(57)【要約】      （修正有）【解決手段】眼炎症状態を処置する際に使用するための、式Ｉ2020121985.tif 000034の化合物またはその薬学的に許容される塩等を含む薬学的組成物。【効果】インテグリンα4のアンタゴニストに関し、かつ、薬学的組成物、主に、局所的に投与する眼科用組成物におけるそれらの使用に関する。該薬学的組成物は、動物、特に、ヒトを含む哺乳動物における、ドライアイ疾患、非感染性ブドウ膜炎（例えば、前部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎、汎ブドウ膜炎）、非感染性結膜炎、虹彩炎、または強膜炎などの眼炎症状態を処置するのに有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼炎症状態を処置する際に使用するための、式I
2020121985.tif 000030
の化合物またはその薬学的に許容される塩、エステル、水和物、溶媒和物、多形、光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー、もしくは鏡像異性体を含む薬学的組成物。
【請求項２】
点眼に適している、請求項1に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記眼炎症状態が、ドライアイ疾患、非感染性ブドウ膜炎、非感染性結膜炎、虹彩炎、および強膜炎からなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
式I
2020121985.tif 000031
の化合物またはその薬学的に許容される塩、エステル、水和物、溶媒和物、多形、光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー、もしくは鏡像異性体と、1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤とを含み、
点眼に適している、薬学的組成物。
【請求項５】
点眼剤、ゲル、軟膏、噴霧剤、またはミストとして製剤化されている、前記請求項のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
点眼液として製剤化されている、前記請求項のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記点眼液が、約10mg/mL〜約100mg/mL、好ましくは約30mg/mL〜約50mg/mLの式Iの化合物またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、多形、光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー、もしくは鏡像異性体を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記点眼液の個別の用量が約10μL〜約100μLの体積を有する、請求項6または請求項7に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
薬学的に許容される塩がカリウム塩である、前記請求項のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
1つまたは複数の追加の治療用物質をさらに含み、該追加の治療用物質が、（a）シクロスポリンA；（b）デキサメタゾン塩基、デキサメタゾンホスフェート、ジフルプレドナート、フルオシノロン、フルオロメトロン塩基、フルオロメトロンアセテート、ロテプレドノール、プレドニゾロンアセテート、プレドニゾロンホスフェート、リメキソロン、およびトリアムシノロンアセトニドからなる群より選択されるステロイド；（c）ブロムフェナク、ジクロフェナク、フルルビプロフェン、ケトロラク、およびネパフェナクからなる群より選択される非ステロイド性抗炎症剤；ならびに（d）LFA-1アンタゴニストからなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
眼炎症状態を処置する際に使用するための、式I
2020121985.tif 000032
の化合物またはその薬学的に許容される塩、エステル、水和物、溶媒和物、多形、光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー、もしくは鏡像異性体。
【請求項１２】
眼炎症状態を処置するための医薬の製造における、式I
2020121985.tif 000033
の化合物またはその薬学的に許容される塩、エステル、水和物、溶媒和物、多形、光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー、もしくは鏡像異性体の使用。
【請求項１３】
前記眼炎症状態が、ドライアイ疾患、非感染性ブドウ膜炎、非感染性結膜炎、虹彩炎、および強膜炎からなる群より選択される、請求項11または請求項12に記載の化合物または使用。
【請求項１４】
前記医薬が、1つまたは複数の追加の治療用物質と組み合わせて使用するためのものであり、該追加の治療用物質が、（a）シクロスポリンA；（b）デキサメタゾン塩基、デキサメタゾンホスフェート、ジフルプレドナート、フルオシノロン、フルオロメトロン塩基、フルオロメトロンアセテート、ロテプレドノール、プレドニゾロンアセテート、プレドニゾロンホスフェート、リメキソロン、およびトリアムシノロンアセトニドからなる群より選択されるステロイド；（c）ブロムフェナク、ジクロフェナク、フルルビプロフェン、ケトロラク、およびネパフェナクからなる群より選択される非ステロイド性抗炎症剤；ならびに（d）LFA-1アンタゴニストからなる群より選択される、請求項12または請求項13に記載の使用。
【請求項１５】
前記薬学的に許容される塩がカリウム塩である、前記請求項のいずれか一項に記載の化合物または使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、2015年7月8日提出の米国特許仮出願第62/189,813号に対する優先権を主張し、その全文は参照により本特許出願に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ドライアイ疾患を含む眼炎症状態を処置する際に使用するための、インテグリンα4アンタゴニストを含む局所眼科用組成物などの薬学的組成物に関する。本発明は、インテグリンα4アンタゴニストを含む局所眼科組成物などの薬学的組成物を投与する段階によって、ヒトおよび他の哺乳動物におけるドライアイ疾患を含む眼炎症状態を処置するための方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ドライアイ疾患（DED）は、最も一般的でかつ不快な眼障害の1つである。これは女性および高齢者でより多く見られる、多因子眼表面疾患と定義されている。DEDは不快、視覚障害、涙膜不安定、および眼表面組織への損傷を引き起こす可能性がある眼表面の炎症の症状と関係づけられる（Research in Dry Eye DEWS Report 2007）。Sternら（Stern et al., 2010；Stern et al., 2013）によって総説が出されたとおり、炎症誘発環境は、涙膜、角膜、および結膜におけるサイトカインおよびケモカインのレベル増大、ならびに結膜上皮および時に涙腺の自己反応性T細胞浸潤の増大が特徴である（Pflugfelder et al., 1999；de Paiva et al., 2009a；Massingale et al., 2009）。涙膜組成（ムチン、脂質、タンパク質）の変化および量の減少は、疾患周期に寄与する涙膜異常を引き起こす。
【０００４】
マウスを乾燥ストレス（DS）の制御された環境に供すと、多くの面で患者のヒトDEDを暗示する眼表面の病態を引き起こす（Dursun et al., 2002；de Paiva et al., 2006b；Niederkorn et al., 2006；de Paiva et al., 2009a）。現時点で、このモデルはDEDを研究するために最も特徴決定された動物モデルである。
【０００５】
インテグリンは、1つのαおよび1つのβサブユニットからなるヘテロ二量体糖タンパク質である。インテグリンは、白血球の細胞表面上で発現して、炎症部位へのそれらの動員において役割を果たす。特定のαおよびβサブユニットの結合は、インテグリンのリガンド特異性を決定する。α4インテグリンサブユニット（CD49d）は、最晩期抗原4、VLA-4（インテグリンα4β1；CD49d/CD29）およびα4β7（CD49d/CD103）の成分である。インテグリンα4β1の場合、対応するリガンドは、免役グロブリンスーパーファミリー接着分子、血管内皮細胞上の血管細胞接着分子1（VCAM-1）および細胞外マトリクス糖タンパク質フィブロネクチンであり、これらはインテグリンα4β1発現細胞のホーミング、輸送、分化、初回抗原刺激、活性化、増殖、および生存を担っている。インテグリンα4β1はリンパ球、単球、マクロファージ、NK細胞、および好酸球上で発現する。インテグリンα4β7およびその対応するリガンド、MAdCAM（粘膜アドレシン細胞接着分子-1）は、白血球の腸への輸送を調節するが、DEDにおけるそれらの関与を排除することはできない。
【０００６】
インテグリンα4サブユニットに対する抗体のナタリズマブは、炎症を大いに阻害し、同様にT細胞仲介性の病態である多発性硬化症（Cross and Naismith, 2014）およびクローン病（Cohen et al., 2014）の両方の臨床転帰を改善することが明らかにされている。異なる接着分子（LFA-1、インテグリンαLβ2）に対する小分子アンタゴニスト、リフィテグラストは、ドライアイ患者に局所的に送達すると、角膜染色を低減し、症状を改善することが明らかにされている（Sheppard et al., 2014）。さらに、インテグリンα4β1に対する特異的小分子アンタゴニスト、BIO-8809は、マウスドライアイモデルにおいて、角膜フルオレセイン染色、結膜T細胞浸潤、ならびに角膜および結膜におけるTNFα発現を低減することが示された（Ecoiffier et al., 2008）。まとめると、これらの考察は、DEDの動物モデルにおいてインテグリンα4の遮断をさらに探究するための理論的根拠を提供した。
【発明の概要】
【０００７】
1つの局面において、本出願は、それを必要とする哺乳動物における眼炎症状態を処置するための方法であって、哺乳動物に式I
2020121985.tif 000002
の化合物またはその薬学的に許容される塩、エステル、無水物、水和物、溶媒和物、多形、光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー、もしくは鏡像異性体（総称して治療用物質Aと呼ぶ）の治療的有効量を眼投与する段階を含む、方法に指向されている。ある特定の態様において、治療用物質Aを局所的に適用する。局所投与は角膜、結膜嚢、および/または眼瞼への投与であってもよい。ある特定の他の態様において、治療用物質Aを局部的に、例えば、結膜下、前房内、硝子体内、テノン嚢下、網膜下、脈絡膜下、または脈絡膜上に適用する。
【０００８】
別の局面において、本出願は、眼炎症状態を処置する際に使用するための、式I
2020121985.tif 000003
の化合物またはその薬学的に許容される塩、エステル、無水物、水和物、溶媒和物、多形、光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー、もしくは鏡像異性体（総称して治療用物質Aと呼ぶ）に指向されている。ある特定の態様において、治療用物質Aを、薬学的に許容される眼科用ビヒクル中などの薬学的に許容されるビヒクル中に提供する。
【０００９】
別の局面において、本出願は、眼炎症状態を処置するのに有用な、式I
2020121985.tif 000004
の化合物またはその薬学的に許容される塩、エステル、無水物、水和物、溶媒和物、多形、光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー、もしくは鏡像異性体（合わせて、治療用物質Aと呼ぶ）と1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物に指向されている。ある特定の態様において、薬学的組成物は眼投与に適している。いくつかのそのような態様において、薬学的組成物は局所的に適用するのに適している。ある特定の態様において、薬学的組成物は結膜嚢または眼瞼に適用するのに適している。ある特定の他の態様において、薬学的組成物は結膜下、前房内、硝子体内、テノン嚢下、網膜下、脈絡膜下、または脈絡膜上に適用するのに適している。
【００１０】
別の局面において、本出願は、点眼剤、噴霧剤、またはミストの形で適用した場合に、眼炎症状態を処置するのに有用な、治療用物質Aと1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物に指向されている。
【００１１】
さらなる局面において、本出願は、局所眼科用製剤として適用した場合に、眼炎症状態を処置するのに有用な、治療用物質Aと1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物に指向されている。
【００１２】
なおいっそうさらなる別の局面において、本出願は、抗原提示細胞のリンパ節への遊走を防止または低減する段階による、それを必要とする哺乳動物（この哺乳動物はヒトであってもよい）における眼炎症状態を処置するための方法に指向されている。そのような方法は、前記哺乳動物（この哺乳動物はヒトであってもよい）に治療用物質Aの治療的有効量を投与する段階を含む。
【００１３】
別の局面において、本出願は、式I
2020121985.tif 000005
の化合物またはその薬学的に許容される塩、エステル、無水物、水和物、溶媒和物、多形、光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー、もしくは鏡像異性体と1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物に指向されている。
【００１４】
さらなる別の局面において、本出願は、それを必要とする哺乳動物（この哺乳動物はヒトであってもよい）におけるDEDなどの眼炎症状態の処置のための方法であって、該哺乳動物/ヒトに、治療的有効量の（a）治療用物質Aを含む薬学的組成物；（b）シクロスポリンA；および（c）1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を投与する段階を含む、方法に指向されている。
【００１５】
なおいっそうさらなる別の局面において、本出願は、それを必要とする哺乳動物（この哺乳動物はヒトであってもよい）におけるDEDなどの眼炎症状態の処置のための方法であって、該哺乳動物/ヒトに、治療的有効量の（a）治療用物質Aを含む薬学的組成物；（b）デキサメタゾン塩基およびデキサメタゾンホスフェート、ジフルプレドナート、フルオシノロン、フルオロメトロン塩基およびフルオロメトロンアセテート、ロテプレドノール、プレドニゾロンアセテートおよびプレドニゾロンホスフェート、リメキソロン、ならびにトリアムシノロンアセトニドからなる群より選択される局所用ステロイド；ならびに（c）1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を投与する段階を含む、方法に指向されている。
【００１６】
なおさらなる局面において、本出願は、それを必要とする哺乳動物（この哺乳動物はヒトであってもよい）におけるDEDなどの眼炎症状態の処置のための方法であって、該哺乳動物/ヒトに、治療的有効量の（a）治療用物質Aを含む薬学的組成物；（b）ブロムフェナク、ジクロフェナク、フルルビプロフェン、ケトロラク、およびネパフェナクからなる群より選択される非ステロイド性抗炎症薬；ならびに（c）1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を投与する段階を含む、方法に指向されている。
【００１７】
なおいっそうさらなる局面において、本出願は、それを必要とする哺乳動物（この哺乳動物はヒトであってもよい）におけるDEDなどの眼炎症状態の処置のための方法であって、該哺乳動物/ヒトに、治療的有効量の（a）治療用物質Aを含む薬学的組成物；（b）リフィテグラストなどのLFA-1インテグリンアンタゴニスト；および（c）1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を投与する段階を含む、方法に指向されている。
【００１８】
さらに別の局面において、本出願は、眼炎症状態の処置のための医薬の製造における、式I
2020121985.tif 000006
の化合物またはその薬学的に許容される塩、エステル、無水物、水和物、溶媒和物、多形、光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー、もしくは鏡像異性体の使用に指向されている。
【００１９】
前述の任意の局面のある特定の態様において、眼炎症状態はドライアイ疾患である。各局面の他の態様において、眼炎症状態は非感染性ブドウ膜炎（前部、中間部、後部、汎）、非感染性結膜炎、虹彩炎、または強膜炎である。
【００２０】
前述の任意の局面のある特定の態様において、治療用物質Aは化合物（I）またはその薬学的に許容される塩である。ある特定の態様において、治療用物質Aは化合物（I）のカリウム塩である。
【００２１】
当業者であれば、前述の任意の処置方法および/または使用は、治療用物質Aを含む薬学的組成物の局所投与または他の眼投与によって達成しうることを理解するであろう。本明細書において用いられる「局所投与」なる用語は、眼の表面に適用する点眼剤、噴霧剤、ミスト、ゲル、クリーム、または軟膏の形での適用、結膜嚢への適用、挿入物を介した適用、眼科用薬剤を送達するために設計された薬物送達デバイスを介した適用などを含む。本明細書において用いられる「他の眼投与」なる用語は、薬学的に許容される製剤、挿入物または眼科用薬剤を送達するために設計されたデバイスの結膜下、前房内、硝子体内、テノン嚢下、網膜下、脈絡膜下、または脈絡膜上適用などを含む。
【００２２】
本明細書において示すデータに基づき、α4インテグリン受容体の遮断は、DEDに加えてブドウ膜炎（前部、中間部、後部、汎）、結膜炎、虹彩炎、または強膜炎（びまん性、結節性、壊死性）のすべての型などの、その病因が白血球に関与する他の眼の炎症および免疫学的状態を処置および改善すると予想される。
【００２３】
式Iの化合物は、(S)-3-(4-((4-カルバモイルピペリジン-1-カルボニル)オキシ)フェニル)-2-((S)-4-メチル-2-(2-(o-トリルオキシ)アセトアミド)ペンタンアミド)プロパン酸；または(2S)-3-[4-({[4-(アミノカルボニル)-1-ピペリジニル]カルボニル}オキシ)フェニル]-2-[((2S)-4-メチル-2-{[2-(2-メチルフェノキシ)アセチル]アミノ}ペンタノイル)アミノ]プロパン酸；またはGW559090としても公知であり、以前に喘息患者において経口吸入経路により臨床試験された（Ravensberg et al., 2006）強力なインテグリンα4アンタゴニストである。
【００２４】
いかなる機構的理論にも縛られることなく、式Iの化合物の効果は抗炎症および疾患修飾の両方であると考えられる。DEDのマウスモデルにおいて、眼に局部的に投与した場合、式Iの化合物は、角膜上皮関門機能を改善し、角膜および結膜における炎症マーカーを減少させ、Tリンパ球の結膜への動員およびホーミングを低減し、かつ、驚くことに、抗原提示細胞の流入領域リンパ節への遊走および活性化を阻止した。式Iの化合物は、全身投与すると無効であった。これは、白血球輸送におけるインテグリンの周知の役割を考慮すると驚くべきことである。白血球輸送の遮断が、式Iの化合物などのインテグリンα4アンタゴニストの唯一のまたは少なくとも主な作用機作であったならば、全身薬物曝露は眼表面での薬物曝露よりも重要であろうと推論することができる。白血球輸送は、循環中の白血球が、細胞接着分子VCAM-1およびMAdCAMとの相互作用を通じて、炎症部位で血管内壁を遊出する前に、それらに結合したインテグリンα4アンタゴニストによって阻害される。式Iの化合物の局所投与経路はこの動物モデルにおけるDEDの徴候を処置する際に有効であったが、全身経路は有効ではなかったという事実は、インテグリンα4拮抗作用による全身効果ではなく局部的効果を示唆するものである。この局部的効果は、インテグリンα4アンタゴニスト、すなわち式Iの化合物に特異的であり、局所用デキサメタゾンホスフェートがDED関連の角膜染色を改善したが抗原提示細胞の流入領域リンパ節への遊走を改善しなかったという点で、局所用ステロイド処置（デキサメタゾンホスフェート）と区別されると考えられる。当業者であれば、これらの考察から、インテグリンα4拮抗作用の治療効果は独特のメカニズムを用いることを理解することができよう。この独特のメカニズムの重要な疾患修飾局面は、局所用ステロイドなどの他の薬物と共有しないメカニズムである、流入領域リンパ節レベルでの、DEDで見られる免疫サイクルの妨害である。
[本発明1001]
眼炎症状態を処置する際に使用するための、式I
2020121985.tif 000007
の化合物またはその薬学的に許容される塩、エステル、水和物、溶媒和物、多形、光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー、もしくは鏡像異性体を含む薬学的組成物。
[本発明1002]
点眼に適している、本発明1001の薬学的組成物。
[本発明1003]
前記眼炎症状態が、ドライアイ疾患、非感染性ブドウ膜炎、非感染性結膜炎、虹彩炎、および強膜炎からなる群より選択される、前記本発明のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1004]
式I
2020121985.tif 000008
の化合物またはその薬学的に許容される塩、エステル、水和物、溶媒和物、多形、光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー、もしくは鏡像異性体と、1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤とを含み、
点眼に適している、薬学的組成物。
[本発明1005]
点眼剤、ゲル、軟膏、噴霧剤、またはミストとして製剤化されている、前記本発明のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1006]
点眼液として製剤化されている、前記本発明のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1007]
前記点眼液が、約10mg/mL〜約100mg/mL、好ましくは約30mg/mL〜約50mg/mLの式Iの化合物またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、多形、光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー、もしくは鏡像異性体を含む、前記本発明のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1008]
前記点眼液の個別の用量が約10μL〜約100μLの体積を有する、本発明1006または本発明1007の薬学的組成物。
[本発明1009]
薬学的に許容される塩がカリウム塩である、前記本発明のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1010]
1つまたは複数の追加の治療用物質をさらに含み、該追加の治療用物質が、（a）シクロスポリンA；（b）デキサメタゾン塩基、デキサメタゾンホスフェート、ジフルプレドナート、フルオシノロン、フルオロメトロン塩基、フルオロメトロンアセテート、ロテプレドノール、プレドニゾロンアセテート、プレドニゾロンホスフェート、リメキソロン、およびトリアムシノロンアセトニドからなる群より選択されるステロイド；（c）ブロムフェナク、ジクロフェナク、フルルビプロフェン、ケトロラク、およびネパフェナクからなる群より選択される非ステロイド性抗炎症剤；ならびに（d）LFA-1アンタゴニストからなる群より選択される、前記本発明のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1011]
眼炎症状態を処置する際に使用するための、式I
2020121985.tif 000009
の化合物またはその薬学的に許容される塩、エステル、水和物、溶媒和物、多形、光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー、もしくは鏡像異性体。
[本発明1012]
眼炎症状態を処置するための医薬の製造における、式I
2020121985.tif 000010
の化合物またはその薬学的に許容される塩、エステル、水和物、溶媒和物、多形、光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー、もしくは鏡像異性体の使用。
[本発明1013]
前記眼炎症状態が、ドライアイ疾患、非感染性ブドウ膜炎、非感染性結膜炎、虹彩炎、および強膜炎からなる群より選択される、本発明1011または本発明1012の化合物または使用。
[本発明1014]
前記医薬が、1つまたは複数の追加の治療用物質と組み合わせて使用するためのものであり、該追加の治療用物質が、（a）シクロスポリンA；（b）デキサメタゾン塩基、デキサメタゾンホスフェート、ジフルプレドナート、フルオシノロン、フルオロメトロン塩基、フルオロメトロンアセテート、ロテプレドノール、プレドニゾロンアセテート、プレドニゾロンホスフェート、リメキソロン、およびトリアムシノロンアセトニドからなる群より選択されるステロイド；（c）ブロムフェナク、ジクロフェナク、フルルビプロフェン、ケトロラク、およびネパフェナクからなる群より選択される非ステロイド性抗炎症剤；ならびに（d）LFA-1アンタゴニストからなる群より選択される、本発明1012または本発明1013の使用。
[本発明1015]
前記薬学的に許容される塩がカリウム塩である、前記本発明のいずれかの化合物または使用。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】式Iの化合物による局所処置がDS誘導性角膜関門破壊を用量依存的に防止することを示す。5日間の乾燥ストレス（DS）後のOGD取り込みの強度スコアの幾何平均±95％信頼区間。NS＝ストレスなし、未処置；DS5＝5日間の乾燥ストレス、局所処置なし；他の群はすべて、DS5および局所処置；Dex＝デキサメタゾンホスフェート 0.1％；BSS＝平衡塩類溶液（Leiter's Pharmacy, San Jose, CA）、デキサメタゾンのビヒクル；V GW＝リン酸緩衝食塩水、pH7（GW559090のビヒクル）；GW_1mg/mL＝GW559090（1mg/mL）；GW_3mg/mL＝GW559090（3mg/mL）；GW_10mg/mL＝GW559090（10mg/mL）；GW_30mg/mL＝GW559090（30mg/mL）。N＝26〜30。対照に比べて*p＜0.05；**p＜0.01（DS5対NS；Dex対Dexビヒクル；GW対GWビヒクル；Log10 OGDデータの混合効果ANOVA）。
【図２】式Iの化合物が、全身ではなく、主に局部的に作用して、DS誘導性角膜関門破壊を改善することを示す。5日間の乾燥ストレス（DS）後のOGD取り込みの強度スコアの幾何平均±95％信頼区間。NS＝ストレスなし、未処置；DS5＝5日間の乾燥ストレス、処置なし；他の群はすべて、DS5および処置；Dex＝デキサメタゾンホスフェート 0.1％；V Dex＝平衡塩類溶液（Leiter's Pharmacy, San Jose, CA）、デキサメタゾンのビヒクル；GW局所＝局所GW559090（30mg/mL；60μg/眼）；GW SC＝皮下GW559090（30mg/mL；120μg）；V GW＝リン酸緩衝食塩水、pH7（GW559090のビヒクル）。N＝26〜30。対照に比べて*p＜0.05；**p＜0.01（DS5対NS；GW対GWビヒクル；Log10 OGDデータの混合効果ANOVA）。
【図３】図3Aおよび3Bは、式Iの化合物による局所処置が炎症マーカーを減少させることを示す。図3A. 角膜におけるIL-1a、MMP-9、CXCL-9、TGF-b1遺伝子の発現±SDの相対倍率。図3B. 結膜におけるTGF-b1遺伝子の発現±SDの相対倍率。線はストレスなし、未処置対照を示す。V GW＝リン酸緩衝食塩水、pH7（ビヒクル）；GW_30mg/mL＝GW559090（30mg/mL）。N＝7〜8。*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；****p＜0.0001（独立t検定）。
【図４】式Iの化合物による局所処置が流入領域頸部リンパ節におけるCD11c+およびCD11c+/MHC II+樹状細胞を減少させることを示す。各マウスからプールした流入領域CLNから単離したゲーティングした細胞パーセント（FACS）を、CD11c、CD11b、およびMHC IIについて染色した。NS＝ストレスなし、未処置；DS1＝1日の乾燥ストレス、処置なし；他の群はすべて、DS1および処置；Dex＝デキサメタゾンホスフェート 0.1％；V GW＝リン酸緩衝食塩水、pH7（デキサメタゾンおよびGW559090用のビヒクル）；GW局所＝局所両側GW559090（30mg/mL；60μg/眼）；GW SC＝GW559090 SC BID（30mg/mL；120μg）。N＝16。対照に比べて*p＜0.05（DS1対NS；GW対GWビヒクル；固定した処置および無作為実験効果による二元配置ANOVAと、続くダネットの多重比較法）。
【図５】式Iの化合物による局所処置が結膜T細胞浸潤を減少させることを示す。5日間の乾燥ストレス（DS）後の細胞密度の群平均および95％信頼区間。NS＝ストレスなし、未処置；DS5＝5日間の乾燥ストレス、処置なし；他の群はすべて、DS5および処置；GW局所＝局所GW559090（30mg/mL；60μg/眼）；V GW＝リン酸緩衝食塩水、pH7（GW559090用のビヒクル）。N＝5。DS5対照に比べて*p＜0.05；***p＜0.001（クラスカルワリス法と、続くダンの多重比較法）。
【図６】40μL（50mg/mL）のGW559090A投与後の、GW559090の結膜および角膜組織濃度を示す。約4000nM（約2400ng/mL）の破線は、タンパク質結合が98％の場合に、約80nM（約48ng/mL）のIC90濃度を達成するのに要するおおよその組織レベルを示す。タンパク質結合が98％の場合に、約8nM（約5ng/mL）のIC50濃度を達成するのに要するおおよその組織レベルは、400nM（約240ng/mL）である。40μL（50mg/mL）のGW559090A投与後、結膜および角膜組織濃度は30分の時点で3000ng/mLを超えており、3時間の時点で角膜組織におけるレベルは1000ng/mL超で持続する。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
I.  DEDのマウスモデルにおけるα4インテグリンアンタゴニストの局部的作用
DEDは、不快、視覚障害、涙膜不安定、および眼表面組織への損傷を引き起こす可能性がある眼表面の炎症の症状と関係づけられる、多因子眼表面疾患である（Research in Dry Eye DEWS Report 2007）。これは環境、薬物誘発性、コンタクトレンズ着用、加齢などの、広域スペクトルの病因を含む。DEDは、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病、スティーブンス・ジョンソン症候群、眼部瘢痕性類天疱瘡（cictricial pemphigoid）、サルコイドーシスなどであるが、それらに限定されない、全身性自己免疫状態に続発する眼の症状を現すことも場合もある（Stern et al., 2010；Zoukhri, 2006による総説）。
【００２７】
眼表面の炎症疾患として、DEDは自己反応性T細胞によって仲介され、角膜関門機能障害、炎症性サイトカインおよびケモカインの発現およびレベル増大、涙膜不安定ならびに不快に関連する。本発明者らは、DEDのマウスモデルにおいて、インテグリンα4アンタゴニストを眼に局部的に投与すると、角膜上皮関門機能を救済し、角膜および結膜における炎症マーカー発現を減少させ、結膜T細胞浸潤を低減し、かつ抗原提示細胞の流入領域リンパ節への遊走および活性化を阻害することを見出した。
【００２８】
初回抗原刺激を受けて、活性化されたTリンパ球は、血管内皮上で対応する接着分子と相互作用する、それらの細胞表面で発現する接着受容体の助けを借りて、血流から炎症部位へと移動する。リンパ球インテグリンα4β1（VLA-4）、α4β7、およびαLβ2（LFA-1）は、それぞれ内皮VCAM-1、MAdCAM、およびICAM-1に結合する。炎症部位で、リンパ球インテグリン受容体は、ある特定の組織構成要素、α4β1の場合はフィブロネクチンと相互作用し得、これはさらにリンパ球のホーミング、活性化、および増殖を助ける（Nojima et al., 1990；Cox et al., 2010）。式Iの化合物は、α4β1に高い親和性を有する（表1）。細胞接着アッセイ法において、この化合物はα4β1のVCAM-1およびフィブロネクチン（CS-1ドメイン）への、ならびにα4β7のMAdCAMへの細胞接着を強力に阻止した（表1）。後者の相互作用は腸環境に関連するが、眼では研究されていない。口内乾燥およびDEDを有するシェーグレン患者において、インテグリンα4β1は口唇組織のTリンパ球浸潤物中において、VCAM-1は血管および樹状細胞上で検出されている（Edwards et al., 1993）。
【００２９】
角膜上皮による蛍光色素の取り込み増大は、DEDの特徴である。以前、マウスにおけるオレゴングリーンデキストラン（OGD）での角膜染色強度は、実験的DS後に角膜関門機能の低下と正に相関することが報告されている（de Paiva et al., 2009a；de Paiva et al., 2006b）。これは、角膜のフルオレセイン染色によって示される、ドライアイ患者で臨床的に観察されたものに類似している。低い染色スコアは色素排除、すなわち角膜関門の完全性の指標である。これに対し、高い染色スコアは関門機能障害を反映する。角膜フルオレセイン染色スコアは、DEDの診断の重要な終点として、また臨床試験の有効性パラメーターとして用いられてきた。
【００３０】
以前に報告されているとおり（de Paiva et al., 2009a；de Paiva et al., 2006b）、制御されたDS環境（以下の材料と方法の項で記載する）において5日間にわたって、マウスは、点状角膜OGD染色として明白な（以下の材料と方法の項で記載する）、角膜関門機能障害を発生した。このマウスモデルにおいて、式Iの化合物の局所投与は、局所用コルチコステロイド、デキサメタゾンホスフェートと同様に、角膜OGD染色を用量依存的に低減した（図1）。局所用ステロイドは、潤滑剤および非ステロイド性免疫調節剤が有効でない場合の、DEDの有効な薬剤であるが、ステロイド関連の眼の有害事象を発生する可能性があるため、典型的には短期で用いる。この動物モデルで異なるインテグリンα4β1アンタゴニスト、BIO-8809による角膜染色の類似の改善が、以前に報告されている（Ecoiffier et al., 2008）。体重に相対的に、薬物のマウス眼への局所適用は、ヒトへの用量を2〜3桁超えている。マウスでの局所処置は関連する全身曝露を達成することは想像できることである。インテグリンは白血球輸送において役割を果たすため、全身曝露はインテグリンアンタゴニストにとって眼疾患を処置するために不可欠であると推論することができる。したがって、全身処置がより有効であるかどうかを判定することが重要であった。興味深いことに、式Iの化合物の同じ用量の全身処置と局所処置とを比較すると、局所的に投与した場合にのみ角膜染色が有意に改善された（図2）。この驚くべき知見は、治療成功のために必要な式Iの化合物を用いたこの疾患の治療に対し、非常に重要な局部的構成要素があることを示唆するものである。
【００３１】
DEDは、眼表面から、自己反応性T細胞の初回抗原刺激が起こる流入領域頸部リンパ節（CLN）への抗原提示樹状細胞（APCまたはDCと呼ばれることが多い）の遊走を含む、免疫サイクルの結果であると示唆されてきた（Pflugfelder et al., 2008）。これらの自己反応性CD4+ T細胞は、次いで、眼表面に戻り、疾患を蔓延する（Coursey et al., 2013；Niederkorn et al., 2006；Zhang et al., 2012）。CD4+ T細胞上に存在するインテグリン受容体により、インテグリンα4アンタゴニストによる処置は流入領域リンパ節におけるT細胞に影響をおよぼすかどうかとの疑問が生じた。1日のDSが流入領域リンパ節におけるCD4+またはCD8+ T細胞を増加させることもなく、また式Iの化合物またはデキサメタゾンによる処置がT細胞の数を減少させることもなかった。以前に報告されたとおり、1日のDSは流入領域リンパ節においてCD11b+単球を有意に上昇させた（Schaumburg et al., 2011；Zhang et al., 2014）。しかし、いずれの薬物処置も、単球の数を低減することはできなかった。
【００３２】
DC枯渇マウスはDEDを発生しないため、DCはDSによって誘導される免疫仲介性の病態にとって重要であることが以前に報告されている（Schaumburg et al., 2011）。CD11c+ DCは、短期DSにより、有意ではないが、流入領域リンパ節中において上昇すると考えられた。これらの細胞に対して有意な効果を持たなかった、局所用デキサメタゾンまたは式Iの化合物での全身処置とは対照的に、活性化（MHC-II+）および非活性化CD11c+細胞は式Iの化合物での局所処置によって減少した（図4）。この驚くべき知見は、式Iの化合物が抗原提示細胞の流入領域リンパ節への遊走を防止すること、およびこの効果は眼表面に存在する薬物を必要とすることを示唆する。同様に、前述したとおり、式Iの化合物での局所処置のみが角膜染色を改善した。まとめると、いかなる特定の理論にも縛られることなく、これらの結果は、式Iの化合物が抗原提示DCの流入領域CLNへの遊走を防止し、したがって免疫サイクルを妨害することにより、DEDに関連する眼炎症を処置するために眼表面のレベルで局部的に作用することを示す。
【００３３】
DEDおよびこのマウスモデルにおける眼表面の炎症誘発環境は、文献中に詳細に記載されている（Corrales et al., 2006；Coursey et al., 2014；de Paiva et al., 2009a；de Paiva et al., 2006a；de Paiva et al., 2009b；de Paiva et al., 2011）。多くのサイトカインおよびケモカインの発現が角膜中および結膜中で増大し、涙膜中のレベル上昇を引き起こす。本明細書において提示する実施例において、式Iの化合物による局所処置は、角膜上皮におけるIL-1α、MMP-9、CXCL-9、およびTGFβ1の発現、ならびに結膜におけるTGFβ1の発現を阻害した（図3）。IL-1αは、上皮および炎症細胞によって放出される炎症誘発サイトカインである。疾患にそれが関連する可能性が、眼表面炎症に対するIL-1受容体アンタゴニスト、EBI-005の臨床開発によって強調されている（Hou et al., 2013；Goldstein et al., 2015）。MMP-9は、DSにおける角膜上皮の密着結合の破損および角膜関門破壊に関係があるとされているプロテアーゼである（de Paiva et al., 2006b；Luo et al., 2004；Pflugfelder et al., 2005）。ドライアイ患者において、MMP-9の涙液レベルは、角膜染色強度および他の臨床パラメーターと相関することが明らかにされている（Chotikavanich et al., 2009）。CXCL9は、CXCL10およびCXCL11と共に、インターフェロン-γ産生Th1細胞を誘引し、ドライアイ患者の涙膜および結膜中で上昇する（Yoon et al., 2010）。TGF-β1は、IL-6およびIL-23と共に、Th-17初回抗原刺激に関与し、ドライアイ患者の涙液中で上昇することが明らかにされている（Gutcher et al., 2011；Stockinger et al., 2007；Zheng et al., 2010）。したがって、式Iの化合物による処置は、DEDにおける眼表面炎症に関連する、この動物モデルにおけるいくつかの炎症マーカーを低減する。
【００３４】
実施例は、マウスDSモデルにおいて、式Iの化合物の使用により、ドライアイの客観的徴候の改善を示している。強力なインテグリンα4アンタゴニストは、眼表面のレベルで局部的に作用して、抗原提示細胞の流入領域リンパ節への遊走を防止し、その結果ドライアイの免疫サイクルを妨害した。抗原提示細胞遊走の阻止によるこの疾患の処置は、インテグリンアンタゴニストの新規でかつ以前には知られていなかった作用機作を示す。
【００３５】
II.  処置方法
DEDを含む眼炎症状態の処置に関する、「処置」または「処置すること」なる用語は、特に、疾患の発生を防止すること、または疾患の経過を変えること（例えば、疾患の進行を遅らせることであるが、それに限定されない）、または疾患の症状を逆転させること、あるいは対象における1つもしくは複数の症状および/または1つもしくは複数の生化学的マーカーを低減すること、1つもしくは複数の症状が悪化もしくは進行するのを防止すること、回復を促進すること、または予後を改善すること、および/またはそれを有しない対象において疾患を防止すること、ならびに既存の疾患の進行を遅らせる、または低減することを意味する。所与の対象について、症状の改善、その悪化、退行、または進行を、客観的または主観的手段によって判定することができる。予防方法（例えば、再発の発生を防止または低減すること）も処置と考える。
【００３６】
任意の対象において、対象が眼炎症状態を有するか、または眼炎症状態を有するリスクが高いかどうかについて、評価を行ってもよい。例えば、角膜のフルオレセイン染色を用いて、ドライアイ疾患を診断する。評価は、予防的治療、維持療法、または調節療法などの適切な治療の経過を示しうる。
【００３７】
したがって、本明細書において提供するのは、対象に治療用物質の治療的有効量を投与する段階によって、眼炎症状態を処置、予防、調節、または減弱する方法である。治療用物質は式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩、エステル、水和物、溶媒和物、多形、光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマーもしくは鏡像異性体である。ある特定の態様において、対象は、ヒトまたは他の哺乳動物などの哺乳動物である。
【００３８】
ある特定の態様において、投与は、局所投与または他の眼投与（例えば、局部注射）などの眼投与である。ある特定の態様において、治療用物質を眼表面に送達する。ある特定の態様において、治療用物質を局所に、例えば、角膜、結膜、および/または眼瞼に投与する。ある特定の態様において、治療用物質を角膜に局所的に投与する。ある特定の態様において、治療用物質を結膜嚢または眼瞼に適用する。ある特定の態様において、局所投与は点眼剤、軟膏、またはローションの適用を含む。ある特定の態様において、治療用物質を結膜下、前房内、硝子体内、テノン嚢下、網膜下、脈絡膜下、または脈絡膜上に適用する。ある特定の態様において、治療用物質を、例えば、眼周囲、眼内、結膜下、眼球後、または前房内注射などの、局部注射を介して送達する。全身投与は好まれないが、ある特定の態様において、投与は全身であってもよい。
【００３９】
ある特定の態様において、投与を、治療用物質を放出する、ミニまたはマイクロポンプなどの持続放出デバイスの挿入によって達成する。持続放出デバイスは生分解性または非生分解性であってもよい。
【００４０】
治療用物質が、治療用物質を眼の角膜および内部領域に浸透させるのに十分な時間、眼表面との接触を維持するように、治療用物質を薬学的に許容される眼科用ビヒクル中において送達してもよい。薬学的に許容される眼科用ビヒクルは、例えば、軟膏、植物油、またはカプセル化材料であってもよい。
【００４１】
ある特定の態様において、治療用物質は、抗原提示細胞の眼表面から流入領域リンパ節への遊走を含む免疫サイクルを妨害するように、局部的に作用する。ある特定の態様において、治療用物質は、抗原提示細胞の流入領域リンパ節への遊走を阻止するように、局部的に作用する。ある特定の態様において、流入領域リンパ節は頸部リンパ節である。
【００４２】
ある特定の態様において、眼炎症状態はドライアイ疾患、非感染性ブドウ膜炎（前部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎、および汎ブドウ膜炎を含む）、非感染性結膜炎、虹彩炎、または強膜炎である。
【００４３】
眼炎症状態がドライアイ疾患である、ある特定の態様において、ドライアイ疾患は、アレルギー、糖尿病、涙腺欠損、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病、パーキンソン病、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、視力矯正のためのLASIK療法から生じる合併症、コンタクトレンズ使用、乾燥気候への曝露、大気汚染、もしくは喫煙、角膜傷害、結膜線維症、スティーブンス・ジョンソン症候群、先天性無涙症（alachrima）、眼部瘢痕性類天疱瘡、サルコイドーシス、またはドライアイ疾患の症状を引き起こす他の薬物による処置によって引き起こされるか、またはそれらに関連する。ある特定の態様において、眼炎症状態はシェーグレン症候群に関連するドライアイ疾患である。したがって、1つの態様において、方法は治療用物質を、アレルギー、糖尿病、涙腺欠損、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病、パーキンソン病、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、視力矯正のためのLASIK療法から生じる合併症、コンタクトレンズ使用、乾燥気候への曝露、大気汚染、もしくは喫煙、角膜傷害、結膜線維症、スティーブンス・ジョンソン症候群、先天性無涙症、眼部瘢痕性類天疱瘡、サルコイドーシスを有するヒト、またはドライアイ疾患の症状を引き起こす他の薬物で処置されたことがあるヒトに投与する段階を含む。
【００４４】
一般に、治療用物質の用量は、対象の年齢、体重、身長、性別、全身の医学的状態、および以前の病歴などの因子に応じて変動する。典型的には、受容者の各患側の眼に約0.001mg〜約3000mg、特に約0.01mg〜約300mg、特に約0.1mg〜約30mg、特に約0.5mg〜約10、特に約1mg〜約5mgの範囲の治療用物質の個別の用量を提供することが望ましい。ある特定の態様において、治療用物質の個別の用量は、各患側の眼に約0.6、約0.8、約1.0、約1.2、約1.4、約1.6、約1.8、約2.0、約2.2、約2.4、約2.6、約2.8、約3.0、約3.2、約3.4、約3.6、約3.8、または約4.0mgである。ある特定の態様において、治療用物質の個別の用量は、各患側の眼に約1.8mgである。ある特定の態様において、治療用物質の個別の用量は、各患側の眼に約3.0mgである。用量の値は軽減する状態の種類および重症度によって変動しうることが留意されるべきである。任意の特定の対象のために、個別の必要性および組成物を投与する者、または組成物の投与を監督する者の専門的判断に従って具体的投与法を経時的に調節すべきであること、ならびに本明細書に示す用量範囲は例示にすぎず、特許請求する組成物の範囲または実施を限定する意図はないことも、さらに理解されるべきである。
【００４５】
予防を含む処置の目的のために、治療用物質を対象に、薬学的に許容される担体中の治療的有効量で投与する。「治療的有効量」は、生理学的に有意な量である。治療用物質は、その存在が、受容対象の生理学に検出可能な変化をもたらす場合に、生理学的に有意である。
【００４６】
ある特定の態様において、薬学的組成物は約1mg/mL〜約100mg/mLの治療用物質を含む。ある特定の態様において、薬学的組成物は約10mg/mL〜約100mg/mLの治療用物質を含む。ある特定の態様において、薬学的組成物は約10mg/mL〜約50mg/mLの治療用物質を含む。ある特定の態様において、薬学的組成物は約10mg/mLの治療用物質を含む。ある特定の態様において、薬学的組成物は約15mg/mLの治療用物質を含む。ある特定の態様において、薬学的組成物は約20mg/mLの治療用物質を含む。ある特定の態様において、薬学的組成物は約25mg/mLの治療用物質を含む。ある特定の態様において、薬学的組成物は約30mg/mLの治療用物質を含む。ある特定の態様において、薬学的組成物は約35mg/mLの治療用物質を含む。ある特定の態様において、薬学的組成物は約40mg/mLの治療用物質を含む。ある特定の態様において、薬学的組成物は約45mg/mLの治療用物質を含む。ある特定の態様において、薬学的組成物は約50mg/mLの治療用物質を含む。
【００４７】
ある特定の態様において、薬学的組成物を約10μL〜約100μLの量で投与する。ある特定の態様において、薬学的組成物を約20μL〜約80μLの量で投与する。ある特定の態様において、薬学的組成物を約20μLの量で投与する。ある特定の態様において、薬学的組成物を約30μLの量で投与する。ある特定の態様において、薬学的組成物を約40μLの量で投与する。ある特定の態様において、薬学的組成物を約50μLの量で投与する。ある特定の態様において、薬学的組成物を約60μLの量で投与する。ある特定の態様において、薬学的組成物を約70μLの量で投与する。ある特定の態様において、薬学的組成物を約80μLの量で投与する。
【００４８】
ある特定の態様において、薬学的組成物を各患側の眼に少なくとも1日1回投与する。ある特定の態様において、薬学的組成物を各患側の眼に少なくとも1日2回投与する。ある特定の態様において、薬学的組成物を各患側の眼に少なくとも1日3回投与する。ある特定の態様において、薬学的組成物を各患側の眼に少なくとも1日4回投与する。ある特定の態様において、薬学的組成物を各患側の眼に少なくとも1日5回投与する。ある特定の態様において、薬学的組成物を各患側の眼に少なくとも1日6回投与する。ある特定の態様において、薬学的組成物を各患側の眼に少なくとも1日7回投与する。ある特定の態様において、薬学的組成物を各患側の眼に少なくとも1日8回投与する。ある特定の態様において、薬学的組成物を各患側の眼に少なくとも1日9回投与する。ある特定の態様において、薬学的組成物を各患側の眼に少なくとも1日10回投与する。
【００４９】
ある特定の態様において、治療的有効量は、投与後少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも3時間、少なくとも4時間、少なくとも5時間、または少なくとも6時間、少なくとも約240ng/mLの組織濃度を達成するのに十分である。ある特定の態様において、組織は結膜である。ある特定の態様において、組織は角膜である。したがって、ある特定の態様において、治療的有効量は、投与後少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも3時間、少なくとも4時間、少なくとも5時間、または少なくとも6時間、少なくとも約240ng/mLの結膜または角膜組織濃度を達成するのに十分である。ある特定の態様において、治療的有効量は、投与後少なくとも6時間、少なくとも約240ng/mLの結膜または角膜組織濃度を達成するのに十分である。
【００５０】
ある特定の態様において、治療的有効量は、投与後少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも3時間、少なくとも4時間、少なくとも5時間、または少なくとも6時間、少なくとも約358ng/mLの組織濃度を達成するのに十分である。ある特定の態様において、組織は結膜である。ある特定の態様において、組織は角膜である。したがって、ある特定の態様において、治療的有効量は、投与後少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも3時間、少なくとも4時間、少なくとも5時間、または少なくとも6時間、少なくとも約358ng/mLの結膜または角膜組織濃度を達成するのに十分である。ある特定の態様において、治療的有効量は、投与後少なくとも6時間、少なくとも約358ng/mLの結膜または角膜組織濃度を達成するのに十分である。
【００５１】
ある特定の態様において、治療的有効量は、投与後少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも3時間、少なくとも4時間、少なくとも5時間、または少なくとも6時間、少なくとも約1000ng/mLの組織濃度を達成するのに十分である。ある特定の態様において、組織は結膜である。ある特定の態様において、組織は角膜である。したがって、ある特定の態様において、治療的有効量は、投与後少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも3時間、少なくとも4時間、少なくとも5時間、または少なくとも6時間、少なくとも約1000ng/mLの結膜または角膜組織濃度を達成するのに十分である。ある特定の態様において、治療的有効量は、投与後少なくとも3時間、少なくとも約1000ng/mLの結膜または角膜組織濃度を達成するのに十分である。
【００５２】
ある特定の態様において、眼投与した治療的有効量は、治療用物質への生理学的に非有意な全身曝露を引き起こす。ある特定の態様において、眼投与した治療的有効量は、全身免疫抑制を生じない。
【００５３】
開示する治療用物質および/またはそのような治療用物質を含む薬学的組成物を、少なくとも約12週間、少なくとも約24週間、少なくとも約36週間、または少なくとも約48週間などの、任意の適切な期間投与してもよい。ある特定の態様において、治療用物質を少なくとも連続12週間投与する。ある特定の態様において、治療用物質を少なくとも連続24週間投与する。ある特定の態様において、治療用物質を少なくとも連続36週間投与する。ある特定の態様において、治療用物質を少なくとも連続48週間投与する。
【００５４】
ある特定の態様において、処置は治療用物質の少なくとも連続2週間の毎日投与を含む。そのような処置レジメンにおいて、治療用物質を、1日に2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、11回、または12回などの、1日に複数回投与してもよい。ある特定の態様において、処置レジメンの期間は2週間を超える。ある特定の態様において、処置レジメンの期間は3週間を超える。ある特定の態様において、処置レジメンの期間は4週間を超える。ある特定の態様において、処置レジメンの期間は5週間を超える。ある特定の態様において、処置レジメンの期間は6週間を超える。ある特定の態様において、処置レジメンの期間は7週間を超える。ある特定の態様において、処置レジメンの期間は8週間を超える。ある特定の態様において、処置レジメンの期間は9週間を超える。ある特定の態様において、処置レジメンの期間は10週間を超える。ある特定の態様において、処置レジメンの期間は11週間を超える。ある特定の態様において、処置レジメンの期間は12週間を超える。
【００５５】
ある特定の態様において、治療用物質（例えば、治療用物質A）を、1つまたは複数の追加の治療用物質と、同じまたは別の薬学的組成物中において同時投与する。そのような追加の治療用物質には、眼炎症状態を処置するために使用される他の治療用物質が含まれうる。
【００５６】
ある特定の態様において、追加の治療用物質はシクロスポリンAである。シクロスポリンAは、微視的真菌トリポクラディウム・インフラツム（Tolypocladium inflatum）によって合成される、11アミノ酸の環状ペプチドである。シクロスポリンAは式[R-[[R*,R*-(E)]]-環式(L-アラニル-D-アラニル-N-メチル-L-ロイシル-N-メチル-L-ロイシル-N-メチル-L-バリル-3-ヒドロキシ-N,4-ジメチル-L-2-アミノ-6-オクテノイル-L-a-アミノ-ブチリル-N-メチルグリシル-N-メチル-L-ロイシル-L-バリル-N-メチル-L-ロイシル)（CAS番号59865-13-3）を有する。
【００５７】
ある特定の態様において、追加の治療用物質はステロイドである。いくつかのそのような態様において、ステロイドは糖質コルチコイドでる。いくつかのそのような態様において、ステロイドはジフルプレドナート、プレドニゾロン、デキサメタゾン、フルオシノロン、フルオロメトロン、ロテプレドノール、メドリゾン、リメキソロン、トリアムシノロン、コルチゾン、またはヒドロコルチゾンである。ある特定の態様において、ステロイドはデキサメタゾン（デキサメタゾン塩基またはデキサメタゾンホスフェートなど）、ジフルプレドナート、フルオシノロン、フルオロメトロン（フルオメトロン塩基またはフルオメトロンアセテートなど）、ロテプレドノール、プレドニゾロン（プレドニゾロンアセテートまたはプレドニゾロンホスフェートなど）、リメキソロン、またはトリアムシノロン（トリアムシノロンアセトニドなど）である。
【００５８】
ある特定の態様において、追加の治療用物質は非ステロイド性抗炎症剤である。いくつかのそのような態様において、非ステロイド性抗炎症剤は、ブロムフェナク、ジクロフェナク、フルルビプロフェン、ケトロラック、およびネパフェナクからなる群より選択される。
【００５９】
ある特定の態様において、追加の治療用物質は、リフィテグラストなどのLFAアンタゴニストである。リフィテグラストは(2S)-2-[[2-(1-ベンゾフラン-6-カルボニル)-5,7-ジクロロ-3,4-ジヒドロ-1H-イソキノリン-6-カルボニル]アミノ]-3-(3-メチルスルホニルフェニル)プロパン酸としても公知であり、WO2006/125119において同定されており、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【００６０】
ある特定の態様において、獣医学において、特に、例えば、イヌ、ネコ、およびウマの乾性角結膜炎；イヌ、ネコ、およびウマの慢性表在性角結膜炎（CSK）；ならびにイヌ、ネコ、およびウマの瞬膜のリンパ形質細胞浸潤などの、眼炎症状態の処置において、治療用物質を使用することができる。
【００６１】
III.  化合物
式Iの化合物は、米国特許第6,867,192号、実施例27に記載の合成を用いて合成することができる。米国特許第6,867,192号の全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【００６２】
簡単に言うと、1つの態様において、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（0.4g）および1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（0.3g）をアセトニトリル（50ml）中の(2-メチルフェノキシ)酢酸（0.345g）の溶液に、窒素雰囲気下で加える。20℃で30分間撹拌した後、4-[(2S)-2-{[(2S)-2-アミノ-4-メチルペンタノイル]アミノ}-3-(tert-ブトキシ)-3-オキソプロピル]フェニル4-(アミノカルボニル)-1-ピペリジンカルボキシレート塩酸塩（1g）と、続いてジイソプロピルエチルアミン（0.35ml）を加え、撹拌を18時間続ける。混合物を減圧下で濃縮し、残渣を1M塩酸（100ml）と酢酸エチル（300ml）との間で分配する。層を分離し、有機相を1M塩酸（2×100ml）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（3×100ml）および食塩水（100ml）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で蒸発させて、白色固体を得る。クロロホルム（5ml）中のこれの溶液に、トリフルオロ酢酸（5ml）および水（1ml）を加える。20℃で3時間撹拌した後、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をトルエン（2×20ml）と共沸させ、次いでエーテルで粉砕して、(2S)-3-[4-({[4-(アミノカルボニル)-1-ピペリジニル]カルボニル}オキシ)フェニル]-2-[((2S)-4-メチル-2-{[2-(2-メチルフェノキシ)アセチル]アミノ}ペンタノイル)アミノ]プロパン酸を得る。
【００６３】
または、別の態様において、DMF（475ml）中の(2S)-3-[4-(アリルオキシ)フェニル]-2-[(tert-ブトキシカルボニル)アミノ]プロパン酸（115.8g）および1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（48.6g）の溶液をワング樹脂（50g）に加える。15分後、1,3-ジイソプロピルカルボジイミド（56.5ml）を加え、混合物を45℃で24時間撹拌する。樹脂をろ過し、DMF（3×360ml）、メタノール（3×360ml）、およびジクロロメタン（3×700ml）で洗浄する。ジクロロメタン（644ml）中の樹脂のスラリーにピリジン（14.7ml）を加える。無水酢酸（26.9ml）を加え、混合物を20℃で12時間撹拌する。樹脂をろ過し、ジクロロメタン（3×550ml）、メタノール（3×370ml）、およびジクロロメタン（3×550ml）で洗浄する。
【００６４】
ジクロロメタン（100ml）中の樹脂20gのスラリーを2〜5℃まで冷却し、ジクロロメタン（80ml）中のフェノール（20g）の溶液で処理した。クロロトリメチルシラン（20ml）を滴加し、混合物を2〜5℃で6時間撹拌する。樹脂をろ過し、ジクロロメタン（3×200ml）、メタノール（3×200ml）、DMF中10％水（2×200ml）、DMF中10％ジイソプロピルエチルアミン（3×200ml）、DMF（200ml）、メタノール（3×200ml）、およびジクロロメタン（3×200ml）で洗浄する。
【００６５】
DMF（55ml）中の樹脂のスラリーをDMF（85ml）中のFmoc-ロイシン（32.7g）および1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（12.5g）の溶液で処理する。5分後、1,3-ジイソプロピルカルボジイミド（19.3ml）を加え、混合物を20℃で15時間撹拌する。樹脂をろ過し、DMF（3×150ml）、メタノール（3×150ml）、およびジクロロメタン（3×150ml）で洗浄する。
【００６６】
樹脂をDMF中20％ピペリジン（180ml）で処理し、20℃で1時間撹拌する。樹脂をろ過し、DMF（3×150ml）、ジクロロメタン（3×150ml）、DMF（3×150ml）、およびジクロロメタン（3×150ml）で洗浄する。DMF（50ml）中のこのスラリーに、DMF（100ml）中の(2-メチルフェノキシ)酢酸（17.9g）および1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（14.6g）の溶液を加える。5分後、1,3-ジイソプロピルカルボジイミド（16.9ml）を加え、混合物を20℃で65時間撹拌する。樹脂をろ過し、DMF（2×150ml）、メタノール（3×150ml）、およびジクロロメタン（3×150ml）で洗浄する。
【００６７】
ジクロロメタン（60ml）中の樹脂のスラリーをジクロロメタン（140ml）中のテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)（5.21g）の溶液と、続いてモルホリン（13ml）で処理する。混合物を20℃で2時間撹拌し、次いで樹脂をろ過し、ジクロロメタン（7×200ml）で洗浄する。
【００６８】
ジクロロメタン（160ml）中の樹脂のスラリーをジイソプロピルエチルアミン（12.4ml）と、続いて5分間隔で3分割したクロロギ酸4-ニトロフェニル（24.8g）で処理する。混合物を20℃で1時間撹拌する。樹脂をろ過し、ジクロロメタン（3×200ml）で洗浄する。樹脂をDMF（180ml）中のイソニペコタミド（15.8g）の溶液で処理し、混合物を20℃で1.5時間撹拌する。樹脂をろ過し、DMF（4×200ml）およびジクロロメタン（2×200ml）で洗浄する。
【００６９】
樹脂をジクロロメタン中50％TFA（200ml）で処理する。20℃で1時間撹拌した後、樹脂をろ過し、ジクロロメタン（5×200ml）で洗浄する。合わせたろ液および洗液を減圧下で蒸発させた。残渣をトルエン（2×100ml）と共沸させ、次いでエーテル（50ml）で粉砕し、得られた白色固体をろ過する。これにアセトニトリル（150ml）を加え、混合物を加熱還流する。得られた懸濁液を20℃まで冷却し、18時間撹拌する。混合物をろ過して、(2S)-3-[4-({[4-(アミノカルボニル)-1-ピペリジニル]カルボニル}オキソ)フェニル]-2-[((2S)-4-メチル-2-{[2-(2-メチルフェノキシ)アセチル]アミノ}ペンタノイル)アミノ]プロパン酸を得る。
【００７０】
ある特定の態様において、治療用物質（例えば、治療用物質A）は、化合物（I）の薬学的に許容される塩である。「薬学的に許容される」なる語句は、健全な医学的判断の範囲内であり、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしにヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適し、妥当なベネフィット/リスク比に釣り合っている、化合物、材料、組成物、および/または剤形を意味するように、本明細書において用いられる。
【００７１】
ある特定の態様において、治療用物質（例えば、治療用物質A）は、化合物（I）のカリウム塩である。
【００７２】
ある特定の態様において、式（I）の化合物を、結合体、複合体、またはプロドラッグとして投与する。ある特定の態様において、式（I）の化合物を、プロドラッグの形で投与する。そのようなプロドラッグは、式（I）の化合物を提供するように対象によって代謝されてもよい。
【００７３】
IV.  薬学的組成物
本明細書において用いられる「薬学的に許容される担体」なる語句は、対象作用物質を1つの器官、または体の一部から別の器官、または体の一部へ運ぶかまたは輸送することに関与する、液体もしくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、またはカプセル化材料などの、薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性であるとの意味で「許容され」なければならず、例えば、担体は処置に対する作用物質の影響を減少させない。すなわち、担体は薬学的に不活性である。
【００７４】
前記組成物は、化合物を薬学的に許容される担体と混合する、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って製剤化されることができる。滅菌リン酸緩衝食塩水は薬学的に許容される担体の一例である。他の適切な担体は当業者には周知である。例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19th Ed. (1995)を参照されたい。
【００７５】
局所投与に適合させた薬学的組成物は、軟膏、クリーム、乳剤、懸濁剤、ローション、散剤、液剤、ペースト、ゲル、噴霧剤、ミスト、エアロゾル、または油剤として製剤化されてもよい。ある特定の態様において、薬学的組成物は、点眼液などの液剤である。そのような態様において、点眼液をヒトまたは非ヒト哺乳動物に、局所的経路を介して、各眼に1日1または複数滴の形で投与する。
【００７６】
眼の処置のために、組成物を局所用の軟膏またはクリームとして適用してもよい。軟膏に製剤化する場合、活性成分をパラフィンまたは水混和性軟膏基剤と共に用いてもよい。または、活性成分を水中油クリーム基剤または油中水基剤と共にクリームに製剤化してもよい。
【００７７】
眼への局所投与に適合させた薬学的組成物には、活性成分を適切な担体中、特に水性溶媒中に溶解または懸濁させる、点眼剤が含まれる。眼に投与する製剤は、眼に適合性のpHおよびモル浸透圧濃度を有する。酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸、および塩酸などの酸；水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、および乳酸ナトリウムなどの塩基；ならびにクエン酸塩/デキストロース、炭酸水素ナトリウム、および塩化アンモニウムなどの緩衝剤を含む、1つまたは複数の眼に許容されるpH調節剤および/または緩衝剤を本発明の組成物中に含むことができる。そのような酸、塩基、および緩衝剤を、組成物のpHを眼に許容される範囲に維持するのに必要な量で含むことができる。1つまたは複数の眼に許容される塩を組成物中に、組成物のモル浸透圧濃度を眼に許容される範囲にするのに十分な量で含むことができる。そのような塩には、ナトリウム、カリウム、またはアンモニウムカチオンおよび塩素、クエン酸、アスコルビン酸、ホウ酸、リン酸、炭酸水素、硫酸、チオ硫酸、または亜硫酸水素アニオンを有するものが含まれる。
【００７８】
本発明の組成物を、眼送達デバイスまたは挿入物を用いて、眼、結膜下、前房内、硝子体内、テノン嚢下、網膜下、脈絡膜下、脈絡膜上、結膜嚢、または眼瞼に局所的に適用してもよい。そのようなデバイスまたは挿入物は、複数の規定された放出速度ならびに持続投与動力学および浸透性による1つまたは複数の治療用物質の制御放出のために設計してもよい。制御放出は、生分解性/生体侵食性ポリマー（例えば、ポリエチレン酢酸ビニル（EVA）、超加水分解（superhydrolyzed）PVA）、ヒドロキシアルキルセルロース（HPC）、メチルセルロース（MC）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）、ポリカプロラクトン、ポリ(グリコール）酸、ポリ(乳)酸、ポリ無水物、ポリマー分子量、ポリマー結晶度、コポリマー比、処理条件、表面仕上げ、幾何学、賦形剤の添加ならびに薬物の拡散、浸食、溶解および浸透を促進するポリマーコーティングの異なる選択および特性を組み込むポリマーマトリックスの設計によって得てもよい。
【００７９】
眼用デバイスまたは挿入物を用いる薬物送達のための製剤は、示された投与経路に適した1つまたは複数の活性物質と補助剤とを組み合わせてもよい。例えば、活性物質は、任意の薬学的に許容される賦形剤、ラクトース、スクロース、デンプン散剤、アルカン酸のセルロースエステル、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウム塩およびカルシウム塩、アカシア、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリジン、および/またはポリビニルアルコールと混合し、通常の投与のために錠剤にしてもまたはカプセル封入してもよい。または、化合物は、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、エタノール、トウモロコシ油、落花生油、綿実油、ゴマ油、トラガカントガム、および/または様々な緩衝液に溶解してもよい。化合物はまた、生分解性および非生分解性の両方のポリマーの組成物、ならびに遅延特性を有する担体または希釈剤と混合してもよい。生分解性組成物の代表例には、アルブミン、ゼラチン、デンプン、セルロース、デキストラン、多糖、ポリ(D,L-ラクチド)、ポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド)、ポリ(グリコリド)、ポリ(ヒドロキシ酪酸)、ポリ(アルキルカーボネート)およびポリ(オルトエステル)、ならびにそれらの混合物が含まれうる。非生分解性ポリマーの代表例には、EVAコポリマー、シリコーンゴムおよびポリ(アクリル酸メチル)、ならびにそれらの混合物が含まれうる。
【００８０】
眼送達用の薬学的組成物には、インサイチューゲル化水性組成物も含まれる。そのような組成物はゲル化剤を、眼または涙液と接触した際にゲル化を促進するのに有効な濃度で含む。適切なゲル化剤には、熱硬化性ポリマーが含まれるが、それらに限定されない。本明細書において用いられる「インサイチューゲル化」なる用語は、眼または涙液と接触した際にゲルを形成する低粘度の液体を含むだけでなく、眼に投与した際に粘度またはゲル硬度の実質的増大を示す半流体およびチキソトロピーゲルなどのより粘稠な液体も含む。例えば、Ludwig (2005)を参照されたく、これは眼薬物送達において使用するためのポリマーの例を教示する目的で参照により本明細書に組み入れられる。
【００８１】
V.  キット
本明細書において同様に提供されるのはキット、例えば、治療目的のためのキットである。キットは、例えば、あらかじめ測定した用量の、本明細書に記載の1つまたは複数の化合物を含んでもよい。キットは細胞を化合物と接触させるためのデバイスおよび使用説明書を任意に含んでもよい。
【００８２】
デバイスにはシリンジ、ミニおよびマイクロポンプなどの埋め込み用ポンプ、ならびに眼に使用するための他のデバイスが含まれる。
【００８３】
本明細書において同様に提供されるのは、治療用物質Aおよび別の治療用物質（組み合わせ療法および組み合わせ組成物において用いた同じもの）を別々の剤形で含むが互いに関連する、治療用組み合わせである。本明細書において用いられる「互いに関連する」なる用語は、別々の剤形が一緒に包装されているか、またはそうではなく、別々の剤形は同じ治療法の一部としての販売用および投与用であることが容易に明らかであるように、互いに添付されていることを意味する。化合物および他の剤は、好ましくはブリスターパックもしくは他の多室パッケージに一緒に包装されるか、または使用者が分けることができる（例えば、2つの容器の間のスコアライン上で引き裂くことにより）、連結され、別々に密封された容器（ホイルパウチなどの）として包装される。
【００８４】
さらに別の態様において、本発明は、別々の容器に(a）本発明の化合物と；(b）本明細書の他所に記載のものなどの別の治療用物質とを含む、キットを提供する。
【実施例】
【００８５】
材料
[3H]GW559090は、1分子あたり5つの3H原子を含み76Ci/mmolの比活性を示すように、Amershamでカスタム合成された。
【００８６】
すべての動物試験は、Jackson Labs（Bar Harbor、ME）から購入した、6〜8週齢のC57BL/6マウスを用いて行った。
【００８７】
結合および細胞接着
ジャーカットJ6細胞（ヒトリンパ芽細胞系）は、FCS（10％）およびグルタミン（2mM）を補充したRPMI 1640中の懸濁培養液として成長させた。RPMI8866細胞（ヒトBリンパ様細胞系）は、FCS（10％）およびグルタミン（2mM）を補充したRPMI 1640中の懸濁培養液として成長させた。RBL-2H3細胞（ラット好塩基性細胞系）は、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1×非必須アミノ酸、1mMピルビン酸Na、10％熱不活化ウシ胎仔血清を補充したイーグルMEMおよびアール塩中で培養した。
【００８８】
J6飽和アッセイ法（ろ過アッセイ法）：式Iの化合物の結合を、VLA-4を発現するヒトJ6細胞で特徴決定した。J6細胞を500gで5分間の遠心分離により回収し、アッセイ緩衝液（50mM HEPES、pH7.5、100mM NaCl、2mMグルコース、1mM MnCl2）に再懸濁した。各ウェルは、細胞1×106個と、NSB（非特異的結合）を規定するための10μMコールドGW559090、または緩衝液のいずれかとを含んでいた。[3H]GW559090（0.02〜50nM）を加えて最終量500μLとし、37℃で2時間インキュベートした。結合した[3H]GW559090を、あらかじめ浸漬したWhatman GF/Bフィルターを通して急速減圧ろ過し、続いて氷冷緩衝液で3回洗浄することにより、遊離型から分離し、次いでシンチラントをフィルターディスクに加え、毎分の壊変をBeckman Scintillation計数器で測定した。飽和曲線の各濃度について加えた[3H]GW559090の実際の量を、標識希釈範囲の50μLのアリコートから壊変を計数することにより測定した。
【００８９】
RBL-2H3細胞における飽和結合アッセイ法（SPAアッセイ法）：アッセイ緩衝液は50mM HEPES、100mM NaCl、1mM MnCl2、pH7.5（NaOHにより）を含んでいた。WGA SPAビーズを1mg/ウェルで用いた。細胞を回収してアッセイ緩衝液に再懸濁し、白色底プレートのウェル1つごとに100万個の細胞を加えた。20μMの最終アッセイ濃度とするためのコールドGW559090（非特異的結合を規定するため）または緩衝液のみを加え、次いでプレート全体に濃度範囲全域の[3H]GW559090を加えた（名目上の[3H]GW559090濃度範囲は0.01〜200nMであった）。最終アッセイ量は250μLであった。次いで、プレートを37℃で2時間インキュベートした。壊変をWallac Microbetaプレートリーダーでシンチレーション（WGA SPAビーズから）により計数した。飽和曲線の各濃度について加えた[3H]GW559090の実際の量を、標識希釈範囲の50μLのアリコートから毎分の壊変を計数することにより測定した。
【００９０】
VCAM細胞接着アッセイ法：ポリスチレン96ウェルマイクロタイタープレートを炭酸水素緩衝液中0.05mg/mLの濃度のIgGにより37℃で2時間コーティングした。溶液を吸引し、プレートをPBSで2回洗浄した。次いで、プレートをPBS中3％BSAのVCAM-1の1：4000希釈液と共に4℃で終夜インキュベートした。使用前に、VCAM-1を吸引し、プレートをPBSで2回洗浄した。
【００９１】
J6またはRPMI細胞（必要に応じて）を蛍光色素BCECF-AM（10μMおよび6×106細胞/mL）により37℃で10分間標識した後、過剰量を500gで5分間の遠心分離により除去し、細胞をHBSS中1.2×107細胞/mLの細胞濃度で再懸濁した。式Iの化合物（濃度範囲38.1pM〜10μM）を含む等しい量のHBSSおよび細胞をVCAM-1コーティングしたプレートに加えた。37℃で30分間のインキュベーション後、非接着または緩く接着している細胞を、プレートを逆転させ、ティッシュペーパー上で吸い取ることにより除去した。PBSで2回洗浄し、吸い取った後、トリトンX-100（2％v/v）を加えた。プレートをWallac Viktorで計数した。接着を阻害した化合物はより低い蛍光読み取り値を示した。
【００９２】
MAdCAM細胞接着アッセイ法：ポリスチレン96ウェルマイクロタイタープレートを炭酸水素緩衝液中0.05mg/mLの濃度のIgGにより37℃で2.5時間コーティングした。溶液を吸引し、プレートをPBSで2回洗浄した。次いで、プレートをPBS中3％BSA中204.0ng/mLの濃度のMAdCAMと共に4℃で終夜インキュベートした。使用前に、MAdCAMを吸引し、プレートをPBSで2回洗浄した。J6またはRPMI細胞（必要に応じて）を蛍光色素BCECF-AM（10μMおよび6×106細胞/mL）により37℃で10分間標識した後、過剰量を500gで5分間の遠心分離により除去し、細胞をHBSS中1.2×107細胞/mLの細胞濃度で再懸濁した。式Iの化合物（濃度範囲38.1pM〜10μM）を含む等しい量のHBSSおよび細胞をMAdCAMコーティングしたプレートに加えた。37℃で30分間のインキュベーション中に接着が起こった。非接着または緩く接着している細胞を、プレートを逆転させ、ティッシュペーパー上で吸い取ることにより除去した。PBSで2回洗浄し、吸い取った後、トリトンX-100（2％v/v）を加えた。プレートをWallac Viktorで計数した。
【００９３】
CS-1細胞接着アッセイ法：ポリスチレン96ウェルマイクロタイタープレートを炭酸水素緩衝液中0.01mg/mLの濃度のCS-1（連結セグメント1、フィブロネクチンの細胞付着ドメイン）により4℃で終夜コーティングした。溶液を吸引し、プレートをPBSで2回洗浄した。次いで、プレートを3％BSA存在下、室温で60分間インキュベートし、「はじいて」BSAを除去し、炭酸水素緩衝液中で2回洗浄した。J6またはRPMI細胞（必要に応じて）を蛍光色素BCECF-AM（10μMおよび6×106細胞/mL）により37℃で10分間標識した後、過剰量を500gで5分間の遠心分離により除去し、細胞をHBSS中1.2×107細胞/mLの細胞濃度で再懸濁した。式Iの化合物（濃度範囲19.0pM〜5μM）を含む等しい量のHBSSおよび細胞をCS-1コーティングしたプレートに加えた。37℃で30分間のインキュベーション中に接着が起こった。非接着細胞または緩く接着している細胞を、プレートを逆転させ、ティッシュペーパー上で吸い取ることにより除去した。PBSで2回洗浄し、吸い取った後、トリトンX-100（2％v/v）を加えた。プレートをWallac Viktorで計数した。
【００９４】
乾燥ストレスの誘導、処置レジメン
6〜8週齢の雌C57BL/6マウスを、以前に記載したとおり、DSに5日間（DS5）供した（de Paiva et al., 2006b；Niederkorn et al., 2006）。各眼に点眼剤1滴（2μL量）での局所両側処置または1日2回の皮下注射（4μL量）を、第1日にDSと同時に開始し、第4日まで続けた。式Iの化合物またはデキサメタゾンホスフェート 0.1％による処置を、相当するように処置したビヒクル対照と比較した。マウスを無作為化して、試験品の1つを投与した。対照マウスは、気流またはスコポラミンに曝露せずに、50〜75％相対湿度に保った非ストレス（NS）環境に維持し、試験品または対照品で処置しなかった。オレゴングリーンデキストラン（OGD）による角膜染色；リアルタイムPCRによる眼表面組織中の炎症マーカーの発現；FACS分析による流入領域頸部リンパ節における細胞集団分析；免疫組織化学検査による結膜T細胞浸潤に対する処置の効果を評価した。
【００９５】
角膜OGD染色
第5日の朝、マウスにスコポラミンを1回皮下投与した。2時間後、以前に記載したとおり、角膜染色を、分子サイズ70kDaの結合蛍光色素であるオレゴングリーンデキストラン（OGD-488）（Invitrogen-Molecular Probes）を用いて評価した（de Paiva et al., 2006b）。手順は、ガラス毛管ピペットを用いた各膜への0.5μL OGDの滴下注入からなり、1分後に安楽死させた。イソフルランガスの吸入と、続く頚椎脱臼により、マウスを安楽死させた。次いで、眼を2mLのBSSで洗浄した。過剰の液体を眼表面からろ紙で角膜に接触せずに注意深く吸い取った。両眼のデジタル写真を、Nikon SMZ-1500立体顕微鏡を用い、露出時間2秒間で、470nm励起および488nm発光波長の下で撮った。各動物からの両眼を評価した。常に右眼が先で、続いて左眼であった。角膜中心の平均強度をデジタル画像から、NIS Elements（バージョン3.0）を用い、角膜中心に興味対象の固定領域（直径2mmの円）を置くことにより評価した。蛍光の平均強度をソフトウェアで読み取り、データベースに保存した（Excel、Microsoft）。この中心円の蛍光測定は、マウスの各眼について、2名の覆面観察者により独立して行った。実験の結論により、結果を両観察者から全試験週間中に収集したすべてのデータを用いて平均した（Excel、Microsoft）。結果をグレーレベルの幾何平均±95％信頼区間で示す。
【００９６】
RNA単離および逆転写
未処置対照マウス、DSに5日間供したマウス（DS5）、式Iの化合物（30m/mL）で局所的に処置したDS5マウス、およびビヒクル処置動物（n＝7/群）から各時点で両眼（左右）から採取し、プールした角膜および結膜上皮から、PicoPure(商標) RNA Isolation Kit（Acturus Bioscience Inc、Mountain View、CA、USA）を製造者のプロトコールに従って用いて、全RNAを単離した。簡単に言うと、角膜上皮細胞を掻き取り、結膜全体を切断し、100μLの抽出緩衝液に加え、42℃で30分間インキュベートした。遠心分離し、DNアーゼ（Qiagen、Valencia、CA、USA）で処理し、2つの異なる洗浄緩衝液で2回洗浄した、前処理済みの精製カラムに、細胞抽出物をロードした。RNAは低イオン強度緩衝液12μL中に溶出された。RNA濃度を260nmの吸光度により、分光光度計（NanoDrop 2000、Thermo Scientific、Wilmington、DE、USA）を用いて測定し、試料を使用するまで-80℃で保存した。第一鎖cDNAを、以前に記載したとおり、1μgの全RNAからランダムヘキサマーによりM-MuLV逆転写酵素（Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads；Amersham Pharmacia Biotech, Inc.、Piscataway、NJ）を用いて合成した（de Paiva et al., 2006a）。
【００９７】
絶対リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応
試料由来のcDNAのアリコート（1〜4μL）を、1反応ごとに下記を含む全量10μLで、リアルタイムPCRのために用いた：0.3μLの使用した遺伝子特異的Taqmanプローブおよび5μLの2×Taqman Fast PCR Master Mix（Applied Biosystems）。リアルタイムPCRを、StepOnePlus(商標) Real-Time PCR System（Applied Biosystems）により、95℃で22秒間の予備変性と、続く95℃で1秒間の変性、アニーリングおよび60℃で20秒間の伸長の40サイクルからなるパラメーターで実施した。試料および標準を二つ組でアッセイした。用いた試薬のPCRおよびDNA混入を評価するために、非鋳型対照および逆転写なしの全RNAをすべての実験に含めた。以下のマウスTaqmanプローブを用いた：IL-1α（Mm00439620）；MMP-9（Mm00442991）；CXCL9（Mm004434946）；TGF-β1（Mm00441724）およびHPRT-1（Mm00446968）。各反応に対し、HPRT-1遺伝子を内因性参照として用いた。定量的PCRの結果を、標的変化＝2−ΔΔCTである、比較CT法により解析した。結果を未処置対照群のHPRT-1のCT値により正規化した（de Paiva et al., 2006b）。
【００９８】
流入領域リンパ節の摘出
頸部流入領域リンパ節（CLN）を外科的に切除し、約8mLの完全RPMI培地を有する丸形培養プレートに入れ、2枚のフロストガラススライドの間で粉砕した。
【００９９】
フローサイトメトリー
以前に記載したとおり、DS条件下で1日処置したC57BL/6マウス由来のCLNの単一細胞懸濁液を調製し、遠心分離し、順次にろ過した（de Paiva et al., 2009a）。その後、1.0mLのACT溶液を30秒間で加え、続いて2.0mLの完全RPMIを加えた。細胞をもう一度遠心分離し、上清を吸引した。次いで、細胞を2.0mLの完全RPMIに再懸濁し、計数の準備をした。計数のために10μLのトリパンブルーを用い、細胞を1×106細胞/mLでチューブに分割した。その後、細胞を20μLの非結合抗マウスCD16/CD32（BD Pharmingen、San Diego、CA）と、続いて80μLの直接結合した一次抗体またはアイソタイプ中、氷上でインキュベートした。最後に、試料を1mL PBS/1％FBSで洗浄し、遠心分離し、1：1000のPIを含む0.3mL PBS/1％FBSに再懸濁した。試料を、A BD LSRII Benchtop血球計算器で分析を実施するまで、4℃で保存した。データをBD Diva Software（BD Pharmingen）およびFlowJo（TreeStar Inc）を用いて解析した。
【０１００】
結膜T細胞浸潤
免疫組織化学検査のために、マウス5匹/群（n＝5）の眼および付属器を切除し、最適切削温度（OCT化合物：VWR、Suwanee、GA）に包埋し、液体窒素中で急速凍結した。8μmの矢状切片をクリオスタット（HM 500；Micron、Waldorf、Germany）で切断し、ガラススライド上に置き、これを-80℃で保存した。免疫組織化学検査を実施して、CD4（クローンH129.9、10ug/mL、BD Bioscience、San Diego、CA）について陽性に染色された結膜上皮および角膜実質中の細胞を検出し、計数した。凍結切片を前述の一次抗体および適切なビオチン化二次抗体（BD Pharmingen）ならびにVectastain Elite ABCで、NovaRed試薬（Vector、Burlingame、CA）を用いて染色した。二次抗体単独および適切な抗マウスアイソタイプ（BD Biosciences）も対照として用いた。各動物から2つの切片を調べ、デジタルカメラを備えた顕微鏡（Eclipse E400およびDS-Fi1；Nikon）で撮影した。結膜の杯細胞が多い領域において、500μmの間の上皮における少なくとも500μmの長さにわたって、陽性に染色された細胞を画像分析ソフトウェア（NIS Elements Software、バージョン3.0、BR、Nikon）を用いて計数した。
【０１０１】
統計分析
OGDデータの歪んだ分布により、分析をlog10スケールで行って、データをより正規に分布させた。Log10 OGDデータを2名の観察者および左右の眼で平均した。混合効果ANOVAモデルは、固定効果としての処置群および無作為効果としての週を含んだ。95％および99％信頼区間を、疾患（別々の動物施設に維持した5日間DS対未処置群）および化合物処置効果（処置対ビヒクル）について構築した。これらの比較はすべてあらかじめ計画した（各処置をそのビヒクル群と比較）ものであったため、多重度に対する調節は行わなかった。Log10スケールの処置効果推定値および信頼限界を元のOGDスケールに再変換し、したがって群の幾何平均およびそれらの信頼限界の比の推定値を表した。遺伝子発現分析のために、独立T検定を実施して、薬物およびビヒクル処置を比較した。フローサイトメトリー分析のために、固定した処置および無作為実験効果による二元配置ANOVAを用いて、処置の差を試験した。この分析の後に、ダネットの多重比較法を行って、各処置群とビヒクル群とを比較した。T細胞密度を各切片について算出し、各動物について切片で平均した。平均細胞密度データの分布は非正規であったため、ノンパラメトリック法（クラスカルワリス法と、続くダンの多重比較法）を用いて分析した。
【０１０２】
実施例1.  GW559090の薬理学
ヒトJ6細胞への[3H]GW559090結合は、飽和性であり、かつ、4つの別々の実験由来の、平均Kd＝0.19nM（0.08〜0.43）（幾何平均および95％CL）の単一結合部位により、これらの実験で記載された。[3H]GW559090に対する単一の高親和性結合部位は、ラットα4β1を発現するラットRBL-2H3細胞でも示され、平均Kd＝1.04nM（0.58〜1.89）であった。
【０１０３】
細胞接着の阻害をコーティングしたマイクロタイタープレート中で、VCAM-1およびCS-1（フィブロネクチンドメイン）に対するα4β1（ジャーカットJ6細胞）；MAdCAMに対するα4β7（RPMI 8866細胞）について判定した。GW559090はVCAM-1へのJ6細胞接着を、平均IC50＝7.72nM（2.39〜24.9）の単相様式で阻害した。GW559090はまた、CS-1へのJ6細胞接着を平均IC50＝8.04nM（3.05〜21.2）で、およびMAdCAMへの細胞接着を二相様式で阻害し、J6細胞におけるMAdCAM−GW559090結合のための高親和性および低親和性部位の存在を支持していた。RPMI 8866 MAdCAM結合は主にα4β7仲介性細胞接着を測定する。GW559090はMAdCAMへのRPMI 8866細胞接着を、IC50＝23.0nM（20.0〜26.4）で阻害した。GW559090はまた、VCAM-1およびCS-1へのRPMI 8866結合も、単純な単相様式で、それぞれIC50＝4.81nM（2.82〜8.20）および24.5nM（同じ二つ組の値）で阻害した。
【０１０４】
（表１）α4インテグリンへの[3H]GW559090の結合、および細胞接着の阻害
2020121985.tif 000011
【０１０５】
加えて、式Ｉの化合物は、LFA-1を含む非α4インテグリンに対して高度に選択的であると報告されている（Ravensberg et al., 2006）。MDS Pharmaスクリーンでの53の受容体および4つの輸送体に対する放射性リガンド結合アッセイ法において、式Iの化合物（10μM）により有意な阻害は観察されなかった。
【０１０６】
実施例2.  式Iの化合物による局所処置は乾燥誘導性角膜関門破壊を防止する。
本発明者らは、未処置非ストレス（NS）およびドライアイ対照群（DS5、図1）の間でOGD染色によって測定した角膜浸透性に有意な増大を見出した。コルチコステロイド療法は、ヒトおよびマウスの両方で、ドライアイの角膜上皮疾患を改善すると報告されている（de Paiva et al., 2006a；de Paiva et al., 2006b；Marsh and Pflugfelder, 1999）ため、本発明者らは陽性対照としてデキサメタゾン（Dex）による局所処置を用いた。0.1％Dexによる処置はOGD強度スコアを有意に改善した。1mg/mLの低用量から30mg/mLの高用量までの、式Iの化合物の用量範囲を調査した。そのビヒクルに対して、式Iの化合物の濃度が上がるにつれて、OGD強度スコアの有意な低下が示された。最も有効な濃度は30mg/mL（図1）であり、したがってこの濃度をその後の試験で用いた。
【０１０７】
実施例3.  式Iの化合物は眼表面に対し局所的に作用する。
式Iの化合物の全身投与の角膜染色に対する効果を調べるために、局所および皮下（SC）の2つの投与経路を比較した。同じ用量をSCに（1回の4μLボーラスとして120μg）および局所的に（各眼への2μLの点眼剤として60μg）投与した。式Iの化合物を全身投与したマウスにも、ビヒクル点眼剤を局所的に投与した。図2に示すとおりに、かつ図1と同様に、局所デキサメタゾンはOGD取り込みを減少させた。式Iの化合物による局所処置は、ここでも、そのビヒクルと比べて、DS誘導性角膜関門破壊を有意に減少させた。この効果は、式Iの化合物を全身投与した場合には観察されなかった。これらの結果は、式Iの化合物の局部的治療効果は、伝統的な点眼剤としての局所投与によって達成されることを示す。これは、全身薬物曝露を必要とする、血流からの白血球輸送におけるインテグリンの公知の役割を考慮すると、驚くべき知見である。局所的に投与した薬物からのこの局部的作用は、α4インテグリンアンタゴニストの新規作用機作を示唆するものである。
【０１０８】
実施例4.  式Iの化合物による局所処置は眼表面上の炎症マーカーを減少させる
DEDはしばしば、角膜および結膜中のT細胞関連サイトカイン、マトリックスメタロプロテイナーゼおよび炎症サイトカインの増加を伴う（Coursey et al., 2014；de Paiva et al., 2009a；Yoon et al., 2010）。本発明者らは、5日間のDS中に30mg/mLの式Iの化合物で局所的に処置したマウスを用いて、角膜および結膜中のIL-1α、TGF-β1、MMP-9およびCXCL-9の発現を調べ、ビヒクルを投与したマウスと比較した。これらの遺伝子はDSによって高度に誘導性であるため、これらを選択した（Coursey et al., 2014；de Paiva et al., 2009a；de Paiva et al., 2006b；de Paiva et al., 2006a；Yoon et al., 2007）。実験群および非ストレス対照のいずれも、ハウスキーピング遺伝子のほぼ同等の発現を示し；実験群は非ストレス対照に対して較正した。結果を図3に示す。
【０１０９】
GW559090で処置した角膜では、ビヒクル対照に比べて、IL-1α、MMP-9、TGF-β1およびCXCL9転写物の有意な減少が見られた（図3A）。結膜では、TGF-β1発現の有意な低減が見られたが、IL-1α、MMP-9およびCXCL-9に関しては変化はなかった（図3B）。これらの結果は、式Iの化合物が眼表面で炎症のマーカーを減少させうることを示す。
【０１１０】
実施例5.  式Iの化合物による局所処置は樹状細胞活性化を低下させる。
流入領域CLNはDEDにおける免疫サイクルの不可欠な部分である（Pflugfelder et al., 2008；Schaumburg et al., 2011）。式Iの化合物のCLNに対する影響があるとすれば、それを判定するために、マウスをDSに1日供し、式Iの化合物で1日2回局所的にまたは全身に（皮下；局所と同じ120μg用量）のいずれかで処置した。皮下薬物を投与したマウスには同時にビヒクルを両眼に局所的に投与して、局所点眼剤によって起こる眼表面の湿潤を模倣した。流入領域CLNを切除し、T細胞（CD4、CD8）、単球（CD11b）、樹状細胞（CD11c）およびMHC IIのフローサイトメトリー分析のために調製した。
【０１１１】
1日のDSは正常マウスに比べて、CLN中のCD11b+単球の有意な増加を引き起こした。試験した他の細胞集団はどれも、流入領域CLNにおいてDSにより有意に変化しなかった。どの処置もT細胞集団またはCD11b+単球のいずれに対しても影響を有しなかった。CD11c+およびCD11c+/MHC II+細胞は、有意ではないが、DSによって増加する傾向があったが、式Iの化合物による局所処置は、ビヒクル対照群に比べて、DCの活性化および非活性化型の両方を低減させた。式Iの化合物による全身処置も、デキサメタゾンホスフェートによる局所処置も、同じ効果を生じなかった。結果を図4に示す。
【０１１２】
式Iの化合物が、局所的に投与した場合にのみ、このドライアイのマウスモデルにおいて抗原提示細胞のCLNへの遊走を阻害し、角膜染色を改善したが、全身投与した場合にはそれらの効果はなかったとの事実は、興味をそそる知見である。これは、DEDの処置におけるインテグリンα4アンタゴニストの、全身効果ではなく局部的効果を示唆する。この局部的効果は、インテグリンα4アンタゴニストGW559090に特異的であり、局所用デキサメタゾンホスフェートがDED関連角膜染色を改善したが抗原提示細胞の流入領域リンパ節への遊走を改善しなかったという点で局所ステロイド処置（デキサメタゾンホスフェート）とは区別されると考えられる。当業者であれば、これらの考察から、インテグリンα4拮抗作用の治療効果は独特かつ新規のメカニズムを用いることが理解されよう。
【０１１３】
実施例6.  ウサギにおけるPK試験
本明細書においてGW559090Aと呼ぶ、GW559090のカリウム塩を雄ニュージーランドホワイトウサギに1滴の両側滴剤として局所眼投与により与えた（試験#1：1時点あたりn＝ウサギ2羽/4つの眼；試験#2：1時点あたりn＝ウサギ3羽/6つの眼）。示した時点（投与後0.5、1、3、6時間）で、眼組織を採取し、分析のために処理した。GW559090の濃度を角膜および眼球結膜において液体クロマトグラフィ・タンデム質量分析法（LC-MS/MS）により測定した。
【０１１４】
両方の試験で、40μL（50mg/mL）の単回局所投与の後、眼球結膜におけるCmax値が投与後1時間（Tmax）で観察された。平均結膜濃度は一般には経時的に低下し、投与後6時間を通じて定量可能であった。両方の試験で、40μL（50mg/mL）の単回局所投与の後、角膜におけるCmax値が投与後0.5時間（Tmax）で観察された。平均角膜濃度は一般には経時的に低下し、投与後6時間を通じて定量可能であった。平均角膜濃度は投与後3および6時間の時点で平均結膜濃度よりも高かった。約358ng/mLの結膜および角膜組織濃度は6時間まで持続した（図6）。結膜および角膜組織濃度は30分で3000ng/mLを超え、角膜組織のレベルは3時間で1000ng/mLよりも高いままであった（図6）。
【０１１５】
実施例7.  ニュージーランドホワイトウサギへの13週間の局所眼投与
GW559090Aをこの試験で用いた。本実施例における用量および濃度は親化合物、GW559090について表す。
【０１１６】
GW559090Aをニュージーランドホワイトウサギに13週間局所眼投与により与えた。動物に1日に6または12回、1時間の投与間隔で投与した。処置群は下記であった：（1）ビヒクル（1日12回）、（2）30mg/mL/回を1日6回、（3）50mg/mL/回を1日6回、または（4）50mg/mL/回を1日12回。
【０１１７】
GW559090Aを、0.5％塩化ナトリウムを含む25mMリン酸緩衝液中の保存溶液として製剤化して、50mg/mL保存溶液とし、これを第3もしくは4群への投与に用いるか、または0.75％塩化ナトリウムを含む25mMリン酸緩衝液でさらに希釈して、第2群への投与用の30mg/mL溶液とした。対照動物は50mg/mL溶液用のビヒクル（0.5％塩化ナトリウムを含む25mMリン酸緩衝液）で処置した。
【０１１８】
13週間の処置期間中、ウサギに0.06mLの一定の投与量でGW559090Aまたはビヒクルの局所眼用量を毎日投与した（1日に6または12回、1時間の投与間隔で投与）。試験品製剤またはビヒクルを、右眼の部分的に裏返した下眼瞼に適切な距離から注意深く滴下して、容積式ピペットの眼との接触を防止した。次いで、下および上眼瞼を約5秒間、緩やかに合わせて、用量の損失を防止し、外部眼表面への均質な分布を補助した。非投与の眼はいかなる時点でも処置せず、動物内未処置対照部位とした。
【０１１９】
30もしくは50mg/mL/回を1日6回または50mg/mL/回を1日12回、1時間の投与間隔での局所眼投与による13週間の、GW559090Aの滴下注入は、耐容性が良く、眼変化または全身毒性を引き起こさなかった。無毒性量（NOAEL）は50mg/mL/回を1日12回、1時間の投与間隔であった。この用量において、第13週の値に基づき、AUC0-1（0-24）曝露は雄では19.6（235）ng.h/mL、雌では35.5（426）ng.h/mLであり；Cmaxは雄では38.1g/mL、雌では68.0ng/mLであった。
【０１２０】
GW559090Aの眼投与後の雄および雌ウサギのGW559090に関する複合平均毒物動態学パラメーターを、それぞれ表2および表3に示す。
【０１２１】
（表２）GW559090Aの眼投与後の雄ウサギのGW559090に関する複合平均毒物動態学パラメーター
2020121985.tif 000012
a.  1日6回投与
b.  1日12回投与
c.  1日の最初の投与後
NA：適用なし
【０１２２】
（表３）GW559090Aの眼投与後の雌ウサギのGW559090に関する複合平均毒物動態学パラメーター
2020121985.tif 000013
a.  1日6回投与
b.  1日12回投与
c.  1日の最初の投与後
NA：適用なし
【０１２３】
「AUC0-24」は、AUC0-1に1日の全投与回数を掛けて1日の全推定AUCを表すものを指す。
【０１２４】
実施例8.  ビーグル犬への13週間の局所眼投与
GW559090Aをこの試験で用いた。本実施例における用量および濃度は親化合物のGW559090について表す。
【０１２５】
GW559090Aをビーグル犬に13週間局所眼投与により与えた。動物に1日に6または12回、1時間の投与間隔で投与した。処置群は下記であった：（1）ビヒクル（1日12回）、（2）30mg/mL/回を1日6回、（3）50mg/mL/回を1日6回、または（4）50mg/mL/回を1日12回。
【０１２６】
GW559090Aを、0.5％塩化ナトリウムを含む25mMリン酸緩衝液中の保存溶液として製剤化して、50mg/mL保存溶液とし、これを第3もしくは4群への投与に用いるか、または0.75％塩化ナトリウムを含む25mMリン酸緩衝液でさらに希釈して、第2群への投与用の30mg/mL溶液とした。
【０１２７】
13週間の処置期間中、イヌに0.06mLの一定の投与量でGW559090またはビヒクル（1日12回）の局所眼用量を毎日投与した（1日に6または12回、1時間の投与間隔で投与）。試験品製剤またはビヒクルを、左眼の裏返した下眼瞼に適切な距離から注意深く滴下して、容積式ピペットの眼との接触を防止した。次いで、下および上眼瞼を約5秒間、緩やかに合わせて、用量の損失を防止し、外部眼表面への均質な分布を補助した。非投与の眼はいかなる時点でも処置せず、動物内未処置対照部位とした。
【０１２８】
50mg/mLまでの濃度で1日12回までの左眼の下眼瞼への試験品の滴下注入は耐容性が良かった。試験品の局部的作用または全身作用に起因すると考えられる所見はなかった。
【０１２９】
結論として、30もしくは50mg/mL/回を1日6回または50mg/mL/回を1日12回、1時間の投与間隔でのビーグル犬への13週間の、GW559090Aの局所眼投与は、耐容性が良く、眼変化または全身毒性を引き起こさなかった。無毒性量（NOAEL）は、したがって、50mg/mL/回を1日12回であった。この用量で、雌雄を合わせた第13週の値に基づき、AUC0-1曝露は11.2ng.h/mL（推定AUC0-24は134ng.h/mL）であり；Cmaxは28.7ng/mLであった。
【０１３０】
GW559090Aの眼投与後の雄および雌イヌのGW559090に関する毒物動態学値の概要を、それぞれ表4および表5に示す。
【０１３１】
（表４）GW559090Aの眼投与後の雄イヌのGW559090に関する毒物動態学パラメーター
2020121985.tif 000014
a.  1日の最初の投与後
b.  1日6回投与
c.  1日12回投与
NA：適用なし
【０１３２】
（表５）GW559090Aの眼投与後の雌イヌのGW559090に関する毒物動態学パラメーター
2020121985.tif 000015
a.  1日の最初の投与後
b.  1日6回投与
c.  1日12回投与
NA：適用なし
【０１３３】
実施例9.  ドライアイ患者におけるGW559090の安全性、耐容性、および有効性を評価するための無作為二重盲検プラシーボ対照並行群デザイン
これは二部式試験である。第1部は1つまたは複数の施設で行われ、健常志願者におけるGW559090の非盲検用量漸減耐容性試験である。耐容量の特定後、試験は第2部に移る。第2部は、ドライアイ疾患（DED）処置のためにGW559090の安全性および有効性を評価する、前向きプラシーボ対照無作為二重盲検並行群多施設試験である。
【０１３４】
第1部は最大2つの処置部門を有する。最大10名の健常志願者の一方の眼に50mg/mLのGW559090 TIDを7日間投与する。この用量が10名の患者において耐容性を示せば、試験は第2部に進み、これより低い用量は試験しない。50mg/mLが十分に耐容性を示さなければ、第二のコホートの10名の健常志願者の一方の眼に30mg/mLのGW559090 TIDを7日間投与する。この用量が耐容性を示せば、試験は第2部に進む。耐容性の評価は身体的所見のおよび耐容性アンケートに対する回答の調査に基づく。どちらの用量も耐容性を示さなければ、試験を中止する。個々の患者がプロトコールのこの段階に参加する最長期間は22日とする（14日間のスクリーニング、7日間のGW559090、1日の追跡）。
【０１３５】
第2部では、中等度から重症のDEDを有する約90名の対象をプラシーボならし（run-in）期間に登録し、この間にプラシーボ1滴TIDを14日間投与する。プラシーボならし期間の後、登録基準にまだ適合しており、ならし期間中の投与にコンプライアンスを示した、最初の約76名の対象を、2部門の一方に2：1の比（GW559090：プラシーボ）で無作為に割り付ける。対象を、GW559090の最高耐容量（第1部から）を1日3回送達、またはプラシーボ（ビヒクル）の投与を1日3回のいずれかに無作為に割り付ける。対象は最長12週間、薬物を割り付けられたとおりに続ける。対象がプロトコールのこの段階に参加する最長期間は115日とする（14日間のスクリーニング、14日間のプラシーボならし、84日間の処置、および3日の追跡）。
【０１３６】
プロトコールの第2部は、ドライアイ集団における概念証明を確立するためである。前臨床モデルで観察された有効性はデキサメタゾンに対して非劣性であったことを考慮すると、眼の上皮の完全性を直接反映する、客観的生理学的バイオマーカー（角膜染色）に対して意味のある効果が見られるであろうと予想するのは理にかなっている。複数の終点が研究者または対象のいずれかによる報告バイアスに供されるため、二重盲検無作為アプローチは適切である。以前の試験で、部分的にはビヒクル点眼剤の潤滑効果により、顕著なプラシーボ効果が見られたため、プラシーボ（ビヒクル）部門を含めた。したがって、臨床結果は、この効果を説明せずに評価することはできない。
【０１３７】
実施例10.  ドライアイ患者におけるGW559090の安全性、耐容性、および有効性を評価するための試験
この試験では、中等度から重症のDEDを有する約200名の対象を最初にスクリーニングする。約120名の対象を、2部門の一方に1：1の比（GW559090：プラシーボ）で無作為に割り付ける。対象を、GW559090の最高耐容量（例えば、50mg/mL）を1日3回送達、またはプラシーボ（ビヒクル）の投与を1日3回のいずれかに無作為に割り付ける。試験のこの段階の期間は98〜101日間とする（14日間のプラシーボならし、84日間の処置、および任意に3日の追跡）。
【０１３８】
中間分析の完了後、追加の対象を並行用量範囲試験に無作為に割り付ける。中間分析により、TIDの最高耐容量に強い反応が示されれば、約200名の対象を次の5群の1つに無作為に割り付ける：プラシーボTID；3mg/mL TID；30mg/mL TID；50mg/mL TID；または50mg/mL BID。中間分析により、TIDの最高耐容量に中等度の反応が示されれば、約140名の対象を次の4群の1つに無作為に割り付ける：プラシーボTID；3mg/mL TID；30mg/mL TID；または50mg/mL TID。
【０１３９】
参照文献
2020121985.tif 000016
2020121985.tif 000017
2020121985.tif 000018
2020121985.tif 000019
2020121985.tif 000020
【０１４０】
例示的態様
A1.
2020121985.tif 000021
である式Iの化合物あるいはその任意の薬学的に許容される異性体、水和物、無水物、溶媒和物、エステル、塩型、遊離酸もしくは遊離塩基、プロドラッグ、複合体、結合体、または多形と、1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
A2.  局所的に適用する、態様A1に記載の薬学的組成物。
A3.  結膜嚢または眼瞼に適用する、態様A1に記載の薬学的組成物。
A4.  結膜下、前房内、硝子体内、テノン嚢下、網膜下、脈絡膜下、または脈絡膜上に適用する、態様A1に記載の薬学的組成物。
A5.  眼炎症状態を処置するのに有用な、態様A2、A3、またはA4に記載の薬学的組成物。
A6.  点眼剤、噴霧剤、またはミストの形で適用する、前記態様のいずれかに記載の薬学的組成物。
A7.  挿入物または他の送達デバイスにより適用する、前記態様のいずれかに記載の薬学的組成物。
A8.  それを必要とする哺乳動物/ヒトにおける眼炎症状態の処置のための方法であって、該哺乳動物/ヒトに、
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である式Iの化合物あるいはその任意の薬学的に許容される異性体、水和物、無水物、溶媒和物、エステル、塩型、遊離酸もしくは遊離塩基、プロドラッグ、複合体、結合体、または多形、および1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤の治療的有効量を投与する段階を含む、方法。
A9.  組成物を局所的に適用する、態様A8に記載の方法。
A10.  組成物を結膜嚢または眼瞼に適用する、態様A8に記載の方法。
A11.  組成物を結膜下、前房内、硝子体内、テノン嚢下、網膜下、脈絡膜下、または脈絡膜上に適用する、態様A8に記載の方法。
A12.  組成物を点眼剤、噴霧剤、またはミストの形で適用する、前記態様のいずれかに記載の方法。
A13.  組成物を挿入物または他の送達デバイスにより適用する、前記態様のいずれかに記載の方法。
A14.  眼炎症状態の処置において使用するための、
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である式Iの化合物あるいはその任意の薬学的に許容される異性体、水和物、無水物、溶媒和物、エステル、塩型、遊離酸もしくは遊離塩基、プロドラッグ、複合体、結合体、または多形と、1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物。
A15.  抗原提示細胞のリンパ節への遊走を阻止する段階によって、それを必要とする哺乳動物/ヒトにおける眼炎症状態を処置するための方法であって、該哺乳動物/ヒトに、
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である式Iの化合物あるいはその任意の薬学的に許容される異性体、水和物、無水物、溶媒和物、エステル、塩型、遊離酸もしくは遊離塩基、プロドラッグ、複合体、結合体、または多形、および1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤の治療的有効量を投与する段階を含む、方法。
A16.  それを必要とする哺乳動物/ヒトにおける眼炎症状態の処置のための方法であって、該哺乳動物/ヒトに、治療的有効量の（a）
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である式Iの化合物あるいはその任意の薬学的に許容される異性体、水和物、無水物、溶媒和物、エステル、塩型、遊離酸もしくは遊離塩基、プロドラッグ、複合体、結合体、または多形を含む薬学的組成物；ならびに（b）シクロスポリンA、および1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を投与する段階を含む、方法。
A17.  それを必要とする哺乳動物/ヒトにおける眼炎症状態の処置のための方法であって、該哺乳動物/ヒトに、治療的有効量の（a）
2020121985.tif 000026
である式Iの化合物あるいはその任意の薬学的に許容される異性体、水和物、無水物、溶媒和物、エステル、塩型、遊離酸もしくは遊離塩基、プロドラッグ、複合体、結合体、または多形を含む薬学的組成物；ならびに（b）デキサメタゾン塩基およびデキサメタゾンホスフェート、ジフルプレドナート、フルオシノロン、フルオロメトロン塩基およびフルオロメトロンアセテート、ロテプレドノール、プレドニゾロンアセテートおよびプレドニゾロンホスフェート、リメキソロンと、トリアムシノロンアセトニドからなる群より選択される局所用ステロイド、ならび1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を投与する段階を含む、方法。
A18.  それを必要とする哺乳動物/ヒトにおける眼炎症状態の処置のための方法であって、該哺乳動物/ヒトに、治療的有効量の（a）
2020121985.tif 000027
である式Iの化合物あるいはその任意の薬学的に許容される異性体、水和物、無水物、溶媒和物、エステル、塩型、遊離酸もしくは遊離塩基、プロドラッグ、複合体、結合体、または多形を含む薬学的組成物；ならびに（b）ブロムフェナク、ジクロフェナク、フルルビプロフェン、ケトロラク、およびネパフェナクからなる群より選択される非ステロイド性抗炎症薬、ならび1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を投与する段階を含む、方法。
A19.  それを必要とする哺乳動物/ヒトにおける眼炎症状態の処置のための方法であって、該哺乳動物/ヒトに、治療的有効量の（a）
2020121985.tif 000028
である式Iの化合物あるいはその任意の薬学的に許容される異性体、水和物、無水物、溶媒和物、エステル、塩型、遊離酸もしくは遊離塩基、プロドラッグ、複合体、結合体、または多形を含む薬学的組成物；ならびに（b）LFA-1インテグリンアンタゴニスト、および1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を投与する段階を含む、方法。
A20.  LFA-1インテグリンアンタゴニストがリフィテグラストである、態様A19に記載の方法。
A21.  組成物を点眼剤、噴霧剤、またはミストの形で局所的に適用する、態様A15、A16、A17、A18、A19、またはA20に記載の方法。
A22.  眼炎症状態の処置のための医薬の製造における、
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である式Iの化合物あるいはその任意の薬学的に許容される異性体、水和物、無水物、溶媒和物、エステル、塩型、遊離酸もしくは遊離塩基、プロドラッグ、複合体、結合体、または多形、および1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤の使用。
A23.  眼炎症状態が、ドライアイ疾患、非感染性ブドウ膜炎（例えば、前部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎、または汎ブドウ膜炎）、非感染性結膜炎、虹彩炎、または強膜炎である、前記態様のいずれかに記載の薬学的組成物、方法、または使用。
A24.  眼炎症状態がドライアイ疾患である、前記態様のいずれかに記載の薬学的組成物、方法、または使用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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