(57)【要約】      （修正有）【課題】神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起により媒介される疾患(例えばタウオパチー)の治療又は診断に使用する、リン酸化タウタンパク質を指向する重鎖抗体可変ドメイン（ＶＨＨ）及びその接合体の提供。【解決手段】タウタンパク質のＣ末端に由来する単一リン酸化ペプチド又はリン酸化タウに富むヒトアルツハイマー病脳抽出物で免疫したラクダ科動物より単離した重鎖抗体可変ドメイン（ＶＨＨ）。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸化タウタンパク質を指向し、ラクダ科動物をタウタンパク質のＣ末端に由来する配列CSIDMVDS(PO3H2)PQLATLAD(配列番号６)の単一リン酸化ペプチド又はリン酸化タウに富むヒトアルツハイマー病脳抽出物で免疫することにより取得可能であることを特徴とする単離されたラクダ科動物重鎖抗体可変ドメイン(VHH)。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン酸化タウタンパク質を指向する抗体及びその接合体に関する。本発明はまた、これら抗体接合体の、リン酸化タウタンパク質により媒介される疾患の治療又は診断のための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
認知症の全症例の約70％は、認知に重要な脳領域及び神経回路の選択的障害に関連するアルツハイマー病(AD)に起因する。アルツハイマー病は、神経原線維変化(NFT)(特に海馬の錐体ニューロンにおけるもの)及び多数のアミロイド斑により特徴付けられる。
【０００３】
AD脳標本についての超微細研究により、NFTが主に対合螺旋状フィラメント(paired helical filament；PHF)から構成され、これらフィラメントが軸対称の直径約10nmの原線維の対であり、65nmの規則的周期性の螺旋状三次元構造を有することが明らかとなった(Kidd 1963 Nature，197，192-3；Wisniewskiら 1976 J Neurol Sci.，27,173-81)。1985年に、Brionら(Archives de biologie (Bruxelles)，95，229-235)は、PHFの主成分がマイクロチューブリン関連タンパク質(MAP)であるタンパク質タウであることを証明した。この結果は幾人かの著者らにより確証された：Grundke-Iqbalら 1986 Proc Natl Acad Sci U.S.A.，83，4913-7；Kosikら 1986 Proc Natl Acad Sci U.S.A.，83，4044-8；Delacourte及びDefossez 1986 J Neurol Sci.，76，173-86；Woodら 1986 Proc Natl Acad Sci U.S.A.，83，4040-3；Nukina及びIhara 1986 J Biochem.，99，1541-4；Pollockら 1986 Lancet，2，1211；Montejo de Garciniら 1986 Biochem Biophys Res Commun.，141，790-6。その後、NFT中のタンパク質タウが異常にリン酸化され(Grundke-Iqbal及びIqbalら 1986 Proc Natl Acad Sci U.S.A.，83，4913-7；Iharaら 1986 J Biochem.，99，1807-10；Iqbalら 1986 Lancet，2，421-6；Brionら 1986 Lancet，2，1098；Kopkeら 1993 J Biol Chem.，268，24374-84)、それらが正常タウ及び他のMAPの隔絶を導き(Alonsoら 1994 Proc Natl Acad Sci U.S.A.，91，562-6；Alonsoら 1997 Proc Natl Acad Sci U.S.A.，94，298-303)、このことが微小管の分解を引き起こし、よって軸索輸送を傷害し、正常なニューロン及びシナプス機能が損なわれて、シナプス喪失及びニューロン死に至ることが示された。過リン酸化タウはまた、不溶性となり、自己凝集して対合螺旋状フィラメント(PHF)及びNFTを形成する。これら全てのプロセスの結末が認知症である。タウのリン酸化は、複数のキナーゼとホスファターゼとの間の均衡によって調節される(Iqbalら 2005 Biochim Biophys Acta，1739，198-210；Blennowら 2006 Lancet，368，387-403)。異常リン酸化タウの量の増加により、AD脳でのタウレベルは年齢適合コントロールのものより８倍程度高い(Khatoonら 1992 J Neurochem.，59，750-3)。タウ及びNFT形成がADの原因であるのか又は結果であるのかは、現時点で不明である(Blennowら 2006 Lancet，368，387-403)。
【０００４】
タウは、70年代に初めて単離され、MAPとして同定され(Weingartenら 1975 Proc Natl Acad Sci U.S.A.，72，1858-62；Clevelandら 1977 J Mol Biol.，116，227-47；Clevelandら 1977 J Mol Biol.，116，207-25)、主にニューロンで発現する(Tucker 1990 Brain Res Brain Res Rev.，15，101-20；Schoenfeld及びObar 1994 Int Rev Cytol.，151，67-137)。ヒトタウ遺伝子は第17染色体に位置し、そこで100kb以上を占め、少なくとも16エキソンを含有する(Neveら 1986 Brain Res.，387，271-80；Andreadisら 1992 Biochemistry，31，10626-33；Andreadisら 1995 Nucleic Acids Res.，23，3585-93)。オルターナティブスプライシングにより、タウ遺伝子は異なるmRNAを生じ、６つのタウイソフォームの産生をもたらす(Goedertら 1989 Neuron，3，519-26；Himmlerら 1989 Mol Cel Biol.，9，1381-8)。６つのタウイソフォームは、各々31〜32アミノ酸の３つ又は４つの微小管結合性リピート(Ｒ)及び各々29アミノ酸の１つ、２つ又は０のアミノ末端インサート(Ｎ)の存在により互いに異なり、0N3R、1N3R、2N3R、0N4R、1N4R及び2N4Rタウを生じる。タウタンパク質の６つのイソフォームは、352〜441アミノ酸の範囲である(Goedertら 1989 Neuron，3，519-26；Himmlerら 1989 Mol Cell Biol.，9，1381-8；Goedertら 1989 The EMBO J.，8，393-9)。これらイソフォームの各々は、発生の間に差動的に発現するので、特異的な生理学的機能を発揮し得る。例えば、0N3Rタウは胎児脳に存在する唯一のイソフォームである一方、６つ全てのイソフォームが成人期の間に発現する(Kosikら 1989 Neuron，2，1389-97；Goedert及びJakes 1990 EMBO J.，9，4225-30；Bueeら 2000 Brain Res Brain Res Rev.，33，95-130)。
【０００５】
4R:3Rタウ比率は、mRNA及びタンパク質の両方について、正常脳ではほぼ等しいが、ほとんどの神経変性性タウオパチーでは、攪乱により、通常、この比率が増大する(Hangerら 2009 Trends Mol Med.，15，112-9)。過リン酸化/病的タウタンパク質は、特異的mAbを用いて、ウェスタンブロットで55〜74kDaのバンドとして可視化され得る(Bueeら 2000 Brain Res Brain Res Rev.，33，95-130)。
【０００６】
タウ441(441アミノ酸)は、80のセリン/スレオニン及び５つのチロシンの推定リン酸化部位を含有し、タウの確立された機能は、微小管結合ドメイン(Ｒ)を介して微小管へ結合することにより微小管の組立て及び安定性を促進することである(Weingartenら 1975 Proc Natl Acad Sci U.S.A.，72，1858-62；Clevelandら 1977 J Mol Biol.，116，227-47；Clevelandら 1977 J Mol Biol.，116，207-25；Bohmら 1990 Acta Histochem Suppl.，39，357-64；Nixon及びSihag 1991 Trends Neurosci.，14，501-6；Drechselら 1992 Mol Biol Cell.，3，1141-54；Brandt及びLee 1993 J Neurochem.，61，997-1005)。タウの微小管組立て促進活性はリン酸化の程度により調節される。過リン酸化は、微小管組立てを刺激するタウの能力を抑制する(Lindwall及びCole 1984 J Biol Chem.，259，5301-5)。40を超えるセリン/スレオニン部位でのタウのAD過リン酸化が同定されている(Hasegawaら 1992 J Biol Chem，267，17047-54；Morishima-Kawashimaら 1995 J Biol Chem.，270，823-9；Hangerら 1998 Trends Mol Med，15，112-9；Vegaら 2005 Brain Res Brain Mol Res.，138，135-44)。AT8 mAbが認識するエピトープであるSer202のリン酸化は、神経原線維変化の形成と相関することが見出され、ADタイプのタウ病態の早期マーカーであると報告されている(Merckenら 1992 Acta Neuropathol.，84，265-72；Biernatら 1992 EMBO J.，11，1593-7；Suら 1994 Neuroreport，5，2358-62；Hernandezら 2003 Neurob Aging.，24，1087-94；Blazquez-Llorcaら 2011 J Alzheimer's Dis.，26，683-98)。タウのＣ末端に近いSer422のリン酸化も、NFTの発生と密接に関連すると報告されている。Ser422でリン酸化したタウの量は、ADの重篤度と共に増加することが見出されており、このリン酸化部位もまたADに顕著な病態である(Bussiereら 1999 Acta Neuropathol.，97，221-30；Augustinackら 2002 Acta Neuropathol.，103，26-35；Haaseら 2004 J Neurochem.，88，1509-20；Pennanen及びGotz 2005 Biochem Biophys Res Commun.，337，1097-101；Detersら 2008 Eur J Neurosci.，28，137-47；Grueningerら 2011 Mol Cell Biochem.，357，199-207)。
【０００７】
アミロイド-β(Aβ)沈着とは異なり、NFTは、AD脳においてステレオタイプで予測可能なパターンで発生する(Arnoldら 1991 Cereb Cortex，1，103-16；Braak及びBraak 1991 Acta Neuropathol.，82，239-59；Braakら 2006 Acta Neuropathol.，112，389-404)。Braak及びBraak(1991 Acta Neuropathol.，82，239-59)は、臨床病理学的研究においてNFTの進行を表現する６つのステージを提案した。最初のNFTは、一貫して、移行嗅内(嗅周)領域に出現し(ステージＩ)、嗅内皮質固有域、次いで海馬CA1領域に拡がる(ステージII)。次に、NFTは、辺縁系構造(例えば海馬体の鉤状回(ステージIII)及び扁桃体)、視床及び前障(ステージIV))に進展して蓄積する。最後に、NFTは全ての等皮質野に出現する(等皮質ステージ)が、連合野はより前により重篤に罹患し(ステージV)、続いて一次感覚野、運動野及び視覚野(ステージVI)に出現する。線条体及び黒質の重大な関与は後期等皮質ステージの間に生じる(Serrano-Pozo，Froschら 2011 Cold Spring Harb Perspect Med.，1，a006189)。異なるグループによる複数の臨床病理学的研究により、脳内のNFT量は認知症の重篤度及び継続期間と相関することが確立された(Arriagadaら 1992 Neurology，42，631-9；Biererら 1995 Arch Neurol.，52，81-8；Gomez-Islaら 1997 Ann Neurol.，41，17-2；Giannakopoulosら 2003 Neurology，60，1495-500；Ingelssonら 2004 Neurology，62，925-31)。上述したNFTの選択的分布は、AD型認知症症候群に典型的な階層的な神経心理学的プロフィールと適合する(Serrano-Pozoら 2011 Cold Spring Harb Perspect Med.，1，a006189)。
【０００８】
アルツハイマー病(AD)において、過リン酸化しミスフォールディングしたタウの蓄積は、ニューロンの細胞体、樹状突起及び軸索で生じる。神経原線維変化(NFT)は細胞体中の凝集タウに関連付けられ、主に、海馬、嗅内皮質及び等皮質層の中サイズ錐体ニューロンに見出される。ニューロピルスレッド(Braakら 1986 Neurosci Lett.，65，351-5)は、細胞体の間で揺れ動く、小さな、断片化された蛇行性突起である。これら蛇行性線維(Duyckaertsら 1989 Neuropathol Appl Neurobiol.，15，233-47)は、神経原線維変化を有するニューロンの樹状突起に蓄積するPHFを含有する(Braak及びBraak 1988 Neuropathol Appl Neurobiol.，14，39-44)。ニューロピルスレッドはADにおいて常に神経原線維変化に伴って生じ、神経原線維変性の初期段階に出現する(Braakら 1994 Acta Neuropathol.，87，554-67)。最後に、別のタウ病変：ジストロフィー性神経突起(過リン酸化タウを含有する)は神経突起斑の周囲に見出される。これらは、主に、対合螺旋状フィラメント(PHF)に富む軸索突起から構成される(Kidd 1964 Brain，87，307-20)。興味深いことに、ジストロフィー性神経突起は、アミロイド前駆体タンパク質(APP)、ミトコンドリアポリン及びクロモグラニン-Ａに対して免疫反応性であることがある(Suら 1998 Acta Neuropathol.，96，463-71；Dicksonら 1999 Exp Neurol.，156，100-10；Woodhouseら 2006 Acta Neuropathol.，112，429-37；Perez-Graciaら 2008 Acta Neuropathol.，116，261-8)。
【０００９】
アルツハイマー病(AD)の他に、タウオパチーと呼ばれる関連する神経変性性疾病ファミリーもまた、タウ含有神経原線維変化の沈着により特徴付けられる。これには、進行型核上性麻痺(PSP；スティール-リチャードソン-オルスゼフスキー病)、皮質基底核変性症(CBD)、ピック病(PD)、タウ変異により引き起こされる第17染色体関連振せん麻痺を伴う前頭側頭型認知症(FTDP-17)が含まれる。これらタウオパチーのいずれにおいても、神経原線維の病態は異常過リン酸化タウからなり、新皮質でのこれら病理学的変化は認知症に関連付けられる。疾患が異なれば、異なるタウ凝集体及びフィラメントが存在し得、異なる疾患は異なる組成のタウイソフォーム(タウ3R又は4R)により惹起される。例えばピック病では、ほとんどのタウが、２番目の微小管結合性リピート(R2)をコードするエキソン10を含まない3Rイソフォームである。対照的に、CBD及びPSPでは、ほとんどのタウが4Rである(Morrisら 1999 Mov Dis.，14，731-6；Sergeantら 2005 Biochim Biophys Acta.，1739，179-197；Yoshida 2006 Neuropathology，26，457-470；Liu及びGong 2008 Mol Neurodegener.，3，8；Zhongら 2012 J Biol Chem.，287，20711-9；Avilaら 2013 Aging Dis.，4，23-8；Iqbalら 2013 Front Neurol.，4，112)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
アミロイド斑及びタウ病変のインビボ検出は、アルツハイマー病(AD)及び他のタウオパチーの早期診断の実施並びに治療効果の追跡に重要である。現在、これら病変の検出は、該変化に関して良好な親和性及び特異性を有する分子に基づく。今日、ヒトでは、陽電子断層撮影法(PET)及び磁気共鳴撮像法(MRI)により、アミロイド斑の可視化が可能である。しかし、インビボ画像化様式に用いる化合物の大部分は、タウ病変に結合しない。したがって、特異的なタウ画像化剤を開発する必要性が存在する。最近、Maruyamaらは、[11C]-PBB3-PETを用いて、AD患者のタウ病変をインビボで可視化できる可能性を証明した(Maruyamaら 2013 Neuron.，79，1094-108)。にもかかわらず、化合物を放射性標識する必要があること及び空間分解能が低いことは、依然として、PETベース法の主要な欠点である。逆に、MRIは遥かに高い空間分解能を有し、動物及び患者の撮像に幅広く利用可能である。そうであっても、MRIの感度は低いことから、患者においてNFTを検出することができる専用の造影剤の開発が必要となる。
【００１１】
従来型イムノグロブリンは、２つの重鎖及び２つの軽鎖から構成されるヘテロ四量体であり、合わせた分子量は約150kDaである。ラクダ科のメンバーにおいて、血清抗体の相当な割合が分子量約80kDのホモ二量体IgGである(Hamers-Castermanら 1993 Nature，363，446-448)。この重鎖イムノグロブリン(Ig)は３つのドメインを含有し、その可変領域はVHHと呼ばれる。組換えVHH(サイズ12〜14kD程度)は、インタクトな抗原結合ドメインを構成し、広範な抗原結合レパートリを示す。その超可変領域は拡張しており、特有の特徴(例えば、３〜４の疎水性フレームワーク残基(これらは従来型抗体ではVLと相互作用する)の、より親水性のアミノ酸での置換)を示す。拡がったCDRを安定させるため、VHHは、標準的なジスルフィド結合に加え、ヒトコブラクダではCDR1とCDR3との間、ラマではCDR2とCDR3との間に余分のジスルフィド結合を有し得る(Harmsen及びDe Haard 2007 Appl Microbiol Biotechnol.，77，13-22；Muyldermans 2001 J Biotechnol.，74，277-302)。拡張したCDR3ループは凸面状立体構造を採用することができる一方、従来型パラトープは凹面状又は平面状構造に限られている(Muyldermans 2001 J Biotechnol.，74，277-302)。これら特徴により、VHHは、従来型抗体に対しては免疫原性が乏しい独特なエピトープを認識することが可能である(Lafayeら 2009 Mol Immuno.，46，695-704；Wernery 2001 J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health.，48，561-568)。VHHは、定義によれば、単価抗体(本来、アビディティ効果は排除される)であるが、インビトロでIC50として測定される生物学的活性は、従来型の二価抗体分子に類似することもある(Thysら 2010 Antiviral Res.，87，257-264)。
【００１２】
免疫したラクダ又はラマのVHHレパートリから抗原特異的VHHを選択する方法、例えばファージディスプレイが記載されている。VHH遺伝子をファージディスプレイベクターにクローニングし、パニングにより抗原結合性物質を取得し、選択したVHHを細菌で発現させる。組換えVHHは、従来型抗体フラグメント(Fab又はscFv)と比べて幾つかの利点を有する。なぜならば、唯だ１つのドメインがクローニングされ、これらVHHは良好に発現し、水性環境に高度に可溶性であり、高温で安定だからである。約12〜14kDaの小サイズのために、VHHは迅速に(約60kDaのカットオフを有する)腎濾過体を通過し、迅速な血液クリアランスを生じる。加えて、小サイズにより急速な組織浸透がもたらされる。scFvについての４時間、IgGについての50時間と比較して短いVHH血清半減期(約２時間)は、画像化を利用するインビボ診断及び疾患標的用の興味対象の物質に結合したVHHの標的化に関して有利である。なぜならば、非特異的に結合したVHHが組織から素早く除去されると期待されるからである。更に、少なくとも8.5の等電点を有するVHHは、マイクロピノサイトーシス及び吸収媒介エンドサイトーシスにより、BBBを横切って移動することができる。このようなVHHは、哺乳動物の血液脳関門を横切って興味対象の物質を送達するためのペプチドベクターの製造に使用することができる(国際出願WO 2009/004495及びWO 2010/004432)。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明に至る研究の枠組みの中で、本発明者らは、２匹のアルパカ(Lama pacos)をリン酸化タウ(ホスホ-タウ、リン-タウ又はp-タウ)に富むアルツハイマー病脳(海馬)抽出物及びリン酸化タウタンパク質に対して免疫した。ファージディスプレイライブラリの構築及びパニングによりリン酸化タウを標的するVHHを同定した。細菌での発現後、選択したVHHを、p-タウエピトープに対するイムノブロッティング及びELISAによりスクリーニングし、その後、神経病理学的に確証されたAD又は他のタウオパチーを有するヒト症例及び神経原線維変化病態を有するトランスジェニックマウスモデルの脳切片で試験した。本発明者らは、変異タウトランスジェニックマウス及びADヒトの脳サンプルにおいて細胞体の神経原線維変化、ニューロピルスレッド及びジストロフィー性神経突起を免疫標識するVHHを同定した(タウ-A2又はA2と呼ぶ)。加えて、VHHタウ-A2は、他のタウオパチー、前頭側頭型認知症、皮質基底核変性症及び進行型核上性麻痺におけるグリアp-タウ封入体の検出を可能にする。このVHHタウ-A2は、配列番号１のアミノ酸配列のCDR1(相補性決定領域１)、配列番号２のアミノ酸配列のCDR2及び配列番号３のアミノ酸配列のCDR3を含んでなる配列番号４のアミノ酸配列を有する。VHHタウ-A2は、Ｃ末端タウリン酸化ペプチドのリン酸化セリン422(pS422)を特異的に認識する。更に、常磁性体ガドリニウム(Gd)又はAlexa Fluor(登録商標)488蛍光体でのVHHタウ-A2の標識は、部位特異的結合アプローチを用いて行い、その結果、機能的に有効なVHH接合体を生じた。蛍光VHHタウ-A2の静脈内投与後のライブの二光子顕微鏡観察により、VHHタウ-A2の緩徐な血管外遊出及び神経原線維変化に対する精巧な向性を伴う脳実質への浸透が証明された。
【００１４】
したがって、本発明は、リン酸化タウタンパク質、好ましくはリン酸化タウタンパク質のリン酸化セリン422を指向することを特徴とする単離されたラクダ科動物重鎖抗体可変ドメイン(VHHと呼ぶ)を提供する。
本明細書で使用する場合、タウタンパク質とは、タウタンパク質の周知の６つのイソフォームをいい(Goedertら 1989 Neuron，3，519-26；Himmlerら 1989 Mol Cel Biol.，9，1381-8)、好ましくは4Rイソフォームをいう。
１つの好適な実施形態において、本発明のVHHは、ラクダ科動物をタウタンパク質のＣ末端に由来する配列CSIDMVDS(PO3H2)PQLATLAD(配列番号６)の単一リン酸化ペプチド又はリン酸化タウに富むヒトアルツハイマー病脳(好ましくは海馬)抽出物又はセリン422がリン酸化されたリン酸化タウタンパク質のようなリン酸化タウタンパク質で、好ましくはタウタンパク質のＣ末端に由来する配列CSIDMVDS(PO3H2)PQLATLAD(配列番号６)の単一リン酸化ペプチドで免疫することにより取得可能である。
リン酸化タウに富むヒトアルツハイマー病脳(好ましくは海馬)抽出物は、Merckenら 1992 Acta Neuropathol.，84，265-272に記載されたとおりに取得することができる。
【００１５】
有利には、本発明のVHHは、以下の工程：
(ａ)ラクダ科動物、好ましくはアルパカ(Lama pacos)をタウタンパク質のＣ末端に由来する配列CSIDMVDS(PO3H2)PQLATLAD(配列番号６)の単一リン酸化ペプチド又はリン酸化タウに富むヒトアルツハイマー病脳(好ましくは海馬)抽出物又はリン酸化タウタンパク質(例えばセリン422がリン酸化されたリン酸化タウタンパク質)で、好ましくはタウタンパク質のＣ末端に由来する配列CSIDMVDS(PO3H2)PQLATLAD(配列番号６)の単一リン酸化ペプチドで免疫する工程、
(ｂ)免疫したラクダ科動物の末梢白血球を単離し、トータルRNAを取得し、対応するcDNAを合成する工程(方法は当該分野で公知である；例えば、Lafayeら 1995 Res Immunol.，146，373-82[1996，Res Immunol.，147，61と誤植]を参照)、
(ｃ)VHHドメインをコードするcDNAフラグメントのライブラリを構築する工程、
(ｄ)工程(ｃ)で取得したVHHドメインをコードするcDNAをmRNAにPCRを用いて転写し、mRNAをリボソームディスプレイ形式に変換し、リボソームディスプレイによりVHHドメインを
選択する工程、及び
(ｅ)ベクター(例えば、適切なベクターはpET22(Novagen，Cat. No. 69744-3)である)でVHHドメインを発現させ、任意に、発現したVHHドメインを精製する工程
を含んでなる方法により取得可能である。
【００１６】
本方法の１つの好適な実施形態においては、工程(ａ)では、ラクダ科動物を、500μgの配列CSIDMVDS(PO3H2)PQLATLAD(配列番号６)のペプチド又はリン酸化タウに富むヒトアルツハイマー病脳(好ましくは海馬)抽出物又はセリン422がリン酸化されたリン酸化タウタンパク質で０日目、21日目及び40日目に免疫する。結合したラクダ科動物抗体は、ポリクローナルウサギ抗ラクダ科動物IgG(例えば、Muyldermans 1994 Protein Eng.，7，1129-35を参照)及びホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体で検出することができる。
本方法の別の１つの好適な実施形態においては、工程(ｃ)では、ライブラリは、VHHドメインをコードするDNAフラグメントをPCRにより増幅し、得られたPCR産物をファージベクター(適切なファージベクターの例はpHENである；Hoogenboomら 1992 J Mol Biol.，227，381-8)にライゲートすることにより構築することができる。
工程(ｃ)の１つの特定の実施形態において、VHHドメインをコードするDNAフラグメントは、配列番号７の配列のプライマー(CH2FORTA4と呼ぶ)及び配列番号８の配列のプライマー(VHBACKA6と呼ぶ)を用いるPCRにより増幅し、増幅産物を配列番号９の配列のプライマー(VHBACKA4と呼ぶ)及び配列番号10の配列のプライマー(VHFOR36と呼ぶ)のいずれかを用いる２回目のPCRに付する。このような方法は、国際PCT出願第WO 2004/044204号に記載されている。
【００１７】
リボソームディスプレイ技術により、タンパク質を該タンパク質をコードするmRNAと共にインビトロで選択することが可能になる。特定のタンパク質、例えばVHHフラグメントをコードするDNAライブラリをインビトロで転写する。mRNAを精製して、インビトロ翻訳に使用する。mRNAは停止コドンを欠くので、リボソームはmRNAの末端部で立ち往生し、mRNA、リボソーム及び機能的タンパク質の三元複合体を生じる(Hanes及びPlucktum 1997 Proc Natl Acad Sci U.S.A.，94，4937-42)。これら三元複合体のライブラリを見込まれるリガンド(抗体の場、抗原)に対して試験する。三元複合体(リボソーム、mRNA、タンパク質)のリガンドへの結合により、当該複合体に結合しており逆転写PCR(RT-PCR)でcDNAへ転写することができるコーディングmRNAの回収が可能となる。稀なリガンド結合性分子を富化するため及び最良の親和性を有する分子を選択するために、選択及び回収のサイクルを繰り返すことができる。リボソームディスプレイ選択の方法は当該分野で公知である；例えばMouratouら 2007 Proc Natl Acad Sci U.S.A.，104，17983-8を参照。
【００１８】
本発明のVHHの１つの好適な実施形態において、そのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端へ、配列番号１のアミノ酸配列(VHHのCDR1に相当)、配列番号２のアミノ酸配列(CDR2に相当)及び配列番号３のアミノ酸配列(CDR3に相当)を含んでなる。
１つのより好適な実施形態において、VHHは、以下のアミノ酸配列：
−  配列番号４(完全長形態のVHHタウ-A2に相当)、又は
−  配列番号５(短形態のVHHタウ-A2に相当)
からなる。
【００１９】
本明細書で使用する場合、用語「単離(された)」とは、天然環境の成分から分離されたVHHをいう。幾つかの実施形態において、VHHは、例えば電気泳動(例えば、SDS-PAGE、等電点電気泳動(IEF)、キャピラリ電気泳動)又はクロマトグラフィー(例えば、ゲル濾過、イオン交換又は逆相HPLC)により測定したとき、純度95％又は99％を超えて精製される。抗体純度の評価方法の概説については、例えば、Flatmanら 2007 J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.，848，79-87を参照。
本明細書で使用する場合、用語「VHH」とは、ラクダ科動物(ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカなど)の重鎖抗体の可変抗原結合ドメインをいう(Nguyenら 2000 EMBO J.，19，921-930；Muyldermans 2001 J Biotechnol.，74，277-302及びVanlandschootら 2011 Antiviral Res. 92，389-407の概説を参照)。VHHはナノボディ(Nb)とも呼ばれる。
【００２０】
有利には、本発明に従うVHHは、塩基性等電点、好ましくは8.5〜10.5、より好ましくは9.5〜10.5の間の等電点(pI)を有する。
本発明は、天然、組換え又は合成の上記のとおりのVHHを包含する。
本明細書で使用する場合、用語「組換え」とは、遺伝子操作法(クローニング、増幅)を用いて前記VHHを作製することをいう。
本明細書で使用する場合、用語「合成」とは、インビトロでの化学的及び/又は酵素的合成による前記VHHの作製をいう。
本発明に従うVHHは、単量体又はホモ多量体(例えば、ホモ二量体又はホモ三量体)の形態であることができる。
【００２１】
本発明はまた、ラクダ科動物をタウタンパク質のＣ末端に由来する配列CSIDMVDS(PO3H2)PQLATLAD(配列番号６)の単一リン酸化ペプチド又はリン酸化タウに富むヒトアルツハイマー病脳(好ましくは海馬)抽出物又はセリン422がリン酸化されたリン酸化タウタンパク質のようなリン酸化タウタンパク質で免疫する工程を含んでなる、好ましくは上記のとおりの工程(ａ)〜(ｅ)を含んでなる、上記のとおりのリン酸化タウタンパク質を指向するVHHを取得する方法を提供する。
本発明はまた、本発明に従うVHHを含んでなる単離されたラクダ科動物血清、好ましくはアルパカ血清を提供する。
本発明はまた、上記のとおり、リン酸化タウタンパク質のリン酸化セリン422を指向し、そのアミノ酸配列が配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも95％の同一性又は好ましさが増す順に、少なくとも96％、97％、98％若しくは99％の同一性を有する、配列番号５のVHHタウ-A2の単離されたバリアントを提供する。
特に断らない限り、本明細書において言及する２つの配列間の同一性パーセントは、当該２つの配列の全長にわたるアラインメントから算出する。
本バリアントの１つの好適な実施形態において、そのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端へ、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列及び配列番号３のアミノ酸配列を含んでなる。
【００２２】
別の１つの好適な実施形態において、バリアントは、以下の変異：
−  配列番号５のアミノ酸配列の３位のグルタミン残基(Glu，Ｑ)がアスパラギン酸(Asp，Ｄ)及びグルタミン酸(Glu，Ｅ)からなる群より選択されるアミノ酸残基、好ましくはGluで置換されており、
−  配列番号５のアミノ酸配列の52位のイソロイシン残基(Ile，Ｉ)がアラニン(Ala，Ａ)及びグリシン(Gly，Ｇ)からなる群より選択されるアミノ酸残基、好ましくはGlyで置換されており、
−  配列番号５のアミノ酸配列の86位のバリン残基(Val，Ｖ)がアラニン(Ala，Ａ)、セリン(Ser，Ｓ)、チロシン(Tyr，Ｔ)、アスパラギン(Asp，Ｎ)、グルタミン(Gln、Ｑ)、アスパラギン酸(Asp，Ｄ)、グルタミン酸(Glu，Ｅ)、リジン(Lys、Ｋ)、アルギニン(Arg、Ｒ)及びグリシン(Gly，Ｇ)からなる群より選択されるアミノ酸残基、好ましくはGlyで置換されており、
−  任意に、２つのアミノ酸残基が配列番号５のアミノ酸配列のＮ末端位置に付加されており、当該２つのアミノ酸残基がジペプチド グルタミン酸-バリン(E-V)及びアスパラギン酸-バリン(D-V)からなる群より選択され、好ましくはD-Vである
を有する配列番号５のアミノ酸配列を有する。
【００２３】
１つの特定の実施形態において、VHHバリアントは、配列番号15のアミノ酸配列から本質的になる。
別の１つの特定の実施形態において、VHHバリアントは、配列番号16のアミノ酸配列から本質的になる(このVHHバリアントは、配列番号５のアミノ酸配列と比較して、Ｎ末端位置に追加のジペプチドを含まない)。
本発明はまた、本発明に従うVHH又はVHHバリアント(好ましくは配列番号15のVHHバリアント)を含むポリペプチドからなり、該ポリペプチドに含まれるVHH又はVHHバリアントがリン酸化タウタンパク質、好ましくはリン酸化タウタンパク質のリン酸化セリン422に結合することができるVHH誘導体を提供する。
【００２４】
別の１つの特定の実施形態において、VHH誘導体は式P-C-Z又はZ-C-P、好ましくはP-C-Z(式中、
− Ｐは、本発明に従うVHH又はVHHバリアントを含んでなるか又は該VHH又はVHHバリアントからなる、100〜500アミノ酸、好ましくは100〜150アミノ酸のペプチドであって、そのアミノ酸配列が接近可能な還元型システイン残基を有しない、好ましくは還元型システイン残基を有しない、ペプチドであり、
− Ｃはシステイン残基であり、
− Ｚは、システイン残基を含有しない、１〜10アミノ酸スペーサー、好ましくは１〜10の中性又は負荷電アミノ酸のスペーサーであって、そのアミノ酸残基は同一であるか又は異なる、スペーサーである)
を有する。
本発明に関して、表現「接近可能な還元型システイン残基」とは、本発明に従って規定されるとおりの接合工程に関して接近可能なシステイン残基をいう。
【００２５】
１つの好適な実施形態において、VHH誘導体は式P-C-Z又はZ-C-P、好ましくはP-C-Z
(式中、
− Ｐは、接近可能な還元型システイン残基を有しない、好ましくは還元型システイン残基を有しない、100〜500アミノ酸、好ましくは100〜150アミノ酸のペプチドであり、
− Ｃはシステイン残基であり、
− Ｚは、
ａ)そのアミノ酸残基がセリン(Ｓ)、アラニン(Ａ)、バリン(Ｖ)及びグリシン(Ｇ)からなる群、より好ましくはセリン(Ｓ)、アラニン(Ａ)及びバリン(Ｖ)からなる群より選択される、２〜10アミノ酸スペーサー、好ましくは２アミノ酸スペーサーであって、その少なくとも２つのアミノ酸残基は異なるスペーサーを表すか、又は
ｂ)システイン残基を含有せず、ジペプチド セリン-アラニン(S-A)及びセリン-バリン(S-V)を含んでなる、２〜10アミノ酸スペーサー、好ましくは２〜10の中性又は負荷電アミノ酸のスペーサーを表す)
を有する。
有利には、システイン残基Ｃは立体的に接近可能である。
有利には、アミノ酸スペーサーＺのアミノ酸残基は、アラニン、バリン、セリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンからなる群より、好ましくはアラニン、バリン及びセリンからなる群より選択される。
有利には、Ｚがａ)に規定されるとおりである場合、アミノ酸スペーサーＺは１つの又は少なくとも１つのセリンを含んでなり、より有利には、アミノ酸スペーサーＺはセリン及びアラニン残基のみ又はセリン及びバリン残基のみから本質的になる。
【００２６】
本VHH誘導体の１つの好適な実施形態において、アミノ酸スペーサーＺは２アミノ酸の配列、例えば、アミノ酸配列S-A又はS-Vからなる。
式P-C-ZのVHH誘導体のアミノ酸配列Ｐは、そのＣ末端に、１〜10アミノ酸スペーサーＹ、好ましくは１〜10の中性又は負荷電アミノ酸のスペーサー(ここで、前記アミノ酸スペーサーＹのアミノ酸残基は同一か又は異なり、前記アミノ酸スペーサーＹはシステイン残基を含有しない)を有することができる。
式Z-C-PのVHH誘導体のアミノ酸配列Ｐは、そのＮ末端に、１〜10アミノ酸スペーサーＹ、好ましくは１〜10の中性又は負荷電アミノ酸のスペーサー(ここで、前記アミノ酸スペーサーＹのアミノ酸残基は同一か又は異なり、前記アミノ酸スペーサーＹはシステイン残基を含有しない)を有することができる。
有利には、アミノ酸スペーサーＹのアミノ酸残基は、アラニン、バリン、セリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンからなる群より、好ましくはアラニン、バリン、セリン及びグリシンからなる群より選択される。
好ましくは、アミノ酸スペーサーＹは、４つの中性アミノ酸のスペーサー、例えばアミノ酸配列G-G-G-S(配列番号11)を表す。
【００２７】
式P-C-ZのVHH誘導体のアミノ酸配列Ｐはまた、そのＮ末端に、１〜50アミノ酸配列Ｘ(ここで、前記アミノ酸配列Ｘのアミノ酸残基は同一か又は異なり、前記アミノ酸配列Ｘはシステイン残基を含有しない)を有することができる。
式Z-C-PのVHH誘導体のアミノ酸配列Ｐはまた、そのＣ末端に、１〜50アミノ酸配列Ｘ(ここで、前記アミノ酸配列Ｘのアミノ酸残基は同一か又は異なり、前記アミノ酸配列Ｘはシステイン残基を含有しない)を有することができる。
アミノ酸配列Ｘは、タグ、例えば６×Hisタグ(配列番号12)、及び酵素切断部位、例えばアミノ酸配列LVPRGS(配列番号13)のトロンビン切断部位を含んでなることができる。
【００２８】
１つの好適な実施形態において、本発明に従うVHH誘導体は、式P'-C-Z、P'-Y-C-Z、X-P'-C-Z、X-P'-Y-C-Z、Z-C-P'、Z-C-Y-P'、Z-C-P'-X又はZ-C-Y-P'-X(ここで、P'は本発明に従うVHH又はVHHバリアントである)を有する。
有利には、前記VHH誘導体は、Ｎ末端からＣ末端へ、アミノ酸タグ、例えば６×Hisタグ、酵素切断部位、例えばトロンビン切断部位、本発明に従うVHH又はVHHバリアント、アミノ酸スペーサー、システイン及び第２のアミノ酸スペーサーを含んでなる。このVHH誘導体は、式X-P'-Y-C-Z(式中、Ｐ'はVHH又はVHHバリアントである)のVHH誘導体に相当する。
１つの好適な実施形態において、前記VHH誘導体は配列番号14のアミノ酸配列を有する(タウ-A2-SH)。
別の１つの好適な実施形態において、前記VHH誘導体は配列番号17のアミノ酸配列を有する(タウ-A2var-SH)。このVHH誘導体は本発明に従う配列番号15のVHHバリアントを含んでなる。
【００２９】
本発明はまた、本発明に従うVHH又はVHHバリアント又はVHH誘導体をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
本発明に従うポリヌクレオチドは、組換えDNA技術及び/又は化学的DNA合成の周知の方法により取得してもよい。
本発明はまた、本発明に従うポリヌクレオチドを、宿主細胞における前記ポリヌクレオチドの転写の調節を可能とする転写プロモーターの制御下に含んでなる組換え発現カセットを提供する。前記ポリヌクレオチドはまた、宿主細胞におけるその翻訳の調節を可能にする適切な制御配列に連結することができる。
本発明はまた、本発明に従うポリヌクレオチドを含んでなる組換えベクター(例えば、組換え発現ベクター)を提供する。有利には、前記組換えベクターは、本発明に従う発現カセットを含んでなる組換え発現ベクターである。
【００３０】
用語「ベクター」とは、本明細書で使用する場合、連結した別の核酸を伝播させることができる核酸分子をいう。この用語には、自己複製核酸構造としてのベクター、及び導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターが含まれる。或る特定のベクターは、それが作動可能に連結した核酸の発現を導くことができる。このようなベクターは本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。
本発明はまた、本発明に従う組換え発現カセット又は組換えベクターを含有する宿主細胞を提供する。宿主細胞は原核生物又は真核生物宿主細胞である。
用語「宿主細胞」とは、外因性核酸が導入された細胞をいい、当該細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、形質転換細胞には、初代形質転換細胞、及び継代数にかかわらず初代形質転換細胞から誘導された子孫が含まれる。子孫は、核酸内容物が親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含有してもよい。最初の形質転換細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体子孫もまた含まれる。
【００３１】
６×ヒスチジンタグを有する配列番号４のアミノ酸配列のVHHタウ-A2を発現する真核生物宿主細胞を、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM；28 rue du Dr Roux，75724 Paris Cedex 15，France)に番号I-4835で2014年１月16日に寄託した。
配列番号14のアミノ酸配列のVHHタウ-A2-SHを発現する真核生物宿主細胞を、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM；28 rue du Dr Roux，75724 Paris Cedex 15，France)に番号I-4836で2014年１月16日に寄託した。
配列番号17のアミノ酸配列のVHHタウ-A2var-SH(タウA2 VAR-SHとも呼ぶ)を発現する真核生物宿主細胞を、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM；28 rue du Dr Roux，75724 Paris Cedex 15，France)に番号I-4951で2015年１月21日に寄託した。
【００３２】
本発明はまた、上記のとおりの宿主細胞において式P-C-Z又はZ-C-Pのオリゴペプチドを製造する方法であって以下の工程：
−  本発明に従う組換え発現カセット又は組換えベクターを含有する宿主細胞を提供する工程、
−  前記宿主細胞を培養する工程、
−  任意に、式P-C-Z又はZ-C-Pのオリゴペプチドを精製する工程
を含んでなる方法を提供する。
オリゴペプチドを精製する方法、例えばクロマトグラフィー(例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル透過クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィー)は、当該分野において周知である。
【００３３】
本発明はまた、興味対象の物質に直接又は間接に共有結合又は非共有結合した本発明に従うVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体(特に、上記の式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体)を含んでなる診断剤又は治療剤を提供する。
本発明に従う興味対象の物質は、哺乳動物又はヒトの血液脳関門を透過してもしなくてもよい。興味対象の物質が血液脳関門を透過する場合、本発明に従うVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体(特に、上記の式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体)の使用により、血液脳関門を横切る前記興味対象の物質の送達を増強させることができる。
１つの実施形態において、前記興味対象の物質は診断又は治療用化合物である。
別の１つの実施形態において、前記興味対象の物質は、診断又は治療用化合物を含んでなるリポソーム又はポリマー性物質である(Villarazaら 2010 Chem Rev.，110，2921-2959)。
【００３４】
有利には、前記診断用化合物は、以下：
−  酵素、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース-6-ホスファターゼ又はβ-ガラクトシダーゼ；
−  蛍光体、例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)、紫外(UV)領域の波長で励起される青色蛍光色素(例えば、AMCA(7-アミノ-4-メチルクマリン-3-酢酸)；Alexa Fluor(登録商標)350)、青色光で励起される緑色蛍光色素(例えば、FITC、Cy2、Alexa Fluor(登録商標)488)、緑色光で励起される赤色蛍光色素(例えば、ローダミン、Texas Red、Cy3、Alexa Fluor色素546、564及び594)、又は近赤外光で励起される色素(例えば、Cy5)(これらは電子検出器(CCDカメラ、光電子増倍管)で可視化される)；
−  放射性同位体、例えば、PET撮像法に使用することができる18F、11C、13N、15O、68Ga、82Rb、44Sc、64Cu、86Y、89Zr、124I、152Tb、又はSPECT/シンチグラフィー研究に使用することができる67Ga、81mKr、99mTc、111In、123I、125I、133Xe、201Tl、155Tb、195mPt、又はオートラジオグラフィー若しくはインサイチュハイブリダイゼーションに使用することができる14C、3H、35S、32P、125I、又は化合物の標識に使用することができる211At-、212Bi-、75Br-、76Br-、131I-、111In、177Lu-、212Pb-、186Re-、188Re-、153Sm-、90Y；
−  NMR又はMRI造影剤、例えば、常磁性体 ガドリニウム(Gd)、ジスプロシウム(Dy)及びマンガン(Mn)、及び酸化鉄(例えば、MION、SPIO又はUSPIO)又は鉄白金(SIPP)をベースにする超常磁性体、及びＸ核、例えば、18F、13C、23Na、17O、15N；
−  ナノ粒子、例えば、金ナノ粒子(B. Van de Broekら，ACSNano，Vol. 5，No. 6，4319-4328，2011)又は量子ドット(A. Sukhanovaら，2012 Nanomedicine，8 516-525)
からなる群より選択される。
【００３５】
１つの好適な実施形態において、前記診断用化合物は、蛍光体、より好ましくはAlexa Fluor(登録商標)488であるか、又はMRI造影剤、より好ましくはガドリニウムである。
診断剤は、検出に使用される場合、シンチグラフィー研究用の放射性原子、例えば99Tc若しくは123I、又は核磁気共鳴(NMR)撮像(MRIとしても知られる)用のスピン標識、例えば、13C、9F、Fe、Gd、123I、111In、Mn、15N若しくは7Oを含んでなってもよい。
有利には、前記治療用化合物は、ペプチド、酵素、核酸、ウイルス及び化合物から選択される。前記治療用化合物は、鎮痛化合物、抗炎症化合物、抗抑うつ化合物、抗痙攣化合物、細胞毒性化合物又は抗神経変性化合物であることができる。
上記の興味対象の物質は、本発明に従うVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体(特に、上記の式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体)に、該VHH、VHHバリアント若しくはVHH誘導体(特に、上記の式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体)の一方の末端部(Ｎ末端又はＣ末端)で又は該VHH、VHHバリアント若しくはVHH誘導体の１つのアミノ酸の側鎖で、直接に共有結合又は非共有結合していることができる。興味対象の物質はまた、前記VHH、VHHバリアント又はVHH誘導体に、該VHH、VHHバリアント若しくはVHH誘導体(特に、上記の式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体)の一方の末端部で又は該VHH、VHHバリアント若しくはVHH誘導体の１つのアミノ酸の側鎖で、スペーサーにより間接的に共有結合又は非共有結合していることができる。ペプチド(特に抗体)に興味対象の物質を結合する従来方法は当該分野において公知である(例えば、Ternynck及びAvrameas 1987 「Techniques immunoenzymatiques」 INSERM編，Paris；Hermanson，2010，Bioconjugate Techniques，Academic Pressを参照)。
【００３６】
多くの化学的架橋法もまた当該分野において公知である。架橋試薬はホモ二官能性(すなわち、同じ反応を受ける２つの官能基を有する)であってもよいし、ヘテロ二官能性(すなわち、２つの異なる官能基を有する)であってもよい。多くの架橋試薬が市販されている。使用に関する詳細な指示は、商業的供給業者から容易に入手可能である。ポリペプチド架橋及び接合体製造に関する一般的な言及は、WONG，Chemistry of protein conjugation and cross-linking，CRC Press (1991)に見出される。
本発明に従うVHH又はVHHバリアント又はVHH誘導体(特に、上記の式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体)は、当該分野に公知である一般的な有機化学技法を利用して、特定の放射性同位体、NMR若しくはMRI造影剤、蛍光体、ナノ粒子又は酵素で標識してもよい。例えば、March，J. ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY：REACTIONS，MECHANISMS，AND STRUCTURE(第３版、1985)；Hermanson，2010，Bioconjugate Techniques，Academic Pressを参照。
【００３７】
加えて、本発明に従うVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体はまた、ジアゾニウムヨウ化物を直接介するジアゾ化アミノ誘導体のヨウ素化により(Greenbaum 1936 F Am J Pharm.，108，17を参照)、又は不安定なジアゾ化アミンの安定なトリアゼンへの変換により、又は非放射性ハロゲン化前駆体の安定なトリアルキルスズ誘導体(これは、次いで、当該分野に周知の幾つかの方法によりヨウ素化合物へ変換することができる)への変換により、任意の適切な放射性ヨウ素同位体、例えば、131I、125I又は123I(ただし、これらに限定されない)で標識されてもよい。Satyamurthy及びBarrio 1983 J Org Chem.，48，4394；Goodmanら 1984 J Org Chem.，49，2322；Mathisら 1994 J Labell Comp Radiopharm.，905；Chumpraditら 1991 J Med Chem.，34，877；Zhuangら 1994 J Med Chem.，37，1406；Chumpraditら 1994 J Med Chem.，37，4245を参照。
具体的には、本発明に従うVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体は、当該分野に公知の幾つかの技法のいずれかにより、SPECT用に123Iで標識することができる。例えば、Kulkarni 1991 Int J Rad Appl Inst. (Part B) 18，647を参照。
【００３８】
本発明に従うVHH又はVHHバリアント又はVHH誘導体はまた、公知の金属放射性標識、例えば、テクネチウム-99m(99mTc)で放射性標識してもよい。そのような金属イオンに結合するリガンドを導入するための置換基の改変は、放射性標識の分野の当業者により、過度の実験を要することなく行うことができる。その後、本発明に従う金属放射性標識VHH、VHHバリアント又はVHH誘導体を用いて、神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起を検出することができる。99mTcの放射性標識誘導体の製造は当該分野において周知である。例えば、Zhuangら 1999 Nucl Med Biol.，26，217-24；Oyaら 1998 Nucl Med Biol.，25，135-40；Hornら 1997 Nucl Med Biol.，24，485-98を参照。
本発明はまた、興味対象の物質と直接又は間接に結合した本発明に従うVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体(特に、上記の式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体)(機能的接合体)を取得するための結合方法に関する。
第１のストラテジによれば、本発明に従うVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体を、非部位特異的アプローチを用いて興味対象の物質に接合する。前記非部位特異的方法は、興味対象の物質と本発明に従うVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体との接合工程を含んでなる。
【００３９】
興味対象の物質が金属、例えばNMR又はMRI造影剤(例えば、常磁性体 ガドリニウム(Gd)、ジスプロシウム(Dy)及びマンガン(Mn)、酸化鉄若しくは鉄白金をベースとする超常磁性体、及びＸ核、例えば18F、13C、23Na、17O、15N、或いは例えば、放射性金属同位体(例えば、90Y、177Lu、64Cu、99mTc、111In、212Pb、212Bi)である場合、非部位特異的方法にはキレート剤が用いられ、以下の工程：
(i)エステル又は無水物の形態、好ましくはエステルの形態の活性化されたキレート剤を、本発明に従うVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体のリジン残基と接合する工程、及び
(ii)工程(i)のリガンドを興味対象の物質でキレート化する工程
が含まれる。
【００４０】
キレート剤を用いる非部位特異的方法の代替法は、興味対象の物質がキレート剤で「予備キレート化」される方法であり、以下の工程：
(i')興味対象の物質を、エステル又は無水物の形態、好ましくはエステルの形態の活性化されたキレート剤でキレート化する工程、及び
(ii')工程(i')の予備キレート化した興味対象の物質を、本発明に従うVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体のリジン残基と接合する工程
を含んでなる。
接合工程(i)又は(ii')の間、温度は、１℃から40℃まで、好ましくは４℃から20℃まで変化してもよい。溶液は１〜６時間撹拌してもよい。好ましくは、pHは接合工程(i)又は(ii')の間、７〜8.5の間で維持する。
【００４１】
接合工程(i)又は(ii')は、イミダゾールを含むか又は含まないPBS/NaCl中で行うことができる。
接合工程(i)又は(ii')の間、エステル又は無水物の形態の活性化されたキレート剤は、緩衝液、例えばリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)溶液に溶解してもよい。
１つの好適な実施形態において、エステル又は無水物の形態の活性化されたキレート剤とVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体のリジン残基のアミノ官能基との間のモル比は、１〜10の範囲であり、好ましくは４である。
接合工程(i)とキレート化工程(ii)との間、又はキレート化工程(i')と接合工程(ii')との間に、透析濾過又は透析による緩衝液交換工程が存在してもよい。有利には、溶液は、例えばVivaspinTMデバイスを用いて、透析濾過される。この緩衝液交換工程の間、媒体は１〜５℃の範囲の温度で冷却される。この緩衝液交換工程の間、緩衝液は、例えば酢酸ナトリウム溶液と、好ましくは０〜６時間、より好ましくは２〜３時間の撹拌下で、交換される。
キレート化工程(ii)又は(i')の間、溶液を１〜４時間、好ましくは２〜３時間撹拌する。キレート化工程は、好ましくは１〜60℃、より好ましくは４℃で行う。
【００４２】
その後、透析濾過又は透析による第２の緩衝液交換工程が存在してもよい。有利には、溶液は、例えばVivaspinTMデバイスを用いて、透析濾過される。この第２の緩衝液交換工程の間、媒体は１〜５℃の範囲の温度で冷却される。この第２の透析濾過工程の間、緩衝液は、例えば、NaClを含有するPBSの混合物(PBS/NaCl；有利には300mM NaCl)と交換される。緩衝液は、同じ方法(透析濾過)により濃縮されてもよい。
リジン数に依存して、VHH、VHHバリアント又はVHH誘導体あたりの興味対象の物質の平均密度は、０〜(リジン数＋１)の間で変化してもよい。好ましくは、VHH、VHHバリアント又はVHH誘導体あたりの興味対象の物質の平均密度は、０〜６の間で変化してもよい。
【００４３】
第二のストラテジによれば、本発明に従う式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体は、興味対象の物質に、部位特異的アプローチを用いて接合する。部位特異的アプローチは以下の利点を有する：
− 式P-C-Z又はZ-C-Pの標識VHH誘導体は化学的に規定されている。なぜならば、本方法により、ヒト使用の観点(品質管理、安全性など)で必須の特徴である十分に規定された接合体が得られるからである。
− この方法は容易で標準である。なぜならば、興味対象の物質での式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体の標識は、短い反応時間で単純な手順による単一工程で実施することができるからである。工程中のモニタリングの必要がなく、標識の程度と結合性との間での妥協の必要もない。これらは、更なる最適化、実験再現性及び製造規模拡大のための鍵となる利点である。
− この方法は、式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体の鍵となる特性に影響しない：例えば、接合体のpIは、BBB横断を可能にするはずである8.5を超えて維持される。更に、標的に関して接合体と競合し得る非標識の式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体が残存しない；生理学的pHでの短い反応時間という温和な条件は、式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体を、起こり得る変性及び/又は活性喪失から保護する。
− この方法は融通が利く。なぜならば、この方法によれば、種々の式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体と造影剤、蛍光体又は他の興味対象の分子とを別々に製造し、その後単一工程で組み合わせることができる柔軟なモジュール型アプローチが可能となるからである。その結果、接合体のセットについて、最適化並びにIHC(免疫組織化学)及びMRI(磁気共鳴撮像法)による川下評価を容易に行うことができる。
− とりわけ、この方法により、全体収率の向上が可能となる一方、反応工程数が減り、VHHのリジン又はヒスチジンでの副反応がなく、VHHの機能及び3D構造が全体的に維持される。
【００４４】
本発明に従う部位特異的方法は、本発明に従う式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体と、興味対象の物質を有するチオール反応性化合物、例えば、興味対象の物質を有する下記の式(I)又は(I')のマレイミド化合物とのチオール付加による接合工程を含んでなる。非部位特異的接合は当初緩衝液の交換を要した一方、VHH、特にタウ-A2-SH又はタウ-A2var-SHと、興味対象の物質を有するチオール反応性化合物との間の部位特異的接合は、PBS/NaCl/イミダゾール緩衝液中で直接行うことができる。システインでの特異的チオ付加は、穏やかな条件下で効率的に制御され得るため、該ストラテジにより、A. Papiniら，Int. J. Pept. Protein Res.，1992, 39，348-355；B. Rudolfら，J. Organomet. Chem，1996，522，313-315；J. Paulechら，Biochim. Biophys. Acta，2013，1834，372-379で以前に言及されている起こり得る副反応を生じることなく、該プロセスの反応工程数の削減及び全体収率の向上が可能になる。
【００４５】
組換えタンパク質は、通常、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)による精製を可能にするHisタグを有して発現させる。Ni2+ニトリロ三酢酸樹脂を用いる場合、組換えタンパク質は、代表的には、500mMイミダゾール含有PBS緩衝液で溶出させる。非部位特異的アプローチでは、イミダゾールの窒素は、NHSエステル加水分解を促進する(すなわち、反応性種を分解する)ことによって接合体化に干渉することがある(G. T. Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，2013；P. Cuatrecasasら，Biochemistry，1972，11，2291-2299)。したがって、緩衝液交換工程を、このプロセスに、上流のアフィニティー精製と接合体化の間で含ませて、イミダゾールを除去しなければならない。幾つかのグループ(A. Papiniら；B. Rudolfら；J. Paulechら)がヒスチジン側鎖のアルキル化を以前に報告していることから、イミダゾールとマレイミド基との副反応が予想された。にもかかわらず、アフィニティーカラム溶出緩衝液において、限定的に過剰のマレイミド試薬及びモル大過剰のイミダゾールを用い、興味対象の物質を有するチオール反応性化合物をVHH、特にタウ-A2-SH又はタウ-A2var-SHと直接接合させることができた。
【００４６】
式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体のシステインとチオール反応性化合物、例えば下記の式(I)又は(I')のマレイミド化合物との間でのチオ付加は、０〜20℃の範囲の温度、好ましくは４℃で、例えば２〜４時間行うことができる。
前記オリゴペプチドのシステインとチオール反応性化合物、例えば下記の式(I)又は(I')のマレイミド化合物との間でのチオ付加は、好ましくは４〜7.5の範囲のpH、より好ましくはpH6.8で行う。pHが４未満であれば、反応は進行せず、7.5を超えると、反応は非特異的となる(リジンに反応する)。接合工程は、イミダゾールを含むか又は含まないPBS/NaCl中、好ましくはイミダゾールの存在下に行うことができる。
その後、透析濾過又は透析による緩衝液交換工程が存在してもよい。有利には、溶液は、例えばVivaspinTMデバイスを用いて、透析濾過される。次いで、溶液は、同じ方法(透析濾過)により濃縮されてもよい。
しかし、接合工程をイミダゾールを含むPBS/NaCl中で行う場合、(イミダゾールを除去しないために)その後の透析濾過又は透析工程を行わないことが好ましい。
非特異的方法であっても、特異的方法であっても、興味対象の物質は上記のとおりであり得る。
１つの好適な実施形態によれば、興味対象の物質は、上記のとおりの治療用又は診断用化合物、好ましくは、上記のとおりの蛍光体、放射性同位体及びNMR又はMRI造影剤からなる群より選択される診断用化合物である。
【００４７】
本発明者らは、興味対象の物質が蛍光体又はNMR若しくはMRI造影剤である場合、合成した接合体が非標識VHHの重要な機能的特性を保持することを観察した。
１つの好適な実施形態によれば、興味対象の物質は、蛍光体、例えば、青色光により励起される緑色蛍光色素、具体的にはFITC、Cy2、Alexa Fluor(登録商標)488、好ましくはAlexa Fluor(登録商標)488である。
別の１つの好適な実施形態によれば、興味対象の物質は、NMR又はMRI造影剤、例えば、常磁性体 ガドリニウム(Gd)、ジスプロシウム(Dy)及びマンガン(Mn)、酸化鉄(例えば、MION、SPIO、USPIO)又は鉄白金(SIPP)をベースにする超常磁性体、及びＸ核、例えば、18F、13C、23Na、17O、15Nである。より好ましくは、興味対象の物質は、常磁性体 ガドリニウム(Gd)、ジスプロシウム(Dy)及びマンガン(Mn)から選択されるNMR又はMRI造影剤であり、好ましくはガドリニウム(Gd)である。
【００４８】
キレート剤は、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸(DOTA)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、1,4,7-トリス(カルボキシメチルアザ)シクロドデカン-10-アザアセチルアミド(DO3A)、ニトリロ三酢酸(NTA)(Chongら 2008 Bioconjug Chem.，19，1439-47)、D-ペニシラミン(Pen)、2,3-ジメルカプトコハク酸(DMSA)、2,3-ジメルカプト-1-プロパンスルホン酸(DMPS)(Andersen 1999 Chem Rev.，99，2683-2710)、2,3-ジメルカプトプロパノール(BAL)、トリエチレンテトラミン(Trien)、テトラチオモリブデン酸アンモニウム(TTM)アニオン(Brewer及びAskari 2005 J Hepatol.，42，S13-S21)、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、2-(p-イソチオシアナトベンジル)-6-メチル-ジエチレントリアミン五酢酸(IB4M)(Nweら 2011 J Inorg Biochem.，105，722-7)、ヒドロキシピリジノン(HOPO)(Villarazaら，2010 Chem Rev.，110，2921-59)から選択されてもよい。
興味対象の物質がガドリニウムである場合、DOTAが好ましいキレート剤である。
【００４９】
本発明はまた、システイン残基Ｃが、スルフィド結合により、好ましくはチオエーテル又はジスルフィド結合により、少なくとも１つの興味対象の物質に結合している上記式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体を提供する。有利には、システイン残基Ｃは、少なくとも１つの興味対象の物質に、当該興味対象の物質を有するチオール反応性化合物により結合している。
本発明に関して、チオール反応性化合物は、マレイミド、ハロアセチル、アルキルハライド若しくはアジリジン化合物、アクリロイル誘導体、アリール化剤、又はチオール-ジスルフィド交換試薬(Hermanson G. T.，2010，Bioconjugate Techniques，Academic Press)である。
本発明に関して、マレイミド化合物は、少なくとも１つのマレイミド官能基、好ましくは１〜６のマレイミド官能基、より好ましくは１つのマレイミド官能基を有する化合物である。
好ましくは、チオール反応性化合物は、マレイミド官能基のＣ-Ｃ二重結合を介してシステイン残基Ｃと反応するマレイミド化合物である。
【００５０】
本発明のマレイミド化合物は、以下のとおりの式(I)：
【化１】
2020015754.tif 000002
(I)
(式中：
− Ｂ、Ｂ'1、Ｂ'2及びＢ”は、同一か又は異なって、独立して、単結合、又はポリオール(例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、好ましくは２〜12のオキシエチレン(OE)単位を有するもの)、ポリオレフィン(好ましくは、２〜12の芳香環を有するもの)、ポリアルキル(好ましくは、２〜12の炭素原子を有するもの)、ビニルポリマー(例えば、ポリ(アルキルメタクリレート)、好ましくは２〜12のメタクリレート基を有するもの)、ポリアルデヒド(好ましくは、２〜12のカルボニル基を有するもの)、ポリ酸エステル(好ましくは２〜12のエステル基を有するもの)から選択されるスペーサーであり、
− Ｄ、Ｄ'及びＤ”は、同一か又は異なって、独立して、アミン、アミド、アミノアルコール、尿素、チオ尿素、カルバメート、カルボネート、エステル、エーテル、チオエーテル、アリール、ヘテロアリール(例えば、トリアゾール)、オキシム基から選択され、
− Ａは単結合又はキレート剤であり、
− SIは興味対象の物質であり、
− Ｘ'は、酸、アミン、アミド、エステル、エーテル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はヘテロアリール官能基であり、
− ｎ=１〜100、好ましくはｎ=１、２又は３)
のものであり得る。
【００５１】
本発明に関しては：
− アルキル基は、(C1〜C12)アルキル基、好ましくは(C1〜C6)アルキル基、例えばメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、tert-ブチル及びイソブチル基から選択される；
− アルケニル基は、少なくとも１つの炭素-炭素二重結合を有する、２〜12(好ましくは２〜６)の炭素原子の炭化水素鎖から選択される。アルケニル基の例としては、エテニル、プロペニル、イソプロペニル、2,4-ペンタジエニルが挙げられる；
− アルキニル基は、少なくとも１つの炭素-炭素三重結合を有する、２〜12(好ましくは２〜６)の炭素原子の炭化水素鎖から選択される；
− アリール基は、少なくとも１つの単純な芳香環から誘導される任意の官能基又は置換基を意味し；芳香環は、環の各原子が互いに重なるp-軌道を含む非局在化π系を有する任意の平面環状化合物に相当する。より具体的には、用語 アリールは、フェニル、ビフェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、アントラシル、ピレニル、及びその置換形態を含むが、これらに限定されない。本発明のアリール基は、好ましくは４〜12の炭素原子、より好ましくは５又は６の炭素原子を含んでなる；
【００５２】
− ヘテロアリール基は、少なくとも１つの上記のとおりの芳香環から誘導され、Ｐ、Ｓ、Ｏ及びＮから選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含有する任意の官能基又は置換基を意味する。用語 ヘテロアリールは、フラン、ピリジン、ピロール、チオフェン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソキサゾール、トリアゾール、チアゾール、イソチアゾール、テトラゾール、ピリダゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、ベンゾフラン、イソベンゾフラン、インドール、イソインドール、ベンゾチオフェン、ベンゾ[c]チオフェン、ベンズイミダゾール、インダゾール、ベンズオキサゾール、ベンズイソキサゾール、ベンゾチアゾール、キノリン、イソキノリン、キノキサリン、キナゾリン、シノリン、プリン及びアクリジンを含むが、これらに限定されない。本発明のアリール及びヘテロアリール基は、好ましくは４〜12の炭素原子、より好ましくは５又は６の炭素原子を含んでなる；
本発明に従う酸、アミン、アミド、エステル、エーテル及びチオエーテル基は、好ましくは１〜12、より好ましくは１〜６の炭素原子を有する。
【００５３】
１つの好適な実施形態によれば、Ａはキレート剤であり、興味対象の物質SIは蛍光体(例えば、Alexa Fluor(登録商標)488)又はNMR若しくはMRI造影剤(例えば、ガドリニウム)である。
有利には、キレート剤Ａは、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸(DOTA)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、1,4,7-トリス(カルボキシメチルアザ)シクロドデカン-10-アザアセチルアミド(DO3A)、ニトリロ三酢酸(NTA)、D-ペニシラミン(Pen)、2,3-ジメルカプトコハク酸(DMSA)、2,3-ジメルカプト-1-プロパンスルホン酸(DMPS)、2,3-ジメルカプトプロパノール(BAL)、トリエチレンテトラミン(Trien)、テトラチオモリブデン酸アンモニウム(TTM)アニオン、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、2-(p-イソチオシアナトベンジル)-6-メチル-ジエチレントリアミン五酢酸(IB4M)又はヒドロキシピリジノン(HOPO)から選択される。
有利には、興味対象の物質SIはガドリニウムであり、キレート剤はDOTAである。
【００５４】
１つの特に好適な実施形態によれば、本発明のマレイミド化合物は、式(I')：
【化２】
2020015754.tif 000003
(I')
(式中、Ｂ、Ｂ'1、Ｂ'2、Ｂ”、Ａ，SI及びｎは上記と同義である)
のものであってもよい。
式(I)又は(I')のマレイミド化合物は、固相法により、好ましくはFmoc化学を用いて、より好ましくはFmoc-Gly-Wang樹脂上で合成されてもよい。
式(I')のマレイミド化合物：
【化３】
2020015754.tif 000004
(I')
(式中、Ｂ、Ｂ'1、Ｂ'2、Ｂ”、Ａ，SI及びｎは上記と同義である)
もまた本発明の一部である。
【００５５】
本発明の別の１つの目的は、システイン残基が少なくとも１つの興味対象の物質(例えば、蛍光体[例えばAlexa Fluor(登録商標)488]又はNMR若しくはMRI造影剤[例えばガドリニウム])に結合している、好ましくはシステイン残基が、本発明に従って規定されるチオール反応性化合物を介して、より好ましくはマレイミド化合物を介して、少なくとも１つの興味対象の物質に結合している上記の式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体である。前記式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体は、本発明の部位特異的方法に従って取得可能である。
本発明はまた、本発明の非部位特異的方法に従って取得可能である、興味対象の物質に接合したVHH又はVHHバリアント、及び、本発明の部位特異的方法に従って取得可能である、興味対象の物質を有するチオール反応性化合物、例えば式(I)のマレイミド化合物に接合した式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体も提供する。
興味対象の物質がペプチドである場合、本発明に従うVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体及び前記興味対象の物質は、本発明に従うVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体及び適切なペプチドを含む融合ポリペプチドとして遺伝子工学により作製することができる。この融合ポリペプチドは、公知の適切な宿主細胞において、従来方法により発現させることができる。
【００５６】
本発明に従うVHH、VHHバリアント、VHH誘導体、治療又は診断剤は、注射、例えば静脈内、動脈内、硬膜下腔内(脊髄液を介して)、腹腔内、筋内若しくは皮下注射により、又は鼻内滴下により、対象者(哺乳動物又はヒト)に投与することができる。
本発明に従うVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体は、ヒト対象者に投与する場合、ヒトにおける免疫原性を低減させるためにヒト化することができる。ヒト化抗体又はそのフラグメントを作製する方法は、当該分野において公知である(Vinckeら 2009，J Biol Chem.，284，3273-84)。
本発明に従う診断剤は、脳撮像、又は神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起により媒介される疾患、例えば、アルツハイマー病(AD)、ピック病(PD)、前頭側頭型認知症(FTD)、皮質基底核変性症(CBD)及び進行型核上性麻痺(PSP)を含むタウオパチー、好ましくはAD、FTD、CBD及びPSPの診断若しくはモニタリングに使用することができる。
本発明はまた、本発明に従うVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体(特に、式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体)及び上記のような興味対象の物質並びに随意に診断試薬を含んでなるキットを提供する。
本発明はまた、本発明に従う診断剤及び診断試薬を含んでなるキットを提供する。
本発明に従うキットは、脳撮像、又は神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起により媒介される疾患、例えば、アルツハイマー病(AD)、ピック病(PD)、前頭側頭型認知症(FTD)、皮質基底核変性症(CBD)及び進行型核上性麻痺(PSP)を含むタウオパチー、好ましくはAD、FTD、CBD及びPSPの診断若しくはモニタリングに使用することができる。
【００５７】
本発明はまた、対象者における、神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起により媒介される疾患、例えば、アルツハイマー病(AD)、ピック病(PD)、前頭側頭型認知症(FTD)、皮質基底核変性症(CBD)及び進行型核上性麻痺(PSP)を含むタウオパチー、好ましくはAD、FTD、CBD及びPSPの診断又はモニタリングのための、本発明に従う診断剤の使用を提供する。
本明細書で使用する場合、「対象者」は哺乳動物、好ましくはヒト、最も好ましくは神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起により媒介される疾患、例えば、アルツハイマー病(AD)、ピック病(PD)、前頭側頭型認知症(FTD)、皮質基底核変性症(CBD)及び進行型核上性麻痺(PSP)を含むタウオパチー、好ましくはAD、FTD、CBD及びPSPを有すると疑われるヒトである。
本発明はまた、対象者において、神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起により媒介される疾患、例えば、アルツハイマー病(AD)、ピック病(PD)、前頭側頭型認知症(FTD)、皮質基底核変性症(CBD)及び進行型核上性麻痺(PSP)を含むタウオパチー、好ましくはAD、FTD、CBD及びPSPを診断するためのインビトロ又はエキソビボ方法であって、以下の工程：
ａ)インビトロで、前記対象者からの適切な生物学的サンプルを本発明に従う診断剤と接触させる工程、及び
ｂ)前記生物学的サンプルにおいて、リン酸化タウタンパク質の存否を決定する工程を含んでなり、リン酸化タウタンパク質の存在が、対象者が神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起により媒介される疾患、例えば、アルツハイマー病(AD)、ピック病(PD)、前頭側頭型認知症(FTD)、皮質基底核変性症(CBD)及び進行型核上性麻痺(PSP)を含むタウオパチー、好ましくはAD、FTD、CBD及びPSPを有することを示す方法を提供する。
【００５８】
工程ｂ)は、VHH-抗原複合体又はVHHバリアント-抗原複合体(すなわち、VHHはリン酸化タウタンパク質を指向する)の存否を決定することにより行うことができる。
本発明はまた、対象者において、神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起により媒介される疾患、例えば、アルツハイマー病(AD)、ピック病(PD)、前頭側頭型認知症(FTD)、皮質基底核変性症(CBD)及び進行型核上性麻痺(PSP)を含むタウオパチー、好ましくはAD、FTD、CBD及びPSPの進行又は退行をモニターするためのインビトロ又はエキソビボ方法であって、以下の工程：
ａ)インビトロで、前記対象者からの適切な生物学的サンプルを本発明に従う診断剤と接触させる工程、
ｂ)前記生物学的サンプルにおいて、リン酸化タウタンパク質の量を測定する工程、及び
ｃ)工程(ｂ)で測定した量を、前記対象者について以前に得たリン酸化タウタンパク質の量と比較する工程
を含んでなり、リン酸化タウタンパク質の量有意な増加が神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起により媒介される疾患の進行のマーカーを構成し、リン酸化タウタンパク質の有意な減少が神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起により媒介される疾患の退行のマーカーを構成する方法を提供する。
【００５９】
本明細書で使用する場合、用語「有意な増加」及び「有意な減少」とは、以前に当該対象者からの適切な生物学的サンプルにおいて測定されたリン酸化タウタンパク質の量(参照量として使用)に対して、適切な生物学的サンプルにおけるリン酸化タウタンパク質のそれぞれ、より高い量又はより低い量をいう。
工程ｂ)はまた、VHH-抗原複合体又はVHHバリアント-抗原複合体の量を測定することにより行うことができる。
前記適切な生物学的サンプルは、脳生検又は死後脳組織であり得る。
脳生検又は死後脳組織において神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起を検出する方法に関する本発明の観点によれば、該方法は、ホルマリン固定組織を本発明に従う診断剤の溶液とインキュベートすることを含み得る。インキュベーションに際して、診断用化合物は組織中の神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起を標識し、染色又は標識された神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起は、任意の標準的方法により検出又は可視化することができる。このような検出手段には、顕微鏡観察法、例えば明視野、蛍光、レーザ共焦点及び交差偏光顕微鏡観察が含まれる。生検又は死後組織における神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起の定量方法には、例えば、本発明に従う診断剤又はその水溶性で非毒性の塩を生検又は死後組織のホモジネートとインキュベートすることが含まれる。組織は、当該分野において周知の方法により取得し、ホモジナイズする。有利には、診断用化合物は放射性同位体標識化合物であるが、他の診断用化合物、例えば酵素、蛍光体、ナノ粒子又はNMR若しくはMRI造影剤を使用することもできる。
【００６０】
本発明はまた、対象者における神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起のインビボ画像化法であって、以下の工程：
ａ)対象者、好ましくはヒトに検出可能量の本発明に従う診断剤を投与する工程、及び
ｂ)前記対象者における診断剤を撮像法により検出する工程
を含んでなる方法を提供する。
本発明に従う方法により、対象者、好ましくはヒトの脳における神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起の存在及び位置の決定が可能になる。
本明細書で使用する場合、「検出可能量」は、投与された診断剤の量がリン酸化タウタンパク質への診断剤の結合の検出を可能にするに十分であることを意味する。
本明細書で使用する場合、「画像化有効量」は、投与された診断剤の量がリン酸化タウタンパク質への診断剤の結合の画像化を可能にするに十分であることを意味する。
【００６１】
画像化法には、神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起をインビボで検出するために使用される非侵襲的神経撮像法、例えば磁気共鳴分光法(MRS)若しくは撮像法(MRI)、又はガンマ撮像法、例えば陽電子断層撮影法(PET)若しくは単一光子放出コンピュータ断層撮影(SPECT)が含まれる。
インビボ画像化のためには、利用可能な検出装置のタイプは、標識選択の主因である。例えば、ガドリニウム、鉄又はマンガンをベースとする造影剤は、興味対象の物質に結合した本発明に従うVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体を、磁気共鳴分光法(MRS)又は撮像法(MRI)により検出するために使用することができる。放射性同位体(例えば19F)、蛍光体(例えばAlexa Fluor(登録商標)488)又はNMR若しくはMRI造影剤(例えばガドリニウム)も、本発明の方法におけるインビボ画像化に特に適切である。使用する装置のタイプは、興味対象の物質の選択における指針を示す。例えば、所与の装置タイプで検出可能な様式の崩壊を示す放射性核種を選択しなければならない。造影剤又は放射性核種の半減期も考慮する。放射性同位体に関しては、半減期は、脳による最大取込み時に依然として検出可能であるように十分に長くあるべきであるが、対象者が有害な放射線を維持しないように十分に短くあるべきである。本発明に従う放射性標識VHH、VHHバリアント又はVHH誘導体は、放出された適切な波長のガンマ放射線を検出するガンマ撮像法を用いて検出することができる。ガンマ撮像法には、SPECT及びPETが含まれるがこれらに限定されない。SPECT検出のためには、好ましくは、粒子を放出しないが、140〜200keV範囲の光子を多数生じる放射性同位体が選択される。PET検出のためには、放射性標識は、陽電子放出性放射性核種、例えばPETカメラにより検出される２つの511keVガンマ線を生成して消滅する19Fである。
【００６２】
一般に、検出可能な診断剤の投薬量は、考慮すべき事項、例えば、患者の年齢、病状、性別及び疾患の程度、あれば禁忌、併用している治療法及び他の変量に依存して変化し、当該分野の医師により調整されるべきである。対象者への投与は、局所的であってもよいし、全身性であってもよく、静脈内、動脈内、硬膜下腔内(脊髄液を介する)などにより行われ得る。投与はまた、検査部位に依存して、皮内であってもよいし、腔内であってもよい。化合物がリン酸化タウタンパク質と結合するに十分な時間(例えば30分〜48時間)の経過後、対象者の検査対象領域を、ルーチンの撮像法、例えばMRS/MRI、SPECT、平面シンチレーション撮像、PETにより、また新開発の技法により検査する。正確なプロトコルは、上記のような患者特有の要因に依存して、また検査対象の身体部位、投与方法及び用いる標識タイプに依存して変える必要がある；具体的手順の決定は当業者にはルーチンワークである。
本発明はまた、診断剤としての、本発明に従う診断用化合物に結合した本発明に従うVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体、特に式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体を提供する。
本発明はまた、上記のような治療剤及び医薬的に許容され得るキャリアを含んでなる医薬組成物を提供する。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「医薬的に許容され得るキャリア」は、医薬投与に適合可能ないずれの溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張化及び吸収遅延化剤などを含むものと意図される。適切なキャリアは、当該分野において標準の教科書であるRemington's Pharmaceutical Sciencesの最新版に記載されている。好適なキャリア又は希釈剤の例としては、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソーム、カチオン性脂質及び非水性ビヒクル(例えば、不揮発性油)もまた使用し得る。医薬活性物質についてのこのような媒体及び剤の使用は当該分野において周知である。従来の媒体又は剤のいずれも、上記のとおりの治療剤と適合性でない場合を除き、本発明の組成物における使用が企図される。
本発明はまた、医薬、特に神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起により媒介される疾患、例えば、アルツハイマー病(AD)、ピック病(PD)、前頭側頭型認知症(FTD)、皮質基底核変性症(CBD)及び進行型核上性麻痺(PSP)を含むタウオパチー、好ましくはAD、FTD、CBD及びPSPの治療に使用する医薬としての、本発明に従うVHH、VHHバリアント、VHH誘導体、治療剤又は医薬組成物を提供する。
【００６４】
本発明はまた、神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起により媒介される疾患、例えば、アルツハイマー病(AD)、ピック病(PD)、前頭側頭型認知症(FTD)、皮質基底核変性症(CBD)及び進行型核上性麻痺(PSP)を含むタウオパチー、好ましくはAD、FTD、CBD及びPSPを予防又は治療する方法であって、その必要がある対象者に本発明に従う治療剤又は医薬組成物を投与することを含んでなる方法を提供する。
本明細書で使用する場合、用語「治療」には、疾患、疾患症状又は疾患素因を有する患者に、当該疾患、疾患症状又は疾患素因を治癒し(cure、heal)、緩和し、軽減し、変化させ、修復し(remedy)、寛解し、改善し又はそれらに影響を及ぼすことを目的として、本発明に従うVHH、VHHバリアント、VHH誘導体、治療剤又は医薬組成物を投与することが含まれる。
用語「予防」は、神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起により媒介される疾患、例えば、アルツハイマー病(AD)、ピック病(PD)、前頭側頭型認知症(FTD)、皮質基底核変性症(CBD)及び進行型核上性麻痺(PSP)を含むタウオパチー、好ましくはAD、FTD、CBD及びPSPの進行が減速し、及び/又は消失すること、或いは神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起により媒介される疾患、例えば、アルツハイマー病(AD)、ピック病(PD)、前頭側頭型認知症(FTD)、皮質基底核変性症(CBD)及び進行型核上性麻痺(PSP)を含むタウオパチー、好ましくはAD、FTD、CBD及びPSPの発症が遅延し又は生じないことを意味する。
【００６５】
別の観点において、本発明は、哺乳動物の血液脳関門(好ましくは、ヒト血液脳関門)を横切る上記興味対象の物質の送達用のペプチドベクターを製造するための、本発明に従うVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体、特に式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体の使用に関する。
本発明はまた、治療剤としての、本発明に従う治療用化合物に結合した式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体を提供する。
前述の特徴に加えて、本発明は、本発明を例示する実施例に言及する下記の説明並びに添付の図面から明らかになる他の特徴を更に含んでなる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、リン酸化タウ及びタウタンパク質に対するInti血清及びRascar血清の結合を示す。アルパカポリクローナル抗体をウサギ抗アルパカ抗体で検出した。
【図２】図２は、精製VHHタウ-A2の、リン酸化タウ、タウ(非リン酸化)及びOva-pS422ペプチドへの結合を示す。
【図３Ａ】図３は、種々のタウオパチー：AD(図3A)、FTD(図3B)、PSP(図3B)及びPD(図3C)を有する症例からのヒトパラフィン切片における、VHHタウ-A2及びmAb AT8を用いるNFTの免疫組織化学的染色を示す。
【図３Ｂ】図３は、種々のタウオパチー：AD(図3A)、FTD(図3B)、PSP(図3B)及びPD(図3C)を有する症例からのヒトパラフィン切片における、VHHタウ-A2及びmAb AT8を用いるNFTの免疫組織化学的染色を示す。
【図３Ｃ】図３は、種々のタウオパチー：AD(図3A)、FTD(図3B)、PSP(図3B)及びPD(図3C)を有する症例からのヒトパラフィン切片における、VHHタウ-A2及びmAb AT8を用いるNFTの免疫組織化学的染色を示す。
【図４】図４は、Tg4510マウス自由浮遊切片におけるVHHタウ-A2及びmAb AT8を用いるNFTの免疫組織化学的染色を示す。
【図５】図５は、VHHタウ-A2及びタウ-pS422 mAbで可視化したAD脳抽出物及びリン酸化タウ(p-タウ)についてのウェスタンブロットを示す。レーン１及び３：p-タウ＋それぞれタウ-A2及びタウ-pS422 mAb。レーン２及び４：AD抽出物＋それぞれタウ-A2及びタウ-pS422 mAb。
【図６】図６は、マレイミド-(DOTA/Gd)3(化合物１)の固相合成を示す。
【図７】図７は、タウ-A2及びその誘導体の生化学的及び組織学的特徴決定を示す。Ａ：instantBlue染色SDS-PAGEゲルによるVHHタウ-A2-SH(レーン１)及びタウ-A2-S-AF488(レーン２)のタンパク質プロフィール分析。Ｂ：3-10 IEFゲルでのNEPHGEによるタウ-A2誘導体のpIの決定。Ｃ：Tg4510パラフィン切片でのタウ-A2-S-AF488によるNFTのインビトロ画像化。VHHの存在は、VHHを指向するウサギポリクローナル抗体の添加により明らかにした。Ｄ：ネガティブコントロール：ウサギ抗VHHタウ-A2のみを用いるTauPS2APP VHHフリーのパラフィン切片でのIHC。Ｅ：Tg4510自由浮遊切片での皮質におけるタウ-A2-S-AF488によるNFTの直接蛍光染色。Ｆ：Tg4510自由浮遊切片での海馬におけるタウ-A2-S-AF488によるNFTの直接蛍光染色。
【図８】図８は、８ヶ月齢Tg4510マウスにおけるタウ-A2-S-AF488の大脳注射後のNFTのインビボ画像化を示す。矢印はNFTの標識を示す。スケールバー＝50μm。
【図９】図９は、血管から拡散しNFTを標識するタウ-A2-S-AF488のインビボ二光子画像化を示す。Ａ：10mg/kgのタウ-A2-S-AF488の静脈内注射の１分後、120分後、180分後のTg4510マウス皮質領域における蛍光の最大強度投影。iv注射前には微かな非特異的シグナルのみが検出され得たが、iv注射の数秒後には樹枝状血管の強い染色が観察された(T1)。120分後にはNFTの特異的標識(白矢印)が観察され、180分後には最大強度が観察された(3D再構成(MIP))。実験は２匹のマウスで行った。Ｂ：タウ-A2-S-AF488のIV注射の４時間後、脳を採集し、IHCを５μmパラフィン切片で行った。ウサギポリクローナル抗VHH抗体を用いて、NFTの存在及びタウ-A2-S-AF488による標識を明らかにした。
【図１０】図10は、タウ-A2-SHのアミノ酸配列の発現についての最適化を示す。配列番号14のタウ-A2-SH。配列番号17のタウ-A2var-SH。
【図１１−１】図11は、タウ-A2バリアントの生化学的及び組織学的特徴を示す。Ａ：instant Blue染色SDS-PAGEゲルによるVHHタウ-A2-SH(左)及びタウ-A2var-SH(右)のタンパク質プロフィール分析。Ｂ：3-10 IEFゲルでのNEPHGEによるタウ-A2-SH(レーン１)及びタウ-A2var-SH(レーン２)のpIの決定。Ｃ：被覆したリン酸化タウタンパク質に対するVHHタウ-A2-SH及びVHHタウ-A2var-SHのELISA結合。ネガティブコントロールは無関係のVHHを用いて行った。VHH結合は、マウス抗HisタグmAb及びペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体の添加により明らかにした。Ｄ：Tg4510マウスについてのIHCによるVHHタウ-A2-SH及びVHHタウ-A2var-SHの比較。VHHを２μg/mlの濃度で用い、その存在は、抗HisマウスmAb及びペルオキシダーゼ標識抗マウスIgにより明らかにした。
【図１１−２】図11の続き。
【図１２】図12は、８ヶ月齢Tg4510マウスにおけるタウ-A2var-S-(DOTA/Gd)3の静脈内注射後のNFTのインビボ画像化を示す。タウ-A2var-S-(DOTA/Gd)3のIV注射の４時間後に、脳を採集し、IHCを５μmパラフィン切片で行った。ウサギポリクローナル抗VHH抗体を用いて、NFTの存在及びタウ-A2var-S-(DOTA/Gd)3による標識を明らかにした。
【実施例】
【００６７】
実施例Ｉ：ALEXA FLUOR(登録商標)488又はガドリニウム造影剤に結合した抗リン酸化タウVHHの創出及びそのインビトロ/インビボ評価
材料及び方法
１．抗タウ特異的VHH(タウ-A2)の作製、選択及び精製
1.1  抗原調製及びアルパカにおける液性免疫応答の誘導
対象者
AD患者(BraakステージＶ及びVI)由来のヒト皮質脳組織をNeuroCEB脳バンクから入手した。このバンクは、患者組織(フランスアルツハイマー協会を含む)のコンソーシアムにより運営されている脳献体プログラムに関係するものであり、フランス国文部科学省(Ministry of Research and Universities)に対してフランス国法律が要求するとおりに宣言している。フランス国の生命倫理に関する法律に従い、脳献体について書面による明示の同意を得た。
組織抽出をMerckenら(1992 Acta Neuropathol.，84，265-272)に従って行った。AD脳の皮質(0.2ｇ)を、10％スクロースを含有する10容量の10mM Tris、１mM EGTA、0.8Ｍ NaCl(pH7.4)中でホモジナイズし、27,000×ｇにて20分間４℃で遠心分離した。ペレットを取り出し、上清を１％ N-ラウリルサルコシン及び１％ β-メルカプトエタノールに調整し、回転させながら2.5時間37℃でインキュベートした。上清混合物を100,000ｇにて35分間20℃で遠心分離した。PHF含有ペレットをPBSで穏やかに洗浄し、最後に同じ緩衝液に再懸濁した。
一匹のアルパカ(Inti)をタウペレットで、別のアルパカ(Rascar)を、KLH(Eurogentec)に結合した、タウタンパク質のＣ末端に由来する配列CSIDMVDS(PO3H2)PQLATLAD(配列番号６)の単一リン酸化ペプチドで免疫した。
250μll(500μg)の両抗原を、最初の免疫用には250μlのフロイント完全アジュバントと混合し、追加免疫用には250μlのフロイント不完全アジュバントと混合した。０日目、21日目及び40日目の３回の免疫後、52日目に、血清サンプルを採取し、組換えリン酸化タウタンパク質又は組換え非リン酸化タウタンパク質を用いるELISAにより免疫応答をモニターした。
【００６８】
1.2  ライブラリの構築及びパニング
免疫動物の血液250mlを52日目に採集し、末梢血白血球を、Ficoll(Pharmacia)不連続グラジエントでの遠心分離により単離し、更なる使用まで−80℃で保存した。トータルRNA及びcDNAを、以前にLafaye P.ら(1995 Res Immunol.，146，373-382)に記載されたように取得し、VHHドメインをコードするDNAフラグメントを、VH遺伝子のそれぞれ3'及び5'フランキング領域にそれぞれアニールするCH2FORTA4及びVHBACKA6プライマーを用いるPCRにより増幅した。増幅産物を、プライマーVHBACKA4及びVHFOR36のいずれかを用いる第２ラウンドのPCRにおいてテンプレートとして使用した。プライマーは、増幅産物の5'及び3'末端部に相補的であり、VHH遺伝子の末端部にSfiI及びNotI制限部位が組み込まれていた。PCR産物を消化し、ファージ発現ベクターpHEN1にライゲートした。得られたライブラリは、２つのサブライブラリ(一方はタウペレットに由来し、他方はKLHに結合したリン酸化ペプチドに由来した)から構成されていた。両方のサブライブラリを用いてファージを作製し単離した後、プールした。
ライブラリ(＞６×108クローン)を、完全長のリン酸化タウタンパク質に対してパニングした。Nunc Immunotubes(Maxisorp)チューブをPBS中において抗原(10μg/ml)で４℃にて一晩コーティングした。ファージ(1012形質導入単位)を、コーティングしたチューブと37℃にて１時間、穏やかな撹拌下でインキュベートすることによりパニングした。３回のパニングの各々で異なるブロッキング剤を用いた：２％スキムミルク、1:4希釈Licorブロッキング緩衝液及び４％ BSAをそれぞれ用いた。ファージクローンを、検出にHRP/抗M13モノクローナル抗体接合体(GE Healthcare)を用いる標準的なELISA手順によりスクリーニングした(下記参照)。スクリーニングはリン酸化タウタンパク質及びタウタンパク質を並行して用いて行った。
【００６９】
1.3  VHHの発現
ベクターpHEN1内の選択したナノボディのコーディング配列を、NcoI及びNotI制限部位を用いて、6-ヒスチジンタグを含有する細菌発現ベクターpET23にサブクローニングした。形質転換したE. coli BL21(DE3) LysS細胞は、IPTG(0.5mM)での16℃にて一晩の誘導後、細胞質にVHHを発現する。精製VHHを、細胞質抽出物から、Ni2+を担持するHiTrapクルードカラム(GE Healthcare)を製造業者の指示に従って用いるIMACにより単離した。VHHを50mMリン酸ナトリウム緩衝液、300mM NaCl及び500mMイミダゾール緩衝液に溶出させ、300mM NaClを含有するPBS緩衝液(PBS/NaCl)において透析した。
また、選択したVHHのコーディング配列を、Ｃ末端部にStrepタグを含有する改変pASK IBA2 発現ベクターにサブクローニングした(Skerra及びSchmidt 1999 Biomol Eng.，16，79-86)。同じ制限部位を用いた。E. coli XL2-Blue超コンピテント細胞を形質転換して、無水テトラサイクリン(AHT，200μg/l)で16℃にて一晩の誘導後にVHHを周辺質に発現させた。次いで、Strep-Tactinカラム(IBA)を製造業者の指示に従って用いて、VHHを細菌抽出物から精製した。
【００７０】
２．MRI造影剤及び蛍光体へのVHHタウ-A2の結合
2.1  一般的な合成法
特に断らない限り、アミノ酸誘導体及び試薬は、それぞれNovabiochem及びSigma-Aldrichから購入したものである。ペプチド及びVHH溶液の濃度(正味のタンパク質含量)は、当該化合物を６Ｎ HClで110℃にて20時間加水分解した後、Beckman 6300分析装置を用いる定量的アミノ酸分析(AAA)により測定した。RP-HPLC/MS分析は、UV検出装置2487(220nm)と、エレクトロスプレーイオン化(ポジティブモード)源(Waters)を備えたQ-TofmicroTM分光計(Micromass)とに接続したAlliance 2695システムで行った。サンプルをオートサンプラーで４℃に冷却した。線形グラジエントは、アセトニトリル＋0.025％ギ酸(Ａ)/水＋0.04％TFA＋0.05％ギ酸(Ｂ)を用いた10分間又は20分間にわたるものであった。用いたカラムはXBridgeTM BEH300 C18(3.5μm，2.1×100mm)(Waters)(グラジエント10〜100％ Ａ)であった。ソース温度を120℃に、脱溶媒和温度を400℃に維持した。コーン電圧は40Ｖであった。サンプルを、0.4〜１mg/ml濃度で、Ｂを添加したそれぞれの緩衝液に注入した。
マレイミド-(DOTA/Gd)3化合物１は、図６に示すとおり、9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)化学を用いる固相ペプチド合成により製造した。
【００７１】
2.2  タウ-A2-SHの製造
Cys操作VHH(タウ-A2-SH)のコーディング配列を、NcoI及びXhoI制限部位を用いて細菌発現ベクターpET23dにクローニングした。まとめると、タウ-A2-SH(配列番号14)は、Ｎ末端からＣ末端へ、６-ヒスチジンタグ、トロンビン切断部位、VHHタウ-A2配列、続いてG3Sスペーサー及び３つの付加アミノ酸CSAを含んでなる。形質転換したE. coli BL21(DE3) pLysS細胞は、IPTG(0.5mM)での16℃にて一晩の誘導後、細胞質にタウ-A2-SHを発現する。精製VHHを、細胞質抽出物から、Ni2+を担持するHiTrapクルードカラム(GE Healthcare)を製造業者の指示に従って用いるIMACにより単離した。タンパク質を500mMイミダゾールを含有するPBS/NaClに溶出させた後、PBS/NaClに透析した。
AAA：Ala 14.3 (14)，Arg 9.6 (10)，Asp+Asn 7.3 (6)，Glu+Gln 11.2 (10)，Gly 18.4 (19)，His 5.7 (6)，Ile 4.2 (4)，Leu 8.6 (8)，Lys 5.3 (5)，Phe 4 (4)，Pro 2.9 (2)，Ser 18.9 (23)，Thr 10.5 (12)，Tyr 6.1 (7)，Val 11.5 (11)。
MS：15499.286(C669H1047N205O213S4 計算値15498.190)。このMSは、Ｎ末端欠失メチオニンを有するタンパク質に相当する。
【００７２】
2.3  タウ-A2-S-Alexa Fluor(登録商標)488(タウ-A2-S-AF488)の合成
タウ-A2-SHのＣ末端トリペプチドに存在するシステインを用いて、タウ-A2-SHをマレイミドAlexa Fluor(登録商標)488蛍光体(Invitrogen)に結合した。タウ-A2-SHを含有する溶液のpHを6.8〜７に調整した。次いで、溶液を、10倍モル過剰のトリス(２-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)と共に室温にて30分間穏やかに撹拌して、分子間ジスルフィド結合を完全に還元させた。ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解した10倍モル過剰のマレイミドAlexa Fluor(登録商標)488蛍光体を添加した。特に、高効率の接合のために、最終溶液中のDMFの体積割合を５％未満に維持した。接合を２時間室温にて遮光下で行った。次いで、300mM NaCl(全体濃度)を含有するPBSでの連続透析により接合していないマレイミド蛍光体を除去した。
【００７３】
2.4  タウ-A2-S-(DOTA/Gd)3の合成
接合前に、タウ-A2-SH(4.2ml，PBS/NaCl(pH6.8)中0.32mg/ml)をTCEP(24.6μg，５当量)で30分間処理して、VHHの二量体化を予防した。水溶液(78μl)中のマレイミド-(DOTA/Gd)3(0.78mg，VHH当たり１チオール基に対して3.8当量)をタンパク質に添加し、溶液を４℃にて３時間撹拌した。次いで、溶液をPBS/NaCl中、Slide-A-Lyzerカセット(Thermo Scientific)(3,500 MWCO)を用いて透析した。タウ-A2-SH及びタウ-A2-S-(DOTA/Gd)3のアリコート(20μl)をRP-HPLC/MS分析用に緩衝液Ｂ(20μl)で希釈した。更に、同じ化合物のアリコート(10μl)をELISA分析用に20mM Tris緩衝液(pH7.3)(90μl)に希釈した。4.2mlのタウ-A2-S-(DOTA/Gd)3(0.24mg/ml)を65％の収率で得た。収率は最終産物タウ-A2-S-(DOTA/Gd)3の現実の量を予想量(正味のタンパク質含量)で除して算出した。更なる実験のために、Vivaspin 2遠心分離フィルターデバイス(3,000 MWCO PES)を用いてタウ-A2-S-(DOTA/Gd)3の溶液を４倍に濃縮した。
AAA：Ala 13.4 (14)，Arg 9.6 (10)，Asp+Asn 8.0 (6)，Glu+Gln 11.8 (10)，Gly 24.4 (22)，His* (6)，Ile 4.2 (4)，Leu 8.6 (8)，Lys 18.9* (8)，Phe 4 (4)，Pro 2.9 (2)，Ser 16.8 (23)，Thr 10.7 (12)，Tyr 6.1 (7)，Val 11.4 (11)。[*Hisは、アンモニウムとの共溶出のために決定できない。Lysは、分析条件下ではマレイミド誘導体との共溶出のために過大評価される]。
MS：17887.549(C751H1174N227O244S4Gd3 計算値17886.980)。
【００７４】
３．免疫組織化学及び生化学によるタウ-A2及びタウ-A2接合体のインビトロ特徴決定
3.1  対象者
ヒト脳組織をNeuroCEB脳バンクから得た。前臨床実験をTg4510(Santacruzら 2005 Science，309，476-81)トランスジェニックマウスについて行った。動物実験の手順は、フランス国及びEUの法(科学目的に使用する動物の保護についての欧州共同体理事会指令[European Communities Council Directive]2010/63/EU)の倫理標準に厳格に従い、かつ、地元の動物管理及び取扱い委員会の認可後に行った。動物は高用量のペントバルビタールナトリウム(100mg/kg)を用いて犠牲にし、その後10％緩衝化ホルマリンで灌流固定した。その後、脳を取り出し、ホルマリンに少なくとも24時間浸漬し、４℃で保存した。
3.2  組織抽出物
組織抽出はMerckenら(1992 Acta Neuropathol.，84，265-272)に従って行った。
【００７５】
3.3  イムノブロット
リン酸化タウタンパク質をNuPAGE(登録商標)LDSサンプル緩衝液(Invitrogen)に再懸濁した。脳抽出物は、８Ｍ尿素を含有するNuPAGE(登録商標)LDSサンプル緩衝液(Invitrogen)に再懸濁した。NuPAGE Novex 4-12％ Bis-trisゲル(Invitrogen)を用いるポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)による分離後、Hybond-C(Amersham)への半乾燥転写を行い、Xcell IIブロットモジュール(Invitrogen)を用いてウェスタンブロッティングを行った。免疫化学反応の前に、メンブレンを４％スキムミルク溶液でブロックした。メンブレンのイムノブロッティングを、VHH(His又はStrepタグを有する)又は抗p-タウ422 mAb(Grueningerら 2011 Mol Cell Biochem.，357，199-207)により行い、ウサギ抗Hisタグ(eBioscience)ポリクローナル抗体に続くペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギイムノグロブリン(Abcam)により、又は抗Strepタグモノクローナル抗体(例えば、番号I-4703でCNCMに寄託したハイブリドーマが産生する抗体C23-21)に続くペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン(Bio-rad)により顕現させた。最後に、化学発光キット(GE Healthcare)を用いてペルオキシダーゼ活性を可視化した。
【００７６】
3.4  ELISA
マイクロタイタープレート(Nunc，Denmark)を、PBSに希釈した１μg/mlの、リン酸化タウ若しくはタウタンパク質、又はオボアルブミンタンパク質に結合した配列番号６のリン酸化ペプチドとの４℃で一晩のインキュベーションにより被覆した。プレートをPBS中0.1％ Tween 20の緩衝液で洗浄した。タウ-A2(His又はStrepタグを有する)をPBS中0.5％ゼラチン、0.1％ Tween 20の緩衝液で希釈した。37℃で２時間のインキュベーション後、プレートを再び洗浄し、その後、それぞれ、ウサギ抗Hisタグポリクローナル抗体(eBiosciences)に続いてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギイムノグロブリン(Abcam)、又は抗Strepタグモノクローナル抗体(例えば抗体C23-21)に続いてペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン(Bio-rad)を加え、最後に製造業者のプロトコルに従ってOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド，Dako)により顕色した。
3.5  配列解析
VHHをコードするDNAはGATC Biotechが配列決定した。配列をSerial Clonerで処理した。
3.6  pIの測定
VHHのpIを、IEF 2-9ゲル(Invitrogen)を用いる等電点電気泳動により測定した。アノードにサンプル適用するNEPGHE(非平衡pHグラジエントゲル電気泳動)を用いた。なぜならば、そのことにより、pH8.5〜10.5を含む塩基性範囲のゲルにおける最適なタンパク質分析が可能となるからである。プロトコルはSERVAGel IEF 3-10指示マニュアルに詳述されていた。
【００７７】
3.7  免疫組織化学及び免疫蛍光
免疫組織化学を、ホルマリン固定組織(パラフィン包埋若しくは凍結切片又はビブラトーム切片)について行った。標準的なIHCプロトコルを適用し、各組織条件に適合させた。免疫染色実験のほとんどを、パラフィン切片を用いて行ったので、ここでは、パラフィン包埋材料についての詳細なプロトコルを記載する。脳組織の免疫染色は４μm厚のパラフィン切片で行った。ヒト組織及びマウス組織の両方を用いた(AD又は他のタウオパチーを有するヒト患者及びTg4510マウス[Santacruzら 2005 Science，309，476-481])。切片をキシレン中で脱パラフィン化し、エタノール(100％、90％及び70％)(各溶液について５分間)及び最後に10分間の流水(水道水)により再水和させた。次いで、切片を98％ギ酸中で５分間インキュベートし、流水(水道水)下で再度洗浄し、３％過酸化水素及び20％メタノールで内因性ペルオキシダーゼをクエンチし、最後に水で洗浄した。切片をTBS＋0.5％ Tween中２％のウシ血清アルブミン中で30分間インキュベートすることにより、非特異結合をブロックした。次いで、適切な希釈率の一次抗体(His又はStrepタグを有する１〜10μg/mlのVHH)を適用し、スライスを湿潤チャンバ内で４℃にて一晩インキュベートした。スライドをTBS-Tweenで洗浄し、TBS-Tween中の二次抗体であるウサギ抗Hisタグ(1/1000)又は自家製ビオチン化抗strep mAb C23-21と室温で１時間インキュベートした。次いで、スライドをDako REALTM検出システムの試薬、ペルオキシダーゼ/DAB+と製造業者の指示に従ってインキュベートした。良好なＳＮ比が得られるまで(約５分間)、色素原(DAB)を発色させた。TBS-Tweenでの洗浄後、スライドをヘマトキシリンで対比染色した。NFTの標識のために、ビオチン化mAb AT8(ThermoScientific)をポジティブコントロールとして並行して用いた。
タウ-A2-S-AF488を用いるNFTの免疫蛍光染色を、Tg4510マウスからビブラトーム(Leica VT1000S)を用いて得た40μm厚の自由浮遊切片について行った。３×５分間のPBSでの洗浄後、切片を、２％のBSAを含有するPBS-Triton 0.2％と15分間インキュベートすることによりブロックした後、PBS-Triton 0.2％中１μg/mlのタウ-A2-S-AF488へ代えて、４℃にて一晩インキュベートした。最後に切片をPBSで洗浄し、水性マウンティング媒体(Mowiol)を用いてマウントした。
【００７８】
４  二光子撮像及び相関的免疫組織化学によるタウ-A2及びタウ-A2接合体のインビボ評価4.1  対象者
タウ-A2及びタウ-A2-S-(DOTA/Gd)3のインビボ評価をTg4510トランスジェニックマウスについて行った。
4.2  VHHの定位注射及びIHC
麻酔したTg4510雌性トランスジェニックマウス(ｎ=２)に注射あたり２μlのVHHを0.5μl/分の速度で定位注射した。マウスをイソフルラン(１〜２％)と空気との混合物(１Ｌ/分)で麻酔した。マウスを定位フレームに配置し、Dremelを用いて頭蓋を両側で穿孔した。鈍い針先を備えるHamiltonシリンジを用いてMR造影剤を注射した。各マウスに、各半球で前頭皮質及び海馬の計４ヶ所で注射した。前頭皮質の定位座標は、十字縫合から＋0.86mm前方、正中線から±1.5mm側方、硬膜から−0.65mm腹側であった。海馬の定位座標は、十字縫合から−2.18mm後方、正中線から±1.5mm側方、硬膜から−1.8mm腹側であった。注射の２時間後又は24時間後にマウスを安楽死させ、マウスにPBS(pH7.6)中４％パラホルムアルデヒドの心臓内灌流を行った。脳を取り出し、同じ固定液中で一晩４℃にて後固定した。４μm厚のパラフィン切片を作製した。大脳組織でのVHHの存在は、上述の免疫組織化学的手順を用いて検出した。
【００７９】
4.3．Tg4510マウスにおけるタウ-A2-S-AF488を用いる二光子顕微鏡観察
１)開頭術
２匹の８ヶ月齢Tg4510マウスをイソフルラン(純粋O2中１％ vol/vol)の吸入により麻酔し、加温ブランケット(37℃)に配置した。定位フレームを用いて、運動皮質の位置を特定した。切開部位での局所麻酔のために50μlの２％リドカインを皮下注射し、該切開部位の皮膚を除去した。円刃刀を用いて２mm未満の開頭手術を行った。VHHタウ-A2-S-AF488の脳内注射の場合、硬膜を切開した。静脈内注射の場合、硬膜はインタクトに維持した。動きによるアーチファクトを回避するため、頭蓋開口部を２％低融点アガロース及びカバーガラスで覆った。光学的ウィンドウを確保し、歯科用セメントで頭蓋の露出部、創縁及びカバーガラスの端部を覆った。
２)タウ-A2-S-AF488の投与
脳内注射：1.2μg(1.5μL)のタウ-A2-S-AF488を、１匹のTg4510マウスの脳に、皮質表面から深さ1.5mmで注射した。次いで、注射後４時間の間、二光子撮像を行った。
静脈内注射：270μg(150μl)のタウ-A2-S-AF488を１匹のTg4510マウスの尾静脈にゆっくりと注射した。次いで、その後の３時間に二光子撮像を行った。
３)二光子撮像
二光子撮像は、二光子レーザ走査型顕微鏡システム及びPrairieViewソフトウェア(Prairie Technologies，Middelton，WI，USA)で、16× 0.9NA水浸対物レンズ(Nikon，Tokyo，Japan)を920nmにチューニングした二光子レーザ(MaiTai DeepSee，Spectra Physics，Mountain View，CA，USA)と共に用いて行った。画像は画素サイズ0.5μmにて512×512で獲得した。組織では20mW未満のレーザー出力を用いるように注意した。
【００８０】
５．ウサギポリクローナル抗VHH抗体の取得
精製したアルパカイムノグロブリンを用いて１匹のウサギを免疫した。VHHに対するウサギポリクローナル抗体を２工程で精製した。先ず、ポリクローナル抗体を、プロテインＡ-セファロース4Bビーズを用いるイムノクロマトグラフィーにより単離した。次いで、タウ-A2var-SHで標識したセファロース4Bビーズを用いる別のイムノクロマトグラフィーを行った。このセファロース標識は製造業者(GE)の指示に従って行った。得られる精製抗体は、ウサギ抗体の全量の１％未満を占めていた。この抗体をウサギポリクローナル抗VHH抗体と呼ぶ。この抗体はタウ-A2 VHHに結合する。
【００８１】
結果
１．ポリクローナル応答、ライブラリの構築及び具体的な抗タウVHHの選択
３回の免疫後、Inti(脳抽出物)及びRascar(タウ-pS422)の血清を採集し、それらのリン酸化タウ及び非リン酸化タウへの結合をELISAにより分析した(図１)。Inti及びRascarの血清はリン酸化タウ及び非リン酸化タウの両方を認識したが、Intiの免疫応答はRascarのものより良好であるようであった。しかし、前者はリン酸化タウ及び非リン酸化タウを有意に識別せず、後者はリン酸化タウに関してより高い免疫応答を示した。
血清中に存在する１つ又は幾つかの抗リン酸化タウ抗体が固定マウス組織においてタウ病変を認識し得ることを確実にするために、TauPS2APP(Grueninger F.ら，2010，Neurobiol Dis.，37:294-306)からの凍結ミクロトーム浮遊切片及び非凍結ビブラトーム浮遊切片の両方についてIHCを行った。Intiの血清はタウ病変の免疫染色を示さなかった一方、Rascarの血清は、ミクロトーム切片及びビブラトーム切片の両方においてNFTの特異的タウ染色を示した(データは示さず)。
Intiポリクローナル血清はIHCでNFTを免疫検出しなかったにもかかわらず、血漿におけるリン酸化タウ特異的抗体の存在を排除できない。事実、IHCシグナルの欠如は、(TauPS2APPマウスのNFTに存在するリン酸化タウのエピトープを認識し得る)抗リン酸化タウ抗体の低頻度に起因し得る。これら２匹の動物から得た２つのライブラリをパニング実験用にプールした。
【００８２】
末梢血白血球からのトータルRNAをcDNA合成のテンプレートとして使用した。このcDNAを用いて、VHHのコーディング配列をPCRにより増幅し、ベクターpHEN1にクローニングした。その後の形質転換により、各々約３×108クローンの２つのライブラリを得た。両ライブラリをプールし、最良の親和性を示すVHHを、リン酸化タウを用いる３回のパニングサイクルによりファージディスプレイで選択した。96の個別クローンをリン酸化タウタンパク質及びタウタンパク質についてELISAにより試験した。唯一のクローンがリン酸化タウに特異的に結合することが見出された(VHHタウ-A2)。
このVHHをベクターpET23又はベクターpASK IBA2にサブクローニングして、それぞれHisタグ又はストレプトアビジンタグを有するVHHを高レベルで発現させた。収量＜１mg/l細菌培養物が得られた。単一ドメイン産物は、SDS-PAGE及びRP-HPLC/MSにより純粋〜均質であることが示され(データは示さず)；pI値は9.5を超えていた。動的光散乱実験により、タウ-A2は、精製後に、単量体形態であり(RH=4.5±0.3nm)、凝集していないことが示された。VHHタウ-A2のアミノ酸配列を配列番号４とする。
【００８３】
２．VHHタウ-A2によるNFTの認識
2.1  VHHタウ-A2はＣ末端タウペプチドのリン酸化セリン422を認識する
幾つかのセリン及びスレオニンは、病原形態のタウにおいてリン酸化されている。エピトープ認識におけるリン酸化の役割を評価するため、ELISAを、リン酸化タウ、及びオボアルブミン(Ova)タンパク質に結合した、タウタンパク質のＣ末端に由来する単一リン酸化ペプチド(配列CSIDMVDS(PO3H2)PQLATLAD；配列番号６)について行った。リン酸化タウは、S422を含む複数の部位でリン酸化された完全長タウタンパク質であった。VHHタウ-A2は両化合物に結合し、このことから、リン酸化セリン422(pS422)を含むエピトープを認識したことが示唆される(図２)。
【００８４】
2.2  NFTに対するVHHタウ-A2の免疫反応性
VHH特異的免疫反応性の分布をヒトAD脳、他のタウオパチー(前頭側頭型認知症[FTD]、進行型核上性麻痺[PSP]及びピック病[PD])の組織及びトランスジェニックTg4510マウス脳において調べた。
VHHタウ-A2は、AD患者のパラフィン切片においてNFTを免疫検出する良好な能力を示した(図3A)。また、タウ陽性グリア封入体をFTD症例(オリゴデンドログリアコイル小体)及びPSP症例(アストロサイト房)で観察した(図3B)。興味深いことに、参照抗タウAT8 mAbにより同定した代表的な細胞封入体(ピック小体)はタウ-A2について陰性であった(図3C)。このことから、このVHHが幾らかの特異性を示すことが示唆される。他のタウオパチーとは対照的に、ピック小体は唯一3Rタウタンパク質から構成される。よって、タウ-A2は主に４つのリピートでタウを認識するという仮説を立てることができる。野生型マウスの組織では標識は観察されなかった。
パラフィン包埋組織での結果と一致して、マウス自由浮遊ビブラトーム切片でVHHタウ-A2を用いてNFTの免疫検出を容易に達成することができることが示された(図４)。
脳組織におけるVHHタウ-A2の免疫反応性を確証するため、ウェスタンブロットイムノアッセイをAD患者から得た脳抽出物について行った。タウ-pS422 mAb(Grueningerら 2011 Mol Cell Biochem.，357，199-207)を参照抗体として用いた。並列に組換えリン酸化タウ(p-タウ)をSDS-PAGEゲルに負荷した。リン酸化タウタンパク質は、VHHタウ-A2及びタウ-pS422 mAbの両方によって明らかにされた。１つの主要なバンド(70〜100kDaのリン酸化タウに相当)が、AD抽出物においてタウ-A2及びタウ-pS422で免疫検出された。タウ-pS422 mAbでは、分子量130〜150kDaの２つの更なるバンドが観察され、AD脳におけるタウ-pS422の凝集の存在が示されたが、これらバンドはタウ-A2では非常に微かであった(図５)。
【００８５】
３．Cys操作タウ-A2及びAlexa Fluor(登録商標)488マレイミドへの抗体結合
Ｎ末端からＣ末端へ、６-ヒスチジンタグ、トロンビン切断部位、VHHタウ-A2配列、続いてG3Sスペーサー及び３つの更なるアミノ酸CSAを含有するCys操作タウ-A2をベクターpET23dにクローニングして、高レベル発現を可能とした(タウ-A2-SH又はA2-SHと呼ぶ；配列番号14)。チオ付加によりタウ-A2-SHをマレイミドAlexa Fluor(登録商標)488に接合した。得られる産物タウ-A2-S-AF488をSDS-PAGE、IEF/NEPGHE(図7A及び7B)及びRP-HPLC/MSにより分析した。産物は、SDS-PAGE及びRP-HPLC/MSにより純粋〜均質であることが示された。全ての分析が、タウ-A2-SHは、VHHタウ-A2上に１つのAF488を有する十分に規定された接合体(タウ-A2-S-AF488と呼ぶ)に完全に変換されたことを示した。タウ-A2-SHは約10(9.5〜10.5)のpIを有しており、AF488接合後にこの値は僅かに減少したが、依然として＞9.5のままであった(図7B参照)。タウ-A2-SH及びタウ-A2-S-AF488の水力学半径(RH)をDLSにより別々に測定した。経時的サイズ分布により、タウ-A2-SHについては2.66±0.0788nmの平均RH、タウ-A2-S-AF488については3.576±0.225nmの平均RHが明らかとなった。このことから、共に溶液中で単量体形態であることが示唆された。
【００８６】
４．VHHタウ-A2-S-AF488でのNFTの検出
4.1  Tg4510マウスの脳スライスにおけるインビトロ標識
マウス脳切片との直接インキュベーション後、タウ-A2-S-AF488は、標準のIHC(図7C〜7D)及び直接蛍光染色(図7E〜7F)により、Tg4510マウスにおけるNFTを検出する良好な能力を示した。
4.2  脳内注射後の二光子撮像
開頭術及び硬膜穿孔に続いてTg4510マウス脳へ1.2μg(1.5μL)を直接脳内注射した後に、タウ-A2-S-AF488のインビボ二光子撮像を行った。大量のCSFが観察され、(注射前でさえ)高い自家蛍光が観察された。適切な二光子撮像に対するこれら制限にもかかわらず、局所皮質注射後にNFTの特異的染色が検出された(図８)。
【００８７】
4.3  VHHタウ-A2-S-AF488の静脈内注射後の二光子撮像
10mg/kg用量のタウA2-S-AF488を、２匹のTg4510マウスの尾静脈に注射した(270μg，150μL)。このマウスのBBBの完全性は以前にMRIにより検証されており、このマウスにおいて信号変調は見られないことから、BBBの破壊はないことが示唆された(データは示さず)。脳における接合体の血管外漏出及び染色を、脳ウィンドウで二光子顕微鏡観察により注射後４時間記録した(ｚ＝表面〜深さ360μm)。図9Aは、同一領域での180分までの経時的なタウA2-S-AF488のインビボ画像化(最大強度投影-MIP)を示す。iv注射の数秒後に樹枝状血管の強力な染色が観察されたが、20分後には劇的に低下し、数本の毛細管のみが染色されたままであった。このことから、循環における接合体化VHHの短い半減期(10〜20分)が示唆される。iv注射の120分後、NFTが可視化され始めた。赤色チャネル信号の不在により、蛍光シグナルが特異的であり(データは示さず)、一般的な自家蛍光によるものでないことが証明された。脳内におけるVHHタウA2-S-AF488の血管外遊出及び染色を、注射後の３時間、脳ウィンドウ(皮質表面直下から350μmまでの深さ)について二光子顕微鏡観察により記録した。強力な自家蛍光バックグランド及び大量のCSF(上記参照)に加えて、Tg4510マウスは顕著な脳萎縮を示した。iv注射の数秒後、密集した血管の強い染色を観察した。注射の２時間後には、自家蛍光シグナルの残存にもかかわらず、NFTの特異的タウ染色を観察した。注射の３時間後でさえもNFTの持続的で特異的な標識が観察された(図9A)。このことから、タウA2-S-AF488の脳半減期は数時間わたるまで延長したことが示唆された。
タウA2-S-AF488の静脈内注射の４時間後、脳を採集して、５μm厚パラフィン切片を作製した。次いで、ウサギポリクローナル抗VHH抗体を用いてIHCを行い、タウA2-S-AF488の拡散及びタウA2-S-AF488によるNFTの標識を確証した(図9B)。
【００８８】
６．コントロール実験
NFTフリーマウスにおける評価
タウA2-S-AF488を野生型NFTフリーC57BL/6マウスに静脈内注射した。二光子顕微鏡観察アッセイにより、脳実質において特異的なインビボ染色は観察されなかった(データは示さず)。
従来型IgG抗体との比較
Tg4510マウスへのAF488接合抗タウmAb(Grueninger F.ら，2010，Neurobiol Dis.，37:294-306)のiv注射により、NFTの検出はできなかった。このことから、この標準的な抗タウ-pS422イムノグロブリンは有意に血管外漏出しないことが示された。
【００８９】
７．結論
iv注射後の二光子顕微鏡観察により、VHHタウA2-S-AF488は、BBBを横切り、更に２つめの関門(原形質膜)を横切ってニューロン内に浸透して細胞質内の標的に到達する能力が明らかとなった。NFT標識の長期検出(３時間)によっても、脳内におけるこのVHHの長い半減期が示唆される。
【００９０】
８．MRI造影剤への抗体結合
1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸(DOTA)をキレート剤として用いて、VHHタウ-A2-SHをガドリニウム(MRI造影剤)で標識した。合成マレイミド-(DOTA/Gd)3化合物へのタウ-A2-SHのチオ付加を含む部位特異的結合ストラテジを用いた。タウ-A2-SHは、RP-HPLC/MSにより示されるように、十分に規定された接合体タウ-A2-S-(DOTA/Gd)3に完全に変換された(収率65％)。タウ-A2-S-(DOTA/Gd)3のpIは、非標識タウ-A2-SHのものと比較して僅かに低下していた(データは示さず)。
【００９１】
実施例II：タウ-A2-SHのバリアント タウ-A2var-SHの合成
VHHタウ-A2はリン酸化タウを特異的に検出したが、その生産レベルはかなり低く、平均150μg/Lであり、凝集する傾向がある。したがって、特性が改善されたVHHタウ-A2のバリアントを提供する必要があった。
配列番号14のVHHタウ-A2-SHの２つの疎水性領域に位置する２つの疎水性アミノ酸を変異させた：76位のイソロイシンをグリシンと置換し(I76G)、110位のバリンをグリシンと置換した(V110G)(図10)。これら変異によりVHHの親水性が増大し、GRAVY指数が、タウ-A2-SHについての−0.280から該バリアントについての−0.365に増大した(GRAVY又はハイドロパシー指数の総平均はタンパク質の溶解性を示す：正のGRAVY(疎水性)、負のGRAVY(親水性))。26位のグルタミンもグルタミン酸で変異し(Q26E)、22位と23位との間にアスパラギン酸(D)及びバリン(V)を付加して、pIを僅かに低下させた(塩基性がより低い)(図10)。これら３つの変異アミノ酸(D23、E26及びG110)はCDRの外側に位置する。この変異体をタウ-A2var-SHと呼ぶ(配列番号17)。
【００９２】
VHHタウ-A2var-SH(配列番号17)をpET23dベクターにクローニングしてE.coliで発現させた。VHHタウ-A2var-SHをイミダゾール中で溶出させることによりNi-NTA樹脂で精製した。タウ-A2-SH及びタウ-A2var-SHの分析の比較を幾つかの方法で行った：
− SDS-PAGEにより、見かけの分子量約15〜16KDaに唯１つのバンドが明らかとなった(図11A)。親の対応物より５倍以上である0.8〜１mg/Lと推定される発現レベルを有するタウ-A2var-SHの良好な産生が観察された。更に、タウ-A2var-SHは凝集する傾向がより低い。pIは9.68であり、タウ-A2-SHより塩基性が僅かに低い(図11B)。
− リン酸化タウを認識する両VHHの能力をELISAにより評価した(図11C)。タウ-A2var-SH及びタウ-A2-SHの結合極性を比較しても、リン酸化タウの認識に差は見られなかった(図11C)。
− タウ-A2var-SHの機能的活性を更に評価するため、NFTのマウスモデル(Tg4510マウス)の組織についてIHCを行った。異なる化合物との脳スライスのインキュベーション及び抗His二次抗体により顕色の後、マウス組織上で両化合物によるNFTの検出が観察された(図11D)。タウ-A2varを用いる免疫染色は、タウ-A2を用いる場合と比較して僅かではあるが増強していた。
【００９３】
アフィニティーカラム溶出の直後の非透析タンパク質溶液について類似の手順を用いてVHHタウ-A2var-SHを標識した。
その後、VHHタウ-A2var-S-(DOTA/Gd)3によるNFTのインビボ検出能力を調べた。10mg/kg用量のタウ-A2var-S-(DOTA/Gd)3を２匹のTg4510マウスの尾静脈に注射した(270μg、150μL)。タウ-A2var-S-(DOTA/Gd)3の静脈内注射の４時間後、脳を採集し、５μm厚パラフィン切片を作製した。次いで、ウサギポリクローナル抗VHH抗体を用いるIHCを行った。皮質でNFTが標識された(図12)。これらデータにより、タウ-A2var-S-(DOTA/Gd)3の脳透過、拡散及びタウ-A2var-S-(DOTA/Gd)3によるNFTの標識が確証される。
【００９４】
結論
これら結果は、タウ-A2varがリン酸化タウ及びNFTの認識に関してタウ-A2と類似する様式で挙動することを証明している。iv注射後のIHCにより、VHHタウ-A2var-S-(DOTA/Gd)3は、BBBを横切り、更に２つめの関門(原形質膜)を横切ってニューロン内に浸透して細胞質内の標的に到達する能力が明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【配列表】
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