(57)【要約】【課題】タンパク質等の生体高分子の非特異吸着が充分に抑制される多孔質ポリマー粒子を提供する。【解決手段】スチレン系モノマーに由来するモノマー単位と、親水基及び重合性の二重結合を有する親水性モノマーに由来するモノマー単位とを含む共重合体を含有する、多孔質ポリマー粒子を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スチレン系モノマーに由来するモノマー単位と、親水基及び重合性の二重結合を有する親水性モノマーに由来するモノマー単位とを含む共重合体を含有する、多孔質ポリマー粒子。
【請求項２】
前記スチレン系モノマーに由来するモノマー単位が、ジビニルベンゼンに由来するモノマー単位を含む、請求項１に記載の多孔質ポリマー粒子。
【請求項３】
前記親水性モノマーに由来するモノマー単位が、親水基としてポリオキシアルキレン基又は多糖鎖を有するモノマーに由来するモノマー単位を含む、請求項１又は２に記載の多孔質ポリマー粒子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の多孔質ポリマー粒子を備える、分離材。
【請求項５】
請求項４に記載の分離材を備える、カラム。
【請求項６】
スチレン系モノマーと、親水基及び重合性の二重結合を有する親水性モノマーとを共重合させて形成された共重合体を含有するポリマー粒子を形成させることと、
前記ポリマー粒子を多孔質化させることと、を備える、多孔質ポリマー粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔質ポリマー粒子、分離材、カラム及び多孔質ポリマー粒子の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、タンパク質に代表される生体高分子を分離精製する場合、一般的には、合成高分子を母体とする多孔質粒子、親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とする粒子が用いられている。
【０００３】
多孔質の合成高分子を母体とするイオン交換体は、塩濃度による体積変化が小さく、カラムに充填しクロマトグラフィーで用いた場合、通液時の耐圧性が良いといった利点を持っている。しかし、このイオン交換体は、タンパク質等の分離に用いた場合、疎水的相互作用に基づく不可逆吸着等の非特異吸着が起き、ピークの非対称化が発生する、又は、該疎水的相互作用でイオン交換体に吸着されたタンパク質が吸着されたまま回収できないことがあるといった問題点があった。
【０００４】
一方、デキストラン、アガロース等の多糖に代表される親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とするイオン交換体は、タンパク質の非特異吸着が殆どないという利点がある。しかし、このイオン交換体は、水溶液中で著しく膨潤するため、溶液のイオン強度による体積変化及び、遊離酸形と負荷形との体積変化が大きく、機械的強度も十分ではないという欠点を有する。特に、架橋ゲルをクロマトグラフィーで使用する場合、通液時の圧力損失が大きく、通液によりゲルが圧密化するといった欠点がある。
【０００５】
親水性天然高分子の架橋ゲルが持つ欠点を克服するため、いわば“骨格”となる剛直な物質と組み合わせる試みがこれまでになされている。例えば、特許文献１では、いわゆるマクロネットワーク構造のコポリマーの細孔を、モノマーから合成した架橋共重合体のゲルで埋めたハイブリッドコポリマーのイオン交換体が挙げられている。特許文献１では、架橋共重合体ゲルについて、架橋度が低い場合、圧力損失、体積変化等の問題があるが、ハイブリッドコポリマーにすることで通液特性が改善され、圧力損失が少なくなること、また、イオン交換容量が向上し、リーク挙動が改善されることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第３９６６４８９号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、特許文献１に記載のハイブリッドコポリマーを形成する前のコポリマーは、タンパク質等の生体高分子の分離に使用した場合、非特異吸着が起きるという欠点を有する。
【０００８】
本発明は、タンパク質等の生体高分子の非特異吸着が充分に抑制される多孔質ポリマー粒子、該多孔質ポリマー粒子を備える分離材、該分離材を備えるカラム、及び該多孔質ポリマー粒子の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一側面は、スチレン系モノマーに由来するモノマー単位と、親水基及び重合性の二重結合を有する親水性モノマーに由来するモノマー単位とを含む共重合体を含有する、多孔質ポリマー粒子を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の一側面に係る多孔質ポリマー粒子は、スチレン系モノマーに由来するモノマー単位と、親水基及び重合性の二重結合を有する親水性モノマーに由来するモノマー単位とを含む共重合体を含有するため、当該多孔質ポリマー粒子をタンパク質等の生体高分子精製用カラムに用いる場合、タンパク質等の生体高分子の非特異吸着を充分に抑制することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明のいくつかの実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１２】
（多孔質ポリマー粒子）
一実施形態に係る多孔質ポリマー粒子は、共重合体を含有する。当該共重合体は、スチレン系モノマーに由来するモノマー単位と、親水基及び重合性の二重結合を有する親水性モノマーに由来するモノマー単位とを含む。多孔質ポリマー粒子は、スチレン系モノマーと、親水基及び重合性の二重結合を有する親水性モノマーとを共重合させて形成された共重合体を含有するポリマー粒子を形成させることと、当該ポリマー粒子を多孔質化させることとを備える方法により製造することができる。
【００１３】
スチレン系モノマーは、単官能性モノマーであってもよく、多官能性モノマーであってもよい。単官能性モノマーであるスチレン系モノマーとしては、スチレン、ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、α−メチルスチレン、ｏ−エチルスチレン、ｍ−エチルスチレン、ｐ−エチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、ｐ−ｎ−ブチルスチレン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、ｐ−ｎ−ヘキシルスチレン、ｐ−ｎ−オクチルスチレン、ｐ−ｎ−ノニルスチレン、ｐ−ｎ−デシルスチレン、ｐ−ｎ−ドデシルスチレン、ｐ−メトキシスチレン、ｐ−フェニルスチレン、ｐ−クロロスチレン、３，４−ジクロロスチレン等のスチレン及びその誘導体が挙げられる。これらの単官能性モノマーは、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの中で、耐酸性、耐アルカリ性を有するスチレンを使用することが好ましい。また、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、アルデヒド基等の官能基を有するスチレン誘導体も使用することができる。
【００１４】
多官能性モノマーであるスチレン系モノマーとしては、ジビニルベンゼン、ジビニルビフェニル、ジビニルナフタレン、ジビニルフェナントレン等のジビニル化合物が挙げられる。これらの多官能性モノマーは、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの中で、耐久性、耐膨潤性、耐酸性、耐アルカリ性の観点から、ジビニルベンゼンを使用することが好ましい。ジビニルベンゼンの使用量は、モノマーの全質量基準で５０質量％以上であることが好ましく、６０質量％以上であることがより好ましく、７０質量％以上であることがさらに好ましい。ジビニルベンゼンの使用量が５０質量％以上である場合、分離材の膨潤度を低くし、カラム圧が高くなることを抑える傾向がある。また、同様の観点から、ジビニルベンゼンの使用量は、９５質量％以下であることが好ましい。
【００１５】
親水基及び重合性の二重結合を有する親水性モノマーは、親水基及び重合性の二重結合を有するものであれば特に限定されない。
【００１６】
親水基は、タンパク質等の生体高分子の非特異吸着をより抑制できる観点から、ポリオキシアルキレン基又は多糖鎖が好ましく、ポリオキシアルキレン基がより好ましい。ポリオキシアルキレン基は、ポリオキシプロピレン基、又はポリオキシエチレン基が好ましく、ポリオキシエチレン基がより好ましい。
【００１７】
重合性の二重結合は、重合性を有するアルケニル基等が挙げられる。重合性を有するアルケニル基は、−ＣＨ＝ＣＨ２、−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２、又は−ＣＨ＝ＣＨＣＨ３が好ましい。
【００１８】
親水基及び重合性の二重結合を有する親水性モノマーとしては、例えば、親水基及び重合性の二重結合を有する芳香族エーテル、親水基及び重合性の二重結合を有する脂肪族エーテル、並びにこれらの混合物が挙げられる。親水基及び重合性の二重結合を有する芳香族エーテルとしては、アクアロン（登録商標）ＲＮ−１０、ＲＮ−２０（第一工業製薬株式会社製）等のポリオキシエチレンノニルプロペニルフェニルエーテルなどが挙げられる。親水基及び重合性の二重結合を有する脂肪族エーテルとしては、ラテムル（登録商標）ＰＤ−４２０（花王株式会社製）等のポリオキシアルキレンアルケニルエーテルなどが挙げられる。これらは、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの中で、タンパク質等の生体高分子の非特異吸着をより抑制できる観点から、親水基及び重合性の二重結合を有する芳香族エーテルが好ましい。
【００１９】
親水基及び重合性の二重結合を有する親水性モノマーの使用量は、モノマーの全質量基準で１質量％以上であることが好ましい。当該使用量が１質量％以上である場合、水滴の安定性が良好となり、大きな単一孔の形成が抑制される傾向がある。同様の観点から、当該使用量は、３質量％以上がより好ましく、５質量％以上がさらに好ましく、７質量％以上が特に好ましく、８質量％以上が極めて好ましい。また、親水基及び重合性の二重結合を有する親水性モノマーの使用量は、モノマーの全質量基準で５０質量％以下であることが好ましい。当該使用量が５０質量％以下である場合、重合後に粒子形状を保つことが容易となる傾向がある。同様の観点から、当該使用量は、４０質量％以下がより好ましく、３０質量％以下がさらに好ましく、２０質量％以下が特に好ましく、１５質量％以下が極めて好ましい。
【００２０】
親水基及び重合性の二重結合を有する親水性モノマーをスチレン系モノマーと共重合させて共重合体を形成させることにより、当該共重合体を含有する多孔質ポリマー粒子の表面及び細孔内に親水基が取り込まれるため、多孔質ポリマー粒子の表面及び細孔内が親水化され、タンパク質等の生体高分子の非特異吸着を抑制することが可能となる。
【００２１】
なお、上述のモノマー以外のその他のモノマーを用いることもできる。
【００２２】
多孔質ポリマー粒子を合成するためには、多孔質化剤を使用することができる。多孔質化剤としては、重合時に相分離を促して粒子の多孔質化を促進する有機溶媒が挙げられる。有機溶媒である多孔質化剤としては、例えば、脂肪族又は芳香族の炭化水素類、エステル類、ケトン類、エーテル類、アルコール類が挙げられる。具体的には、トルエン、ジエチルベンゼン、キシレン、シクロヘキサン、オクタン、酢酸ブチル、フタル酸ジブチル、メチルエチルケトン、ジブチルエーテル、１−ヘキサノール、イソアミルアルコール、２−オクタノール、デカノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール等が挙げられる。これらは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００２３】
多孔質化剤として水を取り込み易い物質を使用した場合、粒子内部に大きな孔が開き易くなるため好ましい。
【００２４】
多孔質化剤は、モノマーの全質量に対して０〜２００質量％使用することができる。多孔質化剤の量で粒子の空孔率をコントロールすることができる。さらに多孔質化剤の種類によって、孔の大きさ及び形状をコントロールすることができる。
【００２５】
また、溶媒として使用する水を多孔質化剤とする場合には、モノマーに油溶性界面活性剤を溶解させることで、水を吸収し、粒子を多孔質化させることが可能である。
【００２６】
多孔質化に使用される油溶性界面活性剤としては、分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸及び鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のソルビタンモノエステル、例えば、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノミリステート及びヤシ脂肪酸から誘導されるソルビタンモノエステル；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のジグリセロールモノエステル、例えば、ジグリセロールモノオレエート（例えば、Ｃ１８：１脂肪酸のジグリセロールモノエステル）、ジグリセロールモノミリステート、ジグリセロールモノイソステアレート及びヤシ脂肪酸のジグリセロールモノエステル；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４アルコール、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２アルコール及び鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４アルコール（例えば、ヤシ脂肪アルコール）のジグリセロールモノ脂肪族エーテル；これらの油溶性界面活性剤の混合物が挙げられる。
【００２７】
好ましい油溶性界面活性剤としては、ソルビタンモノラウレート（例えば、ＳＰＡＮ（登録商標）２０、好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、最も好ましくは約７０％を超えるソルビタンモノラウレート）、ソルビタンモノオレエート（例えば、ＳＰＡＮ（登録商標）８０、好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、最も好ましくは約７０％を超えるソルビタンモノオレエート）、ジグリセロールモノオレエート（例えば、好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、最も好ましくは約７０％を超えるジグリセロールモノオレエート）、ジグリセロールモノイソステアレート（例えば、好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、最も好ましくは約７０％を超えるジグリセロールモノイソステアレート）、ジグリセロールモノミリステート（例えば、好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、最も好ましくは約７０％を超えるジグリセロールモノミリステート）、ジグリセロールのココイル（例えば、ラウリル及びミリストイル）エーテル、これらの混合物等が挙げられる。
【００２８】
これらの油溶性界面活性剤は、モノマーの全質量に対して０〜８０質量％の範囲で使用することができ、５〜８０質量％の範囲で使用することが好ましい。油溶性界面活性剤の量が５質量％以上である場合、水滴の安定性が良好となり、大きな単一孔の形成が抑制される傾向がある。また、８０質量％以下である場合、重合後に粒子形状を保つことが容易となる傾向がある。
【００２９】
これらの油溶性界面活性剤を親水基及び重合性の二重結合を有する親水性モノマーと併せて使用する場合、油溶性界面活性剤の使用量は、油溶性界面活性剤と、親水基及び重合性の二重結合を有する親水性モノマーとの全質量基準で、５０〜９５質量％であることが好ましく、６０〜９０質量％であることがより好ましく、７０〜８５質量％であることが特に好ましい。
【００３０】
また、多孔質化剤として溶解性粒子を使用してもよい。溶解性粒子とは、例えば、酸、アルカリ、溶剤等によって溶解させることが可能な粒子である。溶解性粒子の構成材料として、具体的には、炭酸カルシウム、第三リン酸カルシウム、シリカ、ポリマー、金属コロイド等を使用することができる。除去し易さの観点から、炭酸カルシウム、第三リン酸カルシウム等を用いることが好ましい。溶解性粒子の粒径は、０．６〜５μｍであることが好ましい。粒子内の通液性を向上させる観点から、１〜５μｍであることがより好ましい。
【００３１】
重合反応に用いられる水性媒体としては、水、又は、水と水溶性溶媒（例えば、低級アルコール）との混合媒体が挙げられる。水性媒体には、界面活性剤が含まれていてもよい。界面活性剤としては、アニオン系、カチオン系、ノニオン系及び両性イオン系の界面活性剤のうち、いずれも用いることができる。
【００３２】
アニオン系界面活性剤としては、例えば、オレイン酸ナトリウム、ヒマシ油カリ等の脂肪酸油、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム等のアルキル硫酸エステル塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のアルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルカンスルホン酸塩、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム等のジアルキルスルホコハク酸塩、アルケルニルコハク酸塩（ジカリウム塩）、アルキルリン酸エステル塩、ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩などが挙げられる。
【００３３】
カチオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルアミンアセテート、ステアリルアミンアセテート等のアルキルアミン塩、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド等の第四級アンモニウム塩などが挙げられる。
【００３４】
ノニオン系界面活性剤としては、例えば、ポリエチレングリコールアルキルエーテル類、ポリエチレングリコールアルキルアリールエーテル類、ポリエチレングリコールエステル類、ポリエチレングリコールソルビタンエステル類、ポリアルキレングリコールアルキルアミン又はアミド類等の炭化水素系ノニオン界面活性剤、シリコンのポリエチレンオキサイド付加物類、ポリプロピレンオキサイド付加物類等のポリエーテル変性シリコン系ノニオン界面活性剤、パーフルオロアルキルグリコール類等のフッ素系ノニオン界面活性剤などが挙げられる。
【００３５】
両性イオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルジメチルアミンオキサイド等の炭化水素界面活性剤、リン酸エステル系界面活性剤及び亜リン酸エステル系界面活性剤が挙げられる。
【００３６】
界面活性剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。上記界面活性剤の中で、モノマーの重合時の分散安定性に優れる観点から、アニオン系界面活性剤が好ましい。
【００３７】
必要に応じて添加される重合開始剤としては、例えば、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、オルソクロロ過酸化ベンゾイル、オルソメトキシ過酸化ベンゾイル、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔｅｒｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルパーオキサイド等の有機過酸化物；２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、１，１’−アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）等のアゾ系化合物などが挙げられる。重合開始剤は、モノマー１００質量部に対して、０．１〜７．０質量部の範囲で使用することができる。
【００３８】
重合温度は、モノマー及び重合開始剤の種類に応じて適宜選択することができる。重合温度は、２５〜１１０℃が好ましく、５０〜１００℃がより好ましい。
【００３９】
重合工程において、粒子の分散安定性を向上させるために、乳化液に高分子分散安定剤を添加してもよい。
【００４０】
高分子分散安定剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリカルボン酸、セルロース類（ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース等）、ポリビニルピロリドンなどが挙げられ、トリポリリン酸ナトリウム等の無機系水溶性高分子化合物も併用することができる。これらのうち、メチルセルロース、ポリビニルアルコール又はポリビニルピロリドンが好ましい。高分子分散安定剤の添加量は、モノマー１００質量部に対して１〜１０質量部が好ましい。
【００４１】
水中でモノマーが単独に乳化重合した粒子の発生を抑えるために、亜硝酸塩類、亜硫酸塩類、ハイドロキノン類、アスコルビン酸類、水溶性ビタミンＢ類、クエン酸、ポリフェノール類等の水溶性の重合禁止剤を用いてもよい。
【００４２】
多孔質ポリマー粒子の平均粒径は、好ましくは３００μｍ以下、より好ましくは１５０μｍ以下、さらに好ましくは１００μｍ以下である。また、多孔質ポリマー粒子の平均粒径は、好ましくは１０μｍ以上、より好ましくは３０μｍ以上、さらに好ましくは５０μｍ以上である。多孔質ポリマー粒子の平均粒径が１０μｍ以上である場合、カラム充填後のカラム圧が増加することを抑制できる傾向がある。平均粒径は、以下の測定法により求めることができる。１）粒子を、超音波分散装置を使用して水（界面活性剤等の分散剤を含む）に分散させ、１質量％の粒子を含む分散液を調製する。２）粒度分布計（シスメックスフロー、シスメックス株式会社製）を用いて、上記分散液中の粒子約１万個の画像により平均粒径を測定する。
【００４３】
多孔質ポリマー粒子の全体積基準で３０体積％以上７０体積％以下の細孔容積を有し、大部分の細孔直径が０．０１μｍ以上０．６μｍ未満である細孔（すなわちマクロボアー）を有する多孔質ポリマー粒子が好ましい。より好ましくは、細孔容積が５０体積％以上７０体積％以下で、細孔直径が０．１μｍ以上０．６μｍ未満である。これらの範囲内である場合、細孔に入れない物質が増えてくることを抑制できるとともに、表面積が小さくなることを抑制できる傾向がある。これらは前記の多孔質化剤により調整可能である。
【００４４】
多孔質ポリマー粒子の比表面積は、２０ｍ２／ｇ以上であることが好ましい。より高い実用性の観点から、多孔質ポリマー粒子の比表面積は、３５ｍ２／ｇ以上であることがより好ましく、４０ｍ２／ｇ以上であることがさらに好ましい。比表面積が２０ｍ２／ｇ以上である場合、分離する物質の吸着量が少なくなることを抑制できる傾向がある。多孔質ポリマー粒子の比表面積は、後述の水銀圧入法にて測定することができる。
【００４５】
（分離材）
一実施形態に係る分離材は、多孔質ポリマー粒子を備える。分離材は、例えば、後述の多孔質ポリマー粒子と当該多孔質ポリマー粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層とを備える複合体であってもよく、後述のイオン交換体であってもよい。
【００４６】
（複合体）
複合体は、多孔質ポリマー粒子と当該多孔質ポリマー粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層とを備える。複合体は、例えば、多孔質ポリマー粒子に、水酸基を有する高分子を吸着させた後、架橋することにより、多孔質ポリマー粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、水酸基を有する高分子を含む被覆層を形成することにより得られる。薄膜でコーティングすることによりカラム圧の上昇を抑制することができる。
【００４７】
水酸基を有する高分子は、水酸基を有する親水性高分子が好ましく、水酸基を有する多糖類がより好ましい。水酸基を有する多糖類を使用することにより、タンパク質の非特異吸着をより抑制することが可能となる上、官能基を導入した際のタンパク質吸着量が天然高分子と同等以上とすることが可能となる。水酸基を有する多糖類としては、アガロース、デキストラン、セルロース、キトサン等が挙げられ、アガロース又はデキストランが好ましい。各々重量平均分子量１万〜２０万程度のものが使用できる。また、水酸基を有する高分子は、界面吸着能を向上させる観点から、疎水基を導入した変性体も用いることができる。
【００４８】
水酸基を有する高分子を多孔質ポリマー粒子にコーティングさせる方法としては、例えば、水酸基を有する高分子の溶液を多孔質ポリマー粒子表面又は内部に吸着させ、未吸着分を除去した後、架橋剤により架橋反応させて、細孔内に水酸基を有する高分子を担持させる方法がある。この方法では、まず、水酸基を有する高分子の溶液を多孔質ポリマー粒子に含浸させて吸着させる。水酸基を有する高分子の溶媒としては、水酸基を有する高分子を溶解することのできるものであれば、何でも使用できるが、通常、水が最も一般的である。溶媒に溶解させる高分子の濃度は、５〜２０ｍｇ／ｍＬが好ましい。含浸方法としては、水酸基を有する高分子の溶液に多孔質ポリマー粒子を加えて一定時間攪拌する方法が挙げられる。攪拌時間は、多孔質ポリマー粒子の表面状態によっても変わるが、１〜６時間含浸すれば高分子濃度が多孔質ポリマー粒子の内部で外部濃度と平衡状態となる。その後、水、アルコール等の溶媒で洗浄し、未吸着分の水酸基を有する高分子を除去する。
【００４９】
次いで、架橋剤を加えて多孔質ポリマー粒子の細孔内に溶液状で保持されている水酸基を有する高分子を架橋反応させて、架橋体を形成させることができる。このとき、架橋体は、水酸基を有する３次元架橋網目構造を有するようになる。
【００５０】
架橋剤としては、例えば、エピクロルヒドリン等のエピハロヒドリン、グルタルアルデヒド等のジアルデヒド化合物、メチレンジイソシアネート等のジイソシアネート化合物、エチレングリコールジグリシジルエーテル等のグリシジル化合物などのような水酸基に活性な官能基を２個以上有する化合物が挙げられる。また、原料の水酸基を有する高分子として、キトサンのようなアミノ基を有する化合物を使用する場合には、ジクロルオクタンのようなシバライドも架橋剤として使用できる。
【００５１】
この架橋反応には通常触媒が用いられる。該触媒は架橋剤の種類により異なるが、例えば、架橋剤がエピクロルヒドリン等の場合には水酸化ナトリウム等のアルカリが有効であり、架橋剤がジアルデヒド化合物の場合には塩酸等の鉱酸が有効である。
【００５２】
架橋剤による架橋反応は、通常、原料の水酸基を有する高分子の溶液を細孔内に含浸させた多孔質ポリマー粒子を適当な媒体中に分散して懸濁させた系に架橋剤を添加することにより行うことができる。架橋剤の添加量は、水酸基を有する高分子として多糖類を使用した場合には、多糖類を形成する単糖類の１単位を１モルとすると、それに対して０．１〜１００モル倍の範囲内で、目的とする分離材の性能に応じて選定することができる。一般的に、架橋剤の添加量を少なくすると、被覆層が多孔質ポリマー粒子から剥離し易くなる傾向がある。また、架橋剤の添加量が過剰で、かつ、水酸基を有する高分子との反応率が高い場合、原料の水酸基を有する高分子の特性が損なわれる傾向がある。
【００５３】
また、架橋反応時の触媒の使用量としては、架橋剤の種類にもよるが、通常、水酸基を有する高分子として多糖類を使用する場合、多糖類を形成する単糖類の１単位を１モルとすると、これに対して好ましくは０．０１〜１０モル倍の範囲、より好ましくは０．１〜５モル倍の範囲で使用される。
【００５４】
温度等の架橋反応条件を変化させることにより、架橋反応を生起させてもよい。例えば、該架橋反応条件を温度条件とした場合、反応系の温度を上げ、その温度が反応温度に達すれば架橋反応が生起する。
【００５５】
水酸基を有する高分子溶液等を含浸させた多孔質ポリマー粒子を分散して懸濁させる媒体は、含浸させた高分子溶液から高分子、架橋剤等を抽出してしまうことなく、且つ、架橋反応に不活性なものであれば制限はない。そのような媒体としては、具体的には、水、アルコール等が挙げられる。
【００５６】
架橋反応は、通常、５〜９０℃の範囲の温度で、１〜１０時間かけて行うことができる。好ましくは、３０〜９０℃の範囲の温度である。
【００５７】
架橋反応終了後、生成した多孔質ポリマー粒子と架橋ゲルとの複合体を濾別し、次いで、メタノール、エタノール等の親水性有機溶媒などで洗浄し、未反応の高分子、懸濁用媒体等を除去すれば、多孔質ポリマー粒子の表面の少なくとも一部に水酸基を有する高分子がコーティングされた粒子が得られる。コーティング量は、熱分解の重量減少等で測定することができる。
【００５８】
（イオン交換体）
イオン交換体は、例えば、水酸基を有する高分子を含む被覆層を備える分離材を、イオン交換基、リガンド（例えばプロテインＡ）等を粒子表面の水酸基を介して導入することにより得られる。イオン交換体は、イオン交換精製、アフィニティ精製等に使用することができる。イオン交換基を導入する方法に用いるハロゲン化アルキル基含有化合物としては、モノハロゲン酢酸、モノハロゲンプロピオン酸等のモノハロゲンカルボン酸及びそのナトリウム塩、ジエチルアミノエチルクロライド等の１級、２級又は３級アミンのハロゲン化物及びその塩酸塩、４級アンモニウム塩のハロゲン化物及びの塩酸塩等が挙げられる。ハロゲン化物は、臭化物、塩化物が好ましい。また、イオン交換基を導入する反応を促進するために、有機溶媒を用いることが有効である。有機溶媒は、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、イソブタノール、１−ペンタノール、イソペンタノール等のアルコール類を用いることができる。このようなハロゲン化アルキル基含有化合物の使用量は、イオン交換基を導入する粒子の全質量に対して０．２質量％以上使用することが好ましい。
【００５９】
通常、このイオン交換基の導入は、多孔質ポリマー粒子の細孔内にコーティングされた水酸基を有する高分子に行われるので、湿潤状態の粒子を、濾過等により水切りした後、所定濃度のアルカリ性水溶液に浸漬し、一定時間放置した後、水、又は水−有機溶媒混合系で、ハロゲン化アルキル基含有化合物を添加して反応させることができる。この反応は、温度４０〜９０℃で、還流下、０．５〜１２時間行うことが好ましい。上記の反応で使用されるハロゲン化アルキル基含有化合物の種類により、付与されたイオン交換基が決定される。
【００６０】
弱塩基性基であるアミノ基をイオン交換基として導入する方法としては、前記ハロゲン化アルキル基含有化合物のうち、モノ−、ジ−又はトリ−アルキルアミノクロライド、モノ−、ジ−又はトリ−アルカノールアミノクロライド、モノ（又はジ−）アルキル−モノ（又はジ−）アルカノールアミノクロライド等の２級又は３級アミノハロゲナイドなどを複合体に反応させる方法などが挙げられる。これらのアミンの使用量は、複合体の全質量に対して０．２質量％以上使用することができる。反応条件は、例えば、４０〜９０℃で０．５〜１２時間であることができる。
【００６１】
強塩基性基である四級アンモニウム基をイオン交換基として導入する場合には、まず、上述のように複合体に３級アミノ基を導入し、該３級アミノ基にエピクロルヒドリン等のハロゲン化アルキル基含有化合物を反応させて４級アンモニウム基に変換させる方法などが挙げられる。又は、４級アンモニウムクロライド等の４級アミノハロゲナイドなどを上述の１〜３級アミノクロライドと同様の方法で複合体と反応させてもよい。
【００６２】
弱酸性基であるカルボキシル基をイオン交換基として導入する方法としては、上記ハロゲン化アルキル基含有化合物として、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等のモノハロゲノカルボン酸又はそのナトリウム塩を複合体に反応させる方法などが挙げられる。これらのカルボン酸又はそのナトリウム塩の使用量は、イオン交換基を導入する複合体の全質量に対して０．２質量％以上使用することができる。
【００６３】
強酸性基であるスルホン酸基をイオン交換基として導入する方法としては、複合体に対してエビクロロヒドリン等のグリシジル化合物を反応させ、さらに亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム等の亜硫酸塩又は重亜硫酸塩の飽和水溶液に該複合体を添加し、３０〜９０℃で１〜１０時間反応させる方法などが挙げられる。
【００６４】
イオン交換基を導入する他の方法としては、アルカリ性雰囲気下で複合体に１，３−プロパンスルトンを反応させる方法も挙げられる。１，３−プロパンスルトンは、複合体の全質量に対して０．４質量％以上使用することができる。反応条件は、例えば、０〜９０℃で０．５〜１２時間であることができる。
【００６５】
これらの方法以外のイオン交換基の導入方法としては、スルホプロピルを反応させる方法、エピハロヒドリン等のグリシジル化合物を付加させた後に該グリシジル基にイオン交換基を導入する方法も挙げられる。
【００６６】
本実施形態に係る多孔質ポリマー粒子の細孔内に水酸基を有する高分子の架橋ゲルを担持させ、イオン交換基又はプロテインＡ等のリガンドを導入することにより得られたイオン交換体は、通常１０〜３００μｍの粒径のものが好ましいが、分取用又は工業用のクロマトグラフィーでの使用には、カラム内圧の極端な増加を避けるために、１０〜３００μｍのものがより好ましい。
【００６７】
本実施形態に係る多孔質ポリマー粒子の細孔内に水酸基を有する高分子を架橋によりコーティングした後、粒子表面、細孔内にイオン交換基又はプロテインＡ等のリガンドを導入することにより得られる分離材は、タンパク質等の生体高分子の分離において、天然高分子、ポリマーからなる粒子の持つそれぞれの利点をあわせ持った特性を示す。この性能は、従来の技術では発揮されなかったものである。特にこのような本実施形態のイオン交換体の骨格となる多孔質ポリマー粒子は、上記のような方法で作られる多孔質ポリマー粒子であるため、非特異吸着が起こりにくく、耐久性、耐アルカリ性にも強い。また、水酸基を有する高分子の架橋体をコーティングすることにより非特異吸着がより起こりにくく、タンパク質の脱吸着がよりし易い。さらに本実施形態のイオン交換体は、同一流速下でのタンパク質等の吸着容量（動的吸着容量）が大きい点でも従来のイオン交換樹脂に比べて好ましい性質を有する。
【００６８】
分離材は、タンパク質等の生体高分子の静電的相互作用による分離、アフィニティ精製等に用いるのに好適である。例えば、タンパク質を含む混合溶液の中に本実施形態に係る分離材を添加し、静電的相互作用によりタンパク質だけを該分離材に吸着させた後、該分離材を溶液から濾別し、塩濃度の高い水溶液中に添加すれば、分離材に吸着しているタンパク質を容易に脱離、回収できる。また、該分離材は、カラムクロマトグラフィーにおいての使用も可能であり、特に液体クロマトグラフィー用分離材として好適である。
【００６９】
該分離材を用いて分離できる生体高分子は、水溶性の物質が好ましい。具体的には、例えば、血清アルブミン、免疫グロブリン等の血液タンパク質などのタンパク質；生体中に存在する酵素；バイオテクノロジーにより生産されるタンパク質生理活性物質；ＤＮＡ；生理活性を有するペプチドなどの生体高分子が挙げられる。生体高分子の分子量は、２００万以下が好ましく、５０万以下がより好ましい。また、公知の方法に従い、タンパク質の等電点、イオン化状態等によって、分離材の性質及び分離条件等を選ぶことができる。公知の方法としては、例えば、特開昭６０−１６９４２７号公報等に記載の方法が挙げられる。
【００７０】
（カラム）
一実施形態に係るカラムは、本実施形態に係る分離材を備え、例えば、本実施形態に係る分離材を充填して得ることができる。該カラムは、上述のような多孔質ポリマー粒子を備える分離材を用いるため、使用する溶出液の性質に依らず、カラム内での分離材の体積変化が殆どなく、操作性に優れる。該カラムは、上述の生体高分子、特にタンパク質の精製用カラムとして好適に使用することができる。
【００７１】
カラムでタンパク質等の生体高分子の分離を行う場合、カラムに通液されるタンパク質等の生体高分子の溶液の通液速度は、一般的に４００ｃｍ／ｈ以下の範囲であるが、本実施形態に係る分離材を使用したカラム場合は、通常のタンパク質分離用のイオン交換体よりも速い速度である８００ｃｍ／ｈ以上でも高吸着容量で使用できる。なお、本明細書における通液速度とは、φ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムに分離材を充填し、液を流した際の通液速度を示す。
【実施例】
【００７２】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００７３】
実施例１
１．多孔質ポリマー粒子１の合成
５００ｍＬの三口フラスコに、スチレン系モノマーとして純度９６質量％のジビニルベンゼン（ＤＶＢ９６０、新日鉄住金化学株式会社製）１６ｇ、ポリオキシアルキレン基を有する親水性モノマーとしてラテムルＰＤ−４２０（花王株式会社製）１．６ｇ、油溶性界面活性剤としてスパン８０（商品名）６．４ｇ、及び重合開始剤として過酸化ベンゾイル０．６４ｇを、高分子分散安定剤であるメチルセルロース５０水溶液（０．１質量％）に加え、マイクロプロセスサーバーを使用して乳化させた後、得られた乳化液をフラスコに移し、８０℃のウォーターバスで加熱しながら、攪拌機を用いて約８時間撹拌した。得られた粒子をろ過により取り出した後、純水及びアセトンで洗浄を行い、多孔質ポリマー粒子１を得た。
【００７４】
２．評価
（タンパク質の非特異吸着能の評価）
得られた粒子０．５ｇを、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）濃度２０ｍｇ／ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）５０ｍＬに投入し、２４時間室温で攪拌を行った。次いで、遠心分離で上澄み液をとった後、分光光度計で該上澄み液のＢＳＡ濃度を測定した。得られたＢＳＡの濃度に基づいて、粒子に吸着したＢＳＡ量を算出した。ＢＳＡの濃度は、分光光度計により２８０ｎｍの吸光度から確認した。非特異吸着量１７ｍｇ／粒子ｇ以下の場合をＡ、１７ｍｇ／粒子ｇを超えて５７ｍｇ／粒子ｇ以下の場合をＢ、５７ｍｇ／粒子ｇを超える場合をＣとして、非特異吸着能を評価した。結果を下記表１に示す。
【００７５】
（平均細孔径及び比表面積の測定）
得られた粒子の平均細孔径及び比表面積を水銀圧入法にて測定した。具体的には、水銀圧入測定装置（オートポア：株式会社島津製作所製）を用いて以下のようにして測定した。試料約０．０５ｇを、標準５ｍＬ粉体用セル（ステム容積０．４ｍＬ）に採り、初期圧２１ｋＰａ（約３ｐｓｉａ、細孔直径約６０μｍ相当）の条件で測定した。水銀パラメータは、装置デフォルトの水銀接触角１３０ｄｅｇｒｅｅｓ、水銀表面張力４８５ｄｙｎｅｓ／ｃｍに設定した。また、細孔径０．０５〜５μｍの範囲に限定してそれぞれの値を算出した。結果を下記表１に示す。
【００７６】
実施例２
スパン８０を使用せず、親水性モノマーとしてポリオキシアルキレン基を有する親水性モノマーアクアロンＲＮ−２０（第一工業製薬株式会社製）１．６ｇを使用したこと以外は実施例１と同様にして多孔質ポリマー粒子２を得た。得られた多孔質ポリマー粒子２について、実施例１と同様にして評価し、その結果を下記表１に示す。
【００７７】
比較例１
親水基及び重合性の二重結合を有する親水性モノマーを使用せず、スパン８０を８ｇ使用したこと以外は実施例１と同様にして多孔質ポリマー粒子３を得た。得られた多孔質ポリマー粒子３について、実施例１と同様にして評価し、その結果を下記表１に示す。
【００７８】
比較例２
親水基及び重合性の二重結合を有する親水性モノマーを使用せず、スチレン系モノマーとして純度９６質量％のジビニルベンゼン（ＤＶＢ９６０、新日鉄住金化学株式会社製）１２ｇ、多孔質化剤としてジエチルベンゼン９．６ｇ及びドデカノール１４．４ｇ、安定化剤としてポリビニルアルコール水溶液（０．０５質量％）を用いたこと以外は実施例１と同様にして多孔質ポリマー粒子４を得た。得られた多孔質ポリマー粒子４について、実施例１と同様にして評価し、その結果を下記表１に示す。
【００７９】
【表１】
2020015809.tif 000002
【００８０】
表１の結果から、本願の実施例１及び２で得られた多孔質ポリマー粒子は、比較例１及び２で得られた多孔質ポリマー粒子と比べて、タンパク質の非特異吸着を充分に抑制できることが確認された。