(57)【要約】【課題】血中のフリー体のＡＩＭを増加させる組成物を提供することを課題とする。【解決手段】ドリアン及び／又はアサフェティダの搾汁物、乾燥物または抽出物を有効成分として含有する血中のフリー体ＡＩＭ増加用の組成物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドリアン及び／又はアサフェティダの搾汁物、乾燥物または抽出物を有効成分として含有する血中のフリー体ＡＩＭ増加用の組成物。
【請求項２】
ドリアン果実抽出物がγ−グルタミルシステインを含有する請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ドリアン及び／又はアサフェティダの搾汁物、乾燥物または抽出物が、血中のＡＩＭとＩｇＭ複合体からフリー体ＡＩＭを生成させる作用を有する請求項１または２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血中フリー体ＡＩＭ増加用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＩＭ（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ；ＣＤ５Ｌ、ａｐｉ６、Ｓｐαとも称する）は、組織マクロファージが特異的に産生する分子量約５０ｋＤａの分泌型タンパク質である（非特許文献１）。ＡＩＭは、システイン残基を多く含む特異的な配列であるｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ（ＳＲＣＲ）ドメインをタンデムに３つつなげた構造をしており、それぞれのシステイン残基は各ドメイン内で互いにジスルフィド結合することで、コンパクトな球状の立体構造をしていると考えられている。
【０００３】
ＡＩＭは、尿中へ排出されず、血液中で安定的に存在する。このために、ＩｇＭとの結合が深く関与していること、またほとんどすべてのＡＩＭは血液中ではＩｇＭと複合体を形成し、非結合体で存在することがほとんどないことが報告されている（非特許文献２）。
そしてＡＩＭとＩｇＭの結合様式は、ＩｇＭ五量体のギャップの中にＡＩＭが嵌まり込むような形で結合し、ＡＩＭが持つ、システインを多く含む３つのドメインのうち、２番目のドメインに存在するフリーのシステイン残基が、ＩｇＭ五量体にあるギャップの片側に存在するフリーのシステインとジスルフィド結合により結合していること、ＡＩＭのＣ末端側の３番目のドメイン内に存在する正に荷電したアミノ酸のクラスターが、ギャップのもう片側に存在する負に荷電したアミノ酸クラスターと電荷による結合をしており、ＡＩＭにより、ギャップの両側のＩｇＭがクロスブリッジされていることが明らかになっている（非特許文献３）。
【０００４】
ヒトにおけるＡＩＭの作用効果の全貌は、未だ不明な点が多いが、その作用効果の一部が明らかになるにつれて、新たな医薬用途の発明がなされている。
特許文献１には、ＡＩＭを含有してなる、肝疾患の予防・治療剤の発明が記載されている。
【０００５】
特許文献２には、ＡＩＭもしくはその部分ペプチドを含有してなる、腎疾患の予防・治療剤の発明が記載されている。
特許文献１および２には、いずれもＡＩＭタンパク質又はペプチド断片を有効成分とする疾患治療剤や、その遺伝子を利用した新たな治療剤やＡＩＭ遺伝子の利用が開示されている。
また特許文献３は、ＡＩＭの作用を抑止する医薬発明が記載されている。すなわちＡＩＭと結合性を有し、ＡＩＭ作用を抑制する抗体やＡＩＭ遺伝子に対するアンチセンス核酸や、ＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸を投与することで、ＡＩＭの作用を抑制し、メタボリックシンドロームを治療するための医薬発明が記載されている。
【０００６】
ＡＩＭは、生体中ではマクロファージによって産生されるが、血液中では、上記の通り、ＩｇＭと複合体を形成しており、不活性化されている。そして、腎疾患や肝臓疾患の進行に伴って、フリー体のＡＩＭが出現し、疾患の改善にプラスに作用する。
例えば、急性腎障害、脂肪肝、肝細胞癌、肥満、真菌性腹膜炎、多発性硬化症などさまざまな疾患症状に対し抑制的な効果を示すことが確認されている。特にネコに腎不全が多発するのは、ネコのＡＩＭが、ＡＩＭ−ＩｇＭ五量体（複合体）から解離しないためであることが明らかになっている（非特許文献４）。
また、このような疾患の指標として、血中のＡＩＭ濃度を測定する技術が、特許文献４、５、６に開示されている。
しかし、これまで血中に存在するＩｇＭの五量体とＡＩＭの複合体からＡＩＭをフリー体として生成させる手段や薬剤は提供されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１６２０２１号
【特許文献２】国際公開第２０１５／１１９２５３号
【特許文献３】国際公開第２０１１／１４５７２３号
【特許文献４】国際公開第２０１１／１４５７２５号
【特許文献５】国際公開第２０１７／０２２３１５号
【特許文献６】国際公開第２０１７／０４３６１７号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８９：４１３−４２２，１９９９
【非特許文献２】Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ３，１１８７−１１９８，Ａｐｒｉｌ  ２５，２０１３
【非特許文献３】Ｈｉｒａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ａｄｖ．２０１８；４：ｅａａｕ１１９９  １０  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１８
【非特許文献４】Ｓｕｇｉｓａｗａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．６：３５２５１（２０１６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、多数の天然物や化合物のＡＩＭに対する作用を研究する過程で、多数の天然物や抽出物のスクリーニングを行い、ドリアン果実抽出物及び香辛料に利用されるアサフェティダ抽出物が、血中のＡＩＭとＩｇＭの複合体からＡＩＭを生成させることを見出し、本発明をなした。
すなわち、本発明は、血中のＡＩＭとＩｇＭの複合体からＡＩＭを生成させ、血中のフリー体のＡＩＭ濃度を上昇させる作用を有する組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下の構成からなる。
（１）ドリアン及び／又はアサフェティダの搾汁物、乾燥物または抽出物を有効成分として含有する血中のフリー体ＡＩＭ増加用の組成物。
（２）ドリアン果実抽出物がγ−グルタミルシステインを含有する（１）に記載の組成物。
（３）ドリアン及び／又はアサフェティダの搾汁物、乾燥物または抽出物が、血中のＡＩＭとＩｇＭ複合体からフリー体ＡＩＭを生成させる作用を有する（１）または（２）に記載の組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、ドリアン及び／又はアサフェティダの搾汁物、乾燥物または抽出物を有効成分として含有する血中のフリー体ＡＩＭ増加用の組成物が提供される。
本発明の組成物は、血中のフリー体ＡＩＭを増加させ、急性腎障害、脂肪肝、肝細胞癌、肥満、真菌性腹膜炎、多発性硬化症等のフリー体ＡＩＭが関与する疾患の予防改善剤として利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ドリアン果実熱水抽出物（熱水抽出エキス）、ドリアン果実から搾汁した果汁（ドリアン果汁）、ドリアン果実凍結乾燥粉末を試験試料のフリー体ＡＩＭ増加作用の試験結果を示すウエスタンブロット画像である。
【図２】図１の画像から読み取った試験試料のフリー体ＡＩＭの量を示すグラフである。
【図３】ドリアン果実のブタノール抽出物のフリー体ＡＩＭ増加作用の試験結果を示すウエスタンブロット撮影画像を示す。
【図４】図３の画像より読み取ったフリー体ＡＩＭの量を示すグラフである。
【図５】γ−グルタミルシステインのフリー体ＡＩＭ増加作用の試験結果を示すウエスタンブロット撮影画像を示す。
【図６】図５の画像より読み取ったフリー体ＡＩＭの量を示すグラフである。
【図７】アサフェティダ抽出物のフリー体ＡＩＭ増加作用の試験結果を示すウエスタンブロット画像である。
【図８】図７の画像より読み取ったフリー体ＡＩＭの量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明について具体的に説明する。
本発明でいう「フリー体ＡＩＭ」とは、ＡＩＭがＩｇＭの五量体から生成して、単独で血中に存在している状態をいう。当該フリー体ＡＩＭは、ＩｇＭをはじめとする血中のタンパク質や糖蛋白質と非結合の状態である。
ドリアン及び／又はアサフェティダの搾汁物、乾燥物または抽出物とは、ドリアン果実或いはアギを搾汁した搾汁液、乾燥させた乾燥物、あるいはドリアン果実又はアサフェティダの溶媒抽出物あるいは水蒸気蒸留物をいう。
本発明でいう「組成物」とは、ドリアン及び／又はアサフェティダの搾汁物、乾燥物または抽出物を含有し、血中フリー体増加効果を発揮するものをいう。「組成物」には食品、医薬品、健康食品、動物用飼料を包含する。
本発明においては、ＩｇＭ等と結合した状態のＡＩＭを「複合体ＡＩＭ」という。また複合体ＡＩＭとフリー体ＡＩＭの両方を合わせたＡＩＭ量を「全ＡＩＭ量」という。
なお、ＡＩＭの検出、定量は、特許文献４〜６に開示された抗ＡＩＭモノクローナル抗体を用いるイムノアッセイ法で測定することができる。
【００１４】
＜ドリアン果実抽出物＞
以下ドリアン果実抽出物について説明する。
本発明に用いるドリアン（Ｄｕｒｉｏ  ｚｉｂｅｔｈｉｎｕｓ  Ｍｕｒｒ．、Ｄｕｒｉｏ  ｏｘｌｅｙａｎｕｓ、Ｄｕｒｉｏ  ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓを含むＤｕｒｉｏ  ｓｐｐ．）は、ボルネオ島から西マレーシアを原産地とし、東南アジアに広く分布するパンヤ科の植物である。
本発明の有効成分であるドリアン果実抽出物は、ドリアンの果実の可食部から水性の溶媒によって抽出した物又は非水溶性の有機溶媒で抽出したもの、或いは水蒸気蒸留によって抽出したものをいう。
【００１５】
本発明において、溶媒抽出に用いられる抽出溶媒は、植物材料からの溶媒抽出に用いられる公知の抽出溶媒であればいずれも使用可能である。抽出溶媒としては、親水性の高い溶媒を用いると、本願発明の目的に合致した、効果の高い抽出物が得られるため、好ましく用いられる。このような溶媒として、本発明では、水、水溶性有機溶剤又はこれらの混合溶媒から選ばれる溶媒が特に好ましく用いられる。前記水溶性有機溶媒とは、水と相溶性を有する溶媒を指し、具体的には、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、等の低級アルコール、ブチレングリコール、プロピレングリコール等の多価アルコール類、その他アセトン等の極性の高い有機溶剤が挙げられる。また非水溶性の有機溶媒としては、ブタノール、酢酸メチル、酢酸エチル等の脂肪族カルボン酸エステル類が例示できる。
【００１６】
抽出に当たっては、ドリアン果肉、又はドリアン果肉乾燥物を、公知の適当な手段で果肉試料を細断、破砕する。溶媒による抽出は公知の方法に従って行えばよい。例えば、水、水溶性有機溶媒又はこれらの混合溶媒を抽出溶媒として用いた場合、抽出原料に対して質量比で１〜５０倍、好ましくは３〜１０倍の抽出溶媒量で、０℃〜１００℃の範囲で、かつ抽出溶媒の沸点より低い温度条件下で、０．１〜５０時間、好ましくは０．５〜２４時間抽出すればよい。抽出は静置状態でも良いが、より効率的に抽出を行うには、適度に攪拌しながら抽出を行うのが望ましい。
【００１７】
こうして得られるドリアン果実抽出物は、このまま食品に配合して良いし、濃縮や乾固させたものを錠剤などの形態に加工しても良い。さらに、抽出物を公知の順相カラムクロマトグラフィーや逆相カラムクロマトグラフィーや、分取用液体クロマトグラフィーなどの精製手段により分画、精製することにより得られる画分を用いても良い。
【００１８】
ドリアン果実抽出物には、分析により、次の化学式１で表されるγ−グルタミルシステインを含有していることを確認できる。
【００１９】
【化１】
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【００２０】
本発明のドリアン果実抽出物を配合した組成物は、フリー体のＡＩＭ増加の目的で各種医薬品、食品、健康食品、動物飼料等とすることが可能である。剤形としては特に制限されず、種々の形態とすることができ、具体的には、錠剤、カプセル剤、顆粒剤等経口投与のための形態とすることができる。
【００２１】
本発明に係るドリアン果実抽出物の、フリー体ＡＩＭ増加用組成物への配合量は、特に制限されず、また、目的、対象とする疾病により異なるので、一概に規定できるものではないが、一般的には乾固物換算で０．００００１〜９９質量％、好ましくは０．００１〜９９質量％で用いることで、血中のフリー体のＡＩＭ濃度を増加させることができる。
【００２２】
＜アサフェティダ抽出物＞
本発明で用いるアサフェティダは、和名をアギと呼ぶオオウイキョウ属アギ（ａｓｓａｆｏｅｔｉｄａ、学名：Ｆｅｒｕｌａ  ａｓｓａ−ｆｏｅｔｉｄａ）の植物又は、この植物から得られる樹脂状の香料をいう。樹脂状の香料のアサフェティダは、複数の揮発性硫黄化合物を含みニンニクやドリアンに似た強烈な臭いがある。アサフェティダは、別名をヒングとも呼ばれている。樹脂又はアギ全草から水蒸気蒸留して得られる蒸留物や、水又はアルコール抽出物であるアギエキスを抽出原料として使用することができる。
【００２３】
水蒸気蒸留によって本発明の組成物を得るには、樹脂状のアサフェティダ香料又は植物アギ、あるいはオオウイキョウ属の植物を乾燥させ又は生のままで使用することができる。水蒸気蒸留に先立ち、植物又は樹脂の裁断物を蒸留水に浸漬する。浸漬は、一般的に植物体１ｋｇに対して蒸留水を１〜１０Ｌの割合で使用するのが好ましい。浸漬温度は、特に限定されず、常温で行うのが好ましい。浸漬時間は、１〜２４時間程度である。あるいは、アサフェティダ根塊から得られる樹脂状の塊を同様に処理してもよい。
水蒸気蒸留は、公知の方法で実施すればよい。水蒸気蒸留水又は精油画分を回収し、これを本発明の組成物として用いる。
【００２４】
なお、植物アギ、あるいはオオウイキョウ属の植物から本発明の組成物を得るには植物体は、必要に応じて水洗浄した後、裁断し水切りしたものを用いる。原料のアギやオオウイキョウ属の植物は、搾汁または抽出の効率を高めるため、搾汁または抽出の前に、原料を細断（約１〜２０ｍｍ）し、またはミキサーなどで破砕する。
【００２５】
搾汁の調製は、濾布や、各種のフィルター、メッシュ金網などを用いて通常の方法で行うことができる。この場合、加圧して作業効率を高めてもよい。別法として、遠心分離（１０００〜２００００ｒｐｍ）により搾汁を得ることもできる。
【００２６】
抽出液の調製は、溶媒として、水のほか、各種の有機溶媒およびそれらの混合物を用い、公知の抽出方法で行う。抽出操作を行う前に、原料をそのまま、または粗く細断したものを、疎水性もしくは親水性溶媒単独または混合有機溶媒で洗浄し、色素等の不要物を除去してもよい。疎水性溶媒としては、クロロホルム、エーテル、ヘキサン、シクロヘキサン、トルエン、ジクロロメタン、石油エーテルおよびベンゼンなどが挙げられ、親水性溶媒としては低級アルコール（例、メチル、エチル、ｎ−プロピル）、酢酸エチル、アセトンおよびアセトニトリルなどが挙げられる。所望により原料に水を適宜加え、原料を湿潤させてもよい。
【００２７】
水で抽出を行うには、例えば、原料１質量部に対し、水０．５〜１０質量部を加え、４０〜１２０℃で、５分〜２時間、好ましくは１０〜６０分間、さらに好ましくは１０〜２０分間抽出を行うことができる。このとき、撹拌により抽出効率を高めることもできる。また、抽出は、加熱還流により行うこともできる。抽出後、濾布、フィルターまたはメッシュ金網などを用いて濾過または圧搾を行う。この場合、加圧して作業効率を高めてもよい。また、別法として、遠心分離（１０００〜２００００ｒｐｍ）により抽出液を得ることもできる。回収率を高めるために、この抽出・濾過工程を１〜５回繰り返すことができる。
【００２８】
有機溶媒で抽出を行うには、例えば、原料１質量部に対し、溶媒０．５〜１０質量部を加え、水での抽出と同様にして抽出物を得ることができる。用いる溶媒としては上記した疎水性、親水性溶媒を単独で、または２種以上を組み合わせて使用することができ、含水溶媒も使用できる。特に、上記のように抽出前に原料を疎水性溶媒で洗浄して色素等の不要物を除去する場合および下記のように抽出後の粗抽出物を疎水性溶媒で洗浄する場合において、抽出に用いる溶媒としては、水、低級アルコール、５０〜８０％（ｖ／ｖ）含水低級アルコールが好ましい。これらの低級アルコールとしては上記と同様のものを例示できる。溶媒の除去は、濾過、遠心分離、蒸留などの常法に従って行うことができる。
【００２９】
本発明においては、得られた抽出物（抽出液を含む）は、そのまま本発明のフリー体ＡＩＭ増加用の組成物として使用することができる。また、精製、濃縮、乾燥などの処理を行ってもよい。
【００３０】
精製・濃縮は、上記抽出物を、親水性溶媒または含水溶媒に分散または溶解させ、濃縮して析出物を取得することを繰り返すことによって行うことができる。
或いは、公知の分離・精製に用いるクロマトグラフィー装置に高濃度に濃縮した画分を得ることもできる。これらの精製操作は繰り返して行うことができる。
【００３１】
本発明に使用可能なアサフェティダ抽出物は、市販されている抽出物であっても使用可能である。
【００３２】
本発明のアサフェティダ抽出物を配合した組成物は、フリー体のＡＩＭ増加の目的で各種医薬品、食品、健康食品、動物飼料等とすることが可能である。剤形としては特に制限されず、種々の形態とすることができ、具体的には、錠剤、カプセル剤、顆粒剤等経口投与のための形態とすることができる。
【００３３】
本発明に係るアサフェティダ抽出物の、フリー体ＡＩＭ増加用組成物への配合量は、特に制限されず、また、目的、対象とする疾病により異なるので、一概に規定できるものではないが、一般的には乾固物換算で０．００００１〜９９質量％、好ましくは０．００１〜９９質量％で用いることで、血中のフリー体のＡＩＭ濃度を増加させることができる。
【実施例】
【００３４】
実施例、試験例を示し、本発明についてさらに説明する。
＜実施例１．ドリアン果実抽出物＞
１．抽出物の調製
ドリアン果実を凍結乾燥させ、ミルサーにて粉末状にした。粉末状にしたドリアン果実（６．００ｇ）を高速溶媒抽出ＡＳＥ２００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、１００℃  １０００ｐｓｉの条件で抽出を行い、熱水抽出物（１．０９ｇ）を得た。
【００３５】
２．フリー体ＡＩＭ増加効果確認試験
（１）試験試料
熱水抽出物（熱水抽出エキス）、ドリアン果実から搾汁した果汁（ドリアン果汁）、ドリアン果実凍結乾燥粉末を試験試料とした。
【００３６】
（２）試験方法
ヒト血清とＰＢＳ（−）とを２：３の比率で混合し、血清希釈液を調製した。
熱水抽出物及びドリアン果実凍結乾燥粉末は、２０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように、ＰＢＳに分散又は溶解させた。ドリアン果汁は、そのまま試験に用いた。
果実の凍結乾燥粉末および熱水抽出物のＰＢＳ溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）あるいはドリアン果汁と血清希釈液を等容量で混合し、３７℃１時間インキュベートした。インキュベートしたものをフリー体ＡＩＭの増加を確認するウエスタンブロッティング用の試料とした。
【００３７】
（３）ウエスタンブロッティング
ウエスタンブロッティング用試料に４×ＬＤＳ試料用緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え混合し、１ウェルあたり血清が１μＬ含まれるようＸＶ  ＰＡＮＴＥＲＡ  ＭＰ  Ｇｅｌ（ゲル濃度：５〜２０％、ディー・アール・シー）にロードし、２００Ｖの定電圧でＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により試料中のタンパク質を分離した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｙｂｏｎｄ  Ｐ  ＰＶＤＦ  ０．４５、ＧＥヘルスケア）に転写した。
転写後のＰＶＤＦ膜をＴｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｗｉｔｈ  Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ  ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、続いてブロッキング溶液（５％スキムミルク／ＴＢＳＴ）に浸した後、室温で１時間振盪し、ブロッキング処理を行った。
ブロッキング処理を行ったＰＶＤＦ膜は抗体希釈用緩衝液で希釈した抗体と４℃、１６〜１８時間反応させた。反応後、ＰＶＤＦ膜を３回ＴＢＳＴで洗浄し、ブロッキング溶液で二次抗体を希釈して室温、１時間の条件で二次抗体反応を行った。なお、使用した抗体の希釈条件は以下の通りである。一次抗体：抗ヒト／マウスＡＩＭ抗体  ｒａｂ１(宮崎研究室で生産・非特許文献２等で使用)（１：３０００）、二次抗体：抗ウサギ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（１：５０００）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
反応終了後、再度３回、ＴＢＳＴで洗浄し、ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥヘルスケア）を基質として用い、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  Ｔｏｕｃｈ（ＢｉｏＲａｄ）にてシグナルの検出・撮影を行った。
同様の操作を血清のみの試料（ＰＢＳ添加）についても行った。
【００３８】
（４）結果
ウエスタンブロッティングの撮影画像を図１、画像より読み取ったフリー体ＡＩＭ量を図２に示す。
図１、図２に示すとおり、本来は血清には殆ど検出されないフリー体のＡＩＭに相当するバンドがドリアン果汁、ドリアン果実の凍結乾燥粉末及びドリアンの熱水抽出物（熱水抽出エキス）が出現した。なお図１には比較対照として、ヒト血清とＰＢＳの混合物に試料に相当する容量のＰＢＳを添加したものをＰＢＳと略記して表示した。このバンドがフリー体のＡＩＭであることは非特許文献２等で使用している組み換えＡＩＭを電気泳動の対照とすることで確認できた。
以上の試験結果から、ドリアンの果実には、通常血中に存在しないフリー体のＡＩＭを増加させる作用があることがわかった。
ドリアン抽出物による血中のフリー体ＡＩＭの増加により、急性腎障害、脂肪肝、肝細胞癌、肥満、真菌性腹膜炎、多発性硬化症等のフリー体ＡＩＭが関与する疾患の予防改善剤として期待される。
【００３９】
＜実施例２．ドリアン果実中のフリー体ＡＩＭ増加活性の分画＞
１．分画操作
ドリアン果汁２５ｍＬに対して、同量のブタノール（以下ＢｕＯＨ）２５ｍＬを加えて液々分配し、さらにその水層を再度ＢｕＯＨ  ２５ｍＬで繰り返し抽出した。
水層およびＢｕＯＨ層をそれぞれ乾固し、水層画分２．７ｇとＢｕＯＨ層画分１８０ｍｇを得た。
得られた水層画分２．７ｇをＸＧ−Ｃ３０Ｍ−５  １０×２５０ｍｍ  ５μｍカラム、移動相２％アセトニトリル（０．１％ギ酸水溶液）、流速５ｍＬ／分、検出ＵＶ２１０ｎｍの条件による高速液体クロマトグラフィーを用いてさらに分画を行った。
画分は、実施例１と同様にウエスタンブロッティングによって、フリー体ＡＩＭの増加効果を確認しながら行った。図３にブタノール抽出物のウエスタンブロット撮影画像、図４に画像より読み取ったフリー体ＡＩＭの量を示す。
得られた活性画分を乾固し、Ａｍｉｄｅ−８０  ７．８×３００ｍｍ  １０μｍカラム、移動相８０％アセトニトリル水溶液、流速２．８ｍＬ／分、検出ＵＶ２１０ｎｍの条件による高速液体クロマトグラフィーで再分画し、２ｍｇの最終活性画分を得た。
得られた最終活性画分は、ＴｏＦＭＳにて分子量及び組成式を得た。この最終画分は、分子量ｍ／ｚ２５１．０６９６（Ｍ＋Ｈ）、組成式Ｃ８Ｈ１４Ｎ２Ｏ５Ｓであった。この結果から活性物質の１つは、γ−グルタミルシステインと推定し、標品試薬としてγ−グルタミルシステイン(ＳＩＧＭＡ)を入手し、ＨＰＬＣで保持時間の一致、ＴｏＦＭＳにて分子量組成式及びフラグメンテーションの一致を確認した。
γ−グルタミルシステインは、次の化学式１で表すことができる。
【００４０】
【化２】
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【００４１】
＜実施例３．グルタミルシステインのフリー体ＡＩＭ増加効果確認試験＞
実施例１と同様に、グルタミルシステインのフリー体ＡＩＭ増加効果を確認した。
図５に高純度γ−グルタミルシステインのヒト血清中のＡＩＭ増加効果を確認したウエスタンブロット画像、図６にこの画像から読み取ったフリー体ＡＩＭ量のグラフを示す。（なお図５、図６には比較対照として、ヒト血清とＰＢＳの混合物に試料に相当する容量のＰＢＳを添加したものをＰＢＳと略記して表示した。）
γ−グルタミルシステインは強いフリー体ＡＩＭ増加作用を有することが確認された。
【００４２】
＜実施例４．アサフェティダ抽出物によるフリー体ＡＩＭ増加効果確認試験＞
市販されている水蒸気蒸留法で抽出されたアサフェティダ抽出物を用いて血中フリー体ＡＩＭの増加作用について試験を行った。
（１）試験試料
アサフェティダオイル(バイオアクティブズジャパン株式会社)を試験試料とした。
アサフェティダオイルは、最終の濃度が１％（Ｖ／Ｖ）になるようジメチルスルフォオキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた。
【００４３】
（２）試験方法
ヒト血清とＰＢＳ（−）とを２：３の比率で混合し、血清希釈液を調製した。
ＤＭＳＯに溶解したアサフェティダオイルをＰＢＳ（−）容量の１／５量を添加して調製した溶液と血清希釈液を等量で混合し、３７℃１時間インキュベートした。果実の凍結乾燥粉末および熱水抽出物のＰＢＳ溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）あるいはドリアン果汁と血清希釈液を等容量で混合し、３７℃１時間インキュベートした。これをウエスタンブロッティング用の試料とした。
【００４４】
（３）ウエスタンブロッティング
ウエスタンブロッティング用試料に４×ＬＤＳ試料用緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え混合し、１ウェルあたり血清が１μＬ含まれるようＸＶ  ＰＡＮＴＥＲＡ  ＭＰ  Ｇｅｌ（ゲル濃度：５〜２０％、ディー・アール・シー）にロードし、２００Ｖの定電圧でＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により試料中のタンパク質を分離した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｙｂｏｎｄ  Ｐ  ＰＶＤＦ  ０．４５、ＧＥヘルスケア）に転写した。
転写後のＰＶＤＦ膜をＴｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｗｉｔｈ  Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ  ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、続いてブロッキング溶液（５％スキムミルク／ＴＢＳＴ）に浸した後、室温で１時間振盪し、ブロッキング処理を行った。
ブロッキング処理を行ったＰＶＤＦ膜は抗体希釈用緩衝液で希釈した抗体と４℃、１６〜１８時間反応させた。反応後、ＰＶＤＦ膜を３回ＴＢＳＴで洗浄し、ブロッキング溶液で二次抗体を希釈して室温、１時間の条件で二次抗体反応を行った。なお、使用した抗体の希釈条件は以下の通りである。一次抗体：抗ヒト／マウスＡＩＭ抗体  ｒａｂ１（１：３０００）、二次抗体：抗ウサギ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（１：５０００）。
反応終了後、再度３回、ＴＢＳＴで洗浄し、ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥヘルスケア）を基質として用い、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  Ｔｏｕｃｈ（ＢｉｏＲａｄ）にてシグナルの検出・撮影を行った。
同様の操作を血清のみの試料についても行った。
【００４５】
（４）結果
ウエスタンブロッティングの撮影画像を図７に示す。
図７に示すとおり、アサフェティダ抽出物には、通常血中に存在しないフリー体のＡＩＭを増加させる作用があることがわかった。アサフェティダ抽出物による血中のフリー体ＡＩＭの増加により、急性腎障害、脂肪肝、肝細胞癌、肥満、真菌性腹膜炎、多発性硬化症等のフリー体ＡＩＭが関与する疾患の予防改善剤として期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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