(57)【要約】【課題】光干渉断層撮像方式により試料容器内の被撮像物を撮像する撮像装置において、温度変化に起因する画像品質の変動を抑制する。【解決手段】本発明は、光干渉断層撮像方式の撮像装置１００であって、試料容器ＷＰ内の被撮像物に照明光を入射させるとともに被撮像物からの反射光を受光する物体光学系２３と、試料容器に対する物体光学系２３の光軸方向の焦点位置を調整する焦点制御部２３４と、物体光学系２３の温度を検出する温度検出部２３７と、焦点位置の調整量を、温度検出部２３７の検出温度および予め求められた検出温度と調整量との相関関係に基づき算出し、該調整量に応じて焦点制御部を作動させる制御部３とを備える。【選択図】図１
2020052031.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光干渉断層撮像方式の撮像装置であって、
試料容器内の被撮像物に照明光を入射させるとともに前記被撮像物からの反射光を受光する物体光学系と、
前記試料容器に対する前記物体光学系の光軸方向の焦点位置を調整する焦点制御部と、
前記物体光学系の温度を検出する温度検出部と、
前記焦点位置の調整量を、前記温度検出部の検出温度および予め求められた前記検出温度と前記調整量との相関関係に基づき算出し、該調整量に応じて前記焦点制御部を作動させる制御部と
を備える撮像装置。
【請求項２】
前記物体光学系は前記照明光を前記被撮像物に収束させるとともに前記反射光を集光する対物レンズを含み、
前記焦点制御部は、前記照明光および前記反射光の光路における前記対物レンズの位置を前記調整量に応じて調整する、請求項１に記載の撮像装置。
【請求項３】
前記反射光に対する参照光の光路を形成する参照光学系と、
前記参照光の光路長を調整する光路調整機構と
をさらに備え、
前記温度検出部は前記参照光学系の温度を検出し、
前記制御部は、前記参照光学系の検出温度および予め求められた前記参照光学系の検出温度と前記光路長の調整量との相関関係に基づき前記光路長の調整量を算出し、該調整量に応じて前記光路調整機構を作動させる請求項１または２に記載の撮像装置。
【請求項４】
光干渉断層撮像方式の撮像装置であって、
前記試料容器に照明光を入射させるとともに前記試料容器からの反射光を受光する物体光学系と、
前記反射光に対する参照光の光路を形成する参照光学系と、
前記参照光の光路長を調整する光路調整機構と、
前記参照光学系の温度を検出する温度検出部と、
前記光路長の調整量を、前記温度検出部の検出温度および予め求められた前記検出温度と前記光路長の調整量との相関関係に基づき算出し、該調整量に応じて前記光路調整機構を作動させる制御部と
を備える撮像装置。
【請求項５】
前記参照光学系は参照ミラーを含み、
前記光路調整機構は、前記参照光の光路における前記参照ミラーの位置を前記光路長の調整量に応じて調整する、請求項３または４に記載の撮像装置。
【請求項６】
恒温恒湿環境に維持される内部空間に前記試料容器を収容可能なインキュベータ部を有し、前記インキュベータ部に収容された前記試料容器内の前記被撮像物を撮像する請求項１ないし５のいずれかに記載の撮像装置。
【請求項７】
光干渉断層撮像方式の撮像装置の制御方法であって、
試料容器内の被撮像物に照明光を入射させるとともに前記被撮像物からの反射光を受光する物体光学系の温度を検出する工程と、
前記焦点位置の調整量を、検出温度および予め求められた前記検出温度と前記調整量との相関関係に基づき算出し、該調整量に応じて前記試料容器に対する前記物体光学系の光軸方向の焦点位置を調整する工程と
を備える撮像装置の制御方法。
【請求項８】
光干渉断層撮像方式の撮像装置の制御方法であって、
参照光の光路を形成する参照光学系の温度を検出する工程と、
前記参照光の光路長の調整量を、検出温度および予め求められた前記検出温度と前記調整量との相関関係に基づき算出し、該調整量に応じて前記光路長を調整する工程と
を備える撮像装置の制御方法。
【請求項９】
所定の時間間隔を隔てて複数回撮像を行い、撮像ごとの前記検出温度に応じた前記調整を実行する請求項７または８に記載の撮像装置の制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、光干渉断層撮像方式により試料容器内の被撮像物を撮像する撮像装置およびその制御方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
医学や生化学の技術分野では、容器中で培養された細胞や微生物を観察することが行われる。観察対象となる細胞等に影響を与えることなく観察を行う方法として、顕微鏡等を用いて細胞等を撮像する技術が提案されている。このような技術の１つとして、光コヒーレンストモグラフィ（Optical Coherence Tomography；ＯＣＴ）技術を利用したものがある。この技術は、光源から出射される低コヒーレンス光を照明光として被撮像物に入射させ、被撮像物からの反射光（信号光）と光路長が既知である参照光との干渉光を検出することで、被撮像物からの反射光の深さ方向における強度分布を求めて断層画像化するものである。
【０００３】
従来のＯＣＴ撮像技術は、生体の網膜を観察する目的で用いられることが多かったが、生体から採取された組織や培養された細胞等、試料容器内に収容された被撮像物の撮像に用いられることも増えてきている。本願出願人も、ウェルプレートなどの試料容器に担持された被撮像物を撮像する際に好適な技術を先に開示している（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
このように容器内の試料の撮像にＯＣＴ技術を利用する用途としては、同一の試料を長期間にわたり所定の時間間隔で撮像することでその変化を観察する、いわゆるタイムラプス撮像への応用が期待される。光学顕微鏡を用いたタイムラプス撮像は以前から広く行われており、時間経過に伴う温度変化が光学系の焦点位置の変動をもたらすことが知られている。また、このような焦点位置の変動の影響を抑えるための技術も提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１８−１０５６８３号公報
【特許文献２】特開２００５−１０７３０２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
信号光と参照光との干渉光からの演算により光軸方向と平行な断面における断層画像を撮像するＯＣＴ撮像技術では、撮像時の焦点位置および参照光路長など光学系の設定状態が画像の品質に影響を及ぼすが、これらがどのような設定となっているかを画像から判断することは困難である。その一方、これらの設定は撮像時の温度の影響を受ける。このため、ＯＣＴ撮像技術をタイムラプス撮像に応用するためには温度変化に伴う撮像条件の変動を抑えることが必要となるが、従来の顕微鏡撮像技術は、撮像原理の異なるＯＣＴ撮像に適用することのできるものとはなっていなかった。
【０００７】
この発明は上記課題に鑑みなされたものであり、光干渉断層撮像方式により試料容器内の被撮像物を撮像する撮像装置において、温度変化に起因する画像品質の変動を抑制することのできる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この発明の一の態様は、光干渉断層撮像方式の撮像装置であって、上記目的を達成するため、試料容器内の被撮像物に照明光を入射させるとともに前記被撮像物からの反射光を受光する物体光学系と、前記試料容器に対する前記物体光学系の光軸方向の焦点位置を調整する焦点制御部と、前記物体光学系の温度を検出する温度検出部と、前記焦点位置の調整量を、前記温度検出部の検出温度および予め求められた前記検出温度と前記調整量との相関関係に基づき算出し、該調整量に応じて前記焦点制御部を作動させる制御部とを備えている。
【０００９】
また、この発明の一の態様は、光干渉断層撮像方式の撮像装置の制御方法であって、上記目的を達成するため、試料容器内の被撮像物に照明光を入射させるとともに前記被撮像物からの反射光を受光する物体光学系の温度を検出する工程と、前記焦点位置の調整量を、検出温度および予め求められた前記検出温度と前記調整量との相関関係に基づき算出し、該調整量に応じて前記試料容器に対する前記物体光学系の光軸方向の焦点位置を調整する工程とを備えている。
【００１０】
このように構成された発明では、予め求められている物体光学系の温度と焦点位置の調整量との相関関係に基づき、撮像時の焦点位置がそのときの温度検出結果に応じて設定される。このため、温度変化に伴う焦点位置の変動を抑え、この変動に起因する画像品質の変動を抑制することができる。
【００１１】
また、この発明の一の態様は、光干渉断層撮像方式の撮像装置であって、上記目的を達成するため、前記試料容器に照明光を入射させるとともに前記試料容器からの反射光を受光する物体光学系と、前記反射光に対する参照光の光路を形成する参照光学系と、前記参照光の光路長を調整する光路調整機構と、前記参照光学系の温度を検出する温度検出部と、前記光路長の調整量を、前記温度検出部の検出温度および予め求められた前記検出温度と前記光路長の調整量との相関関係に基づき算出し、該調整量に応じて前記光路調整機構を作動させる制御部とを備えている。
【００１２】
また、この発明の一の態様は、光干渉断層撮像方式の撮像装置の制御方法であって、上記目的を達成するため、参照光の光路を形成する参照光学系の温度を検出する工程と、前記参照光の光路長の調整量を、検出温度および予め求められた前記検出温度と前記調整量との相関関係に基づき算出し、該調整量に応じて前記光路長を調整する工程とを備えている。
【００１３】
このように構成された発明では、予め求められている参照光学系の温度と参照光の光路長の調整量との相関関係に基づき、撮像時の参照光の光路長がそのときの温度検出結果に応じて設定される。このため、温度変化に伴う参照光の光路長の変動を抑え、この変動に起因する画像品質の変動を抑制することができる。
【発明の効果】
【００１４】
上記のように、本発明によれば、温度変化に伴う物体光学系の焦点位置または参照光学系の参照光の光路長の変動を抑えることで、温度変化に起因する画像品質の変動を抑制することが可能となっている。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明に係る撮像装置の一実施形態の概略構成を示す図である。
【図２】物体光学系の温度と焦点位置との関係を模式的に示す図である。
【図３】温度変化に対応するフォーカス調整量の求め方を示す原理図である。
【図４】温度とフォーカス調整量との相関関係を求める処理を示すフローチャートである。
【図５】温度とミラー調整量との相関関係を求める処理を示すフローチャートである。
【図６】タイムラプス撮像を示すフローチャートである。
【図７】物体光学系の温度特性からフォーカス調整量を求める方法を示す図である。
【図８】撮像部の変形例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明に係る撮像装置の具体的な実施形態について説明する。本実施形態は、インキュベータ内で継続的に培養される細胞、細胞コロニー等の試料を光干渉断層撮像（Optical Coherence Tomography；ＯＣＴ）技術によって断層撮像し、これにより得られたデータに基づき、試料の断層画像および三次元画像を構成する機能を有する。この撮像装置は、一定の培養環境で培養される試料を所定の時間間隔を隔てて撮像する、いわゆるタイムラプス撮像に好適なものである。
【００１７】
図１は本発明に係る撮像装置の一実施形態の概略構成を示す図である。この撮像装置１００の構成は、所定の培養環境を実現し試料を培養するインキュベータ部１、試料をＯＣＴ撮像する撮像部２、および、これらを制御するとともに撮像データに基づき画像処理を実行する制御部３に大別することができる。以下の各図における方向を統一的に示すために、図１に示すようにＸＹＺ直交座標軸を設定する。ここでＸＹ平面が水平面を表す。また、Ｚ軸が鉛直軸を表し、より詳しくは（−Ｚ）方向が鉛直下向き方向を表している。
【００１８】
インキュベータ部１は、試料を培養する容器、例えばウェルプレートＷＰを収容可能な内部空間ＳＰを有するチャンバ１１と、チャンバ１１の内部空間ＳＰの温湿度および内部雰囲気を調整する環境調整部１２とを備えている。チャンバ１１は、撮像装置１の図示しない本体フレームに固定されている。環境調整部１２は制御部３に設けられたインキュベータ制御部３０１により制御されて、チャンバ１１内の温湿度および内部雰囲気を所定の培養環境に適合するよう調整する。
【００１９】
試料の容器としては、上面に複数の、例えば９６（＝１２×６）個のウェルＷが設けられたウェルプレート（マイクロプレート、マイクロタイタープレート等とも称される）ＷＰを好適に用いることができる。なお、ウェルＷの配設数については上記に限定されず任意である。また、例えばディッシュと呼ばれる浅皿型の容器を用いることも可能である。ここでは外形サイズが予めわかっているウェルプレートＷＰが用いられるものとする。
【００２０】
ウェルプレートＷＰは、図示を省略する開閉扉を介して外部からチャンバ１１内に搬入され、またチャンバ１１から外部へ搬出される。チャンバ１１の底面には、平面サイズにおいてウェルプレートＷＰより一回り小さい開口１１１が設けられている。チャンバ１１内に搬入されるウェルプレートＷＰは、その底面を開口１１１に臨ませてチャンバ１１内に設置される。チャンバ１１には、ウェルプレートＷＰの底面とチャンバ１１底面との間を気密状態に維持するためのシール部材や、ウェルプレートＷＰをチャンバ１１底部に固定するための固定部材等がさらに設けられてもよい。
【００２１】
ウェルプレートＷＰに設けられた少なくとも一部のウェルＷには、被撮像物である細胞等を含む試料が予め作製されている。試料は培養環境が整えられたチャンバ１１内で所定時間、培養される。そして、予め作成された撮像スケジュールに基づき、定められた撮像時刻が到来する度に、撮像部２が作動して試料の撮像を行う。培養および撮像の期間中、試料を保持するウェルプレートＷＰはチャンバ１１内に静置された状態に維持される。そのため、例えば撮像ごとのウェルプレートＷＰの搬送によって起こり得る細胞等の変位を防止することができる。
【００２２】
チャンバ１１から底面を露出させたウェルプレートＷＰの下方に、撮像部２が配置される。撮像部２には、被撮像物の断層画像を非接触、非破壊（非侵襲）で撮像することが可能な光干渉断層撮像（Optical Coherence Tomography；ＯＣＴ）装置が用いられる。詳しくは後述するが、ＯＣＴ装置である撮像部２は、被撮像物への照明光を発生する光源２１と、光ファイバカプラ２２と、物体光学系２３と、参照光学系２４と、分光器２５と、光検出器２６とを備えている。
【００２３】
撮像部２では、例えば発光ダイオードまたはスーパールミネッセントダイオード（ＳＬＤ）などの発光素子を有する光源２１から、広帯域の波長成分を含む低コヒーレンス光ビームが出射される。光源２１は、制御部３に設けられた光源制御部３１６により点灯制御される。細胞等の試料を撮像する目的においては、入射光を試料の内部まで到達させるために、例えば近赤外線が用いられることが好ましい。
【００２４】
光源２１は光ファイバカプラ２２を構成する光ファイバの１つ２２１に接続されており、光源２１から出射される低コヒーレンス光は、光ファイバカプラ２２により２つの光ファイバ２２２，２２３への光に分岐される。光ファイバ２２２は物体系光路を構成する。より具体的には、光ファイバ２２２の端部から出射される光は物体光学系２３に入射する。
【００２５】
物体光学系２３は、コリメータレンズ２３１と対物レンズ２３２とを備えている。光ファイバ２２２の端部から出射される光はコリメータレンズ２３１を介して対物レンズ２３２に入射する。対物レンズ２３２は、光源２１からの光（照明光）を試料に収束させる機能と、試料から出射される反射光を集光してビームスプリッタ２２に向かわせる機能とを有する。図では単一の対物レンズ２３２が記載されているが、複数の光学素子が組み合わされていてもよい。被撮像物からの反射光は対物レンズ２３２、コリメータレンズ２３１を介し信号光として光ファイバ２２２に入射する。対物レンズ２３２の光軸はウェルプレートＷＰの底面に直交しており、この例では光軸方向は鉛直軸方向と一致している。
【００２６】
対物レンズ２３２は鏡筒２３３に収容されており、鏡筒２３３は昇降部材２３４により支持され、昇降部材２３４は昇降機構２３５により支持されている。昇降機構２３５は昇降部材２３４を昇降させるための適宜の機構、例えばリニアモータまたはボールねじ機構を有している。昇降機構２３５は支持部材２３６に固定されている。支持部材２３６は例えばステンレス、アルミニウム、鋼鉄等の金属製の部材であり、ベース板２３０に固定されている。ベース板２３０は撮像装置１の図示しない本体フレームに固定されている。
【００２７】
昇降機構２３５は、制御部３に設けられた焦点制御部３１２からの駆動信号によって作動し、鏡筒２３３を昇降させる。これにより対物レンズ２３２が上下方向（Ｚ方向）、つまりウェルプレートＷＰ底面に対し接近および離間方向に移動することで、Ｚ方向における対物レンズ２３２の焦点位置が調整される。
【００２８】
光源２１から光ファイバカプラ２２に入射した光の一部は光ファイバ２２３を介して参照光学系２４に入射する。参照光学系２４は、コリメータレンズ２４１、折り返しミラー２４２および参照ミラー２４３を備えており、これらが光ファイバ２２３とともに参照系光路を構成する。具体的には、光ファイバ２２３の端部から出射される光がコリメータレンズ２４１、折り返しミラー２４２を介して参照ミラー２４３に入射する。参照ミラー２４３により反射された光は参照光として光ファイバ２２３に入射する。折り返しミラー２４２は、参照光の光路を適宜に折り返すことで装置の小型化に寄与するものである。
【００２９】
参照ミラー２４３は、進退部材２４４の側面に取り付けられ、進退部材２４４は進退機構２４５により支持されている。進退機構２４５は進退部材２４４をＹ方向に進退させるための適宜の機構、例えばリニアモータまたはボールねじ機構を有している。進退機構２４５は支持部材２４６に固定されている。支持部材２４６は例えばステンレス、アルミニウム、鋼鉄等の金属製の部材であり、ベース板２３０に固定されている。
【００３０】
進退機構２４５は、制御部３に設けられたミラー制御部３１３からの駆動信号によって作動し、進退部材２４４をＹ方向に進退させる。これにより参照ミラー対２４３がＹ方向、つまり折り返しミラー２４２に対し接近および離間方向に移動することで、参照ミラー２４３により反射される参照光の光路長が調整される。
【００３１】
試料の表面もしくは内部の反射面で反射された反射光（信号光）と、参照ミラー２４３で反射された参照光とは光ファイバカプラ２２で混合され光ファイバ２２４を介して光検出器２６に入射する。このとき、信号光と参照光との間で位相差に起因する干渉が生じるが、干渉光の分光スペクトルは反射面の深さにより異なる。つまり、干渉光の分光スペクトルは被撮像物の深さ方向の情報を有している。したがって、干渉光を波長ごとに分光して光量を検出し、検出された干渉信号をフーリエ変換することにより、被撮像物の深さ方向における反射光強度分布を求めることができる。このような原理に基づくＯＣＴ撮像技術は、フーリエドメイン（Fourier Domain）ＯＣＴ（ＦＤ−ＯＣＴ）と称される。
【００３２】
この実施形態の撮像部２は、光ファイバ２２４から光検出器２６に至る干渉光の光路上に分光器２５が設けられている。分光器２５としては、例えばプリズムを利用したもの、回折格子を利用したもの等を用いることができる。干渉光は分光器２５により波長成分ごとに分光されて光検出器２６に受光される。
【００３３】
光検出器２６が検出した干渉光に応じて光検出器２６から出力される干渉信号をフーリエ変換することで、試料のうち、照明光の入射位置における深さ方向、つまりＺ方向の反射光強度分布が求められる。ウェルプレートＷＰに入射する光ビームをＸ方向に走査することで、ＸＺ平面と平行な平面における反射光強度分布が求められ、その結果から当該平面を断面とする試料の断層画像を作成することができる。その原理は周知であるため、詳細な説明は省略する。
【００３４】
また、Ｙ方向におけるビーム入射位置を多段階に変更しながら、その都度断層画像の撮像を行うことで、試料をＸＺ平面と平行な断面で断層撮像した多数の断層画像を得ることができる。Ｙ方向の走査ピッチを小さくすれば、試料の立体構造を把握するのに十分な分解能の画像データを得ることができる。Ｘ方向およびＹ方向へのビーム走査は、例えば図示しないガルバノミラー等の光路を変化させる光学部品を用いてビーム入射位置をＸＹ方向に変化させる方法、試料を担持するウェルプレートＷＰと撮像部２０とのいずれかをＸＹ方向に移動させてこれらの相対位置を変化させる方法などにより実現可能である。
【００３５】
制御部３は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）３０１、画像処理部３０２、メモリ３０３、画像メモリ３０４およびＡ／Ｄコンバータ３１５を備えている。ＣＰＵ３０１は、所定の制御プログラムを実行することで装置全体の動作を司り、後述する各所の処理を実現する。ＣＰＵ３０１が実行する制御プログラムや処理中に生成したデータはメモリ３０３に保存される。Ａ／Ｄコンバータ３１５は、撮像部２の光検出器２６から受光光量に応じて出力される信号をデジタルデータに変換する。画像処理部３０２は、Ａ／Ｄコンバータ３１５から出力されるデジタルデータに基づき後述する信号処理を行って、被撮像物の二次元断層画像および三次元画像を作成する。撮像部２からＡ／Ｄコンバータ３１５を介して送られる画像データ、および画像処理部３０２により作成された断層画像、三次元画像の画像データは、画像メモリ３０４により適宜記憶保存される。
【００３６】
また、制御部３は、ユーザからの操作入力を受け付け、また各種の情報をユーザに報知するためのユーザインターフェース機能を有する。この目的のために、制御部３には、装置の機能選択や動作条件設定などに関する操作入力を受け付け可能な例えばキーボード、マウス、タッチパネルなどの入力デバイス３２１と、信号処理部３３により作成された断層画像や３Ｄ復元部３４により作成された立体像など各種の処理結果を表示する例えば液晶ディスプレイからなる表示部３２２とが設けられている。
【００３７】
物体光学系２３においては、例えば対物レンズ２３２などの光学素子やそれを支持する部材が熱変形するため、周囲温度の変化により焦点位置が変動することがある。また、参照光学系２４においても同様に、周囲温度の変化によって参照光路長が変動することがある。焦点位置の変動は、撮像される画像内における合焦位置の変動の原因となる。また、参照光路長の変動は、画像内に現れる被撮像物の位置の変動の原因となる。
【００３８】
このような変動は単発の撮像においてはさほど大きな問題とはならないと考えられる。しかしながら、時間間隔を空けて同一の試料を複数回撮像し、画像を比較することで試料の変化を観察するタイムラプス撮像においては、画像ごとに撮像条件が異なることは画像間の比較を難しくすることから避けるべきである。
【００３９】
この目的のために物体光学系２３および参照光学系２４を恒温環境に置くことも考えられるが、装置構成の複雑化や待機時間中にも多くのエネルギーを消費すること等を考えれば現実的とはいえない。そこでこの実施形態では、撮像時の物体光学系２３および参照光学系２４の少なくとも一方の周囲温度を検出し、その検出結果に応じて焦点位置および参照ミラー位置の少なくとも一方を調整することで、温度変化に起因する撮像条件の変動を抑えるようにしている。
【００４０】
タイムラプス撮像を良好に行うという目的のために撮像装置１に必要とされる仕様は、最初の撮像の際にユーザにより調整された撮像条件が、時間をおいた後の撮像においても同様に再現されることである。最初の画像が撮像される時点では、所望の画像を得るために、ユーザにより種々の撮像条件が試行されると考えられる。そうして確定された撮像条件が、後の撮像においても不変であることが求められる。なお、ここでいう撮像条件とは、物体光学系２３における対物レンズ２３２の焦点位置と、参照光学系２４における参照光路長とを指している。
【００４１】
この実施形態の撮像部２には、物体光学系２３の周囲温度を検出するための温度センサ２３７と、参照光学系２４の周囲温度を検出するための温度センサ２４７とが設けられている。より具体的には、温度センサ２３７は物体光学系２３に設けられた比較的大型の金属部材である支持部材２３６に取り付けられている。一方、温度センサ２４７は、参照光学系２４に設けられた比較的大型の金属部材である支持部材２４６に取り付けられている。これらの部材の温度は、観察光学系２３および参照光学系２４３それぞれの周囲温度を代表的に表すものと考えられる。
【００４２】
温度センサ２３７，２４７としては室温周辺における温度を精度よく検出することができるものが望ましく、例えば熱電対を用いることができる。温度センサ２３７，２４７の出力は制御部３のＡ／Ｄコンバータ３１４によりデジタルデータに変換され、ＣＰＵ３０１によって処理され、焦点位置および参照光路長の調整に利用される。
【００４３】
以下、物体光学系２３について、周囲温度の検出結果に基づく焦点位置調整の原理と具体的な動作とにつき説明する。ただし参照光学系２４においても同様の考え方を適用することが可能であり、共通する部分については説明を省略することがある。
【００４４】
ＣＰＵ３０１から焦点制御部３１２に対しては、焦点位置を調整するための調整量を含む制御指令が与えられる。調整量は、例えばパルスモータの駆動パルス数であり、焦点制御部３１２は与えられた調整量に応じて昇降機構２３５を作動させることにより対物レンズ２３２を動かし焦点位置を変化させる。ただし、そのときの実際の焦点位置は周囲温度の影響を受けており、所望の位置に正しく設定されているとは限らない。つまり、ＣＰＵ３０１から出力される調整量は焦点位置を間接的に規定するものにすぎず、実際の焦点位置は、調整量と周囲温度とによって決まっている。
【００４５】
図２は物体光学系の温度と焦点位置との関係を模式的に示す図である。物体光学系２３の焦点位置は、ＣＰＵ３０１から焦点制御部３１２に対し焦点位置の調整量（以下、「フォーカス調整量」という）Ｖｆを含む制御指令が与えられる。図２（ａ）左のグラフに示すように、物体光学系２３周囲の温度が一定であれば、焦点位置Ｚｆは概ねフォーカス調整量Ｖｆの変化に比例して変化すると考えられる。例えばこのときの温度をＴ１とすると、フォーカス調整量Ｖｆ＝Ｖ１に対応する焦点位置ＺｆはＺ１である。図において、符号ＭはウェルＷ内に注入される培地、Ｃは培地中に担持される細胞である。
【００４６】
ここで、温度がＴ１からＴ２に変化したとする。このとき、図２（ａ）右の模式図に示すように、対物レンズ２３２やその支持機構が温度変化により変形することで焦点位置が変動する。すなわち、図２（ａ）左のグラフに示すように、同じフォーカス調整量Ｖ１に対し、温度Ｔ１のとき焦点位置はＺ１であったのに対し、温度Ｔ２になると焦点位置はＺ２へ移動する。なお、焦点位置Ｚ１，Ｚ２については、このように概念として図上で考えることはできるが、ＯＣＴ撮像画像において焦点位置が明示的に現れるものではなく、焦点が画像のどこにあるかを知ることは一般的には困難である。
【００４７】
フォーカス調整量Ｖｆを固定して温度Ｔと焦点位置Ｚｆとの関係を表すと、図２（ｂ）に示すように、フォーカス調整量Ｖｆが同じであっても温度Ｔにより焦点位置Ｚｆは変動する。ここでは温度Ｔと焦点位置Ｚｆとが線形の関係で表されている。焦点位置Ｚｆが温度Ｔに対しどのように変化するかは物体光学系２３の構造に依存し、必ずしもこのように線形とは限らないが、本実施形態のような撮像装置１００の設置状況を考えると、装置内の温度の変化幅はせいぜい１０℃程度である。したがって、この程度の温度変化であれば、このような線形の近似は現実的なものであるといえる。
【００４８】
時間間隔を空けた複数回の撮像の間で焦点位置Ｚｆを一定に維持するためには、フォーカス調整量Ｖｆを一定とすればよいのではなく、むしろ温度変化に対応してフォーカス調整量を変える必要がある。図２に示した例でいえば、温度Ｔ１、フォーカス調整量Ｖ１であるときの焦点位置Ｚ１が、温度Ｔ２においても維持されるようにフォーカス調整量Ｖｆの値を設定する必要がある。これを可能とするには、温度変化に対し焦点位置Ｚｆを一定に維持するためにフォーカス調整量Ｖｆをどのように変化させればよいかを明らかにする必要がある。以下、これを可能とするための処理について説明する。
【００４９】
図３は温度変化に対応するフォーカス調整量の求め方を示す原理図である。図３（ａ）左の模式図に示すように、物体側に適宜の反射面Ｓｒを配置し、この反射面ＳｒのＺ方向位置をＺｒとする。ここで、対物レンズ２３２を介して反射面Ｓｒに照明光を入射させ、反射面Ｓｒからの反射光の受光強度を検出する。対物レンズ２３２の焦点が反射面Ｓｒに合うときに反射光の強度が最大になると考えられる。
【００５０】
そこで、図３（ａ）左の模式図において点線矢印で示すように、フォーカス調整量Ｖｆを種々に変更設定することで焦点位置を変化させながら、反射光の受光強度を検出する。そうすると、図右のグラフに示すように、フォーカス調整量Ｖｆがある値Ｖｒのときに受光強度が最大となる。このとき、対物レンズ２３２の焦点が反射面Ｓｒに合っているとみなせる。
【００５１】
種々の温度Ｔに対して上記の測定を行うと、図３（ｂ）に示すように、温度Ｔと、反射光強度が最大となるフォーカス調整量Ｖｒとの関係を表す曲線Ｃｎ（この例では直線）が得られる。この関係は、温度によらず焦点位置Ｚｆを一定値Ｚｒに維持するために必要なフォーカス調整量Ｖｒを示すものとなっている。
【００５２】
この関係が、他の焦点位置においても成り立つとして前述の例に当てはめるためには、図３（ｃ）に示すように、曲線Ｃｎを平行移動して点（Ｔ１，Ｖ１）を通る新たな曲線Ｃｎａを求めればよい。この曲線Ｃｎａは、焦点位置ＺｆをＺ１に固定したときの温度Ｔとフォーカス調整量Ｖｆとの相関関係を表したものに相当している。したがって、曲線Ｃｎａから任意の温度Ｔ２に対応するフォーカス調整量Ｖ２を決定することができる。
【００５３】
このような温度特性は装置の個体差を含み得るが、同一個体の装置においては経時的に大きく変動することはない。そこで、撮像装置１００の個体ごとに、適宜のタイミング（例えば出荷時やメンテナンス実施時）に上記の温度とフォーカス調整量との相関関係を当該装置の温度特性として求めておけば、以後の撮像動作においてはこの関係を用いて、温度変化によらず焦点位置を一定に維持することが可能となる。
【００５４】
図４は温度とフォーカス調整量との相関関係を求めるための処理を示すフローチャートである。焦点位置を一意に定めるために、適宜の位置、代表的には撮像時に試料が置かれる位置、つまりウェルプレートＷＰがチャンバ１１に収容されたときの下面位置に相当する位置に、ダミー試料としての反射板が設置される（ステップＳ１０１）。また、反射光の強度のみを求めればよいので、参照光の光路はいずれかの位置で遮蔽される（ステップＳ１０２）。
【００５５】
この状態で、光源２１からの光出射を開始し（ステップＳ１０３）、前記したように対物レンズ２３２を動かしながら光検出器２６に受光される反射光の強度を検出し、強度が最大となるときのフォーカス調整量Ｖｆの値を記録する。これを種々の温度で実施する（ステップＳ１０４）。その結果から、焦点位置Ｚｆを一定に維持するための温度Ｔとフォーカス調整量Ｖｆとの相関関係を、物体光学系２３の温度特性として特定することができる（ステップＳ１０５）。
【００５６】
参照光学系２４における温度特性も基本的には同じような考え方で求めることができるが、単に参照ミラー２４３の位置を変化させても参照光の強度は変化しないため、図４の処理をそのまま適用することはできない。この場合には次のようにすればよい。
【００５７】
図５は温度とミラー調整量との相関関係を求めるための処理を示すフローチャートである。ここでは、参照ミラー２４３の位置を設定するためにＣＰＵ３０１からミラー制御部３１３に与えられる調整量を「ミラー調整量」と称し、符号Ｖｍを付すこととする。この処理では、物体光学系２３に対する処理と同様に、撮像時の試料の位置に反射板が設置される（ステップＳ２０１）。参照系光路は遮蔽されず、これに代えて、フォーカス調整量Ｖｆが適宜の値に設定される（ステップＳ２０２）。これにより、物体側光路長が規定される。
【００５８】
この状態で光源２１から光出射が開始されると（ステップＳ２０３）、参照光路長が物体系光路長と等しいときに干渉光が検出される。つまり、干渉光の強度を検出することで、固定された物体側光路長を介して間接的に参照光路長を知ることができる。そこで、ミラー調整量Ｖｍを変化させることで参照ミラー２４３を動かしながら光検出器２６に受光される干渉光を検出し、物体側光路長と参照光路長とが等しくなるときのミラー調整量Ｖｍの値を記録する。物体側光路長と参照光路長とが等しくなる時のミラー調整量Ｖｍの値は干渉光から生成された断層画像を確認することで容易に取得できる。そして、これを種々の温度で実施する（ステップＳ２０４）。その結果から、参照光路長を一定に維持するための温度Ｔとミラー調整量Ｖｍとの相関関係を、参照光学系２４の温度特性として特定することができる（ステップＳ２０５）。
【００５９】
上記のようにして物体光学系２３および参照光学系２４の温度特性を求めておけば、撮像の時間間隔が長くその間の温度変化が無視できないタイムラプス撮像においても、各撮像における撮像条件（焦点位置および参照光路長）を一定に維持することができる。
【００６０】
図６はタイムラプス撮像を示すフローチャートである。撮像対象となる試料は予めチャンバ１１内で培養されているものとする。最初に、ユーザの目的に応じた画像を得るために、ユーザ操作により試料に適合した撮像条件の設定が行われる。この撮像条件には、焦点位置および参照ミラー位置も含まれる（ステップＳ３０１）。
【００６１】
そして、この時点の物体光学系２３および参照光学系２４の温度が検出され（ステップＳ３０２）、設定されたフォーカス調整量Ｖｆおよびミラー調整量Ｖｍの値が検出温度と関連付けてメモリ３０３に記憶保存される（ステップＳ３０３）。なお、フォーカス調整量Ｖｆおよびミラー調整量Ｖｍの値は検出温度と関連付けられているが、実際にメモリ３０３に記憶されているのはフォーカス調整量Ｖｆおよびミラー調整量Ｖｍの値のみであり温度の情報は含まれない。この点については後で説明する。
【００６２】
こうしてユーザにより設定された撮像条件で、撮像部２によりＯＣＴ撮像が行われる（ステップＳ３０４）。ここでいう「撮像」は、単に干渉光強度のデータを取得するだけの処理であってもよく、またデータに基づく画像処理までを含むものであってもよい。いずれにせよ、被撮像物の姿はこの時点でデータとして固定される。
【００６３】
必要数の画像の撮像が終了していれば（ステップＳ３０５においてＹＥＳ）、この時点で撮像処理は終了する。そうでない場合には（ステップＳ３０５においてＮＯ）、予め定められた撮像間隔を実現するため、次の撮像時刻が到来するまで待機状態となる（ステップＳ３０６）。この間に各種画像処理が行われてもよい。撮像後の試料はチャンバ１１内に留め置かれており、試料は一定の培養環境で引き続き培養される。
【００６４】
撮像時刻が到来すると（ステップＳ３０６においてＹＥＳ）、その時点の物体光学系２３および参照光学系２４の温度が検出される（ステップＳ３０７）。そして、それらの温度検出結果と、メモリ３０３に記憶されている最初の撮像におけるフォーカス調整量Ｖｆおよびミラー調整量Ｖｍの設定値とに基づき、今回の撮像に適用されるフォーカス調整量Ｖｆとミラー調整量Ｖｍとが算出される（ステップＳ３０８）。具体的な算出方法については後述する。
【００６５】
算出されたフォーカス調整量Ｖｆおよびミラー調整量ＶｍがＣＰＵ３０１から焦点制御部３１２およびミラー制御部３１３に与えられることで、対物レンズ２３２の焦点位置および参照ミラー２４３の位置が調整される（ステップＳ３０９）。これにより、たとえ前回の撮像から温度変化があったとしても、焦点位置および参照ミラー位置については前回と同じ条件が実現されているはずである。この状態で新たにＯＣＴ撮像を行い（ステップＳ３０４）、以後は必要な回数の撮像が終了するまで上記処理を繰り返すことで、目的とされるタイムラプス撮像が完了する。
【００６６】
図７は物体光学系の温度特性からフォーカス調整量を求める方法を示す図である。なお、参照光学系２４の温度特性からミラー調整量Ｖｍを求める方法も原理は同じである。図７（ａ）に示すように、図４の処理で求められた物体光学系２３の温度特性は、一般化された形では曲線Ｃｎ（図３（ｂ））の形状のみが特定され、曲線の縦軸方向位置は特定されない。タイムラプス撮像における最初の撮像では、ユーザ設定されたフォーカス調整量の値Ｖ１とそのときの温度Ｔ１とが決まることにより、縦軸方向位置も含めて一意に特定された温度特性曲線Ｃｎａが確定する。
【００６７】
以後の撮像では、この曲線Ｃｎａに基づき、撮像時の温度Ｔ２に対応するフォーカス調整量Ｖ２を導出することができ、フォーカス調整量Ｖ２に応じたフォーカス調整を行うことで、焦点位置Ｚｆは最初の撮像時の値Ｚ１と同じになっているはずである。
【００６８】
このように、一般化された温度特性曲線Ｃｎからユーザの初期設定に応じた固有の温度特性曲線Ｃｎａを特定するためには、そのときのフォーカス調整量の値Ｖ１と温度Ｔ１との２つの情報が必要となる。ここで、図７（ａ）に示すように、予め適宜の基準温度Ｔｓを固定的に定めておけば、温度の情報を保存しておく必要はなくなる。すなわち、ユーザ設定時のフォーカス調整量Ｖ１とそのときの温度Ｔ１とで特定される曲線Ｃｎａが基準温度Ｔｓにおいて取る値Ｖｓのみを、そのときのフォーカス調整量を表す値としてメモリ３０３に記憶させておけばよい。そうすれば、メモリ３０３に記憶されている値Ｖｓと、予め定められている値Ｖｓとから、事後的にいつでも曲線Ｃｎａを特定することができる。
【００６９】
この方法は、２つの情報Ｖ１，Ｔ１から曲線Ｃｎａを特定することと等価である。図７（ｂ）に示すように、温度特性曲線をより一般化して曲線で表したとしても同じように考えることができる。
【００７０】
なお、図７（ａ）に示すように温度特性が直線で表される場合は、より簡便には、事前に求められた曲線Ｃｎの傾きｋのみで一般化された温度特性を表現することができる。この場合にフォーカス調整量Ｖ２を求めるには、次のようにすることができる。図７（ａ）の関係から明らかなように、次式：
Ｖｓ−Ｖ１＝ｋ（Ｔ１−Ｔｓ）  …  （式１）
が成り立つ。これを変形して、次式：
Ｖｓ＝Ｖ１＋ｋ（Ｔ１−Ｔｓ）  …  （式２）
が得られる。ユーザ設定により値Ｖ１，Ｔ１が確定したとき、これらと既知の値ｋ，Ｔｓを（式２）に代入して得られる値Ｖｓをメモリ３０３に記憶させておく。
【００７１】
任意の温度Ｔ２に対応するフォーカス調整量Ｖ２についても、図７（ａ）から次式：
Ｖ２＝Ｖｓ−ｋ（Ｔ２−Ｔｓ）  …  （式３）
が成立するから、メモリ３０３に記憶されている値Ｖｓと、現在の温度Ｔ２と、既知の値ｋ，Ｔｓとから直ちにフォーカス調整量Ｖ２を求めることができる。
【００７２】
なお、図７（ｂ）に示すように曲線Ｃｎが２次以上の多項式で表される形状である場合には、定数項以外の各項によって、一般化された温度特性を表現することが可能である。ユーザ設定時の値によって定数項が確定することにより、一意の温度特性曲線Ｃｎａが特定されることになる。
【００７３】
以上のように、本実施形態の撮像装置１００では、ＯＣＴ撮像装置によりタイムラプス撮像を実現するのに際し、焦点位置および参照ミラー位置の調整量と温度との相関関係を撮像に先立って求めておく。そして、撮像時にはこの相関関係を用いて、その時点の温度に対応する焦点位置および参照ミラー位置の調整量を導出することで、各撮像間での温度変化に起因して焦点位置および参照ミラー位置が変動することが防止される。このように各撮像間で撮像条件が揃えられているため、得られる画像は相互比較に適したものとなっている。
【００７４】
以上説明したように、上記実施形態においては、ウェルプレートＷＰが本発明の「試料容器」に相当している。また、物体光学系２３、参照光学系２４、温度センサ２３７，２４７および制御部３が、それぞれ本発明の「物体光学系」、「参照光学系」、「温度検出部」および「制御部」として機能している。また、焦点制御部３１２および昇降機構２３５が一体として本発明の「焦点調整機構」として機能する一方、ミラー制御部３１３および進退機構２４５が一体として本発明の「光路調整機構」として機能している。
【００７５】
なお、本発明は上記した実施形態に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない限りにおいて上述したもの以外に種々の変更を行うことが可能である。例えば、上記実施形態では物体光学系２３および参照光学系２４のそれぞれに温度センサが設けられ、その検出結果に基づきフォーカス調整量およびミラー調整量が求められる。しかしながら、物体光学系２３および参照光学系２４のいずれか一方のみに上記構成を適用しても十分な効果が得られる。また、構造によっては、物体光学系および参照光学系の温度検出を共通の温度センサで検出することも可能である。
【００７６】
また例えば、上記撮像部２の変形例として、次のような構成のものも利用可能である。すなわち、ＯＣＴ装置において光の分波／合波機能を実現するに当たり、上記した光ファイバカプラを用いるもの以外に、ビームスプリッタを用いたものが知られている。このような構成の撮像部を用いる場合にも、本発明は有効に機能する。さらに、次のような構成も適用可能である。
【００７７】
図８は撮像部の変形例を示す図である。この例では、撮像部２ａに光ファイバカプラ２２０が設けられる。ただし光ファイバ２２４は使用されず、光ファイバ２２２から出射される光の光路に対してコリメータレンズ２２３およびビームスプリッタ２２７が設けられる。そして、ビームスプリッタ２２７により分岐される２つの光路にそれぞれ物体光学系２３、参照光学系２４が配置される。このような構成ではビームスプリッタ２２７により信号光と参照光とが合成され、それにより生じた干渉光が光ファイバ２２２，２２６を通って光検出器２６へ導かれる。このような構成のＯＣＴ装置に対しても、本発明を好適に適用することが可能である。
【００７８】
また、上記実施形態はＦＤ−ＯＣＴ撮像装置であるが、本発明は撮像原理に関係なく、ＯＣＴ撮像装置全般に適用することができるものである。例えばＴＤ−ＯＣＴ（Time Domain OCT）、ＳＤ−ＯＣＴ（Spectral Domain OCT）と呼ばれる撮像装置にも、本発明を適用することができる。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
この発明は、容器中で継続的に培養される細胞等の試料を定期的に観察する目的に特に有効であり、医療や創薬の分野に幅広く利用することが可能である。
【符号の説明】
【００８０】
１  インキュベータ部
２  撮像部
３  制御部
１００  撮像装置
２２  光ファイバカプラ
２３  物体光学系
２４  参照光学系
２３５  昇降機構（焦点調整機構）
２３７，２４７  温度センサ（温度検出部）
２４５  進退機構（光路調整機構）
３１２  焦点制御部（焦点調整機構）
３１３  ミラー制御部（光路調整機構）
ＷＰ  ウェルプレート（試料容器）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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