(57)【要約】【課題】難治性感染根管歯の感染を制御する薬剤として好適な、歯の根管への浸透性が良好であり、スメア層除去、細菌除去、バイオフィルム除去のために用いられる歯科口腔用組成物を提供する。【解決手段】歯科口腔用組成物は、抗菌ナノ粒子と、ナノバブルとを含有するから、ナノバブルの自己圧壊作用が、抗菌ナノ粒子の抗菌作用と相乗的に作用することにより、歯および口腔内の感染を制御することができる。【選択図】図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗菌ナノ粒子と、ナノバブルとを含有することを特徴とする、歯科口腔用組成物。
【請求項２】
前記ナノバブルのゼータ電位が−１０ｍＶ以下である、請求項１に記載の歯科口腔用組成物。
【請求項３】
前記ナノバブルの濃度が１×１０６〜１×１０９個／ｍＬであり、
前記ナノバブルの平均気泡径が１０〜３００ｎｍである、
請求項１または２に記載の歯科口腔用組成物。
【請求項４】
前記抗菌ナノ粒子の平均粒径が２０〜５００ｎｍである、請求項１または２に記載の歯科口腔用組成物。
【請求項５】
前記抗菌ナノ粒子の濃度が０．０００１〜０．３％（ｗ／ｖ）である、請求項１または２に記載の歯科口腔用組成物。
【請求項６】
前記抗菌ナノ粒子が、抗生剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウィルス剤、消毒剤、根管拡大剤、抗炎症剤、創傷治癒や組織再生を促進する生理活性物質および幹細胞由来セクレトーム・エクソゾーム・ｍｉＲＮＡからなる群のいずれか一つ以上を内包している、あるいは他の成分を内包しない単味である請求項１または２に記載の歯科口腔用組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の歯科口腔用組成物を含有する、歯の根管内の細菌感染治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯のう蝕治療、抜髄・感染根管治療、歯周疾患治療、修復・補綴治療、インプラント周囲炎治療等に用いる、歯内・歯外部、歯周組織、舌、口蓋、口腔内修復物・補綴物の細菌を抑制する抗菌ナノ粒子とナノバブルとを併用した歯科口腔用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
超高齢化社会において歯の健康・機能維持は健康長寿を達成する上で必須である。深い虫歯で神経を除去（抜髄）すると２０年ぐらいまでに再感染して根の下に膿が溜まる根尖性歯周炎（感染根管）となり（頻度１５〜２０％、年間１，０００万件）、さらにその約２５％は難治性に陥り、抜歯・破折の一途を辿る。よって、本発明者は「抜髄しても根尖性歯周炎に至らないようにする歯髄再生治療法」を開発し、すでに臨床研究５症例で安全性を確認し、有効性を示唆した（非特許文献１）。さらにイヌ根尖性歯周炎モデルにおいても、除菌後、抜髄歯と同様の治療法を行うことにより、根尖歯周組織および歯髄再生に成功している（非特許文献２）。一方、難治性感染根管の病因は通常根管貼薬に用いる水酸化カルシウム製剤に対して耐性のE. faecalis（Enterococcus faecalis）が象牙細管や複雑な細孔をもつ歯根の奥深くに侵入し、バイオフィルムを形成するためと推定されている（非特許文献３）。したがって、難治性感染根管治療においては、根管の洗浄・貼薬、および根尖歯周組織の化学的・物理的刺激の可及的除去法の開発が重要である。
【０００３】
難治性感染根管は咬合に影響を与えるばかりでなく、慢性の感染源として免疫力の衰えた高齢者の全身に多大な影響を及ぼす。骨粗鬆症治療薬服用中の場合顎骨壊死の危険性により抜歯できない場合も多い。また、抜歯してインプラントを適用できる症例は中高齢者では減少する。したがって、難治性感染根管歯の感染を制御し、抜歯や破折を回避し、歯の機能回復を図ることは、超高齢社会で健康維持に重要である。
【０００４】
本発明の発明者は、歯科用ナノバブル発生装置を用いて、ナノサイズの超微細な気泡（ナノバブル）の優れた浸透亢進作用を利用して、標的となる患部に薬剤を有利に浸透させ得る薬剤組成物を提案している（特許文献１）。しかし、難治性感染根管歯の感染を制御する薬剤として、ドキシサイクリン等の抗菌剤をナノバブルと併用すると、ナノバブルの浸透亢進作用が発揮されないという問題を見出した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開  ＷＯ２０１６／０８４７８０Ａ１号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nakashima M., Iohara K., Murakami M., Nakamura H., Sato Y., Ariji Y., Matsushita K.: Pulp regeneration by transplantation of dental pulp stem cells in pulpitis: A pilot clinical study. Stem Cell Res Therapy Mar 9; 8(1):61, 2017.
【非特許文献２】藤田将典、庵原耕一郎、堀場直樹、立花克郎、中村洋、中島美砂子：「感染根管歯におけるナノバブルと超音波を用いた根管内無菌化と歯髄再生」日本歯科保存   学雑誌. 57(2): 170-179, 2014.
【非特許文献３】興地隆史：「歯内療法の争点―難治性根尖性歯周炎の病因と臨床―」Niigata Dent. J. 36(2): 1-15, 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はかかる問題に鑑みてなされたものであって、難治性感染根管歯の感染を制御する薬剤として好適な、歯の根管への浸透性が良好であり、スメア層除去、細菌除去、バイオフィルム除去のために用いられる歯科口腔用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明にかかる歯の根管内の洗浄・貼薬用に適した歯科口腔用組成物薬剤は、以下の構成を備えている。
抗菌ナノ粒子と、ナノバブルとを含有することを特徴とする、歯科口腔用組成物。
組成物中に含有されるナノバブルの気相と液相との界面間で界面張力により加圧が生じ、気泡径が小さくなると表面張力による内圧が高くなる。内圧が高くなることで気泡内の気体が液体中に溶け出し、気泡径が小さくなり気泡が消滅する。この自己圧壊作用により、水や窒素などが分解されフリーラジカルが生成される。ナノバブルの自己圧壊作用が、抗菌ナノ粒子の抗菌作用と相乗的に作用することによって、歯および口腔内の感染を制御することができる。
【０００９】
前記ナノバブルは、ゼータ電位が−１０ｍＶ以下、濃度が１×１０６〜１×１０９個／ｍＬ、平均気泡径が１０〜３００ｎｍであることが好ましい。
【００１０】
前記抗菌ナノ粒子は、平均粒径が２０〜５００ｎｍ、前記抗菌ナノ粒子の濃度が０．０００１〜０．３％（ｗ／ｖ）であることが好ましく、また、抗生剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウィルス剤、消毒剤、根管拡大剤、創傷治癒や組織再生を促進する生理活性物質抗炎症剤、創傷治癒や組織再生を促進する生理活性物質および幹細胞由来セクレトーム・エクソゾーム・ｍｉＲＮＡからなる群のいずれか一つ以上を内包していてもよく、あるいは他の成分を内包しない単味であっても良い。
【００１１】
本発明の歯科口腔用組成物を含有する、歯の根管内の細菌感染治療用組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の歯科口腔用組成物は、抗菌ナノ粒子とナノバブルとを併用することにより、効果的に歯の根管内のスメア層の除去、細菌・バイオフィルムの除去ならびに歯髄および根尖歯周組織の抗炎症・治癒促進・再生促進が可能である。したがって、根管の洗浄により、難治性感染根管歯の細菌感染を制御し、治癒・再生が促進できる細菌感染治療用組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】粒度分布を示す（Ａ）ナノバブル水のみ（ＮＢ）、（Ｂ）ドキシサイクリンと９８％ナノバブル水併用（ＤＯＸＹ＋ＮＢ）、（Ｃ）最終濃度０．００６％（ｗ／ｖ）抗菌ナノ粒子のみ（ＡＡ）、（Ｄ）最終濃度０．００６重量体積％（ｗ／ｖ）抗菌ナノ粒子と９８％ナノバブル水併用（ＡＡ＋ＮＢ）グラフである。
【図２】ブタ歯根内の根管壁（ＲＣ）を（Ａ）蒸留水（ＤＷ）、（Ｂ）５０％ナノバブル水のみ（ＮＢ）、（Ｃ）最終濃度０．００６％（ｗ／ｖ）抗菌ナノ粒子（ＡＡ）、（Ｄ）抗菌ナノ粒子と５０％ナノバブル水併用（ＡＡ＋ＮＢ）、（Ｅ）最終濃度３５μｇ／ｍＬドキシサイクリン（ＤＯＸＹ）、（Ｆ）最終濃度５μｇ／ｍＬドキシサイクリンと５０％ナノバブル水の併用（ＤＯＸＹ＋ＮＢ）を用いて５分間洗浄した後、象牙細管内深部に対して、蛍光薬剤（テトラサイクリン）を浸透させた蛍光実体顕微鏡写真である。
【図３】根管内のスメア層を（Ａ）蒸留水（ＤＷ）、（Ｂ）９８％ナノバブル水（ＮＢ）、（Ｃ）最終濃度０．００６％（ｗ／ｖ）抗菌ナノ粒子（ＡＡ）、（Ｄ）最終濃度０．００６％（ｗ／ｖ）抗菌ナノ粒子と９８％ナノバブル水併用（ＡＡ＋ＮＢ）により５分間洗浄した後の走査電子顕微鏡像の図面代用写真であり、（Ｅ）洗浄後の象牙細管数（象牙質壁０．０１ｍｍ２あたりのTotal number of dentinal tubules）を統計学的に解析したグラフである。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図４】根管内のスメア層を（Ａ）９８％ナノバブル水（ＮＢ）、（Ｂ）最終濃度３５μｇ／ｍＬドキシサイクリン（ＤＯＸＹ）、（Ｃ）ドキシサイクリンとナノバブル水併用（ＤＯＸＹ＋ＮＢ）により５分間洗浄した後の走査電子顕微鏡像の図面代用写真であり、（Ｄ）洗浄後の象牙細管数（象牙質壁０．０１ｍｍ２あたりのTotal number of dentinal tubules）を統計学的に解析したグラフである。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図５】Enterococcus faecalis (ATCC 19433)を嫌気条件で１４日間培養しハイドロキシアパタイトディスク上に形成したバイオフィルムの除去を（Ａ）蒸留水（ＤＷ）、（Ｂ）９８％ナノバブル水（ＮＢ）、（Ｃ）最終濃度０．００６％（ｗ／ｖ）抗菌ナノ粒子（ＡＡ）、（Ｄ）最終濃度０．００６％（ｗ／ｖ）抗菌ナノ粒子と９８％ナノバブル水の併用（ＡＡ＋ＮＢ）により５分行った場合の走査電子顕微鏡像を示す図面代用写真であり、（Ｅ）一定面積（０．００２５ｍｍ２）あたりの細菌数（Total number of bacteria）を統計学的に解析したグラフである。
【図６】イヌ歯での感染根管モデルの作製法を模式的に示す断面図である。
【図７】イヌ感染根管モデルにおけるナノバブルとドキシサイクリンの併用による根管洗浄と貼薬処置を模式的に示す断面図である。
【図８】イヌ感染根管モデルにおけるドキシサイクリン・ナノバブル水の根管治療効果を示す図である。（Ａ）ドキシサイクリン（ＤＯＸＹ、５０μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ）に対する根管治療開始時の細菌の感受性を示す図面代用写真。（Ｂ）最終濃度３５μｇ／ｍＬドキシサイクリン単味（ＤＯＸＹ）、あるいは最終濃度３５μｇ／ｍＬドキシサイクリンと９９％ナノバブル水併用（ＤＯＸＹ＋ＮＢ）による根管洗浄と貼薬後の根管内の細菌コロニー数の変化を示すグラフである。
【図９】ドキシサイクリン抵抗性の難治性感染根管モデル（イヌ）におけるナノバブル水と抗菌ナノ粒子の併用による根管洗浄と貼薬処置を模式的に示す断面図である。
【図１０】（Ａ）抗菌ナノ粒子（ＡＡ）に対する根管治療開始時の細菌の感受性を示す図面代用写真、（Ｂ）イヌドキシサイクリン抵抗性の難治性感染根管モデルにおける９８％ナノバブル水と最終濃度０．００６％（ｗ／ｖ）抗菌ナノ粒子の併用による根管治療効果を示す、根管洗浄と貼薬後の根管内の細菌コロニー数の変化を示すグラフである。
【図１１】イヌドキシサイクリン抵抗性の難治性感染根管モデルにおける９８％ナノバブル水と最終濃度０．００６％（ｗ／ｖ）抗菌ナノ粒子の根管治療による根尖病巣の骨吸収像の変化を治療開始前および治療２か月後にＣＢＣＴにて検査し、ＯｓｉｒｉＸにより解析した図である。（Ａ）ＣＢＣＴによる骨吸収像を示す図面代用写真であり、（Ｂ）抗菌ナノ粒子（ＡＡ）およびナノバブル水の併用（ＡＡ＋ＮＢ）による根管洗浄と貼薬による治療２か月後の骨吸収体積を術前と統計学的に比較したグラフである。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１２】イヌドキシサイクリン抵抗性の難治性感染根管モデルにおける９８％ナノバブル水と最終濃度０．００６％（ｗ／ｖ）抗菌ナノ粒子根管治療による細菌およびバイオフィルムの除去効果をグラム染色により比較した図である。（Ａ）は抗菌ナノ粒子のみ（ＡＡ）であり、根管治療後４か月であり、（Ｂ）は抗菌ナノ粒子およびナノバブル水を併用（ＡＡ＋ＮＢ）し、さらに歯髄幹細胞（アテロコラーゲン中に膜分取歯髄幹細胞およびＧ−ＣＳＦを含む根管充填材）を移植して２か月後の歯根を示す。（Ａ）（Ｂ）における歯のａ、ｂ、ｃの枠はそれぞれ、ａ歯根表面、ｂセメント小腔(lacunae)、ｃ根尖部歯周組織を示す。
【図１３】イヌドキシサイクリン抵抗性の難治性感染根管モデルにおける９８％ナノバブル水と最終濃度０．００６％（ｗ／ｖ）抗菌ナノ粒子の根管治療による根尖病巣の骨吸収像の変化を移植前、歯髄幹細胞治療２か月後の移植時および歯髄幹移植後２か月後の抜去時にＣＢＣＴにて検査し、ＯｓｉｒｉＸにより解析した図である。（Ａ）は、ＣＢＣＴによる骨吸収像を示す図面代用写真であり、（Ｂ）は抗菌ナノ粒子（ＡＡ）および抗菌ナノ粒子とナノバブル水との併用（ＡＡ＋ＮＢ）による根管洗浄と貼薬後、さらに、抗菌ナノ粒子（ＡＡ）および抗菌ナノ粒子とナノバブル水との併用（ＡＡ＋ＮＢ）で根管治療した根について細胞治療２か月後および移植後２か月後の骨吸収面積を術前と統計学的に比較したグラフである。
【図１４】Streptococcus ｍutans (ＡＴＣＣ  ２５１７５)を好気条件で２日間培養しハイドロキシアパタイトディスク上に形成したバイオフィルムの除去を、（Ａ）蒸留水（ＤＷ）、（Ｂ）５０％ナノバブル水（ＮＢ）、（Ｃ）最終濃度０．００３％（ｗ／ｖ）抗菌ナノ粒子と５０％ナノバブル水の併用（ＡＡ＋ＮＢ）、（Ｄ）最終濃度０．００６％（ｗ／ｖ）抗菌ナノ粒子と５０％ナノバブル水の併用（ＡＡ＋ＮＢ）、（Ｅ）最終濃度０．０３％（ｗ／ｖ）抗菌ナノ粒子と５０％ナノバブル水の併用（ＡＡ＋ＮＢ）、（Ｆ）最終濃度０．０７５％（ｗ／ｖ）抗菌ナノ粒子と５０％ナノバブル水の併用（ＡＡ＋ＮＢ）、（Ｇ）最終濃度０．００３％（ｗ／ｖ）抗菌ナノ粒子（ＡＡ）、（Ｈ）最終濃度０．００６％（ｗ／ｖ）抗菌ナノ粒子（ＡＡ）、（Ｉ）最終濃度０．０３％（ｗ／ｖ）抗菌ナノ粒子（ＡＡ）、（Ｊ）最終濃度０．０７５％（ｗ／ｖ）抗菌ナノ粒子（ＡＡ）により５分行った場合の走査電子顕微鏡像を示す図面代用写真であり、（Ｋ）一定面積（０．００２５ｍｍ２）あたりの細菌数（Total number of bacteria）を統計学的に解析したグラフである（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の歯科口腔用組成物は、抗菌ナノ粒子とナノバブルとを含有している。歯科口腔用組成物の成分である抗菌ナノ粒子およびナノバブルについて、以下に説明する。
【００１５】
＜抗菌ナノ粒子＞
抗菌ナノ粒子は、シアノアクリレートナノポリマーすなわちナノサイズのアクリレート系ポリマー粒子であり、細菌壁の糖鎖ペプチド表層と親和性が高い。抗菌ナノ粒子が細菌に吸着すると、その部分は細菌壁の合成が阻害される。よって、細菌は内圧が保てずに自己融解する特徴を有する。抗菌ナノ粒子は生分解されるため蓄積されず安全性が高く、耐性ができず自然環境を崩さない。シアノアクリレートナノポリマーの原料として用いられるモノマーの側鎖構造体は直鎖のｎ−ブチル基であり、代謝系にてホルムアルデヒドを生じないため安全である。また、抗菌ナノ粒子は低濃度で抗菌効果を有する。
【００１６】
抗菌ナノ粒子の平均粒径は、細菌壁の合成を阻害する観点から、２０〜５００ｎｍが好ましく、１００〜５００ｎｍがより好ましく、１３０〜２５０ｎｍがさらに好ましい。本発明において平均粒径とは、メジアン径（Ｄ５０）すなわち累積分布５０体積％時の粒径をいう。また、本発明において範囲「Ａ〜Ｂ」はＡ以上Ｂ以下を示す。
【００１７】
歯科口腔用組成物に含まれる抗菌ナノ粒子の濃度（ｗ／ｖ）は、０．０００１〜０．３％が好ましく、０．００１〜０．０６％がより好ましく、０．００２〜０．０１％がさらに好ましい。なお、本発明において抗菌ナノ粒子の濃度は、重量／容量パーセント（％（ｗ／ｖ））すなわち歯科口腔用組成物１００（ｍＬ）に含まれる抗菌ナノ粒子の重量（ｇ）で示す。
【００１８】
抗菌ナノ粒子は、例えば、特許第４９６３２２１号に記載の方法により製造することができる。この方法により製造される抗菌ナノ粒子は多孔性である。このため、抗菌ナノ粒子の孔の内部に薬剤を抱合させることが可能である。抗菌ナノ粒子に抱合させる薬剤としては、例えば、アンピシリン、ドキシサイクリン、バンコマイシン、レボフロキサンジン等の抗生剤・抗菌剤が挙げられる。また、例えば、抗真菌剤、抗ウィルス剤、消毒剤、根管拡大剤、抗炎症剤、創傷治癒や組織再生を促進する生理活性物質および幹細胞由来セクレトーム・エクソゾーム・ｍｉＲＮＡがあげられる。
【００１９】
抗菌ナノ粒子に抗菌剤を抱合させることで、抗菌ナノ粒子の吸着性により抗菌剤を細菌壁に付着させ、効果的に抗菌作用を奏する。ただし、上述したとおり、抗菌ナノ粒子は細菌壁の合成を阻害して細菌を自己融解することにより抗菌作用を奏するから、抗菌剤を抱合させないで用いることもできる。
【００２０】
抗菌剤にはナノバブルの性質に影響を及ぼすものも存在する。しかし、抗菌剤を抗菌ナノ粒子に抱合させた状態で用いることにより、抗菌剤によるナノバブルへの影響を抑制できる。
【００２１】
抗菌ナノ粒子に薬剤を抱合させる方法としては、薬剤の水溶液中に抗菌ナノ粒子を浸漬させる方法や、薬剤の共存下において、シアノアクリレート系モノマーをアニオン重合させる方法等が挙げられる。これら例示した二つの方法では、簡便であり抱合率が高くなることから、後者のアニオン重合させる方法がより好ましい。
【００２２】
抗菌ナノ粒子に抱合させる薬剤の濃度は、当該薬剤の性質、使用時の容量などに応じて適宜設定することができる。抗菌剤を抱合させる場合、通常、抗菌ナノ粒子１００重量％中に０．１〜０．８重量％程度である。
【００２３】
＜ナノバブル＞
本発明の発明者は、既に、歯科用ナノバブル発生装置を用いて、ナノバブルがスメア層（根管拡大清掃時に生じる細菌が混じった切削片が象牙質の象牙細管に詰まったもの）を除去できること、人工的にアパタイト表面に作製したE. faecalisのバイオフィルムを除去できることについて特許出願をしている（特願２０１７−１５２５９４）。当該特許出願に係る明細書において、抜去歯のin vitro実験によりナノバブルが象牙細管内１ｍｍ以上深部へ薬剤を浸透させることを明らかにした。
【００２４】
ナノバブルは、圧壊時に発生するフリーラジカルの作用により菌の増殖を抑制する。さらに溶液中の微粒子（ナノバブル）の周りに形成される電気二重層中の、液体流動が起こり始める「すべり面」の電位であるゼータ電位が、微粒子の流動性、凝集性、保存性などに関係すると考えられる。
【００２５】
ナノバブルは、液状もしくはゲル状を呈する形態中に超微細な気泡として含有されており、気体（空気、二酸化炭素、窒素、酸素、オゾン等）がナノサイズの気泡内に導入され、表面張力による高い内圧が付与され、かつマイナスに帯電している。すなわち、ナノバブルは、高い内圧と帯電荷を有しており、その表面特性やブラウン運動のごとき運動特性等に基づくところの有効な除去促進作用によって、超音波機器等を用いて気泡を破壊することなく、効果的に菌の増殖を抑制できる。ナノバブルに含有される気体は、一種または二種以上を用いることができる。二種以上の気体を用いる場合としては、例えば、気体Ａのみからなるナノバブルと気体Ｂのみからなるナノバブルとの混合物を用いる場合もあれば、気体Ａと気体Ｂとの混合物を含むナノバブルを用いる場合もある。
【００２６】
本発明の歯科口腔用組成物が液体製剤である場合、これを構成する溶液は水溶液であることが好ましい。本発明において、ナノバブル状態にある気体を含む水溶液をナノバブル水といい、ナノバブル状態にある気体を含むゲルをナノバブルゲルという。
【００２７】
ナノバブル水において、水溶液のｐＨは特に限定されるものではないが、例えば５．００〜６．００の弱酸性とすることが可能である。なお、ナノバブルのゼータ電位はｐＨが５．００以上で負であり、その絶対値は時間を経ても大きくは変化しない。また、ナノバブル水において、硬度は特に限定されるものではないが、例えば硬度２０〜３０とすることが可能である。
【００２８】
ナノバブルの気泡径としては、菌の増殖を効果的に抑制する観点から、その平均気泡径（Ｄ５０）は１００〜３００ｎｍが好ましく、１００〜２５０ｎｍがより好ましく、更に好適には１３０〜２３０ｎｍがさらに好ましい。ナノバブルの気泡径（直径、サイズ）を上記の範囲に設定することにより、有効な除去促進作用が得られ、抗菌ナノ粒子との併用によって高い抗菌効果を奏する。なお、ナノバブルの気泡径が大きくなりすぎると、除去促進作用が低下するようになる。ナノバブルの気泡径が小径であるほど、一般的に長期保存の安定性に優れる。ナノバブルの気泡径は、逆浸透膜、空気圧等を利用して所望のサイズに調整することができる。
【００２９】
ナノバブルは、気泡径がナノサイズであることによりその表面張力により内圧が高くなり、またマイナスに帯電する。ここで、ナノバブルの内圧は、一般にナノバブルの気泡径に対して、Ｙｏｕｎｇ−Ｌａｐｌａｃｅ（ヤング−ラプラス）の式により求められ、本発明に用いたナノバブルは、約３〜３００気圧程度の内圧を有している。また、ナノバブルの水中でのゼータ電位は、−４０〜０ｍＶであり、ナノバブルはマイナスに帯電していると考えられる。ナノバブルのゼータ電位としては、一般に、−４０〜０ｍＶの範囲内、中でも−４０〜−１０ｍＶの範囲内であることが望ましい。ナノバブルのゼータ電位を上記の範囲に設定することにより、有効な除去促進作用が得られる。
【００３０】
また、ナノバブルの濃度としては、一般に規定容積中に含まれるバブルの個数として示され、本発明では、１×１０６〜１×１０９個／ｍＬが好ましく、５×１０６〜５×１０８個／ｍＬがより好ましく、１×１０６〜１×１０８個／ｍＬがさらに好ましい。ここで、かかるナノバブルの存在量が少なくなりすぎると、除去促進作用を有利に発揮できなくなるからである。また、多くなりすぎると、除去促進作用が飽和する傾向があり、経済的観点からも利点に乏しいものとなる。
【００３１】
なお、上記の如きナノバブルのサイズやその存在濃度は、市販のナノ粒子測定装置を用いて測定することができる。例えば、(株)島津製作所のナノ粒子分布測定装置（ＳＡＬＤ−７１００）や、日本カンタム・デザイン(株)から入手することのできるナノ粒子解析装置（ナノサイトＬＭ−２０）等が挙げられる。また、ゼータ電位は、マルバルーン事業部スペクトリス（株)から入手することのできるゼータサイザーナノＺ、大塚電子(株)のゼータ電位測定システム（ＥＬＳＺ−２０００Ｚ）、協和界面化学(株)のゼータ電位測定装置（ＺＣ−３０００）等があげられる。
【００３２】
ところで、本発明において、ナノサイズの気泡径を有するナノバブルは、公知の各種のナノバブル発生装置を用いて形成され得るものである。特に、高分子樹脂フィルムに初期破壊現象であるクレーズを生成してなる通気性フィルムを通じて、それによる気体透過量の制御下において、所定の気体を放出せしめることによって、ナノバブルが形成されるようにした装置（例えば、特許第３８０６００８号公報、特許第５３９０２１２号公報に記載）が有利に用いられる。
【００３３】
ナノバブル水もしくはナノバブルゲルの製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば下記である。即ち、少なくとも、気体透過部に気体透過量を制限し得る高分子樹脂フィルムにクレーズを生成してなる通気性フィルムを配する筒状の気体透過装置を該筒状の循環路内に設置することにより、該筒状気体透過部の外周径と該筒状循環路の内周径との差異により形成される間隙に、ポンプを用いて液圧を調製して、水もしくはゲル状流動体を導入するとともに、気体透過装置の気体透過部に加圧状態を調整して気体を供給することにより、水もしくはゲル状流動体にナノサイズの微細な気泡が混入される。
【００３４】
本発明の歯科口腔用組成物は、抗菌ナノ粒子を含有する液体もしくはゲル状の予備組成物と、ナノバブルを含有する水の液体あるいはゲルの固体と、を混合して調整することができる。なお、歯科口腔用組成物は、抗菌ナノ粒子以外の薬剤、細胞抽出物、創傷治癒や組織再生を促進する生理活性物質、細胞培養上清（セクレトーム、エクソゾーム、ｍｉＲＮＡ）、微生物発酵産物、植物抽出物、精製タンパク質等の種々の組成物と組み合わせて使用可能である。ただし、これらは、歯科口腔用組成物の機能、特にナノバブルと抗菌ナノ粒子との併用による細菌感染制御作用を阻害しない範囲で用いられる。
【００３５】
本発明の歯科口腔用組成物は、口腔内付着物の除去促進剤として用いることができる。口腔内付着物は、例えば、スメア層、歯垢（プラーク）、バイオフィルム又は舌苔である。
スメア層を除去するための口腔内付着物の除去促進剤では、単にスメア層を除去するのみならず象牙質強度を保持する必要がある。なお、スメア層は、その一部が象牙細管内まで入り込み、この象牙細管内まで入り込んだスメア層はスメアプラグ又はスメア栓と呼ばれることがある。
プラーク、バイオフィルム又は舌苔を除去するための口腔内付着物の除去促進剤では、ナノバブルを含有するゲルであるナノバブルゲルを適用する。ナノバブルゲルの粘度は、特に限定されるものではないが、例えば４５０Ｍｐａ・ｓ以下である。ナノバブルゲルの粘度が高すぎると流動性が低下するため利便性が低下するおそれがあるからである。
【００３６】
また、本発明の歯科口腔用組成物は、中高齢者の狭窄根管を拡大するための根管拡大補助剤として用いることができる。この場合、歯科口腔用組成物は、根管拡大清掃剤をさらに含むこととなる。根管拡大清掃剤は、特に限定されるものではないが、例えばＥＤＴＡ、クエン酸、クロルヘキシジン、ＭＴＡＤ等が挙げられる。
【００３７】
本発明の歯科口腔用組成物は、抗菌ナノ粒子とナノバブルとの相乗的な作用により、歯の根管内の細菌感染を治療できる。このため、難治性感染根管の洗浄・貼薬、および根尖歯周組織の化学的・物理的刺激の可及的除去に有効な、歯の根管内の細菌感染治療用組成物として用いることができる。
【実施例】
【００３８】
［実施例１］
（抗菌ナノ粒子混合ナノバブル水の粒径分布測定・ゼータ電位測定）
４種類の溶液［ナノバブル水（０．５×１０８個／ｍＬ、５０％）、ドキシサイクリン（最終濃度３５μｇ／ｍＬ）とナノバブル水（０．５×１０８個／ｍＬ、５０％）との混合物、抗菌ナノ粒子（最終濃度０．００６重量体積％（ｗ／ｖ）、(株)ナノカム製）、抗菌ナノ粒子（最終濃度０．００６％重量体積（ｗ／ｖ））とナノバブル水（０．５×１０８個）との混合物]をそれぞれ１０ｍＬずつ調製した。調製した溶液について、水中に存在する超微細気泡の粒度分布をナノ粒子解析システム  ナノサイトシリーズ（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ社製）により測定し、ゼータ電位はゼータ電位測定装置  ゼータサイザー  ナノ  シリーズ（Malvern Instruments社製）で測定した。なお、本実施例および実施例２以下では、ナノバブル水は歯科用ナノバブル発生装置  ＦＯＡＭＥＳＴ  ８（登録商標、（株）ナック製）で空気を用いて製造したナノバブル水を用いた。ナノバブル水の％は、歯科用ナノバブル発生装置から得られた原液を蒸留水で希釈した希釈率（希釈後のナノバブル水における原液の割合）を示している。
【００３９】
ナノバブル水と抗菌ナノ粒子の解析システムによる測定は、シリンジでサンプル約５ｍＬを採水し、装置アダプタにアプライし、アダプタを本体にセットして、測定を実施した。ゼータ電位測定は、サンプル２００μＬを測定用セルにアプライし、セルを装置本体のユニットにセットして測定を実施した。結果を表１および図１に示す。なお、以下の説明、表および図では、適宜、ナノバブル水をＮＢ、ドキシサイクリンとナノバブル水との混合物をＤＯＸＹ＋ＮＢ、抗菌ナノ粒子をＡＡ、抗菌ナノ粒子とナノバブル水との混合物をＡＡ＋ＮＢと記す。
図１は、粒度分布を示すグラフであり、（Ａ）ＮＢ、（Ｂ）ＤＯＸＹ＋ＮＢ、（Ｃ）ＡＡ、（Ｄ）ＡＡ＋ＮＢの結果を示している。
【００４０】
【表１】
2020015695.tif 000003
【００４１】
その結果、図１および表１に示すように、９８％ナノバブル水、最終濃度０．００６％（ｗ／ｖ）抗菌ナノ粒子と９８％ナノバブル水（０．５×１０８個／ｍＬ）とを併用した混合物の粒度分析のピーク粒径はそれぞれ１８０ｎｍ、１７９ｎｍであった。また、ゼータ電位はそれぞれ−２３．８ｍＶ、−１８．４ｍＶであった。よって、抗菌ナノ粒子との併用の有無によりナノバブル水の特性にほとんど差が見られなかった。一方、ドキシサイクリン（最終濃度３５μｇ／ｍＬ）と９９％ナノバブル水（０．５×１０８個／ｍＬ）との併用における粒度分布のピーク粒径及びゼータ電位はそれぞれ２４８ｎｍ、−４．０ｍＶと、９８％ナノバブル水単独での特性との間に差が見られた。
したがって、抗菌ナノ粒子はナノバブル特性に影響を与えないが、ドキシサイクリンはナノバブル特性に影響を与えることが示唆された。
【００４２】
［実施例２］
（ナノバブル水による根管象牙質細管浸透作用）
イヌ抜去歯前歯の擬似根管を＃６０まで根管拡大形成し、根尖をユニファスト（多目的常温重合レジン、製品名、(株)ジーシー製）にて閉鎖した。５％次亜塩素酸ナトリウム２ｍＬおよび５ｍＬ生理食塩水で洗浄し、さらにスメアクリーン（３％ＥＤＴＡ水溶液、製品名、日本歯科薬品(株)製）を２分間根管内に適用し、４℃で生理食塩水内にて保存した。根管内をブローチ綿栓にて乾燥した。最終濃度０．００６％（ｗ／ｖ）抗菌ナノ粒子と９８％ナノバブル水（０．５×１０８個／ｍＬ）との併用（混合物）、最終濃度０．００６％（ｗ／ｖ）の抗菌ナノ粒子、９８％ナノバブル水（０．５×１０８個／ｍＬ）、最終濃度３５μｇ／ｍＬのドキシサイクリン、最終濃度３５μｇ／ｍＬのドキシサイクリンと９８％ナノバブル水（０．５×１０８個）との併用（混合物）、最終濃度５ｍｇ／ｍＬテトラサイクリンと蒸留水（ＤＷ）との併用（混合物）の薬液をそれぞれ調製した。ピペットにて薬液を根管内に輸送して５分間適用し、根管象牙細管内に薬剤を浸透させた。生理食塩水にて洗浄後、ブローチ綿栓にて薬液を除去し、根管内を乾燥させた。歯は歯髄腔が平行になるように金属製の台にユーティリティーワックス（製品名、カボデンタルシステムズジャパン（株）製）、ユニファストＩＩＩ（超速硬性常温重合レジン、製品名、(株)ジーシー製）にて固定した。ユニファストＩＩＩが硬化したらゼーゲミクロトーム（製品名、来夏マイクロシステムズ(株)製）にて厚さ約３００μＬの切片標本を作製し、実体蛍光顕微鏡にて観察した。
【００４３】
図２（Ａ）〜図２（Ｆ）は、ブタ歯根内の根管壁（ＲＣ）から象牙細管内深部に対して、蛍光薬剤（テトラサイクリン）を浸透させた蛍光実体顕微鏡写真である。同図に示すように、根管象牙細管内への浸透度は、抗菌ナノ粒子とナノバブル水との混合物、ナノバブル水、抗菌ナノ粒子、蒸留水の順に高かった。抗菌ナノ粒子とナノバブル水との混合物、ナノバブル水では、１ｍｍぐらいまで象牙細管内に浸透がみられた。抗菌ナノ粒子のみでは浸透力が無く、ナノバブル水により抗菌ナノ粒子の浸透度が有意に高められていた。また、ドキシサイクリンとナノバブル水との混合物の浸透度は、ドキシサイクリン単独と比べて高い結果となった。
【００４４】
［実施例３］
（ブタ根管象牙質スメア層除去）
割りやすいように予めＤｉｓｃ（研磨ディスク）で切れ目を入れたブタ歯の擬似根管をＫファイル（製品名、マニー（株）製）にて＃７０まで根管拡大形成し、５％次亜塩素酸ナトリウム２ｍＬ及び３％過酸化水素水２ｍＬにて交互洗浄した。５ｍＬ生理食塩水でさらに洗浄、４℃で生理食塩水内にて保存した。ナノバブル水（０．５×１０８個／ｍＬ）、抗菌ナノ粒子とナノバブル水（０．５×１０８個／ｍＬ）の併用、抗菌ナノ粒子、ドキシサイクリン、ドキシサイクリンとナノバブル水（０．５×１０８個／ｍＬ）の併用、蒸留水の６種類のスメア層除去剤２ｍＬを５分間適用し、スメア層を洗浄した。生理食塩水にて洗浄後、抜歯柑子にて半分に割り、２％グルタールアルデヒドにて１２時間固定し、３０、５０、７０、９０、１００％エタノールにて脱水後、白金１０ｋＶにて蒸着した。蒸着は、マグネトロンスパッタ装置（製品名：ＭＳＰ−２０−ＵＭ、（株）真空デバイス製）を用いて導電膜蒸着（スパッターコーティング）により行った。その後、それぞれの標本を走査電子顕微鏡（製品名：ＶＥ９８００、（株）キーエンス製）にて、根管根尖部から１．５ｍｍ、３ｍｍ、４．５ｍｍ、６．０ｍｍのところを観察した。
【００４５】
洗浄後の象牙細管数を計測したところ、蒸留水平均１２３穴、ナノバブル水４３３穴、抗菌ナノ粒子４０５穴、抗菌ナノ粒子とナノバブル水の併用５２７穴であった。スメア層は蒸留水ではほとんど除去できなかったが、ナノバブル水、抗菌ナノ粒子、抗菌ナノ粒子とナノバブル水の併用では有意にスメア層除去が確認された（危険率Ｐ＜０．０１）。また、抗菌ナノ粒子によるナノバブル水のスメア層除去効果への悪影響は無く、むしろ除去効果は向上していた（図３（Ａ）〜図３（Ｅ））。
【００４６】
一方で、ドキシサイクリン、ドキシサイクリンとナノバブル水との併用（混合物）で洗浄を行った場合の象牙細管数はそれぞれ３６穴、２３穴であり、ドキシサイクリンはナノバブル水のスメア層除去効果を著しく阻害した（危険率Ｐ＜０．０１）（図４（Ａ）〜図４（Ｄ）参照）。
【００４７】
［実施例４］
（ナノバブル水によるEnterococcus faecalisの歯垢・バイオフィルム除去）
４８ｗｅｌｌ細胞培養プレートの各ｗｅｌｌに、ブレインハートインフュージョン培地（ＢＨＩ  Ｂｒｏｔｈ）と、５％スークロース１ｍＬとを添加した後、同ｗｅｌｌに５０μＬのEnterococcus faecalis（ＡＴＣＣ  １９４３３）培養液を加えた。ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）ｄｉｓｃ（製品名：ＨＡ４８−３、細胞培養用ディスク、フナコシ(株)製）を浸漬し、１４日間培養し、歯垢・バイオフィルムを形成させた。ナノバブル水の洗浄効果を検討するため、このＨＡ ｄｉｓｃに対して、抗菌ナノ粒子、抗菌ナノ粒子（最終濃度０．００６％ｗ／ｖ）とナノバブル水（０．５×１０８個／ｍＬ）との併用を３０分作用させ、未処置のものと、走査電子顕微鏡像により比較した。
その結果、ナノバブル水、抗菌ナノ粒子、抗菌ナノ粒子とナノバブル水との併用とも蒸留水では除去されなかったバイオフィルムを同様に除去できた（図５（Ａ）〜図５（Ｅ）参照）。
【００４８】
［実施例５］
（イヌ感染根管モデルにおけるドキシサイクリン・ナノバブルによる根管内の除菌効果）
１歳齢のイヌに全身麻酔を施した後、イヌ上下顎小臼歯部に抜髄処置を行い、根尖部まで＃５０〜５５で拡大した。５％次亜塩素酸ナトリウム溶液と３％過酸化水素水で交互洗浄後、さらに生理食塩水で洗浄した。根管口に綿球をおき、根管を開放状態にして１か月そのまま放置した。さらに、生理食塩水で洗浄後、ペーパーポイントで根管内を完全乾燥し、セメントとレジンにて完全に仮封した。２か月後、歯科用ＣＴ（ＣＢＣＴ・コーンビームＣＴ）にて根尖部透過像により、感染根管が作製されたことを確認した（図６参照）。
【００４９】
根管内の細菌数を計測するため、生理食塩水に浸した＃５５の滅菌済みペーパーポイントを根管内に１分入れて釣菌を行い、根管内の細菌簡易培養検査用液体培地プラディア（製品名、昭和薬品化工（株）製）にペーパーポイントを入れた。ついで、段階希釈法にて血液寒天培地バイタルメディア（製品名，極東製薬工業(株)製）に播種し、２日間嫌気培養後コロニーの数をカウントした（図７参照）。
【００５０】
釣菌後の根管に５％次亜塩素酸ナトリウムと３％過酸化水素水にてそれぞれ計２ｍＬずつ交互に洗浄を行い、さらに生理食塩水５ｍＬにて根管を洗浄した。引き続き、滅菌ペーパーポイントにて根管内を乾燥し、９９％ナノバブルと最終濃度３５μｇ／ｍＬになるように調整したドキシサイクリンであるビブラマイシン（製品名、ファイザー(株)製）とを併用した混合物の溶液２ｍＬを左側上下顎小臼歯の根管内に注入し洗浄を２分行った。右側上下顎小臼歯は最終濃度３５μｇ／ｍＬになるように調整したドキシサイクリン水溶液のみにて洗浄した。生理食塩水にて５ｍＬ洗浄後、ペーパーポイントで根管内を完全乾燥し、洗浄で用いた溶液と同様のものをペーパーポイントに浸して根管内に挿入し、貼薬処置を行った。ストッピング（製品名：テンポラリーストッピング、(株)ジーシー製）とコンポジットレジン（製品名：クリアフィルメガボンドおよびクリアフィル  ＤＣコアオートミックス  ＯＮＥ、クラレノリタケデンタル(株)製）を用いて仮封した。
【００５１】
１週間から１０日後に２回目の釣菌を行った後、前回と同様にナノバブル水とドキシサイクリンあるいはドキシサイクリンを用いて洗浄および貼薬処置を行った。さらにその１週間から１０日後に３回目の釣菌を行い、再度前回と同様の洗浄および貼薬処置を行った。同様の操作を３回目まで行った。その１週間から１０日後に４回目の釣菌を行った。釣菌したサンプルは段階希釈法にて血液寒天培地に播種し、２日間嫌気培養後コロニー数を測定した。得られた結果は、統計ソフト（ＳＰＳＳ，ＩＢＭ，Ａｒｍｏｎｋ，ＵＳＡ）にてノンパラメトリック検定を用いて統計処理を行った。
【００５２】
イヌの歯を抜髄後１か月根管開放し２か月封鎖すると、ＣＢＣＴにおいて根尖部に透過像が認められた（図６参照）。ＨＥ染色像においては、歯槽骨の吸収および根尖部歯周組織の破壊がみられ，炎症性細胞の浸潤がみられた。根管内細菌をプラディア培地で観察すると、培地が混濁し陽性を示した。細菌数は無限大（図８（Ａ）参照）であった。よって、抜髄後１か月根管開放し２か月封鎖することにより感染根管モデルが作製できることが示された。
【００５３】
治療開始時の根管内細菌に対してドキシサイクリンは、５０μｇ／ｍＬでは感受性を示さなかったが、２００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬで感受性を示した（図８（Ａ）参照）。細菌数はナノバブルとドキシサイクリンあるいはドキシサイクリン単味のいずれにおいても、初回では減少がみられたが、その後やや増加傾向がみられ、除菌効果は見られなかった（図８（Ｂ）参照）。
【００５４】
（イヌ難治性感染根管モデルにおけるナノバブル水と抗菌ナノ粒子との併用による根管内の除菌効果）
続いて、上記のナノバブル水とドキシサイクリンあるいはドキシサイクリン単味のいずれに対しても抵抗性を示した難治性感染根管に対して、まず、前回と同様に、根管内の細菌数を段階希釈法にて２日間嫌気培養後、コロニーの数をカウントした。釣菌後の根管に５％次亜塩素酸ナトリウムと３％過酸化水素水にてそれぞれ計２ｍＬずつ交互に洗浄を行い、さらに生理食塩水５ｍＬにて根管を洗浄した。引き続き，滅菌ペーパーポイントにて根管内を乾燥し、９８％ナノバブルおよび最終濃度０．００６％ｗ／ｖになるように調整した抗菌ナノ粒子の溶液２ｍＬを左側上下顎小臼歯の根管内に注入し洗浄を２分行った。右側上下顎小臼歯は最終濃度０．００６％ｗ／ｖの抗菌ナノ粒子のみ２ｍＬにて洗浄した。左側は１００％ナノバブル５ｍＬおよび生理食塩水５ｍＬにて洗浄した。右側は生理食塩水のみ５ｍＬにて洗浄した。ペーパーポイントで根管内を完全乾燥し、左側は洗浄と同様の抗菌ナノ粒子・ナノバブル水、右側は抗菌ナノ粒子のみをペーパーポイントに浸して根管内に挿入し、貼薬処置を行い、仮封した（図９参照）。
【００５５】
１週間から１０日後に２回目の釣菌を行った後、前回と同様にナノバブルと抗菌ナノ粒子あるいは抗菌ナノ粒子のみを用いて洗浄および貼薬処置を行った。さらにその１週間から１０日後に３回目の釣菌を行い、再度前回と同様の洗浄および貼薬処置を行った。同様の操作を３回目まで行った。その１週間から１０日後に４回目の釣菌を行った。釣菌したサンプルは２日間嫌気培養後コロニー数を測定し、同様に統計処理を行った。
【００５６】
一方、イヌ難治性根管治療開始時の根管からの釣菌液１００μＬを５ｍＬのBrain Heart Infusion液体培地（Brain infusion solids１２．５ｇ／Ｌ、Beef heart infusion solids５．０ｇ/Ｌ、Proteose peptone１０ｇ/Ｌ、グルコース２．０ｇ/Ｌ、塩化ナトリウム５．０ｇ/Ｌ、リン酸水素二ナトリウム２．５ｇ/Ｌ、牛胎児血清５％）に添加して、３７℃・２００ｒｐｍで１４時間培養した。また、抗菌ナノ粒子溶液（０．３％ｗ／ｖ原液、及び０．００６％ｗ／ｖ（５０倍希釈））を滅菌済１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに１ｍＬずつ調製し、調製した抗菌ナノ粒子溶液に滅菌済ペーパーディスク（ユニ・カセット＜バイオプシー＞シックス用濾紙、サクラファインテックジャパン（株）製）を入れて、ペーパーディスクに抗菌ナノ粒子溶液を染み込ませた。生育を確認した釣菌液１００μＬをBrain Heart Infusion寒天培地(Brain infusion solids１２．５ｇ／Ｌ、Beef heart infusion solids５．０ｇ/Ｌ、プロテオースペプトン（Proteose peptone）１０ｇ/Ｌ、グルコース２．０グラム/Ｌ、塩化ナトリウム５．０ｇ/Ｌ、リン酸水素二ナトリウム２．５ｇ/Ｌ、牛胎児血清５％、寒天１０ｇ/Ｌ）へ滴下し、スプレッダーで一面に均等に展開した。抗菌ナノ粒子溶液を染み込ませたペーパーディスクを、ピンセットを用いて寒天培地上に置いた。寒天培地をアネロパック（「アネロパウチ・ケンキ」、三菱ガス化学（株）製）とともに密閉容器に入れて密封し、３７℃インキュベータで静止培養を行った。培養開始後、２４時間後の阻止円の径を測定した。
【００５７】
その結果、プレート全体には釣菌液由来微生物の生育が見られたが、０．３％（ｗ／ｖ）抗菌ナノ粒子を染み込ませたディスクを置いた箇所の周囲には、円状に微生物の生育が見られない部分（阻止円）が存在し、根管内細菌の抗菌ナノ粒子に対する感受性が明らかとなった（図１０（Ａ）参照）。
【００５８】
細菌数はナノバブル水と抗菌ナノ粒子の併用による洗浄および貼薬により徐々に減少がみられ、３回の洗浄および貼薬により細菌は検出限界以下に減少した。抗菌ナノ粒子のみではほとんど減少はみられなかった(図１０（Ｂ）参照)。
【００５９】
図１０（Ｂ）において、４回目の釣菌時に抗菌ナノ粒子のみで細菌数がほとんど減少しなかった根管について、さらに、ナノバブル水のみで洗浄し、貼薬した根管では、全く細菌数の減少はみられなかった。よって、ナノバブル水のみでは細菌除去効果がないことが示された。
【００６０】
（イヌ難治性感染根管モデルにおけるナノバブル・抗菌ナノ粒子による根尖部透過像の縮小）
難治性根管治療開始時および根管治療開始後２か月のＣＢＣＴ検査を行った。根尖部の透過像をＯｓｉｒｉＸプログラムにより画像解析し、体積を測定した（図１１（Ａ）参照）。結果は開始前／開始後の体積比で表した。
その結果、抗菌ナノ粒子を根管治療に用いた場合は１．１であり、ナノバブル水と抗菌ナノ粒子を併用した場合は約０．４で、危険率Ｐ＜０．０１で有意差がみられた（ｎ＝９）（図１１（Ｂ）参照）。すなわち、ナノバブル水と抗菌ナノ粒子を併用した場合、有意に根尖部の骨添加による根尖透過像の縮小がみられた。
【００６１】
［実施例６］
（イヌ難治性感染根管モデルにおける除菌後の歯髄幹細胞移植による歯髄再生）
１歳齢のイヌにおいて、全身麻酔を施した後、上顎前歯を抜歯した。直ちに、輸送液（２０mｇ／ｍＬゲンタマイシン（ゲンタロール、（株）日本点眼薬研究所製）および０．２５mg/ｍＬアンホテリシンＢ（ファンギゾン、ブリストル・マイヤーズ（株）製）含有Ｈａｎｋｓ液）に入れ輸送した。輸送後、歯髄組織を採取し、細切後、０．０４ｍｇ／ｍＬリベラーゼ溶液により歯髄組織を酵素消化し、得られた細胞を１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭにて、５％ＣＯ２インキュベータ内にて培養した。７０％コンフルエントに達した後に膜遊走分取法にて歯髄幹細胞を分取した。イヌ初代歯髄細胞を２×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬで膜上部に播種し、下部構造体の２４ｗｅｌｌ中に１０％イヌ自己血清を含むＤＭＥＭ中に遊走因子Ｇ−ＣＳＦ（ノイトロジン，中外製薬(株)製）を最終濃度で１００ｎｇ／ｍＬ入れ、４８時間後にＧ−ＣＳＦを取り除き１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭに培地交換した。さらに培養して、７０％コンフルエント後に継代し、６代目まで継代し、凍結した。ついで、ナノバブル水と抗菌ナノ粒子の併用にて除菌した難治性感染根管歯の根管内を５％次亜塩素酸ナトリウムと３％過酸化水素水にてそれぞれ計２ｍＬずつ交互に洗浄を行い、生理食塩水５ｍＬにて根管を洗浄した。さらにスメアクリーンを２分反応させ、生理食塩水にて洗浄し、ペーパーポイントにて乾燥させた。同種移植として、前記の膜分取歯髄幹細胞５×１０５個に２０μＬのｓｃａｆｆｏｌｄ（コーケンコラーゲンインプラント、（株）高研製）とＧ−ＣＳＦ１００μｇ／ｍＬを１．５μＬ混合し、根管内に注入した。その上に止血用ゼラチン（スポンゼル、アステラス製薬（株)製）をおき、グラスアイオノマーセメント（フジＩＸ、(株)ジーシー製）およびコンポジットレジン（クリアフィルメガボンドおよびクリアフィルＤＣコアオートミックスＯＮＥ、クラレノリタケデンタル（株）製）にて窩洞を封鎖した。移植２か月後に根尖部歯周組織を含めて歯を抜去し、通法通り縦断面の約５μｍパラフィン切片を作製し、ＨＥ染色後に形態観察を行った。コントロールとしては、抗菌ナノ粒子のみで根管治療し、細胞移植を行っていない根管を用いた。
【００６２】
次に、グラム染色を、グラムカラーグラム染色液セット（Ｍｅｒｃｋ：ＨＸ９５００１８）を用いて行った。すなわち、パラフィン切片を脱パラフィン後、１％クリスタル紫溶液に５分浸漬し、流水洗浄、グラムのヨウ素液で５分、流水洗浄、アセトン・アルコール数秒、流水洗浄、塩基性フクシンで２〜５分、流水洗浄した。その後、アセトン・エタノール数秒、プロピルアルコール２回、エタノール、キシレン２回洗浄後、封入した。
【００６３】
さらに、移植前および移植後２か月抜去前に、ＣＢＣＴ検査を行った。根尖部の透過像をＯｓｉｒｉＸプログラムにより画像解析し、根尖病巣の体積を測定した。結果は治療開始前／移植後２か月の体積比で表した。
【００６４】
ナノバブル水と抗菌ナノ粒子の併用にて除菌した根管内に膜分取歯髄幹細胞を移植すると、血管新生および神経突起伸長を伴う歯髄組織および根尖歯周組織が再生された(図１２（Ｂ）参照)。グラム染色では、細菌やバイオフィルムは検出されなかった。一方、コントロールの抗菌ナノ粒子のみで根管治療した標本のグラム染色では、象牙細管内、セメント小腔や歯根表面に細菌やバイオフィルムが見られた(図１２（Ａ）参照)。
【００６５】
ナノバブル水と抗菌ナノ粒子を根管治療に併用した根管では、移植２か月後（抜歯直前）において根尖病巣が治療前の約０．２５に減少した。一方、コントロールの抗菌ナノ粒子のみを根管治療に用いた場合は、移植２か月後（抜歯直前）において根尖病巣が治療前の約１．５で、増加傾向がみられた（図１３（Ａ）および図１３（Ｂ）参照）。
【００６６】
［実施例７］
（抗菌ナノ粒子とナノバブルの混合物によるStreptococcus ｍutansの歯垢・バイオフィルム除去）
４８ｗｅｌｌ細胞培養プレートの各ｗｅｌｌに、ブレインハートインフュージョン培地（ＢＨＩ  Ｂｒｏｔｈ）と、５％スークロース１ｍｌとを添加した後、同ｗｅｌｌに５０μＬのStreptococcus ｍutans（ＡＴＣＣ  ２５１７５）培養液を加えた。ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）ｄｉｓｃ（製品名：ＨＡ４８−３、細胞培養用ディスク、フナコシ(株)製）を浸漬し、２日間培養し、歯垢・バイオフィルムを形成させた。ナノバブル水の洗浄効果を検討するため、このＨＡ ｄｉｓｃに対して、蒸留水、５０％ナノバブル（０．５×１０８個／ｍｌ）、抗菌ナノ粒子（最終濃度０．００３、０．００６、０．０３、０．０７５％（ｗ／ｖ））、抗菌ナノ粒子（最終濃度０．００３、０．００６、０．０３、０．０７５％（ｗ／ｖ））と５０％ナノバブル水との併用（混合物）を５分作用させ、未処置のものと、走査電子顕微鏡像により比較した。その結果、抗菌ナノ粒子とナノバブル水の混合物において、ナノバブル水単独での洗浄よりもバイオフィルム除去効果が高く、特に０．００３％および０．００６％の抗菌ナノ粒子濃度において効果が顕著であった。また、抗菌ナノ粒子単体では洗浄効果がほとんど見られなかった。抗菌ナノ粒子とナノバブル水の混合物では、抗菌ナノ粒子０．００３％（Ｃ）および０．００６％（Ｄ）において、蒸留水（Ａ）との間に危険率Ｐ＜０．０５で有意差がみられた。抗菌ナノ粒子０．００３％（Ｃ）とナノバブル水（Ｂ）との間には危険率Ｐ＜０．０５で有意差がみられた。抗菌ナノ粒子０．００６％（Ｄ）とナノバブル水（Ｂ）との間には危険率Ｐ＜０．０１で有意差がみられた。（図１４（Ａ）〜（Ｋ）参照）。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
う蝕治療、抜髄・感染根管治療に利用できる。
【図１】
2020015695.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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