(57)【要約】【課題】  本発明は、皮膚におけるスキンケア機能及びその向上に関与するフィラグリンの前駆物質であるプロフィラグリン用のｍＲＮＡの増加を促進する、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤を提供する。【解決手段】  本発明のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤は、アルゲエキス、及びマンダリンオレンジエキスから選択される少なくとも１種を有効成分とする。これにより、上記課題を解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルゲエキス及びマンダリンオレンジエキスから選択される少なくとも１種を有効成分とする、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤。
【請求項２】
請求項１に記載のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤を含んでなる、プロフィラグリン産生促進剤。
【請求項３】
請求項１に記載のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤を含んでなる、フィラグリン産生促進剤。
【請求項４】
請求項１に記載のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤を含んでなる、スキンケア剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚における保湿性向上に関与するフィラグリンの前駆体であるプロフィラグリンのｍＲＮＡ発現量を促進し、該ｍＲＮＡの増加を促進させることができる、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚はヒトの体の最も外側に存在し、細菌をはじめとする種々の外界からの刺激に対するバリアとしての役割を有している。皮膚は、大きく分けて、表皮、真皮、及び皮下組織の三層構造となっており、一番上の表皮は、内側から順に基底層、有棘層、顆粒層、さらには角層に分けられ、角層が生体を被覆する層となる。
【０００３】
角層は、角化細胞が産生するケラチンや脂質など様々な物質から構成されており、角化細胞が基底層から分裂し、ケラチンを生産し分化し、成熟しながら上層へ移行する。これを角化（keratinozation）という。
【０００４】
皮膚の加齢や外部環境の変化への不完全な角層の対応によって、シワの形成、肌理の不正常、荒れ肌等が起こる。このとき、角層における水分量の低下は重要な因子となるため、皮膚における保湿は重要であるといえる。
【０００５】
皮膚における保湿には、天然保湿因子（Natural Moisturizing Factors（ＮＭＦ））が関わっている。この天然保湿因子の主成分であるアミノ酸は、顆粒層のケラトヒアリン顆粒に由来するフィラグリン（filaggrin）が角層内で分解されて産生される。
【０００６】
すなわち、顆粒層に存在する表皮ケラチノサイトで発現したプロフィラグリンは、その後、直ちにリン酸化されてケラトヒアリン顆粒に蓄積される。角化に際して、プロフィラグリンは、脱リン酸化され、加水分解を経てフィラグリンへと分解され、角層に移行して、角質細胞の細胞質内でケラチン線維の凝集させたのち、角層上層でアミノ酸などに分解される。
【０００７】
近年、このフィラグリンが皮膚の水分保持に非常に重要かつ必要不可欠であること、及び乾燥などの条件によってフィラグリンの合成力が低下し、角層におけるアミノ酸量が低下することが報告されている。
従って、表皮ケラチノサイトにおいてプロフィラグリンｍＲＮＡの発現を促進することによって、フィラグリンの合成を促進し、その結果として、角質層内のアミノ酸量を増大させ、角層の水分環境、保湿性能を大幅に改善できることが期待される。
【０００８】
さらにフィラグリンは分解によって、ヒスチジンを生じ得るが、その生じたヒスチジンからヒスチダーゼの作用によってｔ−ウロカニン酸が産生され、これは紫外線からの皮膚防御に役立つことが知られている。皮膚における保湿性の維持や紫外線からの影響の低減は、皮膚機能の正常化や、シワ形成の抑制、肌荒れの防止等に有効であることが知られている。また、フィラグリンがアレルギー発症やアトピー性皮膚炎と関連するとの報告もされている。したがって、フィラグリンの合成の促進により、皮膚機能の改善・正常化、シワ形成の抑制、肌荒れの防止等を含む、皮膚のスキンケア効果が期待できる。
【０００９】
フィラグリン産生促進剤としては、例えば、カンゾウ抽出物（特許文献１）、天然植物中に含まれるフラバノン配糖体として知られるリクイリチン（特許文献２）などが提案されている。
また、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤も提案されている（特許文献３）。
【００１０】
しかしながら、高いプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を有し、安価であり、安全性が高いフィラグリン産生促進剤が依然として望まれていると言える。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００２−３６３０５４号公報
【特許文献２】特開２００３−１４６８８６号公報
【特許文献３】特許第４７６８２３８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、皮膚におけるスキンケア機能及びその向上に関与するフィラグリンの前駆物質であるプロフィラグリン用のｍＲＮＡの増加を促進する、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者等は今般、アルゲエキス、マンダリンオレンジエキス、及びそれらの組み合わせが、プロフィラグリン用のｍＲＮＡの増加を促進する効果があることを見出した。すなわち、本発明者等は、ヒト皮膚三次元モデルを用いた試験を行うことによって、アルゲエキス、マンダリンオレンジエキス、及びそれらの組み合わせに、プロフィラグリンの発現促進効果があることを、高い精度で確認することに成功した。
【００１４】
本発明はかかる知見に基づくものである。
【００１５】
すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。
【００１６】
＜１＞  アルゲエキス及びマンダリンオレンジエキスから選択される少なくとも１種を有効成分とする、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤。
＜２＞  前記＜１＞のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤を含んでなる、プロフィラグリン産生促進剤。
＜３＞  前記＜１＞のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤を含んでなる、フィラグリン産生促進剤。
＜４＞  前記＜１＞のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤を含んでなる、スキンケア剤。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤によれば、フィラグリンの前駆物質であるプロフィラグリン用のｍＲＮＡの産生を促進することができる。これによって、皮膚におけるプロフィラグリンの産生が促進され、その結果、フィラグリンの合成を促進することができる。
【００１８】
さらに、フィラグリンの合成の促進により、皮膚機能の改善・正常化、シワ形成の抑制、肌荒れの防止等を含む、皮膚のスキンケア効果が期待できる。
【００１９】
なお、本発明において使用されるアルゲエキス及びマンダリンオレンジエキはいずれも食品用途にも使用されるものであることから、本発明によるプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤及びスキンケア剤はいずれも安全性の高いものである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図は、実施例の試験結果（フィラグリン遺伝子の発現比）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の実施形態について説明する。
【００２２】
プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤
本発明によるプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤は、前記したように、アルゲエキス、及びマンダリンオレンジエキスから選択される少なくとも１種を有効成分とするものである。
ここで、「有効成分とする」とは、本発明によるプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤が、プロフィラグリン用のｍＲＮＡの発現を促進する作用を、生体内で奏するのに充分な使用量（すなわち、有効量）のアルゲエキス、マンダリンオレンジエキス及びそれらの組み合わせを含有することをいう。
【００２３】
ここで、「発現促進」とは、タンパク質の一種であるプロフィラグリンの合成のためのｍＲＮＡの発現を促進することを意味する。
【００２４】
また、ここでいう「促進」とは、発現促進剤を使用しない場合に比べて、プロフィラグリン用のｍＲＮＡの発現が促進されることを意味し、ここには、発現量が増加すること、発現する速度が向上すること、低下した発現能の改善などを包含する。
【００２５】
アルゲエキス
アルゲエキスとは、海藻の一種であるサガラメ(Eisenia arborea Areschoug）の抽出物である。サガラメは、褐藻類、コンブ科(Laminariaceae)、アラメ属(Eisenia）の海藻で、アラメとちがって一次側葉のみで、葉の途中から二次側葉が生えない。一般的には、食材として用いられている。
【００２６】
なおアルゲエキスには、フィラグリンの前駆物質であるプロフィラグリンのｍＲＮＡの産生促進効果があることは、従来知られておらず、今回初めて判明したことである。
【００２７】
アルゲエキス、すなわちサガラメ抽出物は、サガラメから抽出されたものであれば特に制限はないが、例えば、以下のようにして得ることができる。
【００２８】
なお、抽出物には、抽出液、該抽出液の希釈液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物もしくは精製物のいずれもが含まれる。
【００２９】
サガラメとしては、全草を使用することができるが、好ましくは葉の部分に相当する部分を使用する。
【００３０】
サガラメは、乾燥した後、抽出効率を考えると、細切，乾燥，粉砕等の処理を行った後に抽出を行うことが好ましい。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。
【００３１】
サガラメの抽出に用いる溶媒としては、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合液を用いることができる。
【００３２】
前記抽出溶媒として使用し得る水としては、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。従って、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００３３】
前記親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられ、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができる。
【００３４】
なお、前記水と親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する場合には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して３〜２０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して３〜１５質量部添加することが好ましい。多価アルコールの場合は水１０質量部に対して３〜２０質量部添加することが好ましい。
【００３５】
抽出に使用する有機溶媒の量は、原料に対して望ましくは５〜１００倍量程度、さらに望ましくは１０〜５０倍量程度が良い。さらに抽出効率を上げるため、抽出溶媒中で撹拌やホモジナイズしてもよい。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが適切である。
【００３６】
得られた抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。なお、得られた抽出液はそのままでも産生促進剤として使用することができるが、濃縮液又はその乾燥物としたものの方が利用しやすいことがある。抽出液の乾燥物を得るにあたっては、吸湿性を改善するためにデキストリン、シクロデキストリン等のキャリアーを添加してもよい。また、抽出原料は特有の匂いと味を有しているため、その生理活性の低下を招かない範囲で脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能である。精製は、具体的には活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等によって行うことができる。
【００３７】
マンダリンオレンジエキス
マンダリンオレンジエキスとは、マンダリンオレンジ（Citrus reticulata）の抽出物である。マンダリンオレンジは、ミカン科（Rutaceae）ミカン属（Citrus）植物であり、好ましくはその果皮、果実、果肉を用いる。なお、未熟又は成熟のどちらを用いることもできる。
【００３８】
なおマンダリンオレンジエキスには、フィラグリンの分解に関与するとされる酵素カスパーゼ１４の増加効果が報告されているが、フィラグリンの前駆物質であるプロフィラグリンのｍＲＮＡの産生促進効果があることは、従来知られておらず、今回初めて判明したことである。
【００３９】
マンダリンオレンジエキス（マンダリンオレンジの抽出物）は、マンダリンオレンジエキスから抽出されたものであれば特に制限はないが、例えば、以下のようにして得ることができる。
【００４０】
マンダリンオレンジエキスとは、植物体の各種使用部位を生のまま又は乾燥したものを粉砕後搾取したもの、或いは、生のまま又は乾燥したものを粉砕後、溶媒で抽出したものである。
【００４１】
マンダリンオレンジエキスを得るための抽出溶媒としては、水、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブタノール、イソブタノール等の低級アルコール或いは含水低級アルコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、１，２−ブチレングリコール、１，４−ブチレングリコール、１，５−ペンタンジオール、１，２−ペンタンジオール、１，３−ペンタンジオール、１，４−ペンタンジオール、１，３，５−ペンタントリオール、グリセリン、ポリエチレングリコール（分子量１００〜１０万）等の多価アルコール或いは含水多価アルコール、アセトン、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、エチルメチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、キシレン、ベンゼン、クロロホルム、四塩化炭素、フェノール、トルエン等の各種有機溶媒や、適宜規定度を調製した酸（塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、ギ酸、酢酸等）やアルカリ（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、アンモニア等）の中から選ばれる１種もしくは２種以上の混液が挙げられ、特に水、エタノール及び１，３−ブチレングリコールから選ばれる１種又は２種以上を選択することが好ましい。
【００４２】
抽出溶媒として使用し得る水としては、上記アルゲエキスの場合と同様に選択するとよい。
【００４３】
マンダリンオレンジエキスを得るための抽出方法については、その溶媒の温度や原料に対する溶媒の重量比率、又は抽出時間についても、種々の原料及び使用する溶媒に対しそれぞれを任意に設定することができる。溶媒の温度としては−４℃から１００℃の範囲で任意に設定できるが、原料中に含まれる成分の安定性の点から、１０〜４０℃付近が好ましい。又、原料に対する溶媒の重量比率も、例えば原料：溶媒が、４：１〜１：１００の範囲内で任意に設定することができ、特に１：１〜１：２０の重量比率が好ましい。
【００４４】
マンダリンオレンジエキスは、溶媒抽出後、更に適宜精製操作を施すことも可能であり、精製操作としては、酸（塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、有機酸等）又はアルカリ（水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、アンモニア等）添加による分解、微生物による発酵又は代謝変換、イオン交換樹脂や活性炭、ケイ藻土等による成分吸着、種々の分離モード（イオン交換、親水性吸着、疎水性吸着、サイズ排除、配位子交換、アフィニティー等）を有するクロマトグラフィーを用いた分画、濾紙やメンブランフィルター、限外濾過膜等を用いた濾過、加圧又は減圧、加温又は冷却、乾燥、ｐＨ調整、脱臭、脱色、長時間の静置保管等が例示でき、これらを任意に選択し組み合わせた処理を行うことが可能である。
【００４５】
得られた抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。なお、得られた抽出液はそのままでも産生促進剤として使用することができるが、濃縮液又はその乾燥物としたものの方が利用しやすいことがある。抽出液の乾燥物を得るにあたっては、吸湿性を改善するためにデキストリン、シクロデキストリン等のキャリアーを添加してもよい。また、抽出原料は特有の匂いと味を有しているため、その生理活性の低下を招かない範囲で脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能である。精製は、具体的には活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等によって行うことができる。
【００４６】
本発明においては、アルゲエキス及びマンダリンオレンジエキスは、必要に応じて、市販品を使用してもよい。
【００４７】
本発明のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤として、アルゲエキス及びマンダリンオレンジエキスを使用する場合、これらは、上記したような有効成分としての有効量が使用されるが、例えば、アルゲエキスであれば、０．０００１重量％以上、好ましくは０．０００５重量％以上、より好ましくは０．００１重量％以上用いることができ、マンダリンオレンジエキスであれば、０．０００１重量％以上、好ましくは０．０００２重量％以上、より好ましくは０．００６重量％以上用いることができる。さらにこれらアルゲエキス及びマンダリンオレンジエキスは、互いに効果を補完し合うこと（場合によって互いに亢進すること）が期待できることから、これらを組み合わせて使用することもでき、その場合には、それぞれの使用量を他法の使用量に応じて削減することができる。さらに、これらアルゲエキス及びマンダリンオレンジエキスの使用量に特に上限はないが、例えば、１０重量％以下としてもよい。
【００４８】
本発明の別の態様によれば、アルゲエキス、及びマンダリンオレンジエキスから選択される少なくとも１種を用いる、プロフィラグリンｍＲＮＡの発現促進方法が提供される。
【００４９】
用途
本発明の有効成分であるアルゲエキス、マンダリンオレンジエキスまたはそれらの組み合わせは、プロフィラグリンｍＲＮＡの発現促進活性を有するものであり（後述する実施例）、プロフィラグリンの合成促進、フィラグリンの合成促進、皮膚のスキンケア効果を奏するものである。
【００５０】
皮膚のスキンケアは、皮膚の状態の悪化の予防、抑制もしくは改善効果を含み、より具体的には例えば、皮膚機能の改善・正常化、紫外線からの防御、シワ形成の抑制、肌荒れの防止等を含む。
【００５１】
ここで、皮膚の状態の悪化とは、例えば、皮膚のバリア機能の低下、皮膚の乾燥、皮膚のかさつき、角層の水分量の低下、皮膚炎などが包含される。皮膚のバリア機能の低下には、バリア機能の維持も包含される。また、皮膚のバリア機能の低下は、好ましくは、紫外線の照射下における皮膚のバリア機能の低下である。
また、ここで、悪化した状態の「予防、抑制または改善」は、そのような状態の、調節、進行の遅延、緩和、発症予防、再発予防などを包含する意味で使用される。
【００５２】
本発明の別の態様によれば、本発明によるプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤を含んでなる、プロフィラグリン産生促進剤が提供される。プロフィラグリン産生促進剤は、アルゲエキス、及びマンダリンオレンジエキスから選択される少なくとも１種を含むものである。
【００５３】
ここで、「プロフィラグリン産生促進」とは、プロフィラグリン合成用のｍＲＮＡの発現が促進された結果、プロフィラグリン自体の産生が促進されることを意味する。ここでいう「促進」とは、産生促進剤を使用しない場合に比べて、プロフィラグリン用の産生が促進されることを意味し、ここには、産生量が増加すること、産生する速度が向上すること、低下した産生能の改善などを包含する。
【００５４】
本発明の別の態様によれば、本発明によるプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤を含んでなる、フィラグリン産生促進剤が提供される。フィラグリン産生促進剤は、アルゲエキス、及びマンダリンオレンジエキスから選択される少なくとも１種を含むものである。
【００５５】
ここで、「フィラグリン産生促進」とは、フィラグリン合成用のｍＲＮＡの発現が促進された結果、プロフィラグリン自体の産生が促進され、さらにその結果として、フィラグリン自体の産生が促進されることを意味する。ここでいう「促進」とは、産生促進剤を使用しない場合に比べて、フィラグリン用の産生が促進されることを意味し、ここには、産生量が増加すること、産生する速度が向上すること、低下した産生能の改善などを包含する。
【００５６】
本発明のさらに別の態様によれば、本発明のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤を含んでなる、スキンケア剤が提供される。スキンケア剤は、必要に応じて適宜選択したその他の成分を含有してなる。
なお、スキンケア剤は、スキンケア用組成物と言い換えることができる。
【００５７】
本発明のスキンケア剤の用途としては、特に制限はなく、各種用途から適宜選択することができ、例えば、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、ゼリー、リップクリーム、口紅、入浴剤、トニック、リンス、シャンプー、アストリンゼント、などが挙げられる。
【００５８】
本発明のスキンケア剤におけるプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤の配合量は、スキンケア剤の種類や各抽出物の生理活性等によって適宜調製することができるが、好適な配合率は固形分換算して０．００１〜５０質量％が好ましく、０．０１〜１０質量％がより好ましい。
【００５９】
本発明のスキンケア剤には、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用の妨げにならない限り特に制限はなく、スキンケア剤の製造に通常使用される各種主剤及び助剤、その他任意の助剤を配合することができる。前記その他の成分としては、例えば、美白剤、収斂剤、殺菌・抗菌剤、紫外線吸収剤、細胞賦活剤、消炎・抗アレルギー剤、抗酸化・活性酸素除去剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、香料、などが挙げられる。
【００６０】
なお、本発明の産生促進剤、及びスキンケア剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【実施例】
【００６１】
以下において、本発明を下記の実施例によって詳細に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
【００６２】
以下のようにして、ヒト皮膚三次元モデルを用いて、アルゲエキス及びマンダリンオレンジエキスのプロフィラグリンのｍＲＮＡ産生促進効果を評価した。
【００６３】
１．材料及び方法
（１）対照物質（Control）
・リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ（−））
なお以下において、下記の評価試験における被験サンプル名として、[1]Controlと標記する。
【００６４】
（２）陽性対照物質（Positive control）
・１．０％セリシン溶液
セリシンをＰＢＳ（−）に溶解させ、１．０％のセリシン溶液を調整した。
なお以下において、下記の評価試験における被験サンプル名として、[2]Positive Control (セリシン) と標記する。
【００６５】
（３）被験物質
被検物質は、アルゲエキス及びマンダリンオレンジエキスであり、これらはそれぞれ、下記の市販品を使用することで調達した。
・アルゲエキス：  商品名「アイセニアヴェール」（一丸ファルコス株式会社製）
・マンダリンオレンジエキス：  商品名「マンダリンクリア」（一丸ファルコス株式会社製）
【００６６】
これらを用いて、以下の[3]〜[8]の被験サンプルを用意した。下記において「％」は、各エキスをＰＢＳ（−）で希釈した際の各エキスの重量パーセント濃度を意味する。
[3]  アルゲエキス  ０．００１％
[4]  アルゲエキス  ０．００２％
[5]  アルゲエキス  ０．００３％
[6]  マンダリンオレンジエキス０．００６％
[7]  アルゲエキス：マンダリンオレンジエキス＝０．００２％：０．００６％
[8]  アルゲエキス：マンダリンオレンジエキス＝０．００２％：０．００３％
【００６７】
（４）使用細胞モデルおよび培養液
細胞モデル（ヒト皮膚３次元モデル）：ＥＰＩ−２００ＳＩＴ（ＭａｔＴｅｋ社）
培地：ＥＰＩ−１００−ＮＭＭ  培地（ＭａｔＴｅｋ社）
遺伝子：ＦＬＧ（フィラグリン）ＮＭ＿００２０１６．１（タカラバイオ株式会社）
【００６８】
２．試験方法
ヒト皮膚３次元モデルを、３７℃、５％  ＣＯ２濃度に設定したインキュベーター内で１８時間前培養した。
次いで、培地交換の後、１．０％セリシン溶液または各被験物質を各々５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、３７℃、５％  ＣＯ２濃度に設定したインキュベーター内で２４時間培養した。培養終了後、ＰＢＳ（−）で細胞モデル表面を十分洗浄した。
【００６９】
次いで、ｔｏｔａｌＲＮＡ精製キット（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎＲ ＲＮＡ（タカラバイオ株式会社））によりＲＮＡを抽出した。
得られたサンプルの一部を５０倍に希釈し、２６０ｎｍの吸光度を測定してＴｏｔａｌＲＮＡ量を測定した。
【００７０】
計算式：
ＯＤ２６０ｎｍ×４０（factor）×５０（希釈率）＝Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ量（ｎｇ／μＬ）
【００７１】
逆転写酵素（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（タカラバイオ株式会社））を用いてＰＣＲによる逆転写反応（反応条件：３７℃１５  分、８５℃５  秒）を行い、ｃＤＮＡを作成した。
【００７２】
リアルタイムＰＣＲ反応は、ＰＣＲ用プレミックス試薬（ＳＹＢＲＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ＴａｑＴＭ  ＩＩ（タカラバイオ株式会社））を用いた。ＰＣＲ用プレミックス試薬（ＳＹＢＲＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ  （Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ））（２Ｘ）１２．５μＬ、ＰＣＲ  Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（１０μＭ）１μＬ、ＰＣＲ  Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー（１０μＭ）１  μＬ、ｃＤＮＡを１μＬまたは２μＬ加え、ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏを用いて全量を２５μＬにした。
【００７３】
リアルタイムＰＣＲ反応は、９５℃で１０秒の初期変性の後、９５℃で５秒、６０〜６５℃で３０秒のサイクルを４５回、６０〜９５℃で０．２ｄｅｇ／ｓの反応を１回繰り返した。
ＰＣＲ  反応後、ΔΔＣｔ法によりＣｏｎｔｒｏｌと試験区とのｍＲＮＡ発現量を比較した。
【００７４】
結果は、表１及び図１に示されるとおりであった。
これらでは、Ｃｏｎｔｒｏｌを１．００としたフィラグリン遺伝子の発現比を示した。発現比が１．００より高ければ、Ｃｏｎｔｒｏｌより強い遺伝子の発現が認められたことになり、フィラグリン遺伝子の発現が促進されていることが確認できる。
【００７５】
結果のとおり、陽性対照の１．０％セリシン溶液は発現が増加していたことから、本試験系はフィラグリン遺伝子の発現促進を確認できる試験系であることが示された。さらに、各被験物質について比較した結果、各々１．０以上の有意な発現比であることから、フィラグリン遺伝子の発現促進効果が認められた。
【００７６】
【表１】
2020121949.tif 000002
【図１】
2020121949.tif 000003