(57)【要約】【課題】神経栄養因子発現量増進剤を提供すること。【解決手段】ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ−1,3−グルカンからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、神経栄養因子発現量増進剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ−1,3−グルカンからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、神経栄養因子発現量増進剤。
【請求項２】
ユーグレナ、パラミロン、及びパラミロン加工物からなる群より選択される少なくとも1種を含有する、請求項１に記載の神経栄養因子発現量増進剤。
【請求項３】
前記ユーグレナを含有し、且つ前記ユーグレナがユーグレナ・グラシリスである、請求項１又は２に記載の神経栄養因子発現量増進剤。
【請求項４】
前記ユーグレナを含有し、且つ前記ユーグレナがユーグレナ・グラシリスEOD-1株（受託番号FERM BP-11530）である、請求項１又は２のいずれかに記載の神経栄養因子発現量増進剤。
【請求項５】
前記パラミロンを含有し、且つ前記パラミロンがユーグレナ・グラシリス由来のパラミロンである、請求項１又は２のいずれかに記載の神経栄養因子発現量増進剤。
【請求項６】
前記パラミロンを含有し、且つ前記パラミロンがユーグレナ・グラシリスEOD-1株（受託番号FERM BP-11530）由来のパラミロンである、請求項１又は２のいずれかに記載の神経栄養因子発現量増進剤。
【請求項７】
BDNF発現量増進用である、請求項１〜６のいずれかに記載の神経栄養因子発現量増進剤。
【請求項８】
食品組成物、食品添加剤、化粧品、化粧品添加剤、又は医薬である、請求項１〜７のいずれかに記載の神経栄養因子発現量増進剤。
【請求項９】
経口組成物である、請求項１〜８のいずれかに記載の神経栄養因子発現量増進剤。
【請求項１０】
神経細胞活性化、神経変性疾患の予防又は改善、気分障害の予防又は改善、気力の向上、記憶力向上、糖及び／又は脂質代謝の改善、食欲抑制、脳卒中による脳傷害の抑制、脳卒中による後遺症の抑制、脳卒中後の運動機能の回復促進、疼痛抑制、視力増強、学習能力向上、注意力改善、抗ストレス、集中力改善、睡眠の質改善、精神安定化、抗肥満、脳機能改善、日常生活における運動機能の維持又は改善、学習機能の精度向上、脳腫瘍の予防又は改善、痴呆症の予防又は改善、脳虚血障害の予防又は改善、脊髄損傷の改善、及びてんかんの予防又は改善からなる群より選択される少なくとも1種に用いるための、請求項１〜９のいずれかに記載の神経栄養因子発現量増進剤。
【請求項１１】
ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ−1,3−グルカンからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、
神経細胞活性化、神経変性疾患の予防又は改善、気分障害の予防又は改善、気力の向上、記憶力向上、糖及び／又は脂質代謝の改善、食欲抑制、脳卒中による脳傷害の抑制、脳卒中による後遺症の抑制、脳卒中後の運動機能の回復促進、疼痛抑制、視力増強、学習能力向上、注意力改善、抗ストレス、集中力改善、睡眠の質改善、精神安定化、抗肥満、脳機能改善、日常生活における運動機能の維持又は改善、学習機能の精度向上、脳腫瘍の予防又は改善、痴呆症の予防又は改善、脳虚血障害の予防又は改善、脊髄損傷の改善、及びてんかんの予防又は改善からなる群より選択される少なくとも1種に用いるための組成物。
【請求項１２】
ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ−1,3−グルカンからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、神経突起伸長促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経栄養因子発現量増進剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化の進展や社会経済状況等を背景として、近年、アルツハイマー病等の神経変性疾患やうつ病等の気分障害等が増加している。BDNF（Brain-Derived Neurotrophic Factor）等の神経栄養因子は、神経細胞の新生、生存、発達、成長等に関与しており、これらの疾患や状態の改善に関与することが報告されている。例えば、特許文献１では、プラセンタ抽出物が神経栄養因子の発現量を増進すること、及び該抽出物を用いた上記疾患や状態の改善剤について報告されている。
【０００３】
ユーグレナは、ミドリムシ属（＝ユーグレナ属）に属する微細藻類であり、食品材料として利用されている。また、ユーグレナ抽出物を皮膚に適用することも行われている。また、パラミロンは、ミドリムシが産生するβ−1,3−グルカンであり、創傷治療やアレルギー抑制などに有用であることが報告されている。しかしながら、ユーグレナやβ−1,3−グルカンと神経栄養因子遺伝子との関連については未だしられていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2012−136448号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、神経栄養因子発現量増進剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ−1,3−グルカンからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、神経栄養因子発現量増進剤であれば、上記課題を解決できることを見出した。この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。  即ち、本発明は、下記の態様を包含する：
【０００７】
項１．  ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ−1,3−グルカンからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、神経栄養因子発現量増進剤。
【０００８】
項２．  ユーグレナ、パラミロン、及びパラミロン加工物からなる群より選択される少なくとも1種を含有する、項１に記載の神経栄養因子発現量増進剤。
【０００９】
項３．  前記ユーグレナを含有し、且つ前記ユーグレナがユーグレナ・グラシリスである、項１又は２に記載の神経栄養因子発現量増進剤。
【００１０】
項４．  前記ユーグレナを含有し、且つ前記ユーグレナがユーグレナ・グラシリスEOD-1株（受託番号FERM BP-11530）である、項１又は２のいずれかに記載の神経栄養因子発現量増進剤。
【００１１】
項５．  前記パラミロンを含有し、且つ前記パラミロンがユーグレナ・グラシリス由来のパラミロンである、項１又は２のいずれかに記載の神経栄養因子発現量増進剤。
【００１２】
項６．  前記パラミロンを含有し、且つ前記パラミロンがユーグレナ・グラシリスEOD-1株（受託番号FERM BP-11530）由来のパラミロンである、項１又は２のいずれかに記載の神経栄養因子発現量増進剤。
【００１３】
項７．  BDNF発現量増進用である、項１〜６のいずれかに記載の神経栄養因子発現量増進剤。
【００１４】
項８．  食品組成物、食品添加剤、化粧品、化粧品添加剤、又は医薬である、項１〜７のいずれかに記載の神経栄養因子発現量増進剤。
【００１５】
項９．  経口組成物である、項１〜８のいずれかに記載の神経栄養因子発現量増進剤。
【００１６】
項１０．  神経細胞活性化、神経変性疾患の予防又は改善、気分障害の予防又は改善、気力の向上、記憶力向上、糖及び／又は脂質代謝の改善、食欲抑制、脳卒中による脳傷害の抑制、脳卒中による後遺症の抑制、脳卒中後の運動機能の回復促進、疼痛抑制、視力増強、学習能力向上、注意力改善、抗ストレス、集中力改善、睡眠の質改善、精神安定化、抗肥満、脳機能改善、日常生活における運動機能の維持又は改善、学習機能の精度向上、脳腫瘍の予防又は改善、痴呆症の予防又は改善、脳虚血障害の予防又は改善、脊髄損傷の改善、及びてんかんの予防又は改善からなる群より選択される少なくとも1種に用いるための、項１〜９のいずれかに記載の神経栄養因子発現量増進剤。
【００１７】
項１１．  ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ−1,3−グルカンからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、
神経細胞活性化、神経変性疾患の予防又は改善、気分障害の予防又は改善、気力の向上、記憶力向上、糖及び／又は脂質代謝の改善、食欲抑制、脳卒中による脳傷害の抑制、脳卒中による後遺症の抑制、脳卒中後の運動機能の回復促進、疼痛抑制、視力増強、学習能力向上、注意力改善、抗ストレス、集中力改善、睡眠の質改善、精神安定化、抗肥満、脳機能改善、日常生活における運動機能の維持又は改善、学習機能の精度向上、脳腫瘍の予防又は改善、痴呆症の予防又は改善、脳虚血障害の予防又は改善、脊髄損傷の改善、及びてんかんの予防又は改善からなる群より選択される少なくとも1種に用いるための組成物。
【００１８】
項１２．ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ−1,3−グルカンからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、神経突起伸長促進剤。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、神経栄養因子発現量増進剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】神経栄養因子発現量測定試験（試験例1）の結果を示す。縦軸は、BDNFの発現量をβ-actinの発現量で除した値の相対値である。横軸中、コントロールはネガティブコントロールとしてPBSを添加した場合を示し、その他は被検物質及びその濃度を示す。
【図２】神経突起伸長評価試験（試験例2）の結果を示す、SH-SY5Y細胞の写真像である。写真下方において、PBSはネガティブコントロールとしてPBSを添加した場合を示し、パラミロンはパラミロンを添加した場合を示す。
【図３】神経突起伸長評価試験（試験例2）の結果を示す、神経突起長の測定結果である。縦軸は、神経突起長の平均値（相対値）を示す。PBSはネガティブコントロールであり、PBSをCaco-2細胞培地に添加して得られた試験用液をSH-SY5Y細胞に添加した場合を示し、RAはポジディブコントロールであり、試験用液に代えてレチノイン酸を添加した場合を示し、その他はパラミロンを各濃度でCaco-2細胞培地に添加して得られた試験用液をSH-SY5Y細胞に添加した場合を示す。*は、t検定によるPBSに対する有意差が0.05未満であることを示し、**は同有意差が0.01未満であることを示し、***は同有意差が0.001未満であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００２２】
本明細書中において、「及び／又は」なる表現については、「及び」と「又は」のいずれを選択した場合の意味も包含する。すなわち、「A及び／又はB」なる表現には、「A又はB」と「A及びB」のいずれの意味も包含される。
【００２３】
本発明は、その一態様において、ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ−1,3−グルカンからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、神経栄養因子発現量増進剤（本明細書において、「本発明の剤」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
【００２４】
1．ユーグレナ
ユーグレナは、ミドリムシ属（＝ユーグレナ属）に属する微細藻類であり、その限りにおいて特に制限されない。ユーグレナとして、具体的には、例えばEuglena gracilis（ユーグレナ・グラシリス）、Euglena longa、Euglena caudata、Euglena oxyuris、Euglena tripteris、Euglena proxima、Euglena viridis、Euglena sociabilis、Euglena ehrenbergii、Euglena deses、Euglena pisciformis、Euglena spirogyra、Euglena acus、Euglena geniculata、Euglena intermedia、Euglena mutabilis、Euglena sanguinea、Euglena stellata、Euglena terricola、Euglena klebsi、Euglena rubra、Euglena cyclopicolaなどが挙げられる。これらの中でも、本発明の効果をより確実に発揮できるという観点から、好ましくはユーグレナ・グラシリスが挙げられ、より好ましくはユーグレナ・グラシリスEOD-1株［2013年6月28日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター｛NITE-IPOD（郵便番号292-0818  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8  120号室）｝にブダペスト条約の規定下で、受託番号FERM BP-11530として国際寄託済み］が挙げられる。
【００２５】
ユーグレナの形態は、ユーグレナの細胞体又はその成分の大半を含むものである限り、特に制限されない。ユーグレナの形態としては、例えばユーグレナの乾燥粉末形態、ユーグレナの懸濁液、ユーグレナエキス等が挙げられ、中でも、好ましくはユーグレナの乾燥粉末形態が挙げられる。
【００２６】
ユーグレナの乾燥状態におけるパラミロン含有率は、例えば50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上である。
【００２７】
ユーグレナは、1種単独であってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【００２８】
2．β−1,3−グルカン、パラミロン
β−1,3−グルカンは、グルコースがβ1,3結合のみで連結してなる1本の糖鎖（又は糖鎖構造）を主鎖として有するものであれば特に制限されない。β−1,3−グルカンは、直鎖状のものに限らず、分枝鎖を有するものも包含する。
【００２９】
β−1,3−グルカン誘導体の重量平均分子量は、特に限定されないが、例えば1×104〜2×106、好ましくは5×104〜1×106、更に好ましくは1×105〜1×106ある。なお、重量平均分子量は、GPC法により測定することができる。
【００３０】
β−1,3−グルカンは、化学合成により得られたものであってもよいが、入手容易性等の観点から、各種生物が産生する天然β−1,3−グルカンが好ましい。天然β−1,3−グルカンとしては、例えばパラミロン、カードラン、ラミナラン、カロース、レンチナン、シゾフィラン等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはパラミロンが挙げられる。以下、パラミロンについて説明する。
【００３１】
パラミロンは、ユーグレナ由来のβ−1,3−グルカンであり、その限りにおいて特に制限されない。
【００３２】
パラミロンが由来するユーグレナについては、上記「1．ユーグレナ」における説明と同様である。
【００３３】
パラミロンの質量平均分子量は、特に限定されないが、例えば1×104〜5×106、好ましくは2×104〜1×106、より好ましくは5×104〜1×106、さらに好ましくは1×105〜5×105である。
【００３４】
なお、質量平均分子量は、SEC-MALS分析により、以下の条件で測定 することができる：
SEC装置：LC−10AVP system（Shimadzu Co．、日本）、
使用カラム：KD-806M（shodex．、日本）、
MALS検出器：DAWN HELEOSII（wyatt Technologies．、U．S．A．）、
溶離液：1%LiCl/DMI、
流速：0.5 mL/分。
【００３５】
パラミロンは、ユーグレナの細胞内において、通常、β−1,3−グルカン鎖が形成する3重螺旋構造体が一定の規則性の基に高度に集積してなるパラミロン粒子として存在している。
【００３６】
パラミロン粒子の形状は、特に制限されないが、通常は、偏平な回転楕円体状である。
【００３７】
パラミロン粒子の粒子径分布は、特に制限されないが、例えば0.5〜15μm、好ましくは1〜6μmである。また、パラミロン粒子の平均粒子径も特に制限されないが、例えば1〜10、好ましくは2〜4μmである。
【００３８】
パラミロンの形態は、パラミロンを含むものである限り、特に制限されない。ユーグレナの形態としては、例えばパラミロンの乾燥粉末形態、パラミロンの懸濁液等が挙げられ、中でも、好ましくはパラミロンの乾燥粉末形態が挙げられる。
【００３９】
パラミロンは、1種単独であってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【００４０】
3．ユーグレナ及びパラミロンの製造方法
ユーグレナは、液体に含まれたユーグレナを培養する工程（培養工程）を含む方法により、大量に調製することが可能である。培養工程は、例えば公知の方法（例えば、特許第5883532号公報に記載の方法）に従って行うことができる。該培養工程では、典型的には、水と、ユーグレナと、ユーグレナが利用できる栄養素とを含む液体（培養液）を撹拌しつつ好気条件でユーグレナ属微細藻類を培養する。
【００４１】
栄養素としては、糖類（グルコース（ブドウ糖）、フルクトース（果糖）などの単糖類、又は、スクロース（ショ糖）、マルトース（麦芽糖）などの二糖類）、ミネラル類（例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、鉄、亜鉛、モリブデン、銅、リン、窒素、硫黄、又は、ホウ素など）、ビタミンB類（例えばビタミンB1（チアミン）、ビタミンB2（リボフラビン）、ナイアシン、パントテン酸、ビタミンB6（ピリドキシン、ピリドキサール、又はピリドキサミン）、ビタミンB12（シアノコバラミン）、葉酸、ビオチンなど）などが挙げられる。培養液中の栄養素の濃度は、ユーグレナの生存、増殖等が可能な濃度である限り特に制限されない。
【００４２】
培養工程の光条件は特に制限されず、培養工程は明条件と暗条件のいずれで行われてもよい。従属栄養培養にて培養する際には暗条件で培養される。明条件としては、藻類を増殖させるための通常の光強度を採用することができる。暗条件としては、例えば10μmol/m2/s未満、好ましくは光が全く当たらない完全な暗所条件が挙げられる。
【００４３】
培養工程における培養温度は、ユーグレナが増殖できる温度であれば、特に限定されない。該培養温度（培養液の温度）としては、例えば、20℃〜35℃が採用される。
【００４４】
培養工程における液体のpHは、ユーグレナが増殖できるpHであれば、特に限定されない。ユーグレナが増殖できるpHとしては、例えば3.0〜5.5が採用される。
【００４５】
培養工程の後に、液体の遠心分離や重力分離などによってユーグレナを濃縮することが好ましい。得られたユーグレナは、所望の形態に応じて、追加の処理（例えば、液体への懸濁、水中又は油中への分散、エキス抽出、乾燥粉末化等）に供することができる。
【００４６】
パラミロン粒子は、公知の方法（例えば特許第5883532号公報に記載の方法）に従って又は準じて、ミドリムシから分離、単離、又は精製することによって製造することができる。パラミロン粒子は、例えばミドリムシの細胞膜を破壊することによって得られる細胞内容成分を回収することによって、容易に得ることができる。また、必要に応じて、パラミロン粒子を精製してもよい。パラミロン粒子の精製については各種知られており（例えば、特許第5883532号公報）、それらの方法に従って行うことができる。精製工程としては、例えば、界面活性剤処理工程、洗浄工程などが挙げられる。得られたユーグレナは、所望の形態に応じて、追加の処理（例えば、液体への懸濁、水中又は油中への分散、乾燥粉末化等）に供することができる。
【００４７】
4．パラミロン加工物
パラミロン加工物は、パラミロンに対して加工処理、例えば物理処理、化学処理等することによって得られるものであり、その限りにおいて特に制限されない。パラミロン化合物としては、例えば、繊維化パラミロン、アモルファスパラミロン等が挙げられる。アモルファルパラミロンは、公知の方法に従って又は準じて、例えば特開2011−184592号公報に記載の方法を用いて化学的に処理することにより、得ることができる。
【００４８】
パラミロン化合物としては、繊維化パラミロンが好ましい。以下に、繊維化パラミロンについて説明する。
【００４９】
繊維化パラミロンは、ユーグレナ由来のβ−1,3−グルカンであり、繊維状の形態のものである限りにおいて特に制限されない。これまで、パラミロン粒子を化学処理（アルカリ処理等）して得られたアモルファスパラミロンが報告されているが、これは、電子顕微鏡で観察すると繊維化であるとは認められず、形や大きさが不定形の塊であるため、繊維化パラミロンには包含されない。
【００５０】
繊維化パラミロンの重量平均分子量は、特に限定されないが、例えば1×104〜2×107、好ましくは1×105〜5×105である。
【００５１】
なお、重量平均分子量は、SEC-MALS分析により、以下の方法で測定することができる：SEC装置：LC−10ADvp system（Shimadzu Co．、日本）、使用カラム：KD-806M（shodex．、日本）、
MALS検出器：DAWN HELEOSII（wyatt Technologies．、U．S．A．）、溶離液：1%LiCl/DMI、
流速：0.5 mL/分。
【００５２】
繊維化パラミロンの繊維の直径は、特に制限されないが、例えば10〜500 nm、好ましくは20〜300 nm、より好ましくは50〜200 nmである。繊維化パラミロンの繊維の直径は、通常、繊維化パラミロンの電子顕微鏡像に基づいて測定することができる。
【００５３】
繊維化パラミロンの水中沈定体積は、特に制限されないが、例えば30〜300 mL/g、好ましくは50〜250 mL/g、より好ましくは70〜200 mL/gである。
【００５４】
水中沈定体積は以下の方法に従って又は準じて測定することができる：
「日本食物繊維学会監修、日本食物繊維学会編集委員会編（２００８）食物繊維  ‐基礎と応用‐  第３版, ｐ．１１１  第一出版, 東京」に記載されている方法に準じて測定を行う。具体的には、次の通りである。サンプルのスラリー状の試験試料を、25 mL容積のプラスチックチューブに、乾燥質量換算で125 mg計り取り、プラスチックチューブを手で激しく振って、内容物を撹拌する。その後、25 mL容積のメスシリンダーに内容物を移し、25 mLになるまで純水を加える。メスシリンダー内の液体を撹拌した後、37℃で24時間静置する。これによりサンプルが沈殿し、界面を介して分けられる2つの層（沈殿したサンプルを主に含む層（下層）、及び水を主に含む層（上層））が生じる。下層の体積をメスシリンダーの目盛から求め、得られた体積をサンプル質量（乾燥質量）で除して、水中沈定体積（mL/g）を算出する。試験は3回又は4回行い、平均値及び標準偏差を算出する。
【００５５】
繊維化パラミロンは、酵素による分解に対して、比較的高い耐性を有する。例えば、βグルカナーゼの分解により生成されるモノマー（グルコース）の量は、繊維化パラミロン1 g当たり、例えば0.1〜50 mg、好ましくは1〜10 mgである。
【００５６】
この量は以下の方法に従って又は準じて測定することができる：
反応液［被検物質30 mg（乾燥重量）、緩衝液（東京化成工業社製 B0156、フタル酸水素カリウム-水酸化ナトリウムバッファー (pH4.0)）5 mL、酵素液（日本バイオコン社製  endo-1,3-β-Glucanase (酵素含有量：50 units/mL)）0.1 mL、純水、反応液量 10 mL］を調製し、40℃で24時間、45 rpmで水平振盪する。振盪後、直ちに凍結保存し、濃縮のために凍結乾燥する。凍結乾燥後、各試料に純水を0.5 mLずつ加え、攪拌する（20倍濃縮）。遠心分離（10000G、5分間、4℃）し、上澄を回収する作業を2回繰り返す。回収した上澄中のグルコース濃度を、測定キット（和光純薬工業社製、グルコースCII-テストワコー）を用いて測定する。測定値に基づいて、被検物質1 g当たりのグルコース生成量（mg）を算出する。
【００５７】
繊維化パラミロンは、アルカリ溶液への溶解性が、比較的低い。例えば、繊維化パラミロンは、0.1〜0.3Mの水酸化ナトリウム水溶液に対して溶解しない。ここで、「溶解しない」とは、例えば、当該水溶液に繊維化パラミロンを懸濁した後（例えば、直後〜1時間経過後）の溶液の吸光度（660 nm）が、例えば0.1以上、好ましくは1.0以上であることを意味する。
【００５８】
溶解性は以下の方法に従って又は準じて測定することができる：
被検物質250 mg（乾燥重量）をバイアル中の試験液（純水、0.1M NaOH水溶液、0.3M NaOH水溶液）10 mLに懸濁する。バイアルを20秒間、手で激しく振った後、およびシェーカーで80 rpmで1時間振盪した後に、それぞれバイアル中の液の660 nmにおける吸光度を測定する。なお、吸光度の測定は、日本分光株式会社製分光光度計 V-730を用いて行う。
【００５９】
繊維化パラミロンの結晶化度の粒状パラミロンに対する相対値（繊維化パラミロンの結晶化度／粒状パラミロンの結晶化度）は、例えば0.60〜0.90、好ましくは0.65〜0.80である。
【００６０】
結晶化度は以下の方法に従って又は準じて測定することができる：
被検物質について、XRD測定する。条件は次のとおりである。機器：PANalytical X’Pert3 Powder、管電圧：45kV、管電流：40mA、測定範囲：5.005〜50.018°、測定間隔：0.013°、解析ソフト：HighScore。結晶化度は2θ=5〜80°における非晶質部の強度と結晶部の強度の比により解析する。解析は各測定テ一夕から装置によるバックグラウンドを除去（バックグラウンド設定Auto、ベンティングファクター0、粒状度100）した後に実施し、非晶質部は2θ=14、29°を通る接線で決定する。それぞれの非晶質部を決定するペンディングファクターと粒状度の条件は、0/20とする。
【００６１】
繊維化パラミロンは、水などの溶媒に分散した形態であってもよいし、乾燥形態であってもよい。繊維化パラミロンは、乾燥形態であっても、水に再分散することが可能である。
【００６２】
なお、本明細書において、「乾燥形態」とは、水分含量が15質量％以下、好ましくは10質量％以下、より好ましくは5質量％以下であることを示す。
【００６３】
繊維化パラミロンとしては、好ましくはこのパラミロン粒子を物理的に解繊処理して得られる、パラミロン粒子の解繊物を用いることができる。また、この解繊処理をユーグレナに適用することによって得られる、ユーグレナの解繊処理物を、繊維化パラミロンとして用いることもできる。
【００６４】
解繊処理は、パラミロン粒子中に存在するβ-1,3グルカンの水素結合をほとんど切断せずに（例えば、β-1,3グルカンの水素結合の10％以下、5％以下、2％以下、1％以下しか切断せずに）解繊することができる処理、又はパラミロン粒子中に存在するβ−1,3−グルカン鎖又はこれが形成する3重螺旋構造体の一部又は全部を解くことができる処理である限り特に制限されない。好ましくはパラミロン粒子中に存在するβ-1,3グルカンの水素結合をほとんど切断せずに解繊処理し、繊維状とすることが好ましい。パラミロン粒子の様な微粒子を摩砕（せん断）又は粉砕（好ましくは摩砕（せん断））することができる公知の処理を、解繊処理として採用することができる。
【００６５】
解繊処理は、公知の摩砕機（せん断機）、粉砕機などの装置を用いて行うことができる。解繊処理に用いる装置としては、例えば石臼式摩砕機、ジェットミル、二軸混練機、高圧ホモジナイザー、高圧乳化機、二軸押し出し機、ビーズミルなどが挙げられる。これらの中でも、好ましくは石臼式摩砕機やビーズミルが挙げられる。
【００６６】
解繊処理は、湿式で行うことも、乾式で行うこともできる。湿式で解繊処理を行う方が、繊維化パラミロンをより効率的に溶液中に分散させることが可能となり、好ましい。湿式で行う場合の溶媒としては、繊維化パラミロンを分散可能な溶媒である限り特に制限されず、水を好適に用いることができる。
【００６７】
解繊処理は、1種単独であってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。また、一部が解繊処理されたパラミロンであってもよく、解繊処理されたパラミロンを含む限り本発明の意図するものである。
【００６８】
5．用途
ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ−1,3−グルカンは、神経栄養因子発現量増進作用を有するので、ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ−1,3−グルカンからなる群より選択される少なくとも1種は、神経栄養因子発現量増進剤の有効成分として利用することができる。
【００６９】
発現量の増進対象領域としては、特に制限されるものではないが、例えば神経細胞、神経組織（例えば脳等）、体液（特に、血液）等が挙げられる。
【００７０】
また、ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ−1,3−グルカンは、神経栄養因子発現量増進作用を有するので、ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ−1,3−グルカンからなる群より選択される少なくとも1種は、神経突起伸長促進剤の有効成分として利用することができる。
【００７１】
また、ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ−1,3−グルカンからなる群より選択される少なくとも1種は、神経栄養因子発現量増進作用及び／又は神経突起伸長促進に基づく種々の用途、例えば神経細胞活性化（例えば、神経細胞の分化、生存、機能の維持及び再生、神経突起（例えば樹状突起、軸索）の伸長、神経伝達物質の合成等の促進）、神経変性疾患（例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ポリグルタミン病（ハンチントン病、脊髄小脳変性症等）、プリオン病（ウシ海綿状脳症、クロイツフェルト・ヤコブ病等）等）の予防又は改善、気分障害（例えばうつ病、不安等）の予防又は改善、気力の向上、記憶力向上、糖及び／又は脂質代謝の改善（より具体的には、例えばインスリン感受性、糖尿病の改善）、食欲抑制（より具体的には、例えば過食や肥満の抑制）、脳卒中による脳傷害の抑制、脳卒中による後遺症の抑制、脳卒中後の運動機能の回復促進、疼痛抑制（特に、慢性疼痛の抑制）、視力増強、学習能力向上、注意力改善、抗ストレス、集中力改善、睡眠の質改善、精神安定化、抗肥満、脳機能改善、日常生活における運動機能の維持又は改善、学習機能の精度向上、脳腫瘍の予防又は改善、痴呆症の予防又は改善、脳虚血障害の予防又は改善、脊髄損傷の改善、及びてんかんの予防又は改善からなる群より選択される少なくとも1種に用いるための組成物や本発明の剤等の有効成分として利用することも可能である。好ましくは、これらの用途の内の複数（2つ以上、より好ましくは3つ以上、さらに好ましくは4つ以上、よりさらに好ましくは5つ以上、よりさらに好ましくは6つ又はそれ以上）の用途を含む包括的な用途に利用することができる。
【００７２】
さらには、以下に列挙する用途、目的、対象、：
（a）認知機能の維持
（b）記憶力の維持
（c）集中力のサポート
（d）学習能力のサポート
（e）ストレスケア
に利用することもできる。
【００７３】
対象となる神経栄養因子は、特に制限されるものではないが、例えばBDNF、NGF、NT-3、NT-4/5、NT-6、CNTF、LIF、GDNF等が挙げられる。これらの中でも、特に好ましくはBDNFが挙げられる。これらは、1種単独であってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【００７４】
本発明の剤は、各種分野において、例えば食品組成物（健康食品、健康増進剤、栄養補助食品（サプリメントなど）を包含する）、食品添加剤、化粧品、化粧品添加剤、医薬、試薬、飼料などとして用いることができる。本発明の剤は、好ましくは経口組成物である。
【００７５】
本発明の剤の形態は、特に限定されず、用途に応じて、各用途において通常使用される形態をとることができる。
【００７６】
本発明の剤の形態としては、用途が食品組成物の場合は、液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳などの飲料、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキミックス、乳製品（例えば、粉末状、液状、ゲル状、固形状等）、パン、菓子（例えば、クッキー等）などが挙げられる。
【００７７】
本発明の剤の形態としては、用途が化粧品である場合は、例えば乳液、化粧液、フェイスクリーム、ハンドクリーム、ローション、ボディソープ、シャンプー、リンス、化粧用ゲル、パック、ファンデーション、リップクリーム、洗顔剤等が挙げられる。
【００７８】
本発明の剤の形態としては、用途が医薬である場合は、例えば軟膏剤、外用液剤（リニメント剤、ローション剤等）、スプレー剤（外用エアゾール剤、ポンプスプレー剤等）、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤（プラスター剤、硬膏剤等のテープ剤（リザーバー型、マトリックス型等）、パップ剤、パッチ剤、マイクロニードル等）、点眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、坐剤、直腸用半固形剤、注腸剤等の非経口摂取に適した製剤形態（特に、外用製剤形態）；  錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などの経口摂取に適した製剤形態（経口製剤形態）が挙げられる。
【００７９】
本発明の剤の形態としては、用途が添加剤、健康増進剤、栄養補助食品（サプリメントなど）などである場合は、例えば錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などが挙げられる。
【００８０】
本発明の剤は、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、食品組成物（健康食品、健康増進剤、栄養補助食品（サプリメントなど）を包含する）、食品添加剤、化粧品、化粧品添加剤、医薬、試薬、飼料などに配合され得る成分である限り特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、着色料、香料、キレート剤などが挙げられる。
【００８１】
本発明の剤における有効成分の含有量は、用途、使用態様、適用対象の状態などに左右されるものであり、限定はされないが、例えば0.0001〜100質量％、好ましくは0.001〜50質量％とすることができる。
【００８２】
本発明の剤の適用（例えば、投与、摂取、接種など）量は、神経栄養因子発現量増進作用を発現する有効量であれば特に限定されず、通常は、有効成分の乾燥重量として、一般に一日あたり0.1〜10000 mg/kg体重である。上記適用量は1日1回以上（例えば1〜3回）に分けて適用するのが好ましく、年齢、病態、症状により適宜増減することもできる。
【実施例】
【００８３】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００８４】
参考例1
ユーグレナとして、ユーグレナ・グラシリスEOD-1株（独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（NITE-IPOD）の乾燥粉末（神鋼環境ソリューション製、パラミロン含有率70％以上）を準備した。
【００８５】
参考例2
パラミロン粒子を以下のようにして調製した。
【００８６】
準備したユーグレナ・グラシリスEOD-1株（培養後、乾燥前の状態のもの）を、5フラスコ分の液体を集め、集めた液体を遠心管内で遠心分離（500×g、4分間、室温）した。遠心管内の上澄み液をいったん取り除いて回収した。回収した上澄み液を遠心管に入れて遠心管内の沈殿物を分散させ、100 mL容積のメスシリンダーに全て移した。さらに、メスシリンダーに、回収した上澄み液を加えて、90 mLにメスアップした。
【００８７】
［酵素処理工程］
90 mLにメスアップした液体を200 mLビーカーに移し、撹拌しながら塩酸水溶液を添加することによって液体のpHを3に調整した。タンパク質分解酵素（酸性プロテアーゼ 製品名「プロテアーゼＹＰ−ＳＳ」ヤクルト薬品工業社製 至適pH2.5~3.0）を5 g／L濃度となるように液体に添加した。液体を撹拌しつつ50℃にて2時間、酵素処理を施した。
【００８８】
［界面活性剤処理工程］
ドデシル硫酸ナトリウムの濃度が3.0質量／容量（w／v）％となるように、酵素処理工程を経た液体に、ドデシル硫酸ナトリウムの水溶液を加えた。ドデシル硫酸ナトリウムを含む液体を撹拌しつつ、塩酸水溶液の添加によって液体のpHを3に調整した。さらに、液体をプロペラ撹拌機（回転速度200 rpm）で60℃にて30分間撹拌した。
【００８９】
［分離工程］
遠心分離（1000×g、2分間、室温）によってパラミロンを沈殿させ、界面活性剤処理工程を経た液体から、パラミロンを分離した。ドデシル硫酸ナトリウムの濃度が1.0質量／容量％となるように変更した点、pHを調整しなかった点以外は、同様にしてさらに界面活性剤処理工程を行った。その後、上記と同様にして分離工程を行った。このようにして、界面活性剤処理工程及び分離工程をそれぞれ3回ずつ行った。
【００９０】
［洗浄工程］
分離工程において遠心分離によって沈殿したパラミロンを、純水によって懸濁させ、40℃にて10分間静置した。次に、遠心分離（1000×g、2分間、室温）によってパラミロンを沈殿させた。このような操作を合計3回行った。
【００９１】
［乾燥工程］
洗浄工程において遠心分離によって沈殿したパラミロンを、50℃にて乾燥させて、パラミロン粒子を得た。得られたパラミロン粒子を、以下の試験例でパラミロンとして用いた。
【００９２】
試験例1．神経栄養因子発現量測定試験
サンプル（パラミロン）の神経栄養因子発現量に対する影響を解析した。具体的には、以下のようにして解析した。
【００９３】
試験例1-1．Caco-2細胞の培養
ヒト腸管上皮のモデル細胞として、ヒト結腸ガン由来Caco-2細胞を用いた。Caco-2細胞は、10%非働化Fetal Bovine Serum(FBS) (56℃の恒温槽で40 分間加熱することで補体を不活性化したもの)、10 万U/Lペニシリン（Meiji, Tokyo, Japan）、100 mg/Lストレプトマイシン（Meiji）、2.0 g/L NaHCO3を含むDalbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）培地（日水製薬, Tokyo, Japan）を用い、37℃、5 % CO2存在下で継代培養した。
【００９４】
試験例1-2．SH-SY5Y細胞
ヒト神経のモデル細胞として、ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞を用いた。SH-SY5Y細胞は、10%非働化Fetal Bovine Serum(FBS) (56℃の恒温槽で40 分間加熱することで補体を不活性化したもの)、10 万U/Lペニシリン（Meiji, Tokyo, Japan）、100 mg/Lストレプトマイシン（Meiji）、2.0 g/L NaHCO3を含むDalbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）培地（日水製薬, Tokyo, Japan）を用い、37℃、5 % CO2存在下で継代培養した。凍結保存したSH-SY5Y細胞を融解し培養する際には、コラーゲンIV（Cellmatrix TypeIV）(Nitta Gelatin, Osaka, Japan）をpH 3.0 のHCl (Wako) で10倍に希釈した溶液でコーティングしたディッシュを使用し、培養時に1 mMピルビン酸ナトリウム (Wako)、0.1 mM 非必須アミノ酸 (Wako) を添加した。
【００９５】
試験例1-3．パラミロンサンプルの調製方法
パラミロンはPBSを用いて100 mg/mLに調製し、-20℃で保存したものを適宜解凍して使用した。
【００９６】
試験例1-4．Caco-2細胞との共培養（Co-Culture System）
セルカルチャーインサート用の24 ウェルプレート(Corning, 353504)上に乗せるインサート(Apical (AP) side) (Cell Culture Insert, Transparent PET Membrane 24 Well 0.4μm pore size, 353095)にCaco-2細胞を2×105 cells/mlで250 μL/insertとなるように播種した。細胞は非働化した10% FBSを含有するDMEM培地を用いた。14日間に渡って誘導培養し、三日おきにDMEM培地を交換した。
【００９７】
インサートの下部(Basolateral (BL) compartment)には750 μLのDMEM培地（非働化した10% FBSを含む）を入れた。ブランクとしてAPとBL両方同じ量のDMEM培地のみ入れた。
【００９８】
上記方法にてCaco-2細胞を分化させ、電気抵抗値測定システム (Millicell ERS-2 System) を用いて、経上皮電気抵抗値（TER）を測定することにより、タイトジャンクションの形成を確認した。
【００９９】
サンプル添加の前日にSH-SY5Y細胞を24ウェルプレートに1×105 cells/wellで播種した。Caco-2細胞の分化を確認した後、15日目にパラミロンサンプルを終濃度500μg/mLになるようにDMEM培地と混合し、APに添加し、BL側の24ウェルプレート中のSH-SY5Y細胞と37℃、5% CO2存在下で48時間共培養した。ネガティブコントロールサンプルとしてPBSを同量に添加した。ポジテシィブコントロールサンプルとしてレスベラトロール（終濃度10μM）を用いた。
【０１００】
試験例1-5．神経栄養因子発現量の測定
High Pure RNA Isolation Kit (Roche, Diagnostics Gmbh, Mannheim, Germany) を用いてライセートの回収及びRNA抽出を行った。total RNAの濃度はNano Drop 2000c (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) を用いて測定した。
【０１０１】
0.2 mLチューブ (SEIKO, Fukuoka, Japan) にRNA 1 μg, oligo dT (20) primer (10 μM) 0.5 μLにRNaseフリーの滅菌水を加え、全量を13.5 μLに調製した。PTC-200 Peltier Thermal Cycler (BIO-RAD, Laboratories, Hercules, CA, USA) を用いて、65℃で5分間アニーリングさせた。その後、直ちに5分間氷上に静置した。5×RT Buffer (TOYOBO, Osaka, Japan) 4 μL, 10 mM dNTP set (GE Healthcare, Amersham Place, UK) 2 μL, ReverTra Ace (TOYOBO) 0.5 μLを加え、42℃で20分間、99℃で5分間反応させ、cDNA合成を行った。
【０１０２】
プライマーの合成はSigma社に委託した。内部コントロールであるβ-actinとBDNF遺伝子をそれぞれ検出するためのプライマー配列は以下に示す。
β-actin Homo sapiens
Forward  5’ -TGGCACCCAGCACAATGAA-3’（配列番号1）
Reverse  5’ -CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’ （配列番号2）
BDNF Homo sapiens
Forward  5’-GAGGTCTTTACGGATGTCAAC-3’（配列番号3）
Reverse  5’-GGCCAGGTCATCACTATTG-3’（配列番号4）。
【０１０３】
0.2 mLチューブを (サンプルの本数)×(希釈倍率の数)＋(検量線サンプル分) 用意した。検量線用サンプルと測定用サンプルのcDNAを滅菌水で希釈した。検量線用サンプルは10, 50, 250, 1250, 6250, 31250倍希釈の6つを作製し、測定用サンプルはそれぞれ10倍希釈した。新しい0.2 mLチューブを検量線用サンプル、測定用サンプル、ネガティブコントロールの必要本数分用意した。検量線用及び測定用サンプルでは、滅菌水 49 μL, プライマー (10 μM) 各3.5 μL, 希釈したcDNA 7 μLを混合した混合液を作製した。ネガティブコントロールでは、滅菌水 17 μL, プライマー (10 μM) 各0.5 μLの混合液を作製した。フラッシュでチューブ壁についた液体を落とした後、検量線用と測定用サンプルにTHUNDERBIRD (R) qPCR Mixを25.5 μLずつ加え、20回以上ピペッティングを行った。ネガティブコントロールには酵素7 μLを加えた後、同様にピペッティングを行った。96 well plateに各サンプル25 μLを3 wellずつ分注した。ネガティブコントロールでは、25 μLを1 wellに分注した。プレートにシールを貼り、Thermal Cycler Dice Real Time System TP800 (Takara, Shiga, Japan) を用いて、リアルタイムPCRを行った。反応条件は、95℃ 30秒を1サイクル、95℃ 5秒 → 55℃ 10秒 → 72℃ 20秒を45サイクル、95℃ 15秒 → 60℃ 30秒 → 95℃ 15秒を1サイクルとした。各サンプル3 wellの平均値を取り、DMSOを基準として、各サンプルの相対値を算出した。
【０１０４】
試験例1-6．結果
結果を図１に示す。パラミロンを培地に添加した細胞との共培養により、神経細胞における神経栄養因子の発現量が増加することが分かった。このことから、パラミロンを培地に添加した細胞から放出される因子が、神経細胞における神経栄養因子の発現量を増加させることが示唆された。以上より、パラミロンが神経栄養因子発現量増進作用を有することが分かった。
【０１０５】
試験例2．神経突起伸長評価試験
サンプル（パラミロン）の神経突起伸長に対する影響を解析した。具体的には、以下のようにして解析した。なお、Caco-2細胞、SH-SY5Y細胞の培養およびパラミロンサンプルの調製方法は試験例1-1、1-2および1-3に記載する内容に準じた。
【０１０６】
試験例2-1．Caco-2細胞との共培養（Co-Culture System）および神経突起伸長評価
セルカルチャーインサート用の24 ウェルプレート(Corning, 353504)上に乗せるインサート(Apical (AP) side) (Cell Culture Insert, Transparent PET Membrane 24 Well 0.4μm pore size, 353095)にCaco-2細胞を2×105cells/mlで250 μL/insertとなるように播種した。細胞は非働化した10% FBSを含有するDMEM培地を用いた。14日間に亘って誘導培養し、3日おきにDMEM培地を交換した。
【０１０７】
インサートの下部(Basolateral (BL) compartment)には750 μLのDMEM培地（非働化した10% FBSを含む）を入れた。ブランクとしてAPとBL両方同じ量のDMEM培地のみ入れた。
【０１０８】
上記方法にてCaco-2細胞を分化させ、電気抵抗値測定システム (Millicell ERS-2 System) を用いて、経上皮電気抵抗値（TER）を測定することにより、タイトジャンクションの形成を確認した。
【０１０９】
Caco-2細胞の分化を確認した後、15日目にパラミロンサンプルを終濃度100、300、又は500μg/mLになるようにDMEM培地と混合し、APに添加し、BL側の24ウェルプレート中の1日後の培養液を回収し、試験溶液とした。また、ネガティブコントロールとして、パラミロンサンプルに代えてPBSを使用して同様の操作を行い、試験溶液を得た。
【０１１０】
なお、サンプル添加の前日にSH-SY5Y細胞を96ウェルブラックプレートに1×104cells/wellで播種し24時間培養した。
【０１１１】
次の日に試験溶液をDMEM培地で2倍希釈し、SH-SY5Y細胞に添加した。24時間培養後以下の手順にて、神経突起伸長を評価した。なお。ポジティブコントロールとして試験溶液に代えてレチノイン酸を培地中濃度が10μMになるように加えた。
（1）SH-SY5Y細胞に8％パラホルムアルデヒドを100 μl加え、15分間固定した。
（2）細胞を1×PBSで3回洗浄した。
（3）ブロッキングバッファーを100 μl/well 加え1時間室温静置した。
（4）ブロッキングバッファーを除去後、抗体希釈バッファーで500倍希釈したNeuro-Chrom Pan Neuronal Marker（Merck ミリポア）を50 μl/well添加し、遮光下4℃で一晩静置した。
（5）細胞を1×PBSで3回洗浄した。
（6）抗体希釈バッファーで1000倍に希釈したAlexa Fluor 555 F (ab’)2 fragment of goat anti-mouse IgG (H+L)を50 μl/well添加し、遮光下室温で1時間反応させた。
（7）細胞を1×PBSで3回洗浄した。
（8）1×PBSで800倍に希釈したHoechst 33342を100 μl/well加え遮光下室温で15分間反応させた。
（9）細胞を1×PBSで1回洗浄した。
（10）1×PBSを150 μl/well加えIN Cell Analyzer 2200を用いて神経突起長の測定を行った。
【０１１２】
試験例2-2．結果
SH-SY5Y細胞の写真像を図２に示し、神経突起長の測定結果を図３に示す。パラミロンを培地に添加した後に得られる培養上清により、神経細胞における神経突起が伸長することが分かった。このことから、パラミロンを培地に添加した細胞から放出される因子が、神経細胞において神経突起を伸長させることが示唆された。以上より、パラミロンが神経突起伸長作用を有することが分かった。
【図１】
2020164511.tif 000002
【図２】
2020164511.tif 000003
【図３】
2020164511.tif 000004
【配列表】
2020164511000001.app