(57)【要約】      （修正有）【課題】皮膚美白活性を有するペプチドを提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列のＮ末端にフェルラ酸が結合したペプチドからなる皮膚美白活性を有するペプチド。【効果】本発明のペプチドは、メラニン生成を抑制し、チロシナーゼの活性を抑制し、メラニン形成と関連した因子の発現を抑制し、メラノソーム移動を抑制することによって、皮膚美白に対して優れた効果を示す。本発明のペプチドは、小型であるために、皮膚透過度が非常に優れる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚美白活性を有するペプチド及びそれを有効成分として含む皮膚美白用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
形質転換増殖因子β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ  １、ＴＧＦ−β１）は、多種の細胞で成長、分化及び死滅調節を通じて組織の発達や恒常性を保持させる因子である。形質転換増殖因子β１は、メラニン細胞でメラニン生成に対する抑制効果を示すと知られている（非特許文献１）。
【０００３】
形質転換増殖因子β１のこのような機能は、メラニン生成に重要な酵素であるチロシナーゼの分解を増加させて表わす。また、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連遺伝子−１、チロシナーゼ関連遺伝子−２のようなメラニン生成関与酵素の発現を調節する転写因子であるＭＩＴＦ（Ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）の分解を促進させるＥＲＫ１／２活性を促進させて、メラニン形成抑制を表わすこともある（非特許文献２）。
【０００４】
本発明者らは、先行研究を通じて形質転換増殖因子β１の一部アミノ酸配列を基にしたペプチドを開発し、メラニン細胞での美白効能を検証した。以後、そのペプチドの機能を極大化するために、多様な化学合成物との結合を通じる構造改善研究を進行し、効能スクリーニング過程を通じて従来のペプチドよりも美白効能が向上した本発明の素材を探し出した。
【０００５】
本明細書の全般に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照して挿入されて、本発明が属する技術分野のレベル及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  Ｖｏｌ．２７２，Ｎｏ．７，Ｉｓｓｕｅ  ｏｆ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １４，ｐｐ．３９６７−３９７２，１９９７
【非特許文献２】Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ８４：１１５５−１２２８，２００４；１０．１１５２／ｐｈｙｓｒｅｖ．０００４４．２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、優れた皮膚美白活性を有するペプチドを開発するために鋭意研究した。その結果、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端にフェルラ酸が結合したペプチドからなるペプチドがメラニン生成を抑制し、チロシナーゼの活性を抑制し、メラニン形成と関連した因子の発現を抑制することによって、皮膚美白に対して優れた効果を示すということを究明することによって、本発明を完成するに至った。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端にフェルラ酸が結合したペプチドからなる皮膚美白活性を有するペプチドを提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、前記ペプチドを含む皮膚美白用組成物を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、前記ペプチドの皮膚美白用途を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、前記ペプチドを用いた皮膚美白方法を提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってより明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、優れた皮膚美白活性を有するペプチドを開発するために鋭意研究した結果、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端にフェルラ酸が結合したペプチドからなるペプチドがメラニン生成を抑制し、チロシナーゼの活性を抑制し、メラニン形成と関連した因子の発現を抑制し、メラノソーム移動を抑制することによって、皮膚美白に対して優れた効果を示すということを究明した。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、皮膚美白活性を有するペプチド及びそれを有効成分として含む皮膚美白用組成物に関するものであって、前記ペプチドは、メラニン生成を抑制し、チロシナーゼの活性を抑制し、メラニン形成と関連した因子の発現を抑制し、メラノソーム移動を抑制することによって、皮膚美白に対して優れた効果を示す。また、前記ペプチドは、小型であるために、皮膚透過度が非常に優れ、優れた活性及び安定性によって化粧品に非常に有利に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一実施例によるペプチドの細胞毒性を評価した結果を示すグラフである。
【図２ａ】本発明の一実施例によるペプチドを黒色腫細胞株（Ｂ１６Ｆ１０）に処理し、メラニン生成量を測定した結果を示すグラフである。
【図２ｂ】本発明の一実施例によるペプチドを黒色腫細胞株（Ｂ１６Ｆ１０）に処理し、メラニン生成量を測定した結果を示す写真である。
【図３】本発明の一実施例によるペプチドを黒色腫細胞株（Ｂ１６Ｆ１０）に処理し、光学顕微鏡を通じてメラニン生成を観察した結果を示す写真である。
【図４】本発明の一実施例によるペプチドを黒色腫細胞株（Ｂ１６Ｆ１０）に処理し、細胞内チロシナーゼ活性を測定した結果を示すグラフである。
【図５】本発明の一実施例によるペプチドを黒色腫細胞株（Ｂ１６Ｆ１０）に処理し、チロシナーゼ抗体を用いて細胞内チロシナーゼ発現程度を確認した結果を示す写真である。
【図６】本発明の一実施例によるペプチドを黒色腫細胞株（Ｂ１６Ｆ１０）に処理し、メラニン形成因子の遺伝子発現変化をＰＣＲで確認した結果を示す写真である。
【図７】本発明の一実施例によるペプチドを黒色腫細胞株（Ｂ１６Ｆ１０）に処理し、メラニン形成因子のタンパク質に特異的な抗体を用いて、これらの発現変化を確認した結果を示す写真である。
【図８】本発明の一実施例によるペプチドを黒色腫細胞株（Ｂ１６Ｆ１０）に処理し、メラニン形成因子信号伝達物質であるＣＲＥＢのリン酸化程度を特異的な抗体を用いて確認した結果を示す写真である。
【図９】本発明の一実施例によるペプチドをヒト角質形成細胞株（ＨａＣａｔ）に処理し、角質形成細胞の活性及び食菌作用に関連した遺伝子発現変化をＰＣＲで確認した結果を示す写真である。
【図１０】本発明の一実施例によるペプチドをヒト角質形成細胞株（ＨａＣａｔ）に処理し、角質形成細胞へのメラノソーム流入抑制を確認した結果を示すグラフである。
【図１１】本発明の一実施例によるペプチドをヒト角質形成細胞株（ＨａＣａｔ）に処理し、角質形成細胞のメラノソーム食菌作用抑制を顕微鏡を通じて確認した結果を示す写真である。
【図１２】本発明の一実施例によってメラノソーム流入抑制効果を観察するために、蛍光−結合生体粒子（ｂｉｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を用いて角質細胞食菌作用アッセイを行った結果を示す写真である。
【図１３】本発明の一実施例によるペプチドをヒト角質形成細胞株（ＨａＣａｔ）に処理し、角質形成細胞でのメラノソーム分解能を確認した結果を示すグラフである。
【図１４ａ】本発明の一実施例によるペプチドをリポソーム化してＣ５７ＢＬ／６マウスのしっぽに塗布し、生体内美白効能を観察した結果を示す写真である。
【図１４ｂ】本発明の一実施例によるペプチドをリポソーム化してＣ５７ＢＬ／６マウスのしっぽに塗布し、生体内美白効能を観察した結果（比較例）を示す写真である。
【図１４ｃ】本発明の一実施例によるペプチドをリポソーム化してＣ５７ＢＬ／６マウスのしっぽに塗布し、生体内美白効能を観察した結果（実施例）を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
【００１７】
本発明の一態様は、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端にフェルラ酸が結合したペプチドからなる皮膚美白活性を有するペプチドに関するものである。
【００１８】
本発明の一具現例によれば、前記ペプチドは、メラニン生成を抑制し、チロシナーゼの活性及び発現を抑制し、メラニン形成に関与する因子であるＭＩＴＦ、ＰＡＲ２、ＴＲＰ１の発現を抑制し、ペプチドは、メラニン形成に関与する信号伝達物質であるＣＲＥＢのリン酸化を抑制し、皮膚美白に関与するメラノソーム移動を抑制するだけではなく、メラノソーム分解を促進する。このような結果は、本発明のペプチドが皮膚美白に非常に優れた効能を有するということを意味する。
【００１９】
本明細書で使われる用語“ペプチド”は、ペプチド結合によってアミノ酸残基が互いに結合されて形成された線形の分子を意味する。本発明のペプチドは、当業者に公知の化学的合成方法、特に、固相合成技術（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−５４（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ．ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．：Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，１１１（１９８４））または液相合成技術（米国登録特許第５，５１６，８９１号）によって製造可能である。
【００２０】
本発明のペプチドは、アミノ酸配列の一部位を選定し、その活性を増加させるために、Ｎ末端及び／またはＣ末端に変形を誘導することができる。
【００２１】
例えば、前記ペプチドのＣ末端は、ヒドロキシ基（−ＯＨ）、アミノ基（−ＮＨ２）、アザイド（−ＮＨＮＨ２）などに変形されたものであるが、これらに限定されるものではない。また、前記ペプチドのＮ末端は、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で構成された群から選択される保護基が結合されたものであるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
このようなＮ末端及び／またはＣ末端の変形を通じて、本発明のペプチドの半減期を増加させて、生体内投与時に高い半減期を有し、ペプチドの安定性を大きく改善する作用を行う。
【００２３】
本明細書で使われる用語“安定性”は、“インビボ”安定性だけではなく、保存安定性（例えば、常温保存安定性）も意味する。前述した保護基は、生体内のタンパク質切断酵素の攻撃から本発明のペプチドを保護する作用を行う。
【００２４】
本発明の他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端にフェルラ酸が結合したペプチドからなるペプチドを有効成分として含む皮膚美白用組成物に関するものである。
【００２５】
前記皮膚美白用組成物は、前述した本発明のペプチドを有効成分として含むために、両者間の共通内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【００２６】
本発明の皮膚美白用組成物は、化粧品組成物として製造可能である。
【００２７】
前記化粧品組成物は、当業者にとって、通常製造される如何なる剤型にも製造可能であり、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤−含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション、及びスプレーなどに剤型化され、より詳細には、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレー及び／またはパウダーの剤型として製造可能であるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
前記化粧品組成物の剤型が、ペースト、クリームまたはゲルである場合には、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク及び／または酸化亜鉛などが用いられうる。
【００２９】
また、前記化粧品組成物の剤型が、パウダーまたはスプレーである場合には、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム及び／またはポリアミドパウダーが用いられうる。
【００３０】
また、前記化粧品組成物の剤型が、スプレーである場合には、さらにクロロフルオロハイドロカーボン、プロパン、ブタン及び／またはジメチルエーテルのような推進体を含みうる。
【００３１】
前記化粧品組成物の剤型が、溶液または乳濁液である場合には、担体成分として、溶媒、溶解化剤及び／または乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール及び／またはソルビタンの脂肪酸エステルを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
前記化粧品組成物の剤型が、懸濁液である場合には、担体成分として、水、エタノール及び／またはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及び／またはポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガ及び／またはトラガントなどが用いられうるが、これらに限定されるものではない。
【００３３】
前記化粧品組成物の剤型が、界面−活性剤含有クレンジングである場合には、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホスクシン酸モノエステル、イセチオン酸、イミダゾリウム誘導体、メチルタウリン、サルコシン酸、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体及び／またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが用いられうるが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
本発明の化粧品組成物に含まれる成分は、有効成分としての配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端にフェルラ酸が結合したペプチドからなるペプチド及び担体成分の以外に、化粧品組成物に通用される成分を含むものであり、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び／または香料のような通常の補助剤を含むものであるが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲が、これら実施例によって制限されないということは、当業者にとって自明である。
【実施例】
【００３６】
合成例１：ペプチド合成
クロロトリチルクロライドレジン（Ｃｈｌｏｒｏ  ｔｒｉｔｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｒｅｓｉｎ；ＣＴＬ  ｒｅｓｉｎ、Ｎｏｖａ  ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃａｔ  Ｎｏ．０１−６４−００２１）７００ｍｇを反応容器に入れ、メチレンクロライド（ＭＣ）１０ｍｌを加えて３分間撹拌した。次いで、溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍｌを入れて３分間撹拌した後、再び溶媒を除去した。反応器に１０ｍｌのジクロロメタン溶液を入れ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）４００ｍｍｏｌｅを入れた後、撹拌してよく溶かし、１時間撹拌しながら反応させた。反応後、洗浄し、メタノールとＤＩＥＡ（２：１）とをＤＣＭ（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）に溶かして１０分間反応させ、過量のＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）で洗浄した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を１０ｍｌ入れて３分間撹拌した後、再び溶媒を除去した。脱保護溶液（２０％のピペリジン（Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）／ＤＭＦ）１０ｍｌを反応容器に入れ、１０分間常温で撹拌した後、溶液を除去した。同量の脱保護溶液を入れ、再び１０分間反応を保持した後、溶液を除去し、それぞれ３分ずつＤＭＦで２回、ＭＣで１回、ＤＭＦで１回洗浄して、Ａｓｐ−ＣＴＬレジン（Ｒｅｓｉｎ）を製造した。新たな反応器に１０ｍｌのＤＭＦ溶液を入れ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ、ＨｏＢｔ２００ｍｍｏｌｅ及びＢｏｐ２００ｍｍｏｌｅを入れた後、撹拌してよく溶かした。反応器に４００ｍｍｏｌｅのＤＩＥＡを分画で２回にわたって入れた後、あらゆる固体が溶けるまで少なくとも５分間撹拌した。溶かしたアミノ酸混合溶液を脱保護されたレジンがある反応容器に入れ、１時間常温で撹拌しながら反応させた。反応液を除去し、ＤＭＦ溶液で３回５分ずつ撹拌した後、除去した。反応レジンを少量取ってカイザーテスト（Ｎｉｈｙｄｒｉｎ  Ｔｅｓｔ）を用いて反応程度を点検した。脱保護溶液で、前記のように同様に２回脱保護反応させて、Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＣＴＬレジンを製造した。ＤＭＦとＭＣとで十分に洗浄し、もう一度カイザーテストを行った後、前記と同様に、下記のアミノ酸付着実験を行った。選定されたアミノ酸配列に基づいて、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨ、及びＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ順に連鎖反応させた。Ｆｍｏｃ−保護基を脱保護溶液で１０分ずつ２回反応させた後、よく洗浄して除去した。引き続き活性化されたフェルラ酸（Ｆｅｒｕｌｉｃ  ａｃｉｄ）を結合させた後、製造されたペプチジルレジンをＤＭＦ、ＭＣ及びメタノールでそれぞれ３回を洗浄し、窒素空気を徐々に流して乾燥した後、Ｐ２Ｏ５下で真空に減圧して完全に乾燥した後、脱漏溶液［トリフルオロ酢酸（Ｔｒｉｆｌｕｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）８１．５％、蒸留水５％、チオア���ソール（Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ）５％、フェノール（Ｐｈｅｎｏｌ）５％、ＥＤＴ２．５％、及びＴＩＳ１％］３０ｍｌを入れた後、常温で時々振りながら２時間反応を保持した。フィルタリングを行ってレジンを濾し、レジンを少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を用いて全体ボリュームが半分程度残るように蒸留し、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、２回さらに冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去し、窒素下で十分に乾燥して、精製前、Ｆｅｒｕｌｏｙｌ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＣＯＯＨペプチド１（配列番号１）を０．７７ｇ合成（収率：８８．０％）した。分子量測定器を用いて測定時に、前記ペプチドの分子量１６４３．７（理論値：１６４３．７）が得られた。
【００３７】
【表１】
2020158524.tif 000002
【００３８】
実施例１：細胞毒性実験
４８ウェル培養用平板に、分周されたメラニン形成細胞（Ｂ１６Ｆ１０  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）を３７℃培養器で２４時間培養した後、各板の培地を除去し、無血清培地に取り替えた後、本ペプチドを濃度別（１、１０、５０、１００、１５０、２００ｕＭ）に処理した。次いで、７２時間培養した後、ＭＴＴ試薬を入れ、４時間反応させた後、生成されたホルマザンをＤＭＳＯで溶かし、５６０ｎｍで吸光度を測定して、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端にフェルラ酸が結合したペプチドからなるペプチドのメラニン細胞に対する細胞毒性の有無を確認するために、ＭＴＴアッセイを進行し、その結果を図１に示した。
【００３９】
図１から確認できるように、１ｕＭから２００ｕＭ処理群まで細胞毒性を示さないことを確認した。
【００４０】
実施例２：メラニン生成量の測定
６ウェル培養用平板に、分周されたメラニン形成細胞（Ｂ１６Ｆ１０  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）を３７℃培養器で２４時間培養した後、各板の培地を除去し、新たな培地（２％血清培地）に取り替えた後、α−ＭＳＨ（２００ｎｇ／ｍｌ）、アルブチン（２００、５００ｕＭ）及び本ペプチドを濃度別（５０、１００、２００ｕＭ）に処理した。次いで、７２時間培養した後、培養液を除去し、細胞を取り外した後、１．５ｍｌチューブに移して、１３，０００ｒｐｍで３分間遠心分離して、上澄み液を除去し、細胞ペレットを回収してメラニンを観察した。細胞ペレットを２Ｍ  ＮａＯＨ  １５０μｌずつ入れて、６０℃で３０分間細胞内メラニンを溶解させた。９６ウェル平板の各ウェルに溶解させて得た上澄み液を１００μｌずつ入れて、４９０ｎｍで吸光度を測定して、その結果を図２ａ及び図２ｂに示した。
【００４１】
図２ａ及び図２ｂから確認できるように、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端にフェルラ酸が結合したペプチドからなるペプチドの濃度依存的なメラニン生成抑制効果を確認した（＊＊Ｐ≦０．０１）。
【００４２】
実施例３：メラニン生成量の肉眼観察
６ウェル培養用平板に、分周されたメラニン形成細胞（Ｂ１６Ｆ１０  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）を３７℃培養器で２４時間培養した後、各板の培地を除去し、新たな培地（１０％血清培地）に取り替えた後、α−ＭＳＨ（２００ｎｇ／ｍｌ）、アルブチン（５００ｕＭ）及び本ペプチドを濃度別（５０、１００、２００ｕＭ）に処理した。次いで、７２時間培養した後、光学顕微鏡を通じて形成されたメラニンを観察した結果を図３に示した。
【００４３】
図３から確認できるように、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端にフェルラ酸が結合したペプチドからなるペプチドの濃度依存的なメラニン生成抑制効果を細胞の形態で確認した。
【００４４】
実施例４：細胞内チロシナーゼ活性の測定
黒色腫細胞株（Ｂ１６Ｆ１０）細胞を６ウェル培養用平板に２４時間培養し、α−ＭＳＨ（２００ｎｇ／ｍｌ）と濃度別ペプチド（５０、１００、２００ｕＭ）または陽性対照群であるアルブチン（２００、５００ｕＭ）とを処理して７２時間培養した。次いで、氷の上に６ウェル培養用平板を載せ、冷たいＰＢＳで洗浄した後、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が含有された０．１Ｍ  リン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ６．８、溶解バッファ）を３００μｌ入れ、細胞を１．５ｍｌチューブに集めて、−２７０℃に急速冷凍させた後、解凍させる反応を５回繰り返して細胞膜を破壊した。次いで、１３，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、上澄み液を他の１．５ｍｌチューブに集め、この試料のタンパク質を定量した。試料のタンパク質濃度が同じ濃度になるように希釈して、９６ウェル培養用平板に３個ウェルずつ分周し、１０ｍＭ  Ｌ−ｄｏｐａ  ２０μｌを添加して３７℃で１時間培養後、４７５ｎｍで吸光度を測定し、その結果を図４に示した。
【００４５】
図４から確認できるように、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端にフェルラ酸が結合したペプチドからなるペプチドの濃度依存的なチロシナーゼ活性抑制効果を確認した（＊＊Ｐ≦０．０１）。
【００４６】
実施例５：チロシナーゼ発現量の測定
６ウェル培養用平板に、分周されたメラニン形成細胞（Ｂ１６Ｆ１０  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）を３７℃培養器で２４時間培養した後、各板の培地を除去し、新たな培地（１０％血清培地）に取り替えた後、α−ＭＳＨ（２００ｎｇ／ｍｌ）及び本ペプチドを濃度別（５０、１００ｕＭ）に処理した。次いで、４８時間培養した後、ＦＩＴＣが付着されたチロシナーゼ抗体（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国）及びＦＩＴＣ付着２次ＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国）を用いて細胞内発現タンパク質を染色し、蛍光顕微鏡を通じて発現程度を測定して、その結果を図５に示した。
【００４７】
図５から確認できるように、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端にフェルラ酸が結合したペプチドからなるペプチドの濃度依存的なチロシナーゼ発現抑制効果を確認した。
【００４８】
実施例６：メラニン形成因子の遺伝子発現の変化観察
メラニン形成細胞（Ｂ１６Ｆ１０  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）を６ウェル培養用平板に２４時間培養後、α−ＭＳＨ（２００ｎｇ／ｍｌ）、アルブチン（５００ｕＭ）及び本ペプチドを濃度別（１００、２００ｕＭ）に処理する。２４時間培養された細胞のＲＮＡ抽出後、ｃＤＮＡを製作した。メラニン形成に関与する因子であるＭＩＴＦ、チロシナーゼ及びＴＲＰ１に対するそれぞれの特異的な下記表２のプライマーを用いてＰＣＲし、各遺伝子の発現変化を観察して、その結果を図６に示した。
【００４９】
【表２】
2020158524.tif 000003
【００５０】
図６から確認できるように、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端にフェルラ酸が結合したペプチドからなるペプチドの高いＭＩＴＦ、チロシナーゼ、ＴＲＰ１遺伝子発現抑制効果を確認した。
【００５１】
実施例７：メラニン形成因子のタンパク質発現の変化観察
メラニン形成細胞（Ｂ１６Ｆ１０  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）を６ウェル培養用平板に２４時間培養後、α−ＭＳＨ（２００ｎｇ／ｍｌ）及び本ペプチドを濃度別（５０、１００ｕＭ）に処理した。次いで、７２時間培養した後、細胞を溶解してメラニン形成に関与する核心因子であるＭＩＴＦ（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国）及びチロシナーゼ（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国）の発現を特異的な抗体を用いたウェスタンブロット方法を用いて観察して、その結果を図７に示した。
【００５２】
図７から確認できるように、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端にフェルラ酸が結合したペプチドからなるペプチドのＭＩＴＦ及びチロシナーゼタンパク質発現抑制効果を確認した。
【００５３】
実施例８：メラニン形成信号伝達物質の観察
メラニン形成細胞（Ｂ１６Ｆ１０  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）を６ウェル培養用平板に２４時間培養後、α−ＭＳＨ（２００ｎｇ／ｍｌ）及び本ペプチドを濃度別（５０、１００ｕＭ）に処理した。次いで、１０分間細胞を培養した後、細胞を溶解してメラニン形成に関与する信号伝逹物質であるＣＲＥＢのリン酸化程度を特異的な抗体（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国）を用いたウェスタンブロット方法を用いて観察して、その結果を図８に示した。
【００５４】
図８から確認できるように、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端にフェルラ酸が結合したペプチドからなるペプチドのＣＲＥＢリン酸化抑制効果を確認した。
【００５５】
前記結果を通じて、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端にフェルラ酸が結合したペプチドからなるペプチドが、α−ＭＳＨで活性化されたＭＣ１Ｒ信号伝逹経路を阻害して、メラニン生成抑制効果を示すということを確認することができた。
【００５６】
実施例９：角質形成細胞の活性及び食菌作用に関連した遺伝子発現の変化観察
ヒト角質形成細胞株（ＨａＣａＴ）を６ウェル培養用平板に２４時間培養後、活性を誘導する物質であるトリプシン及び本ペプチドを濃度別（１００、２００ｕＭ）に処理した。次いで、１６時間培養された細胞のＲＮＡ抽出後、ｃＤＮＡを製作した。トリプシン作用によって活性化された角質形成細胞の表面受容体のうち１つであるＰＡＲ２に対する特異的なプライマー対（下記表３参照）を用いてＰＣＲし、各遺伝子の発現変化を観察して、その結果を図９に示した。
【００５７】
【表３】
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【００５８】
図９から確認できるように、セリンプロテアーゼであるトリプシン処理による角質細胞のＰＡＲ２活性化によって、遺伝子発現が誘導され、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端にフェルラ酸が結合したペプチドからなるペプチド処理を通じて濃度依存的にＰＡＲ２遺伝子発現が減少することを観察した。
【００５９】
実施例１０：角質形成細胞へのメラノソーム流入抑制の確認（分離されたメラノソーム使用）
ヒト角質形成細胞株（ＨａＣａＴ）を６ウェル培養用平板に２４時間培養し、無血清培養培地にマウス黒色腫細胞株（Ｂ１６Ｆ１０）から分離したメラノソームを３時間前処理し、濃度別ペプチド（１０、５０、１００、２００ｕＭ）または陽性対照群であるアルブチン（２００ｕＭ）を処理して４８時間培養した。次いで、ＰＢＳで洗浄して、流入されていないメラノソームを除去し、角質形成細胞を収集、沈澱した後、得たペレットに１Ｍ  ＮａＯＨを添加し、８０℃オーブンでペレットを溶解させた後、４９０ｎｍでＯＤ値を測定する。配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端にフェルラ酸が結合したペプチドからなるペプチドの濃度別メラノソーム流入抑制効果を観察するために、メラノーマから分離したメラノソームを用いて角質細胞食菌作用アッセイを行って、その結果を図１０に示した。
【００６０】
図１０から確認できるように、吸光度測定を通じて角質細胞内に流入されたメラノソームの量を確認した結果、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端にフェルラ酸が結合したペプチドからなるペプチドの食菌作用抑制効果を確認することができた。
【００６１】
実施例１１：角質形成細胞へのメラノソーム流入抑制の確認（分離されたメラノソーム使用）
ヒト角質形成細胞株（ＨａＣａＴ）を６ウェル培養用平板に２４時間培養し、無血清培養培地にマウス黒色腫細胞株（Ｂ１６Ｆ１０）から分離したメラノソームを３時間前処理し、濃度別ペプチド（１０、５０、１００、２００ｕＭ）または陽性対照群であるアルブチン（２００ｕＭ）を処理して４８時間培養した。次いで、後にＰＢＳで洗浄して、流入されていないメラノソームを除去し、フォンタナ・マッソン染色（ｆｏｎｔａｎａ−ｍａｓｓｏｎ  ｓｔａｉｎ）して、角質形成細胞のメラノソーム食菌作用抑制を顕微鏡を通じて観察した。配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端にフェルラ酸が結合したペプチドからなるペプチドの濃度別メラノソーム流入抑制効果を観察するために、黒色腫から分離したメラノソームを用いて角質細胞食菌作用アッセイを行って、その結果を図１１に示した。
【００６２】
図１１から確認できるように、光学顕微鏡イメージ分析を通じて角質細胞内に流入されたメラノソームの量を確認した結果、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端にフェルラ酸が結合したペプチドからなるペプチドの濃度依存的な食菌作用抑制効果を確認することができた。
【００６３】
実施例１２：角質形成細胞へのメラノソーム流入抑制の確認（生体粒子使用）
ヒト角質形成細胞株（ＨａＣａＴ）を２４ウェル培養用平板に２４時間培養し、０．５％ＦＢＳ培養培地に濃度別ペプチド（１００、２００ｕＭ）または陽性対照群であるアルブチン（２００ｕＭ）を処理して２４時間培養した。次いで、Ｖｙｂｒａｎｔ．Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｖ−６６９４）を使ってヒト角質形成細胞株の食菌作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）抑制を蛍光顕微鏡を通じて観察した。配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端にフェルラ酸が結合したペプチドからなるペプチドの濃度別メラノソーム流入抑制効果を観察するために、蛍光−結合生体粒子を用いて角質細胞食菌作用アッセイを行って、その結果を図１２に示した。
【００６４】
図１２から確認できるように、蛍光顕微鏡イメージ分析を通じて角質細胞内に流入された生体粒子の量を確認した結果、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端にフェルラ酸が結合したペプチドからなるペプチドの明らかな食菌作用抑制効果を確認することができた。
【００６５】
実施例１３：角質形成細胞でのメラノソーム分解能の観察
ヒト角質形成細胞株（ＨａＣａＴ）を６ウェル培養用平板に２４時間培養し、無血清培養培地にマウス黒色腫細胞株（Ｂ１６Ｆ１０）から分離したメラノソームを４８時間処理した後、ＰＢＳで洗浄して、流入されていないメラノソームを除去し、濃度別ペプチド（１００、２００ｕＭ）または陽性対照群であるアルブチン（２００ｕＭ）及びＴＧＦ  β−１を処理して７２時間培養した。角質形成細胞で食菌作用されたメラノソームの分解を測定するために、角質形成細胞を収集、沈澱した後、得たペレットに１Ｍ  ＮａＯＨを添加し、８０℃オーブンでペレットを溶解させた後、４９０ｎｍでＯＤ値を測定して、その結果を図１３に示した。
【００６６】
図１３から確認できるように、角質細胞に流入されたメラノソームに対する配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端にフェルラ酸が結合したペプチドからなるペプチドの分解促進効能を観察した結果、濃度依存的な効果が確認された。
【００６７】
実施例１４：生体内美白効能の観察（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
８週齢のＣ５７ＢＬ／６ラットのしっぽにリポソーム化されたペプチド（５，０００ｐｐｍ）及び陽性対照群であるアルブチンを１日に１回ずつ塗布して、約８週間実験を進行した。実験終了後にラットを犠牲して、しっぽ皮膚組織を摘出し、それをパラフィンで包埋してパラフィンブロックを製作した。次いで、パラフィン切片に作ってフォンタナ・マッソン染色して形態学的に観察して、その結果を図１４ａないし図１４ｃに示した。
【００６８】
図１４ａから確認できるように、８週間塗布実験を進行した結果、対照群に比べて、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端にフェルラ酸が結合したペプチドからなるペプチドを含んだリポソーム処理群のしっぽの色が明るくなることを観察することができた。
【００６９】
また、図１４ｂ及び図１４ｃのＦ＆Ｍ染色を通じるメラニン分布確認結果、対照群表皮の基底層に分布されたメラニンに比べて、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端にフェルラ酸が結合したペプチドからなるペプチド処理群の分布量が著しく少ないことを確認することができた。
【００７０】
以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者において、このような具体的な記述は、単に望ましい具現例であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物とによって定義される。
【図１】
2020158524.tif 000005
【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【配列表】
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