(57)【要約】      （修正有）【課題】ＥＧＦＲ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤による治療によって引き起こされる皮膚状態を治療、予防するためのＢＲａｆ阻害剤の提供。【解決手段】（１，５-イソキノリンジアミン，N1-(４-クロロフェニル）-６-メチル-N５-［３-（９H-プリン-６-イル）-２-ピリジニル］)、１，５-イソキノリンジアミン，N1-(３-クロロ-４-フルオロフェニル）-６-メチル-N５-［３-（９H-プリン-６-イル）-２-ピリジニル］)、（２-キナゾリンアミン，６-［１-［［３-（１，１-ジメチルエチル）-１-メチル-１H-ピラゾール-５-イル］アミノ］-６-メチル-５-イソキノリニル］-N-メチル））、（２-キナゾリンアミン，N-メチル-６-［６-メチル-１-［［３-（トリフルオロメトキシ）フェニル］アミノ］-５-イソキノリニル］）、またはベムラフェニブ、のいずれかから選ばれる、ＭＡＰＫ（ＥＲＫ）の活性化剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＲａｆ阻害剤を含むＭＡＰＫ（ＥＲＫ）活性化剤であって、前記ＢＲａｆ阻害剤が
Ｃ−１（１，５-イソキノリンジアミン，N1-(４-クロロフェニル）-６-メチル-N５-［３-（９H-プリン-６-イル）-２-ピリジニル］)：
2020121997.tif 000015
Ｃ−１５（１，５-イソキノリンジアミン，N1-(３-クロロ-４-フルオロフェニル）-６-メチル-N５-［３-（９H-プリン-６-イル）-２-ピリジニル］)：
2020121997.tif 000016
Ｃ−１９（２-キナゾリンアミン，６-［１-［［３-（１，１-ジメチルエチル）-１-メチル-１H-ピラゾール-５-イル］アミノ］-６-メチル-５-イソキノリニル］-N-メチル））：
2020121997.tif 000017
Ｃ−Ａ（２-キナゾリンアミン，N-メチル-６-［６-メチル-１-［［３-（トリフルオロメトキシ）フェニル］アミノ］-５-イソキノリニル］）：
2020121997.tif 000018
またはベムラフェニブ、のいずれかから選ばれる、ＭＡＰＫ（ＥＲＫ）の活性化剤。
【請求項２】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１に記載のＭＡＰＫ（ＥＲＫ）の活性化剤。
【請求項３】
軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、フォーム、スプレー、ローション 、液体、懸濁液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、フィルム、セメント、粉末、にかわ、エアロゾル、包帯および皮膚パッチのいずれかまたはこれらの組み合わせから選択される剤形を有する、請求項１または２のいずれかに記載のＭＡＰＫ（ＥＲＫ）の活性化剤。
【請求項４】
表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤および／またはホスホイノシチド−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤による治療によって誘発される、ざ瘡様発疹、丘疹膿疱性発疹、異常な頭髪の成長、異常な顔の毛の成長、異常な毛の成長、異常なまつ毛の成長、化膿性肉芽腫を伴ったまたは伴わない爪周囲炎、および毛細血管拡張症から選択される皮膚状態を処置するための薬剤を製造するための、請求項１に記載のＭＡＰＫ（ＥＲＫ）の活性化剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年３月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／３０６１４７号の優先権を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、ＥＧＦＲ阻害剤および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤による治療によって引き起こされる皮膚反応を治療および／または予防するためのＢＲａｆ阻害剤を含む組成物ならびにその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、ＥｒｂＢファミリーの受容体チロシンキナーゼである。ＥＧＦＲの活性化は、ホモ二量体化／ヘテロ二量体化、特異的チロシン残基のリン酸化、および受容体の細胞内部分におけるいくつかのタンパク質の動員をもたらす。これに応答して、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫ経路および／またはＰＩ３Ｋ経路などの下流シグナル伝達経路を活性化して、細胞増殖、生存、浸潤、および転移に関連する遺伝子の核活性化を含む細胞標的にさらに影響を及ぼし得る。したがって、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）シグナル伝達経路は、ＥＧＦＲが異常に活性化される様々な増殖状態に関与する。これらの経路を標的とする様々な治療剤は、肺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、および膵臓癌などの様々な関連疾患の治療に使用される。治療剤（阻害剤）は、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに向けられたモノクローナル抗体（セツキシマブ、パニツムマブなど）および受容体のチロシンキナーゼの競合阻害剤である小分子チロシンキナーゼ阻害剤（ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブなど）を含む。
【０００４】
癌における制御されていない細胞分裂を引き起こす特定の分子経路を阻止するＥＧＦＲ阻害剤の能力は、化学療法に伴う重篤な全身有害事象の発生率を低下させた。しかしながら、ＥＧＦＲ阻害剤に対する皮膚有害事象が報告されており、おそらく皮膚および付属器構造におけるＥＧＦＲの豊富な発現のためである。ＥＧＦＲ阻害剤に対する皮膚の有害反応には、ざ瘡様（丘疹膿疱性）発疹、異常な頭皮、顔の毛および／またはまつ毛の成長、化膿性肉芽腫を伴ったまたは伴わない爪周囲炎、ならびに毛細血管拡張症が含まれる。
【０００５】
ＢＲａｆは、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫまたはＥＲＫ）シグナル伝達経路の調節に関与するシグナルトランスダクションタンパク質キナーゼである。ＢＲａｆ中の突然変異は、制御されない細胞増殖をもたらし得るＭＡＰＫ（ＭＡＰＫ）経路を介した構成的シグナル伝達を誘導する場合がある。ＢＲａｆ阻害剤の使用は、ＢＲａｆの下流エフェクターであるリン酸化ＥＲＫのレベルの阻害または低下によって決定することができるように、ＭＡＰＫシグナル伝達の阻害と関連することが証明されている。さらに、逆説的に、ＢＲａｆ阻害剤は、ＢＲａｆ野生型細胞におけるＭＡＰＫシグナル伝達の活性化（リン酸化されたＥＲＫのレベルの上昇によって決定される）とは反対の効果を誘発し得ることがさらに観察されている。
【０００６】
したがって、ＥＧＦＲ阻害剤またはＰＩ３Ｋ阻害剤の皮膚有害反応を、そのような阻害剤で治療された対象において改善または予防するために使用することができる効果的な組成物の必要性が当該技術分野において存在する。
【発明の概要】
【０００７】
いくつかの実施形態によれば、ＥＧＦＲで治療された対象におけるＥＧＦＲ阻害剤によって誘発されるか、それと関連するか、またはそれによって引き起こされる皮膚反応／状態の治療または予防のための治療有効量のＢＲａｆ阻害剤を含む組成物およびその使用が提供される。いくつかの実施形態では、皮膚反応／状態は、ＰＩ３Ｋ阻害剤によって誘発されるか、それと関連するか、またはそれによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、ＢＲａｆ阻害剤を含む組成物は、全身的または局所的に投与されてもよい。いくつかの例示的な実施形態では、ＢＲａｆ阻害剤を含む組成物は、冒された皮膚領域に局所投与される。いくつかの実施形態では、皮膚反応には、ざ瘡様（丘疹膿疱性）発疹、異常な頭皮の成長、異常な顔面の成長、異常な毛の成長、異常なまつ毛の成長、化膿性肉芽腫を伴ったまたは伴わない爪周囲炎、および毛細血管拡張症などの状態が含まれるが、これらに限定されない。
【０００８】
いくつかの実施形態によれば、それを必要とする対象のＥＧＦＲ阻害剤治療によって引き起こされる皮膚有害反応を治療する方法であって、治療有効量のＢＲａｆ阻害剤またはそれを含む医薬組成物の投与を含む方法が提供される。
【０００９】
いくつかの実施形態によれば、それを必要とする対象のＥＧＦＲ阻害剤治療によって引き起こされる皮膚有害反応を予防する方法であって、治療有効量のＢＲａｆ阻害剤またはそれを含む医薬組成物の投与を含む方法が提供される。
【００１０】
いくつかの実施形態によれば、それを必要とする対象のＰＩ３Ｋ阻害剤治療によって引き起こされる皮膚状態を治療する方法であって、治療有効量のＢＲａｆ阻害剤またはそれを含む医薬組成物の投与を含む方法が提供される。
【００１１】
いくつかの実施形態によれば、それを必要とする対象のＰＩ３Ｋ阻害剤治療によって引き起こされる皮膚状態を予防する方法であって、治療有効量のＢＲａｆ阻害剤またはそれを含む医薬組成物の投与を含む方法が提供される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤治療によって引き起こされる皮膚有害反応の治療または予防のための有効量のＢＲａｆ阻害剤を含む組成物の使用が提供される。いくつかの実施形態では、組成物は局所投与される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤治療によって引き起こされる皮膚反応の治療または予防のための有効量のＢＲａｆ阻害剤を含む組成物であって、局所投与される組成物の使用が提供される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ＢＲａｆ阻害剤は、ＢＲａｆの活性および／または発現を阻害することができる任意の好適な薬剤または薬物を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＢＲａｆ阻害剤は、ＢＡＹ４３−９００６（ソラフェニブ）、ＬＧＸ８１８（エンコラフェニブ）、ＰＬＸ４０３２（ベムラフェニブ）、ＧＳＫ２１１８４３６（ダブラフェニブ）、ＡＲＱ１９７（ティバチニブ）、ＧＳＫ１１２０２１２（トラメチニブ）、ＡＲＱ７３６、ＡＲＱ６８０、ＡＺ６２８、ＣＥＰ−３２４９６、Ｃ−１、Ｃ−１５、Ｃ−１９、Ｃ−Ａ、ＧＤＣ−０８７９、ＮＭＳ−Ｐ１８６、ＮＭＳ−Ｐ３４９、ＮＭＳ−Ｐ３８３、ＮＭＳ−Ｐ３９６、ＮＭＳ−Ｐ７３０、ＰＬＸ３６０３（ＲＯ５２１２０５４）、ＰＬＸ４７２０（ジフルオロフェニル−スルホンアミン）、ＰＦ−０４８８０５９４、ＰＬＸ４７３４、ＲＡＦ２６５、ＲＯ４９８７６５５、ＳＢ５９０８８５、ＢＭＳ９０８６６２、ＷＹＥ−１３０６００、ＴＡＫ６３２、ＭＬＮ２４８０、ＸＬ２８１、およびそれらの組み合わせから選択されてもよい。各可能性は、別個の実施形態である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＢＲａｆ阻害剤は、Ｃ−１、Ｃ−１５、Ｃ−１９、およびＣ−Ａから選択されてもよい。各可能性は、別個の実施形態である。
【００１６】
Ｃ−１、Ｃ−１５、Ｃ−１９、およびＣ−Ａは、例えば、カーナハン（Ｃａｒｎａｈａｎ）ら（Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２０１０  Ａｕｇ；９（８）：２３９９−４１０）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）ら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２００９、５２（２０）、６１８９−６１９頁）において開示され、以下の分子構造を含む：
Ｃ−１：
2020121997.tif 000002
Ｃ−１５：
2020121997.tif 000003
Ｃ−１９：
2020121997.tif 000004
Ｃ−Ａ：
2020121997.tif 000005
【００１７】
いくつかの実施形態では、ＢＲａｆ阻害剤は、下流ＭＡＰＫ（ＥＲＫ）の逆説的な活性化を示す。
【００１８】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、ＥＧＦＲの活性および／または発現を阻害することができる任意の好適な薬剤または薬物を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、Ｉｒｅｓｓａ（ゲフィチニブ）、Ｔａｒｃｅｖａ（エルロチニブ）、Ｔｙｋｅｒｂ（ラパチニブ）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ）、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（パニツムマブ）、Ｃａｐｒｅｌｓａ（バンデタニブ）、Ｐｏｒｔｒａｚｚａ（ネチツムマブ）、Ｔａｇｒｉｓｓｏ（オシメルチニブ）から選択されてもよい。各可能性は、別個の実施形態である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＰＩ３Ｋの活性および／または発現を阻害することができる任意の好適な薬剤または薬物を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＧＤＣ−０９８０（アピトリシブ）、ＧＤＣ−０９４１（ピクチリシブ）、ＢＡＹ  ８０−６９４６（コパンリシブ）、ＢＫＭ１２０（プパルリシブ）、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５（ダクトリシブ）、ＩＰＩ  １４５（デュベリシブ）、イデラリシブ（ＧＳ−１１０１またはＣＡＬ−１０１）、ワートマニン、およびＬＹ２９４００２から選択されてもよい。各可能性は、別個の実施形態である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、組成物は、医薬組成物である。特定の実施形態では、組成物は、化粧品または皮膚科学的投与に好適な形態である。
【００２１】
いくつかの実施形態では、組成物は、１つ以上のＢＲａｆ阻害剤および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、組成物は、局所組成物である。いくつかの実施形態では、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、フォーム、スプレー、または液体から選択される形態の局所組成物。
【００２３】
いくつかの実施形態によれば、表皮成長因子様受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤および／またはホスホイノシチド−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤でそれを必要とする対象を治療することによって誘発される皮膚状態を治療または予防する方法であって、ＢＲａｆ阻害剤を前記対象に投与し、それにより皮膚状態を治療することを含む方法が提供される。
【００２４】
いくつかの実施形態では、皮膚状態は、ざ瘡様発疹、丘疹膿疱性発疹、異常な頭髪の成長、異常な顔の毛の成長、異常な毛の成長、異常なまつ毛の成長、化膿性肉芽腫を伴ったまたは伴わない爪周囲炎、および毛細血管拡張症から選択される。いくつかの実施形態では、皮膚状態は、ざ瘡様発疹である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、対象は、ＢＲａｆ阻害剤の投与前に、ＥＧＦＲ阻害剤および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤で治療される。
【００２６】
いくつかの実施形態では、投与は、局所投与および全身投与から選択されてもよい。
【００２７】
いくつかの実施形態では、全身投与は、経腸投与および非経口投与から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、全身投与は、経口投与を含む。
【００２８】
さらなる実施形態では、局所投与は、対象の肌への局部投与を含んでもよい。
【００２９】
いくつかの実施形態によれば、それを必要とする対象における皮膚状態を治療または予防するための医薬組成物であって、治療有効量のＢＲａｆ阻害剤および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供され、皮膚状態は、ＥＧＦＲ阻害剤および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤による治療に関連する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、全身投与または局部投与のために製剤化されてもよい。
【００３１】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、経口投与のために製剤化されてもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、錠剤、カプセル、液体、懸濁液、および粉末から選択される剤形であってもよい。
【００３２】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所投与のために製剤化されてもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、フォーム、スプレー、ローション、液体、および皮膚パッチから選択される剤形であってもよい。
【００３３】
いくつかの実施形態によれば、それを必要とする対象におけるざ瘡様発疹を治療または予防する方法であって、治療有効量のＢＲａｆ阻害剤を含む医薬組成物を対象に投与し、それにより対象におけるざ瘡様発疹を治療することを含む方法が提供される。
【００３４】
いくつかの実施形態によれば、ＥＧＦＲ阻害剤および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤による治療によって引き起こされる皮膚反応を治療および／または予防するための薬物の臨床開発の候補としてのＢＲａｆ阻害剤集団から、好適なＢＲａｆ阻害剤を同定またはスクリーニングするための方法であって、
（ｉ）既知または新規のＢＲａｆ阻害剤の集団を提供すること；
（ｉｉ）前記ＢＲａｆ阻害剤によるＭＡＰＫ（ＥＲＫ）の活性化を測定すること；
（ｉｉｉ）前記皮膚反応を治療または予防するための臨床開発の候補として最も高い逆説的なＭＡＰＫ活性化効果を有するＢＲａｆ阻害剤を選択すること
を含む方法が提供される。
【００３５】
本発明のさらなる実施形態、特徴、利点、および適用範囲の全範囲は、以下に与えられる詳細な説明および図面から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の趣旨および範囲内の様々な変更および修正が、詳細な説明から当業者には明らかになるので、詳細な説明は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示としてのみ与えられることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１Ａ】ＢＲａｆ阻害剤（０．３μＭ、１μＭ、または３μＭのＣ−１９またはベムラフェニブ）による治療後のヒト一次ケラチノサイト（ＨＥＫａ）におけるＥＲＫの活性化を示す。示されたＢＲａｆ阻害剤、陰性対照（ビヒクル処理細胞（ＤＭＳＯ  ０．１％））、陽性対照（成長因子ミックス（ＨＫＧＳ）で処理された細胞）、または非処理細胞（未処理）による処理後のＨＥＫ細胞溶解物中のリン酸化ＥＲＫ（ホスホ−ＥＲＫ）のウェスタンブロット分析を示すピクトグラムである。
【図１Ｂ】ＢＲａｆ阻害剤（０．３μＭ、１μＭ、または３μＭのＣ−１９またはベムラフェニブ）による治療後のヒト一次ケラチノサイト（ＨＥＫａ）におけるＥＲＫの活性化を示す。ＨＥＫ溶解物中の全ＥＲＫのウェスタンブロット分析を示すピクトグラムである。
【図１Ｃ】ＢＲａｆ阻害剤（０．３μＭ、１μＭ、または３μＭのＣ−１９またはベムラフェニブ）による治療後のヒト一次ケラチノサイト（ＨＥＫａ）におけるＥＲＫの活性化を示す。図１Ａ〜Ｂに示されるウェスタンブロットのデンシトメトリー分析に基づく、リン酸化されたＥＲＫと全ＥＲＫとの比を示す棒グラフである。サイズマーカー（Ｋｄ）は、図１Ａ〜Ｂに提示されたブロットの左側の数字によって示されている。
【図２Ａ】ＢＲａｆ阻害剤（０．３μＭ、１μＭ、または３μＭのＣ−１またはＣ−１５）による治療後のヒト一次ケラチノサイト（ＨＥＫａ）におけるＥＲＫの活性化を示す。示されたＢＲａｆ阻害剤、陰性対照（ビヒクル処理細胞（ＤＭＳＯ  ０．１％））、陽性対照（成長因子ミックス（ＨＫＧＳ）で処理された細胞）、または非処理細胞（未処理）による処理後のＨＥＫ細胞溶解物中のリン酸化ＥＲＫ（ホスホ−ＥＲＫ）のウェスタンブロット分析を示すピクトグラムである。
【図２Ｂ】ＢＲａｆ阻害剤（０．３μＭ、１μＭ、または３μＭのＣ−１またはＣ−１５）による治療後のヒト一次ケラチノサイト（ＨＥＫａ）におけるＥＲＫの活性化を示す。ＨＥＫ溶解物中の全ＥＲＫのウェスタンブロット分析を示すピクトグラムである。
【図２Ｃ】ＢＲａｆ阻害剤（０．３μＭ、１μＭ、または３μＭのＣ−１またはＣ−１５）による治療後のヒト一次ケラチノサイト（ＨＥＫａ）におけるＥＲＫの活性化を示す。図２Ａ〜Ｂに示されるウェスタンブロットのデンシトメトリー分析に基づく、リン酸化されたＥＲＫと全ＥＲＫとの比を示す棒グラフである。サイズマーカー（Ｋｄ）は、図２Ａ〜Ｂに提示されたブロットの左側の数字によって示されている。
【図３Ａ】ＢＲａｆ阻害剤（０．３μＭ、１μＭ、または３μＭのＣ−ＡまたはＺＭ）による治療後のヒト一次ケラチノサイト（ＨＥＫａ）におけるＥＲＫの活性化を示す。示されたＢＲａｆ阻害剤、陰性対照（ビヒクル処理細胞（ＤＭＳＯ  ０．１％））、陽性対照（成長因子ミックス（ＨＫＧＳ）で処理された細胞）、または非処理細胞（未処理）による処理後のＨＥＫ細胞溶解物中のリン酸化ＥＲＫ（ホスホ−ＥＲＫ）のウェスタンブロット分析を示すピクトグラムである。
【図３Ｂ】ＢＲａｆ阻害剤（０．３μＭ、１μＭ、または３μＭのＣ−ＡまたはＺＭ）による治療後のヒト一次ケラチノサイト（ＨＥＫａ）におけるＥＲＫの活性化を示す。ＨＥＫ溶解物中の全ＥＲＫのウェスタンブロット分析を示すピクトグラムである。
【図３Ｃ】ＢＲａｆ阻害剤（０．３μＭ、１μＭ、または３μＭのＣ−ＡまたはＺＭ）による治療後のヒト一次ケラチノサイト（ＨＥＫａ）におけるＥＲＫの活性化を示す。図３Ａ〜Ｂに示されるウェスタンブロットのデンシトメトリー分析に基づく、リン酸化されたＥＲＫと全ＥＲＫとの比を示す棒グラフである。サイズマーカー（Ｋｄ）は、図３Ａ〜Ｂに提示されたブロットの左側の数字によって示されている。
【図４Ａ】様々なＢＲａｆ阻害剤（１μＭのＣ−１９、Ｃ−１、Ｃ−１５、ＣＡ、またはベムラフェニブ）による治療後のヒト一次ケラチノサイト（ＨＥＫａ）におけるＥＲＫの活性化を示す。示されたＢＲａｆ阻害剤、陰性対照（ビヒクル処理細胞（ＤＭＳＯ  ０．１％））、陽性対照（成長因子ミックス（ＨＫＧＳ）で処理された細胞）、または非処理細胞（未処理）による処理後のＨＥＫ細胞溶解物中のリン酸化ＥＲＫ（ホスホ−ＥＲＫ）のウェスタンブロット分析を示すピクトグラムである。
【図４Ｂ】様々なＢＲａｆ阻害剤（１μＭのＣ−１９、Ｃ−１、Ｃ−１５、ＣＡ、またはベムラフェニブ）による治療後のヒト一次ケラチノサイト（ＨＥＫａ）におけるＥＲＫの活性化を示す。ＨＥＫ溶解物中の全ＥＲＫのウェスタンブロット分析を示すピクトグラムである。
【図４Ｃ】様々なＢＲａｆ阻害剤（１μＭのＣ−１９、Ｃ−１、Ｃ−１５、ＣＡ、またはベムラフェニブ）による治療後のヒト一次ケラチノサイト（ＨＥＫａ）におけるＥＲＫの活性化を示す。図４Ａ〜Ｂに示されるウェスタンブロットのデンシトメトリー分析に基づく、リン酸化されたＥＲＫと全ＥＲＫとの比を示す棒グラフである。サイズマーカー（Ｋｄ）は、図４Ａ〜Ｂに提示されたブロットの左側の数字によって示されている。
【図５Ａ】ＭＩＡ  ＰａＣａ２  ＫＲＡＳ細胞の増殖に対するＢＲａｆ阻害剤の効果を示す棒グラフである。Ｃ−１  ＢＲａｆ阻害剤（０．０２μＭ、０．０５μＭ、０．１４μＭ、０．４１μＭ、０．１２３μＭ、０．３７μＭ、１．１μＭ、３．３μＭ、または１０μＭの濃度）の存在下での細胞の相対的な増殖（ビヒクル（ＤＭＳＯ  ０．１％）の％）を示す棒グラフである。
【図５Ｂ】ＭＩＡ  ＰａＣａ２  ＫＲＡＳ細胞の増殖に対するＢＲａｆ阻害剤の効果を示す棒グラフである。Ｃ−１５  ＢＲａｆ阻害剤（０．０２μＭ、０．０５μＭ、０．１４μＭ、０．４１μＭ、０．１２３μＭ、０．３７μＭ、１．１μＭ、３．３μＭ、または１０μＭの濃度）の存在下での細胞の相対的な増殖（ビヒクル（ＤＭＳＯ  ０．１％）の％）を示す棒グラフである。
【図５Ｃ】ＭＩＡ  ＰａＣａ２  ＫＲＡＳ細胞の増殖に対するＢＲａｆ阻害剤の効果を示す棒グラフである。Ｃ−１９  ＢＲａｆ阻害剤（０．０２μＭ、０．０５μＭ、０．１４μＭ、０．４１μＭ、０．１２３μＭ、０．３７μＭ、１．１μＭ、３．３μＭ、または１０μＭの濃度）の存在下での細胞の相対的な増殖（ビヒクル（ＤＭＳＯ  ０．１％）の％）を示す棒グラフである。
【図５Ｄ】ＭＩＡ  ＰａＣａ２  ＫＲＡＳ細胞の増殖に対するＢＲａｆ阻害剤の効果を示す棒グラフである。ＭＩＡ−Ｐａｃａ２細胞を増殖培地に播種し、次いで無血清培地中で２４時間飢餓状態にした。次いで、ＢＲａｆ阻害剤を様々な濃度で細胞に添加し、７２時間後に、細胞の増殖をＡＴＰ−ｌｉｔｅ増殖アッセイによって決定する。ベムラフェニブＢＲａｆ阻害剤（０．０２μＭ、０．０５μＭ、０．１４μＭ、０．４１μＭ、０．１２３μＭ、０．３７μＭ、１．１μＭ、３．３μＭ、または１０μＭの濃度）の存在下での細胞の相対的な増殖（ビヒクル（ＤＭＳＯ  ０．１％）の％）を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明は、ＥＧＦＲ阻害剤および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤による治療によって誘発または引き起こされた皮膚反応を治療または予防することができる組成物であって、治療有効量の１つ以上のＢＲａｆ阻害剤を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、冒された皮膚領域に投与するのに好適な局所組成物である。
【００３８】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＥＧＦＲ阻害剤による治療によって誘発または引き起こされた皮膚反応を治療または予防することができる組成物であって、治療有効量の１つ以上のＢＲａｆ阻害剤を含む組成物を提供する。
【００３９】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤による治療によって誘発または引き起こされた皮膚反応は、ざ瘡様（丘疹膿疱性）発疹、異常な頭皮の成長、異常な顔面の成長、異常な毛の成長、異常なまつ毛の成長、化膿性肉芽腫を伴ったまたは伴わない爪周囲炎、および毛細血管拡張症から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、肌状態は、ざ瘡様発疹である。いくつかの実施形態では、状態は、ざ瘡様発疹である。
【００４０】
いくつかの実施形態によれば、ＥＧＦＲで治療された対象におけるＥＧＦＲ阻害剤によって誘発または引き起こされる皮膚反応の治療または予防のための治療有効量のＢＲａｆ阻害剤を含む組成物およびその使用が提供される。いくつかの実施形態では、ＢＲａｆ阻害剤を含む組成物は、局所投与される。いくつかの実施形態では、皮膚反応には、ざ瘡様（丘疹膿疱性）発疹、異常な頭皮の成長、異常な顔面の成長、異常な毛の成長、異常なまつ毛の成長、化膿性肉芽腫を伴ったまたは伴わない爪周囲炎、および毛細血管拡張症などの状態が含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＰＩ３Ｋ阻害剤による治療によって誘発または引き起こされた皮膚反応を治療または予防することができる組成物であって、治療有効量の１つ以上のＢＲａｆ阻害剤を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、冒された皮膚領域に投与するのに好適な局所組成物である。いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤による治療によって誘発または引き起こされた皮膚反応は、ざ瘡様（丘疹膿疱性）発疹、異常な頭皮の成長、異常な顔面の成長、異常な毛の成長、異常なまつ毛の成長、化膿性肉芽腫を伴ったまたは伴わない爪周囲炎、および毛細血管拡張症から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、肌状態は、ざ瘡様発疹である。いくつかの実施形態では、状態は、ざ瘡様発疹である。
【００４２】
いくつかの実施形態によれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤で治療された対象におけるＰＩ３Ｋ阻害剤によって誘発または引き起こされる皮膚反応の治療または予防のための治療有効量のＢＲａｆ阻害剤を含む組成物およびその使用が提供される。いくつかの実施形態では、ＢＲａｆ阻害剤を含む組成物は、局所投与される。いくつかの実施形態では、皮膚反応には、ざ瘡様（丘疹膿疱性）発疹、異常な頭皮の成長、異常な顔面の成長、異常な毛の成長、異常なまつ毛の成長、化膿性肉芽腫を伴ったまたは伴わない爪周囲炎、および毛細血管拡張症などの状態が含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語および語句を以下に定義する。これらの用語および語句は、本明細書の術語または表現が、当業者の知識と組み合わせて、本明細書に提示された教示および指針に照らして当業者によって解釈されるように、説明するためのものであり、限定するものではないことを理解されたい。
【００４４】
本明細書で使用する場合、用語「ＢＲＡＦ」、「Ｂ−Ｒａｆ」、「Ｂｒａｆ」、および「ＢＲａｆ」は同じ意味で使用してもよい。関連するセリン／スレオニン−タンパク質キナーゼＢＲａｆに関する用語は、細胞シグナル伝達経路である。ＢＲａｆに関する阻害剤という用語は、ＷＴまたは変異したＢＲａｆの活性および／または発現に影響を及ぼすことができる任意の１つ以上の薬剤（薬物）、化合物、または分子を対象とする。阻害剤は、選択的であっても非選択的であってもよい。いくつかの実施形態では、阻害剤は、例えば、標的ＢＲａｆがＷＴ  Ｒａｆである細胞においてＭＡＰＫ活性の増加を誘発する逆説的なＭＡＰＫ効果を示してもよい。ＢＲａｆ阻害剤は、当該技術分野において既知である。例えば、米国特許出願公開第２０１３０１５６７６８号は、このような阻害剤を開示している。例えば、カーナハン（Ｃａｒｎａｈａｎ）ら（Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２０１０  Ａｕｇ；９（８）：２３９９−４１０）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）ら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２００９、５２（２０）、６１８９−６１９頁）は、ＢＲａｆ阻害剤を開示している。いくつかの実施形態では、ＢＲａｆ阻害剤は、化合物、その誘導体、その許容される塩、および／またはその溶媒和物を含んでもよい。
【００４５】
本明細書で使用する場合、用語「ＥＧＦＲ」は、関連するＥｒｂＢファミリーの受容体チロシンキナーゼが細胞シグナル伝達経路である表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に関する。ＥＧＦＲに関する阻害剤という用語は、ＷＴまたは変異したＥＧＦＲの活性および／または発現に影響を及ぼすことができる任意の１つ以上の薬剤（薬物）、化合物、または分子を対象とする。阻害剤は、選択的であっても非選択的であってもよい。
【００４６】
本明細書で使用する場合、用語「ＰＩ３Ｋ」は、ホスホイノシチド−３キナーゼタンパク質に関する。ＰＩ３Ｋタンパク質は、ホスホイノシチド−２リン酸から細胞膜中のホスホイノシチド三リン酸への脂質セカンドメッセンジャーの生成を触媒する。ラパマイシン（ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ）経路のホスホイノシチド−３キナーゼ／プロテインキナーゼ−Ｂ／哺乳動物標的は、増殖制御、代謝、および翻訳開始などの重要な細胞機能の重要なシグナル伝達経路である。ＰＩ３Ｋに関する阻害剤という用語は、ＷＴまたは変異したＰＩ３Ｋの活性および／または発現に影響を及ぼすことができる任意の１つ以上の薬剤（薬物）、化合物、または分子を対象とする。阻害剤は、選択的であっても非選択的であってもよい。
【００４７】
本明細書で使用する場合、用語「皮膚反応」、「皮膚有害反応」、および「皮膚状態」は、同じ意味で使用されてもよく、ＥＧＦＲ阻害剤および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤による治療の結果として発達した／発生した／開始された／誘発された／引き起こされた／進展した肌（皮膚）状態に関する。いくつかの実施形態では、肌状態は、ＥＧＦＲ阻害剤での治療の副作用である。いくつかの実施形態では、肌状態は、ＰＩ３Ｋ阻害剤での治療の副作用である。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「治療有効量」は、所望の治療効果または予防効果を実質的に誘発、促進、またはもたらす医薬成分の量を指す。いくつかの実施形態では、この用語は、所与の状態の治療効果および投与レジメン、具体的には、治療される障害の１つ以上の症状をある程度緩和または予防する量を提供する、投与される化合物の量を指す。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、処方されるがそれ自体の治療効果を有さない医薬成分の送達および／または薬物動態学的特性を増強するために使用され、それが、対象にいずれの望ましくないもしくは不都合な効果または拒絶反応も誘発しないまたは引き起こさない希釈剤またはビヒクルを指す。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「医薬組成物」は、好適な（許容される）希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、および／または担体と共に、治療有効量の本発明の化合物を指す。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、処方されるがそれ自体の治療効果を有さない医薬成分の送達および／または薬物動態学的特性を増強するために使用され、それが、対象にいずれの望ましくないもしくは不都合な効果または拒絶反応も誘発しないまたは引き起こさない希釈剤またはビヒクルを指す。  薬学的に許容される担体は、当業者に周知であり、リン酸緩衝液および／または生理食塩水が含まれるが、これらに限定されない。さらに、そのような薬学的に許容される担体は、水溶液または非水溶液、懸濁液、およびエマルジョンであってもよい。
【００５２】
本明細書で使用する場合、ＥＧＦＲ阻害剤および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤によって誘発される皮膚状態を「治療すること」または「治療」という用語は、状態の治癒、改善、修復、または回復を指す。本明細書で使用する場合、ＥＧＦＲ阻害剤および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤によって誘発される皮膚状態を「予防すること」または「予防」という用語は、対象が皮膚状態を被ることを妨げることを指す。いくつかの実施形態では、これらの用語は、皮膚症状の発症を避けるまたは回避することを指す。いくつかの実施形態では、予防は、皮膚状態に関連する損傷を改善することを目的とする。
【００５３】
いくつかの実施形態によれば、ＢＲａｆ阻害剤は、ＢＲａｆの活性または発現を阻害することができる任意の好適な薬剤または薬物を含んでもよいまたはそれらからなってもよい。いくつかの実施形態では、ＢＲａｆ阻害剤は、ＢＡＹ４３−９００６（ソラフェニブ）、ＬＧＸ８１８（エンコラフェニブ）、ＰＬＸ４０３２（ベムラフェニブ）、ＧＳＫ２１１８４３６（ダブラフェニブ）、ＡＲＱ１９７（ティバチニブ）、ＧＳＫ１１２０２１２（トラメチニブ）、ＡＲＱ７３６、ＡＲＱ６８０、ＡＺ６２８、Ｃ−１、Ｃ−１５、Ｃ−１９、Ｃ−Ａ、ＣＥＰ−３２４９６、ＧＤＣ−０８７９、ＮＭＳ−Ｐ１８６、ＮＭＳ−Ｐ３４９、ＮＭＳ−Ｐ３８３、ＮＭＳ−Ｐ３９６、ＮＭＳ−Ｐ７３０、ＰＬＸ３６０３（ＲＯ５２１２０５４）、ＰＬＸ４７２０（ジフルオロフェニル−スルホンアミン）、ＰＦ−０４８８０５９４、ＰＬＸ４７３４、ＲＡＦ２６５、ＲＯ４９８７６５５、ＳＢ５９０８８５、ＢＭＳ９０８６６２、ＷＹＥ−１３０６００、ＴＡＫ６３２、ＭＬＮ２４８０、ＸＬ２８１、およびそれらの組み合わせから選択されてもよい。各可能性は、別個の実施形態である。
【００５４】
例えば、カーナハン（Ｃａｒｎａｈａｎ）ら（Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２０１０  Ａｕｇ；９（８）：２３９９−４１０）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）ら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２００９、５２（２０）、６１８９−６１９頁）において、Ｃ−１、Ｃ−１５、Ｃ−１９、およびＣ−Ａが開示され、以下の分子構造を含む：
Ｃ−１：
2020121997.tif 000006
Ｃ−１５：
2020121997.tif 000007
Ｃ−１９：
2020121997.tif 000008
Ｃ−Ａ：
2020121997.tif 000009
【００５５】
いくつかの実施形態では、ＢＲａｆ阻害剤は逆説的なＭＡＰＫ活性化効果を示す。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、ＥＧＦＲの活性および／または発現を阻害することができる任意の好適な薬剤または薬物を含んでもよいまたはそれらからなってもよい。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、Ｉｒｅｓｓａ（ゲフィチニブ）、Ｔａｒｃｅｖａ（エルロチニブ）、Ｔｙｋｅｒｂ（ラパチニブ）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ）、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（パニツムマブ）、Ｃａｐｒｅｌｓａ（バンデタニブ）、Ｐｏｒｔｒａｚｚａ（ネチツムマブ）、Ｔａｇｒｉｓｓｏ（オシメルチニブ）、およびそれらの組み合わせから選択されてもよい。各可能性は、別個の実施形態である。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＰＩ３Ｋの活性および／または発現を阻害することができる任意の好適な薬剤または薬物を含んでもよいまたはそれらからなってもよい。いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＧＤＣ−０９８０（アピトリシブ）、ＧＤＣ−０９４１（ピクチリシブ）、ＢＡＹ  ８０−６９４６（コパンリシブ）、ＢＫＭ１２０（プパルリシブ）、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５（ダクトリシブ）、デュベリシブ（ＩＰＩ  １４５）、イデラリシブ（ＧＳ−１１０１またはＣＡＬ−１０１）、ワートマニン、およびＬＹ２９４００２から選択されてもよい。各可能性は、別個の実施形態である。各可能性は、別個の実施形態である。
【００５８】
すべてのＢＲａｆ薬物は、ＢＲａｆ阻害剤活性を示すが、本開示の発明者は、多くがＥＧＦＲ阻害剤および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤による治療によって引き起こされる皮膚反応の治療または予防には不適切であることを見出した。
【００５９】
理論に拘泥するものではないが、本発明者は、逆説的なＭＡＰＫ効果（ＭＡＰＫ活性化）を示すそのＢＲａｆ阻害剤のみが、ＥＧＦＲ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、またはそれらの混合物による治療によって引き起こされる皮膚反応の治療または予防のための好適な薬物候補であると考える。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、またはそれらの混合物による治療によって引き起こされる皮膚反応の治療または予防に好適な逆説的なＭＡＰＫ効果を示すＢＲａｆ阻害剤が提供される。
【００６１】
本明細書では、その逆説的なＭＡＰＫ効果のために、ＢＲａｆ阻害剤は、ＥＧＦＲ阻害剤での治療によって引き起こされるまたは誘発されるざ瘡様発疹などの皮膚状態を治療するのに有用であることが初めて開示される。
【００６２】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤による治療によって引き起こされる皮膚反応の治療または予防に好適な逆説的なＭＡＰＫ効果を示すＢＲａｆ阻害剤が提供される。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤治療は、癌に罹患している対象に投与される抗癌治療である。
【００６３】
本明細書では、その逆説的なＭＡＰＫ効果のために、ＢＲａｆ阻害剤は、ＰＩ３Ｋ阻害剤での治療によって引き起こされるまたは誘発されるざ瘡様発疹などの皮膚状態を治療するのに有用であることが初めてさらに開示される。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤による治療によって引き起こされる皮膚反応の治療または予防に好適な逆説的なＭＡＰＫ効果（ＭＡＰＫの活性化）を示すＢＲａｆ阻害剤が提供される。いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤治療は、癌に罹患している対象に投与される抗癌治療である。
【００６５】
逆説的なＭＡＰＫ効果は、多数の既存または新規のＢＲａｆ阻害剤のうち、ＥＧＦＲ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、またはそれらの混合物による治療によって引き起こされる皮膚反応の治療または予防のために好適な候補の選択に好適であるＢＲａｆ阻害剤のスクリーニングのための有用なツールとして役立ち得る。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤による治療によって引き起こされる皮膚反応を治療および／または予防するための薬物の臨床開発の候補としてのＢＲａｆ阻害剤集団から、好適なＢＲａｆ阻害剤をスクリーニングするための方法であって、
（ｉ）既知または新規のＢＲａｆ阻害剤の集団を提供すること、
（ｉｉ）前記ＢＲａｆ阻害剤によるＭＡＰＫ（ＥＲＫ）の活性化を測定すること（以下の実施例１参照）、
（ｉｉｉ）臨床開発の候補として最高の逆説的なＭＡＰＫ活性化効果を有するＢＲａｆ阻害剤を選択すること
を含む方法が提供される。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本発明における使用のための組成物は、治療有効量の１つ以上のＢＲａｆ阻害剤および薬学的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つのＢＲａｆ阻害剤および薬学的に許容される担体を含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、全身投与または局所投与に好適ないくつかの形態のいずれかで処方されてもよい。
【００６９】
いくつかの実施形態では、本発明における使用のための組成物は、治療有効量の１つ以上のＢＲａｆ阻害剤および薬学的に許容される担体を含み、全身的にまたは局所的に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つのＢＲａｆ阻害剤および薬学的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、全身投与に好適ないくつかの形態のいずれかで処方されてもよい。いくつかの実施形態では、全身投与は、経腸および非経口投与から選択されてもよい。
【００７０】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物の調製において、ＢＲａｆ阻害剤は、包接錯体、ナノエマルジョン、およびマイクロエマルジョンとして好適に処方されてもよい。
【００７１】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、例えば、ゲル、懸濁液、軟膏、ローション、液体、溶液、エマルジョンまたはマイクロエマルジョン、フィルム、セメント、粉末、にかわ、エアロゾル、スプレー、フォーム、パッチ、包帯等、およびそれらの組み合わせなどの皮膚科学的な局所的および／または局部的な投与に好適ないくつかの形態のいずれかで処方されてもよい。各可能性は、別個の実施形態である。
【００７２】
いくつかの実施形態では、投与される投薬量および／または投薬計画は、対象の皮膚状態の年齢、健康、体重、重症度、ＥＧＦＲ阻害剤および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤による治療の使用、治療の頻度、ならびに所望の効果の性質に依存する。各可能性は、別個の実施形態である。
【００７３】
いくつかの実施形態では、いずれかの単位剤形におけるＢＲａｆ阻害剤の量および性質は、レシピエント対象、投与頻度、ＥＧＦＲおよび／またはＰＩ３Ｋ阻害剤治療、皮膚状態の部位、ならびに重症度などに応じて変化し得る治療有効量を含む。各可能性は、別個の実施形態である。
【００７４】
いくつかの実施形態では、処方におけるＢＲａｆ阻害剤の濃度、量、またはパーセンテージは、広範に変化してもよく、処方の容量、粘度、剤形などと同様に投与計画に依存してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、ＢＲａｆ阻害剤の濃度は、０．５ｎＭ〜１０００ｎＭおよびそのいずれかの部分範囲で変化してもよい。各可能性は、別個の実施形態である。例えば、いくつかの実施形態では、ＢＲａｆ阻害剤の量は、０．５μｇ〜１０００ｍｇおよびそのいずれかの部分範囲で変化してもよい。各可能性は、別個の実施形態である。いくつかの実施形態では、ＢＲａｆ阻害剤の量は、２００〜１０００マイクログラムの範囲であってもよい。例えば、いくつかの実施形態では、ＢＲａｆ阻害剤のパーセンテージは、製剤の０．００５〜５％の範囲、およびそのいずれかの部分範囲であってもよい。各可能性は、別個の実施形態である。いくつかの実施形態では、ＢＲａｆ阻害剤のパーセンテージは、０．０１〜３％の範囲であってもよい。いくつかの実施形態では、ＢＲａｆ阻害剤のパーセンテージは、０．１〜３％の範囲であってもよい。
【００７５】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、皮膚状態に影響を及ぼすことができる少なくとも１つのさらなる治療剤をさらに含んでもよい。
【００７６】
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、それ自体が当業者に既知の様式、例えば、従来の混合、顆粒化、糖衣錠作製、ソフトゲルカプセル化、溶解、抽出、または凍結乾燥プロセスによって製造されてもよい。
【００７７】
いくつかの実施形態では、ＢＲａｆ阻害剤は、１つ以上の治療剤と共に、単一の組成物または別々の組成物で投与されてもよい。各可能性は、別個の実施形態である。
【００７８】
いくつかの実施形態では、ＢＲａｆ阻害剤（またはそれを含む医薬組成物）は、追加の治療剤（またはそれを含む医薬組成物）の投与の前に、投与と同時に、または投与後に投与されてもよい。各可能性は、別個の実施形態である。
【００７９】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、制御放出系で送達されてもよい。
【００８０】
いくつかの実施形態では、ＢＲａｆ阻害剤は、全身または局部経路を含む、従来の薬物の送達に好適な任意の利用可能な従来の方法および経路を使用して投与することができる。一般に、本発明が意図する投与経路には、経腸経路、非経口経路、または吸入経路が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００８１】
いくつかの実施形態では、吸入投与以外の非経口投与経路には、局所、経皮、皮下、筋肉内、眼窩内、嚢内、髄腔内、胸骨内、および静脈内経路、つまり、消化管を通る以外の任意の投与経路が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。非経口投与は、全身送達または局部送達を果たすために行うことができる。全身送達が所望される場合、投与は、典型的には、医薬製剤の侵襲的または全身的に吸収された局所または粘膜投与を伴うことができる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、ＢＲａｆ阻害剤はまた、経腸投与によって対象に送達することができる。経腸投与経路には、経口および直腸（例えば坐剤を使用して）送達が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００８３】
いくつかの実施形態によれば、投与は、局所的な投与である。いくつかの実施形態によれば、組成物は、体表面への局所投与のために処方される。局所使用のための製剤の非限定的な例としては、クリーム、軟膏、ローション、ゲル、フォーム、懸濁液、水溶液または共溶媒溶液、膏薬、および噴霧可能な液体形態が挙げられる。本発明の組成物のための他の好適な局所製品形態には、例えば、エマルジョン、ムース、フォーム、ローション、溶液、および血清が含まれる。追加の好適な局所製品形態には、パッチ、包帯などが含まれる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、錠剤、粉末、カプセル、ペレット、溶液、懸濁液、エリキシル、エマルジョン、ゲル、クリーム、または坐剤などの固体または液体形態であることができる。薬学的に許容される担体には、ガム、デンプン、糖類、セルロース系材料、およびそれらの混合物が含まれる。製剤はまた、液体製剤の静脈内、動脈内、もしくは筋肉内注射、液体もしくは固体製剤の経口投与によって、または局所適用によって投与することができる。直腸坐剤を用いて投与することもできる。
【００８５】
活性成分を含有する医薬組成物の調製は、当技術分野において十分に理解されている。典型的には、このような組成物は、鼻咽頭に送達されるポリペプチドのエアロゾルとして、または液体溶液もしくは懸濁液のいずれかとしての注射剤として調製されるが、注射前の液体中の溶液または懸濁液に好適な固体形態も調製することができる。製剤は、乳化させることもできる。活性治療成分は、しばしば、薬学的に許容され、活性成分と適合する賦形剤と混合される。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。
【００８６】
さらに、いくつかの実施形態では、所望であれば、組成物は、活性成分の有効性を高める湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの少量の補助物質を含有することができる。
【００８７】
いくつかの実施形態では、活性成分は、中和された薬学的に許容される塩形態として組成物中に処方することができる。薬学的に許容される塩には、無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸、または酢酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等などの有機酸で形成される酸付加塩が含まれる。遊離カルボキシル基から形成される塩は、無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等などの有機塩基から誘導することもできる。
【００８８】
別の実施形態では、活性化合物は、例えば、リポソームなどの小胞中に送達することができる。
【００８９】
いくつかの実施形態では、体表面（例えば、肌）への局所投与のために、例えば、クリーム、軟膏、ゲル、ローション、溶液、共溶媒溶液、懸濁液、パッチ、包帯、液体、フォームなどを使用してもよい。ＢＲａｆ阻害剤またはその生理学的に許容される誘導体、例えば、塩、水和物などは、薬学的担体を伴ったもしくは伴わない生理学的に許容される希釈剤中の溶液、懸濁液、またはエマルジョンとして都合よく調製および適用される。
【００９０】
いくつかの実施形態によれば、経口用量、注射可能用量、または局所用量などの好適なＢＲａｆ阻害剤の単位用量を有するキットが提供される。
【００９１】
いくつかの実施形態によれば、そのようなキットにおいて、単位用量を含有する容器に加えて、情報添付文書が皮膚状態の治療におけるＢＲａｆ阻害剤の使用および付随する利益を記載する。
【００９２】
いくつかの実施形態によれば、ＥＧＦＲ阻害剤による治療に誘発され、引き起こされ、または関連する皮膚状態を治療または予防するのに使用するためのキットであって、治療有効量のＢＲａｆ阻害剤を含む組成物および使用説明書を含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、医薬組成物である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、好適な剤形で提供される。いくつかの実施形態では、剤形は、全身的および局所的から選択される。いくつかの実施形態では、局所剤形は、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、スプレー、皮膚パッチ、ローション、包帯、液体、またはそれらの任意の組み合わせから選択されてもよいが、これらに限定されない。各可能性は、別個の実施形態である。いくつかの実施形態では、全身投与形態は、錠剤、カプセル、液体、懸濁液、および粉末、またはそれらの任意の組み合わせから選択される経口形態であるが、これらに限定されない。各可能性は、別個の実施形態である。
【００９３】
いくつかの実施形態によれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤による治療に誘発され、引き起こされ、または関連する皮膚状態を治療または予防するのに使用するためのキットであって、治療有効量のＢＲａｆ阻害剤を含む組成物および使用説明書を含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、医薬組成物である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、好適な剤形で提供される。いくつかの実施形態では、剤形は、全身的および局所的から選択される。いくつかの実施形態では、局所剤形は、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、スプレー、皮膚パッチ、ローション、包帯、液体、またはそれらの任意の組み合わせから選択されてもよいが、これらに限定されない。各可能性は、別個の実施形態である。いくつかの実施形態では、全身投与形態は、錠剤、カプセル、液体、懸濁液、および粉末、またはそれらの任意の組み合わせから選択される経口形態であるが、これらに限定されない。各可能性は、別個の実施形態である。
【００９４】
用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含んでいる）」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含んでいる）」、「ｈａｖｉｎｇ（有する）」、およびそれらの同根語は、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ（含むがこれに限定されない）」を意味する。用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含んでいる）」は、いくつかの実施形態では、それぞれ「ｃｏｎｓｉｓｔｓ（からなる）」および「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ（からなる）」に限定される。用語「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（からなる）」は、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含んでいる）および限定された」を意味する。用語「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（から本質的になる）」は、組成物、方法、または構造が追加の成分、ステップ、および／または部分を含んでもよいが、追加の成分、ステップ、および／または部分が、特許請求の範囲に記載の組成物、方法、または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変更しない場合に限ることを意味する。
【００９５】
本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」（ある）、および「ｔｈｅ（該）」は、文脈が特に明白に示さない限り、複数の指示対象を含む。例えば、用語「ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ（化合物）」または「ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ（少なくとも１つの化合物）」は、その混合物を含む複数の化合物を含んでもよい。
【００９６】
特定の実施形態の前述の説明は、他の人が最新の知識を適用することにより、過度の実験をすることなく、かつ一般的な概念から逸脱することなく、そのような特定の実施形態を様々な適用のために容易に修正および／または適合させることができ、したがって、そのような適応および修正は、開示された実施形態の均等物の意味および範囲内で理解されるべきであり、そのように意図される本発明の一般的な性質を完全に明らかにする。本明細書で用いられる表現または用語は、説明のためであって限定のためではないことを理解されたい。様々な開示された化学構造および機能を実行するための手段、材料、およびステップは、本発明から逸脱することなく様々な代替形態をとってもよい。
【００９７】
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態をより完全に説明するために提示される。しかしながら、それらは、本発明の広い範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。
【実施例】
【００９８】
実施例１−ヒト正常ケラチノサイト細胞（ＨＥＫａ）における様々なＢＲａｆ阻害剤によるＭＡＰＫ（ＥＲＫ）の活性化。
【００９９】
関連するケラチノサイト細胞におけるＥＲＫの活性化に対する様々なＢＲａｆ阻害剤の効果を決定するために、ＥＲＫリン酸化のレベルを、ＢＲａｆ阻害剤での治療に応答して、ヒト正常ケラチノサイト細胞において測定した。
実験手順：
【０１００】
ヒト正常ケラチノサイト細胞ＨＥＫａを１０ｃｍ皿（３００，０００細胞／皿）に接種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌朝、細胞を２時間飢餓状態にし、次いで、様々な阻害剤（または対照治療）で２時間治療した。インキュベーション後、細胞をＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、タンパク質抽出物を好適な抗体を用いてホスホＥＲＫおよび総ＥＲＫ２の検出のためにウェスタンブロットにより分析した。未処理および０．１％ＤＭＳＯ処理済細胞を陰性対照として使用した。成長因子混合物（ＨＫＧＳ）を陽性対照として使用した（Ｇｉｂｃｏ  ＣＡＴ番号：Ｓ００１５）。
【０１０１】
ウェスタンブロット：全抽出物の７．５μｇを１０％または１２％アクリルアミドゲルに装入した。トランスファー後、膜をＴＢＳＴ／５％スキムミルクでブロックし、次いで、マウス抗ホスホＥＲＫ（ＴＢＳＴ  ５％ＢＳＡ中１：１０００、４℃でＯＮ）およびヤギ抗マウスＨＲＰ（ＴＢＳＴ  ５％ＢＳＡ中１：１０，０００、１時間ＲＴ）でインキュベートした。スーパーシグナルウェストピコ化学発光基質を使用して膜を露出させた。次いで、膜を１時間０．５％のアジ化ナトリウムと共にインキュベートすることにより、ＨＲＰを不活性化させた。シグナルの欠如を確実にするために、洗浄およびＥＣＬ露出後、膜をＴＢＳＴ／５％スキムミルクで１５分間再ブロックし、次いで、ウサギ抗全ＥＲＫ２（ＴＢＳＴ  ５％ＢＳＡ中１：５００、４℃でＯＮ）、ヤギ抗ウサギＨＲＰ（ＴＢＳＴ  ５％ＢＳＡ中１：５，０００、１時間ＲＴ）でインキュベートし、最後にスーパーシグナルウェストピコ化学発光基質を使用して露出させた。得られた画像（フィルム）をスキャンし、画像Ｊソフトウェアを使用してシグナルを定量した。
【０１０２】
実験に使用したＢＲａｆ阻害剤には、０．３μＭ、１μＭ、または３μＭの濃度でＣ−１、Ｃ−１５、Ｃ−１９、Ｃ−Ａ、またはベムラフェニブが含まれた。ＺＭ（ＺＭ３３６３７２）は、本実験においてＢｒａｆ活性剤として作用し、対照として使用されたｃ−Ｒａｆ阻害剤である。
【０１０３】
Ｃ−１、Ｃ−１５、Ｃ−１９、Ｃ−Ａ、およびＺＭ３３６３７２（対照）は、例えば、カーナハン（Ｃａｒｎａｈａｎ）ら（Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２０１０  Ａｕｇ；９（８）：２３９９−４１０）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）ら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２００９、５２（２０）、６１８９−６１９頁）において開示され、以下の分子構造を含む：
Ｃ−１：
2020121997.tif 000010
Ｃ−１５：
2020121997.tif 000011
Ｃ−１９：
2020121997.tif 000012
Ｃ−Ａ：
2020121997.tif 000013
ＺＭ３３６３７２（ＺＭ）
2020121997.tif 000014
【０１０４】
結果を図１Ａ〜Ｃから図４Ａ〜Ｃに提示する。
【０１０５】
図１Ａ〜Ｃに示される結果は、Ｃ−１９またはベムラフェニブＢＲａｆ阻害剤の量の増加（０．３μＭ、１μＭ、または３μＭ）による治療後のヒト初代ケラチノサイト（ＨＥＫａ）におけるＥＲＫの活性化（リン酸化ＥＲＫの相対量の増加によって決定される）を証明する。
【０１０６】
図２Ａ〜Ｃに示される結果は、Ｃ−１またはＣ−１５ＢＲａｆ阻害剤の量の増加（０．３μＭ、１μＭ、または３μＭ）による治療後のヒト初代ケラチノサイト（ＨＥＫａ）におけるＥＲＫの活性化（リン酸化ＥＲＫの相対量の増加によって決定される）を証明する。
【０１０７】
図３Ａ〜Ｃに示される結果は、Ｃ−ＡまたはＺＭ３３６３７２（ＺＭ）ＢＲａｆ阻害剤の量の増加（０．３μＭ、１μＭ、または３μＭ）による治療後のヒト初代ケラチノサイト（ＨＥＫａ）におけるＥＲＫの活性化（リン酸化ＥＲＫの相対量の増加によって決定される）を証明する。
【０１０８】
図４Ａ〜Ｃに示される結果は、１μＭのＣ−１９、Ｃ−１、Ｃ−１５、ＣＡ、もしくはベムラフェニブＢＲａｆ阻害剤、またはＺＭ（対照、活性剤）による治療後のヒト初代ケラチノサイト（ＨＥＫａ）におけるＥＲＫの活性化（リン酸化ＥＲＫの相対量の増加によって決定される）を証明する。
【０１０９】
本明細書の上に提示した結果は、関連するケラチノサイト細胞における下流ＭＡＰＫ（ＥＲＫ）の活性化に対する様々なＢＲａｆ阻害剤の逆説的な効果を証明する。さらに、結果は、ＥＲＫを活性化する際の様々な用量（濃度）で投与された様々な阻害剤の様々な効果を証明する。
【０１１０】
実施例２−増殖ＭＩＡ  ＰａＣａ２  ＫＲＡＳ細胞（Ｒａｓ突然変異を有するＭＩＡ  Ｐａｃａ細胞）に対するＢＲａｆ阻害剤の効果。
ＢＲａｆ阻害剤の耐久性効果を証明するために、突然変異したＫＲａｓを有するＭＩＡ  Ｐａｃａ細胞株を使用した増殖アッセイを行った
【０１１１】
材料および方法：
材料−ＭＩＡ  ＰａＣａ２  ＫＲＡＳ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＭ−ＣＲＬ１４２０）；ＤＭＥＭ（ＡＴＣＣ  ３０−２００２）；ＦＢＳ（バイオロジカルインダストリーズ（Ｂｉｏｌ．  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、カタログ番号０４−００７−１Ａ）；ウマ血清（バイオロジカルインダストリーズ（Ｂｉｏｌ．  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、カタログ番号０４−００４−１Ｂ）、抗生物質（Ｐ／Ｓ、バイオロジカルインダストリーズ（Ｂｉｏｌ．  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、カタログ番号０３−０３１−２Ｂ）、トリプシン（バイオロジカルインダストリーズ（Ｂｉｏｌ．  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、カタログ番号０３−０５０−１Ａ）、トリパンブルー（シグマ（Ｓｉｇｍａ）  Ｔ８１５４）；ＤＭＳＯ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）  Ｄ２６５０）、ＢＲａｆ阻害剤（（Ｃ−１  メドケムエクスプレス（ＭｅｄＣｈｅｍ  Ｅｘｐｒｅｓｓ）（ＨＹ−１４１７７）；Ｃ−１５；Ｃ−１９；ベムラフェニブ（ロイヤル製薬（Ｒｏｙａｌ  Ｐｈａｒｍａ）））、ＡＴＰｌｉｔｅ（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、カタログ番号６０１６９４１）
【０１１２】
細胞成長：１日目に、細胞を培養培地（ＤＭＥＤ／ＦＢＳ／ウマ血清および抗生物質）に播種する。続いて、細胞を継代培養し、飢餓培地（すなわち、血清枯渇培地）中で２４時間インキュベートする。次いで、試験化合物（ＢＲａｆ阻害剤）を様々な濃度で細胞に添加し、細胞をさらに７２時間インキュベートする（３７℃、５％ＣＯ２）。
【０１１３】
増殖アッセイは、製造業者のプロトコルに従って、ＡＴＰｌｉｔｅ試薬を使用して実施する。結果は、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ（ＢＭＧ）リーダー（モード：ルミネセンス、プログラム：ＡＴＰｌｉｔｅ  ＴＯＰ、測定インターバル時間［ｓ］：０．２５〜１）を使用して読み取る。
【０１１４】
結果：
結果を図５Ａ〜図５Ｄに提示し、ＭＩＡ−Ｐａｃａ２細胞増殖に対する様々な濃度の様々なＢＲａｆ阻害剤の効果を示す。図５Ａは、様々な濃度で提供された場合のＣ−１  ＢＲａｆ阻害剤の細胞に対する効果を示す。図５Ｂは、様々な濃度のＣ−１５  ＢＲａｆ阻害剤の細胞に対する効果を示す。図５Ｃは、様々な濃度のＣ−１９  ＢＲａｆ阻害剤の細胞に対する効果を示す。図５Ｄは、様々な濃度のベムラフェニブの細胞に対する効果を示す。
【０１１５】
実施例３−ＢＲａｆ阻害剤を使用したＥＧＦＲおよび／またはＰＩ３Ｋで治療した対象における皮膚状態の治療
ＥＧＦＲおよび／またはＰＩ３Ｋ阻害剤で対象を治療することによって誘発される皮膚状態を治療するために、このような皮膚状態と診断された対象（すなわち、ＥＧＦＲ阻害剤および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤で治療された、または治療されている対象）は、前記状態を治療するために、ＢＲａｆ阻害剤を投与される。対照として、プラセボ治療（ビヒクル）が提供される。
【０１１６】
要約すると、治療プロトコルは、以下の工程を含む：
【０１１７】
対象−ＥＧＦＲ阻害剤（セツキシマブ、パニツムマブ、ネチツムマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、バンデタニブ、および／もしくはオシメラチブを含む）またはＰＩ３Ｋ阻害剤（ブパリシブ、ダクトソリブ、ピクフィシブ、および／もしくはイデラリシブを含む）で治療される患者。患者は、皮膚状態（ざ瘡様を含む）と診断される。
【０１１８】
治療−対象は、顔、首、および胸の一方の身体側を好適な剤形の局所ＢＲａｆ阻害剤で６〜２０週間治療される。剤形は、０．１〜３％のＢＲａｆ阻害剤を含む局所剤形である。対照−対象は、活性物質としてＢＲａｆ阻害剤を含まない好適なプラセボ組成物で治療される。局所的に適用すると、治療されていない身体側でプラセボ治療が行われる。
【０１１９】
治療期間中、皮膚状態皮疹の速度、皮疹の重症度、皮疹の身体位置、および他の関連する皮膚事象を含む様々なパラメータが試験される。検査される身体位置には、顔、首、および胸が含まれる。
【０１２０】
試験治療期間の終わりに、試験されたパラメータは、治療有効性を決定するために、治療された身体領域をプラセボ治療領域と比較することによって決定される。
【０１２１】
実施例４−全身投与されたＢＲａｆ阻害剤を使用したＥＧＦＲおよび／またはＰＩ３Ｋで治療した対象における皮膚状態の治療
ＥＧＦＲおよび／またはＰＩ３Ｋ阻害剤で対象を治療することによって誘発される皮膚状態を治療するために、このような皮膚状態と診断された対象（すなわち、ＥＧＦＲ阻害剤および／もしくはＰＩ３Ｋ阻害剤で治療された、または治療されている対象）は、前記状態を治療するために、ＢＲａｆ阻害剤を全身投与される。対照として、治療対象を制御するためのプラセボ治療（ビヒクル）が提供される。
【０１２２】
要約すると、治療プロトコルは、以下の工程を含む：
【０１２３】
対象−ＥＧＦＲ阻害剤（セツキシマブ、パニツムマブ、ネチツムマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、バンデタニブ、および／もしくはオシメラチブを含む）またはＰＩ３Ｋ阻害剤（ブパリシブ、ダクトソリブ、ピクフィシブ、および／もしくはイデラリシブを含む）で治療される患者。患者は、皮膚状態（ざ瘡様を含む）と診断される。
【０１２４】
治療−対象は、好適な投与形態の全身性ＢＲａｆ阻害剤で６〜２０週間治療される。剤形は、２００〜１０００マイクログラムのＢＲａｆ阻害剤を含む経口剤形である。対照−対象は、活性物質としてＢＲａｆ阻害剤を含まない、対応する好適なプラセボ組成物で治療される。
【０１２５】
治療期間中、皮膚状態皮疹の速度、皮疹の重症度、皮疹の身体位置、および他の関連する皮膚事象を含む様々なパラメータが試験される。検査される身体位置には、顔、首、および胸が含まれる。
【０１２６】
試験治療期間の終わりに、試験されたパラメータは、治療有効性を決定するために、治療された対象とプラセボ治療された対象とを比較することによって決定される。
【図１Ａ】
2020121997.tif 000019
【図１Ｂ】
2020121997.tif 000020
【図１Ｃ】
2020121997.tif 000021
【図２Ａ】
2020121997.tif 000022
【図２Ｂ】
2020121997.tif 000023
【図２Ｃ】
2020121997.tif 000024
【図３Ａ】
2020121997.tif 000025
【図３Ｂ】
2020121997.tif 000026
【図３Ｃ】
2020121997.tif 000027
【図４Ａ】
2020121997.tif 000028
【図４Ｂ】
2020121997.tif 000029
【図４Ｃ】
2020121997.tif 000030
【図５Ａ】
2020121997.tif 000031
【図５Ｂ】
2020121997.tif 000032
【図５Ｃ】
2020121997.tif 000033
【図５Ｄ】
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