(57)【要約】      （修正有）【課題】ＭＲＥ１１−ＲＡＤ５０−ＮＢＳ１（ＭＲＮ）複合体のエンドヌクレアーゼ活性を上昇させる技術を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、前記特定のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性を上昇させる活性を有するペプチド、を有効成分とする、ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＭＲＥ１１−ＲＡＤ５０−ＮＢＳ１（ＭＲＮ）複合体のエンドヌクレアーゼ活性を上昇させる活性を有するペプチド、
を有効成分とする、ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤。
【請求項２】
前記ペプチドのアミノ酸配列が、ＦＷＸＸＸＦ（配列番号２、ここで、Ｆはフェニルアラニンを表し、Ｗはトリプトファンを表し、Ｘは任意のアミノ酸を表す。）のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤。
【請求項３】
細胞に、請求項１又は２に記載のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤を導入する工程を含む、ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性上昇方法。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤を有効成分とする、ＭＲＮ複合体の機能不全に起因する疾患の予防又は治療剤。
【請求項５】
ＭＲＮ複合体の機能不全に起因する前記疾患が、毛細血管拡張性運動失調症（ＡＴ）、毛細血管拡張性運動失調症様疾患（ＡＴＬＤ）又はナイミーヘン症候群である、請求項４に記載の予防又は治療剤。
【請求項６】
被験物質の存在下で、ＣＴＰ１遺伝子に変異を有する細胞のＤＮＡ損傷感受性を測定する工程と、
前記ＤＮＡ損傷感受性が前記被験物質の非存在下と比較して低下した場合に、前記被験物質はＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤であると判断する工程と、を含み、
前記ＣＴＰ１遺伝子の変異が、（ｉ）分裂酵母のＣｔｐ１タンパク質のＣ末端の１５残基を欠失する変異に相当する変異、又は、（ｉｉ）分裂酵母のＣｔｐ１タンパク質の第２８７番目のフェニルアラニン、第２８８番目のトリプトファン又は第２９２番目のフェニルアラニンをそれぞれ異なるアミノ酸に置換する変異に相当する変異である、ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤が、ＭＲＮ複合体の機能不全に起因する疾患の予防又は治療剤である、請求項６に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＲＥ１１−ＲＡＤ５０−ＮＢＳ１（ＭＲＮ）複合体のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤及びその使用に関する。より詳細には、本発明は、ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤、ＭＲＮ複合体の機能不全に起因する疾患の予防又は治療剤、及び、ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
二本鎖ＤＮＡ切断（Ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ、ＤＳＢ）の修復機構には、主に、相同組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：ＨＲ）及び非相同末端再結合（ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ−ｊｏｉｎｉｎｇ：ＮＨＥＪ）が存在する。これらのうち、塩基配列のエラーが起こりにくいのがＨＲであり、主にＳ期及びＧ２期に姉妹染色分体を鋳型としてＤＳＢが修復される。また、Ｇ１期では主にＮＨＥＪによりＤＳＢが修復される。
【０００３】
ＨＲによるＤＳＢ修復機構では、まずＤＳＢにＭＲＮ複合体及びＡｔａｘｉａ−Ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ−Ｍｕｔａｔｅｄ（ＡＴＭ）タンパク質がリクルートされる。続いてＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性により、５’末端を有するＤＮＡ鎖にニックが導入される。続いて、ＭＲＮ複合体により、切断されたＤＮＡ鎖がＤＳＢに向かって分解される。その結果、３’末端が突出したＤＮＡ末端が形成される。
【０００４】
例えば、特許文献１には、ＭＲＮ複合体形成の調節因子をスクリーニングするための方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００７−５２５１６２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性を上昇させる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の態様を含む。
［１］配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＭＲＥ１１−ＲＡＤ５０−ＮＢＳ１（ＭＲＮ）複合体のエンドヌクレアーゼ活性を上昇させる活性を有するペプチド、を有効成分とする、ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤。
［２］前記ペプチドのアミノ酸配列が、ＦＷＸＸＸＦ（配列番号２、ここで、Ｆはフェニルアラニンを表し、Ｗはトリプトファンを表し、Ｘは任意のアミノ酸を表す。）のアミノ酸配列を含む、［１］に記載のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤。
［３］細胞に、［１］又は［２］に記載のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤を導入する工程を含む、ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性上昇方法。
［４］［１］又は［２］に記載のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤を有効成分とする、ＭＲＮ複合体の機能不全に起因する疾患の予防又は治療剤。
［５］ＭＲＮ複合体の機能不全に起因する前記疾患が、毛細血管拡張性運動失調症（ＡＴ）、毛細血管拡張性運動失調症様疾患（ＡＴＬＤ）又はナイミーヘン症候群である、［４］に記載の予防又は治療剤。
［６］被験物質の存在下で、ＣＴＰ１遺伝子に変異を有する細胞のＤＮＡ損傷感受性を測定する工程と、前記ＤＮＡ損傷感受性が前記被験物質の非存在下と比較して低下した場合に、前記被験物質はＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤であると判断する工程と、を含み、前記ＣＴＰ１遺伝子の変異が、（ｉ）分裂酵母のＣｔｐ１タンパク質のＣ末端の１５残基を欠失する変異に相当する変異、又は、（ｉｉ）分裂酵母のＣｔｐ１タンパク質の第２８７番目のフェニルアラニン、第２８８番目のトリプトファン又は第２９２番目のフェニルアラニンをそれぞれ異なるアミノ酸に置換する変異に相当する変異である、ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤のスクリーニング方法。
［７］前記ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤が、ＭＲＮ複合体の機能不全に起因する疾患の予防又は治療剤である、［６］に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性を上昇させる技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実験例１で使用した二本鎖ＤＮＡ断片の構造を示す図である。
【図２】実験例１におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図３】（ａ）〜（ｃ）は、実験例２の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［遺伝子名及びタンパク質名の表記］
本明細書において、ヒト遺伝子及びヒトタンパク質は、大文字のアルファベットで表すものとする。また、マウス遺伝子は、先頭文字を大文字のアルファベットで、それ以降を小文字のアルファベットで表すものとする。また、マウスタンパク質は大文字のアルファベットで表すものとする。また、酵母遺伝子は大文字のアルファベットで表し、酵母タンパク質は先頭文字を大文字のアルファベットで、それ以降を小文字のアルファベットで表すものとする。しかしながら、場合により、ヒト遺伝子、マウス遺伝子、その他の種の遺伝子を厳密に区別せずに大文字のアルファベットで表す場合がある。また、ヒトタンパク質、マウスタンパク質、その他の種のタンパク質を厳密に区別せずに大文字のアルファベットで表す場合がある。
【００１１】
［ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤］
１実施形態において、本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とする、ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤を提供する。本明細書において、「有効成分とする」とは、主要な活性成分として含むことを意味する。
【００１２】
実施例において後述するように、発明者らは、本実施形態のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤をＭＲＮ複合体に作用させることにより、ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性を上昇させることができることを明らかにした。
【００１３】
配列番号１に記載のアミノ酸配列は、分裂酵母のＣｔｐ１タンパク質のＣ末端から１５残基のアミノ酸配列に対応する。分裂酵母のＣｔｐ１タンパク質のアミノ酸配列を配列番号３に示す。Ｃｔｐ１タンパク質のＣ末端から１５残基のアミノ酸配列は、酵母からヒトに至るまでよく保存されている。
【００１４】
ヒトＭＲＥ１１タンパク質のアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿００５５８１．２、ＮＰ＿００５５８２．１、ＮＰ＿００１３１７２７６．１等である。マウスＭＲＥ１１タンパク質のアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿０６１２０６．１等である。出芽酵母ＭＲＥ１１タンパク質のアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿０１３９５１．１等である。分裂酵母ＭＲＥ１１タンパク質のアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿５９２９３５．１等である。
【００１５】
ヒトＲＡＤ５０タンパク質のアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿００５７２３．２等である。マウスＲＡＤ５０タンパク質のアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿０３３０３８．２等である。出芽酵母ＲＡＤ５０タンパク質のアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿０１４１４９．１等である。分裂酵母ＭＲＥ１１タンパク質のアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿００１３４２９６８．１等である。
【００１６】
ヒトＮＢＳ１タンパク質のアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿００２４７６．２、ＮＰ＿００１０１９８５９．１等である。マウスＮＢＳ１タンパク質のアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿０３８７８０．３等である。出芽酵母ＮＢＳ１タンパク質（Ｘｒｓ２と呼ばれている。）のアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿０１０６５７．３等である。分裂酵母ＮＢＳ１タンパク質のアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿００１０１８８２３．１等である。
【００１７】
ヒトＣＴＰ１タンパク質のアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿００２８８５．１、ＮＰ＿９７６０３６．１、ＮＰ＿９７６０３７．１等である。マウスＣＴＰ１タンパク質のアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿００１０７４６９２．１等である。出芽酵母ＣＴＰ１タンパク質（ＳＡＥ２と呼ばれている。）のアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿００９８５０．１等である。分裂酵母ＣＴＰ１タンパク質のアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿５８８１５９．２等である。
【００１８】
本実施形態のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤において、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性を上昇させる活性を有している限り変異を有していてもよい。すなわち、本実施形態のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤は、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とするものであってもよい。ここで、１若しくは数個とは、例えば１〜５個であってもよく、１〜４個であってもよく、１〜３個であってもよく、１〜２個であってもよい。
【００１９】
また、実施例において後述するように、発明者らは、Ｃｔｐ１タンパク質のＣ末端に存在するＦＷＸＸＸＦ（配列番号２、ここで、Ｆはフェニルアラニンを表し、Ｗはトリプトファンを表し、Ｘは任意のアミノ酸を表す。）のアミノ酸配列が、Ｃｔｐ１タンパク質の機能に重要であることを明らかにした。
【００２０】
したがって、本実施形態のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤において、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して変異を有するペプチドは、ＦＷＸＸＸＦ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【００２１】
本実施形態のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤において、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して変異を有するペプチドは、架橋性基を有していてもよい。
【００２２】
本実施形態のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤が架橋性基を有している場合、ＭＲＮ複合体と接触させた後、ＭＲＮ複合体と架橋することが可能になる。この結果、本実施形態のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤を、ＭＲＮ複合体の立体構造上の適切な位置に固定することが可能になり、より少ないエンドヌクレアーゼ活性上昇剤で、ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性を上昇させることが可能になる。
【００２３】
架橋性基としては、例えば紫外線照射により架橋可能な基が挙げられる。より具体的には、非天然型アミノ酸である、パラベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐａ）、トリフルオロメチル・ジアジニリル・フェニルアラニン（ｔｍｄＰｈｅ）、アジド基を有するアジドフェニルアラニン等が挙げられる。ｐＢｐａは約３６５ｎｍの光照射によりラジカルを発生し、近隣の炭素原子と共有結合を形成する。ｔｍｄＰｈｅのジアリジン基も約３６５ｎｍの光照射によりカルベンを発生して共有結合を形成する。また、アジド基も約３６５ｎｍの波長で架橋することができる。
【００２４】
すなわち、本実施形態のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤において、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して変異を有するペプチドは、上記の非天然型アミノ酸を含んでいてもよい。架橋性基を有するアミノ酸残基の位置は、ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性を上昇させる活性を有している限り特に限定されず、例えば、５’末端であってもよいし、３’末端であってもよいし、５’末端又は３’末端以外の位置であってもよい。配列番号４に、架橋性基を有するエンドヌクレアーゼ活性上昇剤のアミノ酸配列の例を示す。配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの５’末端にパラベンゾイルフェニルアラニン残基を付加したものである。
【００２５】
［ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性上昇方法］
１実施形態において、本発明は、細胞に、上述したエンドヌクレアーゼ活性上昇剤を導入する工程を含む、ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性上昇方法を提供する。
【００２６】
上述したように、エンドヌクレアーゼ活性上昇剤を細胞に導入することにより、細胞のＤＮＡ損傷修復能を向上させることができる。したがって、本実施形態の方法は、細胞のＤＮＡ損傷修復能の向上方法であるということもできる。
【００２７】
ところで、近年、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を用いたゲノム編集が盛んに行われている。ゲノム編集は、Ｃａｓタンパク質により形成されたＤＳＢを修復する過程を利用して行われる。そこで、細胞のＤＮＡ損傷修復能を向上させることにより、ゲノム編集効率を向上させることができる。
【００２８】
したがって、上述したエンドヌクレアーゼ活性上昇剤は、ゲノム編集効率の向上剤であるということもできる。また、本実施形態の方法は、ゲノム編集効率の向上方法であるということもできる。
【００２９】
より具体的には、本発明は、細胞に、ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡの発現ベクター；Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓタンパク質の発現ベクター又はＣａｓタンパク質のｍＲＮＡ；上述したエンドヌクレアーゼ活性上昇剤；任意選択で標的部位に相同な塩基配列を有するＤＮＡ断片、を導入する工程を含む、ゲノム編集方法を提供する。本実施形態のゲノム編集方法によれば、高効率でゲノム編集を行うことができる。
【００３０】
Ｃａｓタンパク質としては、Ｃａｓ９、Ｃａｓ３等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３１】
［ＭＲＮ複合体の機能不全に起因する疾患の予防又は治療剤］
１実施形態において、本発明は、上述したエンドヌクレアーゼ活性上昇剤を有効成分とする、ＭＲＮ複合体の機能不全に起因する疾患の予防又は治療剤を提供する。
【００３２】
実施例において後述するように、発明者らは、上述したエンドヌクレアーゼ活性上昇剤をＭＲＮ複合体に作用させることにより、ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性を上昇させることができることを明らかにした。
【００３３】
したがって、上述したエンドヌクレアーゼ活性上昇剤は、ＭＲＮ複合体の機能不全に起因する疾患の予防又は治療剤として用いることができる。すなわち、上述したエンドヌクレアーゼ活性上昇剤を、機能不全に陥ったＭＲＮ複合体に作用させることにより、ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性を上昇させ、ＭＲＮ複合体の機能を改善させることができる。
【００３４】
ＭＲＮ複合体の機能不全に起因する疾患としては、毛細血管拡張性運動失調症（ＡＴ）、毛細血管拡張性運動失調症様疾患（ＡＴＬＤ）、ナイミーヘン症候群等が挙げられる。
【００３５】
ＡＴは、Ａｔａｘｉａ−Ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ−Ｍｕｔａｔｅｄ（ＡＴＭ）遺伝子の変異による疾患であり、眼球運動の異常、皮膚の毛細血管拡張症、免疫不全、早期老化を伴う進行性の神経変性疾患である。ＡＴＭタンパク質はＭＲＮ複合体と物理的に相互作用することが知られている。
【００３６】
ＡＴＬＤは、ＭＲＥ１１遺伝子の変異による疾患であり、症状はＡＴによく似ている。しかし、ＡＴとは異なり、毛細血管拡張や免疫不全は見られない。
【００３７】
ナイミーヘン症候群は、ＮＢＳ１遺伝子の変異による疾患であり、小頭症、成長遅滞、免疫不全、放射線感受性、癌性質を特徴とする常染色体劣性遺伝疾患である。
【００３８】
これらの疾患は、ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性を上昇させることにより予防又は治療できる可能性がある。
【００３９】
本実施形態に係る予防又は治療剤において、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して変異を有するペプチドは、フリー体であってもよいし、薬理学的に許容される塩であってもよいし、溶媒和物であってもよいし、薬理学的に許容される塩の溶媒和物であってもよい。
【００４０】
薬理学的に許容される塩としては、トリフルオロ酢酸塩、塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、燐酸塩、硝酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、酢酸塩、プロパン酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、グルタル酸塩、アジピン酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩等が挙げられる。
【００４１】
また、溶媒和物としては、薬学的に許容される溶媒和物であれば特に制限されず、例えば、水和物、有機溶媒和物等が挙げられる。
【００４２】
本実施形態の予防又は治療剤において、上述したエンドヌクレアーゼ活性上昇剤は、薬学的に許容される担体と混合された医薬組成物として製剤化されていることが好ましい。医薬組成物は、経口的に使用される剤型であってもよく、非経口的に使用される剤型であってもよい。経口的に使用される剤型としては、例えば錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等が挙げられる。非経口的に使用される剤型としては、例えば注射剤、吸入剤、坐剤、貼付剤等が挙げられる。
【００４３】
薬学的に許容される担体としては、例えば、精製水、酸化チタン、カルナウバロウ、合成スクワラン、クロタミトン、ゼラチン等の基材；エチルセルロース、グリセリン、メタクリル酸コポリマーＳ等の結合剤；結晶セルロース、クロスカルメロースナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、ヒプロメロース等の賦形剤；アラビアゴム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、ポビドン、ベンジルアルコール、酢酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム等の安定剤；マクロゴール４００、マクロゴール６０００等の可塑剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤等が挙げられる。
【００４４】
医薬組成物は添加剤を更に含んでいてもよい。添加剤としては、ショ糖、乳糖、サッカリン等の甘味剤；ペパーミント、ｌ−メントール等の香料；安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェノール等の防腐剤等が挙げられる。
【００４５】
医薬組成物は、上記の担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
【００４６】
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等のほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、又は経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、患者の症状、投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
【００４７】
上述したエンドヌクレアーゼ活性上昇剤の投与量は、ペプチドの種類、患者の症状等により変動するが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１〜５００ｍｇ、例えば約１．０〜２５０ｍｇ、例えば約１．０〜１００ｍｇ程度を、１日１回、又は数回に分けて投与することが適切であると考えられる。
【００４８】
非経口的に投与する場合、その投与量は、ペプチドの種類、患者の症状、投与方法等により変動するが、全身投与を行う場合は、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１〜５００ｍｇ、例えば約１．０〜２５０ｍｇ、例えば約１．０〜１００ｍｇ程度を、１日１回、又は数回に分けて投与することが適切であると考えられる。局所投与を行う場合は、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．００１〜１０ｍｇ、例えば約０．０１〜５ｍｇ、例えば約０．０２〜２ｍｇ程度を、１日１回、又は数回に分けて投与することが適切であると考えられる。
【００４９】
［ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤のスクリーニング方法］
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、ＣＴＰ１遺伝子に変異を有する細胞のＤＮＡ損傷感受性を測定する工程と、前記ＤＮＡ損傷感受性が前記被験物質の非存在下と比較して低下した場合に、前記被験物質はＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤であると判断する工程と、を含み、前記ＣＴＰ１遺伝子の変異が、（ｉ）分裂酵母のＣｔｐ１タンパク質のＣ末端の１５残基を欠失する変異に相当する変異、又は、（ｉｉ）分裂酵母のＣｔｐ１タンパク質の第２８７番目のフェニルアラニン、第２８８番目のトリプトファン又は第２９２番目のフェニルアラニンをそれぞれ異なるアミノ酸に置換する変異に相当する変異である、ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤のスクリーニング方法を提供する。
【００５０】
本実施形態のスクリーニング方法において、被験物質としては特に制限されず、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ、ペプチドライブラリ等が挙げられる。
【００５１】
細胞としては、ＤＮＡ損傷修復過程においてＭＲＮ複合体が機能する種の細胞であれば特に制限されず、酵母細胞、マウス細胞、ヒト細胞等が挙げられる。ＣＴＰ１遺伝子に変異を有する細胞としては、これらの細胞においてＣＴＰ１遺伝子に変異を導入した細胞を用いることができる。
【００５２】
ここで、実施例において後述するように、（ｉ）分裂酵母のＣｔｐ１タンパク質のＣ末端の１５残基を欠失する変異に相当する変異、及び、（ｉｉ）分裂酵母のＣｔｐ１タンパク質の第２８７番目のフェニルアラニン、第２８８番目のトリプトファン又は第２９２番目のフェニルアラニンをそれぞれ異なるアミノ酸に置換する変異に相当する変異は、ＣＴＰ１タンパク質が機能しなくなる変異、すなわち、ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性を上昇させる活性を低下又は欠失させる変異である。
【００５３】
上記（ｉｉ）の変異としては、例えば、Ｆ２８７Ａ、Ｗ２８８Ａ、Ｆ２９２Ａ等が挙げられる。これらの変異はいずれか１種の変異であってもよいし、２種以上の変異の組み合わせであってもよい。
【００５４】
また、「相当する変異」とは、上記細胞が分裂酵母以外の種の細胞である場合であっても、分裂酵母の上記アミノ酸に対応する位置のアミノ酸に変異が導入されることを意味する。異なる種のＣＴＰタンパク質のアミノ酸配列において、どのアミノ酸が互いに相当するかは、例えばＣｌｕｓｔａｌＷ等のプログラムを用いて特定することができる。
【００５５】
被験物質の存在下で、ＣＴＰ１遺伝子に変異を有する細胞のＤＮＡ損傷感受性を測定する工程は、特に限定されず、例えば、細胞にＤＮＡ損傷刺激を与えてその生存率を測定すること等により行うことができる。ＤＮＡ損傷刺激としては、例えば、紫外線照射、抗癌剤の添加等が挙げられる。
【００５６】
被験物質の存在下における細胞のＤＮＡ損傷感受性（生存率）は、例えば下記式（１）により算出することができる。
被験物質の存在下における生存率（％）＝（被験物質の存在下、ＤＮＡ損傷刺激の存在下における生細胞数）／（被験物質の存在下、ＤＮＡ損傷刺激の非存在下における生細胞数）×１００  …（１）
【００５７】
また、被験物質の非存在下における細胞のＤＮＡ損傷感受性（生存率）は、例えば下記式（２）により算出することができる。
被験物質の非存在下における生存率（％）＝（被験物質の非存在下、ＤＮＡ損傷刺激の存在下における生細胞数）／（被験物質の非存在下、ＤＮＡ損傷刺激の非存在下における生細胞数）×１００  …（２）
【００５８】
その結果、被験物質の存在下における細胞のＤＮＡ損傷感受性が、被験物質の非存在下における細胞のＤＮＡ損傷感受性と比較して低下した場合に、被験物質はＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤であると判断することができる。
【００５９】
例えば、被験物質の非存在下における生存率と比較して、被験物質の存在下における生存率が上昇した場合、被験物質の存在下では、被験物質の非存在下と比較して細胞のＤＮＡ損傷感受性が低下したと判断することができる。
【００６０】
被験物質の非存在下における細胞のＤＮＡ損傷感受性は、被験物質の存在下における細胞のＤＮＡ損傷感受性と同時に測定して比較してもよいし、別々に測定して比較してもよい。あるいは、被験物質の存在下における細胞のＤＮＡ損傷感受性を、予め測定された、被験物質の非存在下における細胞のＤＮＡ損傷感受性と比較してもよい。
【００６１】
上述したように、ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性上昇剤は、ＭＲＮ複合体の機能不全に起因する疾患の予防又は治療剤として使用することができる。
【００６２】
したがって、本実施形態のスクリーニング方法は、ＭＲＮ複合体の機能不全に起因する疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法であるということもできる。
【００６３】
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性を上昇させる活性を有するペプチドの有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、ＭＲＮ複合体の機能不全に起因する疾患の予防又は治療方法を提供する。
【００６４】
１実施形態において、本発明は、ＭＲＮ複合体の機能不全に起因する疾患の予防又は治療のための、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性を上昇させる活性を有するペプチドを提供する。
【００６５】
１実施形態において、本発明は、ＭＲＮ複合体の機能不全に起因する疾患の予防又は治療剤を製造するための、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性を上昇させる活性を有するペプチドの使用を提供する。
【００６６】
上記各実施形態において、ＭＲＮ複合体の機能不全に起因する疾患、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、１若しくは数個等については、上述したものと同様である。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６８】
［実験例１］
（ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性の測定）
まず、ＭＲＮ複合体の基質となる二本鎖ＤＮＡ断片を調製した。具体的には、配列番号５及び６に示すＤＮＡ断片同士をアニーリングして、図１に示す二本鎖ＤＮＡ断片を調製し、ＭＲＮ複合体の基質に用いた。図１中、「ｂ」はビオチン標識されていることを表し、「ＴＡＭ」はＴＡＭＲＡ標識されていることを表す。ビオチン標識は、エキソヌクレアーゼ活性によるＤＮＡの分解を阻害し、ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性のみを検出するために行った。また、ＴＭＡＲＡ標識は、切断されたＤＮＡ断片を検出するために行った。
【００６９】
続いて、表１に示す組成の反応液を調製し、図１に示す二本鎖ＤＮＡ断片に、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「ＣＴ１５」という。）、又は、配列番号７に示すアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「ＣＴ１５−５Ａ」という。）を様々な濃度でＭＲＮ複合体に作用させた。表１に示すように、反応液にＭＲＥ１１−ＲＡＤ５０複合体及びＦＬＡＧ標識したＮｂｓ１（Ｎｂｓ１−ＦＬＡＧ）を添加することにより、反応液内でＭＲＮ複合体を形成させた。
【００７０】
続いて、３０℃で６０分間インキュベートして反応させた後、ＥＤＴＡ、ＳＤＳ、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを含む溶液を加え、除タンパク質反応（５０℃、３０分）を行った。続いて、各サンプルに対して、ホルムアミドを最終濃度８０％となるように加えて９８℃で加熱することによりＤＮＡを１本鎖にし、８Ｍ尿素及び１０％ホルムアミドを含むポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動（ＰＡＧＥ）で分離した。続いて、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ＦＬＡ９５００（ＧＥヘルスケア社）を用いて、ＰＡＧＥ後のゲルのＴＭＡＲＡの蛍光を検出した。
【００７１】
【表１】
2020176068.tif 000002
【００７２】
下記表２に、ＣＴ１５ペプチド及びＣＴ１５−５Ａペプチドのアミノ酸配列を示す。ＣＴ１５−５Ａペプチドは、ＣＴ１５ペプチドのＮ末端側から、５、８、９、１０、１３番目のアミノ酸をそれぞれアラニンに置換したペプチドである。
【００７３】
【表２】
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【００７４】
図２は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。図２中、「ＭＲＮ」はＭＲＮ複合体を表し、「−」は添加しなかったことを表し、「＋」は添加したことを表す。
【００７５】
その結果、ＭＲＮ複合体にＣＴ１５ペプチドを添加すると、ＣＴ１５ペプチドの添加量が増加するにしたがって、消化されたＤＮＡ断片の増加が検出された。一方、ＭＲＮ複合体にＣＴ１５−５Ａペプチドを添加しても、消化されたＤＮＡ断片は検出されなかった。
【００７６】
この結果から、ＣＴ１５ペプチドの添加により、ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性が上昇することが明らかとなった。また、ＣＴ１５ペプチドによるＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性の上昇には、ＣＴ１５ペプチドのＮ末端側から５、８、９、１０、１３番目のアミノ酸のいずれかが重要であることが明らかとなった。
【００７７】
［実験例２］
（ＣＴＰ１遺伝子変異株の作製）
まず、Ｕｒａ３＋遺伝子をマーカーとした遺伝子破壊を行い、分裂酵母９７２株由来のＣＴＰ１遺伝子破壊株（遺伝子型：ｃｔｐ１ｄｅｌｔａ：：ｕｒａ４＋  ｈ−  ｓｍｔ０  ａｄｅ６−７０４  ｌｅｕ１−３２  ｕｒａ４−Ｄ１８  ｈｉｓ−Ｄ１  ａｒｇ−Ｄ１）を作製した。続いて、作製したＣＴＰ１遺伝子破壊株に、下記表３に示すＣＴＰ１遺伝子の発現ベクターをそれぞれ導入し、ＣＴＰ１遺伝子変異株を作製した。発現ベクターとしては、ｐＲＥＰ８１を使用した。表３中、「ｗｔ」は野生型であることを示し、「ｅｍｐｔｙ」はプラスミドＤＮＡのみを導入したことを示す。
【００７８】
【表３】
2020176068.tif 000004
【００７９】
続いて、各ＣＴＰ１遺伝子変異株を液体完全培地で一晩培養し、１０倍毎の希釈系列を作製した。続いて、通常の寒天培地、終濃度１μＭのカンプトテシンを含む寒天培地、及び、終濃度５μＭのカンプトテシンを含む寒天培地に、各ＣＴＰ１遺伝子変異株の希釈系列をスポットした。続いて、３０℃で４〜５日間培養し、スポットを観察した。
【００８０】
ここで、カンプトテシンは抗癌剤の一種である。カンプトテシンはトポイソメラーゼＩ−ＤＮＡ複合体と結合して安定化する。その結果、ＤＮＡ複製が阻害され、カンプトテシン−トポイソメラーゼＩ−ＤＮＡ複合体が除去されないと、細胞死に至る。これに対し、ＭＲＮ−Ｃｔｐ１複合体が機能すれば、カンプトテシン−トポイソメラーゼＩ−ＤＮＡ複合体を除去することができ、菌はコロニーを形成することができる。一方、ＭＲＮ−Ｃｔｐ１複合体が機能しないと、菌はコロニーを形成することができない。
【００８１】
図３（ａ）〜（ｃ）は、実験結果を示す写真である。図３（ａ）は通常の寒天培地（カンプトテシンを含まない寒天培地）の結果であり、図３（ｂ）は終濃度１μＭのカンプトテシンを含む寒天培地の結果であり、図３（ｃ）は終濃度５μＭのカンプトテシンを含む寒天培地の結果である。図３（ａ）〜（ｃ）中、「Ｃｐｔ」はカンプトテシンを表す。
【００８２】
その結果、Ｃｔｐ１（ＦＷＥ−５Ａ）変異株、Ｃｔｐ１（ＦＷＥ−３Ａ）変異株、Ｃｔｐ１（Ｗ２８８Ａ）変異株、Ｃｔｐ１（Ｆ２８７Ａ）変異株は、終濃度５μＭのカンプトテシンの存在下でコロニーを形成することができないことが明らかとなった。また、Ｃｔｐ１（Ｆ２９２Ａ）変異株は、終濃度５μＭのカンプトテシンの存在下において、コロニー形成量が顕著に減少したことが明らかとなった。
【００８３】
以上の結果から、Ｃｔｐ１タンパク質のＦ２８７、Ｗ２８８、Ｆ２９２の各アミノ酸残基がＣｔｐ１タンパク質の機能に特に重要であることが明らかとなった。すなわち、Ｃｔｐ１タンパク質のＣ末端の近傍に、ＦＷＸＸＸＦ（配列番号２、ここで、Ｆはフェニルアラニンを表し、Ｗはトリプトファンを表し、Ｘは任意のアミノ酸を表す。）のアミノ酸配列が存在することが、Ｃｔｐ１タンパク質の機能に重要であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明によれば、ＭＲＮ複合体のエンドヌクレアーゼ活性を上昇させる技術を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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