(57)【要約】【課題】血液浄化療法を施行する前に、血液浄化療法が当該ヒトにとって臨床的有効性を示すことを予測可能な方法を提供すること。【解決手段】ヒトから採取された血液中のメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＴｈ１細胞の割合を測定する工程を含む、前記ヒトに対する血液浄化療法の臨床的有効性を予測するためのデータを収集する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトから採取された血液中のメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＴｈ１細胞の割合を測定する工程を含む、前記ヒトに対する血液浄化療法の臨床的有効性を予測するためのデータを収集する方法。
【請求項２】
前記ヒトが中枢神経系炎症性脱髄疾患を罹患した患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記中枢神経系炎症性脱髄疾患が多発性硬化症である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記血液浄化療法が免疫吸着療法である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液浄化療法の臨床的有効性を予測するためのデータを収集する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性硬化症（ＭＳ）は、自己免疫学的機序によって中枢神経組織が障害される疾患である。多く患者は、視力の低下、筋力の低下、感覚障害、歩行障害などの症状を呈し、症状の再発と寛解を繰り返す。このような多発性硬化症は、特に再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）と呼ばれる。ＲＲＭＳ患者は、徐々に障害が悪化していき、二次性進行型多発性硬化症（ＳＰＭＳ）へと移行する。
【０００３】
近年、これら病態の解明に関する研究が進むに伴い、疾患修飾薬の開発も進められている。疾患修飾薬は、ＲＲＭＳにおける再発率の低下及び病態の進行抑制に対して有効であり得るが、再発時の治療方法としてはステロイドパルス療法が中心となっており、最終的に日常生活動作（ＡＤＬ）に支障をきたす神経障害を残す場合もある。更に、ＳＰＭＳに対して有効な治療方法は、ほとんどない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】MichaelJ.K. et al. Atherosclerosis Supplements 14 (2013) 175-178.
【非特許文献２】SebastianS. et al. Eur. Neurol. 2016;75:300-306.
【非特許文献３】MichaelJ.K. et al. Journal of Neuroinflammation 2012, 9:80.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
日本においては、ＲＲＭＳの急性増悪期の治療において、ステロイドパルス療法では病態の寛解が不十分である場合に、血漿交換療法（ＰＥ：Plasma exchange）が医療保険の適用対象となっている。また、欧米においても、血漿交換療法は、中枢神経系炎症性脱髄疾患の治療手段の１つとして推奨されている。本発明者らは、これまでに年間６０〜８０例の多発性硬化症患者に対して血液浄化療法を施行しており、３２．４％において客観的指標が改善し、６４．９％において自覚症状として改善が見られた。なかでも、血液浄化療法は、ＲＲＭＳ患者だけでなくＳＰＭＳ患者にも有効である場合があった。
【０００６】
免疫吸着療法を含めた血液浄化療法では、治療効果を示す患者群と治療効果をあまり示さない患者群が存在し、統計学的に高い成功率が得られないという問題点がある（非特許文献１〜３）。加えて、血液浄化療法は、長い施行時間と高価な設備を必要とする。そのため、これらが十分な普及を実現するための問題点となっていると考えられている。
【０００７】
そこで、本発明の目的は、血液浄化療法を施行する前に、血液浄化療法が当該ヒトにとって臨床的有効性を示すことを予測可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の［１］〜［１２］を提供する。
［１］  ヒトから採取された血液中のメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＴｈ１細胞の割合を測定する工程を含む、ヒトに対する血液浄化療法の臨床的有効性を予測するためのデータを収集する方法。
［２］  ヒトが中枢神経系炎症性脱髄疾患を罹患した患者である、［１］に記載の方法。
［３］  中枢神経系炎症性脱髄疾患が多発性硬化症である、［２］に記載の方法。
［４］  血液浄化療法が免疫吸着療法である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］  メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ３＋ＣＤ８−ＣＤ４５ＲＡ−細胞である、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］  Ｔｈ１細胞がＩＦＮγ＋ＩＬ１７Ａ−細胞である、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］  血液浄化療法の臨床的有効性を予測するために、ヒトから採取された血液中のメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＴｈ１細胞の割合を測定する方法。
［８］  ヒトが中枢神経系炎症性脱髄疾患を罹患した患者である、［７］に記載の方法。
［９］  中枢神経系炎症性脱髄疾患が多発性硬化症である、［８］に記載の方法。
［１０］  血液浄化療法が免疫吸着療法である、［７］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］  メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ３＋ＣＤ８−ＣＤ４５ＲＡ−細胞である、［７］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］  Ｔｈ１細胞がＩＦＮγ＋ＩＬ１７Ａ−細胞である、［７］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］  ヒトから採取された血液中のメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＴｈ１細胞の割合を測定する工程を含む、ヒトに対する血液浄化療法の臨床的有効性を予測する方法。
［１４］  メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＴｈ１細胞の割合が１０％以上である場合に、血液浄化療法が該ヒトに対して有効であると予測することを含む、［１３］に記載の方法。
［１５］  メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＴｈ１細胞の割合が１５％以上である場合に、血液浄化療法が該ヒトに対して有効であると予測することを含む、［１３］に記載の方法。
［１６］  ヒトが中枢神経系炎症性脱髄疾患を罹患した患者である、［１３］〜［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］  中枢神経系炎症性脱髄疾患が多発性硬化症である、［１６］に記載の方法。
［１８］  血液浄化療法が免疫吸着療法である、［１３］〜［１７］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、血液浄化療法を施行する前に、血液浄化療法が当該ヒトにとって臨床的有効性を示すことを予測可能な方法を提供することができる。
【００１０】
血液浄化療法は、特にステロイド治療に抵抗性を示す患者、及び、合併症又は副作用の発現のためにステロイド治療を施行できない患者に対する治療方法として有効であり、早期施行が望まれる。本発明によれば、ヒトの末梢血中のメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＴｈ１細胞の割合を測定し、特定の閾値との大小を比較することにより、当該ヒト対象の治療に血液浄化療法が有効であるかどうかを事前に評価することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】レスポンダー群及び非レスポンダー群の臨床的特徴を比較したグラフである。
【図２】レスポンダー群及び非レスポンダー群の臨床的特徴を比較したグラフである。
【図３】レスポンダー群及び非レスポンダー群の臨床的特徴を比較したグラフである。
【図４】免疫吸着療法の施行前後におけるＴ細胞頻度の変化を示すグラフである。
【図５】レスポンダー群及び非レスポンダー群の免疫吸着療法施行前のＴｈ１細胞頻度を比較したグラフとそのＲＯＣ曲線を示すグラフである。
【図６】免疫吸着療法の施行前後におけるＴｈ１細胞の遺伝子発現の変化を示すグラフである。
【図７】レスポンダー群及び非レスポンダー群の免疫吸着療法の施行前後における制御性Ｔ細胞頻度の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の一実施形態は、ヒトから採取された血液中のメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＴｈ１細胞の割合を測定する工程を含む、ヒトに対する血液浄化療法の臨床的有効性を予測するためのデータを収集する方法である。
【００１３】
本実施形態に係る方法によれば、ヒトから採取された血液サンプルにおいて、メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞中のＴｈ１細胞集団の割合を測定することによって、血液浄化療法が臨床的に有効であるかどうかを予測し得る。
【００１４】
血液浄化療法（ＰＰ：Plasmapheresis）には、免疫吸着療法（ＩＡＰＰ：Immunoadsorption plasmapheresis）、単純血漿交換療法（ＳＰＥ：Simple plasma exchange）と二重膜ろ過療法（ＤＦＰＰ：Doublefiltration plasmapheresis）がある。免疫吸着療法は、血液製剤を必要とせず、より簡便に実施することができる。血液浄化療法の効果には、病因物質の除去、免疫調節機能があり、自己抗体（抗ＡＱＰ４抗体等）、各種炎症性サイトカイン、補体、及び免疫複合体の除去、生体内におけるサイトカイン産生を調節し、Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫バランスを改善することが挙げられる。免疫吸着療法において、本実施形態に係る方法により、高い精度で臨床的有効性を予測することができる。
【００１５】
血液浄化療法を施行した場合には、当該方法によって有効に治療効果が得られる者（レスポンダー）と、あまり治療効果が得られない者（非レスポンダー）が存在する。血液浄化療法の臨床的有効性は、その病態の障害度が改善したかどうかで判断することができる。中枢神経系炎症性脱髄疾患の障害度の指標としては、例えば、総合障害尺度（ＥＤＳＳ：Expanded disability status scale）、機能別障害度（ＦＳ：Functionalsystem score）が挙げられる。ＥＤＳＳ及びＦＳの評価基準は、例えば、Kurtzke JF.Neurology 1983 Nov;33(11):1444-52.の記載を参考にしてもよい。
【００１６】
血液浄化療法の施行前に本実施形態に係る方法を実施することにより、臨床的に有効でないヒトに対して血液浄化療法を施行することを避けることができ、その結果、当該ヒトの精神的又は身体的負担を軽減することができるだけでなく、より効率的な治療を提供することが可能となる。
【００１７】
本方法を適用するヒトは、血液浄化療法の施行を検討されることが望ましいヒトであり、例えば、中枢神経系炎症性脱髄疾患を罹患した患者である。さらに、血液浄化療法は他の治療との併用が可能であり、他の治療と併用することによって、個々の患者の病態に適した治療の選択が可能となる。特に、副腎皮質ステロイドの投与等のステロイド治療に抵抗性を示す患者、合併症又は副作用の発現のためにステロイド治療を施行できない患者に対して、本実施形態に係る方法は有用である。
【００１８】
中枢神経系炎症性脱髄疾患としては、中枢神経系において脱髄を伴う炎症性疾患であれば限定されず、例えば、多発性硬化症（ＭＳ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、バロー同心円硬化症（ＢＣＳ）、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性横断性脊髄炎（ＡＴＭ）、中枢末梢連合脱髄症（ＣＣＰＤ）、特発性視神経炎（ＩＯＮ）が挙げられる。特に多発性硬化症は、疾患を特定するまでに種々の呼称が存在する。ＭＳ患者は、最初に単一の脱髄性症状（ＣＩＳ：Clinically isolated syndrome）で発症し、二番目のエピソード（脱髄性症状）を再発した場合にＣＤＭＳ（Clinically definite multiple sclerosis）と診断される。また、ＲＩＳ（Radiologically isolated syndrome）は、ＭＳを示唆する核磁気共鳴画像（ＭＲＩ）による所見があるが、無症状の患者と定義されている。中枢神経系炎症性脱髄疾患が多発性硬化症であると、高い精度で免疫吸着療法に対する臨床的有効性を予測することができる。
【００１９】
中枢神経系に脱髄を生じ得る疾患としては、例えば、フェニルケトン尿症、テイ・サックス病、ニーマン・ピック病、ゴーシェ病、ハーラー症候群、クラッベ病及びその他の白質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィー、副腎脊髄ニューロパチー、Ｌｅｂｅｒ遺伝性視神経症、一酸化炭素中毒、遅延性低酸素性脳脱髄症候群、進行性皮質下虚血性脱髄、浸透圧性脱髄症候群（橋中心髄鞘崩壊症）、Ｍａｒｃｈｉａｆａｖａ−Ｂｉｇｎａｍｉ病、ビタミンＢ１２欠乏症、進行性多巣性白質脳症、亜急性硬化性全脳炎、熱帯性痙性対麻痺、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症、視神経炎、急性播種性脳脊髄炎、急性出血性白質脳症が挙げられる。
【００２０】
ヒトから採取された血液は、ヒトの末梢血管から採取された血液であってよい。末梢血管から採取することにより、ヒトへの身体的負担がより少ない。
【００２１】
血液からメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞及びＴｈ１細胞を同定する方法は、当業者に周知な方法で実施すればよい。これらＴ細胞を同定する方法としては、例えば、血液からリンパ球を分離し、更に所定の抗原に対する蛍光標識抗体を用いて染色し、フローサイトメーターを用いて、メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８−ＣＤ４５ＲＡ−細胞）を同定することができる。さらに、同様にして、蛍光標識抗体を用いて、Ｔｈ１細胞（ＩＦＮγ＋ＩＬ１７Ａ−細胞）を同定することができる。
【００２２】
得られたデータを用いて、ヒトに対する血液浄化療法の臨床的有効性を予測することができる。
【００２３】
メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＴｈ１細胞の割合が１０％以上であると、血液浄化療法の臨床的有効性が高いと予測することができる。また、メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＴｈ１細胞の割合が１０％以上、１１％以上、１２％以上、１３％以上、１４％以上、１５％以上、又は２０％以上であると、より高い精度で血液浄化療法の臨床的有効性を予測することができる。
【００２４】
また、メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＴｈ１細胞の割合が、健康成人から採取した血液中のメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＴｈ１細胞の割合を平均した値よりも高い場合に、血液浄化療法の臨床的有効性がより高いと予測することもできる。健康成人１３名から採取した血液から算出したメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＴｈ１細胞の割合の平均値は１０．９％である。
【００２５】
本発明の他の実施形態は、ヒトから採取された血液中のメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＴｈ１細胞の割合を測定する工程を含む、ヒトに対する血液浄化療法の臨床的有効性を予測する方法である。
【００２６】
ヒトから採取された血液中のメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＴｈ１細胞の割合を測定する工程に関しては、上述の実施形態と同様である。
【００２７】
本実施形態に係る方法により、ヒト対象に対する血液浄化療法が臨床的に有効であると予測された場合、実際に当該ヒトに血液浄化療法を施行することが勧められる。
【実施例】
【００２８】
多発性硬化症患者（ＭＳ患者）２１例に対して、免疫吸着療法（ＩＡＰＰ）を施行し、ＩＡＰＰ治療が有効である群（レスポンダー群）と有効でない群（非レスポンダー群）に分けて、両者の違いを調査した。
【００２９】
各ＭＳ患者について、年齢、性別、ＭＳの種類（ＲＲＭＳ又はＳＰＭＳ）、罹患期間、総合障害尺度（ＥＤＳＳ：Expanded disability status scale）、年間再発率（ＡＲＲ）、免疫吸着療法（ＩＡＰＰ）施行時の病態（再発時又は非再発時）を調査した。次に、ＭＳ患者の末梢血管から採血し、腰部から脳脊髄液（ＣＳＦ）を採取し、ＭＲＩ測定により画像解析を行った。
【００３０】
その後、免疫吸着療法を約２〜７日に１回施行し、４回目のＩＡＰＰ施行後に、末梢血管から血液を採取した。患者の病態により、更にＩＡＰＰの施行を継続した。また、ＭＳ患者に対して多発性硬化症の障害度を示す標準的指標として総合障害尺度（ＥＤＳＳ：Expanded Disability status scale）及び機能別障害度（ＦＳ：Functional system score）を用いて臨床的有効性を評価し、いずれかの指標が改善した患者を「レスポンダー」に分類し、いずれも改善しなかった患者を「非レスポンダー」に分類した。自覚的改善があったとしても、上記指標が改善しなかった患者は非レスポンダーに分類した。
【００３１】
採取した血液サンプルから末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離し、所定の抗原に対する蛍光標識抗体を用いて染色し、フローサイトメーターを用いて、メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８−ＣＤ４５ＲＡ−細胞）を同定した。さらに、メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞から、Ｔｈ１細胞（ＩＦＮγ＋ＩＬ１７Ａ−細胞）、Ｔｈ１７細胞（ＩＦＮγ−ＩＬ１７Ａ＋細胞）、及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞、ＩＦＮγ−ＩＬ１７Ａ−Ｆｏｘｐ３＋細胞）の各集団の割合を測定した。なお、細胞の同定に使用した蛍光標識抗体は、抗ＣＤ３抗体（BioLegend製）、抗ＣＤ８抗体（BioLegend製）、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体（BD Biosciences製）、抗ＩＦＮγ抗体（BioLegend製）、抗ＩＬ１７Ａ抗体（BioLegend製）、抗Ｆｏｘｐ３抗体（BD Biosciences製）である。
【００３２】
各ＭＳ患者をレスポンダー群と非レスポンダー群に分類したところ、レスポンダー群は１２名であり、非レスポンダー群は９名であった。レスポンダー群と非レスポンダー群について、各種臨床状態、脳脊髄液における検査所見及び画像診断に基づき、比較した結果を図１〜図３に示す。
【００３３】
図１は、両群のＭＳ患者の年齢、性別、罹患期間、再発寛解型／進行型の割合、ＥＤＳＳ、年間再発率（ＡＲＲ）、血液浄化療法施行時の病態を示すグラフである。しかし、いずれの項目においても、レスポンダー群と非レスポンダー群の間で有意な差がある項目はなかった。
【００３４】
図２（ａ）は、両群のＭＳ患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＩｇＧインデックスである。ＩｇＧインデックスとは、総タンパク量の個人差を補正するために、ＣＳＦ中のアルブミン濃度に対するＩｇＧ濃度の比を、血清アルブミン濃度に対する血清ＩｇＧ濃度の比で除した値である。図２（ｂ）は、両群のＭＳ患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）中のオリゴクローナルバンド（ＯＣＢ）の有無を示すグラフである。図２（ｂ）中、ｐｏｓｉｔｉｖｅはＯＣＢが発見された人数を示し、ｎｅｇａｔｉｖｅはＯＣＢが発見されなかった人数を示す。ＯＣＢとは、ＣＳＦを電気泳動したときに、ＭＳ病態で増加した免疫グロブリン（特にＩｇＧ）に由来する複数のバンドとして観察されるものであり、ＭＳ患者（初期病態を除く。）の８０〜９０％で観察される。しかし、いずれの項目においても、レスポンダー群と非レスポンダー群の間で有意な差がある項目はなかった。
【００３５】
図３は、両群のＭＳ患者の核磁気共鳴画像（ＭＲＩ）測定による所見を示すグラフである。図３（ａ）は、Ｂａｒｋｈｏｆの評価基準、例えば、Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．  ２０１６  Ｍａｒｃｈ；１５（３）：２９２−３０３．に記載の評価基準にしたがって評価したグラフである。図３（ａ）中、縦軸は評価基準にしたがうスコアを示し、各点は個々のＭＳ患者を示す。図３（ｂ）は、側脳室に垂直に位置する脳室周囲もしくは深部白質の病変（Ｄａｗｓｏｎ’ｓ  ｆｉｎｇｅｒ）が有無を示したグラフである。図３（ｂ）中、ｐｏｓｉｔｉｖｅは病変が発見された人数を示し、ｎｅｇａｔｉｖｅは病変が発見されなかった人数を示す。しかし、いずれの項目においても、レスポンダー群と非レスポンダー群の間で有意な差がある項目はなかった。
【００３６】
次に、レスポンダー群と非レスポンダー群について、メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＩＦＮγ＋ＩＬ１７Ａ−細胞（Ｔｈ１細胞）、ＩＦＮγ-ＩＬ１７Ａ＋細胞（Ｔｈ１７細胞）、ＩＦＮγ＋ＩＬ１７Ａ＋細胞頻度を測定し、比較した結果をそれぞれ図４（ａ）〜（ｃ）に示す。図４中、「ＨＣ」は健康成人から採取された血液中の各細胞頻度を示す。Ｔｈ１７細胞及び制御性Ｔ細胞頻度と比較して、Ｔｈ１細胞頻度は非レスポンダー群よりもレスポンダー群のほうが有意に高かった（ｐ＜０．０１）。また、免疫吸着療法の施行前後を比較すると、Ｔｈ１細胞頻度は、免疫吸着療法によって低下することもなかった。免疫吸着療法の施行前のＴｈ１細胞頻度の数値を図５（ａ）及び表１に示す。
【表１】
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【００３７】
図５（ｂ）は、図５（ａ）に基づき、Ｔｈ１細胞頻度が高い順に並べて、各患者がレスポンダーか非レスポンダーかを解析し、ＲＯＣ曲線で表したグラフである。縦軸は、感度（レスポンダーのうち、Ｔｈ１細胞頻度に基づきレスポンダーと予測しうる割合）を示し、横軸は偽陽性率（非レスポンダーのうち、Ｔｈ１細胞頻度に基づき非レスポンダーと予測しうる割合を１００から引いたもの）を示す。ＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）は０．９５であり、Ｔｈ１細胞頻度と免疫吸着療法の治療効果は高精度で相関していることがわかった。
【００３８】
さらに、免疫吸着療法の施行前後のＴｈ１細胞内における特定の遺伝子（ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ４、ＩＦＮＧ、ＴＢＸ２１）の発現量の変化を調べた。免疫吸着療法を施行することにより、ＳＴＡＴ１遺伝子が有意に低下する傾向が見られた。
【００３９】
最後に、レスポンダー群と非レスポンダー群について、メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）頻度を測定し、比較した結果を図７（ａ）に示す。両群とも、免疫吸着療法の前後で制御性Ｔ細胞頻度に有意な変化は見られなかった。また、両群の制御性Ｔ細胞頻度の変化率についても比較したが、有意な差はなかった（図７（ｂ））。
【００４０】
以上の結果から、Ｔｈ１細胞頻度（メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＴｈ１細胞の割合）が特定の数値よりも高いと、血液浄化療法による治療効果が得られると予測することが可能であることがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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