(57)【要約】      （修正有）【課題】がんを治療する、転移性がん細胞を殺傷する、潜在的悪性新生物細胞を殺傷する、及び／またはがん転移を予防する方法の提供。【解決手段】対象における乳癌の治療及び／又は乳癌の予防において使用するための、抗ＡＧＥ抗体を含む組成物であって、抗ＡＧＥ抗体が、カルボキシメチルリジン修飾タンパク質に結合する組成物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における乳癌の治療及び／又は乳癌の予防において使用するための、抗ＡＧＥ抗体を含む組成物であって、前記抗ＡＧＥ抗体が、カルボキシメチルリジン修飾タンパク質に結合する、前記組成物。
【請求項２】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１に記載の、使用のための組成物。
【請求項３】
対象が、ヒト、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、及びネコからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の、使用のための組成物。
【請求項４】
対象が、ヒトである、請求項１〜３のいずれかに記載の、使用のための組成物。
【請求項５】
抗ＡＧＥ抗体が、ヒト、ネコ、イヌ、ウマ、ラクダ、アルパカ、ウシ、ヒツジ、及びヤギからなる群から選択される種に対して非免疫原性である、請求項１〜４のいずれかに記載の、使用のための組成物。
【請求項６】
対象が、乳癌を有する、請求項１〜５のいずれかに記載の、使用のための組成物。
【請求項７】
対象が、乳癌を有さない、請求項１〜６のいずれかに記載の、使用のための組成物。
【請求項８】
単位投与量形態である、請求項１〜７のいずれかに記載の、使用のための組成物。
【請求項９】
複数回投与形態である、請求項１〜８のいずれかに記載の、使用のための組成物。
【請求項１０】
無菌である、請求項１〜９のいずれかに記載の、使用のための組成物。
【請求項１１】
抗ＡＧＥ抗体が、ＡＧＥ修飾を発現する乳癌細胞に結合する、請求項１〜１０のいずれかに記載の、使用のための組成物。
【請求項１２】
対象が、妊娠している、請求項１〜１１のいずれかに記載の、使用のための組成物。
【請求項１３】
対象が、以前に癌性悪液質と診断されている、請求項１〜１２のいずれかに記載の、使用のための組成物。
【請求項１４】
対象が、免疫不全である、請求項１〜１３のいずれかに記載の、使用のための組成物。
【請求項１５】
（ａ）対象が、ヒトである；
（ｂ）抗ＡＧＥ抗体が、ヒトに非免疫原性である；
（ｃ）前記対象が、乳癌を有する；及び
（ｄ）組成物が、単位投与量形態である、
請求項１〜１４のいずれかに記載の、使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
老化細胞は、部分的に機能性または非機能性であり、増殖停止の状態にある細胞である。老化は、細胞の特徴的な状態であり、バイオマーカーｐ１６Ｉｎｋ４ａ（「ｐ１６」）の活性化及びβ−ガラクトシダーゼの発現などのバイオマーカーに関連付けられる。老化は、細胞の損傷またはストレス（成長因子による過剰刺激など）とともに開始する。損傷またはストレスは、細胞内のミトコンドリアＤＮＡに負の影響を与えて、それらに、細胞内の糖と反応してメチルグリオキサール（ＭＧ）を形成するフリーラジカルを産生させる。転じて、ＭＧは、タンパク質または脂質と反応して、終末糖化産物（ＡＧＥ）を生成する。タンパク質構成要素のリジンの場合、ＭＧは反応して、ＡＧＥであるカルボキシメチルリジンを形成する。ＡＧＥはまた、血液内の糖と外部細胞タンパク質との非酵素反応からも形成される。
【０００２】
ミトコンドリアＤＮＡに対する損傷またはストレスはまた、細胞に、細胞周期遮断タンパク質を産生するように誘発するＤＮＡ損傷応答も引き起こす。これらの遮断タンパク質は、細胞分裂を予防する。損傷またはストレスの継続は、ｍＴＯＲ産生を引き起こし、これが転じて、タンパク質合成を活性化し、タンパク質分解を不活性化する。細胞の更なる刺激は、プログラム細胞死（アポトーシス）をもたらす。
【０００３】
ｐ１６は、Ｓ相を阻害することによって細胞周期の制御に関与するタンパク質である。それは、老化中または様々なストレス（ＤＮＡ損傷、酸化ストレス、もしくは薬物に対する曝露など）に応答して活性化され得る。ｐ１６は典型的には、ＤＮＡ損傷に応答して細胞を老化させ、細胞が過剰増殖状態に入るのを不可逆的に予防する腫瘍抑制タンパク質とみなされる。しかしながら、いくつかの腫瘍はｐ１６の過剰発現を示す一方で、他の腫瘍は下方制御された発現を示すため、この点についてはいくらかの曖昧さが存在している。証拠は、いくつかの腫瘍におけるｐ１６の過剰発現が、欠陥網膜芽細胞腫タンパク質（「Ｒｂ」）から生じることを示唆している。ｐ１６は、Ｒｂに対して作用してＳ相を阻害させ、Ｒｂは、ｐ１６を下方制御し、負のフィードバックを作り出す。欠損Ｒｂは、Ｓ相の阻害及びｐ１６の下方制御のいずれもすることができず、故に過剰増殖細胞内でのｐ１６の過剰発現をもたらす。Ｒｏｍａｇｏｓａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，ｐ１６Ｉｎｋ４ａ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ：ａ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ  ｔｕｍｏｒｓ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．３０，２０８７−２０９７（２０１１）。
【０００４】
老化細胞は、がん細胞の成長を煽ることが知られている。老化細胞は、炎症促進性因子を含む細胞内シグナリングに関与する多くの因子の分泌に関連付けられ、これらの因子の分泌は、老化関連分泌表現型またはＳＡＳＰと称されている。１つの研究は、老化間葉系幹細胞が、ＩＬ−６の分泌によって乳癌細胞の増殖及び遊走を促進することを示した（Ｄｉ，Ｇ−ｈ．ｅｔ  ａｌ．ＩＬ−６Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ，ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ，Ｖｏｌ．９，１１，ｅ１１３５７２（２０１４））。別の研究は、老化ヒト線維芽細胞が、マトリックスメタロプロテイナーゼの分泌によって腫瘍の成長を増加させることを示した（Ｌｉｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｔｈｅ  Ｅａｒｌｙ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｔｕｍｏｒｓ  ｖｉａ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒ
ｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．６７，３１１７−３１２６（２００７））。
【０００５】
老化細胞は、ＳＡＳＰの一部として活性酸素種（「ＲＯＳ」）を分泌する。ＲＯＳは、細胞の老化を維持する上で重要な役割を果たすと考えられている。ＲＯＳの分泌は、老化細胞が隣接細胞の老化を誘発する傍観者効果を作り出し、つまりＲＯＳは、ｐ１６発現を活性化することが知られる正にその細胞損傷を作り出し、老化をもたらす（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｇ．，Ａ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｂｙｓｔａｎｄｅｒ  ｅｆｆｅｃｔ：ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ，Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏ．１１，３４５−３４９（２０１２））。ｐ１６／Ｒｂパスウェイは、ＲＯＳの誘発をもたらし、これが転じて、ＲＯＳを更に増強する正のフィードバックループを作り出すタンパク質キナーゼＣデルタを活性化し、不可逆的な細胞周期停止の維持を助ける。がん細胞をＲＯＳに曝露することが、過剰増殖細胞内での細胞相停止を誘発することによって、がんを治療するのに有効であり得ることさえ示唆されている（Ｒａｙｅｓｓ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ  ｐ１６，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．１３０，１７１５−１７２５（２０１２））。
【０００６】
終末糖化産物（ＡＧＥ、ＡＧＥ修飾タンパク質または最終糖化産物とも称される）は、糖とタンパク質側鎖との非酵素反応から生じる（Ａｎｄｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ  Ａｒｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｂｙ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  Ｅｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｄｕｒｉｎｇ  Ａｇｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．２５８，１２３，１２５（１９９９））。このプロセスは、シッフ塩基を形成するための還元糖とアミノ基との可逆的な反応とともに開始し、これが進行して、共有結合したアマドリ転位産物を形成する。一旦形成されると、アマドリ産物は更なる転位を受けて、ＡＧＥを産生する。真性糖尿病（ＤＭ）によって引き起こされる高血糖、及び酸化ストレスは、膜タンパク質のこの翻訳後修飾を促進する（Ｌｉｎｄｓｅｙ  ＪＢ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆｏｒ
Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  Ｅｎｄ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＲＡＧＥ）ａｎｄ  ｓｏｌｕｂｌｅ
ＲＡＧＥ（ｓＲＡＧＥ）：Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．６（１），７−１４，（２００９））。ＡＧＥは、糖尿病合併症、炎症、網膜症、腎症、アテローム性動脈硬化症、卒中、内皮細胞機能障害、及び神経変性障害を含むいくつかの病態に関連付けられている（Ｂｉｅｒｈａｕｓ  Ａ，“ＡＧＥｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ
ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＡＧＥ−ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ．Ｉ．Ｔｈｅ  ＡＧＥ  ｃｏｎｃｅｐｔ，”Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．３７（３），５８６−６００（１９９８））。
【０００７】
ＡＧＥ修飾タンパク質はまた、老化細胞のマーカーでもある。最終糖化産物と老化とのこの関連は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｇｒｕｂｅｒ，Ｌ．（ＷＯ２００９／１４３４１１、２００９年１１月２６日）、Ａｎｄｏ，Ｋ．ら（Ｍｅｍｂｒａｎｅ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ  Ａｒｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｂｙ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  Ｅｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｄｕｒｉｎｇ  Ａｇｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．２５８，１２３，１２５（１９９９））、Ａｈｍｅｄ，Ｅ．Ｋ．ら（“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ
Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ  Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｏｆ  ＷＩ−３８Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ”Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ，ｖｏｌ．９，２５
２，２６０（２０１０））、Ｖｌａｓｓａｒａ，Ｈ．ら（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｏｎ  Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  Ｃｅｌｌ
Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｉｎｄｕｃｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｂｙ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１６６，５３９，５４５（１９８７））、及びＶｌａｓｓａｒａら（“Ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｌｕｃｏｓｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  Ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡＩ，Ｖｏｌ．８２，５５８８，５５９１（１９８５））を参照されたい。更に、Ａｈｍｅｄ，Ｅ．Ｋ．らは、最終糖化産物が「細胞タンパク質及び細胞外タンパク質に対する自然損傷の主要な原因のうちの１つ」であることを示している（Ａｈｍｅｄ，Ｅ．Ｋ．ら、上記参照、３５３頁）。したがって、最終糖化産物の蓄積は、老化に関連付けられる。最終糖化産物の形成は、酸化に関連付けられるため、最終糖化産物の蓄積は、老化細胞内でのＲＯＳの形成の結果であり得る（Ｆｕ，Ｍ．−Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  Ｅｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔ，ＮΕ−（Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｈｔｙｌ）ｌｙｓｉｎｅ，Ｉｓ  ａ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  Ｌｉｐｉｄ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｘｉｄａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７１，９９８２−９９８６（１９９６））。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００９／１４３４１１号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Romagosa, C. et al., Oncogene 30: 2087-97 (2011)
【非特許文献２】Di,G-h. et al., PLOS One 9,11: e113572 (2014)
【非特許文献３】Liu,D. et al., Cancer Res 67: 3117-26(2007)
【非特許文献４】Nelson, G., Aging Cell 11: 345-49 (2012)
【非特許文献５】Rayess, H. et al., Int J Cancer 130: 1715-25 (2012)
【非特許文献６】Ando, K. et al., BiochemBiophys Res Commun. 258:123-27 (1999)
【非特許文献７】Lindsey JB, et al., Diabetes Vascular DiseaseResearch 6(1):7-14 (2009)
【非特許文献８】Bierhaus A, Cardiovasc Res 37(3): 586-600 (1998)
【非特許文献９】Ahmed, E. K. et al., Aging Cells 9: 252-72(2010)
【非特許文献１０】Vlassara, H. et al., J.Exp.Med. 166: 539-49 (1987)
【非特許文献１１】Vlassara, H. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5588-92 (1985)
【非特許文献１２】Fu,M.-X., et al., J.Biol.Chem. 271: 9982-86(1996)
【発明の概要】
【００１０】
第１の態様において、本発明は、がんを治療、転移性がん細胞を殺傷、潜在的悪性新生物細胞を殺傷、及び／またはがん転移を予防する方法であって、対象に抗ＡＧＥ抗体を含む組成物を投与することを含む、方法である。
【００１１】
第２の態様において、本発明は、がんを治療、転移性がん細胞を殺傷、潜在的悪性新生物細胞を殺傷、及び／またはがん転移を予防する方法であって、第１の抗ＡＧＥ抗体及び第２の抗ＡＧＥ抗体を含む組成物を投与することを含む、方法である。第２の抗ＡＧＥ抗体は、第１の抗ＡＧＥ抗体とは異なる。
【００１２】
第３の態様において、本発明は、がんを有する対象を治療、転移性がん細胞を殺傷、潜在的悪性新生物細胞を殺傷、及び／またはがん転移を予防する方法であって、抗ＡＧＥ抗体の第１の投与と、その後、第１の投与ががんを治療、転移性がん細胞を殺傷、潜在的悪性新生物細胞を殺傷、及び／またはがん転移を予防する有効性について、対象を検査することと、その後、抗ＡＧＥ抗体の第２の投与とを含む、方法である。
【００１３】
第４の態様において、本発明は、がんを治療、転移性がん細胞を殺傷、潜在的悪性新生物細胞を殺傷、及び／またはがん転移を予防するための医薬の製造のための、抗ＡＧＥ抗体の使用である。
【００１４】
第５の態様において、本発明は、がんを治療、転移性がん細胞を殺傷、潜在的悪性新生物細胞を殺傷、及び／またはがん転移を予防する上での使用のための、抗ＡＧＥ抗体を含む組成物である。
【００１５】
第６の態様において、本発明は、がんを治療、転移性がん細胞を殺傷、潜在的悪性新生物細胞を殺傷、及び／またはがん転移を予防するための組成物であって、第１の抗ＡＧＥ抗体と、第２の抗ＡＧＥ抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、組成物である。第１の抗ＡＧＥ抗体は、第２の抗ＡＧＥ抗体とは異なる。
【００１６】
第７の態様において、本発明は、転移性がんを診断する方法であって、ＡＧＥ修飾を発現する細胞に結合した抗ＡＧＥ抗体を含む免疫複合体を検出することを含む、方法である。
【００１７】
第８の態様において、本発明は、転移性がん細胞に結合した抗ＡＧＥ抗体を含む免疫複合体である。転移性がん細胞は、ＡＧＥ修飾を発現する。
【００１８】
第９の態様において、本発明は、転移性がんを診断するためのキットであって、抗ＡＧＥ抗体と、対照試料と、任意で、抗ＡＧＥ抗体に結合する試薬とを含む、キットである。
【００１９】
定義
【００２０】
「ペプチド」という用語は、２〜５０個のアミノ酸で構成される分子を意味する。
【００２１】
「タンパク質」という用語は、５０個を超えるアミノ酸で構成される分子を意味する。
【００２２】
「終末糖化産物」、「ＡＧＥ」、「ＡＧＥ修飾タンパク質またはペプチド」、「最終糖化産物」、及び「ＡＧＥ抗原」は、糖とタンパク質側鎖との反応の結果として形成され、更に転位し、不可逆的な架橋を形成する、修飾タンパク質またはペプチドを指す。このプロセスは、シッフ塩基を形成するための還元糖とアミノ基との可逆的な反応とともに開始し、これが進行して、共有結合したアマドリ転位産物を形成する。一旦形成されると、アマドリ産物は更なる転位を受けて、ＡＧＥを産生する。ＡＧＥ修飾タンパク質及びＡＧＥ修飾タンパク質に対する抗体は、ＢｕｃａｌａのＵＳ５，７０２，７０４（「Ｂｕｃａｌａ」）及びＡｌ−ＡｂｅｄらのＵＳ６，３８０，１６５（「Ａｌ−Ａｂｅｄ」）に記載されている。糖化アルブミンに見出されるＮ−デオキシフルクトシルリジンなどの、ＡＧＥを形成するのに必要な転位を受けていない糖化タンパク質またはペプチドは、ＡＧＥではない。ＡＧＥは、２−（２−フロイル）−４（５）−（２−フラニル）−１Ｈ−イミダゾール（「ＦＦＩ」）、５−ヒドロキシメチル−１−アルキルピロール−２−カルボアルデヒド（「ピラリン」）、１−アルキル−２−ホルミル−３，４−ジグリコシルピロール（「ＡＦＧＰ」）、非蛍光モデルＡＧＥ、カルボキシメチルリジン、及びペントシジンなど
のＡＧＥ修飾の存在（ＡＧＥエピトープまたはＡＧＥ部分とも称される）によって特定され得る。別のＡＧＥであるＡＬＩは、Ａｌ−Ａｂｅｄに記載されている。
【００２３】
「細胞上のＡＧＥ修飾タンパク質に結合する抗体」、「抗ＡＧＥ抗体」、または「ＡＧＥ抗体」は、ＡＧＥ修飾タンパク質またはペプチドに結合し、抗体の定常領域を含む抗体又は他のタンパク質を意味し、上記ＡＧＥ修飾されているタンパク質またはペプチドは通常、細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト、ネコ、イヌ、ウマ、ラクダ科（例えば、ラクダもしくはアルパカ）、ウシ、ヒツジ、またはヤギ細胞の表面上に結合した状態で見出されるタンパク質またはペプチドである。「細胞上のＡＧＥ修飾タンパク質に結合する抗体」、「抗ＡＧＥ抗体」、または「ＡＧＥ抗体」は、同じ特異性及び選択性で、ＡＧＥ修飾タンパク質またはペプチドと、同じ非ＡＧＥ修飾タンパク質またはペプチドとの両方に結合する抗体または他のタンパク質は含まない（つまりＡＧＥ修飾の存在は、結合を増加させない）。アルブミンは、通常細胞の表面上に結合した状態で見出されるタンパク質ではないため、ＡＧＥ修飾アルブミンは、細胞上のＡＧＥ修飾タンパク質ではない。「細胞上のＡＧＥ修飾タンパク質に結合する抗体」、「抗ＡＧＥ抗体」、または「ＡＧＥ抗体」は、細胞の除去、破壊、または死をもたらす抗体のみを含む。例えば、毒素、薬物、または他の化学物質もしくは粒子に接合されている抗体もまた、含まれる。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体であるが、ポリクローナル抗体もまた許容可能である。
【００２４】
「老化細胞」という用語は、増殖停止の状態にあり、１つ以上の老化のバイオマーカー（ｐ１６Ｉｎｋ４ａの活性化または老化関連β−ガラクトシダーゼの発現など）を発現する細胞を意味する。
【００２５】
「バリアント」という用語は、具体的に特定された配列とは異なり、１つ以上のヌクレオチド、タンパク質、またはアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されているヌクレオチド、タンパク質、またはアミノ酸配列を意味する。バリアントは、天然に存在する対立遺伝子バリアントであっても、天然に存在しないバリアントであってもよい。特定された配列のバリアントは、特定された配列の機能的特徴のうちのいくつかまたは全てを保持し得る。
【００２６】
「配列同一性パーセント（％）」は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して、最大配列同一性パーセントを達成した後、かついかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しない、参照ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である候補配列内のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定することが目的の整列は、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、様々な方法で達成することができる。好ましくは、配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）から公的に入手可能であるか、または米国著作権局にユーザ文書とともに提出されており、米国著作権登録第ＴＸＵ５１００８７号の下に登録されているソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定されており、変動しない。
【００２７】
アミノ酸配列比較のためにＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況において、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する所与のアミノ酸配列Ａの配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する特定のアミノ酸配列同
一性％を有するか、または含む所与のアミノ酸配列Ａとも表現することができる）は、以下、分数Ｘ／Ｙの１００倍（式中、Ｘは、配列整列プログラムＡＬＩＧＮ−２によって、そのプログラムのＡ及びＢの整列において同一のマッチとしてスコア化されるアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である）のように計算される。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＢへのＡのアミノ酸配列同一性％は、ＡへのＢのアミノ酸配列同一性％とは等しくないだろう。別段具体的に述べられない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性％値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して得られる。
【００２８】
「免疫複合体」という用語は、抗原に結合した抗体の組み合わせを意味する。免疫複合体はまた、「抗体−抗原複合体」とも称され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】抗体結合実験における応答対時間のグラフである。
【図２】がん転移を診断するためのキットを示す。
【図３】腫瘍成長、転移能、及び悪液質に対する抗ＡＧＥ抗体の効果を調査するインビボ研究の過程を通した、正規化した腫瘍体積のグラフを示す。
【図４】腫瘍成長、転移能、及び悪液質に対する抗ＡＧＥ抗体の効果を調査するインビボ研究の過程を通した、正規化したマウスの体重のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおける近年の研究は、活発に増殖している細胞が侵襲性ではないこと、及び転移性がん細胞などの侵襲性細胞が増殖しておらず、細胞周期停止にあるはずであることを示唆している（Ｍａｔｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｔｅ  Ｒｅｑｕｉｒｅｓ  Ｇ１Ｃｅｌｌ−Ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．３５，１６２−１７４（２０１５））。他の研究者らは、ＲＯＳの形成ががん細胞の転移を誘発し得ることを見出している（Ｐｏｒｐｏｒａｔｏ，Ｐ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｓｗｉｔｃｈ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌ．８，７５４−７６６（２０１４））。
【００３１】
細胞相停止及びＲＯＳの産生は、転移性がん細胞に、細胞表面上のＡＧＥ修飾タンパク質の存在を含むことが予想される老化細胞の多くの特徴を与える。したがって、ＡＧＥ修飾タンパク質は、転移性がん細胞を探索し、破壊するために、抗体を使用して標的とすることができる抗原を提供する。抗ＡＧＥ抗体の投与は、転移性がん細胞を殺傷することにより、がんを治療する。抗ＡＧＥ抗体の投与は、がん患者において転移を予防し、予防的な様式でがんの拡散を予防するために使用することができる。
【００３２】
脂漏性角化症、光線角化症、及び上皮内癌などの潜在的悪性新生物は、細胞表面上のＡＧＥ修飾タンパク質の存在を含むことが予想される老化細胞の多くの特徴（ｐ１６の発現など）を有する。したがって、ＡＧＥ修飾タンパク質は、潜在的悪性新生物細胞を探索し、破壊するために、抗体を使用して標的とすることができる抗原を提供する。抗ＡＧＥ抗体の投与は、潜在的悪性新生物細胞を殺傷することにより、がんを予防する。抗ＡＧＥ抗体の投与は、予防的な様式で患者においてがんを予防する。
【００３３】
細胞上のＡＧＥ修飾タンパク質に結合する抗体（「抗ＡＧＥ抗体」または「ＡＧＥ抗体」）は、当該技術分野において既知である。例としては、ＵＳ５，７０２，７０４（Ｂｕｃａｌａ）及びＵＳ６，３８０，１６５（Ａｌ−Ａｂｅｄら）に記載されるものが挙げられる。例としては、ＦＦＩ、ピラリン、ＡＦＧＰ、ＡＬＩ、カルボキシメチルリジン、カ
ルボキシエチルリジン、及びペントシジンなどのＡＧＥ修飾を有する１つ以上のＡＧＥ修飾タンパク質に結合する抗体、ならびにそのような抗体の混合物が挙げられる。好ましくは、抗体は、カルボキシメチルリジン修飾タンパク質に結合する。好ましくは、抗体は、それが使用される動物に対して非免疫原性であり、例えば、ヒト、伴侶動物（ネコ、イヌ、及びウマを含む）、ならびに商業的に重要な動物（ラクダ（またはアルパカ）、ウシ（ウシ亜科）、ヒツジ、及びヤギなど）に対して非免疫原性である。より好ましくは、抗体は、抗体に対する免疫応答を減少させるために動物の抗体と同じ種の定常領域を有し、例えば、（ヒトでは）ヒト化、（ネコでは）ネコ化、（イヌでは）イヌ化、（ウマでは）ウマ化、（ラクダもしくはアルパカでは）ラクダ化、（ウシでは）ウシ化、（ヒツジでは）ヒツジ化、または（ヤギでは）ヤギ化される。最も好ましくは、抗体は、（可変領域を除いて）それが使用される動物の抗体と同一であり、例えば、ヒト抗体、ネコ抗体、イヌ抗体、ウマ抗体、ラクダ抗体、ウシ抗体、ヒツジ抗体、またはヤギ抗体である。これらの動物の抗体の定常領域及び他の部分の詳細は、以下に記載される。好ましくは、抗体は、モノクローナル抗体であるが、ポリクローナル抗体もまた許容可能である。
【００３４】
特に好ましい抗ＡＧＥ抗体としては、カルボキシメチルリジンまたはカルボキシエチルリジンＡＧＥ修飾を呈するタンパク質またはペプチドに結合するものが挙げられる。カルボキシメチルリジン（Ｎ（イプシロン）−（カルボキシメチル）リジン、Ｎ（６）−カルボキシメチルリジン、または２−アミノ−６−（カルボキシメチルアミノ）ヘキサン酸としても知られる）及びカルボキシエチルリジン（Ｎ−イプシロン−（カルボキシエチル）リジンとしても知られる）は、酸化ストレス及び化学糖化の結果としてタンパク質またはペプチド及び脂質上に見出される。ＣＭＬ及びＣＥＬ修飾タンパク質またはペプチドは、様々な細胞上で発現される受容体ＲＡＧＥによって認識される。ＣＭＬ及びＣＥＬはよく研究されており、ＣＭＬ及びＣＥＬ関連産物は市販されている。例えば、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．は、ＣＭＬ−ＢＳＡ抗原、ＣＭＬポリクローナル抗体、ＣＭＬ免疫ブロットキット、及びＣＭＬ競合ＥＬＩＳＡキット（ｗｗｗ．ｃｅｌｌｂｉｏｌａｂｓ．ｃｏｍ／ｃｍｌ−ａｓｓａｙｓ）、ならびにＣＥＬ−ＢＳＡ抗原及びＣＥＬ競合ＥＬＩＳＡキット（ｗｗｗ．ｃｅｌｌｂｉｏｌａｂｓ．ｃｏｍ／ｃｅｌ−ｎ−ｅｐｓｉｌｏｎ−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ−ｌｙｓｉｎｅ−ａｓｓａｙｓ−ａｎｄ−ｒｅａｇｅｎｔｓ）を販売している。特に好ましい抗体としては、キーホールリンペットヘモシアニンに接合したカルボキシメチルリジンに対して産生された市販のマウス抗最終糖化産物抗体の可変領域、つまりヒト定常領域（またはそれが投与される動物の定常領域）を有するように修飾されたＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ、カタログ番号ＭＡＢ３２４７）から入手可能なカルボキシメチルリジンＭＡｂ（クローン３１８００３）が挙げられる。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．のカタログ番号ＭＡＢ３２４７に対応するカルボキシメチルリジン抗体などの市販の抗体は、診断目的向けのものであり得、動物またはヒトにおける使用には適さない材料を含有し得る。好ましくは、市販の抗体は、毒素または他の潜在的に有害な材料を除去するために、動物またはヒトにおける使用前に精製及び／または単離される。
【００３５】
抗ＡＧＥ抗体は、好ましくは最大で９×１０−３、８×１０−３、７×１０−３、または６×１０−３（秒−１）の抗体−抗原複合体からの低い解離速度、つまりｋｄ（ｋｂａｃｋまたはオフ速度とも称される）を有する。抗ＡＧＥ抗体は、細胞のＡＧＥ修飾タンパク質に対する高い親和性を有し、これは、最大で９×１０−６、８×１０−６、７×１０−６、６×１０−６、５×１０−６、４×１０−６、または３×１０−６（Ｍ）の低い解離定数ＫＤとして表され得る。好ましくは、抗ＡＧＥ抗体の結合特性は、図１に示される、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ、カタログ番号ＭＡＢ３２４７）から入手可能なカルボキシメチルリジンＭＡｂ（クローン３１８００３）に類似しているか、それと同じであるか、またはそれよりも優れている。
【００３６】
抗ＡＧＥ抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を通してＡＧＥ修飾細胞を破壊し得る。ＡＤＣＣは、細胞媒介免疫防御機構であり、そこでは、免疫系のエフェクター細胞が、膜表面抗原に特異的抗体が結合している標的細胞を活発に溶解させる。ＡＤＣＣは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好中球、または好酸球によって媒介され得る。エフェクター細胞は、結合した抗体のＦｃ部分に結合する。ＮＫ９２細胞（ＮａｎｔＫｗｅｓｔ，Ｃｕｌｖｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能な細胞株）などのＮＫ細胞を、抗ＡＧＥ抗体の投与とともに、またはそれに後続して投与することで、補体価、及びそれ故に抗ＡＧＥ抗体が転移性がん細胞を殺傷する有効性を増強することができる。抗ＡＧＥ抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を通してＡＧＥ修飾細胞を破壊し得る。ＣＤＣにおいて、免疫系の補体カスケードは、抗体が標的抗原に結合することによって引き起こされる。
【００３７】
抗ＡＧＥ抗体は、ＡＧＥ修飾細胞の破壊を引き起こす薬剤に接合され得る。そのような薬剤は、毒素、細胞傷害性剤、磁性ナノ粒子、及び磁性スピンボルテックスディスクであり得る。
【００３８】
抗ＡＧＥ抗体に接合したポア形成毒素（ＰＦＴ）（Ａｒｏｉａｎ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｏｒｅ−Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｔｏｘｉｎｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｎｏｎ−Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｅｎｓｅｓ（ＣＮＩＤｓ），”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１０：５７−６１（２００７））などの毒素は、ＡＧＥ修飾細胞を選択的に標的とし、それを除去するために、患者に注射され得る。抗ＡＧＥ抗体は、ＡＧＥ修飾細胞を認識し、それに結合する。その後、毒素は、細胞表面でのポア形成、及び浸透圧溶解を通した後続する細胞除去を引き起こす。
【００３９】
抗ＡＧＥ抗体に接合した磁性ナノ粒子は、ＡＧＥ修飾細胞を標的とし、それを除去するために、患者に注射され得る。磁性ナノ粒子は、ＡＧＥ修飾細胞を選択的に除去するために、磁場を適用することによって加熱され得る。
【００４０】
代替手段として、血管を遮断し得る自己凝集を回避するために、磁場が適用されるときにのみ磁化される磁性スピンボルテックスディスクは、磁場が適用されるときにスピンを開始し、標的細胞の膜破壊を引き起こす。抗ＡＧＥ抗体に接合した磁性スピンボルテックスディスクは、他の細胞を除去することなく、ＡＧＥ修飾細胞型を特異的に標的とする。
【００４１】
抗体は典型的には、連結して「Ｙ」形分子を形成する、ポリペプチドの２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む。定常領域は、抗原を標的とするために使用される機構を決定する。「Ｙ」（可変領域）の先端のアミノ酸配列は、異なる抗体間で変動する。この変動が、抗体に、抗原に結合するその特異性を与える。軽鎖及び重鎖の末端を含む可変領域は、超可変（ＨＶ、相補性決定領域またはＣＤＲとも称されることがある）領域及びフレームワーク（ＦＲ）領域に更に細分される。抗体が組み換えで調製されるとき、「Ｙ」の各先端が抗原のうちの１つに対して特異的になって、２つの異なる抗原に結合する可変領域（または相補性決定領域）を有する単一の抗体を有することもまた可能であり、これらは、二重特異性抗体と称される。
【００４２】
本発明のヒト化抗ＡＧＥ抗体は、配列番号２２に示されるアミノ酸のヒト定常領域配列を有し得る。ヒト化抗ＡＧＥ抗体の重鎖相補性決定領域は、配列番号２３（ＣＤＲ１Ｈ）、配列番号２４（ＣＤＲ２Ｈ）、及び配列番号２５（ＣＤＲ３Ｈ）に示されるタンパク質配列のうちの１つ以上を有し得る。ヒト化抗ＡＧＥ抗体の軽鎖相補性決定領域は、配列番号２６（ＣＤＲ１Ｌ）、配列番号２７（ＣＤＲ２Ｌ）、及び配列番号２８（ＣＤＲ３Ｌ）に示されるタンパク質配列のうちの１つ以上を有し得る。
【００４３】
ヒト（ホモサピエンス）抗体免疫グロブリンＧ１の重鎖は、配列番号１のタンパク質配列を有し得るか、またはそれを含み得る。重鎖の可変ドメインは、配列番号２のタンパク質配列を有し得るか、またはそれを含み得る。重鎖（配列番号２）の可変ドメインの相補性決定領域は、配列番号４１、配列番号４２、及び配列番号４３に示される。ヒト（ホモサピエンス）抗体免疫グロブリンＧ１のカッパ軽鎖は、配列番号３のタンパク質配列を有し得るか、またはそれを含み得る。カッパ軽鎖の可変ドメインは、配列番号４のタンパク質配列を有し得るか、またはそれを含み得る。任意で、配列番号４の１２８位のアルギニン（ＡｒｇまたはＲ）残基は、省略され得る。軽鎖（配列番号４）の可変ドメインの相補性決定領域は、配列番号４４、配列番号４５、及び配列番号４６に示される。可変領域は、コドン最適化され、合成され、ヒト免疫グロブリンＧ１定常領域を含有する発現ベクター内にクローニングされ得る。加えて、可変領域は、非ヒト抗体のヒト化において使用されてもよい。
【００４４】
抗体重鎖は、配列番号１２のＤＮＡ配列、つまりマウス抗ＡＧＥ免疫グロブリンＧ２ｂ重鎖によってコードされ得る。配列番号１２によってコードされるマウス抗ＡＧＥ免疫グロブリンＧ２ｂ重鎖のタンパク質配列は、配列番号１６に示される。マウス抗体の可変領域は、配列番号２０に示され、これは、配列番号１６の２５〜１４２位に対応する。あるいは、抗体重鎖は、配列番号１３のＤＮＡ配列、つまりキメラ抗ＡＧＥヒト免疫グロブリンＧ１重鎖によってコードされ得る。配列番号１３によってコードされるキメラ抗ＡＧＥヒト免疫グロブリンＧ１重鎖のタンパク質配列は、配列番号１７に示される。キメラ抗ＡＧＥヒト免疫グロブリンは、２５〜１４２位の配列番号２０のマウス可変領域を含む。抗体軽鎖は、配列番号１４のＤＮＡ配列、つまりマウス抗ＡＧＥカッパ軽鎖によってコードされ得る。配列番号１４によってコードされるマウス抗ＡＧＥカッパ軽鎖のタンパク質配列は、配列番号１８に示される。マウス抗体の可変領域は、配列番号２１に示され、これは、配列番号１８の２１〜１３２位に対応する。あるいは、抗体軽鎖は、配列番号１５のＤＮＡ配列、つまりキメラ抗ＡＧＥヒトカッパ軽鎖によってコードされ得る。配列番号１５によってコードされるキメラ抗ＡＧＥヒトカッパ軽鎖のタンパク質配列は、配列番号１９に示される。キメラ抗ＡＧＥヒト免疫グロブリンは、２１〜１３２位の配列番号２１のマウス可変領域を含む。
【００４５】
本発明のヒト化抗ＡＧＥ抗体は、１つ以上のヒト化重鎖またはヒト化軽鎖を有し得るか、またはそれを含み得る。ヒト化重鎖は、配列番号３０、３２、または３４のＤＮＡ配列によってコードされ得る。配列番号３０、３２、及び３４によってコードされるヒト化重鎖のタンパク質配列はそれぞれ、配列番号２９、３１、及び３３に示される。ヒト化軽鎖は、配列番号３６、３８、または４０のＤＮＡ配列によってコードされ得る。配列番号３６、３８、及び４０によってコードされるヒト化軽鎖のタンパク質配列はそれぞれ、配列番号３５、３７、及び３９に示される。好ましくは、ヒト化抗ＡＧＥ抗体は、元の抗体特異性を保持しながら、ヒト配列の量を最大化する。配列番号２９、３１、及び３３から選択されるタンパク質配列を有する重鎖と、配列番号３５、３７、及び３９から選択されるタンパク質配列を有する軽鎖とを含有する完全ヒト化抗体が、構築され得る。
【００４６】
特に好ましい抗ＡＧＥ抗体は、マウスモノクローナル抗ＡＧＥ抗体をヒト化することによって得ることができる。マウスモノクローナル抗ＡＧＥ抗体は、配列番号４７に示される重鎖タンパク質配列（可変ドメインのタンパク質配列は配列番号５２に示される）と、配列番号５７に示される軽鎖タンパク質配列（可変ドメインのタンパク質配列は配列番号６２に示される）とを有する。好ましいヒト化重鎖は、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、または配列番号５１に示されるタンパク質配列を有する（ヒト化重鎖の可変ドメインのタンパク質配列はそれぞれ、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、及び配列番号５６に示される）。好ましいヒト化軽鎖は、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、または配列番号６１に示されるタンパク質配列を有する（ヒト化軽鎖の可変
ドメインのタンパク質配列はそれぞれ、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、及び配列番号６６に示される）。好ましくは、ヒト化抗ＡＧＥモノクローナル抗体は、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、及び配列番号５１からなる群から選択されるタンパク質配列を有する重鎖と、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１からなる群から選択されるタンパク質配列を有する軽鎖とで構成される。これらのタンパク質配列で構成されるヒト化モノクローナル抗ＡＧＥ抗体は、より良好な結合及び／または改善された免疫系の活性化を有し得、これは、より大きな有効性をもたらす。
【００４７】
非ヒト種に由来する抗体のタンパク質配列は、配列番号２に示される配列を有する重鎖または配列番号４に示される配列を有するカッパ軽鎖の可変ドメインを含むように修飾され得る。非ヒト種は、イエネコもしくはイエイヌなどの伴侶動物、またはウシ、ウマ、もしくはラクダなどの家畜であり得る。好ましくは、非ヒト種は、マウスではない。ウマ（Ｅｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ）抗体免疫グロブリンガンマ４の重鎖は、配列番号５のタンパク質配列（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ４４５５１８）を有し得るか、またはそれを含み得る。ウマ（Ｅｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ）抗体免疫グロブリンデルタの重鎖は、配列番号６のタンパク質配列（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ６３１９４２）を有し得るか、またはそれを含み得る。イヌ（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）抗体免疫グロブリンＡの重鎖は、配列番号７のタンパク質配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｌ３６８７１）を有し得るか、またはそれを含み得る。イヌ（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）抗体免疫グロブリンＥの重鎖は、配列番号８のタンパク質配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｌ３６８７２）を有し得るか、またはそれを含み得る。ネコ（Ｆｅｌｉｓ
ｃａｔｕｓ）抗体免疫グロブリンＧ２の重鎖は、配列番号９のタンパク質配列（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ８１１１７５）を有し得るか、またはそれを含み得る。
【００４８】
ラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ及びＣａｍｅｌｕｓ  ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ）、ラマ（Ｌａｍａ  ｇｌａｍａ、Ｌａｍａ  ｐａｃｏｓ、及びＬａｍａ  ｖｉｃｕｇｎａ）、アルパカ（Ｖｉｃｕｇｎａ  ｐａｃｏｓ）、ならびにグアナコ（Ｌａｍａ
ｇｕａｎｉｃｏｅ）などのラクダ科の動物は、他の哺乳動物には見出されない特有の抗体を有する。重鎖及び軽鎖四量体で構成される従来の免疫グロブリンＧ抗体に加えて、ラクダ科はまた、軽鎖を含有せず重鎖二量体として存在する重鎖免疫グロブリンＧ抗体も有する。これらの抗体は、重鎖抗体、ＨＣＡｂ、単一ドメイン抗体、またはｓｄＡｂとして知られ、ラクダ科重鎖抗体の可変ドメインは、ＶＨＨとして知られる。ラクダ科重鎖抗体は、重鎖ＣＨ１ドメインを欠き、他の種には見出されないヒンジ領域を有する。ヒトコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）単一ドメイン抗体の可変領域は、配列番号１０のタンパク質配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＪ２４５１４８）を有し得るか、またはそれを含み得る。ヒトコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）四量体免疫グロブリンの重鎖の可変領域は、配列番号１１のタンパク質配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＪ２４５１８４）を有し得るか、またはそれを含み得る。
【００４９】
ラクダ科に加えて、重鎖抗体はまた、サメ、ガンギエイ、及びエイなどの軟骨魚類にも見出される。この種類の抗体は、免疫グロブリン新抗原受容体またはＩｇＮＡＲとして知られ、ＩｇＮＡＲの可変ドメインは、ＶＮＡＲとして知られる。ＩｇＮＡＲは、各々が１つの可変ドメインと５つの定常ドメインとで構成される２つの同一の重鎖二量体として存在する。ラクダ科と同様に、軽鎖は存在しない。
【００５０】
追加の非ヒト種のタンパク質配列は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ）、ＤＮＡ  Ｄａｔａｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．
ａｃ．ｊｐ／ａｒｓａ）、またはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）などのオンラインデータベースに容易に見出すことができる。
【００５１】
抗ＡＧＥ抗体またはそのバリアントは、配列番号２または配列番号２０（その翻訳後修飾を含む）のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含み得る。少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する可変領域は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有し得るが、その配列を含む抗ＡＧＥ抗体は、ＡＧＥに結合する能力を保持する。置換、挿入、または欠失は、可変領域外の領域において生じ得る。
【００５２】
抗ＡＧＥ抗体またはそのバリアントは、配列番号４または配列番号２１のアミノ酸配列（その翻訳後修飾を含む）と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含み得る。少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する可変領域は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有し得るが、その配列を含む抗ＡＧＥ抗体は、ＡＧＥに結合する能力を保持する。置換、挿入、または欠失は、可変領域外の領域において生じ得る。
【００５３】
あるいは、抗体は、キーホールリンペットヘモシアニンに接合したカルボキシメチルリジン（ＣＭＬ−ＫＬＨ）に対して産生された市販のマウス抗最終糖化産物抗体の相補性決定領域、つまりＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ、カタログ番号ＭＡＢ３２４７）から入手可能なカルボキシメチルリジンＭＡｂ（クローン３１８００３）を有し得る。
【００５４】
抗体は、対象の免疫系による標的細胞の破壊を可能にする定常領域を有し得るか、またはそれを含み得る。
【００５５】
ＡＧＥ修飾タンパク質の２種類以上のＡＧＥに結合する抗体の混合物もまた、使用されてもよい。
【００５６】
２つの異なるエピトープに指向された抗ＡＧＥ抗体である二重特異性抗体もまた、使用されてもよい。そのような抗体は、１つの抗ＡＧＥ抗体のものに由来する可変領域（または相補性決定領域）と、異なる抗体に由来する可変領域（または相補性決定領域）とを有するだろう。
【００５７】
抗体断片が、全抗体の代わりに使用されてもよい。例えば、免疫グロブリンＧは、酵素での消化によってより小さな断片へと分解され得る。パパイン消化は、重鎖内ジスルフィド架橋のＮ末端側を切断して、Ｆａｂ断片を産生する。Ｆａｂ断片は、軽鎖と、重鎖の２つのＮ末端ドメインのうちの１つ（Ｆｄ断片としても知られる）とを含む。ペプシン消化は、重鎖内ジスルフィド架橋のＣ末端側を切断して、Ｆ（ａｂ’）２断片を産生する。Ｆ（ａｂ’）２断片は、軽鎖と、ジスルフィド架橋によって結合された２つのＮ末端ドメインとの両方を含む。ペプシン消化はまた、Ｆｖ（可変断片）断片及びＦｃ（結晶化可能断片）断片も形成し得る。Ｆｖ断片は、２つのＮ末端可変ドメインを含有する。Ｆｃ断片は、細胞上の免疫グロブリン受容体と及び補体カスケードの初期要素と相互作用するドメインを含有する。ペプシンはまた、重鎖の第３の定常ドメイン（ＣＨ３）前の免疫グロブリンＧも切断して、大断片Ｆ（ａｂｃ）及び小断片ｐＦｃ’を産生し得る。あるいは、抗体
断片は、組み換えで産生され得る。
【００５８】
追加の抗体が所望される場合、それらは、周知の方法を使用して産生され得る。例えば、ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）は、免疫原、及び所望される場合アジュバントの１回以上の注射によって哺乳動物宿主内で産生され得る。典型的には、免疫原（及びアジュバント）は、皮下または腹腔内注射によって哺乳動物内に注射される。免疫原は、ＡＧＥ−アンチトロンビンＩＩＩ、ＡＧＥ−カルモジュリン、ＡＧＥ−インスリン、ＡＧＥ−セルロプラスミン、ＡＧＥ−コラーゲン、ＡＧＥ−カテプシンＢ、ＡＧＥ−アルブミン（ＡＧＥ−ウシ血清アルブミン（ＡＧＥ−ＢＳＡ）、ＡＧＥ−ヒト血清アルブミン、及び卵白アルブミンなど）、ＡＧＥ−クリスタリン、ＡＧＥ−プラスミノーゲン活性化因子、ＡＧＥ−内皮血漿膜タンパク質、ＡＧＥ−アルデヒド還元酵素、ＡＧＥ−トランスフェリン、ＡＧＥ−フィブリン、ＡＧＥ−銅／亜鉛ＳＯＤ、ＡＧＥ−アポリポタンパク質Ｂ、ＡＧＥ−フィブロネクチン、ＡＧＥ−膵臓リボース、ＡＧＥ−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ及びＩＩ、ＡＧＥ−ヘモグロビン、ＡＧＥ−Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰアーゼ、ＡＧＥ−プラスミノーゲン、ＡＧＥ−ミエリン、ＡＧＥ−リゾチーム、ＡＧＥ−免疫グロブリン、ＡＧＥ−赤血球グルタミン酸輸送タンパク質、ＡＧＥ−β−Ｎ−アセチルヘキソミナーゼ（ヘキソキナーゼ）、ＡＧＥ−アポリポタンパク質Ｅ、ＡＧＥ−赤血球膜タンパク質、ＡＧＥ−アルドース還元酵素、ＡＧＥ−フェリチン、ＡＧＥ−赤血球スペクトリン、ＡＧＥ−アルコール脱水素酵素、ＡＧＥ−ハプトグロビン、ＡＧＥ−チューブリン、ＡＧＥ−甲状腺ホルモン、ＡＧＥ−フィブリノーゲン、ＡＧＥ−β２−ミクログロブリン、ＡＧＥ−ソルビトール脱水素酵素、ＡＧＥ−α１−アンチトリプシン、ＡＧＥ−炭酸脱水素酵素、ＡＧＥ−リボヌクレアーゼ、ＡＧＥ−低密度リポタンパク質、ＡＧＥ−ヘキソキナーゼ、ＡＧＥ−アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ、ＡＧＥ−リボヌクレアーゼ、ＡＧＥ−ヘモグロビン（ＡＧＥ−ヒトヘモグロビンなど）、ＡＧＥ−アルブミン（ＡＧＥ−ウシ血清アルブミン（ＡＧＥ−ＢＳＡ）及びＡＧＥ−ヒト血清アルブミンなど）、ＡＧＥ−低密度リポタンパク質（ＡＧＥ−ＬＤＬ）、ならびにＡＧＥ−コラーゲンＩＶなどの細胞のＡＧＥ修飾タンパク質であり得る。完全な、溶解された、または部分的に消化されたＡＧＥ修飾赤血球などのＡＧＥ修飾細胞もまた、ＡＧＥ抗原として使用することができる。アジュバントの例としては、フロイント完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡ合成−トレハロースジコリノミコレート、水酸化アルミニウム（ミョウバン）、熱ショックタンパク質ＨＳＰ７０またはＨＳＰ９６、モノホスホリルリピドＡを含有するスクアレン乳濁液、α２−マクログロブリン、ならびに界面活性物質（油乳濁液、プロイロニックポリオール、ポリアニオン、及びジニトロフェノールを含む）が挙げられる。免疫応答を改善するために、免疫原は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、コレラ毒素、不安定性エンテロトキシン、シリカ粒子、または大豆トリプシン阻害剤などの宿主内で免疫原性であるポリペプチドに接合されてもよい。好ましい免疫原接合体は、ＡＧＥ−ＫＬＨである���あるいは、ｐＡｂはニワトリ内で作製され得、これはＩｇＹ分子を産生する。
【００５９】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）はまた、宿主または宿主に由来するリンパ球を免疫化し、ｍＡｂを分泌する（または潜在的に分泌する）リンパ球を収集し、それらのリンパ球を不死化細胞（例えば、骨髄腫細胞）に融合し、所望されるｍＡｂを分泌する細胞を選択することによっても作製され得る。ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術などの他の技術が使用されてもよい。抗体の可変ドメインをコードする遺伝子を、ヒト（または他の動物）免疫グロブリンの定常ドメインの遺伝子にスプライスすることによる、キメラ抗体の生成のための技術は、アミノ酸レベルで実質的にヒトである（ヒト化されている）か、または別の動物（ネコ、イヌ、ウマ、ラクダ、ウシ、ヒツジ、もしくはヤギなど）に実質的に「〜化」された「キメラ抗体」をもたらす。所望される場合、ｍＡｂは、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、透析法、硫酸アンモニウム沈殿法、または親和性クロマトグラフィーなどの従来の手順によって、培養培地ま
たは腹水から精製されてもよい。加えて、ヒトモノクローナル抗体は、第３のコピーのＩｇＧヒトトランス遺伝子座及び発現停止された内在性マウスＩｇ遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスの免疫化によって、またはヒト−トランスジェニックマウスを使用して生成され得る。ヒト化モノクローナル抗体及びその断片の産生はまた、ファージディスプレイ技術を通して生成することもできる。
【００６０】
「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与に適合するあらゆる全ての溶剤、分散培地、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、ならびに等張剤及び吸収遅延剤などを含む。そのような担体または希釈剤の好ましい例としては、水、食塩水、リンゲル溶液、及びデキストロース溶液が挙げられる。補助的活性化合物もまた、組成物中に組み込まれてもよい。非経口投与に使用される溶液及び懸濁液としては、無菌希釈剤（注射用水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶剤など）、抗菌剤（ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなど）、酸化防止剤（アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなど）、緩衝液（酢酸、クエン酸、またはリン酸など）、及び浸透圧調節用の薬剤（塩化ナトリウムまたはデキストロースなど）を挙げることができる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調節することができる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数回用量バイアル内に封入され得る。
【００６１】
注射に好適な薬学的組成物としては、無菌注射可能溶液または分散液の即時調製用の無菌水溶液または分散液が挙げられる。注射に好適な抗体の薬学的組成物中には、様々な賦形剤が含まれ得る。静脈内投与について、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ  ＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。あらゆる場合において、組成物は無菌でなくてはならず、シリンジを使用して投与するために流体であるべきである。そのような組成物は、製造及び保管中安定しているべきであり、細菌及び真菌などの微生物による汚染に対して保存されなくてはならない。様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、及びチメロサールは、微生物汚染を含有し得る。組成物中には、糖、アルコール（マニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトール、及び塩化ナトリウムなど）などの等張剤が含まれてもよい。吸収を遅延することができる組成物としては、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの薬剤が挙げられる。無菌注射可能溶液は、必要に応じて成分のうちの１つまたはその組み合わせとともに、必要な量の抗体、及び任意で他の治療構成要素を適切な溶剤中に組み込み、その後、無菌化することによって調製され得る。無菌注射可能溶液の調製のための無菌固体の調製方法としては、固体を得るための真空乾燥及び凍結乾燥が挙げられる。
【００６２】
吸入による投与について、抗体は、好適な噴霧剤、例えば、二酸化炭素などの気体を含有する噴霧器または加圧容器からエアロゾルスプレーとして送達され得る。抗体はまた、例えば、ｉＳＰＥＲＳＥ（商標）吸入薬物送達プラットフォーム（ＰＵＬＭＡＴＲＩＸ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）を使用して、乾燥粉末としての吸入を介して送達することもできる。ニワトリ抗体（ＩｇＹ）である抗ＡＧＥ抗体の使用は、吸入によって投与される場合、ヒトを含む様々な動物において非免疫原性であり得る。
【００６３】
局所適用は、皮膚に存在するがんならびに潜在的悪性新生物、例えば、黒色腫、脂漏性角化症、及び光線角化症にとって有効であり得る。局所投与用の組成物は、クリームまたはローションの形態であり得る。
【００６４】
各種の抗体の適切な投薬量レベルは一般に、１ｋｇの患者体重当たり約０．０１〜５００ｍｇであるだろう。好ましくは、投薬量レベルは、約０．１〜約２５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．５〜約１００ｍｇ／ｋｇであるだろう。好適な投薬量レベルは、約０
．０１〜２５０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜１００ｍｇ／ｋｇ、または約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇであり得る。この範囲内で、投薬量は、０．０５〜０．５、０．５〜５、または５〜５０ｍｇ／ｋｇであり得る。各種の抗体は、１日当たり１〜４回（１日当たり１回または２回など）のレジメンで投与され得るものの、抗体は典型的には、インビボで長期の半減期を有する。したがって、各種の抗体は、１日１回、１週間に１回、２もしくは３週間に１回、１ヶ月に１回、または６０〜９０日に１回投与され得る。
【００６５】
異なる身体の部分、特にリンパ節内へのがんの拡散について患者を試験することによって、抗ＡＧＥ抗体の投与を受ける対象を検査して、がんの治療が有効であるかどうかを決定し得る。生検、内視鏡検査法、血液検査、または画像診断検査（Ｘ線もしくはＣＴスキャンなど）などの、任意の好適な診断試験を使用することができる。診断検査はまた、検出のための抗ＡＧＥ抗体も含み得る。抗体の投与及び後続する検査は、所望される治療結果が達成されるまで反復されてもよい。同様に、対象を検査して、新生物の大きさの減少または消失によって潜在的悪性新生物の治療が有効であるかどうかを決定し得る。
【００６６】
単位投与量形態（ｕｎｉｔ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍ）を作製して、投与及び投薬量均一性を促進することができる。単位投与量形態は、治療される対象への単回投薬量として適した物理的に別々の単位を指し、これは、必要な薬学的担体に関連して治療有効量の１つ以上の種類の抗体を含有する。好ましくは、単位投与量形態は密閉容器内にあり、かつ無菌である。
【００６７】
転移性がんを発症し得る任意の哺乳動物が、本明細書に記載される方法によって治療され得る。ヒトは、治療に好ましい哺乳動物である。治療され得る他の哺乳動物としては、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、及び伴侶動物（イヌまたはネコなど）が挙げられる。治療を必要とする対象は、がんの診断によって特定され得る。転移を特に受けやすいがんとしては、肺癌、黒色腫、結腸癌、腎細胞癌、前立腺癌、子宮頚癌、膀胱癌、直腸癌、食道癌、肝臓癌、口腔癌及び咽喉癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、ならびに胃癌が挙げられる。治療は、転移性がんを経験する患者のものであり得る。がんを有するが、いかなる転移も特定される前である患者に治療を与えて、転移を予防することもできる。同様に、潜在的悪性新生物を発症し得る任意の哺乳動物が、本明細書に記載される方法によって治療され得る。ヒトは、治療に好ましい哺乳動物である。治療され得る他の哺乳動物としては、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、及び伴侶動物（イヌまたはネコなど）が挙げられる。治療を必要とする対象は、潜在的悪性新生物の診断によって特定され得る。
【００６８】
特に好ましい治療群としては、手術、放射線療法、または化学療法などの従来のがん治療を受けることができない対象が挙げられる。転移性がんを有するか、またはがん転移のリスクにある患者は、他の診断、健康状態、または合併症のために特定のがん治療を受けることができない可能性がある。例えば、妊娠している女性は、胎児を害するリスクのために放射線療法を受けることができない。老齢または衰弱した患者（癌性悪液質を経験する患者など）は、侵襲的手順を生き延びないリスクのために手術には良好な候補ではない可能性がある。多くの化学療法薬物は免疫系を害するため、免疫不全または慢性感染症を既に有する患者は、化学療法を受けることができない可能性がある。
【００６９】
抗ＡＧＥ抗体は、免疫パニング及び免疫吸着などの細胞精製プロセスにおいて使用されてもよい。精製プロセスは、望ましい細胞または望まれない細胞を、組織培養、細胞培養、または血液から単離する上で有用である。細胞精製は、骨髄移植などの移植または輸血などの輸注において有用であり得る。細胞精製は、転移性悪性細胞を除去し、有益な幹細胞を濃縮するための化学療法中の自家幹細胞移植において特に有用である。抗ＡＧＥ抗体を使用する免疫パニング及び免疫吸着は、転移性がんを、組織培養、細胞培養、または血
液試料から単離し得る。
【００７０】
抗ＡＧＥ抗体はまた、がん転移を診断するために使用することもできる。ＡＧＥ修飾タンパク質を発現する転移性がん細胞に結合した抗ＡＧＥ抗体を含む免疫複合体（抗体−抗原複合体としても知られる）は、転移性がんを予想するか、または示すことができる特有の分析物である。抗ＡＧＥ抗体の転移性がん細胞への特異的結合は、無症候レベルでのがん転移の検出を可能にし得る。診断用抗ＡＧＥ抗体を使用して、新たな場所での転移のリスクを提起する、循環転移性がん細胞を検出することができる。あるいは、診断用抗ＡＧＥ抗体を使用して、特定の場所から得た細胞を転移性がん細胞の存在について検査することができる。生検は、リンパ節、肺、肝臓、脳、もしくは骨などの転移性がん細胞の蓄積のリスクが知られている特定の身体の部分から、または疑わしいしこりなどの他の症状のために転移が疑われる身体の部分から細胞を採取することを伴い得る。抗ＡＧＥ抗体は、対象となる分析物を検出するために抗体を用いる任意の診断方法において使用されてもよい。例えば、免疫複合体は、蛍光標識もしくは放射標識などの標識を抗体に付着させた後、好適な画像技術を使用して、免疫蛍光法、フローサイトメトリー、もしくは標識細胞分取（ＦＡＣＳ）などの細胞学的技術を使用して、免疫測定法、特に酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット法、もしくは免疫沈殿法などの生化学的技術を使用して、または免疫パニングなどの細胞精製技術を使用して検出され得る。
【００７１】
図２は、がん転移を診断するためのキット２００を示す。キットは、抗ＡＧＥ抗体２１０と、対照２２０と、任意で、抗ＡＧＥ抗体を検出するための試薬２３０とを含み得る。抗ＡＧＥ抗体、対照、及び任意の試薬は、ビン、アンプル、エンベロープ、試験管、バイアル、フラスコ、またはシリンジなどの任意の好適な容器内に提供され得る。抗ＡＧＥ抗体及び／または試薬は任意で、蛍光標識、放射標識、または金粒子などで標識され得る。対照は、二次抗体が作製された動物に由来する正常な血清、既知の量のＡＧＥ修飾タンパク質もしくはペプチドを含有する溶液、またはＡＧＥ修飾を呈する固定もしくは保存細胞であり得る。抗ＡＧＥ抗体を検出するための試薬の例としては、ロバにおいて作製され、ローダミンで標識された抗ヒトポリクローナル抗体などの二次抗体が挙げられる。キットは任意で、容器２４０内に収容され得る。キットは任意で、印刷された説明書２５０を含み得る。好ましくは、キットの内容物は無菌であり、使用準備ができている。
【００７２】
キットは任意で、キット成分を収容するための容器を含み得る。容器は、プラスチックなどの強固で耐久性のある材料から形成されても、袋または側面が柔らかい箱などのように柔軟であってもよい。
【００７３】
キットは任意で、使用説明書を含み得る。説明書は、印刷された説明書として、または電子形式（ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）ドライブ上、セキュアデジタルカード（ＳＤ）カード上など）で提供されても、インターネット上にホストされ、クイックレスポンス（ＱＲ）コードを通してアクセス可能であってもよい。
【００７４】
キットは任意で、緩衝液、固定液、遮断溶液、プロテアーゼ阻害剤、分析用の基質（顕微鏡スライドガラス及び／またはカバーガラスなど）、マイクロタイタープレート、ならびに細胞抽出試薬（洗剤及び洗剤溶液など）などの追加の診断材料または機器を含有し得る。
【００７５】
配列番号１に対応する１文字表記のアミノ酸配列を、以下に示す。
2020158531.tif 000003
【００７６】
上記のアミノ酸配列の１６〜１３３位は、配列番号２に対応する。上記のアミノ酸配列の４６〜５０位は、配列番号４１に対応する。上記のアミノ酸配列の６５〜８１位は、配列番号４２に対応する。上記のアミノ酸配列の１１４〜１２２位は、配列番号４３に対応する。
【００７７】
配列番号３に対応する１文字表記のアミノ酸配列を、以下に示す。
2020158531.tif 000004
【００７８】
上記のアミノ酸配列の１６〜１２８位は、配列番号４に対応する。任意で、配列番号４の１２８位のアルギニン（ＡｒｇまたはＲ）残基は、省略され得る。上記のアミノ酸配列の３９〜５４位は、配列番号４４に対応する。上記のアミノ酸配列の７０〜７６位は、配列番号４５に対応する。上記のアミノ酸配列の１０９〜１１７位は、配列番号４６に対応する。
【００７９】
配列番号１２に対応するＤＮＡ配列を、以下に示す。
2020158531.tif 000005
【００８０】
配列番号１３に対応するＤＮＡ配列を、以下に示す。
2020158531.tif 000006
【００８１】
配列番号１４に対応するＤＮＡ配列を、以下に示す。
2020158531.tif 000007
【００８２】
配列番号１５に対応するＤＮＡ配列を、以下に示す。
2020158531.tif 000008
【００８３】
配列番号１６に対応する１文字表記のアミノ酸配列を、以下に示す。
2020158531.tif 000009
【００８４】
上記のアミノ酸配列の１２３位のアラニン残基は任意で、セリン残基で置換され得る。上記のアミノ酸配列の１２４位のチロシン残基は任意で、フェニルアラニン残基で置換され得る。上記のアミノ酸配列の２５〜１４２位は、配列番号２０に対応する。配列番号２０は任意で、１２３及び１２４位に置換を含み得る。配列番号２０は任意で、末端バリン残基の後に１つの追加のリジン残基を含有し得る。
【００８５】
配列番号１７に対応する１文字表記のアミノ酸配列を、以下に示す。
2020158531.tif 000010
【００８６】
配列番号１８に対応する１文字表記のアミノ酸配列を、以下に示す。
2020158531.tif 000011
【００８７】
上記のアミノ酸配列の２１〜１３２位は、配列番号２１に対応する。
【００８８】
配列番号１９に対応する１文字表記のアミノ酸配列を、以下に示す。
2020158531.tif 000012
【００８９】
配列番号２２に対応する１文字表記のアミノ酸配列を、以下に示す。
2020158531.tif 000013
【００９０】
配列番号２３に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、ＳＹＴＭＧＶＳである。
【００９１】
配列番号２４に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、ＴＩＳＳＧＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧである。
【００９２】
配列番号２５に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、ＱＧＧＷＬＰＰＦＡＸであり、Ｘは、任意の天然に存在するアミノ酸であり得る。
【００９３】
配列番号２６に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＳＲＧＹＳＹＭＨである。
【００９４】
配列番号２７に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、ＬＶＳＮＬＥＳである。
【００９５】
配列番号２８に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、ＱＨＩＲＥＬＴＲＳである。
【００９６】
配列番号２９に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、
2020158531.tif 000014
である。
【００９７】
配列番号３０に対応するＤＮＡ配列は、
2020158531.tif 000015
である。
【００９８】
配列番号３１に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、
2020158531.tif 000016
である。
【００９９】
配列番号３２に対応するＤＮＡ配列は、
2020158531.tif 000017
である。
【０１００】
配列番号３３に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、
2020158531.tif 000018
である。
【０１０１】
配列番号３４に対応するＤＮＡ配列は、
2020158531.tif 000019
である。
【０１０２】
配列番号３５に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、
2020158531.tif 000020
である。
【０１０３】
配列番号３６に対応するＤＮＡ配列は、
2020158531.tif 000021
である。
【０１０４】
配列番号３７に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、
2020158531.tif 000022
である。
【０１０５】
配列番号３８に対応するＤＮＡ配列は、
2020158531.tif 000023
である。
【０１０６】
配列番号３９に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、
2020158531.tif 000024
である。
【０１０７】
配列番号４０に対応するＤＮＡ配列は、
2020158531.tif 000025
である。
【０１０８】
配列番号４７に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、
2020158531.tif 000026
である。
【０１０９】
配列番号４８に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、
2020158531.tif 000027
である。
【０１１０】
配列番号４９に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、
2020158531.tif 000028
である。
【０１１１】
配列番号５０に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、
2020158531.tif 000029
である。
【０１１２】
配列番号５１に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、
2020158531.tif 000030
である。
【０１１３】
配列番号５２に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、
2020158531.tif 000031
である。
【０１１４】
配列番号５３に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、
2020158531.tif 000032
である。
【０１１５】
配列番号５４に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、
2020158531.tif 000033
である。
【０１１６】
配列番号５５に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、
2020158531.tif 000034
である。
【０１１７】
配列番号５６に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、
2020158531.tif 000035
である。
【０１１８】
配列番号５７に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、
2020158531.tif 000036
である。
【０１１９】
配列番号５８に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、
2020158531.tif 000037
である。
【０１２０】
配列番号５９に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、
2020158531.tif 000038
である。
【０１２１】
配列番号６０に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、
2020158531.tif 000039
である。
【０１２２】
配列番号６１に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、
2020158531.tif 000040
である。
【０１２３】
配列番号６２に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、
2020158531.tif 000041
である。
【０１２４】
配列番号６３に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、
2020158531.tif 000042
である。
【０１２５】
配列番号６４に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、
2020158531.tif 000043
である。
【０１２６】
配列番号６５に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、
2020158531.tif 000044
である。
【０１２７】
配列番号６６に対応する１文字表記のアミノ酸配列は、
2020158531.tif 000045
である。
【実施例】
【０１２８】
実施例１：抗最終糖化産物抗体の投与のインビボ研究。この実施例は、抗ＡＧＥ抗体が細胞表面上にＡＧＥ修飾タンパク質を有する細胞を標的とし得ることを示す。この研究において考慮される細胞は老化細胞であるものの、それらは、転移性がん細胞のモデルと見なされ得る。
【０１２９】
抗最終糖化産物抗体の効果を試験するために、老齢のＣＤ１（ＩＣＲ）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に抗体を３週間にわたって１週間に１回（１、８、及び１５日目）、１日２回、静脈内注射によって投与し、その後、１０週間の無治療期間を続けた。検査抗体は、キーホールリンペットヘモシアニンに接合したカルボキシメチルリジンに対して産生された市販のマウス抗最終糖化産物抗体、つまりＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ、カタログ番号ＭＡＢ３２４７）から入手可能なカルボキシメチルリジンＭＡｂ（クローン３１８００３）であった。生理食塩水の対照参照を、対照動物において使用した。
【０１３０】
「若年」と称されるマウスは、生後８週間である一方で、「老齢」と称されるマウスは、生後８８週間（±２日）であった。抗体の投与によるいかなる有害事象も認められなかった。研究において使用される異なる動物群を、表１に示す。
【０１３１】
【表１】
2020158531.tif 000046
【０１３２】
老化細胞のマーカーであるＰ１６ＩＮＫ４ａ  ｍＲＮＡを、群の脂肪組織中で実時間ｑＰＣＲによって定量化した。結果を、表２に示す。表において、ΔΔＣｔ＝ΔＣｔ平均対照群（２）−ΔＣｔ平均実験群（１または３または５）であり、倍発現＝２−ΔΔＣｔである。
【０１３３】
【表２】
2020158531.tif 000047
【０１３４】
上記の表は、予想通り、未治療の老齢マウス（対照群２）が未治療の若年マウス（対照群１）よりも２．５５倍多いｐ１６Ｉｎｋ４ａ  ｍＲＮＡを発現することを示す。これは、回復８５日目の終了時に安楽死させた群２の未治療の老齢マウスを、治療２２日目の終了時に安楽死させた群１の未治療の若年マウスと比較したときに観察された。群２の未治療の老齢マウスの結果を、８５日目に安楽死させた群３の治療した老齢マウスの結果と比較したとき、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ  ｍＲＮＡは群３におけるよりも群２において１．２３倍高いことが観察された。したがって、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ  ｍＲＮＡ発現のレベルは、老齢マウスを２．５μｇ／グラム／１日２回／週の抗体で治療したときにより低かった。
【０１３５】
群２（対照）の未治療の老齢マウスの結果を、２２日目に安楽死させた群５（５μｇ／グラム）の治療した老齢マウスの結果と比較したとき、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ  ｍＲＮＡは群５（５μｇ／グラム）におけるよりも群２（対照）において３．０３倍高いことが観察された。この比較は、群５の動物を５．０μｇ／グラム／１日２回／週で治療したとき、未治療の若年マウス（すなわち、群１）と同等のｐ１６Ｉｎｋ４ａ  ｍＲＮＡ発現レベルを示し、群５の動物がより低いレベルのｐ１６Ｉｎｋ４ａ  ｍＲＮＡ発現を有することを示した。回復８５日目の終了時に安楽死させた群３（２．５μｇ／グラム）のマウスとは異なり、群５のマウスは、治療２２日目の終了時に安楽死させた。
【０１３６】
これらの結果は、抗体投与が老化細胞の殺傷をもたらしたことを示す。
【０１３７】
腓腹筋の質量もまた測定して、筋肉減少症に対する抗体投与の効果を決定した。結果を、表３に示す。結果は、抗体の投与が対照と比較して筋肉質量を増加させたが、これは５．０μｇ／グラム／１日２回／週でのより高い投薬量でのみそのようであったことを示す。
【０１３８】
【表３】
2020158531.tif 000048
【０１３９】
これらの結果は、細胞のＡＧＥに結合する抗体の投与が、老化のバイオマーカーであるｐ１６Ｉｎｋ４ａを発現する細胞の減少をもたらしたことを実証する。データは、老化細胞の減少が、老齢マウスにおいて筋肉質量の増加を直接もたらすことを示す。これらの結果は、筋肉減少症の典型的な徴候である筋肉質量の減少を、細胞のＡＧＥに結合する抗体の投与によって治療することができることを示す。結果は、抗体の投与が、老化細胞を除去することによって、がん転移を治療する上で有効であることを示唆する。
【０１４０】
実施例２：検査抗体の親和性及び動態
【０１４１】
実施例１において使用した検査抗体の親和性及び動態を、細胞のＡＧＥ修飾タンパク質のモデル基質としてＮα，Ｎα−ビス（カルボキシメチル）−Ｌ−リジントリフルオロ酢酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して分析した。ブランクとしてＦｃ１セットを有する、及び検査抗体で固定化したＦｃ２（１５０，０００Ｄａの分子量）を有するＳｅｒｉｅｓ  ＳセンサーチップＣＭ５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を使用して、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）で無標識相互作用分析を実行した。泳動緩衝液は、２５℃の温度のＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．０５％のＰ−２０、７．４のｐＨ）であった。ソフトウェアは、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ２００評価ソフトウェア、バージョン２．０であった。二重参照（Ｆｃ２−１及び緩衝液注射のみ）を分析において使用し、データをラングミュア１：１結合モデルにフィットさせた。
【０１４２】
【表４】
2020158531.tif 000049
【０１４３】
応答対時間のグラフを、図１に示す。分析から以下の値を決定した。ｋａ（１／Ｍｓ）＝１．８５７×１０３、ｋｄ（１／ｓ）＝６．７８１×１０−３、ＫＤ（Ｍ）＝３．６５１×１０−６、Ｒｍａｘ（ＲＵ）＝１９．５２、及びＣｈｉ２＝０．１１４。フィッティングのＣｈｉ２値はＲｍａｘの１０％未満であるため、フィットは信頼できるものである。
【０１４４】
実施例３：マウス抗ＡＧＥ  ＩｇＧ２ｂ抗体及びキメラ抗ＡＧＥ  ＩｇＧ１抗体の構築及び産生
【０１４５】
マウス及びキメラヒト抗ＡＧＥ抗体を調製した。マウス抗ＡＧＥ抗体ＩｇＧ２ｂ重鎖のＤＮＡ配列を、配列番号１２に示す。キメラヒト抗ＡＧＥ抗体ＩｇＧ１重鎖のＤＮＡ配列を、配列番号１３に示す。マウス抗ＡＧＥ抗体カッパ軽鎖のＤＮＡ配列を、配列番号１４に示す。キメラヒト抗ＡＧＥ抗体カッパ軽鎖のＤＮＡ配列を、配列番号１５に示す。遺伝子配列を合成し、高発現哺乳動物ベクター内にクローニングした。配列をコドン最適化した。完成した構築物を配列確認してから、トランスフェクションへと進行した。
【０１４６】
トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ２９３細胞を振盪フラスコ内に播種し、無血清合成培地を使用して成長させた。ＤＮＡ発現構築物を、０．０３リットルの懸濁液ＨＥＫ２９３細胞内に一過的にトランスフェクトした。２０時間後、細胞を試料採取して、生存率及び生存細胞数を得、力価を測定した（Ｏｃｔｅｔ  ＱＫｅ，ＦｏｒｔｅＢｉｏ）。一過的トランスフェクション産生実行を通して、追加の読み取りを取得した。５日目に培養物を収集し、細胞密度、生存率、及び力価について各々の追加の試料を測定した。
【０１４７】
マウス及びキメラ抗ＡＧＥ抗体の馴化培地を収集し、遠心分離及び濾過によって一過的トランスフェクション産生実行から浄化した。上清をタンパク質Ａカラムに流し、低ｐＨ緩衝液で溶出させた。０．２μｍの膜フィルターを使用して濾過を実行してから、アリコートした。精製及び濾過の後、ＯＤ２８０からタンパク質濃度及び消衰係数を計算した。収率及びアリコートの要約を、表５に示す。
【０１４８】
【表５】
2020158531.tif 000050
【０１４９】
ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ−ＳＤＳ）分析によって、抗体純度を評価した。
【０１５０】
実施例４：マウス（親）及びキメラ抗ＡＧＥ抗体の結合
【０１５１】
実施例３に記載されるマウス（親）及びキメラ抗ＡＧＥ抗体の結合を、直接結合ＥＬＩＳＡによって調査した。抗カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＡＢ３２４７）を、対照として使用した。ＣＭＬをＫＬＨ（ＣＭＬ−ＫＬＨ）に接合させ、ＣＭＬ及びＣＭＬ−ＫＬＨの両方をＥＬＩＳＡプレート上に一晩コーティングした。ＨＲＰヤギ抗マウスＦｃを使用して、対照及びマウス（親）抗ＡＧＥ抗体を検出した。ＨＲＰヤギ抗ヒトＦｃを使用して、キメラ抗ＡＧＥ抗体を検出した。
【０１５２】
抗原を、１×リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中、１μｇ／ｍＬに希釈した。９６ウェルのマイクロタイターＥＬＩＳＡプレートを、１００μＬ／ウェルの希釈した抗原でコーティングし、４℃で一晩放置した。プレートを１×ＰＢＳ、２．５％のＢＳＡで遮断し、翌朝室温で１〜２時間放置した。５０μｇ／ｍＬの開始濃度で、１×ＰＢＳ、１％のＢＳＡでの段階希釈で抗体試料を調製した。二次抗体を１：５，０００に希釈した。１００μＬの抗体希釈物を各ウェルに適用した。マイクロプレート振盪機で、プレートを室温で０．５〜１時間インキュベートした。プレートを１×ＰＢＳで３回洗浄した。１００μＬ／ウェルの希釈したＨＲＰ接合ヤギ抗ヒトＦｃ二次抗体を、各ウェルに適用した。マイクロプレート振盪機で、プレートを１時間インキュベートした。その後、プレートを１×ＰＢＳで３回洗浄した。１００μＬのＨＲＰ基質ＴＭＢを各ウェルに添加して、プレートを展開した。３〜５分間が経過した後、１００μＬの１ＮのＨＣｌを添加することによって反応を終了させた。第２の直接結合ＥＬＩＳＡを、ＣＭＬコーティングのみで実行した。マイクロプレートリーダーを使用して、ＯＤ４５０での吸光度を読み取った。
【０１５３】
ＣＭＬ及びＣＭＬ−ＫＬＨ  ＥＬＩＳＡのＯＤ４５０吸光度の生データを、以下のプレートマップに示す。ウェルプレート中、９６個のウェルのうち４８個を使用した。プレートマップ中のブランクウェルは、未使用のウェルを示す。
【０１５４】
ＣＭＬ及びＣＭＬ−ＫＬＨ  ＥＬＩＳＡのプレートマップ：
2020158531.tif 000051
【０１５５】
ＣＭＬのみのＥＬＩＳＡのＯＤ４５０吸光度の生データを、以下のプレートマップに示す。ウェルプレート中、９６個のウェルのうち２４個を使用した。プレートマップ中のブランクウェルは、未使用のウェルを示す。
【０１５６】
ＣＭＬのみのＥＬＩＳＡのプレートマップ：
2020158531.tif 000052
【０１５７】
対照及びキメラ抗ＡＧＥ抗体は、ＣＭＬ及びＣＭＬ−ＫＬＨの両方への結合を示した。マウス（親）抗ＡＧＥ抗体は、ＣＭＬまたはＣＭＬ−ＫＬＨのいずれかへの非常に弱い結合〜無結合を示した。反復したＥＬＩＳＡのデータは、対照及びキメラ抗ＡＧＥのＣＭＬへの結合を確認する。全ての緩衝液対照は、負のシグナルを示した。
【０１５８】
実施例５：ヒト化抗体
【０１５９】
親（マウス）抗体配列の選択部分をヒトフレームワーク配列と融合する複数のハイブリッド配列を作り出すことによって、ヒト化抗体を設計した。そのフレームワークにわたる全体的配列同一性、マッチする界面位置、同様に分類されるＣＤＲ正準位置、及び除去されなくてはならないＮ−グリコシル化部位の存在に基づいて、アクセプターフレームワークを特定した。２つの異なる重鎖及び軽鎖ヒトアクセプターフレームワークに基づいて、３つのヒト化軽鎖及び３つのヒト化重鎖を設計した。重鎖のアミノ酸配列を配列番号２９、３１、及び３３に示し、これらはそれぞれ配列番号３０、３２、及び３４に示されるＤＮＡ配列によってコードされる。軽鎖のアミノ酸配列を配列番号３５、３７、及び３９に示し、これらはそれぞれ配列番号３６、３８、及び４０に示されるＤＮＡ配列によってコードされる。ヒト化配列を目測及びコンピュータモデル化によって系統的に分析して、抗原結合を保持する可能性が最も高い配列を単離した。この目的は、元の抗体特異性を保持しながら、最終ヒト化抗体におけるヒト配列の量を最大化することであった。ヒト化軽鎖及び重鎖を組み合わせて、９つのバリアントの完全ヒト化抗体を作り出すことができた。
【０１６０】
３つの重鎖及び３つの軽鎖を分析して、それらのヒト化度（ｈｕｍａｎｎｅｓｓ）を決定した。抗体ヒト化度スコアは、Ｇａｏ，Ｓ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｈｕｍａｎｎｅｓｓ  ｓｃｏｒｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎｓ”，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：５５（２０１３年７月５日）に記載される方法に従って計算した。ヒト化度スコアは、抗体可変領域配列がいかにヒトらしく見えるかを表す。重鎖では、７９以上のスコアがヒトらしく見えることを示し、軽鎖では、８６以上のスコアがヒトらしく見えることを示す。３つの重鎖、３つの重鎖、親（マウス）重鎖、及び親（マウス）軽鎖のヒト化度を、以下の表６に示す。
【０１６１】
【表６】
2020158531.tif 000053
【０１６２】
まず可変領域配列を合成することによって、完全長抗体遺伝子を構築した。配列を、哺乳動物細胞内での発現に最適化した。その後、これらの可変領域配列を、既にヒトＦｃドメインを含有する発現ベクター内にクローニングした（重鎖には、ＩｇＧ１を使用した）。
【０１６３】
血清の不在下で合成培地を使用して、重鎖及び軽鎖のプラスミドを懸濁液ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトすることによって、ヒト化抗体の小規模の産生を実行した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅタンパク質Ａ培地（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、馴化培地内の全抗体を精製した。
【０１６４】
配列番号２９、３１、及び３３に示されるアミノ酸配列を有する３つの重鎖と、配列番号３５、３７、及び３９に示されるアミノ酸配列を有する３つの軽鎖との各組み合わせから、９つのヒト化抗体を産生した。比較キメラ親抗体もまた調製した。抗体及びそれらのそれぞれの力価を、以下の表７に示す。
【０１６５】
【表７】
2020158531.tif 000054
【０１６６】
ヒト化抗体の結合は、例えば、用量依存的結合ＥＬＩＳＡまたは細胞ベースの結合アッセイによって評価することができる。
【０１６７】
実施例６（予言）：転移性がん細胞の殺傷、及び転移性がんの治療
【０１６８】
ヒト卵巣癌細胞（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＢｉｏＡｒｒａｙ，Ｓｈｉｒｌｅｙ，ＮＹ）の凝集体を、２つの群（Ａ及びＢ）のＴ及びＢ細胞欠乏ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ（ＳＣＩＤ）マウス、具体的にはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ，ＣＴ）から入手可能なＮＳＧマウスの腹腔内に植え付ける。群Ａは、生理食塩水が静脈内注射される対照群であり、群Ｂは、１匹のマウス当たり１グラム当たり５μｇの記載される抗ＡＧＥモノクローナル抗体のうちのいずれかが静脈内注射される。
【０１６９】
がん細胞の植え付けの８０日後、群Ａ及びＢの両方のマウスは、肉眼及び組織学的試験を受ける。抗体で治療した群Ｂのマウスは、群Ａの対照マウスよりも有意に少ない転移性病巣を有する。
【０１７０】
実施例６：カルボキシメチルリジンモノクローナル抗体の投与のインビボ研究
【０１７１】
腫瘍成長、転移能、及び悪液質に対するカルボキシメチルリジン抗体の効果を調査した。マウス乳癌腫瘍モデルを使用して、マウスにおいてインビボ研究を実行した。雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）は、研究の１日目の時点で生後１１週間であった。
【０１７２】
４Ｔ１マウス乳腺腫瘍細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２５３９）を、１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのグルタミン、２５μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、１００単位／ｍＬのペニシリンＧ  Ｎａ、及び１００μｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。腫瘍細胞を、５％のＣＯ２及び９５％の空気の雰囲気中、３７℃の加湿インキュベーター内の組織培養フラスコ内に維持した。
【０１７３】
その後、培養した乳癌細胞をマウス内に移植した。対数期成長中に４Ｔ１細胞を収集し、移植日に１×１０６個の細胞／ｍＬの濃度でリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁した。１×１０５個の４Ｔ１細胞（０．１ｍＬの懸濁液）を各検査動物の右側腹部に皮下移
植することによって、腫瘍を引き起こした。腫瘍の体積が８０〜１２０ｍｍ３の標的範囲に接近するにつれて、それらをモニターした。式、腫瘍体積＝（腫瘍幅）２（腫瘍長さ）／２を使用して、腫瘍体積を決定した。１ｍｍ３の腫瘍体積が１ｍｇの重量を有するという想定を使用して、腫瘍重量を概算した。移植の１３日後（研究１日目と指定）、個々の腫瘍体積が１０８〜１２６ｍｍ３の範囲、及び群平均腫瘍体積が１１２ｍｍ３で、マウスを４つの群（ｎ＝１５／群）に選別した。４つの治療群を、以下の表８に示す。
【０１７４】
【表８】
2020158531.tif 000055
【０１７５】
抗カルボキシメチルリジンモノクローナル抗体を、治療剤として使用した。２５０ｍｇのカルボキシメチルリジンモノクローナル抗体を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から得た。カルボキシメチルリジンモノクローナル抗体の投薬溶液を、ビヒクル（ＰＢＳ）中１及び０．５ｍｇ／ｍＬで調製して、１０ｍＬ／ｋｇの投薬体積中それぞれ１０及び５μｇ／ｇの活性投薬量を用意した。投薬溶液を光から保護して４℃で保管した。
【０１７６】
全ての治療は、マウスに１回用量を投与した研究１日目を除いて、２１日間にわたって１日２回静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。研究１９日目に、尾静脈劣化のために静脈内投薬できない動物について、静脈内投薬を腹腔内（ｉ．ｐ．）投薬に変更した。投薬体積は、２０グラムの体重当たり０．２００ｍＬ（１０ｍＬ／ｋｇ）であり、個々の各動物の体重に調整した。
【０１７７】
この研究を２３日間継続した。ノギスを使用して、腫瘍を１週間に２回測定した。１〜５日目は動物を毎日、その後、研究完了まで１週間に２回秤量した。あらゆる副作用についても、マウスを観察した。許容される毒性は、研究中の２０％未満の群平均の体重減少かつ１０％以下の治療関連死と定義された。研究最終日（２３日目）のデータを使用して、治療有効性を決定した。
【０１７８】
群１〜３の腫瘍体積中央値（ＭＴＶ）を比較することによって、抗カルボキシメチルリジン抗体が腫瘍成長を阻害する能力を決定した。腫瘍体積は、上述のように測定した。腫瘍成長阻害パーセント（ＴＧＩ％）は、対照群のＭＴＶのパーセンテージとして表される、対照群（群１）のＭＴＶと薬物治療した群のＭＴＶとの差と定義された。％ＴＧＩは、式、％ＴＧＩ＝（１−ＭＴＶ治療／ＭＴＶ対照）×１００に従って計算することができる。図３は、腫瘍成長、転移能、及び悪液質に対する抗ＡＧＥ抗体の効果を調査するインビボ研究の過程を通した、正規化した腫瘍体積のグラフを示す。
【０１７９】
群１〜３の肺癌病巣を比較することによって、抗カルボキシメチルリジン抗体ががん転移を阻害する能力を決定した。阻害パーセント（阻害％）は、対照群の転移性病巣の平均数のパーセンテージとして表される、対照群の転移性病巣の平均数と、薬物治療した群の転移性病巣の平均数との差と定義された。阻害％は、以下の式、阻害％＝（１−病巣の平
均数治療／病巣の平均数対照）×１００に従って計算することができる。
【０１８０】
群１〜３の肺及び腓腹筋の重量を比較することによって、抗カルボキシメチルリジン抗体が悪液質を阻害する能力を決定した。組織重量もまた、１００ｇの体重に正規化した。図４は、腫瘍成長、転移能、及び悪液質に対する抗ＡＧＥ抗体の効果を調査するインビボ研究の過程を通した、正規化したマウスの体重のグラフを示す。
【０１８１】
治療有効性を、研究中に観察された退縮応答の発生率及び規模によってもまた評価した。治療は、動物において腫瘍の部分的な退縮（ＰＲ）または完全な退縮（ＣＲ）を引き起こし得る。ＰＲ応答において、腫瘍体積は、研究の過程中、３回の連続する測定にわたってその１日目の体積の５０％以下、かつこれら３回の測定のうちの１つ以上について１３．５ｍｍ３以上であった。ＣＲ応答において、腫瘍体積は、研究の過程中、３回の連続する測定にわたって１３．５ｍｍ３未満であった。
【０１８２】
Ｗｉｎｄｏｗｓ６．０７用Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して、統計学的分析を実行した。マンホイットニーのＵ検定を使用して、２つの群の２３日目の平均腫瘍体積（ＭＴＶ）の差の統計学的分析を達成した。転移性病巣の比較を、ダネット分散分析によって評価した。正規化した組織重量を、分散分析によって比較した。有意水準Ｐ＝０．０５で、両側の統計学的分析を実行した。統計学的に有意であるもの、または統計学的に有意ではないものとして、結果を分類した。
【０１８３】
研究の結果を、以下の表９に示す。
【０１８４】
【表９】
2020158531.tif 000056
【０１８５】
全ての治療レジメンは、いかなる治療関連死もなく、許容された。唯一の動物死は、転移による非治療関連死であった。ＴＧＩ％は、５μｇ／ｇ（群２）及び１０μｇ／ｇの治療群（群３）について有意性への傾向（Ｐ＞０．０５、マンホイットニー）を示した。阻害％は、５μｇ／ｇの治療群について有意性への傾向（Ｐ＞０．０５、ダネット分散分析）を示した。阻害％は、１０μｇ／ｇの治療群について統計学的に有意（Ｐ≦０．０１、ダネット分散分析）であった。カルボキシメチルリジン抗体が悪液質を治療する能力は、治療群と対照群との間の肺及び腓腹筋の器官重量の比較に基づいて、有意性への傾向（Ｐ＞０．０５、分散分析）を示した。結果は、抗カルボキシメチルリジンモノクローナル抗
体の投与が、がん転移を減少させることができることを示す。
【０１８６】
実施例７：転移性がんの診断（仮想）
【０１８７】
乳癌を有する患者は、腫大したリンパ節を呈する。腫瘍学者は、乳癌が彼女のリンパ節に転移していることを疑う。腫瘍学者は、彼女の腫大したリンパ節のうちの１つから血液試料及び生検を得る。蛍光標識抗ＡＧＥ抗体及び対照を含有するキットを使用して、血液試料及び生検からの細胞を、ＡＧＥ修飾がん細胞の存在について検査する。診断検査は、患者の血液中に循環ＡＧＥ修飾がん細胞の存在を、及びリンパ節内に転移性乳癌細胞の存在を示す。ＭｉｌｌｅｒらのＵＳ７，５４１，１５０に記載されるように、周知のがんマーカーである細胞表面ヌクレオリンについての第２の細胞染色は、癌性細胞の存在を確認する。
【０１８８】
参考文献
１．Ｇｒｕｂｅｒらの国際出願公開第ＷＯ２００９／１４３４１１号（２００９年１１月２６日）。
２．Ｂｕｃａｌａらの米国特許第５，７０２，７０４号（１９９７年１２月３０日発行）。
３．Ａｌ−Ａｂｅｄらの米国特許第６，３８０，１６５号（２００２年４月３０日発行）。
４．Ｗｒｉｇｈｔらの米国特許第６，３８７，３７３号（２００２年５月１４日発行）。
５．Ｖａｎｌｅｒｂｅｒｇｈｅらの米国特許第４，２１７，３４４号（１９８０年８月１２日発行）。
６．Ｗａｌｌａｃｈの米国特許第４，９１７，９５１号（１９９０年４月１７日発行）。
７．Ｗａｌｌａｃｈの米国特許第４，９１１，９２８号（１９９０年３月２７日発行）。
８．Ｓｍｉｔｈらの米国特許出願公開第ＵＳ２０１０／２２６９３２号（２０１０年９月９日）。
９．Ａｎｄｏ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ  Ａｒｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｂｙ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  Ｅｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ａｇｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌ．２５８，１２３−２７（１９９９）。
１０．Ｌｉｎｄｓｅｙ  ＪＢ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  Ｅｎｄ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＲＡＧＥ）ａｎｄ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ＲＡＧＥ（ｓＲＡＧＥ）：Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．６（１），７−１４，（２００９）。
１１．Ｂｉｅｒｈａｕｓ  Ａ，“ＡＧＥｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＡＧＥ−ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ．  Ｉ．Ｔｈｅ  ＡＧＥ  ｃｏｎｃｅｐｔ，”Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．３７（３），５８６−６００  （１９９８）。
１２．Ｍｅｕｔｅｒ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．“Ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ
ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｒｅ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  ｏｘｙｇｅｎ
”Ｊ  Ａｓｓｉｓｔ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｇｅｎｅｔ．２０１４Ａｕｇ１０．［印刷前オンライン先行公開］。
１３．Ｂａｋｅｒ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｐ１６Ｉｎｋ４ａ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｌａｙｓ  ａｇｅｉｎｇ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ”，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４７９，ｐｐ．２３２−２３６，（２０１１）。
１４．Ｊａｎａ  Ｈａｄｒａｂｏｖａ，ｅｔ  ａｌ．“Ｃｈｉｃｋｅｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ：Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｉｎｈａｌｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ａｉｒｗａｙｓ”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（印刷中、２０１４年５月５日オンライン入手可能）。
１５．Ｖｌａｓｓａｒａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ
Ｇｌｕｃｏｓｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  Ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８２，５５８８，５５９１（１９８５）。
１６．Ｒｏｌｌ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉ−ＣＤ２０Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ”，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，Ｖｏｌ．５８，Ｎｏ．６，１５６６−１５７５（２００８）。
１７．Ｋａｊｓｔｕｒａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｙｏｃｉｔｅ  Ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｇｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅａｒｔ”，Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１０７（１１），１３７４−８６，（２０１０）。
１８．ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｄａｍａｇｅ  ａｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  Ａｎｔｉｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ”，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，Ｖｏｌ．５６（１１），３８４７，３８４７（２００７）。
１９．Ｍａｎｅｓｓｏ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  β−Ｃｅｌｌ
Ｔｕｒｎｏｖｅｒ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  β−Ｃｅｌｌ  Ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｓｏｕｒｃｅｓ  ｏｆ  β−Ｃｅｌｌｓ  ｏｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  β−ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＨＩＰ
Ｒａｔ”，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，Ｖｏｌ．２９７，Ｅ３２３，Ｅ３２４（２００９）。
２０．Ｋｉｒｓｔｅｉｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ
Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ
Ｉ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ｅｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，Ｖｏｌ．９０，４３９，４３９−４４０（１９９２）。
２１．Ｍｕｒｐｈｙ，Ｊ．Ｆ．，“Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ”，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ：Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１４（４），６７−８０（２０１０）。
２２．Ｖｉｒｅｌｌａ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，“Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ｅｎｄ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ
ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ＬＤＬ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．４４，４８７−４９３（２００３）。
２３．Ａｍｅｌｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ＬＤＬ  ａｎｄ  Ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ＬＤＬ  ｏｎ  Ｅａｒｌｙ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔ
ｅｒｏｌｅｍｉｃ  Ｒａｂｂｉｔｓ”，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１６，１０７４（１９９６）。
２４．“Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ”、ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａでオンライン入手可能（２０１４年１１月１４日）。
２５．“Ｗｈａｔ  ｉｓ  ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ？”、ｗｗｗ．ｉｏｆｂｏｎｅｈｅａｌｔｈ．ｏｒｇ／ｗｈａｔ−ｓａｒｃｏｐｅｎｉａでオンライン入手可能（２０１４年）。
２６．Ｂｌａｈｄ，Ｗ．，“Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ  ｗｉｔｈ  ａｇｉｎｇ”、ｗｗｗ．ｗｅｂｍｄ．ｃｏｍ／ｈｅａｌｔｈｙ−ａｇｉｎｇ／ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ−ｗｉｔｈ−ａｇｉｎｇでオンライン入手可能（２０１４年８月３日）。
２７．“Ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ”、ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｋｅｙｈｏｌｅ＿ｌｉｍｐｅｔ＿ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎでオンライン入手可能（２０１４年４月１８日）。
２８．“ＣＭＬ−ＢＳＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄａｔａ  Ｓｈｅｅｔ”、ｗｗｗ．ｃｅｌｌｂｉｏｌａｂｓ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅｓ／ｄｅｆａｕｌｔ／ｆｉｌｅｓ／ＳＴＡ−３１４−ｃｍｌ−ｂｓａ．ｐｄｆでオンライン入手可能（２０１０年）。
２９．“ＣＭＬ（Ｎ−ｅｐｓｉｌｏｎ−（Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）Ｌｙｓｉｎｅ）Ａｓｓａｙｓ  ａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ、ｗｗｗ．ｃｅｌｌｂｉｏｌａｂｓ．ｃｏｍ／ｃｍｌ−ａｓｓａｙｓでオンライン入手可能（２０１４年１２月１５日アクセス）。
３０．Ｃｒｕｚ−Ｊｅｎｔｏｆｔ，Ａ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ：Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｏｎ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ”，Ａｇｅ  ａｎｄ  Ａｇｅｉｎｇ，Ｖｏｌ．３９，ｐｐ．４１２−４２３（Ａｐｒｉｌ１３，２０１０）。
３１．Ｒｏｌｌａｎｄ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ：ｉｔｓ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ，ｅｔｉｏｌｏｇｙ，ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ”，Ｊ．Ｎｕｔｒ．Ｈｅａｌｔｈ  Ａｇｉｎｇ，Ｖｏｌ．１２（７），ｐｐ．４３３−４５０（２００８）。
３２．Ｍｅｒａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｎε−（ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｌｙｓｉｎｅ（ＣＥＬ）：Ｐｏｓｓｉｂｌｅ
ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  ＣＥＬ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌ．４０７，ｐｐ．４２０−４２５（Ｍａｒｃｈ１２，２０１１）。
３３．Ｒｅｄｄｙ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｎε−（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｌｙｓｉｎｅ  ｉｓ  ａ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ（ＡＧＥ）ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３４，ｐｐ．１０８７２−１０８７８（Ａｕｇｕｓｔ１，１９９５）。
３４．Ｎａｙｌｏｒ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ：ａ
ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ”，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．９３（１），ｐｐ．１０５−１１６（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ５，２０１２）。
３５．Ｋａｔｃｈｅｒ，Ｈ．Ｌ．，“Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｓｈｅｄ  ｎｅｗ  ｌｉｇｈｔ  ｏｎ  ａｇｉｎｇ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃｏｗ），Ｖｏｌ．７８（９），ｐｐ．１０６１−１０７０（２０１３）。
３６．Ａｈｍｅｄ，Ｅ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ  Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｏｆ  ＷＩ−３８Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ”，Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ，Ｖ
ｏｌ．９，２５２，２６０（２０１０）。
３７．Ｖｌａｓｓａｒａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，“Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｏｎ  Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｉｎｄｕｃｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｂｙ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ”，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１６６，５３９，５４５（１９８７）。
３８．Ｆｉｅｌｄｉｎｇ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ：ａｎ  ｕｎｄｉａｇｎｏｓｅｄ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｏｌｄｅｒ  ａｄｕｌｔｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ：ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ，ｅｔｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１２（４），ｐｐ．２４９−２５６（Ｍａｙ２０１１）。
３９．Ｍａａｓｓ，Ｄ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，“Ａｌｐａｃａ（Ｌａｍａ  ｐａｃｏｓ）ａｓ  ａ  ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ  ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃａｍｅｌｉｄ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ＶＨＨｓ）”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．３２４，Ｎｏ．１−２，ｐｐ．１３−２５（Ｊｕｌｙ３１，２００７）。
４０．Ｓｔｒｉｅｔｚｅｌ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｌｉｎｅ  ＩｇＧｓ”，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５８，ｐｐ．２１４−２２３（２０１４）。
４１．Ｐａｔｅｌ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｏｇ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｅｐｓｉｌｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ  ｇｅｎｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．４１，ｐｐ．２８２−２８６（１９９５）。
４２．Ｗａｇｎｅｒ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍａｐ  ｏｆ
ｔｈｅ  Ｉｇ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｉｏｎ
ｒｅｖｅａｌｓ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｓｅｖｅｎ  ＩｇＧ  ｉｓｏｔｙｐｅｓ
ａｎｄ  ｆｏｒ  ＩｇＤ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｏｒｓｅ”，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１７３，ｐｐ．３２３０−３２４２（２００４）。
４３．Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｎａｔｕｒａｌｌｙ
ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｅｖｏｉｄ  ｏｆ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎｓ”，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３６３，ｐｐ．  ４４６−４４８（Ｊｕｎｅ３，１９９３）。
４４．Ｄｅ  Ｇｅｎｓｔ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｃａｍｅｌｉｄｓ”，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ＆Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３０，ｐｐ．１８７−１９８（２００５年７月１１日オンライン入手可能）。
４５．Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｃａｍｅｌｉｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｃａｍｅｌｕｓ  ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ  ａｎｄ  Ｃａｍｅｌｕｓ  ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．４０５，ｐｐ．３５−４６（２０１４年１月１８日オンライン入手可能）。
４６．Ｎｇｕｙｅｎ，Ｖ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｃａｍｅｌ  ｈｅａｖｙ−ｃｈａｉｎ
ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｄｉｖｅｒｓｅ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ＶＨＨ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｅｎｌａｒｇｅ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ”，Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ，５，ｐｐ．９２１−９３０（２０００）。
４７．Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ＶＨ  ｄｏｍａｉｎ  ｆｒｏｍ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｃａｍｅｌ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ
ｌａｃｋｉｎｇ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎｓ”，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．９，ｐｐ．１１２９−１１３５（１９９４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2020158531.tif 000060
【配列表】
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