(57)【要約】【課題】本発明は、（Ｓ，Ｓ）−ＳＤＧ、（Ｒ、Ｒ）−ＳＤＧ、（Ｓ、Ｒ）−ＳＤＧ、（Ｒ、Ｓ）−ＳＤＧ、ＳＤＧ、ＳＥＣＯ、ＥＬ、ＥＤ、これらの類似体、これらの立体異性体およびその他の関連分子を使用する治療および予防方法を使う、放射線防護および化学防御のための組成物および方法を提供する。【解決手段】それを必要としている対象中で生体分子、細胞、または組織を放射線損傷から保護する方法であって、有効量の少なくとも１つの生理活性成分を前記対象に投与することを含み、前記生理活性成分がセコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせを含む方法。【選択図】図１２
2020121987.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）を含む、喘息の処置を必要としている対象における喘息を処置するための組成物。
【請求項２】
前記ＳＤＧが（Ｓ，Ｓ）−ＳＤＧである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＳＤＧが（Ｒ，Ｒ）−ＳＤＧである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＳＤＧが合成ＳＤＧである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
食用組成物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
経口投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＳＤＧが、約１ナノモル濃度（ｎＭ）〜約１モル（Ｍ）の濃度である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＳＤＧの濃度が約２５μＭ〜約２５０μＭである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記対象がヒト対象である、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利
本発明は、その一部が、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）により授与された認可番号Ｒ０１（ＣＡ１３３４７０）、１Ｐ３０ＥＳ０１３５０８−０２、ＲＣ１ＡＩ０８１２５１および５−Ｐ３０−ＣＡ−０１６５２０−３４Ｓ２の下に政府支援を得てなされたものである。政府は本発明に対し一定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの立体異性体、これらの代謝物、およびこれらの類似体を使う、発癌性物質誘発性肺癌および中皮腫からまたは次亜塩素酸イオンからなどの、放射線防護および放射線緩和ならびに化学防御のための組成物および方法が提供される。
【背景技術】
【０００３】
電離放射線は、生命体中で広範囲の有害作用を生じる。人は、職業災害として、診断および治療上のＸ線検査手順中に、電子機器使用時に、原子力事故のバックグラウンドから、航空・宇宙旅行中に、ならびに太陽光への長期の曝露（例えば、日光浴する人または屋外作業者）から、放射線に曝される。天然放射線への暴露は、多くの形態で発生する。空気、水、および土壌などの天然資源は、天然の放射線放出物質（放射性核種）と接触する際に汚染されることがあり、ラドンはこのようなよくある天然放射線源の１つである。加えて、現在の地球規模の発展によって、多くの人々を致死量の放射線に曝す可能性がある危険な手段としてのテロリズムが定着してしまった。したがって、放射線に曝される前に、または曝されている間に投与可能な薬剤（すなわち、放射線防護剤）、および、放射線被曝後の治療薬としての薬剤（すなわち、放射線緩和剤）を見つけることは、非常に重要である。
【０００４】
さらに、肺癌は、米国での癌死亡率の主要な原因である。新規の標的治療薬、改善された腫瘍進行度診断技術および外科的手法、ならびに、局所的に進展した肺癌のための併用化学放射線療法の利用の増加にもかかわらず、全体の死亡率の低下は最小限にとどまっている（Ｔａｎ  ＆  Ｓｐｉｖａｃｋ（２００９）Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ６５：１２９−１３７）。癌の化学防御は、悪性病変の発生の前に、発癌のプロセスを防ぐ、抑制する、または逆転させるように設計された特異的な天然のまたは合成の薬剤を用いる食餌療法および薬理学的介入の使用と定義されている（Ｈｏｎｇ  ＆  Ｓｐｏｒｎ，（１９９７），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：１０７３−１０７７）。  肺癌化学防御に対する１つの戦略は、解毒第２相酵素の発現上昇を介する、タバコの、環境の発癌性物質およびその他の発癌性物質の代謝および体内動態を調節する薬剤の使用に的を絞っている。多くの合成のおよび天然の化合物が第２相酵素の発現を誘発すると知られている。Ｎｒｆ２／ＡＲＥ調節第２相酵素の誘導が発癌性物質に対する感受性を下げるために極めて効果的な戦略であることを裏付ける、多くの報告がなされている。我々は、亜麻仁（ＦＳ）およびその主要リグナンであるＳＤＧ（両方とも、天然物質の濃縮および合成により得られる）が、化学的発癌性物質誘発性肺癌のマウスモデルにおいて効果的な肺癌化学防御剤であることを示すデータを保持している。
【０００５】
肺癌の約８５％は喫煙が原因である。タバコの煙中の主要な肺発癌性物質は、ベンゾ［ａ］ピレン（ＢａＰ）に代表される多環式芳香族炭化水素である。よりよい治療薬が開発されるまで、死亡を減らすために最も有望なことは、健診、禁煙、または化学防御による予防であろう。化学防御剤は、暴露されているが比較的健康な多数の対象に長期間投与する必要がある。化学防御剤は、安全、非毒性、美味で、理想的には、手頃な価格である必要がある。多くの化学防御剤が肺癌の分野で研究されてきたが、これらの基準を満たすものはない。最も有望な手法の１つは、第２相抗酸化剤および解毒酵素の発現上昇である。都合の悪いことに、現在まで患者で試験されたオルチプラズまたはスルホラファンなどの第２相酵素活性化剤は、受け入れ難いほど有毒であることがわかった（Ｐｅｎｄｙａｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ  １０：２６９−２７２）。したがって、タバコの煙中の肺発癌性物質により誘発される酸化ストレスおよびＤＮＡ損傷の予防に効果的な、安全で、非毒性の化学防御剤がどうしても必要とされている。
【０００６】
別のよく知られた環境発癌物質はアスベストであり、これは、断熱用に商業的に使用される一群の天然の水和繊維状ケイ酸塩繊維を指す。動物モデルおよび患者の両方において、アスベスト繊維の吸入が、悪性の中皮腫（ＭＭ）および肺癌などの腫瘍疾患（Ｃａｒｂｏｎｅ  ＆  Ｙａｎｇ（２０１２）．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １８：５９８−６０４；Ｎｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ３２：１００５−１０１３）、ならびに肺線維症に繋がり得ることが明確に立証されている。ＭＭは、胸膜および腹膜の中皮細胞から生じる極めて侵襲性の強い癌で、約１年の生存期間中央値である（Ｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１，７４４４−７４５３；Ｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．Ｃｈｅｓｔ  １１６，５０４−５２０；Ｂｅｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ４０，１２４１−１２４５）。非常に初期の疾患での手術以外に、現在の療法では治癒しない（Ｓｔｅｒｍａｎ  ＆  Ａｌｂｅｌｄａ（２００５）．Ｒｅｓｐｉｒｏｌｏｇｙ  １０，２６６−２８３）。現在、ＭＭにより米国で年間約３，０００人が死亡し、西ヨーロッパでさらに年間５，０００人が死亡している。
【０００７】
アスベストの使用は多くの欧米諸国で制限されているが、世界中の多くの国で未だに使用されており、２００８年に２百万トンを超える量が採掘されたと推定されている（Ｓｕｒｖｅｙ，Ｂ．Ｇ．（２０１０）．Ｗｏｒｌｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ２００４−０８．Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｇｅｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｕｒｖｅｙ）。したがって、ほとんど予防策が採用されないでアスベストの使用が増加している第三世界（特にインド）において、ＭＭの症例が劇的に増加する可能性がある。しかし、先進国においても、重大な曝露が未だ存在する。これらには、既存のアスベスト（すなわち、鉛管、配管、絶縁体、絶縁体除去、など）ならびにスーパーファンド（放置された有害産業廃棄物の撤去のための基金）アスベスト有害廃棄物処理場などに作業者を暴露する多くの種類の職業が含まれる。環境曝露および家庭内曝露も存在する。例えば、鉱業またはアスベスト工場が閉鎖された地域でのＭＭのリスクの増加がある。
【０００８】
アスベストと癌との間の関連における重要な問題は、吸入されたアスベスト繊維が肺中に極めて長期間残存し、それにより、患者が曝露から離れたとしても、連続的な損傷を生じることである。この長期の潜伏期（３０〜５０年にもなることも多い）のために、過去に暴露された個人は、一生を通してＭＭおよび他の癌のリスクが高いままである。
【０００９】
癌の化学防御は、発癌の開始期または新生細胞の癌への進行のいずれかを防止、停止、または逆転させることを目的とする。この定義は単純に聞こえるが、効果的な化学防御剤を見つけることは非常に困難であった。第１に、発癌性物質が癌を誘発する機序は通常、複数の機序を含み、効力の達成を困難にし、複数の活性を有する薬剤を必要とする。第２に、この薬剤は、健康であるが危険な状態にある個人の大きな集団中の少数の腫瘍を防ぐために使用されるので、極めて非毒性で、耐容性良好で、かつ手頃な価格である必要がある。
したがって、発癌性物質または化学兵器剤、塩素および次亜塩素酸イオンならびにそのほかの有害な毒物などの他の有害な化学薬品への暴露の前に、または暴露中に投与可能な薬剤（すなわち、化学防御剤）を見つけることも極めて重要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｔａｎ  ＆  Ｓｐｉｖａｃｋ（２００９）Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ６５：１２９−１３７
【非特許文献２】Ｈｏｎｇ  ＆  Ｓｐｏｒｎ，（１９９７），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：１０７３−１０７７
【非特許文献３】Ｐｅｎｄｙａｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ  １０：２６９−２７２
【非特許文献４】Ｃａｒｂｏｎｅ  ＆  Ｙａｎｇ（２０１２）．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １８：５９８−６０４
【非特許文献５】Ｎｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ３２：１００５−１０１３
【非特許文献６】Ｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１，７４４４−７４５３
【非特許文献７】Ｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．Ｃｈｅｓｔ  １１６，５０４−５２０
【非特許文献８】Ｂｅｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ４０，１２４１−１２４５
【非特許文献９】Ｓｔｅｒｍａｎ  ＆  Ａｌｂｅｌｄａ（２００５）．Ｒｅｓｐｉｒｏｌｏｇｙ  １０，２６６−２８３
【非特許文献１０】Ｓｕｒｖｅｙ，Ｂ．Ｇ．（２０１０）．Ｗｏｒｌｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ２００４−０８．Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｇｅｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｕｒｖｅｙ
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一態様では、本発明は、それを必要としている対象中で生体分子（核酸のような遺伝物質、タンパク質または脂質など）、細胞、または組織を、放射線損傷から保護する方法に関し、この方法は、上記対象に有効量の亜麻仁、その生理活性成分、その分解物または代謝物を投与することを含む。上記対象に対する投与は、有害な放射線曝露への曝露の前の、その間の、およびその後の投与を包含する。暴露前、その間およびその後の時間は、数秒、数分、数時間、数日、数週間、数ヶ月さらには数年であってよい。生理活性成分には、セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせが包含される。
【００１２】
別の態様では、本発明は、放射線に暴露されたことのあるまたは暴露されるであろう対象中で放射線損傷を処置または予防する方法に関し、この方法は、上記対象に有効量の少なくとも１つの生理活性成分を投与することを含み、上記生理活性成分はセコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせを含む。
【００１３】
別の態様では、本発明は、それを必要としている対象中で生体分子（核酸のような遺伝物質、タンパク質または脂質など）、細胞、または組織を、偶発的放射線曝露から生じる放射線損傷から保護する方法に関し、この方法は、上記対象に有効量の亜麻仁、その生理活性成分、その分解物または代謝物を投与することを含む。
【００１４】
別の態様では、本発明は、生体分子（核酸のような遺伝物質、タンパク質または脂質など）、細胞、または組織を、老化の原因となる放射線損傷から保護する方法に関する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、生体分子（核酸のような遺伝物質、タンパク質または脂質など）、細胞、または組織を、天然および合成両方由来の化学発癌性物質および毒物への暴露から生じる放射線損傷から保護する方法に関する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、それを必要としている対象中で生体分子（核酸のような遺伝物質、タンパク質または脂質など）、細胞、または組織を、癌処置のための放射線療法から生じる放射線損傷から保護する方法に関し、この方法は、上記対象に有効量の亜麻仁、その生理活性成分、その分解物または代謝物を投与することを含む。
【００１７】
別の態様では、本発明は、それを必要としている対象中で生体分子（核酸のような遺伝物質、タンパク質または脂質など）、細胞、または組織を、放射線損傷から保護する方法に関し、この方法は、有効量の少なくとも１つの生理活性成分を上記対象に投与することを含み、上記生理活性成分は、セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、放射線損傷は偶発的放射線曝露から生じる。いくつかの実施形態では、放射線損傷は、癌（例えば、肺癌）処置のための放射線療法から生じる。
【００１８】
別の態様では、本発明は、それを必要としている対象中で生体分子（核酸のような遺伝物質、タンパク質または脂質など）、細胞、または組織に対する放射線誘発性損傷を予防する方法に関し、この方法は、上記対象に有効量の亜麻仁、その生理活性成分、またはその代謝物を投与することを含む。
【００１９】
別の態様では、本発明は、それを必要としている対象中で生体分子（核酸のような遺伝物質、タンパク質または脂質など）、細胞、または組織に対する放射線誘発性損傷を予防する方法に関し、この方法は、上記対象に有効量の少なくとも１つの生理活性成分を投与することを含み、上記生理活性成分は、セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせを含む。
【００２０】
別の態様では、本発明は、生体分子（核酸のような遺伝物質、タンパク質または脂質など）、細胞、または組織を、細胞の放射線損傷から保護する方法に関し、この方法は、有効量の少なくとも１つの生理活性成分を上記細胞と接触させることを含み、上記生理活性成分は、セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせを含む。
【００２１】
別の態様では、本発明は、それを必要としている対象中で生体分子（核酸のような遺伝物質、タンパク質または脂質など）、細胞、または組織を、発癌性物質による損傷から保護する方法に関し、この方法は、上記対象に有効量の亜麻仁、その生理活性成分、その分解物または代謝物を投与することを含む。上記対象に対する投与は、天然および合成の両方由来化学発癌性物質および毒物への有害な暴露の前の、その間の、およびその後の投与を包含する。暴露前、その間およびその後の時間は、数秒、数分、数時間、数日、数週間、数ヶ月さらには数年であってよい。生理活性成分には、セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせが包含される。
【００２２】
別の態様では、本発明は、それを必要としている対象中で生体分子を、天然および合成両方由来の化学発癌性物質および毒物に対する偶発的曝露から生じる発癌性物質による損傷から保護する方法に関し、この方法は、上記対象に有効量の亜麻仁、その生理活性成分、その分解物または代謝物を投与することを含む。
【００２３】
別の態様では、本発明は、生体分子（核酸のような遺伝物質、タンパク質または脂質など）、細胞、または組織を、肺癌または中皮腫の原因となる天然および合成両方由来の化学発癌性物質および毒物による放射線損傷から保護する方法に関する。
【００２４】
別の態様では、本発明は、生体分子（核酸のような遺伝物質、タンパク質または脂質など）、細胞、または組織を、発癌性物質による損傷から保護する方法に関し、この方法は、上記生体分子、細胞、または組織を有効量の生理活性成分と接触させることを含む。上記生体分子、細胞、または組織との接触は、天然および合成の両方由来化学発癌性物質および毒物への有害な暴露の前の、その間の、およびその後の接触を包含する。暴露前、その間およびその後の時間は、数秒、数分、数時間、数日、数週間、数ヶ月さらには数年であってよい。生理活性成分には、セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせが包含される。
【００２５】
別の態様では、本発明は、１種または複数種の発癌性物質に暴露されたことのあるまたは暴露されるであろう対象中で発癌性物質誘発性癌に起因する発癌性物質誘発性損傷、悪性転換または癌発生を処置または予防する方法に関し、この方法は、上記対象に有効量の少なくとも１つの生理活性成分を投与することを含み、上記生理活性成分は、セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせを含む。
【００２６】
別の態様では、本発明は、１種または複数種の発癌性物質に暴露された対象を発癌性物質誘発性癌から保護する方法に関し、この方法は、上記対象に有効量の亜麻仁、その生理活性成分、その代謝物を投与することを含む。
【００２７】
別の態様では、本発明は、それを必要としている対象中で生体分子（核酸のような遺伝物質、タンパク質または脂質など）、細胞、または組織を、次亜塩素酸イオンによる損傷から保護する方法に関し、この方法は、上記対象に有効量の亜麻仁、その生理活性成分、その分解物または代謝物を投与することを含む。上記対象に対する投与は、天然および合成の両方由来化学発癌性物質および毒物への有害な暴露の前の、その間の、およびその後の投与を包含する。暴露前、その間およびその後の時間は、数秒、数分、数時間、数日、数週間、数ヶ月さらには数年であってよい。生理活性成分には、セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせが包含される。
【００２８】
別の態様では、本発明は、次亜塩素酸イオンに暴露されたことのある、または暴露されるであろう対象中で次亜塩素酸イオン誘発性損傷を処置または予防する方法に関し、この方法は、上記対象に有効量の少なくとも１つの生理活性成分を投与することを含み、上記生理活性成分は、セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせを含む。
【００２９】
別の態様では、本発明は、生体分子（核酸のような遺伝物質、タンパク質または脂質など）、細胞、または組織を、次亜塩素酸イオンによる損傷から保護する方法に関し、この方法は、次亜塩素酸イオンに暴露された、または暴露が想定される上記生体分子、細胞、または組織を有効量の生理活性成分と接触させることを含む。上記生体分子、細胞、または組織との接触は、天然および合成の両方由来化学発癌性物質および毒物への有害な暴露の前の、その間の、およびその後の接触を包含する。暴露前、その間およびその後の時間は、数秒、数分、数時間、数日、数週間、数ヶ月さらには数年であってよい。生理活性成分には、セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせが包含される。
【００３０】
別の態様では、本発明は、前述の方法の１つで使用するための組成物に関する。
【００３１】
別段に定義されていない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者に通常理解されているものと同じ意味を有する。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記載例および図面から明らかになるであろう。しかし、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好適実施形態を示してはいるものの、実例として与えられているにすぎず、この詳細な説明から、本発明の趣旨および範囲内での様々な変更および修正が当業者には明らかであることは理解されたい。また、実施形態が本発明の異なる態様の下で記載されている場合であっても、適切な場合にはいつでも、本発明のいずれの実施形態も１種または複数種の本発明のその他の実施形態と組み合わせることができることも意図されている。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
それを必要としている対象中で生体分子、細胞、または組織を放射線損傷から保護する方法であって、有効量の少なくとも１つの生理活性成分を前記対象に投与することを含み、前記生理活性成分がセコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせを含む方法。
（項目２）
前記対象が放射線に暴露されるであろう対象である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記対象が放射線に暴露されたことがある対象である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記対象が治療手順の一部として放射線に暴露されたことがあるまたは暴露されるであろう、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記対象が放射線療法を受けているまたは受けるであろう癌患者である、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記癌患者が肺癌患者である、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記対象が診断手順の一部として放射線に暴露されたことがあるまたは暴露されるであろう、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記診断手順が歯のまたは骨のＸ線検査である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記診断手順がＰＥＴまたはＣＴスキャンである、項目７に記載の方法。
（項目１０）
前記対象が放射線に偶発的に暴露されたことがある、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記対象が彼らの職業の一部として放射線に暴露されたことがあるまたは暴露されるであろう、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記職業が研究室技術者である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記対象がラドンに暴露されたことがある、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記対象がテロリズムの結果として放射線に暴露されたことがある、項目１に記載の方法。
（項目１５）
それを必要としている対象中で生体分子、細胞、または組織を発癌性物質誘発性損傷、悪性転換および癌発生から保護する方法であって、有効量の少なくとも１つの生理活性成分を前記対象に投与することを含み、前記生理活性成分がセコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせを含む方法。
（項目１６）
前記対象が１種または複数種の発癌性物質に暴露されるであろう対象である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記対象が１種または複数種の発癌性物質に暴露されたことがある対象である、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
前記対象が癌を有する、項目１５に記載の方法。
（項目１９）
前記対象が１種または複数種の発癌性物質に偶発的に暴露されたことがあるまたは暴露されるであろう、項目１５に記載の方法。
（項目２０）
前記対象がテロリストの行為の結果として１種または複数種の発癌性物質または化学戦争毒物に暴露されたことがあるまたは暴露されるであろう、項目１５に記載の方法。
（項目２１）
前記対象が嗜癖の結果として１種または複数種の発癌性物質に暴露されたことがあるまたは暴露されるであろう、項目１５に記載の方法。
（項目２２）
前記嗜癖が喫煙である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記対象が彼らの職業の結果として１種または複数種の発癌性物質に暴露されたことがあるまたは暴露されるであろう、項目１５に記載の方法。
（項目２４）
前記対象の職業が研究室技術者である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
それを必要としている対象中で生体分子、細胞、または組織を次亜塩素酸イオンによる損傷から保護する方法であって、有効量の少なくとも１つの生理活性成分を前記対象に投与することを含み、前記生理活性成分がセコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせを含む方法。
（項目２６）
前記生体分子が核酸である、項目１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記生体分子がタンパク質または脂質である、項目１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
前記生理活性成分が（Ｓ，Ｓ）−ＳＤＧである、項目１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
前記生理活性成分が（Ｒ，Ｒ）−ＳＤＧである、項目１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記生理活性成分が合成ＳＤＧである、項目１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記生理活性成分がＳＤＧ類似体である、項目１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
前記生理活性成分が食用組成物中で投与される、項目１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
前記投与するステップが経口的に投与することを含む、項目１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３４）
前記生理活性成分が約１ナノモル濃度（ｎＭ）〜約１モル（Ｍ）の濃度のＳＤＧである、項目１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
前記ＳＤＧの濃度が約２５μＭ〜約２５０μＭである、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記対象がヒト対象である、項目１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
放射線に暴露されたことがあるまたは暴露されるであろう対象中で放射線損傷を処置または予防する方法であって、有効量の少なくとも１つの生理活性成分を前記対象に投与することを含み、前記生理活性成分がセコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせを含む方法。
（項目３８）
前記対象が治療手順の一部として放射線に暴露されたことがあるまたは暴露されるであろう、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記対象が放射線療法を受けているまたは受けるであろう癌患者である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記癌患者が肺癌患者である、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記対象が診断手順の一部として放射線に暴露されたことがあるまたは暴露されるであろう、項目３７に記載の方法。
（項目４２）
前記診断手順が歯のまたは骨のＸ線検査である、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記診断手順がＰＥＴまたはＣＴスキャンである、項目４１に記載の方法。
（項目４４）
前記対象が放射線に偶発的に暴露されたことがある、項目３７に記載の方法。
（項目４５）
前記対象が彼らの職業の一部として放射線に暴露されたことがある暴露されるであろう、項目３７に記載の方法。
（項目４６）
前記対象の職業が研究室技術者である、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記対象がラドンに暴露されたことがある、項目３７に記載の方法。
（項目４８）
前記対象が、テロリズムの結果として放射線に暴露されたことがある、項目３７に記載の方法。
（項目４９）
１種または複数種の発癌性物質に暴露されたことがあるまたは暴露されるであろう対象中で発癌性物質誘発性損傷、悪性転換または癌発生を処置または予防する方法であって、有効量の少なくとも１つの生理活性成分を前記対象に投与することを含み、前記生理活性成分がセコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせを含む方法。
（項目５０）
前記発癌性物質誘発性損傷、悪性転換または癌発生が癌である、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記癌が肺癌である、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記癌が悪性中皮腫である、項目５０に記載の方法。
（項目５３）
前記対象が前記癌を発症していない、項目５０に記載の方法。
（項目５４）
前記対象が１種または複数種の発癌性物質に偶発的に暴露されたことがあるまたは暴露されるであろう、項目４９に記載の方法。
（項目５５）
前記対象がテロリストの行為の結果として前記１種または複数種の発癌性物質または化学戦争毒物に暴露されたことがあるまたは暴露されるであろう、項目４９に記載の方法。
（項目５６）
前記対象が嗜癖の結果として１種または複数種の発癌性物質に暴露されたことがあるまたは暴露されるであろう、項目４９に記載の方法。
（項目５７）
前記嗜癖が喫煙である、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記対象が彼らの職業の結果として１種または複数種の発癌性物質に暴露されたことがあるまたは暴露されるであろう、項目４９に記載の方法。
（項目５９）
前記対象の職業が研究室技術者である、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記１種または複数種の発癌性物質がアスベストである、項目４９に記載の方法。
（項目６１）
前記１種または複数種の発癌性物質がタバコの煙である、項目４９に記載の方法。
（項目６２）
前記対象が喫煙者である、項目４９に記載の方法。
（項目６３）
前記対象が以前の喫煙者である、項目４９に記載の方法。
（項目６４）
前記対象が副流煙に暴露される非喫煙者である、項目４９に記載の方法。
（項目６５）
次亜塩素酸イオンに暴露されたことがあるまたは暴露されるであろう対象中で次亜塩素酸イオン誘発性損傷を処置または予防する方法であって、有効量の少なくとも１つの生理活性成分を前記対象に投与することを含み、前記生理活性成分がセコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせを含む方法。
（項目６６）
前記生理活性成分が（Ｓ，Ｓ）−ＳＤＧである、項目３７〜６５のいずれか１項に記載の方法。
（項目６７）
前記生理活性成分が（Ｒ，Ｒ）−ＳＤＧである、項目３７〜６５のいずれか１項に記載の方法。
（項目６８）
前記生理活性成分が合成ＳＤＧである、項目１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目６９）
前記生理活性成分がＳＤＧ類似体である、項目３７〜６５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７０）
前記生理活性成分が食用組成物中で投与される、項目３７〜６５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７１）
前記投与するステップが経口的に投与することを含む、項目３７〜６５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７２）
前記生理活性成分が約１ナノモル濃度（ｎＭ）〜約１モル（Ｍ）の濃度のＳＤＧである、項目３７〜６５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７３）
前記ＳＤＧの濃度が約２５μＭ〜約２５０μＭである、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記対象がヒト対象である、項目３７〜６５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７５）
生体分子、細胞、または組織を放射線損傷から保護する方法であって、前記生体分子、細胞、または組織を有効量の少なくとも１つの生理活性成分と接触させることを含み、前記生理活性成分がセコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせを含む方法。
（項目７６）
生体分子、細胞、または組織を発癌性物質誘発性損傷から保護する方法であって、前記生体分子、細胞、または組織を有効量の少なくとも１つの生理活性成分と接触させることを含み、前記生理活性成分がセコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせを含む方法。
（項目７７）
生体分子、細胞、または組織を次亜塩素酸イオンによる損傷から保護する方法であって、前記生体分子、細胞、または組織を有効量の少なくとも１つの生理活性成分と接触させることを含み、前記生理活性成分がセコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせを含む方法。
（項目７８）
前記生体分子が核酸である、項目７５〜７７のいずれか１項に記載の方法。
（項目７９）
前記生体分子がタンパク質または脂質である、項目７５〜７７のいずれか１項に記載の方法。
（項目８０）
前記生理活性成分が（Ｓ，Ｓ）−ＳＤＧである、項目７３〜７５のいずれか１項に記載の方法。
（項目８１）
前記生理活性成分が（Ｒ，Ｒ）−ＳＤＧである、項目７５〜７７のいずれか１項に記載の方法。
（項目８２）
前記生理活性成分が合成ＳＤＧである、項目７５〜７７のいずれか１項に記載の方法。
（項目８３）
前記生理活性成分がＳＤＧ類似体である、項目７５〜７７のいずれか１項に記載の方法。
（項目８４）
前記生理活性成分が約１ナノモル濃度（ｎＭ）〜約１モル（Ｍ）の濃度のＳＤＧである、項目７５〜７７のいずれか１項に記載の方法。
（項目８５）
前記ＳＤＧの濃度が約２５μＭ〜約２５０μＭである、項目８４に記載の方法。
（項目８６）
前記細胞または組織が癌細胞または組織である、項目７５〜７７のいずれか１項に記載の方法。
（項目８７）
前記癌が肺癌である、項目８６に記載の方法。
（項目８８）
前記癌が悪性中皮腫である、項目８６に記載の方法。
（項目８９）
前記生体分子、細胞、または組織がヒト生体分子、細胞、または組織である、項目７５〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】Ａ−Ｂ。プラスミド（ｐＢＲ３２２）ＤＮＡ弛緩に対するγ線量増加の効果。スーパーコイル（ＳＣ）はコンパクト型を表す。オープンコイル（ＯＣ）型は、弛緩型または損傷型のプラスミドを表す。（Ａ）−スーパーコイル（ＳＣ）型は、下側の明瞭なバンド（３，０００ｂｐの位置の）であり、オープンコイル（ＯＣ）型は上側の明瞭なバンドである。レーン１−１ｋｂ  ＤＮＡ標準ラダー、レーン２および３−無処理プラスミドＤＮＡ、レーン４および５−１０Ｇｙに暴露したプラスミドＤＮＡ、レーン６および７−２５Ｇｙに暴露したプラスミドＤＮＡ、レーン８および９−５０Ｇｙに暴露したプラスミドＤＮＡ。（Ｂ）−ＳＣおよびＯＣ型が、全プラスミドＤＮＡのパーセントとして表されている。全ての試料を各条件で２回試験した。データは、平均±標準偏差として表されている。ｐ＜０．０５を有意と見なした。＊および＊＊は、それぞれ、無処理ＳＣおよびＯＣ型に比べた場合に有意差があることを示す。
【図２】Ａ−Ｉ。γ線誘発性プラスミド（ｐＢＲ３２２）ＤＮＡ弛緩に対する合成ＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）、ＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）および市販ＳＤＧの濃度増加の効果。全試料を２５Ｇｙのγ線量に暴露した。ＳＤＧ濃度は２５、５０、１００および２５０μＭであった。図（Ａ）、（Ｄ）、および（Ｇ）−２５、５０、１００および２５０μＭのＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）、ＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）およびＳＤＧ（市販）の存在下で２５Ｇｙに暴露後のプラスミドＤＮＡの代表的アガロースゲルスキャンを示す。レーン１−１ｋｂ  ＤＮＡ標準ラダー、レーン２および３−無処理プラスミドＤＮＡ、レーン４および５−２５μＭ、レーン６および７−５０μＭ、レーン８および９−１００μＭ、ならびにレーン１０および１１−２５０μＭ  ＳＤＧ。図（Ｂ）、（Ｅ）および（Ｈ）−ＳＣおよびＯＣ型が、全プラスミドＤＮＡのパーセントとして表されている。全ての試料を各条件で２回試験した。データは、平均±標準偏差として表した。ｐ＜０．０５を有意と見なした。＊および＃は、それぞれ、無処理ＳＣおよびＯＣ型に比べた場合に有意差があることを示す。＊＊および＃＃は、ＳＤＧ処理なしで２５Ｇｙに暴露した試料に比べた場合に有意差があることを示す。図（Ｃ）、（Ｆ）および（Ｉ）では、プラスミドＤＮＡ弛緩のＳＤＧ依存的抑制が示されている。ＥＣ５０値は曲線の下に示す二次方程式から決定した。
【図３】Ａ−Ｂ。仔ウシ胸腺のＤＮＡ断片化に対するγ線量増加の効果。γ線へのＤＮＡ暴露により、小分子量断片が生成される。小分子量断片はより高い分子量のＤＮＡより速く動く。高分子量ＤＮＡ（＞６，０００ｂｐ）と比較した低分子量ＤＮＡ断片（＜６，０００ｂｐ）の密度の測定は、放射線誘発性損傷の程度を反映する。（Ａ）レーン１−１ｋｂ  ＤＮＡ標準ラダー、レーン２および３−無処理仔ウシ胸腺ＤＮＡ、レーン４および５−２５Ｇｙに暴露したＤＮＡ、レーン６および７−５０Ｇｙに暴露したＤＮＡ。（Ｂ）−高および低分子量ＤＮＡ型が、全ＤＮＡのパーセントとして表されている。全ての試料を各条件で２回試験した。データは、平均±標準偏差として表した。ｐ＜０．０５を有意と見なした。＊は、それぞれ、無処理に比べた場合に有意差があることを示す。
【図４】Ａ−Ｆ。γ線誘発性仔ウシ胸腺ＤＮＡ断片化に対する合成ＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）、ＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）および市販ＳＤＧの濃度増加の効果。全試料を５０グレイのγ線量に暴露した。ＳＤＧ濃度は２５、５０、１００および２５０μＭであった。図（Ａ）、（Ｃ）、および（Ｅ）−２５、５０、１００および２５０μＭのＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）、ＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）およびＳＤＧ（市販）の存在下で５０Ｇｙに暴露後の仔ウシ胸腺ＤＮＡの代表的アガロースゲルスキャンを示す。レーン１−１ｋｂ  ＤＮＡ標準ラダー、レーン２および３−無処理ＤＮＡ、レーン４および５−２５μＭ、レーン６および７−５０μＭ、レーン８および９−１００μＭ、ならびにレーン１０および１１−２５０μＭ  ＳＤＧ。図（Ｂ）、（Ｄ）および（Ｆ）−高および低分子量ＤＮＡ型が、全ＤＮＡのパーセントとして表されている。全ての試料を各条件で２回試験した。データは、平均±標準偏差として表した。ｐ＜０．０５を有意と見なした。＊は無処理ＤＮＡに比べた場合に有意差があることを示す。＃は、ＳＤＧ処理なしで、５０Ｇｙに暴露した試料に比べた場合に有意差があることを示す。
【図５】Ａ−Ｆ。γ線誘発性仔ウシ胸腺ＤＮＡ断片化に対する、非常に低濃度の合成ＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）、ＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）および市販ＳＤＧの効果。全試料を５０Ｇｙのγ線量に暴露した。ＳＤＧ濃度は０．５、１．０、５．０および１０μＭであった。図（Ａ）、（Ｃ）、および（Ｅ）−０．５、１．０、５．０および１０μＭのＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）、ＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）およびＳＤＧ（市販）の存在下で５０Ｇｙに暴露後の仔ウシ胸腺ＤＮＡの代表的アガロースゲルスキャンを示す。レーン１−１ｋｂ  ＤＮＡ標準ラダー、レーン２および３−無処理ＤＮＡ、レーン４および５−０．５μＭ、レーン６および７−１．０μＭ、レーン８および９−５．０μＭ、ならびにレーン１０および１１−１０μＭ  ＳＤＧ。図（Ｂ）、（Ｄ）および（Ｆ）−高および低分子量ＤＮＡ型が、全ＤＮＡのパーセントとして表されている。全ての試料を各条件で２回試験した。データは、平均±標準偏差として表した。ｐ＜０．０５を有意と見なした。＊は無処理ＤＮＡに比べた場合に有意差があることを示す。＃は、ＳＤＧ処理なしで、５０Ｇｙに暴露した試料に比べた場合に有意差があることを示す。
【図６】Ａ−Ｂ。γ線誘発性仔ウシ胸腺ＤＮＡ断片化に対するＳＤＧ、ＳＥＣＯ、ＥＤおよびＥＬの効果。全試料を５０Ｇｙのγ線量に暴露した。ＳＤＧ、ＳＥＣＯ、ＥＤおよびＥＬを１０μＭの濃度で使用した。（Ａ）１０μＭ  ＳＤＧ、ＳＥＣＯ、ＥＤおよびＥＬの存在下で５０Ｇｙに暴露後の仔ウシ胸腺ＤＮＡの代表的アガロースゲルスキャンを示す。レーン１−１ｋｂ  ＤＮＡ標準ラダー、レーン２および３−無処理ＤＮＡ、レーン４、５および６−ＩＲ  ５０Ｇｙ、レーン７および８−ＳＤＧ、レーン９および１０−ＳＥＣＯ、レーン１１および１２−ＥＤ、ならびにレーン１３および１４−ＥＬ。（Ｂ）高および低分子量ＤＮＡ型が、全ＤＮＡのパーセントとして表されている。全ての試料を各条件で２回試験した。データは、平均±標準偏差として表した。ｐ＜０．０５を有意と見なした。＊は無処理ＤＮＡに比べた場合に有意差があることを示す。＃は、５０Ｇｙ単独に暴露した試料に比べた場合に有意差があることを示す。
【図７】Ａ−Ｃ。マウス一次肺細胞の放射線量応答に対するＳＤＧ処置の効果。（Ａ）上皮細胞；（Ｂ）内皮細胞および（Ｃ）ＷＴ繊維芽細胞。γ線照射（０、２、４、６、８Ｇｙ）の前に、細胞を異なる濃度のＳＤＧで６時間処理し、インキュベートした。１２〜１４日目に全ての可視コロニーを計数し、生存率を対照値に対し正規化した。データを平均±標準誤差として表した。照射細胞対５０μＭ  ＳＤＧ前処理照射細胞について、＊＊はｐ≦０．００１、＊はｐ≦０．０１、＃はｐ≦０．０５。
【図８】Ａ−Ｂ。アルカリコメットアッセイを使いる、肺細胞中での放射線誘発性ＤＮＡ一本鎖切断（ＳＳＢ）の評価。（Ａ）２Ｇｙ照射した一次肺細胞（上皮、内皮およびＷＴ繊維芽細胞）でのＤＮＡ損傷の動力学的評価；それぞれの処理に対し、少なくとも１００〜１５０細胞を計数した。ＤＮＡ損傷をそれぞれの細胞に対し「テイルモーメント」（テイル中のＤＮＡの量とテイル長の積）を計算することにより評価した。非照射対照対それらのそれぞれの照射細胞について、＊はｐ≦０．００１；（Ｂ）照射した一次肺細胞に対するＳＤＧ（５０μＭ）処理（照射前０、２、４、６時間での処理）の効果。データを平均±標準誤差として表した。照射細胞対ＳＤＧ前処理照射細胞について、＊はｐ≦０．００１、＃はｐ≦０．０１。挿入図：一次肺上皮細胞の代表的蛍光顕微鏡写真。細胞をＳＤＧ（５０μＭ）で前処理し、γ線（２Ｇｙ）に暴露し、アガロース中に埋め込み、溶解し、電気泳動を行い（０．６６Ｖ／ｃｍ、２５分）、ＳＹＢＲグリーンで染色し、蛍光顕微鏡下で可視化した後、コメットテイル形成を調べた。（Ａ）対照細胞、（Ｂ）ＳＤＧ（５０μＭ）、（Ｃ）ＩＲ（２Ｇｙ）に３０分の暴露後、（Ｄ）ＳＤＧ（５０μＭ、６時間）で前処理し、照射した細胞。
【図９】Ａ−Ｃ。照射したマウス一次肺細胞、すなわち、上皮細胞、内皮細胞およびＷＴ繊維芽細胞中でのγ−Ｈ２ＡＸフォーカス誘導の蛍光評価。細胞をＳＤＧ（５０μＭ）で６時間処理し、γ線照射（２Ｇｙ）した。所望の時間間隔で細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、洗浄して、γ−Ｈ２ＡＸ抗体で検出し、細胞核をＤＡＰＩを使って対比染色した。細胞を蛍光顕微鏡下で可視化した。全細胞（青）、γ−Ｈ２ＡＸ陽性細胞（緑）を視野毎に計数し、γ−Ｈ２ＡＸ陽性細胞のパーセンテージを計算した。それぞれの処理毎に少なくとも５００細胞を計数し、実験を２回行った。データを平均±標準誤差として表した。照射細胞対ＳＤＧ前処理照射細胞について、＊はｐ≦０．０５、＊＊はｐ≦０．００５。
【図１０】マウス肺上皮細胞でのγ−Ｈ２ＡＸフォーカス（緑）の免疫蛍光法可視化の代表的パネル。細胞をＳＤＧで６時間前処理後、γ線照射（２Ｇｙ）し、さらに３０分インキュベートした。細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、γ−Ｈ２ＡＸ抗体で検出した。ＤＮＡをＤＡＰＩで対比染色した（青）。画像は蛍光顕微鏡を用いて取得した。
【図１１】Ａ−Ｃ。照射したマウス一次肺細胞におけるγ−Ｈ２ＡＸフォーカス誘導のフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）確認。一次肺細胞、すなわち、上皮細胞（Ａ）、内皮細胞（Ｂ）およびＷＴ繊維芽細胞（Ｃ）をＳＤＧ（５０μＭ）で６時間処理し、γ線照射（２Ｇｙ）した。所望の時間間隔で細胞をＦＡＣＳ分析用に処理した。Ｓｕｍｍｉｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅを使ってデータを定量化し、平均±標準誤差として表した。照射細胞対ＳＤＧ前処理照射細胞について、＊はｐ≦０．０５、＊＊はｐ≦０．０１。
【図１２】Ａ−Ｃ。一次肺細胞における放射線誘発性アポトーシス死の評価。照射一次肺細胞、すなわち、上皮細胞（Ａ）、内皮細胞（Ｂ）およびＷＴ繊維芽細胞（Ｃ）に対するＳＤＧ（５０ｍＭ）前処理（６時間）の効果の定量評価。細胞を固定し、ＤＡＰＩで染色して蛍光顕微鏡下での形態学的分析のために可視化した。それぞれの処理毎に、５つの異なる視野から少なくとも５００細胞を計数し、アポトーシス細胞のパーセンテージを計算した。実験を２回行った。データを平均±標準誤差として表した。照射細胞対ＳＤＧ前処理照射細胞について、＊はｐ≦０．０５、＊＊はｐ≦０．００５。
【図１３】Ａ−Ｅ肺上皮細胞におけるアポトーシスの制御因子に与えるＳＤＧ処理の効果の評価。マウス一次肺細胞（上皮細胞）をＳＤＧ（５０μＭ）で６時間処理した後、２Ｇｙに暴露した。インキュベーション後、６、２４、および４８時間目に細胞を採取した。所望の時間間隔で全ＲＮＡを上皮細胞から単離し、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析によりＢａｘおよびＢｃｌ−２遺伝子発現を評価した（ＡおよびＢ）。分析を３回行い、遺伝子発現を１８ＳリボソームＲＮＡに対し正規化した。ＢａｘおよびＢｃｌ−２タンパク質レベルをウェスタンブロット分析により評価した。代表的画像（Ｃ）およびβ−アクチンに対し正規化したデンシトメトリー分析（ＤおよびＥ）。データを平均±標準誤差で表した。ＳＤＧ処理細胞またはＳＤＧ＋ＩＲ処理細胞に比較したＩＲ暴露細胞について、＊はｐ≦０．０５、＊＊はｐ≦０．０１。
【図１４】Ａ−Ｃ。活性カスパーゼ３および切断ＰＡＲＰのレベルの放射線誘発性の上昇に対するＳＤＧの効果。マウス一次肺細胞（上皮細胞）をＳＤＧ（５０μＭ）で６時間処理した後、２Ｇｙに暴露した。照射後、６、２４、および４８時間目に細胞を採取した。切断カスパーゼ３および切断ＰＡＲＰタンパク質レベルをウェスタンブロット分析により評価した。（Ａ）代表的画像および（ＢおよびＣ）β−アクチンに対し正規化したデンシトメトリー分析。分析は２回繰り返して行い、データを平均±標準誤差で表した。ＳＤＧ処理細胞に比較したＩＲ暴露細胞について、＊はｐ≦０．０５、＊＊はｐ≦０．０１。
【図１５Ａ−Ｂ】Ａ−Ｂ。ＳＤＧは次亜塩素酸イオンを除去する。図１５Ａは、ＡＰＦおよびＨＰＦ蛍光のＣｌＯ−依存的な増大を示す。図１５Ｂは、ＳＤＧによるＣｌＯ−の除去作用を示す。図１５Ｃは、合成ＳＤＧジアステレオマーＳＤＧ（Ｓ，Ｓ）およびＳＤＧ（Ｒ，Ｒ）の除去効果を示す。全ての試料を２回試験した。データは、平均±標準偏差として表した。ｐ＜０．０５を有意と見なした。＊は、無処理対照に比べた場合に有意差があることを示す。
【図１５Ｃ】ＳＤＧは次亜塩素酸イオンを除去する。図１５Ａは、ＡＰＦおよびＨＰＦ蛍光のＣｌＯ−依存的な増大を示す。図１５Ｂは、ＳＤＧによるＣｌＯ−の除去作用を示す。図１５Ｃは、合成ＳＤＧジアステレオマーＳＤＧ（Ｓ，Ｓ）およびＳＤＧ（Ｒ，Ｒ）の除去効果を示す。全ての試料を２回試験した。データは、平均±標準偏差として表した。ｐ＜０．０５を有意と見なした。＊は、無処理対照に比べた場合に有意差があることを示す。
【図１６Ａ−Ｂ】Ａ−Ｂ。ＳＤＧはγ線誘発による次亜塩素酸塩生成を排除する。図１６ＡおよびＢは、γ線誘発によるＡＰＦおよびＨＰＦ蛍光増加を示す。図１６ＣおよびＤは、増加する放射線量での、ＡＰＦまたはＨＰＦを含む燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の次亜塩素酸塩の生成に対するＳＤＧの効果を示す（図１５の凡例を参照）。図１６Ｅ、ＦおよびＧは、タウリンのγ線誘発性塩素化を示す。図１６Ｅは、タウリンの次亜塩素酸塩依存的な塩素化を示す。図１６Ｆは、全ての実験条件に対するタウリンクロラミンの吸光度を示す。図１６Ｇは、図１６Ｆと同様の各種条件下での次亜塩素酸塩濃度を示す。図１６Ａ〜Ｅに対しては、全ての試料を２回繰り返して実験し、図１６ＦおよびＧに対しては、全ての試料を４回繰り返して実験した。データは、平均±標準偏差として表した。ｐ＜０．０５を有意と見なした。＊は、無処理対照に比べた場合に有意差があることを示す。
【図１６Ｃ−Ｄ】Ｃ−Ｄ。ＳＤＧはγ線誘発による次亜塩素酸塩生成を排除する。図１６ＡおよびＢは、γ線誘発によるＡＰＦおよびＨＰＦ蛍光増加を示す。図１６ＣおよびＤは、増加する放射線量での、ＡＰＦまたはＨＰＦを含む燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の次亜塩素酸塩の生成に対するＳＤＧの効果を示す（図１５の凡例を参照）。図１６Ｅ、ＦおよびＧは、タウリンのγ線誘発性塩素化を示す。図１６Ｅは、タウリンの次亜塩素酸塩依存的な塩素化を示す。図１６Ｆは、全ての実験条件に対するタウリンクロラミンの吸光度を示す。図１６Ｇは、図１６Ｆと同様の各種条件下での次亜塩素酸塩濃度を示す。図１６Ａ〜Ｅに対しては、全ての試料を２回繰り返して実験し、図１６ＦおよびＧに対しては、全ての試料を４回繰り返して実験した。データは、平均±標準偏差として表した。ｐ＜０．０５を有意と見なした。＊は、無処理対照に比べた場合に有意差があることを示す。
【図１６Ｅ】Ａ−Ｂ。ＳＤＧはγ線誘発による次亜塩素酸塩生成を排除する。図１６ＡおよびＢは、γ線誘発によるＡＰＦおよびＨＰＦ蛍光増加を示す。図１６ＣおよびＤは、増加する放射線量での、ＡＰＦまたはＨＰＦを含む燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の次亜塩素酸塩の生成に対するＳＤＧの効果を示す（図１５の凡例を参照）。図１６Ｅ、ＦおよびＧは、タウリンのγ線誘発性塩素化を示す。図１６Ｅは、タウリンの次亜塩素酸塩依存的な塩素化を示す。図１６Ｆは、全ての実験条件に対するタウリンクロラミンの吸光度を示す。図１６Ｇは、図１６Ｆと同様の各種条件下での次亜塩素酸塩濃度を示す。図１６Ａ〜Ｅに対しては、全ての試料を２回繰り返して実験し、図１６ＦおよびＧに対しては、全ての試料を４回繰り返して実験した。データは、平均±標準偏差として表した。ｐ＜０．０５を有意と見なした。＊は、無処理対照に比べた場合に有意差があることを示す。
【図１６Ｆ−Ｇ】Ｆ−Ｇ。ＳＤＧはγ線誘発による次亜塩素酸塩生成を排除する。図１６ＡおよびＢは、γ線誘発によるＡＰＦおよびＨＰＦ蛍光増加を示す。図１６ＣおよびＤは、増加する放射線量での、ＡＰＦまたはＨＰＦを含む燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の次亜塩素酸塩の生成に対するＳＤＧの効果を示す（図１５の凡例を参照）。図１６Ｅ、ＦおよびＧは、タウリンのγ線誘発性塩素化を示す。図１６Ｅは、タウリンの次亜塩素酸塩依存的な塩素化を示す。図１６Ｆは、全ての実験条件に対するタウリンクロラミンの吸光度を示す。図１６Ｇは、図１６Ｆと同様の各種条件下での次亜塩素酸塩濃度を示す。図１６Ａ〜Ｅに対しては、全ての試料を２回繰り返して実験し、図１６ＦおよびＧに対しては、全ての試料を４回繰り返して実験した。データは、平均±標準偏差として表した。ｐ＜０．０５を有意と見なした。＊は、無処理対照に比べた場合に有意差があることを示す。
【図１７Ａ−Ｂ】Ａ−Ｂ。次亜塩素酸塩誘発性の仔ウシ胸腺ＤＮＡ損傷。図１７ＡおよびＣは、ＨＯＣｌへの暴露後の仔ウシ胸腺ＤＮＡの代表的アガロースゲルスキャンを示す。図１７ＢおよびＤは、高および低分子量ＤＮＡ断片を全ＤＮＡのパーセントとして示す。図１７ＥおよびＦは、プラスミドＤＮＡへの次亜塩素酸塩誘導性損傷に対するＳＤＧの効果を示す。図１７Ｅは、ＨＯＣｌへ暴露後のプラスミドＤＮＡの代表的アガロースゲルを示す。図１７Ｆは、全プラスミドＤＮＡのパーセントとして表されるＳＣおよびＯＣ型を示す。図１７Ａでは、レーン１−１ｋｂ  ＤＮＡ標準ラダー、レーン２および３−無処理ＤＮＡ、レーン４および５−０．１ｍＭ、レーン６および７−０．２ｍＭ、レーン８および９−０．４ｍＭ、レーン１０および１１−０．５ｍＭ、ならびにレーン１２および１３−０．６ｍＭ  ＣｌＯ−である。図１７Ｃでは、レーン１−１ｋｂ  ＤＮＡ標準ラダー、レーン２および３−無処理ＤＮＡ、レーン４および５−０．５ｍＭ  ＨＯＣｌ、レーン６および７−０．５ｍＭ  ＨＯＣｌ＋ＳＤＧ（市販）１μＭ、レーン８および９−０．５ｍＭ  ＨＯＣｌ＋ＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）１μＭ、レーン１０および１１−０．５ｍＭ  ＨＯＣｌ＋ＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）１μＭ、レーン１２および１３−０．５ｍＭ  ＨＯＣｌ＋ケルセチン１μＭ、ならびにレーン１４および１５−０．５ｍＭ  ＨＯＣｌ＋シリビニン１μＭである。図１７Ｅでは、レーン１−１ｋｂ  ＤＮＡ標準ラダー、レーン２および３−無処理ＤＮＡ、レーン４および５−４．５ｍＭ  ＨＯＣｌ、レーン６および７−４．５ｍＭ  ＨＯＣｌ＋ＳＤＧ  ２５μＭである。全ての試料を各条件で２回試験した。データは、平均±標準偏差として表した。ｐ＜０．０５を有意と見なした。＊および＃は、無処理対照に比べた場合に有意差があることを示す。
【図１７Ｃ−Ｄ】Ｃ−Ｄ。次亜塩素酸塩誘発性の仔ウシ胸腺ＤＮＡ損傷。図１７ＡおよびＣは、ＨＯＣｌへの暴露後の仔ウシ胸腺ＤＮＡの代表的アガロースゲルスキャンを示す。図１７ＢおよびＤは、高および低分子量ＤＮＡ断片を全ＤＮＡのパーセントとして示す。図１７ＥおよびＦは、プラスミドＤＮＡへの次亜塩素酸塩誘導性損傷に対するＳＤＧの効果を示す。図１７Ｅは、ＨＯＣｌへ暴露後のプラスミドＤＮＡの代表的アガロースゲルを示す。図１７Ｆは、全プラスミドＤＮＡのパーセントとして表されるＳＣおよびＯＣ型を示す。図１７Ａでは、レーン１−１ｋｂ  ＤＮＡ標準ラダー、レーン２および３−無処理ＤＮＡ、レーン４および５−０．１ｍＭ、レーン６および７−０．２ｍＭ、レーン８および９−０．４ｍＭ、レーン１０および１１−０．５ｍＭ、ならびにレーン１２および１３−０．６ｍＭ  ＣｌＯ−である。図１７Ｃでは、レーン１−１ｋｂ  ＤＮＡ標準ラダー、レーン２および３−無処理ＤＮＡ、レーン４および５−０．５ｍＭ  ＨＯＣｌ、レーン６および７−０．５ｍＭ  ＨＯＣｌ＋ＳＤＧ（市販）１μＭ、レーン８および９−０．５ｍＭ  ＨＯＣｌ＋ＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）１μＭ、レーン１０および１１−０．５ｍＭ  ＨＯＣｌ＋ＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）１μＭ、レーン１２および１３−０．５ｍＭ  ＨＯＣｌ＋ケルセチン１μＭ、ならびにレーン１４および１５−０．５ｍＭ  ＨＯＣｌ＋シリビニン１μＭである。図１７Ｅでは、レーン１−１ｋｂ  ＤＮＡ標準ラダー、レーン２および３−無処理ＤＮＡ、レーン４および５−４．５ｍＭ  ＨＯＣｌ、レーン６および７−４．５ｍＭ  ＨＯＣｌ＋ＳＤＧ  ２５μＭである。全ての試料を各条件で２回試験した。データは、平均±標準偏差として表した。ｐ＜０．０５を有意と見なした。＊および＃は、無処理対照に比べた場合に有意差があることを示す。
【図１７Ｅ−Ｆ】Ｅ−Ｆ。次亜塩素酸塩誘発性の仔ウシ胸腺ＤＮＡ損傷。図１７ＡおよびＣは、ＨＯＣｌへの暴露後の仔ウシ胸腺ＤＮＡの代表的アガロースゲルスキャンを示す。図１７ＢおよびＤは、高および低分子量ＤＮＡ断片を全ＤＮＡのパーセントとして示す。図１７ＥおよびＦは、プラスミドＤＮＡへの次亜塩素酸塩誘導性損傷に対するＳＤＧの効果を示す。図１７Ｅは、ＨＯＣｌへ暴露後のプラスミドＤＮＡの代表的アガロースゲルを示す。図１７Ｆは、全プラスミドＤＮＡのパーセントとして表されるＳＣおよびＯＣ型を示す。図１７Ａでは、レーン１−１ｋｂ  ＤＮＡ標準ラダー、レーン２および３−無処理ＤＮＡ、レーン４および５−０．１ｍＭ、レーン６および７−０．２ｍＭ、レーン８および９−０．４ｍＭ、レーン１０および１１−０．５ｍＭ、ならびにレーン１２および１３−０．６ｍＭ  ＣｌＯ−である。図１７Ｃでは、レーン１−１ｋｂ  ＤＮＡ標準ラダー、レーン２および３−無処理ＤＮＡ、レーン４および５−０．５ｍＭ  ＨＯＣｌ、レーン６および７−０．５ｍＭ  ＨＯＣｌ＋ＳＤＧ（市販）１μＭ、レーン８および９−０．５ｍＭ  ＨＯＣｌ＋ＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）１μＭ、レーン１０および１１−０．５ｍＭ  ＨＯＣｌ＋ＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）１μＭ、レーン１２および１３−０．５ｍＭ  ＨＯＣｌ＋ケルセチン１μＭ、ならびにレーン１４および１５−０．５ｍＭ  ＨＯＣｌ＋シリビニン１μＭである。図１７Ｅでは、レーン１−１ｋｂ  ＤＮＡ標準ラダー、レーン２および３−無処理ＤＮＡ、レーン４および５−４．５ｍＭ  ＨＯＣｌ、レーン６および７−４．５ｍＭ  ＨＯＣｌ＋ＳＤＧ  ２５μＭである。全ての試料を各条件で２回試験した。データは、平均±標準偏差として表した。ｐ＜０．０５を有意と見なした。＊および＃は、無処理対照に比べた場合に有意差があることを示す。
【図１８Ａ−Ｂ】Ａ−Ｂ。２−アミノプリン（２−ＡＰ）の次亜塩素酸塩誘発性の修飾に対するＳＤＧ（処理前および処理後）の効果。図１８Ａは、全条件に対する代表的スペクトルを示す。図１８Ｂは、図１８Ａと同様の異なる条件下での３７４ｎｍにおける蛍光を示す。図１８Ｃは、ＳＤＧによる％保護を示す。全ての試料を各条件で２回試験した。データは、平均±標準偏差として表した。ｐ＜０．０５を有意と見なした。＊および＃は、それぞれ、無処理２−ＡＰ対照および処理に比べた場合に有意差があることを示す。
【図１８Ｃ】２−アミノプリン（２−ＡＰ）の次亜塩素酸塩誘発性の修飾に対するＳＤＧ（処理前および処理後）の効果。図１８Ａは、全条件に対する代表的スペクトルを示す。図１８Ｂは、図１８Ａと同様の異なる条件下での３７４ｎｍにおける蛍光を示す。図１８Ｃは、ＳＤＧによる％保護を示す。全ての試料を各条件で２回試験した。データは、平均±標準偏差として表した。ｐ＜０．０５を有意と見なした。＊および＃は、それぞれ、無処理２−ＡＰ対照および処理に比べた場合に有意差があることを示す。
【図１９】Ａ−Ｂ。ＳＤＧは２−アミノプリン（２−ＡＰ）のγ線誘発性修飾を防ぐ。図１９Ａは、全条件に対する代表的スペクトルを示す。図１９Ｂは、３７４ｎｍでの蛍光を示す。全ての試料を各条件で２回試験した。データは、平均±標準偏差として表した。ｐ＜０．０５を有意と見なした。＊および＃は、それぞれ、無処理２−ＡＰ対照および処理に比べた場合に有意差があることを示す。
【図２０】ヌクレオベース塩素化からのＤＮＡ保護におけるＳＤＧの作用に関して提案される機序。
【図２１】亜麻仁およびそのリグナンによる化学防御の機序。ＳＤＧは、多段階の発癌プロセスを抑制することにより、タバコおよびその他の環境発癌物質に起因する肺腫瘍形成を軽減する。我々は、リグナンＳＤＧが、Ｎｒｆ２調節第２相解毒経路の調節、およびおそらくその他の機序を介して、両方の動物モデルにおいて、化学防御活性を有することを示す証拠を提供する。我々は、ＳＤＧの保護作用が、直接的ＲＯＳ除去作用および／または間接的抗酸化／抗炎症特性、ならびに発癌性物質毒性およびＤＮＡ損傷の低減により媒介されることを裏付けるデータをさらに提供する。
【図２２】ＳＤＧは、細胞中のベンゾアルファピレンにより誘発されるＤＮＡ酸化損傷を減らす。ＳＤＧ（１０μＭ）を、２５μＭのタバコおよび環境由来の発癌物質ベンゾアルファピレン（ＢａＰ）に暴露したヒト上皮細胞（Ａ５４９）に加え、質量分析を使って、８−オキソ−７，８−ジヒドログアニン（８−オキソ−ｄＧｕｏ）の存在により示される、ＤＮＡに対する酸化損傷を検出した。ＳＤＧは、発癌性物質曝露後の３および６時間でＤＮＡ損傷を低減化した。
【図２３】細胞中の発癌性物質ベンゾアルファピレン誘発性ＲＯＳを示す。レドックス感受性蛍光染料により検出されるように、ＢａＰへのマウス上皮細胞の暴露により、有害な活性酸素種（ＲＯＳ）が誘導される。発癌性物質への暴露後、早くも２時間で、蛍光強度の明確な増加により細胞中でのＲＯＳの生成が示される。
【図２４】ＳＤＧは発癌性物質曝露によるＲＯＳ生成を防ぐ。マウス上皮細胞を１０または２０μＭのＢａＰおよび増加する濃度のＳＤＧ（０、０．１、０．５、１、５μＭ  ＳＤＧ）に暴露し、２時間後（図２３から妥当と判断された時間）にＲＯＳを検出した。ＳＤＧは有害なＲＯＳを無視できるレベルまで除去した。
【図２５】ＳＤＧはＢａＰに暴露されたヒト上皮細胞中で遺伝毒性ストレスを防ぐ。ＢａＰなどの強力な発癌性物質への細胞の暴露は、ｐ５３タンパク質のレベルの増加により示される遺伝毒性ストレスを誘発する。これは、５、１０、２５および５０μＭの濃度でのＳＤＧの存在により、用量依存的に軽減される。
【図２６】ＳＤＧは、ＢａＰに暴露されたヒト上皮細胞中で酸化的ＤＮＡ損傷を防ぐ。ＢａＰなどの強力な発癌性物質への細胞の暴露は、二重鎖ＤＮＡ切断のマーカーであるγ−Ｈ２ＡＸのレベルの増加で示される、酸化的ＤＮＡ損傷を誘発する。これは、５、１０、２５、５０および１００μＭの濃度でのＳＤＧの存在により、用量依存的に軽減される。
【図２７】ＳＤＧは、ＢａＰに暴露されたヒト上皮細胞中でＤＮＡ付加物形成を防ぐ。ＢａＰなどの強力な発癌性物質への細胞の暴露は、ＤＮＡ付加物の形成を誘発する。ＤＮＡ付加物は発癌性物質に共有結合されたＤＮＡの断片であり、悪性病変の発生に直接関連する。ＤＮＡ付加物レベルは、単独または組み合わせて加えられるＳＤＧまたはその代謝物ＥＤおよびＥＬの存在により低減される。
【図２８】化学的発癌性物質誘発性の肺腫瘍のマウスモデル。マウス（Ａ／Ｊ系統）に、タバコおよび環境由来の発癌物質ＢａＰの４回の腹腔内注射（週１回）を１ｍｇ／Ｋｇ用量で行う。マウスの亜麻仁またはリグナン食餌を曝露時に開始する。曝露後の種々の時間にマウスを評価し、腫瘍量、マウスの体重、全体の健康プロファイルを決定する。
【図２９】亜麻仁はマウス中の腫瘍量を低減させる：発癌性物質に暴露されたマウス肺の全体の病理学的プロファイル。ＢａＰ曝露および食用亜麻仁投与の数ヶ月後のマウス肺の代表的臨床的画像。
【図３０】亜麻仁はマウス中の腫瘍量を低減させる：発癌性物質に暴露されたマウス肺の病理組織学的プロファイル。ＢａＰ曝露および食用亜麻仁投与の数ヶ月後のマウス肺の代表的Ｈ＆Ｅ染色肺切片。対照食餌（上段パネル）または亜麻仁（下段パネル）を摂取したマウスの矢印で示される結節は、亜麻仁摂取マウス中でより小さいように見える。それぞれのパネルは、異なる動物を表す。
【図３１】Ａ−Ｂ。亜麻仁はマウス中の腫瘍量を低減させる：腫瘍量の定量的評価。全体の腫瘍面積（Ａ）および結節サイズ（Ｂ）について、画像解析ソフトウエアを使って組織学的マウス肺切片を形態学的に評価した。亜麻仁食餌を摂取したマウス中の腫瘍により占められる肺の面積において有意な減少があった（ｐ＜０．０３）。同様に、より小さい腫瘍結節サイズの傾向があった。
【図３２】Ａ−Ｂ。亜麻仁はマウス中の腫瘍量を低減させる：腫瘍量の定量的評価。肺当たりの腫瘍結節の全数（Ａ）および肺に浸潤している腫瘍％（Ｂ）について、画像解析ソフトウエアを使って組織学的マウス肺切片を形態学的に評価した。肺当たりのより少ない腫瘍結節（Ａ）および亜麻仁補充によるより少ない腫瘍浸潤（Ｂ）の傾向が認められた。
【図３３】亜麻仁補充は、ＢａＰにより誘発される肺癌による消耗作用を防止する。動物重量をＢａＰ曝露後２００日にわたり長期的に測定した。亜麻仁食餌を摂取し、ＢａＰに暴露されたマウスは、対照食餌を摂取してＢａＰに暴露されたマウスより高い重量を示した。
【図３４】実施例５用の実験スキーム。
【図３５】哺乳類リグナン代謝物は、亜麻仁（ＦＳ）および亜麻仁リグナン成分（ＦＬＣ）補充食餌の毎日摂取４日後の血液中で検出できる。特に、液体クロマトグラフィー、タンデム型質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を使って、エンテロジオール（ＥＤ）およびエンテロラクトン（ＥＬ）が検出できる。食餌は、２種の食餌中で検出可能なリグナン代謝物レベルを反映して、同等のリグナンレベルを送達するように設計された。
【図３６】アスベスト曝露の前に投与された亜麻仁（ＦＳ）および亜麻仁リグナン成分（ＦＬＣ）は、マクロファージ（ＭＦ）、好中球（ＰＭＮ）およびリンパ球（Ｌｙ）の数により明らかなように、腹腔内青石綿アスベスト注射により誘発された腹部炎症を低減した。特に、ＦＳおよびＦＬＣは、腹部中でマクロファージの流入を優位に低減した。＊はｐ＜０．０５。
【図３７】Ａ−Ｄ。マウスはＦＳおよびＦＬＣ食餌を開始し、２４時間後にアスベストに暴露した。図３４の実験スキームに従って、曝露の３日後に、血漿中（Ｂ、Ｄ）および腹部中（Ａ、Ｃ）のサイトカインレベル（ＴＮＦαおよびＩＬ−１β）をＥＬＩＳＡを使って決定した。両食餌は、アスベスト曝露により誘発された腹部および体循環中の炎症促進性サイトカインの分泌を妨げる傾向を示した。
【図３８Ａ−Ｂ】Ａ−Ｂ。炎症細胞はまた、食餌（Ａ）で低下する傾向を示したが、４００および８００ｍｇの青石綿アスベストにより誘発されたＴＮＦα（Ｂ）およびＩＬ−１β（Ｃ）サイトカインレベルは、アスベスト曝露後１日目の食餌中に添加されたＦＬＣにより有意に低減された（＊ｐ＜０．０５）。＊ｐは、アスベストに暴露された対照食餌摂取マウスに比べての有意性を示す。
【図３８Ｃ】炎症細胞はまた、食餌（Ａ）で低下する傾向を示したが、４００および８００ｍｇの青石綿アスベストにより誘発されたＴＮＦα（Ｂ）およびＩＬ−１β（Ｃ）サイトカインレベルは、アスベスト曝露後１日目の食餌中に添加されたＦＬＣにより有意に低減された（＊ｐ＜０．０５）。＊ｐは、アスベストに暴露された対照食餌摂取マウスに比べての有意性を示す。
【図３９】マウスにおける種々濃度のＳＤＧの経口胃管投与後のＳＤＧおよび代謝物の血漿中濃度。
【図４０】マウスにおける種々用量のＳＤＧの経口胃管投与後の肺中の抗酸化酵素遺伝子発現レベル。
【図４１】マウスにおける１００ｍｇ／ｋｇのＳＤＧの経口胃管投与後の血漿中（Ａ）および肺組織中（Ｂ）のＳＤＧレベルならびに対応するＡＯＥ遺伝子発現のレベル（Ｃ）の動力学を示す。
【図４２Ａ】実施例７用の実験スキーム。
【図４２Ｂ】実施例７用の実験スキーム。
【図４３】実施例７用の臨床試験設計。
【図４４】マウスの鼻上皮において、１０％ＦＳの給餌により、ＨＯ−１およびＮＱＯ−１が増加することを示すウェスタンブロット。
【図４５】４０ｇＦＳ食餌後のヒト頬側上皮細胞でのＨＯ−１遺伝子発現の動力学（＊０日目からｐ＜０．０５）。
【図４６】ＦＳ摂取の一人の患者中の尿中ＩｓｏＰレベルの動力学。
【図４７】ＦＳ摂取の健常人中および肺移植患者中の尿中８−オキソ−ｄＧｕｏレベルの動力学。
【図４８】ＳＤＧまたは亜麻仁食餌はアスベスト誘発性ＲＯＳ／炎症を減らすと仮定される。
【図４９】炎症性サイトカイン分泌およびニトロソ化／酸化ストレスを検出するための、細胞のアスベスト曝露の実験計画（模式図）。
【図５０】ＳＤＧは、インビトロでヒト中皮細胞によるアスベスト誘発性ＲＯＳ分泌を低減する。
【図５１】培養未処理マクロファージ中のアスベスト誘発性酸化ストレス（ＲＯＳ放出）の評価：アスベスト曝露後直ちにアスベスト誘発性ＲＯＳが生成され、観察期間中持続した。
【図５２】Ａ−Ｂ。アスベストへの暴露の数時間後にマクロファージに投与されたＳＤＧは、酸化ストレスを低減する。
【図５３】Ａ−Ｂ。アスベストへの暴露数時間後にマクロファージに投与されたＳＤＧは、ニトロソ化ストレスを低減する。
【図５４】Ａ−Ｂ。アスベストへの暴露数時間後にマクロファージに投与されたＳＤＧは、炎症性のサイトカイン（ＩＬ−１β）分泌を低減する。
【図５５】Ａ−Ｂ。アスベストへの暴露数時間後にマクロファージに投与されたＳＤＧは、炎症性のサイトカイン分泌（ＴＮＦ−α）を低減する。
【図５６】２つのマウスモデルを使うアスベスト誘発性中皮腫におけるＳＤＧの試験：アスベスト曝露後に中皮腫を遺伝的に発症しやすい少なくとも２つのマウスモデルを使って、我々は、マウスにおける単回投与のアスベストに対する亜麻仁およびＳＤＧの急性効果を評価する。また、亜麻仁およびＳＤＧがアスベスト誘発性急速進行型ＭＭの遺伝的モデルにおける腫瘍の発生を抑制するかどうかを試験する。
【図５７】アスベストに暴露されたＭＥＸＴＡＧマウスに与えられたＳＤＧに富む（３５％ＳＤＧ）ＦＬＣ食餌は、炎症を低減した。
【図５８】ＮＦ２マウスのアスベスト暴露および亜麻仁／ＳＤＧリグナン配合物評価の実験計画。
【図５９】Ａ−Ｂ。アスベスト曝露後のＮＦ２マウスにおける腹部炎症の動力学：炎症細胞の流入は、アスベスト曝露後３日までにピークに達し、９日までに次第に少なくなった。したがって、全てのその後の実験で、３日を炎症評価時点として選択した。
【図６０】Ａ−Ｂ。亜麻仁およびそのＳＤＧに富むリグナン成分は、アスベスト誘発性炎症を低減した（より若齢のマウス）：全白血球（Ａ）は、食餌中のＦＳまたはＦＬＣ添加と共に減少したが、有意ではなかった。しかし、細胞間の差異、特にマクロファージレベルを見ると、レベルは、亜麻仁およびＳＤＧリグナン食餌の両方により有意に低減された（Ｂ）。
【図６１】Ａ−Ｃ。亜麻仁およびそのＳＤＧに富むリグナン成分は、アスベスト誘発性炎症を低減した（より老齢のマウス）：腹部アスベストに暴露された老齢マウス（Ａ）は、ただの３００，０００細胞／ｍＬに比べて、３，０００，０００ＷＢＣ／ｍＬの腹部洗浄液を示す（１０倍多い）ように、アスベストに対し、より感受性が高い。結果は、炎症細胞の好中球（Ｂ）およびマクロファージ（Ｃ）が、若齢マウス中よりも老齢マウス中で両方とも有意に多かったことを示した。
【図６２】Ａ−Ｂ。ＳＤＧに富む亜麻仁リグナン抽出物（食餌配合物で投与された）は、老齢マウス中でアスベスト炎症を低減する：雄ＮＦ２（１２９ＳＶ）（＋／−）マウスに４００μｇのアスベストを０日目に注射した（腹腔内）。マウスは試験食餌（０％ＦＳまたは１０％ＦＬＣ）をアスベスト曝露の前の週（−７日目）に開始し、アスベスト曝露後３日目に屠殺した。５ｍＬ  １ｘＰＢＳで腹部洗浄（ＡＬ）を行った（１ｍＬの腹部洗浄液を遠心分離し、上清を凍結した）。血漿を集めて、−８０℃で凍結した。洗浄液中の細胞を評価し、ＳＤＧに富む食餌により、全ＷＢＣおよび好中球、マクロファージおよび好酸球が全て有意に減少したことを示した。
【図６３】Ａ−Ｃ。ＳＤＧに富む亜麻仁リグナン抽出物（食餌配合物で投与された）は、老齢マウス中でアスベスト炎症サイトカイン分泌およびニトロソ化ストレスを低減する：雄ＮＦ２（１２９ＳＶ）（＋／−）マウスに４００μｇのアスベストを０日目に注射した（腹腔内）。マウスは試験食餌（０％ＦＳまたは１０％ＦＬＣ）をアスベスト曝露の前の週（７日目）に開始し、アスベスト曝露後３日目に屠殺した。５ｍＬ  １ｘＰＢＳで腹部洗浄（ＡＬ）を行った（１ｍＬの腹部洗浄液を遠心分離し、上清を凍結した）。血漿を集めて、−８０℃で凍結した。サイトカインのＩＬ１βおよびＴＮＦα、ならびに亜硝酸塩のレベルは、ＳＤＧに富む食餌により有意に低減した。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
次の詳細な説明では、本発明の完全な理解を可能とするために、多くの具体的詳細が記述される。しかしながら、本発明はこれらの具体的詳細がなくても実施が可能であることは、当業者には理解されよう。その他の場合で、周知の方法、操作、および要素については、本発明を不明瞭にすることを避けるために、詳細には記述していない。
【００３４】
本明細書で提供されるのは、亜麻仁、その生理活性成分、またはその代謝物を用いる、放射線防護および化学防御のための治療的および予防的な方法である。代表的実施形態では、生理活性成分には、セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの異性体（立体異性体を含む）、またはこれらの組み合わせが含まれる。
【００３５】
本出願の発明者らは、亜麻仁、その生理活性成分、および／またはその分解物または代謝物が、生体分子、細胞、および組織を放射線損傷、次亜塩素酸イオン誘発性損傷、発癌性物質誘発性損傷および悪性病変から保護するのに効果的であることを発見した。したがって、発明者らは、亜麻仁、その生理活性成分、またはその代謝物が、生体分子、細胞、および組織を、放射線損傷、次亜塩素酸イオン誘発性損傷、発癌性物質による損傷および癌発生から保護するために使用され得ることを発見した。
【００３６】
本明細書で提供される方法による放射線防護または放射線緩和を必要としている対象は、潜在的に有害な量の放射線に暴露されるであろう、暴露されている、または暴露されたことのある対象である。このような曝露は、放射線への単回の曝露、周期的曝露、散発性曝露または継続した曝露であってよいことは理解されよう。また、このような放射線曝露には、偶発的曝露、付随的または意図的曝露が含まれることも理解されよう。
【００３７】
本発明の方法による放射線防護または放射線緩和を必要とする可能性のある対象の例としては、治療法の一部として放射線に暴露される患者（例えば、放射線療法を必要とする癌患者）、疾患または状態を診断するために放射線に暴露される対象（例えば、歯のまたは骨のＸ線を受ける対象、ＰＥＴスキャン、ＣＴスキャンなどを受ける患者）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法による放射線防護または放射線緩和を必要とする可能性のある対象の例にはまた、彼らの職業またはライフスタイルの選択の結果として放射線に暴露される可能性のある人（例えば、平均放射線レベルよりも高いレベルに暴露される、飛行機のフライトクルーまたはその他の高頻度の航空機利用者、さらには宇宙旅行者；研究室の技術者およびその他の作業者；または電子機器の使用により暴露される人）またはラドンの蓄積に暴露される人（例えば住居または鉱山での蓄積）または太陽光からの天然放射線に暴露される屋外作業者または陽光に曝される人が含まれる。本発明の方法による放射線防護を必要とする可能性があるその他の対象には、漏れまたは放出（例えば、原子炉漏れまたは事故または研究室での放出）、などの放射線に偶発的に暴露される人が含まれる。戦争またはテロリズムの結果として、核弾頭の爆発の結果としての放射線に暴露される人も意図されている。追加の対象には、放射性の物質をまき散らす従来の爆発物の、テロリストによる爆破に曝される人が含まれる。
【００３８】
本明細書で提供される方法による化学防御を必要としている対象は、潜在的に有害な量の発癌性物質またはその他の毒物に暴露されるであろう、現在暴露されている、または暴露されたことのある対象である。このような曝露は、一つのまたはいくつかの合成または天然の発癌性物質またはその他の毒物、例えば、化学兵器剤の組み合わせに対する単回の曝露、周期的曝露、散発性曝露または継続する曝露であってよいことは理解されよう。また、このような曝露には、偶発的曝露、付随的または意図的曝露が含まれることも理解されよう。また、このような曝露は、直接的曝露または間接的暴露であり得ることは理解されよう。例えば、次亜塩素酸イオンへの間接的暴露は、電離放射線への直接的暴露の結果であり得る。
【００３９】
本発明の方法による化学防御を必要とする可能性のある対象の例としては、彼らの職業またはライフスタイル選択の結果として発癌性物質またはその他の毒物に暴露される人（例えば、石油産業の作業者、自動車排出粒子に暴露される料金所係員、研究室技術者およびその他の作業者）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法による化学防御を必要とする可能性があるその他の対象には、飲料水または空気中の発癌性物質（例えば、アスベスト、多環芳香族炭化水素）の漏れまたは放出など、発癌性物質に偶発的に暴露される人が含まれる。嗜癖の結果として発癌性物質に暴露される人（喫煙者）も意図されている。追加の対象には、化学兵器剤などの発癌性物質およびその他の癌促進物質をまき散らすテロリストの行為に曝される人が含まれる。
【００４０】
一態様では、本発明は、それを必要としている対象中で生体分子（核酸のような遺伝物質、タンパク質または脂質など）、細胞、または組織を放射線損傷から保護する方法に関し、この方法は、上記対象に有効量の亜麻仁、その生理活性成分、その分解物または代謝物を投与することを含む。上記対象に対する投与は、有害な放射線曝露への暴露の前の、その間の、およびその後の投与を包含する。暴露前、その間およびその後の時間は、数秒、数分、数時間、数日、数週間、数ヶ月さらには数年であってよい。生理活性成分には、セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせが包含される。
【００４１】
別の態様では、本発明は、放射線に暴露されたことのあるまたは暴露されるであろう対象中で放射線損傷を処置または予防する方法に関し、この方法は、上記対象に有効量の少なくとも１つの生理活性成分を投与することを含み、上記生理活性成分は、セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせを含む。
【００４２】
別の態様では、本発明は、それを必要としている対象中で生体分子（核酸のような遺伝物質、タンパク質または脂質など）、細胞、または組織を、偶発的放射線曝露から生じる放射線損傷から保護する方法に関し、この方法は、上記対象に有効量の亜麻仁、その生理活性成分、その分解物または代謝物を投与することを含む。
【００４３】
別の態様では、本発明は、生体分子（核酸のような遺伝物質、タンパク質または脂質など）、細胞、または組織を、老化の原因となる放射線損傷から保護する方法に関する。
【００４４】
別の態様では、本発明は、生体分子（核酸のような遺伝物質、タンパク質または脂質など）、細胞、または組織を、天然および合成両方の、化学兵器剤を含む化学発癌性物質および毒物への暴露から生じる放射線損傷から保護する方法に関する。
【００４５】
別の態様では、本発明は、それを必要としている対象中で生体分子（核酸のような遺伝物質、タンパク質または脂質など）、細胞、または組織を、癌処置のための放射線療法から生じる放射線損傷から保護する方法に関し、この方法は、上記対象に有効量の亜麻仁、その生理活性成分、その分解物または代謝物を投与することを含む。
【００４６】
別の態様では、本発明は、それを必要としている対象中で生体分子（核酸のような遺伝物質、タンパク質または脂質など）、細胞、または組織を、放射線損傷から保護する方法に関し、この方法は、有効量の少なくとも１つの生理活性成分を上記対象に投与することを含み、上記生理活性成分は、セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、放射線損傷は偶発的放射線曝露から生じる。いくつかの実施形態では、放射線損傷は、癌（例えば、肺癌）処置のための放射線療法から生じる。
【００４７】
別の態様では、本発明は、それを必要としている対象中で生体分子（核酸のような遺伝物質、タンパク質または脂質など）、細胞、または組織に対する放射線誘発性損傷を予防する方法に関し、この方法は、上記対象に有効量の亜麻仁、その生理活性成分、またはその代謝物を投与することを含む。
【００４８】
別の態様では、本発明は、それを必要としている対象中で生体分子（核酸のような遺伝物質、タンパク質または脂質など）、細胞、または組織に対する放射線誘発性損傷を予防する方法に関し、この方法は、上記対象に有効量の少なくとも１つの生理活性成分を投与することを含み、上記生理活性成分は、セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせを含む。
【００４９】
別の態様では、本発明は、生体分子（核酸のような遺伝物質、タンパク質または脂質など）、細胞、または組織を、細胞中の放射線損傷から保護する方法に関し、この方法は、上記細胞を有効量の少なくとも１つの生理活性成分と接触させることを含み、上記生理活性成分は、セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせを含む。
【００５０】
別の態様では、本発明は、それを必要としている対象中で生体分子（核酸のような遺伝物質、タンパク質または脂質など）、細胞、または組織を、発癌性物質による損傷から保護する方法に関し、この方法は、上記対象に有効量の亜麻仁、その生理活性成分、その分解物または代謝物を投与することを含む。上記対象に対する投与は、天然および合成両方の化学発癌性物質および毒物への、有害な暴露への暴露の前の、その間の、およびその後の投与を包含する。暴露前、その間およびその後の時間は、数秒、数分、数時間、数日、数週間、数ヶ月さらには数年であってよい。生理活性成分には、セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせが包含される。
【００５１】
別の態様では、本発明は、それを必要としている対象中で生体分子を、天然および合成両方の化学発癌性物質および毒物に対する偶発的曝露から生じる発癌性物質による損傷から保護する方法に関し、この方法は、上記対象に有効量の亜麻仁、その生理活性成分、その分解物または代謝物を投与することを含む。
【００５２】
別の態様では、本発明は、生体分子（核酸のような遺伝物質、タンパク質または脂質など）、細胞、または組織を、肺癌または中皮腫の原因となる天然および合成両方の化学発癌性物質および毒物による損傷から保護する方法に関する。
【００５３】
別の態様では、本発明は、生体分子（核酸のような遺伝物質、タンパク質または脂質など）、細胞、または組織を、発癌性物質による損傷から保護する方法に関し、この方法は、上記生体分子、細胞、または組織を有効量の生理活性成分と接触させることを含む。上記生体分子、細胞、または組織との接触は、天然および合成両方の化学発癌性物質および毒物への、損害を与える暴露の前の、その間の、およびその後の接触を包含する。暴露前、その間およびその後の時間は、数秒、数分、数時間、数日、数週間、数ヶ月さらには数年であってよい。生理活性成分には、セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせが包含される。
【００５４】
別の態様では、本発明は、１種または複数種の発癌性物質に暴露されたことのあるまたは暴露されるであろう対象中で発癌性物質誘発性癌に起因する発癌性物質誘発性損傷、悪性転換または癌発生を処置または予防する方法に関し、この方法は、上記対象に有効量の少なくとも１つの生理活性成分を投与することを含み、上記生理活性成分は、セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせを含む。
【００５５】
別の態様では、本発明は、１種または複数種の発癌性物質に暴露された対象を発癌性物質誘発性癌から保護する方法に関し、この方法は、上記対象に有効量の亜麻仁、その生理活性成分、その代謝物を投与することを含む。
【００５６】
別の態様では、本発明は、それを必要としている対象中で生体分子（核酸のような遺伝物質、タンパク質または脂質など）、細胞、または組織を、次亜塩素酸イオンによる損傷から保護する方法に関し、この方法は、上記対象に有効量の亜麻仁、その生理活性成分、その分解物または代謝物を投与することを含む。上記対象に対する投与は、天然および合成両方の化学発癌性物質および毒物への、有害な暴露への暴露の前の、その間の、およびその後の投与を包含する。暴露前、その間およびその後の時間は、数秒、数分、数時間、数日、数週間、数ヶ月さらには数年であってよい。生理活性成分には、セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせが包含される。
【００５７】
別の態様では、本発明は、次亜塩素酸イオンに暴露されたことのあるまたは暴露されるであろう対象中で次亜塩素酸イオン誘発性損傷を処置または予防する方法に関し、この方法は、上記対象に有効量の少なくとも１つの生理活性成分を投与することを含み、上記生理活性成分は、セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせを含む。
【００５８】
別の態様では、本発明は、生体分子（核酸のような遺伝物質、タンパク質または脂質など）、細胞、または組織を、次亜塩素酸イオンによる損傷から保護する方法に関し、この方法は、次亜塩素酸イオンに暴露されたまたは暴露が想定される上記生体分子、細胞、または組織を有効量の生理活性成分と接触させることを含む。上記生体分子、細胞、または組織との接触は、天然および合成両方の化学発癌性物質および毒物への、有害な暴露への暴露の前の、その間の、およびその後の接触を包含する。暴露前、その間およびその後の時間は、数秒、数分、数時間、数日、数週間、数ヶ月さらには数年であってよい。生理活性成分には、セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）、エンテロラクトン（ＥＬ）、これらの類似体、これらの立体異性体、またはこれらの組み合わせが包含される。
【００５９】
別の態様では、本発明は、前述の方法の１つで使用するための組成物に関する。
【００６０】
亜麻仁、その生理活性成分、およびその代謝物は、当技術分野において既知であり、米国特許出願公開第２０１０／０２３９６９６号、同第２０１１／０３００２４７号、および同第２０１４／０３０８３７９号、ならびに国際公開第２０１４／２００９６４号に記載されている。これらの公開特許のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６１】
亜麻仁中で見出される主要リグナンは、２，３−ビス（３−メトキシ−４−ヒドロキシベンジル）ブタン−１，４−ジオール（セコイソラリシレジノールまたはＳＥＣＯ）であり、これは植物中でその天然の状態でコンジュゲートのセコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）として貯蔵される。ＳＤＧは、ヒトの腸中でエンテロジオール（ＥＤ）、およびエンテロラクトン（ＥＬ）へと代謝される。エンテロジオールおよびエンテロラクトンの合成類似体が知られている（例えば、Ｅｋｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，２００３，５：４９１を参照されたい）。
【００６２】
「分解物」は、ＳＤＧなどの分子の、より小さい分子への分解の生成物である。
【００６３】
「代謝物」は、代謝または代謝プロセスにより生成される物質である。例えば、ＳＤＧの代謝物は、ＥＬまたはＥＤである。
【００６４】
当業者なら、代謝物が、天然代謝物の化学的に合成された等価物であってもよいことを理解するであろう。
【００６５】
「類似体」は、その構造が別の化合物の構造に関連する化合物である。類似体は合成類似体であってもよい。
【００６６】
「成分」または「構成成分」は、混合物または化合物中の要素または構成要素である。
【００６７】
「生成物」は、化学反応から生じる物質である。
【００６８】
「抽出物」は、例えば、亜麻仁由来の、物質の有効成分または濃縮エッセンスを含む調製物である。
【００６９】
「医薬組成物」は、薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤を伴う、有効量の有効成分、例えば、（Ｓ，Ｓ）−ＳＤＧ、（Ｒ、Ｒ）−ＳＤＧ、メソＳＤＧ、ＳＤＧ、ＳＥＣＯ、ＥＬ、ＥＤおよびこれらの類似体を指す。「治療有効量」は、所定の状態および投与療法に対し治療効果をもたらす量を指す。
【００７０】
本明細書で記載の組成物は、「治療有効量」を含んでよい。「治療有効量」は、必要な服用量で必要な期間にわたり、所望の治療結果を達成するのに効果的な量を指す。治療有効量は、病態、年齢、性別、および個人の体重、ならびに個人において所望の反応を誘発する組成物の能力などの因子に応じて変わり得る。また、治療有効量は、治療上有益な効果が、分子の有毒または有害な作用を上回る量である。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な」という語句は、化合物、物質、組成物、キャリア、および／または剤形を指し、これらは、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題や合併症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触して用いるのに適しており、妥当なベネフィットリスク比に見合っている。
【００７２】
「薬学的に許容可能な賦形剤」は、一般的に安全で、毒性がなく、かつ生物学的にもその他の観点でも不適切ではない、医薬組成物の調製において有用である賦形剤を意味し、獣医学的使用およびヒトへの薬学的使用に許容可能な賦形剤を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な賦形剤」は、１種または２種以上のこのような賦形剤を含む。
【００７３】
医薬組成物は、経口、非経口、経粘膜、経皮、筋肉内、静脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、頭蓋内、腟内、腫瘍内、または口腔内などの当業者に既知のいずれかの適切な方法によって対象に投与できる。有効成分を適切なポリマー中に埋め込み、それをその後皮下、腫瘍内、口腔内に挿入する、皮膚に貼付剤として使用する、または膣内に挿入することにより、制御放出も使用できる。医療装置を有効成分でコーティングすることも含まれる。
【００７４】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は経口投与され、したがって、経口投与に適する形態、すなわち、固形または液状製剤として処方される。適切な固形経口製剤には、錠剤、カプセル剤、丸剤、粒剤、ペレット剤などが含まれる。適切な液体経口製剤には、溶液、懸濁液、分散液、乳剤、油剤などが含まれる。いくつかの実施形態では、有効成分は、カプセル中に処方される。この実施形態では、本発明の組成物は、活性化合物および不活性キャリアまたは希釈剤に加えて、その他の賦形剤およびゼラチンカプセルのほかに乾燥剤を含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、液状製剤の静脈内、動脈内、または筋肉内注射により投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は経口投与用に処方された液状製剤である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は膣内投与用に処方された液状製剤である。適切な液体製剤には、溶液、懸濁液、分散液、乳剤、油剤などが含まれる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は静脈内に投与され、従って、静脈内投与に適する形態に処方される。別の実施形態では、医薬組成物は動脈内に投与され、従って、動脈内投与に適する形態に処方される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は筋肉内に投与され、従って、筋肉内投与に適する形態に処方される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は口腔内に投与され、従って、口腔内投与に適する形態に処方される。
【００７６】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は局所的に体表面に投与され、従って、局所投与に適する形態に処方される。適切な局所製剤には、ゲル、軟膏、クリーム剤、ローション、点滴薬、制御放出ポリマーなどが含まれる。局所投与のために、亜麻仁、その生理活性成分、その代謝物が調製され、医薬キャリアを含有してまたは非含有で、生理学的に受容可能な希釈剤中の溶液、懸濁液、またはエマルジョンとして適用される。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、制御放出組成物であり、すなわち、亜麻仁、その生理活性成分、その代謝物が投与後に一定期間にわたり放出される組成物である。制御または持続放出組成物には、親油性貯蔵物（例えば、脂肪酸、ろう、油）中の配合物が含まれる。他の実施形態では、組成物は即効型組成物であり、すなわち、全ての亜麻仁、その生理活性成分、その代謝物が投与後直ちに放出される組成物である。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法で使用するための組成物は、１日１回治療量で投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、２日毎に１回、１週間に２回、１週間に１回、または２週毎に１回投与される。
【００７９】
ＳＤＧを抽出し、精製する技術は、当技術分野において既知であり、米国特許第５，７０５，６１８号に記載されている。この特許は参照により本明細書に組み込まれる。ＳＤＧ、その立体異性体および類似体を合成する技術は、Ｍｉｓｈｒａ  ＯＰ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０１３，（１９）：５３２５−５３２８および国際公開第２０１４／２００９６４号に記載されている。これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で提供される方法で使用するための生理活性成分はまた、当該技術分野において知られているように、哺乳動物の、容易に代謝可能な形態の、エンテロジオール（ＥＤ）またはエンテロラクトン（ＥＬ）へと直接的に化学合成することもできる。
【００８０】
（Ｓ，Ｓ）−ＳＤＧ、（Ｒ、Ｒ）−ＳＤＧ、（Ｓ，Ｒ）−ＳＤＧ、（Ｒ、Ｓ）−ＳＤＧ、メソＳＤＧ、ＳＥＣＯ、ＥＬ、ＥＤまたはこれらの類似体は、０．１ｎｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇの用量で投与できる。
【００８１】
（Ｓ，Ｓ）−ＳＤＧ、（Ｒ、Ｒ）−ＳＤＧ、（Ｓ，Ｒ）−ＳＤＧ、（Ｒ、Ｓ）−ＳＤＧ、メソＳＤＧ、ＳＤＧ、ＳＥＣＯ、ＥＬ、ＥＤまたはこれらの類似体による処置は、単回投与から数日、数ヶ月、数年、または不定期間にわたる。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「処置」は、治療処置または予防または防止処置を指し、その目的は、本明細書に記載のような標的とされる病態または障害を防止するかもしくは和らげること、またはその両方である。したがって、本明細書で提供される方法で使用するための組成物は、例えば、放射線、発癌性物質、毒物または次亜塩素酸イオンへの暴露の前に、対象に投与できる。いくつかの事例では、本明細書で提供される方法で使用するための組成物は、暴露の後に、対象に投与できる。したがって、本明細書に記載の状態を処置することは、対象における状態を予防、阻害、または抑制することを指し得る。
【００８３】
さらに、本明細書で使用される場合、「処置する」および「処置」という用語は、治療的処置、および予防または防止的処置を指し、その目的は、疾患または状態に関連する好ましくない生理的な変化を防止するまたは遅くする（小さくする）ことである。有益な、または望ましい臨床結果としては、検出可能な場合もそうでない場合も含めて、症状の軽減、疾患または状態の程度の減少、疾患または状態の安定化（すなわち、疾患または状態が悪化しない状態）、疾患または状態の進行の遅れまたは緩徐化、疾患または状態の改善または緩和、および疾患または状態の寛解（部分的なまたは全体の）が挙げられるが、これらに限定されない。「処置」はまた、処置を受けていない場合の予測生存期間に比べて生存期間を延長することを意味してもよい。処置を必要とする人には、例えば、放射線、発癌性物質、毒物、または次亜塩素酸イオンに既に暴露されたことのある人、ならびに暴露されやすい人または暴露されることが予測される人が含まれる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本明細書で記載の処置および方法および組成物を必要とする対象としては、肺の疾患および障害、例えば喘息、癌、ＣＯＰＤ、および中皮腫の患者が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、適する対象には、心血管の障害および状態、皮膚のたるみおよび中枢神経系（ＣＮＳ）疾患（例えば、アルツハイマー痴呆）などの老化に関連する障害および状態の患者を含めることができる。いくつかの実施形態では、適する対象は、皮膚の障害および状態（例えば、乾癬）の患者、ならびに美容的な皮膚状態（例えば、しわ、および染み）の患者を含んでよい。いくつかの実施形態では、適する対象は、胃腸の障害および状態、例えば、ＩＢＤおよびクローン病の患者を含んでよい。いくつかの実施形態では、適する対象は、心血管の障害および状態の患者を含んでよい。いくつかの実施形態では、適する対象は、黒色腫の患者を含んでよい。いくつかの実施形態では、適する対象は、黄斑変性症などの眼疾患の患者を含んでよい。いくつかの実施形態は、適する対象は、癌、例えば、乳癌、前立腺癌および子宮癌の患者を含んでよい。いくつかの実施形態では、適する対象は、認知機能障害およびその他の認知障害の患者を含んでよい。
【００８５】
「対象」という用語は、哺乳動物、例えば、ヒト、伴侶動物（例えば、犬、猫、鳥など）、家畜（例えば、牛、羊、豚、馬、家禽など）および実験動物（例えば、ラット、ネズミ、モルモット、鳥など）を含む。ヒトに加えて、対象は、イヌ、ネコ、ブタ、雌ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、水牛、ダチョウ、モルモット、ラット、マウス、トリ（例えば、インコ）およびその他の野生の、家畜化されたまたは商業的に有用な動物（例えば、ニワトリ、ガチョウ、七面鳥、魚）を含んでよい。「対象」という用語は、すべての点で正常である個体を排除しない。「対象」という用語は、ある状態またはその後遺症に対する治療を必要とするヒトまたはそれらに罹患し易いヒトを含むがこれらに限定されない。
【００８６】
「約（ａｂｏｕｔ）」「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、当業者により定められた特定の値に対する許容可能な誤差範囲内にあることを意味する。この許容可能な誤差範囲は、その値が測定または決定される方法、すなわち、測定システムの制約に依存する部分もあろう。
【００８７】
本発明の好ましい実施形態をより完全に説明するために、以下の実施例を示す。しかし、これらの実施例は、いかなる観点からも、本発明の広い範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００８８】
実施例
実施例１
合成（Ｓ，Ｓ）および（Ｒ，Ｒ）−セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）は裸のプラスミドＤＮＡおよびゲノムＤＮＡをγ線損傷から保護する。
原子核壊変の結果として、３種類の放射線、すなわち、正電荷を有するアルファ（α）線、負電荷を有するベータ（β）線および電荷を保持しないガンマ（γ）線が生成される。
γ線の場合、電磁波は非常に小さい波長（＜０．００５ｎｍ）を有し、したがって、分子および原子を電離することができる高エネルギーを有する。生物学的系中または溶液中では、電離放射線は水の放射線分解によりヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）を生成する。これらのヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）は、脂質、タンパク質およびゲノムＤＮＡなどの細胞成分に対する電離放射線誘発性損傷の主要な発生源である。γ線により生成されるヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）は、ＤＮＡ中で単鎖および二重鎖切断を生ずる。（・ＯＨ）ラジカルは、デオキシリボースおよびプリンならびにピリミジン基剤からＨ原子を除去することにより、または塩基の二重結合に付加することにより、ＤＮＡを損傷する。これらの反応はＤＮＡ鎖の切断を生ずる。
【００８９】
抗酸化特性およびフリーラジカル除去特性を有する化合物は、放射線防護剤として機能でき、放射線誘発性ＤＮＡ損傷を防ぐことができる。前臨床のおよび臨床試験を実施可能にする大量のセコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）を製造するための高コスト、ばらつきおよび難しさに関連して、天然資源からＳＤＧを単離するための抽出、精製および濃縮方法が複雑であるという理由から、ＳＤＧを化学的に合成した。天然化合物であるバニリンおよびグルコースを使用して、ＳＤＧの２種の鏡像異性体（これらの構造は以下に示す）：ＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）およびＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）の合成に成功した（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０１３，（１９）：５３２５）。
【化１】
2020121987.tif 000003
【００９０】
Ｃｈｒｉｓｔｏｆｉｄｏｕ−Ｓｏｌｏｍｉｄｏｕら、およびその他の研究者による多くの研究で、ＳＤＧは強力な抗酸化剤であり、かつ強力なフリーラジカル除去剤であることが示されている。重要なのは、最近の研究で、合成ＳＤＧ鏡像異性体が強力な抗酸化およびフリーラジカル除去特性を有することが示されたことである（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０１３，（１９）：５３２５−５３２８）。本実施例では、市販ＳＤＧと比較して、合成したＳＤＧ鏡像異性体（Ｓ，Ｓ）−ＳＤＧおよび（Ｒ，Ｒ）−ＳＤＧの放射線防護特性を調査し、評価した。プラスミドＤＮＡ弛緩アッセイを使って、プラスミドのγ線照射への暴露後にスーパーコイルからオープンコイルへのプラスミドＤＮＡ（ｐＢＲ３２２）の変換を防止するＳＤＧの能力を測定することにより、ならびにＤＮＡのγ線照射への暴露後にゲノムＤＮＡ断片化の抑制を評価することにより、３種の化合物の放射線防護特性を評価した。ＳＤＧは、腸内細菌により代謝されて、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）およびエンテロラクトン（ＥＬ）を生成する。したがって、ゲノムＤＮＡのγ線照射誘発性断片化に対するこれらのＳＤＧ代謝物の効果も評価した。
【００９１】
材料と方法
化学薬品
プラスミドＤＮＡ（ｐＢＲ３２２）、臭化エチジウム、超高純度１０Ｘ  ＴＡＥ緩衝液および１ｋｂ  ＤＮＡラダーをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。アガロース（超高純度）および仔ウシ胸腺ＤＮＡをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）（市販）、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）、エンテロジオール（ＥＤ）およびエンテロラクトン（ＥＬ）をＣｈｒｏｍａｄｅｘ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）から購入した。
【００９２】
セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）の合成
合成ＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）およびＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）立体異性体を、Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０１３，（１９）：５３２５−５３２８に記載のように合成した。
【００９３】
プラスミドＤＮＡおよび仔ウシ胸腺ＤＮＡのγ線への暴露
様々な濃度のＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）、ＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）およびＳＤＧ（市販）を含有してまたは非含有でプラスミドＤＮＡ（ｐＢＲ３２２）または仔ウシ胸腺ＤＮＡ試料を、Ｍａｒｋ１セシウム（Ｃｓ−１３７）照射器（Ｊ．Ｌ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｓａｎ  Ｆｅｒｎａｎｄｏ，ＣＡ）を使って、ｐＨ７．４の燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で、１．７Ｇｙ／分の線量率のγ線に暴露した。
【００９４】
放射線誘発性プラスミドＤＮＡ弛緩の測定
放射線誘発性の鎖切断およびスーパーコイル（ＳＣ）からオープンコイル（ＯＣ）への変換に対する試験化合物の効果を、プラスミドＤＮＡ（ｐＢＲ３２２）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使って測定した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のプラスミドＤＮＡ（５００ｎｇ）を種々の濃度（２５〜２５０μＭ）のＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）、ＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）およびＳＤＧ（市販）と混合し、ＰＢＳ中で２５Ｇｙで照射した。放射線曝露後３０分に、試料をローディングダイと混合し、ＴＡＥ緩衝液（ｐＨ８．３）中の１００Ｖでのアガロース（１％）ゲル電気泳動に供した。ゲルを臭化エチジウム（０．５μｇ／ｍＬ）で４０分間染色し、２０分間洗浄後、ＵＶトランスイルミネーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で可視化した。取り込んだゲル画像をスキャンし、オープンコイル（ＯＣ）およびスーパーコイル（ＳＣ）プラスミドＤＮＡバンドの密度をＧｅｌ−ｄｏｃ画像解析器プログラムにより決定した。ＳＣおよびＯＣプラスミドＤＮＡの濃度を全体密度（ＯＣ＋ＳＣ）の％として表した。
【００９５】
放射線誘発性ＤＮＡ断片化の測定
ＤＮＡ中の放射線誘発性の鎖切断に対する試験化合物の効果を、仔ウシ胸腺ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使って測定した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のＤＮＡ（５００ｎｇ）を種々の濃度（２５〜２５０μＭ）のＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）、ＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）およびＳＤＧ（市販）と混合し、５０Ｇｙで３０分間照射した。第２シリーズの実験を、０．５〜１０μＭの範囲で濃度を変えて行った。試料をローディングダイと混合し、ＴＡＥ緩衝液（ｐＨ８．３）中の１００Ｖでのアガロース（１％）ゲル電気泳動に供した。ゲルを臭化エチジウム（０．５μｇ／ｍＬ）で４０分間染色し、２０分間洗浄後、ＵＶトランスイルミネーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で可視化した。取り込んだゲル画像をスキャンし、仔ウシ胸腺ＤＮＡ断片の密度を、Ｇｅｌ−Ｐｒｏ画像解析器プログラム（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）により決定した。仔ウシ胸腺ＤＮＡの低分子量の（＜６，０００ｂｐ）および高分子量の（＞６，０００ｂｐ）断片の密度を全体密度（低分子量＋高分子量）の％として表した。
【００９６】
データ解析
得られたデータは、平均値±標準偏差として表される。データを、Ｓｔａｔｖｉｅｗ  Ｐｒｏｇｒａｍを使って、ボンフェローニの補正を用いる事後比較による一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に供した。ｐ値≦０．０５を有意と見なした。
【００９７】
結果
プラスミドＤＮＡ（ｐＢＲ３２２）を使って、合成ＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）、ＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）、およびＳＤＧ（市販）の放射線防護潜在力を決定した。この調査に使用した放射線防護アッセイは、γ線に暴露後のプラスミドＤＮＡは、非暴露プラスミドＤＮＡより遅く移動するという原理に基づいている。これは単純に、スーパーコイルプラスミドＤＮＡが、アガロースゲル中で、コンパクトサイズであるためにより速く移動するという事実による。比較すると、プラスミドＤＮＡ中の放射線誘発による切れ目がスーパーコイルを解きほどき、相対的により大きいサイズのプラスミドを生じ、これはゲル中でより遅い速度で移動する。したがって、スーパーコイルプラスミドＤＮＡと比較して、オープンコイルプラスミドＤＮＡの密度を決定することにより、放射線誘発性損傷の程度が示される。
【００９８】
放射線は線量依存的なＳＣからＯＣへのＤＮＡプラスミド変換を生じさせる
有意なＤＮＡ損傷を生ずるが、それでも放射線緩和剤を試験するための治療濃度域を可能にする放射線量を選択するために、プラスミドＤＮＡを、１０、２５および５０Ｇｙガンマ線に暴露した。図１１Ａに示す結果は、ＯＣ型プラスミドＤＮＡの放射線量依存的な増加ならびにＳＣ型の放射線量依存的な低下があることを示す。ＳＣおよびＯＣの分布（図１Ｂ）は、ＳＣ％が、０、１０、２５および５０Ｇｙで、６８．７３±２．５４％からそれぞれ、５０．９１±２．３１、３８．３７±３．７３および３５．６６±４．２４％（ｐ＜０．０５）に低下したことを示す。同時に、ＯＣ％は、０、１０、２５および５０Ｇｙで、３１．２６±２．５０％からそれぞれ、４９．０８±２．３１％、６１．６２±３．７３％および６７．３３±４．２４％（ｐ＜０．０５）に増加したことを示す。これらの最初の実験に基づいて、２５Ｇｙの放射線量（この線量で、かなりの明確に確認できる損傷が達成された）をその後の実験のために選択して、異なるＳＤＧの放射線防護特性を測定した。
【００９９】
プラスミドＤＮＡ弛緩アッセイを用いる合成ＳＤＧの放射線防護活性
プラスミドＤＮＡを選択した線量の２５Ｇｙのγ線に暴露し（図１参照）、ＤＮＡ損傷（ＳＣからＯＣの形成）％抑制を種々の濃度（２５〜２５０μＭ）でのそれぞれのＳＤＧ剤（合成および市販）に対して決定した。
【０１００】
２５、５０、１００および２５０μＭのＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）の存在下で２５Ｇｙに暴露後のプラスミドＤＮＡの代表的ゲルブロットを図２Ａに示し、半定量的濃度分析を図２Ｂに示し、対照と比較した％抑制を図２Ｃに示す。興味深いことに、増加する濃度のＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）（２５、５０、１００および２５０μＭ）の存在下で有意（ｐ＜０．０５）にかつ用量依存的に、ＳＣ型の比率が増加しＯＣ型の濃度が減少した。％抑制プロット（図２Ｃ）を使って、ＥＣ５０値（すなわち、２５Ｇｙでのプラスミド弛緩の５０％を防止するために必要な有効濃度（ＥＣ））をそれぞれの薬剤に対し決定でき、この値はＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）の場合、１４１．７７μＭである。プラスミドＤＮＡ弛緩を防止するためのこの値は、ＤＰＰＨフリーラジカルを除去するためのＥＣ５０値と同等である。これらの結果は、合成ＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）鏡像異性体の放射線防護特性を実証する。類似の結果を、ＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）鏡像異性体（図２Ｄ〜Ｆ）およびＳＤＧ（市販）（図２Ｇ〜Ｉ）について示し、それぞれ、ＥＣ５０は、１２７．９６μＭおよび９８．３８μＭである。プラスミドＤＮＡ弛緩を防止するためのこれらの値は、ＤＰＰＨフリーラジカルを除去するためのそれぞれのＥＣ５０値と同等である。これらの結果は、合成ＳＤＧおよび市販の天然ＳＤＧ両方の放射線防護特性を実証する。
【０１０１】
放射線は、高分子量から低分子量断片にわたる線量依存的なＤＮＡ断片化を生じさせる
放射線は、図３Ａ中のＤＮＡゲルに示すように、ＤＮＡ断片化の増加を誘発する。サイズに基づいて、仔ウシ胸腺ＤＮＡ断片を２つの群：高分子量（＞６，０００ｂｐ）サイズおよび低分子量（＜６，０００ｂｐ）サイズに分割した。高分子量および低分子量断片の分布（図３Ｂ）は、高分子量ＤＮＡの％が８８．１６±０．５０％から、２５および５０Ｇｙで６７．８２±７．８９および３４．９４±４．４５％（ｐ＜０．０５）にそれぞれ減少したことを示す。同時に、低分子量断片の比率は１１．８３±０．５０から、２５および５０Ｇｙで３２．１７±７．８９％および６５．０５±４．４５％（ｐ＜０．０５）にそれぞれ増加した。結果（図３Ｂ）は、高分子量ＤＮＡ断片の有意な減少および低分子量ＤＮＡ断片の有意な増加を示し、５０ＧｙでのＤＮＡに対する損傷を示す。これらの最初の実験に基づいて、５０Ｇｙの放射線量（この線量で、明確な確認可能な仔ウシ胸腺ＤＮＡ断片化が観察された）を、異なるＳＤＧの放射線防護特性を決定する以降の実験のために選択した。
【０１０２】
仔ウシ胸腺ＤＮＡ断片化アッセイを用いる合成ＳＤＧの放射線防護活性
上述のように、仔ウシ胸腺ＤＮＡの放射線誘発性断片化を使って、合成ＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）、ＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）およびＳＤＧ（市販）の放射線防護潜在力を決定した。
高ＳＤＧ濃度（２５〜２５０μＭ）：図４Ａは、２５、５０、１００および２５０μＭのＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）の存在下で５０Ｇｙに暴露後の、仔ウシ胸腺ＤＮＡの代表的ＤＮＡゲルを示す。増加する濃度のＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）（２５、５０、１００および２５０μＭ）の存在下で、放射線曝露後に高分子量ＤＮＡ型の比率が有意に（ｐ＜０．０５）増加したが、低分子量断片は減少した。種々の濃度のＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）の存在下での高分子量および低分子量ＤＮＡ型の分布を図４Ｂに示す。これらの結果は、仔ウシ胸腺ゲノムＤＮＡを用いる我々の合成ＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）鏡像異性体の放射線防護特性を示す。同様に、図４Ｃ〜Ｄおよび４Ｅ〜Ｆに提示される結果は、合成ＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）およびＳＤＧ（市販）の放射線防護特性をそれぞれ示す。これらの結果は、仔ウシ胸腺ゲノムＤＮＡを用いる合成ＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）および（Ｓ，Ｓ）鏡像異性体の放射線防護特性を示す。
【０１０３】
ＤＮＡ保護におけるＳＤＧの下限値をさらに決定するために、０．５〜１０μＭの範囲で、より低い濃度の全３種のＳＤＧを試験する一連のＤＮＡ断片化実験を行った。
低ＳＤＧ濃度（０．５〜１０μＭ）：低濃度のＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）、ＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）およびＳＤＧ（市販）で行った実験の結果を、抗酸化およびフリーラジカル除去活性に関するそれらのＥＣ５０値と比較して図５に示す。より高いＳＤＧ濃度と同様に、仔ウシ胸腺ＤＮＡ断片化アッセイを使ってこのセクションで示されるこれらの結果は、低濃度であっても、合成ＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）、およびＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）鏡像異性体が強力な放射線防護特性を有することを実証する。
【０１０４】
仔ウシ胸腺ＤＮＡ断片化アッセイを用いるＳＤＧ代謝物の放射線防護活性
上述の仔ウシ胸腺ＤＮＡの放射線誘発性断片化を用いてＳＤＧ代謝物のＳＥＣＯ、ＥＤおよびＥＬの放射線防護潜在力を決定し、ＳＤＧと比較した。１０μＭの濃度のそれぞれの試験薬剤を、有効量の中央値として上で示された前の知見に基づいて、選択した。結果を図６に示す。データは、ＳＤＧおよびその代謝物のＳＥＣＯ、ＥＤ、ＥＬが、それらの放射線防護特性の点で同等効力であることを示す。
【０１０５】
考察
本実施例の結果は、合成ＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）およびＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）鏡像異性体が強力な放射線防護特性を有することを示す。プラスミドＤＮＡ（ｐＢＲ３２２）を使って決定したこれらの鏡像異性体の放射線防護潜在力は、それらの濃度の増加と共に増加した。これらの合成ＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）およびＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）鏡像異性体は、プラスミドＤＮＡに対する放射線誘発性損傷を、濃度依存的に防いだ。ＳＤＧの合成異性体の放射線防護潜在力は、市販ＳＤＧと同等であった。合成鏡像異性体ＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）およびＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）はまた、仔ウシ胸腺ゲノムＤＮＡの放射線誘発性ＤＮＡ断片化も防いだ。試験した最低濃度で、ＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）およびＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）は、仔ウシ胸腺ＤＮＡの低分子量断片の放射線誘発性生成を完全に防ぎ、合成ＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）およびＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）鏡像異性体の強力な放射線防護特性を示した。低濃度のＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）、ＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）およびＳＤＧ（市販）を使った結果は、仔ウシ胸腺ＤＮＡをγ線損傷から保護するために必要な濃度は、それらの抗酸化およびフリーラジカル除去活性に関するＥＣ５０値に比べてずっと低いことを示した。重要なことに、哺乳類リグナンＳＤＧ代謝物のＳＥＣＯ、ＥＤおよびＥＬは、等しく強力なＤＮＡ保護特性を示した。
【０１０６】
フラボノイドは強力な抗酸化活性を有する。特に、このようなポリフェノールはフリーラジカル除去活性を有し、ビタミンＥやＣよりインビトロで効果的な抗酸化剤であることが知られている。抗酸化特性を有する食用および薬用の植物も、酸化ストレスに関連する多くのヒト疾患を防ぐことが知られており、有用な放射線防護剤である。ビタミンおよびミネラルなどの抗酸化剤は、放射線曝露から何年も経過した後で、チェルノブイリ作業者における染色体異常誘発因子のレベルを抑えた。我々は、放射線誘発性損傷における、リグナンポリフェノールに富む穀物である全粒粉食用亜麻仁、ならびにＳＤＧに富む亜麻仁リグナン配合物の役割を、胸部放射線性損傷のマウスモデルを使って調査してきた。我々は、放射線曝露の前および後の両方で投与した場合に、亜麻仁がマウスの放射線誘発性炎症および酸化ストレスを緩和したことを示した。我々はまた、リグナンビフェノールＳＤＧに富む亜麻仁のリグナン成分のみを含む食餌を与えられた照射マウスも、血流力学的測定値および生存期間の有意な改善を示し、同時に、肺炎症および組織酸化損傷の改善も示したことを実証した。これらの調査は、インビボでの放射線誘発性組織損傷に対し、リグナンＳＤＧの作用を通して亜麻仁が保護的であることを示した。
【０１０７】
スーパーオキシドアニオン（Ｏ２−）、ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）、および過酸化水素などの活性酸素種（ＲＯＳ）の生成の増加は、種々の実験的および病理学的状態下で組織損傷に繋がる。活性酸素種は、細胞膜脂質、タンパク質およびゲノムＤＮＡの酸化修飾により細胞損傷をもたらす。多くの調査は、抽出された、精製された、または合成の亜麻仁が、インビトロならびにインビボで強力な抗酸化剤であることを示した。したがって、ＳＤＧは抗酸化剤として、放射線療法を受けている患者中の放射線誘発性組織損傷を含む種々の実験的および疾患状態下で治療的潜在力を有する。
【０１０８】
ポリフェノールは一般に植物中でグリコシドとして存在し、抗酸化特性を有する。フラボノイドは、抗酸化剤として、活性酸素種の生成に関与する酵素の活性を妨げ、フリーラジカルを消去し、遷移金属をキレート化しフェントン反応においてそれらをレドックス不活性にする。セコイソラリシレジノール（ＳＤＧ）は亜麻仁中の主要リグナンであり、インビトロならびにインビボで強力な抗酸化剤であることが示されている。亜麻仁リグナンセコイソラリシレジノール（ＳＤＧ）の治療潜在力を調査するために、バニリンを前駆物質分子として用いる化学反応によりＳＤＧを合成し、合成ＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）およびＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）の抗酸化特性を、それらの還元力、金属キレート化潜在力、ならびにヒドロキシル、パーオキシおよびＤＰＰＨラジカルに対するフリーラジカル除去活性を評価することにより明確にした。本実施例では、我々は、合成ＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）、ＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）鏡像異性体および市販のＳＤＧ（対照として）の放射線防護特性を、プラスミドＤＮＡ（ｐＢＲ３２２）および仔ウシ胸腺ＤＮＡに対するγ線照射誘発性損傷を防ぐそれらの潜在力を評価することにより調査した。プラスミドＤＮＡに対する放射線誘発性損傷は、オープンコイル型のプラスミドＤＮＡの増加およびスーパーコイル型のプラスミドＤＮＡの減少により評価した。ゲノムＤＮＡに対する放射線誘発性損傷は、ＤＮＡ断片化のレベルを決定することにより評価した。この実施例中で、我々は、無細胞系で放射線誘発性ＤＮＡ損傷に対する合成ＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）、ＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）および市販ＳＤＧの効力を調査した。
【０１０９】
ＳＤＧ分子の抗酸化特性は前に示した。我々は、天然の市販ＳＤＧが、γ線に暴露された細胞において強力なフリーラジカル除去特性を有することを示した。これらの合成ＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）およびＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）鏡像異性体の抗酸化特性およびフリーラジカル除去特性を調査し、強力な還元力、高い金属イオンキレート化する潜在力、ならびにヒドロキシル、パーオキシおよびＤＰＰＨラジカルに対し高いフリーラジカル除去活性を有することを示した。合成ＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）およびＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）のこれらの特性は、これらの分子が、細胞のレドックス状態を調節する、金属イオン濃度を下げる、および酸素フリーラジカルを除去するための強力な潜在力を示すことを明らかにする。合成ＳＤＧ鏡像異性体のこれらの特性は、フリーラジカル反応の開始、増殖ならびに終止の３つの全てのステップで作用し、かつこれらを妨げることにより機能するそれらの能力を示唆し、これらの根源的な機序がインビボでのＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）およびＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）鏡像異性体の放射線防護特性に関与する可能性を示唆している。
【０１１０】
ＳＤＧによるゲノムＤＮＡの最大放射線防護は、それらのフリーラジカル除去および抗酸化効果に対するＥＣ５０値よりかなり小さい約５．０μＭの濃度で既に達成されているという、１つの観察結果があった。したがって、抗酸化剤およびフリーラジカル除去剤としてのＳＤＧは、ＤＮＡ放射線防護剤および放射線緩和剤としても機能し得る。
【０１１１】
まとめると、本実施例で、合成ＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）およびＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）鏡像異性体が強力な放射線防護特性を有することが実証された。これらの鏡像異性体の放射線防護潜在力は、プラスミドＤＮＡ（ｐＢＲ３２２）および仔ウシ胸腺ＤＮＡを使って決定された。合成ＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）およびＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）鏡像異性体は、プラスミドＤＮＡに対する放射線誘発性損傷を、濃度依存的に防いだ。合成鏡像異性体ＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）およびＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）はまた、仔ウシ胸腺ゲノムＤＮＡの放射線誘発性断片化も防いだ。５μＭの濃度で、ＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）およびＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）は仔ウシ胸腺ＤＮＡの低分子量断片の放射線誘発性生成を完全に防ぎ、これらの鏡像異性体が有する強力な放射線防護特性を示している。
【０１１２】
実施例２
肺細胞中のリグナンセコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）の放射線防護特性
細胞に対する放射線傷害は、活性酸素種（ＲＯＳ）の生成により開始される。細胞機構に対しＲＯＳにより加えられる損傷の範囲には、脂質過酸化、ＤＮＡタンパク質架橋、塩基修飾、付加物形成ならびに単鎖および二重鎖切断（ＤＮＡ  ＳＳＢおよびＤＳＢ）が含まれる。これらの修飾は放射線誘発性アポトーシスおよび細胞死に結びつけられてきた。細胞ＤＮＡ損傷は放射線誘発性細胞死における既知の決定要因であるので、フリーラジカル反応を妨げることにより、または放射線誘発性アポトーシスを調節することにより放射線損傷に対しＤＮＡを保護できる薬剤を特定し活用するために、大きな努力が払われてきた。
【０１１３】
放射線誘発性遺伝子毒性の阻止は、暴露時に系中の抗酸化剤の存在により達成できる。抗酸化剤は、フリーラジカル連鎖反応を妨害するＲＯＳ除去剤であり得るので、抗酸化剤の補充により放射線誘発性酸化ストレスから細胞ＤＮＡを保護することが可能である。多くの合成および天然の抗酸化化合物が放射線防護効力に関し調査されてきた。しかし、それらの大部分は、それらの有効濃度で固有の毒性および副作用を示すか、または短い保存可能期間および低バイオアベイラビリティを有する。したがって、効果的で非毒性の放射線防護剤に関する研究は、食用抗酸化剤および栄養補助食品への調査に至った。
【０１１４】
我々は、過酸素症、胃酸吸入傷害、および虚血／再潅流傷害などの肺酸化損傷の前臨床マウスモデルでの食用亜麻仁（ＦＳ）補充の保護効果を評価した。我々は、ＦＳの保護効果は、肺組織中で抗酸化酵素発現を高めるその能力に一部は起因するであろうと結論付けた。重要なのは、曝露前ならびに暴露後の両方に投与した場合、食用ＦＳが胸部放射線の有害作用を緩和したことである。これらの調査では、亜麻仁は放射線誘発性肺組酸化織損傷を低減させ、肺炎症を低減させ、さらに肺線維症を防いだ。
【０１１５】
以前の報告は、多様な亜麻仁の作用は、抗酸化、抗炎症および抗発がん性効果を有することが示された亜麻仁のリグナンに起因する可能性があることを示唆した。セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）は主なＦＳリグナンであり（乾燥重量の約１％）、おそらくこれがＦＳ穀物の有益な健康効果に寄与しているのであろう。ＳＤＧは、腸中で腸内細菌により、哺乳類リグナン、すなわち、エンテロジオール（ＥＤ）およびエンテロラクトン（ＥＬ）へと代謝される。ＳＤＧは、アテローム性動脈硬化症および糖尿病などの多くの疾患の前臨床モデルの処置で有益であることが示された。また、ＳＤＧは動物モデルで心臓保護作用を発揮すると報告されている。ＦＳリグナンは、Ａｄｏｌｐｈｅら（Ｂｒ  Ｊ  Ｎｕｔｒ  ２０１０，１０３：９２９）のＳＤＧの健康効果に関する最近の概説でまとめられているように、多様な癌タイプに対し防御的であり、また、動物において黒色腫転移を減らすことが報告されている。
【０１１６】
さらに、ＳＤＧの抗酸化およびフリーラジカル除去特性は十分に実証されており、このことは、化合物のフリーラジカル除去能力がその放射線防護効力と直接関連し得るため、最も重要である。肺内皮細胞に関する我々の調査では、細胞がγ線照射に暴露された場合ＳＤＧはフリーラジカル除去特性を示し、一方で、ＳＤＧに富む全亜麻仁リグナン成分（ＦＬＣ）は、マウス中で放射線防護および放射線緩和を媒介した。しかし、ＳＤＧの放射線防護特性のキャラクタリゼーションは、確立されていない。
【０１１７】
この調査は、ＦＳリグナンＳＤＧの放射線防護能力を明確にし、その作用に関与する可能な機序を調べるために行った。この調査の第１の目的は、マウス一次肺細胞中、特に、上皮、内皮細胞および繊維芽細胞中で放射線誘発性クローン原性細胞死に対するＳＤＧの役割を評価することである。細胞の放射線誘発性増殖死は細胞ＤＮＡ損傷に直接関連しているので、我々は、ＳＤＧが放射線誘発性ＤＮＡ鎖切断から細胞を保護できるかどうかを、アルカリコメットアッセイ（ＳＳＢ）およびγ−Ｈ２ＡＸフォーカスの形成（ＤＳＢ）を使って評価した。さらに、我々は、ＩＲ誘発性細胞死からのマウス一次肺細胞の予防におけるＳＤＧ前処理の効果を調査した。多くの調査は、ＩＲ誘発性細胞死におけるアポトーシス促進性タンパク質Ｂａｘ（Ｂｃｌ−２結合Ｘタンパク質）の役割を実証している。我々はまた、ＢａｘおよびそのアンタゴニストＢｃｌ−２（Ｂ細胞白血病／リンパ腫２）のｍＲＮＡ発現に対するＳＤＧの直接的効果を分析し、ＳＤＧ保護の機序がこれらの重要なアポトーシス制御因子の比率のシフトに関連するかどうかを決定した。我々の調査結果は、ＦＳ中の強力な生理活性成分であるリグナンＳＤＧが、肺細胞における放射線防護を媒介することを明らかにし、したがって、ＦＳの放射線防護効果への新規洞察を提供する。
【０１１８】
材料と方法
試薬
セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）は市販品である（ＣｈｒｏｍａＤｅｘ，Ｉｎｃ．，ＣＡ）。コメットアッセイキットはＴｒｅｖｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．，（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から購入した。Ｐ−ヒストンＨ２ＡＸ（ウサギｍＡｂ）はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ））から購入した。燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｌ−グルタミン、グルコース１ｇ／ｌ含有、重炭酸ナトリウム不含）、ヘペス緩衝液、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、４’，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、コラゲナーゼ、トリトンＸ１００およびディスパーゼは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡから購入した。
【０１１９】
細胞株
繊維芽細胞および内皮細胞はＣ５７／ｂｌ６マウスから単離した。繊維芽細胞単離のために、マウスの肺を採取し、細かく切り刻み、ディスパーゼ（２ｍｇ／ｍｌ）と共に４５分間インキュベートした。数片をプレートに蒔き、前に記載の通りに、繊維芽細胞を培養し、継代３と１０との間で使用した。前に記載の通りに、肺微小血管内皮細胞（ＰＭＶＥＣ）をマウス肺から単離した。簡単に説明すると、新たに採取したマウス肺をコラゲナーゼで処理し、続けて、血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ）に対するｍＡｂでコートした磁気ビーズへの付着により、細胞の単離を行った。上皮細胞（Ｃ１０）は、正常なＢＡＬＢ／ｃマウス肺外植片から最初に誘導され、非腫瘍形成性であり、接触阻害され、初期継代で２型肺胞細胞の特徴を有する。
【０１２０】
クローン原性生存
指数関数的増殖細胞を単一細胞として播種し、一晩インキュベートした。細胞を種々の用量のリグナンＳＤＧ（１０〜５０μＭ）と６時間処理後、照射した（２、４、６および８Ｇｙ）。リグナン投与量は、１０％の亜麻仁が摂取される場合に、血液循環中の到達生理的レベル以内であるように動物調査に基づいて選択した。細胞を、Ｍａｒｋ１セシウム（Ｃｓ−１３７）照射器（Ｊ．Ｌ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｓａｎ  Ｆｅｒｎａｎｄｏ，ＣＡ）を用いて、１．７Ｇｙ／分の線量率で照射した。照射の１０〜１５日後にコロニーを染色して計数し、生存率を計算した。
【０１２１】
コメット分析
指数関数的増殖細胞を培養し、異なる時間間隔でＳＤＧ（５０μＭ）で処理後、照射した（２Ｇｙ）。製造業者（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）の説明書に従い、細胞をコメットアッセイ用に処理した。簡単に説明すると、細胞（ＰＢＳ中の１ｘ１０５細胞／ｍＬ）をＬＭＡｇａｒｏｓｅ（登録商標）と混合（１：１０、ｖ／ｖ）し、直ちにＣｏｍｅｔＳｌｉｄｅ（商標）上にピペッティングした。その後、細胞を溶解し（４℃、３０分）、巻き戻しのために暗所で保持した（室温）。水平型電気泳動ユニット中にて１８ボルト（２００アンペア）で２５分間、電気泳動を行った。スライドをＤＷで２回洗浄し、７０％エタノールで固定し、４５℃で乾燥した。ＤＮＡをＳＹＢＲグリーン（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）で染色した。少なくとも群当たり１５０細胞をスコア化した。細胞の目視分析およびコメットテイル長さを、コメット画像解析ソフトウエア（Ｃｏｍｅｔ  Ａｓｓｅｙ  ＩＶ、Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ，Ｈａｖｅｒｈｉｌｌ，ＵＫ）を使って測定した。モノクロームＣＣＤ  ＦｉｒｅＷｉｒｅカメラを使って、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ５１蛍光顕微鏡で画像を取り込んだ。
【０１２２】
γ−Ｈ２ＡＸの免疫染色およびフローサイトメトリー
γ−Ｈ２ＡＸの免疫染色のために、細胞をカバーガラス上に播種し（５，０００細胞／カバーガラス）、５０μＭのＳＤＧで前処理し（６時間）、照射した（２Ｇｙ）。所望の時間間隔で、細胞を固定し（４％パラホルムアルデヒド）、洗浄してＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％の５％ヤギ血清含有トリトンＸ−１００、１％ＢＳＡ）でブロッキングした。細胞をγ−Ｈ２ＡＸ一次抗体と共に（１：２００）４℃で一晩インキュベートし、続けて、ＰＢＳＴで洗浄し（３ｘ５分）、二次抗体（Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）と共に室温で１時間インキュベートした。細胞核をＤＡＰＩで対比染色して蛍光顕微鏡下で可視化した。
【０１２３】
ＦＡＣＳ分析のために、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄した。次に、細胞を４５分間固定し（Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ緩衝液、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、その後、透過洗浄バッファー（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ＵＳＡ）を使って洗浄した。細胞を、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（１：１００ｖ／ｖ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳ）にコンジュゲートされたウサギモノクローナルホスホヒストンγ−Ｈ２ＡＸ（Ｓｅｒ１３９）抗体２００μｌ中に再懸濁し、４℃で３０分インキュベートした。細胞を洗浄緩衝液で再度洗浄し、分析した。ＣｙＡｎ  ＡＤＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）フローサイトメーター（Ｄａｋｏ，Ｄｅｎｍａｒｋ）Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を使ってγ−Ｈ２ＡＸを測定し、陽性細胞をＳｕｍｍｉｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｄａｋｏ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使って定量した。
【０１２４】
アポトーシス細胞の形態学的検出
アポトーシス細胞は、核と細胞質の凝縮、膜の泡状突起物形成（ｂｌｅｂｂｉｎｇ）、細胞収縮、および核ＤＮＡの分解により形態学的に特徴付けられ、最初は大きな断片であり、その後はヌクレオソームの断片で、最終的には十分に包み込まれたアポトーシス小体が形成される。アポトーシスを受けている細胞のパーセンテージを、微小核の検出に使用したスライドから顕微鏡的に決定した（細胞遺伝学的損傷）。それぞれの実験毎（実験は２回行った）に、少なくとも５００細胞を計数し、アポトーシス細胞パーセントを以下のように求めた：
％細胞死＝Ｎａ／Ｎｔｘ１００
式中、Ｎａはアポトーシス小体を伴う細胞の数、Ｎｔは分析した細胞の合計数である。
【０１２５】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）による遺伝子発現分析
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により提供されたＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｐｒｏｂｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓを使ってｑＰＣＲを行った。アポトーシス遺伝子のｍＲＮＡ発現に対するＳＤＧ処理の効果を評価するために、Ｂａｘ（Ｍｍ００４３２０５１＿ｍ１）およびＢｃｌ−２（Ｍｍ００４７７６３１＿ｍ１）に対する個別のＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイを行った。
【０１２６】
簡単に説明すると、細胞をＳＤＧ（５０μＭ、６時間）で前処理し、照射した（２Ｇｙ）。全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使って単離し、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使って定量化した。その後、ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から提供されたＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ  ｔｏ  ｃＤＮＡキットを使ってＶｅｒｉｔｉ（登録商標）Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒで行った。ｑＰＣＲを、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で反応ウエル当たり２５ｎｇのｃＤＮＡを使って行った。遺伝子発現データを１８ＳリボソームＲＮＡに対し正規化し、ΔΔＣＴ法により無処理対照試料に対し較正した。
【０１２７】
ウェスタンブロッティングによるアポトーシス検出
イムノブロッティングを用いて観察されるＢａｘ（アポトーシスプロモーター）、Ｂｃｌ−２（アポトーシス阻害剤）、切断カスパーゼ３、および切断ポリ（アデノシンジホスフェートリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）のレベルにより、マウス肺上皮細胞中のアポトーシスを決定した。簡単に説明すると、細胞をプロテアーゼ阻害剤を含むＰＢＳ中に溶解した。その後、細胞ライセートの免疫ブロット分析を、１０ウエルＳＤＳ１２％ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）使って行った。電気泳動を２００Ｖで１時間行った。ＰｏｌｙＳｃｒｅｅｎ  ＰＶ転写膜（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）への転写を２５ボルトで１時間行った。膜を５％脱脂粉ミルク含有燐酸塩緩衝食塩水中で一晩ブロッキングした。その後、脱脂粉ミルクを廃棄し、膜を一次抗体と共にインキュベートした。Ｂａｘ、Ｂｃｌ−２、切断カスパーゼ３、および切断ＰＡＲＰのタンパク質レベルを、ＢａｘおよびＢｃｌ−２に対するウサギ抗マウスモノクローナル抗体、およびウサギ抗マウス切断カスパーゼ３（Ａｓｐ１７５）モノクローナル抗体およびウサギポリクローナル抗切断ＰＡＲＰ（２１４／２１５）切断部位特異的抗体を使って、製造業者（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）推奨の希釈を用いて検出した。膜を５回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされた二次抗体中、室温で４５分間インキュベートした。Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｌｕｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を使って膜を発色させ、特異的二次抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）により検出されたβ−アクチン発現レベルを使って添加量を調整した、特異的バンド（Ｂａｘに対し２０ｋＤａ、Ｂｃｌ−２に対し２６ｋＤａ、切断カスパーゼ３に対し１７／１９ｋＤａ、および切断ＰＡＲＰに対し８９ｋＤａ）の濃度測定スキャンにより定量した。
【０１２８】
統計
データは平均値＋／−標準誤差で表される。クローン原性アッセイの生存曲線をＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈソフトウェア（４．０）を使って作製した。群間の統計的差異を一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使って決定した。統計的有意差が認められた場合（ｐ＜０．０５）は、個々の比較をＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ／Ｄｕｎｎ検定（Ｓｔａｔｖｉｅｗ４．０）を使って行った。
【０１２９】
結果
ＳＤＧ処理は照射された一次肺細胞のコロニー形成能力を高める
クローン原性生存アッセイは、環境的および医薬的発癌性物質、電離放射線などへの暴露後の何らかの遺伝毒性のストレスを細胞が受けた後の細胞の増殖死を決定するために広く使用される。この実施例では、一次肺細胞（それぞれ、上皮細胞、内皮細胞および繊維芽細胞）のクローン形成能の放射線誘発性低下に対するＳＤＧ（１０〜５０μＭ）の前処理の効果を評価した。結果は、ＳＤＧ（１０〜５０μＭ）単独では、それぞれの無処理対照細胞（１００％）に比べて、３つ全ての細胞型のコロニー形成能力に対し何らの有害作用も誘発しなかったことを示す（図１Ａ〜１Ｃ）。
【０１３０】
照射線処理は、上皮および内皮細胞のコロニー形成能力を線量依存的に有意に（ｐ≦０．０１）低下させた。細胞を照射前にＳＤＧで処理した場合には、全ての処理群で生存率が有意に向上した（図７Ａ、７Ｂ）。繊維芽細胞中のクローン形成能の放射線誘発性低下に対する最大の保護が、５０μＭのＳＤＧ前処理照射群で観察された（図７Ｃ）。したがって、我々は、ＳＤＧのこの特定の濃度を我々のその後の調査用に選択した。
【０１３１】
ＳＤＧは、照射一次肺細胞中でＤＮＡ  ＳＳＢの形成を防ぐ
我々は、最初に、放射線生物学的に妥当な２Ｇｙの照射後の全ての細胞型（内皮、上皮、繊維芽細胞）中でのＤＮＡ損傷の動力学を決定する調査を行った。予想通り、放射線曝露は、テイルモーメントの増加から明らかなように、それらのそれぞれの非照射対照細胞に比べて、全ての細胞型で有意なＤＮＡ損傷を誘発した。ＤＮＡ損傷の程度は、照射後３０分で最大であった。ＤＮＡ損傷の程度は、照射後の時間が６０分に達すると減少し、その後、照射後２時間までにさらに急に低下した。したがって、我々は、放射線誘発性ＤＮＡ損傷に関連するさらなる調査のために３０分間の時間間隔を選択した（図８Ａ）。
【０１３２】
放射線曝露（２Ｇｙ）により、非照射対照細胞に比べて、コメットテイル長さの有意な増加を生じた。細胞を、照射前に種々の時間間隔（０時間、２時間、４時間、６時間および２４時間）で処理した。ＳＤＧ（５０μＭ）による細胞の前処理は、全ての時間間隔において、３つ全ての型の肺細胞中で放射線誘発性のコメットテイル長さを有意に抑制した。しかし、放射線誘発性ＤＮＡテイルモーメントに対する最大保護は、全ての細胞型で、照射の前の６時間のＳＤＧ処理において観察された（図８Ｂ）。照射された（ＳＤＧの存在および／または非存在下で）肺上皮細胞中の、コメットテイルの形成を示す代表的蛍光顕微鏡写真を図８Ｂの挿入図に示した。
【０１３３】
ＳＤＧ処置は、マウス一次肺細胞中でγ−Ｈ２ＡＸフォーカスの形成を抑止する
ＳＤＧがＤＮＡ酸化損傷に対して保護できるかどうかという我々の仮説をさらに検証するために、γ−Ｈ２ＡＸフォーカスの誘導に対するＳＤＧの作用もまた評価した。
照射後のマウス一次肺細胞中のγ−Ｈ２ＡＸ形成により実証される、酸化的ＤＮＡ損傷に対するＳＤＧ前処理の効果を、標準的顕微鏡生成画像解析（図９、１０）およびフローサイトメトリー（図１１）法の両方を使って評価した。蛍光顕微鏡分析の結果は、放射線（２Ｇｙ）暴露により３つ全ての細胞型でγ−Ｈ２ＡＸフォーカスの形成の有意な増加が生じたことを示す（図９）。フォーカス／細胞の数は、照射後１５分までに実質的に増加し、ピークは３０分であったが（上皮、内皮および繊維芽細胞に対しそれぞれ、４６．７％±０．５、３３．６％±３．２および３０．０％±１．４のγ−Ｈ２ＡＸ陽性細胞）、数は、依然として非照射対照細胞より有意に大きいとはいえ、曝露の１時間以内に著しく減少した。全ての値は、それらのそれぞれの非照射対照細胞に比べて有意に大きかった（全ての細胞型でｐ＜０．００５）（図９）。
【０１３４】
照射上皮細胞、内皮細胞および繊維芽細胞中のγ−Ｈ２ＡＸ陽性細胞の数が、それぞれ、２２．７％±２．１７、２１．９２％±２．８８および２２．１％±１．９に低下したので、ＳＤＧ前処理（ＩＲ前に６時間）は、γ−Ｈ２ＡＸの誘導を有意に低減した（上皮細胞でｐ＜０．００５、内皮細胞および繊維芽細胞でｐ＜０．０５）。ＳＤＧの前処理により３つ全ての型の肺細胞が放射線誘発性ＤＮＡ鎖切断から保護されたので、γ−Ｈ２ＡＸフォーカスの形成から細胞を保護するＳＤＧの能力は、細胞型と無関係であるように思われた。図１０は、一次肺上皮細胞中のγ−Ｈ２ＡＸ陽性細胞の顕微鏡分析の代表的蛍光顕微鏡写真を示す。
【０１３５】
放射線曝露後のγ−Ｈ２ＡＸ陽性細胞の誘導の抑制に対するＳＤＧの保護作用を、フローサイトメトリーを使ってさらに確認した。予想通り、照射後にγ−Ｈ２ＡＸ陽性細胞の誘導において類似のパターンが観察されたが、γ−Ｈ２ＡＸ陽性細胞の数は、すべての細胞型でＳＤＧ前処理により有意に抑止された（図１１）。
【０１３６】
ＳＤＧ処理は一次肺細胞のＩＲ誘発性アポトーシス死を防ぐ
アポトーシスの観点からＳＤＧの細胞保護効果を調査するために、顕微鏡による可視化のために細胞核をＤＡＰＩで染色し、計数した。顕微鏡分析は、対照細胞はインタクトクロマチンを有した（アポトーシス細胞、約４〜５％）が、放射線曝露はアポトーシス細胞のパーセンテージを、時間および線量依存的に有意に（ｐ≦０．０５）増加させたことを示した。２４時間で、アポトーシス細胞のパーセンテージは、上皮および内皮細胞中で、それぞれ、１３．９％±１．０８および１５．１％±１．９５であると観察された。図１２（ＡおよびＢ）で明らかなように、ＳＤＧ前処理（５０μＭ）は、アポトーシス細胞のパーセンテージのにおけるＩＲ誘発性の増加を有意に（ｐ≦０．０５）阻止した（上皮および内皮細胞中で、それぞれ９．９％±１．０８および１０．７１％±１．４５アポトーシス細胞）。放射線曝露により２４時間および４８時間でそれぞれアポトーシス細胞の３６．４％および４１．８％の著しい増大が生じたことから、繊維芽細胞が最も感受性であることが明らかになった。重要なのは、上皮および内皮細胞で示されるように、ＳＤＧによる前処理が、肺繊維芽細胞中でもアポトーシスの程度を有意に低減したことである（図１２Ｃ）。
【０１３７】
ＳＤＧ処置はマウス一次肺上皮細胞中でアポトーシスの制御因子の発現を変更する
ＤＮＡ損傷および細胞死を抑制するＳＤＧの放射線防護効果をさらに明らかにするために、我々は、ＳＤＧがアポトーシス促進性および抗アポトーシス性の制御因子タンパク質の比率を変化させ得ると仮定した。したがって、我々は、放射線の存在下または非存在下での肺細胞のＳＤＧ処理がＢａｘおよびＢｃｌ−２の遺伝子発現を変更するかどうか、およびこれらの変化がタンパク質レベルでの変化に繋がるかどうかを試験した。このために、肺上皮、内皮および繊維芽細胞をＳＤＧ（５０μＭ）で処理し、酵素ｍＲＮＡレベルをＩＲ後の６、２４、および４８時間でｑＰＣＲにより評価した（図１３ＡおよびＢ）。我々は、２Ｇｙにより、ＩＲ後の２４時間および４８時間でアポトーシス促進性Ｂａｘ  ｍＲＮＡレベルの約１１倍の増加が生じ、これはＳＤＧ前処理により有意に（ｐ＜０．０５）抑制されたことを観察した。あるいは、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡレベルは放射線曝露により変化することはなく、むしろ、ＳＤＧ前処理細胞において、ＩＲ処理後の２４時間および４８時間で、それぞれ６．６および３．５倍増加した。ＢａｘおよびＢｃｌ−２  ｍＲＮＡレベルにおける変化のウェスタンブロット分析によるタンパク質検証時に、我々は、ＢａｘおよびＢｃｌ−２タンパク質両方のレベルがその後増加し、ＳＤＧ前処理細胞中ではそれらのレベルが減少する傾向にあることを見出した（図１３Ｃは代表的ブロットを示し、１３Ｄと１３Ｅは、バンド密度の定量を示す）。ＳＤＧにより観察された放射線防護の裏にある根源的な機序をさらに調査するために、我々は、アポトーシスシグナル伝達カスケードに関連する重要なタンパク質：実行役である切断カスパーゼ３および切断ＰＡＲＰのレベルの変更におけるＳＤＧの効果を評価した。全体として、切断カスパーゼ３および切断ＰＡＲＰのレベルは、ＩＲの６、２４、および４８時間後に照射細胞中で有意に増加し、ＳＤＧ前処理細胞中ではそれらのレベルは減少する傾向にあった（図１４Ａは、代表的ブロットを示し、１４Ｂおよび１４Ｃはバンド密度の定量を示す）。
【０１３８】
考察
この実施例中で、我々は、ＦＳリグナンＳＤＧがマウス一次肺細胞を、放射線誘発性ＤＮＡ酸化損傷およびアポトーシス死に対し保護することを示した。我々は、ＳＤＧ前処理が、クローン原性生存により測定されるようにＩＲ誘発性細胞傷害性を改善するのみでなく、肺細胞中でＤＮＡ鎖切断（ＤＳＢおよびＳＳＢ）および細胞死の誘導も減らすことを認めた。重要なのは、アポトーシスの調節に関連する遺伝子の発現もＳＤＧ処置により変えられたことである。これらの知見は、ＳＤＧが放射線シナリオにおいて、および放射線療法の治療指数の改善において、非毒性放射線防護剤として有用であり得ることを示唆する。
【０１３９】
ＩＲ誘発性細胞死は細胞の放射線感受性の古典的マーカーであり、これは、クローン原性生存の喪失により特徴付けられる。同様に、我々はまた、３つ全てのマウス肺細胞中でクローン形成能の放射線量依存的な低下にも注目した。このクローン形成能の低下は、ＳＤＧ前処理により有意に減弱化された（図７）。細胞ＤＮＡは、細胞におけるＩＲ誘発性損傷の主要標的である。曝露中に生成されたＲＯＳは、細胞ＤＮＡ中で一連の変化を引き起こし、これは、変異、塩基傷害、架橋結合、ＳＳＢおよびＤＳＢの範囲に及ぶ。ＤＮＡ中の損傷は、置き換えることはできず、したがって修復する必要があり、未修復のまま残されると、細胞はアポトーシスまたは壊死の誘導を起こすかも知れない。したがって、標的細胞ＤＮＡの保護は、遺伝毒性の侵襲に対する第１選択の防御を与える。ＲＯＳ生成は、曝露の数秒以内に起こり、照射後数分間持続する。したがって、即時ＤＮＡ損傷などの初期放射線反応は、放射線曝露後の数分以内に起こる。同様に、照射された細胞の時間依存性動力学的調査で、我々はまた、コメットテイル長さからも明らかなように、ＤＮＡ鎖切断の程度は３０分以内にその最大レベルに達し、その後下がることを認めた（図８Ａ）。
【０１４０】
コメットアッセイは、細胞レベルでのＤＮＡ損傷／修復の検出に対し感受性の高い技術であり、ＤＮＡ鎖切断の研究に広く使用されてきた。ポリフェノールは、ＲＯＳ媒介性の酸化的ＤＮＡ損傷を低減することにより、放射線の有害な作用から正常組織または細胞を保護する能力を有する。この調査では、標準的アルカリコメットアッセイを用いることにより、我々はまた、マウス一次肺細胞中のＩＲ誘発性ＳＳＢに対するＳＤＧの役割も評価した。我々の結果は、クリシンやエピカテキンなどの他のフェノール成分に関する同様の放射線誘発性ＤＮＡ  ＳＳＢからの保護効果を示す、他の報告と一致する。
【０１４１】
ＳＳＢは細胞により容易に修復されるが、ＤＳＢは細胞が修復するにはより困難であり、突然変異を生ずる可能性がより高く、したがって、ＤＳＢはたいていの場合、致死細胞イベントを意味する。Ｈ２ＡＸ分子は、照射により導入されたそれぞれのＤＮＡ二重鎖切断に関してメガベース長のクロマチンドメインに沿ってリン酸化（γ−Ｈ２ＡＸ）され、γ−Ｈ２ＡＸの喪失または脱リン酸化はＤＮＡ修復と時間的に相関する。我々は、ここで、３つ全ての型の試験した細胞で、ＳＤＧがＩＲ誘発性ＤＳＢから細胞ＤＮＡを保護したことを報告する。我々の結果は、リスベラトロールおよび緑茶カテキンなどのポリフェノールがＩＲ誘発性ＤＮＡ鎖切断から細胞を保護することを同様に示すいくつかの他の調査と一致する。しかし、放射線の比存在下では、ＳＤＧは、これらのいずれの細胞においても、何ら毒作用を示さなかった。ＤＮＡ酸化損傷は多くの癌への前駆物質であると考えられるので、抗酸化剤として作用するＳＤＧによるこのような損傷の減少を癌のリスクの減少に繋げることができる。
【０１４２】
細胞および組織でのＩＲ誘発性アポトーシスは、一部は細胞中のＤＮＡ損傷の誘発によるものであることが知られている。いくつかの機序（Ｏ６−メチルグアニン、塩基Ｎアルキル化、嵩高いＤＮＡ付加物、ＤＮＡ架橋）がＤＮＡ損傷依存アポトーシスに関与しているが、ＤＮＡ二重鎖切断がアポトーシス細胞死の誘発において主要な役割を果たす。この調査では、ＳＤＧによる細胞の前処理が、肺細胞中の放射線誘発性アポトーシスに対し保護し、コメットテイル長さおよびγ−Ｈ２ＡＸフォーカス形成を抑制した。したがって、放射線誘発性アポトーシス細胞死に対するＳＤＧの保護効果は、細胞の酸化ストレスを減らすその能力、イオン恒常性の修復およびＤＮＡ損傷を防ぐその能力に起因するのであろう。これらの知見は、我々のマウスの虚血再灌流および放射線誘発性組織損傷の調査における食用全粒粉亜麻仁の抗アポトーシス特性と一致し、ＳＤＧを、組織中の保護的な抗アポトーシス効果を媒介する亜麻仁中の有望な生理活性成分として示唆している。
【０１４３】
ＩＲは細胞環境中の抗酸化酵素のレベルを低下させるので、抗酸化剤による細胞の前処理は、ＲＯＳをさらに妨害し、それにより、ＲＯＳと生体分子との相互作用のリスクを減らす。前の実施例では、我々は、亜麻仁リグナン複合体を含む食餌での動物の予備給餌が、マウス肺中の保護的第２相抗酸化酵素のレベルを高めたことを以前に報告した。これらの作用に対する仮定上の機序は、抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ）媒介性の転写誘導の活性化を含む。さらに、Ｎｒｆ２はまた、酸化ストレス媒介性細胞傷害性に対する保護に関与する種々の抗酸化酵素のデノボ合成を開始させる。いくつかの他の報告はまた、クルクミンおよびＥＧＣＧなどのポリフェノールが、第２相抗酸化酵素を誘導するそれらの能力により示唆される、酸化ストレスに対する保護作用を発揮することを示唆している。
【０１４４】
ＳＤＧが、ＤＮＡに対するその抗酸化特性および保護効果によりマウス一次肺細胞中の細胞死を減らすということは、結果から明らかである。我々の調査結果は、ザクロ中で見つけられた一種のポリフェノールであるエラグ酸がＨＯ−１およびＮｒｆ−２遺伝子の発現上昇を介してＵＶＡ誘発性酸化ストレスおよびアポトーシスからヒトケラチノサイトを保護することを報告したＨｓｅｕらの結果（Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ２０１２，５０：１２４５）を裏付ける。我々の調査は、ＩＲ誘発性酸化損傷およびアポトーシス細胞死の抑制におけるＳＤＧの放射線防護作用は、抗酸化防御系の直接誘導による可能性があるという新しい証拠を提供する。
【０１４５】
まとめると、これらの結果は、亜麻仁中の亜麻仁リグナンＳＤＧが、動物調査で観察された全粒粉の保護的効果に寄与すると思われる強力な放射線防護特性を有することを示す。
【０１４６】
実施例３
セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）は次亜塩素酸イオンを除去する：放射線からのゲノムＤＮＡのＳＤＧによる保護の新規機序
強力な酸化剤である次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）は、生理学的に存在する塩化物イオンと過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）との間の反応を触媒する活性化ミエロペルオキシダーゼによって好中球により生成される。活性化好中球はＨ２Ｏ２およびスーパーオキシドアニオンＯ２・−を生成する。生理的ｐＨで、ＨＯＣｌおよび次亜塩素酸イオン（ＣｌＯ−）の両方の混合物が存在する。ＨＯＣｌは酸化的損傷により微生物を死滅させる。しかし、過剰な産生は組織への損傷を引き起こすことが知られている。次亜塩素酸塩はアデニンヌクレオチドを修飾し、クロラミンの形成が起こり、これが好中球媒介毒性の主要な機序であると思われる。
【０１４７】
ＨＯＣｌおよびその共役塩基ＣｌＯ−は、アミノ酸、ペプチド、および脂質を酸化し、細胞ＤＮＡおよびＲＮＡ中の塩基を塩素化することが示されている。ＨＯＣｌ／ＣｌＯ−の反応により、グアニンおよびチミンの環内−ＮＨ基ならびにグアニン、アデニンおよびシトシン誘導体のＮＨ２基の位置でプリンおよびピリミジンヌクレオチドの両方が修飾され、（ＲＮＨＣｌ）およびＲＲ’ＮＣｌなどのクロラミンが形成される。一次修飾塩基は、ＳＫＭ−１細胞のＤＮＡおよびＲＮＡ中の５−クロロシトシン、８−クロロアデニンおよび８−クロログアニンであることがわかった。
【０１４８】
γ線は原子および分子を電離できることが知られている。生物学的系または溶液中では、電離放射線はヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）を生成し、これが、脂質、タンパク質およびＤＮＡを含む細胞成分に対する電離放射線誘発性損傷の発生源であると考えられている。しかし、これらの極めて不安定なラジカルは、生理液中に極めて高濃度で存在するＣｌ−イオンにより除去され得る。これにより反応性塩素含有中間体が生成され、この中で相対的に安定なＣｌＯ−が放射線由来毒物である。塩化物含有溶液では、ＣｌＯ−およびその他の酸化的性質の活性な塩素誘導体が放射線分解の生成物として形成される。それらは、生物の生理的な機能の抑制に寄与し得る。したがって、我々は、放射線誘発性のＤＮＡまたはタンパク質損傷は、一部は、放射線生成ＣｌＯ−により媒介されるということを提案する。
【０１４９】
化学的に合成したＳＤＧの２つのジアステレオマーは、それらの抗酸化特性、フリーラジカル除去特性およびＤＮＡ保護特性において同等効力であることが最近示された。本調査は、非常に新規で特異的な蛍光プローブを使って、生理食塩水中でγ線誘発性ＣｌＯ−生成からのＤＮＡの放射線防護に関してＳＤＧを評価する。次亜塩素酸塩特異的３’−（ｐ−アミノフェニル）フルオレセイン（ＡＦＰ）およびヒドロキシルラジカル感受性３’−（ｐ−ヒドロキシフェニル）フルオレセイン（ＨＰＦ）は、上記活性酸素種（ＲＯＳ）の測定に関し、より大きな特異性および再現性を提供する。
【０１５０】
材料と方法
化学薬品
ＲＯＳ標識プローブＡＰＦおよびＨＰＦ、プラスミドＤＮＡ（ｐＢＲ３２２）、１ｋｂ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡラダーをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。
【０１５１】
次亜塩素酸塩の測定
ＰＢＳ中のＲＯＳプローブＡＦＰおよびＨＰＦの蛍光を、次亜塩素酸塩の存在下またはγ線曝露後に４９０ｎｍ／５１５ｎｍで励起／発光にて測定した。データは、相対蛍光単位（ＲＦＵ）として表す。
【０１５２】
タウリンクロラミンの測定による次亜塩素酸塩のγ線誘発性生成
タウリンの塩素化をＴＭＢアッセイを使って測定した。データはタウリンクロラミン（吸光度）ならびにＣｌＯ−濃度（μＭ）として表される。
【０１５３】
仔ウシ胸腺およびプラスミドＤＮＡへの次亜塩素酸塩誘発性損傷
仔ウシ胸腺またはプラスミドＤＮＡを次亜塩素酸塩と共に３７℃で２時間インキュベートした。ＤＮＡ試料をアガロース（１％）ゲル電気泳動に供し、分析した。
【０１５４】
２−アミノプリン（２−ＡＰ）の次亜塩素酸塩誘発性塩素化の測定
ＰＢＳ中の２−ＡＰを次亜塩素酸塩に暴露し、２６０〜３９０ｎｍで、３７４ｎｍに最大発光を有する蛍光スペクトルを記録した。２−ＡＰの％変化を計算した。
【０１５５】
データの統計分析
得られたデータは、平均値±標準偏差として表される。データを、Ｓｔａｔｖｉｅｗ  Ｐｒｏｇｒａｍを用いるボンフェローニの補正を使い、事後比較による一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に供した。ｐ値≦０．０５を有意と見なした。
【０１５６】
結果
この調査で、我々は、生理溶液中での放射線曝露からのＤＮＡ保護の可能な機序として、放射線誘発性ＣｌＯ−を除去するＳＤＧの能力を調べた。
【０１５７】
ＳＤＧは次亜塩素酸イオンを除去する
選択したフルオロプローブの特異性を、次亜塩素酸ナトリウムを使って評価した。図１５Ａは、ＣｌＯ−濃度（１〜４μＭ）の増加に伴うＡＰＦの蛍光強度の線形増加を示す。重要なことに、ＨＰＦ蛍光強度の増加はごくわずかに過ぎず、ＡＰＦの蛍光は主としてＣｌＯ−依存性であることを示している。ＣｌＯ−用量を、その後の実験のために、この範囲内となるように選択した。次に、ＳＤＧ（市販）により、ＣｌＯ−を除去するＳＤＧの能力を評価した。実際に、ＳＤＧはＣｌＯ−を用量依存的に低減させた（図１５Ｂ）。最後に、我々は、合成ＳＤＧジアステレオマーＳＤＧ（Ｓ，Ｓ）およびＳＤＧ（Ｒ，Ｒ）のＣｌＯ−除去効果を評価した。０．５μＭで、ＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）およびＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）、ならびにＳＤＧ（市販）は、ＣｌＯ−除去剤として確立されているシリビニンに類似の、同等の効力でＣｌＯ−を除去した（図１５Ｃ）。
【０１５８】
ＳＤＧはγ線誘発性次亜塩素酸塩を除去する
ＡＰＦの蛍光強度の増加により明らかなように、放射線はＣｌＯ−を線量依存的に生成する。特に、５０Ｇｙのγ線誘発性ＡＰＦおよびＨＰＦ（図１６Ａ）は、ＳＤＧにより用量依存的に減少した（図１６ＡおよびＢ）。ＡＰＦ蛍光の低下の最初の傾斜（１，８１６．３０）は、ＨＰＦ（６９５．７５）に比べてより大きく、ＣｌＯ−に対するＳＤＧの選択的除去効果を示す（挿入図、図１６Ａ）。ＡＰＦに対するＳＤＧの効果は、ＨＰＦに比べて、有意により顕著であった（図１６Ｂ）。ＳＤＧは、ＡＰＦ（図１６Ｃ）およびＨＰＦ（図１６Ｄ）蛍光の増加により示される、放射線曝露（２５および５０Ｇｙ）由来のＣｌＯ−生成を低減させた（ｐ＜０．０５）。ＡＰＦ／ＨＰＦ比率はＳＤＧにより低下し、ＣｌＯ−の選択的除去を示す。
【０１５９】
タウリンの塩素化としての次亜塩素酸塩の放射線量依存的増加
放射線誘発性ＣｌＯ−が生物学的分子中のＮＨ基を塩素化することを確定するために、我々は、タウリンの放射線誘発性塩素化について評価した。結果（図１６Ｅ）は、生理食塩水中では、５０、１００、および２００Ｇｙでγ線がタウリンクロラミン形成を有意に高め、γ線がＣｌＯ−生成を誘発し、これは塩化物濃度に依存したことを示す（図１６Ｆ）。この結果は、放射線が生理的溶液中で、生体分子に損害を与えることが可能なＣｌＯ−を誘導するという強力な証拠を提供する。
【０１６０】
ＳＤＧは仔ウシ胸腺およびプラスミドＤＮＡへの次亜塩素酸塩誘発性損傷を保護する
我々は、ＣｌＯ−がゲノム（図１７Ａ〜Ｄ）およびプラスミド（図１７Ｅ〜Ｆ）ＤＮＡに対し損傷を誘発するかどうかを明確にした。実際に、ＣｌＯ−はＤＮＡ断片化を用量依存的に誘発し（図１７Ａ、Ｂ）、低分子量断片が増加した。０．５ｍＭ次亜塩素酸塩１．０μＭに暴露されたゲノムＤＮＡに対する損傷は、すべてのＳＤＧ（市販または合成）により、既知の抗酸化剤のケルセチンおよびＣｌＯ−除去剤のシリビニンと同等のレベルまで低減された（図１７Ｃ、Ｄ）。同様に、ＣｌＯ−によるプラスミドＤＮＡに対する損傷も、ＳＤＧにより低減された（図１７Ｅ、Ｆ）。特に、我々は、アガロースゲル電気泳動で異なる移動パターンを有する、損傷を受けたオープンコイルＤＮＡと比べて、スーパーコイル（ＳＣ）プラスミドＤＮＡの量を評価した。２５μＭでのＳＤＧの存在により、プラスミドＤＮＡに対するＣｌＯ−誘発性損傷が低減され、ＤＮＡはＯＣ型（１８．６％±９．４％）に比べて大部分がスーパーコイル型（８１．３％±９．４％）で保存された。
【０１６１】
２−ＡＰの次亜塩素酸塩誘発性塩素化に対するＳＤＧの保護効果
ＤＮＡへのＣｌＯ−の損傷がヌクレオベース修飾により起こるのかどうかを明確にするために、我々は、プリンの蛍光性類似体である２−ＡＰのＣｌＯ−誘発性塩素化を評価した。次亜塩素酸塩は、放射線曝露により生成されるものと同等の濃度（１０μＭ）で与えた場合（図１５Ａ、１６Ａ、１７Ｃ）２−ＡＰ蛍光を低減し、これはＳＤＧによる前処理（６０秒）により阻止された（１８Ａ、Ｂ）。最も重要なのは、ＳＤＧによる後処理は、ＣｌＯ−への曝露の＋１５、＋３０、＋６０、＋１２０、＋１８０または＋３００秒後にＳＤＧが添加された場合、次亜塩素酸塩誘発性２−ＡＰ修飾からの有意な回復をもたらしたことである（図１８ＢおよびＣ）。これらの結果は、プリン塩基の次亜塩素酸塩誘発性修飾に対するＳＤＧのヌクレオベース保護特性を示している。
【０１６２】
２−ＡＰのγ線誘発性塩素化に対するＳＤＧの保護効果
放射線がヌクレオベース塩素化を誘発するかどうかを明確にするために、我々は、上記と同じ系、すなわち、２−ＡＰ蛍光（図１９Ａ）を使用した。実際に、γ線への暴露により蛍光強度の線量依存的減少が生じ（ＣｌＯ−の存在下の場合と類似の観察（図１８Ａ））、これはＳＤＧにより阻止された（図１９Ａ、Ｂ）。これらの結果は、γ線がヌクレオベースの塩素化を誘発することを示し、プリン塩基のこのような放射線誘発性修飾に対するＳＤＧの保護特性を立証した。
【０１６３】
放射線によるヌクレオベース塩素化を防止または緩和するＳＤＧの作用の提案される機序
Ｎ−塩素化ヌクレオベースの回復または阻止の機序に関して、我々は、電子が豊富な芳香環によるＮ−Ｃｌ−分子の二電子還元、または一電子還元によりＮ−ラジカルが生成し、これが、次に、フェノール性のＳＤＧ成分中の−ＯＨ基から水素原子を奪い取ることを示唆する。機構１（図２０）は、ＳＤＧ保護の提案される機序を示す。我々のこの調査の結果は、次亜塩素酸イオンを除去することおよび放射線誘発性ＤＮＡ損傷から保護することによるＳＤＧの放射線防護作用の新しい機序に対する証拠を提供する。
【０１６４】
考察
この調査の結果は、次の証拠を提供する：ｉ）既知のリグナン抗酸化剤およびフリーラジカル除去剤であるＳＤＧは、化学的手段ならびに放射線により生理的溶液中で生成した次亜塩素酸イオンを解毒した；ｉｉ）ＳＤＧは、次亜塩素酸塩誘発性損傷からゲノムＤＮＡならびにプラスミドＤＮＡを保護した；ｉｉｉ）ＳＤＧ防御（次亜塩素酸塩誘発性ＤＮＡ損傷からの保護または回復）の機序は、次亜塩素酸塩の除去およびヌクレオベース上のクロラミン（−ＮＣｌ）からのアミノ（−ＮＨ）基の再生を含む；ｉｖ）γ線への暴露は、タウリンクロラミン形成の増加をもたらした；ｖ）γ線への暴露は、プリン塩基の塩素化の増加をもたらし、これはＳＤＧにより阻止された；ｖｉ）ＳＤＧの作用は、曝露前または暴露後に添加される場合、次亜塩素酸塩誘発性損傷からのＤＮＡの保護の点で等しく効果的であり、すなわち、ＳＤＧはヌクレオベース塩素化の保護剤および／または緩和剤として機能できる；ｖｉｉ）市販のＳＤＧ、シリビニン、およびケルセチン（天然の抗酸化フラボノイド）に比べて、合成ＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）およびＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）ジアステレオマーは、次亜塩素酸イオンの除去および次亜塩素酸塩誘発性ＤＮＡ損傷の防止において同等に強力であった。これらの結果は、ヌクレオベースの次亜塩素酸塩誘発性修飾に対するＳＤＧの保護および緩和特性を示す。
【０１６５】
胸部放射線損傷のマウスモデルを使って、リグナンポリフェノールに富む穀物である全粒粉食用亜麻仁、ならびにＳＤＧに富む亜麻仁リグナン配合物の、組織放射線防護的な役割を確定した。これらの調査は、インビボの放射線誘発性組織損傷に対するリグナンＳＤＧの放射線防護的および放射線を緩和する特性を明確にした。抽出、精製、または合成亜麻仁ＳＤＧは、インビトロならびにインビボで強力な抗酸化剤である。ＳＤＧの治療潜在力を調査するために、我々は、新規化学反応によりＳＤＧを合成し、合成ＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）およびＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）の抗酸化特性を、それらの還元力、金属キレート化潜在力、および・ＯＨ、パーオキシおよびＤＰＰＨラジカルに対するフリーラジカル除去活性を評価することにより明確にした。我々はまた、合成ＳＤＧ（Ｒ、Ｒ）、ＳＤＧ（Ｓ、Ｓ）鏡像異性体の放射線防護特性を、プラスミドＤＮＡ（ｐＢＲ３２２）および仔ウシ胸腺ＤＮＡに対するγ線照射誘発性損傷を防ぐそれらの潜在力を評価することにより実証した。
【０１６６】
我々はまた、ＳＤＧによるゲノムＤＮＡの最大放射線防護は約５．０μＭの濃度で既に達成されており、これはそれらのフリーラジカル除去および抗酸化効果に対するＥＣ５０値、通常１３０〜２００μＭの範囲、より低い濃度であることを示した。この調査で確認したように放射線誘発性次亜塩素酸塩の除去におけるＳＤＧの最大効力は、０．５〜５μＭの範囲に入ることに留意するのは興味深い。このことは、ＳＤＧのＤＮＡ保護効果は、一部は、有害なＣｌＯ−の除去に起因することを示唆している。２−ＡＰの次亜塩素酸塩誘発性修飾に対するＳＤＧの保護効果を示す結果は、ＳＤＧが、ヌクレオベースに対する次亜塩素酸塩誘発性損傷を防ぐことによりＤＮＡを保護することを示す。
【０１６７】
ＨＯＣｌは、ＮＡＤＰＨオキシダーゼおよび基質としての塩化物イオンにより生成される過酸化水素を用いて活性化好中球のミエロペルオキシダーゼにより産生される。ＨＯＣｌは、ヌクレオベースを塩素化および酸化できる。ＨＯＣｌはヌクレオベースを塩素化できるので、これが遺伝子毒性を引き起こす可能性がある。塩素化ヌクレオシドは特定されており、炎症および癌に関連があるとされた。
【０１６８】
それによりＳＤＧが放射線誘発性損傷からＤＮＡを保護できる、下記に示すいくつかの可能な機序が存在するであろう。１）ヌクレオベースの塩素化および酸化を生じさせる次亜塩素酸イオンを除去することによる機序；２）塩化物イオンと反応することにより次亜塩素酸塩を生成する・ＯＨフリーラジカルを除去することによる機序。我々は、燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中ならびに食塩水単独中（予備実験）の塩化物イオンの存在下で、・ＯＨの産生が劇的に低下することを観察した。身体における生理液中の高濃度の塩化物イオンを考慮すると、次亜塩素酸塩の産生およびＤＮＡを含む細胞成分に対する次亜塩素酸塩誘発性損傷の重要性が、放射線損傷の主なメカニズムであろう。３）ルテオリン、ケンペロールおよびケルセチンなどのいくつかのフラボノイドのように、ＤＮＡ塩基対と結合することによる機序；４）プリンおよびピリミジン塩基上、特にＣ５、Ｃ６およびＣ８の位置ならびにデオキシリボースの位置でのプロトンの除去または・ＯＨの付加を阻止することによる機序。これらの機序はフリーラジカル誘発性ＤＮＡ損傷からの保護に対し提案された。５）最後に、形成されたクロロアミンの還元による、したがって、核酸において内部および外部アミノ基を再生することによる機序。したがって、次亜塩素酸イオンの除去剤としてならびに抗酸化剤でありフリーラジカル除去剤および次亜塩素酸塩誘発性塩素化からのヌクレオベースの保護剤として、ＳＤＧはＤＮＡ放射線防護剤および放射線緩和剤として機能できる。
【０１６９】
次亜塩素酸塩は、次亜塩素酸塩陰イオン（ＣｌＯ−）、次亜塩素酸（ＨＣｌＯ）および遊離塩素（Ｃｌ２）の混合物として溶液中にｐＨ依存的な量で存在する。生理的ｐＨで、ＣｌＯ−およびＨＣｌＯは主要分子である。・ＯＨなどの強力な一電子酸化剤と異なり、次亜塩素酸塩は二電子酸化剤であり、・ＯＨより反応性が低く、選択性が高い。次亜塩素酸塩は、電子が豊富な芳香環およびＮＨ−化合物を塩素化できる。次亜塩素酸塩は、一級および二級アルコールならびにベンジルメチレン基および三級メチン基ならびにフェノールを酸化する。上記反応の第１ステップは塩素化であり、加水分解／ＨＣｌ除去がそれに続く。ＳＤＧは、アミノ基を除く上記の全ての反応部位を含み、このことが、ＳＤＧ分子を強力な次亜塩素酸塩除去剤にしている。機構１（図２０）で、我々は、ヌクレオベースの一電子または二電子還元を用いるＳＤＧによるＤＮＡ保護の新規機序を提案した。
【０１７０】
まとめると、我々は、ＳＤＧが次亜塩素酸塩（ＣｌＯ−）  イオンを除去し、放射線誘発性次亜塩素酸塩およびＤＮＡ損傷を防ぐことを示した。次亜塩素酸イオンは、塩素化／酸化によりＤＮＡ塩基を修飾し、その後ＤＮＡ損傷を生じることが知られているので、我々の調査結果は、癌処置のための放射線療法または放射線への偶発的曝露に関連する正常組織の損傷の放射線防護剤としてＳＤＧが有用であり得ることを示している。
【０１７１】
実施例４
亜麻仁およびそのリグナンはベンゾアルファピレンの作用に対し保護する
亜麻仁、ＳＤＧおよびリグナン誘導体は、多段階の発癌プロセスを抑制することにより、タバコおよびその他の環境発癌物質に起因する肺腫瘍形成を軽減する（図２１）。この実施例では、動物モデルにおいて、リグナンＳＤＧがＮｒｆ２に調節される第２相解毒経路の調節、およびおそらくその他の機序を介して、化学防御活性を有することを示す実験が提供される。ＳＤＧの保護作用は、直接的ＲＯＳ除去作用および／または間接的抗酸化／抗炎症特性、ならびに発癌性物質毒性およびＤＮＡ損傷の低減により媒介される。
【０１７２】
レドックス感受性蛍光染料により検出されるように（図２３）、タバコおよび環境の発癌物質ベンゾアルファピレン（ＢａＰ）へのマウス上皮細胞の暴露により、有害な活性酸素種（ＲＯＳ）が誘導される。発癌性物質への暴露後、早くも２時間後に、蛍光強度の明確な増加により細胞中のＲＯＳの生成が示される。
【０１７３】
細胞中でＳＤＧが発癌性物質により誘発されたＤＮＡ酸化損傷を低減させることを示すために、ＳＤＧ（１０μＭ）を、２５μＭのＢａＰに暴露したヒト上皮細胞（Ａ５４９）に加え、質量分析を使って、８−オキソ−７，８−ジヒドログアニン（８−オキソ−ｄＧｕｏ）の存在により示される、ＤＮＡに対する酸化的損傷を検出した。ＳＤＧは、発癌性物質曝露後、３および６時間でＤＮＡ損傷を低減化した（図２２）。同様に、ＳＤＧが発癌性物質曝露由来のＲＯＳ生成を阻止することを示すために、マウス上皮細胞を、１０または２０μＭのＢａＰおよび濃度増加のＳＤＧ（０、０．１、０．５、１、５μＭ  ＳＤＧ）に暴露し、２時間後にＲＯＳを検出した。ＳＤＧは有害なＲＯＳを無視できるレベルまで除去した（図２４）。
【０１７４】
同様に、ＳＤＧは、ＢａＰに暴露されたヒト上皮細胞中の遺伝毒性ストレスを防ぐ。ＢａＰなどの強力な発癌性物質への細胞の暴露は、ｐ５３タンパク質のレベルの増加により示される遺伝毒性ストレスを誘発する（図２５）。これは、５、１０、２５および５０μＭの濃度のＳＤＧの存在により、用量依存的に軽減される。ＳＤＧはまた、ＢａＰに暴露されたヒト上皮細胞中の酸化的ＤＮＡ損傷を防ぐ。ＢａＰなどの強力な発癌性物質への細胞の暴露は、二重鎖ＤＮＡ切断のマーカーであるγ−Ｈ２ＡＸのレベルの増加により示されるＤＮＡ酸化損傷を誘発する（図２６）。これは、５、１０、２５、５０および１００μＭの濃度のＳＤＧの存在により、用量依存的に軽減される。さらに、ＳＤＧは、ＢａＰに暴露されたヒト上皮細胞中のＤＮＡ付加物形成を防ぐ。ＢａＰなどの強力な発癌性物質への細胞の暴露は、ＤＮＡ付加物の形成を誘発する（図２７）。ＤＮＡ付加物は、発癌性物質に共有結合されるＤＮＡの断片であり、悪性病変の発生に直接関連する。ＤＮＡ付加物レベルは、単独でまたは組み合わせて加えられるＳＤＧまたはその代謝物ＥＤおよびＥＬの存在により低減される。
【０１７５】
亜麻仁およびそのリグナンは、化学的発癌性物質誘発性肺腫瘍のマウスモデルで保護を提供する。マウス（Ａ／Ｊ系統）に、タバコおよび環境発癌物質ＢａＰを腹腔内に１ｍｇ／Ｋｇ用量で４回注射投与（週１回）した（図２８）。マウスは亜麻仁またはリグナン食餌を曝露時に開始する。曝露後の種々の時間にマウスを評価し、腫瘍量、マウスの体重、全体の健康プロファイルを特定した。
【０１７６】
亜麻仁はマウス中の腫瘍量を低減させる
図２９は、ＢａＰ曝露および食用亜麻仁投与の数ヶ月後のマウス肺の代表的臨床的画像を示す。図３０は、ＢａＰ曝露および食用亜麻仁投与の数ヶ月後のマウス肺の代表的Ｈ＆Ｅ染色肺切片を示す。対照食餌（上段パネル）または亜麻仁（下段パネル）を摂取したマウスの矢印で示される結節は、亜麻仁摂取マウスで小さいように見える。それぞれのパネルは、異なる動物を表す。
【０１７７】
全体の腫瘍面積および結節サイズについて、画像解析ソフトウエアを使って、組織学的マウス肺切片を形態学的に評価した（図３１ＡおよびＢ）。亜麻仁食餌を摂取したマウスの腫瘍により占められる肺の面積において有意な減少があった（ｐ＜０．０３）。同様に、より小さい腫瘍結節サイズの傾向があった。肺当たりの腫瘍結節の全数（図３２Ａ）および肺に浸潤している腫瘍％（図３２Ｂ）についても、組織学的マウス肺切片を同様に形態学的に評価した。亜麻仁補充による、肺当たりのより少ない腫瘍結節（Ａ）およびより少ない腫瘍浸潤（Ｂ）の傾向が認められた。
【０１７８】
最終的に、亜麻仁補充がＢａＰにより誘発される肺癌による消耗作用を防止することが示された。動物重量をＢａＰ曝露後２００日にわたり長期的に測定した。亜麻仁食餌を摂取し、ＢａＰに暴露されたマウスは、対照食餌を摂取してＢａＰに暴露されたマウスより高い重量を示した（図３３）。
【０１７９】
実施例５
亜麻仁およびそのリグナンは、アスベスト誘発性損傷から細胞および組織を保護する
緒言
悪性中皮腫（ＭＭ）は、破壊的な、有痛で致死タイプの、治療および処置の現実的な見込みのない癌である。ＭＭの発生は、アスベスト繊維への暴露に直接結びつけられてきた。最近の調査は、アスベスト誘発性癌の発病が、残留性アスベスト繊維により引き起こされる慢性炎症および酸化的組織損傷に起因することを示している。全粒粉亜麻仁（ＦＳ）は、既知の抗酸化、抗炎症および癌化学防御特性を有する。この実施例では、食餌中に添加されたリグナンセコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）に富むＦＳおよびそのリグナン成分（ＦＬＣ）の、急性のアスベスト誘発性炎症および炎症性サイトカイン放出を防ぐ能力をＮｆ２＋／ｍｕｔ、Ｃｄｋｎ２ａ＋／ｍｕｔマウスで試験した。
【０１８０】
材料と方法
マウスの食餌およびアスベストへの曝露
リグナンセコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）に富むＦＳおよびそのリグナン成分（ＦＬＣ）をげっ歯類固形飼料に与えた。マウス（Ｎｆ２＋／ｍｕｔ、Ｃｄｋｎ２ａ＋／ｍｕｔ）に、単回の４００ｍｇの青石綿アスベストのｉｐボーラスの１日後（＋１）または１日前（−１）に、１０％ＦＳまたは１０％ＦＬＣ補充食餌を与え、３日後に腹部炎症および炎症促進性サイトカイン放出について評価した（図３４参照）。ＮＦ２マウス株はアスベストへ暴露時に急速進行型のＭＭを発症するので、この株を選択した。
【０１８１】
組織採取および分析
液体クロマトグラフィー、タンデム型質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を使って、哺乳類リグナンエンテロラクトン（ＥＬ）およびエンテロジオール（ＥＤ）などの亜麻仁リグナン代謝物の全身レベル（すなわち、血漿）を評価して、ＦＳがこのマウス株の腸管内菌叢により効果的に代謝されること、およびレベルがその他のマウスモデルのものと同等であることを確認した。
【０１８２】
ＰＢＳを使って腹部洗浄を行い、サイトスピン分析を使ってマクロファージ（ＭＦ）および好中球（ＰＭＮ）のレベルを決定した。
【０１８３】
考察
液体クロマトグラフィー、タンデム型質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を使って、哺乳類リグナンエンテロラクトン（ＥＬ）およびエンテロジオール（ＥＤ）などの亜麻仁リグナン代謝物の全身レベル（すなわち、血漿）を評価し、ＦＳがこのマウス株の腸管内菌叢により効果的に代謝されること、およびレベルがその他のマウスモデルのものと同等であることを確認した（図３７）。マクロファージ（ＭＦ）および好中球（ＰＭＮ）の腹部洗浄液レベルは、ＦＳおよびＦＬＣの両方が、アスベストにより誘発された急性腹部炎症を低減させたことを示した（図３６および３８）。さらに、炎症促進性サイトカインＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βのレベルもまた、食用薬剤により低減された（図３７および３８）。
【０１８４】
結論：これらの調査結果は、亜麻仁およびそのリグナン成分の化学防御特性は、アスベスト誘発性組織および細胞損傷からの保護にまで及ぶ。したがって、亜麻仁は悪性中皮腫の化学防御の際の食用薬剤として使用できる。
【０１８５】
実施例６
インビボでのＳＤＧ投与の用量および動力学の最適化
この実施例では、水溶性の形態でＳＤＧを経口胃管投与されたマウスでの薬物動態学、バイオアベイラビリティ、および用量反応に関するデータが提供される。
【０１８６】
投薬調査：５、２５、５０および１００ｍｇ／ｋｇ体重のＳＤＧ用量をマウスに（各用量ｎ＝５）経口投与し、４時間後、分析用に組織を集めた。ＳＤＧおよびその生理活性代謝物ＥＤ、ＥＬおよびＳＥＣＯの血漿中濃度を液体クロマトグラフィーおよび質量分析により分析し、ｎｇ／ｍＬで表した（図３９）。また、ＳＤＧおよびその代謝物の細胞内標的であるＮｒｆ２調節抗酸化酵素（ＡＯＥ）の遺伝子発現レベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲを使って同じ動物由来の肺組織で測定した（図４０）。ＨＯ１、ＮＱＯ１およびＧＳＴの遺伝子発現レベルは、わずか５ｍｇのＳＤＧ／Ｋｇでベースラインの２〜３倍に増加し、１００ｍｇ／ｋｇのＳＤＧで、平均でベースラインの６倍に達した。遺伝子レベルは、肺組織中のタンパク質レベルにおける、低いがそれでも有意な増加により裏付けられる。
【０１８７】
薬物動態学的調査：有意なＡＯＥ発現を誘発し同時に循環中のＳＤＧの検出が可能な用量である１００ｍｇ／ｋｇを選択後、薬物動態学的調査を行って、標的組織（すなわち、肺）中のバイオアベイラビリティおよび生物学的効果を決定した。１５分、３０分、および１、２、４、６、８、１２時間に血液試料ならびに組織（肺、脳、肝臓、腎臓、脾臓）を収集した。上記のように血漿および肺中のＳＤＧレベルを決定した（図４１）。１００ｍｇのＳＤＧ／ｋｇの単回用量は十分に吸収され、インタクトＳＤＧは循環中で投与後６時間まで（図４１Ａ）検出可能であり、およびフラッシングされた、血液不含肺組織中で４時間検出可能であった（図４１Ｂ）。ＳＤＧの血漿および肺組織中の濃度は、３０分でそれぞれ０．８および１２．６μＭのレベルに達した。注目すべきことに、代表的なＡＯＥ遺伝子発現レベル（ＨＯ−１、ＮＱＯ１、ＧＳＴ）の明確な誘発が、ベースラインに対して有意に上昇した（ｐ＜０．０５）（図４１Ｃ）。観察された遺伝子発現の増加は、ウェスタンブロッティングで測定したタンパク質レベルの増加と相関した（図は示さず）。重要なことに、同じ用量で毎日２回７日間投与されたＳＤＧは、不耐性も毒性も示さなかった。これらのデータは、この可溶性ＳＤＧ形態により、有意なバイオアベイラビリティおよび効力を得られることを示す。したがって、ヒトの治療でのＳＤＧの使用が大いに促進され、毒性のリスクはありそうにない。したがって、５０〜１００ｍｇ／Ｋｇ（１日当たり１または２ｍｇのＳＤＧ）の用量が、標的組織中で予測される保護効果を誘導するのに十分であり、さらなる調査に使用できる。
【０１８８】
実施例７
Ｎｒｆ２欠損マウス中のＢａＰ誘発性肺腫瘍形成における発癌の開始期または促進期に対するＳＤＧの効果
肺傷害モデルからのデータは、食餌中のＦＳおよびＦＳ由来ＳＤＧは、肺中のＮｒｆ２およびＮｒｆ２活性化遺伝子ならびにタンパク質を発現増加させ得ることを示す。この実施例では、Ｎｒｆ２ノックアウトマウスを使って、この経路の活性化がＳＤＧの化学防御作用の重要な機序であるという仮説を試験し、ＳＤＧが発癌の開始期および促進期の両方において活性を有するかどうかを明確にする。
【０１８９】
Ｎｒｆ２欠損マウスにおけるＳＤＧの効果
これらの実験では、野性型Ａ／Ｊマウス中でのＢａＰ誘発性肺癌モデルで経口投与した合成ＳＤＧの効果を、Ａ／Ｊ背景（我々の動物施設で現在維持しているコロニー）に戻し交配したＮｒｆ２欠損マウスと比較した。簡単に説明すると、１つの野性型（ＷＴ）マウス群および１つのノックアウト（ＫＯ）マウス群に対照食餌を摂取させる。１つのＷＴマウス群および１つのＫＯマウス群にＳＤＧをそれらの飲料水経由で投与し、図４２Ａに示すように、毎日５０および１００ｍｇ／ｋｇのＳＤＧ消費を達成する（肺癌の発症の抑制における用量反応関係を試験するため）。ＳＤＧ投薬調査および動力学により、ＳＤＧは少なくとも数日間投与されるべきであり（これは、食餌が組織中で定常状態に達するために必要な最小限の時間であると決定されたため）、続けて、毎週４回の１ｍｇ／マウスのベンゾ［ａ］ピレン（ＢａＰ）のｉ．ｐ．注射が必要であると決定された。経口投与（経口胃管で、または飲料水に入れて）される５０および１００ｍｇ／ｋｇのＳＤＧはいずれも、肺中で相酵素発現を誘発できる（図４１参照）。４、６および９ヶ月でマウスを屠殺し（図４２Ｂ参照）、肺組織をａ）画像解析による腫瘍量の組織評価および定量、ｂ）Ｎｒｆ２調節ＡＯＥ発現および酸化ストレスのウェスタンブロット検出、ｃ）マウス組織および尿中の８−オキソ−７，８−ジヒドロ−２’−デオキシグアノシン（８−オキソｄＧｕｏ）レベル、およびｄ）ＤＮＡ付加物形成のために、採取した。マウスのサブセットをａ）管支肺胞洗浄検査、およびｂ）ＣＤ１１ｂ／Ｌｙ６Ｇ、ＣＤ１１ｂ／Ｆ４／８０、および抗ＣＤ３に対する抗体をそれぞれ用いる好中球、活性化マクロファージおよびＴ細胞などの炎症細胞のＦＡＣＳ分析、を使って肺炎症について評価する。
【０１９０】
統計：統計的有意性を得るために群当たり必要とされるマウスの数は、２０マウス／群と示唆された。
【０１９１】
分析：上記のように（図２９および３１）、５０および１００ｍｇ／ｋｇのＳＤＧを与えられるＷＴマウスでは、腫瘍の数とサイズの減少が予測されるが、１００ｍｇ／Ｋｇ用量での結果はさらに著しい（より少ない腫瘍）。対照（薬剤なし）を与えられるＮｒｆ２  ＫＯマウスでは、ＢａＰを解毒する能力の喪失のために、対照食餌摂取ＷＴマウスに比べた場合、より多くの数の腫瘍が予測される。しかし、ＳＤＧの主要な効果はＮｒｆ２活性化を介して媒介されるので、ＳＤＧを受けているＮｒｆ２  ＫＯマウスでの腫瘍の減少は予測されない（薬剤を与えられていないＫＯマウスに比較して）。Ｎｒｆ２／ＳＤＧマウスでの腫瘍量において認められる減少が何であっても、ＳＤＧの直接的フリーラジカル除去効果などの、同様に寄与している他の機序に起因するものであり、これらは酸化ストレスのマーカーの測定により検出可能なはずである。
【０１９２】
発癌の開始期および／または促進期におけるＳＤＧおよびＮｒｆ２活性化の役割
上記データは、ＢａＰの開始期および促進期の両方の期間中のＳＤＧ投与に関する明確な機序的データを提供すると期待される。開始期中のみ（図４２Ａ、プランＢ）または促進期中のみ（図４２Ａ、プランＣ）のＳＤＧ補充の効力を明確にすることも興味あることである。したがって、このスキーマで概要を述べた実験を、これらの異なる給餌スケジュールを用いて野性型Ａ／Ｊマウスで行った。
【０１９３】
分析：促進期または開始期中にＳＤＧを投与する場合、腫瘍数およびサイズの減少が予測される。上記のように、調査はＮｒｆ２  ＫＯマウスで繰り返され、この活性への第２相酵素発現上昇の寄与を明確にする。発癌中にＮｒｆ２は２つの役割を有し、その１つは腫瘍形成開始期中に防止的であり、２つめは悪性進行を促進することが、最近報告された。これらの調査結果は、肺癌における悪性の進行を防ぐためのＮｒｆ２の使用を示唆し、一方、Ｎｒｆ２活性化剤は肺癌予防にさらによく適合することを示唆する。ＳＤＧは化学防御剤として効果的であることが予測される。ＳＤＧの抗発がん性効果におけるＮｒｆ２の役割にもかかわらず、例えば、全身性体液（血液）または肺組織におけるｍｉＲＮＡの調節などの他の機序もまた関与し、またはより重要であることもあり得る。
【０１９４】
喫煙者へのＳＤＧ補助剤の投与の、酸化ストレスの全身性および肺特異的バイオマーカーに対する効果
遺伝的および生化学的評価項目によるＳＤＧの経口投与の遺伝的および生化学的臨床試験がデザインされる。
【０１９５】
選択集団：第１群は、喫煙経験の全くない健常なボランティアからなる。この群は、「非誘導」環境におけるＳＤＧ補充により誘発される変化を評価するために、目的の遺伝子および酸化バイオマーカーの真のベースラインレベル（おそらく低い）の評価を可能とする。第２群の被験者は、現行の喫煙者から構成されるであろう。この群は、次の理由で選択される：ｉ）彼らは活発な癌形成開始の高いリスクがあり、化学防御試験における潜在的被験者である、およびｉｉ）喫煙が呼吸上皮でそれ自身のゲノム変化、ならびに活性な酸化ストレスを誘発することが以前に示されている。この群は、喫煙者のゲノムおよび酸化ストレスマーカーのプロファイリングを可能にし、既に「活性化された」環境中でどのようなゲノム変化がＳＤＧにより誘発されるのかを決定することを可能にする。この群はまた、この高いリスク集団における上昇した酸化ストレスマーカーのＳＤＧによる減少の測定を可能にする。それぞれの患者がまたプラセボ対照およびＳＤＧ補助剤の両方（両方ともゼラチンカプセル剤で投与される）を摂取する、クロスオーバーデザインが選択される（図４３参照）。
【０１９６】
投与量：ＳＤＧ含量の大きなばらつきを避けるために市販調製物（ＢＲＥＶＡＩＬ（商標））を選択し、バイオアベイラビリティを未処理または粉砕した亜麻仁の異なるバッチで観察した。あるいは、Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０１３，（１９）：５３２５に記載のものなどの合成ＳＤＧを使用する。薬理的調査で、５０ｍｇのＳＤＧを含むこの配合物での毎日投薬により、癌の減少に関連する最高五分位で認められるものに類似のＥＮＬレベル（中央値、６３ｎｍｏｌ／Ｌ）を産生したことが示された。
【０１９７】
臨床試験：試験は、単一施設、無作為化、二重盲検、２期クロスオーバー試験となろう。１ヶ月の休薬期間が介在する２つの３週間処置期間が存在する（図４３）。クロスオーバーデザインの原理は、被験者内の処置の比較が、すべての「被験者効果」を比較から取り除き、試験の効率と検出力を高めるということである。２０人の健康なボランティア（１０人の喫煙者および１０人の生涯非喫煙者）は無作為化されて、順に、５０ｍｇのＳＤＧ（１カプセルのＢＲＥＶＡＩＬ（商標）または合成ＳＤＧ）を毎日３週間摂取し、続けて１ヶ月休薬期間の後、プラセボ（同じ提供者（Ｌｉｇｎａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）による、ＳＤＧ不含の同じカプセル）をさらに３週間摂取するか、またはプラセボを３週間、１ヶ月の休薬期間、およびその後に５０ｍｇのＳＤＧを３週間摂取する。口腔上皮（口腔スワブ）、呼気凝縮液、尿および血液をベースライン、ならびに２、３、７、９、および１０週に取得する。現行の喫煙状態は尿中コチニンアッセイにより確認される。試験は、ペンシルベニア州立大学治験審査委員会で承認され、全参加者は書面でのインフォームドコンセントを提出する。包括的喫煙歴や受動喫煙（ＥＴＳ）を含むベースラインでの詳細なアンケート調査が実施される。参加者は、副作用の調査、試験薬剤摂取に対する遵守、一時的タバコおよび薬物使用に関するデータ収集ならびに試料収集のために毎週診察される。
【０１９８】
統計の根拠／検出力分析：目的とする主要な比較は、尿中８−オキソ−７，８−ジヒドロ−２’−デオキシグアノシン（８−オキソ−ｄＧｕｏ）により測定される尿中酸化ストレスの変化、呼気凝縮液の変化（試験的なもの）、およびＳＤＧ処置後の試験被験者の口腔内上皮における遺伝子発現レベルの変化である。２０人の患者は、この予備的な試験に対し合理的な検出力を提供すると想定される。この試験の性質のために、多重比較に対し補正を適用しない。試験は、ＳＤＧ補助剤の効果の評価が得られるようにデザインされる。また、持ち越し効果の試験に対する検出力は限られているが、４週間の休薬期間はこれらの懸念を不要にするはずであるということに留意されたい。
【０１９９】
経口ＳＤＧ摂取後の口腔内スワブ上皮細胞中の遺伝子発現変化の評価
これらの実験では、口腔内粘膜の上皮細胞を気管支上皮組織の代用組織として使用する。このような細胞は、侵襲的気管支鏡検査を必要とする気管支上皮細胞より容易に得られる（すなわち、単に頬の綿棒によるふき取りを用いて）。ヒトでのこの手法の妥当性は、口腔内上皮が遺伝子アレイ調査で気道気管支組織の代用組織として機能し得るという証拠により裏付けられる。
【０２００】
この手法は、マウスで摂食ＦＳを使用することによりさらに検証された。マウスに対照または１０％ＦＳ食餌を３週間給餌した後、一連の組織を採取し、２つの代表的なＮｒｆ−２誘導可能タンパク質（ＨＯ−１およびＮＱＯ１）の発現を、免疫ブロット法により分析した。これらのマーカーの肺および肝臓における著しい増加が認められた（データは示さず）。重要なことに、両タンパク質の鼻上皮での明確に検出可能な増加が認められ（図４４）、したがって、鼻咽頭組織も肺の代用品として使用できることを実証する。また、ヒトでのこの手法を裏付けるいくつかの実施可能データも存在する。全粒粉ＦＳ（毎日４０ｇ）を２人の健康なボランティアに投与した。口腔内スワブを採取し、ＲＮＡをうまく抽出し、ｃＤＮＡを作製した。Ｎｒｆ２依存性遺伝子ＨＯ−１の相対的発現レベルを測定した。図４５に示すように、ＨＯ−１のｍＲＮＡ発現は、１人の被験者で３４％、２人目の被験者で６３％増加した（ｐ＜０．０５）。これらのデータは、この手法が実施可能であり、健常なボランティアにおいて、ＦＳおよびＳＤＧがＮｒｆ２依存性遺伝子を増幅することを示す。
【０２０１】
この試験では、ベースラインで、および繊維対照およびＦＳ食餌の２および４週後に、対照および喫煙被験者の両方で口腔内スワブを採取した。ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡが上記のように生成され、ＲＴ−ＰＣＲに供して、ＮＱＯ−１、ＨＯ−１、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含む代表的な抗酸化剤および第２相薬物代謝酵素の相対的発現レベルを評価する。Ｎｒｆ２誘導可能酵素の「典型的な」代表的物質であることに加えて、選択した酵素は重要な機構的役割を演ずる可能性もある。ＮＱＯ１は、タバコの煙中に存在する前発癌物質の解毒および活性化の二重の役割を果たす。ＮＱＯ１の変異遺伝子型は、日本人被験者での肺癌リスクの低下と有意に関連していた。ＨＯ−１もまた、遺伝的調査で、シガレットの煙中の酸化剤および芳香族炭化水素に対する細胞保護剤と示唆されている。したがって、ＨＯ−１はまた、亜麻仁の効果をモニターするための重要なバイオマーカーでもある。多くの調査で、ＧＳＴ多型、喫煙、および肺癌の間の関係が示された。重要なのは、肺細胞中のベンゾ［ａ］ピレン由来ＤＮＡ付加物が、肺特異的ＧＳＴによりチトクロムＰ−４５０およびアルド・ケト還元酵素の両方が媒介する代謝から生じる反応性中間体の解毒により調節されることである。ベンゾ［ａ］ピレンは重要な肺発癌性物質でありタバコの煙中に存在するので、ＧＳＴは、喫煙者における亜麻仁の効果のバイオマーカーとしてモニターされる。
【０２０２】
データ分析：５人の健康な非喫煙ボランティアの口腔内スワブ由来の大きなｃＤＮＡプールを作成し、分析用の「ベースライン」コンパレータとして使用する。β−アクチンおよびＧＡＰＤＨを使って、全試験試料由来のｃＤＮＡをこのプールに正規化する。正規化した後、それぞれの試験試料をベースラインコンパレータと比較し、パーセントまたは倍率変化を計算する。一次解析は、喫煙未経験者および現行喫煙者におけるＳＤＧ摂取の３週間前および３週間後の遺伝子発現の変化を比較することである（対応のあるｔ検定を使って）。値はまた、それらのプラセボ対照試料の値と比較される。追加の分析により、休薬値（反復測定ＡＮＯＶＡ）、およびベースライン時点ならびにＳＤＧおよびプラセボ摂食後の非喫煙者と喫煙者との間の比較を含む、すべての時点にわたるＳＤＧによる発現の変化が比較される。２対３週のデータおよび３週対休薬データを比較して、反応の動力学が確立される。
【０２０３】
同じ患者集団中でのＳＤＧによる酸化ストレス減少の測定
ヒト被験者中の酸化ストレスを測定するのは難しいが、最も確立された手法の１つは、ＩｓｏＰの尿中レベルを測定することである。このマーカーに対し信頼性が高く再現可能なアッセイが開発されてきた。４０ｇのＦＳを１３週まで摂取した、肺移植を待っている患者からデータを入手した。尿ＩｓｏＰは徐々に低下することがわかったが、ＦＳ摂食により、全身の酸化ストレスの低下徴候が認められた（一部のＩｓｏＰサブカテゴリはＦＳ前レベルの２６％に低下した）。代表的な患者のデータを図４６に示す。シガレット煙中の発癌性物質であるＢａＰは、活性酸素種媒介ＤＮＡ鎖切断および８−オキソ−７，８−ジヒドロ−２’−デオキシグアノシン（８−オキソ−ｄＧｕｏ）形成を引き起こす。８−オキソ−ｄＧｕｏは、ＬＣ−ＭＲＭ／ＭＳを使って、生物検体（尿、肝臓、肺）中で検出可能である。２人のヒトボランティア由来のデータは、毎日４０ｇのＦＳの３週間の消費が８−オキソ−ｄＧｕｏの減少の傾向を誘発することを示し、傾向はまた、同じ食餌を摂取した肺移植患者（ｎ＝５）でも認められた（図４７）。
【０２０４】
試験：試験では、対照および喫煙被験者の両方で尿試料が複数の時点で採取される。尿中ＩｓｏＰおよび８−オキソ−ｄＧｕｏのレベルが盲検方式で測定される。
【０２０５】
肺酸化ストレスを評価するための呼気凝縮液
これらの被験者で気管支鏡検査のような侵襲的試験を行うことが可能でないことを考慮して、非侵襲的試料収集技術である呼気凝縮液（ＥＢＣ）が、肺酸化ストレスを調査するために使用される。多くの物質が呼気中に認められ、それらは呼気の冷却により（すなわち、凝縮させることにより）得られる液体中で検出可能である。この方法の利点は、肺中の酸化ストレスバイオマーカーのリアルタイム分析および評価のための非侵襲的サンプリング方法として、非侵襲的で簡便であることである。酸化ストレスのバイオマーカーには、Ｈ２Ｏ２、イソプロスタン（ＩｓｏＰ）、マロンジアルデヒド、４−ヒドロキシ−２−ノネナール、抗酸化剤、グルタチオンおよびニトロソ化ストレスマーカーが含まれる。ＥＢＣ中のイソプロスタンレベルを、肺酸化ストレスに対するＦＳの効果を調査する有用な非侵襲的手法として評価する。８−ＩｓｏＰは、対照被験者および喫煙者から収集したＥＢＣ由来の尺度であった。非喫煙者でのレベルは一律に低くて、試験感度（１．２ｐｇ／ｍｌ±０．６、ｎ＝８）に近く、ＥＢＣは非喫煙者では有用ではないことを示唆する。レベルは、４人の喫煙者でのみ測定されたが、興味深いことに、これらの被験者の内の２人は、極めて高レベル：１６ｐｇ／ｍｌおよび６．５ｐｇ／ｍｌであった。したがって、高ベースラインレベルを有するこれらの喫煙者では、ＥＢＣを肺特異的酸化ストレスを追跡するのに使用する。
【０２０６】
データ分析：それぞれの被験者に対してベースライン値が測定され、処置（３週間）の終了時にて認められる変化が、対応のあるｔ検定を使って評価される。追加の分析により、休薬値（反復測定ＡＮＯＶＡ）、およびベースライン時点およびＳＤＧ摂食後の非喫煙者と喫煙者との間の比較を含むすべての時点にわたる、ＳＤＧによる発現の変化が比較される。我々は、２対３週のデータおよび３週対休薬データを比較して、反応の動力学を確立できる。
【０２０７】
亜麻仁リグナン、ＳＤＧの化学防御特性
これらの実験では、ＳＤＧが生体異物からの毒性を減らし、スルホラファンに類似のＢａＰなどの発癌性物質を解毒できるという仮説が試験される。第１に、気管支上皮細胞に対するインビトロでのＳＤＧの効果が評価される。ＭＴＴアッセイなどの細胞傷害性試験を、下記の全てのＳＤＧ用量に対し行う。第２に、ＢａＰマウスモデル中に経口投与されたＳＤＧが評価される。
【０２０８】
正常なマウスおよびヒト一次肺上皮細胞でのＢａＰのＳＤＧ媒介性解毒の評価およびＮｒｆ２媒介性の第２相酵素発現の誘発
ＢａＰ（１０または２０μＭ）は、上皮細胞により代謝的に活性化された場合、用量および時間依存的形式でＲＯＳを誘導する（図２３）。マウスの調査では、不死化Ｃ１０マウス気管支細胞株（Ｂａｌｂ／Ｃマウス由来）が使用される。理由は、これらの細胞は非腫瘍形成性であり、接触阻害され、調査下にある全てのＮｒｆ２調節機構を含むためである。Ａ５４９細胞（形質転換されているが、高度に分化された肺癌細胞株であり、ヒト１型肺胞上皮細胞のモデルに使われ（図２２〜２３のデータ参照）、かつ重要なことに、一次気管支上皮細胞である）を使って類似の調査が行われる。
【０２０９】
直接的なＲＯＳ妨害を評価するために、一連の臨床的に意義のある濃度（０．１〜１０μＭ）のＳＤＧが１０μＭのＢ［ａ］Ｐと同時に加えられ、直接的抗酸化活性を示す、Ｈ２ＤＣＦ蛍光の減少について測定される。液体クロマトグラフィー／多重反応モニタリング質量分析（ＬＣ／ＭＲＭ−ＭＳ）もまた、ＧＳＳＧ：ＧＳＨ比を測定するためのものである。ＢａＰはまた、ＬＣ−ＭＲＭ／ＭＳを使って測定できるＤＮＡ付加物形成を迅速に誘発できる（図２２）。ＢａＰにより引き起こされるＢａＰ誘発性ＤＮＡ酸化損傷は、８−オキソ−ｄＧｕｏ形成、標準的コメット画像解析を使う個々の細胞のテイルモーメント（データは示さず）、またはγ−Ｈ２ＡＸの検出のための免疫ブロットの濃度分析（データは示さず）により測定できる。ＤＮＡ付加物および酸化的変化を評価するために、一連の濃度のＳＤＧが１０μＭのＢ［ａ］Ｐと同時に加えられ、これらのパラメータが測定される。さらに、ＭＴＴ細胞傷害性アッセイを行って、発癌性物質の非存在下および存在下のこれらの細胞に対する直接的ＳＤＧ効果が評価される（ＦＳおよびＦＬＣのみがインビボで試験され得る）。次に、気管支上皮細胞中の第２相酵素を発現上昇させる精製ＳＤＧの能力が試験される。特に、リグナンＳＤＧ（０．１〜１０μＭ）処理を伴うインキュベーションの０、１、２、４、２４、４８、および７２時間後のＧＳＴ−Ｙａ、ならびにＮＱＯ−１のメッセージおよびタンパク質の誘導が測定される。これらの酵素は、第２相システムの特徴的な代表的ＡＲＥ調節酵素として選択される。ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫ブロット分析が実行される。第２相酵素発現上昇の経時変化を特定した後、上皮細胞をＳＤＧで前処理し、最大の第２相誘導の時点でＢａＰを加える。上記アッセイを使って、酸化ストレス、ＤＮＡ損傷、および細胞死が評価される。
【０２１０】
データ分析、予測される結果および追加の調査：第１セットの調査は、ＳＤＧの直接的抗酸化効果を明確にする。第２セットの調査は、ＳＤＧそれ自体が消失する、後の時点で行われ（したがって、直接的抗酸化効果は存在しない）、その第２相酵素誘発効果によるＳＤＧの効果を明確にする。酸化ストレスおよび炎症の追加の測定を行って、血漿酸化ストレス測定値（血漿マロンジアルデヒド）および炎症促進性のストレスマーカー（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１α、ＩＬ１β、ＴＮＦ−α、Ｃ反応性タンパク質）のＳＤＧによる低下を明確にする。
【０２１１】
Ａ／Ｊマウス化学発癌性物質誘発性肺腫瘍形成のマウスモデルにおける、ＳＤＧの化学防御特性
上記（図４２Ａ、プランＡ）と同じ試験デザインにより、Ａ／Ｊマウス肺でのＢａＰ誘発性発癌の進行に対する経口投与ＳＤＧの効果が調査される。ＳＤＧ補充マウスが対照と直接比較される。追跡調査試験が行われ、これには、開始期中のみにＳＤＧを使った試験（図４２Ａ、プランＢ）、および促進期中のみにＳＤＧを使った試験（図２２Ａ、プランＣ）が含まれる。
【０２１２】
統計：動物試験は通常、２０匹のマウスの３群以上を含み（例えば、対照対５０ｍｇ／ＫｇのＳＤＧ）、ＡＮＯＶＡまたはその他の適切な線形モデルを使って解析される。全ての計算は、両側検定、０．０５のアルファレベル、および少なくとも８０％の検出力を前提とする。
【表１】
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【０２１３】
実施例８
アスベスト誘発性発癌に対するＳＤＧの効果
ＳＤＧまたは亜麻仁食餌は、アスベスト誘発性ＲＯＳ／炎症を減らし、１）ＲＯＳ、２）低減したサイトカイン、３）低減したＨＭＧＢ１、４）より少ない腫瘍化フォーカス、および５）より少ない腫瘍、をもたらすと仮定される。根底にある仮説は、低減された炎症および酸化ストレスが、細胞の低減された悪性転換およびより少ない腫瘍量をもたらすであろうということである（図４８参照）。
【０２１４】
亜麻仁リグナンＳＤＧがアスベスト誘発性炎症ならびに酸化およびニトロソ化ストレスを低減させるであろうという仮説を試験するために、マウス腹膜マクロファージを様々な濃度の青石綿アスベスト繊維（１０、２０、３０、および４０ｎｇ／ｃｍ２）に暴露した。アスベスト曝露後の種々の時間（３、４、６、および８時間）で、細胞をＳＤＧ（５０μＭ）と共にインキュベートし、２４時間後に上清を集め、炎症性のサイトカイン分泌およびニトロソ化／酸化ストレスを検出した（図４９）。
【０２１５】
ＳＤＧは、インビトロでヒト中皮細胞によるアスベスト誘発性ＲＯＳ分泌を低減させる（図５０）。細胞中のアスベスト誘発性ＲＯＳ検出するための実験プラン：（ヒト中皮の）ＨＭ細胞またはマウスマクロファージを２０％ＤＭＥＭ中で２４時間プレート培養した；ＨＢＳＳ中の２０μＭのＤＣＦを１時間加えた；Ｈ２Ｏ２（１００μＭ）、アスベスト（１０μｇ青石綿／ｃｍ２）および／またはＳＤＧ（５０μＭ）を含む１％ＤＭＥＭで上清を置換した；およびアスベスト曝露の開始後３６時間まで蛍光レベルをモニターした。結果は、アスベストおよびＨ２Ｏ２は高レベルのＲＯＳを誘導するが、培地中へのＳＤＧの添加がＲＯＳレベルをベースラインレベルまで有意に低下させたことを示す（図５０）。
【０２１６】
培養未処理マクロファージにおけるアスベスト誘発性酸化ストレス（ＲＯＳ放出）を評価した。細胞をＲＯＳ感受性染料Ｈ２ＤＣＦＤＡで３０分間処理した後、ビークル、４０μｇ／ｃｍ２アスベスト繊維、または４ｕＭ次亜塩素酸塩溶液に暴露し、９０、１５０分および２７時間にわたり、分光測定により蛍光強度を測定した。アスベスト曝露後直ちにアスベスト誘発性ＲＯＳが生成され、観察期間中持続した（図５１）。
【０２１７】
アスベストへの暴露数時間後にマクロファージに投与されたＳＤＧは、酸化ストレスを低減する（図５２）。雌Ｃ５７／Ｂｌ６マウスに２ｍＬのチオグリコレートを注射し、３日後に腹膜マクロファージを採取した。ウエル当たり２百万細胞を６ウエルプレートに播種し、２０μｇ／ｃｍ２のアスベストに暴露した。細胞を２５または５０μＭのＳＤＧ（合成ＳＤＧ）で、アスベスト曝露の３、４、６、または８時間後に処理した。細胞をアスベスト曝露２４時間後に採取した。凍結上清試料で分析を行った。結果は、脂質過酸化のマーカーであるマロンジアルデヒドが、アスベスト曝露時間と共に増加したことを示す（図５２Ａ）。細胞に加えられた２５および５０μＭのＳＤＧにより、ＭＤＡのレベルは、有意に減少した（ｐ＜０．０５）（図５２Ｂ）。
【０２１８】
アスベストへの暴露数時間後にマクロファージに投与されたＳＤＧは、ニトロソ化ストレスを低減する（図５３）。アスベスト曝露後の細胞中のニトロソ化ストレスの低減におけるＳＤＧを評価するために、雌Ｃ５７／Ｂｌ６マウスに２ｍＬのチオグリコレートを注射し、３日後に腹膜マクロファージを採取した。ウエル当たり２百万細胞を６ウエルプレートに播種し、２０μｇ／ｃｍ２のアスベストに暴露した。細胞を２５または５０μＭのＳＤＧ（合成ＳＤＧ）で、アスベスト曝露の３、４、６、または８時間後に処理した。細胞をアスベスト曝露２４時間後に採取した。凍結上清試料で分析を行った。結果は、ニトロソ化ストレスのマーカーである亜硝酸塩が、アスベスト曝露時間と共に増加したことを示す（図５３Ａ）。細胞に加えられた２５および５０μＭのＳＤＧにより、ＭＤＡのレベルは、有意に減少した（ｐ＜０．０５）（図５３Ｂ）。
【０２１９】
アスベストへの暴露数時間後にマクロファージに投与されたＳＤＧは、炎症性のサイトカイン（ＩＬ−１β）分泌を低減する（図５４）。アスベスト曝露後の細胞中の炎症性のサイトカイン（ＩＬ−１β）の分泌の低減におけるＳＤＧを評価するために、雌Ｃ５７／Ｂｌ６マウスに２ｍＬのチオグリコレートを注射し、３日後に腹膜マクロファージを採取した。ウエル当たり２百万細胞を６ウエルプレートに播種し、２０μｇ／ｃｍ２のアスベストに暴露した。細胞を２５または５０μＭのＳＤＧ（合成ＳＤＧ）で、アスベスト曝露の３、４、６、または８時間後に処理した。細胞をアスベスト曝露２４時間後に採取した。新しい上清試料で分析を行った。結果は、炎症促進性サイトカインのマーカーであるＩＬ−１βが、アスベスト曝露時間と共に増加したことを示す（図５４Ａ）。細胞に加えられた２５および５０μＭのＳＤＧにより、ＩＬ１βのレベルは、有意に減少した（ｐ＜０．０５）（図５４Ｂ）。
【０２２０】
アスベストへの暴露数時間後にマクロファージに投与されたＳＤＧは、炎症性のサイトカイン（ＴＮＦ−α）分泌を低減する（図５５）。アスベスト曝露後の細胞中の炎症性のサイトカイン（ＴＮＦ−α）の分泌の低減におけるＳＤＧを評価するために、雌Ｃ５７／Ｂｌ６マウスに２ｍＬのチオグリコレートを注射し、３日後に腹膜マクロファージを採取した。ウエル当たり２百万細胞を６ウエルプレートに播種し、２０μｇ／ｃｍ２のアスベストに暴露した。細胞を２５または５０μＭのＳＤＧ（合成ＳＤＧ）で、アスベスト曝露の３、４、６、または８時間後に処理した。細胞をアスベスト曝露２４時間後に採取した。新しい上清試料で分析を行った。結果は、炎症促進性サイトカインのマーカーであるＴＮＦ−αが、アスベスト曝露時間と共に増加したことを示す（図５５Ａ）。細胞に加えられた２５および５０μＭのＳＤＧにより、ＴＮＦ−αのレベルは、有意に減少した（ｐ＜０．０５）（図５５Ｂ）。
【０２２１】
簡単に説明すると、この実施例のインビトロ実験は、（１）ＳＤＧはヒト中皮細胞およびマウス未処理のマクロファージ中のアスベスト誘発性ＲＯＳを阻止する；（２）ＳＤＧはアスベストに暴露されたマウス腹膜マクロファージによる炎症性サイトカイン分泌を阻止する；および（３）ＳＤＧはアスベストに暴露されたマウス腹膜マクロファージ中の酸化ストレス（脂質過酸化）およびニトロソ化ストレス（亜硝酸塩レベル）を阻止する、ということを示す。これらのインビトロ実験は、アスベスト曝露による慢性炎症および最終的な悪性病変を低減することにおけるＳＤＧの有用性を明らかにするインビボ実験を支持する。
【０２２２】
したがって、２匹のマウスモデルを使ってＳＤＧがアスベスト誘発性中皮腫で試験され、この場合マウスは、アスベスト曝露後に中皮腫を発症し易い遺伝的素因がある。これらのモデルを使って、マウスへのアスベスト単回投与に対する亜麻仁およびＳＤＧの急性効果を評価する。また、亜麻仁およびＳＤＧがアスベスト誘発性急速進行型ＭＭのこれらのモデルにおける腫瘍の発生を抑制するかどうかを試験する（図５６）。
【０２２３】
ＳＤＧに富む亜麻仁リグナン食餌（ＦＬＣ）は、ＭＥＸＴＡＧマウス中のアスベスト誘発性腹部炎症を低減させる（図５７）。簡単に説明すると、６匹の雄ＭＥＸＴＡＧマウス（１０〜１２週齢）に０．５ｍＬの容積の４００μｇの青石綿アスベストをｉｐ注射した。アスベスト注射の前に、半分のマウスにＳＤＧに富むＦＬＣ食餌（３５％ＳＤＧ）を２週間与え、残りのマウスには標準食餌を与えた。３日後、マウスを５ｍＬのＰＢＳで洗浄し、洗浄液を上清および細胞計数用に採取した。サイトスピンを行い、３〜５個の別々の視野を計数し、全細胞の差異％を計算した。０％ＦＳ摂取マウスに比べて、１０％ＦＬＣ摂取マウスは、２６％の腹部洗浄液中ＷＢＣの減少があった（ｐ＝０．０１４）（図５７）。
【０２２４】
アスベストに暴露した７週齢雄ＮＦ２（１２９ｓｖ）（＋／−）マウスで急性期調査を行い、食餌により投与された亜麻仁およびリグナンＳＤＧ配合物の効果を評価した。ＮＦ２マウスのアスベスト暴露および亜麻仁／ＳＤＧリグナン配合物評価の実験計画を図５８に示す。簡単に説明すると、雄ＮＦ２（１２９ＳＶ）（＋／−）を０日目に腹腔内注射経由で４００μｇアスベストに暴露した。マウスは試験食餌（０％ＦＳ、１０％ＦＳ、１０％ＦＬＣ；各群ｎ＝２マウス）をアスベスト曝露の２４時間前（−１日目）に開始し、アスベスト曝露後３日目に屠殺した。５ｍＬ  １ｘＰＢＳを用いて腹部洗浄（ＡＬ）を行った。炎症細胞の流入は、アスベスト曝露後３日までにピークになり、９日までに次第に少なくなった。したがって、全てのその後の実験で、炎症を評価する時点として３日を選択した（図５９）。
【０２２５】
亜麻仁およびそのＳＤＧに富むリグナン成分は、アスベスト誘発性炎症を低減した（より若齢のマウス）（図６０）。全白血球（あう６０Ａ）は、食餌中のＦＳまたはＦＬＣ添加と共に減少したが、有意ではなかった。しかし、細胞間の差異、特にマクロファージレベルを見ると、レベルは、亜麻仁およびＳＤＧリグナン食餌の両方により有意に低減された（図６０Ｂ）。
【０２２６】
亜麻仁およびそのＳＤＧに富むリグナン成分は、アスベスト誘発性炎症を低減した（老齢マウス）（図６１）。腹部アスベストに暴露された老齢マウス（図６１Ａ）は、ただの３００，０００細胞／ｍＬに比べて、３，０００，０００ＷＢＣ／ｍＬの腹部洗浄液を示す（１０倍多い）ように、アスベストに対し、より感受性が高い。結果は、炎症細胞の好中球（図６１Ｂ）およびマクロファージ（図６１Ｃ）が両方とも、若齢マウス中よりも老齢マウス中で有意に多いことを示した。
【０２２７】
ＳＤＧ（食餌配合物で投与される）に富む亜麻仁リグナン抽出物は、老齢マウス中のアスベスト炎症を低減する（図６２）。雄ＮＦ２（１２９ＳＶ）（＋／−）マウスに４００μｇのアスベストを０日目に注射した（腹腔内）。マウスは試験食餌（０％ＦＳまたは１０％ＦＬＣ）をアスベスト曝露の前の週（−７日目）に開始し、アスベスト曝露後３日目に屠殺した。５ｍＬ  １ｘＰＢＳで腹部洗浄（ＡＬ）を行った（１ｍＬの腹部洗浄液を遠心分離し、上清を凍結した）。血漿を集めて、−８０℃で凍結した。洗浄液中の細胞を評価し、ＳＤＧに富む食餌により、全ＷＢＣおよび好中球、マクロファージおよび好酸球が全て有意に減少したことを示した。
【０２２８】
ＳＤＧ（食餌配合物で投与される）に富む亜麻仁リグナン抽出物は、老齢マウス中のアスベスト炎症性サイトカイン分泌およびニトロソ化ストレスを低減する（図６３）。雄ＮＦ２（１２９ＳＶ）（＋／−）マウスに４００μｇのアスベストを０日目に注射した（腹腔内）。マウスは試験食餌（０％ＦＳまたは１０％ＦＬＣ）をアスベスト曝露の前の週（７日目）に開始し、アスベスト曝露後３日目に屠殺した。５ｍＬ  １ｘＰＢＳで腹部洗浄（ＡＬ）を行った（１ｍＬの腹部洗浄液を遠心分離し、上清を凍結した）。血漿を集めて、−８０℃で凍結した。ＳＤＧに富む食餌により、サイトカインのＩＬ１βおよびＴＮＦα、ならびに亜硝酸塩のレベルが有意に低減した。
【０２２９】
簡単に説明すると、ＮＦ２マウスを使ったこれらのインビボ実験は、次のことを示している。（１）ＳＤＧに富む食餌を摂取したマウスは、腹部洗浄液ＷＢＣにより測定して、腹部炎症を有意に低減させた；（２）ＳＤＧに富む食餌は、腹部洗浄液中の好中球の数を低減させた；（３）炎症促進性サイトカイン、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαのレベルは、ＳＤＧに富む食餌を摂取したマウスで低減された；および（４）ＳＤＧに富む食餌を摂取したマウスは腹部洗浄液亜硝酸塩のより低いレベルを有し、アスベスト繊維への暴露により誘発されたニトロソ化ストレスの低減を示唆する。
【０２３０】
これらの実施例中のこれらの調査は、ＳＤＧの化学防御活性を実証する。ＳＤＧによる口腔内上皮中の第２相酵素の誘導および酸化ストレス低減を評価するために、より大規模のバイオマーカー調査が行われる。発癌性物質に露出された対象、例えば、以前のまたは現行の喫煙者での経口ＳＤＧの毎日投与後の酸化ストレスおよび炎症を測定する、追加の測定が行われる。かつこれらの測定には、血漿酸化ストレス測定（血漿マロンジアルデヒド）および炎症促進性のストレスマーカー（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１α、ＩＬ１β、ＴＮＦ−α、Ｃ反応性タンパク質、Ｆ２−イソプロスタン）の測定が含まれる。
【０２３１】
本発明の特定の特徴を本明細書で例証し、説明してきたが、当業者であれば、多くの修正、置き換え、変更、および等価物を思いつくであろう。したがって、追加の請求項は、全てのこのような修正および変更が、本発明の真の趣旨の範囲内に入る場合には、これらを包含することを意図していることは理解されよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ−Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ−Ｂ】
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【図１６Ｃ−Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ−Ｇ】
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【図１７Ａ−Ｂ】
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【図１７Ｃ−Ｄ】
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【図１７Ｅ−Ｆ】
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【図１８Ａ−Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８Ａ−Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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