(57)【要約】【課題】土壌汚染や毒性が低く、抵抗性誘導効果および成長促進効果に優れた植物賦活剤、およびその製造方法を提供すること目的とする。【解決手段】炭素数４〜３０の脂肪酸を０．１〜８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させることで得られる脂肪酸代謝物を含む植物賦活剤、および炭素数４〜３０の脂肪酸を０．１〜８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させる脂肪酸代謝工程を含む、脂肪酸代謝物を含む植物賦活剤の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素数４〜３０の脂肪酸を０．１〜８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させることで得られる脂肪酸代謝物を含む植物賦活剤。
【請求項２】
前記脂肪酸が、２０℃で液体の脂肪酸である請求項１記載の植物賦活剤。
【請求項３】
前記プロテオバクテリアが、菌数１×１０8〜９×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌに前培養されたプロテオバクテリアである請求項１または２記載の植物賦活剤。
【請求項４】
前記代謝が、Ｍｇ、Ｐ、ＮａおよびＫから選ばれる少なくとも１種以上のミネラルの存在下での代謝である請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物賦活剤。
【請求項５】
バイオサーファクタントを含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の植物賦活剤。
【請求項６】
前記代謝が、１０〜４０℃の条件下での代謝である請求項１〜５のいずれか１項に記載の植物賦活剤。
【請求項７】
抵抗性誘導剤として機能する請求項１〜６のいずれか１項に記載の植物賦活剤。
【請求項８】
ナス科植物の青枯れ病予防剤として機能する請求項１〜７のいずれか１項に記載の植物賦活剤。
【請求項９】
炭素数４〜３０の脂肪酸を０．１〜８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させる脂肪酸代謝工程を含む、脂肪酸代謝物を含む植物賦活剤の製造方法。
【請求項１０】
前記脂肪酸が、２０℃で液体の脂肪酸である請求項９記載の植物賦活剤の製造方法。
【請求項１１】
前記プロテオバクテリアが、菌数１×１０8〜９×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌに前培養されたプロテオバクテリアである請求項９または１０記載の植物賦活剤の製造方法。
【請求項１２】
前記脂肪酸代謝工程を、Ｍｇ、Ｐ、ＮａおよびＫから選ばれる少なくとも１種以上のミネラルの存在下で実施する請求項９〜１１のいずれか１項に記載の植物賦活剤の製造方法。
【請求項１３】
バイオサーファクタントを含む植物賦活剤の製造方法である請求項９〜１２のいずれか１項に記載の植物賦活剤の製造方法。
【請求項１４】
前記脂肪酸代謝工程を、１０〜４０℃の条件下で実施する請求項９〜１３のいずれか１項に記載の植物賦活剤の製造方法。
【請求項１５】
抵抗性誘導剤として機能する植物賦活剤の製造方法である請求項９〜１４のいずれか１項に記載の植物賦活剤の製造方法。
【請求項１６】
ナス科植物の青枯れ病予防剤として機能する植物賦活剤の製造方法である請求項９〜１５のいずれか１項に記載の植物賦活剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物賦活剤および植物賦活剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
古くから、植物の成長促進を目的とし、温度条件や日照条件の最適化や施肥などの対策が行われてきた。しかし、これらの対策には限界がある。例えば、施肥に用いる肥料の量を多くしても一定以上の成長促進効果は期待できないばかりか、肥料を多く与えすぎると、かえって植物成長の障害となり、ひいては土壌を汚染してしまう恐れがある。
【０００３】
そこで、前記の対策に加え、成長促進（葉茎の拡大、塊茎塊根の成長促進等を包含する概念である）、休眠抑制、植物のストレスに対する抵抗性の付与、抗老化等の植物成長調節作用などを有する植物賦活剤による成長促進などが報告されている。例えば、特許文献１には、炭素原子数が４〜２４のケトール脂肪酸を有効成分とする植物賦活剤が記載されている。
【０００４】
一方、植物の病害虫防除は化学合成農薬に大きく依存しているが、農薬使用量の削減が土壌汚染や人への健康被害の観点から望まれている。
【０００５】
従来、農薬を使用せずに、植物を病害虫防除する方法として、病害抵抗性誘導剤による対策が知られている。病害抵抗性誘導剤としては、例えば、プロペナゾール、イソチアニル、アシベンゾラルＳメチル（ＡＳＭ）、３’−クロロ−４，４’−ジメチル−１，２，３−チアジアゾール−５−カルボキサニリド（チアジニル）、バリダマイシンなどが挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−１３１００６号公報
【特許文献２】特開平６−３０５９２１公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１記載の植物賦活剤による効果は充分ではなく、賦活作用にさらに優れた植物賦活剤が求められている。また、従来の抵抗性誘導剤は、化学合成されたものであり、毒性が極めて高いという問題がある。前記のプロペナゾール、イソチアニル、アシベンゾラルＳメチル（ＡＳＭ）、３’−クロロ−４，４’−ジメチル−１，２，３−チアジアゾール−５−カルボキサニリド（チアジニル）は、病原菌やウイルスがエリシターとなるサリチル酸による全身獲得抵抗性の誘導（サリチル酸経路）には対応するが、害虫による食害や傷害応答として合成されるジャスモン酸（およびエチレン）による抵抗性の誘導（ジャスモン酸経路）には効果がない。また、バリダマイシンはナス科植物の青枯れ病に対して有効とされているが、例外的にトマトに対しては薬害が生じるので使用できないという問題がある。また、特許文献２は、化学合成されたリノール酸の過酸化物を植物生育調節剤に使用することが開示されているが、病害予防効果が不十分であった。
【０００８】
過酸化脂質をはじめ脂肪酸酸化物が抗菌作用を示すことは知られている。また、リノレン酸などの脂肪酸を原料にし、植物体内でジャスモン酸などが生合成されることも知られている。しかしながら、脂肪酸が微生物代謝によって酸化された脂肪酸代謝物に抵抗性誘導があることは知られていない。
【０００９】
さらに、これらの抵抗性誘導剤や過酸化脂質等は水に対して極めて難溶であり、処理する際には強力な乳化剤や分散剤が必要であった。
【００１０】
本発明は、前記課題を鑑み、土壌汚染や毒性が低く、抵抗性誘導効果および成長促進効果に優れた植物賦活剤、およびその製造方法を提供すること目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、炭素数４〜３０の脂肪酸を０．１〜８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させることで得られる脂肪酸代謝物を含む植物賦活剤に関する。
【００１２】
前記脂肪酸が、２０℃で液体の脂肪酸である植物賦活剤が好ましい。
【００１３】
前記プロテオバクテリアが、菌数１×１０8〜９×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌに前培養されたプロテオバクテリアである植物賦活剤が好ましい。
【００１４】
前記代謝が、Ｍｇ、Ｐ、ＮａおよびＫから選ばれる少なくとも１種以上のミネラルの存在下での代謝である植物賦活剤が好ましい。
【００１５】
前記植物賦活剤が、バイオサーファクタントを含む植物賦活剤であることが好ましい。
【００１６】
前記代謝が、１０〜４０℃の条件下での代謝である植物賦活剤が好ましい。
【００１７】
前記植物賦活剤が、抵抗性誘導剤として機能する植物賦活剤が好ましい。
【００１８】
前記植物賦活剤が、ナス科植物の青枯れ病予防剤として機能する植物賦活剤が好ましい。
【００１９】
また、本発明は、炭素数４〜３０の脂肪酸を０．１〜８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させる脂肪酸代謝工程を含む、脂肪酸代謝物を含む植物賦活剤の製造方法に関する。
【００２０】
前記脂肪酸が、２０℃で液体の脂肪酸である植物賦活剤の製造方法が好ましい。
【００２１】
前記プロテオバクテリアが、菌数１×１０8〜９×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌに前培養されたプロテオバクテリアである植物賦活剤の製造方法が好ましい。
【００２２】
前記脂肪酸代謝工程を、Ｍｇ、Ｐ、ＮａおよびＫから選ばれる少なくとも１種以上のミネラルの存在下で実施する植物賦活剤の製造方法が好ましい。
【００２３】
バイオサーファクタントを含む植物賦活剤の製造方法である植物賦活剤の製造方法が好ましい。
【００２４】
前記脂肪酸代謝工程を、１０〜４０℃の条件下で実施する植物賦活剤の製造方法が好ましい。
【００２５】
抵抗性誘導剤として機能する植物賦活剤の製造方法である植物賦活剤の製造方法が好ましい。
【００２６】
ナス科植物の青枯れ病予防剤として機能する植物賦活剤の製造方法である植物賦活剤の製造方法が好ましい。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の植物賦活剤は、土壌汚染や毒性が低く、抵抗性誘導効果および成長促進効果に優れる。また、本発明の植物賦活剤の製造方法によれば、土壌汚染や毒性が低く、抵抗性誘導効果および成長促進効果に優れる植物賦活剤を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】シロイヌナズナの遺伝子発現量を示すグラフである。
【図２】リアルタイムＰＣＲによるＰＲ１遺伝子の増幅曲線である。
【図３】ナスの根における生育促進結果を示す写真である。
【図４】ナスの根における生育促進結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
植物賦活剤
本発明の植物賦活剤は、炭素数４〜３０の脂肪酸を０．１〜８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させることで得られる脂肪酸代謝物を含むことを特徴とする。
【００３０】
前記脂肪酸代謝物を植物の根、茎または葉に噴霧や塗布することで、植物に抵抗性を誘導したり、成長を促進したりすることができる。これは、脂肪酸代謝物中に抵抗性誘導に関係するサリチル酸経路やジャスモン酸経路を活性化する物質またはこの物質の前駆体が含まれていることによると考えられる。また、成長促進効果も確認できることから成長を活性化する物質も含まれていると考えられる。
【００３１】
前記代謝は、炭素数４〜３０の脂肪酸を素材とし、所定の溶存酸素濃度環境下においてプロテオバクテリアが外分泌または内分泌する酵素等により分解や合成が行われることをいう。例えば、所定の溶存酸素濃度環境下、前記脂肪酸を含有する培地でプロテオバクテリアを培養する方法が挙げられる。
【００３２】
本発明にて用いられる脂肪酸の炭素数は４〜３０であり、１０〜２０が好ましい。炭素数が４未満の場合は、融点・沸点が低いため、培養時の温度で揮発性が高くなり培地中に残存しにくくなる傾向がある。また、３０を超える場合は、融点・沸点が高くなるため、培養時の温度で固体となり培地と混合できず分離してしまう傾向がある。ただし、融点は水素結合の数によって炭素数のみに依存しない場合もある。
【００３３】
本発明にて用いられる脂肪酸は、代謝効率の観点や培地中で固化することを抑制する観点から、２０〜３０℃で液体であることが好ましく、２０℃で液体であることがより好ましい。
【００３４】
前記脂肪酸は、飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸のいずれか、もしくは両方を含む混合物とすることができる。また、植物油やグリセリドの形態や遊離脂肪酸を用いることができるが、分解速度に優れるという理由から遊離脂肪酸（モノカルボン酸）が好ましい。
【００３５】
炭素数４〜３０の遊離脂肪酸としては、酪酸（ブチル酸）、吉草酸（バレリアン酸）、カプロン酸、エナント酸（ヘプチル酸）、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、エレオステアリン酸、アラキジン酸、ミード酸、アラキドン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ネルボン酸、セロチン酸、モンタン酸、メリシン酸などが挙げられ、なかでも炭素数が１０〜２０のカプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、エレオステアリン酸、アラキジン酸、ミード酸、アラキドン酸が好ましく、炭素数が１８のオレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸がより好ましい。
【００３６】
前記脂肪酸を含有する培地を使用する場合の脂肪酸の含有量は、１００ｇ／ｌ以下が好ましく、６０ｇ／ｌ以下がより好ましく、１２ｇ／ｌ以下がさらに好ましい。１００ｇ／ｌを超える場合は、培地の水分との乳化が困難となり、代謝効率が悪化する恐れやプロテオバクテリアの生育を阻害する恐れがある。また、脂肪酸の含有量の下限は特に限定されないが、１．０ｇ／ｌ以上が好ましい。
【００３７】
前記脂肪酸を含有する培地は、他にミネラル成分を含有することが好ましい。ミネラル成分としては、特に限定されず微生物培養に用いられるミネラル成分を挙げることができる。例えば、マグネシウム（Ｍｇ）、リン（Ｐ）、ナトリウム（Ｎａ）またはカリウム（Ｋ）を有する成分が挙げられる。これらの成分は単独で使用することも、複数を併用することもできる。なお、培地中のミネラル成分の含有量は特に限定されず、従来の好気性細菌の培養方法とすることができる。
【００３８】
本発明にて用いられるプロテオバクテリアは、本発明の効果を損なわない限り特に限定されない。脂肪酸の代謝効率や生育効率の観点からは、増殖に適した温度（至適温度）が１０〜４０℃のプロテオバクテリアが好ましく、２０〜３０℃のプロテオバクテリアがより好ましい。
【００３９】
前記プロテオバクテリアは、脂肪酸の代謝効率に優れるという理由から、前培養されたプロテオバクテリアであることが好ましく、菌数が１×１０8〜９×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌまで前培養されていることがより好ましい。
【００４０】
本発明においては、代謝における溶存酸素濃度は、０．１ｍｇ／ｌ以上である。溶存酸素濃度が０．１ｍｇ／ｌ未満の場合は、プロテオバクテリアの活動が低下し脂肪酸の代謝効率が極めて低くなる傾向がある。また、溶存酸素濃度は８ｍｇ／ｌ以下であり、５ｍｇ／ｌ以下が好ましく、３ｍｇ／ｌ以下がより好ましい。溶存酸素濃度が８ｍｇ／ｌを超える場合は、培地中の酸素により脂肪酸が酸化してしまい、植物賦活効果が低下する傾向がある。なお、溶存酸素濃度は株式会社堀場製作所製の溶存酸素計でＰＯ電極に隔膜ガルバニ電極法または隔膜ポーラログラフ法により測定される値とする。
【００４１】
前記代謝における温度は使用するプロテオバクテリアに応じて適宜調整することができ、脂肪酸の代謝効率の観点から、１０〜４０℃が好ましく、２０〜３０℃がより好ましい。
【００４２】
本発明の植物賦活剤は、脂肪酸代謝物に加えバイオサーファクタントを含有することが、脂肪酸および脂肪酸代謝物が水に可溶となり、代謝効率や取扱性の観点から好ましい。なお、本発明に係るバイオサーファクタントとは、プロテオバクテリアに由来する界面活性剤である。
【００４３】
本発明の植物賦活剤は、土壌汚染や毒性が低く抵抗性誘導剤および成長促進剤としての優れた効果を有する。特に抵抗性誘導剤としては、サリチル酸経路およびジャスモン酸経路の両抵抗性誘導を活性化できるという点において従来の抵抗性誘導剤に比べて優れる。また、植物の根、葉または茎の一部に処理することにより植物全身の抵抗性誘導および成長を活発化することができる。
【００４４】
前述のように、ナス科植物の青枯れ病に対する抵抗性誘導剤として知られるバリダマイシンは、例外的にトマトに対して薬害が生じるので使用できないが、本発明の植物賦活剤は、トマトについても薬害を起こさずに青枯れ病に対する抵抗性誘導効果を発揮する。
【００４５】
本発明の植物賦活剤は植物一般に適用することができる。例えば、ナス科、ウリ科などの双子葉類植物、イネ科などの単子葉類植物が挙げられる。また、使用方法としては、植物の葉、茎、根などに塗布したり散布したりする方法や、土壌に散布や灌水する方法などが挙げられる。
【００４６】
製造方法
本発明の脂肪酸代謝物を含む植物賦活剤の製造方法は、炭素数４〜３０の脂肪酸を０．１〜８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させる脂肪酸代謝工程を含むことを特徴とする。
【００４７】
前記脂肪酸代謝工程は、炭素数４〜３０の脂肪酸を素材とし、所定の溶存酸素濃度環境下においてプロテオバクテリアが外分泌または内分泌する酵素等により分解や合成が行われる工程である。例えば、所定の溶存酸素濃度環境下、前記脂肪酸を含有する培地でプロテオバクテリアを培養する方法が挙げられる。
【００４８】
前記脂肪酸代謝工程における溶存酸素濃度は、０．１ｍｇ／ｌ以上である。溶存酸素濃度が０．１ｍｇ／ｌ未満の場合は、プロテオバクテリアの活動が低下し脂肪酸の代謝効率が極めて低くなる傾向がある。また、溶存酸素濃度は８ｍｇ／ｌ以下であり、５ｍｇ／ｌ以下が好ましく、３ｍｇ／ｌ以下がより好ましい。溶存酸素濃度が８ｍｇ／ｌを超える場合は、培地中の酸素により脂肪酸が酸化してしまい、植物賦活効果が低下する傾向がある。なお、溶存酸素濃度は株式会社堀場製作所製の溶存酸素計でＰＯ電極に隔膜ガルバニ電極法または隔膜ポーラログラフ法により測定される値とする。
【００４９】
前記溶存酸素濃度は、培養容器、振とう数、通気量などによって、調整することができる。
【００５０】
前記脂肪酸代謝工程における培養条件は、溶存酸素濃度を所定の範囲とすること以外は、従来の好気性細菌を培養する条件と同様の条件とすることができる。例えば、フラスコによる振とうや、スピナーフラスコまたはジャーファメンターによる通気培養により３〜７日間培養する方法が挙げられる。
【００５１】
培養日数は、脂肪酸の乳化、分解等が充分に行われる日数とすることが好ましいが、撹拌や菌量によって培養日数は変化する。なお、脂肪酸代謝工程の終了は、脂肪酸の分解状態を、波長２３０ｎｍにおける吸光度、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣ／ＭＳ）、液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）等で確認することが好ましい。
【００５２】
脂肪酸代謝工程における温度は使用するプロテオバクテリアに応じて適宜調整することができ、脂肪酸の代謝効率の観点から、１０〜４０℃の条件下で実施することが好ましく、２０〜３０℃の条件下で実施することがより好ましい。
【００５３】
脂肪酸代謝工程における脂肪酸およびプロテオバクテリアは、本発明の植物賦活剤の説明で前述したものを使用することができる。
【００５４】
なお、プロテオバクテリアの前培養工程としては、特に限定されず従来の好気性細菌の培養方法とすることができる。前培養されたプロテオバクテリアは、遠心分離等により菌体のみを回収し、脂肪酸代謝工程に用いることが好ましい。
【００５５】
本発明の製造方法により得られる植物賦活剤は、脂肪酸代謝物に加えバイオサーファクタントを含有することが、脂肪酸および脂肪酸代謝物が水に可溶となり、代謝効率や取扱性の観点から好ましい。なお、本発明に係るバイオサーファクタントとは、プロテオバクテリアに由来する界面活性剤である。
【００５６】
本発明の植物賦活剤は、培地、バイオサーファクタントを含むプロテオバクテリアの外分泌物、菌体などとの混合物である培養液として得られる。当該培養液を本発明の植物賦活剤としてもよく、当該培養液から菌体を遠心分離などにより除去して用いてもよい。培養液は原液のままでも使用することができるが、原液の場合は高温時に植物への処理部分が、ミネラル分が蒸発濃縮され浸透圧の影響で縮む恐れがあり、希釈することが望ましい。希釈倍率としては本発明の効果を発揮する限り特に限定されないが、１００〜５００倍希釈が好ましい。なお、除去した菌体は再度、脂肪酸を含有する培地で培養することにより脂肪酸代謝工程を繰り返し行うことができる。
【実施例】
【００５７】
本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。
【００５８】
試験用植物賦活剤の調製
＜前培養工程＞
ガラス製三角フラスコ内の１ｌの水にペプトン（Ｄｉｆｃｏ製のタンパク質酵素加水分解物）２０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物１．５ｇ、リン酸水素二カリウム１．５ｇを溶解させ、１２１℃、２０分のオートクレーブ滅菌を行い、室温まで冷却後、プロテオバクテリアの菌液を植菌した。なお、培養容器の口はシリコ栓で密栓した。植菌後の容器をバイオシェーカー（タイテック株式会社製のＢＲ−２３ＵＭ）を用い、２０℃、１２０ｒｐｍの条件下で、２４時間培養を行った。培養液中の菌数は５×１０8ｃｅｌｌｓ／ｍｌであった。培養後、培養液を１５，０００×Ｇ、２０℃の条件で遠心分離することで菌体を培養液から分離させ、菌体を回収した。
【００５９】
＜脂肪酸代謝工程＞
ガラス製三角フラスコ内の１ｌの滅菌水に、リノール酸（和光純薬工業株式会社製の一級リノール酸）１２ｇ、硫酸マグネシウム七水和物１．５ｇ、リン酸水素二カリウム１．５ｇおよび前培養工程で得られた菌体の全量を加えた。これを、バイオシェーカー（タイテック株式会社製のＢＲ−２３ＵＭ）を用い、２０℃、１２０ｒｐｍ、溶存酸素濃度４ｍｇ／ｌの条件下で、４日間培養を行った。なお、リノール酸の分解は株式会社島津製作所製の分光光度計ＢｉｏＳｐｅｃ−ｍｉｎｉで波長２３０ｎｍの吸光度を測定することにより培養液を分析し、リノール酸中間生成物の１つである酸化脂質の生成具合により確認した。培養後、菌体を含む培養液を試験用植物賦活剤とし、下記の評価を行った。
【００６０】
キュウリ葉の灰色かび病菌
・実施例１
ポットで生育中のキュウリの本葉に水で５００倍に希釈した試験用植物賦活剤を噴霧した。噴霧から２４時間後、噴霧処理した本葉に灰色かび病菌の胞子懸濁液を染み込ませたろ紙を接触させることで病原菌を接種させた。その後、５日間、２３±２℃、高湿度の環境で生育させ、病原菌接種部位の病徴を評価した。結果を表１に示す。なお予防効果は下記の基準に基づき判断した。
◎：病徴無し
○：僅かに壊死等による褐変等の病徴が認められる
△：明らかに壊死等の褐変症状または病原菌接種部位全体が黄変などの病徴が認められる
×：接種部位全体が壊死等による褐変症状があるまたは褐変面積は大きくないが病原菌接種部位に穴が空くほどの病徴が認められる
【００６１】
・比較例１〜５
試験用植物賦活剤に替えて、水、５００倍希釈木酢液、０．０４％ソルビタン脂肪酸水溶液、０．２％炭酸水素カリウムと０．０１％ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルとの混合水溶液、乳液化済みの０．０８％テトラクロロイソフタロニトリル水溶液を用いたこと以外は実施例１と同様に処理して観察した。結果を表１に示す。
【００６２】
【表１】
2020122000.tif 000002
【００６３】
表１に示す結果より、本発明の植物賦活剤がキュウリの灰色かび病に対する抵抗性を誘導していることがわかる。
【００６４】
シロイヌナズナの根
・実施例２〜４
土壌で栽培中のシロイヌナズナの根に、１０倍、１００倍および５００倍に希釈した試験用植物賦活剤を灌水することで処理した。処理から２４時間後に軟腐病菌（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ  ｓｕｂｓｐ．  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）を地上の葉茎に接種させた。その後、３日間、２３±２℃、高湿度の環境で生育させ、１週間後まで病原菌接種部位の病徴を評価した。結果を表２に示す。発病抑制は下記の基準に基づき判断した。
◎：無処理対比で無病徴葉の面積が全葉面積あたり１．６０倍以上
○：無処理対比で無病徴葉の面積が全葉面積あたり１.４０〜１．５９倍
△：無処理対比で無病徴葉の面積が全葉面積あたり１．２０〜１．３９倍
×：無処理対比で無病徴葉の面積が全葉面積あたり１．２０倍未満
【００６５】
さらに、処理２４時間後に各シロイヌナズナからＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを作成し、サリチル酸経路遺伝子およびジャスモン酸経路遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲにて調べた。なお、遺伝子発現量はｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅの発現量をネガティブコントロールとして計測した。サリチル酸経路のＰＲ１、ＰＲ２、ＰＲ５ジャスモン酸経路のＰＲ３、ＰＲ４およびＰＤＦ１の発現量を図１に示す。ＰＲ１のリアルタイムＰＣＲにおけるＰＣＲ増幅曲線を図２に示す。
【００６６】
・比較例６〜１３
試験用植物賦活剤に替えて、水、過酸化脂質、プロペナゾール、イソチアニル、アシベンゾラルＳメチル（ＡＳＭ）、３’−クロロ−４，４’−ジメチル−１，２，３−チアジアゾール−５−カルボキサニリド（チアジニル）、ケトール脂肪酸水溶液１およびケトール脂肪酸水溶液２を用いたこと以外は実施例２と同様に処理して観察した。結果を表２に示す。
【００６７】
比較例７で使用した過酸化脂質は次の調製方法により調製した。
三角フラスコに蒸留水１００ｍｌ、３２％水酸化ナトリウム水溶液１ｍｌを加えて攪拌子にて攪拌し、湯浴で５０℃とした。さらに、リノール酸（和光純薬工業株式会社製の一級リノール酸）１．２ｇ、３５％過酸化水素０．５３ｍｌ加えて湯浴中大気圧下リフラックス５０℃で、３日間反応させた。反応進捗はシリカゲルプレート（Ｍｅｒｃｋ社製の６０Ｆ２５４  ｏｎ  ｇｒａｓｓ  ｐｌａｔｅ）を用いて展開溶媒クロロホルム：メタノール＝１０：１、硫酸発色にて確認した。原料スポットの直下にＵＶ吸収および硫酸で発色するスポットが過酸化脂質であり、それが原料に対して目算で４〜５割ほどになるところで反応を終了させた。得られた反応物を５％塩酸にて中和し、クロロホルムを加え、クロロホルム層を回収し、分液ロートで水および飽和食塩水で洗浄し、無水ボウショウで脱水した後、クロロホルム層のみをろ過回収、濃縮、真空乾燥させ、シロップ状のリノール酸酸化物を得た。得られたリノール酸酸化物０．６ｇ、リン酸水素二カリウム７５ｍｇ、硫酸マグネシウム七水和物７５ｍｇとともに蒸留水に懸濁させて過酸化脂質とした。
【００６８】
比較例１２で使用したケトール脂肪酸水溶液１は、次の調製方法により調製した。
大豆由来リポキシダーゼ（シグマアルドリッチ社製）１０ｍｇを、リノール酸１ｇ、リン酸二水素カリウム０．１５ｇおよび蒸留水１００ｍｌからなるリノール酸懸濁液へ加えて１昼夜攪拌し、過酸化脂質１を生成させた。なお、過酸化脂質の生成は、ＴＬＣ（展開溶媒クロロホルム：エタノール＝２０：１、硫酸発色）による標準物質との比較、およびＯＤ２３４ｎｍの上昇により確認した。また、過酸化脂質１の主要成分が１３ＨＰＯＤＥ（（９Ｚ，１１Ｅ）−１３−（ヒドロペルオキシ）−９，１１−オクタデカジエン酸）であることをＮＭＲにより確認した。
得られた過酸化物質１にアレンオキシドシンターゼ（シグマアルドリッチ社製）０．１ｍｇを加えて１昼夜攪拌することでケトール脂肪酸とし、その後、氷冷下希塩酸を添加して反応液のｐＨを３．０とすることで酵素反応を停止させた。そしてｐＨを６．５に調整してケトール脂肪酸水溶液１とした。
【００６９】
比較例１３で使用したケトール脂肪酸水溶液２は、次の調製方法により調製した。
コーン胚芽１０ｇを乳鉢ですりつぶし、蒸留水３０ｍｌを加えてさらに乳鉢上ですりつぶして懸濁液とした。得られた懸濁液を１６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することで得られた上清をコーン胚芽由来リポキシゲナーゼ含有物とした。
コーン胚芽由来リポキシゲナーゼ含有物１０ｍｇを、リノール酸１ｇ、リン酸二水素カリウム０．１５ｇおよび蒸留水１００ｍｌからなるリノール酸懸濁液へ加えて１昼夜攪拌し、過酸化脂質２を生成させた。なお、過酸化脂質の生成は、ＴＬＣ（展開溶媒クロロホルム：エタノール＝２０：１、硫酸発色）による標準物質との比較、およびＯＤ２３４ｎｍの上昇により確認した。また、過酸化脂質２の主要成分が９ＨＰＯＤＥ（（９Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ）−９−（ヒドロペルオキシ）−１０，１２−オクタデカジエン酸）であることをＮＭＲにより確認した。
得られた過酸化物質２にアレンオキシドシンターゼ（シグマアルドリッチ社製）０．１ｍｇを加えて１昼夜攪拌することでケトール脂肪酸とし、その後、氷冷下希塩酸を添加して反応液のｐＨを３．０とすることで酵素反応を停止させた。そしてｐＨを６．５に調整してケトール脂肪酸水溶液２とした。
【００７０】
【表２】
2020122000.tif 000003
【００７１】
表２および図１に示す結果より、本発明の植物賦活剤がシロイヌナズナの軟腐病に対する抵抗性を誘導していることがわかる。また、遺伝子の発現量はサリチル酸経路、ジャスモン酸経路ともにＡＳＭやプロペナゾールよりも高いことがわかる。
【００７２】
トマトの葉茎（ポット栽培）
・実施例５
３週間ポットで栽培したトマト（桃太郎）の葉茎に、試験用植物賦活剤の原液１０ｍｌを灌注した。なお、灌注前にポット中の土（約１００ｇ）を充分に湿らせた。灌注から１時間後および２４時間後に、青枯れ病菌を葉茎に接種させた。その後、７日間、３０℃、高湿度の環境で生育させ、青枯れ病の発病率および薬害の発生率を評価した。結果を表３に示す。
【００７３】
さらに、接種から２４時間後および７２時間後の各トマトからＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを作成し、サリチル酸経路遺伝子およびジャスモン酸経路遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲにて調べた。なお、遺伝子発現量は無処理での発現量を１とした場合の指数で示す。結果を表３に示す。
【００７４】
・比較例１４および１５
試験用植物賦活剤に替えて、水および脂肪酸（リノール酸）を用いたこと以外は実施例５と同様に処理して観察した。結果を表３に示す。
【００７５】
【表３】
2020122000.tif 000004
【００７６】
表３に示す結果より、本発明の植物賦活剤が薬害を発生させずにトマトの青枯れ病に対する抵抗性を誘導していることがわかる。また、遺伝子の発現量はサリチル酸経路、ジャスモン酸経路ともに高いことがわかる。
【００７７】
トマトの葉茎（圃場）
・実施例６
青枯れ病の激発圃場にてトマト（麗夏）の苗を６０ｃｍの株間で植え付け、水で５０倍に希釈した試験用植物賦活剤を噴霧（２０ｍｌ／株）および／または土壌灌注（２００ｍｌ／株）を１週間ごとに実施した。その後４週間、１週間ごとに青枯れ病の発病率および薬害の発生率を評価した。結果を表４に示す。
【００７８】
・比較例１６および１７
試験用植物賦活剤に替えて、無処理およびバリダマイシンを用いたこと以外は実施例６と同様に処理して観察した。結果を表４に示す。
【００７９】
【表４】
2020122000.tif 000005
【００８０】
表４に示す結果より、本発明の植物賦活剤がトマトの薬害の発生を抑制しながら、青枯れ病に対する抵抗性を誘導していることがわかる。
【００８１】
ミニバラの葉茎（プランター）
・実施例７
屋外のプランターに植え付けたミニバラ（ルージュ）の葉茎に、水で１００倍に希釈した試験用植物賦活剤を、植え付け直後および１週間間隔で噴霧（５０ｍｌ／株程度）し、自然発生する病害（うどんこ病および黒星病）を１週目および４週目に評価した。結果を表５に示す。
【００８２】
・比較例１８および１９
試験用植物賦活剤に替えて、無処理および０．０２％メパニピリムを用いたこと以外は実施例７と同様に処理して観察した。結果を表５に示す。
【００８３】
【表５】
2020122000.tif 000006
【００８４】
表５に示す結果より、本発明の植物賦活剤がミニバラのうどんこ病および黒星病に対する抵抗性を誘導していることがわかる。
【００８５】
ミニバラの葉茎（ポット）
・実施例８〜１０
ポット栽培のミニバラ（ルージュ）の葉茎に、水で１０倍、１００倍および５００倍に希釈した試験用植物賦活剤を、植え付け直後、１週間後、２週間後および３週間後に噴霧（５０ｍｌ／株程度）し、湿らせたペーパータオルを敷いた密閉箱に移し、多湿条件下で栽培した。１週間後、自然発生する病害（灰色かび病）を、無処理の比較区に対する病防率で評価した。結果を表６に示す。
【００８６】
【表６】
2020122000.tif 000007
【００８７】
表６に示す結果より、本発明の植物賦活剤がミニバラの灰色かび病に対する抵抗性を誘導していることがわかる。
【００８８】
芝の生育促進（発芽率）
・実施例１１
シャーレに湿らせたろ紙を敷き、その上に西洋芝の種３０粒を等間隔に並べた。ろ紙に水で５００倍に希釈した試験用植物賦活剤を注入し、シャーレの蓋をした状態で、２０±２℃、植物育成ライト照射環境で１６時間、暗条件で８時間の繰り返し条件にて３日後と５日後に主根の発芽率を評価した。結果を表７に示す。
【００８９】
・比較例２０
試験用植物賦活剤に替えて、水を用いたこと以外は実施例１１と同様に処理して観察した。結果を表７に示す。
【００９０】
【表７】
2020122000.tif 000008
【００９１】
表７に示す結果より、本発明の植物賦活剤が西洋芝の発芽を促進していることがわかる。
【００９２】
芝の生育促進（葉茎成長）
・実施例１２〜１４
７２穴のセルトレーに種まき用培土を入れ、芝の種を蒔き、乳鉢で粉砕した赤玉土をふるいにかけて薄く覆土した。このセルトレーをステンレス製のタッパーに置いて、１ｃｍ程度の水を張り底面給水とした。これを、２０±２℃、植物育成ライト照射環境で１６時間、暗条件で８時間の繰り返し条件にて育成した。なお、底面の水が完全になくなった時点で水を補給した。そして、全セルの発芽を確認した後、水で１０倍、１００倍および５００倍に希釈した試験用植物賦活剤をスプレーで各セルごとに５ｍｌずつ噴霧処理し、１４日間の葉茎の長さを測定し評価した。結果を表８に示す。
【００９３】
・比較例２１
試験用植物賦活剤に替えて、水を用いたこと以外は実施例１２と同様に処理して観察した。結果を表８に示す。
【００９４】
【表８】
2020122000.tif 000009
【００９５】
表８に示す結果より、本発明の植物賦活剤が西洋芝の茎葉の成長を促進させていることがわかる。
【００９６】
ナスの生育促進
・実施例１５
１５ｃｍ以上までポットで生育したナス（台木赤ナス、穂木千両）の苗１７株を株間６０ｃｍで植え付け、適宜化成肥料、配合肥料および有機質肥料を基肥とし、追肥も行った。水で５０〜１００倍に希釈した試験用植物賦活剤を、植え付け直後および１週間間隔で噴霧（２０〜５０ｍｌ／株程度）および灌注（１００〜３００ｍｌ／株程度）した。そして、１週間ごとに１５ｃｍ以上になった果実を収穫し、収穫個数を評価した。また、整枝は全て３本仕立てとし、植え付け１週間後から主茎の茎長を測定し評価した。結果を表９に示す。
【００９７】
さらに、植え付けから２．３か月後、畝に水を十分に与え柔らかくした後、株元を解しながら株を引き抜いた。引き抜き後、地上部１ｃｍを切断し、根側を水洗し、常温で１日乾燥させた後、６０℃の恒温乾燥器（三洋電機株式会社製のＭＯＶ−１１２Ｕ）で２４時間乾燥させて、乾燥重量を電子天秤（株式会社島津製作所製のＵＸ２２０Ｈ）で計測した。任意に選択した３株についての計測結果を表１０に示す。また、乾燥後の根を撮影した写真を図３および図４に示す。
【００９８】
・比較例２２
試験用植物賦活剤に替えて、無処理としたこと以外は実施例１５と同様に処理して観察した。結果を表９および表１０ならびに図３および図４に示す。
【００９９】
【表９】
2020122000.tif 000010
【０１００】
【表１０】
2020122000.tif 000011
【０１０１】
表９および表１０ならびに図３および図４に示す結果より、本発明の植物賦活剤がナスの成長を促進させていることがわかる。
【０１０２】
上記の結果より、本発明の植物賦活剤および本発明の製造方法により製造される植物賦活剤が、土壌汚染や毒性が低く、抵抗性誘導効果および成長促進効果に優れた植物賦活剤であることがわかる。
【図１】
2020122000.tif 000012
【図２】
2020122000.tif 000013
【図３】
2020122000.tif 000014
【図４】
2020122000.tif 000015