(57)【要約】【課題】簡素な構成で複数の蛍光の位相を変調させることができる光学機器、位相板および像の形成方法を提供する。【解決手段】光学機器１０は、第１の波長の光および第２の波長の光に対して位相変調を与える共通の位相変調マスク５０と、第１の波長の光および第２の波長の光を位相変調マスク５０に入射させる照射光学系３０と、位相変調マスク５０によって位相変調された第１の波長の光および第２の波長の光を集光して点像分布関数に応じた像を形成する集光光学系６０と、を備える。位相変調マスク５０は位相板であり、この位相板は、第１の波長の光用の位相板の厚みと、第２の波長の光用の位相板の厚みと、の間の厚みを有する。【選択図】図１
2020052434.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の波長の光および第２の波長の光に対して位相変調を与える共通の位相変調マスクと、
前記第１の波長の光および前記第２の波長の光を、前記位相変調マスクに入射させる照射光学系と、
前記位相変調マスクによって位相変調された前記第１の波長の光および前記第２の波長の光を集光して点像分布関数に応じた像を形成する集光光学系と、を備え、
前記位相変調マスクは位相板であり、
前記位相板は、前記第１の波長の光用の位相板の厚みと、前記第２の波長の光用の位相板の厚みと、の間の厚みを有する、光学機器。
【請求項２】
前記第１の波長の光および前記第２の波長の光は、それぞれ、蛍光物質から生じる第１蛍光および第２蛍光である、請求項１に記載の光学機器。
【請求項３】
前記第１蛍光の波長帯域および前記第２蛍光の波長帯域は、それぞれ広がりを有しており、前記第１蛍光の波長帯域の一部と前記第２蛍光の波長帯域の一部とが互いに重なり合う、請求項２に記載の光学機器。
【請求項４】
前記第１の波長の光は、前記第１の波長に強度のピークを持つ光であり、
前記第２の波長の光は、前記第２の波長に強度のピークを持つ光である、請求項１ないし３の何れか一項に記載の光学機器。
【請求項５】
前記照射光学系は、対物レンズを備え、
前記位相変調マスクは、前記第１の波長の光の輝点および前記第２の波長の光の輝点を、それぞれ撮像面上において２点に結像させ、且つ、前記対物レンズと、前記第１の波長の光の輝点および前記第２の波長の光の輝点との距離に応じて、前記撮像面上において、前記第１の波長の光の２つの輝点像および前記第２の波長の光の２つの輝点像が回転する前記点像分布関数を形成するように、前記第１蛍光および前記第２蛍光の位相を変調する、請求項１ないし４の何れか一項に記載の光学機器。
【請求項６】
前記集光光学系は、前記第１の波長の光の前記像および前記第２の波長の光の前記像を撮像する撮像部を備える、請求項１ないし５の何れか一項に記載の光学機器。
【請求項７】
試料を設置するためのステージを備え、
前記照射光学系は、光源部から出射された光を前記試料に照射し、
前記集光光学系は、前記試料中に含まれる物質から生じた前記第１の波長の光および前記第２の波長の光を集光する、請求項６に記載の光学機器。
【請求項８】
前記試料は、第１蛍光色素と第２蛍光色素を含み、
前記光源部は、前記第１蛍光色素および前記第２蛍光色素において活性状態と不活性状態が繰り返されるように、前記試料に光を照射し、
前記撮像部は、前記第１蛍光物質および前記第２蛍光物質が活性状態と不活性状態を繰り返す間に、前記第１蛍光物質から生じた前記第１の波長の光の前記像および前記第２蛍光物質から生じた前記第２の波長の光の前記像を撮像する、請求項７に記載の光学機器。
【請求項９】
第１の波長の光および第２の波長の光から点像分布関数に応じた像を形成する方法であって、
前記第１の波長の光用の位相板の厚みと、前記第２の波長の光用の位相板の厚みと、の間の厚みを有し、前記第１の波長の光および前記第２の波長の光に対して位相変調を与える共通の位相板に、前記第１の波長の光および前記第２の波長の光を入射させ、
前記位相板によって位相変調された前記第１の波長の光および前記第２の波長の光を集光して点像分布関数に応じた像を形成する、像の形成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学機器および像の形成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
たとえば、光学顕微鏡といった光学機器では、光の位相変調を利用して、解像度の向上や収差補正等様々な機能が実現されている。特許文献１には、所定の広域スペクトル幅内において互いに異なる複数の波長の光束の位相を変調する位相変調器が記載されている。この位相変調器は、光源から照射された光束を、回折格子により波長毎に異なる角度に回折させる。波長毎に回折された光束は集光レンズを経て空間位相変調器に入射する。位相変調器は各波長にそれぞれ対応する複数の位相変調領域を有しており、回折格子による回折によって、各波長の光束は、それぞれの波長に対応する位相変調領域に入射する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１０−２５９２２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１の技術では、光束を波長毎に対応する位相変調領域に入射させるために、回折格子やプリズム等によって光束を回折させることが要求される。したがって、光学系が複雑になることや、位相変調のための構成が複雑になるといった問題が生じる。
また、特許文献１の位相変調器は、波長毎に複数の位相変調領域を有するため、位相変調器が大型化するといった問題も生じる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の第１の態様は、光学機器に関する。本態様に係る光学機器は、第１の波長の光および第２の波長の光に対して位相変調を与える共通の位相変調マスクと、第１の波長の光および第２の波長の光を、位相変調マスクに入射させる照射光学系と、位相変調マスクによって位相変調された第１の波長の光および第２の波長の光を集光して点像分布関数に応じた像を形成する集光光学系と、を備える。ここで、位相変調マスクは位相板であり、位相板は、第１の波長の光用の位相板の厚みと、第２の波長の光用の位相板の厚みと、の間の厚みを有する。
【０００６】
本発明の第２の態様は、第１の波長の光および第２の波長の光から点像分布関数に応じた像を形成する方法に関する。本態様に係る像の形成方法は、第１の波長の光用の位相板の厚みと、第２の波長の光用の位相板の厚みと、の間の厚みを有し、第１の波長の光および第２の波長の光に対して位相変調を与える共通の位相板に、第１の波長の光および第２の波長の光を入射させ、位相板によって位相変調された第１の波長の光および第２の波長の光を集光して点像分布関数に応じた像を形成する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、簡素な構成で複数の蛍光の位相を変調させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、実施形態に係る位相変調マスクを備えた光学機器の構成を示す模式図である。
【図２】図２（ａ）は、実施形態に係る２つの輝点像がＺ軸方向における蛍光の発光点の位置に応じて撮像面上で回転することを示す模式図である。図２（ｂ）は、実施形態に係るＤＨ−ＰＳＦを示す図である。
【図３】図３（ａ）は、実施形態に係る全ての第１蛍光色素が活性状態にあることを示す模式図である。図３（ｂ）は、実施形態に係る全ての第１蛍光色素が不活性状態にあることを示す模式図である。図３（ｃ）、（ｄ）は、実施形態に係る第１蛍光色素の一部が活性状態にあることを示す模式図である。図３（ｅ）は、実施形態に係る全ての第２蛍光色素が活性状態にあることを示す模式図である。図３（ｆ）は、実施形態に係る全ての第２蛍光色素が不活性状態にあることを示す模式図である。図３（ｇ）、（ｈ）は、実施形態に係る第２蛍光色素の一部が活性状態にあることを示す模式図である。
【図４】図４（ａ）〜（ｅ）は、実施形態に係る第１の３次元超解像画像を取得する手順を示す模式図である。図４（ｆ）は、実施形態に係る第１物質の数を取得する手順を示す模式図である。
【図５】図５（ａ）は、実施形態に係る複数の第１の２次元画像から取得された第１の３次元超解像画像と、複数の第２の２次元画像から取得された第２の３次元超解像画像とを示す模式図である。図５（ｂ）は、実施形態の変更例に係る複数の共通の２次元画像から取得された第１および第２の３次元超解像画像を示す模式図である。
【図６】図６（ａ）は、実施形態に係る位相変調器を備えた光学機器の構成を示す模式図である。図６（ｂ）は、実施形態に係る位相変調器の構成を示す模式図である。
【図７】図７（ａ）、（ｂ）は、それぞれ、実施形態に係る位相変調器に設定される第１位相変調パターンと第２位相変調パターンを示す図である。
【図８】図８（ａ）、（ｂ）は、実施形態に係る第１位相変調パターンを用いて第１蛍光を観察した場合の結像状態とグラフを示す図である。図８（ｃ）、（ｄ）は、実施形態に係る第１位相変調パターンを用いて第２蛍光を観察した場合の結像状態とグラフを示す図である。図８（ｅ）、（ｆ）は、実施形態に係る第２位相変調パターンを用いて第１蛍光を観察した場合の結像状態とグラフを示す図である。図８（ｇ）、（ｈ）は、実施形態に係る第２位相変調パターンを用いて第２蛍光を観察した場合の結像状態とグラフを示す図である。
【図９】図９は、実施例１の位相変調パターンの構成を示す図である。
【図１０】図１０は、実施例１の位相変調パターンを用いた場合の第１蛍光の結像状態を示す図である。
【図１１】図１１は、実施例１の位相変調パターンを用いた場合の第２蛍光の結像状態を示す図である。
【図１２】図１２（ａ）、（ｂ）は、実施例１の位相変調パターンを用いて第１蛍光を観察した場合の結像状態とグラフを示す図である。図１２（ｃ）、（ｄ）は、実施例１の位相変調パターンを用いて第２蛍光を観察した場合の結像状態とグラフを示す図である。
【図１３】図１３（ａ）〜（ｃ）は、実施例１の位相変調パターンに係る第１位相変調パターンと第２位相変調パターンを統合することについて詳細に説明する図である。図１３（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ、第１位相変調パターンと、第２位相変調パターンと、実施例１の位相変調パターンにおいて、液晶パネルの１つの画素位置を模式的に示す図である。
【図１４】図１４（ａ）は、実施例２の位相変調パターンにおける領域の配置を示す模式図である。図１４（ｂ）〜（ｄ）は、実施例２の位相変調パターンの構成を示す模式図である。
【図１５】図１５（ａ）、（ｂ）は、実施例２の位相変調パターンを用いて第１蛍光を観察した場合の結像状態とグラフを示す図である。図１５（ｃ）、（ｄ）は、実施例２の位相変調パターンを用いて第２蛍光を観察した場合の結像状態とグラフを示す図である。図１５（ｅ）、（ｆ）は、実施例２の位相変調パターンを用いて第１蛍光と第２蛍光を観察した場合の結像状態を示す図である。
【図１６】図１６（ａ）、（ｂ）は、それぞれ、実施例２の位相変調パターンを用いて第１蛍光と第２蛍光を広視野で観察した結果を示す図である。
【図１７】図１７（ａ）は、実施例３の位相変調パターンにおける領域の配置を示す模式図である。図１７（ｂ）〜（ｄ）は、実施例３の位相変調パターンの構成を示す模式図である。
【図１８】図１８（ａ）、（ｂ）は、実施例３の位相変調パターンを用いて第１蛍光を観察した場合の結像状態とグラフを示す図である。図１８（ｃ）、（ｄ）は、実施例３の位相変調パターンを用いて第２蛍光を観察した場合の結像状態とグラフを示す図である。図１８（ｅ）、（ｆ）は、実施例３の位相変調パターンを用いて第１蛍光と第２蛍光を観察した場合の結像状態を示す図である。
【図１９】図１９（ａ）、（ｂ）は、それぞれ、実施例３の位相変調パターンを用いて第１蛍光と第２蛍光を広視野で観察した結果を示す図である。
【図２０】図２０（ａ）は、実施例４の位相変調パターンにおける領域の配置を示す模式図である。図２０（ｂ）〜（ｄ）は、実施例４の位相変調パターンの構成を示す模式図である。
【図２１】図２１（ａ）、（ｂ）は、実施例４の位相変調パターンを用いて第１蛍光を観察した場合の結像状態とグラフを示す図である。図２１（ｃ）、（ｄ）は、実施例４の位相変調パターンを用いて第２蛍光を観察した場合の結像状態とグラフを示す図である。図２１（ｅ）、（ｆ）は、実施例４の位相変調パターンを用いて第１蛍光と第２蛍光を観察した場合の結像状態を示す図である。
【図２２】図２２（ａ）、（ｂ）は、それぞれ、実施例４の位相変調パターンを用いて第１蛍光と第２蛍光を広視野で観察した結果を示す図である。
【図２３】図２３（ａ）は、実施例５の位相変調パターンにおける領域の配置を示す模式図である。図２３（ｂ）〜（ｅ）は、実施例５の位相変調パターンの構成を示す模式図である。
【図２４】図２４（ａ）、（ｂ）は、実施例５の位相変調パターンを用いて第１蛍光を観察した場合の結像状態とグラフを示す図である。図２４（ｃ）、（ｄ）は、実施例５の位相変調パターンを用いて第２蛍光を観察した場合の結像状態とグラフを示す図である。図２４（ｅ）、（ｇ）は、実施例５の位相変調パターンを用いて第１蛍光を観察した場合の結像状態を示す図である。図２４（ｆ）、（ｈ）は、実施例５の位相変調パターンを用いて第２蛍光を観察した場合の結像状態を示す図である。
【図２５】図２５（ａ）、（ｂ）は、それぞれ、実施例５の位相変調パターンを用いて第１蛍光と第２蛍光を広視野で観察した結果を示す図である。
【図２６】図２６は、実施例６の位相変調パターンの構成を示す図である。
【図２７】図２７（ａ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）は、実施例６の位相変調パターンを用いて第１蛍光を観察した場合の結像状態を示す図である。図２７（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）、（ｈ）は、実施例６の位相変調パターンを用いて第２蛍光を観察した場合の結像状態を示す図である。
【図２８】図２８（ａ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）は、実施例６の位相変調パターンを用いて第１蛍光を観察した場合の結像状態を示す図である。図２８（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）、（ｈ）は、実施例６の位相変調パターンを用いて第２蛍光を観察した場合の結像状態を示す図である。
【図２９】図２９（ａ）は、実施形態に係る第１位相変調パターンに対応するように作製された位相板を示す模式図である。図２９（ｂ）は、実施形態に係る第２位相変調パターンに対応するように作製された位相板を示す模式図である。図２９（ｃ）は、実施例１の位相変調パターンと同様に統合した位相板を示す模式図である。図２９（ｄ）〜（ｆ）は、実施形態に係る位相板を厚み方向に平行な平面で切断したときの切断面を示す模式図である。
【図３０】図３０（ａ）は、実施形態に係る第１位相変調パターンに対応するように作製された位相板を示す模式図である。図３０（ｂ）は、実施形態に係る第２位相変調パターンに対応するように作製された位相板を示す模式図である。図３０（ｃ）は、実施例２の位相変調パターンと同様に統合した位相板を示す模式図である。図３０（ｄ）〜（ｆ）は、実施形態に係る位相板を厚み方向に見た場合の領域を模式的に示す図である。図３０（ｇ）〜（ｉ）は、実施形態に係る位相板を厚み方向に平行な平面で切断したときの切断面を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下の実施形態は、中心波長の異なる２種類の蛍光を観察するための光学機器に本発明を適用したものである。実施形態の光学機器は、試料に光を照射して、試料から生じた蛍光を撮像部により撮像する蛍光顕微鏡である。本発明を適用可能な光学機器は、以下の実施形態に限られるものではなく、蛍光顕微鏡以外の顕微鏡、カメラ等の撮像機器、望遠鏡、内視鏡、プラネタリウム等であってよい。また、本発明を適用可能な光学機器は、蛍光を撮像および観察するための装置に限らず、蛍光以外の光を撮像および観察するための装置であってもよい。
【００１０】
図１に示すように、光学機器１０は、照射光学系３０と、ビームエキスパンダ３７と、ステージ４０と、位相変調マスク５０と、集光光学系６０と、コントローラ７１、７２と、情報処理装置１００と、を備える。図１には、互いに直交するＸＹＺ軸が示されている。
【００１１】
ステージ４０には、試料が載せられたスライドガラス４１が設置される。実施形態の試料は、被検細胞を含む生体試料である。被検細胞は、たとえば病変組織から採取される。被検細胞の核は、第１物質と第２物質を含む。撮像対象となる第１物質および第２物質は、たとえば疾患マーカーとなる遺伝子、タンパク質またはペプチド等の生体物質である。実施形態の第１物質は、ＨＥＲ２遺伝子であり、実施形態の第２物質は、１７番染色体のセントロメア領域であるＣＥＰ１７である。
【００１２】
試料の調製により、第１物質と第２物質には、それぞれ蛍光物質が結合している。実施形態では、第１物質に結合される蛍光物質は第１蛍光色素であり、第２物質に結合される蛍光物質は第２蛍光色素である。また、試料の調製により、被検細胞の核は、第３蛍光色素により特異的に染色されている。
【００１３】
第１蛍光色素は、後述する光源２１からの光が照射されると第１の波長を中心波長とする第１蛍光を生じる活性状態と、光源２１からの光が照射されても第１蛍光を生じない不活性状態とにスイッチング可能である。第１蛍光色素は、光源２１からの光が照射されると不活性化し、後述する光源２３からの光が照射されると活性化する。第２蛍光色素は、後述する光源２２からの光が照射されると第２の波長を中心波長とする第２蛍光を生じる活性状態と、光源２２からの光が照射されても第２蛍光を生じない不活性状態とにスイッチング可能である。第２蛍光色素は、光源２２からの光が照射されると不活性化し、光源２３からの光が照射されると活性化する。第３蛍光色素は、光源２３からの光が照射されると第３の波長を中心波長とする第３蛍光を生じる。
【００１４】
撮像対象の物質は、上記のように物質に結合する蛍光色素に限らず、自家蛍光を生じる物質であってもよい。スライドガラス４１に載せられる試料は、生体試料に限らない。撮像対象の物質は、生体試料に含まれる物質に限らず、生体試料に由来しない物質であってもよい。たとえば、撮像対象の物質は、蛍光ビーズなど、蛍光を生じる粒子等の蛍光物質であってもよい。
【００１５】
照射光学系３０は、光源部２０と、シャッター３１と、１／４波長板３２と、ビームエキスパンダ３３と、集光レンズ３４と、ダイクロイックミラー３５と、対物レンズ３６と、を備える。照射光学系３０は、試料に光を照射して、試料中に含まれる蛍光標識された第１〜第３物質から、それぞれ第１〜第３蛍光を生じさせ、第１蛍光と第２蛍光を、位相変調マスク５０における同一の入射領域に入射させる。
【００１６】
光源部２０は、光源２１〜２３と、ミラー２４と、ダイクロイックミラー２５、２６と、を備える。
【００１７】
光源２１〜２３は、それぞれ、異なる波長の光を出射する。具体的には、光源２１、２２、２３から出射される光の波長は、それぞれ、６４０ｎｍ、４８８ｎｍ、４０５ｎｍである。光源２１〜２３としては、レーザ光源を用いるのが好ましいが、水銀ランプ、キセノンランプ、ＬＥＤ等を用いてもよい。上述したように、光源２１からの出射される光は、被検細胞に含まれる第１蛍光色素を励起させて第１蛍光を生じさせるとともに、第１蛍光色素を不活性化する。光源２２から出射される光は、被検細胞に含まれる第２蛍光色素を励起させて第２蛍光を生じさせるとともに、第２蛍光色素を不活性状態にする。光源２３から出射される光は、被検細胞に含まれる第３蛍光色素を励起させて第３蛍光を生じさせるとともに、第１蛍光色素と第２蛍光色素を活性状態にする。なお、実施形態では、第１蛍光の中心波長である第１の波長は６９０ｎｍであり、第２蛍光の中心波長である第２の波長は５３０ｎｍである。
【００１８】
ミラー２４は、光源２１からの光を反射する。ダイクロイックミラー２５は、光源２１からの光を透過し、光源２２からの光を反射する。ダイクロイックミラー２６は、光源２１、２２からの光を透過し、光源２３からの光を反射する。光源２１〜２３からの光の光軸は、ミラー２４とダイクロイックミラー２５、２６により、互いに一致させられる。なお、光源２１〜２３に代えて、１つの光源が、波長６４０ｎｍ、４８８ｎｍ、４０５ｎｍの光を出射してもよい。
【００１９】
シャッター３１は、コントローラ７１により駆動され、光源部２０から出射された光を通過させる状態と、光源部２０から出射された光を遮断する状態とに切り替える。これにより、被検細胞に対する光の照射時間が調整される。１／４波長板３２は、光源部２０から出射された直線偏光の光を円偏光に変換する。蛍光色素は、所定の偏光方向の光に反応する。よって、光源部２０から出射された励起用の光を円偏光に変換することにより、励起用の光の偏光方向が、蛍光色素が反応する偏光方向に一致し易くなる。これにより、被検細胞に含まれる蛍光色素に効率良く蛍光を励起させることができる。ビームエキスパンダ３３は、スライドガラス４１上における光の照射領域を広げる。集光レンズ３４は、対物レンズ３６からスライドガラス４１に平行光が照射されるよう光を集光する。
【００２０】
ダイクロイックミラー３５は、光源部２０から出射された光を反射し、被検細胞から生じた蛍光を透過する。対物レンズ３６は、ダイクロイックミラー３５で反射された光を、スライドガラス４１に導く。ステージ４０は、コントローラ７２により駆動され、水平面であるＸ−Ｙ平面内で移動する。被検細胞から生じた蛍光は、対物レンズ３６を通り、ダイクロイックミラー３５を透過し、ビームエキスパンダ３７により平行光とされる。
【００２１】
位相変調マスク５０は、第１蛍光および第２蛍光に対して位相変調を与える。位相変調マスク５０は、対物レンズ３６と、ダイクロイックミラー３５と、ビームエキスパンダ３７と、集光レンズ６１とが構成する光学系のフーリエ面に配置され、位相変調マスク５０の同一の入射領域に入射する光の位相を変調する作用を有する。
【００２２】
なお、位相差が“θ”の場合と、位相差が“θ＋ｎ×２π”（ｎ＝±０、１、２、３…）の場合とは、蛍光に対して与えられる位相差としては実質的に同じである。したがって、位相変調マスク５０によって第１蛍光に与えられる位相差と第２蛍光に与えられる位相差は、１つの値に限らず、１つの値にｎ×２πが加算された値でもよい。
【００２３】
位相変調マスク５０は、位相変調マスク５０を透過する光の位相を変調させる場合、図１に示すように配置される。透過する光の位相を変調させる位相変調マスク５０は、たとえば、アクリル樹脂等の透明部材からなる位相板、液晶パネルを備えた位相変調器等により構成される。
【００２４】
位相変調マスク５０は、位相変調マスク５０により反射する光の位相を変調させる場合、図６（ａ）に示すように配置される。反射する光の位相を変調させる位相変調マスク５０は、たとえば、液晶パネルを備えた位相変調器、デフォーマブルミラー、デフォーマブルミラーと同様に構成された反射部材等により構成される。なお、位相変調マスク５０が液晶パネルを備えた位相変調器により構成される場合、図６（ａ）に示すように、ビームエキスパンダ３７に代えて偏光板３８とミラー３９が配置され、位相変調マスク５０は、位相変調器５１の位置に配置される。位相変調マスク５０がデフォーマブルミラーやデフォーマブルミラーと同様に構成された反射部材等により構成される場合、図６（ａ）に示す構成から、偏光板３８が省略され、位相変調マスク５０は、位相変調器５１の位置に配置される。
【００２５】
透過する光の位相を変調させる位相変調マスク５０の構成例については、追って図２９（ａ）〜図３０（ｉ）を参照して説明する。反射する光の位相を変調させる位相変調マスク５０の構成例については、追って図６（ａ）〜図２８（ｈ）を参照して説明する。
【００２６】
位相変調マスク５０は、第１蛍光色素から生じた第１蛍光の点像分布関数に応じた像を形成し、第２蛍光色素から生じた第２蛍光の点像分布関数に応じた像を形成する。実施形態の位相変調マスク５０は、１つの第１蛍光色素から生じた第１蛍光を撮像部６２の撮像面６２ａにおいて２つの焦点に結像させ、１つの第２蛍光色素から生じた第２蛍光を撮像部６２の撮像面６２ａにおいて２つの焦点に結像させる。このような点像分布関数は、ＤＨ−ＰＳＦ（Double-Helix Point Spread Function）と呼ばれる。位相変調マスク５０は、フーリエ面に入射する第１蛍光および第２蛍光の位相を変調し、第１蛍光および第２蛍光の両方について、撮像面６２ａにおいてＤＨ−ＰＳＦに応じた像を形成する。
【００２７】
なお、位相変調マスク５０は、第１蛍光と第２蛍光の場合とは異なり、第３蛍光について、撮像面６２ａにおいてＤＨ−ＰＳＦに応じた像を形成するようには構成されていない。この理由は、後述するように、第３蛍光が、核の領域の特定だけに用いられるためである。位相変調マスク５０を透過した第３蛍光の位相は、位相変調マスク５０により多少変調されるものの、撮像部６２により第３蛍光が撮像されれば、十分に核の領域を特定できる。
【００２８】
集光光学系６０は、位相変調された第１蛍光および第２蛍光を集光してＤＨ−ＰＳＦに応じた像を形成する。集光光学系６０は、集光レンズ６１と撮像部６２を備える。集光レンズ６１は、位相変調マスク５０を通った蛍光を集光して、撮像部６２の撮像面６２ａに導く。撮像部６２は、撮像面６２ａに照射された蛍光の像を撮像し、２次元画像を生成する。撮像部６２は、たとえばＣＣＤ等により構成される。
【００２９】
ここで、上述したように、１つの第１蛍光色素から生じた第１蛍光と、１つの第２蛍光色素から生じた第２蛍光とは、位相変調マスク５０の作用により、それぞれ、撮像面６２ａ上で２つの焦点に結像される。すなわち、撮像面６２ａにおいて第１蛍光と第２蛍光のＤＨ−ＰＳＦに応じた像が形成される。このとき、位相変調マスク５０の作用により、２つの焦点にそれぞれ対応する輝点像は、図２（ａ）に示すように、Ｚ軸方向すなわちスライドガラス４１の深さ方向における蛍光の発光点の位置に応じて、撮像面６２ａ上で回転する。つまり、２つの輝点像を結ぶ直線と、基準となる直線とがなす角が、Ｚ軸方向における蛍光の発光点の位置に応じて、撮像面６２ａ上において変化する。
【００３０】
すなわち、位相変調マスク５０は、対物レンズ３６と試料における第１蛍光色素との距離に応じて、撮像面６２ａ上において、第１蛍光の２つの輝点像が回転するＤＨ−ＰＳＦを形成するように、第１蛍光の位相を変調するよう構成されている。同様に、位相変調マスク５０は、対物レンズ３６と試料における第２蛍光色素との距離に応じて、撮像面６２ａ上において、第２蛍光の２つの輝点像が回転するＤＨ−ＰＳＦを形成するように、第２蛍光の位相を変調するよう構成されている。
【００３１】
たとえば、スライドガラス４１においてＺ軸方向に異なる２つの位置にある蛍光色素から生じた蛍光は、それぞれ位相変調マスク５０により２つに分割され、撮像面６２ａ上に照射される。このとき、撮像面６２ａ上における２つの輝点像を結ぶ直線は、たとえば、図２（ａ）に示すように、一方の蛍光色素については基準線と＋θ１の角をなし、もう一方の蛍光色素については基準面と＋θ２の角をなす。したがって、２つの輝点像を結ぶ直線が、基準線に対してなす角を取得すれば、Ｚ軸方向における蛍光色素の位置を取得できる。実施形態では、第１蛍光と第２蛍光について、撮像部６２により撮像された２次元画像に基づいて、上記のようにＺ軸方向における位置が取得される。
【００３２】
なお、ＤＨ−ＰＳＦは、図２（ｂ）に示す式により表すことができる。図２（ｂ）の式において、“輝点１”と“輝点２”は、図２（ａ）に示すような撮像面６２ａに結像した２つの輝点像を示す。“撮像面上の座標”は、２つの輝点像の元となる蛍光色素の撮像面６２ａ上の座標を示す。
【００３３】
上記のように、位相変調マスク５０の同一の入射領域には、第１蛍光および第２蛍光の両方が入射し、位相変調マスク５０は、波長が互いに異なる第１蛍光および第２蛍光に対して、それぞれ位相を変調させる。これにより、第１蛍光を、第１蛍光の位相を変調させるための領域に導き、第２蛍光を、第２蛍光の位相を変調させるための領域に導く必要がない。したがって、第１蛍光の位相変調領域と第２蛍光の位相変調領域とを別々に設ける必要がないため、別々の位相変調領域に第１蛍光と第２蛍光を導くために、光束を回折するための回折格子や、光束を分岐させるためのプリズム等も不要になる。よって、位相変調マスク５０によれば、簡素な構成で第１蛍光と第２蛍光の両方に対して位相を変調させ、第１蛍光と第２蛍光のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を形成できる。
【００３４】
また、第１蛍光と第２蛍光を別の光路に分岐させるような場合、各光路の光学素子の組み付け等にずれが生じることにより、所望のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を形成できなくなる可能性がある。しかしながら、位相変調マスク５０によれば、光路を分岐させる光学素子が不要になるため、光学素子の組み付け等のずれにより生じる影響を抑制できる。したがって、精度の高い２次元画像を生成できる。このような２次元画像の精度向上は、後述する３次元超解像画像を生成するような実施形態の光学機器１０において特に好ましい。
【００３５】
図１に戻り、情報処理装置１００は、パーソナルコンピュータであり、本体１１０と、表示部１２０と、入力部１３０と、を備える。本体１１０は、処理部１１１と、記憶部１１２と、インターフェース１１３と、を備える。
【００３６】
処理部１１１は、たとえばＣＰＵである。記憶部１１２は、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ハードディスク等である。処理部１１１は、記憶部１１２に記憶されたプログラムに基づいて、インターフェース１１３を介して、光源部２０の光源２１〜２３と、撮像部６２と、コントローラ７１、７２を制御する。
【００３７】
処理部１１１は、第１蛍光の２次元画像に基づいて、上記のように第１蛍光の発光点のＺ軸方向における位置を取得し、第１蛍光の３次元超解像画像を生成する。同様に、処理部１１１は、第２蛍光の２次元画像に基づいて、上記のように第２蛍光の発光点のＺ軸方向における位置を取得し、第２蛍光の３次元超解像画像を生成する。以下では、第１蛍光の２次元画像を「第１の２次元画像」と称し、第２蛍光の２次元画像を「第２の２次元画像」と称し、第３蛍光の２次元画像を「第３の２次元画像」と称する。第１蛍光の３次元超解像画像を「第１の３次元超解像画像」と称し、第２蛍光の３次元超解像画像を「第２の３次元超解像画像」と称する。
【００３８】
表示部１２０は、処理部１１１による処理結果等を表示するためのディスプレイである。入力部１３０は、ユーザによる指示の入力を受け付けるためのキーボードとマウスである。
【００３９】
次に、第１および第２の３次元超解像画像の生成手順について説明する。
【００４０】
まず、図３（ａ）〜（ｄ）を参照し、第１の２次元画像を取得する手順について説明する。
【００４１】
図３（ａ）に示すように、試料の調製において、第１蛍光色素は、第１物質に特異的に結合する中間物質を介して第１物質に結合される。第１物質は遺伝子であるため、中間物質として核酸プローブを用いることができる。１つの第１物質には多数の第１蛍光色素が結合する。図３（ａ）には、第１蛍光色素がそれぞれ結合した２つの第１物質が模式的に示されている。初期状態では、全ての第１蛍光色素が活性状態にある。図３（ａ）に示す状態で、光源２１からの光が所定時間、被検細胞に照射されると、図３（ｂ）に示すように、全ての第１蛍光色素が不活性状態となる。
【００４２】
図３（ｂ）に示す状態で、光源２３からの光が所定時間、被検細胞に照射されると、たとえば図３（ｃ）に示すように、一部の第１蛍光色素が活性化する。光源２３からの光の照射時間を調整することにより、活性化される第１蛍光色素の割合が変化する。図３（ｃ）に示す状態で、再び光源２１からの光が所定時間、被検細胞に照射されると、活性化した第１蛍光色素から第１蛍光が生じ、その後、図３（ｂ）に示すように、全ての第１蛍光色素が不活性状態になる。
【００４３】
そして、再び光源２３からの光が所定時間、被検細胞に照射されると、たとえば図３（ｄ）に示すように、一部の第１蛍光色素が活性化する。図３（ｄ）に示す状態で、再び光源２１からの光が所定時間、被検細胞に照射されると、活性化した第１蛍光色素から第１蛍光が生じ、その後、図３（ｂ）に示すように、全ての第１蛍光色素が不活性状態になる。図３（ｃ）、（ｄ）に示すように、各回の活性化処理で活性化される第１蛍光色素の分布は、その都度異なる。
【００４４】
処理部１１１は、光源２１、２３を駆動して、上記のように第１蛍光色素に対して活性化と不活性化を繰り返し行う。撮像部６２は、その都度異なる第１蛍光色素の分布を撮像する。こうして、処理部１１１は、複数の第１の２次元画像、たとえば３０００枚の第１の２次元画像を取得する。
【００４５】
続いて、図３（ｅ）〜（ｈ）を参照し、第２の２次元画像を取得する手順について説明する。第２の２次元画像の取得は、第１の２次元画像の取得と略同様に行われる。
【００４６】
すなわち、図３（ｅ）に示す初期状態で、光源２２からの光が所定時間、被検細胞に照射されると、図３（ｆ）に示すように、全ての第２蛍光色素が不活性状態となる。図３（ｆ）に示す状態で、光源２３からの光が所定時間、被検細胞に照射されると、たとえば図３（ｇ）に示すように、一部の第２蛍光色素が活性化する。図３（ｇ）に示す状態で、再び光源２２からの光が所定時間、被検細胞に照射されると、活性化した第２蛍光色素から第２蛍光が生じ、その後、図３（ｆ）に示すように、全ての第２蛍光色素が不活性状態になる。そして、再び光源２３からの光が所定時間、被検細胞に照射されると、たとえば図３（ｈ）に示すように、一部の第２蛍光色素が活性化する。
【００４７】
処理部１１１は、光源２２、２３を駆動して、上記のように第２蛍光色素に対して活性化と不活性化を繰り返し行う。撮像部６２は、その都度異なる第２蛍光色素の分布を撮像する。こうして、処理部１１１は、複数の第２の２次元画像、たとえば３０００枚の第２の２次元画像を取得する。
【００４８】
続いて、図４（ａ）〜（ｅ）を参照し、第１の３次元超解像画像を生成する手順について説明する。なお、第２の３次元超解像画像を生成する手順は、第１の３次元超解像画像と同様であるので、以下、第１の３次元超解像画像を生成する手順についてのみ説明する。
【００４９】
図４（ａ）に示すように、上記のようにして複数の第１の２次元画像が取得される。図４（ａ）に示す第１の２次元画像上には、撮像された第１蛍光が黒丸で示されている。図４（ｂ）に示すように、処理部１１１は、それぞれの第１の２次元画像において、ガウスフィッティングにより第１蛍光の輝点８１を抽出する。そして、処理部１１１は、抽出した輝点８１について、Ｘ−Ｙ平面における座標と、輝度とを取得する。
【００５０】
続いて、処理部１１１は、輝度が同程度で、かつ、距離が所定の範囲内にある２つの輝点８１を参照する。処理部１１１は、参照した２つの輝点８１を、あらかじめ記憶部１１２に記憶された２つの輝点のテンプレートとフィッティングさせる。処理部１１１は、ある精度以上でフィッティングできた２つの輝点８１を、１つの第１蛍光色素から生じた第１蛍光が位相変調マスク５０により分割されたものであるとして、ペアリングする。
【００５１】
続いて、図４（ｃ）に示すように、処理部１１１は、ペアとなる２つの輝点８１に基づいて、２つの輝点８１の元となる第１蛍光色素のＸ−Ｙ平面における点８２を取得する。続いて、図４（ｄ）に示すように、処理部１１１は、ペアとなる２つの輝点８１を結ぶ直線と、基準線とのなす角度θを取得する。処理部１１１は、取得した角度θに基づいて、Ｚ軸方向における第１蛍光色素の座標を算出する。こうして、図４（ｅ）に示すように、処理部１１１は、Ｘ−Ｙ平面における座標と、Ｚ軸方向における座標とに基づいて、複数の第１蛍光色素の３次元座標を取得する。そして、図４（ｅ）に示すように、処理部１１１は、それぞれの第１の２次元画像において取得した複数の３次元座標を重ね合わせることにより、第１の３次元超解像画像を生成する。
【００５２】
このように、第１および第２の３次元超解像画像が取得されると、第１および第２の２次元画像が用いられる場合に比べて、第１蛍光の発光点および第２蛍光の発光点を精度よく把握できる。これにより、医師等は、第１および第２の３次元超解像画像を参照して、Ｚ軸方向における第１物質の分布を把握でき、病状の判断や治療方針の決定をより的確に行える。
【００５３】
次に、図４（ｆ）を参照し、第１物質の数を取得する手順について説明する。
【００５４】
図４（ｆ）に示すように、処理部１１１は、第１の３次元超解像画像の座標点を、第１物質に対応するグループに分類する。たとえば、処理部１１１は、所定の参照空間を３次元座標空間において走査し、この参照空間内に含まれる座標点の数が閾値より多く、かつ、周囲よりも座標点の数が多い参照空間の位置を抽出する。そして、処理部１１１は、抽出した位置において参照空間に含まれる座標点のグループを、図４（ｆ）の破線で示すように、１つの第１物質に対応するグループに分類する。
【００５５】
続いて、処理部１１１は、被検細胞の３次元空間における核の範囲を取得する。具体的には、処理部１１１は、対物レンズ３６をＺ軸方向に変位させて、Ｚ軸方向の異なる複数のフォーカス位置において、第３蛍光に基づく第３の２次元画像を取得する。第３の２次元画像において、第３蛍光が検出される領域は核に対応し、第３蛍光が検出されない領域は、核以外、すなわち細胞質等に対応する。処理部１１１は、複数の第３の２次元画像ごとに、第３蛍光が検出された領域から核の輪郭を取得する。そして、処理部１１１は、各フォーカス位置とその位置における核の輪郭とに基づいて、３次元座標空間における核の範囲を取得する。
【００５６】
続いて、処理部１１１は、３次元座標空間において、被検細胞の核の範囲に含まれるグループの数を、第１物質の数として取得する。なお、第１の３次元超解像画像に複数の被検細胞が含まれる場合、第１物質の数は、たとえば、被検細胞ごとに取得された第１物質の数を平均化することにより取得される。処理部１１１は、第２物質の数についても、第２の３次元超解像画像に基づいて同様に取得する。
【００５７】
処理部１１１は、上記のように取得した第１物質の数と第２物質の数との比、すなわち、“第１物質の数／第２物質の数”を算出する。“第１物質の数／第２物質の数”は、たとえば、２．２より大きいと乳癌陽性と判定でき、１．８より小さいと乳癌陰性と判定でき、１．８以上２．２以下であると境界と判定できる。
【００５８】
このように、第１および第２の３次元画像に基づいて第１物質および第２物質の数が取得されると、“第１物質の数／第２物質の数”を精度よく算出できる。これにより、医師等に、より精度の高い判定結果を提示できる。
【００５９】
＜撮像手順の変更例＞
上記撮像手順では、撮像部６２により第１蛍光と第２蛍光とを別々に撮像した。この場合、図５（ａ）に示すように、処理部１１１は、複数の第１の２次元画像を取得した後で、複数の第２の２次元画像を取得する。そして、処理部１１１は、複数の第１の２次元画像に基づいて、第１の３次元超解像画像を取得し、複数の第２の２次元画像に基づいて、第２の３次元超解像画像を取得する。このように、第１の２次元画像と第２の２次元画像とが別々に撮像されると、撮像に要する時間が長くなってしまう。
【００６０】
そこで、上記撮像手順に代えて、撮像部６２により第１蛍光と第２蛍光とを同時に撮像してもよい。この場合、処理部１１１は、第１および第２蛍光色素が活性状態のときに、光源２１、２２を同時に点灯させ、被検細胞に光源２１、２２からの光を同時に照射する。これにより、被検細胞から第１蛍光と第２蛍光が同時に生じ、撮像部６２の撮像面６２ａには、第１蛍光と第２蛍光が同時に照射される。このとき取得される２次元画像は、図５（ｂ）に示すように、第１の２次元画像と第２の２次元画像が重ね合わされた共通の２次元画像となる。なお、このように第１蛍光と第２蛍光を同時に生じさせる場合、撮像部６２はカラーＣＣＤ等により構成される。
【００６１】
この場合も、図５（ｂ）に示すように、処理部１１１は、共通の２次元画像における第１蛍光に基づいて、第１の３次元超解像画像を生成し、共通の２次元画像における第２蛍光に基づいて、第２の３次元超解像画像を生成する。このように第１蛍光と第２蛍光とが同時に撮像部６２により撮像されると、撮像に要する時間を大幅に短縮できる。
【００６２】
＜位相変調マスクの事前検証＞
上述したように、位相変調マスク５０は、波長が互いに異なる第１蛍光と第２蛍光に対応できるように構成された。ところで、１種類の蛍光に最適な位相差を生じさせて１種類の蛍光の点像分布関数に応じた像を適正に形成する位相変調マスクは、一般的に知られている。そこで、本発明者は、位相変調マスクを２種類の蛍光に対応させるために、まず、第１蛍光に最適な位相変調マスクにより、第１蛍光と第２蛍光の位相を変調させる検証と、第２蛍光に最適な位相変調マスクにより、第１蛍光と第２蛍光の位相を変調させる検証と、を行った。
【００６３】
図６（ａ）に示すように、この検証で用いた光学機器１０は、図１に示す構成と比較して、ビームエキスパンダ３７に代えて偏光板３８とミラー３９を備え、位相変調マスク５０に代えて位相変調器５１を備える。偏光板３８は、たとえば偏光プリズムにより構成される。偏光板３８は、偏光方向が位相変調器５１に対して適切な偏光方向となるよう設置される。ミラー３９は、偏光板３８を通過した蛍光を反射して位相変調器５１に導く。この検証で用いた位相変調マスクは、入射する光を反射させる際に位相を変調させる位相変調器５１である。位相変調器５１は、対物レンズ３６と、ダイクロイックミラー３５と、偏光板３８と、ミラー３９と、集光レンズ６１とが構成する光学系のフーリエ面に配置される。位相変調器５１は、図１に示した位相変調マスク５０と同様に、撮像面６２ａにおける点像分布関数を変調する作用を有する。
【００６４】
図６（ｂ）に示すように、位相変調器５１は、液晶パネル５１ａを備える。位相変調器５１が駆動されると、設定に応じて、液晶パネル５１ａ内の液晶分子５１ｂが回転し、光の入射方向における液晶分子５１ｂの幅が変化する。このように光の入射方向において各液晶分子５１ｂの幅が変化すると、位相変調器５１の入射領域における位置に応じて屈折率の差が生じるようになる。これにより、液晶パネル５１ａに入射しミラー５１ｃによって反射される光の位相が、入射位置に応じて変調される。
【００６５】
位相変調器５１は、画像が入力されると、入力された画像に基づいて液晶パネル５１ａの各画素の階調を設定する。位相変調器５１に入力される画像は、位相変調器５１の各画素の階調を表す情報を保持している。位相変調器５１は、入力された画像から各画素に設定する階調を取得し、各画素の階調が入力画像に基づく所望の階調となるように、各液晶分子５１ｂの回転角度を設定する。このように、位相変調器５１は、入力画像に基づいて液晶分子５１ｂの回転角度を設定し、各画素の階調パターンを設定する。なお、位相変調器５１は、画像以外を受け付け可能に構成されている場合、位相変調器５１の各画素の階調を表す情報を保持する画像以外のデータに基づいて、液晶パネル５１ａの各画素の階調を設定してもよい。
【００６６】
本検証では、位相変調器５１として、浜松ホトニクス社製の“LCOS-SLM01”が用いられた。ステージ４０のスライドガラス４１上には、第１の蛍光ビーズと第２の蛍光ビーズが配置された。第１の蛍光ビーズは、光源２１からの光が照射されると、中心波長が６９０ｎｍの蛍光、すなわち第１蛍光を生じる。第２の蛍光ビーズは、光源２２からの光が照射されると、中心波長が５３０ｎｍの蛍光、すなわち第２蛍光を生じる。
【００６７】
本検証では、第１蛍光を観察する場合、第１の蛍光ビーズに対して対物レンズ３６をＺ軸方向にスキャンし、第１の蛍光ビーズのＺ軸方向における位置を相対的に変化させた。同様に、第２蛍光を観察する場合、第２の蛍光ビーズに対して対物レンズ３６をＺ軸方向にスキャンし、第２の蛍光ビーズのＺ軸方向における位置を相対的に変化させた。このように対物レンズ３６をＺ軸方向にスキャンすることにより、Ｚ軸方向の異なる位置に複数の蛍光ビーズが配置されている状態と同様の状態にできる。そして、撮像部６２により蛍光を撮像し、対物レンズ３６のスキャン位置ごとに蛍光の画像を取得した。
【００６８】
位相変調器５１の液晶パネル５１ａは、図６（ｂ）に示したように液晶分子５１ｂの傾きを変化させることにより、１画素につき２５６階調で位相変調できるよう構成されている。各画素の階調は０〜２５５に設定可能であり、階調が０〜２５５のいずれかに設定されることにより、２５６階調の位相変調が実現される。液晶パネル５１ａの全画素について設定された階調のパターン分布を、位相を変調させる分布として、以下「位相変調パターン」と称する。すなわち、液晶パネル５１ａの各画素について設定された階調の分布が、位相変調パターンに相当する。位相変調器５１に画像が入力され位相変調パターンが設定されることにより、液晶パネル５１ａの各画素の階調が設定され、図６（ｂ）に示すように、位相変調器５１に入射する蛍光の位相が画素ごとに変化する。
【００６９】
図７（ａ）に示す第１位相変調パターンは、第１の波長の光用、すなわち第１蛍光に最適な位相変調パターンである。第１位相変調パターンは、第１の波長の光、すなわち第１蛍光に第１位相変調を与える。図７（ｂ）に示す第２位相変調パターンは、第２の波長の光用、すなわち第２蛍光に最適な位相変調パターンである。第２位相変調パターンは、第２の波長の光、すなわち第２蛍光に第２位相変調を与える。位相変調器５１の位相変調パターンが第１位相変調パターンに設定されると、位相変調器５１に入射する第１蛍光について、撮像面６２ａにおいてＤＨ−ＰＳＦに応じた像が形成される。位相変調器５１の位相変調パターンが第２位相変調パターンに設定されると、位相変調器５１に入射する第２蛍光について、撮像面６２ａにおいてＤＨ−ＰＳＦに応じた像が形成される。
【００７０】
図７（ａ）、（ｂ）において、階調が０の画素は黒で示されており、階調が２５５の画素は白で示されている。階調が０の画素は、入射する光の位相を変調しない。階調が２５５の画素に入射する第１蛍光の位相は、階調が０の画素に入射する第１蛍光の位相に対して２πだけずれる。階調が１８３の画素に入射する第２蛍光の位相は、階調が０の画素に入射する第２蛍光の位相に対して２πだけずれる。
【００７１】
なお、本検証および後述する検証において、位相変調器５１の入射面により生じる収差を補正するために、位相変調器５１に第１蛍光を入射させる場合、位相変調器５１に設定する位相変調パターンには、所定の第１補正マスクを合成し、位相変調器５１に第２蛍光を入射させる場合、位相変調器５１に設定する位相変調パターンには、所定の第２補正マスクを合成した。第１補正マスクが合成されることにより、階調が２５５を越える画素については、その階調を２５６で除算した余りの値を、当該画素の階調とした。第２補正マスクが合成されることにより、階調が１８３を越える画素については、その階調を１８４で除算した余りの値を、当該画素の階調とした。
【００７２】
図８（ａ）〜（ｈ）を参照して、位相変調器の事前検証の結果について説明する。
【００７３】
図８（ａ）、（ｂ）は、位相変調器５１に第１位相変調パターンを設定し、第１蛍光を観察した場合の検証結果である。この場合、図８（ａ）に示すように、第１蛍光が撮像面６２ａにおいて２点に結像され、対物レンズ３６のＺ軸方向のスキャンにより、２点の結像位置により作られる直線が１８０度回転した。また、図８（ｂ）に示すように、対物レンズ３６のＺ軸方向のスキャン位置と、２点の結像位置により作られる直線の角度との関係は、１対１に対応したカーブとなった。図８（ａ）、（ｂ）の結果から、この場合は第１蛍光のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成できることが分かった。
【００７４】
図８（ｃ）、（ｄ）は、位相変調器５１に第１位相変調パターンを設定し、第２蛍光を観察した場合の検証結果である。この場合、図８（ｃ）に示すように、Ｚ軸方向の位置によってはＤＨ−ＰＳＦの形状が崩れた。また、図８（ｄ）に示すように、角度とスキャン位置の関係を示すカーブにおいて、一部に大きな段差が現れた。図８（ｃ）、（ｄ）の結果から、この場合は第２蛍光のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成できないことが分かった。
【００７５】
図８（ｅ）、（ｆ）は、位相変調器５１に第２位相変調パターンを設定し、第１蛍光を観察した場合の検証結果である。この場合、図８（ｅ）に示すように、Ｚ軸方向の位置によってはＤＨ−ＰＳＦの形状が崩れた。また、図８（ｆ）に示すように、スキャン位置と角度との関係を示すカーブが大きく崩れ、スキャン位置と角度とが１対１に対応しなかった。図８（ｅ）、（ｆ）の結果から、この場合は第１蛍光のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成できないことが分かった。
【００７６】
図８（ｇ）、（ｈ）は、位相変調器５１に第２位相変調パターンを設定し、第２蛍光を観察した場合の検証結果である。この場合、図８（ｇ）に示すように、２つの輝点像が適正となった。また、図８（ｈ）に示すように、角度とスキャン位置との関係は、１対１に対応したカーブとなった。図８（ｇ）、（ｈ）の結果から、この場合は第２蛍光のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成できることが分かった。
【００７７】
図８（ａ）、（ｂ）、（ｇ）、（ｈ）の結果から、位相変調器５１の位相変調パターンの設定と、位相変調器５１に入射させる蛍光の中心波長との組合せが最適である場合、蛍光のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成できた。このことは結果としては妥当であったと言える。一方、位相変調器５１の位相変調パターンの設定と、位相変調器５１に入射させる蛍光の中心波長との組合せが最適でない場合、蛍光のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成できなかった。このことから、位相変調器５１の位相変調パターンの設定と、位相変調器５１に入射させる蛍光とを適切に選択する必要があることが分かった。
【００７８】
以上の結果を踏まえて、本発明者は、第１蛍光と第２蛍光の両方に対応できるように、第１蛍光にとって最適な第１位相変調パターンと、第２蛍光にとって最適な第２位相変調パターンとを統合することを考えた。その際に、本発明者は、第１蛍光と第２蛍光の波長帯域が重なることに着目した。第１蛍光は、第１の波長に強度のピークを持つ光であり、第２蛍光は、第２の波長に強度のピークを持つ光である。すなわち、第１蛍光の波長帯域は、第１の波長を中心波長としてある程度の広がりを有しており、第２蛍光の波長帯域は、第２の波長を中心波長としてある程度の広がりを有する。そして、第１蛍光の波長帯域の一部と、第２蛍光の波長帯域の一部とは互いに重なり合う。
【００７９】
発明者は、第１蛍光の波長帯域の一部と第２蛍光の波長帯域の一部とが重なり合う場合に、第１蛍光に最適な第１位相変調パターンと、第２蛍光に最適な第２位相変調パターンとを以下のように統合すれば、統合した位相変調パターンによって第１蛍光と第２蛍光のＤＨ−ＰＳＦに応じた像が適正に形成できることを見いだした。以下に示す実施例１〜６の位相変調パターンは、第１位相変調パターンと第２位相変調パターンとを様々な方法で統合した例である。また、発明者は、実施例１〜６の位相変調パターンによって、第１蛍光および第２蛍光のＤＨ−ＰＳＦに応じた像が適正に形成されるか否かを検証した。
【００８０】
＜実施例１の位相変調パターン＞
実施例１の位相変調パターンは、第１位相変調パターンと第２位相変調パターンとを、位置ごとに所定の割合で合成することにより作製される。第１位相変調パターンと第２位相変調パターンとをａ対ｂで合成する場合、以下の式に示すように、実施例１の位相変調パターンの階調は、第１位相変調パターンの第１の階調と、第２位相変調パターンの第２の階調とに基づいて算出される。
【００８１】
実施例１の位相変調パターンの階調
＝（第１の階調×ａ＋第２の階調×ｂ）／（ａ＋ｂ）
（ａ、ｂは、いずれも正の実数）
【００８２】
具体的に実施例１の位相変調パターンを用いる場合、実施例１の位相変調パターンに対応する画像が作製され、作製された画像が位相変調器５１に入力され、入力された画像に基づいて位相変調器５１において実施例１の位相変調パターンが実現される。実施例１の位相変調パターンに対応する画像の各画素における階調は、第１の波長の光用の階調と、第２波長の光用の階調との間の階調に設定される。すなわち、第１蛍光に最適な第１位相変調パターンの同じ画素位置における階調と、第２蛍光に最適な第２位相変調パターンの同じ画素位置における階調とに基づいて、上記式により算出される。こうして作製された実施例１の位相変調パターンに対応する画像が、位相変調器５１に入力されることにより、位相変調器５１において実施例１の位相変調パターンが設定され、液晶パネル５１ａの各液晶分子５１ｂの回転角度が設定される。
【００８３】
図９は、（ａ、ｂ）＝（９、１）、（８、２）、（７、３）、（６、４）、（５、５）、（４、６）、（３、７）、（２、８）、（１、９）のときの、実施例１の位相変調パターンを示す図である。以下、これら９つの位相変調パターンについて検証を行った結果を示す。
【００８４】
図１０は、上記のような実施例１の９種類の位相変調パターンと、第１位相変調パターンと、第２位相変調パターンとを用いて、第１蛍光を観察した場合の撮像面６２ａにおける第１蛍光の結像状態を示す図である。上下方向は、対物レンズ３６のスキャン位置を示している。最も左側の“６９０ｎｍ”と最も右側の“５３０ｎｍ”は、それぞれ第１位相変調パターンと第２位相変調パターンを用いた場合を示している。
【００８５】
図１０に示すように、各スキャン位置のいずれにおいても、右へ進むにつれて、すなわち第２位相変調パターンの配合比率が上昇し位相変調パターンが第２位相変調パターンに近付くにつれて、ＤＨ−ＰＳＦに応じた輝点像がぼやけていく様子が見られた。また、スキャン位置が−３μｍや−４μｍの場合は、右へ進むにつれて、２つの輝点の中間に０次光に基づく新たな輝点が現れた。特に、（ａ、ｂ）＝（１、９）の位相変調パターンと第２位相変調パターンとを用いた場合、実線の枠で囲んだ部分に示すように、０次光の輝点像の輝点強度が、ＤＨ−ＰＳＦに応じた輝点像に比べて高かった。このような場合、０次光をＤＨ−ＰＳＦの輝点と誤認識することで、スキャン位置と角度との関係を示すカーブや、３次元超解像画像を適正に生成できない可能性がある。
【００８６】
図１１は、上記のような実施例１の９種類の位相変調パターンと、第１位相変調パターンと、第２位相変調パターンとを用いて、第２蛍光を観察した場合の撮像面６２ａにおける第２蛍光の結像状態を示す図である。
【００８７】
図１１に示すように、各スキャン位置のいずれにおいても、左へ進むにつれて、すなわち第１位相変調パターンの配合比率が上昇し位相変調パターンが第１位相変調パターンに近付くにつれて、ＤＨ−ＰＳＦに応じた輝点像がぼやけていく様子が見られた。特に、（ａ、ｂ）＝（９、１）、（８、２）、（７、３）の位相変調パターンと第１位相変調パターンとを用いた場合、実線の枠で囲んだ部分に示すように、スキャン位置によっては輝点が２点よりも多くなった。
【００８８】
図１０、１１の結果から、（ａ、ｂ）＝（６、４）、（５、５）、（４、６）、（３、７）、（２、８）で実施例１の位相変調パターンを設定した場合、第１蛍光と第２蛍光の両方のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成できることが分かった。
【００８９】
さらに、（ａ、ｂ）＝（５、５）で実施例１の位相変調パターンを設定した場合の検証結果について、図１２（ａ）〜（ｄ）を参照して説明する。
【００９０】
図１２（ａ）、（ｂ）は、第１蛍光を観察した場合の結果を示しており、図１２（ｃ）、（ｄ）は、第２蛍光を観察した場合の結果を示している。図１２（ａ）、（ｃ）に示すように、２点の結像位置により作られる直線の傾きが−９０度〜＋９０度の範囲で、第１蛍光と第２蛍光の両方のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成できた。また、図１２（ｂ）、（ｄ）に示すように、角度とスキャン位置との関係は１対１に対応したカーブとなった。
【００９１】
以上の検証結果から、位相変調器５１に実施例１の位相変調パターンを設定する場合に、第１位相変調パターンと第２位相変調パターンを所定の割合で合成して実施例１の位相変調パターンとすれば、実施例１の位相変調パターンにより、第１蛍光と第２蛍光の両方のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成できることが分かった。なお、中心波長が異なる３種類以上の蛍光に対しても、同様に、３種類の蛍光に最適な位相変調パターンを所定の割合で合成することにより、３つの蛍光のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成できる。
【００９２】
次に、図１３（ａ）〜（ｃ）を参照して、上記のように第１位相変調パターンと第２位相変調パターンを合成することについて詳細に説明する。図１３（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ、第１位相変調パターンと、第２位相変調パターンと、実施例１の位相変調パターンにおいて、液晶パネル５１ａの１つの画素位置を模式的に示す図である。図１３（ａ）〜（ｃ）では、便宜上、１つの液晶分子５１ｂにより１つの画素の階調が設定されるものとする。
【００９３】
図１３（ａ）に示すように、第１蛍光に基づいてＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成させるために、所定の画素位置に入射する第１蛍光が液晶分子５１ｂを往復で通過する距離を、第１距離Ｌ１とする。同様に、図１３（ｂ）に示すように、第２蛍光のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成させるために、所定の画素位置に入射する第２蛍光が液晶分子５１ｂを往復で通過する距離を、第２距離Ｌ２とする。第１距離Ｌ１によって第１蛍光の位相が変調される大きさは、第２距離Ｌ２によって第２蛍光の位相が変調される大きさに等しい。すなわち、第１蛍光の波長と、第２蛍光の波長と、液晶分子５１ｂの屈折率とを考慮すると、第１距離Ｌ１に基づく第１蛍光の光路長と第２距離Ｌ２に基づく第２蛍光の光路長とは互いに等しい。
【００９４】
図１３（ｃ）に示すように、第１蛍光と第２蛍光の両方のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成させるために、所定の画素位置に入射する第１蛍光と第２蛍光が液晶分子５１ｂを往復で通過する距離を、第３距離Ｌ３とする。このとき、第３距離Ｌ３は、第１距離と第２距離との間に設定される。すなわち、実施例１の位相変調パターンの各位置における位相変調の大きさは、第１位相変調パターンにおける位相変調の大きさと、第２位相変調パターンにおける位相変調の大きさとの間の大きさに設定されている。具体的には、上記のような実施例１の位相変調パターンの式と同様、第３距離Ｌ３は、以下の式により算出される。
【００９５】
第３距離Ｌ３＝（第１距離Ｌ１×ａ＋第２距離Ｌ２×ｂ）／（ａ＋ｂ）
【００９６】
実施例１の位相変調パターンが設定されると、図１３（ｃ）に示すような設定が全ての画素位置において行われる。これにより、実施例１の位相変調パターンは、第１蛍光と第２蛍光の両方のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成できるようになる。
【００９７】
なお、（ａ、ｂ）＝（５、５）のとき、第３距離Ｌ３は、第１距離Ｌ１と第２距離Ｌ２の中間に設定されることになる。この場合、第１蛍光には、第１蛍光を第１位相変調パターンにより位相変調させる大きさと、第１蛍光を第２位相変調パターンにより位相変調させる大きさとの中間の大きさの位相変調が生じる。第２蛍光には、第２蛍光を第１位相変調パターンにより位相変調させる大きさと、第２蛍光を第２位相変調パターンにより位相変調させる大きさとの中間の大きさの位相変調が生じる。
【００９８】
＜実施例２の位相変調パターン＞
図１４（ａ）に示すように、実施例２の位相変調パターンは、第１位相変調パターンと第２位相変調パターンとをモザイク状に配置することにより作製される。実施例２の位相変調パターンでは、入射領域を多数に区分した領域群が、薄いグレーの領域からなる第１領域と、濃いグレーの領域からなる第２領域とに区分される。第１領域の各領域と第２領域の各領域はそれぞれ隣り合っている。薄いグレーの領域には、第１位相変調パターンが設定され、濃いグレーの領域は、第２位相変調パターンが設定される。実施例２の位相変調パターンでは、第１領域の１つの領域と第２領域の１つの領域は、いずれも一辺がＭピクセルの正方形形状とされる。
【００９９】
すなわち、実施例２の位相変調パターンは、入射領域において、第１の波長の光に第１位相変調を与えるための領域、すなわち第１位相変調パターンが設定された第１領域と、第２の波長の光に第２位相変調を与えるための領域、すなわち第２位相変調パターンが設定された第２領域とを含む。言い換えれば、入射領域のある領域において、実施例２の位相変調パターンでは、第１領域に入射する光束が位相変調のために進む距離が、図１３（ａ）に示す第１距離Ｌ１に設定され、第２領域に入射する光束が位相変調のために進む距離が、図１３（ｂ）に示す第２距離Ｌ２に設定される。
【０１００】
図１４（ｂ）〜（ｄ）は、それぞれＭ＝１、３、５のときの、実施例２の位相変調パターンを示す図である。図１４（ｂ）〜（ｄ）には、中央付近における第１位相変調パターンと第２位相変調パターンの配置が拡大表示されている。以下、これら３つの位相変調パターンについて検証を行った結果を示す。
【０１０１】
図１５（ａ）〜（ｄ）は、Ｍ＝１の実施例２の位相変調パターンを用いて、蛍光を観察した結果を示す図である。図１５（ａ）、（ｂ）に示すように、第１蛍光を観察した場合、２つの輝点像が適正となり、スキャン位置と角度との関係も１対１に対応したカーブとなった。図１５（ｃ）、（ｄ）に示すように、第２蛍光を観察した場合も、２つの輝点像が適正となり、スキャン位置と角度との関係も１対１に対応したカーブとなった。したがって、Ｍ＝１の実施例２の位相変調パターンを用いることにより、第１蛍光と第２蛍光の両方のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成できることが分かった。
【０１０２】
図１５（ｅ）、（ｆ）は、Ｍ＝５の実施例２の位相変調パターンを用いて、第１蛍光と第２蛍光を観察した結果を示す図である。この場合も、第１蛍光を観察した場合と、第２蛍光を観察した場合とにおいて、いずれも２つの輝点像が適正となった。したがって、Ｍ＝５の実施例２の位相変調パターンを用いることにより、第１蛍光と第２蛍光の両方のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成できることが分かった。
【０１０３】
図１６（ａ）は、Ｍ＝１、３の実施例２の位相変調パターンを用いて、第１蛍光を広視野で観察した結果を示す図である。図１６（ｂ）は、Ｍ＝１、３の実施例２の位相変調パターンを用いて、第２蛍光を広視野で観察した結果を示す図である。図１６（ａ）、（ｂ）において、上段は、蛍光を直接観察した場合に撮像部６２により生成される画像である。下段は、上段の画像のコントラストを調整した画像である。図１６（ａ）、（ｂ）において、左側の画像はＭ＝１の位相変調パターンに対応し、右側の画像はＭ＝３の位相変調パターンに対応する。
【０１０４】
図１６（ａ）、（ｂ）の下段の画像において、矢印で示す位置に輝点が現れている。この輝点は、第１位相変調パターンと第２位相変調パターンとがモザイク状で周期的に配置されていることにより生じた回折光に基づく輝点である。回折角はＭの値が大きいほど小さいため、Ｍ＝１の位相変調パターンを用いた場合よりも、Ｍ＝３の位相変調パターンを用いた場合の方が、回折光が画像の中心に近い領域に現れることになる。Ｍ＝３の場合、本来観察したいＤＨ−ＰＳＦに応じた輝点の一部に、回折光が重畳していることが分かった。
【０１０５】
したがって、実施例２の位相変調パターンを用いる場合には、Ｍの値をなるべく小さくするのが望ましいと言える。ただし、位相変調器５１の１つの画素のサイズが小さい場合には、Ｍの値を大きくしても回折光が視野に入らないこともあり得る。また、回折光の輝点は、本来観察したいＤＨ−ＰＳＦに応じた輝点に比べて暗いため、回転角度に基づいて３次元座標を算出する際に、特に問題とならないこともあり得る。なお、中心波長が異なる２種類の蛍光のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成できるＭの値は、上記のような１、３、５に限らない。
【０１０６】
＜実施例３の位相変調パターン＞
図１７（ａ）に示すように、実施例３の位相変調パターンは、実施例２の位相変調パターンと同様、第１位相変調パターンと第２位相変調パターンとをモザイク状に配置することにより作製される。ただし、実施例３の位相変調パターンでは、第１領域の１つの領域と第２領域の１つの領域は、いずれも上下方向にＭピクセルであり左右方向にＮピクセルの長方形形状とされる。
【０１０７】
図１７（ｂ）〜（ｄ）は、それぞれ（Ｍ、Ｎ）＝（１、２）、（１、４）、（１、３２）のときの、実施例３の位相変調パターンを示す図である。以下、これら３つの位相変調パターンについて検証を行った結果を示す。
【０１０８】
図１８（ａ）〜（ｄ）は、（Ｍ、Ｎ）＝（１、２）の実施例３の位相変調パターンを用いて、蛍光を観察した結果を示す図である。図１８（ａ）、（ｂ）に示すように、第１蛍光を観察した場合、２つの輝点像が適正となり、スキャン位置と角度との関係も１対１に対応したカーブとなった。図１８（ｃ）、（ｄ）に示すように、第２蛍光を観察した場合も、２つの輝点像が適正となり、スキャン位置と角度との関係も１対１に対応したカーブとなった。したがって、（Ｍ、Ｎ）＝（１、２）の実施例３の位相変調パターンを用いることにより、第１蛍光と第２蛍光の両方のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成できることが分かった。
【０１０９】
図１８（ｅ）、（ｆ）は、（Ｍ、Ｎ）＝（１、３２）の実施例３の位相変調パターンを用いて、第１蛍光と第２蛍光を観察した結果を示す図である。この場合も、第１蛍光を観察した場合と、第２蛍光を観察した場合とにおいて、２つの輝点像が適正となった。したがって、（Ｍ、Ｎ）＝（１、３２）の実施例３の位相変調パターンを用いることにより、第１蛍光と第２蛍光の両方のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成できることが分かった。
【０１１０】
図１９（ａ）は、（Ｍ、Ｎ）＝（１、２）、（１、４）の実施例３の位相変調パターンを用いて、第１蛍光を広視野で観察した結果を示す図である。図１９（ｂ）は、（Ｍ、Ｎ）＝（１、２）、（１、４）の実施例３の位相変調パターンを用いて、第２蛍光を広視野で観察した結果を示す図である。図１９（ａ）、（ｂ）において、左側の画像は（Ｍ、Ｎ）＝（１、２）の位相変調パターンに対応し、右側の画像は（Ｍ、Ｎ）＝（１、４）の位相変調パターンに対応する。
【０１１１】
図１９（ａ）、（ｂ）の下段の画像において、図１６（ａ）、（ｂ）の場合と同様、矢印で示す位置に輝点が現れている。図１７（ａ）の上下方向と左右方向は、図１９（ａ）、（ｂ）の画像において、それぞれ左右方向と上下方向に対応する。本検証では、Ｍの値は１に固定されているため、図１９（ａ）、（ｂ）の下段の画像に示すように、回折光は左右方向において両端の同じ位置に現れた。一方、Ｎの値が大きくなると、回折光は左右方向における位置を保ちながら、上下方向において画像の中心に近付いた。また、（Ｍ、Ｎ）＝（２、４）の条件が示すような長方形形状の実施例３の位相変調パターンを用いた場合も、実施例２の位相変調パターンの検証からも分かるように、Ｍの値が１から２へと大きくなることによって、回折光が左右方向において画像の中心に近付くことが想定される。
【０１１２】
したがって、実施例３の位相変調パターンを用いる場合には、Ｍ、Ｎの値をなるべく小さくするのが望ましいと言える。なお、中心波長が異なる２種類の蛍光のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成できるＭ、Ｎの値は、上記のような（１、２）、（１、４）、（１、３２）に限らない。
【０１１３】
＜実施例４の位相変調パターン＞
図２０（ａ）に示すように、実施例４の位相変調パターンは、第１位相変調パターンと第２位相変調パターンとをストライプ状に配置することにより作製される。第１領域の１つの領域と第２領域の１つの領域は、いずれも左右方向にＭピクセルのストライプ形状とされる。第１領域の各領域と第２領域の各領域は、第１蛍光および第２蛍光が入射する入射領域の一端から他端にわたって延びている。すなわち、上下方向の長さは、設定可能な長さの最大のピクセル値とされる。
【０１１４】
図２０（ｂ）〜（ｄ）は、それぞれＭ＝１、２、１６のときの、実施例４の位相変調パターンを示す図である。以下、これら３つの位相変調パターンについて検証を行った結果を示す。
【０１１５】
図２１（ａ）〜（ｄ）は、Ｍ＝１の実施例４の位相変調パターンを用いて、蛍光を観察した結果を示す図である。図２１（ａ）、（ｂ）に示すように、第１蛍光を観察した場合、２つの輝点像が適正となり、スキャン位置と角度との関係も１対１に対応したカーブとなった。図２１（ｃ）、（ｄ）に示すように、第２蛍光を観察した場合も、２つの輝点像が適正となり、スキャン位置と角度との関係も１対１に対応したカーブとなった。したがって、Ｍ＝１の実施例４の位相変調パターンを用いることにより、第１蛍光と第２蛍光の両方のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成できることが分かった。
【０１１６】
図２１（ｅ）、（ｆ）は、Ｍ＝１６の実施例４の位相変調パターンを用いて、第１蛍光と第２蛍光を観察した結果を示す図である。この場合も、第１蛍光を観察した場合と、第２蛍光を観察した場合とにおいて、２つの輝点像が適正となった。したがって、Ｍ＝１６の実施例４の位相変調パターンを用いることにより、第１蛍光と第２蛍光の両方のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成できることが分かった。
【０１１７】
図２２（ａ）は、Ｍ＝１、２の実施例４の位相変調パターンを用いて、第１蛍光を広視野で観察した結果を示す図である。図２２（ｂ）は、Ｍ＝１、２の実施例４の位相変調パターンを用いて、第２蛍光を広視野で観察した結果を示す図である。図２２（ａ）、（ｂ）において、左側の画像はＭ＝１の位相変調パターンに対応し、右側の画像はＭ＝２の位相変調パターンに対応する。
【０１１８】
図２２（ａ）、（ｂ）の下段の画像において、図１６（ａ）、（ｂ）の場合と同様、矢印で示す位置に輝点が現れている。ただし、実施例２の位相変調パターンの場合とは異なり、図２２（ａ）、（ｂ）の下段の画像に示すように、回折光は上下方向にのみ現れた。一方、Ｍの値が大きくなると、実施例２の位相変調パターンと同様、回折光は、上下方向において画像の中心に近付いた。
【０１１９】
したがって、実施例４の位相変調パターンを用いる場合には、Ｍの値をなるべく小さくするのが望ましいと言える。なお、中心波長が異なる２種類の蛍光のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成できるＭの値は、上記のような１、２、１６に限らない。
【０１２０】
＜実施例５の位相変調パターン＞
図２３（ａ）に示すように、実施例５の位相変調パターンは、第１位相変調パターンと第２位相変調パターンとを同心円状に配置することにより作製される。言い換えれば、第１領域の各領域と第２領域の各領域は、同心のリング形状である。なお、第１領域の各領域の中心と第２領域の各領域の中心とは、ずれていてもよい。第１領域の１つの領域と第２領域の１つの領域は、中心からＭピクセル遠ざかるごとに、互いに入れ替わるように配置される。
【０１２１】
図２３（ｂ）〜（ｅ）は、それぞれＭ＝１、２、５、６０のときの、実施例５の位相変調パターンを示す図である。以下、これら４つの位相変調パターンについて検証を行った結果を示す。
【０１２２】
図２４（ａ）〜（ｄ）は、Ｍ＝１の実施例５の位相変調パターンを用いて、蛍光を観察した結果を示す図である。図２４（ａ）、（ｂ）に示すように、第１蛍光を観察した場合、２つの輝点像が適正となり、スキャン位置と角度との関係も１対１に対応したカーブとなった。図２４（ｃ）、（ｄ）に示すように、第２蛍光を観察した場合も、２つの輝点像が適正となり、スキャン位置と角度との関係も１対１に対応したカーブとなった。したがって、Ｍ＝１の実施例５の位相変調パターンを用いることにより、第１蛍光と第２蛍光の両方のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成できることが分かった。
【０１２３】
図２４（ｅ）、（ｆ）は、Ｍ＝５の実施例５の位相変調パターンを用いて、第１蛍光と第２蛍光を観察した結果を示す図である。この場合も、第１蛍光を観察した場合と、第２蛍光を観察した場合とにおいて、２つの輝点像が適正となった。したがって、Ｍ＝５の実施例５の位相変調パターンを用いることにより、第１蛍光と第２蛍光の両方のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成できることが分かった。
【０１２４】
図２４（ｇ）、（ｈ）は、Ｍ＝６０の実施例５の位相変調パターンを用いて、第１蛍光と第２蛍光を観察した結果を示す図である。この場合、第１蛍光を観察した場合と、第２蛍光を観察した場合とにおいて、２つの輝点像が崩れてしまうことが確認された。したがって、Ｍの値が大きくなり過ぎると、第１蛍光と第２蛍光のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成できなくなることが分かった。
【０１２５】
図２５（ａ）は、Ｍ＝２、５の実施例５の位相変調パターンを用いて、第１蛍光を広視野で観察した結果を示す図である。図２５（ｂ）は、Ｍ＝２、５の実施例５の位相変調パターンを用いて、第２蛍光を広視野で観察した結果を示す図である。図２５（ａ）、（ｂ）において、左側の画像はＭ＝２の位相変調パターンに対応し、右側の画像はＭ＝５の位相変調パターンに対応する。
【０１２６】
図２５（ａ）、（ｂ）の下段の画像において、矢印で示すような、輝点像を囲むリング状の回折光が現れている。Ｍ＝２、５の下段の画像を参照すると、この回折光は、Ｍの値が大きくなるにつれて、より直径の小さなリング状の回折光として現れ、本来観察したいＤＨ−ＰＳＦに応じた輝点に近付くことが分かった。したがって、実施例５の位相変調パターンを用いる場合には、Ｍの値をなるべく小さくするのが望ましいと言える。なお、中心波長が異なる２種類の蛍光のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成できるＭの値は、上記のような１、２、５に限らない。
【０１２７】
また、実施例５の位相変調パターンによれば、実施例２〜４の位相変調パターンに比べて、回折光は円に沿ってより広い範囲に分散されるため、回折光の輝度は小さくなる。したがって、実施例５の位相変調パターンを用いる場合に、回折光が本来観察したいＤＨ−ＰＳＦに応じた輝点に重なったとしても、大きな問題となることはない。このことから、Ｍの値が小さい実施例５の位相変調パターンは、実施例２〜４の位相変調パターンよりも、第１蛍光と第２蛍光の両方のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成できると言える。
【０１２８】
＜実施例６の位相変調パターン＞
実施例６の位相変調パターンは、位置や大きさ等を変更した第１位相変調パターンと第２位相変調パターンとを、実施例２の位相変調パターンと同様に正方形形状のモザイク状に配置することにより作製される。
【０１２９】
図２６は、８種類の実施例５の位相変調パターンを示す図である。“mosaicROTATE5”は、中心まわりに５度回転した第１位相変調パターンと、第２位相変調パターンとをモザイク状に配置した位相変調パターンである。“mosaicROTATE30”は、中心まわりに３０度回転した第１位相変調パターンと、第２位相変調パターンとをモザイク状に配置した位相変調パターンである。“mosaicSHIFT5”は、右方向に５ピクセルだけシフトした第１位相変調パターンと、左方向に５ピクセルだけシフトした第２位相変調パターンとをモザイク状に配置した位相変調パターンである。“mosaicSHIFT10”は、右方向に１０ピクセルだけシフトした第１位相変調パターンと、左方向に１０ピクセルだけシフトした第２位相変調パターンとをモザイク状に配置した位相変調パターンである。
【０１３０】
“mosaicEXPAND10”は、１０ピクセルだけ直径を拡大した第１位相変調パターンと、第２位相変調パターンとをモザイク状に配置した位相変調パターンである。“mosaicEXPAND40”は、４０ピクセルだけ直径を拡大した第１位相変調パターンと、第２位相変調パターンとをモザイク状に配置した位相変調パターンである。“mosaicREDUCE20”は、２０ピクセルだけ直径を縮小した第１位相変調パターンと、第２位相変調パターンとをモザイク状に配置した位相変調パターンである。“mosaicREDUCE40”は、４０ピクセルだけ直径を縮小した第１位相変調パターンと、第２位相変調パターンとをモザイク状に配置した位相変調パターンである。以下、これら８つの位相変調パターンについて検証を行った結果を示す。
【０１３１】
図２７（ａ）、（ｂ）は、“mosaicROTATE5”を用いて、蛍光を観察した結果を示す図である。この場合、第１蛍光を観察した場合と、第２蛍光を観察した場合とにおいて、２つの輝点像が適正となった。図２７（ｃ）、（ｄ）は、“mosaicROTATE30”を用いて、蛍光を観察した結果を示す図である。この場合、第１蛍光を観察した場合と、第２蛍光を観察した場合とにおいて、２つの輝点像が崩れてしまうことが確認された。したがって、第１位相変調パターンの回転角度と第２位相変調パターンの回転角度の差が大きくなると、第１蛍光と第２蛍光のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成できなくなることが分かった。
【０１３２】
図２７（ｅ）、（ｆ）は、“mosaicSHIFT5”を用いて、蛍光を観察した結果を示す図である。この場合、第１蛍光を観察した場合と、第２蛍光を観察した場合とにおいて、図２７（ｇ）、（ｈ）は、“mosaicSHIFT10”を用いて、蛍光を観察した結果を示す図である。この場合、第１蛍光を観察した場合と、第２蛍光を観察した場合とにおいて、２つの輝点像が適正となったが、“mosaicSHIFT5”に比べて輝点像が僅かに崩れた。
【０１３３】
なお、“mosaicSHIFT10”の輝点像が、“mosaicSHIFT5”に比べて僅かに崩れている理由は、１つの中心波長のみに最適な位相変調パターンに、当該中心波長の蛍光が入射する場合を考えると明らかである。すなわち、位相変調パターンに入射する蛍光が、当該位相変調パターンに最適な蛍光であっても、入射するビームの中心が位相変調パターンの中心から離れるほど、輝点像の形状が崩れる。このため、中心からのシフト量が大きい“mosaicSHIFT10”において、輝点像が崩れやすくなる。
【０１３４】
図２８（ａ）、（ｂ）は、“mosaicEXPAND10”を用いて、蛍光を観察した結果を示す図である。この場合、第１蛍光を観察した場合と、第２蛍光を観察した場合とにおいて、２つの輝点像が適正となった。図２８（ｃ）、（ｄ）は、“mosaicEXPAND40”を用いて、蛍光を観察した結果を示す図である。この場合、第１蛍光を観察した場合と、第２蛍光を観察した場合とにおいて、２つの輝点像が適正となったが、“mosaicEXPAND10”に比べて輝点像が僅かに崩れた。
【０１３５】
なお、“mosaicEXPAND40”の輝点像が、“mosaicEXPAND10”に比べて僅かに崩れている理由は、１つの中心波長のみに最適な位相変調パターンに、当該中心波長の蛍光が入射する場合を考えると明らかである。すなわち、位相変調パターンに入射する蛍光が、当該位相変調パターンに最適な蛍光であっても、入射するビームの直径が位相変調パターンの直径とかけ離れるほど、輝点像の形状が崩れる。このため、直径のずれ量が大きい“mosaicEXPAND40”において、輝点像が崩れやすくなる。
【０１３６】
図２８（ｅ）、（ｆ）は、“mosaicREDUCE20”を用いて、蛍光を観察した結果を示す図である。この場合、第１蛍光を観察した場合と、第２蛍光を観察した場合とにおいて、２つの輝点像が適正となった。図２８（ｇ）、（ｈ）は、“mosaicREDUCE40”を用いて、蛍光を観察した結果を示す図である。この場合、第１蛍光を観察した場合と、第２蛍光を観察した場合とにおいて、２つの輝点像が適正となったが、“mosaicREDUCE20”に比べて輝点像が僅かに崩れた。なお、“mosaicREDUCE40”の輝点像が、“mosaicREDUCE20”に比べて僅かに崩れている理由は、“mosaicEXPAND40”の場合の崩れと同様の理由である。
【０１３７】
＜透明部材からなる位相板への適用＞
図２９（ａ）〜（ｆ）を参照して、実施例１に示す位相変調パターンを、透明部材からなる位相板に適用する例について説明する。
【０１３８】
図２９（ａ）は、図７（ａ）に示す第１位相変調パターンに対応するように作製された位相板９１である。図２９（ｂ）は、図７（ｂ）に示す第２位相変調パターンに対応するように作製された位相板９２である。位相板９１、９２は、位相板５２と同じ材料からなる。位相板９１において、厚みが大きい部分は、第１位相変調パターンにおいて白に近い領域に対応し、厚みが小さい部分は、第１位相変調パターンにおいて黒に近い領域に対応する。同様に、位相板９２において、厚みが大きい部分は、第２位相変調パターンにおいて白に近い領域に対応し、厚みが小さい部分は、第２位相変調パターンにおいて黒に近い領域に対応する。
【０１３９】
位相板９１の最大の厚みは、最大の厚み部分に入射する第１蛍光の位相が１波長だけずれるように設計されている。同様に、位相板９２の最大の厚みは、最大の厚み部分に入射する第２蛍光の位相が１波長だけずれるように設計されている。位相板９１は、第１の波長の光、すなわち第１蛍光に第１位相変調を与える。位相板９２は、第２の波長の光、すなわち第２蛍光に第２位相変調を与える。
【０１４０】
このような位相板９１、９２を、実施例１の位相変調パターンと同様に合成して、図２９（ｃ）に示すように、位相板５２を作製する。位相板５２の厚みは、第１の波長の光用の位相板の厚みと第２の波長の光用の位相板の厚みとの間の厚み、すなわち、第１蛍光に最適な位相板９１の厚みと、第２蛍光に最適な位相板９２の厚みとの間の厚みを有する。位相板５２は、アクリル樹脂等の透明部材からなる。なお、位相板５２を構成する透明部材は、必ずしも透明でなくてもよく、光を透過できればよい。
【０１４１】
なお、位相板９１の厚みＴ１と、位相板９２の厚みＴ２とは、以下の式により算出される。以下の式において、ｎ１は、位相板９１、９２の周辺の屈折率、すなわち空気の屈折率である。ｎ２は、位相板９１、９２の屈折率、すなわち作製しようとする位相板５２の屈折率である。λ１は、第１蛍光の中心波長であり、λ２は、第２蛍光の中心波長である。θは、位相のシフト量である。
【０１４２】
厚みＴ１＝λ１×θ／｛２π（ｎ２−ｎ１）｝
厚みＴ２＝λ２×θ／｛２π（ｎ２−ｎ１）｝
なお、Ｔ２／Ｔ１＝λ２／λ１である。
【０１４３】
たとえば、位相板９１、９２において、第１蛍光および第２蛍光の位相の最大シフト量がθｍａｘである場合、θｍａｘを上記式に代入して得られる厚みＴ１、Ｔ２は、それぞれ、位相板９１、９２の最大厚みに対応する。そして、位相板５２の厚みは、位相板９１の最大厚みと位相板９２の最大厚みとの間の厚みに設定される。同様に、位相板９１、９２が最大厚みとなる領域以外の領域においても、位相板５２の厚みは、位相のシフト量に基づいて得られる厚みＴ１と厚みＴ２の間の厚みに設定される。
【０１４４】
なお、上記厚みを算出する式において、θの範囲が、２（ｍ−１）π＜θ≦２ｍπ（ｍは正の整数）の場合、下記式が好ましい。これにより、光の透過率の低下を抑制できる。
【０１４５】
厚みＴ１＝λ１｛θ−２（ｍ−１）π｝／｛２π（ｎ２−ｎ１）｝
厚みＴ２＝λ２｛θ−２（ｍ−１）π｝／｛２π（ｎ２−ｎ１）｝
【０１４６】
図２９（ｄ）〜（ｆ）は、それぞれ、図２９（ａ）〜（ｃ）において点線で囲んだ領域を厚み方向に平行な平面で切断したときの切断面を模式的に示す図である。点線で囲んだ領域の厚みは、位相板９１の場合、第１の厚みＨ１であり、位相板９２の場合、第２の厚みＨ２であるとする。第１の厚みＨ１は、第１蛍光のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成させるための厚みであり、第２の厚みＨ２は、第２蛍光のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成させるための厚みである。ここで、位相板５２は、実施例１の位相変調パターンを作製する場合と同様の手法に基づいて作製されており、位相板５２の厚みは、位相板９１の厚みと、位相板９２の厚みとの間の厚みで分布する。したがって、点線で囲んだ領域の位相板５２の厚みを第３の厚みＨ３とすると、第３の厚みＨ３は、以下の式により算出される。
【０１４７】
第３の厚みＨ３＝（第１の厚みＨ１×ａ＋第２の厚みＨ２×ｂ）／（ａ＋ｂ）
【０１４８】
このように作製された位相板５２は、実施例１の位相変調パターンが位相変調器５１に設定された場合と同様、第１蛍光と第２蛍光の両方のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成できる。なお、実施例１の位相変調パターンにおける検証結果と同様、ａの値とｂの値が接近するほど、第１蛍光と第２蛍光の両方のＤＨ−ＰＳＦに応じた像をより適正に形成できる。
【０１４９】
次に、図３０（ａ）〜（ｉ）を参照して、実施例２に示す位相変調パターンを、透明部材からなる位相板に適用する例について説明する。
【０１５０】
図３０（ａ）の位相板９１は、図２９（ａ）の位相板と同様であり、図３０（ｂ）の位相板９２は、図２９（ｂ）の位相板と同様である。このような位相板９１、９２を、実施例２の位相変調パターンと同様にモザイク状に配置して、図３０（ｃ）に示すように、位相板５２を作製する。
【０１５１】
図３０（ｄ）において薄いグレーで示すように、位相板９１は、全領域において第１蛍光にのみ最適な厚みとなるように作製されている。図３０（ｅ）において濃いグレーで示すように、位相板９２は、全領域において第２蛍光にのみ最適な厚みとなるように作製されている。すなわち、位相板９１は、第１位相変調パターンと同様に設定されており、位相板９２は、第２位相変調パターンと同様に設定されている。図３０（ｆ）において薄いグレーと濃いグレーのモザイク形状で示すように、図３０（ｃ）に示す位相板５２は、第１蛍光に最適な厚みの第１領域と、第２蛍光に最適な厚みの第２領域とがモザイク状に配置されている。
【０１５２】
言い換えれば、図３０（ｆ）において薄いグレーが示す第１領域は、入射領域において、第１の波長の光、すなわち第１蛍光に第１位相変調を与えるように構成された領域である。図３０（ｆ）において濃いグレーが示す第２領域は、入射領域において、第２の波長の光、すなわち第２蛍光に第２位相変調を与えるように構成された領域である。
【０１５３】
図３０（ｇ）〜（ｉ）は、それぞれ、図３０（ｄ）〜（ｆ）の点線で囲んだ領域を厚み方向に平行な平面で切断したとき切断面を模式的に示す図である。以下、便宜上、実施例２の位相変調パターンにおいてＭの値を１とする。点線で囲んだ領域の４画素区間における厚みは、位相板９１の場合、第１の厚みＨ１１〜Ｈ１４であり、位相板９２の場合、第２の厚みＨ２１〜Ｈ２４であるとする。この場合、位相板５２の厚みは、たとえば図３０（ｉ）に示すように、位相板９１の厚みと位相板９２の厚みとが交互に現れるような厚みとなる。
【０１５４】
言い換えれば、図３０（ｉ）に示す位相板５２の構成は以下のようになる。図３０（ｆ）に示すように、位相板５２は、入射領域において、薄いグレーの領域からなる第１領域と、濃いグレーの領域からなる第２領域とを含む。第１領域の各領域と第２領域の各領域はそれぞれ隣り合っている。第１領域には、位相板９１と同様の厚みが設定される。第２領域には、位相板９２と同様の厚みが設定される。図３０（ｉ）に示すように、第１領域に対応する位置の厚みは、第１の厚みＨ１１、Ｈ１３とされ、第２領域に対応する位置の厚みは、第２の厚みＨ２２、Ｈ２４とされる。
【０１５５】
このように作製された位相板５２は、実施例１の位相変調パターンが位相変調器５１に設定された場合と同様、第１蛍光と第２蛍光の両方のＤＨ−ＰＳＦに応じた像を適正に形成できる。
【０１５６】
なお、上述したように、図１に示した位相変調マスク５０の構成例として、透明部材からなる位相板５２と、液晶パネル５１ａを有する位相変調器５１とについて説明したが、位相変調マスク５０の構成例は、これに限らない。たとえば、位相変調マスク５０は、入射面内の各位置において入射方向の異なる位置で、設定に応じて光を反射する微小なミラーを備えたデフォーマブルミラーでもよい。あるいは、位相変調マスク５０は、入射面内の各位置において入射方向の異なる位置で光を反射する反射部材でもよい。
【符号の説明】
【０１５７】
１０  光学機器
２０  光源部
３０  照射光学系
４０  ステージ
３６  対物レンズ
５０  位相変調マスク
５１  位相変調器
５２  位相板
６０  集光光学系
６２  撮像部
６２ａ  撮像面
１１１  処理部
【図１】
2020052434.tif 000003
【図２】
2020052434.tif 000004
【図３】
2020052434.tif 000005
【図４】
2020052434.tif 000006
【図５】
2020052434.tif 000007
【図６】
2020052434.tif 000008
【図７】
2020052434.tif 000009
【図８】
2020052434.tif 000010
【図９】
2020052434.tif 000011
【図１０】
2020052434.tif 000012
【図１１】
2020052434.tif 000013
【図１２】
2020052434.tif 000014
【図１３】
2020052434.tif 000015
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2020052434.tif 000018
【図１７】
2020052434.tif 000019
【図１８】
2020052434.tif 000020
【図１９】
2020052434.tif 000021
【図２０】
2020052434.tif 000022
【図２１】
2020052434.tif 000023
【図２２】
2020052434.tif 000024
【図２３】
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【図２４】
2020052434.tif 000026
【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
2020052434.tif 000030
【図２９】
2020052434.tif 000031
【図３０】
2020052434.tif 000032