(57)【要約】【課題】抗ＨＥＲ２糖操作抗体群およびその使用の提供。【解決手段】本開示は、Ｆｃのそれぞれに同じＮ−グリカンを有する抗ＨＥＲ２ＩｇＧ分子の均一な集団を含む新規クラスの抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体に関する。本発明の抗体は、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体からＦｃ糖鎖工学によって作製することができる。重要なことに、本発明の抗体は、糖鎖工学により操作されていない対応するモノクローナル抗体と比較してＡＤＣＣ活性が増大し、Ｆｃ受容体結合親和性が増大した、改善された治療的価値を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１４年５月２７日に出願された米国仮出願連続番号第（ＵＳＳＮ）６２／００３，１０４号、２０１４年７月２日に出願されたＵＳＳＮ  ６２／０２０，１９９号および２０１５年１月３０日に出願されたＵＳＳＮ  ６２／１１０，３３８号への優先権の利益を主張する。これらそれぞれの内容は、それらの全体が参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
Ｆｃグリコシル化は、治療用モノクローナル抗体の分野において重要な主題となっている。Ｆｃグリコシル化により、Ｆｃ受容体結合および補体活性化などのＦｃエフェクター機能を有意に改変する、したがって、治療用抗体のｉｎ  ｖｉｖｏにおける安全性および有効性プロファイルに影響を及ぼすことができる。
【０００３】
遺伝子操作に基づくいくつかの発現系により治療用モノクローナル抗体が産生されることが報告されている。これらとしては、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなどの酵母、昆虫細胞株、および、さらには細菌が挙げられる。しかし、これらの発現系には、治療用抗体のエフェクター機能に負の影響を及ぼす可能性があるいくつかの欠点がある。
【０００４】
大多数の認可を受けた生物製剤は、所望のグリコシル化パターンを有するタンパク質を送達し、したがって、免疫原性の低下およびより高いｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性および安定性を確実にするために、哺乳動物細胞培養系において産生される。ＣＨＯ細胞またはＮＳ０細胞などの非ヒト哺乳動物発現系は、複雑な、ヒト型グリカンを付加するために必要な機構を有する。しかし、これらの系において産生されるグリカンは、ヒトにおいて産生されるグリカンとは異なる可能性がある。それらのグリコシル化機構により、多くの場合、タンパク質フォールディングを変更させ、免疫原性を誘導し、薬物の循環寿命を短縮させる可能性がある望ましくない炭水化物決定因子が付加される。特に、Ｎ−アセチルノイラミン酸のようなシアル酸は大多数の哺乳動物細胞では効率的に付加されず、これらの細胞では６−結合が欠けている。シアル酸の移行に必要な種々の酵素活性を用いた細胞の工学的操作では、タンパク質薬にヒト様パターンのグリコフォームを成功裏にもたらすことが未だできていない。現在まで、動物細胞または糖タンパク質を工学的に操作してヒトタンパク質と可能な限り密接に類似した、高度にシアリル化された産物をもたらすことが必要とされている。
【０００５】
さらに、哺乳動物の細胞培養では、全てが同じ性質を有するとは限らないグリコシル化パターンの不均一な混合物が送達される。治療用タンパク質の安全性、有効性および血清中半減期のような性質は、これらのグリコシル化パターンの影響を受ける可能性がある。
【０００６】
トラスツズマブ（ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（登録商標））は、ＨＥＲ２過剰発現転移性乳がんの患者の処置に関して１９９８年に認可を受けたものであり（Ｂａｓｅｌｇａら、（１９９６年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  １４巻：７３７〜７４４頁）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ受容体の細胞外構成成分に結合するヒト化抗ＨＥＲ２ＩｇＧ抗体である。ＨＥＲ２の過剰発現は、ヒト乳がんのおよそ２０％において観察され（以下、ＨＥＲ２陽性乳がんと称される）、これらの腫瘍に付随する侵襲性の成長および臨床転帰不良に関係づけられる（Ｓｌａｍｏｎら（１９８７年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５巻：１７７〜１８２頁）。トラスツズマブは種々の異なる機構で機能するが、主要な作用は、がん細胞の表面上のヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ−２）の細胞外膜部分に結合し、それにより、その細胞内チロシンキナーゼの活性化を妨げることである。ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）は、免疫系により媒介される抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に作用し、補体を固定することができるが、補体依存性細胞傷害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）（ＣＤＣ）を媒介することはできないと考えられている。
トラスツズマブは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において産生され、Ｆｃドメインにおけるグリコシル化パターンが非常に不均一である。不均一な混合物中の抗ＨＥＲ２ＩｇＧ分子のそれぞれは全てが同じ性質を有するとは限らない可能性があり、また、治療用タンパク質に結合したある特定のＮ結合オリゴ糖により患者において望ましくない影響が誘発される可能性があり、したがって、これらは安全性に懸念があるとみなされる。単一の薬剤（単独療法）としてもたらされる抗体トラスツズマブに対する奏効率は、約１５〜２６％にわたる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂａｓｅｌｇａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（１９９６年）１４巻：７３７〜７４４頁
【非特許文献２】Ｓｌａｍｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７年）２３５巻：１７７〜１８２頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本開示の一態様は、Ｆｃのそれぞれに同じＮ−グリカンを有する抗ＨＥＲ２ＩｇＧ分子の均一な集団を含む抗ＨＥＲ２糖操作抗体群（ｇｌｙｃｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）の組成物に関する。本発明の抗ＨＥＲ２糖操作抗体群は、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体からＦｃ糖鎖工学によって作製することができる。重要なことに、抗ＨＥＲ２糖操作抗体群は、糖鎖工学により操作されていない対応するモノクローナル抗体と比較してＡＤＣＣ活性が増大したまたはＦｃ受容体結合親和性が増大した、改善された治療的価値を有する。
【０００９】
本明細書で使用される場合、「抗ＨＥＲ２糖操作抗体群（ｇｌｙｃｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」（「抗ＨＥＲ２ＧＡｂｓ」）という用語は、Ｆｃ上に同じグリコフォームを有する抗ＨＥＲ２ＩｇＧ分子の均一な集団を指す。「抗ＨＥＲ２糖操作抗体（ｇｌｙｃｏａｎｔｉｂｏｄｙ）」（「抗ＨＥＲ２ＧＡｂ」）という用語は、抗ＨＥＲ２糖操作抗体群内の個々のＩｇＧ分子を指す。
【００１０】
好ましい実施形態では、Ｎ−グリカンはＦｃ領域のＡｓｎ−２９７に付着している。
【００１１】
一部の実施形態では、本明細書に記載の抗ＨＥＲ２糖操作抗体（ｇｌｙｃｏａｎｔｉｂｏｄｙ）は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。好ましい実施形態では、糖操作抗体は、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））の軽鎖配列および重鎖配列を含む。
【００１２】
トラスツズマブからＦｃ糖鎖工学によって構築された、いくつかの機能的に活性な抗ＨＥＲ２糖操作抗体群が本明細書に開示されている。重要なことに、最適化グリコフォームを有する抗ＨＥＲ２糖操作抗体群は、トラスツズマブと比較して改善されたＡＤＣＣ活性を示す。これは、ＡＤＣＣ活性が改善された、均一にＦｃ−グリコシル化された抗ＨＥＲ２抗体が成功裏に生成されたことを示す最初の報告である。
【００１３】
一部の実施形態では、本明細書に記載の抗ＨＥＲ２糖操作抗体群は、トラスツズマブと比較してＦｃγＲＩＩＩＡへの増強された結合を示すという点で特徴付けられる。
【００１４】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＮ−グリカンは二分岐（ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）構造を有する。一部の実施形態では、Ｎ−グリカンは、バイセクティング（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）ＧｌｃＮＡｃを含む。
【００１５】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＮ−グリカンは、α２−６末端シアル酸を少なくとも１つ含む。ある特定の実施形態では、Ｎ−グリカンは、α２−６末端シアル酸を１つ含む。好ましい実施形態では、Ｎ−グリカンは、α２−６末端シアル酸を２つ含む。
【００１６】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＮ−グリカンは、α２−３末端シアル酸を少なくとも１つ含む。ある特定の実施形態では、Ｎ−グリカンは、α２−３末端シアル酸を１つ含む。好ましい実施形態では、Ｎ−グリカンは、α２−３末端シアル酸を２つ含む。
【００１７】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＮ−グリカンは、ガラクトースを少なくとも１つ含む。ある特定の実施形態では、Ｎ−グリカンは、ガラクトースを１つ含む。好ましい実施形態では、Ｎ−グリカンは、ガラクトースを２つ含む。
【００１８】
本開示によるＮ−グリカンは、コアフコースを含まないことが好ましい。
【００１９】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＮ−グリカンは、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群より選択される配列を有する。
【００２０】
好ましい実施形態では、本明細書に記載のＮ−グリカンは、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群より選択される配列を有する。
【００２１】
本開示の別の態様は、本明細書に記載の抗ＨＥＲ２糖操作抗体群またはその抗原結合性断片の組成物と薬学的に許容される担体とを含む医薬製剤を特徴とする。
【００２２】
本開示による医薬製剤は、治療薬に使用することができる。本発明の抗ＨＥＲ２ＧＡｂ分子は、ＨＥＲ２に関連するヒト疾患を処置および診断するために有用である。好ましい実施形態では、乳がんまたは他のＨＥＲ２関連腫瘍または他の疾患を有する患者に抗ＨＥＲ２ＧＡｂ分子を投与する。
【００２３】
本開示には、患者においてＨＥＲ２発現がんを処置するための方法であって、患者に、有効量の本明細書に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法が含まれる。
【００２４】
一部の実施形態では、ＨＥＲ２発現がんは乳がんである。
【００２５】
本発明の抗ＨＥＲ２ＧＡｂ分子は、これだけに限定されないが化学療法および放射線療法を含めた他の抗がん療法と組み合わせて、そしてある特定の他の場合にはＧ−ＣＳＦなどのいくつかのサイトカインと組み合わせて投与することができる。
【００２６】
さらに、本開示は、単独療法、または実質的に均一な本明細書に記載の糖操作抗体群と他の抗体および／もしくは他の治療剤とを含む併用療法に適した組み合わせ医薬組成物も提供する。医薬組成物は、共製剤（ｃｏｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）として投与することもでき、共投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）治療レジメンで使用することもできる。
【００２７】
本明細書に記載の抗ＨＥＲ２糖操作抗体群は、ＦＤＡによる認可を受けたまたは開発中の抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体から生成することができる。抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体は、ヒト化モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体またはキメラモノクローナル抗体であってよい。
【００２８】
本明細書に記載の抗ＨＥＲ２糖操作抗体群は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製することができる。抗ＨＥＲ２糖操作抗体群は、Ｆｃ糖鎖工学によって生成することができる。ある特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２糖操作抗体群は、哺乳動物細胞培養によって得られた抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体から酵素的にまたは化学酵素的に工学的に作製される。
【００２９】
さらに別の態様では、本開示は、抗ＨＥＲ２糖操作抗体を作出する方法であって、（ａ）抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体をアルファ−フコシダーゼおよび少なくとも１種のエンドグリコシダーゼと接触させ、それにより、Ｆｃ上に脱フコシル化単糖ＧｌｃＮＡｃを有する抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体を作製するステップと、（ｂ）適切な条件下でＧｌｃＮＡｃに炭水化物部分を付加するステップと含む方法に関する。
【００３０】
一部の実施形態では、抗ＨＥＲ２糖操作抗体を作出するために使用される抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体はトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））である。
【００３１】
一部の実施形態では、炭水化物部分は、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃおよびＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃからなる群より選択される。
【００３２】
好ましい実施形態では、炭水化物部分は、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃからなる群より選択される。
【００３３】
ステップ（ｂ）の付加は、トランスグリコシラーゼによって実施することができる。トランスグリコシラーゼとしては、これだけに限定されないが、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＡおよびＥｎｄｏＭが挙げられる。
【００３４】
本発明の方法に有用なエンドグリコシダーゼとしては、これだけに限定されないが、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＭおよびＥｎｄｏ−Ｆ３が挙げられる。
【００３５】
一部の実施形態では、アルファ−フコシダーゼは、配列番号５と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００３６】
ある特定の実施形態では、アルファ−フコシダーゼは、組換えＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓアルファ−Ｌ−フコシダーゼである。
【００３７】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細が以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴または利点は、以下の図およびいくつかの実施形態の詳細な説明から、ならびに添付の特許請求の範囲からも明らかになるであろう。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
各抗ＨＥＲ２ＩｇＧ分子のＦｃ領域に同じＮ−グリカンを有する抗ＨＥＲ２ＩｇＧ分子の均一な集団を含む抗ＨＥＲ２糖操作抗体群または抗原結合性断片の組成物。
（項目２）
前記抗ＨＥＲ２ＩｇＧ分子が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記抗ＨＥＲ２ＩｇＧ分子が、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）の軽鎖配列および重鎖配列を含む、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記抗ＨＥＲ２糖操作抗体群が、トラスツズマブよりも改善されたＡＤＣＣを有することを特徴とする、項目１に記載の組成物。
（項目５）
前記抗ＨＥＲ２糖操作抗体群が、トラスツズマブよりも改善されたＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を有することを特徴とする、項目１に記載の組成物。
（項目６）
前記Ｎ−グリカンが前記Ｆｃ領域のＡｓｎ−２９７に付着している、項目１に記載の組成物。
（項目７）
前記Ｎ−グリカンがフコースを含まない、項目１に記載の組成物。
（項目８）
前記Ｎ−グリカンが、α２−６末端シアル酸を少なくとも１つ含む、項目１に記載の組成物。
（項目９）
前記Ｎ−グリカンが、α２−６末端シアル酸を２つ含む、項目１に記載の組成物。
（項目１０）
前記Ｎ−グリカンが、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群より選択される、項目１に記載の組成物。
（項目１１）
前記Ｎ−グリカンが、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群より選択される、項目１０に記載の組成物。
（項目１２）
項目１から１１までのいずれか一項に記載の抗ＨＥＲ２糖操作抗体群または抗原結合性断片の組成物と薬学的に許容される担体とを含む医薬製剤。
（項目１３）
ＨＥＲ２発現腫瘍の処置を必要とする患者においてＨＥＲ２発現腫瘍を処置する方法であって、前記患者に、有効量の項目１２に記載の医薬製剤を投与するステップを含む、方法。
（項目１４）
前記腫瘍がＨＥＲ２過剰発現腫瘍である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記ＨＥＲ２過剰発現腫瘍が乳がんである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記患者に、抗ＨＥＲ２治療剤を投与するステップをさらに含む、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記抗ＨＥＲ２治療剤がラパチニブ、トラスツズマブまたはペルツズマブである、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
第２の治療剤を共投与としてまたは共製剤として前記患者に投与するステップをさらに含む、項目１３に記載の方法。
（項目１９）
項目１に記載の抗ＨＥＲ２糖操作抗体を作出する方法であって、
（ａ）抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体をα−フコシダーゼおよび少なくとも１種のエンドグリコシダーゼと接触させ、それにより、単一のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有する脱フコシル化抗体を得るステップと、
（ｂ）適切な条件下でＧｌｃＮＡｃに炭水化物部分を付加するステップと
を含む、方法。
（項目２０）
前記抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体がトラスツズマブである、項目２３に記載の方法。（項目２１）
前記抗ＨＥＲ２糖操作抗体をｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製する、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
前記抗ＨＥＲ２糖操作抗体を、細胞培養によって得られた抗体から酵素的に工学的に作製する、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を流加培養するステップを含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
カップリングさせる前記グリカンが、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群より選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２５）
カップリングさせる前記グリカンが、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃからなる群より選択される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
ステップ（ｂ）の前記付加をトランスグリコシラーゼによって行う、項目１９に記載の方法。
（項目２７）
前記エンドグリコシダーゼが、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＳ２、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＦ、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３である、項目１９に記載の方法。（項目２８）
前記α−フコシダーゼが、配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、項目１９に記載の方法。
（項目２９）
前記α−フコシダーゼが組換えＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  α−フコシダーゼである、項目１９に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、モノクローナル抗体のＦｃ糖鎖工学の略図を示す。経路（Ａ）は、フコシル化抗体と非フコシル化抗体の混合物が生じる、当技術分野で公知の方法を示す。経路（Ｂ）は、均一な糖操作抗体群が生じる、本発明の方法を示す。
【００３９】
【図２】図２は、抗ＨＥＲ２ＧＡｂｓである１０２、１０２、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１１０および１１１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【００４０】
【図３】図３は、ＥＳＩ／ＭＳによる抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０１のインタクトな分子量を示す。
【００４１】
【図４】図４は、ＥＳＩ／ＭＳによる抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０４のインタクトな分子量を示す。
【００４２】
【図５】図５は、抗ＨＥＲ２ＧＡｂｓ  １０１のトリプシン消化後に切断されたグリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲのＭＳスペクトルを示す。
【００４３】
【図６】図６は、抗ＨＥＲ２ＧＡｂｓ  １０４のトリプシン消化後に切断されたグリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲのＭＳスペクトルを示す。
【００４４】
【図７】図７は、抗ＨＥＲ２ＧＡｂｓ  １０１、１０２、１０４、１０６、１０７、１０８、およびトラスツズマブのＡＤＣＣ活性を示す。リツキシマブは陰性対照として使用した。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
したがって、改善された抗ＨＥＲ２抗体を用いてモノクローナル抗体療法を改善することが依然として必要とされている。治療用抗体を生成する、目的の不均一な混合物中の数種類の特定のグリコフォームは、治療目的で、所望のグリコフォームとして明確に定義されたグリカン構造および配列を含有する。
【００４６】
本開示は、「糖操作抗体群（ｇｌｙｃｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という名称の新規クラスのモノクローナル抗体の開発に関する。「糖操作抗体群（ｇｌｙｃｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、本発明者、Ｃｈｉ−Ｈｕｅｙ  Ｗｏｎｇ博士により造り出されたものであり、Ｆｃ上に単一の一様なグリコフォームを有するモノクローナル抗体（好ましくは、治療用モノクローナル抗体）の均一な集団を指す。均一な集団を構成する個々の糖操作抗体群は同一であり、同じエピトープに結合し、また、明確に定義されたグリカン構造および配列を有する同じＦｃグリカンを含有する。
【００４７】
本発明の実施では、別段の指定のない限り、当技術分野の技術の範囲内に入る分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技法を使用する。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｉ巻およびＩＩ巻（Ｄ．  Ｎ．  Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５年）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．  Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．、１９８７年）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６年）；Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；論文集、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．  Ｈ．  ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．  Ｐ．  Ｃａｌｏｓ編、１９８７年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５４巻および１５５巻（Ｗｕら編）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７年）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ、１９８８年）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．  Ｍ．  ＷｅｉｒおよびＣ．  Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６年）を参照されたい。
【００４８】
定義：
本明細書で使用される場合、「グリカン」という用語は、多糖、オリゴ糖または単糖を指す。グリカンは糖残基の単量体であってもポリマーであってもよく、直鎖であっても分枝していてもよい。グリカンとしては、天然の糖残基（例えば、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、ガラクトース、マンノース、フコース、ヘキソース、アラビノース、リボース、キシロースなど）および／または修飾された糖（例えば、２’−フルオロリボース、２’−デオキシリボース、ホスホマンノース、６’スルホＮ−アセチルグルコサミンなど）が含まれ得る。グリカンとは、本明細書では、糖タンパク質、糖脂質、グリコペプチド、グリコプロテオーム、ペプチドグリカン、リポ多糖またはプロテオグリカンなどの複合糖質の炭水化物部分を指すためにも使用される。グリカンは、通常、単糖間のＯ−グリコシド結合のみからなる。例えば、セルロースはβ−１，４結合したＤ−グルコースで構成されるグリカン（または、より詳細にはグルカン）であり、キチンはβ−１，４結合したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンで構成されるグリカンである。グリカンは、単糖残基のホモポリマーであってもヘテロポリマーであってもよく、直鎖であっても分枝していてもよい。グリカンは、糖タンパク質およびプロテオグリカンのようにタンパク質に付着して見いだされ得る。グリカンは、一般に、細胞の外表面上に見いだされる。Ｏ結合およびＮ結合グリカンは、真核生物では非常に一般的であるが、原核生物においても、一般的ではないが見いだされ得る。Ｎ結合グリカンは、シークオン（ｓｅｑｕｏｎ）内のアスパラギンのＲ基窒素（Ｎ）に付着して見いだされる。シークオンは、Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ配列であり、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「フコース」、「コアフコース」および「コアフコース残基」という用語は、互換的に使用され、Ｎ−アセチルグルコサミンとα１，６位結合したフコースを指す。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「フコシル化された」という用語は、ＦｃのＮ−グリカンにコアフコースが存在することを指し、「脱フコシル化された」という用語は、ＦｃのＮ−グリカンにコアフコースが存在しないことを指す。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「Ｎ−グリカン」、「Ｎ結合グリカン」、「Ｎ結合グリコシル化」、「Ｆｃグリカン」および「Ｆｃグリコシル化」という用語は、互換的に使用され、Ｆｃを含有するポリペプチド内のアスパラギン残基のアミド窒素と結合したＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が付着したＮ結合オリゴ糖を指す。「Ｆｃを含有するポリペプチド」という用語は、Ｆｃ領域を含む、抗体などのポリペプチドを指す。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「グリコシル化パターン」および「グリコシル化プロファイル」という用語は、互換的に使用され、糖タンパク質または抗体から酵素的にまたは化学的に放出され、次いで、それらの炭水化物構造について、例えば、ＬＣ−ＨＰＬＣ、またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳなどを使用して分析されたＮ−グリカン種の特徴的な「指紋」を指す。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１巻、１号（２００５年）、２８〜５７頁の総説を参照されたい。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「糖鎖工学により操作されたＦｃ」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｆｃ領域上のＮ−グリカンが、酵素的にまたは化学的に変更または工学的に操作されていることを指す。「Ｆｃ糖鎖工学」という用語は、本明細書で使用される場合、糖鎖工学により操作されたＦｃを作出するために使用される酵素的または化学的なプロセスを指す。工学的操作の典型的な方法は、例えば、その内容が本明細書によって参照により組み込まれるＷｏｎｇら、ＵＳＳＮ１２／９５９，３５１に記載されている。
【００５４】
「エフェクター機能」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体Ｆｃ領域のＦｃ受容体またはリガンドとの相互作用によって生じる生化学的事象を指す。例示的な「エフェクター機能」としては、補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などが挙げられる。そのようなエフェクター機能は、当技術分野で公知の様々なアッセイを使用して評価することができる。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」という用語は、ある特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した、分泌されたＩｇにより、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を有する標的細胞に特異的に結合し、その後、細胞毒により標的細胞を死滅させることが可能になる、細胞傷害性の形態を指す。抗体は、細胞傷害性細胞を「武装」させるものであり、そのような死滅に絶対必要なものである。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲ発現は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９巻：４５７〜９２頁（１９９１年）の４６４頁、表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または米国特許第５，８２１，３３７号に記載されているものなどのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイを実施することができる。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。その代わりにまたはそれに加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５巻：６５２〜６５６頁（１９９８年）に開示されているものなどの動物モデルにおいて評価することができる。
【００５６】
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」という用語は、本明細書で使用される場合、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。古典的な補体経路の活性化は、同族抗原に結合する抗体（適切なサブクラスのもの）に補体系の第１の構成成分（Ｃ１ｑ）が結合することによって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２巻：１６３頁（１９９６年）に記載のＣＤＣアッセイを実施することができる。
【００５７】
「アポトーシスを誘導する」抗体とは、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞の収縮、小胞体の拡大、細胞断片化、および／または膜小胞（アポトーシス小体と称される）の形成によって決定されるプログラム細胞死を誘導する抗体である。細胞は、感染細胞であることが好ましい。アポトーシスに関連する細胞事象を評価するために種々の方法が利用可能である。例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）のトランスロケーションはアネキシン結合によって測定することができ、ＤＮＡ断片化はＤＮＡラダー化によって評価することができ、ＤＮＡ断片化に伴う核／クロマチン凝縮は低二倍体細胞の何らかの増加によって評価することができる。アポトーシスを誘導する抗体は、アネキシン結合アッセイにおいて、無処理の細胞に対して約２〜５０倍、好ましくは約５〜５０倍、最も好ましくは約１０〜５０倍のアネキシン結合の誘導をもたらす抗体であることが好ましい。
【００５８】
「キメラ」抗体（免疫グロブリン）は、特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である重鎖および／または軽鎖の一部を有し、鎖（複数可）の残りは、別の種に由来するまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体、ならびに所望の生物活性を示す限りはそのような抗体の断片、の対応する配列と同一または相同である（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１巻：６８５１〜６８５５頁（１９８４年））。ヒト化抗体とは、本明細書で使用される場合、キメラ抗体のサブセットである。
【００５９】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの部分に関して、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）由来の超可変領域残基で置き換えられた、ヒト免疫グロブリン（レシピエントまたはアクセプター抗体）である。いくつかの場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基で置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体においては見いだされない残基を含んでよい。これらの改変は、結合親和性などの抗体の性能をさらに磨くために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、一般には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域であるが、ＦＲ領域は結合親和性を改善する１つまたは複数のアミノ酸置換を含んでよい。ＦＲにおけるこれらのアミノ酸置換の数は、一般には、Ｈ鎖では６以下であり、Ｌ鎖では３以下である。ヒト化抗体は、場合により、一般にはヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分も含む。さらなる詳細に関しては、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１巻：５２２〜５２５頁（１９８６年）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２巻：３２３〜３２９頁（１９８８年）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ２巻：５９３〜５９６頁（１９９２年）を参照されたい。
【００６０】
「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「緩和」とは、治療的処置および予防または防止措置の両方を指し、ここで、目的は、標的とした病的状態または障害を防止するまたは減速させる（減らす）ことである。処置を必要とするものとしては、すでに障害を有するものならびに障害を有しやすいものまたは障害が防止されるべきものが挙げられる。被験体または哺乳動物は、治療量の抗体を本発明の方法に従って受けた後、患者が以下のうちの１つまたは複数の観察可能かつ／または測定可能な低下または不在を示した場合、感染に対して成功裏に「処置」されている：感染細胞の数の低下または感染細胞の不在；感染した総細胞のパーセントの低下；ならびに／または特定の感染に付随する症状のうちの１つまたは複数のいくらかの程度までの軽減；罹患率および死亡率の低下、ならびに生活の質の問題の改善。疾患における成功裏の処置および改善を評価するための上記のパラメータは医師によく知られている常套的な手順によって容易に測定可能である。
【００６１】
１種または複数種の別の治療剤「と組み合わせた（ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ）」投与は、同時（並行（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ））投与および任意の順序での連続した（ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ）投与を含む。
【００６２】
「担体」とは、本明細書で使用される場合、使用される投与量および濃度でそれに暴露される細胞または哺乳動物に対して非毒性である、薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む。多くの場合、生理的に許容される担体は、水性ｐＨ緩衝溶液である。生理的に許容される担体の例としては、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸を含めた抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含めた単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【００６３】
「糖操作抗体群（ｇｌｙｃｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、本発明者、Ｃｈｉ−Ｈｕｅｙ  Ｗｏｎｇ博士により造り出されたものであり、単一の一様化されたグリコフォームがＦｃ領域に結合したモノクローナル抗体（好ましくは、治療用モノクローナル抗体）の均一な集団を指す。基本的に均一な集団を構成する個々の糖操作抗体群は同一であり、同じエピトープに結合し、また、明確に定義されたグリカン構造および配列を有する同じＦｃグリカンを含有する。
【００６４】
「均一な（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）」、「一様な（ｕｎｉｆｏｒｍ）」、「一様に（ｕｎｉｆｏｒｍｌｙ）」および「均一性（ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）」という用語は、Ｆｃ領域のグリコシル化プロファイルに関しては、互換的に使用され、１つの所望のＮ−グリカン種によって単一のグリコシル化パターンが表され、前駆Ｎ−グリカンの痕跡量はほとんどないまたは全くないことを意味するものとする。ある特定の実施形態では、前駆Ｎ−グリカンの痕跡量は約２％未満である。
【００６５】
「基本的に純粋な」タンパク質とは、組成物の総重量に基づいて、例えば、少なくとも約９１重量％、少なくとも約９２重量％、少なくとも約９３重量％、少なくとも約９４重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９６重量％、少なくとも約９７重量％、少なくとも約９８重量％、または少なくとも約９９重量％を含め、少なくとも約９０重量％のタンパク質を含む組成物を意味する。
【００６６】
「基本的に均一な」タンパク質は、組成物の総重量に基づいて、例えば、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％を含め、少なくとも約９８重量％のタンパク質で構成される組成物を意味する。ある特定の実施形態では、タンパク質は、抗体、構造バリアント、および／またはその抗原結合性断片である。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「ＩｇＧ」、「ＩｇＧ分子」、「モノクローナル抗体」、「免疫グロブリン」、および「免疫グロブリン分子」という用語は、互換的に使用される。本明細書で使用される場合、「分子」とは、抗原結合性断片も指し得る。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体について述べるものである。好ましいＦｃＲは、ネイティブな配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲはＩｇＧ抗体に結合するもの（ガンマ受容体）であり、これらの受容体の対立遺伝子バリアントおよび代替的にスプライスされた形態を含め、ＦｃγＲＩサブクラスの受容体（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩサブクラスの受容体（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体（ＣＤ１６）が挙げられる。ＦｃγＲＩＩ受容体としてはＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「抑制受容体（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」）があり、これらは、同様のアミノ酸配列を有し、主にその細胞質ドメインが異なる。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン内に免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。抑制受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン内に免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（総説Ｍ．  ｉｎ  Ｄａｅｒｏｎ、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５巻：２０３〜２３４頁（１９９７年）を参照されたい）。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９巻：４５７〜９２頁（１９９１年）；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４巻：２５〜３４頁（１９９４年）；およびｄｅ  Ｈａａｓら、Ｊ．  Ｌａｂ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｅｄ．  １２６巻：３３０〜４１頁（１９９５年）に概説されている。今後同定されるものを含めた他のＦｃＲが本明細書における「ＦｃＲ」という用語に包含される。この用語は、母系ＩｇＧの胎児への移行に関与する新生児受容体、ＦｃＲｎも包含する（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１７巻：５８７頁（１９７６年）およびＫｉｍら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４巻：２４９頁（１９９４年））。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、免疫応答を引き出すことができる任意の物質と定義される。本明細書で使用される場合、「抗原特異的」という用語は、特定の抗原または抗原の断片の供給により特異的な細胞増殖がもたらされるような細胞集団の性質を指す。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「免疫原性」という用語は、免疫応答を刺激する免疫原、抗原、またはワクチンの能力を指す。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体またはＴ細胞受容体の抗原結合部位と接触する、抗原分子の一部と定義される。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「特異的に結合すること」という用語は、結合対（例えば、抗体と抗原）間の相互作用を指す。種々の例では、特異的に結合することは、約１０−６モル／リットル、約１０−７モル／リットル、または約１０−８モル／リットル、またはそれ未満の親和性定数によって具体化することができる。
【００７３】
「単離された」抗体とは、同定され、その天然の環境の構成成分から分離および／または回収された抗体である。その天然の環境の混入構成成分は、抗体の研究、診断または治療的な使用に干渉する材料であり、それらとして、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が挙げられる。
【００７４】
「実質的に類似した」、「実質的に同じ」、「等価の」、または「実質的に等価の」という句は、本明細書で使用される場合、２つの数値（例えば、一方が分子に関連し、他方が参照／比較用（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）分子に関連する）間の類似性の程度が十分に高く、したがって、当業者により、前記値（例えば、Ｋｄ値、抗ウイルス効果など）により測定される生物学的特性の文脈内で、その２つの値の差異の生物学的および／または統計的有意性がほとんどまたは全くないとみなされるだろうことを示す。前記２つの値の差異は、参照／比較用分子についての値の関数として、例えば、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、および／または約１０％未満である。
【００７５】
「実質的に低下した」または「実質的に異なる」という句は、本明細書で使用される場合、２つの数値（一般に、一方が分子に関連し、他方が参照／比較用分子に関連する）の差異の程度が十分に高く、したがって、当業者により、前記値（例えば、Ｋｄ値）により測定される生物学的特性の文脈内で、その２つの値の差異が統計的に有意であるとみなされるだろうことを示す。前記２つの値の差異は、参照／比較用分子についての値の関数として、例えば、約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、および／または約５０％超である。
【００７６】
「結合親和性」とは、一般に、（例えば、抗体）の単一の結合性部位とその結合パートナー（例えば、抗原）の間の非共有結合性の相互作用の総計の強度を指す。別段の指定のない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」とは、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する内因性の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載のものを含めた当技術分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は、一般に、抗原にゆっくりと結合し、容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は、一般に、抗原により速く結合し、より長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定する種々の方法は当技術分野で公知であり、そのいずれも本発明の目的に関して使用することができる。特定の例示的な実施形態は以下に記載されている。
【００７７】
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。これらのドメインは、一般に、抗体の最も可変性の部分であり、抗原結合部位を含有する。
【００７８】
「可変性」という用語は、可変ドメインのある特定の部分が、その配列が抗体の間で広範囲にわたって異なり、特定の抗体のそれぞれのその特定の抗原に対する結合および特異性に使用されるという事実を指す。しかし、可変性は抗体の可変ドメイン全体を通して一様に分布しているのではない。可変性は、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの両方にある相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と称される３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と称される。ネイティブな重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、大部分がベータ−シート立体配置をとっている４つのＦＲ領域を含み、これは、ベータ−シート構造の一部と接続し、いくつかの場合にはそれを形成するループを形成する３つのＣＤＲと接続している。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域の極めて近傍に一緒に保持され、他の鎖由来のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ（１９９１年）を参照されたい）。定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ）への抗体の関与などの、種々のエフェクター機能を示す。
【００７９】
抗体のパパイン消化により、それぞれが単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と称される２つの同一の抗原結合性断片と、容易に結晶化できることが名称に反映されている残りの「Ｆｃ」断片とが生じる。ペプシン処理により、抗原結合性部位を２つ有し、なお抗原と架橋結合することが可能なＦ（ａｂ’）２断片がもたらされる。
【００８０】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含有する最小の抗体断片である。二本鎖Ｆｖ種では、この領域は、密接に非共有結合により結びついた重鎖可変ドメイン１つと軽鎖可変ドメイン１つの二量体からなる。単鎖Ｆｖ種では、重鎖可変ドメイン１つと軽鎖可変ドメイン１つが柔軟なペプチドリンカーによって共有結合により連結していてよく、したがって、軽鎖および重鎖が二本鎖Ｆｖ種のものと類似した「二量体」構造で結びついていてよい。この立体配置では、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位が規定される。集合的に、６つのＣＤＲによって抗原結合特異性が抗体に付与される。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的なＣＤＲを３つのみ含むＦｖの半分）でさえ、結合性部位全体よりも親和性は低いが、抗原を認識し、それに結合する能力を有する。
【００８１】
Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステインを含めた重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端の数残基の付加により、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨとは、本明細書では、定常ドメインのシステイン残基（複数可）に遊離のチオール基を有するＦａｂ’に対する名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、最初は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生じた。抗体断片の他の化学的カップリングも公知である。
【００８２】
任意の脊椎動物種に由来する抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と称される、２つの明白に異なる型のうちの一方に割り当てることができる。
【００８３】
抗体（免疫グロブリン）は、重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには主要なクラスが５つ存在する：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、これらの一部は、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けられる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと称される。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および３次元立体配置は周知であり、一般に、例えば、Ａｂｂａｓら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４版（２０００年）に記載されている。抗体は、抗体と１つまたは複数の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合または非共有結合による結びつきによって形成されるより大きな融合分子の一部であってよい。
【００８４】
「全長抗体」、「インタクトな抗体」および「全抗体」という用語は、本明細書では互換的に使用され、下で定義される通り、抗体断片ではなく実質的にインタクトな形態にある抗体を指す。この用語は、特に、Ｆｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。
【００８５】
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部分のみを含み、その部分は、インタクトな抗体内に存在する場合にその部分に通常付随する機能の少なくとも１つ、できるだけ多く、大多数または全てを保持する。一実施形態では、抗体断片は、インタクトな抗体の抗原結合部位を含み、したがって、抗原に結合する能力を保持する。別の実施形態では、抗体断片、例えば、Ｆｃ領域を含む断片は、ＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能および補体結合などの、Ｆｃ領域がインタクトな抗体内に存在する場合に通常付随する生物学的機能の少なくとも１つを保持する。一実施形態では、抗体断片は、インタクトな抗体と実質的に類似したｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有する一価抗体である。例えば、そのような抗体断片は、断片にｉｎ  ｖｉｖｏにおける安定性を付与することが可能なＦｃ配列に連結した抗原結合性アームを含んでよい。
【００８６】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、微量に存在し得る、可能性のある天然に存在する変異以外は同一である。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特性を示す。そのようなモノクローナル抗体は、一般には、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、ここで、標的結合性ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合性ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスによって得られたものである。例えば、選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローンまたは組換えＤＮＡクローンのプールなどの複数のクローンから固有のクローンを選択することであってよい。例えば、標的に対する親和性を改善するため、標的結合配列をヒト化するため、細胞培養物中でのその産生を改善するため、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるその免疫原性を低下させるため、多重特異性抗体を創出するためなどで、選択された標的結合配列をさらに変更できること、および、変更された標的結合配列を含む抗体も本発明のモノクローナル抗体であることが理解されるべきである。一般には異なる決定因子（エピトープ）を対象とする異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子を対象とする。モノクローナル抗体調製物は、それらの特異性に加えて、一般には他の免疫グロブリンが混入していないという点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の特性を示すものであり、任意の特定の方法による抗体の作製が必要であるとは解釈されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５頁（１９７５年）；Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８年）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３〜６８１頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１年））、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９２年）；Ｓｉｄｈｕら、Ｊ．
Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３３８巻（２号）：２９９〜３１０頁（２００４年）；Ｌｅｅら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３４０巻（５号）：１０７３〜１０９３頁（２００４年）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１巻（３４号）：１２４６７〜１２４７２頁（２００４年）；およびＬｅｅら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４巻（１〜２号）：１１９〜１３２頁（２００４年）を参照されたい）、およびヒト免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子座または遺伝子の一部または全部を有する動物においてヒトまたはヒト様抗体を産生させるための技術（例えば、ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；ＷＯ９１／１０７４１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０巻：２５５１頁（１９９３年）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２巻：２５５〜２５８頁（１９９３年）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７巻：３３頁（１９９３年）；米国特許第５，５４５，８０７号；５，５４５，８０６号；５，５６９，８２５号；５，６２５，１２６号；５，６３３，４２５号；５，６６１，０１６号；Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ．
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８巻：８５６〜８５９頁（１９９４年）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８巻：８１２〜８１３頁（１９９４年）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １４巻：８４５〜８５１頁（１９９６年）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １４巻：８２６頁（１９９６年）およびＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１３巻：６５〜９３頁（１９９５年）を参照されたい）を含めた様々な技法によって作出することができる。
【００８７】
本明細書のモノクローナル抗体は、詳細には、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、鎖（複数可）の残りは、別の種に由来するまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体、ならびに所望の生物活性を示す限りはそのような抗体の断片、の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体を含む（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１巻：６８５１〜６８５５頁（１９８４年））。
【００８８】
以下の総説論文およびそこに引用されている参考文献も参照されたい：ＶａｓｗａｎｉおよびＨａｍｉｌｔｏｎ、Ａｎｎ．    Ａｌｌｅｒｇｙ，  Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １巻：１０５〜１１５頁（１９９８年）；Ｈａｒｒｉｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２３巻：１０３５〜１０３８頁（１９９５年）；ＨｕｒｌｅおよびＧｒｏｓｓ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ５巻：４２８〜４３３頁（１９９４年）。
【００８９】
「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」という用語は、本明細書で使用される場合、配列内で超可変性であり、および／または構造的に定義されているループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は、６つの超可変領域を含む；ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、およびＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）。いくつもの超可変領域の記述が使用されており、本明細書に包含される。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は配列の可変性に基づくものであり、最も一般的に使用されている（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１年））。Ｃｈｏｔｈｉａは、その代わりに、構造ループの場所に言及する（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６巻：９０１〜９１７頁（１９８７年））。ＡｂＭ超可変領域は、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造ループの折衷を示すものであり、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ  ＡｂＭ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｓｏｆｔｗａｒｅに使用されている。「ｃｏｎｔａｃｔ」超可変領域は、入手可能な複合体結晶構造の解析に基づくものである。これらの超可変領域のそれぞれに由来する残基を以下に示す。
ループ  Ｋａｂａｔ  ＡｂＭ  Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃｏｎｔａｃｔ
Ｌ１  Ｌ２４−Ｌ３４  Ｌ２４−Ｌ３４  Ｌ２６−Ｌ３２  Ｌ３０−Ｌ３６
Ｌ２  Ｌ５０−Ｌ５６  Ｌ５０−Ｌ５６  Ｌ５０−Ｌ５２  Ｌ４６−Ｌ５５
Ｌ３  Ｌ８９−Ｌ９７  Ｌ８９−Ｌ９７  Ｌ９１−Ｌ９６  Ｌ８９−Ｌ９６
Ｈ１  Ｈ３１−Ｈ３５Ｂ  Ｈ２６−Ｈ３５Ｂ  Ｈ２６−Ｈ３２  Ｈ３０−Ｈ３５Ｂ
（Ｋａｂａｔ番号付け）
Ｈ１  Ｈ３１−Ｈ３５  Ｈ２６−Ｈ３５  Ｈ２６−Ｈ３２  Ｈ３０−Ｈ３５
（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け）
Ｈ２  Ｈ５０−Ｈ６５  Ｈ５０−Ｈ５８  Ｈ５３−Ｈ５５  Ｈ４７−Ｈ５８
Ｈ３  Ｈ９５−Ｈ１０２  Ｈ９５−Ｈ１０２  Ｈ９６−Ｈ１０１  Ｈ９３−Ｈ１０１
【００９０】
超可変領域は、以下の通り「伸長された超可変領域」を含み得る：ＶＬにおける２４−３６または２４−３４（Ｌ１）、４６−５６または５０−５６または４９−５６（Ｌ２）および８９−９７または８９−９６（Ｌ３）、ならびにＶＨにおける２６−３５（Ｈ１）、５０−６５または４９−６５（Ｈ２）および９３−１０２、９４−１０２、または９５−１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基は、これらの定義のそれぞれについて、Ｋａｂａｔら、上記に従って番号付けされる。
【００９１】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基とは、本明細書において定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００９２】
「Ｋａｂａｔと同様の可変ドメイン残基の番号付け」または「Ｋａｂａｔと同様のアミノ酸位番号付け」という用語およびその変形は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１年）における抗体の編集物（ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ）の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのために使用される番号付け系を指す。この番号付け系を使用して、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＨＶＲにおける短縮、または挿入に対応して、より少ないまたは追加的なアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後ろに単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従って残基５２ａ）、および重鎖ＦＲ残基８２の後ろに挿入残基（Ｋａｂａｔに従って例えば残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含み得る。所与の抗体について、「標準の」Ｋａｂａｔ番号付けされた配列を有する抗体の配列の相同性の領域におけるアラインメントによって残基のＫａｂａｔ番号付けを決定することができる。
【００９３】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖内に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することが可能になる。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２６９〜３１５頁（１９９４年）を参照されたい。
【００９４】
「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、断片は、同じポリペプチド鎖内で接続した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）（ＶＨ−ＶＬ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間での対形成が可能になるには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインは強制的に別の鎖の相補的なドメインと対形成し、２つの抗原結合部位が創出される。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０巻：６４４４〜６４４８頁（１９９３年）により詳細に記載されている。
【００９５】
「ヒト抗体」とは、ヒトによって産生された抗体および／または本明細書に開示されているヒト抗体を作出するための技法のいずれかを使用して作出された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合性残基を含むヒト化抗体を明確に排除する。
【００９６】
「親和性成熟した」抗体とは、その１つまたは複数のＨＶＲに１つまたは複数の変更を伴う抗体であり、その変更により、それらの変更（複数可）を有さない親抗体と比較して、抗体の抗原に対する親和性の改善がもたらされる。一実施形態では、親和性成熟した抗体は、標的抗原に対してナノモル濃度またはさらにはピコモル濃度の親和性を有する。親和性成熟した抗体は、当技術分野で公知の手順によって作製される。Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年）には、ＶＨドメインおよびＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟が記載されている。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム変異誘発は、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１巻：３８０９〜３８１３頁（１９９４年）；Ｓｃｈｉｅｒら、Ｇｅｎｅ  １６９巻：１４７〜１５５頁（１９９５年）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５５巻：１９９４〜２００４頁（１９９５年）；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５４巻（７号）：３３１０〜９頁（１９９５年）；およびＨａｗｋｉｎｓら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２６巻：８８９〜８９６頁（１９９２年）により説明されている。
【００９７】
「遮断」抗体または「アンタゴニスト」抗体とは、それが結合する抗原の生物活性を阻害するまたは低下させる抗体である。ある特定の遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を実質的にまたは完全に阻害する。
【００９８】
「アゴニスト抗体」とは、本明細書で使用される場合、目的のポリペプチドの機能活性の少なくとも１つを模倣する抗体である。
【００９９】
「障害」とは、本発明の抗体を用いた処置から利益を得る任意の状態である。障害には、哺乳動物に問題の障害の素因を与える病的状態を含めた慢性および急性の障害または疾患が含まれる。本明細書において処置される障害の非限定的な例としてはがんが挙げられる。
【０１００】
「細胞増殖性障害」および「増殖性障害」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖に関連する障害を指す。一実施形態では、細胞増殖性障害はがんである。
【０１０１】
「腫瘍」とは、本明細書で使用される場合、悪性であるか良性であるかにかかわらず全ての新生細胞成長および増殖、ならびに全ての前がん性およびがん性細胞および組織を指す。「がん」、「がん性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」および「腫瘍」という用語は、本明細書で言及される場合、相互排他的なものではない。
【０１０２】
「がん」および「がん性」という用語は、一般に、調節されていない細胞成長／増殖を一般に特徴とする哺乳動物の生理的状態を指すまたは記述する。がんの例としては、これだけに限定されないが、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられる。そのようながんのより詳細な例としては、扁平上皮細胞がん（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｎｃｅｒ）、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇ）、腹膜がん、肝細胞がん、胃腸がん、膵がん（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ
ｃａｎｃｅｒ）、神経膠芽腫、子宮頸がん（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、卵巣がん（ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ）、肝がん、膀胱がん、ヘパトーマ、乳がん（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎がん、肝がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝癌、白血病および他のリンパ球増殖性障害、および種々の型の頭頸部がんが挙げられる。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、免疫応答を引き出すことができる任意の物質と定義される。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、「抗原特異的」という用語は、特定の抗原または抗原の断片の供給により特異的な細胞増殖がもたらされるような細胞集団の性質を指す。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、処置される個体または細胞の自然経過を変更する試みにおける臨床介入を指し、予防法のためまたは臨床病理の過程中のいずれかで実施することができる。望ましい処置の効果としては、疾患の出現または再発の防止、症状の緩和、疾患のあらゆる直接または間接的な病理学的影響の減弱、炎症および／または組織／器官損傷の防止または減少、疾患の進行の速度の低下、病態の好転または一時的緩和（ｐａｌｌｉａｔｉｏｎ）、および寛解または予後の改善が挙げられる。一部の実施形態では、疾患または障害の発生を遅延させるために本発明の抗体を使用する。
【０１０６】
「個体」または「被験体」は、脊椎動物である。ある特定の実施形態では、脊椎動物は、哺乳動物である。哺乳動物としては、これだけに限定されないが、農場動物（例えば、ウシなど）、競技動物、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ、およびウマなど）、霊長類、マウスおよびラットが挙げられる。ある特定の実施形態では、脊椎動物は、ヒトである。
【０１０７】
「哺乳動物」とは、処置の目的に関しては、ヒト、家畜動物および農場動物、ならびに動物園の動物、競技動物、または愛玩動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含めた、哺乳動物に分類される任意の動物を指す。ある特定の実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【０１０８】
「有効量」とは、治療的または予防的結果を達成するために必要な投与量および期間で有効な量を指す。
【０１０９】
本発明の物質／分子の「治療有効量」は、個体の病態、年齢、性別、および体重、ならびに個体における所望の応答を引き出す物質／分子の能力などの因子に応じて変動し得る。治療有効量は、物質／分子のあらゆる毒性の影響または有害な影響よりも治療的に有益な影響が上回る量でもある。「予防有効量」とは、所望の予防的結果を達成するために必要な投与量および期間で有効な量を指す。必ずではないが、一般に、予防用量は、被験体に疾患の前またはより早い段階で使用されるので、予防有効量は治療有効量よりも少なくなる。
【０１１０】
「細胞傷害性薬剤」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞の機能を阻害するもしくは妨げ、かつ／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位元素（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２およびＬｕの放射性同位元素）、化学療法剤（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤）、核酸分解酵素などの酵素およびその断片、抗生物質、ならびに、断片および／もしくはそのバリアントを含めた、細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素もしくは酵素的に活性な毒素などの毒素、ならびに以下に開示されている種々の抗腫瘍剤または抗がん剤を含むものとする。他の細胞傷害性薬剤が下に記載されている。殺腫瘍剤（ｔｕｍｏｒｉｃｉｄａｌ  ａｇｅｎｔ）は腫瘍細胞の破壊を引き起こすものである。
【０１１１】
「化学療法剤」はがんの処置において有用な化学化合物である。化学療法剤の例としては、チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、およびウレドパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチルオロメラミンを含めた、エチレンイミンおよびメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ−ラパコン（ｌａｐａｃｈｏｎｅ）；ラパコール（ｌａｐａｃｈｏｌ）；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレチン（ｓｃｏｐｏｌｅｃｔｉｎ）、および９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチイン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンギスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；クロラムブシル、クロマファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）などのニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）；エンジイン抗生物質（例えば、カリチアマイシン、特に、カリチアマイシンガンマ１ＩおよびカリチアマイシンオメガＩ１など（例えば、Ａｇｎｅｗ、Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔｌ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．、３３巻：１８３〜１８６頁（１９９４年）を参照されたい）；ジネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）Ａを含めたジネミシン；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カルビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗薬；デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキサート、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）；フォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルチン；ジアジクオン；エルフロルニチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ）酢酸塩；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシンおよびアンサマイトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ）；ラゾキサン；リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）；シゾフラン（ｓｉｚｏｆｕｒａｎ）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎ）Ａおよびアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、パクリタキセルのアルブミンで工学的に操作したナノ粒子製剤であるＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ−ｆｒｅｅ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌｌ．）、およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｖｉｎ）；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））；上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体；ならびに、上記の２つまたはそれ超の組み合わせ、例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの併用療法の略語であるＣＨＯＰ、および、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））と５−ＦＵおよびロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｖｉｎ）の組み合わせの処置レジメンの略語であるＦＯＬＦＯＸなどが挙げられる。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、「処置」とは、処置される個体または細胞の自然経過を変更する試みにおける臨床介入を指し、予防法のためまたは臨床病理の過程中のいずれかで実施することができる。望ましい処置の効果としては、疾患の出現または再発の防止、症状の緩和、疾患のあらゆる直接または間接的な病理学的影響の減弱、炎症および／または組織／器官損傷の防止または減少、疾患の進行の速度の低下、病態の好転または一時的緩和、および寛解または予後の改善が挙げられる。一部の実施形態では、疾患または障害の発生を遅延させるために本発明の抗体を使用する。
【０１１３】
「個体」または「被験体」は、脊椎動物である。ある特定の実施形態では、脊椎動物は、哺乳動物である。哺乳動物としては、これだけに限定されないが、農場動物（例えば、ウシなど）、競技動物、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ、およびウマなど）、霊長類、マウスおよびラットが挙げられる。ある特定の実施形態では、脊椎動物は、ヒトである。
【０１１４】
「哺乳動物」とは、処置の目的に関しては、ヒト、家畜動物および農場動物、ならびに動物園の動物、競技動物、または愛玩動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含めた、哺乳動物に分類される任意の動物を指す。ある特定の実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【０１１５】
「有効量」とは、所望される治療的または予防的結果を達成するために必要な投与量および期間で有効な量を指す。
【０１１６】
本発明の物質／分子の「治療有効量」は、個体の病態、年齢、性別、および体重、ならびに個体における所望の応答を引き出す物質／分子の能力などの因子に応じて変動し得る。治療有効量は、物質／分子のあらゆる毒性の影響または有害な影響よりも治療的に有益な影響が上回る量でもある。「予防有効量」とは、所望の予防的結果を達成するために必要な投与量および期間で有効な量を指す。必ずではないが、一般に、予防用量は、被験体に疾患の前またはより早い段階で使用されるので、予防有効量は治療有効量よりも少なくなる。
【０１１７】
「細胞傷害性薬剤」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞の機能を阻害するもしくは妨げ、かつ／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位元素（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２およびＬｕの放射性同位元素）、化学療法剤（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤）、核酸分解酵素などの酵素およびその断片、抗生物質、ならびに、その断片および／もしくはバリアントを含めた、細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素もしくは酵素的に活性な毒素などの毒素、および以下に開示されている種々の抗腫瘍剤または抗がん剤を含むものとする。他の細胞傷害性薬剤が下に記載されている。殺腫瘍剤は腫瘍細胞の破壊を引き起こすものである。
【０１１８】
１種または複数種の別の治療剤「と組み合わせた」投与は、同時（並行）投与および任意の順序での連続した投与を含む。
【０１１９】
糖操作抗体群
培養物中で哺乳動物細胞から産生された組換えタンパク質のグリコシル化は、治療用抗体の有効な使用を確実にすることにおける重要なプロセスである（Ｇｏｏｃｈｅｅら、１９９１年；ＪｅｎｋｉｎｓおよびＣｕｒｌｉｎｇ、１９９４年）。哺乳動物の細胞培養では、全てが同じ性質を有するわけではない、グリコシル化パターンの不均一な混合物が送達される。治療用タンパク質の安全性、有効性および血清中半減期のような性質は、これらのグリコシル化パターンの影響を受ける可能性がある。本発明者らは、「糖操作抗体群（ｇｌｙｃｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という名称の新規クラスのモノクローナル抗体を開発することにより、グリコフォーム不均一性問題に成功裏に対処した。
【０１２０】
「糖操作抗体群（ｇｌｙｃｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、本発明者、Ｃｈｉ−Ｈｕｅｙ  Ｗｏｎｇ博士により造り出されたものであり、Ｆｃ上に単一の一様化されたグリコフォームを有するモノクローナル抗体（好ましくは、治療用モノクローナル抗体）の均一な集団を指す。均一な集団を構成する個々の糖操作抗体群は同一であり、同じエピトープに結合し、また、明確に定義されたグリカン構造および配列を有する同じＦｃグリカンを含有する。
【０１２１】
糖操作抗体群は、市販されているまたは開発中のモノクローナル抗体（好ましくは、治療用モノクローナル抗体）から生成することができる。治療的使用のためのモノクローナル抗体は、ヒト化モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体またはキメラモノクローナル抗体であってよい。治療的使用のための認可されたモノクローナル抗体の例としては、これだけに限定されないが、ムロモナブ（Ｍｕｒｏｍｏｍａｂ）、アブシキシマブ、リツキシマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、エタネルセプト、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、イブリツモマブ（Ｉｂｒｉｔｏｍｏｍａｂ）、アダリムマブ、アレファセプト、オマリズマブ、エファリズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、ナタリズマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、エクリズマブおよびセルトリズマブが挙げられる。
【０１２２】
治療用モノクローナル抗体からＦｃ糖鎖工学によって導出された機能的に活性な糖操作抗体群が本明細書に記載されている。最適化グリコフォームを有する糖操作抗体群は、治療用モノクローナル抗体と比較してより強力な生物活性を示す。最適化グリコフォームを有する糖操作抗体群により、治療的使用のための代替物がもたらされ得ることが意図されている。
【０１２３】
抗ＨＥＲ２糖操作抗体（抗ＨＥＲ２ＧＡｂ）
ＨＥＲ２遺伝子は、乳がんのおよそ３０％で過剰発現または増幅される。ＨＥＲ２が過剰発現または増幅している乳がん患者では、無病生存期間および全生存期間が短縮される。ＨＥＲ２タンパク質は、固有であり、ＨＥＲ２遺伝子を過剰発現するがんの抗体療法に対する有用な標的であると考えられている。モノクローナル抗体である抗ＨＥＲ２、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））は、この標的に関する悪性のがんに対する療法において成功裏に使用されており、これは、ＨＥＲ２過剰発現乳がんの処置に関して１９９８年にＦＤＡによる認可を受けている。これだけに限定されないが、乳がんを含めた、ＨＥＲ２を発現する細胞が関与する様々な疾患の予防および／または処置においてより有効である、ＨＥＲ２に対する改善された治療用抗体がなお必要とされている。
【０１２４】
本開示は、「抗ＨＥＲ２糖操作抗体群」（「抗ＨＥＲ２ＧＡｂ」）と称される新規クラスの抗ＨＥＲ２抗体を特徴とする。抗ＨＥＲ２糖操作抗体群は、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体からＦｃ糖鎖工学によって生成することができる。均一な集団を構成する個々の抗ＨＥＲ２糖操作抗体群は同一であり、明確に定義されたグリカン構造および配列を有する同じＦｃグリカンを含有する。本発明による抗ＨＥＲ２ＧＡｂは、その親抗体と同じヒトＨＥＲ２抗原のエピトープに特異的に結合する。
【０１２５】
「親抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、抗ＨＥＲ２糖操作抗体を作製するために使用される抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体を指す。
【０１２６】
親抗体は、哺乳動物細胞培養物、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓまたは昆虫細胞株などの細胞培養によって得ることができる。親抗体は哺乳動物細胞培養物中で産生されることが好ましい。親抗体はＦＤＡの認可を受けたものであってもよく、開発中のものであってもよい。ＦＤＡの認可を受けた抗ＨＥＲ２治療用抗体としては、トラスツズマブ（ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ））、ラパチニブ（タイケルブ（Ｔｙｋｅｒｂ））、ペルツズマブ（Ｐｅｒｊｅｔａ）、アド−トラスツズマブエムタンシン（Ｋａｄｃｙｌａ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が挙げられる。
【０１２７】
一部の実施形態では、本明細書に記載の抗ＨＥＲ２ＧＡｂは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。好ましい実施形態では、抗ＨＥＲ２ＧＡｂは、トラスツズマブの軽鎖配列および重鎖配列を含む。
【０１２８】
以下の表１は、トラスツズマブの重鎖および軽鎖配列を示す。
【表１】
2020176143.tif 000002
【０１２９】
一部の実施形態では、Ｎ−グリカンはＦｃ領域のＡｓｎ−２９７に付着している。
【０１３０】
本発明によるＮ−グリカンは、「トリマンノースコア」または「五糖コア」とも称されるＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２という共通の五糖コアを有し、ここで、「Ｍａｎ」はマンノースを指し、「Ｇｌｃ」はグルコースを指し、「ＮＡｃ」はＮ−アセチルを指し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを指す。
【０１３１】
一部の実施形態では、Ｎ−グリカンは二分岐構造を有する。
【０１３２】
本明細書に記載のＮ−グリカンは、「バイセクティング」ＧｌｃＮＡｃを含む鎖内置換を有し得る。グリカンがトリマンノースコア上にバイセクティングＧｌｃＮＡｃを含む場合、構造は、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ３と表される。グリカンがトリマンノースコアに付着したコアフコースを含む場合、構造は、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆ）と表される。Ｎ−グリカンは、１つまたは複数の末端シアル酸（例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸）を含んでよい。「Ｓｉａ」と表される構造は、末端シアル酸を指す。シアリル化は、二分岐構造のα１−３アームまたはα１−６アームのいずれかにおいて起こり得る。
【０１３３】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＮ−グリカンは、α２−６末端シアル酸を少なくとも１つ含む。ある特定の実施形態では、Ｎ−グリカンは、α２−６末端シアル酸を１つ含む。好ましい実施形態では、Ｎ−グリカンは、α２−６末端シアル酸を２つ含む。
【０１３４】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＮ−グリカンは、α２−３末端シアル酸を少なくとも１つ含む。ある特定の実施形態では、Ｎ−グリカンは、α２−３末端シアル酸を１つ含む。好ましい実施形態では、Ｎ−グリカンは、α２−３末端シアル酸を２つ含む。
【０１３５】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＮ−グリカンは、ガラクトースを少なくとも１つ含む。ある特定の実施形態では、Ｎ−グリカンは、ガラクトースを１つ含む。好ましい実施形態では、Ｎ−グリカンは、ガラクトースを２つ含む。
【０１３６】
本開示によるＮ−グリカンは、コアフコースを含まないことが好ましい。
【０１３７】
表３は、抗ＣＤ２０糖操作抗体群における例示的なＮ−グリカンの一覧である。本開示の複数の実施形態は、本明細書において列挙されているＮ−グリカンのいずれを含んでもよく排除してもよい。
【表２−１】
2020176143.tif 000003
【表２−２】
2020176143.tif 000004
【表２−３】
2020176143.tif 000005
【０１３８】
抗ＨＥＲ２糖操作抗体群の生物学的特性
Ｆｃにおけるグリコシル化は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび循環半減期を含めた種々の免疫グロブリンエフェクター媒介性機能に影響を及ぼす可能性がある。ＡＤＣＣ増強は、治療用抗体の薬効を改善するための重要な戦略である。ＡＤＣＣ増強には、薬物費用の低減という利益のために、有効薬物投与量を低減させる潜在性がある。本明細書に記載の抗ＨＥＲ２糖操作抗体群は、機能的性質を特徴とし得る。抗ＨＥＲ２ＧＡｂは、ヒトＨＥＲ２発現細胞に対するアポトーシスを含めた細胞増殖阻害活性を有する。一部の実施形態では、抗ＨＥＲ２ＧＡｂは、その親抗体と比較してより強力な細胞増殖阻害活性を示す。
【０１３９】
抗ＨＥＲ２糖操作抗体群のＡＤＣＣ活性
本発明による糖操作抗体のＡＤＣＣ活性は、親抗体のＡＤＣＣ活性と比較して、少なくとも３倍増大した、好ましくは少なくとも９倍、より好ましくは少なくとも１０倍増大したＡＤＣＣ活性、好ましくは少なくとも１２倍増大したＡＤＣＣ活性、好ましくは少なくとも２０倍増大したＡＤＣＣ活性、最も好ましくは少なくとも３０倍増大したＡＤＣＣ活性である。
【０１４０】
本発明の糖操作抗体のＡＤＣＣ溶解活性は、ＳＫＢＲ５、ＳＫＢＲ３、ＬｏＶｏ、ＭＣＦ７、ＯＶＣＡＲ３および／またはＫａｔｏ  ＩＩＩなどの標的がん細胞株を使用して、親抗体と比較して測定することができる。
【０１４１】
表３は、トラスツズマブと比較した、抗ＨＥＲ２ＧＡｂｓの例示的なＡＤＣＣ活性の増強の一覧である。例示的なアッセイが実施例に記載されている。
【表３】
2020176143.tif 000006
【０１４２】
本明細書に記載のいくつかの抗ＨＥＲ２ＧＡｂｓ、特にＧＡｂ１０１およびＧＡｂ１０４は、その親抗体であるトラスツズマブと比較してＡＤＣＣ活性の増強を示す。本発明の糖操作抗体群は、ＨＥＲ２陽性疾患に対する治療剤として優れた効果を示し得、治療剤の開発における抗ＨＥＲ２ＧＡｂの使用は本発明の目的であることが意図されている。
【０１４３】
抗ＨＥＲ２糖操作抗体群のＣＤＣ活性
驚いたことに、本明細書に記載の糖操作抗体により、ＣＤＣに影響を及ぼすことなく、ＡＤＣＣの改善をもたらすことができる。例示的なＣＤＣアッセイが実施例に記載されている。例示的な実施形態では、糖操作抗体のＡＤＣＣは増大するが、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）などの他の免疫グロブリン型エフェクター機能は同様のままである、または有意には影響を受けない。
【０１４４】
ＦｃγＲＩＩＩと抗ＨＥＲ２糖操作抗体群との間の結合
表４は、抗ＨＥＲ２ＧＡｂｓおよびハーセプチンの例示的なＦｃγＲＩＩＩＡ結合の一覧である。
【表４】
2020176143.tif 000007
【０１４５】
ＦｃγＲＩＩＩＡ結合は、当技術分野で公知のアッセイを使用して測定することができる。例示的なアッセイが実施例に記載されている。Ｆｃ受容体結合は、抗ＨＥＲ２ＧＡｂ
対  トラスツズマブの相対比として決定することができる。例示的な実施形態では、Ｆｃ受容体結合は、少なくとも２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍または２０倍、３０倍、４０倍、５０倍またはそれを超えて増大する。
【０１４６】
結合データから、トラスツズマブと比較して、抗ＨＥＲ２ＧＡｂｓ、特にＧＡｂ１０１およびＧＡｂ１０４が標的分子ＨＥＲ２に対してより強力な結合親和性を示すことが示された。
【０１４７】
総合すると、抗ＨＥＲ２ＧＡｂｓ、特にＧＡｂ１０１およびＧＡｂ１０４は、トラスツズマブと比較して、ＡＤＣＣ活性の増強およびより強力なＦｃγＲＩＩＩＡ結合親和性を示す。本発明の糖操作抗体群により、単独で、または、好ましくは、そのような抗体を２種またはそれ超含む組成物中のいずれかで、および場合によって化学療法などの他の処置と組み合わせて優れた臨床応答をもたらすことができることが意図されている。ＡＤＣＣが増強された抗ＨＥＲ２糖操作抗体により、ＨＥＲ２陽性疾患に対する代替治療薬をもたらすことができることが意図されている。本発明の糖操作抗体群のエフェクター機能の増大は、より低濃度かつ低頻度で投薬することが可能になり、それにより、抗体毒性および／または抗体耐性の発生の潜在性が減少することを意味するので、有利なことに、本発明の糖操作抗体群を使用して、現在の投与経路および現在の治療レジメンを変更することができる。さらに、それらのエフェクター機能の改善により、組換え宿主系において産生された対応する抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体を用いた処置には以前に抵抗性または不応性であった臨床的適応症を処置するための新しい手法がもたらされる。
【０１４８】
抗ＨＥＲ２ＧＡｂの調製
本発明の抗ＨＥＲ２糖操作抗体群は、市販されているまたは前臨床または臨床開発中の抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（「親抗体」）からＦｃ糖鎖工学によって作製することができる。モノクローナル抗体は治療用モノクローナル抗体であることが好ましい。Ｆｃ糖鎖工学は、酵素的にまたは化学酵素的に実施することができる。好ましい実施形態では、親抗体はトラスツズマブである。
【０１４９】
本発明の糖操作抗体群におけるＮ−グリカンは、脱フコシル化されていることが好ましい。
【０１５０】
Ｎ−グリカンの脱フコシル化は、ＦｃドメインのＮ−グリカン内のコアフコースを除去するプロセスである。脱フコシル化は酵素的に使用することができる。Ｎ−グリカンは２つのＦｃドメイン間に埋め込まれているので、酵素的脱フコシル化効率は、立体的な障害、すなわち、フコシダーゼのフコース残基への接近がＦｃドメインの一部によって遮断されることに起因して、はるかに低い。
【０１５１】
多くのα−フコシダーゼが当技術分野で公知である。例としては、Ｔｕｒｂｏ  ｃｏｒｎｕｔｕｓ、Ｃｈａｒｏｎｉａ  ｌａｍｐａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｕｌｍｉｎａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、ウシ腎臓（Ｇｌｙｋｏ）、ニワトリ肝臓に由来するα−フコシダーゼ（Ｔｙａｇａｒａｊａｎら、１９９６年、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６巻：８３〜９３頁）およびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｎｉｈｏｔｉｓに由来するα−フコシダーゼＩＩ（Ｇｌｙｋｏ、ＰＲＯｚｙｍｅ）が挙げられる。同様に多種多様なフコシダーゼが市販されている（とりわけ、Ｇｌｙｋｏ、Ｎｏｖａｔｏ、Ｃａｌｉｆ．；ＰＲＯｚｙｍｅ、Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ、Ｃａｌｉｆ．；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）。しかし、コアフコースをＮ結合グリカンから効率的に除去することが分かっているα−フコシダーゼは存在しない。
【０１５２】
ＷＯ２０１３／１２０６６では、ウシ腎臓由来のα−フコシダーゼによる（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ−リツキシマブの脱フコシル化が開示された。ＷＯ２０１３／１２０６６に記載の通り、（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ−リツキシマブの反応混合物をウシ腎臓由来のα−フコシダーゼ（Ｐｒｏｚｙｍｅから市販されている）と一緒に３７℃で２０日間インキュベートして、（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ−リツキシマブのフコースが完全に除去された。
【０１５３】
免疫グロブリンの熱不安定性が本分野において知られている（Ｖｅｒｍｅｅｒら、Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．  Ｊａｎ  ７８巻：３９４〜４０４頁（２０００年））。Ｆａｂ断片は加熱処理に対する感受性が最も高く、一方、Ｆｃ断片は、ｐＨの低下に対する感受性が最も高い。抗体の熱安定性および機能活性を検査するために、ＷＯ２０１３／１２０６６に記載されているものと同じ実験を実施し、３７℃で３日間熱処理した後に抗体がＣＤ２０に対する結合親和性を約１０％失ったことを見いだした。さらに、本発明者らは、３７℃で７日間熱処理した後に抗体がＣＤ２０に対する結合親和性を約２０％失ったことを見いだした。ＷＯ２０１３／１２０６６に記載の通り、抗体のＣＤ２０に対する結合親和性は、３７℃で２０日間などの持続的な熱処理後に有意に失われることが意図されている。
【０１５４】
治療的価値が改善された糖操作抗体群を合成するための本発明者らの試みにおいて、Ｎ結合グリカンからフコース残基を効率的に除去することができるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ
ｆｒａｇｉｌｉｓ  α−フコシダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿２１２８５５．１）が予想外に発見された。効率的な脱フコシル化は、特定の酵素を使用して成功裏に達成されている。重要なことに、本発明の糖操作抗体群の作出効率は、図１において例示されているように、容易なＮ−グリカンの脱フコシル化をもたらす特定のα−フコシダーゼを使用することによって有益に改善されている。
【０１５５】
したがって、本発明は、α−フコシダーゼの組成物、および、α−フコシダーゼを使用してＮ−グリカンのコアフコースを除去するための、改善された方法を提供する。α−フコシダーゼは、配列番号５またはそのバリアントの配列に対して少なくとも８０％、８５％  ９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。脱フコシル化の改善された方法は、抗体をα−フコシダーゼと接触させるステップを含み、ここで、α−フコシダーゼは、配列番号５、そのバリアントまたは断片の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０１５６】
抗ＨＥＲ２糖操作抗体を作出するための、改善された方法であって、（ａ）抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体をα−フコシダーゼおよび少なくとも１種のエンドグリコシダーゼと接触させ、それにより、単一のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有する脱フコシル化抗体を得るステップと、（ｂ）適切な条件下でＧｌｃＮＡｃに炭水化物部分を付加するステップと、を含む方法が本明細書の記載に含まれる。
【０１５７】
一部の実施形態では、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体はトラスツズマブである。
【０１５８】
Ｎ−グリカン内のオリゴ糖の可変性部分を切り取るために、エンドグリコシダーゼを使用する。本明細書で使用されるエンドグリコシダーゼの例としては、これだけに限定されないが、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＦ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＳおよびそのバリアントが挙げられる。
【０１５９】
本発明の方法によるα−フコシダーゼは、配列番号５、その機能的バリアントの配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０１６０】
一部の実施形態では、α−フコシダーゼは、配列番号５、そのバリアントまたは断片の配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０１６１】
ある特定の実施形態では、α−フコシダーゼは、組換えＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  α−フコシダーゼである。
【表５】
2020176143.tif 000008
【０１６２】
本発明の方法のステップ（ａ）により、単一のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有する脱フコシル化抗体が導かれる。その後、トランスグリコシラーゼを使用した酵素媒介性グリコシル化を実施して、指定の炭水化物部分をＧｌｃＮＡｃに付加し、糖鎖を伸長させる。したがって、糖操作抗体群の均一な集団を作製することができる。本明細書に記載のトランスグリコシラーゼの例としては、これだけに限定されないが、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＦ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＳおよびそのバリアントが挙げられる。
【０１６３】
一部の実施形態では、本発明の方法による炭水化物部分は、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃおよびＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃからなる群より選択される。
【０１６４】
好ましい実施形態では、炭水化物部分は、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−３／α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ２（α２−６／α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−３）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃからなる群より選択される。
【０１６５】
本発明の方法におけるステップ（ｂ）により、糖鎖の伸長が導かれる。糖鎖を伸長させるための１つの方法は、酵素により触媒されるグリコシル化反応を通じたものである。グリコシル化反応は付加反応であり、いかなる酸、水などの付随的な排除も伴わずに進行するので、酵素により触媒されるグリコシル化反応の中でも、糖ドナーとして糖オキサゾリンを使用するグリコシル化がオリゴ糖の合成に関して有用であることが当技術分野で周知である（Ｆｕｊｉｔａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  ２００１年、１５２８巻、９〜１４頁）。
【０１６６】
一部の実施形態では、炭水化物部分は、糖オキサゾリンである。
【０１６７】
適切な条件は、反応混合物を少なくとも２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７０分、８０分、９０分または１００分、好ましくは６０分未満にわたってインキュベートすることも含む。インキュベーションは室温で行うことが好ましく、およそ２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃または４５℃で行うことがより好ましく、およそ３７℃で行うことが最も好ましい。
【０１６８】
本発明のα−フコシダーゼのポリペプチドは、それらの単離または精製を補助するために、誘導体化または修飾することができることが理解されよう。したがって、本発明の一実施形態では、本発明において使用するためのポリペプチドを、分離手段に直接かつ特異的に結合することができるリガンドを付加することによって誘導体化または修飾する。あるいは、ポリペプチドを、結合対の一方のメンバーを付加することによって誘導体化または修飾し、分離手段に、結合対の他方のメンバーを付加することによって誘導体化または修飾される試薬を含める。任意の適切な結合対を使用することができる。本発明において使用するためのポリペプチドを、結合対の一方のメンバーを付加することによって誘導体化または修飾する好ましい実施形態では、ポリペプチドにヒスチジン−タグを付けるまたはビオチン−タグを付けることが好ましい。一般には、ヒスチジンまたはビオチンタグのアミノ酸コード配列を遺伝子レベルで含め、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて組換えによりタンパク質を発現させる。ヒスチジンまたはビオチンタグは、一般には、ポリペプチドの一端、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかに存在する。ヒスチジンタグは、一般には６つのヒスチジン残基からなるが、これより長くてもよく、一般には、最大７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸または２０アミノ酸またはそれ未満、例えば、５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸または１アミノ酸であってよい。さらに、ヒスチジンタグは、アミノ酸置換、好ましくは上で定義されている保存的置換を１つまたは複数含有してよい。
【０１６９】
本明細書に記載のバリアントポリペプチドは、アミノ酸配列が配列番号５のものから変動するものであるが、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む酵素の同じまたは同様の機能を示す。
【０１７０】
本明細書で使用される場合、配列に関するパーセント（％）配列同一性は、配列をアラインメントし、必要であれば、最大のパーセント配列同一性を達成するためにギャップを導入した後の、参照ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である候補ポリペプチド配列内のアミノ酸残基の百分率と定義される。パーセント配列同一性を決定するためのアラインメントは、当技術分野の技術の範囲内である種々のやり方で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含めた、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【０１７１】
本発明のいくつかの好ましい実施形態が実施例において実証されている。
【０１７２】
医薬組成物および製剤
抗ＨＥＲ２ＧＡｂを本明細書に記載の通り調製した後、「凍結乾燥前製剤」を作製することができる。製剤を調製するための抗ＨＥＲ２ＧＡｂは、基本的に純粋であることが好ましく、基本的に均一であることが望ましい（すなわち、混入タンパク質などを含まない）。「基本的に純粋な」タンパク質とは、組成物の総重量に基づいて、少なくとも約９０重量％、好ましくは少なくとも約９５重量％のタンパク質を含む組成物を意味する。「基本的に均一な」タンパク質とは、組成物の総重量に基づいて、少なくとも約９９重量％のタンパク質を含む組成物を意味する。ある特定の実施形態では、タンパク質は抗体である。
【０１７３】
凍結乾燥前製剤中の抗ＨＥＲ２ＧＡｂの量は、所望の用量体積、投与の様式（複数可）などを考慮に入れて決定する。選択されたタンパク質がインタクトな抗体（全長抗体）である場合、例示的な出発タンパク質濃度は、約２ｍｇ／ｍＬから約５０ｍｇ／ｍＬまで、好ましくは約５ｍｇ／ｍＬから約４０ｍｇ／ｍＬまで、最も好ましくは約２０ｍｇ／ｍＬから３０ｍｇ／ｍＬまでである。タンパク質は、一般に、溶液中に存在する。例えば、タンパク質は、ｐＨ緩衝溶液中に約４〜８、好ましくは約５〜７のｐＨで存在し得る。例示的な緩衝液としては、ヒスチジン、リン酸、トリス、クエン酸、コハク酸および他の有機酸が挙げられる。緩衝液の濃度は、例えば、緩衝液および製剤（例えば、再構成製剤）の所望の等張性に応じて、約１ｍＭから約２０ｍＭまで、または約３ｍＭから約１５ｍＭまでであり得る。以下で実証される通り、凍結保護性を有し得るという点で、ヒスチジンが好ましい緩衝液である。コハク酸が別の有用な緩衝液であることが示された。
【０１７４】
凍結保護剤を凍結乾燥前製剤に添加する。好ましい実施形態では、凍結保護剤は、スクロースまたはトレハロースなどの非還元糖である。凍結乾燥前製剤中の凍結保護剤の量は、一般に、再構成した時に得られる製剤が等張性になるような量である。しかし、高張性の再構成製剤も適切であり得る。さらに、凍結保護剤の量は、凍結乾燥した時に許容されない量のタンパク質の分解／凝集が起こるほど少ないものであってはならない。凍結保護剤が糖（例えば、スクロースまたはトレハロースなど）であり、タンパク質が抗体である場合、凍結乾燥前製剤中の例示的な凍結保護剤濃度は、約１０ｍＭから約４００ｍＭまで、好ましくは約３０ｍＭから約３００ｍＭまで、最も好ましくは約５０ｍＭから約１００ｍＭまでである。
【０１７５】
タンパク質と凍結保護剤の比は、各々のタンパク質と凍結保護剤の組み合わせに対して選択する。タンパク質濃度が高い等張性の再構成製剤を生成するためにタンパク質としての選択された抗体と、凍結保護剤としての糖（例えば、スクロースまたはトレハロース）との場合、抗体に対する凍結保護剤のモル比は、１モルの抗体に対して約１００モルから約１５００モルまでの凍結保護剤、好ましくは１モルの抗体に対して約２００モルから約１０００モルまでの凍結保護剤、例えば、１モルの抗体に対して約２００モルから約６００モルまでの凍結保護剤であり得る。
【０１７６】
本発明の好ましい実施形態では、凍結乾燥前製剤に界面活性剤を添加することが望ましいことが見いだされた。その代わりに、またはそれに加えて、凍結乾燥製剤および／または再構成製剤に界面活性剤を添加することができる。例示的な界面活性剤としては、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０または８０）；ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）；トリトン；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；ラウリル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｌａｕｒｅｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）；オクチルグリコシドナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｏｃｔｙｌ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；ラウリルスルホベタイン、ミリスチルスルホベタイン、リノレイルスルホベタイン、またはステアリルスルホベタイン；ラウリルサルコシン、ミリスチルサルコシン、リノレイルサルコシンまたはステアリルサルコシン；リノレイルベタイン、ミリスチルベタイン、またはセチルベタイン；ラウロアミドプロピルベタイン、コカミドプロピルベタイン、リノールアミドプロピルベタイン、ミリスタミドプロピルベタイン、パルニドプロピルベタイン、またはイソステアラミドプロピルベタイン（例えばラウロアミドプロピル）；ミリスタミドプロピルジメチルアミン、パルミドプロピルジメチルアミン、またはイソステアラミドプロピルジメチルアミン；ナトリウムメチルココイルタウレート、または二ナトリウムメチルオレイルタウレート；およびＭＯＮＡＱＵＡＴＴＭシリーズ（Ｍｏｎａ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｐａｔｅｒｓｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、ポリエチルグリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリプロピルグリコール（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌ  ｇｌｙｃｏｌ）、およびエチレンとプロピレングリコールの共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＰＦ６８など）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。添加する界面活性剤の量は、再構成されたタンパク質の凝集が減少し、再構成後の微粒子物の形成が最小限になるような量にする。例えば、界面活性剤は、凍結乾燥前製剤中に、約０．００１〜０．５％、好ましくは約０．００５〜０．０５％の量で存在してよい。
【０１７７】
本発明のある特定の実施形態では、凍結乾燥前製剤の調製において、凍結保護剤（例えば、スクロースまたはトレハロースなど）と増量剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）の混合物を使用する。増量剤により、中に過剰なポケットを伴わない一様な凍結乾燥ケーキなどの作製が可能になり得る。
【０１７８】
製剤の所望の特性に悪影響を及ぼさないのであれば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版、Ｏｓｏｌ，  Ａ．編（１９８０年）に記載されているものなどの、他の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤を凍結乾燥前製剤（および／または凍結乾燥製剤および／または再構成製剤）に含めることができる。許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性のものであり、それらとして、追加的な緩衝剤；防腐剤；共溶媒；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；ＥＤＴＡなどのキレート剤；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ポリエステルなどの生分解性ポリマー；ならびに／またはナトリウムなどの塩形成性対イオンが挙げられる。
【０１７９】
本明細書に記載の医薬組成物および製剤は、安定であることが好ましい。「安定な」製剤／組成物とは、保管に際してその中の抗体の物理的安定性および化学的安定性および完全性が基本的に保持される製剤／組成物である。タンパク質安定性を測定するための種々の分析技法が当技術分野において利用可能であり、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、２４７〜３０１頁、Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、Ｐｕｂｓ（１９９１年）およびＪｏｎｅｓ，  Ａ．  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．
１０巻：２９〜９０頁（１９９３年）に概説されている。安定性は、選択された温度で選択された期間にわたって測定することができる。
【０１８０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用する製剤は、無菌であるべきである。これは、凍結乾燥および再構成の前またはその後に滅菌濾過膜を通して濾過することによって容易に達成される。あるいは、混合物全体の無菌性は、タンパク質以外の成分を、例えば約１２０℃で約３０分にわたってオートクレーブすることによって達成することができる。
【０１８１】
タンパク質、凍結保護剤および他の任意選択の構成成分を混合した後、製剤を凍結乾燥する。この目的のために、Ｈｕｌｌ５０（登録商標）（Ｈｕｌｌ、ＵＳＡ）またはＧＴ２０（登録商標）（Ｌｅｙｂｏｌｄ−Ｈｅｒａｅｕｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）フリーズドライヤーなどの多くの異なるフリーズドライヤーが利用可能である。フリーズドライは、製剤を凍結させ、その後、一次乾燥に適した温度で凍結した内容物から氷を昇華させることによって達成される。この条件の下で、産物の温度は製剤の共融点または崩壊温度を下回る。一般には、一次乾燥の棚温度は、一般には約５０〜２５０ｍＴｏｒｒにわたる適切な圧力で、約−３０〜２５℃にわたる（産物が一次乾燥の間凍結したままであることを条件とする）。乾燥に必要な時間は、主に、製剤、試料を保持する容器のサイズおよび型（例えば、ガラスバイアル）ならびに液体の体積により規定され、これは、数時間から数日（例えば、４０〜６０時間）までにわたる。二次乾燥段階は、主に、使用する容器の型およびサイズならびにタンパク質の型に応じて、約０〜４０℃で行うことができる。しかし、本明細書では、二次乾燥ステップは必要でない場合があることが見いだされた。例えば、凍結乾燥の水除去相全体を通した棚温度は、約１５〜３０℃（例えば、約２０℃）であり得る。二次乾燥に必要な時間および圧力は、例えば温度および他のパラメータに応じて、適切な凍結乾燥ケーキが生じる時間および圧力である。二次乾燥時間は、産物中の所望の残留水分レベルにより規定され、一般には、少なくとも約５時間（例えば、１０〜１５時間）かかる。圧力は、一次乾燥ステップの間に使用する圧力と同じであってよい。フリーズドライ条件は、製剤およびバイアルサイズに応じて変動し得る。
【０１８２】
いくつかの場合には、移行ステップを回避するために、タンパク質の再構成を行う容器中でタンパク質製剤を凍結乾燥することが望ましい。この場合、容器は、例えば、３ｃｃ、５ｃｃ、１０ｃｃ、２０ｃｃ、５０ｃｃまたは１００ｃｃのバイアルであってよい。一般命題として、凍結乾燥により、水分含量が約５％未満、および好ましくは約３％未満である凍結乾燥製剤がもたらされる。
【０１８３】
所望の段階、一般には、タンパク質を患者に投与する時に、希釈剤を用いて凍結乾燥製剤を再構成し、したがって、再構成製剤中のタンパク質の濃度を少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、例えば、約５０ｍｇ／ｍＬから約４００ｍｇ／ｍＬまで、より好ましくは約８０ｍｇ／ｍＬから約３００ｍｇ／ｍＬまで、最も好ましくは約９０ｍｇ／ｍＬから約１５０ｍｇ／ｍＬまでにすることができる。そのような再構成製剤中の高タンパク質濃度は、再構成製剤の皮下送達が意図されている場合に特に有用であると考えられる。しかし、静脈内投与などの他の投与経路に関しては、再構成製剤中のタンパク質の濃度はより低いことが所望される場合がある（例えば、再構成製剤中、約５〜５０ｍｇ／ｍＬ、または約１０〜４０ｍｇ／ｍＬのタンパク質）。ある特定の実施形態では、再構成製剤中のタンパク質の濃度は、凍結乾燥前製剤中のタンパク質の濃度よりも有意に高い。例えば、再構成製剤中のタンパク質の濃度は、凍結乾燥前製剤中のタンパク質の濃度の約２〜４０倍、好ましくは３〜１０倍、最も好ましくは３〜６倍（例えば、少なくとも３倍または少なくとも４倍）であり得る。
【０１８４】
一般には、再構成は、完全な湿潤化（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）を確実にするために約２５℃の温度で行うが、所望であれば他の温度を使用することができる。再構成に必要な時間は、例えば、希釈剤の型、賦形剤（複数可）およびタンパク質の量に依存する。例示的な希釈剤としては、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）、滅菌食塩溶液、リンゲル液またはデキストロース溶液が挙げられる。希釈剤は、場合によって防腐剤を含有する。例示的な防腐剤が上に記載されており、好ましい防腐剤はベンジルまたはフェノールアルコールなどの芳香族アルコールである。使用する防腐剤の量は、異なる防腐剤濃度をタンパク質との適合性について評価すること、および防腐剤有効性試験によって決定する。例えば、防腐剤が芳香族アルコール（例えば、ベンジルアルコールなど）である場合、約０．１〜２．０％、好ましくは約０．５〜１．５％、しかし最も好ましくは約１．０〜１．２％の量で存在してよい。再構成製剤は、サイズが１０μｍ超の粒子をバイアル当たり６０００個未満有する。
【０１８５】
免疫コンジュゲート
別の態様では、本発明は、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはその断片）、もしくは放射性同位元素（すなわち、放射性コンジュゲート（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ））などの細胞傷害性薬剤とコンジュゲートした抗体を含む免疫コンジュゲート、または抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。
【０１８６】
がんの処置において、細胞傷害性薬剤または細胞増殖抑制剤、すなわち、腫瘍細胞を死滅させるまたは阻害するための薬物を局所送達するために抗体−薬物コンジュゲートを使用することにより（ＳｙｒｉｇｏｓおよびＥｐｅｎｅｔｏｓ（１９９９年）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９巻：６０５〜６１４頁；Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−ＤｕｖａｚおよびＳｐｒｉｎｇｅｒ（１９９７年）Ａｄｖ．  Ｄｒｇ  Ｄｅｌ．  Ｒｅｖ．  ２６巻：１５１〜１７２頁；米国特許第４，９７５，２７８号）、薬物部分の腫瘍への標的化送達、およびそこでの細胞内蓄積が可能になり、これらのコンジュゲートしていない薬物薬剤を全身投与した場合には、排除しようとする腫瘍細胞だけでなく、正常細胞に対しても許容されないレベルの毒性が生じる可能性がある（Ｂａｌｄｗｉｎら、（１９８６年）Ｌａｎｃｅｔ（１９８６年３月１５日）：６０３〜０５頁；Ｔｈｏｒｐｅ、（１９８５年）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ
Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａ．  Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５〜５０６頁）。そのため、最小の毒性での最大の有効性が求められる。ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体のどちらもこれらの戦略において有用であることが報告されている（Ｒｏｗｌａｎｄら、（１９８６年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、２１巻：１８３〜８７頁）。これらの方法において使用される薬物としては、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、およびビンデシンが挙げられる（Ｒｏｗｌａｎｄら、（１９８６年）、上記）。抗体−毒素コンジュゲートに使用される毒素としては、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシンなどの植物毒素、ゲルダナマイシンなどの小分子毒素（Ｍａｎｄｌｅｒら（２０００年）Ｊｏｕｒ．  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔ．  Ｃａｎｃｅｒ
Ｉｎｓｔ．  ９２巻（１９号）：１５７３〜１５８１頁；Ｍａｎｄｌｅｒら（２０００年）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １０巻：１０２５〜１０２８頁；Ｍａｎｄｌｅｒら（２００２年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  １３巻：７８６〜７９１頁）、メイタンシノイド（ＥＰ１３９１２１３；Ｌｉｕら、（１９９６年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３巻：８６１８〜８６２３頁）、およびカリチアマイシン（Ｌｏｄｅら（１９９８年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５８巻：２９２８頁；Ｈｉｎｍａｎら（１９９３年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５３巻：３３３６〜３３４２頁）が挙げられる。毒素は、チューブリン（ｔｕｂｕｔｉｎ）結合、ＤＮＡ結合、またはトポイソメラーゼ阻害を含めた機構によってそれらの細胞傷害効果および細胞増殖抑制効果に影響を及ぼす可能性がある。いくつかの細胞傷害性薬物は、大型の抗体またはタンパク質受容体リガンドとコンジュゲートすると不活性になるまたは活性が低くなる傾向がある。
【０１８７】
抗体誘導体
本発明の抗体は、当技術分野で公知であり、容易に入手可能な追加的な非タンパク質性部分を含有するようにさらに改変することができる。一実施形態では、抗体の誘導体化に適した部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、これだけに限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダム共重合体）、およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ホモポリマー、ポリプロピレンオキシド（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ）／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中で安定であるので、製造において有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量のものであってよく、また、分枝していても分枝していなくてもよい。抗体に付着させるポリマーの数は変動し得、１つ超のポリマーを付着させる場合、そのポリマー分子は同じであっても異なってもよい。一般に、誘導体化に使用するポリマーの数および／または型は、これだけに限定されないが、改善しようとする抗体の特定の性質または機能、抗体誘導体が規定の条件下で療法に使用されるものであるかなどを含めた考察に基づいて決定することができる。
【０１８８】
別の実施形態では、放射に曝露させることによって選択的に加熱することができる抗体と非タンパク質性部分のコンジュゲートが提供される。一実施形態では、非タンパク質性部分は、炭素ナノチューブである（Ｋａｍら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １０２巻：１１６００〜１１６０５頁（２００５年））。放射は、任意の波長のものであってよく、これだけに限定されないが、普通の細胞は害されないが、非タンパク質性部分は抗体−非タンパク質性部分の近位の細胞が死滅する温度まで加熱される波長を含む。
【０１８９】
治療適用
トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））は、腫瘍がＨＥＲ２タンパク質を過剰発現するまたはＨＥＲ２遺伝子増幅を有する早期乳がんならびに転移性乳がんの患者の処置に関して広く使用されており、当技術分野で公知である。当技術分野では、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ／トラスツズマブを用いた乳がん患者の処置は、例えば、ＨＥＲ２陽性疾患を有する患者に対して推奨され、常套的なものである。乳がんにおけるＨＥＲ２陽性疾患は、免疫組織化学的方法によって検出される高いＨＥＲ２（タンパク質）発現レベル（例えば、ＨＥＲ２（＋＋＋）、もしくはＨＥＲ２遺伝子増幅（例えば、ＨＥＲ２遺伝子コピー数が腫瘍細胞当たり４コピーのＨＥＲ２遺伝子よりも多い）またはそれらの両方が、乳房組織生検材料もしくは乳房組織切除物などの患者から得られる試料において、もしくは転移部位に由来する組織において見いだされる場合に存在する。
【０１９０】
ＡＤＣＣが増強された抗ＨＥＲ２糖操作抗体群により、ＨＥＲ２発現腫瘍を処置するための代替治療薬がもたらされる。本発明の糖操作抗体群のエフェクター機能の増大は、より低濃度かつ低頻度で投薬することが可能になり、それにより、抗体毒性および／または抗体耐性の発生の潜在性が減少することを意味するので、有利なことに、本発明の糖操作抗体群を使用して、現在の投与経路および現在の治療レジメンを変更することができる。さらに、それらのエフェクター機能の改善により、組換え宿主系において産生された対応する抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体を用いた処置には以前に抵抗性または不応性であった臨床的適応症を処置するための新しい手法がもたらされる。
【０１９１】
したがって、本開示は、ＨＥＲ２発現腫瘍を有する患者を処置するための方法であって、患者に、有効量の本明細書に記載の糖操作抗体を投与するステップを含む方法に関する。好ましい態様では、本開示は、乳がんを処置するための方法を提供する。
【０１９２】
上記の組成物は医薬組成物であってよく、薬学的に許容される担体をさらに含んでよい。
【０１９３】
組成物は、それを必要とする被験体（例えば、がんを有する、または有する疑いがあるヒト患者）に組成物を投与することによって送達することができる。一部の実施形態では、抗がん剤をがんの処置に有効な量で被験体に送達する。他の実施形態では、検出可能な標識、好ましくはがんの画像化に適した薬剤をがん細胞および／またはがん性組織の検出に有効な量で被験体（例えば、固形腫瘍を有する、または有する疑いがあるヒト患者）に送達する。
【０１９４】
「アポトーシスを誘導する」抗体とは、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞の収縮、小胞体の拡大、細胞断片化、および／または膜小胞（アポトーシス小体と称される）の形成によって決定されるプログラム細胞死を誘導する抗体である。細胞は、感染細胞であることが好ましい。アポトーシスに関連する細胞事象を評価するために、種々の方法が利用可能である。例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）のトランスロケーションはアネキシン結合によって測定することができ、ＤＮＡ断片化はＤＮＡラダー化によって評価することができ、ＤＮＡ断片化に伴う核／クロマチン凝縮は低二倍体細胞の何らかの増加によって評価することができる。アポトーシスを誘導する抗体は、アネキシン結合アッセイにおいて、無処理の細胞に対して約２〜５０倍、好ましくは約５〜５０倍、最も好ましくは約１０〜５０倍のアネキシン結合の誘導をもたらす抗体であることが好ましい。
【０１９５】
抗体「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（ネイティブな配列のＦｃ領域またはアミノ酸配列バリアントのＦｃ領域）に起因する生物活性を指し、抗体のアイソタイプによって変動する。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御；およびＢ細胞活性化が挙げられる。
【０１９６】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」とは、ある特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した、分泌されたＩｇにより、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を有する標的細胞に特異的に結合し、その後、細胞毒により標的細胞を死滅させることが可能になる、細胞傷害性の形態を指す。抗体は、細胞傷害性細胞を「武装」させるものであり、そのような死滅に必要なものである。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲ発現は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９巻：４５７〜９２頁（１９９１年）の４６４頁、表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または米国特許第５，８２１，３３７号に記載されているものなどのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイを実施することができる。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。その代わりにまたはそれに加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ（ＵＳＡ）９５巻：６５２〜６５６頁（１９９８年）に開示されているものなどの動物モデルにおいて評価することができる。
【０１９７】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体について述べるものである。ある特定の実施形態では、ＦｃＲは、ネイティブな配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲはＩｇＧ抗体に結合するもの（ガンマ受容体）であり、これらの受容体の対立遺伝子バリアントおよび代替的にスプライスされた形態を含め、ＦｃγＲＩサブクラスの受容体、ＦｃγＲＩＩサブクラスの受容体、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体が挙げられる。ＦｃγＲＩＩ受容体としてはＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「抑制受容体（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」）があり、これらは、同様のアミノ酸配列を有し、主にその細胞質ドメインが異なる。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメイン内に免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。抑制受容体ＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメイン内に免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｍ．  Ｄａｅｒｏｎ、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５巻：２０３〜２３４頁（１９９７年）によって概説されている）。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９巻：４５７〜９２頁（１９９１年）；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４巻：２５〜３４頁（１９９４年）；およびｄｅ  Ｈａａｓら、Ｊ．  Ｌａｂ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｅｄ．  １２６巻：３３０〜４１頁（１９９５年）に概説されている。今後同定されるものを含めた他のＦｃＲが本明細書における「ＦｃＲ」という用語に包含される。この用語は、母系ＩｇＧの胎児への移行に関与する新生児受容体、ＦｃＲｎも包含する（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１７巻：５８７頁（１９７６年）およびＫｉｍら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４巻：２４９頁（１９９４年））。
【０１９８】
「ヒトエフェクター細胞」とは、１つまたは複数のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を発揮する白血球である。細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を発揮することが好ましい。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球が挙げられ、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、ネイティブな供給源から、例えば、血液から単離することができる。
【０１９９】
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」とは、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。古典的な補体経路の活性化は、同族抗原に結合した抗体（適切なサブクラスのもの）に補体系の第１の構成成分（Ｃ１ｑ）が結合することによって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２巻：１６３頁（１９９６年）に記載のＣＤＣアッセイを実施することができる。
【０２００】
「処置すること」または「処置」または「緩和」とは、治療的処置および予防または防止措置の両方を指し、ここで、目的は、標的とした病的状態または障害を防止するまたは減速させる（減らす）ことである。処置を必要とするものとしては、すでに障害を有するものならびに障害を有しやすいものまたは障害が防止されるべきものが挙げられる。被験体または哺乳動物は、治療量の抗体を本発明の方法に従って受けた後、患者が以下の１つまたは複数のうちの観察可能かつ／または測定可能な低下または不在を示した場合、感染に対して成功裏に「処置」されている：感染細胞の数の低下または感染細胞の不在；感染した総細胞のパーセントの低下；ならびに／または特定の感染に付随する症状のうちの１つまたは複数のいくらかの程度までの軽減；罹患率および死亡率の低下、ならびに生活の質の問題の改善。疾患における成功裏の処置および改善を評価するための上記のパラメータは医師によく知られている常套的な手順によって容易に測定可能である。
【０２０１】
「治療有効量」という用語は、被験体または哺乳動物における疾患または障害を「処置する」ために有効な抗体または薬物の量を指す。前述の「処置すること」の定義を参照されたい。
【０２０２】
１種または複数種の別の治療剤「と組み合わせた」投与は、同時（並行）投与および任意の順序での連続した投与を含む。
【０２０３】
「担体」とは、本明細書で使用される場合、使用される投与量および濃度でそれに暴露される細胞または哺乳動物に対して非毒性である、薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む。多くの場合、生理的に許容される担体は、水性ｐＨ緩衝溶液である。生理的に許容される担体の例としては、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸を含めた抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含めた単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０２０４】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細が以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴または利点は、以下の図およびいくつかの実施形態の詳細な説明から、ならびに添付の特許請求の範囲からも明らかになるであろう。
【０２０５】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示されている技法は、本発明者により、本発明の実施においてよく機能することが発見された技法であり、したがって、それを実施するための好ましい方式を構成するとみなすことができることが当業者には理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態に多くの変更を行うことができ、それでもなお、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果が得られることを理解するべきである。
【実施例】
【０２０６】
例示的な一般手順
【０２０７】
方法Ａ：チオ−グリカンドナーによるグリコシル化
グリコシル化のために、モレキュラーシーブＭＳ−４Åを活性化するために真空系に接続し、１時間加熱した。活性化したモレキュラーシーブを室温まで冷却した後、ドナー（１位置のグリコシル化について１．５〜２．０当量）およびアクセプター（１．０当量）を含有するフラスコに添加した。混合物にジクロロメタンを添加し、次いで、溶液を室温で３時間撹拌した。−７８℃で溶液にＮ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ、１．７〜２．２当量）およびトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（ＴＭＳＯＴｆ、０．１当量）を添加し、次いで、−２０℃で溶液を撹拌した。反応を、裏がガラスのシリカゲルプレート（Ｍｅｒｃｋ  ＤＣ  Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０Ｆ２５４）で行った薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析によってモニターし、ＵＶ光（２５４ｎｍ）および酸性モリブデン酸アンモニウムセリウムによって可視化した。アクセプターが完全に消費された後、飽和ＮａＨＣＯ３（ａｑ）および２０％Ｎａ２Ｓ２Ｏ３を用いて反応をクエンチし、次いで、混合物を、セライトのパッドを通して濾過した。２部分のジクロロメタンを用いて水層を抽出した後、合わせた有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濃縮した。粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出系としてトルエン／酢酸エチル）によって精製して、産物を生じさせた（収率をスキーム上に示した）。
【０２０８】
方法Ｂ：フッ化物−グリカンドナーによるグリコシル化
乾燥トルエン中トリフルオロメタンスルホン酸銀（５当量）、ビス（シクロペンタジエニル）ハフニウムジクロリド（３．５当量）および４Åの活性化したモレキュラーシーブの混合物を室温で１時間撹拌した。次いで、反応混合物を−５０℃まで冷却し、トルエン中アクセプター（１．０当量）およびドナー（１．２〜１．５当量）の溶液を添加した。混合物を−１０℃で２〜８時間撹拌した。ＴＬＣによりアクセプターの完全な消費が示された後、Ｅｔ３Ｎを用いて反応をクエンチし、ＥｔＯＡｃで希釈し、セライトを通して濾過した。濾液を水性ＮａＨＣＯ３およびブライン溶液で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出系としてトルエン／酢酸エチル）によって精製して産物を生じさせた（収率をスキーム上に示した）。
【０２０９】
方法Ｃ：Ｏ−アセチルの脱保護
ＮａＯＭｅ（０．２５当量）をＴＨＦ／メタノール（２／３）中出発材料（１．０当量）の溶液に添加した。反応を室温で撹拌し、ＴＬＣ分析によってモニターした。アセチル基を完全に脱保護した後、溶液をＩＲ−１２０によって中和し、濾過し、濃縮した。粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出系としてヘキサン／酢酸エチル）によって精製して産物を生じさせた（収率をスキーム上に示した）。
【０２１０】
方法Ｄ：Ｏ−Ｔｒｏｃの脱保護
Ｚｎ粉末（２０当量）および酢酸（０．２当量）をＴＨＦ中出発材料（１．０当量）の溶液に添加した。反応を室温で撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析によってモニターした。Ｔｒｏｃ基を完全に脱保護した後、溶液を濾過し、濃縮した。粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出系としてヘキサン／酢酸エチル）によって精製して産物を生じさせた（収率をスキーム上に示した）。
【０２１１】
方法Ｅ：ベンジリデンの脱保護
ｐ−トルエンスルホン酸（ｐＴＳＡ、１．５当量）をＡＣＮ／ＭｅＯＨ（２／１）中出発材料（１．０当量）の溶液に添加した。反応を室温で撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析によってモニターした。ベンジリデン基を完全に除去した後、トリメチルアミンによって反応をクエンチし、次いで、濃縮した。粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出系としてヘキサン／酢酸エチル）によって精製して産物を生じさせた（収率をスキーム上に示した）。
【０２１２】
方法Ｆ：全体的な脱保護
保護されたオリゴ糖（５０ｍｍｏｌ）とエチレンジアミン：ｎＢｕＯＨ（１／４）１０ｍＬの混合物を９０℃で一晩撹拌した。揮発性物質を蒸発させ、粗製物をＡｃ２Ｏ／ピリジン（１／２）１０ｍＬと一晩反応させた。高真空を使用して溶媒を除去し、産物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出系としてアセトン／トルエン）によって精製した。産物を、ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中ナトリウムメトキシドを使用して一晩にわたって脱アセチル化した。ＩＲ−１２０を使用することによって反応を中和し、次いで、濾過し、真空中で濃縮した。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出系としてアセトン／トルエン）によって精製した。産物をＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ：ＨＣＯＯＨ（６／３／１）１０ｍＬに溶解させ、Ｐｄ（ＯＨ）２（５０重量％）を添加し、反応物を一晩にわたって水素化した。反応混合物を、セライトを通して濾過し、減圧下で濃縮した。残留物を、溶離液として水を使用してＧ−１５ゲルカラムクロマトグラフィーによって精製した。産物を凍結乾燥して白色粉末を生じさせた（収率をスキーム上に示した）。
【０２１３】
方法Ｇ：酵素的（２，６）−シアリル化
出発材料（５μｍｏｌ）、ＣＴＰ（１μｍｏｌ）、Ｎｅｕ５Ａｃ（９．５μｍｏｌ）、ＰＥＰ（１０μｍｏｌ）、α−２，６シアリルトランスフェラーゼ（２００μＬ、推定濃度２ｍｇ／Ｌ）、ＣＭＫ（８０単位）、ＰＫ（４０単位）、およびＰＰＡ（４０単位）を、１％ＢＳＡ（１３０μＬ）を含有する５０μｍｏｌのカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．４）に溶解させた。反応物を３７℃で穏やかに撹拌しながら２日間インキュベートした。Ｇ−１５ゲルクロマトグラフィー（溶離液Ｈ２Ｏ）を使用することによって産物を精製して、凍結乾燥後に所望の産物を白色固体としてもたらした。
【化１】
2020176143.tif 000009
【化２】
2020176143.tif 000010
【化３】
2020176143.tif 000011
【化４】
2020176143.tif 000012
【０２１４】
（実施例１）
例示的な抗ＨＥＲ２ＧＡｂｓの生成
抗ＨＥＲ２ＧＡｂ３０１
トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）のＦｃ領域からのＡｓｎ２９７のＮ結合グリカンの完全な除去はＰＮＧａｓｅ  Ｆによって達成され、改変ＩｇＧおよび無改変ＩｇＧからのトリプシン処理グリコペプチド（ｔｒｙｐｔｉｃ  ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ）の４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｅｕＰＡＧＥおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を用いて評価される。トリプシン処理グリコペプチドの分子量は、各アスパラギンにおけるＮ結合グリコシル化の潜在的部位を決定するため、および優勢なグリカンの種を解明するための助けとなる。
【０２１５】
抗ＨＥＲ２ＧＡｂ２０１
Ｆｃ領域にＧｌｃＮＡｃ−Ｆｕｃのグリカン構造を有する従来のトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）に由来する糖操作抗体を１種または複数種のエンドグリコシダーゼ（Ｅｎｄｏ  Ｓおよび／またはＥｎｄｏ  Ｆ１、Ｅｎｄｏ  Ｆ２、Ｅｎｄｏ  Ｆ３）で処理し、次いで、アルファ−フコシダーゼで処理して、コアフコースを高い切断効率で切断し、Ｆｃ領域に単糖ＧｌｃＮＡｃを有する糖操作抗体をもたらした。
【０２１６】
５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）中Ｅｎｄｏ  Ｓ（１０μｇ）、Ｅｎｄｏ
Ｆ１／Ｅｎｄｏ  Ｆ２／Ｅｎｄｏ  Ｆ３（１０μｇ）、フコシダーゼ（２ｍｇ）およびトラスツズマブ（２ｍｇ）の混合物を３７℃で２４時間にわたって振とうした。反応混合物を精製のためにプロテインＡアフィニティーカラムに供した。抗ＨＥＲ２ＧＡｂ２０１の画分を収集した（収率：９６．６％）。収集した画分をトリプシン処理した。トリプシン処理したグリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲおよびＥＥＱＹＮＳＴＹＲを、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを使用して分析して抗ＨＥＲ２ＧＡｂ２０１のグリコシル化パターンを確認した。
【０２１７】
抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０１
鶏卵の卵黄１００ｍＬにエタノールを添加し、徹底的に混合した。遠心分離した後、上清を廃棄し、ペレットを収集した。ペレットをエタノールで２回洗浄した。ペレットに水を添加し、徹底的に混合した。混合物を遠心分離した。遠心分離した後、上清を廃棄し、ペレットを収集した。ペレットをエタノールと混合した。上清を収集し、凍結乾燥させて、白色の脱脂粉末１．５ｇを得た。粉末をリン酸緩衝液に溶解させ、酵素的消化のためにエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ１ｍｇを用いて処理した。反応混合物を水溶性有機溶媒と徹底的に混合し、遠心分離して上清を収集した。上清をイオン交換カラムによって精製した。グルカン−１０１（Ｓｉａ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ）１８ｍｇを得た。
【０２１８】
水中、グリカン−１０１（Ｓｉａ２（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ）（３０ｍｇ）、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ）（６２．７ｍｇ）およびＥｔ３Ｎ（８９μＬ）の溶液を４℃で１時間にわたって撹拌した。反応混合物を、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラムでのゲル濾過クロマトグラフィーに供し、０．０５％水性Ｅｔ３Ｎにより溶出して、グリカンオキサゾリン−１０１を収集した。
【０２１９】
グリカンオキサゾリン−１０１を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中、エンドグリコシダーゼおよび抗ＨＥＲ２ＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０１を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲおよびＥＥＱＹＮＳＴＹＲを、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析して、抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０１のグリコシル化パターンを確認した。
【０２２０】
抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０２
水中、グリカン−１０２（Ｓｉａ（α２−６）Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ）（３０ｍｇ）、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ）（６２．７ｍｇ）およびＥｔ３Ｎ（８９μＬ）の溶液を４℃で１時間にわたって撹拌した。反応混合物をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラムでのゲル濾過クロマトグラフィーに供し、０．０５％水性Ｅｔ３Ｎによって溶出した。産物（グリカンオキサゾリン−１０２）を含有する画分を合わせ、凍結乾燥して白色粉末を生じさせた。
【０２２１】
グリカンオキサゾリン−１０２を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中、エンドグリコシダーゼおよび抗ＨＥＲ２ＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０２を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲおよびＥＥＱＹＮＳＴＹＲを、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析して、抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０２のグリコシル化パターンを確認した。
【０２２２】
抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０３
水（５９３μＬ）中、グリカン−１０３（Ｓｉａ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ）（３０ｍｇ）、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ）（６２．７ｍｇ）およびＥｔ３Ｎ（８９μＬ）の溶液を４℃で１時間にわたって撹拌した。反応混合物をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラムでのゲル濾過クロマトグラフィーに供し、０．０５％水性Ｅｔ３Ｎによって溶出した。産物（グリカンオキサゾリン−１０３）を含有する画分を合わせ、凍結乾燥して白色粉末を生じさせた。
【０２２３】
グリカンオキサゾリン−１０３を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中、エンドグリコシダーゼおよび抗ＨＥＲ２ＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０３を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲおよびＥＥＱＹＮＳＴＹＲを、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析して、抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０３のグリコシル化パターンを確認した。
【０２２４】
抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０４
水中、グリカン−１０４（Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ）（３０ｍｇ）、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ）（６２．７ｍｇ）およびＥｔ３Ｎ（８９μＬ）の溶液を４℃で１時間にわたって撹拌した。反応混合物をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラムでのゲル濾過クロマトグラフィーに供し、０．０５％水性Ｅｔ３Ｎによって溶出した。産物（グリカンオキサゾリン−１０４）を含有する画分を合わせ、凍結乾燥して白色粉末を生じさせた。
【０２２５】
グリカンオキサゾリン−１０４を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中、エンドグリコシダーゼおよび抗ＨＥＲ２ＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０４を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲおよびＥＥＱＹＮＳＴＹＲを、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析して、抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０４のグリコシル化パターンを確認した。
【０２２６】
抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０５
水中、グリカン−１０５（ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ）（３０ｍｇ）、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ）（６２．７ｍｇ）およびＥｔ３Ｎ（８９μＬ）の溶液を４℃で１時間にわたって撹拌した。反応混合物をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラムでのゲル濾過クロマトグラフィーに供し、０．０５％水性Ｅｔ３Ｎによって溶出した。産物（グリカンオキサゾリン−１０５）を含有する画分を合わせ、凍結乾燥して白色粉末を生じさせた。
【０２２７】
グリカンオキサゾリン−１０５を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中、エンドグリコシダーゼおよび抗ＨＥＲ２ＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０５を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲおよびＥＥＱＹＮＳＴＹＲを、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析して、抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０５のグリコシル化パターンを確認した。
【０２２８】
抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０６
水中（５９３μＬ）、グリカン−１０６（ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ）（３０ｍｇ）、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ）（６２．７ｍｇ）およびＥｔ３Ｎ（８９μＬ）の溶液を４℃で１時間にわたって撹拌した。反応混合物をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラムでのゲル濾過クロマトグラフィーに供し、０．０５％水性Ｅｔ３Ｎによって溶出した。産物（グリカンオキサゾリン−１０６）を含有する画分を合わせ、凍結乾燥して白色粉末を生じさせた。
【０２２９】
グリカンオキサゾリン−１０６を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中、エンドグリコシダーゼおよび抗ＨＥＲ２ＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０６を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲおよびＥＥＱＹＮＳＴＹＲを、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析して、抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０６のグリコシル化パターンを確認した。
【０２３０】
抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０７
水中、グリカン−１０７（ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ）（３０ｍｇ）、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ）（６２．７ｍｇ）およびＥｔ３Ｎ（８９μＬ）の溶液を４℃で１時間にわたって撹拌した。反応混合物をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラムでのゲル濾過クロマトグラフィーに供し、０．０５％水性Ｅｔ３Ｎによって溶出した。産物（グリカンオキサゾリン−１０７）を含有する画分を合わせ、凍結乾燥して白色粉末を生じさせた。
【０２３１】
グリカンオキサゾリン−１０７を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中、エンドグリコシダーゼおよび抗ＨＥＲ２ＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０７を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲおよびＥＥＱＹＮＳＴＹＲを、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析して、抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０７のグリコシル化パターンを確認した。
【０２３２】
抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０８
水中、グリカン−１０８（ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ）（３０ｍｇ）、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ）（６２．７ｍｇ）およびＥｔ３Ｎ（８９μＬ）の溶液を４℃で１時間にわたって撹拌した。反応混合物をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラムでのゲル濾過クロマトグラフィーに供し、０．０５％水性Ｅｔ３Ｎによって溶出した。産物（グリカンオキサゾリン−１０８）を含有する画分を合わせ、凍結乾燥して白色粉末を生じさせた。
【０２３３】
グリカンオキサゾリン−１０８を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中、エンドグリコシダーゼおよび抗ＨＥＲ２ＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０８を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲおよびＥＥＱＹＮＳＴＹＲを、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析して、抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０８のグリコシル化パターンを確認した。
【０２３４】
抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０９
水中、グリカン−１０９（ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ）（３０ｍｇ）、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ）（６２．７ｍｇ）およびＥｔ３Ｎ（８９μＬ）の溶液を４℃で１時間にわたって撹拌した。反応混合物をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラムでのゲル濾過クロマトグラフィーに供し、０．０５％水性Ｅｔ３Ｎによって溶出した。産物（グリカンオキサゾリン−１０９）を含有する画分を合わせ、凍結乾燥して白色粉末を生じさせた。
【０２３５】
グリカンオキサゾリン−１０９を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中、エンドグリコシダーゼおよび抗ＨＥＲ２ＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０９を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲおよびＥＥＱＹＮＳＴＹＲを、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析して、抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０９のグリコシル化パターンを確認した。
【０２３６】
抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１１０
水中、グリカン−１１０（ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ）（３０ｍｇ）、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ）（６２．７ｍｇ）およびＥｔ３Ｎ（８９μＬ）の溶液を４℃で１時間にわたって撹拌した。反応混合物をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラムでのゲル濾過クロマトグラフィーに供し、０．０５％水性Ｅｔ３Ｎによって溶出した。産物（グリカンオキサゾリン−１１０）を含有する画分を合わせ、凍結乾燥して白色粉末を生じさせた。
【０２３７】
グリカンオキサゾリン−１１０を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中、エンドグリコシダーゼおよび抗ＨＥＲ２ＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１１０を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲおよびＥＥＱＹＮＳＴＹＲを、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析して、抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１１０のグリコシル化パターンを確認した。
【０２３８】
抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１１１
水中、グリカン−１１１（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ）（３０ｍｇ）、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ）（６２．７ｍｇ）およびＥｔ３Ｎ（８９μＬ）の溶液を４℃で１時間にわたって撹拌した。反応混合物をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラムでのゲル濾過クロマトグラフィーに供し、０．０５％水性Ｅｔ３Ｎによって溶出した。産物（グリカンオキサゾリン−１１１）を含有する画分を合わせ、凍結乾燥して白色粉末を生じさせた。
【０２３９】
グリカンオキサゾリン−１１１を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中、エンドグリコシダーゼおよび抗ＨＥＲ２ＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１１１を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲおよびＥＥＱＹＮＳＴＹＲを、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析して、抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１１１のグリコシル化パターンを確認した。
【０２４０】
（実施例２）
抗ＨＥＲ２ＧＡｂｓの特徴付け
一般
糖鎖工学により操作されたｍＡｂのＭＳ分光分析。インタクトな分子量の糖鎖工学により操作された抗体を、ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を備えたＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ  ＥＴＤ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）でＢＥＨ  Ｃ４  ｃｏｌｕｍｎ（１．０ｍｍ×１５０ｍｍ，１．７  ｍ、Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用したＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによって検出した。簡単に述べると、使用した勾配は、３分の時点で１％緩衝液Ｂから２０分の時点で４０％緩衝液Ｂまで、毎分５０ｕＬの流量であり、ここで、緩衝液ＡはＨ２０中０．１％ギ酸であり、緩衝液Ｂは８０％アセトニトリル中０．１％ギ酸であった。フルスキャンＭＳ条件：イオントラップを用いて質量範囲ｍ／ｚ８００〜４０００。エレクトロスプレー電圧を４．０ｋＶに維持し、キャピラリーの温度を２７５℃に設定した。
【０２４１】
トリプシン処理したグリコペプチドを分析するために、ナノエレクトロスプレーイオン供給源（Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ，Ｉｎｃ）、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  Ｓｅｒｉｅｓバイナリ高速液体クロマトグラフィーポンプ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）およびＦａｍｏｓオートサンプラー（ＬＣ  Ｐａｃｋｉｎｇｓ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ）を備えたＬＴＱＦＴ  Ｕｌｔｒａ（直線四重極イオントラップフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ、ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で高分解能かつ高質量精度のナノフローＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験を行った。消化溶液を、毎分１０ｕＬの流量で、自己充填したプレカラム（１５０μｍ  Ｉ．Ｄ．×２０ｍｍ，５μｍ，１００Å）上に注入した（６μｌ）。自己充填した逆相Ｃ１８ナノカラム（７５μｍ  Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍ，５μｍ，１００Å）上で、水中０．１％ギ酸を移動相Ａとして、８０％アセトニトリル中の０．１％ギ酸を移動相Ｂとして使用し、毎分３００ｎｌの流量で作動させて、クロマトグラフィー分離を行った。サーベイフルスキャンMS条件：質量範囲ｍ／ｚ３２０〜２００００、ｍ／ｚ４００で分解能１００，０００。１０個の最も強力なイオンをＬＴＱによるＭＳ２に関して逐次的に単離した。エレクトロスプレー電圧を１．８ｋＶに維持し、キャピラリーの温度を２００℃に設定した。
【０２４２】
トラスツズマブにおけるＮ−グリコシル化の分析
本発明者らは、グリコペプチド前駆体に適用した衝突解離（ＣＩＤ）エネルギーに対するオリゴ糖由来断片イオン（オキソニウムイオン）の収量をモニターする質量分析法を開発した。オキソニウムイオン法の多重反応モニタリング（ＭＲＭ）は、来たるバイオシミラー（ｂｉｏｓｉｍｉｌａｒ）治療薬の常套的な品質管理分析に関する規制要件を満たすことができた。
【０２４３】
５μｇのトラスツズマブを２Ｍのグアニジン−ＨＣｌ、２５μｌに溶解させ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加して最終濃度を５ｍＭにした。１１０℃で１０分インキュベートした後、１０ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＡ）中、３７℃で１時間にわたって還元型システイン残基をアルキル化した。５ｍＭのＤＴＴを添加して室温で１０分にわたって過剰なＩＡＡをクエンチした。産物を５０ｍＭの炭酸水素アンモニウム中１５倍に希釈した後、スピンカラムを用いて微量遠心分離した（タンパク質ＭＷカットオフ１０ｋＤａ）。トリプシン消化を、酵素：タンパク質比１：２５（ｗ／ｗ）を使用し、３７℃で４時間にわたって実施した。試料をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために−２０℃で凍結させた。
【０２４４】
ｍ／ｚ２０４オキソニウムイオン（ＨｅｘＮＡｃ）モニタリングによるグリコペプチド定量化を、４０００  ＱＴｒａｐトリプル四重極質量分析計（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）をＡｇｌｉｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣシステムと共に使用して実施した。グリコペプチドの微小不均一性を相対的に定量化するために、可能性のあるグリカン組成物全てを網羅する前駆イオンｍ／ｚをｉｎ−ｓｉｌｉｃｏで導き、各前駆イオンについて単一の定量的トランジションをモニターした（Ｑ３  ｍ／ｚ＝２０４）。
【０２４５】
ＭＳデータ解析
取得した生データを、Ａｎａｌｙｓｔ  １．５（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）を用いて処理した。各トランジションの質量クロマトグラムを統合し、ピーク面積によって定量化した。全ての構成成分を合わせた合計に対する各構成成分の百分率組成を算出した。
【０２４６】
グリカンオキサゾリン−１０１を、５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中ＥｎｄｏＳおよび抗ＨＥＲ２ＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温または３０℃で０．５〜１時間インキュベートした。反応が完了した後、プロテインＡアフィニティーカラムを用いて抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０１を精製し、さらなる精製のために陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑにローディングした。精製された抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０１をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認し、抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０１のＩｇＧ分子の分子量をＭＳによって確認した（表６、抗ＨＥＲ２ＧＡｂｓ  １０１および１０４について図３および４）。Ｎ−グリカンプロファイリングをトリプシン消化によって実施し、切断されたグリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲに基づいて、ナノスプレーＬＣ／ＭＳによって分析した。抗ＨＥＲ２ＧＡｂｓ  １０２、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１１０および１１１を同じ様式で合成し、本明細書に記載されているのと同じ手順によって分析した。抗ＨＥＲ２ＧＡｂｓ  １０１、１０２、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１１０および１１１についてのＮ−グリカンプロファイリングの結果が表７に示されている。図５および６は、抗ＨＥＲ２ＧＡｂｓ  １０１および１０４のトリプシン消化後に切断されたグリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲのＭＳを示す。
【０２４７】
表６．ＥＳＩ／ＭＳ分析：インタクトな分子量の抗ＨＥＲ２  Ｇａｂｓ
【表６】
2020176143.tif 000013
【０２４８】
表７．抗ＨＥＲ２  ＧａｂｓのＮ−グリカンプロファイリング
【表７】
2020176143.tif 000014
【０２４９】
（実施例３）
抗Ｈｅｒ２  ＧＡｂ  ＥＬＩＳＡ結合アッセイ
一般
糖鎖工学により操作されたハーセプチン抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる検出。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は全て、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）エーテルを用い、ＤＴＴを添加しまたは添加せずに実施した。
【０２５０】
炭酸コーティング緩衝液（ｐＨ１０）１００μＬ中組換えヒトＨＥＲ２タンパク質（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．から購入）（１μｇ／ｍＬ）を、９６ウェルの高結合プレートに４℃で一晩にわたってコーティングした。次いで、ＰＢＳＴ中２％ウシ血清アルブミンを添加して、室温で１時間プレートをブロッキングし、その後、抗ＨＥＲ２ＧＡｂｓ  １０１、１０２、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１１０および１１１の連続希釈物をプレートに添加し、１時間インキュベートした。インキュベートした後、ＨＲＰとコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧを反応混合物に添加し、１時間インキュベートした。ＯＰＤ基質のアリコートを添加し、４５０ｎｍにおける吸光度を記録した。実験全体を通して、各インキュベーションステップの後にプレートをＰＢＳで２回洗浄した。ＥＬＩＳＡ結合の結果が表８に示されている。
【表８】
2020176143.tif 000015
【０２５１】
実施例４：ＳＫ−ＢＲ−３細胞における抗ＨＥＲ２ＧＡｂｓのＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ
ＡＤＣＣアッセイをＰｒｏｍｅｇａレポーターバイオアッセイキットを用いて行った。標的細胞であるＳＫ−ＢＲ−３がん細胞株をＡＴＣＣから得、１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清および１％の抗生物質−抗真菌薬（Ｇｉｂｃｏ）を追加したＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ（改変）培地（Ｇｉｂｃｏ）において維持した。ＡＤＣＣアッセイの準備のとき、ＳＫ−ＢＲ−３細胞を回収し、２日間にわたって３８４ウェルマイクロプレート中で平板培養した。ついで、異なるグリカン形態を有するハーセプチンの一連の滴定物（ｔｒｉｔｒａｔｉｏｎ）を添加し、その後Ｖ１５８バリアントを有するＦｃγＩＩＩａ受容体を発現する、ＮＦＡＴ操作Ｊｕｒｋａｔ細胞とともに６時間にわたって３７℃でインキュベーションした。読み出しを、Ｂｉｏ−Ｇｌｏｗルシフェラーゼ基質をプレートに添加することを介して行い、ｖｉｃｔｏｒ３発光プレートリーダーを用いて記録した。エフェクター細胞と標的細胞との比率は、１２．５である。結果を図７および表９において示す。
【表９】
2020176143.tif 000016
【０２５２】
（実施例５）
抗ＨＥＲ２ＧＡｂｓのＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合親和性
一般
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。ＳＰＲ実験は全て、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｔ２００を用い、２５℃、ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）を泳動緩衝液として使用して実施した。ヤギ抗ヒト（Ｆａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｉｎｃ．）の（Ｆａｂ’）２断片を利用し、ＣＭ５センサーチップの参照チャネルおよび活性チャネルの両方に固定化した後、抗体試料を捕捉した。糖鎖工学により操作された抗体と複合体型グリコシル化ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＨＥＫ２９３細胞により発現）の間の相互作用を、５つの異なる濃度のＦｃγＲＩＩＩＡを毎分３０ｕｌで２４０秒の会合、その後４２０秒の解離時間に対して使用した単一サイクルの動力学的方法によって記録した。バックグラウンド減算のために二重照合（ｄｏｕｂｌｅ−ｒｅｆｅｒｅｎｃｉｎｇ）を用いてデータを処理し、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で１：１ラングミュア結合モデルに当てはめて動力学的／親和性定数を得た。
【０２５３】
ＨＥＫ−２９３細胞株にＦｃγＲＩＩＩＡをトランスフェクトして組換えタンパク質を発現させた。分泌されたＦｃγＲＩＩＩＡ組換えタンパク質を精製し、次いで、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中、段階的な濃度に希釈した（２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、および１２．５ｎＭ）。抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０１、ＧＡｂ１０２、ＧＡｂ１０３、ＧＡｂ１０４、ＧＡｂ１０５、ＧＡｂ１０６、ＧＡｂ１０７、ＧＡｂ１０８、ＧＡｂ１０９、ＧＡｂ１１０およびＧＡｂ１１１のそれぞれをＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中、１０ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、次いで、抗ヒトＦａｂドメイン抗体を予め固定化したＣＭ５チップに捕捉した。ＦｃγＲＩＩＩＡの段階的な滴定物（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）を注射し、毎分３０ｍｌの流量で結合させた。単一サイクルの動力学データを、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して１：１結合モデルに当てはめて、平衡定数（Ｋａ／Ｋｄ）を測定した。結果が表４に示されている。
【図１】
2020176143.tif 000017
【図２】
2020176143.tif 000018
【図３】
2020176143.tif 000019
【図４】
2020176143.tif 000020
【図５】
2020176143.tif 000021
【図６】
2020176143.tif 000022
【図７】
2020176143.tif 000023
【配列表】
2020176143000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月3日(2020.8.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
【図５】図５は、抗ＨＥＲ２ＧＡｂｓ  １０１のトリプシン消化後に切断されたグリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号３）のＭＳスペクトルを示す。図５は、配列番号４として「ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ」を開示する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
【図６】図６は、抗ＨＥＲ２ＧＡｂｓ  １０４のトリプシン消化後に切断されたグリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号３）のＭＳスペクトルを示す。図６は、配列番号４として「ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ」を開示する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６８】
本発明のα−フコシダーゼのポリペプチドは、それらの単離または精製を補助するために、誘導体化または修飾することができることが理解されよう。したがって、本発明の一実施形態では、本発明において使用するためのポリペプチドを、分離手段に直接かつ特異的に結合することができるリガンドを付加することによって誘導体化または修飾する。あるいは、ポリペプチドを、結合対の一方のメンバーを付加することによって誘導体化または修飾し、分離手段に、結合対の他方のメンバーを付加することによって誘導体化または修飾される試薬を含める。任意の適切な結合対を使用することができる。本発明において使用するためのポリペプチドを、結合対の一方のメンバーを付加することによって誘導体化または修飾する好ましい実施形態では、ポリペプチドにヒスチジン−タグを付けるまたはビオチン−タグを付けることが好ましい。一般には、ヒスチジンまたはビオチンタグのアミノ酸コード配列を遺伝子レベルで含め、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて組換えによりタンパク質を発現させる。ヒスチジンまたはビオチンタグは、一般には、ポリペプチドの一端、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかに存在する。ヒスチジンタグは、一般には６つのヒスチジン残基（配列番号６）からなるが、これより長くてもよく、一般には、最大７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸または２０アミノ酸またはそれ未満、例えば、５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸または１アミノ酸であってよい。さらに、ヒスチジンタグは、アミノ酸置換、好ましくは上で定義されている保存的置換を１つまたは複数含有してよい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１６】
５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）中Ｅｎｄｏ  Ｓ（１０μｇ）、Ｅｎｄｏ
Ｆ１／Ｅｎｄｏ  Ｆ２／Ｅｎｄｏ  Ｆ３（１０μｇ）、フコシダーゼ（２ｍｇ）およびトラスツズマブ（２ｍｇ）の混合物を３７℃で２４時間にわたって振とうした。反応混合物を精製のためにプロテインＡアフィニティーカラムに供した。抗ＨＥＲ２ＧＡｂ２０１の画分を収集した（収率：９６．６％）。収集した画分をトリプシン処理した。トリプシン処理したグリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号３）およびＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号４）を、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを使用して分析して抗ＨＥＲ２ＧＡｂ２０１のグリコシル化パターンを確認した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１９】
グリカンオキサゾリン−１０１を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中、エンドグリコシダーゼおよび抗ＨＥＲ２ＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０１を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号３）およびＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号４）を、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析して、抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０１のグリコシル化パターンを確認した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２１】
グリカンオキサゾリン−１０２を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中、エンドグリコシダーゼおよび抗ＨＥＲ２ＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０２を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号３）およびＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号４）を、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析して、抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０２のグリコシル化パターンを確認した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２３】
グリカンオキサゾリン−１０３を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中、エンドグリコシダーゼおよび抗ＨＥＲ２ＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０３を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号３）およびＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号４）を、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析して、抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０３のグリコシル化パターンを確認した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２５】
グリカンオキサゾリン−１０４を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中、エンドグリコシダーゼおよび抗ＨＥＲ２ＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０４を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号３）およびＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号４）を、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析して、抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０４のグリコシル化パターンを確認した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２７】
グリカンオキサゾリン−１０５を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中、エンドグリコシダーゼおよび抗ＨＥＲ２ＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０５を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号３）およびＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号４）を、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析して、抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０５のグリコシル化パターンを確認した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２９】
グリカンオキサゾリン−１０６を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中、エンドグリコシダーゼおよび抗ＨＥＲ２ＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０６を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号３）およびＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号４）を、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析して、抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０６のグリコシル化パターンを確認した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３１】
グリカンオキサゾリン−１０７を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中、エンドグリコシダーゼおよび抗ＨＥＲ２ＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０７を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号３）およびＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号４）を、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析して、抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０７のグリコシル化パターンを確認した。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３３】
グリカンオキサゾリン−１０８を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中、エンドグリコシダーゼおよび抗ＨＥＲ２ＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０８を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号３）およびＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号４）を、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析して、抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０８のグリコシル化パターンを確認した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３５】
グリカンオキサゾリン−１０９を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中、エンドグリコシダーゼおよび抗ＨＥＲ２ＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０９を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号３）およびＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号４）を、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析して、抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０９のグリコシル化パターンを確認した。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３７】
グリカンオキサゾリン−１１０を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中、エンドグリコシダーゼおよび抗ＨＥＲ２ＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１１０を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号３）およびＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号４）を、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析して、抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１１０のグリコシル化パターンを確認した。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３９】
グリカンオキサゾリン−１１１を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中、エンドグリコシダーゼおよび抗ＨＥＲ２ＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を、プロテインＡアフィニティーカラム、その後、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑを用いて精製して、所望の産物である抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１１１を収集した。産物をトリプシン処理し、グリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号３）およびＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号４）を、ナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析して、抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１１１のグリコシル化パターンを確認した。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４６】
グリカンオキサゾリン−１０１を、５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中ＥｎｄｏＳおよび抗ＨＥＲ２ＧＡｂ２０１の混合物に添加し、室温または３０℃で０．５〜１時間インキュベートした。反応が完了した後、プロテインＡアフィニティーカラムを用いて抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０１を精製し、さらなる精製のために陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ  Ｑにローディングした。精製された抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０１をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認し、抗ＨＥＲ２ＧＡｂ１０１のＩｇＧ分子の分子量をＭＳによって確認した（表６、抗ＨＥＲ２ＧＡｂｓ  １０１および１０４について図３および４）。Ｎ−グリカンプロファイリングをトリプシン消化によって実施し、切断されたグリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号３）に基づいて、ナノスプレーＬＣ／ＭＳによって分析した。抗ＨＥＲ２ＧＡｂｓ  １０２、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１１０および１１１を同じ様式で合成し、本明細書に記載されているのと同じ手順によって分析した。抗ＨＥＲ２ＧＡｂｓ  １０１、１０２、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１１０および１１１についてのＮ−グリカンプロファイリングの結果が表７に示されている。図５および６は、抗ＨＥＲ２ＧＡｂｓ  １０１および１０４のトリプシン消化後に切断されたグリコペプチドＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号３）のＭＳを示す。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４８】
表７．抗ＨＥＲ２  ＧａｂｓのＮ−グリカンプロファイリング
【表７】
2020176143.tif 000024
【外国語明細書】
2020176143000001.pdf