(57)【要約】      （修正有）【課題】治療および／または診断薬の送達のための限界サイズナノ粒子、脂質ナノ粒子を作製するためのデバイスおよびシステムの提供。【解決手段】第１の溶液を受容し、第１の溶液を含む第１のストリームを提供するように作られた第１の入口マイクロチャネル；第２の溶液を受容し、第２の溶液を含む第２のストリームを提供するように作られた第２の入口マイクロチャネル；および、第１および第２のストリームを受容するために作られた第３のマイクロチャネルを含むデバイス。第３のマイクロチャネルは、第１および第２のストリームを流動させるように構成された第１の領域と、第１および第２のストリームを混合するように構成された第２の領域とを有して第１および第２の溶液の混合液を含む第３のストリ−ムを提供し、第３のマイクロチャネルの第２の領域は、２０μｍから３００μｍの水力直径と２００μｍから３００μｍの幅を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
約１０ｎｍから約１００ｎｍの直径を有する、限界サイズ脂質ナノ粒子。
【請求項２】
水性コアを包囲する脂質二重層を含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記脂質二重層が、リン脂質を含む、請求項２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
前記リン脂質が、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、およびセレブロシドからなる群から選択される、請求項３に記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記リン脂質が、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸ジアシルホスファチジルコリンである、請求項３に記載のナノ粒子。
【請求項６】
前記リン脂質が、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）である、請求項３に記載のナノ粒子。
【請求項７】
約５０モルパーセントから約９９モルパーセントのリン脂質を含む、請求項３に記載のナノ粒子。
【請求項８】
ステロールをさらに含む、請求項２〜７のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項９】
前記ステロールが、コレステロールである、請求項８に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
約１０モルパーセントから約３５モルパーセントのコレステロールを含む、請求項８に記載のナノ粒子。
【請求項１１】
ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、およびＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールからなる群から選択されるポリエチレングリコール−脂質をさらに含む、請求項２〜１０のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
前記ポリエチレングリコール−脂質が、ＤＬＰＥ−ＰＥＧ、ＤＭＰＥ−ＰＥＧ、ＤＰＰＣ−ＰＥＧ、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧからなる群から選択される、請求項１１に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
前記ポリエチレングリコール−脂質が、ＤＳＰＥ−ＰＥＧである、請求項１１に記載のナノ粒子。
【請求項１４】
約１モルパーセントから約１０モルパーセントのポリエチレングリコール−脂質を含む、請求項１１に記載のナノ粒子。
【請求項１５】
疎水性コアを包囲する脂質単分子層を含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項１６】
前記脂質単分子層が、リン脂質を含む、請求項１５に記載のナノ粒子。
【請求項１７】
前記リン脂質が、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、およびセレブロシドからなる群から選択される、請求項１６に記載のナノ粒子。
【請求項１８】
前記リン脂質が、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸ジアシルホスファチジルコリンである、請求項１６に記載のナノ粒子。
【請求項１９】
前記Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸ジアシルホスファチジルコリンが、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）である、請求項１６に記載のナノ粒子。
【請求項２０】
約１０モルパーセントから約７０モルパーセントのリン脂質を含む、請求項１６に記載のナノ粒子。
【請求項２１】
前記疎水性コアが、脂肪酸トリグリセリドを含む、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項２２】
前記脂肪酸トリグリセリドが、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸トリグリセリドである、請求項２１に記載のナノ粒子。
【請求項２３】
前記脂肪酸トリグリセリドが、オレイン酸トリグリセリド（トリグリセリドトリオレイン）である、請求項２１に記載のナノ粒子。
【請求項２４】
約３０モルパーセントから約９０モルパーセントの脂肪酸トリグリセリドを含む、請求項２１に記載のナノ粒子。
【請求項２５】
診断薬をさらに含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項２６】
治療薬をさらに含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項２７】
治療薬剤および診断薬剤をさらに含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項２８】
前記治療薬が、化学治療薬（すなわち抗腫瘍薬）、麻酔薬、ベータアドレナリン遮断薬、抗高血圧薬、抗鬱薬、抗痙攣薬、制吐薬、抗ヒスタミン薬、抗不整脈薬、および抗マラリア薬からなる群から選択される、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項２９】
前記治療薬が、抗腫瘍薬である、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項３０】
前記抗腫瘍薬が、ドキソルビシンである、請求項２９に記載のナノ粒子。
【請求項３１】
水性コアを包囲する脂質二重層を含むナノ粒子であって、
前記二重層は、
（ａ）リン脂質と、
（ｂ）ステロールと、
（ｃ）ポリエチレングリコール−脂質とを含み、
前記コアは、治療または診断薬を含む、ナノ粒子。
【請求項３２】
限界サイズナノ粒子である、請求項３１に記載のナノ粒子。
【請求項３３】
約１０ｎｍから約５０ｎｍの直径を有する、請求項３１に記載のナノ粒子。
【請求項３４】
疎水性コアを包囲する脂質単分子層を含むナノ粒子であって、
前記単分子層は、リン脂質を含み、
前記コアは、脂肪酸トリグリセリド、および／または治療もしくは診断薬を含む、ナノ粒子。
【請求項３５】
限界サイズナノ粒子である、請求項３４に記載のナノ粒子。
【請求項３６】
約１０ｎｍから約８０ｎｍの直径を有する、請求項３４に記載のナノ粒子。
【請求項３７】
治療薬を対象に投与するための方法であって、請求項２６〜３６のいずれか一項に記載のナノ粒子を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項３８】
診断薬を対象に投与するための方法であって、請求項２５、２７、または３１〜３６のいずれか一項に記載のナノ粒子を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項３９】
治療薬を投与することにより治療可能な疾患または状態を治療するための方法であって、治療有効量の請求項２６〜３６のいずれか一項に記載のナノ粒子を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項４０】
診断薬を投与することにより診断可能な疾患または状態を診断するための方法であって、請求項２５、２７、または３１〜３６のいずれか一項に記載のナノ粒子を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項４１】
第１および第２の隣接するストリームの流動のために構成された第１の領域と、前記ストリームを混合するための第２の領域とを有するデバイスにおいて、限界サイズ脂質ナノ粒子を作製するための方法であって、
（ａ）第１の溶媒を含む第１のストリームを、第１の流量で前記デバイスに導入することと、
（ｂ）第２の溶媒中の脂質粒子形成材料を含む第２のストリームを、第２の流量で前記デバイスに導入し、第１および第２の隣接するストリームを提供することであって、前記第１および第２の溶媒は、同じではなく、前記第１の流量対前記第２の流量の比は、約２．０から約１０．０である、ことと、
（ｃ）前記第１および第２のストリームを、前記第１の領域から前記第２の領域に流動させることと、
（ｄ）前記第１および第２のストリームを、前記デバイスの前記第２の領域内で混合し、脂質ナノ粒子を含む第３のストリームを提供することとを含む方法。
【請求項４２】
前記デバイスが、マイクロ流体デバイスである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記第１および第２のストリームを混合することが、カオス的移流を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記第１および第２のストリームを混合することが、マイクロミキサーによる混合を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記第１および第２のストリームを混合することが、前記第１の領域内でバリアにより防止される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記バリアが、チャネル壁、シース液、または同心管である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記第３のストリームを水性緩衝液で希釈することをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
前記第３のストリームを希釈することは、前記第３のストリームおよび水性緩衝液を、第２の混合構造内に流動させることを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
限界サイズ脂質ナノ粒子を含む前記水性緩衝液を透析して、前記第２の溶媒の量を低減することをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記第１の溶媒が、水性緩衝液である、請求項４１に記載の方法。
【請求項５１】
前記第１のストリームが、診断薬を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５２】
前記第１のストリームが、治療薬を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５３】
前記第１のストリームが、治療薬および診断薬を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５４】
前記治療薬が、化学治療薬、麻酔薬、ベータアドレナリン遮断薬、抗高血圧薬、抗鬱薬、抗痙攣薬、制吐薬、抗ヒスタミン薬、抗不整脈薬、および抗マラリア薬からなる群から選択される、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記治療薬が、抗腫瘍薬である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記抗腫瘍薬が、ドキソルビシンである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記第２の溶媒が、水混和性溶媒である、請求項４１に記載の方法。
【請求項５８】
前記水混和性溶媒が、水性アルコールである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記水性アルコールが、エタノールである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記第２のストリームが、リン脂質を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項６１】
前記リン脂質が、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、およびセレブロシドからなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記リン脂質が、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸ジアシルホスファチジルコリンである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸ジアシルホスファチジルコリンが、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記第２のストリームが、約１０モルパーセントから約９９モルパーセントのリン脂質を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
前記第２のストリームが、ステロールをさらに含む、請求項４１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記ステロールが、コレステロールである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記第２のストリームが、約１０モルパーセントから約３５モルパーセントのコレステロールを含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記第２のストリームが、ポリエチレングリコール−脂質をさらに含む、請求項４１〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記ポリエチレングリコール−脂質が、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、およびＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールからなる群から選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記ポリエチレングリコール−脂質が、ＤＬＰＥ−ＰＥＧ、ＤＭＰＥ−ＰＥＧ、ＤＰＰＣ−ＰＥＧ、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧからなる群から選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記ポリエチレングリコール−脂質が、ＤＳＰＥ−ＰＥＧである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
約１モルパーセントから約１０モルパーセントのポリエチレングリコール−脂質を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７３】
前記第２のストリームが、脂肪酸トリグリセリドをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項７４】
前記脂肪酸トリグリセリドが、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸トリグリセリドである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記脂肪酸トリグリセリドが、オレイン酸トリグリセリド（トリグリセリドトリオレイン）である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
約３０モルパーセントから約９０モルパーセントの脂肪酸トリグリセリドを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
請求項４１〜７６のいずれか一項に記載の方法により得ることができるナノ粒子。
【請求項７８】
限界サイズ脂質ナノ粒子を生成するためのデバイスであって、
（ａ）第１の溶媒を含む第１の溶液を受容するための第１の入口と、
（ｂ）前記第１の入口と流体連通して、前記第１の溶媒を含む第１のストリームを提供する、第１の入口マイクロチャネルと、
（ｃ）第２の溶媒中の脂質粒子形成材料を含む第２の溶液を受容するための第２の入口と、
（ｄ）前記第２の入口と流体連通して、前記第２の溶媒中の前記脂質粒子形成材料を含む第２のストリームを提供する、第２の入口マイクロチャネルと、
（ｅ）前記第１および第２のストリームを受容するための第３のマイクロチャネルであって、前記第１および第２のストリームを流動させるように構成された第１の領域と、前記第１および第２のストリームの内容物を混合して、限界サイズ脂質ナノ粒子を含む第３のストリームを提供するように構成された第２の領域とを有する、第３のマイクロチャネルと
を含むデバイス。
【請求項７９】
前記マイクロチャネルの前記第２の領域が、浅浮き彫り構造を含む、請求項７８に記載のデバイス。
【請求項８０】
前記マイクロチャネルの前記第２の領域が、主要流動方向と、少なくとも１つの溝または突起が画定された１つ以上の表面とを有し、前記溝または突起が、前記主要方向と角度を形成する方位を有する、請求項７８に記載のデバイス。
【請求項８１】
前記第２の領域が、マイクロミキサーを含む、請求項７８に記載のデバイス。
【請求項８２】
前記第１および第２のストリームの流量を変動させるための手段をさらに含む、請求項７８に記載のデバイス。
【請求項８３】
各マイクロチャネルが、約２０μｍから約３００μｍの水力直径を有する、請求項７８に記載のデバイス。
【請求項８４】
１０ｍｓ未満で完全混合が生じる、請求項７８に記載のデバイス。
【請求項８５】
加熱領域をさらに含む、請求項７８に記載のデバイス。
【請求項８６】
脂質ナノ粒子を生成するためのデバイスであって、
（ａ）第１の溶媒を含む第１の溶液を受容するための第１の入口と、
（ｂ）前記第１の入口と流体連通して、前記第１の溶媒を含む第１のストリームを提供する、第１の入口マイクロチャネルと、
（ｃ）第２の溶媒中の脂質粒子形成材料を含む第２の溶液を受容するための第２の入口と、
（ｄ）前記第２の入口と流体連通して、前記第２の溶媒中の前記脂質粒子形成材料を含む第２のストリームを提供する、第２の入口マイクロチャネルと、
（ｅ）前記第１および第２のストリームを受容するための複数のマイクロチャネルであって、それぞれ、前記第１および第２のストリームを流動させるように構成された第１の領域と、前記第１および第２のストリームの内容物を混合して、脂質ナノ粒子に影響する複数のストリームを提供するように構成された第２の領域とを有する、複数のマイクロチャネルと、
（ｆ）脂質ナノ粒子を含む前記複数のストリームを受容し、組み合わせるための第４のマイクロチャネルと
を含むデバイス。
【請求項８７】
前記第１および第２のストリームを受容するための前記複数のマイクロチャネルのそれぞれが、
（ａ）前記第１の入口マイクロチャネルと流体連通して、前記第１の溶媒を含む前記第１のストリームを受容する、第１のマイクロチャネルと、
（ｂ）前記第２の入口マイクロチャネルと流体連通して、前記第２の溶媒を含む前記第２の入口ストリームを受容する、第２のマイクロチャネルと、
（ｃ）前記第１および第２のストリームを受容するための第３のマイクロチャネルであって、それぞれ、前記第１および第２のストリームを流動させるように構成された第１の領域と、前記第１および第２のストリームの内容物を混合して、脂質ナノ粒子に影響する複数のストリームを提供するように構成された第２の領域とを有する、第３のマイクロチャネルと
を含む、請求項８６に記載のデバイス。
【請求項８８】
前記第１および第２のストリームを受容するための２個から約４０個のマイクロチャネルを含み、２乃至１６００ｍＬ／分の全流量を有する、請求項８６または８７に記載のデバイス。
【請求項８９】
前記第２の領域が、それぞれ約２０μｍから約３００μｍの水力直径を有する、請求項８６または８７に記載のデバイス。
【請求項９０】
前記第２の領域が、それぞれ約１乃至４０ｍｌ／分の流体流量を有する、請求項８６または８７に記載のデバイス。
【請求項９１】
前記第１および第２のマイクロチャネル内の前記第１および第２のストリームの温度を、それらが前記第３のマイクロチャネルに進入する前に所定の温度に上昇させるために効果的な加熱要素をさらに含む、請求項８６または８７に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が明示的にここに組み込まれる、２０１１年１０月２５日出願の米国特許出願第６１／５５１，３６６号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、治療および／または診断薬の送達のための限界サイズナノ粒子、脂質ナノ粒子を使用するための方法、ならびに脂質ナノ粒子を作製するための方法およびシステムに関する。
【発明の背景】
【０００３】
脂質成分から可能な限り小さい（「限界サイズ」）粒子を生成する能力は、薬物送達から化粧品製造に至る用途において重要である。たとえば、薬物送達の領域では、サイズは、静脈（ｉ．ｖ．）注射後の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の生体内分布の重要な決定因子である。直径１００ｎｍ以下の長期循環ＬＮＰは、疾患部位、たとえば腫瘍ならびに感染および炎症部位において漏出性の脈管を通して浸出するそれらの能力により、そのような領域に優先的に蓄積することができる。直径約５０ｎｍ未満のＬＮＰは、リンパ管を通して浸透して、組織、たとえば骨髄に蓄積することができ、一方３０ｎｍ以下の粒子は、体内のより多くの組織に進行的に到達することができる。直径約８ｎｍ未満の粒子は、腎臓により排出される。したがって、１０〜５０ｎｍのサイズ範囲内の粒子は、血管外標的組織に到達する可能性が最も高いため、これらの粒子を生成できることが特に重要である。
【０００４】
限界サイズＬＮＰを作製する方法は、ほぼ３０年間、実質的に進化していない。方法は全て、「トップダウン」式アプローチを採用しており、脂質の水中への分散によってより大きな構造が形成され、続いて機械的破砕によってより小さい系が生成される。１００ｎｍサイズ範囲内の二重層ベシクルを作製するための好ましい方法は、１００ｎｍ以下の細孔径を有するポリカーボネートフィルタを通した予形成多重層ベシクル（ミクロンサイズ範囲）の押出しを含み、約５０ｎｍ未満の系の生成には有用ではない。通常、限界サイズ系を作製するための主流となる方法は、多重層ベシクルの超音波照射、通常はチップ超音波照射を含んでいるが、これは、試料汚染、試料分解、および最も重要なことには拡張性の欠如という制限を有する。二重層形成脂質、たとえばホスファチジルコリン（ＰＣ）を含有する脂質系の場合、超音波照射は、直径２０ｎｍという微小な限界サイズのベシクルＬＮＰをもたらし、一方ＰＣ／コレステロール（Ｃｈｏｌ）系は、それより幾分大きいＬＮＰをもたらす。あるいは、ＰＣおよび非極性脂質、たとえばトリグリセリドからなるナノエマルジョンの生成には、超音波照射または他の乳化技術が適用されている。しかしながら、５０ｎｍ未満のサイズ範囲を有する安定な系の生成は困難であることが分かっている。
【０００５】
有用なサイズのＬＮＰは、従来のトップダウン式の方法により調製され得るが、これらのＬＮＰの拡張可能な調製を促進する改善された方法が必要とされている。本発明は、この必要性を満たすことを目指し、さらなる関連した利点を提供する。
【発明の概要】
【０００６】
一側面において、本発明は、治療および／または診断薬剤の送達に有用な限界サイズ脂質ナノ粒子を提供する。一態様において、限界サイズ脂質ナノ粒子は、約１０ｎｍから約１００ｎｍの直径を有する。ある特定の態様において、脂質ナノ粒子は、水性コアを包囲する脂質二重層を有する。脂質二重層は、リン脂質を含む。他の態様において、脂質ナノ粒子は、疎水性コアを包囲する脂質単分子層を有する。脂質単分子層は、リン脂質を含む。ある特定の態様において、ナノ粒子は、水性コアを包囲する脂質二重層を含み、二重層は、リン脂質、ステロール、およびポリエチレングリコール−脂質を含み、コアは、治療または診断薬剤を含む。他の態様において、ナノ粒子は、疎水性コアを包囲する脂質単分子層を含み、単分子層は、リン脂質を含み、コアは、脂肪酸トリグリセリドならびに治療および／または診断薬剤を含む。
【０００７】
他の側面において、ナノ粒子を使用する方法が提供される。一態様において、本発明は、治療薬剤を対象に投与するための方法であって、本発明のナノ粒子を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。別の態様において、本発明は、診断薬剤を対象に投与するための方法であって、本発明のナノ粒子を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。さらなる態様において、本発明は、治療薬剤を投与することにより処置可能な疾患または状態を処置するための方法であって、治療有効量の本発明のナノ粒子を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。別の態様において、本発明は、診断薬剤を投与することにより診断可能な疾患または状態を診断するための方法であって、本発明のナノ粒子を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【０００８】
本発明のさらなる側面において、限界サイズナノ粒子を作製するための方法が提供される。一態様において、方法は、第１および第２の隣接するストリームの流動のために構成された第１の領域と、ストリームを混合するための第２の領域とを有するデバイスにおいて、限界サイズ脂質ナノ粒子を作製することを含み、
（ａ）第１の溶媒を含む第１のストリームを、第１の流量でデバイスに導入することと、（ｂ）第２の溶媒中の脂質粒子形成材料を含む第２のストリームを、第２の流量でデバイスに導入し、第１および第２の隣接するストリームを提供することであって、第１および第２の溶媒は、同じではなく、第１の流量対第２の流量の比は、約２．０から約１０．０である、ことと、
（ｃ）第１および第２のストリームを、第１の領域から第２の領域に流動させることと、（ｄ）第１および第２のストリームを、デバイスの第２の領域内で混合し、脂質ナノ粒子を含む第３のストリームを提供することと
を含む。
【０００９】
別の側面において、本発明は、限界サイズ脂質ナノ粒子を作製するためのデバイスを提供する。
【００１０】
一態様において、デバイスは、
（ａ）第１の溶媒を含む第１の溶液を受容するための第１の入口と、
（ｂ）第１の入口と流体連通して、第１の溶媒を含む第１のストリームを提供する、第１の入口マイクロチャネルと、
（ｃ）第２の溶媒中の脂質粒子形成材料を含む第２の溶液を受容するための第２の入口と、
（ｄ）第２の入口と流体連通して、第２の溶媒中の脂質粒子形成材料を含む第２のストリームを提供する、第２の入口マイクロチャネルと、
（ｅ）第１および第２のストリームを受容するための第３のマイクロチャネルであって、第１および第２のストリームを流動させるように構成された第１の領域と、第１および第２のストリームの内容物を混合して、限界サイズ脂質ナノ粒子を含む第３のストリームを提供するように構成された第２の領域とを有する、第３のマイクロチャネルとを含む。
【００１１】
別の態様において、デバイスは、
（ａ）第１の溶媒を含む第１の溶液を受容するための第１の入口と、
（ｂ）第１の入口と流体連通して、第１の溶媒を含む第１のストリームを提供する、第１の入口マイクロチャネルと、
（ｃ）第２の溶媒中の脂質粒子形成材料を含む第２の溶液を受容するための第２の入口と、
（ｄ）第２の入口と流体連通して、第２の溶媒中の脂質粒子形成材料を含む第２のストリームを提供する、第２の入口マイクロチャネルと、
（ｅ）第１および第２のストリームを受容するための複数のマイクロチャネルであって、それぞれ、第１および第２のストリームを流動させるように構成された第１の領域と、第１および第２のストリームの内容物を混合して、脂質ナノ粒子に影響する複数のストリームを提供するように構成された第２の領域とを有する、複数のマイクロチャネルと、（ｆ）脂質ナノ粒子を含む複数のストリームを受容し、組み合わせるための第４のマイクロチャネルと
を含む。この態様において、第１および第２のストリームを受容するための複数のマイクロチャネルのそれぞれは、
（ａ）第１の入口マイクロチャネルと流体連通して、第１の溶媒を含む第１のストリームを受容する、第１のマイクロチャネルと、
（ｂ）第２の入口マイクロチャネルと流体連通して、第２の溶媒を含む第２の入口ストリームを受容する、第２のマイクロチャネルと、
（ｃ）第１および第２のストリームを受容するための第３のマイクロチャネルであって、それぞれ、第１および第２のストリームを流動させるように構成された第１の領域と、第１および第２のストリームの内容物を混合して、脂質ナノ粒子に影響する複数のストリームを提供するように構成された第２の領域とを有する、第３のマイクロチャネルとを含んでもよい。
【００１２】
本発明の上記側面およびそれに付随する利点の多くは、添付の図面と関連して考慮されると、以下の詳細な説明を参照することによってより良く理解されるため、本発明の上記側面およびそれに付随する利点の多くは、より容易に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の代表的システム、連続流スタガ型ヘリンボーンマイクロミキサー（continuous-flow staggered herringbone micromixer）の概略図である。２つの別個のストリームの混合は、パターニングされた中央チャネル内で生じ、注入された流体をカオス的に撹拌する溝付きの壁が交互の二次流を形成させる。カオス的混合は、界面面積の指数関数的増加をもたらし、したがって２つの流体間の拡散距離を低減する。２つの相（水およびエタノールを含有する完全溶媒和脂質）の急速な相互拡散が、ＬＮＰの自己集合をもたらし、そのサイズは、主としてその脂質組成および水／エタノール流量比に依存する。
【図２Ａ】図２Ａは、水／エタノール流量比（ＦＲＲ）を増加させることにより生成された、限界サイズＬＮＰベシクル（図Ａ）およびリン脂質安定化固体コアナノスフェア（図Ｂ）を示す。ＦＲＲは、エタノールチャネルにおいて一定流量（０．５ｍｌ／分）を維持し、水チャネルの流量を０．５ｍｌ／分から４．５ｍｌ／分に増加させることにより変動させた。サイズ測定値は、ＤＬＳ（数加重）を使用して得られた。
【図２Ｂ】図２Ｂは、水／エタノール流量比（ＦＲＲ）を増加させることにより生成された、限界サイズＬＮＰベシクル（図Ａ）およびリン脂質安定化固体コアナノスフェア（図Ｂ）を示す。ＦＲＲは、エタノールチャネルにおいて一定流量（０．５ｍｌ／分）を維持し、水チャネルの流量を０．５ｍｌ／分から４．５ｍｌ／分に増加させることにより変動させた。サイズ測定値は、ＤＬＳ（数加重）を使用して得られた。
【図３Ａ】図３Ａは、Ｍｎ2+の非存在下（上のパネル）および２ｍＭ  Ｍｎ2+の存在下（下のパネル）で分散させた、ＰＯＰＣ（図３Ａ）；ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ、５５／４５モル／モル（図３Ｂ）およびＰＯＰＣ／トリオレイン（ＴＯ）、６０／４０モル／モル（図３Ｃ）ＬＮＰの31Ｐ−ＮＭＲスペクトルを示す。ＦＲＲ＝３（水ストリームに対して３ｍｌ／分、エタノールストリームに対して１ｍｌ／分、エタノール相における全脂質濃度１０ｍｇ／ｍｌ）でＬＮＰを生成した。
【図３Ｂ】図３Ｂは、Ｍｎ2+の非存在下（上のパネル）および２ｍＭ  Ｍｎ2+の存在下（下のパネル）で分散させた、ＰＯＰＣ（図３Ａ）；ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ、５５／４５モル／モル（図３Ｂ）およびＰＯＰＣ／トリオレイン（ＴＯ）、６０／４０モル／モル（図３Ｃ）ＬＮＰの31Ｐ−ＮＭＲスペクトルを示す。ＦＲＲ＝３（水ストリームに対して３ｍｌ／分、エタノールストリームに対して１ｍｌ／分、エタノール相における全脂質濃度１０ｍｇ／ｍｌ）でＬＮＰを生成した。
【図３Ｃ】図３Ｃは、Ｍｎ2+の非存在下（上のパネル）および２ｍＭ  Ｍｎ2+の存在下（下のパネル）で分散させた、ＰＯＰＣ（図３Ａ）；ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ、５５／４５モル／モル（図３Ｂ）およびＰＯＰＣ／トリオレイン（ＴＯ）、６０／４０モル／モル（図３Ｃ）ＬＮＰの31Ｐ−ＮＭＲスペクトルを示す。ＦＲＲ＝３（水ストリームに対して３ｍｌ／分、エタノールストリームに対して１ｍｌ／分、エタノール相における全脂質濃度１０ｍｇ／ｍｌ）でＬＮＰを生成した。
【図４Ａ】図４Ａは、ＦＲＲ＝３（水ストリームに対して３ｍｌ／分、エタノールストリームに対して１ｍｌ／分、エタノール相における全脂質濃度１０ｍｇ／ｍｌ）で生成された、ＰＯＰＣ（図４Ａ）、ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ（図４Ｂ）、およびＰＯＰＣ／ＴＯ（図４Ｃ）ＬＮＰの低温ＴＥＭ顕微鏡写真である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＦＲＲ＝３（水ストリームに対して３ｍｌ／分、エタノールストリームに対して１ｍｌ／分、エタノール相における全脂質濃度１０ｍｇ／ｍｌ）で生成された、ＰＯＰＣ（図４Ａ）、ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ（図４Ｂ）、およびＰＯＰＣ／ＴＯ（図４Ｃ）ＬＮＰの低温ＴＥＭ顕微鏡写真である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＦＲＲ＝３（水ストリームに対して３ｍｌ／分、エタノールストリームに対して１ｍｌ／分、エタノール相における全脂質濃度１０ｍｇ／ｍｌ）で生成された、ＰＯＰＣ（図４Ａ）、ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ（図４Ｂ）、およびＰＯＰＣ／ＴＯ（図４Ｃ）ＬＮＰの低温ＴＥＭ顕微鏡写真である。
【図５】図５は、ＬＮＰのサイズに対するＰＯＰＣ／ＴＯモル比の効果を示す。異なるＰＯＰＣ／ＴＯ比（表１を参照されたい）に基づくナノエマルジョンを、ＦＲＲ＝３（水ストリームに対して３ｍｌ／分、エタノールストリームに対して１ｍｌ／分、エタノール相における全脂質濃度１０ｍｇ／ｍｌ）で生成した。ＤＬＳで測定したＬＮＰサイズのデータ点（丸）は、３回の実験の平均±ＳＤを表す。理論値は、説明されるように計算し、計算値を使用して曲線フィッティング（二次指数関数的減衰）をプロットした。
【図６Ａ】図６Ａは、０．１モル／モル（図６Ａ）および０．２モル／モル（図６Ｂ）のＤ／Ｌ比でドキソルビシンを投入したＰＯＰＣ  ＬＮＰの低温ＴＥＭ顕微鏡写真である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、０．１モル／モル（図６Ａ）および０．２モル／モル（図６Ｂ）のＤ／Ｌ比でドキソルビシンを投入したＰＯＰＣ  ＬＮＰの低温ＴＥＭ顕微鏡写真である。
【図７Ａ】図７Ａは、限界サイズ脂質ナノ粒子の作製に有用な本発明の代表的平行流体構造の三次元図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図７Ａに示される代表的平行流体構造の上面図および側面図を示す。上面図は、平行な２つの平面ヘリンボーン構造を示す。側面図は、流体平行流体構造が３つの層を有し、全体で６つのヘリンボーン構造を形成することを示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、限界サイズ脂質ナノ粒子の作製に有用な本発明の第２の代表的平行流体構造の三次元図である。
【図８】図８は、図７Ａに示される代表的平行流体構造の、入口ポートと各層の第１のセクションとの間の擬似圧力降下の画像である。より高い下流側の抵抗に起因して、各層における下流側の抵抗は本質的に同一である。
【図９】図９は、ホルダに装着されたマイクロ流体拡張デバイス（チップ）の画像である。デバイスは、背面境界プレートに対して押し付けられ、ポートはＯリングでシールされている。
【図１０】図１０は、拡張システム（平行流体デバイス）および単一ミキサーデバイスにより調製された、代表的ＰＯＰＣ／コレステロールベシクル（最終脂質濃度は８ｍｇ／ｍＬであった）の平均ベシクル直径を比較している。
【図１１】図１１は、拡張システム（平行流体デバイス）および単一ミキサーデバイスにより調製された、代表的ＤＳＰＣ／コレステロールベシクル（最終脂質濃度は３ｍｇ／ｍＬであった）の平均ベシクル直径を比較している。
【図１２】図１２は、加熱チャンバを有する本発明の代表的温度制御流体デバイスである。
【図１３】図１３は、加熱チャンバを有する本発明の代表的温度制御流体デバイスである。
【図１４】図１４は、加熱チャンバを有する本発明の代表的温度制御流体デバイスである。
【図１５】図１５は、本発明の代表的脂質二重層ナノ粒子におけるモルパーセントコレステロール（Ｃｈｏｌ）の関数としての粒径（ｎｍ）を比較している。
【図１６】図１６は、共にＣＤ−１マウスの血漿中６．５％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（ＰＥＧ）を含有するＰＯＰＣおよびＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ（７：３）ＤＯＸ投入系の保持特性を評価する、ｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態学的（ＰＫ）試験の結果を比較している。
【図１７】図１７は、５０％ＦＢＳ：ＰＯＰＣ／ＰＥＧ（Ｄ／Ｌ  ０．１）、ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ  ７０／３０／６．５（Ｄ／Ｌ  ０．１）、ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ  ７０／３０／６．５（Ｄ／Ｌ  ０．１５）、ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ  ６５／３５／６．５（Ｄ／Ｌ  ０．１）、およびＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ  ６５／３５／６．５（Ｄ／Ｌ  ０．１５）の存在下で行った、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出試験の結果を比較している。
【発明の詳細な説明】
【００１４】
本発明は、限界サイズ脂質ナノ粒子、ナノ粒子を使用するための方法、ならびにナノ粒子を作製するための方法およびシステムを提供する。
【００１５】
限界サイズ脂質ナノ粒子
本発明の一側面において、限界サイズ脂質ナノ粒子が提供される。ここで使用される場合、「限界サイズ」という用語は、粒子において可能な最も低いサイズ限界を指す。粒子の限界サイズは、粒子の組成、すなわち粒子の成分および粒子中のそれらの量の両方に依存する。限界サイズ脂質ナノ粒子は、分子構成成分の充填特性に基づいて調製され得る、最小のエネルギー的に安定な脂質ナノ粒子として定義される。
【００１６】
一側面において、脂質ナノ粒子が約１０ｎｍから約１００ｎｍの直径を有する限界サイズ脂質ナノ粒子が提供される。
【００１７】
本発明の限界サイズ脂質ナノ粒子は、コアと、コアを包囲するリン脂質を含むシェルとを含む。ある特定の態様において、コアは、脂質（たとえば脂肪酸トリグリセリド）を含み、半固体または固体である。他の態様において、コアは、液体（たとえば水性）である。一態様において、コアを包囲するシェルは、単分子層である。別の態様において、コアを包囲するシェルは、二重層である。
【００１８】
ある特定の態様において、限界サイズナノ粒子は、水性コアを包囲する脂質二重層を含む。ナノ粒子は、有利には、水溶性薬剤、たとえば水溶性治療および診断薬剤が投入され、薬物送達ビヒクルとして機能し得る。
【００１９】
脂質二重層（またはシェル）ナノ粒子は、リン脂質を含む。好適なリン脂質は、ジアシルホスファチジルコリンを含み、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、およびセレブロシドを含む。一態様において、リン脂質は、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸ジアシルホスファチジルコリンである。代表的なリン脂質は、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）である。これらの態様において、ナノ粒子は、約５０モルパーセントから約９９モルパーセントのリン脂質を含む。
【００２０】
ある特定の態様において、ナノ粒子は、ステロールをさらに含む。これらの態様において、ナノ粒子は、約１０モルパーセントから約３５モルパーセントのステロールを含む。代表的なステロールは、コレステロールを含む。一態様において、リン脂質対ステロール（たとえばコレステロール）の比は、５５：４５（モル：モル）である。別の態様において、リン脂質対ステロールの比は、６０：４０（モル：モル）である。さらなる態様において、リン脂質対ステロールの比は、６５：３５（モル：モル）である。さらなる態様において、リン脂質対コレステロールの比は、７０：３０（モル：モル）である。
【００２１】
本発明のナノ粒子は、ポリエチレングリコール−脂質（ＰＥＧ−脂質）をさらに含んでもよい。好適なポリエチレングリコール−脂質は、ＰＥＧ修飾脂質、たとえばＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、およびＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールを含む。代表的なポリエチレングリコール−脂質は、ＤＬＰＥ−ＰＥＧ、ＤＭＰＥ−ＰＥＧ、ＤＰＰＣ−ＰＥＧ、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧを含む。一態様において、ポリエチレングリコール−脂質は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（たとえばＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）である。これらの態様において、ナノ粒子は、約１モルパーセントから約１０モルパーセントのポリエチレングリコール−脂質を含む。
【００２２】
代表的な態様において、ナノ粒子は、５５〜１００％のＰＯＰＣおよび１０モル％までのＰＥＧ−脂質（水性コアＬＮＰ）を含む。
【００２３】
他の態様において、本発明の脂質ナノ粒子は、ホスホグリセリドを含む１種以上の他の脂質を含んでもよく、その代表例は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、およびジリノレオイルホスファチジルコリンを含む。リンが欠乏した他の化合物、たとえばスフィンゴ脂質およびグリコスフィンゴ脂質ファミリーが有用である。トリアシルグリセロールもまた有用である。
【００２４】
本発明の代表的な粒子は、約１０ｎｍから約５０ｎｍの直径を有する。下限直径は、約１０ｎｍから約１５ｎｍである。
【００２５】
他の態様において、限界サイズナノ粒子は、疎水性コアを包囲する脂質単分子層を含む。これらのナノ粒子は、有利には、疎水性薬剤、たとえば疎水性または難水溶性治療および診断薬剤が投入されてもよい。
【００２６】
ある特定の態様において、疎水性コアは、脂質コアである。代表的な脂質コアは、脂肪酸トリグリセリドを含む。これらの態様において、ナノ粒子は、約３０モルパーセントから約９０モルパーセントの脂肪酸トリグリセリドを含む。好適な脂肪酸トリグリセリドは、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸トリグリセリドを含む。一態様において、脂肪酸トリグリセリドは、オレイン酸トリグリセリド（トリグリセリドトリオレイン）である。
【００２７】
脂質単分子層は、リン脂質を含む。好適なリン脂質は、上述のものを含む。この態様において、ナノ粒子は、約１０モルパーセントから約７０モルパーセントのリン脂質を含む。
【００２８】
ある特定の態様において、リン脂質対脂肪酸トリグリセリドの比は、２０：８０（モル：モル）から６０：４０（モル：モル）である。好ましくは、トリグリセリドは、約４０％未満および約８０％以下の割合で存在する。
【００２９】
本発明の限界サイズ脂質ナノ粒子は、１種以上の治療および／または診断薬剤を含み得る。これらの薬剤は、典型的には、粒子コア内に含有される。本発明の粒子は、広範な治療および／診断薬剤を含み得る。
【００３０】
好適な治療薬は、化学治療薬（すなわち抗腫瘍薬）、麻酔薬、ベータアドレナリン遮断薬、抗高血圧薬、抗鬱薬、抗痙攣薬、制吐薬、抗ヒスタミン薬、抗不整脈薬、および抗マラリア薬を含む。
【００３１】
代表的な抗腫瘍薬は、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ストレプトゾシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、メクロレタミン、塩酸塩、メルファラン、シクロホスファミド、トリエチレンチオホスホルアミド、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、フルオロウラシル、ヒドロキシウレア、チオグアニン、シタラビン、フロクスウリジン、ダカルバジン、シスプラチン、プロカルバジン、ビノレルビン、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、ベキサロテン、テニポシド、トレチノイン、イソトレチノイン、シロリムス、フルベストラント、バルルビシン、ビンデシン、ロイコボリン、イリノテカン、カペシタビン、ゲムシタビン、塩酸ミトキサントロン、オキサリプラチン、アドリアマイシン、メトトレキセート、カルボプラチン、エストラムスチン、およびそれらの薬学的に許容される塩を含む。
【００３２】
ある特定の態様において、治療薬剤は、抗腫瘍薬である。一態様において、抗腫瘍薬は、ドキソルビシンである。
【００３３】
一態様において、本発明は、水性コアを包囲する脂質二重層を含むナノ粒子を提供し、二重層は、リン脂質、ステロール、およびポリエチレングリコール−脂質を含み、コアは、治療または診断薬剤を含む。ある特定の態様において、ナノ粒子は、限界サイズナノ粒子である。ある特定の態様において、ナノ粒子は、約１０ｎｍから約５０ｎｍの直径を有する。
【００３４】
一態様において、本発明は、疎水性コアを包囲する脂質単分子層を提供し、単分子層は、リン脂質を含み、コアは、脂肪酸トリグリセリドならびに／または治療もしくは診断薬剤を含む。ある特定の態様において、ナノ粒子は、限界サイズナノ粒子である。ある特定の態様において、ナノ粒子は、約１０ｎｍから約８０ｎｍの直径を有する。
【００３５】
本発明の脂質ナノ粒子は、治療および／または診断薬剤の送達に有用である。
【００３６】
別の側面において、本発明は、治療および／または診断薬剤を対象に投与するための方法を提供する。方法において、治療および／または診断薬剤を含む本発明のナノ粒子が、対象に投与される。
【００３７】
別の側面において、本発明は、疾患または状態を処置するのに効果的な治療薬剤を投与することにより処置可能な疾患または状態を処置するための方法を提供する。方法において、治療薬剤を含む本発明のナノ粒子が、それを必要とする対象に投与される。
【００３８】
限界サイズ脂質ナノ粒子を作製するための方法
さらなる側面において、本発明は、限界サイズ脂質ナノ粒子を作製するための方法を提供する。一態様において、本発明は、第１および第２の隣接するストリームの流動のために構成された第１の領域と、ストリームを混合するための第２の領域とを有するデバイスにおいて、脂質ナノ粒子を作製するための方法であって、
（ａ）第１の溶媒（たとえば水ストリーム）を含む第１のストリームを、第１の流量でデバイスに導入することと、
（ｂ）第２の溶媒中の脂質粒子形成材料を含む第２のストリームを、第２の流量でデバイスに導入し、第１および第２の隣接するストリームを提供することであって、第１および第２の溶媒は、同じではなく、第１の流量対第２の流量の比は、約２．０から約１０．０である、ことと、
（ｃ）第１および第２のストリームを、第１の領域から第２の領域に流動させることと、（ｄ）第１および第２のストリームを、デバイスの第２の領域内で混合し、脂質ナノ粒子を含む第３のストリームを提供することと
を含む方法を提供する。
【００３９】
一態様において、デバイスは、マイクロ流体デバイスである。ある特定の態様において、流動予混合は、層流である。ある特定の態様において、混合中の流動は、層流である。
【００４０】
一態様において、脂質ナノ粒子は、限界サイズ脂質ナノ粒子である。
【００４１】
方法において、限界サイズ脂質ナノ粒子は、第１および第２のストリームの急速混合により調製される。限界サイズナノ粒子の形成は、他の因子の中でも、脂質粒子形成材料を含有する溶液の極性を変更する速度（たとえば、異なる極性を有する２つのストリームの急速混合）に依存する。ある特定の態様において、急速混合は、流動制御、すなわち第１の流量対第２の流量の比の制御により達成される。ある特定の態様において、第１の流量対第２の流量の比は、１：１を超える（たとえば、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１であり、中間の比を含む）。他の態様において、急速混合は、ストリームの組成を制御することにより達成される。臨界点を超える溶媒極性の急速な変化は、限界サイズナノ粒子形成をもたらす。たとえば、第２のストリームにおけるエタノール含量を１００％未満に低減する（水含量を０％超に増加させる）ことにより、１：１に近い流量比でストリームを急速混合することができる。
【００４２】
ある特定の態様において、第１および第２のストリームを混合することは、カオス的移流を含む。他の態様において、第１および第２のストリームを混合することは、マイクロミキサーによる混合を含む。ある特定の態様において、第１および第２のストリームを混合することは、第１の領域内でバリア（たとえば、チャネル壁、シース液、または同心管）により防止される。ある特定の態様において、方法は、第３のストリームを水性緩衝液で希釈すること（たとえば、第３のストリームおよび水性緩衝液を第２の混合構造内に流動させること、または、脂質粒子を含む水性緩衝液を透析して、第２の溶媒の量を低減すること）をさらに含む。
【００４３】
方法において、第１の溶媒は、水性緩衝液であり、第２の溶媒は、水混和性溶媒（たとえばアルコール、たとえばエタノール）である。一態様において、第２の溶媒は、水性アルコールである。
【００４４】
上述のように、ある特定の態様において、第２のストリームは、脂質粒子形成材料（たとえば、上述のような脂質）を含む。一態様において、第２のストリームは、脂肪酸トリグリセリドを含む。この態様において、脂肪酸トリグリセリドは、約３０モルパーセントから約９０モルパーセントの量で第２のストリーム中に存在してもよい。好適な脂肪酸トリグリセリドは、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸トリグリセリドを含む。代表的な脂肪酸トリグリセリドは、オレイン酸トリグリセリド（トリグリセリドトリオレイン）である。
【００４５】
ある特定の態様において、第２のストリームは、リン脂質を含む。リン脂質は、約１０モルパーセントから約９９モルパーセントの量で第２のストリーム中に存在してもよい。一態様において、リン脂質は、ジアシルホスファチジルコリンである。好適なリン脂質は、上述のもの、たとえばＣ８〜Ｃ２０脂肪酸ジアシルホスファチジルコリンを含む。代表的なリン脂質は、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）である。
【００４６】
ある特定の態様において、リン脂質対脂肪酸トリグリセリドの比は、２０：８０（モル：モル）から６０：４０（モル：モル）である。
【００４７】
ある特定の態様において、第２のストリームは、ステロール（たとえばコレステロール）を含む。ステロールは、約１０モルパーセントから約３５モルパーセントの量で第２のストリーム中に存在してもよい。一態様において、ステロールは、コレステロールである。いくつかの態様において、リン脂質対コレステロールの比は、５５：４５（モル：モル）である。
【００４８】
ある特定の態様において、第２のストリームは、ポリエチレングリコール−脂質を含む。好適なポリエチレングリコール−脂質は、上述のものを含む。ポリエチレングリコール−脂質は、約１モルパーセントから約１０モルパーセントの量で第２のストリーム中に存在してもよい。代表的なポリエチレングリコール−脂質は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（たとえばＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）である。
【００４９】
一態様において、方法は、脂質ナノ粒子に治療および／または診断薬剤を投入して、治療および／または診断薬剤を含む脂質ナノ粒子を提供することをさらに含む。代替として、第１または第２のストリームは、薬剤の溶解度に基づいて治療および／または診断薬剤を含むことができる。
【００５０】
本発明は、水性コアベシクル系と、ＴＯ等の疎水性脂肪を含有する固体コア系の両方に対して、高流量比において限界サイズのＬＮＰ系を生成することができるマイクロ流体混合アプローチを提供する。
【００５１】
制御可能な様式で均質エマルジョンを生成するためにマイクロ流体デバイスを使用した報告がいくつかある。これらの研究は、２つの非混和性の相（油および水）を使用し、ミクロンサイズの液滴の形成をもたらしたが、これらの方法を使用してナノサイズの系は達成されなかった。マイクロメートル以下のサイズのリポソーム分散液の制御された形成のためのマイクロ流体アプローチが行われており、水混和性有機溶媒（イソプロピルアルコール）中に溶解した脂質のストリームを、２つの水ストリームの間のマイクロ流体チャネルに流体力学的に集中させた時に、リポソームが形成された。５０ｎｍから１５０ｎｍの範囲の直径を有する微小単層ベシクルが形成されたが、そのサイズは、緩衝液対アルコールの比に依存していた。ベシクルのサイズは、アルコール濃度を低下させると増加し、６０：１という高い緩衝液対アルコールの比を使用して、最小ベシクルが達成された。
【００５２】
本発明は、スタガ型ヘリンボーンマイクロミキサーを使用して、２０ｎｍという微小なサイズを有するＬＮＰの形成を提供する。流動集中アプローチ（flow-focused approach）の場合のように、ＬＮＰ自己集合は、２つの混和性相の相互拡散により生じる。ヘリンボーンミキサーの存在により、移動距離に伴う２つの流体間の表面積の指数関数的増加がもたらされ、はるかに速い相互拡散がもたらされる。これにより、３という低い水性緩衝液対アルコール流量比で、限界サイズベシクルおよび固体コアＬＮＰを形成することができる。
【００５３】
直径２０〜４０ｎｍのサイズ範囲の限界サイズベシクルは、以前には、大きな多重層系の強力な超音波照射を使用することによってのみ達成されていた。超音波照射は、試料分解および汚染を含む数々の不利点を有する。以前に形成された構造を破砕するためのエネルギーの相当な入力を伴わないマイクロ流体アプローチは、極めてより穏やかであり、そのような効果をもたらす可能性が低い。さらに、超音波照射とは対照的に、限界サイズベシクルＬＮＰの生成は、複数のミキサーを並列に組み付けることにより、マイクロ流体アプローチを使用して容易に拡張することができる。
【００５４】
直径１００ｎｍ以下のサイズ範囲内の疎水性脂質コアを含有する固体コアナノエマルジョンＬＮＰ系を生成することを試みた、超音波照射および他の技術を使用した数々の研究がなされている。直径約６０ｎｍ未満の固体コアＬＮＰの生成の報告は少ない。５０ｎｍ未満の直径を有するナノエマルジョンは、現行の技術を使用して達成することが困難である。さらに、超音波照射を使用して、ＰＣ／ＴＯ混合物のサイズを、これらの成分の割合を変動させることにより変動させる取り組みが以前になされているが、これらの取り組みは、油滴およびリポソームの生成により難航している。本発明のマイクロ流体アプローチは、これまで到達不可能であったサイズ範囲内の安定な脂質ナノエマルジョンを生成する能力を提供する。
【００５５】
上述のように、１０〜５０ｎｍのサイズ範囲内のＬＮＰは、より大きな系よりもはるかに血管外標的組織に浸透することができるため、薬物送達用途において特別な利点を提供する。抗がん剤を含有するＬＮＰ系（直径８０〜１００ｎｍのサイズ範囲内）の大きな不利点は、それらが腫瘍の領域において浸出することができる一方で、腫瘍組織自体への浸透が僅かであることである。同様に、現在利用可能なＬＮＰ系は、「有窓」内皮を示す組織、たとえば肝臓、脾臓または骨髄に浸透し得るが、他の組織に浸透する能力が非常に限られている。本発明のマイクロ流体混合技術により利用可能な限界サイズ系は、ＬＮＰ送達技術の適用可能性を拡張するための大きな実用性を有する。
【００５６】
以下は、本発明の代表的方法および系の説明である。
【００５７】
本発明は、「ボトムアップ」式アプローチを使用して限界サイズＬＮＰ系を生成するための急速マイクロ流体混合技術を提供する。ここで使用される場合、「ボトムアップ」という語句は、周囲の媒体の極性の急速な増加に応答して、粒子が溶液からの濃縮により生成される方法を指す。一態様において、ＬＮＰは、脂質を含有する有機（エタノール）ストリームを水ストリームと急速に混合するためにカオス的移流を達成するヘリンボーン連続流マイクロ流体混合デバイスを使用して形成された。代表的な脂質系は、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ＰＯＰＣ／コレステロール（Ｃｈｏｌ）、およびＰＯＰＣとトリグリセリドトリオレイン（ＴＯ）との混合物を含んでいた。結果は、水ストリームとエタノールストリームとの間の流量比（ＦＲＲ）を増加させることにより、純粋なＰＯＰＣならびにＰＯＰＣとＣｈｏｌおよびＴＯとの混合物に対して、限界サイズＬＮＰ系を得ることができることを示している。さらに、限界サイズＰＯＰＣ／ＴＯ分散液のサイズは、ＰＯＰＣ／ＴＯ比を変動させることにより、２０ｎｍから８０ｎｍの範囲にわたり変動し得る。
【００５８】
マイクロ流体混合は、限界サイズＬＮＰ系を高流量比で生成し得る。本発明は、脂質成分の物理的特性および割合と一致され得る最小の安定ＬＮＰ系を構成する「限界サイズ」系を提供する。ＬＮＰは、溶解した脂質を含有するエタノールストリームを水ストリームとマイクロ流体ミキサー内で混合することにより形成された。脂質が経験する媒体の極性を急速に増加させるほど、得られるＬＮＰはある限界サイズに達するまで小さくなるはずであると推論された。（１）混合速度、および（２）混合されている水対エタノール体積の比の２つの因子が、極性の増加速度に影響し得る。ヘリンボーンマイクロミキサー内での混合速度は、全流量と共に増加する。より急速な混合および増加した希釈効果の両方に起因して、水流量対エタノール流量の比（流量比、ＦＲＲ）が増加するにつれて、より小さいＬＮＰが生成される。さらに、より高い流量比では、最終エタノール濃度が低下し、したがって、完全混合が達成された後、粒子融合および脂質交換（オストワルド熟成）に起因して、より大きなＬＮＰの生成が低減される。
【００５９】
ヘリンボーンマイクロ流体混合デバイスを使用してＦＲＲを増加させることにより限界サイズＬＮＰ系が形成され得るかを決定するように、第１の組の実験を計画した。エタノール（脂質を含有する）および水（１５４ｍＭ生理食塩水）ストリームを混合することによりＬＮＰを形成したが、１から９の範囲のＦＲＲに対応して、エタノールの流量を一定に保持し（０．５ｍｌ／分）、水相の流量を０．５ｍｌ／分から４．５ｍｌ／分の範囲にわたり増加させた。したがって、全流量は、１ｍｌ／分から５ｍｌ／分の範囲にわたり変動した。３つの代表的な脂質系を調査した。最初の２つ、ＰＯＰＣおよびＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５；モル／モル）は、水和後に二重層ベシクルを形成することが知られており、一方第３のＰＯＰＣおよびトリオレイン（ＴＯ）の混合物は、ＰＯＰＣが疎水性ＴＯのコアを包囲する外側単分子層を形成した、「固体コア」エマルジョンを形成し得る。図２Ａに示されるように、ＰＯＰＣ系では、動的光散乱（ＤＬＳ；数モード）により分析される約２０ｎｍの直径を有する限界サイズＬＮＰが、３以上のＦＲＲに対して観察される。これらの系は、光学的に透明であり、ＤＬＳにより示される微小サイズと一致した。ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ混合物では、約４０ｎｍの直径を有する限界サイズＬＮＰが、２を超えるＦＲＲに対して観察された。
【００６０】
ＰＯＰＣ／ＴＯ混合物の場合、ＰＯＰＣ脂質がＴＯの固体コアの周囲の単分子層を形成すると仮定すると、限界サイズは、ＰＯＰＣ／ＴＯ比に敏感であることが予期される。分子当たりのＰＯＰＣ面積を０．７ｎｍ2、単分子層の厚さを２ｎｍ、およびＴＯ分子量を８８５．４、ならびに密度を０．９１ｇ／ｍｌと仮定すると、直径約２０ｎｍの限界粒径には、６０／４０（モル／モル）のＰＯＰＣ／ＴＯ比が必要となる。図２Ｂに示されるように、５以上のＦＲＲに対して、ＰＯＰＣ／ＴＯ（６０／４０；モル／モル）混合物において２０ｎｍの平均粒径を有するＬＮＰ系が得られた。これらの微小系は、光学的に透明であった。ＬＮＰサイズは、異なる実験の間で極めて再現性がある（±２ｎｍ以内）ことにも留意されたい。２５％エタノールの存在下、２０℃で少なくとも２４時間インキュベートしたＰＯＰＣ／ＴＯナノエマルジョンの粒径の増加は観察されなかった（データは図示せず）。透析して残留エタノールを除去したら、ＰＯＰＣ／ＴＯの２０ｎｍ系は、少なくとも数カ月間安定なままであった。
【００６１】
31Ｐ−ＮＭＲ試験により決定される限界サイズＬＮＰ構造。31Ｐ−ＮＭＲ技術を使用して、二重層ベシクル構造に一致して、リン脂質の一部がバルク水性緩衝液から隔離されているかどうかを、または、ＰＯＰＣ単分子層により包囲された固体コアに一致して、ＰＯＰＣの全てが外側単分子層内にあるかどうかを決定した。これは、外側単分子層内のリン脂質から生じる31Ｐ−ＮＭＲシグナルがＭｎ2+を添加することにより除去され得るため、達成するのが容易であった。Ｍｎ2+は、到達され得るリン脂質の31Ｐ−ＮＭＲシグナルを効果的に排除する拡張剤（broadening agent）として機能する。微小単層ベシクルの場合、これは外側単分子層に対応し、31Ｐ−ＮＭＲシグナルは、Ｍｎ2+の添加後に５０％以上低減される。一方、リン脂質の全てが外側単分子層上にあるはずである固体コア系の場合、Ｍｎ2+への曝露後にシグナルの完全な排除が予期される。
【００６２】
図３Ａ〜３Ｃは、２ｍＭ  Ｍｎ2+の非存在下および存在下での、ＰＯＰＣ（図３Ａ）、ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ、５５／４５モル／モル（図３Ｂ）およびＰＯＰＣ／ＴＯ、６０／４０モル／モル（図３Ｃ）ＬＮＰ系に対して得られた31Ｐ  ＮＭＲスペクトルを示す。予期されるように、緩衝剤がＭｎ2+を含有しない場合、３つ全ての調製物において鋭い「等方性」ピークが観察され（上のパネル）、これは、ベシクルの転動および脂質の側方拡散効果に起因する急速な等方性運動平均化効果（isotropic motional averaging effect）に一致する。Ｍｎ2+の添加は、シグナル強度をＰＯＰＣおよびＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ系の初期シグナルの５０％以下のレベルまで低減し（図３Ａおよび３Ｂ、下のパネル）、極めて小さい単層ベシクルの存在を示している。二重層の厚さおよび脂質分子当たりの面積が既知である場合、ベシクルの外側の脂質対内側の脂質の比（Ｒｏ／ｉ）を使用して、ベシクルサイズを決定することができる。ＰＯＰＣおよびＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ系のＲｏ／ｉは、図３Ａおよび３Ｂから計算され、３．５ｎｍの二重層の厚さを仮定して、それぞれ１．７および１．３５であることが判明したが、これは直径約３０ｎｍおよび５０ｎｍのサイズに対応する。これらの値は、ＤＬＳにより測定されたものより大きいが、これは、内側単分子層における充填密度の増加、および／または少ない割合の多重層ベシクルに起因して生じ得る。
【００６３】
ＰＯＰＣ／ＴＯ（６０／４０；モル／モル）ＬＮＰ系の場合、拡張剤の添加は、31Ｐ−ＮＭＲシグナルの完全な排除をもたらし（図３Ｃ、下のパネル）、全てのＰＯＰＣが外側単分子層内に位置するＴＯコア系と一致する。ベシクル内部におけるＰＯＰＣからの残留シグナルは検出されないことから、二重層ベシクルの集団の証拠はない。
【００６４】
ＬＮＰサイズおよび構造の低温透過型電子顕微鏡観察。異なるサイズおよび形態のＬＮＰの形成を確認するため、低温ＴＥＭを使用してＰＯＰＣ、ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ、およびＰＯＰＣ／ＴＯ系を可視化した。顕微鏡写真は、ＰＯＰＣおよびＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ系が、ＤＬＳおよび31Ｐ−ＮＭＲデータと一致して、１５〜２５ｎｍ（図４Ａ）および２５〜４５ｎｍ（図４Ｂ）のサイズ範囲を有するベシクル形態を有することを示している。ＰＯＰＣ／ＴＯ分散液の場合、低温ＴＥＭは、ＤＬＳサイズデータと良く一致して、１５ｎｍから２５ｎｍの範囲のサイズを有する球状高電子密度粒子の存在を明らかにしている（図４Ｃ）。
【００６５】
マイクロ流体混合により生成されたＬＮＰの限界サイズに対するＰＯＰＣ／ＴＯ比の影響。上述のように、ＰＯＰＣ／ＴＯ混合物から生成されたＬＮＰの限界サイズは、リン脂質対トリグリセリドのモル比に依存するはずである。直径２０、４０、６０、および８０ｎｍのＬＮＰを形成するために必要なモル比を計算してＬＮＰ系を生成するために使用し、ＤＬＳによりそのサイズを測定した。図５は、理論値を表す曲線と比較した、ＰＯＰＣ／ＴＯモル比の関数としてのＰＯＰＣ／ＴＯ  ＬＮＰの平均直径の減少を示す。表１は、ＰＯＰＣ／ＴＯ  ＬＮＰの予測サイズとＤＬＳ推定サイズとの間の直接比較を示す。ＰＯＰＣ／ＴＯ比に基づく予測サイズと実際のサイズとの間に良好な一致が見られる。
【表１】
2020121986.tif 000002
【００６６】
限界サイズベシクルＬＮＰ内にドキソルビシンを投入および保持することができる。本発明の一側面において、限界サイズベシクルＬＮＰ系内に治療薬および診断薬剤を投入および保持することができる。そのような系の低いトラップ容積（trapped volume）は、弱塩基性薬物、たとえばドキソルビシンの蓄積をもたらすｐＨ勾配（内部酸性（inside acidic））を形成させるために使用され得る溶質（たとえば硫酸アンモニウム）の封入を制限することが予期される。広く使用されている抗腫瘍薬であるドキソルビシンは、ｐＨ勾配を示す従来の１００ｎｍリポソーム系内に容易に蓄積され得るため、モデル化合物として選択された。硫酸アンモニウムを含有するＰＯＰＣで構成されるＬＮＰ系は、以下のように調製された。生理食塩水中で調製されたＰＯＰＣ系と比較して、サイズの大きな変化は観察されなかった。外部硫酸アンモニウムの除去後、硫酸アンモニウム含有ＬＮＰを、様々な量のドキソルビシンの存在下で６０℃でインキュベートした（初期薬物／脂質（Ｄ／Ｌ）比は、０．０５、０．１および０．２モル／モルに設定した）。全ての場合において、３０分以内に１００％に近い薬物投入の有効性が達成された（データは示さず）。投入試料のＤＬＳ分析は、空の前駆体（約２０ｎｍ）と比較して、粒径の増加を示さなかった。
【００６７】
薬物投入ＬＮＰの形態に対するドキソルビシン投入の効果をさらに調査するために、Ｄ／Ｌ  ０．１および０．２モル／モルで投入されたＰＯＰＣ  ＬＮＰに対する低温ＴＥＭ観察を行った。低温ＴＥＭ観察からの代表的な画像を、図６Ａおよび６Ｂに示す。リポソームドキソルビシン調合物の以前の低温ＴＥＭ観察は、「コーヒー豆」形状のリポソーム形態をもたらす封入薬物の直線状沈殿物の存在を示していた。ここで、Ｄ／Ｌ  ０．１で投入されたＬＮＰは、同様の外観を示し、１００ｎｍ系において観察されるものと同様の薬物沈殿パターンを示している（図６Ａ）。しかしながら、０．２モル／モルというより高いＤ／Ｌ比では、ベシクルの内部は、より均一に高電子密度であるように見え、沈殿したドキソルビシンは、非晶質沈殿物に合体し、明確に画定された構造組織を有さないようであり（図６Ｂ）；いくつかの粒子は、細長い形状に見える。それにもかかわらず、粒子のほとんどは球状のままであり、これらの顕微鏡写真における粒子のサイズ分析（約１５０の偏りのない試料に基づく）は、０．１モル／モルおよび０．２モル／モルで投入されたＬＮＰにおいて、それぞれ２２±８ｎｍおよび２２±１０ｎｍ（平均±ＳＤ）のサイズを示した。
【００６８】
高い表面／体積比および非常に小さな膜曲率半径を示す限界サイズ系では、封入薬物を安定に保持する投入ＬＮＰの能力が問題となり得る。それに関して、４℃で保存されたドキソルビシン投入ＬＮＰの安定性を、８週間の期間監視した。検出可能な薬物放出／粒径変化は観察されなかった。３７℃でインキュベートされた試料においては、投入薬物の９０％（０．１モル／モル系）および７５％（０．２モル／モル系）が、２４時間の時点で封入されたままであった（データは示さず）。これらの結果は、難溶性ベシクル内沈殿物を形成する封入薬物の能力が、薬物投入限界サイズＬＮＰに適正な保持力をもたらすのに役立ち得る因子の１つとなり得ることを示している。
【００６９】
ある特定の態様において、脂質ナノ粒子中のステロールおよびポリエチレングリコール−脂質の存在が、ナノ粒子のサイズ特性を改善した（たとえば、約１５ｎｍから約３５ｎｍの有利な粒径を維持した）。図１に概略的に示されるデバイスを使用して、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）を１つの入口（１０２）に導入し、エタノール中の脂質（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を含む、または含まないＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ）を、第２の入口（１０６）に導入した。それぞれ、デバイスに導入する前に約６０℃に加熱した。全流量は４ｍＬ／分であり、ＦＲＲは５：１（水３．３３ｍＬ／分、エタノール０．６６ｍＬ／分）であり、エタノール中の脂質の初期濃度は２０ｍＭであった。生成物を、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水中で一晩透析し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎユニット（１０Ｋ  ＭＷＣＯ）により濃縮した。結果を表２および３に示す。
【表２】
2020121986.tif 000003
【表３】
2020121986.tif 000004
【００７０】
図１５は、本発明の代表的脂質二重層ナノ粒子におけるモルパーセントコレステロール（Ｃｈｏｌ）の関数としての粒径（ｎｍ）を比較している。３％モルＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の存在により、ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ系のサイズは、３５％モルＣｈｏｌまで維持され得る。サイズは、数加重のＤＬＳにより測定した。
【００７１】
上述のように、ある特定の態様において、本発明の脂質ナノ粒子は、有利に治療薬剤が投入され得る。代表的な例において、ＰＯＰＣ／ＰＥＧ系（Ｃｈｏｌ不含）へのドキソルビシン（ＤＯＸ）の投入は、６０℃で行われた。１００％に近い薬物投入の有効性が３０分以内に達成された。しかしながら、Ｃｈｏｌ含有系（ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ）は、薬物の存在下においてはこの温度で不安定であった（系は崩壊し、粗大凝集物の形成が生じた）。したがって、ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ系へのドキソルビシンの投入は、３７℃で行われた（３時間、Ｄ／Ｌ  ０．１モル／モル）。形成段階において３％のＰＥＧが調合物に含まれ、投入前に追加の３．５％が後に注入された。系内のコレステロールの存在は、ドキソルビシン保持の改善をもたらした（ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方において）。
【００７２】
図１６は、共にＣＤ−１マウスの血漿中６．５％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（ＰＥＧ）を含有するＰＯＰＣおよびＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ（７：３）ＤＯＸ投入系の保持特性を評価する、ｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態学的（ＰＫ）試験の結果を比較している。結果は、ポリエチレングリコール脂質を含む系が、保持の向上を証明することを示している。
【００７３】
図１７は、５０％ＦＢＳの存在下で行われたｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出試験の結果を比較している。評価された系は、ＰＯＰＣ／ＰＥＧ（Ｄ／Ｌ  ０．１）、ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ  ７０／３０／６．５（Ｄ／Ｌ  ０．１）、ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ７０／３０／６．５（Ｄ／Ｌ  ０．１５）、ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ  ６５／３５／６．５（Ｄ／Ｌ  ０．１）、およびＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ  ６５／３５／６．５（Ｄ／Ｌ  ０．１５）であった。結果は、３０％から３５％へのＣｈｏｌ含量の増加が、ＤＯＸ保持の増加を提供すること、および０．１５モル／モルへのＤ／Ｌ比の増加が、薬物保持にいかなる改善ももたらさなかったことを証明する。
【００７４】
限界サイズナノ粒子を作製するためのデバイスおよびシステム
別の側面において、本発明は、限界サイズナノ粒子を作製するためのデバイスおよびシステムを提供する。一態様において、デバイスは、
（ａ）第１の溶媒を含む第１の溶液を受容するための第１の入口（１０２）と、（ｂ）第１の入口と流体連通して、第１の溶媒を含む第１のストリームを提供する、第１の入口マイクロチャネル（１０４）と、
（ｃ）第２の溶媒中の脂質粒子形成材料を含む第２の溶液を受容するための第２の入口（１０６）と、
（ｄ）第２の入口と流体連通して、第２の溶媒中の脂質粒子形成材料を含む第２のストリームを提供する、第２の入口マイクロチャネル（１０８）と、
（ｅ）第１および第２のストリームを受容するための第３のマイクロチャネル（１１０）であって、第１および第２のストリームを流動させるように構成された第１の領域（１１２）と、第１および第２のストリームの内容物を混合して、限界サイズ脂質ナノ粒子を含む第３のストリームを提供するように構成された第２の領域（１１４）とを有する、第３のマイクロチャネル（１１０）と
を含む。そのように形成された脂質ナノ粒子は、マイクロチャネル１１６により第２の（混合）領域から出口１１８に導かれる。
【００７５】
上記の参照番号は、図１に概略的に示される代表的デバイスを指す。
【００７６】
一態様において、マイクロチャネルの第２の領域は、浅浮き彫り構造を含む。ある特定の態様において、マイクロチャネルの第２の領域は、主要流動方向と、少なくとも１つの溝または突起が画定された１つ以上の表面とを有し、溝または突起は、主要方向と角度を形成する方位を有する。他の態様において、第２の領域は、マイクロミキサーを含む。
【００７７】
デバイスおよびシステムにおいて、第１および第２のストリームの流量を変動させるための手段を使用してストリームが急速に混合され、それにより限界サイズナノ粒子が提供される。
【００７８】
ある特定の態様において、１つ以上のマイクロチャネルは、約２０μｍから約３００μｍの水力直径を有する。
【００７９】
ある特定の態様において、本発明のデバイスは１０ｍｓ未満で生じる完全混合を提供する。
【００８０】
一態様において、デバイスは、平行マイクロ流体構造である。
【００８１】
ある特定の態様において、デバイスの１つ以上の領域が加熱される。
【００８２】
本発明の限界サイズナノ粒子を作製するための他の代表的なデバイスおよびシステムを、以下で説明する。
【００８３】
平行流体構造。ある特定の側面において、本発明は、２つ以上の流体混合構造（すなわち、流体構造のアレイ）を含むデバイスを提供する。ある特定の態様において、本発明は、約２ｍＬ／分から約１６００ｍＬ／分の流量で脂質ナノ粒子を生成することができる、２個から約４０個の平行流体混合構造を含む単一デバイス（すなわちアレイ）を提供する。これらの態様において、デバイスは、脂質ナノ粒子特性を変化させずに２ｍＬから約２０，０００ｍＬを生成する。
【００８４】
一態様において、脂質ナノ粒子を生成するためのデバイスは、
（ａ）第１の溶媒を含む第１の溶液を受容するための第１の入口と、
（ｂ）第１の入口と流体連通して、第１の溶媒を含む第１のストリームを提供する、第１の入口マイクロチャネルと、
（ｃ）第２の溶媒中の脂質粒子形成材料を含む第２の溶液を受容するための第２の入口と、
（ｄ）第２の入口と流体連通して、第２の溶媒中の脂質粒子形成材料を含む第２のストリームを提供する、第２の入口マイクロチャネルと、
（ｅ）第１および第２のストリームを受容するための複数のマイクロチャネルであって、それぞれ、第１および第２のストリームを流動させるように構成された第１の領域と、第１および第２のストリームの内容物を混合して、脂質ナノ粒子に影響する複数のストリームを提供するように構成された第２の領域とを有する、複数のマイクロチャネルと、（ｆ）脂質ナノ粒子を含む複数のストリームを受容し、組み合わせるための第４のマイクロチャネルと
を含む。
【００８５】
ある特定の態様において、第１および第２のストリームを受容するための複数のマイクロチャネルのそれぞれは、
（ａ）第１の入口マイクロチャネルと流体連通して、第１の溶媒を含む第１のストリームを受容する、第１のマイクロチャネルと、
（ｂ）第２の入口マイクロチャネルと流体連通して、第２の溶媒を含む第２の入口ストリームを受容する、第２のマイクロチャネルと、
（ｃ）第１および第２のストリームを受容するための第３のマイクロチャネルであって、それぞれ、第１および第２のストリームを流動させるように構成された第１の領域と、第１および第２のストリームの内容物を混合して、脂質ナノ粒子に影響する複数のストリームを提供するように構成された第２の領域とを有する、第３のマイクロチャネルとを含む。
【００８６】
ある特定の態様において、デバイスは、第１および第２のストリームを受容するための、２個から約４０個のマイクロチャネルを含む。これらの態様において、デバイスは、２ｍＬ／分から約１６００ｍＬ／分の全流量を有する。
【００８７】
ある特定の態様において、第２の領域は、それぞれ約２０μｍから約３００μｍの水力直径を有する。ある特定の態様において、第２の領域は、それぞれ１ｍＬ／分から約４０ｍＬ／分の流体流量を有する。
【００８８】
加熱要素を含む態様において、加熱要素は、第１および第２のマイクロチャネル内の第１および第２のストリームの温度を、それらが第３のマイクロチャネルに進入する前に所定の温度に上昇させるために効果的である。これらの態様において、入口流体は所望の温度に加熱され、流体温度が脂質ナノ粒子形成の前に認め得るほどに変化しないように、混合は十分急速に生じる。
【００８９】
一態様において、本発明は、平行マイクロ流体構造を含む限界サイズナノ粒子を作製するためのシステムを提供する。平行構造において、Ｎ×Ｆ（Ｆは非平行化の実装において使用される流量である）の全流量が達成されるようにＮ個の単一ミキサーが配列される。本発明の代表的な平行マイクロ流体構造を、図７Ａ〜７Ｃに概略的に示す。
【００９０】
代表的な平行マイクロ流体構造の斜視図を図７Ａに示し、平面図を図７Ｂに示す。
【００９１】
図７Ａを参照すると、デバイス２００は、１つの第１の溶媒入口（２０２）、２つの第２の溶媒入口（２０６および２０６’）、２つの混合領域（１１０および１１０’）、ならびに単一出口（２０８）を含む各システムに対して垂直に配設された３つの流体システム（１００ａ、１００ｂ、および１００ｃ）を含む。各システムは、第１および第２のストリームを受容するためのマイクロチャネル（それぞれ２０２ならびに２０６および２０６’）を含む。
【００９２】
図７Ｂを参照すると、各流体システムは、
（ａ）第１の入口（１０２ａ）を介して第１の入口マイクロチャネル（１０４ａ）と流体連通して、第１の溶媒を含む第１のストリームを受容する、第１のマイクロチャネル（２０２）と、
（ｂ）第２の入口（１０６ａ）を介して第２の入口マイクロチャネル（１０８ａ）と流体連通して、第２の溶媒を含む第２の入口ストリームを受容する、第２のマイクロチャネル（２０６）と、
（ｃ）第１および第２のストリームを受容するための第３のマイクロチャネル（１１０ａ）であって、それぞれ、第１および第２のストリームを流動させるように構成された第１の領域（１１２ａ）と、第１および第２のストリームの内容物を混合して、脂質ナノ粒子を含む複数のストリームを提供するように構成された第２の領域（１１４ａ）とを有する、第３のマイクロチャネル（１１０ａ）と
を含む。図７Ｂにおいて、マイクロチャネル１１６ａは、デバイスから脂質ナノ粒子を導く出口１１８ａを介して、複数のストリームの１つを、混合領域から第４のマイクロチャネル２０８に導く。
【００９３】
図７Ｂを参照すると、デバイスのこの態様において、流体システム１００ａは、第２の第２の溶媒入口（２０６’）および混合領域（１１０ａ’）を含み、構成成分は、参照番号１０２ａ’、１０４ａ’、１０６ａ’、１０８ａ’、１１２ａ’、１１４ａ’、１１６ａ’および１１８ａ’により示されることが理解される。これらの参照番号は、図７Ｂにおけるそのダッシュ記号のない相当物（１０２、１０４、１０６、１０８、１１２、１１４、１１６、および１１８）に対応する。
【００９４】
この構造は、単一ミキサーチップと比較してより高い流量でベシクルを生成し、単一ミキサーチップにより生成されたものと同一のベシクルを生成する。この代表的な態様において、６つのミキサーが、３つの試薬入口を使用して統合される。これは、図７Ａおよび７Ｂに示されるように、平面平行化と垂直平行化の両方を使用して達成される。
【００９５】
平面平行化は、同じ水平面上に１つ以上のミキサーを設置することを指す。これらのミキサーは、流体バスチャネル（bus channel）により接続されても、またはされなくてもよい。入口と出口との間に同一流体経路を形成することにより、各ミキサーを通る等しい流動が確保され、または、図７Ｃに示されるように低インピーダンスバスチャネル（ミキサーの流体インピーダンスより大幅に低い流体インピーダンスを有するチャネル）を使用して入口および出口を接続することにより、効果的に等しい流動が達成される。
【００９６】
図７Ｃは、水平に配設された５つの流体システム（１００ａ、１００ｂ、１００ｃ、１００ｄ、および１００ｅ）を含むデバイス３００を示し、各システムは、１つの第１の溶媒入口、１つの第２の溶媒入口、１つの混合領域、および単一の出口（２０８）を含む。デバイス３００は、第１および第２のストリームを受容するためのマイクロチャネル（２０２および２０６）、ならびにデバイス内で生成された脂質ナノ粒子をデバイスから導くためのマイクロチャネル（２０８）を含む。
【００９７】
図７Ｃを参照すると、流体システム１００ａは、
（ａ）第１の入口（１０２ａ）を介して第１の入口マイクロチャネル（１０４ａ）と流体連通して、第１の溶媒を含む第１のストリームを受容する、第１のマイクロチャネル（２０２）（入口２０３を有する）と、
（ｂ）第２の入口（１０６ａ）を介して入口マイクロチャネル（１０４ａ）と流体連通して、第２の溶媒を含む第２の入口ストリームを受容する、第２のマイクロチャネル（２０６）（入口２０５を有する）と、
（ｃ）第１および第２のストリームを受容するための第３のマイクロチャネル（１１０ａ）であって、第１および第２のストリームを流動させるように構成された第１の領域（１１２ａ）と、第１および第２のストリームの内容物を混合して、脂質ナノ粒子に影響する第３のストリームを提供するように構成された第２の領域（１１４ａ）とを有する、第３のマイクロチャネル（１１０ａ）と
を含む。図７Ｃにおいて、マイクロチャネル１１６ａは、出口１１８ａを介して、第３のストリームを混合領域から第４のマイクロチャネル２０８に導く。マイクロチャネル２０８は、出口２０９を介して、脂質ナノ粒子をデバイスから導く。
【００９８】
図７Ｂを参照すると、デバイスのこの態様において、流体システム１００ａは、第２の第２溶媒入口（２０６’）および混合領域（１１０ａ’）を含み、構成成分は、参照番号１０２ａ’、１０４ａ’、１０６ａ’、１０８ａ’、１１２ａ’、１１４ａ’、１１６ａ’および１１８ａ’により示されることが理解される。これらの参照番号は、図７Ｂにおけるそのダッシュ記号のない相当物（１０２、１０４、１０６、１０８、１１２、１１４、１１６、および１１８）に対応する。
【００９９】
一態様において、本発明は、ｎ個の流体デバイスを含む、限界サイズ脂質ナノ粒子を生成するためのデバイスを提供し、各流体デバイスは、
（ａ）第１の溶媒を含む第１の溶液を受容するための第１の入口（１０２ａ）と、（ｂ）第１の入口と流体連通して、第１の溶媒を含む第１のストリームを提供する、第１の入口マイクロチャネル（１０４ａ）と、
（ｃ）第２の溶媒中の脂質粒子形成材料を含む第２の溶液を受容するための第２の入口（１０６ａ）と、
（ｄ）第１および第２のストリームを受容するための第３のマイクロチャネル（１１０ａ）であって、第１および第２のストリームを流動させるように構成された第１の領域（１１２ａ）と、第１および第２のストリームの内容物を混合して、マイクロチャネル１１６ａにより混合領域から導かれる限界サイズ脂質ナノ粒子を含む第３のストリームを提供するように構成された第２の領域（１１４ａ）とを有する、第３のマイクロチャネル（１１０ａ）と
を含み、各流体デバイス（１００ａ〜１００ｎ）の第１の入口（１０２ａ〜１０２ｎ）は、第１の溶液を第１の入口のそれぞれに提供する第１のバスチャネル（２０２）を通して流体連通しており、
各流体デバイス（１００ａ〜１００ｎ）の第２の入口（１０６ａ〜１０６ｎ）は、第２の溶液を第２の入口のそれぞれに提供する第２のバスチャネル（２０６）を通して流体連通しており、
各流体デバイス（１００ａ〜１００ｎ）の出口（１１８ａ〜１１８ｎ）は、第３のストリームをデバイスから導く第３のバスチャネル（２０８）を通して流体連通している。参照番号は、図７Ｃにおける代表的デバイス３００を指す。
【０１００】
ある特定の態様において、ｎは、２から４０の整数である。
【０１０１】
垂直平行化は、平面ミキサー（planar mixer）を形成し、それらを互いにスタックして、垂直バスを通して入口および出口を接続することにより達成される。理論的には、入口からより低いミキサーに流動する流体は、一番上のミキサーに流動する流体よりも高い抵抗を受け、したがってより低い流量となる。しかしながら、２つのミキサーを隔てる距離は５００ミクロン未満であり、混合構造（各層に対して同一である）の全体的抵抗と比較して、増加する抵抗は無視できる。これは、実験結果と流体流動シミュレーション（図８）の両方から確認される。この条件が成り立つ混合層を隔てる距離は、バスの幅に依存する。
【０１０２】
平行化デバイスは、まず、平面バスチャネルにより平行に接続された１つ以上のマイクロ流体ミキサーを有する平面平行化ミキサーのポジ型を作製することにより形成される。次いで、これらの型を使用して、平面平行化ミキサーの層がキャスト、エンボス加工、または別様に成形され、次いでその１つ以上の層が、垂直バスチャネルを使用してスタック、接合および接続され得る。ある特定の実装において、平面ミキサーおよびバスは、垂直にスタックする前に、２つの別個の型から形成されてもよい（所望により）。一態様において、標準的リソグラフィーを使用して、シリコンウエハ上の２つの平面構造のポジ型を形成する。次いで、等量比の（on-ratio）ＰＤＭＳの厚い層を型に流し込み、脱気し、８０℃で２５分間硬化させる。次いで、硬化したＰＤＭＳを剥離し、次いで１０：１のＰＤＭＳの第２の層を、５００ｒｐｍで６０秒間ウエハ上に回転塗布し、次いで８０℃で２５分間ベーキングする。ベーキングの後、両方の層を酸素プラズマに曝露し、次いで配列させる。次いで、配列させたチップを８０℃で１５分間ベーキングする。次いで、このプロセスを繰り返して、所望の数の層を形成する。配列は、チップを切断し、それぞれを個々に配列させることにより、および、硬化中のポリマーの収縮を考慮して、各層に対し個々のウエハを作製することにより促進することができる。
【０１０３】
カスタムチップホルダを使用して、このチップは、標準的なねじ式コネクタを用いてポンプに接続されている（図９を参照されたい）。これにより、７２ｍｌ／分という高い流量を達成することが可能となった。以前は、単一要素ミキサーにおいて、ピンがチップからの噴出物を漏出することが多いため、約１０ｍｌ／分の流動は信頼性がなかった。これらのホルダとの接続のため、チップは、背面側でガラスにシールされ、上面側で、接続穴が予め穿孔されたポリカーボネートまたはガラスのカスタム切断片にシールされる。ＰＣからＰＤＭＳへの接合は、シラン処理を使用して達成される。Ｏリングによる信頼性のあるシールを形成するには、硬質表面が必要である。シラン化学はナノ粒子の形成に影響することが示されているため、ミキサーのシールのためにガラスの裏打ちが維持される。
【０１０４】
本発明のデバイスおよびシステムは、限界サイズナノ粒子の拡張可能な生成を提供する。以下の結果は、同一平均直径により示唆されるように、図７Ａおよび７Ｂに示されるマイクロ流体ミキサーを使用して同一ベシクルを生成する能力を実証している。
【０１０５】
平行マイクロ流体構造を使用して生成された代表的な限界サイズナノ粒子（ＤＳＰＣ／コレステロールベシクル）の拡張調合のための平均ベシクル直径（ｎｍ）を、図１１における単一ミキサーマイクロ流体デバイスを使用して生成されたものと比較する（最終脂質濃度は３ｍｇ／ｍＬであった）。ＤＳＰＣ／コレステロールベシクルの調合は、単一マイクロ流体ミキサー内で、３：１の緩衝液：脂質−エタノール体積流量比、１２ｍｌ／分の全流量で混合することにより、１３０μｍ×３００μｍミキサー（チャネル断面）を使用して行う。７２ｍｌ／分（６倍の拡張）の処理量を可能とする拡張ミキサーは、６つのオリジナルのミキサーからなり、２つのミキサーの３つの組が垂直にスタックされ、水平に互いに隣接して設置される。マイクロ流体デバイス内での混合後の最終脂質濃度は、３ｍｇ／ｍｌである。エラーバーは、マイクロ流体ミキサーで作製された複数の調合物の標準偏差を表す（１×ミキサーに対してｎ＝３、および６×ミキサーに対してｎ＝２）。
【０１０６】
平行マイクロ流体構造を使用して生成された代表的な限界サイズナノ粒子（ＤＳＰＣ／コレステロールベシクル）の拡張調合の平均ベシクル直径（ｎｍ）を、図１１における単一ミキサーマイクロ流体デバイスを使用して生成されたものと比較する（最終脂質濃度は３ｍｇ／ｍＬであった）。ＤＳＰＣ／コレステロールベシクルの調合は、単一マイクロ流体ミキサー内で、３：１の緩衝液：脂質−エタノール体積流量比、１２ｍｌ／分の全流量で混合することにより、１３０μｍ×３００μｍミキサー（チャネル断面）を使用して行う。７２ｍｌ／分（６倍の拡張）の処理量を可能とする拡張ミキサーは、６つのオリジナルのミキサーからなり、３つのミキサーの２つの組が垂直にスタックされ、水平に互いに隣接して設置される。マイクロ流体デバイス内での混合後の最終脂質濃度は、３ｍｇ／ｍｌである。エラーバーは、マイクロ流体ミキサーで作製された複数の調合物の標準偏差を表す（１×ミキサーに対してｎ＝３、および６×ミキサーに対してｎ＝２）。
【０１０７】
温度制御流体構造。別の態様において、本発明は、限界サイズ脂質ナノ粒子を作製するための温度制御流体構造を提供する。これらの構造において、ストリームが高い表面積（加熱器面積）対体積の比を有するチャンバを通って流動する際に、溶液は急速に加熱され得る。ＣＯＭＳＯＬシミュレーションは、溶液が、１ｍＬ／分の流量で１０ｍｍ×１０ｍｍ×１００μｍチャンバを通って流動することにより加熱され得ることを示した。シミュレーションは、溶液がチャンバの最初の５分の１において加熱し、したがって流量はおそらく５ｍＬ／分に増加され得ることを示した。
【０１０８】
代表的な温度制御流体構造を、図１２〜１４に示す。
【０１０９】
以下の例は、本発明を限定するのではなく例示する目的で提供される。
【０１１０】
［実施例］
例１
代表的なＬＮＰの調製および特性決定
この例では、代表的なＬＮＰの調製および特性決定を説明する。
【０１１１】
脂質および化学薬品。１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）を、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）から入手した。１，２，３−トリ（ｃｉｓ−９−オクタデセノイル）グリセロール（トリオレイン酸グリセリル、ＴＯ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、および塩酸ドキソルビシンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｎａｄａ  Ｌｔｄ．（Ｏａｋｖｉｌｌｅ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）からのものであった。
【０１１２】
マイクロミキサーの設計および製造。マイクロミキサーは、回転および伸長局所流の反復シーケンスを誘導し、したがって注入されたストリームの急速混合を誘導する、チャネルの床上の非対称溝のパターンに基づく配置（スタガ型ヘリンボーン設計）を有する連続流システムのためのカオスミキサーであった。デバイスは、ソフトリソグラフィー、すなわちエラストマー中の微細加工マスターのレプリカ成形により製造した。デバイスは、幅２００μｍおよび高さ７９μｍの混合チャネルを特徴とし、チャネルのルーフ上に高さ３１μｍおよび厚さ５０μｍの特徴によりヘリンボーン構造が形成されている（図１を参照されたい）。流体接続は、シリンジとの接続用の２１Ｇ１針に取り付けられた、内径１／３２”、外径３／３２”の配管で行った。入口ストリームには、概して１ｍｌ、３ｍｌ、および５ｍｌのシリンジを使用した。デュアルシリンジポンプ（ＫＤ２００、ＫＤ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、デバイスを通る流量を制御した。
【０１１３】
ＬＮＰ形成。脂質（リポソーム系の調製のためのＰＯＰＣまたはＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５／４５モル比）、ナノエマルジョンの調製のための異なる比のＰＯＰＣ／ＴＯ）を、１０ｍｇ／ｍｌの全脂質でエタノールに溶解した。ＬＮＰは、エタノール脂質混合物をマイクロミキサーの混合チャネルの第１の入口に、水性水和溶液（生理食塩水、１５４ｍＭ  ＮａＣｌ）を第２の入口に注入することにより調製した（図１を参照されたい）。エタノールチャネルにおいて一定流量を維持し、水チャネルの流量を変動させる（典型的には０．５〜４．５ｍｌ／分）ことにより、適切な流量比（ＦＲＲ、水ストリーム体積流量対エタノール体積流量の比）を設定した。このようにして形成されたＬＮＰの水性分散液は、２つの隣接するストリームの混合から得られる出口ストリームから回収し、１５４ｍＭ生理食塩水に対して透析して、残留エタノールを除去した。
【０１１４】
硫酸アンモニウム勾配を示すＰＯＰＣ  ＬＮＰの形成。上述のように硫酸アンモニウムを含有する限界サイズベシクルＰＯＰＣ  ＬＮＰを形成したが、但し生理食塩水を３００ｍＭ硫酸アンモニウム溶液で置きかえた（ＦＲＲは３、エタノール溶液中１０ｍｇ／ｍｌのＰＯＰＣ）。形成後、ＬＮＰを３００ｍＭ硫酸アンモニウムに対して透析し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心分離フィルタユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して１０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０スピンカラム上でベシクル外溶液（extravesicular solution）を１５４ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４と交換することにより、硫酸アンモニウム勾配を形成した。
【０１１５】
ドキソルビシン投入および分析。塩酸ドキソルビシンを５ｍｇ／ｍｌで生理食塩水に溶解し、硫酸アンモニウム含有ＬＮＰに添加して、０．０５、０．１、および０．２の薬物対脂質の比をもたらした。次いで、試料を６０℃で３０分間インキュベートし、最適投入条件をもたらした。捕捉された薬物の検出の前に、試料をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０スピンカラムに通すことにより、捕捉されなかったドキソルビシンを除去した。
【０１１６】
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ５０蛍光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）を用いて、蛍光強度（励起および発光波長はそれぞれ４８０ｎｍおよび５９０ｎｍ）によりドキソルビシンを分析し、０．５％の最終濃度までの１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の添加により、１００％放出に対する値を得た。リン脂質濃度は、標準分析キット（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）を使用した酵素比色法により決定した。投入効率は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０スピンカラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィーによる、ＬＮＰ封入薬物からの外部薬物の分離前および後に、薬物レベルと脂質レベルの両方を定量し、各薬物／脂質比を比較することにより決定した。
【０１１７】
粒径測定。ＬＮＰを生理食塩水で適切な濃度に希釈し、ＮＩＣＯＭＰモデル３７０サブミクロン粒径分析器（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）を使用して、動的光散乱（ＤＬＳ）により平均粒径（数加重）を決定した。粒径分析器は、リポソーム（ＰＯＰＣおよびＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ系）および脂質コアナノスフェア（ＰＯＰＣ／ＴＯ系）のサイズを決定するために、それぞれベシクルおよび固体粒子モードで操作した。
【０１１８】
核磁気共鳴分光法。１６２ＭＨｚで動作するＢｒｕｋｅｒ  ＡＶＩＩ  ４００分光計を使用して、プロトンデカップリング31Ｐ−ＮＭＲスペクトルを得た。１ｓのパルス間遅延および６４ｋＨｚのスペクトル幅を有する１５μｓ、５５度のパルスで、約１０，０００スキャンに対応する自由誘導減衰（ＦＩＤ）を得た。５０Ｈｚの線幅拡大に対応する指数関数的増加を、フーリエ変換前にＦＩＤに適用した。試料温度は、Ｂｒｕｋｅｒ  ＢＶＴ  ３２００温度ユニットを使用して調整した。測定は２５℃で行った。
【０１１９】
低温透過型電子顕微鏡法（低温ＴＥＭ）。２０〜４０ｍｇ／ｍｌ（全脂質）でＬＮＰを含有するＰＢＳ  ３μＬを、有孔カーボンフィルムを有する標準電子顕微鏡グリッドに滴下することにより、試料を調製した。Ｖｉｔｒｏｂｏｔシステム（ＦＥＩ、Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ、ＯＲ）で吸い取ることにより過剰の液体を除去し、次いで液体エタン中のＬＮＰ懸濁液をプランジ凍結して、アモルファス氷の薄膜内にベシクルを急速凍結させた。ＡＭＴ  ＨＲ  ＣＣＤ側方装着カメラを用いて、極低温条件下、２９Ｋの倍率で画像を撮像した。画像コントラストを強調するために、５〜８μｍのアンダーフォーカスでの低線量条件下で、Ｇａｔａｎ  ７０度低温移送ホルダを用いて、試料をＦＥＩ  Ｇ２０  Ｌａｂ６  ２００ｋＶ  ＴＥＭ内に投入した。
【０１２０】
本発明の好ましい態様を例示し説明したが、本発明の精神および範囲から逸脱せずに、様々な変更を行うことができることが理解される。
【０１２１】
独占的な所有権または特権が請求される本発明の態様は、以下に定義される。
【図１】
2020121986.tif 000005
【図２Ａ】
2020121986.tif 000006
【図２Ｂ】
2020121986.tif 000007
【図３Ａ】
2020121986.tif 000008
【図３Ｂ】
2020121986.tif 000009
【図３Ｃ】
2020121986.tif 000010
【図４Ａ】
2020121986.tif 000011
【図４Ｂ】
2020121986.tif 000012
【図４Ｃ】
2020121986.tif 000013
【図５】
2020121986.tif 000014
【図６Ａ】
2020121986.tif 000015
【図６Ｂ】
2020121986.tif 000016
【図７Ａ】
2020121986.tif 000017
【図７Ｂ】
2020121986.tif 000018
【図７Ｃ】
2020121986.tif 000019
【図８】
2020121986.tif 000020
【図９】
2020121986.tif 000021
【図１０】
2020121986.tif 000022
【図１１】
2020121986.tif 000023
【図１２】
2020121986.tif 000024
【図１３】
2020121986.tif 000025
【図１４】
2020121986.tif 000026
【図１５】
2020121986.tif 000027
【図１６】
2020121986.tif 000028
【図１７】
2020121986.tif 000029
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月27日(2020.4.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デバイスであって、
第１の溶液を受容し、第１の溶液を含む第１のストリームを提供するように作られた第１の入口マイクロチャネル；
第２の溶液を受容し、第２の溶液を含む第２のストリームを提供するように作られた第２の入口マイクロチャネル；および、
前記第１のストリームおよび前記第２のストリームを受容するために作られた第３のマイクロチャネルであって、前記第３のマイクロチャネルは、前記第１のストリームおよび第２のストリームを流動させるように構成された第１の領域と、前記第１のストリームおよび前記第２のストリームを混合するように構成された第２の領域とを有して前記第１の溶液および前記第２の溶液の混合液を含む第３のストリ−ムを提供し、前記第３のマイクロチャネルの前記第２の領域は、２０μｍから３００μｍの水力直径と２００μｍから３００μｍの幅を有する第３のマイクロチャネル；
を含むデバイス。
【請求項２】
前記第３のマイクロチャネルの前記第２の領域は７９μｍから１３０μｍの高さを有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記第３のマイクロチャネルがマイクロミキサーを含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
前記第３のマイクロチャネルの前記第２の領域はカオス的移流マイクロミキサーを含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項５】
前記第３のマイクロチャネルの前記第２の領域が、浅浮き彫り構造を含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項６】
前記浅浮き彫り構造が、複数のヘリンボーン浅浮き彫り構造を含む、請求項５に記載のデバイス。
【請求項７】
前記第３のマイクロチャネルの前記第２の領域が、主要流動方向と、少なくとも１つの溝または突起が画定された１つ以上の表面とを有し、少なくとも１つの前記溝または突起が、前記主要方向と角度を形成する方位を有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項８】
前記第３のマイクロチャネルの前記第２の領域が、１ｍＬ／分〜４０ｍＬ／分の流体流量を支持するように構成された、請求項１に記載のデバイス。
【請求項９】
前記第１の入口マイクロチャネルと前記第２の入口マイクロチャネルが、それぞれ、２０μｍから３００μｍの水力直径を有する部分を少なくとも含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１０】
更に一つ以上の加熱器を含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１１】
システムであって、
第１の溶液を受容し、第１の溶液を含む第１のストリームを提供するように作られた第１の入口マイクロチャネル；
第２の溶液を受容し、第２の溶液を含む第２のストリームを提供するように作られた第２の入口マイクロチャネル；
前記第１のストリームおよび第２のストリームを受容するために作られた第３のマイクロチャネルであって、前記第３のマイクロチャネルは、前記第１のストリームおよび前記第２のストリームを流動させるように構成された第１の領域と、前記第１のストリームおよび前記第２のストリームを混合するように構成された第２の領域とを有して前記第１の溶液および前記第２の溶液の混合液を含む第３のストリ−ムを提供し、前記第３のマイクロチャネルの前記第２の領域は、２０μｍから３００μｍの水力直径と２００μｍから３００μｍの幅を有する、第３のマイクロチャネル；
第１の流量で前記第１の入口マイクロチャネルに第１の溶液を提供するように作られた第１のポンプ；および、
第２の流量で前記第２の入口マイクロチャネルに第２の溶液を提供するように作られた第２のポンプ；
を含み、
前記第１の流量対前記第２の流量の比が２．０〜１０．０である、システム。
【請求項１２】
前記第１の流量と前記第２の流量が、前記第３のマイクロチャネルの前記第２の領域内に、１ｍＬ／分〜４０ｍＬ／分の流量を提供するように作られた、
請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記第１の流量と前記第２の流量が、前記第３のマイクロチャネルの前記第２の領域内に、１０ｍＬ／分〜４０ｍＬ／分の流量を提供するように作られた、
請求項１１に記載のシステム。
【請求項１４】
前記第１の流量対前記第２の流量の比が３．０〜１０．０である、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１５】
前記第３のマイクロチャネルの前記第２の領域は７９μｍから１３０μｍの高さを有する、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１６】
前記第３のマイクロチャネルがマイクロミキサーを含む、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１７】
前記第３のマイクロチャネルの前記第２の領域はカオス的移流マイクロミキサーを含む、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１８】
前記第３のマイクロチャネルの前記第２の領域が、浅浮き彫り構造を含む、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１９】
浅浮き彫り構造が、複数のヘリンボーン浅浮き彫り構造を含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
前記第３のマイクロチャネルの前記第２の領域が、主要流動方向と、少なくとも１つの溝または突起が画定された１つ以上の表面とを有し、少なくとも１つの前記溝または突起が、前記主要方向と角度を形成する方位を有する、請求項１１に記載のシステム。
【請求項２１】
前記第３のマイクロチャネルの前記第２の領域が、１ｍＬ／分〜４０ｍＬ／分の流体流量を支持するように構成された、請求項１１に記載のシステム。
【請求項２２】
前記第１の入口マイクロチャネルと前記第２の入口マイクロチャネルが、それぞれ、２０μｍから３００μｍの水力直径を有する部分を少なくとも含む、請求項１１に記載のシステム。
【請求項２３】
更に一つ以上の加熱器を含む、請求項１１に記載のシステム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２１】
独占的な所有権または特権が請求される本発明の態様は、以下に定義される。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載の事項を、そのまま、付記しておく。
［１］
約１０ｎｍから約１００ｎｍの直径を有する、限界サイズ脂質ナノ粒子。
［２］
水性コアを包囲する脂質二重層を含む、［１］に記載のナノ粒子。
［３］
前記脂質二重層が、リン脂質を含む、［２］に記載のナノ粒子。
［４］
前記リン脂質が、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、およびセレブロシドからなる群から選択される、［３］に記載のナノ粒子。
［５］
前記リン脂質が、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸ジアシルホスファチジルコリンである、［３］に記載のナノ粒子。
［６］
前記リン脂質が、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）である、［３］に記載のナノ粒子。
［７］
約５０モルパーセントから約９９モルパーセントのリン脂質を含む、［３］に記載のナノ粒子。
［８］
ステロールをさらに含む、［２］〜［７］のいずれか一に記載のナノ粒子。
［９］
前記ステロールが、コレステロールである、［８］に記載のナノ粒子。
［１０］
約１０モルパーセントから約３５モルパーセントのコレステロールを含む、［８］に記載のナノ粒子。
［１１］
ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、およびＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールからなる群から選択されるポリエチレングリコール−脂質をさらに含む、［２］〜［１０］のいずれか一に記載のナノ粒子。
［１２］
前記ポリエチレングリコール−脂質が、ＤＬＰＥ−ＰＥＧ、ＤＭＰＥ−ＰＥＧ、ＤＰＰＣ−ＰＥＧ、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧからなる群から選択される、［１１］に記載のナノ粒子。
［１３］
前記ポリエチレングリコール−脂質が、ＤＳＰＥ−ＰＥＧである、［１１］に記載のナノ粒子。
［１４］
約１モルパーセントから約１０モルパーセントのポリエチレングリコール−脂質を含む、［１１］に記載のナノ粒子。
［１５］
疎水性コアを包囲する脂質単分子層を含む、［１］に記載のナノ粒子。
［１６］
前記脂質単分子層が、リン脂質を含む、［１５］に記載のナノ粒子。
［１７］
前記リン脂質が、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、およびセレブロシドからなる群から選択される、［１６］に記載のナノ粒子。
［１８］
前記リン脂質が、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸ジアシルホスファチジルコリンである、［１６］に記載のナノ粒子。
［１９］
前記Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸ジアシルホスファチジルコリンが、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）である、［１６］に記載のナノ粒子。
［２０］
約１０モルパーセントから約７０モルパーセントのリン脂質を含む、［１６］に記載のナノ粒子。
［２１］
前記疎水性コアが、脂肪酸トリグリセリドを含む、［１５］〜［２０］のいずれか一に記載のナノ粒子。
［２２］
前記脂肪酸トリグリセリドが、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸トリグリセリドである、［２１］に記載のナノ粒子。
［２３］
前記脂肪酸トリグリセリドが、オレイン酸トリグリセリド（トリグリセリドトリオレイン）である、［２１］に記載のナノ粒子。
［２４］
約３０モルパーセントから約９０モルパーセントの脂肪酸トリグリセリドを含む、［２１］に記載のナノ粒子。
［２５］
診断薬をさらに含む、［１］〜［２４］のいずれか一に記載のナノ粒子。
［２６］
治療薬をさらに含む、［１］〜［２４］のいずれか一に記載のナノ粒子。
［２７］
治療薬剤および診断薬剤をさらに含む、［１］〜［２４］のいずれか一に記載のナノ粒子。
［２８］
前記治療薬が、化学治療薬（すなわち抗腫瘍薬）、麻酔薬、ベータアドレナリン遮断薬、抗高血圧薬、抗鬱薬、抗痙攣薬、制吐薬、抗ヒスタミン薬、抗不整脈薬、および抗マラリア薬からなる群から選択される、［２５］〜［２７］のいずれか一に記載のナノ粒子。［２９］
前記治療薬が、抗腫瘍薬である、［２５］〜［２７］のいずれか一に記載のナノ粒子。［３０］
前記抗腫瘍薬が、ドキソルビシンである、［２９］に記載のナノ粒子。
［３１］
水性コアを包囲する脂質二重層を含むナノ粒子であって、前記二重層は、
（ａ）リン脂質と、
（ｂ）ステロールと、
（ｃ）ポリエチレングリコール−脂質とを含み、
前記コアは、治療または診断薬を含む、ナノ粒子。
［３２］
限界サイズナノ粒子である、［３１］に記載のナノ粒子。
［３３］
約１０ｎｍから約５０ｎｍの直径を有する、［３１］に記載のナノ粒子。
［３４］
疎水性コアを包囲する脂質単分子層を含むナノ粒子であって、前記単分子層は、リン脂質を含み、前記コアは、脂肪酸トリグリセリド、および／または治療もしくは診断薬を含む、ナノ粒子。
［３５］
限界サイズナノ粒子である、［３４］に記載のナノ粒子。
［３６］
約１０ｎｍから約８０ｎｍの直径を有する、［３４］に記載のナノ粒子。
［３７］
治療薬を対象に投与するための方法であって、［２６］〜［３６］のいずれか一に記載のナノ粒子を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
［３８］
診断薬を対象に投与するための方法であって、［２５］、［２７］、または［３１］〜［３６］のいずれか一に記載のナノ粒子を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
［３９］
治療薬を投与することにより治療可能な疾患または状態を治療するための方法であって、治療有効量の［２６］〜［３６］のいずれか一に記載のナノ粒子を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
［４０］
診断薬を投与することにより診断可能な疾患または状態を診断するための方法であって、［２５］、［２７］、または［３１］〜［３６］のいずれか一に記載のナノ粒子を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
［４１］
第１および第２の隣接するストリームの流動のために構成された第１の領域と、前記ストリームを混合するための第２の領域とを有するデバイスにおいて、限界サイズ脂質ナノ粒子を作製するための方法であって、
（ａ）第１の溶媒を含む第１のストリームを、第１の流量で前記デバイスに導入することと、
（ｂ）第２の溶媒中の脂質粒子形成材料を含む第２のストリームを、第２の流量で前記デバイスに導入し、第１および第２の隣接するストリームを提供することであって、前記第１および第２の溶媒は、同じではなく、前記第１の流量対前記第２の流量の比は、約２．０から約１０．０である、ことと、
（ｃ）前記第１および第２のストリームを、前記第１の領域から前記第２の領域に流動させることと、
（ｄ）前記第１および第２のストリームを、前記デバイスの前記第２の領域内で混合し、脂質ナノ粒子を含む第３のストリームを提供することとを含む方法。
［４２］
前記デバイスが、マイクロ流体デバイスである、［４１］に記載の方法。
［４３］
前記第１および第２のストリームを混合することが、カオス的移流を含む、［４１］に記載の方法。
［４４］
前記第１および第２のストリームを混合することが、マイクロミキサーによる混合を含む、［４１］に記載の方法。
［４５］
前記第１および第２のストリームを混合することが、前記第１の領域内でバリアにより防止される、［４１］に記載の方法。
［４６］
前記バリアが、チャネル壁、シース液、または同心管である、［４５］に記載の方法。［４７］
前記第３のストリームを水性緩衝液で希釈することをさらに含む、［４１］に記載の方法。
［４８］
前記第３のストリームを希釈することは、前記第３のストリームおよび水性緩衝液を、第２の混合構造内に流動させることを含む、［４７］に記載の方法。
［４９］
限界サイズ脂質ナノ粒子を含む前記水性緩衝液を透析して、前記第２の溶媒の量を低減することをさらに含む、［４７］に記載の方法。
［５０］
前記第１の溶媒が、水性緩衝液である、［４１］に記載の方法。
［５１］
前記第１のストリームが、診断薬を含む、［４１］に記載の方法。
［５２］
前記第１のストリームが、治療薬を含む、［４１］に記載の方法。
［５３］
前記第１のストリームが、治療薬および診断薬を含む、［４１］に記載の方法。
［５４］
前記治療薬が、化学治療薬、麻酔薬、ベータアドレナリン遮断薬、抗高血圧薬、抗鬱薬、抗痙攣薬、制吐薬、抗ヒスタミン薬、抗不整脈薬、および抗マラリア薬からなる群から選択される、［５２］または［５３］に記載の方法。
［５５］
前記治療薬が、抗腫瘍薬である、［５４］に記載の方法。
［５６］
前記抗腫瘍薬が、ドキソルビシンである、［５５］に記載の方法。
［５７］
前記第２の溶媒が、水混和性溶媒である、［４１］に記載の方法。
［５８］
前記水混和性溶媒が、水性アルコールである、［５７］に記載の方法。
［５９］
前記水性アルコールが、エタノールである、［５８］に記載の方法。
［６０］
前記第２のストリームが、リン脂質を含む、［４１］に記載の方法。
［６１］
前記リン脂質が、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、およびセレブロシドからなる群から選択される、［６０］に記載の方法。
［６２］
前記リン脂質が、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸ジアシルホスファチジルコリンである、［６０］に記載の方法。
［６３］
前記Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸ジアシルホスファチジルコリンが、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）である、［６２］に記載の方法。
［６４］
前記第２のストリームが、約１０モルパーセントから約９９モルパーセントのリン脂質を含む、［６０］に記載の方法。
［６５］
前記第２のストリームが、ステロールをさらに含む、［４１］〜［６４］のいずれか一に記載の方法。
［６６］
前記ステロールが、コレステロールである、［６５］に記載の方法。
［６７］
前記第２のストリームが、約１０モルパーセントから約３５モルパーセントのコレステロールを含む、［６６］に記載の方法。
［６８］
前記第２のストリームが、ポリエチレングリコール−脂質をさらに含む、［４１］〜［６７］のいずれか一に記載の方法。
［６９］
前記ポリエチレングリコール−脂質が、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、およびＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールからなる群から選択される、［６８］に記載の方法。
［７０］
前記ポリエチレングリコール−脂質が、ＤＬＰＥ−ＰＥＧ、ＤＭＰＥ−ＰＥＧ、ＤＰＰＣ−ＰＥＧ、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧからなる群から選択される、［６８］に記載の方法。
［７１］
前記ポリエチレングリコール−脂質が、ＤＳＰＥ−ＰＥＧである、［７０］に記載の方法。
［７２］
約１モルパーセントから約１０モルパーセントのポリエチレングリコール−脂質を含む、［６８］に記載の方法。
［７３］
前記第２のストリームが、脂肪酸トリグリセリドをさらに含む、［６０］に記載の方法。
［７４］
前記脂肪酸トリグリセリドが、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸トリグリセリドである、［７３］に記載の方法。
［７５］
前記脂肪酸トリグリセリドが、オレイン酸トリグリセリド（トリグリセリドトリオレイン）である、［７３］に記載の方法。
［７６］
約３０モルパーセントから約９０モルパーセントの脂肪酸トリグリセリドを含む、［７３］に記載の方法。
［７７］
［４１］〜［７６］のいずれか一に記載の方法により得ることができるナノ粒子。
［７８］
限界サイズ脂質ナノ粒子を生成するためのデバイスであって、
（ａ）第１の溶媒を含む第１の溶液を受容するための第１の入口と、
（ｂ）前記第１の入口と流体連通して、前記第１の溶媒を含む第１のストリームを提供する、第１の入口マイクロチャネルと、
（ｃ）第２の溶媒中の脂質粒子形成材料を含む第２の溶液を受容するための第２の入口と、
（ｄ）前記第２の入口と流体連通して、前記第２の溶媒中の前記脂質粒子形成材料を含む第２のストリームを提供する、第２の入口マイクロチャネルと、
（ｅ）前記第１および第２のストリームを受容するための第３のマイクロチャネルであって、前記第１および第２のストリームを流動させるように構成された第１の領域と、前記第１および第２のストリームの内容物を混合して、限界サイズ脂質ナノ粒子を含む第３のストリームを提供するように構成された第２の領域とを有する、第３のマイクロチャネルとを含むデバイス。
［７９］
前記マイクロチャネルの前記第２の領域が、浅浮き彫り構造を含む、［７８］に記載のデバイス。
［８０］
前記マイクロチャネルの前記第２の領域が、主要流動方向と、少なくとも１つの溝または突起が画定された１つ以上の表面とを有し、前記溝または突起が、前記主要方向と角度を形成する方位を有する、［７８］に記載のデバイス。
［８１］
前記第２の領域が、マイクロミキサーを含む、［７８］に記載のデバイス。
［８２］
前記第１および第２のストリームの流量を変動させるための手段をさらに含む、［７８］に記載のデバイス。
［８３］
各マイクロチャネルが、約２０μｍから約３００μｍの水力直径を有する、［７８］に記載のデバイス。
［８４］
１０ｍｓ未満で完全混合が生じる、［７８］に記載のデバイス。
［８５］
加熱領域をさらに含む、［７８］に記載のデバイス。
［８６］
脂質ナノ粒子を生成するためのデバイスであって、
（ａ）第１の溶媒を含む第１の溶液を受容するための第１の入口と、
（ｂ）前記第１の入口と流体連通して、前記第１の溶媒を含む第１のストリームを提供する、第１の入口マイクロチャネルと、
（ｃ）第２の溶媒中の脂質粒子形成材料を含む第２の溶液を受容するための第２の入口と、
（ｄ）前記第２の入口と流体連通して、前記第２の溶媒中の前記脂質粒子形成材料を含む第２のストリームを提供する、第２の入口マイクロチャネルと、
（ｅ）前記第１および第２のストリームを受容するための複数のマイクロチャネルであって、それぞれ、前記第１および第２のストリームを流動させるように構成された第１の領域と、前記第１および第２のストリームの内容物を混合して、脂質ナノ粒子に影響する複数のストリームを提供するように構成された第２の領域とを有する、複数のマイクロチャネルと、
（ｆ）脂質ナノ粒子を含む前記複数のストリームを受容し、組み合わせるための第４のマイクロチャネルとを含むデバイス。
［８７］
前記第１および第２のストリームを受容するための前記複数のマイクロチャネルのそれぞれが、
（ａ）前記第１の入口マイクロチャネルと流体連通して、前記第１の溶媒を含む前記第１のストリームを受容する、第１のマイクロチャネルと、
（ｂ）前記第２の入口マイクロチャネルと流体連通して、前記第２の溶媒を含む前記第２の入口ストリームを受容する、第２のマイクロチャネルと、
（ｃ）前記第１および第２のストリームを受容するための第３のマイクロチャネルであって、それぞれ、前記第１および第２のストリームを流動させるように構成された第１の領域と、前記第１および第２のストリームの内容物を混合して、脂質ナノ粒子に影響する複数のストリームを提供するように構成された第２の領域とを有する、第３のマイクロチャネルとを含む、［８６］に記載のデバイス。
［８８］
前記第１および第２のストリームを受容するための２個から約４０個のマイクロチャネルを含み、２乃至１６００ｍＬ／分の全流量を有する、［８６］または［８７］に記載のデバイス。
［８９］
前記第２の領域が、それぞれ約２０μｍから約３００μｍの水力直径を有する、［８６］または［８７］に記載のデバイス。
［９０］
前記第２の領域が、それぞれ約１乃至４０ｍｌ／分の流体流量を有する、［８６］または［８７］に記載のデバイス。
［９１］
前記第１および第２のマイクロチャネル内の前記第１および第２のストリームの温度を、それらが前記第３のマイクロチャネルに進入する前に所定の温度に上昇させるために効果的な加熱要素をさらに含む、［８６］または［８７］に記載のデバイス。
【外国語明細書】
2020121986000001.pdf