(57)【要約】【課題】新規の壊死性腸炎治療用組成物を提供する。【解決手段】壊死性腸炎治療用組成物は、脱分化脂肪細胞を有効成分として含有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱分化脂肪細胞を有効成分として含有する、壊死性腸炎治療用組成物。
【請求項２】
前記脱分化脂肪細胞が壊死性腸炎患者又は患畜由来の自家細胞である、請求項１に記載の壊死性腸炎治療用組成物。
【請求項３】
腸管の炎症部に投与されるように用いられる、請求項１又は２に記載の壊死性腸炎治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、壊死性腸炎治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、新生児医療の発展により、出生体重が１５００ｇ以下である低体重児又は生後３２週未満で産まれる早産児が増加している。これら新生児では、腸管が未熟であることや細菌による感染、腸管での血流障害等によって、新生児壊死性腸炎（necrotizing enterocolitis；NEC）が発生するリスクが高まっている。ＮＥＣは、主に生後３０日未満、特に２週間以内の低体重児又は早産児において発症しやすく、敗血症、低栄養、短腸症候群等を高い確率で合併し、死亡率は３０％程度である。また、治癒しても発達遅延や腸管の狭窄等の後遺症が残る虞がある。
【０００３】
ＮＥＣの治療方法としては、一般的に、禁乳、胃内容物の吸引、輸液、抗生剤の投与等が挙げられるが、腸管穿孔の場合には、外科的手術が必要となる。
また、近年、間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell；MSC）がＮＥＣの治療に有効であることがＮＥＣのモデルラットを用いた試験により示されている（例えば、非特許文献１等参照）。
【０００４】
一方、間葉系幹細胞と同様な分化能を有する細胞として脱分化脂肪細胞（dedifferentiated fat cells；DFAT cells）が知られている。ＤＦＡＴ細胞は、脂肪組織を構成する成熟脂肪細胞を単離し、天井培養法を用いることで、自発的に脱分化を開始し、多分化能を獲得した細胞である（例えば、特許文献１、２等参照）。
本発明者らは、これまで、ＤＦＡＴ細胞を用いて、歯周組織再生用材料（例えば、特許文献３等参照）や真皮再建用テンプレート（例えば、特許文献４等参照）を開発している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００４／１１１２１１号
【特許文献２】特開２０００−８３６５６号公報
【特許文献３】国際公開第２０１４／１９６５０３号
【特許文献４】特開２０１６−０８７１８７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Drucker NA et al., “Stem cell therapy in necrotizing enterocolitis: Current state and future directions.”, Seminars in Pediatric Surgery, Vol. 27, Issue 1, p57-64, 2018.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来のＮＥＣの治療法は、対症療法が主となっている。一方、ＮＥＣの治療にＭＳＣを用いる場合には、大量且つ純度の高い幹細胞を速やかに投与する必要があると考えられる。しかしながら、間葉系幹細胞は、採取時の侵襲が大きく、増殖速度が遅く、さらに採取後の細胞には、間葉系幹細胞以外の細胞も多く混在している。そのため、短期間で純度の高い細胞を大量に調製することが困難である。
従って、ＮＥＣの新規で有効な治療法が求められている。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、新規の壊死性腸炎治療用組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＤＦＡＴ細胞をＮＥＣモデルラットに投与することで、優れた治療効果を発揮することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る壊死性腸炎治療用組成物は、ＤＦＡＴ細胞を有効成分として含有する。
前記ＤＦＡＴ細胞が壊死性腸炎患者又は患畜由来の自家細胞であってもよい。
上記第１態様に係る壊死性腸炎治療用組成物は、腸管の炎症部に投与されるように用いられてもよい。
【発明の効果】
【００１１】
上記態様の壊死性腸炎治療用組成物によれば、新規で有効な壊死性腸炎治療用組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】ＮＥＣモデルラットの作製方法を示す概略図である。
【図１Ｂ】実施例１におけるＮＥＣモデルラットへのＤＦＡＴ細胞の投与スケジュールを示す概略図である。
【図２】実施例１におけるＤＦＡＴ細胞の代わりにビヒクル（重炭酸リンゲル液）を投与したＮＥＣモデルラット（Ｖｅｈｉｃｌｅ群）及びＤＦＡＴ投与群でのラットの生存率を示すグラフである。
【図３】実施例１における健常ラット（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）、Ｖｅｈｉｃｌｅ群及びＤＦＡＴ投与群から摘出された腸管を示す画像である。
【図４】実施例１におけるＣｏｎｔｒｏｌ群、Ｖｅｈｉｃｌｅ群及びＤＦＡＴ投与群での腸管の壊死度合いを肉眼で評価した結果を示すグラフである。
【図５】病理学的重症度スケールがｇｒａｄｅ０〜３であるラット腸管のヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色像である。
【図６】実施例２におけるＣｏｎｔｒｏｌ群、Ｖｅｈｉｃｌｅ群及びＤＦＡＴ投与群の腸管のＨＥ染色像の評価結果を示すグラフである。
【図７Ａ】実施例２におけるＣｏｎｔｒｏｌ群、Ｖｅｈｉｃｌｅ群及びＤＦＡＴ投与群の腸管の抗活性型カスパーゼ−３抗体による免疫染色像である。
【図７Ｂ】実施例２におけるＣｏｎｔｒｏｌ群、Ｖｅｈｉｃｌｅ群及びＤＦＡＴ投与群の腸管の抗活性型カスパーゼ−３抗体による免疫染色像の評価結果を示すグラフである。
【図８Ａ】実施例３におけるＮＥＣモデルラットから摘出された腸管で発現が上昇したタンパク質（Ｐａｔｈｗａｙ解析により抽出された、Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，ＰＰＡＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙのｔｅｒｍに含まれる、発現上昇した１３種類のタンパク質）について、ｓｈａｍ群、並びに、ＮＥＣモデルラット（ｖｅｈｉｃｌｅ−ｍｉｌｄ群、ｖｅｈｉｃｌｅ−ｓｅｖｅｒｅ群及びＤＦＡＴ投与群）での発現量を示すグラフである。
【図８Ｂ】実施例３におけるＮＥＣモデルラットから摘出された腸管で発現が減少したタンパク質Ｐａｔｈｗａｙ解析により抽出された、Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，ＰＰＡＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙのｔｅｒｍに含まれる、発現低下した４種類のタンパク質）について、ｓｈａｍ群、並びに、ＮＥＣモデルラット（ｖｅｈｉｃｌｅ−ｍｉｌｄ群、ｖｅｈｉｃｌｅ−ｓｅｖｅｒｅ群及びＤＦＡＴ投与群）での発現量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
≪壊死性腸炎治療用組成物≫
本実施形態の壊死性腸炎治療用組成物（以下、「ＮＥＣ治療用組成物」と略記する場合がある）は、ＤＦＡＴ細胞を有効成分として含有する。
なお、ここでいう「ＤＦＡＴ細胞を有効成分として含有する」とは、ＤＦＡＴ細胞をＮＥＣの治療効果を奏する成分として含有することを意味する。
【００１４】
現在、ＮＥＣの治療への臨床応用が検討されているＭＳＣは、ＥＳ細胞と比べて、腫瘍形成能が低いと考えられており、骨髄、羊水、臍帯血及び脂肪組織等から採取することができる。しかしながら、骨髄からのＭＳＣの採取は侵襲性が高く、ＭＳＣは骨髄中の全有核細胞数に対して０．００１％以上０．０１％以下程度の極微量しか含まれず、加齢とともに増殖力が低下するため、採取対象となるドナーの年齢に増殖力は依存する。羊水からのＭＳＣの採取は、侵襲性は低いが、ＭＳＣは羊水中の全有核細胞数に対して１％以上２％以下程度の微量しか含まれず、増殖が遅い。脂肪組織からのＭＳＣの採取は、侵襲性は低いが、ＭＳＣは間質血管分画中の全有核細胞数に対して０．３％以上４％以下程度の微量しか含まれないため、細胞治療に必要な１０８個程度の細胞数を得るためには、通常５０ｍＬ以上３００ｍＬ以下の脂肪組織の採取が必要となる。また、脂肪組織のＭＳＣは、骨髄及び羊水中のＭＳＣに対して増殖力は高いが、加齢とともに増殖力が低下するため、採取対象となるドナーの年齢に増殖力は依存する。さらに、細胞組織からＭＳＣを採取する際に、ＭＳＣ以外の細胞を多く含むため、継代培養を複数回繰り返して純化する必要があり、純化に時間を要する。
これに対して、ＤＦＡＴ細胞は、脂肪組織の約３０％を占める成熟脂肪細胞を原料としているため、１０ｍＬ程度の少量の脂肪組織から細胞数１０８個程度の細胞治療に十分なＤＦＡＴ細胞が得られる。従って、採取に伴う侵襲性は、脂肪組織からＭＳＣを採取するより低い。また、脂肪組織から成熟脂肪細胞を単離する際に、その他の細胞が混入しにくいため、培養早期より純度の高いＤＦＡＴ細胞が得られる。さらに、ＤＦＡＴ細胞の増殖力はＭＳＣと同等であるが、その増殖力や多分化能はＭＳＣと異なり採取対象となるドナーの年齢や基礎疾患の影響を受けずに保たれる。
また、後述する実施例に記載のとおり、ＤＦＡＴ細胞をＮＥＣモデルラットに腹腔内投与することで、組織修復効果及びＮＥＣ重症度の改善効果が示されており、ＤＦＡＴ細胞の投与はＮＥＣの治療効果を期待できる。
【００１５】
ＤＦＡＴ細胞は、ＮＥＣ患者又は患畜由来の自家細胞であってもよく、当該患者又は患畜以外のドナー由来の他家細胞であってもよい。当該患者又は患畜以外のドナーとしては、ＮＥＣ患者又は患畜と同種の動物であればよく、年齢及び性別は問わない。
ＮＥＣの治療にＮＥＣ患者又は患畜由来の自家細胞を用いる場合、低体重であり、発達が未熟な患者又は患畜であっても、少量の成熟脂肪細胞から大量に自家細胞のＤＦＡＴ細胞を調製することができる。さらに、ＤＦＡＴ細胞は、上述のとおり増殖力が高いことから、短期間に必要量の細胞数を得ることができ、速やかに患者又は患畜に投与することができる。また、自家細胞であるため、免疫拒絶を受けるリスクがない。
また、当該患者又は患畜以外のドナー由来の他家細胞である場合、免疫拒絶により速やかに排除される可能性があるが、他家細胞であるＤＦＡＴ細胞が炎症部において抗炎症作用を発現することができるため、十分に治療効果が期待できる。また、他家細胞である場合、外科手術時に廃棄される脂肪組織から採取された成熟脂肪細胞を用いて調製することができ、侵襲度が低い。さらに、これら廃棄される脂肪組織から採取された成熟脂肪細胞を用いて調製されたＤＦＡＴ細胞からなるバンキングシステムを容易に構築することができ、このバンキングシステムを利用することで、患者又は患畜に適したＤＦＡＴ細胞を適宜選択して用いることもできる。
【００１６】
本実施形態のＮＥＣ治療用組成物に含まれるＤＦＡＴ細胞は、公知の方法、例えば、特許文献２に記載の方法を用いて、動物の脂肪組織から採取された成熟脂肪細胞から調製することができる。具体的には、まず、脂肪組織からコラゲナーゼ処理等により成熟脂肪細胞を単離する。次いで、単離された成熟脂肪細胞を天井培養法によって培養することでＤＦＡＴ細胞が得られる。調製されたＤＦＡＴ細胞は、継代培養を少なくとも１回した後、すぐに使用することができる。
【００１７】
本実施形態のＮＥＣ治療用組成物に含まれるＤＦＡＴ細胞は、ＣＤ３１陰性、ＣＤ４５陰性及びＨＬＡ−ＤＲ陰性である。ＣＤ３１、ＣＤ４５及びＨＬＡ−ＤＲは、細胞表面抗原であり、例えばフローサイトメトリー、細胞染色等により検出することができる。そのため、これら細胞表面抗原を検出することで、ＤＦＡＴ細胞の純度を確認することができる。具体的には、例えば、蛍光標識抗体を用いるフローサイトメトリーでは、ネガティブコントロール（アイソタイプコントロール）と比較してより強い蛍光を発する細胞が検出された場合、当該細胞は当該細胞表面抗原について「陽性」と判定される。蛍光標識抗体は、当該技術分野において公知の任意の抗体を使用することができ、例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）等により標識された抗体が挙げられるが、これらに限定されない。細胞染色において、着色する又は蛍光を発する細胞が顕微鏡下にて観察された場合、当該細胞は当該細胞表面抗原について「陽性」と判定される。細胞染色は、抗体を使用する免疫細胞染色であってもよく、抗体を使用しない非免疫細胞染色であってもよい。
上記細胞表面抗原を検出するタイミングとしては、特別な限定はなく、例えば、成熟脂肪細胞からＤＦＡＴ細胞が調製された直後、継代培養中、製剤化する前等が挙げられる。
【００１８】
本実施形態のＮＥＣ治療用組成物は、公知の方法を用いて適宜製剤とすることができ、一般的な細胞製剤が含む成分を配合することができる。具体的には、本実施形態のＮＥＣ治療用組成物の製剤においては、製剤上の必要に応じて、適宜の薬学的に許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、吸着剤、甘味剤、希釈剤等の任意成分を配合することができる。
【００１９】
本実施形態のＮＥＣ治療用組成物の投与方法としては、腸管の炎症部に投与されるように用いられることが好ましい。投与方法として具体的には、例えば、血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与、皮下投与等が挙げられる。中でも、腹腔内投与又は腸管内投与が好ましい。
【００２０】
本実施形態のＮＥＣ治療用組成物の投与量としては、ＮＥＣの重症度や、剤型、投与対象の体重等によって変わり得るが、ＤＦＡＴ細胞を、例えば、１回当たり、１．０×１０５個／ｋｇ体重以上１．０×１０１０個／ｋｇ体重以下の範囲で投与することができる。また、本実施形態のＮＥＣ治療用組成物の投与は、単回投与でもよく、複数回投与であってもよい。複数回投与である場合は、例えば、２時間以上１２時間以下の期間毎、毎日、２日に１回等の頻度で投与することができる。
【００２１】
本実施形態のＮＥＣ治療用組成物の投与対象としては、哺乳動物であることが好ましい。哺乳動物としては、特別な限定はないが、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ等が挙げられる。中でも、哺乳動物としては、ヒトが好ましい。
【００２２】
また、一実施形態において、本発明は、ＮＥＣ治療用組成物の製造のための、ＤＦＡＴ細胞の使用を提供することができる。
また、一実施形態において、本発明は、ＮＥＣの治療のための、ＤＦＡＴ細胞の使用を提供することができる。
また、一実施形態において、本発明は、ＮＥＣ患者又は患畜に投与して、組織修復又はＮＥＣ重症度の改善のために使用される、ＤＦＡＴ細胞を提供することができる。
また、一実施形態において、本発明は、ＤＦＡＴ細胞の治療有効量をＮＥＣ患者又は患畜に投与する、ＮＥＣの治療方法を提供することができる。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２４】
［実施例１］
１．マウスＤＦＡＴ細胞の調製
マウスＤＦＡＴ細胞は、特許文献２に記載の方法を用いて、マウス脂肪組織から採取された成熟脂肪細胞から、予め調製した。
【００２５】
２．ＮＥＣモデルラットの作製及びＤＦＡＴ細胞の投与
ＮＥＣモデルラットは、参考文献１（Guven A et al., “Hyperbaric oxygen therapy reduces the severity of necrotizing enterocolitis in a neonatal rat model.”, Journal of Pediatric Surgery, Vol. 44, Issue 3, p534-540, 2009.）に記載の方法を用いて、作製することができる（図１Ａ参照）。
ＮＥＣモデルラットの作製と並行したＤＦＡＴ細胞の投与（以下、「ＤＦＡＴ投与群」と称する場合がある）（ｎ＝１４）は、図１Ｂに示すプロトコールに沿って、行った。具体的には、まず、妊娠２１日齢のラットを帝王切開して、仔ラットを取り出した。次いで、仔ラットに、低体温刺激（４℃５分間）、低酸素刺激（１００％二酸化炭素環境下、１０分間）及び酸素投与（１００％酸素環境下、５分間）からなるストレス負荷を、１日に２回ずつ４日間にわたって行った。また、生後２時間後及び２８時間後に、仔ラットの体重１ｋｇに対して３ｍｇ以上４ｍｇ以下程度のリポ多糖（Lipopolysaccharide；LPS）（大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４株由来）を胃内投与した。ＤＦＡＴ細胞は、生後３１時間後及び５５時間後に、それぞれ１．０×１０６ｃｅｌｌｓずつ、２回に分けて、腹腔内投与した（図１Ｂ参照）。生後９６時間後に開腹した。
また、生後３１時間後及び５５時間後に、ＤＦＡＴ細胞の代わりに、ビヒクル（重炭酸リンゲル液（エイワイファーマ株式会社製））のみを投与した仔ラットも準備した（以下、「Ｖｅｈｉｃｌｅ群」と称する場合がある）（ｎ＝１４）。
さらに、上記ストレス及びリポ多糖を投与せずに生育した健常仔ラットも準備した（以下、「Ｃｏｎｔｒｏｌ群」と称する場合がある）（ｎ＝６）。
【００２６】
生後９６時間後（４日後）までの生存率の推移を図２に示す。
図２から、ＤＦＡＴ投与群では、生後４日後までの生存率が６０％程度であったのに対して、Ｖｅｈｉｃｌｅ群では３０％程度であり、生存率が有意に高かった。
【００２７】
３．肉眼での観察
生後４日後の各群の仔ラットの腸管を摘出して、肉眼で観察した（図３参照）。
図３から、ＤＦＡＴ投与群では、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と同様に、腸管は正常であったのに対して、Ｖｅｈｉｃｌｅ群では腸管の壊死が観察された（図３中、「Ｖｅｈｉｃｌｅ群」の矢頭参照）。
また、以下の評価基準に従って、各群のラットの腸管の状態を評価した。ＤＦＡＴ投与群及びＶｅｈｉｃｌｅ群では、準備した１４匹中、９匹について評価を行った。Ｃｏｎｔｒｏｌ群では、準備した６匹中、６匹とも評価対象とした。結果を図４に示す。
【００２８】
（評価基準）
スコア０：正常腸管
スコア１：軽度出血
スコア２：中等度出血、又は腸管壁が褐色〜黒色に変化
スコア３：重度出血、又は腸管穿孔
【００２９】
図４から、ＤＦＡＴ投与群では、評価対象である９匹中、スコア０の仔ラットは７匹であった。これに対して、Ｖｅｈｉｃｌｅ群では、評価対象である９匹中、スコア０である仔ラットは３匹であり、スコア１以上の仔ラットが評価対象の３分の２を占めていた。
【００３０】
［実施例２］
１．ＮＥＣモデルラットの作製及びＤＦＡＴの投与
実施例１と同様の方法を用いて、ＤＦＡＴ投与群、Ｖｅｈｉｃｌｅ群及びＣｏｎｔｒｏｌ群を各１０匹ずつ準備した。
【００３１】
２．病理学的評価
（１）ＨＥ染色
摘出した腸管から組織片を作製し、ＨＥ染色を行い、腸管の壊死の重症度を評価した。各群のＨＥ染色像について、参考文献１に記載の評価基準（具体的には、以下参照）に従い、評価した（図５参照）。結果を図６に示す。なお、ＤＦＡＴ投与群では、準備した１０匹中、８匹について評価を行った。Ｖｅｈｉｃｌｅ群では、準備した１０匹中、９匹について評価を行った。Ｃｏｎｔｒｏｌ群では、準備した１０匹中、１０匹とも評価対象とした。
【００３２】
（評価基準）
ｇｒａｄｅ０：正常
ｇｒａｄｅ１：絨毛中心の分離が観察される、他の異常はない
ｇｒａｄｅ２：絨毛中心の分離、粘膜下層の浮腫及び上皮脱落が観察される
ｇｒａｄｅ３：上皮の露出、絨毛の欠損、全層の壊死又は穿孔が観察される
【００３３】
図６から、ＤＦＡＴ投与群では、評価対象である８匹中、ｇｒａｄｅ０の仔ラットが５匹であり、ｇｒａｄｅ３である仔ラットは観察されなかった。一方、Ｖｅｈｉｃｌｅ群では、評価対象である９匹中、ｇｒａｄｅ０の仔ラットは観察されず、ｇｒａｄｅ３である仔ラットが５匹であり、評価対象の２分の１以上を占めていた。
【００３４】
（２）抗活性型カスパーゼ−３抗体による免疫染色
摘出した腸管から組織片を作製し、抗活性型カスパーゼ−３抗体による免疫染色を行い、アポトーシスした細胞を染色した。各群の免疫染色像の代表例を図７Ａに示す。各群の免疫染色像について、参考文献１に記載の評価基準（具体的には、以下参照）に従い、評価した。結果を図７Ｂに示す。なお、ＤＦＡＴ投与群及びＣｏｎｔｒｏｌ群では、準備した１０匹中、１０匹とも評価対象とした。Ｖｅｈｉｃｌｅ群では、準備した１０匹中、８匹について評価を行った。
【００３５】
（評価基準）
ｇｒａｄｅ０：正常
ｇｒａｄｅ１：絨毛先端にアポトーシス核がある
ｇｒａｄｅ２：すべての繊毛先端にアポトーシス核がある、クリプトは保たれている
ｇｒａｄｅ３：移行部がアポトーシス核で分離している
【００３６】
図７Ａ及び図７Ｂから、ＤＦＡＴ投与群では、評価対象である１０匹中、ｇｒａｄｅ０の仔ラットが８匹であり、評価対象の５分の４を占めていた。一方、Ｖｅｈｉｃｌｅ群では、評価対象である８匹中、ｇｒａｄｅ０の仔ラットが観察されず、ｇｒａｄｅ１である仔ラットが１匹、ｇｒａｄｅ２である仔ラットが５匹、ｇｒａｄｅ３である仔ラットが２匹であった。
【００３７】
［実施例３］
１．ＮＥＣモデルラットの作製及びＤＦＡＴの投与
実施例１と同様の方法を用いて、ＤＦＡＴ投与群を準備した（ｎ＝３）。
また、生後３１時間後及び５５時間後に、ＤＦＡＴ細胞の代わりに、ビヒクル（重炭酸リンゲル液（エイワイファーマ株式会社製））のみを投与した仔ラットも準備した（以下、「ｖｅｈｉｃｌｅ−ｍｉｌｄ群」又は「ｍｉｌｄ群」と称する場合がある）（ｎ＝３）。
また、生後３１時間後及び５５時間後に、ＤＦＡＴ細胞の代わりに、ビヒクル（重炭酸リンゲル液（エイワイファーマ株式会社製））のみを投与した仔ラットも準備した（以下、「ｖｅｈｉｃｌｅ−ｓｅｖｅｒｅ群」又は「ｓｅｖｅｒｅ群」と称する場合がある）（ｎ＝３）。
さらに、上記ストレス及びリポ多糖を投与せずに生育した健常仔ラットも準備した（以下、「ｓｈａｍ（見せかけ）群」と称する場合がある）（ｎ＝３）。
【００３８】
２．プロテオーム解析
１．で準備した各ラット群の腸管を摘出しタンパク抽出を行い、タンパク質の網羅的解析であるＬＣ−ＭＳ/ＭＳを用いて、プロテオーム解析を行なった。その結果、腸管において検出されたタンパク質１４２６種類のうち、ＮＥＣモデルラットにおいて発現が上昇したタンパク質は３３５種類であり、発現が減少したタンパク質は１０１種類であり、ＮＥＣモデルラットにおいて発現が変動したタンパク質は合計４３６種類であった。発現の上昇及び減少の選定条件は以下のとおりとした。
【００３９】
（条件）
発現上昇：ｓｈａｍ群に対するｍｉｌｄ群の発現量の比  mild/sham＞1.5、且つ、
ｓｈａｍ群に対するｓｅｖｅｒｅ群の発現量の比  severe/sham＞2.0
（ｓｈａｍ群が検出限界以下の場合には、
ｍｉｌｄ群及びｓｅｖｅｒｅ群の両方で検出されるタンパク質であって、
ｍｉｌｄ群に対するｓｅｖｅｒｅ群の発現量の比  severe/mild＞2.0/1.5）
発現減少：ｓｈａｍ群に対するｍｉｌｄ群の発現量の比  mild/sham＜1/1.5、
ｓｈａｍ群に対するｓｅｖｅｒｅ群の発現量の比  severe/sham＜1/2.0、且つ、
ｍｉｌｄ群に対するｓｅｖｅｒｅ群の発現量の比  severe/mild＜1.5/2.0
【００４０】
これらＮＥＣモデルラットにおいて発現が変動したタンパク質４３６種類について、ＫＥＧＧのＰａｔｈｗａｙデータベース（https://www.genome.jp/kegg/pathway.html；検索日２０１９年６月１日）を用いて、Ｐａｔｈｗａｙ解析を行なった。解析条件は以下のとおりである。結果を以下の表１に示す。
【００４１】
（解析条件）
ｐ＜０．０５；
Ｆｏｌｄ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ＞２；
Ｓｙｍｂｏｌｓ  ｎｕｍｂｅｒ＞３；
Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｓｃｏｒｅ＞２
【００４２】
【表１】
2020066624.tif 000002
【００４３】
発現が上昇したタンパク質（上記Ｐａｔｈｗａｙ解析により抽出された、Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ、ＰＰＡＲ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙのｔｅｒｍに含まれる、発現上昇した１３種類のタンパク質）の各ラット群での発現量を示すグラフを図８Ａに、ＮＥＣモデルラットにおいて発現が減少したタンパク質（上記Ｐａｔｈｗａｙ解析により抽出された、Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ、ＰＰＡＲ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙのｔｅｒｍに含まれる、発現低下した４種類のタンパク質）の各ラット群での発現量を示すグラフを図８Ｂに示す。図８Ａ及び図８Ｂにおいて、いずれもｓｈａｍ群での各タンパク質の発現量を１とした場合の各群での相対値を示す。発現の上昇及び減少の改善の選定条件は以下のとおりとした。
【００４４】
（条件）
発現上昇：ＮＥＣモデルラットにおいて発現が上昇し、且つＤＦＡＴ投与により発現が改善したタンパク質は３３５種類のうち、
ｓｅｖｅｒｅ群に対するＤＦＡＴ投与群の発現量の比  DFAT/severe＜1/2.0、且つ、
ｍｉｌｄ群に対するＤＦＡＴ投与群の発現量の比  DFAT/mild＜1/1.5
発現減少：ＮＥＣモデルラットにおいて発現が減少し、且つＤＦＡＴ投与により発現が改善したタンパク質は１０１種類のうち、
ｓｅｖｅｒｅ群に対するＤＦＡＴ投与群の発現量の比  DFAT/severe＞2.0、且つ、
ｍｉｌｄ群に対するＤＦＡＴ投与群の発現量の比  DFAT/mild＞1.5
【００４５】
ＮＥＣモデルラットにおいて発現が変動したタンパク質４３６種類のうち、ＤＦＡＴ投与群において発現の上昇が改善されたタンパク質は８６種類、発現の減少が改善されたタンパク質は７種類であり、ＮＥＣモデルラットにおいてＤＦＡＴ投与により発現の変動が改善したタンパク質は合計９３種類であった。
【００４６】
これらＮＥＣモデルラットにおいてＤＦＡＴ投与により発現の変動が改善したタンパク質９３種類について、ＫＥＧＧのＰａｔｈｗａｙデータベース（https://www.genome.jp/kegg/pathway.html；検索日2019年２０１９年６月１日）を用いて、Ｐａｔｈｗａｙ解析を行なった。解析条件は以下のとおりである。結果を以下の表２に示す。
【００４７】
（解析条件）
ｐ＜０．０５；
Ｆｏｌｄ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ＞２；
Ｓｙｍｂｏｌｓ  ｎｕｍｂｅｒ＞３；
Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｓｃｏｒｅ＞２
【００４８】
【表２】
2020066624.tif 000003
【００４９】
表１に示すＰａｔｈｗａｙ解析から、ＮＥＣモデルラットでは、Ａｃａｔ１（アセチル補酵素Ａ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ  １）等に代表される脂肪酸代謝関連タンパク質群（Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ、ＰＰＡＲ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ）が最も顕著に発現変動を示すことが明らかとなった。
さらに、図８Ａ、図８Ｂ及び表２から、ＮＥＣモデルラットで発現が変動したタンパク質において、ＤＦＡＴの投与により、Ａｃａｄｍ（中鎖アシル補酵素Ａ脱水素酵素）、Ａｌｄｈ７ａ１（アルデヒド脱水素酵素  ７ａ１）、Ａｃｏｘ１（アセチル補酵素Ａオキシダーゼ  １）、Ｅｃｈｓ１（エノイル補酵素Ａヒドラターゼ  １）等の脂肪酸分解を担うタンパク質群（Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）の発現異常が改善されることが明らかとなった。
これらの結果から、脂肪酸代謝関連タンパク質がＮＥＣの治療標的となり得ることが示唆された。同時に、ＤＦＡＴの投与により、脂肪酸代謝関連タンパク質の発現異常が改善される可能性が示された。
【００５０】
以上のことから、ＤＦＡＴ細胞は、ＮＥＣの治療に有効であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本実施形態のＮＥＣ治療用組成物によれば、ＮＥＣを治療することができる。
【図１Ａ】
2020066624.tif 000004
【図１Ｂ】
2020066624.tif 000005
【図２】
2020066624.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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