(57)【要約】      （修正有）【課題】タンパク質を含み、更には前記タンパク質の酸化を防止する化合物を含む液体製剤、そのような液体製剤の製造及び使用方法の提供。【解決手段】タンパク質と、液体製剤中のタンパク質の酸化を防止する化合物とを含む液体製剤であって、化合物が、Ｎ−アセチル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−Ｌ−トリプトファンアミド及びメラトニン、又はそれらの薬学的に許容される塩からなる群より選択される、製剤。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質と、液体製剤中のタンパク質の酸化を防止する化合物とを含む液体製剤であって、化合物が、５−ヒドロキシ−トリプトファン、５−ヒドロキシ  インドール、７−ヒドロキシ  インドール、及びセロトニンからなる群より選択される、製剤。
【請求項２】
対象に対する投与のために適切な薬学的製剤である、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
水性である、請求項１又は２に記載の製剤。
【請求項４】
製剤中の化合物が約０．３ｍＭから約５ｍＭである、請求項１から３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５】
製剤中の化合物が約１ｍＭである、請求項１から４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６】
化合物が、タンパク質中のトリプトファン及び／又はメチオニンの酸化を防止する、請求項１から５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項７】
化合物が、活性酸素種によるタンパク質の酸化を防止する、請求項１から６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項８】
活性酸素種が、一重項酸素、超酸化物（Ｏ２−）、過酸化水素、ヒドロキシルラジカル、及びアルキル過酸化物からなる群より選択される、請求項７に記載の製剤。
【請求項９】
タンパク質が酸化の影響を受けやすい、請求項１から８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１０】
タンパク質中のトリプトファンが酸化の影響を受けやすい、請求項１から９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１１】
タンパク質が抗体である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１２】
抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、又は抗体断片である、請求項１１に記載の製剤。
【請求項１３】
製剤中のタンパク質濃度が約１ｍｇ／ｍＬから約２５０ｍｇ／ｍＬである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１４】
安定剤、バッファー、界面活性剤、及び等張化剤からなる群より選択される一又は複数の添加剤を更に含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１５】
製剤が約４．５から約７．０のｐＨを有する、請求項３から１４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１６】
タンパク質の酸化を防ぐ化合物の量を液体製剤に加えることを含む、液体製剤の製造方法であって、化合物が、５−ヒドロキシ−トリプトファン、５−ヒドロキシ  インドール、７−ヒドロキシ  インドール、及びセロトニンからなる群より選択される、方法。
【請求項１７】
タンパク質の酸化を防ぐ化合物の量を液体製剤に加えることを含む、液体製剤中のタンパク質の酸化を防止する方法であって、化合物が、５−ヒドロキシ−トリプトファン、５−ヒドロキシ  インドール、７−ヒドロキシ  インドール、及びセロトニンからなる群より選択される、方法。
【請求項１８】
製剤が、対象に対する投与のために適切な薬学的製剤である、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
製剤が水性である、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
製剤中の化合物が約０．３ｍＭから約５ｍＭである、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
製剤中の化合物が約１ｍＭである、請求項１６から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
化合物が、タンパク質中のトリプトファン及び／又はメチオニンの酸化を防止する、請求項１６から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
化合物が、活性酸素種によるタンパク質の酸化を防止する、請求項１６から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
活性酸素種が、一重項酸素、超酸化物（Ｏ２−）、過酸化水素、ヒドロキシルラジカル、及びアルキル過酸化物からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
タンパク質が酸化の影響を受けやすい、請求項１６から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
タンパク質中のトリプトファンが酸化の影響を受けやすい、請求項１６から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
タンパク質が抗体である、請求項１６から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、又は抗体断片である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
製剤中のタンパク質濃度が約１ｍｇ／ｍＬから約２５０ｍｇ／ｍＬである、請求項１６から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
製剤が、安定剤、バッファー、界面活性剤、及び等張化剤からなる群より選択される一又は複数の添加剤を更に含む、請求項１６から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
製剤が約４．５から約７．０のｐＨを有する、請求項１６から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
タンパク質組成物中のタンパク質の酸化を防止する化合物のスクリーニング方法であって、Ｌ−トリプトファンに比べて酸化電位及び光感受性が低い化合物を選択すること、並びに選択された化合物の、タンパク質の酸化を防止する効果を試験することを含む方法。
【請求項３３】
光感受性が、光暴露時に化合物によって生成されるＨ２Ｏ２の量に基づいて測定される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
Ｌ−トリプトファンによって生成されるＨ２Ｏ２の量の約２０％未満を生成する化合物が選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
酸化電位がサイクリックボルタンメトリーによって測定される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
選択された化合物が、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ジヒドロクロリド（ＡＡＰＨ）、光、及び／又はフェントン試薬によって生成された活性酸素種によるタンパク質の酸化を防止する効果について試験される、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、どちらも参照によりその内容全体が本明細書に組み入れられる、２０１３年３月１３日出願の米国仮特許出願第６１／７８０８４５号、及び２０１３年１１月２７日出願の同第６１／９０９８１３号の利益を請求する。
【０００２】
本発明は、タンパク質を含み、更には前記タンパク質の酸化を防止する化合物を含む液体製剤、そのような液体製剤の製造及び使用方法、並びにタンパク質組成中のタンパク質の酸化を防止する化合物のスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
アミノ酸残基の酸化的分解反応は、プロテイン薬剤において一般的に観察される現象である。複数のアミノ酸残基、特にメチオニン（Ｍｅｔ）、システイン（Ｃｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、及びチロシン（Ｔｙｒ）は、酸化の影響を受けやすい（Li et al., Biotechnology and Bioengineering 48:490-500 (1995)）。酸化は、典型的には、様々な処理工程の間に、タンパク質が過酸化水素、光、金属イオン、又はこれらの組合せに暴露されるとき観察される（Li et al., Biotechnology and Bioengineering 48:490-500 (1995)）。特に、光（Wei, et al., Analytical Chemistry 79(7):2797-2805 (2007)）、ＡＡＰＨ又はフェントン試薬（Ji et al., J Pharm Sci 98(12):4485-500 (2009)）に暴露されたタンパク質は、トリプトファン残基に酸化レベルの上昇を示しており、過酸化水素に暴露されたタンパク質は典型的にメチオニンの酸化のみを示している（Ji et al., J Pharm Sci 98(12):4485-500 (2009)）。光暴露は、一重項酸素、過酸化水素及び超酸化物を含む活性酸素種（ＲＯＳ）の形成によりタンパク質の酸化を引き起こすことができ（Li et al., Biotechnology and Bioengineering 48:490-500 (1995); Wei, et al., Analytical Chemistry 79(7):2797-2805 (2007); Ji et al., J Pharm Sci 98(12):4485-500 (2009); Frokjaer et al., Nat Rev Drug Discov 4(4):298-306 (2005)）、タンパク質の酸化は、典型的には、フェントン媒介性反応においてヒドロキシルラジカルを介して（Prousek et al., Pure and Applied Chemistry 79(12):2325-2338 (2007)）、及びＡＡＰＨ媒介性反応においてアルコキシル過酸化物を介して（Werber et al., J Pharm Sci 100(8):3307-15 (2011)）起こる。トリプトファンの酸化は、ヒドロキシトリプトファン、キヌレニン、及びＮ−ホルミルキヌレニンを含む無数の酸化生成物を生み、安全性及び有効性に影響を与える可能性を有する（Li et al., Biotechnology and Bioengineering 48:490-500 (1995); Ji et al., J Pharm Sci 98(12):4485-500 (2009); Frokjaer et al., Nat Rev Drug Discov 4(4):298-306 (2005)）。生物学的機能の欠失と相関するモノクローナル抗体の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）における特定のトリプトファン残基の酸化が報告されている（Wei, et al., Analytical Chemistry 79(7):2797-2805 (2007)）。ヒスチジン配位金属イオンによって媒介されたＴｒｐ酸化が、Ｆａｂ分子について最近報告されている（Lam et al., Pharm Res 28(10):2543-55 (2011)）。Ｆａｂ製剤中におけるポリソルベート２０の自動酸化は、様々な過酸化物を生成するもので、これも同じレポートにおいて言及されている。また、タンパク質中のＭｅｔ残基は内的抗酸化剤として作用し（Levine et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93(26):15036-15040 (1996)）、過酸化物によって容易に酸化することが示されているため、自動酸化により誘導されるこのような過酸化物の生成は、製剤の長期貯蔵中にタンパク質中のメチオニンの酸化を引き起こしうる。アミノ酸残基の酸化は、タンパク質の生物活性に影響を与える可能性を有する。これは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に特に当てはまる。ＩｇＧ１  ｍＡｂ中のＭｅｔ２５４及びＭｅｔ４３０におけるメチオニンの酸化は、トランスジェニックマウスの血清半減期に影響する可能性があり（Wang et al., 分子 Immunology 48(6-7):860-866 (2011)）、また、ヒトＩｇＧ１のＦｃＲｎ及びＦｃ−γ受容体への結合に影響を与える（Bertolotti-Ciarlet et al., Molecular Immunology 46(8-9)1878-82 (2009)）。
【０００４】
タンパク質の安定性は、特に液体状態において、製剤の製造及び貯蔵の間に評価される必要がある。薬学的製剤の開発は、時として活性成分の酸化を防ぐための抗酸化剤の添加を含む。製剤に対するＬ−メチオニンの添加は、タンパク質及びペプチド中においてメチオニン残基の酸化を減少させた（Ji et al., J Pharm Sci 98(12):4485-500 (2009); Lam et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 86(11):1250-1255 (1997)）。同様に、Ｌ−トリプトファンの添加は、トリプトファン残基の酸化を減少させることを示した（Ji et al., J Pharm Sci 98(12):4485-500 (2009); Lam et al., Pharm Res 28(10):2543-55 (2011)）。しかしながら、Ｌ−Ｔｒｐは、ＵＶ領域（２６０〜２９０ｎｍ）において高い吸光度を有し、したがって光酸化の間の主要な標的である（Creed, D., Photochemistry and Photobiology 39(4):537-562 (1984)）。Ｔｒｐは、酸素依存性のチロシン（Babu et al., Indian J Biochem Biophys 29(3):296-8 (1992)）及び他のアミノ酸（Bent et al., Journal of the American Chemical Society 97(10):2612-2619 (1975)）の光酸化を亢進させる内因性の光増感剤と仮定された。Ｌ−Ｔｒｐは光に暴露されると過酸化水素を生成できること、及びＬ−ＴｒｐはＵＶ光下においてスーパーオキシドアニオンを介して過酸化水素を生成することが実証された（McCormick et al., Science 191(4226):468-9 (1976); Wentworth et al., Science 293(5536):1806-11 (2001); McCormick et al., Journal of the American Chemical Society 100:312-313 (1978)）。加えて、トリプトファンは、光への暴露により一重項酸素を生じさせることが知られている（Davies, M.J., Biochem Biophys Res Commun 305(3):761-70 (2003)）。ポリソルベート２０の自動酸化により誘導されるタンパク質の酸化と同様に、正常な取扱い条件下において、タンパク質製剤中における他の添加剤（例えばＬ−Ｔｒｐ）によるＲＯＳ発生時にタンパク質の酸化が起こることがありうる。
【０００５】
最近の研究から、タンパク質を安定化させるための標準の添加剤、例えばＬ−Ｔｒｐ及びポリソルベートの、タンパク質組成物への添加により、ＲＯＳによって誘導されるタンパク質の酸化といった予測不能の望ましくない結果を生じる可能性があることが明らかになっている。したがって、タンパク質組成物中において使用される代替的添加剤の同定、及びそのような組成物の開発に対する需要が依然として存在する。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書においては、タンパク質と、製剤中におけるタンパク質の酸化を防止する化合物とを含む製剤、前記製剤の作製方法、及びタンパク質組成物中におけるタンパク質の酸化を防止する化合物のスクリーニング方法が提供される。
【０００７】
本明細書において、一態様では、タンパク質と、液体製剤中におけるタンパク質の酸化を防止する化合物とを含む液体製剤であって、化合物は、５−ヒドロキシ−トリプトファン、５−ヒドロキシ  インドール、７−ヒドロキシ  インドール、及びセロトニンからなる群より選択される、製剤が提供される。
【０００８】
いくつかの実施態様では、液体製剤は、対象に投与するために適した薬学的製剤である。いくつかの実施態様では、製剤は水性である。
【０００９】
いくつかの実施態様では、製剤中のタンパク質の酸化を防止する化合物は、製剤中において、約０．３ｍＭ〜約１０ｍＭ、又は多くとも化合物が可溶である最大濃度である。いくつかの実施態様では、製剤中のタンパク質の酸化を防止する化合物は、約０．３ｍＭ〜約９ｍＭ、約０．３ｍＭ〜約８ｍＭ、約０．３ｍＭ〜約７ｍＭ、約０．３ｍＭ〜約６ｍＭ、約０．３ｍＭ〜約５ｍＭ、約０．３ｍＭ〜約４ｍＭ、約０．３ｍＭ〜約３ｍＭ、約０．３ｍＭ〜約２ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約２ｍＭ、約０．６ｍＭ〜約１．５ｍＭ、又は約０．８ｍＭ〜約１．２５ｍＭである。いくつかの実施態様では、製剤中のタンパク質の酸化を防止する化合物は、約０．３ｍＭ〜約１ｍＭである。いくつかの実施態様では、製剤中のタンパク質の酸化を防止する化合物は約０．３ｍＭ〜約５ｍＭである。いくつかの実施態様では、製剤中のタンパク質の酸化を防止する化合物は約１ｍＭである。いくつかの実施態様では、化合物は、タンパク質中のトリプトファン及び／又はメチオニンの酸化を防止する。いくつかの実施態様では、化合物は、活性酸素種によるタンパク質の酸化を防止する。いくつかの実施態様では、活性酸素種は、一重項酸素、超酸化物（Ｏ２−）、過酸化水素、ヒドロキシルラジカル、及びアルキル過酸化物からなる群より選択される。
【００１０】
いくつかの実施態様では、製剤中のタンパク質は酸化の影響を受けやすい。いくつかの実施態様では、タンパク質中のトリプトファンは、酸化の影響を受けやすい。いくつかの実施態様では、タンパク質は、抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、又は抗体断片）である。いくつかの実施態様では、製剤中のタンパク質濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。
【００１１】
いくつかの実施態様では、製剤は更に、安定剤、バッファー、界面活性剤、及び等張化剤からなる群より選択される一又は複数の添加剤を含む。いくつかの実施態様では、製剤のｐＨは約４．５〜約７．０である。
【００１２】
本明細書において、別の態様では、タンパク質の酸化を防止する量の化合物を液体製剤に添加することを含む、液体製剤の作製方法であって、化合物が、５−ヒドロキシ−トリプトファン、５−ヒドロキシ  インドール、７−ヒドロキシ  インドール、及びセロトニンからなる群より選択される、方法が提供される。本明細書において、別の態様では、タンパク質の酸化を防止する量の化合物を液体製剤に付加することを含む、液体製剤中のタンパク質の酸化を防止する方法であって、化合物が、５−ヒドロキシ−トリプトファン、５−ヒドロキシ  インドール、７−ヒドロキシ  インドール、及びセロトニンからなる群より選択される、方法が提供される。
【００１３】
本明細書に記載される方法のいくつかの実施態様では、製剤は、対象に投与するために適した薬学的製剤である。いくつかの実施態様では、製剤は水性である。本明細書に記載される方法のいくつかの実施態様では、製剤中の化合物は、製剤中において、約０．３ｍＭ〜約１０ｍＭ、又は多くとも化合物が可溶である最大濃度である。いくつかの実施態様では、製剤中の化合物は、約０．３ｍＭ〜約９ｍＭ、約０．３ｍＭ〜約８ｍＭ、約０．３ｍＭ〜約７ｍＭ、約０．３ｍＭ〜約６ｍＭ、約０．３ｍＭ〜約５ｍＭ、約０．３ｍＭ〜約４ｍＭ、約０．３ｍＭ〜約３ｍＭ、約０．３ｍＭ〜約２ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約２ｍＭ、約０．６ｍＭ〜約１．５ｍＭ、又は約０．８ｍＭ〜約１．２５ｍＭの濃度である。いくつかの実施態様では、製剤中の化合物は、約０．３ｍＭ〜約１ｍＭである。いくつかの実施態様では、製剤中の化合物は、約０．３ｍＭ〜約５ｍＭである。いくつかの実施態様では、製剤中の化合物は約１ｍＭ〜である。
【００１４】
いくつかの実施態様では、化合物は、タンパク質中のトリプトファン、及び／又はメチオニンの酸化を防止する。いくつかの実施態様では、化合物は、活性酸素種によるタンパク質の酸化を防止する。いくつかの実施態様では、活性酸素種は、一重項酸素、超酸化物（Ｏ２−）、過酸化水素、ヒドロキシルラジカル、及びアルキル過酸化物からなる群より選択される。
【００１５】
いくつかの実施態様では、タンパク質は酸化の影響を受けやすい。いくつかの実施態様では、タンパク質中のトリプトファンは、酸化の影響を受けやすい。いくつかの実施態様では、タンパク質は、抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、又は抗体断片）である。いくつかの実施態様では、製剤中のタンパク質濃度は約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。
【００１６】
いくつかの実施態様では、安定剤、バッファー、界面活性剤、及び等張化剤からなる群より選択される一又は複数の添加剤が、製剤中に添加される。いくつかの実施態様では、製剤のｐＨは約４．５〜約７．０である。
【００１７】
本明細書において、別の態様では、タンパク質組成物中におけるタンパク質の酸化を防止する化合物のスクリーニング方法であって、Ｌ−トリプトファンより酸化電位及び光感受性が共に低い化合物を選択すること、並びに選択された化合物の、タンパク質の酸化を防止する効果を試験することを含む方法が提供される。
【００１８】
本方法のいくつかの実施態様では、光感受性は、光暴露時に化合物によって生成されるＨ２Ｏ２の量に基づいて測定される。いくつかの実施態様では、Ｌ−トリプトファンによって生成されるＨ２Ｏ２の量の約２０％未満を生成する化合物が選択される。いくつかの実施態様では、酸化電位は、サイクリックボルタンメトリーによって測定される。いくつかの実施態様では、選択された化合物は、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ジヒドロクロリド（ＡＡＰＨ）、光、及び／又はフェントン試薬によって生成された活性酸素種によるタンパク質の酸化を防止する効果について試験される。
【００１９】
本明細書に記載される種々の実施態様の一つ、一部、又は全部を組み合わせて本発明の他の実施態様を形成することができることを理解されたい。本発明の上記態様及び他の態様は、当業者には明らかであろう。本発明の上記実施態様及び他の実施態様について、以下の「発明を実施するための形態」で更に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】２５０Ｗ／ｍ２での光暴露の八時間後における、Ａ）ｍＡｂ１中のＦａｂ、及びＢ）ｍＡｂ１中のＦｃの酸化を示す一連のグラフである。ｍＡｂ１は、２０ｍＭのヒスチジンアセテート、２５０ｍＭのトレハロース、０．０２％のポリソルベート２０中に５ｍｇ／ｍＬで存在した。ｍＡｂ１参照試料を除くすべてのバイアルは光照射装置内に配置された。ホイルコントロールのバイアルは、光照射装置内に配置する前にホイルで覆った。各試料について、三つの別個の実験バイアルの平均値を求めた。但し、「１０ｍＭ  Ｍｅｔ、１ｍＭ  Ｔｒｐ」（＊）は、二つの実験バイアルの平均であり、ｍＡｂ１参照試料は、ＨＰＬＣに三回の独立した注入を行った一つの実験バイアルであった。エラーバーは、一つの標準偏差を表している。
【図２】Ｌ−Ｔｒｐによる用量依存Ｈ２Ｏ２生成を示すグラフである。ひし形は、Ｌ−Ｔｒｐのみを；三角形はＬ−Ｔｒｐ＋ＳＯＤを；円及び四角形はＬ−Ｔｒｐ＋ＮａＮ３＋ＳＯＤを示す。すべての試験は２０ｍＭのＬ−Ｈｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ５．５）中で行った。
【図３】Ａ）１、３及び７日間にわたって周囲光条件に暴露されたときの、３．２ｍＭのＬ−Ｔｒｐを含有する５０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ１製剤中における過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の生成、及びＢ）周囲光条件への暴露の１０日後の、３．２ｍＭのＬ−Ｔｒｐを含有するｍＡｂ１製剤中におけるパーセント（％）Ｆａｂ酸性化を示す一連のグラフである。
【図４】２５０Ｗ／ｍ２で４時間にわたる光ストレス下における、トリプトファン誘導体及びインドール誘導体による過酸化水素生成を示す一連のグラフである。Ａ）２０ｍＭのＨｉｓＡｃ（ｐＨ５．５）製剤中における過酸化水素（μＭ）生成のためのリプトファン誘導体（１ｍＭ）のスクリーニング。Ｂ）２０ｍＭのＨｉｓＡｃ（ｐＨ５．５）製剤中における過酸化水素（μＭ）生成のためのインドール誘導体（１ｍＭ）のスクリーニング。
【図５】光暴露時の、様々なＴｒｐ誘導体によるＨ２Ｏ２生成に対するＮａＮ３の影響を示すグラフである。データは、Ｌ−Ｔｒｐによって生成された過酸化物に対する比率として示されている。
【図６】酸化電位と光誘導過酸化物形成との相関を示すグラフである。四角形の枠内の領域は、候補抗酸化剤化合物を示している。
【図７】ＡＡＰＨインキュベーション後の、Ａ）ｍＡｂ１中のＦａｂ、及びＢ）ｍＡｂ１中のＦｃの酸化を示す一連のグラフである。ｍＡｂ１参照試料及びＡＡＰＨなしの場合を除き、すべての試料はＡＡＰＨと共にインキュベートした。ｍＡｂ１参照試料を除くすべての試料は、４０℃でインキュベートした。示されたデータは、三つの実験試料の平均±１ＳＤである。但し、ｍＡｂ１参照試料は六回のＨＰＬＣ注入の平均であり、エラーバーを有していない。
【図８】２５０Ｗ／ｍ２での光暴露の十六時間後の、Ａ）ｍＡｂ１中のＦａｂ、及びＢ）ｍＡｂ１中のＦｃの酸化を示す一連のグラフである。ｍＡｂ１参照試料を除くすべてのバイアルは光照射装置内に配置された。ホイルコントロールのバイアルは、光照射装置内に配置する前にホイルで覆った。各試料について、三つの別個の実験バイアルの平均値を求めた。但し、Ｌ−トリプタオファンアミド（＊）は、二つの実験バイアルの平均であり、ｍＡｂ１参照試料は、ＨＰＬＣに三回の独立した注入を行った一つのバイアルであった。エラーバーは、一つの標準偏差を表している。
【図９】１０ｐｐｍのＨ２Ｏ２及び０．２ｍＭのＦｅ（ＩＩＩ）を用いたフェントン反応後の、Ａ）３ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ１中のＦａｂの、及びＢ）３ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ１中のＦｃの酸化を示す一連のグラフである。反応は、４０ｏＣで３時間インキュベートし、１００ｍＭのＬ−Ｍｅｔでクエンチし、パパイン消化後にＲＰ−ＨＰＬＣを用いて分析した。すべての試料は三つの別個のバイアルの平均であり、ｍＡｂ１コントロール（参照試料）は、ＨＰＬＣに五回の独立した注入を行った一つのバイアルであった。エラーバーは、一つの標準偏差を表している。
【図１０】Ａ）Ｌ−Ｔｒｐ及びＢ）５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン励起の、１Ｏ２の生成及びクエンチにおける推定機構を示す一連の略図である。ｋ２５Ｃは、１Ｏ２のクエンチの二次速度定数を表し（Dad et al., J Photochem Photobiol B, 78(3):245-51 (2005)）、Ｅｏｘは分子の酸化電位対Ａｇ／ＡｇＣｌである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
Ｉ．定義
発明を詳細に記載する前に、本発明が、特定の組成物又は生体系に限定されるものではなく、言うまでもなく様々に変形可能であることを理解されたい。また、本明細書で用いる用語は、特定の実施態様を説明するためのものであり、限定することを目的としていないことを理解されたい。
【００２２】
用語「薬学的製剤」は、有効な活性成分の生物学的活性を許容するような形態の、製剤が投与される被験体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。このような製剤は滅菌である。
【００２３】
「滅菌」製剤は、無菌である、又はすべての生きた微生物及びその胞子を有さない若しくは実質的に有さない。
【００２４】
「安定な」製剤は、それに含有されるタンパク質が、貯蔵時にその物理的安定性及び／又は化学安定性及び／又は生物活性を実質的に保持するものである。好ましくは、製剤は、貯蔵時に、その物理的及び化学安定性、並びにその生物活性を実質的に保持する。貯蔵期間は、通常、製剤の目的の有効期間に基づいて選択される。タンパク質の安定性を測定するための種々の分析技術が当技術分野で利用可能であり、例えば、Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991)及びJones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)に概説がある。安定性は、選択された期間にわたり、選択された量の光暴露及び／又は温度で測定される。安定性は、様々な方法で定性的に及び／又は定量的に評価することができ、そのような方法には、凝集体形成の評価（例えば分子ふるいクロマトグラフィーを用いて、濁度を測定することにより、及び／又は目視検査により）；ＲＯＳ形成の評価（例えば光ストレスアッセイ又は２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ジヒドロクロリド（ＡＡＰＨ）ストレスアッセイを用いることにより）；タンパク質の特定のアミノ酸残基の酸化（例えばモノクローナル抗体のＴｒｐ残基及び／又はＭｅｔ残基）；陽イオン交換クロマトグラフィー、イメージキャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）又はキャピラリーゾーン電気泳動を用いて電荷不均一性を評価することにより；アミノ末端又はカルボキシ末端配列分析；質量分光分析；還元されたインタクトな抗体を比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析；ペプチドマップ（例えばトリプシン又はＬＹＳ−Ｃ）分析；生物活性又はタンパク質の標的結合機能（例えば、抗体の抗原結合機能）を評価すること；などが含まれる。不安定性は、凝集、アミド分解（例えばＡｓｎアミド分解）、酸化（例えばＭｅｔ酸化及び／又はＴｒｐ酸化）、異性化（例えばＡｓｐ異性化）、クリッピング／加水分解／断片化（例えばヒンジ領域断片化）、スクシンイミド形成、不対システイン、Ｎ末端延長、Ｃ末端処理、グリコシル化差異などのうちのいずれか一つ又は複数を伴う。
【００２５】
タンパク質は、色及び／又は透明性の目視検査時に又はＵＶ光散乱により若しくは分子ふるいクロマトグラフィーにより測定した時に、凝集、沈殿及び／又は変性をまったく又はほとんど示さないのであれば、薬学的製剤中において「その物理的安定性を保持している」。
【００２６】
タンパク質は、タンパク質が下記に定義するその生物活性を依然として保持していると考えられるような、所与の時点の化学安定性を有する場合、薬学的製剤中において「その化学安定性を保持している」。化学安定性は、タンパク質の化学変性した形態を検出して定量化することにより、評価することができる。化学変成は、例えば、トリプシンペプチドマッピング、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を用いて評価可能なタンパク質の酸化を伴う。他の種類の化学変成には、例えば、イオン交換クロマトグラフィー又はｉｃＩＥＦにより評価可能なタンパク質の荷電変化が含まれる。
【００２７】
タンパク質は、所与の時点のタンパク質の生物活性が、例えばモノクローナル抗体の抗原結合アッセイにおいて決定したとき、薬学的製剤が調製された時点で呈示された生物活性の約１０％以内（アッセイの誤差内）であれば、薬学的製剤中において「その生物活性を保持している」。
【００２８】
本明細書で使用されるタンパク質の「生物活性」は、タンパク質のその標的に対する結合能、例えばモノクローナル抗体の抗原に対する結合能を指す。「生物活性」は、インビトロ又はインビボで測定可能な生物学的応答を更に含むことができる。このような活性は、拮抗性でも作動性でもよい。
【００２９】
「酸化しやすい」タンパク質は、限定されないが、メチオニン（Ｍｅｔ）、システイン（Ｃｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、及びチロシン（Ｔｙｒ）といった、酸化しやすいことが判明している一又は複数の残基を含むものである。例えば、モノクローナル抗体のＦａｂ部分中のトリプトファンアミノ酸又はモノクローナル抗体のＦｃ部分中のメチオニンアミノ酸は酸化しやすい。
【００３０】
「等張性」とは、対象の製剤がヒトの血液と実質的に同じ浸透圧を有することを意味する。等張性製剤は、通常、約２５０〜３５０ｍＯｓｍの浸透圧を有する。等張性は、例えば、蒸気圧又は氷凍結型浸透圧計を用いて測定することができる。
【００３１】
本明細書で使用される、「バッファー」は、その酸塩基コンジュゲート成分の作用によりｐＨの変化に抵抗する緩衝液を指す。本発明のバッファーのｐＨは、好ましくは約４．５〜約８．０の範囲内である。例えば、ヒスチジンアセテートは、この範囲内でｐＨを制御するバッファーの一例である。
【００３２】
「防腐剤」は、製剤中の細菌作用を実質的に低減し、したがって例えば多用途製剤の生産を容易にするために、任意選択的に製剤に含めることができる化合物である。可能な防腐剤の例には、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド（アルキル基が長鎖化合物であるアルキルベンジルジメチルアンモニウム  クロリドの混合物）、及び塩化ベンゼトニウムが含まれる。他の種類の防腐剤には、フェノール、ブチル、及びベンジルアルコールなどの芳香族アルコール、メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールが含まれる。一実施態様では、本明細書の防腐剤はベンジルアルコールである。
【００３３】
本明細書において使用される「界面活性剤」は、表面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤を指す。本明細書における界面活性剤の例には、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０及び、ポリソルベート８０）；ポロキサマー（例えばポロキサマー１８８）；トリトン；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；ラウリル硫酸ナトリウム；ナトリウムオクチルグルコシド；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−、又はステアリル−スルホベタイン；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−又はステアリル−サルコシン；リノレイル−、ミリスチル−、又はセチル−ベタイン；ラウロアミドプロピル−、コカミドプロピル−、リノールアミドプロピル−、ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−、又はイソステアラミドプロピル−ベタイン（例えばラウロアミドプロピル）；ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−、又はイソステアラミドプロピル−ジメチルアミン；メチルココイルナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌ  ｃｏｃｏｙｌ）−、又はメチルオレイル−タウレート二ナトリウム塩；及びＭＯＮＡＱＵＡＴＴＭシリーズ（Ｍｏｎａ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、ニュージャージー州パターソン）；ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、並びにエチレン及びプロピレングリコールのコポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＰＦ６８など）；などが含まれる。一実施態様では、本明細書における界面活性剤はポリソルベート２０である。
【００３４】
本明細書で使用される「薬学的に許容される」添加剤又は担体には、薬学的に許容される担体、安定剤、バッファー、酸、塩基、糖類、防腐剤、界面活性剤、等張化剤などが含まれ、これらは当技術分野において周知である（Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22ndEd., Pharmaceutical Press, 2012）。薬学的に許容される添加剤の例はバッファーを含み、それは例えば、リン酸塩（phosphate）、クエン酸塩（citrate）、酢酸塩（acetate）、及び他の有機酸；アスコルビン酸、Ｌ−トリプトファン及びメチオニンを含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；金属錯体、例えばＺｎ−タンパク質複合体；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトール又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート、ポロキサマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳTMである。「薬学的に許容される」添加剤又は担体は、使用される活性成分の有効用量を提供するために対象に合理的に投与することができ、且つ使用される投与量及び濃度でそれに暴露される対象にとって非毒性のものである。
【００３５】
製剤化されるタンパク質は、好ましくは実質的に純粋で望ましくは実質的に均一である（例えば、夾雑タンパク質などを含まない）。「実質的に純粋な」タンパク質とは、組成物の総重量に基づいて、少なくとも約９０重量％のタンパク質（例えば、モノクローナル抗体）、好ましくは少なくとも約９５重量％のタンパク質を含む組成を意味する。「実質的に均一な」タンパク質とは、組成物の総重量に基づいて、少なくとも約９９重量％のタンパク質（例えば、モノクローナル抗体）を含む組成を意味する。
【００３６】
用語「タンパク質」「ポリペプチド」及び「ペプチド」は、本明細書においては、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために互換的に使用される。ポリマーは、直鎖状でも分枝状でもよく、修飾されたアミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸が割り込んでいてもよい。この用語はまた、自然に又は介入により改変されているアミノ酸ポリマーを包含しており；その例として、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは改変、例えば、標識化成分とのコンジュゲーションが挙げられる。この定義には、例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸等を含む）の一又は複数の類似体を含むタンパク質、並びに、当技術分野において既知の他の修飾も含まれる。本明細書の定義に包含されるタンパク質の例には、例えばレニンといった哺乳動物のタンパク質；ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポ蛋白；α１アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体ホルモン；グルカゴン；レプチン；因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子、及びヴォンヴィレブランド因子といった凝固因子；プロテインＣのような抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性剤；ウロキナーゼ又はヒトの尿といったプラスミノーゲン活性因子又は組織型プラスミノーゲン活性因子（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子−α及び−β；デスレセプター５及びＣＤ１２０といった腫瘍壊死因子受容体；ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）；Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）；Ｂリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）；増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（正常なＴ細胞の発現及び分泌活性化制御）；ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミュラー管抑制因子；レラキシンＡ鎖；レラキシンＢ鎖；プロレラキシン（ｐｒｏｒｅｌａｘｉｎ）；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；βラクタマーゼといった微生物タンパク；デオキシリボヌクレアーゼ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ−４といった細胞傷害性Ｔ−リンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）；インヒビン；アクチビン；血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）；血管内皮増殖因子ファミリータンパク質（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、及びＰ１ＧＦ）；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）ファミリータンパク質（例えば、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、及びそれらのダイマー）；ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ４、及びＦＧＦ９といった繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリー；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；ＶＥＧＦ受容体（例えばＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、及びＶＥＧＦＲ３）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体（例えば、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、及びＥｒｂＢ４  受容体）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体（例えば、ＰＤＧＦＲ−α及びＰＤＧＦＲ−β）、及び繊維芽細胞増殖因子受容体といった、増殖因子又はホルモンの受容体；ＴＩＥリガンド（アンジオポ��チン、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ２）；ＴＩＥ１及びＴＩＥ２といったアンジオポエチン受容体；プロテインＡ又はＤ；リウマトイド因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、又は−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、又はＮＴ−６）といったニューロトロフィン因子、又はＮＧＦ−ｂなどの神経成長因子；ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、又はＴＧＦ−β５を含む、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βといったトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子−Ｉ及び−ＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；脱（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９及びＣＤ２０などのＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；抗毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；ＣＸＣＬ１２及びＣＸＣＲ４などのケモカイン；インターフェロン−α、−β、及び−γといったインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）のようなサイトカイン、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０；ミッドカイン；超酸化物ジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；分解促進因子；例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部分といった、ウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４及びＶＣＡＭといったインテグリン；エフリン；Ｂｖ８；デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）；Ｄｅｌ−１；ＢＭＰ９；ＢＭＰ１０；フォリスタチン；肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）／散乱係数（ＳＦ）；Ａｌｋ１；Ｒｏｂｏ４；ＥＳＭ１；パールカン；ＥＧＦ様ドメイン、マルチプル（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）７（ＥＧＦＬ７）；ＣＴＧＦ及びそのファミリーのメンバー；トロンボスポンジン１及びトロンボスポンジン２などのトロンボスポンジン；コラーゲンＩＶ及びコラーゲンＸＶＩＩＩなどのコラーゲン；ＮＲＰ１及びＮＲＰ２などのニューロピリン；プレイオトロフィン（ＰＴＮ）；プログラニュリン；プロリフェリン；Ｎｏｔｃｈ１及びＮｏｔｃｈ４などのＮｏｔｃｈタンパク質；Ｓｅｍａ３Ａ、Ｓｅｍａ３Ｃ、及びＳｅｍａ３Ｆなどのセマフォリン；ＣＡ１２５（卵巣がん抗原）のような腫瘍関連抗原；イムノアドヘシン；並びに上記タンパク質のいずれかの断片及び／又は変異体、更には、抗体断片を含む、例えば上記タンパク質のいずれかを含む一又は複数のタンパク質に結合する抗体が含まれる。
【００３７】
本明細書における用語「抗体」とは、本明細書で最も広い意味で用いられ、具体的には、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の生物活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００３８】
「単離された」タンパク質（例えば、単離された抗体）は、その自然環境の成分から同定及び分離及び／又は回収されたものである。その自然環境の夾雑物成分は、タンパク質の研究、診断、又は治療の用途に干渉しうる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様の溶質を含みうる。単離されたタンパク質には、タンパク質の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないであろうことから、組み換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常、単離されたタンパク質は、少なくとも一つの精製工程により調製される。
【００３９】
「天然抗体」は、通常、二つの同一の軽（Ｌ）鎖及び二つの同一の重（Ｈ）鎖からなる、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋を有している。各重鎖は、複数の定常ドメインが続く可変ドメイン（ＶＨ）を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、他端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基は、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられる。
【００４０】
用語「定常ドメイン」は、免疫グロブリンの他の部分、即ち抗原結合部位を含む可変ドメインより多くの保存アミノ酸配列を有する免疫グロブリンの部分を指す。定常ドメインは、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（まとめてＣＨという）、及び軽鎖のＣＨＬ（又はＣＬ）ドメインを含む。
【００４１】
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端ドメインを指す。重鎖の可変ドメインを「ＶＨ」と称する。軽鎖の可変ドメインは「ＶＬ」と称する。これらドメインは、通常、抗体の最も変わり易い部分であり、抗原結合部位を含んでいる。
【００４２】
「可変」なる用語は、可変ドメインのある部分が、抗体間で配列が広範囲に相違しているという事実を指し、それぞれの特定の抗体のその特定の抗原への結合及び特異性に使用される。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメインにわたって均一に分布しているのではない。それは、軽鎖及び重鎖可変ドメインの双方において、超可変領域（ＨＶＲ）と称される三つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存されている部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ四つのＦＲ領域を含み、大部分がβシート立体配置をとって三つのＨＶＲにより繋がっており、これはβシート構造と繋がり、場合によってはβシート構造の一部を形成するループを形成する。各鎖のＨＶＲは、ＦＲ領域により互いに極めて近接した状態で保持され、他の鎖のＨＶＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)を参照のこと）。定常ドメインは、抗原との抗体の結合には直接関わっていないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与など、多様なエフェクター機能を呈する。
【００４３】
任意の哺乳動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる二つの明確に区別される型の一つに割り当てることができる。
【００４４】
本明細書において使用されるＩｇＧの「アイソタイプ」又は「サブクラス」という用語は、これらの定常領域の化学特性及び抗原特性により定義される免疫グロブリンのサブクラスのいずれかを意味する。その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）は異なるクラスに割り当てられる。免疫グロブリンには五つの主要なクラス、即ちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位は周知であり、その概説は、例えばCellular and Mol. Immunology, 4th ed., W.B. Saunders, Co., 2000に記載されている。抗体は、抗体の、一又は複数の他のタンパク質又はペプチドとの共有結合又は非共有結合により形成される大きな融合分子の一部であってもよい。
【００４５】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「抗体全体」は、本明細書では互換可能に使用されて、その実質的にインタクトな形態の抗体を指し、後述するような抗体断片を指すのではない。この用語は、特にＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【００４６】
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
【００４７】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる二つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。パパイン処置は、２つの抗原結合部位を有し、なお抗原を架橋することが可能なＦ（ａｂ’）２断片を産む。「Ｆａｂ」断片は、重鎖及び軽鎖可変ドメインを含み、更に軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されている点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書において、Ｆａｂ’の一般名称であり、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つ。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生成された。抗体断片の他の化学結合も知られている。抗体断片の他の化学結合も知られている。
【００４８】
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小抗体断片である。一実施態様において、二本鎖「Ｆｖ」種は、一本の重鎖と一本の軽鎖の可変ドメインが、堅固な非共有結合をなした二量体からなる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、柔軟なペプチドリンカーによって一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインが共有結合性に連結することができ、よって軽鎖及び重鎖は、二本鎖Ｆｖ種と類似の「二量体」構造に結合することができる。この配置において、各可変ドメインの三つのＨＶＲは相互作用し、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を規定する。集合的に、六つのＨＶＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に対して特異的な三つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、全結合部位よりも親和性が低下するものの、抗原を認識して結合する能力を有している。
【００４９】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドはＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓＦＶが抗原結合に望まれる構造を形成することを可能にする。ｓｃＦｖの総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315, 1994を参照のこと。
【００５０】
用語「ダイアボディ」は、二つの抗原結合部位を持つ抗体断片を指し、その断片は、同一ポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬ）。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成ができないリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは二価でも二特異性でもよい。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。トリアボディ及びテトラボディもHudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。
【００５１】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、少量で存在しうる可能な変異体、例えば天然発生変異体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一である。したがって、修飾語「モノクローナル」は、個別抗体の混合物ではないという抗体の性質を示す。特定の実施態様では、このようなモノクローナル抗体は、通常、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、この場合、標的に結合するポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスにより得られた。例えば、この選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールといった複数のクローンからの特有のクローンの選択とすることができる。重要なのは、選択された標的結合配列を更に変化させることにより、例えば標的に対する親和性の向上、標的結合配列のヒト化、細胞培養物中におけるその生成の向上、インビボでの免疫原性の低減、多重特異性抗体の生成などが可能になること、並びに、変化させた標的結合配列を含む抗体も、本発明のモノクローナル抗体であることである。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体の調製物は、他の免疫グロブリンで通常汚染されていないという点で有利である。
【００５２】
修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で作製しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明にしたがって使用されるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)）、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４８１６５６７号参照）、ファージ−ディスプレイ技術（例えば、Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); and Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)参照）、並びに、動物において、ヒト免疫グロブリン座位の一部若しくは全部又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子を有するヒト又はヒト様抗体を生成する技術（例えば、国際公開第１９９８／２４８９３号；同第１９９６／３４０９６号；同第１９９６／３３７３５号；同第１９９１／１０７４１号；Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０７号；同第５５４５８０６号；同第５５６９８２５号；同第５６２５１２６号；同第５６３３４２５号；及び同第５６６１０１６；Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); and Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)参照）を含む様々な技術により作製することができる。
【００５３】
本明細書においては、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分は特定の種に由来する抗体又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一若しくは相同であるが、鎖（複数可）の残りの部分は別の種に由来する抗体又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一若しくは相同である、「キメラ」抗体、並びに、所望の生物学的活性を呈するものである限りそのような抗体の断片を、特に含む（例えば、米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)）。キメラ抗体は、抗体の抗原結合領域が、例えば、対象とする抗原を含むマカクザルを免疫化することにより生成される抗体に由来する、ＰＲＩＭＡＴＴＺＥＤ（登録商標）抗体を含む。
【００５４】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。一実施態様では、ヒト化抗体は、レシピエントのＨＶＲ由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び／又は能力を有するマウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）のＨＶＲ由来の残基によって置き換えられた、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例においては、ヒト免疫グロブリンのＦＲの残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。更に、ヒト化抗体はレシピエント抗体又はドナー抗体において見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能を更に改良するためになされうる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインのすべてを実質的に含み、超可変ループのすべて又は実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲのすべて又は実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のものである。また、ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリン、通常はヒト免疫グロブリン、の定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含む。更なる詳細については、例えば、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). See also, e.g., Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)；及び米国特許第６９８２３２１号及び同第７０８７４０９号を参照されたい。
【００５５】
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するもの、及び／又は本明細書に記載の、ヒト抗体を製造するための任意の技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む、当技術分野で既知の様々な技術を用いて生産することができる。Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)。ヒトモノクローナル抗体の調製にやはり利用可能であるのは、Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)に記載の方法である。van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)も参照されたい。ヒト抗体は、抗原投与に応答してこのような抗体を生成するように修飾されているが、内在性の座位が無効にされたトランスジェニック動物、例えば免疫化キセノマウスに、抗原を投与することにより調製することができる（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術について米国特許第６０７５１８１号及び同第６１５０５８４号を参照）。更には、例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成されるヒト抗体に関してLi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)を参照されたい。
【００５６】
本明細書で使用される用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」は、配列が超可変である、及び／又は構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般的に、抗体は、ＶＨに三つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬに三つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の計六つのＨＶＲを含む。天然抗体において、Ｈ３及びＬ３は六つのＨＶＲのうちで最も高い多様性を示し、特にＨ３は抗体に高度な特異性を付与するのに独特の役割を果たすと考えられている。例として、Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003)を参照のこと。実際、重鎖のみからなる天然に生じるラクダ科の抗体は、軽鎖の非存在下で機能的で安定である。例えば、Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)を参照されたい。
【００５７】
複数のＨＶＲの描写が使用されており、本明細書に含まれる。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は配列可変性に基づいており、最も一般的に使用されている（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに、構造ループの位置を参照する（Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。ＡｂＭ  ＨＶＲは、Ｋａｂａｔ  ＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａ構造的ループの間の妥協を表し、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」ＨＶＲは、利用できる複合体結晶構造の解析に基づく。これらの各ＨＶＲからの残基は以下に記される。
【００５８】
2020164531.tif 000003
【００５９】
ＨＶＲは、以下のような「拡大ＨＶＲ」を含むことができる：ＶＬの２４〜３６又は２４〜３４（Ｌ１）、４６〜５６又は５０〜５６及び８９〜９７又は８９〜９６（Ｌ３）、並びにＶＨの２６〜３５（Ｈ１）、５０〜６５又は４９〜６５（Ｈ２）及び９３〜１０２、９４〜１０２、又は９５〜１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基には、これら各々を定義するために、上掲のＫａｂａｔらに従って番号を付した。
【００６０】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書で定義しているＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
【００６１】
用語「Ｋａｂａｔの可変ドメイン残基番号付け」又は「Ｋａｂａｔのアミノ酸位置の番号付け」及びそれらの変形は、上掲のＫａｂａｔ等の抗体の編集の軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインに対して用いられる番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを用いると、実際の線状のアミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＨＶＲの短縮物又はそれらへの挿入物に相当する、より少ないアミノ酸又は付加的なアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入物（Ｋａｂａｔによれば残基５２ａ）及び重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔによれば残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ番号付けは、「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付けされた配列と、抗体の配列相同性がある領域において配列比較することによって、所与の抗体について決定されうる。
【００６２】
Ｋａｂａｔ番号付けシステムは一般に、可変ドメイン内の残基（およそ軽鎖の残基１〜１０７及び重鎖の残基１〜１１３）を指す場合に用いられる（例えば、Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）。免疫グロブリン重鎖定常領域内の残基を指す場合には、一般に「ＥＵ番号付けシステム」又は「ＥＵインデックス」を用いる（参照例：上掲のＫａｂａｔらに記載のＥＵインデックス）。「ＫａｂａｔのＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の残基番号を指す。
【００６３】
「線形抗体」という表現は、Zapata et al. (1995 Protein Eng, 8(10):1057-1062)に記載の抗体を指す。簡潔には、これら抗体は、相補的な軽鎖ポリペプチドと共に一対の抗原結合領域を形成する、一対のタンデム型Ｆｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。線形抗体は、二重特異性又は単一特異性とすることができる。
【００６４】
本明細書において使用される用語「約」は、当業者が決定するそれぞれの値の許容される誤差範囲を指し、部分的に測定又は決定の方法、即ち測定システムの限界に依存する。例えば、「約」は、技術分野毎に、１以内の標準偏差又は１を上回る標準偏差を意味することができる。本明細書中の「およそ」の値又はパラメーターへの言及は、その値又はパラメーター自体に対する実施態様を含む（記載する）。例えば、「約Ｘ」との記載には「Ｘ」の記載が含まれる。
【００６５】
本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、内容が明らかに他を指さない限り複数系を含む。したがって、例えば、「一の化合物」への言及は、そのような化合物の二つ以上の組合せなども含むことがある。
【００６６】
本明細書に記載される本発明の態様及び実施態様は、態様及び実施態様を「含む」、「からなる」及び／又は「から本質的になる」を含む。
【００６７】
ＩＩ．タンパク質製剤及び調製物
本発明は、ここでは、タンパク質と、液体製剤中のタンパク質の酸化を防止する化合物とを含む液体製剤であって、化合物が、５−ヒドロキシ−トリプトファン、５−ヒドロキシ  インドール、７−ヒドロキシ  インドール、及びセロトニンからなる群より選択される、液体製剤に関する。いくつかの実施態様では、製剤中の化合物は、製剤中において、約０．３ｍＭ〜約１０ｍＭ、又は多くとも化合物が可溶である最大濃度である。いくつかの実施態様では、製剤中の化合物は、約１ｍＭである。いくつかの実施態様では、化合物は、トリプトファン、及びメチオニンからなる群より選択されるタンパク質中において一又は複数のアミノ酸の酸化を防止する。いくつかの実施態様では、化合物は、活性酸素種（ＲＯＳ）によるタンパク質の酸化を防止する。更なる実施態様では、活性酸素種は、一重項酸素、超酸化物（Ｏ２−）、アルコキシルラジカル、ペルオキシルラジカル、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、二水素三酸化物（Ｈ２Ｏ３）、ヒドロトリオキシラジカル（ＨＯ３・）、オゾン（Ｏ３）、ヒドロキシルラジカル、及びアルキルペルオキシドからなる群より選択される。いくつかの実施態様では、本明細書に記載のタンパク質は酸化の影響を受けやすい。いくつかの実施態様では、タンパク質中のメチオニン、システイン、ヒスチジン、トリプトファン、及び／又はチロシンは、酸化の影響を受けやすい。いくつかの実施態様では、タンパク質中のトリプトファン及び／又はメチオニンは、酸化の影響を受けやすい。例えば、モノクローナル抗体のＦａｂ部分中のトリプトファンアミノ酸及び／又はモノクローナル抗体のＦｃ部分中のメチオニンアミノ酸は、酸化の影響を受けやすいことがある。いくつかの実施態様では、タンパク質は治療用タンパク質である。本明細書のいくつかの実施態様では、タンパク質は抗体である。いくつかの実施態様では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、又は抗体断片である。更なる実施態様では、化合物は、抗体のＦａｂ部分中の一又は複数のアミノ酸の酸化を防止する。更に別の実施態様では、化合物は、抗体のＦｃ部分中の一又は複数のアミノ酸の酸化を防止する。いくつかの実施態様では、本明細書において提供される製剤は、対象に投与するために適した薬学的製剤である。本明細書で使用される、治療又は投与の目的のための「対象」又は「個体」は、哺乳動物に分類されるいずれかの動物を指し、それには、ヒト、家畜、動物園の動物、スポーツ用の動物、又は愛玩用の動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどが含まれる。好ましくは、哺乳動物はヒトである。いくつかの実施態様では、製剤は水性である。本明細書のいくつかの実施態様では、製剤中のタンパク質（例えば、抗体）の濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様では、製剤は更に、安定剤、バッファー、界面活性剤、及び等張化剤からなる群より選択される一又は複数の添加剤を含む。例えば、本発明の製剤は、モノクローナル抗体、タンパク質の酸化を防止する本明細書に提供される化合物（例えば、５−ヒドロキシインドール）と、製剤のｐＨを所望のレベルに維持するバッファーとを含むことができる。いく��かの実施態様では、本明細書に提供される製剤のｐＨは約４．５〜約７．０である。
【００６８】
製剤中のタンパク質及び抗体は、当技術分野で既知の方法を使用して調製される。液体製剤中の抗体（例えば、完全長抗体、抗体断片及び多重特異性抗体）は、当技術分野で利用可能な技術を使用して調製される。その非限定的且つ例示的な方法について、以下のセクションにおいて更に詳細に記載する。本明細書における方法は、ペプチドに基づく阻害剤などの他のタンパク質を含む製剤を調製するために、当業者によって採用されうる。治療用タンパク質の製造のために、一般によく理解され、共通に用いられる技術及び手順について、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., 2003); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., J. Wiley and Sons, 2002); Current Protocols in Protein Science, (Horswill et al., 2006); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6thed., J. Wiley and Sons, 2010)を参照されたい。これらはすべて、参照によりその全体が本明細書に包含される。
【００６９】
Ａ．抗体調製物
本明細書に提供される液体製剤中の抗体は、対象の抗原に対するものである。好ましくは、抗原は、生物学的に重要なポリペプチドであり、障害を有する哺乳動物に対する抗体の投与は、その哺乳動物に治療的利益を提供することができる。しかしながら、非ポリペプチド抗原に対する抗体も考慮される。
【００７０】
抗原は、ポリペプチドである場合、膜貫通分子（例えば、受容体）又は増殖因子といったリガンドである。例示的抗原には、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などの分子；ＣＤ２０；ｏｘ−ＬＤＬ；ｏｘ−ＡｐｏＢ１００；レニン；ヒト増殖ホルモン及びウシ増殖ホルモンを含む増殖ホルモン；増殖ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体ホルモン；グルカゴン；因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子、及びヴォンヴィレブランド因子といった凝固因子；プロテインＣなどの抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性剤；ウロキナーゼ又はヒトの尿といったプラスミノーゲン活性因子又は組織型プラスミノーゲン活性因子（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；デスレセプター５及びＣＤ１２０といった腫瘍壊死因子受容体；腫瘍壊死因子−α及び−β；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（正常なＴ細胞の発現及び分泌活性化制御）；ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミュラー管抑制因子；レラキシンＡ鎖；レラキシンＢ鎖；プロレラキシン（ｐｒｏｒｅｌａｘｉｎ）；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；βラクタマーゼといった微生物タンパク；デオキシリボヌクレアーゼ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ−４といった細胞傷害性Ｔ−リンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）；インヒビン；アクチビン；ホルモン又は増殖因子の受容体；プロテインＡ又はＤ；リウマトイド因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、又は−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、又はＮＴ−６）といったニューロトロフィン因子、又はＮＧＦ−ｂなどの神経成長因子；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦといった繊維芽細胞増殖因子；上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、又はＴＧＦ−β５を含む、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βといったトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子−Ｉ及び−ＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；脱（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９  及びＣＤ２０などのＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；抗毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−α、−β、及び−γといったインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０；超酸化物ジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；分解促進因子；例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部分といった、ウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４及びＶＣＡＭといったインテグリン；ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４受容体のような腫瘍関連抗原；並びに上記ポリペプチドのいずれかの断片が含まれる。
【００７１】
（ｉ）抗原調製物
任意選択的に他の分子にコンジュゲートされる、可溶型抗原又はその断片は、抗体を生成するためのイムノゲンとして使用することができる。受容体といった膜貫通分子のために、これらの断片（例えば、受容体の細胞外ドメイン）をイムノゲンとして使用することができる。代替的に、膜貫通分子を発現する細胞をイムノゲンとして使用することができる。このような細胞は、自然源（例えば、がん細胞株）に由来するものとすることができるか、又は膜貫通分子を発現するように組み換え技術によって形質転換された細胞でもよい。抗体の調製に有用な他の抗原及びその形態は、当業者には自明である。
【００７２】
（ｉｉ）特定の抗体に基づく方法
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原及びアジュバントの複数回にわたる皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注入により動物内で生成される。関連抗原を、免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又はダイズトリプシン阻害因子に、二機能性剤又は誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基によるコンジュゲート）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基による）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ＲとＲ１は異なるアルキル基）にコンジュゲートすることが有益である。
【００７３】
動物は、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して、例えば１００μｇ又は５μｇのタンパク質又はコンジュゲート（それぞれ、ウサギ又はマウスの場合）を３体積のフロイントの完全アジュバントと混合し、その溶液を複数の部位に皮内注入することにより、免疫化される。一ヶ月後、動物は、複数部位への皮下注入により、フロイントの完全アジュバント中において、ペプチド又はコンジュゲートの初期量の１／５〜１／１０を用いて追加免疫される。７日〜１４日後、動物を出血させ、血清を、抗体力価についてアッセイする。動物は、力価が水平状態に達するまで追加免疫される。好ましくは、動物は、同じ抗原のコンジュゲートを用いて追加免疫されるが、異なるタンパク質に、及び／又は異なる架橋結合剤により、コンジュゲートされる。また、コンジュゲートは、タンパク質融合として組み換え細胞培養物内で作製することができる。また、ミョウバンのような凝集剤が、免疫応答を亢進するために適切に使用される。
【００７４】
対象のモノクローナル抗体は、最初にKohler et al., Nature, 256:495 (1975)により記載され、更に例えば、Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981), and Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)に記載された、ヒト−ヒトハイブリドーマに関するハイブリドーマ法を用いて作製することができる。更なる方法には、例えば、ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒト自然ＩｇＭ抗体の生成に関する米国特許第７１８９８２６号に記載されているものが含まれる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）が、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 及びVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載されている。
【００７５】
様々な他のハイブリドーマ技術については、例えば、米国特許出願公開第２００６／２５８８４１号；同第２００６／１８３８８７号（完全ヒト抗体）、同第２００６／０５９５７５号；同第２００５／２８７１４９号；同第２００５／１００５４６号；同第２００５／０２６２２９号；及び米国特許第７０７８４９２及び同第７１５３５０７号を参照されたい。ハイブリドーマ法を用いたモノクローナル抗体を生成するための例示的プロトコールについて、以下のように記載する。一実施態様では、マウス、又はハムスターなどの他の適切な宿主動物は、免疫化に使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を生成する、又は生成することができるリンパ球を引き出すために、免疫化される。抗体は、対象のポリペプチド又はその断片、及びモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）／トレハロースジコリノミコラート（ＴＤＭ）（Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, Mont.）の複数回にわたる皮下（ｓｃ）若しくは腹腔内（ｉｐ）注入により、動物内において生成される。対象のポリペプチド（例えば、抗原）又はその断片は、当技術分野で周知の方法、例えば組み換え法を用いて調製される。このような方法の一部について更に以下で記載する。免疫化された動物の血清は、抗抗原抗体についてアッセイされ、任意選択的に追加免疫が投与される。抗抗原抗体を生成する動物のリンパ球が単離される。或いは、リンパ球はインビトロで免疫を与えられてもよい。
【００７６】
次いで、リンパ球を、ポリエチレングリコールといった適切な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成する。例えば、Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)を参照のこと。効率よく融合し、選択された抗体生成細胞により抗体の安定した高レベル生成をサポートし、ＨＡＴ培地等の培地に対して感受性である骨髄腫細胞が、使用される。例示的な骨髄腫細胞株には、限定されないが、マウス骨髄種株、例えば、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USAから入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍から誘導されるもの及びAmerican Type Culture Collection, Rockville, Md. USAから入手可能なＳＰ−２又はＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞である。ヒトモノクローナル抗体の生成のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も記載されている（Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., モノクローナル抗体Production Techniques and Applications pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
【００７７】
このように調製されたハイブリドーマ細胞は、適切な培地中、例えば、非融合の親骨髄腫細胞の成長又は生存を阻害する一又は複数の物質を含む培地中で播種され、培養される。例えば、親骨髄腫細胞に酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）がない場合、ハイブリドーマの培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含むことになり、この物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を妨げる。好ましくは、例えば、Even et al., Trends in Biotechnology, 24(3), 105-108 (2006)に記載されるように、無血清ハイブリドーマ細胞培養方法が、ウシ胎児血清などの動物由来の血清の使用を低減するために使用される。
【００７８】
ハイブリドーマ細胞培養物の生産性を向上させるツールとしてのオリゴペプチドが、Franek, Trends in Monoclonal Antibody Research, 111-122 (2005)に記載されている。具体的には、標準の培地が、特定のアミノ酸（アラニン、セリン、アスパラギン、プロリン）で、又はタンパク質加水分解物の画分で濃縮され、アポトーシスは、三〜六個のアミノ酸残基からなる合成オリゴペプチドにより有意に抑制される。ペプチドは、ミリモル又はそれより高い濃度で存在する。
【００７９】
ハイブリドーマ細胞が成長する培地は、本明細書に記載される抗体に対して結合するモノクローナル抗体の生成についてアッセイされる。ハイブリドーマ細胞により生成されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降により又はインビトロ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定される。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、スキャッチャード分析により決定することができる。例えば、Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)を参照のこと。
【００８０】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を生成するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンが、希釈手順を制限することによりサブクローニングされ、標準的方法により成長させられる。例えば、Ｇｏｄｉｎｇ（上掲）を参照。この目的のための好適な培地は、例えば、Ｄ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物における腹水腫瘍としてインビボで成長させてもよい。サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーなどにより、培地、腹水又は血清から適切に分離される。ハイブリドーマ細胞からタンパク質を単離するための一手順が、米国特許出願公開第２００５／１７６１２２号及び米国特許第６９１９４３６に記載されている。本方法は、結合工程において離液性塩などの最小の塩を使用することと、好ましくは更に溶出工程において少量の有機溶媒を使用することとを含む。
【００８１】
（ｉｉｉ）特定のライブラリースクリーニング法
本明細書に記載される製剤及び組成物中の抗体は、コンビナトリアルライブラリーを使用して一又は複数の所望の活性を有する抗体をスクリーニングすることにより作製することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするために、様々な方法が当技術分野で知られている。このような方法の概要は、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J., 2001)に記載されている。例えば、対象の抗体を生成する一つの方法は、Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93に記載されている、ファージ抗体ライブラリーの使用によるものである。
【００８２】
原則として、合成抗体クローンは、ファージコートタンパク質に融合した抗体可変領域（Ｆｖ）の様々な断片を表示するファージを含むファージライブラリーをスクリーニングすることにより選択される。このようなファージライブラリーは、所望の抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによりパニングされる。所望の抗原に結合できるＦｖ断片を発現するクローンは、抗原に吸着され、よってライブラリーの非結合クローンから分離される。次いで、結合クローンは抗原から溶出され、抗原吸着／溶出のサイクルを追加することにより更に濃縮されうる。いずれの抗体も、対象のファージクローンを選択するための適切な抗原スクリーニング手順を設計し、続いて対象のファージクローン由来のＦｖ配列と、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), vols. 1-3に記載される適切な定常領域（Ｆｃ）配列を用いて完全長抗体クローンを構築することにより、得ることができる。
【００８３】
特定の実施態様では、抗体の抗原結合ドメインは、約１１０のアミノ酸の二つの可変（Ｖ）領域から形成されるもので、これら可変領域は、軽鎖可変（Ｖｌ）及び重鎖可変（ＶＨ）の一つずつからなり、共に三つの超可変ループ（ＨＶＲ）又は相補性決定領域（ＣＤＲ）を呈する。可変ドメインは、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載のように、ファージ上に、ＶＨとＶＬとが短い可動性のペプチドにより共有的に結合している単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、又はそれらの各々が定常ドメインに融合して非共有的に相互作用するＦａｂ断片として、機能的に表示することができる。本明細書で使用する場合、ｓｃＦｖコード化ファージクローンとＦａｂコード化ファージクローンとは、まとめて「Ｆｖファージクローン」又は「Ｆｖクローン」と称される。
【００８４】
ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別々にクローニングし、ファージライブラリー内でランダムに組み換えることができ、次いでこれは、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載のように、抗原結合クローンについて検索することができる。免疫化起源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なく免疫原に対して高親和性抗体を提供する。代替的に、Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)に記載されるように、ナイーブなレパートリーを、どのような免疫化もすることなく、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対してヒト抗体の単一起源を提供するために、クローンニングすることができる。最後に、ナイーブなライブラリーは、幹細胞由来の再配置されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを用いて、高度に可変のＣＤＲ３領域をコードし、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)により記載されるようにインビトロでの再配置を達成することにより、合成的に作製することもできる。
【００８５】
特定の実施態様では、線状ファージが、マイナーコートタンパク質ｐＩＩＩへの融合により抗体断片を表示するために使用される。抗体断片は、例えば、Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)により記載されているように、ＶＨとＶＬドメインが同じポリペプチド鎖上において可動性ポリペプチドスペーサーにより接続されている単鎖Ｆｖ断片として、又は、一の鎖がｐＩＩＩに融合し、他の鎖が細菌性宿主細胞ペリプラズム中に分泌されるＦａｂ断片として、表示させることができ、この場合、例えばHoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)に記載されているように、Ｆａｂコートタンパク質構造のアセンブリが、野生型コートタンパク質の一部を表示することにより、ファージ表面上に表示される。
【００８６】
一般に、抗体遺伝子断片をコードする核酸は、ヒト又は動物から収集される免疫細胞から得られる。抗抗原クローンにバイアスしたライブラリーが望まれる場合、対象を抗原で免疫化して抗体応答を生じさせ、脾臓細胞及び／又は循環Ｂ細胞、他の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をライブラリー構築のために回収する。一実施態様では、抗抗原クローンにバイアスされたヒト抗体遺伝子断片ライブラリーは、機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを有する（且つ機能的な内因性の抗体生成系を欠く）トランスジェニックマウスにおいて抗抗原抗体応答を生成し、抗原免疫化により抗原に対するヒト抗体を生成するＢ細胞が生じさせることにより、得られる。ヒト抗体を生成するトランスジェニックマウスの生成について後述する。
【００８７】
抗抗原反応性細胞集団は、抗原特異的膜結合抗体を発現するＢ細胞を単離するための適切なスクリーニング手順を用いることにより、例えば、抗原アフィニティークロマトグラフィーを用いた細胞分離又は蛍光色素標識された抗原への細胞の吸着と、それに続くフローサイトメトリーセルソーティング（ＦＡＣＳ）により、更に濃縮することができる。
【００８８】
代替的に、免疫化されていないドナー由来の脾臓細胞及び／又はＢ細胞又は他のＰＢＬの使用は、可能な抗体レパートリーをよりよく表し、更には抗原が抗原性でない任意の動物（ヒト又は非ヒト）種を用いる抗体ライブラリーの構築を可能にする。インビトロ抗体遺伝子構築を取り込んだライブラリーの場合、再配置されていない抗体遺伝子セグメントをコードする核酸を提供するために、幹細胞が対象から回収される。対象の免疫細胞は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ目、ルプリン（ｌｕｐｒｉｎｅ）、イヌ、ネコ科、ブタ、ウシ、ウマ、及びトリ種などの様々な動物種から得ることができる。
【００８９】
抗体可変遺伝子セグメント（ＶＨ及びＶＬセグメントを含む）をコードする核酸は、対象の細胞から回収されて、増殖される。再配置されたＶＨ及びＶＬ遺伝子ライブラリーの場合、所望のＤＮＡは、Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989)に記載のように、リンパ球からゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを単離し、続いて、再配置されたＶＨ及びＶＬ遺伝子の５’及び３’末端と一致するプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより得ることができ、これにより発現のための多様なＶ遺伝子レパートリーを作製することができる。このＶ遺伝子は、Orlandi et al. (1989) and in Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989)に記載のように、成熟Ｖドメインをコードするエクソンの５’末端のバックプライマーと、Ｊセグメント内部に位置するフォワードプライマーとを用いて、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡから増幅することができる。しかしながら、ｃＤＮＡから増幅するために、バックプライマーは、Jones et al., Biotechnol., 9: 88-89 (1991)に記載のようにリーダーエクソン内に位置するもので、フォワードプライマーはSastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989)に記載のように定常領域内部に位置するものでもよい。相補性を最大にするために、Orlandi et al. (1989)又はSastry et al. 1989に記載のように、プライマーに縮重を組み込んでもよい。特定の実施態様では、ライブラリーの多様性は、例えばMarks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)の方法に記載されるように、又はOrum et al., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993)の方法に記載されるように、各Ｖ遺伝子ファミリーを標的にしたＰＣＲプライマーを用いて免疫細胞の核酸試料中に存在するすべての利用可能なＶＨ及びＶＬ構成を増幅することにより、最大化される。増幅されたＤＮＡの、発現ベクターへのクローニングのために、Orlandi et al. (1989)に記載のように、希少な制限部位を、一端におけるタグとして、又はClackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)に記載のように、タグ付けしたプライマーを用いたさらなるＰＣＲ増幅により、ＰＣＲプライマー内部に導入することができる。
【００９０】
合成的に再配置されたＶ遺伝子のレパートリーは、Ｖ遺伝子セグメントからインビトロで誘導することができる。ヒトＶＨ遺伝子断片の大部分は、クローニング及び配列決定されて（Tomlinson et al., J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)に報告）、マッピングされる(Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993)に報告); これらのクローニングされたセグメント（Ｈ１及びＨ２ループのすべての主要な立体構造を含む）を使用し、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)に記載のように、多様な配列及び長さのＨ３ループをコードするＰＣＲプライマーを用いて多様なＶＨ遺伝子レパートリーを生成することができる。また、ＶＨレパートリーは、Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992)に記載のように、単一長の長いＨ３ループに焦点を合わせたすべての配列多様性を伴うように作製することができる。ヒトＶκ及びＶλセグメントは、クローニング及び配列決定されて（Williams and Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)に報告）、合成軽鎖レパートリーを作製するために使用することができる。合成Ｖ遺伝子レパートリーは、ＶＨ及びＶＬ折り畳みの範囲と、Ｌ３及びＨ３の長さとに基づいており、大きな構造多様性を有する抗体をコードする。ＤＮＡをコードするＶ遺伝子の増幅に続いて、生殖系列Ｖ遺伝子セグメントを、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)の方法に従ってインビトロで再構成することができる。
【００９１】
抗体断片のレパートリーを、複数の方法でＶＨ及びＶＬ遺伝子レパートリーを組み合わせることにより、構築することができる。各レパートリーは、様々なベクター中においてつくり出すことができ、そのベクターは、例えばHogrefe et al., Gene, 128: 119-126 (1993)に記載されているようにインビトロで、又はコンビナトリアルインフェクション、例えば、Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993)に記載されているｌｏｘＰ系によりインビボで、組み換えられる。インビボでの組換え法は、大腸菌の形質転換効率により強いられるラブラリーサイズの限界を克服するために、二本鎖種のＦａｂ断片を利用する。ナイーブＶＨ及びＶＬレパートリーは、一方はファージミドに、他方はファージベクターに、別々にクローニングされる。次いでこれら二つのライブラリーは、ファージミド含有細菌のファージ感染により、各細胞が異なる組み合わせを含み、ライブラリーサイズが存在する細胞の数（約１０１２個のクローン）によってのみ制限されるように、組合せられる。両方のベクターは、ＶＨ及びＶＬ遺伝子が単一のレプリコン上に組み換えられ、ファージビリオン中に共にパッケージされるように、インビボでの組換えシグナルを含む。これら巨大なライブラリーは、良好な親和性（Ｋｄ−１＝約１０−８Ｍ）を有する多様な抗体を多数提供する。
【００９２】
代替的に、レパートリーは、例えば、Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991)に記載のように、同じベクターに連続してクローニングされるか、又は例えば、Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)に記載のように、ＰＣＲによってアセンブルされた後でクローニングされる。また、ＰＣＲアセンブリーは、可動性ペプチドスペーサーをコードするＤＮＡと、ＶＨ及びＶＬのＤＮＡとを結合させて単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）レパートリーを形成するために使用することができる。また別の技術では、Embleton et al., Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992)に記載のように、「細胞内ＰＣＲアセンブリー」が、ＰＣＲによりリンパ球内部でＶＨ及びＶＬ遺伝子を混合し、次いで連結した遺伝子のレパートリーをクローニングするために使用される。
【００９３】
ナイーブライブラリー（天然又は合成）によって生成された抗体は、中低度の親和性（約１０６〜１０７Ｍ−１のＫｄ−１）を有しうるが、上掲のWinter et al. (1994)に記載のように、親和性成熟を、二次ライブラリーから構築及び選択することによりインビトロで模倣することもできる。例えば、Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)の方法において、又はGram et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992)の方法において、エラープローンポリメラーゼ（Leung et al., Technique 1: 11-15 (1989)に報告）を使用することにより、突然変異をインビトロでランダムに導入することができる。加えて、一又は複数のＣＤＲをランダムに変異させることによって、例えば、選択した個々のクローンにおいて、対象のＣＤＲに及ぶランダム配列を有するプライマーによりＰＣＲを使用し、より親和性の高いクローンをスクリーニングすることにより、親和性成熟を行うことができる。国際公開第９６０７７５４号（１９９６年３月１４日）には、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域に突然変異を誘導し、軽鎖遺伝子のライブラリーを生成するための方法が記載されている。別の有効な手法は、Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992)に記載のように、免疫化されていないドナーから得られた天然に存在するＶドメイン変異体のレパートリーによるファージディスプレイを用いて選択されたＶＨ又はＶＬドメインを組み換え、複数回のチェーンリシャッフリングにおいてより高い親和性についてスクリーニングすることである。この技術により、約１０−９Ｍ以下の親和性を有する抗体及び抗体断片の生成が可能である。
【００９４】
ライブラリーのスクリーニングは、当技術分野で既知の様々な技術によって達成することができる。例えば、抗原は、吸着プレートのウェルのコーティングに使用して、吸着プレートに付着させた宿主細胞上で発現させる又はセルソーティングに使用するか、又はストレプトアビジンコーティングされたビーズにより捕獲するためにビオチンにコンジュゲートさせるか、又はファージディスプレイライブラリーのパニングのための他のいずれかの方法において使用することができる。
【００９５】
ファージライブラリー試料は、ファージ粒子の少なくとも一部を吸着剤に結合させるために適した条件下で、固定化されている抗原と接触させる。通常、ｐＨ、イオン強度、温度などを含む条件は、生理的条件を模倣するために選択される。固体相に結合したファージは、洗浄された後で、例えばBarbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991)に記載のように酸により、又は例えばMarks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)に記載のようにアルカリにより、又は例えばClackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)の抗原競合法に類似の手順において、抗原競合により、溶出される。ファージは、一回の選択で、２０〜１，０００倍に濃縮することができる。更に、濃縮されたファージは、細菌培養物中で成長させ、更なる回の選択に供することが可能である。
【００９６】
選択の効率は、洗浄の間の解離の動態、及び単一のファージ上の複数の抗体断片が同時に抗原と結合するかどうかを含む複数の要因に依存する。速い解離動態（及び弱い結合親和性）は、短い洗浄、多価のファージディスプレイ、及び固体相の抗原の高いコーティング密度を用いることにより保持することができる。高密度は、多価の相互作用によりファージを安定化させるだけでなく、解離したファージの再結合に有利である。遅い解離動態（及び良好な結合親和性）を有する抗体の選択は、Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990)及び国際公開第９２／０９６９０号に記載のような長い洗浄及び一価のファージディスプレイと、Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992)に記載のような抗原の低いコーティング密度を用いることによって促進することができる。
【００９７】
たとえわずかな違いであったとしても、抗原に対する異なる親和性のファージ抗体の中で選択することが可能である。しかしながら、選択された抗体のランダム異変（例えば、いくつかの親和性成熟技術において実行される）は、多くの変異体を生じやすく、その多くは抗原への結合であり、一部は親和性の向上である。抗原を限定すると、稀な高い親和性のファージが競合して除かれる場合がある。親和性の高い変異体をすべて保持するために、ファージを、余分なビオチン化抗原、但し抗原に対する標的モル親和定数より低いモル濃度のビオチン化抗原と共にインキュベートすることができる。次いで、高い親和性結合ファージをストレプトアビジンでコーティングした常磁性体ビーズによって捕獲することができる。このような「平衡捕獲」は、親和性の低い過剰なファージから、二倍という小さな親和性で変異体の単離を可能にする感度で、抗体がその結合親和性に従って選択されることを可能にする。また、解離動態に基づいて区別するために、固体相に結合したファージの洗浄に使用される条件を操作することができる。
【００９８】
抗抗原クローンは、活性に基づいて選択される。特定の実施態様では、本発明は、自然に抗原を発現するか又は遊離する浮遊抗原若しくは他の細胞構造に結合する抗原抗抗原抗体を提供する。このような抗抗原抗体に対応するＦｖクローンは、（１）上記のようなファージライブラリーから抗抗原クローンを単離し、任意選択的に、適切な細菌宿主中において成長させることによりファージクローンの単離された集団を増殖させること；（２）それぞれブロッキング活性及び非ブロッキング活性を有することが望ましい、抗原及び二次タンパク質を選択すること；（３）固定化されている抗原に対して抗抗原ファージクローンを吸着させること；（４）過剰な二次タンパク質を使用して、二次タンパク質の結合決定要因と重複する又は二次タンパク質の結合決定要因に共有される抗原結合決定要因を認識する望ましくないクローンをすべて溶出すること；並びに（５）工程（４）の後吸着されたまま保持されるクローンを溶出することによって選択することができる。任意選択的に、所望のブロッキング／非ブロッキング特性を有するクローンは、本明細書に記載の選択手順を一又は複数回繰り返すことにより更に濃縮することができる。
【００９９】
ハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体又はファージディスプレイＦｖクローンをコードするＤＮＡは、容易に単離され、一般的な手順を用いて配列決定される（例えば、ハイブリドーマ又はファージＤＮＡ鋳型から対象の重鎖及び軽鎖コード化領域を特異的に増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより）。ＤＮＡは、単離されると、発現ベクター中に配置され、次いで、これは、他の形では免疫グロブリンタンパク質を生成しない宿主細胞中、例えば、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞中にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞中の所望のモノクローナル抗体の合成を得ることができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌中における組み換え発現に関する総説には、Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993) and Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992)が含まれる。
【０１００】
ＦｖクローンをコードするＤＮＡは、重鎖及び／又は軽鎖定常領域をコードする既知のＤＮＡ配列（例えば、適切なＤＮＡ配列は上掲のKabat et al.から得ることができる）と組み合わされて、完全長又は不完全長の重鎖及び／又は軽鎖を形成することができる。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ定常領域を含む、あらゆるアイソタイプの定常領域がこの目的のために使用できること、並びにそのような定常領域は任意のヒト又は動物種から得ることができることを理解されたい。一の動物（例えばヒト）種の可変ドメインＤＮＡから得られ、次いで別の動物種の定常領域ＤＮＡに融合されて「ハイブリッド」、完全長重鎖及び／又は軽鎖のコード配列を形成するＦｖクローンは、本明細書において使用される「キメラ」及び「ハイブリッド」抗体の定義に含まれる。特定の実施態様では、ヒト可変ＤＮＡに由来するＦｖクローンは、ヒト定常領域ＤＮＡに融合して、完全長又は不完全長ヒト重鎖及び／又は軽鎖のコード配列を形成する。
【０１０１】
また、ハイブリドーマから誘導される抗抗原抗体をコードするＤＮＡは、例えば、ハイブリドーマクローンから誘導される相同なマウスの配列に代えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換すること（例えばMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)の方法で）により、修飾することができる。ハイブリドーマ由来又はＦｖクローン由来の抗体又は断片をコードするＤＮＡは、免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることによって、更に修飾することができる。このようにして、Ｆｖクローン又はハイブリドーマクローン由来の抗体の結合特異性を有する「キメラ」又は「ハイブリッド」抗体が調製される。
【０１０２】
（ｉｖ）ヒト化及びヒト抗体
非ヒト抗体をヒト化するための種々の方法が当技術分野で既知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトであるソースから導入された一又は複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と呼ばれ、典型的には「インポート」可変ドメインから取得される。ヒト化は、基本的には、Winter and co-workers (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)）の方法に従って、げっ歯類のＤＣＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列と置換することにより、実施されうる。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ないドメインが、非ヒト種由来の対応する配列により置換されている、キメラ抗体（米国特許第４８１６５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基及び可能であればいくつかのＦＲ残基がげっ歯動物抗体における相似部位由来の残基により置換されているヒト抗体である。
【０１０３】
ヒト化抗体を作製する際に使用されるヒト可変ドメイン（軽鎖と重鎖の両方）の選定は、抗原性を低下させることが非常に重要である。いわゆる「最も適した」方法によれば、げっ歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメインの配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次いで、そのげっ歯動物の配列と最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として採択する（Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 (1987)）。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループである、すべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体について使用してもよい（Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)）。
【０１０４】
抗体が、抗原に対する高親和性及び他の望ましい生物学的特性を保持した状態でヒト化されることは、更に重要である。この目標を達成するために、本方法の一実施態様によれば、ヒト化抗体は、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用した、親配列及び多様な概念的ヒト化産物の分析のプロセスにより調製される。三次元の免疫グロブリンモデルは、一般に入手可能であり、当業者にはなじみがある。選択された候補免疫グロブリン配列の推定される三次元立体配座構造を図示及び表示するコンピュータープログラムが入手可能である。これらの表示を精査することにより、候補免疫グロブリン配列が機能する際に残基が果たすと考えられる役割の分析、即ち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響する残基の分析が可能になる。この方式では、ＦＲ残基が、レシピエント配列及びインポート配列から選択され、組み合わされることで、所望の抗体特徴（例えば、一又は複数の標的抗原に対する親和性の向上）が達成される。一般に、超可変領域残基は、抗原結合への影響を及ぼすことに直接かつ最も実質的に関わっている。
【０１０５】
本明細書に記載される製剤及び組成物中のヒト抗体は、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を、上述のように既知のヒト定常ドメイン配列と組合わせることにより構築することができる。別法では、ヒトモノクローナル抗体はハイブリドーマ法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の生成のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株は、例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); and Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)によって記載されている。
【０１０６】
免疫化の際に、内因性の免疫グロブリンが生成されなくてもヒト抗体の完全なレパートリーを生成する能力があるトランスジェニック動物（例えばマウス）を作製することが可能である。例えば、キメラマウス及び生殖細胞系突然変異マウスにおいて、抗体の重鎖接合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性が欠失していると、内因性抗体生成は完全に阻害されることが記載されている。そのような生殖細胞系突然変異マウスにおいてヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイを移入することにより、抗原による攻撃を行った際にヒト抗体が産生されるであろう。例えば、Jakobovits et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993);及びDuchosal et al. Nature 355:258 (1992)を参照のこと。
【０１０７】
また、非ヒト抗体、例えばげっ歯類の抗体からヒト抗体を誘導するために、遺伝子シャフリングを使用することができ、この場合ヒト抗体は、出発非ヒト抗体と同様の親和性と特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法によれば、本明細書に記載のようなファージディスプレイ技術により得られる非ヒト抗体断片の重鎖又は軽鎖可変領域は、ヒトＶドメイン遺伝子の一のレパートリーで置き換えられて、非ヒト鎖／ヒト鎖ｓｃＦｖ又はＦａｂキメラ鎖の集団を形成する。抗原による選択の結果、非ヒト鎖／ヒト鎖キメラｓｃＦｖ又はＦａｂが単離され、ここで、ヒト鎖は、初代ファージディスプレイクローン中の対応する非ヒト鎖の除去時に破壊される抗原結合部位を回復させ、即ち、エピトープがヒト鎖パートナーの選択を支配（インプリント）する。残りの非ヒト鎖を置き換えるために工程が繰り返されると、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日発行の国際公開第９３／０６２１３号）。ＣＤＲグラフティングによる非ヒト抗体の常套的なヒト化とは異なり、この技術は、非ヒト起源のＦＲ又はＣＤＲ残基をまったく有さない完全なるヒト抗体を提供する。
【０１０８】
（ｖ）抗体断片
抗体断片は、酵素消化などの常套的手段によって、又は組み換え技術によって生成される。特定の状況では、抗体全体ではなく抗体断片を使用することが有利である。小さい断片は、迅速なクリアランスを可能にし、固形腫瘍へのアクセスの改善に繋がりうる。特定の抗体断片の総説について、Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134を参照されたい。
【０１０９】
様々な技術が抗体断片の生成のために開発されてきた。従来、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク分解性消化を介して誘導された（例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan et al., Science 229:81 (1985)を参照のこと）。しかしながら、これらの断片は、今では組換え宿主細胞により直接産生され得る。Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片はすべて、大腸菌中に発現され且つ大腸菌から分泌されるので、大量のこれら断片を容易に生成することが可能である。抗体断片は、上述の抗体ファージライブラリーから単離することができる。或いは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、大腸菌から直接回収され、化学的に結合してＦ（ａｂ’）２断片を形成しうる（Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)）。Ｆ（ａｂ’）２断片は、別の方法によって、組換え宿主細胞培養物から直接単離されうる。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含む、インビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片が、米国特許第５８６９０４６に記載されている。抗体断片の生成のためのその他の技術は当業者にとって明らかであろう。特定の実施態様では、抗体は一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び同第５５８７４５８号を参照されたい。Ｆｖ及びｓｃＦｖは、定常領域を欠くインタクトな結合部位を有する唯一の種である；したがって、それらはインビボでの使用中に非特異的結合を低減させるために適していると思われる。ｓｃＦｖ融合タンパク質は、ｓｃＦｖのアミノ又はカルボキシ末端におけるエフェクタータンパク質の融合を生じさせるように構築される。上掲のAntibody Engineering, ed. Borrebaeckを参照されたい。抗体断片は、例えば、米国特許第５６４１８７０号に記載されるように「直線抗体」であってもよい。そのような直線抗体は、単一特異的であっても、又は二重特異的であってもよい。
【０１１０】
（ｖｉ）多重特異性抗体
多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なるエピトープについて結合特異性を有し、この場合これらエピトープは通常異なる抗原に由来している。このような分子は通常二つの異なるエピトープにのみ結合するが（即ち二重特異性抗体、ＢｓＡｂｓ）、この表現を本発明で使用する場合、更なる特異性を有する三重特異性抗体のような抗体も包含される。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片（例えばＦ（ａｂ’）２二重特性抗体）として調製することができる。
【０１１１】
二重特異性抗体を作製するための方法は、当技術分野において既知である。完全長の二重特異性抗体の常套的な生成は、二つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づいており、この場合の二本の鎖は、異なる特異性を有する（Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)）。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖はランダムに取り合わされるため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の潜在的な混合物を生成し、そのうち１個のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、通常はアフィニティークロマトグラフィー工程により行われるが、相当に面倒であり、生成の収率は低い。類似の手順は、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
【０１１２】
異なるアプローチによれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原合体部位）は、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。融合は、好ましくは、ヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖の定常ドメインとの間で行われる。典型的には、軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）が、融合体のうち少なくとも一つに存在する。免疫グロブリン重鎖融合体と、所望により免疫グロブリン軽鎖とをコードしているＤＮＡを別々の発現ベクター中に挿入し、適切な宿主生物中に共にトランスフェクトする。これは、不均等な比率の三本のポリペプチド鎖が構造中で使用された場合に最適な収率が得られる実施態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合を調節する際に大きな柔軟性を提供する。ただし、少なくとも二本のポリペプチド鎖が等しい比率で発現することにより収率が高まるとき、又はその比率が特に重要性をもたないときは、一つの発現ベクター中の二本又は全三本のポリペプチド鎖のコード配列を挿入することが可能である。
【０１１３】
このアプローチの一の実施態様において、二重特異性抗体は、第１の結合特異性を一方のアームに、複合免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）を他方のアームに有する、ハイブリッド複合免疫グロブリン重鎖から構成される。この非対称構造は、望ましくない免疫グロブリン鎖の組合せからの所望の二重特異性化合物の分離を容易にすることが見出されたが、これは、二重特異性分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖が存在することが容易な分離方式を提供するからである。このアプローチは、国際公開第９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体の生成の更なる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)を参照のこと。
【０１１４】
国際公開第９６／２７０１１号に記載されている別のアプローチによれば、抗体分子対の間の接触面を工学操作することにより、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の比率（％）が最大化することが可能である。一つの接触面は、抗体の定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法において、第１の抗体分子の接触面由来の一又は複数の小さいアミノ酸側鎖は、より大きい側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）で置き換えられる。大きい側鎖と同一又は類似の大きさを有する相補的な「空洞」は、大きいアミノ酸側鎖を小さい側鎖（例えばアラニン又はトレオニン）で置き換えることにより、第２の抗体分子の接点上に形成される。これは、ヘテロ二量体の収率をホモ二量体等の他の望ましくない最終生成物より高めるメカニズムを提供する。
【０１１５】
二重特異性抗体は、架橋抗体又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体のうち一方はアビジンと、他方はビオチンと、カップリングされ得る。そのような抗体は、例えば、望ましくない細胞に対して免疫系細胞を標的化すること（米国特許第４６７６９８０号）、及びＨＩＶ感染症の治療に用いること（国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／２００３７３号及びＥＰ０３０８９）が提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋方法を使用して作製され得る。好適な架橋剤は当技術分野において周知であり、米国特許第４６７６９８０号において、いくつかの架橋技術と共に開示されている。
【０１１６】
抗体断片から二重特異性抗体を生成するための技術も、文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を用いて調製することができる。Brennan et al., Science 229: 81 (1985)には、インタクト抗体をタンパク質分解的に開裂してＦ（ａｂ’）２断片を生成する手順が記載されている。これらの断片は、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元され、隣接するジチオールを安定化し、分子間のジスルフィド形成を防止する。次いで、生成されたＦａｂ’断片をチオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体のうち一方を、メルカプトエチルアミンを用いた還元によりＦａｂ’−チオールに再変換し、等モル量の他方のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成する。生成された二重特異性抗体は、酵素の選択的な固定化のための作用剤として使用することができる。
【０１１７】
最近の進歩により、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収することが容易になっており、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成しうる。Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)には、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の生成が記載されている。各Ｆａｂ’断片は、大腸菌から別々に分泌されたもので、インビトロで定方向化学カップリングを受けて二重特異性抗体を形成した。
【０１１８】
組換え細胞培養物から直接、二重特異性抗体断片を作製し単離するための様々な技術も記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて生成された。Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合により、二つの異なる抗体のＦａｂ’部分と連結された。抗体ホモ二量体は、ヒンジ領域で還元されて単量体を形成し、次いで、再酸化されて抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法は、抗体ホモ二量体の生成にも利用することができる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)により記載された「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代替的メカニズムを提供した。この断片は、きわめて短いために同一鎖上の二つのドメイン間の対形成を可能にするリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と繋がっている重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは、もう一つの断片の相補的なＶＬ及びＶＨドメインとの対形成を強いられ、それにより、二つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用により二重特異性抗体断片を作製するための別の戦略も報告されている。Gruber et al, J. Immunol, 152:5368 (1994)参照。
【０１１９】
三価以上の抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体が調製されうる。Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991))。
【０１２０】
（ｖｉｉ）単一ドメイン抗体
いくつかの実施態様では、本明細書に記載される抗体は単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体は、抗体の、重鎖可変ドメインの全部又は一部、又は軽鎖可変ドメインの全部又は一部を含む単一ポリペプチド鎖である。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, Mass.；例えば、米国特許第６２４８５１６Ｂ１参照）。一実施態様では、単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部又は一部からなる。
【０１２１】
（ｖｉｉｉ）抗体変異体
いくつかの実施態様では、本明細書に記載される抗体のアミノ酸配列修飾を考慮する。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することにより、又はペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終構築物に到達させるために作成されうる。アミノ酸の改変は、配列が作成されるときに、対象抗体のアミノ酸配列中に導入されうる。
【０１２２】
（ｉｘ）抗体誘導体
本発明の製剤及び組成物中の抗体は、当技術分野で既知であり、容易に入手可能な追加の非タンパク質性部分を含めるために、更に修飾することができる。特定の実施態様では、抗体の誘導体化に適切な部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定しないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキソラン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体又はランダム共重合体）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造上の利点を有し得る。ポリマーはいずれかの分子量のものであってよく、分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は変動し、複数のポリマーが結合する場合、それらは同じ分子又は異なる分子でありうる。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が特定の条件下で治療に使用されるのかなどを含む検討事項に基づいて決定することができる。
【０１２３】
（ｘ）ベクター、宿主細胞、及び組換え法
抗体は、組換え法を使用して生成することもできる。抗抗原抗体の組換え生産の場合、抗体をコードする核酸が単離され、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能なベクター中に挿入される。抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離され、従来の手順を用いて （例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定されうる。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分は、通常、限定しないが、以下のうち一又は複数を含む：シグナル配列、複製源、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列。
【０１２４】
（ａ）シグナル配列成分
本明細書に記載される製剤及び組成物中の抗体は、直接組換え的に生成されるだけでなく、好ましくは成熟タンパク質又はポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有するシグナル配列又は他のポリペプチドである、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして生成することもできる。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識及びプロセシングされる（例えば、シグナルペプチダーゼによって切断）されるものである。天然抗体  シグナル配列を認識及びプロセシングしない原核生物宿主細胞の場合、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、又は熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置き換えられる。酵母分泌の場合、天然シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、因子リーダー（サッカロミセス及びクルイベロミセスα因子リーダー）、又は酸ホスファターゼリーダー、カンジダアルビカンスグルコアミラーゼリーダー、又は国際公開第９０／１３６４６号に記載のシグナルによって置き換えられる。哺乳動物の細胞発現では、哺乳動物シグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。
【０１２５】
（ｂ）複製開始点
発現ベクター及びクローニングベクターの両方は、一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターが複製することを可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクター中において、この配列は、宿主の染色体ＤＮＡから独立してベクターが複製することを可能にするものであり、複製の開始点又は自己複製配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母、及びウイルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製の開始点は、大部分のグラム陰性細菌に適しており、２μ、プラスミド開始点は酵母に適しており、種々のウイルスの開始点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）は哺乳動物細胞中におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製開始点の成分は哺乳動物の発現ベクターには不要である（ＳＶ４０開始点は、早期プロモーターを含むという理由のみで典型的に使用される。）
【０１２６】
（ｃ）選択遺伝子成分
発現ベクター及びクローニングべクターは、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含みうる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質又は他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、又はテトラサイクリンに耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性欠陥を補う、又は（ｃ）複合培地から得られない重要な栄養素、例えば、バシリに対する遺伝子コードＤ−アラニンラセマーゼを供給するタンパク質をコードする。
【０１２７】
選択スキームの一例は、宿主細胞の増殖を停止させる薬物を利用する。異種遺伝子により成功裏に形質転換される細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生成し、したがって選択レジメを生き延びる。このようなドメイン選択の例は、薬物ネオマイシン、ミコフェノール酸及びヒグロマイシンを使用する。
【０１２８】
哺乳動物細胞の適切な選択可能マーカーの別の例は、ＤＨＦＲ、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉ及び−ＩＩ、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどの抗体コード核酸を取り込む細胞成分の同定を可能にするものである。
【０１２９】
例えば、ＤＨＦＲ遺伝子を用いて形質転換された細胞は、メトトレキサート（Ｍｔｘ）、ＤＨＦＲの競合アンタゴニストを含む培地において形質転換体を培養することにより同定される。このような条件下において、ＤＨＦＲ遺伝子を、いずれかの他の共形質転換核酸と共に増幅させる。内因性のＤＨＦＲ活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）を使用することができる。
【０１３０】
代替的に、ＧＳ遺伝子を用いて形質転換された細胞は、ＧＳの阻害剤であるＬ−メチオニンスルホキシイミン（Ｍｓｘ）を含む培地で形質転換体を培養することにより同定される。このような条件下において、ＧＳ遺伝子を、いずれかの他の共形質転換された核酸と共に増幅させる。ＧＳ選択／増殖系を、上述のＤＨＦＲ選択／増殖系と組み合わせて使用してもよい。
【０１３１】
代替的に、対象の抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲ遺伝子、及びアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）のような別の選択可能マーカーを用いて形質転換又は共形質転換された宿主細胞（特に内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、例えばカナマイシン、ネオマイシン、又はＧ４１８などのアミノグリコシド抗生物質のような選択可能なマーカーの選択剤を含む培地における細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９参照。
【０１３２】
酵母における使用に適した選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)）。ｔｒｐ１遺伝子は、ＡＴＣＣ番号４４０７６又はＰＥＰ４−１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母の突然変異株の選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。次いで、酵母宿主細胞ゲノムにおけるｔｒｐ１損傷の存在により、トリプトファンの非存在下における増殖による形質転換の検出に効果的な環境が提供される。同様に、Ｌｅｕ２欠乏酵母株（ＡＴＣＣ２０６２２又は３８６２６）が、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドにより補完される。
【０１３３】
加えて、１．６μｍの円形プラスミドｐＫＤ１から誘導されるベクターを、クリベロマイシス酵母の形質転換に使用することができる。代替的に、組換え仔ウシキモシン大規模生産用の発現系が、クルイベロマイシスラクチスについて報告されている。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)。クルイベロマイシスの工業用菌株による成熟した組換えヒト血清アルブミンの分泌のための適切なマルチコピー発現ベクターも開示されている。Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)。
【０１３４】
（ｄ）プロモーター成分
発現ベクター及びクローニングベクターは、一般に、宿主生物体によって認識され、抗体をコードする核酸に動作可能に連結されたプロモーターを含む。原核生物宿主との使用に適したプロモーターには、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、及びｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーターが含まれる。しかしながら、他の既知の細菌プロモーターも適している。細菌系に使用されるプロモーターも、抗体をコードするＤＮＡに動作可能に連結されたシャイン−ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含むであろう。
【０１３５】
プロモーター配列が真核生物について知られている。事実上、すべての真核生物遺伝子は、転写開始部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から７０〜８０塩基上流に見られる別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域であり、この領域ではＮはいずれかのヌクレオチドでよい。大部分の真核生物遺伝子の３’末端は、コード配列の３’末端へのポリＡ末尾の付加のためのシグナルでありうるＡＡＴＡＡＡ配列である。これら配列のすべては、真核生物の発現ベクター中に適切に挿入される。
【０１３６】
酵母宿主と共に使用するための適切なプロモーター配列の例には、３−ホスホグリセラートキナーゼ、又は他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼのプロモーターが含まれる。
【０１３７】
増殖条件によって転写が制御されるという更なる利点を有するプロモーターを誘導できる他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、並びにマルトース及びガラクトースを利用するための酵素のプロモーター領域である。酵母発現に用いられる適切なベクター及びプロモーターは、ＥＰ７３６５７に更に記載されている。酵母エンハンサーも、酵母プロモーターと共に有利に使用される。
【０１３８】
哺乳動物の宿主細胞中のベクターからの抗体転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えばアドノウイルス２）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サルウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノム、又はアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーターなどの異種哺乳動物プロモーターから得られるプロモーター、又は熱衝撃プロモーターにより、そのようなプロモーターが宿主細胞系と適合する限り、制御することができる。
【０１３９】
ＳＶ４０ウイルスの早期及び後期プロモーターは、やはりＳＶ４０ウイルスの複製開始点を含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウイルスを用いた哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現する系は、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の修飾は、米国特許第４６０１９７８号に記載されている。単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞中におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)も参照されたい。代替的に、ラウス肉腫ウイルスの長い末端リピートをプロモーターとして使用することができる。
【０１４０】
（ｅ）エンハンサーエレメント成分
より高等な真核生物による抗体をコードするＤＮＡの転写は、しばしばベクター中にエンハンサー配列を挿入することにより増強される。現在のところ、多くのエンハンサー配列が哺乳動物の遺伝子から既知である（グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルスからのエンハンサーが使用されるであろう。例には、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（塩基対１００〜２７０）、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化の亢進要素についてYaniv, Nature 297:17-18 (1982)も参照されたい。エンハンサーは、抗体コード化配列への５’又は３’位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくは、プロモーターから５’位に位置している。
【０１４１】
（ｆ）転写終結成分
真核生物の宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞）において使用される発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡｓの未翻訳領域である、通常は５’、場合によっては３’から取得できる。これら領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの未翻訳部分においてポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分は、ウシ増殖ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号及び本明細書に記載の発現ベクターを参照。
【０１４２】
（ｇ）宿主細胞の選択及び形質転換
本明細書のベクター中におけるＤＮＡのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、原核細胞、酵母、又は上記の高等真核細胞である。この目的のために適切な原核生物には、グラム陰性又はグラム陽性生物体といった真正細菌、例えば、大腸菌類のような腸内細菌科、例えば、大腸菌、エンテロバクター属、エルビニア菌属、クレブシエラ菌、プロテウス、サルモネラ菌、例えばネズミチフス菌、セラシア属、例えばセラチア菌、及び赤痢菌、並びに枯草菌及びバチルスリケニフォルミスといった桿菌（例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６７１０に開示されたバチルスリケニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿菌、及びストレプトマイシンが含まれる。一つの好ましい大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）、及び大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）といった他の菌株も適している。これらの例は限定的なものではなく説明的なものである。
【０１４３】
完全長抗体、抗体融合タンパク質、及び抗体断片は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が不要であるとき、例えば治療抗体が、腫瘍細胞の破壊においてそれ自体が効果的である細胞傷害性薬剤（例えば毒素）にコンジュゲートしているとき、細菌中において生成することができる。完全長抗体は、より長い循環半減期を有する。大腸菌中における生成は、より速く、且つ最も経費効率的である。抗体断片及びポリペプチドの細菌中における発現については、発現及び分泌を最適化するための翻訳開始領域（ＴＩＲ）及びシグナル配列について記載した米国特許５６４８２３７号（Carter et. Al.）、同第５７８９１９９号（Joly et al.）、同第５８４０５２３号（Simmons et al.）を参照されたい。また、大腸菌中における抗体断片の発現について記載したCharlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 245-254も参照されたい。発現後、抗体は、可溶型画分中において、大腸菌細胞ペーストから単離され、例えばアイソタイプに応じてプロテインＡ又はＧカラムにより精製することができる。最終的な精製は、例えばＣＨＯ細胞において発現された抗体を精製するための手順と同様に実行することができる。
【０１４４】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母といった真核微生物は、抗体コード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセスセレヴィシェ、又は一般的なパン酵母は、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用される。しかしながら、多数の他の属、種、及び株が一般的に入手可能で且つこの場合に有用であり、それらには、シゾサッカロミセスポンベ；例えば、クルイベロミセスラクチス、クルイベロミセスフラジリス（ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ１２４２４）、クルイベロミセス、ブルガリクス（ＡＴＣＣ１６０４５）、クルイベロミセスウィッカーラミー（ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ２４１７８）、クルイベロミセスワルティー（ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ５６５００）、クルイベロミセスドロソフィラルム（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ３６９０６）、クルイベロミセスサーモトレランス（ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、及びクルイベロミセスマーキシアヌス（ｍａｒｘｉａｎｕｓ）といったクルイベロミセス宿主；ヤロウィア属（ＥＰ４０２２２６）；ピキアパストリス（ＥＰ１８３０７０）；カンジダ；トリコデルマリーシア（ＥＰ２４４２３４）；アカパンカビ；シュワンニオミセスオクキデンタリスといったシュワンニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属；及び例えばニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム、並びに偽装性コウジ菌及びアスペルギルスニガーといったアスペルギルス宿主などの糸状菌である。治療用タンパク質の生成のための酵母及び糸状菌の使用について論じた総説については、例えばGerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)を参照されたい。
【０１４５】
グリコシル化経路が「ヒト化」されている、特定の真菌及び酵母株が選択され、部分的又は完全なヒトグルコシル化パターンを有する抗体が生成されうる。例えば、Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)（ピキアパストリス中のグリコシル化経路のヒト化について記載）；及び上掲のGerngross et al.を参照されたい。
【０１４６】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株及び変異体と、ヨトウガ（イモムシ）、ネッタイシマカ（蚊）、ヒトスジシマカ（蚊）、キイロショウジョウバエ（ショウジョウバエ）、及びカイコといった宿主由来の対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株、例えば、オートグラファカルフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変異体及びカイコＮＰＶのＢｍ−５株は公に入手可能であり、このようなウイルスは、特にヨトウガ細胞のトランスフェクションのために、本発明によるウイルスとして使用される。
【０１４７】
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、ウキクサ（ウキクサ科）、アルファルファ（Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、タバコの植物細胞培養物も宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体生成に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。
【０１４８】
脊椎動物細胞も宿主として使用してよく、培養物（組織培養物）中の脊椎動物細胞の伝播は常套的手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ヒト胎児腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)）に記載の、浮遊培養における増殖のためにサブクローニングされた２９３又は２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Mather et al., Annals N. Y Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝がん系（ＨｅｐＧ２）である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ＤＨＦＲ−  ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）；及びＮＳ０及びＳｐ２／０といった骨髄腫細胞系が含まれる。抗体生成に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 255-268を参照されたい。
【０１４９】
宿主細胞は、上述の、抗体生成用の発現又はクローニングベクターを用いて形質転換され、プロモーターを含むように適切に修飾された一般的な栄養培地において培養され、形質転換体を選択するか、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅させる。
【０１５０】
（ｈ）宿主細胞の培養
抗体を生成するために使用される宿主細胞は、種々の培地中において培養することができる。ハムのＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコの改良イーグル培地（（ＤＭＥＭ）といった市販の培地は、宿主細胞の培養に適している。加えて、Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980)、米国特許第４７６７７０４号；同第４６５７８６６号；同第４９２７７６２号；同第４５６０６５５号；又は同第５１２２４６９号；国際公開９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載の培地のいずれもが、宿主細胞の培地として使用できる。これら培地のいずれにも、ホルモン及び／又は他の増殖因子（例えばインスリン、トランスフェリン、又は上皮増殖因子）、塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びホスフェート）、バッファー（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えばＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮＴＭ薬）、微量元素（最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される）、及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。他のあらゆる必要な補充物も、当業者に既知の適切な濃度で含めることができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に以前使用されたものであり、当業者には明らかであろう。
【０１５１】
（ｘｉ）抗体の精製
組換え技術を使用した場合、抗体は、細胞周辺腔内で細胞内に生成されるか又は、培地中に直接分泌されうる。抗体が細胞内に生成される場合、最初の工程として、宿主細胞か又は溶解断片の何れかである微粒子状破片は、例えば遠心分離又は限外濾過により除去されうる。Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順を記載する。簡潔には、細胞ペーストは、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ及びフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で、約３０分間にわたって融解される。細胞破片は、遠心分離により除去され得る。抗体が培地中に分泌される場合、一般的に、そのような発現系からの上清はまず、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮される。ＰＭＳＦ等のプロテアーゼ阻害剤は、タンパク質分解を阻害するように前述の工程のいずれかに含まれてよく、抗生物質は、偶発的な夾雑物の増殖を防止するために含まれてよい。
【０１５２】
細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーは、典型的には好ましい精製工程の一つである。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに左右される。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に使用することができる（Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)）。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプとヒトγ３について推奨される（Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)）。親和性リガンドが結合するマトリックスは、大抵の場合アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。孔制御ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのような機械的に適切なマトリックスは、アガロースによって達成されるものより、流速を高め、処理時間を短縮することができる。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、精製のためにベーカーボンドＡＢＸＴＭ樹脂（J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.）が有用である。タンパク質精製のための他の技術、例えばイオン交換カラムでの断片化、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンセファロースＴＭでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿も、回収対象となる抗体に応じて利用可能である。
【０１５３】
一般に、研究、試験、及び臨床に使用される抗体を調製するための様々な方法が、当技術分野で確立されており、上記方法と一致し、及び／又は対象となる特定の抗体について当業者により適切とみなされる。
【０１５４】
Ｂ．生物学的に活性な抗体の選択
上述のように生成される抗体に一又は複数の「生物活性」アッセイを実行し、治療的見地から有利な特性を持つ抗体を選択することができる。抗体は、意図された抗原に結合する能力についてスクリーニングされる。例えば、抗ＤＲ５抗体（例えば、ドロジツマブ（ｄｒｏｚｉｔｕｍａｂ））のために、デスレセプター５（ＤＲ５）に結合する能力を検出するアッセイにおいて抗体の抗原結合特性を評価することができる。
【０１５５】
別の実施態様では、抗体の親和性は、例えば、飽和結合；ＥＬＩＳＡ；及び／又は競合アッセイ（例えばＲＩＡの）によって決定することができる。
【０１５６】
また、抗体に他の生物活性アッセイを行うことにより、治療としてのその有効性を評価することができる。このようなアッセイは、当技術分野で既知であり、標的抗原及び抗体の使用目的に応じて決まる。
【０１５７】
対象の抗原上の特定のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されているような常套的なクロスブロッキングアッセイを実行することができる。代替的に、例えばChampe et al., J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995)に記載のエピトープマッピングを実行し、抗体が対象のエピトープに結合するかどうかを決定することができる。
【０１５８】
Ｃ．製剤の調製
本明細書において提供されるのは、タンパク質と、液体製剤中のタンパク質の酸化を防止する化合物とを含む液体製剤を調製する方法である。液体製剤は、所望の純度を有するタンパク質と、液体製剤中のタンパク質の酸化を防止する化合物とを混合することにより調製される。特定の実施態様では、製剤化されるタンパク質は、前もって凍結乾燥されておらず、本明細書で対象とする製剤は水性製剤である。いくつかの実施態様では、タンパク質は治療用タンパク質である。特定の実施態様では、タンパク質は抗体である。更なる実施態様では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、又は抗体断片である。特定の実施態様では、抗体は完全長抗体である。一実施態様では、製剤中の抗体はＦ（ａｂ’）２などの抗体断片であり、この場合、完全長抗体には起こりえない問題（例えば、抗体のＦａｂへのクリッピング）に対応する必要が生じうる。製剤中に存在するタンパク質の治療的有効量は、例えば、所望の用量体積及び投与モードを考慮することにより決定される。約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ〜約２２５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約１７５ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ又は約４５ｍｇ／ｍＬ〜約５５ｍｇ／ｍＬが、製剤中の例示的タンパク質濃度である。いくつかの実施態様では、本明細書に記載のタンパク質は酸化の影響を受けやすい。いくつかの実施態様では、タンパク質中の、メチオニン、システイン、ヒスチジン、トリプトファン、及びチロシンからなる群より選択される一又は複数のアミノ酸は、酸化の影響を受けやすい。いくつかの実施態様では、タンパク質中のトリプトファンは、酸化の影響を受けやすい。いくつかの実施態様では、タンパク質中のメチオニンは、酸化の影響を受けやすい。いくつかの実施態様では、本明細書において提供される抗体は、抗体のＦａｂ部分及び／又はＦｃ部分における酸化の影響を受けやすい。いくつかの実施態様では、本明細書において提供される抗体は、抗体のＦａｂ部分のトリプトファンアミノ酸における酸化の影響を受けやすい。更なる実施態様では、酸化の影響を受けやすいトリプトファンアミノ酸は、抗体のＣＤＲにある。いくつかの実施態様では、本明細書において提供される抗体は、抗体のＦｃ部分のメチオニンアミノ酸における酸化の影響を受けやすい。
【０１５９】
本明細書において本発明により提供される液体製剤は、タンパク質と、液体製剤中のタンパク質の酸化を防止する化合物を含み、化合物が、５−ヒドロキシ−トリプトファン、５−ヒドロキシ  インドール、７−ヒドロキシ  インドール、及びセロトニンからなる群より選択される。いくつかの実施態様では、製剤中の化合物は、約０．３ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度、又は多くとも化合物が製剤中において可溶である最大濃度である。特定の実施態様では、製剤中の化合物は、約０．３ｍＭ〜約９ｍＭ、約０．３ｍＭ〜約８ｍＭ、約０．３ｍＭ〜約７ｍＭ、約０．３ｍＭ〜約６ｍＭ、約０．３ｍＭ〜約５ｍＭ、約０．３ｍＭ〜約４ｍＭ、約０．３ｍＭ〜約３ｍＭ、約０．３ｍＭ〜約２ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約２ｍＭ、約０．６ｍＭ〜約１．５ｍＭ、又は約０．８ｍＭ〜約１．２５ｍＭの濃度である。いくつかの実施態様では、製剤中の化合物は、約１ｍＭである。いくつかの実施態様では、化合物は、タンパク質中の一又は複数のアミノ酸の酸化を防止する。いくつかの実施態様では、化合物は、トリプトファン、メチオニン、チロシン、ヒスチジン、及び／又はシステインからなる群より選択されるタンパク質中の一又は複数のアミノ酸の酸化を防止する。いくつかの実施態様では、化合物は、活性酸素種（ＲＯＳ）によるタンパク質の酸化を防止する。更なる実施態様では、活性酸素種は、一重項酸素、超酸化物（Ｏ２−）、アルコキシルラジカル、ペルオキシルラジカル、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、二水素三酸化物（Ｈ２Ｏ３）、ヒドロトリオキシラジカル（ＨＯ３・）、オゾン（Ｏ３）、ヒドロキシルラジカル、及びアルキルペルオキシドからなる群より選択される。更なる実施態様では、化合物は、抗体のＦａｂ部分中の一又は複数のアミノ酸の酸化を防止する。更に別の実施態様では、化合物は、抗体のＦｃ部分中の一又は複数のアミノ酸の酸化を防止する。
【０１６０】
いくつかの実施態様では、液体製剤は更に、安定剤、バッファー、界面活性剤、及び等張化剤からなる群より選択される一又は複数の添加剤を含む。本発明の液体製剤は、ｐＨ緩衝液中で調製される。本発明のバッファーのｐＨは、約４．５〜約７．０の範囲である。特定の実施態様では、ｐＨの範囲は、ｐＨ４．５〜６．５、ｐＨ４．５〜６．０、ｐＨ４．５〜５．５、ｐＨ４．５〜５．０、ｐＨ５．０〜７．０、ｐＨ５．５〜７．０、ｐＨ５．７〜６．８、ｐＨ５．８〜６．５、ｐＨ５．９〜６．５、ｐＨ６．０〜６．５、又はｐＨ６．２〜６．５である。本発明の特定の実施態様では、液体製剤のｐＨは６．２又は約６．２である。本発明の特定の実施態様では、液体製剤のｐＨは６．０又は約６．０である。この範囲内にｐＨを制御するバッファーの例には、有機及び無機酸、並びにその塩が含まれる。例えば、酢酸（例えば、ヒスチジンアセテート、アルギニンアセテート、酢酸ナトリウム）、スクシネート（例えば、ヒスチジンスクシネート、アルギニンスクシネート、ナトリウムスクシネート）、グルコン酸、ホスフェート、フマル酸、シュウ酸、乳酸、シトレート、及びこれらの組合せ。バッファー濃度は、例えば、バッファー及び製剤の所望の等張性に応じて、約１ｍＭ〜約６００ｍＭとすることができる。特定の実施態様では、製剤は、ヒスチジンバッファー（例えば、約５ｍＭ〜１００ｍＭの濃度の）を含む。ヒスチジンバッファーの例には、ヒスチジンクロリド、ヒスチジンアセテート、ヒスチジンホスフェート、ヒスチジン硫酸塩、ヒスチジンスクシネートなどが含まれる。特定の実施態様では、製剤は、ヒスチジン及びアルギニン（例えば、ヒスチジンクロリド−アルギニンクロリド、ヒスチジンアセテート−アルギニンアセテート、ヒスチジホスフェート−アルギニンホスフェート、ヒスチジン硫酸塩−アルギニン硫酸塩、ヒスチジンスクシネート−アルギニンスクシネートなど）が含まれる。特定の実施態様では、製剤は、約５ｍＭ〜１００ｍＭの濃度のヒスチジンを含み、アルギニンは５０ｍＭ〜５００ｍＭの濃度である。一実施態様では、製剤は、ヒスチジンアセテート（例えば、約２０ｍＭ）−アルギニンアセテート（例えば、約１５０ｍＭ）を含む。特定の実施態様では、製剤は、ヒスチジンスクシネート又はエステル（例えば、約２０ｍＭ）−アルギニンスクシネート（例えば、約１５０ｍＭ）を含む。特定の実施態様では、製剤中のヒスチジンは、約１０ｍＭ〜約３５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１５ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約３５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ又は約２０ｍＭ〜約２５ｍＭである。更なる実施態様では、製剤中のアルギニンは、約５０ｍＭ〜約５００ｍＭ（例えば、約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、又は約２００ｍＭである）。
【０１６１】
本発明の液体製剤は、更に二糖（例えば、トレハロース又はショ糖）のような糖類を含むことができる。本明細書で使用される「糖類」は、一般的な組成物（ＣＨ２Ｏ）ｎ及びその誘導体を含み、単糖類、二糖類、三糖類、多糖類、糖アルコール、還元糖、非還元糖などが含まれる。本明細書における糖類の例には、グルコース、ショ糖、トレハロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デキストラン、グリセリン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、シリトール（ｓｙｌｉｔｏｌ）、ソルビトール、マンニトール、メリビオース、メレジトース、ラフィノース、マンノトリオース、スタキオース、ラクツロース、マルチュロース、グルシトール、マルチトール、ラクチロール、イソ−マルチュロースなどが含まれる。
【０１６２】
任意選択的に、界面活性剤を液体製剤に添加することができる。例示的な界面活性剤には、ポリソルベート（例えばポリソルベート２０、８０など）又はポロキサマー（例えばポロキサマー１８８など）の非イオン性界面活性剤が含まれる。界面活性剤は、製剤化された抗体の凝集を低減する、及び／又は製剤中の粒子の形成を最小化する、又は吸着を低減するような量で添加される。例えば、界面活性剤は、製剤中に、約０．００１％〜約０．５％、約０．００５％〜約０．２％、約０．０１％〜約０．１％、約０．０２％〜約０．０６％、又は約０．０３％〜約０．０５％の量で存在する。特定の実施態様では、界面活性剤は、製剤中に、０．０４％又は約０．０４％の量で存在する。特定の実施態様では、界面活性剤は、製剤中に、０．０２％又は約０．０２％の量で存在する。一実施態様では、製剤は界面活性剤を含まない。
【０１６３】
一実施態様では、製剤は、上記に同定された薬剤（例えば、抗体、バッファー、糖類、及び／又は界面活性剤）を含み、基本的に、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノール及びベンゼトニウムＣｌといった、一又は複数の保存料を含まない。別の実施態様では、特に製剤がマルチドーズ型製剤である場合、保存料が製剤に含まれてもよい。保存料の濃度は、約０．１％〜約２％、好ましくは約０．５％〜約１％の範囲とすることができる。製剤の所望の特性に悪影響を及ぼさない限り、Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に記載されるもののような、一又は複数の他の薬学的に許容される担体、添加剤又は安定剤が製剤に含まれてもよい。本明細書における典型的な薬学的に許容される添加剤は、介在性薬物分散剤、例えば、水溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒｈｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標））、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。特定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、ｒＨｕＰＨ２０を含み、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８に開示されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰが、コンドロイチナーゼなどの一又は複数の追加的グルコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【０１６４】
製剤は、更に金属イオンキレート剤を含みうる。金属イオンキレート剤は、当業者に周知であり、必ずしも限定するわけではないが、アミノポリカルボキシレート、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（β−アミノエチル  エーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、ＥＤＤＳ（エチレンジアミンジコハク酸）、ＰＤＴＡ（１，３−プロピレンジアミン四酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＡＤＡ（β−アラニン二酢酸）、ＭＧＣＡ（メチルグリシン二酢酸）などを含む。加えて、本明細書のいくつかの実施態様は、ホスホネート／ホスホン酸キレート剤を含む。
【０１６５】
等張化剤は、組成物中の液体の浸透圧を調整又は維持するために含まれる。タンパク質及び抗体といった大きく荷電した生体分子と共に使用されるとき、等張剤は、荷電したアミノ酸側鎖の群と相互作用することにより、分子間及び分子内の相互作用の電位を低下させることができるため、「安定剤」としても機能しうる。等張化剤は、他の成分の相対量を考慮して、０．１％〜２５重量％、又は好ましくは１〜５重量％の量で存在することができる。好ましい等張化剤には、多価の糖アルコール、好ましくは三価以上の糖アルコール、例えばグリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールが含まれる。
【０１６６】
本明細書の製剤はまた、治療される特定の兆候に必要な、一を超えるタンパク質又は小分子薬であって、好ましくは他のタンパク質に悪影響を与えない相補的活性を有するものを含みうる。例えば、抗体が抗ＤＲ５（例えば、ドロジツマブ）である場合、それは別の薬剤（例えば、化学療法剤、及び抗腫瘍性薬剤）と組み合わせられる。
【０１６７】
いくつかの実施態様では、製剤はインビボでの投与を目的としている。いくつかの実施態様では、製剤は無菌である。製剤は、滅菌濾過膜を通した濾過により滅菌される。本明細書の治療製剤は、通常、滅菌アクセスポートを有する容器中、例えば、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有するバイアル中に配置される。投与の経路は、単回又は複数回のボーラス又は適切な方式での長時間の点滴、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病巣内又は関節内の経路による注射又は点滴、局所投与、吸引による、又は徐放若しくは持続放出手段による、許容される既知の方法に従う。
【０１６８】
本発明の液体製剤は、貯蔵時に安定である。いくつかの実施態様では、液体製剤中のタンパク質は、約０〜５oＣで少なくとも約１２ヶ月、少なくとも約１８ヶ月、少なくとも約２１ヶ月、又は少なくとも約２４ヶ月（又は少なくとも約５２週）にわたる貯蔵時に安定である。いくつかの実施態様では、液体製剤中のタンパク質は、約−２０oＣで少なくとも約１２ヶ月、少なくとも約１８ヶ月、少なくとも約２１ヶ月、又は少なくとも約２４ヶ月（又は少なくとも約５２週）に渡る貯蔵時に安定である。いくつかの実施態様では、液体製剤中のタンパク質は、製剤製造中に安定である。いくつかの実施態様では、液体製剤中のタンパク質は、金属合金容器（例えば、ステンレス鋼容器）内で貯蔵されたとき安定である。いくつかの実施態様では、液体製剤中のタンパク質は、ガラス製バイアル内で貯蔵されたとき安定である。いくつかの実施態様では、液体製剤中のタンパク質は、プラスチック容器内で貯蔵されたとき安定である。いくつかの実施態様では、液体製剤中のタンパク質の物理的安定性、化学安定性、又は生物活性が評価又は測定される。当技術分野で既知のいずれの方法も、安定性及び生物活性の評価に使用できる。いくつかの実施態様では、安定性は、貯蔵後、液体製剤中のタンパク質の酸化により測定される。安定性は、製剤化の頃と、貯蔵後において、製剤中の抗体の物理的安定性、化学安定性、及び／又は生物活性を評価することにより試験することができる。物理的及び／又は化学安定性は、種々の異なる方法で、定性的に及び／又は定量的に評価することができ、そのような方法には、凝集物形成の評価（例えば分子ふるいクロマトグラフィーを用いるもの、濁度を測定することによるもの、及び／又は目視検査によるもの）；陽イオン交換クロマトグラフィー又はキャピラリーゾーン電気泳動を用いて電荷不均一性を評価することによるもの；アミノ末端又はカルボキシ末端配列分析；質量分光分析；還元されたインタクトな抗体を比較するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析；ペプチドマップ（例えばトリプシン又はＬＹＳ−Ｃ）分析；抗体の生物活性又は抗原結合機能を評価することなどが含まれる。不安定性は、凝集、脱アミド（例えばＡｓｎ脱アミド）、酸化（例えばＴｒｐ酸化）、異性化（例えばＡｓｐ異性化）、クリッピング／加水分解／断片化（例えばヒンジ領域断片化）、スクシンイミド形成、不対システイン、Ｎ末端伸長、Ｃ末端プロセシング、グリコシル化の差異などの原因となりうる。いくつかの実施態様では、タンパク質中の酸化は、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、又はトリプシンペプチドマッピングのうちの一又は複数を用いて決定される。いくつかの実施態様では、抗体中の酸化は、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、又はトリプシンペプチドマッピングのうちの一又は複数と、以下の式を用いてパーセンテージとして決定される：
2020164531.tif 000004
【０１６９】
インビボでの投与に使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、製剤の調製の前又は後の、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
【０１７０】
本明細書では、タンパク質の酸化を防止する化合物の量を液体製剤に添加することを含む、液体製剤の製造方法又は液体製剤中のタンパク質の酸化防止方法も提供され、この場合化合物は、５−ヒドロキシ−トリプトファン、５−ヒドロキシ  インドール、７−ヒドロキシ  インドール、及びセロトニンからなる群より選択される。本明細書において本発明は、タンパク質の酸化を防止する量の化合物を液体製剤に添加することを含む、液体製剤中のタンパク質の酸化を防止する方法も提供し、この場合化合物は、５−ヒドロキシ−トリプトファン、５−ヒドロキシ  インドール、７−ヒドロキシ  インドール、及びセロトニンからなる群より選択される。特定の実施態様では、液体製剤は抗体を含む。本明細書に提供されるタンパク質の酸化を防止する化合物の量は、約０．３ｍＭ〜約１０ｍＭ、又は本明細書に開示される量のいずれかである。
【０１７１】
ＩＩＩ．タンパク質製剤の投与
液体製剤は、タンパク質（例えば、抗体）を用いた治療を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトに対し、既知の方法、例えば静脈内投与ボーラスとして又は一定期間にわたる連続的注入により、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、髄腔内、経口、局所、若しくは吸入経路で、投与される。一実施態様では、液体製剤は、静脈内投与により哺乳動物に投与される。このような目的のために、製剤は、例えば注射器を用いて又はＩＶラインを介して注入される。一実施態様では、液体製剤は、皮下投与により哺乳動物に投与される。
【０１７２】
タンパク質の適切な投与量（「治療的有効量」）は、例えば、治療される状態、状態の重症度及び経過、タンパク質の投与が予防を目的とするものであるか又は治療を目的とするものであるか、薬歴、患者の病歴及びタンパク質に対する応答、使用されるタンパク質の種類、及び主治医の裁量によって決定される。タンパク質は、単回で、又は一連の治療にわたって患者に適切に投与され、診断後のいずれかの時点で患者に投与されうる。タンパク質は、単一治療として、又は問題の状態の治療に有用な他の薬物又は療法と組み合わせて、投与されうる。本明細書で使用される場合、用語「治療」は、治療的処置及び予防的若しくは防護的手段の両方に言及する。治療を必要とするものには、既にその障害を有しているもの、並びにその障害が予防されるべきものが含まれる。本明細書で使用される場合、「障害」は、治療の恩恵を受けるであろうあらゆる状態であり、哺乳動物を問題の障害に罹患させる病理学的状態を含む慢性及び急性の障害又は疾患を含むがそれに限定されない。
【０１７３】
薬理的意味において、本発明の文脈上、タンパク質（例えば、抗体）の「治療的有効量」は、治療に抗体が有効である障害の予防又は治療において有効な量を指す。一般的な命題として、投与されるタンパク質の治療的有効量は、例えば毎日投与された場合、単回投与か複数回投与かに関わらず、患者の体重１ｋｇ当たり約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり、使用されるタンパク質の典型的な範囲は、約０．３〜約２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．３〜約１５ｍｇ／ｋｇである。しかしながら、他の用量用法も使用してよい。例えば、タンパク質は、約１００〜４００ｍｇの用量で、１、２、３、又は４週毎に投与することができるか、又は約１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１５．０、又は２０．０ｍｇ／ｋｇの用量で１、２、３、又は４週毎に投与される。容量は、単回の用量又は複数回の用量（例えば、２又は３回の用量）として、例えば点滴で投与してもよい。この療法の進行は、従来技術により容易にモニタすることができる。
【０１７４】
ＩＶ．タンパク質酸化の防止のための化合物のスクリーニング方法
本明細書では、タンパク質組成物中のタンパク質の酸化を防止する化合物のスクリーニング方法も提供される。いくつかの実施態様では、方法は、Ｌ−トリプトファンより酸化電位及び光感受性が共に低い化合物を選択すること、並びに選択された化合物の、タンパク質の酸化を防止する効果を試験することを含む方法が提供される。いくつかの実施態様では、光感受性は、光暴露時に化合物によって生成されるＨ２Ｏ２の量に基づいて測定される。例えば、化合物を含む液体組成物を、一定量の時間にわたって２５０Ｗ／ｍ２の光に暴露することができ、その結果得られたＨ２Ｏ２の形成を定量化する。光感受性の低い化合物は、特定量の光への暴露により、同じ量の光に暴露された光感受性の高い化合物と比較して少ないＨ２Ｏ２を生成する。いくつかの実施態様では、Ｈ２Ｏ２の量の約１５％未満、約２０％未満、又は約２５％未満を生成する化合物が選択される。Ｈ２Ｏ２は、酸化の影響を受けやすいタンパク質中のアミノ酸残基の酸化により生成される。いくつかの実施態様では、酸化電位は、サイクリックボルタンメトリーによって測定される。
【０１７５】
いくつかの実施態様では、選択された化合物は、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ジヒドロクロリド（ＡＡＰＨ）、光、及び／又はフェントン試薬によって生成された活性酸素種によるタンパク質の酸化を防止する効果について試験される。本明細書の実施態様のいずれにおいても、実施例（例えば、実施例２及び３）に記載される方法は、タンパク質組成物中におけるタンパク質の酸化を防止する化合物のスクリーニングに使用することができる。
【０１７６】
Ｖ．製造品
本発明の別の実施態様では、本発明の液体製剤を保持し、任意選択的にその使用に関する指示を提供する容器を含む製品が提供される。適切な容器には、例えば、瓶、バイアル、及びシリンジが含まれる。容器は、ガラス、金属合金（例えばステンレス鋼）又はプラスチックといった種々の材料から形成することができる。例示的な一容器は、３００ｃｃの金属合金容器（例えば、−２０oＣでの貯蔵用の）である。例示的な一容器は、３〜２０ｃｃの単回使用ガラス製バイアルである。代替的に、マルチドーズ製剤のために、容器は３〜１００ｃｃのガラス製バイアルでもよい。容器は製剤を保持し、容器の上又は容器に関連付けられたラベルは使用の説明を表示することができる。製品は更に、商業的見地及びユーザの検知から望ましい他の材料を含むことができ、それには、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、注射器、及び使用の説明が書かれた添付文書が含まれる。
【０１７７】
本明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にするのに十分であると考えられる。本明細書に示され、記載されるもの以外に、上記説明から当業者には本発明の種々の修正例が明らかであり、それら修正例は特許請求の範囲に含まれる。本明細書に引用されるすべての公開公報、特許、及び特許出願は、ここでの参照によりその全体がすべての目的のために本明細書に包含される。
【実施例】
【０１７８】
本発明は、以下の実施例を参照することにより、よりよく理解されるであろう。ただし、これらの実施例は、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載される実施例及び実施態様が例示のみを目的としていること、そのような観点から様々な修正又は変更が当業者に示唆され、本出願及び特許請求の意図及び範囲に含まれることを理解されたい。
【０１７９】
実施例１：抗酸化剤Ｌ−Ｔｒｐは、タンパク質製剤中のモノクローナル抗体を酸化するＲＯＳを生成する。
モノクローナル抗体は、抗体が水と一重項酸素との反応を触媒して過酸化水素を生成しうる、抗体触媒水酸化経路（ＡＣＷＯＰ）を介してＲＯＳを生成することが示されている（Wentworth et al., Science 293(5536):1806-11 (2001); Wentworth et al., Proc Natl Acad Sci U S A 97(20):10930-5 (2000)）。ＡＣＷＯＰでは、超酸化物アニオン、三酸化二水素、オゾン、及び場合によってはヒドロトリオキシ基を含む様々なＲＯＳが、経路内において、過酸化水素の生成を目的として生成される（Zhu et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101(8):2247-52 (2004)）。モノクローナル抗ＤＲ５抗体中の、表面暴露トリプトファンである、本明細書ではｍＡｂ１とも呼ぶドロジツマブ（ＣＡＳ番号９１２６２８−３９−８）は、弱い光条件下においてさえ、時間及び濃度に依存してＡＣＷＯＰを助ける基質（１Ｏ２及びＯ２−）ジェネレーターとして機能することが示されている（Sreedhara et al., Mol. Pharmaceutics (2013)）。薬剤的に適切な条件下での貯蔵の間に、ｍＡｂ１が特に酸化の影響を受けやすいことが実証された（Sreedhara et al., Mol. Pharmaceutics (2013)）。酸化は、部位特異的であり、トリプシンペプチドマッピングにより評価したところ、重鎖ＣＤＲ（Ｆａｂ）上のＴｒｐ５３（Ｗ５３）に局在することが示された。加えて、逆相ＨＰＬＣアッセイが、パパイン消化、ＤＴＴ還元、及び逆相分離を介してｍＡｂ１のＨＣ  Ｆａｂ及びＦｃ領域における全体の酸化を測定するために使用された。ＲＰ−ＨＰＬＣからのピークが、ＬＣ／ＭＳを用いて同定され、チロシンペプチドマップの結果との強い相関を示し、これによりＲＰ法をＷ５３（即ち％Ｆａｂ）酸化の検出の代替として使用可能であることが示唆された（Sreedhara et al., Mol. Pharmaceutics (2013)）。ＲＰパパイン消化法において、Ｆａｂ及びＦｃ酸化のピークが、それぞれの主要なピークの前に溶出され、それらの全ピーク領域に対する％Ｆａｂ及び％Ｆｃ酸化の定量化が可能となった。この試験は更に、過酸化水素が、超酸化物及び一重項酸素を含む複数のＲＯＳの代理として機能しうることを示した。
【０１８０】
制限された（即ち、制御された）光暴露がタンパク質酸化を研究するための加速ストレスモデルとして使用可能であるかどうかを決定するために、同じヒトモノクローナルＩｇＧ１抗体（ｍＡｂ１）を使用して抗酸化剤候補をスクリーニング及び評価した。タンパク質製剤中に使用される抗酸化剤であるＬ−トリプトファン（Ｌ−Ｔｒｐ）が、最近になって、感光性であり（Igarashi et al., Anal Sci 23(8):943-8 (2007)）、光暴露によりＨ２Ｏ２を生成する能力を有することが示された。光ストレス下におけるｍＡｂ１のＬ−Ｔｒｐに対する感度を、抗酸化剤候補としてのＬ−メチオニン（Ｌ−Ｍｅｔ）を添加した場合としない場合について評価した。ｍＡｂ１を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中に発現させ、プロテインＡクロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーによる親和性精製を含む一連のクロマトグラフィー法により精製した。ｍＡｂ１を、５ｍｇ／ｍＬで、ガラス製バイアル中、２０ｍＭのヒスチジンアセテート、２５０ｍＭのトレハロース及び０．０２％のポリソルベート２０の製剤中において、１ｍＭのＬ−Ｔｒｐ及び１０ｍＭ〜１００ｍＭにわたる様々な濃度のＬ−Ｍｅｔを用いて調製し、Ａｔｌａｓ  ＳｕｎＴｅｓｔ  ＣＰＳ＋Ｘｅｎｏｎ試験計器（Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）中において２５０Ｗ／ｍ２の光に八時間暴露した。コントロールバイアルをアルミホイルに包み、同様に処理した。光暴露後、溶液を、逆相ＨＰＬＣによる分析のために調製した。ＲＰ−ＨＰＬＣの場合、ストレス試験のｍＡｂ１溶液を、０．１ＭのＴｒｉｓ、４．４ｍＭのＥＤＴＡ、及び１．１ｍＭのシステイン中において１．１ｍｇ／ｍＬで調製した。０．１ｍｇ／ｍＬのパパイン１５０μＬを、１．３５ｍＬのｍＡｂ１溶液に加えた後、３７℃で二時間インキュベートした。インキュベート後、９００μＬの溶液を、１Ｍのジチオスレイトール（ＤＴＴ）１００μＬと混合し、更に３０分間３７℃でインキュベートした。次いで試料を、Ｖａｒｉａｎ、Ｉｎｃ．Ｐｕｒｓｕｉｔ３μｍ、２ｍｍ  ＩＤ×２５０ｍｍのジフェニルカラム（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）と連動する、２８０ｎｍでのＵＶ検出を備えたＡｇｉｌｅｎｔ、Ｉｎｃ．１１００／１２００ＨＰＬＣシステム（Santa Clara, CA）にかけた。移動相Ａは、水中０．１％のＴＦＡであった。移動相Ｂは、アセトニトリル中０．１％のＴＦＡであった。移動相の勾配は、０分における３４％Ｂから５０．０分における４３％Ｂへ、次いで５０．１分における９５％Ｂへと直線的に増加した。勾配は、６０．１分まで９５％Ｂに維持され、次いで６０．１〜６０．２分に９５％Ｂから３４％Ｂへと直線的に減少した。勾配は、８０．２分のサイクルの最後まで３４％Ｂに維持された。カラムの温度は６５℃であり、全体の流速は０．２ｍＬ／分であり、各試料の注入体積は６μＬであった。次いでクロマトグラムを、酸化の定量化のために積分した。
【０１８１】
加えて、ｍＡｂ１が、Ｌ−Ｈｉｓベースのバッファー（ｐＨ６．０）中において安定であることが判明した。ｍＡｂ１  Ｆａｂの酸化に対するＬ−Ｔｒｐ及びＬ−Ｍｅｔの光暴露の効果の分析により、ｍＡｂ１の参照試料（光暴露なし）及びホイルコントロールが約２％のＦａｂ酸化を有することが示された（図１Ａ）。ホイルコントロール及び参照試料は、同レベルのＦａｂ酸化を示し、熱のみがＦａｂの酸化を引き起こしているとは考えられなかった。ｍＡｂ１が光に暴露されると（「添加剤なし」試料）、Ｆａｂ酸化は４％に倍増した。１ｍＭのＬ−Ｔｒｐを加えると、Ｆａｂ酸化は約９％まで増加し、遊離型Ｌ−Ｔｒｐが光暴露下でＲＯＳを生成することによりＦａｂ上でＷ５３の酸化が生じた可能性が示唆された。１０、２５、５０、及び１００ｍＭのＬ−Ｍｅｔを、１ｍＭのＬ−Ｔｒｐを含む製剤に更に加えると、Ｆａｂの酸化はやや低減したように思われたが、１００過剰モルのＬ−ＭｅｔもＦａｂの酸化をホイルコントロールのレベルまで低下させることはなかった（図１Ａ）。
【０１８２】
ｍＡｂ１のＦｃ領域における酸化の大部分がＭｅｔ残基であるＭｅｔ２５４及びＭｅｔ４３０であったことが示された（Sreedhara et al., Mol. Pharmaceutics (2013)）。ｍＡｂ１  Ｆｃの酸化に対するＬ−Ｔｒｐ及びＬ−Ｍｅｔの光暴露効果の分析により、ｍＡｂ１の参照試料及びホイルコントロールが、光へ暴露する前に約８％のＦｃ酸化を有していたことが示された（図１Ｂ）。光への暴露は、製剤バッファー中のｍＡｂ１については、Ｆｃの酸化をわずかに増大させただけであった（「添加剤なし」）。しかしながら、１ｍＭのＬ−Ｔｒｐと共になされたインキュベーションにより、Ｆｃ領域内のこれらＭｅｔ部位に、ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイによれば２０％を上回る酸化が見られた。様々な濃度のＬ−Ｍｅｔ（１０、２５、５０及び１００ｍＭ）を、１ｍＭのＬ−Ｔｒｐを含む製剤に加えると、Ｆｃの酸化量は低減したが、１００ｍＭのＬ−ＭｅｔもＦｃの酸化をコントロールのレベルまで低下させることはなかった（図１Ｂ）。
【０１８３】
Ｌ−Ｔｒｐが、超酸化物イオンにより、及び準化学量論的にＨ２Ｏ２を生成する一方、同様の条件下で抗体は触媒量を生成することが以前に報告された（Wentworth et al., Science 293(5536):1806-11 (2001); McCormick et al., Journal of the American Chemical Society 100:312-313 (1978)）。薬学的に適切な条件下、例えばＩＣＨ条件下及び周囲光条件下の両方での遊離型Ｌ−Ｔｒｐの感度を試験するために、０．３２ｍＭ〜７．５ｍＭのＬ−Ｔｒｐを含む製剤（Ｌ−Ｔｒｐはリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解されている）を３時間２５０Ｗ／ｍ２のＵＶ光及び約１５０ｋルクスの可視光に曝した。試料を取り、Ａｍｐｌｅｘアッセイにより直ちに分析し、これら条件下で生成されたＨ２Ｏ２の量を検出した。大量のＨ２Ｏ２が、遊離型Ｌ−Ｔｒｐにより、光暴露時に、濃度に依存して生成された（図２）。このようなＨ２Ｏ２生成は、一重項酸素の既知のクエンチャーである５０ｍＭのアジ化ナトリウムの存在下で大きく低減した（図２）。Ｌ−Ｔｒｐを、５０ｍＭのＮａＮ３と１５０Ｕの超酸化物ジスムターゼ（ＳＯＤ）の組合せ又はＳＯＤのみと共にインキュベートすると、大量のＨ２Ｏ２が、ＮａＮ３を含まない試料中に依然として検出された。これにより、一重項酸素に加えて、光照射時にＳＯＤによってＨ２Ｏ２に変換される超酸化物イオンも生成されることが示された。
【０１８４】
ＩＣＨ光条件下で遊離型Ｌ−Ｔｒｐの光感受性を確認する一方で、実験室で典型的にみられる周囲光の効果を試験した。様々な実験室におけるＤＬＭ１デジタル光露光計を使用した測定は、実験室の卓上において平均３００ルクス（白色蛍光照明）、層流フードにおいて平均３００ルクス（白色蛍光照明）及び南東の太陽光に曝された窓枠について約１００００ルクスを示した。これら条件下で、５０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ１を含む製剤バッファー中のＬ−Ｔｒｐは、Ａｍｐｌｅｘ  Ｕｌｔｒａ  Ｒｅｄアッセイを用いて検出したところ、マイクロモル範囲の過酸化水素を生成した（図３Ａ）。過酸化物の生成は、明度（３００、３０００、及び１００００ルクス）と時間（１、３、及び７日）の両方により増加した。タンパク質試料は、ｍＡｂ１特異的ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイを用いて更に分析したところ、明度の上昇によるＷ５３の酸化に対応して重鎖Ｆａｂの酸化を示した（図３Ｂ）。同時に、これら条件下でのｍＡｂ１における％Ｆｃ酸化は、３００から１００００ルクスの間でそれぞれ５から４０％まで上昇した。このような光暴露のレベル及び時間は、充填／仕上げ工程の前の、及び可能であれば製剤バイアルの検査中の、周囲光及び温度での薬物物質の取扱いのために薬学的に適切であるように決定された。これらの結果は、Ｌ−Ｔｒｐが光感受性であること、Ｌ−Ｔｒｐが、ｍＡｂ製品の品質に有害となりうる一重項酸素、超酸化物及びＨ２Ｏ２を含め、複数の活性酸素種を生成すること、並びにＬ−Ｔｒｐ含有バッファーの取り扱い及び貯蔵の間に注意が必要であることを支持するものであった。
【０１８５】
実施例２：候補抗酸化剤化合物のスクリーニング
トリプトファン（Ｔｒｐ）は、ヒドロキシルラジカル及び一重項酸素といったＲＯＳの存在下において酸化的及び求電的な追加反応を受ける、電子の豊富なアミノ酸である。タンパク質中においてＴｒｐの酸化を保護するいずれの抗酸化剤候補も、これらＲＯＳに対して、優れていないといしても同様の反応性を有さなければならない。Ｌ−Ｔｒｐ構造に基づいているか又は抗酸化特異性を有することが報告されている一連の化合物を評価した。本試験において抗酸化能力についてスクリーニングされた化合物には、トリプトファンの誘導体、インドール、サリチル酸及びアントラニル酸などの芳香族酸、並びに何らかのビタミンが含まれた。種々の化合物の化学構造は、（Ａ）トリプトファン誘導体、（Ｂ）キヌレニン、（Ｃ）インドール誘導体、及び（Ｄ）芳香族酸誘導体に基づくものであった。
【０１８６】
（Ａ）トリプトファン誘導体
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【０１８７】
（Ｂ）キヌレニン
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【０１８８】
（Ｃ）インドール誘導体
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【０１８９】
（Ｄ）芳香族酸誘導体
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【０１９０】
光感受性スクリーニングアッセイから得られた候補抗酸化剤化合物
Ｌ−Ｔｒｐは特定の状況下で効果的な抗酸化剤であるが、通常の処理の間、特別な事前注意なしではその光感受性により有用性が制限されることがある。上記分子の光感受性を調査して、分子をＬ−Ｔｒｐに対するそのＨ２Ｏ２生成能力について評価した。スクリーニングツールとして、抗酸化剤候補を四時間にわたり２５０Ｗ／ｍ２の光に曝し、その結果のＨ２Ｏ２形成をＡｍｐｌｅｘ  Ｕｌｔｒａ  Ｒｅｄアッセイにより定量化した。具体的には、抗酸化剤を、２０ｍＭのヒスチジンアセテートバッファー（ｐＨ５．５）中で１ｍＭに調製した。１ｍＭの抗酸化剤溶液を、ガラス製バイアルに分注し（２ｍＬ／ガラス製バイアル）、Ａｔｌａｓ  ＳｕｎＴｅｓｔ  ＣＰＳ＋  Ｘｅｎｏｎ  Ｔｅｓｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）中において四時間にわたり２５０Ｗ／ｍ２の光に曝した。４時間にわたる、全体のＵＶ用量は９０ワット−時間／ｍ２であり、全体の可視用量は２２万ルクス時間であった。コントロールバイアルをアルミホイルに包み、同様に処理した。光への暴露後に生成された過酸化水素の量を、製造者が推奨する手順に従ってＡｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  Ｒｅｄ  Ａｓｓａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて測定した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の添加時、染剤が化学量論的に１：１でＨ２Ｏ２と反応し、その結果蛍光性酸化生成物であるレゾルフィンが生成された。この試験では、蛍光性の読み取りは、励起及び放出をそれぞれ５６０ｎｍ及び５９０ｎｍに設定したＳｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｍ２  Ｍｉｃｒｏ−ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて行われた。最終的なＨ２Ｏ２濃度は、０μｍ〜２０μｍの検量線を用いて決定された。
【０１９１】
光暴露時のトリプトファン誘導体による過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）生成の分析により、Ｌ−Ｔｒｐと比較した場合、光（４時間にわたる２２万ルクス時間に相当）及びバッファー（２０ｍＭのＬ−Ｈｉｓ−アセテート（ｐＨ５．５））の類似条件下において、５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン（５−ＨＴ）は約十分の一のＨ２Ｏ２を生成する一方、キヌレニンは約五分の一のＨ２Ｏ２を生成することが示された（図４Ａ）。他のトリプトファン誘導体は、Ｌ−Ｔｒｐによって生成されたＨ２Ｏ２の、３０％〜１０５％の間のいずれかを生成した。Ｌ−Ｔｒｐとの比較において、トロロクス（水溶性ビタミンＥ誘導体）は、１２３倍のＨ２Ｏ２を生成し、ピリドキシン（ビタミンＢ６）は５倍のＨ２Ｏ２（表１）を生成した。Ｌ−Ｔｒｐのような基本構造を有するインドールは、Ｌ−Ｔｒｐと同様に挙動したが、インドール−３−酢酸は２倍のＨ２Ｏ２を生成した（図４Ｂ）。インドールのヒドロキシ誘導体は、光暴露時に生成するＨ２Ｏ２の量が無視できる程度であるという点で５−ＨＴと同様に挙動した。複数の生化学的に適切なＬ−Ｔｒｐの誘導体、即ちトリプタミン、セロトニン及びメラトニンも試験した。トリプタミンはＬ−Ｔｒｐの約半分のＨ２Ｏ２を生成した（表１）。興味深いことに、セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン）は、インドール及びトリプトファンの５−ＯＨ誘導体と非常によく似た挙動を呈し、光暴露時にほとんどＨ２Ｏ２を生成しなかったが、メラトニン（Ｎ−アセチル−５−メトキシトリプタミン）はｐＬ−Ｔｒｐによって生成されるＨ２Ｏ２の三分の一未満を生成した（表１）。
【０１９２】
表１：試験化合物とＬ−Ｔｒｐの過酸化水素生成比
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【０１９３】
光照射の間に形成されるＲＯＳを理解するために、５０ｍＭのＮａＮ３、既知の一重項酸素クエンチャーの存在下においてＴｒｐ誘導体のいくつかを、上述のようにして光暴露下で試験した。試験したすべての化合物が、このような条件下で生成される過酸化水素の量に実質的な低減を示し、一重項酸素が、Ｔｒｐ及びその誘導体の光照射時に生成される主要なＲＯＳであることが示唆された（図５）。
【０１９４】
サリチル酸のような他の芳香族化合物及び誘導体も、それに報告された抗酸化特性に基づいて試験した（Baltazar et al., Curr Med Chem 18(21):3252-64 (2011)）。サリチル酸は光暴露時にほとんどＨ２Ｏ２を生成しなかったが、その５−ＯＨ誘導体はＬ−Ｔｒｐと同様に挙動した（表１）。一方、アントラニル酸はＬ−Ｔｒｐの二倍のＨ２Ｏ２を生成したが、５−ＯＨ−アントラニル酸はＬ−Ｔｒｐの半分のＨ２Ｏ２しか生成しなかった（表１）。
【０１９５】
ＣＶスクリーニングアッセイから得られた候補抗酸化化合物
光感受性スクリーニングアッセイの結果に基づいて、芳香環置換基を有する化合物は、生成される過酸化水素の量に影響すると思われた。目標とするのは、タンパク質薬ではなく添加剤の優先的酸化であるので、酸化電位の低い添加剤が、効果的な抗酸化剤として機能していると思われた。化合物の酸化／還元特性を調査した。Ｌ−Ｔｒｐ及び誘導体を含む複数の化合物が、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）を用いてタンパク質中のＴｒｐ酸化の保護について評価され、それらの酸化電位に基づいて順位付けされた（表２）。具体的には、候補抗酸化剤を脱イオン化水に溶解し、次いで０．２Ｍの過塩素酸リチウム電解質溶液に添加した。溶液を、作用電極としてＭｏｄｅｌ６１６  ＲＤＥ  Ｇｌａｓｓｙ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅを有するＥＧ＆Ｇ  Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｍｏｄｅｌ２６４Ａ  Ｐｏｌａｒｏｇｒａｐｈ／Ｖｏｌｔａｍｍｅｔｅｒにより特徴付けた。溶液を、１００又は５００ｍＶ／秒のスキャンレートで、−０．１０Ｖから＋１．５０Ｖまでスキャンした。分析セルを、窒素で四分間パージした後で各抗酸化剤溶液をスキャンした。入力は、作用電極の電位の線形スキャンであり、出力は結果として得られる電流の測定値であった。電位がスキャンされるとき（直線的に増加又は減少）、ＣＶセル内の電気化学的に活性な種は作用電極の表面において酸化及び還元反応を受け、その結果連続的に測定される電流が生じた。酸化還元反応は、電流の急激な上昇又は下降（ピーク）によって特徴付けられた。酸化反応が起こった電位を陽極ピーク電位（又は酸化電位）と呼び、還元が起こった電位を陰極ピーク（又は還元）電位と呼んだ。
【０１９６】
本試験における添加剤の酸化電位は、０．４１０〜１．０８０Ｖ  ｖｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌの範囲であった（表２）。このような条件下において、Ｌ−Ｔｒｐは、０．９３８Ｖ  ｖｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌの不可逆の酸化電位を有した。九つの化合物が、Ｌ−Ｔｒｐより低い酸化電位を有することが判明し、それには酸化電位が０．５３５〜０．６００Ｖ  ｖｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌである５−ＯＨ化合物のすべてが含まれた。試験したすべての化合物のうち、５−アミノ−ＤＬ−トリプトファンの酸化電位が最も低く、０．４１０Ｖであり、Ｎ−アセチル化合物（０．７３０〜０．８８０Ｖ）、及び５−メトキシ−ＤＬ−トリプトファン（０．８９０Ｖ）もＬ−Ｔｒｐより低かった。七つの化合物がＬ−Ｔｒｐより高い酸化電位を有していた（表２）。それらは、インドール−３−酢酸、５−フルオロ−Ｌ−トリプトファン、トリプタミン、Ｌ−トリプトファンアミド、Ｌ−キヌレニン、５−ニトロ−ＤＬ−トリプトファン、及びサリチル酸であった。本試験において、サリチル酸の酸化電位が最も高かった（１．０８０Ｖ  ｖｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌ）。試験したすべての化合物が不可逆的ＣＶを示し、一度酸化されるとこれらの種は電子を受け取らず、恐らくそれ以上電気化学反応に関与することはないことが示唆された。
【０１９７】
表２：添加剤の酸化電位
2020164531.tif 000014
酸化（陽極ピーク）電位を、０．２Ｍの過塩素酸リチウム中において、ガラス状炭素作用電極を有するサイクリックボルタンメトリーを使用して測定した。
【０１９８】
酸化電位と光誘導によるＨ２Ｏ２の精製との相関を、１６の化合物について決定した。これら化合物は、Ｌ−Ｔｒｐの酸化電位を上回る及び下回る酸化電位と、Ｌ−ＴｒｐのＨ２Ｏ２生成レベルを上回る及び下回る同生成レベルとを有していた（図６）。インドールとトリプトファンは光暴露下でのＨ２Ｏ２生成において同様に挙動したので、５員環のＣ３位の置換がこの特性に影響しない可能性があった。しかしながら、Ｃ３位に、−ＣＨ２ＣＯＯＨの置換を含むインドール−３−酢酸、及び-ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２の置換を含むトリプタミンの生成は、Ｌ−Ｔｒｐの、それぞれ二倍及び二分の一であった。これらのデータにより、Ｃ３置換が光活性化及び過酸化物生成に関与していることが示唆された。Ｃ３置換は分子の酸化電位には影響せず、このような実験条件下では、インドール自体がＬ−Ｔｒｐより有意に低い酸化電位を有していた。６員の芳香環のＣ５における置換は、極めて予想通りに挙動した。一般に、-ＮＨ２及び-ＯＨのような電子供与基を有する化合物は、その親化合物より低い酸化電位を有し、また光活性化によるＨ２Ｏ２生成のレベルは低い（例えば５−アミノ−ＤＬ−トリプトファン、５−ヒドロキシインドール−３−酢酸、５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン、５−ヒドロキシインドール、セロトニン）。同様に、高い酸化電位を有する化合物は、このような条件下でより多くのＨ２Ｏ２  を生成した（５−メトキシ−ＤＬ−トリプトファン、Ｌ−Ｔｒｐ、インドール−３−酢酸、５−フルオロ−Ｌ−トリプトファン）。このような相関には例外があり；いくつかの化合物は高い酸化電位を有するがそれほどＨ２Ｏ２を生成せず（例えばサリチル酸及びＬ−キヌレニン）、これら六員の芳香族化合物には、Ｌ−Ｔｒｐのインドール骨格を含む化合物には観察されない、重要な役割を果たす他のメカニズムが存在する可能性が示唆された。対象のエリアは、Ｌ−Ｔｒｐより酸化電位が低く、光暴露によるＨ２Ｏ２生成が少ない化合物を含む座標部分であった（図６、点線で囲んだ部分）。これら二つの特質を有する化合物は、（１）タンパク質上でＴｒｐより速く酸化し、（２）製剤製造中の長期にわたる貯蔵及び／又は自然環境下での処理の間に殆どＨ２Ｏ２を生成せず、したがってこのような条件下で更なる酸化からタンパク質を保護することができるため、新規の候補抗酸化剤と考えられた。
【０１９９】
実施例３：候補抗酸化化合物はモノクローナル抗体製剤の酸化を減少させた。
光処理時にＬ−Ｔｒｐより少ないＨ２Ｏ２を生成する化合物、並びにＬ−Ｔｒｐより酸化電位の低い化合物を、それらの抗酸化特性の可能性を評価するために、酸化ストレスモデルとしてＡＡＰＨ、光、及びフェントン反応を用いて選択した（表３）。ｍＡｂ１を、異なる酸化ストレスモデルによるＴｒｐ酸化から保護する選択候補抗酸化剤の有効性を評価するためのモデルタンパク質として使用した。各ストレスモデルは、異なるメカニズムで酸化を生じさせ、したがって各々がバイオ医薬品の安定性の評価に有益であった。ＡＡＰＨ、又は２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ジヒドロクロリドは、分解したポリソルベートなどの製剤から生じる可能性のあるアルキル過酸化物を模倣するためのストレスモデルとして使用される。ＡＡＰＨの分解により、アルキル、アルコキシル、及びアルキルペルオキシル基が生じ、これらは、メチオニン、チロシン、及びトリプトファン残基を含むタンパク質中のアミノ酸残基を酸化することが示されている（Ji et al., J Pharm Sci 98(12):4485-500 (2009); Chao et al., Proc Natl Acad Sci U S A 94(7):2969-74 (1997)）。同様に、処理及び貯蔵の間に薬物が受ける周囲光への暴露を模倣するために、ストレスモデルとして制御光が使用される。バイオ医薬品の光誘導性の酸化は、一重項酸素（１Ｏ２）及び／又は超酸化物陰イオン（Ｏ２−）のメカニズムを経ることが示された（Sreedhara et al., Mol. Pharmaceutics (2013)）。フェントン反応も、酸化ストレスモデルとして一般的に使用される。Ｈ２Ｏ２とＦｅイオンとのこのような混合物は、触媒される金属、ヒドロキシルラジカルメカニズムにより酸化を生じさせ（Prousek et al., Pure and Applied Chemistry 79(12):2325-2338 (2007)）、薬物の製造と貯蔵に使用されるステンレス鋼の表面からの金属残留物をモデル化するために使用される。
【０２００】
表３：酸化ストレスモデル
2020164531.tif 000015
【０２０１】
ｍＡｂ１上でのトリプトファン（Ｗ５３）の酸化は、ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＬＣ−ＭＳ法を用いて以前完全に特徴づけられた（Sreedhara et al., Mol. Pharmaceutics (2013)）。簡単には、ｍＡｂ１はパパインで消化されると重鎖（ＨＣ）Ｆａｂ、ＨＣ  Ｆｃ、及び軽鎖断片を生成する。断片は、ＤＴＴで還元され、次いで分離され、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により同定された。ＨＣ  Ｆａｂ及びＨＣ  Ｆｃの酸化バージョンは、それらの天然対応物より速く溶出することが判明した。酸化及び天然のピークの下の集積面積の比較を使用して、ＨＣ  Ｆａｂ及びＦｃの酸化が定量化された。加えて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳペプチドマップ（トリプシン消化により、及びＬｙｓ−Ｃ消化により）は、ＨＣ  Ｆａｂの酸化が主にＴｒｐ残基、Ｗ５３の酸化であり、ＨＣ  Ｆｃの酸化の大部分が二つのＭｅｔ残基、即ちＭ２５４とＭ４３０の酸化によるものであることを示した。パパイン消化ＲＰ−ＨＰＬＣ法を本試験に使用することにより、ＨＣ  Ｆａｂ酸化の定量化によりＴｒｐ残基の酸化を、及びＨＣ  Ｆｃ酸化の定量化によりＭｅｔ残基の酸化を、それぞれ調査することが可能であった。
【０２０２】
％Ｆａｂ酸化及び％Ｆｃ酸化を次のように計算した（各抗体分子が二つのＦａｂを有すること；したがって得られる％Ｆａｂ酸化は、Ｆａｂ酸化を含む酸化したインタクトな抗体の％を反映したものではないことに注意されたい）：
2020164531.tif 000016
【０２０３】
ｍＡｂ１光ストレス試験のために、ｍＡｂ１を、２０ｍＭのヒスチジンアセテート（ｐＨ６．０）、２５０ｍＭのトレハロース、及び０．０２％のポリソルベート２０の製剤中、５ｍｇ／ｍＬに調製した。抗酸化剤を、２０ｍＭのヒスチジンアセテート（ｐＨ６．０）、２５０ｍＭのトレハロース、及び０．０２％のポリソルベート２０中において調製された１０ｍＭの原液から１ｍＭ（最終濃度）で添加した。例外は、同じバッファー（即ち、２０ｍＭのヒスチジンアセテート（ｐＨ６．０）、２５０ｍＭのトレハロース、及び０．０２％のポリソルベート２０）中、２００ｍＭのＬ−Ｍｅｔ原液から、最終濃度１、１０、２５、５０、及び１００ｍＭとなるように添加されたＬ−Ｍｅｔであった。これら製剤を含有するガラス製バイアルを、常温でＡｔｌａｓ  ＳｕｎＴｅｓｔ  ＣＰＳ＋  Ｘｅｎｏｎ  Ｔｅｓｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）において２５０Ｗ／ｍ２の光に暴露した。コントロールバイアルをアルミホイルに包み、同様に処理した。光暴露後、上述のように逆相ＨＰＬＣによる分析のために溶液を調製した。
【０２０４】
ｍＡｂ１  ＡＡＰＨストレス試験のために、ｍＡｂ１を、２０ｍＭのヒスチジンアセテート（ｐＨ６．０）、２５０ｍＭのトレハロース、及び０．０２％のポリソルベート２０の製剤中、４ｍｇ／ｍＬに調製した。抗酸化剤を、２０ｍＭのヒスチジンアセテート（ｐＨ６．０）、２５０ｍＭのトレハロース、及び０．０２％のポリソルベート２０中において調製された１０ｍＭの原液から、１ｍＭ（最終濃度）で添加した。１０ｍＭのＡＡＰＨ２００μＬを、２ｍＬの各ｍＡｂ１溶液に加え、次いで４０℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、各溶液を、製剤バッファー（２０ｍＭのヒスチジンアセテート（ｐＨ６．０）、２５０ｍＭのトレハロース、及び０．０２％のポリソルベート２０）と、ＰＤ−１０カラムを用いてバッファー交換し、最終的なｍＡｂ１濃度を２．３ｍｇ／ｍＬとした。バッファー交換後、各溶液を、上記のように逆相ＨＰＬＣによる分析のために調製した。
【０２０５】
ｍＡｂ１フェントンストレス試験のために、ｍＡｂ１を、２０ｍＭのヒスチジン塩酸塩（ｐＨ６．０）の製剤中において３ｍｇ／ｍＬに調製した。抗酸化剤を、２０ｍＭのヒスチジン塩酸塩中で調製された１０ｍＭの原液から、最終濃度１ｍＭで添加した。最終濃度０．２ｍＭのＦｅＣｌ３及び１０ｐｐｍのＨ２Ｏ２を各ｍＡｂ１溶液に加え、次いで４０℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、各反応物を、１００ｍＭのＬ−Ｍｅｔ（２０ｍＭのヒスチジン塩酸塩中２００ｍＭのＬ−Ｍｅｔの原液から調製された）を添加することによりクエンチし、次いで上述のように逆相ＨＰＬＣによる分析のために調製した。
【０２０６】
ＡＡＰＨと共に２４時間４０℃でｍＡｂ１をインキュベートすることにより、２７％のＦａｂ（Ｔｒｐ残基）酸化（図７Ａ）及び４７％のＦｃ（Ｍｅｔ残基）酸化（図７Ｂ）が生じることが決定された。光ストレス及びサイクリクヴォルタンメトリーを用いて以前にスクリーニングされた七つの添加剤を、Ａｂ１と共に、ＡＡＰＨ条件下でインキュベートし、抗酸化剤の能力を評価した。七つの化合物のうち六つが、ＡＡＰＨ誘導Ｆａｂ酸化を有意に低減することが判明した（図７Ａ）。これら六つの化合物すべては、インドール骨格を含んでいた。更に、試験したすべてのヒドロキシ誘導体（５−ヒドロキシ−Ｌ−Ｔｒｐ、５−ヒドロキシインドール、７−ヒドロキシインドール、及びセロトニン）は、Ｆａｂの酸化をコントロールレベルの近くまで低減した（約２％）。一方、サリチル酸は、ＡＡＰＨストレス下において、Ｆａｂの酸化に対して殆ど影響力を持たなかった。添加剤の中で、ＡＡＰＨ誘導Ｆｃ酸化のレベルに影響を与えると思われるものはなかった（図７Ｂ）。
【０２０７】
光ストレス試験のために、ｍＡｂ１を１６時間２５０Ｗ／ｍ２の光に曝しながら、前述の七つの添加剤を試験した（図８）。ｍＡｂ１を光に暴露することにより（「添加剤なし」）、Ｆａｂ酸化はコントロールレベル（「ｍＡｂ１参照試料」、図８Ａ）の３．５倍に増大した。Ｌ−Ｔｒｐがモデルタンパク質である上皮小体ホルモン（ＰＴＨ）中において、Ｔｒｐ酸化に対する保護を提供することが以前に示された（Ji et al., J Pharm Sci 98(12):4485-500 (2009)）。しかしながら、この研究は、１ｍＭのＬ−ＴｒｐをｍＡｂ１に添加することにより、恐らくは光暴露したＬ−Ｔｒｐにより一重項酸素などのＲＯＳが生成されることより（図２）、Ｆａｂ酸化が１１倍を超えるまで増大することを見出した。ヒドロキシ化合物（５−ヒドロキシ−Ｌ−Ｔｒｐ、５−ヒドロキシインドール、７−ヒドロキシインドール、及びセロトニン）の添加は、光誘導性のＦａｂ酸化に対する保護を提供し、Ｆａｂの酸化をコントロールレベル近傍まで低減した（図８Ａ）。一方、サリチル酸はＬ−トリプトファンアミドと同様に働き、Ｆａｂ酸化をコントロールレベルの８倍に増大させた。同様の結果が、光ストレス下におけるＦｃ酸化について観察された（図８Ｂ）。ｍＡｂ１の光暴露により、Ｆｃ酸化がコントロールレベルの４０％増となり、Ｌ−Ｔｒｐの添加によりＦｃ酸化がコントロールレベルの７倍に増大した。コントロール（添加剤なし）と比較して、Ｌ−トリプトファンアミド及びサリチル酸もＦｃ酸化を増大させた。ヒドロキシ化合物は、恐らく光暴露下でのＲＯＳ生成がＬ−Ｔｒｐより極めて少ないために、添加剤なしコントロールと同様のＦｃ酸化を生じさせた。実施例２の光スクリーニング及びＮａＮ３試験の結果により、添加剤により生成されたＨ２Ｏ２の量とｍＡｂ１のＦｃ  Ｍｅｔ酸化との間にかなりの相関性が示された。
【０２０８】
Ｈ２Ｏ２とＦｅイオンの混合物を用いたフェントン反応は、金属に触媒される、ヒドロキシルラジカル反応により酸化を生じさせる（Prousek et al., Pure and Applied Chemistry 79(12):2325-2338 (2007)）。この反応は、Ｆａｂ、即ちトリプトファンの酸化をｍＡｂ１中に生じさせた。反応は、上述のＡＡＰＨ及び光誘導性の酸化の両方について有用な選択抗酸化剤の存在下でも実施された。フェントン媒介性反応に対する抗酸化剤の特性に関連するデータを、上述のＲＰ−ＨＰＬＣアッセイを用いて分析した（図９）。試験した条件下では、フェントン反応により、ｍＡｂ１のＦａｂ領域にコントロールの約四倍の酸化が生じた。サリチル酸を除き、試験した抗酸化剤の大部分は、Ｌ−Ｔｒｐに対して同様のヒドロキシルラジカルクエンチ特性を示し、これは、添加剤を含まない場合と比較してＦａｂ酸化を約２５％保護した（図９Ａ）。Ｆｃ酸化からの保護に関し、試験した添加剤（サリチル酸以外）の結果はＬ−Ｔｒｐよりやや良好であった（図９Ｂ）。
【０２０９】
芳香環における電子供与基は、インドリルラジカルカチオンの形成及び場合によってはラジカルとのより速い反応を促進する。芳香環に結合したヒドロキシル基は、酸素原子が、共鳴構造に関与しうる電子の対を一つだけ有し、酸化電位の低下及び場合によっては求電子攻撃に対する感受性の上昇を招くため、電子供与体である。表２に見られるように、ヒドロキシル置換は実質的に酸化電位の低下を招くもので、これら化合物がＬ−Ｔｒｐ及び／又はインドールより優れた抗酸化剤を作製できることを示唆している。ヒドロキシル置換インドール及びＴｒｐ誘導体も、光照射時に最小量の過酸化水素を生成する（表１）。これは、５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファンについて実証された高いクエンチ定数（Dad et al., J Photochem Photobiol B, 78(3):245-51 (2005)）と相まって、光エネルギーを分子酸素に伝えるうえでのこれら分子の量子効率が低いことに起因すると考えられていた。図７及び図８に示すように、ヒドロキシル置換インドール及びトリプトファン誘導体は、ＡＡＰＨ、光及びフェントンによってｍＡｂ１のＦａｂ領域のＷ５３に誘導される酸化に対し、かなりの保護を提供した。しかしながら、これら化合物のうち、ＡＡＰＨが誘導した分解におけるｍＡｂ１のＦｃ領域のＭｅｔ酸化に対して実質的な抗酸化保護を提供するものはなかった。対照的に、インドール及びトリプトファン誘導体は、光媒介性の酸化の下では予測通りに挙動した。光活性化により過酸化物の生成量が増大する分子（例えば、Ｌ−Ｔｒｐ及びＴｒｐ−アミド）も、ｍＡｂ１のＦｃ領域においてより大きなＭｅｔ酸化を生じさせる一方、−ＯＨ誘導体のＨ２Ｏ２生成は少なく、光酸化条件下でのＦｃ領域におけるＭｅｔ酸化量も低下した。メチオニンは、Ｈ２Ｏ２及びアルキル過酸化物により、求核置換反応を通して容易にメチオニンスルホキシドに酸化された（Li et al., Biotechnology and Bioengineering 48:490-500 (1995)）。メチオニンのメチオニンスルホキシドへの光酸化は、一重項酸素を介して起こるが、この反応は異なる中間体を介して起こる（Li et al., Biotechnology and Bioengineering 48:490-500 (1995)）。ＡＡＰＨは熱応力下で分解し、Ｍｅｔ及びＴｒｐそれぞれに対して異なる反応性を有するアルキル過酸化物及びアルコキシルラジカルの両方を生じさせる（Werber et al., J Pharm Sci 100(8):3307-15 (2011)）。以前の研究により、Ｌ−Ｔｒｐが、ＡＡＰＨによって誘導されたＰＴＨにおけるＴｒｐの酸化を防止できること、及びＬ−Ｔｒｐが同じ条件下でＰＴＨにおけるＭｅｔ酸化を防止しないことが示されている（Ji et al., J Pharm Sci 98(12):4485-500 (2009)）。同様に、Ｌ−Ｍｅｔは、ＡＡＰＨ誘導性の酸化からＰＴＨを保護することができたが、Ｔｒｐの酸化を保護することはなかった。これらの観察内容は、Ｍｅｔの酸化が主に求核置換反応によるもので、Ｔｒｐの酸化が主にラジカルメカニズムによるものである反応メカニズムと一致するものであった。
【０２１０】
一重項酸素に、最終的にはＨ２Ｏ２に繋がるＬ−Ｔｒｐの光活性化の推定メカニズム、及び５−ＨＴによる一重項酸素の形成及びクエンチを図１０に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年6月24日(2020.6.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質と、液体製剤中のタンパク質の酸化を防止する化合物とを含む液体製剤であって、化合物が、Ｎ−アセチル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−Ｌ−トリプトファンアミド及びメラトニン、又はそれらの薬学的に許容される塩からなる群より選択される、製剤。
【請求項２】
対象に対する投与のために適切な薬学的製剤である、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
水性である、請求項１又は２に記載の製剤。
【請求項４】
製剤中の化合物が０．３ｍＭから５ｍＭである、請求項１から３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５】
製剤中の化合物が０．３ｍＭから１ｍＭである、請求項１から４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６】
化合物が、タンパク質中のトリプトファン、システイン、ヒスチジン、チロシン及び／又はメチオニンの酸化を防止する、請求項１から５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項７】
化合物が、活性酸素種によるタンパク質の酸化を防止する、請求項１から６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項８】
活性酸素種が、一重項酸素、超酸化物（Ｏ２−）、過酸化水素、ヒドロキシルラジカル、及びアルキル過酸化物からなる群より選択される、請求項７に記載の製剤。
【請求項９】
タンパク質が酸化の影響を受けやすい、請求項１から８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１０】
タンパク質中のトリプトファンが酸化の影響を受けやすい、請求項１から９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１１】
タンパク質が抗体である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１２】
抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、又は抗体断片である、請求項１１に記載の製剤。
【請求項１３】
製剤中のタンパク質濃度が１ｍｇ／ｍＬから２５０ｍｇ／ｍＬである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１４】
安定剤、バッファー、界面活性剤、及び等張化剤からなる群より選択される一又は複数の添加剤を更に含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１５】
製剤が４．５から７．０のｐＨを有する、請求項３から１４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１６】
化合物がＮ−アセチル−Ｌ−トリプトファンである、請求項１から１５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１７】
タンパク質の酸化を防ぐ化合物をタンパク質製剤に加えることを含む、タンパク質製剤の製造方法であって、化合物が、Ｎ−アセチル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−Ｌ−トリプトファンアミド及びメラトニン、又はそれらの薬学的に許容される塩からなる群より選択される、方法。
【請求項１８】
タンパク質製剤中のタンパク質の酸化を防止する方法であって、タンパク質の酸化を防ぐ化合物を製剤に加えることを含み、化合物が、Ｎ−アセチル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−Ｌ−トリプトファンアミド及びメラトニン、又はそれらの薬学的に許容される塩からなる群より選択される、方法。
【請求項１９】
製剤が、対象に対する投与のために適切な薬学的製剤である、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
製剤が水性である、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
製剤中の化合物が０．３ｍＭから５ｍＭである、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
製剤中の化合物が０．３ｍＭから１ｍＭである、請求項１７から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
化合物が、タンパク質中のトリプトファン、システイン、ヒスチジン、チロシン及び／又はメチオニンの酸化を防止する、請求項１７から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
化合物が、活性酸素種によるタンパク質の酸化を防止する、請求項１７から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
活性酸素種が、一重項酸素、超酸化物（Ｏ２−）、過酸化水素、ヒドロキシルラジカル、及びアルキル過酸化物からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
タンパク質が酸化の影響を受けやすい、請求項１７から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
タンパク質中のトリプトファンが酸化の影響を受けやすい、請求項１７から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
タンパク質が抗体である、請求項１７から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、又は抗体断片である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
製剤中のタンパク質濃度が１ｍｇ／ｍＬから２５０ｍｇ／ｍＬである、請求項１７から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
製剤が、安定剤、バッファー、界面活性剤、及び等張化剤からなる群より選択される一又は複数の添加剤を更に含む、請求項１７から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
製剤が４．５から７．０のｐＨを有する、請求項２０から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
化合物がＮ−アセチル−Ｌ−トリプトファンである、請求項１７から３２のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１０】
一重項酸素に、最終的にはＨ２Ｏ２に繋がるＬ−Ｔｒｐの光活性化の推定メカニズム、及び５−ＨＴによる一重項酸素の形成及びクエンチを図１０に示す。
＜さらなる実施態様＞
［実施態様１］
タンパク質と、液体製剤中のタンパク質の酸化を防止する化合物とを含む液体製剤であって、化合物が、５−ヒドロキシ−トリプトファン、５−ヒドロキシ  インドール、７−ヒドロキシ  インドール、及びセロトニンからなる群より選択される、製剤。
［実施態様２］
対象に対する投与のために適切な薬学的製剤である、実施態様１に記載の製剤。
［実施態様３］
水性である、実施態様１又は２に記載の製剤。
［実施態様４］
製剤中の化合物が約０．３ｍＭから約５ｍＭである、実施態様１から３のいずれか一項に記載の製剤。
［実施態様５］
製剤中の化合物が約１ｍＭである、実施態様１から４のいずれか一項に記載の製剤。
［実施態様６］
化合物が、タンパク質中のトリプトファン及び／又はメチオニンの酸化を防止する、実施態様１から５のいずれか一項に記載の製剤。
［実施態様７］
化合物が、活性酸素種によるタンパク質の酸化を防止する、実施態様１から６のいずれか一項に記載の製剤。
［実施態様８］
活性酸素種が、一重項酸素、超酸化物（Ｏ２−）、過酸化水素、ヒドロキシルラジカル、及びアルキル過酸化物からなる群より選択される、実施態様７に記載の製剤。
［実施態様９］
タンパク質が酸化の影響を受けやすい、実施態様１から８のいずれか一項に記載の製剤。
［実施態様１０］
タンパク質中のトリプトファンが酸化の影響を受けやすい、実施態様１から９のいずれか一項に記載の製剤。
［実施態様１１］
タンパク質が抗体である、実施態様１から１０のいずれか一項に記載の製剤。
［実施態様１２］
抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、又は抗体断片である、実施態様１１に記載の製剤。
［実施態様１３］
製剤中のタンパク質濃度が約１ｍｇ／ｍＬから約２５０ｍｇ／ｍＬである、実施態様１から１２のいずれか一項に記載の製剤。
［実施態様１４］
安定剤、バッファー、界面活性剤、及び等張化剤からなる群より選択される一又は複数の添加剤を更に含む、実施態様１から１３のいずれか一項に記載の製剤。
［実施態様１５］
製剤が約４．５から約７．０のｐＨを有する、実施態様３から１４のいずれか一項に記載の製剤。
［実施態様１６］
タンパク質の酸化を防ぐ化合物の量を液体製剤に加えることを含む、液体製剤の製造方法であって、化合物が、５−ヒドロキシ−トリプトファン、５−ヒドロキシ  インドール、７−ヒドロキシ  インドール、及びセロトニンからなる群より選択される、方法。
［実施態様１７］
タンパク質の酸化を防ぐ化合物の量を液体製剤に加えることを含む、液体製剤中のタンパク質の酸化を防止する方法であって、化合物が、５−ヒドロキシ−トリプトファン、５−ヒドロキシ  インドール、７−ヒドロキシ  インドール、及びセロトニンからなる群より選択される、方法。
［実施態様１８］
製剤が、対象に対する投与のために適切な薬学的製剤である、実施態様１６又は１７に記載の方法。
［実施態様１９］
製剤が水性である、実施態様１６から１８のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様２０］
製剤中の化合物が約０．３ｍＭから約５ｍＭである、実施態様１６から１９のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様２１］
製剤中の化合物が約１ｍＭである、実施態様１６から２０のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様２２］
化合物が、タンパク質中のトリプトファン及び／又はメチオニンの酸化を防止する、実施態様１６から２１のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様２３］
化合物が、活性酸素種によるタンパク質の酸化を防止する、実施態様１６から２２のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様２４］
活性酸素種が、一重項酸素、超酸化物（Ｏ２−）、過酸化水素、ヒドロキシルラジカル、及びアルキル過酸化物からなる群より選択される、実施態様２３に記載の方法。
［実施態様２５］
タンパク質が酸化の影響を受けやすい、実施態様１６から２４のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様２６］
タンパク質中のトリプトファンが酸化の影響を受けやすい、実施態様１６から２５のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様２７］
タンパク質が抗体である、実施態様１６から２６のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様２８］
抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、又は抗体断片である、実施態様２７に記載の方法。
［実施態様２９］
製剤中のタンパク質濃度が約１ｍｇ／ｍＬから約２５０ｍｇ／ｍＬである、実施態様１６から２８のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様３０］
製剤が、安定剤、バッファー、界面活性剤、及び等張化剤からなる群より選択される一又は複数の添加剤を更に含む、実施態様１６から２９のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様３１］
製剤が約４．５から約７．０のｐＨを有する、実施態様１６から３０のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様３２］
タンパク質組成物中のタンパク質の酸化を防止する化合物のスクリーニング方法であって、Ｌ−トリプトファンに比べて酸化電位及び光感受性が低い化合物を選択すること、並びに選択された化合物の、タンパク質の酸化を防止する効果を試験することを含む方法。
［実施態様３３］
光感受性が、光暴露時に化合物によって生成されるＨ２Ｏ２の量に基づいて測定される、実施態様３２に記載の方法。
［実施態様３４］
Ｌ−トリプトファンによって生成されるＨ２Ｏ２の量の約２０％未満を生成する化合物が選択される、実施態様３３に記載の方法。
［実施態様３５］
酸化電位がサイクリックボルタンメトリーによって測定される、実施態様３２に記載の方法。
［実施態様３６］
選択された化合物が、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ジヒドロクロリド（ＡＡＰＨ）、光、及び／又はフェントン試薬によって生成された活性酸素種によるタンパク質の酸化を防止する効果について試験される、実施態様３２に記載の方法。
【外国語明細書】
2020164531000001.pdf