(57)【要約】【課題】卵巣癌腹膜播種の分子機構については不明な点が多く、従って卵巣癌の転移及び再発に対する効果的な予測方法及び治療剤が望まれていた。【解決手段】本発明は、被験体由来の腹水中の組織因子（Tissue Factor、TF）の発現を検出することを特徴とする、被験体における卵巣癌の転移又は再発の予測方法、及び卵巣癌の治療効果のモニタリング方法を提供する。本発明はまた、TFに結合し得る抗体と、抗癌剤とのコンジュゲートを含む卵巣癌治療剤であって、腹腔内投与される、上記治療剤を提供する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体由来の腹水中の組織因子（Tissue Factor、TF）の発現を検出することを特徴とする、被験体における卵巣癌の転移又は再発の予測方法。
【請求項２】
被験体由来の腹水中のTFの発現を検出することを特徴とする、卵巣癌の治療効果のモニタリング方法。
【請求項３】
TFに特異的に結合する抗体を用いてTFの発現を検出する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
ウェスタンブロット法、免疫組織学的検出法、免疫沈降法、又はELISA法によってTFの発現を検出する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
被験体由来の腹水中のTF発現を、正常の対照サンプルにおけるTF発現又は基準値と比較して、卵巣癌の転移若しくは再発の可能性がある、又は治療効果が低いと判定するステップを含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
TFに特異的に結合する抗体を含有する、被験体における卵巣癌の転移又は再発の検出のためのキット。
【請求項７】
TFに結合し得る抗体と、抗癌剤とのコンジュゲートを含む卵巣癌治療剤であって、腹腔内投与される、上記治療剤。
【請求項８】
抗体が、TFに特異的に結合するモノクローナル抗体である、請求項７記載の治療剤。
【請求項９】
抗癌剤が、有糸分裂阻害剤（微小管作用薬）、アルキル化剤、抗癌性抗生物質、代謝拮抗剤、プラチナ製剤、トポイソメラーゼ阻害剤、分子標的薬、及び放射性同位元素から選択される、請求項７又は８記載の治療剤。
【請求項１０】
投与対象患者が、腫瘍摘出手術後の患者である、請求項７〜９のいずれか１項記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験体における卵巣癌の検出方法を提供するものであり、より具体的には卵巣癌の転移又は再発の予測方法、及び卵巣癌の治療効果のモニタリング方法を提供する。本発明はまた、卵巣癌の腹膜浸潤機構に関する新たな知見に基づく卵巣癌治療剤を提供する。
【背景技術】
【０００２】
卵巣癌は女性性器の悪性腫瘍のうち最も死亡率が高いが、その主要因は腹腔内播種性転移という、腹腔内全体に癌細胞が広がり微小な転移を形成する進展形式にある。卵巣は骨盤内臓器であるため、腫瘍が発生しても自覚症状に乏しく、40〜50％の症例がこの腹膜播種性転移を起こした進行症例で発見される。
【０００３】
卵巣癌の臨床経過としては、腹膜播種による胸腹水貯留のため、呼吸苦や腹部膨満感を引き起こすのみならず、治療上でも腹膜播種の制御が困難であるため、最終的に生命維持の恒常性が破綻して落命することが多い。従って、卵巣癌の治療方針や患者の予後を決める上で、腹膜播種形成の分子機構の解明が重要である。
【０００４】
従来、「癌細胞がまず腹膜中皮に直接接着した後、上皮間葉転換を介して腹膜の間質内に浸潤する」という機序が腹膜播種の主たる成立機構として認識されてきた（非特許文献１及び２）。
【０００５】
一方、組織因子（Tissue Factor, TF）は分子量47,000の膜貫通型糖タンパク質であり、通常は血管外組織や血管内皮下の線維芽細胞等に発現しており、血管傷害により血液が流出した際に血中の第VII因子や第VIIa因子と結合して血液凝固カスケードを開始させる因子であることが知られている。TFは遺伝子発現の制御、細胞遊走・細胞死の抑制、炎症、創傷治癒等に関与する他、癌の進行との関連についても報告されている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Gynecol Oncol. 2009; 113: 8143-8148
【非特許文献２】Cancer Metastasis Rev. 2012; 31: 143-162
【非特許文献３】Blood, 2012; 119(4), 924-932
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、卵巣癌の転移について上記の機序を説明し得る実際の転移巣の形態的な提示はほとんど示されておらず、従って、卵巣癌腹膜播種の分子機構については不明な点が多く残されていた。そして、卵巣癌の転移及び再発に対する効果的な予測方法及び治療剤が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで、本発明者等は、卵巣癌患者の腹膜転移部分を形態学的に検討する目的で、卵巣癌患者の腹膜転移部分を詳細に観察した。
【０００９】
その結果、本発明者等は、「癌細胞集塊が腹膜上皮に接着することなく、周囲にフィブリン網を形成して腹腔内に存在したまま腹膜上皮に対峙し、宿主の間質から自身の周囲に線維芽細胞や血管内皮細胞の遊走およびそれに伴う新生血管網の形成を誘導し、それらを足場に成長した後に血管新生誘導経路を利用して腹膜間質へ浸潤する」という新しい卵巣癌の腹膜浸潤機構を発見した。そして、腹膜播種患者の腹膜上皮腹腔側で発育する卵巣癌細胞の周囲にTFが強発現しており、血液中と比較して有意に多量のTFが腹水中で検出されることを見出し、これらの知見に基づき、本発明に到った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下を提供するものである。
１．被験体由来の腹水中の組織因子（Tissue Factor、TF）の発現を検出することを特徴とする、被験体における卵巣癌の転移又は再発の予測方法。
２．被験体由来の腹水中のTFの発現を検出することを特徴とする、卵巣癌の治療効果のモニタリング方法。
３．TFに特異的に結合する抗体を用いてTFの発現を検出する、上記１又は２記載の方法。
４．ウェスタンブロット法、免疫組織学的検出法、免疫沈降法、又はELISA法によってTFの発現を検出する、上記３記載の方法。
５．被験体由来の腹水中のTF発現を、正常の対照サンプルにおけるTF発現又は基準値と比較して、卵巣癌の転移若しくは再発の可能性がある、又は治療効果が低いと判定するステップを含む、上記１〜４のいずれか記載の方法。
６．TFに特異的に結合する抗体を含有する、被験体における卵巣癌の転移又は再発の検出のためのキット。
７．TFに結合し得る抗体と、抗癌剤とのコンジュゲートを含む卵巣癌治療剤であって、腹腔内投与される、上記治療剤。
８．抗体が、TFに特異的に結合するモノクローナル抗体である、上記７記載の治療剤。
９．抗癌剤が、有糸分裂阻害剤（微小管作用薬）、アルキル化剤、抗癌性抗生物質、代謝拮抗剤、プラチナ製剤、トポイソメラーゼ阻害剤、分子標的薬、及び放射性同位元素から選択される、上記７又は８記載の治療剤。
１０．投与対象患者が、腫瘍摘出手術後の患者である、上記７〜９のいずれか記載の治療剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明者等が見出した卵巣癌の浸潤機構は従来の常識を覆すものであり、新たな視点から卵巣癌の検出及び治療のための手段を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ａ：卵巣癌腹膜転移症例の患者から取得した組織切片における免疫組織染色の結果を示す。腹膜中皮細胞層（黒矢じり）の外側にCD31陽性の血管内皮細胞によって構築される血管のネットワーク（白矢印）が見られる。黒矢印は癌細胞集塊を示す。バーは50μm。Ｂ：Ａ中の四角で囲んだ部分の拡大写真を示す。バーは25μm。
【図２】卵巣癌腹膜転移症例の患者から取得した組織切片におけるTFの発現を示す。Ａ：TFは線維組織（白矢じり）で検出された。バーは50μm。Ｂ：卵巣癌細胞集塊の周囲でTFが検出された。バーは100μm。Ｃ：腹膜中皮細胞層が広範囲に消失し（白矢じり）、腹腔及び卵巣癌細胞集塊周辺の間質組織は統合されていた（黒矢印）。バーは100μm。Ｄ：卵巣癌細胞集塊の周囲でTFが検出された。バーは200μm。
【図３】卵巣癌の腹膜浸潤機構を模式的に示す。Ａ：癌細胞が腹膜組織に炎症を誘導し、透過性を亢進した毛細血管からフィブリノゲンが析出されて癌細胞集塊周囲にフィブリン網を形成し、癌細胞集塊が腹膜上皮に接着することなくこれに対峙する。Ｂ：癌細胞集塊周囲のフィブリン網内に線維芽細胞や血管内皮細胞の遊走およびそれに伴う新生血管網の形成が誘導される。Ｃ：新生された血管や間質組織を足場に癌細胞集塊が発育する。Ｄ：発育した癌細胞集塊が血管誘導経路を利用して腹膜中皮細胞層の欠損を拡大しつつ腹膜間質内に浸潤する。
【図４】Ａ：ステージＩ〜IVの卵巣癌患者（33症例）における腹水中及び血液中のTF濃度を示す。データは同じ術者により２重に測定した中央値を示す。*：p<0.001。Ｂ：腹水サンプルと血液サンプルの双方が取得できた12名の被験体について、各サンプル中のTF濃度を比較して示す。*：p=0.001。Ｃ：卵巣癌患者由来の一次病変組織（Pri）及び腹膜転移組織（Met）におけるTFの発現をRT-PCRで確認した結果を示す。PC：陽性対照（卵巣癌細胞株SKOV3）、NC：陰性対照（cDNAテンプレートを含まないサンプル）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明者等は、腹膜上皮の腹腔側で発育する卵巣癌細胞集塊の周囲にフィブリン網形成に関わるTFが強発現していることを見出した。卵細胞癌の新たな腹膜浸潤機構を示す本発明者等の知見は、卵巣癌の転移又は再発の予測、卵巣癌の治療効果のモニタリングに利用することができ、また新たな卵巣癌治療剤を提供することができる。
【００１４】
本発明は、一態様において、被験体由来の腹水中の組織因子（Tissue Factor、TF）の発現を検出することを特徴とする、被験体における卵巣癌の転移又は再発の予測方法を提供する。
本発明はまた、別の態様において、被験体由来の腹水中のTFの発現を検出することを特徴とする、卵巣癌の治療効果のモニタリング方法を提供する。
【００１５】
本明細書において、「TFの発現」とは、特に組織因子（TF）タンパク質の発現を意図するものとし、特に示さない限り、「TF」とは「TFタンパク質」を意味するものとする。
【００１６】
上記の通り、通常、TFは膜貫通型のタンパク質として存在するが、本発明者等は、ステージI〜IVと診断された卵巣癌患者の腹水中に血液中と比較して有意に多量のTFが存在することを見出した。
【００１７】
本発明において、被験体は、哺乳動物であり、特に限定するものではないが、ヒトであることが好ましい。卵巣癌の転移又は再発を検出するため、被験体は、卵巣癌を有するとして診断された被験体、及び卵巣摘出手術等の治療を受けた被験体であり得る。あるいは、本発明の方法を治療薬の開発等の研究で利用するためには、被験体は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、サル等の非ヒト哺乳動物であり得る。
【００１８】
ヒトTFのアミノ酸配列の情報は、米国国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information, NCBI）が管理するデータベースからGenBank: AAA61152.1として取得することができる。また、ヒトTFをコードする遺伝子の塩基配列については、同様にGene ID: 2152として取得することができる。非ヒト哺乳動物におけるTFのアミノ酸配列及びこれをコードする遺伝子の塩基配列等の情報についても、同様に取得することができる。
【００１９】
TFの発現は、特に限定するものではないが、一般的には、当分野で通常行われているように、TFに特異的に結合する抗体を用いて検出することができる。抗体の検出のためには、限定するものではないが、例えばウェスタンブロット法、免疫組織学的検出法、免疫沈降法、又はELISA法を利用することができる。
【００２０】
本発明において用いる抗体は、TF、特に膜結合型TFにおける細胞外ドメインを特異的に認識して結合し得る抗体であって、他のタンパク質には結合しない抗体であることが好ましい。あるいはまた、抗体は、TF特有のマイクロパーティクルを認識する抗体であっても良い。
【００２１】
本明細書において、「結合する」及び「特異的に結合する」とは、特に限定するものではないが、抗原と抗体との結合が10-8M以下、好ましくは10-9M以下、より好ましくは10-10M以下のKD値の結合親和性を有するものであることを意味し得る。
【００２２】
あるいはまた、本明細書において「TFに特異的に結合する」とは、TFに対する結合が、一般的な結合アッセイで検出して、TF以外の物質に対する結合と比較して2倍以上、3倍以上、4倍以上である場合を意味し得る。例えば、当分野で通常使用される蛍光標識によって結合を検出する場合に、S/N比が2以上、3以上、4以上である場合を意味し得る。
【００２３】
ウェスタンブロット法による検出は、TFを含み得るサンプルを、SDS-PAGEによって展開した後、タンパク質を疎水性膜に転写し、TFに特異的に結合し得る抗体を用いて検出することを含む。
【００２４】
免疫組織学的検出法は、被験体から採取した組織切片を固定した後、TFとこれに対する抗体との結合を可視化することによって行う。可視化のための方法としては、オートラジオグラフィー、金コロイド法、蛍光抗体法、酵素抗体法等が挙げられ、また、抗体の標識は、TFに対して結合する抗体を直接標識するものであっても、標識した二次抗体を使用するものであっても良い。
【００２５】
免疫沈降法は、サンプル中のTFと、これに対する抗体との反応で得られる複合体を形成させ、ビーズに固相化したプロテインA若しくはG又は二次抗体と結合させた後、未結合の物質と分離することを含む。
【００２６】
ELISA法は、抗原抗体反応の後、酵素標識した一次抗体又は二次抗体による酵素活性を測定して数値化することを含み、直接法、間接法、サンドイッチ法、競合法が知られ、当分野において広く使用されている検出・定量方法である。
【００２７】
本発明において使用される抗体は、TFに特異的に結合するものである限り、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体であっても良いが、モノクローナル抗体であることが好ましい。また、本発明の抗体は、卵巣癌の転移又は再発の検出のためにin vitroで使用することが意図され、従って、マウス、ウサギ、ヤギ等の非ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体のいずれであっても良く、特に限定するものではない。
【００２８】
抗原が特定されている場合の抗体の作製方法は当分野において周知である。本発明において使用し得る抗体は、TF又はその断片を非ヒト哺乳動物に免疫して、公知の手法によってポリクローナル抗体として取得することができる。また、モノクローナル抗体は、TFに対する抗体を産生する抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させて得られるハイブリドーマから得ることができる。
【００２９】
本発明において使用し得る抗体はまた、活性が実証された抗体のアミノ酸配列情報又は該抗体をコードするポリヌクレオチドの塩基配列情報に基づいて、遺伝子工学的手法を用い、あるいは化学合成手段を用いて、合成によって取得することもできる。活性が実証された抗体の配列情報に基づいて更なる抗体を作製する場合、特に元の抗体の相補性決定領域（CDR）の配列を考慮して、同一又は同等の結合親和性を有する抗体を作製することができ、また更に結合親和性の高い抗体を得ることもできる。
【００３０】
遺伝子工学的手法によって抗体を作製する場合、重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチドを適切な宿主細胞に導入して発現させ、組換え蛋白質として得ることができる。この場合、ポリヌクレオチドはDNAであってもRNAであっても良く、また宿主細胞への導入手段は当分野で使用されているものを適宜利用することができる。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するためのベクターとして、ウイルスベクター、プラスミドベクター、ファージベクター等を適宜使用することができる。宿主細胞としては、例えば大腸菌等の細菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等を利用することができる。ここで、重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、別個のベクターに導入しても、同一のベクターに連結して導入しても良い。
【００３１】
例えば、本発明において使用し得る抗体の重鎖及び軽鎖をコードするcDNAを、場合によってシグナル配列、ポリA配列、更にプロモーター配列等の調節配列、選択マーカーと共に含むベクターに組み込んで、適切な宿主細胞中に導入して培養することで、TFを特異的に認識し得る抗体を組換えタンパク質として取得することができる。
【００３２】
従って、本発明において使用し得る抗体は、上記のようにして作製された抗体であり、例えば遺伝子工学的手法を用いて取得された組換えタンパク質であるか、あるいは化学合成手段を用いて合成されたタンパク質であり得る。
【００３３】
本発明において使用し得る抗体をモノクローナル抗体として使用する場合、抗体は、IgG抗体分子、IgM抗体分子、又はそれらの抗原結合性断片及び抗原結合性誘導体であり得る。例えば、抗体は、完全抗体、Fab、Fab'、F(ab')2断片、また重鎖可変領域（VH）及び軽鎖可変領域（VL）をリンカーで連結した一本鎖抗体（scFv）断片、scFv-Fc、sc(Fv)2、Fv、ダイアボディー等であり得る。
【００３４】
scFv、scFv-Fc、及びsc(Fv)2はリンカーで可変領域を連結した合成ポリペプチドである。リンカーとしては、当分野で通常使用されるものであればいずれでも良く、特に限定するものではないが、例えば5〜25個、好ましくは10〜20個のアミノ酸残基からなるペプチドリンカー、例えばGSリンカー等を好適に使用することができる。
【００３５】
本発明において使用し得る抗体には更に、抗原結合性に影響しない範囲で当業者に理解され得る誘導体、例えば抗体精製を容易にしたり安定性を高めたりするための修飾が施された誘導体も含まれる。本明細書においては、TFとの結合性を保持する断片及び誘導体を、文脈に矛盾のない限り、便宜的に「抗体」に含めることが意図される。
【００３６】
本発明において使用し得る抗体はまた、二量体、三量体、四量体等の多量体として合成することもできる。更に、本発明において使用し得る抗体は、TFに結合する第1の特異性と、他の抗原に対して結合する第2の特異性とを有する二重特異性抗体であっても良い。当業者であれば、本明細書の記載、及び当分野における技術常識に基づいて、本発明の抗体を用途に応じた適切な形態のものとして取得することができる。
【００３７】
本発明において使用し得る抗体として、TFに対する結合特異性を有する抗体として市販されているものを使用しても良く、またそのような抗体の合成を依頼することもできる。更に、本発明において使用し得る抗体は、検出のために標識された抗体であっても良く、標識は、特に限定するものではないが、例えば蛍光色素標識、酵素標識、放射性標識等であって良い。
【００３８】
TFの発現の検出は、サンプル中のTFの存在又は増減（変動）を検出することを含む。更に、本発明の方法は、例えば、被験体由来の腹水中のTF発現を検出するステップに加えて、卵巣癌を有さない正常の対照サンプルにおけるTF発現、又は予め作成した基準値と比較して卵巣癌の転移若しくは再発の可能性があると判定するステップを含み得る。あるいは、本発明の方法は、被験体由来の腹水中のTF発現を検出するステップに加えて、卵巣癌を有さない正常の対照サンプルにおけるTF発現、又は予め作成した基準値と比較して、被験体に対して行われた手術等の卵巣癌に対する治療の効果が低いと判定するステップを含み得る。
【００３９】
「基準値」は、例えばサンプル中のTF濃度、TFに結合する抗体量（絶対量若しくは標識に由来する蛍光強度等）等として得ることができる。あるいは、「基準値」は、ウェスタンブロットで検出されたバンド強度から算出することもできる。
【００４０】
例えば、卵巣癌患者と健常者、あるいは卵巣癌の各ステージにおける臨床的症状との相関性を考慮して2群（高発現群及び低発現群）に分けた数値を多数の被験体由来のデータからそれぞれ取得し、統計学的に得られるカットオフ値を基準値として使用することができる。
【００４１】
上記の基準値を使用して、被験体由来の腹水サンプルからの検出結果に基づいて、その被験体の状態、例えば卵巣癌の転移又は再発の可能性を予測することが可能となる。上記の基準値と比較して被験体由来のTFの検出結果が高い場合に、その被験体が卵巣癌の転移又は再発の可能性を予測することが可能である。
一実施形態において、本発明の方法は、卵巣癌の転移及び／又は再発を予測するための方法であり得る。
【００４２】
本発明の方法は、被験体由来の腹水中のTFを新たなバイオマーカーとして検出するものである。被験体由来の検出結果から、被験体由来の腹水サンプル中でTFが高発現している場合に、被験体において卵巣癌が転移又は再発をしている可能性が示される。
【００４３】
＜キット＞
本発明はまた、TFに特異的に結合する抗体を含有する、被験体における卵巣癌の転移又は再発の検出のためのキットを提供する。本キットは、上記の本発明の方法において好適に使用することができる。
【００４４】
本発明のキットにより、TFに特異的に結合する抗体を被験体に由来する腹水サンプルと接触させ、サンプル中の上記抗体と結合する抗原、すなわちTFの発現の有無及び／又は発現量を検出することができる。例えば上記抗体、又は上記抗体に対する二次抗体を蛍光試薬や発色試薬等で標識し、蛍光又は発色を検出することで確認することができる。
更に、本発明のキットは、抗体とTFとの結合反応のための反応液、反応容器、検出のための標識試薬、二次抗体、緩衝剤、使用説明書等を含むことができる。
【００４５】
＜卵巣癌治療剤＞
本発明はまた、TFに結合し得る抗体と、抗癌剤とのコンジュゲートを含む卵巣癌治療剤であって、腹腔内投与される、上記治療剤を提供する。
【００４６】
抗TF抗体を用いた抗癌剤のデリバリーシステムが開発されつつあるが、それらは血中投与を念頭においている（例えばYamamoto et al., Cancer Sci, 2015; 106: 627-634；Koga et al., Int J. Cancer, 2015; 137: 1457-1466; Sugaya et al., Cancer Sci, 2016; 107: 335-340）。一方、卵巣癌の抗癌剤投与法の一つに腹腔内投与が挙げられているが（Karam et al., Ann Oncol. 2017; 28: 711-717）、これまで周囲にTFを強発現させたまま卵巣癌細胞集塊が腹腔内で発育するという概念がなかったため、抗TF抗体を用いた抗癌剤においては腹腔内投与という選択肢はなかった。本発明により、卵巣癌の腹膜播種症例には腹腔内投与のほうが有利である理論的根拠が示された。
【００４７】
TFに結合し得る抗体は、本明細書中で上記した通りのものを好適に使用することができるが、ヒトへの投与が意図される場合、好ましくはヒトTFに特異的に結合するモノクローナル抗体である。また、ヒトに投与する場合、ヒト化抗体又はヒト抗体であることが好ましい。
本発明の治療剤は、上記の抗体を、細胞増殖抑制活性及び／又は細胞毒性を有する抗癌剤とコンジュゲートとして作製される。
【００４８】
抗癌剤としては、特に限定するものではないが、例えば有糸分裂阻害剤（微小管作用薬）、アルキル化剤、抗癌性抗生物質、代謝拮抗剤、プラチナ製剤、トポイソメラーゼ阻害剤、分子標的薬、放射性同位元素等から選択されるものを好適に使用することができる。
【００４９】
有糸分裂阻害剤（微小管作用薬）としては、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、パクリタキセル、ドセタキセル等が挙げられる。
アルキル化剤としては、例えば、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、シクロホスファミド、ダカルバジン、テモゾロミド等が挙げられる。
【００５０】
抗癌性抗生物質としては、例えば、ブレオマイシン、マイトマイシンC、アクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、アムルビシン等が挙げられる。
代謝拮抗剤としては、例えば、フルオロウラシル（5-FU）、シタラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、フルダラビン、メルカプトプリン、アザシチジン、メトトレキサート等が挙げられる。
【００５１】
プラチナ製剤としては、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン等が挙げられる。
トポイソメラーゼ阻害剤としては、例えば、エトポシド、ドキソルビシン、ミトキサントロン、テニポシド、イリノテカン等が挙げられる。
【００５２】
分子標的薬としては、例えば、トラスツズマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ等が挙げられる。
放射性同位元素としては、例えば、89Sr、223Ra、131I、90Y等が挙げられる。
【００５３】
TFに結合し得る抗体と、抗癌剤とのコンジュゲートの作製は、特に限定するものではなく、当分野で通常用いられる手段により適宜達成することができる。
【００５４】
本発明の治療剤は、更に他の薬剤と組み合わせて使用することができる。また、本発明の治療剤は、単独、又は他の有効成分と組み合わせて上記の治療剤を有効成分として含有する医薬組成物として使用することもできる。医薬組成物には、本発明の治療剤及び他の有効成分の他に、投与形態に応じて、当分野で通常使用される担体、賦形剤、緩衝剤、安定化剤等を含めることができる。
【００５５】
本発明の治療剤の投与対象患者は、特に限定するものではないが、手術又は化学療法による卵巣癌治療後の患者であり、特に腫瘍摘出手術後の患者とすることが好ましい。
【００５６】
本発明の治療剤又は医薬組成物は、被験体に対して腹腔内投与により投与されることが意図される。腹腔内投与により、癌細胞集塊に強発現するTFに対して抗体が結合することで治療剤濃度が局所的に高くなり、癌細胞を標的とした抗癌剤による攻撃が非常に有効に達成され得る。
【００５７】
本発明の治療剤の投与量は、患者の体重、年齢、疾患の重篤度等に応じて変動するものであり、特に限定するものではないが、例えば0.0001〜100mg/kg体重の範囲の有効成分を１日１回〜数回、２日毎、３日毎、１週間毎、２週間毎、毎月、２カ月毎、３カ月毎に投与することが可能である。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００５９】
［実施例１  卵巣癌組織におけるTFの発現及び卵巣癌の腹膜浸潤機構］
倫理委員会の承認のもとに、金沢大学附属病院産婦人科で手術施行した卵巣癌患者から採取した腹膜組織の一部を解析に用いた。
腹膜播種のある20名の卵巣癌患者から採取した腹膜を、その表面を傷つけないよう留意してゴム板に貼り付けて、10%中性緩衝ホルマリンで固定した。固定後に5mm間隔で腹膜組織を切開し、垂直に立ててカセット内に並べてパラフィン包埋した。包埋したパラフィンブロックから3μmの厚さで切片を作成し、それらをプレパラートに貼り付けてHE染色や免疫染色に供した(Obata T. et al., PLOS one. 2017; 12(11): e0188641)。
取得したホルマリン固定切片に対する免疫組織染色は下記の要領でABC法を用いて行った。
【００６０】
＜抗原賦活化＞
まず、各プレパラートをpH6またはpH9のクエン酸緩衝液で96℃で20分間処理した。
一次抗体として下記の抗体を用い、プレパラートを4℃で一晩処理した。
1. TF (clone:2K1, Abcam, Cambridge, UK) マウスモノクローナル抗体（1:2002希釈）
2. フィブリノゲンα鎖 (clone:UC45, Abcam, Cambridge, UK) マウスモノクローナル抗体（1:100希釈）
3. CD34 (clone:QBEnd-10, Dako, Santa Clara, US) マウスモノクローナル抗体（1:100希釈）
4. ポドプラニン (clone:D2-40, Dako, Santa Clara, US) マウスモノクローナル抗体（1:100希釈）
5. αSMA (clone:1A4, Dako, Santa Clara, US) マウスモノクローナル抗体（1:500希釈）
6. 血管内皮細胞増殖因子-A (VEGF-A, clone:VG1, Dako, Santa Clara, US) マウスモノクローナル抗体（1:50希釈）
7. CD31 (clone:EPR3094, Abcam, Cambridge, UK) ウサギモノクローナル抗体（1:25希釈）
8. 間質細胞由来因子-1/CXCL12 (SDF-1/CXCL12, Abcam, Cambridge, UK) ウサギポリクローナル抗体（1:1000希釈）
【００６１】
次いで、二次抗体として下記の抗体を用い、室温でプレパラートを30分間処理した。
1. ビオチン標識ウマ抗マウスIgG
2. ビオチン標識ヤギ抗ウサギIgG  
【００６２】
ABC染色は下記のキットを用いて施行し、顕微鏡下に観察した。
1. アビジン-ビオチン複合体 (VECTASTAIN ABC kit; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)
2. ジアミノベンジジン(Liquid DAB+ Substrate Chromogen System; Dako, Carpinteria, CA, USA)
【００６３】
その結果、20名中9名が高異型度漿液性腺癌症例であったが、そのうちの4名に形態的に下記の播種形成所見が観察された。
ポドプラニンで認識される腹膜中皮細胞層はインタクトに保たれた状態で、それに対峙する癌細胞集塊の周囲にはTFやフィブリノゲンの発現を認めるフィブリン網が形成されていた。また癌細胞集塊を含めたフィブリン網内には遊走してきたCD31、CD34およびVEGF-A陽性の血管内皮細胞が観察され、さらに血管腔が形成されると血管内に宿主側の間質との間を循環する赤血球が確認された（図１Ａ−Ｂ）。
【００６４】
一方、遊走してきた線維芽細胞により癌細胞集塊の周囲に形成された間質組織にはαSMAおよびポドプラニン発現陽性のがん間質線維芽細胞(CAF)が観察された。さらに進行すると癌細胞集塊と腹膜間質組織を結ぶ栄養血管の走行ルート周囲で中皮細胞層の消失が拡大され、この部位において癌細胞集塊の腹膜間質組織内への浸潤・進展像が観察された。またこれらの一連の過程で癌細胞集塊周囲にTFが強発現していることが観察された（図２Ａ−Ｄ）。
【００６５】
上記の結果から、下記の新しい卵巣癌の腹膜浸潤機構が推測される（図３Ａ−Ｄ）。
すなわち、図３Ａに示すように、癌細胞が腹膜組織に炎症を誘導し、透過性を亢進した毛細血管からフィブリノゲンが析出されて癌細胞集塊周囲にフィブリン網を形成し、癌細胞集塊が腹膜上皮に接着することなくこれに対峙する（図３Ａ）。
【００６６】
次いで、図３Ｂに示すように、癌細胞集塊周囲のフィブリン網内に線維芽細胞や血管内皮細胞の遊走およびそれに伴う新生血管網の形成が誘導される（図３Ｂ）。
新生された血管や間質組織を足場に癌細胞集塊が発育する（図３Ｃ）。
発育した癌細胞集塊が血管誘導経路を利用して腹膜中皮細胞層の欠損を拡大しつつ腹膜間質内に浸潤する（図３Ｄ）。
【００６７】
［実施例２  卵巣癌患者の血中及び腹水中TF発現量の測定］
33例のステージI〜IVの卵巣癌患者における腹水中また血中のTF濃度の値を、市販のキット（Quantikine Human Coagulation Factor III/Tissue Factor Immunoassay, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）を用いてELISAで測定した。
【００６８】
その結果、腹水サンプルを用いて測定した25例の患者のうちの21例は、TF濃度が血漿中での正常範囲とされる22.6 - 53.6 pg/mlより高値を示していた。また、腹水中TF (n=25)と血液中TF (n=20) を比較すると、腹水中のTFが著明に高値であった（図４Ａ）。さらに同一患者 (n=12)の腹水及び血中のTF濃度を比較すると、全ての患者において腹水中の方が血中より顕著に高い値であった（図４Ｂ）。
【００６９】
［実施例３  ステージIII〜IVの卵巣癌患者における血中及び腹水中TF発現量の測定］
また、腹膜播種のあるステージIII〜IVの20例の卵巣癌患者における血中及び腹水中TF濃度（pg/ml）を表１に示す。「−」はサンプルの取得ができなかったため測定していないことを示す。
【００７０】
その結果、いずれの患者においても測定されたTF濃度は血中よりも腹水中で顕著に高いことが確認された。また、同一患者において、パクリタキセル、シスプラチン、又はハイカムチンを用いた化学療法による治療前後での腹水中のTF濃度を比較したところ、治療後に腹水中TF値が著明に減少していた。
【００７１】
【表１】
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mucinous：粘液性腺癌；HGSOC：高悪性度漿液性卵巣癌；low-grade serous：低悪性度漿液性卵巣癌；poor diff：低分化腺癌；clear：明細胞腺癌；adenocarcinoma：腺癌（細分類不可）。
【００７２】
［実施例４  RT-PCRによるTFの検出］
卵巣癌組織におけるTFの存在を更に確認するために、患者組織におけるTFの発現についてRT-PCRを行った。
RNeasy Mini Kit（Qiagen, Hilden, Germany）を使用して、卵巣癌患者由来の一次病変組織及び腹膜転移組織の凍結腫瘍サンプルからRNAを抽出した。DNase（Ambion Diagnostics Inc., Austin, TX）処理の後、全RNA 1μgをSuperScript II（Invitrogen Carlsbad, CA）を使用して逆転写した。
【００７３】
TFの増幅のためには以下の配列を有するプライマー：
5’-GCCAGGAGAAAGGGGAAT-3’（配列番号１）及び
5’-CAGTGCAATATAGCATTTGCAGTAGC-3’（配列番号２）
を使用し、対照としてのGAPDHの増幅のためには以下の配列を有するプライマー：
5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’（配列番号３）及び
5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’（配列番号４）
を使用した。
【００７４】
PCRは、95℃で30秒間、60℃で30秒間、及び72℃で30秒間を50サイクル実施した。増幅後、得られたPCR産物をMinElute Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。精製したPCR産物の配列をDNAシーケンサー（3730xl DNA Analyzer; Thermo Fisher Scientific）を使用して解析し、検出した。
その結果、図４Ｃに示すように、一次病変（Pri）及び腹膜転移（Met）組織の双方で、TF mRNAの発現が確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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