(57)【要約】      （修正有）【課題】創傷治癒用又は皮膚再生用組成物の提供。【解決手段】ジペノサイド７５（Gypenoside LXXV）を有効成分として含む、創傷治癒用又は皮膚再生用薬学的組成物。皮膚線維芽細胞（fibroblast cell）又は角質形成細胞を増殖又は移動させることを特徴とする前記薬学的組成物。成長因子（growth factor）遺伝子の発現を促進することを特徴とする前記薬学的組成物。薬学的に許容される担体をさらに含む前記薬学的組成物。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジペノサイド７５（Gypenoside LXXV）を有効成分として含む、創傷治癒用又は皮膚再生用薬学的組成物。
【請求項２】
前記組成物は、皮膚線維芽細胞（fibroblast cell）又は角質形成細胞を増殖又は移動させることを特徴とする、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記組成物は、成長因子（growth factor）遺伝子の発現を促進することを特徴とする、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記組成物は、皮膚外用剤の形態で提供されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物は、液剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、スプレー剤、パッチ剤、ゲル剤又はエアゾール剤であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
ジペノサイド７５（Gypenoside LXXV）を有効成分として含む、創傷治癒用又は皮膚再生用医薬部外品組成物。
【請求項８】
ジペノサイド７５（Gypenoside LXXV）を有効成分として含む、皮膚再生用化粧料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジペノサイド７５（Gypenoside LXXV）を有効成分として含む創傷治癒用又は皮膚再生用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、身体を保護する防御膜の役割を果たし、疾患に対する身体の一次防御線であり、表皮（epidermis）が微生物侵入に対する障壁となる。よって、創傷ともいう傷、火傷、擦過傷及びその他の皮膚の損傷の治療における一次的な目的は、感染を予防するための迅速な縫合（closure）及び創傷治癒である。
【０００３】
創傷治癒（wound healing）とは、臨床的に皮膚が完全に縫合されることを意味し、角質細胞（keratinocyte）、線維芽細胞（fibroblast）、血管内皮細胞（endothelial cell）、マクロファージ（macrophage）、血小板（platelet）などの各種細胞が相互作用して調節する複雑な過程である（非特許文献１，２）。それぞれの過程は、多くの成長因子（growth factor）、サイトカイン（cytokine）及びケモカイン（chemokine）が調節する複雑な信号伝達網により調節される。
【０００４】
創傷治癒は、一般に炎症（inflammation）、増殖（proliferation）及び再形成（remodelling）の３つの段階を伴う複雑な過程である（非特許文献３）。第１段階において、止血（haemostasis）を達成するための凝固（clotting）、次に細菌及び壊死組織を破壊するための好中球の補充、次にマクロファージの補充が行われる。第２段階において、血管新生（angiogenesis）が生じ、ここで内皮細胞が創傷部位に移動し、それと同時に線維芽細胞が創傷部位に移動して肉芽組織（granulation tissue）が生産されるのを助ける。肉芽組織の形成は再上皮化（reepithelialisation）を誘導する。最終段階において、コラーゲンの生産と破壊のレベルが均等になり、治癒した創傷は最大強度を達成するために徐々に変更される。創傷治癒は、これらの過程のいずれかが適切に機能しないか、好適な時期に機能しないと、遅延したり、損なわれたりする。これは慢性的な創傷を誘発し得るが、このような創傷は個人にとって重要な問題であるだけでなく、コストが大きくなるという臨床的問題でもある。よって、皮膚及び表皮組織を再生させる身体の自然過程を加速化する組成物が求められている。
【０００５】
一方、高麗人参は、パナキサジオール（Panaxadiol, PD）系、パナキサトリオール（Panaxatriol, PT）系、オレアナン（Oleanane）系などの各種ジンセノサイド（Ginsenoside）及びジペノサイド（Gypenoside）を含有する。その種類によって免疫機能増強、中枢興奮作用、副腎皮質刺激ホルモン分泌促進、血小板凝集抑制など機能が異なるので、同系のジンセノサイドでも同じ効果を予測することは困難な現状である。
【０００６】
こうした背景の下、本発明者らは、ジペノサイド７５（Gypenoside 75）が角質形成細胞株の細胞移動（migration）及び増殖（proliferation）に関与し、マウスモデルにおいて創傷治療効果を発揮することを確認し、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Sorg et al., European Surgical Research. 2017
【非特許文献２】Gonzalez et al., An Bras Dermato, 2016
【非特許文献３】Grazul-Bilska et al., Drugs of Today 39, 2003
【非特許文献４】Shibata S., 2001, J. Korean Med. Sci., 16 Suppl:S28-37
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ジペノサイド７５（Gypenoside LXXV）を有効成分として含む、創傷治癒用又は皮膚再生用薬学的組成物を提供することを目的とする。
【０００９】
また、本発明は、ジペノサイド７５（Gypenoside LXXV）を有効成分として含む、創傷治癒用又は皮膚再生用医薬部外品組成物を提供することを目的とする。
【００１０】
さらに、本発明は、ジペノサイド７５（Gypenoside LXXV）を有効成分として含む、保湿用化粧料組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
以下、これらを具体的に説明する。一方、本発明で開示される各説明及び実施形態はそれぞれの他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本発明で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本発明に含まれる。また、以下の具体的な記述により本発明が限定されるものではない。
【００１２】
また、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、通常の実験のみを用いて本発明に記載された本発明の特定の態様の多くの等価物を認識し、確認することができるであろう。さらに、このような等価物も本発明に含まれることが意図されている。
【００１３】
前記目的を達成するための本発明の一態様は、ジペノサイド７５（Gypenoside LXXV）を有効成分として含む、創傷治癒用又は皮膚再生用薬学的組成物を提供する。
【００１４】
本発明の「ジペノサイド７５」とは、ジペノサイド（gypenoside; Gyp）の一種を意味し、「Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ ＬＸＸＶ」、「ＧｙｐＬＸＸＶ」、「Ｇ７５」と相互交換的に用いられる。具体的には、前記ジペノサイド７５は、化学式（１）で表されるものであってもよい。
【００１５】
【化１】
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【００１６】
前記ジペノサイド７５は、化学的に合成することもでき、天然物質から分離することもできる。本発明のジペノサイド７５を天然物質から分離した場合には、前記ジペノサイド７５を含むものであれば、天然物の抽出物又はその分画物が全て含まれる。
【００１７】
また、本発明による化合物は、キラル中心を有するので、Ｒ又はＳ異性体、ラセミ体、ジアステレオマー混合物及びそれぞれのジアステレオマーとして存在し、これら全ての異性体及び混合物は本発明に含まれる。
【００１８】
本発明における「ジペノサイド（gypenoside; Gyp）」とは、トリテルペノイドサポニン（triterpenoid saponin）を意味する。前記ジペノサイドの種類としては、ＧｙｐＬＸＸＶをはじめとして、ＧｙｐＸＶＩＩ、ＧｙｐＸＬＩＸ、ＧｙｐＬＸＸＩＶ、ＧｙｐＸＬＶ、ジペノサイドＵＬ１、ジペノサイドＵＬ２、ジペノサイドＵＬ３、ジペノサイドＵＬ４、ジペノサイドＵＬ５、ジペノサイドＵＬ６、ジペノサイドＵＬ７などが知られている。
【００１９】
本発明のジペノサイド７５は、公知の方法によりジンセノサイドＲｂ１から脱グリコシル化（deglycosylated）して得ることもでき、商業的に入手したものを用いることもできる。
【００２０】
本発明における「脱グリコシル化（deglycosylated）」とは、グリコシド（glycoside）が結合していた化合物から除去されることを意味する。前記「グリコシド（glycoside）」とは、配糖体とも呼ばれ、グリコシド結合（glycosidic bond）により他の官能基に結合している糖分子を意味する。本発明の目的上、前記脱グリコシル化とは、ジンセノサイド化合物内の配糖体が加水分解されて除去されることを意味し、前記配糖体は、グルコース部分（glucose moiety）と同じ意味に解釈されてもよい。一般に、ジンセノサイドの有効性は、その疎水性と細胞壁透過率を強化する脱グリコシル化の程度に応じて増加することが知られており（非特許文献４）、ジンセノサイドＲｂ１から脱グリコシル化して得られた本発明のＧｙｐＬＸＸＶも、大きいサイズ（約１，０００Ｄａ）を有するジンセノサイドに比べて、生体内吸収率が高いことが知られている。
【００２１】
本発明における「創傷治癒」とは、皮膚細胞の損傷による傷を治療することを意味し、前記傷とは、生体の損傷が全て含まれるものであり、創傷ともいう。前記治療とは、本発明の薬学組成物を創傷が生じた個体に投与することにより、創傷の悪化を抑制又は遅延させたり、創傷の症状を好転又は有利に変化させるあらゆる行為を意味する。
【００２２】
前記「個体」とは、創傷が生じたか、創傷が生じる可能性のあるヒトを含むあらゆる動物を意味する。前記動物は、ヒトだけでなく、それに類似する症状の治療を必要とするウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラクダ、カモシカ、イヌ、ネコなどの哺乳動物であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
本発明における「皮膚再生」とは、皮膚保湿の増加、皮膚弾力の増進、皮膚厚の増加、皮膚のシワの改善、皮膚刺激の緩和及び皮膚損傷の回復作用が全て含まれるものであり、具体的には物理的な要因による皮膚損傷から皮膚を再生させることであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
前記組成物は、皮膚線維芽細胞（fibroblast cell）又は角質形成細胞を増殖又は移動させることを特徴とするものであってもよい。
【００２５】
本発明の一実施例においては、創傷治癒において重要な役割を果たすことが知られている角質形成細胞株（keratinocyte, HaCaT cell）及びヒト真皮線維芽細胞（human dermal fibroblast）の増殖及び移動を促進することが確認された。その結果、ジンセノサイド７５が対照群に比べて細胞の増殖及び移動に非常に優れていることが確認された。これは、本発明の組成物が創傷治癒又は皮膚再生に利用可能であることを示唆するものである。また、本発明の組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで皮膚細胞の増殖及び移動を促進する用途に用いられるが、これらに限定されるものではない。さらに、前記皮膚細胞は、角質形成細胞株又はヒト真皮線維芽細胞を含むものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
前記組成物は、成長因子（growth factor）遺伝子の発現を促進することを特徴とするものであってもよい。
【００２７】
本発明の一実施例においては、ケラチン細胞及び皮膚線維芽細胞をジペノサイド７５で処理して各種遺伝子、特に成長因子遺伝子の発現を促進することにより、皮膚再生に関与することが確認された。これは、本発明の組成物が創傷治癒又は皮膚再生に利用可能であることを示唆するものである。
【００２８】
本発明の薬学的組成物に含まれる前記ジペノサイド７５の含有量は、薬学的組成物が創傷治癒又は皮膚再生効果を発揮するものであれば限定されるものではないが、最終組成物の総重量に対してＧｙｐＬＸＸＶを０．０００１重量％〜５０重量％含んでもよく、具体的には０．０１重量％〜１０重量％含んでもよい。
【００２９】
前記組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい。
【００３０】
本発明における「薬学的に許容される」とは、前記組成物に接触する細胞やヒトに毒性がないという特性を示すことを意味する。
【００３１】
具体的には、前記薬学組成物は、それぞれ通常の方法により散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エアゾール剤などの経口剤形、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形態に剤形化して用いられてもよい。本発明において、前記薬学組成物に含まれる担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油が挙げられる。製剤化する場合は、通常用いる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調製される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、これらの固形製剤は、少なくとも１つの賦形剤、例えばデンプン、炭酸カルシウム（calcium carbonate）、スクロース（sucrose）又はラクトース（lactose）、ゼラチンなどを混合して調製される。また、通常の賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤も用いられる。経口用液体製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが挙げられ、通常用いられる通常の希釈剤である水、液体パラフィン以外に種々の賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが用いられてもよい。非経口用製剤としては、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥剤、坐剤が挙げられる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（propylene glycol）、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物性油、オレイン酸エチルなどの注射可能なエステルなどが用いられてもよい。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（witepsol）、マクロゴール、ツイーン（tween）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが用いられてもよい。しかし、本発明の組成物は、創傷治療という目的上、皮膚外用剤の形態で提供されてもよい。具体的には、液剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、スプレー剤、パッチ剤、ゲル剤、エアゾール剤などの皮膚外用剤の形態で用いられてもよい。
【００３２】
本発明の薬学的組成物は、創傷治療に一般に用いられる化合物、例えば抗生剤、抗炎症剤、皮膚治療用調剤、麻酔剤、鎮痛剤などをさらに含んでもよい。これらは、それぞれの剤形に応じて若干異なってもよく、具体的には皮膚外用剤の形態で提供される場合に含まれてもよいが、これに限定されるものではない。一般に、創傷部位の感染を防止したり、感染による創傷の悪化を防止するために、創傷部位に抗生剤、抗菌剤などの薬剤を供給してもよく、痛みの緩和のために、局所麻酔剤、鎮痛剤などを供給してもよく、創傷治癒における過度な炎症反応を防止するために、抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤を供給してもよい。様々な機能性薬剤を含有させて供給することにより、使用上の利便性を図り、効率的な創傷治癒に役立つ環境を造成し、創傷治癒効果をさらに向上させることができる。
【００３３】
本発明の他の態様は、創傷を誘発した個体に前記組成物を投与するステップを含む創傷の治癒方法を提供する。
【００３４】
本発明の薬学組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明における「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用できる合理的な利益／リスク比で疾患を治療するのに十分であり、副作用を起こさない程度の量を意味し、有効用量レベルは、患者の健康状態、創傷の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する感受性、投与方法、投与時間、投与経路及び排出率、治療期間、配合又は同時に用いられる薬物が含まれる要素、並びにその他医学分野で公知の要素により決定されてもよい。
【００３５】
本発明における「投与」とは、適切な方法で個体に所定の物質を導入することを意味する。
【００３６】
本発明の創傷治癒方法において、前記組成物を投与する投与経路及び投与方法は特に限定されるものではなく、目的とする該当部位に前記組成物を含む組成物を送達できるものであれば任意の投与経路及び投与方法を用いることができる。具体的には、前記組成物は、経口又は非経口の様々な経路で投与することができ、その投与経路の例としては、口腔、直腸、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経皮、鼻腔内、吸入などで投与されることが挙げられ、より具体的には皮膚に塗布して投与されることが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３７】
本発明のさらに他の態様は、ジペノサイド７５（Gypenoside LXXV）を有効成分として含む、創傷治癒用又は皮膚再生用医薬部外品組成物を提供する。
【００３８】
本発明における「医薬部外品」とは、ヒトや動物の疾病を治療、軽減、処置又は予防する目的で用いられる繊維、ゴム製品又はそれに類似するもの、人体に対する作用が弱いか、人体に直接作用せず、器具、機械でないものとそれに類似するもの、感染予防のために殺菌、殺虫及びそれに類似する用途で用いられる製剤のいずれかに該当する物品であって、ヒトや動物の疾病を診断、治療、軽減、処置又は予防する目的で用いる物品のうち器具、機械、装置でないもの、及びヒトや動物の構造と機能に薬理学的影響を与える目的で用いる物品のうち器具、機械、装置でないものを除く物品を意味する。
【００３９】
前記組成物を医薬部外品添加物として用いる場合は、前記組成物をそのまま添加してもよく、他の医薬部外品又は医薬部外品成分と共に用いてもよく、通常の方法で適宜用いてもよい。有効成分の混合量は、使用目的に応じて適宜決定される。
【００４０】
本発明の医薬部外品組成物は、具体的には消毒剤、ボディソープ、口腔洗浄剤、ウェットティッシュ、洗剤、石鹸、ハンドウォッシュ、加湿器除菌剤、マスク、軟膏剤又はフィルタ充填剤であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
本発明のさらに他の態様は、ジペノサイド７５（Gypenoside LXXV）を有効成分として含む、皮膚再生用化粧料組成物を提供する。
【００４２】
本発明の化粧料組成物は、皮膚再生だけでなく、皮膚のシワの改善及び創傷治療効果を発揮するものであり、これについては前述した通りである。前記化粧料組成物は、通常の化粧料製造方法により様々な形態に製造することができる。例えば、前記化粧料組成物は、ジペノサイドを含有する香粧製品、化粧水、クリーム、ローションなどの形態に製造してもよく、これは通常のクレンジング液、収斂化粧水及び保湿液で希釈して用いてもよい。また、前記化粧料組成物は、化粧料組成物分野で通常用いられる安定化剤、可溶化剤、ビタミン、顔料、香料などの通常の補助剤を含んでもよい。前記化粧料組成物において、前記ジペノサイドの含有量は、皮膚再生及び創傷除去を達成するのに有効な量、例えば組成物の総重量に対して０．００１〜１０重量％の含有量であってもよく、具体的には約０．０１〜１重量％の含有量であってもよい。
【００４３】
前記化粧料組成物の剤形は、溶液、外用軟膏、クリーム、フォーム、栄養化粧水、柔軟化粧水、香水、パック、柔軟水、乳液、メイクアップベース、エッセンス、石鹸、液体洗浄料、入浴剤、サンスクリーンクリーム、サンオイル、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、ローション、パウダー、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション、パッチ又はスプレーであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
前記化粧料組成物は、一般の皮膚化粧料に配合される化粧品学的に許容される担体を１種以上さらに含んでもよく、通常の成分として、例えば油分、水、界面活性剤、保湿剤、低級アルコール、増粘剤、キレート剤、無機塩類、色素、酸化防止剤、殺菌剤、防腐剤、香料などを適宜配合してもよいが、これらに限定されるものではない。
【発明の効果】
【００４５】
本発明のジペノサイド７５（Gypenoside LXXV）を有効成分として含む組成物は、創傷治癒及び皮膚再生に優れた効果があるので、創傷治癒及び皮膚再生用組成物として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ＨａＣａＴケラチン細胞を様々な濃度の様々なジンセノサイド（ginsenoside）で処理した実験結果である。図１のＡはＭＴＴ分析結果であり、青色に近いほど相対的な増殖値が低いことを意味し、赤色に近いほど相対的な増殖値が高いことを意味する。図１のＢはＨａＣａＴケラチン細胞の移動を位相差顕微鏡（phase-contrast microscopy）で確認した図である。
【図２】ジペノサイド７５（Ｇ７５）とマデカソサイド （ＭＡ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験データである。図２のＡはＨａＣａＴケラチン細胞の細胞増殖をＭＴＴ分析で確認した結果であり、図２のＢはヒト真皮線維芽細胞（dermal fibroblast）の細胞増殖をＭＴＴ分析で確認した結果であり、図２のＣはＧ７５によるＨａＣａＴケラチン細胞移動を確認した図である。
【図３】ジペノサイド７５（Ｇ７５）とマデカソサイド （ＭＡ）の実験結果であり、図３のＡはマウスにおける創傷治療効果を確認した写真であり、図３のＢは測定した創傷治療面積を示す図である。
【図４】創傷治療に関与する生物学的経路とジペノサイド７５の関係を図式化したものである。
【図５】図５のＡ及びＢはＧ７５で処理した創傷組織におけるＣＴＧＦタンパク質の発現レベルを比較した図であり、図５のＣはＣＴＧＦで処理した創傷組織におけるヒト真皮線維芽細胞増殖を確認した図である。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
以下、実施例及び実験例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例及び実験例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明がこれらの実施例及び実験例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４８】
創傷治療に効果的な高麗人参成分の選別
様々なジンセノサイドが創傷回復の重要な過程であるＨａＣａＴケラチン細胞の移動及び細胞増殖に及ぼす影響を調べるための実験を行った。
【００４９】
実施例１−１：ＨａＣａＴケラチン細胞増殖の分析
主なジンセノサイドであるＲｂ１、Ｒｄ、Ｒｅ及びＲｇ１と、その他のジンセノサイドであるＣ−Ｋ、Ｆ１、Ｆ２、Ｇ１７、Ｇ７５、ＰＰＤ、ＰＰＴ、Ｒｇ２、Ｒｇ３、Ｒｈ１及びＲｈ２を用いて、ＨａＣａＴケラチン細胞を０．０１〜２０μＭの濃度で処理し、４８時間後にＭＴＴ分析を行った（図１Ａ）。対照群としてはＤＭＳＯを用いた。
【００５０】
その結果、様々なジンセノサイドが細胞増殖にある程度効果を発揮することが確認された。具体的には、概して１０μＭの濃度のときに最も優れた効果を発揮し、２０μＭの濃度ではむしろ効果が減少することが確認された。
【００５１】
また、ほとんどのジンセノサイドが対照群と比較して相対的に１０２％〜１２０％程度の細胞増殖効果を発揮するのに対して、Ｇ７５においては約１３６．８％の効果を発揮することが確認された。
【００５２】
実施例１−２：ＨａＣａＴケラチン細胞移動の分析
実施例１−１で選別したＧ７５の創傷治療効果を確認するために、掻創（scratch wound）縫合の分析を行った。
【００５３】
具体的には、ＨａＣａＴケラチン細胞を６ウェル培養プレートで２４時間培養し、その後２００−ｕｌマイクロピペットチップでプレートを引っ掻き、残余物をＰＢＳで洗浄し、次に細胞を２４時間培養し、１０μＭジンセノサイド又はＤＭＳＯで処理してギャップ領域を測定した（図１Ｂ）。
【００５４】
その結果、ほとんどのジンセノサイドにおいて対照群と比較してある程度効果があったが、Ｇ７５で処理した場合に効果が最も優れることが確認された。
【００５５】
まとめると、他のジンセノサイドと比較してＧ７５がＨａＣａＴケラチン細胞の増殖に最も優れた効果を発揮することが確認され、１０μＭの濃度のときに細胞増殖効果が最も優れることが分かった。
【実施例２】
【００５６】
Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ ＬＸＸＶの創傷治療効果
実施例１の結果に基づいて、創傷治療に効果があることが知られている物質であるマデカソサイド （madecassoside, MA）とＧ７５の比較実験を行った。
【００５７】
実施例２−１：ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＧｙｐｅｎｏｓｉｄｅ ＬＸＸＶの効果の確認
ＨａＣａＴケラチン細胞とヒト真皮線維芽細胞を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を行った。
【００５８】
各細胞を９６ウェルプレートに播種（seed）して３７℃で４８時間培養し、その後Ｇ７５、ＭＡ又はＤＭＳＯを用いて、５μＭ又は１０μＭの濃度で処理し、４８時間後にＮｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Promega, Wi, USA）により細胞増殖を確認し、実施例１−２と同様に細胞移動を確認した（図２）。
【００５９】
その結果、２種の細胞の両方において、ＭＡは１０μＭの濃度で処理した場合に限って若干の効果を発揮したのに対して、Ｇ７５は５μＭ及び１０μＭの濃度で処理した場合に細胞増殖及び細胞移動が有意に増加することが確認された。また、Ｇ７５が同じ濃度のＭＡに比べて優れた効果を発揮することが確認された。
【００６０】
実施例２−２：ｉｎ ｖｉｖｏでのＧｙｐｅｎｏｓｉｄｅ ＬＸＸＶの効果の確認
切除創傷（excision wound）マウスモデルを用いてＩｎ ｖｉｖｏで創傷縫合活性を測定した。
【００６１】
８週齢のＩＣＲマウスをＮａｒａｂｉｏｔｅｃｈから購入して１週間適応させ、その後実験に用いた。マウスの背部位に５ｍｍの直径を有する全層（full-thickness）円形創傷を２つずつ負わせ、創傷縫合の変化を元の創傷面積に対比させて測定した。各創傷部位をＧ７５（５μＭ／ｗｏｕｎｄ）又はＭＡ（１０μＭ／ｗｏｕｎｄ）で１日に１回ずつ９日間処理した。対照群としてＤＭＳＯ−プロピレングリコールを用いた。
【００６２】
その結果、対照群に比べてＧ７５及びＭＡを用いた場合に創傷部位が小さいことが確認された。これらの効果は治療翌日から明らかに示された。また、Ｇ７５とＭＡにおいては、概して同等又はＧ７５のほうが若干好ましい効果を発揮する傾向があった。
【００６３】
まとめると、Ｇ７５の効果は、創傷治療に効果があることが知られている物質であるマデカソサイドと同等であるか、より優れることが確認された。これは、本発明のＧ７５が創傷治療用組成物として利用可能であることを示唆するものである。
【実施例３】
【００６４】
Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ ＬＸＸＶの作用機序の確認
Ｇ７５が創傷回復にいかに関与するかを確認するために、ＲＮＡシーケンシングを行った。
【００６５】
背に切除創傷を形成してＧ７５又は対照群で処理し、その後３日目に創傷組織からＲＮＡを分離して分析した。ｐ値が０．０５以下であり、１．７倍以上の変化がある場合に有意な変化があるものと見なした。
【００６６】
その結果、Ｇ７５の処理により１０４８個の遺伝子の発現レベルが変化することが確認され、前記遺伝子が創傷治療に関与する成長因子（Growth Factor）の発現を調節するものと推測された。
【００６７】
Ｇ７５が創傷治療に関与する成長因子に及ぼす影響を確認するために、ＲＮＡ配列分析の結果に基づいてｍＲＮＡ発現レベルを測定した。Ｇ７５が有意に発現レベルを増加させた遺伝子のリストを表１に示す。
【００６８】
【表１】
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【００６９】
その結果、ＣＴＧＦ（Connective tissue growth factor）の発現レベルが最も有意に増加することが確認された。
【００７０】
Ｇ７５の処理においてＣＴＧＦタンパク質の発現が増加するか否かを確認するために、創傷をＧ７５で処理し、３日後に皮膚組織を回収してウェスタンブロッティングを行った結果、Ｇ７５で処理した場合にＣＴＧＦタンパク質の発現が有意に増加することが確認された（図５Ａ）。また、ＥＬＩＳＡ分析を行った結果、ヒト真皮線維芽細胞の培養上清をＧ７５で処理した場合にＣＴＧＦの生産量が増加することが確認された（図５Ｂ）。
【００７１】
さらに、ＣＴＧＦの処理において、対照群に比べてヒト真皮線維芽細胞増殖が増加することが確認された（図５Ｃ）。
【００７２】
前記実験結果から、Ｇ７５がＣＴＧＦ生産に関与することにより創傷治療効果を発揮することが分かった。
【００７３】
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明には、前記詳細な説明ではなく後述する特許請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
【図１】
2020066618.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年1月14日(2020.1.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジペノサイド７５（Gypenoside LXXV）を有効成分として含み、前記ジペノサイド７５が創傷治癒又は皮膚再生効果を示す、創傷治癒用又は皮膚再生用薬学的組成物。
【請求項２】
前記組成物は、皮膚線維芽細胞（fibroblast cell）又は角質形成細胞を増殖又は移動させることを特徴とする、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記組成物は、成長因子（growth factor）遺伝子の発現を促進することを特徴とする、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記組成物は、皮膚外用剤の形態で提供されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物は、液剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、スプレー剤、パッチ剤、ゲル剤又はエアゾール剤であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
ジペノサイド７５（Gypenoside LXXV）を有効成分として含み、前記ジペノサイド７５が創傷治癒又は皮膚再生効果を示す、創傷治癒用又は皮膚再生用医薬部外品組成物。
【請求項８】
ジペノサイド７５（Gypenoside LXXV）を有効成分として含み、前記ジペノサイド７５が創傷治癒又は皮膚再生効果を示す、創傷治癒用又は皮膚再生用化粧料組成物。
【請求項９】
ジペノサイド７５（Gypenoside LXXV）の、創傷治癒又は皮膚再生のための使用。