(57)【要約】【課題】本発明は、簡便なヒスタミン測定のためのサンプリング方法及びキットを提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、検体について非侵襲的にサンプリングを行い、得られた試料についてヒスタミンを検出する方法及びキットを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）検体を非侵襲的にサンプリングし、検体から測定用の試料を取得する工程、及び
（ｉｉ）工程（ｉ）においてサンプリングした試料を、ヒスタミン測定に供する工程、
を含む、ヒスタミン食中毒検査用又はヒスタミン食中毒予防用の、ヒスタミン測定方法。
【請求項２】
検体が魚である場合、非侵襲的サンプリングが、当該魚の口から、鰓孔から、肛門から、魚体表面について、若しくはミンチではない魚肉の切り身の表面について行われるものである、又は
検体が鶏である場合、非侵襲的サンプリングが、当該鶏の口から、肛門から、若しくはミンチではない鶏肉の切り身の表面について行われるものである、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
非侵襲的サンプリングが、綿棒を用いた拭き取りにより行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ヒスタミン測定がヒスタミンデヒドロゲナーゼを用いる比色法又は抗ヒスタミン抗体を用いるイムノクロマト法によるヒスタミン測定である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ヒスタミン測定がヒスタミンデヒドロゲナーゼを用いる比色法であり、さらに誤反応抑制剤を用いる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のヒスタミン測定方法を行うための使用説明書、及びヒスタミン測定用試薬を含む、ヒスタミン測定キット、ここで前記使用説明書は検体からのサンプリングを非侵襲的に行うことを記載したものである、前記キット。
【請求項７】
試料採取部、反応部、及び使用説明書を含むヒスタミン測定キットであって、前記反応部がヒスタミン測定試薬を含むものであり、前記使用説明書が検体からのサンプリングを非侵襲的に行うことを記載したものである、ヒスタミン食中毒検査用の、ヒスタミン測定キット。
【請求項８】
ヒスタミン測定試薬が、ヒスタミンデヒドロゲナーゼ及び比色法用試薬、又は抗ヒスタミン抗体及びイムノクロマト用試薬を含む、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
ヒスタミン測定試薬が、ヒスタミンデヒドロゲナーゼ、比色法用試薬及び誤反応抑制剤を含む、請求項７に記載のキット。
【請求項１０】
試料採取部、反応部、センサー部及び使用説明書を含むヒスタミン測定装置であって、前記反応部がヒスタミンデヒドロゲナーゼを含むものであり、前記使用説明書が検体からのサンプリングを非侵襲的に行うことを記載したものであり、前記センサー部がヒスタミンの電気化学的測定用のセンサーを備えている、ヒスタミン食中毒検査用の、ヒスタミン測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒスタミン測定のためのサンプリング方法及びキット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒスタミンは体内で起こるアレルギー反応の化学伝達物質であるため、ヒスタミンを多量に蓄積した食品を摂取するとアレルギー様中毒が起こる。ヒスタミンによるアレルギー反応の具体的な症状としては、食後数分から数時間で顔面などに発赤が生じ、続いてかゆみ、じん麻疹や湿疹が出、ひどい場合はじん麻疹が全身に広がり気管支炎や血圧降下を起こす場合もある。こうしたことから、食品加工工場や食品衛生監視機関、臨床検査室などにおいてヒスタミン量を簡易且つ迅速に測定することができるヒスタミンの測定法が強く求められていた。
【０００３】
例えば赤身の魚やその加工工程において、ヒスタミン産生菌が活動しヒスタミンが産生され蓄積されうる。ヒスタミンを多く含む食品を喫食するとアレルギー様中毒が生じ、これはヒスタミン食中毒と呼ばれることがある。食材中のヒスタミン量が一定以下であることを加工前に確認することは重要であるが、魚肉がヒスタミンを多く含むかは、その魚肉が腐敗していることと必ずしも相関しないため、いわゆる腐敗臭のような臭いのみで判別できない場合もあり、魚肉の鮮度測定とは別に、ヒスタミン測定が必要となる。
【０００４】
ヒスタミン量の測定法としては、蛍光分析法、薄層クロマトグラフィーやペーパークロマトグラフィーを用いるクロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、抗原抗体反応法、及び酵素法等が知られている。本願出願人は、簡便であり、高精度であることから酵素法に着目し、これまでにヒスタミンデヒドロゲナーゼを用いてヒスタミンを測定する方法を開発している（特許文献１及び特許文献２）。
【０００５】
ヒスタミン食中毒が発生した場合の原因究明のための検査には、主にＨＰＬＣ法や蛍光光度法が使用される。しかしながらこれらの方法は、検査に時間がかかり、ヒスタミン食中毒の予防のための迅速な検査には不向きである。また検査がヒスタミンを蛍光標識で誘導体化する工程を必要とするなど、手間がかかり、全数検査等は困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−１５７５９７号公報（特許第３９２６０７１号）
【特許文献２】特開２００４−１２９５９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本願出願人が開発し、用いてきたヒスタミンデヒドロゲナーゼを用いるヒスタミン測定方法（特許文献１及び特許文献２）は、魚肉等の可食部をミンチにした後にヒスタミンを測定する必要があった。可食部をミンチにすると、その検体（個体）は商品として販売できない又は販売しにくいなど、使用用途が限られる。また、ヒスタミン測定のために、可食部の一部をミンチにしなければならない、という手間があった。また、従来のヒスタミン検査は、可食部をミンチにする等、侵襲的であることから、全数検査が実質的に不可能であったのみならず、検査できる検体数も限られ、検査頻度も少なかった。
【０００８】
したがって本発明は、上記の問題点の少なくとも一部を解決しうるヒスタミン測定方法及びキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記の問題点に鑑み、検体のヒスタミン量を測定するに当たり、非侵襲的にサンプリングを行い、そのようにして得られた試験サンプルをヒスタミン測定試験に供することにより、検体を破壊することなく、当該検体に含まれる可食部におけるヒスタミンの有無を判別することができることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
本発明は以下の態様を包含する。    
［１］  （ｉ）検体を非侵襲的にサンプリングし、検体から測定用の試料を取得する工程、及び
（ｉｉ）工程（ｉ）においてサンプリングした試料を、ヒスタミン測定に供する工程、
を含む、ヒスタミン食中毒検査用又はヒスタミン食中毒予防用の、ヒスタミン測定方法。
［２］  検体が魚である場合、非侵襲的サンプリングが、当該魚の口から、鰓孔から、肛門から、魚体表面について、若しくはミンチではない魚肉の切り身の表面について行われるものである、又は
検体が鶏である場合、非侵襲的サンプリングが、当該鶏の口から、肛門から、若しくはミンチではない鶏肉の切り身の表面について行われるものである、
実施形態１に記載の方法。    
［３］  非侵襲的サンプリングが、綿棒を用いた拭き取りにより行われる、実施形態１又は２に記載の方法。      
［４］  ヒスタミン測定がヒスタミンデヒドロゲナーゼを用いる比色法又は抗ヒスタミン抗体を用いるイムノクロマト法によるヒスタミン測定である、実施形態１〜３のいずれかに記載の方法。    
［５］  ヒスタミン測定がヒスタミンデヒドロゲナーゼを用いる比色法であり、さらに誤反応抑制剤を用いる、実施形態１〜３のいずれかに記載の方法。    
［６］  実施形態１〜５のいずれかに記載のヒスタミン測定方法を行うための使用説明書、及びヒスタミン測定用試薬を含む、ヒスタミン測定キット、ここで前記使用説明書は検体からのサンプリングを非侵襲的に行うことを記載したものである、前記キット。    
［７］  試料採取部、反応部、及び使用説明書を含むヒスタミン測定キットであって、前記反応部がヒスタミン測定試薬を含むものであり、前記使用説明書が検体からのサンプリングを非侵襲的に行うことを記載したものである、ヒスタミン食中毒検査用の、ヒスタミン測定キット。    
［８］  ヒスタミン測定試薬が、ヒスタミンデヒドロゲナーゼ及び比色法用試薬、又は抗ヒスタミン抗体及びイムノクロマト用試薬を含む、実施形態７に記載のキット。    
［９］  ヒスタミン測定試薬が、ヒスタミンデヒドロゲナーゼ、比色法用試薬及び誤反応抑制剤を含む、実施形態７に記載のキット。    
［１０］  試料採取部、反応部、センサー部及び使用説明書を含むヒスタミン測定装置であって、前記反応部がヒスタミンデヒドロゲナーゼを含むものであり、前記使用説明書が検体からのサンプリングを非侵襲的に行うことを記載したものであり、前記センサー部がヒスタミンの電気化学的測定用のセンサーを備えている、ヒスタミン食中毒検査用の、ヒスタミン測定装置。    
［１１］  誤反応抑制剤が
（Ａ）  （ｉ−ａ）ホウ酸若しくは下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
【化１】
2020030048.tif 000002
（式中、Ｒ１〜Ｒ５は、それぞれ独立に、Ｈ、ボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基、チオール基、ｔｅｒｔ‐ブトキシカルボニルアミノ基、及び置換された若しくは置換されていないＣ１〜Ｃ１０アルキル基、アルケニル基、又はアルキニル基からなる群から選択され、
Ｒ６は、ボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基及びチオール基からなる群より選択される少なくとも一種の置換基により置換された若しくは置換されていないＣ１〜Ｃ１０アルキル基、アルケニル基、又はアルキニル基からなる群から選択される）で表されるボロン酸又はその塩、又は
（ｉ−ｂ）アルキル硫酸塩、
（Ｂ）  双性イオンを有し、カルボキシ基を有しない化合物を含む緩衝溶液であって、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＥＰＰＳ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＡＣＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳＯ、及びＰＩＰＥＳからなる群から選択される緩衝液、Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）又は炭酸緩衝液、
（Ｃ）  双性イオンを有し、スルホ基を有する化合物を含む緩衝液であって、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＥＰＰＳ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＡＣＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳＯ、及びＰＩＰＥＳからなる群から選択される緩衝液、並びに
（Ｄ）  双性イオンを有し、スルホ基を有し、かつ２位にヒドロキシ基を有する化合物を含む緩衝液であって、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、及びＭＯＰＳＯからなる群から選択される緩衝液、
からなる群より選択される、上記いずれかの実施形態。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、検体を破壊することなく、当該検体に含まれるヒスタミンを測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、０〜１００ｐｐｍにおけるヒスタミン量の測定結果を示す。Ａは目視による色調変化、Ｂは色調を数値化した場合の、Ｋ値とヒスタミン量の検量線を示す。
【図２】図２は、ヒスタミン不検出サンプル（Ａはイワシ、Ｂはアジ）の様々な部位をサンプリングし、測定した結果を示す。１は口、２は魚体表面、３は肛門、４は鰓孔、５は内臓除去後洗浄した腹腔内、６は三枚おろし後の中骨回りの身、７は三枚おろし後の身、８はミンチを各々の方法でサンプリング、測定した結果を示す。
【図３】図３は、加速試験前のイワシ（Ａ）またはアジ（Ｂ）を非侵襲にてサンプリングし、ヒスタミン量を測定した結果を示す。１は口、２は魚体表面、３は肛門、４は鰓孔（アジのみ）をサンプリングした結果を示す。アジ（１）〜（３）は異なる個体である。
【図４】図４は、２０℃にて１８時間保存した後のイワシ（Ａ）、またはアジ（Ｂ）三匹に含まれるヒスタミン量をそれぞれ測定した結果を示す。１は口、２は魚体表面、３は肛門、４は鰓孔、５はドリップ（アジのみ）６は内臓除去後の腹腔内、７は洗浄後の腹腔内、８は三枚おろし後の中骨回りの身、９は三枚おろし後の身、１０，１１は共にミンチを各々の方法でサンプリング、測定した結果を示す。イワシ（１）〜（３）は異なる個体である。またアジ（１）〜（３）は異なる個体である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．ヒスタミン測定のためのサンプリング方法
ある実施形態において、本発明は、ヒスタミン測定のためのサンプリング方法を提供する。本明細書におけるヒスタミンには、その塩も含まれる。ある実施形態において、サンプリングは、ヒスタミンを含み得る検体について行う。ヒスタミンを含み得る検体としては、魚、ミンチにされていない魚肉（例えばミンチにされていない魚の切り身、三枚におろした魚の切り身等）、畜肉、鶏肉、チーズ、醤油、魚醤及びワイン等、液状及び固形状の食品、尿及び血漿等の体液、生体物質、及び生体組織等が挙げられる。
【００１４】
ある実施形態において、本発明は、ヒスタミン測定のための非侵襲的サンプリング方法を提供する。別の実施形態において本発明は、
（ｉ）検体を非侵襲的にサンプリングし、検体から測定用の試料を取得する工程、及び
（ｉｉ）工程（ｉ）においてサンプリングした試料を、ヒスタミン測定に供する工程、
を含む、ヒスタミン測定方法を提供する。この方法は例えば、ヒスタミン食中毒検査用又はヒスタミン食中毒予防用に用いることができる。
【００１５】
ある実施形態において、検体のヒスタミン量を測定するに当たり、サンプリングは非侵襲的に行う。本明細書において「非侵襲的にサンプリングを行う」、「非侵襲的にサンプリングをする」、又は「非侵襲的なサンプリング」、とは、検体をサンプリングのために傷つけることなく、例えば魚肉であればこれをミンチにすることなく、測定用の試料を採取することをいう。なお、本明細書において「非侵襲的サンプリング」は、対象試料をサンプリングのためにさらに傷つけない手法であればよく、既に傷つけられている試料、例えば切り身にされた魚や三枚におろされた魚について、当該試料をさらに傷つけることなくサンプリングを行うことも、本明細書にいう非侵襲的サンプリングに包含されるものとする。例えば切り身にされた魚や三枚におろされた魚、鶏肉の表面などについて綿棒を用いた拭き取りにより行うサンプリングは、本明細書にいう「非侵襲的サンプリング」に該当する。
【００１６】
ある実施形態において、検体が魚である場合、非侵襲的サンプリングは、当該魚の口、喉、口腔、食道、胃、肛門、腸、鰓孔、エラ、魚体表面、ミンチではない魚肉の切り身の表面について行うことができる。ある実施形態において、検体が鶏肉である場合、非侵襲的サンプリングは、ミンチではない鶏肉の切り身の表面について行うことができる。また加工前の鶏であれば、非侵襲的サンプリングは、鶏の口、喉、口腔、食道、胃、肛門、腸、について行うことができる。口からサンプリング器具を挿入することにより、口、口腔、喉、食道、胃のサンプリングを非侵襲的に行うことが可能になる。また、肛門からサンプリング器具を挿入することにより、肛門、腸のサンプリングを非侵襲的に行うことが可能になる。また、鰓孔（さいこう）からサンプリング器具を挿入することにより、エラのサンプリングを非侵襲的に行うことが可能になる。
【００１７】
なお、非侵襲的とは、医学用語としては、体の開口部への又は皮膚内への器具の挿入を要しない手法について用いられることがあるが、本発明はヒト患者を対象とする医学的検査方法ではなく、主として、食されることを前提とする魚や鶏等の検体についてのヒスタミン測定方法に関するものであることから、サンプリング器具を口、鰓孔又は肛門から検体内に挿入することを伴う手法であっても本明細書にいう「非侵襲的サンプリング」に該当するものとする。本明細書において非侵襲的サンプリングのことを、検体又は検体の一部を破壊する工程を含まないサンプリング、或いは検体を実質的に破壊しないサンプリングということがある。「検体を実質的に破壊しない」、とは、原則として検体を破壊しないことを意味するが、例外的に、食される検体の可食性を損なわない、食される検体の可食部を損なわない、又は食される検体の外観など商品価値を損なわない程度に軽微な破壊は許容され、このような検体の軽微な破壊であっても、本明細書にいう「検体を実質的に破壊しない」に包含されるものとする。例えば魚について、エラが一般的に食される部位ではない場合、鰓孔からのサンプリングによりエラに軽微な損傷が生じても、食品として、或いは商品としてはほとんど問題にならないと考えられ、したがってそのようなサンプリングも本明細書にいう非侵襲的サンプリングに包含されるものとする。口や肛門からのサンプリングについても同様である。
【００１８】
ある実施形態において、非侵襲的サンプリングは、綿棒を用いた拭き取りにより行うことができる。
【００１９】
ある実施形態において、ヒスタミン測定はヒスタミンデヒドロゲナーゼを用いる比色法又は抗ヒスタミン抗体を用いるイムノクロマト法により行うことができる。ある実施形態において、本発明のヒスタミン測定方法は、ヒスタミンを測定することを目的として試料をミンチにする工程を含まない。
【００２０】
ある実施形態において本発明は、本発明に係るヒスタミン測定方法を行うための使用説明書、及びヒスタミン測定用試薬を含む、ヒスタミン測定キットを提供する。ある実施形態において、使用説明書は検体からのサンプリングを非侵襲的に行うことを記載したものである。ある実施形態においてヒスタミン測定用試薬は、ヒスタミンデヒドロゲナーゼ及び比色法用試薬を含む。別の実施形態において、ヒスタミン測定用試薬は、抗ヒスタミン抗体及びイムノクロマト用試薬を含む。ある実施形態において、このキットに含まれるヒスタミン測定用試薬は、誤反応抑制剤を含みうる。
【００２１】
ある実施形態において、本発明は、本発明のヒスタミン測定方法又はキットを用いた、ヒスタミン食中毒検査方法、及び、ヒスタミン食中毒予防方法を提供する。
【００２２】
本明細書において、「ヒスタミンデヒドロゲナーゼ」とは、酸化還元酵素に分類され、以下の反応：
【化２】
2020030048.tif 000003
によるヒスタミンの酸化を触媒する酵素である。上記反応式において、式（ＩＩＩ）の化合物はヒスタミンであり、式（ＩＶ）の化合物は４−イミダゾリルアセトアルデヒドである。一実施形態において、メディエーターは、本明細書に記載のメディエーター、例えばＰＭＳ（フェナジニウムメチルサルフェート）であり、この場合還元型メディエーターは還元型ＰＭＳ（ＰＭＳＨ２）である。
【００２３】
測定精度の点から、ヒスタミンデヒドロゲナーゼは、好ましくはヒスタミンに特異的に作用する、すなわち、ヒスタミンに特異的に作用するが他のアミンに対しては全く作用しないか、又は弱く作用することが好ましい。特に、ヒスタミンデヒドロゲナーゼは、ヒスタミンには作用するが、カダベリン及びプトレシンには作用しないことが好ましい。ヒスタミンデヒドロゲナーゼは、細菌由来、例えばリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属に属する細菌に由来するものであることが好ましい。ヒスタミンデヒドロゲナーゼは、天然に由来するものを抽出及び／又は精製して得てもよいし、生物の遺伝子情報に基づき、公知の遺伝子工学的な手法により生産されたものであってもよい。ヒスタミンデヒドロゲナーゼを生産する具体的な方法は当業者には知られており、例えば、特開２００１−１５７５９７号公報に記載の方法を使用することができる。また、本発明において使用できる具体的なヒスタミンデヒドロゲナーゼとしては、特開２００１−１５７５９７号公報に記載のヒスタミンデヒドロゲナーゼが挙げられる。一実施形態において、本発明のキットにおいて、ヒスタミンデヒドロゲナーゼの測定時又は保管時、好ましくは測定時の終濃度は、限定するものではないが、１ｍＵ／ａｓｓａｙ〜２０Ｕ／ａｓｓａｙ、好ましくは、５ｍＵ／ａｓｓａｙ〜２Ｕ／ａｓｓａｙ、より好ましくは１０ｍＵ／ａｓｓａｙ〜０．５Ｕ／ａｓｓａｙ、さらに好ましくは２５ｍＵ／ａｓｓａｙ〜０．２５Ｕ／ａｓｓａｙであってよい（但し、１Ｕは３７℃、ｐＨ９．０において１分間に１μｍｏｌの４−イミダゾリルアセトアルデヒドを生成する酵素量として定義される）。上記ヒスタミンデヒドロゲナーゼの濃度は例示であり、反応時間に応じて適宜調整することができる。
【００２４】
ある実施形態において本発明のヒスタミン測定方法は、誤反応抑制剤を使用するものでありうる。本発明に使用可能な誤反応抑制剤は、
（Ａ）  （ｉ−ａ）ホウ酸若しくは下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
【化３】
2020030048.tif 000004
（式中、Ｒ１〜Ｒ５は、それぞれ独立に、Ｈ、ボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基、チオール基、ｔｅｒｔ‐ブトキシカルボニルアミノ基、及び置換された若しくは置換されていないＣ１〜Ｃ１０アルキル基、アルケニル基、又はアルキニル基からなる群から選択され、
Ｒ６は、ボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基及びチオール基からなる群より選択される少なくとも一種の置換基により置換された又は置換されていないＣ１〜Ｃ１０アルキル基、アルケニル基、又はアルキニル基からなる群から選択される）で表されるボロン酸又はその塩、又は
（ｉ−ｂ）アルキル硫酸塩、
（Ｂ）  双性イオンを有し、カルボキシ基を有しない化合物を含む緩衝溶液であって、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＥＰＰＳ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＡＣＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳＯ、及びＰＩＰＥＳからなる群から選択される緩衝液、Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）又は炭酸緩衝液、
（Ｃ）  双性イオンを有し、スルホ基を有する化合物を含む緩衝液であって、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＥＰＰＳ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＡＣＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳＯ、及びＰＩＰＥＳからなる群から選択される緩衝液、並びに
（Ｄ）  双性イオンを有し、スルホ基を有し、かつ２位にヒドロキシ基を有する化合物を含む緩衝液であって、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、及びＭＯＰＳＯからなる群から選択される緩衝液、
からなる群より選択されるものでありうる。
【００２５】
本明細書において「ホウ酸」とは、化学式Ｂ（ＯＨ）３で表わされるホウ素のオキソ酸を意味する。また、本明細書において、「ボロン酸」とは、ホウ酸のヒドロキシ基を置換したものであり、以下の式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物を意味し得る：
【００２６】
【化４】
2020030048.tif 000005
（式中、Ｒ１〜Ｒ５は、それぞれ独立に、Ｈ、ボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基、チオール基、ｔｅｒｔ‐ブトキシカルボニルアミノ基、及び置換された又は置換されていないＣ１〜Ｃ１０（例えばＣ１〜Ｃ８、Ｃ１〜Ｃ６、又はＣ１〜Ｃ４）アルキル基、アルケニル基、又はアルキニル基からなる群から選択され、Ｒ６は、ボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基及びチオール基からなる群より選択される少なくとも一種の置換基により置換された又は置換されていないＣ１〜Ｃ１０（例えばＣ１〜Ｃ８、Ｃ１〜Ｃ６、又はＣ１〜Ｃ４）アルキル基、アルケニル基、又はアルキニル基からなる群から選択される）。式（Ｉ）の化合物中、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも一つはハロゲン基、好ましくはフッ素又は塩素、又は、ｔｅｒｔ‐ブトキシカルボニルアミノ基である。本明細書におけるボロン酸の例として、限定するものではないが、ブチルボロン酸、４−クロロフェニルボロン酸、４−フルオロフェニルボロン酸、及び３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］フェニルボロン酸が挙げられる。
【００２７】
本明細書において、「塩」とは、ある化合物の特定の置換基（例えば、ヒドロキシ基）に基づいて、塩基又は酸を用いて調製された活性化合物の塩をいう。塩は、使用した塩基又は酸により塩基性付加塩と酸付加塩とに分類できる。
【００２８】
「塩基性付加塩」としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、トリメチルアミン塩、エタノールアミン塩、ブロカイン塩等の脂肪族アミン塩、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン等のアラルキルアミン塩、ピリジン塩等の複素環芳香族アミン塩、アルギニン塩等の塩基性アミノ酸塩、テトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩等の第４級アンモニウム塩、及びアンモニウム塩等が挙げられる。
【００２９】
「酸付加塩」としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、過塩素酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩等の有機酸塩、メタンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等のスルホン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等の酸性アミノ酸等が挙げられる。
【００３０】
本発明において、ホウ酸若しくはボロン酸又はその塩の濃度は、ヒスタミンデヒドロゲナーゼによるヒスタミンの酸化に由来しない誤反応（本明細書では、単に「誤反応」とも記載する）を低減し得るものであれば特に限定されない。そのような濃度は、本願明細書の記載を参照して当業者であれば容易に決定することができる。ホウ酸若しくはボロン酸又はその塩の例として、測定時又は保管時、好ましくは測定時の終濃度として、５ｍＭ以上、１０ｍＭ以上、２０ｍＭ以上、２５ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、８０ｍＭ以上、又は１００ｍＭ以上であってよく、また１０００ｍＭ以下、５００ｍＭ以下、４００ｍＭ以下、３００ｍＭ以下、２００ｍＭ以下、１５０ｍＭ以下、又は１２０ｍＭ以下となるような濃度が挙げられる。例えば、測定時又は保管時の終濃度は、５ｍＭ〜１０００ｍＭ、２５ｍＭ〜３００ｍＭ、又は５０ｍＭ〜２００ｍＭであってよい。
【００３１】
本発明において、アルキル硫酸塩の種類は誤反応を低減し得るものであれば特に限定されないが、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸カリウム、ステアリル硫酸ナトリウム、ステアリル硫酸ナトリウムラウリル硫酸トリエタノールアミン、ラウリル硫酸アンモニウム等のアルキル硫酸エステル塩；及びラウレス硫酸ナトリウム、ラウレス硫酸トリエタノールアミン等のポリオキシエチレンアルキル硫酸塩からなる群から選択される一種以上であってよい。アルキル硫酸塩は、例えばラウリル硫酸ナトリウムである。
【００３２】
本発明において、アルキル硫酸塩の濃度は、誤反応を低減し得るものであれば特に限定されない。そのような濃度は、本願明細書の記載を参照して当業者であれば容易に決定することができる。アルキル硫酸塩の例として、測定時又は保管時、好ましくは測定時の終濃度として、０．０１％以上、０．０５％以上、好ましくは０．１％以上、０．５％以上、又は１％以上が挙げられ、また１０％以下、５％以下、又は２％以下が挙げられ、例えば約０．０５％〜２％又は約０．１〜１％となるような濃度が挙げられる。
【００３３】
ヒスタミンデヒドロゲナーゼを用いた比色法によるヒスタミン測定において、ヒスタミンデヒドロゲナーゼによるヒスタミンの酸化に由来しない誤反応の程度や誤反応の低減若しくは抑制の程度は、例えば実施例で記載した様な目視確認又はＩｌｌｕｓｔｒａｔｏｒ  ＣＳ２（Ａｄｏｂｅ社製）等のソフトウェアを用いて数値化された色調を比較することによって評価することができる。
【００３４】
一実施形態において、本発明のヒスタミン測定試薬は、メディエーターをさらに含み得る。本明細書において、「メディエーター」とは、ヒスタミンデヒドロゲナーゼによって触媒される酸化還元反応を、例えば、補因子として作用することによって、容易にする分子を指す。メディエーターは、好ましくは基質から発色試薬への電子の移行を促す物質である。反応系における適切なメディエーターは、当業者であれば容易に選択することができ、メディエーターの例として、限定するものではないが、１−メトキシＰＭＳ（１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート）、ＰＭＳ（フェナジニウムメチルサルフェート）、ＰＥＳ（フェナジニウムエチルサルフェート）及び１−メトキシＰＥＳ（１−メトキシ−５−エチルフェナジニウムエチルサルフェート）、ベンゾキノン及びその誘導体、フェリシアン化物（カリウム若しくはナトリウム塩）、フェロセン及びその誘導体、ジクロロフェノールインドフェノール、ナフトキノン及びその誘導体、フェナントロリンキノン及びその誘導体、フェナントレンキノン及びその誘導体、アントラキノン及びその誘導体、ルテニウム塩、ルテニウム錯体等が挙げられ、好ましくは１−メトキシＰＭＳ、ＰＭＳ、ＰＥＳ及び１−メトキシＰＥＳであり、さらに好ましくは１−メトキシＰＭＳである。一実施形態において、本発明の測定試薬は、測定時又は保管時の終濃度として、１μＭ以上、１０μＭ以上、２０μＭ以上、２５μＭ以上、３０μＭ以上、又は３５μＭ以上、８０μＭ以下、７０μＭ以下、６０μＭ以下、５０μＭ以下、４５μＭ以下、例えば１μＭ〜８０μＭ、３５μＭ〜４５μＭ又は約４２μＭのメディエーターを含む。
【００３５】
一実施形態において、本発明のヒスタミン測定試薬は、発色試薬をさらに含み得る。発色試薬は、ヒスタミンデヒドロゲナーゼによってヒスタミンが酸化された際に発色するものであることが好ましく、このような発色を観察することによって、簡便にヒスタミンの存在を検出することができる。発色試薬の例として、テトラゾリウム塩、例えばＷＳＴ−４（２−ベンゾチアゾリル−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−［４−（２−スルホエチルカルバモイル）フェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム）、ＷＳＴ−５（２，２’−ジベンゾチアゾリル−５，５’−ビス［４−ジ（２−スルホエチル）カルバモイルフェニル］−３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ジテトラゾリウム、二ナトリウム塩）、ＷＳＴ−８（２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）、ＮＢＴ（３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド］）、ＩＮＴ（２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド）、及びＸＴＴ（２，３−ビス（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルフォフェニル）−５−［（フェニルアミノ）カルボニル］−２Ｈ−テトラゾリウム水酸化物）が挙げられる。ＷＳＴ−４、ＷＳＴ−５、ＷＳＴ−８、ＮＢＴ、ＩＮＴ、及びＸＴＴ等のテトラゾリウム塩は、還元されるとホルマザン色素を生じる。この色素を検出することによりヒスタミンを検出することが可能となる。一実施形態において、ヒスタミンが酸化される際の発色試薬の発色反応は、前記メディエーターを介して促進される。一実施形態において、本発明の測定試薬は、測定時又は保管時の終濃度として、０．１ｍＭ以上、０．２ｍＭ以上、０．３ｍＭ以上、０．４ｍＭ以上、又は０．５ｍＭ以上、１０ｍＭ以下、５ｍＭ以下、又は２ｍＭ以下、例えば０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、０．５ｍＭ〜２ｍＭ又は１．１ｍＭの発色試薬を含む。
【００３６】
一実施形態において、本発明のヒスタミン測定試薬は、バッファーをさらに含み得る。バッファーとしては、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＥＰＰＳ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、及びＨＥＰＰＳＯ、ＡＣＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳＯ、及びＰＩＰＥＳからなる群から選択される双性イオンを有し、カルボキシ基を有さない化合物を含む緩衝液、Ｔｒｉｓ又は炭酸緩衝液が挙げられる。双性イオンを有し、カルボキシ基を有さない化合物を含む緩衝液は、好ましくはＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＥＰＰＳ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、及びＨＥＰＰＳＯからなる群から選択され、さらに好ましくは、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、及びＥＰＰＳからなる群より選択される。一実施形態において、緩衝液は、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＥＰＰＳ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＡＣＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳＯ、及びＰＩＰＥＳからなる群、好ましくはＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＥＰＰＳ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、及びＨＥＰＰＳＯからなる群から選択される双性イオンを有し、スルホ基を有する化合物を含む緩衝液、Ｔｒｉｓ又は炭酸緩衝液であり得る。一実施形態において、緩衝液は、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、及びＭＯＰＳＯからなる群、好ましくはＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、及びＨＥＰＰＳＯからなる群から選択される双性イオンを有し、スルホ基を有し、かつ２位にヒドロキシ基を有する化合物を含む緩衝液、Ｔｒｉｓ又は炭酸緩衝液であり得る。バッファーのｐＨとしては６．０〜１１．０程度が好ましく、より好ましくは７．０以上、８．０以上又は８．５以上であってよく、また１０．０以下又は９．５以下であってよく、例えば約８．５〜９．５であってよい。バッファーの濃度としては、測定時又は保管時、好ましくは測定時の終濃度として、例えば１ｍＭ以上、１０ｍＭ以上、又は１５０ｍＭ以上であってよく、３００ｍＭ以下、２００ｍＭ以下、又は１５０ｍＭ以下、例えば１ｍＭ〜３００ｍＭ、５０ｍＭ〜１５０ｍＭ、又は約１００ｍＭであってよい。
【００３７】
一実施形態において、本発明のヒスタミン測定試薬又は本発明のキットは、ヒスタミンを含む可能性がある試料からヒスタミンを抽出するための抽出液をさらに含み得る。抽出液は公知のものを用いればよく、例えばトリクロロ酢酸、メタノール、又は中性リン酸緩衝液（特開２００１−０９９８０３号）、又はキレート剤を含む抽出液（特開２００４−１２９５９７号）を使用することができ、水又は各種緩衝液を使用することもできる。また、本発明の測定試薬又は本発明のキットは、さらなる成分（例えば、糖（ラクトース、マルトース、ガラクロース、スクロース、グルコース、トレハロース等）、澱粉（可溶性澱粉を含む）、デキストリン（分岐デキストリン、シクロデキストリン、高度分岐環状デキストリン（クラスターデキストリン）を含む））及び／又は使用説明書を含んでもよい。
【００３８】
一実施形態において、本発明のキットは、試料採取部、及び反応部を含み得る。試料採取部は、ヒスタミンを含む可能性がある試料を採取可能なものであれば特に限定されないが、例えば、綿棒、スポンジ、多孔性プラスティック、濾紙、不織布、スポイトが挙げられる。試料採取部は、試料採取の際の簡便性の点から、例えば棒状であることが好ましく、特に好ましくは、繊維状やスポンジ状のふき取り部分を備えた棒状の形状、例えば綿棒のような形状である。
【００３９】
反応部は、試料採取部によって採取された試料にヒスタミンが存在する場合に、反応が生ずる部位である。一実施形態において、反応部は、ヒスタミン測定試薬を含む。一実施形態において、反応部に含まれるヒスタミン測定試薬はヒスタミンデヒドロゲナーゼ及び比色法用試薬、又は抗ヒスタミン抗体及びイムノクロマト用試薬を含む。一実施形態において、本明細書に記載のヒスタミンデヒドロゲナーゼ及び前記ホウ酸若しくはボロン酸又はその塩、又はアルキル硫酸ナトリウムは、上記緩衝液等の溶液中に含まれる形で、又は凍結乾燥物として含まれる形で、本発明のキット中の試料採取部又は反応部に含まれ得る。反応部は、好ましくは透明の容器であり、これにより目視により発色の有無を観察し、ヒスタミンを検出することができる。
【００４０】
一実施形態において、本発明のキットは、試料採取部、及び反応部に加えて抽出部を含み得る。抽出部は、試料採取部によって採取された試料にヒスタミンが存在する場合に、このヒスタミンを抽出液中に抽出する部位である。一実施形態において、抽出部は、ヒスタミン測定試薬を含む。一実施形態において、抽出部に含まれるヒスタミン測定試薬はヒスタミンデヒドロゲナーゼ及び比色法用試薬、又は抗ヒスタミン抗体及びイムノクロマト用試薬を含む。一実施形態において、本明細書に記載のヒスタミンデヒドロゲナーゼ及び前記ホウ酸若しくはボロン酸又はその塩、又はアルキル硫酸ナトリウムは、上記緩衝液等の溶液中に含まれる形で、又は凍結乾燥物として含まれる形で、本発明のキット中の抽出部に含まれ得る。抽出部で抽出されたヒスタミンを含む試料を反応部に移し、反応を行うことができる。
【００４１】
本明細書における、ヒスタミンの「検出」には、ヒスタミンの有無の検出に加えて、ヒスタミンの定量も含まれる。ヒスタミンの定量は、発色基質を用いる場合には発色の程度に基づいて行うことができる。例えば、既知濃度のヒスタミンを含むサンプルを複数、例えば２以上、好ましくは３以上、４以上、５以上用いて、これらとの比較により、好ましくは検量線に基づいて定量を行うことができる。
【００４２】
一実施形態において、本発明の測定試薬又は本発明のキットは、ヒスタミンデヒドロゲナーゼ、誤反応抑制剤（例えばホウ酸若しくはボロン酸又はその塩）、メディエーター、及び発色試薬を含み得る。別の実施形態において、本発明のキットは、ヒスタミンデヒドロゲナーゼ、誤反応抑制剤（例えばホウ酸若しくはボロン酸又はその塩）、及びメディエーターを含み得る。
【００４３】
ある実施形態において、本発明はヒスタミン測定装置を提供する。この装置は、試料採取部、反応部、センサー部及び使用説明書を含む。前記反応部はヒスタミンデヒドロゲナーゼを含みうる。前記使用説明書は検体からのサンプリングを非侵襲的に行うことを記載したものである。前記センサー部はヒスタミンの電気化学的測定用のセンサーを備えている。この装置は、ヒスタミン食中毒検査用に使用することができる。
【００４４】
２．ヒスタミンを検出するための方法
一態様において、本発明は、非侵襲的にサンプリングを行い、採取した試料について、（ｉ）ヒスタミンデヒドロゲナーゼ、及び（ｉｉ）誤反応抑制剤を使用する、ヒスタミンを検出するための方法を提供する。誤反応抑制剤としては、（ｉｉ−ａ）ホウ酸若しくはボロン酸又はその塩、又は（ｉｉ−ｂ）アルキル硫酸塩等が挙げられるが、本明細書に記載の他の誤反応抑制剤を使用してもよい。
【００４５】
本発明のヒスタミンを検出するための方法は、ヒスタミンをヒスタミンデヒドロゲナーゼにより酸化する工程（以下、「酸化工程」とも記載する）、及びヒスタミンデヒドロゲナーゼによるヒスタミンの酸化を検出する工程（以下、「検出工程」とも記載する）を含み得る。
【００４６】
酸化工程は、当業者に公知の方法により行うことができる。例えば、ヒスタミンを含む可能性がある試料を、本明細書に記載のヒスタミンデヒドロゲナーゼを含む溶液と混合することにより行うことができる。
【００４７】
検出工程もまた、当業者に公知の方法により行うことができる。ヒスタミンの酸化の検出は、例えば発色試薬を用いて、任意にメディエーターもさらに用いて、行うことができる。酸化工程の有無又は程度に基づいて、ヒスタミンの有無を検出し、又はその存在量を測定することができる。
【００４８】
本発明のヒスタミンを検出するための方法は、酸化工程及び検出工程に加えて、非侵襲的サンプル採取工程及び／又はヒスタミン抽出工程を、酸化工程の前に含み得る。
【００４９】
サンプル採取工程では、ヒスタミンを測定しようとする試料から、本発明の方法に適した形で、すなわち非侵襲的に、サンプリングを行う。サンプリング（試料採取ともいう）は、例えば、綿棒、スポンジ、多孔性プラスティック、濾紙、不織布、スポイト等の試料採取部を、特に好ましくは、繊維状やスポンジ状のふき取り部分を備えた棒状の形状、例えば綿棒をヒスタミンを測定しようとする試料に非侵襲的に接触させることにより行うことができる。
【００５０】
ヒスタミン抽出工程では、前記の非侵襲的に採取されたサンプルからヒスタミンを抽出することにより、後の酸化工程及び検出工程を容易にする。ヒスタミン抽出工程は、ヒスタミンを測定しようとする試料（例えば、本発明の方法が非侵襲的サンプル採取工程を含む場合には、上記試料が採取された採取部）を、ヒスタミン抽出液と混合することにより行うことができる。ヒスタミン抽出液は公知のものを用いればよく、例えばトリクロロ酢酸、メタノール、又は中性リン酸緩衝液（特開２００１−０９９８０３号）、又はキレート剤を含む抽出液（特開２００４−１２９５９７号）、水又は各種緩衝液を使用することもできる。
【００５１】
ある実施形態において、本発明の方法又はキットを用いることにより、ヒスタミン食中毒を予防又は回避しうる。すなわち、ある実施形態では、本発明の方法又はキットを用いることにより検体を測定した結果、検体からヒスタミン食中毒を引き起こしうる量のヒスタミンが検出された場合には、当該検体を、食しない、食品加工しない、又は廃棄処分とすることができる。またある実施形態において、本発明の方法及びキットを用いることにより、魚を入荷するための受け入れ検査のときに、迅速かつ簡便にヒスタミン測定を行い、検査した魚を受け入れるか否かの判断をすることができる。すなわち、ある実施形態では、本発明の方法又はキットを用いることにより魚検体を測定した結果、魚検体からヒスタミン食中毒を引き起こしうる量のヒスタミンが検出された場合には、当該魚検体を、受け入れないことができる。また、受け入れ検査段階でヒスタミンが微量検出された検体でも、その後の品質管理、温度管理、加工調理方法における安全管理等を徹底すれば、ヒスタミン量の増大を伴うことなく、加工食品を製造したり、魚肉を食事用に提供することが可能となる。
【００５２】
ヒスタミン産生菌で汚染された食材を検出するためには、可食部におけるヒスタミン量が一定量を超えていないことを確認することが重要であるが、ヒスタミン含有量は、固定的なものではなく、ヒスタミン産生菌により刻々と生産されるものである。初期段階で可食部においてヒスタミン量が少なかった場合でも、その検体にヒスタミン産生菌が存在し、且つ保存状態が劣悪であった場合には、受け入れ検査時と加工時でのヒスタミン量に乖離が生じる恐れがある。一方で、ヒスタミン産生菌による汚染がない検体では、経時的なヒスタミン量の増加はほとんどないと考えられる。原料受け入れ検査におけるヒスタミン検査で重要なことは、検体の可食部にヒスタミンがどの程度含まれているかに加え、今後経時的にヒスタミン量が増えるリスクを有する検体であるか否か、すなわち、検体がヒスタミン産生菌に汚染されているか否かを感度良く且つ迅速に確認することである。したがってある実施形態では本発明は、検体がヒスタミン産生菌に汚染されているか否かを確認する方法を提供する。本発明の方法又はキットを用いることにより、可食部におけるヒスタミン量が微量である段階で、早期にリスクを発見することができ、結果に応じて食材の取扱い方法を決定することができる。たとえば、ある実施形態では、本発明の方法又はキットを用いることにより魚検体を測定した結果、魚検体から微量のヒスタミンが検出された場合には、当該魚検体につき、ヒスタミン産生菌がさらに増殖しない条件で当該魚を品質管理し、温度管理し、加工調理することができる。別の実施形態では、本発明の方法又はキットを用いることにより魚検体を測定した結果、魚検体から微量のヒスタミンが検出された場合には、当該魚検体につき、ヒスタミン産生菌がさらに増殖しない条件で当該魚を品質管理し、温度管理し、加工調理するよう指導することができる。このように、本発明の方法又はキットにより、受け入れ検査後、その検査結果に応じて魚等の食材の取り扱い方法を決定することができる。
【００５３】
ある実施形態において、ヒスタミン食中毒を引き起こしうる量のヒスタミンとは、５０ｐｐｍより高い濃度、６０ｐｐｍ以上、７０ｐｐｍ以上、８０ｐｐｍ以上、９０ｐｐｍ以上、又は１００ｐｐｍ以上の濃度のヒスタミンをいう。ある実施形態において、ヒスタミン産生菌がさらに増殖しない条件での品質管理や、温度管理を必要とする、微量のヒスタミンとは、２０ｐｐｍ以下、３０ｐｐｍ以下、４０ｐｐｍ以下、例えば５０ｐｐｍ未満の濃度のヒスタミンをいう。食品またはその可食部において許容可能なヒスタミンの基準値は日本では未設定であるが、諸外国では例えば主な魚類及び水産加工品ではＣｏｄｅｘやＥＵでは１００ｐｐｍ、アメリカでは５０ｐｐｍという基準値が設けられている。当業者であれば、本明細書の記載や各国での基準値に基づき、ヒスタミン量を指標として検体を取り扱うための自主的な管理基準値を適宜設定することができる。
【００５４】
本発明により、検体を破壊することなく、当該検体に含まれるヒスタミンを測定することができる。ある実施形態において、本発明により、迅速かつ簡便にヒスタミンを測定することができる。例えばある実施形態において、本発明により、魚や鶏肉等の検査頻度を高めることができ、別の実施形態では、本発明により全数検査が可能となる。
【実施例】
【００５５】
以下の実施例は、例示のみを意図したものであり、何ら本発明の技術的範囲を限定することを意図するものではない。特に断らない限り、試薬は、市販されているか、又は当技術分野で慣用の手法、公知文献の手順に従って入手又は調製する。
【００５６】
＜実施例１：検量線の作成＞
２％トレハロース、１．０８ｍＭ  ＮＢＴ、４１．５μＭ  １−メトキシＰＭＳ及び０．１２８Ｕ  ヒスタミンデヒドロゲナーゼ（特開２００１−１５７５９７に従って作製）を含むヒスタミン測定試薬を、測定チューブに０．２ｍＬずつ分取し、凍結乾燥した。イワシ一匹を三枚におろし、包丁で細かくペースト状にミンチにして均一化し、ポリスチレン製の試験管に１ｇを採取した。試験管に１ｍＬの滅菌水を添加し、スパーテルにて混合した後にボルテックスミキサーにて１０秒間攪拌した。この溶液を、綿棒（綿球部φ４．５ｍｍ程度）を用いてサンプリングした後、検量線作成のために、各種既知濃度のヒスタミン溶液を調製後、１０μＬを同綿棒に添加した。
【００５７】
ｐＨを９．０に調整した０．１Ｍ四ホウ酸ナトリウム十水和物及び０．１Ｍクエン酸二ナトリウム三水和物を含む０．１Ｍ  ＨＥＰＰＳＯバッファー  ０．４ｍＬを抽出液として充填した容器に綿棒を押し込み、抽出液を全量測定チューブに振り落とし、ヒスタミン測定試薬と反応させた。
【００５８】
結果を図１に示す。図１に示される通り、目視によりサンプル中に含まれるヒスタミンを検出でき、そのおよその濃度も測定できることがわかった。
【００５９】
図１に示すような目視における判断を数値データでも確認する目的で、以下の方法により、色調の数値化を行った。すなわち、発色後の測定試薬チューブの写真を、ＳＴＹＬＵＳ  ＴＧ−４  Ｔｏｕｇｈ（オリンパス社製）にて撮影した。その後、測定チューブの画像の中央付近の色を、ＣＭＹＫ（シアン、マゼンタ、イエロー、ブラック）に数値変換した。具体的には、Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｏｒ  ＣＳ２（Ａｄｏｂｅ社製）を使用し、ツールウィンドウのスポイトツールにより、撮影された測定チューブ中央付近を選択し、カラーウィンドウにてＣＭＹＫカラーコードに変換した数値（％）を確認することで、数値化した。数値化は、すべて「Ｋの値」を用いた。０〜１００ｐｐｍヒスタミン存在下において、Ｋ値とヒスタミン濃度は良好な相関性が得られ、数値化によりヒスタミンを定量することが可能であると示された。
【００６０】
＜実施例２：サンプルのヒスタミン含有量測定＞
２％トレハロース、１．０８ｍＭ  ＮＢＴ、４１．５μＭ  １−メトキシＰＭＳ及び０．１２８Ｕ  ヒスタミンデヒドロゲナーゼ（特開２００１−１５７５９７に従って作製）を含むヒスタミン測定試薬を、測定チューブに０．２ｍＬずつ分取し、凍結乾燥した。
【００６１】
イワシまたはアジを用意し、綿棒（綿球部φ４．５ｍｍ程度）を用いて口の先端から約５ｃｍ及び肛門から約２ｃｍの挿入、鰓孔からエラ及び魚体表面のふき取りを行った。魚検体は、口から５ｃｍの綿棒の挿入により、口、口腔、食道、及び胃の一部についてサンプリングを行うことができた。また肛門から２ｃｍの綿棒の挿入により、肛門、腸の一部のサンプリングを行うことができた。他の実験でも同様である。
【００６２】
その後、内臓を除去した直後の腹腔内、洗浄後の腹腔内、三枚におろした身そのものまたは中骨回りの身をそれぞれ綿棒でふき取った。更に、可食部を包丁で細かくペースト状にミンチにして均一化し、ポリスチレン製の試験管に１ｇを採取した。試験管に１ｍＬの滅菌水を添加して、スパーテルにて混合した後にボルテックスミキサーにて１０秒間攪拌した溶液を綿棒にて採水した。ｐＨを９．０に調整した０．１Ｍ四ホウ酸ナトリウム十水和物及び０．１Ｍクエン酸二ナトリウム三水和物を含む０．１Ｍ  ＨＥＰＰＳＯバッファー  ０．４ｍＬを抽出液として充填した容器を、ヒスタミン測定試薬の入った上部にセットした。各箇所をサンプリング済の綿棒を抽出液容器内に押し込み、抽出液を全量測定チューブに振り落とし、ヒスタミン測定試薬と反応させた。
【００６３】
ミンチについて、チェックカラーヒスタミン（キッコーマンバイオケミファ社製）に従って試験して、ヒスタミン含有量を測定した結果、両サンプルともにヒスタミンは検出されなかった（一匹につき試行回数２反復で実施）。
【００６４】
綿棒を用いて魚の各種部位についてサンプリングを行い、ヒスタミンを測定した結果を図２に示す。
【００６５】
また、図２に示すような目視における判断を数値化データでも確認する目的で、実施例１と同様にして、色調の数値化を行った。数値化はすべて「Ｋの値」を用い、１５分放置後の数値を以下の表１に示す。
【００６６】
【表１】
2020030048.tif 000006
【００６７】
図２及び表１に示される通り、魚の様々な部位において発色は見られず、ヒスタミンが不検出であることを正確に測定できることが確認された。
【００６８】
＜実施例３：加速試験によるヒスタミン検出サンプルの測定＞
２％トレハロース、１．０８ｍＭ  ＮＢＴ、４１．５μＭ  １−メトキシＰＭＳ及び０．１２８Ｕ  ヒスタミンデヒドロゲナーゼ（特開２００１−１５７５９７に従って作製）を含むヒスタミン測定試薬を、測定チューブに０．２ｍＬずつ分取し、凍結乾燥した。
【００６９】
サンプルは、イワシまたはアジを三匹用意した。加速試験前に、綿棒を用いて非侵襲にてサンプリング可能な、口の先端から約５ｃｍ、肛門から約２ｃｍの挿入、魚体表面、エラ（アジのみ）のふき取りを行いサンプリングした。サンプリングした後、すべてのサンプルを２０℃にて１８時間放置した。放置後のサンプルについて、上記と同様、始めに非侵襲で可能な部位を、綿棒を用いてサンプリングした。具体的には、口の先端から約５ｃｍ及び肛門から約２ｃｍの挿入、エラ及び魚体表面のふき取り及びドリップの採水（アジのみ）を行った。ドリップは採水できたサンプルのみ実施した。
【００７０】
その後、内臓を除去した直後の腹腔内、洗浄後の腹腔内、三枚におろした身そのものまたは中骨回りの身をそれぞれ綿棒でふき取った。更に、可食部を包丁で細かくペースト状にミンチにして均一化し、ポリスチレン製の試験管に１ｇを採取した。試験管に１ｍＬの滅菌水を添加して、スパーテルにて混合した後にボルテックスミキサーにて１０秒間攪拌した溶液を綿棒にて採水した。
【００７１】
ｐＨを９．０に調整した０．１Ｍ四ホウ酸ナトリウム十水和物及び０．１Ｍクエン酸二ナトリウム三水和物を含む０．１Ｍ  ＨＥＰＰＳＯバッファー  ０．４ｍＬを抽出液として充填した容器を、ヒスタミン測定試薬の入った上部にセットした。各箇所をサンプリング済の綿棒を抽出液容器内に押し込み、抽出液を全量測定チューブに振り落とし、ヒスタミン測定試薬と反応させた。また、ミンチについては、チェックカラーヒスタミンを用いてヒスタミン量を定量した。
【００７２】
２０℃にて保存する前の結果を図３（Ａはイワシ、Ｂはアジ）に示す。また、図３に示すような目視における判断を数値化データでも確認する目的で、実施例１と同様にして、色調の数値化を行った。数値化はすべて「Ｋの値」を用い、１５分放置後の数値を以下の表２に示す。
【００７３】
【表２】
2020030048.tif 000007
【００７４】
図３に及び表２に示すように、加速試験前のサンプルからは発色が見られず、数値化した値を実施例１の検量線と比較すると、どの部位においても１０ｐｐｍ以下となり、実施例２の結果とも一致した。
【００７５】
２０℃にて保存後のサンプルをチェックカラーヒスタミンにて測定したヒスタミン量を表３に、綿棒にて測定した結果を図４に示す。
【００７６】
【表３】
2020030048.tif 000008
【００７７】
また、図４に示すような目視における判断を数値化データでも確認する目的で、実施例１と同様にして、色調の数値化を行った。数値化はすべて「Ｋの値」を用い、１５分放置後の数値を以下の表４に示す。
【００７８】
【表４】
2020030048.tif 000009
【００７９】
表４に示す通り、２０℃にて１８時間保存したサンプルからはすべてヒスタミンが検出され、図４のように、綿棒でサンプリングしたほぼすべての部位からも発色が確認された。
【００８０】
実施例１の検量線及び表４の数値から算出した、各ミンチにおけるヒスタミン濃度（抽出時、２倍希釈されることを考慮した値）を表５に示す。
【００８１】
【表５】
2020030048.tif 000010
【００８２】
表３及び表５に示す通り、チェックカラーヒスタミンによる定量値と綿棒による発色とでおおよその相関が得られた。
【００８３】
ヒスタミンが不検出であると考えられる、加速試験前のサンプル（非侵襲的にサンプリングしたもの）では発色が見られなかった一方で、２０℃にて保存後のサンプル（非侵襲的にサンプリングしたもの）ではヒスタミン検出が低濃度（十数ｐｐｍ程度）の場合にも、口や鰓孔、肛門、ドリップで濃い発色が確認された。これは、ヒスタミン産生菌が内臓、主に腸内で繁殖し、可食部に徐々に移行することから、内臓に近接した部位での測定は、可食部における検査と比較して、高感度に検出することができるからであると考えられる。本方法により非侵襲のサンプリングで、可食部に存在する微量のヒスタミンを検出することができることが示された。これにより、サンプルの全数検査や、経時的なヒスタミン量の変化を測定することが可能となり、大規模な食中毒の防止に繋がると考えられる。
【００８４】
＜実施例４＞
種々のヒスタミン測定を行う中で、一部の実験（下記に記載）において、ヒスタミン及びヒスタミンデヒドロゲナーゼを含まない系を用いた場合でも多少の発色が認められた。これは誤反応によるものと考えられる。誤発色の程度は、比色法を用いた目視判定で、約１０ｐｐｍ程度に相当するものであった。この誤差は、ヒスタミン食中毒検査のためのヒスタミン測定では許容できると考えられるが、より正確な比色法でのヒスタミン測定のために、誤発色を抑制する物質について、以下の検討を行った。
【００８５】
＜実験１：発色試薬の検討＞
トレハロース２％、発色試薬（１．０８ｍＭ  ＷＳＴ−４、ＷＳＴ−５、ＷＳＴ−８、ＩＮＴ、ＮＢＴ、又はＸＴＴ）、４１．５μＭ  １−メトキシＰＭＳ、及び０．１２８Ｕ  ヒスタミンデヒドロゲナーゼ（特開２００１−１５７５９７に従って作製）を含むヒスタミン測定試薬を、測定チューブに０．２ｍＬずつ分取し、凍結乾燥した。検量線の作成のために、各種既知濃度のヒスタミン溶液を調製後、０．１ｍＬを綿棒に添加した。また、サンプルについては、柵状のマグロのドリップ０．１ｍＬを綿棒に添加するか、又は柵状のマグロの表面を綿棒にて拭き取った。
【００８６】
ｐＨを９．０に調整したＥＤＴＡ（２Ｎａ）０．４ｍＬを抽出液として充填した容器に綿棒を押し込み、さらにこれらを振り落として測定チューブに移し、抽出液とヒスタミン測定試薬を反応させた。
【００８７】
その結果、ＷＳＴ−４、ＷＳＴ−５、ＷＳＴ−８、ＮＢＴ、ＩＮＴ、及びＸＴＴのうちいずれの発色試薬を用いても目視によりサンプル中に含まれるヒスタミンを検出でき、そのおよその濃度も測定できることがわかった。そこで目視における判断を数値データでも確認する目的で、実施例１と同じ方法により、色調の数値化を行った。結果を以下の表に示す。
【００８８】
【表６】
2020030048.tif 000011
【００８９】
また、以下の通りヒスタミン及びヒスタミンデヒドロゲナーゼを含まない系で試験を行った。具体的には、ＥＤＴＡ（２Ｎａ）を０．１Ｍ、ｐＨ８．５に調製し、これを０．４ｍＬ、トレハロース２％、１．０８ｍＭ  ＮＢＴ、及び４１．５μＭ  １−メトキシＰＭＳを含む試薬０．２ｍＬを凍結乾燥したものに添加した。混合後、室温で６０分放置し、発色の程度を確認した。その結果、ヒスタミン及びヒスタミンデヒドロゲナーゼを含まない系でも多少の発色（誤反応）が認められた。この目視における判断を数値データでも確認する目的で、上記と同様にして、色調の数値化を行った。数値化は、すべて「Ｋの値」を用い、６０分放置の前後の色調の差は２７．４５であった。
【００９０】
＜実験２：バッファーの検討１＞
実験１において、ヒスタミンを含まないサンプルについても発色が認められたことから、この誤反応を抑制又は低減するためにバッファーの検討を行った。
【００９１】
ＥＤＴＡ（２Ｎａ）、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、及びＣＡＰＳを、全て０．１Ｍ、ｐＨ８．５に調製し、これを０．４ｍＬ、トレハロース２％、１．０８ｍＭ  ＮＢＴ、及び４１．５μＭ  １−メトキシＰＭＳを含む試薬０．２ｍＬを凍結乾燥したものに添加した。混合後、室温で６０分放置し、発色の程度を確認した。その結果、バッファーの使用により誤発色の抑制が見られた。この目視における判断を数値データでも確認する目的で、実施例１と同様にして、色調の数値化を行った。数値化は、すべて「Ｋの値」を用い、６０分放置の前後の色調の差を以下の表に示す。
【００９２】
【表７】
2020030048.tif 000012
【００９３】
上記の表に示される通り、ヒスタミンを含まないサンプルについてみられる誤発色は、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、及びＥＰＰＳバッファーを用いた実験系において、顕著に抑制された。また、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＴＡＰＳ及びＣＨＥＳについても、誤反応を抑制する傾向が認められた。
【００９４】
＜実験３：バッファーの検討２＞
ＥＤＴＡ（２Ｎａ）、炭酸水素ナトリウム／炭酸二ナトリウム、ホウ酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン全て０．１Ｍ、ｐＨ９．０となるように調製し、これを０．４ｍＬ、トレハロース２％、１．０８ｍＭ  ＮＢＴ、及び４１．５μＭ  １−メトキシＰＭＳを含む試薬０．２ｍＬを凍結乾燥したものに添加した。混合後、室温で６０分放置し、発色の程度を確認した。
【００９５】
その結果、誤発色の抑制が見られた。この目視における判断を数値データでも確認する目的で、実施例１と同様にして、色調の数値化を行った。数値化は、すべて「Ｋの値」を用い、６０分放置の前後の色調の差を以下の表に示す。
【００９６】
【表８】
2020030048.tif 000013
【００９７】
上記の表に示される通り、炭酸及びホウ酸は誤反応抑制作用を示した。
【００９８】
＜実験４：サンプル存在下での誤反応の抑制１＞
包丁を用いて細かくミンチ状にした魚肉サンプル（サバ）１ｇを、１）０．１Ｍ  ＨＥＰＰＳＯ溶液（ｐＨ８．５）、２）０．１Ｍ  ＨＥＰＰＳＯ溶液（ｐＨ９．０）、３）２５ｍＭホウ酸入り０．１Ｍ  ＨＥＰＰＳＯ溶液（ｐＨ８．５）、及び４）２５ｍＭホウ酸入り０．１Ｍ  ＨＥＰＰＳＯ溶液（ｐＨ９．０）のいずれか１ｍｌと混合し、スパーテルにて十分に混合した後、ボルテックスミキサーを用いて１０秒間攪拌して抽出を行った。抽出液を綿棒にて採水し、予め０．４ｍＬの上記１）〜４）の溶液を入れたポリスチレン製の試験管内で綿棒を懸濁し、全量をトレハロース２％、１．０８ｍＭ  ＮＢＴ、及び４１．５μＭ  １−メトキシＰＭＳを含む試薬０．２ｍＬを凍結乾燥したものに添加した。反応後、室温で６０分放置し、発色の程度を確認した。ブランク対照としては、上記試薬を０．１Ｍ  ＨＥＰＰＳＯ溶液（ｐＨ８．５又はｐＨ９．０）０．４ｍＬに溶解させた。なお、上記魚肉サンプルは、チェックカラーヒスタミン（キッコーマンバイオケミファ社製）を用いて事前にヒスタミン含量を測定し、ヒスタミンが検出されなかったものを用いた。本実験系ではヒスタミンデヒドロゲナーゼを反応系中に含んでおらず、すなわち、魚肉サンプル中にヒスタミンは含まれていない上に、仮に微量のヒスタミンが反応系中に存在したとしても、ヒスタミンデヒドロゲナーゼを含まないため、ヒスタミンが発色をもたらすことはないと考えられる。
【００９９】
その結果、ヒスタミン及びヒスタミンデヒドロゲナーゼ非存在下でも着色が認められた。このことから、ＨＥＰＰＳＯにより試薬由来の誤反応を抑えても、さらに反応系中に魚肉などのサンプルを加えた際には、ヒスタミンに由来しない誤反応と思われる発色を完全に抑えることはできなかった。一方、ＨＥＰＰＳＯにさらにホウ酸を加えることによって、魚肉などのサンプルを加えた場合であっても、ヒスタミンに由来しない誤反応と思われる発色を顕著に抑制することができた。
【０１００】
また、この目視における判断を数値データでも確認する目的で、実施例１と同様にして、色調の数値化を行った。数値化は、すべて「Ｋの値」を用い、６０分放置の前後の色調の差を以下の表に示す。
【０１０１】
【表９】
2020030048.tif 000014
【０１０２】
以上の通り、誤発色は、ｐＨ８．５及び９．０いずれにも見られ、多い場合ではヒスタミン標準品を用いて発色を行わせた場合の２５ｐｐｍ程度に相当する発色を示し、誤発色がヒスタミン検出の判断を誤らせうることが示唆された。また、誤発色はホウ酸を添加することによって抑制できることが示唆された。
【０１０３】
＜実験５：サンプル存在下での誤反応の抑制２＞
ミンチ状にした魚肉サンプル（サバ）  １ｇを、１）対照、又は２５ｍＭの以下のボロン酸：２）フェニルボロン酸、３）４−クロロフェニルボロン酸、４）４−フルオロフェニルボロン酸、５）ブチルボロン酸、又は６）３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］フェニルボロン酸を含む０．１Ｍ  ＨＥＰＰＳＯ（ｐＨ８．５）１ｍＬにて抽出した。抽出は、スパーテルにて魚肉と各抽出液を十分に混合した後に、ボルテックスミキサーを用いて１０秒間攪拌した。抽出液を綿棒にて採水し、予め０．４ｍＬの上記１）〜６）の溶液を入れたポリスチレン製の試験管内で綿棒を懸濁し、全量をトレハロース２％、１．０８ｍＭ  ＮＢＴ、及び４１．５μＭ  １−メトキシＰＭＳを含む試薬０．２ｍＬを凍結乾燥したものに添加した。反応後、室温で６０分放置し、発色の程度を確認した。
【０１０４】
その結果、誤発色の抑制が見られた。この目視における判断を数値データでも確認する目的で、実施例１と同様にして、色調の数値化を行った。数値化は、すべて「Ｋの値」を用い、６０分放置の前後の色調の差を以下の表に示す。
【０１０５】
【表１０】
2020030048.tif 000015
【０１０６】
上記の表に示される通り、ボロン酸を加えることによって、サンプル由来の誤反応を強く抑制することができ、特に３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］フェニルボロン酸を加えた場合にその顕著は効果であった。
【０１０７】
＜実験６：ホウ酸濃度の検討＞
ミンチ状にした魚肉サンプル（サバ）  ２ｇを、０ｍＭ〜１００ｍＭの各濃度のホウ酸を含む０．１Ｍ  ＨＥＰＰＳＯ（ｐＨ８．５）２ｍＬにて実験５と同様の方法で抽出した。０．４ｍＬの抽出液に綿棒を懸濁し、全量をトレハロース２％、１．０８ｍＭ  ＮＢＴ、及び４１．５μＭ  １−メトキシＰＭＳを含む試薬０．２ｍＬを凍結乾燥したものに添加した。反応後、室温で６０分放置し、発色の程度を確認した。その結果、ホウ酸は濃度依存的に誤反応を低減した。
【０１０８】
この目視における判断を数値データでも確認する目的で、実施例１と同様にして、色調の数値化を行った。数値化は、すべて「Ｋの値」を用い、６０分放置の前後の色調の差を以下の表に示す。
【０１０９】
【表１１】
2020030048.tif 000016
【０１１０】
以上の通り、ホウ酸は濃度依存的に誤反応を低減した。
【０１１１】
＜実験７：ＳＤＳによる誤反応の抑制＞
ミンチ状にした魚肉サンプル（サバ）  ２ｇを、０％〜１％の各濃度のＳＤＳを含む０．１Ｍ  ＨＥＰＰＳＯ（ｐＨ８．０）２ｍＬにて実験５と同様の方法で抽出した。０．４ｍＬの抽出液に綿棒を懸濁し、全量をトレハロース２％、１．０８ｍＭ  ＮＢＴ、及び４１．５μＭ  １−メトキシＰＭＳを含む試薬０．２ｍＬを凍結乾燥したものに添加した。反応後、室温で６０分放置し、発色の程度を確認した。その結果、ＳＤＳも誤反応を低減することが確認された。
【０１１２】
この目視における判断を数値データでも確認する目的で、実施例１と同様にして、色調の数値化を行った。数値化は、すべて「Ｋの値」を用い、６０分放置の前後の色調の差を以下の表に示す。
【０１１３】
【表１２】
2020030048.tif 000017
【０１１４】
以上の通り、ＳＤＳも誤反応を低減することが示された。
【０１１５】
＜実験８：ホウ酸が呈色反応を阻害しないことの確認＞
ミンチ状にした魚肉サンプル（サバ）  ２ｇを、２５ｍＭ又は１００ｍＭのホウ酸を含む０．１Ｍ  ＨＥＰＰＳＯ（ｐＨ９．０）２ｍＬにて実験５と同様の方法で抽出した。抽出後、０．４ｍＬの抽出液に０、１０、２５、５０、７５、１００ｐｐｍ相当のヒスタミンを添加し、この抽出液に綿棒を懸濁し、全量をトレハロース２％、１．０８ｍＭ  ＮＢＴ、及び４１．５μＭ  １−メトキシＰＭＳを含む試薬０．２ｍＬを凍結乾燥したものに添加した。反応後、室温で１５分放置し、発色の程度を確認した。その結果、ホウ酸の添加はヒスタミン由来の発色に悪影響を与えないことが確認された。この目視における判断を数値データでも確認する目的で、実施例１と同様にして、色調の数値化を行った。数値化は、すべて「Ｋの値」を用い、１５分放置の前後の色調の差を以下の表に示す。
【０１１６】
【表１３】
2020030048.tif 000018
【０１１７】
上記の表に示す通り、ホウ酸濃度を１００ｍＭとしても測定を行うことができたため、ホウ酸の添加はヒスタミン由来の発色に悪影響を与えないことが示された。
【０１１８】
上記の実験のとおり、ホウ酸や式（Ｉ）又は（ＩＩ）のボロン酸化合物、アルキル硫酸塩、各種の緩衝剤等により誤反応（誤発色）を抑制することができた。本発明のヒスタミン測定方法は必ずしもこのような化合物を必要としないが、これらの誤反応抑制剤を用いると、より正確なヒスタミン測定が可能となる。そのため、このような誤反応抑制剤は本発明のヒスタミン測定に用いることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明により、ヒスタミン測定において、検体をミンチにするなど破壊する必要がなく、非侵襲的なヒスタミン検査が可能となる。これにより、例えばそのまま食事に提供される魚肉についても、非破壊的にヒスタミンを検出することが可能となる。
【０１２０】
本発明を例示により説明したが、本発明の精神から逸脱することなく、種々の変法を行うことができる。本明細書において言及された文献はいずれも、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。
【図１】
2020030048.tif 000019
【図２】
2020030048.tif 000020
【図３】
2020030048.tif 000021
【図４】
2020030048.tif 000022
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月23日(2019.5.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）検体を非侵襲的にサンプリングし、検体から測定用の試料を取得する工程、及び
（ｉｉ）工程（ｉ）においてサンプリングした試料を、ヒスタミン測定に供する工程、を含む、ヒスタミン食中毒検査用又はヒスタミン食中毒予防用の、ヒスタミン測定方法であって、
検体が魚である場合、非侵襲的サンプリングが、当該魚の口から、鰓孔から、肛門から、魚体表面について、腹腔について、若しくはミンチではない魚肉の切り身の表面について行われるものである、又は
検体が鶏である場合、非侵襲的サンプリングが、当該鶏の口から、肛門から、腹腔について、若しくはミンチではない鶏肉の切り身の表面について行われるものである、前記方法。
【請求項２】
非侵襲的サンプリングが、綿棒を用いた拭き取りにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒスタミン測定がヒスタミンデヒドロゲナーゼを用いる比色法又は抗ヒスタミン抗体を用いるイムノクロマト法によるヒスタミン測定である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ヒスタミン測定がヒスタミンデヒドロゲナーゼを用いる比色法であり、さらに誤反応抑制剤を用いる、請求項１又は２に記載の方法であって、誤反応抑制剤が、
（Ａ）（ｉ−ａ）ホウ酸若しくは下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
【化１】
2020030048.tif 000023
（式中、Ｒ１〜Ｒ５は、それぞれ独立に、Ｈ、ボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基、チオール基、ｔｅｒｔ‐ブトキシカルボニルアミノ基、及び置換された若しくは置換されていないＣ１〜Ｃ１０アルキル基、アルケニル基、又はアルキニル基からなる群から選択され、
Ｒ６は、ボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基及びチオール基からなる群より選択される少なくとも一種の置換基により置換された又は置換されていないＣ１〜Ｃ１０アルキル基、アルケニル基、又はアルキニル基からなる群から選択される）で表されるボロン酸又はその塩、又は
（ｉ−ｂ）アルキル硫酸塩、及び
（Ｂ）双性イオンを有し、カルボキシ基を有しない化合物を含む緩衝溶液であって、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＥＰＰＳ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＡＣＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳＯ、及びＰＩＰＥＳからなる群から選択される緩衝液、Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）又は炭酸緩衝液
からなる群より選択される、前記方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒスタミン測定方法を行うための使用説明書、及びヒスタミン測定用試薬を含む、ヒスタミン測定キットであって、ここで前記使用説明書は検体からのサンプリングを非侵襲的に行うことを記載したものであり、
検体が魚である場合、非侵襲的サンプリングが、当該魚の口から、鰓孔から、肛門から、魚体表面について、腹腔について、若しくはミンチではない魚肉の切り身の表面について行われるものである、又は
検体が鶏である場合、非侵襲的サンプリングが、当該鶏の口から、肛門から、腹腔について、若しくはミンチではない鶏肉の切り身の表面について行われるものである、前記キット。
【請求項６】
試料採取部、反応部、及び使用説明書を含むヒスタミン測定キットであって、前記反応部がヒスタミン測定試薬を含むものであり、前記使用説明書が検体からのサンプリングを非侵襲的に行うことを記載したものである、ヒスタミン食中毒検査用の、ヒスタミン測定キットであって、
検体が魚である場合、非侵襲的サンプリングが、当該魚の口から、鰓孔から、肛門から、魚体表面について、腹腔について、若しくはミンチではない魚肉の切り身の表面について行われるものである、又は
検体が鶏である場合、非侵襲的サンプリングが、当該鶏の口から、肛門から、腹腔について、若しくはミンチではない鶏肉の切り身の表面について行われるものである、前記キット。
【請求項７】
ヒスタミン測定試薬が、ヒスタミンデヒドロゲナーゼ及び比色法用試薬、又は抗ヒスタミン抗体及びイムノクロマト用試薬を含む、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
ヒスタミン測定試薬が、ヒスタミンデヒドロゲナーゼ、比色法用試薬及び誤反応抑制剤を含む、請求項６に記載のキットであって、誤反応抑制剤が、
（Ａ）（ｉ−ａ）ホウ酸若しくは下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
【化２】
2020030048.tif 000024
（式中、Ｒ１〜Ｒ５は、それぞれ独立に、Ｈ、ボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基、チオール基、ｔｅｒｔ‐ブトキシカルボニルアミノ基、及び置換された若しくは置換されていないＣ１〜Ｃ１０アルキル基、アルケニル基、又はアルキニル基からなる群から選択され、
Ｒ６は、ボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基及びチオール基からなる群より選択される少なくとも一種の置換基により置換された又は置換されていないＣ１〜Ｃ１０アルキル基、アルケニル基、又はアルキニル基からなる群から選択される）で表されるボロン酸又はその塩、又は
（ｉ−ｂ）アルキル硫酸塩、及び
（Ｂ）双性イオンを有し、カルボキシ基を有しない化合物を含む緩衝溶液であって、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＥＰＰＳ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＡＣＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳＯ、及びＰＩＰＥＳからなる群から選択される緩衝液、Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）又は炭酸緩衝液
からなる群より選択される、キット。
【請求項９】
試料採取部、反応部、及びセンサー部を含む、使用説明書が付属したヒスタミン測定装置であって、前記反応部がヒスタミンデヒドロゲナーゼを含むものであり、前記使用説明書が検体からのサンプリングを非侵襲的に行うことを記載したものであり、前記センサー部がヒスタミンの電気化学的測定用のセンサーを備えており、
検体が魚である場合、非侵襲的サンプリングが、当該魚の口から、鰓孔から、肛門から、魚体表面について、腹腔について、若しくはミンチではない魚肉の切り身の表面について行われるものである、又は
検体が鶏である場合、非侵襲的サンプリングが、当該鶏の口から、肛門から、腹腔について、若しくはミンチではない鶏肉の切り身の表面について行われるものである、
ヒスタミン食中毒検査用の、ヒスタミン測定装置。