(57)【要約】【課題】本発明の一態様は、受容液の自由度が高く、より簡便かつ故障リスクの低い三次元造形方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明の一態様に係る三次元造形方法は、受容液Ａの液面に、受容液Ａと反応してゲル化する溶液Ｂを添加して下地層を形成する工程と、前記下地層の上に、受容液Ａと反応してゲル化する溶液Ｃを滴下することにより形成されるゲルを積層して、三次元構造体を形成する工程とを含む。【選択図】図１
2020121531.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容液Ａの液面に、受容液Ａと反応してゲル化する溶液Ｂを添加して下地層を形成する下地層形成工程と、
前記下地層の上に、受容液Ａと反応してゲル化する溶液Ｃを滴下することにより形成されるゲルを積層して、三次元構造体を形成する造形工程とを含む、三次元構造体の製造方法。
【請求項２】
前記下地層形成工程において、前記受容液Ａの液面に対して前記溶液Ｂをインクジェットで塗布することによって前記下地層を形成する、請求項１に記載の三次元構造体の製造方法。
【請求項３】
前記下地層形成工程において、前記受容液Ａの液面に、前記溶液Ｂをスプレー塗布することによって前記下地層を形成する、請求項１に記載の三次元構造体の製造方法。
【請求項４】
前記下地層の、鉛直上方から見た面積が、目的の形状を有する三次元構造体と前記下地層とが接する面積よりも大きい、請求項１〜３のいずれか１項に記載の三次元構造体の製造方法。
【請求項５】
前記下地層の、鉛直上方から見た形状が正多角形または円である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の三次元構造体の製造方法。
【請求項６】
前記下地層形成工程において、鉛直上方から見た下地層のアスペクト比が１：２以下となるように前記溶液Ｂを添加する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の三次元構造体の製造方法。
【請求項７】
前記下地層には、三次元構造体を構成するゲルの直径よりも小さい孔が形成されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の三次元構造体の製造方法。
【請求項８】
前記下地層の比重が前記受容液Ａの比重よりも小さい、請求項１〜７のいずれか１項に記載の三次元構造体の製造方法。
【請求項９】
前記造形工程の後に前記下地層を除去する下地層除去工程を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の三次元構造体の製造方法。
【請求項１０】
前記溶液Ｂが、前記溶液Ｃと異なる組成である、請求項９に記載の三次元構造体の製造方法。
【請求項１１】
前記三次元構造体が細胞を含有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の三次元構造体の製造方法。
【請求項１２】
前記三次元構造体が含有する細胞が植物細胞である、請求項１１に記載の三次元構造体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、三次元構造体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
三次元構造体の製造方法として、例えば、特許文献１および２、並びに非特許文献１のようにマイクロビーズを用いた従来技術が挙げられる。
【０００３】
特許文献１には、ゲル形成性Ａ液を、前記Ａ液と接触するとゲルを生成するゲル形成性Ｂ液（受容液）を有する水槽に噴射位置を変えながら噴射することで、次々にゲルマイクロビーズが癒着した三次元構造体を製造する方法が開示されている。
【０００４】
特許文献２には、熱源上に配置された基体上に、細胞とポリマー粒子とを含む組成物を配し、温度変化により前記組成物をゾル状態からゲル状態に変化させることを繰り返して三次元細胞集合体を製造する方法が開示されている。
【０００５】
また、非特許文献１には、３Ｄバイオプリンタを用いて、垂直方向に移動可能なエレベータステージ上にゲルを積層する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−１２６４５９号公報
【特許文献２】特開２０１６−１１１９８８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】International Journal of Bioprinting(2016)-Volume 2,Issue 2，p.153-162
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、上述のような従来技術には改善の余地があった。例えば、特許文献１では、三次元構造体を形成するゲルは受容液中で固定されていない。そのため、受容液中に形成されたゲルは容易に移動し、それゆえ、目的の形状を有する３次元構造体を形成することが困難になる恐れがある。また、受容液中のゲルの移動を防ぐために、増粘剤を用いて受容液を高粘度にして流動を抑えると、植物細胞または動物細胞を使用した三次元構造体を作製する場合に、細胞培養の阻害要因となり得る。
【０００９】
特許文献２では、三次元細胞集合体の積層面が熱源より離れすぎると、ポリマー粒子を含む組成物がゲル化しにくくなり、嵩高い積層体を作ることが困難である。一方、ポリマー粒子を含む組成物を滴下するインクジェットノズルが熱源に近すぎると、滴下する前に組成物がゲル化してしまう恐れがあるため、インクジェットノズルと積層面とが一定の距離離れることになる。しかし、この場合、滴下する組成物が飛翔中に風等の影響を受け、着弾位置がずれてしまう。加えて、加熱により組成物に含まれる細胞がダメージを受ける可能性も否定できない。
【００１０】
また、非特許文献１は、エレベータステージを動かす際に受容液が流動するため、造形精度が低下し得る。また、受容液の流動が落ち着くまでに一定の時間を要し、作業効率が悪い。加えて、３Ｄバイオプリンタの構造上、受容液が漏れるリスクがあり、装置の故障につながる恐れもある。
【００１１】
本発明の一態様は、受容液の自由度が高く、より簡便かつ装置の故障リスクの低い、三次元構造体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の課題を解決するために、鋭意研究を行った結果、前記受容液Ａと、受容液Ａと反応してゲル化する溶液とを用いて形成した下地層上に、ゲルを積層することによって、任意の三次元構造体を簡便に得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明は、以下の態様を含む。
【００１３】
＜１＞受容液Ａの液面に、受容液Ａと反応してゲル化する溶液Ｂを添加して下地層を形成する下地層形成工程と、前記下地層の上に、受容液Ａと反応してゲル化する溶液Ｃを滴下することにより形成されるゲルを積層して、三次元構造体を形成する造形工程とを含む、三次元構造体の製造方法。
【００１４】
＜２＞前記下地層形成工程において、前記受容液Ａの液面に対して前記溶液Ｂをインクジェットで塗布することによって前記下地層を形成する、＜１＞に記載の三次元構造体の製造方法。
【００１５】
＜３＞前記下地層形成工程において、前記受容液Ａの液面に、前記溶液Ｂをスプレー塗布することによって前記下地層を形成する、＜１＞に記載の三次元構造体の製造方法。
【００１６】
＜４＞前記下地層の、鉛直上方から見た面積が、目的の形状を有する三次元構造体と前記下地層とが接する面積よりも大きい、＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の三次元構造体の製造方法。
【００１７】
＜５＞前記下地層の、鉛直上方から見た形状が正多角形または円である、＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の三次元構造体の製造方法。
【００１８】
＜６＞前記下地層形成工程において、鉛直上方から見た下地層のアスペクト比が１：２以下となるように前記溶液Ｂを添加する、＜１＞〜＜５＞のいずれか１つに記載の三次元構造体の製造方法。
【００１９】
＜７＞前記下地層には、三次元構造体を構成するゲルの直径よりも小さい孔が形成されている、＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の三次元構造体の製造方法。
【００２０】
＜８＞前記下地層の比重が前記受容液Ａの比重よりも小さい、＜１＞〜＜７＞のいずれか１つに記載の三次元構造体の製造方法。
【００２１】
＜９＞前記造形工程の後に前記下地層を除去する下地層除去工程を含む、＜１＞〜＜８＞のいずれか１つに記載の三次元構造体の製造方法。
【００２２】
＜１０＞前記溶液Ｂが、前記溶液Ｃと異なる組成である、＜９＞に記載の三次元構造体の製造方法。
【００２３】
＜１１＞前記三次元構造体が細胞を含有する、＜１＞〜＜１０＞のいずれか１つに記載の三次元構造体の製造方法。
＜１２＞前記三次元構造体が含有する細胞が植物細胞である、＜１１＞に記載の三次元構造体の製造方法。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の一態様によれば、受容液の自由度が高く、より簡便かつ故障リスクの低い三次元造形方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明に係る三次元構造体の製造方法における工程の一例を表す概略図である。
【図２】（ａ）は、参考例１におけるインクジェットヘッドの移動方向を示した図であり、（ｂ）は参考例１において形成された下地層を撮影した画像を示した図である。
【図３】（ａ）は、参考例２におけるインクジェットヘッドの移動方向を示した図であり、（ｂ）は参考例２において形成された下地層を撮影した画像を示した図である。
【図４】（ａ）は、参考例３におけるインクジェットヘッドの移動方向を示した図であり、（ｂ）は参考例３において形成された下地層を撮影した画像を示した図である。
【図５】（ａ）〜（ｄ）は、参考例４におけるインクジェットヘッドの移動手順を示した図である。
【図６】実施例１におけるインクジェットヘッドの移動方向を示した図である。
【図７】実施例１において形成された三次元構造体を撮影した画像を示した図である。
【図８】実施例２におけるインクジェットヘッドの移動方向を示した図である。
【図９】実施例２において形成された三次元構造体を撮影した画像を示した図である。
【図１０】実施例３におけるインクジェットヘッドの移動方向を示した図である。
【図１１】実施例３において形成された三次元構造体を撮影した画像を示した図である。
【図１２】（ａ）〜（ｆ）は、実施例４におけるインクジェットヘッドの移動手順を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定にされるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。
【００２７】
また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上Ｂ以下」を意図する。図面において、Ｘ軸、Ｙ軸、Ｚ軸は、三次元空間における方向を規定している。Ｘ軸、Ｙ軸は水平方向を表し、Ｘ軸とＹ軸とは直交する。Ｚ軸はＸＹ平面に対して垂直な方向を表す。
【００２８】
〔１．三次元構造体の製造方法〕
本発明の一実施形態に係る三次元造形方法は、受容液Ａの液面に、受容液Ａと反応してゲル化する溶液Ｂを添加して下地層を形成する下地層形成工程と、前記下地層の上に、受容液Ａと反応してゲル化する溶液Ｃを滴下することにより形成されるゲルを積層して、三次元構造体を形成する造形工程とを含む。
【００２９】
＜受容液Ａ、溶液Ｂおよび溶液Ｃ＞
本発明の一実施形態に係る溶液Ｂおよび溶液Ｃは、受容液Ａと反応してゲル化する溶液である。すなわち、溶液Ｂまたは溶液Ｃの液滴を受容液Ａに滴下すると、当該液滴の表面にゲル被膜が形成される。これにより、ゲルが形成される。本明細書において、溶液Ｂは、下地層を形成するために使用される溶液を表し、溶液Ｃは、三次元構造体を造形するために使用される溶液を表す。前記溶液Ｂは、前記溶液Ｃと同じ溶液であっても、異なる溶液であってもよい。
【００３０】
受容液Ａと溶液Ｂまたは溶液Ｃとの組み合わせとして、アルカリ土類金属塩の水溶液とアルギン酸塩水溶液；カルシウム塩、トロンビンおよびフィブリノーゲンのうち、２成分を含む水溶液と残りの１成分を含む水溶液；ポリビニルアルコール水溶液とホウ酸水溶液；塩化ナトリウム水溶液とペプチドハイドロゲル形成性ペプチド水溶液；温水と昇温時ゲル化型熱可逆ハイドロゲル形成性親水性高分子水溶液等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。細胞を含有する三次元構造体を形成する場合には生物親和性等の観点から、受容液Ａと溶液Ｂまたは溶液Ｃとの組み合わせは、アルカリ土類金属塩の水溶液およびアルギン酸塩であることが好ましい。
【００３１】
例えば、前記アルカリ土類金属塩として塩化カルシウム、塩化バリウム、塩化マグネシウム、塩化ストロンチウム等が挙げられる。前記アルギン酸塩としてアルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム等が挙げられる。アルカリ土類金属塩の水溶液とアルギン酸塩水溶液との反応により得られたゲルは、アルギン酸のアルカリ土類金属塩を含む。アルギン酸のアルカリ土類金属塩としては、例えば、アルギン酸カルシウム、アルギン酸バリウム、アルギン酸ストロンチウム、アルギン酸マグネシウム等が挙げられる。
【００３２】
なお、前記のような組み合わせにおいて、どちらを受容液Ａ、どちらを溶液Ｂまたは溶液Ｃにしても構わないが、溶液Ｂまたは溶液Ｃを滴下する際の利便性の観点から、粘度の低い溶液を溶液Ｂまたは溶液Ｃとする方が好ましい。
【００３３】
本発明の一実施形態では、上述のようにゲル化する溶液の組み合わせを用いる手法、すなわち、温度変化を伴わないゲル化を容易に行う手法を用いることにより、細胞へのダメージを排除できる。なお、特許文献２と同様に温度変化によりゾル−ゲル変化する材料としては、寒天（９０℃）、ゼラチン（５０〜６０℃）、カラギナン（７０℃）、ペクチン（８０℃）、ジェランガム（９０℃）、キサンタンガム＋ローカストビーンガム（８０℃）、タマリンドシードガム（８５℃）、カードラン（５０℃）等が挙げられる。前記括弧内の数字は溶解温度である。
【００３４】
アルカリ土類金属イオンの濃度は、細胞を含有する三次元構造体を形成する場合には培養時に細胞に与える影響を抑制する観点から、３０〜１，５００ｍＭであることが好ましく、４５〜１，０００ｍＭであることがより好ましい。また、アルギン酸塩の濃度は、特に限定されないが、高粘度化による取り扱い性低下抑制の観点から、０．５重量％〜１．５重量％であることが好ましい。
【００３５】
受容液Ａ、溶液Ｂおよび／または溶液Ｃは、上述した成分の他に浸透圧調製剤、ｐＨ調整剤等を含んでいてもよい。
【００３６】
浸透圧調製剤としては、例えば、マンニトール、ソルビトール等が挙げられる。
【００３７】
ｐＨ調整剤としては、例えば、２−モルホリノエタンスルホン酸（以降ＭＥＳと省略）、リン酸緩衝液等が挙げられる。なお、一般的に細胞の培養に適したｐＨの範囲は５．５〜６程度である。
【００３８】
＜下地層形成工程＞
下地層形成工程は、受容液Ａの液面に、受容液Ａと反応してゲル化する溶液Ｂを添加して下地層を形成する工程である。本発明の一実施形態において、目的の三次元構造体を形成する前に、前記受容液Ａの液面に下地層を形成する。具体的には、水槽に受容液Ａを満たし、前記受容液Ａの液面に対して、前記溶液Ｂを接触させる。溶液Ｂは受容液Ａと反応し、その結果、ゲルが形成される。これにより、ゲルから構成された下地層を形成することができる。
【００３９】
下地層を形成することにより、受容液の粘度を高粘度にしたり、受容液を有する水槽内にエレベータステージを設置したりすることなく、三次元構造体を保持できるため、三次元構造体の造形精度を高めることができる。また、エレベータステージの昇降に伴う受容液の流動がないため、プロセス時間が長くなることはない。さらに、エレベータステージがないため、液漏れのリスクもない。また、エレベータステージがないため、装置のコストも抑制することができる。
【００４０】
図１は、本発明の三次元構造体の製造方法における工程の一例を表した概略図である。図１の（ａ）および（ｆ）は、下地層形成工程の一例を表す。
【００４１】
受容液Ａの液面に対して、溶液Ｂを接触させる方法は特に限定されない。受容液Ａの液面に、溶液Ｂをスプレー塗布することによって下地層を形成（以下、「スプレー方式」とも称する）してもよい。または、受容液Ａの液面に対して溶液Ｂをインクジェットで塗布することによって下地層を形成（以下、「インクジェット方式」とも称する）してもよい。
【００４２】
例えば、図１の（ａ）は、水槽に満たされた受容液Ａ１の液面に、スプレーノズル２を用いて、受容液Ａ１と反応してゲル化する溶液Ｂ３をスプレー塗布する下地層形成工程を示す。このとき、所望の大きさの下地層を形成するために、溶液Ｂ３が塗布される範囲を制御するマスク４を介して、溶液Ｂ３をスプレー塗布することが好ましい。図１の（ｂ）は、下地層形成工程において形成された下地層を表す。受容液Ａ１と反応した受容液Ｂ３は、ゲル化し下地層５を形成する。下地層５は、受容液Ａ１の液面付近に形成される。マスクの開口形状によって下地層の形状を変更できる。
【００４３】
または、図１の（ｆ）のように、水槽に満たされた受容液Ａ１の液面に、インクジェット６を用いて、受容液Ａ１と反応してゲル化する溶液Ｂ３を添加することによって下地層５を形成してもよい。このとき、インクジェットをＸ軸方向およびＹ軸方向に移動させながら溶液Ｂ３を滴下することが好ましい。
【００４４】
スプレー方式は、簡易に下地層を形成するのに適している。また、インクジェット方式では、着弾位置および噴霧量を詳細に制御できるため、下地層の構造および膜厚等の制御が容易である。例えば、インクジェット方式によれば、孔等を有する下地層を形成することが容易である。その他の溶液Ｂの滴下方法としては、例えば、接触式／非接触式の各種ディスペンサ法が挙げられる。下地層を任意の形状に形成できるため、インクジェット法または非接触式であるジェットディスペンサ法等が好ましい。
【００４５】
溶液Ｂの吐出量および飛翔速度等は、溶液の組成等に応じて適宜調整すればよい。溶液Ｂの吐出量は、例えば、２００〜７００ｐＬであってもよい。この場合、吐出された液滴の直径は７０〜１２０μｍであり得る。また、液滴の飛翔速度は１．５〜８ｍ／ｓであってもよい。
【００４６】
下地層形成工程において、鉛直上方から見た前記下地層のアスペクト比が１：２以下となるように溶液Ｂを添加することが好ましい。下地層形成工程において、鉛直上方から見た前記下地層のアスペクト比を１：２以下に保ったまま溶液Ｂを添加することがさらに好ましい。すなわち、下地層のＸＹ平面におけるアスペクト比を小さく保ったまま下地層を形成することが好ましい。また、前記下地層は、アスペクト比の小さい形状であることが好ましい。下地層は、受容液Ａの流動による影響を受けやすい。下地層のアスペクト比が大きい、すなわち、下地層が棒状などの形状であると、受容液Ａの流動によって大きく変形する場合がある。アスペクト比を小さくすることで、受容液Ａの流動の影響による下地層の変形を小さくすることができる。前記下地層のＸＹ平面におけるアスペクト比は、例えば、１：２以下であることが好ましい。前記下地層のＸＹ平面におけるアスペクト比１：２とは、例えば、球状のゲルが２個連結した場合を表す。アスペクト比１：２以下に保ったまま下地層を形成するには、球状のゲルを、同じ方向に連続して描画する場合、描画方向に連続して吐出する球状のゲルにより形成される長さが、描画方向と直交する方向の辺において既に形成されている球状のゲルの長さの２倍を超えないように描画することが好ましい。また、アスペクト比を小さく保ちながら所望の形状を有する下地層を形成するための方法の一例として、前記下地層を、中心部から外縁部に向かって形成する方法もある。
【００４７】
前記下地層の、鉛直上方から見た形状、すなわちＸＹ平面における形状は、正多角形または円であることが好ましい。前記下地層を正多角形または円のようにアスペクト比の小さい形状とすることで、下地層形成工程において、最後までアスペクト比を小さく保ったまま下地層を形成することができる。
【００４８】
前記下地層は、三次元構造体を構成するゲルの直径よりも小さい孔が形成されていることが好ましい。下地層に孔を設けることにより、孔から受容液Ａが染み出し、下地層の表面に受容液Ａが供給される。よって、後述の造形工程において、溶液Ｃを下地層の上に滴下することで、溶液Ｃと受容液Ａを接触させることができる。また、前記孔の大きさがゲルの直径より小さいことにより、滴下された溶液Ｃから形成されたゲルが孔を通り抜けることを防ぐことができる。
【００４９】
前記下地層の、鉛直上方から見た面積、すなわちＸＹ平面における面積（以下、「下地層の面積」と称する）は、目的の形状を有する三次元構造体と前記下地層とが接する面積よりも大きいことが好ましい。下地層の面積が、目的の三次元構造体と前記下地層とが接する面積よりも大きいと、三次元構造体を十分に安定して保持することができる。ただし、下地層の面積が大きすぎると、ゲルを積層していく過程で、下地の端部がめくれて三次元構造体に巻き込まれる等の影響を及ぼすおそれがある。従って、下地層のＸＹ平面における面積の８割以上が、目的の三次元構造体と接することが好ましい。
【００５０】
前記下地層の比重は前記受容液Ａの比重よりも小さいことが好ましい。下地層の比重を受容液Ａの比重よりも小さくすることで、受容液Ａの液面に下地層を配置することができる。
【００５１】
＜造形工程＞
造形工程は、前記下地層の上に、受容液Ａと反応してゲル化する溶液Ｃを滴下することにより形成されるゲルを積層して、三次元構造体を形成する工程である。下地層は受容液Ａの液面付近に存在している。従って、下地層に向かって溶液Ｃを滴下することにより、溶液Ｃと受容液Ａが接触する。溶液Ｃは受容液Ａと反応し、その結果、ゲルが形成される。そして、これを繰り返すことにより、ゲルを積層して、三次元構造体を形成することができる。
【００５２】
溶液Ｃを滴下する方法は、特に限定されないが、インクジェット方式またはディスペンサ方式が好ましい。これにより、着弾位置および噴霧量を制御することができるため、三次元構造体の形状を制御しやすい。
【００５３】
図１の（ｃ）〜（ｅ）は、三次元構造体を形成する造形工程の一例を表す。
【００５４】
図１の（ｃ）は、受容液Ａ１の液面付近に形成された下地層５の上に、インクジェット６を用いて、受容液Ａ１と反応してゲル化する溶液Ｃ７を滴下して、三次元構造体８の第１層目を形成する工程を示す。このとき、図１の（ｆ）の場合と同様に、インクジェット６をＸ軸方向およびＹ軸方向に移動させながら受容液Ｃ７を滴下することが好ましい。下地層５は受容液Ａ１の液面付近に形成されている。下地層５の上に溶液Ｃ７を滴下することで、下地層５がわずかに受容液Ａ１中に沈み込み、溶液Ｃ７は受容液Ａ１と接触して反応し、ゲル化する。そして、形成されたゲルを積層することによって、三次元構造体８を形成することができる。三次元構造体８は下地層５上に保持されるため、ゲルを所望の位置に形成することができる。それゆえ、造形精度を向上させることができる。図１の（ｄ）は、三次元構造体の第１層目の積層が完了した状態を示す。図１の（ｅ）は、図１の（ｃ）に引き続き、三次元構造体８の第２層目以降を形成する工程を示す。第２層目以降も溶液Ｃを滴下するたびに下地層を徐々に受容液内に押し込むことができるため、次々にゲルを積層させることができる。
【００５５】
インクジェット方式またはディスペンサ方式における、溶液Ｃを吐出するためのノズル径は、適宜決定される。例えば、溶液Ｃが植物細胞を含む場合、植物細胞の大きさは、約２０〜５０μｍ程度であるため、ノズル径が６０μｍ以上であれば、ノズルが詰まるリスクを低減できる。例えば、ノズル径は６０〜１５０μｍであってもよい。
【００５６】
ピコリットル〜ナノリットル単位の溶液Ｃを吐出できるという観点からは、インクジェット方式が好ましい。インクジェット方式としては、ピエゾ方式を用いることが好ましい。ピエゾ方式では、電圧を加えて圧電素子を変形させる。これにより生じた圧力によって、溶液を吐出する。吐出されるインクの液滴サイズを、電気パルス信号によって均一に制御できるという観点から、ピエゾ方式が好ましい。また、ピエゾ方式であれば、溶液を加熱するサーマル方式に比べて、細胞に与える影響が少ない。
【００５７】
ディスペンサ方式として、例えばジェットディスペンサ方式を用いてもよい。ジェットディスペンサ方式も、インクジェット方式と同様に非接触であることから、繊細な細胞を用いた造形に適している。また、ジェットディスペンサ方式は、インクジェット方式と同様に比較的微量の液滴を安定して吐出できるという観点からも好ましい。
【００５８】
溶液Ｃの吐出量および飛翔速度等は、溶液Ｂと同様に、溶液の組成等に応じて適宜調整すればよい。
【００５９】
本発明の一実施形態において、受容液Ａを有する水槽は、垂直方向に移動可能な機構を水槽内部に有していない。非特許文献１では、形成したゲルの移動を防ぐために、エレベータステージにゲルを固着させることを開示している。本発明の一実施形態では、前記下地層によって、三次元構造体が保持され、かつ三次元構造体の造形過程で下地層は液中へと沈下していくため、前記垂直方向に移動可能な機構は不要である。また、受容液Ａを高粘度にする必要がない為、細胞の培養に最適な受容液設計が可能となる。
【００６０】
また、溶液Ｂの比重は溶液Ｃの比重よりも小さいことが好ましい。この場合、溶液Ｃを滴下した場合に下地層が受容液内に押し込まれやすい。よって、容易にゲルを積層させることができる。
【００６１】
本発明の一実施形態において、前記三次元構造体が細胞を含有してもよい。すなわち、三次元構造体を造形するために使用される溶液Ｃが細胞を含んでいてもよい。前記三次元構造体が含有する細胞は、植物細胞であってもよく、動物細胞であってもよい。
【００６２】
前記細胞は、分化能を有する細胞、すなわち未分化の細胞であってもよく、特定の組織に分化した細胞であってもよく、またはその両方であってもよい。
【００６３】
分化能を有する植物細胞としては、例えば、脱分化細胞が挙げられる。脱分化細胞としては、植物組織から採取した細胞からカルスを得て、このカルスから得られた細胞等が挙げられる。植物組織としては、根、茎、葉、花弁、種子、胚、胚珠、子房、葯、花粉および成長点（茎頂分裂組織および根端分裂組織）等が挙げられる。また、これらの植物組織の細胞を、特定の組織に分化した細胞として用いることもできる。
【００６４】
分化能を有する動物細胞としては、例えば、人工多機能性幹細胞や胚性幹細胞等の幹細胞が挙げられる。特定の組織に分化した動物細胞としては、血管内皮細胞、繊維芽細胞、平滑筋細胞、赤血球、白血球、血小板、がん細胞、さらには、大腸菌、乳酸菌などの細菌（単細胞）等が挙げられる。
【００６５】
＜下地層除去工程＞
本発明の一実施形態にかかる三次元構造体の製造方法は、造形工程の後に前記下地層を除去する下地層除去工程を含んでもよい。別の一実施形態において、下地層を除去せずに、三次元構造体の一部としてもよい。
【００６６】
下地層を除去する方法は、特に限定されないが、例えば、下地層形成用の溶液Ｂとしてアルギン酸塩、受容液Ａとして塩化カルシウム水溶液を用いた場合、アルカリ土類金属を補足するキレート剤により容易に下地層を除去することができる。
【００６７】
より容易に下地層を除去するためには、下地層の材料と三次元構造体の材料とが異なること、つまり、前記溶液Ｂが、前記溶液Ｃと異なる組成であることが好ましい。このとき、下地層は化学的に除去可能な材料とすることで、下地層のみを除去することができる。
【００６８】
〔２．三次元構造体〕
本明細書において「三次元構造体」とは、複数のゲルを積層して造形された構造体である。三次元構造体の形状は、シート状、チューブ状、球状、多面体、錐体、それらの複合体等であってもよく、特に限定されない。
【００６９】
前記三次元構造体は、植物細胞または動物細胞を含んでいてもよく、細胞を含んでいなくてもよい。
【００７０】
本発明の一実施形態において、三次元構造体が植物細胞を含んでいる場合、三次元構造体は、複数の植物細胞を積層して造形された構造体であり、目的とする植物体の概形に等しい形状に造形された構造体であることが好ましい。ここで、目的とする植物体は、根、茎および葉を備えた植物体全体であってもよく、一部の器官であってもよい。
【００７１】
本発明の一実施形態にかかる三次元構造体の製造方法によって、通常の生産方法によって生産された場合または自然条件によって生育した場合の形状と異なる形状を有する三次元構造体を造形することが可能となる。例えば、葉が大きい、葉の数が多い、または葉の配置が異なる三次元構造体により、光合成を効率的に行う植物体を得ることができる。また、根が太い、根が長い、根の数が多い、または茎が太い三次元構造体により、水分または養分の吸収力が高い植物体を得ることができる。
【００７２】
本発明の一実施形態において、三次元構造体が動物細胞を含んでいる場合、三次元構造体は、複数の動物細胞を積層して造形された構造体であり、目的とする器官、および臓器等の概形に等しい形状に造形された構造体であることが好ましい。
【００７３】
また、細胞を含んでいない三次元構造体を、細胞培養の足場として用いることもできる。このような三次元構造体上で細胞を培養することにより、所望の形状を有する植物体、器官、臓器等を形成してもよい。
【００７４】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００７５】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７６】
〔参考例１：インクジェット方式による正方形（２ｃｍ×２ｃｍ）の下地層形成（１）〕
＜材料＞
受容液Ａおよび溶液Ｂとして下記の溶液を用いた。なお、受容液Ａおよび溶液ＢのｐＨはＭＥＳ−ＫＯＨにより、いずれも５．８に調整している。
・受容液Ａ：塩化カルシウム２０ｍＭ水溶液（０．４Ｍマンニトール、１５ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ  ＭＥＳ−ＫＯＨを含む）
・溶液Ｂ：アルギン酸ナトリウム０．６重量％水溶液（０．４Ｍマンニトール、１５ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ  ＭＥＳ−ＫＯＨを含む）
＜装置＞
溶液Ｂの滴下には、受容液Ａが満たされた容器を保持するための受容液容器保持ステージを有し、ＸＹ方向に移動可能であるステージ（以下、「ＸＹ自動ステージ」とも称する）にインクジェットヘッドを搭載したインクジェット装置を使用した。前記インクジェットヘッドとしては、ピエゾ方式の単ノズルのインクジェットヘッドを用いた。吐出のための開口部の直径が６０μｍであるノズルを用いた。
【００７７】
＜下地層の形成＞
受容液Ａを満たす容器としては、シャーレを用いた。上述のように調製した受容液Ａが満たされたシャーレを、受容液容器保持ステージ上に配置する。インクジェット装置のＸＹ自動ステージを図２の（ａ）に示す経路に沿って移動させながら、インクジェットヘッドから上述のように調製した溶液Ｂを受容液Ａの液面に吐出した。インクジェットヘッドの溶液Ｂの吐出量を１滴当たり約３５０ｐＬに設定した。このとき、溶液Ｂの液滴の直径は約８７μｍであり、飛翔速度は約４ｍ／ｓであった。また、溶液Ｂを滴下する間隔は、Ｘ軸方向およびＹ軸方向ともに４３μｍとした。「滴下する間隔」とは、直前に滴下された液滴の中心から、次に滴下される液滴の中心までの距離のことである。４３μｍとは、溶液Ｂの液滴の半径とおよそ同じ距離であり、溶液Ｂの液滴を、隣り合う液滴同士が約半分ずつ重なるようにして連結させ、下地層を形成した。形成された下地層の厚さは約１００μｍであった。
【００７８】
図２の（ｂ）は、形成された下地層を示す。若干変形しているが、正方形に近い下地層を形成することができた。図２の（ａ）のように下地層を形成した場合、下地層の形成開始後しばらくは、下地層のＸＹ平面におけるアスペクト比が大きい。そのため、受容液の流動の影響を受けやすい。それゆえに下地層の形状が若干変形したと考えられる。
【００７９】
〔参考例２：インクジェット方式による正方形（２ｃｍ×２ｃｍ）の下地層形成（２）〕
＜材料＞
参考例１と同様にして、受容液Ａおよび溶液Ｂを調製した。
【００８０】
＜装置＞
参考例１と同様のインクジェット装置を使用した。
【００８１】
＜下地層の形成＞
インクジェット装置のＸＹ自動ステージを図３の（ａ）に示す経路に沿って移動させながら、溶液Ｂを受容液Ａの液面に吐出した以外は、実施例１と同様にして行った。図３の（ｂ）は、形成された下地層を示す。正方形の下地層を精度よく形成することができた。アスペクト比が小さい状態を保ちながら下地層を形成したため、製造例１に比べて更に精度よく下地層を形成できたと考えられる。
【００８２】
〔参考例３：インクジェット方式による円状（直径３ｃｍ）の下地層形成〕
＜材料＞
受容液Ａおよび受容液Ｂとして下記の溶液を用いた。なお、受容液Ａおよび溶液ＢのｐＨはＭＥＳ−ＫＯＨにより、いずれも５．８に調整している。
・受容液Ａ：塩化カルシウム４０ｍＭ水溶液（０．４Ｍマンニトール、１５ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ  ＭＥＳ−ＫＯＨを含む）
・溶液Ｂ：アルギン酸ナトリウム１．２重量％水溶液（０．４Ｍマンニトール、１５ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ  ＭＥＳ−ＫＯＨを含む）
＜装置＞
参考例１と同様のインクジェット装置を使用した。
【００８３】
＜下地層の形成＞
上述のように調製した受容液Ａが満たされたシャーレを、受容液容器保持ステージ上に配置する。インクジェット装置のＸＹ自動ステージを図４の（ａ）に示す経路に沿って移動させながら、インクジェットヘッドから上述のように調製した溶液Ｂを受容液Ａの液面に吐出した。インクジェットヘッドの溶液Ｂの吐出量を１滴当たり約３５０ｐＬに設定した。このとき、溶液Ｂの液滴の直径は約８７μｍであり、飛翔速度は約４ｍ／ｓであった。また、溶液Ｂを滴下する間隔は、Ｘ軸方向およびＹ軸方向ともに６４μｍとした。６４μｍとは、溶液Ｂの液滴の半径の約１．５倍の距離であり、溶液Ｂの液滴を、隣り合う液滴同士が約４分の１ずつ重なるようにして連結させ、下地層を形成した。
【００８４】
図３の（ｂ）は、形成された下地層を示す。円形の下地層を精度よく形成することができた。参考例２と同様にアスペクト比が小さい状態を保ちながら下地層を形成したため、精度よく下地層を形成できたと考えられる。
【００８５】
〔参考例４：インクジェット方式による網状（３ｃｍ×３ｃｍ）の下地層形成〕
＜材料＞
参考例３と同様にして、受容液Ａおよび溶液Ｂを調製した。
【００８６】
＜装置＞
参考例１と同様のインクジェット装置を使用した。
【００８７】
＜下地層の形成＞
インクジェット装置のＸＹ自動ステージを図５の（ａ）〜（ｄ）に示す手順で移動させながら、インクジェットヘッドから溶液Ｂを受容液Ａの液面に吐出した以外は、参考例３と同様にして行った。具体的には、まず、図５の（ａ）に示すように、ＸＹ自動ステージを、Ｘ軸方向に移動させながら溶液Ｂを滴下し、ゲルをＸ軸方向に平行となるようにライン状に配置した。そして、ＸＹ自動ステージをＹ軸方向に１２０μｍ移動してから、（ａ）と同様に、Ｘ軸方向に移動させながら溶液Ｂを滴下し、ゲルをライン状に配置した。この手順を所望のサイズになるまで繰り返した。すなわち、図５の（ｂ）に示すようにゲルを形成した。次に、網状の下地層を形成するため、図５の（ａ）および（ｂ）で行った手順と同じ要領で、図５の（ｃ）に示すように、Ｙ軸方向に移動させながら溶液Ｂを滴下し、ゲルをＹ軸方向に平行になるようにライン状に配置した。図５の（ｄ）に示すように、形成された網状の下地層は、約３０μｍ×約３０μｍの孔を有していた。なお、ライン状にゲルを配置する際、アスペクト比が大きい状態となるため、一部で変形が見られた。
【００８８】
〔参考例５：スプレー方式による正方形（２ｃｍ×２ｃｍ）の下地層形成〕
＜材料＞
参考例１と同様にして、受容液Ａおよび溶液Ｂを調製した。
【００８９】
＜装置＞
霧状に散布可能なタイプの、市販のスプレーノズルを使用した。また、マスクとして、２ｃｍ×２ｃｍの正方形の開口部を設けたポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルムを使用した。
【００９０】
＜下地層の形成＞
図１の（ａ）と同様に下地層を形成した。具体的には、受容液Ａが満たされたシャーレ上方に、受容液表面に接しない程度に可能な限り近くマスクを配置した。マスクの開口部は、溶液Ｂがシャーレからはみ出さないようにシャーレよりも小さい。マスクの数ｃｍ上方から、スプレーノズルを用いて、溶液Ｂをマスクよりも大きい範囲に対して噴霧し、受容液Ａの液面に塗布した。
【００９１】
参考例２と同様に、正方形の下地層を形成することができた。
【００９２】
〔実施例１：インクジェット方式により作製された下地層上への三次元構造体の造形（１）〕
＜材料＞
（受容液Ａ）
参考例２と同様の溶液を使用した。
【００９３】
（溶液Ｃ）
参考例２の溶液Ｂと同様の組成の溶液を使用した。
【００９４】
（下地層）
参考例２において作製された、２ｃｍ×２ｃｍの正方形の下地層を使用した。
【００９５】
＜装置＞
参考例１と同様のインクジェット装置を使用した。
【００９６】
＜三次元構造体の造形＞
インクジェット装置のＸＹ自動ステージを図６に示す経路に沿って、移動させながら、溶液Ｃを下地層の上に吐出し、文字「Ｋ」となるようにゲルを配置した。これを３回繰り返した。それ以外は、実施例１と同様の条件で行った。
【００９７】
得られた三次元構造体の画像を図７に示す。このように、目的の造形が可能であった。三次元構造体の厚みは約３００μｍであった。なお、下地層がない状態で実施例１の方法で三次元構造体の造形を行った場合、文字「Ｋ」が判別できるような三次元構造体は得られなかった。
【００９８】
〔実施例２：インクジェット方式により作製された下地層上への三次元構造体の造形（２）〕
＜材料＞
（受容液Ａ）
参考例２と同様の溶液を使用した。
【００９９】
（溶液Ｃ）
参考例２の溶液Ｂと同様の組成の溶液に、細胞（プロトプラスト）を細胞密度１．５×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬとなるように分散させた溶液を使用した。
【０１００】
（下地層）
参考例２と同様の方法で作製された、７ｍｍ×７ｍｍの正方形の下地層を使用した。
【０１０１】
＜三次元構造体の造形＞
インクジェット装置のＸＹ自動ステージを図８に示す経路に沿って移動させながら、インクジェットヘッドから上述のように調製した溶液Ｃを下地層の上に吐出し、５ｍｍ×５ｍｍの正方形となるようにゲルを配置した。これを２５回繰り返した。インクジェットヘッドの溶液Ｃの吐出量を１滴当たり約３００ｐＬに設定した。このとき、溶液Ｃの液滴の直径は約８３μｍであり、飛翔速度は約３．５ｍ／ｓであった。また、溶液Ｃを滴下する間隔は、Ｘ軸方向およびＹ軸方向ともに６０μｍとした。
【０１０２】
得られた三次元構造体の画像を図９に示す。このように、目的の造形が可能であった。三次元構造体の厚みは約２．５ｍｍであった。なお、下地層がない状態で実施例１の方法で三次元構造体の造形を行った場合、紐状に連なったゲルが多数見られたのみであり、目的の三次元構造体は得られなかった。
【０１０３】
〔実施例３：インクジェット方式により作製された下地層上への三次元構造体の造形（３）〕
＜材料＞
（受容液Ａ）
参考例３と同様の溶液を使用した。
【０１０４】
（溶液Ｃ）
参考例３の溶液Ｂと同様の組成の溶液を使用した。
【０１０５】
（下地層）
参考例４において作製された、３ｃｍ×３ｃｍの網状の下地層を使用した。
【０１０６】
＜三次元構造体の造形＞
インクジェット装置のＸＹ自動ステージを図１０に示す経路に沿って移動させながら、インクジェットヘッドから上述のように調製した溶液Ｃを下地層の上に吐出し、直径０．７ｃｍの円となるようにゲルを配置した。これを３回繰り返した。それ以外は、参考例３と同様の条件で行った。
【０１０７】
得られた三次元構造体の画像を図１１に示す。このように、目的の造形が可能であった。なお、下地層がない状態で実施例１の方法で三次元構造体の造形を行った場合、紐状に連なったゲルが多数見られたのみであり、目的の三次元構造体は得られなかった。
【０１０８】
〔実施例４：スプレー方式により作製された下地層上への三次元構造体の造形〕
＜材料＞
（受容液Ａ）
参考例５と同様の溶液を使用した。
【０１０９】
（溶液Ｃ）
参考例５の溶液Ｂと同様の組成の溶液を使用した。
【０１１０】
（下地層）
参考例５において作製された、２ｃｍ×２ｃｍの正方形の下地層を使用した。
【０１１１】
＜三次元構造体の造形＞
インクジェット装置のＸＹ自動ステージを図１２に示す経路に沿って移動させながら、インクジェットヘッドから上述のように調製した溶液Ｃを下地層の上に吐出し、直径１．０ｃｍの円となるようにゲルを配置した。具体的には、まず、図１２の（ａ）に示すように、Ｘ軸方向に連続して溶液Ｂを吐出し、隣り合う液滴同士が重ならないようにライン状に配置した。そして、ゲルを１行配置し終わった後、図１２の（ｂ）に示すように、直前にライン状に配置したゲルの開始点からＹ方向に８０μｍずらして、直前にライン状に配置したゲルと同じ方向で次の行のゲルを配置することを繰り返した。図１２の（ｃ）は、配置されたゲルをＹ軸方向から見た図である。次に、図１２の（ｄ）に示すように、図１２の（ｂ）で観察される隙間を埋めるようにして、図１２の（ｂ）と同じ要領でＸ軸方向にライン状にゲルを配置した。図１２の（ｅ）は、図１２の（ｄ）で配置されたゲルをＹ軸方向から見た図である。この図１２の（ｂ）および（ｄ）を３回繰り返した。なお、図１２の（ｂ）および（ｄ）で便宜上、ゲルを長方形に配置するように描かれているが、最終形状が図１２の（ｆ）に示す円形となるように三次元構造体を形成した。インクジェットヘッドの溶液Ｃの吐出量を１滴当たり約３５０ｐＬに設定した。このとき、溶液Ｃの液滴の直径は約８７μｍであり、飛翔速度は約４ｍ／ｓであった。また、溶液Ｃを滴下する間隔は、Ｘ軸方向は１６０μｍ、Ｙ軸方向は８０μｍとした。
【０１１２】
このように、ゲルが連結するように溶液Ｃを滴下しなかった場合にも、実施例３と同様に、目的の造形が可能であった。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本発明の一態様によれば、三次元構造体を簡便に製造することができる。
【符号の説明】
【０１１４】
１  受容液Ａ
２  スプレーノズル
３  溶液Ｂ
４  マスク
５  下地層
６  インクジェット
７  溶液Ｃ
８  三次元構造体
【図１】
2020121531.tif 000003
【図２】
2020121531.tif 000004
【図３】
2020121531.tif 000005
【図４】
2020121531.tif 000006
【図５】
2020121531.tif 000007
【図６】
2020121531.tif 000008
【図７】
2020121531.tif 000009
【図８】
2020121531.tif 000010
【図９】
2020121531.tif 000011
【図１０】
2020121531.tif 000012
【図１１】
2020121531.tif 000013
【図１２】
2020121531.tif 000014