(57)【要約】【課題】ターゲットとなるＮmerのオリゴヌクレオチドを高い純度で容易に分離する方法を提供する。【解決手段】Ｎmerのオリゴヌクレオチドの製造方法であって、（Ｎ−１）merのオリゴヌクレオチド鎖にＮ番目のヌクレオシドを結合させる（Ｎ−１）縮合工程と、その縮合工程の後に、Ｎ番目のヌクレオシドが結合しなかった（Ｎ−１）merのオリゴヌクレオチド鎖の末端ヌクレオチドの５’端末に第（Ｎ−１）キャッピング化合物を結合させる（Ｎ−１）キャッピング工程と、そのキャッピング工程の後に、Ｎmerのオリゴヌクレオチド及びそれ以外の物質を液体クロマトグラフィーにより分離する工程とを含み、（Ｎ−１）キャッピング工程では、第（Ｎ−１）キャッピング化合物を結合させた（Ｎ−１）merのオリゴヌクレオチドの方が、Ｎmerのオリゴヌクレオチドよりも、液体クロマトグラフィーの充填剤との親和力が大きい第（Ｎ−１）キャッピング化合物を用いる。【選択図】図１
2020158399.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ個のヌクレオシドを順に結合させて、Ｎ ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
（Ｎ−１） ｍｅｒのオリゴヌクレオチド鎖にＮ番目のヌクレオシドを結合させる（Ｎ−１）縮合工程と、
前記（Ｎ−１）縮合工程の後に、前記Ｎ番目のヌクレオシドが結合しなかった前記（Ｎ−１） ｍｅｒのオリゴヌクレオチド鎖の末端ヌクレオチドの５’端末に第（Ｎ−１）キャッピング化合物を結合させる（Ｎ−１）キャッピング工程と、
前記（Ｎ−１）キャッピング工程の後に、Ｎ ｍｅｒのオリゴヌクレオチド及びそれ以外の物質である不純物を液体クロマトグラフィーにより分離する工程と
を含み、
前記（Ｎ−１）キャッピング工程では、前記第（Ｎ−１）キャッピング化合物を結合させた前記（Ｎ−１） ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの方が、前記Ｎ ｍｅｒのオリゴヌクレオチドよりも、前記液体クロマトグラフィーの充填剤との親和力が大きい前記第（Ｎ−１）キャッピング化合物を用いている、Ｎ ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの製造方法。
【請求項２】
（Ｎ−３） ｍｅｒのオリゴヌクレオチド鎖に（Ｎ−２）番目のヌクレオシドを結合させる（Ｎ−３）縮合工程と、
前記（Ｎ−３）縮合工程の後に、前記（Ｎ−２）番目のヌクレオシドが結合しなかった前記（Ｎ−３） ｍｅｒのオリゴヌクレオチド鎖の末端ヌクレオチドの５’端末に第（Ｎ−３）キャッピング化合物を結合させる（Ｎ−３）キャッピング工程と、
（Ｎ−２） ｍｅｒのオリゴヌクレオチド鎖に（Ｎ−１）番目のヌクレオシドを結合させる（Ｎ−２）縮合工程と、
前記（Ｎ−２）縮合工程の後に、前記（Ｎ−１）番目のヌクレオシドが結合しなかった前記（Ｎ−２） ｍｅｒのオリゴヌクレオチド鎖の末端ヌクレオチドの５’端末に第（Ｎ−２）キャッピング化合物を結合させる（Ｎ−２）キャッピング工程と
を含み、
前記（Ｎ−３）キャッピング工程では、前記第（Ｎ−３）キャッピング化合物を結合させた前記（Ｎ−３） ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの方が、前記Ｎ ｍｅｒのオリゴヌクレオチドよりも、前記液体クロマトグラフィーの充填剤との親和力が大きい前記第（Ｎ−３）キャッピング化合物を用い、
前記（Ｎ−２）キャッピング工程では、前記第（Ｎ−２）キャッピング化合物を結合させた前記（Ｎ−２） ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの方が、前記Ｎ ｍｅｒのオリゴヌクレオチドよりも、前記液体クロマトグラフィーの充填剤との親和力が大きい前記第（Ｎ−２）キャッピング化合物を用いている、請求項１に記載のＮ ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの製造方法。
【請求項３】
１番目のヌクレオシドに２番目のヌクレオシドを結合させる第１縮合工程と、
前記第１縮合工程の後に、前記２番目のヌクレオシドが結合しなかった前記１番目のヌクレオシドの５’端末に第１キャッピング化合物を結合させる第１キャッピング工程と
を含み、
前記第１キャッピング工程では、前記第１キャッピング化合物を結合させた前記１番目のヌクレオシドの方が、前記Ｎ ｍｅｒのオリゴヌクレオチドよりも、前記液体クロマトグラフィーの充填剤との親和力が大きい前記第１キャッピング化合物を用いている、請求項１または２に記載のＮ ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ個のヌクレオチドを順に結合させて、Ｎ ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを製造する、Ｎ ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
オリゴヌクレオチドの合成方法には、リン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、ホスホロアミダイト法などがあり、現在ではホスホロアミダイト法を用いた固相合成（固相法）が最も汎用的に使用されている（非特許文献１）。固相法はプロセス最適化がなされ自動化も進んでおり、スピード面で有利である。
【０００３】
これらのオリゴヌクレオチド合成技術に関しては、それぞれの反応に適した試薬や反応条件の検討、改良が詳細になされてきており、例えば１回のオリゴヌクレオチド鎖伸長反応（縮合反応）の収率として、リン酸トリエステル法ではおよそ９０〜９５％、β-シアノエチルホスホロアミダイト法等を含むホスファイト法ではおよそ９８〜９９％を達成している。
【０００４】
具体的には、ホスホロアミダイト法によれば、次のようにして、核酸が合成される。
【０００５】
先ず、合成しようとする核酸の３’末端になるヌクレオシドをスクシニル基等のリンカーを介して固相担体に担持させる。次いで、このヌクレオシド・リンカーを担持させた固相担体を核酸自動合成装置の反応容器に入れて、以降、核酸自動合成装置が合成プログラムに従って、前記ヌクレオシド５’−ＯＨ基の脱保護反応、５’−ＯＨ基へのヌクレオシドホスホロアミダイトのカップリング反応、未反応の５’−ＯＨ基のキャッピング反応、生成したホスファイトの酸化反応の４つの反応からなるサイクルを繰り返して、目的の配列を有する核酸が合成される。最終的に合成された核酸は、アンモニア等を用いて、リンカーを加水分解させて、固相担体から切り出される。
【０００６】
このオリゴヌクレオチド合成法は、化学反応としては、ほぼ完成された方法とみなされているが、１回の縮合反応の収率が９９％であっても５０ｍｅｒを超えるような長鎖オリゴヌクレオチドを合成する場合には最終収率が大幅に減少してしまう。また従来のオリゴヌクレオチド合成法では、比較的高い純度でオリゴヌクレオチドを合成できるものの、合成反応が途中で停止したオリゴヌクレオチド等の不純物が合成産物中にある程度の量で生じるため、合成後にゲル濾過、エタノール沈殿等の脱塩、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製、ＰＡＧＥ精製等で精製を行う必要があり、この精製工程が最終収率をさらに低下させる要因にもなっていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】S. L. Beaucage, D. E. Bergstorm, G. D. Glick, R. A. Jones, Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry; John Wiley & Sons (2000)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のように様々な精製方法があるが、例えばＨＰＬＣによる精製工程においては、以下のような問題があった。
【０００９】
例えば５０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドをターゲットの物質として合成すると、不純物として４９ｍｅｒのオリゴヌクレオチドにキャッピング用の化合物が結合した物質、４８ｍｅｒのオリゴヌクレオチドにキャッピング用の化合物が結合した物質、４７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドにキャッピング用の化合物が結合した物質、・・・が、固相担体から切り出された液中にターゲット物質とともに存在している。このような液をＨＰＬＣのカラムに導入してターゲット物質と不純物とを分離させてターゲット物質だけを取り出すのであるが、４９ｍｅｒのオリゴヌクレオチドにキャッピング用の化合物が結合した物質はターゲット物質とカラムの充填剤（固定相）との親和性の度合が非常に近いため、完全に分離することが非常に困難であった。
【００１０】
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、ターゲットとなるＮ ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを高い純度で容易に分離する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明のオリゴヌクレオチドを製造する方法は、Ｎ個のヌクレオシドを順に結合させて、Ｎ ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを製造する方法であって、（Ｎ−１） ｍｅｒのオリゴヌクレオチド鎖にＮ番目のヌクレオシドを結合させる（Ｎ−１）縮合工程と、前記（Ｎ−１）縮合工程の後に、前記Ｎ番目のヌクレオシドが結合しなかった前記（Ｎ−１） ｍｅｒのオリゴヌクレオチド鎖の末端ヌクレオチドの５’端末に第（Ｎ−１）キャッピング化合物を結合させる（Ｎ−１）キャッピング工程と、前記（Ｎ−１）キャッピング工程の後に、Ｎ ｍｅｒのオリゴヌクレオチド及びそれ以外の物質である不純物を液体クロマトグラフィーにより分離する工程とを含み、前記（Ｎ−１）キャッピング工程では、前記第（Ｎ−１）キャッピング化合物を結合させた前記（Ｎ−１） ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの方が、前記Ｎ ｍｅｒのオリゴヌクレオチドよりも、前記液体クロマトグラフィーの充填剤との親和力が大きい前記第（Ｎ−１）キャッピング化合物を用いていることを特徴とする。
【００１２】
そして、（Ｎ−３） ｍｅｒのオリゴヌクレオチド鎖に（Ｎ−２）番目のヌクレオシドを結合させる（Ｎ−３）縮合工程と、前記（Ｎ−３）縮合工程の後に、前記（Ｎ−２）番目のヌクレオシドが結合しなかった前記（Ｎ−３） ｍｅｒのオリゴヌクレオチド鎖の末端ヌクレオチドの５’端末に第（Ｎ−３）キャッピング化合物を結合させる（Ｎ−３）キャッピング工程と、（Ｎ−２） ｍｅｒのオリゴヌクレオチド鎖に（Ｎ−１）番目のヌクレオシドを結合させる（Ｎ−２）縮合工程と、前記（Ｎ−２）縮合工程の後に、前記（Ｎ−１）番目のヌクレオシドが結合しなかった前記（Ｎ−２） ｍｅｒのオリゴヌクレオチド鎖の末端ヌクレオチドの５’端末に第（Ｎ−２）キャッピング化合物を結合させる（Ｎ−２）キャッピング工程とを含み、前記（Ｎ−３）キャッピング工程では、前記第（Ｎ−３）キャッピング化合物を結合させた前記（Ｎ−３） ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの方が、前記Ｎ ｍｅｒのオリゴヌクレオチドよりも、前記液体クロマトグラフィーの充填剤との親和力が大きい前記第（Ｎ−３）キャッピング化合物を用い、前記（Ｎ−２）キャッピング工程では、前記第（Ｎ−２）キャッピング化合物を結合させた前記（Ｎ−２） ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの方が、前記Ｎ ｍｅｒのオリゴヌクレオチドよりも、前記液体クロマトグラフィーの充填剤との親和力が大きい前記第（Ｎ−２）キャッピング化合物を用いてもよい。
【００１３】
１番目のヌクレオシドに２番目のヌクレオシドを結合させる第１縮合工程と、前記第１縮合工程の後に、前記２番目のヌクレオシドが結合しなかった前記１番目のヌクレオシドの５’端末に第１キャッピング化合物を結合させる第１キャッピング工程とを含み、前記キャッピング工程では、前記第１キャッピング化合物を結合させた前記１番目のヌクレオシドの方が、前記Ｎ ｍｅｒのオリゴヌクレオチドよりも、前記液体クロマトグラフィーの充填剤との親和力が大きい前記第１キャッピング化合物を用いていてもよい。
【発明の効果】
【００１４】
第（Ｎ−１）キャッピング化合物を結合させた（Ｎ−１） ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（不純物）の方が、Ｎ ｍｅｒのオリゴヌクレオチドよりも、液体クロマトグラフィーの充填剤との親和力が大きいので、不純物がターゲット物質よりも液体クロマトグラフィーの通過時間が長くなり、ターゲット物質を分取した後に不純物が出てくるため、ターゲット物質を純度高く分離することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】オリゴヌクレオチドの固相合成サイクルを示した図である。
【図２】従来の方法により合成したオリゴヌクレオチドのクロマトグラフィーを示した模式的な図である。
【図３】実施形態１において合成したオリゴヌクレオチドのクロマトグラフィーを示した模式的な図である。
【図４】実施形態２において合成したオリゴヌクレオチドのクロマトグラフィーを示した模式的な図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
図１にβシアノエチルホスホロアミダイト法によるオリゴヌクレオチドの固相合成サイクルを示す。最初のヌクレオシドの３’末端をスクシニル基等のリンカーを介して固相担体に担持させたものを出発点とし、ヌクレオシド５’−ＯＨ基の脱保護反応、５’−ＯＨ基へのヌクレオシドホスホロアミダイトのカップリング：縮合反応（次のヌクレオシドを結合）、未反応の５’−ＯＨ基のキャッピング反応、生成したホスファイトの酸化反応の４つの反応からなるサイクルを繰り返して核酸の鎖を延ばしていく。ここでＢ１、Ｂ２は核酸塩基（例えば、アデニル基、グアニル基、シトシル基、チミニル基、ウラシル基）あるいは保護されていてもよい核酸塩基である。また、キャッピング反応に使用されるキャッピング試薬は、未反応の５’−ＯＨ基をアセチル化する試薬であり（図中のＣａｐがアセチル基）、無水酢酸が使用される。
【００１７】
図１に示すサイクルにより１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを作成し、固相担体から切り離して、オリゴヌクレオチド用ＨＰＬＣにて分離・計測したクロマトグラフィーを図２に示す。オリゴヌクレオチド用ＨＰＬＣはカラムの固体相に疎水性の充填剤が用いられており、キャッピングされた１ｍｅｒから９ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１０１〜１０９が不純物として、順にカラム出口で検出され、最後にターゲット物質である１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１１０が検出される。なお、１ｍｅｒのオリゴヌクレオチドとは、出発物質である最初のヌクレオシドのことである。
【００１８】
図２からわかるように、キャッピングされた９ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１０９は、１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１１０の直前に検出される。ターゲット物質はＨＰＬＣを用いて分取されるのであるが、図２に示されているようにキャッピングされた９ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１０９の最後の部分と１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１１０の最初の部分とが重なっているため、この重なっている部分は分取することができない。この場合、１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１１０はクロマトグラフィーの立ち上がりが非常に早いため、分取を開始するタイミングが非常に難しい。つまり、不純物質を完全に除くために分取開始を遅くするとターゲット物質の多くを分取できずに無駄になってしまい、逆にターゲット物質をできるだけ多く取ろうとして分取の開始を早めると、不純物質が混入する虞があるからである。
【００１９】
上述のような事情のため、ターゲット物質のオリゴヌクレオチドを高い純度でできるだけ多く分取する方法が求められており、本願発明者ら種々の検討を行って本願発明を想到するにいたった。
【００２０】
本明細書において、オリゴヌクレオチドの構成単位となる「ヌクレオシド」とは、核酸塩基が糖（例えば、リボース）の１’位にＮ−グリコシド化により結合された化合物を意味する。
【００２１】
本明細書において、「核酸塩基」とは、核酸の合成に使用されるものであれば特に制限されず、例えば、シトシル基、ウラシル基、チミニル基等のピリミジン塩基、アデニル基、グアニル基等のプリン塩基を挙げることができる。また、「保護されていてもよい核酸塩基」とは、例えば、アミノ基を有する核酸塩基であるアデニル基、グアニル基、またはシトシル基において、アミノ基が保護されていてもよいことを意味し、核酸塩基のアミノ基が５’位の脱保護条件に耐え得る保護基により保護されている核酸塩基が好ましい。
【００２２】
このような「アミノ基の保護基」としては、特に限定されず、例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第３版、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（ＪＯＨＮ  ＷＩＬＬＹ＆ＳＯＮＳ）出版（１９９９年）等に記載されている保護基を挙げることができる。
【００２３】
また、該「核酸塩基」には、上記した基の他に、核酸塩基が任意の置換基（例えば、ハロゲン原子、アルキル基、アラルキル基、アルコキシ基、アシル基、アルコキシアルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ等）により任意の位置に１〜３個置換されている修飾核酸塩基（例えば、８−ブロモアデニル基、８−ブロモグアニル基、５−ブロモシトシル基、５−ヨードシトシル基、５−ブロモウラシル基、５−ヨードウラシル基、５−フルオロウラシル基、５−メチルシトシル基、８−オキソグアニル基、ヒポキサンチニル基等）も包含される。
【００２４】
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用物或いはその用途を制限することを意図するものではない。
【００２５】
（実施形態１）
実施形態１では、図１に示す反応サイクルを用いて１０個のヌクレオシドを結合させて１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを作成した。ただし、キャッピング化合物を一部変更した。担体はオリゴヌクレオチド固相合成に使用される任意の固体担体、例えばポリスチレン（PS）、シリカゲル、ポリエチレングリコール、製造法によりコントロールされた孔を有する多孔質ガラスビーズであるコントロールポアドグラス（ＣＰＧ）等を用いることができる。
【００２６】
５’−ＯＨ基の保護基は、最も一般的にはジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）であるがこれに限定するものではない。脱保護基の工程では、５’−ＯＨ基からのジメトキシトリチル基の脱離（脱保護基）をさせるために、好適には、３％トリクロロ酢酸−ジクロロメタン溶液又は３％ジクロロ酢酸−ジクロロメタン溶液を用いることができる。
【００２７】
縮合反応の工程では、ヌクレオシド−３’−Ｏ−ホスホロアミダイト誘導体（５’−ＯＨ基がＤＭＴｒにより保護されている）と、活性化剤である酸触媒とを添加する。縮合反応に用いるヌクレオシド−３’−Ｏ−ホスホロアミダイト誘導体としては、ＤＮＡ合成の場合には、デオキシリボヌクレオシド−３’−Ｏ−ホスホロアミダイト誘導体、すなわち保護又は無保護デオキシアデノシン、保護又は無保護デオキシグアノシン、保護又は無保護デオキシシチジン、保護又は無保護チミジンの各々の−３’−Ｏ−ホスホロアミダイト体を用いることができる。ＲＮＡ合成の場合には、リボヌクレオシド−３’−Ｏ−ホスホロアミダイト誘導体、すなわち保護又は無保護アデノシン、保護又は無保護グアノシン、保護又は無保護シチジン、保護又は無保護ウリジンの各々の−３’−Ｏ−ホスホロアミダイト体を用いればよい。
【００２８】
キャッピング工程では、上記の縮合反応において反応せずに残ったヌクレオチドの５’−ＯＨ基をアセチル化することによりキャッピングを行う。本実施形態では、１サイクル（第１キャッピング工程）から８サイクル（第８キャッピング工程）まではキャッピング試薬（第１〜第８キャッピング化合物）としてＨＰＬＣのカラム充填剤と親和性の低い化合物（例えば、無水酢酸）を用いた。９サイクル目の第９キャッピング工程では第９キャッピング化合物として、第１〜第８キャッピング化合物よりもＨＰＬＣのカラム充填剤と親和性の高い化合物（例えば、ヘキサン酸無水物）を用いた。
【００２９】
次に酸化反応の工程では、縮合反応の工程で鎖伸長されたヌクレオチドの三価のリン酸結合を、酸化試薬により酸化し、安定な五価の正リン酸結合に変換する。
【００３０】
この後、脱保護基の工程になり、次のサイクルに入る。各工程が終了したら、未反応物や副生物を洗浄することにより除去する。
【００３１】
サイクルを９回繰り返すと、目的物である１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが担体に担持された状態で出来上がる。この１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドをアンモニアによって担体から脱離させる。この溶液からアンモニアを除去し、目的物および１〜９ｍｅｒのオリゴヌクレオチドにキャッピング化合物が結合した不純物が含まれた溶液を得、これをＨＰＬＣを用いて各成分を分離させてクロマトグラフィーを得た。このクロマトグラフィーを図３に示す。
【００３２】
本実施形態のクロマトグラフィーでは、図２とは異なり、９ｍｅｒのオリゴヌクレオチドにキャッピング化合物が結合した不純物２０９が１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１１０よりも後に出てくる。１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１１０が検出される直前に不純物がないため、１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１１０を分取する際に、分取の開始時は目的物の出始めを確実に得ることができる。また、１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１１０が出終わるタイミングと９ｍｅｒのオリゴヌクレオチドにキャッピング化合物が結合した不純物２０９が出始めるタイミングが重なるおそれがあるが、重なる部分に含まれる１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１１０はごく微量であるので、重なった部分を廃棄しても問題はない。
【００３３】
本実施形態では、第９キャッピング工程において第９キャッピング化合物として第１〜第８キャッピング化合物よりもＨＰＬＣのカラム充填剤と親和性の高い化合物（例えば、ヘキサン酸無水物）を用いることにより、９ｍｅｒのオリゴヌクレオチドにキャッピング化合物が結合した不純物２０９が、１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１１０よりもＨＰＬＣにおいてカラム通過時間が長くなって、１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１１０よりも後ほど検出装置部・分取装置部に現れてくる。すなわち、９ｍｅｒのオリゴヌクレオチドにキャッピング化合物が結合した不純物２０９の方が、１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１１０よりも、ＨＰＬＣのカラムに充填された充填剤との親和力が大きいため、このような現象が生じるのである。これにより、目的とする１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１１０を、高純度で、回収率が高く、容易に分取することができる。
【００３４】
（実施形態２）
実施形態２は、第１〜第９キャッピング化合物が実施形態１と異なっており、それ以外の使用化合物、使用プロセスなどは実施形態１と同じである。
【００３５】
本実施形態では、第１〜第９キャッピング化合物としてＨＰＬＣのカラム充填剤と親和性が無水酢酸よりも高い化合物（例えば、安息香酸無水物）を使用した。９サイクルの工程を終えて担体から１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド及び不純物を脱離させて、これをＨＰＬＣを用いて各成分を分離させてクロマトグラフィーを得た。このクロマトグラフィーを図４に示す。
【００３６】
実施形態２では、第１〜第９キャッピング化合物としてＨＰＬＣのカラム充填剤と親和性無水酢酸よりも高い化合物（例えば、安息香酸無水物）を使用したことにより、１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１１０が最初にＨＰＬＣのカラム出口で検出され、その後にキャッピングされた１ｍｅｒから９ｍｅｒのオリゴヌクレオチド３０１〜３０９が不純物として、順にカラム出口で検出される。すなわち、キャッピングされた１ｍｅｒから９ｍｅｒのオリゴヌクレオチド３０１〜３０９の方が、１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１１０よりも、ＨＰＬＣのカラムに充填された充填剤との親和力が大きいため、ＨＰＬＣによる分離工程において、１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１１０が最初にＨＰＬＣのカラム出口で検出されるのである。
【００３７】
本実施形態では、１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１１０が最初にＨＰＬＣのカラム出口で検出されるので、ＨＰＬＣの送液速度を大きくするなどして、１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１１０がカラム出口から出てくる時間を短縮することができ、工程時間短縮が可能になる。従来の方法や実施形態１のように、１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１１０よりも不純物の方が先にＨＰＬＣのカラムから出てくる場合は、目的物と不純物とが十分に分離するように、１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１１０のディテクションタイムを十分に大きくする必要があり、目的物の分離に時間がかかる。本実施形態では実施形態１と同じ効果も奏する。
【００３８】
（その他の実施形態）
上述の実施形態は本願発明の例示であって、本願発明はこれらの例に限定されず、これらの例に周知技術や慣用技術、公知技術を組み合わせたり、一部置き換えたりしてもよい。また当業者であれば容易に思いつく改変発明も本願発明に含まれる。
【００３９】
オリゴヌクレオチドの製造方法は、βシアノエチルホスホロアミダイト法に限定されず、他の公知の製造方法であっても構わない。また、固相法に限定されず、液相法を用いてもよい。
【００４０】
オリゴヌクレオチドにおいては、連結されているヌクレオシドの数（Ｎ個）は２以上であればよく、特に限定されない。
【００４１】
キャッピング化合物は、図１に示す各サイクルにおいて全て同じ物質を用いてもよいし、各サイクルごとに異なる物質を用いてもよいし、特定のサイクル（１つのサイクル又は複数のサイクル）のみ他のサイクルと異なる物質を用いてもよい。キャッピング化合物は、カルボン酸無水物が好ましく、カルボン酸の種類は特に限定されない。例えば、プロピオン酸無水物、酪酸無水物、吉草酸無水物、ラウリン酸無水物などの飽和脂肪酸の無水物、無水安息香酸などの芳香族カルボン酸無水物等を好ましく挙げることができる。その他、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸又はアジピン酸などの飽和ジカルボン酸の無水物でもよく、アクリル酸、メタクリル酸、オレイン酸又はリノール酸などの不飽和モノカルボン酸の無水物でもよい。また、マレイン酸やフマル酸などの不飽和ジカルボン酸の無水物でもよい。その他、カルボキシル基の他に水酸基等の別の官能基を有しているカルボン酸（例えばサリチル酸）の無水物であってもよい。
【００４２】
実施形態２において、１ｍｅｒ〜６ｍｅｒのオリゴヌクレオチドに結合させるキャッピング化合物を無水酢酸に変更してもよい。このとき、キャッピング化合物が結合された７ｍｅｒ〜９ｍｅｒのオリゴヌクレオチドは、キャッピング化合物が無水酢酸である場合は１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの直前であって近くに検出されるため、分離時間を十分に長くして分離を行う必要があるが、キャッピング化合物を安息香酸無水物にしているので、１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの後ろ側に出てくる。そして、キャッピング化合物が結合された６ｍｅｒのオリゴヌクレオチドはＨＰＬＣにおいて１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドと十分分離された位置に出てくるため、ＨＰＬＣの分離時間を短縮できる。
【００４３】
なお、キャッピング工程を行うのは、各サイクルでの未反応ヌクレオチドを、それ以上反応しないようにそのサイクルでキャップして、合成終了後の精製段階において、目的物と分子量や物性（例えば親水性）を大きく異なるものにすることにより、精製を容易にすることが目的である。しかしながら、本願に開示された、酢酸無水物とは異なるキャッピング化合物を用いれば、例えば、１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを合成する際、１〜６サイクルではキャッピング工程を行わず、７〜９サイクルにおいてのみキャッピング工程を行うことにすれば、クロマトグラフィーにおいて目的物が現れる位置と、不純物が現れる位置とは大きく異ならせることが可能になり、６サイクル分のキャッピング工程を行わないことにより、コストを低減できて製造時間を短縮することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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