(57)【要約】      （修正有）【課題】PCB 153の体内負荷を増加させることなく、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)患者のn-3 PUFAのレベルを上昇させることにより、NAFLDを治療するための組成物の提供。【解決手段】少なくとも40重量％の、エイコサペンタエン酸(EPA)及びドコサヘキサエン酸(DHA)又はそれらの誘導体の少なくとも1種を含み、組成物中のPCB 153の量が5.0ng/g未満である組成物。前記組成物がさらに混合トコフェロール等の抗酸化物質を含むことが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)と診断された患者の治療に使用するためのn-3系多価不飽和脂肪酸(n-3 PUFA)の組成物であって、該組成物中の脂肪酸の重量基準で、少なくとも40重量％の、エイコサペンタエン酸(EPA)およびドコサヘキサエン酸(DHA)またはそれらの誘導体の少なくとも1種を含み、該組成物中のPCB 153の量が5.0ng/g未満であることを特徴とする、組成物。
【請求項２】
前記患者の血液中のn-3 PUFAのレベル上昇をもたらすか、またはn-3 PUFAの不足を是正する、請求項1に記載の使用のための請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
n-3 PUFAの上昇または是正が、全脂肪酸のパーセンテージとして赤血球EPAおよびDHAにおいて得られた変化として測定され、この上昇が少なくとも10％である、請求項1または2に記載の使用のための請求項1または2に記載の組成物。
【請求項４】
n-3 PUFAのレベルが、血液中の全血漿または血清リン脂質脂肪酸レベルの約8.0重量％以上に上昇する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用のための請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項５】
オメガ3指数(％)が20％増加する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の使用のための請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が、特定医療用経腸製剤、特定保健用食品、特定医療用食品(FSMP)、特別用途食品(FSDU)、医学的栄養剤、および医療用食品の群から選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の使用のための請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物中の脂肪酸の重量基準で、少なくとも60％のEPAおよびDHAの少なくとも1種を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の使用のための請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物のEPA：DHAの重量比が約1：10〜約10：1の範囲である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の使用のための請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が海産油に由来する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の使用のための請求項1〜8のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１０】
PUFAが、遊離脂肪酸形態、エステル化形態、リン脂質形態、モノ/ジ/トリ-グリセリド形態およびそれらの塩の少なくとも1種で提示される、請求項1〜9のいずれか1項に記載の使用のための請求項1〜9のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が約84重量％のEPAおよびDHAを含み、好ましくはグラムあたり460mgのEPA-エチルエステルおよび380mgのDHA-エチルエステルを含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の使用のための請求項1〜10のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１２】
PCB 153の量が4.0ng/g未満、3.0ng/g未満、2.0ng/g未満、1.0ng/g未満または0.7ng/g未満である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の使用のための請求項1〜11のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が抗酸化物質、好ましくは混合トコフェロールをさらに含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の使用のための請求項1〜12のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１４】
オメガ3指数(％)が血液中の全脂肪酸の約6.0％以上に上昇する、請求項1〜13のいずれか1項に記載の使用のための請求項1〜13のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物が血液中のn-3 PUFAに対するn-6 PUFAの比率のアンバランスを是正する、請求項1〜14のいずれか1項に記載の使用のための請求項1〜14のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１６】
非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)と診断された患者を治療する方法であって、n-3系多価不飽和脂肪酸(n-3 PUFA)の組成物を、該患者の血液中のn-3 PUFAのレベルを上昇させるか、またはn-3 PUFAの不足を是正するのに十分な量で、該患者に投与することを含んでなり、該組成物が、該組成物中の脂肪酸の重量基準で、少なくとも40重量％の、エイコサペンタエン酸(EPA)およびドコサヘキサエン酸(DHA)またはそれらの誘導体の少なくとも1種を含み、該組成物中のPCB 153の量が5.0ng/g未満であることを特徴とする、方法。
【請求項１７】
n-3 PUFAの上昇または是正が、全脂肪酸のパーセンテージとして赤血球EPAおよびDHAで得られた変化として測定され、この上昇が少なくとも10％である、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
n-3 PUFAのレベルが、血液中の全血漿または血清リン脂質脂肪酸レベルの約8.0重量％以上に上昇する、請求項16または17に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物が、前記患者の血液中のn-3 PUFAのレベルを上昇させるか、またはn-3 PUFAの不足を是正するのに十分な期間にわたり、該患者に投与される、請求項16〜18のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０】
n-3系多価不飽和脂肪酸(PUFA)の組成物であって、該組成物中の脂肪酸の重量基準で、少なくとも40重量％の、EPAおよびDHAまたはそれらの誘導体の少なくとも1種を含み、該組成物中のPCB 153の量が5.0ng/g未満であることを特徴とする、組成物。
【請求項２１】
抗酸化物質、好ましくは混合トコフェロールをさらに含む、請求項20に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2015年6月26日に出願されたノルウェー国特許出願第20150838号の利益を主張するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)と診断された患者を治療するための組成物に関する。特に、本発明は、PCB 153の量が最小限に抑えられているn-3系多価不飽和脂肪酸(n-3 PUFA)の組成物を提供する。なぜならば、この特定のPCB同族体はNAFLDの病態生理のけん引役であることが判明したからである。本発明はさらに、NAFLDと診断された患者の治療に使用するための組成物を提供する。さらにまた、本発明は、PCB 153の体内負荷量を増加させることなく、NAFLD患者の血液中のn-3 PUFAのレベルを上昇させる方法、またはn-3 PUFAの不足を是正する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
NAFLDは、過度のアルコール摂取以外の原因により肝臓に脂肪が蓄積した(脂肪症)ときに生じる、脂肪肝の一形態である。NAFLDは西側先進国で最もよく見られる肝障害である。これは、北米における慢性肝疾患(CLD)の一般的な原因であり、また、肝臓移植を必要とするCLDの負担をますます増大させる要因でもある。これは、肝細胞癌、2型糖尿病、および心血管疾患のリスクを増加させることが示されている。NAFLDは、非アルコール性脂肪肝(NAFL)と非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)の両方を包含し、後者は該疾患のより深刻な形態である。NAFLからNASHに、肝硬変に、そして最終的には肝不全に進行する際の比較的長い無症候期間は、治療法の開発における重大な課題であり、現在のところ、FDAが承認したNASHの治療法は存在しない。2013年9月に、米国食品医薬品局(FDA)と米国肝臓病学会(AASLD)は、共同してこの課題に取り組むためのワークショップを開催した。その共同ワークショップでは、疾患修飾薬(disease modifier)に関して大きな知識の格差が存在すること、また、特定のリスク集団を見つけて、その健康状態を改善する方法を緊急に開発する必要があることが指摘された。
【０００４】
非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)および非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)という用語は、NAFLDが単純脂肪肝(組織学的に肝細胞の5％超)を含むかなり広範囲の肝疾患を包含するという事実にもかかわらず、しばしば同じ意味で使われている。脂肪肝(hepatosteatosis)は、NAFLとも呼ばれており、炎症反応と細胞損傷を伴わない場合には、比較的良性の障害である可能性が最も高い。しかしながら、NAFLD患者のサブグループは、脂肪肝に加えて肝細胞の損傷および炎症を有し、こうした状態は非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)として知られている。
【０００５】
NAFLは、インスリン抵抗性およびメタボリックシンドローム(MetS)に関連しており、5％を超える肝脂肪変性の存在によって定義される。体重減少を含むライフスタイルの変化は肝臓脂肪を改善する可能性があるが、さらなる治療法が必要である。もともと他のインスリン抵抗性の状態のために開発された治療法は、メトホルミンやチアゾリジンジオン類を含めて、ある程度の効果があるかもしれないが、これらの薬剤の長期使用には懸念がある。したがって、NAFLDを治療するための組成物および方法が必要とされている。
【０００６】
オメガ3脂肪酸による治療は安全であり、NAFLDの治療に使える可能性があるとして関心を集めている。例えば、Scorlettiら、「Effects of purified Eicosapentaenoic and Docosahexaenoic Acids in Non-alcoholic Fatty Liver Disease: Results from the WELCOME study(非アルコール性脂肪肝疾患における精製されたエイコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸の効果：WELCOME試験の結果)」、Hepatology, 2014は、DHAおよびEPA治療による赤血球DHAの富化が肝臓脂肪率の減少と直線的に関連することを示している。また、Louら、「Serum phospholipid omega-3 polyunsaturated fatty acids and insulin resistance in type 2 diabetes mellitus and non-alcoholic fatty liver disease (2型糖尿病および非アルコール性脂肪肝疾患における血清リン脂質オメガ3多価不飽和脂肪酸およびインスリン抵抗性)」、Journal of Diabetes and Its Complications, 28 (2014), 711-714は、血清リン脂質オメガ3多価不飽和脂肪酸(PUFA)とNAFLD患者との関係を評価するために設計された臨床試験において、対照群と比較してNAFLD群では総n-3 PUFAレベルが有意に低かった(6.97±2.32％対10.08±2.76％, p＜0.05)ことを示している。酸化的ストレスおよび肝ミトコンドリアはNAFLDの病因に関与しており、かつ肝臓グルタチオン(GSH)が減少しているが、これは、Oliveiraら、「Liver mitochondrial dysfunction and oxidative stress in the pathogenesis of experimental nonalcoholic fatty liver disease (実験的非アルコール性脂肪肝疾患の病因における肝ミトコンドリア機能不全および酸化的ストレス)」、Braz J Med Biol Res 39(2), 2006によって示されている。オメガ3 PUFAの補給は、脂肪肝における脂質過酸化を低減させ、肝臓の肝含有量を減少させ、GSHを増加させる。さらに、いくつかの特許出願は、異なるオメガ3脂肪酸類の組み合わせが、NAFLDの治療においてプラスの効果をもたらし得ることを示唆している。WO2014/142364は、治療有効量のエイコサペンタエン酸(EPA)またはエチル-EPAを含む組成物を投与することを含む、脂肪肝疾患または障害の治療方法を開示している。
【０００７】
ポリ塩化ビフェニル(PCB)は、アメリカの全成人の血清中に検出しうる残留性の環境汚染物質である。Caveら、「Polychlorinated Biphenyls, Lead, and Mercury are associated with liver disease in American adults (ポリ塩化ビフェニル、鉛および水銀はアメリカ人の肝疾患と関連する); NHanes 2003-2004」、Environmental Health Perspectives, Volume 18, No 12, 2010は、PCB、鉛および水銀への曝露が、疫学調査で非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)に関連していたアラニントランスアミナーゼ(ALT)の原因不明の上昇と関連していることを報告している。存在し得る209種のPCB同族体の中で、ポリ塩化ビフェニル153 (PCB 153)は最も高い血清レベルを有する。Wahlangら、「Polychlorinated biphenyl 153 is a diet-dependent obesogen that worsens nonalcoholic fatty liver disease in male C57BL6/J mice (ポリ塩化ビフェニル153は雄C57BL6/Jマウスの非アルコール性脂肪肝疾患を悪化させる食餌依存性オビーソゲンである)」、Journal of Nutritional Biochemistry 24 (2013), 1587-1595は、高脂肪摂食マウスにおけるPCB 153曝露が内臓脂肪症、肝脂肪症、および血漿アディポカインの増加と関連していたことを報告している。同様に、β酸化に関与する肝遺伝子の発現が減少した一方で、脂質生合成に関連する遺伝子の発現は増加した。同様の結果は高脂肪食(HFD)のみまたはPCB 153のみに曝露したマウスでは見られず、この特定のPCB同族体とHFDとの間の相乗的相互作用が肥満およびNAFLDの劇的な増加をもたらすことを実証している。したがって、PCB 153は、高脂肪食と一緒に投与した場合に、肝脂肪症を悪化させ、アディポサイトカインを変化させ、正常な肝脂質代謝を破壊するオビソゲンである。PCB 153と高脂肪食(HFD)との間に相乗的な相互作用があるため、PCB 153に曝露された個体では、曝露のない個体と比較して肥満およびNAFLが増加する可能性がある。この作用のメカニズムは、Shiら、「Metabolic analysis of the effects of polychlorinated biphenyls in nonalcoholic fatty liver disease (非アルコール性脂肪肝疾患におけるポリ塩化ビフェニルの影響の代謝解析)」、J. Proteome Res. 2012, 3805-3815によって一部明らかにされており、HFDと組み合わせたPCB 153が肝代謝を大幅に変化させることを示している。HFDのみ、およびPCB 153と組み合わせたHFDに曝露されたマウスは、14種類の代謝産物の肝臓レベルに大きな差異を示す。例えば、HFD＋PCB 153処置マウスにおけるグルタチオンは、HFD処置のみと比較して6倍減少した。それゆえ、PCB 153は代謝経路に影響を与える食事毒素である。
米国の全成人はPCB 153に曝露されているため、この特定の栄養物-毒物相互作用はヒトの肥満/NAFLDに潜在的に影響を与えている。
【０００８】
多量のオメガ3を含む組成物は、一般的に粗魚油由来の濃縮物であって、異なる種類の脂肪酸を必然的に含有する。出発原料、すなわち粗魚油はまた、ダイオキシン、PCB、臭素化難燃剤(BFR)などの様々な残留性有機汚染物質(POP)をも含有する。親油性POPの物理化学的性質のために、それらは海洋環境に蓄積し、ヒトへの曝露は主に魚および魚油の食事摂取から生じる。さらに、多価不飽和脂肪酸を濃縮するプロセスは、その製造プロセスで親油性汚染物質が除去されなければ、そうした汚染物質をも濃縮することになる。
【０００９】
先行技術に開示された多くのプロセスは、粗製の油からオメガ3脂肪酸の濃縮物を取得する方法に取り組んでおり、いくつかの特許および特許出願は、魚油を精製して、POPの濃度を低下させる方法を開示している。WO2004/007654は、作動流体を用いて油または脂肪中の環境汚染物質を減少させる方法を記載している。さらに、EP 2 438 819は、POPの含有量が強制的上限値未満である海産油からエイコサペンタエン酸(EPA)およびドコサヘキサエン酸(DHA)のエステル類の濃縮物を得る方法を提供している。さらに、米国特許第8,258,330号は、魚油中のPOPの濃度を低下させる方法におけるキャリア流体組成物およびその使用を開示しており、その方法を使用して様々なダイオキシン、フラン、コレステロール、PCB、ポリ臭化ジフェニルエーテル(PBDE)、塩素化炭化水素、および多環式芳香族炭化水素(PAH)の濃度を報告している。しかしながら、これらの開示のいずれも、NAFLDなどの所与の適応症のための組成物として使用するための、例えば処理、分離および濃縮後の、または特定のPOP類の削減後の、オメガ3脂肪酸類の特定の組成物についての教示を提供していない。
【発明の概要】
【００１０】
上述の理由から、本出願人は、NAFLD患者の脆弱な(特定のPCBに特に影響を受けやすい)グループでは、この患者グループの治療に使用するための高度に精製されたオメガ3組成物が必要とされていると認定した。特に、生体が特定のPCB、すなわちPCB 153、に対して他のPCBよりも高い脆弱性を示すことがあり、また、この特定のPCBがNAFLDにマイナスの影響を及ぼすことから、本出願人は、NAFLD患者の治療のためのオメガ3多価不飽和脂肪酸(PUFA)組成物が、このPCBを最少量で含むべきであることを見出した。
【００１１】
NAFLDと診断された患者を治療するための組成物および方法の必要性、ならびにこの患者グループが1つの特定のPCBに対して特に脆弱であるという新情報に基づいて、本発明は、PCB 153の含有量が極めて低い新規n-3 PUFA組成物、およびそれらの使用方法を提供する。
【００１２】
したがって、第1の態様において、本発明は、組成物中の脂肪酸の重量基準で、少なくとも40重量％の、(all-Zオメガ3)-5,8,11,14,17-エイコサペンタエン酸(EPA)および(all-Zオメガ3)-4,7,10,13,16,19-ドコサヘキサエン酸(DHA)またはそれらの誘導体の少なくとも1種を含む組成物であって、PCB 153の量が組成物1gあたり5.0ng未満である組成物を提供する。
組成物は、好ましくは、NAFLDと診断された患者の治療に使用するためのものである。
【００１３】
さらに、本発明は、PCB 153の体内負荷量を増加させることなく、患者、特にNAFLD患者、の血液中のn-3 PUFAのレベルを上昇させる方法、またはn-3 PUFAの不足を是正する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図1a）および図1b）は、EPAおよびDHAの高濃縮組成物についての、それぞれ2010年および2014〜2015年の、2つの一連のバッチにおけるPCB 153の量を示すバッチデータグラフを提供する。
【図２】図2は、脂質処理したHepG2細胞における脂質蓄積の増加を、対照細胞と比較して示す棒グラフである。HepG2細胞を、2：1の比のオレイン酸：パルミチン酸(O：P)1mMに24時間曝露するか、または対照(C)として未処理のままにした。脂質の細胞内蓄積は、波長490nmで分光光度法を用いてオイルレッド(oil red)O染色により検出し、定量した。OD：光学密度。
【図３】図3は、多価不飽和脂肪酸(PUFA)のEPAおよびDHAで処理した後のHepG2細胞における細胞内脂質蓄積の減少を示す棒グラフである。HepG2細胞を、1mMのオレイン酸/パルミチン酸と共に、100μMの濃度のEPAとDHA(1：1)を用いて、または対照として脂肪酸フリーのウシ血清アルブミン(BSA)を用いて、24時間処理した。脂質の細胞内蓄積は、波長490nmで分光光度法を用いてオイルレッドO染色により検出し、定量した。OD：光学密度。
【図４】図4は、NAFLDの実験的in vitroモデルにおいて、PCB 153曝露が脂質蓄積に及ぼすPUFA (EPAおよびDHA)の有益な効果を弱めることを示す棒グラフである。脂肪性HepG2細胞(オレイン酸/パルミチン酸で処理することにより誘導された)をPUFA (EPAおよびDHA)で処理し、DMSOに溶解したPCB 153(保存液1mM、最終濃度50μM)または対照としてDMSOのみに曝露した。脂質の細胞内蓄積は、波長490nmで分光光度法を用いてオイルレッドO染色により検出し、定量した。OD：光学密度。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、環境汚染物質PCB 153の量が特に低い、n-3 PUFAの新規組成物を提供する。非アルコール性脂肪肝疾患の診断を受けた患者は、血液中のn-3 PUFAのレベルが非常に低くなりやすく、n-3 PUFA不足を示すことが多い。用語「不足」とは、n-3 PUFAのレベルが、不適切な食事摂取のため、または病状/疾病による該栄養素のさらなる必要性のために、患者グループにとって準最適(suboptimal)であることを意味する。本発明の組成物および方法は、ターゲット集団における栄養素不足を是正することができる。それゆえに、本発明の組成物は、非アルコール性脂肪肝疾患と診断された患者における海産n-3 PUFAのエイコサペンタエン酸(EPA)とドコサヘキサエン酸(DHA)の栄養素不足を是正する。NAFLでは、この疾患は単純脂肪症の段階にあり、すなわち、肝臓の脂肪含有量は5％w/w超であって、炎症がない；そのため、NASH患者はこの定義に含まれない。n-3 PUFAの不足を是正するために、かなり高用量の本組成物が、長期間にわたって、例えば数年にわたって、場合によっては残りの生涯にわたって、患者に投与されるべきである。
【００１６】
本発明の一実施形態では、組成物、方法および使用は、NAFL、すなわち、NAFL疾患の初期段階(NAFLD)、例えば脂肪症を治療するために向けられる。好ましくは、本発明による治療における使用または治療の方法は、脂肪症の段階に向けられ、この段階では疾患は可逆的であって、NASHに進行していない。
【００１７】
高脂肪処理マウスでは、PCB 153と高脂肪食との間に相乗的相互作用があり、高脂肪食単独と比較して、肥満およびNAFLDの劇的な増加を結果的に招く。したがって、PCB 153は、食餌性NAFLDを悪化させる食餌依存のPCB同族体である。この毒素は高脂肪処理マウスにおける代謝プロファイルを変化させ、かつ肝臓のスカベンジング能力を低下させるが、これはNAFLDの病態生理の一部である。それゆえに、NAFLD患者のためのいかなる治療も、患者をPCB 153のさらなる寄与にさらすべきではない、ということが重要である。従って、本発明のn-3 PUFA組成物、好ましくはNAFLD治療用の該組成物は、極めて少ない量のPCB 153を含む。NAFL患者は一般に、その血液中に低レベルのn-3 PUFAを有し、本発明の組成物を長期間投与することによってそのレベルが上昇し、かつ/またはオメガ3の不足が是正されると、組成物から血中PCB 153レベルへの寄与は全くないか、最小限にとどまるであろう。本発明の組成物を使用することによって、PCB 153に対するn-3 PUFAの比率を増加させることができる。その結果、本発明の組成物は、より多量のPCB 153を含む同様の組成物と比較して、NAFLD患者に対して特に改善された効果を奏することが期待される。
【００１８】
組成物のn-3 PUFAは、油、特に海産油に由来し、とりわけ魚油由来であるが、藻類油、植物油または微生物油由来であってもよい。本明細書で使用する用語「海産油」(marine oil)は、魚、貝(甲殻類)および海洋哺乳類からの油を含む。魚油はPOPへのヒト曝露の主な発生源であり、ヒト血液中に見出されるPCBのレベルおよび特定の同族体は、ヒトが摂取する汚染された魚に見出される量および同族体パターンと関連している。したがって、汚染物質および特定の同族体(PCB 153を含む)のヒト体内負荷量は、摂取された油に関係しているため、オメガ3製品の品質が問題となる。
【００１９】
本発明の組成物は、PCB 153の量が最小限に低減されている精製油を含み、好ましくは、油は所望の形態にさらに処理加工されており、かつ実現可能で有用な濃度にまで分離されている。本発明の組成物を製造するための原料油として使用できる魚油の非限定的な例は、例えば、メンヘーデン油(Menhaden oil)、タラ肝油(Cod Liver oil)、ニシン油(Herring oil)、カペリン油(Capelin oil)、イワシ油(Sardine oil)、アンチョビ油(Anchovy oil)、サケ油(Salmon oil)、サバ油(Mackerel oil)、シール油(Seal oil)、およびオキアミ油(Krill oil)である。一実施形態では、魚油はアジ(Horse Mackerel)由来ではない。上記の魚油は、魚の器官から(例えば、タラ肝油)、ならびに魚の肉または魚全体から回収することができる。本発明の最終組成物の、EPAおよびDHAを含めた、n-3 PUFAは、種々の形態であってよく、遊離脂肪酸形態；エステル化形態、例えばC1-C4アルキルエステル、好ましくはエチルエステル；リン脂質；モノ/ジ/トリ-グリセリド；およびそれらの塩のうちの少なくとも1つの形態で提示される。好ましくは、PUFAは、エステル化形態、遊離酸形態、または塩形態であり、より好ましくはエステル化形態、最も好ましくはエチルエステル形態である。n-3 PUFA、またはEPAもしくはDHAに言及する場合、一般的には、これらの形態および誘導体のすべてが含まれる。
【００２０】
一実施形態において、組成物は、組成物中の脂肪酸の重量基準で、少なくとも40％の、EPAおよびDHAの少なくとも1種、より好ましくは、少なくとも45％、55％、65％、75％、85％または95％の、EPAおよびDHAの少なくとも1種を含む。一実施形態では、組成物は、1種の脂肪酸、好ましくはEPAまたはDHAのいずれか一方を、高濃度で含有する。例えば、組成物は、その中の脂肪酸の重量％で、少なくとも80％のEPA、例えば少なくとも90％のEPA、例えば約97％のEPAを含むことができる。少なくとも一実施形態では、組成物は、その中の脂肪酸の重量基準で、少なくとも60％の、EPAおよびDHAの少なくとも1種、例えば、組成物中の脂肪酸の重量基準で、少なくとも75重量％、少なくとも80％、例えば約84％の、EPAおよびDHAの少なくとも1種を含む。一実施形態では、組成物はDHAを含まない。別の実施形態では、組成物はEPAを含まない。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態において、組成物のEPA：DHAの重量比は、約1：10〜約10：1、約1：8〜約8：1、約1：6〜約6：1、約1：5〜約5：1、約1：4〜約4：1、約1：3〜約3：1、または約1：2〜約2：1の範囲である。少なくとも一実施形態では、組成物のEPA：DHAの重量比は、約1：2〜約2：1の範囲である。少なくとも一実施形態では、組成物のEPA：DHAの重量比は、約1：1〜約2：1の範囲である。少なくとも一実施形態では、組成物のEPA：DHAの重量比は、約1.2：約1.3の範囲である。
【００２２】
別の実施形態において、組成物は、EPAとDHA、またはそれらの誘導体、の特定の混合物から選択され、例えば、油1gあたり約360mgのEPAと240mgのDHA、油1gあたり400mgのEPAと200mgのDHA、油1gあたり500mgのEPAと200mgのDHA、油1gあたり150mgのEPAと500mgのDHA、油1gあたり460mgのEPAと380mgのDHA、油1gあたり900mg超のEPA、油1gあたり900mg超のDHA、および97％のEPA、を含む組成物から選択される。
【００２３】
好ましい実施形態において、本発明に従って使用するための組成物は、約84重量％のEPAおよびDHAのn-3 PUFA混合物を含み、好ましくは、Omacor、Lovazaという名称の医薬品、またはこれらのジェネリック医薬品のように、グラムあたり460mgのEPA-エチルエステルと380mgのDHA-エチルエステルを含み、この場合、PCB 153の量は5.0ng/g未満である。
【００２４】
EPAおよびDHAに加えて、他の多価不飽和脂肪酸、特にオメガ3脂肪酸が組成物中に存在してもよい。一実施形態では、組成物は、EPAおよびDHA以外の少なくとも1種の脂肪酸をさらに含む。少なくとも1種の他の脂肪酸は、例えば、α-リノレン酸(ALA)、ヘンエイコサペンタエン酸（HPA）、ドコサペンタエン酸(DPA)、エイコサテトラエン酸(ETA)、エイコサトリエン酸(ETE)、ステアリドン酸(SDA)、ヘキサデカトリエン酸(HTA)、テトラコサペンタエン酸、テトラコサヘキサエン酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される。一実施形態では、組成物はDPAを、例えば5重量％まで、例えば約2重量％含む。ある種のオメガ6脂肪酸、例えばアラキドン酸またはγ-リノレン酸などが存在してもよいが、その含有量を低く保つことが好ましい。
【００２５】
PCB 153と高脂肪食(HFD)の間には相乗的相互作用があるため、肥満およびNAFLは、曝露のない患者と比較して、PCB 153に曝露した患者において増加し、PCB 153とHFDとが組み合わさると肝代謝を大きく変化させる。代謝物グルタチオンは、HFD単独と比較して、HFD＋PCB 153では大幅に減少することが示されている。酸化的ストレス、肝ミトコンドリアの機能、および肝グルタチオン(GSH)の減少は、NAFLDの病因に関与している。しかしながら、オメガ3 PUFAは、脂肪肝における脂質過酸化を低減させ、肝臓の肝含有量を減少させ、GSHを増加させる。しかし、この有益なn-3 PUFAの効果は、本発明の組成物を使用しない限り、PCB 153の存在によって打ち消される可能性がある。したがって、PCB 153とオメガ3 PUFAが同じ代謝プロセスに反対方向で影響を及ぼすことを認識すると、オメガ3脂肪酸の効果を打ち消すほどの量のPCB 153を含まないオメガ3組成物をこの患者グループに提供することが重要である。従って、本発明の組成物中のPCB 153の量は最小限に抑えられる。PCB 153の量は5.0ng/g(組成物)未満にすべきである。より好ましくは、組成物中のPCB 153の量は、4.0ng/g未満、3.0ng/g未満、2.0ng/g未満、さらには1.0ng/g未満、例えば0.7ng/g未満である。
【００２６】
組成物は、少なくとも1種の抗酸化物質をさらに含んでもよい。本組成物に適する抗酸化物質の例としては、限定するものではないが、α-トコフェロール(ビタミンE)、混合トコフェロール、EDTAカルシウム二ナトリウム、酢酸αトコフェリル類、ブチルヒドロキシトルエン類(BHT)、およびブチルヒドロキシアニソール類(BHA)が挙げられる。好ましい実施形態では、組成物は混合トコフェロールを含む。混合トコフェロールは、典型的には、α-、γ-およびδ-トコフェロールの全ての形態を含む。一実施形態では、組成物はα-トコフェロールを唯一の抗酸化物質として含まない。組成物は少なくとも1mg/g(組成物)の量で抗酸化物質を含むべきである。一実施形態では、組成物は3.0mg/g(組成物)未満の量で抗酸化物質を含む。一実施形態では、混合トコフェロールなどの抗酸化物質は、非遺伝子組換え生物(genetically modified organism: GMO)由来である。好ましくは、組成物は非GMO混合トコフェロールを含む。
【００２７】
別の態様において、本発明は、NAFLD患者の血液中のn-3 PUFAのレベルを上昇させる方法、またはn-3 PUFAの不足を是正する方法を提供する。この方法は、PCB 153の体内負荷に寄与することなく、例えば患者の血液中のPCB 153レベルの上昇に寄与することなく、n-3 PUFAレベルの上昇または是正を提供する。本発明は、患者、特にNAFLD患者の血液中のn-3 PUFAのレベルを上昇させる方法、またはn-3 PUFAの不足を是正する方法を提供し、該方法では、組成物中の脂肪酸の重量基準で、少なくとも40重量％の、EPAおよびDHAまたはそれらの誘導体の少なくとも1種を含み、かつ組成物中のPCB 153の量が5.0ng/g未満である組成物を、該患者に投与する。
【００２８】
本発明は、NAFLDと診断された患者における海産n-3 PUFAの血中レベルを上昇させる方法を提供する。本発明の方法または組成物の使用によって達成されるn-3 PUFAの上昇または是正は、赤血球中のDHAおよび/またはEPAの富化として定量することができる。一実施形態では、本発明の方法を使用することによって得られた赤血球EPAおよびDHAの変化は、全脂肪酸のパーセンテージとして、少なくとも10％、例えば少なくとも20％、例えば30〜60％の上昇である。
【００２９】
あるいは、実際の赤血球EPAおよび赤血球DHAの定量的測定を行うことができる。本発明の方法により、赤血球EPAおよび赤血球DHAの量の大幅増加が達成される。
【００３０】
あるいは、血漿リン脂質または血清リン脂質中のDHAおよびEPA量、または全PUFA量を定量することができる。これらの方法でも、血液検査を実施して、その量を、例えばガスクロマトグラフィーによって測定する。Louら(2014)に関連して、本発明は、血液中の血清リン脂質中の全n-3 PUFAレベルが全脂肪酸の約8.0重量％以上、例えば約10.0重量％以上に上昇する方法を提供する。全n-3 PUFAレベルは、全血漿または血清リン脂質脂肪酸の重量パーセンテージ(wt％)で、血漿または血清リン脂質エイコサペンタエン酸(EPA)およびドコサヘキサエン酸(DHA)レベルの合計として定義され得る。血液サンプル中の、個々の脂肪酸のレベルに加えて、PUFAレベル、すなわちEPAとDHAの合計は、ガスクロマトグラフィーによって測定することができる。Eideら、「The association between Marine n-3 polyunsaturated fatty acid level and survival after renal transplantation (海産n-3系多価不飽和脂肪酸レベルと腎移植後の生存との関連性)」、Clin J Am Soc Nephrol 10, June 2015によって報告されたコホート研究も参照されたい；そこには、研究対象集団のPUFAレベルが示されている。血漿リン脂質中の海産n-3 PUFAの中央値レベルは7.95重量％であり、Louらによって見出されたレベルと同様であった。この研究の一般的な結論は、より高い血漿リン脂質海産n-3 PUFAレベルがより良好な患者生存と関連する、というものであった。これらのデータに基づいて、本出願人は、PCB 153レベルが特に低い組成物を使用することによって、NAFLD患者でPUFAの同じ血中レベルが達成されるべきであると理論付ける。したがって、一実施形態では、本発明は、本発明の組成物を投与することによって、NAFLDと診断された患者の血液中の血漿リン脂質中のn-3 PUFAのレベルを約8.0重量％以上に上昇させる方法を提供する。より好ましくは、n-3 PUFAレベルを約10.0重量％以上に上昇させる。
【００３１】
好ましくは、前記レベルの上昇または栄養不足の是正は、赤血球中の全脂肪酸に対する海産オメガ3 PUFAのパーセンテージであるオメガ3指数の有意な増加として評価される。赤血球脂肪酸組成、ひいてはオメガ3指数は、サンプリング前の最後の数日間の対象者の食事によってより多く影響される血漿測定値とは対照的に、海産オメガ3 PUFAの長期摂取を反映している。同時に、本発明の組成物を使用すると、オメガ3 PUFAのレベルは上昇するが、血液中のPCB 153の量は最小限に増加するか、または変わらない。その結果、本発明の方法により、血液中のオメガ3 PUFA対PCB 153の比は上昇することが期待される。オメガ3指数は、EPA＋DHAを赤血球の全脂肪酸含有量のパーセンテージとして表現する。したがって、別の実施形態では、本発明は、NAFLDと診断された患者に、n-3 PUFAを含む本発明の組成物を、n-3 PUFAの不足を是正するのに、またはその血中レベルを上昇させるのに十分な量で十分な時間にわたり投与することを含んでなる、NAFLDと診断された患者を治療する方法を提供し、この方法ではオメガ3指数(％)が増加する。非アルコール性脂肪肝疾患の診断を受けた患者は、血液中のn-3 PUFAのレベルが非常に低くなりやすく、オメガ3指数が約3％、例えば3〜4％であるか、さらに低いことがある。本発明の方法または組成物を用いる本明細書に開示された治療により、患者のオメガ3指数(％)の絶対値は、約6.0％以上、より好ましくは7.0％以上、例えば8.0％以上に増加すると期待される。一実施形態では、オメガ3指数は、治療の結果として、少なくとも10％、例えば少なくとも20％、例えば少なくとも40％の倍率増加で増加する。特に治療開始前に非常に低いレベルを有する患者の場合には、オメガ3指数の100％またはそれ以上の倍率増加でさえも、治療の結果として期待される。
【００３２】
別の実施形態において、本発明は、血液中のn-3 PUFAに対するn-6 PUFAの比率のアンバランスを是正するための開示された方法を提供する。一実施形態では、本発明は、血漿リン脂質中のn-3 PUFAに対するn-6 PUFAの比率を、約4.0未満、より好ましくは3.0未満の比に是正する方法を提供する。
【００３３】
さらに、本発明の組成物または方法を使用することにより、NAFLDと診断された患者は肝臓脂肪の減少を示す可能性が高い。肝臓脂肪率の改善が期待され、これはDHAおよび/またはEPAの富化に関連している。一実施形態では、本発明の方法は、治療中に、肝臓脂肪の少なくとも10％の減少、より好ましくは肝臓脂肪(肝脂肪変性)の少なくとも15％の減少、より好ましくは肝臓脂肪の少なくとも20％の減少をもたらす。結果は、例えば、治療開始時の肝臓脂肪の量、組成物の投与量、および患者が治療されていた期間に依存する。
【００３４】
本発明の有益な効果を実証するための臨床試験が進行中である。この試験では、非アルコール性脂肪肝に関連する危険因子に及ぼす栄養是正の影響が評価される。この試験の評価項目は、上記のものに加えて、肝臓酵素ALT、AST、GGT；総コレステロール；LDLコレステロール；HDLコレステロール；および小集団でのMRIによる肝臓脂肪である。本発明の一実施形態では、この試験で達成される効果が、本発明の方法によりもたらされる。
【００３５】
本発明の一つ以上の実施形態において、本方法は、少なくとも、患者の血液中のn-3 PUFAのレベルを測定するステップを含む。こうした測定は、1回または数回行うことができ、PUFAのレベルが許容可能なレベルであるかどうかを調べるために、または投与すべき用量など、その後の治療を決定するために、定期的に行うことができる。PUFAレベルは、例えばガスクロマトグラフィーにより、血漿リン脂質、血清リン脂質において測定されるか、あるいはPUFAのレベルは赤血球において測定され得る。本方法はさらに、個々のn-3 PUFAまたは全n-3 PUFAの増加パーセントを算出するステップを含むことができる。一実施形態では、組成物の用量は、PUFA不足を是正するため、PUFAレベルを上昇させるため、またはオメガ6：オメガ3比のアンバランスを是正するために、測定の結果に基づいて調整される。
【００３６】
組成物の1日あたりの総投与量は、約0.600g〜約6.000gの範囲であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、組成物の総投与量は、約0.800g〜約4.000g、約1.000g〜約4.000g、例えば3.000g、または約1.000g〜約2.000gの範囲である。
【００３７】
組成物は、1〜10回の投与量で、例えば1日1〜4回、例えば1日1回、2回、3回または4回、さらに例えば1日1回、2回または3回投与することができる。投与は、対象者にn-3 PUFAの投与量を提供する経口または任意の他の投与形態であり得る。好ましい実施形態では、対象者は1gのカプセルを1日3回投与され、好ましくは、該カプセルはそれぞれ460mgのEPA-エチルエステルと380mgのDHA-エチルエステルを含む。一実施形態では、その用量は、個々の患者について測定されたn-3 PUFAのレベルに応じて調整される。組成物は、好ましくは、長期間にわたって、例えば12〜52週間など、例えば24〜46週間投与される。12〜16週後にn-3 PUFAの適切なレベルに達すると予想されるが、患者はこのレベルを維持するために治療を継続すべきである。一実施形態では、患者は残りの生涯にわたって組成物を服用し続けるべきである。PCB 153の含有量が低い開示された組成物を、開示された用量および期間で投与することによって、上記の治療結果が予測される。
【００３８】
組成物は、NAFLDに関連する危険因子を減らすことができる。特に、本発明の組成物または方法を用いることによって、肝脂肪症を軽減し、かつ/または肝脂質代謝を正常化し、かつ/またはアディポサイトカインを是正することで肝機能が改善され、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、慢性肝疾患、肝細胞癌、2型糖尿病、および心血管疾患のリスクを低減させることができる。一実施形態では、本発明の方法は、NAFLを逆転させ、したがって、この疾患がNASH、肝硬変または肝不全へと進行するリスクを減らすことができる。
【００３９】
別の態様において、本発明は、NAFLDと診断された患者の治療に使用するための、少なくとも40重量％の、EPAおよびDHAまたはその誘導体の少なくとも1種を含み、PCB 153の量が5.0ng/g未満である組成物を提供する。この態様は、最初の2つの態様について上で概説したのと同じ実施形態を含む。それゆえに、この使用は、先に記載したように、患者の血液中のn-3 PUFAのレベル上昇をもたらすか、またはn-3 PUFAの不足を是正する。
【００４０】
本開示のいくつかの実施形態において、組成物は有効医薬成分(API)として作用する。いくつかの実施形態では、組成物の脂肪酸は薬学的に許容される量で存在する。本明細書で使用する用語「薬学的に有効な量」は、それを必要とする対象者における少なくとも1つの健康問題を治療する、例えば結果や症状などを軽減および/または緩和する、のに十分な量を意味する。本発明の少なくともいくつかの実施形態では、組成物は追加の活性薬剤を含まない。この実施形態では、組成物はNAFLDと診断された患者の薬学的治療において使用され得る。組成物が医薬組成物である場合、組成物は、組成物の重量基準で、少なくとも75％のEPAおよびDHAの少なくとも1種を含むことが好ましい。例えば、一実施形態では、組成物は、組成物の重量基準で、少なくとも80％、例えば少なくとも85％、少なくとも90％、または少なくとも95％のEPAおよびDHAを含む。
【００４１】
別の実施形態において、本発明による組成物は、EPAおよびDHAの少なくとも1種を含む食品サプリメントまたは栄養補助食品である。関連する実施形態では、本発明は、特定医療用経腸製剤(Enteral Formulas for Special Medical Use)、特定保健用食品(Foods for Specified Health Uses)、特定医療用食品(Food for Special Medical Purposes: FSMP)、特別用途食品(Food for Special Dietary Use: FSDU)、医学的栄養剤(Medical Nutrition)、および医療用食品(Medical food)の群から選択される組成物を提供する。このような組成物は、n-3 PUFAなどの特定の栄養素が不足している患者に特に適している。組成物は、特有の栄養要求を有するNAFLD患者の栄養管理に適している。こうした組成物は、典型的には、医学的管理下で対象者に投与される。この実施形態では、組成物は、NAFLDと診断された患者の血液中のn-3 PUFAのレベルを上昇または是正するために、関連するn-3 PUFA、特に第1の態様に開示されるようなEPAおよび/またはDHAを含む。したがって、NAFLD患者の治療用の組成物は、上記の群から選択される。好ましい実施形態では、組成物は、NAFLD患者への投与に適した医療用食品であるか、またはその一部を形成する。本発明の組成物および方法は、ターゲット集団における栄養不足を是正することができる。したがって、本発明はNAFLDに関連する危険因子の栄養的是正を提供する。また、NAFLDの栄養管理において、例えば医療用食品として、本組成物を使用する場合、組成物はEPAおよび/またはDHAの高濃縮組成物とすることが好適である。好ましくは、組成物は、組成物の重量基準で、少なくとも55％のEPAおよびDHAの少なくとも1種を含む。
【００４２】
開示される本組成物は、例えば、カプセル、錠剤、または他の任意の薬物送達形態で、投与することができる。例えば、組成物をゼラチンカプセルの中などに封入し得る。上記のそれぞれの製剤形態は、組成物の定義にすべて包含される。そのような製剤の例としては、自己マイクロ乳化型薬物送達システム(SMEDDS)、自己ナノ乳化型薬物送達システム(SNEDDS)、および自己乳化型薬物送達システム(SEDDS)があり、これらは水性の溶液の中でエマルションを形成している。例えば、組成物は、胃液/腸液と混合されたときに自然発生的にエマルションを形成する、上記のいずれかの予備濃縮物の形態であり得る。そのようなエマルションは、形成されると、体内への取り込みのための脂肪酸の向上したもしくは改善された安定性、および/または吸収のための増大した表面積を提供することができる。さらに、組成物は、有効成分/栄養成分がマイクロカプセル化されているエマルションおよび製剤の形態、またはゲルもしくは半固体製剤の形態であり得る。
【００４３】
本発明の組成物は、粗魚油からPCB 153を除去するプロセスによって調製される。このプロセスは、米国を指定するWO2004/007654(参照により本明細書に組み込まれる)に概説されるストリッピング法を含むことができる。WO2004/007654に概説されるように、そのようなストリッピング法には、薄膜蒸発プロセス、分子蒸留、または揮発性作動流体を使用する脂肪酸油混合物の短行程蒸留が含まれる。揮発性作動流体は、精製すべき脂肪酸油混合物と混合されてもよいし、ストリッピング工程で別々に添加されてもよい。揮発性作動流体は、脂肪酸エステル、脂肪酸アミド、および遊離脂肪酸の少なくとも1種を含む。PCB 153は、その揮発性作動流体と一緒に取り除かれる。こうしたプロセスは、PCB 153を除去するように最適化されたステップをさらに含み、好ましくは、ストリッピングカラムに送る供給速度の調整を含む。特に、高濃度のEPAおよび/またはDHA(例えば、組成物中の脂肪酸の重量基準で、少なくとも60％のEPAおよびDHAの少なくとも1種)を含む組成物を調製する場合、PCB 153の低レベルは、例えばストリッピングカラムへの供給速度を低下させることによって、達成される。一実施形態では、ストリッピングされる脂肪酸油混合物の供給速度は10〜80kg/h・m2である。供給速度を低下させると、より多くのPCB 153汚染物質が除去されることが分かった。その結果として生産能力が低下するにしても、極めて高純度の油を得ることの成果は非常に有利である。あるいは、温度を、好ましくは200〜240℃の範囲内で、上げることによって、またはストリッピングを2回以上行うことによって、ストリッピング工程の条件を変更してもよい。ストリッピング工程の条件およびパラメータは、供給物の組成、利用可能な装置、特にどの製品組成を調製するのかといった、いくつかのパラメータに依存する。一実施形態では、汚染物質を除去し、PCB 153含有量が低減された精製油中間体を調製するためのストリッピング工程に続いて、エステル交換工程を行う。好ましくは、ストリッピング処理工程の後に、ストリッピングされた海産油混合物を、実質的に無水の条件下で、かつ適切な触媒(化学触媒または酵素)の存在下で、C1-C6アルコールとのエステル交換反応を少なくとも1回行って、海産油混合物中にトリグリセリドとして存在する脂肪酸を、対応するアルコールのエステルに変換する工程を行う。その後、得られた生成物を精製することができ、すなわち、脂肪酸の分離および所望のn-3 PUFAの回収によって精製する。これは、例えば、蒸留、好ましくは1回以上の分子蒸留を含んでもよいし、あるいはクロマトグラフィー分離のような他の方法で行ってもよい。最終組成物は、好ましくはエステル化および回収後に、請求項に記載の少量のPCB 153を含む。
【００４４】
以下、本発明の好ましい実施形態を、単なる例示として、添付の図面を参照して説明する。図1aおよび1bは、EPAおよびDHAの高濃縮組成物についての、それぞれ2010年および2014〜2015年の、2つの一連のバッチにおけるPCB 153の量の分析からのバッチデータを提供する。
【実施例】
【００４５】
［実施例１  EPAおよびDHAの組成物中のPCB 153の測定］
EPAおよびDHAエチルエステルの高濃縮組成物中のPCB 153の量を、下記の方法を用いて、2010年および2014〜2015年に調製したバッチにおいて定量し、製造プロセスの進展を評価し、かつ精製工程(ストリッピング)の有効性を検討した。約5gの組成物をn-ヘキサンに溶解し、13C標識したPCBの定量用標準品を加えた。酸性シリカゲルおよびアルミナ酸化物による清浄化の後、13C標識した注入用標準品を添加した。PCB 153の量の測定は、高分解能ガスクロマトグラフィー/高分解能質量分析システムで行った。計算は、対象の各天然同族体(PCB 153を含む)につき1つの13C標識標準品を使用して、同位体希釈法により行った。
【００４６】
結果(図1aおよび1b)は、2010年に生産されたバッチと比較して、2014〜2015年に製造されたバッチでは最適化プロセスがより低いPCB 153レベルをもたらすことを示している。2014〜2015年の組成物では、PCB 153の量は一貫して1.0ng/g未満であった。
【００４７】
［実施例２  PCB 153に曝露したおよび曝露しない脂肪性HepG2細胞に対するオメガ3効果のin vitro評価］
脂肪過剰蓄積の側面を有する肝細胞脂肪症の実験モデルであるHepG2細胞のin vitroヒトNAFLDモデルは、in vitroで細胞への脂質曝露を行うことによって、明白な細胞傷害の非存在下にかなりの細胞内脂肪蓄積を誘導することにより樹立した。パルミチン酸(C16：0)とオレイン酸(C18：1)は、健常者とNAFLD患者の両方において、肝臓トリグリセリド中の最も豊富な脂肪酸である。ヒト肝細胞由来の細胞株であるHepG2細胞を、1日目に5000細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに播種した。Gomez-Lechonら、「A human hepatocellular in vitro model to investigate steatosis (脂肪症を研究するためのヒト肝細胞in vitroモデル)」、Chemico-Biological Interactions 165 (2007): 106-116に以前に記載されたように、2日目に、これらの細胞をオレイン酸-パルミチン酸の組み合わせ(2：1の比で1mM)で24時間処理した。脂質の細胞内蓄積を、波長490nmで分光光度法を用いて、オイルレッドO染色により検出して定量した。オイルレッドOは、パラホルムアルデヒドで細胞を固定した後に、細胞内脂質の油滴を染色する。比色乳酸脱水素酵素(LDH)アッセイを用いて、細胞死が存在しないことを確認した。乳酸脱水素酵素(LDH)は、多くの異なるタイプの細胞に存在する細胞質内酵素である。形質膜が損傷すると、LDHは細胞培養培地に放出される。放出されたLDHは、LDH細胞傷害性検出キットを用いて、メーカーの説明書に従った手順により、共役した酵素反応によって定量した。その結果は、HepG2細胞の脂質曝露が、明白な細胞傷害の非存在下で、未処理対照細胞と比較して増加した細胞内脂肪蓄積をもたらし、NAFLDの実験モデルに相当することを示している(図2)。
【００４８】
実験的NAFLDに対するn-3 PUFAの効果を評価するために、HepG2細胞を、1mMのオレイン酸/パルミチン酸と共に、100μMの濃度のEPAおよびDHA(1：1)を用いて、または対照として脂肪酸フリーのウシ血清アルブミン(BSA)を用いて、24時間処理した。脂肪酸フリーのBSAを6mM脂肪酸/2.4mM BSAの比で用いて脂肪酸保存液を調製したので、対照としてBSAを使用した。脂質の細胞内蓄積は、波長490nmで分光光度法を用いて、オイルレッドO染色により検出して定量した。EPAおよびDHAで処理すると、細胞内脂質の蓄積が減少した(図3)。
【００４９】
上記のように、EPA/DHAで処理したおよび処理していない、脂肪性HepG2細胞を、DMSOに溶解したPCB 153(保存液1mM、最終濃度50μM)または対照としてDMSO単独に曝露した。プレーティングの24時間後に、EPA/DHAとPCB 153を、オレイン酸/パルミチン酸と共に添加し、該細胞を37℃で24時間処理した。上記のように脂質のオイルレッドO染色を用いて、細胞内脂質の蓄積を定量した。PCB 153曝露は、NAFLDの実験的in vitroモデルにおいて、脂肪症の発生に対するn-3 PUFA (EPA/DHA)の有益な効果を弱めることが判明した(図4)。
【図１】
2020121972.tif 000002
【図２】
2020121972.tif 000003
【図３】
2020121972.tif 000004
【図４】
2020121972.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月7日(2020.4.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非アルコール性脂肪肝(NAFL)患者の治療に使用するためのn-3系多価不飽和脂肪酸(n-3 PUFA)の組成物であって、該組成物中の脂肪酸の重量基準で、少なくとも60重量％のエイコサペンタエン酸(EPA)エチルエステルおよびドコサヘキサエン酸(DHA)エチルエステルの少なくとも1種を含み、該組成物中のPCB 153の量が0.7ng/g未満であることを特徴とする、組成物。
【請求項２】
前記患者の血液中のn-3 PUFAのレベル上昇をもたらすか、またはn-3 PUFAの不足を是正する、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
n-3 PUFAの上昇または是正が、全脂肪酸のパーセンテージとして赤血球EPAおよびDHAにおいて得られた変化として測定され、この上昇が少なくとも10％である、請求項1または2に記載の組成物。
【請求項４】
n-3 PUFAのレベルが、血液中の全血漿または血清リン脂質脂肪酸レベルの約8.0重量％以上に上昇する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項５】
オメガ3指数(％)が20％増加する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が、特定医療用経腸製剤、特定保健用食品、特定医療用食品(FSMP)、特別用途食品(FSDU)、医学的栄養剤、および医療用食品の群から選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物のEPAエチルエステル：DHAエチルエステルの重量比が約1：10〜約10：1の範囲である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が海産油に由来する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が約84重量％のEPAエチルエステルおよびDHAエチルエステルを含み、好ましくはグラムあたり460mgのEPA-エチルエステルおよび380mgのDHA-エチルエステルを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が抗酸化物質、好ましくは混合トコフェロールをさらに含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１１】
オメガ3指数(％)が血液中の全脂肪酸の約6.0％以上に上昇する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が血液中のn-3 PUFAに対するn-6 PUFAの比率のアンバランスを是正する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１３】
n-3系多価不飽和脂肪酸(PUFA)の組成物であって、該組成物中の脂肪酸の重量基準で、少なくとも60重量％のEPAエチルエステルおよびDHAエチルエステルの少なくとも1種を含み、該組成物中のPCB 153の量が0.7ng/g未満であることを特徴とする、組成物。
【請求項１４】
抗酸化物質、好ましくは混合トコフェロールをさらに含む、請求項13に記載の組成物。
【外国語明細書】
2020121972000001.pdf