(57)【要約】      （修正有）【課題】老化を抑制する薬剤。【解決手段】老化抑制薬剤であって、ＮＭ＿０２６３３３(1-269aa)の部分タンパク質であるＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)、または、ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)の活性部分を有すると共にＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)のうち１もしくは複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入等した配列から成るペプチド、或いは、前記ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)タンパク質または前記ペプチドと等しい作用を有するＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)誘導体を有効成分として含有する。ＮＣＸ１（Na+-Ca2+exchanger1）チャンネルの阻害活性を有するＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６を有効成分として含有する。テロメア長を延伸する作用、臓器の萎縮を抑制する作用、皮膚老化を抑制する作用、心臓の線維化を抑制する作用を有することが好ましい。【選択図】図７
2020158467.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体老化を抑制する薬剤であって、
ＮＭ＿０２６３３３(1-269aa)の部分タンパク質であるＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)、または、ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)の活性部分を有すると共にＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)のうち１もしくは複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、及び／または付加した配列から成るペプチド、或いは、前記ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa) タンパク質または前記ペプチドと等しい作用を有するＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)誘導体を有効成分として含有する
ことを特徴とする個体老化抑制剤。
【請求項２】
ＮＣＸ１（Na+ - Ca2+ exchanger 1）チャンネルの阻害活性を有する
請求項１に記載の個体老化抑制剤。
【請求項３】
個体老化を抑制する薬剤であって、
ＮＣＸ１（Na+ - Ca2+ exchanger 1）チャンネルの阻害活性を有する化合物を有効成分として含有する
ことを特徴とする個体老化抑制剤。
【請求項４】
ＮＣＸ１（Na+ - Ca2+ exchanger 1）チャンネルの阻害活性を有する化合物が、ＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６である
請求項３に記載の個体老化抑制剤。
【請求項５】
テロメア長を延伸する作用を有する
請求項１ないし４のいずれかに記載の個体老化抑制剤。
【請求項６】
臓器の萎縮を抑制する作用を有する
請求項１ないし５のいずれかに記載の個体老化抑制剤。
【請求項７】
皮膚老化を抑制する作用を有する
請求項１ないし６のいずれかに記載の個体老化抑制剤。
【請求項８】
心臓の線維化を抑制する作用を有する
請求項１ないし７のいずれかに記載の個体老化抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、個体老化を抑制する薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内の遊離Ｃａ２＋は、心筋や平滑筋の収縮、神経伝達物質の放出、遺伝子発現の制御などに関与する重要なイオンであり、このＣａ２＋濃度は、細胞膜や筋小胞体膜のＣａ２＋Ｃａ２＋ポンプ、Ｃａ２＋チャンネル、ＮＣＸ（Na+ - Ca2+ exchanger）チャンネルにより調節されている。
【０００３】
ＮＣＸ１（Na+ - Ca2+ exchanger 1）チャンネルは、Ｎａ＋とＣａ２＋を交換輸送する細胞膜イオントランスポーターであり、心血管系疾病や糖尿病などとの関係については報告があり、その阻害剤についても報告がある（特許文献１〜６、非特許文献１〜４）。
例えば、特許文献２には、ＮＣＸ１阻害剤のフェノキシアニリン誘導体とフェノキシピリジン誘導体が挙げられ、循環器系疾患治療薬としての用途が記載され、特許文献５には、ＮＣＸ阻害剤を、糖尿病患者への膵島移植時の膵島細胞保護剤としての用途が記載されている。
【０００４】
特許文献７は、本出願の先行出願であり、ＮＭ＿０２６３３３(1-269aa)タンパク質及びＮＣＸ１阻害剤を用いて、生体の老化に関連するオートファジー障害や、核膜またはクロマチン構造の変化や、細胞内タンパクの融解や、テロメア長の減少や、ゲノムまたはエピゲノムの変化を抑制することが記載されている。
【０００５】
しかし、個体としての老化については、ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)やＮＣＸ１阻害剤との関係が開示されている従来技術はない。
他方、アンチエイジングに対する需要は大きく、その医薬が期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００３／０６８２６３
【特許文献２】特開２００６−４５１４２
【特許文献３】特表２００８−５１０１５０
【特許文献４】特表２０１０−５２０７５９
【特許文献５】特開２０１２−２５６７３
【特許文献６】特表２０１６−５１１２６６
【特許文献７】特開２０１８−２０３６７９
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】日薬理誌（Folia Pharmacol. Jpn.）129，2007, 262−265
【非特許文献２】DIABETES, VOL. 60, AUGUST 2011, 2076−2085
【非特許文献３】DIABETES, VOL. 59, JULY 2010, 1693−1688
【非特許文献４】THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 285, NO. 29, 22291−22298, July 16, 2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明は、個体としての老化を抑制する薬剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため、本出願の個体老化抑制剤は次の構成を備える。すなわち、個体老化を抑制する薬剤であって、ＮＭ＿０２６３３３(1-269aa)の部分タンパク質であるＮＭ＿０２６３３３(88-269aa) 、または、ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)の活性部分を有すると共にＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)のうち１もしくは複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、及び／または付加した配列から成るペプチド、或いは、前記ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa) タンパク質または前記ペプチドと等しい作用を有するＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)誘導体を有効成分として含有することを特徴とする。
なお、ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)のうち１もしくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加は、人為的に行ってもよい。その場合は、通常３０アミノ酸以内、好ましくは１０アミノ酸以内、さらに好ましくは５アミノ酸以内であり、その調製には、公知のハイブリダイゼーション技術が利用できる。
【００１０】
特に、ＮＣＸ１（Na+ - Ca2+ exchanger 1）チャンネルの阻害活性を有することが好ましい。
【００１１】
同様に、個体老化を抑制する薬剤であって、ＮＣＸ１（Na+ - Ca2+ exchanger 1）チャンネルの阻害活性を有する化合物を有効成分として含有することを特徴とする個体老化抑制剤でもよい。
【００１２】
ＮＣＸ１（Na+ - Ca2+ exchanger 1）チャンネルの阻害活性を有する化合物としては、ＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６が有用である。
【００１３】
また、テロメア長を延伸する作用を有することが好ましい。
【００１４】
臓器の萎縮を抑制する作用を有することが好ましい。
【００１５】
皮膚老化を抑制する作用を有することが好ましい。
【００１６】
心臓の線維化を抑制する作用を有することが好ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によると、生体の個体としての老化の抑制、特にテロメア長を延伸する作用によってアンチエイジングに寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】組み換えＮＭ＿０２６３３３(1-269aa)のアミノ酸配列を示す説明図
【図２】ＮＭ＿０２６３３３(1-269aa)の部分タンパク質であるＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)のアミノ酸配列を示す説明図
【図３】ＮＭ＿０２６３３３(1-269aa)及びＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)の細胞内Ｃa濃度に及ぼす影響を示すグラフ
【図４】野性型線維芽細胞（ＷＴ）、老化促進モデル線維芽細胞（ＴＧ）、ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)を投与した老化促進モデル線維芽細胞（ＴＧ  ＮＭ88-269）のオーファジー・核膜蛋白に及ぼす影響を示すウエスタンブロット写真
【図５】野性型線維芽細胞（ＷＴ）、老化促進モデル線維芽細胞（ＴＧ）、ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)を投与した老化促進モデル線維芽細胞（ＴＧ  ＮＭ88-269）のエピゲノム・クロマチン構造に及ぼす影響を示すウエスタンブロット写真
【図６】ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)の細胞内局在を示す染色写真
【図７】野性型マウス（ＷＴ）及び老化促進モデルマウス（ＴＧ）の白血球テロメア長を示すグラフ（ａ）及び老化促進モデルマウス（ＴＧ）及びＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)を投与した老化促進モデルマウス（ＴＧ  ＮＭ＿０２６３３３）の白血球テロメア長を示すグラフ（ｂ）
【図８】ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)によるテロメラーゼ活性を示すウエスタンブロット写真（ａ）及びグラフ（ｂ）
【図９】老化促進モデル線維芽細胞（ＴＧ）内Ｃａイオン濃度に対するＮＣＸ１阻害剤の作用を示すグラフ
【図１０】老化促進モデルマウス（ＴＧ）と高食塩食マウス（ＷＴsalt）の白血球のテロメア長を示すグラフ（ａ）及びＮＣＸ１阻害剤による老化促進モデルマウス（ＴＧ）の白血球テロメア長への作用を示すグラフ（ｂ）
【図１１】ＮＣＸ１阻害剤による老化促進モデル線維芽細胞のテロメア長への作用を示すグラフ（ａ）、ＮＣＸ１阻害剤によるCF6投与したＨＥＫ−２９３細胞のテロメア長への作用を示すグラフ（ｂ）、ＮＭ＿０２６３３３(1-269aa)による老化促進モデル線維芽細胞のテロメア長への作用を示すグラフ（ｃ）、ＮＭ＿０２６３３３(1-269aa)によるCF6投与したＨＥＫ−２９３細胞のテロメア長への作用を示すグラフ（ｄ）
【図１２】ＮＣＸ１阻害剤によるマウス臓器（肝臓、心臓、腎臓、脾臓）重量への作用を示すグラフ
【図１３】ＮＣＸ１阻害剤及びＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)によるマウス皮膚老化への作用を示す写真及びグラフ
【図１４】ＮＣＸ１阻害剤及びＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)によるマウス心臓老化への作用を示す写真及びグラフ
【図１５】ＮＣＸ１阻害剤による培養線維芽細胞アポトーシスへの作用を示すチャート（Ａ）及び定量グラフ（Ｂ）
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下に、本発明の実施形態を説明する。実施形態は、上記の先行技術文献や従来公知の技術を援用して適宜設計変更可能である。
【００２０】
本出願発明者は、特許文献７で、ＮＭ＿０２６３３３(1-269aa)タンパク質が老化促進細胞に発現する老化マーカーを阻害することを開示した。
本出願は、その延長として、下記のように、老化促進モデル動物(Coupling factor 6過剰発現マウス: TGマウス)に、ＮＭ＿０２６３３３(1-269aa)の部分タンパク質であるＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)及びＮＣＸ１阻害剤を腹腔内投与し、白血球テロメア長の延伸、加齢に伴う臓器萎縮の抑制、皮膚老化の抑制、心臓の線維化の抑制を確認し、ＮＭ＿０２６３３３(1-269aa)の部分タンパク質であるＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)及びＮＣＸ１阻害剤が、個体としての老化の抑制に有用であることを見出して得たものである。
【００２１】
細胞内酸性化に起因する２種類の老化促進モデルマウスの心臓及び腎臓から組織を採取し、マイクロアレー法により、共通して発現が低下しているタンパク質のスクリーニングを行った。
1種類目の老化促進モデルマウスとしては、７週齢の雄性C57BL/6Jの野生型と７週齢の雄性human coupling factor 6 (CF6) 過剰発現マウス（ヒトCF6＋human elongation factor 1 プロモーターのDNA断片を作成し、２系統のＴＧ（老化促進モデル）マウスを確立し、そのうちの１系統を使用）を用い、２種類目の老化促進モデルマウス（高食塩摂取マウス）としては、４週齢の雄性C57BL/6Jの野生型に普通食または高塩食（8% NaCl）を３週間摂取させた７週齢マウスを用いた。
【００２２】
ＲＮＡ単離には、組織を氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で手早くすすぎ、製造者の説明書に従ってＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用することにより行った。ＲＮＡ品質は分光光度分析（ＯＤ２６０／２８０）により保証された。ＲＮＡは、分光光度分析により２６０ｎｍで定量した。全ＲＮＡからのｍＲＮＡの直線的増幅は、Ａｍｉｎｏ  Ａｌｌｙｌ  ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ（商標）ａＲＮＡキット（Ａｍｂｉｏｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）を用い、製造者の推奨に従って２回の連続増幅工程で得た。２つの異なる供給源からのＲＮＡサンプルをＣｙ３結合デオキシリボヌクレオチドまたはＣｙ５結合デオキシリボヌクレオチド（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ドイツ）のいずれかで標識した異なるマイクロアレイスライドを用いて各２反復の実験を行った。実験的ａＲＮＡに由来するプローブ上の蛍光色素はＣｙ５であり、対照プローブ上の色素はＣｙ３であった。
【００２３】
ｃＤＮＡマイクロアレイには、ＴＧマウスとＷＴ（野性型）マウスまたは高食塩摂取マウスと普通食摂取マウスの間の心臓及び腎臓を検体として採取し、ＤＮＡマイクロアレイＡｃｅＧｅｎｅ−Ｍｏｕｓｅ  Ｏｌｉｇｏ  Ｃｈｉｐ  ３０Ｋ  １  Ｃｈｉｐ  Ｖｅｒｓｉｏｎ（日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社、神奈川、日本）を用いた。標識されたプローブをハイブリダイゼーション溶液（５×塩化ナトリウム及びクエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、４×デンハート液、２０％ハイブリダイゼーション溶液、０．１ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ及び１０％ホルムアミド）と混合し、４６℃で１４時間のハイブリダイゼーション後、これらのスライドを５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中、室温で２分、５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中、３０℃で１０分、０．５×ＳＳＣ中、室温で２分洗浄した。スライドのＣｙ３蛍光及びＣｙ５蛍光を、４２８アレイスキャナー（ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ）でスキャンし、蛍光をＤＮＡＳＩＳアレイソフトウエアバージョン２．６（日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社、神奈川、日本）で定量した。現行の分析では強度依存グローバルノーマライゼーション（平均：１０，０００）を使用した。強度依存ノーマライゼーションは、このような２色試験において色素関連のアーチファクトを消去するために使用される。各遺伝子に関する結果を３つのスライドから得られた平均とした。データはＣｙ５（ＴＧマウスまたは高食塩摂取マウスの場合）とＣｙ３（野生型マウスまたは普通食摂取マウスの場合）のノーマライズ後の比とし、２０００以上の強度を使用した。
４種類のマイクロアレーで安定した発現があり安定して発現抑制が認められ、機能が特定されていないｃＤＮＡのみが報告されている遺伝子を探索した結果、ＮＭ＿０２６３３３の２６９個のアミノ酸配列から成るタンパク質が同定された。ＴＧマウスの心臓で0.375±0.042、腎臓で0.430±0.209、高食塩摂取マウスの心臓で0.655±0.138、腎臓で0.204±0.408であり、野生型マウスまたは普通食摂取マウスに比較して有意な安定した発現低下が認められた。
【００２４】
図１は、組み換えＮＭ＿０２６３３３(1-269aa)のアミノ酸配列を示す説明図である。
ＮＭ＿０２６３３３発現ベクターからBamH I とPstIの制限酵素で切り出し後、pGEX-4T-3に挿入し、組み換えＮＭ＿０２６３３３(1-269aa)を作成した。なお、ベクターとしては、ＮＭ＿０２６３３３塩基配列に従い合成された人工合成遺伝子が組み込まれたpBApo-CMV Neoベクター（タカラバイオ株式会社、京都）を用いた。
組み換えＮＭ＿０２６３３３(1-269aa)は、２６９個のアミノ酸からなるタンパク質であり、N末端から90番目Vから193番目hまでがNeuregulin  Regionで膜貫通ドメインと考えられる。
【００２５】
図２は、ＮＭ＿０２６３３３(1-269aa)の部分タンパク質であるＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)のアミノ酸配列を示す説明図である。
ＮＭ＿０２６３３３発現ベクターから次のプライマーを用いて増幅後、EcoRIで切り出し、pGEX-4T-3に挿入し、ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)を作成した。
Forward primer: NM (88aa EcoRI F1) 5’-CCGGAATTCCATGGTTTTAGTAGCAACATT 3’
Reverse primer: NM (EcoRI R1) 5’-CCGGAATTCTTAATGATGATGATGATGATG-3’
【００２６】
部分タンパク質ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)は、１８２個のアミノ酸からなるタンパク質であり、N末端から87番目lまでを除去したものである。ＮＭ＿０２６３３３(1-269aa)
と同様に、Neuregulin  Region（膜貫通ドメイン）を有し、さらに細胞質部分に存在すると考えられるC端からなる。
【００２７】
図３は、ＮＭ＿０２６３３３(1-269aa)及びＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)の細胞内Ｃa濃度に及ぼす影響を示すグラフである。
前記の老化促進モデル線維芽細胞（ＴＧ）を10％FBS-DMEMで培養し、Fura-2 AMをload後440/480nmの２波長法で測定した。
【００２８】
上段グラフのように、ＴＧ細胞（線維芽細胞）にアセチルコリン10−6M投与すると細胞内Ｃa濃度がスパイク状に上昇し、その後徐々に低下した。
中段グラフのように、ＮＭ＿０２６３３３(1-269aa)を2-3分前に投与されたＴＧ細胞では、アセチルコリン投与の細胞内Ｃa濃度はスパイク上昇後速やかに低下し、Ｃa流入阻害が認められた。
下段グラフのように、ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)を2-3分前に投与されたＴＧ細胞においても、同様に、アセチルコリン投与の細胞内Ｃa濃度はスパイク上昇後速やかに低下し、Ｃa流入阻害が認められた。
このように、ＮＭ＿０２６３３３(1-269aa)とＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)とでは、細胞内Ｃa濃度に及ぼす影響、すなわち、ＮＣＸ１チャネルに及ぼす影響に差異はなかったため、老化シグナル抑制作用には、N端1-87は必要なく、Neuregulin Regionとそれに続く細胞質部分（C端側）が重要であることが示唆された。
【００２９】
図４は、野性型線維芽細胞（ＷＴ）、老化促進モデル線維芽細胞（ＴＧ）、ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)を投与した老化促進モデル線維芽細胞（ＴＧ  ＮＭ88-269）のウエスタンブロット写真である。
ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)によるオーファジー・核膜蛋白に及ぼす影響について検討した。
ウエスタンブロットでは、６ｃｍのペトリディッシュに細胞を培養し、ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)投与４８時間経過後、細胞を採取しRIPA Lysis buffer に溶解し、その上清に同量のLaemmli (5% βメルカプト添加)を加え、攪拌後９５℃で５分処理後、BioRadの5%-20%ゲルにアプライし膜に転写後、各抗体で染色した。
【００３０】
タンパク質発現の測定には、細胞サンプルをＲＩＰＡ溶解バッファー（２０ｍｍｏｌ／ｌトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＧＴＡ、１％トリトンＸ−１００、１％グリセロール、１ｍｍｏｌ／ｌジチオトレイトール及び０．５ｍｍｏｌ／ｌフェニルメチルスルホニルフルオリド）中でホモジナイズし、サンプルを、５％β−メルカプトエタノールを含んだＬａｅｍｍｌｉバッファーと混合し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にロードした。タンパク質をポリビニリデンジフルオリドメンブレンに電気泳動的に転写し、ＬＣ３ＩＩ、ｐ６２、Ａｔｇ７、Ｈ４Ｋ５ac、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ３、エメリン、ラミンＡ／Ｃ、ヘテロクロマチンタンパク質１α（ＨＰ１α）、ｈｉｇｈ−ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｂｏｘ  １（ＨＭＧＢ１）及びＧＡＰＤＨに対する一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。タンパク質バンドをECL Plus（登録商標；GEヘルスケア、米国）検出システムにより検出し、デンシトメトリー分析を、Ｓｃｉｏｎイメージソフトウエアを用いて行い、各サンプルにおいてタンパク質バンドに対する相対比を計算した。
【００３１】
オートファジー関連タンパク質と核膜ラミナタンパク質のウエスタンブロットによると、老化促進モデル線維芽細胞（ＴＧ）で認められたLC3 IIとP62の増加、Atg7と核膜ラミナであるLamin、Emerinの減少、並びに、クロマチンリモデリングに関連するHeterochromatin protein 1αの減少は、ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)の投与によりすべてキャンセルされ、野性型線維芽細胞（ＷＴ）と同様になった。
そのため、ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)には老化シグナル抑制作用があるものと考えられる。
【００３２】
図５は、野性型線維芽細胞（ＷＴ）、老化促進モデル線維芽細胞（ＴＧ）、ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)を投与した老化促進モデル線維芽細胞（ＴＧ  ＮＭ88-269）のエピゲノム・クロマチン構造に及ぼす影響を示すウエスタンブロット写真である。
老化促進モデル線維芽細胞（ＴＧ）に認められたHistone 4 lysine 5 (H4K5) acetylation (ac)、H3K4 trimethylation (me3)、H4K20me3の増加とH3K9me3並びにH3K27me3の減少は、ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)の投与によりすべてキャンセルされ、野性型線維芽細胞（ＷＴ）と同様になった。
そのため、ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)には老化シグナル抑制作用があるものと考えられる。
【００３３】
図６は、ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)の細胞内局在を示す染色写真である。
老化促進モデル線維芽細胞（ＴＧ）にＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)を投与し24時間後にHis-Tag 抗体とTexas-Red二次抗体を用いて染色した。
右図のように、Triton X（界面活性剤）処理をしない細胞表面の染色では、輪郭を構成する細胞膜は染色されなかった。一方、左図のように、Triton X（界面活性剤）処理した細胞の染色では、輪郭を構成する細胞膜は鮮明に染色された。
これにより、ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)はNeuregulin Regionで細胞膜に結合し（貫通し）、C端に付いているHis-Tagが細胞質側に存在することが確認された。
【００３４】
図７は、野性型マウス（ＷＴ）及び老化促進モデルマウス（ＴＧ）の白血球のテロメア長を示すグラフ（ａ）、並びに、老化促進モデルマウス（ＴＧ）及びＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)を投与した老化促進モデルマウス（ＴＧ  ＮＭ88-269aa）のテロメア長を示すグラフ（ｂ）である。
ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)は、老化促進モデルマウス（ＴＧ  ＮＭ88-269aa）の腹腔に0.6 mg/kg隔日投与した。
１００週齢前後の雄性・雌性マウスC57BL/6Jの７匹の野性型マウス（ＷＴ）と５匹の老化促進モデルマウス（ＴＧ）から採血し、QIAamp DNA Blood Mini Kitを用いて白血球ゲノムＤＮＡを抽出した。同様に、老化促進モデルマウス（ＴＧ）と、ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)を腹腔内投与した老化促進モデルマウス（ＴＧ  ＮＭ88-269aa）から白血球ゲノムＤＮＡを抽出した。
【００３５】
テロメア長は、ＣＦＸ３８４リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、デンマーク）にて、改良型モノクロマルチプレックス定量ＰＣＲ法（１）を用いて測定した。二重鎖ＰＣＲにおいて、アルブミンをコードするシングルコピー遺伝子γ−グロビンを同じウェルでテロメア鋳型と同時に増幅し、異なるサンプルで異なるＤＮＡ量を調整するための参照として使用した。ＰＣＲ試薬の終濃度は、容量１０μＬ中、１×ＱｕａｎｔｉＦａｓｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ）、２０ｎｇ  ＤＮＡ、３００ｎｍｏｌ／ｌフォワードテロメアプライマー（５’−ＡＣＡＣＴＡＡＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＡＧＴＧＴ−‘３）、３００ｎｍｏｌ／ｌリバーステロメアプライマー（５’−ＴＧＴＴＡＧＧＴＡＴＣＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＡＣＡ−‘３）、３５０ｎｍｏｌ／ｌフォワード３６Ｂ４  γ−グロビンプライマー（５’−ＡＣＴＧＧＴＣＴＡＧＧＡＣＣＣＧＡＧＡＡＧ−‘３）、及び３５０ｎｍｏｌ／ｌリバース３６Ｂ４  γ−グロビンプライマー（５’−ＴＣＡＡＴＧＧＴＧＣＣＴＣＴＧＧＡＧＡＴＴ−‘３）であった。本温度サイクルプロフィールは次の通りであった：ステージ１：９５℃で１５分；ステージ２：９４℃で１５秒、４９℃で１５秒の２サイクル；及びステージ３：９４℃で１５秒、６２℃で１０秒、シグナルの取得を伴って７３℃で１５秒、８４℃で１０秒、シグナルの取得を伴って８７℃で１５秒の４０サイクル；ステージ４：シグナルの取得を伴って６５℃で０．０５秒の１サイクル。ＱｕａｎｔｉＦａｓｔ中のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉが二本鎖ＤＮＡに結合して蛍光シグナルを生じる。７３℃での読み取りをテロメア鋳型の増幅のＣｔ値とした（初期サイクルで３６Ｂ４  γ−グロビンシグナルがまだベースラインにある場合）。８７℃での読み取りを３６Ｂ４  γ−グロビン鋳型の増幅のＣｔ値とした（この温度でテロメア鋳型は完全に融解される）。ステージ４の６５℃でのシグナル取得を、再実行のためにプライマーが二量体を形成したウェルを同定するために使用した。
２回の「Ｔ」実行（テロメア反復配列のコピー数のため）及び２回の「Ｓ」実行（シングルコピー遺伝子のコピー数のため）。この試験で用いた参照シングルコピー遺伝子は齧歯類３６Ｂ４  γ−グロビンであった。２つのＴ測定値の平均を２つのＳ測定値の平均で割って平均Ｔ／Ｓ比を算出した。なおこの比は、サザンブロット末端制限断片分析（２）によるテロメア長の独立した測定値と極めてよく一致していることが従前に判明している。テロメア長は、controlに対する相対値で示した。
【００３６】
その結果、図７（ａ）のように、老化促進モデルマウス（ＴＧ）の白血球テロメア長は、野性型マウス（ＷＴ）より有意に短縮していた。
一方、、図７（ｂ）のように、老化促進モデルマウス（ＴＧ  ＮＭ88-269aa）では、ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)投与後4週目より白血球テロメア長は延伸が認められ、8週後では1.5倍の延伸が確認された。
そのため、ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)には老化シグナル抑制作用があるものと考えられる。
【００３７】
図８は、ＮＭ＿０２６３３３(1-269aa)によるテロメラーゼ活性を示すウエスタンブロット写真（ａ）及びグラフ（ｂ）である。
ＮＭ＿０２６３３３(1-269aa)を培養細胞（TG線維芽細胞、HEK 293細胞）に投与したところ、図８（ａ）（ｂ）のように、ＮＭ＿０２６３３３(1-269aa)を導入した場合（ＨＥＫrNMP、ＷＴrNMP、ＴＧrNMP）はいずれも、テロメラーゼ活性の亢進が確認された。特に、老化促進モデル線維芽細胞（ＴＧrNMP）におけるテロメラーゼ活性の亢進が顕著であった。
【００３８】
図９は、老化促進モデル線維芽細胞（ＴＧ）内Ｃａイオン濃度に対するＮＣＸ１阻害剤の作用を示すグラフである。
老化促進モデルマウス（ＴＧ）の線維芽細胞を10％FBS-DMEMで培養し、アセチルコリン10−6Mの細胞内Ｃａイオン濃度に及ぼす影響について、Fura-2 AMをloadし440/480nmの２波長法で測定した。
【００３９】
その結果、上段グラフのように、アセチルコリン投与すると細胞内Ｃa濃度がスパイク状に上昇し、その後徐々に低下した。一方、下段グラフのように、アセチルコリン投与前に、ＮＣＸ１阻害剤であるＳＮ−６を投与した場合は、細胞内Ｃa濃度はスパイク後速やかに低下し、Ｃa流入阻害が認められた。
【００４０】
図１０は、ＮＣＸ１阻害剤によるマウス白血球テロメア長への作用を示すグラフである。
前述と同様に、白血球テロメア長をＰＣＲ法で測定した。
【００４１】
図１０（ａ）のように、約100週齢の老化促進モデルマウス（ＴＧ）と高食塩食マウス（ＷＴsalt）から採血し、白血球のテロメア長を測定したところ、老化促進モデルマウス（ＴＧ）も高食塩食マウス（ＷＴsalt）も、白血球テロメア長は有意に短縮していた。
一方、図１０（ｂ）のように、ＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６（3mg/Kg）をマウス（middle-aged ＴＧ及びold-agedＴＧ）の腹腔に隔日投与した場合は、投与後４週目から白血球テロメア長は延伸が認められ、10週後では約15％の白血球テロメア長延伸が確認された。
【００４２】
図１１は、ＮＣＸ１阻害剤及びＮＭ＿０２６３３３(1-269aa)による培養細胞テロメア長への作用を示すグラフである。
前述と同様に、ＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６並びにＮＭ＿０２６３３３(1-269)をそれぞれ、老化促進モデル線維芽細胞（ＴＧ）並びにCF6投与したＨＥＫ−２９３細胞（ＨＥＫ）に投与し48時間後のテロメア長をＰＣＲ法で測定した。
【００４３】
その結果、ＮＣＸ１阻害剤（図１１ａｂ）とＮＭ＿０２６３３３(1-269aa) （図１１ｃｄ）は同様に、老化促進モデル線維芽細胞（ＴＧ）（図１１ａｃ）及びCF6投与したＨＥＫ−２９３細胞（ＨＥＫ）（図１１ｂｄ）に認められたテロメア長の短縮をキャンセルした。
【００４４】
図１２は、ＮＣＸ１阻害剤による臓器重量への作用を示すグラフである。
前述と同様に、ＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６（3mg/Kg）を、老化促進モデルマウス（ＴＧ）の腹腔に１２−２４週間隔日投与し臓器重量を測定した。
【００４５】
その結果、肝臓と脾臓の臓器重量は、老化促進モデルマウス（ＴＧ）で減少が確認されず、ＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６の影響も確認されなかったが、心臓と腎臓の臓器重量は、老化促進モデルマウス（ＴＧ）で減少し、ＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６の投与によりその減少の抑制が確認された。
臓器重量の減少、すなわち臓器萎縮は、老化に伴ったものであるため、臓器の老化、すなわち個体として老化の抑制にＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６は有用である。
【００４６】
図１３は、ＮＣＸ１阻害剤及びＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)によるマウス皮膚老化への作用を示す写真及びグラフである。
前述と同様に、ＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６（3mg/kg）並びにＮＭ＿０２６３３３(88-269) (0.6 mg/kg)をそれぞれ、老化促進モデルマウス（ＴＧ）の腹腔に１２−２４週間隔日投与した。
【００４７】
上段のHE染色写真のように、皮膚老化に及ぼす影響を組織学的に検討したところ、老化促進モデルマウス（ＴＧ）は、野性型マウス（ＷＴ）に比べて皮下脂肪の減少と真皮の肥厚・襞形成が認められたが、ＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６並びにＮＭ＿０２６３３３(88-269)を投与した場合（ＴＧ ＳＮ、ＴＧ ＮＭ88-269）は、皮下脂肪減少や真皮の肥厚・襞形成がほぼ消失した。
また、下段グラフのように、老化促進モデルマウス（ＴＧ）における皮下脂肪の減少は、ＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６及びＮＭ＿０２６３３３(88-269)の投与によって改善された。
皮膚老化は個体老化の典型的な表出であるため、ＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６及びＮＭ＿０２６３３３(88-269) は、個体として老化の抑制に有用である。
【００４８】
図１４は、ＮＣＸ１阻害剤及びＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)によるマウス心臓老化への作用を示す写真及びグラフである。
前述と同様に、ＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６（3mg/kg）並びにＮＭ＿０２６３３３(88-269) (0.6 mg/kg)をそれぞれ、老化促進モデルマウス（ＴＧ）の腹腔に１２−２４週間隔日投与した。
【００４９】
左欄は、HE染色（HE）とマッソントリクロム染色（M）による写真である。老化促進モデルマウス（ＴＧ）では、心臓の線維化（マッソントリクロム染色で青色）が顕著に観察されたが、ＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６並びにＮＭ＿０２６３３３(88-269) （ＴＧ）を投与した場合（ＴＧ ＳＮ、ＴＧ ＮＭ88-269）、線維化が軽減された。
また、右欄グラフのように、老化促進モデルマウス（ＴＧ）における心臓の線維化は、ＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６及びＮＭ＿０２６３３３(88-269)の投与によって有意に抑制された。
臓器老化も個体老化の典型的な表出であるため、ＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６及びＮＭ＿０２６３３３(88-269) は、個体として老化の抑制に有用である。
【００５０】
図１５は、ＮＣＸ１阻害剤による培養細胞アポトーシスへの作用を示すグラフである。
前述と同様に、ＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６を、野性型線維芽細胞（ＷＴ）及び老化促進モデル線維芽細胞（ＴＧ）に投与し48時間後のアポトーシスをAnnexin V-FITC Apoptosis Detection Kitを用いて測定した。
【００５１】
その結果、代表的なチャート（Ａ）及び定量グラフ（Ｂ）のように、アポトーシスは、野性型線維芽細胞（ＷＴ）に比べて老化促進モデル線維芽細胞（ＴＧ）で有意に多く、ＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６投与（ＳＮ−６  ＋）により、老化促進モデル線維芽細胞（ＴＧ）に認められたアポトーシスの亢進はほぼ完全に抑制された。
すなわち、図１２及び１４で示したＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６投与による老化促進モデルマウス（ＴＧ）の心臓重量の減少（臓器萎縮に起因）の抑制は、心臓構成細胞のアポトーシス亢進に対する阻害作用によるものと考えられる。
【００５２】
本発明では、ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)タンパク質、または、ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)の活性部分を有すると共にＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)のうち１もしくは複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、及び／または付加した配列から成るペプチド、或いは、前記ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa) タンパク質または前記ペプチドと等しい作用を有するＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)誘導体を生体に導入し、生体の老化を抑制する方法を、新規な方法として提供可能でもある。
【００５３】
更に、生体の個体としての老化を抑制する作用を有する薬剤の候補物質をスクリーニングする方法も提供可能である。
すなわち、候補物質が、ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)タンパク質、または、ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)の活性部分を有すると共にＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)のうち１もしくは複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、及び／または付加した配列から成るペプチド、或いは、前記ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa) タンパク質または前記ペプチドと等しい作用を有するＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)誘導体の発現を誘導し得るか否か、または、ＮＭ＿０２６３３３(88-269aa)タンパク質の活性を誘導し得るか否かを評価する工程と、候補物質を被験体に導入する工程と、被験体における老化シグナルが低減し得るか否かを評価する工程とを設けるか、或いは、候補物質が、ＮＣＸ１チャンネルを阻害し得るか否かを評価する工程と、候補物質を被験体に導入する工程と、被験体における個体としての老化シグナルが低減し得るか否かを評価する工程とを設ける。
【００５４】
被験物質としては、任意の公知化合物や新規化合物が使用でき、例えば、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、核酸（ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドなど）、糖質（単糖、二糖、オリゴ糖、多糖など）、脂質（飽和または不飽和の直鎖、分岐鎖、環を含む脂肪酸など）、アミノ酸、蛋白質（オリゴペプチド、ポリペプチドなど）、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サル等の哺乳動物などが挙げられる。
【００５５】
非ヒト動物が用いられる場合、候補物質の非ヒト動物への投与には従来公知の方法が利用できる。例えば、経口投与、非経口投与（静脈注射、皮下注射、腹腔内注射、局所注入など）が挙げられる。投与量、投与間隔、投与期間等は、用いる候補物質や動物の種類等に応じて適宜設定される。
【００５６】
候補物質の有効性の評価には、従来公知の方法が利用でき、例えば、候補物質を投与した非ヒト動物から骨髄や血液等の生体試料を採取し、老化シグナルの低減量を測定することによって行える。
【００５７】
また、本発明によって提供される薬剤においては、各種循環器系疾患（例えば、末梢循環障害、冠循環障害、及び、脳循環障害による循環器系障害）の治療薬として使用する場合は、一般的な医薬製剤として調製される。例えば、本発明薬剤を製剤上許容しうる担体（例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、矯味剤、乳化剤、希釈剤、溶解補助剤）と混合して得られる医薬組成物または錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤、注射剤、座剤、吸入剤、経皮吸収剤等の製剤として経口または非経口に適した形態で処方される。
【００５８】
このような製剤を製造するには、従来公知の溶剤、可溶化剤、当張化剤、保存剤、抗酸化剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、安定化剤等を添加することができる。溶剤としては、例えば、水、生理食塩水、可溶化剤としては、例えば、エタノール、ポリソルベート類、クレモルファ、賦形剤としては、例えば、乳糖、デンプン、結晶セルロース、マンニトール、マルトース、リン酸水素カルシウム、軽質無水ケイ酸、炭酸カルシウム、結合剤としては、例えば、デンプン、ポリビニルピロリド、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、ケルボキシメチルセルロース、アラビアゴム、崩壊剤としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油が、安定化剤としては、例えば、乳糖、マンニトール、マルトース、ポリソルベート類、マクロゴール類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油が挙げられる。
また、必要に応じて、グリセリン、ジメチルアセトアミド、７０％乳酸ナトリウム、界面活性剤、塩基性物質（例えば、水酸化ナトリウム、エチレンジアミン、エタノールアミン、炭酸ナトリウム、アルギニン、メグルミン、トリスアミノメタン）などが添加可能である。
【００５９】
本発明薬剤の投与量は、動物実験の結果及び種々の状況を勘案して、単回及び反復投与したときに総投与量が一定量を超えないように定められる。具体的な投与量は、投与方法、患者または被処理動物の状況、例えば0.1mg−1000mgの範囲内で、年齢、体重、性別、感受性、食事、投与時間、併用する薬剤、患者またはその病気の程度に応じて変化し、一定の条件のもとにおける適量と投与回数は、上記指針をもととして専門医の適量決定試験によって決定される。
【００６０】
本発明薬剤による末梢循環改善作用、冠循環改善作用（例えば、抗狭心症作用）及び脳循環改善作用は、血管収縮抑制作用及び血流量増加作用等によって確認することができる。
血管収縮抑制作用を確認する場合には、例えば哺乳動物の胸部大動脈を摘出した後、Ｃａイオン流入増加物質で処理し、Ｃａイオン流入増加物質による動脈の収縮を誘発させ、その後、ＮＣＸ１阻害剤で処理した場合のＣａイオン流入増加物質による動脈の収縮を測定し、ＮＣＸ１阻害剤を投与していない時の収縮を基準とすることで血管収縮の抑制作用を確認することができる。
【００６１】
また、血流量の増加作用を確認する場合には、例えば、哺乳動物にＣａイオン流入増加物質を投与し、Ｃａイオン流入増加物質によって高血圧が誘発された哺乳動物を作製し、ＮＣＸ１阻害剤を高血圧動物に腹腔内投与した後、皮膚血流量を測定し、投与前の血流量と比較することで血流量の増加作用を確認することができる。
【００６２】
さらに、本発明薬剤を利用して、Ｃａイオン流入増加物質または老化シグナルと関連する循環器系疾患の診断をすることも可能である。 例えば、各種循環器系疾患患者にＮＣＸ１阻害剤を投与し、血管収縮の抑制作用及び血流量の増加作用等を測定することによってＣａイオン流入増加物質と関連する循環器系疾患かどうか判断することができる。これによると、生体内に多種類存在し微量であるＣａイオン流入増加物質を特異抗体やＨＰＬＣを用いて定量する必要がなくなるため、簡便で短時間に疾患の診断を行える。また例えば、ＮＣＸ１阻害剤を患者に対して経口又は外用(塗布等)的に投与し、レーザードップラー式血流画像化装置を用いて患者の手指等の皮膚血流量を測定することにより、Ｃａイオン流入増加物質または老化シグナルと関連する循環器系疾患の診断をすることが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明によると、生体の個体としての老化抑制に寄与するため、産業上有用である。
【図１】
2020158467.tif 000003
【図２】
2020158467.tif 000004
【図３】
2020158467.tif 000005
【図４】
2020158467.tif 000006
【図５】
2020158467.tif 000007
【図６】
2020158467.tif 000008
【図７】
2020158467.tif 000009
【図８】
2020158467.tif 000010
【図９】
2020158467.tif 000011
【図１０】
2020158467.tif 000012
【図１１】
2020158467.tif 000013
【図１２】
2020158467.tif 000014
【図１３】
2020158467.tif 000015
【図１４】
2020158467.tif 000016
【図１５】
2020158467.tif 000017
【配列表】
2020158467000001.app