(57)【要約】      （修正有）【課題】茶抽出物又はカテキンと、柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体とを含む、組成物の提供。【解決手段】茶抽出物又はカテキンと、柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体とを含む、組成物、及び当該組成物を含む機能性食品。【効果】本発明の組成物は、抗がん作用、抗筋萎縮作用、抗肥満作用等を目的とした機能性食品等として有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑茶抽出物又はカテキンと、柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体とを含む、組成物。
【請求項２】
緑茶抽出物又はカテキンが、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート及びメチル化カテキンからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体が、エリオジクチオール、ナリンゲニン及びヘスペレチン、並びにこれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
緑茶抽出物又はカテキンがガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート又はメチル化カテキンであり、柑橘類抽出物又はフラバノンがエリオジクチオールである請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
抗がん作用、抗筋萎縮作用、抗肥満作用、抗炎症作用、コレステロール低下作用、血栓又は脳梗塞予防作用及び免疫増強作用からなる群から選ばれる少なくとも１つの作用を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
緑茶抽出物又はカテキンと、柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはフラバノン配糖体とを含む、機能性食品。
【請求項７】
緑茶抽出物又はカテキンが、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート及びメチル化カテキンからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項６に記載の食品。
【請求項８】
柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体が、エリオジクチオール、ナリンゲニン及びヘスペレチン、並びにこれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項６に記載の食品。
【請求項９】
緑茶抽出物又はカテキンがガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート又はメチル化カテキンであり、柑橘類抽出物又はフラバノンがエリオジクチオールである請求項６に記載の食品。
【請求項１０】
抗がん作用、抗筋萎縮作用、抗肥満作用、抗炎症作用及びコレステロール低下作用、血栓又は脳梗塞予防作用及び免疫増強作用からなる群から選ばれる少なくとも１つの作用を有する、請求項６〜９のいずれか１項に記載の食品。
【請求項１１】
緑茶抽出物又はカテキンと、柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体とを含む、抗がん剤、抗筋萎縮剤、抗肥満剤、抗炎症剤、コレステロール低下剤、血栓又は脳梗塞予防剤及び免疫増強剤からなる群から選ばれるいずれかの剤。
【請求項１２】
緑茶抽出物又はカテキンが、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート及びメチル化カテキンからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１１に記載の剤。
【請求項１３】
柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体が、エリオジクチオール、ナリンゲニン及びヘスペレチン、並びにこれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１１に記載の剤。
【請求項１４】
緑茶抽出物又はカテキンがガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート又はメチル化カテキンであり、柑橘類抽出物又はフラバノンがエリオジクチオールである請求項１１に記載の剤。
【請求項１５】
柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体を含む、緑茶抽出物又はカテキンの抗がん作用、抗筋萎縮作用、抗肥満作用、抗炎症作用、コレステロール低下作用、血栓又は脳梗塞予防作用及び免疫増強作用からなる群から選ばれる少なくとも１つの作用の増強剤。
【請求項１６】
緑茶抽出物又はカテキンが、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート及びメチル化カテキンからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１５に記載の増強剤。
【請求項１７】
柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体が、エリオジクチオール、ナリンゲニン及びヘスペレチン、並びにこれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１５に記載の増強剤。
【請求項１８】
緑茶抽出物又はカテキンがガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート又はメチル化カテキンであり、柑橘類抽出物又はフラバノンがエリオジクチオールである請求項１５に記載の増強剤。
【請求項１９】
緑茶抽出物又はカテキンと、柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体とを含む組成物を被検体に摂取させることを特徴とする、当該緑茶抽出物又はカテキンの、前記被検体における抗がん作用、抗筋萎縮作用、抗肥満作用、抗炎症作用、コレステロール低下作用、血栓又は脳梗塞予防作用及び免疫増強作用からなる群から選ばれる少なくとも１つの作用を増強させる方法（ヒトに対する医療行為を除く）。
【請求項２０】
緑茶抽出物又はカテキンが、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート及びメチル化カテキンからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体が、エリオジクチオール、ナリンゲニン及びヘスペレチン、並びにこれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
緑茶抽出物又はカテキンがガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート又はメチル化カテキンであり、柑橘類抽出物又はフラバノンがエリオジクチオールである請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、緑茶抽出物又はカテキン、及び柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体を含む機能性食品等に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは現在、国民の三分の一の死因を占めており、適切な治療手段の確立が緊急の課題である。多発性骨髄腫において、レナリドマイドやプロテアソームに対する特異的阻害剤ボルテゾミブの導入により治療環境が改善しつつある。しかし一方で既存薬に対してがん細胞が抵抗性を獲得し、再発するケースが非常に多い。このことから従来とは異なった作用機作を持つ抗がん剤を開発することが必要とされている。さらに、用量規定毒性 (Dose limiting toxicity; DLT)が異なれば、既存の治療法と併用することが可能であり、より有効な治療戦略の立案が可能となる。
【０００３】
緑茶に含まれる主要なカテキンの一種であるEGCG (エピガロカテキンガレート；Epigallocatechin-O-gallate) は抗がん作用を有することが報告されており (非特許文献1)、血液がんの一種である慢性リンパ性白血病患者において第二相臨床試験が行われている (非特許文献2)。我々はこれまでにEGCGが細胞膜上の標的分子67-kDa Laminin Receptor (67LR) に結合することで抗がん作用を発揮することを明らかにした (非特許文献3-6)。この67LR は本来、基底膜構成成分であるラミニンと結合するタンパク質として発見された (非特許文献7)。 最近の研究において、 67LR はがん細胞において発現が異常に亢進しており (非特許文献8)、その発現と浸潤、転移の間に強い相関性が認められている (非特許文献9-15)。EGCG は67LR を介して選択的に白血病細胞や多発性骨髄腫細胞のみを死滅させることが報告され (非特許文献16-17)、EGCGが67LR陽性の白血病細胞や多発性骨髄腫細胞に対する分子標的剤となりうることが示された。しかしながら EGCG の白血病細胞や多発性骨髄腫細胞に対する致死作用は限定的であり (非特許文献2) 、EGCGを抗がん剤として利用する上でその作用増強が強く望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Khan N, Afaq F, Saleem M, et al. Targeting multiple signaling pathways by green tea polyphenol (-)-epigallocatechin-3-gallate.Cancer. res., 2006;66:2500-2505.
【非特許文献２】Shanafelt TD, Call TG, and Zent CS, et al. Phase I trial of daily oral Polyphenon E in patients with asymptomatic Rai stage 0 to II chronic lymphocytic leukemia. J. Clin. Oncol., 2009;27:3808-3814.
【非特許文献３】Tachibana H, Koga K, Fujimura Y, et al. A receptor for green tea polyphenol EGCG. Nat. Struct. Mol. Biol., 2004;11:380-381.
【非特許文献４】Umeda D, Tachibana H, Yamada K. Epigallocatechin-3-O-gallate disrupts stress fibers and the contractile ring by reducing myosin regulatory light chain phosphorylatio mediated through the target molecule 67 kDa laminin receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005;333:628-635.
【非特許文献５】Umeda D, Yano S, Yamada K, et al. Involvement of 67-kDa laminin receptor-mediated myosin phosphatase activation in antiproliferative effect of epigallocatechin-3-O-gallate at a physiological concentration on Caco-2 colon cancer cells. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2008;371:172-176.
【非特許文献６】Umeda D, Yano S, Yamada K, et al.Green tea polyphenol epigallocatechin- 3-gallate (EGCG) signaling pathway through 67-kDa laminin receptor. J. Biol. Chem., 2008;283:3050-3058.
【非特許文献７】Nelson J, McFerran NV, Pivato G, et al. The 67 kDa laminin receptor: structure, function and role in disease. Biosci. Rep., 2008;28:33-48.
【非特許文献８】Cioce V, Castronovo V, and Shmookler BM, et al. Increased expression of the laminin receptor in human colon cancer. J. Natl. Cancer. Inst., 1991;83:29-36.
【非特許文献９】Menard S, Castronovo V, Tagliabue E, et al. New insights into the metastasis- associated 67 kD laminin receptor. J. Cell Biochem., 1997;67:155-165.
【非特許文献１０】Menard S, Taqliabue E, Colnaghi MI. The 67 kDa laminin receptor as a prognostic factor in human cancer. Breast Cancer Res. Treat., 1998;52:137-145.
【非特許文献１１】Vacca A, Ribatti D, Roncali L, et al. Melanocyte tumor progression is associated with changes in angiogenesis and expression of the 67-kilodalton laminin receptor. Cancer, 1993;72:455-461.
【非特許文献１２】Sanjuan X, Fernandez PL, Miquel, et al. Overexpression of the 67-kD laminin receptor correlates with tumour progression in human colorectal carcinoma. J. Pathol., 1996;179:376-380.
【非特許文献１３】Chen FX, Qian YR, Duan YH, et al. Down-regulation of 67LR reduces the migratory activity of human glioma cells in vitro. Brain Res. Bull, 2009;79:402-408.
【非特許文献１４】Fontanini G, Vignati S, Chine S, et al. 67-Kilodalton laminin receptor expression correlates with worse prognostic indicators in non-small cell lung carcinomas. Clin. Cancer Res., 1997;3:227-231.
【非特許文献１５】Basolo F, Pollina L, Pacini F, et al. Expression of the Mr 67,000 laminin receptor is an adverse prognostic indicator in human thyroid cancer: an immunohistochemical study. Clin. Cancer Res., 1996;2:1777-1780.
【非特許文献１６】Britschgi A, Simon HU, Tobler A, et al. Epigallocatechin-3-gallate induces cell death in acute myeloid leukaemia cells and supports all-trans retinoic acid-induced neutrophil differentiation via death-associated protein kinase 2. Br. J. Haematol., 2010;149:55-64.
【非特許文献１７】Shammas MA, Neri P, Koley H, et al. Specific killing of multiple myeloma cells by (-)-epigallocatechin-3-gallate exracted from green tea: activity and therapeutic implications. Blood, 2006;108:2804-2810.
【非特許文献１８】Kanda H, Tateya S, Tamori Y, et al. MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity. J. Clin. Invest. 2006;116(6):1494-1505.
【非特許文献１９】Byun H, Fujimura Y, Yamada K, et al. TLR4 signaling inhibitory pathway induced by green tea polyphenol epigallocatechin-3-gallate through 67-kDa laminin receptor, J. Immunol., 2010;185:33-45.
【非特許文献２０】Yan H, Lamm ME, Bjorling E, Huang YT. Multiple functions of immunoglobulin A in mucosal defense against viruses: an in vitro measles virus model. Virol. 2002;76(21):10972-10979.
【非特許文献２１】Fujimura Y, Yamada K, Tachibana H, A lipid raft-associated 67kDa laminin receptor mediates suppressive effect of epigallocatechin-3-O-gallate on FcepsilonRI expression, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005;336:674-681.
【非特許文献２２】Holy EW, Stampfli SF, Akhmedov A, et al. Laminin receptor activation inhibits endothelial tissue factor expression. J. Mol. Cell Cardiol. 2010;48:1138-45.
【非特許文献２３】Santilli G, Piotrowska I, Cantilena S, et al. Polyphenol Eenhances the antitumor immune response in neuroblastoma by inactivating myeloid suppressor cells, Clin. Cancer. Res., 2013;19:1116-1125.
【非特許文献２４】Gundimeda U, McNeill T1, Fan TK, et al. Green tea catechins potentiate the neuritogenic action of brain-derived neurotrophic factor: Role of 67-kDa laminin receptor and hydrogen peroxide. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2014;28:218-224.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、緑茶抽出物又はカテキンと、柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体とを含む組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、緑茶抽出物又はカテキンと、柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体とを含む組成物が抗がん作用、抗筋萎縮作用、抗肥満作用などの各種作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、緑茶抽出物又はカテキンと、柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体とを含む、組成物である。
また本発明は、緑茶抽出物又はカテキンと、柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはフラバノン配糖体とを含む、機能性食品である。
さらに、本発明は、緑茶抽出物又はカテキンと、柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体とを含む、抗がん剤、抗筋萎縮剤、抗肥満剤、抗炎症剤、コレステロール低下剤、血栓又は脳梗塞予防剤及び免疫増強剤からなる群から選ばれるいずれかの剤である。
さらに、本発明は、柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体を含む、緑茶抽出物又はカテキンの抗がん作用、抗筋萎縮作用、抗肥満作用、抗炎症作用、コレステロール低下作用、血栓又は脳梗塞予防作用及び免疫増強作用からなる群から選ばれる少なくとも１つの作用の増強剤である。
さらに、本発明は、緑茶抽出物又はカテキンと、柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体とを含む組成物を被検体に摂取させることを特徴とする、当該緑茶抽出物又はカテキンの、前記被検体における抗がん作用、抗筋萎縮作用、抗肥満作用、抗炎症作用、コレステロール低下作用、血栓又は脳梗塞予防作用及び免疫増強作用からなる群から選ばれる少なくとも１つの作用を増強させる方法（ヒトに対する医療行為を除く）である。
【０００７】
本発明において、緑茶抽出物又はカテキンとしては、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート及びメチル化カテキンからなる群から選ばれる少なくとも１種である。
本発明において、柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体としては、エリオジクチオール、ナリンゲニン及びヘスペレチン、並びにこれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１種である。
本発明の好ましい態様において、緑茶抽出物又はカテキンは、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート又はメチル化カテキンであり、柑橘類抽出物又はフラバノンは、エリオジクチオールである。
本発明の組成物、食品、剤及び増強剤は、抗がん作用、抗筋萎縮作用、抗肥満作用、抗炎症作用、コレステロール低下作用、血栓又は脳梗塞予防作用及び免疫増強作用からなる群から選ばれる少なくとも１つの作用を有するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、緑茶抽出物又はカテキンと、柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体とを含む組成物が提供される。本発明の組成物は、抗がん作用、抗筋萎縮作用、抗肥満作用等を目的とした機能性食品等として有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】EGCG のがん細胞アポトーシス誘導作用に対するEriodictyolの併用効果を示す図。ヒト多発性骨髄腫細胞株U266 を96 well plate に播種（5×104cells/mL）し、EGCG 及び Eriodictyolを添加(5 μM /L)した培地で96 時間培養した。細胞を回収後Annexin V Alexa Fluor 488 で細胞を染色しフローサイトメーターにてアポトーシスが誘導された細胞を検出した。
【図２】腫瘍移植マウスに対するEGCG とEriodictyol併用の抗がん作用を示す図。多発性骨髄腫細胞株MPC-11をBalb/cマウスの右背部に皮下注射し、EGCG (15 mg/kg) 及びEriodictyol (15 mg/kg)を2日に一度投与した。投与開始から腫瘍の体積及び生存期間を測定した。
【図３】腫瘍移植マウスに対するEGCG とEriodictyol 組み合わせによる肝毒性を示す図。多発性骨髄腫細胞株MPC-11をBalb/cマウスの右背部に皮下注射し、EGCG (15 mg/kg) 及びEriodictyol (15 mg/kg)を2日に一度投与した。肝毒性について、血清中Aspartate Aminotransferase (AST) 及び Alanine aminotransferase (ALT) 活性を測定した。
【図４】廃用性筋萎縮に及ぼすEGCGとEriodictyol併用物の効果を示す図。C57BL/6J マウスにEGCG 又はEriodictyol を 1日に1回投与（5 mg/kg）した。投与開始から7 日後に尾懸垂を開始した。尾懸垂開始から10 日後に屠殺し大腿四頭筋の重量を測定した。
【図５】高脂肪高ショ糖(HF/HS)食摂取マウスに対する緑茶抽出物とEriodictyolの併用摂取効果を示す図。C57BL/6J マウスに、緑茶抽出物(0.2%) 及びEriodictyol (0.45 g/kg diet) を添加した餌を摂取させた。 8週間の飼育後、体重、血清中の総コレステロール、LDL の各値を測定した。また、脂肪組織におけるMCP-1 のmRNA発現量をreal-time PCR法で測定した。
【図６】高脂肪高ショ糖(HF/HS)食摂取マウスの肝臓におけるコレステロール代謝関連遺伝子発現に対する緑茶抽出物とEriodictyolの併用摂取効果を示す図。C57BL/6J マウスに、緑茶抽出物 (0.2%) 及びEriodictyol (0.45 g/kg diet) を添加した餌を摂取させた。 8週間の飼育後,肝臓におけるコレステロール代謝関連遺伝子のmRNA発現量をreal-time PCR法で測定した。   HMGCR（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase）：コレステロール合成の律速酵素であり、ロバスタチンなどコレステロール低下薬の創薬ターゲット   HMGCS（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase）：コレステロール合成に関与する酵素  LDLR（low density lipoprotein receptor）：肝臓におけるLDL 取り込み分子
【図７】抗血栓性因子産生に対する緑茶抽出物とEriodictyolの併用摂取効果を示す図。C57BL/6J マウスに、緑茶抽出物 (0.2%)及びEriodictyol (0.45 g/kg diet) を添加した餌を摂取させた。8週間の飼育後,血清中のTFPI量をELISA法を用いて測定した。
【図８】血清IgA量に対する緑茶抽出物とEriodictyolの併用摂取効果を示す図。C57BL/6J マウスに、緑茶抽出物 (0.2%)及びEriodictyol (0.45 g/kg diet) を添加した餌を摂取させた。8週間の飼育後,血清中のIgA量をELISA法を用いて測定した。
【図９】EGCG、EGCG3”Me、緑茶抽出物のがん細胞致死誘導活性に対するEriodictyol、Eriodictyol関連物質(Naringenin, Hesperetin) 及びEriodictyol含有食品抽出物の組み合わせ効果を示す図。ヒト多発性骨髄腫細胞株U266 を96 well plate に播種（5×104 cells/mL ）し、各成分を添加した培地で96 時間培養した。 細胞を回収後トリパンブルー法にて生細胞数を測定した。
【図１０】EriodictyolによるEGCG活性増強の67LR 依存性を示す図。ヒト多発性骨髄腫細胞株U266 を96 well plate に播種（5×104 cells/mL）し、抗67LR抗体 (20 μg/mL) で3時間処理した。その後、 5 μM のEriodictyol 及び  EGCG を終濃度 5 μM となるように添加した培地で96時間培養し、生細胞数を計測した。
【図１１】EGCG のAkt活性化能に対するEriodictyol の増強効果を示す図。多発性骨髄腫細胞株MPC-11をBalb/cマウスの右背部に皮下注射移植（1×106cells）し、EGCG (15 mg/kg) 及びEriodictyol  (15 mg/kg)を投与し6時間後に腫瘍を摘出し、溶解バッファーにて回収後、Akt 活性を測定した。
【図１２】EGCG の67LR依存的がん細胞致死誘導経路の活性化 (酸性スフィンゴミエリナーゼ活性化)に対するEriodictyol の増強効果を示す図。多発性骨髄腫細胞株MPC-11をBalb/cマウスの右背部に皮下注射移植（1×106 cells）し、EGCG (15 mg/kg) 及びEriodictyol  (15 mg/kg)を投与し 6時間後に腫瘍を摘出し、溶解バッファーにて回収後、酸性スフィンゴミエリナーゼ活性を測定した。
【図１３】EGCG の 67LR 依存的がん細胞致死活性 (Caspase-3 活性)に対するEriodictyol の増強効果を示す図。多発性骨髄腫細胞株MPC-11をBalb/cマウスの右背部に皮下注射移植（1×106 cells）し、EGCG (15 mg/kg) 及びEriodictyol  (15 mg/kg)を投与し 6時間後に腫瘍を摘出した。腫瘍の組織切片を作成し、免疫組織染色にてCaspase-3 が活性化された細胞の割合を測定した。
【図１４】Eriodictyol が EGCG 及びその構造類似体の抗がん作用に及ぼす影響を示す図。ヒト多発性骨髄腫細胞株 U266 を、SOD (5 U/mL)、Catalase (200 U/mL)及び1% FCSを含むRPMI 1640培地に、 5×104 cells /mL  にて 24 well plate に播種し、各成分を添加して96時間後にトリパンブルー法にて生細胞数を測定した。
【図１５】Naringenin が EGCG 及びその構造類似体の抗がん作用に及ぼす影響を示す図。ヒト多発性骨髄腫細胞株 U266 を、SOD (5 U/mL)、Catalase (200 U/mL)及び1% FCSを含む RPMI 1640  培地に、5×104 cells /mL にて 24 well plate に播種し、各成分を添加して96時間後にトリパンブルー法にて生細胞数を測定した。
【図１６】Hesperetin が EGCG 及びその構造類似体の抗がん作用に及ぼす影響を示す図。ヒト多発性骨髄腫細胞株 U266 を、SOD (5 U/mL)、Catalase (200 U/mL)及び1% FCSを含むRPMI 1640  培地に 5×104 cells /mL にて 24 well plate に播種し、各成分を添加して 96時間後にトリパンブルー法にて生細胞数を測定した。
【図１７】Eriocitrinが EGCG 及びその構造類似体の抗がん作用に及ぼす影響を示す図。ヒト多発性骨髄腫細胞株 U266 を、SOD (5 U/mL)、Catalase (200 U/mL)及び1% FCSを含む RPMI 1640  培地に 5×104 cells /mL にて 24 well plate に播種し、各成分を添加して96時間後にトリパンブルー法にて生細胞数を測定した。
【図１８】Naringinが EGCG 及びその構造類似体の抗がん作用に及ぼす影響を示す図。ヒト多発性骨髄腫細胞株 U266 を、SOD (5 U/mL)、Catalase (200 U/mL)及び1% FCSを含有するRPMI 1640  培地に 5×104 cells /mL にて 24 well plate に播種し、各成分を添加して96時間後にトリパンブルー法にて生細胞数を測定した。
【図１９】Hesperidinが EGCG 及びその構造類似体の抗がん作用に及ぼす影響を示す図。ヒト多発性骨髄腫細胞株 U266 を、SOD (5 U/mL)、Catalase (200 U/mL)及び1% FCSを含むRPMI 1640  培地に 5×104 cells /mL にて 24 well plate に播種し、各成分を添加して96時間後にトリパンブルー法にて生細胞数を測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明者は、ポリフェノールの一種Eriodictyol がEGCG の抗がん作用を増強することを明らかにした。さらに、Eriodictyol は EGCG のもつ抗肥満作用、抗炎症作用、コレステロール低下作用、抗血栓性作用、免疫増強作用及び抗筋萎縮作用を増強することを明らかにした。またEriodictyol又はその構造類似体若しくはその配糖体、又はEriodictyol を含有する天然物が、EGCG若しくはその構造類似体の作用、又はEGCG を含有する天然物の作用を顕著に高めることを明らかにした。
【００１１】
茶の抽出物は、抗がん作用、抗インスリン抵抗作用、抗炎症作用、抗アレルギー作用、抗筋萎縮作用、動脈硬化予防作用、抗血栓性作用、又はアルツハイマー予防作用を有することについて報告がある。これまでの研究においては、緑茶ポリフェノール であるEGCGは、細胞表面タンパクである67LR に結合することで多彩な生理活性を発現することが示されている。一方で、その他の成分がその作用を増強させるか、あるいは減弱させるかは不明であった。
【００１２】
本発明者は、Eriodictyol が EGCG による67LR の活性化を増強することで、in vivo 及び in vitro にてEGCG の抗がん作用、抗筋萎縮作用、抗肥満作用、抗炎症作用、抗血栓性作用及びコレステロール低下作用を促進することを明らかにした。またEriodictyol とEGCGとの併用によって緩和される肥満誘発性の MCP-1 の上昇は、インスリン抵抗性や高脂血症の原因となることから(非特許文献18)、この併用は、インスリン抵抗性や高脂血症に対する予防又は治療を意図する食品、医薬品又はサプリメントなどの開発に有用である。さらに本発明者は、Eriodictyol と EGCGとを併用することで、免疫において重要である血中 IgA 量を上昇させることを明らかにした。IgA は感染症予防において重要であることから (非特許文献19)、Eriodictyol とEGCGとの併用は、感染症を予防又は治療を意図する食品、医薬品又はサプリメントなどの開発に有用である。
【００１３】
EGCGは、67LR を活性化することで抗がん作用や抗筋萎縮作用のみならず抗炎症作用 (非特許文献20)、抗アレルギー作用(非特許文献21)、動脈硬化予防作用 (非特許文献22)、抗血栓性作用 (非特許文献22)、免疫増強作用(非特許文献23)、及び神経細胞保護作用(非特許文献24) を発揮することが知られている。
従って、(a1) Eriodictyol若しくはその構造類似体であるNaringenin若しくはHesperetin、(a2) 生体内でこれらのポリフェノールとして代謝されうるこれらポリフェノールの配糖体、又は(a3) これらを含有する食品と、(b1)EGCG、(b2)当該EGCGと同様に67LR アゴニストとしての作用を有するメチル化EGCG、又は(b3)これらを含有する食品との併用は、抗がん作用、抗筋萎縮作用、抗肥満作用、抗インスリン抵抗作用、抗炎症作用、抗アレルギー作用、動脈硬化予防作用、抗血栓性作用、抗神経変性作用、抗炎症性作用を有する。従って、上記(a1)、(a2)又は(a3)と(b1)、(b2)又は(b3)との組み合わせは、上記作用に起因する疾患、例えば血栓性疾患（例えば肺塞症、DIC、心筋梗塞又は脳梗塞等）、癌、筋萎縮、肥満、インスリン抵抗性疾患、炎症性疾患（シューレン病や膠原病等）、アレルギー疾患、動脈硬化、神経変性疾患（アルツハイマーや認知症等の脳疾患）の予防又は治療を意図する食品、医薬品又はサプリメントとして有用である。
【００１４】
（１）緑茶抽出物
本発明における緑茶抽出物は、ツバキ科の常緑樹である茶の木より作製した抽出物である。本発明において使用される緑茶の木としては、カメリアタリエンシス、カメリアシネンシスなどの茶の木が挙げられる。例えばチャノキ（Camellia sinensis (L.) Kuntze）、アッサムチャ（Camellia sinensis (L.) Kuntze var. assamica (J.W.Mast.) Kitam.）、カメリアシネンシスとカメリアタリエンシスの交配種、「やぶきた」、「べにふうき」、「べにふじ」、「べにほまれ」、「やえほ」、「するがわせ」、「ゆたかみどり」、「かなやみどり」、「おくむさし」、「青心大パン」、「青心烏龍」、「大葉烏龍」、「紅花」、「べにひかり」、「やまかい」、「やまみどり」、「からべに」、「香駿」、「そうふう」、「ふくみどり」、「みねかおり」、「べにひかり」、「みなみかおり」、「いずみ」、「ふうしゅん」、「たまみどり」、「やまかい」、「くりたわせ」、「しゅんめい」、「さやまみどり」、「あさぎり」、「ほくめい」、「ただにしき」、「あさひ」、「さやまかおり」、「めいりょく」、「やまとみどり」、「あさつゆ」、「とよか」、「なつみどり」、「うじひかり」、「おおいわせ」、「ごこう」、「印雑 131」、「まきのはらわせ」、「たかちほ」、「こまかげ」、「さみどり」、「こまかげ」、「はつもみじ」、「りょうふう」、「みなみさやか」、「さえみどり」、「おくゆたか」、「ふじみどり」、「サンルージュ」及び「おくみどり」などの茶品種が用いられ、「やぶきた」、「べにふうき」、「かなやみどり」、「おくむさし」、「そうふう」、「ふうしゅん」、「ただにしき」、「サンルージュ」がより好ましい。また、これらの茶の木からの茶葉の例としては煎茶、玉露、番茶、茎茶、芽茶、玄米茶、粉茶、抹茶、釜煎り茶、甜茶、包種茶、ウーロン茶、紅茶等が挙げられる。
茶の木からの茶葉成分の抽出溶媒として、水若しくは有機溶剤、またはこれらの混合液が用いられる。
【００１５】
有機溶剤としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等の炭素数１〜４の低級アルコール、ジメチルケトン、メチルエチルケトン、アセトンおよびメチルイソブチルケトン等のケトン類などの極性有機溶剤、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、またはジエチルエーテル等の非極性有機溶剤が挙げられる。更にこれら極性有機溶剤と非極性有機溶剤を適宜組み合わせた混合物を使用することもできる。好ましくは、熱水、エタノール、含水エタノールである。含水アルコールのアルコール濃度は、３０ｖ／ｖ％〜９０ｖ／ｖ％、好ましくは４０ｖ／ｖ％〜７０ｖ／ｖ％である。熱水の場合の温度は４０〜１００℃、好ましくは６０〜１００℃である。
【００１６】
抽出物を得るための抽出方法は、浸漬による抽出、加熱抽出、連続抽出、超臨界抽出等の公知の方法を挙げることができる。
抽出物は、その後、公知の方法で濃縮してもよい。
得られた抽出物または濃縮物等は、公知の方法で更に精製してもよい。精製方法としては、限外ろ過、吸着樹脂処理、分子クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、液−液抽出等が挙げられる。
【００１７】
乾燥方法は噴霧乾燥、凍結乾燥などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
茶葉抽出物中には、ポリフェノールやカテキン類などが含まれている。茶抽出物は、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、メチル化カテキンなどが含まれていることが好ましく、エピガロカテキンガレートを含有していることが更に好ましい。
本発明におけるメチル化カテキンは主として、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート（以下、ＥＧＣＧ３”Ｍｅという）、エピカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート（以下、ＥＣＧ３”Ｍｅという）、エピカテキン−３−Ｏ−（４−Ｏ−メチル）ガレート（以下、ＥＣＧ４”Ｍｅという）、エピガロカテキン−３−Ｏ−（４−Ｏ−メチル）ガレート（以下、ＥＧＣＧ４”Ｍｅという）、ガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート（以下、ＧＣＧ３”Ｍｅという）、カテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート（以下、ＣＧ３”Ｍｅという）、カテキン−３−Ｏ−（４−Ｏ−メチル）ガレート（以下、ＣＧ４”Ｍｅという）、又は、ガロカテキン−３−Ｏ−（４−Ｏ−メチル）ガレート（以下、ＧＣＧ４”Ｍｅという）及びこれらの異性化体を含むことが好ましい。
【００１８】
緑茶抽出物の組成物における含有率は、組成物の剤型または投与形態によって異なるが、後述の柑橘類抽出物又はフラバノンとの含有率を考慮して適宜設定することができる。
また、本発明においては、茶抽出物に含まれるカテキンとは別のカテキンを組成物に含有させることができる。例えば合成カテキンなどが挙げられる。合成カテキンは、公知方法により得ることができる（Chem. Asian J. 2010, 5, 2231-2248. DOI: 10.1002/asia.201000372）。
【００１９】
（２）柑橘類抽出物
本発明における柑橘類抽出物は、柑橘類からの抽出処理物であり、フラバノン等を含有している。柑橘類としては、例えば以下のものが挙げられる。
ミカン属（カンキツ属）：
オレンジ、グレープフルーツ、ユズ、ダイダイ、カボス、スダチ、ユコウ、ゆうこう、シークヮーサー、レモン、ライム、ナツミカン、ハッサク、イヨカン、ブンタン、マンダリンオレンジ、ウンシュウミカン、ポンカン、タチバナ、紀州ミカン、バレンシアオレンジ、ネーブルオレンジ、ブラッドオレンジ、ジャッファ・オレンジ、ベルガモット、キノット等
また、上記ミカン属柑橘類のほかに、カラタチ類、キンカン類などを用いることができる。
【００２０】
柑橘類を抽出するために使用される抽出溶剤としては、前記と同様、水若しくは有機溶剤、またはこれらの混合液が用いられる。
有機溶剤としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等の炭素数１〜４の低級アルコール、ジメチルケトン、メチルエチルケトン、アセトンおよびメチルイソブチルケトン等のケトン類などの極性有機溶剤、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、またはジエチルエーテル等の非極性有機溶剤が挙げられる。好ましくは、水又はエタノールである。更にこれら極性有機溶剤と非極性有機溶剤を適宜組み合わせた混合物を使用することもできる。
抽出物を得るための抽出方法は、浸漬による抽出、加熱抽出、連続抽出、超臨界抽出等の公知の方法を挙げることができる。抽出物は、その後、公知の方法で濃縮してもよい。
得られた抽出物または濃縮物等は、公知の方法で更に精製してもよい。精製方法としては、限外ろ過、吸着樹脂処理、分子クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、液−液抽出等が挙げられる。
【００２１】
柑橘類抽出物中には、フラバノンが含まれている。柑橘類抽出物は、エリオジクチオール、ナリンゲニン及びヘスペレチン及びそれらの配糖体（エリオジクチオール配糖体、ナリンゲニン配糖体、ヘスペレチン配糖体）などが含まれていることが好ましく、エリオジクチオールを含有していることが更に好ましい。
また、本発明においては、柑橘類抽出物に含まれるフラバノンとは別のフラバノンを組成物に含有させることができる。例えば合成フラバノン、フラバノンに糖を結合させた糖転移化合物などが挙げられる。例えば、合成エリオジクチオール、合成ナリンゲニン及び合成ヘスペレチンなどが挙げられ、これらを１種又は複数種混合することができる。合成エリオジクチオール、合成ナリンゲニン及び合成ヘスペレチンなどは、公知手法により得ることができる（European J Org Chem., 2012(3): 449-462. doi:10.1002/ejoc.201101228）。
また、柑橘類抽出物の組成物中の含有率は、組成物の剤型または投与形態によって異なる。
本発明の組成物において、茶抽出物又はカテキンと、柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体との比（茶抽出物／柑橘類抽出物、質量比）は、それぞれの濃縮程度によっても異なるが、好ましくは100〜0.01とすることができる。そして、茶抽出物又はカテキン、及び柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体の組成物中の含有量は、上記質量比の範囲で適宜設定することができる。例えば茶抽出物又はカテキンは９０重量％〜０．００１重量％、好ましくは３０重量％〜０．０１重量％であり、はフラバノン若しくはその配糖体は９０重量％〜０．００１重量％、好ましくは２０重量％〜０．０１重量％である。
【００２２】
（３）組成物
本発明の組成物は、上記の各成分以外に、食品用として許容可能な担体や公知または周知の他の添加剤を含んでいてもよい。
上記添加剤としては、一般に医薬又は食品に使用される、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、矯味矯臭剤、乳化剤、界面活性剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤、吸収促進剤等を挙げることができ、所望により、これらを適宜組み合わせて使用することもできる。
本発明の組成物は、液状、固形状、粉末、ゲル状のいずれの形態であってもよく、本発明の組成物の剤型は、経口用剤型、例えば錠剤、散剤、カプセル剤（ハードカプセル剤、ソフトカプセル剤）、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ、等の形態としてもよい。これらの製剤は常法に従って調製することができる。
組成物が溶液状の場合は、好ましく用いられる担体としては水等の水性媒体を挙げることができる。
【００２３】
また、組成物が固形状の場合は、添加成分としては、結晶セルロース、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム等の賦形剤、コーンスターチ、アルギン酸等の膨化剤を用いることができる。
また、粉末、固形剤又は液剤に成型するのに必要な化合物として、エリスリトール、マルチトール、ヒドロキシプロピルセルロース、カオリン、タルクなどが挙げられる。
本発明の組成物は、抗がん作用、抗筋萎縮作用、抗肥満作用、抗炎症作用、コレステロール低下作用、血栓又は脳梗塞予防作用及び免疫増強作用からなる群から選ばれる少なくとも１つの作用を有する。従って、上記組成物を、抗がん剤、抗筋萎縮剤、抗肥満剤、抗炎症剤、コレステロール低下剤、血栓若しくは脳梗塞予防剤、又は免疫増強剤として使用することができる。上記それぞれの剤における茶抽出物又はカテキン、及び柑橘類抽出物又はフラバノンの調製、これらの各成分の含有率等については、前記と同様である。
【００２４】
本発明の組成物を摂取させる対象は、特に限定されるものではないが、ヒトのほか、ヒトを除く哺乳動物、例えば実験動物（マウス、ラット、モルモット、ウサギ等）、家畜（ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ等）、愛玩動物（イヌ、ネコ等のペット類）などが挙げられる。本発明の組成物によれば、がん、筋萎縮（例えば筋萎縮性側索硬化症（ALS）等）、炎症性疾患、血栓又は脳梗塞高脂血症、感染症の予防又は治療、あるいは生活習慣病や肥満の改善を期待することができる。
【００２５】
（４）食品
本発明の食品は、茶抽出物又はカテキンと、柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体とを含むものであり、特に抗がん作用、抗筋萎縮作用、抗肥満作用、抗炎症作用、コレステロール低下作用、血栓又は脳梗塞予防作用及び免疫増強作用からなる群から選ばれる少なくとも１つの作用を目的とした機能性食品、サプリメント等として使用される。
本発明の組成物を含有する食品（特に機能性食品）の形態としては、例えばサプリメント（散剤、顆粒剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠）が挙げられるが、その他にも、飲料（お茶、炭酸飲料、乳酸飲料、スポーツ飲料等）、菓子（ガム、チョコレート、クッキー、キャンデー等）、油、油脂食品（マヨネーズ、ドレッシング、バター等）、調味料（ケチャップ、ソース等）、流動食、乳製品（牛乳、ヨーグルト、チーズ等）、パン類、麺類（うどん、そば、ラーメン、パスタ、冷麦、ビーフン等）等が挙げられる。但し、これらの形態に限定されるものではない。
【００２６】
本発明の食品を摂取させる対象は、前記と同様であり、特に限定されるものではないが、ヒトのほか、ヒトを除く哺乳動物、例えば実験動物（マウス、ラット、モルモット、ウサギ等）、家畜（ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ等）、愛玩動物（イヌ、ネコ等のペット類）などが挙げられる。
本発明の食品において、茶抽出物又はカテキン、及び柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体の含有量は、前記組成物の項で述べた内容と同様であり、上記質量比の範囲で適宜設定することができる。例えば茶抽出物又はカテキンは９０重量％〜０．００１重量％、好ましくは３０重量％〜０．０１重量％であり、はフラバノン若しくはその配糖体は９０重量％〜０．００１重量％、好ましくは２０重量％〜０．０１重量％である。
【００２７】
（４）増強剤
前記の通り、本発明者は、Eriodictyol が EGCG のもつ抗がん作用、抗肥満作用、抗炎症作用、コレステロール低下作用、抗血栓性作用、免疫増強作用及び抗筋萎縮作用を増強することを明らかにした。
そこで本発明は、柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体を含む、緑茶抽出物又はカテキンの抗がん作用、抗筋萎縮作用、抗肥満作用、抗炎症作用、コレステロール低下作用、血栓又は脳梗塞予防作用及び免疫増強作用からなる群から選ばれる少なくとも１つの作用の増強剤を提供する。また本発明は、緑茶抽出物又はカテキンと、柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体とを含む組成物を被検体に摂取させることを特徴とする、当該緑茶抽出物又はカテキンの、前記被検体における抗がん作用、抗筋萎縮作用、抗肥満作用、抗炎症作用、コレステロール低下作用、血栓又は脳梗塞予防作用及び免疫増強作用からなる群から選ばれる少なくとも１つの作用を増強させる方法を提供する（但し、ヒトに対する医療行為を除くことができる）。
柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体を増強剤又は増強方法として使用する場合も、前記組成物の項で述べた内容と同様に適用することができる。
本発明の増強剤及び増強方法の対象となる被検体は、前記と同様であり、特に限定されるものではないが、ヒトのほか、ヒトを除く哺乳動物、例えば実験動物（マウス、ラット、モルモット、ウサギ等）、家畜（ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ等）、愛玩動物（イヌ、ネコ等のペット類）などが挙げられる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２８】
実験方法
EGCG のがん細胞アポトーシス誘導作用に対するEriodictyolの併用効果
ヒト多発性骨髄腫細胞株U266を、 10% ウシ胎児血清 (FCS) 添加RPMI1640 培地にて 37℃、水蒸気飽和した 5% CO2条件下で継代及び維持した。細胞は対数増殖期で培養維持した。培養に使用した RPMI 1640 培地は、超純水 1 L あたり RPMI 1640 培地 10.4 g、HEPES 2.38 g、注射用ペニシリン G カリウム 10 万単位、硫酸ストレプトマイシン注射用 100 mg 、NaHCO3  2.0 g を懸濁した後、フィルター滅菌した。
その後、FCS を RPMI 1640 培地に添加し、細胞培養に使用した。ヒト多発性骨髄腫細胞株U266に対するEGCG とEriodictyolとの組み合わせによるアポトーシス誘導作用を検討するために、Annexin V 及びPI を用いた二重染色を実施した。Propidium Iodide （PI）染色液は、PI (Sigma)を 50 μg/mL の濃度となるように PBS に懸濁したものを用いた。
【００２９】
超純水 1 L に対し、NaCl 8.0 g、KCl  0.2 g、Na2HPO41.15 g、KH2PO40.2 g を溶解してPBSを調製し、オートクレーブ滅菌した。用いたAnnexin V Binding Buffer は10 mM HEPES, 140mM NaCl; 2.5 mM CaCl2(Wako); pH 7.4となるよう調整しフィルター滅菌に供した。用いたEriodictyolは 100%  ジメチルスルホキシド(DMSO) にて 5 mM となるように調整し、-30℃ にて保存した。EGCG（Sigma社より購入）を、超純水にて 5 mM となるように調整し、-30℃ にて保存した。U266 を1% FCS及び SOD (5 U/mL)、Catalase (200 U/mL)含有RPMI 1640 に 5×104cells/mL (U266)になるよう調整して 96 well plate に播種し、EGCG 及びEriodictyolが終濃度で 5μM となるよう添加し96 時間培養した。
【００３０】
その後、充分に懸濁した細胞培養液を 300 ×g 5 minにて遠心し、上清を除去した後、Annexin V Binding Buffer にて懸濁し、細胞数を血球計算盤により計測し再び 300 ×g 5 分にて遠心し、Annexin V Binding Buffer にて懸濁した。この細胞懸濁液 100μL に対しAnnexin V Alexa Fluor 488 Conjugate を 5μL (Invitrogen) 添加し、さらにPI染色液2μL を添加し、室温にて15 min放置した。その後、Annexin V Binding Buffer 400 μL を上から添加し、フローサイトメーターである FACS Caliber (Becton, Dickinson and Company)を用いて測定を行った。コンペンセーションをかけたのちAnnexin V Alexa Fluor 488 Conjugate を FL 1 にて測定し、陽性とみなされた細胞をアポトーシス細胞とした。
【００３１】
腫瘍移植マウスに対するEGCG と Eriodictyol併用の抗がん作用
5 週齢メスbalb/cマウスを2 週間予備飼育したのち、マウス多発性骨髄腫細胞株MPC-11を5 ×106 cells/mL となるようにRPMI培地に懸濁した細胞懸濁液を、 イソフルラン (マイラン製薬, Tokyo, Japan) 麻酔下で各マウスの右背面部に200μL皮下注射し、移植を行った。移植11 日後、EGCG (15 mg/kg i.p.)及びEriodictyol  (15 mg/kg i.p.) を2日に一度投与し、2 日おきに腫瘍体積をノギスで測定した。腫瘍体積は次の式にて算出した。
＜腫瘍体積 (mm3) = (短径)2x長径x 0.5＞
倫理的観点より、腫瘍体積が 4000mm3を超えたものからイソフルラン (マイラン製薬, Tokyo, Japan) 麻酔下で、心臓採血により屠殺した。
【００３２】
腫瘍移植マウスに対するEGCG と Eriodictyol 組み合わせによる肝毒性 
5 週齢メスbalb/cマウスを2 週間予備飼育したのち、マウス多発性骨髄腫細胞株MPC-11を5 ×106 cells/mL となるようにRPMI培地に懸濁した細胞懸濁液を、イソフルラン (マイラン製薬, Tokyo, Japan) 麻酔下で各マウスの右背面部に200μL皮下注射し、移植を行った。移植11 日後、EGCG (15 mg/kg i.p.)及びEriodictyol  (15 mg/kg i.p.) を2日に一度投与した。麻酔下で、心臓採血により屠殺を行った。採血した血液は、37℃で2 時間静置し凝固させた後、4℃、2000 x gで15 分間遠心して血清を採取した。得られた血清について、肝毒性の指標である血清中 Aspartate Aminotransferase (AST) 及び Alanine aminotransferase (ALT) 活性を、キット(Wako)を用いて測定した。 
【００３３】
廃用性筋萎縮に及ぼすEGCGとEriodictyol併用物の効果 
12 週齢のオスC57BL/6Jマウスを平均体重が等しくなるように 5 群に群わけし、それぞれ、GR (Ground) 群、TS (Tail suspension) 群、EGCG群、Eriodictyol群、EGCG + Eriodictyol群とした。GR 群および TS 群には群分け開始から生理食塩水を、EGCG群にはEGCGを、Eriodictyol群にはEriodictyolをそれぞれ胃内投与し(5 mg/kg)、EGCG + Eriodictyol群にはEGCGとEriodictyol (5 mg/kg) をゾンデにより胃内投与した。群分け開始から 7日間は通常飼育し、その後TS群、EGCG群、Eriodictyol群、EGCG + Eriodictyol群の4群は尾懸垂試験を施した。尾懸垂試験10日後 (実験開始から17日後)、全マウスをイソフルラン麻酔下で腹部大動脈採血により屠殺し、大腿四頭筋を摘出し、重量を測定した。各サンプルは実験期間中毎日投与した。
【００３４】
高脂肪高ショ糖(HF/HS)食摂取マウスに対する緑茶抽出物とEriodictyolの併用摂取効果 
12 週齢オス C57BL/6J マウスを1 週間予備飼育したのち、平均体重が等しくなるように 5 群にわけ、Control (AIN-93G準拠食) 群、HF/HS (高脂肪高ショ糖食) 群、やぶきた(0.2% (HF/HS +やぶきた) 群、Eriodictyol (HF/HS + Eriodictyol) 群、やぶきた+Eriodictyol (HF/HS + やぶきた + Eriodictyol) 群とした。やぶきた(0.2%) 及びEriodictyol (0.45 g/kg diet) を添加した飼料を摂食させた。飼料は4 g/day で与え、自由飲水で 8週間飼育した。マウスは、16 時間絶食後、イソフルラン麻酔下で腹部大動脈採血により屠殺した。採血した血液は、37℃で2 時間静置し凝固させた後、4℃、2000 x gで15 分間遠心して血清を採取した。血清中の総コレステロール及び LDL 値を測定した。脂肪組織をトライゾールにて処理し、cDNA合成後real-time PCRによってMCP-1 のmRNA発現量を測定した。
【００３５】
高脂肪高ショ糖(HF/HS)食摂取マウスの肝臓におけるコレステロール代謝関連遺伝子発現に対する緑茶抽出物とEriodictyolの併用摂取効果  
12 週齢オス C57BL/6J マウスを1 週間予備飼育したのち、平均体重が等しくなるように 5 群にわけ、control (AIN-93G準拠食) 群、HF/HS (高脂肪高ショ糖食) 群、やぶきた(0.2% (HF/HS +やぶきた) 群、Eriodictyol (HF/HS + Eriodictyol) 群、やぶきた+ Eriodictyol (HF/HS + やぶきた + Eriodictyol) 群とした。やぶきた(0.2%) 及びEriodictyol (0.45 g/kg diet) を添加した飼料を摂食させた。飼料は 4 g/day で与え、自由飲水で8週間飼育した。マウスは、16時間絶食後、イソフルラン麻酔下で腹部大動脈大動脈採血により屠殺した。肝臓組織をトライゾールにて処理し、cDNA合成後real-time PCRによって3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase (HMGCR)、 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase（HMCGS）、及びlow density lipoprotein receptor （LDLR）のmRNA発現量を測定した。
【００３６】
抗血栓性因子産生に対する緑茶抽出物とEriodictyolの併用摂取効果 
12 週齢オス C57BL/6J マウスを1 週間予備飼育したのち、平均体重が等しくなるように 4 群にわけ、HF/HS (高脂肪高ショ糖食) 群、やぶきた(0.2% (HF/HS +やぶきた) 群、Eriodictyol (HF/HS + Eriodictyol) 群、やぶきた+ Eriodictyol (HF/HS + やぶきた + Eriodictyol) 群とした。やぶきた(0.2%) 及びEriodictyol (0.45 g/kg diet) を添加した飼料を摂食させた。飼料は 4 g/day で与え、自由飲水で8週間飼育した。マウスは、16 時間絶食後、イソフルラン麻酔下で腹部大動脈採血により屠殺した。採血した血液は、37℃で2時間静置し凝固させた後、4℃、2000 x gで15 分間遠心して血清を採取した。血清中の抗血栓性因子である tissue factor pathway inhibitor (TFPI) 量をELISA法により測定した。
【００３７】
血清IgA量に対する緑茶抽出物とEriodictyolの併用摂取効果   
12 週齢オス C57BL/6J マウスを1 週間予備飼育したのち、平均体重が等しくなるように 4 群にわけ、HF/HS (高脂肪高ショ糖食) 群、やぶきた(0.2% (HF/HS +やぶきた) 群、Eriodictyol (HF/HS + Eriodictyol) 群、やぶきた+ Eriodictyol (HF/HS + やぶきた + Eriodictyol) 群とした。やぶきた(0.2%) 及びEriodictyol (0.45 g/kg diet) を添加した飼料を摂食させた。飼料は 4 g/day で与え、自由飲水で8週間飼育した。マウスは、16 時間絶食後、イソフルラン麻酔下で腹部大動脈採血により屠殺した。採血した血液は、37℃で2 時間静置し凝固させた後、4℃、2000 x gで15 分間遠心して血清を採取した。血清中のIgA量を ELISA法により測定した。
【００３８】
EGCG、EGCG3”Me、緑茶抽出物のがん細胞致死誘導活性に対するEriodictyol、Eriodictyol関連物質(Naringenin, Hesperetin)及びEriodictyol含有食品抽出物の組み合わせ効果 
ヒト多発性骨髄腫細胞株U266は 、10% FCS 添加RPMI1640 培地にて 37℃、水蒸気飽和した 5% CO2条件下で継代、維持した。細胞は対数増殖期で培養維持した。培養に使用した RPMI 1640 培地は、超純水 1 L あたり RPMI 1640 培地 10.4 g、HEPES 2.38 g、注射用ペニシリン G カリウム 10 万単位、硫酸ストレプトマイシン注射用 100 mg、NaHCO3  2.0 g を懸濁した後、フィルター滅菌した。
実験に用いたレモン皮抽出物はレモン6 個 からおろし金を用いて果皮 100 g を採取し100% EtOH 100 mL を加え、乳鉢にて破砕した。さらにガーゼにて繊維の除去を行い、1号の濾紙および漏斗を用い、自然ろ過にて沈殿物を除去した。その後12000 x gにて遠心分離を行い、上清を回収した。得られたレモンエタノール抽出液をエバポレーターを用いて溶媒を揮発させ、レモンエタノール抽出画分を得た。このレモンエタノール抽出画分をDMSO に再溶解し、レモン抽出物とした。その後、U266 を1% FCS SOD (5 U/mL)、Catalase (200 U/mL)含有RPMI 1640 に 5 ×104cells/mLになるよう調整して 96 well plate に播種し、EGCG、EGCG3”Me、緑茶抽出物のがん細胞致死誘導活性に対するEriodictyol、Eriodictyol関連物質(Naringenin, Hesperetin) 及びEriodictyol含有食品を添加し96 時間培養した。培養後、トリパンブルー法にて生細胞数を測定した。
【００３９】
EriodictyolによるEGCG活性増強の67LR 依存性 
ヒト多発性骨髄腫細胞株U266は、10% FCS 添加RPMI1640 培地にて 37℃、水蒸気飽和した 5% CO2条件下で継代、維持した。細胞は対数増殖期で培養維持した。培養に使用した RPMI 1640 培地は、超純水 1 L あたり RPMI 1640 培地 10.4 g、HEPES 2.38 g、注射用ペニシリン G カリウム 10 万単位、硫酸ストレプトマイシン注射用 100 mg、NaHCO3  2.0 g を懸濁した後、フィルター滅菌した。U266 を1% FCS SOD (5 U/mL)、Catalase (200 U/mL)含有RPMI 1640 に 5 ×104cells/mLになるよう調整して 96 well plate に播種し、直ちに、終濃度が 20 μg/mL となるように Anti-67LR Monoclonal Antibody であるMLuc5 (abcam) を添加した。3 時間後、Eriodictyol及び EGCGを終濃度が 5 μM となるよう添加した。生細胞数はATPlite One Step (パーキンエルマー) にて測定した。 
【００４０】
EGCG のAkt活性化能に対するEriodictyol の増強効果 
5 週齢メスbalb/cマウスを2 週間予備飼育したのち、マウス多発性骨髄腫細胞株MPC-11を5 ×106 cells/mL となるようにRPMI培地に懸濁した細胞懸濁液を、 200 μL 右背部に皮下注射移植した。移植11 日後、EGCG (15 mg/kg i.p.)及びEriodictyol  (15 mg/kg i.p.) を投与し、6時間後に屠殺を実施し、腫瘍を摘出した。移植11 日後、 EGCG (15 mg/kg i.p.) 及び Eriodictyol (15 mg/kg i.p.) を投与した。6 時間後屠殺した。腫瘍を摘出し、ライゼートにした後、回収したサンプル(1 mg/mL protein lyste 20 μL) に  Kinase Assay buffer 20 μL、Biotinylated Akt Substrate WS  10 μL、dH2O  50 μL、ATP/MgCl2Mix  20μL を順に添加し、37℃ にて 45分間インキュベートした後、Kinase Stop Solution  を 10 μL 添加した。その後、Streptavidin-Coated 96-Well に 80 μL ずつ添加し、30℃ にて 60分間放置した。その後プレートを三度洗浄し、Phosphoserine Detection Antibody を 100 μL ずつ添加し、30℃にて60分間放置した。その後プレートを三度洗浄し、HRP-Antibody Conjugateを 100 μL ずつ添加し、30℃にて60分間放置した。その後プレートを三度洗浄した後、基質である TMB solution を 100μL ずつ添加した。30℃にて20分間放置後に停止液を100 μL ずつ添加した後、450 nm のプレートリーダーにて吸光度を測定した。 
【００４１】
EGCG の67LR依存的がん細胞致死誘導経路の活性化 (酸性スフィンゴミエリナーゼ活性化)に対するEriodictyol の増強効果
5 週齢メスbalb/cマウスを2 週間予備飼育したのち、マウス多発性骨髄腫細胞株MPC-11を5 ×106 cells/mL となるようにRPMI培地に懸濁した細胞懸濁液を、 200 μL 右背部に皮下注射移植した。移植11 日後、EGCG (15 mg/kg i.p.)及びEriodictyol (15 mg/kg i.p.) を投与し、6時間後に屠殺した。腫瘍を摘出し、ライゼートにした後、遠心した。上清を PBS にて 2 mg protein/ mL となるようにしたのち、エッペンドルフチューブに 20 μL 分注し、基質混合液 (BODIPY-C12-SM 2 μL 、10%Triton 10 μL、1M sodium acetate pH 4.5 20 μL  dH2O 78 μL) を 8 μL 添加し、タッピングにて混合したのちフラッシュし、 37℃にて8時間インキュベートした。さらに、停止液 (クロロホルム  CHCl3 :MeOH = 2:1)  を 60 μL 添加し、あらかじめ乾燥器にて活性化させた 薄層クロマトグラフィー（TLC）プレートに 10 μLづつスポットし、展開溶媒(dH2O:MeOH:クロロホルム  CHCl3 = 8:35:60 ) にて展開した。 TLC 法にて酸性スフィンゴミエリナーゼ活性を測定した (n = 5 S.E.M.)。 
【００４２】
EGCG の 67LR 依存的がん細胞致死活性 (Caspase-3 活性)に対するEriodictyol の増強効果
5 週齢メスbalb/cマウスを2 週間予備飼育したのち、マウス多発性骨髄腫細胞株MPC-11を5 ×106 cells/mL となるようにRPMI培地に懸濁した細胞懸濁液を、 200 μL 右背部に皮下注射移植した。移植11 日後、EGCG (15 mg/kg i.p.)及びEriodictyol (15 mg/kg i.p.) を2日に一度投与し、6 時間後に屠殺した。腫瘍を摘出し、組織切片を作成し、免疫組織染色にてCaspase-3 が活性化された細胞数を測定した。
【００４３】
統計
実験結果の統計処理には Tukey’s testを用い、0.05 未満を有意とした。
【００４４】
実施例1
EGCG のがん細胞アポトーシス誘導作用に対するEriodictyolの併用効果（図１） 
EGCGのがん細胞アポトーシス誘導作用に対するEriodictyol の効果を評価するため、ヒト多発性骨髄腫細胞株U266 を5×104cells/mL となるよう調整して 96 well plate に播種し、EGCG 及びEriodictyolを終濃度が5 μM となるよう添加し96 時間培養した。96時間培養後、Annexin V Alexa Fluor 488 Conjugate を 5 μL (Invitrogen) 添加した。PI 染色液2 μL を添加し、室温にて15分間放置した。その後、Annexin V Binding Buffer 400 μL を添加し、フローサイトメーターにてアポトーシスが誘導された細胞数を測定した。
その結果、Eriodictyol は EGCG のアポトーシス誘導作用を増強させることが明らかとなった。
【００４５】
実施例2
腫瘍移植マウスに対するEGCG と Eriodictyol併用の抗がん作用（図２）
EGCG とEriodictyol 組み合わせによる抗がん作用を評価するため、Balb/cマウスを2 週間予備飼育したのち、マウス多発性骨髄腫細胞株MPC-11を5 ×106 cells/mL となるようにRPMI培地に懸濁した細胞懸濁液を右背部に皮下注射した。腫瘍生着を確認後、EGCG (15 mg/kg i.p.) 及びEriodictyol  (15 mg/kg i.p.)を2日に一度投与し、腫瘍の体積を測定した。その結果、Eriodictyol とEGCGの 併用は腫瘍成長を顕著に阻害するとともに生存期間を有意に延長させることを明らかにした。
【００４６】
実施例3
腫瘍移植マウスに対するEGCG と Eriodictyol 組み合わせによる肝毒性（図３） 
マウス多発性骨髄腫細胞株MPC-11を移植したマウスにEGCG (15 mg/kg i.p.) 及びEriodictyol  (15 mg/kg i.p.)を2日に一度投与した。屠殺時のマウス血清中のAspartate Aminotransferase (AST) 及び Alanine aminotransferase (ALT) 活性を測定した。
その結果、EGCG とEriodictyol の組み合わせは AST 及び ALT の上昇を誘導しなかったことから、肝毒性を示さないことを明らかにした。 
【００４７】
実施例4
廃用性筋萎縮に及ぼすEGCGとEriodictyol併用物の効果（図４） 
尾懸垂試験誘導性マウスの廃用性筋萎縮に及ぼすEGCGならびにEriodictyolの作用について検討した。C57BL/6J マウスに水又は各サンプルをゾンデにより1日に1回 胃内投与した。投与開始から7 日後、尾懸垂試験を開始し、尾懸垂試験開始から10 日後、イソフルラン麻酔下で腹部大動脈採血によりマウスを屠殺し、大腿四頭筋を摘出し重量を測定した。
その結果、EGCGおよびEriodictyolはそれぞれ単独では筋萎縮に対して効果を示さなかったのに対し、EGCGとEriodictyolを併用投与したマウスでは筋萎縮が抑制されていた。以上の結果から、EGCGとEriodictyolの併用は筋萎縮抑制作用を示すことが明らかになった。
【００４８】
実施例 5
高脂肪高ショ糖(HF/HS)食摂取マウスに対する緑茶抽出物とEriodictyolの併用摂取効果（図５） 
高脂肪高ショ糖食摂食肥満モデルマウスにおけるやぶきた及びEriodictyolの肥満に対する作用において検討を行った。12 週齢オス C57BL/6J マウスを1 週間予備飼育したのち、平均体重が等しくなるように各群に分け、飼料を 4 g/day で与え自由飲水で8週間飼育した。体重を測定後16時間絶食させ、その後、イソフルラン麻酔下で腹部大動脈採血により屠殺した。採血により採取した血液は37℃で2時間静置し凝固させた後、4℃、2000 x gで15分間遠心して血清を採取した。血清中の総コレステロール及び LDL 値を測定した。脂肪組織をトライゾールにて処理し、cDNA合成後real-time PCRによって MCP-1 のmRNA発現量を測定した。
その結果、高脂肪高ショ糖食摂取により上昇した体重、脂肪組織MCP-1発現量、LDL値、血清コレステロール値に対してやぶきた及びEriodictyol 単独群では効果が見られなかったが、やぶきたとEriodictyol の併用群ではこれら全ての値に対して上昇抑制効果が観察された。
【００４９】
実施例6
高脂肪高ショ糖(HF/HS)食摂取マウスの肝臓におけるコレステロール代謝関連遺伝子発現に対する緑茶抽出物とEriodictyolの併用摂取効果（図６） 
高脂肪高ショ糖食摂食肥満モデルマウスにおける、やぶきた及びEriodictyolの肝臓におけるコレステロール代謝関連遺伝子発現に対する作用について検討した。C57BL/6J マウスを 1 週間予備飼育したのち、平均体重が等しくなるように各群に分け、飼料を4 g/day で与え自由飲水で 8週間飼育した。16時間絶食後、イソフルラン麻酔下で腹部大動脈採血により屠殺した。肝臓組織をトライゾールにて処理し、cDNA合成後real-time PCRによって HMGCR、HMCGS及び LDLRのmRNA発現量を測定した。
その結果、やぶきた及びEriodictyol 単独群では効果が観察されなかったのに対し、やぶきたとEriodictyol の併用群において肝臓におけるHMGCR及び HMCGSの発現量の低下が見られた。また、肝臓におけるLDLRの発現量が上昇していた。
【００５０】
実施例7
抗血栓性因子産生に対する緑茶抽出物とEriodictyolの併用摂取効果（図７） 
マウスにおけるやぶきた及びEriodictyolの抗血栓性因子産生に対する作用について検討した。12 週齢オス C57BL/6J マウスを1 週間予備飼育したのち、平均体重が等しくなるように各群に分け、飼料を 4 g/day で与え自由飲水で8週間飼育した。16時間絶食後、イソフルラン麻酔下で腹部大動脈採血により屠殺した。採血により採取した血液は37℃で2 時間静置し凝固させた後、4℃、2000 x gで15 分間遠心して血清を採取した。血清中の抗血栓性因子であるTFPI 量をELISA法にて測定した。
その結果、やぶきた単独群では作用を与えなかったのに対し、やぶきたとEriodictyol の併用群においてTFPI 量の発現量の上昇が見られた。
【００５１】
実施例8
血清IgA量に対する緑茶抽出物とEriodictyolの併用摂取効果（図８） 
マウスにおけるやぶきた及びEriodictyolの血清IgA量に対する作用について検討した。12 週齢オス C57BL/6J マウスを1 週間予備飼育したのち、平均体重が等しくなるように各群に分け、飼料を 4 g/day で与え自由飲水で8週間飼育した。16時間絶食後、イソフルラン麻酔下で腹部大動脈採血により屠殺した。採血により採取した血液は37℃で2 時間静置し凝固させた後、4℃、2000 x gで15 分間遠心して血清を採取した。血清中のIgA量を ELISA法にて測定した。
その結果、やぶきた単独群では作用を与えなかったのに対し、やぶきたとEriodictyol の併用群においてIgA量の上昇が見られた。
【００５２】
実施例9
EGCG、EGCG3”Me、緑茶抽出物のがん細胞致死誘導活性に対するEriodictyol、Eriodictyol関連物質(Naringenin, Hesperetin) ならびにEriodictyol含有食品抽出物の組み合わせ効果（図９）
EGCG若しくはその構造類似体、又はEGCG を含有する天然物とEriodictyol若しくはその構造類似体、又はEriodictyol を含有する天然物との併用効果を評価するため、ヒト多発性骨髄腫細胞株U266 を5×104cells/mL となるよう調整して 96 well plate に播種し、EGCG 及びEriodictyolを終濃度で 5 μM となるよう添加し、96時間培養した。96 時間培養後、トリパンブルー法にて生細胞数を測定した。
その結果、Eriodictyol又はその構造類似体であるNaringenin若しくはHesperetin、及びEriodictyol を含有するレモン抽出物はEGCG、EGCG”Me、緑茶抽出物の抗がん作用を顕著に高めることを見出した。
【００５３】
実施例10
EriodictyolによるEGCG活性増強の67LR 依存性（図１０）
EriodictyolによるEGCG活性増強の67LR 依存性を検討するために U266 細胞を5 ×104 cells/mLになるよう調整して 96 well plate に播種し、終濃度が 20 μg/mL となるように抗67LR抗体を添加した。3 時間後、Eriodictyol及び EGCGを終濃度が 5 μM となるよう培地に添加した。培養96時間後の生細胞数をATPlite One Step (パーキンエルマー) にて測定した。
その結果、EGCGとEriodictyolとの併用による抗がん作用は抗67LR抗体の前処理により消失した。このことから、EGCGの生理活性に対するEriodictyolの増強作用は67LR に依存することが示された。
【００５４】
実施例11
EGCG のAkt活性化能に対するEriodictyol の増強効果（図１１）
EGCG の 67LR 依存的がん細胞致死誘導活性を担うAktの活性化に対する Eriodictyol の作用を検討するため、Balb/cマウスにマウス多発性骨髄腫細胞株MPC-11を皮下注射移植した。移植11 日後、EGCG (15 mg/kg i.p.)及びEriodictyol (15 mg/kg i.p.) を投与した6 時間後に屠殺し、摘出した腫瘍におけるAkt 活性を測定した。
その結果、Eriodictyol 及びEGCG 併用はAkt 活性を顕著に上昇させることを見出した。このことから、in vivo においてEriodictyolはEGCGによる67LRシグナリングの活性化を増強することが明らかとなった。
【００５５】
実施例12
EGCG の67LR依存的がん細胞致死誘導経路の活性化 (酸性スフィンゴミエリナーゼ活性化)に対するEriodictyol の増強効果（図１２）
EGCG の 67LR 依存的がん細胞致死誘導活性を担う酸性スフィンゴミエリナーゼの活性化に対する Eriodictyol の作用を検討するため、Balb/cマウスにマウス多発性骨髄腫細胞株MPC-11を皮下注射移植した。移植11 日後、EGCG (15 mg/kg i.p.)及びEriodictyol  (15 mg/kg i.p.) を投与した6 時間後に屠殺し、摘出した腫瘍における酸性スフィンゴミエリナーゼ活性を測定した。
その結果、Eriodictyol及びEGCG の併用は酸性スフィンゴミエリナーゼ活性を顕著に上昇させることを明らかにした。以上のことから、in vivo においてEriodictyolはEGCGによる67LRシグナリングの活性化を増強することが明らかとなった。
【００５６】
実施例13
EGCG の 67LR 依存的がん細胞致死活性 (Caspase-3 活性)に対するEriodictyol の増強効果（図１３）
EGCG の 67LR 依存的がん細胞致死誘導機構活性の指標となるCaspase-3 活性化に対する Eriodictyol の作用を検討するため、5 週齢メスbalb/cマウスにマウス多発性骨髄腫細胞株MPC-11を皮下注射移植した。移植11 日後、EGCG (15 mg/kg i.p.)及びEriodictyol  (15 mg/kg i.p.) を投与した6時間後に屠殺し、摘出した腫瘍の組織切片を作成し、Caspase-3 の活性化状態を評価した。
その結果、EriodictyolはEGCGのCaspase-3活性化能を顕著に増強することを明らかにした。
【００５７】
実験方法（２）
EGCG及びその類似体の抗がん作用に対するEriodictyol及びその類似体の併用効果
ヒト多発性骨髄腫細胞株U266は、 10% ウシ胎児血清 (FCS) 添加RPMI1640 培地にて 37℃、水蒸気飽和した 5% CO2 条件下で継代、維持した。細胞は対数増殖期で培養維持した。培養に使用した RPMI 1640 培地は、超純水 1 L あたり RPMI 1640 培地 10.4 g、HEPES 2.38 g、注射用ペニシリン G カリウム 10 万単位、硫酸ストレプトマイシン注射用 100 mg、NaHCO3  2.0 g を懸濁した後、フィルター滅菌した。その後、FCS を RPMI 1640 培地に添加し、細胞培養に使用した。超純水 1 L に対し、NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4 1.15 g、KH2PO4 0.2 g を溶解してPBSを調製し、オートクレーブ滅菌した。
Eriodictyol及びその構造類似体であるNaringenin、Hesperetin、ならびにそれらの配糖体であるEriocitrin、Naringin、Hesperidinは、100%  ジメチルスルホキシド (DMSO) にて 5 mM となるように調整し、-30℃ にて保存した。EGCG 及び (-)-Gallocatechin gallate (GCG) は超純水にて 5 mM となるように調整し、-30℃ にて保存した。EGCG3”Meは10%DMSO dH2Oにて 5 mM となるように調整し、-30℃ にて保存した。
U266 を1% FCS及び SOD (5 U/mL)、Catalase (200 U/mL)含有RPMI 1640 に 5×104 cells/mL になるよう調整して 24 well plate に播種し、EGCG 及び類似体又は Eriodictyol及びその類似体を、終濃度で 5 mM となるよう添加し96 時間培養した。培養後、トリパンブルー法にて生細胞数を測定した。
【００５８】
統計
実験結果の統計処理には Student‘s testを用い、Vehicle 群の Control と比較してP値が 0.05 未満を有意とした。
【００５９】
実施例14
Eriodictyol が EGCG 及びその構造類似体の抗がん作用に及ぼす影響  
EGCG 及びその構造類似体の抗がん作用に対するEriodictyol の効果を評価するため、ヒト多発性骨髄腫細胞株U266 を5×104cells/mL となるよう調整して 24 well plate に播種し、Eriodictyol及びその構造類似体を終濃度が 5 mM となるよう添加し96時間培養した。96 時間培養後、トリパンブルー法にて生細胞数を測定した。
その結果、EriodictyolはEGCG 及びその構造類似体であるEGCG 3”Me, GCG（ガロカテキンガレート）の抗がん作用を顕著に高めることを見出した  （図14）。
【００６０】
実施例15
Naringenin が EGCG 及びその構造類似体の抗がん作用に及ぼす影響  
EGCG 及びその構造類似体の抗がん作用に対するNaringenin の効果を評価するため、ヒト多発性骨髄腫細胞株U266 を5×104cells/mL となるよう調整して 24 well plate に播種し、Naringenin及びその構造類似体を終濃度が 5 mM となるよう添加し96時間培養した。96 時間培養後、トリパンブルー法にて生細胞数を測定した。
その結果、NaringeninはEGCG 及びその構造類似体であるEGCG 3”Me, GCGの抗がん作用を顕著に高めることを見出した（図15）。
【００６１】
実施例16
Hesperetinが EGCG 及びその構造類似体の抗がん作用に及ぼす影響  
EGCG 及びその構造類似体の抗がん作用に対するHesperetinの効果を評価するため、ヒト多発性骨髄腫細胞株U266 を5×104cells/mL となるよう調整して 24 well plate に播種し、Hesperetin及びその構造類似体を終濃度が 5 mM となるよう添加し96時間培養した。96 時間培養後、トリパンブルー法にて生細胞数を測定した。
その結果、HesperetinはEGCG 及びその構造類似体であるEGCG 3”Me, GCGの抗がん作用を顕著に高めることを見出した（図16）。
【００６２】
実施例17
Eriodictyol 配糖体であるEriocitrin が EGCG 及びその構造類似体の抗がん作用に及ぼす影響  
EGCG 及びその構造類似体の抗がん作用に対するEriocitrin の効果を評価するため、ヒト多発性骨髄腫細胞株U266 を5×104cells/mL となるよう調整して 24 well plate に播種し、Eriocitrin及びその構造類似体を終濃度が 5 mM となるよう添加し96 時間培養した。96 時間培養後、トリパンブルー法にて生細胞数を測定した。
その結果、EriocitrinはEGCG 及びその構造類似体であるEGCG 3”Me, GCGの抗がん作用を顕著に高めることを見出した（図17）。
【００６３】
実施例18
Naringenin 配糖体であるNaringin が EGCG 及びその構造類似体の抗がん作用に及ぼす影響  
EGCG 及びその構造類似体の抗がん作用に対するNaringin の効果を評価するため、ヒト多発性骨髄腫細胞株U266 を5×104cells/mL となるよう調整して 24 well plate に播種し、Naringin及びその構造類似体を終濃度が 5 mM となるよう添加し96 時間培養した。96 時間培養後、トリパンブルー法にて生細胞数を測定した。
その結果、NaringinはEGCG の抗がん作用を顕著に高めることを見出した（図18）。
【００６４】
実施例19
Hesperetin配糖体であるHesperidin が EGCG 及びその構造類似体の抗がん作用に及ぼす影響  
EGCG 及びその構造類似体の抗がん作用に対するHesperidin の効果を評価するため、ヒト多発性骨髄腫細胞株U266 を5×104cells/mL となるよう調整して 24 well plate に播種し、Hesperidin及びその構造類似体を終濃度が 5 mM となるよう添加し96時間培養した。96 時間培養後、トリパンブルー法にて生細胞数を測定した。
その結果、HesperidinはEGCG 及びその構造類似体であるEGCG 3”Me, GCGの抗がん作用を顕著に高めることを見出した（図19）。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明の組成物は、抗癌作用、抗炎症作用等を有する機能性食品として有用である。
【図１】
2020121990.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2020121990.tif 000007
【図７】
2020121990.tif 000008
【図８】
2020121990.tif 000009
【図９】
2020121990.tif 000010
【図１０】
2020121990.tif 000011
【図１１】
2020121990.tif 000012
【図１２】
2020121990.tif 000013
【図１３】
2020121990.tif 000014
【図１４】
2020121990.tif 000015
【図１５】
2020121990.tif 000016
【図１６】
2020121990.tif 000017
【図１７】
2020121990.tif 000018
【図１８】
2020121990.tif 000019
【図１９】
2020121990.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月23日(2020.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑茶抽出物又はカテキンと、柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体とを含む、組成物であって、
緑茶抽出物又はカテキンが、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート及びメチル化カテキンからなる群から選ばれる少なくとも１種であって９０重量％〜０．００１重量％（但し０．０５〜０．５重量％を除く）を含み、柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体が、エリオジクチオール、ナリンゲニン及びヘスペレチン、並びにこれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１種であって９０重量％〜０．００１重量％（但し０．００１〜１．０重量％を除く）を含む、前記組成物。
【請求項２】
抗がん、抗筋萎縮、抗肥満、抗炎症、コレステロール低下、血栓又は脳梗塞予防、免疫増強、抗アレルギー、動脈硬化予防及び６７ｋＤａラミニンレセプター依存的作用誘導からなる群から選ばれる少なくとも１つ用の、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
緑茶抽出物又はカテキンと、柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体とを含む、食品組成物であって、
緑茶抽出物又はカテキンが、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート及びメチル化カテキンからなる群から選ばれる少なくとも１種であって９０重量％〜０．００１重量％（但し０．０５〜０．５重量％を除く）を含み、柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体が、エリオジクチオール、ナリンゲニン及びヘスペレチン、並びにこれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１種であって９０重量％〜０．００１重量％（但し０．００１〜１．０重量％を除く）を含む、前記組成物。
【請求項４】
抗がん、抗筋萎縮、抗肥満、抗炎症、コレステロール低下、血栓又は脳梗塞予防、免疫増強、抗アレルギー、動脈硬化予防及び６７ｋＤａラミニンレセプター依存的作用誘導からなる群から選ばれる少なくとも１つ用の、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記緑茶抽出物又はカテキンは、ヒトの等価用量として０．４ｍｇ／ｋｇ〜３２．４ｍｇ／ｋｇで摂取され、かつ、前記柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体は、ヒトの等価用量として０．４ｍｇ／ｋｇ〜７．２９ｍｇ／ｋｇで摂取される、請求項３又は４に記載の組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物を含む、機能性食品。
【請求項７】
緑茶抽出物又はカテキンと、柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体とを含む、抗がん剤、抗筋萎縮剤、抗肥満剤、抗炎症剤、コレステロール低下剤、血栓又は脳梗塞予防剤、免疫増強剤、抗アレルギー剤、動脈硬化予防剤及び６７ｋＤａラミニンレセプター依存的作用誘導剤からなる群から選ばれるいずれかの剤であって、
緑茶抽出物又はカテキンが、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート及びメチル化カテキンからなる群から選ばれる少なくとも１種であって９０重量％〜０．００１重量％（但し０．０５〜０．５重量％を除く）を含み、柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体が、エリオジクチオール、ナリンゲニン及びヘスペレチン、並びにこれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１種であって９０重量％〜０．００１重量％（但し０．００１〜１．０重量％を除く）を含む、前記剤。
【請求項８】
前記緑茶抽出物又はカテキンは、ヒトの等価用量として０．４ｍｇ／ｋｇ〜３２．４ｍｇ／ｋｇで摂取され、かつ、前記柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体は、ヒトの等価用量として０．４ｍｇ／ｋｇ〜７．２９ｍｇ／ｋｇで摂取される、請求項７に記載の剤。
【請求項９】
柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体を含む、緑茶抽出物又はカテキンの抗がん作用、抗筋萎縮作用、抗肥満作用、抗炎症作用、コレステロール低下作用、血栓又は脳梗塞予防作用、免疫増強作用、抗アレルギー作用、動脈硬化予防作用及び６７ｋＤａラミニンレセプター依存的作用からなる群から選ばれる少なくとも１つの作用の増強用食品組成物であって、柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体が、エリオジクチオール、ナリンゲニン及びヘスペレチン、並びにこれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１種であって９０重量％〜０．００１重量％（但し０．００１〜１．０重量％を除く）を含む、前記組成物。
【請求項１０】
柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体を含む、緑茶抽出物又はカテキンの６７ｋＤａラミニンレセプター依存的作用の増強用食品組成物であって、柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体が、エリオジクチオール、ナリンゲニン及びヘスペレチン、並びにこれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１種である、前記組成物。
【請求項１１】
緑茶抽出物又はカテキンが、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート及びメチル化カテキンからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項９又は１０に記載の食品組成物。
【請求項１２】
柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体を含む、緑茶抽出物又はカテキンの抗がん作用、抗筋萎縮作用、抗肥満作用、抗炎症作用、コレステロール低下作用、血栓又は脳梗塞予防作用、免疫増強作用、抗アレルギー作用、動脈硬化予防作用及び６７ｋＤａラミニンレセプター依存的作用からなる群から選ばれる少なくとも１つの作用の増強剤であって、柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体が、エリオジクチオール、ナリンゲニン及びヘスペレチン、並びにこれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１種である、前記増強剤。
【請求項１３】
柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体を含む、緑茶抽出物又はカテキンの６７ｋＤａラミニンレセプター依存的作用の増強剤であって、柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体が、エリオジクチオール、ナリンゲニン及びヘスペレチン、並びにこれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１種である、前記組成物。
【請求項１４】
緑茶抽出物又はカテキンが、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート及びメチル化カテキンからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１２又は１３に記載の増強剤。
【請求項１５】
緑茶抽出物又はカテキンと、柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体とを含む組成物を被検体に摂取させることを特徴とする、当該緑茶抽出物又はカテキンの、前記被検体における抗がん作用、抗筋萎縮作用、抗肥満作用、抗炎症作用、コレステロール低下作用、血栓又は脳梗塞予防作用、免疫増強作用、抗アレルギー作用、動脈硬化予防作用及び６７ｋＤａラミニンレセプター依存的作用からなる群から選ばれる少なくとも１つの作用を増強させる方法（ヒトに対する医療行為を除く）であって、
柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体が、エリオジクチオール、ナリンゲニン及びヘスペレチン、並びにこれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１種である、前記方法。
【請求項１６】
緑茶抽出物又はカテキンと、柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体とを含む組成物を被検体に摂取させることを特徴とする、当該緑茶抽出物又はカテキンの、６７ｋＤａラミニンレセプター依存的作用を増強させる方法（ヒトに対する医療行為を除く）であって、
柑橘類抽出物又はフラバノン若しくはその配糖体が、エリオジクチオール、ナリンゲニン及びヘスペレチン、並びにこれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１種である、前記方法。
【請求項１７】
緑茶抽出物又はカテキンが、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート及びメチル化カテキンからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１５又は１６に記載の方法。