(57)【要約】      （修正有）【課題】Sequencing by Synthesisアプリケーションにおけるヌクレオチドの取り込み効率を高める新しい修飾ヌクレオチドリンカーに関し、これらの修飾ヌクレオチドリンカーを調製する方法を提供する。【解決手段】下式の構造を含むヌクレオシドまたはヌクレオチド。2020015722.tif 000036【選択図】図１
2020015722.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンカーを介してフルオロフォアに共有結合するヌクレオシドまたはヌクレオチドであ
って、前記リンカーは式Ｉもしくは式ＩＩ、または両者の組み合わせの構造を含む、ヌク
レオシドまたはヌクレオチド：
【化１】
2020015722.tif 000029
（式中、R1は、水素または置換されていてもよいC1-6アルキルから選択され；
R2は、水素または置換されていてもよいC1-6アルキルから選択され；
R3は、水素、置換されていてもよいC1-6アルキル、-NR5-C(=O)R6、または-NR7-C(=O)-O
R8から選択され；
R4 は水素または置換されていてもよいC1-6アルキルから選択され；
R5 およびR7はそれぞれ独立して、水素、置換されていてもよいC1-6アルキル、置換さ
れていてもよいフェニル、または置換されていてもよいC7-12アラルキルから選択され；
R6およびR8はそれぞれ独立して、置換されていてもよいC1-6アルキル、置換されていて
もよいフェニル、置換されていてもよいC7-12アラルキル、置換されていてもよいC3-7シ
クロアルキル、または置換されていてもよい5〜10員ヘテロアリールから選択され；
【化２】
2020015722.tif 000030
の各メチレン反復単位は置換されていてもよく；
Xはメチレン（CH2）、酸素（O）、または硫黄（S）から選択され；
mは0〜20の整数であり；
nは1〜20の整数であり；
pは1〜20の整数である）。
【請求項２】
R1はメチルである、請求項１に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項３】
R2は水素である、請求項１または２に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項４】
R2は置換されていてもよいC1-6アルキルである、請求項１または２に記載のヌクレオシ
ドまたはヌクレオチド。
【請求項５】
R2はメチルである、請求項４に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項６】
mは0である、請求項１〜５の何れか一項に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項７】
mは1である、請求項１〜５の何れか一項に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項８】
nは1である、請求項１〜７の何れか一項に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項９】
式Ｉの構造はまた、式Ｉａにより表される、請求項１に記載のヌクレオシドまたはヌク
レオチド。
【化３】
2020015722.tif 000031
【請求項１０】
R3は置換されていてもよいC1-6アルキルである、請求項１に記載のヌクレオシドまたは
ヌクレオチド。
【請求項１１】
R3はメチルである、請求項１０に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項１２】
R3は-NH-C(=O)R6である、請求項１に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項１３】
R6はメチルである、請求項１２に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項１４】
R3は-NH-C(=O)OR8である、請求項１に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項１５】
R8はt-ブチルである、請求項１４に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項１６】
R4は水素である、請求項１、１０〜１５の何れか一項に記載のヌクレオシドまたはヌク
レオチド。
【請求項１７】
R4は置換されていてもよいC1-6アルキルである、請求項１、１０〜１５の何れか一項に
記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項１８】
R4はメチルである、請求項１７に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項１９】
Xはメチレンである、請求項１、１０〜１８の何れか一項に記載のヌクレオシドまたは
ヌクレオチド。
【請求項２０】
XはOである、請求項１、１０〜１８の何れか一項に記載のヌクレオシドまたはヌクレオ
チド。
【請求項２１】
XはSである、請求項１、１０〜１８の何れか一項に記載のヌクレオシドまたはヌクレオ
チド。
【請求項２２】
pは1である、請求項１、１０〜２１の何れか一項に記載のヌクレオシドまたはヌクレオ
チド。
【請求項２３】
pは2である、請求項１、１０〜２１の何れか一項に記載のヌクレオシドまたはヌクレオ
チド。
【請求項２４】
式ＩＩの構造はまた、式ＩＩｂ、式ＩＩｃ、式ＩＩｄ、式ＩＩｅ、または式ＩＩｆによ
り表される、請求項１に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【化４】
2020015722.tif 000032
【請求項２５】
前記ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、前記リンカーの左側に結合する、請求項１〜
２４の何れか一項に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項２６】
リンカーを介してフルオロフォアに共有結合するヌクレオシドまたはヌクレオチドであ
って、前記リンカーは式ＩＩＩの構造を含む、ヌクレオシドまたはヌクレオチド：
【化５】
2020015722.tif 000033
（式中、L1は空であるか、請求項１〜２４の何れか一項に記載のリンカーまたは保護部分
、もしくはその組み合わせを含み；
L2は置換されていてもよいC1-20アルキレン、置換されていてもよいC1-20ヘテロアルキ
レン、置換されていてもよい、置換芳香族基に中断されたC1-20アルキレン、または置換
されていてもよい、置換芳香族基に中断されたC1-20ヘテロアルキレンから選択され；
L3は置換されていてもよいC1-20アルキレン、または置換されていてもよいC1-20ヘテロ
アルキレンから選択され；
RAは水素、シアノ、ヒドロキシ、ハロゲン、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、C1-6ハロ
アルキル、C1-6ハロアルコキシ、またはアジドから選択され、
【化６】
2020015722.tif 000034
の反復単位の少なくとも１つはアジド基を含み；
Zは酸素（O）またはNRBから選択され；
RBおよびRCはそれぞれ独立して、水素、または置換されていてもよいC1-6アルキルから
選択され；
kは1〜50の整数である）。
【請求項２７】
L1は空である、請求項２６に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項２８】
L2は置換されていてもよいC1-20アルキレンである、請求項２６または２７に記載のヌ
クレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項２９】
L2はヘプチレンである、請求項２８に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項３０】
L2は、１つまたは複数の窒素原子を含む、置換されていてもよいC1-20ヘテロアルキレ
ンである、請求項２６または２７に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項３１】
前記C1-20ヘテロアルキレンの少なくとも１つの炭素原子はオキソ（＝O）で置換されて
いる、請求項３０に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項３２】
L2は置換フェニル基で中断されている、請求項２８〜３１の何れか一項に記載のヌクレ
オシドまたはヌクレオチド。
【請求項３３】
前記フェニル基は、ニトロ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、C1-6アルキル、C1-6アルコキ
シ、C1-6ハロアルキル、C1-6ハロアルコキシ、またはスルホニルヒドロキシドから選択さ
れる１つまたは複数の置換基で置換されている、請求項３２に記載のヌクレオシドまたは
ヌクレオチド。
【請求項３４】
kは2である、請求項２６〜３１の何れか一項に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド
。
【請求項３５】
L3は置換されていてもよいC1-20アルキレンである、請求項２６〜３４の何れか一項に
記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項３６】
L3はエチレンである、請求項３５に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項３７】
L3は、１つまたは複数の酸素原子を含む、置換されていてもよいC1-20ヘテロアルキレ
ンである、請求項２６〜３４の何れか一項に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項３８】
前記保護部分は、DNA損傷を防ぐ分子を含む、請求項２６〜３７の何れか一項に記載の
ヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項３９】
前記保護部分は、トロロックス、没食子酸、p-ニトロベンジル（pNB）、もしくはアス
コルベート、またはその組み合わせを含む、請求項３８に記載のヌクレオシドまたはヌク
レオチド。
【請求項４０】
RBは水素である、請求項２６〜３９の何れか一項に記載のヌクレオシドまたはヌクレオ
チド。
【請求項４１】
RCは水素である、請求項２６〜４０の何れか一項に記載のヌクレオシドまたはヌクレオ
チド。
【請求項４２】
式ＩＩＩの構造はまた、式ＩＩＩａ、式ＩＩＩｂ、または式ＩＩＩｃにより表される、
請求項２６に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド：
【化７】
2020015722.tif 000035
（式中、RDはニトロ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、C1-6
ハロアルキル、C1-6ハロアルコキシ、またはスルホニルヒドロキシドから選択される）。
【請求項４３】
RDはニトロ、シアノ、ハロ、またはスルホニルヒドロキシドから選択される、請求項４
２に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項４４】
前記フルオロフォアは前記リンカーの左側に結合する、請求項２６〜４３の何れか一項
に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項４５】
請求項１〜４４の何れか一項に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むキット。
【請求項４６】
フルオロフォアおよび請求項１〜４４の何れか一項に記載のリンカーを含む、ヌクレオ
シドまたはヌクレオチドを修飾するための試薬。
【請求項４７】
ポリヌクレオチドに取り込まれたヌクレオシドまたはヌクレオチドを検出する方法であ
って、
（ａ）請求項１〜４４の何れか一項に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチドをポリヌ
クレオチドに取り込むステップと；
ステップ（ａ）で取り込まれた前記ヌクレオシドまたはヌクレオチドからの蛍光シグナ
ルを検出するステップとを含む、方法。
【請求項４８】
鋳型核酸鎖および部分的にハイブリダイズされた核酸鎖を提供するステップをさらに含
み、ステップ（ａ）は、前記鋳型鎖の対応する位置のヌクレオシドまたはヌクレオチドに
対し相補的な少なくとも１つのヌクレオシドまたはヌクレオチドを、前記ハイブリダイズ
された鎖に取り込み、ステップ（ｂ）は、前記取り込まれたヌクレオシドまたはヌクレオ
チドの塩基を特定することにより、前記鋳型鎖の相補的なヌクレオシドまたはヌクレオチ
ドの同一性を示す、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
鋳型核酸分子を配列決定する方法であって、
１つまたは複数の標識ヌクレオチドを、前記鋳型核酸に対し相補的な核酸鎖に取り込む
ステップと；
前記鋳型核酸分子の配列を決定するため、１つまたは複数の取り込まれた標識ヌクレオ
チドに存在する塩基の同一性を決定するステップとを含み；
前記１つまたは複数の標識ヌクレオチドに存在する塩基の同一性は、前記標識ヌクレオ
チドにより生成される蛍光シグナルを検出することにより決定され、
少なくとも１つの取り込まれた標識ヌクレオチドは請求項１〜４４の何れか一項に記載
のヌクレオチドである、方法。
【請求項５０】
前記１つまたは複数のヌクレオチドに存在する塩基の同一性は、各ヌクレオチド取り込
みステップの後に決定される、請求項４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願の一部の実施形態は、DNAシーケンシングにおけるヌクレオチドの取り込み増加
および他の診断アプリケーション、例えばsequencing by synthesisのための、新しいヌ
クレオシドリンカーまたはヌクレオチドリンカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
分子研究の進歩は、部分的に、分子またはその生物学的反応を特徴付けるために用いら
れる技術の向上により導かれてきた。特に、核酸、DNAおよびRNAの研究は、配列分析およ
びハイブリダイゼーション事象の研究に用いられる技術の開発の恩恵を受けてきた。
【０００３】
核酸の研究を向上した技術の例としては、固定された核酸の構築アレイ（fabricated a
rray）の開発が挙げられる。このアレイは、典型的には、固体支持物質に固定されたポリ
ヌクレオチドの高密度マトリックスを有する。例えば、Fodor et al., Trends Biotech. 
12: 19-26, 1994（これには、マスクにより保護されているが規定の領域では露出し、適
切に修飾されたヌクレオチドホスホラミダイトを結合させることができる化学増感ガラス
を用いた、異なる核酸をアセンブルする方法が記載されている）を参照のこと。構築アレ
イはまた、既知のポリヌクレオチドを固体支持体の所与の位置に点在させる（「spotting
」）させる技法により製造することも可能である（例えば、Stimpson et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. 92: 6379-6383, 1995）。
【０００４】
アレイに結合した核酸のヌクレオチド配列を決定する１つの方法は、「sequencing by 
synthesis」または「SBS」と呼ばれる。DNAのヌクレオチド配列を決定するこの技法は、
理想的には、配列決定する核酸の反対側で正確に相補的なヌクレオチドの制御された（つ
まり、１つずつの）取り込みを必要とする。これは、各ヌクレオチド残基が１つずつ配列
決定されるようにヌクレオチドを多数のサイクルで加え、制御されていない一連のヌクレ
オチドの取り込みを防ぐことにより正確な配列決定を可能にする。取り込まれたヌクレオ
チドはそれぞれ、それに結合した適切な標識を用いて、標識部の除去および後続の次のシ
ーケンシングラウンド前に読み出される。
【０００５】
従って、核酸シーケンシング反応の文脈では、シーケンシング法の効率を高められるよ
う、sequencing by synthesis中のヌクレオチド取り込み速度を増加可能であることが望
ましいだろう。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書で開示する一部の実施形態は、リンカーを介してフルオロフォアに共有結合す
るヌクレオシドまたはヌクレオチドであって、前記リンカーは式Ｉもしくは式ＩＩ、また
は両者の組み合わせの構造を含む、ヌクレオシドまたはヌクレオチドに関する。
【０００７】
【化１】
2020015722.tif 000003
（式中、R1およびR2はそれぞれ独立して、水素または置換されていてもよいC1-6アルキル
から選択され；
R3は、水素、置換されていてもよいC1-6アルキル、-NR5-C(=O)R6、または-NR7-C(=O)-O
R8から選択され；
R4 は水素または置換されていてもよいC1-6アルキルから選択され；
R5 およびR7はそれぞれ独立して、水素、置換されていてもよいC1-6アルキル、置換さ
れていてもよいフェニル、または置換されていてもよいC7-12アラルキルから選択され；
R6およびR8はそれぞれ独立して、置換されていてもよいC1-6アルキル、置換されていて
もよいフェニル、置換されていてもよいC7-12アラルキル、置換されていてもよいC3-7シ
クロアルキル、または置換されていてもよい5〜10員ヘテロアリールから選択され；
【化２】
2020015722.tif 000004
の各メチレン反復単位は置換されていてもよく；
Xはメチレン（CH2）、酸素（O）、または硫黄（S）から選択され；
mは0〜20の整数であり；
nは1〜20の整数であり；
pは1〜20の整数である。）
【０００８】
一部の実施形態において、式Ｉの構造を含む、フルオロフォアで標識したヌクレオシド
またはヌクレオチドは、次の構造を含まない。
【０００９】
【化３】
2020015722.tif 000005
【００１０】
本明細書で開示する一部の実施形態は、リンカーを介してフルオロフォアに共有結合す
るヌクレオシドまたはヌクレオチドであって、前記リンカーは式ＩＩＩの構造を含む、ヌ
クレオシドまたはヌクレオチドに関する。
【００１１】
【化４】
2020015722.tif 000006
（式中、L1は空であるか、式Ｉもしくは式ＩＩで示されるいずれか１つのリンカー、保護
部分、またはその組み合わせを含み；
L2は置換されていてもよいC1-20アルキレン、置換されていてもよいC1-20ヘテロアルキ
レン、置換されていてもよい、置換芳香族基に中断されたC1-20アルキレン、または置換
されていてもよい、置換芳香族基に中断されたC1-20ヘテロアルキレンから選択され；
L3は置換されていてもよいC1-20アルキレン、または置換されていてもよいC1-20ヘテロ
アルキレンから選択され；
RAは水素、シアノ、ヒドロキシ、ハロゲン、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、C1-6ハロ
アルキル、C1-6ハロアルコキシ、またはアジドから選択され、
【化５】
2020015722.tif 000007
の反復単位の少なくとも１つはアジド基を含み；
Zは酸素（O）またはNRBから選択され；
RBおよびRCはそれぞれ独立して、水素または置換されていてもよいC1-6アルキルから選
択され；
kは1〜50の整数である。）
【００１２】
本明細書で開示する一部の実施形態は、標識ヌクレオシドまたは標識ヌクレオチドを含
み、フルオロフォアとヌクレオシドまたはヌクレオチドの間にリンカーを備えるキットで
あって、前記リンカーは式Ｉ、式ＩＩ、もしくは式ＩＩＩのいずれか１つ、またはその組
み合わせの構造を含む、キットに関する。
【００１３】
本明細書で開示する一部の実施形態は、フルオロフォアおよびリンカーを含むヌクレオ
シドまたはヌクレオチドを修飾する試薬であって、前記リンカーは式Ｉ、式ＩＩ、もしく
は式ＩＩＩのいずれか１つ、またはその組み合わせの構造を含む、試薬に関する。
【００１４】
本明細書で開示する一部の実施形態は、ポリヌクレオチドに取り込まれたヌクレオシド
を検出する方法であって、
（ａ）リンカーを含む標識ヌクレオシドまたは標識ヌクレオチドをポリヌクレオチドに
取り込むステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）で取り込まれた前記標識ヌクレオシドまたは標識ヌクレオチドか
らの蛍光シグナルを検出するステップとを含み、
前記リンカーは式Ｉ、式ＩＩ、もしくは式ＩＩＩのいずれか１つ、またはその組み合わ
せの構造を含む、方法に関する。一部の実施形態において、前記方法はさらに、鋳型核酸
鎖および部分的にハイブリダイズした核酸鎖を提供するステップを含み、ステップ（ａ）
は、鋳型鎖の対応する位置のヌクレオシドまたはヌクレオチドに対し相補的な少なくとも
１つのヌクレオシドまたはヌクレオチドを、ハイブリダイズした鎖に取り込み、ステップ
（ｂ）は、取り込まれたヌクレオシドまたはヌクレオチドの塩基を特定することにより、
前記鋳型鎖の相補的なヌクレオシドまたはヌクレオチドの同一性を示す。
【００１５】
本明細書で開示する一部の実施形態は鋳型核酸分子を配列決定する方法であって、
１つまたは複数の標識ヌクレオチドを、鋳型核酸に対し相補的な核酸鎖に取り込むステ
ップと；
前記鋳型核酸分子の配列を決定するため、１つまたは複数の取り込まれた標識ヌクレオ
チドに存在する塩基の同一性を決定するステップとを含み；
前記１つまたは複数の標識ヌクレオチドに存在する塩基の同一性は、前記標識ヌクレオ
チドにより生成される蛍光シグナルを検出することにより決定され、
少なくとも１つの取り込まれた標識ヌクレオチドは上記のようなリンカーを含み、
前記リンカーは式Ｉ、式ＩＩ、もしくは式ＩＩＩのいずれか１つ、またはその組み合わ
せの構造を含む、方法に関する。一部の実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチドに
存在する塩基の同一性を、各ヌクレオチド取り込みステップの後に決定する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａは、標準標識ヌクレオチドの部分連結基構造を示す図である。図１Ｂは、図１Ａの標準連結基に２つの実現可能なリンカー125および130を挿入した、図１Ａの標識ヌクレオチドを示す図である。
【図２】図１Ａの標識ヌクレオチドと、図１Ｂの修飾標識ヌクレオチドを用いた、核酸取り込み速度のグラフである。
【図３】図３Ａは、図１Ａの標準連結基に挿入される追加リンカーの構造式を示す図である。図３Ｂは、図１Ａの標準連結基に挿入される追加リンカーの構造式を示す図である。図３Ｃは、図１Ａの標準連結基に挿入される追加リンカーの構造式を示す図である。図３Ｄは、図１Ａの標準連結基に挿入される追加リンカーの構造式を示す図である。図３Ｅは、図１Ａの標準連結基に挿入される追加リンカーの構造式を示す図である。
【図４】図１Ｂの125の挿入および図３Ｂの315の挿入の、シーケンシングの質に対する効果を評価するために用いた、２色素シーケンシング（two dye sequencing）ランのデータ表である。
【図５】図５Ａは、リンカー挿入125およびリンカー挿入315を用いた図４のシーケンシングランのリード１についての誤り率のグラフである。図５Ｂは、リンカー挿入125およびリンカー挿入315を用いた図４のシーケンシングランのリード２についての誤り率のグラフである。
【図６】図１Ｂの125の挿入および図３Ａの310の挿入の、シーケンシングの質に対する効果を評価するために用いた、シーケンシングランのデータ表である。
【図７】図７Ａは、リンカー挿入125を用いた図６のシーケンシングランの、リード１についての誤り率のグラフである。図７Ｂは、リンカー挿入125を用いた図６のシーケンシングランの、リード２についての誤り率のグラフである。
【図８】図８Ａは、標準LN3リンカー構造の例を示す図である。図８Ｂは、図８ＡのLN3リンカー構造の修飾構造の例を示す図である。図８Ｃは、図８ＡのLN3リンカー構造の修飾構造の例を示す図である。図８Ｄは、図８ＡのLN3リンカー構造の修飾構造の例を示す図である。図８Ｅは、図８Ｄのリンカーへの保護部分の挿入を示す図である。
【図９】図９Ａは、SSリンカーを有するffAにおける不純物の出現を示すクロマトグラムである。図９Ｂは、SSリンカーを有するffAおよびAEDIリンカーを有するffAの安定性を比較する表である。図９Ｃは、22時間IMX60°におけるSSリンカーffAおよびAEDIリンカーffAの比較を示すクロマトグラムであり、SSリンカーではここでも不純物が示される。
【図１０Ａ】リンカーを変化させた溶液における、ヌクレオチド取り込みスピードの予期せぬ増加を示す図であり、１μＭでの取り込み速度を示すグラフである。
【図１０Ｂ】リンカーを変化させた溶液における、ヌクレオチド取り込みスピードの予期せぬ増加を示す図であり、表にまとめた結果を示す。
【図１０Ｃ】リンカーを変化させた溶液における、ヌクレオチド取り込みスピードの予期せぬ増加を示す図であり、NR550S0を有するAEDIリンカーおよびSSリンカーを図式的に示す図である。
【図１１Ａ】異なるA-550S0（同じ濃度）を有するV10組み合わせについての散布図を示す図である。
【図１１Ｂ】溶液中のFFAリンカーのKcatを示す図である。
【図１２Ａ】M111、ヒト550について、2x151サイクルのシーケンシング測定基準（sequencing metrics）を示す図である。
【図１２Ｂ】M111、ヒト550について、2x151サイクルのシーケンシング測定基準（sequencing metrics）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書で開示する一部の実施形態は、リンカーを介してフルオロフォアに共有結合す
るヌクレオシドまたはヌクレオチドであって、前記リンカーは下記の式Ｉもしくは式ＩＩ
、または両者の組み合わせの構造を含み、その変数の定義は上記で定義される、ヌクレオ
シドまたはヌクレオチドに関する。
【００１８】
【化６】
2020015722.tif 000008
【００１９】
式Ｉの構造の一部の実施形態において、R1は水素である。一部の他の実施形態では、R1
は置換されていてもよいC1-6アルキルである。一部のこのような実施形態では、R1はメチ
ルである。
【００２０】
本明細書で記載する式ＩのR1のいずれの実施形態でも、R2は水素である。一部の他の実
施形態では、R2は置換されていてもよいC1-6アルキルである。一部のこのような実施形態
では、R2はメチルである。一実施形態では、R1およびR2の両方がメチルである。別の実施
形態では、R1およびR2の両方が水素である。
【００２１】
式Ｉの構造の一部の実施形態において、mは0である。一部の他の実施形態では、mは1で
ある。
【００２２】
式Ｉの構造の一部の実施形態において、nは1である。
【００２３】
式Ｉの構造の一部の実施形態において、式Ｉの構造はまた、式Ｉａまたは式Ｉｂで表す
ことが可能である。
【００２４】
【化７】
2020015722.tif 000009
【００２５】
本明細書で記載する一部の実施形態において、式Ｉａを「AEDI」といい、式Ｉｂを「SS
」という。
【００２６】
式ＩＩの構造の一部の実施形態において、R3は水素である。一部の他の実施形態におい
て、R3は置換されていてもよいC1-6アルキルである。一部のこのような実施形態において
、R3はメチルである。一部の実施形態において、R3は-NR5-C(=O)R6である。一部のこのよ
うな実施形態において、R5は水素である。一部のこのような実施形態において、R6は置換
されていてもよいC1-6アルキル、例えば、メチルである。一部の実施形態において、R3は
-NR7-C(=O)OR8である。一部のこのような実施形態において、R7は水素である。一部のこ
のような実施形態において、R8は置換されていてもよいC1-6アルキル、例えば、t-ブチル
である。
【００２７】
本明細書で記載する式ＩＩのR3のいずれの実施形態でも、R4は水素である。一部の他の
実施形態において、R4は置換されていてもよいC1-6アルキルである。一部のこのような実
施形態において、R4はメチルである。一実施形態において、R3およびR4の両方がメチルで
ある。別の実施形態において、R3およびR4の両方が水素である。一実施形態において、R3
は-NH(C=O)CH3であり、R4は水素である。別の実施形態において、R3は-NH(C=O)OtBu (Boc
)であり、R4は水素である。
【００２８】
式ＩＩの構造の一部の実施形態において、Xはメチレンであり、これは置換されていて
もよい。別の実施形態では、Xは酸素（O）である。さらに別の実施形態では、Xは硫黄（S
）である。
【００２９】
式ＩＩの構造の一部の実施形態において、pは1である。一部の他の実施形態では、pは2
である。
【００３０】
式ＩＩの構造の一部の実施形態において、式ＩＩの構造はまた、式ＩＩａ、式ＩＩｂ、
式ＩＩｃ、式ＩＩｄ、式ＩＩｅ、または式ＩＩｆで表すことが可能である。
【００３１】
【化８】
2020015722.tif 000010
【００３２】
本明細書で記載する一部の実施形態において、式ＩＩａを「ACA」といい、式ＩＩｂを
「AcLys」といい、式ＩＩｃを「BocLys」といい、式ＩＩｄを「dMeO」といい、式ＩＩｅ
を「dMeS」といい、式ＩＩｆを「DMP」という。
【００３３】
本明細書で記載する式Ｉまたは式ＩＩの構造を含むリンカーを介してフルオロフォアで
標識したヌクレオシドまたはヌクレオチドの任意の実施形態において、ヌクレオシドまた
はヌクレオチドはリンカーの左側に、直接または追加の連結部を介して結合することが可
能である。
【００３４】
本明細書で開示する一部の実施形態は、リンカーを介してフルオロフォアに共有結合す
るヌクレオシドまたはヌクレオチドであって、前記リンカーは式ＩＩＩの構造を含み、変
数の定義は上記で定義される、ヌクレオシドまたはヌクレオチドに関する。
【００３５】
【化９】
2020015722.tif 000011
【００３６】
式ＩＩＩの構造の一部の実施形態において、L1は空である。一部の他の実施形態におい
て、L1は式Ｉまたは式ＩＩ、特に式Ｉａ、式Ｉｂ、式ＩＩ、式ＩＩａ、式ＩＩｂ、式ＩＩ
ｃ、式ＩＩｄ、式ＩＩｅ、または式ＩＩｆの構造を含む上記のリンカーである。一部の他
の実施形態において、L1はDNAの損傷を防ぐ分子を含む保護部分とすることが可能である
。一部のこのような実施形態において、保護部分はトロロックス、没食子酸、p-ニトロベ
ンジル（pNB）、もしくはアスコルベート、またはその組み合わせを含む。
【００３７】
式ＩＩＩの構造の一部の実施形態において、L2は置換されていてもよいC1-20アルキレ
ンである。一部のさらなる実施形態において、L2は置換されていてもよいC4-10アルキレ
ンである。一部のこのような実施形態において、L2はヘプチレンである。一部の他の実施
形態において、L2は置換されていてもよいC1-20ヘテロアルキレンである。一部のこのよ
うな実施形態において、置換されていてもよいC1-20ヘテロアルキレンは、１つまたは複
数の窒素原子を含む。一部のこのような実施形態において、C1-20ヘテロアルキレンの少
なくとも１つの炭素原子はオキソ（＝O）で置換されている。一部のさらなる実施形態に
おいて、L2は置換されていてもよいC3-6ヘテロアルキレンである。一部の実施形態におい
て、L2は置換C6-10アリール基などの置換芳香族基、または１〜３個のヘテロ原子を含む5
〜10員置換ヘテロアリール基で中断される。一部のこのような実施形態において、L2は置
換フェニル基により中断される。一部のこのような実施形態において、フェニル基は、ニ
トロ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、C1-6ハロアルキル、
C1-6ハロアルコキシ、またはスルホニルヒドロキシドから選択される１つまたは複数（最
大４つ）の置換基で置換されている。一部のさらなるこのような実施形態において、フェ
ニル基は、ニトロ、シアノ、ハロ、またはスルホニルヒドロキシド（つまり、-S(=O)2OH
）から選択される、１〜４つの置換基で置換されている。
【００３８】
式ＩＩＩの構造の一部の実施形態において、
【化１０】
2020015722.tif 000012
のRAは、水素またはアジドから選択される。一部のこのような実施形態において、一方の
RAがアジドであり、もう一方が水素である場合、kは２である。
【００３９】
式ＩＩＩの構造の一部の実施形態において、L3は置換されていてもよいC1-20アルキレ
ンである。一部のさらなる実施形態において、L3は置換されていてもよいC1-6アルキレン
である。一部のこのような実施形態において、L3はエチレンである。一部の他の実施形態
において、L3は置換されていてもよいC1-20ヘテロアルキレンである。一部のこのような
実施形態において、置換されていてもよいC1-20ヘテロアルキレンは、１つまたは複数の
酸素原子を含む。一部のこのような実施形態において、L1は置換されていてもよいC1-6ア
ルキレンオキシド、例えばC1-3アルキレンオキシドである。
【００４０】
式ＩＩＩの構造の一部の実施形態において、RBは水素である。一部の実施形態において
、RCは水素である。一部のさらなる実施形態において、RBおよびRCの両方が水素である。
【００４１】
式ＩＩＩの構造の一部の実施形態において、式ＩＩＩの構造はまた、式ＩＩＩａ、式Ｉ
ＩＩｂ、または式ＩＩＩｃにより表すことが可能である。
【００４２】
【化１１】
2020015722.tif 000013
（式中、RDはニトロ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、C1-6
ハロアルキル、C1-6ハロアルコキシ、またはスルホニルヒドロキシドから選択される。一
部のさらなる実施形態において、RDはニトロ、シアノ、ハロ、またはスルホニルヒドロキ
シドから選択される。）
【００４３】
本明細書で記載する、式ＩＩＩの構造を含むリンカーを介してフルオロフォアで標識し
たヌクレオシドまたはヌクレオチドの任意の実施形態において、フルオロフォアはリンカ
ーの左側に、直接または追加の連結部を介して結合することが可能である。
【００４４】
式Ｉ、式ＩＩ、または式ＩＩＩの構造を含むリンカーに関する、本明細書に記載の任意
の実施形態において、用語「置換されていてもよい」が変数を定義するために用いられる
場合、そのような変数は置換されていなくてもよい。
【００４５】
定義
別途定義がない限り、本明細書で用いる全ての科学技術用語は当業者により通常理解さ
れるものと同じ意味である。用語「含んでいる（including）」ならびに他の形態、例え
ば「含む（include）」、「含む（includes）」、および「含んだ（included）」の使用
は、限定的ではない。用語「有している（having）」ならびに他の形態、例えば「有する
（have）」、「有する（has）」、および「有した（had）」の使用は、限定的ではない。
本明細書で用いる場合、請求項の移行句でも本文でも、「含む（comprise(s)）」および
「含んでいる（comprising）」の用語は、非限定（open-ended）の意味を有すると解釈さ
れるべきである。つまり、上記の用語は、「少なくとも有している（having at least）
」または「少なくとも含んでいる（including at least）」と同義的に解釈されるべきで
ある。例えば、プロセスの文脈で用いられる場合、用語「含んで（comprising）」は、該
プロセスが少なくとも記載されたステップを含むものの、追加のステップも含んでよいこ
とを意味する。化合物、組成物、またはデバイスの文脈で用いられる場合、用語「含んで
（comprising）」は、該化合物、組成物、またはデバイスが、少なくとも記載された特徴
または構成要素を含むものの、追加の特徴または構成要素も含んでよいことを意味する。
【００４６】
本明細書で用いるセクションの見出しは構成を目的とするのみであり、記載する主題を
限定するものと解釈されるべきではない。
【００４７】
本明細書で用いる場合、一般的な有機物の略語を次のように定義する。
Ac  アセチル
Ac2O  無水酢酸
aq.  水性
Bn  ベンジル 
Bz  ベンゾイル
BOCまたはBoc  tert-ブトキシカルボニル
Bu  n-ブチル
cat.  触媒性
°C  摂氏温度
CHAPS  3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホナート
dATP  デオキシアデノシン三リン酸
dCTP  デオキシシチジン三リン酸
dGTP  デオキシグアノシン三リン酸
dTTP  デオキシチミジン三リン酸
ddNTP(s)  ジデオキシヌクレオチド
DCM  メチレンクロリド
DMA  ジメチルアセトアミド
DMAP  4-ジメチルアミノピリジン
DMF  N,N'-ジメチルホルムアミド
DMSO  ジメチルスルホキシド
DSC  N,N'-スクシンイミジルカーボネート
EDTA  エチレンジアミン四酢酸
Et  エチル
EtOAc  酢酸エチル
ffN  完全機能性ヌクレオチド
ffA  完全機能性アデノシンヌクレオチド
g  グラム
GPC  ゲル浸透クロマトグラフィ
hまたはhr  時間
Hunig’s base  N,N-ジイソプロピルエチルアミン
iPr  イソプロピル
Kpi  pH7.0の10 mMリン酸カリウム緩衝液
IPA  イソプロピルアルコール
LCMS  液体クロマトグラフィ−質量分析
LDA  ジイソプロピルアミドリチウム
mまたはmin  分
MeCN  アセトニトリル
mL  ミリリットル
PEG  ポリエチレングリコール
PG  保護基
Ph  フェニル
pNB  p-ニトロ-ベンジル
ppt  沈殿物
rt  室温
SBS  合成による配列決定（Sequencing by Synthesis）
-S(O)2OH  スルホニルヒドロキシド
TEA  トリエチルアミン
TEAB  テトラエチルアンモニウムブロミド
TFA  トリフルオロ酢酸
Tert, t  三級
THF  テトラヒドロフラン
TLC  薄層クロマトグラフィ
TSTU  O-(N-スクシンイミジル)-N,N,N′,N′-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボ
ラート
μL  マイクロリットル
【００４８】
本明細書で用いる場合、用語「アレイ」は、１つまたは複数の基質に結合されている異
なるプローブ分子の集団であって、この異なるプローブ分子が、相対的な位置に従って互
いに区別することが可能であるような、プローブ分子の集団を指す。アレイには、基質上
の異なるアドレス指定可能な位置に各々位置付けられる異なるプローブ分子が含まれ得る
。あるいは、または加えて、アレイは、異なるプローブ分子を各々担持する個別の基質を
含むことができ、この異なるプローブ分子は、基質が結合している表面上の基質の位置、
または液体中の基質の位置によって識別することが可能である。個別の基質が表面上に位
置付けられている例示的なアレイとして、限定されるわけではないが、例えば、米国特許
第６３５５４３１号明細書、米国特許出願公開第２００２／０１０２５７８号明細書、お
よびＰＣＴ公開国際公開第００／６３４３７号に記載されるような、ウェル中にビーズを
含むものが挙げられる。液体アレイ、例えば、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）など
のマイクロ流体デバイスを用いたものの中のビーズを区別するために本発明で用いること
ができる例示的なフォーマットは、例えば、米国特許第６５２４７９３号明細書に記載さ
れている。本発明において用いることが可能なアレイのさらなる例としては、限定される
わけではないが、米国特許第５４２９８０７号明細書、同第５４３６３２７号明細書、同
第５５６１０７１号明細書、同第５５８３２１１号明細書、同第５６５８７３４号明細書
、同第５８３７８５８号明細書、同第５８７４２１９号明細書、同第５９１９５２３号明
細書、同第６１３６２６９号明細書、同第６２８７７６８号明細書、同第６２８７７７６
号明細書、同第６２８８２２０号明細書、同第６２９７００６号明細書、同第６２９１１
９３号明細書、同第６３４６４１３号明細書、同第６４１６９４９号明細書、同第６４８
２５９１号明細書、同第６５１４７５１号明細書、同第６６１０４８２号明細書、国際公
開第９３／１７１２６号、同第９５／１１９９５号、同第９５／３５５０５号、欧州特許
第７４２２８７号明細書および同第７９９８９７号明細書に記載されるものが挙げられる
。
【００４９】
本明細書で用いる場合、用語「共有結合した（covalently attached）」または「共有
結合した（covalently bonded）」は、原子間における電子対の共有を特徴とする化学結
合の形成を指す。例えば、共有結合したポリマーコーティングは、他の手段、例えば付着
または静電相互作用による表面への結合と比較して、基質の官能化した表面との化学結合
を形成するポリマーコーティングを指す。表面に共有結合したポリマーは、共有結合以外
の手段によっても結合可能であることが理解されよう。
【００５０】
本明細書で用いる場合、「a」および「b」が整数である「Ca」〜「Cb」または「Ca-b」
は、特定の基の炭素原子数を指す。つまり、基は、「a」個以上「b」個以下の炭素原子を
含み得る。したがって、例えば、「C1〜C4アルキル」基または「C1-4アルキル」基は、１
〜４個の炭素を有する全てのアルキル基、つまり、CH3-、CH3CH2-、CH3CH2CH2-、(CH3)2C
H-、CH3CH2CH2CH2-、CH3CH2CH(CH3)-、および(CH3)3C-を指す。
【００５１】
用語「ハロゲン」または「ハロ」は、本明細書で用いる場合、フッ素、塩素、臭素、ま
たはヨウ素などの、元素周期表の７列目の放射線安定性原子のうちのいずれか１つを意味
し、フッ素および塩素が好適である。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「アルキル」は、完全に飽和した（つまり、二重結合も三重
結合も含まない）直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を指す。アルキル基は、１〜２０個の炭
素原子を有してよい（これが本明細書で現れる場合は常に、「１〜２０」などの数値範囲
は、与えられた範囲における各整数を指し、例えば、「１〜２０個の炭素原子」は、該ア
ルキル基が１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子など、２０個以下の炭素原
子からなっていてよいことを意味するが、本定義はまた、数値範囲が指定されていない用
語「アルキル」の出現時にもあてはまる）。アルキル基はまた、１〜９個の炭素原子を有
する中程度のサイズのアルキルとすることができる。アルキル基はまた、１〜４個の炭素
原子を有する低級アルキルとすることが可能である。アルキル基は、「C1-4アルキル」ま
たは類似の呼称で指定することができる。例に過ぎないが、「C1-4アルキル」は、アルキ
ル鎖中に１〜４個の炭素原子があること、つまり、該アルキル鎖がメチル、エチル、プロ
ピル、イソ-プロピル、n-ブチル、イソ-ブチル、sec-ブチル、およびt-ブチルからなる群
から選択されることを示す。典型的なアルキル基としては、限定されるわけではないが、
メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第三ブチル、ペンチル
、およびヘキシルなどが挙げられる。アルキル基は、置換または非置換とすることができ
る。
【００５３】
本明細書で用いる場合、「アルコキシ」は式-ORを指し、ここでRは、「C1-9アルコキシ
」など上記で定義したアルキルであり、限定されるわけではないが、メトキシ、エトキシ
、n-プロポキシ、1-メチルエトキシ（イソプロポキシ）、n-ブトキシ、イソ-ブトキシ、s
ec-ブトキシ、およびtert-ブトキシなどが含まれる。
【００５４】
本明細書で用いる場合、「ヘテロアルキル」は、１つまたは複数のヘテロ原子、つまり
、窒素、酸素、および硫黄を含むがこれらに限定されない炭素以外の元素を鎖骨格中に含
む直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を指す。ヘテロアルキル基は１〜２０個の炭素原子を有
してよいが、本定義はまた、数値範囲が指定されていない用語「ヘテロアルキル」の出現
時にもあてはまる。ヘテロアルキル基はまた、１〜９個の炭素原子を有する中程度のサイ
ズのヘテロアルキルとすることができる。ヘテロアルキル基はまた、１〜４個の炭素原子
を有する低級ヘテロアルキルとすることができる。ヘテロアルキル基は、「C1-4ヘテロア
ルキル」または類似の呼称で指定することができる。ヘテロアルキル基は、１つまたは複
数のヘテロ原子を含むことができる。例に過ぎないが、「C1-4ヘテロアルキル」は、ヘテ
ロアルキル鎖中に１〜４個の炭素原子があり、加えて、鎖骨格中に１つまたは複数のヘテ
ロ原子があることを示す。
【００５５】
本明細書で用いる場合、「アルキレン」は炭素および水素のみを含む、分岐鎖または直
鎖の完全飽和ジラジカル化学基を意味し、これは２つの結合点（つまり、アルカンジイル
）を介して分子の残りの部分に結合する。アルキレン基は１〜２０個の炭素原子を有する
ことができるが、本定義は数値範囲が指定されていない用語アルキレンの出現時にもあて
はまる。アルキレン基はまた、１〜９個の炭素原子を有する中程度のサイズのアルキレン
とすることができる。アルキレン基はまた、１〜４個の炭素原子を有する低級アルキレン
とすることができる。アルキル基は、「C1-4アルキレン」または類似の呼称で指定するこ
とができる。例に過ぎないが、「C1-4アルキレン」は、アルキレン鎖中に１〜４個の炭素
原子があること、つまり、アルキレン鎖は、メチレン、エチレン、エタン-1,1-ジイル、
プロピレン、プロパン-1,1-ジイル、プロパン-2,2-ジイル、1-メチル-エチレン、ブチレ
ン、ブタン-1,1-ジイル、ブタン-2,2-ジイル、2-メチル-プロパン-1,1-ジイル、1-メチル
-プロピレン、2-メチル-プロピレン、1,1-ジメチル-エチレン、1,2-ジメチル-エチレン、
および1-エチル-エチレンからなる群から選択される。本明細書で用いる場合、アルキレ
ンが芳香族基により中断される場合、それは、２つの結合点を介したアルキレン鎖の炭素
−炭素結合間での芳香族基の挿入、または、１つの結合点を介したアルキレン鎖の一方の
末端への芳香族基の結合を指す。例えば、n-ブチレンがフェニル基により中断される場合
、例示的な構造としては、
【化１２】
2020015722.tif 000014
が挙げられる。
【００５６】
本明細書で用いる場合、用語「ヘテロアルキレン」は、アルキレンの１つまたは複数の
骨格原子が炭素以外の原子、例えば、酸素、窒素、硫黄、リン、またはその組み合わせか
ら選択される、アルキレン鎖を指す。ヘテロアルキレン鎖の長さは、２〜２００００とす
ることが可能である。例示的なヘテロアルキレンとしては、限定されるわけではないが、
-OCH2-、-OCH(CH3)-、-OC(CH3)2-、-OCH2CH2-、-CH(CH3)O-、-CH2OCH2-、-CH2OCH2CH2-、
-SCH2-、-SCH(CH3)-、-SC(CH3)2-、-SCH2CH2-、-CH2SCH2CH2-、-NHCH2-、-NHCH(CH3)-、-
NHC(CH3)2-、-NHCH2CH2-、- -CH2NHCH2-、および-CH2NHCH2CH2-などが挙げられる。本明
細書で用いる場合、ヘテロアルキレンが芳香族基に中断される場合、それは、２つの結合
点を介したヘテロアルキレン鎖の１つの炭素−炭素結合もしくは炭素−ヘテロ元素結合の
間への芳香族基の挿入、または、１つの結合点を介したヘテロアルキレン鎖の一方の末端
への芳香族基の結合を指す。例えば、n-プロピレンオキシドがフェニル基により中断され
る場合、例示的な構造としては、
【化１３】
2020015722.tif 000015
が挙げられる。
【００５７】
本明細書で用いる場合、「アルケニル」は、直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖において１
つまたは複数の二重結合を含むアルキル基を指す。アルケニル基は非置換または置換とす
ることができる。
【００５８】
本明細書で用いる場合、「アルキニル」は、直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖において１
つもしくは複数の三重結合を含むアルキル基を指す。アルキニル基は、非置換または置換
とすることができる。
【００５９】
本明細書で用いる場合、「シクロアルキル」は、完全に飽和した（二重結合も三重結合
もない）単環式または多環式の炭化水素環系を指す。２つ以上の環から構成される場合、
該環は縮合した様式で互いに結合していてよい。シクロアルキル基は、環の中に３〜１０
個の原子を含むことが可能である。一部の実施形態において、シクロアルキル基は、環の
中に３〜８個の原子を含むことが可能である。シクロアルキル基は非置換または置換とす
ることができる。典型的なシクロアルキル基としては、決して限定されるわけではないが
、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、
およびシクロオクチルが挙げられる。
【００６０】
用語「芳香族」は、Π電子共役系を有する環または環系を指し、これには炭素環式芳香
族基（例えば、フェニル）および複素環式芳香族基（例えば、ピリジン）の両方が含まれ
る。該用語には、全ての環系が芳香族であれば、単環式または縮環多環（つまり、隣接す
る原子対を共有する環）の基が含まれる。
【００６１】
本明細書で用いる場合、「アリール」は、環骨格において炭素のみを含む芳香族環また
は芳香族環系（つまり、２つの隣接する炭素原子を共有する２つ以上の縮合環）を指す。
アリールが環系である場合、系の全ての環が芳香族である。アリール基は６〜１８個の炭
素原子を有することができるが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「アリール
」の出願時にも当てはまる。一部の実施形態において、アリール基は６〜１０個の炭素原
子を有する。アリール基は、「C6-10アリール」、「C6もしくはC10アリール」、または類
似の呼称で指定することができる。アリール基の例としては、限定されるわけではないが
、フェニル、ナフチル、アズレニル、およびアントラセニルが挙げられる。
【００６２】
「アラルキル」または「アリールアルキル」は、「C7-14アラルキル」などのアルキレ
ン基を介して置換基として結合したアリール基であり、限定されるわけではないが、ベン
ジル、2-フェニルエチル、3-フェニルプロピル、およびナフチルアルキルが挙げられる。
一部の場合、アルキレン基は低級アルキレン基（つまり、C1-4アルキレン基）である。
【００６３】
本明細書で用いる場合、「ヘテロアリール」は、芳香族環または芳香族環系（つまり、
２つの隣接する原子を共有する２つ以上の縮合環）を指し、これは、１つまたは複数のヘ
テロ原子、つまり、限定されるわけではないが、窒素、酸素、および硫黄を含む炭素以外
の元素を環骨格において含む。ヘテロアリールが環系である場合、系における全ての環は
芳香族である。ヘテロアリール基は５〜１８の環員（つまり、炭素原子およびヘテロ原子
を含む、環骨格を構成する原子数）を有することができるが、本定義は、数値範囲が指定
されていない用語「ヘテロアリール」の出現時にもあてはまる。一部の実施形態において
、ヘテロアリール基は５〜１０の環員または５〜７の環員を有する。ヘテロアリール基は
、「5〜7員ヘテロアリール」、「5〜10員ヘテロアリール」、または類似の呼称で指定す
ることができる。ヘテロアリール環の例としては、限定されるわけではないが、フリル、
チエニル、フタラジニル、ピロリル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾ
リル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、ピリジニル
、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、キノリニル、イソキノリニ
ル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、インドリル、イソイ
ンドリル、およびベンゾチエニルが挙げられる。
【００６４】
「ヘテロアラルキル」または「ヘテロアリールアルキル」は、アルキレン基を介して置
換基として結合したヘテロアリール基である。例としては、限定されるわけではないが、
2-チエニルメチル、3-チエニルメチル、フリルメチル、チエニルエチル、ピロリルアルキ
ル、ピリジルアルキル、イソオキサゾリルアルキル、およびイミダゾリルアルキルが挙げ
られる。一部の場合、アルキレン基は低級アルキレン基（つまり、C1-4アルキレン基）で
ある。
【００６５】
本明細書で用いる場合、「シクロアルキル」は完全に飽和したカルボシクリル環または
カルボシクリル環系を意味する。例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペ
ンチル、およびシクロヘキシルが挙げられる。
【００６６】
「O-カルボキシ」基は、「-OC(=O)R」基を指し、式中、Rは、本明細書で定義されるよ
うに、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-7カルボシクリル、C6
-10アリール、5〜10員ヘテロアリール、および5〜10員ヘテロシクリルから選択される。
【００６７】
「C-カルボキシ」基は「-C(=O)OR」基を指し、式中、Rは、本明細書で定義されるよう
に、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-7カルボシクリル、C6-1
0アリール、5〜10員ヘテロアリール、および5〜10員ヘテロシクリルから選択される。非
限定的例としてはカルボキシル（つまり、-C(=O)OH）が挙げられる。
【００６８】
「シアノ」基は「-CN」基を指す。
【００６９】
「アジド」基は「-N3」基を指す。
【００７０】
「O-カルバミル」基は「-OC(=O)NRARB」基を指し、式中、RAおよびRBはそれぞれ独立し
て、本明細書で定義されるように、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニ
ル、C3-7カルボシクリル、C6-10アリール、5〜10員ヘテロアリール、および5〜10員ヘテ
ロシクリルから選択される。
【００７１】
「N-カルバミル」基は「-N(RA)OC(=O)RB」基を指し、式中、RAおよびRBはそれぞれ独立
して、本明細書で定義されるように、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキ
ニル、C3-7カルボシクリル、C6-10アリール、5〜10員ヘテロアリール、および5〜10員ヘ
テロシクリルから選択される。
【００７２】
「C-アミド」基は「-C(=O)NRARB」基を指し、式中、RAおよびRBはそれぞれ独立して、
本明細書で定義されるように、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、
C3-7カルボシクリル、C6-10アリール、5〜10員ヘテロアリール、および5〜10員ヘテロシ
クリルから選択される。
【００７３】
「N-アミド」基は「-N(RA)C(=O)RB」基を指し、式中、RAおよびRBはそれぞれ独立して
、本明細書で定義されるように、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル
、C3-7カルボシクリル、C6-10アリール、5〜10員ヘテロアリール、および5〜10員ヘテロ
シクリルから選択される。
【００７４】
「アミノ」基は「-NRARB」基を指し、式中、RAおよびRBはそれぞれ独立して、本明細書
で定義されるように、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-7カル
ボシクリル、C6-10アリール、5〜10員ヘテロアリール、および5〜10員ヘテロシクリルか
ら選択される。非限定的例としては遊離アミノ（つまり、-NH2）が挙げられる。
【００７５】
本明細書で用いる場合、用語「トロロックス（Trolox）」は6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テ
トラメチルクロマン-2-カルボン酸を指す。
【００７６】
本明細書で用いる場合、用語「アスコルベート」はアスコルビン酸塩を指す。
【００７７】
本明細書で用いる場合、用語「没食子酸」は3,4,5-トリヒドロキシ安息香酸を指す。
【００７８】
本明細書で用いる場合、置換基は、１つまたは複数の水素原子が別の原子または基に交
換されている非置換親基（unsubstituted parent group）に由来する。別段の指示がない
限り、基が「置換されている」とみなされる場合、それは該基が、C1-C6アルキル、C1-C6
アルケニル、C1-C6アルキニル、C1-C6ヘテロアルキル、C3-C7カルボシクリル（ハロ、C1-
C6アルキル、C1-C6アルコキシ、C1-C6ハロアルキル、およびC1-C6ハロアルコキシで置換
されていてもよい）、C3-C7-カルボシクリル-C1-C6-アルキル（ハロ、C1-C6アルキル、C1
-C6アルコキシ、C1-C6ハロアルキル、およびC1-C6ハロアルコキシで置換されていてもよ
い）、5〜10員ヘテロシクリル（ハロ、C1-C6アルキル、C1-C6アルコキシ、C1-C6ハロアル
キル、およびC1-C6ハロアルコキシで置換されていてもよい）、5〜10員ヘテロシクリル-C
1-C6-アルキル（ハロ、C1-C6アルキル、C1-C6アルコキシ、C1-C6ハロアルキル、およびC1
-C6ハロアルコキシで置換されていてもよい）、アリール（ハロ、C1-C6アルキル、C1-C6
アルコキシ、C1-C6ハロアルキル、およびC1-C6ハロアルコキシで置換されていてもよい）
、アリール(C1-C6)アルキル（ハロ、C1-C6アルキル、C1-C6アルコキシ、C1-C6ハロアルキ
ル、およびC1-C6ハロアルコキシで置換されていてもよい）、5〜10員ヘテロアリール（ハ
ロ、C1-C6アルキル、C1-C6アルコキシ、C1-C6ハロアルキル、およびC1-C6ハロアルコキシ
で置換されていてもよい）、5〜10員ヘテロアリール(C1-C6)アルキル（ハロ、C1-C6アル
キル、C1-C6アルコキシ、C1-C6ハロアルキル、およびC1-C6ハロアルコキシで置換されて
いてもよい）、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、C1-C6アルコキシ、C1-C6アルコキシ(C1-C6)
アルキル（つまり、エーテル）、アリールオキシ、スルフヒドリル（メルカプト）、ハロ
(C1-C6)アルキル（例えば、-CF3）、ハロ(C1-C6)アルコキシ（例えば、-OCF3）、C1-C6ア
ルキルチオ、アリールチオ、アミノ、アミノ(C1-C6)アルキル、ニトロ、O-カルバミル、N
-カルバミル、O-チオカルバミル、N-チオカルバミル、C-アミド、N-アミド、S-スルホン
アミド、N-スルホンアミド、C-カルボキシ、O-カルボキシ、アシル、シアナト、イソシア
ナト、チオシアナト、イソチオシアナト、スルフィニル、スルホニル、およびオキソ（＝
O）から独立して選択される、１つまたは複数の置換基で置換されていることを意味する
。基が「置換されていてもよい」と記載されている場合は必ず、その基は上記の置換基で
置換され得る。
【００７９】
あるラジカル命名法は、文脈により、モノラジカルまたはジラジカルの何れかを含み得
ることを理解すべきである。例えば、置換基が分子の残余に対し２つの結合点を必要とす
る場合、その置換基はジラジカルであることが理解される。例えば、２つの結合点を必要
とするアルキルとして特定された置換基には、-CH2-、-CH2CH2-、および-CH2CH(CH3)CH2-
などのジラジカルが含まれる。同様に、２つの結合点を必要とするアミノとして特定され
た基には、-NH-、および-N(CH3)-などのジラジカルが含まれる。他のラジカル命名法は明
確に、ラジカルが「アルキレン」または「アルケニレン」などのジラジカルであることを
示す。
【００８０】
置換基がジラジカルとして描かれる（つまり、分子の残余に対し２つの結合点を有する
）場合は必ず、該置換基は別段の指示がない限り、任意の指向性構成で結合され得ること
を理解するべきである。したがって、例えば、-AE-または
【化１４】
2020015722.tif 000016
と描かれる置換基には、Aが分子の一番左の結合点に結合するように方向づけられた置換
基、および、Aが分子の一番右の結合点に結合する場合が含まれる。
【００８１】
本明細書で開示する化合物が少なくとも１つの立体中心を持つ場合、それらは個別の鏡
像異性体およびジアステレオマーとして、またはラセミ体を含むそのような異性体の混合
物として存在し得る。個別異性体の分離または個別異性体の選択的合成は、当業者に周知
の種々の方法の適用により達成される。別段の指示がない限り、全てのそのような異性体
およびその混合物は、本明細書で開示する化合物の範囲に含まれる。
【００８２】
本明細書で用いる場合、「ヌクレオチド」には、複素環塩基、糖、および１つまたは複
数のリン酸基を含むニトロゲンが含まれる。それらは核酸配列のモノマー単位である。RN
Aでは、糖はリボースであり、DNAでは、デオキシリボース、つまり、リボースに存在する
ヒドロキシル基を欠いた糖である。複素環塩基を含むニトロゲンは、プリン塩基またはピ
リミジン塩基であり得る。プリン塩基にはアデニン（A）およびグアニン（G）、ならびに
その修飾誘導体またはアナログが含まれる。ピリミジン塩基には、シトシン（C）、チミ
ン（T）、およびウラシル（U）、ならびにその修飾誘導体またはアナログが含まれる。デ
オキシリボースのC-1原子は、ピリミジンのN-1またはプリンのN-9に結合する。
【００８３】
本明細書で用いる場合、「ヌクレオシド」は構造的にヌクレオチドに類似しているが、
リン酸部が欠けている。ヌクレオシドアナログの例は、標識が塩基に連結し、糖部分に結
合したリン酸基がないものだろう。用語「ヌクレオシド」は、本明細書では、当業者によ
り理解されるような通常の意味で用いられる。例としては、限定されるわけではないが、
リボース部を含むリボヌクレオシドおよびデオキシリボース部を含むデオキシリボヌクレ
オシドが挙げられる。修飾ペントース部とは、酸素原子が炭素に替えられ、および／また
は、炭素が硫黄原子または酸素原子に替えられている、ペントース部である。「ヌクレオ
シド」は、置換塩基およびまたは糖部を有し得るモノマーである。加えて、ヌクレオシド
は、より大きいDNAおよび／またはRNAの、ポリマーおよびオリゴマーに取り込まれ得る。
【００８４】
本明細書で用いる場合、用語「ポリヌクレオチド」は通常、核酸を指し、DNA（例えば
、ゲノムDNA、cDNA）、RNA（例えば、mRNA）、合成オリゴヌクレオチド、および合成核酸
アナログが含まれる。ポリヌクレオチドには、天然もしくは非天然の塩基、またはその組
み合わせ、および、天然または非天然の骨格結合（backbone linkage）、例えばホスホロ
チオエート、PNA、もしくは2′-O-メチル-RNA、またはその組み合わせが含まれ得る。
【００８５】
本明細書で用いる場合、用語「フェージング（phasing）」はSBSにおける現象を指し、
これは3'ターミネーターおよびフルオロフォアの不完全な除去、および、所定のシーケン
シングサイクルにおいて、ポリメラーゼによるクラスタ内DNA鎖の一部の取り込みが完了
されなかったことにより引き起こされる。プレフェージング（pre-phasing）は、有効3'
ターミネーターのないヌクレオチドの取り込みにより引き起こされ、取り込み事象が１サ
イクル先に進む。フェージングおよびプレフェージングは、特定のサイクルについて抽出
される強度が現在のサイクルのシグナル、ならびに、先行および後続のサイクルのノイズ
から構成される原因となる。サイクル数が増えるにつれ、フェージングに影響された各ク
ラスタの配列断片は増え、正しい塩基の特定を妨げる。プレフェージングは、SBS中の非
保護または非ブロック化の微量3'-OHヌクレオチドの存在により引き起こされ得る。非保
護3'-OHヌクレオチドは、製造プロセス中に生成され得、または、貯蔵および試薬の取り
扱いプロセス中に生成される可能性がある。従って、より速いSBSサイクル時間、より低
いフェージング値およびプレフェージング値、ならびに、より長いシーケンシングリード
長をもたらすヌクレオチドアナログまたは連結基の修飾は、SBSアプリケーションにより
大きな利点をもたらす。
【００８６】
本明細書で用いる場合、用語「保護部分」には、限定されるわけではないが、DNA損傷
（例えば、光損傷または他の化学損傷）を防ぐことが可能な分子が含まれる。一部の特定
の例としては、ビタミンC、ビタミンE誘導体、フェノール酸、ポリフェノール、ならびに
その誘導体およびアナログなどの抗酸化剤が挙げられる。用語「保護部分」を定義するあ
る文脈では、それは、保護部分の１つまたは複数の官能基と、本明細書で記載するリンカ
ーの対応する官能基の間の反応により生じる部分を指す。例えば、保護部分が「没食子酸
」である場合、それは遊離カルボキシル基を有する没食子酸自体ではなく、没食子酸のア
ミドおよびエステルを指し得る。
【００８７】
検出可能標識
本明細書で記載する一部の実施形態は、従来の検出可能標識の使用に関する。検出は、
蛍光分光法を含む任意の適切な方法または他の光学的方法により行うことが可能である。
好適な標識はフルオロフォアであり、これはエネルギーの吸収後、定義された波長で放射
線を発する。多くの適切な蛍光標識が知られている。例えば、Welch et al.（Chem. Eur.
J. 5(3):951-960, 1999）は、本発明で用いることが可能なダンシル官能化（dansyl-fun
ctionalised）蛍光部分を開示する。Zhu et al.（Cytometry 28:206-211, 1997）は蛍光
標識Cy3およびCy5の使用を記載し、これも本発明で用いることが可能である。使用に適し
た標識はまた、Prober et al. (Science238:336-341, 1987)；Connell et al. (BioTechn
iques 5(4):342-384, 1987)、Ansorge et al. (Nucl. Acids Res. 15(11):4593-4602, 19
87)、およびSmith et al. (Nature 321:674, 1986)に開示されている。他の商業的に利用
可能な蛍光標識としては、限定されるわけではないが、フルオレセイン、ローダミン（TM
R、texas red（登録商標）およびRoxを含む）、アレクサ、ボディピー（bodipy）、アク
リジン、クマリン、ピレン、ベンゾアントラセン、およびシアニンが挙げられる。
【００８８】
多数の標識、例えば、bi-fluorophore FRET cassette（Tet. Let. 46:8867-8871, 2000
）を本出願で用いることも可能である。Multi-fluor dendrimeric system（J. Am. Chem.
Soc. 123:8101-8108, 2001）も用いることが可能である。蛍光標識が好ましいが、他の
形態の検出可能標識が有用であることが当業者には明らかであろう。例えば、量子ドット
（Empodocles et al., Nature 399:126-130, 1999）、金ナノ粒子（Reichert et al., An
al. Chem. 72:6025-6029, 2000）、およびマイクロビーズ（Lacoste et al., Proc. Natl
. Acad. Sci USA97(17):9461-9466, 2000）などの微粒子も全て用いることが可能である
。
【００８９】
多成分標識も本出願で用いることが可能である。多成分標識は、検出用のさらなる化合
物との相互作用に依存するものである。生物学で用いる最も一般的な多成分標識は、ビオ
チン−ストレプトアビジンシステムである。ビオチンは、ヌクレオチド塩基に結合する標
識として使用される。ストレプトアビジンは次に別途加えられ、検出を実行可能にする。
他の多成分システムも利用可能である。例えば、ジニトロフェノールは、検出に用いるこ
とが可能である商業的に利用可能な蛍光抗体を有する。
【００９０】
別段の指示がない限り、ヌクレオチドへの言及はまた、ヌクレオシドに適用可能である
ことを意図する。本出願はまた、DNAに関連してさらに記載されるだろうが、該記載も別
段の指示がない限りRNA、PNA、および他の核酸に適用可能であろう。
【００９１】
シーケンシング法
本明細書で記載するヌクレオシドまたはヌクレオチドは、種々のシーケンシング技法と
共に用いることが可能である。一部の実施形態において、標的核酸のヌクレオチド配列を
決定するプロセスは、自動化プロセスとすることが可能である。
【００９２】
本明細書で提示するヌクレオチドアナログは、sequencing-by-synthesis（SBS）法など
のシーケンシング手順で用いることが可能である。簡潔に言えば、SBSは、標的核酸を１
つまたは複数の標識ヌクレオチド、DNAポリメラーゼなどに接触させることにより開始す
ることが可能である。標的核酸を鋳型として用いてプライマーを伸長させる場所であるそ
れらのフィーチャが、検出可能な標識ヌクレオチドを取り込むだろう。オプションとして
、標識ヌクレオチドはさらに、ヌクレオチドをプライマーにいったん加えたらさらなるプ
ライマーの伸長を終了させる、可逆的終了特性を備えることが可能である。例えば、可逆
的ターミネーター部分を有するヌクレオチドアナログを、非ブロック化剤を送達して該部
分を取り除くまで後続の伸長が起き得ないように、プライマーに加えることが可能である
。したがって、可逆的終了を用いる実施形態では、非ブロック化試薬をフローセルに（検
出実行の前後で）送達することが可能である。洗浄は種々の送達ステップの間で行うこと
が可能である。サイクルをその後ｎ回繰り返してプライマーをｎヌクレオチド分伸長させ
、それにより長さｎの配列を検出することが可能である。本開示の方法により生成される
アレイと共に使用するのに容易に適合させることが可能な、例示的なSBS手順、流体シス
テム、および検出プラットフォームは、例えば、Bentley et al., Nature 456:53-59 (20
08)、国際公開第０４／０１８４９７号；同第９１／０６６７８号；同第０７／１２３７
４４号；米国特許第７０５７０２６号明細書；同第７３２９４９２号明細書；同第７２１
１４１４号明細書；同第７３１５０１９号明細書、または同第７４０５２８１号明細書、
および米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号明細書に記載されており、これら
はそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【００９３】
パイロシーケンシングなど、サイクル性反応を用いる他のシーケンシング手順を用いる
ことが可能である。パイロシーケンシングは、特定のヌクレオチドが新生核酸鎖に取り込
まれる際の無機ピロリン酸（PPi）の放出を検出する（Ronaghi, et al., Analytical Bio
chemistry 242(1), 84-9 (1996)；Ronaghi, Genome Res. 11(1), 3-11 (2001)；Ronaghi 
et al. Science 281(5375), 363 (1998)；米国特許第６２１０８９１号明細書；同第６２
５８５６８号明細書、および同第６２７４３２０号明細書（これらはそれぞれ参照により
本明細書に組み込まれる））。パイロシーケンシングでは、放出されたPPiは、ATPスルフ
リラーゼによりアデノシン三リン酸（ATP）に変換されることにより検出することが可能
であり、結果として生じるATPは、ルシフェラーゼ生成光子を介して検出することが可能
である。したがって、シーケンシング反応は、発光検出システムを介してモニタリングす
ることが可能である。蛍光に基づく検出システムに用いられる励起放射線源は、パイロシ
ーケンシング手順に必要ではない。本開示のアレイへのパイロシーケンシングの適用に用
いることが可能な、有用な流体システム、検出器、および手順は、例えば、ＷＩＰＯ特許
出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／５７１１１、米国特許出願公開第２００５／０１９１６９８
号明細書、米国特許第７５９５８８３号明細書、および同第７２４４５５９号明細書に開
示されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【００９４】
例えば、Shendure et al. Science 309:1728-1732 (2005)；米国特許第５５９９６７５
号明細書；および同第５７５０３４１号明細書（これらはそれぞれ参照により本明細書に
組み込まれる）に記載されているものを含む、sequencing-by-ligation反応も有用である
。一部の実施形態は、例えばBains et al., Journal of Theoretical Biology135(3), 30
3-7 (1988)；Drmanac et al., Nature Biotechnology 16, 54-58 (1998)；Fodor et al.,
Science251(4995), 767-773 (1995)；および国際公開第１９８９／１０９７７号（これ
らはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているsequencing-by-hybr
idization手順を含み得る。sequencing-by-ligationとsequencing-by-hybridizationの手
順の両方で、ゲル含有ウェル（または他の凹状フィーチャ）に存在する核酸を、オリゴヌ
クレオチド送達および検出の反復サイクルにかける。本明細書で記載する、または本明細
書に引用する参考文献におけるSBS法のための流体システムは、sequencing-by-ligation
またはsequencing-by-hybridizationの手順のための試薬の送達に、容易に適合させるこ
とが可能である。典型的には、オリゴヌクレオチドは蛍光標識され、本明細書または本明
細書で引用する参考文献でSBS手順に関し記載されたものと同様に、蛍光検出器を用いて
検出することが可能である。
【００９５】
一部の実施形態は、DNAポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを伴う方法を利
用することが可能である。例えば、ヌクレオチドの取り込みは、フルオロフォア担持ポリ
メラーゼとγ-リン酸標識ヌクレオチドの間の蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）相互反応
を介して、または、ゼロモード波長を用いて検出することが可能である。FRETに基づくシ
ーケンシングのための技法および試薬は、例えば、Levene et al. Science 299, 682-686
(2003)；Lundquist et al. Opt. Lett.33, 1026-1028 (2008)；Korlach et al. Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008)に記載されており、これらの開示は参照に
より本明細書に組み込まれる。
【００９６】
一部のSBS実施形態には、ヌクレオチドの伸長生成物への取り込み時に放出される光子
の検出を含む。例えば、放出光子の検出に基づくシーケンシングは、Ion Torrent社（コ
ネチカット州ギルフォード、a Life Technologies社の子会社）から商業的に利用可能な
電気検出器および関連技法、または、米国特許出願公開第２００９／００２６０８２号明
細書；同第２００９／０１２７５８９号明細書；同第２０１０／０１３７１４３号明細書
；または同第２０１０／０２８２６１７号明細書（これらはそれぞれ参照により本明細書
に組み込まれる）に記載されているシーケンシング法およびシステムを用いることが可能
である。
【００９７】
例示的な修飾リンカー
追加の実施形態が以下の例においてさらに詳細に開示されるが、これは特許請求の範囲
を限定することを意図するものでは決してない。
【００９８】
図１Ａは、標識ヌクレオチド100の部分構造式を示す。標識ヌクレオチド100は、完全機
能性アデノシンヌクレオチド（ffA）110、標準リンカー部115、および蛍光色素120を含む
。標準リンカー部115は、sequencing-by-synthesis（SBS）用の標識ヌクレオチドの合成
で典型的に用いられるリンカー部とすることができる。一例では、蛍光色素120はNR550S0
である。この例では、標識ヌクレオチド100は「ffA-NR550S0」と記載することができる。
別の例では、蛍光色素120はSO7181であり、標識ヌクレオチド100は「ffA-SO7181」と記載
することができる。
【００９９】
図１Ｂは、標準リンカー部115に対し２つの実現可能な構造修飾を有する、図１Ａの標
識ヌクレオチド100を示す。一例では、標準リンカー部115は、アミド部のカルボニル（つ
まり、-C(=O)-）とアミノ（つまり、-NH-）部の間にAEDI挿入125を含む。この例では、修
飾標識ヌクレオチドは「ffA-AEDI-NR550S0」と記載することができる。別の例では、標準
リンカー部115はSS挿入130を含み、該修飾標識ヌクレオチドは「ffA-SS-NR550S0」と指定
することができる。
【０１００】
図２は、図１Ａの標識ヌクレオチド100と図１Ｂの修飾標識ヌクレオチド100を用いた、
ヌクレオチド取り込み速度のグラフを示す。アッセイを55℃で、40mMのエタノールアミン
（pH9.8）、9mMのMgCl、40mMのNaCl、1mMのEDTA、20nMのプライマー：鋳型DNAおよび30μ
g/mLのポリメラーゼ812（MiSeqキットV2）を有する0.2% CHAPS、1mMのヌクレオチドにお
いて実行した。酵素をDNAに結合し、次に、短時間（最大10秒）クエンチフローマシンに
おいてヌクレオチドと急速に混ぜてから500mMのEDTAでクエンチする。いくつかの時点を
各ヌクレオチドについてとる。生成したサンプルを次に変性ゲル上で分析し、DNA+1に変
換されたDNAのパーセンテージを求め、時間に対しプロットして、各ヌクレオチドについ
て一次速度定数を求める。データを下記表１に集計する。データは、SS挿入130を含む標
識ヌクレオチド（ffa-SS-NR550S0）の取り込み速度が、標準リンカー115を含む標識ヌク
レオチド（ffa-NR550S0）の取り込み速度と比較し約２倍速かったことを示す。AEDI挿入1
25を含む標識ヌクレオチド（ffa-AEDI-NR550S0）の取り込み速度は、ffa-NR550S0の取り
込み速度と比較し約４倍速かった。データはまた、標準リンカー115および蛍光色素SO718
1を含む標識ヌクレオチド（ffA-SO7181）の取り込み速度が、ffa-NR550S0の取り込み速度
と比較し約４倍速かったことを示す。
【０１０１】
【表１】
2020015722.tif 000017
【０１０２】
図３Ａ〜３Ｆは、図１Ａの標準リンカー部115に対する追加挿入310、315、320、325、3
30、および335の構造式を示す。ACA挿入310では、挿入125と比較して、ジメチル置換基を
取り除き、硫黄−硫黄（S-S）結合を炭素−炭素結合に交換する。硫黄−硫黄結合はSBS（
例えば、２色素SBSまたは４色素SBS）に必要ではない。
【０１０３】
AcLys挿入315では、アセチルに保護されたリシンを用いて挿入125を交換する。
【０１０４】
BocLys挿入320では、tert-ブトキシカルボニルに保護されたリシンを用いて挿入125を
交換する。
【０１０５】
dMeO挿入325では、挿入125と比較し、硫黄-硫黄（S-S）結合を酸素−炭素（O-CH2）結
合と交換する。
【０１０６】
dMeS挿入330では、挿入125と比較し、硫黄−硫黄（S-S）結合を硫黄−炭素（S-CH2）結
合と交換する。
【０１０７】
DMP挿入335では、挿入125と比較し、硫黄−硫黄（S-S）結合を硫黄−炭素（CH2）結合
と交換する。
【０１０８】
本明細書に記載する種々の例において、ジメチル置換パターンを含む挿入（例えば、AE
DI挿入125、dMeO挿入325、およびdMeS挿入330）では、SBS中のヌクレオチド取り込み速度
が速いことが分かった。
【０１０９】
本明細書に記載する種々の例において、挿入における炭素鎖の長さはまた、変えること
ができる。
【０１１０】
図４は、図１ＢのAEDI挿入125および図３ＢのAcLys挿入315のシーケンシングの質に対
する効果を評価するために用いた、２色素シーケンシングランについてのデータ表を示す
。シーケンシングを、ヒト550bp鋳型を用いて2回150サイクルでMiseqハイブリッドプラッ
トフォーム上を走らせた。新しい色素セット、V10/cyan-peg4 A-AEDI550S0、V10/cyan-pe
g4 A-AcLys550S0、およびV10/cyan A-AcLys 550S0を、標準的な商業的色素セットV4およ
びNova platform V5.75の改良色素セットと比較した。V10/cyan-peg4 A-AEDI550S0サンプ
ル、V10/cyan-peg4 A-AcLys550S0サンプル、およびV10/cyan A-AcLys 550S0サンプルのそ
れぞれについて、フェージング値（Ph R1）は、AEDI挿入およびAcLys挿入のないサンプル
のフェージング値よりも低かった。そのため、追加的な挿入125および挿入３１５を含む
標識ヌクレオチドは、シーケンシングの質の向上を示した。
【０１１１】
図５Ａおよび５Ｂは、それぞれ、図４のシーケンシングランの、リード１の誤り率のグ
ラフおよびリード２の誤り率のグラフを示す。リード１では、V10/cyan-peg4 A-AEDI550S
0およびV10/cyan-peg4 A-AcLys550S0の誤り率は、挿入のない、色素V10/Cyan-peg4の同様
のセットよりも低かった。リード２では、AcLys挿入315を用いる場合がさらに顕著であり
、最終誤り率は、挿入なし色素セットに比べ30％減った。そのため、挿入125および挿入3
15は、シーケンシングの質を著しく向上させることが分かった。
【０１１２】
図６は、AEDI挿入125およびACA挿入310のシーケンシングの質に対する効果を評価する
ために用いた、シーケンシングランのデータ表を示す。シーケンシングを、ヒト550bp鋳
型を用いて2回150サイクルでMiseqハイブリッドプラットフォーム上を走らせた。新しい
色素セット、V10/cyan-peg4 A-AEDI550S0、V10/cyan-peg4 A-ACALys550S0を、標準的な商
業的色素セットV4およびNova platform V5.75の改良色素セットと比較した。ここでも、V
10/cyan-peg4 A-AEDI550S0サンプルおよびV10/cyan-peg4 A-ACA550S0サンプルそれぞれの
フェージング値（Ph R1）は、AEDI挿入およびACA挿入のないサンプルと比較して低く、し
たがって、シーケンシングの質の向上を示した。
【０１１３】
図７Ａおよび７Ｂはそれぞれ、図６のシーケンシングランの、リード１の誤り率のグラ
フ、および、リード２の誤り率のグラフを示す。新しい挿入AEDI（V10/cyan-peg4 A-AEDI
550S0）を含むセットでのリード１の誤り率は、挿入のない色素、V10/Cyan-peg4の同様の
セットよりも低かった。挿入ACA（V10/Cyan-peg4 ACA550S0）は、標準的V10/Cyan-peg4に
、両リードにおける類似の誤り率グラフを提供した。AEDIは再びシーケンシングの質の向
上を示した。これらのデータはまた、挿入の構造自体がシーケンシングの質の向上に影響
を与えることを示した。
【０１１４】
図８Ａは、標準LN3リンカー800の構造式を示す。LN3リンカー800は、第１置換アミド官
能部分810、第２アジド置換PEG官能部分815、および第３エステル官能部分820を含み、こ
れらは色素分子825をヌクレオチド830に連結するためのリンカー構造であることが望まれ
得る。第１官能部分810は、例えば、色素分子825をLN3リンカー800に結合するために用い
ることができる。第２官能基815は、例えば、色素分子825をLN3リンカー800から切断する
ために用いることができる、切断可能官能基である。第３官能部分820は、例えば、ヌク
レオチド830をLN3リンカー800に結合するために用いることができる。図８Ｂは標準LN3リ
ンカー800に対する一部の修飾を示し、ここではフェノキシ部分850が、-NO2、-CN、ハロ
、または-SO3Hから選択される１〜４個の置換基で置換されている。加えて、エステル部
分820は、アミド部分855と交換されている。
【０１１５】
図９Ａは、SSリンカーを有するffAにおける不純物の出現を示すグラフである。HPLC精
製後のffA-SS-NR550S0で、不純物は微塩基性条件（pH8〜9）において一晩で出現した。0.
1MのTEAB/CH3CNにおいて室温で一晩。図９Ｂは、SSリンカーを有するffAとAEDIリンカー
を有するffAの安定性を比較するものであり、AEDIリンカーがSSリンカーに比べ著しく向
上した安定性を示す。ffA-LN3-NR550S0を内部基準として用いた。ジスルフィド副生成物
：(NR550S0-S-)2。図９Ｃは、22時間IMX 60°におけるSSリンカーffAとAEDIリンカーffA
の比較を示し、ここでもSSリンカーで不純物が示される。内部管理はffA-LN3-NR550S0で
ある。Di-P：二リン酸。
【０１１６】
図１０Ａ、１０Ｂ、および１０Ｃは、リンカーを変えた溶液におけるヌクレオチド取り
込みスピードの予期せぬ増加を示す。図Ａは1μMにおける取り込み速度を示す。結果は、
色素およびリンカーが、取り込みキネティクスに著しい影響を与えることを示し、表１０
Ｂは取り込みキネティクスにおけるAEDIリンカーの利点を明確に示す。図１０Ｃは、NR55
0S0と共にAEDIリンカーおよびSSリンカーを図式的に示す。
【０１１７】
図１１Ａは、異なるA-550S0（同じ濃度）を有するV10組み合わせについての散布図を示
す。散布図は、タイル１、サイクル２である。図１１Ｂは溶液中のKcat FFAリンカーを示
す。表面において、取込み速度の点で、AEDIリンカーはリンカーなしよりも速いことが分
かる：（散布図の）「A」クラウドが中央にわずかに寄っている。AcLysリンカーはAEDIや
リンカーなしより遅い：「A」クラウドがx軸に寄っている。BocLysリンカーはリンカーな
しに似ており、AEDIリンカーから遠くはない。溶液では、ACAリンカーが最も遅い一方、A
EDIとACLyのKcatは類似しており、BocLysがそれに続くことが分かる。
【０１１８】
図１２Ａおよび１２Ｂは、M111、ヒト550、2x151サイクルでのシーケンシング基準を示
す。異なるA-550S0（同じ濃度）と組み合わせたffNの使用。AEDIリンカーおよびBocLysリ
ンカーの両方が、類似した良好なシーケンシング結果を提供することが分かる。AEDIおよ
びAcLysの溶液Kcatは類似しているが、AEDIのシーケンシング結果のほうがわずかに良い
。
【０１１９】
LN3リンカー800はオプションのフェノキシ部分835を含み、これは図８Ｃに示すようにL
N3リンカー800から取り除くことができる。LN3リンカー800はまた、オプションのアミド
部分840およびオプションのエーテル部分845を含み、これは両方とも図８Ｄに示すように
LN3リンカー800から取り除くことができる。アミド部分810、フェノキシ部分835のような
ある官能基を取り除く目的は、それらがヌクレオチドの取り込み中に、取込み効率を低減
する可能性がある酵素との否定的な相互作用を有するか否かをテストするためである。
【０１２０】
図８Ｅは、保護部分860のリンカーへの挿入または追加を示す。保護部分860は、官能部
分810と色素分子825の間に挿入される（または、図８Ａ〜８Ｃのフェノキシ部分835また
は850に結合することが可能である）。保護部分860は例えば、DNA損傷を防ぐ分子とする
ことができる。光損傷または他の化学損傷を含むDNA損傷は、SBSの累積的影響（つまり、
サイクルごと）の一つである。DNA損傷を実質的に低減するまたは除去することは、より
効率的なSBSおよびより長いシーケンシングリードを提供することができる。一部の実施
形態において、保護部分860は、トロロックス、没食子酸、2-メルカプトエタノール（Ｂ
ＭＥ）などといった三重項状態のクエンチャから選択することが可能である。一部の他の
実施形態において、保護部分860は、4-ニトロベンジルアルコール、またはアスコルビン
酸ナトリウムなどのアスコルビン酸の塩といった、クエンチング試薬または保護試薬から
選択することが可能である。一部の他の実施形態において、保護剤は、標識したヌクレオ
シドまたはヌクレオチドと共有結合を形成させるのではなく、緩衝液に物理的に混ぜるこ
とが可能である。しかしながら、このアプローチはより高い濃度の保護剤を必要とし、効
率性が落ち得る。代替として、ヌクレオシドまたはヌクレオチドに共有結合した保護部分
が、DNA損傷をよりうまく防ぐことができる。図８Ｃ、８Ｄ、および８Ｅの一部のさらな
る実施形態において、エステル部分821はまた、アミド部分855と交換することが可能であ
り、フェノキシ部分835はさらに置換することが可能である。
【０１２１】
図８Ａ〜８Ｅに示す任意の例において、図１ＢのAEDI挿入125およびSS挿入130、ならび
に図３Ａ〜３Ｆの挿入300は、例えば、リンカー800の第１官能部分810および色素部分825
の間に挿入され得る。
【実施例】
【０１２２】
例
追加の実施形態を以下の例においてさらに詳細に開示するが、これは特許請求の範囲を
限定することを意図するものでは決してない。
【０１２３】
ffA-LN3-AEDI-NR550S0を調製するための通常の反応手順：
【化１５】
2020015722.tif 000018
【０１２４】
50mLの丸底フラスコで、Boc-AEDI-OH（1g、3.4mmol）をDCM（15mL）に溶解し、TFA（1.
3mL、17mL）を室温で溶液に加えた。反応混合物を2時間撹拌した。TLC（DCM:MeOH=9:1)は
、Boc-AEDI-OHの完全な消費を示した。反応混合物を蒸発乾固させた。TEAB（2M、〜15mL)
を次に残渣に加え、中性になるまでpHをモニタリングした。混合物を次にH2O/CH3CN（1:1
、〜15mL)に溶解し、蒸発乾固させた。手順を3回繰り返し、余分なTEAB塩を取り除いた。
白色固体残渣をCH3CN（20mL）で処置し、0.5時間撹拌した。溶液を濾過し、固体をCH3CN
で洗浄し、純AEDI-OH-TFA塩を得た（530 mg、80％）。1H NMR（400MHz、D2O、δ(ppm)）
；3.32（t、J=6.5 Hz、2H、NH2-CH2）；2.97（t、J=6.5 Hz、2H、S-CH2）；1.53（s、6H
、2x CH3）。13C NMR（400 MHz、D2O、δ(ppm)）：178.21（s、CO）；127.91、117.71（2
s、TFA）；51.87（s、C-(CH3)2）；37.76（t、CH2-NH2）；34.23（t、S-CH2）；23.84（q
、2x CH3）。19F NMR（400 MHz、D2O, δ(ppm)）：-75.64。
【０１２５】
50mLの丸底フラスコで、色素NR550S0（114mg、176μmol）をDMF（無水、20mL）に溶解
し、蒸発乾固させた。手順を3回繰り返した。無水DMA（10mL）とヒューニッヒ塩基（92μ
L、528μmol、3当量）を次に丸底フラスコにピペットで移した。TSTU（69mg、228μmol、
1.3当量）を一部に加えた。反応混合物を室温で保持した。30分後、TLC（CH3CN：H2O＝85
：15）分析が、反応が終了したことを示した。0.1M TEAB中のAEDI-OH（68mg、352μmol、
2当量）を反応混合物に加え、室温で3時間撹拌した。TLC（CH3CN：H2O＝8：2)は活性エス
テルの完全な消費を示し、赤い斑点が活性エステル下に出現した。一方、分析HPLCはまた
、活性エステルの完全な消費および生成物の形成を示した。反応はTEAB緩衝液（0.1M、10
mL）でクエンチし、揮発性溶媒は減圧蒸発により取り除き（HV）、Axiaカラムにおいて精
製して、NR550S0-AEDI-OHを得た。収率：60％。
【０１２６】
25mLの丸底フラスコで、NR550S0-AEDI-OH（10μmol）をDMF（無水、5mL）に溶解し、蒸
発乾固した。手順を3回繰り返した。無水DMA（5mL）およびDMAP（1.8mL、15μmol、1.5当
量）を次に丸底フラスコに加えた。DSC（5.2mg、20μmol、2当量）を一部に加えた。反応
混合物を室温で保持した、30分後、TLC（CH3CN：H2O＝8：2）分析が、反応が終了したこ
とを示した。ヒューニッヒ塩基（3.5μL、20μmol）を反応混合物にピペットで移した。
次にpppA-LN3（0.5mLのH2O中に20μmol、2当量）とEt3N（5μL）との溶液を反応混合物に
加え、室温で一晩撹拌した。TLC（CH3CN：H2O＝8：2）が活性エステルの完全な消費を示
し、赤い斑点がベースライン上に出現した。一方、分析HPLCも活性エステルの完全な消費
と最終生成物の形成を示した。反応はTEAB緩衝液（0.1M、10mL）でクエンチし、DEAE Sep
hadexカラム（25g Biotageカラム）に搭載した。カラムを下記表２に示すようにグラディ
エントで溶出した。
【０１２７】
A：0.1 M TEAB緩衝液（10% CH3CN）
B：1 M TEAB緩衝液（10% CH3CN）
【０１２８】
グラディエント：
【表２】
2020015722.tif 000019
【０１２９】
所望の生成物を45％〜100％の1M TEAB緩衝液から溶出した。生成物を含有する断片を組
み合わせ、蒸発させ、HPLC（YCLコラム、8mL／分）により精製した。収率：53％。
【０１３０】
要約すると、本発明は、リンカーを介してフルオロフォアに共有結合したヌクレオシド
またはヌクレオチドであって、前記リンカーは式Ｉもしくは式ＩＩ、または両者の組み合
わせの構造を含む、クレオシドまたはヌクレオチドに関し得る。
【０１３１】
【化１６】
2020015722.tif 000020
（式中、R1およびR2はそれぞれ独立して、水素または置換されていてもよいC1-6アルキル
から選択され；
R3は、水素、置換されていてもよいC1-6アルキル、-NR5-C(=O)R6、または-NR7-C(=O)-O
R8から選択され；
R4 は水素または置換されていてもよいC1-6アルキルから選択され；
R5 およびR7はそれぞれ独立して、水素、置換されていてもよいC1-6アルキル、置換さ
れていてもよいフェニル、または置換されていてもよいC7-12アラルキルから選択され；
R6およびR8はそれぞれ独立して、置換されていてもよいC1-6アルキル、置換されていて
もよいフェニル、置換されていてもよいC7-12アラルキル、置換されていてもよいC3-7シ
クロアルキル、または置換されていてもよい5〜10員ヘテロアリールから選択され；
【化１７】
2020015722.tif 000021
の各メチレン反復単位は置換されていてもよく；
Xはメチレン（CH2）、酸素（O）、または硫黄（S）から選択され；
mは0〜20の整数であり；
nは1〜20の整数であり、
pは、フルオロフォアで標識したヌクレオシドまたはヌクレオチドが次の構造を持たな
い場合は、1〜20の整数である：
【化１８】
2020015722.tif 000022
【０１３２】
上記のヌクレオシドまたはヌクレオチドの一部の場合では、式Ｉの構造はまた、式Ｉａ
または式Ｉｂで表される。
【０１３３】
【化１９】
2020015722.tif 000023
【０１３４】
さらに、式ＩＩの構造は、式ＩＩａ、式ＩＩｂ、式ＩＩｃ、式ＩＩｄ、式ＩＩｅ、また
は式ＩＩｆで表すこともできる。
【０１３５】
【化２０】
2020015722.tif 000024
【０１３６】
具体的には、本発明は、リンカーを介してフルオロフォアに共有結合したヌクレオシド
またはヌクレオチドであって、前記リンカーは式Ｉもしくは式ＩＩ、または両者の組み合
わせの構造を含む、ヌクレオシドまたはヌクレオチドに関し得る。
【０１３７】
【化２１】
2020015722.tif 000025
（式中、R1は置換されていてもよいC1-6アルキルから選択され；
R2は水素または置換されていてもよいC1-6アルキルから選択され；
R3は、置換されていてもよいC1-6アルキル、-NR5-C(=O)R6、または-NR7-C(=O)-OR8から
選択され；
R4 は水素または置換されていてもよいC1-6アルキルから選択され；
R5 およびR7はそれぞれ独立して、水素、置換されていてもよいC1-6アルキル、置換さ
れていてもよいフェニル、または置換されていてもよいC7-12アラルキルから選択され；
R6およびR8はそれぞれ独立して、置換されていてもよいC1-6アルキル、置換されていて
もよいフェニル、置換されていてもよいC7-12アラルキル、置換されていてもよいC3-7シ
クロアルキル、または置換されていてもよい5〜10員ヘテロアリールから選択され；
【化２２】
2020015722.tif 000026
の各メチレン反復単位は置換されていてもよく；
Xはメチレン（CH2）、酸素（O）、または硫黄（S）から選択され；
mは0〜20の整数であり；
nは1〜20の整数であり、
pは、1〜20の整数である。）
【０１３８】
式Ｉの構造はまた、式Ｉａで表されることが好適である。
【０１３９】
【化２３】
2020015722.tif 000027
【０１４０】
さらに、式ＩＩの構造は、式ＩＩｂ、式ＩＩｃ、式ＩＩｄ、式ＩＩｅ、または式ＩＩｆ
でも表される。
【０１４１】
【化２４】
2020015722.tif 000028
【図１】
2020015722.tif 000037
【図２】
2020015722.tif 000038
【図３】
2020015722.tif 000039
【図４】
2020015722.tif 000040
【図５】
2020015722.tif 000041
【図６】
2020015722.tif 000042
【図７】
2020015722.tif 000043
【図８−１】
2020015722.tif 000044
【図８−２】
2020015722.tif 000045
【図９−１】
2020015722.tif 000046
【図９−２】
2020015722.tif 000047
【図１０Ａ】
2020015722.tif 000048
【図１０Ｂ】
2020015722.tif 000049
【図１１Ａ】
2020015722.tif 000050
【図１１Ｂ】
2020015722.tif 000051
【図１２Ａ】
2020015722.tif 000052
【図１２Ｂ】
2020015722.tif 000053
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月21日(2019.8.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンカーを介してフルオロフォアに共有結合するヌクレオシドまたはヌクレオチドであって、前記リンカーは式ＩＩの構造を含む、ヌクレオシドまたはヌクレオチド：
【化１】
2020015722.tif 000054
式ＩＩ
（式中、R3は、置換されていてもよいC1-6アルキル、-NR5-C(=O)R6、または-NR7-C(=O)-OR8から選択され；
R4 は水素または置換されていてもよいC1-6アルキルから選択され；
R5 およびR7はそれぞれ独立して、水素、置換されていてもよいC1-6アルキルから選択され；
R6およびR8はそれぞれ独立して、置換されていてもよいC1-6アルキル；
【化２】
2020015722.tif 000055
のメチレン反復単位は置換されていてもよく；
Xはメチレン（CH2）、酸素（O）、または硫黄（S）から選択され；
pは1〜20の整数である）。
【請求項２】
R3は置換されていてもよいC1-6アルキル又はメチルである、請求項１に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項３】
R3は-NH-C(=O)R6である、請求項１に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項４】
R6はメチルである、請求項３に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項５】
R3は-NH-C(=O)OR8である、請求項１に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項６】
R8はt-ブチルである、請求項５に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項７】
R4は水素である、請求項１〜６の何れか一項に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項８】
R4は置換されていてもよいC1-6アルキル又はメチルである、請求項１〜６の何れか一項に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項９】
pは1又は２である、請求項１〜８の何れか一項に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項１０】
式ＩＩの構造はまた、式ＩＩｂ、式ＩＩｃ、式ＩＩｄ、式ＩＩｅ、または式ＩＩｆにより表される、請求項１に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【化３】
2020015722.tif 000056
式ＩＩｂ
【化４】
2020015722.tif 000057
式ＩＩｃ
【化５】
2020015722.tif 000058
式ＩＩｄ
【化６】
2020015722.tif 000059
式ＩＩｅ、
または
【化７】
2020015722.tif 000060
式ＩＩｆ
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れか一項に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むキット。
【請求項１２】
フルオロフォアおよび請求項１〜１０の何れか一項に記載のリンカーを含む、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを修飾するための試薬。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドに取り込まれたヌクレオシドまたはヌクレオチドを検出する方法であって、
（ａ）請求項１〜１０の何れか一項に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチドをポリヌクレオチドに取り込むステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）で取り込まれた前記ヌクレオシドまたはヌクレオチドからの蛍光シグナルを検出するステップとを含む、方法。
【請求項１４】
鋳型核酸鎖および部分的にハイブリダイズされた核酸鎖を提供するステップをさらに含み、ステップ（ａ）は、前記鋳型鎖の対応する位置のヌクレオシドまたはヌクレオチドに対し相補的な少なくとも１つのヌクレオシドまたはヌクレオチドを、前記ハイブリダイズされた鎖に取り込み、ステップ（ｂ）は、前記取り込まれたヌクレオシドまたはヌクレオチドの塩基を特定することにより、前記鋳型鎖の相補的なヌクレオシドまたはヌクレオチドの同一性を示す、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
鋳型核酸分子を配列決定する方法であって、
１つまたは複数の標識ヌクレオチドを、前記鋳型核酸に対し相補的な核酸鎖に取り込むステップと；
前記鋳型核酸分子の配列を決定するため、１つまたは複数の取り込まれた標識ヌクレオチドに存在する塩基の同一性を決定するステップとを含み；
前記１つまたは複数の標識ヌクレオチドに存在する塩基の同一性は、前記標識ヌクレオチドにより生成される蛍光シグナルを検出することにより決定され、
少なくとも１つの取り込まれた標識ヌクレオチドは請求項１〜１０の何れか一項に記載のヌクレオチドである、方法。
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月24日(2019.10.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2020015722.tif 000061
【図２】
2020015722.tif 000062
【図３】
2020015722.tif 000063
【図４】
2020015722.tif 000064
【図５】
2020015722.tif 000065
【図６】
2020015722.tif 000066
【図７】
2020015722.tif 000067
【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【外国語明細書】
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