(57)【要約】      （修正有）【課題】予め充填されたプラスチッククロマトグラフィーカラムの滅菌方法を提供する。【解決手段】適切なレベルのガンマ線を照射して滅菌を行う。照射中の充填媒体を保護するためにカラムに充填する保護液に特定の添加剤を含めることにより、十分な充填媒体官能基は維持され、親和性捕捉性の低下は阻止または回避される。同時にプラスチックカラムの機械的特性と定格圧力も維持される。【選択図】図１
2020024207.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
滅菌充填クロマトグラフィーカラムを調製する方法であって、
（ａ）管を選択するステップと、
（ｂ）前記管の中に充填媒体を加え、前記管の両端を閉じることにより、充填カラムを作製するステップと、
（ｃ）前記カラムに、８ｋＧｙ以上約４０ｋＧｙまでの線量のガンマ線を照射することにより、滅菌充填クロマトグラフィーカラムを作製するステップとを含む、方法。
【請求項２】
前記クロマトグラフィーカラムは、前記管と、第１のフローディストリビュータと、第２のフローディストリビュータとを含み、
前記管、前記第１のフローディストリビュータ、および前記第２のフローディストリビュータは各々、同一のまたは異なるプラスチック材料からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プラスチック材料は、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリアミド、アセタール、ガラス充填プラスチック、炭素充填プラスチック、ガラス繊維プラスチック、または炭素繊維プラスチック、または炭素繊維プラスチックを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記充填媒体は、アガロース、シリカ、セラミック、またはアクリル酸エステルもしくはセルロース系材料の重合体を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記充填媒体は、イオン交換基、疎水性および帯電性を有するマルチモーダル基、金属キレート基、疎水基、または、免疫グロブリンＩｇＧに結合可能なブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）ポリペプチドのうちの１つ以上を用いて官能化されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記イオン交換基は、第四級アミン、硫酸塩、およびカルボン酸塩のうちの１つ以上を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記疎水基は、プロピル、オクチル、およびフェニル基のうちの１つ以上を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ＳｐＡポリペプチドは、全長野生型ＳｐＡ、組換えＳｐＡ、ＳｐＡドメインＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、もしくはＺから選択されたＳｐＡドメインを含む単量体ＳｐＡポリペプチド、または、ＳｐＡドメインＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、もしくはＺから選択されたいずれか２つ、３つ、４つ、または５つ以上のＳｐＡドメインを任意に組合わせたものを含む多量体ＳｐＡポリペプチド、または、その機能的等価物を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記ＳｐＡポリペプチドは多量体ＳｐＡポリペプチドを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記多量体ＳｐＡポリペプチドは、ＳｐＡドメインＢ、Ｃ、およびＺから選択された４つまたは５つのＳｐＡドメインを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＳｐＡドメインはすべて同一である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記多量体ＳｐＡポリペプチドは５つのＳｐＡドメインＣを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記カラム内の前記充填媒体に保護液を加えるステップをさらに含み、
前記保護液は、０．１〜２５．０パーセント（体積／体積）のアルコールを含む、請求
項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記保護液は、０．１〜５．０パーセント（体積／体積）のアルコールを含み、
前記アルコールは芳香族アルコールを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記芳香族アルコールはベンジルアルコールを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記保護液は、２．０〜２５．０パーセント（体積／体積）のアルコールを含み、
前記アルコールは脂肪族第一級アルコールを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記脂肪族第一級アルコールはエタノールを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記管の両端を閉じるステップは、
前記管よりもわずかに大きいフローディストリビュータを前記管の端部に挿入し締り嵌めを一端においてなすステップと、
充填媒体を前記管に加えるステップと、
別のフローディストリビュータを挿入することにより、前記管の中に媒体の充填ベッドを作製するステップとを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ガンマ線照射の線量は、８、１０、１５、２０、２５、３０、３３、３５、または４０ｋＧｙ以上を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ガンマ線照射の前に気密防水容器に前記カラムを封入するステップをさらに含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ガンマ線照射の前に第２の気密防水容器に前記カラムを封入することにより、二重層の囲いを与えるステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
滅菌充填クロマトグラフィーカラムであって、
（ａ）２つの端部を有する滅菌中空管と、
（ｂ）前記管内の滅菌充填クロマトグラフィー媒体とを含み、前記管の両端が閉じられることにより、充填カラムが作製され、
前記充填カラムの無菌性保証レベル（ＳＡＬ）は１０−３微生物数／カラムである、滅菌充填クロマトグラフィーカラム。
【請求項２３】
前記充填カラムのＳＡＬは１０−６微生物数／カラムである、請求項２２に記載の滅菌充填クロマトグラフィーカラム。
【請求項２４】
前記クロマトグラフィーカラムは、前記管と、第１のフローディストリビュータと、第２のフローディストリビュータとを含み、
前記管、前記第１のフローディストリビュータ、および前記第２のフローディストリビュータは各々、同一のまたは異なるプラスチック材料からなる、請求項２２および２３のいずれか一項記載の滅菌充填クロマトグラフィーカラム。
【請求項２５】
前記プラスチック材料は、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリアミド、アセタール、ガラス充填プラスチック、炭素充填プラスチック、ガラス繊維プラスチック、または炭素繊維プラスチック、または炭素繊維プラスチックを含む、請求項２４に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項２６】
前記充填媒体は、アガロース、シリカ、セラミック、またはアクリル酸エステルもしく
はセルロース系材料の重合体を含む、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項２７】
前記充填媒体は、イオン交換基、疎水性および帯電性を有するマルチモーダル基、金属キレート基、疎水基、または、免疫グロブリンＩｇＧに結合可能なブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）ポリペプチドのうちの１つ以上を用いて官能化されている、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項２８】
前記イオン交換基は、第四級アミン、硫酸塩、およびカルボン酸塩のうちの１つ以上を含む、請求項２７に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項２９】
前記疎水基は、プロピル、オクチル、およびフェニル基のうちの１つ以上を含む、請求項２７に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項３０】
前記ＳｐＡポリペプチドは、全長野生型ＳｐＡ、組換えＳｐＡ、ＳｐＡドメインＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、もしくはＺから選択されたＳｐＡドメインを含む単量体ＳｐＡポリペプチド、または、ＳｐＡドメインＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、もしくはＺから選択されたいずれか２つ、３つ、４つ、または５つ以上のＳｐＡドメインを任意に組合わせたものを含む多量体ＳｐＡポリペプチド、または、その機能的等価物を含む、請求項２７に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項３１】
前記ＳｐＡポリペプチドは多量体ＳｐＡポリペプチドを含む、請求項３０に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項３２】
前記多量体ＳｐＡポリペプチドは、ＳｐＡドメインＢ、Ｃ、およびＺから選択された４つまたは５つのＳｐＡドメインを含む、請求項３１に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項３３】
前記ＳｐＡドメインはすべて同一である、請求項３２に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項３４】
前記多量体ＳｐＡポリペプチドは５つのＳｐＡドメインＣを含む、請求項３３に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項３５】
前記管の内径よりもわずかに大きい外径を有するフローディストリビュータによって前記管の２つの端部が閉じられて締り嵌めがなされている、請求項２２〜３４のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項３６】
前記カラムは気密防水容器に封入される、請求項２２〜３５のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項３７】
前記カラムがさらにガンマ線照射の前に第２の気密防水容器に封入されることにより、二重層の囲いが設けられる、請求項３６に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項３８】
滅菌充填クロマトグラフィーカラムであって、
第１の端部と第２の端部を有する滅菌中空管と、
前記管の第１の端部に固定された第１の滅菌フローディストリビュータと、
前記管の内径よりも大きい外径を有する第２の滅菌フローディストリビュータと、
前記第１のフローディストリビュータと前記第２のフローディストリビュータとの間において前記管に充填された滅菌充填媒体とを含み、
前記第２のフローディストリビュータは、前記管の第２の端部内に固定されて、前記第
１のフローディストリビュータと前記第２のフローディストリビュータとの間において前記中空管の中に、前記充填媒体が充填されるチャンバを形成し
前記充填クロマトグラフィーカラムの無菌性保証レベルは１０−３微生物数／カラムである、滅菌充填クロマトグラフィーカラム。
【請求項３９】
前記カラムのＳＡＬは１０−６微生物数／カラムである、請求項３８に記載の滅菌充填クロマトグラフィーカラム。
【請求項４０】
前記カラム内の前記充填媒体の特異吸着レベルは、ガンマ線で照射されていないカラム内の同種の充填媒体の特異吸着レベルの少なくとも６０％である、請求項３８に記載の滅菌充填クロマトグラフィーカラム。
【請求項４１】
前記充填媒体は、０．５〜５．０パーセント（体積／体積）の芳香族アルコール、または、２．０〜２５パーセント（体積／体積）の脂肪族第一級アルコールを含む、請求項３８に記載の滅菌充填クロマトグラフィーカラム。
【請求項４２】
前記充填媒体は、０．５〜３．０パーセント（体積／体積）のベンジルアルコールを含む、請求項３８に記載の滅菌充填クロマトグラフィーカラム。
【請求項４３】
前記充填媒体は、２．０〜２０％のエタノールを含む、請求項３８に記載の滅菌充填クロマトグラフィーカラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示はクロマトグラフィーカラムの滅菌に関する。
背景
カラムクロマトグラフィーは、分離および／または精製技術である。この技術では、充填された媒体の固定「ベッド」が硬質の管またはカラムに収容されている。充填媒体は、固体の粒子の形態（「固定相」）であってもよく、または、液体固定相で覆われた固体支持材料であってもよい。いずれにしても、充填媒体は一般的に、カラム管の内容積を満たす。
【背景技術】
【０００２】
分離クロマトグラフィーでは、液体サンプル（「移動相」）がカラムの中を通り抜けるときに、このサンプル内の異なる化合物は、固定相との関係が異なることにより、移動相よりも速度が低下して異なる速度でカラムの中を移動する。このため、固定相との関係が強い化合物は、それよりも関係が弱い化合物よりも移動速度が遅く、この速度の違いの結果、化合物はカラムの中を通ってカラムから出るときに分離される。
【０００３】
アフィニティクロマトグラフィーでは、充填媒体が、液体サンプル中の１つ以上の所望の化合物または分子と特定的に結合する、抗原、抗体、またはリガンド等の結合剤を含む。このため、液体サンプルが充填媒体を通って流れるときに、上記所望の化合物または分子のみがカラムの中に残る。その後、溶離液が、充填媒体を通って流れるときに、所望の化合物または分子を、充填媒体に付着した結合剤から分離する、または、結合剤を充填媒体から分離する。いずれにしても、所望の化合物または分子は、カラムから出されて溶離液の中に集められる。アフィニティクロマトグラフィーは、核酸精製、無細胞抽出物からのタンパク質の精製、および血液からの精製を含む、多数の用途で使用することができる。
【０００４】
連続プロセスおよび多品種プロセス等のバイオプロセスにおける新たな開発では、微生物のコントロールに一層の厳重さが求められる。細胞培養から下流の精製までの滅菌流路は、汚染のリスクが低下していなければならない。したがって、高レベルの性能を維持する滅菌使い捨てカラムを作ることが可能であるということは、非常に有益であろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
概要
プラスチッククロマトグラフィーカラムに、特定範囲、たとえば８．０〜３５または４０ｋＧｙのガンマ線を照射した場合に、これらのクロマトグラフィーカラムが、異なる無菌性保証レベル（ＳＡＬ）に滅菌される一方で、非常に有益な機能を維持しているという発見に、本発明は少なくとも一部基づいている。たとえば、最大３５または４０ｋＧｙという高レベルの照射でも、プラスチックカラムは、照射後、それぞれの最初のガンマ線照射前定格圧力と機械的特性を維持している。加えて、共有結合した親和性リガンド、たとえば固定プロテインＡを含有した充填媒体を含むカラムは、本明細書に記載の滅菌方法による処理後、適切な性能を維持している。本明細書に記載の方法は、照射中の充填媒体を保護するためにカラムに充填された保護液に特定の添加剤を含めることにより、一般的に照射によって発生し得る、充填媒体を変性させるために使用される結合剤たとえばプロテインＡの親和性捕捉性の低下を、阻止または回避する。
【０００６】
ある局面において、本開示は、クロマトグラフィーカラムを作製して充填し、次に、本
明細書に記載の特定の技術とパラメータを用いてこれらのカラムを滅菌する方法に注目する。これらの方法は、（ａ）たとえば所望の量の充填媒体を収容するのに適切な内径と長さを有する、プラスチック材料または別の適切な弾性材料からなるカラム管を選択するステップと、（ｂ）たとえば、プロテインＡ、たとえば全長野生型ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）または組換え形態のプロテインＡ等の、官能化もしくは結合剤に共有結合された、充填媒体、たとえばアガロースもしくはシリカビーズまたは他の適切なクロマトグラフィー充填媒体を加えるステップと、（ｃ）たとえば、管内に「プレス嵌め」または「締り嵌め」されたものとして与えることができるキャップまたはシールで管を閉じることにより、充填された媒体を管内に充填ベッドとして封入して、媒体の封止充填ベッドを得るステップと、（ｄ）任意で、気密防水容器たとえばプラスチックバッグ、シリンダ、またはボックス内に、充填カラムを封入するまたは封じ込めるステップと、（ｅ）上記容器内のカラムに、８ｋＧｙ以上約３５または４０ｋＧｙまでの線量、たとえば、１０、１５、２０、２５、３０、３３、３５、または４０ｋＧｙの線量のガンマ線を照射するステップとを含む。
【０００７】
次に、任意でまだ気密容器内にあるカラムを、放射源から外し、このカラムを、密閉容器内で移動させることにより、カラムの内外の無菌状態を維持してもよい。気密防水容器は、カラムの外面の無菌性を保つ必要がある場合のみ、必要である。このような容器がなくても、滅菌されたカラムの内部および充填媒体は、カラムの入口と出口が密閉されたままであれば、無菌状態を保つであろう。
【０００８】
このレベルの照射によって、無菌性保証レベル（ＳＡＬ）という観点から説明できる滅菌充填カラムが得られる。ＳＡＬは、１つの単位、たとえば１つの充填カラムの滅菌後の非無菌性の確率であり、ＳＡＬは、放射線量と、照射前の材料の固有バイオバーデンとによって決まる。本明細書に記載のカラム構成要素等、バイオバーデンが低いアイテムは、線量２５ｋＧｙを用いたとき、１０−６微生物数／単位という無菌性保証レベルに達するであろう。これは、比較的高い無菌レベルである（滅菌された１００万個の単位のうち１単位のみ、たとえば１つのカラムのみが非無菌状態）。照射前の充填カラムの初期バイオバーデンがより高い場合は、より高いレベル、たとえば３０〜４０ｋＧｙのガンマ線を用いて、これと同一のＳＡＬを得ることができる。別の、幾分低いがそれでも有用な無菌レベルは、線量８ｋＧｙを用いたときに得られる１０−３微生物数／単位である（Guide to
Irradiation and Sterilization validation of Single-Use Systems, Bioprocess International, 2008およびこの中の引用文献参照）。他のレベルは、１０−４微生物数／単
位および１０−５微生物数／単位を含む。
【０００９】
これらの方法のさまざまな実装例において、プラスチック材料は、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリアミド、アセタール、ガラス充填プラスチック、炭素充填プラスチック、ガラス繊維プラスチック、または炭素繊維プラスチック、または炭素繊維プラスチックを含み得る。充填媒体は、アガロース、シリカ、セラミック、またはアクリル酸エステルもしくはセルロース系材料の重合体を含み得る。
【００１０】
いくつかの実施形態において、充填媒体は、イオン交換基、疎水性および帯電性を有するマルチモーダル基、金属キレート基、疎水基、または、免疫グロブリンＩｇＧに結合可能なブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）ポリペプチドのうちの１つ以上を用いて官能化されていてもよい。たとえば、イオン交換基は、第四級アミン、硫酸塩、およびカルボン酸塩のうちの１つ以上を含み得る。また、疎水基は、プロピル、オクチル、およびフェニル基のうちの１つ以上を含み得る。
【００１１】
加えて、さまざまな実装例において、ＳｐＡポリペプチドは、全長野生型ＳｐＡ、組換えＳｐＡ、ＳｐＡドメインＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、もしくはＺから選択されたＳｐＡドメイ
ンを含む単量体ＳｐＡポリペプチド、または、ＳｐＡドメインＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、もしくはＺから選択されたいずれか２つ、３つ、４つ、または５つ以上のＳｐＡドメインを任意に組合わせたものを含む多量体ＳｐＡポリペプチド、または、その機能的等価物を含み得る。たとえば、ＳｐＡポリペプチドは多量体ＳｐＡポリペプチドであってもよく、たとえば、多量体ＳｐＡポリペプチドは、ＳｐＡドメインＢ、Ｃ、およびＺから選択された４つまたは５つのＳｐＡドメインを含み得る。たとえば、ＳｐＡドメインすべてが同一であってもよく、３つ、４つまたは５つのＳｐＡドメインすべてがＣドメインであってもよい。
【００１２】
さまざまな実施形態において、本明細書に記載の滅菌カラム製造方法はさらに、適切な大きさを有する第１および第２のフローディストリビュータを選択するステップを含み、少なくとも第２のフローディストリビュータ（または第１および第２のフローディストリビュータ双方）は、管の内径よりも大きい直径、たとえば、管の内径よりも約０．２５〜５．０％大きい直径を有する。上記方法はまた、第１のフローディストリビュータを管の第１の端部に永続的に固定するステップと、カラム管内に充填媒体を加えた後に、第２のフローディストリビュータを管の第２の端部に挿入するステップとを含み得る。このとき、軸方向力を加えることによって第２のフローディストリビュータをカラム管内に押込んで締り嵌めし、たとえばそうすることによって、第１および第２のフローディストリビュータの間において管内に密閉たとえば静水圧密閉チャンバを形成するのに十分有効なフープ応力を誘起する。上記方法はまた、管内における第２のフローディストリビュータの長手方向位置を、（ｉ）カラム管内の所望の位置に第２のフローディストリビュータが達するまでさらに軸方向力を第２のフローディストリビュータに加えることにより、または、（ｉｉ）液体をチャンバ内に押込んで水圧力を加えて第２のフローディストリビュータを管の第２の端部に向けて戻すように移動させることにより、または、（ｉ）と（ｉｉ）の組合わせにより、調整するステップと、第２のフローディストリビュータが適切に位置決めされたときに、第２のフローディストリビュータを管内に永続的に固定するステップとを含み得る。
【００１３】
特定の実装例において、充填媒体は、適切な緩衝液中に約４０％〜約７０％の固体を含むスラリーであってもよい。充填媒体がカラム内に充填された後に、保護液を加えてもよい。この保護液は、充填された媒体の官能性に影響を与え得る緩衝剤またはそれ以外の添加剤を含み得る。たとえば、本明細書に記載のように、芳香族アルコールを低いパーセンテージ（Ｖ／Ｖ）で保護液に加えることによって、プロテインＡ等の結合剤で官能化された、ガンマ線滅菌充填媒体の親和性捕捉性を保つことができる。
【００１４】
さまざまな実装例において、カラム内の充填媒体に加えられる保護液は、０．１〜２５．０パーセント（体積／体積）のアルコールを含み得る。たとえば、いくつかの実施形態において、保護液は、０．１〜５．０パーセント（体積／体積）のアルコールを含み、このアルコールは、ベンジルアルコール等の芳香族アルコールを含む。他の実施形態において、保護溶液は、２．０〜２５．０パーセント（体積／体積）のアルコールを含み、このアルコールは、エタノール等の脂肪族第一級アルコールを含む。
【００１５】
別の局面において、本開示は、滅菌クロマトグラフィーカラムそのものに注目する。これらの滅菌充填クロマトグラフィーカラムは、（ａ）２つの端部を有する滅菌中空管と、（ｂ）この管内の滅菌充填クロマトグラフィー媒体とを含み、この管の両端が閉じられることにより、充填カラムが作製され、充填カラムの無菌性保証レベル（ＳＡＬ）は１０−３微生物数／カラムである。いくつかの実装例において、ＳＡＬは１０−６微生物数／カラムである。
【００１６】
これらの滅菌充填クロマトグラフィーカラムについて、クロマトグラフィーカラムは、
管と、第１のフローディストリビュータと、第２のフローディストリビュータとを含み、これらの構成要素は各々、同一のまたは異なるプラスチック材料からなるものであってもよい。プラスチック材料は、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリアミド、アセタール、ガラス充填プラスチック、炭素充填プラスチック、ガラス繊維プラスチック、または炭素繊維プラスチック、または炭素繊維プラスチックのうちの１つ以上を含み得る。
【００１７】
さまざまな実施形態において、カラム内の充填媒体は、アガロース、シリカ、セラミック、またはアクリル酸エステルもしくはセルロース系材料の重合体を含み得る。特定の実装例において、充填媒体は、イオン交換基、疎水性および帯電性を有するマルチモーダル基、金属キレート基、疎水基、または、免疫グロブリンＩｇＧに結合可能なブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）ポリペプチドのうちの１つ以上で官能化されていてもよい。たとえば、イオン交換基は、第四級アミン、硫酸塩、およびカルボン酸塩のうちの１つ以上を含み得る。また、疎水基は、プロピル、オクチル、およびフェニル基のうちの１つ以上を含み得る。
【００１８】
いくつかの実施形態において、ＳｐＡポリペプチドは、全長野生型ＳｐＡ、組換えＳｐＡ、ＳｐＡドメインＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、もしくはＺから選択されたＳｐＡドメインを含む単量体ＳｐＡポリペプチド、または、ＳｐＡドメインＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、もしくはＺから選択されたいずれか２つ、３つ、４つ、または５つ以上のＳｐＡドメインを任意に組合わせたものを含む多量体ＳｐＡポリペプチド、または、その機能的等価物を含み得る。たとえば、ＳｐＡポリペプチドは、たとえば、ＳｐＡドメインＢ、Ｃ、およびＺから選択された４つまたは５つのＳｐＡドメインを含む多量体ＳｐＡポリペプチドであってもよい。たとえば、ＳｐＡドメインすべてが同一であってもよく、たとえば、多量体ＳｐＡポリペプチドは、３つ、４つまたは５つのＳｐＡドメインＣを含み得る。
【００１９】
特定の実施形態において、管の２つの端部は、管の内径よりもわずかに大きい外径を有して締り嵌めをなすフローディストリビュータによって閉じられる。加えて、本明細書に記載の実施形態および実装例のうちのいずれかにおいて、カラムは、本明細書に記載のように照射前に気密防水容器内に封じ込められてもよい。加えて、カラムはさらに、ガンマ線照射前に第２の気密防水容器内に封じ込められて二重層の囲いが与えられてもよい。したがって、最終製品は、気密防水容器内に封じ込められた、滅菌され予め充填されたプラスチッククロマトグラフィーカラムである。これらの機能性および経済性が高いカラムは、使い捨て可能とみなすことができるが、複数回再利用されるための機能的完全性を有する。
【００２０】
いくつかの実装例において、本開示は滅菌充填クロマトグラフィーカラムに注目し、このカラムは、第１の端部および第２の端部を有する滅菌中空管と、管の第１の端部に固定された第１の滅菌フローディストリビュータと、管の内径よりも大きい外径を有する第２の滅菌フローディストリビュータと、第１のフローディストリビュータと第２のフローディストリビュータとの間において管に充填された滅菌充填媒体とを含む。第２のフローディストリビュータは、管の第２の端部内に固定されて、第１のフローディストリビュータと第２のフローディストリビュータとの間において中空管の中に、充填媒体が充填されるチャンバを形成する。充填クロマトグラフィーカラムの無菌性保証レベルは、１０−３または１０−６微生物数／カラムである。
【００２１】
これらの滅菌クロマトグラフィーカラム内の充填媒体は、ガンマ線が照射されていないカラム内の同種の充填媒体の特異吸着レベルの少なくとも６０％の特異吸着レベルを有し得る。加えて、さまざまな実施形態において、充填媒体は、０．５〜５．０パーセント（体積／体積）の芳香族アルコール、または、２．０〜２５パーセント（体積／体積）の脂肪族第一級アルコールを含み得る。たとえば、充填媒体は、０．５〜３．０パーセント（
体積／体積）のベンジルアルコールまたは２．０〜２０％のエタノールを含み得る。
【００２２】
いくつかの実施形態において、プラスチック管はさらに、第１の端部において増大した端部直径ＤＴｅを有してチャンバを形成し、第１のフローディストリビュータはＤＴｉよりも大きい外径Ｄｆｄを有し、第１のフローディストリビュータは、管の第１の端部内に直接締り嵌めによって固定されて十分なフープ応力を誘起する。特定の実施形態において、第１のフローディストリビュータは管に永続的に結合される、または、第１および第２のフローディストリビュータ双方が溶接接合等の永続結合によって管の内壁に固定されてもよい。
【００２３】
特定の実施形態において、カラムまたは管内のチャンバの中に充填媒体を含む新たなクロマトグラフィーカラムは、静水圧で密閉されていてもよい。特定の実施形態において、チャンバは、１平方インチ当たり少なくとも５０ポンドの内圧に耐えるように構成される。いくつかの実施形態において、これらの３つの特徴すべてが存在する。いくつかの実施形態において、プラスチック管および第２のフローディストリビュータは同一種類のプラスチックからなり、第１のフローディストリビュータは管に一体化された機能である。
【００２４】
本明細書で使用する「プラスチック」という用語は、さまざまな高分子材料から作られたクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィーカラムの構成要素を指し、上記高分子材料は、熱可塑性物質、たとえばアクリロニトリル・ブタジエン・スチレン（ＡＢＳ）、アクリル樹脂、たとえばポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリオレフィン、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＴＥ）、ポリカーボネート、および、２種類以上のプラスチックおよび／または高分子材料からなるさまざまなプラスチック複合材料、ならびに、熱硬化性プラスチック、たとえばエポキシ樹脂および繊維（たとえばガラス、金属（たとえばステンレス鋼）、または炭素繊維）強化プラスチック等である。
【００２５】
本明細書で使用する「ベッド高さ」という用語は、完成したクロマトグラフィーカラム内に含まれる充填媒体のベッドの直線状の高さを指す。
【００２６】
本明細書で使用する「充填媒体」は、後にカラム内に「充填ベッド」を形成する、不規則な形状または球形の粒子の形態の固体材料のスラリーまたは懸濁液である。充填媒体は、シリカ、セラミック、アガロース、アクリルまたはセルロースポリマー等のさまざまな材料から作ることができる。固体材料は、イオン性、疎水性、または特異親和性という特徴を与える分子構造で（たとえば抗体またはプロテインＡ等の結合剤で）官能化されていてもよい。
【００２７】
本明細書で使用する「充填ベッド」は、クロマトグラフィーカラム内のクロマトグラフィー充填媒体の最終状態を指す。この最終状態はさまざまなやり方で得られる。たとえば、１つの方法は、ベッドの軸方向の圧縮を生じさせる流体の流れをフローディストリビュータのうちの一方または双方と組合わせることである。当該技術で周知の他の方法は、粒子の重力沈降、振動による沈降、および／または機械的な軸方向の圧縮のみを含む。充填後、充填ベッドは、一般的に抗菌性添加剤を含む保護液内において水和した状態のままである。本明細書に記載のこの保護液は、さらにまたは代わりに、ガンマ線照射の有害な影響から、官能化された固体サポートの完全性または性能を保護するのに役立ち得る、１つ以上の緩衝剤またはその他の添加材を含み得る。たとえば、保護液は、照射後の媒体のクロマトグラフィー性能の保全性を高める、低いパーセント（Ｖ／Ｖ）の、エタノールもしくはベンジルアルコール等の脂肪族もしくは芳香族アルコール、または、糖アルコール等のポリオールを含み得る。
【００２８】
本明細書で使用する「ベッドサポート」は、さまざまな液体を通しつつも、充填ベッドを含む充填媒体の小さな粒子は保持する、ネット、スクリーン、メッシュ、またはフリットである。これらのベッドサポートは、フローディストリビュータに直接接続されていてもよい。
【００２９】
本明細書で使用する「永続結合」および「永続的に結合される」という用語は、２つの構成要素間のこのような結合が、結合をまたは結合された構成要素（たとえば管とフローディストリビュータ）のうちの一方または双方を破断する以外に、分離できないことを示すために用いている。
【００３０】
本明細書に記載の新たな方法およびシステムは、数多くの利点と利益を提供する。たとえば、この新たな方法によって、ベッドの高さと直径が十分にカスタマイズ可能で可変であり、かつ所望のＳＡＬを有しつつも、十分に官能性がある充填媒体を有する、予め充填され使い捨て可能なカラムを調製することができる。驚くべきことに、本明細書に記載のガンマ線照射方法は、充填媒体または結合剤の性能を大幅に低下させることはなく、かつ、汚染物質を生じさせるもしくは取込むこともなく、または、このような汚染物質を、標準水性緩衝剤内での使用後にクロマトグラフィーカラムを組立てるのに使用される材料から浸出させることもなかった。
【００３１】
特に定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術および科学用語は、本発明が属する技術の当業者が一般に理解するのと同一の意味を有する。本発明の実施または試験において、本明細書に記載のものと同様または均等の方法および材料を使用することができるが、適切な方法および材料が以下に記載されている。本明細書に記載のすべての刊行物、特許出願、特許、およびその他の引用文献は、その全体を本明細書に引用により援用する。コンフリクトに備えて、本明細書が定義を含み管理する。加えて、材料、方法、および実施例は専ら例示のためであり限定を意図したものではない。
【００３２】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面と以下の説明に記載されている。本発明のその他の特徴、目的、および利点は、以下の説明および図面、ならびに請求項から明らかになるであろう。
【００３３】
異なる図面における同様の参照符号は同様の要素を示す。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本明細書に記載のクロマトグラフィーカラムのうちの１つの概略図である。
【図２ａ】図１のカラムの概略断面図である。
【図２ｂ】図１のカラムの分解概略断面図である。
【図３ａ】カラム管の概略図である。
【図３ｂ】カラム管の断面を示す概略図である。
【図４ａ】本明細書に記載の新たなクロマトグラフィーカラムにおいて使用し得るフローディストリビュータの一例の上面図である。
【図４ｂ】本明細書に記載の新たなクロマトグラフィーカラムにおいて使用し得るフローディストリビュータの一例の正面図である。
【図４ｃ】本明細書に記載の新たなクロマトグラフィーカラムにおいて使用し得るフローディストリビュータの一例の底面図である。
【図５】カラム管への挿入直後のフローディストリビュータの断面を示す概略図である。
【図６】軸方向力をフローディストリビュータの上から加えてフローディストリビュータをカラム管に押込んでゆるみのない締り嵌めをなすために用いられるプレス内のカラム管の断面を示す概略図ある。
【図７】上部フローディストリビュータが適所で溶接された後のクロマトグラフィーカラムの概略図である。
【図８】本明細書に記載のクロマトグラフィーカラムのうちの１つの製造における基本工程のフローチャートである。
【図９ａ】端部が面取りされている管にフローディストリビュータを押込むときに発生する力の概略図である。
【図９ｂ】端部が面取りされている管にＯリングを有するフローディストリビュータを押込むときに発生する力の概略図である。
【図１０ａ】締り嵌めが形成された後に管にフローディストリビュータを押込むときに発生する力の概略図である。
【図１０ｂ】締り嵌めが形成された後に管にＯリングを有するフローディストリビュータを押込むときに発生する力の概略図である。
【図１１】管にフローディストリビュータを押込んで締り嵌めを形成するときに発生する力の一例を示すグラフである。
【図１２】管に押込まれている状態のフローディストリビュータの概略図である。
【図１３】ガンマ線照射されたポリプロピレンと照射されていないポリプロピレンの物理的外観の図である。
【図１４Ａ】水／エタノールへの暴露後の照射されていない構成要素と照射された構成要素の保持時間とピーク面積を示すグラフである。
【図１４Ｂ】水／エタノールへの暴露後の照射されていない構成要素と照射された構成要素の保持時間とピーク面積を示すグラフである。
【図１４Ｃ】水／エタノールへの暴露後の照射されていない構成要素と照射された構成要素の保持時間とピーク面積を示すグラフである。
【図１４Ｄ】水／エタノールへの暴露後の照射されていない構成要素と照射された構成要素の保持時間とピーク面積を示すグラフである。
【図１４Ｅ】水／エタノールへの暴露後の照射されていない構成要素と照射された構成要素の保持時間とピーク面積を示すグラフである。
【図１４Ｆ】水／エタノールへの暴露後の照射されていない構成要素と照射された構成要素の保持時間とピーク面積を示すグラフである。
【図１４Ｇ】水／エタノールへの暴露後の照射されていない構成要素と照射された構成要素の保持時間とピーク面積を示すグラフである。
【図１４Ｈ】水／エタノールへの暴露後の照射されていない構成要素と照射された構成要素の保持時間とピーク面積を示すグラフである。
【図１４Ｉ】水／エタノールへの暴露後の照射されていない構成要素と照射された構成要素の保持時間とピーク面積を示すグラフである。
【図１４Ｊ】水／エタノールへの暴露後の照射されていない構成要素と照射された構成要素の保持時間とピーク面積を示すグラフである。
【図１５】純粋なポリプロピレンと照射されたポリプロピレンの引張応力歪み曲線を示すグラフである。
【図１６】純粋なポリプロピレンと照射されたポリプロピレンの引張応力歪み曲線（歪み範囲減少）を示すグラフである。
【図１７】純粋なポリプロピレンと照射されたポリプロピレンの曲げ応力歪み曲線を示すグラフである。
【図１８】純粋なポリプロピレンと照射されたポリプロピレンの引張応力歪み曲線を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
詳細な説明
本明細書に記載の滅菌されたクロマトグラフィーカラムは、比較的安価なプラスチック材料で作ることができ、したがって、使い捨て可能とみなすことができるが、特に、複数
回の使用にも耐えるよう十分に頑強に設計されている。本明細書に記載の新たな滅菌方法は、所望の無菌性保証レベル（ＳＡＬ）を与えることにより、このクロマトグラフィーカラムを、現在入手できるクロマトグラフィーカラムよりも遥かに有用性が高いものにしつつ、充填された媒体の適切な機能性を維持するとともに求められる定格圧力と機械的特性を維持する。よって、この新たな滅菌され予め充填された使い捨て可能なカラムは、無菌または滅菌製造プロセス、たとえばタンパク質精製プロセスに使用できるようになっている。イオン化放射線は、ヒドロキシラジカルまたは一重項酸素等の活性酸素種によって、ポリペプチドを含む材料を劣化させる可能性があることは一般的に知られているので、結果として得られるこれらの性能は驚くべきものである。
【００３６】
本発明の実施形態は、無菌であり精製プロセスに使用できるタンパク質精製システムで用いるための、カラム内のクロマトグラフィー媒体の充填ベッドを含む組成物と適切な接続部とを含む。実施例は、ガンマ線照射による滅菌後でもクロマトグラフィー性能を保つクロマトグラフィーカラム用の材料を明らかにする。実施例はさらに、たとえば親和性に基づく分離のために官能化され、無菌性を得るのに十分なガンマ線照射の後に適切な分離性能を維持している、シリカおよびアガロース等の複数の固体サポートタイプのカラム充填媒体を明らかにする。他の実施例は、構成のカラム材料が、カラム材料から抽出または浸出可能な汚染物質を増やすガンマ線照射からの悪影響を受けないことを明らかにする。実施例はまた、バイオ医薬品精製プロセスで一般的に用いられている生物学的分離に用いるのに適した形態の滅菌された組成物を得るための手段を提供する。
【００３７】
クロマトグラフィーカラムの滅菌
新たな滅菌クロマトグラフィーカラムは、本明細書で定義するプラスチックからなり、したがって、その全体を、広範に利用されているプラスチック／熱可塑性物質および／または組成物（ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリアミド（多様なナイロン等）、アセタール、またはガラス充填、金属充填、もしくは炭素充填プラスチック、たとえばガラス繊維、鋼繊維、および炭素繊維プラスチック等）、またはエラストマー成分から作ることができ、所望のＳＡＬになるようガンマ線で滅菌される。当然、これらの材料は潜在的に、過剰に高い線量のガンマ線によってダメージを受ける可能性がある。加えて、充填媒体および官能化材料、たとえば結合剤も、不適切なレベルの放射線によってダメージを受ける可能性がある。このため、ＳＡＬガイドラインを満たすように十分滅菌されていながら、カラム充填媒体の十分な機能特性、カラムの機械的特性、および定格圧力を維持する、予め充填された使い捨て可能なクロマトグラフィーカラムを作製できたことは、驚くべきことであった。さらに、照射しても、目立った汚染物質が、一般的に使用される有機溶媒から抽出されることも、標準の水性緩衝剤における使用後に材料から浸出することもないことは、驚くべきことであった。
【００３８】
一般的に、カラムは、たとえば一種類以上の親和性リガンドまたは結合剤（例として、プロテインＡリガンド、たとえば組換え天然構造、または作り変えられた機能ドメイン）、イオン性相互作用リガンド、混合モードリガンド、および疎水性リガンドで官能化できる、シリカ、アガロース、セラミック、またはその他の高分子バックボーン等、さまざまな充填媒体のうちのいずれかで、充填される。一般的に、プロテインＡリガンドは、全長野生型ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）、組換え形態のプロテインＡ（たとえばPeyser他の米国特許第７，６９１，６０８号に記載）、または、たとえばドメインＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ，Ｅのうちのいずれか１つまたはこれらを組合わせたものから選択された、ＳｐＡのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以上のドメインを含む単量体もしくは多量体リガンド、またはプロテインＺ（たとえば、Spectorの米国特許第８，５９２，５５５号
およびHall他の米国特許第８，３２９，８６０号に記載）を、含み得る。たとえば、多量体ポリペプチドは、３つ、４つ、または５つ以上のドメインからなるものであってもよく、これらのドメインはすべて同一でも異なっていてもよい。たとえば、多量体プロテイン
は、５つのＳｐＡ  Ｃドメインを含んでペンタＣポリペプチドを形成し得る。
【００３９】
カラムおよび充填媒体、ならびにクロマトグラフィーカラムの特定の実施形態の組立方法のその他の詳細は、以下に示される。
【００４０】
カラムの充填後、充填媒体は、保護液による保護のために水和状態に保たれる。本明細書に記載のこの保護液は、たとえば、チオール基（たとえばシステイン）および脂肪族炭素上のヒドロキシル基（たとえばエタノール）等の化学基を含む特定の成分を含むように設計されている。加えて、保護液は、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等の化合物を含む他のアルコールを含み得る。
【００４１】
芳香族化合物は、放射線増感剤であり放射線ダメージを増すものであることが見出されることがあるが、芳香族アルコール、ベンジルアルコールを用いる本方法は、クロマトグラフィー媒体上に固定されたプロテインＡポリペプチドに対する保護性が高いことがわかった。このため、充填媒体と、官能化剤、たとえばプロテインＡ等の本明細書に記載の結合剤またはリガンドの、機能特性は、低いパーセンテージ（Ｖ／Ｖ）たとえば１〜２５％、たとえば１、２、３、５、７、８、１０、１２、１５、１８、２０、２３、または２５％の、脂肪族アルコール（たとえばエチルおよびイソプロピル）、芳香族アルコール（たとえばベンジル、トリプトフォール、チロソール、およびフェネチルアルコール（フェニルエタノール））または、糖アルコール（たとえばソルビトールおよびマンニトール）等のポリオールといった、アルコール含む、保護液の中で照射したときに、保護することができる。
【００４２】
充填媒体と保護液でカラムを充填し、フローディストリビュータをカラム管内に固定した後に、任意で、予め充填されたカラム全体を、気密防水容器に封入する。この容器は、たとえば、可撓性もしくは剛性を有し得るものでありかつ内側にある滅菌されたカラムとともに簡単に運ぶことができる、プラスチック、ゴム、またはその他の材料からなるバッグ、シリンダ、またはボックスである。この容器は、破裂させずに運ぶことができかつ容器内の滅菌条件の下で滅菌され予め充填されたカラムを維持するのに十分な頑強性を有するように設計される。場合によっては、カラムは容器を追加しなくても滅菌された状態を保つ。
【００４３】
容器への封入後、容器全体とその内部の予め充填されたカラムに、所望のＳＡＬが得られる線量のガンマ線を照射する。ＳＡＬの一般的な概念は、たとえば、全体を本明細書に引用により援用する「Guide to Irradiation and Sterilization Validation of Single-Use Bioprocess Systems,” BioProcess Int’l, 10-22 (May 2008)」に記載されている
。ガンマ線の線量の測定単位は、吸収された放射線エネルギを定量化するキログレイ（ｋＧｙ）である。１グレイは、１キログラムの物質による１ジュールの放射線エネルギの吸収である（１ｋＧｙ＝１ジュール／グラム）。８ｋＧｙ以上の線量は一般的に、低いバイオバーデンレベルを取除くのに十分であり、滅菌レベルとして１０−３微生物数／単位をもたらす。１０−６微生物数／単位というレベルは一般的に、２５ｋＧｙ以上の線量を用いると得ることができる。しかしながら、ガンマ線の線量が高すぎると、カラム充填媒体の機能が失われ、カラムそのものの機能でさえも失われる可能性がある。したがって、予め充填されたカラムに対するガンマ線のレベルは、８．０ｋＧｙ以上でなければならず、上限は約３５ｋＧｙ以上であってもよい。たとえば、照射レベルは、線量約８ｋＧｙと４０ｋＧｙの間から、たとえば、８、１２、１５、１７．５、２０、２２．５、２５、２７．５、３０、３２．５、３３、３５、３８、および４０ｋＧｙから選択される。
【００４４】
このような放射線量は、たとえば、照射された製品全体にイオン化（電子の乱れ）を生じさせるアイソトープ源（たとえばコバルト６０）から放出された高エネルギの光子を用
いることで、得ることができる。たとえば、充填されたカラムが封入された容器をチャンバに入れ、このチャンバ内で、所望のＳＡＬを得るのに十分な長さの時間、カラムを放射源に暴露してもよい。その後、また気密容器内にあるカラムを、放射源から外し、封入容器内で移動させることで、カラムの無菌性を維持することができる。カラム流路の無菌性は、製造プロセスで使用される、他の機器への滅菌接続ポートを提供する封止された配管と流路を用いることによって、ボックスまたはバッグ容器の外側で、維持することができる。カラム内の無菌性は、長時間の使用、たとえば滅菌されたカラムを収容するのに用いられる容器の性質に一部応じて一カ月、または二か月以上の使用にわたり、維持される。以下の実施例は、さまざまなレベルでガンマ線を照射すると、カラムの物理的特性の変化は最小であり、機械的および構造的特性は、照射されていないカラムのものと同様である。他の実施例は、ガンマ線照射後、クロマトグラフィー媒体の機能的特性の変化はごくわずかであり、クロマトグラフィー媒体はなおも生物学的製造に使用するのに適した態様で機能することを、明らかにしている。
【００４５】
クロマトグラフィーカラムおよび充填媒体
本明細書に記載のクロマトグラフィーカラムは主として、カラム管と一対のフローディストリビュータ（または１つのフローディストリビュータと１つの端部キャップ）で構成される。フローディストリビュータは、円筒ディスクと、液体がディスクに流れ込んでディスクを通過することを可能にする１つ以上の入口／出口パイプとを含む。加えて、フローディストリビュータは、フローディストリビュータのディスクの充填媒体側に装着された、ベッドサポート、スクリーン、および／またはフィルタを含み得る。
【００４６】
フローディストリビュータの流路は、標準的な技法と周知の設計に従って設計すればよく、フローディストリビュータ自体は、たとえば、管と同一または同様のプラスチック材料で作ればよいが、カラムの中に流す液体および試薬に対して不活性の金属、セラミック、またはその他の材料で作ってもよい。
【００４７】
管は、流体（たとえば液体）を第１の端部（たとえば上端）から第２の端部（たとえば下端）に流すことができる、中空で、典型的は丸い、円筒である。管の内径は、流体を管に流すとともに流体を管から出すためのフローディストリビュータを収容するように大きさが定められて構成される。クロマトグラフィーカラムのさまざまな性能仕様に基づいて、管を多様なサイズと構成で作製することができる。いくつかの実施形態において、管は、システムに生じた内部動作圧の下で構造上の完全性を維持しつつ、最大約１８５ｐｓｉ（たとえば約２０、３０、４０、５０、または６０ｐｓｉ）もの内圧に耐えることができるように大きさが定められて構成される。いくつかの実施形態において、管は、典型的には円筒形であり、内径が約５ｃｍ〜約１００ｃｍ、長さが約５〜約９０ｃｍである。
【００４８】
一般的に、さまざまな要因に基づく管の全誘起フープ応力は、クロマトグラフィーカラムが受けるであろう予測内圧等の、エンドユーザの仕様に応じて変化し得る。カラムの組立および充填方法の詳細は、その全体を本明細書に引用により援用するＵＳ２０１３／０１９３０５２（ＷＯ２０１３／１１６３６７に対応）に記載されている。
【００４９】
図４ａ〜図４ｃは、いくつかの実装例において、フローディストリビュータ２４が、第１面２８に沿って中央領域に形成された取付孔２６と、第２面３２に沿って形成された複数の溝およびチャネル３０のシステムとを有する、ディスク状部材であることを示す。取付孔２６は、取付具を収容するように大きさが定められて構成されたブラインドホールである。取付孔２６は、取付具を収容するために１つ以上の特徴を有する。特定の実装例において、取付孔２６は、ねじ山が形成された取付具（たとえばＭ３０×３．５のねじ山が形成された取付具）を収容するためにねじ山が形成されている。いくつかの実施形態において、取付具は、接着剤、溶接、差込みピン、もしくはルアー（luer）接続、または、そ
の他の十分な接続技術等の、他のさまざまなやり方で、フローディストリビュータ２４に接続される。いくつかの実施形態において、取付具は、フローディストリビュータ２４に一体化された構成要素として製造される。フローディストリビュータ２４はまた、流路３４を含み、この流路は、取付孔２６をフローディストリビュータ２４の第２面３２に液圧接続することにより、フローディストリビュータ２４の第２面３２と取付孔２６に挿入された取付具との間に流体を通すことができるようにしている。
【００５０】
フローディストリビュータ２４は、成形、鋳造、機械加工、またはその他の方法等の、さまざまな製造技術によって形成することができ、市場で入手できる。いくつかの実施形態において、フローディストリビュータ２４の全体形状が、鋳造または成形によって作られ、溝およびチャネル３０が、この全体形状の機械加工によって作られる。いくつかの実施形態において、管の内径と密に係合するよう、フローディストリビュータの外径を、旋盤を用いて形成することで確実に外縁を丸くし耐性を持たせる。
【００５１】
取付具は機械的装着具であり、これをフローディストリビュータに固定または取付けることにより、流体を、フローディストリビュータおよびフローディストリビュータが中に配置された管に送るまたはそこから出すことができる。流体を送るために、取付具は、その中心軸に沿って貫通するように形成された流体送り孔を有する。取付具はまた、取付具を保持するためのフローディストリビュータの取付孔に収容されるための１つ以上の特徴を含む。図１、図２ａ、および図２ｂに示されるように、この例において、取付孔２６と係合するために、取付具３８はねじ山が形成された端部４０（たとえばＭ３０×３．５のねじ山が形成された端部）を有する。取付具３８はまた、取付孔２６の中で取付具３８を回転させて固定するための工具（たとえばトルクレンチ）で把持できるナット部４２を有する。いくつかの実施形態において、取付具２８は、接着剤、溶接、差込みピン、もしくはルアー（luer）接続、または、その他の十分な接続技術等の、他の種類の接続機構を含む。
【００５２】
取付具３８は、設置される場所に応じて他の特徴をさらに有し得る。たとえば、上部フローディストリビュータ２４ａに設置される入口取付具３８ａは、この取付具のねじ山が形成された端部の反対側の端部において、接続特徴を有していてもよい。ホース接続等の接続特徴により、ホースまたは管を取付具に簡単に接続できる。この例において、入口取付具２４ａは、衛星器具（たとえばトリクランプまたはカムロック）形式のホース取付具等のホース取付具に収容されるように大きさが定められて構成されたリセス４４を定める。
【００５３】
代わりに、下部フローディストリビュータ２４ｂに接続される出口取付具３８ｂが、入口取付具と異なる方式の接続部を有していてもよい。この例において、出口取付具３８ｂはホース４６に固定され、それにより、出口取付具３８ｂは、遠隔急速取外し出口取付具４８に液圧接続される。遠隔急速取外し出口取付具４８は、ユーザにとって出口取付具３８ｂよりも簡単にアクセスできる領域に搭載または配置することができる。
【００５４】
クロマトグラフィーカラムの構成要素（たとえば、管２０、フローディストリビュータ２４ａ、２４ｂ、取付具３８ａ、３８ｂ、およびその他の構成要素）は、構造的にかつ化学的に適切なさまざまなプラスチック材料のうちのいずれかから作ることができる。たとえば、これらの構成要素は、１つ以上の熱可塑性物質（たとえばアクリロニトリル・ブタジエン・スチレン（ＡＢＳ）、アクリル樹脂（たとえばＰＭＭＡ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、他の熱可塑性材料、または複合材料）、および熱硬化性プラスチック（たとえばエポキシ樹脂、および繊維（たとえばガラスまたは炭素）強化プラスチック）からなるものであってもよい。材料を選択する際に考慮することは、材料特有の機械的特性、および、システムの誘起
内部動作圧に材料が耐えるか否かを含む。
【００５５】
上部および下部フローディストリビュータ２４ａおよび２４ｂは、カラムの製造および充填中に管２０の上部と底部に設置される（たとえば圧入される）。いくつかの実施形態において、管２０と、フローディストリビュータ２４ａ、２４ｂのうちの一方または双方は、上部フローディストリビュータ２４ａの挿入と媒体材料による管２０の充填の前に、永続的に結合される。カラムの十分な試験の後に、第２の、たとえば上部フローディストリビュータ２４ａが適所で永続的に結合される。
【００５６】
このような永続的な結合は、結合を、または結合された構成要素（たとえば管２０とフローディストリビュータ２４ａ、２４ｂ）を破断する以外に、簡単に外すことはできない。上端に、任意で追加のキャップ（たとえば上端キャップ）５４を管２０の上に載せて固定し位置合わせすることにより、カラムの上端のフローディストリビュータ２４ａ上に設置された入口取付具３８ａが、追加の上端キャップ５４の入口取付孔５６を通るようにする。主として見た目に美しい機能である、このような任意の上端キャップ５４は、固定具、接着剤、管と上端キャップの間の摩擦、またはその他のメカニズム等の、さまざまな固定メカニズムを利用して、管２０に固定することができる。
【００５７】
本明細書に記載のクロマトグラフィーカラムの管には、エンドユーザによって指定されるカラムクロマトグラフィーで使用される固相カラム充填媒体を充填すればよい。可能な充填媒体のこの多様性は、ベース粒子の組成にもこれらの粒子の機能的な化学的性質（たとえば親和性、イオン交換、および疎水性相互作用）にも及ぶ。カラム充填媒体は、溶離溶媒に加えられた固相粒子のスラリーを含み得る。固相粒子は、さまざまなメッシュサイズの、アガロース、シリカゲル（ＳｉＯ２）、アルミナ（Ａｌ２Ｏ３）、セルロース、および他の適切な材料を含み得る。溶離剤は、脱イオン化水、エタノール、またはアセトン等のさまざまな溶媒のうちの１つ以上を含み得る。
【００５８】
充填媒体の例は、アガロース（たとえば、GE Health Care社のSepharose（登録商標）Fast FlowおよびCapto（商標））、制御多孔質ガラス（Millipore社のProSep（登録商標））、セラミックハイドロキシアパタイト、ポリメタクリレート（たとえばTosoh Bioscience社のToyoPearl（登録商標））、およびその他の合成高分子樹脂（たとえばLife Technologies社のPoros（商標）媒体およびＥＭＤ社のFractogel（商標）媒体）を含むが、これらに限定されない。
【００５９】
充填クロマトグラフィーカラムの製造方法
特定のプラスチック／熱可塑性物質の１つの周知の特徴は、それらに固有のたわみ性、すなわち力が加えられたときに砕けずに変形する能力である。新たなクロマトグラフィーカラムは、カラム管２０を作製するために使用される、誘起されたフープ応力によって定められるプラスチックの「流動能力」、たとえば弾性を利用する組立プロセスを用いて作製される。カラム管２０は、指定された内側寸法と外側寸法を有する、押出成形、鋳造、成形（射出成形、ロトモールド、もしくはその他）、または機械加工されたプラスチック／熱可塑性物質もしくはテープ布設複合材料から作られる。フローディストリビュータ２４に関する本明細書に記載の設計および方法は、カラム管２０の公称内径よりも大きい外径を含み、以下ではこれを締り嵌めとして説明する。
【００６０】
フローディストリビュータ２４が円筒カラム管２０とともに用いられる場合は、フローディストリビュータ２４の外面を、不均一性ができる限り少ない（たとえば無い）丸い形状にして、フローディストリビュータ２４が管２０に圧入されたときに、確実に、均一なフープ応力が誘起されるとともに、フローディストリビュータ２４が管２０の内壁の表面に対して十分に液密噛合し封止されるようにもしなければならない。十分な程度の均一な
丸みまたは真円度は、フローディストリビュータ２４を旋盤上で旋削することによって容易に得られるが、この程度の均一な丸みを得る他の方法は当業者には周知である。
【００６１】
許容できる締り嵌めの程度は、管２０およびフローディストリビュータ２４を囲む特定のプラスチック／熱可塑性物質または複合構成要素の機械的特性、すなわち弾性または流動能力によって、したがってポリプロピレンの場合は管２０の壁の厚みによって決定されるが、すべての場合において、フローディストリビュータ２４の外径は管２０の公称内径よりも大きく、フローディストリビュータ２４が管２０に押込まれたときに十分な誘起フープ応力を保証するのに必要な締り嵌めを生じさせる。
【００６２】
この組立プロセスは、特有の利点を新たなクロマトグラフィーカラムに提供する。寸法がより安定している材料（鋼、ガラス等）で構成された従来のカラムは、フローディストリビュータ２４がカラム管よりもやや小さくなるように設計されており、これは、組立時にこの構成要素を容易にカラム管に挿入しカラム管の中の所望の位置まで動かすことができるようにするのに必要である。Ｏリングまたは同様の封止機構をフローディストリビュータ２４の周りに用いて、フローディストリビュータ２４と管２０の壁との間の液密シールを得る。これらの従来の設計では、管内径よりも小さい外径を有するフローディストリビュータと、Ｏリングを含める必要性との組合わせによって、「デッドスペース」と呼ばれる領域が、フローディストリビュータ２４と管２０の壁との間においてＯリングが着座している点まで生じる。これらの「デッドスペース」はカラムの流れに晒すのが困難であるため、カラムの清掃性とその結果として得られる清浄度にとってリスクとなる。締り嵌め設計は、従来のカラムの「デッドスペース」を無くすか大幅に減少させることによって、カラムの使用と使用の間で汚染物質を持越すリスクが最小になる。また、いくつかの実施形態では、締り嵌めにより、Ｏリングを完全に無くすことによって、カラムの複雑度、コスト、および封止不全のために完全性を損なうリスクを最小にすることができる。この特徴の別の利点は、カラムクロマトグラフィーによって精製中の貴重な製品を、そのようなＯリング（典型的にエラストマー製）から放出され得る汚染物質に晒すことを、減じる点にある。汚染物質に晒されると、抽出物および浸出物の調査という形態の、コストと時間を要するリスク評価が必要になる。
【００６３】
図８に示されるように、新たなクロマトグラフィーカラム５０の作製方法はいくつかのステップを含む。
【００６４】
第１に、本明細書中の他の箇所で説明されるように、最終的なカラムに望まれる媒体材料の体積を収容するのに適切な直径および長さと、適切な弾性とを有するプラスチックカラム管２０を指定する（８０２）。管の長さは、最終的なカラムの中の媒体材料の長さ、すなわち「ベッド高さ」の約２倍であるべきである。管２０の最終的な長さは内径とほぼ同じであってもよく、たとえば、２００および／または１９９．９０ｍｍの内径の管２０の最終的な長さは、約１５０〜２５０ｍｍ、たとえば約２００ｍｍであってもよい。管の各端の内面に沿って形成される面取部も選択される。この面取部は、カラム管２０の中に押込まれるフローディストリビュータ２４を位置合わせし、挿入するのを助けるために必要である。
【００６５】
第２に、適切に大きさが定められるフローディストリビュータ２４は、管の内径（「ＩＤ」）よりもやや大きい、たとえば約０.２５％、０．５〜約１．０、１．５、２．０、
２．５、３．０または３．５％大きい外径を有するように指定される必要がある（８０４）。たとえば、内径がおよび／または１９９．９０ｍｍのポリプロピレン管については、フローディストリビュータ２４の外径（「ＯＤ」）は２０１．９０ｍｍよりも大きく、たとえば２０２と２０４の間、２０２．５、２０３、２０３．５、２０４、２０４．５、２０５、２０５．５ｍｍ）でなければならない。フローディストリビュータ２４は、管２０
の壁の内部に十分なフープ応力を誘起するよう、特定の公称ＯＤを有するように設計される。適切な公称ＯＤを選択する際、考慮すべき要因は、カラム管のＩＤおよびその壁厚の両方の公差とフローディストリビュータ２４のＯＤの公差とを含む形状と組合わされた、構成材料の物理的特性（たとえば摩擦係数、ヤング率、弾性率、および降伏伸び）を含む。組立品を一緒にプレス嵌めするのに必要な力は（たとえば有限要素解析などの高度な分析ツールによって）理論的に求めることができ、代替案として、この評価は特定の構成材料を用いた実証的研究によって行なわれてもよい。
【００６６】
いくつかの実施形態では、フローディストリビュータは、使用時の適合性を保証するため、かつ、たとえば溶接時にフローディストリビュータを管の内壁に固定することを単純化するために、管と同じ材料で作られてもよい。
【００６７】
第３に、図５に示されるように、第１の、たとえば下部フローディストリビュータ２４ｂを、管２０の第１の端、たとえば下端に固定する（８０６）。これは任意の周知の手段によって行なわれてもよいし、または、第１のフローディストリビュータと関連付けられるすべてのデッドスペースを回避するか減少させるのに役立つように、本明細書中に記載される締り嵌め法を用いてもよい。たとえば、第１のフローディストリビュータ２４ｂは、金属クランプ、管２０（内壁または外壁のいずれか）およびフローディストリビュータ周壁へのねじ切り、接着剤、およびさまざまな種類の溶接を用いて固定することができる。要点は、この第１のフローディストリビュータ２４ｂを管２０の第１の端に一旦固定すると動かさなくてもよいことである。いくつかの実施形態では、第１のフローディストリビュータ２４ｂは管２０の一体部分として形成される。たとえば、第１のフローディストリビュータは周知の技術を用いて管２０の特徴として成形されてもよい。
【００６８】
第１の、たとえば下部フローディストリビュータに締り嵌め法を用いる場合、当該フローディストリビュータは最初、必要な圧力で効果的な液圧封止をなすための誘起フープ応力によって所望の場所に保持され、次いで、溶接、ねじ、または接着剤を含む任意の周知の手段を用いてその場所に永続的に固定されてもよい。特に、適切な締り嵌めを確立するために、フローディストリビュータ２４は管の面取りされた下端と位置合わせされ、次いで、約１０００ｌｂｆ〜１０，０００ｌｂｆ（たとえば１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００または１０，０００ｌｂｆ）の軸方向力がフローディストリビュータ２４に加えられてフローディストリビュータ２４をカラム管２０に押込むことによって、管の内径が広がる。たとえば、フローディストリビュータ２４が管２０に挿入される間、管２０およびフローディストリビュータ２４の両方が塑性変形して互いに嵌合し、管２０の変形の大きさはフローディストリビュータ２４の変形の大きさよりも大きい。
【００６９】
フローディストリビュータを管に押込むのに必要な力は、数ある要因の中でも、管内に形成される面取部の角度と、（上述の）構成材料の形状寸法と組合わされた当該材料に特有の他の物理的特性とに依存する。たとえば、第２のフローディストリビュータを管に押込んで管の内部に締り嵌めを確立するための軸方向力は、締り嵌めと、管壁の厚みと、管およびフローディストリビュータの材料の特定の機械的特性との関数である。フローディストリビュータを管のいずれかの端に押込むのに必要な力は、ロードセル、または同様の張力試験計器によって測定することができ、フローディストリビュータと管壁との間の適正な締り嵌めを保証するために、組立のたびに検査されるべきである。フローディストリビュータを管に押込むのに必要な軸方向力は、管壁とフローディストリビュータ外周縁との間の接着および変形摩擦力によって生じる対抗力よりも大きく、かつ反対方向でなければならない。
【００７０】
以下の式１は、挿入力をさらに説明する。
【００７１】
【数１】
2020024207.tif 000003
【００７２】
式中、Ｆappliedはフローディストリビュータの管への挿入に対抗する摩擦力を克服す
るのに必要な軸方向力であり、Ｆfriction,insertionはフローディストリビュータおよび管壁の材料同士の接着による摩擦力であり、Ｆfriction,deformationはフローディストリビュータおよび／または管壁の変形による摩擦力であり、Ｆfriction,netは正味の摩擦力である。必要であれば、潤滑油を塗布して接着摩擦力を除去し、その結果として得られる、フローディストリビュータを挿入するのに必要な軸方向力を、潤滑油を用いずにフローディストリビュータを挿入するのに必要な全軸方向力から減じることによって、２つの対抗摩擦力を区別することができる。
【００７３】
または、フローディストリビュータを管に押込んで、その結果として得られる十分な誘起フープ応力を生じさせるための、最少軸方向力を決定することができる。この誘起フープ応力は、フローディストリビュータを管の内部の指定場所に保持する径方向力として作用する。周知の締り嵌めの式を考慮して、すべての管およびフローディストリビュータのサイズについての誘起フープ応力を表す式を導出した。
【００７４】
誘起フープ応力は、誘起フープ応力に、管壁と接触しているフローディストリビュータの周方向面積を乗じることによって、管壁がフローディストリビュータの壁に及ぼす全径方向力と、関連付けることができる。以下の式２は、これをさらに説明する。
【００７５】
【数２】
2020024207.tif 000004
【００７６】
式中、Ｆradialは、フローディストリビュータの壁に向かって径方向内向きに作用する、管壁の回りに等しく分散する径方向力であり、Ａcontact,fdは、管壁と接触しているフローディストリビュータの面積である。さらに、この径方向力は、フローディストリビュータと管の内壁との間の垂直方向の摩擦力Ｆfriction,netと直接関連することもわかる。ゆえに、摩擦力を克服してフローディストリビュータを管に押込むのに必要な力Ｆappliedを、フローディストリビュータを管の内部の所望の場所に保持する誘起フープ応力σhoop tensionと関連付けることができる。以下の式４、５および６は、この関係をさらに説
明する。
【００７７】
【数３】
2020024207.tif 000005
【００７８】
式中、μfrictionはフローディストリビュータ材料と管壁材料との間の摩擦係数である。
【００７９】
この相関の結果、所与の誘起フープ応力が、推奨される最大操作圧力よりも高い、たとえば２倍、３倍、または４倍の適正な安全係数まで漏れ止めシールを提供することが経験的試験によって保証される限り、カラムの適正な操作圧力を保証し、ロードセルまたは同様の計器を用いて組立時に確認することができる。ほこり、湿度、酸化膜、表面仕上げ、摺動速度、温度、振動、ならびにカラムおよびフローディストリビュータ壁の汚染程度は、摩擦係数μfrictionの値の変動に寄与することによって、記録された挿入力に影響を及ぼし得ることに留意することが重要である。この誤差を減らすために、必要な誘起フープ応力を得るための正確な摩擦係数（μfriction）および後で加えられる荷重（Ｆapplied
）を決定するすべての初期試験は、安定した、繰返し可能な製造／実験環境、すなわちクリーンルームで行なわれることが推奨される。究極的に、設備はほこりをほとんど有さず、低湿度、最少の紫外線（材料の機械的特性に影響を及ぼし得る）、最少の振動、一定温度（室温状態に近い）、低い汚染程度、および一定の挿入速度を有することが好ましい。
【００８０】
また、以下の式を用いて、結果として得られる締り嵌めに対する表面仕上げの大きさを求め、（我々の場合は材料についての）表面仕上げは全体の締り嵌めに対して無視できることが示された。
【００８１】
【数４】
2020024207.tif 000006
【００８２】
式中、δeffは事実上の締め代であり、Δδは管内壁およびフローディストリビュータ
の周囲面の表面仕上げを考慮した、測定締め代に対する補正である。
【００８３】
【数５】
2020024207.tif 000007
【００８４】
式中、Ｒｚ，ｔｕｂｅは、管の内壁の表面仕上げであり、Ｒz,fdは、フローディストリビュータの外壁の表面仕上げである。
【００８５】
この圧力を包含するのに十分な誘起フープ応力を保証するため、ある一定の圧力まで漏れを防止するためにフローディストリビュータと管壁との間の締め代の量の関係を展開させるための実験をまず行なってもよい。式（１）は、誘起フープ応力がフローディストリビュータと管壁との間の漏れ止めシールを作り出すのに直接関与していることを示す。管およびフローディストリビュータの材料が一定であることを考慮すると、３つの主な変数、すなわち締り嵌めδint、管の外径Ｄtube,oおよびフローディストリビュータの外径Ｄfdが誘起フープ応力の大きさに寄与する。これらの値のうちの２つが選択されると、３番
目の変数を変えることによって、漏れに対する内圧に対する、フローディストリビュータを挿入するために加える力Ｆappliedのいくつかのケースを試験することができる。フロ
ーディストリビュータを越えた漏れがまったくない状態で適正な内圧が得られると、加えた力の値を用いて、所望の圧力を包含するのに必要な誘起フープ応力を逆計算することができる。ある一定のクロマトグラフィーカラムサイズ（管内径）について必要な誘起フープ応力が見つかると、誘起フープ応力に寄与する３つの主な変数を再び変更して、それらが同じ最終の誘起フープ応力値を最終的に得るする限り、設計を最適化することができる
。
【００８６】
図９ａおよび図９ｂは、フローディストリビュータ２４が管２０に最初に押込まれて面取部２２に達する前に生じる力の概略自由物体図を示す。最初にフローディストリビュータ２４が管２０に入ったとき、管２０はまだ膨張していない。フローディストリビュータ２４と管２０の壁との間の干渉によって、強制的に管２０が拡大され、フローディストリビュータ２４が圧縮される。管２０の壁厚はフローディストリビュータ２４の直径および厚みよりも小さいため、全体的な正味の力によって管壁が膨張する（なお、フローディストリビュータ２４はそれに応じて少量の圧縮を受ける）。これが起こるためには、軸方向の力は、誘起フープ応力によって生じる力を克服するのに十分大きい必要がある。軸方向力は線形アクチュエータからのものであり、水平方向または径方向力は誘起フープ応力からのものである。軸方向力は単に摩擦力を克服している。摩擦力は、誘起フープからの力の値に直接関連する。
【００８７】
図１０ａおよび図１０ｂは、フローディストリビュータ２４が管２０の軸長に沿って押込まれて面取部２２を通過した後に生じる力の概略自由物体図を示す。軸方向力のいくつかの成分は管２０を膨張させるのに寄与しているが、応力はフローディストリビュータ２４と管２０との最初の接触点から３〜５の特性寸法だけ離れて分散しており、管２０はフローディストリビュータ２４の前ですでに膨張している。ゆえに、フローディストリビュータ２４が管２０の長さに沿ってさらに軸方向に挿入されると、フローディストリビュータ２４を押圧する軸方向力はさらに大きくなり、フローディストリビュータ２４との接触点だけでなく、フローディストリビュータ２４の前の３〜５の特性寸法でも生じるより高い誘起フープ応力を克服する。いくつかの実施形態では、面取部は管壁の端で始まり、たとえば管の全長に沿って延在してもよい。
【００８８】
図１１は、一実施形態における、フローディストリビュータ２４が管２０内に進む際にフローディストリビュータ２４を管２０に圧入するのに必要な軸方向力を示すグラフである。示されるように、力は最初、フローディストリビュータ２４の第１の部分が入って管面取部２２の最初の部分を通過する間、ピークまで増加する。最初は、フローディストリビュータ２４および管壁は静摩擦を受けており、静摩擦を克服するための力は最大である。フローディストリビュータ２４および管２０の壁の変形が、フローディストリビュータ２４の管２０内への摺動に取って代わられると、フローディストリビュータ２４を管に圧入し続けるのに必要な力は、動摩擦を受けているため低下する。動摩擦は、克服すべき静摩擦よりもはるかに小さい。このグラフには、２つのさらなるピークも存在する。約２１ｍｍにおける第１のピークは、面取部２２の下部がフローディストリビュータ２４のＯリング溝２６内にあるとき（図１２に示す）に対応する。第２のピークは、フローディストリビュータ２４全体が面取部を越えて管２０の領域内に係合している点に対応する。示されるように、この例では、最大軸方向力は約１２００〜１３００ｌｂｆである。
【００８９】
ある実施形態については、フローディストリビュータ２４の外壁のＯリング溝２６内に配置されたＯリングを用いることによってシールを向上させることができる。ある実施形態では、フローディストリビュータを所定の位置に保持するのにプレス嵌めまたは締り嵌めで十分であるが、他の実施形態ではより永続的な接着部が望ましい。
【００９０】
フローディストリビュータ２４が管の第１の端、たとえば下端に約１〜１０ｃｍ、たとえば６．０、６．５、７．０、７．５、８．０または８．５ｃｍ押込まれると、フローディストリビュータ２４は、たとえばフローディストリビュータ２４および管が同一のまたは実質的に同様の材料からなる場合、たとえば溶接によって所定の位置に永続的に固定されてもよい。フローディストリビュータとカラム管との間の溶接を形成するために、熱ジグ溶接、（たとえば４２０℃での）熱ガス溶接、超音波、押出成形、レーザ、導電、高周
波等を含むがこれらに限定されないさまざまな溶接技術を用いてもよい。これら２つの部分が異なる材料からなる場合、それらは、外部に取付けられて管を圧縮し、かつフローディストリビュータを管の内部のその場所にアンカー固定する力を加える金属ホースクランプなどの機械クランプを用いることによって、または接着剤もしくは管壁を通過してフローディストリビュータに入る機械ファスナによって、接続されてもよい。
【００９１】
第４に、入口および出口取付具３８ａ、３８ｂを第１の（たとえば下部）および第２の（たとえば上部）フローディストリビュータ２４ａ、２４ｂに装着する（８０８）。入口および出口取付具３８ａ、３８ｂはねじ山領域４０を有し、これらは上部および下部フローディストリビュータ２４ａ、２４ｂのねじ取付孔２６に螺合される。各取付具の下端（すなわちフローディストリビュータと噛合う端）またはフローディストリビュータのねじ取付孔２６の末端に、凹部（たとえばＯリンググランド）が形成されてもよい。この例では、取付具３８とフローディストリビュータ２４との間にＯリングが配置されて、取付具３８とフローディストリビュータとが互いにねじ止めされるとそれらの間にシール（たとえば液密シール）が形成される。この境界面に十分なシールを作るためのＯリングの適正な圧縮を保証するためにトルクレンチを用いてもよい。
【００９２】
次に、液体スラリーの形態の充填媒体を、カラム管２０の内部の、下部フローディストリビュータ２４ｂの上方の空間（チャンバ）に装填する（８１０）。
【００９３】
次に、図６および図７に示されるように、第２の、たとえば上部フローディストリビュータ２４ａを管類で配管すると（かつ随意に液体源にすでに接続すると）、第１のフローディストリビュータ２４ｂを締り嵌め法を用いて挿入するのとほぼ同じやり方でフローディストリビュータ２４ａを管２０に挿入する（８１２）。第２のフローディストリビュータに締り嵌め法を用いることが重要である。なぜなら、この第２の（たとえば上部）フローディストリビュータ２４ａが管２０に押込まれる最初の場所は、第２のフローディストリビュータの最初の位置を試験後に再調整することが望ましい場合があるため、すぐに確定すべきでないからである。ゆえに、第２の、たとえば上部フローディストリビュータ２４ａを管２０の内部で動かして最終調整を行なうことができるように、締り嵌め法が用いられる。また、締り嵌めは、カラムの試験時に用いられる圧力で液密シールを保証するように設計および実施されることも重要である。
【００９４】
この時点で、充填媒体を、特定の媒体に好適な方法、たとえば、適切に調合された溶液（「移動相」もしくは「充填バッファ」）もしくはカラム出口取付具３８ｂから適用される吸引を用いたフロー、または任意の他の好適な周知の技術もしくは方法を用いて、充填ベッドの内部に積極的に沈降させることができる。第２の、たとえば上部フローディストリビュータは、当該フローディストリビュータが充填媒体に接触して充填媒体を圧縮して所望の位置に達し得るまで当該フローディストリビュータにさらなる軸方向力を加えることによって、管にさらに押込まれ得る。そのような圧縮は、充填媒体の性質に依存して、充填ベッド高さのまったくのゼロ〜３０％以上に及び得る。ＨＥＴＰ（理論段相当高さ）試験および非対称性分析によって測定されるカラムの性能は、一部、ベッドの圧縮の関数である。適宜、挿入したフローディストリビュータ２４ａを管の端に向けて出してベッドの圧縮を減少させることも可能である。これは、第１および第２のフローディストリビュータ同士の間に形成されるチャンバの内部の液体に力を加えることによって、静水圧を用いて行なわれる。第１のフローディストリビュータ２４Ｂは永続的に固定されるため、プレス嵌めを用いて固定される第２のフローディストリビュータ２４Ａは、プレス嵌めを克服するのに十分な力がカラム管の内部の液体によって自身に及ぼされると移動する。
【００９５】
次に、保持されておらず、かつ容易に検出可能な試験品（たとえばＵＶモニタリングによるアセトンまたは導電率モニタリングによる塩化ナトリウム）のパルス注入によって、
カラム充填媒体の適合性を試験してもよい（８１８）。充填試験の結果に基づいて、上部フローディストリビュータ２４ａは充填ベッド内にさらに進む（たとえば押込まれる）ことができ、充填試験を繰返すことができる。上部フローディストリビュータが管の中に入り過ぎて充填ベッドの過剰圧縮を引起こす可能性がある場合、出口取付具を密封した状態で入口取付具からチャンバに液体を押入れることによって、水圧力を用いて上部フローディストリビュータ２４ａを管の上端に向けて戻し、充填ベッドの圧縮を減少させることができる。カラム充填の適合性が判定されると、カラムは次いで、エンドユーザの仕様に従って、静菌性保存溶液で衛生化され、および／または洗い流され得る。
【００９６】
第２の、たとえば上部フローディストリビュータ２４ａを適切に位置決めすると、第１のフローディストリビュータを固定するための溶接または上述の他の手段などによってフローディストリビュータ２４ａを永続的に固定してもよい（８１８）。いくつかの実施形態では、上部（または第２の）フローディストリビュータ２４ａを管２０の内壁に固定するのに締り嵌めが十分であり得る。
【００９７】
いくつかの実施形態では、装填された最終的なクロマトグラフィーカラムは、次いでトップキャップ、基部、および／またはサイドガードが取付けられてもよい。クロマトグラフィーカラムは次に最後の消毒を受け、使用されてもよいし出荷用に包装されてもよい。
【００９８】
使用方法
本明細書に記載のシステムおよび方法は、典型的には多大な資本支出を必要とする耐久ハードウェア設備に存在する他のクロマトグラフィーカラムに匹敵する性能を有する、使い捨て可能で、予め充填され、予め認定された（pre-qualified）滅菌クロマトグラフィ
ーカラムを、エンドユーザに提供する。この新たな滅菌されたカラムは、他の周知のクロマトグラフィーカラムと同じやり方で使用されるが、使い捨て可能でありかつ無菌性であるので、この新たなカラムは、毒性の、そうでなければ有害な試薬、たとえばウィルス、病原体、および毒素を分離し精製するのに特に役立つ。さらに、これらの滅菌カラムは、カラムを再利用し効果のない洗浄をするときに発生することが多い汚染の恐れを伴うことなく使用できる。たとえば、これらの滅菌されたカラムは、滅菌連続プロセス、および、高レベルの微生物管理が必要な多製品設備において使用できる。
【００９９】
この新たな滅菌カラムは、使い捨て可能なシステムにおいて、および、多重カラムクロマトグラフィーシステムにおいて使用できる。この新たな滅菌カラムはまた、滅菌接続を介して滅菌システムに接続できる。
【０１００】
いくつかの用途において、カラムは、２種類以上のＳｐＡ分子とともにさまざまなアフィニティ捕捉媒体で予め充填できる。
【０１０１】
実施例
本発明を以下の実施例においてさらに説明する。これらの実施例は、請求項に記載の本発明の範囲を限定するものではない。
【０１０２】
実施例１−圧力耐性に対するガンマ線の影響
この実施例の目的は、本明細書に記載の新たな滅菌方法が、プラスチッククロマトグラフィーカラムおよびその部品に及ぼす影響を判定することであった。この試験は、各構成要素の圧力耐性に対するガンマ線の影響を試験するために、充填媒体を含まない、組立てられたクロマトグラフィーカラムを照射することと、クロマトグラフィーカラムの部品を照射することを含んでいた。
【０１０３】
カラム材料−ＯＰＵＳ（商標）クロマトグラフィーカラム（Repligen Corporation）
・１４ｃｍのフローディストリビュータ
・１４ｃｍのベッドサポート−ポリプロピレンメッシュ
・１４ｃｍのフローディストリビュータＯリング
・ポートＯリング（小型Ｏリング）
・入口ポート
・ポートクランプ
・ポートプラグ
・１４ｃｍの押出成形ポリプロピレン管
方法
クロマトグラフィーカラムの構成要素に、１５〜４０ｋＧｙの間の線量、所望の目標として２５ｋＧｙの線量で、ガンマ線を照射した。この照射は、契約滅菌サービスをIsomedix Services Business（Northborough、マサチューセッツ州）を通して提供する滅菌の請負企業であるSteris Corporationによって行なわれた。実際の線量は２１．３〜２５．３ｋＧｙの間であった。Steris社は、アイソトープ源（コバルト６０）から放出される高エネルギのフォトンを用いて、予め充填されたカラム全体にイオン化（電子の乱れ）を生じさせる。生体細胞では、この乱れが、結果としてＤＮＡおよびその他の細胞組織にダメージを生じさせる。フォトンによって誘起される、分子レベルでのこれらの変化により、生物体が死滅する、または、生物体の繁殖が不可能になる。このようにして所望の滅菌が提供される。
【０１０４】
照射後の試験のために、水を充填した圧力タンクにカラムを装着した。圧力タンクには、最大１００ｐｓｉ（７バール）の外部不活性ガスタンクを用いて圧力をかけることができる。カラムに、先ず水を充填し、次に増大する圧力を加えた。圧力計をカラムの入口に装着し、試験中の圧力上昇をモニタリングした。
【０１０５】
結果
照射されていない新たなクロマトグラフィーカラムの定格最大圧力は４バールである。照射されたカラムは、上部アダプタが溶接されていなかったため、耐えられる最大圧力は４バール未満と予測された。
【０１０６】
上部フローアダプタは、圧力が５．５バールに達するまで動かなかった。５．５バールで、上部フローアダプタは、ゆっくりと動き始め、最終的にはカラムから完全に取外すことができた。この試験は、照射されたカラムが、照射されていないカラムと同等の圧力耐性を有することを立証している。
【０１０７】
実施例２−浸出物および抽出物に対するガンマ線の影響
この実施例の目的は、ガンマ線で滅菌されたクロマトグラフィーカラムの材料の適合性を判定することであった。この実施例では、カラムの部品からの浸出物および抽出物に対するガンマ線の影響を判定する。
【０１０８】
カラム材料−ＯＰＵＳ（商標）クロマトグラフィーカラム（Repligen Corporation）
・１４ｃｍのフローディストリビュータ−機械加工され成形されたポリプロピレン
・１４ｃｍのベッドサポート−ポリプロピレンメッシュ
・１４ｃｍのフローディストリビュータＯリング‐白金硬化シリコーン
・ポートＯリング（小形Ｏリング）‐白金硬化シリコーン
・入口ポート−機械加工ポリプロピレン
・１４ｃｍの押出成形ポリプロピレンチューブ
方法
実施例１で先に述べたSteris Isomedix（Northborough、マサチューセッツ州）によっ
て、ＯＰＵＳ（商標）クロマトグラフィーカラムの構成要素に、１５〜４０ｋＧｙの間の
線量、所望の目標として２５ｋＧｙの線量で、ガンマ線が照射された。実際の線量は２１．３〜２５．３ｋＧｙの間であった。
【０１０９】
照射されたカラム材料も照射されていないカラム材料も、７２時間３７℃の２０％エタノールと水それぞれに浸漬させた。インキュベーション時間の最後に上澄み液を逆相ＨＰＬＣによって分析した。
【０１１０】
浸出物および抽出物の検出に用いられるＨＰＬＣ方法
・ＨＰＬＣカラム  ＹＭＣ  Ｃ１８−３μｍ、１２ｎｍ
・緩衝液Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液
・緩衝液Ｂ：０．１％ＴＦＡアセトニトリル溶液
・流量  １ｍＬ／分
【０１１１】
【表１】
2020024207.tif 000008
【０１１２】
結果
図１４Ａ〜図１４Ｊを参照して、照射されていないカラム部品も照射されたカラム部品も、２０％エタノール中の浸出物と抽出物のレベルは水中のものよりもわずかに高い。これらのグラフは、プラスチックの照射後に、目立った浸出物および抽出物は現れないことを示している。サンプル間に見られるばらつきは、統計上重要なものではない。
【０１１３】
２０％エタノール中において、試験したすべてのカラム部品は、照射後の抽出物のレベルが、照射前の部品よりも低いことを示した。水中において、カラム本体は、照射後の抽出物のレベルがわずかに高かったが、相違は統計上重要なものではなかった。ベッドサポートは、水中における抽出物のレベルが、照射後の方が高かった。しかしながら、全体的な変化は小さかった。照射されたサンプルにおいて、いくつかの化合物ピークは減少または完全に消失した。これはおそらく、ガンマ線照射による架橋が原因である。
【０１１４】
実施例３−物理的外観に対するガンマ線の影響
この実施例の目的は、組立てられたクロマトグラフィーカラムの物理的外観に対するガンマ線の影響を試験することであった。
【０１１５】
カラム材料−ＯＰＵＳ（商標）クロマトグラフィーカラム（Repligen Corporation）
・１４ｃｍのフローディストリビュータ−機械加工され成形されたポリプロピレン
・１４ｃｍのベッドサポート−ポリプロピレンメッシュ
・１４ｃｍのフローディストリビュータＯリング−白金硬化シリコーン
・ポートＯリング（小形Ｏリング）−白金硬化シリコーン
・入口ポート−機械加工されたポリプロピレン
・ポートクランプ
・ポートプラグ
・１４ｃｍの押出成形ポリプロピレン管
方法
実施例１で先に述べたSteris Isomedix（Northborough、マサチューセッツ州）によっ
て、ＯＰＵＳ（商標）クロマトグラフィーカラムに、１５〜４０ｋＧｙの間の線量、所望の目標として２５ｋＧｙの線量で、ガンマ線が照射された。実際の線量は２１．３〜２５．３ｋＧｙの間であった。
【０１１６】
結果
図１３に示されるように、照射されたポリプロピレンカラムは、照射されなかったカラムと比較して、オフホワイト／黄色の色合いを有していたが、それ以外は元のままであった。
【０１１７】
実施例４−機械的特性に対するガンマ線の影響
この実施例の目的は、クロマトグラフィーカラム管の機械的特性に対するガンマ線の影響を試験することであった。具体的に、目的は、応力対歪み曲線を導出することであった。この曲線から、降伏引張強度、降伏伸び、破断引張応力、破断伸び、および弾性率すべてがわかった。
【０１１８】
カラム材料−ＯＰＵＳ（商標）クロマトグラフィーカラム（Repligen Corporation）
・１４ｃｍの押出成形ポリプロピレン管
方法
Steris Isomedix（Northborough、マサチューセッツ州）によって、ＯＰＵＳ（商標）
クロマトグラフィーカラム管に、１５〜４０ｋＧｙの間の線量、所望の目標として２５ｋＧｙの線量で、ガンマ線が照射された。実際の線量は２１．３〜２５．３ｋＧｙの間であった。
【０１１９】
照射後、Intertek PTL（Pittsfield、マサチューセッツ州）が、ＡＳＴＭ  Ｄ６３８‐１０に従って引張試験を行なった。照射されていない純粋な押出成形ＰＰ管の５つのサンプルと、照射押出成形ＰＰ管の５つのサンプルが調製され（カラム管から切出され）、試験された。具体的なパラメータは次の通りである。
【０１２０】
サンプルの調製
Intertek PTLによる機械加工
サンプルの種類
ＡＳＴＭ  Ｔｙｐｅ１引張試験片
サンプルの寸法
０．５００インチ×０．１２５インチ（平均）
クロスヘッドスピード
５０ｍｍ／分
伸縮計
５０ｍｍゲージ長ベースで１６０％。実践最小要件を満たす。
【０１２１】
Ｅ８３：弾性率（クラスＢ−２）／伸び（クラスＣ）
調整
２３℃±２℃／５０％±１０％ＲＨで４０＋時間
試験条件
２３℃±２℃／５０％±１０％ＲＨ
結果
表２は、この一連の実験から得られたデータをまとめたものである。図１５および図１
６は、純粋な押出成形ＰＰ管と照射された押出成形ＰＰ管の間のごくわずかな違いを示している。実験したすべてのサンプルの、最初の最小値から最大値までによって表わされている弾性変形領域は非常に良く似ているように見える。照射されたサンプルは、降伏後の応力の各増分変化が少しだけさらに延びる傾向があり、これは、より強靭な材料の特徴であろう（破断までの曲線下の領域）が、曲線の弾性領域に含まれているのは関連のある材料のみである。なぜなら、組立てにおいてプラスチック永続的な変形が生じる訳ではないからである。すべての干渉は、如何なる塑性変形も材料に生じないように設計された。張力または圧縮を受けた結果として、時間の経過に伴い、材料にわずかなクリープが発生することに注目することは、有意義である。これは、プラスチックの通常の物理的特性である。
【０１２２】
表２では、図１６の分析の結果得られた、純粋な押出成形ＰＰ管と照射された押出成形ＰＰ管の工学特性を比較している。どちらのサンプルも、降伏伸びは同じであったが、照射されたサンプルの伸びはわずかに大きく、降伏引張雇用度は１４０ＰＳＩよりもわずかに高かった。これは、総降伏引張強度の３％未満であり、特に、純粋なサンプルと照射されたサンプルの標準偏差がそれぞれ３５％と４９％であったことを考慮すると、これは最小ファクタとみなすことができる。弾性変形領域内の応力対歪み曲線の傾斜によって表わされる弾性率は、照射されたサンプルの方が、純粋なサンプルよりも、２０，０００ＰＳＩ高い。弾性率が高いということは、材料の弾力がより高いことを表わしており、このため、材料はより大きな大きさのエネルギを吸収することができ、それでもなお元の形状に戻ることができる。材料の弾性は以下の式で表わされる。
【０１２３】
【数６】
2020024207.tif 000009
【０１２４】
式中、Ｕｒは弾性エネルギ係数、σは応力、εは歪み、εｙは降伏歪みの値である。
結論として、材料はいずれも非常に良く似た弾性変形を示したが、照射されたサンプルは、照射されていない純粋なサンプルよりも弾性が大きいとみなされるであろう。このことは、照射されたサンプルが、照射されていない純粋なサンプルと比較して、降伏点に至る歪みの大きさに達するはより多くの圧力が必要であることを意味する。
【０１２５】
【表２】
2020024207.tif 000010
【０１２６】
実施例５−機械的性質に対するガンマ線の影響
この実施例の目的は、クロマトグラフィーカラム管の機械的特性に対するガンマ線の影響を試験することであった。具体的に、目的は、応力対歪み曲線を導出することであった。曲げ応力および５％の歪みと曲げ率はいずれもこの曲線から見出された。
【０１２７】
カラム材料−ＯＰＵＳ（商標）クロマトグラフィーカラム（Repligen Corporation)
・１４ｃｍの押出成形ポリプロピレン管
方法
実施例１で先に述べたSteris Isomedix（Northborough、マサチューセッツ州）によっ
て、ＯＰＵＳ（商標）クロマトグラフィーカラム管に、１５〜４０ｋＧｙの間の線量、所望の目標として２５ｋＧｙの線量で、ガンマ線が照射された。実際の線量は２１．３〜２５．３ｋＧｙの間であった。
【０１２８】
照射後、Intertek PTL（Pittsfield、マサチューセッツ州）が、ＡＳＴＭ  Ｄ７９０‐１０に従って曲げ試験を行なった。純粋な押出成形ポリプロピレン管の５つのサンプルと、照射押出成形ＰＰ管の５つのサンプルが調製され（カラム管から切出され）、試験された。具体的なパラメータは次の通りである。
【０１２９】
サンプルの調製
Intertek PTLによる機械加工
サンプルの種類
ＡＳＴＭ  引張試験片
サンプルの寸法
０．５００インチ×０．１２５インチ×５インチ（平均）
クロスヘッドスピード
０．０５４インチ／分
スパン長
２．０１６インチ
伸縮計
５０ｍｍゲージ長ベースで１６０％。実践最小要件を満たす。
【０１３０】
Ｅ８３：弾性率（クラスＢ−２）／伸び（クラスＣ）
スパンと深さの比率
１６±１：１
サポートの半径
０．１９７インチ
ローディングノーズの半径
０．１９７インチ
調整
２３℃±２℃／５０％±１０％ＲＨで４０＋時間
試験条件
２３℃±２℃／５０％±１０％ＲＨ
結果
図１７は、純粋な押出成形ＰＰ管と照射された押出成形ＰＰ管の間のごくわずかな違いを示している。すべてのサンプルに対して３点曲げ試験を６％の歪みになるまで実施し、照射されたサンプルは、純粋なサンプルと同じ距離だけ延ばすのに、少しだけ大きな圧力を要した。
【０１３１】
表３は、図１７の分析の結果得られた、純粋な押出成形ＰＰ管と照射された押出成形ＰＰ管の工学特性を比較している。ここでもまた、予測通り、照射されたサンプルの曲げ率は純粋なサンプルよりもわずかに高く、これは、押出成形されたＰＰ管が、照射されると、少しだけ弾性が増すことを示している。
【０１３２】
結論として、図１７に示されているように、純粋なサンプルと照射されたサンプルの間の違いは、極めて小さかった。照射されたサンプルは、照射後に少しだけ弾性が増した。表３は、先に述べた仮定を裏付けている。
【０１３３】
【表３】
2020024207.tif 000011
【０１３４】
実施例６−機械的特性に対するガンマ線の影響−フローディストリビュータＯリング
この実施例の目的は、クロマトグラフィーカラムのシリコーンＯリングの機械的特性に対するガンマ線の影響を試験することであった。具体的に、目的は、材料ごとに応力対歪み曲線を導出することであった。破断引張強度および破断伸びはすべてこの曲線から見出された。
【０１３５】
カラム材料
・１４ｃｍのフローディストリビュータＯリング
・１４ｃｍの押出成形ポリプロピレン管
方法
Steris Isomedix（Northborough、マサチューセッツ州）によって、フローディストリ
ビュータおよびＯリングとともに組立てられたＯＰＵＳ（商標）クロマトグラフィーカラム管に、１５〜４０ｋＧｙの間の線量、所望の目標として２５ｋＧｙの線量で、ガンマ線が照射された。実際の線量は２１．３〜２５．３ｋＧｙの間であった。
【０１３６】
照射後、Intertek PTL（Pittsfield、マサチューセッツ州）が、ＡＳＴＭ  Ｄ４１２‐０６ａに従って引張試験を行なった。純粋なシリコーンＯリングの２つのサンプルと、照射されたシリコーンＯリングの２つのサンプルが調製され試験された。試験したＯリングは、照射プロセスを経た組立てられたカラムから取り出された。このため、Ｏリングは、長時間張力と圧縮双方が加えられ、かつ、照射プロセス中も張力と圧縮が加えられていたことになる。同じく試験のために、純粋なＯリングが在庫から出された。具体的なパラメータは次の通りである。
【０１３７】
サンプルの調製
Intertek PTLによる切断
サンプルの種類
複数のＯリング
クロスヘッドスピード
２０インチ／分
伸縮計
１．０インチゲージ長ベースで１０００％
調整
２３℃±２℃／５０％±１０％ＲＨで４０＋時間
試験条件
２３℃±２℃／５０％±１０％ＲＨ
結果
図１８は、照射されていない純粋なシリコーンＯリングと照射されたシリコーンＯリングの応力対歪み曲線を示す。照射された組立てられたカラムから取り出された照射されたサンプルと異なり、照射されていない純粋なＯリングは、在庫から取り出されたものである。言い換えると、照射されたサンプルは、管の壁とフローディストリビュータとの間で圧縮（およぼ２０％の圧縮）を受けるとともに張力を受けており（フローディストリビュータ内でＯリンググランドに嵌めるために伸張される）、このことが、材料の何らかの内部クリープに寄与している可能性がある。内部クリープによって、サンプルはわずかに長くなり、降伏まで伸びることはない。このことは、図１７から明らかである。照射されたサンプルにも、より急峻な弾性領域（弾性率）、より高い降伏および破断応力、およびより低い歪み−破断ポイントがある。これらはすべて、材料が少しだけより頑強でより弾力性があることから明らかである。照射と最初の圧縮／張力が組み合わさったことで、照射されたサンプルは、純粋なシリコーンＯリングよりも少しだけより弾力性がありより頑強になった。表４は、先に述べた仮定を裏付けている。
【０１３８】
【表４】
2020024207.tif 000012
【０１３９】
実施例７−機械的特性に対するガンマ線の影響−フローディストリビュータＯリング
この実施例の目的は、クロマトグラフィーカラムのシリコーンＯリングの機械的特性に対するガンマ線の影響を試験することであった。具体的に、目的は、Ｏリングサンプルの
硬度値を導出することであった。
【０１４０】
カラム材料−ＯＰＵＳ（商標）クロマトグラフィーカラム（Repligen Corporation）
・１４ｃｍのフローディストリビュータＯリング
方法
実施例１で述べたように、Steris Isomedix（Northborough、マサチューセッツ州）に
よって、ＯＰＵＳ（商標）クロマトグラフィーカラムのフローディストリビュータＯリングに、１５〜４０ｋＧｙの間の線量、所望の目標として２５ｋＧｙの線量で、ガンマ線が照射された。実際の線量は２１．３〜２５．３ｋＧｙの間であった。
【０１４１】
照射後、Intertek PTL（Pittsfield、マサチューセッツ州）が、ＡＳＴＭ  Ｄ２２４０‐０５（２０１０）に従って硬度試験を行なった。照射されていない純粋なシリコーンＯリングの５つのサンプルと、照射されたシリコーンＯリングの５つのサンプルが調製され試験された。具体的なパラメータは次の通りである。
【０１４２】
サンプルの調製
Intertek PTLによりＯリングから薄片を切出す
圧子貫入時間間隔
１秒
使用した圧子
Ａ
調整
２３℃±２℃／５０％±１０％ＲＨで４０＋時間
試験条件
２３℃±２℃／５０％±１０％ＲＨ
結果
表５では、純粋なシリコーンＯリングと照射されたＯリングの定格硬度を比較している。材料の硬度は、力が一定であるという条件で、指定器具が材料の中に押込まれる距離を表わす単位であるデュロメータによって説明される。たとえば、これらの試験は、切頭された３５°の円錐形を有する直径１．１〜１．５ｍｍの硬化鋼ロッドを指定するＡＳＴＭ
Ｄ２２４０  タイプＡスケールに従って実行された。円錐部分の先端を、Ｏリングから切出したサンプルに、８．０６４Ｎの力で押込む。円錐部の先端は、材料の硬度に応じて、０〜２．５４ｍｍの範囲のうちのいずれかの距離延ばすことができる。この先端が２．５４ｍｍ移動した場合、材料のショアＡ硬度は０であろう。逆に、先端の移動が０ｍｍの場合、材料のショアＡ硬度は１００であろう。
【０１４３】
照射されたサンプルのショアＡ硬度は７３、照射されていない純粋なシリコーンＯリングのショアＡ硬度は７７であった。供給業者によると、シリコーンＯリングのショアＡ硬度は７５なので、照射されたサンプルも照射されていない純粋なサンプルも、平均値からの標準偏差が２であるが、これは、この試験にの誤差が±５であるので、ごくわずかであるとみなすことができる。
【０１４４】
【表５】
2020024207.tif 000013
【０１４５】
実施例８  アガロース媒体が充填されたＯＰＵＳ（商標）カラムに対するガンマ線の影響
この実施例の目的は、充填ベッドの流動特性がガンマ線照射後に変化するか否か判断することであった。
【０１４６】
材料および方法
ＯＰＵＳ（商標）カラム（Repligen Corporation）に、Sepharose 6 Fast Flow媒体（GE Healthcare）を、寸法が内径（ｉｄ）２０ｃｍ×ベッド高さ（ＢＨ）２０ｃｍになるまで充填した。最初の試験の実行後、Steris（Northborough、マサチューセッツ州）で、３６．３ｋＧｙと３９．９ｋＧｙの間の線量でガンマ線をカラムに照射し、再試験した。
【０１４７】
試験では、理論段、非対称性、および圧力を、１００ｃｍ／時間（ｈｒ）で求めた。カラムを、３カラム体積の１００ｍＭのＮａＣｌ中で平衡状態にし、その後、１％カラム体積の１０％アセトン溶液をカラム上にパルス噴射した。
【０１４８】
【表６】
2020024207.tif 000014
【０１４９】
結果
ガンマ線照射カラムの充填ベッドの理論段数、非対称性、および圧力降下の変化は、各々２０％未満であった。結果は、Sepharose 6FF等のアガロース媒体を充填したＩＤ２０
ｃｍ×ＢＨ２０ｃｍのＯＰＵＳカラムの完全性は、滅菌線量のガンマ線照射後も損なわれないままであることを示している。
【０１５０】
実施例９−結合容量に対するガンマ線の影響
この試験の目的は、ガンマ線照射後のさまざまな充填媒体の官能性のレベルを求めることであった。プロテインＡを用いて官能化したシリカおよびアガロース媒体を試験した。静的結合容量（ＳＢＣ）モードおよび動的結合容量（ＤＢＣ）モード双方におけるヒトの多クローン性ＩｇＧ（ｈＩｇＧ）の能力を、用いて、これらのアフィニティ充填媒体に対するガンマ線照射の機能的影響を評価した。
【０１５１】
方法
シリカ媒体、Davisil（登録商標）（W.R. Grace）およびSepharose（商標）4 Fast Flowという成分を、還元アミノ化という化学作用を利用して、組換えプロテインＡ、ｒＳＰ
Ａ（Repligen Corporation）で固定した。また、同じ媒体を、異なるプロテインＡリガンド、ＭＢ４（Repligen）で固定した。ＭＢ４は、各々がＧ２９Ａ変位体を有する４つのＢドメインを含む多量体組換えプロテインＡリガンドである。ｒＳＰＡで固定されたSepharose 4FFは、CaptivA（商標）PriMab（商標）という商品名で、Repligen社から販売されている。すべての媒体サンプルを、２０％エタノール溶液において保管した。固定されたサンプルのうちの半分は比較対照のために取っておき、残りの半分をガンマ線照射（２８．６〜３３．５ｋＧｙ）のためにSteris（Northborough、マサチューセッツ州）に送った。
【０１５２】
体積１００μｌの各媒体を計量して１．５ｍｌ遠心分離管に入れ、１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄して媒体を平衡状態にした。１．０ｍｌの１０ｇ／ＬのＩｇＧ（SeraCare）を媒体に加え、３０分間回転混合した。インキュベーション後に、媒体を１．０ｍｌのＰＢＳで５回洗浄した。次に、ｐＨ２．８の、１０ｍｌの１００ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水を加えてｈＩｇＧを溶離した。溶離液中のｈＩｇＧの量は、２８０ｎｍの紫外線測定によって求めた。結合容量（グラムＩｇＧ／Ｌ媒体）を、ＵＶ２８０結果を１００で乗算し、次に吸光係数１．３で除すことによって、計算した。
【０１５３】
ＩｇＧの動的結合容量
量が約３．４２ｍｌの各媒体をカラムに充填して、ベッド高さ１０ｃｍのカラムを作製した（オムニフィット、ＩＤ０．６６ｃｍ）。各カラムに、ＡＫＴＡエクスプローラＦＰＬＣ（GE Healthcare）を用い、流量２．０ｍｌ／分でＰＢＳを充填した。ＩｇＧ（SeraCare）を、２．２ｍｇ／ｍｌになるようにＰＢＳで希釈した後、滞留時間が３．０分とな
る流速でカラムに入れた。５％のｈＩｇＧブレークスルー（breakthrough）における結合容量を求めた。
【０１５４】
結果
結果を表７に示す。
【０１５５】
【表７】
2020024207.tif 000015
【０１５６】
これらの結果は、ガンマ線照射後の充填媒体官能基の割合が、照射されてない対照サンプルの６６．０％と９０．０％の間であったことを示す。この結果は、高レベルのガンマ線照射（２８．６〜３３．５ｋＧｙ）からすると、予想外に高かった。これらのデータはまた、試験したすべての媒体において、初期容量の６５％を上回る容量が維持され、８０％を超える容量が維持された場合もあったことを明らかにしている。この性能により、照射されたプロテインＡ媒体１リットル当たり２０ｇ〜４２ｇの抗体製品を精製して、タンパク質精製プロセスを支援するであろう。
【０１５７】
実施例１０−結合容量との関連における、ガンマ線照射中の媒体保護液組成物の影響
この試験の目的は、ガンマ線照射中の充填媒体保護液の組成物が、暴露後の官能能力（functional capacity）に影響するか否か判断することであった。プロテインＡを用いて
官能化したアガロース媒体に、複数の異なる溶液中でガンマ線を照射した。動的（ＤＢＣ）モードにおけるヒトの多クローン性ＩｇＧ（ｈＩｇＧ）についての能力を用いて、動的結合アッセイにおけるこれらのアフィニティ充填媒体の性能に対するガンマ線の影響を評価した。
【０１５８】
方法
CaptivA（商標）PriMab（商標）（ｒＳＰＡで固定したSepharose 4FF、Repligen Corporation）プロテインＡ媒体の、１３×２０ｍｌのサンプルを、１３種類の溶液に流し込んだ。５０％のスラリー濃度で各々２０ｍｌのサンプルを調製した。１３のサンプル各々を、目標ガンマ線照射線量４０ｋＧｙのためにSteris（Northborough、マサチューセッツ州）に送った。実際の線量は、３６．３ｋＧｙと３９．９ｋＧｙの間であった。ガンマ線照射に続いて、各々のＤＢＣを求めた。
【０１５９】
ＩｇＧの動的結合容量
量が約１ｍｌの各媒体を、カラム（ＸＫ５、ＩＤ０．５ｃｍ）に充填した。各カラムに、ＡＫＴＡエクスプローラＦＰＬＣ（GE Healthcare）を用い、流量１ｍｌ／分でＰＢＳ
を充填した。ｈＩｇＧ（SeraCare）を、２．２ｍｇ／ｍｌになるようにＰＢＳで希釈した後、滞留時間が６分となる流速でカラムに入れた。１０％のｈＩｇＧブレークスルーにおける結合容量を求めた。
【０１６０】
結果
結果を表８に示す。
【０１６１】
【表８】
2020024207.tif 000016
【０１６２】
この結果は、その中でプロテインＡ媒体にガンマ線を照射した溶液が、官能能力に対して重要な影響を及ぼすとを示している。脱イオン水のみの中では、官能能力は元の＜１０％に低下する。前の実施例は、２０％エタノール中で２８．６〜３３．５ｋＧｙの間の線量で照射した後の、結合容量が、比較対照の＞６５％であったことを示した。このことは、脂肪族第一級アルコールが、プロテインＡ分子を含有するアフィニティ媒体の性能の維持に有益であることを示す。この実験において、２０％エタノール溶液中の２００ｍＭのアスコルビン酸を用いたときに、同様の結果が得られた。
【０１６３】
意外にも、アセテートまたはエタノールを含まない２％ベンジルアルコールを用いた溶液中で照射した媒体は、官能結合すべてを保持していた。このことは、ガンマ線に対する暴露中の芳香族アルコールの存在が、保護という利点をもたらすことを明らかにしている。アセテートが存在するサンプルは、ｐＨ５のときよりもｐＨ６のときの方が安定性が低いが、各々、水単独のときと比較して高い能力を保持していた。アセテートサンプル中のアスコルビン酸の存在は、濃度の増加に対して適度な保護硬化をもたらした。
【０１６４】
他の実施形態
本発明について、その詳細な説明に関連付けて述べてきたが、上記説明は、例示を意図したものであって、添付の請求項の範囲によって定められる発明の範囲を限定することを意図したものではないことが、理解されるはずである。他の側面、利点、実施形態、および変形は、以下の請求項の範囲に含まれる。
【図１】
2020024207.tif 000017
【図２Ａ】
2020024207.tif 000018
【図２Ｂ】
2020024207.tif 000019
【図３Ａ】
2020024207.tif 000020
【図３Ｂ】
2020024207.tif 000021
【図４Ａ】
2020024207.tif 000022
【図４Ｂ】
2020024207.tif 000023
【図４Ｃ】
2020024207.tif 000024
【図５】
2020024207.tif 000025
【図６】
2020024207.tif 000026
【図７】
2020024207.tif 000027
【図８】
2020024207.tif 000028
【図９ａ】
2020024207.tif 000029
【図９ｂ】
2020024207.tif 000030
【図１０ａ】
2020024207.tif 000031
【図１０ｂ】
2020024207.tif 000032
【図１１】
2020024207.tif 000033
【図１２】
2020024207.tif 000034
【図１３】
2020024207.tif 000035
【図１４Ａ】
2020024207.tif 000036
【図１４Ｂ】
2020024207.tif 000037
【図１４Ｃ】
2020024207.tif 000038
【図１４Ｄ】
2020024207.tif 000039
【図１４Ｅ】
2020024207.tif 000040
【図１４Ｆ】
2020024207.tif 000041
【図１４Ｇ】
2020024207.tif 000042
【図１４Ｈ】
2020024207.tif 000043
【図１４Ｉ】
2020024207.tif 000044
【図１４Ｊ】
2020024207.tif 000045
【図１５】
2020024207.tif 000046
【図１６】
2020024207.tif 000047
【図１７】
2020024207.tif 000048
【図１８】
2020024207.tif 000049
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月30日(2019.10.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
滅菌充填クロマトグラフィーカラムを調製する方法であって、
（ａ）管を選択するステップと、
（ｂ）前記管の中に充填媒体を加え、前記管の両端を閉じることにより、充填カラムを作製するステップと、
（ｃ）前記カラムに、８ｋＧｙ以上約４０ｋＧｙまでの線量のガンマ線を照射することにより、滅菌充填クロマトグラフィーカラムを作製するステップとを含む、方法。
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月22日(2019.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリンＩｇＧに結合可能なブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）ポリペプチドを用いて官能化されている充填媒体を含む、充填クロマトグラフィーカラムのための保護液であって、
水中またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の２％ベンジルアルコールを含み、
前記充填クロマトグラフィーカラムに、前記保護液の存在下で、８ｋＧｙ以上約４０ｋＧｙまでの線量のガンマ線を照射するときに、前記充填クロマトグラフィーカラムが滅菌され、前記ＳｐＡポリペプチドはそれらの動的結合容量の実質的にすべてを保つ、保護液。
【請求項２】
前記ＳｐＡポリペプチドは、全長野生型ＳｐＡ、組換えＳｐＡ、ＳｐＡドメインＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、もしくはＺから選択されたＳｐＡドメインを含む単量体ＳｐＡポリペプチド、または、ＳｐＡドメインＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、もしくはＺから選択されたいずれか２つ、３つ、４つ、または５つ以上のＳｐＡドメインを任意に組合わせたものを含む多量体ＳｐＡポリペプチド、または、その機能的等価物を含む、請求項１に記載の保護液。
【請求項３】
前記ＳｐＡポリペプチドは多量体ＳｐＡポリペプチドを含む、請求項２に記載の保護液。
【請求項４】
前記多量体ＳｐＡポリペプチドは、ＳｐＡドメインＢ、Ｃ、およびＺから選択された４つまたは５つのＳｐＡドメインを含む、請求項３に記載の保護液。
【請求項５】
前記ＳｐＡドメインはすべて同一である、請求項４に記載の保護液。
【請求項６】
前記多量体ＳｐＡポリペプチドは５つのＳｐＡドメインＣを含む、請求項５に記載の保護液。
【外国語明細書】
2020024207000001.pdf