(57)【要約】  【課題】スポンジ、粉末、再生医療用の細胞培養用担体として用いることができる凝集物の製造方法を提供する。  【解決手段】溶媒中でシルクフィブロイン及びシルクナノファイバーを混合する工程を含む、凝集物の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶媒中で、シルクフィブロイン及びシルクナノファイバーを混合する工程を含む、凝集物の製造方法。
【請求項２】
前記工程は、シルクフィブロイン溶液及びシルクナノファイバー分散液を混合する工程である、請求項１に記載の凝集物の製造方法。
【請求項３】
前記工程は、シルクフィブロイン溶液にシルクナノファイバーを添加する工程である、請求項１に記載の凝集物の製造方法。
【請求項４】
前記工程は、シルクナノファイバー分散液にシルクフィブロインを添加する工程である、請求項１に記載の凝集物の製造方法。
【請求項５】
シルクナノファイバー分散液のｐＨが３．０以上１２.０未満である、請求項２又は４に記載の凝集物の製造方法。
【請求項６】
シルクフィブロイン溶液のｐＨが３．０以上１２.０未満である、請求項２又は３に記載の凝集物の製造方法。
【請求項７】
凝集物中のシルクフィブロインの含有量が１質量％以上である、請求項１〜６のいずれかに記載の凝集物の製造方法。
【請求項８】
凝集物中のシルクナノファイバーの含有量が０．１質量％以上である、請求項１〜７のいずれかに記載の凝集物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凝集物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シルクは高い生体適合性を持ち、近年、シルクのスポンジ、フィルム、粉末、再生医療用の細胞培養用担体及び複合体など潜在的に有用な二次的形態についてさらに研究されている。これらの二次形態の多くは、シルクを水溶液に処理し、再度不溶化させて凝集物とすることにより作製することができる。
【０００３】
水溶液中に溶解させたシルクから、水に不溶なシルクを得るための方法として、シルクフィブロインの水溶液にメタノールなどの有機溶剤を混合したり（非特許文献１）、加温（非特許文献２）、攪拌（特許文献１）、超音波（特許文献２）などにより強いずり応力をかけたりする方法が用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１２／００７０４２７号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１３／００６０００８号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kasoju N, Hawkins N, Pop-Georgievski O, Kubies D, Vollrath F.,“Silk fibroin gelation via non-solvent induced phase separation.”Biomater Sci. 2016;4(3):460-73.
【非特許文献２】Matsumoto A, Chen J, Collette AL, Kim UJ, Altman GH, Cebe P, Kaplan DL.,“Mechanisms of silk fibroin sol-gel transitions.”J Phys Chem B. 2006 Nov 2;110(43):21630-8.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者等は、シ本発明者等は鋭意検討の結果、シルクナノファイバーとシルクフィブロインとを溶液中で混合することにより、シルク凝集物を製造することができることを見出した。そして、このような凝集物は、シルクのスポンジ、粉末、再生医療用の細胞培養用担体として好適に用いることができることに想到し、本発明に到達したものである。
【０００７】
本発明は、スポンジ、粉末、再生医療用の細胞培養用担体として用いることができる凝集物の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
即ち、本発明は、下記の凝集物の製造方法に関する。
１．溶媒中で、シルクフィブロイン及びシルクナノファイバーを混合する工程を含む、凝集物の製造方法。
２．前記工程は、シルクフィブロイン溶液及びシルクナノファイバー分散液を混合する工程である、項１に記載の凝集物の製造方法。
３．前記工程は、シルクフィブロイン溶液にシルクナノファイバーを添加する工程である、項１に記載の凝集物の製造方法。
４．前記工程は、シルクナノファイバー分散液にシルクフィブロインを添加する工程である、項１に記載の凝集物の製造方法。
５．シルクナノファイバー分散液のｐＨが３．０以上１２.０未満である、項２又は４に記載の凝集物の製造方法。
６．シルクフィブロイン溶液のｐＨが３．０以上１２.０未満である、項２又は３に記載の凝集物の製造方法。
７．凝集物中のシルクフィブロインの含有量が１質量％以上である、項１〜６のいずれかに記載の凝集物の製造方法。
８．凝集物中のシルクナノファイバーの含有量が０．１質量％以上である、項１〜７のいずれかに記載の凝集物の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の製造方法は、溶媒中でシルクフィブロイン及びシルクナノファイバーを混合する工程を含むことにより、溶媒中でシルクフィブロインとシルクナノファイバーとを十分に混合することができ、３次元ゲル構造体として用いることができる凝集物を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】フィブロインとシルクナノファイバーとを混合した状態を示す図である。
【図２】フィブロインとシルクナノファイバーとを混合した状態を示す図である。
【図３】フィブロインとシルクナノファイバーとを混合した状態を示す図である。
【図４】過酸化水素蒸気への曝露後の凝集物の状態を示す図である。
【図５】過酸化水素蒸気への曝露後の凝集物の状態を示す図である。
【図６】ｐＨが凝集物の製造に及ぼす影響を試験した際の試験結果を示す図である。
【図７】ｐＨが凝集物の製造に及ぼす影響を試験した際の試験結果を示す図である。
【図８】ｐＨが凝集物の製造に及ぼす影響を試験した際の試験結果を示す図である。
【図９】ｐＨが凝集物の製造に及ぼす影響を試験した際の試験結果を示す図である。
【図１０】ｐＨが凝集物の製造に及ぼす影響を試験した際の試験結果を示す図である。
【図１１】ｐＨが凝集物の製造に及ぼす影響を試験した際の試験結果を示す図である。
【図１２】ｐＨが凝集物の製造に及ぼす影響を試験した際の試験結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の凝集物の製造方法は、溶媒中でシルクフィブロイン及びシルクナノファイバーを混合する工程を含む。本発明の凝集物の製造方法は、上記工程を含むことにより、溶媒中でシルクフィブロインとシルクナノファイバーとを十分に混合することができ、３次元ゲル構造体として用いることができる凝集物を製造することができる。
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１３】
本発明の凝集物の製造方法は、溶媒中でシルクフィブロイン及びシルクナノファイバーを混合する工程を含む製造方法である。本発明の製造方法では、溶媒中でシルクフィブロイン及びシルクナノファイバーを混合することができれば、混合方法は特に限定されない。すなわち、上記工程は、（１）シルクフィブロインを溶媒に溶解させたシルクフィブロイン溶液と、シルクナノファイバーを溶媒に分散させたシルクナノファイバー分散液とを混合する工程、（２）上記シルクフィブロイン溶液にシルクナノファイバーを添加する工程、（３）上記シルクナノファイバー分散液にシルクフィブロインを添加する工程のいずれであってもよい。上記工程は、シルクフィブロインとシルクナノファイバーとをより一層均一に混合することができる点で、（１）シルクフィブロインを溶媒に溶解させたシルクフィブロイン溶液と、シルクナノファイバーを溶媒に分散させたシルクナノファイバー分散液とを混合する工程であることが好ましい。
【００１４】
（溶媒）
溶媒としては、シルクナノファイバーを分散することができれば特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、有機溶剤と水との混合溶液などが挙げられる。
【００１５】
（シルクナノファイバー）
シルクナノファイバーとしては特に限定されず、シルクを解繊して得られる微細繊維を用いることができる。より具体的には、天然物から精製したものや商業的に入手可能なものなどを使用することができる。なお、シルクは主にフィブロインとセリシンの２種類のタンパク質から構成されるが、本発明に用いられるシルクナノファイバーはセリシンを含んでいてもよく、セリシンを含んでいなくてもよい。
【００１６】
上記シルクナノファイバーは、例えば、弱アルカリ性の液中にシルクを分散させ、エレクトロスピニングする方法により得られるシルクナノファイバーを用いることにより製造することができる。
【００１７】
シルクナノファイバーの平均短径は、０．０１ｎｍ以上が好ましく、０．１ｎｍ以上がより好ましく、１ｎｍ以上が更に好ましく、５ｎｍ以上が特に好ましい。また、シルクナノファイバーの平均短径は、３０００ｎｍ以下が好ましく、５００ｎｍ以下がより好ましく、２００ｎｍ以下が更に好ましく、１００ｎｍ以下が特に好ましい。シルクナノファイバーの平均短径の上限が上記範囲であると、製造される凝集物の均一性がより一層向上する。また、シルクナノファイバーの平均短径の下限が上記範囲であると、凝集物がより一層形成され易くなる。
【００１８】
凝集物中のシルクナノファイバーの含有量は、０．１質量％以上が好ましく、１質量％以上がより好ましく、１０質量％以上が更に好ましい。また、凝集物中のシルクナノファイバーの含有量は、９０質量％以下が好ましく、５０質量％以下がより好ましい。凝集物中のシルクナノファイバーの濃度の上限が上記範囲であると、製造される凝集物の均一性がより一層向上する。また、凝集物中のシルクナノファイバーの濃度の下限が上記範囲であると、凝集物がより一層形成され易くなる。なお、上記凝集物中のシルクナノファイバーの含有量は、得られた凝集物を後述する乾燥工程に記載された乾燥方法等により乾燥させて測定した、乾燥後の凝集物中の含有量である。
【００１９】
上記工程において、シルクナノファイバー分散液を用いる場合、シルクナノファイバー分散液を調製する調製方法としては特に制限されず、溶媒中にシルクナノファイバーを従来公知の方法により添加して分散させる調製方法が挙げられる。
【００２０】
シルクナノファイバー分散液を調製するための溶媒としては、上述の溶媒を用いることができる。中でも、安全性に優れる点で、水が好ましい。すなわち、シルクナノファイバー分散液として、シルクナノファイバー水分散液を用いることが好ましい。
【００２１】
シルクナノファイバー分散液のｐＨは、２．０〜１４．０であることが好ましく、３．０〜１２．０であることがより好ましく、４．０〜７．０であることが更に好ましい。ｐＨが上記範囲であることにより、凝集物がより一層形成され易くなり、凝集物の形状安定性がより一層向上する。
【００２２】
シルクナノファイバー分散液中のシルクナノファイバーの濃度は、０．０１質量％以上が好ましく、０．５質量％以上がより好ましい。また、シルクナノファイバー分散液中のシルクナノファイバーの濃度は、２０．０質量％以下が好ましく、５．０質量％以下がより好ましい。シルクナノファイバー分散液中のシルクナノファイバーの濃度の上限が上記範囲であると、製造される凝集物の均一性がより一層向上する。また、シルクナノファイバー分散液中のシルクナノファイバーの濃度の下限が上記範囲であると、凝集物がより一層形成され易くなる。
【００２３】
上記工程において、シルクナノファイバー分散液を用いる場合、シルクナノファイバー分散液の液温としては、０〜１００℃が好ましく、２〜６０℃がより好ましい。
【００２４】
（シルクフィブロイン）  
シルクフィブロインとしては特に限定されず、蚕などによって作られる絹糸の主要成分である、繊維状のタンパク質を用いることができる。より具体的には、天然物から精製したものや商業的に入手可能なものなどを使用することができる。
【００２５】
凝集物中のシルクフィブロインの含有量は、１質量％以上が好ましく、１０質量％以上がより好ましく、２０質量％以上が更に好ましい。また、凝集物中のシルクフィブロインの濃度は、９５質量％以下が好ましく、９０質量％以下がより好ましい。凝集物中のシルクフィブロインの濃度の上限が上記範囲であると、製造される凝集物の均一性がより一層向上する。また、凝集物中のシルクフィブロインの濃度の下限が上記範囲であると、凝集物がより一層形成され易くなる。なお、上記凝集物中のシルクフィブロインの含有量は、得られた凝集物を後述する乾燥工程に記載された乾燥方法等により乾燥させて測定した、乾燥後の凝集物中の含有量である。
【００２６】
上記工程において、シルクフィブロイン溶液を用いる場合、シルクフィブロイン溶液を調製する調製方法としては特に制限されず、溶媒中にシルクフィブロインを従来公知の方法により添加して溶解させる調製方法が挙げられる。
【００２７】
シルクフィブロイン溶液を調製するための溶媒としては、上述の溶媒を用いることができる。中でも、安全性に優れる点で、水が好ましい。すなわち、シルクフィブロイン溶液として、シルクフィブロイン水溶液を用いることが好ましい。
【００２８】
シルクフィブロイン溶液のｐＨは、２．０〜１４．０であることが好ましく、３．０〜１２．０であることがより好ましく、４．０〜７．０であることが更に好ましい。ｐＨが上記範囲であることにより、凝集物がより一層形成され易くなり、凝集物の形状安定性がより一層向上する。
【００２９】
シルクフィブロイン溶液中のシルクフィブロインの濃度は、０．１質量％以上が好ましく、０．５質量％以上がより好ましい。また、シルクフィブロイン溶液中のシルクフィブロインの濃度は、１０．０質量％以下が好ましく、５．０質量％以下がより好ましい。シルクフィブロイン溶液中のシルクフィブロインの濃度の上限が上記範囲であると、製造される凝集物の均一性がより一層向上する。また、シルクフィブロイン溶液中のシルクフィブロインの濃度の下限が上記範囲であると、凝集物がより一層形成され易くなる。
【００３０】
上記工程において、シルクフィブロイン溶液を用いる場合、シルクフィブロイン溶液の液温としては、０〜１００℃が好ましく、２〜６０℃がより好ましい。
【００３１】
溶媒中で、シルクフィブロイン及びシルクナノファイバーを混合してから、凝集するまでの凝集時間は、１０分以下が好ましく、５分以下がより好ましく、１分以下が更に好ましく、３０秒以下が特に好ましい。凝集時間の上限が上記範囲であると、凝集物をより一層迅速に形成することができる。また、凝集時間の下限は特に限定されず、１秒程度である。
【００３２】
（他の成分）  
上記工程において、溶媒は、シルクナノファイバー及びシルクフィブロインの他に、他の成分を含んでいてもよい。このようなその他の成分としては、シルクナノファイバー及びシルクフィブロインを分解しなければ特に限定されず、酵素、天然高分子及び／又は合成高分子並びにそれらの塩、低分子物質、金属イオン、有機物イオン、無機物イオン等が挙げられる。
【００３３】
天然高分子及び合成高分子としては特に限定されず、例えば、多糖類、核酸、炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、ポリ（アミノ酸）、ポリ乳酸、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸、ヒアルロン酸、アルギン酸、キトサン、ポリグルタミン酸、アルブミン、ゼラチン、デキストラン、プルラン、カラギーナン、コラーゲン、カードラン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、フコイダン、アミロース、アミロペクチン、ペクチン、及びポリビニルアルコール等が挙げられる。また、これらの誘導体を用いてもよい。誘導体としては特に限定されず、架橋性の官能基が導入されたものが好ましい。架橋性の官能基としては、例えば、フェノール性水酸基等が挙げられる。これらの中でも、凝集物がより一層形成され易くなる点で、ヒアルロン酸、アルギン酸、キトサン、ポリビニルアルコール、及びこれらのフェノール性水酸基導入体が好ましい。
【００３４】
上記天然高分子又は合成高分子は、一種単独で用いてもよいし、二種以上を混合して使用してもよい。
【００３５】
なお、上記工程において、シルクフィブロイン及びシルクナノファイバーを含む溶媒中に天然高分子及び合成高分子が二種以上含まれる場合、上記の濃度は、上記溶媒中に含まれる全ての天然高分子及び合成高分子の合計の濃度を意味する。
【００３６】
酵素としては特に限定されず、分子間に架橋を形成させる反応を触媒する酵素が挙げられる。分子間に架橋を形成させる反応を触媒する酵素としては、例えば、西洋わさび由来ぺルオキシターゼ（ＨＲＰ）、トランスグルタミナーゼ、チロシナーゼ等が挙げられる。これらの中でも、凝集物がより一層形成され易くなり、凝集物の形状安定性がより一層向上する点で、西洋わさび由来ぺルオキシターゼが好ましい。
【００３７】
溶媒中のＨＲＰ酵素の含有量は、０．１〜１００００Ｕ／ｍｌが好ましく、０．５〜２０００Ｕ／ｍｌがより好ましく、１〜５００Ｕ／ｍｌが更に好ましい。加水分解酵素の含有量の上限が上記範囲であると、加水分解酵素を過剰に添加することなく凝集物をより一層形成し易くなる。また、加水分解酵素の含有量の下限が上記範囲であると、凝集物をより一層形成し易くなる。
【００３８】
（乾燥工程）
本発明の凝集物の製造方法は、上記工程の後に、更に、溶媒中で製造された凝集物を乾燥させる乾燥工程を有していてもよい。
【００３９】
凝集物を乾燥させる乾燥方法としては特に限定されず、例えば、乾燥器中で静置する方法、凍結真空乾燥の方法等が挙げられる。
【００４０】
乾燥温度は、１０℃以上が好ましく、２０℃以上がより好ましい。また、乾燥温度は、１５０℃以下が好ましく、１００℃以下がより好ましい。乾燥温度の上限が上記範囲であることにより、乾燥による凝集物の変形がより一層抑制される。また、乾燥温度の下限が上記範囲であることにより、凝集物がより一層十分に乾燥される。
【００４１】
乾燥時間は、３０分以上が好ましく、１２０分以上がより好ましく、１８０分以上が更に好ましい。また、乾燥時間は、３００００分以下が好ましく、２１６０分以下がより好ましく、１４４０分以下が更に好ましく、１２００分以下が特に好ましい。乾燥時間の上限が上記範囲であることにより、乾燥による凝集物の変形がより一層抑制される。また、乾燥時間の下限が上記範囲であることにより、凝集物がより一層十分に乾燥される。
【実施例】
【００４２】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明する。但し、本発明は実施例に限定されない。
【００４３】
試験例１（フィブロインとシルクナノファイバーの混合）
フィブロインとシルクナノファイバーとを様々な方法で混合し、凝集物の生成について確認した。具体的には、先ず、６．０質量％のフィブロイン水溶液と、２．０質量％のシルクナノファイバー水分散液を調製した。フィブロインは、ながすな繭株式会社製のフィブロインを用いた。また、シルクナノファイバーとして、ながすな繭株式会社製のシルクナノファイバーを用いた。次いで、以下の方法により、溶媒である水中でフィブロインとシルクナノファイバーとを混合した。
【００４４】
（実施例１）
フィブロイン水溶液とシルクナノファイバー水分散液とを、１：１（体積比）となるように混合し、スクリュー管内で十分に撹拌した。混合後の状態を図１に示す。
【００４５】
（実施例２）
フィブロイン水溶液とシルクナノファイバー水分散液とをダブルシリンジ内で、フィブロイン水溶液中のフィブロインと、シルクナノファイバー分散水とが１：１（体積比）となるように混合した。混合後の状態を図２に示す。
【００４６】
（実施例３）
シルクナノファイバー水分散液に西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）２０Ｕ／ｍＬを溶解させ、フィブロイン水溶液と、ダブルシリンジ内で、１：１（体積比）となるように混合した。混合後の状態を図３に示す。
【００４７】
＜結果＞
図１〜３の結果から、実施例１〜３において、凝集体を製造することができたことが確認された。シルクフィブロイン及びシルクナノファイバーを混合してから、凝集するまでの凝集時間は３０秒以下であった。
【００４８】
試験例２（過酸化水素蒸気への曝露試験）
上記実施例２及び実施例３で製造された凝集体を、過酸化水素蒸気に、２０℃、１０分間の条件で曝露した後、スパチュラで抑えて状態を観察した。結果を図４（実施例２）及び図５（実施例３）に示す。
【００４９】
＜結果＞
図４及び図５の結果から、実施例２及び３で製造された凝集体は、過酸化水素蒸気に曝露しても変化しないことが分かった。
【００５０】
試験例３（ｐＨが凝集物の製造に及ぼす影響）
（実施例４〜１０）
２．０質量％のシルクナノファイバー水分散液５００μｌ、及び、６．０質量％のシルクフィブロイン水溶液５００μｌを調製し、それぞれを別々のエッペンチューブに入れた。次いで、表１に示す量のＨＣｌをそれぞれに添加し、十分に撹拌して、ｐＨを表１に示す値に調整した。次いで、ｐＨを調整したシルクナノファイバー水分散液と、ｐＨを調整したシルクフィブロイン水溶液とを混合し、撹拌した後の状態を観察した。結果を図６〜図１２に示す。
【００５１】
【表１】
2020158582.tif 000002
【００５２】
＜結果＞
図６〜図１２の結果から、実施例４〜１０では、酸性条件において、凝集体が製造されることが確認された。また、ＨＣｌの滴下量が増加すると、凝集体が徐々に柔らかくなることが分かった。
【図１】
2020158582.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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