(57)【要約】【課題】新規な育毛剤を提供する。【解決手段】本開示に係る育毛剤は、歯髄幹細胞培養上清と毛乳頭幹細胞培養上清とを含む。前記育毛剤の製造方法も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯髄幹細胞培養上清と毛乳頭幹細胞培養上清とを含む、育毛剤。
【請求項２】
歯髄幹細胞培養上清と毛乳頭幹細胞培養上清との含有比率が、体積比で０．１：１０〜１０：０．１である、請求項１に記載の育毛剤。
【請求項３】
歯髄幹細胞および毛乳頭幹細胞をそれぞれ培養する工程、または、歯髄幹細胞および毛乳頭幹細胞を共培養する工程；および、
前記歯髄幹細胞の培養により得られた培養上清および前記毛乳頭幹細胞の培養により得られた培養上清をそれぞれ回収する工程、または、共培養された歯髄幹細胞および毛乳頭幹細胞の培養上清を回収する工程；
を含む育毛剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯髄幹細胞培養上清と毛乳頭幹細胞培養上清とを含む育毛剤およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、薄毛および脱毛等に対する治療薬や治療法が開発され実用化されている。例えば、頭皮の血行を改善して毛母細胞からの発毛を促進する効果を有するミノキシジル、男性ホルモンであるフィナステリドが２型５αリクターゼの分泌を阻害し、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）の生成を抑制するフィナステリドなどがしばしば使用されている。
【０００３】
しかし、従来の育毛治療には効果を奏さない例や、効果が充分とはいえない例が存在する。そこで、近年進歩が目覚ましい再生医療の一環として育毛の研究も行われている。自家脂肪由来幹細胞を頭皮に移植する方法や、ヒト脂肪由来幹細胞を含有する育毛剤が開発されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Biomedical Research 31(1), pp27-34, 2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、薄毛および脱毛の治療ニーズは現状で充足されているとはいえない。本開示の目的は、上記の状況に鑑みて、新たな育毛剤およびその製造方法を提供することである。発明者らは、歯髄幹細胞培養上清および毛乳頭幹細胞培養上清を含む育毛剤が高い育毛効果を有することを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、以下の態様を含む。
＜１＞  歯髄幹細胞培養上清と毛乳頭幹細胞培養上清とを含む、育毛剤。
＜２＞  歯髄幹細胞培養上清と毛乳頭幹細胞培養上清との含有比率が、体積比で０．１：１０〜１０：０．１である、＜１＞に記載の育毛剤。
＜３＞  歯髄幹細胞および毛乳頭幹細胞をそれぞれ培養する工程、または、歯髄幹細胞および毛乳頭幹細胞を共培養する工程；および、
前記歯髄幹細胞の培養により得られた培養上清および前記毛乳頭幹細胞の培養により得られた培養上清をそれぞれ回収する工程、または、共培養された歯髄幹細胞および毛乳頭幹細胞の培養上清を回収する工程；
を含む育毛剤の製造方法。
【発明の効果】
【０００７】
本開示によれば、高い育毛効果を有する育毛剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本開示に係る育毛剤を８週間投与した前後の写真を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
＜細胞培養上清を含む育毛剤＞
本開示に係る育毛剤は、歯髄幹細胞培養上清と毛乳頭幹細胞培養上清とを含む。
本開示において「育毛効果」とは、通常用いられる意味で用いられ、発毛を促進する効果または脱毛を抑制する効果など、毛周期に影響して毛数を増加させる効果を有することを指す。
【００１０】
本開示に係る育毛剤においては、歯髄幹細胞を培養して得られた歯髄幹細胞培養上清、および毛乳頭幹細胞を培養して得られた毛乳頭幹細胞培養上清を育毛剤の有効成分として含有する。「培養上清」は細胞そのものを含まない培養液と定義される。
【００１１】
歯髄幹細胞培養上清および毛乳頭幹細胞培養上清が育毛効果を示す機序については明らかではないが、歯髄幹細胞培養上清および毛乳頭幹細胞培養上清のそれぞれにサイトカイン等の生理活性物質が含まれ、これらが相乗的に働くことが機序の一つとして考えられる。
しかしながら、本発明は、前記推定に何ら拘束されるものではない。
【００１２】
＜歯髄幹細胞の培養上清の調製＞
歯髄幹細胞の培養上清は、特許６２９６６２２号およびProc Natl Acad Sci U S A 2000;97:13625-30又はProc Natl Acad Sci U S A 2003;100:5807-12に記載されている方法によって調製することができる。
概略としては、脱落または抜歯した乳歯または永久歯から歯髄を採取し、付着性細胞培養用の培養器で培養を行い、接着性を示す細胞のコロニーを継代培養することによって歯髄幹細胞を選択することができる。あるいは、細胞の大きさや形態に基づいて歯髄幹細胞を選択してもよい。選択した歯髄幹細胞を培養し培養上清を回収すればよい。
【００１３】
歯髄幹細胞の培養上清を調製するために用いる歯髄幹細胞は、前記方法によって調製される歯髄幹細胞には限定されない。例えば、体細胞を材料として作成された歯髄幹細胞であってもよい。
＜毛乳頭幹細胞の培養上清の調製＞
【００１４】
毛乳頭幹細胞の培養上清は、毛乳頭幹細胞を培養し培養上清を回収することによって得ることができる。毛乳頭幹細胞はタカラバイオ株式会社などから市販されており、これを培養して培養上清を得ることができる。
【００１５】
培養上清は、凍結または凍結乾燥してもよいし、凍結乾燥した培養上清を適切な溶媒に溶解したものでもよい。凍結乾燥により、良好な保存安定性が得られる。ＮＫ細胞培養上清の凍結乾燥方法としては、培養上清の凍結乾燥に通常用いられている方法を適用することができる。
【００１６】
本開示の育毛剤における歯髄幹細胞培養上清および毛乳頭幹細胞培養上清の含有量は、それぞれ０．１体積％〜５０体積％であることが好ましい。さらに好ましくは、各１質量％〜２０質量％であり、より好ましくは各２質量％〜１５質量％であり、特に好ましくは各２％〜１０％であある。
育毛剤における歯髄幹細胞培養上清および毛乳頭幹細胞培養上清の含有量は、育毛剤全体積に対する歯髄幹細胞培養上清または毛乳頭幹細胞培養上清の体積として計算される。
【００１７】
本開示の育毛剤における歯髄幹細胞培養上清および毛乳頭幹細胞培養上清の含有量の比率は上記の範囲において特に限定はされないが、体積比で０．１：１０〜１０：０．１であることが好ましく、１：１０〜１０：１であることがさらに好ましく、１：５〜５：１であることがより好ましく、１：３〜３：１であることが特に好ましく、１：２〜２：１であることが最も好ましい。例えば、歯髄幹細胞培養上清および毛乳頭幹細胞培養上清の含有量の比率を、１：１とすればよい。
歯髄幹細胞培養上清および毛乳頭幹細胞培養上清の含有量は、歯髄幹細胞培養上清の含有量が、毛乳頭幹細胞培養上清の含有量の含有量より高いことが好ましい。
【００１８】
＜基材＞
本開示の育毛剤は、基材を含んでいてもよい。基材としては、一般的な化粧料に使用される基材を特に制限なく使用することができる。例えば、水；エタノール；グリセリン；プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ブチレングリコールなどの多価アルコール；植物抽出液；およびこれらの組み合わせ；を挙げることができる。市販のローションを基材として使用することもできる。
【００１９】
歯髄幹細胞培養上清および毛乳頭幹細胞培養上清と基材との混合は、本開示の育毛剤のいずれの段階で行ってもよい。例えば、歯髄幹細胞培養上清と毛乳頭幹細胞培養上清とを混合し、その後に基材と混合すればよい。あるいは、歯髄幹細胞培養上清および毛乳頭幹細胞培養上清のうちいずれかと基材とを混合し、その後にもう一方の培養上清と混合してもよい。その他、培養上清を濃縮または凍結乾燥し、その後基材に混合してもよい。
また、歯髄幹細胞培養上清および毛乳頭幹細胞培養上清は一剤としなくてもよい。例えば、歯髄幹細胞培養上清および毛乳頭幹細胞培養上清をそれぞれ含有する二剤以上がキットとしてもよい。例えば、歯髄幹細胞培養上清を含有する第１剤と毛乳頭幹細胞培養上清を含有する第２剤を含むキットを挙げることができる。
【００２０】
本開示に係る育毛剤は他の成分を追加的に含んでもよい。追加的に含まれ得る成分としては、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）が挙げられる。
あるいは、本開示に係る育毛剤は育毛効果を有する他の有効成分を含んでもよい。例えば、ミノキシジル、フィナステリド、塩化カルプロニウム、セファランチン、イソフラボン、センブリエキス、トコフェロール酢酸エステル、エチニルエストラジオール、ペンタデカン酸グリセリドおよびグリチルリチン酸ジカリウムを挙げることができる。
【００２１】
本開示に係る育毛剤の形態は特に限定されない。形態の例は液体状（液状、ゲル状など）及び固体状（粉状、細粒、顆粒状など）である。本開示に係る育毛剤は、スプレーなどによって霧状に散布可能な液体の形態を有していてもよい。
【００２２】
＜歯髄幹細胞培養上清および毛乳頭幹細胞培養上清を含む育毛剤の製造方法＞
【００２３】
本開示においては、歯髄幹細胞および毛乳頭幹細胞をそれぞれ培養する工程、または、歯髄幹細胞および毛乳頭幹細胞を共培養する工程；および、前記歯髄幹細胞の培養により得られた培養上清および前記毛乳頭幹細胞の培養により得られた培養上清をそれぞれ回収する工程、または、共培養された歯髄幹細胞および毛乳頭幹細胞の培養上清を回収する工程；を含む育毛剤の製造方法も提供される。
歯髄幹細胞培養上清および毛乳頭幹細胞培養上清を含む育毛剤についての記載は、本開示の製造方法にも適用することができる。
培養は、例えば実施例に示した方法で行えばよい。培養上清の回収は、例えば培養液をろ過など公知の方法によって培養液から細胞を除去することによって行えばよい。
【００２４】
歯髄幹細胞と毛乳頭幹細胞とはそれぞれ別に培養してもよいし、歯髄幹細胞と毛乳頭幹細胞とを混合して共培養してもよい。歯髄幹細胞と毛乳頭幹細胞とを混合して培養した場合、前記歯髄幹細胞の培養により得られた培養上清を回収する工程および毛乳頭幹細胞の培養により得られた培養上清を回収する工程は、１つの工程として行うことができ、また、歯髄幹細胞培養上清と毛乳頭幹細胞培養上清とを混合する工程は不要である。
歯髄幹細胞の培養により得られた培養上清および毛乳頭幹細胞の培養により得られた培養上清をそれぞれ別に回収した場合には、歯髄幹細胞培養上清と毛乳頭幹細胞培養上清とを混合する工程をさらに含んでいてもよい。
【００２５】
本開示の製造方法は、前記回収された培養上清に遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、保存、および脱塩の中から選択される一つ以上の処理を施す工程をさらに含んでもよい。このような工程を含むことにより、育毛剤の取り扱いや保存、運搬がより容易になる。回収された歯髄幹細胞培養上清および毛乳頭幹細胞培養上清のいずれか一方を前記工程の対象としてもよいし、両方の培養上清を対象としてもよい。あるいは、回収された歯髄幹細胞培養上清と毛乳頭幹細胞培養上清との混合物を前記工程の対象としてもよい。なお、本明細書において、「培養上清」は、使用される文脈において特に除外されない限りは、回収した培養上清を処理して得られた結果物を包含する。
【００２６】
また、前記製造方法は、前記回収された培養上清に、追加の成分を添加する工程をさらに含んでいてもよい。そのような追加の成分の添加により、育毛剤全体の特性を向上することが可能である。各々の工程ならびに追加の成分等については、本開示に係る育毛剤の説明において記載した事項がそのまま当てはまる。前記回収された培養上清に遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、保存、および脱塩の中から選択される一つ以上の処理を施す工程と、前記回収された培養上清に、追加の成分を添加する工程の両方を含む場合には、両工程はどちらを先に行ってもよく、また可能な場合には同時並行して行ってもよい。
【００２７】
本開示においては、本開示に係る育毛剤を、育毛対象部位に有効な量投与することを含む、育毛を促進する方法、も提供される。育毛対象部位は頭皮であることが好ましい。本開示に係る育毛剤は、薄毛または脱毛の治療を必要とする対象の頭皮に有効な量を投与すればよい。投与方法としては、頭皮への塗布および頭皮に皮下注射を挙げることができる。
本開示に係る育毛剤が２剤以上のキットである場合には、歯髄幹細胞培養上清を含有する組成物と毛乳頭幹細胞培養上清を含有する組成物を使用時に混合してもよいし、別々に使用してもよい。
【００２８】
育毛剤の１回の投与量は、頭皮に塗布することによって投与する場合には頭皮に均一に塗布できる程度であれば特に限定されない。脱毛の程度および育毛対象部位の面積に応じて決定すればよく、例えば、０．５〜２０ｍＬであり、１ｍＬ〜１０ｍＬがさらに好ましく、より好ましくは１ｍＬ〜５ｍＬであり、１ｍL〜２ｍLであることが特に好ましい。投与間隔用量は、１日１回〜１日１０回とすればよいが、１日２回または1日１回が好ましい。あるいは、２日〜７日に１回としてもよい。
なお、実施形態によっては、本開示に係る育毛剤に加えて、他の育毛作用を有する物質を別途投与してもよい。
【００２９】
本開示によれば、歯髄幹細胞培養上清および毛乳頭幹細胞培養上清の育毛剤の製造における使用も提供される。
【００３０】
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量（質量）基準である。
【実施例】
【００３１】
＜ヒト歯髄幹細胞の培養および培養上清の回収＞
ヒト歯髄幹細胞として、ヒト乳歯の歯髄組織より調製したヒト乳歯歯髄幹細胞（ＳＨＥＤ）を用いた。ヒト乳歯歯髄幹細胞の調製方法は、特許６２９６６２２号およびProc Natl Acad Sci U S A 2000;97:13625-30又はProc Natl Acad Sci U S A 2003;100:5807-12に記載されている通りである。簡潔には、以下の通りである。
【００３２】
（１）細胞培養
ヒト乳歯より歯髄をゆっくりと取り、３ｍｇ／ｍＬのＩ型コラゲナーゼ及び４ｍｇ／ｍＬのディスパーゼの溶液中で３７℃にて１時間消化した。７０ｍｍの細胞ストレーナ（Falcon; BD Labware, Franklin Lakes, NJ）を用いて濾過した後、２０％の間葉系細胞成長サプリメント（Lonza Inc, Walkersville, MD）及び抗生物質（１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び０．２５ｍｇ／ｍＬのアムホテリシンＢ；ＧＩＢＣＯ社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；GIBCO, Rockville, MD）中で３７℃、５％ＣＯ２下にて細胞を培養した。培養上清を除き、接着性を有する細胞を歯髄幹細胞として選択し、約１×１０４細胞／ｃｍ２で継代培養した。１〜３回継代した細胞を実験に用いた。
【００３３】
（２）培養上清の回収
ＳＨＥＤ（４×１０５細胞）をＤＭＥＭ／Ｆ１２（Invitrogen-Gibco-BRL, Grand Island, NY）無血清培地中で３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培養７２時間後にＳＨＥＤの培養上清を回収し、３００×ｇで５分間遠心し、０．２２ｍｍのシリンジフィルターを用いて濾過した。
【００３４】
＜ヒト毛乳頭幹細胞の培養および培養上清の回収＞
（１）細胞培養
ヒト毛乳頭幹細胞（ＨＦＤＰＣ）は、タカラバイオ株式会社から市販されているものを使用した。メーカーの添付文書の記載に従って３代継代培養した。
【００３５】
（２）培養上清の回収
ＨＦＤＰＣ（４×１０５細胞）をＤＭＥＭ／Ｆ１２（Invitrogen-Gibco-BRL, Grand Island, NY）無血清培地中で３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培養７２時間後にＨＦＤＰＣの培養上清を回収し、３００×ｇで５分間遠心し、０．２２ｍｍのシリンジフィルターを用いて濾過した。
【００３６】
＜育毛剤の調製＞
上記で得た、ヒト歯髄幹細胞培養上清とヒト毛乳頭幹細胞培養上清とを体積比１：１で混合し、前記混合物の含有量が６体積％となるように水で希釈して育毛剤を調製した。すなわち、育毛剤におけるヒト歯髄幹細胞培養上清およびヒト毛乳頭幹細胞培養上清の含有量はそれぞれ３体積％である。
【００３７】
＜臨床研究＞
男性型脱毛症（ＡＧＡ）と診断された男性３名に、調製した育毛剤を１日２回、８週間にわたって頭皮に塗布することによって投与した。１回当たりの投与量は、治療部位の面積および脱毛程度に応じて１〜２ｍＬとした。
＜評価方法＞
本開示の育毛剤の投与前、および８週間の投与後に発毛効果を目視で判断して以下の基準で育毛効果の評価を行った。
・評価基準
著明改善：密度の高い毛髪成長（薄くなった領域がほぼ完全に被われている。頭皮における毛髪の密度は薄毛化していない領域とほぼ等しい）
中等度改善：中等度の毛髪成長（薄くなった領域が、新発毛により部分的に被われているが、薄くならなかった領域に比べると密度は低い（容易に識別できる））
軽度改善：軽微な毛髪成長（明確な毛髪成長がみられるが、薄くなった領域をかなり被うということはない）
不変：可視的毛髪成長なし
悪化：毛髪成長の後退
＜評価結果＞
３名のうち２名は著名改善、１名は中等度改善が認められた。また、図１の上段、中段、下段のそれぞれに３名各人の写真を示す。左側が投与前の写真であり、右側が８週間投与後の写真である。以上に示される通り、本開示の育毛剤は高い育毛効果を有していた。
【００３８】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。
【図１】
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