(57)【要約】【課題】ヒアルロン酸産生促進作用を有する新規なヒアルロン酸産生促進剤とその用途を提供する。【解決手段】本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、植物油の不鹸化物を有効成分とする。本発明は、前記ヒアルロン酸産生促進剤を含有する美容組成物もまた提供する。本発明のヒアルロン酸産生促進剤及びそれを含む美容組成物は、例えば経皮投与による皮膚の保湿、張り向上、皮膚のしわ改善等への用途が期待される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物油の不鹸化物を有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項２】
前記植物油が、大豆胚軸油、大豆油及びコーン油からなる群から選ばれる一種又は二種以上である、請求項１に記載のヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項３】
前記不鹸化物を、０．１質量％以上１００質量％以下含有する、請求項１又は２に記載のヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のヒアルロン酸産生促進剤、並びに、化粧品学的又は薬学的に許容される添加剤を含有する美容組成物。
【請求項５】
植物油の不鹸化物、並びに、化粧品学的又は薬学的に許容される添加剤を含有する美容組成物。
【請求項６】
皮膚の保湿、皮膚の張り向上、及び皮膚のしわ改善から選ばれる少なくとも一種の用途に用いるための請求項４又は５に記載の美容組成物。
【請求項７】
経皮投与用である、請求項４〜６のいずれか一項に記載の美容組成物。
【請求項８】
請求項４又は５に記載の美容組成物の製造方法であって、植物油の不鹸化物、並びに、化粧品学的又は薬学的に許容される添加剤を配合することを含む、前記製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸産生促進剤に関し、より詳細には植物油の不鹸化物を有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、主として表皮、真皮及び皮下組織に分けられる。真皮は、表皮の下にあって皮膚構造を支えるために、コラーゲン、ヒアルロン酸等で構成される細胞外マトリックスと呼ばれる生体構造物で満たされている。ヒアルロン酸は、グリコサミノグリカンの一種であって、硫酸基を持たず、グルクロン酸とＮ―アセチルグルコサミン残基が反復的に鎖形状で連結されている高分子物質である。これらの細胞外マトリックスは、繊維芽細胞等によって産生される。
【０００３】
若々しさが維持されている皮膚では、細胞外マトリックス成分の産生が促進され、皮膚の弾力性、水分保持と張りが保たれている。紫外線等の酸化ストレスや加齢によって、ヒアルロン酸等の細胞外マトリックス成分が減少すると、しみ、しわ、たるみ、肌荒れといった症状に代表される皮膚の老化が進行する。
【０００４】
皮膚ヒアルロン酸量が酸化ストレスや加齢によって減少する状態を改善するために、ヒアルロン酸産生促進作用を有する物質が提案されている。特許文献１には、「大豆種子、大豆胚芽、大豆胚、大豆芽、小麦種子、小麦胚芽、小麦胚、小麦芽、豆乳及びオカラよりなる群から選ばれた少なくとも一種から得られた植物抽出物を含有することを特徴とするヒアルロン酸産生促進剤」が開示されている（請求項５）。上記植物抽出物は、「植物を水、有機溶媒、水と有機溶媒の混合物などを用いて、低温、室温、加温条件下での含浸法、蒸留法、圧搾法、超音波法、超臨界流体法、亜臨界流体法などで抽出物を回収する」ことにより調製される（段落〔００２０〕）。実際には、大豆胚芽に５％過塩素酸水溶液を加えて酸性条件下で植物から抽出物を酸溶液中に回収し、回収された液体画分を３０％水酸化ナトリウム溶液で中和することによりダイズ胚芽抽出物を得（実施例３）、このダイズ胚芽抽出物を４００、８００又は２０００μｇ／ｍＬの濃度で培地に添加し、そこに播種された正常ヒト皮膚繊維芽細胞が産生するヒアルロン酸量を測定している（実施例１３、図８及び９）。その結果、ダイズ胚芽抽出物にはヒアルロン酸産生作用があると報告された。
【０００５】
特許文献２には、「β−シトステロール及び／又はその脂肪酸エステルを有効成分とすることを特徴とするヒアルロン酸産生促進剤」が開示されている（請求項１）。β−シトステロールとその脂肪酸エステルは、”野菜、豆類、穀物等の植物から単離精製されたものや化学合成されたものであってもよい”（段落〔００１０〕）。特許文献２で実際に行った実施例１では、β−シトステロール試薬を０．１〜１０μＭの濃度で添加した培地に播種した正常ヒト皮膚繊維芽細胞が産生するヒアルロン酸量が測定された（表１）。その結果、β−シトステロールには、正常ヒト繊維芽細胞のヒアルロン酸産生促進作用があると報告された（段落〔００１４〕）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００７／１４８７３７（植物抽出物の調製方法、並びに植物抽出物及びその用途）
【特許文献２】特開２００９−０５７２９０（ヒアルロン酸産生促進剤）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１や２のヒアルロン酸産生促進剤の効果は、後述の比較例１及び２に示すように、未だ十分なレベルではない。そこで、本発明の目的は、天然由来で安全かつ従来のヒアルロン酸産生促進剤よりも効果の高い新規なヒアルロン酸産生促進剤とその用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、上記課題を鋭意検討したところ、植物油に含まれる不鹸化物にヒアルロン酸産生促進作用があることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、植物油の不鹸化物を有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤を提供する。特許文献１の実施例３等で実際に使用した植物抽出物は、水溶性成分である。それに対して、本発明が使用する植物油の不鹸化物は、植物油をアルカリで鹸化反応させた後に有機溶媒層に移行する脂溶性成分である。したがって、本発明と特許文献１とは、ヒアルロン酸産生促進剤の有効成分が明らかに相違する。
【０００９】
本発明の植物油の不鹸化物には、特許文献２に記載のβ−シトステロールのようなステロールが含まれている。後述する比較例２と実施例１との対比から明らかなように、植物油の不鹸化物を有効成分とする本発明の効果は、β−シトステロール単独からなるものよりも明らかに優れる。すなわち、本発明の効果は、β−シトステロール単独では得られず、植物油の不鹸化物に基づくといえる。
【００１０】
前記植物油は、大豆胚軸油、大豆油及びコーン油からなる群から選ばれる一種又は二種以上であることが好ましい。
【００１１】
前記ヒアルロン酸産生促進剤は、前記不鹸化物を０．１質量％以上１００質量％以下含有することが好ましい。
【００１２】
本発明は、また、前記ヒアルロン酸産生促進剤、並びに化粧品学的又は薬学的に許容される添加剤を含有する美容組成物を提供する。
【００１３】
本発明は、また、植物油の不鹸化物、並びに化粧品学的又は薬学的に許容される添加剤を含有する美容組成物を提供する。
【００１４】
前記美容組成物は、例えば経皮投与用である。
【００１５】
前記美容組成物の用途は、特に皮膚の保湿、皮膚の張り向上、及び皮膚のしわ改善から選ばれる少なくとも一種である。
【００１６】
本発明は、また、前記美容組成物の製造方法であって、植物油の不鹸化物、並びに化粧品学的又は薬学的に許容される添加剤を配合することを含む、前記製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
植物油の不鹸化物を有効成分とする本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、特許文献１のダイズ胚芽抽出物等や特許文献２のβ−シトステロールを有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤と比べて優れたヒアルロン酸産生向上作用が得られる。
【００１８】
本発明に従った植物油の不鹸化物を有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤は、植物油に由来する天然の成分であるため、副作用が少ない可能性が高い。このヒアルロン酸産生促進剤又はそれを含む美容組成物を摂取することにより、優れた美容効果を得ることが可能である。本発明のヒアルロン酸産生促進剤又はそれを含む美容組成物は、皮膚のヒアルロン酸産生の向上に基づいて、皮膚の保湿、張り向上やしわ改善に有用であることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、本発明に従うヒアルロン酸産生促進剤（実施例１〜３）、並びに本発明に従わないヒアルロン酸産生促進剤（比較例１及び２）をそれぞれ所定の濃度で培地に添加して、そこで成人由来正常ヒト繊維芽細胞の培養試験を行い、培養上清中のヒアルロン酸産生率を調べた結果である。ヒアルロン酸産生率は、対照（０．１％ＤＭＳＯ）での細胞当たりのヒアルロン酸産生量を１００としたとき相対比率として示されている。比較例１（大豆胚芽塩酸抽出物）では、対照と比べても低いヒアルロン酸産生率を示した。比較例２（β−シトステロール）でも、対照と同程度のヒアルロン酸産生率を示した。それらに対して、本発明に従う実施例１〜３（植物油の不鹸化物）では、いずれも対照や比較例１と比べて高いヒアルロン酸産生率を示した。
【図２】図２は、実施例１において、大豆胚軸油不鹸化物の濃度の異なるヒアルロン酸産生促進剤を試験培地に添加して成人由来正常ヒト繊維芽細胞の培養試験を行い、ヒアルロン酸産生率を測定した結果を示す。比較のため、比較例２において、β−シトステロールについても、同様の培養試験を行った。β−シトステロールを単独に含む比較例２では、ヒアルロン酸産生率が、β−シトステロールの濃度依存的に上昇しているものの、その上昇率は非常に緩やかである。一方、本発明に従う実施例１では、ヒアルロン酸産生率は、大豆胚軸油不鹸化物の濃度依存的かつ顕著に増大した。１０μｇ／ｍＬの大豆胚軸油不鹸化物を含むヒアルロン酸産生促進剤の産生率は、５０μｇ／ｍＬのβ−シトステロールを含むヒアルロン酸産生促進剤よりも有意に高かった。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下に、本発明のヒアルロン酸産生促進剤の好適な実施形態を詳細に説明する。本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、植物油の不鹸化物を有効成分とする。植物油の不鹸化物とは、植物油をアルカリと反応させ、脂肪酸塩（石鹸）が生じる鹸化反応を行った時に、鹸化されない脂溶性成分である。植物油の不鹸化物は、一般にステロール類を含み、脂溶性ビタミン、トコフェロール、トコトリエノール、スクアレン等を含み得る。
【００２１】
前記植物油は、不鹸化物を含有する限り、特に制限はないが、好ましくは食用の植物油である。植物油の例には、大豆胚軸油、大豆油、コーン油、菜種油、米ぬか油、綿実油、ごま油、オリーブ油、ヒマワリ油、紅花油、パーム油、ヤシ油、パーム核油等が挙げられ、大豆胚軸油、大豆油及びコーン油から選ばれる一種又は二種以上が好ましく挙げられ、大豆胚軸油がより好ましく挙げられる。植物油は、通常、植物油の由来となる油糧植物を常法により圧搾及び／又は溶剤抽出後に得られる原油を、常法により脱ガム、脱酸、脱色及び脱臭の精製工程を経ることにより得られる。本発明に使用する植物油は、原油、上記精製工程の中間油、及び精製油のいずれでもよく、好ましくは精製油である。なお、大豆胚軸油は、大豆種子（胚軸の含有量が約２質量％）中の大豆胚軸（大豆胚芽とも呼ばれる）の含有量を１５質量％以上まで高めた油糧原料より得られた植物油である。
【００２２】
鹸化反応により植物油から不鹸化物を濃縮する場合、鹸化反応は常法に基づく。例えば、植物油を約１００℃に保ち、アルカリ水溶液を徐々に加えながら、穏やかに攪拌する。上記アルカリ水溶液には、例えば、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム等又はこれらの組み合わせが用いられる。鹸化反応時に、アルコール、塩等の鹸化促進剤を添加してもよい。鹸化反応後、脂溶性である不鹸化物をジエチルエーテル等の有機溶媒中に抽出する。抽出した不鹸化物を無水硫酸ナトリウム等で脱水して乾燥する。
【００２３】
本発明に使用する不鹸化物は、また、上記不鹸化物を含有する植物油でもよい。植物油中の不鹸化物の含有量は、例えば精製大豆胚軸油で１．５〜６．１５質量％、精製大豆油で０．１〜１質量％、精製コーン油で０．４〜２質量％である。植物油は、好ましくは大豆胚軸油、大豆油及びコーン油からなる群から選ばれる一種又は二種以上であり、特に好ましくは大豆胚軸油である。また、植物油の鹸化反応によって濃縮された不鹸化物を上記植物油に添加したものをヒアルロン酸産生促進剤としてもよい。
【００２４】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、経皮的又は経口的に摂取される。経皮用のヒアルロン酸産生促進剤は、必須成分の植物油の不鹸化物に加えて、化粧品学的又は薬学的に許容される添加剤を含んでもよい。そのような添加剤の例には、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、１，４−ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、ペンチレングリコール、イソプレングリコール、グルコース、マルトース、フルクトース、キシリトール、ソルビトール、マルトトリオース、エリスリトール等の多価アルコール；メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコール、イソブチルアルコール等の低級アルコール；２−エチルヘキサノール、ノナノール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール等の高級アルコール；オレイン酸、イソステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、ウンデシレン酸等の高級脂肪酸類；カルナバロウ、キャンデリラロウ、ミツロウ、ラノリン等のロウ類；ソルビトール、マンニトール、グルコース、ショ糖、ラクトース、トレハロース等の糖類；カラギーナン、キサンタンガム、ゼラチン、ペクチン、アガロース、アルギン酸塩、デキストリン、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、アラビアガム、カラヤガム、トラガントガム、タマリンドガム等の増粘剤；フェノキシエタノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、パラオキシ安息香酸エステル、安息香酸、サリチル酸とその塩類、ソルビン酸とその塩類、デヒドロ酢酸とその塩類、クロルクレゾール、ヘキサクロロフェン等の防腐剤；ラウロイル硫酸ナトリウム、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン等の非イオン界面活性剤、アルキルサルフェート塩、ノルマルドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤、ポリオキシエチレンドデシルモノメチルアンモニウムクロライド等の陽イオン界面活性剤；ステロイド系及び非ステロイド系抗炎症剤；ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＦ、ビタミンＫ等のビタミン類やジカプリル酸ピリドキシン、ジパルミチン酸ピリドキシン、ジパルミチン酸アスコルビル、モノパルミチン酸アスコルビル、モノステアリン酸アスコルビル等のビタミン誘導体；フラボノイド、カロテノイド等の抗酸化剤；スクワラン、スクワレン、流動パラフィン等の高級脂肪族炭化水素類；セラミド、セレブロシド、スフィンゴミエリン等のスフィンゴ脂質；コレステロール、フィトステロール等のステロール類；メチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、メチルシクロポリシロキサン、オクタメチルシクロテトラシロキサン、オクタメチルシクロペンタシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、メチルハイドロジェンポリシロキサン等のシリコーン類；パラアミノ安息香酸、パラアミノ安息香酸モノグリセリンエステル、アントラニル酸メチル、ホモメンチル−Ｎ−アセチルアントラニレート、パラメトキシケイ皮酸オクチル、エチル−４−イソプロピルシンナメート等の紫外線吸収剤；ベントナイト、スメクタイト、バイデライト、ノントロナイト、サポナイト、ヘクトライト、ソーコナイト、スチーブンサイト等の鉱物；ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化コバルト、群青、紺青、酸化チタン、酸化亜鉛等の無機顔料；赤色２０２号、黄色４号、青色４０４号等の着色料；香料；香油等が挙げられる。
【００２５】
経口用のヒアルロン酸産生促進剤は、必須成分の植物油の不鹸化物に加えて、化粧品学的又は薬学的に許容される添加剤を含んでもよい。そのような添加剤の例には、経口投与剤の形態に応じて、レシチン、モノグリセリン脂肪酸エステル、有機酸モノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリソルベート等の乳化剤；ミルクフレーバー、バターフレーバー、チーズフレーバー、ヨーグルトフレーバー、コーヒーフレーバー、紅茶フレーバー、シナモンフレーバー、カモミールフレーバー等のフレーバー類；スペアミント油、チョウジ油、ペパーミント油等の香味油；アセトアルデヒド、ベンズアルデヒド、ブチルアルデヒド、シトラール、ネラール、デカナール、エチルバニリン、バニリン、ブチルアルデヒド、ヘキサナール等のアルデヒドからなる香味剤；トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸類（例えばＬ−アスコルビン酸パルミテート）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ターシャルブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）、カテキン、リグナン、γ−オリザノール等の酸化防止剤；シリコーン等の消泡剤；ＤＨＡ、ＥＰＡ、ビタミンＡ、ビタミンＤ、コエンザイムＱ等の生理活性物質等；賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、キサンチン誘導体、アミノ酸、ｐＨ調整剤、清涼化剤、懸濁化剤、粘稠剤、溶解補助剤、コーティング剤、水、アルコール類、水溶性高分子、甘味料、矯味剤、酸味料、香辛料、着色剤等を発明の効果を損なわない質的及び量的範囲で添加することが可能である。
【００２６】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤の形態は、溶液、エマルション（油中水（Ｗ／Ｏ）型又は水中油（Ｏ／Ｗ）型）、固形（粉末、顆粒、フレーク状、ブロック状等）であり得る。本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、好ましくは溶液又はエマルションからなる。
【００２７】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、形態に応じて、適宜の方法により調製することができる。例えば、液状又は固形のヒアルロン酸産生促進剤は、植物油の不鹸化物を、適宜の賦形剤（例えば油脂）及び添加剤とともに混合することにより得られる。賦形剤の選択により、液状又は固形に調整することができる。
【００２８】
エマルション形態のヒアルロン酸産生促進剤は、例えば、植物油の不鹸化物及び不鹸化物を含む植物油の一種又は二種と、前記植物油以外の油脂、乳化剤、その他の添加剤及び水を含む混合物を乳化機等で撹拌混合することにより得られる。エマルションの油分は、通常、１０質量％以上９０質量％以下である。
【００２９】
粉末や顆粒の形態のヒアルロン酸産生促進剤は、例えば、植物油の不鹸化物及び不鹸化物を含む植物油の一種又は二種と、前記植物油以外の油脂、乳化剤、粉末化基材及び水を含む混合物を撹拌混合して得られるエマルションをさらに乾燥粉末化することにより得られる。乾燥粉末化の方法は、例えば、エマルションの噴霧乾燥等が挙げられる。
【００３０】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤に含有される植物油の不鹸化物の含有量は、通常、０．１質量％以上１００質量％以下でよく、好ましくは３質量％以上１００質量％以下、特に好ましくは５質量％以上１００質量％以下である。
【００３１】
本発明は、さらに、前記ヒアルロン酸産生促進剤を含有する美容組成物を提供する。該美容組成物の用途は、植物油の不鹸化物のヒアルロン酸産生促進作用に基づいて、例えば皮膚の保湿、皮膚の張り・弾力の向上、皮膚のしわやたるみの改善、皮膚の硬化防止等の効能を示す化粧品・医薬部外品、機能性食品等である。
【００３２】
本発明の美容組成物の摂取の形態は、特に限定されず、例えば経皮摂取や経口摂取でもよい。経皮用の美容組成物には、経皮用のヒアルロン酸産生促進剤の添加剤として例示したものを配合できる。
【００３３】
経皮用の美容組成物の形態は、水剤、液剤、エアゾール、乳剤、乳液ローション、クリーム、軟膏、粉体又は固形物である。
【００３４】
経皮用の美容組成物の製品例としては、サンタン化粧品、美容液、保湿化粧水、柔軟化粧水、収れん化粧水等のスキンケア化粧品；ファーミング化粧品、アンチセルライト化粧品等のボディ化粧品；基礎化粧品（化粧水、乳液、クリーム）、ファンデーション、下地クリーム、フェイスパウダー、ウォータープルーフ等のメイクアップ化粧品；固形石鹸、液状石鹸等のボディケア製品；シャンプー、リンス等のヘアケア製品；入浴剤；毛髪剤；育毛剤等が挙げられる。
【００３５】
経口用の美容組成物には、経口用のヒアルロン酸産生促進剤の添加剤として例示したものを配合できる。
【００３６】
経口用の美容組成物の製品例には、皮膚の保湿、皮膚の張り向上、及び及び皮膚のしわ改善から選ばれる一種又は二種以上の機能を有する機能性食品が挙げられる。該機能性食品は、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、チュアブル錠、ドロップのような固形製剤や、ドリンク剤、水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ、ドライシロップのような液剤等の形態に加工される。
【００３７】
なお、本発明の経口用の美容組成物は、パン、米飯、スープ、総菜、菓子等の一般加工食品として用いてもよい。
【００３８】
本発明の美容組成物中の植物油の不鹸化物の含有量は、通常、０．００１質量％以上５質量％以下でよく、好ましくは０．００４質量％以上１質量％以下、特に好ましくは０．００８質量％以上０．５質量％以下である。
【００３９】
本発明の美容組成物の配合例を示す。しかし、本発明は、以下の配合例に限定されるものではない。
【００４０】
［配合例１］化粧水
【表１】
2020158404.tif 000003
【００４１】
［配合例２］クリーム
【表２】
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【００４２】
［配合例３］乳液
【表３】
2020158404.tif 000005
【００４３】
［配合例４］錠剤
【表４】
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【００４４】
［配合例５］カプセル
【表５】
2020158404.tif 000007
【００４５】
本発明は、また、前記美容組成物の製造方法であって、植物油の不鹸化物を有効成分として配合することを含む、前記製造方法を提供する。
【実施例】
【００４６】
以下に、本発明に従う実施例を比較例と対比することによって、本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〜３、比較例１〜２〕
植物油の不鹸化物を有効成分とする本発明のヒアルロン酸産生促進剤のヒアルロン酸産生促進作用を、正常ヒト繊維芽細胞を用いて調べた。特許文献１及び２に準じる比較例として、それぞれ大豆胚芽塩酸抽出物及びβ−シトステロールの評価も同様に行った。
【００４７】
１）使用細胞
成人由来正常ヒト繊維芽細胞（製品名ＫＦ−４０１９、倉敷紡績株式会社製）を入手した。
【００４８】
２）培地
以下の培地を用意した。
増殖培地：１０％ＦＢＳ及び１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ添加ＤＭＥＭ培地
試験培地：１％ＦＢＳ及び１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ添加ＤＭＥＭ培地
【００４９】
３）被検物質
ヒアルロン酸産生促進剤の有効成分として以下の被験物質を用意した。
（１）植物油の不鹸化物
大豆胚軸油（下記の大豆胚軸油の製造方法で製造したもの）、大豆油又はコーン油（ともに株式会社Ｊ−オイルミルズ製の精製油）３ｇを共栓付三角フラスコ（容量３００ｍＬ）に測り取った。上記油脂の入った三角フラスコに、２５ｍＬの２Ｍ水酸化カリウム−エタノール溶液、及び２５ｍＬの０．０５ｇ／ｍＬ没食子酸エタノール溶液を添加して混合溶液を得た。上記フラスコに２個の沸騰石を加え、還流冷却管付きソックスレー抽出器を接続し、沸騰蒸気で１時間加熱して鹸化した。還流冷却管から上記フラスコを外して、鹸化液を分液ロート（容量５００ｍＬ）に移した。三角フラスコ内の残存した鹸化液を１００ｍＬの熱水で洗って上記分液ロートに移した。上記分液ロートに５０ｍＬの蒸留水を入れて静置することにより、室温まで冷却した。三角フラスコを１００ｍＬのジエチルエーテルで洗い、その洗浄液を分液ロートに入れ、１分間激しく攪拌し、２層に分かれるまで静置した。上記分液ロートの下層（水層）を除去し、３０ｍＬの蒸留水を加え、水層部で分液ロートの内壁部分を洗いながら緩やかに２〜３回回転させ、静置した。上記分液ロートの下層（水層）を除去し、３０ｍＬの蒸留水を加え、充分に振り混ぜて水洗した。この作業を、下層の洗浄液がフェノールフタレイン溶液で着色しなくなるまで繰り返した。上記分液ロートの上層（ジエチルエーテル層）をビーカーに回収して、無水硫酸ナトリウムで脱水した。この脱水物をロータリーエバポレータで濃縮乾固した。得られた乾固物を細胞試験に使用する不鹸化物とした。大豆胚軸油、大豆油及びコーン油の不鹸化物の収率は、それぞれ、１．８２質量％、０．２４質量％及び０．７０質量％であった。
【００５０】
（大豆胚軸油の製造方法）
大豆種子を８０℃、４５分間加熱し、粗砕機で１／２未満の大きさに粉砕することにより、子葉、種皮及び胚軸の混合物を得た。得られた混合物を、風力分級機にかけて種皮を除き、子葉及び胚軸混合物を得た。得られた子葉及び胚軸混合物を、篩分機を用いて、タイラー７メッシュ篩上画分を取り除き、さらにタイラー１０メッシュ篩下タイラー１４メッシュ篩上の画分を分取することで、胚軸画分（大豆胚軸４０質量％）を得た。上記胚軸画分を６０℃に加温して、圧ぺん機でフレークにし、ｎ−ヘキサンで油分を抽出してミセラを得た。得られたミセラから減圧下、６０〜８０℃で残留するｎ−ヘキサンを除去して粗原油を得た。粗原油を常法により、脱ガム処理、脱酸処理、脱色処理、脱臭処理を行って、大豆胚軸油を得た。
【００５１】
（２）大豆胚芽塩酸抽出物
特許文献１に記載の実施例３のダイズ胚芽抽出物の調製方法を参考にして、大豆胚芽塩酸抽出物の調製を以下の手順で行った。大豆胚芽（加藤製油株式会社製）をブレンダーにかけて粉砕した。粉砕した大豆胚芽を１００ｇビーカーに測り取り、１Ｎ塩酸５００ｍＬを添加して１時間攪拌し、懸濁液を得た。８ｇのポリフェノール除去剤（製品名：ポリクラールＶＴ、富士フィルム和光純薬工業製）を上記懸濁液に添加し、再度１時間攪拌した。前記溶液を遠心分離機にかけて沈殿物を除去し、残った液層を濾紙で濾過して得た濾液を塩酸抽出溶液として回収した。回収した塩酸抽出溶液を、３０％水酸化ナトリウム水溶液を用いて中和した。その中和液を再度濾過し、１００ｍＬのプラスチックチューブに回収、−８０℃で凍結した。凍結させた中和液を凍結乾燥機で凍結乾燥した。凍結乾燥物を乳鉢で細かく粉砕した粉末を大豆胚芽塩酸抽出物とした。
【００５２】
（３）β−シトステロール
β−シトステロール（純度97％以上の試薬）をタマ生化学株式会社から入手した。
【００５３】
４）試験
（１）細胞前培養
前記増殖培地を用いて成人由来正常ヒト繊維芽細胞をＴ−７５フラスコに起眠し、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃、湿潤）内で培養した。培地交換を一日おきに行い、８０％コンフルエントに到達した時点で細胞を回収して以下の試験に供した。
【００５４】
（２）予備試験
細胞毒性の見られない濃度域を決定するために、被験物質の濃度を７段階に変えて以下の試験を行った（各ｎ＝３）。上記細胞を５×１０３ｃｅｌｌｓ／０．１ｍL／ウェルとなるよう上記増殖培地で調製し、９６ウェルプレートに播種した。ＣＯ２インキュベーター内（５％ＣＯ２、３７℃）で１日間培養後、ＤＭＳＯに被験物質を溶解させ、ＤＭＳＯ濃度が０．１質量％となるように添加した試験培地、又は被験物質無溶解の、ＤＭＳＯ濃度が０．１質量％となるように添加した試験培地（対照）に置換した。その後、３日間培養し、ｗｓｔ−８法で生細胞数測定を行った。具体的には、生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．０７５５３−１５）を１０％添加した培地に交換し、ＣＯ２インキュベーター内（５％ＣＯ２、３７℃）でインキュベートし、６０分間の吸光度（４５０ｎｍ）変化量をプレートリーダーで測定した。
【００５５】
（３）細胞増殖試験
細胞増殖の見られる濃度域を決定するために、被験物質を３段階の濃度に変えてＤＭＳＯに溶解させ、さらに試験培地にＤＭＳＯ濃度が０．１質量％となるように添加して得た被験物質添加試験培地について、以下の試験を行った（各ｎ＝５）。また、対照として０．１質量％ＤＭＳＯ溶媒添加試験培地についても同様の試験を行った。
【００５６】
上記細胞を、５×１０３ｃｅｌｌｓ／０．１ｍL／ウェルとなるよう、増殖培地で調製し、９６ウェルプレートに播種した。ＣＯ２インキュベーター内（５％ＣＯ２、３７℃）で１日間培養後、被験物質を添加した試験培地、又は対照の試験培地に置換した。１日間及び３日間培養後、ｗｓｔ−８法で生細胞数測定を行った。具体的には、生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク、Ｃａｔ．Ｎｏ．０７５５３−１５）を１０質量％添加した培地に交換し、ＣＯ２インキュベーター内（５％ＣＯ２、３７℃）でインキュベートし、６０分間の吸光度（４５０ｎｍ）変化量をプレートリーダーで測定した。
【００５７】
上記予備試験及び細胞増殖試験の結果に基づき、被験物質添加試験培地の被験物質濃度を、比較例１（大豆胚芽塩酸抽出物）では特許文献１が採用した４００及び８００μｇ／ｍＬ、比較例２（β−シトステロール）では０．１２４、１０及び５０μｇ／ｍＬ、そして実施例１〜３（植物油不鹸化物）では５０μｇ／ｍＬと決定した。
【００５８】
（４）ヒアルロン酸産生促進試験
実施例１〜３では植物油（大豆胚軸油、大豆油又はコーン油）の不鹸化物、比較例１では大豆胚芽塩酸抽出物、そして比較例２ではβ−シトステロール（試薬）をそれぞれ有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤のヒアルロン酸産生率を以下の手順で測定した。
【００５９】
上記細胞を、５×１０３ｃｅｌｌｓ／０．１ｍＬ／ウェルとなるよう増殖培地で調製し、９６ウェルプレートに播種した。ＣＯ２インキュベーター内（５％ＣＯ２、３７℃）で１日間培養後、上記被験物質添加試験培地又は０．１質量％ＤＭＳＯ溶媒添加試験培地に置換した。その後、３日間培養し、培養上清を回収して測定まで−８０℃の温度で保存した。ＤｕｅＳｅｔ  Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＤＹ３６１４）を用いて、培養上清中のヒアルロン酸濃度を定量化した。各試験を５回行って、平均値と標準偏差を求めた。その際、ヒアルロン酸産生率を、対照（０．１質量％ＤＭＳＯ）の細胞当たりのヒアルロン酸産生量を１００とした場合の相対値で求めた。結果を表６及び図１に示す。なお、細胞当たりのヒアルロン酸産生量は、Ｓｔｕｄｅｎｔ‘ｓ  ｔによる有意差検定により、対照（０．１質量％ＤＭＳＯ）に対して実施例１は危険率０．１％で、実施例２及び３は危険率１％で有意差があった。一方で、比較例２は危険率５％で有意差がなかった。
【００６０】
【表６】
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【００６１】
表６及び図１を見ると、特許文献１と同様に大豆胚芽塩酸抽出物を４００〜８００μｇ／ｍＬの高濃度で含むヒアルロン酸産生促進剤（比較例１）は、対照（０．１質量％ＤＭＳＯ）と比べて低いヒアルロン酸産生率を示す。β−シトステロールを５０μｇ／ｍＬ含むヒアルロン酸産生促進剤（比較例２）もまた、対照と同程度のヒアルロン酸産生率を示す。一方、本発明に従って植物油の不鹸化物を５０μｇ／ｍＬの濃度で含むヒアルロン酸産生促進剤（実施例１〜３）は、いずれもヒアルロン酸産生率が増大した。実施例１〜３の結果は、植物油の不鹸化物にヒアルロン酸産生向上作用があることを示している。特に、大豆胚軸油は、不鹸化物収率及びヒアルロン酸産生率が高いことから、植物油の候補として最も好ましいといえる。
【００６２】
実施例１で用いた大豆胚軸油の不鹸化物には、比較例２のβ−シトステロールのようなステロールが含まれている。特許文献２によれば、β−シトステロール濃度が０．３μＭ（０．１２４μｇ／ｍＬに相当）で最も高いヒアルロン酸産生量を示す。
そこで、β−シトステロールを有効成分として含むヒアルロン酸産生促進剤について、有効成分濃度を０．１２４〜５０μｇ／ｍLに変えてヒアルロン酸産生率を測定するとともに、大豆胚軸油不鹸化物を有効成分として含むヒアルロン酸産生促進剤について、有効成分濃度を１０〜５０μｇ／ｍLに変えてヒアルロン酸産生率を測定した。結果を表７及び図２に示す。なお、細胞当たりのヒアルロン酸産生量は、Ｓｔｕｄｅｎｔ‘ｓ  ｔによる有意差検定により、対照（０．１質量％ＤＭＳＯ）に対して実施例１の大豆胚軸油不鹸化物の濃度を１０μｇ／ｍＬとした検体は、危険率５％で有意差があった。
【００６３】
【表７】
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【００６４】
表７及び図２を見ると、β−シトステロールを単独使用した比較例２では、ヒアルロン酸産生率が濃度依存的に上昇しているものの、その上昇率は非常に緩やかである。一方、大豆胚軸油不鹸化物を使用した実施例１では、ヒアルロン酸産生率は、濃度依存的かつ顕著に増大した。しかも、１０μｇ／ｍＬの大豆胚軸油不鹸化物を用いたヒアルロン酸産生促進剤は、５０μｇ／ｍＬのβ−シトステロールを用いたヒアルロン酸産生促進剤よりも効果が優れている。これは、特許文献１や２から全く予測し得ない意外な知見である。
【図１】
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【図２】
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