(57)【要約】【課題】タンパク質成形体を簡便に製造できる方法を提供すること。【解決手段】成形体前駆体と水とを接触させて、タンパク質成形体を得る工程を備え、前記成形体前駆体が、改変フィブロイン及び溶媒を含むドープ液と、タンパク質と反応して結合を形成可能な反応性基を有する反応剤との反応混合物であり、前記改変フィブロインが、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含み、前記ドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中にリシン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有する、タンパク質成形体の製造方法。［式１及び式２中、（Ａ）ｎモチーフは４〜２７アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が８０％以上である。ＲＥＰは１０〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは１０〜３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。］【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
成形体前駆体と水とを接触させて、タンパク質成形体を得る工程を備え、
前記成形体前駆体が、改変フィブロイン及び溶媒を含むドープ液と、タンパク質と反応して結合を形成可能な反応性基を有する反応剤との反応混合物であり、
前記改変フィブロインが、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含み、
前記ドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中にリシン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有する、タンパク質成形体の製造方法。
［式１及び式２中、（Ａ）ｎモチーフは４〜２７アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が８０％以上である。ＲＥＰは１０〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは１０〜３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。］
【請求項２】
前記ドメイン配列が、ＲＥＰ中にＧＰＧＸＸ（但し、Ｘはグリシン残基以外のアミノ酸残基を示す。）モチーフを含み、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上である、請求項１に記載のタンパク質成形体の製造方法。
【請求項３】
前記ドメイン配列が、ＲＥＰ中にグリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基を含み、かつ、ＲＥＰ中の前記グリシン残基、前記セリン残基、又は前記アラニン残基と隣り合う位置に、前記リシン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載のタンパク質成形体の製造方法。
【請求項４】
前記ドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、前記ＲＥＰ中のアミノ酸配列の中央又は中央近傍に、前記リシン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質成形体の製造方法。
【請求項５】
前記ドメイン配列が、ＲＥＰ中に疎水性アミノ酸残基を含み、かつ、ＲＥＰ中の前記疎水性アミノ酸残基と隣り合う位置に、前記リシン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質成形体の製造方法。
【請求項６】
前記天然由来のフィブロインが、昆虫又はクモ類由来のフィブロインである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質成形体の製造方法。
【請求項７】
前記天然由来のフィブロインが、クモ類の大瓶状スパイダータンパク質（ＭａＳｐ）又は小瓶状スパイダータンパク質（ＭｉＳｐ）である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質成形体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質成形体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生分解性を有するタンパク質の素材化が、環境保全意識の高まり応じて盛んに研究されるようになってきている。例えば、非特許文献１には、シルク粉末又は羊毛粉末を加熱圧縮し樹脂化することでバイオプラスチックを得る方法が報告されており、特許文献１には、粉末状の人工クモ糸タンパク質を加熱圧縮することで、人工クモ糸タンパク質からなる樹脂成形体を得ることが記載されている。それら、所謂人工タンパク質成形体は、合成繊維、合成樹脂等の石油系材料からなる成形体とは異なって、生産及び加工に際して必要なエネルギーが小さいこと等から益々の需要が見込まれている。このような状況下、人工タンパク質成形体を、より簡便に得る方法の実現が期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１７／０４７５０４号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】平井伸治、月刊機能材料誌、２０１４年６月、「廃棄物由来動物タンパク質を用いた環境調和型シルクおよび羊毛樹脂」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、タンパク質成形体を簡便に製造できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］
成形体前駆体と水とを接触させて、タンパク質成形体を得る工程を備え、
成形体前駆体が、改変フィブロイン及び溶媒を含むドープ液と、タンパク質と反応して結合を形成可能な反応性基を有する反応剤との反応混合物であり、
改変フィブロインが、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含み、
ドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中にリシン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有する、タンパク質成形体の製造方法。
［式１及び式２中、（Ａ）ｎモチーフは４〜２７アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が８０％以上である。ＲＥＰは１０〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは１０〜３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。］
［２］
ドメイン配列が、ＲＥＰ中にＧＰＧＸＸ（但し、Ｘはグリシン残基以外のアミノ酸残基を示す。）モチーフを含み、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上である、［１］に記載のタンパク質成形体の製造方法。
［３］
ドメイン配列が、ＲＥＰ中にグリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基を含み、かつ、ＲＥＰ中のグリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基と隣り合う位置に、リシン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有する、［１］又は［２］に記載のタンパク質成形体の製造方法。
［４］
ドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中のアミノ酸配列の中央又は中央近傍に、リシン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有する、［１］〜［３］のいずれかに記載のタンパク質成形体の製造方法。
［５］
ドメイン配列が、ＲＥＰ中に疎水性アミノ酸残基を含み、かつ、ＲＥＰ中の疎水性アミノ酸残基と隣り合う位置に、リシン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有する、［１］〜［４］のいずれかに記載のタンパク質成形体の製造方法。
［６］
天然由来のフィブロインが、昆虫又はクモ類由来のフィブロインである、［１］〜［５］のいずれかに記載のタンパク質成形体の製造方法。
［７］
天然由来のフィブロインが、クモ類の大瓶状スパイダータンパク質（ＭａＳｐ）又は小瓶状スパイダータンパク質（ＭｉＳｐ）である、請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質成形体の製造方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、タンパク質成形体を簡便に製造できる方法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。
【図２】実施例１における成形体前駆体を製造する際の粘度測定結果を示すグラフである。
【図３】実施例１における成形体前駆体及びタンパク質成形体を示す写真である。
【図４】実施例２における成形体前駆体の粘度測定結果を示すグラフである。
【図５】実施例２におけるタンパク質成形体を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１０】
〔タンパク質成形体の製造方法〕
本実施形態に係るタンパク質成形体の製造方法は、成形体前駆体と水とを接触させて、タンパク質成形体を得る工程（接触工程）を備える。成形体前駆体は、改変フィブロイン（詳細は後述する。）及び溶媒を含むドープ液と、タンパク質と反応して結合を形成可能な反応性基を有する反応剤との反応混合物である。
【００１１】
（改変フィブロイン）
本実施形態に係る改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。改変フィブロインは、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側のいずれか一方又は両方に更にアミノ酸配列（Ｎ末端配列及びＣ末端配列）が付加されていてもよい。Ｎ末端配列及びＣ末端配列は、これに限定されるものではないが、典型的には、フィブロインに特徴的なアミノ酸モチーフの反復を有さない領域であり、１００残基程度のアミノ酸からなる。
【００１２】
本明細書において「改変フィブロイン」とは、そのアミノ酸配列が天然由来のフィブロインのアミノ酸配列とは異なるフィブロインを意味する。本明細書でいう「天然由来のフィブロイン」は、そのアミノ酸配列が自然に存在する昆虫又はクモ類等が産生するフィブロインと同一であるフィブロインを意味する。天然由来のフィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。
【００１３】
天然由来のフィブロインとしては、例えば、昆虫又はクモ類が産生するフィブロインが挙げられる。
【００１４】
昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（Ａｎｔｅｒａｅａ  ｐｅｒｎｙｉ）、楓蚕（Ｅｒｉｏｇｙｎａ  ｐｙｒｅｔｏｒｕｍ）、蓖蚕（Ｐｉｌｏｓａｍｉａ  Ｃｙｎｔｈｉａ  ｒｉｃｉｎｉ）、樗蚕（Ｓａｍｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ）、栗虫（Ｃａｌｉｇｕｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、チュッサー蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｍｙｌｉｔｔａ）、ムガ蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ａｓｓａｍａ）等のカイコが産生する絹タンパク質、スズメバチ（Ｖｅｓｐａ  ｓｉｍｉｌｌｉｍａ  ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。
【００１５】
昆虫が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、カイコ・フィブロインＬ鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７６４３０（塩基配列）、ＡＡＡ２７８４０．１（アミノ酸配列））が挙げられる。
【００１６】
クモ類が産生するフィブロインとしては、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。スパイダーシルクタンパク質としては、例えば、ＭａＳｐ（ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２）、ＡＤＦ（ＡＤＦ３及びＡＤＦ４）等の牽引糸タンパク質、ＭｉＳｐ（ＭｉＳｐ１及びＭｉＳｐ２）等が挙げられる。
【００１７】
クモ類が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、ｆｉｂｒｏｉｎ−３（ａｄｆ−３）［Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１０（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５５（塩基配列））、ｆｉｂｒｏｉｎ−４（ａｄｆ−４）［Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１１（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  １［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０４５０４（アミノ酸配列）、Ｕ３７５２０（塩基配列））、ｍａｊｏｒ  ａｎｇｕ１１ａｔｅ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  １［Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ６８８５６（アミノ酸配列）、ＥＦ５９５２４６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  ２［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖａｔａ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ３２４７２（アミノ酸配列）、ＡＦ４４１２４５（塩基配列））、ｍａｊｏｒ  ａｎｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  １［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＪ００４２８（アミノ酸配列）、ＡＪ９７３１５５（塩基配列））、及びｍａｊｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  ２［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＭ３２２４９．１（アミノ酸配列）、ＡＭ４９０１６９（塩基配列））、ｍｉｎｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５８９．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５９１．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ  ｃｒｕｅｎｔａｔａ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ３７２７８．１（アミノ酸配列）等が挙げられる。
【００１８】
天然由来のフィブロインのより具体的な例としては、更に、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋに配列情報が登録されているフィブロインを挙げることができる。例えば、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報のうちＤＩＶＩＳＩＯＮとしてＩＮＶを含む配列の中から、ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮにｓｐｉｄｒｏｉｎ、ａｍｐｕｌｌａｔｅ、ｆｉｂｒｏｉｎ、「ｓｉｌｋ及びｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」、又は「ｓｉｌｋ及びｐｒｏｔｅｉｎ」がキーワードとして記載されている配列、ＣＤＳから特定のｐｒｏｄｕｃｔの文字列、ＳＯＵＲＣＥからＴＩＳＳＵＥ  ＴＹＰＥに特定の文字列の記載された配列を抽出することにより確認することができる。
【００１９】
「改変フィブロイン」は、本発明で特定されるアミノ酸配列を有するものであれば、天然由来のフィブロインに依拠してそのアミノ酸配列を改変したもの（例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列を改変することによりアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、また天然由来のフィブロインに依らず人工的にアミノ酸配列を設計したもの（例えば、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより所望のアミノ酸配列を有するもの）であってもよい。なお、改変フィブロインのアミノ酸配列を改変したものも、そのアミノ酸配列が天然由来のフィブロインのアミノ酸配列とは異なるものであれば、改変フィブロインに含まれる。
【００２０】
本明細書において「ドメイン配列」とは、フィブロイン特有の結晶領域（典型的には、アミノ酸配列の（Ａ）ｎモチーフに相当する。）と非晶領域（典型的には、アミノ酸配列のＲＥＰに相当する。）を生じるアミノ酸配列であり、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるアミノ酸配列を意味する。ここで、（Ａ）ｎモチーフは４〜２７アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が８０％以上である。ＲＥＰは１０〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは１０〜３００の整数を示す。ｍは、２０〜３００の整数であることが好ましく、３０〜３００の整数であることがより好ましい。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。
【００２１】
（Ａ）ｎモチーフは、（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が８０％以上であればよいが、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、少なくとも７つがアラニン残基のみで構成されることが好ましい。アラニン残基のみで構成されるとは、（Ａ）ｎモチーフが、（Ａｌａ）ｋ（Ａｌａはアラニン残基を示し、ｋは４〜２７の整数、好ましくは４〜２０の整数、より好ましくは４〜１６の整数を示す。）で表されるアミノ酸配列を有することを意味する。
【００２２】
ＲＥＰは、１０〜２００アミノ酸残基から構成される。ＲＥＰを構成するアミノ酸残基の１以上が、グリシン残基、セリン残基、及びアラニン残基からなる群より選択されるアミノ酸残基であってよい。すなわち、ＲＥＰは、グリシン残基、セリン残基、及びアラニン残基からなる群より選択されるアミノ酸残基を含んでいてよい。
【００２３】
ＲＥＰを構成するアミノ酸残基の１以上が、疎水性アミノ酸残基であってよい。すなわち、ＲＥＰは、疎水性アミノ酸残基を含んでいることが好ましい。疎水性アミノ酸残基とは、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基を意味する。アミノ酸残基の疎水性指標（ハイドロパシー・インデックス、以下「ＨＩ」とも記す。）については、公知の指標公知の指標（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ  ｉｎｄｅｘ：Ｋｙｔｅ  Ｊ，＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  Ｒ（１９８２）“Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７，ｐｐ．１０５−１３２）を使用する。疎水性アミノ酸残基としては、例えば、イソロイシン（ＨＩ：４．５）、バリン（ＨＩ：４．２）、ロイシン（ＨＩ：３．８）、フェニルアラニン（ＨＩ：２．８）、メチオニン（ＨＩ：１．９）、アラニン（ＨＩ：１．８）が挙げられる。
【００２４】
本実施形態に係る改変フィブロインにおいて、ドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中にリシン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有する。
【００２５】
ドメイン配列は、ＲＥＰ中のグリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基と隣り合う位置に、リシン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していることが好ましく、ＲＥＰ中のグリシン残基と隣り合う位置に、リシン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していることがより好ましい。リシン残基が、グリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基と隣り合う位置に存在する場合、リシン残基の側鎖の可動範囲が広いため、リシン残基の側鎖に存在するアミノ基を介した反応の効率がより向上することとなる。これにより所望の物性を有するタンパク質成形体をより有利に製造することができる。ＲＥＰ中のリシン残基は、グリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基と、グリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基との間に位置していてよく、セリン残基と、グリシン残基との間に位置していてよい。
【００２６】
ドメイン配列は、ＲＥＰ中の疎水性アミノ酸残基と隣り合う位置に、リシン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していることが好ましい。この場合、分子間で疎水性アミノ酸残基同士が疎水的相互作用により固定されることで、リシン残基の側鎖に存在するアミノ基を介した反応の効率がより一層向上する。ＲＥＰ中のリシン残基は、疎水性アミノ酸残基の隣に位置していてよく、疎水性アミノ酸残基と、疎水性アミノ酸残基以外のアミノ酸残基との間に、位置していてもよく、疎水性アミノ酸残基と、グリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基との間に位置していてよく、疎水性アミノ酸残基と、グリシン残基との間に位置していてよい。疎水性アミノ酸残基は、イソロイシン残基、バリン残基、ロイシン残基、フェニルアラニン残基、メチオニン残基、及びアラニン残基からなる群より選択される１種であってよい。
【００２７】
ドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、ドメイン配列のＮ末端及び／又はＣ末端の近傍に位置するＲＥＰ中に、リシン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していてよい。この場合、反応後の分子鎖が長くなるため、物性向上が期待できる。本明細書において、ドメイン配列のＮ末端の近傍に位置するＲＥＰとは、ドメイン配列のＮ末端から１〜３番目に位置するＲＥＰを意味する。例えば、リシン残基は、ドメイン配列のＮ末端から１〜２番目に位置するＲＥＰ中に位置していてよい。本明細書において、ドメイン配列のＣ末端の近傍に位置するＲＥＰとは、ドメイン配列のＣ末端から１〜３番目に位置するＲＥＰを意味する。例えば、リシン残基は、ドメイン配列のＣ末端から１〜２番目に位置するＲＥＰ中に位置していてよい。リシン残基は、ドメイン配列の最もＮ末端側及び／又は最もＣ末端側に位置するＲＥＰ中に位置していることが好ましい。
【００２８】
ドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の中央又は中央近傍にリシン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していてよい。本明細書において、ＲＥＰ中のアミノ酸配列の中央近傍とは、ＲＥＰの中央に位置するアミノ酸残基（中央に位置するアミノ酸残基が２つ存在する場合はＮ末端側のアミノ酸残基）からＮ末端側に向かって１〜５番目の位置、又はＲＥＰの中央に位置するアミノ酸残基（中央に位置するアミノ酸残基が２つ存在する場合はＣ末端側のアミノ酸残基）から１〜５番目の位置を示す。例えば、リシン残基は、ＲＥＰの中央に位置していてもよく、ＲＥＰの中央に位置するアミノ酸残基からＮ末端側、又はＣ末端側に向かって１〜３番目又は１〜２番目に位置していてもよい。
【００２９】
改変フィブロインは、ＲＥＰのアミノ酸配列中に、ＧＰＧＸＸモチーフ（Ｇはグリシン残基、Ｐはプロリン残基、Ｘはグリシン残基以外のアミノ酸残基を示す。）を含むことが好ましい。ＲＥＰ中にこのモチーフが含まれることにより、タンパク質成形体のタフネスをより一層向上させることができる。
【００３０】
改変フィブロインが、ＲＥＰ中にＧＰＧＸＸモチーフを含む場合、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率は、通常１％以上であり、５％以上であってもよく、１０％以上であるのが好ましい。これにより、改変フィブロインの伸度をより向上させることができる。ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の上限に特に制限はなく、５０％以下であってよく、３０％以下であってもよい。
【００３１】
本明細書において、「ＧＰＧＸＸモチーフ含有率」は、以下の方法により算出される値である。式Ａ：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式Ｂ：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロインにおいて、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域に含まれるＧＰＧＸＸモチーフの個数の総数を３倍した数（即ち、ＧＰＧＸＸモチーフ中のＧ及びＰの総数に相当）をｃとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｄとしたときに、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率はｃ／ｄとして算出される。
【００３２】
ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としているのは、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列」（ＲＥＰに相当する配列）には、フィブロインに特徴的な配列と相関性の低い配列が含まれることがあり、ｍが小さい場合（つまり、ドメイン配列が短い場合）、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出結果に影響するので、この影響を排除するためである。なお、ＲＥＰのＣ末端に「ＧＰＧＸＸモチーフ」が位置する場合、「ＸＸ」が例えば「ＡＡ」の場合であっても、「ＧＰＧＸＸモチーフ」として扱う。
【００３３】
図１は、フィブロインのドメイン配列を示す模式図である。図１を参照しながらＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出方法を具体的に説明する。まず、図１に示したフィブロインのドメイン配列（「［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフ」タイプである。）では、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図１中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、ｃを算出するためのＧＰＧＸＸモチーフの個数は７であり、ｃは７×３＝２１となる。同様に、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図１中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、当該配列から更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数ｄは５０＋４０＋１０＋２０＋３０＝１５０である。次に、ｃをｄで除すことによって、ｃ／ｄ（％）を算出することができ、図１のフィブロインの場合２１／１５０＝１４．０％となる。
【００３４】
改変フィブロインは、ＲＥＰの疎水性度が、−０．８以上であることが好ましく、−０．７以上であることがより好ましく、０以上であることが更に好ましく、０．３以上であることが更により好ましく、０．４以上であることが特に好ましい。ＲＥＰの疎水性度の上限に特に制限はなく、１．０以下であってよく、０．７以下であってもよい。
【００３５】
本明細書において、「ＲＥＰの疎水性度」は、以下の方法により算出される値である。式Ａ：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式Ｂ：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロインにおいて、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列（図１の「領域Ａ」に相当する配列。）に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域の各アミノ酸残基の疎水性指標の総和をｅとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｆとしたときに、ＲＥＰの疎水性度はｅ／ｆとして算出される。ＲＥＰの疎水性度の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
【００３６】
ドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中に１以上３０未満のリシン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していてよい。つまり、ＲＥＰに挿入したことに相当するリシン残基の総数は、１以上、２以上、４以上、６以上、８以上、１０以上、１２以上、１４以上、１６以上、１８以上、２０以上、又は２２以上であってよく、２４以下、２２以下、又は１８以下であってもよい。ドメイン配列中のＲＥＰ一つあたりのリシン残基数は、例えば、１〜１０であってよく、１〜６であってよく、１〜３であってよく、１であってよい。
【００３７】
本実施形態に係る改変フィブロインのリシン残基の総数は、１以上３０未満、１以上２４以下、又は１以上１８以下、又は２以上１８以下であってもよい。
【００３８】
本実施形態に係る改変フィブロインは、上述したＲＥＰ中のリシン残基に関する改変に加え、天然由来のフィブロインと比較して、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変が更にあってもよい。
【００３９】
本実施形態に係る改変フィブロインの分子量は、特に限定されないが、例えば、１０ｋＤａ以上７００ｋＤａ以下であってよい。本実施形態に係る改変フィブロインの分子量は、例えば、２０ｋＤａ以上、３０ｋＤａ以上、４０ｋＤａ以上、５０ｋＤａ以上、６０ｋＤａ以上、７０ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、９０ｋＤａ以上、又は１００ｋＤａ以上であってよく、６００ｋＤａ以下、５００ｋＤａ以下、４００ｋＤａ以下、３００ｋＤａ以下、又は２００ｋＤａ以下であってよい。
【００４０】
本実施形態に係る改変フィブロインのより具体的な例として、（ｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む、改変フィブロイン、又は（ｉｉ）配列番号６、又は配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げるこができる。
【００４１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１）は、配列番号８で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ８）に対し、ドメイン配列の最もＮ末端側及びＣ末端側に位置するＲＥＰそれぞれに、リシン残基を１カ所挿入したものである。
【００４２】
配列番号２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２）は、配列番号８で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ８）に対し、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側それぞれから１番目及び２番目に位置するＲＥＰ中に、１カ所ずつリシン残基が挿入されたものである。
【００４３】
配列番号３で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ３）は、配列番号８で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ８）に対し、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側それぞれから１番目〜４番目に位置するＲＥＰ中に、１カ所ずつリシン残基が挿入されたものである。
【００４４】
配列番号４で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ４）は、配列番号８で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ８）に対し、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側それぞれから１番目〜８番目に位置するＲＥＰ中に、１カ所ずつリシン残基が挿入されたものである。
【００４５】
配列番号５で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ５）は、配列番号８で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ８）に対し、ドメイン配列のＮ末端側から、１〜１２番目に位置するＲＥＰ中に、それぞれ１カ所ずつリシン残基を挿入し、Ｃ末端側から、１〜７及び９〜１０番目に位置するＲＥＰ中に、それぞれ１カ所ずつリシン残基を挿入し、Ｃ末端側から、８番目に位置するＲＥＰ中に、２カ所リシン残基が挿入されたものである。
【００４６】
配列番号６で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ６）は、配列番号９で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ９）に対し、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側それぞれから１番目に位置するＲＥＰ中に、６カ所ずつリシン残基を挿入し、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側それぞれから２番目に位置するＲＥＰ中に、３カ所ずつリシン残基が挿入されたものである。
【００４７】
配列番号７で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ７）は、配列番号９で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ９）に対し、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側それぞれから１番目〜９番目に位置するＲＥＰ中に、１カ所ずつリシン残基が挿入されたものである。
【００４８】
配列番号２１で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２１）は、配列番号９で示されるアミノ酸配列に対し、ドメイン配列の最もＣ末端側に位置するＲＥＰ中に、３カ所リシン残基が挿入されたものである。
【００４９】
（ｉ）の改変フィブロインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。（ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号６、又は配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００５０】
上述の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
【００５１】
タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ｍｅｔａｌ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による改変フィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号１７又は配列番号１８で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含むアミノ酸配列）が挙げられる。タグ配列は、リシン残基を含んでいてよい。リシン残基を含むタグ配列の具体例としては、例えば、配列番号１９で示されるアミノ酸配列が挙げられる。タグ配列に含まれるリシン残基数は、１〜５であってよく、２〜４であってよく、３であってよい。
【００５２】
また、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。
【００５３】
さらに、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に改変フィブロインを精製することができる。
【００５４】
さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも使用することができる。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した改変フィブロインを回収することもできる。
【００５５】
タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（ｉｉｉ）配列番号１０（ＰＲＴ１０）、配列番号１１（ＰＲＴ１１）、配列番号１２（ＰＲＴ１２）、配列番号１３（ＰＲＴ１３）、若しくは配列番号１４（ＰＲＴ１４）で示されるアミノ酸配列を含む、改変フィブロイン、又は（ｉｖ）配列番号１５（ＰＲＴ１５）、配列番号１６（ＰＲＴ１６）若しくは配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
【００５６】
（ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００５７】
配列番号１０（ＰＲＴ１０）、配列番号１１（ＰＲＴ１１）、配列番号１２（ＰＲＴ１２）、配列番号１３（ＰＲＴ１３）、又は配列番号１４（ＰＲＴ１４）で示されるアミノ酸配列を含む、改変フィブロインのＧＰＧＸＸモチーフ含有率は、いずれも４０％程度であり、いずれも１０％以上である。
【００５８】
（ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１５、配列番号１６、又は配列番号１９で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００５９】
配列番号１５（ＰＲＴ１５）、配列番号１６（ＰＲＴ１６）、又は配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含む、改変フィブロインのＧＰＧＸＸモチーフ含有率は、いずれも１０％以上である。
【００６０】
上述の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
【００６１】
（核酸）
一実施形態に係る核酸は、上記改変フィブロインをコードする。核酸の具体例として、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、又は配列番号７で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロイン、又はこれらのアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のいずれか一方若しくは両方に配列番号１７又は配列番号１８で示されるアミノ酸配列（タグ配列）を結合させた改変フィブロイン等をコードする核酸が挙げられる。
【００６２】
一実施形態に係る核酸は、上記改変フィブロインをコードする核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含む改変フィブロインをコードする核酸である。当該核酸によりコードされる改変フィブロインの上記ドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中にリシン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有する。
【００６３】
「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。低ストリンジェントな条件とは、少なくとも８５％以上の同一性が配列間に存在する時のみハイブリダイゼーションが起こることを意味し、例えば、０．５％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣを用い、４２℃でハイブリダイズする条件が挙げられる。中ストリンジェントな条件とは、少なくとも９０％以上の同一性が配列間に存在する時のみハイブリダイゼーションが起こることを意味し、例えば、０．５％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣを用い、５０℃でハイブリダイズする条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、少なくとも９５％以上の同一性が配列間に存在する時のみハイブリダイゼーションが起こることを意味し、例えば、０．５％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣを用い、６０℃でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００６４】
（宿主及び発現ベクター）
一実施形態に係る発現ベクターは、上記核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する。調節配列は、宿主における組換えタンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
【００６５】
一実施形態に係る宿主は、上記発現ベクターで形質転換されたものである。宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。
【００６６】
発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、一実施形態に係る核酸を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。
【００６７】
細菌等の原核生物を宿主として用いる場合は、一実施形態に係る発現ベクターは、原核生物中で自立複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、一実施形態に係る核酸及び転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００６８】
原核生物としては、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する微生物を挙げることができる。
【００６９】
エシェリヒア属に属する微生物として、例えば、エシェリヒア・コリ  ＢＬ２１（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（ライフテクノロジーズ社）、エシェリヒア・コリ  ＢＬＲ（ＤＥ３）（メルクミリポア社）、エシェリヒア・コリ  ＤＨ１、エシェリヒア・コリ  ＧＩ６９８、エシェリヒア・コリ  ＨＢ１０１、エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ  Ｋ５（ＡＴＣＣ  ２３５０６）、エシェリヒア・コリ  ＫＹ３２７６、エシェリヒア・コリ  ＭＣ１０００、エシェリヒア・コリ  ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ  ４７０７６）、エシェリヒア・コリ  Ｎｏ．４９、エシェリヒア・コリ  Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ  ＴＢ１、エシェリヒア・コリ  Ｔｕｎｅｒ（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ  Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）  （ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ  Ｗ１４８５、エシェリヒア・コリ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７３２５）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ等を挙げることができる。
【００７０】
ブレビバチルス属に属する微生物として、例えば、ブレビバチルス・アグリ、ブレビバチルス・ボルステレンシス、ブレビバチルス・セントロポラスブレビバチルス・フォルモサス、ブレビバチルス・インボカツス、ブレビバチルス・ラチロスポラス、ブレビバチルス・リムノフィルス、ブレビバチルス・パラブレビス、ブレビバチルス・レウスゼリ、ブレビバチルス・サーモルバー、ブレビバチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１２２３）、ブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２３０８）、ブレビバチルス・ブレビス４７−５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１６６４）、ブレビバチルス・ブレビス４７−５Ｑ（ＪＣＭ８９７５）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６２３）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４５７３）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３株（Ｔａｋａｒａ社製）等を挙げることができる。
【００７１】
セラチア属に属する微生物として、例えば、セラチア・リクエファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｃｅ）ＡＴＣＣ１４４６０、セラチア・エントモフィラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｉｃａｒｉａ）、セラチア・フォンティコーラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）、セラチア・グリメシ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｇｒｉｍｅｓｉｉ）、セラチア・プロテアマキュランス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ）、セラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）、セラチア・プリムシカ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）、セラチア・ルビダエ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｒｕｂｉｄａｅａ）等を挙げることができる。
【００７２】
バチルス属に属する微生物として、例えば、バチルス・サチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）等を挙げることができる。
【００７３】
ミクロバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム  ＡＴＣＣ１５３５４等を挙げることができる。
【００７４】
ブレビバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１４０２０、ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７）ＡＴＣＣ１３８２６，ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・インマリオフィラム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６８、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９）ＡＴＣＣ１３６６５，ＡＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム・ロゼウムＡＴＣＣ１３８２５、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバクテリウム・チオゲニタリスＡＴＣＣ１９２４０、ブレビバクテリウム・アルバムＡＴＣＣ１５１１１、ブレビバクテリウム・セリヌムＡＴＣＣ１５１１２等を挙げることができる。
【００７５】
コリネバクテリウム属に属する微生物として、例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７１，ＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１４０６７、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・アセトグルタミカムＡＴＣＣ１５８０６、コリネバクテリウム・アルカノリティカムＡＴＣＣ２１５１１、コリネバクテリウム・カルナエＡＴＣＣ１５９９１、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０２０，ＡＴＣＣ１３０３２，ＡＴＣＣ１３０６０、コリネバクテリウム・リリウムＡＴＣＣ１５９９０、コリネバクテリウム・メラセコーラＡＴＣＣ１７９６５、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３４０（ＦＥＲＭＢＰ−１５３９）、コリネバクテリウム・ハーキュリスＡＴＣＣ１３８６８等を挙げることができる。
【００７６】
シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物として、例えば、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・ブラシカセラム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｒｕｍ）、シュードモナス・フルバ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｌｖａ）、及びシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）Ｄ−０１１０等を挙げることができる。
【００７７】
上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，６９，２１１０  （１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４号公報）、又はＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等を挙げることができる。
【００７８】
ブレビバチルス属に属する微生物の形質転換は、例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉらの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８３，１５６：１１３０−１１３４）や、Ｔａｋａｇｉらの方法（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，５３：３０９９−３１００）、又はＯｋａｍｏｔｏらの方法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９７，６１：２０２−２０３）により実施することができる。
【００７９】
一実施形態に係る核酸を導入するベクター（以下、単に「ベクター」という。）としては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒｓ３０〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒｓ３２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＧＨＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  Ｂ−４００）より調製、特開昭６０−２２１０９１号公報〕、ｐＧＫＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９８）より調製、特開昭６０−２２１０９１号公報〕、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等を挙げることができる。
【００８０】
宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを用いる場合は、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ等を好適なベクターとして挙げることができる。
【００８１】
ブレビバチルス属に属する微生物に好適なベクターの具体例として、枯草菌ベクターとして公知であるｐＵＢ１１０、又はｐＨＹ５００（特開平２−３１６８２号公報）、ｐＮＹ７００（特開平４−２７８０９１号公報）、ｐＨＹ４８３１（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８７，１２３９−１２４５）、ｐＮＵ２００（鵜高重三、日本農芸化学会誌１９８７，６１：６６９−６７６）、ｐＮＵ１００（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９８９，３０：７５−８０）、ｐＮＵ２１１（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９２，１１２：４８８−４９１）、ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５（特開平７−１７０９８４号公報）、ｐＮＨ３０１（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９２，５８：５２５−５３１）、ｐＮＨ３２６、ｐＮＨ４００（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９５，１７７：７４５−７４９）、ｐＨＴ２１０（特開平６−１３３７８２号公報）、ｐＨＴ１１０Ｒ２Ｌ５（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９４，４２：３５８−３６３）、又は大腸菌とブレビバチルス属に属する微生物とのシャトルベクターであるｐＮＣＯ２（特開２００２−２３８５６９号公報）等を挙げることができる。
【００８２】
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであれば制限されない。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の大腸菌又はファージ等に由来するプロモーターを挙げることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ  Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００８３】
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。発現ベクターにおいて、上記核酸の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
【００８４】
真核生物の宿主としては、例えば、酵母、糸状真菌（カビ等）及び昆虫細胞を挙げることができる。
【００８５】
酵母としては、例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、シワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ヤロウィア属及びハンゼヌラ属等に属する酵母を挙げることができる。より具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クリベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、シワニオマイセス・アルビウス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ａｌｌｕｖｉｕｓ）、シワニオマイセス・オシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・ポリモルファ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピキア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）等を挙げることができる。
【００８６】
酵母を宿主細胞として用いる場合の発現ベクターは通常、複製起点（宿主における増幅が必要である場合）及び大腸菌中でのベクターの増殖のための選抜マーカー、酵母における組換えタンパク質発現のためのプロモーター及びターミネーター、並びに酵母のための選抜マーカーを含むことが好ましい。
【００８７】
発現ベクターが非組込みベクターの場合、さらに自己複製配列（ＡＲＳ）を含むことが好ましい。これにより細胞内における発現ベクターの安定性を向上させることができる（Ｍｙｅｒｓ、Ａ．Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｇｅｎｅ  ４５：２９９−３１０）。
【００８８】
酵母を宿主として用いる場合のベクターとしては、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ＹＩｐ、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５、ｐＡ０８０４、ｐＨＩＬ３Ｏｌ、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣＺα、ｐＧＡＰＺα、ｐＰＩＣＺ  Ｂ等を挙げることができる。
【００８９】
プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであれば制限されない。例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ  １プロモーター、ｇａｌ  １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１  プロモーター、ＣＵＰ  １プロモーター、ｐＧＡＰプロモーター、ｐＧＣＷ１４プロモーター、ＡＯＸ１プロモーター、ＭＯＸプロモーター等を挙げることができる。
【００９０】
酵母への発現ベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０））、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４））、酢酸リチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３））、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法等を挙げることができる。
【００９１】
糸状真菌としては、例えば、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ウスチラーゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ）属、ボトリティス（Ｂｏｔｒｙｔｓ）属、マグナポルサ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）属、ムコア（Ｍｕｃｏｒ）属、メタリチウム（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）属、モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、及びリゾムコア属に属する菌等を挙げることができる。
【００９２】
糸状真菌の具体例として、アクレモニウム・アラバメンゼ（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ａｌａｂａｍｅｎｓｅ）、アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・アクレアツス（アキュレータス）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・サケ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅ）、アスペルギルス・ゾジエ（ソーヤ）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・テュビゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・パラシチクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・フィクム（フィキュウム）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｉｃｕｕｍ）、アスペルギルス・フェニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐｈｏｅｉｃｕｓ）、アスペルギルス・フォエチズス（フェチダス）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フラーブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ヤポニクス（ジャポニカス）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・ハージアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｓｅｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、サーモアスクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）、スポロトリクム・セルロフィルム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｐｈｉｌｕｍ）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、チラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、ノイロスポラ・クラザ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、フザリウム・オキシスポーラス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｓ）、フザリウム・グラミネルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ペニシリウム・クリゾゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・カマンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）、ペニシリウム・カネセンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）、ペニシリウム・エメルソニ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、ペニシリウム・フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウム・グリゼオロゼウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｇｒｉｓｅｏｒｏｓｅｕｍ）、ペニシリウム・パープロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌ���ｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・ロケフォルチ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、マイセリオフトラ・サーモフィルム（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔａｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、ムコア・アンビグス（Ｍｕｃｏｒ  ａｍｂｉｇｕｕｓ）、ムコア・シイルシネロイデェス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、ムコア・フラギリス（Ｍｕｃｏｒ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、ムコア・ヘマリス（Ｍｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ）、ムコア・イナエクイスポラス（Ｍｕｃｏｒ  ｉｎａｅｑｕｉｓｐｏｒｕｓ）、ムコア・オブロンジエリプティカス（Ｍｕｃｏｒ  ｏｂｌｏｎｇｉｅｌｌｉｐｔｉｃｕｓ）、ムコア・ラセモサス（Ｍｕｃｏｒ  ｒａｃｅｍｏｓｕｓ）、ムコア・レクルバス（Ｍｕｃｏｒ  ｒｅｃｕｒｖｕｓ）、ムコア・サトゥルニナス（Ｍｏｃｏｒ  ｓａｔｕｒｎｉｎｕｓ）、ムコア・サブティリススミウス（Ｍｏｃｏｒ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｍｕｓ）、オガタエア・ポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、リゾムコア・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、リゾムコア・プシルス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ）、リゾプス・アルヒザス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ）等を挙げることができる。
【００９３】
宿主が糸状真菌である場合のプロモーターとしては、解糖系に関する遺伝子、構成的発現に関する遺伝子、加水分解に関する酵素遺伝子等いずれであってもよく、具体的にはａｍｙＢ、ｇｌａＡ、ａｇｄＡ、ｇｌａＢ、ＴＥＦ１、ｘｙｎＦ１ｔａｎｎａｓｅｇｅｎｅ、Ｎｏ．８ＡＮ、ｇｐｄＡ、ｐｇｋＡ、ｅｎｏＡ、ｍｅｌＯ、ｓｏｄＭ、ｃａｔＡ、ｃａｔＢ等を挙げることができる。
【００９４】
糸状真菌への発現ベクターの導入は、従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、Ｃｏｈｅｎらの方法（塩化カルシウム法）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９：２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法［Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８：１１１（１９７９）］、コンピテント法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６：２０９（１９７１）］、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００９５】
昆虫細胞として、例えば、鱗翅類の昆虫細胞が挙げられ、より具体的には、Ｓｆ９、及びＳｆ２１等のスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来の昆虫細胞、並びに、Ｈｉｇｈ  ５等のイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）由来の昆虫細胞等が挙げられる。
【００９６】
昆虫細胞を宿主として用いる場合のベクターとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等のバキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２））を挙げることができる。
【００９７】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、ポリペプチドを発現することができる。すなわち、組換え遺伝子導入ベクター及びバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルス（発現ベクター）を得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させることができる。該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）等を挙げることができる。
【００９８】
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターとバキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５号公報）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７））等を挙げることができる。
【００９９】
一実施形態に係る組換えベクターは、形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子をさらに含有していることが好ましい。例えば、大腸菌においては、選択マーカー遺伝子としては、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の各種薬剤に対する耐性遺伝子を用いることができる。栄養要求性に関与する遺伝子変異を相補できる劣性の選択マーカーも使用できる。酵母においては、選択マーカー遺伝子として、ジェネティシンに対する耐性遺伝子を用いることができ、栄養要求性に関与する遺伝子変異を相補する遺伝子、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３等の選択マーカーも使用できる。糸状真菌においては、選択マーカー遺伝子として、ｎｉａＤ（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９，１７９５−１７９７（１９９５））、ａｒｇＢ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌ，６，３８６−３８９，（１９８４）），ｓＣ（Ｇｅｎｅ，８４，３２９−３３４，（１９８９））、ｐｔｒＡ（ＢｉｏｓｃｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，６４，１４１６−１４２１，（２０００））、ｐｙｒＧ（ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，１１２，２８４−２８９，（１９８３）），ａｍｄＳ（Ｇｅｎｅ，２６，２０５−２２１，（１９８３））、オーレオバシジン耐性遺伝子（Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ，２６１，２９０−２９６，（１９９９））、ベノミル耐性遺伝子（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８３，４８６９−４８７３，（１９８６））及びハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｇｅｎｅ，５７，２１−２６，（１９８７））からなる群より選ばれるマーカー遺伝子、ロイシン要求性相補遺伝子等が挙げられる。また、宿主が栄養要求性変異株の場合には、選択マーカー遺伝子として当該栄養要求性を相補する野生型遺伝子を用いることもできる。
【０１００】
一実施形態に係る発現ベクターで形質転換された宿主の選択は、上記核酸に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション及びコロニーハイブリダイゼーション等で行うことができる。当該プローブとしては、上記核酸の配列情報に基づき、ＰＣＲ法によって増幅した部分ＤＮＡ断片をラジオアイソトープ又はジゴキシゲニンで修飾したものを用いることができる。
【０１０１】
（改変フィブロインの製造方法）
本実施形態に係る改変フィブロインは、上記発現ベクターで形質転換された宿主により、上記核酸を発現させる工程を含む方法により、製造することができる。発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。酵母、動物細胞、昆虫細胞により発現させた場合には、糖又は糖鎖が付加されたポリペプチドとして改変フィブロインを得ることができる。
【０１０２】
本実施形態に係る改変フィブロインは、例えば、上記発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に本実施形態に係る改変フィブロインを生成蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。上記宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。
【０１０３】
上記宿主が、大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、上記宿主の培養培地として、該宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、該宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【０１０４】
炭素源としては、該宿主が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。
【０１０５】
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。
【０１０６】
無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
【０１０７】
大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５〜４０℃である。培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
【０１０８】
また、培養中必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【０１０９】
昆虫細胞の培養培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２））等を用いることができる。
【０１１０】
昆虫細胞の培養は、例えば、培養培地のｐＨ６〜７、培養温度２５〜３０℃等の条件下で、培養時間１〜５日間とすることができる。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。
【０１１１】
宿主が植物細胞の場合、形質転換された植物細胞をそのまま培養してもよく、また植物の器官に分化させて培養することができる。該植物細胞を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、又はこれらの培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
【０１１２】
動物細胞の培養は、例えば、培養培地のｐＨ５〜９、培養温度２０〜４０℃等の条件下で、培養時間３〜６０日間とすることができる。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１１３】
上記発現ベクターで形質転換された宿主を用いて改変フィブロインを生産する方法としては、該改変フィブロインを宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、及び宿主細胞外膜上に生産させる方法がある。使用する宿主細胞、及び生産させる改変フィブロインの構造を変えることにより、これらの各方法を選択することができる。
【０１１４】
例えば、改変フィブロインが宿主細胞内又は宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９））、ロウらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０））、又は特開平５−３３６９６３号公報、国際公開第９４／２３０２１号等に記載の方法を準用することにより、改変フィブロインを宿主細胞外に積極的に分泌させるように変更させることができる。すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、改変フィブロインの活性部位を含むポリペプチドにシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、改変フィブロインを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
【０１１５】
上記発現ベクターで形質転換された宿主により生産された改変フィブロインは、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法で単離及び精製することができる。例えば、改変フィブロインが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、精製標品を得ることができる。
【０１１６】
上記クロマトグラフィーとしては、フェニル−トヨパール（東ソー）、ＤＥＡＥ−トヨパール（東ソー）、セファデックスＧ−１５０（ファルマシアバイオテク）を用いたカラムクロマトグラフィーが好ましく用いられる。
【０１１７】
また、改変フィブロインが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として改変フィブロインの不溶体を回収する。回収した改変フィブロインの不溶体は蛋白質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法により改変フィブロインの精製標品を得ることができる。
【０１１８】
改変フィブロイン、又は改変フィブロインに糖鎖の付加された誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清から改変フィブロイン又はその誘導体を回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【０１１９】
（接触工程）
接触工程では、成形体前駆体と水とを接触させて、タンパク質成形体を得る。成形体前駆体は、改変フィブロイン及び溶媒を含むドープ液と、タンパク質と反応して結合を形成可能な反応性基を有する反応剤との反応混合物である。
【０１２０】
成形体前駆体は、水と接触させることにより硬化する。成形体前駆体の硬化体として、タンパク質成形体を得ることができる。
【０１２１】
成形体前駆体と接触させる水の温度は、例えば、１０℃以上であってよく、２０℃以上であってよく、９０℃以下であってよく、７０℃以下であってよい。
【０１２２】
接触工程において、成形体前駆体と、水とを接触させる方法としては、例えば、成形体前駆体に対し、常温の水を添加する方法、成形体前駆体を水中に浸漬する方法、成形体前駆体に対して、水を常温又は加温したスチーム等の状態で噴霧する方法、及び成形体前駆体を水蒸気が充満した高湿度環境下に暴露する方法等が挙げられる。これらの方法の中でも、成形体前駆体に対し、常温の水を添加する方法が好ましい。
【０１２３】
接触工程は、例えば、水と接触させた後の成形体前駆体を乾燥することを含んでいてもよい。乾燥は、例えば、自然乾燥でもよく、乾燥設備を使用して強制的に乾燥させてもよい。乾燥設備としては、接触型又は非接触型の公知の乾燥設備がいずれも使用可能である。また、乾燥温度も、例えば、成形体前駆体に含まれる改変フィブロインが分解したり、成形体前駆体が熱的損傷を受けたりする温度よりも低い温度であれが何ら限定されるものではないが、一般には、２０〜１５０℃の範囲内の温度であり、５０〜１００℃の範囲内の温度であることが好ましい。温度がこの範囲にあることにより、成形体の熱的損傷、又は成形体に含まれる改変フィブロインの分解が生ずることなく、成形体が、より迅速且つ効率的に乾燥される。乾燥時間は、乾燥温度等に応じて適宜に設定され、例えば、過乾燥による成形体の品質及び物性等への影響が可及的に排除され得る時間等が採用される。
【０１２４】
タンパク質成形体の形状は、例えば、板状、フィルム、シート、すい状、柱状、球状、塊状等の形状であってよい。
【０１２５】
本実施形態に係る製造方法は、成形体前駆体を準備する工程を備えていてよい。すなわち、本実施形態に係る製造方法は、成形体前駆体を準備する工程として、例えば、改変フィブロイン及び溶媒を含むドープ液を準備する工程と、ドープ液及び反応剤を反応させる工程とを備えていてもよい。
【０１２６】
ドープ液における溶媒としては、例えば、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、ヘキサフルオロアセトン（ＨＦＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ギ酸、並びに尿素、グアニジン、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、臭化リチウム、塩化カルシウム及びチオシアン酸リチウム等を含む水溶液等を挙げることができる。これらの溶媒は、１種単独で使用してもよく、２種以上を混合して使用してもよい。
【０１２７】
ドープ液における改変フィブロインの含有量は、ドープ液の全質量を基準として、１５質量％以上、３０質量％以上、４０質量％以上又は５０質量％以上であってよい。改変フィブロインの含有量は、ドープ液の製造効率の観点から、ドープ液の全質量を基準として、７０質量％以下、６５質量％以下、又は６０質量％以下であってよい。
【０１２８】
溶解促進剤としては、例えば、以下に示すルイス酸とルイス塩基とからなる無機塩が挙げられる。ルイス塩基としては、例えば、オキソ酸イオン（硝酸イオン、過塩素酸イオン等）、金属オキソ酸イオン（過マンガン酸イオン等）、ハロゲン化物イオン、チオシアン酸イオン、シアン酸イオン等が挙げられる。ルイス酸としては、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン等の金属イオン、アンモニウムイオン等の多原子イオン、錯イオン等が挙げられる。ルイス酸とルイス塩基とからなる無機塩の具体例としては、塩化リチウム、臭化リチウム、ヨウ化リチウム、硝酸リチウム、過塩素酸リチウム、及びチオシアン酸リチウム等のリチウム塩、塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、硝酸カルシウム、過塩素酸カルシウム、及びチオシアン酸カルシウム等のカルシウム塩、塩化鉄、臭化鉄、ヨウ化鉄、硝酸鉄、過塩素酸鉄、及びチオシアン酸鉄等の鉄塩、塩化アルミニウム、臭化アルミニウム、ヨウ化アルミニウム、硝酸アルミニウム、過塩素酸アルミニウム、及びチオシアン酸アルミニウム等のアルミニウム塩、塩化カリウム、臭化カリウム、ヨウ化カリウム、硝酸カリウム、過塩素酸カリウム、及びチオシアン酸カリウム等のカリウム塩、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、硝酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、及びチオシアン酸ナトリウム等のナトリウム塩、塩化亜鉛、臭化亜鉛、ヨウ化亜鉛、硝酸亜鉛、過塩素酸亜鉛、及びチオシアン酸亜鉛等の亜鉛塩、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、硝酸マグネシウム、過塩素酸マグネシウム、及びチオシアン酸マグネシウム等のマグネシウム塩、塩化バリウム、臭化バリウム、ヨウ化バリウム、硝酸バリウム、過塩素酸バリウム、及びチオシアン酸バリウム等のバリウム塩、並びに塩化ストロンチウム、臭化ストロンチウム、ヨウ化ストロンチウム、硝酸ストロンチウム、過塩素酸ストロンチウム、及びチオシアン酸ストロンチウム等のストロンチウム塩が挙げられる。
【０１２９】
溶解促進剤の含有量は、改変フィブロインの全量１００質量部に対して、１．０質量部以上、５．０質量部以上、９．０質量部以上、１５質量部以上又は２０．０質量部以上であってよい。溶解促進剤の含有量は、改変フィブロインの全量１００質量部に対して、４０質量部以下、３５質量部以下又は３０質量部以下であってよい。
【０１３０】
本実施形態に係るドープ液の製造時に、３０〜９０℃に加温してもよい。使用する溶媒、改変フィブロインの種類等に応じて溶解可能な温度を適時設定すればよい。溶解を促進するために振盪、撹拌してもよい。
【０１３１】
ドープ液の粘度は、例えば、２５℃又は３５℃において１００〜１５，０００ｃＰ（センチポイズ）、４０℃において１００〜３０，０００ｃＰ（センチポイズ）等に設定すればよい。紡糸原液の粘度は、例えば京都電子工業社製の商品名“ＥＭＳ粘度計”を使用して測定することができる。
【０１３２】
成形体前駆体は、ドープ液と、反応剤とを反応させることにより得られる反応混合物である。成形体前駆体は、少なくとも一部が反応剤で架橋された改変フィブロインと、溶媒とを含むものであってよい。
【０１３３】
改変フィブロインは、反応性官能基を有している。反応性官能基としては、例えば、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基等が挙げられる。反応剤が有する反応性基は、改変フィブロインが有する上記反応性官能基と反応して結合を形成可能な基であってよい。
【０１３４】
反応性基としては、下記式（Ａ−１）、（Ａ−２）、（Ａ−３）、（Ａ−４）、（Ａ−５）、（Ａ−６）、（Ａ−７）、（Ａ−８）、（Ａ−９）又は（Ａ−１０）で表される基であってよい。各式中の波線は、各基の結合手を示す。
【０１３５】
【化１】
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【０１３６】
式（Ａ−２）中、Ｘ１は酸素原子（Ｏ）又は硫黄原子（Ｓ）を示す。式（Ａ−４）中、Ｘ２は、ハロゲン原子を示し、例えば、塩素原子であってよい。Ｘ３は、脱離基を示す。Ｘ３は、例えば、−Ｎ３、−ＯＲ１、又は−ＯＡｒ１で示される基であってよい。Ｘ３におけるＲ１は、例えば、スクシンイミド基であってよい。Ｘ３におけるＡｒ１は、置換又は無置換のアリール基を示す。置換又は無置換のアリール基は、ハロゲン化アリール基であることが好ましい。ハロゲン化アリール基は、例えば、ペンタフルオロフェニル基であることが好ましい。Ｘ４は、アルキル基を示す。Ｘ４におけるアルキル基の炭素数は、例えば、１〜６であってよく、１〜３であってよい。Ｘ４は、例えば、メチル基であってよい。
【０１３７】
反応剤が有する反応性基の数は、例えば、１〜１０であってよく、２〜５であってよく、２であってよい。反応剤は、１種の反応性基を含むものであってもよく、２種以上の反応性基を含むものであってもよい。
【０１３８】
反応剤は、改変フィブロインと反応して結合を形成可能な第１の反応性基、改変フィブロインと反応して結合を形成可能な第２の反応性基、及び、第１の反応性基と第２の反応性基とを連結する基（連結基）とを有する化合物であってよい。第１の反応性基及び第２の反応性基は、異種の反応性基であってもよく、同種の反応性基であってもよい。
【０１３９】
すなわち、反応剤は、式（Ｂ）：Ａ１−Ｚ−Ａ２で表される化合物であってよい。式（Ｂ）中、Ａ１は、第１の反応性基を示し、Ａ２は、第２の反応性基を示し、Ｚは、連結基を示す。Ａ１及びＡ２は、同種の反応性基であってもよく、異種の反応性基であってもよい。Ａ１及びＡ２は、同種の反応性基であることが好ましい。Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、（Ａ−１）、（Ａ−２）、（Ａ−４）、（Ａ−５）、（Ａ−６）、（Ａ−７）、（Ａ−８）、（Ａ−９）又は（Ａ−１０）で表される基であってよく、アルデヒド基（式（Ａ−１）で表される基）であることが好ましい。Ｚは、２価の炭化水素基であってよい。Ｚとしては、例えば、アルキレン基、シクロアルキレン基、アリーレン基が挙げられる。Ｚの炭素数は、例えば、１〜２０であってよく、１〜１０であってよく、２〜６であってよい。
【０１４０】
反応剤としては、例えば、イソシアネート、スルホニルクロリド、アルデヒド、カルボジイミド、アシルアジド、酸無水物、フルオロベンゼン、カーボネート、Ｎ-ヒドロキシエステル、イミドエステル、エポキシド、フルオロフェニルエステル等のアミン反応性化学基及び／又はアルコール反応性化学基のうちの少なくとも１つを有する化合物が挙げられる。つまり、反応剤は、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基等の反応性基と反応して結合を形成可能な反応性基を有するものである。反応剤は、アルデヒド化合物であることが好ましく、グルタルアルデヒドであることがより好ましい。
【０１４１】
反応温度は、例えば、２０〜８０℃、又は２５〜６０℃であってよい。反応温度は、一定であってもよく、又は段階的に昇温するように調整されてもよい。反応時間（上記反応温度に保持する時間）は、例えば、１〜１０時間、２〜８時間、又は３〜６時間であってよい。
【０１４２】
成形体前駆体は、例えば、ドープ液、及び反応剤をキャビティ内に導入し、キャビティ内でドープ液と、反応剤とを反応させて得ることができる。ドープ液及び反応剤は、別々に導入してもよく、略同時に導入してもよい。例えば、ドープ液を予め導入し、その後、反応剤を導入してもよく、反応剤を予め導入し、その後、反応剤を導入してもよい。反応剤の導入は、反応剤を含む水溶液を導入することにより実施してもよい。反応剤を含む水溶液は、例えば、濃度３０〜７０質量％又は４０〜６０質量％の反応剤を含む水溶液であってよい。
【０１４３】
キャビティの形状は、タンパク質成形体の目的とする形状に応じて、適宜設定することができる。キャビティは、閉鎖空間であってもよく、開放空間であってもよい。開放空間は、例えば、容器の内側の空間であってもよい。例えば、ドープ液及び反応剤は、収容容器（例えば、丸底試験管）内で反応させることができる。
【実施例】
【０１４４】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１４５】
〔改変フィブロインの製造〕
（１）発現ベクターの作製
配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（ＰＲＴ１３）と配列番号２０で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（ＰＲＴ２０）とを設計した。
【０１４６】
配列番号１３で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１３）は、配列番号２２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２２）に対し、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側それぞれから１番目〜８番目に位置するＲＥＰ中に、１カ所ずつリシン残基が挿入されたものである。
【０１４７】
配列番号２０で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２０）は、配列番号２３で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２３）に対し、Ｎ末端側及びＣ末端側それぞれに３カ所リシン残基が挿入されたものである。
【０１４８】
設計したアミノ酸配列を有する改変フィブロインをコードする核酸を合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト、終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。この核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。
【０１４９】
（２）タンパク質の製造
得られた発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表１）にＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまでフラスコ培養を行い（約１５時間）、シード培養液を得た。
【表１】
2020121958.tif 000003
【０１５０】
当該シード培養液を５００ｍＬの生産培地（表２）を添加したジャーファーメンターにＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにした。
【０１５１】
【表２】
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【０１５２】
生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  １２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにし、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、改変フィブロインを発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とする改変フィブロインサイズのバンドの出現により、目的とする改変フィブロインの発現を確認した。
【０１５３】
（３）タンパク質の精製
ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ  Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ社製）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ  グアニジン緩衝液（８Ｍ  グアニジン塩酸塩、１０ｍＭ  リン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収することにより、粉末状の2種類の改変フィブロイン（ＰＲＴ１３及びＰＲＴ２０）を得た。
【０１５４】
＜実施例１＞
（ドープ液の調製）
ＰＲＴ１３をギ酸に溶解して、ＰＲＴ１３を含むドープ液を得た。これをドープ液１とした。ドープ液１では、改変フィブロインの添加量（含有量）をドープ液全量に対して２４質量％とした。
【０１５５】
（成形体前駆体の製造）
所定量のドープ液１を、丸底試験管内に入れた。次いで、丸底試験管内に、５０質量％の濃度でグルタルアルデヒド（ＧＡ）を含む水溶液（ＧＡ水溶液）を添加し、ドープ液と、ＧＡ水溶液とを反応させた。ＧＡ水溶液は、ドープ液の温度が２５℃の条件で、添加した。ＧＡ水溶液を添加してから、反応温度を２５℃に保持し、その後、４０℃に昇温させ、４０℃で７５００秒保持した。その後、反応温度を２５℃まで降温させた後、６０℃まで昇温させた。図２は、反応時間と、粘度及び反応温度との関係を示すグラフである。図２における横軸は、反応時間を示し、縦軸は、粘度又は反応温度を示す。反応後に、弾性ゲルとして、成形体前駆体が得られた。図３に示すように、成形体前駆体は、可逆的な変形が可能であった（図３（ａ）、（ｂ）及び（ｃ））。
【０１５６】
（成形体の製造）
室温（２０〜３０℃）で、成形体前駆体が入った丸底試験管内に、水１０ｍＬを添加することにより、成形体前駆体と、常温の水とを接触させた。成形体前駆体は、水と接触させて、硬化させることにより、タンパク質成形体を得た。図３（ｄ）は、得られたタンパク質成形体を示す写真である。
【０１５７】
＜実施例２＞
（ドープ液の調製）
ＰＲＴ２０を１ｇギ酸２．５７ｇに添加して、室温で１時間以上撹拌して、溶解させた。これにより、ＰＲＴ２０を含むドープ液２を得た。ドープ液２では、改変フィブロインの添加量（含有量）をドープ液全量に対して２８質量％とした。
【０１５８】
（成形体前駆体の製造）
ドープ液２を試験管に入れ、粘度測定を実施した。ドープ液２に、改変フィブロインに対して、１０モル当量のグルタルアルデヒド（ＧＡ）を添加した。ドープ液に、ＧＡを添加した反応混合物の粘度を測定した（１分間測定）。粘度測定は、４．７ｍｍプローブボールを使用した。粘度測定は、２５℃において、５回実施した。温度を６０℃に昇温させ、５分間保持した。６０℃において、粘度測定を５回実施した（１分間測定）。この操作を４回実施した。ドープ液及びＧＡの反応混合物のゲル化は、プローブを用いて確認した。ドープ液２（ＧＡ非添加）の粘度は、２５℃において、３５００ｃＰであり、６０℃において、１０００ｃＰであった。反応混合物の粘度の測定結果を図４に示す。図４の矢印に示す時点でゲル化が起こった。
【０１５９】
（成形体の製造）
ゲル化させた反応混合物に、水を添加して、２４時間保持し、水を除去した後、再度水を添加した。１週間後に水を除去し、得られた反応混合物を乾燥させ、実施例２の成形体を得た。実施例２の成形体の写真を図５に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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