(57)【要約】【課題】間葉系幹細胞、特に骨髄内の間葉系幹細胞、およびその他の骨髄内の細胞の増殖を促進する。【解決手段】本開示は、対象において間葉系幹細胞の増殖を促進するため、または減少を抑制するための、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質を含む組成物；対象において骨髄細胞の増殖を促進するため、または減少を抑制するためのＩＬ−３３を含む組成物；および対象において骨髄抑制を予防および／または治療するためのＩＬ−３３を含む組成物などに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において間葉系幹細胞の増殖を促進するための、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質を含む組成物。
【請求項２】
対象において間葉系幹細胞の減少を抑制するための、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質を含む組成物。
【請求項３】
前記間葉系幹細胞が、骨髄内の間葉系幹細胞である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質が、ＩＬ−３３である、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
対象において骨髄細胞の増殖を促進するための、ＩＬ−３３を含む組成物。
【請求項６】
骨髄内の間葉系幹細胞またはＣＤ４５陽性細胞の増殖を促進する、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
対象において骨髄細胞の減少を抑制するための、ＩＬ−３３を含む組成物。
【請求項８】
対象において骨髄抑制を予防および／または治療するための、ＩＬ−３３を含む組成物。
【請求項９】
前記骨髄抑制が、抗がん剤投与に起因する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
ＩＬ−３３が、
ａ）全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｂ）成熟ＩＬ−３３タンパク質のアミノ酸配列を含み、且つ、全長ＩＬ−３３タンパク質の一部のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｃ）全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質の一部のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、ＣＤ４５陽性細胞を活性化するポリペプチド、
ｄ）全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、ＣＤ４５陽性細胞を活性化するポリペプチド、
ｅ）全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質のアミノ酸配列と約９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、ＣＤ４５陽性細胞を活性化するポリペプチド、
ｆ）全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、ＣＤ４５陽性細胞を活性化するポリペプチド、および
ｇ）全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質をコードする核酸配列と約９０％以上の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ、ＣＤ４５陽性細胞を活性化するポリペプチド
からなる群から選択される、請求項４〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
ＩＬ−３３が、全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項４〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
ＩＬ−３３が、配列番号１〜８のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項４〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
対象において間葉系幹細胞の増殖を促進するための、ＣＤ４５陽性細胞を含む組成物。
【請求項１４】
対象において間葉系幹細胞の減少を抑制するための、ＣＤ４５陽性細胞を含む組成物。
【請求項１５】
前記間葉系幹細胞が、骨髄内の間葉系幹細胞である、請求項１３または１４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、間葉系幹細胞または骨髄細胞の増殖を促進する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗がん剤治療や放射線治療は、骨髄細胞が減少する副作用（骨髄抑制）を引き起こすことが知られている。このような骨髄細胞の減少は、患者の免疫機能や造血機能を低下させ、場合によっては治療の継続を困難にしたり、患者の全身状態を著しく悪化させたりする。しかしながら、骨髄抑制の回復については、好中球に対するＧ−ＣＳＦ製剤が認められる程度であり、多くの場合、自然回復に任せている状況にある。
【０００３】
発明者らは、損傷組織から放出されるＨＭＧＢ１（High mobility group box 1：高移動性グループ1タンパク質）が骨髄中に存在するＰＤＧＦＲα(platelet-derived growth factor receptor alpha)陽性細胞（間葉系幹細胞）を刺激して骨髄から循環系へと動員し、当該動員された細胞が損傷部位へ集積して組織の再生を誘導していることを発見した（特許文献１，２）。しかし、何らかの要因により骨髄内の間葉系幹細胞が減少している場合には、組織の再生が遅延し又は不十分となるおそれがある。つまり、間葉系幹細胞を介した生体内の組織再生メカニズムが有効に機能するためには、骨髄内に必要量の間葉系幹細胞が存在していることが重要となる。
【０００４】
このようなことから、骨髄内の細胞について、その量を維持、回復、増殖させることが望まれており、かかる作用を有する新たな薬の開発が待たれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ／２００８／０５３８９２
【特許文献２】ＷＯ／２００９／１３３９３９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本開示の目的の１つは、間葉系幹細胞、特に骨髄内の間葉系幹細胞、およびその他の骨髄内の細胞の増殖を促進することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ある態様において、本開示は、対象において間葉系幹細胞の増殖を促進するため、または減少を抑制するための、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質を含む組成物を提供する。
ある態様において、本開示は、対象において骨髄細胞の増殖を促進するため、または減少を抑制するための、ＩＬ−３３を含む組成物を提供する。
ある態様において、本開示は、対象において骨髄抑制を予防および／または治療するための、ＩＬ−３３を含む組成物を提供する。
ある態様において、本開示は、対象において間葉系幹細胞の増殖を促進するため、または減少を抑制するための、ＣＤ４５陽性細胞を含む組成物を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本開示により、間葉系幹細胞、特に骨髄内の間葉系幹細胞、および骨髄細胞の増殖の促進または減少の抑制が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】マウスの大腿骨および椎骨から採取した骨髄細胞を、成熟ＩＬ−３３タンパク質を含有する培地で固相培養した結果を示す写真である（培養開始後１０日目）。
【図２】培養開始８日目における骨髄由来付着性細胞の数を示すグラフである。
【図３】培養開始８日目における骨髄由来付着性細胞のＦＡＣＳ解析結果を示す図である。横軸はＰＤＧＦＲαの発現量（ＧＦＰの蛍光で検出）、縦軸はＣＤ４５の発現量（ＡＰＣ（Allophycocyanin）標識された抗ＣＤ４５抗体で検出）をそれぞれ表す。４つの象限に記されている数値は、解析した細胞全体の細胞数に占める、各象限に対応する細胞のパーセンテージを示す。
【図４】培養開始８日目における骨髄由来付着性細胞のうち、ＰＤＧＦＲα＋ＣＤ４５−の細胞と、ＰＤＧＦＲα−ＣＤ４５＋の細胞の数を示すグラフである。
【図５】ＩＬ−３３添加培地で骨髄細胞を１０日間培養したときの培養プレートの１ウェルあたりの細胞数（ａ）、ＰＤＧＦＲα＋ＣＤ４５−細胞数（ｂ）、ＣＤ４５＋細胞数（ｃ）およびコロニーアッセイの結果（ｄ）を示す。
【図６】ＰＤＧＦＲα＋細胞を分取しＩＬ−３３添加培地で培養したときのコロニーアッセイの結果を示す。
【図７】図７ａは、ＰＤＧＦＲα＋細胞（Ｐα＋）を分取した後、骨髄細胞とＩＬ−３３添加培地で共培養するか、または、Transwell上に骨髄細胞を分取し、ＩＬ−３３添加培地で培養し、コロニーアッセイを行った結果を示す。図７ｂは、ＰＤＧＦＲα＋細胞とＣＤ４５−細胞またはＣＤ４５＋細胞をＩＬ−３３添加培地での共培養したときのコロニーアッセイの結果を示す。
【図８】図８ａは、ＭｙＤ８８ＫＯマウスの骨髄細胞をＩＬ−３３添加培地で培養したときのコロニーアッセイの結果を示す。図８ｂは、ＭｙＤ８８ＫＯマウスの骨髄細胞をＩＬ−３３添加培地で１０日間培養したときのＦＡＣＳでの解析結果を示す。
【図９】骨髄細胞をＩＬ−３３／ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤またはＩＬ−３３／ＮＦ−κＢ阻害剤添加培地で培養したときのコロニーアッセイの結果を示す。
【図１０】骨髄細胞をＩＬ−３３／ＤＡＰＴ添加培地で培養したときの、コロニーアッセイの結果（ａ）を示す。骨髄細胞をＩＬ−３３／ＤＡＰＴを添加培地で１０日間培養したときの、ＦＡＣＳで解析したＰＤＧＦＲα＋ＣＤ４５−細胞数（ｂ）と、ＣＤ４５＋細胞数（ｃ）を示す。
【図１１】血清および骨髄液中のＩＬ−３３の濃度を示す。Ｎ.Ｄ.；検出せず。
【図１２】５−ＦＵ投与時の実験方法の概要を（ａ）に示す。５−ＦＵ投与後、５、７、１０、１４日後に骨髄細胞を回収し解析を行った。５−ＦＵ投与後の骨髄細胞数（ｂ）およびＰＤＧＦＲα＋ＣＤ４５−ＴＥＲ１１９−細胞数（ｃ）の継時的変化を示す。
【図１３】マウス骨髄抑制モデルにおける、５−ＦＵ／ＳＴ２中和抗体（ＳＴ２−Ａｂ）投与時の実験方法の概要を（ａ）に示す。５−ＦＵ投与後、１、３、５日後にＳＴ２−Ａｂを投与し、７日後に骨髄細胞を回収して解析を行った。５−ＦＵ／ＳＴ２−Ａｂ投与後の骨髄細胞数の変化（ｂ）、５−ＦＵ／ＳＴ２−Ａｂ投与後の骨髄細胞のコロニーアッセイの結果（ｃ）を示す。
【図１４】マウス骨髄抑制モデルにおける、５−ＦＵ／ＩＬ−３３投与後の骨髄細胞のコロニーアッセイの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本開示では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。例えば、「約２０」は、「１８〜２２」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０〜３０」は、「１８〜３３」を含むものとする。
【００１１】
特に具体的な定めのない限り、本開示で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本開示で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本開示において、一般的な理解に優先する。
【００１２】
本開示において、「細胞」は、文脈に応じて１個の細胞または複数の細胞を意味する。複数の細胞を「細胞集団」と呼ぶ場合もあり、細胞集団は、文脈に応じて一種類の細胞からなる細胞集団または複数種の細胞を含む細胞集団であり得る。
【００１３】
本開示の組成物は、対象に投与され、その生体内で、細胞の増殖を促進し、または減少を抑制する。本開示において、細胞の増殖の促進には、対象における細胞数を増加することが含まれ、細胞の減少の抑制には、対象における細胞数の低下を予防すること、および細胞数の低下を低減することが含まれる。細胞の増殖または減少は、例えば、細胞マーカーを指標とするセルソーティング（ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ等）により評価することができる。
【００１４】
対象としては、ヒト、および非ヒト動物、例えばマウス、ラット、サル、ブタ、イヌ、ウサギ、ハムスター、モルモットなどが挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、対象はヒトである。
【００１５】
ある態様において、本開示の組成物は、間葉系幹細胞の増殖を促進、または減少を抑制する。本開示において、「間葉系幹細胞」は、「間葉系間質細胞」と区別なく用いられ、「ＭＳＣ」と略記される場合もある。間葉系幹細胞は、骨、軟骨、脂肪、筋肉などの間葉系組織への分化能を有する細胞を意味する。間葉系幹細胞は、さらに上皮系組織や神経組織への分化能を有してもよい。間葉系幹細胞は、骨髄、血液、例えば末梢血または臍帯血、皮膚、脂肪、歯髄等に存在する。ある実施形態において、間葉系幹細胞は、骨髄内の間葉系幹細胞である。
【００１６】
ヒト間葉系幹細胞のマーカーとしては、ＰＤＧＦＲα陽性、ＰＤＧＦＲβ陽性、Ｌｉｎ陰性、ＣＤ４５陰性、ＣＤ４４陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ２９陽性、Ｆｌｋ−１陰性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ７３陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ７１陽性、Ｓｔｒｏ−１陽性、ＣＤ１０６陽性、ＣＤ１６６陽性、ＣＤ３１陰性、ＣＤ２７１陽性、ＣＤ１１ｂ陰性の全部または一部が例示できるが、これらに制限されるものではない。ある実施形態では、ヒト間葉系幹細胞は、ＰＤＧＦＲα陽性である。ある実施形態では、ヒト間葉系幹細胞は、ＰＤＧＦＲα陽性且つＣＤ４５陰性である。
【００１７】
マウス間葉系幹細胞のマーカーとしては、ＣＤ４４陽性、ＰＤＧＦＲα陽性、ＰＤＧＦＲβ陽性、ＣＤ４５陰性、Ｌｉｎ陰性、Ｓｃａ−１陽性、ｃ−ｋｉｔ陰性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ２９陽性、Ｆｌｋ−１陰性、ＣＤ２７１陽性、ＣＤ１１ｂ陰性の全部または一部が例示できるが、これらに制限されるものではない。ある実施形態では、マウス間葉系幹細胞は、ＰＤＧＦＲα陽性である。ある実施形態では、マウス間葉系幹細胞は、ＰＤＧＦＲα陽性且つＣＤ４５陰性である。
【００１８】
ある実施形態において、間葉系幹細胞の増殖または減少は、ＰＤＧＦＲα陽性（ＰＤＧＦＲα＋）細胞、またはＰＤＧＦＲα陽性且つＣＤ４５陰性の（ＰＤＧＦＲα＋ＣＤ４５−）細胞の変化により評価される。
【００１９】
ある態様において、本開示の組成物は、骨髄細胞の増殖を促進、または減少を抑制する。本開示において、「骨髄細胞」とは、骨髄内に存在する細胞集団を意味する。骨髄細胞には、ＣＤ４５を発現している細胞（本明細書中、ＣＤ４５陽性細胞またはＣＤ４５＋細胞と記載する）と、発現していない細胞（本明細書中、ＣＤ４５陰性細胞またはＣＤ４５−細胞と記載する）が存在する。ＣＤ４５は、間葉系幹細胞の陰性選択（ネガティブセレクション）マーカーの一つであり、ＣＤ４５陰性細胞には間葉系幹細胞が含まれる。ある実施形態において、本開示の組成物は、骨髄細胞中のＣＤ４５陽性細胞および／または間葉系幹細胞の増殖を促進、または減少を抑制する。
【００２０】
ＣＤ４５は、白血球共通抗原としても知られている１８０−２４０ｋＤの単鎖Ｉ型膜糖タンパク質であり、赤血球および血小板を除く造血系細胞の細胞膜上に発現するチロシンホスファターゼである。ＣＤ４５は、細胞増殖、分化、細胞周期、悪性質転換等の様々な細胞プロセスを調節するシグナル伝達分子として知られている。様々な動物種におけるＣＤ４５のアミノ酸配列は公知である。
【００２１】
本開示の組成物は、骨髄細胞の増殖を促進または減少を抑制することにより、骨髄抑制を治療／または予防しうる。骨髄抑制とは、骨髄の機能が低下した状態を意味し、白血球や好中球などの血球成分の減少が観察される。骨髄抑制の治療／または予防には、白血球減少症または好中球減少症の治療および／または予防が含まれる。骨髄細胞の減少または骨髄抑制は、限定はされないが、例えば、薬剤投与、放射線治療等に起因しうる。骨髄細胞の減少または骨髄抑制を生じうる薬剤としては、限定はされないが、いわゆる抗がん剤が挙げられる。抗がん剤としては、限定はされないが、メトトレキセートを含む葉酸代謝拮抗薬；クラドリビン、６−メルカプトプリン、ネララビン、ペントスタチンを含むプリンアンタゴニスト；カペシタビン、５−フルオロウラシル、ゲムシタビンを含むピリミジンアンタゴニスト；インターフェロン−アルファを含む生物学的応答修飾因子；カルムスチンを含むＤＮＡアルキル化剤；ベンダムスチン、イホスファミド、メルファラン、ダカルバジン、テモゾロミド、プロカルバジンを含むＤＮＡ架橋薬およびアルキル化剤；カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチンを含む白金錯体；ボルテゾミブを含むプロテアソーム阻害剤；タキサン（ドセタキセル、パクリタキセル（アブラキサン（登録商標））を含む）、ビンクリスチン、ビノレルビンを含む紡錘体毒；アントラサイクリン（ダウノルビシン、ダウノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシンを含む）、カンプトテシン（イリノテカンを含む）、エトポシド、ミトキサントロンを含むトポイソメラーゼ阻害剤；エルロチニブ（タルセバ（登録商標））、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、ソラフェニブ、スニチニブを含むチロシンキナーゼ阻害剤が挙げられる。
【００２２】
本開示において、「ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質」とは、ＣＤ４５陽性細胞から他の細胞へのシグナル伝達を亢進する物質を意味し、ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、核酸、脂質、糖質、低分子化合物などであり得る。シグナル伝達の亢進は、シグナル伝達に関する反応、例えば、ｐ３８ＭＡＰＫシグナル経路における反応の増加によるものであってもよく、ＣＤ４５陽性細胞の増加によるシグナル伝達の増加によるものであってもよい。即ち、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質には、ＣＤ４５陽性細胞を増殖させる物質が含まれる。シグナル伝達の亢進には、シグナル伝達の惹起および促進が含まれる。ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質として、ＣＤ４５陽性細胞を増殖させる物質、例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、リポ多糖（Lipopolysaccharide, ＬＰＳ）またはＩＬ−３３を使用し得るが、これらに限定されない。本開示において、「ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる」と「ＣＤ４５陽性細胞を活性化する」は同義で用いられる。
【００２３】
ＩＬ−３３は、ＩＬ−１ファミリーのメンバーとして同定されたサイトカインであり、生物種により異なるが全長２７０残基前後のアミノ酸配列からなる核タンパク質である。ＩＬ−３３は、細胞の傷害または壊死が起こると細胞外に放出され、免疫細胞を活性化してＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３）および／または炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ）の分泌を誘発する。全長のＩＬ−３３タンパク質も活性を有するが、全長ＩＬ−３３タンパク質が生体内でプロテアーゼ（例えばカテプシンＧ（Accession No. P08311等）や好中球エラスターゼ（Accession No. P08246等））によって切断されて生じるＣ末端側のポリペプチド断片が成熟ＩＬ−３３タンパク質として機能することが知られている。
【００２４】
本開示において、「ＩＬ−３３」は、全長ＩＬ−３３タンパク質、成熟ＩＬ−３３タンパク質またはそれらと機能的に同等なポリペプチドであり得る。
【００２５】
本開示において、ＩＬ−３３の起源となる生物種としては、ヒト、および非ヒト動物、例えばマウス、ラット、サル、ブタ、イヌ、ウサギ、ハムスター、モルモットなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
全長ＩＬ−３３タンパク質とは、ＩＬ−３３をコードするｍＲＮＡから翻訳された後、プロテアーゼによるプロセシングを受ける前のＩＬ−３３タンパク質を意味する。本開示において、全長ＩＬ−３３タンパク質としては、全長マウスＩＬ−３３タンパク質（配列番号１、Accession No. Q8BVZ5）、全長ヒトＩＬ−３３タンパク質（配列番号４、Accession No. O95760）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
成熟ＩＬ−３３タンパク質とは、全長ＩＬ−３３タンパク質がプロテアーゼによるプロセシングを受けて生じることが確認または示唆されているＣ末端側のポリペプチドであって、生物学的活性を有するものを意味する。
【００２８】
成熟ＩＬ−３３タンパク質の例としては、全長マウスＩＬ−３３タンパク質の１０２番目から２６６番目のアミノ酸配列（配列番号２）からなるポリペプチド、全長マウスＩＬ−３３タンパク質の１０９番目から２６６番目のアミノ酸配列（配列番号３）からなるポリペプチド、全長ヒトＩＬ−３３タンパク質の９５番目から２７０番目のアミノ酸配列（配列番号５）からなるポリペプチド、全長ヒトＩＬ−３３タンパク質の９９番目から２７０番目のアミノ酸配列（配列番号６）からなるポリペプチド、全長ヒトＩＬ−３３タンパク質の１０９番目から２７０番目のアミノ酸配列（配列番号７）からなるポリペプチド、および全長ヒトＩＬ−３３タンパク質の１１２番目から２７０番目のアミノ酸配列（配列番号８）からなるポリペプチドが知られている。これらのタンパク質はいずれも、本開示の組成物等において用い得る。ある実施形態では、成熟ＩＬ−３３タンパク質は配列番号３または８のアミノ酸配列を有する。
【００２９】
例えば、全長マウスＩＬ−３３タンパク質の１０９番目から２６６番目のアミノ酸配列（配列番号３）からなるポリペプチドは、ＴＮＦ−αの産生を誘導する活性を有することが確認されている（Bae et al, J Biol Chem. 2012 Mar 9;287(11):8205-13）。また、全長ヒトＩＬ−３３タンパク質の１１２番目から２７０番目のアミノ酸配列（配列番号８）からなるポリペプチドは、全長ヒトＩＬ−３３タンパク質と同等の生物学的活性（例えばＳＴ２との結合を介したＮＦ−κＢシグナル伝達経路の活性化）を有することが知られている（Cayrol and Girard, PNAS 2009 Jun 2;106(22):9021-6）。
【００３０】
全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質と「機能的に同等」とは、当該タンパク質と同質の生物学的活性を有することをいい、ここにいう「同質」とは定性的評価において同じであることを意味する。本開示における全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質の生物学的活性としては、例えば、ｐ３８ＭＡＰＫシグナル経路の活性化、免疫細胞からのＴｈ２サイトカインおよび／または炎症性サイトカイン分泌の誘発、ＳＴ２（ＩＬ−３３の受容体）との結合を介したＮＦ−κＢシグナル伝達経路の活性化、ＣＤ４５陽性細胞の活性化の促進等が挙げられる。一つの実施形態において、全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質の生物学的活性は、ＣＤ４５陽性細胞を活性化することである。
【００３１】
例えば、ＩＬ−３３は、以下のａ）〜ｇ）から選択されるポリペプチドであり得る：
ａ）全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｂ）成熟ＩＬ−３３タンパク質のアミノ酸配列を含み、且つ、全長ＩＬ−３３タンパク質の一部のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｃ）全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質の一部のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド、
ｄ）全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数個、例えば、１〜１０個、１〜５個、１〜３個または１もしくは２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド、
ｅ）全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質のアミノ酸配列と約８０％以上、例えば約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド、
ｆ）全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド、および
ｇ）全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質をコードする核酸配列と約７０％以上、例えば約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ、全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド。
【００３２】
本開示において、アミノ酸配列または核酸配列の同一性とは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の配列の一致の程度を意味し、比較対象の配列の領域にわたって最適な状態（アミノ酸またはヌクレオチドの一致が最大となる状態）にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。配列同一性の数値（％）は両方の配列に存在する同一のアミノ酸またはヌクレオチドを決定して、適合部位の数を決定し、次いでこの適合部位の数を比較対象の配列領域内のアミノ酸またはヌクレオチドの総数で割り、得られた数値に１００をかけることにより算出される。最適なアラインメントおよび配列同一性を得るためのアルゴリズムとしては、当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなど）が挙げられる。配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの配列解析ソフトウェアを用いて決定され得る。
【００３３】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983) 等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ（１.５Ｍ ＮａＣｌ、０.１５Ｍ クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×ＳＳＣとする）、５０％ホルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）、および、それと同等のストリンジェンシーをもたらす条件を挙げることができる。
【００３４】
全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質またはそれらと機能的に同等なポリペプチドの入手方法は特に限定されず、例えば組換え発現（哺乳類細胞、酵母、大腸菌、昆虫細胞等）、無細胞系を用いた合成等によって製造できるほか、市販品を購入することも可能である。
【００３５】
ある態様において、本開示の組成物は、ＣＤ４５陽性細胞を含む。ＣＤ４５陽性細胞は、骨髄、血液、リンパ節等に存在し、これらの組織から取得し得る。ＣＤ４５陽性細胞は、通常、浮遊細胞として培養・増殖可能であるが、これに限られるものではなく、一部のＣＤ４５陽性細胞は付着性細胞として培養・増殖可能である。ＣＤ４５陽性細胞を含む組織、例えば骨髄から、ＣＤ４５を指標とするセルソーティング（ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ等）により、ＣＤ４５陽性細胞を分離してもよい。あるいは、多能性幹細胞から分化誘導されたＣＤ４５陽性細胞、または、樹立されたＣＤ４５陽性細胞株を使用してもよい。
【００３６】
ある実施形態において、本開示の組成物は、実質的にＣＤ４５陽性細胞以外の細胞を含まない。「実質的にＣＤ４５陽性細胞以外の細胞を含まない」とは、ＣＤ４５陽性細胞の取得方法と通常当業者に理解される方法により得られた細胞のみを含むことを意味する。例えば、本開示の組成物において、ＣＤ４５陽性細胞が、組成物に含まれる細胞の、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８または９９％以上を占める。本開示の組成物に含まれる細胞の数は、限定されないが、例えば、１細胞〜１×１０１０細胞、１×１０細胞〜１×１０９細胞、１×１０２細胞〜１×１０８細胞、１×１０３細胞〜１×１０８細胞、１×１０４細胞〜１×１０８細胞、１×１０５細胞〜１×１０８細胞、１×１０６細胞〜１×１０８細胞、または１×１０５細胞〜１×１０７細胞である。
【００３７】
ある態様において、本開示の組成物は、Ｎｏｔｃｈ活性化剤を含む。Ｎｏｔｃｈ活性化剤としては公知のものが適宜使用できる。
【００３８】
本開示の組成物は、対象の年齢、体重、健康状態等によって適宜決定される量で投与される。例えば、ＩＬ−３３の場合、１回の投与につき、体重１ｋｇあたり０．００００００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり０．００００１から１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量が選択できる。しかしながら、これらの投与量に制限されるものではない。ＣＤ４５陽性細胞の場合、１回で投与される細胞の数は、限定はされないが、例えば、１細胞〜１×１０１０細胞、１×１０細胞〜１×１０９細胞、１×１０２細胞〜１×１０８細胞、１×１０３細胞〜１×１０８細胞、１×１０４細胞〜１×１０８細胞、１×１０５細胞〜１×１０８細胞、１×１０６細胞〜１×１０８細胞、または１×１０５細胞〜１×１０７細胞である。また、体重１ｋｇあたり、例えば、１細胞〜１×１０９細胞、１×１０細胞〜１×１０８細胞、１×１０２細胞〜１×１０７細胞、１×１０３細胞〜１×１０６細胞、１×１０４細胞〜１×１０６細胞、または１×１０５細胞〜１×１０７細胞となるよう投与され得る。本開示の組成物は、１日１回で、または複数回（例えば２、３または４回）に分けて投与してもよく、１日または数日（例えば２、３、４、５または６日）、１週間または数週間（例えば２、３、４、５または６週間）、１ヶ月または数ヶ月（例えば２、３、４、５または６ヶ月）の間隔をあけて投与してもよい。投与を継続する期間も特に限定されず、１日または数日（例えば２、３、４、５または６日）、１週間または数週間（例えば２、３、４、５または６週間）、１ヶ月または数ヶ月（例えば２、３、４、５または６ヶ月）でありうる。
【００３９】
本開示の組成物は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A）、有効成分に加え、医薬上許容される担体を含んでもよい。医薬上許容される担体としては、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられる。例えば、医薬上許容される担体は、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類などであってよい。組成物が細胞を含む場合、医薬上許容される担体は、水、培地、生理食塩水、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、またはＤ−マンニトールなどを含む等張液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などであってもよい。組成物の剤形は、限定されないが、経口または非経口投与製剤、例えば注射剤である。注射剤には、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤が含まれる。組成物は、凍結されていてもよく、ＤＭＳＯ、グリセロール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、アルブミン、デキストラン、スクロースなどの凍結保護剤を含んでもよい。
【００４０】
本開示の組成物は、全身に、または局所的に投与されうる。投与方法としては、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、髄腔内投与などが挙げられる。ある実施形態において、本開示の組成物は、髄腔内投与される。
【００４１】
本発明の例示的な実施形態を以下に記載する。
［１］
対象において間葉系幹細胞の増殖を促進するための、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質を含む組成物。
［２］
対象において間葉系幹細胞の減少を抑制するための、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質を含む組成物。
［３］
前記間葉系幹細胞が、骨髄内の間葉系幹細胞である、第１項または第２項に記載の組成物。
［４］
前記ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質が、ＩＬ−３３である、第１項〜第３項のいずれかに記載の組成物。
［５］
前記間葉系幹細胞の減少が、抗がん剤投与に起因する、第２項〜第４項のいずれかに記載の組成物。
［６］
対象において骨髄細胞の増殖を促進するための、ＩＬ−３３を含む組成物。
［７］
骨髄内の間葉系幹細胞またはＣＤ４５陽性細胞の増殖を促進する、第６項に記載の組成物。
［８］
対象において骨髄細胞の減少を抑制するための、ＩＬ−３３を含む組成物。
［９］
前記骨髄細胞の減少が、抗がん剤投与に起因する、第８項に記載の組成物。
［１０］
対象において骨髄抑制を予防および／または治療するための、ＩＬ−３３を含む組成物。
［１１］
前記骨髄抑制が、抗がん剤投与に起因する、第１０項に記載の組成物。
［１２］
ＩＬ−３３が、
ａ）全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｂ）成熟ＩＬ−３３タンパク質のアミノ酸配列を含み、且つ、全長ＩＬ−３３タンパク質の一部のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｃ）全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質の一部のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド、
ｄ）全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数個、例えば、１〜１０個、１〜５個、１〜３個または１もしくは２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド、
ｅ）全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質のアミノ酸配列と約８０％以上、例えば約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド
ｆ）全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド、および
ｇ）全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質をコードする核酸配列と約７０％以上、例えば約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ、全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチドからなる群から選択される、第４項〜第１１項のいずれかに記載の組成物。
［１３］
ＩＬ−３３が、
ａ）全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチド
ｂ）成熟ＩＬ−３３タンパク質のアミノ酸配列を含み、且つ、全長ＩＬ−３３タンパク質の一部のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｃ）全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質の一部のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、ＣＤ４５陽性細胞を活性化するポリペプチド、
ｄ）全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、ＣＤ４５陽性細胞を活性化するポリペプチド、
ｅ）全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質のアミノ酸配列と約９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、ＣＤ４５陽性細胞を活性化するポリペプチド、
ｆ）全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、ＣＤ４５陽性細胞を活性化するポリペプチド、および
ｇ）全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質をコードする核酸配列と約９０％以上の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ、ＣＤ４５陽性細胞を活性化するポリペプチド
からなる群から選択される、第４項〜第１２項のいずれかに記載の組成物。
［１４］
ＩＬ−３３が、全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、第４項〜第１３項のいずれかに記載の組成物。
［１５］
ＩＬ−３３が、全長もしくは成熟ＩＬ−３３タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、第４項〜第１４項のいずれかに記載の組成物。
［１６］
ＩＬ−３３が、配列番号１〜８のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドである、第４項〜第１５項に記載の組成物。
［１７］
ＩＬ−３３が、配列番号１〜８のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドである、第４項〜第１６項のいずれかに記載の組成物。
［１８］
ＩＬ−３３をコードする核酸配列が、配列番号９〜１６のいずれかの核酸配列を含む、第４項〜第１７項のいずれかに記載の組成物。
［１９］
ＩＬ−３３が、配列番号３または８のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、第４項〜第１８項のいずれかに記載の組成物。
［２０］
ＩＬ−３３が、配列番号３または８のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、第４項〜第１９項のいずれかに記載の組成物。
［２１］
ＩＬ−３３をコードする核酸配列が、配列番号１１または１６の核酸配列を含む、第４項〜第２０項のいずれかに記載の組成物。
［２２］
ＩＬ−３３が、配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、第４項〜第２１項のいずれかに記載の組成物。
［２３］
ＩＬ−３３が、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、第４項〜第２２項のいずれかに記載の組成物。
［２４］
ＩＬ−３３をコードする核酸配列が、配列番号１１の核酸配列を含む、第４項〜第２３項のいずれかに記載の組成物。
【００４２】
［２５］
対象において間葉系幹細胞の増殖を促進するための、ＣＤ４５陽性細胞を含む組成物。
［２６］
対象において間葉系幹細胞の減少を抑制するための、ＣＤ４５陽性細胞を含む組成物。
［２７］
前記間葉系幹細胞が、骨髄内の間葉系幹細胞である、第２５項または第２６項に記載の組成物。
［２８］
前記間葉系幹細胞の減少が、抗がん剤投与に起因する、第２６項または第２７項に記載の組成物。
［２９］
実質的にＣＤ４５陽性細胞以外の細胞を含まない、第２５項〜第２８項のいずれかに記載の組成物。
【００４３】
［３０］
間葉系幹細胞の増殖を促進する方法であって、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質を含む組成物を対象に投与することを含む方法。
［３１］
間葉系幹細胞の減少を抑制する方法であって、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質を含む組成物を対象に投与することを含む方法。
［３２］
前記ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質が、ＩＬ−３３である、第３０項または第３１項に記載の方法。
［３３］
骨髄細胞の増殖を促進する方法であって、ＩＬ−３３を含む組成物を対象に投与することを含む方法。
［３４］
骨髄細胞の減少を抑制する方法であって、ＩＬ−３３を含む組成物を対象に投与することを含む方法。
［３５］
骨髄抑制を予防および／または治療するための方法であって、ＩＬ−３３を含む組成物を対象に投与することを含む方法。
【００４４】
［３６］
間葉系幹細胞の増殖を促進する方法であって、ＣＤ４５陽性細胞を含む組成物を対象に投与することを含む方法。
［３７］
間葉系幹細胞の減少を抑制する方法であって、ＣＤ４５陽性細胞を含む組成物を対象に投与することを含む方法。
【００４５】
［３８］
対象において間葉系幹細胞の増殖を促進するための医薬の製造のための、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質の使用。
［３９］
対象において間葉系幹細胞の減少を抑制するための医薬の製造のための、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質の使用。
［４０］
前記ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質が、ＩＬ−３３である、第３８項または第３９項に記載の使用。
［４１］
対象において骨髄細胞の増殖を促進するための医薬の製造のための、ＩＬ−３３の使用。
［４２］
対象において骨髄細胞の減少を抑制するための医薬の製造のための、ＩＬ−３３の使用。
［４３］
対象において骨髄抑制を予防および／または治療するための医薬の製造のための、ＩＬ−３３の使用。
【００４６】
［４４］
対象において間葉系幹細胞の増殖を促進するための医薬の製造のための、ＣＤ４５陽性細胞の使用。
［４５］
対象において間葉系幹細胞の減少を抑制するための医薬の製造のための、ＣＤ４５陽性細胞の使用。
【００４７】
本開示で引用するすべての文献は、出典明示により本開示の一部とする。
上記の説明は、すべて非限定的なものであり、添付の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲から逸脱せずに、変更することができる。さらに、下記の実施例は、すべて非限定的な実施例であり、本発明を説明するためだけに供されるものである。
【実施例】
【００４８】
実施例１
ＩＬ−３３含有培地による間葉系幹細胞の増殖促進
（１）材料および方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６〜７週齢、メス）から大腿骨および椎骨を切り出し、周囲に付着した他の組織を取り除いた後、乳鉢内で骨を細かく破砕し、ＰＢＳ（２％ＦＢＳ含有）を加えて細胞を回収した。次いで４０μｍナイロンメッシュに通し、細胞塊や筋組織を除去した。３００ｇで５分間遠心し、上清を捨て、沈殿した細胞をRBC Lysis buffer（Biolegend）に懸濁し、室温で５分間反応させて赤血球を溶解（溶血）させた。RBC Lysis bufferと等量のＰＢＳ（２％ＦＢＳ含有）を加えて反応を停止させた後、３００ｇで５分間遠心した。上清を捨て、沈殿した細胞を下記の培地ＡまたはＢに懸濁し、コラーゲンＩでコートされたプラスチック製の６ウェルプレート（Corning Inc., Cat No.356400）に１×１０６細胞／ウェルの密度で播種して３７℃、５％Ｏ２、５％ＣＯ２の条件下で１０日間培養した（培養４または５日目に一度、同じ組成の新鮮な培地に交換した）。
【００４９】
・培地Ａ（対照）：ＭＥＭα（Gibco）（１５％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン含有；L-Glutamineを終濃度４ｍＭになるように添加し、且つ、下記培地Ｂに添加される成熟マウスＩＬ−３３タンパク質溶液と同容量のＰＢＳを添加したもの）
・培地Ｂ（ＩＬ−３３含有）：ＭＥＭα（Gibco）（１５％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン含有；L-Glutamineを終濃度４ｍＭになるように添加し、且つ、成熟マウスＩＬ−３３タンパク質（配列番号３）を終濃度２ｎｇ／ｍＬになるよう添加したもの）
培養開始１０日目に培地を除去し、プレート上に付着している細胞をディフ・クイック（シスメックス）を用いて染色し、観察した。
【００５０】
（２）結果
大腿骨および椎骨のいずれから採取した骨髄細胞についても、ＩＬ−３３を含む培地を用いて培養することにより、プレート上にコロニーとして得られる細胞の数が著しく増大した（図１）。また、骨髄細胞の培養にコラーゲンＩコーティングなしの６ウェルプレート（costar, Cat No.3516）を用いた点を除いて上記と同じ方法および条件で実験を行った場合でも、同様の結果が得られた。
【００５１】
骨髄由来細胞を固相上で培養すると、間葉系幹細胞を含む付着性の細胞が固相に付着してコロニーを形成することが良く知られている。従って、当該実施例における実験結果は、ＩＬ−３３存在下での培養によって間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の増殖が促進されることを示すものである。
【００５２】
実施例２
ＩＬ−３３含有培地を用いて培養した骨髄由来細胞の解析
（１）材料および方法
ＰＤＧＦＲαプロモーターの下流にＨ２Ｂ−ＧＦＰ融合タンパク質の遺伝子（ｃＤＮＡ）がノックインされたマウス（Hamilton TG, Mol Cell Biol. 2003 Jun;23(11):4013-25）から大腿骨および椎骨を切り出し、周囲に付着した他の組織を取り除いた後、乳鉢内で骨を細かく破砕し、ＰＢＳ（２％ＦＢＳ含有）を加えて細胞を回収した。次いで４０μｍナイロンメッシュに通し、細胞塊や筋組織を除去した。３００ｇで５分間遠心し、上清を捨て、沈殿した細胞をRBC Lysis buffer（Biolegend）に懸濁し、室温で５分間反応させて赤血球を溶解（溶血）させた。RBC Lysis bufferと等量のＰＢＳ（２％ＦＢＳ含有）を加えて溶血反応を停止させた後、３００ｇで５分間遠心した。上清を捨て、沈殿した細胞を下記の培地Ｃ（対照）または培地Ｄ（ＩＬ−３３含有）に懸濁し、コラーゲンＩでコートされたプラスチック製の６ウェルプレート（Corning Inc., Cat No.356400）に１×１０６細胞／ウェルの密度で播種して３７℃、５％Ｏ２、５％ＣＯ２の条件下で８日間培養した（培養４または５日目に一度、同じ組成の新鮮な培地に交換した）。
【００５３】
・培地Ｃ（対照）：ＭＥＭα（Gibco）（１５％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン含有；L-Glutamineを終濃度４ｍＭになるように添加し、且つ、下記培地Ｄに添加される成熟マウスＩＬ−３３タンパク質溶液と同容量のＰＢＳを添加したもの）
・培地Ｄ（ＩＬ−３３含有）：ＭＥＭα（Gibco）（１５％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン含有；L-Glutamineを終濃度４ｍＭになるように添加し、且つ、成熟マウスＩＬ−３３タンパク質（配列番号３）を終濃度１ｎｇ／ｍＬになるよう添加したもの）
【００５４】
培養開始８日目に、プレートに付着している細胞をトリプシン処理により剥がして回収し、間葉系幹細胞の代表的なポジティブマーカーであるＰＤＧＦＲαと代表的なネガティブマーカーであるＣＤ４５の発現をＦＡＣＳで解析した。
【００５５】
（２）結果
大腿骨および椎骨のいずれから採取した骨髄細胞についても、ＩＬ−３３を含む培地を用いて培養することにより、プレート上でコロニーを形成する付着性細胞の数が著しく増大した（図２）。また、表面マーカーの発現パターン別に細胞数を調べたところ、ＰＤＧＦＲα＋ＣＤ４５−細胞と、ＰＤＧＦＲα−ＣＤ４５＋細胞が有意に増加していた（図３および４）。ＩＬ−３３存在下での培養により、間葉系幹細胞の代表的なマーカー発現パターンである「ＰＤＧＦＲα＋ＣＤ４５−」の付着性細胞が顕著に増えていることから、この実験結果は、ＩＬ−３３の作用によって間葉系幹細胞の増殖が促進されたことを示すものと考えられる。
【００５６】
実施例３
材料と方法
マウス
本実施例では、野生型マウスとしてＣ５７ＢＬ／６ｊｊｃｌ（CLEA Japan）を使用した。ＰＤＧＦＲαＧＦＰノックインマウスとしてＢ６．１２９Ｓ４−Ｐｄｇｆｒａｔｍ１１（ＥＧＦＰ）Ｓｏｒ (Jackson Laboratory, 007669）、ＧＦＰトランスジェニックマウスとしてＣ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＣＡＧ−ＥＧＦＰ）１３１０ｓｂ／ＬｅｙＳｏｐＪ（Jackson Laboratory, 006567）を使用した。ＭｙＤ８８ノックアウトマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）（Adachi, O. et al. Targeted Disruption of the MyD88 Gene Results in Loss of IL-1- and IL-18-Mediated Function. Immunity 9, 143-150, doi:10.1016/S1074-7613(00)80596-8 (1998)）はオリエンタルバイオサービスから購入した。マウスは、自動給水下に固形飼料を用いて明暗各１２時間に維持された動物飼育室で飼育した。
【００５７】
骨髄細胞の単離
マウスから大腿骨を採取し、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＰＢＳ（ＰＢＳ／２％ＦＢＳ）中で、乳鉢・乳棒を用いて骨髄細胞を取り出した。細胞懸濁液は40-μM cells strainer（Falcon）に通し、骨などの凝集塊を取り除いた。遠心後、RBC lysis buffer（Biolegend）で溶血し赤血球を取り除いた。
【００５８】
骨髄細胞の培養
骨髄細胞は、コラーゲン被覆６ウェルプレート（Corning Inc.）で１５％ＦＢＳ、１×GlutaMAXTM Supplement（Gibco, Cat No. 35050061）、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Nacalai Tesque）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（Nacalai Tesque）、１×モノチオグリセロール溶液（Wako）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン混合溶液を添加したαＭＥＭで低酸素インキュベーターを用いて培養した。分取をせず全骨髄細胞を培養するときには、５×１０５個／ウェルで培養した。ＦＡＣＳを用いて間葉系間質細胞（ＭＳＣ）を単離するときには、ＰＤＧＦＲα＋細胞を８００個／ウェルで分取した。共培養実験においては、さらに骨髄細胞を５×１０５個／ウェル、ＣＤ４５＋細胞を４.７５×１０５個／ウェル、ＣＤ４５−細胞を２.５×１０３個／ウェルで分取し、ＭＳＣと共培養した。Transwell（Corning Inc.）を用いた培養時には、コラーゲン被覆６ウェルプレート上にＰＤＧＦＲα＋細胞を８００個、Transwell上に骨髄細胞を５×１０５個分取し培養した。ＩＬ−３３（Biolegend）（配列番号３）は１ｎｇ／ｍｌで添加し、コントロールには等量のＰＢＳを添加した。ＤＡＰＴ（ＴＣＩ）は終濃度１μＭまたは１０μＭを添加し、コントロールには等量のＤＭＳＯを添加した。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤（SB203580, AdipoGen）、ＮＫ−κＢ阻害剤（BAY-11-7082, Cayman Chemical）は終濃度５μＭで添加し、コントロールには等量のＤＭＳＯを添加した。培地は４日毎に交換した。分取操作をしていない細胞は１０日間、ＦＡＣＳにて分取した細胞は１２日間培養し、ＦＡＣＳでの解析または Diff-Quick溶液（Sysmex）で染色しコロニー数の解析を行った。
【００５９】
ＦＡＣＳによる細胞の解析、細胞分取
ＦＡＣＳによる細胞の解析、細胞分取は、FACSAriaTMIIIμ（BD Bioscience）またはFACSCantoTMII（BD Bioscience）を、データ解析はFlowJoソフトウェア（Tree Star）を用いて行った。ＰＤＧＦＲαの発現解析にはＰＤＧＦＲαＧＦＰノックインマウスを用いた。培養細胞の解析時における培養プレートからの細胞剥離には、AccutaseTM（Nacalai Tesque）を用いた。抗体添加時には、Ｆｃ受容体への非特異な結合を阻害するため細胞懸濁液にTrustain FcXTM（Biolegend）を添加し５分間４℃でインキュベートした後、ＡＰＣ−結合ＣＤ４５抗体（Biolegend, 103112）、ＰｅｒＣＰ／ｃｙ５.５−結合ＣＤ４５抗体（Biolegend, 103132)、ＰｅｒＣＰ／ｃｙ５.５−結合ＴＥＲ１１９抗体（Biolegend, 116228）を添加し２０分間４℃でインキュベートした。解析前に、死細胞を取り除くためSYTOXTM Blue Dead Cell Stain（Thermo Fisher Scientific）で染色し、ＦＡＣＳで解析を行った。細胞分取時には、１５％ＦＢＳ、１×GlutaMAXTM、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、１×モノチオグリセロール溶液、１％ペニシリン−ストレプトマイシン混合溶液を添加したαＭＥＭへ分取した。
【００６０】
ＥＬＩＳＡ
末梢血はマウスの心臓から採血し、キャピジェクト（Terumo Corporation）をマニュアルに従って使用し血清を回収した。サンプルは使用時まで−８０℃で保存した。骨髄液は、骨を２０ゲージの針で穴をあけた０.６ｍｌマイクロチューブ上で砕き、下に１.５ｍｌマイクロチューブを置いた状態で遠心し（１０００ｇ、５分間）、１.５ｍｌマイクロチューブに回収できた骨髄液を回収した。さらに、ＰＢＳで骨髄液を１／１００希釈後再び遠心し（２０，０００ｇ、５分間）、上清のみを回収して細胞を取り除いた。サンプルは使用時まで−８０度で保存した。ＩＬ−３３の定量には、Mouse IL-33 DuoSet ELISA（R&D Systems）をマニュアルに従って使用し、４５０ｎｍの吸光度をTriStar 2 LB 942 Multimode Readerで測定した。
【００６１】
インビボ実験
５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）投与時には、５−ＦＵ（Kyowa Hakko Kirin Co.）をＰＢＳで希釈し、１５０ｍｇ／ｋｇでマウスに腹腔内投与した。ＩＬ−３３シグナル経路の阻害には、５−ＦＵ投与後１、３、５日目に５０μｇ／ショット Ultra-LEAFTM Purified anti-mouse IL-33Rα(ST2) Antibody（Biolegend）を腹腔内投与した。コントロールには、等量のUltra-LEAFTM Purified Rat IgG1, κIsotype Ctrl Antibody（Biolegend）を腹腔内投与した。ＩＬ−３３の投与では、マウス（ｎ＝６）に５−ＦＵを投与し、５−ＦＵ投与から１、３、５日目に、３匹のマウス（ｎ＝３）に、ＩＬ−３３（Recombinant Mouse IL-33、BioLegend）１μｇを１００μｌのＰＢＳで希釈したものを腹腔内投与し、比較のため、別の３匹のマウス（ｎ＝３）に、ＩＬ−３３を含まないＰＢＳ１００μｌを腹腔内投与した。
【００６２】
そして、５−ＦＵ投与後７日目に、各マウスから大腿骨を採取し、各マウス毎に細胞培養を行った。具体的には、乳鉢に１ｍｌ ＰＢＳ（２％ＦＢＳ）を入れた後、採取した大腿骨を乳鉢に投入して、すりつぶした。続いて、乳鉢上で乳棒を２ｍｌ ＰＢＳ（２％ＦＢＳ）で洗浄してから、乳鉢内で十分ピペッティングし、得られた懸濁液をメッシュサイズ４０μｍのセルストレーナー（cellstrainer）を用いてろ過し、ろ液をチューブに回収した。乳鉢に２ｍｌ ＰＢＳ（２％ＦＢＳ）を入れ、よくピペッティングし、同様にセルストレーナーを介してろ過し、更に、骨をセルストレーナー上へ移して、５ｍｌ ＰＢＳ（２％ＦＢＳ）で骨とセルストレーナーを洗浄すると共にろ液を回収した。チューブに貯留されたろ液を、遠心分離（３００ｇ、４℃、５分間）してから、沈殿物に溶血試薬（1xRBC lysis buffer）を加えて、室温で５分間、溶血処理を行った。そして、等量のＰＢＳ（２％ＦＢＳ）を加えた後、遠心操作によって沈殿した細胞を回収した。回収した細胞を１０ｍｌ ＰＢＳ（２％ＦＢＳ）で洗浄し、細胞数をTC20 Automated cell counter（BioRad）によってカウントした。２×１０６個の細胞を取り出し、１ｍｌのａＭＥＭ（２％ＦＢＳ、SIGMA）で懸濁した後、遠心操作にて細胞を回収した。回収した細胞を３ｍｌの培地で懸濁し、２×１０６個の全細胞をプレート（Collagen coated 6-well dish、Corning）に播種した。細胞を播種したプレートを３７℃、５％Ｏ２、５％ＣＯ２の条件下で１０日間培養した。発生したコロニーの数を集計した。
【００６３】
実施例３−１：ＩＬ−３３は骨髄ＭＳＣのコロニー形成活性を増強する
ＰＤＧＦＲαＧＦＰノックインマウス大腿骨から調製した骨髄細胞を５×１０５細胞ずつ６ウェルプレートに播種し、１０日間ＩＬ−３３添加培地で培養した細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により解析したところ、ＩＬ−３３添加による有意な骨髄細胞の増加が確認できた（図５ａ）。ＭＳＣは幹細胞マーカーであるＰＤＧＦＲαを発現し、血球系のマーカーであるＣＤ４５を発現しないことが知られるため、本実施例においてはＰＤＧＦＲα＋ＣＤ４５−細胞をＭＳＣ分画とした。ＦＡＣＳにより、ＩＬ−３３がＭＳＣを有意に増加させることが明らかになった（図５ｂ）。また同時に、ＩＬ−３３はＭＳＣのみでなくＣＤ４５＋細胞も有意に増加させており、ＩＬ−３３は骨髄内の複数の細胞集団に作用している可能性が示唆された（図５ｃ）。骨髄ＭＳＣは、培養において線維芽細胞様のコロニーを形成するため、線維芽細胞様コロニー形成単位（Colony forming unit-fibroblast; CFU-F）を測定することによりＭＳＣの存在率、増殖率を評価できる。ＩＬ−３３添加培地で１０日間培養後にコロニーアッセイを施行したところ、ＩＬ−３３添加によりコロニー数が約７倍有意に増加し（図５ｄ）、ＩＬ−３３が骨髄ＣＦＵ−Ｆ活性を増強することが明らかとなった。即ち、ＩＬ−３３は骨髄内ＭＳＣのコロニー形成活性を増強することが示された。
【００６４】
実施例３−２：ＩＬ−３３はＣＤ４５＋細胞とＭＳＣの細胞間接触を介して骨髄ＭＳＣのＣＦＵ−Ｆ活性を増強する
ＩＬ−３３による骨髄ＭＳＣのＣＦＵ−Ｆ活性増強メカニズムを検討した。ＩＬ−３３が直接ＭＳＣに作用しＭＳＣのＣＦＵ−Ｆ活性を増強させるか、あるいは他の細胞のシグナルを介しているのかを検討した。ＰＤＧＦＲαＧＦＰノックインマウス大腿骨から調製した骨髄細胞から、ＦＡＣＳによりＭＳＣ（ＰＤＧＦＲα＋細胞）を分取し、ＩＬ−３３添加培地で培養した。しかし、ＭＳＣ単独の培養条件下では、ＩＬ−３３によってＣＦＵ−Ｆ活性は変化しなかった（図６）。このことから、ＩＬ−３３による骨髄ＭＳＣのＣＦＵ−Ｆ活性増強は、骨髄中に存在するＭＳＣ以外の細胞によって間接的に制御されている可能性が示唆された。
【００６５】
ＩＬ−３３による骨髄ＭＳＣのＣＦＵ−Ｆ活性増強がＭＳＣと骨髄細胞の細胞間接触に依存しているか調べた。Transwellを用いることで骨髄細胞とＭＳＣを培地は共有するが細胞同士の接触は起こらない培養条件を作り出し、ＣＦＵ−Ｆ活性を調査した。ＭＳＣと骨髄細胞を共培養（Co-culture）するとＩＬ−３３によりＣＦＵ−Ｆ活性が増加したが、ＭＳＣと骨髄細胞の細胞間接触を抑制した条件下（Transwell）ではＩＬ−３３によるＣＦＵ−Ｆ活性に変化は見られず、ＩＬ−３３によるＭＳＣのＣＦＵ−Ｆ活性増強には細胞間接触が必須であることが示された（図７ａ）。なお、図示を省略しているが、ＩＬ−３３存在下で骨髄細胞を培養すると、液性因子としてＣＣＬ２、ＣＣＬ２２、オステオポンチンの分泌が促進されることが明らかとなったため、これらの物質を、それぞれ培地に添加して骨髄細胞を培養したところ、いずれの物質の添加によってもＣＦＵ−Ｆ活性は変化しなかった。
【００６６】
さらに骨髄中に存在するどの細胞との接触がＭＳＣのＣＦＵ−Ｆ活性を増強させるのか検討した。ＩＬ−３３は骨髄中のＣＤ４５陽性（ＣＤ４５＋）細胞を増加させることから（図５ｃ）、ＣＤ４５陽性細胞との細胞間接触が必要なのではないかと予想し、ＣＤ４５陽性細胞とＣＤ４５陰性（ＣＤ４５−）細胞をそれぞれＦＡＣＳにより分取し、ＩＬ−３３存在下でＭＳＣと共培養した。ＣＤ４５−細胞にはＰＤＧＦＲα＋細胞が含まれたが、無視できる量であった。ＣＤ４５＋細胞との共培養でのみＣＦＵ−Ｆ活性の増強が確認でき、ＩＬ−３３によるＭＳＣのＣＦＵ−Ｆ活性増強はＣＤ４５＋細胞との細胞間接触によって誘導されることが示された（図７ｂ）。
【００６７】
実施例３−３：ＩＬ−３３による骨髄ＭＳＣのＣＦＵ−Ｆ活性増強はＭｙＤ８８シグナル経路依存的である
ＩＬ−３３による骨髄ＭＳＣのＣＦＵ−Ｆ活性増強の分子メカニズムをさらに詳細に検討した。ＩＬ−３３が細胞膜受容体であるＳＴ２／ＩＬ−１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ−１ＲＡＰ）複合体に結合すると、この受容体にアダプタータンパク質であるミエロイド系分化因子（Myeloid differentiation primary response）８８（ＭｙＤ８８）が誘導される。ＭｙＤ８８はＮＦ−κＢ、ｐ３８、ＥＲＫやＪＮＫの活性化を介して、目的遺伝子の活性を制御することが知られている。そこで、ＩＬ−３３による骨髄ＭＳＣのＣＦＵ−Ｆ活性増強におけるＭｙＤ８８シグナル経路の影響を調べるために、ＭｙＤ８８ノックアウト（ＫＯ）マウス大腿骨から調製した骨髄細胞をＩＬ−３３添加培地で培養した。ＭｙＤ８８ＫＯマウスの骨髄細胞ではＩＬ−３３添加によるＣＦＵ−Ｆ活性に変化は認められず、ＩＬ−３３によるＭＳＣのＣＦＵ−Ｆ活性増強にはＭｙＤ８８シグナル経路が必須であるがことが示された（図８ａ）。さらに、ＭｙＤ８８ＫＯマウスの骨髄細胞では、ＩＬ−３３によるＣＤ４５＋細胞の増加も認められず（図８ｂ）、ＩＬ−３３によるＣＦＵ−Ｆ活性増強はＣＤ４５＋細胞におけるＭｙＤ８８シグナル経路に依存する可能性が示唆された。
【００６８】
さらに、ＭｙＤ８８の下流で働くことが知られるｐ３８ＭＡＰＫ経路やＮＦ−κＢ経路の関与を検討した。ＰＤＧＦＲαＧＦＰノックインマウス大腿骨から調製した骨髄細胞において、ＤＭＳＯ添加コントロール群とＮＦ−κＢ阻害剤（ＢＡＹ−１１−７０８２）添加群ではＩＬ−３３によるＣＦＵ−Ｆ活性の増強が見られたが、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤（ＳＢ２０３５８０）添加群ではＩＬ−３３によるＣＦＵ−Ｆ活性の変化は認められなかった（図９）。これらの結果によりＩＬ−３３によるＭＳＣのＣＦＵ−Ｆ活性増強は、ＭｙＤ８８シグナル経路依存的であり、さらにｐ３８ＭＡＰＫ経路を介することが明らかになった。
【００６９】
ＩＬ−３３によってＭｙＤ８８シグナル経路依存的に活性化されたＣＤ４５＋細胞が、ＭＳＣのＣＦＵ−Ｆ活性増強を誘導する分子メカニズムを検討すべく、ＭＳＣの増殖や維持において重要であることが報告されているＮｏｔｃｈシグナル経路の影響を調べた。具体的には、ＰＤＧＦＲαＧＦＰノックインマウス大腿骨から調製した骨髄細胞において、Ｎｏｔｃｈシグナル経路の一部であるγ−セクレターゼを阻害するＤＡＰＴ（（３，５−ジフルオロフェニルアセチル）−Ｌ−アラニル−Ｌ−２−フェニルグリシンｔｅｒｔ−ブチルエステル）を用い、ＩＬ−３３添加によるＭＳＣ増殖に与えるＤＡＰＴの影響を検討した。ＤＡＰＴ存在下ではＩＬ−３３によるＣＦＵ−Ｆ活性の増強が抑制された（図１０ａ）。さらにＤＡＰＴ／ＩＬ−３３添加培地で培養した骨髄細胞をＦＡＣＳで解析すると、ＤＡＰＴの濃度依存的にＭＳＣ数が減少した（図１０ｂ）。一方で、ＤＡＰＴ／ＩＬ−３３添加によってもＣＤ４５＋細胞数の増加は抑制されなかった（図１０ｃ）。
【００７０】
実施例３−４：ＩＬ−３３は生体内において骨髄細胞の恒常性維持に関与する
生体内におけるＩＬ−３３の機能、役割を検討した。まず末梢血、骨髄液中のＩＬ−３３の濃度をＥＬＩＳＡにより測定した（図１１）。その結果、骨髄液には末梢血と比較して著しく高濃度でＩＬ−３３が含まれていることが明らかとなり、ＩＬ−３３が生体骨髄内でも機能していることが示唆された。そこで、抗癌剤である５−ＦＵによって誘導される可逆的なマウス骨髄抑制モデルを用いて、ＩＬ−３３による骨髄細胞の増殖（回復）に対する影響を検討した（図１２ａ）。５−ＦＵ投与後５日目に骨髄細胞が急激に減少し、その後１４日目には骨髄細胞数が正常時のレベルに回復することを確認し、骨髄抑制モデルが作製できたことを確認した（図１２ｂ）。骨髄ＭＳＣを含むＰＤＧＦＲα＋ＣＤ４５−ＴＥＲ１１９−細胞（Morikawa, S. et al. Prospective identification, isolation, and systemic transplantation of multipotent mesenchymal stem cells in murine bone marrow. Journal of Experimental Medicine 206, 2483-2496, doi:10.1084/jem.20091046 (2009)）は５−ＦＵ投与後減少したが、１０日後には回復した（図１２ｃ）。
【００７１】
骨髄抑制回復におけるＩＬ−３３の関与を調べるため、５−ＦＵ投与後１、３、５日目にＩＬ−３３受容体であるＳＴ２の中和抗体（ＳＴ２−Ａｂ）を投与した（図１３ａ）。５−ＦＵ投与後７日目において、ＳＴ２−Ａｂ投与群ではコントロール群に比べて骨髄細胞数の減少傾向がみられ、ＩＬ−３３シグナル経路は骨髄抑制の回復に寄与している可能性が示された（図１３ｂ）。さらに５−ＦＵ／ＳＴ２−Ａｂ投与後の骨髄細胞を培養したところＳＴ２−Ａｂ投与群においてＣＦＵ−Ｆ活性の低下が示されたことから（図１３ｃ）、ＩＬ−３３シグナルが骨髄抑制時のＭＳＣ機能の回復に重要であることが明らかとなった。
【００７２】
さらに、骨髄抑制回復におけるＩＬ−３３の効果を調べた。マウス（ｎ＝６）に５−ＦＵを投与し、投与後１、３、５日目に、３匹のマウス（ｎ＝３）にＩＬ−３３を含むＰＢＳを投与し、比較のため、別の３匹のマウス（ｎ＝３）にＩＬ−３３を含まないＰＢＳを投与した。５−ＦＵ投与後７日目に採取した骨髄細胞を培養し、ＣＦＵ−Ｆ活性を測定した。結果を図１４に示す。ＣＦＵ−Ｆ活性はＩＬ−３３投与群において高かった。この結果は、ＩＬ−３３が骨髄抑制時のＭＳＣ機能を回復すること、また、骨髄抑制の治療または予防に有効であることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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