２４ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、３．３８ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、４．０３ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、４．１４ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、４．４８ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、６．９５ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．００ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２６ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）、７．６６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、８．２９ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）
【０１８６】
［比較例１］
【０１８７】
化合物（ｐ１８）（ＬＹ−４００ＮＨ２）の合成
【０１８８】
【化４３】
2020164855.tif 000044
【０１８９】
［比較例１−１］
化合物（ｐ１７）（ＬＹ―４００ＢＯ）の合成
【０１９０】
【化４４】
2020164855.tif 000045
【０１９１】
上市されているポリエチレングリコール修飾薬剤に用いられているリジン骨格の２分岐型ポリエチレングリコール活性化エステル（３．０ｇ、７．５×１０−５モル、数平均分子量＝３９，７００、日油株式会社製「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＬＹ−４００ＮＳ」）をトルエン（１５ｇ）に４０℃で加温溶解し、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−１，２−ジアミノエタン（４８μＬ、３．０×１０−４モル、東京化成工業（株）製）を添加し、４０℃にて窒素雰囲気下で１時間反応した。反応終了後、反応液を酢酸エチル（１２ｇ）で希釈した後、ヘキサン（１４ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度酢酸エチル（２７ｇ）に溶解し、ヘキサン（１４ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ヘキサン（３０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ１７）（ＬＹ―４００ＢＯ）を得た。収量２．７ｇ。
【０１９２】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１．３７ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、１．４３ｐｐｍ（ｓ、９Ｈ、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ２−Ｃ−（ＣＨ３）３）、１．５１ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．１５ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．３８ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ、−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、３．６５ｐｐｍ（ｍ、約３，６５０Ｈ、−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、４．２１ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）
【０１９３】
［比較例１−２］
化合物（ｐ１８）（ＬＹ−４００ＮＨ２）の合成
【０１９４】
【化４５】
2020164855.tif 000046
【０１９５】
比較例１−１で得られた化合物（ｐ１７）（１．０ｇ、２．５×１０−６モル）をイオン交換水（４．０ｇ）に溶解し、メタンスルホン酸（５７μＬ、８．８×１０−４モル、関東化学（株）製）を添加し、４０℃にて窒素雰囲気下で６時間反応した。反応後、イオン交換水（６．０ｇ）で希釈し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（０．９ｇ）を添加し、ｐＨを１２に調整した後、塩化ナトリウム（２．５ｇ）を添加し溶解した。得られた溶液にＢＨＴ（１．０ｍｇ）含有のクロロホルム（１０ｇ）を添加して、室温で２０分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。有機層と水層を分離し、有機層を回収した後、４０℃で濃縮し、得られた濃縮物をトルエン（３０ｇ）で希釈し、ヘキサン（１５ｇ）を加えて室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（３．０ｍｇ）含有のヘキサン（１５ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ１８）（ＬＹ−４００ＮＨ２）を得た。収量０．７ｇ。分子量を表１に示す。ＨＰＬＣ：アミン純度９７％。
【０１９６】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１．３７ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、１．５１ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．１５ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、３．３８ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ、−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、３．６５ｐｐｍ（ｍ、約３，６５０Ｈ、−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３）、４．２１ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）
【０１９７】
【表１】
2020164855.tif 000047
【０１９８】
［実施例７］
血清中での安定性試験
１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに、マウスまたはヒト血清１ｍＬを加え、各種ポリエチレングリコール誘導体を５．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように添加した。３７℃で９６時間インキュベ−ション後、２００μＬをサンプリングし、そこにアセトニトリルを添加し、ボルテックスにて１分間攪拌し、血清中のたんぱく質を析出させ、遠心分離後、上清を回収した。次に脂肪酸などの疎水性物質を除去するため、回収液にヘキサンを添加し、ボルテックスにて１分間攪拌し、遠心分離後、下層を回収した。この溶液を真空条件にて濃縮し、血清中からポリエチレングリコール誘導体の回収を行った。その後、ＧＰＣ分析を行い、分解性ポリエチレングリコール誘導体の分解率を算出した。
分解率は以下の式にて算出した。
分解率  ＝  （試験前の４０ｋＤａのピーク面積％  −  試験後の４０ｋＤａのピーク面積％）  ÷  （試験前の４０ｋＤａのピーク面積％）  ×  １００
結果を以下の表２に示す。
【０１９９】
【表２】
2020164855.tif 000048
【０２００】
表２によれば、分解性ポリエチレングリコール誘導体である化合物（ｐ３）、（ｐ１３）、（ｐ１６）は、非分解性のポリエチレングリコール誘導体である化合物（ｐ１８）、メトキシＰＥＧアミン４０ｋＤａと同様に、血清中において分解はみられなかった。つまり、当該分解性ポリエチレングリコール誘導体が血中では安定であることが示された。
【０２０１】
［実施例８］
細胞を用いた分解性試験
培地ＲＰＭＩ−１６４０（１０％ＦＢＳ  Ｐｎ／Ｓｔ）１０ｍＬを用いて、１００ｍｍディッシュにＲＡＷ２６４．７を１０×１０６ｃｅｌｌ播種し、３７℃で２４時間培養後、各種ポリエチレングリコール誘導体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう溶解した培地に交換し、３７℃で９６時間培養した。培養後、細胞を１％ＳＤＳ溶液にて溶解し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて希釈し、そこにアセトニトリルを添加し、ボルテックスにて１分間攪拌し、細胞溶解液中のたんぱく質を析出させ、遠心分離後、上清を回収した。次に脂肪酸などの疎水性物質を除去するため、回収液にヘキサンを添加し、ボルテックスにて１分間攪拌し、遠心分離後、下層を回収した。この溶液を真空条件にて濃縮し、細胞内からポリエチレングリコール誘導体の回収を行った。
また、細胞培養に使用した培地中での分解を確認するため、各種ポリエチレングリコール誘導体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう溶解した培地のみで３７℃で９６時間培養し、上記と同操作にてポリエチレングリコール誘導体の回収を行った。
その後、回収した各種ポリエチレングリコール誘導体のＧＰＣ分析を行い、実施例７と同じ計算式にて分解性ポリエチレングリコール誘導体の分解率を算出した。
結果を以下の表３に示す。また、化合物（ｐ３）、（ｐ１３）の細胞実験の前後のＧＰＣチャートをそれぞれ図１と図２、および図３と図４に示す。
【０２０２】
【表３】
2020164855.tif 000049
【０２０３】
表３によれば、分解性ポリエチレングリコール誘導体である化合物（ｐ３）および（ｐ１６）は、細胞内にて効果的に分解し（分解率９９％）、分子量４万から２万に分解することが確認できた。また、化合物（ｐ１３）においては、分解率９９％にて、分子量４万から１万に分解されることが確認できた。これら分解性ポリエチレングリコール誘導体は、細胞培養で用いた培地では分解しないことから、細胞内で特異的に分解されたことが確認できた。一方で、非分解性のポリエチレングリコール誘導体である化合物（ｐ１８）およびメトキシＰＥＧアミン４０ｋＤａにおいては、いずれも細胞内での分解はみられなかった。
【０２０４】
［実施例９］
動物実験による空胞形成評価試験
末端にアミノ基を有する分子量４万である分解性ポリエチレングリコール誘導体である化合物（ｐ３）ＮＨ２―Ｅ（ＦＧ−２００ＭＥ）２と、非分解性であるメトキシＰＥＧアミン４０ｋＤａを用いて、動物実験による空砲形成評価を行った。マウス種はＢａｌｂ／ｃ（８週齢、雄）、ポリエチレングリコール溶液は、生理食塩水を用いてポリエチレングリコール誘導体を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように調製し、マウス尾静脈より２０μＬ投与した。週３回、４週間連続投与を続け、投与終了後、マウスを４％パラホルムアルデヒド水溶液で灌流固定し、パラフィン切片を作製した。ＨＥ染色、および抗ＰＥＧ抗体による免疫染色を行い、脳の脈絡叢上皮細胞における空胞形成を評価した。免疫染色としては、免疫染色キット（ＢＯＮＤ  Ｒｅｆｉｎｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
Ｋｉｔ、ライカ社製）と抗ＰＥＧ抗体（Ｂ−４７抗体、アブカム社製）を用いて実施した。抗ＰＥＧ抗体による免疫染色を行った脳の脈絡叢切片の画像を図５（メトキシＰＥＧアミン４０ｋＤａ）と図６（ＮＨ２―Ｅ（ＦＧ−２００ＭＥ）２）に示す。
その結果、分解性ポリエチレングリコールであるＮＨ２―Ｅ（ＦＧ−２００ＭＥ）２は、メトキシＰＥＧアミン４０ｋＤａに比べ、有意に空胞の形成を抑制した。
なお、本実施例において投与したポリエチレングリコールの量は、あくまで空胞化を評価するために最適化した量であり、当該技術分野における一般的なポリエチレングリコールの投与量と比べ、極めて多量である。
【０２０５】
［実施例１０］
動物実験によるポリエチレングリコールの蓄積性評価試験
末端にアミノ基を有した分子量４万である分解性ポリエチレングリコール誘導体である化合物（ｐ３）ＮＨ２―Ｅ（ＦＧ−２００ＭＥ）２と、非分解性であるメトキシＰＥＧアミン２０ｋＤａ、メトキシＰＥＧアミン４０ｋＤａ、およびコントロールであるＰＢＳを用いて、動物実験によるポリエチレングリコールの蓄積性評価を行った。マウス種はＢａｌｂ／ｃ（８週齢、雄）、ポリエチレングリコール溶液は、生理食塩水を用いてポリエチレングリコール誘導体を６２．５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように調製し、マウス尾静脈より１００μＬ投与した。週３回、４週間連続投与を続け、投与終了後、マウスを４％パラホルムアルデヒド水溶液で灌流固定し、パラフィン切片を作製した。抗ＰＥＧ抗体による免疫染色を行い、脳の脈絡叢上皮細胞における蓄積性を評価した。免疫染色を行ったそれぞれの脳の脈絡叢切片の画像を図７に示す。
図７によれば、ポリエチレングリコールが含まれないＰＢＳを投与したマウスの脈絡叢切片では染色されないのに対し、非分解性であるメトキシＰＥＧアミン４０ｋＤａでは、切片の広範囲で茶色に染色されることが確認された。この染色部分はＰＥＧが蓄積していることを示す。一方、分解性ポリエチレングリコールであるＮＨ２―Ｅ（ＦＧ−２００ＭＥ）２の切片においては、茶色に染色された部分が少なく、分子量が半分のメトキシＰＥＧアミン２０ｋＤａと同等の蓄積を示した。結果として、分解性ポリエチレングリコールは、その分解性により、同分子量の非分解性であるメトキシＰＥＧアミン４０ｋＤａに比べ、有意に組織へのポリエチレングリコールの蓄積を抑制した。
なお、本実施例において投与したポリエチレングリコールの量は、あくまで蓄積性を評価するために最適化した量であり、当該技術分野における一般的なポリエチレングリコールの投与量と比べ、極めて多量である。
【０２０６】
［実施例１１］
動物実験による体内動態試験(放射性同位体)
末端にアミノ基を有した分子量４万である分解性ポリエチレングリコール誘導体であるＮＨ２―Ｅ(ＦＧ−２００ＭＥ）２と、非分解性である２分岐型ＰＥＧアミン４０ｋＤａ（平均分子量＝約４２，０００、日油株式会社製「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＰＡ」）と、非分解性である２分岐型ＰＥＧアミン２０ｋＤａ（平均分子量＝約２０，０００、日油株式会社製「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−２００ＰＡ」）を、それぞれ１０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解し、そこにＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬（０．４６２５ＭＢｑ）を添加し、ボルテックスにて攪拌後、室温で一晩反応させた。反応溶液をＰＤ−１０カラムにて分画し、各フラクションをポリエチレングリコール呈色試薬（チオシアン酸アンモニウムと硝酸コバルト）とガンマカウンターを用いて、１２５Ｉの含まれるフラクションを確認し、回収した。
得られた放射性同位体をラベル化したポリエチレングリコール誘導体を用いて、体内動態を動物実験にて評価した。マウス種はＢａｌｂ／ｃ（８週齢、雄）、ポリエチレングリコール溶液は、生理食塩水を用いてラベル化していないポリエチレングリコール誘導体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように調製し、放射性同位体をラベル化したポリエチレングリコール誘導体を微量添加し、マウス尾静脈より１００μＬ投与した。その後、１、３、６、２４、４８、７２時間でマウスから血液、各臓器を取り出し、ガンマカウンターを用いてラベル化したポリエチレングリコール誘導体の滞留量を測定した。
放射性同位体をラベル化した分解性ポリエチレングリコール誘導体であるＮＨ２―Ｅ(ＦＧ−２００ＭＥ）２と非分解性のポリエチレングリコール誘導体である２分岐型ＰＥＧアミン４０ｋＤａ及び２分岐型ＰＥＧアミン２０ｋＤａの体内動態試験の結果として、図８に血中濃度を示す。
図８によれば、ＮＨ２―Ｅ(ＦＧ−２００ＭＥ）２は、同分子量である非分解性の２分岐型ＰＥＧアミン４０ｋＤａと比較して、同程度の血中半減期を示した。一方で、ＮＨ２―Ｅ(ＦＧ−２００ＭＥ）２は、分子量２０ｋＤａの非分解性の２分岐型ＰＥＧアミン２０ｋＤａと比較して、有意に長い血中半減期を示した。
【産業上の利用可能性】
【０２０７】
本発明の分解性ポリエチレングリコール誘導体は、細胞の空胞を引き起こさない高分子量のポリエチレングリコール誘導体であり、生体関連物質を修飾する用途に効果的に用いることができ、生体内の血中で安定であり、且つ細胞内で分解される。
【図１】
2020164855.tif 000055
【図２】
2020164855.tif 000056
【図３】
2020164855.tif 000057
【図４】
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【図５】
2020164855.tif 000059
【図６】
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【図７】
2020164855.tif 000061
【図８】
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