(57)【要約】      （修正有）【課題】アジュバント添加物を含む免疫原性組成物の提供。【解決手段】アジュバント添加物は、特定のアミノ酸配列を有する受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）及び／又はシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）タンパク質を含む。免疫原は、特定のアミノ酸配列を有するブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む。前記アジュバント添加物を含む免疫原性組成物は、宿主における抗体免疫応答および細胞性免疫応答を増強するために使用され得る。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原；および
アジュバント添加物
を含む免疫原性組成物であって、
前記アジュバント添加物は、配列番号１のアミノ酸配列を有する受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）およびシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）タンパク質からなる群から選択される少なくとも１つを含む、免疫原性組成物。
【請求項２】
標的ペプチドを含む前記ＰＥタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記ＰＥタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記ＰＥタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記免疫原は、配列番号５のアミノ酸配列を有するブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記ＰＣＶ２  ＶＬＰと前記アジュバント添加物との重量比は、１：０．５である、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記ＰＣＶ２  ＶＬＰと前記アジュバント添加物との重量比は、１：１である、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記ＰＣＶ２  ＶＬＰと前記アジュバント添加物との重量比は、１：２である、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記ＰＣＶ２  ＶＬＰの濃度は、約３μｇ／用量である、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記アジュバント添加物の濃度は、約３μｇ／用量である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
宿主における免疫応答の増強方法であって、前記免疫原に対する抗体免疫応答および／または細胞性免疫応答を増強するために、請求項１に記載の免疫原性組成物で前記宿主にワクチン接種することを含む、宿主における免疫応答の増強方法。
【請求項１２】
前記宿主は、少なくとも３週間前に前記免疫原性組成物の用量を投与することにより、ワクチン接種される、請求項１１に記載の宿主における免疫応答の増強方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、免疫原性組成物に関し、特に、アジュバント添加物を含む免疫原性組成物の使用による、宿主における免疫応答の増強方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、免疫原性組成物は、免疫原、アジュバント、および賦形剤を含む。免疫原は、免疫応答を引き起こす物質を含む。免疫原は、ペプチド、タンパク質、または多糖類さえも含み得る。しかしながら、免疫原性組成物中の他の成分が、当該免疫原性組成物の免疫原性効果に影響を及ぼす可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、本開示は、宿主における抗体免疫応答および／または細胞性免疫応答を増強するために使用され得、かつ免疫原に対する十分な免疫保護を与え得る、アジュバント添加物を含む免疫原性組成物に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示のいくつかの実施形態によれば、免疫原性組成物が提供される。前記免疫原性組成物は、免疫原およびアジュバント添加物を含む。前記アジュバント添加物は、配列番号１のアミノ酸配列を有する受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）および／またはシュードモナス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａ（ＰＥ）タンパク質を含む。
【０００５】
上記の実施形態では、標的ペプチドを含む前記ＰＥタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。
【０００６】
上記の実施形態では、前記ＰＥタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を有する。
【０００７】
上記の実施形態では、前記ＰＥタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を有する。
【０００８】
上記の実施形態では、前記免疫原は、配列番号５のアミノ酸配列を有するブタサーコウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ  ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ）２型（ＰＣＶ２）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む。
【０００９】
上記の実施形態では、前記ＰＣＶ２  ＶＬＰと前記アジュバント添加物との重量比は、１：０．５である。
【００１０】
上記の実施形態では、前記ＰＣＶ２  ＶＬＰと前記アジュバント添加物との重量比は、１：１である。
【００１１】
上記の実施形態では、前記ＰＣＶ２  ＶＬＰと前記アジュバント添加物との重量比は、１：２である。
【００１２】
上記の実施形態では、前記ＰＣＶ２  ＶＬＰの濃度は、約３μｇ／用量である。
【００１３】
上記の実施形態では、前記アジュバント添加物の濃度は、約３μｇ／用量である。
【００１４】
本開示の別の実施形態では、宿主における免疫応答の増強方法が記載される。前記方法は、前記免疫原に対する抗体免疫応答および／または細胞性免疫応答を増強するために、上述した免疫原性組成物で前記宿主にワクチン接種することを含む。
【００１５】
上記の実施形態では、前記宿主は、少なくとも３週間前に前記免疫原性組成物の用量を投与することにより、ワクチン接種される。
【発明の効果】
【００１６】
上記に基づいて、本発明は、アジュバント添加物を含む免疫原性組成物を提供する。前記アジュバント添加物は、配列番号１のアミノ酸配列を有する受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）および／またはシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）タンパク質を含む。本開示のアジュバント添加物をワクチン接種用のワクチン組成物に添加することにより、全身性抗体免疫応答および／または細胞性免疫応答が首尾よく誘導および増強され得、したがって免疫原に対する十分な免疫保護を与える。
【００１７】
上記をより理解しやすくするために、図面を伴ういくつかの実施形態が以下に詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
添付の図面は、本開示のさらなる理解を提供するために含まれ、本明細書に組み込まれ、その一部を構成する。図面は、本開示の例示的な実施形態を示し、説明とともに、本開示の原理を説明するのに役立つ。
【図１】実施例１の異なる試験群について、マウスにおけるＰＣＶ２抗体の存在を検出するためのＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【図２】実施例１の異なる試験群について、マウスにおけるＣＤ３＋／ＩＮＦ−γＴ細胞の数を検出するためのフローサイトメトリーの結果を示す図である（図２Ａおよび図２Ｂ）。
【図３】実施例２の異なる試験群について、マウスにおけるＣＤ３＋／ＩＮＦ−γＴ細胞の数を検出するためのフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
現在、免疫原、受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）およびシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）を含む１つの融合タンパク質が、抗原提示細胞またはＣＤ９１に結合することにより、病原体抗原特異的なＴ細胞免疫応答を誘導することができる。しかしながら、ＲＡＰおよびＰＥを含む融合タンパク質の調製は、ワクチン開発の難しさを高めるだけでなく、ＲＡＰおよびＰＥの適用可能性も制限する。
【００２０】
本開示は、宿主における免疫応答を増強するためのアジュバント添加物を含む免疫原性組成物に関する。いくつかの例示的な実施形態では、アジュバント添加物は、配列番号１のアミノ酸配列を有する受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）および／またはシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）タンパク質を少なくとも含み得る。
【００２１】
受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）は、低密度リポタンパク質受容体ファミリーのメンバー、例えば、分化抗原群９１（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ９１、ＣＤ９１）としても知られる低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）に強く結合するアンタゴニストおよび分子シャペロンである。
【００２２】
シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）タンパク質は、この細菌の最も毒性の高い病原性因子である。ＰＥタンパク質は、Ｉａドメイン（アミノ酸配列１〜２５２）、ＩＩドメイン（アミノ酸２５３〜３６４）、Ｉｂドメイン（アミノ酸配列３６５〜４０４）およびＩＩＩドメイン（アミノ酸配列４０５〜６１３）に分けることができる。いくつかの実施形態では、ＰＥタンパク質のアミノ酸配列１〜４０７（ＰＥ４０７）は、アジュバント添加物の一部として使用され、配列番号３のアミノ酸配列を有し得る。しかしながら、本開示はそれに限定されない。特定の実施形態では、ＰＥ４０７のＣ末端に融合された標的ペプチドは、アジュバント添加物の一部として使用され、配列番号２のアミノ酸配列を有し得る。例えば、ＫＤＥＬＫＤＥＬＫＤＥＬを含む標的ペプチド（Ｋ３と呼ばれる）は、ＰＥ４０７のＣ末端に融合され得る（ＰＥ４０７−Ｋ３）。他のタイプの標的ペプチドは、実際の要件に基づいて選択および使用され得る。いくつかの実施形態では、ＰＥタンパク質のアミノ酸配列１〜２５２（ＰＥ２５２）がアジュバント添加物の一部として使用され、配列番号４のアミノ酸配列を有し得る。
【００２３】
いくつかの例示的な実施形態では、免疫原性組成物は、上述した免疫原およびアジュバント添加物を少なくとも含み得る。例えば、免疫原は、配列番号５のアミノ酸配列を有するブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含み得る。しかしながら、本開示はそれに限定されない。既知の最小の動物ウイルスであるブタサーコウイルス（ＰＣＶ）は、ＰＣＶ１およびＰＣＶ２を含む。ＰＣＶ２は、離乳後多臓器性発育不良症候群（ｐｏｓｔ−ｗｅａｎｉｎｇ  ｍｕｌｔｉ−ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｗａｓｔｉｎｇ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＰＭＷＳ）を患っているブタから分離された。ＰＣＶ２関連疾患は、最も重大かつ経済的に重要な（ｍｏｓｔ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ａｎｄ  ｅｃｏｎｏｍｉｃａｌｌｙ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）ブタ疾患の１つになった。
【００２４】
例示的な一実施形態では、ＰＣＶ２  ＶＬＰとアジュバント添加物との重量比は、１：０．５である。いくつかの実施形態では、ＰＣＶ２  ＶＬＰとアジュバント添加物との重量比は、１：１である。特定の実施形態では、ＰＣＶ２  ＶＬＰとアジュバント添加物との重量比は、１：２である。そのような範囲でＰＣＶ２  ＶＬＰとアジュバント添加物との比率を調整することにより、ＰＣＶ２  ＶＬＰに対する十分な抗体免疫応答および／または細胞性免疫応答が確保され得る。
【００２５】
例示的な一実施形態では、免疫原性組成物において、ＰＣＶ２  ＶＬＰの濃度は約３μｇ／用量である。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物において、アジュバント添加物の濃度は約３μｇ／用量である。
【００２６】
更に、免疫原性組成物において、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ウイルス構造タンパク質から組み立てられてもよく、遺伝物質を一切含まない。換言すれば、ＰＣＶ２  ＶＬＰは非感染性であり、不活化された感染性ウイルスの安全な代替品であり得る。例示的な一実施形態では、ＰＣＶ２  ＶＬＰは配列番号５のアミノ酸配列を有する。しかしながら、本開示はそれに限定されない。例えば、他のアミノ酸配列を有するＰＣＶ２  ＶＬＰの他の株を使用してもよい。
【００２７】
少なくとも配列番号１のアミノ酸配列を有する受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）および／またはシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）タンパク質を含むようにアジュバント添加物を設計することにより、全身性抗体免疫応答および／または細胞性免疫応答が、上述したアジュバント添加物を含む免疫原性組成物によって首尾よく誘導され得、したがってＰＣＶ２ウイルスに対する十分な免疫保護を与える。
【００２８】
宿主における免疫応答の増強方法は、上述した免疫原性組成物を使用することにより達成することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＣＶ２  ＶＬＰに対する抗体免疫応答および／または細胞性免疫応答を増強するために、宿主は少なくとも３週間前に免疫原性組成物でワクチン接種される。例示的な一実施形態では、宿主は、少なくとも３週間前に免疫原性組成物の用量を投与することにより、ワクチン接種される。しかしながら、本開示はそれに限定されない。
【００２９】
上述した宿主における抗体免疫応答および／または細胞性免疫応答の増強方法を使用することにより、ＰＣＶ２ウイルスに対する十分な免疫保護が確保され得る。
【実施例】
【００３０】
以下の実験例は、本開示のアジュバント添加物を含む免疫原性組成物が抗体免疫応答および／または細胞性免疫応答を首尾よく誘導することができ、その結果、ＰＣＶ２ウイルスに対する十分な免疫保護が付与され得ることを証明するために実施される。
【００３１】
（実施例１）
免疫応答の増強に対するアジュバント添加物ＰＥおよび／またはＲＡＰの効果
この実施例では、ＰＣＶ２  ＶＬＰ、ＲＡＰ、およびＰＥ４０７−Ｋ３の調製が最初に行われた。具体的には、配列番号５のアミノ酸配列を有するＰＣＶ２  ＶＬＰの調製方法は、以下の通りであった：１×１０６〜４×１０６のＳＦ９細胞に、０．１〜１の感染多重度（ＭＯＩ）のＰＣＶ２−ＯＲＦ２配列を有するバキュロウイルスを感染させ、３〜６日間インキュベートした。細胞ペレットを遠心分離によって収集し、ＰＣＶ２ウイルス様粒子を抽出し、細胞ペレットから精製した。ＰＣＶ２  ＶＬＰを得るために、ＰＣＶ２ウイルス様粒子は３７℃で４〜４８時間、１．６〜１０ｍＭのバイナリーエチレンイミン（ｂｉｎａｒｙ  ｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ、ＢＥＩ）により不活性化された。ＰＣＶ２  ＶＬＰの濃度は、ＢＳＡ標準によって定量化された。
【００３２】
配列番号１のアミノ酸配列を有するＲＡＰの調製方法は、以下の通りである：例えば、ＲＡＰフラグメントを有する大腸菌をＯＤ６００＝０．３〜１．２まで培養した後、０．１〜１０ｍＭのＩＰＴＧでＲＡＰフラグメントの発現を２〜２４時間誘導した。細胞ペレットを遠心分離によって収集した後、ＴＮＥバッファーで抽出した。遠心分離後、抽出物の上清をＨＩＳカラムで精製して、ＲＡＰを得た。ＲＡＰの濃度は、ＢＳＡ標準によって定量化された。
【００３３】
配列番号２のアミノ酸配列を有するＰＥ４０７−Ｋ３の調製方法は、以下の通りである：例えば、ＰＥ４０７−Ｋ３フラグメントを有する大腸菌をＯＤ６００＝０．３〜１．２まで培養した後、０．１〜１０ｍＭのＩＰＴＧでＰＥ４０７−Ｋ３の発現を２〜２４時間誘導した。細胞ペレットを遠心分離によって収集した後、ＴＮＥバッファーで抽出した。遠心分離後、抽出物のペレットを８Ｍ尿素バッファーに溶解させた。リフォールディングプロセスの後、ＰＥ４０７−Ｋ３が得られる。ＰＥ４０７−Ｋ３の濃度は、ＢＳＡ標準によって定量化された。
【００３４】
次に、免疫原性組成物の調製が実施された。この実験例では、ＰＣＶ２  ＶＬＰは、ＰＥまたはＲＡＰと、例えば１：１の比率で均一に混合された。しかしながら、本開示はそれに限定されない。他の実験例では、ＰＣＶ２  ＶＬＰとＰＥまたはＲＡＰは、１：０．５または１：２の比率で均一に混合させることもできる。この実験例では、ＰＣＶ２  ＶＬＰの濃度は約３μｇ／用量であり、アジュバント添加物の濃度は約３μｇ／用量である。ＩＳＡ２０６アジュバントおよび均一混合物は、３１℃の水浴中で２０分間温められた。次に、混合物を３１℃でＩＳＡ２０６アジュバントに加え、（容器のサイズに応じて）４００〜７００ｒｐｍで１．５時間撹拌した。室温で数時間放置した後、ワクチン組成物が得られ、その後４℃で保存された。
【００３５】
この実験例では、Ｂａｌｂ／ｃマウスが試験動物として使用され、Ｂａｌｂ／ｃマウスに皮下注射により免疫原性組成物を注射した。Ｂａｌｂ／ｃマウスは４つの群に分けられ、表１に示すように各群には４匹のマウスがいる。Ａ群はプラセボであり、ＰＣＶ２  ＶＬＰ、ＰＥ、ＲＡＰおよびＩＳＡ２０６アジュバントは注射されなかった。群Ｂに注射された免疫原性組成物は、ＰＣＶ２  ＶＬＰおよびＩＳＡ２０６アジュバントを含む。群Ｃに注射された免疫原性組成物は、ＰＣＶ２  ＶＬＰ、ＲＡＰおよびＩＳＡ２０６アジュバントを含む。群Ｄに注射された免疫原性組成物は、ＰＣＶ２  ＶＬＰ、ＰＥ４０７−Ｋ３およびＩＳＡ２０６アジュバントを含む。
【００３６】
注射後、毎週、顎下腺採血により血液サンプルが採取された。血液サンプルからの血清が、ＰＣＶ２  ＩｇＧ抗体ＥＬＩＳＡ分析のために使用された。マウスは、注射の３週間後にＣＯ２で屠殺された。次に、マウスの脾臓が採取され、フローサイトメーターを使用した細胞免疫染色分析にかけられた。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
［ＰＣＶ２  ＩｇＧ抗体ＥＬＩＳＡ分析］
ＰＣＶ２  ＩｇＧ抗体ＥＬＩＳＡ分析の実験手順：群の４匹のマウスの血清（１０μｌ／各マウス）が同じチューブ中に混合された。各群の血清を５０倍に希釈した後、１００μｌの血清希釈液をＢｉｏｃｈｅｃｋ  ＰＣＶ２  ＥＬＩＳＡキットの抗原プレートの１ウェルに添加し、３７℃で３０分間反応させた。１×ＰＢＳＴで４回洗浄した後、１００μｌの抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（１：１００００）を添加し、３７℃で３０分間反応させた。１×ＰＢＳＴで４回洗浄した後、１００μｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加し、室温で１５分間反応させた。１００μｌの１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を添加した後、４５０ｎｍの波長のシグナルをＥＬＩＳＡリーダーで測定した。
【００３９】
図１は、実施例１の異なる試験群について、マウスにおけるＰＣＶ２抗体の存在を検出するためのＥＬＩＳＡの結果を示す。横軸は、注射前（Ｗ０）、注射の１週間後（Ｗ１）、注射の２週間後（Ｗ２）、注射の３週間後（Ｗ３）の各群のマウスの血清を表す。縦軸は、４５０ｎｍの波長での吸光度（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）の読み取り値を表し、当該読み取り値は血清中のＰＣＶ２抗体の相対量を表すことができる。図１の結果によれば、注射前のＰＣＶ２抗体の量と比較して、注射の１週間後および注射の２週間後ではＰＣＶ２抗体の量に有意な変化はなかった。しかしながら、注射の３週間後では、（ＰＣＶ２  ＶＬＰ免疫原およびアジュバント添加物ＲＡＰ／ＰＥを注射した）群ＣおよびＤのＰＣＶ２抗体は、（ＰＣＶ２  ＶＬＰ免疫原のみを注射した）群Ｂよりも有意に高かった。
【００４０】
アジュバント添加物（ＲＡＰまたはＰＥ）を含む免疫原性組成物は、ＰＣＶ２ウイルスに対する十分な免疫保護を得るために、抗体免疫応答などの免疫応答を首尾よく増強させ得ることがわかる。
【００４１】
［細胞免疫染色分析］
細胞免疫染色分析の実験手順：ステップ１．脾臓細胞の分離および培養：注射の３週間後、マウスをＣＯ２で屠殺し、心臓から血液を採取した（＞０．５ｍｌ）。マウスの脾臓を取り出し、１ｍｌ／ウェルのＤＭＥＭ培地を含む２４ウェルプレートに入れた。ＰＢＳで１回洗浄した後、１．５ｍｌのＲＢＣ溶解バッファーを含む６ｃｍディッシュに脾臓を入れ、シリンジヘッドを使用して５分間粉砕した。粉砕した脾臓をセルストレーナー（４０μｍ）に通して５０ｍｌの遠心管に入れ、該セルストレーナーを８．５ｍｌのＰＢＳでリンスして全量１０ｍｌにした。１３００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、細胞ペレットを収集し、５ｍｌのＰＢＳで洗浄した。１３００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、細胞ペレットを２ｍｌのＲＰＭＩ培地（１０％ＦＢＳ、１％ＰＳＡ）に懸濁した。細胞数計測後、２×１０７個の脾臓細胞／ウェルを６ウェルプレートに播種し、２ｍｌのＲＰＭＩ培地（１０％ＦＢＳ、１％ＰＳＡ）中で培養した。２μｇのＰＣＶ２−ＯＲＦ２免疫原（ＰＣＶ２  ＶＬＰ免疫原）を添加して１６時間反応させた。ＰＣＶ２  ＶＬＰ免疫原は、脾臓細胞のＣＤ３＋Ｔ細胞を刺激して、ＩＦＮ−γを産生することができる。ステップ２．脾臓細胞の免疫染色：ゴルジプラグ（Ｇｏｌｇｉ  ｐｌｕｇ）を添加して４時間反応させた後、細胞を遠心管に入れた。３００×ｇ、４℃、５分間の遠心分離後、上清を除去し、１ｍｌのＰＢＳを洗浄のために添加した。再び１ｍｌのＰＢＳで洗浄した後、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８に特異的な抗体１００μｌ／ウェルを添加し、４℃で３０分間、暗所でインキュベートした。１ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した後、２００μｌのＩＣ固定液（ＰＢＳ：ＩＣ  Ｆｉｘ＝１：１）を加え、暗所にて４℃で一晩反応させた。１ｍｌの１×透過処理洗浄バッファー（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）で洗浄後、１００μｌのＩＦＮ−γ−Ａｂを添加して、暗所にて室温で３０分間反応させた。最後に、フローサイトメトリーによって、ＣＤ３＋ＩＦＮ−γＴ細胞の数を検出した。
【００４２】
図２Ａおよび図２Ｂは、実施例１の異なる試験群について、マウスにおけるＣＤ３＋／ＩＮＦ−γＴ細胞の数を検出するためのフローサイトメトリーの結果を示す。横軸は、ＰＣＶ２  ＶＬＰ免疫原で処理（黒カラム）またはＰＣＶ２  ＶＬＰ免疫原なしで処理（白カラム）した、注射の３週間後の各群のマウスの脾臓細胞を表す。縦軸はＣＤ３＋／ＩＮＦ−γＴ細胞の数を表す。図２Ａの結果によれば、ＰＣＶ２  ＶＬＰのみを注射した群Ｂの脾臓細胞と比較して、ＰＣＶ２  ＶＬＰ＋ＲＡＰを注射した群Ｃの脾臓細胞は、ＰＣＶ２  ＶＬＰ免疫原によって刺激された後、より多くの特異的ＣＤ３＋／ＩＮＦ−γＴ細胞を産生することができる。
【００４３】
図２Ｂの結果によれば、ＰＣＶ２  ＶＬＰのみを注射した群Ｂの脾臓細胞と比較して、ＰＣＶ２  ＶＬＰ＋ＰＥ４０７−Ｋ３を注射した群Ｄの脾臓細胞は、ＰＣＶ２  ＶＬＰ免疫原によって刺激された後、より多くの特異的ＣＤ３＋／ＩＮＦ−γＴ細胞を産生することができる。
【００４４】
アジュバント添加物（ＲＡＰまたはＰＥ）を含む免疫原性組成物は、ＰＣＶ２ウイルスに対する十分な免疫保護を得るために、細胞性免疫応答などの免疫応答を首尾よく増強させ得ることが分かる。
【００４５】
（実施例２）
細胞性免疫応答の増加に対する異なるＰＥフラグメントの効果
この実施例では、ＰＣＶ２  ＶＬＰおよび異なるＰＥフラグメント（ＰＥ２５２、ＰＥ４０７およびＰＥ４０７−Ｋ３）の調製が最初に行われた。具体的には、配列番号５のアミノ酸配列を有するＰＣＶ２  ＶＬＰの調製方法は、実施例１において既に記載されている。配列番号２のアミノ酸配列を有するＰＥ４０７−Ｋ３の調製方法も、実施例１において既に記載されている。更に、配列番号３のアミノ酸配列を有するＰＥ４０７および配列番号４のアミノ酸配列を有するＰＥ２５２の調製方法は、ＰＥ４０７−Ｋ３の調製方法と同様であるため、本明細書では説明しない。
【００４６】
更に、免疫原性組成物の調製方法は実施例１のそれと同様であるため、本明細書では説明しない。この実験例では、ＰＣＶ２  ＶＬＰは、ＰＥまたはＲＡＰと、例えば１：１の比率で均一に混合された。ＰＣＶ２  ＶＬＰの濃度は約３μｇ／用量であり、アジュバント添加物（ＰＥ２５２、ＰＥ４０７およびＰＥ４０７−Ｋ３）の濃度は約３μｇ／用量である。
【００４７】
この実験例では、Ｂａｌｂ／ｃマウスが試験動物として使用され、Ｂａｌｂ／ｃマウスに皮下注射により免疫原性組成物を注射した。Ｂａｌｂ／ｃマウスは４つの群に分けられ、表２に示すように各群には４匹のマウスがいる。群Ａに注射された免疫原性組成物は、ＰＣＶ２  ＶＬＰおよびＩＳＡ２０６アジュバントを含む。群Ｂに注射された免疫原性組成物は、ＰＣＶ２  ＶＬＰ、ＰＥ２５２およびＩＳＡ２０６アジュバントを含む。群Ｃに注射された免疫原性組成物は、ＰＣＶ２  ＶＬＰ、ＰＥ４０７およびＩＳＡ２０６アジュバントを含む。群Ｄに注射された免疫原性組成物は、ＰＣＶ２  ＶＬＰ、ＰＥ４０７−Ｋ３およびＩＳＡ２０６アジュバントを含む。
【００４８】
【表２】
2020164508.tif 000004
【００４９】
マウスは、注射の３週間後にＣＯ２で屠殺された。マウスの脾臓が採取され、フローサイトメーターを使用した細胞免疫染色分析にかけられた。更に、細胞免疫染色分析の実験手順は実施例１のそれと同様であるため、本明細書では説明しない。
【００５０】
図３は、実施例２の異なる試験群について、マウスにおけるＣＤ３＋／ＩＮＦ−γＴ細胞の数を検出するためのフローサイトメトリーの結果を示す。横軸は、ＰＣＶ２  ＶＬＰ免疫原で処理（黒カラム）またはＰＣＶ２  ＶＬＰ免疫原なしで処理（白カラム）した、注射の３週間後の各群のマウスの脾臓細胞を表す。縦軸はＣＤ３＋／ＩＮＦ−γＴ細胞の数を表す。図３の結果によれば、ＰＣＶ２  ＶＬＰのみを注射した群Ａの脾臓細胞と比較して、ＰＣＶ２  ＶＬＰ＋ＰＥ２５２を注射した群Ｂの脾臓細胞は、ＰＣＶ２  ＶＬＰ免疫原によって刺激された後、より多くの特異的ＣＤ３＋／ＩＮＦ−γＴ細胞を産生することができる。更に、群ＢにおいてＰＣＶ２  ＶＬＰ免疫原によって刺激された特異的ＣＤ３＋／ＩＮＦ−γＴ細胞の数は、（ＰＣＶ２  ＶＬＰ＋ＰＥ４０７を注射した）群Ｃおよび（ＰＣＶ２  ＶＬＰ＋ＰＥ４０７−Ｋ３を注射した）群Ｄの当該数よりも有意に高かった。
【００５１】
アジュバント添加物（ＰＥ２５２、ＰＥ４０７およびＰＥ４０７−Ｋ３）を含む免疫原性組成物は、ＰＣＶ２ウイルスに対する十分な免疫保護を得るために、細胞性免疫応答などの免疫応答を首尾よく増強させ得ることが分かる。
【００５２】
実施例１および２は、アジュバント添加物（ＲＡＰおよび／またはＰＥ）をＰＣＶ２  ＶＬＰ免疫原に添加して、ＰＣＶ２  ＶＬＰに対する抗体免疫応答および細胞性免疫応答を増強させるが、本開示はそれに限定されないことは注目に値する。他の実施形態では、アジュバント添加物（ＲＡＰおよび／またはＰＥ）を他の免疫原に添加して、感染性病原体に対する宿主の抗体免疫応答および細胞性免疫応答を増強させることもできる。
【００５３】
上記の実施形態によれば、配列番号１のアミノ酸配列を有する受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）またはシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）タンパク質を含む本開示のアジュバント添加物は、免疫原性組成物中に添加されて、抗体免疫応答および／または細胞性免疫応答を誘導および増強するために使用され、したがって免疫原に対する十分な免疫保護を与える。更に、少なくともＲＡＰおよびＰＥが単一の免疫原性組成物において一緒に使用される場合、免疫応答を更に増強させる相乗効果が観察される場合がある。
【００５４】
本開示の範囲または精神から逸脱することなく、開示された実施形態に対して様々な修正および変更を行うことができることは当業者には明らかであろう。上記に鑑みて、以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）の範囲内にある限り、本開示は修正および変形を包含することが意図されている。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の免疫原性組成物および免疫応答の増強方法は、宿主における免疫応答を増強する際に適用され得る。
【符号の説明】
【００５６】
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ  群
Ｗ０  注射の前
Ｗ１  注射の１週間後
Ｗ２  注射の２週間後
Ｗ３  注射の３週間後
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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