(57)【要約】      （修正有）【課題】ペルツズマブの変異体を開示する。【解決手段】ペルツズマブの一方又は両方の可変軽ドメインにＣｙｓ２３／Ｃｙｓ８８不対システインを含む不対システイン変異体、ペルツズマブのアフコシル化変異体、ペルツズマブの低分子量種（ＬＭＷＳ）、及びペルツズマブの高分子量種（ＨＭＷＳ）を開示する。更に、単離された変異体、組成物、薬学的組成物、及び変異体を含む製造品、並びに変異体及びその組成物を作製して特徴付ける方法を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペルツズマブ及びその不対システイン変異体を含む組成物であって、不対システイン変異体がペルツズマブの一方又は両方の可変軽ドメインにＣｙｓ２３／Ｃｙｓ８８不対システインを含む、組成物。
【請求項２】
不対システイン変異体が、ペルツズマブの一方の可変軽ドメインにのみＣｙｓ２３／Ｃｙｓ８８不対システインを含むヘテロダイマー変異体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
不対システイン変異体が、ペルツズマブの両方の可変軽ドメインにＣｙｓ２３／Ｃｙｓ８８不対システインを含むホモダイマー変異体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ペルツズマブ及び不対システイン変異体の各々が、それぞれ配列番号７及び８の可変軽アミノ酸配列及び可変重アミノ酸配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
ペルツズマブ及び不対システイン変異体の各々が、配列番号１１又は１５の軽鎖アミノ酸配列と、配列番号１２又は１６の重鎖アミノ酸配列とを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
ペルツズマブの一又は複数の追加の変異体を更に含み、追加の変異体が、アフコシル化変異体、低分子量種（ＬＭＷＳ）、高分子量種（ＨＭＷＳ）、糖化変異体、ジスルフィド還元型変異体、非還元性変異体、脱アミド化変異体、シアル酸付加変異体，ＶＨＳ−変異体、Ｃ末端リジン変異体、メチオニン酸化変異体、Ｇ１グリコシル化変異体、Ｇ２グリコシル化変異体、及び非グリコシル化重鎖変異体からなる群より選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
組成物中の不対システイン変異体の量が、Ｆａｂの疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により決定した場合に≦約２５％である、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
組成物中のホモダイマー変異体の量が、インタクトな抗体の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により決定した場合に≦４．９％である、請求項３に記載の組成物。
【請求項９】
組成物中のヘテロダイマー変異体の量が、インタクトな抗体の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により決定した場合に約１３％〜約１８％である、請求項２に記載の組成物。
【請求項１０】
分析アッセイを受けて、組成物中の不対システイン変異体の量が、Ｆａｂの疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により決定した場合に≦約２５％であることが確認されている、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
ペルツズマブ及びペルツズマブのアフコシル化変異体を含む組成物であって、アフコシル化変異体の量が組成物の０．９〜４．１％である、組成物。
【請求項１２】
アフコシル化変異体の量が組成物の２％より多い、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ペルツズマブ、ペルツズマブの低分子量種（ＬＭＷＳ）、及びペルツズマブの高分子量種（ＨＭＷＳ）の混合物を含む組成物であって、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）により決定した場合にＬＭＷＳの量が≦１．６％でありＨＭＷＳの量が≦１．７％である、組成物。
【請求項１４】
ペルツズマブ、ピーク１、及びピーク２の混合物を含む組成物であって、還元型キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム（Ｒ−ＣＥ−ＳＤＳ）アッセイによって測定した場合にピーク１の量が≦０．５％でありピーク２の量が≦１．０％である、組成物。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物と、一又は複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の薬学的組成物を中に含む容器と、がん患者を治療するために薬学的組成物を使用することをその使用者に指示する処方情報を含む添付文書とを含む、製品。
【請求項１７】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物又は請求項１５に記載の薬学的組成物をがん患者に投与することを含む、がん患者の治療法。
【請求項１８】
がんが乳がん、胃がん、卵巣がん、ＨＥＲ２陽性がん、又は低ＨＥＲ３がんである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ペルツズマブ組成物を評価するための方法であって：（１）組成物中の、ペルツズマブの一方又は両方の可変軽ドメインにＣｙｓ２３／Ｃｙｓ８８不対システインを含む不対システイン変異体の量を測定すること；（２）組成物中のアフコシル化ペルツズマブの量を測定すること；又は（３）組成物中の、ペルツズマブの低分子量種（ＬＭＷＳ）又は高分子量種（ＨＭＷＳ）の量を測定することを含む方法。
【請求項２０】
（１）、（２）、及び（３）のうちの二つ又は三つを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ペルツズマブ組成物の生物活性を評価するための方法であって、組成物中のアフコシル化ペルツズマブ変異体の量を測定して、組成物の抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を決定すること、及びアフコシル化ペルツズマブの量が、約０．９％〜約４．１％の範囲であることを確認することを含む方法。
【請求項２２】
キャピラリー電気泳動−レーザー誘起蛍光（ＣＥ−ＬＩＦ）を用いてアフコシル化ペルツズマブの量を測定することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
組成物を作製するための方法であって：（１）ペルツズマブ及びその一又は複数の変異体を含む組成物を製造すること、及び（２）そのように製造された組成物の分析アッセイを行って、含まれる変異体の量を評価することを含み、ここで変異体が：（ｉ）ペルツズマブの一方又は両方の可変軽ドメインにＣｙｓ２３／Ｃｙｓ８８不対システインを含む不対システイン変異体；（ｉｉ）ペルツズマブのアフコシル化変異体；（ｉｉｉ）ペルツズマブの高分子量種（ＨＭＷＳ）；又は（ｉｖ）ペルツズマブの低分子量種（ＬＭＷＳ）を含む、方法。
【請求項２４】
（１）が、組換えチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）由来のペルツズマブ及び変異体を、製造規模で発現すること、及び組成物を精製することを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ペルツズマブの単離された変異体であって、（ａ）ペルツズマブの一方の可変軽ドメインにのみＣｙｓ２３／Ｃｙｓ８８不対システインを含むヘテロダイマー変異体である、ペルツズマブの不対システイン変異体；（ｂ）ペルツズマブの両方の可変軽ドメインにＣｙｓ２３／Ｃｙｓ８８不対システインを含むホモダイマー変異体である、ペルツズマブの不対システイン変異体；（ｃ）ペルツズマブのアフコシル化変異体；（ｄ）ペルツズマブの高分子量種（ＨＭＷＳ）；又は（ｅ）ペルツズマブの低分子量種（ＬＭＷＳ）を含む、単離された変異体。
【請求項２６】
ペルツズマブ組成物の断片化を評価するための方法であって、還元型キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム（Ｒ−ＣＥ−ＳＤＳ）アッセイにより組成物中のピーク１及びピーク２の量を測定すること、及びピーク１の量が≦５％でありピーク２の量が≦１．０％であることを確認することを含む方法。
【請求項２７】
組成物を作製するための方法であって：（１）ペルツズマブ及びその一又は複数の断片を含む組成物を製造すること、及び（２）そのように製造された組成物の分析アッセイを行って、組成物中のピーク１及びピーク２の量を評価することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
３７ＣＦＲ１．５３（ｂ）の下に出願された本非仮特許出願は、２０１３年４月１６日出願の米国仮出願第６１／８１２６０３号の米国特許法１１９（ｅ）に基づく利益を主張し、この仮出願の全体は引用により本明細書に包含される。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂにより提出された配列表を含み、その全体は引用により本明細書に包含される。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１４年４月８日に作成され、Ｐ５５８４Ｒ１−ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔと命名され、大きさは３１３６３バイトである。
【０００３】
本発明はペルツズマブの変異体に関するものである。本発明は、特に、ペルツズマブの一方又は両方の可変軽ドメインにＣｙｓ２３／Ｃｙｓ８８不対システインを含む不対システイン変異体、ペルツズマブのアフコシル化変異体、ペルツズマブの低分子量種（ＬＭＷＳ）、及び高分子量種（ＨＭＷＳ）に関する。本発明は、更に、単離された変異体、組成物、薬学的組成物、及び変異体を含む製造品、並びに変異体及びその組成物を作製及び特徴付ける方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
ペルツズマブ（ＰＥＲＪＥＴＡ（登録商標））（ｒｈｕＭＡｂ  ２Ｃ４とも呼ばれる）は、「ＨＥＲ二量体化阻害剤」と呼ばれる薬剤シリーズの分類の一番目であるモノクローナル抗体（ＭＡｂ）である。ＨＥＲ２に結合することにより、この抗体は、ＨＥＲ２の他のＨＥＲ受容体との二量体化を阻害し、したがって腫瘍増殖を阻害する。２０１２年６月８日、ペルツズマブは、ＨＥＲ２陽性転移性乳がんの治療について米国食品医薬品局（ＵＳ  ＦＤＡ）の承認を受けた。
【０００５】
米国特許第７８６２８１７号（Ａｄａｍｓら）は、ヒト化２Ｃ４バージョン５７４又は組み換えヒト化モノクローナル抗体２Ｃ４（ｒｈｕＭＡｂ  ２Ｃ４）と呼ばれる２Ｃ４抗体のヒト化変異体について記載している。この抗体は、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のサブドメインＩＩに結合した。ｒｈｕＭＡｂ  ２Ｃ４抗体は、実験室規模で生産され、ＨＥＲ２に結合してＭＤＡ−１７５細胞（ＨＥＲ２を１＋レベルで発現する）及びマウスに移植されたＭＣＦ７異種移植片の増殖を阻害することが示された。Adams et al. Cancer Immunol. Immunother. 55(6):717-727 (2006)も参照されたい。
【０００６】
米国特許第６３３９１４２号（Ｂｌａｎｋ及びＢａｓｅｙ）は、抗ＨＥＲ２抗体と一又は複数のその酸性変異体の混合物とを含むＨＥＲ２抗体組成物を記載しており、ここで、その酸性変異体の量は約２５％未満である。ヒト化モノクローナル抗体４Ｄ５変異体８（ｈｕｍＭＡｂ４Ｄ５−８又はトラスツズマブ）は、例示されるＨＥＲ２抗体である。
【０００７】
米国特許第７５６０１１１号、米国特許第７８７９３２５号、及び米国特許第８２４１６３０号（Ｋａｏら）には、抗体の一方又は両方の軽鎖上にアミノ末端リーダー伸長（ＶＨＳ−）を含むペルツズマブの変異体（ｒｈｕＭＡｂ  ２Ｃ４）、いわゆる「ＶＨＳ−変異体」が記載されている。参照試料（第Ｉ相）、ＬｏｔＳ９８０２Ａ（第ＩＩ相）、及び４００Ｌスケールプロセス開発素材を、自然条件でエルマン分析を用いて遊離チオールについて試験したところ、遊離チオールのレベルは試験したすべての試料において検出限界を下回った。キャピラリー電気泳動（ＣＥ）による決定した場合、試験した組成物中１〜２％のペルツズマブがアフコシル化された（Ｇ０−Ｆ）。米国特許第７５６０１１１（Ｋａｏら）の表５を参照されたい。
【０００８】
国際公開第２００９／０９９８２９号（Ｈａｒｒｉｓら）には、脱アミド変異体、糖化変異体、ジスルフィド還元型変異体、非還元性変異体、及びシアル酸付加変異体を含む、ペルツズマブの酸性変異体が記載されている。これら変異体の特徴を、以下に開示するように明らかにした。
【０００９】
表１：国際公開第２００９／０９９８２９号（Ｈａｒｒｉｓら）の酸性変異体
2020015719.tif 000002
国際公開第２００９／０９９８２９号（Ｈａｒｒｉｓら）のジスルフィド還元型変異体、インタクトな抗体の非還元型ＣＥ−ＳＤＳの特徴を明らかにするために使用された実験的方法は、鎖内ジスルフィド結合ではなく、還元型鎖間ジスルフィド結合を評価した。
【００１０】
Zhang et al. Anal. Chem. 84(16):7112-7123 (2012)には、その可変重（ＶＨドメイン）に不対システイン（Ｃｙｓ２２及びＣｙｓ９６）を有する組換え抗体（ｍＡｂ  Ａ）が報告されている。不対システインは、ＣＤ２０に対する抗体の結合に有意な影響を持たないことが判明し、不対システインを有するｍＡｂ  Ａは、効力検定（補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイ）において完全に活性であった。
【００１１】
国際公開第２００９／００９５２３号（Ｋａｏら）には、ＣＤ２０に結合するオクレクリツマブ（ｏｃｒｅｃｌｉｚｕｍａｂ）（ｒｈｕＭＡｂ  ２Ｈ７）抗体の組換え生産の間の鎖間ジスルフィド結合還元の防止が開示されている。
【００１２】
Harris, R. Dev. Biol. (Basel, Switzerland) 122: 117-127 (2005)には、オマリズマブの可変重（ＶＨ）ドメイン内の不対システイン（Ｃｙｓ２２及びＣｙｓ９６）、ヒト化抗ＩｇＥ抗体が開示されている。不対システイン形態の力価は有意に低下していた。
【発明の概要】
【００１３】
本明細書における実験データは、不対システイン変異体、アフコシル化変異体、低分子量種（ＬＭＷＳ）、及び高分子量種（ＨＭＷＳ）を含む、ペルツズマブの変異体形態に関する。これら変異体の同定、特徴付け、及び定量化のための手段は、ペルツズマブ薬組成物のための製造及び品質管理方法において有益である。
【００１４】
したがって、第１の態様では、本発明は、ペルツズマブ及びその不対システイン変異体を含む組成物に関し、ここで不対システイン変異体は、ペルツズマブの一方又は両方の可変軽ドメインにＣｙｓ２３／Ｃｙｓ８８不対システインを含む。不対システイン変異体は、ヘテロダイマー変異体（ペルツズマブの一方の可変軽ドメインにのみＣｙｓ２３／Ｃｙｓ８８不対システインを含む）及び／又はホモダイマー変異体（ペルツズマブの両方の可変軽ドメインにＣｙｓ２３／Ｃｙｓ８８不対システインを含む）を含む。
【００１５】
組成物は、任意選択的に、ペルツズマブの一又は複数の別の変異体、例えばアフコシル化変異体、低分子量種（ＬＭＷＳ）変異体、高分子量種（ＨＭＷＳ）変異体、糖化変異体、ジスルフィド還元型変異体、非還元性変異体、脱アミド化変異体、シアル酸付加変異体，ＶＨＳ−変異体、Ｃ末端リジン変異体、メチオニン酸化変異体、Ｇ１グリコシル化変異体、Ｇ２グリコシル化変異体、及び非グリコシル化重鎖変異体を更に含む。
【００１６】
本発明は、ペルツズマブ及びペルツズマブのアフコシル化変異体を含む組成物に関し、ここでアフコシル化変異体の量は組成物の０．９〜４．１％である。一実施態様では、本発明は、ペルツズマブ及びペルツズマブのアフコシル化変異体を含む組成物にも関し、ここでアフコシル化変異体の量は組成物の２％を上回る。この実施態様によれば、アフコシル化変異体の量は、米国特許第７５６０１１１号、米国特許第７８７９３２５号、及び米国特許第８２４１６３０（Ｋａｏら）において報告されているものを上回っている。
【００１７】
更なる態様では、本発明は、ペルツズマブ、ペルツズマブの低分子量種（ＬＭＷＳ）、及びペルツズマブの高分子量種（ＨＭＷＳ）の混合物を含む組成物に関し、ここでＬＭＷＳの量は≦１．６％であり、ＨＭＷＳの量は≦１．７％である。
【００１８】
本発明は、ペルツズマブ、ピーク１、及びピーク２の混合物を含む組成物にも関し、ここで還元型キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム（Ｒ−ＣＥ−ＳＤＳ）アッセイによって測定した場合のピーク１の量は≦０．５％であり、ピーク２の量は≦１．０％である。
【００１９】
本発明の更なる態様は、本明細書の組成物を使用するか又は含む薬学的組成物、製造品、及びがん患者の治療方法に関する。
【００２０】
別の一態様では、本発明は、ペルツズマブ組成物を評価するための方法に関し、この方法は：（１）組成物中の不対システイン変異体の量を測定することであって、不対システイン変異体がＣｙｓ２３／Ｃｙｓ８８不対システインをペルツズマブの一方又は両方の可変軽ドメインに含む、測定すること；及び／又は（２）組成物中のアフコシル化ペルツズマブの量を測定すること；及び／又は（３）組成物中のペルツズマブの低分子量種（ＬＭＷＳ）又は高分子量種（ＨＭＷＳ）の量を測定することを含む。
【００２１】
また別の一態様では、本発明は、ペルツズマブ組成物の生物活性を評価するための方法に関し、この方法は、組成物中のアフコシル化ペルツズマブ変異体の量を測定して、組成物の抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を決定すること、及びアフコシル化ペルツズマブが約０．９〜約４．１％の範囲内であることを確認することを含む。
【００２２】
別の態様では、本発明は、組成物を作製するための方法に関し、この方法は：（１）ペルツズマブ及びその一又は複数の変異体を含む組成物を製造すること、及び（２）そのように製造された組成物の分析アッセイを行って、含まれる変異体の量を評価することを含み、ここで変異体が：（ｉ）ペルツズマブの一方又は両方の可変軽ドメインにＣｙｓ２３／Ｃｙｓ８８不対システインを含む不対システイン変異体；及び／又は（ｉｉ）ペルツズマブのアフコシル化変異体；及び／又は（ｉｉｉ）ペルツズマブの高分子量種（ＨＭＷＳ）；及び／又は（ｉｖ）ペルツズマブの低分子量種（ＬＭＷＳ）、及び／又は（ｖ）ペルツズマブ；のピーク１断片（ｓ）、及び／又は（ｖｉ）ペルツズマブのピーク２断片を含む、評価することを含む。
【００２３】
別の態様では、本発明はペルツズマブの単離された変異体に関し、ここで単離された変異体は：（Ａ）Ｃｙｓ２３／Ｃｙｓ８８不対システインをペルツズマブの一方の可変軽ドメインにのみ含むヘテロダイマー変異体である、ペルツズマブ不対システイン変異体；及び／又は（ｂ）Ｃｙｓ２３／Ｃｙｓ８８不対システインをペルツズマブの両方の可変軽ドメインに含むホモダイマー変異体である、ペルツズマブの不対システイン変異体；及び／又は（ｃ）ペルツズマブのアフコシル化変異体；及び／又は（ｄ）ペルツズマブの高分子量種（ＨＭＷＳ）；及び／又は（ｅ）ペルツズマブの低分子量種（ＬＭＷＳ）；及び／又は（ｆ）ペルツズマブのピーク１断片（ｓ）、及び／又は（ｇ）ペルツズマブのピーク２断片を含む。
【００２４】
別の一態様では、本発明は、ペルツズマブ組成物の断片化を評価するための方法に関し、この方法は、組成物中のピーク１及びピーク２の量を、還元型キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム（Ｒ−ＣＥ−ＳＤＳ）アッセイによって測定すること、及びピーク１の量が≦５％であり、ピーク２の量が≦１．０％であることを確認することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＨＥＲ２タンパク質構造の模式図、及びその細胞外ドメインのサブドメインＩ−ＩＶ（それぞれ配列番号１−４）の各アミノ酸配列を提供する。
【図２】Ａ及びＢは、マウスモノクローナル抗体２Ｃ４の可変軽（ＶＬ）（図２Ａ）ドメイン及び可変重（ＶＨ）（図２Ｂ）ドメイン（それぞれ配列番号５及び６）；変異体５７４／ペルツズマブのＶＬドメイン及びＶＨドメイン（それぞれ配列番号７及び８）；並びにヒトＶＬ及びＶＨコンセンサスフレームワーク（ヒトκ１、カッパ軽鎖サブグループＩ；ヒトＩＩＩ、重鎖サブグループＩＩＩ）（それぞれ配列番号９及び１０）のアミノ酸配列の配列比較を示す。アステリスクは、ペルツズマブとマウスモノクローナル抗体２Ｃ４間の、又はペルツズマブとヒトフレーワーク間の、可変ドメインの差異を識別する。括弧内は、相補性決定領域（ＣＤＲ）である。
【図３】Ａ及びＢは、ペルツズマブの軽鎖（図３Ａ；配列番号１１）及び重鎖（図３Ｂ；配列番号１２）のアミノ酸配列を示す。太字はＣＤＲである。計算された軽鎖及び重鎖の分子量は、それぞれ２３，５２６．２２ダルトン及び４９，２１６．５６ダルトン（システインは還元状態）である。炭化水素部分は、重鎖のＡｓｎ２９９に結合される。
【図４Ａ】トラスツズマブ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１３）を示す。矢印は、可変軽ドメインと可変重ドメインの境界線である。
【図４Ｂ】トラスツズマブ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。矢印は、可変軽ドメインと可変重ドメインの境界線である。
【図５Ａ】変異ペルツズマブ軽鎖配列（配列番号１５）を示している。
【図５Ｂ】変異ペルツズマブ重鎖配列（配列番号１６）を示している。
【図６】４つの鎖間ジスルフィド結合及び１２の鎖内ジスルフィド結合を含む（主要種）ペルツズマブの構造を示しており、可変軽（ＶＬ）ドメインの各々にＣｙｓ２３／Ｃｙｓ８８鎖内ジスルフィド結合が含まれている。図示されているドメインは下記の通り：ＶＬ＝可変軽ドメイン；ＶＨ＝可変重ドメイン；ＣＬ＝軽鎖定常ドメイン；ＣＨ１＝重鎖定常ドメイン１；ＣＨ２＝重鎖定常ドメイン２；ＣＨ３＝重鎖定常ドメイン３。
【図７】ペルツズマブの非還元型（天然）トリプシンペプチドマップを示している。
【図８】還元型及び非還元型のペルツズマブのトリプシンペプチドマップを示している（フルスケール）。
【図９】還元型及び非還元型のペルツズマブのトリプシンペプチドマップを示している（０〜１２０分）。
【図１０】還元型及び非還元型のペルツズマブのトリプシンペプチドマップを示している（１２０〜２０４分）。
【図１１】パパイン消化ペルツズマブの疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）分析を示している。
【図１２】パパイン消化ペルツズマブのＨＩＣ分析を示している（拡大図）。
【図１３】インタクトなペルツズマブのＨＩＣ分析を示している。濃縮遊離チオールホモダイマー（両方の軽鎖上に遊離チオール）、遊離チオールヘテロダイマー（一方の軽鎖上に遊離チオール）、及び野生型ホモダイマー（主要種抗体）を含む複数のピークが示されている。
【図１４】抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイにおけるペルツズマブ（バッチ抗２Ｃ４９０７−２）の活性を示している。
【図１５】ＡＤＣＣ活性に対するＧ０−Ｆレベルの影響を示している。試験した試料は、第ＩＩＩ相ペルツズマブ（Ｇ０−Ｆ＝２．２％）及び第Ｉ相ペルツズマブ（Ｇ０−Ｆ＝０．８％）であった。
【図１６】ペルツズマブから放出されたＮ−結合型オリゴ糖のキャピラリー電気泳動分析を示している。
【図１７】ペルツズマブから放出されたＮ−結合型オリゴ糖のキャピラリー電気泳動分析を示している（拡大図）。注：Ｇ１オリゴ糖は、末端のガラクトース残基がα１−６分枝又はα１−３分枝に結合している二つの異性体（標識されたＧ１及びＧ１’）を有している。
【図１８】限定Ｌｙｓ−Ｃ消化ペルツズマブ、及び限定Ｌｙｓ−Ｃ消化ペルツズマブであって次いでＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）で処理されたものが示されている。限定されたＬｙｓ−Ｃ消化ペルツズマブ、及び次いでＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）で処理された限定されたＬｙｓ−Ｃ消化ペルツズマブが示されている。
【図１９】ペルツズマブの遊離チオールＦａｂが遊離Ｃｙｓ２３及びＣｙｓ８８をその軽鎖に含むことを確認するペプチドマッピングを示す。遊離チオールを含むＦａｂ由来のＬ２ペプチドをＮＥＭによって標識すると、ペプチドマップ分析においてこのようにシフトした。
【図２０Ａ】主要種又は野生型ＩｇＧ１の概略図である。
【図２０Ｂ】Ｃｙｓ２３／Ｃｙｓ８８ヘテロダイマー変異体の概略図である。
【図２０Ｃ】Ｃｙｓ２３／Ｃｙｓ８８ホモダイマー変異体の概略図である。
【図２１】本明細書の実施例４のアッセイを用いたペルツズマブバッチの％Ｇ０−Ｆ対ＡＤＣＣ活性を示す。
【図２２】ペルツズマブがＨＥＲ２のヘテロダイマー結合部位に結合し、それにより活性化ＥＧＦＲ又はＨＥＲ３とのヘテロダイマー化を防ぐ様子を概略的に示す。
【図２３】トラスツズマブ（ＨＥＲ２  ＥＣＤの膜近傍ドメインの近くのサブドメインＩＶに結合）とペルツズマブ（ＨＥＲ２  ＥＣＤのサブドメインＩＩに結合）の活性の比較である。
【図２４Ａ】ＩｇＧ抗体に結合したオリゴ糖構造を示す。
【図２４Ｂ】ＩｇＧ抗体に結合したオリゴ糖構造を示す。
【図２５】ペルツズマブのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析を示す（フルスケール）。
【図２６】ペルツズマブのＳＥＣ分析を示す（拡大図）。ピークは、主要ピーク（主要種抗体）、高分子量種（ＨＭＷＳ）、及び低分子量種（ＬＭＷＳ）を含む。
【図２７】ペルツズマブ試料のサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ-ＨＰＬＣ）分析を示す。試料Ａは、代表的なペルツズマブ製剤バッチである。試料Ｂは、１．２ｍルクス時間光曝露したペルツズマブバッチである。試料Ｃは、３．６ｍルクス時間光曝露したペルツズマブバッチである。試料Ｄは、ｐＨ３．２で酸処理したペルツズマブバッチである。試料Ｅは、イオン交換−ＨＰＬＣ（ＩＥ-ＨＰＬＣ）からの精製された基本的な変異体である。
【図２８】分析超遠心（ＡＵＣ）沈降速度及びＳＥ-ＨＰＬＣ分析の一致図を示す。エラーバーは、ｎ＝３の決定に基づく二つの標準偏差を表している。他のすべてのデータ点は、単一の決定を示している。円は、ＡＵＣの検出レベルを下回るＨＭＷＳレベルを有する試料を示している。
【図２９】非還元型ペルツズマブのレーザー誘起蛍光（ＬＩＦ）検出によるキャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム分析（ＣＥ−ＳＤＳ）を示す。
【図３０】非還元型（ＮＲ）ペルツズマブのＣＥ−ＳＤＳ−ＬＩＦを示す（拡大図）。
【図３１Ａ】実施例６のＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラフィーを示す（フルスケール）。
【図３１Ｂ】実施例６のＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラフィーを示す（拡大図）。
【図３２Ａ】実施例６の非還元型ＣＥ−ＳＤＳ（ＮＲ−ＣＥ−ＳＤＳ）電気泳動図を示す（フルスケール）。
【図３２Ｂ】実施例６の非還元型ＣＥ−ＳＤＳ（ＮＲ−ＣＥ−ＳＤＳ）電気泳動図を示す（拡大図）。
【図３３Ａ】実施例６の還元型ＣＥ−ＳＤＳ（Ｒ−ＣＥ−ＳＤＳ）電気泳動図を示す（フルスケール）。
【図３３Ｂ】実施例６の還元型ＣＥ−ＳＤＳ（Ｒ−ＣＥ−ＳＤＳ）電気泳動図を示す（拡大図）。
【図３４】酸処理した試料のＮＲ−ＣＥ−ＳＤＳとＲ−ＣＥ−ＳＤＳの電気泳動図の比較である（拡大図）。
【図３５】ＮＲ−ＣＥ−ＳＤＳ及びＳＥ−ＨＰＬＣ間のＦａｂ定量化の相関を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
Ｉ．定義
本明細書の「対システイン」は、抗体といったタンパク質中においてジスルフィド結合を形成する二つのシステイン残基を指す。このようなジスルフィド結合は、鎖間ジスルフィド結合（例えば抗体の重鎖と軽鎖の間のジスルフィド結合、又は抗体の二つの重鎖間のジスルフィド結合）、又は鎖内（例えば抗体の軽鎖内又は抗体の重鎖内）ジスルフィド結合でありうる。大部分のＩｇＧ１抗体は、四つの鎖間ジスルフィド結合と十二の鎖内ジスルフィド結合を含む。図６参照。
【００２７】
「不対システイン変異体」は、一又は複数の対システインがジスルフィド結合状態にない、タンパク質（例えばペルツズマブのような抗体）の変異体である。このような不対システインは、対合してジスルフィド結合を形成していない可能性（例えばタンパク質がはじめからその三次構造に折り畳まれているとき）、又はジスルフィド結合を形成したが後に壊れた可能性（例えば製造中又は貯蔵時に）がある。不対システインは、しばしば遊離チオール又は遊離スルフヒドリルと呼ばれる。一実施態様では、不対システインは鎖内ジスルフィド結合に由来している。一実施態様では、不対システインは、抗体の軽鎖、例えば可変軽ドメイン中にある。一実施態様では、不対システイン変異体はＣｙｓ２３／Ｃｙｓ８８変異体である。
【００２８】
「Ｃｙｓ２３／Ｃｙｓ８８」不対システイン変異体は、抗体の一方又は両方の可変軽ドメインのシステイン残基２３及び８８に分子内ジスルフィド結合を欠く。本出願の図２０（ｂ）及び（ｃ）を参照。
【００２９】
「ホモダイマー変異体」は、抗体の両方の可変軽ドメインにＣｙｓ２３／Ｃｙｓ８８ジスルフィド結合を欠く。本出願の図２０（ｃ）を参照。
【００３０】
「ヘテロダイマー変異体」は、抗体の一の可変軽ドメインにのみＣｙｓ２３／Ｃｙｓ８８ジスルフィド結合を欠く。本出願の図２０（ｂ）を参照。
【００３１】
「アフコシル化変異体」は、一方又は両方の重鎖の残基Ａｓｎ２９９に結合したオリゴ糖構造の一方又は両方が、コアのオリゴ糖構造にフコースを欠く、例えばＦｕｃα（１−＞６）を欠く、抗体のグリコシル化変異体である。
【００３２】
ペルツズマブの「低分子量種」即ち「ＬＭＷＳ」は、主要種即ちインタクトなペルツズマブの分子量より小さな分子量を有するペルツズマブの断片を含む（例えば、インタクトなペルツズマブが、そのペプチド鎖のみを測定したとき約１４５１９７Ｄａの分子量を有する場合）。ＬＭＷＳは、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ-ＨＰＬＣ）及び／又はドデシル硫酸ナトリウムを用いた非還元型キャピラリー電気泳動（ＣＥ−ＳＤＳ）により、例えば実施例５におけるように、検出することができる。一実施態様では、ＬＭＷＳは、ＣＥ−ＳＤＳによって得られる「ピーク６」を含む又は「ピーク６」からなる（例えば、実施例５参照）。
【００３３】
「高分子量種」即ち「ＨＭＷＳ」は、主要種即ちインタクトなペルツズマブの分子量より大きな分子量を有するペルツズマブの調製物を含む（例えば、インタクトなペルツズマブが、そのペプチド鎖のみを測定したとき約１４５１９７Ｄａの分子量を有する場合）。ＨＭＷＳは、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ-ＨＰＬＣ）及び／又はドデシル硫酸ナトリウムアッセイを用いた非還元型キャピラリー電気泳動（ＣＥ−ＳＤＳ）により、例えば実施例５におけるように、検出することができる。
【００３４】
本明細書において「ピーク１」は、ペルツズマブ軽鎖（ＬＣ）より小さいペルツズマブ断片を指す。ピーク１断片は、主要種ペルツズマブから、ＣＥ−ＳＤＳアッセイによって、好ましくは還元型ＣＥ−ＳＤＳ（Ｒ−ＣＥ−ＳＤＳ）アッセイによって、分離することができる。例えば、本出願の図３３Ｂ、表１６、及び表１８を参照。好ましくは、ペルツズマブ組成物中のピーク１の量は≦０．５％である。任意選択的に、Ｒ−ＣＥ−ＳＤＳアッセイが、実施例６に記載のように実行され、補正されたピーク面積（ＣＰＡ）により組成物中の％ピーク１が得られる。
【００３５】
本明細書において「ピーク２」は、ペルツズマブ軽鎖（ＬＣ）より大きく、ペルツズマブ非グリコシル化重鎖（ＮＧＨＣ）より小さいペルツズマブ断片を指す。ピーク２は、主要種ペルツズマブから、ＣＥ−ＳＤＳによって、好ましくは還元型（Ｒ−ＣＥ−ＳＤＳ）アッセイによって分離することができる。ピーク２は、本明細書の実施例６で説明されるように、Ｒ−ＣＥ−ＳＤＳアッセイの間に現れうるピーク３を除外する。例えば、本出願の図３３Ｂ、表１６、及び表１８を参照。好ましくは、ペルツズマブ組成物中のピーク２の量は≦１．０％である。任意選択的に、Ｒ−ＣＥ−ＳＤＳアッセイが、実施例６に記載のように実行され、補正されたピーク面積（ＣＰＡ）により組成物中の％ピーク２が得られる。
【００３６】
「断片化」は、ポリペプチド鎖切断、例えばペルツズマブ軽鎖及び／又は重鎖の切断を指す。断片化は、例えばＮＲ−ＣＥ−ＳＤＳ分析の間の、非共有的に結合したポリペプチド鎖の解離を含まない。
【００３７】
「抗体アッセイ」は、組成物中の被分析物（例えば抗体変異体）の存在又は量を、定性的に評価する及び／又は定量的に測定するアッセイでありうる。アッセイを行った組成物は、薬学的組成物を含む、精製された組成物である。
【００３８】
「Ｆａｂ疎水性相互作用クロマトグラフィーアッセイ」即ち「Ｆａｂ  ＨＩＣアッセイ」は、組成物中において抗体の断片（例えばＦａｂ断片）を生成すること（パパイン酵素を用いて）、及びそのように生成された抗体断片に対してＨＩＣを行い、不対システイン変異体を主要種ペルツズマブから分離することを含む。このような例示的アッセイを、本明細書の実施例１に開示する。
【００３９】
「ＨＥＲ受容体」は、ＨＥＲ受容体ファミリーに属し、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４受容体を含む受容体タンパク質チロシンキナーゼである。ＨＥＲ受容体は通常、ＨＥＲリガンドに結合しうる及び／又は別のＨＥＲ受容体分子と二量体化しうる細胞外ドメイン；脂溶性膜貫通ドメイン；保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン；及びリン酸化されうる複数のチロシン残基を担持するカルボキシル末端シグナル伝達ドメインを含む。
【００４０】
「ＨＥＲ２」という表現は、例えば、Semba et al., PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985) 及びYamamoto et al. Nature 319:230-234 (1986) (Genebank accession number X03363)に記載のヒトＨＥＲ２タンパク質を指す。
【００４１】
本明細書において、「ＨＥＲ２細胞外ドメイン」又は「ＨＥＲ２  ＥＣＤ」は、その断片を含め、細胞の外側にあって、細胞膜に係留されているか、又は循環しているＨＥＲ２のドメインを指す。ＨＥＲ２のアミノ酸配列を図１に示す。一実施態様では、ＨＥＲ２の細胞外ドメインは、四つのドメイン、即ち：「サブドメインＩ」（約１〜１９５のアミノ酸残基；配列番号１）、「サブドメインＩＩ」（約１９６〜３１９のアミノ酸残基；配列番号２）、「サブドメインＩＩＩ」（約３２０〜４８８のアミノ酸残基：配列番号３）、及び「サブドメインＩＶ」（約４８９〜６３０のアミノ酸残基；配列番号４）（シグナルペプチドなしの残基番号付け）を含む。Garrett et al. Mol. Cell. 11 495-505 (2003), Cho et al. Nature 421: 756-760 (2003), Franklin et al. がん Cell 5:317-328 (2004),及びPlowman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 90:1746-1750 (1993)、並びに本出願の図１参照。
【００４２】
本明細書において「ＨＥＲダイマー」は、少なくとも二つのＨＥＲ受容体を含む、非共有的に結合したダイマーである。このような複合体は、例えば、Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994)に記載のように、二つ以上のＨＥＲ受容体を発現する細胞がＨＥＲリガンドに暴露されるとき形成され、免疫沈降によって単離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析することができる。サイトカイン受容体サブユニットのような他のタンパク質（例えばｇｐ１３０）をダイマーに結合させてもよい。好ましくは、ＨＥＲダイマーはＨＥＲ２を含む。
【００４３】
本明細書において、「ＨＥＲヘテロダイマー」は、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３又はＨＥＲ２−ＨＥＲ４ヘテロダイマーといった少なくとも二つの異なるＨＥＲ受容体を含む、非共有結合したヘテロダイマーである。
【００４４】
「ＨＥＲ活性化」は、いずれか一つ又は複数のＨＥＲ受容体の活性化又はリン酸化を指す。一般に、ＨＥＲ活性化はシグナル伝達を引き起こす（例えば、ＨＥＲ受容体又は基質ポリペプチド中のチロシン残基をリン酸化するＨＥＲ受容体の細胞内キナーゼドメインによって引き起こされるもの）。ＨＥＲ活性化は、対象のＨＥＲ受容体を含むＨＥＲダイマーに結合するＨＥＲリガンドによって媒介される場合もある。ＨＥＲダイマーに結合するＨＥＲリガンドは、ダイマー中のＨＥＲ受容体のうちの一又は複数のキナーゼドメインを活性化し、それによりＨＥＲ受容体のうちの一又は複数中のチロシン残基のリン酸化及び／又はＡｋｔ又はＭＡＰＫ細胞内キナーゼといった追加の基質ポリペプチド中のチロシン残基リン酸化を引き起こすことができる。
【００４５】
非ヒト（例えばげっ歯類）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大抵の場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、非ヒト種、例えば、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長動物の超可変領域（ドナー抗体）由来の残基により置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例においては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体において見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能を更に洗練させるためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインのすべてを実質的に含み、超可変ループのすべて又は実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲのすべて又は実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のものである。また、ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリン、典型的にはヒト免疫グロブリンの、定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含む。更なる詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。ヒト化ＨＥＲ２抗体は、具体的には、トラスツズマブ及びヒト化２Ｃ４抗体、例えば本明細書に記載及び定義されるペルツズマブを含む。
【００４６】
本明細書において「インタクトな抗体」は、二つの抗原結合領域、及びＦｃ領域を含むものである。好ましくは、インタクトな抗体は、機能的Ｆｃ領域を有する。一実施態様では、「インタクトなペルツズマブ」は、そのペプチド鎖のみを測定した場合に約１４５１９７Ｄａの分子量を有する。
【００４７】
「超可変領域」なる用語は、本明細書において使用される場合、抗原結合性を生じる抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」即ち「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインの残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）及び８９〜９７（Ｌ３）、並びに重鎖可変ドメインの３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）及び９５〜１０２（Ｈ３）（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. (1991)）、及び／又は「超可変ループ」（例えば、軽鎖可変ドメインの残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜〜５２（Ｌ２）及び９１〜９６（Ｌ３）、並びに重鎖可変ドメインの２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）及び９６〜１０１（Ｈ３）（Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）を含む。「フレームワーク領域」即ち「ＦＲ」残基は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００４８】
本明細書において用語「Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域及び異変Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化しうるが、通常ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６の位置又はＰｒｏ２３０のアミノ酸残基からそのカルボキシル末端まで伸長すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ番号付けシステムによる残基４４９）は、例えば、抗体の製造若しくは精製の間に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組換えにより改変することによって、除去することができる。したがって、インタクトな抗体の組成には、すべてのＫ４４９残基が除去された抗体集団、Ｋ４４９残基がまったく除去されていない抗体集団、及びＫ４４９残基を有する抗体と有さない抗体とを混合して有する抗体集団が含まれうる。
【００４９】
別途示さない限り、本明細書において、免疫グロブリン重鎖中の残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のＥＵインデックスのものであり、これを参照により本明細書に包含する。「ＫａｂａｔのＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。
【００５０】
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有している。例示的な「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などが含まれる。このようなエフェクター機能は、一般に、Ｆｃ領域に結合ドメインが混合していることを必要とし（例えば抗体可変ドメイン）、様々なアッセイを用いて評価することができる。
【００５１】
「天然配列Ｆｃ領域」は、天然にみられるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域は、天然配列ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域（非Ａ及びＡアロタイプ）；天然配列ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域；天然配列ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域；及び天然配列ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域と、天然に存在するその変異体とを含む。
【００５２】
「ネイキッド抗体」は、細胞傷害性部分又は放射性標識などの異種分子とコンジュゲートしていない抗体である。
【００５３】
本明細書において、用語「主要種抗体」又は「野生型抗体」は、組成物中で量的に優性な抗体分子である、組成物中の抗体アミノ酸配列構造を指す。好ましくは、主要種抗体は、ＨＥＲ２のサブドメインＩＩに結合する抗体、トラスツズマブより効率的にＨＥＲ二量体化を阻害する、及び／又はＨＥＲ２のヘテロダイマー結合部位に結合する抗体といったＨＥＲ２抗体である。一実施態様では、主要種抗体は、ＣＤＲ−Ｈ１（配列番号１７又は２３）、ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号１８）、及びＣＤＲ−Ｈ３（配列番号１９）、ＣＤＲ−Ｌ１（配列番号２０）、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号２１又は２４）及びＣＤＲ−Ｌ３（配列番号２２）、それぞれ配列番号７及び８のＶＬ及びＶＨアミノ酸配列（図２Ａ−２Ｂ参照）と、任意選択的に、配列番号１１又は１５の軽鎖アミノ酸配列、及び列配列番号１２又は１６の重鎖アミノ酸配（図３Ａ−３Ｂ及び５Ａ−５Ｂ参照）を含むものである。一実施態様では、主要種抗体はペルツズマブである。
【００５４】
「ＨＥＲ二量体化を阻害する」抗体は、ＨＥＲダイマー又はヘテロダイマーの形成を阻害する又は妨げる抗体である。一実施態様では、このような抗体は、ＨＥＲ２のヘテロダイマー結合部位に結合する。本明細書において最も好ましい二量体化阻害抗体は、ペルツズマブである。
【００５５】
ＨＥＲ２の「ヘテロダイマー結合部位」は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４の細胞外ドメインとのダイマーの形成時に、それに接触する、又はそれとの境界をなすＨＥＲ２の細胞外ドメインの一領域である。この領域は、ＨＥＲ２（配列番号２）のサブドメインＩＩに見られる。Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)。
【００５６】
ＨＥＲ２の「ヘテロダイマー結合部位に結合する」ＨＥＲ２抗体は、サブドメインＩＩ（配列番号２）内の残基に結合し、任意選択的にＨＥＲ２細胞外ドメインの他のドメイン内の残基、例えば、サブドメインＩ及びＩＩＩ（配列番号１及び３）にも結合し、少なくともある程度は、ＨＥＲ２−ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３、又はＨＥＲ２−ＨＥＲ４ヘテロダイマーの形成を、立体的に妨害することができる。Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)は、ＲＣＳＢタンパク質データバンクに寄託された（ＩＤコードＩＳ７８）ＨＥＲ２−ペルツズマブ結晶構造の特徴を明らかにして、ＨＥＲ２のヘテロダイマー結合部位に結合する例示的抗体を例示している。
【００５７】
ＨＥＲ２の「サブドメインＩＩに結合する」抗体は、サブドメインＩＩ（配列番号２）内の残基に結合し、任意選択的にＨＥＲ２の他のサブドメイン、例えばサブドメインＩ及びＩＩＩ（それぞれ配列番号１及び３）内の残基に結合する。
【００５８】
本明細書の目的のために、「トラスツズマブ」及び「２Ｃ４」（これらは互換的に使用される）は、配列番号１３及び１４内部にそれぞれ由来する可変軽（ＶＬ）及び可変重（ＶＨ）アミノ酸配列を含む抗体を指す（図４Ａ−４Ｂ参照）。ペルツズマブは、インタクトな抗体である場合、配列番号１１又は１５に軽鎖アミノ酸配列を、及び配列番号１２又は１６に重鎖アミノ酸配列を含む一実施態様において、好ましくはＩｇＧ１抗体を含む。この抗体は、場合によっては、組換えチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＣ）細胞により生成されてもよい。本明細書の用語「ペルズマム」及び「ｒｈｕＭＡｂ  ２Ｃ４」は、米国一般名（ＵＳＡＮ）又は国際一般名（ＩＮＮ）でペルズマムである薬物のバイオシミラー又は目的のコピーを包含する。
【００５９】
本明細書の目的のために、「トラスツズマブ」及び「ｒｈｕＭＡｂ４Ｄ５」（これらは互換的に使用される）は、配列番号１３及び１４内部にそれぞれ由来する可変軽（ＶＬ）及び可変重（ＶＨ）アミノ酸配列を含む抗体を指す（図４Ａ−４Ｂ参照）。トラスツズマブは、インタクトな抗体である場合、配列番号１３の軽鎖アミノ酸配列及び配列番号１４の重鎖アミノ酸配列を含む一実施態様において、好ましくはＩｇＧ１抗体を含む。この抗体は、場合によっては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＣ）細胞により生成されてもよい。本明細書において、用語「トラスツズマブ」及び「ｒｈｕＭＡｂ４Ｄ５」は、米国一般名（ＵＳＡＮ）又は国際一般名（ＩＮＮ）でトラスツズマブである薬物のバイオシミラー又は目的のコピーを包含する。
【００６０】
本明細書において、「アミノ酸配列変異抗体」は、主要種抗体と異なるアミノ酸配列を有する抗体である。通常、アミノ酸配列変異体は、主要種抗体と少なくとも約７０％の同一性を有し、好ましくは、少なくとも約８０％、更に好ましくは少なくとも約９０％の同一性を有する。アミノ酸配列変異体は、主要種抗体のアミノ酸配列内部の又はそれに隣接する特定の位置に、置換、欠失、及び／又は付加を有する。本明細書のアミノ酸配列変異体の例には、脱アミド化抗体変異体、その一つ又は二つの軽鎖上にアミノ末端リーダー伸長（例えばＶＨＳ−）を有する抗体、その一つ又は二つの重鎖上にＣ末端リジン残基を有する抗体などが含まれ、重鎖及び／又は軽鎖のアミノ酸配列に対する変異の組合せが含まれる。
【００６１】
「酸性変異体」は、主要種抗体より酸性度が高い主要種抗体の変異体である。酸性変異体は、主要種抗体と比較して、負電荷を獲得しているか、又は正電荷を失っている。このような酸性変異体は、イオン交換クロマトグラフィーのような、電荷に従ってタンパク質を分離する分離方法を用いて分解することができる。主要種抗体の酸性変異体は、陽イオン交換クロマトグラフィーによる分離時に、主要ピークより早く溶出する。
【００６２】
「ジスルフィド還元型変異体」は、化学的に遊離チオール形態に還元された、一又は複数の鎖間ジスルフィド結合したシステインを有する。この変異体は、例えば国際公開第２００９／０９９８２９号（Ｈａｒｒｉｓら）に記載の、ドデシル硫酸ナトリウムを用いた非還元型キャピラリー電気泳動（ＣＥ−ＳＤＳ）によってモニターすることができる。
【００６３】
本明細書において、「非還元性変異体」又は「不完全に還元された変異体」は、ジチオスレイトールなどの還元剤による処理によって重鎖及び軽鎖に化学的に還元することのできない主要種抗体の変異体である。このような変異体は、還元剤によって組成物を処理し、結果として得られた組成物を、例えば国際公開第２００９／０９９８２９号（Ｈａｒｒｉｓら）に記載の技術を用いた、ドデシル硫酸ナトリウムによるキャピラリー電気泳動（ＣＥ−ＳＤＳ）のようなタンパク質の大きさを評価する方法を用いて調べることにより、評価することができる。
【００６４】
本明細書の「グリコシル化変異体」抗体は、主要種抗体に結合する一又は複数の炭化水素部分とは異なる、一又は複数の炭化水素部分の結合した抗体である。一実施態様では、グリコシル化変異体は、抗体の一方又は両方の重鎖、例えば重鎖の残基２２９に結合するオリゴ糖構造を有している。一実施態様では、主要種抗体（例えばペルツズマブ）は、そのＦｃ領域に結合した主要なオリゴ糖としてＧ０オリゴ糖を含む。ＩｇＧ１に結合した例示的オリゴ糖構造を、図２４Ａ〜２４Ｂに示す。本明細書のグリコシル化変異体の例には、アフコシル化変異体、そのＦｃ領域に結合したＧ１又はＧ２オリゴ糖構造（Ｇ０オリゴ糖構造の代わりに）を有する抗体（「Ｇ１グリコシル化変異体」又は「Ｇ２グリコシル化変異体」）、抗体の一つ又は二つの重鎖に結合した炭化水素がなにもない抗体（「非グリコシル化重鎖変異体」）、シアル酸付加変異体など、並びにこのようなグリコシル化変性の組合せが含まれる。例えば、米国特許第７５６０１１１号（Ｋａｏら）を参照されたい。
【００６５】
抗体がＦｃ領域を有する場合、オリゴ糖構造が、抗体の一つ又は二つの重鎖の、例えば残基２９９に結合していていよい。一実施態様では、Ｇ０が主要なオリゴ糖構造であり、Ｇ０−Ｆ、Ｇ−１、Ｍａｎ５、Ｍａｎ６、Ｇ１−１、Ｇ１（１−６）、Ｇ１（１−３）及びＧ２といった他のオリゴ糖構造は、組成物中にもっと小さな量でみられる。
【００６６】
別途示さない限り、「本明細書のＧ１オリゴ糖構造」には、Ｇ１（１−６）及びＧ１（１−３）構造が含まれる。
【００６７】
本明細書の目的のために、「シアル酸付加変異体」は、その一つ又は二つの重鎖に結合した一又は複数のシアル酸付加炭化水素部分を含む主要種抗体の変異体である。シアル酸付加変異体は、シアリダーゼ処理した又はしていない組成物を、例えば国際公開第２００９／０９９８２９号に記載のようにして、（例えばイオン交換クロマトグラフィーによって）評価することにより同定することができる。
【００６８】
「糖化変異体」は、グルコースなどの糖が、例えばその一方又は両方の軽鎖に、共有結合している抗体である。このような付加は、（例えば細胞培地中における）タンパク質上のリジン残基との、グルコースの反応によって起こりうる。糖化変異体は、重鎖又は軽鎖の質量の増加を評価する還元型抗体の質量分析によって同定することができる。また、糖化変異体は、国際公開第国際公開第２００９／０９９８２９（Ｈａｒｒｉｓら）に説明されているボロネートクロマトグラフィーにより定量化することができる。
【００６９】
「脱アミド化」抗体は、その一又は複数のアスパラギン残基が、例えばアスパラギン酸、スクシンイミド、又はイソ−アスパラギン酸に誘導体化されている抗体である。脱アミド化抗体の一例は、ペルツズマブ変異体であり、ペルツズマブの一又は複数の重鎖上のＡｓｎ−３８６及び／又はＡｓｎ−３９１が脱アミド化されている。例えば、国際公開第２００９／０９９８２９号（Ｈａｒｒｉｓら）を参照されたい。
【００７０】
本明細書の「アミノ末端リーダー伸長変異体」は、主要種抗体のいずれか一つ又は複数の重鎖又は軽鎖のアミノ末端に、アミノ末端リーダー配列の一又は複数のアミノ酸残基を有する主要種抗体を指す。例示的なアミノ末端リーダー伸長は、抗体変異体の一方又は両方の軽鎖上に存在する、本明細書で「ＶＨＳ−変異体」と呼ぶ三つのアミノ酸残基、ＶＨＳ−を含むか、又はそれらかなる。米国特許第７５６０１１１（Ｋａｏら）を参照されたい。
【００７１】
「Ｃ末端リジン変異体」は、その重鎖のＣ末端にリジン（Ｋ）残基を含む変異体を指す。米国特許第７５６０１１１（Ｋａｏら）を参照されたい。
【００７２】
「メチオニン酸化変異体」は、その中に一又は複数の酸化メチオニン残基、例えば酸化Ｍｅｔ−２５４を含む変異体を指す。米国特許第７５６０１１１（Ｋａｏら）を参照されたい。
【００７３】
用語「がん」とは、制御されない細胞増殖によって典型的に特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を指す。本明細書のがんの例には、乳がん（例えば転移性乳がん）、胃（ｇａｓｔｒｉｃ又はｓｔｏｍａｃｈ）がん、卵巣がん、原発性腹膜がん、及び卵管がんが含まれる。本明細書のがんの例には、ＨＥＲ２陽性がん及び低ＨＥＲ３がんが含まれる。
【００７４】
「ＨＥＲ発現、増幅、又は活性化を呈する」がん又は生物学的試料は、診断試験において、ＨＥＲ受容体を（過剰発現を含めて）発現し、増幅されたＨＥＲ遺伝子を有し、及び／又はそうでなければＨＥＲ受容体の活性化又はリン酸化を呈するものである。
【００７５】
「ＨＥＲ２陽性」がんは、ＨＥＲ２のレベルが通常よりも高いがん細胞を含む。ＨＥＲ２陽性がんの例には、ＨＥＲ２陽性乳がん及びＨＥＲ２陽性胃がんが含まれる。ＨＥＲ２陽性がんを同定するための方法には、ＨＥＲ２タンパク質を測定するアッセイ、例えば免疫組織化学アッセイ（ＩＨＣ）、ＨＥＲ２−コード化核酸を測定するアッセイ、例えば蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月公開の国際公開第９８／４５４７９号参照）及びクロモジェニックｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ；例えばTanner et al., Am. J. Pathol. 157 (5) 1467-1472 (2000); Bella et al., J. Clin. Oncol. 26 (May 20 suppl; abstr 22147) (2008)参照）を含む、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、サザンブロット法、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術、例えば定量的実時間ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）；ｓｈｅｄ抗原（例えばＨＥＲ２  ＥＣＤ）アッセイ（例えば、１９９０年６月１２日発行の米国特許第４９３３２９４号；及び１９９５年３月２８日発行の米国特許第５４０１６３８号参照）、及びインビボアッセイが含まれる。任意選択的に、ＨＥＲ２陽性がんは、２＋又は３＋の免疫組織化学（ＩＨＣ）スコア及び／又は≧２．０のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）増幅比を有する。
【００７６】
「低ＨＥＲ３」がんは、ＨＥＲ３のレベルが通常より低いがん細胞を含む。低ＨＥＲ３がんの例には、卵巣癌、原発性腹膜癌、及び卵管癌が含まれる。例えば、米国特許第７９８１４１８号（Ａｍｌｅｒら）を参照されたい。一実施態様では、低ＨＥＲ３は、ＨＥＲ３  ｍＲＮＡ発現レベルに基づいて決定される（ＣＯＢＡＳ  ｚ４８０（登録商標）器具でのｑＲＴ−ＰＣＲによる評価で濃度比が２．８１以下）。
【００７７】
「エピトープ２Ｃ４」は、抗体２Ｃ４が結合するＨＥＲ２の細胞外ドメイン内の領域である。本質的に２Ｃ４エピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されているような常套的なクロスブロッキングアッセイを実行することができる。好ましくは、抗体は、ＨＥＲ２に対する２Ｃ４の結合を、約５０％以上ブロックする。代替的に、エピトープマッピングを、抗体がＨＥＲ２の２Ｃ４エピトープに本質的に結合するかどうかを評価するために実行することができる。エピトープ２Ｃ４は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインのサブドメインＩＩ（配列番号２）由来の残基を含む。２Ｃ４及びペルツズマブは、ＨＥＲ２の細胞外ドメインに、サブドメインＩ、ＩＩ及びＩＩＩ（それぞれ配列番号１、２、及び３）の接合点で結合する。Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)。
【００７８】
「処置」は、治療的処置及び予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ又はｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方を指す。処置を必要とするものには、既にがんを有するものと、がんが予防されるべきものが含まれる。したがって、本明細書において処置される患者は、がんを有すると診断されているか、又はがんにかかり易い若しくはがんの影響を受けやすいと思われる。
【００７９】
用語「有効量」は、患者のがんの処置に有効な薬物の量を指す。有効量の薬物は、がん細胞数を減少させ；腫瘍の大きさを縮小させ；末梢器官へのがん細胞浸潤を阻害し（即ち、ある程度遅らせ、好ましくは停止させる）；腫瘍転移を阻害し（即ち、ある程度遅らせ、好ましくは停止させる）；腫瘍増殖をある程度阻害し；及び／又はがんに関連する一又は複数の症状をある程度緩和することができる。薬剤は、増殖を防ぎ、及び／又は既存のがん細胞を死滅させ得る範囲で、細胞増殖抑制性及び／又は細胞毒性でありうる。有効量は、無憎悪生存期間を延長し（例えば固形がんの治療効果判定のためのガイドライン（ＲＥＣＩＳＴ）、又はＣＡ−１２５の変化によって測定して）、他覚的反応を引き起こし（部分寛解（ＰＲ）、又は完全寛解（ＣＲ））、全生存期間を延長し、及び／又はがんの一又は複数の症状を改善する（例えば、ＦＯＳＩによる評価で）。
【００８０】
本明細書において治療剤の「固定の」又は「フラットな」用量は、患者の重量（ＷＴ）又は対表面積（ＢＳＡ）には関係なく、ヒト患者に投与される用量を指す。したがって、固定の又はフラットな用量は、ｍｇ／ｋｇ用量又はｍｇ／ｍ２用量としてではなく、代わりに治療剤の絶対量として提供される。
【００８１】
「容器」は、薬学的組成物又は組成物を保持又は収用するために使用することができるオブジェクトを指す。本明細書の容器の例には、バイアル、シリンジ、輸液バッグなどが含まれる。
【００８２】
「輸液バッグ」又は「ＩＶバッグ」は、患者の静脈を介して投与できる溶液を保持することが可能なバッグである。一実施態様では、溶液は、生理食塩水（例えば、約０．９％又は約０．４５％のＮａＣｌ）である。任意選択的に、ＩＶバッグは、ポリオレフィン又は塩化ポリビニルから形成される。
【００８３】
「バイアル」は、液体又は凍結乾燥調製物を保持するために適した容器である。一実施態様では、バイアルは、単回使用バイアルであり、例えば２０ｃｃのストッパーのない単回使用バイアルである。
【００８４】
「添付文書」は、食品医薬品局（ＦＤＡ）又は他の行政権限の命令により、すべての処方薬のパッケージ内に配されなければならないリーフレットである。リーフレットは、一般に、薬物の商標、その一般名、及びその作用のメカニズムを含み；その効能、禁忌、警告、注意、副作用、及び投与形態を述べ、投与の推奨される用量、時間、及び経路の指示を含む。
【００８５】
「薬学的組成物」は、ヒト患者に安全に投与できる、薬学的に活性の薬物（例えばペルツズマブ及び本明細書に記載されるもののような変異体形態）と、一又は複数の「薬学的に活性の賦形剤」（例えばバッファー、安定剤、等張化修飾剤、保存料、界面活性剤など）とを含む組成物である。このような組成物は、例えば、液体であるか又は凍結乾燥されている。
【００８６】
「組換え」タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞のような遺伝的に修飾された宿主細胞により生成されたものである。
【００８７】
「製造規模」は、ＦＤＡ又は他の行政権威により承認された商業的プロセスを用いた、商業的規模、例えば１２０００リットル（Ｌ）以上の規模でのタンパク質薬（例えば抗体）の製造を指す。
【００８８】
「精製」は、プロテインＡクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの、一又は複数の精製工程を指す。
【００８９】
「単離された」変異体は、主要種又は野生型抗体から、一又は複数の精製又は分析手順によって分離された変異体を指す。このような、単離された変異体は、その生物活性及び／又は力価について評価することができる。
【００９０】
ＩＩ．抗体組成物
（ｉ）主要種抗体
本明細書において抗体組成物は、ＨＥＲ２に結合する抗体（ＨＥＲ２抗体）、任意選択的にヒト化ＨＥＲ２抗体を含む。本明細書においてヒト化抗体は、例えば、ヒト可変重ドメイン中に取り込まれた非ヒト超可変領域残留物を含むことができ、更に、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に規定された可変ドメイン番号付けシステムを利用して６９Ｈ、７１Ｈ及び７３Ｈからなる群より選択された位置にフレームワーク領域（ＦＲ）置換を含むことができる。一実施態様では、ヒト化抗体は、位置６９Ｈ、７１Ｈ及び７３Ｈのうちの二つ又はすべてにＦＲ置換を含む。
【００９１】
本明細書で対象とするヒト化抗体の一例は、以下のＶＨ  ＣＤＲ残基を含む：
−ＧＦＴＦＴＤＹＴＭＸ（配列番号１７）（Ｘは好ましくはＤ又はＳ）、例えばＣＤＲ−Ｈ１についてＧＦＴＦＴＤＹＴＭＤ（配列番号２３）；
−ＣＤＲ−Ｈ２についてＤＶＮＰＮＳＧＧＳＩＹＮＱＲＦＫＧ（配列番号１８）；及び／又は
−ＣＤＲ−Ｈ３についてＮＬＧＰＳＦＹＦＤＹ（配列番号１９）、任意選択的にこれらＣＤＲ残基のアミノ酸修飾を含み、例えば、修飾は基本的に抗体の親和性を維持又は改善する。例えば、本発明の方法に使用される抗体変異体は、上記可変重ＣＤＲ配列に、約一から約七、又は約五のアミノ酸置換を有しうる。このような抗体変異体は、例えば後述するような親和性成熟により調製することができる。
【００９２】
ヒト化抗体は、例えば前パラグラフの可変重ドメインＣＤＲ残基に加えて、以下のＶＬ  ＣＤＲ残基を含みうる：
−ＣＤＲ−Ｌ１についてＫＡＳＱＤＶＳＩＧＶＡ（配列番号２０）；
−ＳＡＳＹＸ１Ｘ２Ｘ３、ここでＸ１は好ましくはＲ又はＬであり、Ｘ２は好ましくはＹ又はＥであり、Ｘ３は好ましくはＴ又はＳ（配列番号２１）であり、例えばＣＤＲ−Ｌ２についてＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号２４）であり；及び／又は
−ＣＤＲ−Ｌ３についてＱＱＹＹＩＹＰＹＴ（配列番号２２）。
【００９３】
このようなヒト化抗体は、任意選択的に、上記ＣＤＲ残基のアミノ酸修飾を含み、例えばこのような修飾は基本的に抗体の親和性を維持又は改善する。例えば、対象の抗体変異体は、上記可変軽ＣＤＲ配列に、約一から約七、又は約五のアミノ酸置換を有しうる。このような抗体変異体は、親和性成熟により調製することができる。
【００９４】
本出願は、ＨＥＲ２に結合する親和性成熟抗体も考慮する。本抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体であり、例えばそれぞれ配列番号７及び８の可変軽及び／又は可変重配列（即ち、ペルツズマブのＶＬ及び／又はＶＨ）を含む抗体である。ペルツズマブの親和性成熟変異体は、好ましくは、マウスの２Ｃ４又はペルツズマブを上回る親和性で（例えばＨＥＲ２  ＥＣＤ  ＥＬＩＳＡを用いて評価したとき、例えば約二又は約四倍から約１００倍又は１０００倍高い親和性で）ＨＥＲ２受容体に結合する。置換に関する例示的な可変重ＣＤＲ残基には、Ｈ２８、Ｈ３０、Ｈ３４、Ｈ３５、Ｈ６４、Ｈ９６、Ｈ９９、又は二つ以上（例えば、これら残基の二、三、四、五、六、又は七つ）の組合せが含まれる。変性に関する可変軽ＣＤＲ残基の例には、Ｌ２８、Ｌ５０、Ｌ５３、Ｌ５６、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、Ｌ９６、Ｌ９７又は二つ以上（例えば、これら残基の二から三、四、五、又は約十まで）の組合せが含まれる。
【００９５】
ヒト化抗体又は親和性成熟抗体の様々な形態が考慮される。例えば、ヒト化抗体又は親和性成熟抗体。或いは、ヒト化抗体又は親和性成熟抗体は、インタクトなＩｇＧ１抗体などのインタクトな抗体でもよい。
【００９６】
好ましくは、ＨＥＲ２抗体（主要種ＨＥＲ２抗体及びその抗体変異体の一方又は両方）は、ＨＥＲ２のサブドメインＩＩに結合し、ＨＥＲの二量体化をトラスツズマブより効果的に阻害し、及び／又はＨＥＲ２のヘテロダイマー結合部位に結合する。本明細書における主要種抗体の好ましい実施態様は、配列番号３及び４の可変軽及び可変重アミノ酸配列を含み、最も好ましくは配列番号１１又は１５の軽鎖アミノ酸配列と、配列番号１２又は１６の重鎖アミノ酸配列とを含むものである。
【００９７】
（ｉｉ）不対システイン変異体
本明細書の実施例１及び３は、ペルツズマブの不対システイン変異体について記載している。このような変異体を単離、特徴付け、及び定量化するための分析アッセイには、鎖内ジスルフィド結合（鎖間ジスルフィド結合とは区別されるものとしての）を特異的に評価するアッセイ、例えば、実施例１のような抗体断片（例えばＦａｂ断片）の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）分析、実施例１のようなインタクトな抗体のＨＩＣ、実施例３のような差別的にタグ付けされた抗体のペプチドマッピング分析、及び／又は本明細書の実施例３及びZhang et al. Anal. Chem. 84(16):7112-7123 (2012)のような逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）が含まれる。
【００９８】
一般に、ペルツズマブの優占型は、その二つのＦａｂドメインのＶＬドメインの両方において、Ｃｙｓ２３とＣｙｓ８８の間にジスルフィド結合を含む。図６を参照。
【００９９】
本明細書の一の不対システイン変異体は、ヘテロダイマー変異体であり、その二つのＦａｂ領域の一方においてのみ、可変軽（ＶＬ）ドメインにＣｙｓ２３／Ｃｙｓ８８ジスルフィド結合を欠く。図２０（ｂ）参照。これは、主な不対システイン変異体であると決定された。
【０１００】
本明細書の更なる不対システイン変異体は、ホモダイマー変異体であり、そのＦａｂ領域の両方にＣｙｓ２３／Ｃｙｓ８８ジスルフィド結合を欠く。図２０（ｃ）参照。
【０１０１】
一実施態様では、組成物中における不対システイン変異体の量（ホモダイマー及びヘテロダイマー変異体を含む）は、例えば、Ｆａｂ疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって決定した場合、≦２５％である。
【０１０２】
一実施態様では、組成物中のホモダイマー変異体の量は、例えば、インタクトな抗体のＨＩＣによって決定した場合、≦４．９％である。
【０１０３】
一実施態様では、組成物中のヘテロダイマー変異体の量は、インタクトな抗体のＨＩＣによって決定した場合、約１３％から約１８％である。
【０１０４】
組成物は、任意選択的に、後述するようにこれ以外にも一又は複数の変異体を更に含む。
【０１０５】
本発明は、単離されたペルツズマブの不対システイン変異体にも関し、不対システイン変異体は、ペルツズマブの一又は複数の可変軽ドメインにＣｙｓ２３／Ｃｙｓ８８不対システインを含む。このような単離された不対システイン変異体は、ヘテロダイマー変異体及び／又はホモダイマー変異体を含むか、又はヘテロダイマー変異体及び／又はホモダイマー変異体からなる。このような変異体は、ＨＩＣ又は他の精製方法を用いて単離することができ、後述の実施例１のように力価アッセイなどの生物学的アッセイを行うことができる（ＨＥＲ２−陽性乳がん細胞を用いて）。
【０１０６】
（ｉｉｉ）アフコシル化変異体
本明細書の実施例２及び４は、ペルツズマブのアフコシル化変異体について記載し、組成物中のアフコシル化ペルツズマブのパーセンテージに基づいてＡＤＣＣ活性を決定する方法を実証するものである。
【０１０７】
一実施態様では、本発明は、ペルツズマブ及びペルツズマブのアフコシル化変異体を含む組成物に関し、ここでアフコシル化変異体の量は組成物の２％を上回る。例えば、以下の表９の抗２Ｃ４９０７-２、及びラン１参照。
【０１０８】
代替的一実施態様では、本発明は、アフコシル化変異体の量は組成物の０．９〜４．１％である、ペルツズマブ及びペルツズマブのアフコシル化変異体を含む組成物に関する。このアフコシル化変異体の量は、例えば、実施例４の検証済みＣＥ−ＬＩＦアッセイを用いて定量化することができる。
【０１０９】
任意選択的に、組成物は、不対システイン変異体（前セクションにおいて記載したヘテロダイマー及び／又はホモダイマー）及び／又は後述する追加の変異体を更に含む。
【０１１０】
（ｉｖ）ＬＭＷＳ及びＨＭＷＳ
本発明は更に、単離された形態の又は変異体及び主要種抗体を含む組成物の、ペルツズマブの低分子量種（ＬＭＷＳ）及び／又はペルツズマブの高分子量種（ＨＭＷＳ）に関する。ＬＭＷＳ及びＨＭＷＳは、限定しないが、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ-ＨＰＬＣ）、及び／又はキャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ−ＳＤＳ）を含む様々な技術を用いて単離、特徴付け、及び定量化することができる。
【０１１１】
ＳＥ−ＨＰＬＣアッセイ（例えば実施例５の）を用いると、組成物中の主要種ペルツズマブ、及びＨＭＷＳ又はＬＭＷＳの量は：
主要ピーク≧約９６％、例えば、≧約９６．７％、≧約９７．３％、例えば、≧約９７．４％。
ＨＭＷＳ：≦約２％、例えば、≦約１．７％、例えば、≦約１．５％、例えば≦約１．４％、例えば≦約０．８％。
ＬＭＷＳ：≦約２％、例えば、≦約１．６％、例えば、≦約１．２％、例えば≦約０．６％。
【０１１２】
ＮＲ−ＣＥ−ＳＤＳアッセイ（例えば実施例５の）を用いると、組成物中の主要種ペルツズマブ、及びＨＭＷＳ又はＬＭＷＳの量は：
主要ピーク≧約９５％、例えば、≧約９６．０％、例えば、≧約９７．８％。
ＨＭＷＳ：≦約１％、例えば≦約０．６％。
ＬＭＷＳ：≦約４％、例えば≦約３．４％。
【０１１３】
例えば、ＣＥ−ＳＤＳによって決定した場合の主要ピーク又は主要種ペルツズマブ（ＬＭＷＳ及びＨＭＷＳを除く）の量は、約９５％〜約９９％、例えば、約９６．０％〜約９７．８％、例えば約９５．３％〜約９７．３％主要ピークである。
【０１１４】
任意選択的に、ＬＭＷＳは、ＮＲ−ＣＥ−ＳＤＳによって取得される「ピーク  ６」を含む又はそのような「ピーク６」からなる（例えば実施例５参照）。このようなピーク６は、組成物の約０．９％〜約２．３％、例えば約２％〜約２．３％と決定される。
【０１１５】
（ｖ）ペルツズマブのピーク１及びピーク２断片
本発明は、更に、分離若しくは単離された形態の、又は断片及び主要種抗体を含む組成物の、ペルツズマブのピーク１断片及び／又はピーク２断片に関する。ピーク１及びピーク２は、限定しないが、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ-ＨＰＬＣ）、及び／又はＲ−ＣＥ−ＳＤＳ及びＮＲ−ＣＥ−ＳＤＳを含むキャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ−ＳＤＳ）を含む様々な技術を用いて単離、特徴付け、及び定量化することができる。一実施態様では、ピーク１及びピーク２は、例えば実施例５及び６に記載のように、Ｒ−ＣＥ−ＳＤＳによって分離及び／又は分析され、補正後ピーク面積（ＣＰＡ）により組成物中の％ピーク１又はピーク２が提供される。
【０１１６】
Ｒ−ＣＥ−ＳＤＳアッセイを使用すると（例えば実施例５及び６のように）、組成物中のピーク１の量は、≦５％（例えば０．１３％〜０．４１％のＣＰＡ）であり、組成物中のピーク２の量は≦１．０％（例えば０．４７％〜０．７４％のＣＰＡ）である。
【０１１７】
（ｖｉ）更なる変異体
本明細書において組成物は、任意選択的に、米国特許第７５６０１１１号（Ｋａｏら）及び／又は国際公開第２００９／０９９８２９号（Ｈａｒｒｉｓら）に記載されているものなどの、ペルツズマブの更なる変異体を含む。
【０１１８】
このような更なる変異体の例には、限定されないが、糖化変異体、ジスルフィド還元型変異体、非還元性変異体、脱アミド化変異体、シアル酸付加変異体、ＶＨＳ−変異体、Ｃ末端リジン変異体、メチオニン−酸化変異体、アフコシル化変異体、Ｇ１グリコシル化変異体、Ｇ２グリコシル化変異体、及び非グリコシル化重鎖変異体のうちのいずれか一つ又は複数が含まれる。
【０１１９】
例えば、組成物は、酸性変異体（国際公開第２００９／０９９８２９号、Ｈａｒｒｉｓら参照）を含み、ここで組成物中の酸性変異体は、糖化変異体、脱アミド化変異体、ジスルフィド還元型変異体、シアル酸付加変異体、及び非還元性変異体のうちの一つ、二つ、三つ、四つ、又は五つを含みうる。好ましくは、組成物中のすべての酸性変異体の量は、約２５％未満である。一実施態様では、糖化変異体、脱アミド化変異体、ジスルフィド還元型変異体、シアル酸付加変異体、及び非還元性変異体は、組成物中において酸性変異体の少なくとも約７５〜８０％を占める。
【０１２０】
酸性変異体は、多様な方法によって評価することができるが、好ましくは、そのような方法は、組成物がＩＥＣの前、後、及び／又は最中にシアリダーゼによって処理される（例えばシアル酸付加変異体を評価するため）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）、還元型ＣＥ−ＳＤＳ（例えばジスルフィド還元型変異体を評価するため）、非還元型ＣＥ−ＳＤＳ（例えば非還元性変異体を評価するため）、ボロネートクロマトグラフィー（例えば糖化変異体を評価するため）、及びペプチドマッピング（例えば脱アミド化変異体を評価するため）のうちの一つ、二つ、三つ、四つ、又は五つを含む。
【０１２１】
組成物は、任意選択的に、アミノ末端リーダー伸長変異体を含む。好ましくは、アミノ末端リーダー伸長は、抗体変異体の軽鎖上にある（例えば抗体変異体の一つ又は二つの軽鎖上）。本明細書において抗体変異体は、その重鎖又は軽鎖のいずれか一つ又は複数の上にアミノ末端リーダー伸長を含んでよい。好ましくは、アミノ末端リーダー伸長は、抗体の一つ又は二つの軽鎖上にある。アミノ末端リーダー伸長は、好ましくは、ＶＨＳ−（即ちＶＨＳ−変異体）を含むか、又はＶＨＳ−からなる。組成物中のアミノ末端リーダー伸長の存在は、様々な分析技術によって検出することができ、そのような技術には、限定されないが、Ｎ末端配列分析、電荷不均一性に関するアッセイ（例えば、陽イオン交換クロマトグラフィー又はキャピラリーゾーン電気泳動）、質量分析などが含まれる。組成物中の抗体変異体の量は、通常、変異体を検出するために用いられるいずれかのアッセイ（好ましくは陽イオン交換分析）の検出下限となる量から、主要種抗体の量未満の量にわたる。一般に、組成物中の抗体分子の約２０％以下（例えば約１％〜約１５％、例えば５％〜約１５％、好ましくは約８％〜約１２％）が、アミノ末端リーダー伸長を含む。このようなパーセンテージの量は、好ましくは、陽イオン交換分析を用いて決定される。
【０１２２】
主要種抗体及び／又は変異体の更なるアミノ酸配列変更が考慮され、それには、限定されないが、その一方又は両方の重鎖上にＣ末端リジン残基を含む（例えば抗体変異体が、約１％〜約２０％の量で存在する）抗体、一又は複数の酸化メチオニン残基を含む抗体（例えば、酸化したＭｅｔ−２５４を含むペルツズマブ）などが含まれる。
【０１２３】
更に、上述のアフコシル化変異体及びシアル酸付加変異体を別にして、主要種抗体又は変異体は更なるグリコシル化変異体を含むことができ、その非限定的な例には、そのＦｃ領域に結合したＧ１又はＧ２オリゴ糖構造を含む抗体、一つ又は二つの非グリコシル化重鎖を含む抗体などが含まれる。
【０１２４】
ＩＩＩ．製造及び分析方法
本発明の一実施態様によれば、ペルツズマブ組成物を評価するための方法が提供され、この方法は：（１）組成物中の不対システイン変異体の量を測定することであって、不対システイン変異体が、ペルツズマブの一方又は両方の可変軽ドメインにＣｙｓ２３／Ｃｙｓ８８不対システインを含む、測定すること、及び／又は（２）組成物中のアフコシル化ペルツズマブの量を測定すること、及び／又は（３）組成物中のペルツズマブの低分子量種（ＬＭＷＳ）の量を測定すること、及び／又は（４）組成物中のペルツズマブの高分子量種（ＨＭＷＳ）の量を測定することのうちの、一つ、二つ、三つ、又は四つを含む。任意選択的に、四つすべての分析アッセイが、ペルツズマブ及びその変異体を含む組成物に対して実行される。
【０１２５】
本発明は、組成物の作製方法にも関し、この方法は：（１）ペルツズマブ及びその一又は複数の変異体を含む組成物を製造すること、及び（２）そのように製造された組成物に、一又は複数の分析アッセイを行って、含まれる変異体の量を評価することを含む。分析アッセイは：（ｉ）ペルツズマブの一方又は両方の可変軽ドメイン中にＣｙｓ２３／Ｃｙｓ８８不対システインを含む不対システイン変異体、及び／又は（ｉｉ）ペルツズマブの一方の可変軽ドメインにのみＣｙｓ２３／Ｃｙｓ８８不対システインを含むヘテロダイマー変異体及び／又は（ｉｉｉ）ペルツズマブの両方の可変軽ドメインにＣｙｓ２３／Ｃｙｓ８８不対システインを含むホモダイマー変異体及び／又は（ｉｖ）ペルツズマブのアフコシル化変異体及び／又は（ｖ）ペルツズマブの高分子量種（ＨＭＷＳ）及び／又は（ｖｉ）ペルツズマブの低分子量種（ＬＭＷＳ）、及び／又は（ｖｉｉ）ペルツズマブのピーク１断片及び／又は（ｖｉｉｉ）ペルツズマブのピーク２断片のうちのいずれか一つ又は複数の量を評価及び定量化することができる。このようにして、これら変異体の一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、六つ、七つ、又は八つを分析することができる。
【０１２６】
任意選択的に、分析アッセイは、ヘテロダイマー及び／又はホモダイマー変異体を含む不対システイン変異体を、評価、定量化、又は単離する。例えば、分析アッセイには、抗体断片（例えばＦａｂ断片）又はインタクトな抗体（例えば実施例１参照）の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ペプチドマッピング分析（例えば実施例３参照）、又は逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（例えば実施例３参照）が含まれる。
【０１２７】
一実施態様では、組成物中の不対システイン変異体（ヘテロダイマー及び／又はホモダイマー変異体）の量は、Ｆａｂ疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって決定した場合、≦約２５％である。
【０１２８】
一実施態様では、組成物中のホモダイマー変異体の量は、インタクトな抗体の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって決定した場合、≦４．９％である。
【０１２９】
一実施態様では、組成物中のヘテロダイマー変異体の量は、インタクトな抗体の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって決定した場合、約１３％〜約１８％である。
【０１３０】
任意選択的に、分析アッセイは、アフコシル化変異体を評価、定量化、又は単離する。アフコシル化の量を使用して、組成物の生物活性、例えばＡＤＣＣを決定又は定量化することができる。
【０１３１】
加えて、本方法は、ペルツズマブ組成物の生物活性を評価することを含み、これは、組成物中のアフコシル化ペルツズマブ変異体の量を測定して、組成物の抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を決定すること、及びアフコシル化ペルツズマブの量が約０．９％〜約４．１％の範囲内であることを確認することを含む。例えば、本方法は、アフコシル化ペルツズマブの量を、キャピラリー電気泳動−レーザー誘起蛍光（ＣＥ−ＬＩＦ）を用いて測定することを含む。
【０１３２】
任意選択的に、アフコシル化を評価するための分析アッセイはキャピラリー電気泳動（ＣＥ）であり、これにはキャピラリー電気泳動−レーザー誘起蛍光（ＣＥ−ＬＩＦ）が含まれる。後述の実施例２及び４を参照。アフコシル化変異体の量は、任意選択的に、組成物の約０．９〜約４．１％である（例えば実施例４においてＣＥ−ＬＩＦによって測定した場合）。一実施態様では、アフコシル化変異体の量は、組成物の２％を上回っている（例えば実施例４においてＣＥ−ＬＩＦによって測定した場合）。
【０１３３】
任意選択的に、分析アッセイは、ペルツズマブの低分子量種（ＬＭＷＳ）及び／又は高分子量種（ＨＭＷＳ）を、評価、定量化又は単離する。例示的アッセイには、ＳＥ−ＨＰＬＣ及び／又はＣＥ−ＳＤＳ（例えば、後述の実施例５参照）が含まれる。
【０１３４】
一実施態様では、分析アッセイはＳＥ−ＨＰＬＣを含み（例えば実施例５において）、そのようにして分析される組成物中の主要種ペルツズマブ、ＨＭＷＳ又はＬＭＷＳの量は下記のように決定される：
主要ピーク≧約９６％、例えば、≧約９６．７％、≧約９７．３％、例えば、≧約９７．４％。
ＨＭＷＳ：≦約２％、例えば、≦約１．７％、例えば、≦約１．５％、例えば≦約１．４％、例えば≦約０．８％。
ＬＭＷＳ：≦約２％、例えば、≦約１．６％、例えば、≦約１．２％、例えば≦約０．６％。
【０１３５】
一実施態様では、分析アッセイはＣＥ−ＳＤＳ（例えば実施例５において）を含み、そのようにして分析される組成物中の主要種ペルツズマブ及びＨＭＷＳ又はＬＭＷＳペルツズマブの量は、下記のように決定される：
主要ピーク≧約９５％、例えば、≧約９６．０％、例えば、≧約９７．８％。
ＨＭＷＳ：≦約１％、例えば≦約０．６％。
ＬＭＷＳ：≦約４％、例えば≦約３．４％。
【０１３６】
一実施態様では、組成物がＮＲ−ＣＥ−ＳＤＳによって評価され、主要ピーク又は主要種ペルツズマブ（ＬＭＷＳ及びＨＭＷＳを除く）が、このようにして分析される組成物の約９５％〜約９９％、例えば、約９６．０％〜約９７．８％、例えば約９５．３％〜約９７．３％であることが分かる。
【０１３７】
一実施態様では、組成物中の「ピーク６」の量がＣＥ−ＳＤＳ（例えば実施例５参照）によって評価され、ピーク６ＬＭＷＳの量が、このようにして分析される組成物の約０．９％〜約２．３％、例えば約２％〜約２．３％と決定される。
【０１３８】
一実施態様では、組成物中のピーク１及び／又はピーク２の量がＲ−ＣＥ−ＳＤＳによって評価され（例えば実施例５及び６参照）、ピーク１の量が≦５％（例えば０．１３％〜０．４１％ＣＰＡ）であること、及びピーク２の量が≦１．０％（例えば０．４７％〜  ０．７４％ＣＰＡ）であることが決定される。
【０１３９】
本方法は、任意選択的に、精製された組成物を一又は複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて薬学的組成物を作製することを更に含む。加えて、薬学的組成物を、添付文書（例えばそのユーザに、がんを治療するために薬学的組成物を使用することを指示する処方情報を有する）と共に包装される容器内に入れて、製品をつくることができる。
【０１４０】
ＩＶ．薬学的組成物
ペルツズマブ及びその変異体を含む薬学的組成物は、所望の純度を有する組成物を、一般的に凍結乾燥製剤又は水溶液の形態の任意選択的な薬学的に許容される賦形剤（Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）と混合することにより、貯蔵用に調製される。抗体結晶も考慮される（米国特許出願公開第２００２／０１３６７１９号参照）。薬学的に許容される賦形剤は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、ヒスチジンアセテートのようなバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンといったタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖類；ナトリウムのような塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリソルベート（例えばポリソルベート２０又は８０）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【０１４１】
凍結乾燥させた抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号、米国特許第６６８５９４０号及び米国特許第６８２１５１５号に記載されており、これらは参照により本明細書に明示的に包含される。例示的なトラスツズマブの薬学的組成物は、無菌であり、白色から淡黄色の、静脈内（ＩＶ）投与を目的とした保存料を含まない凍結乾燥粉末であり、４４０ｍｇのトラスツズマブ、４００ｍｇのα，α−トレハロースデハイドレート、９．９ｍｇのＬ−ヒスチジン−ＨＣｌ、６．４ｍｇのＬ−ヒスチジン、及び１．８ｍｇのポリソルベート２０を含んでいる。１．１％のベンジルアルコールを保存料として含有する２０ｍＬの静菌性の注射用水（ＢＷＦＩ）の再構築により、２１ｍｇ／ｍＬのラスツズマブを含む複数回投与溶液（ｐＨ約６．０）が得られる。
【０１４２】
治療的使用のための例示的なペルツズマブの薬学的組成物は、２０ｍＭのヒスチジンアセテート、１２０ｍＭのスクロース、０．０２％のポリソルベート２０（ｐＨ６．０）中に、３０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブを含む。別のペルツズマブ製剤は、２５ｍｇ／ｍＬのペルツズマブ、１０ｍＭのヒスチジン−ＨＣｌバッファー、２４０ｍＭのスクロース、０．０２％のポリソルベート２０を含む（ｐＨ６．０）。
【０１４３】
インビボでの投与に使用される薬学的組成物は、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
【０１４４】
Ｖ．治療的用途及び使用
本明細書の組成物は、例えば転移性又は局所再発性の、切除不能な乳がん、又は新規のステージＩＶの疾患などの、ＨＥＲ２−陽性乳がんといったがんを治療するために使用することができ、免疫組織化学（ＩＨＣ）３＋及び／又は蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）増殖比≧２．０と定義される。任意選択的に、集団に含まれる患者は、治療歴を有さないか又はアジュバント療法後に再発している、ベースラインにおいて≧５０％の左室駆出分画率（ＬＶＥＦ）を有する、及び／又東部共同腫瘍学グループのパフォーマンスステータス（ＥＣＯＧ  ＰＳ）が０又は１である。
【０１４５】
別の実施態様では、組成物は、初期段階ＨＥＲ２−陽性乳がんを治療するために、例えばトラスツズマブ、及び化学療法と組み合わせて使用することができ、この場合化学療法は、アントラサイクリンベースの化学療法、又はカルボプラチンベースの化学療法を含む。一実施態様では、化学療法は、例えば５−ＦＵ、エピルビシン、及びシクロホスファミド（ＦＥＣ）を含む、アントラサイクリンベースの化学療法を含む。別の一実施態様では、化学療法は、例えばハーセプチン（登録商標）／トラスツズマブ（例えばＴＣＨレジメン）に加えてタキサン（例えばドセタキセル）、カルボプラチンを含む、カルボプラチンベースの化学療法を含む。一実施態様では、組成物は、アントラサイクリンベースの化学療法又はカルボプラチンベースの化学療法と同時に投与され、例えばここでペルツズマブ、トラスツズマブ及び化学療法は、３週のサイクルで投与され、ペルツズマブ、トラスツズマブ及び化学療法は各サイクルの１日目に投与される。本明細書において考慮される初期段階のＨＥＲ２−陽性乳がん療法には、ネオアジュバント及びアジュバント療法が含まれる。
【０１４６】
また別の実施態様では、組成物は、任意選択的にトラスツズマブ、並びにプラチン（例えばシスプラチン）及び／又はフルオロピリミジン（ｆｌｕｏｒｏｐｕｒｉｍｉｄｉｎｅ）（例えばカペシタビン及び／又は５−フルオロウラシル（５−ＦＵ））といった化学療法と組み合わせて、ＨＥＲ２−陽性胃がんを治療するために使用することができる。
【０１４７】
別の一実施態様では、組成物は、任意選択的にトラスツズマブ及びビノレルビンと組み合わせて、ＨＥＲ２陽性乳がんを治療するために使用することができる。この実施態様による乳がんは、転移性又は局所進行性であってもよい。患者は、転移性の状況で全身非ホルモン抗がん療法を受けたことがなくてもよい。
【０１４８】
別の一態様では、組成物は、患者のＨＥＲ２陽性乳がんを治療するために使用され、これには組成物、トラスツズマブ、及びアロマターゼ阻害剤（例えばアナストロゾール（ａｎａｓｔｒａｚｏｌｅ）又はレトロゾール）を患者に投与することが含まれる。この実施態様によれば、乳がんは、エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性及び／又はプロゲステロン受容体（ＰｇＲ）陽性乳がんといったホルモン受容体陽性乳がんを含む進行性乳癌がんである。患者は、転移性の状況で全身非ホルモン抗がん療法を受けたことがなくてもよい。この治療方法は、任意選択的に、導入化学療法（例えばタキサンを含む）を患者に投与することを更に含む。
【０１４９】
更なる態様では、組成物は、卵巣がん、原発性腹膜がん、又は卵管がんといった低ＨＥＲ３がんを治療するために使用される。例えば、米国特許第７９８１４１８号（Ａｍｌｅｒら）及び米国特許出願公開第２００６−００１３８１９−Ａ１号（Ｋｅｌｓｅｙ、Ｓ．）を参照されたい。
【０１５０】
抗体及び化学療法的治療は、既知の方法に従ってヒト患者に対して施される。特定の投与計画及び製剤を、本明細書の実施例に記載する。
【０１５１】
本発明の特定の一実施態様によれば、約８４０ｍｇ（負荷用量）のペルツズマブが、続いて約４２０ｍｇ（維持量）の単回又は複数回用量のペルツズマブが投与される。維持量は、好ましくは、約３週毎に、合計で少なくとも二回、臨床的に進行性の疾患、又は管理不能な毒性まで、例えば６〜２０回投与される。これ以上の治療サイクルを含む更に長い治療期間も考慮される。
【０１５２】
がんが胃がんである別の特定の実施態様によれば、ペルツズマブはすべての治療サイクルについて８４０ｍｇの用量で投与される。
【０１５３】
ＶＩ．製造品
本明細書において、製造品の一実施態様は、本明細書の組成物又は薬学的組成物を収容するバイアル、シリンジ、又は輸液（ＩＶ）バッグといった容器を含む。任意選択的に、製品は、本明細書の前セクションによる組成物の使用法を説明した処方情報を有する添付文書を更に含む。
【０１５４】
ＶＩＩ．生物学的物質の寄託
以下のハイブリドーマ細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA）（ＡＴＣＣ）に寄託されている：
2020015719.tif 000003
【０１５５】
本発明の更なる詳細は、以下の非限定的な実施例により説明される。本明細書中の全ての引用文献の開示内容は、参照により本明細書中に明示的に援用される。
【実施例】
【０１５６】
実施例１
ペルツズマブのＣｙｓ２３／Ｃｙｓ８８不対システイン変異体及びその特徴付け
ペルツズマブは、ヒトＩｇＧ１（κ）フレームワークに基づくヒト化モノクローナル抗体（ＭＡｂ）である。組換え抗体は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により生成され、鎖間及び鎖内ジスルフィド結合を有する二つの軽鎖（それぞれ２１４アミノ酸残基）と二つの重鎖（それぞれ４４９アミノ酸残基）とを含む。ペルツズマブの軽鎖及び重鎖配列を、それぞれ図３Ａ及び３Ｂに示す。インタクトなペルツズマブの計算された分子量は１４５１９７Ｄａである（ペプチド鎖のみ、重鎖Ｃ末端リジン残基は含まない）。
【０１５７】
また、各重鎖のＣＨ２ドメインは、Ａｓｎ２９９に単一の保存グリコシル化部位を有する。
【０１５８】
ペルツズマブは、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））とは、軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）（１２のアミノ酸の相違）、重鎖（２９のアミノ酸の相違）及びヒト上皮増殖因子受容体２（ｐ１８５ＨＥＲ２）上で異なるエピトープに結合するという事実において異なる。ヒト上皮細胞上におけるペルツズマブのＨＥＲ２受容体への結合は、ＨＥＲ２がＨＥＲ受容体ファミリーの他のメンバー（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４を含む）と複合体を形成すること、及びＨＥＲ２ホモダイマーを形成することを防止する。複合体の形成をブロックすることにより、ペルツズマブは、リガンドによって開始される、二つの主要なシグナル経路、即ちマイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ及びホスホイノシチド３-キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）を介した細胞内シグナル伝達を阻害する結果、それぞれ細胞の増殖及び生存を阻害する。
【０１５９】
この実施例は、ペルツズマブの不対システイン変異体、即ち抗体の一方又は両方の軽鎖に不対システインを含むＣｙｓ２３／Ｃｙｓ８８不対システイン変異体の同定及び特徴付けに関する。
【０１６０】
遊離スルフヒドリルをエルマン試薬を用いて測定したところ、タンパク質１モルあたり０．１〜０．３モルの無反応スルフヒドリル含有量が示された。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）分析及びペプチドマップ分析により、一方又は両方の軽鎖上のＣｙｓ２３及びＣｙｓ８８における不対システイン残基が明らかになった。パパインＨＩＣを使用して、これら部位における遊離スルフヒドリルを含むＦａｂ変異体のレベルが、商業的製造方法を用いて製造されたペルツズマブ材料中において１２．７％〜１３．５％であることが分かった。インタクトな抗体のＨＩＣ分析は、二つの主要な形態が７８％〜８５％の野生型ペルツズマブと、１３．４％〜１８．４％のペルツズマブヘテロダイマー（一のアーム上の不対システイン対）であることを示した。
【０１６１】
材料及び方法
試験された組成物：この実施例は、現行のペルツズマブの参照基準バッチ抗２Ｃ４９０７-２及び第ＩＩＩ相臨床材料であるラン１と、すべて商業的方法を用いて１２０００リットル（Ｌ）規模で生産された五つの第ＩＩＩ相／市販のバッチ（ラン３〜７）の特徴付けについて記載する。第Ｉ／ＩＩ相臨床材料である、以前の参照基準バッチ抗２Ｃ４-９００-１に対する比較も行われる。
【０１６２】
試験した組成物は、２０ｍＭのＬ-ヒスチジンアセテート、１２０ｍＭのスクロース、及び０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０（ｐＨ６．０）中、３０ｍｇ／ｍＬで市販の製剤に製剤化された製剤原料であった。バッチ抗２Ｃ４-９００-１は、臨床開発の初期において、１０ｍＭのＬ-ヒスチジンクロリド、２４０ｍＭのスクロース、及び０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０（ｐＨ６．０）中、２５ｍｇ／ｍＬで製剤化されたものであった。
【０１６３】
非還元型ペプチドマップ分析及び質量分析によるジスルフィド結合分析：非還元条件下でペルツズマブを変性させ、存在する遊離スルフヒドリル基をすべてアルキル化するために、製剤バッファー中約０．５ｍｇのペルツズマブを、変性バッファー（８ＭのＧｄＨＣｌ、１０ｍＭのＮ-エチルマレイミド（ＮＥＭ）、０．１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０））と混合し、次いで３７℃で３時間インキュベートした。この溶液を、ＮＡＰ-５カラムを用いて６００μＬの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２（ｐＨ７．０）にバッファー交換した。アセトニトリル（ＡＣＮ）を各試料に加え、濃度１０％に到達させた。トリプシン消化を、酵素：基質の比１：１０（ｗ／ｗ）において３７℃で１６時間実行した。結果として得られたペプチドを、亜硫酸分解トリプシンマップのための後述の方法を用いて、ＲＰ-ＨＰＬＣにより分離した。
【０１６４】
亜硫酸分解トリプシンマップ：ペルツズマブペプチドマップを生成するために、タンパク質を、システイン残基の還元及び亜硫酸分解後、消化した。ペルツズマブのアリコート（１ｍｇ）を、システイン残基の還元及び亜硫酸分解のために、３６０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、６Ｍの塩酸グアニジン（ＧｄＨＣｌ）、２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１３ｍＭの亜硫酸ナトリウム、及び３８ｍＭのテトラチオン酸ナトリウムに加えた。試料を３７℃で２０分間インキュベートした。亜硫酸分解した試料を、ＰＤ-１０カラムに充填し、１０ｍＭのＴｒｉｓ、０．１ｍＭのＣａＣｌ２（ｐＨ８．３）で溶出した。バッファー交換に続いて、２０μＬの１０％オクチル-Ｂ-グルコシド溶液及び２０μＬの１ｍｇ／ｍＬトリプシンを加えた。試料を、３７℃で５時間インキュベートした。消化反応を、２５μＬの１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）でクエンチした。結果として得られたペプチドを、Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＢ-Ｃ８カラム（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）を用いて、ＲＰ-ＨＰＬＣによって分離した。ペプチドを、５分間保持した後、溶媒Ｂを５７分で０％から１７％へ（直線勾配）、１４９分で溶媒Ｂ３２％、１６２分で溶媒Ｂ４５％、及び１７３分で溶媒Ｂ９５％という初期条件で分離した。１７９分において、カラムを２５分間１００％溶媒Ａに再調整し、総ランタイムは２０４分であった。溶媒Ａは水中０．１％のＴＦＡからなり、溶媒Ｂはアセトニトリル中０．０８％のＴＦＡからなっていた。カラムを３７℃に維持し、０．５ｍＬ／分の流速で溶出した。溶出プロファイルを２１４ｎｍ及び２８０ｎｍでモニターした。トリプシンペプチドの質量を、分離された消化混合物の、ＬＴＱ  ＯＲＢＩＴＲＡＰＴＭ質量分光計を用いた液体クロマトグラフィー-質量分光学（ＬＣ-ＭＳ）分析によって決定した。
【０１６５】
エルマン分析による遊離スルフヒドリル含有量：ペルツズマブ試料を、反応バッファー（１００ｍＭのリン酸カリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、８Ｍの尿素（ｐＨ８））にバッファー交換し、標準曲線の範囲内で遊離チオール濃度になるような濃度に調節した。ジチオニトロベンゼン（ＤＴＮＢ）の溶液（１０ｍＭ）及びシステイン標準曲線（０〜１００μＭに八ポイント）を、反応バッファー中において調製した。９６ウェルプレート上において、１６５μＬの試料又は標準を、３連ウェルに加えた。反応を、１０μＬのＤＴＮＢの付加により開始させ、次いで３０分間インキュベートした。インキュベーション後、吸光度を、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ  Ｍ２（登録商標）プレートリーダーを用いて４１２ｎｍで測定した。遊離チオールの濃度を、標準曲線から得られた一次方程式を用いて計算した。タンパク質の濃度を、分光光度計から得られた２８０ｎｍにおける吸光度を用いて決定した。遊離チオールは、ペルツズマブ１モル当たりの遊離チオールのモル数として報告される。
【０１６６】
パパインＨＩＣ：パパイン消化ペルツズマブ試料のために、試料を、カルボキシペプチダーゼＢ（ＣｐＢ）によりＣ末端リジンを除去した後、パパインにより消化した。Ｆａｂ及びＦｃドメインを、ポリプロピルアスパルトアミドカラム（４．６ｍｍ×１００ｍｍ、１５００Å、３μｍ）を用いたＨＩＣにより分離した。溶媒Ａは、１．６Ｍの硫酸アンモニウム、２０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ６．０５）からなり、溶媒Ｂは２０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ６．０５）からなっていた。被分析物を、３〜６分で０％〜１８％の勾配の溶媒Ｂ、２１分で２４％の溶媒Ｂで分離した。カラムを流速０．８ｍＬ／分で２５℃に維持した。溶出プロフィールを２８０ｎｍでモニターした。
【０１６７】
インタクトな抗体のＨＩＣ：インタクトなペルツズマブ試料を、ポリプロピルアスパルトアミドカラム（９．４ｍｍ×１００ｍｍ、１５００Å、３μｍ）を用いたＨＩＣにより分離した。溶媒Ａは１．０Ｍの硫酸アンモニウム、２０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ６．０５）からなり、溶媒Ｂは２０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ６．０５）からなっていた。被分析物を、１２％の溶媒Ｂを用いて２５分間均一濃度で分離した。カラムを流速２ｍＬ／分で３０°Ｃに維持した。溶出プロフィールを２８０ｎｍでモニターした。
【０１６８】
ペプチドマスフィンガープリンティングによるＳＤＳ−ＰＡＧＥ：還元及び非還元両方のペルツズマブ試料を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）により分析した。非還元試料について、試料（５μｇ）を、ヨードアセトアミドと共に、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ試料バッファーの存在下で５〜１０分間、６０±２℃で加熱することにより変性させた。試料を、８０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）存在下において、１５〜２０分間６０℃±２℃で還元した。変性した試料を、４％〜２０％のポリアクリルアミド勾配ゲル中で分離させ、ＳＹＰＲＯＴＭ  Ｒｕｂｙ色素で染色し、タンパク質バンドパターンを得た。ペルツズマブ試料と共に、分子量標準及びＳＹＰＲＯＴＭ  Ｒｕｂｙ−染色感度標準（２ｎｇ／レーン及び８ｎｇ／レーンのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を、ゲル上に含めた。
【０１６９】
ペプチドマスフィンガープリンティングは、タンパク質同定のための分析技術である。ゲルを１０μｇの市販の参照基準バッチ抗２Ｃ４９０７-２及びラン５に充填した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分離したすべてのバンドを、トリプシンによってペプチドに切断した。ペプチドの絶対質量は、ＢＲＵＫＥＲＴＭマトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）によって正確に測定される。ペプチド質量のリストを使用して、タンパク質配列を検索することによりタンパク質を同定した。非還元及び還元ペルツズマブの両方において観察されたすべてのバンドが、ペプチドマスフィンガープリンティングによって同定された。
【０１７０】
バイオアッセイによる力価：ペルツズマブ力価方法は、ヒトＨＥＲ２発現乳がん細胞株の増殖を阻害するその能力を測定することによりペルツズマブの力価を評価する。典型的なアッセイにおいて、９６ウェルマイクロタイタープレートに乳癌細胞を播種し、加湿したインキュベーター内でインキュベートした。インキュベーション後、培地を除去し、様々な濃度のペルツズマブ参照基準、アッセイコントロール、及び試料をプレートに加えた。次いでプレートをインキュベートし、生細胞の相対数を、酸化還元色素ＡＬＡＭＡＲＢＬＵＥ（登録商標）を用いて間接的に定量化した。５３０ｎｍでの励起及び５９０ｎｍでの放射を用いて蛍光度を測定した。ＡＬＡＭＡＲＢＬＵＥ（登録商標）は、酸化状態において青色で非蛍光性であるが、細胞の細胞内環境により還元されると蛍光性の高いピンク色の形態となる（Page et al. Int. J. Oncol. 3. 473-476 (1993)）。色及び蛍光度の変化は、生細胞の数に比例する。相対蛍光単位（ＲＦＵ）で発現した結果を、ペルツズマブ濃度に対してグラフ化し、平行線プログラムを用いて参照基準に対するペルツズマブ試料の抗-増殖活性を予測した。
【０１７１】
結果
ジスルフィド結合の割当て：ペルツズマブには３２のシステインが存在して１６のジスルフィド結合を形成しており、そのうち四つは鎖間の、１２は鎖内の結合である。しかしながら、分子の多量体の性質により、九つの異なるジスルフィド結合のみが存在する。天然タンパク質を、トリプシンで消化し、すべてのジスルフィド結合ペプチドの解放を達成した。ペルツズマブバッチのクロマトグラフィーによるプロフィールを図７に示す。市販の参照基準バッチ抗２Ｃ４９０７-２の消化の逆相ＬＣ-ＭＳ分析により、予測したジスルフィド結合ペプチド対のすべてが得られた（表２）。
【０１７２】
表２：ＬＣ−ＭＳにより同定されたジスルフィド結合ペプチド対
2020015719.tif 000004
【０１７３】
同定されたペプチドを、ジスルフィド還元時のぺプチド対から予測されるペプチドの同定により更に確認した（図８、並びに図９及び１０の拡大図）。重鎖ペプチドＴ１９Ｈのダイマー（Ｔ１９Ｈ＝Ｔ１９Ｈ）が、二つのジスルフィド結合を含むと同定された；Ｃｙｓ２２８＝Ｃｙｓ２２８及びＣｙｓ２３１＝Ｃｙｓ２３１対の同定が推察される。一つのジスルフィド対、Ｔ１８Ｈ＝Ｔ２０Ｌが、ＬＣ-ＭＳによって検出されたが、空隙用量の近くまで溶出され、紫外線（ＵＶ）クロマトグラム上の異なるピークとして同定可能ではなかった。このジスルフィド対の存在は、Ｌｙｓ−Ｃ消化のＬＣ-ＭＳ分析により更に確認され、ここでペプチドＴ１８Ｈ＝Ｔ１９Ｌ−Ｔ２０Ｌが観察された。不測の結合は見られなかった。一つのジスルフィド結合は、後述のように、部分的に不対であった。
【０１７４】
遊離スルフヒドリル分析：適切に折り畳まれたペルツズマブ内のすべてのシステイン残基はジスルフィド結合に関与しているはずである。ペプチド及びタンパク質の遊離スルフヒドリル含有量の測定方法であるエルマンのアッセイ（Ellman, G. Arch. Biochem. Biophys. 82 70-77 (1959)）を使用して、ペルツズマブ中に反応性の非修飾（遊離）チオールが存在するかどうかを決定した。すべての材料を、遊離チオール（不対システイン残基）含有量について評価した。結果は表３にまとめられている。
【０１７５】
表３：エルマンのアッセイによる遊離チオール含有量
2020015719.tif 000005
【０１７６】
ペルツズマブ１モル当たり約０．１〜０．３モルの遊離チオールが、分析したすべてのバッチに観察された。８Ｍの尿素の非存在下において、遊離チオールのレベルは、試験されたすべての材料において定量限界（ＱＬ；タンパク質１モル当たり約０．１モルの遊離チオール）未満であり、非変性条件下においてペルツズマブ分子中に存在する遊離チオール（即ち、不対システイン）は埋没しておりエルマン試薬に到達不能であることが示された。
【０１７７】
ＣｐＢ及びパパイン消化後のＨＩＣによるペルツズマブ材料の分析により、ＦｃピークとＦａｂピークの間の別のピークが明らかになり、このピークはＣｙｓ２３及びＣｙｓ８８に不対システイン残基を含有するＦａｂ変異体として同定された（図１１及び１２、遊離チオールＦａｂとして標識化）。この同定は、ＬＣ-ＭＳトリプシンペプチドマッピングにより確認され、ここで試料は、還元及びペプチド消化にの前にＮＥＭの存在下において変性を受けた。パパインＨＩＣ方法を用いた遊離チオールＦａｂ変異体の程度がペルツズマブバッチ全体にわたって測定され、現行プロセスを用いた場合との一貫性が見出された（表４）。
【０１７８】
表４：パパインＨＩＣによって決定されたＣｙｓ２３／Ｃｙｓ８８不対システインＦａｂ変異体又は計算されたインタクトな抗体変異体の相対量
2020015719.tif 000006
【０１７９】
パパインＨＩＣアッセイによれば、商業的プロセスを用いて製造された材料の値は１２．７％〜１３．５％にわたり、その一方参照基準バッチ２Ｃ４-９００-１（第Ｉ／ＩＩ相）の値はやや低く、９．４％であった。
【０１８０】
パパインＨＩＣに基づく％Ｆａｂ変異体から予測される％インタクト抗体変異体への変換：不対システインを含むＦａｂ断片の相対量を使用して、不対システイン変異体のヘテロダイマー又はホモダイマー形態の相対分布を計算することができる。パパインＨＩＣアッセイによって、ペルツズマブ由来のＦａｂ断片の１０％（又はｘ％）が不対システインをＣｙｓ２３／Ｃｙｓ８８に含むことが示される場合、パパインによる５０個の抗体の消化により１００個のＦａｂ断片が生じるはずであるため、５０個のペルツズマブ分子毎に放出される不対システインを含む１０個のＦａｂ断片が存在するはずである。これら１０個のＦａｂ断片が、１０個の異なるペルツズマブ分子由来であると仮定すると、Ｃｙｓ２３／Ｃｙｓ８８不対システインを有する一つのＦａｂを含む相対量のペルツズマブは、約２０％、即ち５０個のペルツズマブ分子のうち１０個（又は２ｘ％）である。具体的に、Ｃｙｓ２３／Ｃｙｓ８８不対システインを含む二つのＦａｂを有するペルツズマブの確率を考慮すると、ペルツズマブのヘテロダイマー不対システイン変異体の相対量は２×１０％×９０％＝１８％（又は２×ｘ％×［１００−ｘ］％）であるはずである。加えて、ペルツズマブのホモダイマーの不対システイン変異体の相対量は、１０％×１０％＝１％（又はｘ％×ｘ％）であるはずである。この場合、いずれのＦａｂにも不対システインを有さない２つのＦａｂを含むペルツズマブの相対量は、９０％×９０％＝８１％（又は［１００−ｘ］％×［１００−ｘ］％）であるはずである。
【０１８１】
加えて、野生型ホモダイマー（不対システインを有さない）及びヘテロダイマー（一つのＦａｂに不対システインを有する）は、ＨＩＣによって直接定量化することができる。インタクトな抗体のＨＩＣは、ペルツズマブを二つの主要なピークに分離し（図１３）、これらはＬＣ-ＭＳトリプシンペプチドマッピングによって野生型ホモダイマー（遊離チオールを有さない）及びヘテロダイマー（一つのＦａｂに遊離チオール対を有する）に同定された。小さな前部ショルダーピークも収集され、パパインＨＩＣによって主にホモダイマー（両方のＦａｂ上に遊離チオール対、約４０％）及びＦｃ酸化を有するペルツズマブと特徴付けられた。インタクトな抗体のＨＩＣを用いて、ペルツズマブは、現行プロセスを用いて製造される材料について約１７％〜１８％のヘテロダイマーを、第Ｉ／ＩＩ相プロセスを用いて製造される材料について同１３％を、それぞれ含むと予測された（表５）。いずれか一つの理論に縛られるものではないが、商業的プロセスによって製造される不対システイン変異体の増量（第Ｉ／ＩＩ相プロセスと比較して）は、チオール酸化（ジスルフィド形成）率より速く起こるタンパク質（即ちＶＬドメイン）のフォールディング率、従って変異体中の遊離システインのトラップに起因している可能性がある。
【０１８２】
表５：インタクトなペルツズマブのＨＩＣにより決定された
インタクトな不対システイン変異体の相対量
2020015719.tif 000007
【０１８３】
ＨＩＣによりペルツズマブの軽鎖上のＣｙｓ２３／Ｃｙｓ８８に不対システイン対が観察されたため、不対システイン変異体の各々の精製された画分を、抗増殖アッセイにおいて試験した。Ｆａｂを含む不対システインが精製され、力価の低下が予測された（予測された力価は天然Ｆａｂと比較して〜５０％であった）（表６）。
【０１８４】
表６：不対システインＦａｂ変異体の抗増殖
2020015719.tif 000008
【０１８５】
加えて、三つのインタクトな形態（野生型ホモダイマー、ヘテロダイマーを含む遊離チオール、及びホモダイマーを含む不対システイン）を、ＨＩＣによって単離し、抗増殖力価アッセイにより試験した。表７参照。
【０１８６】
表７：完全長ペルツズマブの抗増殖活性
不対システイン変異体画分
2020015719.tif 000009
【０１８７】
これらデータは、ペルツズマブの不対システイン変異体が、商業的規模で製造された組成物中に存在することを実証するものである。この実施例のＨＩＣ法（Ｆａｂ断片又はインタクトな抗体を評価する）又は後述の実施例３のペプチドマッピングは、ペルツズマブ組成物中の不対システイン変異体の存在及び量を評価するために使用できるアッセイである。
【０１８８】
実施例２
アフコシル化ペルツズマブ組成物及びその特徴付け
抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、細胞媒介性免疫の一面であり、これによりエフェクター細胞は能動的に、抗原特異性抗体に結合した標的細胞を溶解する。ペルツズマブは、ＨＥＲ２  ３＋細胞を用いて試験したときＡＤＣＣ活性を呈したが、ＨＥＲ２  １＋細胞の場合は活性は殆ど観察されなかった（図１４）。
【０１８９】
ペルツズマブの第Ｉ相及び第ＩＩＩ相の参照基準におけるアフコシル化のレベルを、キャピラリー電気泳動を用いて測定した。ペルツズマブ第ＩＩＩ相参照基準の高レベルのアフコシル化材料（Ｇ０-Ｆ＝２．２％）は、低いＧ０-Ｆ（０．８％）を有していた第Ｉ相参照基準と比較した場合に観察される、高いＡＤＣＣ活性と相関している（図１５）。また、酵素的に脱グリコシル化されたペルツズマブが調製され、試験されて、ＦｃγＲＩＩＩａに結合しないこと及びＡＤＣＣ活性を有さないことが示された（表８）。
【０１９０】
表８：脱グリコシル化ペルツズマブの生物活性
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【０１９１】
これらのデータは、Ｇ０−Ｆ（アフコシル化された）ペルツズマブを測定することが、ペルツズマブのＡＤＣＣ活性を定量化するための有効な手段であることを示している。アフコシル化を定量化するための実験は下記の通りである。
【０１９２】
キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によるオリゴ糖分析：ペルツズマブ試料（２５０〜５００μｇ）を、プロテインＡ固体相抽出アフィニティーチップ（ＰＨＹＴＩＰＳＴＭ）及び自動化液体ハンドリングしステムを用いて精製した。ペルツズマブ試料を、１２ｍＭの塩酸（ｐＨ２．０）を用いてプロテインＡ樹脂から溶出し、５０ｍＭのコハク酸ナトリウム１０μＬを用いて中和した。結果として得られた試料を、２．５Ｕ／ｍＬのＰＮＧａｓｅ  Ｆを用いて１５時間３７℃でインキュベートした。タンパク質を、溶液を９５℃で５分間加熱することにより沈殿させ、遠心分離により除去した。放出されたオリゴ糖を含む上清溶液を減圧乾燥した。放出されたグリカンを、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを含む１５％の酢酸溶液中において８-アミノピレン-１，２，６-トリスルホン酸（ＡＰＴＳ）を用いて５５℃で二時間誘導体化した。アルゴン−イオンレーザー（４８８ｎｍ励起、５２０ｎｍ放出）及びＮ-ＣＨＯコーティングキャピラリー（５０μｍ×５０ｃｍ）を用いる蛍光検出モジュールを備えたキャピラリー電気泳動（ＣＥ）システムを用いて、誘導体化したグリカンの分析を実行した。ランニングバッファーは、４０ｍＭのε−アミノ−ｎ−カプロン酸／酢酸（ｐＨ４．５）、０．２％のヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）であった。試料を、０．５ｐｓｉの圧力によりキャピラリーに注入した。分離を２０ｋＶで実行し、キャピラリーの温度を２０℃に維持した。
【０１９３】
ペルツズマブは、分子のＦｃ部分のＣＨ２ドメイン内においてＡｓｎ２９９にＮ-結合したオリゴ糖部位を含む。各バッチのこの部位に見られる中性オリゴ糖の相対分布は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆによる処理及びＡＰＴＳによる標識化の後でＣＥを使用して決定された。
【０１９４】
放出された誘導体化オリゴ糖のＣＥ分析に基づく電気泳動図を図１６に、拡大図のプロフィールを図１７に示す。分析した材料に関するペルツズマブ中のオリゴ糖の相対量は、表９にまとめられている。
【０１９５】
表９：ペルツズマブ中のオリゴ糖構造の分布（ピーク面積パーセント）
2020015719.tif 000011
【０１９６】
Ｇ０構造を有するオリゴ糖が、すべての材料において優占種である（６２％〜７５％）。Ｇ０グリコフォームは、現在の参照基準バッチ抗２Ｃ４９０７-２及びラン１（６２％〜６４％）と比較した場合、ラン３〜７及び直前の参照基準バッチ２Ｃ４-９００-１においてわずかに他より豊富であった（７０％〜７５％）。Ｇ１グリコフォームは、二分岐構造のいずれかの分枝上に末端ガラクトースを有する二つの異性体に対応する二つのピークとして観察された。これら二つのピークの面積を混合し、Ｇ１グリコフォームの相対量を決定した。Ｇ１及びＧ２グリコフォームは、すべての材料の放出オリゴ糖のそれぞれ約１８％〜２９％及び１％〜３％を占めている。電気泳動図には、他のオリゴ糖構造から生じるピークも観察された（すべて３％以下で存在）。これら構造は、Ｇ０-Ｆ（コアフコースを欠くＧ０）、Ｇ０-ＧｌｃＮＡｃ（一つのＧｌｃＮＡｃを欠くＧ０）、Ｍａｎ５、及び他の少数のグリコフォームを含む（Ma and Nashabeh Anal Chem 71:5185-92 (1999)）。ペルツズマブ上のオリゴ糖構造は、観察されたＣＨＯ由来のＭＡｂｓ（Ma and Nashabeh、上掲）及び天然に存在するヒト免疫グロブリンと一致していた（Flynn et al. Mol Immunol 47:2074-82 (2010)）。
【０１９７】
実施例３
不対システイン変異体を評価するためのペプチドマッピング及びＲＰ−ＨＰＬＣ
材料：実験に使用された材料及びデバイスは以下を含む：３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｎ−エチルマレイミド（ｄ０−ＮＥＭ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌ）、Ｎ−エチルマレイミド（ｄ５−ＮＥＭ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｎｄｏｖｅｒ、ＭＡ）、Ｌ−システイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ；Ｆｉｓｈｅｒ、Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ、ＮＪ）、アセトニトリル（ＡＣＮ、Ｂｕｒｄｉｃｋ  ＆  Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｍｕｓｋｅｇｏｎ、ＭＩ）。すべての化学物質及び試薬は、それ以上精製することなく受け取ったままの状態で使用した。
【０１９８】
抗体の差別的Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）標識：差別的ＮＥＭタグ付け法により、抗体中に既存の遊離チオールがｄ０−ＮＥＭでタグ付けされ、残りのジスルフィド架橋が還元されてｄ５−ＮＥＭでタグ付けされた。最初のｄ０−ＮＥＭタグ付けのために、１００μＬの抗体（３ｍｇ／ｍＬ）を、６．２５ｍＭのｄ０−ＮＥＭを含む４００μＬの変性バッファー（７．５Ｍ  ＧｄｎＨＣｌ、ｐＨ５）と穏やかに混合し、３７℃で２時間インキュベートした。２０μＬのシステイン（１２５ｍＭ）を試料に加え、３７℃で１５分間インキュベートして、残りのｄ０−ＮＥＭを不活性化した。抗体中の残りのジスルフィド架橋を還元するために、１０μＬのＴＣＥＰ（０．５Ｍ）を試料に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで７０μＬのｄ５−ＮＥＭ（１７１ｍＭ）を試料に加え、３７℃で２時間インキュベートして、還元型ジスルフィド架橋により生成された遊離チオールをタグ付けした。０．５ｍＬの差別的ＮＥＭでタグ付けした試料を、ＮＡＰ−５カラムを用いてバッファー交換し、０．６ｍＬのＭＯＰＳバッファー（２０ｍＭＭＯＰＳ、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰ（ｐＨ７））で溶出した。
【０１９９】
抗体のペプチドマップ分析：差別的ＮＥＭでタグ付けした試料を、トリプシン：抗体の比１：５０（ｗ／ｗ）でトリプシンを用いて３７℃で２時間消化した。消化を１０％ＴＦＡでクエンチした。トリプシンで消化した、差別的ＮＥＭでタグ付けした試料を、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いて分離した。孔径３００ÅのＪｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８カラム（２５０ｘ２ｍｍ、５μｍ）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）を、試料のクラマトグラフ分離のために使用した。注入体積は９５μＬであり、カラム温度は５５℃であった。移動相Ａは水中０．１％ＴＦＡであり、移動相Ｂは９０％ＡＣＮ（ｖ／ｖ）中０．０８％ＴＦＡであった。初期条件を、１００％移動相Ａに設定し、試料注入後最初の３分間維持した。移動相Ｂを、次の２０分間に１０％に増やし、次いで１６０分までに４０％、１６２分までに全体に線形勾配で１００％まで更に増やした。移動相Ｂを１７０分まで１００％に維持した。カラムは、１９５分までに１００％移動相Ａに再平衡化した。流速は０．２８ｍＬ／分に維持した。
【０２００】
ＨＰＬＣからの流出物は、陽イオンモードで動作するＬＴＱ  ＯＲＢＩＴＲＡＰＴＭ質量分光計のエレクトロスプレーイオン化源に直接接続された。スプレー電圧は４．５ｋＶであり、キャピラリー温度は３００℃であった。質量分光計は、データ依存性に動作して、ＭＳモードとＭＳ／ＭＳモードの間で自動的に切り替わった。調査のためのフルスキャンＭＳスペクトルが、分解能がｍ／ｚ４００でＲ＝６０，０００に設定されたＦＴ−Ｏｒｂｉｔｒａｐにおいて、ｍ／ｚ３００〜ｍ／ｚ２０００で取得された。五つの最も強力なイオンが、活性化時間３０ｍｓ及び単離幅２．５ｍ／ｚユニットを用いた３５％の正規化衝突エネルギーで、衝突誘起解離（ＣＩＤ）を用いた線形イオントラップにおいて断片化された。動的除外（ＤＥ）機能を有効にしてデータ冗長性を低減し、低強度イオンをデータ依存性ＭＳ／ＭＳスキャンのために選択することがを可能にした。動的除外パラメータは以下の通りであった：反復期間３０秒、除外リストサイズ５００、除外期間９０秒、低除外質量幅０．７６、高除外質量幅１．５６、及び反復カウント２。ＸＣＡＬＩＢＵＲＴＭを用いてデータ分析を実行した。
【０２０１】
現在のペルツズマブ参照基準バッチである抗２Ｃ４９０７-２を、上記方法を用いて分析した。１０．９％のＴ２Ｌペプチド（トリプシン消化によって生成され、Ｃｙｓ２３を含む）及び８．３％のＴ７Ｌペプチド（トリプシン消化によって生成され、Ｃｙｓ８８を含む）がｄ０−ＮＥＭでタグ付けされることが判明した。この実験では不対システインのみがｄ０−ＮＥＭでタグ付けされたことから、これらの結果は、抗２Ｃ４９０７−２の中で約１０％のＣｙｓ２３及びＣｙｓ８８がジスルフィド結合によって結合されないことを示唆していた（即ち、１０％の不対システイン変異体）。不対システインＦａｂ変異体パーセントを不対システインインタクト変異体パーセントに変換するために上記と類似の計算方法を使用して、抗２Ｃ４９０７−２の中で１８％のペルツズマブ分子がヘテロダイマー不対システイン変異体であり、１％のペルツズマブ分子がホモダイマー不対システイン変異体であり、８１％が野生型ホモダイマー形態（不対システインを含まない）であることが推定された。このような結果は、Ｆａｂ断片又はインタクトペルツズマブのＨＩＣ分析の結果と概ね一致する。
【０２０２】
制限エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ消化によるＦａｂの生成：ＭＡｂ  ＡのＦａｂ断片を、限定Ｌｙｓ−Ｃ消化手順により生成した。簡単に説明すると、ＭＡｂ  Ａ（１ｍｇ／ｍｌ）をＬｙｓ−Ｃ酵素と１：４００の比で１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）中において混合し、次いで混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。反応混合物を、ＮＥＭｉｎ（ｐＨ５．５）、３５０ｍＭの酢酸ナトリウム及び８ＭのグアニジンＨＣｌでタグ付けした。消化を、後述するＲＰ−ＨＰＬＣ法により分析した。
【０２０３】
ＲＰ−ＨＰＬＣ条件：ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を、バイナリーグラジエントポンプ、オートサンプラー、温度制御カラムコンパートメント、及びダイオードアレイ検出器を備えたＡＧＩＬＥＮＴ  １２００ＴＭ  ＨＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）で実行した。このシステムは、７５℃及び１ｍｌ／分で使用されるＰｕｒｓｕｉｔ  ３ジフェニル逆相カラム（１５０ｘ４．６ｍｍ、３μｍ、Ｖａｒｉａｎ、Ｌａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）を含んでいた。分離を、２８０ｎｍでの吸光度を用いてモニターした。移動相は、水中０．１％のＴＦＡ（移動相Ａ）及びＡＣＮ中０．０９％のＴＦＡ（移動相Ｂ）からなっていた。３８分法は、移動相Ｂ３２％から３６％への三分勾配で開始され、続いて移動相Ｂ４２％まで１８分の線形勾配が用いられた。カラムを９５％移動相Ｂで５分間洗浄し、３２％移動相Ｂで１０分間平衡化した。
【０２０４】
限定Ｌｙｓ−Ｃ消化（図１８）により生成された遊離チオールＦａｂのＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、遊離チオールＦａｂが約１３％であることが示唆され、これは実施例１のＨＩＣと一貫していた。このように溶出されて後に遊離チオールＦａｂ（図１８）と比較した、ＮＥＭタグ付けされた遊離チオールＦａｂの疎水性は比較的高くなり、遊離チオールの存在が更に確認された。ペプチドマッピングにより遊離チオールＦａｂが確認される図１９も参照されたい。
【０２０５】
実施例４
ＣＥ−ＬＩＦによるアフコシル化の定量化
この実施例は、アフコシル化ペルツズマブ変異体を定量化するための、十分に確認されたキャピラリー電気泳動−レーザー誘起蛍光（ＣＥ−ＬＩＦ）アッセイについて記載する。上記実施例２に開示された方法の修正例には：非ロボット試料調製、試料中の一定のタンパク質濃度を保証する非プロテインＡ精製工程、及び電気泳動的パラメータの変更（バッファー賦形剤濃度）が含まれる。
【０２０６】
アッセイにおいて、ペルツズマブ試料は、製剤バッファーを用いて１０ｍｇ／ｍＬに希釈され、ペプチド-Ｎ-グリカナーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）消化バッファーにバッファー交換される。すると、アスパラギン-結合オリゴ糖が、ＰＮＧａｓｅ  Ｆにより酵素的に解放される。解放されたグリカンは、その後、負に帯電したフルオロフォアである８-アミノピレン−１，３，６-トリスルホン酸（ＡＰＴＳ）により誘導体化される。ＡＰＴＳはすべてのグリカンに三の負電荷を供給し、これによりそれらの迅速な電気泳動分析が可能になる。過剰な誘導体化剤及びＡＰＴＳ-グリカンコンジュゲートを含有する混合物を、電気浸透流を低減するコーティングしたキャピラリーを用いるＣＥにより分析する。分離を、４８８ｎｍの励起波長及び５２０ｎｍの放出バンドパスフィルターを有するアルゴン−イオンレーザーを用いるレーザー誘起蛍光システムによりモニターする。
【０２０７】
アッセイを用いて、相関図を図２１に示す。相関図（％ＡＤＣＣ＝３０．１３３＋１２．４３９ｘ，ｘ＝％Ｇ０−Ｆ）及び４０〜１３５％のＡＤＣＣ範囲を用いると、ペルツズマブの最終スペックは０．９〜４．１％Ｇ０−Ｆに相当する。
【０２０８】
このように、確認されたこのＣＥ−ＬＩＦアッセイを用いると、ペルツズマブ組成物を評価することにより、ＡＤＣＣの観点から生物活性が所望の範囲内（４０〜１３５％のＡＤＣＣ活性＝０．９−４．１％のＧ０−Ｆ）であることが確認できる。
【０２０９】
実施例５
ペルツズマブ高分子量種（ＨＭＷＳ）、低分子量種（ＬＭＷＳ）とそれらの特徴付け
ペルツズマブを、ＳＥ-ＨＰＬＣ及びＣＥ−ＳＤＳにより分析し、分子量種（ＨＭＷＳ）、一般にはダイマーと、低分子量種（ＬＭＷＳ）の量を決定した。希釈時にＨＭＷＳに差異はなく、凝集物が非解離性であることが示唆された。分析超遠心（ＡＵＣ）とＳＥ-ＨＰＬＣの結果は、ＨＭＷＳ定量化の観点からよく一致しており、サイズ排除クロマトグラフィーの不測又は主要なＨＭＷＳの過小評価の証拠は示されなかった。
【０２１０】
材料及び方法
試験対象のペルツズマブ組成物：この実施例は、現行のペルツズマブの参照基準バッチ抗２Ｃ４９０７-２及び第ＩＩＩ相臨床材料であるラン１と、すべて商業的方法を用いて１２０００リットル（Ｌ）規模で生産された五つの第ＩＩＩ相／市販のバッチ（ラン３〜７）の特徴付けについて記載する。
【０２１１】
単離されたＨＭＷＳ：生物学的特徴付けに使用される代表的ＨＭＷＳを調製するために、ラン３のペルツズマブバッチを分取ＨＰＬＣシステムに、調製用ＳＥ-ＨＰＬＣカラム（ＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷ、２１．５ｍｍ×６００ｍｍ）及び上記と同じ均一濃度の移動相を用いて、４．５ｍＬ／分で注入した。高分子量種を分別捕集し、その後製剤バッファーにバッファー交換した。ＨＭＷＳは、続くＳＥ-ＨＰＬＣ分析により純度７０％を示し、残りは主に主要ピークであった。主要ピークも収集され、純度１００％を示した。
【０２１２】
単離されたＬＭＷＳ：単離されたＬＭＷＳを調製するために、ラン３のバッチ番号を、上述のように、パパインで消化し、分取ＨＰＬＣを用いて分別捕集した。優占的な形態は、インタクトなＥＳＩ-ＭＳ分析によりＦｃ及びＦａｂであることが確認された。ＬＭＷＳは、その後の分析的ＳＥ-ＨＰＬＣにより純度９９％を示した。また、単離されたＦａｂ変異体を、パパイン処理を用いて調製し、調製用ＩＥ-ＨＰＬＣにより収集した。Ｆａｂ変異体は、その後の分析的ＳＥ-ＨＰＬＣにより純度１００％を示した。
【０２１３】
ＳＥ−ＨＰＬＣ：ペルツズマブのアリコートを、移動相（０．２Ｍのリン酸カリウム（ｐＨ６．２）、０．２５Ｍの塩化カリウム）を用いて１０ｍｇ／ｍＬに希釈した。試料を、均一濃度に溶出されたＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（７．８ｍｍ×３００ｍｍ）上で分離した。流速は０．５ｍＬ／分であり、カラム温度は常温であった。溶出プロフィールを２８０ｎｍでモニターした。多角度光散乱（ＭＡＬＳ）による検出のために、ペルツズマブ試料を、ＷＹＡＴＴ  ＤＡＷＮ  ＨＥＬＥＯＴＭ  ＭＡＬＳ検出器（６５８ｎｍレーザー使用、１７の検出器）及びＷＹＡＴＴ  ＯＰＴＩＬＡＢＴＭレックス屈折率検出器にインライン接続された、二つの連続するカラムを用いて分離した。
【０２１４】
ＣＥ−ＳＤＳ各ペルツズマブバッチを、蛍光性染料である５  カルボキシテトラメチルローダミン  スクシニミジルエステルを用いて誘導体化した。ＮＡＰ-５カラムを用いて遊離染料を除去した後、非還元試料を、４０ｍＭのヨードアセトミドを付加し、７０℃で５分間加熱することにより調製した。還元試料の分析のために、誘導体化したペルツズマブを、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び１ＭのＤＴＴと、最終濃度１％のＳＤＳ（ｖ／ｖ）になるように混合した。次いで試料を、７０℃で２０分間加熱した。調製された試料を、分析中２０℃に維持された、内径５０μｍ×３１．２ｃｍの融合シリカキャピラリーを用いたＣＥシステム上で分析した。試料を、１０ｋＶで４０秒間の動電注入によりキャピラリーに導入した。分離を、ふるい媒体としてＣＥ-ＳＤＳランニングバッファーを用いる逆極性（負から正へ）モードにおいて、１５ｋＶの一定電圧で実行した。４８８ｎｍで動作するアルゴンイオンレーザーを、蛍光励起のために使用し、結果として得られる放出シグナルを５６０ｎｍでモニターした。
【０２１５】
結果と考察
ＳＥ-ＨＰＬＣは、天然タンパク質の分子サイズの分布に関する定量的情報を提供した。ペルツズマブバッチのＳＥ-ＨＰＬＣプロフィールを図２５に、プロフィールの拡大図を図２６に、それぞれ示す。サイズ除外ピークの相対ピーク面積の分布を表１０に示す。
【０２１６】
表１０：サイズ除外クロマトグラフィーによるペルツズマブの相対的サイズ分布
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【０２１７】
主要ピーク内のペルツズマブ溶出の割合は、すべての材料について９９％を上回った。高分子量種（ＨＭＷＳ）の量は、０．１％〜０．２％の範囲であり、低分子量種（ＬＭＷＳ）は≦０．１％であった。すべてのバッチは同様のクロマトグラフィープロフィールを示した。ダイマー及びそれよりも高い凝集物を含め、精製されたＨＭＷＳ画分は、参照基準バッチの抗２Ｃ４９０７−２に対して４６％の力価を有することが示された。
【０２１８】
ＳＥ-ＨＰＬＣを、３０℃に維持された希釈していない試料及び希釈した試料の両方に対して実行し、希釈及び／又は上昇した室温への曝露延長に起因しうる速く分解する凝集物及びゆっくり分解する凝集物の両方についてペルツズマブＨＭＷＳを試験した。希釈及び／又は加熱した参照基準バッチ抗２Ｃ４９０７-２のＨＭＷＳ含有量に、コントロールと比較して低減は見られなかった。
【０２１９】
参照基準バッチ抗２Ｃ４９０７-２に対するＭＡＬＳと組み合わせたＳＥ-ＨＰＬＣ分離の実行により、ＳＥ-ＨＰＬＣの主要ピークが分子量約１５０ｋＤａのモノマーであることが確認された。
【０２２０】
沈降速度モードでＡＵＣを使用して、ペルツズマブ試料中に存在するＨＭＷＳの特徴を明らかにした。沈降速度は、固体カラムマトリックスの非存在下において、試料中のＨＭＷＳのレベルを測定するサイズ排除クロマトグラフィーから独立した技術である。ＡＵＣを、ペルツズマブ試料に対してＨＭＷＳのレベルを上昇させながら実行し、ＳＥ-ＨＰＬＣが、沈降速度により決定される凝集物のレベル及び種をＳＥ-ＨＰＬＣにより決定される凝集物のレベル及び種と比較することにより、すべての主要なペルツズマブＨＭＷＳの検出を常に可能にするかを決定した。総ＨＭＷＳが０．２％〜７．２％の五つの試料（ＳＥ-ＨＰＬＣにより決定）を、沈降速度により特徴付け、表１１及び図２７のＡ〜Ｅに分類した。
【０２２１】
これら試料は、代表的ペルツズマブ製剤バッチ（Ａに分類）及び濃縮ＨＭＷＳの四つの試料からなっていた。濃縮ＨＭＷＳの試料は、幅広い劣化メカニズム（光への暴露、酸性ｐＨへの暴露、及び精製ＩＥ-ＨＰＬＣの基本的変異体）の代表となるように選ばれた。
【０２２２】
ＳＥ-ＨＰＬＣは、試料Ａ、Ｂ、Ｃ及びＥに一つの主要なＨＭＷＳピークを、試料Ｄに二つのＨＭＷＳピークを、それぞれ示す（図２７）。試料Ａ、Ｂ、Ｃ及びＥについて、ＡＵＣは、沈降係数約９．１ＳのＨＭＷＳピークを一つのみ示した。試料Ｄにおいて、ＡＵＣは、沈降係数約９．１Ｓ及び１０．８Ｓの二つのＨＭＷＳピークを示した。ＡＵＣによって検出されるＨＭＷＳは、ＳＥ-ＨＰＬＣの結果と一致している；両方法が、一つの主要な劣化生成物を示し、試料Ｄの大部分のＨＭＷＳのレベルは低い。
【０２２３】
二つの方法に基づくこれら試料の定量結果の比較を表１１に示す。
表１１：ＡＵＣ及びＳＥ−ＨＰＬＣの結果の比較
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【０２２４】
試料Ｃ、Ｄ、及びＥの場合、両方の技術により測定されるＨＭＷＳパーセントはよく一致している。試料Ａ及びＢ中に存在する低レベルのＨＭＷＳは、３．７％の予測定量化限界を有する（Gabrielson and Arthur, Methods 54:83-91 (2011)）ＡＵＣによる種の正確な定量化を妨げる。これは、ＳＥ-ＨＰＬＣとＡＵＣとのＨＭＷＳパーセントに見られる相違に反映される（表１１）。一定範囲のＨＭＷＳレベルにわたる相関を評価した。相関係数（Lin, L, Biometrics 45:255-68 (1989)）は０．９７（ｎ＝５）と計算され、ＨＭＷＳの定量化に関するＡＵＣとＳＥ-ＨＰＬＣの良好な合致が示唆された（図２８）。
【０２２５】
これら結果は、ＳＥ-ＨＰＬＣがペルツズマブのＨＭＷＳの測定においてロバストであることを確認する。ＳＥ-ＨＰＬＣは、ＡＵＣにより観察されるすべてのＨＭＷＳ種を検出し、正確に定量化することができる。
【０２２６】
ＳＥ-ＨＰＬＣ、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ，及びＣＥ-ＳＤＳにより分析された、サイズに基づく不均一性は、バッチを通して一貫していた。ＳＥ-ＨＰＬＣアッセイは、試験したすべてのバッチについて、同様のレベルのＨＭＷＳ（０．１％〜０．２％）及びＬＭＷＳ（０．０％〜０．１％）を示した。還元試料及び非還元試料のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析により明らかになったバンドパターンは、ＣＥ-ＳＤＳにより生成された電気泳動プロフィールと同様に、一貫していた。
【０２２７】
一実施態様では、ＳＥ−ＨＰＬＣによって評価された、主要種ペルツズマブ及びＨＭＷＳ変異体及びＬＭＷＳ変異体の量は、以下の通りである：
≧９６％の主要ピーク、例えば、≧９６．７％の主要ピーク、例えば、≧９７．３％の主要ピーク、例えば、≧９７．４％の主要ピーク。
≦２％のＨＭＷＳ、例えば、≦１．７％のＨＭＷＳ、例えば、≦１．５％のＨＭＷＳ、例えば、≦１．４％のＨＭＷＳ、例えば≦０．８％のＨＭＷＳ。
≦２％のＬＭＷＳ、例えば、≦１．６％のＭＷＳ、例えば、≦１．２％のＬＭＷＳ、例えば≦０．６％のＬＭＷＳ。
【０２２８】
ＳＥ-ＨＰＬＣによって精製されたペルツズマブのＨＭＷＳ及びＬＭＷＳ画分の両方は、主要ピーク及びコントロールと比較して低い抗増殖活性を呈し、これは十分に有効であった。すべてのサイズ変異体は、コントロールと比較して同等なＨＥＲ２結合活性及びＦｃＲｎ結合活性を示したが、但しＬＭＷＳだけは低いＦｃＲｎ結合を示した。ＬＭＷＳ試料は２／３のＦａｂ断片と１／３のＦｃ断片を含み、抗増殖及びＦｃＲｎ結合活性が低いことが予想される。ＨＭＷＳは高いＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６）Ｖ１５８結合活性を示したが、ＡＤＣＣ活性は低かった。ＬＭＷＳは低いＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６）Ｖ１５８結合活性を示したが、この変異体についてはＡＤＣＣ活性は観察されなかった（表１２）。
【０２２９】
表１２：ペルツズマブの主要ピーク、ＨＭＷＳ、及びＬＭＷＳの生物活性
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【０２３０】
キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ−ＳＤＳ）：レーザー誘起蛍光（ＬＩＦ）検出分析によるＣＥ-ＳＤＳは、変性条件下におけるタンパク質の分子サイズ分布を定量的に評価する手段を提供する高感度アッセイである。非還元試料のＣＥ-ＳＤＳ分析（図２９）において、ペルツズマブは、ＬＭＷＳ及びＨＭＷＳを表す小さなピークを伴う、合計ピーク面積９６％〜９８％からなる突出したピークとして移動した。この技術によって決定されたＨＭＷＳの量は、試験したすべての材料について０．６％であった。ＬＭＷＳとして移動した残りの種を図３０（拡大図）に示す。試料の加熱により誘起された断片化は、アルキル化により最小化された（Salas-Solano et al. Anal Chem 78:6583-6594 (2006)）。ＣＥ-ＳＤＳによって分離された種の相対分布を表１３に列挙する。
【０２３１】
表１３：ＣＥ-ＳＤＳによる非還元型ペルツズマブの相対分布（ピーク面積パーセント）
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【０２３２】
小さな差異が観察され、ピーク６は、参照基準バッチである抗２Ｃ４-９００-１における０．９％（第Ｉ／ＩＩ相プロセス）から参照基準バッチである抗２Ｃ４９０７-２、ラン１、及びラン３〜７の場合の１．７％〜２．３％へと増加していた。
【０２３３】
一実施態様では、ＮＲ−ＣＥ−ＳＤＳによって分離又は単離されたペルツズマブの主要ピーク（ＬＭＷＳ及びＨＭＷＳを含まない）は、約９５％〜約９９％、例えば約９６．０％〜約９７．８％である。任意選択的に、ＣＥ−ＳＤＳによって分離又は単離されたＨＭＷＳの量は、≦１％、例えば≦０．６％であり、ＬＭＷＳの量は≦４％、例えば≦３．４％である。 
【０２３４】
実施例６
ペルツズマブ断片化の検出及び定量化
この実施例の目的は、ペルツズマブ断片検出のための、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）、還元型キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム（Ｒ−ＣＥ−ＳＤＳ）、及び非還元型ＣＥ−ＳＤＳ（ＮＲ−ＣＥ−ＳＤＳ）法を評価することである。
【０２３５】
材料及び方法 
この試験において評価される試料を下記にまとめる。これらは、断片化の増大を引き起こすと思われる種々のストレス条件に暴露されたペルツズマブ試料を含む。
・参照基準（２Ｃ４９０７−２）
・熱的ストレス（４２日間、４０℃）
・酸処理（ｐＨ３．２、１日間、４０℃）
・加速安定性（４０℃で３０日、次いで約５℃で貯蔵）
・実時間製剤（ＤＰ）安定性（Ｔ＝０及びＴ＝５４８日及び約５℃での貯蔵）及び対応する製剤原料（ＤＳ）
【０２３６】
ＳＥ−ＨＰＬＣを、上記実施例５のように実行し、以下の報告可能な値を得た：ＬＭＷＳ、主要ピーク、ＨＭＷＳ、及び定量限界（ＬＯＱ）を超えた上記他のすべての有意なピーク。
【０２３７】
還元型ＣＥ−ＳＤＳ（Ｒ−ＣＥ−ＳＤＳ）を、上記実施例５に従って実行し、次のような報告可能な値を得た：ピーク１、ＬＣ、ピーク２、ピーク３、ＮＧＨＣ、ＨＣ、ピーク５、Ｉｎｃ．Ｒｅｄ．、及びＬＯＱを超える他の有意なピーク。
【０２３８】
非還元型ＣＥ−ＳＤＳ（ＮＲ−ＣＥ−ＣＤＳ）を、上記実施例５のようにして、抗体還元工程を除く試料調製により実行し、ＳＤＳ複合体形成工程からジチオスレイトール（ＤＴＴ）を除外することにより非還元型分析を可能にした。
【０２３９】
ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＮＲ−ＣＥ−ＳＤＳ、及びＲ−ＣＥ−ＳＤＳにより得られる定性的結果を、それぞれ図３１Ａ〜Ｂ、図３２Ａ〜Ｂ、及び図３３Ａ〜Ｂと、それぞれ表１４、１５、及び１６に示す。
【０２４０】
ピークの同定は、Hunt & Nashabeh Analytical Chemistry 71: 2390-2397 (1999), 及びMa & Nashabeh Chromatographia Supplement 53: S75-S89 (2001)に基づく。ＮＲ−ＣＥ−ＳＤＳ分析のために、ピーク２後の小さなピークが、典型的にはデータ報告の間のピーク２の一部として含まれる。この試験のために、この小さなピークはピーク２ａとして別途報告され、断片と軽鎖（ＬＣ）を差別化する。
【０２４１】
表１４：ＳＥ−ＨＰＬＣ定量的データ（ピーク面積％）
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【０２４２】
表１５：ＮＲ−ＣＥ−ＳＤＳ定量的データ（ＣＰＡ％）
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【０２４３】
表１６：Ｒ−ＣＥ−ＳＤＳ定性的データ（ＣＰＡ％）
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【０２４４】
データ評価：関連断片のピーク面積パーセント（又はＣＥ−ＳＤＳのための、修正ピーク面積パーセント（ＣＰＡ％））を比較して、ＣＥ−ＳＤＳ法のいずれかがＳＥ−ＨＰＬＣと比較して非冗長情報を提供するかどうかを決定する。関連断片は、未知の構造を有するピーク、又はポリペプチド鎖の切断から得られる生成物を含むことが既知であるピークを含む。これら断片は、抗体生成物中に存在してＣＥ−ＳＤＳにより一般的に観察される、解離性の非ジスルフィド結合した重鎖及び／又は軽鎖断片とは別個である。断片のピークは、高感度な検出と、正確な定量化を可能にするために、他のピークから分離されなければならない。
【０２４５】
小断片の検出能：小断片は、Ｒ−ＣＥ−ＳＤＳ及びＮＲ−ＣＥ−ＳＤＳ分析の両方で観察することができ、両アッセイにおいてピーク１と命名されている。これらピークは同じ一般的形状及び移動時間を保持し、両アッセイにおいてストレス条件下で同様に上昇する。したがって、ピーク１は、両アッセイにおいて同じ種を含むと推定される。両ＣＥ−ＳＤＳアッセイは、表１７に注記したように、同じ断片を検出することができる。
【０２４６】
酸加水分解により生成された断片の検出能（酸クリップ）：長時間にわたる酸性条件への暴露は、特に、２９０３９Ｄａ（ＨＣ  １−２７２）及び２１５１３Ｄａ（ＨＣ  ２７３−４４８、Ｇ０グリカン）の質量を示す酸処理試料の質量分光分析によりサポートされるように、Ａｓｐ−Ｐｒｏ配列（ペルツズマブ重鎖残基２７２〜２７３）に断片を生成しうる。これら形態の理論的質量は、それぞれ２９０３１Ｄａ及び２１５１０Ｄａである。これら形態の予想される移動時間に基づき、対応するピークは、酸処理試料の還元型ＣＥ−ＳＤＳ分析において明瞭に見ることができる（ピーク２、図３４）が、非還元型アッセイでは更に低いレベルで検出される（低シグナル）。ＩＮＲ−ＣＥ−ＳＤＳアッセイではピーク２の断片は恐らくはジスルフィド結合しており、したがって検出されないと仮定することができる。酸処理試料においてＲ−ＣＥ−ＳＤＳにより検出されるピーク２のレベル（５．５８％）が、この試料についてＳＥ−ＨＰＬＣにより検出されるＬＭＷＳの合計（０．２６％）を超過していることがら、ＳＥ−ＨＰＬＣもこれら形態の検出には不十分であると結論付けることができる。したがって、還元型ＣＥ−ＳＤＳアッセイは、表１７に示されるように、酸加水分解の結果として生じる断片化を検出することができる、本明細書において提示される唯一のアッセイである。
【０２４７】
Ｆａｂ／ＤｅｓＦａｂ断片の検出能：ＳＥ−ＨＰＬＣにより検出されるＬＭＷＳと、非還元型ＣＥ−ＳＤＳアッセイからのピーク３との間には、良好な線形相関がある（ｒ２＝０．９７）（図３５）。ＬＭＷＳは、酵素的に生成されたＦａｂを用いた共溶出の研究により、Ｆａｂ断片を含有していると同定された。同様に、ＮＲ−ＣＥ−ＳＤＳアッセイにおけるピーク３及びピーク５は、それぞれ酵素的に生成されたＦａｂ及びＤｅｓＦａｂを用いた共移動の研究により、同定された（Ｍａ  ＆  Ｎａｓｈａｂｅｈ、上掲）。ｄｅｓＦａｂのピークは、Ｆａｂ形態を生成する重鎖切断から生じ、したがって、Ｆａｂ断片に対して等価なモル量（２：１の質量比に対応）にあり、よって表１７に示すように、この形態に関する情報も、ＳＥ−ＨＰＬＣにより間接的に取得できると仮定される。
【０２４８】
表１７：ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＮＲ−ＣＥ−ＳＤＳ、及びＲ−ＣＥ−ＳＤＳによる断片の検出能
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【０２４９】
還元型ＣＥ−ＳＤＳのピーク３：Ｒ−ＣＥ−ＳＤＳのピーク３は、ペルツズマブに固有であり、他の抗体のＣＥ−ＳＤＳ分析では観察されなかった。更なる特徴付けにより、ピーク３が生成物変異体又は不純物ではなく、方法により誘起された、ＬＣ−ＬＣダイマーの分離可能形態からなるペルツズマブに特異的なアーチファクトであるという結論が支持される。複数の技術を用いてピーク３の特徴を明らかにした。
ピーク３は、ＵＶ及びＬＩＦ検出を用いたＲ−ＣＥ−ＳＤＳにより観察され、染料による標識又は試料調製アーチファクトでないことが示唆される。
Ｒ−ＣＥ−ＳＤＳによる分析時、精製されたペルツズマブの軽鎖画分は、ＬＣの理論的サイズの約２倍の明らかなＭＷを有するピーク３を生成する。
ピーク３は、電気泳動条件に高いキャピラリー温度が含まれるときは観察されず、このような条件下では他のどのような共移動断片も観察されない。
単一のアミノ酸変異体を含む研究は、ＬＣ−ＬＣダイマー形成に相関するＬＣ  ＣＤＲ１及びＣＤＲ２内の三つのアミノ酸残基を同定した。これら三つの残基のいずれかが別のアミノ酸により置換されると、ピーク３は完全に分離し、もはや還元型ＣＥ−ＳＤＳによっては観察されない。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦタンパク質質量フィンガープリンティング（ＰＭＦ）に連結したＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ペルツズマブに宿主細胞タンパク質が存在せず、類似のバンドもＣＥ−ＳＤＳによって観察されるレベルでは検出されないことが確認された。
つまり、これら結果は、方法により誘起された、ペルツズマブに特異的なＬＣ−ＬＣダイマーとしてピーク３が同定されることを支持するものである。
【０２５０】
考察
本試験から得られたデータの評価は以下を示す：
（１）ＮＲ−ＣＥ−ＳＤＳは、断片の検出についてＳＥ−ＨＰＬＣと比較した場合、非冗長の情報を提供する。
（２）（ＳＥ−ＨＰＬＣと比較したとき）ＮＲ−ＣＥ−ＳＤＳ法によって得られる非冗長の断片化情報は、Ｒ−ＣＥ−ＳＤＳ法を使用しても得られる。
表１６に示すように、還元型アッセイにより、製剤原料の製造中に起こりうる低ｐＨへの暴露に起因する切断生成物が検出された。表１８は、ペルツズマブ参照基準、第ＩＩＩ相材料（ｎ＝３）、及び商業的製造プロセスを用いて製造されたバッチ（ｎ＝３９）に関する還元型ＣＥ−ＳＤＳのピーク１及びピーク２について得られる値を含む。ｋ値３．２を用いて、９５／９９の許容差（ＴＩ）がピーク１及びピーク２について計算され、表１８に示されている。ピーク１の９５／９９許容差は０．０〜０．４％ＣＰＡである。ピーク２の９５／９９許容差は０．３〜０．９％ＣＰＡである。
【０２５１】
表１８：試験した４３バッチに関するＲ−ＣＥ−ＳＤＳ定量的データ（ＣＰＡ％）
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【０２５２】
ここでは、製剤原料リリース時ピーク１≦０．５％及びピーク２≦１．０％という最終的な許容基準が選択される。
【０２５３】
ペルツズマブ製剤原料が冷凍保存される場合、ＤＳ安定性に予測される変化はない。加えて、Ｔ＝０及びＴ５４８ｄの両方において製剤について得られたＲ−ＣＥ−ＳＤＳデータによれば（表１９）、名前を挙げる種のいずれについても有意な変化は観察されなかった。
【０２５４】
表１９：ＤＰ安定性試料のＲ−ＣＥ−ＳＤＳの定量的データ（ＣＰＡ％）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
2020015719000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月9日(2019.8.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
2020015719000001.pdf