(57)【要約】      （修正有）【課題】象牙質コラーゲン線維の脱灰材料及びその製造方法の提供。【解決手段】歯科における脱灰に用いられ、好ましくは、象牙質の脱灰に用いられる、水溶性キトサンとアミノカルボン酸系金属キレート剤との抱合体。０．５〜１質量部の水溶性キトサン、１０〜３０質量部のＥＤＴＡ及び０．８〜１．５質量部の架橋剤で製造される象牙質コラーゲン線維の脱灰材料及びその製造方法。【選択図】図３
2020176110.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯科における脱灰に用いられ、好ましくは、象牙質の脱灰に用いられる、水溶性キトサンとアミノカルボン酸系金属キレート剤との抱合体。
【請求項２】
前記アミノカルボン酸系金属キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、アミノ三酢酸、ジヒドロキシエチルグリシン、グリコールエーテルジアミン四酢酸、エチレンジアミン二酢酸、トリエチレンテトラミン六酢酸、シクロヘキサンジアミン四酢酸、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸、１，４，８，１１−テトラアザシクロドデカン四酢酸から選ばれる１種又は２種以上の混合物であり、好ましくは、エチレンジアミン四酢酸であることを特徴とする、請求項１に記載の抱合体。
【請求項３】
０．５〜１質量部の水溶性キトサン、１０〜３０質量部のエチレンジアミン四酢酸及び０．８〜１．５質量部の架橋剤を原料として製造されることを特徴とする、象牙質コラーゲン線維の脱灰材料。
【請求項４】
前記抱合体又は象牙質コラーゲン線維の脱灰材料のｐＨは、中性又はアルカリ性であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抱合体又は象牙質コラーゲン線維の脱灰材料。
【請求項５】
前記水溶性キトサンは、グリコールキトサン、カルボキシメチルキトサン、キトサン塩酸塩、キトサン四級アンモニウム塩、キトサン硫酸エステル、キトサンオリゴ糖及びヒアルロン酸様キトサンから選ばれる１種又は２種以上の混合物であり、好ましくは、グリコールキトサンであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抱合体又は象牙質コラーゲン線維の脱灰材料。
【請求項６】
前記抱合体又は材料の遊離アミノ基含有量は、抱合反応前の水溶性キトサンに比べて１５％未満、好ましくは１〜１０％、より好ましくは３〜５％であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抱合体又は象牙質コラーゲン線維の脱灰材料。
【請求項７】
前記抱合体及び材料のＭｎは、４０ｋＤａより大きく、好ましくは６０ｋＤａ〜３００ｋＤａ、より好ましくは１００ｋＤａ〜２００ｋＤａであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抱合体又は象牙質コラーゲン線維の脱灰材料。
【請求項８】
前記抱合体及び材料のＭｗは、１００ｋＤａより大きく、好ましくは２００ｋＤａ〜８００ｋＤａ、より好ましくは４００ｋＤａ〜６００ｋＤａであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抱合体又は象牙質コラーゲン線維の脱灰材料。
【請求項９】
前記架橋剤は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、グルタルアルデヒド、ビスイミデート及びマレイミドから選ばれる１種又は２種以上の混合物であることを特徴とする、請求項３〜８のいずれか一項に記載の象牙質コラーゲン線維の脱灰材料。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抱合体又は材料と、
口腔応用上許容可能な助剤又は溶媒とを含む、歯科用の脱灰組成物。
【請求項１１】
（ａ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抱合体、材料又は組成物と、
（ｂ）歯科接着剤及び／又は修復剤とを含む、歯科接着修復用の試薬キット又は薬物キット。
【請求項１２】
（ａ）修復が必要な歯の表面に、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抱合体、材料又は組成物の有効量を適用することと、
（ｂ）任意に前記抱合体、材料又は組成物を除去することと、
（ｃ）修復が必要な歯の表面に、歯科接着剤及び／又は修復剤を適用することとを含む、歯科接着修復方法。
【請求項１３】
架橋剤の存在下で、水溶性キトサンとアミノカルボン酸系金属キレート剤とを混合して水溶性キトサンとアミノカルボン酸系金属キレート剤との抱合体を得ることを含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抱合体、材料又は組成物を製造する方法。
【請求項１４】
０．５〜１質量部の水溶性キトサンの水溶液と１０〜３０質量部のＥＤＴＡの水溶液とを混合し、０．８〜１．５質量部の架橋剤を混合溶液に溶解して室温で反応させることを含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
濃度が５〜１０ｍｇ／ｍＬの水溶性キトサンの水溶液と濃度が１００〜３００ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡの水溶液とを等体積混合し、混合溶液のＰＨ＝６．０に調整した後、濃度が８〜１５ｍｇ／ｍＬの量で架橋剤を加え、室温で１２〜１６時間反応させた後、透析法により未反応残留物を除去した後に凍結乾燥して、象牙質コラーゲン線維の脱灰材料を得ることを含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抱合体、材料又は組成物の歯科接着修復システムの製造における応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯科接着修復材料学の分野に属し、具体的には、象牙質コラーゲン線維の脱灰材料及びその製造方法と応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯は、人体の高度に石灰化された器官である。正常な象牙質マトリックスは、規則的に編まれたコラーゲン線維マトリックス、整然と配列された無機相のアパタイト結晶、及び少量の非コラーゲン性タンパク質で構成される。
【０００３】
ハイドロキシアパタイトとコラーゲンとの相対的な位置関係に応じて、象牙質の石灰化は、線維内石灰化と線維外石灰化の２つの部分に分けられる。象牙質中のミネラルの６５％が線維の外にあるが、線維内石灰化は、原線維形態を保持するために重要であり、象牙質のナノスケールでの力学的性質を決定し、象牙質における内因性マトリックスメタロプロテアーゼによるコラーゲンの変性分解を防止することができる。
【０００４】
正常な生理状態では、歯の脱灰と再石灰化とが釣り合っているが、病理状態では、脱灰作用は、再石灰化作用を上回り、歯質組織の破壊を引き起こし、さらに歯の機能を損なう。
【０００５】
口腔の主な疾患であるう蝕は、最も一般的な病理的な脱灰の結果である。う蝕原性微生物は、炭水化物を分解して酸を生成し、象牙質における内因性マトリックスメタロプロテアーゼと協働して、歯の無機質の脱灰及びコラーゲンの有機質の分解を引き起こし、徐々にう蝕穴が形成される。現在、う蝕は、世界保健機関から癌や心血管疾患に続く第３の慢性非伝染性疾患として登録されている。世界保健機関（ＷＨＯ）の２０１５年の研究データから分かるように、永久歯のう蝕患者は、２４億人になり、乳歯のう蝕患者は、６．２１億人になり、う蝕の予防治療は、口腔医学の課題だけでなく、日増しに注目される公衆衛生上の課題となっている。
【０００６】
現在、臨床的には、う蝕に対する治療は、外科手術の治療を主とし、すなわち、う蝕歯組織を除去する上で、まず酸エッチング剤（例えば３０〜４０％のリン酸）で接着面をエッチングして、象牙質コラーゲン線維を脱灰し、次に接着剤を塗布して、露出したコラーゲン線維間に入り込んで架橋して混合層を形成し、最後に修復材料で窩洞を充填して歯体の生理的形態と機能を回復させる。使用される修復材料は、主に樹脂による象牙質接着をベースとした歯色複合樹脂材料である。接着剤と象牙質コラーゲンとで形成される混合層の完全性と安定性は、治療成功及び修復体の長期存在の重要な要因であることが分かる。しかしながら、リン酸等の高い酸エッチング性により、象牙質コラーゲンマトリックスは、酸エッチング剤の作用下で完全に脱灰し、乾燥後に網目状構造からシート状に潰れるため、樹脂接着剤がコラーゲン線維間に入り込みにくく、コラーゲンが接着樹脂でよく保護されない。内因性マトリックスメタロプロテアーゼの作用下で、この部分の樹脂浸透不良領域が分解しやすいため、接着面の完全性が損なわれ、接着強度が低下し、最終的に樹脂による象牙質接着修復の失敗を招くおそれがある。また、これらの内因性マトリックスメタロプロテアーゼが酸性環境で大量に活性化できる研究があるため、リン酸を用いて象牙質をエッチングすると、マトリックスメタロプロテアーゼの活性をある程度刺激する。これらの欠点は、修復体の周囲に二次う蝕の高発病率と象牙質コラーゲンの分解を引き起こす主な要因である。
【０００７】
キチン（ｃｈｉｔｉｎ）は、キチン質又はポリ−β１−４−Ｎ−アセチルグルコサミンとも呼ばれ、Ｎ−アセチルグルコサミンをβ結合して重合することにより形成されたホモ多糖である。甲殻類動物の殻、昆虫の甲殻や真菌の細胞壁に広く含まれる。キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）の化学名は、β−（１→４）−２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコースであり、キチンの脱Ｎ−アセチル化の生成物であり、一般的には、Ｎ−アセチルを５５％以上除去したものがキトサンと呼ばれる。
【０００８】
キレート剤は、金属原子又はイオンと相互作用し、金属原子又はイオンをキレート剤の内部に包接して、安定した錯体又はキレート化合物を形成することができる。
【発明の概要】
【０００９】
従来技術の欠点又は不足に対し、本発明は、う蝕を予防治療し接着面の安定性を向上させることで、接着修復体の耐用年数を延長する歯科用の脱灰剤を提供することを目的とする。より具体的には、本発明は、歯科における脱灰に用いられ、より具体的には象牙質コラーゲン線維の脱灰に用いられる抱合体、材料及び組成物を提供することを目的とする。例えば、本発明は、象牙質コラーゲン線維の脱灰材料を提供することを目的とする。前記抱合体、材料及び組成物は、象牙質コラーゲン線維に元の形態及び網目状構造を維持させ、後続の樹脂接着剤の浸透に役立つことができる。
【００１０】
本発明の技術的課題は、水溶性キトサンとアミノカルボン酸系金属キレート剤との抱合体を提供することにより解決される。
【００１１】
一態様において、本発明は、歯科における脱灰に用いられ、好ましくは、象牙質の脱灰に用いられ、より好ましくは、象牙質コラーゲン線維の脱灰に用いられる水溶性キトサンとアミノカルボン酸系金属キレート剤との抱合体に関する。前記抱合体において、前記水溶性キトサンのアミノ基と前記アミノカルボン酸系金属キレート剤のカルボキシル基は、アミド結合を形成する。
【００１２】
本発明において、キトサンは、以下の構造式を有する。
【化１】
2020176110.tif 000003
ここで、ｎ及びｍは、整数であり、かつｎとｍの比率は、前記キトサンの脱アセチル化の程度に依存している。一態様において、本発明におけるキトサンの脱アセチル化の程度は、少なくとも５５％であり、例えば６０％〜１００％、６５％〜９９％、７０％〜９８％、７５％〜９７％、８０％〜９６％、８５％〜９５％又は少なくとも９０％である。例えば、脱アセチル化の程度が９０％のキトサンに対して、上記構造式において、ｎとｍの比率が９：１である。当業者であれば理解されるように、上記式（Ｉ）において、アミノ基含有モノマー（すなわち、グルコサミンモノマー）及びアセトアミド基含有モノマー（すなわち、アセチルグルコサミンモノマー）は、通常、ランダムに分布し、モノマーの位置と同じモノマーの連続数とがランダムであってよい。一態様において、ｎ＋ｍの総数は、１００より大きく、例えば、１５０より大きく、好ましくは、２００より大きく、２５０より大きく、３００より大きく、３５０より大きく、４００より大きく、４５０より大きく、５００より大きく、６００より大きく、８００より大きく、又は１０００より大きい。他の態様において、ｎ＋ｍの総数は、１００００より小さく、好ましくは、８０００より小さく、７０００より小さく、６０００より小さく、５０００より小さく、４０００より小さく、３５００より小さく、３０００より小さく、２５００より小さく、２０００より小さく、又は１５００より小さい。
【００１３】
一態様において、本発明における水溶性キトサンは、アミノ基を保存してアミノカルボン酸系金属キレート剤のカルボキシル基とアミド結合を形成できる水に可溶なキトサンの塩、エステル、断片、誘導体又は類似体の形態であってよい。前記塩は、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、又は酢酸塩のようなＣ１〜Ｃ６カルボン酸塩等の酸付加塩であってよい。前記エステルは、硫酸エステル、スルホン酸エステル、又は酢酸エステルのようなＣ１〜Ｃ６カルボン酸エステル等であってよい。前記キトサン断片は、キトサンのモノマー構造を保存し、重合度がより小さくかつ水溶性が向上したキトサンの加水分解生成物であってよい。キトサンの水溶性誘導体は、水溶性を増加させる基（例えば、ヒドロキシ基、酢酸基のようなＣ１〜Ｃ６カルボキシ基、又は硫酸基）を前記キトサンに導入した誘導体を含む。
【００１４】
一態様において、本発明における水溶性キトサンは、グリコールキトサン、カルボキシメチルキトサン、キトサン塩酸塩、キトサン四級アンモニウム塩、キトサン硫酸エステル、キトサンオリゴ糖及びヒアルロン酸様キトサンから選ばれる１種又は２種以上の混合物であってよい。
【００１５】
上記グリコールキトサンは、以下の構造式を有する。
【化２】
2020176110.tif 000004
同様に、ａ及びｂは、整数であり、かつａとｂの比率は、前記キトサンの脱アセチル化の程度に依存し、前記グリコールキトサンの脱アセチル化の程度は、式Ｉに関して上述したように定義され、ａ＋ｂの総数は、式Ｉにおけるｎ＋ｍの総数に関して上述したように定義される。当業者であれば理解されるように、上記式（ＩＩ）において、アミノ基含有モノマー及びアセトアミド基含有モノマーは、通常、ランダムに分布し、モノマーの位置と同じモノマーの連続数とがランダムであってよい。式ＩＩにおいて、遊離アミノ基は、アミノカルボン酸系金属キレート剤中のカルボキシル基とアミド結合を形成できる。
【００１６】
一態様において、本発明におけるアミノカルボン酸系金属キレート剤は、水溶性キトサン中のアミノ基とアミド結合を形成できるカルボキシル基を有する。また、前記キレート剤は、通常、１つ又は複数のアミノ基（例えば、１〜４個のアミノ基、通常、三級アミノ基である）を含有する多価カルボン酸（例えば１〜６価カルボン酸）であり、アミノ基及びカルボキシル基は、金属原子／イオンと配位結合を形成できる。また、前記キレート剤は、６〜１８個の炭素原子、例えば、６、１０、１４、１６又は１８個の炭素原子を有してよく、かつヒドロキシル基及びアルコキシ基を有していてもよい。一態様において、アミノカルボン酸系金属キレート剤とキレート可能な金属原子又はイオンは、カルシウム、マグネシウム、鉄、銅、亜鉛などを含み、カルシウムが好ましい。アミノカルボン酸系金属キレート剤の実例は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、アミノ三酢酸（ニトリロ三酢酸とも呼ばれ、ＮＴＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＥＧ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＨＡ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロドデカン四酢酸（ＴＥＴＡ）を含み、エチレンジアミン四酢酸が好ましい。一態様において、前記アミノカルボン酸系金属キレート剤は、上記多価カルボン酸又はその塩の形態、例えば、ナトリウム塩又はカリウム塩を含んでよい。
【００１７】
一態様において、本発明は、歯科用の脱灰材料に関し、好ましくは、象牙質コラーゲン線維の脱灰材料に関する。この態様において、前記歯科用の脱灰材料は、上記水溶性キトサンと上記アミノカルボン酸系金属キレート剤とが抱合反応により製造される。この態様において、前記抱合反応は、架橋剤の存在下で行われる。前記反応において、反応物の総質量に対して、水溶性キトサンの質量部は、０．０５〜２０であってよく、好ましくは、０．１〜１５、０．２〜１０、０．５〜８であり、例えば、０．８、０．９、１、１．２、１．５、２、３、４又は５である。前記反応において、反応物の総質量に対して、アミノカルボン酸系金属キレート剤の質量部は、１〜６０であってよく、好ましくは、５〜５０、１０〜４０であり、例えば、１５、２０、２５、３０、３５又は４５である。前記反応において、反応物の総質量に対して、架橋剤の質量部は、０．１〜１５であってよく、好ましくは、０．２〜１０、０．５〜５であり、例えば、０．６、０．８、１、１．５、２、２．５、３又は３．５である。
【００１８】
好ましくは、本発明に係る材料は、０．５〜１質量部の水溶性キトサン、１０〜３０質量部のアミノカルボン酸系金属キレート剤、及び０．８〜１．５質量部の架橋剤で製造される。
【００１９】
本発明に係る材料は、０．５〜１質量部の水溶性キトサン、１０〜３０質量部のＥＤＴＡ、及び０．８〜１．５質量部の架橋剤で製造される。架橋剤の作用により、水溶性キトサンとＥＤＴＡは、共有結合反応が発生する。
【００２０】
上記抱合反応又は共有結合反応では、水溶性キトサンの遊離アミノ基とアミノカルボン酸系金属キレート剤の遊離カルボキシル基との間にアミド結合を形成する。
【００２１】
好ましくは、本発明に係る材料のｐＨは、中性又はアルカリ性である。
【００２２】
好ましくは、本発明における水溶性キトサンは、グリコールキトサン、カルボキシメチルキトサン、キトサン塩酸塩、キトサン四級アンモニウム塩、キトサン硫酸エステル、キトサンオリゴ糖及びヒアルロン酸様キトサンから選ばれる１種又は２種以上の混合物である。
【００２３】
好ましくは、本発明における架橋剤は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、グルタルアルデヒド、ビスイミデート及びマレイミドから選ばれる１種又は２種以上の混合物である。
【００２４】
一態様において、本発明に係る抱合体又は材料の遊離アミノ基含有量は、抱合反応又は共有結合反応前の水溶性キトサンに比べて２０％未満であり、好ましくは０％〜１５％であり、例えば、０．５％〜１０％、例えば、１％〜５％、例えば、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％又は約４．５％である。
【００２５】
一態様において、本発明に係る抱合体及び材料のＭｎは、４０ｋＤａより大きく、好ましくは、５０ｋＤａより大きく、例えば、６０ｋＤａ〜６００ｋＤａ、８０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜４００ｋＤａ、１２０ｋＤａ〜３００ｋＤａ、１５０ｋＤａ〜２００ｋＤａであり、例えば、約１３０ｋＤａ、約１４０ｋＤａ、約１６０ｋＤａ、約１７０ｋＤａ、約１８０ｋＤａ又は約１９０ｋＤａである。
【００２６】
一態様において、本発明に係る抱合体及び材料のＭｗは、８０ｋＤａより大きく、好ましくは、１００ｋＤａより大きく、例えば、２００ｋＤａ〜８００ｋＤａ、３００ｋＤａ〜７００ｋＤａであり、例えば、約２５０ｋＤａ、約３５０ｋＤａ、約４００ｋＤａ、約４５０ｋＤａ、約５００ｋＤａ、約５５０ｋＤａ、約６００ｋＤａ又は約６５０ｋＤａである。
【００２７】
一態様において、本発明に係る抱合体及び材料のＭｐは、６０ｋＤａより大きく、好ましくは、７０ｋＤａより大きく、例えば、８０ｋＤａ〜６００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜５００ｋＤａであり、例えば、約１５０ｋＤａ、約２００ｋＤａ、約２５０ｋＤａ、約３００ｋＤａ、約３５０ｋＤａ、約４００ｋＤａ又は約４５０ｋＤａである。
【００２８】
一態様において、本発明に係る抱合体及び材料の多分散性指数ＰＤＩは、１〜５であり、好ましくは２〜４であり、例えば約１．５、約２．５、約３、約３．５又は約４．５である。
【００２９】
一態様において、本発明に係る抱合体又は材料のｐＨは、中性又はアルカリ性であり、例えばｐＨ７〜１０であり、例えば７．５、８、８．５、９又は９．５である。
【００３０】
一態様において、本発明は、グリコールキトサンとエチレンジアミン四酢酸との抱合体又はこれらからなる歯科用の脱灰材料に関する。一態様において、前記抱合体及び材料は、以下の構造式で示される。
【化３】
2020176110.tif 000005
当業者であれば理解されるように、式ＩＩＩを有する抱合体は、さらに、遊離アミノ基含有モノマー（すなわち、グルコサミンモノマー）を含んでもよく、前記遊離アミノ基がＥＤＴＡのカルボキシ基とアミド結合を形成していない。また、当業者であれば理解されるように、前記抱合体において、アセトアミド基含有モノマー（すなわち、アセチルグルコサミンモノマー）、ＥＤＴＡアミド基含有モノマー（すなわち、ＥＤＴＡアシル化グルコサミンモノマー）、及び任意の遊離アミノ基含有モノマー（すなわち、グルコサミンモノマー）は、式ＩＩＩにおいて、通常、ランダムに分布し、モノマーの位置と同じモノマーの連続数とがランダムであってよい。前記抱合体又は材料又は式ＩＩＩにおいて、ＥＤＴＡアミド基含有モノマー（任意の遊離アミノ基含有モノマーと共に）とアセトアミド基含有モノマーとの比率は可変であり、使用される上記式Ｉ又は式ＩＩに関して上述したように定義されるグリコールキトサンの脱アセチル化の程度に依存している。前記抱合体又は材料において、本発明に係る抱合体又は材料の遊離アミノ基含有量は、抱合反応又は共有結合反応前のグリコールキトサンに比べて２０％未満であり、好ましくは０％〜１５％であり、例えば、０．５％〜１０％、例えば、１％〜５％、例えば、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％又は約４．５％である。一態様において、ｎは、１００より大きく、例えば、１５０より大きく、好ましくは、２００より大きく、２５０より大きく、３００より大きく、３５０より大きく、４００より大きく、４５０より大きく、５００より大きく、６００より大きく、８００より大きく、又は１０００より大きい。他の態様において、ｎは、１００００より小さく、好ましくは、８０００より小さく、７０００より小さく、６０００より小さく、５０００より小さく、４０００より小さく、３５００より小さく、３０００より小さく、２５００より小さく、２０００より小さく、又は１５００より小さい。
【００３１】
一態様において、本発明は、本発明に係る抱合体又は材料と、口腔応用上許容可能な助剤又は溶媒とを含む歯科用の脱灰組成物に関する。前記組成物において、組成物の重量で計算すると、前記抱合体又は材料の含有量は、０．０５〜５０重量％であり、好ましくは、０．１〜４０重量％であり、例えば０．２〜３０重量％、０．５〜２０重量％、１〜１０重量％であり、例えば１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、７、８又は９重量％である。この態様において、本発明に係る抱合体材料は、粉末（例えば、凍結乾燥粉末）、液剤、ゲル化剤又は懸濁剤の形態であってよい。本発明に係る歯科用の脱灰組成物において、口腔応用上許容可能な助剤又は溶媒とは、提供された濃度又は量で口腔に投与する際に人体に対して安全であり、通常、組成物中の他の成分の活性を阻害しない助剤又は溶媒を指す。一例において、前記助剤は、ゲル化剤、増粘剤、界面活性剤、染料、防腐剤などを含み、米国特許公開ＵＳ２００３／０１５７１３４Ａ１、ＵＳ２０１１／００７６６４６Ａ１、ＵＳ２０１２／０１６１０６７Ａ１に記載される通り、参照により、本明細書中に組み込まれるものとする。一例では、前記溶媒は、水を含んでよい。
【００３２】
一態様において、本発明は、本発明に係る抱合体、材料又は組成物と、歯科接着剤及び／又は修復剤とを含む歯科接着修復用の試薬キット又は薬物キットに関する。接着剤及び修復剤の例は、歯科用の銀合金粉、アクリル樹脂のような複合樹脂、セメントなどを含む。例えば、前記接着剤及び／又は修復剤は、商品名ＡｄｐｅｒＴＭ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｂｏｎｄ  ２又はＦｉｌｔｅｋＴＭ  Ｚ２５０で販売されるものであってよい。
【００３３】
一態様において、本発明は、（ａ）修復が必要な歯の表面に、本発明に係る抱合体、材料又は組成物の有効量を適用することと、（ｂ）任意に前記抱合体、材料又は組成物を除去することと、（ｃ）修復が必要な歯の表面に、歯科接着剤及び／又は修復剤を適用することとを含む、歯科接着修復方法に関する。
【００３４】
一態様において、本発明は、架橋剤の存在下で、水溶性キトサンとアミノカルボン酸系金属キレート剤とを混合して水溶性キトサンとアミノカルボン酸系金属キレート剤との抱合体を得ることを含む、本発明に係る抱合体、材料又は組成物を製造する方法に関する。好ましくは、０．５〜１質量部の水溶性キトサン、１０〜３０質量部のアミノカルボン酸系金属キレート剤、及び０．８〜１．５質量部の架橋剤で製造される。
【００３５】
また、本発明は、象牙質コラーゲン線維の脱灰材料の製造方法を提供する。
【００３６】
本発明の方法は、
水溶性キトサンの水溶液とＥＤＴＡの水溶液とを混合し、架橋剤を混合溶液に溶解して室温で反応させることを含む。架橋剤の作用により、水溶性キトサンとＥＤＴＡは、共有結合反応が発生する。前記反応において、反応物の総質量に対して、水溶性キトサンの質量部は、０．０５〜２０であってよく、好ましくは、０．１〜１５、０．２〜１０、０．５〜８であり、例えば、０．８、０．９、１、１．２、１．５、２、３、４又は５である。前記反応において、反応物の総質量に対して、アミノカルボン酸系金属キレート剤の質量部は、１〜６０であってよく、好ましくは、５〜５０、１０〜４０であり、例えば、１５、２０、２５、３０、３５又は４５である。前記反応において、反応物の総質量に対して、架橋剤の質量部は、０．１〜１５であってよく、好ましくは、０．２〜１０、０．５〜５であり、例えば、０．６、０．８、１、１．５、２、２．５、３又は３．５である。
好ましくは、本発明の製造方法では、混合溶液のｐＨを中性又はアルカリ性、例えばｐＨ７〜１０、例えば７．５、８、８．５、９又は９．５に調整する。
【００３７】
好ましくは、本発明の方法は、
濃度が５〜１０ｍｇ／ｍＬの水溶性キトサンの水溶液と濃度が１００〜３００ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡの水溶液とを等体積混合し、混合溶液のＰＨ＝６．０に調整した後、８〜１５ｍｇ／ｍＬの量で架橋剤を加え、室温で１２〜１６時間反応させた後、適切な条件の透析により未反応残留物を除去した後に凍結乾燥して、象牙質コラーゲン線維の脱灰材料を得ることを含む。
【００３８】
本発明に係る象牙質コラーゲン線維の脱灰材料は、歯科接着修復における象牙質脱灰処理、歯科接着修復システムの製造に用いられる。
【発明の効果】
【００３９】
本発明は、共有結合的な架橋により、アミノカルボン酸系金属キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）の分子構造中の多くのドナー原子を、好ましい水溶性キトサン類物質の骨格に結合して、新規なカルシウムイオンキレート剤を製造し、キトサンの天然高分子の特性及びＥＤＴＡの優れたカルシウムイオンキレート能力を総合的に発揮することで、う蝕損傷領域で象牙質の表面を石灰化する場合に多重の利点を発揮することができる。
【００４０】
第１に、アミノカルボン酸系金属キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）が共有結合された水溶性キトサンのカルシウムイオンキレート能力が著しく増強されるため、象牙質コラーゲン線維外のミネラルと迅速に反応し、臨床治療上許容可能な時間範囲（３０秒以下）内に脱灰を完了できる。
【００４１】
第２に、天然の象牙質コラーゲン自体が選択的透過性を有するため、分子量が４０ｋＤａより大きいものは、コラーゲン分子の外に完全にはじかれ、分子量が６ｋＤａより小さいものは、コラーゲン線維内の空間を自由に通過し、両者間のものは、部分的にコラーゲン線維の内部に入り込むことができる。水溶性キトサンの分子量が大きい（８２ｋＤａ）ため、キレート剤が線維の内部に入り込むことができないことにより、接着界面の象牙質コラーゲンから線維外のミネラルを選択的に除去し、線維内のミネラルを残して、象牙質コラーゲンの網目状構造を維持し、樹脂接着剤の浸透を促進する。
【００４２】
第３に、水溶性キトサン類物質は、多くのポリカチオン構造を含有するため、二次う蝕と活発な根面う蝕における浮遊微生物及び細菌性バイオフィルムに顕著な抑制作用を与え、この新規なカルシウムイオンキレート剤に迅速脱灰と効果的な抗菌の二重機能を与える。
【００４３】
第４に、水溶性キトサンは、極めて優れた生体適合性及び低細胞毒性を有するため、生活歯の歯髄幹細胞の活性を効果的に保護し、従来の酸エッチング剤の歯髄幹細胞への悪影響を回避し、う蝕損傷及び脱灰の象牙質の再生に良好な前提条件を創出することができる。
【００４４】
第５に、水溶性キトサンとアミノカルボン酸系金属キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）との共有結合物は、ｐＨ中性又はアルカリ性であるため、従来の酸エッチング剤により局部的な酸環境を形成して、内因性マトリックスメタロプロテアーゼが大量に活性化する欠点を回避するとともに、脱灰中に多くのカルシウムイオンがキレートされるため、混合層の象牙質コラーゲン周囲のマトリックスメタロプロテアーゼの活性が著しく抑制されて、酵素分解からコラーゲンを保護する作用を発揮する。
【００４５】
以上より、本発明は、象牙質コラーゲン線維以外のミネラルを選択的に除去し、象牙質コラーゲン線維に元の形態及び網目状構造を維持させ、後続の樹脂接着剤の浸透に役立つとともに、コラーゲン内部もミネラルの保護を受けて、外因性刺激で分解することなく、う蝕の予防治療、接着界面の安定性の向上、及び接着修復体の耐用年数の延長にいずれも顕著な効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ＥＤＴＡ、グリコールキトサン、及びグリコールキトサンに架橋されたＥＤＴＡの赤外スペクトル図である。
【図２】誘導結合プラズマ発光分析法で石灰化象牙質における濃度（５０、２５及び１０ｍｇ／ｍＬ）の異なるグリコールキトサンに架橋されたＥＤＴＡカルシウムイオンキレート剤のＣａ２＋に対するキレート速度を測定し、０．１ＭのＥＤＴＡを対照とするものである。
【図３】（Ａ）は、３２％リン酸（ＰＡ）、０．１ＭのＥＤＴＡ又は２５ｍｇ／ｍＬのグリコールキトサンに架橋されたＥＤＴＡ（ＧＣＥ）という異なる象牙質脱灰剤について、湿式接着又は乾式接着モードで、接着剤による象牙質の微引張強度を比較するものである。  図３（Ｂ）は、石灰化象牙質が０．１ＭのＥＤＴＡ又は２５ｍｇ／ｍＬのグリコールキトサンに架橋されたＥＤＴＡという異なる象牙質脱灰剤で処理された後の透過電子顕微鏡画像である。
【図４】濃度の異なるＥＤＴＡ及びグリコールキトサンに架橋されたＥＤＴＡ（ＧＣＥ）のヒト組み換え内因性マトリックスメタロプロテアーゼ−９（ｒＨＭＭＰ−９）の活性に対する阻害作用を比較し、３２％のリン酸（ＰＡ）を対照とするものであり、図４（Ａ）は、ＥＤＴＡ及びグリコールキトサン−ＥＤＴＡのヒト組み換え内因性マトリックスメタロプロテアーゼ−９の活性に対する阻害の程度が類似しているものであり、図４（Ｂ）は、各群の象牙質の混合層における象牙質コラーゲンの分解程度を比較するものである。
【図５】３２％リン酸（ＰＡ）、０．１ＭのＥＤＴＡ又は２５ｍｇ／ｍＬのグリコールキトサンに架橋されたＥＤＴＡ（ＧＣＥ）という異なる象牙質脱灰剤に対する細胞毒性検出である。ＰＢＳを対照とし、図５（Ａ）は、ヒト歯髄幹細胞が異なる象牙質脱灰剤の環境に曝された後の細胞ミトコンドリアデヒドロゲナーゼ活性に対する検出であり、図５（Ｂ）は、ヒト歯髄幹細胞が異なる象牙質脱灰剤の環境に曝された後の細胞内ＤＮＡ含有量に対する検出である。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明は、水溶性キトサンの天然大分子の優位性及びＥＤＴＡの効率的なカルシウムイオンキレート作用を総合的に発揮し、方法は、水溶性キトサン溶液とＥＤＴＡの水溶液とを等体積混合し、共有結合架橋剤を加えて、両者を架橋剤の作用下で共有結合させることを含む。
【００４８】
以下は、発明者が提供する具体的な実施例であり、本発明の技術手段をさらに説明する。
【００４９】
（実施例１）
この実施例の材料は、適切な濃度のグリコールキトサン（重合度≧４００、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）の水溶液とＥＤＴＡの水溶液を混合した後、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドの架橋剤を加え、室温で１４時間撹拌し続けた後、適切な透析条件で未反応残留物を除去する。グリコールキトサンの総量が１０ｇで、ＥＤＴＡが３００ｇで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドの架橋剤が１５ｇである。
【００５０】
例えば、好ましい透析条件は、上記反応液を、分画分子量が１２〜１４ｋＤａで０．０５ＭのＮａＯＨを含有する透析膜に入れて透析して分子量の小さい反応物を除去し、分画分子量１２〜１４ｋＤａで再蒸留水を含有する透析膜で再度透析して未架橋の残留物を除去することである。グリコールキトサンの総量が１０ｍｇで、ＥＤＴＡが３００ｍｇで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドの架橋剤が１５ｍｇである。過程中に、ｐＨ値を調整することにより、ＥＤＴＡを十分かつ迅速に溶解させることができ、例えば、ｐＨを８．０に調整する。
【００５１】
好ましい態様では、製造時に混合溶液のＰＨ値を中性又はアルカリ性に調整することにより、ＰＨ値が中性又はアルカリ性の脱灰材料を製造することができる。
【００５２】
（実施例２）
該実施例は、
（１）グリコールキトサンを脱イオン水に溶解して、濃度が１０ｍｇ／ｍＬのキトサン溶液を形成し、
（２）ＥＤＴＡを脱イオン水に溶解して、濃度が３００ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ水溶液を形成し、
（３）上記２種類の溶液を等体積混合し、混合溶液のＰＨ＝６．０に調整し、
（４）１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドの架橋剤を１５ｍｇ／ｍＬの濃度で上記混合溶液に溶解し、ＥＤＴＡ分子鎖上のカルボキシル基官能基と可溶性キトサン骨格のアミノ官能基とを共有結合させ、室温で１４時間撹拌し続け、
（５）上記反応液を、分画分子量が１２〜１４ｋＤａで０．０５ＭのＮａＯＨを含有する透析膜に入れて透析して分子量の小さい反応物を除去し、分画分子量１２〜１４ｋＤａで再蒸留水を含有する透析膜で再度透析して未架橋の残留物を除去し、−２０℃で凍結乾燥して保存するという点で、実施例１と相違する。水溶性キトサンに架橋されたＥＤＴＡカルシウムイオンキレート剤材料を製造する。
【００５３】
実施例２に記載のとおり、本発明において構築される水溶性キトサンに架橋されたＥＤＴＡカルシウムイオンキレート剤材料は、以下の特徴を有する。
【００５４】
図１に示すように、ＥＤＴＡ、グリコールキトサン、及びグリコールキトサンに架橋されたＥＤＴＡの赤外スペクトル図である。赤外線吸収ピークの位置と強度は、ＥＤＴＡ、グリコールキトサン、及びグリコールキトサンに架橋されたＥＤＴＡ構造組成又は化学基の特徴を反映する。グリコールキトサンに架橋されたＥＤＴＡは、１３００−１４００ｃｍ−１の波長にＥＤＴＡの特徴的な吸収ピーク（Ｃ＝Ｏ引張振動）を検出し、ＥＤＴＡとグリコールキトサンとが化学結合したことを示す。
【００５５】
図２に示すように、誘導結合プラズマ発光分析法で石灰化象牙質における濃度（５０、２５及び１０ｍｇ／ｍＬ）の異なるグリコールキトサンに架橋されたＥＤＴＡカルシウムイオンキレート剤のＣａ２＋に対するキレート速度を測定し、０．１ＭのＥＤＴＡを対照とするものである。その結果、０．１ＭのＥＤＴＡが最も高い脱灰効果を有し、グリコールキトサンに架橋されたＥＤＴＡの脱灰能力が濃度の増加に伴って増加することを示している。
【００５６】
図３に示すように、異なるリン酸（ＰＡ）、０．１ＭのＥＤＴＡ又は２５ｍｇ／ｍＬのグリコールキトサンに架橋されたＥＤＴＡ（ＧＣＥ）という異なる象牙質脱灰剤で象牙質の表面を処理した後の接着強度への影響である。湿式接着に対して、接着前にリントフリーペーパーを用いて象牙質の表面から余分な水分を除去して、処理したサンプルを湿潤に保つ。乾式接着に対して、処理した象牙質を、油や水分を含まない空気で５秒間風乾する。以下の方法で、象牙質の接着強度を測定する。各種の脱灰試薬で処理した後、脱イオン水で洗浄し、その後にＡｄｐｅｒ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｂｏｎｄ  ２（３Ｍ、ＥＳＰＥ、Ｓｔ  Ｐａｕｌ、ＭＮ、ＵＳＡ）で各歯の断片を接着する。接着後、インクリメンタル光硬化を用いて、４ｍｍ厚さの複合樹脂（Ｚ２５０、３Ｍ  ＥＳＰＥ）を、接着剤が被覆された象牙質の表面に置く。接着した歯を３７℃の水中で２４ｈ保存する。次に、各サンプルを０．９ｍｍ×０．９ｍｍ×７ｍｍの細長いものに切断し、各細長いものは、中間に樹脂−象牙質界面を有する。各細長いものをシアノアクリレート接着剤（Ｚａｐｉｔ、Ｄｅｎｔａｌ  Ｖｅｎｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ｃｏｒｏｎａ、ＣＡ、ＵＳＡ）で試験ツールに接続し、かつ汎用試験機（Ｖｉｔｒｏｄｙｎｅ  Ｖ１０００、Ｌｉｖｅｃｏ  Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ）に１ｍｍ／ｍｉｎのクロスヘッド速度で引張力を、破断するまで付与する。破断時の引張荷重を記録し、測定された各束の断面積で除して引張接着強さを得る。各歯の４本の細長いもので得られた平均接着強度で各特定の歯の引張接着強度を示す。歯を統計ユニット（ｎ＝１０歯）として用い、後のデータ分析を行う。図３（Ａ）は、湿式接着又は乾式接着モードで、３２％リン酸で１５秒間処理し、０．１ＭのＥＤＴＡで６０秒間処理するか又は２５ｍｇ／ｍＬのグリコールキトサン−ＥＤＴＡで３０秒間処理し、接着剤による象牙質の微引張強度を比較するものである。リン酸−湿式接着を対照群として統計分析を行った結果、乾式接着モードで３２％リン酸群と０．１ＭのＥＤＴＡ群から接着強度が著しく低下することを検出する（ｐ＜０．０５）。２５ｍｇ／ｍＬのグリコールキトサン−ＥＤＴＡ群に対して、象牙質の湿式接着又は乾式接着で得られた接着強度は、対照群と顕著な差がない。図３（Ｂ）は、石灰化象牙質が０．１ＭのＥＤＴＡで６０秒間処理されるか、又は２５ｍｇ／ｍＬのグリコールキトサン−ＥＤＴＡで３０秒間処理された透過電子顕微鏡画像である。ＥＤＴＡ群は、一部の領域が完全に脱灰し、さらに一部の領域が部分的に脱灰する。グリコールキトサン−ＥＤＴＡ群は、象牙質が一部脱灰し、明らかなミネラルの存在がない線維外空間が見られ、線維内石灰化が依然として完全である。
【００５７】
図４に示すように、濃度の異なるＥＤＴＡ及びグリコールキトサンに架橋されたＥＤＴＡ（ＧＣＥ）のヒト組み換え内因性マトリックスメタロプロテアーゼ−９（ｒＨＭＭＰ−９）の活性に対する阻害作用を比較し、３２％のリン酸（ＰＡ）を対照とするものである。この実験では、精製した組み換えヒトＭＭＰ−９（ｒｈＭＭＰ−９）と汎用のＭＭＰ測定キット（Ｓｅｎｓｏｌｙｔｅ、ＡｎａＳｐｅｃ  Ｉｎｃ．、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、ＧＣＥの可溶性ＭＭＰ−９に対する抑制効果を評価する。ＭＭＰキットは、特異的なＭＭＰによりカットされてメルカプト基を放出する完全なｔｈｉｏｐｅｐｔｏｌｉｄｅを含み、前記メルカプト基は、Ｅｌｌｍａｎ’ｓ試薬により、発色した２−ニトロ−５−メルカプト安息香酸を生成できる。ＥＤＴＡ及びＧＣＥ溶液の一連の希釈液（５０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ）を試験試薬として用い、３２％のＨ３ＰＯ４を対照として用いる。１：５０の体積比で、ｔｈｉｏｐｅｐｔｏｌｉｄｅ基質溶液をアッセイバッファーで０．２ｍＭに希釈する。試験化合物群において、ウェル当たりに、２に含まれたｒｈＭＭＰ−９（１９．６ｎｇ／ウェル）、１０、６の潜在型ＭＭＰ阻害剤及び５０剤６のｔｈｉｏｐｅｐｔｏｌｉｄｅ基質溶液を含有する。追加のアッセイバッファーを加えて、１００個のバッファーウェルを生成する。対照群は、（１）ｒｈＭＭＰ−９酵素のみを含有し、潜在型抗ＭＭＰ剤を含有しない陽性対照、（２）ｒｈＭＭＰ−９酵素及び１０ＭＬのＧＭ６００１（既知のＭＭＰ阻害剤）を含有する阻害剤対照、（３）アッセイバッファー及び濃度の異なる試験溶液を含有する試験化合物対照、（４）アッセイバッファーを含有する基質対照を含む。３７℃で６０分間インキュベートした後に読み取り値を得る。９６−ウェルプレートリーダー（ＶＩＣＴＯＲ  ＮｉｖｏＴＭ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて、４１２ｎｍで吸光度を測定する。バックグラウンドの吸光度は、「基質対照」により測定され、かつｔｈｉｏｐｅｐｔｏｌｉｄｅ基質を含有する他のウェルの読み取り値から減算される。ＧＭ６００、キットに含まれるＭＭＰ阻害剤、及び３種類の濃度のＥＤＴＡ又はＧＣＥの効果は、「陽性対照」における吸光度を調整する百分率として示される。ＭＭＰの抑制（％）は、１−（[Ａ]試験化合物群−[Ａ]試験化合物対照）／（[Ａ]陽性対照−[Ａ]基質対照）で計算し、ここで、[Ａ]は、各ウェルの吸光度値を示す。各試験溶液に対して、６つのウェルの値から平均吸光度値を計算する。図４（Ａ）の結果から、ＥＤＴＡ及びグリコールキトサン−ＥＤＴＡのヒト組み換え内因性マトリックスメタロプロテアーゼ−９の活性に対する阻害の程度が類似していることは明らかである。図４（Ｂ）は、各群の象牙質の混合層における象牙質コラーゲンの分解程度を比較するものである。その結果、３２％リン酸群のコラーゲン分解率が最も高く、次がＥＤＴＡであり、グリコールキトサンに架橋されたＥＤＴＡが最も低いことを示すため、グリコールキトサンに架橋されたＥＤＴＡ群の象牙質コラーゲンに対する保護効果が最も優れることを説明する。
【００５８】
図５に示すように、異なるリン酸（ＰＡ）、０．１ＭのＥＤＴＡ又は２５ｍｇ／ｍＬのグリコールキトサンに架橋されたＥＤＴＡ（ＧＣＥ）という異なる象牙質脱灰剤に対する細胞毒性検出である。ＰＢＳを対照とする。その結果、グリコールキトサンに架橋されたＥＤＴＡ群の細胞の活力が最も高く、次がＥＤＴＡ群であり、３２％リン酸群が最も低いことを示すため、３種類の象牙質脱灰剤のうちグリコールキトサンに架橋されたＥＤＴＡの細胞毒性が最も低いことを説明する。
【００５９】
表１は、ゲル浸透クロマトグラフィーで、グリコールキトサン及びグリコールキトサンに架橋されたＥＤＴＡの分子量を表し、グリコールキトサンとＥＤＴＡとの間の架橋程度を表す。その結果、架橋後に形成されたグリコールキトサン−ＥＤＴＡの分子量が著しく高くなるとともに、遊離アミノ基の量が著しく低下し、グリコールキトサンの骨格上のほぼ全てのアミノ基がＥＤＴＡの分子上のカルボキシル基と反応し、共有結合してアミド結合を形成することを示す。
【表１】
2020176110.tif 000006
略称：Ｍｎ：数平均分子量、Ｍｗ：加重平均分子量、Ｍｐ：分子量ピーク、ＰＤＩ：多分散性指数（ｍｗ／ｍｎ）
【００６０】
（実施例３）
該実施例は、
（１）カルボキシメチルキトサンを脱イオン水に溶解して、濃度が７ｍｇ／ｍＬのキトサン溶液を形成し、
（２）ＥＤＴＡを脱イオン水に溶解して、濃度が２００ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡの水溶液を形成し、ＥＤＴＡの水溶液とカルボキシメチルキトサンとを等体積混合し、混合溶液のＰＨ＝６．０に調整し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドの架橋剤を１３ｍｇ／ｍＬの濃度で上記混合溶液に溶解し、室温で１２時間撹拌し続けるという点で、実施例２と相違する。
【００６１】
（実施例４）
該実施例は、
（１）ヒアルロン酸様キトサンを脱イオン水に溶解して、濃度が８ｍｇ／ｍＬのキトサン溶液を形成し、
（２）ＥＤＴＡを脱イオン水に溶解して、濃度が２５０ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ水溶液を形成し、ＥＤＴＡの水溶液とヒアルロン酸様キトサンとを等体積混合し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドの架橋剤を１２ｍｇ／ｍＬの濃度で上記混合溶液に溶解し、室温で１３時間撹拌し続けるという点で、実施例２と相違する。
【００６２】
（実施例５）
該実施例は、
（１）グリコールキトサンを脱イオン水に溶解して、濃度が５ｍｇ／ｍＬのキトサン溶液を形成し、
（２）ＥＤＴＡを脱イオン水に溶解して、濃度が１００ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ水溶液を形成し、ＥＤＴＡの水溶液とグリコールキトサン溶液とを等体積混合し、混合溶液のＰＨ＝６．０に調整し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドの架橋剤を８ｍｇ／ｍＬの濃度で上記混合溶液に溶解し、室温で１５時間撹拌し続けるという点で、実施例２と相違する。
【００６３】
（実施例６）
該実施例は、
（１）グリコールキトサンを脱イオン水に溶解して、濃度が１０ｍｇ／ｍＬのキトサン溶液を形成し、ＥＤＴＡを脱イオン水に溶解して、濃度が３００ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ水溶液を形成し、ＥＤＴＡの水溶液とグリコールキトサン溶液とを等体積混合し、
（２）グルタルアルデヒドの架橋剤を８．０ｍｇ／ｍＬの濃度で上記混合溶液に溶解し、室温で１４時間撹拌し続けるという点で、実施例２と相違する。
【００６４】
（実施例７）
該実施例は、
（１）グリコールキトサンを脱イオン水に溶解して、濃度が１０ｍｇ／ｍＬのキトサン溶液を形成し、
（２）ＥＤＴＡを脱イオン水に溶解して、濃度が１００ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡの水溶液を形成し、ＥＤＴＡの水溶液とグリコールキトサン溶液とを等体積混合し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドの架橋剤を１５ｍｇ／ｍＬの濃度で上記混合溶液に溶解し、室温で１４時間撹拌し続けるという点で、実施例２と相違する。
【００６５】
以上の内容は、具体的な好ましい実施形態を組み合わせて本発明をさらに詳細に説明するものであるが、本発明の具体的な実施形態がこれに限定されるものであると認められず、当業者であれば、本発明の構想から逸脱することなく、いくつかの簡単な推断演繹又は置換を行うことができ、いずれも本発明の特許請求の範囲によって決定された保護範囲に属するとみなされるべきである。
【図１】
2020176110.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
2020176110.tif 000010
【図５】
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【外国語明細書】
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