(57)【要約】【課題】ヒドロゲルの物性を維持したまま多糖類ヒドロゲルに化学修飾基を導入する方法を提供する。修飾多糖類ヒドロゲルを用いたアッセイ方法も提供する。【解決手段】多糖類ヒドロゲルを過ヨウ素酸化合物で処理することにより、環構造を開環させると共に環構造中のジオール構造をアルデヒド基に変換する工程と、アミン様官能基および末端アルキニル基を有するリンカー化合物をアルデヒド基と反応させてイミン結合を形成させ、その後イミン結合を還元する工程と、末端アルキニル基を有機アジド化合物と反応させる工程とを含む、修飾多糖類のヒドロゲルの製造方法を提供する。修飾多糖類のヒドロゲルを２つ以上水溶液に浮かべる工程と、ヒドロゲルを互いに接触させる工程と、ヒドロゲルを自然に分散させる工程と、所定の時間経過後にヒドロゲル同士の間の距離を測定する工程とを含む、修飾基を介した分子間相互作用のアッセイ方法も提供する。【選択図】図１
2020158617.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾された多糖類のヒドロゲルであって、
修飾される多糖類を構成する複数の単糖ユニットのうちの少なくとも一部は、その環構造中の隣接する２つの炭素原子においてジオール構造を有する単糖ユニットであり、
前記ジオール構造を有する単糖ユニットのうちの少なくとも一部が前記環構造の開環により形成される下記式（Ｉ）で表される構造による修飾を受けており、
【化１】
2020158617.tif 000010
式中、
＊および＊＊は、前記２つの炭素原子に由来する炭素原子であり、
R1は、-NH-、-NH-O-、または-NH-NH-CO-であり、
R2は、両端に炭素原子を有するスペーサー基であり、
R3は、有機アジド化合物に由来する修飾基である、
修飾された多糖類のヒドロゲル。
【請求項２】
前記スペーサー基は、直鎖状もしくは分岐状の脂肪族炭化水素基、芳香族基、ポリエチレングリコール基、またはこれらの組合せを含む基である、請求項１に記載の修飾された多糖類のヒドロゲル。
【請求項３】
R3が糖鎖を含む、請求項１または２に記載の修飾された多糖類のヒドロゲル。
【請求項４】
前記多糖類のヒドロゲルが、寒天、こんにゃく、またはナタデココである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の修飾された多糖類のヒドロゲル。
【請求項５】
環構造中の隣接する２つの炭素原子においてジオール構造を有する単糖ユニットを含む多糖類のヒドロゲルを、過ヨウ素酸化合物で処理することにより、前記環構造を開環させると共に前記ジオール構造を２つのアルデヒド基に変換する工程と、
下記式（ＩＩ）で表される構造を有するリンカー化合物であって、
【化２】
2020158617.tif 000011
式中、R4は、アミノ基、アミノオキシ基、またはヒドラジド基である、リンカー化合物を、前記アルデヒド基と反応させてイミン結合を形成させ、その後前記イミン結合を還元して前記R1基を生成する工程と、
前記リンカー化合物に由来する末端アルキニル基を、下記式（ＩＩＩ）で表される構造を有する有機アジド化合物のアジド基と反応および結合させて、R3基で修飾された多糖類のヒドロゲルを得る工程と
【化３】
2020158617.tif 000012
を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の修飾された多糖類のヒドロゲルの製造方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の修飾された多糖類のヒドロゲルを、２つ以上、水溶液に浮かべる工程と、
前記ヒドロゲルを互いに接触させる工程と、
前記ヒドロゲルを自然に分散させる工程と、
所定の時間経過後に、前記ヒドロゲル同士の間の距離を測定する工程と
を含む、前記修飾基を介した分子間相互作用のアッセイ方法。
【請求項７】
前記接触させる工程は、前記水溶液を撹拌して液流を生じさせることを含み、前記自然に分散させる工程は、前記撹拌を停止することを含む、請求項６に記載のアッセイ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、化学的に修飾された多糖類ヒドロゲルに関する。
【背景技術】
【０００２】
多糖類のヒドロゲルは、寒天、こんにゃく、ナタデココなどの食品の形態で日常生活中に見出され、また、その優れた保水性、生体適合性、生分解性、無毒性、柔軟性、入手容易性、および低コスト性等の特性のために、医学、薬学、生体工学、微生物培養、植物栽培など多様な用途で使用され得る材料である。
【０００３】
多糖類ヒドロゲルを構成する多糖類ネットワーク構造を化学的に修飾できれば、さらなる有用な性質を付与することができ、産業的な応用の幅がさらに広がり得る。
【０００４】
非特許文献１は、バクテリアセルロースのヒドロゲルにポリエチレンイミンをグラフト化し、これにアダマンタンカルボン酸をイオン結合させることによって、アダマンチル基で化学修飾された多糖類ヒドロゲルを得たことを記載している。非特許文献１は、このアダマンタン修飾ヒドロゲルを、シクロデキストリン含有ポリアクリルアミドゲルと接着させたところ、両ゲル間で最大7 kPa程度という強い接着強度が得られ、しかもその接着は簡単な液処理で任意に解体できたことを記載している。これは、多糖類ヒドロゲルの化学修飾により、易解体性の接着材料を開発した例である。
【０００５】
発明者らは、多糖類の研究、特に、細胞同士の相互作用に関わる糖鎖間相互作用（Carbohydrate-Carbohydrate Interactions: CCIs）の研究に携わってきた。細胞膜の主要な構成成分であるスフィンゴ糖脂質（GSLs）は、細胞膜内で均一に分散しているのではなく、互いに水平会合して、高度に密集したマイクロドメインを構築していることが、近年のこの分野の研究により明らかとなってきた。このマイクロドメインの表面には糖鎖が密集した「糖クラスター」が存在し、隣り合う細胞の糖クラスター同士が互いに糖鎖間相互作用することで、細胞同士の接着が誘導される。つまり、ヒトを含む多細胞生物において、CCIs は細胞間接着を引き起こすための最初期かつ重要な分子間相互作用の一つである。
【０００６】
CCIs の例として、桑実胚のコンパクションを引き起こすLeX-LeX間相互作用や、ガン細胞の転移を引き起こすGM3-Gg3 間相互作用などが知られている。これらの例からわかるように、CCIs のメカニズム解明は、多細胞生物の正常な発生機序の理解に加え、望まれない細胞接着により引き起こされる各種疾患の予防・治療薬の開発にも極めて重要である。しかしながら、どのような構造の糖鎖と糖鎖が相互作用するのか（糖鎖選択性）や、どのようなイオンの存在下でCCIs が誘導されるのか（イオン選択性）などを含め、CCIs のメカニズムは殆ど解明されていない。
【０００７】
CCIs のメカニズム解明が困難な理由として、CCIs が非常に微弱な相互作用であることに加え、細胞膜が雑多な成分から構成された混合系であることや、マイクロドメインが細胞表面で絶えず離合集散を繰り返していること、GSLs の発現量が時々刻々と変化することなどが挙げられる。このような困難に対処し、CCIs のメカニズムの詳細を分子レベルで明らかにするために、人工モデル系を用いた研究が行われている。例えば非特許文献２は、糖鎖を有する自己集積単分子膜（SAM）を金基板に固定化し、それと水溶液中に存在する糖鎖高分子との間のCCIs による接着を、表面プラズモン共鳴法（SPR）によって検出している。また、非特許文献３および４は、糖鎖を固定化した金ナノコロイド（GNP）を調製し、CCIs を介したそれらの会合を、透過型電子顕微鏡（TEM）によって評価している。
【０００８】
しかしこれら従来のモデル系では、ナノサイズの化合物（糖鎖高分子や糖修飾GNP）が用いられているため、CCIsを介した接着・会合を評価するためにはSPRやTEM などの高価かつ技術的専門性の高い測定機器の使用が必須となる。
【０００９】
可視サイズの組成物を用いてCCIsを評価できる方法があれば、高価な装置を使用することなく迅速なCCIsの解析が可能となり、この分野の研究の進展に大きく寄与できると考えられる。そのような方法は、CCIsに限らず、生物学的事象等に関わる比較的弱い分子間相互作用の評価に広く応用できると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】菅原ら、セルロース学会第２４回年次大会  講演要旨集  第１１３ページ、Ｐ０６３（２０１７年）
【非特許文献２】Matsuura et al., Glycoconjugate J. 2004, 21, 139-148.
【非特許文献３】de la Fuente et al., J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 6192-6197.
【非特許文献４】Reynolds et al., Langmuir 2006, 22, 1156-1163.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
多糖類ヒドロゲルの特性を活かしながらさらに有用な機能を付与するために、多糖類ヒドロゲルに様々な化学修飾を加えることのニーズが存在する。しかしながら、多糖類はそれ自体分子量が大きく複雑なネットワーク構造を有するため、化学反応の適切な進行およびヒドロゲルの特性維持などを考慮して実用的な修飾方法を見出すことは容易ではない。
【００１２】
一方、肉眼で視認できるアッセイによってCCIsのような分子間相互作用を検出および測定できる方法に対するニーズが存在するが、そのような方法はこれまで十分に開発されてこなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、多糖類ヒドロゲルにモジュール的に様々な化学修飾基を導入できる手法を開発し、さらに、その手法により作製された、ミリメートルスケール以上の大きさを有しうる修飾多糖類ヒドロゲルを用いて、分子間相互作用の検出、定量化、および可視化を行うことができることを見出した。
【００１４】
本開示は以下の実施形態を含む。
［１］
修飾された多糖類のヒドロゲルであって、
修飾される多糖類を構成する複数の単糖ユニットのうちの少なくとも一部は、その環構造中の隣接する２つの炭素原子においてジオール構造を有する単糖ユニットであり、
前記ジオール構造を有する単糖ユニットのうちの少なくとも一部が前記環構造の開環により形成される下記式（Ｉ）で表される構造による修飾を受けており、
【化１】
2020158617.tif 000003
式中、
＊および＊＊は、前記２つの炭素原子に由来する炭素原子であり、
R1は、-NH-、-NH-O-、または-NH-NH-CO-であり、
R2は、両端に炭素原子を有するスペーサー基であり、
R3は、有機アジド化合物に由来する修飾基である、
修飾された多糖類のヒドロゲル。
［２］
前記スペーサー基は、直鎖状もしくは分岐状の脂肪族炭化水素基、芳香族基、ポリエチレングリコール基、またはこれらの組合せを含む基である、［１］に記載の修飾された多糖類のヒドロゲル。
［３］
R3が糖鎖を含む、［１］または［２］に記載の修飾された多糖類のヒドロゲル。
［４］
前記多糖類のヒドロゲルが、寒天、こんにゃく、またはナタデココである、［１］〜［３］のいずれかに記載の修飾された多糖類のヒドロゲル。
［５］
環構造中の隣接する２つの炭素原子においてジオール構造を有する単糖ユニットを含む多糖類のヒドロゲルを、過ヨウ素酸化合物で処理することにより、前記環構造を開環させると共に前記ジオール構造を２つのアルデヒド基に変換する工程と、
下記式（ＩＩ）で表される構造を有するリンカー化合物であって、
【化２】
2020158617.tif 000004
式中、R4は、アミノ基、アミノオキシ基、またはヒドラジド基である、リンカー化合物を、前記アルデヒド基と反応させてイミン結合を形成させ、その後前記イミン結合を還元して前記R1基を生成する工程と、
前記リンカー化合物に由来する末端アルキニル基を、下記式（ＩＩＩ）で表される構造を有する有機アジド化合物のアジド基と反応および結合させて、R3基で修飾された多糖類のヒドロゲルを得る工程と
【化３】
2020158617.tif 000005
を含む、［１］〜［４］のいずれかに記載の修飾された多糖類のヒドロゲルの製造方法。
［６］
［１］〜［４］のいずれかに記載の修飾された多糖類のヒドロゲルを、２つ以上、水溶液に浮かべる工程と、
前記ヒドロゲルを互いに接触させる工程と、
前記ヒドロゲルを自然に分散させる工程と、
所定の時間経過後に、前記ヒドロゲル同士の間の距離を測定する工程と
を含む、前記修飾基を介した分子間相互作用のアッセイ方法。
［７］
前記接触させる工程は、前記水溶液を撹拌して液流を生じさせることを含み、前記自然に分散させる工程は、前記撹拌を停止することを含む、［６］に記載のアッセイ方法。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、異なるレクチンの存在下での糖鎖修飾多糖類ヒドロゲルの相互作用アッセイを示す。
【図２】図２は、異なるカチオンの存在下での糖鎖修飾多糖類ヒドロゲルの相互作用アッセイを示す。
【図３】図３は、異種糖鎖で修飾された多糖類ヒドロゲル間のヘテロ相互作用のアッセイを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
一側面において本開示は、化学的に修飾された多糖類のヒドロゲルを提供する。多糖類のヒドロゲルとは、当業者に通常理解されるように、多糖類ポリマーのネットワーク中に水が保持されている構造である。本実施形態において、修飾される前の多糖類は、その多糖類を構成する複数の単糖ユニットのうちの全部または一部が、その環構造中の隣接する２つの炭素原子においてジオール構造を有するものである。そのような多糖類のヒドロゲルの例として、寒天、こんにゃく、およびバクテリアセルロースが挙げられる。ナタデココは特に好ましいバクテリアセルロースである。ジオール構造は、通常、ピラノース環構造の2,3位炭素におけるジオールであり、またはフラノース環構造の3,4位炭素におけるジオールである。
【００１７】
本実施形態では、多糖類全体の中で、上記ジオール構造を有する１つまたは複数の単糖ユニットのうちの全部または一部が修飾を受ける。例えば、ジオール構造を有する複数の単糖ユニットのうちの０．５〜１００％、より好ましくは１〜１０％が修飾を受け得る。あるいは、多糖類を構成する全単糖ユニットのうちの０．５〜５０％、より好ましくは１〜１０％が修飾を受け得る。この修飾は、ジオール構造を有する単糖ユニットの環構造の開環により形成される下記式（Ｉ）で表される構造による修飾である。
【００１８】
【化４】
2020158617.tif 000006
式中、
＊および＊＊は、上記ジオール構造を形成していた２つの炭素原子に由来する炭素原子である（実際にはメチレン基の形態であるが、２つの水素原子の表示が省略されていることが理解されるべきである）。換言すると、＊および＊＊は、多糖類の構造中で上記ジオール構造を形成する２つの炭素原子の位置に対応する炭素原子である。R1は、-NH-、-NH-O-、または-NH-NH-CO-である（ここで、構造式の左側が、上記＊および＊＊で記された炭素原子への結合である）。R1は、後述するアルデヒド基とアミノ基、アミノオキシ基、またはヒドラジド基との反応により形成される二価の基である。
【００１９】
R2は、両端が炭素元素であるスペーサー基である。R2は例えば、直鎖状もしくは分岐状の脂肪族炭化水素基、芳香族基、ポリエチレングリコール基、またはこれらの組合せを含む基であり得る。R2は炭素数１２以下であることが好ましい。例えばR2は、炭素数５以下のアルキレン、フェニレン（-Ph-）、-(CH2CH2O)n-（ｎ≦６のポリエチレングリコール）、またはこれらの組合せを含む基であり得る。好ましいR2基のより具体的な例は、メチレン、エチレン、プロピレン、フェニレン、-(CH2CH2O)nPh-（ｎ≦３）、および-PhO(CH2CH2O)nCH2-（ｎ≦２）である。これら二価のR2基はどちら向きでもあり得るが、これらの構造式の左側がR1への結合であることが好ましい。
【００２０】
R3は、多糖類ヒドロゲルの修飾の主体となる修飾基であり、後述する有機アジド化合物に由来するもの、すなわち有機基である。有機アジド化合物に由来する有機基あるいは修飾基とは、アジド基で修飾されることができる有機基を意味する。本実施形態において、R3の具体的構造は、個々のアプリケーションに応じて当業者が適宜選択するべきものであり、アジド化されることができるあらゆる有機基をR3とし得る。すなわち、アジド化可能であると当業者が理解する有機基をR3とし得る。
【００２１】
R3は、糖鎖、ペプチド、ポリペプチド、核酸、脂肪酸、脂肪酸エステル、またはこれらの組合せを含み得る。特定の実施形態において、R3は、糖鎖を含む。この場合、多糖類ヒドロゲルの本体に、スペーサーを介してペンダント基として糖鎖が付随することとなる。糖鎖は、１個以上の単糖ユニットを含む。糖鎖は、典型的には、２０個以下、あるいは１５以下、あるいは１０個以下の単糖ユニットが、直鎖状または分岐状に連結したオリゴ糖であり得る。特定の具体例において、糖鎖は、ラクトース、またはシアリルラクトースであり得る。
【００２２】
別の側面において、本開示は、上述した修飾多糖類ヒドロゲルを製造する方法を提供する。この方法においては、化学的に修飾するためのヒドロゲル性多糖類として、上述したように、環構造中の隣接する２つの炭素原子においてジオール構造を有する単糖ユニットを含む多糖類が用いられる。出発材料として使用できる多糖類ヒドロゲルの例としては、寒天、こんにゃく、およびバクテリアセルロース、特にナタデココが挙げられる。これらのヒドロゲルは、タンパク質、塩、可溶性糖などの様々な不純物をネットワーク中に含んだ状態で入手されることが多いため、例えば１２時間、好ましくは１日以上水で洗浄してこれらの不純物を溶出・除去することが好ましい。不純物が除去されたことは、凍結乾燥した場合の乾燥重量の減少により確認することができる。
【００２３】
本実施形態の方法では、この多糖類ヒドロゲルが、過ヨウ素酸化合物で処理される。過ヨウ素酸化合物は、過ヨウ素酸またはその塩であり、例えば過ヨウ素酸ナトリウムまたは過ヨウ素酸カリウムであり得る。この処理による酸化よって、上記ジオール構造が２つのアルデヒド基に変換されると共に、その単糖ユニットが開環する。様々な多糖類のジオール構造を過ヨウ素酸化合物処理によってアルデヒド化することは公知の技術である（例えば、Chem. Commun. 2004, 382-383.；Anal. Chem. 2008, 80, 7213-7217；Peptide Science 2017, 108, e22983.）。例えば、ヒドロゲルを含む水に５〜２５ｇ／Lの過ヨウ素酸化合物を加え、室温で１〜３日撹拌することによりこの処理を行うことができる。途中で新鮮な溶液に交換してもよい。
【００２４】
次に、下記式（ＩＩ）で表される構造を有するリンカー化合物であって、
【化５】
2020158617.tif 000007
式中、R4はアミノ基、アミノオキシ基、またはヒドラジド基である、リンカー化合物を、上記アルデヒド基と反応させてイミン結合を形成させる。R2は上述したスペーサー基である。R4がアミノ基でありR2がメチレン基であるプロパルギルアミンは特に好ましいリンカー化合物である。しかしながら、R2は、アルデヒド反応性アミン様官能基（R4）とアルキニル基とを両端に繋ぎとめる役割を果たすものに過ぎないため、当業者はR2の具体的構造を適宜変更することができる。
【００２５】
リンカー化合物をアルデヒド基と反応させる際には、ヒドロゲル中の水を非水有機溶媒に置き換えることが好ましい。この目的に適しうる有機溶媒の例としては、DMSO、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）、N,N-ジメチルアセトアミド（DMA）、N-メチルピロリドン（NMP）、テトラヒドロフラン（THF）、および1,4-ジオキサン等が挙げられるが、これらに限定されない。DMSOは特に好ましい有機溶媒の一例である。水から有機溶媒への交換は、例えばヒドロゲルを有機溶媒中に１時間以上、好ましくは３時間以上、より好ましくは１２時間以上置くことによって達成され得る。続いて、リンカー化合物を例えば１〜１００ｍＭとなるように加えてさらに１２時間以上撹拌すれば、多糖類ネットワーク上のアルデヒド基とリンカー化合物のR4基とが反応しイミン結合（-CH=N-）が形成される。そこに還元剤（例えば１〜５ｇ／LのNaBH4）を加えることにより、イミン結合が還元され第２級アミン構造による結合（-CH2-NH-）に変換されて、上述したR1基が形成される。その後、上述したのと逆の手順で有機溶媒を水に置き換え直すことにより、再びヒドロゲルの形態が得られる。
【００２６】
この時点で、ヒドロゲル中の多糖類は、上記式（Ｉ）においてR2基がトリアゾール環のかわりに-C≡CHというアルキニル基に結合した構造を有している。リンカー化合物に由来するこの末端アルキニル基を、下記式（ＩＩＩ）で表される構造を有する有機アジド化合物のアジド基と反応および結合させると、上記式（Ｉ）の構造を有する修飾された多糖類のヒドロゲルを得ることができる。
【化６】
2020158617.tif 000008
【００２７】
多糖類ヒドロゲルの末端アルキニル基と有機アジド化合物のアジド基との反応においては、Cu+イオンの存在下におけるアルキン・アジド環化付加反応（CuAAC）を利用することができる。CuAAC自体は公知である。例えば、０．５〜５ｇ／ＬのCuBr2と還元剤（例えば０．５〜５ｇ／Ｌのアスコルビン酸）を含む水溶液に、上記アルキニル修飾化ヒドロゲル、上記有機アジド化合物、およびプロピルアミンを加えて１２時間以上反応させることによりCuAACを行って、R3基で修飾された多糖類のヒドロゲルを得ることができる。
【００２８】
多数の有機アジド化合物が当業者に知られており、本実施形態に使用することができる。また、当業者に知られる手法を用いて、様々な有機化合物にアジド基を導入し、本実施形態に使用することができる。例えば、Tanakaら（ACS Macro Lett., 2014, 3(10), pp.1074-1078）は、2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリド（DMC）を縮合剤として用いてオリゴ糖を直接アジド化する手法を記載している。
【００２９】
当業者の通常の知識に基づいて基質濃度、基質比率、および反応時間などを調節することにより、多糖類上に導入されたアルデヒド基の全てまたは一部にリンカー化合物を結合させ得ることが理解される。同様に、導入されたリンカー基の全てまたは一部にR3基を結合させ得ることが理解される。
【００３０】
別の側面において、本開示は、修飾された多糖類のヒドロゲルを用いて分子間相互作用をアッセイする方法を提供する。このアッセイにおいては、上記R3基を介した分子間相互作用を検出、定量化、および可視化することができる。
【００３１】
まず、修飾された多糖類のヒドロゲルを、２つ以上、容器中の水溶液に浮かべる。当業者に理解されるように、容器中の水溶液に塩化ナトリウムなどの溶質を溶解させ、ヒドロゲルにはより低濃度の水溶液（例えば純水）を保持させれば、比重の違いにより浮遊が促進される。本実施形態におけるヒドロゲルの大きさは特に限定されないが、相互作用の可視化という観点からは、その表面積が１５０ｍｍ２以上であることが好ましい。ヒドロゲルは、キューブ状など、平たい表面を有する形状が好ましい。これはヒドロゲル同士の接触面積を、ひいては、いちどに相互作用し得る修飾基数を増加させることができるからである。本実施形態におけるヒドロゲルは、例えば一辺が５ｍｍ以上である六面体であり得る。
【００３２】
上記２つ以上のヒドロゲルは、互いに同じ修飾を受けていてもよいし、互いに異なる修飾を受けていてもよい。前者の場合にはホモ分子間相互作用のアッセイになり、後者の場合にはヘテロ分子間相互作用のアッセイになり得る。特にヘテロ分子間相互作用のアッセイの場合には、肉眼で修飾基の種類を区別するために、修飾基の種類に対応させてヒドロゲルの形状および／または大きさを異ならせることが有用となり得る。修飾基の種類に対応させて異なる種類の多糖類のヒドロゲルを使用してもよい。あるいは、修飾基の種類に対応させて異なる色のヒドロゲルを使用することによって区別を行うことも可能である。保水性がヒドロゲルの特性の１つである故に、着色した水（例えば色素を含有した水）をヒドロゲルに含ませることによって異なる色のヒドロゲルを簡便に得ることができる。
【００３３】
容器中の水溶液を撹拌すると、撹拌により生じる液流により、浮遊したヒドロゲルが移動する。例えば、容器の底で回転式スターラーを回転させることによる撹拌では、遠心力により渦状の液流が生じ、浮遊したヒドロゲルは中央部分に集まってきて互いに接触するようになる。容器中に３個以上のヒドロゲルを浮かべる場合、「互いに接触する」というのは、全てのヒドロゲルが接触に関与していることは必ずしも意味しないが、少なくとも一対のヒドロゲルが接触に関与する。このように、少なくとも一対のヒドロゲル同士を一旦接触させることが肝要であって、撹拌以外の手段でこれを達成してもよい。
【００３４】
次に、ヒドロゲルを自然に分散させる。「自然に分散させる」とは、ヒドロゲル同士が接触状態に向かうような積極的な干渉をせずに、ヒドロゲルが浮遊して「分散するに任せる」ことを意味する。例えば、上述したスターラーの回転のような撹拌活動を停止させれば、液流が次第に収まって、中央に集まっていたヒドロゲルは自然に分散する。
【００３５】
一定の時間経過後に、ヒドロゲル同士の間の距離を測定することにより、上記修飾基を介した分子間相互作用のアッセイを行うことができる。すなわち、修飾されていないヒドロゲルでは、付加された分子間相互作用が存在しないため、上記「自然に分散させる」工程においてヒドロゲルは浮遊してランダムな位置に分散する。それに対し、ヒドロゲルが修飾されていてその修飾基の存在に依存する分子間相互作用が生じる場合には、上記「自然に分散させる」工程中もヒドロゲル同士の接触が維持される、あるいは分離が遅れる可能性がより高くなるため、アッセイ中の複数のヒドロゲル同士の間の距離を測定すると、全体的にその距離がより短いという結果を得ることができる。これは、分子間相互作用を、肉眼で観察できるレベルで検出・可視化できることを意味する。
【００３６】
アッセイに関わるヒドロゲルの数を増やして結果を集計すれば、距離の短さと分子間相互作用の強さとの相関が検出され得る。例えば、１つの容器に６個のヒドロゲルを浮かべてアッセイを行えば、６Ｃ２＝１５個の距離測定値が得られ、これらの平均値、中央値等を得ることができる。
【００３７】
ヒドロゲル間の距離を決定する具体的な方法は、当業者が適宜選択することができる。例えば、立方体形状のヒドロゲルを使用する場合には、その上面の中心点同士の距離を測定し得る。ヒドロゲルを自然に分散させ始めてから一定時間経過後に上から写真を撮影して、当業者に利用可能な画像解析ソフトウェア（例えばImage J）を用いて各ヒドロゲル間の距離を決定してもよい。
【００３８】
このアッセイ方法は、上記式（Ｉ）の構造によって糖鎖修飾された多糖類ヒドロゲルに限らず、修飾基による表面修飾を受けた多糖類ヒドロゲル一般に広く適用することができ、その修飾基を介した分子間相互作用のアッセイを行うことができる。
【００３９】
以下、実施例を示してより具体的に実施形態を説明するが、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【実施例】
【００４０】
実施例１：糖鎖修飾ナタデココの製造
市販のナタデココを脱イオン水で２４時間以上洗浄したものを修飾反応の出発材料とした。この出発材料は一辺約１．５ｃｍのキューブ状である。ナタデココはバクテリアセルロースであり、従ってグルコースユニットを主成分とする多糖類のヒドロゲルである。グルコースのようなジオール構造を有する単糖ユニットを含むものである限り、他の多糖類ヒドロゲルでも同様の修飾反応を適用できる。修飾反応のスキーム１を下記に示す。
【００４１】
【化７】
2020158617.tif 000009
【００４２】
スキーム１における反応条件：（ｉ）NaIO4、水、室温、１日間；（ｉｉ）プロパルギルアミン、DMSO、室温、２日間、その後NaBH4、DMSO、室温、１日間；（ｉｉｉ）下枠内に示すR基を有する有機アジド（Azide-Fluor-488（Rho）、LacN3、またはSLacN3）、CuBr2、アスコルビン酸、プロピルアミン、水、室温、１日間）。
【００４３】
すなわち、５００ｍＬ水中のナタデココ（NDC）に対して１２．０ｇの過ヨウ素酸ナトリウム（NaIO4）を加えて処理することによって、グルコースユニットの1,2-ジオール部位を酸化開裂させ、２つのアルデヒド基へと変換した。このようにして得られたアルデヒド基含有ナタデココをNDC-alと呼ぶ。アルデヒド基が導入できたことは、アルデヒド基に特有の赤外吸収（IR）ピーク（１７４６ｃｍ−１）の検出によって確認した。
【００４４】
次に、水をジメチルスルホキシド（DMSO）に置き換え、３００ｍＬのDMSO中のNDC-alに７５０μＬのプロパルギルアミン（HC≡CCH2NH2）を加えて反応させ、その後、０．６ｇのNaBH4を加えることにより、アルデヒド基の還元アミノ化を行った。これにより、末端アルキニルが導入されたNDCが得られた。これをNDC-ynと呼ぶ。NDC-ynのヒドロゲルを凍結乾燥させることで得たキセロゲルに対して元素分析を行ったところ、そのN/C比から、セルロース鎖を構成するグルコースユニットのうちおよそ５％にアルデヒド基が導入されていたことが解った。
【００４５】
別途、上述のTanakaらが開発した手法に従って、オリゴ糖のアジド化を行った。すなわち、１．５ｇの市販のラクトース（Lac）一水和物に対し、７．１ｍＬのN,N-ジイソプロピルエチルアミン、２．７１ｇのアジ化ナトリウム、およびイミダゾリウムクロリド系縮合剤として２．１ｇのDMCを含む水１６．５ｍＬを加えて１段階の処理を行うことによってラクトースを直接アジド化した。シアリルラクトース（SLac）については、４１ｍｇのSLacに対して、１６０μＬのトリエチルアミン、８２ｍｇのアジ化ナトリウム、および８３ｍｇの2-クロロ-1,3-ジメチル-1H-ベンズイミダゾール-3-イウムクロリド（CDMBI）を含む水１ｍＬを加えてアジド化を行った。結果としてアジド化ラクトース（LacN3）およびアジド化シアリルラクトース（SLacN3）が得られた。
【００４６】
これらのアジド化オリゴ糖と前述のNDC-ynとを、Cu+を触媒とするクリック反応によりカップリングすることで、Lac修飾NDC（NDC-Lac）およびSLac修飾NDC（NDC-SLac）を合成することができた。有機アジド化合物としてAzide-Fluor-488を用いた対照実験では、この色素による修飾のためナタデココが赤茶色に染まり、水で繰り返し洗浄してもこの色は除去されなかった。Azide-Fluor-488によるNDCまたはNDC-alへの修飾は起こらなかったため、修飾はアルキン特異的であることが確認された。これら修飾ナタデココは、肉眼では修飾前のナタデココと区別がつかないヒドロゲルの物性・形状を維持していた。
【００４７】
実施例２：修飾ナタデココを用いた分子間相互作用アッセイ
NDC-LacおよびNDC-SLacを用いて、それらのペンダント糖鎖を介した分子認識事象を検出できるか、また、分子間相互作用の定量的アッセイを提供できるかを検証するために、まず、各種レクチンを用いた実験を行った。
【００４８】
純水を保持させたNDC-Lacヒドロゲル４個を、フラスコ中のリン酸塩緩衝液（PBS、pH 7.2）に入れると液面に浮遊し、ランダムな位置に分散した。しかしながら、フラスコの底部にある撹拌子（スターラー）を約１０秒間回転させて渦を起こさせると、液流に乗ってヒドロゲルが液面の中央部分に集まり互いに接触するようになった。その後撹拌子を停止させると、液流も徐々に緩くなってやがて液が静止状態になった。レクチン非存在下で上記操作を行った場合には、NDC-Lacヒドロゲルは液面にほぼ均等に分散していた。
【００４９】
それに対し、末端β−ガラクトシドに特異的なレクチンであるRCA120を４２ｎＭの濃度で溶液に含ませて上記操作を行った場合には、NDC-Lac同士の特異的な会合が観察され、概してNDC-Lac間の距離が短かった（図１ａ）。一方、シアル酸特異的なレクチンであるMAL-IIを上記濃度で溶液に含ませて上記操作を行った場合にはこのような会合は観察されず、レクチン非存在条件と同様なヒドロゲルの均等な分散が見られた（図１ｂ）。なお、図１ｂの中央に写っているのが撹拌子である。
【００５０】
NDC-SLacヒドロゲルを用いた実験では全く逆の結果となり、MAL-IIの存在下ではNDC-SLac同士が特異的に会合し、RCA120の存在下ではこのような会合は観察されなかった。
【００５１】
このような実験を１５回ずつ繰り返し、それぞれ撹拌を停止してから一定時間経った後のフラスコを上から撮影し、ヒドロゲル間の距離をImage Jソフトウェアで測定した。これらの画像１枚につき４Ｃ２＝６個の距離データが得られるため、１５回の実験からは９０個の距離データが得られた。これらのデータを集計した結果を図１ｃに示している。なお、図１ｃ、図２、および図３ｃにおいて、括弧内は、それぞれの組合せにおけるヒドロゲル間距離の中央値を示している。図１ｃから、特異的レクチンの存在下では修飾ヒドロゲル間の距離が短くなっていることが明らかに見て取れる。
【００５２】
次に、レクチンを介さずに、NDC-Lac同士の間またはNDC-SLac同士の間に検出可能なCCIsが直接生じるかを評価するために、１００ｍＭのCaCl2、MgCl2、またはNaClを含むリン酸緩衝液中で、すなわち異なるカチオンの存在下において、糖鎖修飾NDC同士の会合を観察し測定した。その結果、NDC-Lac同士の会合はCa2+によって選択的に引き起こされることが明らかになった（図２上）。これは、Ca2+の存在によりLac-Lac相互作用が効果的に引き起こされることを示している。Na+およびMg2+は効果が比較的小さかったが（Mg2+の結果は図示していない）、カチオンを添加しない場合よりは会合を増加させた。NDC-SLac同士の会合に対するNa+またはCa2+の効果は、NDC-Lacに対する効果と比べると小さかった（図２下）。これらのカチオンよりもMg2+の方が、NDC-SLac同士の会合を促進させた（図示していない）。
【００５３】
次に、NDC-LacとNDC-SLacとの間のヘテロCCIsを調べた。この実験では、NDC-LacとNDC-SLacとを肉眼で区別できるように、前者を青色の食品用色素で（図３ａ、ｂの白丸）、後者を赤色の食品用色素で（図３ａ、ｂの黒丸）、それぞれ染色した上で、上記と同様のアッセイを行った。図３ａ、ｂは、それぞれCa2+の存在下、非存在下の実験を撮影した写真を示している。結果として、NDC-LacとNDC-SLacとの間の異種糖鎖間相互作用も、Ca2+の存在により促進されることが明らかになった（図３）。Mg2+およびNa+は効果が比較的小さかったが（Mg2+の結果は図示していない）、カチオンを添加しない場合よりは会合を増加させた。
【００５４】
糖鎖修飾された多糖類ヒドロゲルを用いる本研究は、発明者らの知る限り、高価な測定機器を使うことなく裸眼によるCCIsの評価を可能にした世界初の例であると共に、可視サイズの人工的物体の自己集積をCCIs によって達成した世界初の例でもある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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