(57)【要約】【課題】養子細胞療法薬を製造するための改善された方法を提供すること。【解決手段】本発明は、養子細胞療法薬を製造するための組成物および方法を提供する。特定の実施形態では、本発明は、細胞の集団を採取する方法、ＰＢＭＣを単離し活性化する方法、Ｔ細胞を増大させる方法、およびＴ細胞治療薬をそれを必要とする対象に投与する方法を提供する。特定の実施形態では、細胞の集団は、末梢血、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍から得られる。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
養子細胞療法薬を製造するための改善された方法など。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２０１４年４月２５日に出願された米国仮出願第６１／９８４，５５８号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
配列表に関する記述
本出願に付随する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、これによって参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、ＢＬＢＤ＿０２８＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは３ＫＢであり、２０１５年４月２４日に作成され、本明細書の出願と同時にＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出される。
【０００３】
技術分野
本発明は、免疫エフェクター細胞を製造するための改善されたプラットフォームおよび関連する方法に関する。より詳細には、本発明は、Ｔ細胞を含む治療用免疫エフェクター細胞組成物を製造するための、拡張可能であり、柔軟であり、信頼でき、かつ再現性のある方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
養子免疫療法または養子細胞療法（ＡＣＴ）とは、疾患に対する療法のために遺伝子改変Ｔリンパ球を対象に移入することである。養子免疫療法はがん、感染症、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全症を含めた多種多様な疾患を治療するその潜在性をまだ実現していない。しかし、養子免疫療法戦略の全てではないが大多数は、臨床的に有効な治療用量のＴ細胞を生成するために、Ｔ細胞活性化および増大ステップを必要とする。生細胞培養に固有の複雑さおよび患者間の変動性に起因して、工学的に作製されたＴ細胞を含めたＴ細胞の治療用量を生成するための現行の技術は、煩わしいＴ細胞製造プロセスによって未だ限定されている。既存のＴ細胞製造プロセスは、容易に拡張可能でなく、繰り返すことができず、信頼できず、効率的でもなく、多くの場合、エフェクター免疫細胞機能の消耗および喪失を起こしやすい可能性がある、質の低いＴ細胞産物を生じさせる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在まで、工学的に作製されたＴ細胞養子免疫療法薬は限られた成功しかもたらしておらず、変動する臨床的活性を常に示す。したがって、そのような療法薬は広範にわたる臨床使用には適さない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、一般に、養子細胞療法のための方法を提供する。
【０００７】
種々の実施形態では、Ｔ細胞治療薬を製造するための方法であって、Ｔ細胞および抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞の集団を得るステップと、細胞の集団を、ｉ）１種または複数種のサイトカイン、ｉｉ）抗ＣＤ３抗体またはそのＣＤ３結合性断片、およびｉｉｉ）抗ＣＤ２８抗体もしくはそのＣＤ２８結合性断片、Ｂ７−１もしくはそのＣＤ２８結合性断片、またはＢ７−２もしくはそのＣＤ２８結合性断片を含む細胞培養培地で培養するステップであって、培養により、Ｔ細胞が活性化され、そして刺激されるステップと、活性化された細胞の集団にウイルスベクターを用いて形質導入を行うステップと、細胞の集団を細胞成長培地で培養して形質導入されたＴ細胞を増大させるステップとを含み、それにより、Ｔ細胞治療薬を製造する方法が提供される。
【０００８】
特定の実施形態では、細胞の集団は、末梢血、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍から得られる。
【０００９】
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、末梢血、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、腫瘍、またはＴ細胞株から得られる。
【００１０】
追加的な実施形態では、ＡＰＣは、末梢血、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍から得られる。
【００１１】
一部の実施形態では、細胞の集団は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む。
【００１２】
さらなる実施形態では、細胞の集団を採取するまたは得るステップは、白血球アフェレーシスを含む。
【００１３】
特定の実施形態では、細胞の集団を単離するステップは、沈降を含む。
【００１４】
追加的な実施形態では、沈降は、ＦＩＣＯＬＬ（商標）またはＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を含む。
【００１５】
ある特定の実施形態では、沈降を、半自動フロースルー遠心分離機を使用して実施する。
【００１６】
追加的な実施形態では、半自動フロースルー遠心分離機は、Ｃｏｂｅ  ２９９１  Ｃｅｌｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  ５＋、またはＴｅｒｕｍａ  Ｅｌｕｔｒａである。
【００１７】
特定の実施形態では、方法は、細胞の集団を緩衝液または細胞培養培地で洗浄するステップをさらに含む。
【００１８】
一部の実施形態では、細胞の集団を、１種または複数種のサイトカインを含有するＴ細胞成長培地（ＴＣＧＭ）で洗浄する。
【００１９】
一部の実施形態では、ＴＣＧＭ中の１種または複数種のサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ７、ＩＬ−１５、ＩＬ−９、およびＩＬ−２１からなる群より選択される。
【００２０】
特定の実施形態では、サイトカインはＩＬ−２である。
【００２１】
ある特定の実施形態では、ＩＬ−２の濃度は約２５０ＩＵ／ｍＬである。
【００２２】
ある特定の実施形態では、ＩＬ−２の濃度は約１００ＩＵ／ｍＬから約３００ＩＵ／ｍＬまでである。
【００２３】
一部の実施形態では、単離された細胞の集団は、ＰＢＭＣを含む。
【００２４】
追加的な実施形態では、細胞の集団を速度制御冷凍装置（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒａｔｅ  ｆｒｅｅｚｅｒ）内で凍結保存する。
【００２５】
さらなる実施形態では、凍結保存した細胞の集団を解凍する。
【００２６】
さらなる実施形態では、細胞の集団を、ステップ（ｂ）で培養するためにＴＣＧＭ中に１ｍＬ当たり細胞約１×１０８個の密度で播種する。
【００２７】
さらなる実施形態では、細胞の集団を、ステップ（ｂ）で培養するためにＴＣＧＭ中に１ｍＬ当たり細胞約１×１０７個の密度で播種する。
【００２８】
さらなる実施形態では、細胞の集団を、ステップ（ｂ）で培養するためにＴＣＧＭ中に１ｍＬ当たり細胞約１×１０６個の密度で播種する。
【００２９】
さらなる実施形態では、約１×１０８個の細胞を、ステップ（ｂ）で培養するためにＴＣＧＭ中に１ｍＬ当たり細胞約１×１０６個の密度で播種する。
【００３０】
特定の実施形態では、細胞の集団を細胞培養バッグまたはバイオリアクター中で培養する。
【００３１】
ある特定の実施形態では、ＴＣＧＭは、ＩＬ−２、ＩＬ７、ＩＬ−１５、ＩＬ−９、およびＩＬ−２１からなる群より選択される１種または複数種のサイトカインを含む。
【００３２】
さらなる実施形態では、１種または複数種のサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、およびＩＬ−１５からなる群より選択される。
【００３３】
追加的な実施形態では、１種または複数種のサイトカインは、ＩＬ−２を含む。
【００３４】
追加的な実施形態では、１種または複数種のサイトカインの濃度は、約２５０ＩＵ／ｍＬである。
【００３５】
追加的な実施形態では、１種または複数種のサイトカインの濃度は、約２５ＩＵ／ｍＬから約５００ＩＵ／ｍＬまでである。
【００３６】
さらなる実施形態では、細胞の集団を可溶性抗ＣＤ３抗体および可溶性抗ＣＤ２８抗体と共に培養する。
【００３７】
ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３抗体の濃度は約５０ｎｇ／ｍＬである。
【００３８】
特定の実施形態では、抗ＣＤ２８抗体の濃度は約５０ｎｇ／ｍＬである。
【００３９】
特定の実施形態では、ステップｂ）の細胞の集団を、形質導入前に約１２時間〜約４８時間にわたって培養する。
【００４０】
さらなる実施形態では、ステップｂ）の細胞の集団を、形質導入前に約１６時間〜約３２時間にわたって培養する。
【００４１】
追加的な実施形態では、ステップｂ）の細胞の集団を、形質導入前に少なくとも１８時間にわたって培養する。
【００４２】
さらなる実施形態では、ステップｂ）の細胞の集団を、形質導入前に少なくとも２４時間にわたって培養する。
【００４３】
ある特定の実施形態では、ステップｄ）の細胞の集団に、レトロウイルスベクターを用いて形質導入を行う。
【００４４】
ある特定の実施形態では、ステップｄ）の細胞の集団に、レンチウイルスベクターを用いて形質導入を行う。
【００４５】
さらなる実施形態では、約１×１０９ＴＵ〜約２×１０９ＴＵのウイルスベクターを使用して、１×１０８個の播種細胞への形質導入を行う。
【００４６】
さらなる実施形態では、約１×１０９ＴＵ〜約４×１０９ＴＵのウイルスベクターを使用して、１×１０８個の播種細胞への形質導入を行う。
【００４７】
特定の実施形態では、ウイルスベクターを総培養体積の２０％ｖ／ｖまで希釈する。
【００４８】
特定の実施形態では、ウイルスベクターを総培養体積の約２０％〜約４０％ｖ／ｖまで希釈する。
【００４９】
追加的な実施形態では、細胞の集団への形質導入を約１８〜約４８時間にわたって行う。
【００５０】
さらなる実施形態では、細胞の集団への形質導入を約１８〜約３６時間にわたって行う。
【００５１】
さらなる実施形態では、細胞の集団への形質導入を約２４時間にわたって行う。
【００５２】
追加的な実施形態では、ウイルスベクターは、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００５３】
ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、’グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、およびＶＥＧＦＲ２からなる群より選択される抗原に結合する細胞外ドメイン；ＣＤ８α；ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＰＤ１、およびＣＤ１５２からなる群より選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン；ＣＤ２８、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、およびＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）からなる群より選択される１種または複数種の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびにＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
【００５４】
特定の実施形態では、細胞外ドメインは、抗原に結合する抗体または抗原結合性断片を含む。
【００５５】
さらなる実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αまたはＣＤ２８に由来する。
【００５６】
ある特定の実施形態では、１種または複数種の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、およびＣＤ１３７からなる群より選択される。
【００５７】
さらなる実施形態では、ヒンジ領域ポリペプチドを含む。
【００５８】
追加的な実施形態では、ヒンジ領域ポリペプチドは、ＩｇＧ１またはＣＤ８αのヒンジ領域を含む。
【００５９】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、シグナルペプチドをさらに含む。
【００６０】
特定の実施形態では、シグナルペプチドは、ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチド、ＣＤ８αシグナルポリペプチド、またはヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファシグナルポリペプチドを含む。
【００６１】
追加的な実施形態では、ステップｄ）の細胞の集団を、増大させるために、約５〜約８日にわたって培養する。
【００６２】
ある特定の実施形態では、ステップｄ）の細胞の集団を、増大させるために、細胞培養バッグ中で約５日〜約８日にわたって培養する。
【００６３】
さらなる実施形態では、ステップｄ）の細胞の集団を、増大させるために、細胞培養バッグ中で約５日にわたって培養し、次いで、バイオリアクター中で約３日にわたって培養する。
【００６４】
追加的な実施形態では、ステップｄ）の細胞の集団を、増大させるために、バイオリアクター中で約５日〜約８日にわたって培養する。
【００６５】
さらなる実施形態では、バイオリアクターは、ＷＡＶＥバイオリアクターまたはＧＲＥＸバイオリアクターである。
【００６６】
特定の実施形態では、Ｔ細胞の数を、ステップｄ）の培養の間に少なくとも５０倍増大させる。
【００６７】
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞の数を、ステップｄ）の培養の間に少なくとも１００倍増大させる。
【００６８】
特定の実施形態では、Ｔ細胞の数を、ステップｄ）の培養の間に少なくとも２００倍増大させる。
【００６９】
さらなる実施形態では、Ｔ細胞の数を、ステップｄ）の培養の間に少なくとも３００倍増大させる。
【００７０】
追加的な実施形態では、Ｔ細胞の数を、ステップｄ）の培養の間に少なくとも４００倍増大させる。
【００７１】
追加的な実施形態では、Ｔ細胞の数を、ステップｄ）の培養の間に少なくとも５００倍増大させる。
【００７２】
さらなる実施形態では、Ｔ細胞の数を、ステップｄ）の培養の間に少なくとも６００倍増大させる。
【００７３】
ある特定の実施形態では、方法は、製造されたＴ細胞治療薬を回収するステップをさらに含む。
【００７４】
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞治療薬を回収するステップは、ステップｄ）で増大させた細胞を濃縮および洗浄することを含む。
【００７５】
特定の実施形態では、Ｔ細胞治療薬を、半自動フロースルー遠心分離機を使用して濃縮および洗浄する。
【００７６】
さらなる実施形態では、半自動フロースルー遠心分離機は、Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  ５＋またはＬＯＶＯである。
【００７７】
特定の実施形態では、方法は、Ｔ細胞治療薬を凍結保存するステップをさらに含む。
【００７８】
追加的な実施形態では、凍結保存したＴ細胞を養子細胞療法の方法において使用するために解凍する。
【００７９】
種々の実施形態では、上または本明細書において他の箇所に記載の前述の実施形態のいずれか１つの製造されたＴ細胞および生理的に許容される賦形剤を含む組成物が提供される。
【００８０】
種々の他の実施形態では、それを必要とする対象において悪性疾患を治療する方法であって、対象に、上または本明細書において他の箇所に記載の前述の実施形態のいずれか１つのＴ細胞治療薬を投与するステップを含む方法が提供される。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
Ｔ細胞治療薬を製造するための方法であって、
ａ）Ｔ細胞および抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞の集団を得るステップと、
ｂ）前記細胞の集団を、ｉ）１種または複数種のサイトカイン、ｉｉ）抗ＣＤ３抗体またはそのＣＤ３結合性断片、およびｉｉｉ）抗ＣＤ２８抗体もしくはそのＣＤ２８結合性断片、Ｂ７−１もしくはそのＣＤ２８結合性断片、またはＢ７−２もしくはそのＣＤ２８結合性断片を含む細胞培養培地で培養するステップであって、前記培養により前記Ｔ細胞が活性化され、そして刺激される、ステップと、
ｃ）活性化された前記細胞の集団にウイルスベクターを用いて形質導入を行うステップと、
ｄ）前記細胞の集団を細胞成長培地で培養して形質導入されたＴ細胞を増大させるステップと
を含み、
それにより、前記Ｔ細胞治療薬を製造する、方法。
（項目２）
前記細胞の集団が、末梢血、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍から得られる、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記Ｔ細胞が、末梢血、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、腫瘍、またはＴ細胞株から得られる、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記ＡＰＣが、末梢血、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍から得られる、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記細胞の集団が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記細胞の集団を採取するまたは得るステップが、白血球アフェレーシスを含む、項目１から５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記細胞の集団を単離するステップが、沈降を含む、項目１から５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記沈降が、ＦＩＣＯＬＬ（商標）またはＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記沈降を、半自動フロースルー遠心分離機を使用して実施する、項目７または項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記半自動フロースルー遠心分離機がＣｏｂｅ  ２９９１  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  ５＋、またはＥｌｕｔｒａである、項目９に記載の方法。（項目１１）
前記細胞の集団を緩衝液または細胞培養培地で洗浄するステップをさらに含む、項目１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記細胞の集団を、１種または複数種のサイトカインを含有するＴ細胞成長培地（ＴＣＧＭ）で洗浄する、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ＴＣＧＭ中の前記１種または複数種のサイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ７、ＩＬ−１５、ＩＬ−９、およびＩＬ−２１からなる群より選択される、項目１２に記載の方法。（項目１４）
前記サイトカインがＩＬ−２である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記ＩＬ−２の濃度が約２５０ＩＵ／ｍＬである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
単離された前記細胞の集団がＰＢＭＣを含む、項目１１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記細胞の集団を速度制御冷凍装置内で凍結保存する、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
凍結保存した前記細胞の集団を解凍する、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記細胞の集団を、ステップ（ｂ）で培養するためにＴＣＧＭ中に１ｍＬ当たり細胞約１×１０６個の密度で播種する、項目１または項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記細胞の集団を細胞培養バッグまたはバイオリアクター中で培養する、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記ＴＣＧＭが、ＩＬ−２、ＩＬ７、ＩＬ−１５、ＩＬ−９、およびＩＬ−２１からなる群より選択される１種または複数種のサイトカインを含む、項目１９から２０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記１種または複数種のサイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−７、およびＩＬ−１５からなる群より選択される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記１種または複数種のサイトカインがＩＬ−２を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記１種または複数種のサイトカインの濃度が約２５０ＩＵ／ｍＬである、項目２１から２３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記細胞の集団を可溶性抗ＣＤ３抗体および可溶性抗ＣＤ２８抗体と共に培養する、項目１から２４までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記抗ＣＤ３抗体の濃度が約５０ｎｇ／ｍＬである、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
前記抗ＣＤ２８抗体の濃度が約５０ｎｇ／ｍＬである、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
ステップｂ）の細胞の集団を、形質導入前に約１２時間〜約４８時間にわたって培養する、項目１から２７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
ステップｂ）の細胞の集団が、活性化時に形質導入される、項目１から２７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
ステップｂ）の細胞の集団を、形質導入前に約１時間〜約１２時間にわたって培養する、項目１から２７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
ステップｂ）の細胞の集団を、形質導入前に約１６時間〜約３２時間にわたって培養する、項目１から２７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
ステップｂ）の細胞の集団を、形質導入前に少なくとも１８時間にわたって培養する、項目１から２７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
ステップｂ）の細胞の集団を、形質導入前に少なくとも２４時間にわたって培養する、項目１から２７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
ステップｄ）の細胞の集団に、レトロウイルスベクターを用いて形質導入を行う、項目１から３３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
ステップｄ）の細胞の集団に、レンチウイルスベクターを用いて形質導入を行う、項目１から３４までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
約１×１０９ＴＵ〜約２×１０９ＴＵのウイルスベクターを使用して、１×１０８個の播種細胞に形質導入する、項目１９から３５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記ウイルスベクターを総培養体積の２０％ｖ／ｖまで希釈する、項目１から３６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記ウイルスベクターを総培養体積の約４０％〜約５０％ｖ／ｖまで希釈する、項目１から３６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記細胞の集団を、約１８時間〜約４８時間にわたって形質導入する、項目１から３８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記細胞の集団を、約１８時間〜約３６時間にわたって形質導入する、項目１から３８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記細胞の集団を、約２４時間にわたって形質導入する、項目１から３８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記ウイルスベクターが、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む、項目１から４１までのいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記ＣＡＲが、以下：
ａ）アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、’グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、およびＶＥＧＦＲ２からなる群より選択される抗原に結合する細胞外ドメイン；
ｂ）ＣＤ８α；ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＰＤ１、およびＣＤ１５２からなる群より選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン；
ｃ）ＣＤ２８、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、およびＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）からなる群より選択される１種または複数種の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびに
ｄ）ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン
を含む、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記細胞外ドメインが、前記抗原に結合する抗体または抗原結合性断片を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８αまたはＣＤ２８に由来する、項目４３に記載の方法。（項目４６）
前記１種または複数種の共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、およびＣＤ１３７からなる群より選択される、項目４３に記載の方法。
（項目４７）
ヒンジ領域ポリペプチドをさらに含む、項目４３に記載の方法。
（項目４８）
前記ヒンジ領域ポリペプチドが、ＩｇＧ１またはＣＤ８αのヒンジ領域を含む、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
シグナルペプチドをさらに含む、項目４３に記載の方法。
（項目５０）
前記シグナルペプチドが、ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチド、ＣＤ８αシグナルポリペプチド、またはヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファシグナルポリペプチドを含む、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
ステップｄ）の細胞の集団を、増大させるために約５〜約８日にわたって培養する、項目１から５０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
ステップｄ）の細胞の集団を、増大させるために細胞培養バッグ中で約５日〜約８日にわたって培養する、項目１から５０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
ステップｄ）の細胞の集団を、増大させるために、細胞培養バッグ中で約５日にわたって培養し、次いで、バイオリアクター中で約３日にわたって培養する、項目１から５０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
ステップｄ）の細胞の集団を、増大させるためにバイオリアクター中で約５日〜約８日にわたって培養する、項目１から５０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記バイオリアクターがＷＡＶＥバイオリアクターまたはＧＲＥＸバイオリアクターである、項目５３または項目５４に記載の方法。
（項目５６）
Ｔ細胞の数を、ステップｄ）の培養の間に少なくとも５０倍増大させる、項目１から５５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
Ｔ細胞の数を、ステップｄ）の培養の間に少なくとも１００倍増大させる、項目１から５５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
Ｔ細胞の数を、ステップｄ）の培養の間に少なくとも２００倍増大させる、項目１から５５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
Ｔ細胞の数を、ステップｄ）の培養の間に少なくとも３００倍増大させる、項目１から５５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
Ｔ細胞の数を、ステップｄ）の培養の間に少なくとも４００倍増大させる、項目１から５５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
Ｔ細胞の数を、ステップｄ）の培養の間に少なくとも５００倍増大させる、項目１から５５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
Ｔ細胞の数を、ステップｄ）の培養の間に少なくとも６００倍増大させる、項目１から５５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
製造された前記Ｔ細胞治療薬を回収するステップをさらに含む、項目１から６２までのいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記Ｔ細胞治療薬を回収するステップが、ステップｄ）で増大させた細胞を濃縮および洗浄することを含む、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記Ｔ細胞治療薬を、半自動フロースルー遠心分離機を使用して濃縮および洗浄する、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
前記半自動フロースルー遠心分離機がＣｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  ５＋またはＬＯＶＯである、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記Ｔ細胞治療薬を凍結保存するステップをさらに含む、項目６３から６６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目６８）
凍結保存した前記Ｔ細胞を養子細胞療法の方法において使用するために解凍する、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
項目１から６８までのいずれか一項に記載の製造されたＴ細胞および生理的に許容される賦形剤を含む組成物。
（項目７０）
悪性疾患の治療を必要とする対象において悪性疾患を治療する方法であって、前記対象に項目６９に記載のＴ細胞治療薬を投与するステップを含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１は、Ｔ細胞製造プロセス中の異なる時間に形質導入を行った、形質導入された細胞の形質導入効率およびＶＣＮを示す。Ｄ０、Ｄ１、およびＤ２において、細胞に、ＧＦＰ発現レンチウイルスをＰＢＭＣ１０６個当たり１〜２×１０８ＴＵで用いて形質導入を行った。ＣＤ３、ＣＤ８、またはＣＤ４を発現するＧＦＰ発現細胞のＦＡＣＳ分析により、形質導入効率およびＶＣＮが、活性化の２０〜２４時間後（Ｄ１）に形質導入を行った細胞において最も高いことが決定された。
【図２】図２は、異なる方法を使用して活性化された細胞の形質導入効率を示す。ＰＢＭＣを、（ｉ）プレートに結合させた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体；（ｉｉ）可溶性抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体；ならびに（ｉｉｉ）ビーズに結合させた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を使用して活性化した。活性化された細胞に、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ発現レンチウイルスをＰＢＭＣ１０６個当たり１〜２×１０８ＴＵで用いて形質導入を行った。形質導入効率およびＶＣＮは、可溶性抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を用いて活性化した、Ｔ細胞マーカーＣＤ３、ＣＤ８、またはＣＤ４を発現するＧＦＰにおいて、他の方法と比較して高かった。
【図３】図３は、細胞培養バッグ中での活性化および形質導入がフラスコ中での形質導入と同等であることを示す。Ｄ０において、ＰＢＭＣを、可溶性抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を５０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用して活性化した。活性化された細胞にＤ１においてカッパＬＣ発現レンチウイルスをＰＢＭＣ１０６個当たり３×１０８ＴＵで用いて形質導入を行った。形質導入効率は、細胞の活性化および形質導入を細胞培養バッグまたはフラスコのいずれで行っても同等であった。ＶＣＮは、細胞培養バッグ中で活性化および形質導入を行った細胞においてわずかに高かった。
【図４】図４は、異なる方法によって活性化されたＰＢＭＣの間でＴ細胞増大が同等であることを示すグラフである。ＰＢＭＣを、（ｉ）プレートに結合させた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を使用して活性化した；および（ｉｉ）可溶性抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を使用して活性化した；または精製リンパ球を（ｉｉｉ）ビーズに結合させた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を使用して活性化した。ＰＢＭＣとリンパ球は同じ供給源に由来するものであった。活性化された細胞に、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ発現レンチウイルスをＰＢＭＣ１０６個当たり１〜２×１０８ＴＵで用いて形質導入を行った。１０日間の増大培養期間全体を通して、３つの方法によって活性化したＰＢＭＣの間で細胞増大は同等であった。
【図５】図５は、同等かつ頑強な増大を示した複数のドナー由来のＰＢＭＣを示す。ＰＢＭＣを、可溶性抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を使用して活性化した。活性化された細胞に、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ発現レンチウイルスをＰＢＭＣ１０６個当たり１〜２×１０８ＴＵで用いて形質導入を行った。１０日間培養した、複数のドナー由来の活性化および形質導入された細胞は、互い、および形質導入されていない対照（ＵＴＤ）の間で同等の成長速度を示した。増大させた培養物のそれぞれにおいて１０日目に存在したリンパ球の数も示されている。
【図６】図６は、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ発現が、異なる患者から生成された細胞産物の間で同等であり、平均が約６１％になり、範囲は２９％〜８０％であったことを示す代表的なＦＡＣＳ分析である（ｎ＝５）。ｑＰＣＲによっても、細胞産物の間のＶＣＮは、異なる患者から生成された細胞産物の間で同等であることが実証された。
【図７】図７は、可溶性抗体を使用して活性化したＴ細胞による抗原特異的腫瘍クリアランスが、他の方法を使用して活性化したＴ細胞と同様に良好であった、またはそれより優れていたことを示す。ＰＢＭＣを、（ｉ）プレートに結合させた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体；（ｉｉ）可溶性抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体；ならびに（ｉｉｉ）ビーズに結合させた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を使用して活性化した。活性化された細胞に、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ発現レンチウイルスをＰＢＭＣ１０６個当たり１〜２×１０８ＴＵで用いて形質導入を行った。増大させた抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞をＣＤ１９発現Ｄａｕｄｉ細胞または非ＣＤ１９発現Ｋ５６２細胞と共培養した。可溶性抗体を使用して活性化した抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｄａｕｄｉ細胞を抗原特異的に死滅させたが、他の方法によって活性化した抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞と同じくらいまたはそれよりも良好にはＫ５６２細胞を死滅させなかった。
【図８】図８は、本明細書において意図されている方法を使用して製造したＣＡＲ  Ｔ細胞による抗原特異的腫瘍クリアランスの代表的な実験を示す。可溶性抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を使用して活性化したＰＢＭＣに、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ発現レンチウイルスをＰＢＭＣ１０６個当たり１〜２×１０８ＴＵで用いて形質導入を行った。抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ１９発現Ｄａｕｄｉ細胞を死滅させたが、非ＣＤ１９発現Ｋ５６２細胞は死滅させなかった。
【図９】図９は、小規模研究Ｔ細胞製造プラットフォームとスケールアップした臨床ｃＧＭＰ薬物製造プラットフォームのフローチャート比較を示す。小規模プロセスにより、ＣＡＲＴ構築物のより高いスループットの評価が可能になり、データは大規模ｃＧＭＰ製造プラットフォームと同等であることが保証される。
【図１０】図１０は、新鮮なＰＢＭＣ、細胞培養バッグ、および場合によってＷＡＶＥバイオリアクターを使用するＴ細胞製造プラットフォームのフローチャートを示す。
【図１１】図１１は、凍結ＰＢＭＣ、細胞培養バッグ、および場合によってＷＡＶＥバイオリアクターを使用するＴ細胞製造プラットフォームのフローチャートを示す。
【図１２】図１２は、新鮮なＰＢＭＣおよびＧＲＥＸバイオリアクターを使用するＴ細胞製造プラットフォームを使用するフローチャートを示す。
【図１３】図１３は、小規模および大規模製造方法から製造された最終的なＣＡＲ  Ｔ細胞産物の表現型を比較する代表的な実験を示す。ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＡＲ  Ｔ構築物、ＣＤ５６、およびＣＤ６２Ｌ細胞表面マーカーの発現についてのＦＡＣＳ分析では、プラットフォーム間で最終的なＣＡＲ  Ｔ産物の表現型にいかなる有意差も同定されなかった。２種のプラットフォーム間で全ての表面マーカーについてｐ≧０．２０。（ｎ＝３）。
【図１４】図１４は、Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ（登録商標）５＋Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ）で実施するＦＩＣＯＬＬ（商標）単離および洗浄を使用することによる、１８ドナー由来のＰＢＭＣの細胞組成を示す。結果として得られた細胞集団を、ＦＡＣＳによってＣＤ４５＋細胞、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および単球および樹状細胞について特徴付けた。細胞プロファイルは、１８ドナーの間で一貫していた。
【図１５】図１５は、異なる方法を使用したＣＡＲ  Ｔ細胞製造により、同等の最終細胞産物が産生されたことを示す。小規模デバイス（Ｔ２５フラスコ）および大規模デバイス（ＧＲＥＸ１００、静置細胞培養バッグ、およびＷＡＶＥバイオリアクター）を使用してＣＡＲ  Ｔ細胞を製造した。１０日間の培養期間にわたる細胞の成長速度および増大した細胞数は、方法の間で同等であった。（Ａ）ＦＡＣＳ分析から、ＣＤ３＋細胞の量が製造方法の間で一貫していることが示された。（Ｂ）ｑＰＣＲから、試験した種々の製造方法の間でＣＤ３＋細胞のＶＣＮが同等であることが示された。
【図１６】図１６は、多数のレンチウイルスＣＡＲ構築物の漫画でのマップである。構築物を、プロモーター、ｓｃＦＶ、＋／−リンカー、ヒンジ、膜貫通領域およびシグナル伝達ドメインに関して変動させた。
【図１７】図１７は、種々のＣＡＲ  Ｔ細胞産物が、（Ａ）同等の成長速度；（Ｂ）ＶＣＮ；および（Ｃ）異なるＣＡＲ構築物の細胞表面発現を示したことを示す。
【図１８】図１８は、発現ＣＡＲ  Ｔ細胞を使用した抗原特異的腫瘍クリアランスを示す。（Ａ）抗ＢＣＭＡ発現ＣＡＲ  Ｔ細胞は、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識したＢＣＭＡ発現腫瘍細胞を死滅させた；蛍光をＦＡＣＳによって測定した。（Ｂ）抗ＢＣＭＡ発現ＣＡＲ  Ｔ細胞を、Ｋ５６２細胞、およびＢＣＭＡを発現するように遺伝子改変したＫ５６２細胞と共培養し、２４時間後に上清を収集し、ＩＦＮ−γ放出についてＥＬＩＳＡによってアッセイした（ｎ＝３）。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
Ａ．概要
養子細胞療法薬を製造するための既存の方法は、煩わしく費用がかかるものであり、また、診療所における広範にわたる治療としてのＡＣＴの使用には手ごわい障壁を示している。組成物および方法は、細胞に基づく治療薬の製造に関連するこれらおよび他の問題に対する解決法をもたらす。本発明は、一般には、Ｔ細胞治療薬を製造するための改善された方法に関する。いかなる特定の理論にも縛られることを望むことなく、本明細書において意図されている本発明の方法は、当技術分野における既存のＴ細胞組成物と比較して、再現性があり、信頼でき、かつ頑強なＡＣＴ製造プラットフォームをもたらす。
【００８３】
種々の実施形態では、養子細胞療法薬、免疫エフェクター細胞組成物または治療薬を製造するための方法、免疫エフェクター細胞を増大させるための方法、および免疫エフェクター細胞製造プラットフォームが提供される。特定の好ましい実施形態では、工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲ免疫エフェクター細胞組成物を本明細書において意図されている方法によって製造し、それにより、免疫エフェクター細胞養子細胞療法薬の有効性をさらに増加させることができる。本明細書において意図されている製造された細胞組成物は、これらに限定されないが、がん、感染症、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全症を含めた多数の状態の治療または予防において有用である。
【００８４】
種々の実施形態では、免疫エフェクター細胞を含む治療用組成物を製造するための方法は、免疫エフェクター細胞を含む細胞の集団を得るステップと、細胞の集団を活性化するステップと、細胞の集団を培養して免疫エフェクター細胞を増大させるステップとを含む。特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、および場合によってＮＫ細胞および／またはＮＫＴ細胞を含む。
【００８５】
種々の実施形態では、免疫エフェクター細胞を細胞培養バッグおよび／またはバイオリアクター中で製造する。
【００８６】
他の種々の実施形態では、免疫エフェクター細胞をバイオリアクター中で製造する。
【００８７】
一実施形態では、Ｔ細胞を含む治療用組成物を製造するための方法は、閉鎖系プロセスを使用して対象から細胞を採取し、細胞の集団を単離するステップを含む。特定の実施形態では、細胞を、任意の適切な新鮮なまたは凍結した供給源から単離することができる。ある特定の実施形態では、単離された細胞の集団は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む。単離された細胞の集団を播種して培養を開始し、細胞を一次および共刺激リガンドと接触させることによってＴ細胞を活性化し、刺激する。特定の実施形態では、形質導入された細胞を特定の標的抗原に向け直す（ｒｅｄｉｒｅｃｔ）ために、活性化Ｔ細胞を含む細胞の集団に、ウイルスベクターを用いて形質導入を行う。ある特定の実施形態では、細胞に、ＣＡＲまたは工学的に作製されたＴＣＲをコードするウイルスベクターを用いて形質導入を行う。次いで、形質導入された細胞または形質導入されていない細胞を成長培地で培養して、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を増大させることができる。次いで、製造された免疫エフェクター細胞組成物を、それを必要とする対象を治療するために使用することもでき、後で使用するために凍結させることもできる。
【００８８】
本明細書において意図されている方法を使用して製造される養子細胞療法薬は、再現性のあるレベルの増大、細胞プロファイル、ＶＣＮを有し、抗原特異的腫瘍クリアランスの媒介において有効である細胞性薬品の作製において有効である。当該方法は、養子細胞療法薬の作製における患者間の変動性の低減をもたらすものであり、また、再現性があり、信頼でき、拡張可能であり、かつｃＧＭＰ製造プロセスに変換できるものである。したがって、本明細書において意図されている方法および組成物は、既存の養子細胞免疫療法薬と比較して画期的な改善を表す。
【００８９】
本発明の実施には、特にそれに反する指示がなければ、当技術分野の技術の範囲内に入る化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技法、遺伝学、免疫学、および細胞生物学の従来の方法を使用し、その多くを例示目的で以下に記載する。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２年）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、２００８年７月更新）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉ巻＆ＩＩ巻（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８５年）；Ａｎａｎｄ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ、（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２年）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９９８年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｑ．  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａ．  Ｍ．  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄ．  Ｈ．  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅ．  Ｍ．  ＳｈｅｖａｃｈおよびＷ．  Ｓｔｒｏｂｅｒ編、１９９１年）；Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；ならびにＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどの学術誌内のモノグラフを参照されたい。
【００９０】
本明細書において引用された全ての刊行物、特許および特許出願は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００９１】
Ｂ．定義
別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似した、またはそれと等しい任意の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、組成物、方法および材料の好ましい実施形態が本明細書に記載されている。本発明の目的に関して、次の用語を以下に定義する。
【００９２】
「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、および「ｔｈｅ（その）」という冠詞は、本明細書では、その冠詞の文法上の目的語の１つまたは１つ超（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「ａｎ（１つの）要素」とは、１つの要素または１つ超の要素を意味する。
【００９３】
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、参照数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して３０、２５、２０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％と同程度変動する数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。特定の実施形態では、数値の前の「約」または「およそ」という用語は、プラスまたはマイナス１５％、１０％、５％、または１％の範囲の値を示す。
【００９４】
本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、参照数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さの８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ超である数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。一実施形態では、「実質的に同じ」とは、参照数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さとほぼ同じである影響、例えば、生理的影響を生じる数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。
【００９５】
本明細書全体を通して、文脈がそうでないことを要しない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語は、規定されたステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群を含むが、任意の他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群は排除されないことを意味するものと理解されたい。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」とは、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という句に続くいかなるものも含み、かつそれに限定されることを意味する。したがって、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という句は、列挙されている要素が必要または必須であること、および他の要素は存在してはならないことを示す。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」とは、その句の後に列挙されている要素をいずれも含み、かつ、列挙されている要素に関して本開示に明記されている活性または作用に干渉も寄与もしない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という句は、列挙されている要素が必要または必須であるが、他の要素は任意選択ではなく、それらが、列挙されている要素の活性または作用に影響を及ぼすか否かに応じて、存在してよいまたは存在してはならないことを示す。
【００９６】
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加的な実施形態」または「さらなる実施形態」またはこれらの組合せへの言及は、実施形態に関連して記載されている特定の特徴、構造または特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に包含されることを意味する。したがって、本明細書全体を通して種々の箇所における前述の句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態について言及しているのではない。さらに、１つまたは複数の実施形態において、特定の特徴、構造、または特性を任意の適切な様式で組み合わせることができる。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞製造」または「Ｔ細胞を製造する方法」という用語または同等の用語は、Ｔ細胞の治療用組成物を作製するプロセスを指し、製造方法は、Ｔ細胞を含む細胞の集団または精製されたＴ細胞の集団に対して１回または複数回実施される以下のステップ：採取、単離、洗浄、刺激、活性化、改変、増大、凍結保存、および解凍、またはそれらの任意の適切な組合せのうちの１つもしくは複数、またはその全てを含み得る。
【００９８】
「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」という用語は、当技術分野で認められており、胸腺細胞、ナイーブなＴリンパ球、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止状態のＴリンパ球、または活性化されたＴリンパ球を含むものとする。特定の実施形態における使用に適した例示的なＴ細胞の集団としては、これらに限定されないが、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞、または任意の他のＴ細胞のサブセットが挙げられる。特定の実施形態における使用に適した他の例示的なＴ細胞の集団としては、これらに限定されないが、以下のマーカー：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、およびＨＬＡ−ＤＲのうちの１つまたは複数を発現するＴ細胞が挙げられ、また、所望であれば、正または負の選択技法によってさらに単離することができる。
【００９９】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、円形の核を有する任意の血液細胞（すなわち、リンパ球、単球、またはマクロファージ）と定義される。これらの血液細胞は、感染と戦い、侵入物に適合するための免疫系における重要な構成成分である。リンパ球集団は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞、ＣＤ１４＋単球、ならびに好塩基球／好中球／好酸球／樹状細胞からなる。これらの細胞は、多くの場合、全血から、またはｌｅｕｋｏｐａｃｋから、血液の層を分離させ、血漿の層の下に単球およびリンパ球の軟膜を形成させる親水性多糖であるＦＩＣＯＬＬ（商標）を使用して分離する。一実施形態では、「ＰＢＭＣ」とは、少なくともＴ細胞、および場合によってＮＫ細胞、および抗原提示細胞を含む細胞の集団を指す。
【０１００】
「抗原提示細胞」とは、抗原のプロセシングおよびＴ細胞への提示によって細胞性免疫応答を媒介する免疫応答性細胞の不均一な群を指す。抗原提示細胞としては、これらに限定されないが、マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、Ｂリンパ球、血小板および人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）が挙げられる。
【０１０１】
ａＡＰＣは、Ｋ５６２、Ｕ９３７、７２１．２２１、Ｔ２、およびＣ１Ｒ細胞を、種々の共刺激分子およびサイトカインの安定発現および分泌を導くように工学的に作製することによって作出することができる。特定の実施形態では、Ｋ３２またはＵ３２  ａＡＰＣを使用して、１種または複数種の、抗体に基づく刺激性分子のＡＡＰＣ細胞表面上へのディスプレイを導く。Ｔ細胞の集団は、これらに限定されないが、ＣＤ１３７Ｌ（４−１ＢＢＬ）、ＣＤ１３４Ｌ（ＯＸ４０Ｌ）、および／またはＣＤ８０またはＣＤ８６を含めた種々の共刺激分子を発現するａＡＰＣによって増大させることができる。最後に、ａＡＰＣは、遺伝子改変Ｔ細胞を増大させるため、およびＣＤ８Ｔ細胞上でのＣＤ２８発現を維持するための効率的なプラットフォームをもたらす。ＷＯ０３／０５７１７１およびＵＳ２００３／０１４７８６９において提供されるａＡＰＣは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、「増殖」という用語は、細胞の対称または非対称分裂のいずれかの細胞分裂の増加を指す。特定の実施形態では、「増殖」とは、Ｔ細胞の対称または非対称分裂を指す。「増殖の増加」は、処理された試料中の細胞の数が処理されていない試料中の細胞と比較して増加している場合に起こる。
【０１０３】
「免疫エフェクター細胞」とは、１つまたは複数のエフェクター機能（例えば、細胞傷害性細胞死滅活性、サイトカインの分泌、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの誘導）を有する、免疫系の任意の細胞である。本明細書において意図されている例示的な免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）およびヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）である。当業者には理解される通り、他の細胞も、本明細書に記載のＣＡＲと共に免疫エフェクター細胞として使用することができる。具体的には、免疫エフェクター細胞として、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球、およびマクロファージも挙げられる。特定の実施形態では、Ｔ細胞ならびに１つまたは複数の他の細胞型、例えばＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球、および／またはマクロファージなどを遺伝子改変し、本明細書において意図されている製造方法を使用して増大させる。
【０１０４】
「改変Ｔ細胞」とは、本明細書において意図されている工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを導入することによって改変されたＴ細胞を指す。改変Ｔ細胞とは、遺伝子改変および非遺伝子改変（例えば、エピソームまたは染色体外）の両方を含む。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、「遺伝子工学的に作製された」または「遺伝子改変された」という用語は、細胞内の全遺伝物質に余分の遺伝物質をＤＮＡまたはＲＮＡの形態で付加することを指す。
【０１０６】
「遺伝子改変細胞」、「改変細胞」、および「向け直された細胞」という用語は、互換的に使用される。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、「遺伝子療法」という用語は、遺伝子の発現を回復させる、補正する、または改変する、あるいは治療用ポリペプチド、例えば、ＴＣＲもしくはＣＡＲおよび／または１種もしくは複数種のサイトカインを発現させる目的で、細胞内の全遺伝物質に余分の遺伝物質をＤＮＡまたはＲＮＡの形態で導入することを指す。特定の実施形態では、Ｔ細胞を、細胞のゲノムを改変することなく、例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲを発現するエピソームベクターを細胞に導入することにより、工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように改変する。
【０１０８】
「ｅｘ  ｖｉｖｏ」という用語は、一般に、生物体の外側で行われる行為、例えば、天然の条件の変更が最小であることが好ましい、生物体の外側の人工的な環境において生組織内または生組織上で行われる実験または測定などを指す。特定の実施形態では、「ｅｘ
ｖｉｖｏ」手順は、生物体から取得し、通常は滅菌条件下で、一般には数時間または最大約２４時間であるが状況に応じて最大４８または７２時間を含む時間にわたって実験装置内で培養または調節した生細胞または組織を伴う。ある特定の実施形態では、そのような組織または細胞を収集し、凍結させ、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける処理のために後で解凍することができる。生細胞または組織を使用して数日よりも長く続く組織培養実験または手順は、一般には「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」とみなされるが、ある特定の実施形態では、この用語は、ｅｘ  ｖｉｖｏと互換的に使用することができる。
【０１０９】
「ｉｎ  ｖｉｖｏ」という用語は、一般に、生物体の内側で行われる行為、例えば、細胞の自己再生および細胞の増大などを指す。一実施形態では、「ｉｎ  ｖｉｖｏにおける増大」という用語は、細胞集団の数をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて増加できることを指す。
【０１１０】
「刺激」という用語は、これに限定されないが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナルトランスダクションを含めたシグナルトランスダクション事象が媒介される、刺激性分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）とその同族リガンドの結合によって誘導される一次応答を指す。
【０１１１】
「刺激性分子」とは、同族刺激性リガンドと特異的に結合するＴ細胞上の分子を指す。
【０１１２】
「刺激性リガンド」とは、本明細書で使用される場合、抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）に存在すると、Ｔ細胞上の同族結合パートナー（本明細書では、「刺激性分子」と称される）と特異的に結合することが可能であり、それにより、これらに限定されないが、活性化、免疫応答の開始、増殖などを含めた、Ｔ細胞による一次応答を媒介するリガンドを意味する。刺激性リガンドとしては、これらに限定されないが、ＣＤ３リガンドまたは結合性作用物質、例えば、抗ＣＤ３抗体およびＣＤ２リガンドまたは結合性作用物質、例えば、抗ＣＤ２抗体が挙げられる。
【０１１３】
「活性化」という用語は、検出可能な細胞増殖を誘導するように十分に刺激されたＴ細胞の状態を指す。特定の実施形態では、活性化は、誘導性サイトカイン産生、および検出可能なエフェクター機能にも関連し得る。「活性化Ｔ細胞」という用語はとりわけ、増殖しているＴ細胞を指す。ＴＣＲ単独を通じて生成されるシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であり、１つまたは複数の二次または共刺激シグナルも必要である。したがって、Ｔ細胞の活性化は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を通じた一次刺激シグナルおよび１つまたは複数の二次共刺激シグナルを含む。共刺激は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を通じた、またはＣＤ２を通じた刺激などの一次活性化シグナルを受けたＴ細胞による増殖および／またはサイトカイン産生によって証明することができる。
【０１１４】
「共刺激シグナル」とは、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーションなどの一次シグナルと組み合わさって、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生、および／または特定の分子の上方制御もしくは下方制御を導くシグナルを指す。
【０１１５】
「共刺激リガンド」とは、共刺激分子と結合する分子を指す。共刺激リガンドは、可溶性であってもよく表面上にもたらされてもよい。共刺激リガンドとしては、これらに限定されないが、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＨＶＥＭ、Ｔｏｌｌリガンド受容体と結合するアゴニストまたは抗体およびＢ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンドを挙げることができる。共刺激リガンドはとりわけ、例えば、これらに限定されないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどの、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片も包含する。
【０１１６】
「共刺激分子」とは、Ｔ細胞上の同族結合パートナー、例えば、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、これに限定されないが、増殖を含めた、Ｔ細胞による共刺激応答を媒介するＣＤ２８を指す。
【０１１７】
「自己由来」とは、本明細書で使用される場合、同じ対象に由来する細胞を指す。
【０１１８】
「同種異系」とは、本明細書で使用される場合、比較される細胞とは遺伝的に異なる同じ種の細胞を指す。
【０１１９】
「同系」とは、本明細書で使用される場合、比較される細胞と遺伝的に同一である異なる対象の細胞を指す。
【０１２０】
「異種」とは、本明細書で使用される場合、比較される細胞とは異なる種の細胞を指す。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、「個体」および「対象」という用語は、多くの場合、互換的に使用され、本明細書の他の箇所で開示されている遺伝子療法ベクター、細胞に基づく治療薬、および方法を用いて治療することができるがん、感染症、免疫不全症、炎症性疾患、または自己免疫障害の症状を示す任意の動物を指す。適切な対象（例えば、患者）としては、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットなど）、農場動物、および家畜動物または愛玩動物（例えば、ネコまたはイヌなど）が挙げられる。非ヒト霊長類、および、好ましくは、ヒトが含まれる。典型的な対象としては、がん、感染症、免疫不全症、炎症性疾患、もしくは自己免疫障害を有するヒト、がん、感染症、免疫不全症、炎症性疾患、もしくは自己免疫障害と診断されたヒト、またはがん、感染症、免疫不全症、炎症性疾患、もしくは自己免疫障害を有するリスクがあるヒトが挙げられる。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、本明細書の他の箇所で開示されている遺伝子療法ベクター、細胞に基づく治療薬、および方法を用いて治療することができる特定の適応症と診断された対象を指す。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、疾患または病的状態の症状または病態に対するあらゆる有益なまたは望ましい効果を含み、治療される疾患または状態、例えばがんの１種または複数種の測定可能なマーカーの最小の減少さえ含み得る。治療は、場合によって、疾患もしくは状態の１つもしくは複数の症状の改善もしくは完全な低減、または疾患もしくは状態の進行の遅延のいずれかを伴い得る。「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、必ずしも、疾患または状態、またはそれに付随する症状の完全な根絶または治癒を示すものではない。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」および「予防された（ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ）」、「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」などの同様の単語は、疾患または状態、例えばがんの出現または再発を予防する、阻害する、またはその可能性を低下させる手法を示す。当該用語は、疾患もしくは状態の発症もしくは再発を遅延させること、または疾患もしくは状態の症状の出現もしくは再発を遅延させることも指す。本明細書で使用される場合、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」および同様の単語は、疾患または状態の強度、影響、症状および／または負荷を、疾患または状態の発症または再発の前に低減することも包含する。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、「量」という用語は、有益なまたは所望の、臨床結果を含めた予防または治療結果を達成するための、遺伝子改変された治療用細胞、例えばＴ細胞の「有効量（ａｎ  ａｍｏｕｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」または「有効量（ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」を指す。
【０１２６】
「予防有効量」とは、所望の予防結果を達成するのに有効な、遺伝子改変された治療用細胞の量を指す。必ずではないが、一般には、予防用量は対象に疾患の前またはより早い段階で使用されるので、予防有効量は、治療有効量よりも少ない。
【０１２７】
遺伝子改変された治療用細胞の「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体における所望の応答を引き出すＴ細胞の能力などの因子に応じて変動し得る。治療有効量は、ウイルスまたは形質導入された治療用細胞のあらゆる毒性の影響または有害な影響よりも治療的に有益な影響が上回る量でもある。「治療有効量」という用語は、対象（例えば、患者）を「治療する」のに有効である量を包含する。治療量が示されている場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、医師が、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および患者（対象）の状態の個々の差異を考慮して決定することができる。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、一般に、異常な細胞が制御されずに分裂し、近くの組織に浸潤し得る、疾患または状態のクラスに関する。
【０１２９】
本明細書で使用される場合、「悪性」という用語は、腫瘍細胞の群が、制御されていない成長（すなわち、正常な限界を超えた分裂）、浸潤（すなわち、近接組織への侵入およびその破壊）、ならびに転移（すなわち、リンパ液または血液を介した、体内の他の場所への拡散）のうちの１つまたは複数を示すがんを指す。本明細書で使用される場合、「転移する」という用語は、がんが体の一部分から別の部分に拡散することを指す。拡散した細胞によって形成される腫瘍は、「転移性腫瘍」または「転移」と称される。転移性腫瘍は、元の（原発）腫瘍における細胞と同様の細胞を含有する。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、「良性」または「非悪性」という用語は、大きく成長する可能性があるが、体の他の部分には拡散しない腫瘍を指す。良性腫瘍は自己限定的であり、一般には浸潤も転移もしない。
【０１３１】
「がん細胞」または「腫瘍細胞」とは、癌性増殖物または組織の個々の細胞を指す。腫瘍とは、一般に、細胞の異常な成長によって形成される腫脹または病変を指し、これは、良性、前悪性、または悪性であり得る。大多数のがんは腫瘍を形成するが、いくつか、例えば、白血病は、腫瘍を必ずしも形成しない。腫瘍を形成するがんに関して、がん（細胞）および腫瘍（細胞）という用語は、互換的に使用される。個体内の腫瘍の量は、腫瘍の数、体積、または重量として測定することができる「腫瘍量（ｔｕｍｏｒ  ｂｕｒｄｅｎ）」である。
【０１３２】
「感染症」とは、人から人へまたは生物体から生物体へ伝染する可能性があり、微生物因子によって引き起こされる疾患（例えば、感冒）を指す。感染症は当技術分野で公知であり、それらとして、例えば、肝炎、性行為感染症（例えば、クラミジア、淋病）、結核、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ジフテリア、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、コレラ、およびインフルエンザが挙げられる。
【０１３３】
「自己免疫疾患」とは、体が、自身の組織のある構成要素に対する免疫原性（すなわち、免疫系）応答を生じる疾患を指す。言い換えれば、免疫系は体内のある組織または系を「自己」と認識する能力を失い、あたかもそれを外来であるかのように標的とし、攻撃する。自己免疫疾患は、主に１つの器官が影響を受けるもの（例えば、溶血性貧血および抗免疫甲状腺炎）と、自己免疫疾患プロセスが多くの組織を通じて拡散するもの（例えば、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｎｅｍａｔｏｓｕｓ））に分類することができる。例えば、多発性硬化症は、脳および脊髄の神経線維を囲む鞘を攻撃するＴ細胞によって引き起こされると考えられている。その結果、協調喪失、衰弱、および霧視が生じる。自己免疫疾患は、当技術分野で公知であり、例えば、橋本甲状腺炎、グレーブス病、ループス、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、溶血性貧血、抗免疫甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、セリアック病、クローン病、大腸炎、糖尿病、強皮症、乾癬などが挙げられる。
【０１３４】
「免疫不全症」とは、疾患によってまたは化学物質の投与によって免疫系が損なわれた患者の状態を意味する。この状態により、当該系が、外来物質に対する防御に必要な血液細胞の数および型が欠損したものになる。免疫不全症状態または疾患は当技術分野で公知であり、それらとして、例えば、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）、ＳＣＩＤ（重症複合型免疫不全症）、選択的ＩｇＡ欠損症、分類不能型免疫不全症、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、慢性肉芽腫性疾患、高ＩｇＭ症候群、および糖尿病が挙げられる。
【０１３５】
本明細書で使用される場合、「炎症性疾患」という用語は、感染性または非感染性の原因によって生じ得る急性または慢性の炎症性の状態を指す。種々の感染性の原因としては、髄膜炎、脳炎、ぶどう膜炎、大腸炎、結核、皮膚炎、および成人呼吸窮迫症候群が挙げられる。非感染性の原因としては、外傷（熱傷、切り傷、挫傷、挫滅傷）、自己免疫疾患、および臓器拒絶反応エピソードが挙げられる。
【０１３６】
「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」または「促進する（ｐｒｏｍｏｔｅ）」または「増加させる（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」または「増大させる（ｅｘｐａｎｄ）」とは、一般に、本明細書において意図されている組成物の、ビヒクルまたは対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答と比較してより大きな生理応答（すなわち、下流の効果）を生じさせる、引き出す、または引き起こす能力を指す。測定可能な生理応答としてはとりわけ、当技術分野における理解および本明細書における説明から明らかである、Ｔ細胞増大、活性化、増殖の増加、および／またはがん細胞死滅能力の増加を挙げることができる。「増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」または「増強された（ｅｎｈａｎｃｅｄ）」量とは、一般には、「統計的に有意な」量であり、ビヒクルまたは対照組成物によって生じる応答の１．１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍またはそれ超（例えば、５００倍、１０００倍）（中間の１を超える全ての整数および小数点、例えば、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍などを含める）である増加を含み得る。
【０１３７】
「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」または「低減する（ｌｏｗｅｒ）」または「減る（ｌｅｓｓｅｎ）」または「低下する（ｒｅｄｕｃｅ）」または「軽減する（ａｂａｔｅ）」とは、一般に、本明細書において意図されている組成物の、ビヒクルまたは対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答と比較してより小さな生理応答（すなわち、下流の効果）を生じさせる、引き出す、または引き起こす能力を指す。「減少した（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」または「低下した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」量とは、一般には、「統計的に有意な」量であり、ビヒクル、対照組成物によって生じる応答（参照応答）、または特定の細胞系列における応答の１．１分の１、１．２分の１、１．５分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、１５分の１、２０分の１、３０分の１またはそれ未満（例えば、５００分の１、１０００分の１）（中間の１を超える全ての整数および小数点、例えば、１．５分の１、１．６分の１、１．７分の１、１．８分の１などを含める）である減少を含み得る。
【０１３８】
「維持する（ｍａｉｎｔａｉｎ）」または「保存する（ｐｒｅｓｅｒｖｅ）」または「維持（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ）」または「変化なし（ｎｏ  ｃｈａｎｇｅ）」または「実質的な変化なし（ｎｏ  ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｃｈａｎｇｅ）」または「実質的な減少なし（ｎｏ  ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｄｅｃｒｅａｓｅ）」とは、一般に、本明細書において意図されている組成物の、ビヒクル、対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答、または特定の細胞系列における応答と比較してより小さな、細胞における生理応答（すなわち、下流の効果）を生じさせる、引き出す、または引き起こす能力を指す。同等の応答とは、参照応答と有意に異ならないまたは測定可能なほど異ならない応答である。
【０１３９】
「特異的な結合親和性」または「特異的に結合する」または「特異的に結合した」または「特異的な結合」または「特異的に標的とする」という用語は、本明細書で使用される場合、１つの分子が別の分子にバックグラウンド結合よりも高い結合親和性で結合することを記載するものである。結合性ドメイン（または結合性ドメインを含むＣＡＲまたは結合性ドメインを含有する融合タンパク質）は、例えば、約１０５Ｍ−１を超えるまたはそれと同等の親和性またはＫａ（すなわち、単位１／Ｍの特定の結合相互作用の平衡会合定数）で標的分子に結合するまたはそれと会合する場合、標的分子に「特異的に結合する」。ある特定の実施形態では、結合性ドメイン（またはその融合タンパク質）は、約１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１、または１０１３Ｍ−１を超えるまたはそれと同等のＫａで標的に結合する。「高親和性」結合性ドメイン（またはその単鎖融合タンパク質）とは、Ｋａが少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１、またはそれ超である結合性ドメインを指す。
【０１４０】
あるいは、親和性は、単位Ｍの、特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）と定義することができる（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍまたはそれ未満）。本開示による結合性ドメインポリペプチドおよびＣＡＲタンパク質の親和性は、従来の技法を使用して、例えば、競合ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）によって、または結合会合、または標識したリガンドを使用した置換アッセイによって、または、Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから入手可能なＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００などの表面プラズモン共鳴デバイス、またはそれぞれＣｏｒｎｉｎｇおよびＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒから入手可能なＥＰＩＣ  ｓｙｓｔｅｍもしくはＥｎＳｐｉｒｅなどの光学バイオセンサー技術を使用して、容易に決定することができる（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら（１９４９年）Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ５１巻：６６０頁；および米国特許第５，２８３，１７３号；同第５，４６８，６１４号、または等価物も参照されたい）。
【０１４１】
一実施形態では、特異的な結合の親和性は、バックグラウンド結合の約２倍、バックグラウンド結合の約５倍、バックグラウンド結合の約１０倍、バックグラウンド結合の約２０倍、バックグラウンド結合の約５０倍、バックグラウンド結合の約１００倍、またはバックグラウンド結合の約１０００倍またはそれ超である。
【０１４２】
「抗原（Ａｇ）」とは、動物に注射または吸収される組成物（例えば、腫瘍に特異的なタンパク質を含むものなど）を含めた、動物における抗体の産生またはＴ細胞応答を刺激することが可能な化合物、組成物、または物質を指す。抗原は、開示されている抗原などの異種抗原によって誘導されるものを含めた、特定の体液性または細胞性免疫の産物と反応する。「標的抗原」または「目的の標的抗原」とは、本明細書において意図されているＣＡＲまたは工学的に作製されたＴＣＲの結合性ドメインが結合するように設計されている抗原である。
【０１４３】
「エピトープ」または「抗原決定基」とは、結合性作用物質が結合する抗原の領域を指す。
【０１４４】
「単離されたペプチド」または「単離されたポリペプチド」などは、本明細書で使用される場合、組換えもしくは合成ペプチドもしくはポリペプチド分子または天然に存在しないペプチドもしくはポリペプチドの、細胞の環境から、および細胞の他の構成成分との関連からのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける単離、合成、および／または精製を指す、すなわち、「単離されたペプチド」または「単離されたポリペプチド」などは、ｉｎ  ｖｉｖｏ物質と有意に関連しない。
【０１４５】
本明細書で使用される場合、「単離されたポリヌクレオチド」とは、組換え、合成、または天然に存在しないポリヌクレオチド、例えば、天然には存在せず、人間の手によって作出された、単離された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）または他のポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける単離、合成、および／または精製を指す。特定の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドとは、天然に存在する状態ではそれに隣接する配列から精製された、組換え、合成、または天然に存在しないポリヌクレオチド、例えば、通常はその断片と隣接する配列から取り出されたＤＮＡ断片を指す。
【０１４６】
本明細書において意図されている方法を使用して製造した細胞性治療薬は、内毒素を含まず、また、ｃＧＭＰ実施に従って製造されることが好ましい。本明細書で使用される場合、「内毒素を含まない」という用語は、最大でも痕跡量（すなわち、対象に対して有害な生理的影響がない量）の内毒素、好ましくは検出不可能な量の内毒素を含有する容器および／または組成物を指す。一実施形態では、「内毒素を含まない」という用語は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％内毒素を含まない組成物を指す。内毒素とは、ある特定の細菌、一般には、グラム陰性菌に付随する毒素であるが、内毒素は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓなどのグラム陽性菌において見いだされ得る。最も蔓延している内毒素は、種々のグラム陰性菌の外膜において見いだされるリポ多糖（ＬＰＳ）またはリポオリゴ糖（ＬＯＳ）であり、これは、これらの細菌の疾患を引き起こす能力における中心的な病原性の特徴である。ヒトでは少量の内毒素により、他の有害な生理的影響の中でも、発熱、血圧の低減、ならびに炎症および凝固の活性化が生じ得る。したがって、多くの場合、少量でさえヒトにおける有害作用が引き起こされ得るので、内毒素のほとんどまたは全ての痕跡を薬品容器から除去することが望ましい。内毒素は、当技術分野で公知の方法を使用して容器から除去することができる、例えば、容器をＨＥＰＡ濾過洗浄設備において内毒素を含まない水で清浄にし、２５０℃で発熱物質除去（ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｅ）を行い、クラス１００／１０クリーンルーム（例えば、クラス１００クリーンルームは、空気１立方フィート中に０．５ミクロンよりも大きな粒子を１００個以下含有する）の内側に置かれたＨＥＰＡ濾過ワークステーションで清潔に包装することができる。
【０１４７】
本明細書で使用される場合、「医薬品の製造管理および品質管理規則（ｃｕｒｒｅｎｔ
ｇｏｏｄ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）（ｃＧＭＰ）」という用語は、食品、医薬製品、および医療機器の製造の制御および管理、ならびに品質管理試験を指す。ｃＧＭＰは、必ずしもサンプリングに依拠しないが、その代わりに、薬物および医療機器の製造に伴うプロセス、行為、および操作のあらゆる側面の証拠書類に依拠する。製品をどのように作出し、試験したかを示す証拠書類（それにより、トレーサビリティ、および、将来問題が生じた場合には市場からの回収が可能になる）が正確かつ適正でない場合、その製品は必要な規格に適合せず、汚染されたもの（すなわち、米国では、不純物が混和したもの）とみなされる。さらに、ｃＧＭＰは、一般には、全ての製造および試験設備が使用に適するものとして認定されていること、および、薬物製造プロセスにおいて利用される全ての操作上の方法体系および手順（例えば、製造、清浄、および分析試験）が所定の仕様書に従って検証されて、それらの意図する機能（複数可）の実施が可能であることが実証されていることを必要とする。米国では、「医薬品の製造管理および品質管理規則（ｃｕｒｒｅｎｔ  ｇｏｏｄ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）」という句は、１９３８年、Ｆｏｏｄ，  Ｄｒｕｇ，  ａｎｄ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ａｃｔ（２１  Ｕ．Ｓ．Ｃ．  §  ３５１）の５０１（Ｂ）にある。
【０１４８】
Ｃ．Ｔ細胞製造方法
現在、既存のＴ細胞製造方法は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の単離、活性化、形質導入および増大のための種々の複雑なステップを含む。対照的に、本発明者らは、小規模研究モデルを使用して、単純な、頑強な、よく特徴付けられた、柔軟な、閉鎖系Ｔ細胞製造プラットフォームを開発し、これを、工学的に作製されたＣＡＲ  Ｔ細胞のための大規模な臨床的ｃＧＭＰ製造プロセスに転換した。
【０１４９】
種々の実施形態では、細胞を、閉鎖系加工処理システム（ｃｌｏｓｅｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用して、または閉鎖系細胞加工処理システム（ｃｌｏｓｅｄ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）と組み合わせて製造する。閉鎖系細胞加工処理システムは、処理、遠心分離、インキュベーション、培地添加、細胞選択、細胞洗浄、ならびに「閉じた」または再封可能な容器内への最終的な充填および仕上げを含めたプロセスを自動化する。閉鎖系細胞加工処理システムは、プロセスを組み込み、自動化し、多くの定性的に制御された手作業を再現し、一貫した、オペレーターに左右されない品質をもたらす。
【０１５０】
自動化された閉鎖系細胞加工処理システムに伴う利益としては、療法の費用の有意な低下（一般には、２５〜９０％）および必要なオペレーターの数の減少（一般には、＞７０％）；熟練労働者への依存の低減；よりよい設備使用による資本投資の有意な節約（一般には、３０〜５０％）；品質の改善および品質事象の減少；ならびに、市場の需要に見合うように、より急速にスケールアップおよびスケールアウトできることが挙げられる。
【０１５１】
種々の実施形態では、治療用Ｔ細胞組成物を製造するための方法は、閉鎖系プロセスを使用して免疫エフェクター細胞および抗原提示細胞を含む細胞の集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、単離された細胞の集団を特定の密度で播種して培養を開始し、細胞を一次および共刺激リガンドと接触させることによってＴ細胞を活性化し、そして刺激する。特定の実施形態では、活性化Ｔ細胞を含む細胞の集団に、ＣＡＲまたは工学的に作製されたＴＣＲをコードするウイルスベクターを用いて形質導入を行い、培養して、Ｔ細胞を増大させる。次いで、治療用Ｔ細胞を含む製造された免疫エフェクター細胞組成物を、それを必要とする対象を治療するために使用することもでき、後で使用するために凍結させることもできる。
【０１５２】
１．Ｔ細胞の供給源
特定の実施形態では、Ｔ細胞は、これらに限定されないが、末梢血、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含めた、いくつかの供給源から得ることができる。一実施形態では、Ｔ細胞は、培養したＴ細胞株、例えば、ジャーカット、ＳｕｐＴ１などから得ることもできる。特定の実施形態では、Ｔ細胞を含む細胞の集団、例えば、ＰＢＭＣを本明細書において意図されている製造方法において使用する。他の実施形態では、単離または精製されたＴ細胞の集団を本発明で意図されている製造方法において使用する。
【０１５３】
一実施形態では、Ｔ細胞の供給源は、例えば、Ｓａｎｇｕｉｎｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから商業的に得ることもできる。
２．細胞の採取
【０１５４】
本発明は、改善されたＴ細胞組成物の製造を意図している。細胞は、自己由来／自原性（「自己」）であっても非自己由来（「非自己」、例えば、同種異系、同系または異種）であってもよい。一実施形態では、細胞は、哺乳動物対象から得られる。別の実施形態では、細胞は、霊長類対象から得られる。特定の実施形態では、細胞は、ヒト対象から得られる。
【０１５５】
種々の実施形態では、Ｔ細胞を含む細胞集団を個体から得、本明細書において意図されている製造方法に供す。一実施形態では、個体の循環血液由来の細胞をアフェレーシスの方法、例えば、白血球アフェレーシスによって得る。アフェレーシス産物は、リンパ球、例えば、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含有してもよく、リンパ球、例えば、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、および他の有核白血球を含む白血球アフェレーシス産物であってもよい。一実施形態では、アフェレーシスによって収集した細胞を、血漿画分を除去するため、および、細胞を、その後の加工処理のために適切な緩衝液または培地に入れるために洗浄することができる。細胞は、ＰＢＳを用いて、またはカルシウム、マグネシウム、および他の全てではないにせよほとんどの二価カチオンを欠く別の適切な溶液を用いて洗浄することができる。
【０１５６】
Ｔ細胞を含む細胞の集団が得られたら、細胞の集団内の細胞の細胞計数および生存率を決定することができ、集団またはその一部を、後で使用または分析するために凍結保存することができ、集団内の細胞、例えば、ＰＢＭＣを、いくつかの細胞マーカーパネル、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１２７、およびＨＬＡ−ＤＲを使用して特徴付けることができる。
【０１５７】
特定の実施形態では、本明細書において意図されている製造方法において使用する、アフェレーシス処理された細胞の体積は、約５０ｍＬ〜約５００ｍＬ、約５０ｍＬ〜約２５０ｍＬ、約５０ｍＬ〜約２００ｍＬ、約１００ｍＬ〜約５００ｍＬ、約１００ｍＬ〜約２５０ｍＬ、または約１００ｍＬ〜約２００ｍＬ、またはその間に入る任意の範囲である。
【０１５８】
ある特定の実施形態では、本明細書において意図されている製造方法において使用する、アフェレーシス処理された細胞の体積は、約２５ｍＬ、約５０ｍＬ、約７５ｍＬ、約１００ｍＬ、約１２５ｍＬ、約１５０ｍＬ、約１７５ｍＬ、約２００ｍＬ、約２２５ｍＬ、約２５０ｍＬ、約２７５ｍＬ、約３００ｍＬ、約３２５ｍＬ、約３５０ｍＬ、約３７５ｍＬ、約４００ｍＬ、約４２５ｍＬ、約４５０ｍＬ、約４７５ｍＬ、または約５００ｍＬ、またはその間に入る任意の体積である。
【０１５９】
３．ＰＢＭＣ単離
特定の実施形態では、ＰＢＭＣの集団を本明細書において意図されているＴ細胞製造方法において使用する。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞を含むＰＢＭＣは、当業者に公知のさまざまな任意の技法、例えば遠心分離および沈降、例えば、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）分離などを使用して、対象から収集した単位の血液またはアフェレーシス処理画分から得ることができる。
【０１６０】
ある特定の実施形態では、アフェレーシスによって収集したＰＢＭＣを、半自動フロースルー遠心分離機、例えば、Ｃｏｂｅ  ２９９１  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  ５などを使用して、ＦＩＣＯＬＬ（商標）またはＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配で単離する。一部の実施形態では、アフェレーシスによって収集したＰＢＭＣを、対流遠心エルトリエーションデバイス、例えば、Ｔｅｒｕｍｏ  ＢＣＴ  ＥＬＵＴＲＡ（登録商標）などを使用して、ＦＩＣＯＬＬ（商標）またはＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を使用せずに単離する。Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  ５の使用により、ＰＢＭＣ出発材料のＦｉｃｏｌｌによる閉鎖系加工処理ならびに製造されたＴ細胞組成物の最終的な濃縮および洗浄を１つのデバイスで行うことが可能になる。閉鎖系の使用により、ｃＧＭＰ加工処理のために必要な設備が最小化されることによって製造が単純化し、一貫した、再現性よく純粋なＰＢＭＣまたは最終的なＴ細胞組成物がもたらされる。
【０１６１】
一実施形態では、ＰＢＭＣを、ＥＬＵＴＲＡ（登録商標）対流遠心エルトリエーションデバイスを使用して単離し、Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  ５＋またはＬＯＶＯで洗浄する。
【０１６２】
一部の実施形態では、ＰＢＭＣを単離した後、細胞傷害性Ｔリンパ球とヘルパーＴリンパ球の両方を、活性化、増大、および／または遺伝子改変の前またはその後のいずれかに、閉鎖系デバイスおよびｃＧＭＰ試薬、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳを使用して、ナイーブなＴ細胞亜集団、メモリーＴ細胞亜集団、およびエフェクターＴ細胞亜集団に選別することができる。
【０１６３】
単離後、ＰＢＭＣ細胞計数および生存率を決定することができ、ＰＢＭＣまたはその一部を後で使用または分析するために凍結保存することができ、ＰＢＭＣを、いくつかの細胞マーカーパネル、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６１、およびＣＤ６６ｂを使用して特徴付けることができる。
【０１６４】
特定の実施形態では、ＰＢＭＣを単離した後、それらを、例えばＦｉｃｏｌｌを除去するために、１回または複数回の洗浄ステップに供する。ある特定の実施形態では、細胞を、本明細書において意図されている多くの製造ステップの前、その間、またはその後に、１回または複数回洗浄することができる。洗浄は、任意の適切な緩衝液または培養培地、例えば、ＨＡＢＳもしくはＨＳＡ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ、ＴＣＧＭ、ＰＢＳ、リンゲル液、生理的食塩水、０．９％ＮａＣｌを補充したＣｌｉｎｉＭＡＣＳ緩衝液、または、カルシウム、マグネシウム、および他の全てではないにせよほとんどの二価カチオンを欠く別の適切な溶液、または任意の適切な培養培地、またはそれらの任意の適切な組合せで実施することができる。一実施形態では、ＰＢＭＣを単離した後、それらを、半自動フロースルー遠心分離機、例えば、Ｃｏｂｅ  ２９９１  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  ５、Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅ、ＬＯＶＯなどで洗浄する。別の実施形態では、ＰＢＭＣを単離した後、それらを、別の滅菌容器、例えば、移行容器または培養容器に移す。本明細書で使用される場合、「容器」という用語は、一般に、細胞およびその副産物のｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける培養、取扱い、操作、保管、分析、インキュベート、投与ならびに他の点では樹立、支持、成長、採取、治療、および使用の目的のために、または他の点では本明細書に記載されている種々の目的および本明細書において意図されている種々の目的のために使用することが可能な任意の容器に関する。
【０１６５】
「移行容器」とは、一般に、気体透過性ではない容器を指す。一実施形態では、洗浄を移行容器中で実施し、その後の細胞操作を１つまたは複数の型の細胞培養容器中で実施する。
【０１６６】
細胞培養容器の実例としては、これらに限定されないが、細胞培養バッグ、バイオリアクター（例えば、Ｇａｓ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｆｌａｓｋ（Ｇ−Ｒｅｘ）バイオリアクター、Ｗｉｌｓｏｎ−Ｗｏｌｆ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ；およびＷＡＶＥバイオリアクター、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、細胞または組織培養デバイス、小袋、カプセル、培養バイアル、器具、セルファクトリー（ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒｙ）、容器、培養チューブ（例えば、微量遠心チューブ、ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ  ＴＵＢＥＳ（登録商標）、ＦＡＬＣＯＮ（登録商標）円錐管など）、培養皿（例えば、ペトリ皿）、培養フラスコ、スピナーフラスコ、ローラーボトル、マルチウェルプレート（例えば、２ウェル、４ウェル、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル、および３８４ウェルプレート）、マイクロインキュベーター、マイクロキャリア、マイクロプレート、マイクロスライドおよびチャンバースライドが挙げられる。
【０１６７】
さらに別の実施形態では、ＰＢＭＣを、半自動フロースルー遠心分離機で１回または複数回洗浄し、適切な容器に移し、その中で１回または複数回洗浄することができる。
【０１６８】
細胞培養バッグの例示的な実施形態としては、これらに限定されないが、ＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｂａｇ、ＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ
Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｂａｇ、ＥＸＰ−Ｐａｋ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｂｉｏ−Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ、ＶｕｅＬｉｆｅ（商標）バッグ、ＫｒｙｏＳｕｒｅ（商標）バッグ、ＫｒｙｏＶｕｅ（商標）バッグ、Ｌｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）バッグ、ＰｅｒｍａＬｉｆｅ（商標）バッグ、Ｘ−Ｆｏｌｄ（商標）バッグ、Ｓｉ−Ｃｕｌｔｕｒｅ（商標）バッグ、Ｏｒｉｇｅｎ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｃｒｙｏｂａｇ、およびＶｅｃｔｒａＣｅｌｌ（商標）バッグが挙げられる。特定の実施形態では、細胞培養バッグは、以下の特性の１つまたは複数を含む：気体透過性（材料は、酸素、二酸化炭素および窒素について適切な気体移行率を有する）；無視できる水分損失率（材料は、実際には水に対して不透過性である）；化学的におよび生物学的に不活性であること（材料は、容器の内容物と反応しない）、ならびに種々の条件において柔軟性および強度が保持されること（材料は、容器を電子レンジで加熱すること、ＵＶ照射処理すること、遠心分離すること、または広範囲の温度、例えば、−１００℃〜＋１００℃で使用することを可能にする）。
【０１６９】
本明細書において意図されている細胞培養容器の例示的な体積としては、限定することなく、間に入る任意の体積を含め、約１０ｍＬ、約２５ｍＬ、約５０ｍＬ、約７５ｍＬ、約１００ｍＬ、約１５０ｍＬ、約２５０ｍＬ、約５００ｍＬ、約７５０ｍＬ、約１０００ｍＬ、約１２５０ｍＬ、約１５００ｍＬ、約１７５０ｍＬ、約２０００ｍＬ、またはそれ超の体積が挙げられる。例えば、１０ｍＬから２５ｍＬまでの間に入る体積としては、１１ｍＬ、１２ｍＬ、１３ｍＬ、１４ｍＬ、１５ｍＬ、１６ｍＬ、１７ｍＬ、１８ｍＬ、１９ｍＬ、２０ｍＬ、２１ｍＬ、２２ｍＬ、２３ｍＬ、および２４ｍＬが挙げられる。一実施形態では、細胞培養容器の体積は約１００ｍＬ〜約１０Ｌである。
【０１７０】
単離された細胞を洗浄した後、洗浄後の細胞計数および生存率を決定することができ、後で使用もしくは分析するために凍結保存することができ、かつ／または、いくつかの細胞マーカー、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、ＣＤ２７９、およびＨＬＡ−ＤＲを使用し、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析を使用して特徴付けることができる。
【０１７１】
４．凍結保存
特定の実施形態では、本明細書において意図されているＴ細胞製造方法を、Ｔ細胞を含む新しく単離した細胞の集団を使用して実施する。他の特定の実施形態では、本明細書において意図されている方法を、Ｔ細胞を含む凍結保存した細胞の集団を使用して実施する。細胞は、ＰＢＭＣの採取または単離後、培養の開始および活性化後、形質導入後、または増大後または任意のプロセスステップ後に凍結保存することができる。製造されたＴ細胞組成物は、Ｔ細胞製造プロセス後に凍結保存することもできる。凍結融解サイクルにより、非Ｔ細胞集団を除去することによってより均一なＴ細胞組成物をもたらすことができる。
【０１７２】
細胞集団は、本明細書において意図されている適切な細胞培養容器中で凍結保存することができる。上記、本明細書のＰＢＭＣ単離および他の箇所を参照されたい。細胞集団は、適切な細胞培養培地および／または凍結培地、例えば、５０％ｐｌａｓｍａｌｙｔｅおよび５０％Ｃｒｙｏｓｔｏｒ  １０；５０／４０／１０（ＸＶＩＶＯ／ＨＡＢＳ／ＤＭＳＯ）；Ｃｒｙｏｓｔｏｒ  １０；２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、または１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７．５％ＤＭＳＯ、もしくは３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン、および７．５％ＤＭＳＯを含有する培養培地、または、例えばＨｅｓｐａｎおよびＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａを含有する他の適切な細胞凍結培地中で凍結させることができる。次いで、細胞を、速度制御冷凍装置において毎分１℃の速度で約−８０℃〜約−１３５℃の温度まで凍結させ、液体窒素貯蔵タンクの気相内で保管する。制御凍結の他の例示的な方法、ならびに、すぐに−２０℃にするまたは液体窒素中での非制御凍結も使用することができる。
【０１７３】
凍結保存後、細胞を３７℃のウォーターバス中で解凍し、適切な細胞培養培地または緩衝液、例えば、ＴＣＧＭで洗浄する。解凍した細胞は、その後、本明細書において意図されている製造方法のためにまたは対象に投与するために使用することができる。本明細書の他の箇所で意図されている通り洗浄ステップを実施することができる。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞を含む細胞の集団を個体から単離し、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるさらなる操作を伴わずに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて活性化し、そして刺激して、増殖させる。次いで、そのような細胞を個体に直接再投与することができる。さらなる実施形態では、Ｔ細胞を含む細胞の集団を単離した後、細胞を、工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように遺伝子改変する前にまずｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて活性化し、そして刺激して、増殖させる。この点について、Ｔ細胞は、遺伝子改変する（すなわち、本明細書において意図されている工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように形質導入またはトランスフェクトを行う）前および／またはその後に培養することができる。
【０１７５】
５．培養開始および活性化
十分な治療用量のＴ細胞組成物を達成するために、Ｔ細胞を製造するための既存の方法では、多くの場合、１つまたは複数のラウンドの刺激、活性化および／または増大が行われ、それにより、コンタミネーションの機会がより多く導入され、製造プロセスの費用および時間が増加し、一般に、質の低い細胞療法製品が生じる。
【０１７６】
本明細書において意図されているＴ細胞製造方法は、質の高い治療用製品であるＴ細胞組成物をもたらすことに寄与する単純かつ頑強な培養開始および活性化ステップを含む。一実施形態では、培養開始および活性化は、細胞集団を、細胞培養容器、例えば、細胞培養バッグ、ＧＲＥＸバイオリアクター、ＷＡＶＥバイオリアクターなどに播種し、一次および共刺激Ｔ細胞シグナル伝達経路を通じてＴ細胞を活性化することを含む。細胞組成物を、１つまたは複数の追加的な増殖因子またはサイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ７、および／またはＩＬ−１５、またはそれらの任意の適切な組合せの存在下でさらに培養することができる。
【０１７７】
特定の実施形態では、培養開始は、Ｔ細胞を含む細胞の集団、例えば、ＰＢＭＣを、細胞培養容器に所望の密度、例えば、１種または複数種のサイトカイン、一次刺激リガンド、および共刺激リガンドを含有する適切な細胞培養培地中、１ｍＬ当たり細胞１〜５×１０６個で播種することを含む。別の実施形態では、サイトカイン、刺激リガンド、および共刺激リガンドを後で細胞培養培地中のＰＢＭＣに添加することができる。
【０１７８】
一実施形態では、細胞培養容器は、これらに限定されないが、本明細書の他の箇所で意図されているＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｂａｇ、ＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｂａｇ、ＥＸＰ−Ｐａｋ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｂｉｏ−Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ、ＶｕｅＬｉｆｅ（商標）バッグ、ＫｒｙｏＳｕｒｅ（商標）バッグ、ＫｒｙｏＶｕｅ（商標）バッグ、Ｌｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）バッグ、ＰｅｒｍａＬｉｆｅ（商標）バッグ、Ｘ−Ｆｏｌｄ（商標）バッグ、Ｓｉ−Ｃｕｌｔｕｒｅ（商標）バッグ、およびＶｅｃｔｒａＣｅｌｌ（商標）バッグを含めた細胞培養バッグである。
【０１７９】
特定の実施形態では、細胞培養容器に、合計で約１×１０９個の細胞、約５×１０８個の細胞、約１×１０８個の細胞、約５×１０７個の細胞、約１×１０７個の細胞、約５×１０６個の細胞、または約１×１０６個の細胞、または間に入る任意の量の細胞を播種する。特定の実施形態では、細胞はＰＢＭＣであり、合計で約１×１０８個の細胞を播種する。
【０１８０】
ある特定の実施形態では、細胞集団、例えば、ＰＢＭＣを、細胞培養容器に、１ｍＬ当たり細胞約１×１０７個、１ｍＬ当たり細胞約９×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約８×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約７×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約６×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約４×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約３×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約２×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約１×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約９×１０５個、１ｍＬ当たり細胞約８×１０５個、１ｍＬ当たり細胞約７×１０５個、１ｍＬ当たり細胞約６×１０５個、１ｍＬ当たり細胞約５×１０５個、１ｍＬ当たり細胞約４×１０５個、１ｍＬ当たり細胞約３×１０５個、１ｍＬ当たり細胞約２×１０５個、または１ｍＬ当たり細胞約１×１０５個の密度、または間に入る任意の細胞密度で播種する。特定の実施形態では、ＰＢＭＣを１ｍＬ当たり細胞約１×１０６個の密度で播種する。
【０１８１】
特定の実施形態では、細胞を適切な細胞培養培地を含む細胞培養容器中に播種する。適切な細胞培養培地の実例としては、これらに限定されないが、Ｔ細胞成長培地（ＴＣＧＭ；２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−Ｉ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、および５％ヒトＡＢ血清を補充したＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５）、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ＳＦＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣＴＳ（商標）ＡＩＭ  Ｖ（登録商標）Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｃｌｉｃｋｓ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５（Ｌｏｎｚａ）、ＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）、ならびに、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンを添加し、無血清であるかまたは適量の血清（または血漿）もしくはホルモンの定義済みのセット、ならびに／もしくはＴ細胞の成長および増大のために十分な量のサイトカイン（複数可）を補充したＸ−Ｖｉｖｏ２０（Ｌｏｎｚａ）が挙げられる。特定の実施形態では、細胞培養培地はＴＣＧＭである。
【０１８２】
本明細書において意図されている細胞培養培地は、これらに限定されないが、血清（例えば、ウシ胎仔またはヒト血清）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβ、およびＴＮＦ−αを含めた１つまたは複数の因子をさらに含んでよい。
【０１８３】
一実施形態では、細胞培養培地は、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、および／またはＩＬ−１５、またはそれらの任意の適切な組合せなどの１種または複数種のサイトカインを含んでよい。各サイトカインの適切な濃度またはサイトカインの総濃度の実例としては、約２５ＩＵ／ｍＬ、約５０ＩＵ／ｍＬ、約７５ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１２５ＩＵ／ｍＬ、約１５０ＩＵ／ｍＬ、約１７５ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ、約２５０ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ、約３５０ＩＵ／ｍＬ、約４００ＩＵ／ｍＬ、約４５０ＩＵ／ｍＬ、または約５００ＩＵ／ｍＬまたはその間に入る任意のサイトカインの量が挙げられる。特定の実施形態では、細胞培養培地は、それぞれまたは合計で約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、ＩＬ−１、および／またはＩＬ−１５、またはそれらの任意の組合せを含む。
【０１８４】
特定の実施形態では、細胞培養培地は、それぞれまたは合計で約２５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、ＩＬ−１、および／またはＩＬ−１５、またはそれらの任意の組合せを含む。
【０１８５】
特定の実施形態では、ＰＢＭＣまたは単離されたＴ細胞を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体などの１種または複数種の刺激剤および共刺激剤、ならびにＩＬ−２、ＩＬ−７、および／またはＩＬ−１５などの１種または複数種のサイトカインと接触させる。
【０１８６】
Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＤ２表面タンパク質の刺激を介して一次刺激シグナルをもたらすことによって、およびアクセサリー分子、例えば、ＣＤ２８または４−１ＢＢＬを通じて二次共刺激シグナルをもたらすことによって達成することができる。
【０１８７】
ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、Ｔ細胞を適切なＣＤ３結合性作用物質、例えば、ＣＤ３リガンドまたは抗ＣＤ３モノクローナル抗体と接触させることによって刺激することができる。ＣＤ３抗体の実例としては、これらに限定されないが、ＯＫＴ３、Ｇ１９−４、ＢＣ３、および６４．１が挙げられる。上記の抗体のいずれかと同じエピトープに結合する他の抗体も使用することができる。追加的な抗体、または抗体の組合せは、本明細書の他の箇所で開示されている標準の技法によって調製および同定することができる。一実施形態では、抗ＣＤ３抗体はＯＫＴ３である。
【０１８８】
別の実施形態では、ＣＤ２結合性作用物質を使用して一次刺激シグナルをＴ細胞にもたらすことができる。ＣＤ２結合性作用物質の実例としては、これらに限定されないが、ＣＤ２リガンドおよび抗ＣＤ２抗体、例えば、Ｔ１１．１またはＴ１１．２抗体と組み合わせたＴ１１．３抗体（Ｍｅｕｅｒ，  Ｓ．  Ｃ．ら（１９８４年）Ｃｅｌｌ  ３６巻：８９７〜９０６頁）、および９−１抗体と組み合わせた９．６抗体（Ｔ１１．１と同じエピトープを認識する）（Ｙａｎｇ，  Ｓ．  Ｙ．ら（１９８６年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１３７巻：１０９７〜１１００頁）が挙げられる。
【０１８９】
Ｔ細胞応答の誘導には、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を通じてまたはＣＤ２を介してもたらされる一次刺激シグナルに加えて、第２の共刺激シグナルが必要である。特定の実施形態では、ＣＤ２８結合性作用物質を使用して共刺激シグナルをもたらすことができる。適切な共刺激リガンドとしては、これらに限定されないが、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、Ｔｏｌｌリガンド受容体と結合するアゴニストまたは抗体、およびＢ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンドが挙げられる。
【０１９０】
特定の実施形態では、共刺激リガンドは、これらに限定されないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、１ＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを含めたＴ細胞上に存在する共刺激分子に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含む。
【０１９１】
ＣＤ２８結合性作用物質の実例としては、これらに限定されないが、天然ＣＤ２８リガンド、例えば、ＣＤ２８の天然リガンド（例えば、Ｂ７ファミリーのタンパク質のメンバー、例えば、Ｂ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）など；ならびにＣＤ２８分子と架橋結合することが可能な抗ＣＤ２８モノクローナル抗体またはその断片、例えば、モノクローナル抗体９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８、ＫＯＬＴ−２、１５Ｅ８、２４８．２３．２、およびＥＸ５．３Ｄ１０が挙げられる。一実施形態では、抗ＣＤ２８抗体は１５Ｅ８である。
【０１９２】
一実施形態では、一次刺激シグナルをもたらす分子、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＤ２を通じて刺激をもたらす分子と共刺激分子を同じ表面にカップリングさせる。
【０１９３】
ある特定の実施形態では、刺激シグナルをもたらす結合性作用物質と共刺激シグナルをもたらす結合性作用物質は細胞の表面に局在している。これは、細胞に、細胞表面上に発現するのに適した形態の結合性作用物質をコードする核酸をトランスフェクトまたは形質導入することによって、あるいは、結合性作用物質を細胞表面にカップリングさせることによって達成することができる。
【０１９４】
別の実施形態では、一次刺激シグナルをもたらす分子、例えばＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＤ２を通じて刺激をもたらす分子と共刺激分子を抗原提示細胞上にディスプレイさせる。
【０１９５】
一実施形態では、一次刺激シグナルをもたらす分子、例えばＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＤ２を通じて刺激をもたらす分子と共刺激分子を別々の表面上にもたらす。
【０１９６】
ある特定の実施形態では、刺激シグナルをもたらす結合性作用物質と共刺激シグナルをもたらす結合性作用物質の一方は可溶性であり（溶液中にもたらされる）、他の薬剤（複数可）は１つまたは複数の表面上にもたらされる。
【０１９７】
特定の実施形態では、刺激シグナルをもたらす結合性作用物質と共刺激シグナルをもたらす結合性作用物質はどちらも可溶性の形態でもたらされる（溶液中にもたらされる）。
【０１９８】
種々の実施形態では、本明細書において意図されているＴ細胞を製造するための方法は、Ｔ細胞を可溶性抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体と接触させることによってＴ細胞を活性化するステップを含む。
【０１９９】
特定の実施形態では、Ｔ細胞を活性化するための細胞培養培地は、約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、または約２００ｎｇ／ｍＬの濃度、または間に入る任意の濃度の抗ＣＤ３抗体またはＣＤ３結合性作用物質を含む。
【０２００】
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞を活性化するための細胞培養培地は、約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、または約２００ｎｇ／ｍＬの濃度、または間に入る任意の濃度の抗ＣＤ２８抗体またはＣＤ２８結合性作用物質を含む。
【０２０１】
種々の実施形態では、Ｔ細胞を活性化するための細胞培養培地は、約５０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体および５０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８抗体を含む。
【０２０２】
細胞培養容器中に播種した細胞の集団を、少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１３時間、少なくとも１４時間、少なくとも１５時間、少なくとも１６時間、少なくとも１７時間、少なくとも１８時間、少なくとも１９時間、少なくとも２０時間、少なくとも２１時間、少なくとも２２時間、少なくとも２３時間、または少なくとも２４時間、または間に入る任意の時間の長さにわたって活性化する。
【０２０３】
ある特定の実施形態では、細胞の採取、単離、および洗浄、細胞培養の開始、ならびにＴ細胞の活性化を全て約１８時間〜約３６時間の期間内、または約２４時間の期間内、またはその間に入る任意の時間の長さの内に行う。
【０２０４】
６．形質導入
本明細書において意図されているＴ細胞製造方法は、免疫エフェクター細胞および／またはＴ細胞を、工学的に作製されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変するステップを含む。特定の実施形態では、Ｔ細胞を含む細胞の集団を活性化し、工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように改変し、次いで、増大させるために培養する。ステップは、同じ細胞培養容器中で行うこともでき、異なる容器中で行うこともできる。「形質導入」とは、遺伝子（複数可）または他のポリヌクレオチド配列、例えば、工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを、Ｔ細胞を含めた免疫エフェクター細胞に、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを使用してウイルス感染によって送達することを指す。一実施形態では、レトロウイルスベクターを、感染およびプロウイルスの組み込みによって細胞に形質導入する。ある特定の実施形態では、標的細胞、例えば、ＰＢＭＣまたはＴ細胞は、ウイルスまたはレトロウイルスベクターを使用した感染によって細胞に送達された遺伝子または他のポリヌクレオチド配列を含む場合、「形質導入」されている。特定の実施形態では、形質導入された細胞は、細胞のゲノム内に、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターによって送達された１つまたは複数の遺伝子または他のポリヌクレオチド配列を含む。
【０２０５】
感染性ウイルス粒子およびウイルスストック溶液の作製は、従来の技法を使用して行うことができる。ウイルスストック溶液を調製する方法は当技術分野で公知であり、例えば、Ｙ．  Ｓｏｎｅｏｋａら（１９９５年）Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２３巻：６２８〜６３３頁およびＮ．  Ｒ．  Ｌａｎｄａｕら（１９９２年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．
６６巻：５１１０〜５１１３頁によって例示されている。力価が数百万の１ミリリットル当たりの形質導入単位（ＴＵ／ｍＬ）である組換えウイルスを公知の技法によって生成することができる。超遠心後に、約１０８ＴＵ／ｍＬ、１０９ＴＵ／ｍＬ、１０１０ＴＵ／ｍＬ、１０１１ＴＵ／ｍＬ、または１０１２ＴＵ／ｍＬ、または間に入る任意の力価の濃縮されたストックを得ることができる。
【０２０６】
ウイルスは、ウイルス力価（ＴＵ／ｍＬ）に応じて送達することができ、ウイルス力価は、例えば、ｐ２４ウイルスコートタンパク質に対するＥＬＩＳＡである市販のｐ２４力価アッセイを使用することによって測定することができる。次式を使用してｐ２４のｐｇ／ｍＬを算出することができる：レンチウイルス物理的粒子（ＰＰ）当たりおよそ２０００分子のｐ２４が存在する：（２×１０３）×（ＰＰ当たり２４×１０３Ｄａのｐ２４）、４８×１０６／アボガドロ＝（４８×１０６）Ｉ（６×１０２３）＝ＰＰ当たり８×１０−１７ｇのｐ２４、１×１０−１６ｇのｐ２４当たりおよそ１ＰＰ、１ｐｇのｐ２４当たり１×１０４ＰＰ。合理的に首尾よくパッケージングされた、ＶＳＶ−Ｇシュードタイピングされたレンチウイルスベクターは、１０００物理的粒子（ＰＰ）当たり１ＴＵ〜１００ＰＰ当たり１ＴＵ（またはそれ未満）の範囲の感染指数を有する。したがって、範囲は、およそ１０〜１００ＴＵ／ｐｇのｐ２４である。この変換でＴＵ／ｍＬが得られる。
【０２０７】
感染力価は、形質導入されたヒト骨肉腫（ＨＯＳ）細胞の分析によって決定することもできる（Ｋｕｔｎｅｒら、２００９年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ４巻：４９５〜５０５頁）。簡単に述べると、形質導入されたＨＯＳ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭ中で７日間培養し、その後、ゲノムＤＮＡをＤＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖｅｎｌｏ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、Ｃａｔ番号６９５０６）によって抽出し、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって評価する。ｑＰＣＲプロトコールのプライマー／プローブセットにより、内因性ヒトＲＮａｓｅＰコピーの数当たりのレンチウイルスｐｓｉ−ｇａｇ領域コピーの数を決定することによって、形質導入された細胞のベクターコピー数（ＶＣＮ）を測定する。個々のプロウイルス挿入について配列決定することによりプロウイルスの完全性を評価した。
【０２０８】
一実施形態では、ＨＯＳ細胞株アッセイを使用してウイルス力価を決定する。
【０２０９】
特定の実施形態では、活性化Ｔ細胞を含む細胞の集団に、細胞培養容器中で、ほぼ活性化時、活性化の約１時間後、活性化の約２時間後、活性化の約３時間後、活性化の約４時間後、活性化の約５時間後、活性化の約６時間後、活性化の約７時間後、活性化の約８時間後、活性化の約９時間後、活性化の約１０時間後、活性化の約１１時間後、活性化の約１２時間後、活性化の約１３時間後、活性化の約１４時間後、活性化の約１５時間後、活性化の約１６時間後、活性化の約１７時間後、活性化の約１８時間後、活性化の約１９時間後、活性化の約２０時間後、活性化の約２１時間後、活性化の約２２時間後、活性化の約２３時間後、活性化の約２４時間後、活性化の約２５時間後、活性化の約２６時間後、活性化の約２７時間後、活性化の約２８時間後、活性化の約２９時間後、または活性化の約３０時間後または間の任意の活性化後の期間に形質導入を行う。
【０２１０】
一実施形態では、細胞の集団に、活性化の約２０〜約２４時間後に形質導入を行う。
【０２１１】
本明細書において意図されている製造方法は、活性化Ｔ細胞を含むＰＢＭＣに、細胞培養容器中で、ＰＢＭＣ１０８個当たり約１×１０８〜約１×１０１０ＴＵ、ＰＢＭＣ１０８個当たり約５×１０８〜約５×１０９ＴＵ、ＰＢＭＣ１０８個当たり約１×１０９〜約５×１０９ＴＵ、ＰＢＭＣ１０８個当たり約１×１０９〜約４×１０９ＴＵ、ＰＢＭＣ１０８個当たり約１×１０９〜約３×１０９ＴＵ、ＰＢＭＣ１０８個当たり約１×１０９〜約２×１０９ＴＵ、またはその間に入る任意のＴＵのベクターを用いて形質導入を行うステップを含む。
【０２１２】
一実施形態では、本明細書において意図されている製造方法は、活性化Ｔ細胞を含むＰＢＭＣに、細胞培養容器中で、ＰＢＭＣ１０８個当たり約１×１０８ＴＵ、ＰＢＭＣ１０８個当たり約５×１０８ＴＵ、ＰＢＭＣ１０８個当たり約６×１０８ＴＵ、ＰＢＭＣ１０８個当たり約７×１０８ＴＵ、ＰＢＭＣ１０８個当たり約８×１０８ＴＵ、ＰＢＭＣ１０８個当たり約９×１０８ＴＵ、ＰＢＭＣ１０８個当たり約１×１０９ＴＵ、ＰＢＭＣ１０８個当たり約２×１０９ＴＵ、ＰＢＭＣ１０８個当たり約３×１０９ＴＵ、ＰＢＭＣ１０８個当たり約４×１０９ＴＵ、ＰＢＭＣ１０８個当たり約５×１０９ＴＵ、ＰＢＭＣ１０８個当たり約６×１０９ＴＵ、ＰＢＭＣ１０８個当たり約７×１０９ＴＵ、ＰＢＭＣ１０８個当たり約８×１０９ＴＵ、ＰＢＭＣ１０８個当たり約９×１０９ＴＵ、またはＰＢＭＣ１０８個当たり約１×１０１０ＴＵ、または間に入る任意のＴＵのベクターを用いて形質導入を行うステップを含む。
【０２１３】
特定の実施形態では、細胞に、ＰＢＭＣ１０８個当たり約１×１０７〜約２×１０９ＴＵのベクターを用いて形質導入を行う。
【０２１４】
一実施形態では、本明細書において意図されている製造方法は、活性化Ｔ細胞を含むＰＢＭＣに、細胞培養容器中で、ベクターを約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００、または間に入る任意の整数のＭＯＩで用いて形質導入を行うステップを含む。一実施形態では、ＰＢＭＣに、ベクターを約２０のＭＯＩで用いて形質導入を行う。
【０２１５】
ある特定の実施形態では、ベクターを、細胞培養培地中、最大で細胞培養体積の約１０％、細胞培養体積の約１５％、細胞培養体積の約１６％、細胞培養体積の約１７％、細胞培養体積の約１８％、細胞培養体積の約１９％、細胞培養体積の約２０％、細胞培養体積の約２１％、細胞培養体積の約２２％、細胞培養体積の約２３％、細胞培養体積の約２４％、細胞培養体積の約２５％、細胞培養体積の約３０％、細胞培養体積の約３５％、細胞培養体積の約４０％、細胞培養体積の約４５％、または細胞培養体積の約５０％、またはその間に入る任意のパーセントに希釈することができる。
【０２１６】
特定の実施形態では、ベクターを、細胞培養培地、例えば、ＴＣＧＭ中、最大で細胞培養体積の約２０％に希釈する。
【０２１７】
細胞培養容器中に播種した細胞の集団への形質導入を、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、約４８時間、約５４時間、または約６０時間、または間に入る任意の時間の長さにわたって行う。
【０２１８】
特定の実施形態では、細胞への形質導入を約４８時間にわたって行う。
【０２１９】
細胞への形質導入を行った後、細胞を、本明細書において意図されている１回または複数回の洗浄ステップに供し、その後、増大させるために適切な細胞培養容器中に播種することができる。
【０２２０】
７．増大
本明細書において意図されているＴ細胞製造プラットフォームは、１つまたは複数のラウンドのＴ細胞増大を含んでよい。特定の実施形態では、活性化され、かつ／または形質導入されたＴ細胞を含む細胞の集団を、増大に適した細胞培養培地を含む適切な細胞培養容器中に播種する。特定の実施形態では、細胞をバイオリアクター中に播種し、再播種を伴わずに定期的に採取する。
【０２２１】
ある特定の実施形態では、細胞を、細胞の対数期成長が維持される密度で再播種する。
【０２２２】
特定の実施形態では、細胞を、細胞培養物中に、細胞が対数期成長に留まる限りは、１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０６〜約１×１０７個、１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０６〜約０．９×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０６〜約０．８×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０６〜約０．７×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０６〜約０．６×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０６〜約０．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約０．２×１０６〜約０．５×１０６個、または１ｍＬ当たり細胞約０．３×１０６〜約０．５×１０６個の密度、または間に入る任意の細胞の密度で播種する。
【０２２３】
ある特定の実施形態では、細胞を、細胞培養物中に、細胞が対数期成長に留まる限りは、１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約０．２×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約０．３×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約０．４×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約０．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約０．６×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約０．７×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約０．８×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約０．９×１０６個、または１ｍＬ当たり細胞約１×１０７個の密度、または間に入る任意の細胞の密度で播種する。
【０２２４】
一部の実施形態では、細胞を、バイオリアクター、例えば、ＷＡＶＥバイオリアクター中に、細胞が対数期成長に留まる限りは、１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約０．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約１×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約２×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約３×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約４×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約６×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約７×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約８×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約９×１０６個、または１ｍＬ当たり細胞約１×１０７個の密度または間に入る任意の細胞の密度で播種する。
【０２２５】
特定の実施形態では、Ｔ細胞増大のための適切な細胞培養培地を含む細胞培養容器中に細胞を播種する。Ｔ細胞増大のための適切な細胞培養培地の実例としては、これらに限定されないが、Ｔ細胞成長培地（ＴＣＧＭ）、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ
Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ＳＦＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣＴＳ（商標）ＡＩＭ  Ｖ（登録商標）Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｃｌｉｃｋｓ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５（Ｌｏｎｚａ）、およびＸ−Ｖｉｖｏ２０（Ｌｏｎｚａ）ならびに／またはＴ細胞の成長および増大のために十分な追加的なホルモン、増殖因子、もしくはサイトカイン（複数可）が挙げられる。特定の実施形態では、細胞培養培地はＴＣＧＭである。ある特定の実施形態では、細胞培養培地は、これらに限定されないが、血清（例えば、ウシ胎仔またはヒト血清）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβ、およびＴＮＦ−α、またはそれらの任意の組合せを含めた、１つまたは複数の因子をさらに含む。
【０２２６】
一実施形態では、細胞培養培地は、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、および／またはＩＬ−１５、またはそれらの任意の適切な組合せなどの１種または複数種のサイトカインを含んでよい。各サイトカインの適切な濃度またはサイトカインの総濃度の実例としては、約２５ＩＵ／ｍＬ、約５０ＩＵ／ｍＬ、約７５ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１２５ＩＵ／ｍＬ、約１５０ＩＵ／ｍＬ、約１７５ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ、約２５０ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ、約３５０ＩＵ／ｍＬ、約４００ＩＵ／ｍＬ、約４５０ＩＵ／ｍＬ、または約５００ＩＵ／ｍＬまたはその間に入る任意のサイトカインの量が挙げられる。特定の実施形態では、細胞培養培地は、それぞれまたは合計で約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、ＩＬ−１、および／またはＩＬ−１５、またはそれらの任意の組合せを含む。
【０２２７】
特定の実施形態では、細胞培養培地は、それぞれまたは合計で約２５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、ＩＬ−１、および／またはＩＬ−１５、またはそれらの任意の組合せを含む。
【０２２８】
特定の実施形態では、本明細書において意図されているＴ細胞製造方法は、Ｔ細胞を、約３日〜約１４日、約３日〜約１３日、約３日〜約１２日、約３日〜約１１日、約３日〜約１０日、約３日〜約９日、約３日〜約８日、または約３〜約７日、または約５〜約８日または間に入る任意の日数にわたって増大させるステップを含む。ある特定の実施形態では、本明細書において意図されているＴ細胞製造方法は、Ｔ細胞を、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、または約１２日にわたって増大させるステップを含む。増大は、増大期間全体にわたって同じ容器および／または同じ型の容器中で実施することもでき、増大期間にわたって異なる容器および／または異なる型の容器中で実施することもできる。
【０２２９】
一実施形態では、Ｔ細胞増大を、細胞培養バッグ中で約５日〜約８日にわたって実施する。
【０２３０】
一実施形態では、Ｔ細胞増大を、細胞培養バッグ中で約５日〜約８日にわたって実施し、次いで、これらに限定されないが、ＷＡＶＥまたはＧ−ＲＥＸバイオリアクターを含めたバイオリアクター中で増大を継続する。特定の実施形態では、増大を、バイオリアクター中で約１日、約２日、約３日、約４日、または約５日またはそれ超にわたって継続することができる。
【０２３１】
別の実施形態では、Ｔ細胞増大を、これらに限定されないが、ＷＡＶＥバイオリアクターまたはＧ−ＲＥＸバイオリアクターを含めたバイオリアクター中で約５日〜約８日にわたって実施する。
【０２３２】
ＷＡＶＥバイオリアクターにより、揺動の速度の変動および種々の異なる揺動角度が可能になる。例示的な揺動速度としては、これらに限定されないが、毎分１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０回の揺れが挙げられる。ある特定の実施形態では、本発明の刺激および増大の方法では、揺動プラットフォームの角度が１．５°、２°、２．５°、３°、３．５°、４°、４．５°、５°、５．５°、６°、６．５°、７°、７．５°、８°、８．５°、または９．０°に設定される。
【０２３３】
一実施形態では、ＷＡＶＥバイオリアクターの体積は２５００ｍＬであり、揺動速度は約６または約７ｒｐｍであり、角度は約７から約８の間である。
【０２３４】
一実施形態では、細胞を最初に約１００ｍＬでＧＲＥＸバイオリアクター中に播種し、３日目、４日目、および５日目に新鮮な成長培地約２００ｍＬを培養物に添加する。ある特定の実施形態では、７日目に追加的な培地をＧＲＥＸバイオリアクターに添加して培養体積を約１Ｌにする。
【０２３５】
細胞計数および生存率を毎日または任意の日数で確認し、細胞もしくは細胞の一部を凍結保存することができ、かつ／または、細胞を、マーカー発現、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、ＣＤ１９７およびＨＬＡ−ＤＲ、導入遺伝子についてＦＡＣＳ分析によって特徴付けることができる。
【０２３６】
一実施形態では、本明細書において意図されている製造方法に供されるＴ細胞の集団は、出発Ｔ細胞集団と比較して少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍、または少なくとも１０００倍、またはそれ超増大する。
【０２３７】
８．製造されたＴ細胞組成物の回収
特定の実施形態では、本明細書において意図されているＴ細胞を製造するための方法は、半自動フロースルー遠心分離機、例えば、Ｃｏｂｅ  ２９９１  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  ５、Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅ、ＬＯＶＯなどを使用して、増大させた細胞を採取および洗浄することを含む、製造されたＴ細胞組成物を回収するステップを含む。
【０２３８】
増大させた細胞を採取する前に、採取前試料のアリコートを取得して、細胞計数、生存率、細胞の特徴付け、例えば、ＦＡＣＳ分析、純度、および／または細胞に関する他の一般的な放出基準を確立することができる。さらに、採取後試料のアリコートを取得して、細胞計数および／または生存率を確立することができる。
【０２３９】
次いで、回収されたＴ細胞組成物を１つまたは複数のＩＶバッグまたは他の適切な容器、例えば、ＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｂａｇ、ＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｂａｇ、ＥＸＰ−Ｐａｋ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｂｉｏ−Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ、ＶｕｅＬｉｆｅ（商標）バッグ、ＫｒｙｏＳｕｒｅ（商標）バッグ、ＫｒｙｏＶｕｅ（商標）バッグ、Ｌｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）バッグ、ＰｅｒｍａＬｉｆｅ（商標）バッグ、Ｘ−Ｆｏｌｄ（商標）バッグ、Ｓｉ−Ｃｕｌｔｕｒｅ（商標）バッグ、Ｏｒｉｇｅｎ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｃｒｙｏｂａｇおよびＶｅｃｔｒａＣｅｌｌ（商標）バッグに移し、細胞を使用する準備ができるまで、上および本明細書の他の箇所で論じられている通り速度制御冷凍装置内で凍結保存する。特定の実施形態では、細胞を５０％ｐｌａｓｍａｌｙｔｅおよび５０％Ｃｒｙｏｓｔｏｒ  １０；５０／４０／１０（ＸＶＩＶＯ／ＨＡＢＳ／ＤＭＳＯ）；またはＣｒｙｏｓｔｏｒ  １０中で凍結させる。
【０２４０】
治療用Ｔ細胞組成物を含有するバッグ（容量１０〜２５０ｍＬ）を血液バンク条件で、−８０℃〜−１３５℃でモニターして保管する。注入バッグを必要になるまで冷凍装置内で保管する。
【０２４１】
Ｄ．工学的に作製されたＴ細胞受容体およびキメラ抗原受容体
意図されているＴ細胞製造方法は、高親和性Ｔ細胞受容体（工学的に作製されたＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変されたＴ細胞を、信頼でき、再現性のある様式で増大させるために特に有用である。一実施形態では、Ｔ細胞を、１つまたは複数の工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように遺伝子改変する。本明細書で使用される場合、本明細書において意図されている工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞は、「抗原特異的な向け直されたＴ細胞」と称することができる。
【０２４２】
１．工学的に作製されたＴＣＲ
天然に存在するＴ細胞受容体は、α−サブユニットとβ−サブユニットの２つのサブユニットを含み、そのそれぞれが、各Ｔ細胞のゲノムにおける組換え事象によって生じる独特のタンパク質である。ＴＣＲのライブラリーを、特定の標的抗原に対するそれらの選択性についてスクリーニングすることができる。このように、標的抗原に対して高いアビディティおよび反応性を有する天然ＴＣＲを選択し、クローニングし、その後、養子免疫療法のために使用するＴ細胞の集団に導入することができる。
【０２４３】
一実施形態では、Ｔ細胞を、標的抗原を発現する腫瘍細胞に対する特異性をＴ細胞に付与するＴＣＲを形成する能力を有するＴＣＲのサブユニットをコードするポリヌクレオチドを導入することによって改変する。特定の実施形態では、サブユニットが、トランスフェクトされると、標的細胞に向かい、免疫学的に関連するサイトカインシグナル伝達に関与する能力をＴ細胞に付与するＴＣＲを形成する能力を保持する限り、サブユニットは天然に存在するサブユニットと比較して１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または改変を有する。工学的に作製されたＴＣＲは、関連性のある腫瘍関連ペプチドをディスプレイする標的細胞にも高いアビディティで結合することが好ましく、場合によって、関連性のあるペプチドを提示する標的細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの効率的な死滅を媒介する。
【０２４４】
工学的に作製されたＴＣＲをコードする核酸は、Ｔ細胞の（天然に存在する）染色体におけるそれらの天然の状況から単離されていることが好ましく、本明細書の他の箇所に記載の適切なベクターに組み入れることができる。核酸とそれらを含むベクターはどちらも有益に細胞に移入することができ、その細胞はＴ細胞であることが好ましい。次いで、改変Ｔ細胞は、形質導入された１つまたは複数の核酸によりコードされるＴＣＲの両方の鎖を発現することができる。好ましい実施形態では、工学的に作製されたＴＣＲは、通常は特定のＴＣＲを発現しないＴ細胞に導入されるので、外因性ＴＣＲである。工学的に作製されたＴＣＲの本質的な側面は、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）または同様の免疫学的構成成分によって提示される腫瘍抗原に対する高いアビディティを有することである。工学的に作製されたＴＣＲとは対照的に、ＣＡＲは、標的抗原にＭＨＣ非依存的に結合するように工学的に作製される。
【０２４５】
本発明の核酸によりコードされるタンパク質は、本発明のＴＣＲのα−鎖またはβ−鎖のアミノ末端またはカルボキシル末端部分に付着させた追加的なポリペプチドと、当該付着させた追加的なポリペプチドがα−鎖またはβ−鎖の機能的なＴ細胞受容体を形成する能力およびＭＨＣ依存性抗原認識に干渉しない限りは、共に発現させることができる。
【０２４６】
本明細書において意図されている工学的に作製されたＴＣＲによって認識される抗原としては、これに限定されないが、血液学的がんと固形腫瘍のどちらの抗原も含めた、がん抗原が挙げられる。例示的な抗原としては、これらに限定されないが、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、’グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、およびＶＥＧＦＲ２が挙げられる。
【０２４７】
２．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本明細書において意図されているＴ細胞製造方法は、Ｔ細胞を、本明細書において意図されている１つまたは複数のＣＡＲを発現するように改変するステップを含む。種々の実施形態では、本発明は、腫瘍細胞に対する細胞傷害性を向け直すＣＡＲを発現するように設計されたベクターを用いて遺伝子工学的に作製されたＴ細胞を提供する。ＣＡＲは、標的抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する抗体に基づく特異性とＴ細胞受容体活性化細胞内ドメインを組み合わせて、特異的な抗腫瘍細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生成する分子である。本明細書で使用される場合、「キメラ」という用語は、異なる起源由来の異なるタンパク質またはＤＮＡの部分で構成されていることを記載するものである。
【０２４８】
本明細書において意図されているＣＡＲは、特異的な標的抗原に結合する細胞外ドメイン（結合性ドメインまたは抗原特異的結合性ドメインとも称される）、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲの主要な特性は、免疫エフェクター細胞特異性を向け直し、それにより、増殖、サイトカイン産生、食作用またはモノクローナル抗体、可溶性リガンドもしくは細胞特異的共受容体の細胞特異的標的化能力を活用して標的抗原発現細胞の細胞死を主要組織適合性（ＭＨＣ）非依存的に媒介することが可能な分子の産生を誘発する能力である。
【０２４９】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、これらに限定されないが、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）である標的抗原に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合性断片、テザーリガンド（ｔｅｔｈｅｒｅｄ  ｌｉｇａｎｄ）、または共受容体の細胞外ドメインを含めた、細胞外結合性ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＴＡＡまたはＴＳＡは血液がん細胞上に発現する。別の実施形態では、ＴＡＡまたはＴＳＡは固形腫瘍の細胞上に発現する。特定の実施形態では、固形腫瘍は、神経膠芽腫、非小細胞肺がん、非小細胞肺がん以外の肺がん、乳がん、前立腺がん、膵がん、肝臓がん、結腸がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、脾臓のがん、皮膚がん、神経膠芽腫以外の脳がん、腎臓がん、甲状腺がんなどである。
【０２５０】
特定の実施形態では、ＴＡＡまたはＴＳＡは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、’グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、およびＶＥＧＦＲ２からなる群より選択される。
【０２５１】
ａ．結合性ドメイン
特定の実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲは、腫瘍細胞上に発現される、標的ポリペプチド、例えば、標的抗原に特異的に結合する細胞外結合性ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「結合性ドメイン」、「細胞外ドメイン」、「細胞外結合性ドメイン」、「抗原特異的結合性ドメイン」、および「細胞外抗原特異的結合性ドメイン」という用語は、互換的に使用され、目的の標的抗原に特異的に結合する能力を有するＣＡＲを提供する。結合性ドメインは、生体分子（例えば、細胞表面受容体または腫瘍タンパク質、脂質、多糖、または他の細胞表面標的分子、またはその構成成分）を特異的に認識し、それに結合する能力を有する任意のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、またはペプチドを含み得る。結合性ドメインは、任意の天然に存在する、合成の、半合成の、または組換えによって作製された、目的の生体分子の結合パートナーを含む。
【０２５２】
特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外結合性ドメインは、抗体またはその抗原結合性断片を含む。「抗体」とは、免疫細胞によって認識されるものなどの抗原決定基を含有するペプチド、脂質、多糖、または核酸などの標的抗原のエピトープを特異的に認識し、それに結合する、少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドである結合性作用物質を指す。抗体はその抗原結合性断片を含む。この用語は、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体など）およびその抗原結合性断片などの遺伝子工学的に作製された形態も含む。Ｐｉｅｒｃｅ
Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９４年〜１９９５年（Ｐｉｅｒｃｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）；Ｋｕｂｙ，  Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９７年も参照されたい。
【０２５３】
特定の実施形態では、標的抗原は、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、’グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、またはＶＥＧＦＲ２ポリペプチドのエピトープである。
【０２５４】
軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも称される３つの超可変領域が間に存在する「フレームワーク」領域を含有する。ＣＤＲは、例えば、Ｋａｂａｔら（Ｗｕ，  ＴＴおよびＫａｂａｔ，  Ｅ．  Ａ．、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  １３２巻（２号）：２１１〜５０頁、（１９７０年）；Ｂｏｒｄｅｎ，  Ｐ．およびＫａｂａｔ  Ｅ．  Ａ．、ＰＮＡＳ、８４巻：２４４０〜２４４３頁（１９８７年）；（これによって参照により組み込まれるＫａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、１９９１年を参照されたい）による配列によって、または、Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｃｈｏｉｔｈｉａ，  Ｃ．およびＬｅｓｋ，  Ａ．Ｍ．、Ｊ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１９６巻（４号）：９０１〜９１７頁（１９８７年）、Ｃｈｏｉｔｈｉａ、Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３４２巻：８７７〜８８３頁（１９８９年））による構造によってなど、従来の方法によって定義または同定することができる。
【０２５５】
異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、ヒトなどの種の中で比較的保存されている。構成要素である軽鎖および重鎖の組み合わせたフレームワーク領域である抗体のフレームワーク領域はＣＤＲを３次元空間内に位置付け、整列させるのに役立つ。ＣＤＲは、主に、抗原のエピトープへの結合に関与する。各鎖のＣＤＲは、一般には、Ｎ末端から開始して逐次的に番号が付され、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と称され、また、一般には、特定のＣＤＲが位置する鎖によって同定される。したがって、抗体の重鎖の可変ドメインに位置するＣＤＲはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３と称され、抗体の軽鎖の可変ドメインに位置するＣＤＲはＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３と称される。異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対する異なる結合部位）を有する抗体は異なるＣＤＲを有する。ＣＤＲは抗体間で変動するが、抗原結合に直接関与するのはＣＤＲ内の限られた数のアミノ酸位置である。ＣＤＲ内のこれらの位置は、特異性決定残基（ＳＤＲ）と称される。
【０２５６】
「ＶＨ」または「ＶＨ」への言及は、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、または本明細書に開示されている他の抗体断片のものを含めた、免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。「ＶＬ」または「ＶＬ」への言及は、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、または本明細書に開示されている他の抗体断片のものを含めた、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。
【０２５７】
「モノクローナル抗体」は、Ｂリンパ球の単一のクローンによって、または単一の抗体の軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子がトランスフェクトされた細胞によって産生される抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法によって、例えば、骨髄腫細胞と免疫脾臓細胞の融合によるハイブリッドの抗体形成細胞を作出することにより産生される。モノクローナル抗体はヒト化モノクローナル抗体を含む。
【０２５８】
「キメラ抗体」は、１つの種、例えばヒトなどに由来するフレームワーク残基と、別の種、例えばマウスなどに由来するＣＤＲ（一般に、抗原結合を付与する）を有する。特定の好ましい実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲは、キメラ抗体またはその抗原結合性断片である抗原特異的結合性ドメインを含む。
【０２５９】
ある特定の好ましい実施形態では、抗体は、腫瘍細胞上の表面タンパク質に特異的に結合するヒト化抗体（例えば、ヒト化モノクローナル抗体など）である。「ヒト化」抗体は、ヒトフレームワーク領域と非ヒト（例えば、マウス、ラット、または合成）免疫グロブリン由来の１つまたは複数のＣＤＲとを含む免疫グロブリンである。ヒト化抗体は、遺伝子工学によって構築することができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号を参照されたい）。
【０２６０】
特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外結合性ドメインは、これらに限定されないが、ラクダＩｇ（ラクダ科動物抗体（ＶＨＨ））、Ｉｇ  ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｙ））を含めた、抗体またはその抗原結合性断片を含む。
【０２６１】
「ラクダＩｇ」または「ラクダ科動物ＶＨＨ」とは、本明細書で使用される場合、重鎖抗体の最小の公知の抗原結合単位を指す（Ｋｏｃｈ−Ｎｏｌｔｅら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、２１巻：３４９０〜３４９８頁（２００７年））。「重鎖抗体」または「ラクダ科動物抗体」とは、ＶＨドメインを２つ含有し、軽鎖を含有しない抗体を指す（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ．ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１巻：２５〜３８頁（１９９９年）；ＷＯ９４／０４６７８；ＷＯ９４／２５５９１；米国特許第６，００５，０７９号）。
【０２６２】
「ＩｇＮＡＲ」または「免疫グロブリン新抗原受容体（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ
ｎｅｗ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」とは、１つの可変新抗原受容体（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｎｅｗ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＶＮＡＲ）ドメインおよび５つの定常新抗原受容体（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｎｅｗ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＣＮＡＲ）ドメインのホモ二量体からなるサメ免疫レパートリーに由来する抗体のクラスを指す。
【０２６３】
抗体のパパイン消化により、それぞれが単一の抗原結合性部位を有する、「Ｆａｂ」断片と称される２つの同一の抗原結合性断片と、容易に結晶化できることが名称に反映されている、残りの「Ｆｃ」断片が生じる。Ｆａｂ断片は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含有し、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、Ｆａｂ断片とは、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端において抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステインを含めた数個の残基が付加されていることによって異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書では、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離のチオール基を有するＦａｂ’に対する名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として作製された。抗体断片の他の化学的カップリングも公知である。
【０２６４】
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合性部位を含有する最小の抗体断片である。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインを、柔軟なペプチドリンカーによって共有結合により連結することができ、したがって、軽鎖および重鎖が、二本鎖Ｆｖ種におけるものと類似した「二量体」構造に会合し得る。
【０２６５】
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合性部位を有する抗体断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖内で接続した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）（ＶＨ−ＶＬ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間での対形成が可能になるには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは、強制的に別の鎖の相補的なドメインと対形成し、２つの抗原結合性部位が創出される。ダイアボディは二価または二特異性であってよい。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９巻：１２９〜１３４頁（２００３年）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０巻：６４４４〜６４４８頁（１９９３年）においてより詳細に記載されている。トリアボディおよびテトラボディもＨｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９巻：１２９〜１３４頁（２００３年）に記載されている。
【０２６６】
「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」または「ナノボディ」とは、抗体重鎖の可変領域（ＶＨドメイン）または抗体軽鎖の可変領域（ＶＬドメイン）からなる抗体断片を指す（Ｈｏｌｔ，  Ｌ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１巻（１１号）：４８４〜４９０頁）。
【０２６７】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖内にいずれかの方向で存在する（例えば、ＶＬ−ＶＨまたはＶＨ−ＶＬ）。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それにより、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することが可能になる。ｓｃＦｖの概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｅｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４年）、２６９〜３１５頁を参照されたい。
【０２６８】
ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、’グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、またはＶＥＧＦＲ２ポリペプチドに結合する。
【０２６９】
ｂ．リンカー
ある特定の実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲは、分子の適切な間隔およびコンフォメーションのために付加される、種々のドメイン間、例えば、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にリンカー残基を含んでよい。本明細書において意図されているＣＡＲは、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つまたはそれ超のリンカーを含み得る。特定の実施形態では、リンカーの長さは、約１〜約２５アミノ酸、約５〜約２０アミノ酸、または約１０〜約２０アミノ酸、または間に入る任意のアミノ酸の長さである。一部の実施形態では、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ超のアミノ酸長である。
【０２７０】
リンカーの実例としては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ；グリシン−セリンポリマー（Ｇ１−５Ｓ１−５）ｎ（式中、ｎは、少なくとも１、２、３、４、または５の整数である）；グリシン−アラニンポリマー；アラニン−セリンポリマー；および当技術分野で公知の他の柔軟なリンカーが挙げられる。グリシンおよびグリシン−セリンポリマーは、比較的構造化されておらず、したがって、本明細書に記載のＣＡＲなどの融合タンパク質のドメイン間の中性テザーとして機能することが可能であり得る。グリシンはアラニンに対してさえ、それよりも有意に多くｐｈｉ−ｐｓｉ空間に近づき、また、側鎖が長い残基よりも制限がはるかに少ない（Ｓｃｈｅｒａｇａ、Ｒｅｖ．  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍ．  １１１７３〜１４２頁（１９９２年）を参照されたい）。特定の実施形態では、ＣＡＲの設計には、全体的にまたは部分的に柔軟であるリンカーを含めることができ、したがって、リンカーは、所望のＣＡＲ構造をもたらすために、柔軟なリンカーならびにより柔軟性の低い構造を付与する１つまたは複数の部分を含んでよいことが当業者には認識されよう。
【０２７１】
他の例示的なリンカーとしては、これらに限定されないが、以下のアミノ酸配列：ＧＧＧ；ＤＧＧＧＳ（配列番号１）；ＴＧＥＫＰ（配列番号２）（例えば、Ｌｉｕら、ＰＮＡＳ  ５５２５〜５５３０頁（１９９７年）を参照されたい）；ＧＧＲＲ（配列番号３）（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚら、１９９５年、上記）；（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、＝１、２、３、４または５）（配列番号４）（Ｋｉｍら、ＰＮＡＳ  ９３巻、１１５６〜１１６０頁（１９９６年）；ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号５）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、１９９０年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８７巻：１０６６〜１０７０頁）；ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号６）（Ｂｉｒｄら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２巻：４２３〜４２６頁）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号７）；ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号８）；ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号９）；ＬＲＱＫｄ（ＧＧＧＳ）２ＥＲＰ（配列番号１０）が挙げられる。あるいは、柔軟なリンカーは、ＤＮＡ結合性部位とペプチド自体の両方をモデリングすることが可能なコンピュータプログラムを使用して（ＤｅｓｊａｒｌａｉｓおよびＢｅｒｇ、ＰＮＡＳ
９０巻：２２５６〜２２６０頁（１９９３年）、ＰＮＡＳ  ９１巻：１１０９９〜１１１０３頁（１９９４年）、またはファージディスプレイ法によって合理的に設計することができる。
【０２７２】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、可変領域連結配列をさらに含むｓｃＦＶを含む。「可変領域連結配列」とは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を接続し、２つのサブ結合性ドメインの相互作用に適合するスペーサー機能をもたらすアミノ酸配列であり、したがって、結果生じるポリペプチドは、同じ軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む抗体と同じ標的分子に対する特異的な結合親和性を保持する。一実施形態では、可変領域連結配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ超のアミノ酸長である。特定の実施形態では、可変領域連結配列は、グリシン−セリンポリマー（Ｇ１−５Ｓ１−５）ｎ（式中、ｎは、少なくとも１、２、３、４、または５の整数である）を含む。別の実施形態では、可変領域連結配列は、（Ｇ４Ｓ）３アミノ酸リンカーを含む。
【０２７３】
ｃ．スペーサードメイン
特定の実施形態では、ＣＡＲの結合性ドメインの後ろに、１つまたは複数の「スペーサードメイン」が続き、これは、抗原結合性ドメインをエフェクター細胞表面から離して適切な細胞間接触、抗原結合および活性化を可能にする領域を指す（Ｐａｔｅｌら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９９年；６巻：４１２〜４１９頁）。スペーサードメインは、天然、合成、半合成、または組換え供給源のいずれかに由来するものであってもよい。ある特定の実施形態では、スペーサードメインは、これらに限定されないが、１つまたは複数の重鎖定常領域、例えば、ＣＨ２およびＣＨ３を含めた、免疫グロブリンの部分である。スペーサードメインは、天然に存在する免疫グロブリンヒンジ領域または変更された免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含んでよい。
【０２７４】
一実施形態では、スペーサードメインは、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３を含む。
【０２７５】
ｄ．ヒンジドメイン
ＣＡＲの結合性ドメインの後ろには、一般に、１つまたは複数の「ヒンジドメイン」が続き、これは、抗原結合性ドメインをエフェクター細胞表面から離して位置づけ適切な細胞間接触、抗原結合および活性化を可能にすることにおいて役割を果たす。ＣＡＲは、一般に、結合性ドメインと膜貫通ドメイン（ＴＭ）の間に１つまたは複数のヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、または組換え供給源のいずれかに由来するものであってもよい。ヒンジドメインは、天然に存在する免疫グロブリンヒンジ領域または変更された免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含んでよい。
【０２７６】
本明細書に記載のＣＡＲでの使用に適した例示的なヒンジドメインとしては、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８およびＣＤ７などの１型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域が挙げられ、これは、これらの分子由来の野生型ヒンジ領域であってもよく、変更することもできる。別の実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジ領域を含む。
【０２７７】
ｅ．膜貫通（ＴＭ）ドメイン
「膜貫通ドメイン」は、細胞外結合性部分と細胞内シグナル伝達ドメインを融合し、ＣＡＲを免疫エフェクター細胞の原形質膜に係留する、ＣＡＲの部分である。ＴＭドメインは、天然、合成、半合成、または組換え供給源のいずれかに由来するものであってもよい。
【０２７８】
例示的なＴＭドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、およびＣＤ１５４に由来する（すなわち、少なくともその膜貫通領域（複数可）を含む）ものであってもよい。
【０２７９】
一実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲは、ＣＤ８αに由来するＴＭドメインを含む。別の実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲは、ＣＤ８αに由来するＴＭドメイン、ならびに、ＣＡＲのＴＭドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを連結する、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸の間の長さであることが好ましい短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーを含む。グリシン−セリンリンカーは、特に適切なリンカーをもたらす。
【０２８０】
ｆ．細胞内シグナル伝達ドメイン
特定の実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、標的抗原への有効なＣＡＲ結合のメッセージを免疫エフェクター細胞の内部に伝達して、エフェクター細胞機能、例えば、ＣＡＲと結合した標的細胞への細胞傷害性因子の放出、または細胞外ＣＡＲドメインへの抗原結合に伴って引き出される他の細胞応答を含めた、活性化、サイトカイン産生、増殖および細胞傷害活性を引き出すことに関与するＣＡＲの部分を指す。
【０２８１】
「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含めた補助もしくは活性であり得る。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞を、特殊機能を行うように誘導するタンパク質の部分を指す。通常は、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を使用することができるが、多くの場合、ドメイン全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮された部分を使用する範囲内で、そのような短縮された部分を、エフェクター機能シグナルを伝達する限りは、ドメイン全体の代わりに使用することができる。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮された部分を包含するものとする。
【０２８２】
ＴＣＲ単独によって生成されるシグナルはＴ細胞の完全な活性化に不十分であること、および二次または共刺激シグナルも必要であることが公知である。したがって、Ｔ細胞の活性化は、２つの別個のクラスの細胞内シグナル伝達ドメイン：ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）によって抗原依存的一次活性化を開始する一次シグナル伝達ドメインと、抗原非依存的に作用して二次または共刺激シグナルをもたらす共刺激シグナル伝達ドメインとによって媒介されるということができる。好ましい実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲは、１つまたは複数の「共刺激シグナル伝達ドメイン」および「一次シグナル伝達ドメイン」を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０２８３】
一次シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体の一次活性化を刺激性に、または阻害性に調節する。刺激性に作用する一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ）またはＩＴＡＭとして公知であるシグナル伝達モチーフを含有してよい。
【０２８４】
本発明において特に使用される、一次シグナル伝達ドメインを含有するＩＴＡＭの実例としては、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。特定の好ましい実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインおよび１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。細胞内一次シグナル伝達および共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の順序でタンデムに膜貫通ドメインのカルボキシル末端と連結することができる。
【０２８５】
本明細書において意図されているＣＡＲは、ＣＡＲ受容体を発現するＴ細胞の有効性および増大を増強するための１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「共刺激シグナル伝達ドメイン」または「共刺激ドメイン」という用語は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。
【０２８６】
そのような共刺激分子の実例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＣＴＬＡ４、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＴＲＩＭ、ＬＣＫ３、ＳＬＡＭ、ＤＡＰ１０、ＬＡＧ３、ＨＶＥＭおよびＮＫＤ２Ｃ、およびＣＤ８３が挙げられる。一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、およびＣＤ１３４、およびＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインからなる群より選択される１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【０２８７】
一実施形態では、ＣＡＲは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、’グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、またはＶＥＧＦＲ２ポリペプチドに結合するｓｃＦｖ；ＣＤ８α；ＣＤ４、ＣＤ４５、ＰＤ１、およびＣＤ１５２からなる群より選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン；ならびに、ＣＤ２８、ＣＤ５４、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、およびＣＤ２７８からなる群より選択される１つまたは複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびにＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０２８８】
別の実施形態では、ＣＡＲは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、’グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、またはＶＥＧＦＲ２ポリペプチドに結合するｓｃＦｖ；ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３およびＣＤ８α、およびＣＤ８αからなる群より選択されるヒンジドメイン；ＣＤ８α；ＣＤ４、ＣＤ４５、ＰＤ１、およびＣＤ１５２からなる群より選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン；ならびに、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、およびＣＤ１３７からなる群より選択される１つまたは複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびに、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０２８９】
さらに別の実施形態では、ＣＡＲは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、’グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、またはＶＥＧＦＲ２ポリペプチドに結合する、リンカーをさらに含むｓｃＦｖ；ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３およびＣＤ８α、およびＣＤ８αからなる群より選択されるヒンジドメイン；ＣＤ８α；ＣＤ４、ＣＤ４５、ＰＤ１、およびＣＤ１５２からなる群より選択されるポリペプチドに由来するＴＭドメインと、ＴＭドメインをＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインに連結する、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸の間の長さであることが好ましい短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーとを含む膜貫通ドメイン；ならびに、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、およびＣＤ１３７からなる群より選択される１つまたは複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびに、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０２９０】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、’グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、またはＶＥＧＦＲ２ポリペプチドに結合するｓｃＦｖ；ＣＤ８αポリペプチドを含むヒンジドメイン；約３アミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＣＤ８α膜貫通ドメイン；ＣＤ２８、ＣＤ１３４、およびＣＤ１３７からなる群より選択される１つまたは複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびにＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０２９１】
Ｅ．ポリペプチド
本発明は、一部において、工学的に作製されたＴＣＲおよびＣＡＲポリペプチドならびにその断片、それを含む細胞および組成物、ならびにポリペプチドを発現するベクターを意図している。「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」および「タンパク質」は、互換的に使用され、組換え、合成、または非天然アミノ酸ポリマーを指す。ポリペプチドは、特定の長さに限定されず、例えば、ポリペプチドは、全長タンパク質配列を含んでもよく、全長タンパク質の断片を含んでもよく、また、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに天然に存在するものと天然に存在しないものの両方の、当技術分野で公知の他の修飾を含んでよい。種々の実施形態では、本明細書において意図されているポリペプチドは、タンパク質のＮ末端に、翻訳時にまたは翻訳後にタンパク質の移行を導くシグナル（またはリーダー）配列を含む。本明細書に開示される有用な適切なシグナル配列の実例としては、これらに限定されないが、ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチド、ＣＤ８αシグナルポリペプチド、またはヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファシグナルポリペプチドが挙げられる。ポリペプチドは、種々の周知の組換えおよび／または合成技法のいずれかを使用して調製することができる。本明細書において意図されているポリペプチドは、本開示のＣＡＲ、または本明細書において意図されているポリペプチドの１つもしくは複数のアミノ酸からの欠失、それらへの付加、および／もしくはそれらの置換を有する配列を特に包含する。
【０２９２】
ポリペプチドは、「ポリペプチドバリアント」を包含する。ポリペプチドバリアントは、天然に存在するポリペプチドと、１つまたは複数の置換、欠失、付加および／または挿入の点で異なり得る。そのようなバリアントは、天然に存在するものであってもよく、例えば上記のポリペプチド配列のうちの１つまたは複数を修飾することによって合成により生成することもできる。例えば、特定の実施形態では、１つまたは複数の置換、欠失、付加および／または挿入を導入することにより、工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲの結合親和性および／または他の生物学的性質を改善することが望ましい場合がある。好ましくは、本発明のポリペプチドは、それに対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％のアミノ酸の同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２９３】
ポリペプチドは、「ポリペプチド断片」を包含する。ポリペプチド断片とは、天然に存在するまたは組換えによって作製されたポリペプチドのアミノ末端における欠失、カルボキシル末端における欠失、および／または内部の欠失もしくは置換を有する、単量体であっても多量体であってもよいポリペプチドを指す。ある特定の実施形態では、ポリペプチド断片は、少なくとも５〜約５００アミノ酸長のアミノ酸の鎖を含んでよい。ある特定の実施形態では、断片は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０アミノ酸長であることが理解されよう。
【０２９４】
ポリペプチドはまた、ポリペプチドの合成、精製もしくは同定を容易にするため（例えば、ポリ−Ｈｉｓ）、またはポリペプチドの固体支持体への結合を増強するためのリンカーまたは他の配列とインフレームで融合することもでき、またはコンジュゲートすることもできる。
【０２９５】
上記の通り、本明細書において意図されているポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、短縮、および挿入を含めた種々のやり方で変更することができる。そのような操作のための方法は、一般に、当技術分野で公知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントを、ＤＮＡにおける変異によって調製することができる。変異誘発およびヌクレオチド配列変更のための方法は当技術分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ８２巻：４８８〜４９２頁）、Ｋｕｎｋｅｌら、（１９８７年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５４巻：３６７〜３８２頁）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ，  Ｊ．  Ｄ．ら、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ、第４版、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ．、１９８７年）およびそこに引用されている参考文献を参照されたい。目的のタンパク質の生物活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関する手引きは、Ｄａｙｈｏｆｆら、（１９７８年）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｆｏｕｎｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．）のモデルにおいて見いだすことができる。
【０２９６】
ある特定の実施形態では、バリアントは保存的置換を含有する。「保存的置換」とは、あるアミノ酸により同様の性質を有する別のアミノ酸が置換されているものであり、したがって、ポリペプチドの二次構造およびハイドロパシー的性質は実質的に変化しないことがペプチド化学の当業者には予想されよう。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造に改変を行っても、望ましい特性を有するバリアントまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能分子をまだ得ることができる。
【０２９７】
ポリペプチドバリアントは、グリコシル化された形態、他の分子との集合的コンジュゲート、および無関係の化学的部分（例えば、ペグ化分子）との共有結合コンジュゲートをさらに含む。共有結合バリアントは、当技術分野で公知の通り、アミノ酸の鎖内またはＮ末端もしくはＣ末端の残基に見いだされる基に官能基を連結することによって調製することができる。バリアントとしては、対立遺伝子バリアント、種バリアント、および変異タンパク質も挙げられる。タンパク質の機能活性に影響を及ぼさない領域の短縮または欠失もバリアントである。
【０２９８】
一実施形態では、２種またはそれ超のポリペプチドの発現が望まれる場合、それらをコードするポリヌクレオチド配列を、本明細書の他の箇所で論じられているＩＲＥＳ配列によって分離することができる。別の実施形態では、２種またはそれ超のポリペプチドを、１つまたは複数の自己切断性ポリペプチド配列を含む融合タンパク質として発現させることができる。
【０２９９】
本発明のポリペプチドは、融合ポリペプチドを包含する。好ましい実施形態では、融合ポリペプチドおよび融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。融合ポリペプチドおよび融合タンパク質とは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個またはそれ超のポリペプチドセグメントを有するポリペプチドを指す。融合ポリペプチドは、一般には、Ｃ末端とＮ末端を連結したものであるが、Ｃ末端とＣ末端、Ｎ末端とＮ末端、またはＮ末端とＣ末端を連結することもできる。融合タンパク質のポリペプチドは任意の順序であっても指定の順序であってもよい。融合ポリペプチドまたは融合タンパク質は、融合ポリペプチドの所望の転写活性が保存される限りは、保存的に改変されたバリアント、多型バリアント、対立遺伝子、変異体、部分配列、および種間ホモログも包含し得る。融合ポリペプチドは、化学的な合成方法によって、または２つの部分間の化学結合によって作製することもでき、一般に、他の標準の技法を使用して調製することもできる。融合ポリペプチドを含むライゲーションされたＤＮＡ配列は、本明細書の他の箇所で論じられている適切な転写または翻訳制御エレメントに作動可能に連結している。
【０３００】
一実施形態では、融合パートナーは、ネイティブな組換えタンパク質よりも高収量でのタンパク質の発現を補助する配列（発現エンハンサー）を含む。他の融合パートナーは、タンパク質の溶解度が増加するように、またはタンパク質を所望の細胞内区画にターゲティングすることが可能になるように、または融合タンパク質の細胞膜を通る輸送が容易になるように、選択することができる。
【０３０１】
融合ポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドドメインのそれぞれの間にポリペプチド切断シグナルをさらに含んでよい。さらに、ポリペプチド部位を任意のリンカーペプチド配列に入れることができる。例示的なポリペプチド切断シグナルは、プロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位（例えば、希な制限酵素認識部位、自己切断性リボザイム認識部位）、および自己切断性ウイルスオリゴペプチドなどのポリペプチド切断認識部位を含む（ｄｅＦｅｌｉｐｅおよびＲｙａｎ、２００４年、Ｔｒａｆｆｉｃ、５巻（８号）；６１６〜２６頁を参照されたい）。
【０３０２】
適切なプロテアーゼ切断部位および自己切断性ペプチドは当業者に公知である（例えば、Ｒｙａｎら、１９９７年、Ｊ．  Ｇｅｎｅｒ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８巻、６９９〜７２２頁；Ｓｃｙｍｃｚａｋら（２００４年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ５巻、５８９〜５９４頁を参照されたい）。例示的なプロテアーゼ切断部位としては、これらに限定されないが、ポティウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えば、タバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ）、ポティウイルスＨＣプロテアーゼ、ポティウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビオウイルス（ｂｙｏｖｉｒｕｓ）ＮＩａプロテアーゼ、ビオウイルス（ｂｙｏｖｉｒｕｓ）ＲＮＡ−２にコードされるプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（イネツングロ球状ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ＰＹＶＦ（パースニップ黄斑ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、第Ｘａ因子およびエンテロキナーゼの切断部位が挙げられる。一実施形態では、切断ストリンジェンシーが高いことに起因して、ＴＥＶ（タバコエッチ病ウイルス）プロテアーゼ切断部位、例えば、ＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）（配列番号１１）、例えば、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号１２）およびＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号１３）（式中、Ｘは任意のアミノ酸を表す）（ＴＥＶによる切断は、ＱとＧの間またはＱとＳの間で起こる）が好ましい。
【０３０３】
特定の実施形態では、自己切断性ペプチドは、ポティウイルスおよびカルジオウイルス２Ａペプチド、ＦＭＤＶ（口蹄疫ウイルス）、ウマ鼻炎Ａウイルス、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルスおよびブタテッショウウイルスから得られるポリペプチド配列を含む。
【０３０４】
ある特定の実施形態では、自己切断性ポリペプチド部位は、２Ａまたは２Ａ様部位、配列またはドメインを含む（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、２００１年、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８２巻：１０２７〜１０４１頁）。
【０３０５】
Ｆ．ポリヌクレオチド
特定の実施形態では、本明細書において意図されている１つまたは複数の工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（−））、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えＤＮＡ、合成ＤＮＡ、または天然に存在しないＤＮＡを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドおよび二本鎖ポリヌクレオチドを含む。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載の参照配列（例えば、配列表を参照されたい）のいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはバリアントを含み、一般には、その場合、バリアントは参照配列の少なくとも１つの生物活性を維持する。種々の例示的な実施形態では、本発明は、一部において、ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ウイルスベクター、および導入プラスミド、ならびにそれを含む組成物、および細胞を意図している。
【０３０６】
特定の実施形態では、本発明により、少なくとも約５個、１０個、２５個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、５００個、１０００個、１２５０個、１５００個、１７５０個、または２０００個またはそれ超の本発明のポリペプチドの連続したアミノ酸残基、ならびに全ての中間の長さの本発明のポリペプチドの連続したアミノ酸残基をコードするポリヌクレオチドが提供される。「中間の長さ」とは、この文脈において、引用された値の間の任意の長さ、例えば、６、７、８、９など；１０１、１０２、１０３など；１５１、１５２、１５３など；２０１、２０２、２０３などを意味することが容易に理解されよう。
【０３０７】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」などの用語は、参照ポリヌクレオチド配列に対して実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチド、または下で定義されているストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。これらの用語は、参照ポリヌクレオチドと比較して、１つまたは複数のヌクレオチドが付加されているもしくは欠失している、または異なるヌクレオチドで置き換えられているポリヌクレオチドを包含する。この点について、参照ポリヌクレオチドに対して変異、付加、欠失および置換を含めたある特定の変更を行うことができ、それにより、変更されたポリヌクレオチドが参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持することは当技術分野においてよく理解されている。
【０３０８】
「配列同一性」または、例えば、「と５０％同一の配列」を含む記述は、本明細書で使用される場合、比較のウインドウにわたって、配列がヌクレオチドごとまたはアミノ酸ごとに同一である程度を指す。したがって、「配列同一性の百分率」は、最適にアラインされた２つの配列を比較のウインドウにわたって比較し、両方の配列に同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が存在する位置の数を決定してマッチする位置の数を得、マッチする位置の数を比較のウインドウ内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で割り、その結果に１００を掛けて、配列同一性の百分率を得ることによって算出することができる。本明細書に記載の参照配列のいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチドおよびポリペプチドが包含され、一般には、その場合、ポリペプチドバリアントは参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を維持する。
【０３０９】
２つまたはそれ超のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列の関係を記載するために使用される用語として、「参照配列」、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の百分率」、および「実質的な同一性」が挙げられる。「参照配列」は、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含めて長さが少なくとも１２単量体単位であるが、１５〜１８単量体単位の頻度が高く、多くの場合には、少なくとも２５単量体単位である。２つのポリヌクレオチドはそれぞれ（１）２つのポリヌクレオチド間で類似した配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）、および（２）２つのポリヌクレオチド間で多岐にわたる配列を含み得るので、２つ（またはそれ超）のポリヌクレオチド間の配列の比較は、一般には、２つのポリヌクレオチドの配列を「比較ウインドウ」にわたって比較して、同定し、配列類似性の局所的な領域を比較することによって実施される。「比較ウインドウ」とは、配列を、２つの配列を最適にアラインした後に、同じ数の連続した位置の参照配列と比較する、少なくとも６カ所、通常は約５０〜約１００カ所、より通常は約１００〜約１５０カ所の連続した位置の概念的なセグメントを指す。比較ウインドウは、２つの配列を最適にアラインするために、参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して約２０％またはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでよい。比較ウインドウをアラインするための配列の最適なアラインメントは、アルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ））のコンピュータによる実行によって、または選択された種々の方法のいずれかによって生成される検査および最良のアラインメント（すなわち、比較ウインドウにわたって最も高い百分率相同性がもたらされる）によって行うことができる。例として、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５巻：３３８９頁により開示されているプログラムのＢＬＡＳＴファミリーに対して参照を行うこともできる。配列解析に関する詳細な論述は、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ
＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ、１９９４〜１９９８年、１５章のＵｎｉｔ  １９．３に見いだすことができる。
【０３１０】
本発明のポリヌクレオチドは、それ自体のコード配列の長さにかかわらず、本明細書の他の箇所で開示されているまたは当技術分野で公知のプロモーターおよび／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、追加的な制限酵素部位、多重クローニング部位、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、およびＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナル、および自己切断性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどの他のＤＮＡ配列と組み合わせることができ、したがって、それらの全体の長さは相当に変動し得る。したがって、ほぼどんな長さのポリヌクレオチド断片でも使用することができ、全長は調製の容易さおよび意図された組換えＤＮＡプロトコールでの使用により限定されることが好ましいことが意図されている。
【０３１１】
ポリヌクレオチドは、当技術分野において公知であり、利用可能である種々の十分に確立された技法のいずれかを使用して調製し、操作し、かつ／または発現させることができる。所望のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を適切なベクターに挿入することができる。ベクターの例は、プラスミド、自己複製配列、および転移因子である。追加の例示的なベクターとしては、限定することなく、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、たとえば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来の人工染色体（ＰＡＣ）、ラムダファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、および動物ウイルスが挙げられる。ベクターとして有用な動物ウイルスのカテゴリーの例としては、限定することなく、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられる。発現ベクターの例は、哺乳動物細胞において発現させるためのｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）；哺乳動物細胞におけるレンチウイルス媒介性遺伝子導入および発現のためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、およびｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５−ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。特定の実施形態では、本明細書に開示されているキメラタンパク質のコード配列を、哺乳動物細胞においてキメラタンパク質を発現させるためにそのような発現ベクターにライゲーションすることができる。
【０３１２】
発現ベクター内に存在する「制御エレメント」または「調節配列」は、宿主細胞のタンパク質と相互作用して転写および翻訳を行うベクターの非翻訳（ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）領域−複製起点、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（シャイン・ダルガーノ配列またはコザック配列）イントロン、ポリアデニル化配列、５’および３’非翻訳（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）領域である。そのようなエレメントは、それらの強度および特異性が変動し得る。利用するベクター系および宿主に応じて、遍在プロモーターおよび誘導性プロモーターを含めた、多くの適切な転写および翻訳エレメントを使用することができる。
【０３１３】
特定の実施形態では、これらに限定されないが、発現ベクターおよびウイルスベクターを含めた、本発明の実施において使用するためのベクターは、プロモーターおよび／またはエンハンサーなどの外因性、内因性、または異種性制御配列を含む。「内因性」制御配列とは、ゲノム内で所与の遺伝子に天然に連結した制御配列である。「外因性」制御配列とは、遺伝子操作（すなわち、分子生物学的技法）によって遺伝子の近位に配置された制御配列であり、したがって、その遺伝子の転写が連結したエンハンサー／プロモーターによって導かれる。「異種性」制御配列とは、遺伝子操作される細胞とは異なる種に由来する外因性配列である。
【０３１４】
「プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を指す。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチドを惹起および転写する。特定の実施形態では、哺乳動物細胞において作動可能なプロモーターは、転写が開始される部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域および／または転写開始から７０〜８０塩基上流に見いだされる別の配列、ＣＮＣＡＡＴ領域（Ｎは任意のヌクレオチドであってよい）を含む。
【０３１５】
「エンハンサー」という用語は、転写の増強をもたらすことが可能な配列を含み、一部の場合には、別の制御配列に対する方向とは独立して機能し得るＤＮＡのセグメントを指す。エンハンサーは、プロモーターおよび／または他のエンハンサーエレメントと協同的にまたは相加的に機能し得る。「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーター機能とエンハンサー機能の両方をもたらすことが可能な配列を含有するＤＮＡのセグメントを指す。
【０３１６】
「作動可能に連結した」という用語は、記載されている構成成分が、それらの意図された様式で機能することが可能になる関係にある近位を指す。一実施形態では、この用語は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーなど）と第２のポリヌクレオチド配列、例えば、目的のポリヌクレオチドの機能的な連結を指し、ここで、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を導く。
【０３１７】
本明細書で使用される場合、「構成的発現制御配列」という用語は、作動可能に連結した配列の転写を絶え間なくまたは連続的に可能にするプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーを指す。構成的発現制御配列は、多種多様な細胞および組織型における発現を可能にする「遍在」プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーであってもよく、それぞれ制限された種類の細胞および組織型における発現を可能にする「細胞特異的」、「細胞型特異的」、「細胞系列特異的」または「組織特異的」プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーであってもよい。
【０３１８】
本発明の特定の実施形態において使用するのに適した例示的な遍在発現制御配列としては、これらに限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ウイルスシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルス由来のＨ５、Ｐ７．５、およびＰ１１プロモーター、伸長因子１−アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、真核生物翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータ、メンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β−キネシン（β−ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座（Ｉｒｉｏｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５巻、１４７７〜１４８２頁（２００７年））、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーターおよび骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合性部位置換（ＭＮＤ）プロモーター（Ｃｈａｌｌｉｔａら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ６９巻（２号）：７４８〜５５頁（１９９５年））が挙げられる。
【０３１９】
特定の実施形態では、工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを含むポリヌクレオチドを、Ｔ細胞における安定かつ長期にわたる発現をもたらすプロモーターから、Ｔ細胞を、標的抗原を発現する細胞に向け直すために十分なレベルで発現させることが望ましい場合がある。好ましい実施形態では、プロモーターは、ＥＦ１αプロモーターまたはＭＮＤプロモーターである。
【０３２０】
本明細書で使用される場合、「条件的発現」とは、これらに限定されないが、誘導性発現；抑制可能な発現；特定の生理的状態、生物学的状態、または疾患状態を有する細胞または組織における発現などを含めた、任意の型の条件的発現を指し得る。この定義は、細胞型または組織に特異的な発現を排除するものではない。本発明のある特定の実施形態は、目的のポリヌクレオチドの条件的発現を提供し、例えば、細胞、組織、生物体などを、ポリヌクレオチドの発現が引き起こされる処理もしくは条件、または目的のポリヌクレオチドによりコードされるポリヌクレオチドの発現の増加もしくは減少が引き起こされる処理もしくは条件に供することによって発現を制御する。
【０３２１】
誘導性プロモーター／系の実例としては、これらに限定されないが、グルココルチコイドまたはエストロゲン受容体（対応するホルモンを用いた処理によって誘導可能）をコードする遺伝子に対するプロモーターなどのステロイド誘導性プロモーター、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター（種々の重金属を用いた処理によって誘導可能）、ＭＸ−１プロモーター（インターフェロンによって誘導可能）、「ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ」ミフェプリストンにより調節可能な系（Ｓｉｒｉｎら、２００３年、Ｇｅｎｅ、３２３巻：６７頁）、クメート（ｃｕｍａｔｅ）誘導性遺伝子スイッチ（ＷＯ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存性調節系などが挙げられる。
【０３２２】
条件的発現は、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを使用することによって達成することもできる。本発明のある特定の実施形態によると、ベクターは、部位特異的リコンビナーゼによって媒介される組換えのための少なくとも１つ（一般には、２つ）の部位を含む。本明細書で使用される場合、「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、１つまたは複数の組換え部位（例えば、２、３、４、５、７、１０、１２、１５、２０、３０、５０など）が関与する組換え反応に関与する、除去的（ｅｘｃｉｓｉｖｅ）または統合的なタンパク質、酵素、補因子または関連タンパク質を含み、これは、野生型タンパク質であってもよく（Ｌａｎｄｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３巻：６９９〜７０７頁（１９９３年））、その変異体、誘導体（例えば、組換えタンパク質配列またはその断片を含有する融合タンパク質）、断片、およびバリアントであってもよい。本発明の特定の実施形態における使用に適したリコンビナーゼの実例としては、これらに限定されないが、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ΦＣ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３レソルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥ１、およびＰａｒＡが挙げられる。
【０３２３】
Ｇ．ウイルスベクター
特定の実施形態では、Ｔ細胞を含む細胞の集団、例えば、ＰＢＭＣ、または精製されたＴ細胞の集団に、本明細書において意図されている工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲをコードするレトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターを用いて形質導入を行う。形質導入されたＴ細胞は、安定な、長期にわたる、持続的なＴ細胞応答を引き起こす。
【０３２４】
本明細書で使用される場合、「レトロウイルス」という用語は、そのゲノムＲＮＡを直鎖状二本鎖ＤＮＡコピーに逆転写し、その後、そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに共有結合によって組み込むＲＮＡウイルスを指す。特定の実施形態における使用に適した例示的なレトロウイルスとしては、これらに限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））およびレンチウイルスが挙げられる。
【０３２５】
本明細書で使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、複合レトロウイルスのある群（または属）を指す。例示的なレンチウイルスとしては、これらに限定されないが、：ＨＩＶ（ヒト免疫不全症ウイルス；ＨＩＶ  １型およびＨＩＶ  ２型を含む）；ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス；ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）；ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；ネコ免疫不全症ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全症ウイルス（ＢＩＶ）；およびサル免疫不全症ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。一実施形態では、ＨＩＶに基づくベクターの骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用性配列エレメント）が好ましい。
【０３２６】
「ベクター」という用語は、本明細書では、別の核酸分子を移行させるまたは運搬することが可能な核酸分子を指すために使用される。移行される核酸は、一般に、ベクター核酸分子に連結される、例えば、それに挿入される。ベクターは、細胞における自律複製を導く配列を含んでもよく、宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含んでもよい。有用なベクターとしては、例えば、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体、およびウイルスベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとしては、例えば、複製欠損性レトロウイルスおよびレンチウイルスが挙げられる。
【０３２７】
当業者には明らかになる通り、「ウイルスベクター」という用語は、一般には核酸分子の移行もしくは細胞のゲノム内への組み込みを容易にするウイルス由来の核酸エレメントを含む核酸分子（例えば、導入プラスミド）、または、核酸移行を媒介するウイルス粒子のいずれかを指すために広く使用されている。ウイルス粒子は、一般には、核酸（複数可）に加えて、種々のウイルス構成成分および時には宿主細胞構成成分も含む。
【０３２８】
ウイルスベクターという用語は、核酸を細胞内に移行することが可能なウイルスもしくはウイルス粒子、または移行される核酸自体のいずれかを指し得る。ウイルスベクターおよび導入プラスミドは、主にウイルスに由来する構造的かつ／または機能的な遺伝エレメントを含有する。「レトロウイルスベクター」という用語は、主にレトロウイルスに由来する構造的かつ機能的な遺伝エレメントまたはその一部を含有するウイルスベクターまたはプラスミドを指す。「レンチウイルスベクター」という用語は、主にレンチウイルスに由来するＬＴＲを含めた、構造的かつ機能的な遺伝エレメントまたはその一部を含有するウイルスベクターまたはプラスミドを指す。「ハイブリッドベクター」という用語は、レトロウイルス、例えばレンチウイルス配列とレンチウイルスものではないウイルス配列の両方を含有するベクター、ＬＴＲまたは他の核酸を指す。一実施形態では、ハイブリッドベクターとは、逆転写、複製、組み込みおよび／またはパッケージングのための、レトロウイルス、例えばレンチウイルス配列を含むベクターまたは導入プラスミドを指す。
【０３２９】
特定の実施形態では、「レンチウイルスベクター」、「レンチウイルス発現ベクター」という用語は、レンチウイルス導入プラスミドおよび／または感染性レンチウイルス粒子を指すために使用することができる。本明細書において、例えばクローニング部位、プロモーター、調節エレメント、異種核酸などのエレメントに言及する場合、これらのエレメントの配列は、本発明のレンチウイルス粒子ではＲＮＡ形態で存在し、本発明のＤＮＡプラスミドではＤＮＡ形態で存在することが理解されるべきである。
【０３３０】
プロウイルスの各末端には、「長い末端反復」または「ＬＴＲ」と称される構造がある。「長い末端反復（ＬＴＲ）」という用語は、レトロウイルスＤＮＡの末端に位置する、それらの天然配列に関しては直接反復配列であり、Ｕ３、ＲおよびＵ５領域を含有する、塩基対のドメインを指す。ＬＴＲは、一般に、レトロウイルス遺伝子の発現（例えば、促進、開始および遺伝子転写物のポリアデニル化）のため、およびウイルス複製のための基本的な機能をもたらす。ＬＴＲは、転写制御エレメント、ポリアデニル化シグナルならびにウイルスゲノムの複製および組み込みのために必要な配列を含めた多数の調節シグナルを含有する。ウイルスＬＴＲは、Ｕ３、ＲおよびＵ５と称される３つの領域に分けられる。Ｕ３領域は、エンハンサーおよびプロモーターエレメントを含有する。Ｕ５領域は、プライマー結合性部位とＲ領域の間の配列であり、ポリアデニル化配列を含有する。Ｒ（反復）領域は、Ｕ３領域とＵ５領域に挟まれている。ＬＴＲは、Ｕ３、ＲおよびＵ５領域で構成され、ウイルスゲノムの５’末端と３’末端の両方に見られる。５’ＬＴＲには、ゲノムの逆転写に必要な配列（ｔＲＮＡプライマー結合性部位）およびウイルスＲＮＡの、粒子への効率的なパッケージングに必要な配列（プシー部位）が隣接している。
【０３３１】
本明細書で使用される場合、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルスＲＮＡのウイルスカプシドまたは粒子への挿入に必要である、レトロウイルスゲノム内に位置する配列を指す。例えば、Ｃｌｅｖｅｒら、１９９５年、Ｊ．  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６９巻、４号；２１０１〜２１０９頁を参照されたい。いくつかのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのカプシド形成に必要な最小のパッケージングシグナル（プシー［Ψ］配列とも称される）を使用する。したがって、本明細書で使用される場合、「パッケージング配列」、「パッケージングシグナル」、「プシー」という用語および「Ψ」という記号は、ウイルス粒子形成の間のレトロウイルスＲＮＡ鎖のカプシド形成に必要な非コード配列への言及に使用されている。
【０３３２】
種々の実施形態では、ベクターは、改変された５’ＬＴＲおよび／または３’ＬＴＲを含む。ＬＴＲのいずれかまたは両方が、これらに限定されないが、１つまたは複数の欠失、挿入、または置換を含めた、１つまたは複数の改変を含んでよい。３’ＬＴＲの改変は、多くの場合、レンチウイルスまたはレトロウイルス系の安全性を改善するために、ウイルスを複製欠損性にすることによって行われる。本明細書で使用される場合、「複製欠損性」という用語は、完全な、有効な複製を行うことができず、したがって、感染性ビリオンが産生されないウイルス（例えば、複製欠損性レンチウイルス後代）を指す。「複製コンピテント」という用語は、複製することが可能であり、したがって、ウイルスのウイルス複製が感染性ビリオンを産生可能である野生型ウイルスまたは変異体ウイルス（例えば、複製コンピテントレンチウイルス後代）を指す。
【０３３３】
「自己不活性化」（ＳＩＮ）ベクターとは、最初のラウンドのウイルス複製を超えてのウイルス転写を防止するために、Ｕ３領域として公知の右側（３’）ＬＴＲエンハンサー−プロモーター領域が改変された（例えば、欠失または置換によって）複製欠損性ベクター、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを指す。これは、右側（３’）ＬＴＲ  Ｕ３領域がウイルス複製の間に左側（５’）ＬＴＲ  Ｕ３領域の鋳型として使用され、したがって、ウイルス転写物はＵ３エンハンサー−プロモーターなしでは作られないことに起因する。本発明のさらなる実施形態では、Ｕ５領域が、例えば理想的なポリ（Ａ）配列で置き換えられるように、３’ＬＴＲを改変する。３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、または３’ＬＴＲと５’ＬＴＲの両方に対する改変などのＬＴＲに対する改変も本発明に包含されることに留意するべきである。
【０３３４】
５’ＬＴＲのＵ３領域を異種プロモーターで置き換えて、ウイルス粒子の産生の間にウイルスゲノムの転写を駆動することにより、追加的な安全性の増強が提供される。使用することができる異種プロモーターの例としては、例えば、ウイルスシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、最初期の）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが挙げられる。典型的なプロモーターは、Ｔａｔ非依存的に高レベルの転写を駆動することができる。この置き換えにより、ウイルス産生系に完全なＵ３配列が存在しなくなるので、複製コンピテントウイルスを生成する組換えの可能性が低下する。ある特定の実施形態では、異種プロモーターは、ウイルスゲノムが転写される様式の制御における追加的な利点を有する。例えば、異種プロモーターは、誘導性であってよく、したがって、ウイルスゲノムの全部または一部の転写は、誘導因子が存在する場合にのみ起こる。誘導因子としては、これらに限定されないが、１つまたは複数の化学化合物または宿主細胞を培養する温度またはｐＨなどの生理的条件が挙げられる。
【０３３５】
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ＴＡＲエレメントを含む。「ＴＡＲ」という用語は、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）ＬＴＲのＲ領域に位置する「トランス活性化応答」遺伝エレメントを指す。このエレメントは、レンチウイルストランス活性化因子（ｔａｔ）遺伝エレメントと相互作用してウイルス複製を増強する。しかし、このエレメントは、５’ＬＴＲのＵ３領域を異種プロモーターで置き換える実施形態では必要ない。
【０３３６】
「Ｒ領域」とは、キャップ形成基の開始（すなわち、転写の開始）で始まり、ポリＡトラクトが始まる直前で終わる、レトロウイルスＬＴＲ内の領域を指す。Ｒ領域は、Ｕ３領域とＵ５領域に挟まれているとも定義される。Ｒ領域は、逆転写の間に新生ＤＮＡのゲノムの一方の末端から他方の末端への移行を可能にする役割を果たす。
【０３３７】
本明細書で使用される場合、「ＦＬＡＰエレメント」という用語は、その配列に、レトロウイルス、例えば、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２の中心ポリプリントラクト（ｃｅｎｔｒａｌ  ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）および中心終結配列（ｃＰＰＴおよびＣＴＳ）を含む核酸を指す。適切なＦＬＡＰエレメントは、米国特許第６，６８２，９０７号およびＺｅｎｎｏｕら、２０００年、Ｃｅｌｌ、１０１巻：１７３頁に記載されている。ＨＩＶ−１逆転写の間、中心ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）におけるプラス鎖ＤＮＡの中心的な開始および中心終結配列（ＣＴＳ）における中心的な終結により、三本鎖ＤＮＡ構造：ＨＩＶ−１中心ＤＮＡフラップの形成が導かれる。いかなる理論に縛られることも望むものではないが、ＤＮＡフラップは、レンチウイルスゲノム核内移行のシス活性決定因子として作用し得、かつ／またはウイルスの力価を増大させ得る。特定の実施形態では、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターの骨格は、ベクター内の目的の異種遺伝子の上流または下流の１つまたは複数のＦＬＡＰエレメントを含む。例えば、特定の実施形態では、導入プラスミドはＦＬＡＰエレメントを含む。一実施形態では、本発明のベクターは、ＨＩＶ−１から単離されたＦＬＡＰエレメントを含む。
【０３３８】
一実施形態では、レトロウイルスまたはレンチウイルス移入ベクターは、１つまたは複数の移出エレメントを含む。「移出エレメント」という用語は、ＲＮＡ転写物の細胞の核から細胞質への輸送を調節するシス作用性転写後調節エレメントを指す。ＲＮＡ移出エレメントの例としては、これらに限定されないが、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）（例えば、Ｃｕｌｌｅｎら、１９９１年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６５巻：１０５３頁；およびＣｕｌｌｅｎら、１９９１年、Ｃｅｌｌ  ５８巻：４２３頁を参照されたい）、およびＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）が挙げられる。一般に、ＲＮＡ移出エレメントは、遺伝子の３’ＵＴＲ内に配置され、また、１つまたは多数のコピーとして挿入することができる。
【０３３９】
特定の実施形態では、ウイルスベクター内の異種配列の発現を、転写後調節エレメント、効率的なポリアデニル化部位、および場合によって、転写終結シグナルをベクターに組み入れることによって増加させる。種々の転写後調節エレメント、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９９年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７３巻：２８８６頁）；Ｂ型肝炎ウイルスに存在する転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）（Ｈｕａｎｇら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、５巻：３８６４頁）などは、異種核酸のタンパク質での発現を増加させることができる（Ｌｉｕら、１９９５年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、９巻：１７６６頁）。特定の実施形態では、本発明のベクターは、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥなどの転写後調節エレメントを含む。
【０３４０】
特定の実施形態では、本発明のベクターは、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥなどの転写後調節エレメントを欠くまたはそれを含まない。なぜなら、一部の場合には、これらのエレメントが、細胞形質転換のリスクを上昇させ、かつ／または、ｍＲＮＡ転写物の量を実質的にもしくは有意に増加させないまたはｍＲＮＡ安定性を増加させないからである。したがって、一部の実施形態では、本発明のベクターは、追加的な安全策として、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを欠くまたはそれを含まない。
【０３４１】
異種核酸転写物の効率的な終結およびポリアデニル化を導くエレメントは、異種遺伝子発現を増加させる。転写終結シグナルは、一般に、ポリアデニル化シグナルの下流に見いだされる。特定の実施形態では、ベクターは、発現させるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’側にポリアデニル化配列を含む。「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」という用語は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる新生ＲＮＡ転写物の終結およびポリアデニル化の両方を導くＤＮＡ配列を示す。ポリアデニル化配列は、コード配列の３’末端にポリＡ尾部を付加することによってｍＲＮＡ安定性を促進し、したがって、翻訳効率の上昇に寄与することができる。ポリＡ尾部を欠く転写物は不安定であり、迅速に分解されるので、組換え転写物の効率的なポリアデニル化が望ましい。本発明のベクターに使用することができるポリＡシグナルの実例としては、理想的なポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ−グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）、または当技術分野で公知の別の適切な異種性もしくは内因性ポリＡ配列が挙げられる。
【０３４２】
種々の実施形態では、本発明のベクターは、工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターを含む。ベクターは１つまたは複数のＬＴＲを有してよく、いずれのＬＴＲも、１つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加、または欠失などの１つまたは複数の修飾を含む。ベクターは、形質導入効率を上昇させるための１つまたは複数のアクセサリーエレメント（例えば、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、ウイルスパッケージングを増加させるための１つまたは複数のアクセサリーエレメント（例えば、プシー（Ψ）パッケージングシグナル、ＲＲＥ）、および／または治療用遺伝子の発現を増加させる他のエレメント（例えば、ポリ（Ａ）配列）をさらに含んでよく、場合によって、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含んでよい。多くの他の異なる実施形態を既存の本発明の実施形態から適合させることができることが当業者には理解されよう。
【０３４３】
「宿主細胞」とは、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて本発明の組換えベクターまたはポリヌクレオチドを用いてトランスフェクト、感染、または形質導入を行った細胞を含む。宿主細胞は、パッケージング細胞、産生細胞、およびウイルスベクターを感染させた細胞を含み得る。特定の実施形態では、本発明のウイルスベクターを感染させた宿主細胞を、療法を必要とする対象に投与する。ある特定の実施形態では、「標的細胞」という用語は、宿主細胞と互換的に使用され、トランスフェクト、感染、または形質導入を行った所望の細胞型の細胞を指す。好ましい実施形態では、標的細胞は、Ｔ細胞である。
【０３４４】
妥当なウイルス力価を達成するためには、多くの場合、大規模なウイルス粒子産生が必要である。ウイルス粒子は、ウイルス構造遺伝子および／またはアクセサリー遺伝子、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、またはｎｅｆ遺伝子または他のレトロウイルス遺伝子を含むパッケージング細胞株に移入ベクターをトランスフェクトすることによって産生される。
【０３４５】
本明細書で使用される場合、「パッケージングベクター」という用語は、パッケージングシグナルを欠き、１種、２種、３種、４種またはそれ超のウイルス構造遺伝子および／またはアクセサリー遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターまたはウイルスベクターを指す。一般には、パッケージング細胞にパッケージングベクターを含め、トランスフェクション、形質導入または感染によって細胞に導入する。トランスフェクション、形質導入または感染のための方法は当業者に周知である。本発明のレトロウイルス／レンチウイルス移入ベクターをパッケージング細胞株にトランスフェクション、形質導入または感染によって導入して、産生細胞または細胞株を生成することができる。本発明のパッケージングベクターは、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクションまたは電気穿孔を含めた標準の方法によってヒト細胞または細胞株に導入することができる。一部の実施形態では、パッケージングベクターを、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ゼオシン、チミジンキナーゼ、ＤＨＦＲ、ＧｌｎシンテターゼまたはＡＤＡなどの優性選択可能マーカーと一緒に細胞に導入し、その後、適切な薬物の存在下で選択し、クローンを単離する。選択可能マーカー遺伝子を、パッケージングベクターによりコードされる遺伝子と、例えば、ＩＲＥＳまたは自己切断性ウイルスペプチドによって物理的に連結することができる。
【０３４６】
ウイルスエンベロープタンパク質（ｅｎｖ）は、細胞株から生成される組換えレトロウイルスによって最終的に感染および形質転換することができる宿主細胞の範囲を決定する。ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶおよびＥＩＶなどのレンチウイルスの場合では、ｅｎｖタンパク質は、ｇｐ４１およびｇｐ１２０を含む。本発明のパッケージング細胞によって発現されるウイルスｅｎｖタンパク質は、以前記載されている通り、ウイルスｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子とは別のベクター上にコードされることが好ましい。
【０３４７】
本発明において使用することができるレトロウイルス由来のｅｎｖ遺伝子の実例としては、これらに限定されないが、ＭＬＶエンベロープ、１０Ａ１エンベロープ、ＢＡＥＶ、ＦｅＬＶ−Ｂ、ＲＤ１１４、ＳＳＡＶ、エボラ、センダイ、ＦＰＶ（家禽ペストウイルス）、およびインフルエンザウイルスエンベロープが挙げられる。同様に、ＲＮＡウイルス（例えば、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ、Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、ＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅのＲＮＡウイルスファミリー）に由来するエンベロープ、ならびにＤＮＡウイルス（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｙｉｒｉｄａｅ、およびＩｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅのファミリー）に由来するエンベロープをコードする遺伝子を利用することができる。代表例としては、ＦｅＬＶ、ＶＥＥ、ＨＦＶＷ、ＷＤＳＶ、ＳＦＶ、狂犬病、ＡＬＶ、ＢＩＶ、ＢＬＶ、ＥＢＶ、ＣＡＥＶ、ＳＮＶ、ＣｈＴＬＶ、ＳＴＬＶ、ＭＰＭＶ、ＳＭＲＶ、ＲＡＶ、ＦｕＳＶ、ＭＨ２、ＡＥＶ、ＡＭＶ、ＣＴ１０、およびＥＩＡＶが挙げられる。
【０３４８】
他の実施形態では、本発明のウイルスをシュードタイピングするためのエンベロープタンパク質として、これらに限定されないが、以下のウイルスのいずれかが挙げられる：Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２およびＨ５Ｎ１（トリインフルエンザ）などのＡ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、Ｃ型インフルエンザウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、ノーウォークウイルス群の任意のウイルス、腸内アデノウイルス、パルボウイルス、デング熱ウイルス、サル痘、モノネガウイルス目、リッサウイルス、例えば、狂犬病ウイルス、ラゴスコウモリウイルス（Ｌａｇｏｓ  ｂａｔ  ｖｉｒｕｓ）、モコラウイルス（Ｍｏｋｏｌａ  ｖｉｒｕｓ）、ドゥベンヘイジウイルス（Ｄｕｖｅｎｈａｇｅ  ｖｉｒｕｓ）、ヨーロッパコウモリウイルス１＆２およびオーストラリアコウモリウイルスなど、エフェメロウイルス、ベシクロウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ヘルペスウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型、水痘帯状疱疹、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型および８型、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、パピローマウイルス、マウスガンマヘルペスウイルス、アレナウイルス、例えば、アルゼンチン出血熱ウイルス、ボリビア出血熱ウイルス、サビア関連出血熱ウイルス、ベネズエラ出血熱ウイルス、ラッサ熱ウイルス、マチュポウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄｉａｅ、例えば、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ハンタウイルス、腎症候群を伴う出血熱を引き起こすウイルス、リフトバレー熱ウイルス、エボラ出血熱およびマールブルグ出血熱を含めたＦｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（フィロウイルス）、キャサヌール森林病（Ｋａｙｓａｎｕｒ  Ｆｏｒｅｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）ウイルス、オムスク出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎を引き起こすウイルスを含めたＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、ならびにＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、例えば、ヘンドラウイルスおよびニバーウイルス、大痘瘡および小痘瘡（天然痘）、アルファウイルス、例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、西ナイルウイルス、任意の脳炎を引き起こすウイルス。
【０３４９】
一実施形態では、本発明は、組換えレトロウイルス、例えば、ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質を用いてシュードタイピングされたレンチウイルスを産生するパッケージング細胞を提供する。
【０３５０】
「シュードタイプ」または「シュードタイピング」という用語は、本明細書で使用される場合、ウイルスエンベロープタンパク質が、好ましい特性を有する別のウイルスのエンベロープタンパク質で置換されたウイルスを指す。例えば、ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｅｎｖ遺伝子によりコードされる）は通常ウイルスをＣＤ４＋提示細胞にターゲティングするので、ＨＩＶを水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープタンパク質でシュードタイピングし、それにより、ＨＩＶをより広い範囲の細胞に感染させることを可能にすることができる。本発明の好ましい実施形態では、レンチウイルスエンベロープタンパク質をＶＳＶ−Ｇでシュードタイピングする。一実施形態では、本発明は、ＶＳＶ−Ｇエンベロープ糖タンパク質を用いてシュードタイピングした組換えレトロウイルス、例えば、レンチウイルスを産生するパッケージング細胞を提供する。
【０３５１】
本明細書で使用される場合、「パッケージング細胞株」という用語は、パッケージングシグナルを含有しないが、ウイルス粒子の正しいパッケージングに必要なウイルス構造タンパク質および複製酵素（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を安定にまたは一過性に発現する細胞株に関して使用される。本発明のパッケージング細胞を調製するために、任意の適切な細胞株を使用することができる。一般に、細胞は、哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、パッケージング細胞株を作製するために使用する細胞は、ヒト細胞である。使用することができる適切な細胞株としては、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ  １０Ｔ１／２細胞、ＦＬＹ細胞、Ｐｓｉ−２細胞、ＢＯＳＣ  ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ  １細胞、ＢＳＣ  ４０細胞、ＢＭＴ  １０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｂ−５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞、および２１１Ａ細胞が挙げられる。好ましい実施形態では、パッケージング細胞は、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、またはＡ５４９細胞である。
【０３５２】
本明細書で使用される場合、「産生細胞株」という用語は、パッケージング細胞株およびパッケージングシグナルを含む移入ベクター構築物を含む、組換えレトロウイルス粒子を産生することができる細胞株を指す。感染性ウイルス粒子およびウイルスストック溶液の作製は、従来の技法を使用して行うことができる。ウイルスストック溶液を調製する方法は当技術分野で公知であり、例えば、Ｙ．  Ｓｏｎｅｏｋａら（１９９５年）Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２３巻：６２８〜６３３頁、およびＮ．  Ｒ．  Ｌａｎｄａｕら（１９９２年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６６巻：５１１０〜５１１３頁によって例示されている。感染性ウイルス粒子は、従来の技法を使用してパッケージング細胞から収集することができる。例えば、感染性粒子は、当技術分野で公知の通り、細胞溶解、または細胞培養物の上清の収集により収集することができる。場合によって、所望であれば、収集されたウイルス粒子を精製することができる。適切な精製技法は、当業者に周知である。
【０３５３】
遺伝子（複数可）または他のポリヌクレオチド配列を、トランスフェクションではなく、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを使用してウイルス感染によって送達することは、「形質導入」と称される。一実施形態では、レトロウイルスベクターを、感染およびプロウイルスの組み込みによって細胞に形質導入する。ある特定の実施形態では、標的細胞、例えば、Ｔ細胞は、ウイルスまたはレトロウイルスベクターを使用した感染によって細胞に送達された遺伝子または他のポリヌクレオチド配列を含む場合、「形質導入」されている。特定の実施形態では、形質導入された細胞は、細胞のゲノム内に、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターによって送達された１つまたは複数の遺伝子または他のポリヌクレオチド配列を含む。
【０３５４】
特定の実施形態では、１つまたは複数のポリペプチドを発現する本発明のウイルスベクターを用いて形質導入を行った宿主細胞を、Ｂ細胞悪性疾患を治療および／または予防するために対象に投与する。本発明のある特定の実施形態に従って利用することができる、遺伝子療法におけるウイルスベクターの使用に関する他の方法は、例えば、Ｋａｙ，  Ｍ．  Ａ．（１９９７年）Ｃｈｅｓｔ  １１１巻（補遺６号）：１３８Ｓ〜１４２Ｓ頁；Ｆｅｒｒｙ，  Ｎ．およびＨｅａｒｄ，  Ｊ．  Ｍ．（１９９８年）Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ９巻：１９７５〜８１頁；Ｓｈｉｒａｔｏｒｙ，  Ｙ．ら（１９９９年）Ｌｉｖｅｒ  １９巻：２６５〜７４頁；Ｏｋａ，  Ｋ．ら（２０００年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｌｉｐｉｄｏｌ．  １１巻：１７９〜８６頁；Ｔｈｕｌｅ，  Ｐ．  Ｍ．およびＬｉｕ，  Ｊ．  Ｍ．（２０００年）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ７巻：１７４４〜５２頁；Ｙａｎｇ，  Ｎ．  Ｓ．（１９９２年）Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
１２巻：３３５〜５６頁；Ａｌｔ，  Ｍ．（１９９５年）Ｊ．  Ｈｅｐａｔｏｌ．  ２３巻：７４６〜５８頁；Ｂｒｏｄｙ，  Ｓ．  Ｌ．およびＣｒｙｓｔａｌ，  Ｒ．  Ｇ．（１９９４年）Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ７１６巻：９０〜１０１頁；Ｓｔｒａｙｅｒ，  Ｄ．  Ｓ．（１９９９年）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．  Ｄｒｕｇｓ  ８巻：２１５９〜２１７２頁；Ｓｍｉｔｈ−Ａｒｉｃａ，  Ｊ．
Ｒ．およびＢａｒｔｌｅｔｔ，  Ｊ．  Ｓ．（２００１年）Ｃｕｒｒ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  Ｒｅｐ．  ３巻：４３〜４９頁；およびＬｅｅ，  Ｈ．  Ｃ．ら（２０００年）Ｎａｔｕｒｅ  ４０８巻：４８３〜８頁に見いだすことができる。
【０３５５】
Ｈ．組成物および製剤
本明細書において意図されている組成物は、本明細書において意図されている１つまたは複数のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それを含むベクター、およびＴ細胞組成物を含み得る。組成物としては、これに限定されないが、医薬組成物が挙げられる。「医薬組成物」とは、細胞または動物に、単独で、または療法の１つまたは複数の他のモダリティと組み合わせて投与するために、薬学的に許容されるまたは生理的に許容される溶液に製剤化された組成物を指す。所望であれば、本発明の組成物は、他の薬剤、例えば、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、小分子、化学療法薬、プロドラッグ、薬物、抗体、または他の種々の薬学的に活性な薬剤などとも組み合わせて投与することができることも理解されよう。同様に組成物に含めることができる他の構成成分には、追加の薬剤が意図された療法を送達する組成物の能力に悪影響を及ぼさないものであれば、事実上制限はない。
【０３５６】
「薬学的に許容される」という句は、本明細書では、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題または合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した、妥当な損益比に見合う化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために使用される。
【０３５７】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤」としては、限定することなく、米国食品医薬品局により、ヒトまたは家畜動物における使用に関して許容されるとして認可を受けている任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）、甘味剤、希釈剤、防腐剤、色素／着色剤、香味増強剤（ｆｌａｖｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定剤、等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）、溶媒、界面活性剤、または乳化剤が挙げられる。例示的な薬学的に許容される担体としては、これらに限定されないが、糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロースなど；デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなど；セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなど；トラガント；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバター、ろう、動物性および植物性脂肪、パラフィン、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛；油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油など；グリコール、例えば、プロピレングリコールなど；ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなど；エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなど；寒天；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど；アルギン酸；発熱物質不含水；等張性の食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝溶液；および医薬製剤に使用される任意の他の適合する物質が挙げられる。
【０３５８】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、本明細書において意図されている方法によって製造されるある量の改変Ｔ細胞を含む。一般に、本明細書において意図されている方法によって製造されるＴ細胞を含む医薬組成物は、体重１ｋｇ当たり細胞１０２〜１０１０個、好ましくは体重１ｋｇ当たり細胞１０５〜１０６個（それらの範囲内の全ての整数値を含む）の投与量で投与することができることが規定され得る。細胞の数は、組成物に含まれる細胞型と同様に、組成物の意図された最終的な使用に左右される。本明細書において提供される使用に関して、細胞は、一般に、１リットルまたはそれ未満の体積であり、５００ｍＬまたはそれ未満、さらには２５０ｍＬまたは１００ｍＬまたはそれ未満であり得る。したがって、所望の細胞の密度は、一般には、１ｍｌ当たり細胞１０６個超であり、一般に、１ｍｌ当たり細胞１０７個超、一般に、１ｍｌ当たり細胞１０８個またはそれ超である。臨床的に関連のある免疫細胞の数は、細胞１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１０１０個、１０１１個、または１０１２個と累積的に等しいまたはそれを超える多数の注入に配分することができる。細胞は、療法を受ける患者に対して同種異系、同系、異種、または自己由来のものであってよい。所望であれば、治療は、注入されたＴ細胞の生着および機能を増強するために、本明細書に記載のマイトジェン（例えば、ＰＨＡ）またはリンフォカイン、サイトカイン、および／またはケモカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１８、およびＴＮＦ−ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１αなど）を投与することも含んでよい。
【０３５９】
一般に、本明細書に記載の通り活性化し増大させた細胞を含む組成物を、免疫無防備状態である個体において生じる疾患の治療および予防において利用することができる。具体的には、本明細書において意図されている方法によって製造される改変Ｔ細胞を含む組成物が、がんの治療において使用されている。本発明の改変Ｔ細胞は、単独で、あるいは、担体、希釈剤、賦形剤と、ならびに／または、ＩＬ−２、ＩＬ−７、および／もしくはＩＬ−１５または他のサイトカインもしくは細胞集団などの他の構成成分と組み合わせた医薬組成物として投与することができる。特定の実施形態では、本明細書において意図されている医薬組成物は、ある量の遺伝子改変Ｔ細胞を、１種または複数種の薬学的にまたは生理的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含む。
【０３６０】
本明細書において意図されている改変Ｔ細胞を含む医薬組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；グリシンなどのポリペプチドまたはアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート化剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および防腐剤をさらに含んでよい。本発明の組成物は、非経口投与、例えば、血管内（静脈内または動脈内）、腹腔内または筋肉内投与用に製剤化することが好ましい。
【０３６１】
一実施形態では、組成物を静脈内に投与する。
【０３６２】
液体の医薬組成物は、溶液か、懸濁物か、または他の同様の形態であるかにかかわらず、以下のうちの１つまたは複数を含んでよい：ＤＭＳＯ、滅菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩溶液、好ましくは生理的食塩水、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム、溶媒または懸濁媒体としての機能を果たし得る合成モノグリセリドまたはジグリセリドなどの不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；酢酸、クエン酸またはリン酸などの緩衝液、および、張度を調整するための薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースなど。
【０３６３】
特定の実施形態では、細胞を、注入可能な凍結用培地（ｉｎｆｕｓｉｂｌｅ  ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ  ｍｅｄｉｕｍ）、５０％ｐｌａｓｍａｌｙｔｅおよび５０％Ｃｒｙｏｓｔｏｒ  １０；５０／４０／１０（ＸＶＩＶＯ／ＨＡＢＳ／ＤＭＳＯ）；またはＣｒｙｏｓｔｏｒ  １０中で凍結させる。
【０３６４】
非経口用調製物は、ガラスまたはプラスチックバッグ、アンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアルに封入することができる。注射用医薬組成物は滅菌されていることが好ましい。
【０３６５】
特定の実施形態では、本明細書において意図されている組成物は、有効量の増大させた改変Ｔ細胞組成物を、単独で、または１種または複数種の治療剤と組み合わせて含む。したがって、Ｔ細胞組成物は、単独で、または、例えば放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光ダイナミック療法などの他の公知のがん治療と組み合わせて投与することができる。組成物は、抗生物質と組み合わせて投与することもできる。そのような治療剤は、特定のがんなどの本明細書に記載の特定の疾患状態に対する標準の治療として当技術分野において許容され得る。意図されている例示的な治療剤としては、サイトカイン、増殖因子、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、抗炎症薬、化学療法薬、放射線療法薬、治療用抗体、または他の活性な薬剤および補助的な薬剤が挙げられる。
【０３６６】
ある特定の実施形態では、本明細書において意図されているＴ細胞を含む組成物は、多くの化学療法剤と併せて投与することができる。化学療法剤の実例としては、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、およびウレドパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド（ｔｒｉｅｔｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチルオロメラミンレジュメ（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ  ｒｅｓｕｍｅ）を含めたエチレンイミンおよびメチルアメラミン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソ尿素；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗薬；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵなどのピリミジン類似体；カルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキセート；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルホルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ）およびドセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｏｍｉｔｈｉｎｅ）（ＤＭＦＯ）；Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（商標）（ベキサロテン）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（商標）（アリトレチノイン）などのレチノイン酸誘導体；ＯＮＴＡＫ（商標）（デニロイキンジフチトクス）；エスペラミシン；カペシタビン；および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）、およびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含めた抗エストロゲン；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体などもこの定義に含まれる。
【０３６７】
種々の他の治療剤は、本明細書に記載の組成物と併せて使用することができる。一実施形態では、Ｔ細胞を含む組成物を抗炎症剤と共に投与する。抗炎症剤または抗炎症薬としては、これらに限定されないが、ステロイドおよびグルココルチコイド（ベタメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロンを含む）、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、抗ＴＮＦ薬、シクロホスファミドおよびミコフェノーレートを含めた非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が挙げられる。
【０３６８】
他の例示的なＮＳＡＩＤは、イブプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、ＶＩＯＸＸ（登録商標）（ロフェコキシブ）およびＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）（セレコキシブ）、およびシアリレートなどのＣｏｘ−２阻害剤からなる群より選択される。例示的な鎮痛薬は、アセトアミノフェン、オキシコドン、トラマドールまたは塩酸プロポキシフェンからなる群より選択される。例示的なグルココルチコイドは、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、またはプレドニゾンからなる群より選択される。例示的な生物学的反応修飾物質としては、細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ４、ＣＤ５など）を対象とする分子、ＴＮＦアンタゴニスト（例えば、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））およびインフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））などのサイトカイン阻害剤、ケモカイン阻害剤および接着分子阻害剤が挙げられる。生物学的反応修飾物質としては、モノクローナル抗体ならびに組換え型の分子が挙げられる。例示的なＤＭＡＲＤとしては、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、ペニシラミン、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、Ｇｏｌｄ（経口用（オーラノフィン）および筋肉内用）およびミノサイクリンが挙げられる。
【０３６９】
本明細書において意図されているＣＡＲで改変されたＴ細胞と組み合わせるのに適した治療用抗体の実例としては、これらに限定されないが、アバゴボマブ（ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アデカツムマブ（ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）、アフツズマブ（ａｆｕｔｕｚｕｍａｂ）、アレムツズマブ、アルツモマブ（ａｌｔｕｍｏｍａｂ）、アマツキシマブ、アナツモマブ（ａｎａｔｕｍｏｍａｂ）、アルシツモマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ（ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）、ベバシズマブ、ビバツズマブ（ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、カンツズマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、シタツズマブ（ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ）、シクツムマブ（ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）、クリバツズマブ（ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、コナツムマブ（ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）、ダラツムマブ、ドロジツマブ（ｄｒｏｚｉｔｕｍａｂ）、デュリゴツマブ（ｄｕｌｉｇｏｔｕｍａｂ）、デュシジツマブ（ｄｕｓｉｇｉｔｕｍａｂ）、デツモマブ（ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）、ダセツズマブ（ｄａｃｅｔｕｚｕｍａｂ）、ダロツズマブ（ｄａｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、エクロメキシマブ（ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ）、エロツズマブ、エンシツキシマブ（ｅｎｓｉｔｕｘｉｍａｂ）、エルツマキソマブ（ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、エタラシズマブ（ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）、ファーレツズマブ（ｆａｒｉｅｔｕｚｕｍａｂ）、フィクラツズマブ（ｆｉｃｌａｔｕｚｕｍａｂ）、フィギツムマブ、フランボツマブ（ｆｌａｎｖｏｔｕｍａｂ）、フツキシマブ（ｆｕｔｕｘｉｍａｂ）、ガニツマブ（ｇａｎｉｔｕｍａｂ）、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ（ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、グレムバツムマブ（ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ）、イブリツモマブ、イゴボマブ（ｉｇｏｖｏｍａｂ）、イムガツズマブ（ｉｍｇａｔｕｚｕｍａｂ）、インダツキシマブ（ｉｎｄａｔｕｘｉｍａｂ）、イノツズマブ、インテツムマブ（ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）、イピリムマブ、イラツムマブ（ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）、ラベツズマブ、レクサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ（ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ）、ルカツムマブ（ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ（ｍｉｎｒｅｔｕｍｏｍａｂ）、ミツモマブ（ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）、モキセツモマブ（ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ）、ナルナツマブ（ｎａｒｎａｔｕｍａｂ）、ナプツモマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ（ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）、ノフェツモマブ（ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ）、オカラツズマブ（ｏｃａｒａｔｕｚｕｍａｂ）、オファツムマブ、オララツマブ（ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）、オナルツズマブ（ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ）、オポルツズマブ（ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ）、オレゴボマブ、パニツムマブ、パルサツズマブ（ｐａｒｓａｔｕｚｕｍａｂ）、パトリツマブ（ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ）、ペムツモマブ（ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）、ペルツズマブ、ピンツモマブ（ｐｉｎｔｕｍｏｍａｂ）、プリツムマブ（ｐｒｉｔｕｍｕｍａｂ）、ラコツモマブ（ｒａｃｏｔｕｍｏｍａｂ）、ラドレツマブ（ｒａｄｒｅｔｕｍａｂ）、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ（ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）、サツモマブ（ｓａｔｕｍｏｍａｂ）、シブロツズマブ（ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、シルツキシマブ、シムツズマブ（ｓｉｍｔｕｚｕｍａｂ）、ソリトマブ（ｓｏｌｉｔｏｍａｂ）、タカツズマブ（ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂ）、タプリツモマブ（ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ）、テナツモマブ（ｔｅｎａｔｕｍｏｍａｂ）、テプロツムマブ（ｔｅｐｒｏｔｕｍｕｍａｂ）、ティガツズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブ（ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ）、ウブリツキシマブ（ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）、ベルツズマブ、ボルセツズマブ（ｖｏｒｓｅｔｕｚｕｍａｂ）、ボツムマブ（ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）、ザルツムマブ、ＣＣ４９および３Ｆ８が挙げられる。
【０３７０】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物をサイトカインと併せて投与する。「サイトカイン」とは、本明細書で使用される場合、１つの細胞集団により放出され、細胞間メディエーターとして別の細胞に作用するタンパク質に対する一般的な用語を意味する。そのようなサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカイン、ケモカイン、例えば、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１ａ、および従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインには、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝臓増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−アルファおよび腫瘍壊死因子−ベータ；ミュラー阻害物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−ベータなどの神経増殖因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータなどの形質転換増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子−Ｉおよびインスリン様増殖因子−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導性因子；インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、およびインターフェロン−ガンマなどのインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１などのインターロイキン（ＩＬ）、ＴＮＦ−アルファまたはＴＮＦ−ベータなどの腫瘍壊死因子；ならびにＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含めた他のポリペプチド因子が含まれる。本明細書で使用される場合、サイトカインという用語は、天然の供給源または組換え細胞培養物に由来するタンパク質、およびネイティブな配列のサイトカインの生物活性のある等価物を包含する。
【０３７１】
Ｉ．標的細胞および抗原
本発明は、一部において、標的細胞、例えば、腫瘍またはがん細胞に向け直された、細胞上の標的抗原に結合する結合性ドメインを有する工学的に作製されたＴ細胞受容体またはＣＡＲを含む遺伝子改変免疫エフェクター細胞を作製するための細胞製造プラットフォームを意図している。がん細胞は、血液およびリンパ系を通じて体の他の部分に拡散する可能性もある。がんには、いくつかの主要な型がある。癌腫は、皮膚、または内臓を裏打ちするもしくは覆う組織において生じるがんである。肉腫は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、または他の結合組織もしくは支持組織において生じるがんである。白血病は、骨髄などの血液形成組織において開始し、多数の異常な血液細胞の産生および血液への侵入を引き起こすがんである。リンパ腫および多発性骨髄腫は、免疫系の細胞において生じるがんである。中枢神経系がんは、脳および脊髄の組織において生じるがんである。
【０３７２】
一実施形態では、標的細胞は、抗原、例えば、他の正常な（所望の）細胞の表面上では実質的に見いだされない標的抗原を発現する。一実施形態では、標的細胞は、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、ニューロン、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、グリア細胞、脂肪細胞（ｆａｔ  ｃｅｌｌ）、骨細胞、軟骨細胞、膵島細胞、ＣＮＳ細胞、ＰＮＳ細胞、肝臓細胞、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｓｅ  ｃｅｌｌ）、腎細胞、肺細胞、皮膚細胞、卵巣細胞、濾胞細胞、上皮細胞、免疫細胞、または内皮細胞である。
【０３７３】
ある特定の実施形態では、標的細胞は膵組織、神経組織、心臓組織、骨髄、筋組織、骨組織、皮膚組織、肝臓組織、毛包、血管組織、脂肪組織、肺組織、および腎臓組織の一部である。
【０３７４】
特定の実施形態では、標的細胞は、腫瘍細胞である。別の特定の実施形態では、標的細胞は、がんを有する患者の細胞などの、がん細胞である。開示されている方法を用いて死滅させることができる例示的な細胞としては、以下の腫瘍の細胞が挙げられる：液性腫瘍、例えば、急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、および骨髄芽球性白血病、前骨髄球性（ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ）白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病および赤白血病など）、慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病など）を含めた白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病など。
【０３７５】
別の実施形態では、細胞は、肉腫および癌腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞癌、肺がん、結腸直腸がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌（例えば、膵臓、結腸、卵巣、肺、乳房、胃、前立腺、子宮頸部（ｃｅｒｖｉｘ）、または食道の腺癌）、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、膀胱癌、ＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫など）などの固形腫瘍細胞である。
【０３７６】
一実施形態では、がんは、請求項１に記載の方法では、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、神経内分泌腫瘍、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、皮膚がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、前立腺がん、肝臓がん、腎がん、膵がん、肺がん、胆管がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部がん、甲状腺髄様癌、卵巣がん、神経膠腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および膀胱がん（ｕｒｉｎａｒｙ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）からなる群より選択される。
【０３７７】
一実施形態では、標的細胞は、肝臓、膵臓、肺、乳房、膀胱、脳、骨、甲状腺、腎臓、皮膚、および造血系の悪性細胞である。別の実施形態では、標的細胞は、肝臓がん、膵がん、肺がん、乳がん、膀胱がん（ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、脳がん、骨がん、甲状腺がん、腎臓がん、皮膚がん、または血液学的がんの細胞である。
【０３７８】
一実施形態では、標的抗原は、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、’グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、またはＶＥＧＦＲ２のエピトープである。
【０３７９】
Ｊ．治療方法
本明細書において意図されている方法によって製造される改変Ｔ細胞は、限定することなく、がん、感染症、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全症を含めた種々の状態の治療において使用するための改善された養子免疫療法をもたらす。特定の実施形態では、本明細書において意図されている工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを用いて初代Ｔ細胞を遺伝子改変することにより、初代Ｔ細胞の特異性を腫瘍またはがん細胞に向け直す。一実施形態では、本発明は、Ｔ細胞を、標的抗原を発現するがん細胞を標的とする工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように改変し、改変Ｔ細胞を、それを必要とするレシピエントに注入する細胞療法の一種を含む。注入された細胞は、レシピエント内の腫瘍細胞を死滅させることができる。抗体療法とは異なり、工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲで改変されたＴ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで複製することが可能であり、したがって、持続したがん療法をもたらすことができる長期持続に寄与する。
【０３８０】
一実施形態では、本発明の工学的に作製されたＴＣＲおよびＣＡＲ  Ｔ細胞は、頑強なｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴ細胞増大を行うことができ、また、長時間にわたって持続することができる。別の実施形態では、本発明の工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲ  Ｔ細胞は、再活性化してあらゆる追加的な腫瘍形成または成長を阻害することが可能な特異的なメモリーＴ細胞に進化する。
【０３８１】
特定の実施形態では、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターを含むベクターを用いて遺伝子改変された免疫エフェクター細胞を含む組成物を、限定することなく、肝臓がん、膵がん、肺がん、乳がん、膀胱がん（ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、脳がん、骨がん、甲状腺がん、腎臓がん、または皮膚がんを含めた固形腫瘍またはがんの治療に使用する。
【０３８２】
特定の実施形態では、ＰＳＣＡまたはＭＵＣ１のエピトープに結合する抗原特異的結合性ドメインを含む工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターを含むベクターを用いて遺伝子改変された免疫エフェクター細胞を含む組成物を、これらに限定されないが、膵臓、膀胱、および肺を含めた種々のがんの治療に使用する。
【０３８３】
特定の実施形態では、工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターを含むベクターを用いて遺伝子改変された免疫エフェクター細胞を含む組成物を、急性白血病（例えば、ＡＬＬ、ＡＭＬ、および骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病および赤白血病）、慢性白血病（例えば、ＣＬＬ、ＳＬＬ、ＣＭＬ、ＨＣＬ）を含めた白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、および重鎖病を含めた液性腫瘍の治療に使用する。
【０３８４】
特定の実施形態では、工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターを含むベクターを用いて遺伝子改変された免疫エフェクター細胞を含む組成物を、これらに限定されないが、多発性骨髄腫（ＭＭ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を含めたＢ細胞悪性疾患の治療に使用する。
【０３８５】
多発性骨髄腫は、成熟形質細胞形態のＢ細胞悪性疾患であり、これらの型の細胞の単一のクローンの腫瘍性形質転換を特徴とする。これらの形質細胞は、ＢＭにおいて増殖し、近接する骨、および時には血液に浸潤し得る。多発性骨髄腫のバリアント形態としては、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌型骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、および髄外性形質細胞腫が挙げられる（例えば、Ｂｒａｕｎｗａｌｄら（編）、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１５版（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  ２００１年）を参照されたい）。
【０３８６】
非ホジキンリンパ腫は、リンパ球（白血球）のがんの大きな群を包含する。非ホジキンリンパ腫は、あらゆる年齢で生じ得、多くの場合、正常よりも大きいリンパ節、発熱、および体重減少を特徴とする。非ホジキンリンパ腫には多くの異なる型が存在する。例えば、非ホジキンリンパ腫は、侵襲性（成長が早い）型と無痛性（成長が遅い）型に分けることができる。非ホジキンリンパ腫は、Ｂ細胞およびＴ細胞に由来し得るが、本明細書で使用される場合、「非ホジキンリンパ腫」および「Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫」という用語は、互換的に使用される。Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）としては、バーキットリンパ腫、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、およびマントル細胞リンパ腫が挙げられる。骨髄または幹細胞移植後に生じるリンパ腫は、通常はＢ細胞非ホジキンリンパ腫である。
【０３８７】
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）は、Ｂリンパ球またはＢ細胞と称される未成熟白血球のゆっくりとした増加を引き起こす無痛性（成長が遅い）がんである。がん細胞は血液および骨髄を通じて拡散し、リンパ節または肝臓および脾臓などの他の器官にも影響を及ぼす可能性がある。ＣＬＬは、最終的には骨髄不全を引き起こす。時には、当該疾患の後期には、当該疾患は小リンパ球性リンパ腫と称される。
【０３８８】
特定の実施形態では、本明細書において意図されている改変Ｔ細胞またはそれを含む組成物の治療有効量を、それを必要とする患者に、単独で、または１種もしくは複数種の治療剤と組み合わせて投与するステップを含む方法が提供される。ある特定の実施形態では、本発明の細胞を、がんが発生するリスクがある患者の治療に使用する。したがって、本発明は、がんを治療または予防するための方法であって、それを必要とする対象に本発明の改変Ｔ細胞の治療有効量を投与するステップを含む方法を提供する。
【０３８９】
一実施形態では、それを必要とする対象においてがんを治療する方法は、本明細書において意図されている遺伝子改変免疫エフェクター細胞を含む組成物の有効量、例えば、治療有効量を投与するステップを含む。投与の数量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の型および重症度などの因子によって決定されるが、適切な投与量は、臨床試験によって決定することができる。
【０３９０】
一実施形態では、対象に投与する組成物中の改変Ｔ細胞の量は、１ｍ２当たり改変Ｔ細胞少なくとも０．１×１０７個、１ｍ２当たり改変Ｔ細胞少なくとも０．５×１０７個、１ｍ２当たり改変Ｔ細胞少なくとも１×１０７個、１ｍ２当たり改変Ｔ細胞少なくとも５×１０７個、１ｍ２当たり改変Ｔ細胞少なくとも０．１×１０８個、１ｍ２当たり改変Ｔ細胞少なくとも０．５×１０８個、１ｍ２当たり改変Ｔ細胞少なくとも１×１０８個、１ｍ２当たり改変Ｔ細胞少なくとも５×１０８個、または１ｍ２当たり改変Ｔ細胞少なくとも１×１０９個、または間に入る任意の改変Ｔ細胞の数である。
【０３９１】
対象に投与する改変Ｔ細胞の数は、多くの場合、対象に投与する総細胞数のサブセットのみである。特定の実施形態では、対象に、少なくとも０．１×１０７個の総Ｔ細胞、少なくとも０．５×１０７個の総Ｔ細胞、少なくとも１×１０７個の総Ｔ細胞、少なくとも５×１０７個の総Ｔ細胞、少なくとも０．１×１０８個の総Ｔ細胞、少なくとも０．５×１０８個の総Ｔ細胞、少なくとも１×１０８個の総Ｔ細胞、少なくとも５×１０８個の総Ｔ細胞、少なくとも０．１×１０９個の総Ｔ細胞、少なくとも０．５×１０９個の総Ｔ細胞、少なくとも１×１０９個の総Ｔ細胞、少なくとも５×１０９個の総Ｔ細胞、または少なくとも０．１×１０１０個の総Ｔ細胞または間に入る任意のＴ細胞の数を投与する。
【０３９２】
所望の療法をもたらすために、本発明の組成物の複数回投与が必要になる場合があることが当業者には認識されよう。例えば、組成物を、１週間、２週間、３週間、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、１年、２年、５年、１０年、またはそれ超の期間にわたって１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０またはそれ超の回数、投与することができる。
【０３９３】
ある特定の実施形態では、活性化Ｔ細胞を対象に投与し、その後、再採血し（またはアフェレーシスを実施し）、その血液から本発明に従ってＴ細胞を活性化し、患者にこれらの活性化し増大させたＴ細胞を再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間ごとに複数回行うことができる。ある特定の実施形態では、１０ｃｃから４００ｃｃまでの採血からＴ細胞を活性化することができる。ある特定の実施形態では、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、１００ｃｃ、１５０ｃｃ、２００ｃｃ、２５０ｃｃ、３００ｃｃ、３５０ｃｃ、または４００ｃｃまたはそれ超の採血からＴ細胞を活性化する。理論に縛られずに、この複数の採血／複数の再注入プロトコールを使用することは、ある特定のＴ細胞の集団を選択するのに役立ち得る。
【０３９４】
本明細書において意図されている組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、埋め込みまたは移植によるものを含めた任意の都合のよい様式で行うことができる。好ましい実施形態では、組成物を非経口的に投与する。「非経口投与」および「非経口的に投与する」という句は、本明細書で使用される場合、経腸および局所投与以外の投与形式、通常は注射によるものを指し、限定することなく、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、腫瘍内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内および胸骨内への注射および注入が挙げられる。一実施形態では、本明細書において意図されている組成物を、対象に、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接注射することによって投与する。
【０３９５】
一実施形態では、それを必要とする対象に、対象におけるがんに対する細胞性免疫応答を増加させるために有効量の組成物を投与する。免疫応答は、感染細胞を死滅させることが可能な細胞傷害性Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞によって媒介される細胞性免疫応答、およびヘルパーＴ細胞応答を含み得る。Ｂ細胞を活性化し、したがって、抗体産生を導くことが可能なヘルパーＴ細胞によって主に媒介される体液性免疫応答も誘導することができる。本発明の組成物によって誘導される免疫応答の型を分析するために様々な技法を使用することができ、それらは当技術分野で十分に記載されている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａｄａ  Ｍ．  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄａｖｉｄ  Ｈ．  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅｔｈａｎ  Ｍ．  Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅｒ編（２００１年）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、Ｎ．Ｙ．。
【０３９６】
Ｔ細胞媒介性死滅の場合では、ＣＡＲ−リガンド結合により、Ｔ細胞へのＣＡＲシグナル伝達が開始され、それにより、種々の機構によって標的細胞のアポトーシスを誘導することができるタンパク質を産生または放出するようにＴ細胞を誘導する種々のＴ細胞シグナル伝達経路が活性化される。これらのＴ細胞媒介性機構としては（これらに限定されないが）、細胞内細胞傷害性顆粒のＴ細胞から標的細胞への移行、標的細胞の死滅を直接（または他のキラーエフェクター細胞の動員によって間接的に）誘導することが可能な炎症促進性サイトカインのＴ細胞による分泌、および、標的細胞上のそれらの同族の細胞死受容体（例えば、Ｆａｓ）に結合した後、標的細胞のアポトーシスを誘導する、Ｔ細胞表面上の細胞死受容体リガンド（例えば、ＦａｓＬ）の上方制御が挙げられる。
【０３９７】
一実施形態では、本発明は、がんと診断された対象を治療する方法であって、対象から免疫エフェクター細胞を取り出すステップと、前記免疫エフェクター細胞を本明細書において意図されている工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲをコードする核酸を含むベクターを用いて遺伝子改変するステップと、それにより、改変免疫エフェクター細胞の集団を作製するステップと、改変免疫エフェクター細胞の集団を同じ対象に投与するステップとを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、免疫エフェクター細胞はＴ細胞を含む。
【０３９８】
ある特定の実施形態では、本発明は、対象内の標的細胞集団に対する、免疫エフェクター細胞に媒介される免疫モジュレーター応答を刺激するための方法であって、対象に、工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲ分子をコードする核酸構築物を発現する免疫エフェクター細胞集団を投与するステップを含む方法も提供する。
【０３９９】
本明細書に記載の細胞組成物を投与するための方法は、対象において工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲのいずれかを直接発現するｅｘ  ｖｉｖｏで遺伝子改変された免疫エフェクター細胞の再導入、または、対象に導入されると、工学的に作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを発現する成熟免疫エフェクター細胞に分化する、免疫エフェクター細胞の遺伝子改変された前駆体の再導入をもたらすために有効な任意の方法を含む。１つの方法は、末梢血Ｔ細胞に、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて本発明による核酸構築物を用いて形質導入を行い、形質導入された細胞を対象に戻すステップを含む。
【０４００】
本明細書において引用されている刊行物、特許出願、および発行された特許は全て、個々の刊行物、特許出願、または発行された特許のそれぞれが参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されたものと同じく参照により本明細書に組み込まれる。
【０４０１】
前述の発明は、明瞭な理解のために図解および実施例により少し詳細に記載されているが、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の主旨または範囲から逸脱することなく、それらに対してある特定の変化および改変を成すことができることが当業者には容易に明らかになろう。以下の実施例は、単に例示として提供され、限定としては提供されない。基本的に同様の結果を得るために変化または改変することができる種々の重大でないパラメータは当業者には容易に認識されよう。
【実施例】
【０４０２】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を用いて工学的に作製した自己由来のＴ細胞を使用した養子細胞療法薬（ＡＣＴ）には、未だ、単純かつ頑強な製造プロセスの欠如という課題がある。生細胞培養の固有の複雑さおよび患者間の変動性に起因して、効率的であり、繰り返すことができ、かつ拡張可能な方法を開発することが重要である。さらに、ＡＣＴを多くの患者に対する標準の治療に転換するために、ＡＣＴのための閉鎖系加工処理の開発が重要である。
【０４０３】
現在、既存のＴ細胞製造方法は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の単離、活性化、形質導入および増大のための種々の複雑なステップを含む。対照的に、本発明者らは、小規模研究モデルを使用して、単純な、頑強な、よく特徴付けられた、柔軟な、閉鎖系Ｔ細胞製造プラットフォームを開発し、これを、工学的に作製されたＣＡＲ  Ｔ細胞のための大規模な臨床的ｃＧＭＰ製造プロセスに転換した。
【０４０４】
製造は、１０日間で平均して６．７５（＋／−１．５）の集団倍加レベルを一貫して達成した。平均形質導入効率は、６５．３％（＋／−１２．４％）であった。培養物の純度は一貫して＞９８％ＣＤ３細胞であった。表現型に関しては、動物モデルおよび臨床試験において、Ｔ細胞は、腫瘍退縮に関連する表面マーカーを発現した。さらに、工学的に作製されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方において、抗原を発現した標的の細胞傷害性を示した。
【０４０５】
（実施例１）
小規模製造プラットフォーム
単純であり、信頼できる、かつ再現性のある新規の小規模製造プラットフォームを確立した。製造プラットフォームは、既存の方法よりも複雑でなく、より頑強であり、ＣＡＲ
Ｔ細胞の活性化、形質導入、および増大に関して最小の操作を実行した。さらに、本明細書において意図されている方法によって製造されるＣＡＲ  Ｔ細胞は、既存の方法によって作製されるものよりも優れるまではいかないにせよ同等の工学的に作製されたＣＡＲ
Ｔ細胞治療薬をもたらした。
【０４０６】
１．ＰＢＭＣの採取
小規模研究製造プラットフォームのためのＴ細胞の供給源としてＰＢＭＣを使用した。全血採取からのＰＢＭＣを、ＦＩＣＯＬＬ（商標）勾配を使用して手動で単離し、洗浄することができる。本実験では、凍結ＰＢＭＣを使用した。凍結したＰＢＭＣのバイアルを３７℃ウォーターバス中で解凍した。解凍したら、ＰＢＭＣを、約２０〜３０ｍＬの温かいＴＣＧＭ培地を含有する５０ｍＬの円錐管に移し、次いで、１７５×ｇで１０分にわたって遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを、２５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含有する小体積のＴＣＧＭに再懸濁させた。再懸濁させた細胞のアリコートをマルチサイザーまたは血球計によって計数し、生存細胞の数を決定した。
【０４０７】
２．培養開始および活性化
０日目（Ｄ０）に、ＰＢＭＣを、Ｔ２５培養フラスコ中に、２５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を伴うＴＣＧＭ１０ｍＬの総体積中、１ｍＬ当たり細胞１×１０６個で播種した。１００ｎｇ／μＬの抗ＣＤ３抗体５μＬおよび１００ｎｇ／μＬの抗ＣＤ２８抗体５μＬを培養物に添加することによってＴ細胞を活性化した。ＰＢＭＣ培養物をセットアップしたら、それらを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内に横たえて、引き続いて形質導入される細胞のために１日目まで（Ｄ１）、または引き続き細胞への形質導入を行わない場合には３日目まで（Ｄ３）インキュベートした。
【０４０８】
３．形質導入
ＣＡＲ  Ｔレンチウイルスベクターの力価を決定した。細胞に、ＰＢＭＣ１０６個（Ｄ０において播いたＰＢＭＣの数）当たり１〜２×１０８ＴＵで形質導入を行った。ウイルスを、ＴＣＧＭ＋ＩＬ−２中に希釈して２ｍＬの体積または２０％ｖ／ｖの培養体積にした。細胞に、ウイルスを用いて約４８時間、３日目まで（Ｄ３）形質導入を行った。
【０４０９】
いくつかの実験により、細胞を活性化した後、約２０〜２４時間での形質導入が最も効率的であることが決定された。Ｄ０、Ｄ１、およびＤ２において、細胞にＧＦＰ発現レンチウイルスをＰＢＭＣ１０６個当たり１〜２×１０８ＴＵで用いて形質導入を行った。形質導入後、形質導入されたＴ細胞の種々の型の百分率および形質導入された細胞のベクターコピー数（ＶＣＮ）を決定するために、ＧＦＰ発現細胞をＦＡＣＳ分析によって単離した。ＧＦＰ発現細胞をＴ細胞マーカー発現に基づいて分析した。ＧＦＰおよびＴ細胞マーカーであるＣＤ３、ＣＤ８、またはＣＤ４を発現する形質導入された細胞は、活性化の２０〜２４時間後（Ｄ１）に細胞への形質導入を行った場合により多く同定された。図１。さらに、ＶＣＮは、活性化の２０〜２４時間後（Ｄ１）に形質導入を行った細胞において、より高かった。図１。
【０４１０】
追加的な実験により、可溶性ＣＤ３およびＣＤ２８リガンドを使用して活性化したＴ細胞の形質導入効率が、他の方法によって活性化したＴ細胞の形質導入効率と同等であることが決定された。ＰＢＭＣを、（ｉ）プレートに結合させた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を１μｇ／ｍＬの濃度で２０〜２４時間にわたって；（ｉｉ）可溶性抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を５０ｎｇ／ｍＬの濃度で２０〜２４時間にわたって使用して活性化し、また、ＰＢＭＣと同じ供給源に由来する富化リンパ球を（ｉｉｉ）ＣＤ３／ＣＤ２８ＤｙｎａｂｅａｄをＴ細胞１に対してビーズ３の比で使用した、ビーズに結合させた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を２０〜２４時間を使用して活性化した。活性化後、細胞に、抗ＣＤ１９発現レンチウイルスをＰＢＭＣ１０６個当たり１〜２×１０８ＴＵで用いて形質導入を行った。抗ＣＤ１９  ＣＡＲおよびＴ細胞マーカーであるＣＤ３、ＣＤ８、またはＣＤ４を発現する形質導入された細胞は、細胞を、可溶性抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を用いて活性化した場合に、他の方法と比較してより多く同定された。図２。さらに、ＶＣＮも、可溶性抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を用いて活性化された細胞において高かった。図２。
【０４１１】
実験により、細胞培養バッグ中での活性化および形質導入がフラスコ中での形質導入と同等であることも決定された。Ｄ０においてＰＢＭＣを可溶性抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を５０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用して２０〜２４時間にわたって活性化した。活性化後、Ｄ１において、細胞に、カッパＬＣ発現レンチウイルスをＰＢＭＣ１０６個当たり３×１０８ＴＵで用いて形質導入を行った。カッパＬＣおよびＴ細胞マーカーであるＣＤ３、ＣＤ８、またはＣＤ４を発現する形質導入された細胞の数は、細胞の活性化および形質導入を細胞培養バッグまたはフラスコのいずれで行っても同等であった。図３。
【０４１２】
４．増大
異なる方法によって活性化したＰＢＭＣの間でのＴ細胞増大も決定した。ＰＢＭＣを、（ｉ）プレートに結合させた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を１μｇ／ｍＬの濃度で２０〜２４時間にわたって；（ｉｉ）可溶性抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を５０ｎｇ／ｍＬの濃度で２０〜２４時間にわたって；および（ｉｉｉ）Ｄｙｎａｂｅａｄをビーズ：Ｔ細胞３：１の比で使用した、ビーズに結合させた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を２０〜２４時間にわたって使用して活性化した。活性化後、細胞に、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ発現レンチウイルスをＰＢＭＣ１０６個当たり１〜２×１０８ＴＵで用いて形質導入を行った。活性化および形質導入された細胞を、増大させるために最大１０日にわたって培養した。３つの方法によって活性化したＰＢＭＣの間の細胞増大は、増大培養期間の持続時間全体を通して同等であった。図４。
【０４１３】
本明細書において意図されているＴ細胞製造方法に供した、複数のドナー由来のＰＢＭＣは、再現性があり、かつ頑強な増大、ＣＡＲ細胞表面発現、およびＶＣＮを示した。ＰＢＭＣを、可溶性抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を５０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用して２０〜２４時間にわたって活性化した。活性化された細胞に、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ発現レンチウイルスをＰＢＭＣ１０６個当たり１〜２×１０８ＴＵで用いて形質導入を行った。１０日間培養した、複数のドナー由来の活性化および形質導入された細胞は、互い、および形質導入されていない対照（ＵＴＤ）の間で同等の成長速度を示した。図５。図５は、増大させた培養物のそれぞれにおいて１０日目に存在したリンパ球の数も示す。ＦＡＣＳ分析により、抗ＣＤ１９発現が、異なる患者から生成された細胞産物の間で同等であり、平均が約６１％になり、範囲は２９％〜８０％であることが決定された（ｎ＝５）。図６。ｑＰＣＲによっても、細胞産物間のＶＣＮが同等であることが実証された。図６。
【０４１４】
５．抗原特異的腫瘍クリアランス
可溶性抗体を使用して活性化したＴ細胞による抗原特異的腫瘍クリアランスは、他の方法を使用して活性化したＴ細胞と同様に良好であった、またはそれより優れていた。ＰＢＭＣを、（ｉ）プレートに結合させた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を１μｇ／ｍＬの濃度で２０〜２４時間にわたって；（ｉｉ）可溶性抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を５０ｎｇ／ｍＬの濃度で２０〜２４時間にわたって；および（ｉｉｉ）Ｄｙｎａｂｅａｄをビーズ：Ｔ細胞を３：１の比で使用した、ビーズに結合させた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を２０〜２４時間にわたって使用して活性化した。活性化後、細胞に、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ発現レンチウイルスをＰＢＭＣ１０６個当たり１〜２×１０８ＴＵで用いて形質導入を行った。活性化および形質導入された細胞を、増大させるために最大１０日にわたって培養した。治療用抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞をＣＤ１９発現Ｄａｕｄｉ細胞または非ＣＤ１９発現Ｋ５６２細胞と共培養した。１０日間の共培養後、可溶性抗体を使用して活性化した抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、他の方法を使用して活性化した抗ＣＤ１９  ＣＡＲ
Ｔ細胞と同じくらいまたはそれよりも良好にＤａｕｄｉ細胞を死滅させた。図７および図８。
【０４１５】
６．小規模製造プラットフォーム
全体として、小規模製造プラットフォームを使用して、１０日間のＴ細胞増大プロセスを開発した：Ｄ０において、ＰＢＭＣを１ｍＬ当たり細胞１×１０６個の密度で播き、５０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を使用して約２４時間にわたって活性化する；Ｄ１において、活性化したＰＢＭＣに、２×１０８ＴＵ／１０６細胞を用いて約２４時間〜４８時間にわたって形質導入を行った；Ｄ３〜Ｄ９、形質導入された細胞を増大させ、対数期成長を維持するために再播種する。Ｔ細胞製造プロセスにより、一般には、ドナーに応じてＴ細胞が１００〜６００倍増大する。
【０４１６】
前述の実験により、小規模研究プロセスを大規模な臨床的ｃＧＭＰ製造プロセスに転換するための重要な要素が同定された。その要素を表１に示す。
【表１】
2020015767.tif 000003
【０４１７】
７．プラットフォームの頑強性
多数のレンチウイルスＣＡＲ構築物を設計し、製造し、評価することにより、製造プラットフォームの頑強性が実証された。構築物を、使用するプロモーター、ｓｃＦＶ、＋／−リンカー、ヒンジ、膜貫通領域およびシグナル伝達ドメインに関して変動させた。図１６。
【０４１８】
ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクター（ＬＶ）上清を、他で記載されている通りＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞において産生させた（例えば、Ｎａｌｄｉｎｉら、１９９６年、Ｄｕｌｌら、１９９８年およびＺｕｆｆｅｒｅｙら、１９９８年）。２９３細胞に、４種のプラスミド：ＨＩＶ  ｇａｇ−ｐｏｌをコードするプラスミド、ＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質をコードするプラスミド、ＨＩＶ  ｒｅｖタンパク質をコードするプラスミド、およびＣＡＲをコードするレンチウイルス移入ベクターを一過性にトランスフェクトする。例えば、図１６。
【０４１９】
ＣＡＲ  Ｔ細胞を上記の実施例１に記載の通り製造した。集団倍加により決定したところ、種々のＣＡＲ  Ｔ細胞産物は同等の成長速度を示した（図１７Ａ）；ｑＰＣＲから、ＶＣＮが異なるＣＡＲ  Ｔ細胞の間で同等であり、細胞当たりおよそ１〜４コピーであることが示され（図１７Ｂ）；異なるＣＡＲ構築物の同等の細胞表面発現がＦＡＣＳによって示された；パーセントマーキング（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｍａｒｋｉｎｇ）は、構築物に応じて約４０％〜６０％にわたった（図１７Ｃ）。
【０４２０】
８．機能的なＣＡＲＴ薬品の生成
抗ＢＣＭＡ発現ＣＡＲ  Ｔ細胞を上記の実施例１に記載の通り製造した。これらのＣＡＲ  Ｔ細胞は抗原特異的腫瘍クリアランスを示した。抗ＢＣＭＡ発現ＣＡＲ  Ｔ細胞を、Ｋ５６２細胞、またはＢＣＭＡを発現するように改変されたＫ５６２細胞と４時間にわたって共培養した。抗原を発現している腫瘍細胞を、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、蛍光をＦＡＣＳによって測定した。抗ＢＣＭＡ発現ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ発現Ｋ５６２細胞を死滅させ（図１８Ａ）、ＩＦＮ−γを放出した（図１８Ｂ）。（ｎ＝３）。
【０４２１】
（実施例２）
小規模研究プラットフォームの大規模臨床ｃＧＭＰ薬物製造プラットフォームへの転換
小規模研究プロセスにより、ＣＡＲ構築物のより高いスループットの評価が可能になり、データは大規模ｃＧＭＰ薬物製造プラットフォームと同等であることが保証された。本実施例は、大規模臨床ｃＧＭＰ薬物製造プラットフォームを使用して実施された代表的な実験からのデータをもたらす。
【０４２２】
１．小規模製造方法と大規模製造方法の比較
図９は、小規模研究Ｔ細胞製造プラットフォームとスケールアップした臨床的ｃＧＭＰ薬物製造プラットフォームのフローチャート比較を示す。実施例１において概説した手順を使用してＣＡＲ  Ｔ細胞を製造した。大規模製造、例えば、図１０〜１２に関しては、ＣＡＲ  Ｔ細胞を以下の通り製造した：
【０４２３】
採取。Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｏｐｔｉａ（登録商標）Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍまたは等価物を使用した白血球アフェレーシスによって細胞を採取した。製造プロセスにおいて使用した白血球アフェレーシス産物の出発体積は約１００ｍＬ〜約２００ｍＬであった。細胞のアリコートを計数し、生存率を決定し、凍結保存し、ＦＡＣＳ分析を使用してＰＢＭＣについて特徴付けた。
【０４２４】
単離。ＰＢＭＣを、Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ（登録商標）５＋Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ）で閉鎖系ＦＩＣＯＬＬ（商標）勾配を使用して単離した。ＦＩＣＯＬＬ（商標）後、軟膜を、２％ＨＡＢＳを伴うＣｌｉｎｉＭＡＣＳ緩衝液を用いて洗浄し、次いで、２５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を伴うＴＣＧＭに再懸濁させた。洗浄前および洗浄後の細胞計数、生存率、およびＰＢＭＣ  ＦＡＣＳ分析を実施した。
【０４２５】
凍結保存。大規模製造方法の特定の実施形態は、単離後かつあらゆるさらなる下流の製造の前にＰＢＭＣを凍結保存することを含む。ＰＢＭＣをＴＣＦＭ中に凍結保存し、速度制御冷凍装置内、約−８０℃〜約−１３５℃の温度で速度制御冷凍装置内、毎分１℃の速度で凍結させ、液体窒素貯蔵タンクの気相中で保管した。
【０４２６】
０日目：培養開始／活性化−バッグ、新鮮な細胞。１×１０８個のＰＢＭＣを、２５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を伴うＴＣＧＭ中１ｍＬ当たりＰＢＭＣ１×１０６個の密度で、１００ｍＬのＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｂａｇ中に播種した。ＰＢＭＣを、５０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体および５０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８抗体を培養物に添加することによって活性化し、約２４時間培養した。
【０４２７】
０日目：培養開始／活性化−バッグ、凍結細胞。大規模製造プロセスの特定の実施形態は、凍結ＰＢＭＣの使用を含む。凍結ＰＢＭＣを３７℃のウォーターバス中で解凍し、２５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を伴うＴＣＧＭで洗浄した。２５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を伴うＴＣＧＭ中１×１０８個の解凍したＰＢＭＣを、１００ｍＬのＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｂａｇ中に播種した。解凍したＰＢＭＣを、５０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体および５０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８抗体を培養物に添加することによって活性化し、約２４時間培養した。
【０４２８】
０日目：培養開始／活性化−ＧＲＥＸバイオリアクター。大規模製造プロセスの特定の実施形態は、ＧＲＥＸバイオリアクター中でＴ細胞を製造することを含む。２５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を伴うＴＣＧＭ中１×１０８個のＰＢＭＣを、１００ｍＬのＴＣＧＭ中に播種してＧＲＥＸ−１００に入れた。ＰＢＭＣを、５０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体および５０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８抗体を培養物に添加することによって活性化し、約２４時間培養した。
【０４２９】
１日目：形質導入。活性化された細胞に、ＰＢＭＣ１０８個当たり１〜２×１０９ＴＵのレンチウイルスを用いて形質導入を行った。レンチウイルスをＴＣＧＭ中に培養体積の２０％になるように希釈した。例えば、培養体積がＴＣＧＭ１００ｍＬの場合、ウイルスを、最大体積２０ｍＬが培養物に添加されるようにＴＣＧＭ中に希釈した。細胞に、約４８時間にわたって形質導入を行った。
【０４３０】
３日目〜１０日目：増大。形質導入された細胞を、２５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含有するＴＣＧＭ中で５〜８日にわたって増大させる。増大の１つまたは複数の日のそれぞれにおいて、場合によって細胞のアリコートを取得し、細胞を計数し、生存率を決定し、凍結保存し、ＦＡＣＳ分析を使用してＰＢＭＣについて特徴付けた。細胞成長を対数期で維持するために、必要に応じて、培養物を１ｍＬ当たりＰＢＭＣ０．３×１０６個〜１ｍＬ当たりＰＢＭＣ０．５×１０６個の密度で再播種した。細胞培養バッグに基づく製造に関しては、７日目において、１０日目までさらなる増大を可能にするために、場合によって細胞をＷＡＶＥバイオリアクターに移した。一実施形態では、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目および／または９日目および／または１０日目に細胞計数を行った。一実施形態では、細胞が７日目までに増大の標的レベルに到達しない場合、増大の増加を可能にするために、細胞をＷＡＶＥバイオリアクターに移し、８日目および９日目に培地の灌流を１日当たり２Ｌで行うことができる。
【０４３１】
ＧＲＥＸに基づく製造に関しては、増大期間全体にわたってＧＲＥＸバイオリアクター中で細胞を継続的に培養した。
【０４３２】
１０日目：回収および凍結保存。増大させた細胞を、Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ（登録商標）５＋Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍで回収し、洗浄した。細胞を２Ｌの０．９％ＮａＣｌで洗浄し、次いで、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅを用いて最終的な洗浄を実施した。回収前および回収後の細胞計数、生存率、およびＦＡＣＳ分析を実施してＣＡＲ  Ｔ細胞の純度および同一性を決定した。回収された細胞を、場合によって５０％ｐｌａｓｍａｌｙｔｅおよび５０％Ｃｒｙｏｓｔｏｒ  １０；５０／４０／１０（ＸＶＩＶＯ／ＨＡＢＳ／ＤＭＳＯ）；またはＣｒｙｏｓｔｏｒ  １０中に凍結保存し、速度制御冷凍装置内、約−８０℃〜約−１３５℃の温度で、速度制御冷凍装置内、毎分１℃の速度で凍結させ、液体窒素貯蔵タンクの気相中で保管した。
【０４３３】
２．細胞表現型は、最終細胞産物において、小規模製造方法と大規模製造方法の間で同等である
上記の実施例１に記載の小規模方法および実施例２に記載の大規模方法を使用してＣＡＲ  Ｔ細胞を製造した。最終細胞産物を、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＡＲ  Ｔ構築物、ＣＤ５６、およびＣＤ６２Ｌ細胞表面マーカーの発現についてのＦＡＣＳ分析に供して、最終産物の細胞組成のあらゆる差異を決定した。研究規模のプラットフォームと臨床規模のプラットフォームの間で最終的なＣＡＲ  Ｔ産物の表現型に有意差は観察されなかった。２種のプラットフォーム間で全ての表面マーカーについてｐ≧０．２０。（ｎ＝３）。図１３。
【０４３４】
３．ＰＢＭＣ単離およびＴ細胞採取のための簡易化細胞加工処理
本明細書において意図されている製造方法の主要な利点のうちの１つは、閉鎖系加工処理ステップの実行である。Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ（登録商標）５＋Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ
Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ）を使用してＰＢＭＣを白血球アフェレーシスによって採取し、単離し、洗浄した。最終的な製造されたＣＡＲ  Ｔ細胞産物を回収し、洗浄するためにもＣｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ（登録商標）５＋を使用した。
【０４３５】
最終的なＰＢＭＣおよびＣＡＲ  Ｔ産物を、多数の実験（ｎ＝１８）にわたって特徴付けて、出発材料および最終産物の細胞組成の純度が著しく一貫していることを実証した。図１４。閉鎖系手法の利用により、製造が簡易化し、ｃＧＭＰ加工処理のために必要な設備が最小化した。
【０４３６】
４．製造プロセスの柔軟性
患者間の変動性に取り組むため、および必要な用量レベルのＣＡＲ  Ｔ細胞産物を確実に達成することができるように、ＣＡＲ  Ｔ細胞を増大させるための多数のデバイスを比較して、意図されている製造プロセスによりもたらされる柔軟性を示した。小規模製造プロセス（Ｔ２５フラスコ）および大規模製造プロセス（ＧＲＥＸ１００、静置細胞培養バッグ、およびＷＡＶＥバイオリアクター）を上記の通り実施した。異なる製造方法によって製造された細胞は、１０日間の培養期間にわたって同等の成長速度および増大した細胞数を示した。図１５Ａ。ＦＡＣＳ分析から、ＣＤ３＋／ＣＡＲ＋細胞の量が製造方法の間で一貫することが示された。図１５Ｂ。さらに、ＣＤ３＋／ＣＡＲ＋細胞のＶＣＮは試験した種々の製造方法の間で同等であった。図１５Ｂ。これらの結果により、意図されているＴ細胞製造方法が柔軟なものであり、同等の最終細胞産物を産生することが実証される。
【０４３７】
一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を本明細書および特許請求の範囲に開示されている特定の実施形態に限定するものと解釈されるべきではなく、全ての可能性のある実施形態を、そのような特許請求の範囲に権利が与えられる等価物の全範囲と共に包含すると解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示により限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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