(57)【要約】【課題】保存条件や給与形態の制約を低減し、より低い用量で十分にＴｈ１を増加することができる、Ｔｈ１増加剤を提供することを目的とする。【解決手段】ブチリル置換度が０．３以上２．６以下であり、総置換度が０．５以上２．８以下であるセルロース誘導体を有効成分とするＴｈ１増加剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブチリル置換度が０．３以上２．６以下であり、総置換度が０．５以上２．８以下であるセルロース誘導体を有効成分とする１型ヘルパーＴ細胞増加剤。
【請求項２】
前記セルロース誘導体のブチリル置換度が０．３以上１．５以下であり、総置換度が０．５以上１．５以下である請求項１に記載の１型ヘルパーＴ細胞増加剤。
【請求項３】
前記セルロース誘導体のアセチル置換度が０を超え２．５以下である請求項１に記載の１型ヘルパーＴ細胞増加剤。
【請求項４】
前記セルロース誘導体のアセチル置換度が０である請求項１または２に記載の１型ヘルパーＴ細胞増加剤。
【請求項５】
前記セルロース誘導体が酪酸セルロースまたは酢酸酪酸セルロースである請求項１〜４のいずれか１項に記載の１型ヘルパーＴ細胞増加剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の１型ヘルパーＴ細胞増加剤を含有する食品。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の１型ヘルパーＴ細胞増加剤を含有し、前記セルロース誘導体は１重量％以上５重量％以下である食品。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の１型ヘルパーＴ細胞増加剤を含有する医薬。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の１型ヘルパーＴ細胞増加剤を含有する腫瘍の予防及び／又は治療用医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１型ヘルパーＴ細胞増加剤、食品、及び医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫システムは、病原体、ウイルス感染細胞、及び癌細胞等の異物から生体を守る防御機構であり、その機構には、リンパ球や好中球等の白血球が携わっている。リンパ球には、液性免疫に関わるＢ細胞、及び細胞性免疫に関わるＴ細胞と呼ばれる細胞が含まれ、Ｔ細胞には、ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞が存在する。
【０００３】
ＣＤ４陽性Ｔ細胞の大部分は、ヘルパーＴ細胞と呼ばれる。ヘルパーＴ細胞は、胸腺で生まれ、ナイーブＴ細胞（未成熟Ｔ細胞）として胸腺の外に放出され、抗原刺激により活性化されたナイーブＴ細胞は、活性化された時に存在するサイトカイン等の細胞外環境に応じ、特有の機能を有する１型ヘルパーＴ細胞（以下、Ｔｈ１と称する場合がある）、２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）、又は１７型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１７）に分化し、その抗原の排除に最適な免疫応答を誘導する。また、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の大部分は、抗原刺激により細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に分化する。
【０００４】
Ｔｈ１への分化の促進には、インターロイキン（ＩＬ）−１２及びインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）が関与する。ＩＬ−１２は樹状細胞とマクロファージから、ＩＦＮ−γは主にＴｈ１やナチュラルキラー（ＮＫ）細胞等から産生される。
【０００５】
そして、Ｔｈ１は、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（ＩＬ）−２等のサイトカインを産生し、これらのサイトカインによって細胞傷害性Ｔ細胞が活性化される。そして、細胞傷害性Ｔ細胞は、標的細胞を破壊する。
【０００６】
このような免疫システムを利用した癌等の治療として、細胞傷害性Ｔ細胞を利用した免疫療法の他、細胞傷害性Ｔ細胞の活性を補助するＴｈ１を利用した免疫療法が注目されている。
【０００７】
特許文献１には、ＩＬ−１２産生誘導能を有する乳酸菌の菌体であって、前記菌体が粒度１ミクロン未満に微粒子化され、かつ、分散剤又は賦形剤によって再凝集を防止されているものを有効成分とすることを特徴とするＴｈ１誘導剤、が記載されている。また、「Ｔｈ１誘導」とは、抗原提示細胞からＩＬ−１２を効率よく産生させることで、Ｔｈ０細胞（ナイーブＴｈ細胞）のＴｈ１への分化を促進し、生体内でＴｈ１優位の状態をつくり出すことを指すと記載されている。
【０００８】
特許文献２には、表面にサイトカイン誘導物質を担持する微生物菌体を含有することを特徴とする経口用サイトカイン誘導剤が記載されている。また、特許文献２には、次の記載もある。「本発明によると、経口投与により、免疫反応で重要な役割をするＩＦＮ−γ、ＩＬ−８等のサイトカインの生体内での産生を促進することができ、感染症、自己免疫疾患、炎症、腫瘍等多くの疾患の治療と予防を容易にすることが可能となる。」
【０００９】
非特許文献１には、発酵乳と乳酸菌飲料について調査を行った結果、ビフィズス菌が含まれる場合、その生菌数は２×１０６〜３×１０８ｃｆｕ／ｇ、乳酸菌では２×１０７〜１×１０９ｃｆｕ／ｇであったことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許第４６２１２１８号公報
【特許文献２】特開２００３−０６３９９１号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】多山賢二ら，“発酵乳製品中のビフィズス菌の生菌数および生存性”，日本食生活学会誌，2013年，第24巻，第2号，p.118-123
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
特許文献１には、乳酸菌の菌体を用いて、マウスのマクロファージ液からＩＬ−１２を産生させることが記載されているが、経口投与による効果は示されていない。
【００１３】
また、特許文献２には、形質転換乳酸菌をマウスに５×１０８ＣＦＵ／マウスで各週毎３回胃内投与した結果、血中ＩＦＮ−γの誘導が有意に認められたことが記載されている。非特許文献１に示されるように、ビフィズス菌又は乳酸菌の生菌数は、発酵乳及び乳酸菌飲料１ｇあたり多くとも５×１０８ｃｆｕ程度であることから、発酵乳又は乳酸菌飲料の量に換算すると、１週間で３ｇ程度の投与が必要となる。
【００１４】
種類や月齢にも依存するが、マウスの摂食量が１日あたり３ｇ程度であることを考慮すれば、１４重量％以上の発酵乳及び乳酸菌飲料を混餌投与する必要がある。これはヒトが摂取する場合にも非現実的に多量であり、医薬品として経口摂取するには苦痛を伴う量であり、また、食品として摂取する場合には通常の食事の楽しみを損なう量である。
【００１５】
また、このような従来の特定の細菌を用いる方法では、例えば、ヨーグルト等の発酵乳、及び乳酸菌飲料の保存・輸送のように、意図した細菌を生存させ、当該細菌以外の他の雑菌の繁殖を抑制するために、当該細菌を密閉し、冷蔵し、数週間程度の比較的短い保存期限を設ける必要がある等保存条件や給与形態の制約が多い。
【００１６】
本発明は、保存条件や給与形態の制約を低減し、より低い用量で十分にＴｈ１を増加することができる、Ｔｈ１増加剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の第一は、ブチリル置換度が０．３以上２．６以下であり、総置換度が０．５以上２．８以下であるセルロース誘導体を有効成分とする１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）増加剤に関する。
【００１８】
前記１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）増加剤は、前記セルロース誘導体のブチリル置換度が０．３以上１．５以下であり、総置換度が０．５以上１．５以下であってよい。
【００１９】
前記１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）増加剤は、前記セルロース誘導体のアセチル置換度が０を超え２．５以下であってよい。
【００２０】
前記１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）増加剤は、前記セルロース誘導体のアセチル置換度が０であってよい。
【００２１】
前記１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）増加剤は、前記セルロース誘導体が酪酸セルロースまたは酢酸酪酸セルロースであってよい。
【００２２】
本発明の第二は、前記１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）増加剤を含有する食品に関する。
【００２３】
本発明の第三は、前記１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）増加剤を含有し、前記セルロース誘導体は１重量％以上５重量％以下である食品に関する。
【００２４】
本発明の第四は、前記１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）増加剤を含有する医薬に関する。
【００２５】
本発明の第五は、前記１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）増加剤を含有する腫瘍の予防及び／又は治療用医薬に関する。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、保存条件や給与形態の制約を低減し、より低い用量で十分にＴｈ１を増加することができる、Ｔｈ１増加剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】アセチル化またはブチリル化した酢酸酪酸セルロースの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２】アセチル化またはブチリル化した再生セルロースの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図３】アセチル化した酪酸セルロースの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図４】Ｔｈ１に関するフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図５】フローサイトメトリーに基づくＴｈ１の定量評価を示す図である。
【図６】ＩＮＦ−γ産生細胞に関するフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図７】フローサイトメトリーに基づくＩＮＦ−γ産生細胞の定量評価を示す図である。
【図８】定量ＰＣＲ結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、好ましい実施形態の一例を具体的に説明する。
本開示に係るＴｈ１増加剤は、ブチリル置換度が０．３以上２．６以下であり、総置換度が０．５以上２．８以下であるセルロース誘導体を有効成分とするものである。
【００２９】
［セルロース誘導体］
本開示のセルロース誘導体は、ブチリル置換度が０．３以上２．６以下であるところ、０．３以上１．５以下であることが好ましく、０．５以上１．５以下であることがより好ましく、０．７以上１．４以下であることが更に好ましく、０．８以上１．３以下であることが最も好ましい。ブチリル置換度が０．３未満であると、用量にもよるが一般に消化管内で遊離する酪酸が少なくなり、所望のＴｈ１の増加効果が得られ難い。また、ブチリル置換度が２．６を超えると、おそらく疎水性が高すぎることを理由として、消化管内で腸内細菌等の細菌による分解が抑制され、遊離する酪酸が少なくなる傾向がある。
【００３０】
次に、本開示のセルロース誘導体は、総置換度が０．５以上２．８以下であるところ、０．５以上２．０以下であることが好ましく、０．５以上１．５以下であることがより好ましく、１．０以上１．５以下であることが更に好ましい。総置換度が０．５未満であると、用量にもよるが一般に消化管内で遊離する酪酸が少なくなり、所望のＴｈ１の増加効果が得られ難い。また、総置換度が２．８を超えると、おそらく疎水性が高すぎることを理由として消化管内で腸内細菌等の細菌による分解が抑制され、遊離する酪酸が少なくなる傾向がある。
【００３１】
ここで、ブチリル置換度とは、セルロースの繰り返し単位（グルコピラノース単位）あたりの２位、３位、及び６位の水酸基の水素原子を置換するブチリル基の数の和をいう。アセチル置換度等その他の置換基による置換度も同様である。また、総置換度とは、ブチリル置換度及びその他の置換基による置換度の和をいう。
【００３２】
本開示のセルロース誘導体の置換基は、大腸等消化管への酪酸送達の観点からは、ブチリル基のみ、言い換えれば、本開示のセルロース誘導体は、ブチリル置換度及び総置換度の値が等しいことが好ましいが、ブチリル基以外の置換基により置換されていてもよい。ブチリル基以外の置換基としては、例えば、アセチル基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、２−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシプロピル基、及びメチル基等が挙げられる。セルロースの６位（ヒドロキシメチル基）の一部を酸化してカルボキシル基にしてもよい。消化管内で腸内細菌等の細菌による分解を促進し、遊離する酪酸を多くする観点からは、セルロース誘導体に親水性を付与するのがよく、この観点からはこれらの置換基の中でも、ブチリル基に比して疎水性が低いアセチル基、カルボキシメチル基、カルボキシル基の導入は有効である。ブチリル基以外の置換基のうち１種または２種以上により置換されていてもよい。
【００３３】
特に、ブチリル基以外の置換基として、ブチリル基に比して疎水性が低いアセチル基により置換されている場合について述べる。本開示のセルロース誘導体を結晶性が高い等の理由で比較的ブチリル化が難しいセルロースを原料として用いて製造する場合には、前処理として行うセルロースの活性化処理剤やアシル化反応の媒体等として酢酸を使うのがよく、その結果得られるセルロース誘導体はアセチル基が導入されたものとなる。
【００３４】
あるいは、市販のセルロースアセテートブチレート（酢酸酪酸セルロース）を原料として用い、そのブチリル基およびアセチル基の一部を加水分解して本開示のセルロース誘導体を得る場合には、そのような加水分解反応の媒体等として酢酸を使った結果、得られるセルロース誘導体にアセチル基が残存したり、導入されたものとなる。
【００３５】
上記の通り、本開示のセルロース誘導体は、ブチリル置換度及び総置換度の値が等しいことが好ましく、アセチル置換度は０であることが好ましいが、セルロース誘導体がアセチル基で置換されている場合、そのアセチル置換度は、０を超え２．５以下であることが好ましく、０．１以上１．０以下であることがより好ましい。
【００３６】
ここで、セルロース誘導体がブチリル基のみで置換されている場合、そのセルロース誘導体を酪酸セルロース（または酪酸化セルロース）といい、また、セルロース誘導体の置換基が、ブチリル基以外にアセチル基でも置換されている場合、そのセルロース誘導体を酢酸酪酸セルロース（または酢酸酪酸化セルロースもしくは酢酸化酪酸化セルロース）という。
【００３７】
セルロース誘導体の置換度は、以下の方法により測定することができる。例えば、手塚（Ｔｅｚｕｋａ，  Ｃａｒｂｏｎｙｄｒ．  Ｒｅｓ.  ２７３,  ８３（１９９５））の方法に従いＮＭＲ法で測定できる。すなわち、セルロース誘導体の遊離水酸基をピリジン中でカルボン酸無水物によりアシル化する。ここで使用するカルボン酸無水物の種類は分析目的に応じて選択すべきであり、例えば酪酸セルロースのブチリル置換度を分析する場合は、無水酢酸がよい。その他、例えば酢酸酪酸セルロースのブチリル置換度を分析する場合は無水酢酸が良く、アセチル置換度を分析する場合は無水酪酸がよい。得られた試料を重クロロホルムに溶解し、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定する。置換基がアセチル基またはブチリル基である場合を例に挙げれば、アセチル基の炭素シグナルは１６９ｐｐｍから１７１ｐｐｍの領域に高磁場から２位、３位、６位の順序で、ブチリル基の炭素シグナルは、１７１ｐｐｍから１７３ｐｐｍの領域に同様に高磁場側から２位、３位、６位の順序で現れる。他の例を挙げれば、プロピオニル基を有するセルロース誘導体か、または、プロピオニル基を有しないセルロース誘導体を分析目的で無水プロピオン酸で処理し、プロピオニル置換度を分析する場合は、プロピオニル基のカルボニル炭素のシグナルは、１７２ｐｐｍから１７４ｐｐｍの領域に同じ順序で現れる。手塚の方法やそれに準じる方法で無水カルボン酸で処理したセルロース誘導体の総置換度は３．０なので、セルロース誘導体がもともと有するアシル基のカルボニル炭素シグナルと、無水カルボン酸処理で導入したアシル基のカルボニルシグナルの面積の総和を３．０と規格化し、それぞれ対応する位置でのアセチル基、ブチリル基、及びプロピオニル基の存在比（言い換えれば、各シグナルの面積比）を求めれば、これをセルロース誘導体におけるグルコース環の２位、３位、６位の各アセチル、ブチリルまたはプロピオニル置換度とできる。なお、言うまでもなく、この方法で分析できるアシル基を含む置換基は、分析目的の処理に用いる無水カルボン酸に対応しない置換基のみである。また、１３Ｃ−ＮＭＲのほか、１Ｈ−ＮＭＲで分析することもできる。
【００３８】
ただし、試料であるセルロース誘導体のグルコース環の２位、３位及び６位の総置換度が３．０であり、かつその置換基が全てアセチル基及びブチリル基等の限定的な置換基であることが予め把握される場合には、プロピオニル化の工程を除き、試料を直接重クロロホルムに溶解してＮＭＲスペクトルを測定することもできる。置換基が全てアセチル基及びブチリル基であれば、プロピル化の工程を含む場合と同様に、アセチル基の炭素シグナルは１６９ｐｐｍから１７１ｐｐｍの領域に高磁場から２位、３位、６位の順序で、ブチリル基の炭素シグナルは、１７１ｐｐｍから１７３ｐｐｍの領域に同じ順序で現れるので、それぞれ対応する位置でのアセチル基及びブチリル基の存在比（言い換えれば、各シグナルの面積比）から、セルロース誘導体におけるグルコース環の２位、３位、６位の各アセチル及びブチリル置換度等の置換度を求めることができる。
【００３９】
本開示のセルロース誘導体の製造方法は、特に限定されないが、例えば、次のようにして製造することができる。第一に、セルロース、ブチリル基以外の脂肪族アシル基もしくはその他の置換基のみで置換されたセルロース誘導体、またはブチリル基を有する他のセルロース誘導体を原料として、有機溶媒中、触媒の存在下、原料セルロースまたはセルロース誘導体を無水酪酸または酪酸塩化物と反応させることにより行うことができる。有機溶媒としては、例えば、酢酸、アセトン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、及び塩化リチウムのＤＭＡｃ溶液、並びにこれらの混合溶媒等が挙げられる。これらの中でも、酢酸を少なくとも含む溶媒が好ましい。触媒としては、硫酸、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン等が挙げられる。
【００４０】
第二に、天然セルロースを原料として、必要によりセルロースを活性化処理した後、硫酸触媒の存在下、当該セルロースをアシル化剤でアシル化した後、必要により部分中和し、脱アシル化（加水分解又は熟成）することにより製造できる。より詳細には、通常、酢酸、プロピオン酸及び酪酸等のセルロースをアシル基に対応する有機カルボン酸（ブチリル基により置換する場合は酪酸）により活性化処理を施した後、硫酸触媒を用いて無水酢酸、無水プロピオン酸、及び無水酪酸等のアシル化剤（ブチル化の場合は無水酪酸）によりトリアシルエステルを調製し、酸無水物を分解しカルボン酸／水系で加水分解又は熟成によりアシル化度を調整することにより製造できる。
【００４１】
原料となる天然セルロースとしては、一般的には木材パルプまたはコットンリンターが挙げられる。これら天然セルロースの重量平均重合度はそれぞれ１，５００〜３，０００または３，０００〜６，０００程度である。上記のように天然セルロースを原料として、本開示のセルロース誘導体を調製する場合、その調製過程で重量平均重合度は低下し、５０〜１，５００程度となり得る。本開示のセルロース誘導体の重量平均重合度は特に制限されないが、例えば、セルロース誘導体を調製する際の各種反応操作における攪拌負荷や、熟成工程の後の沈殿化操作における沈殿化剤使用量の観点からは、重量平均重合度は１００〜４００程度が好ましい。
【００４２】
［Ｔｈ１増加剤］
本開示のＴｈ１増加剤における、Ｔｈ１とは、ナイーブＴ細胞から分化したインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を優勢に産生するＴ細胞を指す。Ｔｈ１は、典型的には、転写因子Ｔ−ｂｅｔ陽性ＣＤ４陽性のＴ細胞である。
【００４３】
本開示のＴｈ１増加剤における、増加は、ナイーブＴ細胞のＴｈ１への分化、該分化により誘導されるＴｈ１の増殖及び／又は蓄積のいずれの意味も含む。そして、当該増加は、インビボ、インビトロ、及びエックスビボのいずれの系における増加も含む。
【００４４】
当該Ｔｈ１増加剤の投与により、腸管においてＴｈ１が増加する。そして、当該Ｔｈ１増加剤投与の効果は、以下のようにして評価することができる。当該Ｔｈ１増加剤を経口投与されたマウス等の実験動物から単離されたリンパ球のうち、Ｔ−ｂｅｔを発現するＣＤ３及びＣＤ４陽性の細胞を本開示におけるＴｈ１として標識し、フローサイトメトリーによって、そのＴｈ１の比率を、単離されたリンパ球の全数を１００として測定することができる。
【００４５】
当該Ｔｈ１増加剤の投与、特に経口投与により腸管のＴｈ１が増加する機構は以下のとおりである。当該Ｔｈ１増加剤の有効成分である本開示のセルロース誘導体は、哺乳類の消化酵素では分解されず、腸内細菌によって一部あるいは全てが発酵・分解される。この腸内細菌による当該セルロース誘導体の発酵・分解における産物としては、ブチリル基に由来する酪酸；並びにグルコース残基に由来する酢酸、プロピオン酸、及び酪酸等の短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）が考えられる。このうち、特に酪酸が優先的に増加する。
【００４６】
本開示のセルロース誘導体は、腸内細菌によって分解される等のメカニズムにより、腸内で酪酸を遊離し酪酸濃度を高める等の特徴を有する。
【００４７】
特許文献２に記載されるような、特定の細菌を直接投与するようなプロバイオティクス的アプローチに対し、本開示のＴｈ１増加剤を投与することは、腸内で酪酸を与えるよう食物繊維としてのセルロースに関して創意工夫を行うものであり、腸内細菌に対する環境側にアドレスする、いわばプレバイオティクス的アプローチである。
【００４８】
ここで、プロバイオティクスとプレバイオティクスとは対立するものではなく、相乗的に効果を発揮することや、一方が効果を示さない状況で他方が有効に作用する等相補的に効果を発揮することが期待されるものである。
【００４９】
本開示のＴｈ１増加剤は、プレバイオティクス的アプローチをとることができる。そして、本開示のＴｈ１増加剤は、有効成分の保存が容易であったり、給与形態の選択肢が広いとの特徴がある。例えば、本開示のＴｈ１増加剤は室温で１年程度保存することが出来る上、パン、ケーキ、ビスケット等の２００℃を下回る温度で焼いた食品の成分として使うことが出来る。
【００５０】
本開示のＴｈ１増加剤は、食品または医薬に含有されていてもよく、以下のように各種食品または医薬の構成要素として使うことが出来、その投与方法としては、特に経口投与が挙げられる。形態は種々のものを選択できる。例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤、丸剤、懸濁剤、液剤及び乳剤等の通常の医薬品の形態、並びに飲料；ガム、チョコレート、飴、羊羹、及びゼリー等の糖菓製品；麺類；パン、ケーキ、ビスケット等の焼いた食品；缶詰；レトルト食品；畜肉食品；水産練食品；マーガリン、ドレッシング、及びマヨネーズ等の食用油組成物；栄養補助食品；バター、アイスクリーム、ヨーグルト等の牛乳製品；等の通常の食品の形態を採用することができる。これらの中でも、ヒトにおいて効果を得るための用量としては１日あたり１ｇ〜１０ｇの摂取が好ましく、比較的多量の摂取が可能となることから、糖衣錠剤；麺類；ビスケット等の焼いた食品等が好ましい。また、本開示のＴｈ１増加剤は、医薬品の形態または食品の形態に増粘剤として組み込むこともできる。
【００５１】
本開示のＴｈ１増加剤を含有する食品について、セルロース誘導体の含有量としては、食品のうち０．５重量％以上であることが好ましく、１重量％以上５重量％以下であることがより好ましく、１．５重量％以上３％重量以下であることがさらに好ましい。食品中のＴｈ１増加剤の量を上記の範囲とすることで、食品の味や食感を損なうことなくＴｈ１を増加させることができる。
【００５２】
本開示のＴｈ１増加剤が食品または医薬に含有されている場合の予防及び／又は治療（有害作用の軽減又は予防）に有用な対象疾患の具体的な例としては、アレルギー疾患、感染性疾患、及び臓器移植における拒絶反応等である以下のものが挙げられる。スプルー、１型糖尿病、骨髄移植に続く移植片対宿主拒絶反応、変形性関節症、若年性慢性関節炎、ライム病関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、インスリン依存性糖尿病、甲状腺炎、ぜんそく、乾癬、強皮症皮膚炎（ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、アトピー性皮膚炎、移植片対宿主拒絶反応、臓器移植に関連した急性又は慢性の免疫疾患、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、播種性血管内凝固症候群、川崎病、グレーブス病（パセドゥ病）、ネフローゼ症候群、慢性疲労症候群、ヴェーゲナー肉芽腫症、ヘノッホ・シェーライン紫斑病、腎臓における顕微鏡的血管炎、慢性活動性肝炎、ブドウ膜炎、敗血症性ショック、毒素性ショック症候群、敗血症候群、悪液質、後天性免疫不全症候群、急性横断性脊髄炎、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、原発性胆汁性肝硬変症、溶血性貧血、多腺性機能不全症候群１型及び多腺性機能不全症候群２型、シュミット症候群、成人（急性）呼吸窮迫症候群、脱毛症、円形脱毛症、血清反応陰性関節症、関節症、ライター病、乾癬性関節症、クラミジア感染症、エルシニア・サルモネラ感染関連関節症、脊椎関節症、アテローム性疾患／動脈硬化、アレルギー性大腸炎、アトピー性アレルギー、食物アレルギー（ピーナッツアレルギー、ナッツアレルギー、卵アレルギー、乳アレルギー、大豆アレルギー、小麦アレルギー、魚介アレルギー、貝アレルギー又はゴマアレルギー等）、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、類天疱瘡、線状ＩｇＡ病、クームス試験陽性溶血性貧血、後天性悪性貧血、若年性悪性貧血、筋肉脊髄炎／ロイヤルフリー病、慢性粘膜皮膚カンジダ症、巨細胞性動脈炎、原発性硬化性肝炎、後天性免疫不全症候群、後天性免疫不全関連疾患、Ｃ型肝炎、分類不能型免疫不全症（分類不能型低ガンマグロブリン血症）、拡張型心筋症、線維性肺疾患、特発性線維化性肺胞炎、炎症後間質性肺炎、間質性肺炎、結合組織病関連間質性肺疾患、混合性結合組織関連疾患肺疾患、全身性硬化症関連間質性肺疾患、関節リウマチ関連間質性肺疾患、全身性エリテマトーデス関連肺（１ｕｎｇ）疾患、皮膚筋炎／多発性筋炎関連肺疾患、シェーグレン病関連肺疾患、強直性脊椎炎関連肺疾患、血管炎性びまん性肺疾患、ヘモジデリン沈着症関連肺疾患、薬物誘発性間質性肺疾患、放射線線維症、閉塞性細気管支炎、慢性好酸球性肺炎、リンパ球浸潤性肺疾患、感染後間質性肺炎、痛風性関節炎、黒色表皮腫によるＢ型インスリン抵抗性、副甲状腺機能低下症、臓器移植に関連した急性免疫疾患、臓器移植に関連した慢性免疫疾患、変形性関節症、原発性硬化性胆管炎、特発性白血球減少症、腎疾患ＮＯＳ、糸球体腎炎、腎臓における顕微鏡的血管炎、円板状エリテマトーデス、特発性男子不妊症又はＮＯＳ、多発性硬化症（全てのサブタイプに関する）、インスリン依存性糖尿病、交感性眼炎、肺高血圧症による結合組織病、グッドパ���チャー症候群、結節性多発動脈炎の肺症状、急性リウマチ熱、リウマチ様脊椎炎、スティル病、全身性硬化症、高安病／動脈炎、特発性血小板減少症、甲状腺機能亢進症、甲状腺腫甲状腺機能低下症（橋本病）、原発性粘液水腫、水晶体起因性ブドウ膜炎、原発性血管炎、白斑、アレルギー性鼻炎（花粉アレルギー）、アナフィラキシー、ペットアレルギー、ラテックスアレルギー、薬物アレルギー、アレルギー性鼻炎結膜炎、好酸球性食道炎、好酸球増加症候群、好酸球性胃腸炎、皮膚エリテマトーデス、好酸球性食道炎、好酸球増加症候群、好酸球性胃腸炎、下痢並びに腫瘍等が挙げられる。
【００５３】
Ｔｈ１は、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（ＩＬ）−２等のサイトカインを産生するものである。Ｔｈ１の増加は、例えば、ＩＦＮ−γ等のサイトカインの生体内での産生を通じて、感染症、炎症及び腫瘍等の予防や治療に役立つことが期待できる。そして、小腸、大腸、盲腸、結腸、直腸等の腸管、特に大腸の粘膜固有層（lamina propria）におけるＴｈ１が増加することは、腫瘍や食物アレルギー等のアレルギーの予防及び／又は治療に有用である。
【００５４】
本開示のＴｈ１増加剤の投与量は、所望のＴｈ１増加をもたらすのに十分な量で、個体に投与される。具体的には、個体の年齢、体重、性別、健康状態、並びに胃、小腸、及び大腸等の状態等の投与される個体に関する条件、投与方法、及び製剤形態等を考慮して経験的に決定され得る。投与１回における量は、例えば、１２．５ｍｇ／ｋｇ体重〜１２５ｍｇ／ｋｇ体重であってよく、２５ｍｇ／ｋｇ体重〜７５ｍｇ／ｋｇ体重であってよい。また、個体に１回投与されてもよいし、１回を超えて投与されてもよい。１回を超えて投与される場合は、定期的に、不定期に、または必要に応じて投与され得る。適切な投与回数は、投与量と同様に、個体に関する条件、投与方法、及び製剤形態等を考慮して経験的に決定され得る。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によりその技術的範囲が限定されるものではない。
【００５６】
［セルロース誘導体の調製］
（再生セルロースの調製（酢酸酪酸セルロースの塩基触媒脱エステル化））
１．５ｋｇの水酸化ナトリウムを２９．０Ｌの脱イオン水に添加し溶解した。この容器内の気相部を窒素雰囲気とし、原料として２．０ｋｇの酢酸酪酸セルロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、製品番号４１９０６０；以下、「原料酢酸酪酸セルロース」と称する。）を加え、つづいて７．０Ｌのメタノールをゆっくり添加した。この混合物を攪拌しながら３０℃で７２時間保持した。その後、酢酸を添加してｐＨを６．２〜７とした。得られた固形物をろ別し、７５Ｌの脱イオン水を使って洗浄した後、８０℃で減圧乾燥し、８８０．０ｇの白色粉末を得た。これをＣｅｌｌ−ＷＳＣＢとする。なお、後の「置換度の測定」に示すとおり、原料酢酸酪酸セルロースのアセチル置換度は０．１、ブチリル置換度は２．５、及び総置換度は２．６であり、Ｃｅｌｌ−ＷＳＣＢは、アセチル基、ブチリル基を有さない再生セルロースである。
【００５７】
（Ｃｅｌｌ−ＷＳＣＢ（再生セルロース）の溶解）
８５０．０ｇのＣｅｌｌ−ＷＳＣＢ（再生セルロース）を脱イオン水／メタノール混合物（３．４Ｌ／１．７Ｌ）に懸濁し、３０分静置した後、液相をろ別した。得られた湿潤した再生セルロースを５．７Ｌのジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）に懸濁し、３０分静置した後、液相をろ別するという操作を４回繰り返し、再生セルロースの湿潤物から水分を除いた。得られた再生セルロース湿潤物に１．２ｋｇの塩化リチウムと１５．０ＬのＤＭＡｃを加え、窒素雰囲気下で１００℃に昇温し、１時間保持した。この混合物を室温付近まで冷却し、さらにドライアイスを使ってマイナス２０℃まで冷却し１時間保持し、その後室温付近まで昇温させた。透明な再生セルロース溶液が得られた。
【００５８】
（酪酸セルロース（ＷＳＣＢ）の調製）
得られた再生セルロース溶液に窒素雰囲気下、１．１Ｌのピリジンを加え、さらに１．２２１Ｌの無水酪酸をゆっくり加えた。そして、９０℃に昇温し、５時間保持した。その後、５０℃に降温し、１．０Ｌのエタノールをゆっくり添加し、反応混合物を得た。このとき、無水物の分解に基づく昇温によって混合物の温度が上昇したが、温度は常に７５℃以下になるようエタノールの添加速度を調整した。得られた反応混合物を１１０Ｌのテトラヒドロフラン（ＴＦＨ）と脱イオン水の混合物（容積比１／１）にゆっくり添加し、沈殿物を形成させた。沈殿物は、３０Ｌの脱イオン水と３０Ｌのエタノールで順次洗浄した。８０℃で減圧乾燥し、９２５．０ｇの生成物を得た。これをＷＳＣＢとする。なお、後の「置換度の測定」に示すとおり、ＷＳＣＢは、アセチル置換度０．０、ブチリル置換度１．３、総置換度１．３の酪酸セルロースである。
【００５９】
［置換度の測定］
（原料酢酸酪酸セルロースの置換度の測定）
（１）原料酢酸酪酸セルロースのアセチル化
１．２ｇの原料酢酸酪酸セルロースを１２ｍＬのＤＭＡｃに溶解した。この溶液に１２ｍＬのピリジン、９０ｍｇのＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン、１２ｍＬの無水酢酸を加え、窒素雰囲気下、攪拌しながら１００℃に昇温し、１時間保持した。この反応混合物を室温付近まで冷却し、６００ｍＬのメタノール／脱イオン水混合溶媒（容積比１／１）に添加し、沈殿物を形成させ、脱液した。沈殿物は、６０ｍＬの同じ組成の混合溶媒で３回洗浄した。沈殿物は、３０ｍＬのアセトンに溶解した。沈殿物のアセトン溶液を６００ｍＬのメタノール／脱イオン水混合溶媒（容積比１／１）に添加し、沈殿物を形成させ、脱液した。沈殿物は、６０ｍＬの同じ組成の混合溶媒で３回洗浄した。そして、８０℃で減圧乾燥し粉末状の試料を得た。得られた試料は、原料酢酸酪酸セルロースをアセチル化したものである。これをＡＮ０２０とする。
【００６０】
ＡＮ０２０のアセチル基およびブチリル基の合計の置換度は３．０である。アセチル基およびブチリル基の合計の置換度が３．０であること、言い換えれば、未置換水酸基が含まれないことは、アシル化（アセチル化）により得られた試料をもう一度同じ条件で２回目のアシル化（アセチル化）をしたときに、この２回目のアシル化の前後でアセチル基とブチリル基の比率（あるいは、合計の置換度が３．０であるとの前提で算出したアセチル基およびブチリル基のそれぞれの置換度）が変化しないことによって検証した。
【００６１】
得られたＡＮ０２０を重クロロホルムに溶解し、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定した。結果は、図１に示す。グルコース残基２位、３位、及び６位のアセチル基およびブチリル基シグナルをそれぞれＡｃ２、Ａｃ３、Ａｃ６、Ｂｕ２、Ｂｕ３、Ｂｕ６と称する。アセチル基の炭素シグナルは１６９ｐｐｍから１７１ｐｐｍの領域に高磁場から２位、３位、６位の順序で、ブチリル基の炭素シグナルは、１７１ｐｐｍから１７３ｐｐｍの領域に同じ順序で現れるからＡｃ２、Ａｃ３、Ａｃ６、Ｂｕ２、Ｂｕ３、Ｂｕ６は、それぞれ図１に示すとおりのシグナルである。これらシグナルの面積の総和を３．０とし、この総和におけるＡｃ２、Ａｃ３、Ａｃ６の面積の和及びＢｕ２、Ｂｕ３、Ｂｕ６の面積の和の比を求め、それぞれをアセチル置換度及びブチリル置換度とした。その結果、ブチリル置換度は２．５であった。
【００６２】
（２）原料酢酸酪酸セルロースのブチリル化
１２ｍＬの無水酢酸を１８ｍＬの無水酪酸に代えた以外は、上記（１）原料酢酸酪酸セルロースのアセチル化と同様にして、粉末状の試料を得た。これをＡＮ０２１とする。ＡＮ０２１は、原料酢酸酪酸セルロースをブチリル化したものである。
【００６３】
ＡＮ０２１のアセチル基およびブチリル基の合計の置換度も３．０である。アセチル基およびブチリル基の合計の置換度が３．０であること、言い換えれば、未置換水酸基が含まれないことは、アシル化（ブチリル化）により得られた試料をもう一度同じ条件でアシル化（ブチリル化）したときに、この２回目のアシル化の前後でアセチル基とブチリル基の比率（あるいは、合計の置換度が３．０であるとの前提で算出したアセチル基およびブチリル基のそれぞれの置換度）が変化しないことによって検証した。
【００６４】
ＡＮ０２１についても、ＡＮ０２０と同様に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定した。結果は、図１に示す。Ａｃ２、Ａｃ３、Ａｃ６、Ｂｕ２、Ｂｕ３、Ｂｕ６のシグナルの面積の総和を３．０とし、この総和におけるＡｃ２、Ａｃ３、Ａｃ６の面積の和及びＢｕ２、Ｂｕ３、Ｂｕ６の面積の和の比を求め、それぞれをアセチル置換度及びブチリル置換度とした。その結果、アセチル置換度は０．１であった。
【００６５】
（３）アセチル置換度及びブチリル置換度
原料酢酸酪酸セルロースはアセチル基とブチリル基を有し、さらに未置換の水酸基を有するものであるため、この未置換水酸基をアセチル化することで得られたＡＮ０２０について求めたブチリル置換度は、原料酢酸酪酸セルロースのブチリル置換度と等しい。また、ＡＮ０２１について、求めたアセチル置換度も原料酢酸酪酸セルロースのアセチル置換度と等しい。したがって、原料酢酸酪酸セルロースのアセチル置換度は０．１、ブチリル置換度は２．５であり、総置換度は２．６である。
【００６６】
（Ｃｅｌｌ−ＷＳＣＢの置換度の測定）
（１）Ｃｅｌｌ−ＷＳＣＢのアセチル化
１．６ｇのＣｅｌｌ−ＷＳＣＢを１００ｍＬの脱イオン水に懸濁し、室温で３０分静置し、ガラスフィルター（Ｇ３）で脱液し、湿潤したＣｅｌｌ−ＷＳＣＢを得た。この湿潤したＣｅｌｌ−ＷＳＣＢを６０ｍＬのＤＭＡｃに懸濁し、室温で３０分静置し、ガラスフィルター（Ｇ３）で脱液する一連の操作を５回行い、得られた湿潤したＣｅｌｌ−ＷＳＣＢに２４ｍＬのＤＭＡｃ及び２．４ｇの塩化リチウムを加え、窒素雰囲気下、攪拌しながら１００℃に昇温し、１時間保持した。この混合物を室温付近まで冷却し、さらにドライアイスを使ってマイナス２０℃まで冷却し１時間保持し、その後室温付近まで昇温させたところ、透明な溶液が得られた。この溶液に２４ｍｌのピリジン、１８０ｍｇのＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン、２４ｍＬの無水酢酸を加え、窒素雰囲気下、攪拌しながら１００℃に昇温して８時間保持し、その後室温付近まで放冷した。この反応混合物を１，２００ｍＬのメタノール／脱イオン水混合溶媒（容積比１／１）に添加し、沈殿物を形成させ、脱液した。沈殿物は、１２０ｍＬの同じ組成の混合溶媒で３回洗浄した。得られた沈殿物は、６０ｍＬのアセトンに溶解した。なお、この溶解処理においては、マイナス２０℃への冷却と室温付近までの昇温を行った。沈殿物のアセトン溶液を１，２００ｍＬのメタノール／脱イオン水混合溶媒（容積比１／１）に添加して沈殿物を形成させ、脱液した。沈殿物は、１２０ｍＬの同じ組成の混合溶媒で３回洗浄した後、８０℃で減圧乾燥し粉末状の試料を得た。これをＡＮ００９とする。
【００６７】
得られたＡＮ００９を重クロロホルムに溶解し、ＡＮ０２０と同様に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定した。結果は、図２に示す。ＡＮ００９のスペクトルにおいて、ブチリル基に相当するシグナルは認められなかった。
【００６８】
（２）Ｃｅｌｌ−ＷＳＣＢのブチリル化
２４ｍＬの無水酢酸を３８ｍｌの無水酪酸にした以外は、上記（１）Ｃｅｌｌ−ＷＳＣＢのアセチル化と同様にして、粉末状の試料を得た。これをＡＮ０１３とする。ＡＮ０１３は、Ｃｅｌｌ−ＷＳＣＢ（再生セルロース）をブチリル化したものである。
【００６９】
得られたＡＮ０１３を重クロロホルムに溶解し、ＡＮ０２０と同様に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定した。結果は、図２に示す。ＡＮ０１３のスペクトルにおいて、アセチル基に相当するシグナルは認められなかった。
【００７０】
（３）アセチル置換度及びブチリル置換度
得られたＡＮ００９について求めたブチリル置換度は０である。ＣＥＬＬ−ＷＳＣＢからＡＮ００９を得る一連の処理においてブチリル基を付加あるいは脱離させる処理は含まれないため、得られたＡＮ００９について求めたブチリル置換度は、Ｃｅｌｌ−ＷＳＣＢ（再生セルロース）のブチリル置換度と等しい。すなわち、Ｃｅｌｌ−ＷＳＣＢ（再生セルロース）のブチリル置換度は０である。
【００７１】
また、得られたＡＮ０１３について求めたアセチル置換度は０である。ＡＮ０１３について求めたアセチル置換度もＣｅｌｌ−ＷＳＣＢのアセチル置換度と等しい。したがって、Ｃｅｌｌ−ＷＳＣＢのアセチル置換度は０である。したがって、原料酢酸酪酸セルロースの塩基触媒脱エステル化で得られたＣｅｌｌ−ＷＳＣＢのアセチル置換度は０、ブチリル置換度は０である。つまり、Ｃｅｌｌ−ＷＳＣＢは再生セルロースであることが確認できた。
【００７２】
（酪酸セルロース（ＷＳＣＢ）の置換度の測定）
原料酢酸酪酸セルロースを酪酸セルロース（ＷＳＣＢ）に代えた以外は、上記（１）原料酢酸酪酸セルロースのアセチル化と同じ方法で、酪酸セルロース（ＷＳＣＢ）をアセチル化し、粉末状の試料を得た。これをＡＮ００４とする。
【００７３】
得られたＡＮ００４を重クロロホルムに溶解し、ＡＮ０２０と同様に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定した。結果は、図３に示す。
【００７４】
Ｃｅｌｌ−ＷＳＣＢはアセチル基を有しないことから、ＡＮ００４のスペクトルが示すアセチル基はすべて後のアセチル化で導入されたものと考えられる。他方、ＡＮ００４のスペクトルが示すブチリル基はすべてＷＳＣＢに由来するものと考えられる。ＡＮ００４のアセチル基およびブチリル基の合計の置換度も、３．０である。Ａｃ２、Ａｃ３、Ａｃ６、Ｂｕ２、Ｂｕ３、Ｂｕ６のシグナルの面積の総和を３．０とし、この総和におけるＡｃ２、Ａｃ３、Ａｃ６の面積の和及びＢｕ２、Ｂｕ３、Ｂｕ６の面積の和の比を求め、それぞれをアセチル置換度及びブチリル置換度とした。ブチリル置換度は１．３であった。
【００７５】
ＷＳＣＢからＡＮ００４を得る一連の処理においてブチリル基を付加あるいは脱離させる処理は含まれないため、得られたＡＮ００４について求めたブチリル置換度は酪酸セルロース（ＷＳＣＢ）のブチリル置換度と等しい。したがって酪酸セルロース（ＷＳＣＢ）のブチリル置換度は１．３である。
【００７６】
（酪酸セルロース（ＷＳＣＢ）の重合度の測定）
上記の方法でＷＳＣＢをアセチル化することで得たＡＮ００４のポリスチレン換算分子量（重量平均分子量および数平均分子量）をＧＰＣ（ＳＥＣ）で測定し、さらに次の式に基づき重合度（重量平均重合度および数平均重合度）を求め、これをＷＳＣＢの重合度とした。
重合度＝分子量÷（１６２．１４＋ブチリル置換度×７０．０９１＋（３−ブチリル置換度）×４２．０３７）
分子量：重量平均分子量または数平均分子量
【００７７】
ＧＰＣの測定は次の条件で行った。
溶媒：テトラヒドロフラン
試料濃度：０．２％（ｗｔ／ｖｏｌ）
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＫＦ−８０４およびＫＦ−８０５
温度：３０℃
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
試料注入量：５０μｌ
検出：示差屈折率検出器
標準ポリスチレン：Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＭ−１０５（分子量２，７００，０００、１，３９０，０００、６６１，０００、３２３，０００、１２４，０００、４７，２００、１８，３００、６，９４０、２，９８０、および、１，２２０）
【００７８】
このようにして求めたＷＳＣＢの重量平均重合度は２５４、数平均重合度は１２８であった。
【００７９】
［Ｔｈ１増加の評価］
（飼料の調製）
精製飼料ＡＩＮ−９３Ｇ（REEVEら、Journal of Nutrition, 123, 1939-1951(1993）)、には５重量％のセルロースが含まれるところ、このセルロースを全てＷＳＣＢに置き換えたもの（以下、ＷＳＣＢ−ＡＩＮ−９３Ｇと称することがある）を酪酸食として用いた。また、このセルロースを全てＣｅｌｌ−ＷＳＣＢに置き換えたもの（以下、Ｃｅｌｌ−ＷＳＣＢ−ＡＩＮ−９３Ｇと称することがある）を通常食として用いた。
【００８０】
（実験動物）
３週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ系雄性マウスを用いた。
【００８１】
（飼育実験）
１０個体のマウスにＣｅｌｌ−ＷＳＣＢ−ＡＩＮ−９３Ｇを与えて１週間飼育した（予備飼育）。その後、マウスを２群各５個体にグループ分けし、さらに４週間飼育した。このとき、１群にＣｅｌｌ−ＷＳＣＢ−ＡＩＮ−９３Ｇを与え、これを通常食群とした。残り１群にはＷＳＣＢ−ＡＩＮ−９３Ｇを与え、これを酪酸食群とした。飼料はいずれも自由摂取とした。
【００８２】
（細胞分離及びフローサイトメトリー）
飼育したマウスの大腸粘膜固有層からリンパ球を単離するために、大腸を採取し、長手方向に開裂して中の糞便等を洗浄し除去した。そして、洗浄した大腸を３７℃で２０分間、５ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＨＢＳＳ中にて振盪した。上皮細胞及び脂肪組織を除去した後、腸組織を細かく小切片にし、ＲＰＭＩ  １６４０培地（２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、４００Ｕ／ｍｌコラゲナーゼＤ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）、０．２５Ｕ／ｍｌディスパーゼ（ＣＯＲＮＩＮＧ）、及び０．１ｍｇ／ｍｌＤＮａｓｅＩ（ＷＡＫＯ）を添加し、３７℃の水浴中で１時間振盪した。消化した組織を５ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＨＢＳＳで洗浄し、５ｍｌ  ３５％パーコール（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に再懸濁し、１５ｍｌファルコンチューブ中の２．５ｍｌ  ７０％パーコールの上に重層した。そして、室温下にて２０００ｒｐｍで２０分間遠心し、パーコール密度勾配による細胞分離を行った。境界面の細胞を回収して粘膜固有層リンパ球として使用した。
【００８３】
（Ｔｈ１の染色）
回収した細胞は染色バッファー（ＰＢＳ、２％  ＦＢＳ）に懸濁し、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５−で標識された抗ＣＤ３ｅ抗体（１４５−２Ｃ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びＡＰＣ−ｅｆｌｏｕｒ７８０−で標識された抗ＣＤ４抗体（ＲＭ４−５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて染色した。ＣＤ３ｅ、ＣＤ４を染色した後、細胞内Ｆｏｘｐ３、Ｔ−ｂｅｔの染色は、Ｆｏｘｐ３  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｅｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＰＥで標識された抗Ｆｏｘｐ３抗体（ＦＪＫ−１６ｓ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰＥ／ｃｙ７で標識された抗Ｔ−ｂｅｔ（４Ｂ−１０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて行った。
【００８４】
（ＩＮＦ−γ産生刺激ならびに染色）
Ｔｈ１の主要なサイトカインであるＩＮＦ−γの産生能力を調べるために、回収した細胞に２５ｎｇ/ｍｌ  ＰＭＡ、１μｇ/ｍｌ  ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ（いずれもＳｈｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、５μｇ/ｍｌ  Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地（１０％ＦＢＳ（Ｒｏｃｈｅ）、０．１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｕｎｉｔ/ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ/ｍｌ  ストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（いずれもＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を加え、３７℃のＣＯ２インキュベーターで４時間培養した。洗浄後、細胞は染色バッファー（ＰＢＳ、２％  ＦＢＳ）に懸濁し、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５−で標識された抗ＣＤ３ｅ抗体（１４５−２Ｃ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びＡＰＣ−ｅｆｌｏｕｒ７８０−で標識された抗ＣＤ４抗体（ＲＭ４−５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて染色した。ＣＤ３ｅ、ＣＤ４を染色した後、細胞内ＩＮＦ−γの染色は、Ｆｏｘｐ３  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｅｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＦＩＴＣで標識された抗ＩＮＦ−γ抗体（ＸＭＧ１．２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて行った。
【００８５】
そして、フローサイトメトリーはＦＡＣＳｃａｎｔ  ＩＩを使用して行い、データはＦｌｏｗＪｏ  ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ  Ｉｎｃ．）により解析した。
【００８６】
（Ｔｈ１に関するフローサイトメトリー結果）
フローサイトメトリー結果は、図４に示す。ＣＤ３ｅ陽性ＣＤ４陽性であるヘルパーＴ細胞のうち、Ｆｏｘｐ３は発現していないがＴ−ｂｅｔは発現している細胞を、Ｔｈ１とした。Ｔｈ１は、通常食群において１０．３％、酪酸食群において２４．５％と、酪酸食群において高い比率であった。
【００８７】
また、フローサイトメトリーに基づくＴｈ１の定量評価を行った結果は、図５に示す。粘膜固有層リンパ球の全数を１００とし、粘膜固有層リンパ球中のＴｈ１の割合は、通常食群において約１．５％、酪酸食群において約３．５％と、酪酸食群において高い比率であり、Ｔｈ１数は、通常食群において約５．５×１０４個、酪酸食群において１．５×１０５個と、酪酸食群において多かった。有意差の有無はＴ−ｔｅｓｔによって評価した。
【００８８】
以上のとおり、精製飼料のうち５重量％をＷＳＣＢに置き換えただけで、十分にＴｈ１が増加した。
【００８９】
（ＩＮＦ−γ産生細胞に関するフローサイトメトリー結果）
フローサイトメトリー結果は、図６に示す。ＣＤ３ｅ陽性ＣＤ４陽性であるヘルパーＴ細胞のうち、ＩＮＦ−γを発現している細胞を、ＩＮＦ−γ産生細胞とした。同細胞は、通常食群において４．８％、酪酸食群において１０．７％と、酪酸食群において高い比率であった。
【００９０】
また、フローサイトメトリーに基づくＩＮＦ−γ産生細胞の定量評価を行った結果は、図７に示す。粘膜固有層リンパ球の全数を１００とし、粘膜固有層リンパ球中のＩＮＦ−γ産生細胞の割合は、通常食群において約０．５％、酪酸食群において約１．６％と、酪酸食群において高い比率であり、Ｔｈ１数は、通常食群において約２．５×１０４個、酪酸食群において７．５×１０４個と、酪酸食群において多かった。有意差の有無はＴ−ｔｅｓｔによって評価した。
【００９１】
以上のとおり、精製飼料のうち５重量％をＷＳＣＢに置き換えただけで、Ｔｈ１の主要なサイトカインであるＩＮＦ−γを産生する細胞が増加した。
【００９２】
［Ｔｈ１増加における腸内細菌の寄与に関する評価］
（飼料の調製）
Ｔｈ１増加の評価と同様にしてＣｅｌｌ−ＷＳＣＢ−ＡＩＮ−９３Ｇ（通常食）、ＷＳＣＢ−ＡＩＮ−９３Ｇ(酪酸食)を調製した。
【００９３】
（実験動物）
３週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ系雄性マウスを用いた。
【００９４】
（飼育実験）
１５個体のマウスにてＣｅｌｌ−ＷＳＣＢ−ＡＩＮ−９３Ｇを与えて１週間飼育した（予備飼育）。その後、マウスを３群各５個体にグループ分けし、さらに４週間飼育した。このとき、１群にはＣｅｌｌ−ＷＳＣＢ−ＡＩＮ−９３Ｇ（通常食）及び水を与えた。１群にはＣｅｌｌ−ＷＳＣＢ−ＡＩＮ−９３Ｇ（通常食）及び抗菌薬（バンコマイシン、ネオマイシン、アンピシリン、メトロニダゾール（いずれもｗａｋｏ社）を混合した飲水で投与）を与えた。さらに他の１群にはＷＳＣＢ−ＡＩＮ−９３Ｇ（酪酸食）及び抗菌薬（バンコマイシン、ネオマイシン、アンピシリン、メトロニダゾールを混合した飲水で投与）を与えた。４種類の抗菌薬を投与することで腸内細菌を効果的に減少させ変動を抑えることが可能であるため、Ｔｈ１の増加が、腸内細菌の変化による影響ではなくＷＳＣＢに起因するものであるかを検証した。飼料・飲水はいずれも自由摂取とした。
【００９５】
（試料採取）
通常食＋水、通常食＋抗菌薬、酪酸食＋抗菌薬の３群のマウスよりＴｈ１遠位結腸（ｄｉｓｔａｌ  ｃｏｌｏｎ）を採取し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内に保存した。試料をステンレスビーズで破砕し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを抽出した。更に、ランダムプライマーとＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（いずれも東洋紡ライフサイエンス）を用いて逆転写ＰＣＲを行なった。
【００９６】
（定量ＰＣＲ）
遠位結腸（ｄｉｓｔａｌ  ｃｏｌｏｎ）におけるＴ−ｂｅｔをコードするＴｂｘ２１遺伝子の発現量は定量ＰＣＲで評価した。具体的には、定量ＰＣＲはＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｒｏｃｈｅ）を用い、ハウスキーピング遺伝子であるβアクチン（Ａｃｔｂ）に対するＴｂｘ２１の相対発現量を比較Ｃｔ法を用いて算出した。
【００９７】
遠位結腸におけるインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）をコードするＩｎｆｇ遺伝子の発現量は定量ＰＣＲで評価した。具体的には、定量ＰＣＲはＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｒｏｃｈｅ）を用い、ハウスキーピング遺伝子であるβアクチン（Ａｃｔｂ）に対するＩｎｆｇの相対発現量を比較Ｃｔ法を用いて算出した。
【００９８】
（定量ＰＣＲ結果）
定量ＰＣＲ結果は、図８に示す。遠位結腸（ｄｉｓｔａｌ  ｃｏｌｏｎ）におけるＴｂｘ２１遺伝子の相対発現量は、抗菌薬投与下においても通常食群に対して酪酸食群で有意に高い値を示した。また、ＩＦＮ−γをコードするＩｎｆｇ遺伝子の相対発現量は、抗菌薬投与下においても通常食群に対して酪酸食群で有意に高い値を示した。有意差の有無は一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙＡＮＯＶＡ）の後、Ｔｕｋｅｙ‘ｓ  Ｔｅｓｔによって評価した。これらの結果から、腸内細菌叢の変動とは無関係に、ＷＳＣＢはＴｈ１を誘導するものと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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