(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞または対象のゲノム内の、例えばヒトゲノム内の単一部位の編集等の標的を定めた核酸編集に有用である戦略、システム、試薬、方法およびキットを提供する。【解決手段】いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９と、核酸編集酵素または核酸編集酵素ドメイン、例えばデアミナーゼドメインとの融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、標的を定めた核酸編集の方法が提供される。いくつかの実施形態では、標的を定めた核酸編集タンパク質、例えばＣａｓ９と核酸編集酵素または核酸編集ドメインとの融合タンパク質を生成するための試薬およびキットが提供される。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインと、
（ｉｉ）核酸編集ドメインと
を含む融合タンパク質。
【請求項２】
前記核酸編集ドメインがＤＮＡ編集ドメインである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記核酸編集ドメインがデアミナーゼドメインである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
デアミナーゼがシチジンデアミナーゼである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
デアミナーゼがアポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリのデアミナーゼである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
デアミナーゼがＡＰＯＢＥＣ１ファミリのデアミナーゼである、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
デアミナーゼが活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）である、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
デアミナーゼがＡＣＦ１／ＡＳＥデアミナーゼである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
デアミナーゼがアデノシンデアミナーゼである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
デアミナーゼがＡＤＡＴファミリのデアミナーゼである、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記核酸編集ドメインが前記Ｃａｓ９ドメインのＮ末端に融合している、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記核酸編集ドメインが前記Ｃａｓ９ドメインのＣ末端に融合している、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記Ｃａｓ９ドメインおよび前記核酸編集ドメインがリンカーを介して融合している、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
リンカーが、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号９１）、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号５）、（ＧＧＳ）ｎ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号９３）もしくは（ＸＰ）ｎモチーフまたはこれらのうちのいずれかの組み合わせを含み、ｎが独立して１〜３０の整数である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
ＤＮＡ編集の方法であって、ＤＮＡ分子と、
（ａ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインおよび核酸編集ドメインを含む融合タンパク質、および
（ｂ）前記（ａ）の融合タンパク質の標的を前記ＤＮＡ分子の標的ＤＮＡ配列に定めるｓｇＲＮＡ
とを接触させることを含み、
前記ＤＮＡ分子が、前記ＤＮＡ分子のヌクレオチド塩基の脱アミノ化に有効な量で、および前記脱アミノ化に適した条件下で前記融合タンパク質および前記ｓｇＲＮＡと接触させられる、方法。
【請求項１６】
前記核酸編集ドメインがデアミナーゼドメインである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
デアミナーゼがシチジンデアミナーゼである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記デアミナーゼがアポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリのデアミナーゼである、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
デアミナーゼがＡＰＯＢＥＣ１ファミリのデアミナーゼである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
デアミナーゼが活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
デアミナーゼがＡＣＦ１／ＡＳＥデアミナーゼである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
デアミナーゼがアデノシンデアミナーゼである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
デアミナーゼがＡＤＡＴファミリのデアミナーゼである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸編集ドメインが前記Ｃａｓ９ドメインのＮ末端に融合している、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記核酸編集ドメインが前記Ｃａｓ９ドメインのＣ末端に融合している、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｃａｓ９ドメインおよび前記核酸編集ドメインがリンカーを介して融合している、請求項１５〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記リンカーが、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号９１）、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号５）、（ＧＧＳ）ｎ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号９３）もしくは（ＸＰ）ｎモチーフまたはこれらのうちのいずれかの組み合わせを含み、ｎが独立して１〜３０の整数である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的ＤＮＡ配列が疾患または障害に関連する配列を含み、前記ヌクレオチド塩基の前記脱アミノ化により、疾患または障害に関連しない配列が生じる、請求項１５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記標的ＤＮＡ配列が疾患または障害に関連する点変異を含み、前記脱アミノ化により前記点変異が修正される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記標的ＤＮＡ配列が、疾患または障害に関連するＴ→ＣまたはＡ→Ｇ点変異を含み、変異ＣまたはＧ塩基の脱アミノ化により、疾患または障害に関連しない配列が生じる、請求項１５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記疾患または障害に関連する前記配列がタンパク質をコードし、前記脱アミノ化により、前記疾患または障害に関連する前記配列に終止コドンが導入され、その結果、前記コードされたタンパク質が短縮される、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記接触させることが、疾患もしくは障害を有するか、または疾患もしくは障害と診断されている対象中におけるインビボである、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記疾患または障害が、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、表皮剥離性角化症（ＥＨＫ）、シャルコー・マリー・トゥース病４Ｊ型、神経芽細胞腫（ＮＢ）、フォン・ウィルブランド病（ｖＷＤ）、先天性筋強直症、遺伝性腎アミロイドーシス、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、遺伝性リンパ水腫、家族性アルツハイマー病、プリオン病、慢性乳児神経皮膚関節症候群（ＣＩＮＣＡ）、デスミン関連心筋症（ＤＲＭ）または変異ＰＩ３ＫＣＡタンパク質に関連する腫瘍性疾患である、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記標的ＤＮＡ配列が、野生型ＰＩ３Ｋタンパク質と比較してＰＩ３ＫＣＡタンパク質においてアミノ酸配列変異が生じるＴ→Ｃおよび／またはＡ→Ｇ点変異を含み、前記方法により変異ＣまたはＧ塩基が脱アミノ化される、請求項１５〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記点変異が、Ｈ１０４７Ｒ置換が生じるＡ３１４０Ｇ変異である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記標的ＤＮＡ配列が、野生型ＰＳＥＮ１タンパク質と比較してＰＳＥＮ１タンパク質においてアミノ酸配列変異が生じるＴ→Ｃおよび／またはＡ→Ｇ点変異を含み、前記方法により変異ＣまたはＧ塩基が脱アミノ化される、請求項１５〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＰＳＥＮ１タンパク質がＰＳＥＮ１遺伝子のコドン１４３におけるＡ→Ｇ点変異に起因するＩ１４３Ｖ置換を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＰＳＥＮ１点変異がアルツハイマー病に関連している、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記接触させることにより、前記ＰＳＥＮ１遺伝子のコドン１４３における変異シチジン残基が脱アミノ化され、そのため前記Ａ→Ｇ点変異が修正される、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記標的ＤＮＡ配列が、野生型α−抗トリプシンタンパク質と比較してα−抗トリプシンタンパク質においてアミノ酸配列変異が生じるＴ→Ｃおよび／またはＡ→Ｇ点変異を含み、前記方法により変異ＣまたはＧ塩基が脱アミノ化される、請求項１５〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記α−抗トリプシンタンパク質がα−抗トリプシン遺伝子のコドン５５におけるＴ→Ｃ点変異に起因するＬ５５Ｐ置換を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記α−抗トリプシン点変異が慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に関連する、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記接触させることにより、前記α−抗トリプシン遺伝子のコドン５５における変異シチジン残基が脱アミノ化され、そのため前記Ｔ→Ｃ点変異が修正される、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記標的ＤＮＡ配列が、野生型ｖＷＦタンパク質と比較してｖＷＦタンパク質においてアミノ酸配列変異が生じるＴ→Ｃおよび／またはＡ→Ｇ点変異を含み、前記方法により変異ＣまたはＧ塩基が脱アミノ化される、請求項１５〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記ｖＷＦタンパク質がｖＷＦ遺伝子のコドン５０９におけるＴ→Ｃ点変異に起因するＣ５０９Ａ置換を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ｖＷＦ点変異がフォン・ウィルブランド病に関連する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記接触させることにより、前記ｖＷＦ遺伝子のコドン５０９における変異シチジン残基が脱アミノ化され、そのため前記Ｔ→Ｃ点変異が補正される、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記標的ＤＮＡ配列が、野生型カスパーゼ−９タンパク質と比較してカスパーゼ−９タンパク質においてアミノ酸配列変異が生じるＴ→Ｃおよび／またはＡ→Ｇ点変異を含み、前記方法により変異ＣまたはＧ塩基が脱アミノ化される、請求項１５〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記カスパーゼ−９タンパク質がカスパーゼ−９遺伝子のコドン１９７におけるＴ→Ｃ点変異に起因するＬ１９７Ｐ置換を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記カスパーゼ−９点変異が神経芽細胞腫に関連する、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記接触させることにより、前記カスパーゼ−９遺伝子のコドン１９７における変異シチジン残基が脱アミノ化され、そのため前記Ｔ→Ｃ点変異が修正される、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記ヌクレオチド塩基の前記脱アミノ化を検出することを更に含む、請求項１５〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記検出することがＰＣＲによる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記融合タンパク質が請求項１〜１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質である、請求項１５〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
Ｃａｓ９  ＤＮＡ編集タンパク質のＤＮＡ編集活性を検出するためのレポーター構築物であって、
（ａ）Ｃａｓ９  ＤＮＡ編集タンパク質用の標的部位を含むレポーター遺伝子であって、標的を定めたＤＮＡ編集により前記レポーター遺伝子の発現が増加する、レポーター遺伝子と、
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現を制御するプロモーター配列と
を含むレポーター構築物。
【請求項５６】
前記構築物が、
（ｃ）前記Ｃａｓ９  ＤＮＡ編集タンパク質の標的を前記レポーター遺伝子の標的部位に定めるｓｇＲＮＡをコードする配列であって、前記ｓｇＲＮＡの発現が前記レポーター遺伝子の前記発現から独立している、配列
を更に含む、請求項５５に記載のレポーター構築物。
【請求項５７】
前記レポーター遺伝子の前記標的部位が未成熟終止コドンを含み、前記Ｃａｓ９  ＤＮＡ編集タンパク質による鋳型鎖の標的を定めたＤＮＡ編集により、前記未成熟終止コドンがアミノ酸残基をコードするコドンに変換される、請求項５５または５６に記載のレポーター構築物。
【請求項５８】
前記レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質または抗生物質耐性マーカーをコードする、請求項５５〜５７のいずれか一項に記載のレポーター構築物。
【請求項５９】
核酸構築物であって、
ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９配列をコードする配列、
前記Ｃａｓ９をコードする配列と核酸編集酵素または核酸編集酵素ドメインをコードする配列とのインフレームでのクローニングを可能にするように位置するクローニング部位を含む配列、
任意選択的に、前記Ｃａｓ９をコードする配列と前記クローニング部位との間に位置するリンカーをコードする配列
を含む核酸と、
Ｃａｓ９核酸編集融合タンパク質を生成するための、核酸編集酵素または核酸編集酵素ドメインをコードする配列の前記核酸構築物中へのインフレームでのクローニングに好適な試薬、緩衝液および／または使用説明書と
を含むキット。
【請求項６０】
前記クローニング部位を含む前記配列が前記Ｃａｓ９配列のＮ末端である、請求項５９に記載のキット。
【請求項６１】
前記クローニング部位を含む前記配列が前記Ｃａｓ９配列のＣ末端である、請求項５９に記載のキット。
【請求項６２】
前記コードされたリンカーが、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号９１）、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号５）、（ＧＧＳ）ｎ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号９３）もしくは（ＸＰ）ｎモチーフまたはこれらのうちのいずれかの組み合わせを含み、ｎが独立して１〜３０の整数である、請求項５９〜６２のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で、２０１３年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／９１５，３８６号明細書および２０１４年４月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／９８０，３３３号明細書に対する優先権を主張し、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２０の下で、米国特許出願第１４／３２５，８１５号明細書、米国特許出願第１４／３２６，１０９号明細書、米国特許出願第１４／３２６，１４０号明細書、米国特許出願第１４／３２６，２６９号明細書、米国特許出願第１４／３２６，２９０号明細書、米国特許出願第１４／３２６，３１８号明細書および米国特許出願第１４／３２６，３０３号明細書（全て２０１４年７月８日に出願されている）に対する優先権も主張し、これらはそれぞれ参照により本明細書に援用される。
【０００２】
政府支援
本発明は、国防高等研究計画局（ＤＡＲＰＡ）により付与された助成金ＨＲ００１１−１１−２−０００３、国立衛生研究所（ＮＩＨ）により付与された助成金ＧＭ０９５５０１、ならびに宇宙および海軍戦闘システムセンター（Ｓｐａｃｅ  ａｎｄ  Ｎａｖａｌ  Ｗａｒｆａｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｅｎｔｅｒ）（ＳＰＡＷＡＲ）により付与された助成金Ｎ６６００１−１２−Ｃ−４２０７の下で米国政府の支援によってなされた。米国政府は本発明においてある程度の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
核酸配列の標的を定めた編集、例えば特定の修飾のゲノムＤＮＡへの導入は、遺伝子機能の研究にとって非常に有望なアプローチであり、ヒト遺伝性疾患の新たな治療法を提供する可能性も有する１。理想的な核酸編集技法は下記の３つの特徴を有する：（１）所望の修飾の高効率の導入、（２）最小限のオフターゲット活性、および（３）所与の核酸における任意の部位、例えばヒトゲノム内の任意の部位を正確に編集するようにプログラムされる能力２。現在のゲノム操作ツールにより、例えば操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）３、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）４およびごく最近ではＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼＣａｓ９５により、ゲノム中で配列特異的なＤＮＡ切断がもたらされる。このプログラム可能な切断によって、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により切断部位でＤＮＡの変異が生じ得るか、または相同組み換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ）（ＨＤＲ）により切断部位の周囲のＤＮＡの置換が生じ得る６、７。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在の技法の１つの欠点は、ＮＨＥＪおよびＨＤＲの両方が、中程度の遺伝子編集効率と、所望の改変と競合する可能性がある望ましくない遺伝子改変とが概してもたらされる確率的プロセスであるということである８。原理上、ゲノム中の特定の位置で特定のヌクレオチド変化（例えば、疾患関連遺伝子の特定のコドンにおけるＣからＴへの変化）を生じさせることにより、多くの遺伝性疾患を処置し得ることから９、そのような正確な遺伝子編集を達成するようにプログラム可能な方法の開発により、遺伝子編集をベースとするヒト治療法に対する強力な新規の調査ツールおよび潜在的な新規のアプローチの両方が示されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
クラスター化され、規則的に間隔が開いた短パリンドローム反復（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）システムは、様々な生物および細胞株において頑強で一般的なゲノム操作を可能にするように修飾されている１１最近発見された原核生物の適応免疫システムである１０。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）システムはタンパク質−ＲＮＡ複合体であり、この複合体は、この複合体を塩基対合により標的ＤＮＡ配列に局在化させるためのガイドとしてＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）を使用する１２。天然のシステムでは、Ｃａｓタンパク質は次いで、標的としたＤＮＡ配列を切断すべくエンドヌクレアーゼとして作用する１３。標的ＤＮＡ配列はｓｇＲＮＡに対して相補的でなければならず、また、このシステムを機能させるために相補領域の３’末端で「プロトスペーサー隣接モチーフ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ−ａｄｊａｃｅｎｔ  ｍｏｔｉｆ）」（ＰＡＭ）ジヌクレオチドを含まなければならない（図１）１４。既知のＣａｓタンパク質の中でも、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９がゲノム操作用のツールとしてほぼ広範に使用されている１５。このＣａｓ９タンパク質は、２種の異なるヌクレアーゼドメインを含む大きくてマルチドメインのタンパク質である。点変異をＣａｓ９に導入してヌクレアーゼ活性を失活させることができ、その結果、ｓｇＲＮＡプログラム方式でＤＮＡに結合する能力を依然として保持する失活型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）が生じる１６。原理上、別のタンパク質またはドメインに融合した場合、ｄＣａｓ９は、このタンパク質の標的を、適切なｓｇＲＮＡとの同時発現によってのみ、実質的にはあらゆるＤＮＡ配列に定めることができる。
【０００６】
ゲノム操作目的でのｄＣａｓ９複合体の潜在力は非常に大きい。理論上、ｓｇＲＮＡによりプログラムされるゲノム中の特定の部位にタンパク質を導く独特の能力を、ヌクレアーゼを超えた様々な部位特異的ゲノム編集ツール、例えば転写活性化因子、転写抑制因子、ヒストン修飾タンパク質、インテグラーゼおよびリコンビナーゼへと発展させることができる１１。これらの潜在的用途のうちのいくつかは、ＲＮＡ誘導性の転写活性化因子１７、１８、転写抑制因子１６、１９、２０およびクロマチン修飾酵素２１を供給するために、転写活性化因子を有するｄＣａｓ９融合体により最近実施されている。この融合体と様々なｓｇＲＮＡとの単純な同時発現により、標的遺伝子の特定の発現が生じる。この将来性のある研究は、ゲノムの正確な操作のための容易にプログラム可能な配列特異的エフェクタの設計および構築のために道を開いている。
【０００７】
重要なことに、ヒト疾患の原因となるタンパク質変異の８０〜９０％が、１個のみのヌクレオチドの置換、欠失または挿入により起こる６。しかしながら、一般的で直接的な方法で１個のヌクレオチドの操作を可能にするゲノム操作ツールは依然として開発されていない。一塩基遺伝子修正のための最近の戦略として、操作されたヌクレアーゼ（二本鎖切断（ＤＳＢ）の構築、続いて確率的で非効率的な相同組み換え修復（ＨＤＲ）に依存する）およびＤＮＡ−ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドが挙げられる２２。後者の戦略は、編集するヌクレオチドを除くゲノムＤＮＡ中の特定の配列と塩基対を作るＲＮＡ／ＤＮＡ配列の設計を含む。結果として生じるミスマッチは、細胞の内因性修復システムにより認識されて修復され、キメラまたはゲノムのいずれかの配列中に変化を引き起こす。これらの戦略は両方とも、低い遺伝子編集効率および望ましくない遺伝子改変に悩まされる。なぜならば、これらの戦略は、ＨＤＲの偶然性およびＨＤＲと非相同末端結合（ＮＨＥＪ）との間の競合の両方を受けることになるからである２３〜２５。ＨＤＲ効率は、ゲノム内の標的遺伝子の位置２６、細胞周期の状態２７および細胞／組織の種類２８に従って変化する。従って、酵素のような効率でおよび偶然性ではないゲノムＤＮＡ中の正確な位置での特定のタイプの塩基修飾の導入のための直接的でプログラム可能な方法の開発により、遺伝子編集をベースとする調査ツールおよびヒト治療法に対する強力な新規のアプローチが示されるであろう。
【０００８】
本開示のいくつかの態様は、対象のゲノム内の、例えばヒトゲノム内の単一部位の編集等の標的を定めた核酸編集に有用である戦略、システム、試薬、方法およびキットを提供する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９と、核酸編集酵素または核酸編集酵素ドメイン、例えばデアミナーゼドメインとの融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、標的を定めた核酸編集の方法が提供される。いくつかの実施形態では、標的を定めた核酸編集タンパク質、例えばＣａｓ９と核酸編集酵素または核酸編集ドメインとの融合タンパク質を生成するための試薬およびキットが提供される。
【０００９】
本開示のいくつかの態様は、（ｉ）ヌクレアーゼ不活性型ＣＡＳ９ドメインと、（ｉｉ）核酸編集ドメインとを含む融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、この核酸編集ドメインはＤＮＡ編集ドメインである。いくつかの実施形態では、この核酸編集ドメインはデアミナーゼドメインである。いくつかの実施形態では、このデアミナーゼはシチジンデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、このデアミナーゼはアポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリのデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、このデアミナーゼはＡＰＯＢＥＣ１ファミリのデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、このデアミナーゼは活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）である。いくつかの実施形態では、このデアミナーゼはＡＣＦ１／ＡＳＥデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、このデアミナーゼはアデノシンデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、このデアミナーゼはＡＤＡＴファミリのデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、この核酸編集ドメインはＣＡＳ９ドメインのＮ末端に融合している。いくつかの実施形態では、この核酸編集ドメインはＣＡＳ９ドメインのＣ末端に融合している。いくつかの実施形態では、このＣＡＳ９ドメインおよびこの核酸編集ドメインはリンカーを介して融合している。いくつかの実施形態では、このリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号９１）、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号５）、（ＧＧＳ）ｎ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号９３）（例えばＧｕｉｌｉｎｇｅｒ  ＪＰ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＤＢ，Ｌｉｕ  ＤＲ．Ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ  ｉｎａｃｔｉｖｅ  Ｃａｓ９  ｔｏ  ＦｏｋＩ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４；３２（６）：５７７−８２を参照されたい。内容全体が参照により本明細書に援用される）もしくは（ＸＰ）ｎモチーフまたはこれらのうちのいずれかの組み合わせを含み、ｎは独立して１〜３０の整数である。
【００１０】
本開示のいくつかの態様は、ＤＮＡ編集の方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、ＤＮＡ分子と、（ａ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインおよびデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質、および（ｂ）（ａ）の融合タンパク質の標的をＤＮＡ鎖の標的ヌクレオチド配列に定めるｓｇＲＮＡとを接触させることを含み、ＤＮＡ分子が、ヌクレオチド塩基の脱アミノ化に有効な量で、およびこの脱アミノ化に適した条件下で融合タンパク質およびｓｇＲＮＡと接触させられる。いくつかの実施形態では、この標的ＤＮＡ配列は疾患または障害に関連する配列を含み、ヌクレオチド塩基の脱アミノ化により、疾患または障害に関連しない配列が生じる。いくつかの実施形態では、このＤＮＡ配列は、疾患または障害に関連するＴ＞ＣまたはＡ＞Ｇ点変異を含み、変異ＣまたはＧ塩基の脱アミノ化により、疾患または障害に関連しない配列が生じる。いくつかの実施形態では、この脱アミノ化により、疾患または障害に関連する配列における点変異が修正される。いくつかの実施形態では、疾患または障害に関連する配列はタンパク質をコードし、脱アミノ化により、疾患または障害に関連する配列に終止コドンが導入され、その結果、コードされたタンパク質が短縮される。いくつかの実施形態では、脱アミノ化によりＰＩ３ＫＣＡ遺伝子における点変異が修正され、そのためＨ１０４７Ｒ変異および／またはＡ３１４０Ｇ変異が修正される。いくつかの実施形態では、接触させることが、疾患もしくは障害を有しやすいか、疾患もしくは障害を有するか、または疾患もしくは障害と診断されている対象においてインビボで実施される。いくつかの実施形態では、この疾患または障害は、ゲノム中における点変異または単一塩基変異に関連する疾患である。いくつかの実施形態では、この疾患は、遺伝性疾患、がん、代謝性疾患またはリソソーム蓄積症である。
【００１１】
本開示のいくつかの態様は、Ｃａｓ９：ＤＮＡ編集ドメイン融合タンパク質の核酸編集活性を検出するためのレポーター構築物を提供する。いくつかの実施形態では、この構築物は、（ａ）Ｃａｓ９  ＤＮＡ編集タンパク質用の標的部位を含むレポーター遺伝子であって、標的を定めたＤＮＡ編集によりレポーター遺伝子の発現が増加する、レポーター遺伝子と、（ｂ）レポーター遺伝子の発現を制御するプロモーター配列とを含む。いくつかの実施形態では、この構築物は、（ｃ）Ｃａｓ９  ＤＮＡ編集タンパク質の標的をレポーター遺伝子の標的部位に定めるｓｇＲＮＡをコードする配列であって、ｓｇＲＮＡの発現がレポーター遺伝子の発現から独立している、配列を更に含む。いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子の標的部位は未成熟終止コドンを含み、Ｃａｓ９  ＤＮＡ編集タンパク質による鋳型鎖の標的を定めたＤＮＡ編集により、未成熟終止コドンがアミノ酸残基をコードするコドンに変換される。いくつかの実施形態では、このレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質または抗生物質耐性マーカーをコードする。
【００１２】
本開示のいくつかの態様は、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９配列をコードする配列、このＣａｓ９をコードする配列と核酸編集酵素または核酸編集酵素ドメインをコードする配列とのインフレームでのクローニングを可能にするように位置するクローニング部位を含む配列、および任意選択的に、Ｃａｓ９をコードする配列とクローニング部位との間に位置するリンカーをコードする配列を含む核酸構築物を含む、キットを提供する。加えて、いくつかの実施形態では、このキットは、Ｃａｓ９核酸編集融合タンパク質を生成するための、核酸編集酵素または核酸編集酵素ドメインをコードする配列の核酸構築物中へのインフレームでのクローニングに好適な試薬、緩衝液および／または使用説明書を含む。いくつかの実施形態では、このクローニング部位を含む配列はＣａｓ９配列のＮ末端である。いくつかの実施形態では、このクローニング部位を含む配列はＣａｓ９配列のＣ末端である。いくつかの実施形態では、コードされたリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号９１）、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号５）、（ＧＧＳ）ｎ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号９３）（例えばＧｕｉｌｉｎｇｅｒ  ＪＰ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＤＢ，Ｌｉｕ  ＤＲ．Ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ  ｉｎａｃｔｉｖｅ  Ｃａｓ９  ｔｏ  ＦｏｋＩ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４；３２（６）：５７７−８２を参照されたい。内容全体が参照により本明細書に援用される）もしくは（ＸＰ）ｎモチーフまたはこれらのうちのいずれかの組み合わせを含み、ｎは独立して１〜３０の整数である。
【００１３】
本開示のいくつかの態様は、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインと核酸編集酵素または核酸編集酵素ドメインとを含む融合タンパク質、および任意選択的な、Ｃａｓ９ドメインと核酸編集酵素または核酸編集酵素ドメインとの間に位置するリンカーを含むキットを提供する。加えて、いくつかの実施形態では、このキットは、例えばインビトロでのまたはインビボでのＤＮＡまたはＲＮＡの編集に好適な試薬、緩衝液、および／または融合タンパク質の使用説明書を含む。いくつかの実施形態では、このキットは、核酸配列の標的を定めた編集に好適なｓｇＲＮＡの設計および使用に関する使用説明書を含む。
【００１４】
上記概要は、本明細書に開示する技法の実施形態、利点、特徴および使用のうちのいくつかを非限定的な方法で説明するように意図されている。本明細書に開示する技法のその他の実施形態、利点、特徴および使用は、詳細な説明、図面、実施例および特許請求の範囲から明らかであるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ−ＤＮＡ複合体である。ｓｇＲＮＡの３’末端はＣａｓ９ヌクレアーゼとリボ核タンパク質複合体を形成し、ｓｇＲＮＡの２０ｎｔの５’末端は、ＤＮＡにおけるこの５’末端の相補ストレッチを認識する。ＤＮＡ結合には、標的ＤＮＡに対して３−ｎｔのＰＡＭ配列５’が必要である。ｗｔＣａｓ９の場合には、ＰＡＭから３ｎｔで二本鎖ＤＮＡ切断が起きて平滑末端が生成される（矢印で示す）。このバブルの大きさは未知であることに留意すべきである。
【図２】ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（ＰＤＢ  ＩＤ  ３Ｅ１Ｕ）の触媒ドメインの結晶構造である。全ファミリにわたり保存されると考えられるコアの二次構造は、６つのαヘリクスが隣接する５本鎖のβシート（矢印）からなる。活性中心ループ（活性部位ループ）が脱アミノ化の特異性の決定に関与すると考えられる。触媒活性に関与するＺｎ２＋を球形で示す。配列は完全に配列番号９７〜９８に対応する。
【図３】ルシフェラーゼをベースとするレポーターアッセイの設計である。変異した開始コドンを標的とするために、ルシフェラーゼ遺伝子の前の領域およびこの遺伝子を含む領域に対応する多くの配列を標的とするようにｓｇＲＮＡが変更される（Ｃ末端に下線を引いている）。開始コドンとルシフェラーゼ遺伝子との間に「バッファー」領域を追加してＡのみのコドンおよびＴのみのコドン（（ＺＺＺ）Ｘとして示す）を含ませる。シャイン・ダルガノ配列を示す。いくつかの実施形態では、オフターゲット効果を防ぐために全てのＣの塩基対を維持することが好ましい。
【図４】デアミナーゼアッセイである。配列は完全に配列番号９９〜１０５に対応する。
【図５】Ｃａｓ９−ＡＰＯＢＥＣ１融合タンパク質で編集したｓｓＤＮＡのＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
定義
本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別途明確に示さない限り単数への言及および複数への言及を含む。そのため、例えば「薬剤」への言及は、単一の薬剤および複数のそのような薬剤を含む。
【００１７】
用語「Ｃａｓ９」または「Ｃａｓ９ヌクレアーゼ」は、Ｃａｓ９タンパク質またはこの断片（例えば、Ｃａｓ９の活性ＤＮＡ切断ドメインもしくは不活性ＤＮＡ切断ドメインおよび／またはＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含むタンパク質）を含むＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼを意味する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ｃａｓｎ１ヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され、規則的に間隔が開いた短パリンドローム反復）関連ヌクレアーゼと称されるときもある。ＣＲＩＳＰＲは、可動遺伝因子（ウイルス、転位因子および接合性プラスミド）に対する防御を提供する適応免疫システムである。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、スペーサー、先行する可動因子に相補的な配列、および核酸に侵入する標的を含む。ＣＲＩＳＰＲクラスターは転写されてプロセシングされ、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）になる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムでは、プレｃｒＲＮＡの正確なプロセシングには、トランスにコードされた低分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、内因性リボヌクレアーゼ３（ｒｎｃ）およびＣａｓ９タンパク質が必要である。ｔｒａｃｒＲＮＡは、プレｃｒＲＮＡのリボヌクレアーゼ３によるプロセシングのガイドとして機能する。その後、Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡは、スペーサーに相補的な直鎖のまたは環状のｄｓＤＮＡ標的をエンドヌクレアーゼ的に切断する。ｃｒＲＮＡに相補的でない標的鎖が最初にエンドヌクレアーゼ的に切断され、次いで３’−５’エクソヌクレアーゼ的に整えられる。天然では、ＤＮＡの結合および切断は、タンパク質および両方のＲＮＡを概して必要とする。しかしながら、単一のガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」または単に「ｇＲＮＡ」）を、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方の態様を単一のＲＮＡ種に組み込むように操作し得る。例えばＪｉｎｅｋ  Ｍ．，Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  Ｋ．，Ｆｏｎｆａｒａ  Ｉ．，Ｈａｕｅｒ  Ｍ．，Ｄｏｕｄｎａ  Ｊ．Ａ．，Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ  Ｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６−８２１（２０１２）を参照されたい。この内容全体を参照により援用する。Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ反復配列中の短いモチーフ（ＰＡＭまたはプロトスペーサー隣接モチーフ）を認識し、自己と非自己との区別に役立つ。Ｃａｓ９ヌクレアーゼの配列および構造は当業者に公知である（例えば“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｎ  Ｍ１  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ．”Ｆｅｒｒｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｊ．，ＭｃＳｈａｎ  Ｗ．Ｍ．，Ａｊｄｉｃ  Ｄ．Ｊ．，Ｓａｖｉｃ  Ｄ．Ｊ．，Ｓａｖｉｃ  Ｇ．，Ｌｙｏｎ  Ｋ．，Ｐｒｉｍｅａｕｘ  Ｃ．，Ｓｅｚａｔｅ  Ｓ．，Ｓｕｖｏｒｏｖ  Ａ．Ｎ．，Ｋｅｎｔｏｎ  Ｓ．，Ｌａｉ  Ｈ．Ｓ．，Ｌｉｎ  Ｓ．Ｐ．，Ｑｉａｎ  Ｙ．，Ｊｉａ  Ｈ．Ｇ．，Ｎａｊａｒ  Ｆ．Ｚ．，Ｒｅｎ  Ｑ．，Ｚｈｕ  Ｈ．，Ｓｏｎｇ  Ｌ．，Ｗｈｉｔｅ  Ｊ．，Ｙｕａｎ  Ｘ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ  Ｓ．Ｗ．，Ｒｏｅ  Ｂ．Ａ．，ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  Ｒ．Ｅ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：４６５８−４６６３（２００１）、“ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｒａｎｓ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｈｏｓｔ  ｆａｃｔｏｒ  ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ．”Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ  Ｅ．，Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  Ｋ．，Ｓｈａｒｍａ  Ｃ．Ｍ．，Ｇｏｎｚａｌｅｓ  Ｋ．，Ｃｈａｏ  Ｙ．，Ｐｉｒｚａｄａ  Ｚ．Ａ．，Ｅｃｋｅｒｔ  Ｍ．Ｒ．，Ｖｏｇｅｌ  Ｊ．，Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ  Ｅ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４７１：６０２−６０７（２０１１）および“Ａ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｄｕａｌ−ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＤＮＡ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．”Ｊｉｎｅｋ  Ｍ．，Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  Ｋ．，Ｆｏｎｆａｒａ  Ｉ．，Ｈａｕｅｒ  Ｍ．，Ｄｏｕｄｎａ  Ｊ．Ａ．，Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ  Ｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６−８２１（２０１２）を参照されたい。これらのそれぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される）。Ｃａｓ９の相同分子種が様々な種で説明されており、この種としてＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）が挙げられるがこれらに限定されない。追加の好適なＣａｓ９のヌクレアーゼおよび配列が、本開示をベースとして当業者に明らかであるであろう。そのようなＣａｓ９のヌクレアーゼおよび配列として、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ，Ｒｈｕｎ，ａｎｄ  Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，“Ｔｈｅ  ｔｒａｃｒＲＮＡ  ａｎｄ  Ｃａｓ９  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ”（２０１３）ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：５，７２６−７３７（この内容全体が参照により本明細書に援用される）に開示されている生物および座位からのＣａｓ９配列が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、不活性（例えば不活性化）ＤＮＡ切断ドメインを有する。
【００１８】
ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９タンパク質を、（ヌクレアーゼ「失活」Ｃａｓ９の場合に）「ｄＣａｓ９」タンパク質と互換的に称することもできる。不活性ＤＮＡ切断ドメインを有するＣａｓ９タンパク質（またはこの断片を）を生成する方法は既知である（例えば、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３７：８１６−８２１（２０１２）、Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ  ａｓ  ａｎ  ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”（２０１３）Ｃｅｌｌ．２８；１５２（５）：１１７３−８３を参照されたい。これらのそれぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される）。例えば、Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメインは、２個のサブドメイン、即ちＨＮＨヌクレアーゼサブドメインおよびＲｕｖＣ１サブドメインを含むことが知られている。ＨＮＨサブドメインはｇＲＮＡに相補的な鎖を切断し、ＲｕｖＣ１サブドメイは非相補鎖を切断する。これらのサブドメイン内の変異により、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を沈黙させることができる。例えば、変異Ｄ１０Ａおよび変異Ｈ８４１Ａは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９のヌクレアーゼ活性を完全に不活性化する（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３７：８１６−８２１（２０１２）、Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２８；１５２（５）：１１７３−８３（２０１３）。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９の断片を含むタンパク質が提供される。例えば、いくつかの実施形態では、タンパク質は、下記の２種のＣａｓ９ドメインのうちの一方を含む：（１）Ｃａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインまたは（２）Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメイン。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９またはこの断片を含むタンパク質は「Ｃａｓ９多様体」と称される。Ｃａｓ９多様体は、Ｃａｓ９またはこの断片と相同性を共有する。例えば、Ｃａｓ９多様体は、野生型Ｃａｓ９と少なくとも約７０％同一であるか、少なくとも約８０％同一であるか、少なくとも約９０％同一であるか、少なくとも約９５％同一であるか、少なくとも約９６％同一であるか、少なくとも約９７％同一であるか、少なくとも約９８％同一であるか、少なくとも約９９％同一であるか、少なくとも約９９．５％同一であるか、または少なくとも約９９．９％ある。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９多様体は、野生型Ｃａｓ９の対応する断片と少なくとも約７０％同一であるか、少なくとも約８０％同一であるか、少なくとも約９０％同一であるか、少なくとも約９５％同一であるか、少なくとも約９６％同一であるか、少なくとも約９７％同一であるか、少なくとも約９８％同一であるか、少なくとも約９９％同一であるか、少なくとも約９９．５％同一であるか、または少なくとも約９９．９％であるようなＣａｓ９の断片（例えばｇＲＮＡ結合ドメインまたはＤＮＡ切断ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、野生型Ｃａｓ９は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０１７０５３．１、配列番号１（ヌクレオチド）；配列番号２（ア��ノ酸））に対応する。
【化１】
2020164529.tif 000003
【化２】
2020164529.tif 000004
（一重下線：ＨＮＨドメイン、二重下線：ＲｕｖＣドメイン）
【００１９】
いくつかの実施形態では、野生型Ｃａｓ９は、配列番号３（ヌクレオチド）および／または配列番号４（アミノ酸）に対応するか、またはそれを含む。
【化３】
2020164529.tif 000005
【化４】
2020164529.tif 000006
（一重下線：ＨＮＨドメイン、二重下線：ＲｕｖＣドメイン）
【００２０】
いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を不活性化する１種または複数種の変異を有するＣａｓ９アミノ酸配列の一部または全体に対応するか、またはこのアミノ酸配列の一部または全体を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９ドメインはＤ１０Ａ変異および／またはＨ８２０Ａ変異を含む。
ｄＣａｓ９（Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ）：
【化５】
2020164529.tif 000007
（一重下線：ＨＮＨドメイン、二重下線：ＲｕｖＣドメイン）
【００２１】
その他の実施形態では、Ｄ１０ＡおよびＨ８２０Ａ以外の変異を有するｄＣａｓ９多様体が提供され、このｄＣａｓ９多様体によりヌクレアーゼが不活性化されたＣａｓ９（ｄＣａｓ９）が生じる。そのような変異として、例えば、Ｄ１０およびＨ８２０でのその他のアミノ酸置換、またはＣａｓ９のヌクレアーゼドメイン内のその他の置換（例えば、ＨＮＨヌクレアーゼサブドメインおよび／もしくはＲｕｖＣ１サブドメイン中での置換）が挙げられる。いくつかの実施形態では、配列番号３４と少なくとも約７０％同一であるか、少なくとも約８０％同一であるか、少なくとも約９０％同一であるか、少なくとも約９５％同一であるか、少なくとも９８％同一であるか、少なくとも約９９％同一であるか、少なくとも約９９．５％同一であるか、または少なくとも約９９．９％であるｄＣａｓ９の多様体または相同体（例えば配列番号３４の多様体）が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号３４と比べて約５個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸、約２５個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約７５個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸またはより多くのアミノ酸だけ短いまたは長いアミノ酸配列を有するｄＣａｓ９の多様体（例えば配列番号３４の多様体）が提供される。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載したＣａｓ９融合タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質の完全長アミノ酸、例えば上記に記載した配列のうちの１つを含む。しかしながら、その他の実施形態では、本明細書に記載した融合タンパク質は完全長Ｃａｓ９配列を含まず、この断片のみを含む。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載したＣａｓ９融合タンパク質は、Ｃａｓ９断片であって、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡに結合するが、例えばヌクレアーゼドメインの短縮バージョンのみを含むまたはヌクレアーゼドメインを全く含まないという点で機能的ヌクレアーゼドメインを含まないＣａｓ９断片を含む。好適なＣａｓ９ドメインおよびＣａｓ９断片の例示的なアミノ酸配列を本明細書に記載しており、Ｃａｓ９のドメインおよび断片の追加の好適な配列が当業者に明らかであるであろう。
【００２３】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、コリネバクテリウム・ウルセランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ）（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＣ＿０１５６８３．１、ＮＣ＿０１７３１７．１）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＣ＿０１６７８２．１、ＮＣ＿０１６７８６．１）、スピロプラズマ・シルフィディコーラ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ  ｓｙｒｐｈｉｄｉｃｏｌａ）（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＣ＿０２１２８４．１）、プレボテラ・インテルメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＣ＿０１７８６１．１）、スピロプラズマ・タイワネンス（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ  ｔａｉｗａｎｅｎｓｅ）（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＣ＿０２１８４６．１）、ストレプトコッカス・イニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｉａｅ）（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＣ＿０２１３１４．１）、ベルリエラ・バルティカ（Ｂｅｌｌｉｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＣ＿０１８０１０．１）、シクロフレキサス・トルキスＩ（Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ  ｔｏｒｑｕｉｓＩ）（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＣ＿０１８７２１．１）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＮＣＢＩ参照番号：ＹＰ＿８２０８３２．１）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿４７２０７３．１）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）（ＮＣＢＩ参照番号：ＹＰ＿００２３４４９００．１）またはネイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（ＮＣＢＩ参照番号：ＹＰ＿００２３４２１００．１）に由来するＣａｓ９を意味する。
【００２４】
用語「デアミナーゼ」は、脱アミノ化反応を触媒する酵素を意味する。いくつかの実施形態では、デアミナーゼはシチジンデアミナーゼであり、シチジンまたはデオキシシチジンのウラシルまたはデオキシウラシルそれぞれへの加水分解性脱アミノ化を触媒する。
【００２５】
用語「有効量」は本明細書で使用する場合、所望の生物学的反応を誘発するのに十分である生物学的活性な薬剤の量を意味する。例えば、いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼの有効量は、特異的に結合してヌクレアーゼにより切断される標的部位の切断を誘発するのに十分であるヌクレアーゼの量を意味し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載した融合タンパク質の有効量、例えばヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインと核酸編集ドメイン（例えばデアミナーゼドメイン）とを含む融合タンパク質の有効量は、特異的に結合して融合タンパク質により編集される標的部位の編集を誘発するのに十分である融合タンパク質の量を意味し得る。当業者に正しく認識され得るように、ある薬剤の有効量、例えば融合タンパク質、ヌクレアーゼ、デアミナーゼ、リコンビナーゼ、ハイブリッドタンパク質、タンパク質二量体、タンパク質（もしくはタンパク質二量体）とポリヌクレオチドとの複合体またはポリヌクレオチドの有効量は、様々な要因に応じて変動することができ、例えば所望の生物学的反応に応じて、例えば編集される具体的なアレル、ゲノムまたは標的部位に応じて、標的とされる細胞または組織に応じて、および使用される薬剤に応じて変動し得る。
【００２６】
用語「リンカー」は本明細書で使用する場合、２種の分子または部分、例えば融合タンパク質の２種のドメイン、例えばヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインおよび核酸編集ドメイン（例えばデアミナーゼドメイン）等を連結する化学基または分子を意味する。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメイン等のＲＮＡプログラム可能なヌクレアーゼのｇＲＮＡ結合ドメインと核酸編集タンパク質の触媒ドメインとを連結する。いくつかの実施形態では、リンカーはｄＣａｓ９と核酸編集タンパク質とを連結する。典型的には、リンカーは、２種の基、分子、またはその他の部分の間に位置しており、またはこれらに隣接しており、共有結合によりそれぞれに連結されており、そのため、これら２種を連結する。いくつかの実施形態では、リンカーは１個のアミノ酸または複数個のアミノ酸（例えばペプチドまたはタンパク質）である。いくつかの実施形態では、リンカーは、有機分子、基、ポリマーまたは化学部分である。いくつかの実施形態では、リンカーは５〜１００個のアミノ酸長であり、例えば５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３０〜３５個、３５〜４０個、４０〜４５個、４５〜５０個、５０〜６０個、６０〜７０個、７０〜８０個、８０〜９０個、９０〜１００個、１００〜１５０個または１５０〜２００個のアミノ酸長である。より長いまたはより短いリンカーも考慮される。
【００２７】
用語「変異」は本明細書で使用する場合、配列内での、例えば核酸配列内でのもしくはアミノ酸配列内での残基の別の残基への置換、または配列内での１個もしくは複数個の残基の欠失もしくは挿入を意味する。本明細書では概して、元々の残基を特定し、続いて配列内の残基の位置を特定し、続いて新たに置換した残基の素性を特定することにより変異を記載する。本明細書に記載したアミノ酸置換（変異）を生じさせる様々な方法が当技術分野で公知であり、例えばＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０１２））により提供される。
【００２８】
用語「核酸」および「核酸分子」は本明細書で使用する場合、核酸塩基と、酸性部分、例えばヌクレオシド、ヌクレオチド、またはヌクレオチドのポリマーとを含む化合物を意味する。典型的には、ポリマー核酸、例えば３個以上のヌクレオチドを含む核酸分子は直鎖分子であり、この直鎖分子では、隣接するヌクレオチドがホスホジエステル連結により互いに連結されている。いくつかの実施形態では、「核酸」は個々の核酸残基（例えばヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を意味する。いくつかの実施形態では、「核酸」は、３個以上の個々のヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を意味する。本明細書で使用する場合、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」を、ヌクレオチドのポリマー（例えば少なくとも３個のヌクレオチドのひも）を意味するように互換的に使用し得る。いくつかの実施形態では、「核酸」はＲＮＡならびに一本鎖ＤＮＡおよび／または二本鎖ＤＮＡを包含する。核酸は天然に存在することができ、例えばゲノム、転写産物、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、プラスミド、コスミド、染色体、染色分体またはその他の天然に存在する核酸分子と関連して天然に存在し得る。一方、核酸分子は天然には存在しない分子であることができ、例えば組み換えＤＮＡまたは組み換えＲＮＡ、人工染色体、操作されたゲノムもしくはこの断片、もしくは合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、合成ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであることができる、または天然には存在しないヌクレオチドもしくはヌクレオシドを含むことができる。更に、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」および／または類似の用語は、核酸類似体、例えばリン酸ジエステル骨格以外を有する類似体を含む。核酸を、例えば天然源から精製し得、組み換え発現系を使用して産生して任意選択的に精製し得、化学的に合成し得る。例えば化学的に合成される分子の場合では、必要に応じて、核酸は、化学的に修飾された塩基または糖および骨格修飾を有する類似体等のヌクレオシド類似体を含むことができる。別途示さない限り、核酸配列を５’から３’への方向で表す。いくつかの実施形態では、核酸は、天然ヌクレオシド（例えばアデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシンおよびデオキシシチジン）、ヌクレオシド類似体（例えば２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニンおよび２−チオシチジン）、化学的に修飾された塩基、生物学的に修飾された塩基（例えばメチル化塩基）、インターカレートされた塩基（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ  ｂａｓｅ）、修飾された糖（例えば２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノースおよびヘキソース）ならびに／もしくは修飾���れたホスフェート基（例えばホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホラミダイト連結）であるか、またはそれを含む。
【００２９】
用語「増殖性疾患」は本明細書で使用する場合、細胞または細胞集団が増殖速度の異常な上昇を示すという点で細胞または組織の恒常性が妨げられているあらゆる疾患を意味する。増殖性疾患として、過増殖性疾患、例えば前腫瘍性の過形成状態および腫瘍性疾患が挙げられる。腫瘍性疾患は細胞の異常増殖を特徴とし、この腫瘍性疾患として良性の腫瘍および悪性の腫瘍の両方が挙げられる。悪性腫瘍はがんとも称される。
【００３０】
用語「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」を本明細書では互換的に使用し、これらは、ペプチド（アミド）結合により互いに連結されたアミノ酸残基のポリマーを意味する。この用語は、あらゆるサイズの、構造のまたは機能のタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドを意味する。典型的には、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸長である。タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドは、個々のタンパク質または一群のタンパク質を意味し得る。タンパク質中の、ペプチド中のまたはポリペプチド中のアミノ酸のうちの１個または複数個を、例えば化学物質、例えば炭水化物基、水酸基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、接合用の、機能化用のまたはその他の修飾用のリンカー等の付加により修飾し得る。タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドはまた、単一種の分子であることもできる、または複数種の分子の複合体であることもできる。タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドは、天然に存在するタンパク質またはペプチドの単なる断片であることができる。タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドは、天然に存在し得るか、組み換えであり得るか、もしくは合成であり得るか、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。用語「融合タンパク質」は本明細書で使用する場合、少なくとも２種の異なるタンパク質に由来するタンパク質ドメインを含むハイブリッドポリペプチドを意味する。一方のタンパク質は、融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）部分またはカルボキシ末端（Ｃ末端）タンパク質に位置することができ、そのため「アミノ末端融合タンパク質」または「カルボキシ末端融合タンパク質」をそれぞれ形成する。タンパク質は様々なドメインを含むことができ、例えば核酸結合ドメイン（例えば、タンパク質の標的部位への結合を誘導するＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメイン）および核酸切断ドメインまたは核酸編集タンパク質の触媒ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、タンパク質は、タンパク様部分、例えば核酸結合ドメインを構成するアミノ酸配列と、有機化合物、例えば核酸切断剤として作用し得る化合物とを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、核酸、例えばＲＮＡとの複合体中に存在する、またはこの核酸と関連している。本明細書に記載したタンパク質のうちのいずれかを、当技術分野で既知の任意の方法により製造し得る。例えば、本明細書に記載したタンパク質を組み換えタンパク質発現および精製により製造することができ、この組み換えタンパク質発現および精製は、ペプチドリンカーを含む融合タンパク質に特に適している。組み換えタンパク質発現および精製の方法は公知であり、この方法として、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０１２））により説明されているものが挙げられ、この内容全体が参照により本明細書に援用される。
【００３１】
用語「ＲＮＡプログラム可能なヌクレアーゼ」および「ＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼ」を本明細書では互換的に使用し、これらは、切断の標的ではない１種または複数種のＲＮＡと複合体を形成する（例えばこのＲＮＡに結合するまたは関連する）ヌクレアーゼを意味する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡプログラム可能なヌクレアーゼは、ＲＮＡとの複合体中の場合にヌクレアーゼ：ＲＮＡ複合体と称され得る。典型的には、結合したＲＮＡはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と称される。ｇＲＮＡは、２種以上のＲＮＡの複合体として存在し得るか、または単一種のＲＮＡ分子として存在し得る。単一種のＲＮＡ分子として存在するｇＲＮＡは単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と称され得るが、「ｇＲＮＡ」は、単一種の分子または２種以上の分子の複合体のいずれかとして存在するガイドＲＮＡを意味するように互換的に使用される。典型的には、単一ＲＮＡ種として存在するｇＲＮＡは、２種のドメイン、即ち（１）標的核酸と相同性を共有する（例えば、およびＣａｓ９複合体の標的への結合を誘導する）ドメインならびに（２）Ｃａｓ９タンパク質に結合するドメインを含む。いくつかの実施形態では、ドメイン（２）は、ｔｒａｃｒＲＮＡとして既知である配列に対応し、ステム−ループ構造を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ドメイン（２）は、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６−８２１（２０１２）の図１に示すようにｔｒａｃｒＲＮＡと相同であり、この内容全体が参照により本明細書に援用される。ｇＲＮＡのその他の例（例えばドメイン２を含むもの）を、２０１３年９月６日に出願された「Ｓｗｉｔｃｈａｂｌｅ  Ｃａｓ９  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  Ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」という名称の米国仮特許出願第６１／８７４，６８２号明細書および２０１３年９月６日に出願された「Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ」という名称の米国仮特許出願第６１／８７４，７４６号明細書に見出すことができ、これらの内容全体は、それらの全体を参照することにより援用される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは２種以上のドメイン（１）およびドメイン（２）を含み、「伸張ｇＲＮＡ」と称され得る。例えば、伸張ｇＲＮＡは、本明細書に記載したように、例えば２種以上のＣａｓ９タンパク質に結合することでき、２箇所以上の別々の領域で標的核酸に結合し得る。このｇＲＮＡは、標的部位を補完するヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列はヌクレアーゼ／ＲＮＡ複合体の前記標的部位への結合を媒介し、ヌクレアーゼ：ＲＮＡ複合体の配列特異性を付与する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡプログラム可能なヌクレアーゼは（ＣＲＩＳＰＲ関連システム）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであり、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９（Ｃｓｎ１）である（例えば、“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｎ  Ｍ１  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ．”Ｆｅｒｒｅｔｔｉ  Ｊ．Ｊ．，ＭｃＳｈａｎ  Ｗ．Ｍ．，Ａｊｄｉｃ  Ｄ．Ｊ．，Ｓａｖｉｃ  Ｄ．Ｊ．，Ｓａｖｉｃ  Ｇ．，Ｌｙｏｎ  Ｋ．，Ｐｒｉｍｅａｕｘ  Ｃ．，Ｓｅｚａｔｅ  Ｓ．，Ｓｕｖｏｒｏｖ  Ａ．Ｎ．，Ｋｅｎｔｏｎ  Ｓ．，Ｌａｉ  Ｈ．Ｓ．，Ｌｉｎ  Ｓ．Ｐ．，Ｑｉａｎ  Ｙ．，Ｊｉａ  Ｈ．Ｇ．，Ｎａｊａｒ  Ｆ．Ｚ．，Ｒｅｎ  Ｑ．，Ｚｈｕ  Ｈ．，Ｓｏｎｇ  Ｌ．，Ｗｈｉｔｅ  Ｊ．，Ｙｕａｎ  Ｘ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ  Ｓ．Ｗ．，Ｒｏｅ  Ｂ．Ａ．，ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  Ｒ．Ｅ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：４６５８−４６６３（２００１）、“ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｒａｎｓ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｈｏｓｔ  ｆａｃｔｏｒ  ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ．”Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ  Ｅ．，Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  Ｋ．，Ｓｈａｒｍａ  Ｃ．Ｍ．，Ｇｏｎｚａｌｅｓ  Ｋ．，Ｃｈａｏ  Ｙ．，Ｐｉｒｚａｄａ  Ｚ．Ａ．，Ｅｃｋｅｒｔ  Ｍ．Ｒ．，Ｖｏｇｅｌ  Ｊ．，Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ  Ｅ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４７１：６０２−６０７（２０１１）および“Ａ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｄｕａｌ−ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＤＮＡ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．”Ｊｉｎｅｋ  Ｍ．，Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  Ｋ．，Ｆｏｎｆａｒａ  Ｉ．，Ｈａｕｅｒ  Ｍ．，Ｄｏｕｄｎａ  Ｊ．Ａ．，Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ  Ｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６−８２１（２０１２）を参照されたい。これらのそれぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される。
【００３２】
ＲＮＡプログラム可能なヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）は、標的ＤＮＡ切断部位に対するＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションを使用することから、原理上、このタンパク質の標的を、ガイドＲＮＡにより指定される任意の配列に定めることができる。部位特異的切断のための（例えばゲノムを修飾するための）Ｃａｓ９等のＲＮＡプログラム可能なヌクレアーゼの使用方法は当技術分野で既知である（例えば、Ｃｏｎｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８１９−８２３（２０１３）、Ｍａｌｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｉａ  Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８２３−８２６（２０１３）、Ｈｗａｎｇ，Ｗ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１，２２７−２２９（２０１３）、Ｊｉｎｅｋ，  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．ＲＮＡ−ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．ｅＬｉｆｅ  ２，ｅ００４７１（２０１３）、Ｄｉｃａｒｌｏ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１３）、Ｊｉａｎｇ，  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１，２３３−２３９（２０１３）を参照されたい。これらのそれぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される）。
【００３３】
用語「対象」は本明細書で使用する場合、個々の生物を意味しており、例えば個々の哺乳動物を意味する。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は非ヒト哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象は非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態では、対象は齧歯動物である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ネコまたはイヌである。いくつかの実施形態では、対象は、脊椎動物、両生動物、爬虫類、魚類、昆虫、ハエまたは線形動物である。いくつかの実施形態では、対象は研究動物である。いくつかの実施形態では、対象は遺伝子操作されており、例えば遺伝子操作された非ヒト対象である。対象は、どちらか一方の性別および任意の発達段階であることができる。
【００３４】
用語「標的部位」は、デアミナーゼまたはデアミナーゼを含む融合タンパク質（例えば、本明細書に記載したｄＣａｓ９−デアミナーゼ融合タンパク質）により脱アミノ化される核酸分子内の配列を意味する。
【００３５】
用語「処置」、「処置する（ｔｒｅａｔ）」および「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、本明細書に記載したように、疾患もしくは障害またはこれらの１種もしくは複数種の症状を回復させるか、緩和するか、これらの発症を遅延させるか、またはこれらの進行を阻害することを目的とした臨床的介入を意味する。本明細書で使用する場合、用語「処置」、「処置する（ｔｒｅａｔ）」および「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、本明細書に記載したように、疾患もしくは障害またはこれらの１種もしくは複数種の症状を回復させるか、緩和するか、これらの発症を遅延させるか、またはこれらの進行を阻害することを目的とした臨床的介入を意味する。いくつかの実施形態では、１種もしくは複数種の症状が発症した後におよび／または疾患が診断された後に、処置を施すことができる。その他の実施形態では、例えば、症状の発症を予防するためにもしくは遅延させるために、または疾患の発症もしくは進行を阻害するために、症状がない状態で処置を施すことができる。例えば、（例えば症状歴を考慮しておよび／または遺伝因子もしくはその他の感受性因子を考慮して）症状の発症前に、感受性個体に処置を施すことができる。症状が消散された後も処置を続けて、例えばこの症状の再発を予防するまたは遅延させることもできる。
【００３６】
本開示のいくつかの態様は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡとも称される）に結合し、次いで鎖ハイブリダイゼーションにより標的核酸配列に結合するＣａｓ９ドメインと、ＤＮＡ編集ドメイン、例えば核酸塩基（例えばシチジン等）を脱アミノ化し得るデアミナーゼドメインとを含む融合タンパク質を提供する。デアミナーゼによる核酸塩基の脱アミノ化により各残基で点変異を引き起こすことができ、この点変異は本明細書では核酸編集と称される。そのため、Ｃａｓ９多様体またはＣａｓ９ドメインとＤＮＡ編集ドメインとを含む融合タンパク質を、核酸配列の標的を定めた編集に使用し得る。そのような融合タンパク質は、インビトロでのＤＮＡの標的を定めた編集に有用であり、例えば変異細胞または変異動物の生成；標的を定めた変異の導入、例えばエキソビボでの細胞における遺伝的欠陥の修正、例えば、ある対象から得て、後に同じまたは別の対象に再導入する細胞における遺伝的欠陥の修正；および標的を定めた変異の導入、例えば、遺伝的欠陥の修正または対象における疾患関連遺伝子での不活性化変異の導入に有用である。典型的には、本明細書に記載した融合タンパク質のＣａｓ９ドメインは、いかなるヌクレアーゼ活性も有しておらず、代わりにＣａｓ９断片またはｄＣａｓ９タンパク質もしくはｄＣａｓ９ドメインである。本明細書に記載したＣａｓ９融合タンパク質の使用方法も提供される。
【００３７】
非限定的で例示的なヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインを本明細書に記載する。好適なヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインの一例は、下記のＤ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ  Ｃａｓ９ドメイン変異体である：
【化６】
2020164529.tif 000008
（配列番号３７、例えばＱｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ  ａｓ  ａｎ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ．２０１３；１５２（５）：１１７３−８３を参照されたい。この内容全体が参照により本明細書に援用される）。
【００３８】
追加の好適なヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、本開示をベースとして当業者に明らかであろう。そのような追加の好適なヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインの例として、Ｄ１０Ａ変異ドメイン、Ｄ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ変異ドメインおよびＤ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ／Ｎ８６３Ａ変異ドメインが挙げられるがこれらに限定されない（例えばＰｒａｓｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＡＳ９  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐａｉｒｅｄ  ｎｉｃｋａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１３；３１（９）：８３３−８３８を参照されたい。この内容全体が参照により本明細書に援用される）。
【００３９】
Ｃａｓ９と核酸編集酵素または核酸編集ドメインとの融合タンパク質
本開示のいくつかの態様は、（ｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９酵素またはヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインと、（ｉｉ）核酸編集酵素または核酸編集ドメインとを含む融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、この核酸編集酵素または核酸編集ドメインは、ＤＮＡ編集酵素またはＤＮＡ編集ドメインである。いくつかの実施形態では、この核酸編集酵素はデアミナーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、この核酸編集酵素または核酸編集ドメインは、デアミナーゼドメインを含む、またはデアミナーゼドメインである。いくつかの実施形態では、このデアミナーゼはシチジンデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、このデアミナーゼは、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリのデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、このデアミナーゼはＡＰＯＢＥＣ１ファミリのデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、このデアミナーゼは活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）である。いくつかの実施形態では、このデアミナーゼはＡＣＦ１／ＡＳＥデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、このデアミナーゼはアデノシンデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、このデアミナーゼはＡＤＡＴファミリのデアミナーゼである。数種類の核酸編集酵素および核酸編集ドメイン、ならびにそのような酵素またはドメインを含むＣａｓ９融合タンパク質を本明細書において詳細に説明する。追加の好適な核酸編集酵素または核酸編集ドメインが、本開示をベースとして当業者に明らかであろう。
【００４０】
本開示は、様々な構成のＣａｓ９：核酸編集酵素／ドメイン融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、核酸編集酵素または核酸編集ドメインはＣａｓ９ドメインのＮ末端に融合している。いくつかの実施形態では、核酸編集酵素または核酸編集ドメインはＣａｓ９ドメインのＣ末端に融合している。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ドメインおよび核酸編集編集酵素または核酸編集編集ドメインは、リンカーを介して融合している。いくつかの実施形態では、このリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号９１）、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号５）、（ＧＧＳ）ｎ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号９３）（例えばＧｕｉｌｉｎｇｅｒ  ＪＰ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＤＢ，Ｌｉｕ  ＤＲ．Ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ  ｉｎａｃｔｉｖｅ  Ｃａｓ９  ｔｏ  ＦｏｋＩ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４；３２（６）：５７７−８２を参照されたい。この内容全体が参照により本明細書に援用される）もしくは（ＸＰ）ｎモチーフまたはこれらのうちのいずれかの組み合わせを含み、ｎは独立して１〜３０の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０であるか、または複数個のリンカーもしくは複数個のリンカーモチーフが存在する場合には、これらのいずれかの組み合わせである。追加の好適なリンカーモチーフおよびリンカーの構成が当業者に明らかであろう。いくつかの実施形態では、好適なリンカーのモチーフおよび構成として、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｎｋｅｒｓ：ｐｒｏｐｅｒｔｙ，ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２０１３；６５（１０）：１３５７−６９に記載されているものが挙げられ、この内容全体が参照により本明細書に援用される。追加の好適なリンカー配列が、本開示をベースとして当業者に明らかであろう。
【００４１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載した例示的なＣａｓ９融合タンパク質の一般的な構成は下記の構造を含む：
［ＮＨ２］−［核酸編集酵素または核酸編集ドメイン］−［Ｃａｓ９］−［ＣＯＯＨ］、または
［ＮＨ２］−［Ｃａｓ９］−［核酸編集酵素または核酸編集ドメイン］−［ＣＯＯＨ］
（上記構造中、ＮＨ２は融合タンパク質のＮ末端であり、ＣＯＯＨは融合タンパク質のＣ末端である）。
【００４２】
追加の特徴、例えばＮＬＳと融合タンパク質の残部との間のおよび／または核酸編集酵素もしくは核酸編集ドメインとＣａｓ９との間の１種または複数種のリンカー配列が存在し得る。存在し得るその他の例示的な特徴は、局在化配列、例えば核局在化配列、細胞質局在化配列、核外輸送配列等の輸送配列またはその他の局在化配列、ならびに融合タンパク質の可溶化、精製または検出に有用な配列タグである。好適な局在化シグナル配列およびタンパク質タグの配列を本明細書に記載しており、ビオチンカルボキシラーゼキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）タグ、ｍｙｃ−タグ、カルモジュリン−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）−タグ、ヒスチジンタグまたはＨｉｓ−タグとも称されるポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）−タグ、ｎｕｓ−タグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−タグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）−タグ、チオレドキシン−タグ、Ｓ−タグ、Ｓｏｆタグ（例えばＳｏｆタグ１、Ｓｏｆタグ３）、ｓｔｒｅｐ−タグ、ビオチンリガーゼタグ、ＦｌＡｓＨタグ、Ｖ５タグおよびＳＢＰ−タグが挙げられるがこれらに限定されない。追加の好適な配列が当業者に明らかであろう。
【００４３】
いくつかの実施形態では、核酸編集酵素または核酸編集ドメインはデアミナーゼである。例えば、いくつかの実施形態では、デアミナーゼ酵素またはデアミナーゼドメインを有する例示的なＣａｓ９融合タンパク質の一般的な構成は下記の構造を含む：
［ＮＨ２］−［ＮＬＳ］−［Ｃａｓ９］−［デアミナーゼ］−［ＣＯＯＨ］、
［ＮＨ２］−［ＮＬＳ］−［デアミナーゼ］−［Ｃａｓ９］−−［ＣＯＯＨ］、
［ＮＨ２］−［Ｃａｓ９］−［デアミナーゼ］−［ＣＯＯＨ］、または
［ＮＨ２］−［デアミナーゼ］−［Ｃａｓ９］−［ＣＯＯＨ］
（上記構造中、ＮＬＳは核局在化シグナルであり、ＮＨ２は融合タンパク質のＮ末端であり、ＣＯＯＨは融合タンパク質のＣ末端である）。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９とデアミナーゼとの間にリンカーが挿入されている。いくつかの実施形態では、ＮＬＳはデアミナーゼおよび／またはＣａｓ９ドメインのＣ末端に位置している。いくつかの実施形態では、ＮＬＳはデアミナーゼとＣａｓ９ドメインとの間に位置している。配列タグ等の追加の特徴も存在し得る。
【００４４】
好適な種類の核酸編集酵素および核酸編集ドメインの一例はシトシンデアミナーゼであり、例えばＡＰＯＢＥＣファミリのシトシンデアミナーゼである。シトシンデアミナーゼ酵素のアポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリは、制御されているおよび有利な方法で変異誘発を開始するのに役立つ１１種のタンパク質を包含する２９。ファミリの一メンバーである活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）は、転写依存的で鎖が偏向した様式でｓｓＤＮＡ中のシトシンをウラシルに変換することにより、抗体の成熟に関与する３０。アポリポタンパク質Ｂ編集複合体３（ＡＰＯＢＥＣ３）酵素は、逆転写されたウイルスｓｓＤＮＡ中のシトシンの脱アミノ化により、ある種のＨＩＶ−１株からヒト細胞を保護する３１。これらのタンパク質は全て、触媒活性にＺｎ２＋配位モチーフ（Ｈｉｓ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｘ２３〜２６−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｘ２〜４−Ｃｙｓ）および結合した水分子を必要とする。Ｇｌｕ残基は、脱アミノ化反応における求核攻撃用に水分子を水酸化亜鉛に活性化するように作用する。ファミリの各メンバーはそれ自体の特定の「ホットスポット」で優先的に脱アミノ化し、ｈＡＩＤの場合のＷＲＣ（ＷはＡまたはＴであり、ＲはＡまたはＧである）からｈＡＰＯＢＥＣ３Ｆの場合のＴＴＣまで多岐にわたる３２。ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの触媒ドメインの最近の結晶構造（図２）から、６つのαヘリクスが隣接する５本鎖のβシートコアで構成されている二次構造が明らかになっており、この構造は全ファミリにわたり保存されると考えられる３３。活性中心ループがｓｓＤＮＡ結合および「ホットスポット」の同一性の決定の両方に関与することが分かっている３４。これらの酵素の過剰発現はゲノムの不安定性およびがんと関連しており、そのため配列特異的に標的を定めることの重要性が強調される３５。
【００４５】
好適な種類の核酸編集酵素および核酸編集ドメインの別の例はアデノシンデアミナーゼである。例えば、ＡＤＡＴファミリのアデノシンデアミナーゼを、Ｃａｓ９ドメイン、例えばヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインに融合させることができ、このようにしてＣａｓ９−ＡＤＡＴ融合タンパク質が得られる。
【００４６】
本開示のいくつかの態様は、Ｃａｓ９と、デアミナーゼ酵素、例えばＡＰＯＢＥＣ酵素等のシトシンデアミナーゼ酵素またはＡＤＡＴ酵素等のアデノシンデアミナーゼ酵素との系統立った一連の融合体を提供し、この融合体は、これらのデアミナーゼの酵素活性をゲノムＤＮＡ中の特定の部位に誘導するために生成されている。認識剤としてＣａｓ９を使用する利点は下記の２つである：（１）ｓｇＲＮＡ配列を変えるだけでＣａｓ９の配列特性を容易に変更させることができる、および（２）ｄｓＤＮＡを変性させることによりＣａｓ９がその標的配列に結合し、単鎖であるＤＮＡのストレッチが生じ、従って、デアミナーゼにとって実行可能な基質が生じる。ヒトデアミナーゼドメインおよびマウスデアミナーゼドメイン、例えばＡＩＤドメインとの融合タンパク質の生成に成功している。ヒトＡＩＤおよびマウスＡＩＤの触媒ドメインとＣａｓ９との様々なその他の融合タンパク質も考慮される。その他の触媒ドメイン、またはその他のデアミナーゼからの触媒ドメインを使用してＣａｓ９との融合タンパク質も生成することができ、本開示はこの点に関して限定されないことが理解されるであろう。
【００４７】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９とＡＩＤとの融合タンパク質が提供される。ｓｓＤＮＡ中での変異率を高めるようにＣａｓ９融合タンパク質を操作するために、マウスＡＩＤおよびヒトＡＩＤの両方を繊維状ファージの遺伝子Ｖ（非特異的ｓｓＤＮＡ結合タンパク質）に繋ぎ止めた。結果として生じた融合タンパク質は、細胞ベースのアッセイにおいて野生型酵素と比較して変異活性の増強を示した。この研究は、このタンパク質の酵素活性が維持され、融合タンパク質により、この酵素活性の標的を遺伝子配列にうまく定めることできることを実証する３６。
【００４８】
Ｃａｓ９（更にＣａｓ９のｓｇＲＮＡおよび標的ＤＮＡとの複合体におけるＣａｓ９）のいくつかの結晶構造が報告されているが（例えばＪｉｎｅｋ  Ｍ，Ｊｉａｎｇ  Ｆ，Ｔａｙｌｏｒ  ＤＷ，Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ＳＨ，Ｋａｙａ  Ｅ，Ｍａ  Ｅ，Ａｎｄｅｒｓ  Ｃ，Ｈａｕｅｒ  Ｍ，Ｚｈｏｕ  Ｋ，Ｌｉｎ  Ｓ，Ｋａｐｌａｎ  Ｍ，Ｉａｖａｒｏｎｅ  ＡＴ，Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ  Ｅ，Ｎｏｇａｌｅｓ  Ｅ，Ｄｏｕｄｎａ  ＪＡ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｃａｓ９  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｒｅｖｅａｌ  ＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１４；３４３（６１７６）：１２４７９９７．ＰＭＩＤ：２４５０５１３０およびＮｉｓｈｉｍａｓｕ  Ｈ，Ｒａｎ  ＦＡ，Ｈｓｕ  ＰＤ，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ  Ｓ，Ｓｈｅｈａｔａ  ＳＩ，Ｄｏｈｍａｅ  Ｎ，Ｉｓｈｉｔａｎｉ  Ｒ，Ｚｈａｎｇ  Ｆ，Ｎｕｒｅｋｉ  Ｏ．Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｃａｓ９  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔ  ＤＮＡ．Ｃｅｌｌ．２０１４；１５６（５）：９３５−４９．ＰＭＩＤ：２４５２９４７７を参照されたい。これらのそれぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される）、ＤＮＡにおいてＣａｓ９−ＤＮＡ複合体中で単鎖である部分（Ｃａｓ９−ＤＮＡバブルの大きさ）は未知である。しかしながら、複合体が転写を妨げるために特に設計されているｓｇＲＮＡを有するｄＣａｓ９システムでは、転写干渉が、ｓｇＲＮＡが非鋳型鎖に結合する場合にのみ起こることが分かっている。この結果は、ＤＮＡ−Ｃａｓ９複合体におけるＤＮＡのある部分がＣａｓ９により保護されておらず、融合タンパク質中のデアミナーゼの潜在的な標的となる可能性があることを示唆する（Ｑｉ  ＬＳ，Ｌａｒｓｏｎ  ＭＨ，Ｇｉｌｂｅｒｔ  ＬＡ，Ｄｏｕｄｎａ  ＪＡ，Ｗｅｉｓｓｍａｎ  ＪＳ，Ａｒｋｉｎ  ＡＰ，Ｌｉｍ  ＷＡ．Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ  ａｓ  ａｎ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ．２０１３；１５２（５）：１１７３−８３．ＰＭＩＤ：２３４５２８６０を参照されたい。この内容全体が参照により本明細書に援用される）。エクソヌクレアーゼＩＩＩおよびヌクレアーゼＰ１（基質としてのｓｓＤＮＡにのみ作用する）によるフットプリント実験により、非鋳型鎖上の少なくとも２６塩基がこれらの酵素により消化されやすいことが明らかになっており（Ｊｉｎｅｋ  Ｍ，Ｊｉａｎｇ  Ｆ，Ｔａｙｌｏｒ  ＤＷ，Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ＳＨ，Ｋａｙａ  Ｅ，Ｍａ  Ｅ，Ａｎｄｅｒｓ  Ｃ，Ｈａｕｅｒ  Ｍ，Ｚｈｏｕ  Ｋ，Ｌｉｎ  Ｓ，Ｋａｐｌａｎ  Ｍ，Ｉａｖａｒｏｎｅ  ＡＴ，Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ  Ｅ，Ｎｏｇａｌｅｓ  Ｅ，Ｄｏｕｄｎａ  ＪＡ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｃａｓ９  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｒｅｖｅａｌ  ＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１４；３４３（６１７６）：１２４７９９７．ＰＭＩＤ：２４５０５１３０を参照されたい）、この考えが更に支持されてい���。ある場合には、Ｃａｓ９が、１５％の高さの頻度にてＤＮＡの感受性の鎖中で単一塩基置換変異を誘発することも報告されている（Ｔｓａｉ  ＳＱ，Ｗｙｖｅｋｅｎｓ  Ｎ，Ｋｈａｙｔｅｒ  Ｃ，Ｆｏｄｅｎ  ＪＡ，Ｔｈａｐａｒ  Ｖ，Ｒｅｙｏｎ  Ｄ，Ｇｏｏｄｗｉｎ  ＭＪ，Ａｒｙｅｅ  ＭＪ，Ｊｏｕｎｇ  ＪＫ．Ｄｉｍｅｒｉｃ  ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＦｏｋＩ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４；３２（６）：５６９−７６．ＰＭＩＤ：２４７７０３２５を参照されたい。この内容全体が参照により本明細書に援用される）。これらの変異の導入の機構は不明ではあるが、全ての場合において変異される塩基はシトシンであり、このことは、シトシンデアミナーゼ酵素の関与を示す可能性がある。まとめると、これらのデータは、単鎖でありその他の酵素に対して感受性である標的ＤＮＡの一部と明確に一致する。複合体が転写を妨げるために特に設計されているｓｇＲＮＡを有するｄＣａｓ９システムでは、転写干渉が、ｓｇＲＮＡが非鋳型鎖に結合する場合にのみ起こることが分かっている。この結果は、ＤＮＡ−Ｃａｓ９複合体中のＤＮＡのある部分がＣａｓ９で保護されておらず、融合タンパク質中のＡＩＤの潜在的な標的となる可能性があることを示唆する１６。従って、デアミナーゼドメインとのＣａｓ９のＮ末端融合体およびＣ末端融合体の両方が本開示の態様に従って有用である。
【００４９】
いくつかの実施形態では、デアミナーゼドメインおよびＣａｓ９ドメインがリンカーにより互いに融合されている。特定の用途を目的とするデアミナーゼ活性のために最適な長さを達成すべく、デアミナーゼドメイン（例えばＡＩＤ）とＣａｓ９ドメインとの間のリンカーの様々な長さおよび柔軟性を利用し得る（例えば、非常に柔軟なリンカーである形（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号９１）、（ＧＧＳ）ｎおよび（Ｇ）ｎからより強固なリンカーである形（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号５）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号９３）（例えばＧｕｉｌｉｎｇｅｒ  ＪＰ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＤＢ，Ｌｉｕ  ＤＲ．Ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ  ｉｎａｃｔｉｖｅ  Ｃａｓ９  ｔｏ  ＦｏｋＩ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４；３２（６）：５７７−８２を参照されたい。内容全体が参照により本明細書に援用される）および（ＸＰ）ｎまで多岐にわたる）３７。
【００５０】
本開示の態様に従ってＣａｓ９ドメインに融合され得る好適な核酸編集酵素および核酸編集ドメインのいくつかの例、例えばデアミナーゼおよびデアミナーゼドメインを下記に記載する。いくつかの実施形態では、各配列の活性ドメイン、例えば局在化シグナル（核局在化シグナル、核外輸送シグナルを除く、細胞質局在化シグナル）を有しないドメインを使用し得ることが理解されるであろう。
【００５１】
ヒトＡＩＤ：
【化７】
2020164529.tif 000009
（下線：核局在化シグナル、二重下線：核外輸送シグナル）
マウスＡＩＤ：
【化８】
2020164529.tif 000010
（下線：核局在化シグナル、二重下線：核外輸送シグナル）
イヌＡＩＤ：
【化９】
2020164529.tif 000011
（下線：核局在化シグナル、二重下線：核外輸送シグナル）
ウシＡＩＤ：
【化１０】
2020164529.tif 000012
（下線：核局在化シグナル、二重下線：核外輸送シグナル）
マウスＡＰＯＢＥＣ−３：
【化１１】
2020164529.tif 000013
（イタリック：核酸編集ドメイン）
ラットＡＰＯＢＥＣ−３：
【化１２】
2020164529.tif 000014
（イタリック：核酸編集ドメイン）
アカゲザルＡＰＯＢＥＣ−３Ｇ：
【化１３】
2020164529.tif 000015
（イタリック：核酸編集ドメイン、下線：細胞質局在化シグナル）
チンパンジーＡＰＯＢＥＣ−３Ｇ：
【化１４】
2020164529.tif 000016
（イタリック：核酸編集ドメイン、下線：細胞質局在化シグナル）
ミドリザルＡＰＯＢＥＣ−３Ｇ：
【化１５】
2020164529.tif 000017
（イタリック：核酸編集ドメイン、下線：細胞質局在化シグナル）
ヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ｇ：
【化１６】
2020164529.tif 000018
（イタリック：核酸編集ドメイン、下線：細胞質局在化シグナル）
ヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ｆ：
【化１７】
2020164529.tif 000019
（イタリック：核酸編集ドメイン）
ヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ｂ：
【化１８】
2020164529.tif 000020
（イタリック：核酸編集ドメイン）
ヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ｃ：
【化１９】
2020164529.tif 000021
（イタリック：核酸編集ドメイン）
ヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ａ：
【化２０】
2020164529.tif 000022
（イタリック：核酸編集ドメイン）
ヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ｈ：
【化２１】
2020164529.tif 000023
（イタリック：核酸編集ドメイン）
ヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ｄ：
【化２２】
2020164529.tif 000024
（イタリック：核酸編集ドメイン）
ヒトＡＰＯＢＥＣ−１：
【化２３】
2020164529.tif 000025
マウスＡＰＯＢＥＣ−１：
【化２４】
2020164529.tif 000026
ラットＡＰＯＢＥＣ−１：
【化２５】
2020164529.tif 000027
ヒトＡＤＡＴ−２：
【化２６】
2020164529.tif 000028
マウスＡＤＡＴ−２：
【化２７】
2020164529.tif 000029
マウスＡＤＡＴ−１：
【化２８】
2020164529.tif 000030
（イタリック：核酸編集ドメイン）
ヒトＡＤＡＴ−１：
【化２９】
2020164529.tif 000031
（イタリック：核酸編集ドメイン）
【００５２】
いくつかの実施形態では、上記に記載した融合タンパク質は、核酸編集酵素の完全長アミノ酸、例えば上記に記載した配列のうちの１つを含む。しかしながら、その他の実施形態では、本明細書に記載した融合タンパク質は核酸編集酵素の完全長配列を含まず、この断片のみを含む。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載した融合タンパク質は、Ｃａｓ９ドメインと、核酸編集酵素の断片であって、例えば核酸編集ドメインを含む断片とを含む。核酸編集ドメインの例示的なアミノ配列を上記配列中においてイタリック体で示しており、そのようなドメインの追加の好適な配列が当業者に明らかであろう。
【００５３】
本発明の態様に従って使用することができ、例えばヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインに融合させることができる追加の好適な核酸編集酵素配列、例えばデアミナーゼ酵素配列およびデアミナーゼドメイン配列が、本開示をベースとして当業者に明らかであろう。いくつかの実施形態では、そのような追加の酵素配列は、本明細書に記載した配列と少なくとも７０％類似するか、少なくとも７５％類似するか、少なくとも８０％類似するか、少なくとも８５％類似するか、少なくとも９０％類似するか、少なくとも９５％類似するか、少なくとも９６％類似するか、少なくとも９７％類似するか、少なくとも９８％類似するか、または少なくとも９９％類似するデアミナーゼ酵素配列またはデアミナーゼドメイン配列を含む。追加の好適なＣａｓ９ドメイン、Ｃａｓ９多様体およびＣａｓ９配列も当業者に明らかであろう。そのような追加の好適なＣａｓ９ドメインの例として、Ｄ１０Ａ変異ドメイン、Ｄ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ変異ドメインおよびＤ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ／Ｎ８６３Ａ変異ドメインが挙げられるがこれらに限定されない（例えばＰｒａｓｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＡＳ９  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐａｉｒｅｄ  ｎｉｃｋａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１３；３１（９）：８３３−８３８を参照されたい。この内容全体が参照により本明細書に援用される）。
【００５４】
Ｃａｓ９ドメインとデアミナーゼドメインとを含む融合タンパク質を生成するのに好適な追加の戦略は、当技術分野での一般的知識と組み合わせた本開示をベースとして当業者に明らかであろう。リンカーを使用してまたはリンカーを使用することなく本開示の態様に従って融合タンパク質を生成するのに好適な戦略も、本開示および当技術分野での知識を考慮して当業者に明らかであろう。例えば、Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＲＩＳＰＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｏｄｕｌａｒ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｃｅｌｌ．２０１３；１５４（２）：４４２−５１は、リンカー（ＳＰＫＫＫＲＫＶＥＡＳ、配列番号２９）として２ＮＬＳを使用したＣａｓ９とＶＰ６４とのＣ末端融合体を転写活性化に利用し得ることを示した。Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＡＳ９  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐａｉｒｅｄ  ｎｉｃｋａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３；３１（９）：８３３−８は、リンカーを介さないＶＰ６４とのＣ末端融合体を転写活性化に利用し得ることを報告した。更に、Ｍａｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３；１０：９７７−９７９は、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号９１）リンカーを使用したＶＰ６４とのＣ末端融合体を転写活性化剤として使用し得ることを報告した。最近では、ｄＣａｓ９−ＦｏｋＩヌクレアーゼ融合体の生成が成功しており、このｄＣａｓ９−ＦｏｋＩヌクレアーゼ融合体は、親Ｃａｓ９酵素と比較して改善された酵素特異性を示す（Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ  ＪＰ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＤＢ，Ｌｉｕ  ＤＲ．Ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ  ｉｎａｃｔｉｖｅ  Ｃａｓ９  ｔｏ  ＦｏｋＩ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４；３２（６）：５７７−８２およびＴｓａｉ  ＳＱ，Ｗｙｖｅｋｅｎｓ  Ｎ，Ｋｈａｙｔｅｒ  Ｃ，Ｆｏｄｅｎ  ＪＡ，Ｔｈａｐａｒ  Ｖ，Ｒｅｙｏｎ  Ｄ，Ｇｏｏｄｗｉｎ  ＭＪ，Ａｒｙｅｅ  ＭＪ，Ｊｏｕｎｇ  ＪＫ．Ｄｉｍｅｒｉｃ  ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＦｏｋＩ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４；３２（６）：５６９−７６．ＰＭＩＤ：２４７７０３２５、ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合タンパク質においてＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号９３）リンカーまたはＧＧＧＧＳ（配列番号９１）リンカーがそれぞれ使用された）。
【００５５】
疾患関連変異を修正するためのＣａｓ９  ＤＮＡ編集融合タンパク質の使用
いくつかの実施形態は、本明細書に記載したＣａｓ９  ＤＮＡ編集融合タンパク質の使用方法を提供する。いくつかの実施形態では、この融合タンパク質を使用して、標的核酸塩基、例えばＣ残基を脱アミノ化させることにより核酸に点変異を導入する。いくつかの実施形態では、標的核酸塩基の脱アミノ化により遺伝的欠陥が修正され、例えば遺伝子産物の機能の喪失を引き起こす点変異が修正される。いくつかの実施形態では、遺伝的欠陥は疾患または障害に関連しており、例えばＩ型糖尿病等のリソソーム蓄積障害または代謝性疾患に関連している。いくつかの実施形態では、本明細書に記載した方法を使用して、疾患または障害に関連する遺伝子産物をコードする遺伝子またはアレルに不活性型の点変異を導入する。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書において、（例えば増殖性疾患の処置で）Ｃａｓ９  ＤＮＡ編集融合タンパク質を利用して発がん遺伝子に不活性型の点変異を導入する方法が提供される。いくつかの実施形態では、不活性型の変異によりコート配列中に未成熟終止コドンが生成され得、これにより短縮遺伝子産物が発現され、例えば完全長タンパク質の機能を欠く短縮タンパク質が発現され得る。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載した方法の目的は、ゲノム編集により機能不全遺伝子の機能を回復させることである。本明細書に記載したＣａｓ９デアミナーゼ融合タンパク質は、例えばヒト細胞培養物中において疾患関連変異を修正することによる、インビトロでの遺伝子編集に基づくヒト治療に有効であることができる。本明細書に記載した融合タンパク質、例えばＣａｓ９ドメインと核酸デアミナーゼドメインとを含む融合タンパク質を使用して任意の単一点Ｔ−＞ＣまたはＡ−＞Ｇ変異を修正し得ることが当業者に理解されるであろう。前者のケースでは、Ｕに戻る変異Ｃの脱アミノ化により変異が修正され、後者のケースでは、変異Ｇと塩基対を作るＣの脱アミノ化後の一連の複製により変異が修正される。
【００５７】
提供する融合タンパク質によりインビトロまたはインビボで修正され得る疾患関連変異の一例は、ＰＩ３ＫＣＡタンパク質におけるＨ１０４７Ｒ（Ａ３１４０Ｇ）多型である。触媒アルファサブユニット（ＰＩ３ＫＣＡ）タンパク質であるホスホイノシチド−３−キナーゼは、ホスファチジルイノシトールのイノシトール環の３−ＯＨ基をリン酸化するように作用する。ＰＩ３ＫＣＡ遺伝子は多様ながん腫で変異することが分かっており、そのため、このＰＩ３ＫＣＡ遺伝子は強力な発がん遺伝子であると見なされる５０。実際には、Ａ３１４０Ｇ変異が数種のＮＣＩ−６０がん細胞株、例えばＨＣＴ１１６細胞株、ＳＫＯＶ３細胞株およびＴ４７Ｄ細胞株等で存在しており、これらの細胞株はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から容易に入手可能である５１。
【００５８】
いくつかの実施形態では、ＰＩ３ＫＣＡタンパク質中でＨ１０４７Ｒ置換を生じさせる、修正される変異を保有する細胞、例えば点変異を保有する細胞、例えばＰＩ３ＫＣＡ遺伝子のエクソン２０中にＡ３１４０Ｇ点変異を保有する細胞を、Ｃａｓ９デアミナーゼ融合タンパク質をコードする発現構築物およびこの融合タンパク質の標的をコーディングＰＩ３ＫＣＡ遺伝子中の各変異部位に定める適切に設計されたｓｇＲＮＡと接触させる。ｓｇＲＮＡが、この融合酵素の標的をＰＩ３ＫＣＡ遺伝子内である非Ｃ残基に定めるように設計されているコントロール実験を実施し得る。処置した細胞のゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＩ３ＫＣＡ遺伝子の関連配列をＰＣＲ増幅させてヒト細胞培養物での融合タンパク質の活性を評価するために配列決定し得る。
【００５９】
ＰＩ３ＫＣＡ中の点変異の修正に関するこの例は説明を目的として記載されており、本開示を限定することは意図されていないことが理解されるであろう。本開示のＤＮＡ編集融合タンパク質を使用して、その他の点変異ならびにその他のがんおよびその他の増殖性疾患等のがん以外の疾患に関連する変異を修正し得ることを当業者は理解するであろう。
【００６０】
疾患に関連した遺伝子およびアレルにおける点変異の修正の成功により、治療および基礎研究での適用による遺伝子修正の新たな戦略が開発される。Ｃａｓ９とデアミナーゼ酵素またはデアミナーゼドメインとの本開示の融合体のような部位特異的な単一塩基修飾システムは、ある種の遺伝子機能が意図的に抑制されているまたは無効にされている「逆」遺伝子治療での適用も有する。この場合では、未成熟終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）に部位特異的に変異するＴｒｐ（ＴＧＧ）残基、Ｇｌｎ（ＣＡＡおよびＣＡＧ）残基またはＡｒｇ（ＣＧＡ）残基を使用して、インビトロで、エキソビボでまたはインビボでタンパク質機能を無効にし得る。
【００６１】
本開示は、本明細書に記載したＣａｓ９  ＤＮＡ編集融合タンパク質により修正され得る点変異に関連するまたはこの点変異に起因する疾患と診断されている対象の処置方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、そのような疾患、例えば上記に記載したＰＩ３ＫＣＡ点変異に関連するがんを有する対象に、点変異を修正するまたは疾患関連遺伝子に不活性化変異を導入する有効量のＣａｓ９デアミナーゼ融合タンパク質を投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、この疾患は増殖性疾患である。いくつかの実施形態では、この疾患は遺伝性疾患である。いくつかの実施形態では、この疾患は腫瘍性疾患である。いくつかの実施形態では、この疾患は代謝性疾患である。いくつかの実施形態では、この疾患はリソソーム蓄積症である。点変異の修正によりまたは不活性化変異の疾患関連遺伝子への導入により処置し得るその他の疾患は当業者に既知であり、本開示はこの点において限定されない。
【００６２】
本開示は、追加の疾患または障害、例えばデアミナーゼにより媒介される遺伝子編集により修正され得る点変異に関連するまたはこの点変異に起因する疾患または障害の処置方法を提供する。数種のそのような疾患が本明細書に記載されており、本明細書に記載した戦略および融合タンパク質により処置され得る追加の好適な疾患が、本開示をベースとして当業者に明らかであろう。好適な疾患および障害の例を下記に列挙する。各配列での具体的な位置または残基のナンバリングは、使用する特定のタンパク質およびナンバリングスキームに依存することが理解されるであろう。ナンバリングは例えば成熟タンパク質の前駆体およびこの成熟タンパク質で異なる場合があり、種毎の配列の差異がナンバリングに影響を及ぼす可能性がある。当業者は、当技術分野で公知の方法により、例えば相同残基の配列アラインメントおよび決定により、任意の相同タンパク質中のおよび各コード核酸中の各残基を同定し得るであろう。好適な疾患および障害の例として、下記が挙げられるがこれらに限定されない：嚢胞性線維症（例えば、Ｓｃｈｗａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ＣＦＴＲ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｉｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｏｒｇａｎｏｉｄｓ  ｏｆ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ．２０１３；１３：６５３−６５８およびＷｕ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｖｉａ  ｕｓｅ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９．Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ．２０１３；１３：６５９−６６２を参照されたい。これらはいずれも遺伝的欠陥を修正するためにデアミナーゼ融合タンパク質を使用しない）；フェニルケトン尿症  −  例えばフェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子における８３５位（マウス）もしくは２４０位（ヒト）または相同残基でのフェニルアラニンからセリンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）−  例えばＭｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１９９７；３９：４０２−４０５を参照されたい；ベルナール・スーリエ症候群（ＢＳＳ）−  例えば血小板膜糖タンパク質ＩＸにおける５５位もしくは相同残基でのフェニルアラニンからセリンへの変異または残基２４もしくは相同残基でのシステインからアルギニン（Ｔ＞Ｃ変異）−  例えばＮｏｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ．１９９７；９７：３１２−３２０およびＡｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｍａｔｏｌ．２０１４；９３：３８１−３８４を参照されたい；表皮剥離性角化症（ＥＨＫ）−  例えばケラチン１における１６０位もしくは１６１位（開始メチオニンを含む場合）または相同残基でのロイシンからプロピンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）−  例えばＣｈｉｐｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９９２；７０：８２１−８２８を参照されたい。また、ｗｗｗ［ｄｏｔ］ｕｎｉｐｒｏｔ［ｄｏｔ］ｏｒｇでのＵＮＩＰＲＯＴデータベースにおける受入番号Ｐ０４２６４も参照されたい；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）−  例えば、プロセシングされた形態のα１−抗トリプシンにおける５４位もしくは５５位（開始メチオニンを含む場合）または相同残基でのまたはプロセシングされていない形態または相同残基における残基７８でのロイシンからプロリンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）−  例えばＰｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１９９３；１７：７４０−７４３を参照されたい。また、ＵＮＩＰＲＯＴデータベースにおける受入番号Ｐ０１０１１も参照されたい；Ｃｈａｒｃｏｔ−Ｍａｒｉｅ−Ｔｏｏｔ病４Ｊ型  −  例えばＦＩＧ４における４１位または相同残基でのイソロイシンからトレオニンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）−  例えばＬｅｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１１；７：ｅ１００２１０４を参照されたい；神経芽細胞腫（ＮＢ）−  例えばカスパーゼ−９における１９７位または相同残基でのロイシンからプロリンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）−  例えばＫｕｎｄｕ  ｅｔ  ａｌ．，３  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１３，３：２２５−２３４を参照されたい；フォン・ウィルブランド病（ｖＷＤ）−  例えばプロセシングされた形態のフォン・ウィルブランド因子における５０９位もしくは相同残基でのまたはプロセシングされていない形態のフォン・ウィルブランド因子における１２７２位もしくは相同残基でのシステインからアルギニンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）−  例えばＬａｖｅｒｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１９９２を参照されたい。また、ＵＮＩＰＲＯＴデータベースにおける受入番号Ｐ０４２７５；８２：６６−７２も参照されたい；先天性筋強直症  −  例えば筋肉の塩化物チャンネル遺伝子ＣＬＣＮ１における２７７位または相同残基でのシステインからアルギニンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）−  例えばＷｅｉｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊ．ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．２０１２；５９０：３４４９−３４６４を参照されたい；遺伝性腎アミロイドーシス  −  例えばプロセシングされた形態のアポリポタンパク質ＡＩＩにおける７８位もしくは相同残基でのまたはプロセシングされていない形態における１０１位もしくは相同残基での終止コドンからアルギニンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）−  例えばＹａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．２００３；６４：１１−１６を参照されたい；拡張型心筋症（ＤＣＭ）−  例えばＦＯＸＤ４遺伝子における１４８位または相同残基でのトリプトファンからアルギニンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）、例えばＭｉｎｏｒｅｔｔｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２００７；１９：３６９−３７２を参照されたい；遺伝性リンパ水腫  −  例えばＶＥＧＦＲ３チロシンキナーゼにおける１０３５位または相同残基でのヒスチジンからアルギニンへの変異（Ａ＞Ｇ変異）、例えばＩｒｒｔｈｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２０００；６７：２９５−３０１を参照されたい；家族性アルツハイマー病  −  例えばプレセニリン１における１４３位または相同残基でのイソロイシンからバリンへの変異（Ａ＞Ｇ変異）、例えばＧａｌｌｏ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．２０１１；２５：４２５−４３１を参照されたい；プリオン病  −  例えばプリオンタンパク質における１２９位または相同残基でのメチオニンからバリンへの変異（Ａ＞Ｇ変異）−  例えばＬｅｗｉｓ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００６；８７：２４４３−２４４９を参照されたい；慢性乳児神経皮膚関節症候群（ＣＩＮＣＡ）−  例えばクリオピリンにおける５７０位または相同残基でのチロシンからシステインへの変異（Ａ＞Ｇ変異）−  例えばＦｕｊｉｓａｗａ  ｅｔ．ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２００７；１０９：２９０３−２９１１を参照されたい；ならびにデスミン関連心筋症（ＤＲＭ）−  例えばαＢクリスタリンにおける１２０位または相同残基でのアルギニンからグリシンへの変異（Ａ＞Ｇ変異）−  例えばＫｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９；２７４：２４１３７−２４１４１を参照されたい。全ての参考文献およびデータベースエントリの内容全体が参照により本明細書に援用される。
【００６３】
本明細書で開示したＣａｓ９：核酸編集酵素／ドメイン融合タンパク質の標的を標的部位、例えば編集する点変異を有する部位に定めるためには、Ｃａｓ９：核酸編集酵素／ドメイン融合タンパク質とガイドＲＮＡ、例えばｓｇＲＮＡとを同時に発現させることが概して必要であることが当業者に明らかであろう。本明細書の別の箇所でより詳細に説明するように、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９結合を可能にするｔｒａｃｒＲＮＡフレームワークとガイド配列とを概して含み、このガイド配列は、Ｃａｓ９：核酸編集酵素／ドメイン融合タンパク質に配列特異性を付与する。いくつかの実施形態では、このガイドＲＮＡは構造５’−［ガイド配列］−ｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａｇａａａｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａａｃｕｕｇａａａａａｇｕｇｇｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｕｕｕｕ−３’（配列番号３８）を含み、この構造中、ガイド配列は、標的配列に相補的である配列を含む。このガイド配列は、典型的には２０ヌクレオチド長である。Ｃａｓ９：核酸編集酵素／ドメイン融合タンパク質の標的を特定のゲノム標的部位に定めるのに好適なガイドＲＮＡの配列は、本開示をベースとして当業者に明らかであろう。そのような好適なガイドＲＮＡ配列は、編集する標的ヌクレオチドの５０ヌクレオチド上流内のまたは下流内の核酸配列に相補的であるガイド配列を概して含む。Ｃａｓ９：核酸編集酵素／ドメイン融合タンパク質の標的を特定の標的配列に定めるのに適したガイドＲＮＡ配列のいくつかの例を下記に記載する。
【００６４】
ホスホイノシチド−３−キナーゼ触媒アルファサブユニット（ＰＩ３ＫＣＡまたはＰＩＫ３ＣＡ）におけるＨ１０４７Ｒ（Ａ３１４０Ｇ）多型（変異したヌクレオチドの位置および各コドンに下線を引いている）：
【化３０】
2020164529.tif 000032
（ヌクレオチド配列  −  配列番号３９、タンパク質配列  −  配列番号４０）。
【００６５】
Ｃａｓ９：核酸編集酵素／ドメイン融合タンパク質の標的を変異Ａ３１４０Ｇ残基に定めるのに好適なガイド配列の例として、５’−ａｕｃｇｇａａｕｃｔａｕｕｕｕｇａｃｕｃ−３’（配列番号４１）、５’−ｕｃｇｇａａｕｃｕａｕｕｕｕｇａｃｕｃｇ−３’（配列番号４２）、５’−ｃｕｕａｇａｕａａａａｃｕｇａｇｃａａｇ−３’（配列番号４３）、５’−ａｕｃｕａｕｕｕｕｇａｃｕｃｇｕｕｃｕｃ−３’（配列番号４４）、５’−ｕａａａａｃｕｇａｇｃａａｇａｇｇｃｕｕ−３’（配列番号４５）、５’−ｕｇｇｕｇｇｃｕｇｇａｃａａｃａａａａａ−３’（配列番号４６）、５’−ｇｃｕｇｇａｃａａｃａａａａａｕｇｇａｕ−３’（配列番号４７）、５’−ｇｕｇｕｕａａｕｕｕｇｕｃｇｕａｃｇｕａ−３’（配列番号４８）が挙げられるがこれらに限定されない。Ｃａｓ９：核酸編集酵素／ドメイン融合タンパク質の標的を、変異ＰＩ３ＫＣＡ配列、下記に記載する追加の配列のうちのいずれか、または疾患と関連する追加の変異配列に定めるのに好適な追加のガイド配列が、本開示をベースとして当業者に明らかであろう。
【００６６】
フェニルケトン尿症  フェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子における残基２４０でのフェニルアラニンのセリンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）（変異したヌクレオチドの位置および各コドンの位置に下線を引いている）：
【化３１】
2020164529.tif 000033
（ヌクレオチド配列  −  配列番号４９、タンパク質配列  −  配列番号５０）。
ベルナール・スーリエ症候群（ＢＳＳ）−  血小板膜糖タンパク質ＩＸにおける残基２４でのシステインからアルギニン（Ｔ＞Ｃ変異）：
【化３２】
2020164529.tif 000034
（ヌクレオチド配列  −  配列番号５１、タンパク質配列  −  配列番号５２）。
表皮剥離性角化症（ＥＨＫ）−  ケラチン１における残基１６１でのロイシンからプロリンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）：
【化３３】
2020164529.tif 000035
（ヌクレオチド配列  −  配列番号５３、タンパク質配列  −  配列番号５４）。
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）−  α１−抗トリプシンにおける残基５４でのロイシンからプロリンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）：
【化３４】
2020164529.tif 000036
（ヌクレオチド配列  −  配列番号５５、タンパク質配列  −  配列番号５６）。
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）−  α１−抗キモトリプシンにおける残基７８でのロイシンからプロリンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）：
【化３５】
2020164529.tif 000037
（ヌクレオチド配列  −  配列番号８９、タンパク質配列  −  配列番号９０）。
神経芽細胞腫（ＮＢ）−  カスパーゼ−９における残基１９７でのロイシンからプロリンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）：
【化３６】
2020164529.tif 000038
（ヌクレオチド配列  −  配列番号５７、タンパク質配列  −  配列番号５８）。
シャルコー・マリー・トゥース病４Ｊ型  −  ＦＩＧ４における残基４１でのイソロイシンからトレオニンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）：
【化３７】
2020164529.tif 000039
（ヌクレオチド配列  −  配列番号５９、タンパク質配列  −  配列番号６０）。
フォン・ウィルブランド病（ｖＷＤ）−  フォン・ウィルブランド因子における残基１２７２でのシステインからアルギニンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）：
【化３８】
2020164529.tif 000040
（ヌクレオチド配列  −  配列番号６１、タンパク質配列  −  配列番号６２）。
先天性筋強直症  −  筋肉の塩化物チャンネル遺伝子ＣＬＣＮ１における２７７位でのシステインからアルギニンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）：
【化３９】
2020164529.tif 000041
（ヌクレオチド配列  −  配列番号６３、タンパク質配列  −  配列番号６４）。
遺伝性腎アミロイドーシス  −  アポリポタンパク質ＡＩＩにおける残基１１１での終止コドンからアルギニンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）：
【化４０】
2020164529.tif 000042
（ヌクレオチド配列  −  配列番号６５、タンパク質配列  −  配列番号６６）。
拡張型心筋症（ＤＣＭ）−  ＦＯＸＤ４遺伝子における１４８位でのトリプトファンからアルギニンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）：
【化４１】
2020164529.tif 000043
（ヌクレオチド配列  −  配列番号６７、タンパク質配列  −  配列番号６８）。
遺伝性リンパ水腫  −  ＶＥＧＦＲ３チロシンキナーゼにおける残基１０３５でのヒスチジンからアルギニンへの変異（Ａ＞Ｇ変異）：
【化４２】
2020164529.tif 000044
（ヌクレオチド配列  −  配列番号６９、タンパク質配列  −  配列番号７０）。
家族性アルツハイマー病  −  プレセニリン１における残基１４３でのイソロイシンからバリンへの変異（Ａ＞Ｇ変異）：
【化４３】
2020164529.tif 000045
（ヌクレオチド配列  −  配列番号７１、タンパク質配列  −  配列番号７２）。
プリオン病  −  プリオンタンパク質における残基１２９でのメチオニンからバリンへの変異（Ａ＞Ｇ変異）：
【化４４】
2020164529.tif 000046
（ヌクレオチド配列  −  配列番号７３、タンパク質配列  −  配列番号７４）。
慢性乳児神経皮膚関節症候群（ＣＩＮＣＡ）−  クリオピリンにおける残基５７０でのチロシンからシステインへの変異（Ａ＞Ｇ変異）：
【化４５】
2020164529.tif 000047
（ヌクレオチド配列  −  配列番号７５、タンパク質配列  −  配列番号７６）。
デスミン関連心筋症（ＤＲＭ）−  αＢクリスタリンにおける残基１２０でのアルギニンからグリシンへの変異（Ａ＞Ｇ変異）：
【化４６】
2020164529.tif 000048
（ヌクレオチド配列  −  配列番号７７、タンパク質配列  −  配列番号７８）。
【００６７】
ベータ−サラセミア  −  一例は、ヘモグロビンＢにおける残基１１５でのロイシンからプロリンへの変異である。
【化４７】
2020164529.tif 000049
（ヌクレオチド配列  −  配列番号７９、タンパク質配列  −  配列番号８０）。
上記に記載した配列は例示であり、本開示の範囲を限定することは意図されていないことを理解しなければならない。疾患と関連しているおよびＣａｓ９：核酸編集酵素／ドメイン融合タンパク質による修正に適している点変異の好適な追加の配列、ならびに好適なガイドＲＮＡ配列が、本開示をベースとして当業者に明らかであろう。
【００６８】
レポーターシステム
本開示のいくつかの態様は、本明細書に記載した融合タンパク質のデアミナーゼ活性の検出に使用し得るレポーターシステムを提供する。いくつかの実施形態では、このレポーターシステムは、デアミナーゼ活性がルシフェラーゼの発現をもたらすルシフェラーゼベースのアッセイである。デアミナーゼドメイン（例えばＡＩＤドメイン）の潜在的な基質無差別性の影響を最小化するために、非意図的に脱アミノ化の標的となる可能性がある残基（例えば、レポーターシステム内のｓｓＤＮＡ上に潜在的に存在する可能性があるオフターゲットＣ残基）の数を最小化する。いくつかの実施形態では、目的の標的残基は、翻訳を開始することができないルシフェラーゼ遺伝子のＡＣＧ変異した開始コドンに位置し得る。所望のデアミナーゼ活性によりＡＣＧ＞ＡＵＧ修飾が生じ、そのため、ルシフェラーゼの翻訳ならびにデアミナーゼ活性の検出および定量化が可能になる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、一本鎖Ｃ残基を最小化するために、変異した開始コドンと、Ｌｙｓ（ＡＡＡ）、Ａｓｎ（ＡＡＴ）、Ｌｅｕ（ＴＴＡ）、Ｉｌｅ（ＡＴＴ、ＡＴＡ）、Ｔｙｒ（ＴＡＴ）、またはＰｈｅ（ＴＴＴ）残基のストレッチからなるルシフェラーゼ遺伝子の先頭との間にリーダー配列が挿入されている。リーダー配列がルシフェラーゼの発現または活性に悪影響を及ぼさないことを確認するために、結果として生じた変異体を試験し得る。変異した開始コドンによるルシフェラーゼのバックグラウンド活性も決定し得る。
【００７０】
このレポーターシステムを使用して多くの異なるｓｇＲＮＡを試験し、例えば各デアミナーゼ（例えばＡＩＤ酵素）が標的にし得る標的ＤＮＡ配列に対する残基を決定し得る（図３）。Ｃａｓ９−ＤＮＡのバブルの大きさが未知であることから、特定のＣａｓ９デアミナーゼ融合タンパク質のオフターゲット効果を評価するために、非鋳型鎖を標的とするｓｇＲＮＡも試験し得る。いくつかの実施形態では、そのようなｓｇＲＮＡは、変異した開始コドンがｓｇＲＮＡと塩基対を作り得ないように設計される。
【００７１】
プログラム可能で部位特異的なＣからＵへの修飾が可能である融合タンパク質を同定すると、このタンパク質の活性を更に特徴付けることができる。ルシフェラーゼアッセイからのデータを、例えば、ｓｇＲＮＡ標的ＤＮＡに対するヌクレオチドが特定の融合タンパク質による脱アミノ化の標的とされることを説明するヒートマップに組み込むことができる。いくつかの実施形態では、各融合体に関するルシフェラーゼアッセイにおいて最高活性が生じる位置が「標的」位置と見なされ、その他の全てがオフターゲット位置と見なされる。
【００７２】
いくつかの実施形態では、様々なＡＰＯＢＥＣ３酵素またはこのデアミナーゼドメインとのＣａｓ９融合体が提供される。いくつかの実施形態では、その他の核酸編集酵素または触媒ドメインとのＣａｓ９融合タンパク質が提供され、このＣａｓ９融合タンパク質として、例えばシチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ１およびＡＣＦ１／ＡＳＦ等のｓｓＲＮＡ編集酵素、ならびにＣａｓ９に融合するとｓｓＤＮＡ編集活性に使用され得るアデノシンデアミナーゼのＡＤＡＴファミリ３８が挙げられる。そのような融合タンパク質の活性を、上記に記載した同じレポーターシステムおよびアッセイを使用して試験し得る。
【００７３】
いくつかの実施形態では、本明細書において、不活性化された開始コドン、例えば３’−ＴＡＣ−５’から３’−ＣＡＣ−５’の鋳型鎖上の変異を含むレポーター遺伝子を含むレポーターシステムが提供される。標的Ｃの脱アミノ化に成功すると、対応するｍＲＮＡを５’−ＧＵＧ−３’の代わりに５’−ＡＵＧ−３’として転写することができ、レポーター遺伝子の翻訳が可能になる。好適なレポーター遺伝子は当業者に明らかであろう。
【００７４】
上記レポーターシステムの例示的な実施形態の説明は説明のみを目的として記載されており、限定することは意図されていない。追加のレポーターシステム、例えば上記で詳細に説明した例示的なシステムの変形も本開示に包含される。
【実施例】
【００７５】
実施例１：融合タンパク質
例示的なＣａｓ９：デアミナーゼ融合タンパク質を下記に記載する。
Ｃａｓ９：ヒトＡＩＤ融合体（Ｃ末端）
【化４８】
2020164529.tif 000050
（下線：核局在化シグナル、二重下線：核外搬出シグナル、太字：リンカー配列）
Ｃａｓ９：ヒトＡＩＤ融合体（Ｎ末端）
【化４９】
2020164529.tif 000051
（下線：核局在化シグナル、太字：リンカー配列）
Ｃａｓ９：マウスＡＩＤ融合体（Ｃ末端）
【化５０】
2020164529.tif 000052
（下線：核局在化シグナル、太字：リンカー配列、二重下線：核外搬出シグナル）
Ｃａｓ９：ヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ｇ融合体（Ｎ末端）
【化５１】
2020164529.tif 000053
（下線：核局在化シグナル、太字：リンカー（１ＮＬＳ）
Ｃａｓ９：ヒトＡＰＯＢＥＣ−１融合体（Ｎ末端）
【化５２】
2020164529.tif 000054
（下線：核局在化シグナル、太字：リンカー（１ＮＬＳ）、（配列番号９２）
Ｃａｓ９：ヒトＡＤＡＴ１融合体（Ｎ末端）
【化５３】
2020164529.tif 000055
（下線：核局在化シグナル、太字：リンカー配列）
Ｃａｓ９：ヒトＡＤＡＴ１融合体（末端）
【化５４】
2020164529.tif 000056
（下線：核局在化シグナル、太字：リンカー配列）
【００７６】
実施例２：Ｃａｓ９融合タンパク質によるＰＩ３Ｋ点変異の修正
結果としてＰＩ３Ｋタンパク質においてＨ１０４７Ｒアミノ酸置換が生じる、ＰＩ３ＫＣＡ遺伝子のエクソン２０におけるＡ３１４０Ｇ点変異を、この変異タンパク質をコードする核酸と、Ｃａｓ９：ＡＩＤ（配列番号３０）融合タンパク質またはＣａｓ９：ＡＰＯＢＥＣ１（配列番号９２）融合タンパク質およびこの融合タンパク質の標的をこのコーディングＰＩ３ＫＣＡ遺伝子中の変異部位に定める適切に設計したｓｇＲＮＡとを接触させることにより修正する。各エクソン２０配列のゲノムＰＣＲ、例えば３０００〜３２５０個のヌクレオチドのＰＣＲ増幅産物の生成、およびその後のＰＣＴ増幅産物の配列決定により、Ａ３１４０Ｇ点変異を確認する。
【００７７】
エクソン２０中にＡ３１４０Ｇ点変異を含む変異ＰＩ３Ｋタンパク質を発現する細胞と、Ｃａｓ９：ＡＩＤ（配列番号３０）融合タンパク質またはＣａｓ９：ＡＰＯＢＥＣ１（配列番号９２）融合タンパク質をコードする発現構築物およびこの融合タンパク質の標的をこのコーディングＰＩ３ＫＣＡ遺伝子のアンチセンス鎖中の変異部位に定める適切に設計したｓｇＲＮＡとを接触させる。このｓｇＲＮＡは、配列５’−ａｕｃｇｇａａｕｃｔａｕｕｕｕｇａｃｕｃｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａｇａａａｕａ  ｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａａｃｕｕｇａａａａａｇｕｇｇｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｕｕｕｕ  ３’（配列番号８１）；５’−ｕｃｇｇａａｕｃｕａｕｕｕｕｇａｃｕｃｇｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａｇａａａｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａａｃｕｕｇａａａａａ  ｇｕｇｇｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｕｕｕｕ−３’（配列番号８２）；５’−ｃｕｕａｇａｕａａａａｃｕｇａｇｃａａｇｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａｇａａ  ａｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａａｃｕｕｇａａａａａｇｕｇｇｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｕｕｕｕ−３’（配列番号８３）；５’−ａｕｃｕａｕｕｕｕｇａｃｕｃｇｕｕｃｕｃｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａｇａａａｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａａｃｕｕｇ  ａａａａａｇｕｇｇｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｕｕｕｕ−３’（配列番号８４）；５’−ｕａａａａｃｕｇａｇｃａａｇａｇｇｃｕｕｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａ  ｇａａａｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａａｃｕｕｇａａａａａｇｕｇｇｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｕｕｕｕ−３’（配列番号８５）；５’−ｕｇｇｕｇｇｃｕｇｇａｃａａｃａａａａａｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａｇａａａｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａａ  ｃｕｕｇａａａａａｇｕｇｇｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｕｕｕｕ−３’（配列番号８６）；５’−ｇｃｕｇｇａｃａａｃａａａａａｕｇｇａｕｇｕｕｕｕａ  ｇａｇｃｕａｇａａａｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａａｃｕｕｇａａａａａｇｕｇｇｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｕｕｕｕ−３’（配列番号８７）；または５’−ｇｕｇｕｕａａｕｕｕｇｕｃｇｕａｃｇｕａｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａｇａａａｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａａｇｇｃｕａ  ｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａａｃｕｕｇａａａａａｇｕｇｇｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｕｕｕｕ（配列番号８８）である。
【００７８】
Ｃａｓ９：ＡＩＤ融合タンパク質またはＣａｓ９：ＡＰＯＢＥＣ１融合タンパク質のシトシンデアミナーゼ活性により、変異Ｇ３１４０と塩基対を形成するシトシンのウリジンへの脱アミノ化が生じる。１回の複製後に野生型Ａ３１４０を回復させる。処置した細胞のゲノムＤＮＡを抽出し、３０００〜３２５０個のヌクレオチドのＰＣＲ増幅産物を適切なＰＣＲプライマーで増幅させる。このＰＣＲ増幅産物の配列決定により、融合タンパク質による細胞の処置後のＡ３１４０Ｇ点変異の修正を確認する。
【００７９】
実施例３：Ｃａｓ９融合タンパク質によるプレセニリン１点変異の修正
結果としてＰＳＥＮ１タンパク質においてＩ１４３Ｖアミノ酸置換が生じる、プレセニリン１（ＰＳＥＮ１）遺伝子のコドン１４３におけるＡ−＞Ｇ点変異を、この変異ＰＳＥＮ１タンパク質をコードする核酸と、Ｃａｓ９：ＡＩＤ（配列番号３０）融合タンパク質またはＣａｓ９：ＡＰＯＢＥＣ１（配列番号９２）融合タンパク質およびこの融合タンパク質の標的をこのコーディングＰＳＥＮ１遺伝子中の変異部位に定める適切に設計したｓｇＲＮＡとを接触させることにより修正する。家族性アルツハイマー病に関連する例示的なＰＳＥＮ１  Ｉ１４３Ｖ変異の説明に関して例えばＧａｌｌｏ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．２０１１；２５：４２５−４３１を参照されたい。各ＰＳＥＮ１配列のゲノムＰＣＲ、例えばエクソン１４３を中心とする約１００〜２５０個のヌクレオチドのＰＣＲ増幅産物の生成、およびその後のＰＣＴ増幅産物の配列決定により、Ａ−＞Ｇ点変異を確認する。
【００８０】
この変異ＰＳＥＮ１タンパク質を発現する細胞と、Ｃａｓ９：ＡＩＤ（配列番号３０）融合タンパク質またはＣａｓ９：ＡＰＯＢＥＣ１（配列番号９２）融合タンパク質をコードする発現構築物およびこの融合タンパク質の標的をこのコーディングＰＳＥＮ１遺伝子のアンチセンス鎖中の変異部位に定める適切に設計したｓｇＲＮＡとを接触させる。Ｃａｓ９：ＡＩＤ融合タンパク質またはＣａｓ９：ＡＰＯＢＥＣ１融合タンパク質のシトシンデアミナーゼ活性により、コドン１４３中の変異Ｇと塩基対を形成するシトシンのウリジンへの脱アミノ化が生じる。１回の複製後に野生型Ａを回復させる。処置した細胞のゲノムＤＮＡを抽出し、１００〜２５０個のヌクレオチドのＰＣＲ増幅産物を適切なＰＣＲプライマーで増幅させる。このＰＣＲ増幅産物の配列決定により、融合タンパク質による細胞の処置後のＡ−＞Ｇ点変異の修正を確認する。
【００８１】
実施例４：Ｃａｓ９融合タンパク質によるα１−抗トリプシン点変異の修正
結果としてα１−抗トリプシンタンパク質においてＬ５５Ｐアミノ酸置換が生じる、α１−抗トリプシン遺伝子のコドン５５におけるＴ−＞Ｃ点変異を、この変異α１−抗トリプシンタンパク質をコードする核酸と、Ｃａｓ９：ＡＤＡＴ１融合タンパク質（配列番号３５または配列番号３６）およびこの融合タンパク質の標的をこのコーディングα１−抗トリプシン遺伝子中の変異部位に定める適切に設計したｓｇＲＮＡとを接触させることにより修正する。慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に関連する例示的なコドン５５  Ｔ−＞Ｃ変異のより詳細な説明に関して例えばＰｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１９９３；１７：７４０−７４３を参照されたい。コドン５５をコードする各α１−抗トリプシン配列のゲノムＰＣＲ、例えば約１００〜２５０個のヌクレオチドのＰＣＲ増幅産物の生成、およびその後のＰＣＴ増幅産物の配列決定により、Ｔ−＞Ｃ点変異を確認する。
【００８２】
この変異α１−抗トリプシンタンパク質を発現する細胞と、Ｃａｓ９：ＡＩＤ（配列番号３０）融合タンパク質またはＣａｓ９：ＡＰＯＢＥＣ１（配列番号９２）融合タンパク質をコードする発現構築物およびこの融合タンパク質の標的をこのコーディングα１−抗トリプシン遺伝子中のセンス鎖上のコドン５５における変異ヌクレオチドに定める適切に設計したｓｇＲＮＡとを接触させる。Ｃａｓ９：ＡＤＡＴ１融合タンパク質のシトシンデアミナーゼ活性により変異シトシンのウリジンへの脱アミノ化が生じ、そのため、この変異が修正される。処置した細胞のゲノムＤＮＡを抽出し、１００〜２５０個のヌクレオチドのＰＣＲ増幅産物を適切なＰＣＲプライマーで増幅させる。このＰＣＲ増幅産物の配列決定により、融合タンパク質による細胞の処置後のα１−抗トリプシン遺伝子のコドン５５におけるＴ−＞Ｃ点変異の修正を確認する。
【００８３】
実施例５：Ｃａｓ９融合タンパク質によるフォン・ウィルブランド因子点変異の修正
結果としてフォン・ウィルブランド因子タンパク質においてＣ５０９Ａアミノ酸置換が生じる、フォン・ウィルブランド因子遺伝子のコドン５０９におけるＴ−＞Ｃ点変異を、この変異フォン・ウィルブランド因子タンパク質をコードする核酸と、Ｃａｓ９：ＡＤＡＴ１融合タンパク質（配列番号３５または配列番号３６）およびこの融合タンパク質の標的をこのコーディングフォン・ウィルブランド因子遺伝子のセンス鎖中の変異部位に定める適切に設計したｓｇＲＮＡとを接触させることにより修正する。フォン・ウィルブランド病（ｖＷＤ）に関連する例示的なフォン・ウィルブランド因子Ｃ５０９Ａ変異の説明に関して例えばＬａｖｅｒｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１９９２；８２：６６−７を参照されたい。各フォン・ウィルブランド因子ゲノム配列のゲノムＰＣＲ、例えばエクソン５０９を中心とする約１００〜２５０個のヌクレオチドのＰＣＲ増幅産物の生成、およびその後のＰＣＴ増幅産物の配列決定により、Ｔ−＞Ｃ点変異を確認する。
【００８４】
この変異フォン・ウィルブランド因子タンパク質を発現する細胞と、Ｃａｓ９：ＡＤＡＴ１融合タンパク質（配列番号３５または配列番号３６）をコードする発現構築物およびこの融合タンパク質の標的をこのコーディングフォン・ウィルブランド因子遺伝子のセンス鎖における変異部位に定める適切に設計したｓｇＲＮＡとを接触させる。Ｃａｓ９：ＡＤＡＴ１融合タンパク質のシトシンデアミナーゼ活性によりコドン５０９中の変異シトシンのウリジンへの脱アミノ化が生じ、そのため、この変異が修正される。処置した細胞のゲノムＤＮＡを抽出し、１００〜２５０個のヌクレオチドのＰＣＲ増幅産物を適切なＰＣＲプライマーで増幅させる。このＰＣＲ増幅産物の配列決定により、融合タンパク質による細胞の処置後のフォン・ウィルブランド因子遺伝子のコドン５０９におけるＴ−＞Ｃ点変異の修正を確認する。
【００８５】
実施例６：Ｃａｓ９融合タンパク質によるカスパーゼ９点変異の修正  −  神経芽細胞腫
結果としてカスパーゼ−９タンパク質においてＬ１９７Ｐアミノ酸置換が生じる、カスパーゼ−９遺伝子のコドン１９７におけるＴ−＞Ｃ点変異を、この変異カスパーゼ−９タンパク質をコードする核酸と、Ｃａｓ９：ＡＤＡＴ１融合タンパク質（配列番号３５または配列番号３６）およびこの融合タンパク質の標的をこのコーディングカスパーゼ−９遺伝子のセンス鎖中の変異部位に定める適切に設計したｓｇＲＮＡとを接触させることにより修正する。神経芽細胞腫（ＮＢ）に関連する例示的なカスパーゼ−９  Ｌ１９７Ｐ変異の説明に関して例えばＬｅｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１１；７：ｅ１００２１０４を参照されたい。各カスパーゼ−９ゲノム配列のゲノムＰＣＲ、例えばエクソン１９７を中心とする約１００〜２５０個のヌクレオチドのＰＣＲ増幅産物の生成、およびその後のＰＣＴ増幅産物の配列決定により、Ｔ−＞Ｃ点変異を確認する。
【００８６】
この変異カスパーゼ−９タンパク質を発現する細胞と、Ｃａｓ９：ＡＤＡＴ１融合タンパク質（配列番号３５または配列番号３６）をコードする発現構築物およびこの融合タンパク質の標的をこのコーディングカスパーゼ−９遺伝子のセンス鎖における変異部位に定める適切に設計したｓｇＲＮＡとを接触させる。Ｃａｓ９：ＡＤＡＴ１融合タンパク質のシトシンデアミナーゼ活性によりコドン１９７中の変異シトシンのウリジンへの脱アミノ化が生じ、そのため、この変異が修正される。処置した細胞のゲノムＤＮＡを抽出し、１００〜２５０個のヌクレオチドのＰＣＲ増幅産物を適切なＰＣＲプライマーで増幅させる。このＰＣＲ増幅産物の配列決定により、融合タンパク質による細胞の処置後のカスパーゼ−９遺伝子のコドン１９７におけるＴ−＞Ｃ点変異の修正を確認する。
【００８７】
実施例７：２種のｄＣａｓ９−ＡＰＯＢＥＣ１融合タンパク質のデアミナーゼ活性
下記の異なるリンカーを有する２種のｄＣａｓ９−ＡＰＯＢＥＣ１融合タンパク質を生成した。
ｒＡＰＯＢＥＣ１＿ＧＧＳ＿ｄＣａｓ９：
【化５５】
2020164529.tif 000057
下線＝ｒＡＰＯＢＥＣ１、二重下線＝ｄＣａｓ９。
ｒＡＰＯＢＥＣ１＿（ＧＧＳ）３＿ｄＣａｓ９：
【化５６】
2020164529.tif 000058
下線＝ｒＡＰＯＢＥＣ１、二重下線＝ｄＣａｓ９。
【００８８】
両方の融合タンパク質のデアミナーゼ活性を調べた。デアミナーゼアッセイはＮｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１４，４２，ｐ．１０９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４，２７９，ｐ５３３７９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０１４，８８，ｐ．３８５０およびＪ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００６，８０，ｐ．５９９２を出典としており、これらのそれぞれの内容全体が参照により援用される。
【００８９】
これらの融合タンパク質をコードする発現構築物を、ＣＭＶ主鎖プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド５２９７０、Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ  ＪＰ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＤＢ，Ｌｉｕ  ＤＲ．Ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ  ｉｎａｃｔｉｖｅ  Ｃａｓ９  ｔｏ  ＦｏｋＩ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４；３２（６）：５７７−８２を参照されたい）に挿入した。ＴＮＴ  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、これらの融合タンパク質を発現させた。９０分後、５μＬの溶解物を、５’−標識したｓｓＤＮＡ基質（Ｃｙ３−ＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＣＣＧＣＧＧＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴ、配列番号９６）およびＵＤＧ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ）と共に３７℃で３時間にわたりインキュベートした。次いで、ＮａＯＨの１Ｍ溶液（１０μＬ）を添加し、脱塩基部位でＤＮＡを切断した。図４を参照されたい。このＤＮＡを、１０％ＴＢＥ  ＰＡＧＥゲル上で分解させた（図５）。ｐＵＣ１９をＴＮＴシステム中でインキュベートした陰性コントロール、およびこのＤＮＡを標的Ｃの代わりに「Ｕ」で合成している陽性コントロールも含めた。図５には、両方の融合タンパク質がシトシンデアミナーゼ活性を示すことが図示されている。
【００９０】
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１６．Ｑｉ  ＬＳ，Ｌａｒｓｏｎ  ＭＨ，Ｇｉｌｂｅｒｔ  ＬＡ，Ｄｏｕｄｎａ  ＪＡ，Ｗｅｉｓｓｍａｎ  ＪＳ，Ａｒｋｉｎ  ＡＰ，Ｌｉｍ  ＷＡ．Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ  ａｓ  ａｎ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ．２０１３；１５２（５）：１１７３−８３．ＰＭＩＤ：２３４５２８６０．
１７．Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａ  Ｐ，Ｋｏｃａｋ  ＤＤ，Ｖｏｃｋｌｅｙ  ＣＭ，Ａｄｌｅｒ  ＡＦ，Ｋａｂａｄｉ  ＡＭ，Ｐｏｌｓｔｅｉｎ  ＬＲ，Ｔｈａｋｏｒｅ  ＰＩ，Ｇｌａｓｓ  ＫＡ，Ｏｕｓｔｅｒｏｕｔ  ＤＧ，Ｌｅｏｎｇ  ＫＷ，Ｇｕｉｌａｋ  Ｆ，Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ＧＥ，Ｒｅｄｄｙ  ＴＥ，Ｇｅｒｓｂａｃｈ  ＣＡ．ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｇｅｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ｂａｓｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３；１０（１０）：９７３−６．ＰＭＩＤ：２３８９２８９５．
１８．Ｍａｌｉ  Ｐ，Ａａｃｈ  Ｊ，Ｓｔｒａｎｇｅｓ  ＰＢ，Ｅｓｖｅｌｔ  ＫＭ，Ｍｏｏｓｂｕｒｎｅｒ  Ｍ，Ｋｏｓｕｒｉ  Ｓ，Ｙａｎｇ  Ｌ，Ｃｈｕｒｃｈ  ＧＭ．ＣＡＳ９  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐａｉｒｅｄ  ｎｉｃｋａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３；３１（９）：８３３−８．ＰＭＩＤ：２３９０７１７１．
１９．Ｇｉｌｂｅｒｔ  ＬＡ，Ｌａｒｓｏｎ  ＭＨ，Ｍｏｒｓｕｔ  Ｌ，Ｌｉｕ  Ｚ，Ｂｒａｒ  ＧＡ，Ｔｏｒｒｅｓ  ＳＥ，Ｓｔｅｒｎ−Ｇｉｎｏｓｓａｒ  Ｎ，Ｂｒａｎｄｍａｎ  Ｏ，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  ＥＨ，Ｄｏｕｄｎａ  ＪＡ，Ｌｉｍ  ＷＡ，Ｗｅｉｓｓｍａｎ  ＪＳ，Ｑｉ  ＬＳ．ＣＲＩＳＰＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｏｄｕｌａｒ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｃｅｌｌ．２０１３；１５４（２）：４４２−５１．ＰＭＩＤ：２３８４９９８１．
２０．Ｌａｒｓｏｎ  ＭＨ，Ｇｉｌｂｅｒｔ  ＬＡ，Ｗａｎｇ  Ｘ，Ｌｉｍ  ＷＡ，Ｗｅｉｓｓｍａｎ  ＪＳ，Ｑｉ  ＬＳ．ＣＲＩＳＰＲ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＣＲＩＳＰＲｉ）  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３；８（１１）：２１８０−９６．ＰＭＩＤ：２４１３６３４５．
２１．Ｍａｌｉ  Ｐ，Ｙａｎｇ  Ｌ，Ｅｓｖｅｌｔ  ＫＭ，Ａａｃｈ  Ｊ，Ｇｕｅｌｌ  Ｍ，ＤｉＣａｒｌｏ  ＪＥ，Ｎｏｒｖｉｌｌｅ  ＪＥ，Ｃｈｕｒｃｈ  ＧＭ．ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｉａ  Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３；３３９（６１２１）：８２３−６．ＰＭＩＤ：２３２８７７２２．
２２．Ｃｏｌｅ−Ｓｔｒａｕｓｓ  Ａ，Ｙｏｏｎ  Ｋ，Ｘｉａｎｇ  Ｙ，Ｂｙｒｎｅ  ＢＣ，Ｒｉｃｅ  ＭＣ，Ｇｒｙｎ  Ｊ，Ｈｏｌｌｏｍａｎ  ＷＫ，Ｋｍｉｅｃ  ＥＢ．Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ａｎｅｍｉａ  ｂｙ  ａｎ  ＲＮＡ−ＤＮＡ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９６；２７３（５２８０）：１３８６−９．ＰＭＩＤ：８７０３０７３．
２３．Ｔａｇａｌａｋｉｓ  ＡＤ，Ｏｗｅｎ  ＪＳ，Ｓｉｍｏｎｓ  ＪＰ．Ｌａｃｋ  ｏｆ  ＲＮＡ−ＤＮＡ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ｃｈｉｍｅｒａｐｌａｓｔ）  ｍｕｔａｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｍｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｅｖ．２００５；７１（２）：１４０−４．ＰＭＩＤ：１５７９１６０１．
２４．Ｒａｙ  Ａ，Ｌａｎｇｅｒ  Ｍ．Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：ｅｎｄｓ  ａｓ  ｔｈｅ  ｍｅａｎｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．２００２；７（１０）：４３５−４０．ＰＭＩＤ  １２３９９１７７．
２５．Ｂｒｉｔｔ  ＡＢ，Ｍａｙ  ＧＤ．Ｒｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｐｌａｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．２００３；８（２）：９０−５．ＰＭＩＤ：１２５９７８７６．
２６．Ｖａｇｎｅｒ  Ｖ，Ｅｈｒｌｉｃｈ  ＳＤ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ＤＮＡ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｖａｒｉｅｓ  ａｌｏｎｇ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８８；１７０（９）：３９７８−８２．ＰＭＩＤ：３１３７２１１．
２７．Ｓａｌｅｈ−Ｇｏｈａｒｉ  Ｎ，Ｈｅｌｌｅｄａｙ  Ｔ．Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｐａｉｒｓ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓ  ｐｈａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００４；３２（１２）：３６８３−８．ＰＭＩＤ：１５２５２１５２．
２８．Ｌｏｍｂａｒｄｏ  Ａ，Ｇｅｎｏｖｅｓｅ  Ｐ，Ｂｅａｕｓｅｊｏｕｒ  ＣＭ，Ｃｏｌｌｅｏｎｉ  Ｓ，Ｌｅｅ  ＹＬ，Ｋｉｍ  ＫＡ，Ａｎｄｏ  Ｄ，Ｕｒｎｏｖ  ＦＤ，Ｇａｌｌｉ  Ｃ，Ｇｒｅｇｏｒｙ  ＰＤ，Ｈｏｌｍｅｓ  ＭＣ，Ｎａｌｄｉｎｉ  Ｌ．Ｇｅｎｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｚｉｎｃｅ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｇｒａｓｅ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７；２５（１１）：１２９８−３０６．ＰＭＩＤ：１７９６５７０７．
２９．Ｃｏｎｔｉｃｅｌｌｏ  ＳＧ．Ｔｈｅ  ＡＩＤ／ＡＰＯＢＥＣ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｕｔａｔｏｒｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２００８；９（６）：２２９．ＰＭＩＤ：１８５９８３７２．
３０．Ｒｅｙｎａｕｄ  ＣＡ，Ａｏｕｆｏｕｃｈｉ  Ｓ，Ｆａｉｌｉ  Ａ，Ｗｅｉｌｌ  ＪＣ．Ｗｈａｔ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＡＩＤ：ｍｕｔａｔｏｒ，ｏｒ  ａｓｓｅｍｂｌｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｍｕｔａｓｏｍｅ？Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；４（７）：６３１−８．
３１．Ｂｈａｇｗａｔ  ＡＳ．ＤＮＡ−ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅｓ：ｆｒｏｍ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｔｏ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｄｅｆｅｎｓｅ．ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ（Ａｍｓｔ）．２００４；３（１）：８５−９．ＰＭＩＤ：１４６９７７６３．
３２．Ｎａｖａｒａｔｎａｍ  Ｎ，Ｓａｒｗａｒ  Ｒ．Ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００６；８３（３）：１９５−２００．ＰＭＩＤ：１６７２０５４７．
３３．Ｈｏｌｄｅｎ  ＬＧ，Ｐｒｏｃｈｎｏｗ  Ｃ，Ｃｈａｎｇ  ＹＰ，Ｂｒａｎｓｔｅｉｔｔｅｒ  Ｒ，Ｃｈｅｌｉｃｏ  Ｌ，Ｓｅｎ  Ｕ，Ｓｔｅｖｅｎｓ  ＲＣ，Ｇｏｏｄｍａｎ  ＭＦ，Ｃｈｅｎ  ＸＳ．Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｖｉｒａｌ  ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２００８；４５６（７２１８）：１２１−４．ＰＭＩＤ：１８８４９９６８．
３４．Ｃｈｅｌｉｃｏ  Ｌ，Ｐｈａｍ  Ｐ，Ｐｅｔｒｕｓｋａ  Ｊ，Ｇｏｏｄｍａｎ  ＭＦ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ＤＮＡ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００９；２８４（４１）．２７７６１−５．ＰＭＩＤ：１９６８４０２０．
３５．Ｐｈａｍ  Ｐ，Ｂｒａｎｓｔｅｉｔｔｅｒ  Ｒ，Ｇｏｏｄｍａｎ  ＭＦ．Ｒｅｗａｒｄ  ｖｅｒｓｕｓ  ｒｉｓｋ：ＤＮＡ  ｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅｓ  ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００５；４４（８）：２７０３−１５．ＰＭＩＤ  １５７２３５１６．
３６．Ｂａｒｂａｓ  ＣＦ，Ｋｉｍ  ＤＨ．Ｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ  ｆｕｓｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ．ＰＣＴ  Ｉｎｔ  Ａｐｐｌ．２０１０；ＷＯ２０１０１３２０９２Ａ２  ２０１０１１１８．
３７．Ｃｈｅｎ  Ｘ，Ｚａｒｏ  ＪＬ，Ｓｈｅｎ  ＷＣ．Ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｎｋｅｒｓ：ｐｒｏｐｅｒｔｙ，ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２０１３；６５（１０）：１３５７−６９．ＰＭＩＤ：２３０２６６３７．
３８．Ｇｅｒｂｅｒ  ＡＰ，Ｋｅｌｌｅｒ  Ｗ．ＲＮＡ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｂｙ  ｂａｓｅ  ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ：ｍｏｒｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ，ｍｏｒｅ  ｔａｒｇｅｔｓ，ｎｅｗ  ｍｙｓｔｅｒｉｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．２００１；２６（６）：３７６−８４．ＰＭＩＤ：１１４０６４１１．
３９．Ｙｕａｎ  Ｌ，Ｋｕｒｅｋ  Ｉ，Ｅｎｇｌｉｓｈ  Ｊ，Ｋｅｅｎａｎ  Ｒ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．２００５；６９（３）：３７３−９２．ＰＭＩＤ：１６１４８３０３．
４０．Ｃｏｂｂ  ＲＥ，Ｓｕｎ  Ｎ，Ｚｈａｏ  Ｈ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｔｏｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３；６０（１）：８１−９０．ＰＭＩＤ：２２４６５７９５．
４１．Ｂｅｒｓｈｔｅｉｎ  Ｓ，Ｔａｗｆｉｋ  ＤＳ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２００８；１２（２）：１５１−８．ＰＭＩＤ：１８２８４９２４．
４２．Ｈｉｄａ  Ｋ，Ｈａｎｅｓ  Ｊ，Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ  Ｍ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２００７；５９（１５）：１５６２−７８．ＰＭＩＤ：１７９３３４１８．
４３．Ｅｓｖｅｌｔ  ＫＭ，Ｃａｒｌｓｏｎ  ＪＣ，Ｌｉｕ  ＤＲ．Ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１１；４７２（７３４４）：４９９−５０３．ＰＭＩＤ：２１４７８８７３．
４４．Ｈｕｓｉｍｉ  Ｙ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌｓｔａｔ．Ａｄｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９８９；２５：１−４３．ＰＭＩＤ：２６９６３３８．
４５．Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ，Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ．Ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ＴｏｌＡ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｃｅｌｌ．１９９７；９０（２）：３５１−６０．ＰＭＩＤ：９２４４３０８．
４６．Ｎｅｌｓｏｎ  ＦＫ，Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＳＭ，Ｓｍｉｔｈ  ＧＰ．Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ  ｎｏｎｉｎｆｅｃｔｉｖｅ  ｍｕｔａｎｔ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｎｐｏｌａｒ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ＩＩＩ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９８１；１０８（２）：３３８−５０．ＰＭＩＤ：６２５８２９２．
４７．Ｒａｋｏｎｊａｃ  Ｊ，Ｍｏｄｅｌ  Ｐ．Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｐＩＩＩ  ｉｎ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９８；２８２（１）：２５−４１．
４８．Ｓｍｉｔｈ  ＧＰ．Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｈａｇｅ：ｎｏｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｔｈａｔ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｃｌｏｎｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｖｉｒｉｏｎ  ｓｕｒｆａｃｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８５；２２８（４７０５）：１３１５−７．ＰＭＩＤ：４００１９４４．
４９．Ｓｈｅｒｉｄａｎ  Ｃ．Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｉｎｄｓ  ｉｔｓ  ｎｉｃｈｅ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１；２９（２）：１２１−８．ＰＭＩＤ：２１３０１４３５．
５０．Ｌｅｅ  ＪＷ，Ｓｏｕｎｇ  ＹＨ，Ｋｉｍ  ＳＹ，Ｌｅｅ  ＨＷ，Ｐａｒｋ  ＷＳ，Ｎａｍ  ＳＷ，Ｋｉｍ  ＳＨ，Ｌｅｅ  ＪＹ，Ｙｏｏ  ＮＪ，Ｌｅｅ  ＳＨ．ＰＩＫ３ＣＡ  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００５；２４（８）：１４７７−８０．ＰＭＩＤ：１５６０８６７８．
５１．Ｉｋｅｄｉｏｂｉ  ＯＮ，Ｄａｖｉｅｓ  Ｈ，Ｂｉｇｎｅｌｌ  Ｇ，Ｅｄｋｉｎｓ  Ｓ，Ｓｔｅｖｅｎｓ  Ｃ，Ｏ’Ｍｅａｒａ  Ｓ，Ｓａｎｔａｒｉｕｓ  Ｔ，Ａｖｉｓ  Ｔ，Ｂａｒｔｈｏｒｐｅ  Ｓ，Ｂｒａｃｋｅｎｂｕｒｙ  Ｌ，Ｂｕｃｋ  Ｇ，Ｂｕｔｌｅｒ  Ａ，Ｃｌｅｍｅｎｔｓ  Ｊ，Ｃｏｌｅ  Ｊ，Ｄｉｃｋｓ  Ｅ，Ｆｏｒｂｅｓ  Ｓ，Ｇｒａｙ  Ｋ，Ｈａｌｌｉｄａｙ  Ｋ，Ｈａｒｒｉｓｏｎ  Ｒ，Ｈｉｌｌｓ  Ｋ，Ｈｉｎｔｏｎ  Ｊ，Ｈｕｎｔｅｒ  Ｃ，Ｊｅｎｋｉｎｓｏｎ  Ａ，Ｊｏｎｅｓ  Ｄ，Ｋｏｓｍｉｄｏｕ  Ｖ，Ｌｕｇｇ  Ｒ，Ｍｅｎｚｉｅｓ  Ａ，Ｍｉｒｏｎｅｎｋｏ  Ｔ，Ｐａｒｋｅｒ  Ａ，Ｐｅｒｒｙ  Ｊ，Ｒａｉｎｅ  Ｋ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  Ｄ，Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  Ｒ，Ｓｍａｌｌ  Ａ，Ｓｍｉｔｈ  Ｒ，Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｈ，Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  Ｐ，Ｔｅａｑｕｅ  Ｊ，Ｔｏｆｔｓ  Ｃ，Ｖａｒｉａｎ  Ｊ，Ｗｅｂｂ  Ｔ，Ｗｅｓｔ  Ｓ，Ｗｉｄａａ  Ｓ，Ｙａｔｅｓ  Ａ，Ｒｅｉｎｈｏｌｄ  Ｗ，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  ＪＮ，Ｓｔｒａｔｔｏｎ  ＭＲ，Ｆｕｔｒｅａｌ  ＰＡ，Ｗｏｏｓｔｅｒ  Ｒ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ２４  ｋｎｏｗｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＮＣＩ−６０  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｓｅｔ．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２００６；５（１１）：２６０６−１２．ＰＭＩＤ：１７０８８４３７．
【００９１】
本明細書で言及した、例えば背景、概要、詳細な説明、実施例および／または参考文献セクションで言及した全ての刊行物、特許、特許出願、公報およびデータベースエントリ（例えば配列データベースエントリ）は、個々の刊行物、特許、特許出願、公報およびデータベースエントリが参照により本明細書に具体的におよび個々に援用されたかのようにその全体が参照により援用される。矛盾する場合には、本出願、例えば本明細書における任意の定義が統制するであろう。
【００９２】
均等物および範囲
当業者は、本明細書に記載した実施形態の多くの均等物を認識し得るか、または通常の実験のみを使用して確認することができる。本開示の範囲は上記の説明に限定されることを意図されておらず、特許請求の範囲で規定されている通りである。
【００９３】
「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」等の冠詞は、反対の指示がない限りまたは文脈から別途明らかでない限り、１つまたは複数を意味し得る。ある群の２つ以上のメンバーの間に「または（ｏｒ）」を含む請求項または記載は、反対の指示がない限りまたは文脈から別途明らかでない限り、この群のメンバーのうちの１つ、複数または全てが存在する場合に満たされると見なされる。群の２つ以上のメンバーの間に「または（ｏｒ）」を含む群の開示は、この群の厳密に１つのメンバーが存在する実施形態、この群の複数のメンバーが存在する実施形態、およびこの群のメンバーの全てが存在する実施形態を提供する。簡略化のために、これらの実施形態は本明細書において個々に詳述されていないが、これらの実施形態のそれぞれが本明細書に記載されており、具体的に特許請求されるまたは特許請求されない場合があることが理解されるであろう。
【００９４】
本発明は、１つもしくは複数の請求項からのまたは本明細書の１つもしくは複数の関連部分からの１つまたは複数の限定、要素、節または記述用語が別の請求項に導入される全ての変形形態、組み合わせおよび順列を包含することを理解しなければならない。例えば、別の請求項に依存する請求項を改変して、同じ基礎の請求項に依存する任意のその他の請求項中に見出される限定のうちの１つまたは複数を含ませることができる。更に、特許請求の範囲が組成物を列挙する場合、別途示さない限りまたは矛盾もしくは不一致が生じるであろうことが当業者に明らかでない限り、本明細書に開示した製造方法もしくは使用方法のうちのいずれかに従ってまたは当技術分野で既知の方法（存在する場合）に従って、この組成物を製造する方法または使用する方法が包含されることを理解しなければならない。
【００９５】
要素がリストとして示される場合、例えばマーカッシュ群形式で示される場合、この要素のあらゆる可能な部分群も開示されており、任意の要素または要素の部分群をこの群から除去し得ることを理解しなければならない。用語「含む」は開放的であることが意図されており、追加の要素または工程の包含を許容することも留意される。一般に、ある実施形態、ある製品またはある方法が特定の要素、特徴または工程を含むと見なされる場合、そのような要素、特徴または工程からなるまたは本質的になる実施形態、製品または方法も提供されることを理解すべきである。簡略化のために、これらの実施形態は本明細書において個別に詳述されていないが、これらの実施形態のそれぞれが本明細書に記載されており、具体的に特許請求されるまたは特許請求されない場合があることが理解されるであろう。
【００９６】
範囲が示されている場合には終点が含まれる。更に、別途示さない限りまたは文脈および／もしくは当業者の知識から別途明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈が別途明確に規定しない限り、いくつかの実施形態では、述べられた範囲内の任意の具体的な値をこの範囲の下限の単位の十分の一まで仮定し得ることを理解しなければならない。簡略化のために、各範囲中の値は本明細書において個別に詳述されていないが、これらの値のそれぞれが本明細書に記載されており、具体的に特許請求されるまたは特許請求されない場合があることが理解されるであろう。別途示さない限りまたは文脈および／もしくは当業者の知識から別途明らかでない限り、範囲として表される値は、示された範囲内の任意の部分範囲を仮定することができ、この部分範囲の終点は、この範囲の下限の単位の十分の一と同程度の正確さまで表されることも理解しなければならない。
【００９７】
加えて、本発明の任意の特定の実施形態が請求項のうちの任意の１つまたは複数から明確に除外される場合があることを理解しなければならない。範囲が示されている場合、この範囲内の任意の値が請求項のうちの任意の１つまたは複数から明確に除外される場合がある。本発明の組成物および／または方法の任意の実施形態、要素、特徴、用途または態様を任意の１つまたは複数の請求項から除外し得る。簡略化のために、１つまたは複数の要素、特徴、目的または態様が除外されている実施形態の全てが本明細書において明確に規定されているわけではない。
【図１】
2020164529.tif 000059
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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