(57)【要約】      （修正有）【課題】非分解性異常タンパク質の蓄積に関連した障害、具体的には早老症候群、横紋筋障害及び神経変性疾患から選択される障害を治療および／または予防するためのプロテアソーム阻害剤の提供。【解決手段】Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ａｌ（ＭＧ１３２）、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ｎＶａｌ−ａｌ（ＭＧ１１５）、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｂ（ＯＨ）２（ＭＧ２６２）及びＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ａｌ（ＭＧ１１０）から選択される修飾トリペプチド若しくはその薬学的に許容される塩。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非分解性異常タンパク質の蓄積に関連した障害またはがんを治療および／または予防するための使用のためのプロテアソーム阻害剤。
【請求項２】
ＳＲＳＦ１を下方制御することによる、請求項１に記載の使用のためのプロテアソーム阻害剤。
【請求項３】
前記非分解性異常タンパク質が、短縮型および／またはファルネシル化プレラミンＡ、短縮型および／またはファルネシル化Ｂ型ラミン、ならびにＬＭＮＢ１および／またはＬＭＮＢ２の重複によって産生されたタンパク質から選択される、請求項１または２に記載の使用のためのプロテアソーム阻害剤。
【請求項４】
前記障害が、早期老化障害、横紋筋障害および神経変性疾患から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用のためのプロテアソーム阻害剤。
【請求項５】
ペプチド、場合によっては修飾ペプチドから選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用のためのプロテアソーム阻害剤。
【請求項６】
トリペプチド、場合によっては修飾トリペプチドから選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の使用のためのプロテアソーム阻害剤。
【請求項７】
少なくとも２つのロイシンを含む、トリペプチド、場合によっては修飾トリペプチドから選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用のためのプロテアソーム阻害剤。
【請求項８】
ＭＧ１３２、ＭＧ１１５、ＭＧ２６２およびＭＧ１１０から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の使用のためのプロテアソーム阻害剤。
【請求項９】
ＭＧ１１５、ＭＧ２６２およびＭＧ１１０から選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載の使用のためのプロテアソーム阻害剤。
【請求項１０】
前記障害が、早老症候群、横紋筋障害および神経変性疾患から選択される、またはがんを治療および／または予防するためである、請求項１から９のいずれか一項に記載の使用のためのプロテアソーム阻害剤。
【請求項１１】
前記障害が、早老症候群および眼球咽頭型筋ジストロフィーから選択される、またはがんを治療および／または予防するためである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の使用のためのプロテアソーム阻害剤。
【請求項１２】
前記障害が、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群、非定型プロジェリア症候群、拘束性皮膚障害、ネスター・ギレルモ（Ｎｅｓｔｏｒ−Ｇｕｉｌｌｅｒｍｏ）プロジェリア症候群、ウェルナー症候群、ブルーム症候群、ロートムンド−トムソン症候群、コケイン症候群、色素性乾皮症および硫黄欠乏性毛髪発育異常症から選択される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の使用のためのプロテアソーム阻害剤。
【請求項１３】
皮膚老化、具体的にはヒト皮膚老化を予防するおよび／または弱めるためのプロテアソーム阻害剤の皮膚科学的使用、皮膚美容的使用または化粧品使用。
【請求項１４】
生理的老化を弱めるためのプロテアソーム阻害剤の使用。
【請求項１５】
加齢性障害およびそれらの代謝結果を治療および／または予防するための使用のためのプロテアソーム阻害剤であって、前記加齢性障害が、好ましくは骨粗鬆症、２型糖尿病およびアテローム性動脈硬化症から選択される、プロテアソーム阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロジェリンおよび／またはファルネシル化プレラミンＡなどの、非分解性異常タンパク質の蓄積に関連した障害、ならびに具体的にはこれらの上記異常タンパク質と関連した早期老化障害の治療および／または予防におけるプロテアソーム阻害剤の使用に関する。
【０００２】
本発明は、プロジェリンおよび／またはファルネシル化プレラミンＡ関連性の皮膚老化を予防するおよび／または弱めるためのプロテアソーム阻害剤の皮膚科学的使用、皮膚美容的（ｄｅｒｍｏｃｏｓｍｅｔｉｃ）使用または化粧品使用にも関する。本発明は、プロジェリンおよび／またはファルネシル化プレラミンＡ関連性の生理的老化を弱めるためのプロテアソーム阻害剤の使用にも関する。
【０００３】
本発明は、具体的には皮膚、脂肪組織、骨、内皮および血管平滑筋細胞を含めた血管を含めた組織における、プロジェリンおよび／またはファルネシル化プレラミンＡの存在および／または蓄積と関連した加齢性障害およびそれらの代謝結果、ならびにそれらの皮膚、心臓、脳または腎臓への病理学的結果の治療および／または予防におけるプロテアソーム阻害剤の使用にも関する。
【０００４】
本発明は、遺伝性の神経変性疾患および／または筋肉疾患の間の毒性タンパク質の存在および／または蓄積と関連した障害の治療におけるプロテアソーム阻害剤の使用にも関する。
【０００５】
本発明は、がんなどの、ＳＲＳＦ１の過剰発現と関連した障害の治療におけるプロテアソーム阻害剤の使用にも関する。
【背景技術】
【０００６】
ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群（ＨＧＰＳ、ＯＭＩＭ＃１７６６７０）は、４〜８百万人中に１人の子供が侵され成長障害、非常に薄い皮膚、皮下脂肪の減少、脱毛、骨粗鬆症および短い寿命および約１３．５年での死に繋がる心臓疾患を含む正常な成人の老化に類似する症状を伴う珍しい遺伝的障害である（非特許文献１、非特許文献２）。この症候群は、ラミンＡをコードするＬＭＮＡ遺伝子のエキソン１１内のｄｅ  ｎｏｖｏミスセンス点突然変異ｃ．１８２４  Ｃ＞Ｔ、ｐ．Ｇ６０８Ｇによって引き起こされる（非特許文献３、非特許文献４）。この突然変異は、プロジェリンと呼ばれる短縮型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）および永久ファルネシル化プレラミンＡをもたらすカルボキシ末端球状ドメインにおける５０のアミノ酸の欠失に繋がるエキソン１１における隠れたドナースプライス部位を活性化する。このタンパク質は、プレラミンＡの残基６０７〜６５６が欠けているがファルネシル化の標的である、Ｃ末端ＣＡＡＸボックスは保持している。細胞内タンパク質分解の切断部位は、短縮型ラミン／プロジェリンでは失われているので、永久ファルネシル化のままである。ラミンＡ／Ｃは、Ｂ型ラミンと共に、核内膜の下にある線維網、核ラミナの主要な構成要素である。
【０００７】
細胞レベルでは、ＨＧＰＳ早期老化障害は、核エンベロープ構造における劇的欠損、核形状における大規模な変化、小疱形成、「ヘルニア形成」、１つの核極からの一部の核内膜（ＩＮＭ）タンパク質の減少および下にある異質染色質の分裂によって特徴付けられる。ラミンＡは、内部核マトリックスの構成要素でもあるので、ＨＧＰＳ患者細胞におけるその変化は、核小体、小斑点および核内構造体などの核機能領域の分布および／または構造組織に影響し得る。核マトリックス組成物における異常は、ゲノム不安定性に繋がる、ＤＮＡ修復から、ＲＮＡ転写およびスプライシングまでの、ＤＮＡおよびＲＮＡ代謝ステップにおける欠陥ももたらす。核の代謝欠陥ならびに細胞周期、代謝経路および細胞コンパートメント機能に対するそれらの結果は、細胞性老化に繋がる（非特許文献５）。
【０００８】
プロジェリンは、生理的老化の間にＬＭＮＡ遺伝子における突然変異を伴わずに産生されることが示されており（非特許文献６）かつプロジェリン合成がＵＶで誘導されたＲＯＳ産生によって（非特許文献８）主としてＮＡＤＰＨオキシダーゼＮＯＸ１過活性（非特許文献９）によってトリガーされることが示されている、人間（非特許文献７）およびマウスの皮膚における老化のバイオマーカーと考えられている。どちらの現象も、患者からのヒト培養ケラチノサイトおよびＸｐｃ−／−マウスの両方において、ＤＮＡ修復遺伝的疾患である、色素性乾皮症Ｃ型（ＸＰＣ）において観察されている（非特許文献９）。ＮＯＸ１の同等の過活性は、他のＤＮＡ修復疾患において報告されておりかつプロジェリン産生にも繋がり得る（非特許文献１０）。培養細胞における複製老化の間のテロメア短縮は、プロジェリン合成を誘導した（非特許文献１１）。内皮および血管平滑筋細胞、骨および脂肪組織細胞、骨格および心筋細胞などの、間葉系列からの細胞は、プロジェリンに対してより特異的に感受性であり、これは、ファルネシル化プレラミンＡによっても誘導されかつ成人の表皮幹細胞において観察される現象（非特許文献１３）である、これらの組織の再生を担う成人の幹細胞の進行性の消滅（非特許文献１２）を誘導する。一方で、酸化ストレスは、血管からの平滑筋細胞の老化の間にファルネシル化プレラミンＡの産生をもたらすｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方におけるＺＭＰＳＴＥ２４の遮断をもたらした（非特許文献１４）。１か月齢と９７歳との間では、非ＨＧＰＳ対象からの冠状動脈におけるプロジェリン染色は増加した（非特許文献１５）。さらには、内皮老化の間、核から細胞質ゾルへのＳＲＳＦ１の誤った局在化は、いくつかのｍＲＮＡ、その中でもプレラミンＡ  ｍＲＮＡにおける異常なスプライシング現象をもたらした（非特許文献１６）。プレラミンＡ  ｍＲＮＡのｍｉＲ−９誘導性の切断が原因で、プロジェリンもファルネシル化プレラミンＡも、脳神経細胞および星状細胞において産生されなかった（非特許文献１７、非特許文献１８）。しかしながら、プロジェリンまたはファルネシル化プレラミンＡは、神経細胞においてラミンＢ蓄積と共に酸化ストレス（非特許文献２１、非特許文献２２）への反応における血管（非特許文献１９）および上衣細胞（非特許文献２０）によるそれらの合成を通して脳の老化に間接的に寄与し得る（非特許文献２３）。
【０００９】
ＨＧＰＳ、ならびにプレラミンＡ処理に関連した他の早老症候群を治療するための戦略は、３つの主軸：ｉ／特にイソプレノイド生合成の遮断によってまたはその合成の遮断によって、ファルネシル化プレラミンＡの毒性を減少すること、ｉｉ／成熟したプロジェリンｍＲＮＡ次いでプロジェリン合成に繋がるＬＭＮＡエキソン１１の隠れたスプライシング部位をブロックすること、ｉｉｉ／細胞内のプロジェリンまたはファルネシル化プレラミンＡを分解することに分類され得る。
【００１０】
第１の戦略のみが、最新のヒト患者における治験に繋がった（非特許文献５）。
【００１１】
ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）、ロナファルニブは、試験されているが（非特許文献２４）その利益は議論の余地がある（非特許文献２５）。ＲＡＳは、ヒトがんにおける最も頻繁に変異した腫瘍遺伝子としてよく確立されておりかつ正常および腫瘍形成ＲＡＳの両方ともファルネシル化を必要とするので、ファルネシルトランスフェラーゼ（Ｆｔａｓｅ）は、抗がん剤発見の最も魅力的な目標の１つである。多数のＦｔａｓｅ阻害剤（ＦＴＩ）が、７０より多くの臨床試験において開発および試験されてきた（非特許文献２６）。結果は、大いに失望させるものであり、しかしながら、Ｆｔａｓｅが阻害された場合でもまだＨ−ＲＡＳおよびＫ−ＲＡＳはゲラニルゲラニル化され得ることの驚くべき発見を伴った（非特許文献２７）。さらに、１つのＦＴＩ、ＦＴＩ−２７７は、プロテアソーム活性を阻害することが示されている（非特許文献２８）。しかしながら、ＦＴＩ有効性が培養細胞（非特許文献２９）および早老症臨床試験（非特許文献２４）におけるよりもずっと低いいくつかのマウスモデルにおいて、これまで早老症患者からの培養細胞において用いられたいずれのＦＴＩも、プロテアソームに対する阻害活性を立証しておらずあるいは本発明に記載のようなプロジェリンまたはプレラミンＡの量の減少を示していない。
【００１２】
２００８から２０１３年の間に試験された、別の治療は、ゾレドロネート（ファルネシルピロリン酸シンターゼのアミノビスフォスフォネート阻害剤、Ｚｏ）とプラバスタチン（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼのスタチン阻害剤、Ｐｒａ）との組み合わせ、すなわちＺｏＰｒａである。ＺｏＰｒａをロナファルニブと組み合わせる第３の臨床試験は、進行中である。
【００１３】
第２の戦略は、培養されたＨＧＰＳ細胞ならびに早老症のマウスモデルの両方において検証されている。短いオリゴヌクレオチドは、ＬＭＮＡ突然変異によって活性化されたＬＭＮＡエキソン１１の隠れたスプライシング部位に結合しかつプロジェリンｍＲＮＡおよびＨＧＰＳ細胞におけるタンパク質生合成の減少に繋がる（非特許文献３０）。２種のモルホリノ−オリゴヌクレオチドの静脈内投与は、早老症の病態生理学機序、臨床的および生物学的症状の両方を再現している、ＫＩマウスモデルＧ６０９Ｇの寿命およびいくつかの生物学的指標を救済する（非特許文献３１）。１種のモルホリノは、ＬＭＮＡエキソン１１の隠れたスプライシング部位を標的としかつプロジェリンｍＲＮＡ産生を阻害するのに対して、第２の種は、ＬＭＮＡエキソン１０スプライシング部位を標的とし、したがってラミンＣ  ｍＲＮＡの産生を支持しかつラミンＡ  ｍＲＮＡの産生を低下させる。同じ早老症ＫＩマウスモデルにおいて、スプライシング因子ＳＲＳＦ１は、ＬＭＮＡエキソン１１の隠れた部位に結合しかつプロジェリンｍＲＮＡの産生を支持することが実証されている（非特許文献３２）。
【００１４】
第３の戦略、細胞内のプロジェリンまたはファルネシル化プレラミンＡの分解は、調査されている。免疫抑制薬ラパマイシンは、マクロオートファジーの活性化によって、ＨＧＰＳ線維芽細胞におけるプロジェリンを低下させかつそれらの核形状表現型を救済する（非特許文献３３、非特許文献３４および後の２０１３年正誤表）。したがって、ラパマイシンは、ＨＧＰＳの適した治療を構成することが提案されている。ファルネシル基によって核ラミナに固定されているラミンＢ１は、細胞質ゾルへ輸送されかつ活性化ＲＡＳによってなどの、発がん性損傷後に培養細胞における自食作用によって分解されることが示されている（非特許文献３５）。
【００１５】
しかしながら、ＨＧＰＳおよび関連する、類似の、または同一の病態生理学機序を有する他の早老症候群の有効な治療の必要性は依然としてある。前記機序は、短縮型および／またはファルネシル化プレラミンＡおよび／またはＢ型ラミンの存在、ならびに／あるいはＬＭＮＡ、ＬＭＮＢ１および／またはＬＭＮＢ２の複製に関与し得る。こうした治療は、ラミンに関連した生理的老化が付随する疾患を予防および／または治療するためにも有益であり得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｒ．Ｃ．Ｈｅｎｎｅｋａｍ著、「Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ−Ｇｉｌｆｏｒｄ  ｐｒｏｇｅｒｉａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ」Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ。Ｐａｒｔ  Ａ  １４０、２６０３〜２６２４（２００６年）
【非特許文献２】Ｍ．Ａ．Ｍｅｒｉｄｅｔｈら著、「Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｃｏｕｒｓｅ  ｏｆ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ−Ｇｉｌｆｏｒｄ  ｐｒｏｇｅｒｉａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ」Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５８、５９２〜６０４（２００８年）
【非特許文献３】Ａ．Ｄｅ  Ｓａｎｄｒｅ−Ｇｉｏｖａｎｎｏｌｉら著、「Ｌａｍｉｎ  ａ  ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ−Ｇｉｌｆｏｒｄ  ｐｒｏｇｅｒｉａ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００、２０５５（２００３年）
【非特許文献４】Ｍ．Ｅｒｉｋｓｓｏｎら著、「Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｌａｍｉｎ  Ａ  ｃａｕｓｅ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ−Ｇｉｌｆｏｒｄ  ｐｒｏｇｅｒｉａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ」Ｎａｔｕｒｅ  ４２３、２９３〜２９８（２００３年）
【非特許文献５】Ｐ．Ｃａｕら著、「Ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｔｒｉｘ，ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ａｎｄ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ａｇｉｎｇ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ  ｉｎ  ａ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ」Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ＆ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ、（２０１４年）
【非特許文献６】Ｐ．Ｓｃａｆｆｉｄｉ、Ｔ．Ｍｉｓｔｅｌｉ著、「Ｌａｍｉｎ  Ａ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｇｉｎｇ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１２、１０５９〜１０６３（２００６年）
【非特許文献７】Ｄ．ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋら著、「Ｔｈｅ  ｍｕｔａｎｔ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｌａｍｉｎ  Ａ  ｔｈａｔ  ｃａｕｓｅｓ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ−Ｇｉｌｆｏｒｄ  ｐｒｏｇｅｒｉａ  ｉｓ  ａ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｇｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ」ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ２、ｅ１２６９（２００７年）
【非特許文献８】Ｈ．Ｔａｋｅｕｃｈｉ、Ｔ．Ｍ．Ｒｕｎｇｅｒ著、「Ｌｏｎｇｗａｖｅ  ＵＶ  Ｌｉｇｈｔ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  Ａｇｉｎｇ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｇｅｒｉｎ」Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ７、７１（２０１３年）
【非特許文献９】Ｍ．Ｈｏｓｓｅｉｎｉら著、「Ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ａｇｉｎｇ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｒｅｓｃｕｅ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＡＤＰＨ  ｏｘｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ＸＰＣ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １３５、１１０８〜１１１８（２０１５年）
【非特許文献１０】Ｍ．Ｈｏｓｓｅｉｎｉ、Ｋ．Ｅｚｚｅｄｉｎｅ、Ａ．Ｔａｉｅｂ、Ｈ．Ｒ．Ｒｅｚｖａｎｉ著、「Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｓ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｃｌｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｅｘｃｉｓｉｏｎ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １３５、３４１〜３５１（２０１５年）
【非特許文献１１】Ｋ．Ｃａｏら著、「Ｐｒｏｇｅｒｉｎ  ａｎｄ  ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｅ  ｔｏ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ」Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２１、２８３３〜２８４４（２０１１年）
【非特許文献１２】Ｐ．Ｓｃａｆｆｉｄｉ、Ｔ．Ｍｉｓｔｅｌｉ著、「Ｌａｍｉｎ  Ａ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｉｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ａｇｅｉｎｇ」Ｎａｔｕｒｅ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １０、４５２〜４５９（２００８年）
【非特許文献１３】Ｊ．Ｅｓｐａｄａら著、「Ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｃａｕｓｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ−ａｇｉｎｇ  ｍｉｃｅ」Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １８１、２７〜３５（２００８年）
【非特許文献１４】Ｃ．Ｄ．Ｒａｇｎａｕｔｈら著、「Ｐｒｅｌａｍｉｎ  Ａ  Ａｃｔｓ  ｔｏ  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｉｓ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ａｇｉｎｇ」Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２１、２２００〜２２１０（２０１０年）
【非特許文献１５】Ｍ．Ｏｌｉｖｅら著、「Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ−Ｇｉｌｆｏｒｄ  ｐｒｏｇｅｒｉａ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ａｇｉｎｇ」Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ３０、２３０１〜２３０９（２０１０年）
【非特許文献１６】Ｆ．Ｊ．Ｂｌａｎｃｏ、Ｃ．Ｂｅｒｎａｂｅｕ著、「Ｔｈｅ  Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ  ＳＲＳＦ１  ａｓ  ａ  Ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ」Ｆｒｏｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３、５４（２０１２年）
【非特許文献１７】Ｈ．−Ｊ．Ｊｕｎｇら著、「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｅｌａｍｉｎ  Ａ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌａｍｉｎ  Ｃ  ｂｙ  ｍｉＲ−９，ａ  ｂｒａｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ」Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０９、Ｅ４２３〜Ｅ４３１（２０１２年）
【非特許文献１８】Ｘ．Ｎｉｓｓａｎら著、「Ｕｎｉｑｕｅ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ−  Ｇｉｌｆｏｒｄ  Ｐｒｏｇｅｒｉａ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｉｓ  Ｄｕｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｕｒａｌ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｉＲ−９  ＭｉｃｒｏＲＮＡ」Ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ２、１〜９（２０１２年）
【非特許文献１９】Ｊ．Ｃ．Ｋｏｖａｃｉｃ、Ｐ．Ｍｏｒｅｎｏ、Ｖ．Ｈａｃｈｉｎｓｋｉ、Ｅ．Ｇ．Ｎａｂｅｌ、Ｖ．Ｆｕｓｔｅｒ著、「Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ，ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ，ａｎｄ  ａｇｉｎｇ：Ｐａｒｔ  １  ｏｆ  ａ  ２−ｐａｒｔ  ｒｅｖｉｅｗ」Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２３、１６５０〜１６６０（２０１１年）
【非特許文献２０】Ｙ．Ｔａｋａｍｏｒｉ、Ｔ．Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ、Ｔ．Ｍｏｒｉ、Ｊ．Ｋｏｓａｋａ、Ｈ．Ｙａｍａｄａ著、「Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ｆｅｒｒｅｔ（Ｍｕｓｔｅｌａ  ｐｕｔｏｒｉｕｓ  ｆｕｒｏ）ｂｒａｉｎ」Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５２２、１８１８〜１８３８（２０１４年）
【非特許文献２１】Ｈ．−Ｍ．Ｇａｏ、Ｈ．Ｚｈｏｕ、Ｊ．−Ｓ．Ｈｏｎｇ著、「ＮＡＤＰＨ  ｏｘｉｄａｓｅｓ：ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ」Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ３３、２９５〜３０３（２０１２年）
【非特許文献２２】Ｐ．Ｂ．Ｃａｍｐｏｓ、Ｂ．Ｓ．Ｐａｕｌｓｅｎ、Ｓ．Ｋ．Ｒｅｈｅｎ著、「Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ａｇｉｎｇ  ｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｏｄｅｌ  ｂｒａｉｎ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ａ  ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ」Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ａｇｉｎｇ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ６、２９２（２０１４年）
【非特許文献２３】Ａ．Ｂａｒａｓｃｕら著、「Ｏｘｙｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｌｔｅｒｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｓｈａｐｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｌａｍｉｎｓ  ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：ａ  ｒｏｕｔｅ  ｔｏ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ」Ｎｕｃｌｅｕｓ（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘ．）３、４１１〜４１７（２０１２年）
【非特許文献２４】Ｌ．Ｂ．Ｇｏｒｄｏｎら著、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ａ  ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ−Ｇｉｌｆｏｒｄ  ｐｒｏｇｅｒｉａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ」Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０９、１６６６６〜１６６７１（２０１２年）
【非特許文献２５】Ｊ．Ｃｏｕｚｉｎ−Ｆｒａｎｋｅｌ著、「Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｄｒｕｇ  ｔｒｉａｌ  ｏｆｆｅｒｓ  ｕｎｃｅｒｔａｉｎ  ｓｔａｒｔ  ｉｎ  ｒａｃｅ  ｔｏ  ｓａｖｅ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｅｒｉａ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７、１５９４〜１５９５（２０１２年）
【非特許文献２６】Ｓ．Ａ．Ｈｏｌｓｔｅｉｎ、Ｒ．Ｊ．Ｈｏｈｌ著、「Ｉｓ  ｔｈｅｒｅ  ａ  ｆｕｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｐｒｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ？」Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １２、７０４〜７０９（２０１２年）
【非特許文献２７】Ｙ．Ｌｉｎ、Ｙ．Ｚｈｅｎｇ著、「Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」Ｅｘｐｅｒｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、１〜２０（２０１５年）
【非特許文献２８】Ｅ．Ｔ．Ｅｆｕｅｔ、Ｋ．Ｋｅｙｏｍａｒｓｉ著、「Ｆａｒｎｅｓｙｌ  ａｎｄ  ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎｄｕｃｅ  Ｇ１  ａｒｒｅｓｔ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ」Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６６、１０４０〜１０５１（２００６年）
【非特許文献２９】Ｓ．Ｇ．Ｙｏｕｎｇ、Ｓ．Ｈ．Ｙａｎｇ、Ｂ．Ｓ．Ｄａｖｉｅｓ、Ｈ．Ｊ．Ｊｕｎｇ、Ｌ．Ｇ．Ｆｏｎｇ著、「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｅｎｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｇｅｒｉａ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５、１７１ｐｓ１７３（２０１３年）
【非特許文献３０】Ｐ．Ｓｃａｆｆｉｄｉ、Ｔ．Ｍｉｓｔｅｌｉ著、「Ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ａｇｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ−Ｇｉｌｆｏｒｄ  ｐｒｏｇｅｒｉａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ」Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １１、４４０〜４４５（２００５年）
【非特許文献３１】Ｆ．Ｇ．Ｏｓｏｒｉｏら著、「Ｓｐｌｉｃｉｎｇ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ａ  ｎｅｗ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ａｇｉｎｇ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３、１０６ｒａ１０７（２０１１年）
【非特許文献３２】Ｉ．Ｃ．Ｌｏｐｅｚ−Ｍｅｊｉａら著、「Ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＬＭＮＡ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ａｇｉｎｇ」Ｈｕｍａｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０、４５４０〜４５５５（２０１１年）
【非特許文献３３】Ｋ．Ｃａｏら著、「Ｒａｐａｍｙｃｉｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅｓ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｉｎ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ−Ｇｉｌｆｏｒｄ  Ｐｒｏｇｅｒｉａ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｃｅｌｌｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３、８９ｒａ５８（２０１１年）
【非特許文献３４】Ｖ．Ｃｅｎｎｉら著、「Ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｅｄ  ｐｒｅｌａｍｉｎ  Ａ  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｌａｍｉｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｐｒｏｇｅｒｉａ」Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  ５５、ｅ３６（２０１１年）
【非特許文献３５】Ｚ．Ｄｏｕら著、「Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌａｍｉｎａ」Ｎａｔｕｒｅ  ５２７、１０５〜１０９（２０１５年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
実施例１に示されるように、発明者は、驚いたことにＭＧ１３２などの、プロテアソーム阻害剤の使用が、ＨＧＰＳ細胞におけるプロジェリンクリアランスを誘導することを発見した。実際に、ＭＧ１３２は、ＨＧＰＳ細胞において以下の２つの独立した機能を有する。
−  一方では、ＭＧ１３２は、自食作用およびしたがってタンパク質分解を誘導し、かつ
−  他方では、ＭＧ１３２は、プロジェリンｍＲＮＡに繋がるプレラミンＡ  ｍＲＮＡスプライシングに関与する、ＳＲＳＦ１と呼ばれる転写因子の量を減少する（３２）
【００１８】
その結果の方向として、プロジェリンは、自食作用によって分解されるのみならずまたＳＲＳＦ１の下方制御のためにより少なく産生される。
【００１９】
発明者は、驚いたことにプロテアソーム阻害剤の使用が、がん細胞を治療すること（実施例２を参照）および眼球咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）の動物モデルを治療すること（実施例３を参照）に有効であることも示した。
【００２０】
本発明は、したがって具体的には早期老化障害に繋がる、短縮型および／またはファルネシル化プレラミンＡなどの、非分解性異常タンパク質の蓄積に関連した障害を治療および／または予防するための使用のためのプロテアソーム阻害剤に関する。
【００２１】
好ましくは、プロテアソーム阻害剤は、ＳＲＳＦ１を下方制御することによる、早期老化障害に繋がる短縮型および／またはファルネシル化プレラミンＡなどの、非分解性異常タンパク質の蓄積に関連した障害を治療および／または予防するための使用のためである。
【００２２】
本発明は、治療的有効量のプロテアソーム阻害剤を前記対象に投与することを含む、それを必要とする対象において、早期老化障害に繋がる短縮型および／またはファルネシル化プレラミンＡなどの、非分解性異常タンパク質の蓄積に関連した障害を治療および／または予防するための方法にも関する。
【００２３】
本発明は、皮膚老化、具体的にはヒト皮膚老化を予防および／または弱めるためのプロテアソーム阻害剤の皮膚科学的使用、皮膚美容的使用または化粧品使用にも関する。本発明は、プロジェリンおよび／またはファルネシル化プレラミンＡが関連する生理的老化などの、生理的老化を弱めるためのプロテアソーム阻害剤の使用にも関する。
【００２４】
本発明は、加齢性障害およびそれらの代謝結果、具体的には皮膚、脂肪組織、骨、血管ならびにそれらの内皮および血管平滑筋細胞などの、プロジェリンおよび／またはファルネシル化プレラミンＡを発現している組織を含めたものならびに皮膚、心臓、脳または腎臓へのそれらの結果の治療および／または予防におけるプロテアソーム阻害剤の使用にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＭＧ１３２、プロテアソーム阻害剤は、ＨＧＰＳ線維芽細胞におけるプロジェリンレベルを減少する。  （Ａ）対照線維芽細胞（対照１：８４７１および対照２：８４９８）と比較してＨＧＰＳ線維芽細胞（ＡＧ０１９７２）においてプロテアソーム活性の有意の増加（トリプシン：Ｚ−ＬＲＲ−アミノルシフェリン、キモトリプシン：Ｓｕｃ−ＬＬＶＹアミノルシフェリンおよびカスパーゼ様：Ｚ−ｎＬＰｎＬＤ−アミノルシフェリン）が観察された（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）。それぞれの実験は、同一継代レベルの細胞で実施された。発光は、相対発光量（ＲＬＵ）として測定される。  （Ｂ）上パネルは、未処置（対照）または１０μＭのＭＧ１３２もしくはＤＭＳＯで３、６、２４および４８時間処置されたＨＧＰＳ線維芽細胞からの全ライセートにおけるプロジェリンおよびチューブリンのウエスタンブロット評価、下パネルは、上パネルに記載されている、ＩｍａｇｅＪソフトウェアによって定量化されたプロジェリンバンドであり、かつプロジェリン発現レベルは、対照細胞値に対して正規化された。（ｎ＝６±ＳＥＭ）。＊ｐ＜．０５、＊＊ｐ＜．０１、＊＊＊ｐ＜．００１、実験対対照（ＤＭＳＯ処置細胞）。  （Ｃ）ＤＭＳＯ（対照）または１０μＭのＭＧ１３２、ＭＧ１１５、ＭＧ２６２、ボルテゾミブ（ＢＴＺ）またはカルフィルゾミブ（ＣＦＺ）で４８時間処置されたＨＧＰＳ線維芽細胞からの全ライセートにおけるプロジェリン、アクチンおよびＧＡＰＤＨのウエスタンブロット評価。反転画像。  （Ｄ）２４時間ＭＧ１３２処置後のＨＧＰＳ線維芽細胞（ＡＧ０１９７２、ＡＧ１１４９８および５９６８）におけるプロテアソーム活性（トリプシン：Ｚ−ＬＲＲ−アミノルシフェリン、キモトリプシン：Ｓｕｃ−ＬＬＶＹアミノルシフェリンおよびカスパーゼ様：Ｚ−ｎＬＰｎＬＤ−アミノルシフェリン）（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）。発光は、相対発光量（ＲＬＵ）として決定される。Ｃ＝ＤＭＳＯで２４時間処置された対照細胞。
【図２】プロジェリンクリアランスは、自食作用誘導に部分的に起因する。  （Ａ）ウエスタンブロットのプロジェリンおよびＧＡＰＤＨ特有のバンドはＩｍａｇｅＪソフトウェアによって定量化されかつプロジェリン発現レベルはＧＡＰＤＨ値に対して正規化された。（ｎ＝６±ＳＥＭ）。＊Ｐ＜．０５、＊＊Ｐ＜．０１、＊＊＊Ｐ＜．００１、実験対対照（ＤＭＳＯ処置細胞）。それぞれ、未処置のＨＧＰＳ線維芽細胞（対照）あるいはＤＭＳＯ（４８時間）、１０μＭ  ＭＧ１３２（３６時間および４８時間）、クロロキン（４８時間）（１μＭ、１０μＭ、２５μＭまたは５０μＭ）または１０μＭ  ＭＧ１３２およびクロロキン（１μＭ、１０μＭ、２５μＭまたは５０μＭ）両方を同時に加えて（４８時間）処置された細胞からの全ライセートにおけるプロジェリンレベル。  （Ｂ）ウエスタンブロットのプロジェリンおよびＧＡＰＤＨ特有のバンドはＩｍａｇｅＪソフトウェアによって定量化されかつプロジェリン発現レベルはＧＡＰＤＨ値に対して正規化された。（ｎ＝４±ＳＥＭ）。＊Ｐ＜．０５、＊＊Ｐ＜．０１、＊＊＊Ｐ＜．００１、実験対対照（未処置細胞）。ＭＧ１３２（１０μＭ）、クロロキン（５０μＭ）、バフィロマイシンＡ１（１００ｎＭ）、カスパーゼ−６阻害剤Ｚ−ＶＥＩＤ−ＦＭＫ（５０μＭ）またはレプトマイシンＢ（２０ｎｇ／ｍｌ）で４８時間処置された（＋）ＨＧＰＳ線維芽細胞全ライセートにおけるプロジェリンレベル。
【図３】ＭＧ１３２は、プロジェリン転写およびスプライシング因子ＳＲＳＦ−１タンパク質発現を低下させる。  （Ａ）ＭＧ１３２に応答したプロジェリン転写の下方制御。ＤＭＳＯ処置細胞（対照）と比較した１０μＭ  ＭＧ１３２で処置されたＨＧＰＳ線維芽細胞におけるプロジェリンｍＲＮＡレベルの定量的リアルタイムＰＣＲ解析（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）。＊＊＊Ｐ＜．００１。  （Ｂ）上パネル、ＭＧ１３２は、スプライシング因子ＳＲＳＦ−１発現を低下させる。ＤＭＳＯ（−）（対照）、ＭＧ１３２（１０μＭ）、クロロキン（５０μＭ）、バフィロマイシンＡ１（１００ｎＭ）またはパン−カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫで処置されたＨＧＰＳ線維芽細胞からの全ライセートにおけるラミンＡ／Ｃ、プロジェリン、アクチン、ＳＲＳＦ−１、ＬＣ３Ｂ−ＩおよびＬＣ３Ｂ−ＩＩのウエスタンブロット評価。示されたように、併用処置も実施された。下パネルは、上パネルに記載されている、プロジェリン、ＳＲＳＦ−１およびアクチン特有のバンドがＩｍａｇｅＪソフトウェアによって定量化された。プロジェリンおよびＳＲＳＦ−１発現レベルはアクチン値に対して正規化された。（平均±ＳＥＭ、ｎ＝５）。
【図４】ＭＧ１３２は、ｍＲＮＡレベルの減少は誘導するがラミンＡ／Ｃのタンパク質レベルの減少は誘導しない。  （Ａ）ＭＧ１３２は、ラミンＡおよびラミンＣ転写レベルを低下させる。１０μＭ  ＭＧ１３２で処置されたＨＧＰＳ線維芽細胞におけるラミンＡおよびラミンＣ  ｍＲＮＡレベルの定量的リアルタイムＰＣＲ解析（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）。  （Ｂ）ラミンＡおよびＣ両方のタンパク質レベルは、ＭＧ１３２でのＨＧＰＳ線維芽細胞処置（１０μＭ）で増加する。３つの異なる実験の代表的なウエスタンブロットおよび平均値が示される。＊Ｐ＜．０５、＊＊Ｐ＜．０１、＊＊＊Ｐ＜．００１、実験対対照（ＤＭＳＯ処置細胞）。
【図５】ＭＧ１３２は、ＨＧＰＳ細胞株における核の形状異常を改善する。  正常核（滑らかな楕円形状を有する核）および異常核（小疱、不規則形状、または複数の折りたたみを有する核）の割合は、手動ブラインド計数（ｍａｎｕａｌ  ｂｌｉｎｄ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ）によって計算された。３つの異なる実験の代表的な画像および平均値が示される。＊Ｐ＜．０５。
【図６】ＭＧ１３２は、患者ｉＰＳ由来のＭＳＣおよびＶＳＭＣにおけるプロジェリンレベルを低下させる。  ＨＧＰＳ線維芽細胞、ＨＧＰＳ由来ｉＰＳ−ＭＳＣまたはｉＰＳ−ＶＳＭＣの生存度は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙを用いて示した濃度におけるＭＧ１３２での処置後２４時間で測定された。結果は、未処置細胞と比較したＭＧ１３２処置細胞の生存度割合として報告される。
【図７】ＭＧ１３２は、ＬｍｎａＧ６０９Ｇ／Ｇ６０９Ｇマウス骨格筋におけるプロジェリンレベルを低下させる。  （Ａ）ＤＭＳＯで処置された左側筋（−）および１μｇ／ＫｇのＭＧ１３２で処置された右側筋（＋）に対応する、ラミンＡ、プロジェリン、ラミンＣおよびＳＲＳＦ−１特有のバンドは、ＩｍａｇｅＪソフトウェアによって定量化されてそれらの発現レベルがＧＡＰＤＨ値に対して正規化された。  （Ｂ）１０μｇ／Ｋｇ処理後の（Ａ）と同じ定量化。＊ｐ＜．０５、＊＊ｐ＜．０１、ＭＧ１３２処置対対照未処置細胞。
【図８】プロテアソーム阻害剤は、２種の培養ヒト腺がん細胞株におけるＳＲＳＦ１レベルを低下させる。  ２種の細胞株は、ＤＭＳＯに希釈した３種の濃度のプロテアソーム阻害剤と共に２４時間インキュベートされた。  ２０μｇの総タンパク質抽出物が、それぞれのレーンにおいて析出した。  プロテアソーム阻害剤との２４時間インキュベーション後のＳＲＳＦ１の量が、ＤＭＳＯビヒクルのみでおよびアクチン（黒色容器）またはＧＡＰＤＨ（灰色容器）と関連してインキュベートされた対照細胞におけるＳＲＳＦ１の量の割合で表された。  （Ａ）ＨＴＣ１１６、結腸腺がん  （Ｂ）ＰＡＮＣ−１、膵臓腺がん。
【図９】ショウジョウバエＯＰＭＤモデルにおけるＭＧ１３２の有益な効果。  （Ａ）幼虫に給餌されたＭＧ１３２の毒性は、８０匹の野生型一齢幼虫をＤＭＳＯ中の薬物の濃度を増加して、またはＤＭＳＯ単独で再構成した５ｍｌのインスタントショウジョウバエ培地（ｉｎｓｔａｎｔ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｄｉｕｍ）を含有するバイアル内に移すことによって判定された。グラフは、２５℃において成虫に達しているハエの割合を示す。  （Ｂ）２５℃における、ＤＭＳＯ単独または３種の異なる濃度のＭＧ１３２を給餌された、羽根位置の欠陥を示している、ＰＡＢＰＮ１−１７ａｌａを発現しているハエ（Ａｃｔ８８Ｆ−ＰＡＢＰＮ１−１７ａｌａ／＋）の定量化。全ての濃度が、異常な羽根の配置を有するハエの数の減少をもたらした。記録されたハエの数が示される。カイ二乗検定を用いて＊＊＊ｐ値＜０．００１および＊＊ｐ値＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
定義
本明細書で使用する場合、「プロテアソーム阻害剤」と言う語は、プロテアソームの酵素活性をブロックする化合物である。哺乳類の２６Ｓ細胞質ゾルおよび核のプロテアソームは、１つの２０Ｓタンパク質分解コアおよび２つの１９Ｓ調節キャップ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃａｐ）サブユニットでできている（３６）。２０Ｓコアは、樽形の空洞を提供しその中でタンパク質が分解される。
【００２７】
２０Ｓコアは、４つのリング、２つのαおよび２つのβでできている。それぞれのαリングは、７つの遺伝子によってコードされた７つの異なるα−サブユニットを含み、かつそれぞれのβリングは、７つの遺伝子によってコードされた７つの異なるβ−サブユニットを含む。
【００２８】
１９Ｓ調節キャップサブユニットは、６つのＡＴＰａｓｅｓおよび２つの非ＡＴＰａｓｅサブユニットを含む基部と、最大１０個の非ＡＴＰａｓｅサブユニットを含有する蓋とから構成される。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「治療すること」または「治療」という語は、こうした語が当てはまる障害または状態、あるいはこうした障害または状態の１種または複数の症状を反転すること、軽減すること、その進行を阻害すること、または予防することを意味する。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「予防すること」または「予防」と言う語は、まだそれを有していると診断されていない対象において疾患または状態が発生することを軽減することを指す。
【００３１】
「治療的有効量」は、対象に治療的利益を与えるために必要である活性剤の最小量が意図される。例えば、「治療的有効量」は、疾患に関連した病理学的症状、疾患進行または生理学的状態において改善を誘導する、向上させるまたはさもなければ生じるあるいは障害への耐性を改善する量である。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「対象」という語は、齧歯類、ネコ、イヌ、および霊長類などの哺乳動物を意味する。好ましくは本発明による対象は、ヒトである。本発明の全ての治療および方法は、哺乳動物、具体的には非ヒト哺乳動物、ならびにヒトに適用し得る。好ましくは、それらはヒトに適用し得る。
【００３３】
本発明による非分解性異常タンパク質の蓄積に関連した障害の治療
本発明は、短縮型および／またはファルネシル化プレラミンＡおよび／またはＢ型ラミン、あるいはＬＭＮＢ１および／またはＬＭＮＢ２の重複によって産生されたタンパク質などの、非分解性異常タンパク質の蓄積に関連した障害を治療および／または予防するための使用のためのプロテアソーム阻害剤に関する。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「非分解性異常タンパク質の蓄積に関連した障害」は、前記タンパク質が分解されないので細胞内に蓄積される、異常タンパク質の存在に関与する障害である。前記異常タンパク質は、ミスフォールドされたタンパク質、または突然変異体タンパク質であり得る。非分解性異常タンパク質の蓄積は、核および／または細胞質ゾルであり得る。好ましくは、非分解性異常タンパク質は、短縮型および／またはファルネシル化プレラミンＡ、短縮型および／またはファルネシル化Ｂ型ラミン、あるいはＬＭＮＢ１および／またはＬＭＮＢ２の重複によって産生されたタンパク質である。短縮型およびファルネシル化プレラミンＡの好ましい例は、プロジェリンである。
【００３５】
好ましくは、非分解性異常タンパク質の蓄積に関連した障害は、非分解性異常タンパク質の核蓄積に関連した障害である。好ましくは、前記障害は、早期老化障害、横紋筋および神経変性障害から選択される。前記障害では、核における非分解性異常タンパク質の蓄積がある。
【００３６】
好ましくは、非分解性異常タンパク質の蓄積に関連した障害は、非分解性異常タンパク質の細胞質ゾル蓄積に関連した障害である。好ましくは、前記障害は、横紋筋および神経変性障害から選択される。横紋筋および神経変性障害の中で、好ましくは眼球咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）を例証として挙げることができる。ＯＰＭＤモデルでのプロテアソーム阻害剤の使用は、実施例３において示される。
【００３７】
より好ましくは、本発明に従って、前記障害は、早期老化障害から選択される。早期老化障害は、多数のまたは全ての組織に影響しかつ影響を受けた個体が老化に関連した特徴のうちの一部のみを示すか（これは「区域性（ｓｅｇｍｅｎｔａｌ）」と呼ばれる）、または１つの組織にのみ影響する（これは「単様式（ｕｎｉｍｏｄａｌ）」と呼ばれる）のいずれかである、促進老化によって特徴付けされる。例えば、早期老化障害は、促進老化が関与し、かつ以下の突然変異の少なくとも１つが存在する障害から選択され得る：
−  プレラミンＡおよび／またはラミンＢが、短縮型である、ならびに／あるいは
−  プロジェリンおよび／またはプレラミンＡおよび／またはラミンＢが、ファルネシル化されている、ならびに／あるいは
−  ＬＭＮＡ、ＬＭＮＢ１および／またはＬＭＮＢ２が、重複している。
【００３８】
例えば、ＬＭＮＢ１が重複している場合、この遺伝的欠陥は成人発症型常染色体優性白質ジストロフィーに繋がる（３７）。
【００３９】
早期老化障害は、早老症候群の中から選択され得る。
【００４０】
早老症候群は、老化を思い起こさせるが早すぎるように見えかつその発達が劇的に促進される臨床症状を含む遺伝性ヒト障害である。促進老化のほとんどのヒト症候群は、２つの主要な機序：核ラミナおよびマトリックスタンパク質における欠陥またはＤＮＡ修復に関与するタンパク質における変化のうちの１つによって引き起こされる（５）。
【００４１】
早老症候群の中で、それぞれ、ＬＭＮＡ、ＺＭＰＳＴＥ２４またはＢＡＮＦ１における突然変異が原因の、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群（ＨＧＰＳ）、非定型プロジェリア症候群（ＡＰＳ）、拘束性皮膚障害、ネスター・ギレルモ（Ｎｅｓｔｏｒ−Ｇｕｉｌｌｅｒｍｏ）プロジェリア症候群、ならびにその産生物がＤＮＡ修復に関与する遺伝子における突然変異が原因の、ウェルナー、ブルーム、ロートムンド−トムソン、またはコケイン症候群、色素性乾皮症および硫黄欠乏性毛髪発育異常症を例証として挙げることができる。
【００４２】
好ましくは、プロテアソーム阻害剤は、ＳＲＳＦ１を下方制御することによる非分解性異常タンパク質の蓄積に関連した障害を治療および／または予防するための使用のためである。
【００４３】
ＳＲＳＦ１は、セリン／アルギニン−リッチスプライシング因子ファミリーに属する、セリン／アルギニン−リッチスプライシング因子１である。「ＳＲＳＦ１を下方制御すること」は、プロテアソーム阻害剤が、未治療の対照と比較してＳＲＳＦ１タンパク質を少なくとも１０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％下方制御することを意味する。ＳＲＳＦ１の下方制御は、実施例１および図３Ｂに記載のように測定してよい。理論に拘泥されるものではないが、本発明による使用のためのプロテアソーム阻害剤は、ＳＲＳＦ１下方制御に繋がる、ＳＲＳＦ１レベルのカスパーゼ介在性の低下を誘導することによってその作用を発揮し得る。この下方制御は、次いでプロジェリン転写レベルを減少させ、かつしたがってプロジェリン産生を減少させる。
【００４４】
好ましくは、本発明による非分解性異常タンパク質の蓄積に関連した障害を治療および／または予防するために用いられるプロテアソーム阻害剤は、化学化合物である。好ましくは、プロテアソーム阻害剤は、ＭＧ１３２を含まない。より好ましくは、プロテアソーム阻害剤は、ペプチド、場合によっては修飾ペプチドから選択される。より好ましくは、プロテアソーム阻害剤は、ＭＧ１３２を除いた、ペプチド、場合によっては修飾ペプチドから選択される。
【００４５】
ペプチドは、好ましくはトリペプチド、場合によっては修飾トリペプチドである。好ましくは、これらのペプチドは、少なくとも２つのロイシンを含むトリペプチド、場合によっては修飾トリペプチドである。修飾は、アルデヒド官能基の付加、または−Ｂ（ＯＨ）２のような、化学化合物の付加であってよい。
【００４６】
好ましくは、これらのペプチドには、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｂ（ＯＨ）２、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｖａ−Ｈ、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ａｌおよびＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ａｌが含まれる。
【００４７】
修飾トリペプチドＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｂ（ＯＨ）２は、ＭＧ２６２という名でも知られる。
【００４８】
修飾トリペプチドＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｖａ−Ｈは、ＭＧ１１５という名でも知られる。
【００４９】
修飾トリペプチドＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ａｌは、ＭＧ１３２という名でも知られる。修飾トリペプチドＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ａｌは、ＭＧ１１０という名でも知られる。
【００５０】
より好ましくは、プロテアソーム阻害剤は、ＭＧ１１５、ＭＧ２６２、ＭＧ１１０およびＭＧ１３２から選択される。より好ましくは、プロテアソーム阻害剤は、ＭＧ１１５、ＭＧ１１０およびＭＧ２６２から選択される。
【００５１】
本発明は、具体的にはＭＧ１１５、ＭＧ２６２、ＭＧ１１０およびＭＧ１３２から選択される、本発明のプロテアソーム阻害剤を含む医薬組成物にも関する。
【００５２】
本発明のプロテアソーム阻害剤は、ペプチドである場合、細胞における前記ペプチドの蓄積を増加する薬剤に結合または付着し得る。
【００５３】
適した薬剤とのこうした結合は、前記ペプチドを、細胞膜透過性基剤など、より膜透過性にするであろう。こうした薬剤は細胞膜透過性基剤、例えば正に帯電したアミノ酸−リッチペプチド、好ましくはアルギニン−リッチペプチドであってよい。好ましくは、アルギニン−リッチペプチドは、配列ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号１２）を有するポリアルギニンタグである。他の細胞浸透ペプチドは、アミノペプチダーゼ（ＣＤ１３）Ｎリガンド（ＣＮＧＲＣＧ）由来のＮＧＲペプチド、アンテナペディアリーダーペプチド（ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＶＫＶＱＲＧ  配列番号１３）、Ｂｃｌ−２結合ペプチド（デカノイル−ＫＮＬＷＡＡＱＲＹＧＲＥＬＲＲＭＳＤＥＦＥＧＳＦＫＧＬ  配列番号１４）、ｔａｔ配列（ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ  配列番号１５）、ブフォリン（ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ  配列番号１６）、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルスのペプチドフラグメント（ＨＴＬＶ）−１１  Ｒｅｘ（ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ  配列番号１７）、脂質膜転位ペプチド（ＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ  配列番号１８）およびペネトラチン（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＧＧ  配列番号１９）の中から選択してよい。
【００５４】
本発明のプロテアソーム阻害剤は、ペプチドである場合、その薬学的に活性の塩のうちの１つの形態で投与してよい。適した薬学的に活性の塩は、酸付加塩ならびにアルカリ塩またはアルカリ土類塩を含む。例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、マグネシウムまたはカルシウム塩が取得され得る。ペプチドは、有機および無機酸と薬学的に許容可能な塩を形成する。こうした酸付加塩形成に適した酸の例は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、マロン酸、サリチル酸、ｐ−アミノサリチル酸、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、アスコルビン酸、マレイン酸、スルホン酸、ホスホン酸、過塩素酸、硝酸、ギ酸、プロピオン酸、グルコン酸、乳酸、酒石酸、ヒドロキシマレイン酸、ピルビン酸、フェニル酢酸、安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、亜硝酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、エチレンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフチルスルホン酸、スルファニル酸、カンファースルホン酸（ｃａｍｐｈｅｒｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、マンデル酸、ｏ−メチルマンデル酸、水素−ベンゼンスルホン酸、ピクリン酸、アジピン酸、Ｄ−ｏ−トリル酒石酸（Ｄ−ｏ−ｔｏｌｙｌ  ｔａｒｔａｒｉｃ  ａｃｉｄ）、タルトロン酸、ａ−トルイル酸、（ｏ，ｒｎ，ｐ）−トルイル酸、ナフチルアミンスルホン酸、および他の当業者に良く知られている無機物またはカルボン酸である。塩は、従来の手法で塩を生成するために十分な量の所望の酸と遊離塩基形態を接触させることによって調製される。
【００５５】
本発明のペプチドは、非ペプチド部分とも結合し得る。ペプチドと対にされるポリマー分子は、典型的には約５００〜２０，０００Ｄａなどの、約３００〜１００，０００Ｄａの範囲の分子量を有する、天然または合成のホモポリマーまたはヘテロポリマーなどの、任意の適したポリマー分子であってよい。適したポリマー分子の例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）などの、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）を含めた、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、分岐ＰＥＧ、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボン酸、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリエチレン−ｃｏ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−ｃｏ−マレイン酸無水物、カルボキシメチルデキストランを含めたデキストラン、あるいは免疫原性を低下させるためならびに／または機能的ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）および／もしくは血清半減期を増加させるために適した任意の他のバイオポリマーからなる群から選択されるポリマー分子が含まれる。ポリマー分子の別の例は、ヒトアルブミンまたは別の豊富な血漿タンパク質である。一般には、ポリアルキレングリコール由来ポリマーは、生体適合性、非毒性、非抗原性、非免疫原性であり、種々の水溶性を有し、かつ生存生物から容易に排泄される。
【００５６】
したがって、本発明のプロテアソーム阻害剤は、治療組成物を形成するために薬学的に許容可能な賦形剤、および場合によっては生分解性ポリマーなどの、徐放性マトリックスと組み合わせてよい。
【００５７】
「薬学的」または「薬学的に許容可能な」は、適切に、哺乳動物、特にヒトに投与された場合に有害な、アレルギー性のまたは他の不適当な反応を生じない分子存在物および組成物を指す。薬学的に許容可能な基剤または賦形剤は、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、封入材料または任意のタイプの製剤助剤を指す。
【００５８】
医薬組成物の形態、投与経路、投薬量および投薬計画は、患者の治療される状態、病気の重症度、年齢、体重、および性別などに必然的に依存する。
【００５９】
本発明の医薬組成物は、局所、経口、非経口、鼻腔内、胃内（ｉｎｔｒａｇａｓｔｒａｌ）、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、膣内、直腸、舌下、経皮的または眼球内投与などのために製剤され得る。投与形態には、例えば丸薬、錠剤、フィルム錠剤、コーティング錠剤、カプセル、リポソーム製剤、ミクロおよびナノ製剤、粉末および被覆物（ｄｅｐｏｓｉｔｓ）が含まれる。好ましくは、医薬組成物は、注射されることが可能な製剤のための薬学的に許容可能なビヒクルを含有する。これらは、具体的には等張性、無菌の、食塩水（一ナトリウムまたは二ナトリウムリン酸塩、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムなどあるいはこうした塩の混合物）、または場合によって、滅菌水または生理食塩水の添加で、注射可能な溶液の構成を可能にする乾燥、特に凍結乾燥組成物であってよい。
【００６０】
投与に使用される投与量は、種々のパラメーターの関数として、および具体的には用いられる投与方法、関連した病状、または代わりに治療の所望の継続期間の関数として適合させてよい。医薬組成物を調製するために、有効量のプロテアソーム阻害剤を薬学的に許容可能な基剤または水性媒体中に溶解または分散させてよい。注射可能な使用のために適した医薬品形態には、無菌水溶液または分散液；ゴマ油、落花生油または水性プロピレングリコールを含めた製剤；および無菌注射液または分散液の即時調製のための無菌粉末が含まれる。全ての場合において、形態は、無菌でなければならずかつ容易な注射可能性が存在する程度まで流動性でなければならない。形態は、製造および保管の状態下で安定でなければならずかつ細菌および真菌などの、微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。
【００６１】
遊離塩基または薬理学的に許容可能な塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの、界面活性剤と適切に混合された水において調製され得る。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物においてならびに油においても調製され得る。保管および使用の通常の状態下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐために防腐剤を含有する。
【００６２】
基剤は、例えば、水、エタノール、多価アルコール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適した混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒体であってもよい。
【００６３】
適当な流動性は、例えば、レシチンなどの、コーティングの使用によって、分散液の場合は必要な粒径の維持によっておよび界面活性剤の使用によって、維持され得る。
【００６４】
微生物の作用の予防は、種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合において、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことは好ましいであろう。
【００６５】
注射可能な組成物の持続的吸収は、組成物における吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。
【００６６】
無菌注射液は、必要とされる量の活性化合物を、必要に応じて、種々の上記に列挙された他の成分と共に適切な溶媒に組み込みその後にろ過滅菌することによって調製される。
【００６７】
一般には、分散液は、種々の滅菌された活性成分を、基本的な分散媒体および上記に列挙されたものの中から必要な他の成分を含有する無菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合は、調製の好ましい方法は、活性成分に加えて前もって滅菌ろ過されたその溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末を与える真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【００６８】
製剤後、溶液は、投薬量製剤に適合した手法でかつ治療上有効であるような量で投与されるであろう。製剤は、上述の注射可能な溶液の類のような、種々の剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども用いてよい。
【００６９】
水溶液における非経口投与のために、例えば、溶液は、必要な場合は適切に緩衝されるべきでありかつ液体希釈剤は最初に十分な食塩水またはグルコースで等張にされる。
【００７０】
これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与のために特に適する。これに関連して、用いてよい無菌水性媒体は、本開示に照らせば当業者に分かるであろう。例えば、一回投薬量は、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解してよくかつ１０００ｍｌの皮下注入流体に加えるかまたは注入の提案される部位において注入してよい（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照）。いくらかの投薬量の変動は、治療される対象の状態に応じて必然的に発生するであろう。投与の責任を負う人物が、いずれにしても、個々の対象に適切な投与量を決定するであろう。
【００７１】
静脈内または筋肉内注入などの、非経口投与のために製剤された化合物に加えて、他の薬学的に許容可能な形態には、例えば錠剤または他の経口投与のための固体、徐放カプセル、および現在使用されている任意の他の形態が含まれる。
【００７２】
プロテアソーム阻害剤は、単独で、または少なくとも１種の他の薬物と併用して用いてよい。こうした薬物は、抗炎症剤（３８）；（３１）から知られている、５’−ＧＣＴＡＣＣＡＣＴＣＡＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧ−３’（配列番号１）および５’−ＧＧＧＴＣＣＡＣＣＣＡＣＣＴＧＧＧＣＴＣＣＴＧＡＧ−３’（配列番号２）のような、アンチセンスオリゴヌクレオチド；ゾレドロネートのような、ファルネシルピロリン酸シンターゼのアミノビスフォスフォネート阻害剤；プラバスタチンのような、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼのスタチン阻害剤；ＮＯＸ１阻害剤などの他のペプチド；シャペロンまたはそれらのＡＴＰａｓｅ活性の活性剤；トレハロース、リチウム塩、スペルミジンなどの、自食作用活性剤；ファスジル塩酸塩、Ｙ−２７６３２、ＨＡ１０７７またはＨ８９などの、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤；ＢｉｏＡｘｏｎｅ  ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓのＢＡ−２１０（Ｃｅｔｈｒｉｎ（登録商標））などの、Ｒｈｏ阻害剤；およびそれらの混合物から選択してよい。
【００７３】
こうした薬物は、化学療法または免疫療法でもあり得る。
【００７４】
本発明は、皮膚老化、具体的にはヒト皮膚老化を予防および／または弱めるためのプロテアソーム阻害剤の皮膚科学的使用、皮膚美容的使用または化粧品使用にも関する。本発明は、生理的老化を弱めるためのプロテアソーム阻害剤の使用にも関する。
【００７５】
プロテアソーム阻害剤は、上記で述べた通りである。
【００７６】
プロテアソーム阻害剤は、皮膚老化を予防および／または弱めるため、ならびに具体的には皺、小皺を減少するため、ならびに／あるいは皮膚の菲薄化ならびに／または柔らかい皮膚および衰えた皮膚の外観を予防するために用いられ得る。
【００７７】
本発明は、加齢性障害およびそれらの代謝結果、具体的には皮膚、脂肪組織、骨、血管ならびにそれらの内皮および血管平滑筋細胞などの、プロジェリンおよび／またはファルネシル化プレラミンＡを発現している組織を含めたものならびに皮膚、心臓、脳または腎臓へのそれらの結果の治療および／または予防における使用のプロテアソーム阻害剤にも関する。具体的には、加齢性障害は、骨粗鬆症、２型糖尿病および動脈硬化症から選択され得る。したがって、好ましくは、本発明は、加齢性障害およびそれらの代謝結果、具体的には皮膚、脂肪組織、骨、血管ならびにそれらの内皮および血管平滑筋細胞などの、プロジェリンおよび／またはファルネシル化プレラミンＡを発現している組織を含めたものならびに皮膚、心臓、脳または腎臓へのそれらの結果を治療および／または予防するための使用のためのプロテアソーム阻害剤に関する。好ましくは、前記加齢性障害は、骨粗鬆症、２型糖尿病および動脈硬化症から選択される。
【００７８】
プロテアソーム阻害剤の投与は、上述のような任意の適した方法によってよい。プロテアソーム阻害剤の適した量は、経験的に決定され得るが、典型的には下記に示される範囲内である。プロテアソーム阻害剤の単回投与は、患者のために有益な効果を有するのに十分であり得るが、典型的な投与レジームが、例えば、６か月毎に週に１回または２回を２〜４週間、または４から６か月毎に一日一回を１週間であってよい、２回以上投与された場合に有益であり得ることが理解されるであろう。
【００７９】
投与のための投薬量は、組成物の性質、投与経路ならびに投与レジームのスケジュールおよびタイミングを含めた多数の要因に依存するであろう。
【００８０】
本発明の分子または分子の組み合わせの適した投与量は、投与当り１μｇから１０μｇまで、１５μｇまで、２０μｇまで、２５μｇまで、３０μｇまで、３５μｇまで、５０μｇまで、１００μｇまで、５００μｇまでまたはそれ以上の程度であってよい。適した投与量は、１５μｇ未満であるが、少なくとも１ｎｇ、または少なくとも２ｎｇ、または少なくとも５ｎｇ、または少なくとも５０ｎｇ、または少なくとも１００ｎｇ、または少なくとも５００ｎｇ、または少なくとも１μｇ、または少なくとも１０μｇであってよい。本発明の一部の分子については、用いられる投与量は、より多く、例えば、１ｍｇまで、２ｍｇまで、３ｍｇまで、４ｍｇまで、５ｍｇまでまたはそれ以上であってよい。こうした投与量は、選択された経路による投与のために適切な体積を可能にするために適した濃度で、液体製剤において提供され得る。
【００８１】
本発明による診断方法
本発明は、ｉ）細胞核における糸状ＰＭＬ−ＮＢの検出、およびｉｉ）第２のパラメーターの検出を含む、対象の生物試料における、非分解性異常タンパク質の蓄積に関連した障害、具体的には早期老化障害を診断するための方法にも関する。前記第２のパラメーターは、対象の老化の臨床症状、および／または生物試料におけるＤＮＡ切断の検出から選択され得る。
【００８２】
実際、実施例に示されるように、発明者は、糸状ＰＭＬ−ＮＢがＨＧＰＳ細胞のマーカーであり、かつしたがって非分解性異常タンパク質の蓄積に関連した障害、具体的には早期老化障害の診断方法において使用可能であり得ることを発見した。
【００８３】
ＰＭＬ−ＮＢ（前骨髄球性白血病−核内構造体）は、核内構造体でありかつ核マトリックスと緊密に関連した離散した核スペックルとして記述されている（３９）。ＰＭＬ遺伝子は、当初は急性前骨髄球性白血病のＴ（１５；１７）染色体転位におけるレチノイン酸受容体α遺伝子の融合パートナーとして特定された。ＰＭＬ−ＮＢは、直径０．２μｍから１．２μｍのサイズの範囲でありかつそれらは熱ショック、重金属暴露およびＤＮＡ損傷などのストレスに反応してサイズ、位置および数が変化する動的構造である。
【００８４】
ＰＭＬ−ＮＢは、免疫蛍光法、ウエスタンブロットまたはフローサイトメトリーのような、当技術分野において知られている旧知の方法のおかげで、検出され得る。
【００８５】
したがって、本発明による、対象の生物試料において、非分解性異常タンパク質の蓄積に関連した障害、具体的には早期老化障害（より詳細にはＨＧＰＳおよび他の早老症候群）を診断するための方法は、ｉ）前記生物試料における糸状ＰＭＬ−ＮＢを検出すること、およびｉｉ）第２のパラメーターを検出することを含む。糸状ＰＭＬ−ＮＢが検出される場合、および第２のパラメーターが検出される場合、次いで対象が、非分解性異常タンパク質の蓄積に関連した障害に悩まされていることが結論づけられ得る。
【００８６】
生物試料は、皮膚生検からの細胞、末梢血細胞、頬骨粘膜または尿からの上皮細胞であってよい。
【００８７】
本発明によるがん治療
最後に、本発明は、上記で述べたような、かつがんを治療および／または予防するための、ＳＲＳＦ１を下方制御するプロテアソーム阻害剤にも関する。前記用途は、驚いたことに下記の実施例２において示される。
【００８８】
前記プロテアソーム阻害剤は、上記で述べた通りであってよい。好ましくは、前記プロテアソーム阻害剤は、ＭＧ１３２、ＭＧ１１５、ＭＧ２６２およびＭＧ１１０から選択され得る。
【００８９】
ヒトがんにおけるＳＲＳＦ１がん原遺伝子の過剰発現が、観察されている（４０）。したがって、ＳＲＳＦ１を下方制御することによって、本発明のプロテアソーム阻害剤は、がんを治療することが可能である。
【００９０】
がんは、任意の種類であってよい。好ましくは、がんは、乳がん、肺がん、前立腺がん、腎臓がん、大腸がんおよび皮膚がんから選択される。
【００９１】
本発明は、以下の図および実施例を考慮してさらに例示される。
【実施例】
【００９２】
実施例１：ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群におけるＭＧ１３２治療下の自食作用誘導およびＳＲＳＦ−１下方制御による有効なプロジェリンのクリアランス
材料および方法
細胞培養
対照対象（８４９８：１歳男性、８４７１：６０男性、７３１Ｃ：９６歳男性）およびＨＧＰＳ  ｐ．Ｇｌｙ６０８Ｇｌｙ突然変異を保有する患者（５９６８：５歳男性）からのヒト真皮線維芽細胞（皮膚生検から確立された線維芽細胞）は、マルセイユのティモンヌ病院（Ｔｉｍｏｎｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ）、遺伝医学部門（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、生物遺伝資源機関（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ）（ＣＲＢ  ＴＡＣ）による規定（Ａ．Ｒｏｂａｇｌｉａ−ＳｃｈｌｕｐｐおよびＫ．Ｂｅｒｔａｕｘ）に従って調製および保存されていた。ＨＧＰＳ線維芽細胞（ＡＧ０１９７２：１４歳女性、ＡＧ１１４９８：１４歳男性）は、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから取得した。細胞を、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で３７℃で１５％ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１Ｘペニシリン−ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補ったダルベッコ変法イーグル培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において培養した。線維芽細胞を、ＭＧ１３２（４７４７９０。Ｍｅｒｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＬＴＤ）、ＭＧ１１５（ＳＣＰ０００５。Ｓｉｇｍａ）、ＭＧ２６２（Ｉ−１２０−２００。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ボルテゾミブ（Ｓ１０１３。Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ）、カルフィルゾミブ（Ｓ２８５３。Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ）、クロロキン二リン酸塩結晶（Ｃ６６２８。Ｓｉｇｍａ）、バフィロマイシンＡ１（Ｂ１７９３。Ｓｉｇｍａ）、カスパーゼ−６阻害剤Ｚ−ＶＥＩＤ−ＦＭＫ（ＦＭＫ００６。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、パン−カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（ＦＭＫ００１。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびレプトマイシンＢ（Ｌ２９１３。Ｓｉｇｍａ）の存在下または非存在下で培養した。
【００９３】
ｓｉＲＮＡトランスフェクション
ＳＲＳＦ−１のノックダウンのために、ＨＧＰＳ細胞を、ＩＮＴＥＲＦＥＲｉｎ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を用いて１０ｎＭ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ＨＧＰＳ細胞を、トランスフェクションの前日に６ウェル培養容器において１０００００〜２０００００細胞で播種した。２２ｐｍｏｌｅのｓｉＲＮＡを、８μｌのＩＮＴＥＲＦＥＲｉｎ試薬と混合した、２００μｌの無血清ＤＭＥＭ培地に希釈した。管を、１０秒ボルテックスして室温で１０分間インキュベートした。トランスフェクション混合物を、血清含有ＤＭＥＤ培地中の細胞に加えた。培地を４時間後に交換して細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。ＳＲＳＦ−１  ｓｉＲＮＡ（ＡＭ１６７０８）は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。
【００９４】
抗体
調査において用いた抗体には、
ウサギ  抗ラミンＡ／Ｃポリクローナル抗体（ＳＣ−２０６８１、ウエスタンブロット解析のために１：１０００希釈でおよび免疫蛍光標識のために１：２００で用いた。Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）；マウス抗プロジェリンモノクローナル抗体（ｓｃ−８１６１１、ウエスタンブロット解析のために１：１０００希釈でおよび免疫蛍光標識のために１：２００で用いた。Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）；ウサギ抗ＰＭＬポリクローナル抗体（ｓｃ−９８６３−Ｒ、免疫蛍光標識のために１：２００で用いた。Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）；マウス抗ＰＭＬモノクローナル抗体（ｓｃ−９６６、免疫蛍光標識のために１：１００で用いた。Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）；ヤギ抗ＳＰ１００ポリクローナル抗体（ｓｃ−１６３２８、免疫蛍光標識のために１：５０で用いた。Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）；マウス抗ＨＰ１モノクローナル抗体（２ＨＰ−１Ｈ５−ＡＳ、免疫蛍光標識のために１：１００で用いた。Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ）；ウサギ抗ＡＴＲＸポリクローナル抗体（ｓｃ−１５４０８、免疫蛍光標識のために１：５０で用いた。Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）；抗ＤＡＸＸ（ａｂ３２１４０、免疫蛍光標識のために１：５０で用いた。Ａｂｃａｍ）；ウサギポリクローナル抗ＣＢＰ抗体（０６−２９７、免疫蛍光標識のために１：２００で用いた。Ｕｐｓｔａｔｅ）；マウス抗ユビキチン抗体（ＰＷ８８０５、免疫蛍光標識のために１：１０で用いた。Ｅｎｚｏ）；マウス抗モノ−およびポリユビキチン化複合体モノクローナル抗体（ＦＫ２、ウエスタンブロット解析のために１：１０００で用いた。Ｅｎｚｏ）；ウサギ抗フィブリラリンポリクローナル抗体（ａｂ５８２１、免疫蛍光標識のために１：１００で用いた。Ａｂｃａｍ）；ヤギポリクローナル抗ラミンＢ１／Ｂ２抗体（ｓｃ６２１７、免疫蛍光標識のために１：１００で用いた。Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）；ヤギ抗エメリンポリクローナル抗体（ｓｃ−８０８６、免疫蛍光標識のために１：１００で用いた。Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）；マウス抗２６Ｓモノクローナル抗体（６５１４４、免疫蛍光標識のために１：１で用いた。Ｐｒｏｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃ．）；マウス抗Ｎｕｐ１５３モノクローナル抗体（ａｂ９３３１０、免疫蛍光標識のために１：１０で用いた。Ａｂｃａｍ）；マウス抗ｐ５３モノクローナル抗体（ａｂ２６、免疫蛍光標識のために１：２００で用いた。Ａｂｃａｍ）；ウサギ抗ｐ６２ポリクローナル抗体（ａｂ３７０２４、ウエスタンブロット解析のために１：１０００でおよび免疫蛍光標識のために１：１００で用いた。Ａｂｃａｍ）；ウサギ抗ＬＣ３Ｂポリクローナル抗体（＃２７７５、ウエスタンブロット解析のために１：１０００でおよび免疫蛍光標識のために１：４００で用いた。Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）；ウサギ抗ＳＱＳＴＭ１／ｐ６２ポリクローナル抗体（＃５１１４、ウエスタンブロット解析のために１：１００���でおよび免疫蛍光標識のために１：１００で用いた。Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）；ウサギ抗ラミンＣポリクローナル抗体（ＢＰ４５０５、免疫蛍光標識のために１：２００で用いた。Ａｃｒｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＧｍｂＨ）；ウサギ抗ＳＲＳＦ１モノクローナル抗体（ａｂ１２９１０８、ウエスタンブロット解析のために１：１０００で用いた。Ａｂｃａｍ）；マウス抗グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼモノクローナル抗体（ＭＡＢ３７４、ウエスタンブロット解析のために１：１００００で用いた。Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）；マウス抗α−チューブリンモノクローナル抗体（Ｔ６０７４、ウエスタンブロット解析のために１：１０，０００で用いた。Ｓｉｇｍａ）またはマウス抗β−アクチンモノクローナル抗体（ＡＣ−４０、ウエスタンブロット解析のために１：１０，０００で用いた。Ｓｉｇｍａ）；ウサギ抗Ｓｕｍｏ２／３ポリクローナル抗体（ａｂ−３７４２、ウエスタンブロット解析のために１：１０００で用いた。Ａｂｃａｍ）が含まれた。
【００９５】
蛍光顕微鏡検査法
遠心分離によって集めた細胞を、サイトスピン（Ｓｈａｎｄｏｎ）を用いて遠心分離（３００ｒｐｍで５分間）によってポリリジンでコートしたスライド上に塗布した。細胞を、次いでＰＢＳ  ｐＨ７．２中２％（ｗ／ｖ）のパラホルムアルデヒドにおいて室温で１０分間定着させた。スライドを、使用に先立って−８０℃で保管した。細胞を、１００μＬの透過処理緩衝液（０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭスクロース、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、３ｍＭ  ＭＧＣｌ２）を用いて室温で３分間透過処理した。非特異的な抗体結合を、ＰＢＳ中３％のウシ血清アルブミン（ｗ／ｖ）（ＰＢＳ−ＢＳＡ）で３０分間ブロックした。透過処理した細胞を、一次抗体と共に３７℃で３時間インキュベートした。洗浄後、次いで細胞を、二次抗体（Ａ１１００１、Ａ１１０５８、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１／４００）と共に３７℃で２０分間インキュベートした。核を、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ａｂｃｙｓ）に希釈したＤＡＰＩ（５０ｎｇ／ｍｌ）で室温で１０分間染色した。試料を、４％パラホルムアルデヒド中で５分間定着させた。染色した細胞を、Ａｘｉｏｐｌａｎ  ２イメージング顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）上で観察またはレーザー共焦点走査システム（Ｌｅｉｃａ）に取り付けたＮｉｋｏｎ倒立顕微鏡によって検査した。全ての抗体を、それらの特異性および動作について個々の染色反応において試験した。一次抗体がない対照は、全て陰性であった。
【００９６】
異常核の形態学の定量化
３人のＨＧＰＳ患者（ＡＧ０１９７２、ＡＧ１１４９８、５９６８）および２人の正常な個人（８４７１、８４９８）からの線維芽細胞を、１０μＭ  ＭＧ１３２、または同体積のビヒクル（ＤＭＳＯ、０．０２５％ｖ／ｖ）を含有するＤＭＥＭ培地で４８時間培養した。ラミンＡ／ＣまたはＤＡＰＩに関して染色した細胞を、Ａｘｉｏｐｌａｎ  ２イメージング顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いて蛍光顕微鏡検査法によって検査した。異常核の形態学の定量化のために、正常核（滑らかな楕円形状を有する核）および異常核（小疱、不規則形状、または複数の折りたたみを有する核）の割合を、手動ブラインド計数によって計算した。それぞれの細胞株について少なくとも２００個の線維芽細胞核を、無作為に選択して２つの独立した実験において検査した。結果を、計数した全核の平均割合として図示で示す。
【００９７】
ＲＮＡ単離、逆転写、およびリアルタイムＰＣＲ
全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  ｐｌｕｓ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州、バレンシア）を用いて単離した。１μｇのＲＮＡを、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて逆転写した。リアルタイムＰＣＲ増幅を、プログラム：５０℃で２分間のＵＮＧインキュベーション、９５℃で１０分間の初期変性、４０サイクルの増幅：９５℃で１５秒間の変性および６０℃で１分間のアニーリングを用いてＧＡＰＤＨ（Ｈｓ００２６６７０５＿ｇ１）、プロジェリン（Ｆ：ＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＴＣＧＧＧＧ（配列番号３）Ｒ：ＴＣＴＧＧＧＧＧＣＴＣＴＧＧＧＣ（配列番号４）およびプローブ：ＣＧＣＴＧＡＧＴＡＣＡＡＣＣＴ（配列番号５））、ラミンＡ（Ｆ：ＴＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣＣＡＧＴＧＴＣＡＣＧ（配列番号６）Ｒ：ＡＧＴＴＣＴＧＧＧＧＧＣＴＣＴＧＧＧＴ（配列番号７）およびプローブ：ＡＣＴＣＧＣＡＧＣＴＡＣＣＧ（配列番号８））ならびにラミンＣ（Ｆ：ＣＡＡＣＴＣＣＡＣＴＧＧＧＧＡＡＧＡＡＧＴＧ（配列番号９）Ｒ：ＣＧＧＣＧＧＣＴＡＣＣＡＣＴＣＡＣ（配列番号１０）およびプローブ：ＡＴＧＣＧＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧ（配列番号１１））（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のために予め設計したプライマーを用いてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｒｏｃｈｅ、独国）上でＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実行した。全てのＰＣＲ反応を、三重に実施した。しきい値サイクル（Ｃｔ）値を、ＧＡＰＤＨ発現に対する正規化を用いる２−ΔΔＣＴ相対定量法によって相対的なｍＲＮＡ発現を計算するために用いた。
【００９８】
ウエスタンブロット
全線維芽細胞タンパク質を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有する２００μＬのＮＰ４０細胞溶解緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールスバッド）において抽出した。あるいは、細胞を、尿素（８Ｍ尿素、５ｍＭジチオスレイトール、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））で溶解した。細胞を、２回超音波処理し（それぞれ３０秒）、４℃で３０分間インキュベートし次いで１０，０００ｇで１０分間遠心分離した。タンパク質濃度を、ビシンコニン酸法（Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）で評価し、ｎａｎｏｄｒｏｐ  １０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を用いて５６２ｎｍにおける吸光度を測定した。等量のタンパク質（４０μｇ）を、ＸＴ  Ｔｒｉｃｉｎｅ  ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ、米国）を用いて１０％トリス−グリシンゲル（Ｔｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｇｅｌ）（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）ＸＴ  ｐｒｅｃａｓｔ  ｇｅｌ）上に充填した。電気泳動後、ゲルを、ニトロセルロース膜またはＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＦＬポリフッ化ビニリデン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に電気泳動転写させ、ＰＢＳに１：１希釈したＯＤＹＳＳＥＹブロッキングバッファー内に室温で１時間ブロックして、種々の一次抗体と共に４℃で一晩または室温で２時間インキュベートした。ブロットを、ＴＢＳ−Ｔバッファー［２０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０］で洗ってＯｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファー（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中１：１０，０００のＩＲ−Ｄｙｅ  ８００結合二次ロバ抗ヤギまたはＩＲ−Ｄｙｅ  ７００結合二次抗マウス抗体（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共にインキュベートした。ＩＲ−Ｄｙｅ  ８００およびＩＲ−Ｄｙｅ  ７００検出のために、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。ＧＡＰＤＨ、α−チューブリンまたはβ−アクチンを、全細胞タンパク質充填対照として使用した。
【００９９】
免疫沈降
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて免疫沈降を行った。５μｇのマウスモノクローナル抗プロジェリン抗体（Ａｂｃａｍ）を、５０μｌ（１．５ｍｇ）のＤｙｎａｂｅａｄｓに加えて室温で１０分間回転させた。上清を除去してビーズ−抗体複合体を、５ｍＭのＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有するＴｗｅｅｎ−２０を含む２００μＬのＰＢＳにおいて洗った。上清を除去してＤｙｎａｂｅａｄｓを、プロテアーゼ、ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および５ｍＭのＮＥＭを含有するＮＰ４０細胞溶解緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて抽出した２００μｌ細胞溶解物（２００μｇのタンパク質）と共にインキュベートし、管を室温で３０分間回転させた。ビーズを、製造者の手順に従って３回洗った。タンパク質を、５ｍＭのＮＥＭを含有する２０μｌの溶出緩衝液で溶出した。ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよび免疫ブロット法を上述の通りに実行した。
【０１００】
プロテアソーム活性アッセイ
プロテアソーム活性を、培養細胞におけるプロテアソーム複合体と関連したキモトリプシン様、トリプシン様またはカスパーゼ様プロテアーゼ活性の測定を可能にするＰｒｏｔｅａｓｏｍｅ−Ｇｌｏ（商標）３−Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｃｅｌｌ−Ｂａｓｅｄ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いることによってＨＧＰＳおよび対照細胞において判定した。Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ−Ｇｌｏ（商標）Ｃｅｌｌ−Ｂａｓｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔは、それぞれ特異的な発光プロテアソーム基質を含有する。これらのペプチド基質は、それぞれ、キモトリプシン様、トリプシン様およびカスパーゼ様活性のためのＳｕｃ−ＬＬＶＹアミノルシフェリン（スクシニル−ロイシン−ロイシン−バリン−チロシン−アミノルシフェリン）、Ｚ−ＬＲＲ−アミノルシフェリン（Ｚ−ロイシン−アルギニン−アルギニン−アミノルシフェリン）およびＺ−ｎＬＰｎＬＤ−アミノルシフェリン（Ｚ−ノルロイシン−プロリン−ノルロイシン−アスパルテート−アミノルシフェリン）である。細胞（１０，０００細胞／ウェル）を、９６−ウェルプレートにおいて１００μｌ／ウェルで３７℃、５％ＣＯ２で培養した。プレートを、２２℃に平衡させてから１００μｌ／ウェルの基質およびルシフェリン検出試薬を加えた。ウェルの内容物を、プレート振とう機を用いて７００ｒｐｍで２分間混合して室温で１０分間インキュベートした。プロテアソームによる切断後、ルシフェラーゼの基質（アミノルシフェリン）が放出され、ルシフェラーゼ反応の進行および光の生成を可能にする。発光を、ＧｌｏＭａｘ−Ｍｕｌｔｉ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を用いて相対発光量（ＲＬＵ）として判定する。
【０１０１】
老化の測定
老化を、Ｂｅｔａ−Ｇｌｏ  Ａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）で、製造業者の説明に従って測定した。発光強度を、ＧｌｏＭａｘ−Ｍｕｌｔｉ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を用いて相対発光量（ＲＬＵ）として判定した。
【０１０２】
生存度および細胞毒性アッセイ
生存度および細胞毒性を、ＭｕｌｔｉＴｏｘ−Ｆｌｕｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で、製造業者の説明に従って測定した。ＭｕｌｔｉＴｏｘ−Ｆｌｕｏｒ  Ａｓｓａｙは、同時に２つのプロテアーゼ活性（１つは、蛍光発生性、細胞浸透性ペプチド基質（グリシル−フェニルアラニルアミノフルオロクマリン、ＧＦ−ＡＦＣ）を用いる細胞生存度のマーカーであり、かつ他方は、細胞毒性のマーカー（ビスアラニル−アラニル−フェニルアラニル−ローダミン１１０、ｂｉｓ−ＡＡＦ−Ｒ１１０）である）を測定する。生細胞および死細胞のプロテアーゼは、異なる励起および放出スペクトルを有し、それらを同時に検出することを可能にする、異なる産生物、ＡＦＣおよびＲ１１０を産生する。結果を、ＧｌｏＭａｘ−Ｍｕｌｔｉ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を用いて測定した相対蛍光単位（ＲＦＵ）で示す。データは、３重に行った少なくとも３つの独立した実験の代表である。
【０１０３】
増殖アッセイ
細胞増殖率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で、製造業者の説明に従って測定した。吸光度を、ＧｌｏＭａｘ−Ｍｕｌｔｉ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）で観察した。
【０１０４】
線維芽細胞リプログラミング
リプログラミングによる誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）の発生を、マルセイユ公立病院機構（Ａｓｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｑｕｅ  Ｈｏｐｉｔａｕｘ  ｄｅ  Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ）において実施されたＨＧＰＳ患者生検から単離した線維芽細胞（１３−８２４３）またはコーリエル医学研究所（Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（カムデン、米国）によって提供された（ＡＧ０１９７２）線維芽細胞を用いて実行した。細胞株を、４つの転写因子、すなわちＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４のレトロウイルス介在トランスフェクションに基づいた山中の原法を用いてｉＰＳＣにリプログラミングした（４１）。ｉＰＳＣ株を、分化前に最大で１５代継代まで増幅した。
【０１０５】
多能性幹細胞培養および分化
ＨＧＰＳ  ｉＰＳＣを、ＳＴＯマウス線維芽細胞上で成長させて、１０ｍｇ／ｍｌのマイトマイシンＣで不活性化し、３０，０００／ｃｍ２で播種して先述の通りに成長させた（４２）。分化については、ｉＰＳＣを、既刊の分化のために指導された手順を用いて間葉系幹細胞（ＭＳＣ−ｉＰＳＣ）に分化した（４３〜４５）。ＣＤ３１＋細胞の蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分離によってｉＰＳＣからＶＳＭＣを取得した（４６）。
【０１０６】
マウス
ヒトＨＧＰＳ突然変異ｃ．１８２４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｙ６０９Ｇｌｙ）に相当する、内在性Ｌｍｎａ遺伝子内のｃ．１８２７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｙ６０９Ｇｌｙ）突然変異を保有するノックインマウスモデル（ＬｍｎａＧ６０９Ｇ／Ｇ６０９Ｇ）は、これまでに記述されている（３１）。ＭＧ１３２（１または１０μｇ／体重Ｋｇ）を、８月齢の同型接合ノックインマウス（ＬｍｎａＧ６０９Ｇ／Ｇ６０９Ｇ）の右腓腹筋内に週３回２週間イソフルラン麻酔下で注射した。反対側の筋肉は、対照（ＤＭＳＯ）としての役割を果たした。ＭＧ１３２を、筋肉内注射のためにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し次いで１００μｌ滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に希釈した。ビヒクル単独もＭＧ１３２処置も、マウスにおいていかなる明白な損傷もストレス反応も生じなかった。動物実験は、実験動物の管理と使用のための欧州ガイドライン（ＥＵ指令２０１０／６３／ＥＵ）に準拠してかつフランス国立保健医学研究所（Ｆｒｅｎｃｈ  ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（ＩＮＳＥＲＭ）およびエクスマルセイユ大学の倫理委員会の実験動物の管理と使用のためのガイドによって提供された勧告に従って実施した。
【０１０７】
統計的解析
統計的解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅで実行した。群間の相違を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して両側のスチューデントのｔ検定を用いてアッセイした。全てのケースで実験データを、ｔ検定要件（正規分布および同様の分散）を満たすと仮定し、ｔ検定の仮定が有効ではなかったケースにおいては、ノンパラメトリック統計法（マンホイットニー検定）を用いた。．０５未満のＰ値は、有意とみなした。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。
【０１０８】
結果
ＨＧＰＳ細胞株における新規バイオマーカーとしての糸状ＰＭＬ−ＮＢの特定
ＨＧＰＳ細胞の旧知の特質は、プロジェリンの蓄積であり、発明者はしたがってＨＧＰＳに罹患した３人の患者の線維芽細胞におけるプロジェリンの細胞内局在性を調査した（ＡＧ１１４９８、ＡＧ０１９７２、５９６８）。免疫染色は、培養における後期の継代での核質内プロジェリン断続点（ｉｎｔｒａｎｕｃｌｅｏｐｌａｓｍｉｃ  ｐｕｒｏｇｅｒｉｎ  ｐｕｎｃｔｕａｔｅ  ｄｏｔｓ）および線維状凝集体の広範な蓄積を明らかにした（データは示さず）。
【０１０９】
ＰＭＬ−ＮＢは、プロテアソーム分解の標的とされるミスフォールドされたタンパク質の隔離の部位として作用することが提案されており（４７）かつ細胞性老化の制御に関係があるとされているので（４８）、発明者は、これらの細胞小器官がプロジェリン蓄積または分解に関与し得ると仮定した。発明者は、ＨＧＰＳに罹患した３人の患者の線維芽細胞（ＡＧ１１４９８、ＡＧ０１９７２、５９６８）および２人の健常対象の線維芽細胞（８４７１、８４９８）におけるＰＭＬタンパク質の局在化を調査した。早期継代（９〜１５継代）において、ＰＭＬ−ＮＢは旧知の断続構造のように見え（直径０．５μｍの細胞当り１０〜３０個の塊）、ＰＭＬタンパク質分布は患者および対照において同様であった。後期継代（１６〜２６継代）において、普通ではない球状および糸状ＰＭＬ−ＮＢの数は、培養における細胞倍加と比較して、ＨＧＰＳ核において増加した。対照的に、異常ＰＭＬ−ＮＢは、同様にまたはより時間を経た培養のどちらにおいても（２９〜３３継代）、正常な対照線維芽細胞においてほとんど検出されなかった（データは示さず）。
【０１１０】
発明者は、次いでＰＭＬ−ＮＢの組成物にアクセスした。抗ＰＭＬ抗体およびＰＭＬ−ＮＢの旧知の構成要素（ＳＰ１００、ＨＰ１、ＤＡＸＸ、ＣＢＰおよびＡＴＲＸ）に対する抗体での二重免疫染色を、後期継代においてＨＧＰＳ線維芽細胞で実施し、こうした構造は、従来のＰＭＬ−ＮＢのものに類似の組成物を有しかつ類似の機能を有し得ることを示した（データは示さず）。
【０１１１】
したがって、糸状ＰＭＬ−ＮＢは、ＨＧＰＳ細胞株における新規バイオマーカーと見なされ得る。
【０１１２】
ＰＭＬ−ＮＢは、ＨＧＰＳ線維芽細胞核におけるプロジェリン蓄積細胞小器官である
糸状ＰＭＬ構造の存在とプロジェリンの存在との間の可能性がある相関関係を評価するために、発明者は、ＨＧＰＳ線維芽細胞の抗ＰＭＬおよび抗プロジェリン抗体での二重免疫染色を実施した。興味深いことに、プロジェリンは、ＰＭＬと共存する。共焦点顕微鏡法を用いて、発明者は、ＰＭＬ−ＮＢが、プロジェリンを含有することを示した（データは示さず）。
【０１１３】
プロジェリンに加えて、他の核ラミナ常在タンパク質が、ＰＭＬ−ＮＢに対して標的化される能力を有するかどうかを判定するために、発明者は、ラミンＡ、Ｃ、Ｂ１、Ｂ２、Ｎｕｐ−１５３およびエメリンの細胞内局在性を試験した。調査したタンパク質の中で、Ｂ型ラミン（Ｂ１およびＢ２）のみが、球状および糸状ＰＭＬ−ＮＢ構造内にも含まれた。核内のＰＭＬの共焦点平面の投影および３Ｄ視覚化は、糸状ＰＭＬ−ＮＢが、核質内にあることを示した（データは示さず）。さらに、小胞体または核エンベロープの内腔内に局在化する、カルレティキュリンは、ＰＭＬ−ＮＢ内で全く観察されなかった（データは示さず）。これは、ＰＭＬ−ＮＢは、固定されたプロジェリン、Ｂ型ラミンまたはエメリンであり得る核エンベロープの調査に対応しないことを示唆する。
【０１１４】
ＭＧ１３２、プロテアソーム阻害剤は、ＨＧＰＳ細胞におけるプロジェリンレベルを減少する
３つの主要な相補的なタンパク質分解系、すなわち自食作用、ユビキチンプロテアソーム系（ＵＰＳ）およびカスパーゼがタンパク質分解を仲介する、細胞質ゾルと異なり、真核細胞核においてはＵＰＳおよびカスパーゼのみ機能する。核のプロテアソーム介在タンパク質分解は、異なる核質病巣内で発生すると考えられている（４７）。これらのタンパク質分解性の核サブドメインは、ユビキチン、プロテアソームおよびＳＵＭＯ結合体が濃縮されるＰＭＬ−ＮＢのサブセットに相当する（４９〜５２）。糸状ＰＭＬ構造内へのプロジェリンと一緒のユビキチンおよび２６Ｓプロテアソームの存在は、それらがＵＰＳによるタンパク質および具体的にはプロジェリンの分解に関与し得ることを強く支持する。
【０１１５】
プロテアソーム活性レベルがＨＧＰＳ細胞におけるプロジェリン蓄積に影響を及ぼし得るかどうかを評価するために、発明者は、特異的な蛍光性基質を用いて、３種の異なるプロテアソーム触媒活性、キモトリプシン、トリプシンおよびカスパーゼ様活性を測定した。ＨＧＰＳ細胞は、同様のまたはより時間を経た健常対象のいずれかと比較して３種のプロテアソーム酵素活性の増加した活性を示す（図１Ａ）。これは、ＵＰＳ系が、プロジェリン凝集体を分解する能力が限度を超える飽和点に達し得ることを示す。実際、ＨＧＰＳ患者線維芽細胞が上昇したＲＯＳ（５３）を示すことを考えれば、酸化ストレスは、過剰量のミスフォールドされた、酸化的傷害を受けたかつユビキチン化されたタンパク質から生じるプロテアソームの飽和に繋がり得る。タンパク質分解性複合体ならびに高レベルのＲＯＳおよび酸化タンパク質を構築するために必要なサブユニットの数の減少の結果として、部分的に、発生する欠陥である、ＨＧＰＳ線維芽細胞におけるプロテアソームのタンパク質分解能力における有意の減少は、これまでに記述されている（５４）。全体で、これらの結果は、プロジェリンはＰＭＬ−ＮＢ内に捕捉されかつユビキチンプロテアソーム系（ＵＰＳ）によって自然に分解されないことを示す。
【０１１６】
プロテアソーム阻害剤がプロジェリンのレベルに影響を及ぼすかどうかを判定するために、発明者は、１０μＭのＭＧ１３２でのＨＧＰＳ細胞株への経時変化治療を実施してプロジェリンのレベルをウエスタンブロットによって調査した。予想外に、ＭＧ１３２は、ＭＧ１３２治療の６時間から４８時間までプロジェリンレベルの減少を誘導した。チューブリン対照で正規化した場合、ウエスタンブロットによるタンパク質の定量化は、ＤＭＳＯ処置ＨＧＰＳ細胞と比較してＭＧ１３２処置ＨＧＰＳ細胞において、それぞれ６時間、２４時間および４８時間におけるプロジェリン量の約３１％、５８％および６５％の低下を明らかにした（図１Ｂ）。
【０１１７】
ペプチドアルデヒド（ＭＧ１３２）、およびペプチドボロナート（ＭＧ２６２）プロテアソーム阻害剤はプロジェリンクリアランスを誘発するが他のボロナート類似物（ボルテゾミブおよびカルフィルゾミブ）は誘発せず一方でそれらはプロテアソーム酵素活性における異なる阻害を示す
プロジェリンクリアランスにおけるプロテアソーム阻害の関与を立証または除外するために、発明者は、同条件においていくつかのプロテアソーム阻害剤を試験した。当初ＭＧ１３２よりも効き目が弱いと考えられていた、別のアルデヒドプロテアソーム阻害剤、ＭＧ１１５（Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ｎＶａｌ−ａｌ）は、プロジェリン蓄積の抑制において同一の有効性を有することが分かった（図１Ｃ）。ボロナート類似物ＭＧ２６２（Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ｂｏｒｏｎａｔｅ）は、プロテアソームの活性部位へのより大きいその親和性にもかかわらず効果が少なかった。ＭＧ２６２はアルデヒドＭＧ１３２よりも強力であり（５５）、したがって発明者は、ＭＧ２６２が同一の効果を達成するためにＭＧ１３２より低い濃度において有効であろうことを予想した。しかしながら、発明者は、ＭＧ２６２が、ＭＧ１３２の投与量と等しい投与量においてのみＨＧＰＳ細胞におけるプロジェリンクリアランスを誘導したことを発見した（データは示さず）。これらの発見は、カスパーゼおよびプロテアソーム酵素活性へのＭＧ１３２およびＭＧ２６２の既知の特異な作用と一致する（５６）。
【０１１８】
発明者は、次に２種のＦＤＡ認可の（多発性骨髄腫の治療）プロテアソーム阻害剤、ボルテゾミブおよびカルフィルゾミブのプロジェリンクリアランスへの効果を試験した。アルデヒドＭＧ１３２およびＭＧ１１５とは異なり、プロジェリン発現がＨＧＰＳ対照におけるように維持されるのでこれらの２種の分子は、プロジェリンクリアランスを誘導しない（図１Ｃおよびさらなるデータは示さず）。この無効力は、おそらくＨＧＰＳ細胞株におけるプロテアソーム酵素活性へのそれらの異なる効果に関係する（図１Ｄ）。しかしながら、これらの発見は、プロジェリンクリアランスへのＭＧ１３２効果が、プロテアソームに対して既知のその作用によって仲介されるだけではないことを示唆する。
【０１１９】
プロジェリンクリアランスは、自食作用誘導に部分的に起因する
ユビキチン−プロテアソーム系に加えて、細胞内タンパク質分解の別の主要経路は、自食作用−リソソーム経路である。プロテアソーム阻害で観察されたプロジェリン減少は、このクリアランスがどのように発生し得るかの疑問を提起しかつ特にプロテアソーム阻害が自食作用の代償性の増大をもたらしたことが示されているので、プロジェリンが自食性分解のための基質であり得ることをさらに示唆する（５７〜５９）。マクロオートファジープロセスがＭＧ１３２によって強化されたプロジェリンクリアランスに関与したかどうかを評価するために、発明者は、リソソームの酸性のｐＨを直接変更するリソソーム作用剤クロロキン、またはリソソームプロトンポンプの阻害剤、バフィロマイシンＡ１のいずれかを用いることによって自食作用を阻害した。高投与量のクロロキンまたはバフィロマイシンＡ１でのＭＧ１３２暴露ＨＧＰＳ線維芽細胞の処置は、ＭＧ１３２の効果を部分的に阻害しかつ部分的プロジェリン再発現を誘導し（図２）、ＭＧ１３２処置で観察された増加したプロジェリンのクリアランスが、自食作用−リソソーム経路によってある程度仲介されることを示唆する。高用量のクロロキンまたはバフィロマイシンＡ１単独での処置も、著しく、プロジェリンの発現レベルの低下を引き起こした（図２）。実際に、自食作用の阻害は、プロテアソーム活性の増加および培養ヒト結腸がんにおけるプロテアソームサブユニットの上方制御に繋がることが報告されている（６０）。しかしながら３つのプロテアソーム活性は、これらの２種の阻害剤でのＨＧＰＳ細胞の処置で変更されない。したがってこれらの発見は、プロテアソーム活性化が、クロロキンまたはバフィロマイシンＡ１によって誘導されたプロジェリンレベルの低下に関与しないことを示唆する。ＬＣ３Ｂを、自食作用活性の指標を提供する脂質化によるＬＣ３−ＩからＬＣ３−ＩＩへの変換としての自食作用レベルを評価するために用いた。予想したように、ＬＣ３Ｂ−ＩＩレベルは、プロジェリンレベルの減少に伴って、ＭＧ１３２処置後に増加する（図２Ａ）。ＵＰＳおよび自食作用同時遮断後の不完全なプロジェリン再発現は、プロジェリンクリアランスへのＭＧ１３２有効性が、自食作用に加えて、別のタンパク質分解性付随活性によって仲介されることを示唆する。
【０１２０】
カスパーゼ−６は、アポトーシス時のラミンＡおよびＣ切断を担うと広く考えられている。ラミンＡ／Ｃだけでなくプロジェリンも、位置２２７〜２３０における非らせんリンカー領域Ｌ１２に位置する保存されたＶＥＩＤカスパーゼ６切断（ｃｌｉｖａｇｅ）部位（６１〜６４）を示す。ＭＧ１３２誘導プロジェリンクリアランスにおけるカスパーゼ−６の関与を調査するために、発明者は、ＨＧＰＳ細胞をＭＧ１３２およびカスパーゼ−６阻害剤の組み合わせで４８時間処置した。またもや、プロジェリンレベルは、クロロキンの存在下または非存在下のいずれでもＨＧＰＳ対照より下にとどまった（図２Ｂ）。そうでない場合は、プロジェリンはロイシンリッチな核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を有するので、可能性がある細胞質へのＣＲＭ１仲介プロジェリン輸送を、ロイシンリッチＮＥＳを含有するタンパク質のＣＲＭ１依存性核外輸送を阻害して、レプトマイシンＢを用いて試験した（６５）。レプトマイシンＢは、ＭＧ１３２誘導性プロジェリンクリアランスを阻害しないことが分かった。プロジェリンは、ＭＧ１３２によって阻害された場合に核質においてプロテアソームによって分解できないので、そのクリアランスはしたがって代替経路を介したその分解によって、あるいは新たに合成された（ｎｅｏｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ）タンパク質の下方制御によってまたは核質プロジェリンのレプトマイシンＢ非感受性流出によって説明され得る。実際、核の巨大分子またはＰＭＬを含有する複合体の核エンベロープ破壊を介して細胞質へ出ることは、ラミノパシーにおいて既に示されている（６６）。
【０１２１】
プロジェリンは、ＭＧ１３２を用いるプロテアソーム阻害後に自食作用胞において蓄積する
ＭＧ１３２が、ＰＭＬ−ＮＢ構成要素タンパク質が核小体内に転座されることに繋がり得ることが報告されている［３５、３６］。他の最近の発見は、核小体とＰＭＬ−ＮＢとの間の動的関係を例示した［３７〜３９］。ＭＧ１３２処置後の細胞下のプロジェリン局在性を調査するために、発明者は、ＭＧ１３２（１０μＭ）で６時間および２４時間処置したＨＧＰＳ細胞株にプロジェリンおよびＰＭＬ抗体を用いて経時変化間接免疫蛍光法を実行した。ＭＧ１３２での２４時間処置は、大きいプロジェリンおよびＰＭＬ核内病巣の形成を誘導する（データは示さず）。健常対照からの線維芽細胞においてであろうとＨＧＰＳ患者の線維芽細胞においてであろうと、核小体の高密度繊維状部に局在化する、フィブリラリンに対する抗体を用いる分析は、ＰＭＬおよびエメリンとの部分的一致を示した（データは示さず）。ｐ５３は、細胞をＭＧ１３２で処置した場合に不活性プロテアソームと共にリボソーム産生区画と異なる核小体内領域に局在化することが報告されている（６７）。これらの観察は、我々も核小体に局在化するｐ５３を観察したので我々の結果と一致する。同条件下で、発明者は、ラミンＢ１／Ｂ２、２６Ｓプロテアソームサブユニットおよびユビキチンが、核小体におけるＰＭＬと共存することを示した。したがって、発明者は２４時間ＭＧ１３２処置後にＰＭＬおよびＬＣ３Ｂ細胞質ゾル共存を検出したので、核小体は、プロテアソーム依存性分解がブロックされた場合に蓄積したプロジェリンを固定および一時的に貯蔵する代替隔離部位として作用し得る（データは示さず）。本治療期間中、プロジェリンは主として核小体内に局在化したままであるが（データは示さず）、一方、４８時間後、プロジェリン凝集体が、発明者がそのＬＣ３Ｂとの共局在性を実証した細胞質ゾル内に検出された（データは示さず）。細胞質ゾルプロジェリン含有凝集体の種類をさらに調査するために、発明者は、既知の自食作用基質、ｐ６２、およびリソソーム膜タンパク質、ＬＡＭＰ−２などの自食作用胞の他のマーカーを調査した。プロジェリンおよびｐ６２またはＬＡＭＰ−２抗体での二重免疫蛍光標識法は、細胞質ゾルプロジェリンが、ＨＧＰＳ細胞株の４８時間ＭＧ１３２暴露後のｐ６２およびＬＡＭＰ−２陽性小胞において蓄積したことを裏づけた。総合すれば、これらの結果は、プロジェリンが、ＭＧ１３２処置後に自食作用胞内に蓄積しかつしたがって細胞質において自食分解を受けることを示す。
【０１２２】
ＭＧ１３２はプレラミンＡ異常性ｍＲＮＡスプライシングを下方制御する
全ての主要な分解経路の遮断は、ＨＧＰＳ対照細胞と比較してプロジェリンレベルを回復できなかったので、発明者は、ＭＧ１３２がラミンおよびプロジェリンでの転写レベルにおいて影響を有し得るかどうかをさらに評価した。したがって、発明者は、ＭＧ１３２処置ＨＧＰＳおよび対照細胞におけるプロジェリン転写レベルを定量化するために定量的逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）アッセイを実施した。図３Ａに示すように、ＭＧ１３２処置は、時間依存的様式でプロジェリンｍＲＮＡ発現をほとんど消し、タンパク質および転写レベルの両方におけるプロジェリンへのその二重効果を示した。
【０１２３】
ＬＭＮＡエキソン１１の５’スプライス部位（５’ＳＳ）の認識ならびにｃ．１８２４Ｃ＞Ｔ変異ＬＭＮＡ対立遺伝子からのラミンＡおよびプロジェリンの産生へのセリン−アルギニンリッチスプライシング因子−１（ＳＲＳＦ−１）を含めた、セリン−アルギニン（ＳＲ）リッチタンパク質のサブセットの制御的役割は既に示されている（３２）。さらにＭＧ１３２でのＴ細胞刺激は、ＳＲＳＦ−１の分解を活発に誘導しかつカスパーゼ−３は、Ｔ細胞活性化時のＳＲＳＦ−１タンパク質発現の制御に寄与することが示されている（６８）。自食作用阻害剤の存在下のプロジェリンの部分的な再発現および付随物がＭＧ１３２処置後のプロジェリンｍＲＮＡの発現レベルを減少することから、発明者は、ＭＧ１３２効果が、ＳＲＳＦ−１発現の減少およびしたがって、プロジェリンｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングおよびプロジェリンの産生によっても仲介され得ると仮定した。興味深いことに、発明者は、ＭＧ１３２でのＨＧＰＳ線維芽細胞の４８時間処置が、プロジェリンレベルの減少と同時にＳＲＳＦ−１レベルの有意の減少をもたらしたことを実証する（図３Ｂ）。ＭＧ１３２添加後、プロジェリンが不溶性になりかつ凝集体から完全に抽出されなくなり得ることを排除するため、発明者は、細胞を尿素で可溶化した。本実験は、プロジェリンが処置の７２時間後に再び出現することを示す。したがってプロジェリンクリアランスへのより長時間の効果は、４８時間後の再処置を必要とし得る。カスパーゼが関与する機序がＳＲＳＦ−１発現における役割を果たすかどうかの調査に向けて、発明者は、ＨＧＰＳ細胞処置時にパン−カスパーゼ阻害剤（ＶＡＤ）を加えて対照レベルにわずかに達するプロジェリンの増加に付随する、ＳＲＳＦ−１タンパク質発現の救済を観察した。より高いプロジェリン再発現が、ＭＧ１３２、パン−カスパーゼ阻害剤およびクロロキンの組み合わせを用いることによって観察されたことも、注目すべき非常に興味深いことである。興味深いことに、発明者は、自食作用阻害剤（クロロキンおよびバフィロマイシンＡ１）の両方が、ＳＲＳＦ−１レベルも減少することができることを観察し、これはそれらの処置後に観察されたプロジェリンレベルの減少を説明し得た。ＳＲＳＦ−１レベルの低下へのバフィロマイシンＡ１効果は、実際のところ活性化Ｔ細胞において既に記載されている（６８）。プロジェリンの発現を制御することのＳＲＳＦ−１の関与をより良く理解するために、発明者は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）でＨＧＰＳ細胞を処置してＳＲＳＦ−１細胞内容物を一過的に涸渇させた。図５ｄに提示した結果は、ＳＲＳＦ−１のｓｉＲＮＡノックダウンが、プロジェリンレベルを大いに低下させることを示し、ＭＧ１３２誘導性プロジェリンクリアランスにおけるこのスプライシング因子の重要な役割を立証している。
【０１２４】
総合すれば、結果は、自食作用誘導、カスパーゼおよびＳＲＳＦ１消失を介したスプライシング機序が、ＭＧ１３２処置下のプロジェリンクリアランスに対する収束の役割を果たすことを示す。
【０１２５】
ＳＲＳＦ１は、ラミンＡ／プロジェリンスプライシングスイッチの制御に関与するので、発明者は、ＭＧ１３２がラミンＡ転写発現を調節すると仮定した。この仮説を試験するために、発明者は、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いてＭＧ１３２処置後のＨＧＰＳ細胞でのｍＲＮＡレベルを調査した。ＭＧ１３２経時変化ｑＲＴ−ＰＣＲの分析は、ラミンＡ転写の有意の減少を明らかにした一方で、それよりもずっと明確ではないラミンＣ転写レベルの減少が観察された（図４Ａ）。ラミンＡ／Ｃ  ｍＲＮＡの観察された低下は、発明者にプロテアソーム阻害後のそれらの対応するタンパク質レベルを評価することを促した。図４Ｂに示したように、発明者は、ＭＧ１３２での４８時間処置中にラミンＡおよびＣタンパク質レベルの両方とも増加したことを発見した。
【０１２６】
ＭＧ１３２は、患者ｉＰＳ由来のＭＳＣおよびＶＳＭＣにおけるプロジェリンレベルを低下させる
ＭＧ１３２が他の細胞系統におけるプロジェリンのレベルにも影響を及ぼすかどうかを判定するために、発明者は、ＨＧＰＳ患者の線維芽細胞からｉＰＳＣを生成した。ＨＧＰＳ  ｉＰＳＣ由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）は、一般に述べられているＨＧＰＳ線維芽細胞の異常、すなわち、増殖能の喪失、成熟前老化および核の小疱形成を提示した（６９、７０）。発明者は、プロジェリン抗体でのＭＧ１３２処置ＶＳＭＣの免疫染色を実施した。
【０１２７】
ＭＧ１３２処置ＶＳＭＣは、１．２５μＭで開始して有意にプロジェリンの低下に繋がった（データは示さず）。並行して、発明者は、ＭＧ１３２処置後のプロジェリンおよびＳＲＳＦ−１レベルを調査してＨＧＰＳ線維芽細胞、ｉＰＳ−ＭＳＣおよびｉＰＳ−ＶＳＭＣを比較した。これは、全ての試験した細胞株において、プロジェリンおよびＳＲＳＦ−１レベルがＭＧ１３２処置によって減少したことを明らかにした（データは示さず）。観察したプロジェリンクリアランスは、これは他のＦＤＡ認可のプロテアソーム阻害剤の場合であり、生存度試験は、本調査において用いられる投与量がＨＧＰＳ線維芽細胞、ｉＰＳ−ＭＳＣおよびｉＰＳ−ＶＳＭＣにおいて有意の死滅率を誘導しないことを示し（図６）、非常に低い毒性および早老症のための治療剤としてのＭＧ１３２の強い可能性を示しているので、増加したアポトーシスまたは細胞死と関係しない。
【０１２８】
ＭＧ１３２は、ＬｍｎａＧ６０９Ｇ／Ｇ６０９Ｇマウス筋肉におけるプロジェリンレベルを低下させる
ＭＧ１３２は、種々の細胞株においてほとんど完全なプロジェリンのクリアランスを誘導するので、ｉｎ  ｖｉｖｏでのその効果を調査することは興味深いことであった。発明者は、したがってＭＧ１３２の筋肉内注射が、ヒトＨＧＰＳ突然変異ｃ．１８２４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｙ６０８Ｇｌｙ）に相当する、内在性Ｌｍｎａ遺伝子におけるｃ．１８２７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｙ６０９Ｇｌｙ）突然変異を保有する我々のノックインマウスモデル（ＬｍｎａＧ６０９Ｇ／Ｇ６０９Ｇ）においてプロジェリンクリアランスも向上し得るかどうかを試験した（３１）。図７に示したように、ＭＧ１３２での１μｇ／Ｋｇ処置は、未処置の付帯する筋肉と比較して処置した筋肉におけるプロジェリンレベルの有意の減少を誘導する。これらの条件下でラミンＡの少しの増加およびラミンＣの減少が観察された一方でこれらの変化は有意ではない。１０μｇ／ｋｇ体重での、ＭＧ１３２注射もプロジェリンレベルの有意の減少を生じたが、ラミンＣの減少が伴った。しかしながら、ラミンＡのレベルは、一定に留まるかまたはわずかに増加しこれはラミンＣの完全欠損にもかかわらず健常であったＬｍｎａＬＡＯ／ＬＡＯマウスにおいて以前示されたようにラミンＣ減少を相殺するはずである（７１）。
【０１２９】
これらのデータは、ＨＧＰＳ患者からの線維芽細胞において、プロジェリンはプロテアソームおよびユビキチン化されたタンパク質が位置するＰＭＬ−ＮＢ内に隔絶されることの証拠を提供する。ＭＧ１３２を用いるプロテアソーム阻害は、ＳＲＳＦ−１発現レベルのカスパーゼ仲介の低下ならびにプロジェリンの核転座およびその後の細胞質ゾル内への輸送後に発生する自食作用誘導性プロジェリン分解の両方を誘導する。
【０１３０】
本明細書において報告された結果は、ＭＧ１３２処置後のプロジェリンクリアランスに基づいた、早老症に罹患した子供を治療するための励みになる戦略を提供する。Ａ型ラミンを節約する、プロジェリンで観察された特異性は、典型的な早老症に加えて、プレラミンＡ欠損関連疾患は同一治療の恩恵があり得るという考えをさらに支持する。最後にＭＧアルデヒドファミリー（具体的にはＭＧ１３２およびＭＧ１１５）のプロテアソーム阻害剤のＳＲＳＦ−１下方制御への活性を考慮すると、この分子のファミリーは、その間にプロジェリンが蓄積する生理的老化、ならびにＳＲＳＦ−１によって使用される隠れたスプライス部位の活性化が関与する疾患または一部のがんなどのＳＲＳＦ１過剰発現を示している疾患への有益な影響を有し得る。
【０１３１】
実施例２：プロテアソーム阻害剤は、ヒト腺がん細胞株におけるＳＲＳＦ−１を下方制御する
材料および方法
細胞培養
６種の腺がんヒト細胞株（肺：Ａ５４９、ＨＣＣ８２７；結腸：ＨＣＴ１１６、ＨＴ−２９；膵臓：ＰＡＮＣ−１、Ｍｉｓ  ＰａＣａ−２）を、ＡＴＣＣから取得し、５×１０５から１０６細胞／バイアルを含有するバイアルを得るために必要に応じて培養して増幅し（継代５０から６０）さらなる使用の前にＤＭＳＯ中で凍結して−８０℃で貯蔵した。細胞生存度を、上述の通りに確認した。
【０１３２】
プロテアソーム阻害剤処置
ＭＧ１３２（４７４７９０。Ｍｅｒｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＬＴＤ）、ＭＧ２６２（Ｉ−１２０−２００。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびボルテゾミブ（Ｓ１０１３。Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ）を、ＤＭＳＯ中０．１、１および１０μＭの３濃度で２４時間インキュベートした。対照細胞を、ＤＭＳＯビヒクルのみにおいてインキュベートした。
【０１３３】
抗体
ＳＲＳＦ１、ラミンＡ／Ｃ、プロジェリン、アクチンおよびＧＡＰＤＨ（充填対照として使用）に対する抗体は、実施例１に記載されている。
【０１３４】
ウエスタンブロットおよび画像分析手順は、上記実施例１に詳細記述されている
結果
全ての調査した腺がん細胞株は、（その強度を測定した）ＡＳＦ２アイソフォームに相当する約３２ｋＤａの大きいバンドおよびＳＲＳＦ−１のＡＳＦ１アイソフォームである約２８ｋＤａの２つの小さいバンド、ならびにおそらく二量体である約６０ｋＤａのバンドを伴って、ＳＲＳＦ−１を発現した。４０μｇのタンパク質が析出した場合、ＳＲＳＦ−１バンド強度は、２０μｇの析出したタンパク質を含有するレーンにおいて測定された強度の２倍であった。
【０１３５】
ＤＭＳＯビヒクルは、ＳＲＳＦ−１の量を増加させた（図８）。ＭＧ２６２、ＭＧ１３２およびボルテゾミブは、−２０％から−７７％へ、ＳＲＳＦ−１の量の減少を誘導し、阻害剤有効性がボルテゾミブからＭＧ１３２へ次いでＭＧ２６２へ増加する、用量反応効果を示した。さらに、同一範囲においても、データは、用いた充填投入量対照、アクチンまたはＧＡＰＤＨによって異なった。
【０１３６】
調査した全ての細胞株は、ラミンＡ／Ｃの種々の量を立証したが、プロジェリンを全く発現しなかった。
【０１３７】
これらの結果は、ＳＲＳＦ１に関してＭＧ１３２およびＭＧ２６２を用いてＨＧＰＳ細胞において得られたものを裏づけたのに対して、ボルテゾミブはＨＧＰＳ細胞およびがん細胞において異なる効果を示した。
【０１３８】
実施例３：プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２は、ショウジョウバエモデルにおける眼球咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）への陽性効果を有する
概論
眼球咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）は、通常５０または６０歳代において発生する常染色体優性、晩期発症型の、筋ジストロフィーであり、かつ進行性の眼瞼下垂（眼瞼下垂症）、嚥下困難（嚥下障害）および四肢近位部衰弱によって特徴付けられる。ＯＰＭＤは、世界的に分布している、稀な疾患（欧州においては１／１０００００）であり、ブハラ・ユダヤ人（１／６００）およびケベック（１／１０００）において最も一般的な筋ジストロフィーである（Ｒｅｖｉｅｗｓ：（７２、７３））。この疾患の薬理学的治療は現在のところなく、外科手術が嚥下を改善するためおよび下垂眼瞼を持ち上げるために実施され得る。
【０１３９】
ＯＰＭＤの原因である遺伝子は、ポリ（Ａ）結合タンパク質核１（ＰＡＢＰＮ１）をコードする遺伝子として特定されている。ＯＰＭＤ患者において、ＰＡＢＰＮ１は、タンパク質のＮ末端内に位置するポリアラニントラクト（ｔｒａｃｔ）をコードするＧＣＧリピートの増大を有する（７４）。ポリアラニン増大は、正常タンパク質においては１０のアラニンが存在するので適度であり、タンパク質の突然変異型においては１２から１７のアラニンに増大する。
【０１４０】
ＯＰＭＤの病理学的特質は、管状微細線維から構成されかつ突然変異体不溶性物質ＰＡＢＰＮ１、ならびにＨｓｐ７０、ユビキチンおよびプロテアソームのサブユニットを含有する、筋肉繊維における核封入体である（７５〜７８）。ＰＡＢＰＮ１をメチル化することが知られている、いくつかのＲＮＡ結合タンパク質およびＩ型アルギニンメチルトランスフェラーゼ、ＰＲＭＴ１およびＰＲＭＴ３も、核封入体に補充される（７８〜８０）。ＰＡＢＰＮ１におけるポリアラニン増大は、突然変異体タンパク質のより遅い代謝回転から生じる封入体内へのミスフォールディングおよび凝集を誘導する。
【０１４１】
ＰＡＢＰＮ１は、核のポリアデニル化、ｍＲＮＡの３’端部におけるポリ（Ａ）末端の形成に繋がるｍＲＮＡプロセシング反応における作用を有する。ＰＡＢＰＮ１は、この反応の間に未完成ポリ（Ａ）末端に結合しかつ２つの役割、ポリ（Ａ）末端を合成する酵素、ポリ（Ａ）ポリメラーゼの刺激、およびポリ（Ａ）末端長の制御（８１〜８４）を有する。ＰＡＢＰＮ１は、早期胎芽（８１）、ポリ（Ａ）ＲＮＡ分解または核からの輸送（８５）、代替ポリ（Ａ）部位選択の調節（８６、８７）、および長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の代謝回転（８８）における細胞質性ｍＲＮＡポリ（Ａ）末端の制御にも関与する。
【０１４２】
アラニン伸長型の哺乳類ＰＡＢＰＮ１（ＰＡＢＰＮ１−１７ａｌａ）が、ショウジョウバエ筋肉において特異的に発現されるＯＰＭＤのショウジョウバエモデルが開発されている（８９、９０）。これらのモデルは、疾患特性、すなわち進行性の筋肉衰弱および退化、ならびにＰＡＢＰＮ１核凝集体の形成を繰り返す。ショウジョウバエモデルの妥当性は、ショウジョウバエにおけるＯＰＭＤに関係すると確認された分子機序が、ＯＰＭＤ患者生検において立証されているという事実によって実証されている（９１、９１）。ショウジョウバエモデルは、ＯＰＭＤのための可能性のある活性薬物、具体的には抗凝集薬を特定することにおいて役に立ってきた（９２）。
【０１４３】
材料および方法
薬物補給食品を、以下のように調製した。インスタントショウジョウバエ培地（Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｕｐｐｌｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に可溶化した濃度を増大した薬物、またはＤＭＳＯ単独のいずれかを補って、１％酵母水溶液でそれぞれのバイアルにおいて再構成した。ＭＧ１３２は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＳＣ−２０１２７０）から購入した。それぞれのバイアルは、５ｍｌまたは２．５ｍｌの再構成した培地は含有し、それぞれ、幼虫または成虫まで育てた。個体は、幼虫期から薬物を給餌した。１つのバイアル当り７０から８０の一齢幼虫を移して同バイアルにおいて成虫まで成長させ、成虫を、同一濃度の薬物を含む新たなバイアルに移した。薬物毒性を判定するために、８０の一齢幼虫を、薬物またはＤＭＳＯ単独で補った培地を含有するバイアルに移した。成虫に達した個体を記録した。
【０１４４】
異常な羽根の配置を、出生時に雄の成体を収集すること、１バイアル当り５匹の雄をプールすることおよび異常な羽根の配置を、麻酔せずに、バイアルを通したハエの直接観察により毎日記録することによって定量化した。
【０１４５】
結果
トランスクリプトームの分析は、ショウジョウバエおよびＯＰＭＤのマウスモデルならびに患者生検において保存されているユビキチン−プロテアソーム系の全体的な調節解除を示した（２０）。さらに、プロテアソーム活性は、ＯＰＭＤのマウスモデルにおいて、筋肉内で上方制御されかつこれは筋萎縮と相互に関連する（９３）。これらの結果は、ＵＰＳ調節解除が、筋萎縮に繋がるであろう増加したタンパク質分解を通してＯＰＭＤに関係し得ることを発明者が提案することに繋がった。発明者は、したがってＭＧ１３２を用いてプロテアソーム活性を低下させることがショウジョウバエモデルにおけるＯＰＭＤに有益であり得るかどうかを試験した。発明者は、ＰＡＢＰＮ１−１７ａｌａがＡｃｔ８８Ｆ−ＰＡＢＰＮ１−１７ａｌａ導入遺伝子からの成虫間節飛翔筋において恒常的に発現されるショウジョウバエモデルを使用して（９０）、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＭＧ１３２効果をアッセイした。ＭＧ１３２を、幼虫期から４００、５００および６００μＭの３種の濃度で食物において経口投与した。生存試験は、ハエ培地において６００μＭのＭＧ１３２（０．２％ＤＭＳＯ中）は、生存度のために有害ではないことを示した（図９Ａ）。間節飛翔筋におけるＰＡＢＰＮ１−１７ａｌａ発現は、影響を受けた筋肉機能および筋肉退化から生じる異常な羽根の配置に繋がる（８９）。羽根の配置の欠陥を、成虫の第３日から第１１日まで記録した。ＭＧ１３２の効果を、異常な羽根の配置を有するＡｃｔ８８Ｆ−ＰＡＢＰＮ１−１７ａｌａを発現しているハエの数を記録することによって定量化した。３種全てのＭＧ１３２濃度が、それらがＤＭＳＯ単独と比較して異常な羽根の配置を有するハエの数の有意の減少をもたらしたので、有益な効果を示した（図９Ｂ）。
【０１４６】
したがって、プロテアソーム阻害剤、ＭＧ１３２は、毒性タンパク質凝集体の核蓄積によって特徴付けられる、遺伝的筋疾患、ＯＰＭＤを改善した。
【０１４７】
参考文献
１．Ｒ．Ｃ．Ｈｅｎｎｅｋａｍ著、「Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ−Ｇｉｌｆｏｒｄ  ｐｒｏｇｅｒｉａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ」Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ。Ｐａｒｔ  Ａ  １４０、２６０３〜２６２４（２００６年）。
２．Ｍ．Ａ．Ｍｅｒｉｄｅｔｈら著、「Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｃｏｕｒｓｅ  ｏｆ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ−Ｇｉｌｆｏｒｄ  ｐｒｏｇｅｒｉａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ」Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５８、５９２〜６０４（２００８年）。
３．Ａ．Ｄｅ  Ｓａｎｄｒｅ−Ｇｉｏｖａｎｎｏｌｉら著、「Ｌａｍｉｎ  ａ  ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ−Ｇｉｌｆｏｒｄ  ｐｒｏｇｅｒｉａ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００、２０５５（２００３年）。
４．Ｍ．Ｅｒｉｋｓｓｏｎら著、「Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｌａｍｉｎ  Ａ  ｃａｕｓｅ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ−Ｇｉｌｆｏｒｄ  ｐｒｏｇｅｒｉａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ」Ｎａｔｕｒｅ  ４２３、２９３〜２９８（２００３年）。
５．Ｐ．Ｃａｕら著、「Ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｔｒｉｘ，ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ａｎｄ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ａｇｉｎｇ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ  ｉｎ  ａ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ」Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ＆ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ、（２０１４年）。
６．Ｐ．Ｓｃａｆｆｉｄｉ、Ｔ．Ｍｉｓｔｅｌｉ著、「Ｌａｍｉｎ  Ａ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｇｉｎｇ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１２、１０５９〜１０６３（２００６年）。
７．Ｄ．ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋら著、「Ｔｈｅ  ｍｕｔａｎｔ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｌａｍｉｎ  Ａ  ｔｈａｔ  ｃａｕｓｅｓ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ−Ｇｉｌｆｏｒｄ  ｐｒｏｇｅｒｉａ  ｉｓ  ａ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｇｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ」ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ２、ｅ１２６９（２００７年）。
８．Ｈ．Ｔａｋｅｕｃｈｉ、Ｔ．Ｍ．Ｒｕｎｇｅｒ著、「Ｌｏｎｇｗａｖｅ  ＵＶ  Ｌｉｇｈｔ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  Ａｇｉｎｇ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｇｅｒｉｎ」Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ７、７１（２０１３年）。
９．Ｍ．Ｈｏｓｓｅｉｎｉら著、「Ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ａｇｉｎｇ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｒｅｓｃｕｅ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＡＤＰＨ  ｏｘｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ＸＰＣ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １３５、１１０８〜１１１８（２０１５年）。
１０．Ｍ．Ｈｏｓｓｅｉｎｉ、Ｋ．Ｅｚｚｅｄｉｎｅ、Ａ．Ｔａｉｅｂ、Ｈ．Ｒ．Ｒｅｚｖａｎｉ著、「Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｓ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｃｌｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｅｘｃｉｓｉｏｎ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １３５、３４１〜３５１（２０１５年）。
１１．Ｋ．Ｃａｏら著、「Ｐｒｏｇｅｒｉｎ  ａｎｄ  ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｅ  ｔｏ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ」Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２１、２８３３〜２８４４（２０１１年）。
１２．Ｐ．Ｓｃａｆｆｉｄｉ、Ｔ．Ｍｉｓｔｅｌｉ著、「Ｌａｍｉｎ  Ａ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｉｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ａｇｅｉｎｇ」Ｎａｔｕｒｅ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １０、４５２〜４５９（２００８年）。
１３．Ｊ．Ｅｓｐａｄａら著、「Ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｃａｕｓｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ−ａｇｉｎｇ  ｍｉｃｅ」Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １８１、２７〜３５（２００８年）。
１４．Ｃ．Ｄ．Ｒａｇｎａｕｔｈら著、「Ｐｒｅｌａｍｉｎ  Ａ  Ａｃｔｓ  ｔｏ  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｉｓ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ａｇｉｎｇ」Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２１、２２００〜２２１０（２０１０年）。
１５．Ｍ．Ｏｌｉｖｅら著、「Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ−Ｇｉｌｆｏｒｄ  ｐｒｏｇｅｒｉａ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ａｇｉｎｇ」Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ３０、２３０１〜２３０９（２０１０年）。
１６．Ｆ．Ｊ．Ｂｌａｎｃｏ、Ｃ．Ｂｅｒｎａｂｅｕ著、「Ｔｈｅ  Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ  ＳＲＳＦ１  ａｓ  ａ  Ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ」Ｆｒｏｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３、５４（２０１２年）。
１７．Ｈ．−Ｊ．Ｊｕｎｇら著、「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｅｌａｍｉｎ  Ａ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌａｍｉｎ  Ｃ  ｂｙ  ｍｉＲ−９，ａ  ｂｒａｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ」Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０９、Ｅ４２３〜Ｅ４３１（２０１２年）。
１８．Ｘ．Ｎｉｓｓａｎら著、「Ｕｎｉｑｕｅ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ−  Ｇｉｌｆｏｒｄ  Ｐｒｏｇｅｒｉａ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｉｓ  Ｄｕｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｕｒａｌ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｉＲ−９  ＭｉｃｒｏＲＮＡ」Ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ２、１〜９（２０１２年）。
１９．Ｊ．Ｃ．Ｋｏｖａｃｉｃ、Ｐ．Ｍｏｒｅｎｏ、Ｖ．Ｈａｃｈｉｎｓｋｉ、Ｅ．Ｇ．Ｎａｂｅｌ、Ｖ．Ｆｕｓｔｅｒ著、「Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ，ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ，ａｎｄ  ａｇｉｎｇ：Ｐａｒｔ  １  ｏｆ  ａ  ２−ｐａｒｔ  ｒｅｖｉｅｗ」Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２３、１６５０〜１６６０（２０１１年）。
２０．Ｙ．Ｔａｋａｍｏｒｉ、Ｔ．Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ、Ｔ．Ｍｏｒｉ、Ｊ．Ｋｏｓａｋａ、Ｈ．Ｙａｍａｄａ著、「Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ｆｅｒｒｅｔ（Ｍｕｓｔｅｌａ  ｐｕｔｏｒｉｕｓ  ｆｕｒｏ）ｂｒａｉｎ」Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５２２、１８１８〜１８３８（２０１４年）。
２１．Ｈ．−Ｍ．Ｇａｏ、Ｈ．Ｚｈｏｕ、Ｊ．−Ｓ．Ｈｏｎｇ著、「ＮＡＤＰＨ  ｏｘｉｄａｓｅｓ：ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ」Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ３３、２９５〜３０３（２０１２年）。
２２．Ｐ．Ｂ．Ｃａｍｐｏｓ、Ｂ．Ｓ．Ｐａｕｌｓｅｎ、Ｓ．Ｋ．Ｒｅｈｅｎ著、「Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ａｇｉｎｇ  ｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｏｄｅｌ  ｂｒａｉｎ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ａ  ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ」Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ａｇｉｎｇ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ６、２９２（２０１４年）。
２３．Ａ．Ｂａｒａｓｃｕら著、「Ｏｘｙｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｌｔｅｒｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｓｈａｐｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｌａｍｉｎｓ  ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：ａ  ｒｏｕｔｅ  ｔｏ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ」Ｎｕｃｌｅｕｓ（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘ．）３、４１１〜４１７（２０１２年）。
２４．Ｌ．Ｂ．Ｇｏｒｄｏｎら著、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ａ  ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ−Ｇｉｌｆｏｒｄ  ｐｒｏｇｅｒｉａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ」Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０９、１６６６６〜１６６７１（２０１２年）。
２５．Ｊ．Ｃｏｕｚｉｎ−Ｆｒａｎｋｅｌ著、「Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｄｒｕｇ  ｔｒｉａｌ  ｏｆｆｅｒｓ  ｕｎｃｅｒｔａｉｎ  ｓｔａｒｔ  ｉｎ  ｒａｃｅ  ｔｏ  ｓａｖｅ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｅｒｉａ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７、１５９４〜１５９５（２０１２年）。
２６．Ｓ．Ａ．Ｈｏｌｓｔｅｉｎ、Ｒ．Ｊ．Ｈｏｈｌ著、「Ｉｓ  ｔｈｅｒｅ  ａ  ｆｕｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｐｒｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ？」Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １２、７０４〜７０９（２０１２年）。
２７．Ｙ．Ｌｉｎ、Ｙ．Ｚｈｅｎｇ著、「Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」Ｅｘｐｅｒｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、１〜２０（２０１５年）。
２８．Ｅ．Ｔ．Ｅｆｕｅｔ、Ｋ．Ｋｅｙｏｍａｒｓｉ著、「Ｆａｒｎｅｓｙｌ  ａｎｄ  ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎｄｕｃｅ  Ｇ１  ａｒｒｅｓｔ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ」Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６６、１０４０〜１０５１（２００６年）。
２９．Ｓ．Ｇ．Ｙｏｕｎｇ、Ｓ．Ｈ．Ｙａｎｇ、Ｂ．Ｓ．Ｄａｖｉｅｓ、Ｈ．Ｊ．Ｊｕｎｇ、Ｌ．Ｇ．Ｆｏｎｇ著、「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｅｎｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｇｅｒｉａ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５、１７１ｐｓ１７３（２０１３年）。
３０．Ｐ．Ｓｃａｆｆｉｄｉ、Ｔ．Ｍｉｓｔｅｌｉ著、「Ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ａｇｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ−Ｇｉｌｆｏｒｄ  ｐｒｏｇｅｒｉａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ」Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １１、４４０〜４４５（２００５年）。
３１．Ｆ．Ｇ．Ｏｓｏｒｉｏら著、「Ｓｐｌｉｃｉｎｇ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ａ  ｎｅｗ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ａｇｉｎｇ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３、１０６ｒａ１０７（２０１１年）。
３２．Ｉ．Ｃ．Ｌｏｐｅｚ−Ｍｅｊｉａら著、「Ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＬＭＮＡ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ａｇｉｎｇ」Ｈｕｍａｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０、４５４０〜４５５５（２０１１年）。
３３．Ｋ．Ｃａｏら著、「Ｒａｐａｍｙｃｉｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅｓ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｉｎ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ−Ｇｉｌｆｏｒｄ  Ｐｒｏｇｅｒｉａ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｃｅｌｌｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３、８９ｒａ５８（２０１１年）。
３４．Ｖ．Ｃｅｎｎｉら著、「Ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｅｄ  ｐｒｅｌａｍｉｎ  Ａ  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｌａｍｉｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｐｒｏｇｅｒｉａ」Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  ５５、ｅ３６（２０１１年）。
３５．Ｚ．Ｄｏｕら著、「Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌａｍｉｎａ」Ｎａｔｕｒｅ  ５２７、１０５〜１０９（２０１５年）。
３６．Ａ．ｖｏｎ  Ｍｉｋｅｃｚ著、「Ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｓｙｓｔｅｍ」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ  １１９、１９７７〜１９８４（２００６年）。
３７．Ｑ．Ｓ．Ｐａｄｉａｔｈら著、「Ｌａｍｉｎ  Ｂ１  ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｃａｕｓｅ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ」Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３８、１１１４〜１１２３（２００６年）。
３８．Ｆ．Ｇ．Ｏｓｏｒｉｏら著、「Ｎｕｃｌｅａｒ  ｌａｍｉｎａ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｃａｕｓｅ  ＡＴＭ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｉｎｋ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ａｇｉｎｇ  ｔｏ  ａ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ」Ｇｅｎｅｓ＆ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２６、２３１１〜２３２４（２０１２年）。
３９．Ｃ．Ａ．Ａｓｃｏｌｉ、Ｇ．Ｇ．Ｍａｕｌ著、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｄｏｍａｉｎ」Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １１２、７８５〜７９５（１９９１年）。
４０．Ｓ．Ｄａｓ、Ａ．Ｒ．Ｋｒａｉｎｅｒ著、「Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＳＲＳＦ１，Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  Ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，ｉｎ  ＲＮＡ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ」Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １２、１１９５〜１２０４（２０１４年）。
４１．Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉら著、「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ａｄｕｌｔ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｂｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ」Ｃｅｌｌ  １３１、８６１〜８７２（２００７年）。
４２．Ｌ．Ａｕｂｒｙら著、「Ｓｔｒｉａｔａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ  ｍａｔｕｒｅ  ｉｎｔｏ  ＤＡＲＰＰ３２  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ−ｌｅｓｉｏｎｅｄ  ｒａｔｓ」Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０５、１６７０７〜１６７１２（２００８年）。
４３．Ｋ．Ｇｉｒａｕｄ−Ｔｒｉｂｏｕｌｔら著、「Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｍＲＮＡ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈａｔ  ｍｉＲ−１４８ａ  ａｎｄ  ｍｉＲ−２０ｂ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｖｉａ  ＥＰＡＳ１」Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４３、７７〜８６（２０１１年）。
４４．Ｈ．Ｇｕｅｎｏｕら著、「Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  ｆｕｌｌ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｌｕｒｉｓｔｒａｔｉｆｉｅｄ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ：ａ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ」Ｌａｎｃｅｔ  ３７４、１７４５〜１７５３（２００９年）。
４５．Ｘ．Ｎｉｓｓａｎら著、「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｅｎｇｒａｆｔ  ｉｎｔｏ  ｐｌｕｒｉｓｔｒａｔｉｆｉｅｄ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ」Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０８、１４８６１〜１４８６６（２０１１年）。
４６．Ｓ．Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ、Ｌ．Ｓ．Ｆｅｒｒｅｉｒａ、Ｌ．Ｃｈｅｎ−Ｋｏｎａｋ、Ｔ．Ｐ．Ｋｒａｅｈｅｎｂｕｅｈｌ、Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ著、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ」Ｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ５、１１１５〜１１２６（２０１０年）。
４７．Ｔ．Ｄ．Ｒｏｃｋｅｌ、Ｄ．Ｓｔｕｈｌｍａｎｎ、Ａ．ｖｏｎ  Ｍｉｋｅｃｚ著、「Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｓ  ｄｅｇｒａｄｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｆｏｃａｌ  ｓｕｂｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅｕｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ  １１８、５２３１〜５２４２（２００５年）。
４８．Ｇ．Ｆｅｒｂｅｙｒｅ著、「ＰＭＬ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＡＰＬ  ｉｓ  ａ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ」Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １６、１９１８〜１９２６（２００２年）。
４９．Ｒ．Ｐ．Ｆａｂｕｎｍｉ、Ｗ．Ｃ．Ｗｉｇｌｅｙ、Ｐ．Ｊ．Ｔｈｏｍａｓ、Ｇ．Ｎ．ＤｅＭａｒｔｉｎｏ著、「Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇａｍｍａ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＰＡ２８  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｓ  ａｔ  ｎｕｃｌｅａｒ  ＰＭＬ  ｂｏｄｉｅｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ  １１４、２９〜３６（２００１年）。
５０．Ｖ．Ｌａｌｌｅｍａｎｄ−Ｂｒｅｉｔｅｎｂａｃｈら著、「Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ（ＰＭＬ）ｓｕｍｏｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｂｏｄｙ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，１１Ｓ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ，ａｎｄ  Ａｓ２Ｏ３−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＰＭＬ  ｏｒ  ＰＭＬ／ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ」Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９３、１３６１〜１３７１（２００１年）。
５１．Ｍ．Ｌａｆａｒｇａら著、「Ｃｌａｓｔｏｓｏｍｅ：ａ  ｓｕｂｔｙｐｅ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｂｏｄｙ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｉｎ  １９Ｓ  ａｎｄ  ２０Ｓ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｓ，ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ，ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  １３、２７７１〜２７８２（２００２年）。
５２．Ｖ．Ｌａｌｌｅｍａｎｄ−Ｂｒｅｉｔｅｎｂａｃｈら著、「Ａｒｓｅｎｉｃ  ｄｅｇｒａｄｅｓ  ＰＭＬ  ｏｒ  ＰＭＬ−ＲＡＲａｌｐｈａ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ＳＵＭＯ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ＲＮＦ４／ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐａｔｈｗａｙ」Ｎａｔｕｒｅ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １０、５４７〜５５５（２００８年）。
５３．Ｓ．Ａ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ、Ｊ．Ｍｕｔｅｒ、Ｐ．Ｒｉｔｃｈｉｅ、Ｇ．Ｌａｔｔａｎｚｉ、Ｃ．Ｊ．Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ著、「Ｔｈｅ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎ−ｒｅｐａｉｒａｂｌｅ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｌａｍｉｎｏｐａｔｈｙ  ｐｒｏｇｅｒｉａ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｉｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ＲＯＳ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｓ  ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ  ｂｙ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ」Ｈｕｍａｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０、３９９７〜４００４（２０１１年）。
５４．Ｇ．Ｖｉｔｅｒｉ、Ｙ．Ｗ．Ｃｈｕｎｇ、Ｅ．Ｒ．Ｓｔａｄｔｍａｎ著、「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｒｏｇｅｒｉｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｇｉｌｆｏｒｄ  ｐｒｏｇｅｒｉａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ」Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｇｅｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３１、２〜８（２０１０年）。
５５．Ｊ．Ａｄａｍｓら著、「Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ：Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｂｏｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄｓ」Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ８、３３３〜３３８（１９９８年）。
５６．Ｓ．Ｍｅｉｎｅｒｓら著、「Ｎｏｎｔｏｘｉｃ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ａ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｄｅｆｅｎｓｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ」Ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ＆ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４０、２２３２〜２２４１（２００６年）。
５７．Ｔ．Ｐａｎら著、「Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ  ｉｎ  ｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ」Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ  ３２、１６〜２５（２００８年）。
５８．Ｗ．Ｘ．Ｄｉｎｇら著、「Ｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｆ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｔｏ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｓ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ」Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １７１、５１３〜５２４（２００７年）。
５９．Ｖ．Ｉ．Ｋｏｒｏｌｃｈｕｋ、Ｆ．Ｍ．Ｍｅｎｚｉｅｓ、Ｄ．Ｃ．Ｒｕｂｉｎｓｚｔｅｉｎ著、「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ａｎｄ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ−ｌｙｓｏｓｏｍｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ」ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８４、１３９３〜１３９８（２０１０年）。
６０．Ｘ．Ｊ．Ｗａｎｇら著、「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｒｏｓｓｔａｌｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｗｏ  ｍａｊｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ：ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ」Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ９、１５００〜１５０８（２０１３年）。
６１．Ｔ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ−Ａｌｎｅｍｒｉ、Ｇ．Ｌｉｔｗａｃｋ、Ｅ．Ｓ．Ａｌｎｅｍｒｉ著、「Ｍｃｈ２，ａ  ｎｅｗ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  Ｃｅｄ−３／Ｉｃｅ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ」Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５、２７３７〜２７４２（１９９５年）。
６２．Ｋ．Ｏｒｔｈ、Ａ．Ｍ．Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ、Ｍ．Ｇａｒｇ、Ｃ．Ｊ．Ｆｒｏｅｌｉｃｈ、Ｖ．Ｍ．Ｄｉｘｉｔ著、「Ｔｈｅ  ＣＥＤ−３／ＩＣＥ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｍｃｈ２  ｉｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｌｅａｖｅｓ  ｔｈｅ  ｄｅａｔｈ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｌａｍｉｎ  Ａ」Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７１、１６４４３〜１６４４６（１９９６年）。
６３．Ｅ．Ａ．Ｓｌｅｅ、Ｃ．Ａｄｒａｉｎ、Ｓ．Ｊ．Ｍａｒｔｉｎ著、「Ｅｘｅｃｕｔｉｏｎｅｒ  ｃａｓｐａｓｅ−３，−６，ａｎｄ  −７  ｐｅｒｆｏｒｍ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ，ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ  ｒｏｌｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｅｍｏｌｉｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ」Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７６、７３２０〜７３２６（２００１年）。
６４．Ａ．Ｔａｋａｈａｓｈｉら著、「Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｌａｍｉｎ  Ａ  ｂｙ  Ｍｃｈ２  ａｌｐｈａ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ＣＰＰ３２：ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １  ｂｅｔａ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｒｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ」Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９３、８３９５〜８４００（１９９６年）。
６５．Ｍ．Ｆｕｋｕｄａら著、「ＣＲＭ１  ｉｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｘｐｏｒｔ  ｓｉｇｎａｌ」Ｎａｔｕｒｅ  ３９０、３０８〜３１１（１９９７年）。
６６．Ｗ．Ｈ．Ｄｅ  Ｖｏｓら著、「Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｉｎｖｏｋｅ  ｔｅｍｐｏｒａｒｙ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌａｍｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ」Ｈｕｍａｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０、４１７５〜４１８６（２０１１年）。
６７．Ｔ．Ｋｒｕｇｅｒ、Ｕ．Ｓｃｈｅｅｒ著、「ｐ５３  ｌｏｃａｌｉｚｅｓ  ｔｏ  ｉｎｔｒａｎｕｃｌｅｏｌａｒ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ  １２３、１２０３〜１２０８（２０１０年）。
６８．Ｖ．Ｒ．Ｍｏｕｌｔｏｎ、Ａ．Ｒ．Ｇｉｌｌｏｏｌｙ、Ｇ．Ｃ．Ｔｓｏｋｏｓ著、「Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｅｒｉｎｅ／Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ  Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ  １（ＳＲＳＦ１）ｉｎ  Ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｌｕｐｕｓ  Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ（ＳＬＥ）Ｔ  Ｃｅｌｌｓ」Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８９、４１２６〜４１３４（２０１４年）。
６９．Ｘ．Ｎｉｓｓａｎら著、「Ｕｎｉｑｕｅ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ−  Ｇｉｌｆｏｒｄ  ｐｒｏｇｅｒｉａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｓ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｉＲ−９  ｍｉｃｒｏＲＮＡ」Ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ２、１〜９（２０１２年）。
７０．Ｊ．Ｚｈａｎｇら著、「Ａ  ｈｕｍａｎ  ｉＰＳＣ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｇｉｌｆｏｒｄ  Ｐｒｏｇｅｒｉａ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｎｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｄｅｆｅｃｔｓ」Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ８、３１〜４５（２０１１年）。
７１．Ｃ．Ｃｏｆｆｉｎｉｅｒら著、「Ｄｉｒｅｃｔ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌａｍｉｎ  Ａ，ｂｙｐａｓｓｉｎｇ  ｐｒｅｌａｍｉｎ  ａ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ｃａｕｓｅｓ  ｍｉｓｓｈａｐｅｎ  ｎｕｃｌｅｉ  ｉｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｂｕｔ  ｎｏ  ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ」Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８５、２０８１８〜２０８２６（２０１０年）。
７２．Ａｂｕ−Ｂａｋｅｒ、Ｇ．Ａ．Ｒｏｕｌｅａｕ著、「Ｏｃｕｌｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １７７２、１７３〜１８５（２００７年）。
７３．Ｊ．Ｅ．Ｄａｖｉｅｓ、Ｚ．Ｂｅｒｇｅｒ、Ｄ．Ｃ．Ｒｕｂｉｎｓｚｔｅｉｎ著、「Ｏｃｕｌｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｆｏｒ  ａｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ」Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ３８、１４５７〜１４６２（２００６年）。
７４．Ｂｒａｉｓら著、「Ｓｈｏｒｔ  ＧＣＧ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＰＡＢＰ２  ｇｅｎｅ  ｃａｕｓｅ  ｏｃｕｌｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８、１６４〜１６７（１９９８年）。
７５．Ａｂｕ−Ｂａｋｅｒら著、「Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ  ｉｎ  ｏｃｕｌｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ」Ｈｕｍａｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２、２６０９〜２６２３（２００３年）。
７６．Ｙ．Ｐ．Ｂａｏ、Ｓ．Ｓａｒｋａｒ、Ｅ．Ｕｙａｍａ、Ｄ．Ｃ．Ｒｕｂｉｎｓｚｔｅｉｎ著、「Ｃｏｎｇｏ  ｒｅｄ，ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ，ａｎｄ  ＨＳＰ７０  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｒｅｄｕｃｅ  ａｇｇｒｅｇａｔｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｏｃｕｌｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４１、４７〜５１（２００４年）。
７７．Ｃａｌａｄｏら著、「Ｎｕｃｌｅａｒ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｏｃｕｌｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（Ａ）ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＩ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ  ｗｈｉｃｈ  ｓｅｑｕｅｓｔｅｒ  ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ」Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．９、２３２１〜２３２８（２０００年）。
７８．Ｊ．Ｐ．Ｔａｖａｎｅｚら著、「Ｈｓｐ７０  ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ＰＲＭＴｓ  ａｒｅ  ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｅｄ  ａｔ  ｉｎｔｒａｎｕｃｌｅａｒ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｐｏｌｙａｌａｎｉｎｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ＰＡＢＰＮ１」ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ４、ｅ６４１８（２００９年）。
７９．Ｌ．Ｐ．Ｃｏｒｂｅｉｌ−Ｇｉｒａｒｄら著、「ＰＡＢＰＮ１  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｅｄ  ｉｎ  ｏｃｕｌｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｓ」Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ  １８、５５１〜５６７（２００５年）。
８０．Ｘ．Ｆａｎら著、「ＨｎＲＮＰ  Ａ１  ａｎｄ  Ａ／Ｂ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＰＡＢＰＮ１  ｉｎ  ｏｃｕｌｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ」Ｃａｎ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ  ３０、２４４〜２５１（２００３年）。
８１．Ｂｅｎｏｉｔら著、「Ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙ（Ａ）ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ＰＡＢＰ２，ｉｎ  ｐｏｌｙ（Ａ）ｔａｉｌ  ｌｅｎｇｔｈ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  ｅａｒｌｙ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ」Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  ９、５１１〜５２２（２００５年）。
８２．Ｂ．Ｂｅｎｏｉｔら著、「Ｔｈｅ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｐｏｌｙ（Ａ）−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＩ  ｉｓ  ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ  ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｈａｓ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍＲＮＡ  ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  ａｓ  ｉｔｓ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７、３７７１〜３７７８（１９９９年）。
８３．Ｙ．Ｋｅｒｗｉｔｚら著、「Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（Ａ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｄｉｒｅｃｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙ（Ａ）ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ＲＮＡ」Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  ｊｏｕｒｎａｌ  ２２、３７０５〜３７１４（２００３年）。
８４．Ｕ．Ｋｕｈｎら著、「Ｐｏｌｙ（Ａ）ｔａｉｌ  ｌｅｎｇｔｈ  ｉｓ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙ（Ａ）−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｏｌｙ（Ａ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ」Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８４、２２８０３〜２２８１４（２００９年）。
８５．Ｌ．Ｈ．Ａｐｐｏｎｉら著、「Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙ（Ａ）−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １  ｃａｕｓｅｓ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｍＲＮＡ  ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ」Ｈｕｍａｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９、１０５８〜１０６５（２０１０年）。
８６．ｄｅ  Ｋｌｅｒｋら著、「Ｐｏｌｙ（Ａ）ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  １  ｌｅｖｅｌｓ  ａｆｆｅｃｔ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４０、９０８９〜９１０１（２０１２年）。
８７．Ｍ．Ｊｅｎａｌら著、「Ｔｈｅ  ｐｏｌｙ（Ａ）−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  １  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ」Ｃｅｌｌ  １４９、５３８〜５５３（２０１２年）。
８８．Ｙ．Ｂ．Ｂｅａｕｌｉｅｕ、Ｃ．Ｌ．Ｋｌｅｉｎｍａｎ、Ａ．Ｍ．Ｌａｎｄｒｙ−Ｖｏｙｅｒ、Ｊ．Ｍａｊｅｗｓｋｉ、Ｆ．Ｂａｃｈａｎｄ著、「Ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｌｏｎｇ  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙ（Ａ）−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  １」ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ  ８、ｅ１００３０７８（２０１２年）。
８９．Ｃｈａｒｔｉｅｒ、Ｂ．Ｂｅｎｏｉｔ、Ｍ．Ｓｉｍｏｎｅｌｉｇ著、「Ａ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｏｃｕｌｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＰＡＢＰＮ１」Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  ｊｏｕｒｎａｌ  ２５、２２５３〜２２６２（２００６年）。
９０．Ｃｈａｒｔｉｅｒら著、「Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｐｏｌｙ（Ａ）ｔａｉｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｏｃｕｌｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ」ＰＬｏＳ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１、ｅ１００５０９２（２０１５年）。
９１．Ｓ．Ｙ．Ａｎｖａｒら著、「Ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ＯＰＭＤ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ａｎｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ」Ｓｋｅｌｅｔ  Ｍｕｓｃｌｅ  １、１５（２０１１年）。
９２．Ｎ．Ｂａｒｂｅｚｉｅｒら著、「Ａｎｔｉｐｒｉｏｎ  ｄｒｕｇｓ  ６−ａｍｉｎｏｐｈｅｎａｎｔｈｒｉｄｉｎｅ  ａｎｄ  ｇｕａｎａｂｅｎｚ  ｒｅｄｕｃｅ  ＰＡＢＰＮ１  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｏｃｕｌｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ」ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ３、３５〜４９（２０１１年）。
９３．Ｔｒｏｌｌｅｔら著、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｏｃｕｌｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｓｅｖｅｒｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｔｏ  ｆａｓｔ  ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ  ｆｉｂｒｅｓ」Ｈｕｍａｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９、２１９１〜２２０７（２０１０年）。
【図１】
2020121980.tif 000002
【図２】
2020121980.tif 000003
【図３】
2020121980.tif 000004
【図４】
2020121980.tif 000005
【図５】
2020121980.tif 000006
【図６】
2020121980.tif 000007
【図７】
2020121980.tif 000008
【図８】
2020121980.tif 000009
【図９】
2020121980.tif 000010
【配列表】
2020121980000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月31日(2020.3.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
早老症候群、横紋筋障害及び神経変性疾患から選択される障害を治療及び／又は予防する剤であって、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ａｌ（ＭＧ１３２）、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ｎＶａｌ−ａｌ（ＭＧ１１５）、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｂ（ＯＨ）２（ＭＧ２６２）及びＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ａｌ（ＭＧ１１０）から選択される修飾トリペプチド若しくはその薬学的に許容される塩を含む、剤。
【請求項２】
早老症候群及び眼球咽頭型筋ジストロフィーから選択される障害を治療及び／又は予防する剤である、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
前記早老症候群が、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群、非定型プロジェリア症候群、拘束性皮膚障害、ネスター・ギレルモ（Ｎｅｓｔｏｒ−Ｇｕｉｌｌｅｒｍｏ）プロジェリア症候群、ウェルナー症候群、ブルーム症候群、ロートムンド−トムソン症候群、コケイン症候群、色素性乾皮症及び硫黄欠乏性毛髪発育異常症から選択される、請求項１又は２に記載の剤。
【請求項４】
前記修飾トリペプチドが、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ｎＶａｌ−ａｌ（ＭＧ１１５）、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｂ（ＯＨ）２（ＭＧ２６２）及びＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ａｌ（ＭＧ１１０）から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の剤。
【請求項５】
早老症候群、横紋筋障害及び神経変性疾患から選択される障害を治療及び／又は予防するための医薬組成物であって、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ａｌ（ＭＧ１３２）、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ｎＶａｌ−ａｌ（ＭＧ１１５）、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｂ（ＯＨ）２（ＭＧ２６２）及びＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ａｌ（ＭＧ１１０）から選択される修飾トリペプチド若しくはその薬学的に許容される塩を含み、薬学的に許容される賦形剤を組み合わせて含む、医薬組成物。
【請求項６】
前記修飾トリペプチド若しくはその薬学的に許容される塩が局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下又は眼球内投与されるための製剤である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
注射可能な製剤である、請求項５又は６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記修飾トリペプチドがＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ｎＶａｌ−ａｌ（ＭＧ１１５）、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｂ（ＯＨ）２（ＭＧ２６２）及びＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ａｌ（ＭＧ１１０）から選択される、請求項５〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【外国語明細書】
2020121980000001.pdf