(57)【要約】      （修正有）【課題】排尿傷害を予防又は改善させる医薬組成物の提供。【解決手段】下記化学式(I)で示される化合物を含有する、医薬組成物が提供される。2020015756.tif 000028(式(I)中、R1は、水素又は水酸基であり、R2、R3、R4、R5及びR6は、それぞれ独立して、水素又は-OCH3であり、R7、R8、R9及びR10は、それぞれ独立して、水素又は-OCH3である)【選択図】図１
2020015756.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式(I)で示される化合物を含有する、排尿傷害を予防又は改善させる医薬組成物。
【化１５】
2020015756.tif 000021
(式(I)中、
R1は、水素又は水酸基であり、
R2、R3、R4、R5及びR6は、それぞれ独立して、水素又は-OCH3であり、
R7、R8、R9及びR10は、それぞれ独立して、水素又は-OCH3である)
【請求項２】
前記化学式(I)に示される化合物は、下記化学式(II)から(V)の群より少なくとも1つ選択される化合物である、請求項1に記載の医薬組成物。
【化１６】
2020015756.tif 000022
【化１７】
2020015756.tif 000023
【化１８】
2020015756.tif 000024
及び
【化１９】
2020015756.tif 000025
【請求項３】
前記排尿障害は、過活動膀胱及び/又は前立腺肥大症である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記排尿障害は、頻尿、夜間頻尿、尿失禁、残尿感及び尿勢減弱からなる群より選択される1又は複数の症状を伴う、請求項１から３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
下記化学式(I)で示される化合物を含有する、受容体拮抗剤であって、
前記化合物は、排尿障害関連受容体に対する拮抗作用を示す、受容体拮抗剤。
【化２０】
2020015756.tif 000026
(式(I)中、
R1は、水素又は水酸基であり、
R2、R3、R4、R5及びR6は、それぞれ独立して、水素又は-OCH3であり、
R7、R8、R9及びR10は、それぞれ独立して、水素又は-OCH3である)
【請求項６】
前記排尿障害関連受容体は、ムスカリン受容体、カルシウム受容体及びプリン受容体からなる群より少なくとも１つ選択される、請求項５に記載の受容体拮抗剤。
【請求項７】
排尿障害を予防又は改善するために使用される、請求項５又は６に記載の受容体拮抗剤。
【請求項８】
前記排尿障害は、過活動膀胱及び/又は前立腺肥大症である、請求項５から７のいずれかに記載の受容体拮抗剤。
【請求項９】
前記排尿障害は、頻尿、夜間頻尿、尿失禁、残尿感及び尿勢減弱からなる群より選択される1又は複数の症状を伴う、請求項５から８のいずれかに記載のムスカリン受容体拮抗剤。
【請求項１０】
前記化学式(I)を含有する柑橘類抽出物を含有する、請求項５から９のいずれかに記載の受容体拮抗剤。
【請求項１１】
請求項５から１０のいずれかに記載の受容体拮抗剤を含む、排尿障害治療薬。
【請求項１２】
請求項１又は２に記載の化合物を含有する、排尿障害を予防又は改善するための機能性食品。
【請求項１３】
排尿障害を予防又は改善させるための方法であって、前記方法は、
前記排尿障害を患っている対象者に、下記化学式(I)で示される化合物を含有する医薬組成物又は受容体拮抗剤を投与するステップを含み、
前記化合物は、排尿障害関連受容体に対する拮抗作用を示す、方法。
【化２１】
2020015756.tif 000027
(式(I)中、
R1は、水素又は水酸基であり、
R2、R3、R4、R5及びR6は、それぞれ独立して、水素又は-OCH3であり、
R7、R8、R9及びR10は、それぞれ独立して、水素又は-OCH3である)
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、排尿障害を予防又は改善させる医薬組成物、排尿障害関連受容体に関する拮抗剤又はその医薬組成物又は拮抗剤を用いた排尿障害を予防又は改善させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
健常人の膀胱は、最大で300〜500mlの尿を溜めることができる。成人では、膀胱内に約200mlの尿が溜まると、尿意に関するシグナルが脳に送られ、初発尿意を感じる。かかるシグナルを脳が受け取ると副交換神経が興奮し、その結果、膀胱のムスカリン受容体が刺激され平滑筋(排尿筋)が収縮する。一方、蓄尿段階では、交感神経が優位になり、排尿筋は弛緩した状態にある。
【０００３】
健常人は、尿意を感じると適切に排尿を行なうことができるが、様々な原因によって、頻尿や尿失禁などの排尿障害が生じると、生活の質(QOL)が著しく低下する。このような排尿障害を放置している人が多いのが現状である。その理由は、病院に行くのが恥ずかしいということ以外に、排尿障害であることを認識できていないことが挙げられる。
【０００４】
2002年に開催された国際禁制学会(International Continence Society)において、「尿意切迫感」を主な症状として、「頻尿」や「夜間頻尿」を伴う症状を「過活動膀胱」(Overactive Bladder: OAB)という疾患として提唱された。この提唱に基づいて、排尿障害に対する診断、治療及び予防の取り組みが盛んになってきた。
【０００５】
OABは、蓄尿段階の膀胱が過剰に反応する結果、突然の強い尿意を感じる疾患であり、加齢とともに有病率が増加することが報告されている。OABの患者では、交感神経と副交感神経との調和が崩れ、蓄尿時にも関わらず排尿筋が不随意に収縮することから尿意切迫感や頻尿が起こる。男性において、OABは、前立腺肥大症を伴うことが報告されている。前立腺は、膀胱の直ぐ下で尿道を取り囲むように存在する。前立腺が加齢に伴って肥大化すると、膀胱出口の尿道が圧迫され、「尿勢減弱」や「残尿感」を引き起こす。女性のOAB患者は、加齢や出産などによって骨盤底筋が緩むことが原因で「腹圧性尿失禁」(くしゃみや咳、運動など一過的に腹部に力が加わる動作の際の尿漏れ)を高頻度で併発することが報告されている。これは、女性の尿道が男性の尿道よりも短いためである。排尿障害は、膀胱から尿道までを含めた範囲において、様々な要因で発症する加齢性疾患であるといえる。従って、排尿障害を予防することは、快適な高齢者生活を送る上で極めて重要である。
【０００６】
OABの治療には、抗コリン薬が有効であることが報告されている（例えば、非特許文献1）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】"A comparison of the efficacy and tolerability of solifenacin succinate and extended release tolterodine at treating overactive bladder syndrome: results of the STAR trial." Chapple et al., Eur Urol. 2005 Sep;48(3):464-70.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、市販の抗コリン薬の長期服用は、副作用の虞があった。
【０００９】
本発明は以上の事情に鑑みてなされたものであり、天然に存在する化合物に基づく薬剤又はその薬剤を用いた排尿障害の予防及び/若しくは改善方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者らは、安全性が高い食品素材を用いた排尿障害の予防及び/又は改善に関する研究を行う中で、ノビレチン、タンゲレチン、3', 4', 5, 7-テトラメチルケルセチン及びシネンセチンが排尿障害関連受容体に対する拮抗作用を有し、排尿障害を改善することを発見し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
本発明によれば、
下記化学式(I)で示される化合物を含有する、排尿障害を予防又は改善させる医薬組成物が提供される。
【化１】
2020015756.tif 000003
(式(I)中、
R1は、水素又は水酸基であり、
R2、R3、R4、R5及びR6は、それぞれ独立して、水素又は-OCH3であり、
R7、R8、R9及びR10は、それぞれ独立して、水素又は-OCH3である)
【００１２】
本願発明によれば、
下記化学式(I)で示される化合物を含有する、受容体拮抗剤であって、上記化合物は、排尿障害関連受容体に対する拮抗作用を示す、受容体拮抗剤が提供される。
【化２】
2020015756.tif 000004
(式(I)中、
R1は、水素又は水酸基であり、
R2、R3、R4、R5及びR6は、それぞれ独立して、水素又は-OCH3であり、
R7、R8、R9及びR10は、それぞれ独立して、水素又は-OCH3である)
後述する実施例において実証されている通り、上記化学式(I)で示される化合物は、ムスカリン受容体の選択的標識リガンドである[3H]pirenzepineの、ムスカリン受容体に対する特異的結合を阻害した。従って、この拮抗剤を用いることで、排尿障害関連受容体に対するリガンドの特異的結合を阻害することができる。
【００１３】
本発明によれば、
上記化合物を含む受容体拮抗剤を含む、排尿障害治療薬が提供される。後述する実施例において実証されている通り、上記化学式(I)で示される化合物を含む拮抗剤を含む治療薬を用いることで、排尿障害を治療することができる。従って、この治療薬を、排尿障害を患っている患者に施すことによって、排尿障害を治療することが可能になる。
【００１４】
本願発明によれば、
排尿障害を予防又は改善させるための方法であって、上記方法は、
上記排尿障害を患っている対象者に、下記化学式(I)で示される化合物を含有する医薬組成物又は受容体拮抗剤を投与するステップを含み、上記化合物は、排尿障害関連受容体に対する拮抗作用を示す、方法が提供される。
【化３】
2020015756.tif 000005
(式(I)中、
R1は、水素又は水酸基であり、
R2、R3、R4、R5及びR6は、それぞれ独立して、水素又は-OCH3であり、
R7、R8、R9及びR10は、それぞれ独立して、水素又は-OCH3である)
後述する実施例において実証されている通り、上記化学式(I)で示される化合物を含む医薬組成物又は受容体拮抗剤を投与することによって、排尿障害が改善した。従って、この方法を、排尿障害を患っている患者に施すことによって、排尿障害を予防又は改善させることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ラット脳粗細胞膜における[3H]pirenzepineの特異的結合に対するシークワーサー抽出物(ノビレチン-タンゲレチン混合物)の拮抗作用を示すグラフである。
【図２ａ】図２aは、ラット脳粗細胞膜における[3H]pirenzepineの特異的結合に対するノビレチン及びタンゲレチンの拮抗作用を示すグラフである。
【図２ｂ】図２bは、ノビレチン(Nobiletin)、タンゲレチン(Tangeretin)、3’, 4’, 5, 7-テトラメチルケルセチン(Tetramethylquercetin)及びシネンセチン(Sinensetin)の化学式を示している。
【図２ｃ】図２cは、シークワーサーより単離したノビレチン、タンゲレチン、3’, 4’, 5, 7-テトラメチルケルセチン及びシネンセチンに関する、ムスカリンM1特異的受容体結合活性（[3H]-Pirenzepinの結合に対する抑制作用）を示している。
【図２ｄ】図２dは、シークワーサーより単離したノビレチン、タンゲレチン、3’, 4’, 5, 7-テトラメチルケルセチン及びシネンセチンに関する、非特異的ムスカリン受容体結合活性（[3H]-N-methyl scopolamine (NMS)の結合に対する作用）を示している。
【図３】図３は、ムスカリン受容体に対する各種抽出物及び化合物 (抽出物：10μg/mL、化合物：10μM)の拮抗作用を示すグラフである。
【図４】図４は、酢酸誘発頻尿モデルラットにおける、シークワーサー抽出物の排尿障害改善作用を示すグラフである。図4aはモデルラットにおける最大膀胱内圧を、図4bは基礎圧を、図4cは閾値圧を、図4dは排尿間隔を、図4eは排尿回数を、図4fは1回の排尿量を示している。
【図５】図５は、骨盤うっ血頻尿ラットの膀胱内圧測定に及ぼすノビレチン静脈内投与の効果を示している。
【図６】図６は、骨盤うっ血頻尿ラットの膀胱収縮間隔に及ぼすノビレチン静脈内投与の効果を示している。左側のバーは、シャム群（偽手術群）であり、右側のバーは、骨盤うっ血群である。
【図７】図７は、骨盤うっ血頻尿ラットの膀胱内圧測定に及ぼすノビレチン経口投与の効果を示している。
【図８】図８は、骨盤うっ血頻尿ラットの膀胱収縮間隔に及ぼすノビレチン経口投与の効果を示している。
【図９】図９は、脳梗塞頻尿ラットの膀胱収縮間隔に及ぼすノビレチン静脈内投与の結果を示している。左側のバーは、シャム群であり、右側のバーは、脳梗塞群である。
【図１０】図１０は、膀胱内圧および排尿量を経時的に測定するためのシステムを模式的に示している。
【図１１】図１１は、シークワーサー抽出物(50 mg/kg)を経口投与させたシクロフォスファミド(CYP)誘導膀胱炎モデルラットにおける排尿量、排尿回数及び最大膀胱内圧を示している。
【図１２】図１２は、カルシウム拮抗薬受容体に対するシークワーサー抽出物の作用を示している。
【図１３】図１３は、経壁電気刺激（1 Hz）実験のプロトコルを示している。
【図１４】図１４は、ノビレチンもしくはタンゲレチン存在下での経壁電気刺激（1 Hz）によるラット摘出膀胱の収縮反応に対するアトロピンとα,βメチレンATPの影響を示している。グラフにおいて、左側のバーは、コントロール又はサンプル(ノビレチン又はタンゲレチン)であり、中央のバーは、アトロピンであり、右側のバーは、α,βメチレンATPである。
【図１５】図１５は、コリン作動性及びプリン作動性収縮成分に対するノビレチンとタンゲレチンの作用を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
定義
ムスカリン受容体
アセチルコリン受容体の一種であるムスカリン受容体は、ムスカリンによってもアセチルコリンと同様の働きを示す受容体であり、副交感神経抹消において臓器側細胞の受容体として存在する。ムスカリン受容体は、副交感神経が刺激され、その末梢からアセチルコリンが放出されると、ムスカリン受容体が刺激され、支配下にある臓器の細胞を興奮させたり、抑制させたりするが、臓器の細胞が興奮するか抑制されるかは、その臓器に依存する(即ち、臓器によって異なる)。
【００１７】
拮抗
用語「拮抗剤」とは、例えば、受容体に対するリガンドの特異的結合を競合的に阻害する作用(即ち、拮抗作用)を有する物質を含む薬剤を指す。拮抗作用を有する物質は、アンタゴニストとも呼ばれる。拮抗作用には、アンタゴニストが受容体に結合して受容体に結合できなくなることで拮抗作用が生じるケースとアンタゴニストがリガンドに作用(例えば、結合)してリガンドが受容体に結合できなくなることで拮抗作用が生じるケースが含まれる。
【００１８】
概要
以下、本発明の実施の形態について、詳しく説明する。なお、同様な内容については繰り返しの煩雑をさけるために、摘示説明を省略する。
【００１９】
＜実施形態１：医薬組成物＞
本発明によれば、下記化学式(I)で示される化合物を含有する、排尿障害を予防又は改善させる医薬組成物が提供される。
【化４】
2020015756.tif 000006
(式(I)中、
R1は、水素又は水酸基であり、
R2、R3、R4、R5及びR6は、それぞれ独立して、水素又は-OCH3であり、
R7、R8、R9及びR10は、それぞれ独立して、水素又は-OCH3である)
この医薬組成物を用いることで、排尿障害を予防又は改善させることができる。
【００２０】
本願明細書においては、上記化学式(I)のR2からR10のうちの少なくとも1、2、3、4、5、6、7若しくは8つ又は全てが-OCH3であってもよい。本願明細書においては、上記化学式(I)のR2からR6のうちの少なくとも1、2、3若しくは4つ又は全てが-OCH3であってもよい。本願明細書においては、上記化学式(I)のR7からR10のうちの少なくとも1、2若しくは3つ又は全てが-OCH3であってもよい。本願明細書においては、-OCH3と-OMeは、互いに置換可能である。
【００２１】
本発明によれば、上記化学式(I)に示される化合物は、下記化学式(II)から(V)の群より少なくとも1つ選択される化合物である、排尿障害を予防又は改善させる医薬組成物が提供される。
【化５】
2020015756.tif 000007
【化６】
2020015756.tif 000008
【化７】
2020015756.tif 000009
及び
【化８】
2020015756.tif 000010
この医薬組成物を用いることで、排尿障害を予防又は改善させることができる。
【００２２】
＜実施形態２：排尿障害関連受容体拮抗剤＞
本願発明によれば、下記化学式(I)で示される化合物を含有する、受容体拮抗剤であって、上記化合物は、排尿障害関連受容体に対する拮抗作用を示す、受容体拮抗剤が提供される。
【化９】
2020015756.tif 000011
(式(I)中、
R1は、水素又は水酸基であり、
R2、R3、R4、R5及びR6は、それぞれ独立して、水素又は-OCH3であり、
R7、R8、R9及びR10は、それぞれ独立して、水素又は-OCH3である)
この拮抗剤を用いることで、排尿障害関連受容体に対するリガンドの特異的結合を阻害することができる。
【００２３】
本発明によれば、上記化学式(I)に示される化合物は、下記化学式(II)から(V)の群より少なくとも1つ選択される化合物である、受容体拮抗剤が提供される。
【化１０】
2020015756.tif 000012
【化１１】
2020015756.tif 000013
【化１２】
2020015756.tif 000014
及び
【化１３】
2020015756.tif 000015
【００２４】
本願明細書において、排尿障害関連受容体は、ムスカリン受容体、カルシウム受容体及びプリン受容体からなる群より少なくとも１つ選択される。
【００２５】
上記化学式(II)から(V)で示される化合物は、それぞれ、ノビレチン、タンゲレチン、3’, 4’, 5, 7-テトラメチルケルセチン及びシネンセチンと称される。本願明細書においては、化学式(II)とノビレチンは、互いに置換可能であり、化学式(III)とタンゲレチンは、互いに置換可能であり、化学式(IV)と3’, 4’, 5, 7-テトラメチルケルセチンは、互いに置換可能であり、化学式(V)とシネンセチンは、互いに置換可能である。
【００２６】
上記化合物は、精製された化合物であってよく、合成された化合物であってもよい。また、上記化合物は、植物の粗抽出物中に含まれた形態であってもよい。ノビレチン、タンゲレチン、3’, 4’, 5, 7-テトラメチルケルセチン及びシネンセチンは、後述する柑橘類及び抽出方法から抽出することができる。また、ノビレチン、タンゲレチン、3’, 4’, 5, 7-テトラメチルケルセチン及びシネンセチンは、後述する精製方法を用いることで精製することができる。上記化合物は、水和物であってもよい。
【００２７】
上記化合物又は上記化合物の水和物を医薬組成物又は医薬製剤(拮抗剤)とする場合には、その結晶を常法に従って処理し、後述する賦形剤等と混合すればよい。かかる化合物を有効成分とする医薬製剤としては、注射剤、坐剤、エアゾール剤、経皮吸収剤、軟膏剤、硬膏剤、スプレー剤その他の非経口剤、錠剤、散剤、顆粒剤、粉剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤、液剤その他の経口剤等を挙げることができる。
【００２８】
ここで、上記の錠剤には、糖衣錠、コーティング錠、バッカル剤が含まれ、カプセル剤には、硬カプセル剤、軟カプセル剤の双方が含まれる。また顆粒剤にはコーティングされた顆粒剤も含まれる。また、上記の液剤には、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤等が含まれ、シロップ剤にはドライシロップも含まれる。なお、上述した各製剤には、徐放化されてないものばかりでなく、徐放化されたものも含まれる。こうした製剤は、公知の製剤学的製法に従い、製剤の製法に際して薬理学的に許容できる日本薬局方に記載の基剤、担体、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤等を用いて製造することができる。こうした担体や賦形剤としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、白糖、マンニトール、馬鈴薯デンプン、トウモロコシデンプン、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末等を挙げることができる。
【００２９】
上記医薬組成物又は結合剤としては、例えば、デンプン、トラガントゴム、ゼラチン、シロップ、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシルメチルセルロース等を挙げることができる。上記崩壊剤としては、例えば、デンプン、寒天、ゼラチン末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、炭酸カルシウム、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシルメチルセルロース等を挙げることができる。上記滑沢剤としては、例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム等を挙げることができる。上記着色剤としては、医薬品に添加することが許容されているものであれば使用することができ、特に限定されない。また、これら以外に、矯味剤、矯臭剤等も、必要に応じて適宜使用することができる。
【００３０】
錠剤又は顆粒剤とする場合には、必要に応じて、白糖、ゼラチン、精製セラック、グリセリン、ソルビトール、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、フタル酸セルロースアセテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルメタクリレート、メタアクリル酸重合体等を用いてコーティングしても良く、複数層でコーティングすることもできる。さらに顆粒剤や粉剤をエチルセルロースやゼラチンのようなカプセルに詰めてカプセル剤とすることもできる。
【００３１】
上記化合物を含む医薬組成物若しくは拮抗剤又は上記化合物の水和物を含む医薬組成物若しくは拮抗剤を用いて、注射剤を調製する場合は、必要に応じて、pH調整剤、緩衝材、安定化剤、可溶化剤などを添加することもできる。
【００３２】
本実施形態の排尿障害関連受容体に関する拮抗剤は、排尿障害を予防又は改善するために使用されてもよい。本願明細書において、排尿障害は、何らかの原因で尿の排出が困難である状態を指す。上記排尿障害は、自覚症状を伴うものであっても、伴わないものであってもよく、医師の診断に基づくものであってもよい。
【００３３】
本願明細書において、上記排尿障害は、過活動膀胱及び/又は前立腺肥大症であってもよい。排尿障害(下部尿路機能障害)は、２つのグループに分けることができる。１つは、過活動膀胱であり、もう１つは前立腺肥大症である。過活動膀胱は、我慢できない尿意が急に生じる症状である尿意切迫感を伴う。また、過活動膀胱は、頻尿、夜間頻尿及び尿失禁からなる群より選択される1又は複数の症状を伴ってもよい。過活動膀胱の治療では、抗コリンが第一選択薬として用いられる。前立腺肥大症は、下部尿路閉塞による、尿流抵抗の増大及び/又は膀胱血流障害を伴っていてもよい。前立腺肥大症では、α1遮断薬が第一選択訳として用いられる。また、過活動膀胱は、前立腺肥大症を伴わなくてもよく、前立腺肥大症は過活動膀胱を伴わくてもよい。本願明細書において、上記排尿障害は、過活動膀胱であってもよい。本願明細書において、上記排尿障害は、前立腺肥大症であってもよい。
【００３４】
本願明細書において、前記排尿障害は、頻尿、夜間頻尿、尿失禁、残尿感及び尿勢減弱からなる群より選択される1又は複数の症状を伴っていてもよい。頻尿は、起床から就寝までの排尿回数が多くなる症状である。通常、１日の排尿回数が8回以上の場合は頻尿と診断されるが、これに限定されない。夜間頻尿は、就寝から起床までに排尿のために一時的に起床する症状であり、通常、1回以上の排尿があれば夜間頻尿と診断されるが、これに限定されない。また、尿失禁は、不随意又は無意識に尿が漏れる症状を指す。尿失禁には、腹圧性尿失禁、切迫性尿失禁、溢流性尿失禁、反射性尿失禁、真性尿失禁が含まれる。残尿感は、排尿後も膀胱に尿が残っている(残尿)感覚が伴う症状であり、かかる感覚は、残尿の有無に関係なく生じる。尿勢減弱は、排尿の勢いが低下し、排尿時間が長くなる症状である。上記症状は、検尿、前立腺特異的抗原(PSA)測定、尿流測定、超音波検査、コンピューター断層撮影(CT)検査、磁気共鳴画像(MRI)検査、排尿時膀胱造影、尿流動態検査又はこれらの組み合わせによって判断することができる。
【００３５】
本願明細書の医薬組成物又は排尿障害関連受容体に関する拮抗剤は、上記化学式(I)を含有する柑橘類抽出物を含有してもよい。本願明細書において、上記柑橘類は、ケラジ(Keraji；Citrus Keraji、ポンカン(Ponkan；C. reticulate)、ダンシータンジェリン(Dancy tangerine；C. tangerine)、ジミカン(Jimikan；C. succosa)、シカイカン(Shikaikan；C. suhuiensis)、タチバナ(Tachibana；C. tachibana)、コベニミカン(Kobenimikan；C. erythrosa)、キシュウミカン(Kishumikan；C. kinokuni)、シークワーサー(Shiikuwasha；C. depressa)、コウジ(Koji；C. leiocarpa)であってもよい。好ましくは、上記柑橘類は、ノビレチン、タンゲレチン、3’, 4’, 5, 7-テトラメチルケルセチン及びシネンセチンをより多く含むため、シークワーサーである。本願明細書において、上記柑橘類抽出物は、1又は複数の柑橘類由来である。
【００３６】
本願明細書において、上記医薬組成物又は拮抗剤は、上記抽出物由来のノビレチン、タンゲレチン、3’, 4’, 5, 7-テトラメチルケルセチン及び/又はシネンセチン以外に、合成されたノビレチン、タンゲレチン、3’, 4’, 5, 7-テトラメチルケルセチン及び/又はシネンセチンを含んでいてもよい。本願明細書において、上記医薬組成物又は拮抗剤は、上記ノビレチン、タンゲレチン、3’, 4’, 5, 7-テトラメチルケルセチン及び/又はシネンセチンを含む上記抽出物を含み、合成されたノビレチン、タンゲレチン、3’, 4’, 5, 7-テトラメチルケルセチン及びシネンセチンを含まない。抽出物におけるノビレチン、タンゲレチン、3’, 4’, 5, 7-テトラメチルケルセチン及び/又はシネンセチンの含有率は、抽出物の乾燥重量換算で、10重量%、20重量%、30重量%、40重量%、50重量%、60重量%、70重量%、80重量%、90重量%、95重量%、98重量%及び99重量%からなる群より選択される任意の2点間の数値範囲内であってもよい。
【００３７】
本発明において利用できる柑橘類の部位は、ノビレチン、タンゲレチン、3’, 4’, 5, 7-テトラメチルケルセチン及び/又はシネンセチンを含有する部位であれば特に限定されないが、例えば、果実に加えて、果皮、搾汁残渣(搾り粕)、剪定した葉や小枝、これらの乾燥物等も原料として使用することができる。シークワーサーやポンカンなどの場合は、果実、果皮及び搾汁残渣を使用することが、ノビレチン、タンゲレチン、3’, 4’, 5, 7-テトラメチルケルセチン及び/又はシネンセチンの単位重量あたりの含有量が多いことから好ましい。一方で、剪定した葉や小枝等は、単位重量当たりのノビレチン、タンゲレチン、3’, 4’, 5, 7-テトラメチルケルセチン及び/又はシネンセチンの含有量は果皮ほど多くはないが、大量に発生する。このため、これらを使用することで、環境への負荷を軽減することができる可能性がある。
【００３８】
柑橘類の搾汁残渣を得る方法は特に限定されないが、例えば、柑橘類の果実を圧搾機で処理することにより搾汁残渣を得ることができる。圧搾機は特に限定されないが、ロールプレス機やろ布プレス機、遠心ろ過式分離装置等を使用することが、搾汁した果皮を効率よく得られるために好ましい。
【００３９】
柑橘類の果実及び果皮並びに搾汁残渣の乾燥物を得る方法は特に限定されないが、例えば、柑橘類を50〜70℃、15〜45分の条件で加熱乾燥することにより柑橘類の乾燥物を得ることができる。この際、50℃未満で乾燥させると、15〜45分という短い時間のうちに十分に乾燥させることができない可能性があり、70℃を越えた温度で乾燥させると、柑橘類中に含まれる成分が乾燥中に変性する可能性がある。そこで、柑橘類を加熱乾燥する際には、約60℃で約30分間乾燥させることが好ましい。
【００４０】
天日乾燥により柑橘類の果実及び果皮並びに搾汁残渣の乾燥物を得ることもできる。天日乾燥は、乾燥機械の電気エネルギーを削減できるため、エネルギーコストの観点から工業スケールでの乾燥作業に好適である。また、天日乾燥での温度は、乾燥機械の温度よりも低いため、上記乾燥物の成分の変性を抑制することができる。天日乾燥により上記乾燥物を得る場合は、地域、季節、気候及び柑橘類の量に応じて乾燥時間を適宜調節することができる。例えば、乾燥時間は、3日、4日、5日、10日又は20日であってもよく、更に1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、半年、12ヶ月であってもよい。乾燥場所は、気象条件又は柑橘類の乾燥の程度に応じて変更してもよい。例えば、夜間は、建物(例えば、倉庫又は工場)に柑橘類を保存してもよい。
【００４１】
ある実施形態においては、柑橘類は、乾燥させずに柑橘類抽出物を得ることができる。柑橘類を乾燥させない場合は、乾燥コスト及び乾燥時間を削減することができる。また、柑橘類を乾燥させない場合は、水分含有量が少ない部位（例えば、果皮）を用いて柑橘類抽出物を取得してもよい。
【００４２】
以下に、シークワーサーを用いた柑橘類抽出物の例示的製造方法を説明する。
【００４３】
まず、シークワーサーを水で洗浄し、その後、シークワーサーの果実をそのまま圧搾できる各種の圧搾機で圧搾処理を行う。こうした圧搾機としては、例えば、2つの圧縮ロールの間に10〜20メッシュのエンドレスのネットを挟んで回転させ、連続的に供給されるシークワーサーの果実をこれら2つの圧縮ロールで圧搾するロールプレス搾汁機、シークワーサーの果実をろ布に包んで圧縮し搾汁するろ布プレス機、遠心ろ過式分離装置等を挙げることができる。
【００４４】
果汁を圧搾した搾汁残渣を所定の量、例えば、約300〜約500g(湿重量)秤量する。次いで、この残渣を、例えば、約50〜約70℃にて、ドライヤー等を用いて乾燥させる。乾燥させた搾汁残渣の重量(乾燥重量)を秤量した後、乾燥搾汁残渣を適当な容器に入れ、ここに、上記乾燥重量の1〜2倍容の蒸留水を加えて、この容器を約60〜約80℃の温浴中に移し、1〜3時間抽出する。抽出後、ビーカーを温浴から出して自然冷却させ、その後に、例えば、保留粒子径5μm以下のろ紙をブッフナーロートに敷いて、抽出液の全量を吸引ろ過し、残渣をろ別する。
【００４５】
得られた残渣を、再び、上記と同様に、約50〜約70℃にて、ドライヤー等を用いて乾燥させ、秤量する。乾燥重量の2〜3倍容のエタノールを加えて、室温にて2〜4日間抽出を行う。次いで、上記と同様に、抽出液全量を吸引ろ過し、残渣をろ別する。ろ液を約30〜40℃で約15〜約60分間濃縮する。
【００４６】
得られた濃縮物に、この濃縮物の8〜10倍容の1%(w/v)水酸化ナトリウム水溶液を加えて、室温にてよく混合する。室温にて1〜2日間、例えば、スターラーを用いてこの混合液を撹拌し続ける。その後、例えば、保留粒子径5μm以下のろ紙をロートにセットして自然ろ過し、可溶性成分と不溶性成分とを分離する。得られた不溶性成分を、1〜2倍容の水で洗浄する。残った不溶性成分を5〜10倍容のエタノールで溶出させる。その後エタノール可溶部分を室温にて約15〜約60分間濃縮する。濃縮後の液量は濃縮前の重量の約1/15〜1/20となり、この液量を測定する。
【００４７】
この濃縮液に、液量の8〜10倍容の約0.5〜2%(w/v)水酸化ナトリウム水溶液を加えてよく混合する。次いで、室温にて4〜8日間、例えば、スターラーを用いてこの混合液を撹拌し続ける。その後、例えば、保留粒子径5μm以下のろ紙をロートにセットして自然ろ過し、残渣をろ別する。以上のようにして、ノビレチン、タンゲレチン、3’, 4’, 5, 7-テトラメチルケルセチン及びシネンセチンとを高含有率で含有する画分を得ることができる。
【００４８】
また、シークワーサーを用いた柑橘類抽出物の別の例示的製造方法を説明する。
【００４９】
柑橘類の果実から得た果皮を、天日で３日間自然乾燥させ、乾燥果皮とする。所定量の乾燥果皮に、この５倍容の溶媒を加え、所定の期間、所定の温度で浸漬抽出を行い、抽出液を得る。ここで、抽出溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、各種の混合比の水−メタノール混合液、水−エタノール混合液等を挙げることができる。
得られた粗抽出液を濾過して固形分を除き、濾液全量を濃縮し、濃縮液を得る。この濃縮液に、適当な水相／有機相の混合液を適当量加えて、液−液分配抽出を行う。分配抽出は、混合液の組成を変えて複数回行う。分配抽出によって得られた有機相を濃縮し、オープンカラムに供して、段階的に溶媒濃度を上げるステップグラジエント法による溶出を行い、所望の画分を果皮抽出物（以下、「SPE」という。）として使用する。
【００５０】
次いで、この画分の一部を濃縮し、溶質濃度を調整して、分取カラムクロマトグラフィーを行って粗精製を行う。SPEを、さらにカラムクロマトグラフィーに供し、この抽出物に含まれるノビレチン及び／又はタンゲリチンの量を定量する。
具体的には、シークワーサー等の柑橘類の乾燥果皮6〜10kgに、30〜50Ｌのメタノールを加えて、2〜6℃で7〜21日間抽出し、抽出液を得る。この抽出液を濾過して固形分を除き、フラッシュエバポレータを用いて、濾液全量を濃縮する。次いで、水／酢酸エチル（１／１）を４Ｌ加えて分配抽出をおこなう。得られた酢酸エチル相に、90％メタノール／ｎ−ヘキサン（１／１）を４Ｌ加えて、再度、液−液分配抽出を行う。
【００５１】
引き続き、90％メタノール相の一部を濃縮し、例えば、ODSシリカゲルカラム（Cosmosil 75C18-OPN、50 mmφ×500 mm）にアプライして、20％ずつメタノール濃度を上げるステップグラジエント溶出を行い、60％〜100％メタノールの画分を得る。これらの画分を、大型ロータリーエバポレータにて乾燥させる。
次いで、例えば、上記の画分のうち、80％メタノール画分の一部を濃縮し、メタノールを加えて溶質濃度を900mg/mlに調整し、分取カラムクロマトグラフィーに供する。
【００５２】
上記画分からノビレチン、タンゲレチン、3’, 4’, 5, 7-テトラメチルケルセチン及びシネンセチンを精製する場合は、限定するものではないが、HPLCを用いて精製することができる。以下に例示的な精製条件を記載する。
分取条件：カラム5C18-AR-IIカラム(ナカライテスク(株))
溶出溶媒：70%メタノール/水
溶質濃度：900mg/ml
Injection volume：3ml
Fraction volume：10ml
Flow rate：5ml/分
検出波長：UV215nm
レンジ：20mV
ノビレチン、タンゲレチン、3’, 4’, 5, 7-テトラメチルケルセチン及びシネンセチンの溶出時間は、それぞれ、ノビレチン、タンゲレチン、3’, 4’, 5, 7-テトラメチルケルセチン及びシネンセチンの標準品を用いることで決定することができる。
【００５３】
ノビレチン、タンゲレチン、3’, 4’, 5, 7-テトラメチルケルセチン及びシネンセチンを含む抽出物の製造方法及び精製方法を例示的に説明したが、工業用スケールでは、柑橘類の量を増やして上記抽出物を製造することも可能である。工業用スケールの場合は、上記抽出物を得ることが可能である限りは、各製造プロセスのパラメーターを適宜変更すること、及び製造プロセスの追加、変更又は繰り返すこと、更には製造プロセスの削除も可能である。
【００５４】
＜実施形態３：治療薬＞
本願発明によれば、上記化合物を含む排尿障害関連受容体に関する拮抗剤を含む、排尿障害治療薬が提供される。この治療薬を用いることで排尿障害を治療することが可能になる。ある排尿障害治療薬は、排尿障害の予防及び/又は改善に用いることができる。
【００５５】
上記治療薬は、単独投与又は他の治療薬との併用投与のいずれであれ、排尿障害が治療される有効量で投与される。しかしながら、上記化合物の総投与量は、担当医によって、健全な医学的判断の範囲内で決定される。排尿障害を患っている患者に対する有効量は、排尿障害の重症度；患者の年齢、体重、総体的健康、性別及び食餌；投与時間；投与経路；上記化合物の排出速度；治療期間；上記治療薬と併用している又は同時使用している薬物に依存する。上記化合物の投与量は、投与毎に一定量でなくてもよい。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要な投与量よりも低い投与量で投与し、所望の効果が得られるまで投与量を次第に増大させてもよい。
【００５６】
必要に応じて、1日当たりの有効投与量は、投与目的に応じて、複数投与量に分割してもよい。当業者であれば、良好な医療行為及び個々の患者の臨床症状によって、有効投与量及び併用投与処方を容易に最適化することができるだろう。
【００５７】
上記治療薬の1日当たりの投与量(日用量)は、ノビレチン、タンゲレチン、3’, 4’, 5, 7-テトラメチルケルセチン及び/又はシネンセチン換算で、経口で0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50, 100, 150及び200 mg/kg体重からなる群より選択される2点間の範囲内であってもよい。上記治療薬は、一定期間、すなわち3日以上、好ましくは1週間以上、より好ましくは2週間以上、さらに好ましくは1ヶ月以上、例えば6ヶ月又は1年以上にわたって継続的に投与することが好ましい。上記治療薬の投与は、毎日行うことが好ましいが、期間中継続的に投与する限り、毎日投与しなくてもよい。上記治療薬は、日用量を1日に1回投与してもよいし、1日に日用量を数回に分割して投与してもよい。上記治療薬の投与は、医師による判断により終了してもよいし、患者の自己判断で終了してもよい。
【００５８】
＜実施形態４：機能性食品＞
本願発明によれば、上記化学式(I)で示される化合物を含有する又は上記化学式(II)から(V)の群より選択される少なくとも１つの化合物を含有する、排尿障害を予防又は改善するための機能性食品が提供される。上記化合物又は上記化合物の水和物を必要に応じて適宜添加することにより、排尿障害を予防効果又は改善効果を有する機能性食品若しくは健康商品を提供することができる。
【００５９】
上記化合物又は上記化合物の水和物を、例えば、パン、クッキー及びビスケット、米飯添加用麦及び雑穀、うどん、そば、パスタ、その他の麺類、チーズ、ヨーグルトその他の乳製品、ジャム、マヨネーズ、味噌、醤油その他の大豆製品、茶、コーヒー及びココア、清涼飲料、果実飲料その他の非アルコール性飲料、薬用酒、その他のアルコール性飲料、キャンディー、チョコレートその他のスナック菓子、チューインガム、せんべい、羊羹その他の大豆を原料とする菓子等に添加して機能性食品とすることができる。あるいは動物用餌に添加して機能性配合飼料とすることができる。なお、上記のヨーグルト、醤油、飲料等に添加する場合には、これらの中で本発明の化合物が結晶化して沈殿しないようにするために、溶解助剤や安定化剤を適宜加えることもできる。
【００６０】
また、上記化合物又は上記化合物の水和物を単独で、又は２種以上を混合し、常法に従って粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤とすることにより、健康食品とすることができる。ここで、本発明の化合物を粉末とするためには、生成過程で得られた抽出物を濃縮し、凍結乾燥、スプレードライ、真空乾燥等の方法を用いて乾燥させ、サンプルミル、ブレンダー、ミキサー等によって乾燥固体を粉砕すればよい。また、必要に応じて、コーンスターチ、馬鈴薯デンプン、デキストリン、牡蠣殻粉末などを添加してもよい。
【００６１】
また、上記のようにして得た粉末に、適宜、上述した結合剤を加えて打錠し、錠剤とすることもできる。錠剤とした後に、上述した白糖又はゼラチン等のコーティング剤を用いて、糖衣錠としてもよく、他のコーティング剤を用いて腸溶剤等にすることもできる。さらに上述したようにして得た粉末を常法に従って顆粒とし、顆粒剤を製造することもできる。また、上記の粉末や顆粒を上述したカプセルに適当量充填することによって、カプセル剤とすることもできる。なお、本発明において上記機能性食品及び健康食品には、それ自体が天然に上記化合物を含有する、柑橘類その他の植物果実等は含まないものとする。ただし、上記柑橘類等に上記化合物を添加することで製造される上記食品等は、本発明から除外しないものとする。
【００６２】
1食分の上記機能性食品及び健康食品中に含まれるノビレチン量は、0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50, 100, 150及び200 mg/kg体重からなる群より選択される2点間の範囲内となるように調節することができる。
【００６３】
＜実施形態５：排尿障害を予防又は改善させるための方法＞
本願発明によれば、
排尿障害を予防又は改善させるための方法であって、上記方法は、
上記排尿障害を患っている対象者に、下記化学式(I)で示される化合物を含有する医薬組成物又は受容体拮抗剤を投与するステップを含み、
上記化合物は、排尿障害関連受容体に対する拮抗作用を示す、方法が提供される。
【化１４】
2020015756.tif 000016
(式(I)中、
R1は、水素又は水酸基であり、
R2、R3、R4、R5及びR6は、それぞれ独立して、水素又は-OCH3であり、
R7、R8、R9及びR10は、それぞれ独立して、水素又は-OCH3である)
上記医薬組成物又は受容体拮抗剤を患者に投与する場合には、投与量は、患者の症状の重篤さ、年齢、体重、PSA値、尿流量及び健康状態等の諸条件によって異なる。一般的には、上述した用量及び用法で、1日1回若しくはそれ以上の回数にわたって投与すればよく、以上のような諸条件に応じて、投与の回数及び量を適宜増減すればよい。
【００６４】
上記医薬組成物又は拮抗剤の１日当たりの投与量、投与期間及び投与回数は、上述した治療薬と同様であってもよい。上記医薬組成物又は拮抗剤の投与は、医師による判断により終了してもよいし、患者の自己判断で終了してもよい。
【００６５】
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【実施例】
【００６６】
以下、本発明を実施例及び図面によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。機器の操作及びキットの使用は、各メーカーの製造元プロトコールに従った。
【００６７】
＜実施例１＞
沖縄県東村産のシークワーサーの搾り粕500gをよく洗浄し、1800mLの約70℃の蒸留水を加えて約70℃の湯浴中に入れ、3時間加熱処理した。得られた加熱処理物を、保留粒子径3μmのろ紙(ADVANTEC社製、No.131)を敷いたブッフナーロートを用いて吸引ろ過し、残渣を得た。残渣を圧搾機にかけて搾汁した。
【００６８】
搾汁後の搾汁残渣300g(湿重量)を秤量し、ドライヤー(パナソニック社製、品番  EH5101P  ターボドライ)を用いて、約60℃で30分間乾燥させ、乾燥果皮150gを得た。ここに、搾汁残渣の重量の2倍容の30%(v/v)エタノールを加えて、室温で、3日間エタノール抽出を行った。保留粒子径3μmのろ紙(ADVANTEC社製、No.131)を敷いたブッフナーロートを用いて吸引ろ過し、ろ液3200mgを得た。得られたろ液をロータリーエバポレータで濃縮し、濃縮液を得た。
【００６９】
濃縮液を10倍容の1%(w/v)水酸化ナトリウム水溶液を加えてスターラーで1日間、室温にて撹拌した。得られた不溶性成分を、2倍容の水で洗浄した。残った不溶性成分を5〜10倍容の100%(v/v)エタノールで溶出させた。次いでエタノール溶出成分を、ブッフナーロートを用いて沈殿物をろ別した。ノビレチン及びタンゲレチンの含有率は、それぞれ約60%及び約35%であった。
【００７０】
ノビレチン、タンゲレチン、タンゲレチン、3’, 4’, 5, 7-テトラメチルケルセチン、シネンセチンの精製
得られた抽出物(ろ液)を公知の方法でHPLC分析した。HPLCの条件は以下の通りである。
HPLC装置 ：UV-8011 HPLC(TOSOH社製)
検出器    ：UV Detector
カラム    ：Cholester Waters  内径4.6mm×250mm(Waters社製)
溶出溶媒  ：75% MeOH/水
溶質濃度  ：0.1 mg/mL
Injection volume ：0.005ml
Flow rate  ：1.0 mL/分
検出波長  ：UV 215 nm
レンジ    ：1000 mV
シークワーサー抽出物は、インジェクション後8分から12分の間に生じるピークから回収した。ノビレチンは、インジェクション後約9分の位置に生じるピークから回収した。タンゲレチンは、インジェクション後約11分の位置に生じるピークから回収した。ノビレチンもタンゲレチンもそれぞれ、95%以上の純度を有していた。また、3’, 4’, 5, 7-テトラメチルケルセチン及びシネンセチンもそれらの標品を用いて同様に精製した。
【００７１】
＜実施例２＞
ムスカリン受容体に対する拮抗作用の評価
ラット脳から調製した粗細胞膜標品を用いて、種々の濃度の各種植物抽出物又は成分化合物の存在下における、ムスカリン受容体の選択的標識リガンドである[3H]pirenzepineの特異的結合の減少率よりムスカリン受容体に対する拮抗作用を評価した。かかる拮抗作用は、ラジオレセプターアッセイ法により評価し、50％抑制濃度(IC50値)、抑制定数(Ki値)及びHill係数(nH)を算出した。
【００７２】
SD系ラット(8週齡  オス、日本エスエルシー(株)より購入)を、エーテル麻酔下で開腹し、腹部下行大動脈よりヘパリン処理した注射筒で採血し、屠殺した。動脈から冷却した生理食塩水を還流した後、脳を摘出した。小脳を取り除いた脳に19倍容量の冷却した50mMトリス緩衝液(pH7.4)を加え、ホモジナイズし、4℃下40,000×gで20分間遠心分離した。上清除去後、沈渣に再度19倍容量の冷却した50mMトリス緩衝液(pH7.4)を加え、懸濁後、4℃下40,000×gで20分間遠心分離した。上清除去後、沈渣に29倍容量の冷却した50mMトリス緩衝液(pH7.4)を加え、懸濁し、受容体標品とした。
【００７３】
組織量として受容体標品1mgを、50mMトリス緩衝液に加え、各濃度の被験サンプル及び1nMの[3H]pirenzepineを添加し、終量0.5mLとした。本反応液を25℃で60分インキュベーションした。
【００７４】
それぞれの反応液は、インキュベーション終了後、Cell Harvester(Brandel社製)を用いてガラス繊維濾紙(Whatman GF/B)上で急速吸引濾過した。直ちに濾紙を冷却した50mMリン酸緩衝液(pH7.4)3mLで洗浄した。濾紙にトルエンシンチレーター(2Lのトルエン、1LのTriton-X、15gの2,5-diphenylloxazole、0.3gの1,4-bis[2-(5-phenyloxazolyl)]benzene)を加えて、室温中に6時間以上放置後、その放射活性について液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。ディスプレーサーとして、1μMのatropineを用い、ディスプレーサーの非存在下及び存在下で得られた放射活性をそれぞれ全結合と非特異的結合とし、両者の差を受容体への特異的結合と定義した。
【００７５】
シークワーサー抽出物(ノビレチン-タンゲレチン混合物)は、ラット脳粗細胞膜における[3H]pirenzepineの特異的結合を濃度依存的に抑制した(図1)。その抑制作用から求めたIC50値は13.5±3.4μg/mLであった(表1)。
【００７６】
【表１】
2020015756.tif 000017
【００７７】
これにより、シークワーサー抽出物は、ムスカリン受容体への結合活性を示すことが示唆された。
【００７８】
＜実施例３＞
ムスカリン受容体に対するノビレチンとタンゲレチンの拮抗作用
精製したノビレチン及びタンゲレチンをそれぞれ単独で実施例2と同様の実験を行なった。結果を図2aに示す。図2aに示す通り、ノビレチンは、ラット脳粗細胞膜における[3H]pirenzepineの特異的結合を濃度依存的に抑制した一方で、タンゲレチンは、ラット脳粗細胞膜における[3H]pirenzepineの特異的結合の濃度依存的な抑制作用はみられなかった。ノビレチンの抑制作用から求めたKi値は15.7±2.8μMであった(表2)。
【００７９】
【表２】
2020015756.tif 000018
【００８０】
これにより、ノビレチンは、ムスカリン受容体に対する結合活性を示すことが示唆された。一方、タンゲレチンはムスカリン受容体に対する拮抗作用が弱いか無いことが明らかになった。
【００８１】
シークワーサー由来の4種類の化合物におけるムスカリン受容体結合活性
シークワーサーより単離したノビレチン、タンゲレチン、3’, 4’, 5, 7-テトラメチルケルセチン、シネンセチン（図２b）について、ムスカリンM1特異的受容体結合活性（[3H]-Pirenzepinの結合に対する抑制作用）と、非特異的ムスカリン受容体結合活性（[3H]-N-methyl scopolamine (NMS)の結合に対する作用）を比較検討した。
【００８２】
ムスカリンM1受容体特異的結合活性は、ノビレチン＞3', 4', 5, 7-テトラメチルケルセチン≒シネンセチン＞タンゲレチンの順に強かった(図２c及び表３)。
【００８３】
【表３】
2020015756.tif 000019
【００８４】
ムスカリン非特異的受容体結合活性は、ノビレチンとシネンセチンで認められた（図２d）。
【００８５】
これらの結果から、ノビレチン由来のノビレチン、3', 4', 5, 7-テトラメチルケルセチン、シネンセチン、タンゲレチンはムスカリン受容体、特に、ムスカリンM1受容体結合活性を有することが明らかとなった。また、タンゲレチンは、弱い結合活性を示した(図２c)。このことは、これら4化合物に排尿障害治療作用があることを示している。
【００８６】
＜実施例４＞
ムスカリン受容体に対する各種植物抽出物及び化合物の拮抗作用
各種植物抽出物及び化合物における、ムスカリン受容体に対する拮抗作用について検討した。使用した植物抽出物及び化合物は、表4にリスト化している。
【００８７】
【表４】
2020015756.tif 000020
【００８８】
結果を図3に示している。ノビレチン単独ではムスカリン受容体に対する拮抗作用が確認された。しかしながら、他のフラボノイドやポリフェノール類を多く含む各種抽出物や他のフラボノイド及びポリフェノール化合物においては、ムスカリン受容体に対する拮抗作用がほとんど見られなかった。このことから、ムスカリン受容体に対する拮抗作用は、種々のポリフェノール含有植物抽出物やポリフェノール化合物類に一般的に認められる作用ではなく、ノビレチンに特有の作用であることが示唆された。
【００８９】
＜実施例５＞
酢酸誘発頻尿モデルラット
膀胱炎による頻尿モデルである酢酸誘発頻尿モデルラットを用いて、排尿障害に対する作用を評価した。8週齡、雌のSD系ラット(日本エスエルシー(株)より購入)を用いて、ウレタン麻酔下(0.8 g/kg i.p., 及び0.4 g/kg s.c.)、0.1%酢酸を3mL/hrで膀胱内に持続注入することで頻尿を誘発し、溶媒又はシークワーサー抽出物投与1時間後から30分間の最大膀胱内圧(mmHg)、基礎圧(mmHg)、閾値圧(mmHg)及び排尿間隔(min)をシスメトリー法により測定した。
【００９０】
酢酸誘発頻尿モデルラットにおけるシークワーサー抽出物投与の作用
酢酸誘発頻尿ラットにおいて、シークワーサー抽出物(50mg/kg)投与により、最大膀胱内圧の有意な上昇が認められた(図4a)。また、排尿間隔が有意に延長し(図4d)、排尿回数も有意に減少した(図4e)。一方、本抽出物は、基礎圧(図4b)、閾値圧(図4c)、1回排尿量(図4f)には有意な影響は見られなかった。これらの結果から、シークワーサー抽出物は、頻尿を改善することが示された。
【００９１】
＜実施例６＞
骨盤うっ血排尿障害モデルラットにおける作用
骨盤うっ血排尿障害モデルラットの作製
Sprague-Dawley（SD）系メスラット24頭（200g前後）を2％イソフルレン吸入麻酔下に下腹部正中切開し、両側の総腸骨静脈と子宮静脈を結紮して骨盤うっ血状態とし閉創した。なお、両側総腸骨静脈と子宮静脈を周囲組織から剥離する操作のみを行ったSD系メスラット8頭（200g前後）をシャム群とした。術後3週目に以下の実験に用いた。
【００９２】
ノビレチン静脈内投与実験
骨盤うっ血群8頭とそのシャム群8頭において、2％イソフルレン吸入麻酔下に、経尿道的に直径約1mmの膀胱内圧測定用のカテーテルを膀胱内に挿入し、3方活栓を用いて、膀胱内への生理食塩水注入路と内圧測定路とした。一側の大腿静脈に静脈留置針を挿入し、ノビレチン投与用とした。イソフルレン吸入麻酔を止め、ウレタン（0.6mg/kg）浅麻酔拘束下に膀胱内に生理食塩水を注入（3ml/h）しながら連続膀胱内圧測定を行い、膀胱収縮が一定間隔で出現したところで、ノビレチン（0.3、1、3、10、30mg/kg）を15-20分間隔で静脈内投与し、ノビレチン投与前との比較で膀胱活動に及ぼす効果を調べた(図５及び６)。
【００９３】
ノビレチン経口投与実験
骨盤うっ血ラットの残り16頭のうち、8頭を骨盤うっ血コントロール群とし、8頭を骨盤うっ血ノビレチン群とした。骨盤うっ血ノビレチン群にはうっ血術後1週目から2週間、ノビレチン（30mg/kg）を水1mlに溶解して1日1回、ゾンデで胃内へ投与した。骨盤うっ血コントロール群8頭とシャム群8頭には、同じく2週間、水1mlを1日1回ゾンデで胃内へ投与した。胃内投与の2週間後に、ノビレチン静脈内投与の時と同様に、ウレタン（0.6mg/kg）浅麻酔拘束下に連続膀胱内圧測定を行い、3群間の膀胱活動の差を検討した(図７及び８)。
【００９４】
統計処理
結果は平均±標準誤差で表し、paired t-testまたはnon-paired t-testを用いて、p＜0.05を有意とした。
【００９５】
ノビレチン静脈内投与の結果
骨盤うっ血群はそのシャム群より膀胱収縮間隔（排尿間隔）（それぞれ、9.3±1.1分、12.4±0.7分）が有意に短く、頻尿であった(図６、投与前)。骨盤うっ血群ではノビレチン3-30mg/kg静脈内投与で膀胱収縮間隔（30mg/kgで16.9±1.0分）は延長し、シャム群においても10mg/kg静脈内投与で膀胱収縮間隔（14.4±0.9分）は延長した(図５及び６)。膀胱の最大収縮圧や基線圧に変化はなかった。
【００９６】
ノビレチン経口投与の結果
膀胱収縮間隔はシャム群（13.2±0.9分）に比べて骨盤うっ血コント群（コントロール群）（8.2±0.7分）と骨盤うっ血ノビレチン群（10.6±0.8分）で短かったが、骨盤うっ血ノビレチン群では骨盤うっ血コント群（コントロール群）より膀胱収縮間隔は延長していた(図７及び８)。膀胱基線圧は3群間に差はなかった。最大膀胱収縮圧はシャム群（48.9±2.0 cmH2O）と差のある群はなかったが、骨盤うっ血コント群（コントロール群）（54.1±3.0 cmH2O）に比べて骨盤うっ血ノビレチン群（46.3±2.3 cmH2O）で低下していた。
【００９７】
＜実施例７＞
脳梗塞モデルラットの排尿に対する作用
脳梗塞モデルラットの作製
SD系メスラット8頭（200g前後）を2％イソフルレン吸入麻酔下に頸部を正中切開し、一側の内頸動脈から脳底動脈に達する3-0ナイロン糸を挿入し、その内頸動脈を結紮して脳梗塞を作製し閉創した。なお、一側の内頸動脈を周囲組織から剥離する操作のみを行ったSD系メスラット8頭（200g前後）をシャム群とした。術後1日目に以下の実験に用いた。
【００９８】
ノビレチン静脈内投与実験
脳梗塞群8頭とそのシャム群8頭において、2％イソフルレン吸入麻酔下に、経尿道的に直径約1mmの膀胱内圧測定用のカテーテルを膀胱内に挿入し、3方活栓を用いて、膀胱内への生理食塩水注入路と内圧測定路とした。一側の大腿静脈に静脈留置針を挿入し、ノビレチン投与用とした。イソフルレン吸入麻酔を止め、無麻酔拘束下に膀胱内に生理食塩水を注入（3ml/h）しながら連続膀胱内圧測定を行い、膀胱収縮が一定間隔で出現したところで、ノビレチン（0.3、1、3、10、30mg/kg）を15-20分間隔で静脈内投与し、ノビレチン投与前との比較で膀胱活動に及ぼす効果を調べた。
【００９９】
統計処理
結果は平均±標準誤差で表し、paired t-testまたはnon-paired t-testを用いて、p＜0.05を有意とした。
【０１００】
ノビレチン静脈内投与の結果
脳梗塞群においてはそのシャム群より膀胱収縮間隔（それぞれ、9.2±0.6分、13.5±0.9分）が有意に短く、頻尿であった。脳梗塞群ではノビレチン3-10mg/kg静脈内投与で膀胱収縮間隔（3mg/kgで14.4±2.2分）は延長し、シャム群においても3mg/kg投与で膀胱収縮間隔（17.1±1.6分）は延長した（図９）。膀胱の最大収縮圧や基線圧に変化はなかった。
【０１０１】
＜実施例８＞
薬物誘導膀胱炎モデルラット
薬物誘導膀胱炎モデルラットの作製
CYP誘発膀胱炎モデルラットの作製はChowらの方法に従った（Chow Y. C., Yang S., Huang C. J., Tzen C. Y., Huang P. L., Su Y. H. and Wang P. S.: Epinephrine promotes hemostasis in rats with cyclophosphamide-induced hemorrhagic cystitis. Urology., 67: 636‐641, 2006.）。生理食塩水に溶解したCYP (150 mg/kg) を単回腹腔内投与し、24 h後にシストメトリー法によるウレタン麻酔下膀胱内圧および排尿量を測定した。
【０１０２】
ウレタン麻酔下シストメトリー法による膀胱内圧および排尿量の測定
ウレタン(0.8 g/kg, i.p. 0.4 g/kg, s.c.)麻酔下、恒温パッド (The Deltaphase(登録商標) Isothermal Pad : BRAINTREE SCIENTIFIC, INC.)にてラットを保温し、仰臥位に固定後、下腹部を正中切開した。膀胱頂部に小切開を加え、膀胱内にポリエチレンチューブ (SP-45 : 夏目製作所 (株))を挿入した。切開部を結紮し、膀胱内に挿入したチューブの他端を圧トランスデューサー(MLT0670 Disposable BP Transducer : ADINSTRUMENTS) に接続した。
【０１０３】
図１０に示す装置を用い、膀胱内圧および排尿量の経時的測定を行った。ラットをボールマンゲージ(アクリル製特注品 : 山下枝研 (有) )に伏臥位に固定した。生理食塩水あるいは0.1%酢酸溶液を満たした専用注射筒(テルモシリンジ 10mL)を持続注入器(Model 100 Series : Kd Scientific)に装着した。37℃に設定した水槽(THEAMO MINDER SJ-10R タイテック(株))を介して、膀胱内に生理食塩水あるいは0.1%酢酸溶液を3 mL/hrで持続注入しながら、圧力アンプ(BP Amp : ADINSTRUMENTS)により膀胱内圧を経時的に測定しデータ記録および解析ソフト(Power Lab 4/26 : ADINSTRUMENTS)でシストメトログラムを記録した。また、排尿量は上皿電子天秤(GX-400, AD株式会社エー・アンド・デイ)にシャーレを設置し、尿道口から排出される液を累積的に採取し、その重量変化をPower Lab 4/26で記録した。排尿が安定した後、30分間を投与前として排尿パラメータを測定した。その後、SE 50 mg/kgを経口投与し、投与1時間後から再び測定を開始し、その後30分のデータを投与後の排尿パラメーターとした。
【０１０４】
図１１に示す通り、CYP誘導膀胱炎モデルラットにおいて、シークワーサー抽出物（50m/kg）の経口投与は排尿量を有意に増加させ、排尿回数も有意に減少した。また、最大膀胱内圧が減少した。このことから、シークワーサー抽出物は薬物誘導膀胱炎モデルラットにおいても排尿機能を調節し、頻尿を改善することが示された。
【０１０５】
＜実施例９＞
シークワーサー抽出物のCa拮抗薬受容体への結合活性
受容体標品の調製
SDラットをイソフルラン麻酔下で開腹し，腹部下行大動脈より採血し屠殺した後，脳を摘出した．摘出した脳は小脳を取り除いた。 (+)-[3H]PN200-110 の測定には，摘出後の脳に30 mM Tris-HCl buffer (pH 7.2 または 7.5) を 19 倍量加え, ポリトロンホモジナイザーでホモジナイズした．ホモジネートを遠心分離 (4℃, 40,000×g, 20min) した後, 沈渣に32.3倍量の buffer を加え懸濁し, 受容体膜標品とした。
【０１０６】
[3H] αβ-methylene ATP（MeATP） の測定にはhomogenizing buffer (50 mM Tris, 1mM EDTA, 2μg/mL Soybean trypsin inhibitor, 10 μg/mL Bacitracin : pH 7.4) を摘出後の脳に 10 倍量加え, ポリトロンホモジナイザーでホモジナイズした．ホモジネートを遠心分離 (4℃, 2,000×g, 10min) し上清を分取後，沈渣を 10 倍量の homogenizing buffer で再懸濁し同様の条件にて遠心分離し，上清を分取した．2 回分の上清を合わせ， 37℃で 20 分間インキュベーション後，遠心分離 (4℃, 40,000×g, 20 min) し，沈渣を 19 倍量の incubation buffer ( 50 mM Tris, 3 mM CaCl2 : pH 7.5) を加え懸濁し, 受容体膜標品とした。
【０１０７】
1,4-Dihydropyridine(DHP) Ca 拮抗薬受容体結合活性の測定
1,4-DHP Ca 拮抗薬受容体結合活性の測定は，標識リガンドとして (+)-[3H]PN200-110 を用いるラジオレセプターアッセイ法に従った。即ち，受容体標品を50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) 中でシークワーサー抽出物（SE），0.3 nM (+)-[3H]PN200-110 と25℃，60 分間，遮光条件下でインキュベーションした。インキュベーション後，反応液をガラス濾紙繊維上に急速吸引濾過し，直ちに濾紙を 50 mM Na+/K+ phosphate buffer (pH 7.5) で洗浄した。この濾紙を乾燥後，バイアル瓶に取り，トルエンシンチレーターを加えて室温中に約 6 時間放置後，その放射活性を測定し，特異的結合量を算出した。このとき，displacer として1 μM nifedipine を用いた．測定は全て duplicate で行った。
【０１０８】
結果
シークワーサー抽出物のカルシウム拮抗薬受容体への結合
1,4-DHP Ca 拮抗薬受容体に対するリガンドである(+)-[3H]PN200-110の受容体に対する結合はシークワーサー抽出物によってわずかに抑制された（図１２）。このことから、シークワーサー抽出物はカルシウム受容体拮抗薬結合サイトに結合する活性も有し、カルシウム拮抗作用が期待出来る。カルシウムは膀胱平滑筋収縮を引き起こすことから、シークワーサー抽出物はカルシウム拮抗作用による平滑筋弛緩作用を介しても過活動膀胱における頻尿や尿失禁を改善することが示唆された。
【０１０９】
＜実施例１０＞
ラット摘出膀胱におけるノビレチンおよびタンゲレチンの作用
1. 試薬類
AtropineおよびTetrodotoxinは、Sigma-Aldrich Co.（St Louis, MO, U.S.A.）から購入した。Pyridoxalphosphate-6-azophenyl-2', 4'-disulfonic acid tetrasodium salt（PPADS; a selective P2X antagonist）は、Tocris Bioscience （Minneapolis, MN, U.S.A.）から購入した。Nobiletin（ノビレチン）およびTangeretin（タンゲレチン）はシークワーサーより抽出精製した物を用いた。その他の試薬は、Wako Pure Chemical Industries Ltd.（Osaka, Japan）から購入した。
【０１１０】
2. 実験標本
Japan SLC, Inc.（Shizuoka, Japan）より購入したWistar系雄性ラット（300-350 g）を実験に使用した。実験動物は全て恒温（22±2℃）、恒湿（55±2%）、定時照明（7~19時）の条件下で飼養した。また、動物実験は動物愛護法を尊守し、「武庫川女子大学動物実験規定」に基づいて実施した。
【０１１１】
ペントバルビタール（60 mg/kg、腹腔内投与）深麻酔下のWistar系雄性ラットを放血致死後、膀胱を摘出し、酸素（95% O2 and 5% CO2）を通気した37℃のKrebs-Henseleit液（in mmol/L: NaCl 113, KCl 4.8, MgSO4 1.2, KH2PO4 1.2, CaCl2・2H2O 2.5, NaHCO3 25, glucose 11.5）中で膀胱上部より4切片（3×5 mm）を作成し、これを標本とした。
【０１１２】
3. 経壁電気刺激による収縮測定
標本は酸素を通気したKrebs-Henseleit液（5 mL, 37℃）を満たしたマグヌス管内の白金電極に装着し、静止張力1 gの条件下で懸垂した。30分間の平衡時間をとって標本を安定化させた後、3分ごとに5回Krebs-Henseleit液でwash outし、経壁電気刺激（transmural electrical stimulation, 10 Hz, 0.1 msec duration, 10 V, 10 sec）を加え、生ずる収縮反応を測定した。測定には、トランスデューサー（T7-15-240, A&D Co. Ltd., Tokyo, Japan）を使用し、データの取得と解析にはPowerLab(登録商標) software（ADInstruments Pty Ltd, CO, U.S.A.）を用いた。経壁電気刺激は5分間隔で標本に加えた。経壁電気刺激の2 分後に、ノビレチン（最終濃度10-4 M）またはタンゲレチン（最終濃度10-4 M）もしくは同量の溶媒（Ethanol）を対照として投与し、3分後に2回目の経壁電気刺激を加え収縮反応を測定した。さらに、アトロピン（最終濃度：10-6 M）、α,β-methylene ATP（最終濃度：10-5 M）およびテトロドトキシン（最終濃度：10-6 M）を順に処置し、経壁電気刺激に対する影響を検討した。経壁電気刺激の流れは図13のとおりである。アトロピンで抑制される収縮はコリン作動性の収縮、更にα,β-methylene ATPの反復添加により脱感作される収縮はプリン作動性収縮、テトロドトキシンで抑制される収縮を非コリン、非プリン作動性収縮とし、テトロドトキシンでも抑制されない収縮をテトロドトキシン抵抗性収縮と定義した。
【０１１３】
4. 統計解析法
得られたデータは平均値±標準誤差で示した。有意差検定は、Dunnett's testを使用し、危険率5%未満の場合を有意であると判定した。なお、データの解析には、GraphPad Prism 4.03 software（GraphPad Software, La Jolla, CA, U.S.A.）を用いた。
【０１１４】
5. 実験結果
経壁電気刺激による収縮に対し、ノビレチン（10-4 M）およびタンゲレチンは（10-4 M）はいずれも抑制作用を示し、その抑制率はそれぞれ約30％もしくは19％であった（図１４）。この経壁電気刺激による収縮反応について、関与経路を明らかにするために、各種化合物を用いてさらに検討した。図１４に示すように、コントロールでは約100％あった収縮反応がアトロピ（10-6 M）ン存在下で約68％に減弱し、α,β-methylene ATP（10-6 M）を共存させると約5％にまで減弱した（図１４a）。図１４bに示されているように、ノビレチン存在下で観察される収縮反応は約70%に減弱し、アトロピン存在下で約32％に、α,β-methylene ATP共存下で約2％にまで減弱した。同順にして、タンゲレチン存在下では約81%、アトロピン存在下で約42%、α,β-methylene ATP共存下で約3％にまで減弱した（図１４c）。なお、経壁電気刺激による収縮反応のうち、テトロドトキシン（10-6 M）存在下で残るテトロドトキシン抵抗性の収縮反応は約１％前後のみであった(Data not shown)。
【０１１５】
ノビレチンおよびタンゲレチンは、摘出膀胱における経壁電気刺激による収縮モデルにおいても、有意な抑制作用を示した。このことから、ノビレチンおよびタンゲレチンは、膀胱の収縮を抑制することで、排尿障害を改善する作用があることが示唆された。
【０１１６】
さらに、この経壁電気刺激による収縮反応をアトロピンで抑制されるコリン作動性収縮成分と、α,β-methylene ATP反復処理で減感作されるプリン作動性収縮成分に分けて比較解析した結果、コントロール実験においてはコリン作動性収縮が約32％、プリン作動性収縮が約63％であったことから、経壁電気刺激による収縮反応にはプリン作動性成分が大きく関与していること示唆された（図１５）。
【０１１７】
一方、ノビレチン処置した実験では、コリン作動性収縮が約38％、プリン作動性収縮が約30％であり、タンゲレチン処置した実験では、コリン作動性収縮が約39％、プリン作動性収縮が約39％であった（図１５）。以上の結果を考え合わせると、摘出膀胱における経壁電気刺激による収縮反応のうち、ノビレチンおよびタンゲレチンで抑制される成分は、主にプリン作動性成分であることが１つの可能性として推察される。以上の結果から、ノビレチンおよびタンゲレチンは、プリン作動性収縮にも影響することで、排尿障害を改善することが示唆された。
【０１１８】
本実施例の結果から、ノビレチン、タンゲレチン、3’, 4’, 5, 7-テトラメチルケルセチン及びシネンセチンは、ムスカリン受容体に対して拮抗作用を有することが明らかとなった。更に、ノビレチンは、頻尿を改善する効果を有することから、ノビレチンを用いることで、排尿障害を予防すること、改善させること又は治療することが可能になる。
【０１１９】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【０１２０】
謝辞
「This work was carried out with the support of "Cooperative Research Program for Agriculture Science &Technology Development (Project No.PJ009583)" Rural Development Administration, Republic of Korea.」
農生命バイオ食医薬素材開発事業団（韓国  農村振興庁）
【図１】
2020015756.tif 000029
【図２ａ】
2020015756.tif 000030
【図２ｂ】
2020015756.tif 000031
【図２ｃ】
2020015756.tif 000032
【図２ｄ】
2020015756.tif 000033
【図３】
2020015756.tif 000034
【図４】
2020015756.tif 000035
【図５】
2020015756.tif 000036
【図６】
2020015756.tif 000037
【図７】
2020015756.tif 000038
【図８】
2020015756.tif 000039
【図９】
2020015756.tif 000040
【図１０】
2020015756.tif 000041
【図１１】
2020015756.tif 000042
【図１２】
2020015756.tif 000043
【図１３】
2020015756.tif 000044
【図１４】
2020015756.tif 000045
【図１５】
2020015756.tif 000046
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月11日(2019.10.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ノビレチンを含有する、頻尿を予防又は改善するために使用される医薬組成物。
【請求項２】
前記ノビレチンを含有する柑橘類抽出物を含有する、請求項１に記載の医薬組成物。