(57)【要約】      （修正有）【課題】高感度検出や分子間架橋を可能にする機能を付加することが困難なプロテインＡ及びプロテインＧとは異なる、抗体に結合性を有するペプチドの提供。【解決手段】ヒト血液中から、ＩｇＧに結合するペプチドとして同定されたアミノ酸配列（ＹＤＴＷＫＱＳＴＱＲＬ）からなるペプチド、又は該ペプチドに記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ抗体に対する結合性を有するペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ抗体に対する結合性を有するペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドと対象物質との結合体。
【請求項３】
前記対象物質が、標識物質、架橋性官能基を有する化合物又は医薬である、請求項２に記載の結合体。
【請求項４】
前記対象物質が前記ペプチドのＣ末端側に結合している、請求項２又は３に記載の結合体。
【請求項５】
請求項１に記載のペプチド又は請求項２〜４のいずれか一項に記載の結合体と、抗体との複合体。
【請求項６】
固相と、前記固相の表面に固定された請求項１に記載のペプチドとを含む、抗体結合用担体。
【請求項７】
抗体を含む試料を請求項６に記載の抗体結合用担体に接触させ、前記抗体と前記抗体結合用担体との複合体を形成する工程と、
前記複合体から前記抗体を解離させて回収する工程と、
を含む、前記抗体の精製方法。
【請求項８】
抗原が結合した抗体を含む試料を請求項６に記載の抗体結合用担体に接触させ、前記抗体と前記抗体結合用担体との複合体を形成する工程と、
前記複合体から前記抗原を解離させて回収する工程と、
を含む、前記抗原の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド及びその使用に関する。より具体的には、本発明は、ペプチド、結合体、複合体、抗体結合用担体、抗体の精製方法、抗原の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体のサブクラスのひとつである免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に特異的に結合する物質として、プロテインＡ及びプロテインＧがよく知られている。プロテインＡ及びプロテインＧは、ＩｇＧを精製する場合等に頻繁に用いられる（例えば、特許文献１を参照）。
【０００３】
ところで、微量の物質を同定する際には、質量分析装置が用いられることがある。これまでに、発明者らは、質量分析装置により、血液中のタンパク質等を網羅的に解析するために、血液中のタンパク質の濃縮方法を開発してきた（例えば、特許文献２を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第５７５２５５８号公報
【特許文献２】特許第４５７１２２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、プロテインＡ及びプロテインＧは、双方ともにタンパク質であるため、高感度検出や分子間架橋を可能にする機能を付加することが困難である。そこで、本発明は、抗体に結合性を有するペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下の態様を含む。
［１］配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ抗体に対する結合性を有するペプチド。
［２］［１］に記載のペプチドと対象物質との結合体。
［３］前記対象物質が、標識物質、架橋性官能基を有する化合物又は医薬である、［２］に記載の結合体。
［４］前記対象物質が前記ペプチドのＣ末端側に結合している、［２］又は［３］に記載の結合体。
［５］［１］に記載のペプチド又は［２］〜［４］のいずれか一項に記載の結合体と、抗体との複合体。
［６］固相と、前記固相の表面に固定された［１］に記載のペプチドとを含む、抗体結合用担体。
［７］抗体を含む試料を［６］に記載の抗体結合用担体に接触させ、前記抗体と前記抗体結合用担体との複合体を形成する工程と、前記複合体から前記抗体を解離させて回収する工程と、を含む、前記抗体の精製方法。
［８］抗原が結合した抗体を含む試料を［６］に記載の抗体結合用担体に接触させ、前記抗体と前記抗体結合用担体との複合体を形成する工程と、前記複合体から前記抗原を解離させて回収する工程と、を含む、前記抗原の精製方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、抗体に結合性を有するペプチドを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実験例２における、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
実施例において後述するように、発明者らは、ヒト血液中から、ＩｇＧに結合するペプチドを同定した。このペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有していた。
【００１０】
［ペプチド］
１実施形態において、本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ抗体に対する結合性を有するペプチドを提供する。ここで、１若しくは数個とは、１〜８個であってもよく、１〜５個であってもよく、１〜３個であってもよい。
【００１１】
配列番号１に記載のペプチドはアミノ酸１１残基しかなく、容易に化学合成することができる。また、実施例において後述するように、本実施形態のペプチドは、ヒト血漿中に存在するものであるため、ヒトに投与しても害が少ない。本実施形態のペプチドは医療用途に用いることもできるし、研究用試薬として用いることもできる。
【００１２】
また、本実施形態のペプチドは、１若しくは数個のアミノ酸が安定同位体標識されていてもよく、全てのアミノ酸が安定同位体標識されていてもよい。ここで、１若しくは数個とは、１〜８個であってもよく、１〜５個であってもよく、１〜３個であってもよい。安定同位体としては、例えば、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓ等が挙げられる。
【００１３】
［結合体］
１実施形態において、本発明は、上述したペプチドと対象物質との結合体を提供する。対象物質は、例えば標識物質であってもよいし、架橋性官能基を有する化合物であってもよいし、医薬であってもよい。対象物質は、特定の電磁波の照射によって分解する化合物、架橋剤等であってもよい。
【００１４】
標識物質としては、蛍光物質、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質等が挙げられる。これらの標識物質は、上述したペプチドのＣ末端側、または、抗体結合能を阻害しない部位に結合していることが好ましい。必要に応じてペプチドと対象物質の間にリンカーを入れてもよい。
【００１５】
ペプチドのＣ末端側とは、ペプチドの最もＣ末端のアミノ酸であってもよいし、ペプチドの最もＣ末端から２番目、３番目、４番目、５番目又は６番目のアミノ酸であってもよい。すなわち、標識物質は、ペプチドの抗体結合能を阻害しない限り、ペプチドの最もＣ末端のアミノ酸、ペプチドの最もＣ末端から２番目、３番目、４番目、５番目又は６番目のアミノ酸に結合することができる。
【００１６】
蛍光物質としては、例えば、フルオレセイン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＢＯＤＩＰＹ、シアニン色素、ニトロベンゾオキサジアゾール、アミノメチルクマリン等の低分子蛍光物質が挙げられる。蛍光物質で標識したペプチドに対し、励起光を照射し、蛍光を測定することにより、ペプチドを検出することができる。
【００１７】
核酸としては、例えば、化学合成したオリゴヌクレオチド等が挙げられる。例えば、インベーダー法等を利用して、特定の塩基配列を有する核酸を検出することができる。
【００１８】
標識物質であるアミノ酸としては、上述したものと同様の安定同位体標識されたアミノ酸が挙げられる。
【００１９】
標識物質であるペプチドとしては、６×Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、亜鉛結合性モチーフ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｖ５タグ、Ｓタグ、Ｅタグ、Ｔ７タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ、Ｓｔｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ、ＨＳＶタグ、Ｃｈｉｔｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ（ＣＢＤ）タグ、Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＣＢＰ）タグ等の数アミノ酸から数十アミノ酸からなる機能性ペプチドが挙げられる。
【００２０】
標識物質であるタンパク質としては、緑色蛍光タンパク質等の蛍光を発するタンパク質、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）、Ｍａｌｔｏｓｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ＰｒｏｔｅｉｎＭＢＰ（ＭＢＰ）等の精製に用いられるタンパク質、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素等が挙げられる。例えば、酵素で標識したペプチドに対し、基質を接触させて、発色、発光させることにより、ペプチドを検出することができる。
【００２１】
また、標識物質は、ビオチンであってもよい。ビオチンで標識したペプチドに対し、酵素又は蛍光物質が結合したアビジンを接触させる。続いて、基質を接触させて発色、発光させるか、又は、励起光を照射して蛍光させることにより、ペプチドを検出することができる。
【００２２】
架橋性官能基を有する化合物としては、上述したペプチドに、架橋性官能基を付与することができる化合物が挙げられる。架橋性官能基としては、例えば、スクシンイミド基、アジド基等が挙げられる。
【００２３】
医薬としては、例えば、各種疾患の薬剤、抗癌剤、酵素、核酸等が挙げられる。より具体的には、低分子化合物、中分子化合物、ペプチド、核酸、抗体、タンパク質等が挙げられるが、これに限定されず、ペプチドに結合する物質であれば、どのような物質であってもよい。
【００２４】
特定の電磁波の照射によって分解する化合物又は架橋剤としては、特に限定されず、例えば、２−ニトロベンジル骨格を有する化合物又は架橋剤、クマリン骨格有する化合物又は架橋剤等が挙げられる。
【００２５】
［複合体］
１実施形態において、本発明は、上述したペプチドと抗体との複合体を提供する。また、１実施形態において、本発明は、上述したペプチドと対象物質との結合体と、抗体との複合体を提供する。
【００２６】
実施例において後述するように、上述したペプチドは、抗体に結合する。本実施形態における抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよい。
【００２７】
抗体のクラスとしては、特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ等が挙げられる。
【００２８】
抗体が由来する動物の種類としては、脊椎動物であれば、特に限定されず、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ラット、マウス、フェレット、ウサギ、サル、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ラクダ、ニワトリ等が挙げられる。
【００２９】
上述したペプチドと対象物質の結合体は、抗体と結合し、本実施形態の複合体を形成することができる。
【００３０】
上述したペプチドと対象物質との結合体と、抗体との複合体において、例えば対象物質が医薬である場合、本実施形態の複合体は、薬物送達システムとして利用することができる。
【００３１】
具体的には、医薬を送達したい標的部位に特異的に存在する抗原が知られている場合、この抗原を認識する抗体、上述したペプチド及び医薬の結合体を、標的部位に特異的に送達させることができる。
【００３２】
［抗体結合用担体］
１実施形態において、本発明は、固相と、前記固相の表面に固定された、上述したペプチドとを含む、抗体結合用担体を提供する。
【００３３】
固相としては、粒子、基板、膜、ウェルプレート、スライドガラス、表面プラズモン共鳴法に用いるセンサーチップ、ゲル等が挙げられる。固相が、例えば、粒子、膜等の形態である場合、固相はカラムに充填されていてもよい。ペプチドの固相の表面への固定は、物理的な吸着により行ってもよいし、架橋剤等を用いて共有結合により行ってもよいが、共有結合により固定することが好ましい。
【００３４】
また、ペプチドには架橋剤が付加されていてもよい。この場合、ペプチドが抗体と結合した後に、ペプチドと抗体を架橋剤で架橋することにより、抗体とペプチドを共有結合によって固定化することができる。その結果、抗体を固相に強固に固定化することができる。
【００３５】
［抗体の精製方法］
１実施形態において、本発明は、抗体を含む試料を上述した抗体結合用担体に接触させ、抗体と抗体結合用担体との複合体を形成する工程と、複合体から抗体を解離させて回収する工程と、を含む、抗体の精製方法を提供する。
【００３６】
抗体を含む試料としては、特に限定されず、例えば、脊椎動物から採取した血液、ハイブリドーマの培養液、抗体を発現する形質転換された細胞の培養液又は細胞抽出液等が挙げられるが、抗体を含む試料であれば、どのような試料であってもよい。
【００３７】
血液を採取する脊椎動物は、予め抗原を免疫し抗体を産生させた動物であってもよいし、抗原を免疫していない動物であってもよい。抗体を発現する形質転換された細胞としては、細菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等が挙げられる。
【００３８】
抗体を含む試料を、上述のペプチドが固定された抗体結合用担体に接触させると、抗体と抗体結合用担体との複合体が形成される。続いて、複合体から抗体を解離させると、抗体を精製することができる。
【００３９】
抗体と抗体結合用担体は強く結合する。抗体は、予め決められた操作によって、複合体から抗体を解離させることができる。予め決められた操作としては、複合体を含む溶液のｐＨ、塩濃度、温度等を変化させる操作が挙げられる。
【００４０】
複合体から抗体を解離させて回収する工程は、複合体から上述のペプチドが結合した抗体を解離させて回収する工程であってもよい。
【００４１】
例えば、上述のペプチドと固相が架橋構造により結合しており、その架橋構造が電磁波の照射または特定の試薬の添加によって分解する性質を有する場合、電磁波の照射または特定の試薬の添加によって、抗体を変性させることなく、複合体から上述のペプチドが結合した抗体を解離させて回収することができる。
【００４２】
本実施形態の抗体の精製方法により、抗体を簡便に精製することができる。本実施形態の精製方法は、試薬としての抗体の精製だけでなく、例えば抗体医薬の精製にも利用することができる。
【００４３】
［抗原の精製方法］
１実施形態において、本発明は、抗原と結合した抗体を含む試料を上述した抗体結合用担体に接触させ、前記抗体と前記抗体結合用担体との複合体を形成する工程と、前記複合体から前記抗原を解離させて回収する工程と、を含む、前記抗原の精製方法を提供する。
【００４４】
抗原と抗体を含む試料を、上述のペプチドが固定された抗体結合用担体に接触させると、抗原と抗体と抗体結合用担体との複合体が形成される。続いて、複合体から抗原を解離させると、抗原を精製することができる。ここで、抗体結合用担体のペプチドに架橋剤が付加されていることが好ましい。これにより、抗原と結合した抗体を、抗体結合用担体のペプチドと共有結合により結合することができる。その結果、抗原をより高い純度で精製することが可能になる。
【００４５】
抗原と抗体、抗体と抗体結合用担体は強く結合する。抗原は、予め決められた操作によって、複合体から抗原を解離させることができる。予め決められた操作としては、抗体を変性させる操作、複合体を含む溶液の、ｐＨ、塩濃度、温度等を変化させる操作等が挙げられる。
【００４６】
本実施形態の抗原の精製方法により、抗原を簡便に精製することができる。例えば、上述した抗体結合用担体に血液を接触させ、自己抗体、自己抗体が認識する抗原及び結合用担体の複合体を形成させ、当該複合体から抗原を回収することができる。
【００４７】
これによって、血液中に微量しか存在せず従来法では検出が困難な自己抗体を濃縮し、自己抗体に結合した抗原を抽出して、検出用抗体または質量分析計にて分析することができる。あるいは、本実施形態の抗原の精製方法は、抗原の免疫沈降に適用することができる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４９】
［実験例１］
（ＩｇＧ結合ペプチドの同定）
ヒト血漿からＩｇＧ画分を濃縮し、当該画分に含まれているペプチドを質量分析により探索した。その結果、ＹＤＴＷＫＱＳＴＱＲＬ（配列番号１）のアミノ酸配列からなるペプチドを見出した。
【００５０】
具体的には、まず、ヒト血漿にＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ磁気ビーズを添加した。続いて、室温で１時間穏やかに撹拌した。続いて、磁石を用いてＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ磁気ビーズを吸着させて回収した。
【００５１】
回収したＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ磁気ビーズに結合している物質を、次に示す方法で抽出した。まず、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ磁気ビーズに対し、８０μＬの抽出バッファー（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、２０ｍＭ  ＤＴＴ）を加えた。
【００５２】
続いて、この溶液を２ｍＬの氷冷した高純度アセトンに滴下して混和し、４℃で撹拌した。続いて、４℃で１５分間、１９，０００×ｇで遠心分離を行った。続いて、得られた沈殿物に対して、８０％アセトニトリル／１２ｍＭ  ＨＣｌを含む溶液を加えて、４℃で１時間、撹拌した。
【００５３】
続いて、４℃で１５分間、１９，０００×ｇで遠心分離を行い、上清を回収した。上清を凍結乾燥した後、０．１％トリフルオロ酢酸に溶解させた。得られた溶液には、血漿中に存在し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇに結合する低分子量タンパク質、ペプチド等が含まれている。
【００５４】
続いて、得られた低分子量タンパク質及びペプチドをピペットマンのチップに固定化した逆相Ｃ１８担体にアプライし、０．１％トリフルオロ酢酸で洗浄後、０．１％トリフルオロ酢酸を含む７０％アセトニトリルで溶出した。
【００５５】
続いて、低分子量タンパク質及びペプチドを含む溶出液を凍結乾燥した後、０．１％ギ酸を含む３％アセトニトリル溶液を加えて３０分間撹拌した。続いて、４℃で１５分間、１９，０００×ｇで遠心分離した。
【００５６】
続いて、上清を、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙにより分析した。得られたデータについて、タンパク質同定用ソフトウェア（商品名「ＰＥＡＫＳ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｖｅｒ．７」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）を用いて、ペプチドの検索を行った。
【００５７】
その結果、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる、１１残基のペプチドが同定された。このペプチドの配列は、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ−２）のアミノ酸配列の一部であることが明らかになった。
【００５８】
［実験例２］
実験例１で見出したペプチドと、血漿中ＩｇＧとの結合性を検討した。具体的には、Ｎ末端又はＣ末端にフルオレセイン（ＦＡＭ）を付加したペプチドと、ヒトＩｇＧとの結合性を検討した。
【００５９】
まず、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側に蛍光物質であるＦＡＭを標識したペプチド（以下、「Ｎ−ＦＡＭ」という場合がある。）を化学合成した。また、同様に、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドのＣ末端側に蛍光物質であるＦＡＭを標識したペプチド（以下、「Ｃ−ＦＡＭ」という場合がある。）を化学合成した。
【００６０】
続いて、ヒト血漿にこれらの標識ペプチドをそれぞれ混合し、３７℃で１時間インキュベートした。続いて、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにより標識ペプチドと血漿中ＩｇＧとの結合性を検討した。ヒト血漿中には、約３０ｍｇ／ｍＬ（約０．２ｍＭ）のＩｇＧが含まれていると考えられる。
【００６１】
図１は、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図１中、レーン１〜３はＮ−ＦＡＭを含む試料を泳動したものであり、Ｎ−ＦＡＭの濃度は、それぞれ、０．５ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．００５ｍＭであった。レーン４〜６はＣ−ＦＡＭを含む試料を泳動したものであり、Ｃ−ＦＡＭの濃度は、それぞれ、０．５ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．００５ｍＭであった。
【００６２】
その結果、Ｃ−ＦＡＭと血漿中ＩｇＧとの結合が検出された。一方、Ｎ−ＦＡＭと血漿中ＩｇＧとの結合は低い傾向にあった。
【００６３】
この結果は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドが、ＩｇＧと結合することを示す。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明によれば、抗体に結合性を有するペプチドを提供することができる。
【図１】
2020158415.tif 000002
【配列表】
2020158415000001.app