(57)【要約】【課題】スクアレンを出発原料とした新規スクラレン誘導体を提供し、また、このスクアレン誘導体を用いた抗炎症剤を提供する。【解決手段】一般式（１）で表されるスクアレン誘導体、このスクアレン誘導体を有効成分とする抗炎症剤、およびこのスクアレン誘導体を含有する飲食品、医薬。  【化１】2020176102.tif 000008（式中Ｒ1とＲ2は、いずれか一方が水素で、もう一方がＲ＝（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎＨ、ただしｎ＝１〜１０である）【選択図】  図２
2020176102.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
2020176102.tif 000007
（式中Ｒ1とＲ2は、いずれか一方が水素で、もう一方がＲ＝（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎＨ、ただしｎ＝１〜１０である）で表されるスクアレン誘導体。
【請求項２】
前記一般式（１）におけるＲのｎが１〜４である、請求項１に記載のスクアレン誘導体。
【請求項３】
前記一般式（１）におけるＲ1が水素で、Ｒ2がＲである、請求項１または２に記載のスクアレン誘導体。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれかに記載のスクアレン誘導体を有効成分とする抗炎症剤。
【請求項５】
請求項１ないし３のいずれかに記載のスクアレン誘導体を含有する飲食品。
【請求項６】
請求項１ないし３のいずれかに記載のスクアレン誘導体を含有する医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗炎症活性を有する新規化合物であるスクアレン誘導体、および抗炎症剤に関するものである。また、本発明は、上記抗炎症剤を含有する飲食品または医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
スクアレンは、サメの肝油や藻類などから得られるトリテルペンの一種であり、抗酸化作用、ガンマ線照射による保護作用、抗腫瘍効果など様々な生理活性が知られている。
特許文献１には、スクアレンが低コレステロール血症の患者に対して血中総コレスレロール上昇作用を有することが記載され、また、特許文献２には、ビタミンＡおよびその誘導体の制がん剤としての効果と、スクアレンおよびその誘導体のがん転移防止剤としての効果の両方を有する、スクアレン−ω−アルコールとビタミンＡアシドのエステルの制がんおよびがんの転移抑制作用について記載されている。
【０００３】
一方、近年、ガンや糖尿病、高血圧、脂質異常症等の生活習慣病に加え、花粉症、喘息、アトピー性皮膚炎、食物アレルギーをはじめとするアレルギー性疾患などの炎症を病態とする疾患の増加が、大きな問題となっており、その予防や治療が社会的な課題となっている。しかしながら、生活習慣病、アレルギー性疾患を予防、治療するために医薬品の服用は長期間にわたるため、人体への悪影響は避けられず、また、医療費の増大を招く一因となっている。
【０００４】
一方、医薬品等の高額な治療法に頼ることなく抗炎症効果を得るためには、抗炎症作用を有する天然の食品成分を摂取するという、生活の質を下げることのない食事による予防、軽減、治療方法が求められているものの、特定保健用食品や機能表示性食品は、医薬品と比較して効果が出るために必要な摂取量がさらに多いか、あるいは長期的な摂取が必要であるという課題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−２６６３０６号公報
【特許文献２】特公昭６０−３８３７０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Tetrahedron Letters (1962) No.3, p.121-124
【非特許文献２】Tetrahedron Letters (1968) No.6, p.723-725
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、従来技術の上記状況に鑑みてなされたものであり、天然由来の成分であるスクアレンを化学的に修飾することにより、その抗炎症効果が増強された新規スクアレン誘導体を提供することを課題とする。また、本発明は、該新規スクアレン誘導体を有効成分とする抗炎症剤、該新規スクアレン誘導体を含む飲食品、および該新規スクアレン誘導体を含む医薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、スクアレンを出発原料として、２，３−エポキシスクアレンを合成し、さらにエチレングリコールまたはポリエチレングリコールを付加することにより、新規スクアレン誘導体を合成することに成功した。そして、この新規スクアレン誘導体の優れた抗炎症作用を発見して上記課題を解決できることを見出し、本発明に至った。
【０００９】
本発明は、下記（１）〜（３）の新規スクアレン誘導体に関する。
（１）  一般式（１）
【化１】
2020176102.tif 000003
（式中Ｒ1とＲ2は、いずれか一方が水素で、もう一方がＲ＝（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎＨ、ただしｎ＝１〜１０である）で表されるスクアレン誘導体。
（２）前記一般式（１）におけるＲのｎが１〜４である、上記（１）に記載のスクアレン誘導体。
（３）前記一般式（１）におけるＲ1が水素で、Ｒ2がＲである、上記（１）または（２）に記載のスクアレン誘導体。
【００１０】
また、本発明は、下記（４）の抗炎症剤、下記（５）の飲食品、または下記（６）の医薬に関する。
（４）上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のスクアレン誘導体を有効成分とする抗炎症剤。
（５）上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のスクアレン誘導体を含有する飲食品。
（６）上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のスクアレン誘導体を含有する医薬。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、微細藻類、深海ザメ、あるいは植物由来の天然由来成分であるスクアレンを出発原料として新規エチレングリコール付加スクアレンを合成し、その抗炎症作用を発見、確認したことを特徴とし、マクロファージ様ＲＡＷ細胞を、スクアレンおよびエチレングリコール付加スクアレンで処理することにより、スクアレンでは見出されなかった細胞生存率の低下がエチレングリコール付加スクアレンにおいて見出した。
【００１２】
また、スクアレンおよびエチレングリコール付加スクアレン処理ＲＡＷ細胞において、ＬＰＳが誘導する炎症性化学物質である一酸化窒素産生量の抑制効果、ならびに、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α遺伝子発現レベルおよびケモカインであるＣＣＬ２の遺伝子発現レベルでの抑制効果が認められ、抗炎症効果が確認された。
そして、スクアレンおよびエチレングリコール付加スクアレンのこれら効果の活性比較を行なったところ、エチレングリコール付加スクアレンはスクアレンと比較して、１／１００の濃度で効果を発揮することが明らかとなった。
【００１３】
炎症反応は、生体への異物の浸入、感染、外傷、火傷あるいはアレルゲンなどの有害刺激が作用したときに起こる生体防御反応であるだけでなく、メタボリックシンドローム、動脈硬化疾患、神経変性疾患、自己免疫疾患などの多くの疾患の病態基盤に炎症が存在すると考えられている。
本発明のエチレングリコール付加スクアレン、ポリエチレングリコール付加スクアレンには、今後、炎症予防・改善あるいは症状の緩和効果において、より低濃度で効果を発揮することから、無理なく摂取可能な抗炎症剤として期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】スクアレン濃度１、１０、１００μｇ／ｍＬでの細胞毒性試験の結果を示す。
【図２】実施例１で合成したエチレングリコール付加スクアレンの１、１０、１００μｇ／ｍＬの濃度での細胞毒性試験の結果を示す。
【図３】スクアレン濃度１、１０、１００μｇ／ｍＬでのＮＯ産生測定試験の結果を示す。
【図４】エチレングリコール付加スクアレンの１、１０、１００μｇ／ｍＬの濃度でのＮＯ産生測定試験の結果を示す。
【図５】スクアレンまたはエチレングリコール付加スクアレンで処理した細胞における、ＬＰＳ添加によるＴＮＦ−α遺伝子発現量を示す。
【図６】スクアレンまたはエチレングリコール付加スクアレンで処理した細胞における、ＬＰＳ添加によるＣＣＬ２遺伝子発現量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の新規スクアレン誘導体は、スクアレンを出発原料として、２，３−エポキシスクアレンを合成し、さらにエチレングリコールまたはポリエチレングリコールを付加して合成される。
スクアレンは、下記式（２）の構造のトリテルペンである。
【化２】
2020176102.tif 000004
【００１６】
このスクアレンの末端をエポキシ化して、下記式（３）の２，３−エポキシスクアレンを合成する方法は、非特許文献１、非特許文献２に記載されているように従来公知である。
【化３】
2020176102.tif 000005
【００１７】
例えば、スクアレンは、市販の富士フィルム和光純薬製のものを用いることができ、このスクアレンに対して２当量のＮ−ブロモコハク酸イミドを、エチレングリコールジメチルエーテル水溶液に溶かし、室温２３℃で１時間攪拌した。反応溶液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー方法を用いて精製することで、８１％の収率で２，３−ブロモヒドリンスクアレンが合成できる。更に、２，３−ブロモヒドリンスクアレンを塩基性エタノール溶液中で、室温下１時間攪拌する。反応溶液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー方法を用いて、５％の酢酸エチルを含むヘキサン留分で精製することで、２，３−エポキシスクアレンが合成できる。
【００１８】
次いで合成した２，３−エポキシスクアレンの２位を、以下の方法によりエチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール等の求核試薬と反応させてエーテル化して、下記式（１）の新規化合物を合成する。
一般式（１）
【化１】
2020176102.tif 000006
（式中Ｒ1とＲ2は、いずれか一方が水素で、もう一方がＲ＝（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎＨ、ただしｎ＝１〜１０である）
【００１９】
本発明のスクアレン誘導体の製造方法は、２，３−エポキシスクアレンを例えば、イソプロパノール等のアルコールに溶解させて、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、またはテトラエチレングリコールを加えて８０℃程度で数時間加熱して反応させることで行われる。放冷後、酢酸エチルで抽出してからカラムクロマトグラフィーで精製することにより、本発明のスクアレン誘導体を単離できる。
【００２０】
２，３−エポキシスクアレンを溶解させる溶媒は、例えば、アセトン、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、クロロホルム等であり、また、添加するエチレングリコールの量は、２，３−エポキシスクアレンに対して、５０〜５００当量である。反応温度は５０℃〜９０℃の範囲、反応時間は４〜９時間が好ましい。
【００２１】
単離精製した本発明のスクアレン誘導体の抗炎症活性を、マクロファージ様ＲＡＷ細胞を用いた細胞毒性評価試験により確認する。
細胞毒性試験であるＭＴＴ試験とは、生細胞でＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉ−ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ、ｙｅｌｌｏｗ  ｔｅｔｒａｚｏｌｅ）を可視化する試験であり、ＭＴＴは、生細胞においては紫色のホルマザン色素へ還元され、死細胞では還元されない。ジメチルスルホキシドや、酸性エタノール溶液、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の希塩酸溶液を、不溶性のホルマザン色素を可溶化させるために添加し、得られた着色溶液を５００〜６００ｎｍの波長の間の吸光度を分光光度計で測定することで、生細胞の定量化を行う。吸収極大波長は使用する溶媒に依存する。
【００２２】
また、ＬＰＳが誘導する炎症性化学物質である一酸化窒素（ＮＯ）産生量の抑制効果を確認するために、ＮＯ産生測定試験を行う。ＲＡＷ細胞は、ＬＰＳの添加によりＮＯを産生し、このＮＯは単独またはスーパーオキサイドと反応して、ＤＮＡ障害性を有するペルオキシ亜硝酸を産生し、細胞や組織に障害を与え炎症症状を増悪することが知られている。
【００２３】
上記のような試験により抗炎症活性が確認された本発明のスクアレン誘導体を有効成分とする抗炎症剤には、医薬や栄養補助食品として、錠剤やカプセとして経口投与する態様のものと、特定保健用食品や機能性表示食品を含む飲食品としての態様のものがある。
本発明の抗炎症剤は、炎症の予防、治療に有用である。マクロファージ活性抑制効果を有するため、花粉症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎およびアトピー性皮膚炎等の炎症症状、遅延型アレルギー、胃炎および潰瘍性大腸炎等の炎症性疾患、関節リウマチおよび変性性骨関節炎等の関節炎等の炎症の他にも、動脈硬化、子宮内膜症、急性呼吸急迫症候群、気管支炎、腎臓移植による障害、急性心筋梗塞、糖尿病、全身性エリテマトーデス、クローン病、腎炎、肝炎、肺炎、ＩｇＡ腎症、エンドトキシンショック、および感染症による敗血症等の炎症性疾患を対象とする。
【００２４】
本発明の抗炎症剤を医薬や栄養補助食品として用いる場合、その形状は特に限定されず、コーティング錠、糖衣錠、硬ゼラチンカプセル剤、軟ゼラチンカプセル剤、液剤、粉粒状剤、乳剤または懸濁剤等のいずれの形状でも製剤化できる。製剤化用担体としては特に制限はなく、例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤、界面活性剤、滑沢剤、コーティング剤、着色剤、発色剤、矯味剤、着香剤、酸化防止剤、防腐剤、呈味剤、酸味剤、甘味剤、強化剤、ビタミン剤、膨張剤、増粘剤、流動性促進剤などの中から、製剤に必要な諸特性を損なわないもので、最終製品の剤形に応じたものを１種または２種以上選択することができる。
【００２５】
賦形剤としては、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等が挙げられ、崩壊剤としては、デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロースが、結合剤としては、デンプン、デキストリン、アラビアゴム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴールが挙げられる。界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルベート８０が、滑沢剤としては、タルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコールが、流動性促進剤としては、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウムが挙げられる。
【００２６】
上記医薬や栄養補助食品は、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物用として用いることができる。経口剤としての服用量、摂取量は、それを使用する対象者の症状、性別、年齢に応じて適宜設定することができる。例えば、成人一人あたり一日に、有効成分である式（１）のスクアレン誘導体を、０.１ｍｇ〜５ｇ程度摂取できるよう服用することができる。
【００２７】
本発明の抗炎症剤を飲食品として用いる場合、特定保健用食品、機能性表示食品として機能を表示して用いるだけでなく、一般飲食品として用いることもできる。飲食品としては、例えば、飲料(清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、粉末飲料、果実飲料、乳飲料、ゼリー飲料など)、菓子類(クッキー、ケーキ、ガム、キャンディー、タブレット、グミ、饅頭、羊羹、プリン、ゼリー、アイスクリーム、シャーベットなど)、水産加工品(魚肉ソーセージ、かまぼこ、ちくわ、はんぺんなど)、畜産加工品(ハンバーグ、ハム、ソーセージ、ウィンナー、チーズ、バター、ヨーグルト、生クリーム、チーズ、マーガリン、発酵乳など)、スープ(粉末状スープ、液状スープなど)、主食類(ご飯類、麺類、パン、シリアルなど)、調味料(マヨネーズ、ショートニング、ドレッシング、ソース、たれ、しょうゆなど)などが挙げられる。
例えば、成人一人あたり一日に、有効成分である式（１）のスクアレン誘導体を、０.１ｍｇ〜５ｇ程度摂取できるような量で添加すればよい。
【実施例】
【００２８】
以下に、本発明における式（１）のスクアレン誘導体の製造方法、細胞毒性試験、および抗敗血症活性試験に関する実施例を用いてさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２９】
式（２）のスクアレンから上記方法により合成した式（３）の２，３−エポキシスクアレンを原料にして、式（１）のＲ2がｎ＝１のＲであるエチレングリコール付加スクアレンを合成した。
２，３−エポキシスクアレン３０ｍｇ（７１μｍｏｌ）をイソプロパノール３ｍＬに溶解し、エチレングリコール２.７ｍｇ（４３ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で６時間加熱し、放冷した。水を加えて酢酸エチルで抽出し、無水酢酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー（ワコーゲルｃ−３００）を用いて、ヘキサン・酢酸エチル混合溶媒で精製し、エチレングリコール付加スクアレン１７ｍｇ(４９％)を無色油状物として得た。この精製物の1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲを以下に示す。
【００３０】
エチレングリコール付加スクアレンのスペクトルデータ
ＩＲ・（ＣＨＣｌ3）  ３４５１，２９７７，２８７７，１４５２，１３８１，１２１９，１０８３，９０９，６７０ｃｍ-1.
1Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ  ＣＤＣｌ3）δ５.２０−５.０８（ｍ，５Ｈ），３.７５−３.６８（ｍ，２Ｈ），３.５５−３.４６（ｍ，３Ｈ），２.２９（ｍ，１Ｈ），２.１２−１.９５（ｍ，１６Ｈ），１.６８（ｓ，３Ｈ），１.６２（ｓ，３Ｈ），１.６０（ｂｒ  ｓ，１２Ｈ），１.５２−１.３７（ｍ，５Ｈ），１.１５（ｓ，３Ｈ）.
13Ｃ−ＮＭＲ  （１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）  δ１３５.１，１３５.１，１３４.９，１３４.８，１３１.２，１２４.７，１２４.４，１２４.３，（２Ｃ），７７.８，７６.０，６２.４，６２.２，３９.７，３９.７（２Ｃ），３６.８，２９.７，２８.６，（２Ｃ），２６.７，２６.７，２６.６，２５.７，２１.６，１９.８，１７.７，１６.０（３Ｃ），１６.０.
ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ５１１.４１３１（ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ32Ｈ56ＮａＯ3[Ｍ＋Ｎａ]+  ５１１.４１２７）.
【実施例２】
【００３１】
式（３）の２，３−エポキシスクアレンを原料にして、式（１）のＲ2がｎ＝２のＲであるジエチレングリコール付加スクアレンを合成した。
２，３−エポキシスクアレン３０ｍｇ（７１μｍｏｌ）をイソプロパノール３ｍＬに溶解し、ジエチレングリコール４.６ｍｇ（４３ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で６時間加熱し、放冷した。水を加えて酢酸エチルで抽出し、無水酢酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー（ワコーゲルｃ−３００）を用いて、ヘキサン・酢酸エチル混合溶媒で精製し、ジエチレングリコール付加スクアレン２７ｍｇ（８０％）を無色油状物として得た。この精製物の1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲを以下に示す。
【００３２】
ジエチレングリコール付加スクアレンのスペクトルデータ
ＩＲ・（ＣＨＣｌ3）  ３４４９，３００５，２９７３，２９２９，２８７３，１４５２，１３８３，１２３５，１２１９，１１２７，１０８２，９７１ｃｍ-1.
1Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ  ＣＤＣｌ3）  δ５.２１−５.０５（ｍ，５Ｈ），３.７９−３.４５（ｍ，９Ｈ），２.２９（ｍ，１Ｈ），２.１４−１.９４（ｍ，１６Ｈ），１.６７（ｓ，３Ｈ），１.６０（ｂｒ  ｓ，１５Ｈ），１.４７−１.３３（ｍ，３Ｈ），１.１４（ｓ，３Ｈ），１.１２（ｓ，３Ｈ）.
13Ｃ−ＮＭＲ  （１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）  δ１３５.１（２Ｃ），１３４.９，１３４.８，１３１.２，１２４.６，１２４.４，１２４.３（３Ｃ），７８.１，７４.６，７２.７，７０.８，６１.８，６０.６，３９.７（２Ｃ），３９.７，３７.０，２９.８，２８.３（２Ｃ），２６.８，２６.７，２６.７，２５.７，２１.７，２０.３，１７.７，１６.０（３Ｃ），１６.０.
ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ５５５.４４１６（ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ34Ｈ60ＮａＯ4[Ｍ＋Ｎａ]+  ５５５.４３８９）.
【実施例３】
【００３３】
式（３）の２，３−エポキシスクアレンを原料にして、式（１）のＲ2がｎ＝３のＲであるトリエチレングリコール付加スクアレンを合成した。
２，３−エポキシスクアレン３０ｍｇ（７１μｍｏｌ）をイソプロパノール３ｍＬに溶解し、トリエチレングリコール６.５ｍｇ（４３ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で６時間加熱し、放冷した。水を加えて酢酸エチルで抽出し、無水酢酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー（ワコーゲルｃ−３００）を用いて、ヘキサン・酢酸エチル混合溶媒で精製し、トリエチレングリコール付加スクアレン１１ｍｇ（４０％）を無色油状物として得た。この精製物の1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲを以下に示す。
【００３４】
トリエチレングリコール付加スクアレンのスペクトルデータ
ＩＲ・（ＣＨＣｌ3）  ３４４５，３００６，２９５８，２９２７，２８７４，１４５３，１３７５，１２４６，１１７９，１０８１，９０９ｃｍ-1
1Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ  ＣＤＣｌ3）  δ５.１９−５.０６（ｍ，５Ｈ），３.７９−３.４３（ｍ，１３Ｈ），２.３０（ｍ，１Ｈ），２.１１−１.９４（ｍ，１６Ｈ），１.６７（ｓ，３Ｈ），１.５９（ｂｒ  ｓ，１５Ｈ），１.４５−１.３０（ｍ，３Ｈ），１.１２（ｓ，３Ｈ），１.１１（ｓ，３Ｈ）.
13Ｃ−ＮＭＲ  （１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）  δ１３５.２，１３５.１，１３４.９，１３１.２，１２４.４（２Ｃ），１２４.４（２Ｃ），１２４.３，７７.９，７３.２，７０.６，７０.６，７０.１，６９.９，６１.７，６０.３，３９.８，３９.７，３９.７，３７.０，２９.９，２８.３（２Ｃ），２６.８，２６.８，２６.７，２５.７，２１.９，２０.６，１７.７，１６.１（２Ｃ），１６.０，１６.０.
ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ５９９.４６６１（ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ36Ｈ64ＮａＯ5[Ｍ＋Ｎａ]+  ５９９.４６５１）.
【実施例４】
【００３５】
式（３）の２，３−エポキシスクアレンを原料にして、式（１）のＲ2がｎ＝４のＲであるテトラエチレングリコール付加スクアレンを合成した。
２，３−エポキシスクアレン３０ｍｇ（７１μｍｏｌ）をイソプロパノール３ｍＬに溶解し、テトラエチレングリコール８.４ｍｇ（４３ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で６時間加熱し、放冷した。水を加えて酢酸エチルで抽出し、無水酢酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー（ワコーゲルｃ−３００）を用いて、ヘキサン・酢酸エチル混合溶媒で精製し、テトラエチレングリコール付加スクアレン１３ｍｇ（５１％）を無色油状物として得た。この精製物の1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲを以下に示す。
【００３６】
テトラエチレングリコール付加スクアレンのスペクトルデータ
ＩＲ・（ＣＨＣｌ3）  ３４６０，３００８，２９２８，２８６４，１４５２，１３８３，１２３９，１１０４ｃｍ-1.
1Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ  ＣＤＣｌ3）  δ５.１８−５.０６（ｍ，５Ｈ），３.３６−３.４８（ｍ，１７Ｈ），２.３１（ｍ，１Ｈ），２.１１−１.９５（ｍ，１６Ｈ），１.６８（ｓ，３Ｈ），１.６０（ｂｒ  ｓ，１５Ｈ），１.４５−１.３８（ｍ，３Ｈ），１.１３（ｓ，３Ｈ），１.１１（ｓ，３Ｈ）.
13Ｃ−ＮＭＲ  （１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）  δ１３５.１，１３５.１，１３５.０，１３４.９，１３１.２，１２４.４（２Ｃ），１２４.３（３Ｃ），７７.９，７４.９，７２.７，７０.９，７０.６，７０.６，７０.４，７０.３，６１.６，６０.５，３９.８，３９.７，３９.７，３７.０，２９.９，２８.３（２Ｃ），２６.７（２Ｃ），２６.６，２５.７，２１.７，２０.０，１７.７，１６.０（３Ｃ），１６.０.
ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ６４３.４９２０（ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ38Ｈ68ＮａＯ6[Ｍ＋Ｎａ]+  ６４３.４９１４）.
【実施例５】
【００３７】
マクロファージ様ＲＡＷ細胞を用いた細胞毒性試験を行った。
マクロファージ様ＲＡＷ細胞は、炎症試験に汎用されている細胞であり、スクアレンおよび実施例１で合成したエチレングリコール付加スクアレンのそれぞれについて、ＲＡＷ細胞に対する毒性とその毒性効果の適正濃度の決定するために、ＭＴＴ試験を実施した。
溶媒としてＤＭＳ０（ジメチルスルホキシド：富士フィルム和光純薬製）を用いてＲＡＷ細胞を溶解し、９６ウェルプレートに２×１０4細胞／ウェルの割合で播種し、２４時間ＣＯ2インキュベーター内で細胞をインキュベートした。
【００３８】
細胞播種してから２４時間後、細胞培養液をアスピレート用いて除去し、各試料として、スクアレンまたはエチレングリコール付加スクアレンをそれぞれ、１、１０、１００μｇ／ｍＬの濃度になるように細胞培養液に混合添加し、試料処理を行なった。
試料処理２４時間後、アスピレート用いて試料などの混合培養液を除去し、ＭＴＴを混合した細胞培養液をウェルへ添加して、２４時間、Ｃ０2インキュベーター内でインキュベートした。２４時間後にＳＤＳ処理を行い、さらに２４時間、Ｃ０2インキュベーター内でインキュベートしてから、マイクロプレートリーダーを用いて、吸光度５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００３９】
結果を図１と図２に示す。スクアレン処理細胞においては、１、１０、１００μｇ／ｍＬのいずれの濃度においても、有意な細胞生存率の変動は認められなかった（図１）のに対して、エチレングリコール付加スクアレンにおいては１０および１００μｇ／ｍＬの試料濃度処理の細胞において、有意な細胞生存率の減少が認められた（図２）。
スクアレンと本発明のスクアレン誘導体を比較すると、細胞毒性試験におけるスクアレン誘導体は、スクアレンの１／１００の濃度で効果を発揮した。
【実施例６】
【００４０】
次に、ＲＡＷ細胞を用いたＮＯ産生測定試験を行った。
スクアレンおよびエチレングリコール付加スクアレンのＲＡＷ細胞に対するＮＯ産生に及ぼす影響解析を調べるために、ＤＭＳ０を用いてＲＡＷ細胞を溶解し、９６ウェルプレートに２×１０4細胞／ウェルの割合で播種し、２４時間ＣＯ2インキュベーター内で細胞をインキュベートした。細胞播種してから２４時間後、細胞培養液をアスピレート用いて除去し、各試料として、スクアレンまたはエチレングリコール付加スクアレンをそれぞれ、１、１０、１００μｇ／ｍＬの濃度になるように細胞培養液に混合添加し、試料処理を行なった。
試料処理２４時間後、リポポリサッカライド（ＬＰＳ、グラム陰性菌細胞壁外膜の構成成分）をウェルに添加した。ＬＰＳ添加１２時間後、細胞溶液の上澄を別の９６ウェルプレートへ写し、グリース試薬（２.５％  ｓｕｌｕｆａｎｉｌａｍｉｄｅ，２.５％  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ，０.０５％  ｎ（−１−ｎａｐｈｔｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｄｉａｍｉｎｅ）を等量混合し、１０分間室温、暗所でインキュベートした。その後、マイクロプレートリーダーを用いて、吸光度５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００４１】
結果を図３と図４に示す。ＬＰＳ処理細胞において、有意なＮＯ産生量の増大が認められたが、スクアレン処理細胞群において、１および１０μｇ／ｍＬの濃度において有意なＮＯ産生量の変動は認められなかったが、１００μｇ／ｍＬの濃度において、有意なＮＯ産生量の減少が認められた（図３）。
一方、エチレングリコール付加スクアレンにおいては、スクアレンで減少効果のあった濃度の１／１００の１μｇ／ｍＬの試料濃度処理の細胞において、有意なＮＯ産生量の減少が認められた（図４）。なお、１０および１００μｇ／ｍＬの濃度における有意なＮＯ産生量の減少は、細胞生存率の減少によるものと考察された。
【実施例７】
【００４２】
さらに、サイトカインおよびケモカイン遺伝子発現の測定試験を行った。
スクアレンおよびエチレングリコール付加スクアレンの抗炎症効果のメカニズム解析のため、代表的な炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α、およびケモカインであるＣＣＬ２における遺伝子発現をリアルタイムＰＣＲ法を用いて解析した。リアルタイムＰＣＲでは、ＲＡＷ細胞を１０ｃｍディッシュに２×１０6細胞／ディッシュの割合で播種し、２４時間ＣＯ2インキュベーター内で細胞をインキュベートした。細胞播種してから２４時間後、細胞培養液をアスピレート用いて除去し、各試料として、スクアレンまたはエチレングリコール付加スクアレンを、それぞれ１００μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬの濃度になるように細胞培養液に混合添加し、試料処理を行なった。
【００４３】
なお、試料処理２４時間後、ＬＰＳをディッシュに添加した。ＬＰＳ添加１２時間後、細胞からＩＳＯＧＥＮを用いてＲＮＡ抽出を行なった。抽出したＲＮＡはＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓを用いて遺伝子解析を行なった。
その結果、ＬＰＳ処理によりＴＮＦ−αおよびＣＣＬ２の有意な発現増加が認められたが、しかし、１００μｇ／ｍＬのスクアレンまたは１μｇ／ｍＬエチレングリコール付加スクアレン処理により、ＴＮＦ−α遺伝子（図５）およびＣＣＬ２遺伝子（図６）について、有意な発現減少が認められた。
【００４４】
以上の結果から、本発明の新規スクアレン誘導体はスクアレンと比較して、１／１００の濃度で、抗炎症活性効果を発揮することが明らかとなった。また、その抗炎症活性の原因の一つに、炎症性サイトカインやケモカインの発現量の減少があることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
生体内の炎症反応は、生体への異物の浸入、感染、外傷、火傷あるいはアレルゲンなどの有害刺激が作用したときに起こる生体防御反応であるだけでなく、多くの疾患の病態基盤に炎症が存在すると考えられている。本発明の新規スクアレン誘導体は、より低濃度で抗炎症効果を発揮することから、無理なく摂取可能な抗炎症剤として、炎症予防や症状改善効果が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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