(57)【要約】【課題】  細胞核の染色性に優れ、またエオジンによる細胞質染色とのコントラストにも優れ、さらに溶液状態における安定性にも優れた病理診断用染色剤、この染色剤を用いた細胞核染色方法及び病理標本の製造方法、並びに、上記染色剤の染色成分として好適な色素を提供する。【解決手段】  下記式（１）で表される色素を含有する病理診断用染色剤、この染色剤を用いた細胞核染色方法及び病理標本の製造方法、並びに上記染色剤の色素成分として好適な色素。2020066637.tif 000024  Ｒ１〜Ｒ８、Ｒ１１及びＲ１２は水素原子又は置換基を示す。Ｒ１３〜Ｒ１５は水素原子又は置換基を示す。Ａ１及びＡ２は−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＮＲ１６−又は−ＣＲ１７Ｒ１８−を示し、Ｒ１６〜Ｒ１８は水素原子又は置換基を示す。ｎ１は０〜３の整数であり、ｍは１〜４の整数である。Ｘ−はアニオン性の対イオンを示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される色素を含有する病理診断用染色剤。
【化１】
2020066637.tif 000020
式中、Ｒ１〜Ｒ８、Ｒ１１及びＲ１２は水素原子又は置換基を示す。Ｒ１３〜Ｒ１５は水素原子又は置換基を示す。Ａ１及びＡ２は−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＮＲ１６−又は−ＣＲ１７Ｒ１８−を示し、Ｒ１６〜Ｒ１８は水素原子又は置換基を示す。ｎ１は０〜３の整数であり、ｍは１〜４の整数である。Ｘ−はアニオン性の対イオンを示す。
【請求項２】
前記式（１）で表される色素が下記式（２）で表される、請求項１に記載の病理診断用染色剤。
【化２】
2020066637.tif 000021
上記式中、Ｒ１〜Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ａ１及びＡ２は、それぞれ、式（１）におけるＲ１〜Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ａ１及びＡ２と同義である。Ｒ２１−は−Ｏ−、−Ｓ−又は−Ｃ（ＣＮ）２−を示し、Ｒ２２は＝Ｏ、＝Ｓ又は＝Ｃ（ＣＮ）２を示す。
【請求項３】
前記色素が、Ｒ１〜Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１６〜Ｒ１８から選ばれる少なくとも１つの基の中にカチオン性基を有する、請求項１又は２に記載の病理診断用染色剤。
【請求項４】
前記カチオン性基が下記式（Ｋ−１）〜（Ｋ−３）のいずれかで表される基である、請求項３に記載の病理診断用染色剤。
【化３】
2020066637.tif 000022
式中、＊は結合部位を示す。Ｒ２１〜Ｒ２７はアルキル基又はアリール基を示す。環αは含窒素芳香族環を示す。
【請求項５】
前記カチオン性基を前記Ｒ１１及びＲ１２が有する、請求項３又は４に記載の病理診断用染色剤。
【請求項６】
水を含有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の病理診断用染色剤。
【請求項７】
アルコールを含有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の病理診断用染色剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の病理診断用染色剤を用いて細胞核を染色することを含む、細胞核染色方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の病理診断用染色剤を用いて細胞核を染色することを含む、病理標本の製造方法。
【請求項１０】
エオジン染色により細胞質を染色することを含む、請求項９に記載の病理標本の製造方法。
【請求項１１】
下記式（３）で表される色素。
【化４】
2020066637.tif 000023
上記式中、Ｒ１〜Ｒ８は水素原子又は置換基を示し、Ｒ３１〜Ｒ３６はアルキル基又はアリール基を示す。Ｌ３１及びＬ３２は連結基を示す。Ａ１及びＡ２は−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＮＲ１６−又は−ＣＲ１７Ｒ１８−を示し、Ｒ１６〜Ｒ１８は水素原子又は置換基を示す。ｍ１は２〜４の整数である。Ｘ−はアニオン性の対イオンを示す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病理診断用染色剤、細胞核染色方法、病理標本の製造方法、及び色素に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾患を適切に診断するために病理診断が行われる。この病理診断では、患者から採取した組織ないし細胞を染色して病理標本を作製し、この病理標本を顕微鏡観察して病理組織学的な診断がされる。
病理診断における細胞染色には、古くからヘマトキシリン−エオジン染色（ＨＥ染色）が用いられている。このＨＥ染色では、まずヘマトキシリンを酸化してヘマテインへと変換し、このヘマテインを、媒染剤の金属部分と錯体を形成させて正に帯電した状態とする。この正に帯電した錯体が、負に帯電している核酸に結合することにより、細胞核が青色に染色される。次いでエオジンにより細胞質を赤く染色することにより、細胞核と細胞質とが異なる色で染色された病理標本が作製される。ＨＥ染色に関する技術に関し、例えば非特許文献１を参照することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｊ．Ｊｐｎ．Ｓｏｃ．Ｃｏｌｏｕｒ  Ｍａｔｅｒ．，２０１３年，第８６巻，第６号，ｐ．２１２−２１６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＨＥ染色試薬を構成するヘマトキシリンは、その使用形態を考慮して金属塩、酸化剤等と混合された溶液として提供されるのが一般的である。しかし、この溶液は保存安定性が低く、経時的に色素が析出する。したがって、病理標本の作製においては、ヘマトキシリン溶液をろ過して使用するが、使用を繰り返すことにより色素濃度が低下してしまう問題があった。
そこで本発明は、細胞核の染色性に優れ、またエオジンによる細胞質染色との色のコントラストにも優れ、さらに溶液状態における保存安定性にも優れた病理診断用染色剤を提供することを課題とする。また本発明は、上記病理診断用染色剤を用いた、細胞核染色方法及び病理標本の製造方法を提供することを課題とする。さらに本発明は、上記病理診断用染色剤の染色成分として好適な色素を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の上記の課題は以下の手段により解決された。
〔１〕
下記式（１）で表される色素を含有する病理診断用染色剤。
【化１】
2020066637.tif 000002
式中、Ｒ１〜Ｒ８、Ｒ１１及びＲ１２は水素原子又は置換基を示す。Ｒ１３〜Ｒ１５は水素原子又は置換基を示す。Ａ１及びＡ２は−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＮＲ１６−又は−ＣＲ１７Ｒ１８−を示し、Ｒ１６〜Ｒ１８は水素原子又は置換基を示す。ｎ１は０〜３の整数であり、ｍは１〜４の整数である。Ｘ−はアニオン性の対イオンを示す。
〔２〕
上記式（１）で表される色素が下記式（２）で表される、〔１〕に記載の病理診断用染色剤。
【化２】
2020066637.tif 000003
上記式中、Ｒ１〜Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ａ１及びＡ２は、それぞれ、式（１）におけるＲ１〜Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ａ１及びＡ２と同義である。Ｒ２１−は−Ｏ−、−Ｓ−又は−Ｃ（ＣＮ）２−を示し、Ｒ２２は＝Ｏ、＝Ｓ又は＝Ｃ（ＣＮ）２を示す。
〔３〕
上記色素が、Ｒ１〜Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１６〜Ｒ１８から選ばれる少なくとも１つの基の中にカチオン性基を有する、〔１〕又は〔２〕に記載の病理診断用染色剤。
〔４〕
上記カチオン性基が下記式（Ｋ−１）〜（Ｋ−３）のいずれかで表される基である〔３〕に記載の病理診断用染色剤。
【化３】
2020066637.tif 000004
式中、＊は結合部位を示す。Ｒ２１〜Ｒ２７はアルキル基又はアリール基を示す。環αは含窒素芳香族環を示す。
〔５〕
上記カチオン性基を上記Ｒ１１及びＲ１２が有する、〔３〕又は〔４〕に記載の病理診断用染色剤。
〔６〕
水を含有する、〔１〕〜〔５〕のいずれか１つに記載の病理診断用染色剤。
〔７〕
アルコールを含有する、〔１〕〜〔６〕のいずれか１つに記載の病理診断用染色剤。
〔８〕
〔１〕〜〔７〕のいずれか１つに記載の病理診断用染色剤を用いて細胞核を染色することを含む、細胞核染色方法。
〔９〕
〔１〕〜〔７〕のいずれか１つに記載の病理診断用染色剤を用いて細胞核を染色することを含む、病理標本の製造方法。
〔１０〕
エオジン染色により細胞質を染色することを含む、〔９〕に記載の病理標本の製造方法。
〔１１〕
下記式（３）で表される色素。
【化４】
2020066637.tif 000005
上記式中、Ｒ１〜Ｒ８は水素原子又は置換基を示し、Ｒ３１〜Ｒ３６はアルキル基又はアリール基を示す。Ｌ３１及びＬ３２は連結基を示す。Ａ１及びＡ２は−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＮＲ１６−又は−ＣＲ１７Ｒ１８−を示し、Ｒ１６〜Ｒ１８は水素原子又は置換基を示す。ｍ１は２〜４の整数である。Ｘ−はアニオン性の対イオンを示す。
【０００６】
本明細書において、特定の符号で表示された置換基、連結基、繰り返し構造等（以下、置換基等という。）が複数あるとき、又は複数の置換基等を同時に規定するときには、特段の断りがない限り、それぞれの置換基等は互いに同一でも異なっていてもよい。このことは、置換基等の数の規定についても同様である。また、複数の置換基等が近接するとき（特に、隣接するとき）には、特段の断りがない限り、それらが互いに連結して環を形成してもよい。また、環、例えば脂肪族環、芳香族環、ヘテロ環はさらに縮環して縮合環を形成していてもよい。
本明細書において、ある基の炭素数を規定する場合、この炭素数は、基全体の炭素数を意味する。つまり、この基がさらに置換基を有する形態である場合、この置換基を含めた全体の炭素数を意味する。
本明細書の化学構造式において、化学構造式中に共鳴構造を有する場合、その共鳴構造も含む化学構造を意味している。
【０００７】
本明細書において「〜」を用いて表される数値範囲は、「〜」前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の病理診断用染色剤は、細胞核を選択的に、十分に濃く染色することができ、またエオジンによる細胞質染色との色のコントラストにも優れ、さらに溶液状態における保存安定性にも優れる。また本発明の細胞核染色方法によれば、細胞核を選択的に、かつ十分に濃く染色することができ、また細胞核染色の再現性も高めることができる。また本発明の病理標本の製造方法によれば、細胞核が選択的に、十分に濃く染色された病理標本を得ることができ、また病理標本における細胞核染色の再現性も高めることができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［病理診断用染色剤］
本発明の病理診断用染色剤は、下記式（１）で表される色素を含有する。
【００１０】
【化５】
2020066637.tif 000006
【００１１】
上記式（１）中、Ｒ１〜Ｒ８、Ｒ１１及びＲ１２は水素原子又は置換基を示す。Ｒ１３〜Ｒ１５は水素原子又は置換基を示す。Ａ１及びＡ２は−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＮＲ１６−又は−ＣＲ１７Ｒ１８−を示し、Ｒ１６〜Ｒ１８は水素原子又は置換基を示す。ｎ１は０〜３の整数であり、ｍは１〜４の整数である。Ｘ−はアニオン性の対イオンを示す。
Ｒ１〜Ｒ８及びＲ１１〜Ｒ１８から選ばれる基は、ｍが１〜４となる範囲内においてカチオン性基を有していてもよく、またＲ１３〜Ｒ１５から選ばれる基は、ｍが１〜４となる範囲内においてアニオン性基を有していてもよい。上記カチオン性基及びアニオン性基の詳細については後述する。
また、Ｒ１４同士、Ｒ１５同士、又はＲ１４とＲ１５とが互いに結合して環を形成してもよい。
【００１２】
上記式（１）で表される色素は、水等の溶媒中に溶解した際に、ｍ価のカチオンである色素と、Ｘ−で示されるアニオン性対イオンとに解離する。このｍ価のカチオンである色素は、アニオン性基（リン酸基、カルボキシ基等）を有し負に帯電している核酸等と相互作用し、細胞核を選択的に染色することができる。
すなわち、本発明の病理診断用染色剤を用いた細胞核染色では、ヘマトキシリンを用いた細胞核染色に必要な酸化剤、媒染剤等の添加を要しない。
【００１３】
上記Ｒ１〜Ｒ８として採り得る置換基としては、ヒロドキシ基、ハロゲン原子、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アルキル基、ヘテロアリール基、アミノ基、シアノ基、アルキルカルボニル基、アルキルオキシカルボニル基及びアミノカルボニル基が挙げられる。
上記Ｒ１〜Ｒ８がハロゲン原子の場合、このハロゲン原子としてはフッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子が挙げられ、塩素原子又は臭素原子が好ましく、塩素原子がより好ましい。
上記Ｒ１〜Ｒ８がアルコキシ基の場合、このアルコキシ基の炭素数は１〜６が好ましく、１〜４がより好ましく、１〜３がさらに好ましく、メトキシ、エトキシ、プロポキシが好ましく、メトキシ、エトキシがより好ましい。
上記Ｒ１〜Ｒ８がアリールオキシ基の場合、このアリール基は環構成原子数が６〜１２が好ましく、６〜１０がより好ましく、６〜８がさらに好ましく、フェニルオキシ基が特に好ましい。
上記Ｒ１〜Ｒ８がアルキルチオ基の場合、このアルキルチオ基の炭素数は１〜６が好ましく、１〜４がより好ましく、１〜３がさらに好ましく、メチルチオ、エチルチオが特に好ましい。
上記Ｒ１〜Ｒ８がアリールチオ基の場合、このアリール基は環構成原子数が６〜１２が好ましく、６〜１０がより好ましく、６〜８がさらに好ましく、フェニルチオが特に好ましい。
上記Ｒ１〜Ｒ８がアルケニル基の場合、このアルケニル基の炭素数は２〜６が好ましく、２〜４がより好ましく、２又は３がさらに好ましく、エテニルが特に好ましい。
上記Ｒ１〜Ｒ８がアルキニル基の場合、このアルキニル基の炭素数は２〜６が好ましく、２〜４がより好ましく、２又は３がさらに好ましく、エチニルが特に好ましい。
上記Ｒ１〜Ｒ８がアリール基の場合、このアリール基は環構成原子数が６〜１８が好ましく、６〜１４がより好ましく、６〜１０がさらに好ましく、フェニルが特に好ましい。
上記Ｒ１〜Ｒ８がアルキル基の場合、このアルキル基の炭素数は１〜６が好ましく、１〜４がより好ましく、１〜３がさらに好ましい。また、このアルキル基はフッ素原子を有することも好ましく、より好ましくはパーフルオロアルキル基であり、さらに好ましくはトリフルオロメチルである。
上記Ｒ１〜Ｒ８がヘテロアリール基の場合、このヘテロアリール基は、環構成原子に酸素原子、硫黄原子及び窒素原子のいずれかを有する５員環または６員環のヘテロ環基が好ましく、縮環していてもよく、環構成原子数が２〜１０が好ましく、３〜７がより好ましく、３〜５がさらに好ましく、ピリジル、ピリミジル、ピラジル、トリアジル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、フラニル、チエニルが特に好ましい。
上記Ｒ１〜Ｒ８がアミノ基の場合、無置換のアミノ基、炭素数１〜１２のアミノ基（Ｎ−アルキルアミノ基、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ基、Ｎ−アリールアミノ基、Ｎ，Ｎ−ジアリールアミノ基、Ｎ−アルキル−Ｎ−アリールアミノ基）が好ましい。Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ基の場合、２つのアルキル基が連結基を介して互いに連結してもよく、具体例としては、モルホリノ、ピペリジル、及びピロリジルが挙げられる。
上記Ｒ１〜Ｒ８がアルキルカルボニル基の場合、このアルキルカルボニル基の炭素数は１〜６が好ましく、１〜４がより好ましく、１〜３がさらに好ましく、メチルカルボニルが特に好ましい。
上記Ｒ１〜Ｒ８がアルキルオキシカルボニル基の場合、このアルキルオキシカルボニル基の炭素数は１〜６が好ましく、１〜４がより好ましく、１〜３がさらに好ましく、メトキシカルボニルが特に好ましい。
上記Ｒ１〜Ｒ８がアミノカルボニル基の場合、無置換のアミノカルボニル基、炭素数１〜１２のアミノカルボニル基（アルキル基及び／又はアリール基を置換基として有するアミノカルボニル基を含む）が好ましく、無置換のアミノカルボニル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル基、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノカルボニル基がより好ましい。
【００１４】
なかでも上記Ｒ１〜Ｒ８は、水素原子、ハロゲン原子、アルコキシ基又はヒドロキシル基が好ましい。このアルコキシ基はカチオン性基を有する形態であってもよい。
上記Ｒ１〜Ｒ８は、互いに結合して環を形成してもよい。この場合、形成される環は、Ｒ１〜Ｒ４（又はＲ５〜Ｒ８）が結合するベンゼン環と縮合し、ナフタレン環を形成していることが好ましい。
【００１５】
上記Ｒ１１及びＲ１２として採り得る置換基としては、アルキル基、アルキルカルボニル基及びアルキルスルホニル基が挙げられる。
上記Ｒ１１及びＲ１２がアルキル基の場合、このアルキル基の炭素数は１〜１２が好ましく、１〜１０がより好ましく、２〜６がさらに好ましい。具体例としては、メチル、エチル、プロピル、ブチルが挙げられ、エチル又はプロピルが好ましい。
上記Ｒ１１及びＲ１２がアルキルカルボニル基またはアルキルスルホニル基の場合、これらの基のアルキル部位の好ましい態様は、上記Ｒ１１及びＲ１２がとりうるアルキル基の好ましい態様と同様である。
上記Ｒ１１及びＲ１２はアルキル基であることが好ましい。このアルキル基はカチオン性基を有する形態であることが好ましく、Ｒ１１及びＲ１２がともにエチル基を介してカチオン性基を有すること、あるいはＲ１１及びＲ１２がともにプロピル基を介してカチオン性基を有することがより好ましい。
【００１６】
上記Ｒ１３として採り得る置換基としては、アルキル基及びアリール基が挙げられる。
上記Ｒ１３がアルキル基の場合、このアルキル基の炭素数は１〜６が好ましく、１〜４がより好ましく、１〜３がさらに好ましく、メチル、エチルが特に好ましい。
上記Ｒ１３がアリール基の場合、このアリール基は環構成原子数が６〜１８が好ましく、６〜１４がより好ましく、６〜１０がさらに好ましい。
なかでも上記Ｒ１３は水素原子であることが好ましい。
【００１７】
上記Ｒ１４として採り得る置換基は、ホルミル基、チオアルデヒド基、アルキル基、アルケニル基及びアリール基が挙げられる。
上記Ｒ１４がアルキル基の場合、このアルキル基の炭素数は１〜６が好ましく、１〜４がより好ましく、１〜３がさらに好ましく、メチル、エチルが特に好ましい。
上記Ｒ１４がアルケニル基の場合、このアルケニル基の炭素数は２〜６が好ましく、２〜４がより好ましく、２〜３がさらに好ましく、エテニルが特に好ましい。
上記Ｒ１４がアリール基の場合、このアリールは環構成原子数が６〜１８が好ましく、６〜１４がより好ましく、６〜１０がさらに好ましく、フェニルが特に好ましい。
上記Ｒ１４は、水素原子、ホルミル基、チオアルデヒド基、アルキル基又はアルケニル基であることが好ましい。
【００１８】
上記Ｒ１５として採り得る置換基は、アニオン性基を有することが好ましく、アニオン性基であることがより好ましい。上記Ｒ１５は、水素原子又はアニオン性基であることがより好ましい。
【００１９】
上記Ｒ１６として採り得る置換基としては、アルキル基及びアリール基が挙げられる。
上記Ｒ１６がアルキル基又はアリール基の場合、このアルキル基及びアリール基の好ましい形態は、それぞれ、上記Ｒ１１として採り得るアルキル基及びＲ１３として採り得るアリール基の好ましい形態と同じである。
上記Ｒ１６はアルキル基であることが好ましい。このアルキル基はカチオン性基を有する形態であることも好ましい。
【００２０】
上記Ｒ１７及びＲ１８として採り得る置換基としては、アルキル基及びアリール基が挙げられる。
上記Ｒ１７及び／又はＲ１８がアルキル基の場合、このアルキル基の炭素数は１〜６が好ましく、１〜４がより好ましく、１〜３がさらに好ましく、メチルが特に好ましい。
上記Ｒ１７及び／又はＲ１８がアリール基の場合、このアリール基の好ましい形態は、上記Ｒ１３として採り得るアリール基の好ましい形態と同じである。
上記Ｒ１７及びＲ１８はアルキル基が好ましく、このアルキル基はカチオン性基を有する形態であることも好ましい。
【００２１】
上記Ｒ１〜Ｒ８及びＲ１１〜Ｒ１８として採り得る置換基は、ヒドロキシ基、カルボキシ基、ハロゲン原子、シアノ基又はアミノ基を有する形態であることも好ましい。
このアミノ基の好ましい形態は、上記Ｒ１〜Ｒ８として採り得るアミノ基の好ましい形態と同じである。
【００２２】
上記Ａ１及びＡ２は、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ１６−又は−ＣＲ１７Ｒ１８−であることが好ましい。
【００２３】
（カチオン性基）
上記Ｒ１〜Ｒ８及びＲ１１〜Ｒ１８が有し得るカチオン性基とは、カチオンを有する基を意味する。このカチオン性基は第四級アンモニウムイオンを有する基が好ましく、より好ましくは下記式（Ｋ−１）〜（Ｋ−３）のいずれかで表される基である。
【００２４】
【化６】
2020066637.tif 000007
【００２５】
上記式中、＊はＲ１〜Ｒ８又はＲ１１〜Ｒ１８中に組み込まれるための結合部位を示す。Ｒ２１〜Ｒ２７はアルキル基又はアリール基を示す。環αは含窒素芳香族環を示す。
【００２６】
上記Ｒ２１〜Ｒ２７として採り得るアルキル基は、炭素数は１〜４が好ましく、１又は２がより好ましく、１がさらに好ましく、メチルが好ましい。
上記Ｒ２１〜Ｒ２７として採り得るアリール基は、環構成原子数は６〜１２が好ましく、６〜９がより好ましく、６がさらに好ましく、フェニルが好ましい。
なお、上記Ｒ２１〜Ｒ２７において、隣接する２つのアルキル基が結合して環を形成していてもよく、また結合する際に酸素原子を介して環を形成していてもよい。形成される環としては、例えば、モルホリニウム環、ピペリジニウム環及びピロリジニウム環が挙げられる。
上記Ｒ２１〜Ｒ２７は、アルキル基が好ましく、なかでもメチル基が好ましい。
【００２７】
上記環αにおける含窒素芳香族環は、少なくとも１つの窒素原子を環構成原子として有する、５又は６員環が好ましい。その他の環構成原子としては、炭素原子、硫黄原子、酸素原子が挙げられ、炭素原子が好ましい。上記環αにおける含窒素芳香族環が炭素原子を有する場合、炭素数１〜１２が好ましく、炭素数１〜６がより好ましい。具体例としては、ピリジン環及びイミダゾール環が挙げられる。
【００２８】
上記カチオン性基は、より好ましくは上記式（Ｋ−１）で表される基である。上記式（Ｋ−１）で表される基のなかでも、Ｒ２１〜Ｒ２３がアルキル基である形態が好ましく、Ｒ２１〜Ｒ２３がメチル基である形態がより好ましい。
【００２９】
Ｒ１〜Ｒ８及びＲ１１〜Ｒ１８がカチオン性基を有する形態である場合、カチオン性基を有する、アルキル基又はアルコキシ基が好ましい。
本発明においては、上記Ｒ１〜Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１６〜Ｒ１８のいずれかが上記カチオン性基を有することが好ましく、上記Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１６〜Ｒ１８のいずれかがカチオン性基を有することがより好ましく、上記Ｒ１１及びＲ１２がともにカチオン性基を有することがさらに好ましい。
【００３０】
（アニオン性基）
式（１）において、上記Ｒ１３〜Ｒ１５が有し得るアニオン性基とは、アニオンを有する基を意味する。アニオン性基は−Ｏ−、−Ｓ−又は−Ｃ（ＣＮ）２−が好ましい。
本発明においては、Ｒ１４及びＲ１５のいずれか１つがアニオン性基を有する形態であることが好ましい。また、Ｒ１５のうちの少なくとも１つがアニオン性基であることがより好ましい。式（１）で表される色素は、その分子中にアニオン性基を１つ有する形態であることが好ましい。
【００３１】
式（１）で表される色素は、ｎ１は２又は３（より好ましくは２）が好ましく、この場合、上記２つのＲ１４同士が互いに結合して環を形成する形態が好ましい。この環としては、４〜６員環が好ましく、なかでも、下記環構造が好ましい。
【００３２】
【化７】
2020066637.tif 000008
【００３３】
上記式中、＊１は、Ａ２及びＮ＋−Ｒ１２が結合する炭素原子（式（１）の右側に示された５員環の環構成炭素原子のうち、Ａ２とＮ＋−Ｒ１２との間に挟まれた炭素原子）との結合部位を示し、＊２は、Ｒ１３が結合する炭素原子との結合部位を示す。Ｒ１４Ａは、Ｒ１４同士が互いに結合して環を形成した際の残基を示す。Ｒ１５Ａ−は、上記Ｒ１５として採り得る置換基のうちアニオン性基を有する形態と同義であり、Ｒ１５Ａ−Ｒ１５−は上記アニオン性基であることが好ましい。
Ｒ１４Ａは、＝Ｏ、＝Ｓ又は＝Ｃ（ＣＮ）２が好ましい。
【００３４】
ｎ１は、１〜３が好ましく、２又は３がより好ましい。
ｍは２〜４が好ましく、より好ましくは２又は３であり、特に好ましくは２である。
【００３５】
Ｘ−として採り得るアニオン性の対イオンとしては、特に制限はなく、有機、無機のいずれのイオンでもよい。代表的な例としては、ハロゲンイオン（フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、沃素イオン）、水酸化物イオン、過塩素酸イオン、テトラフルオロホウ酸イオン、ヘキサフルオロリン酸イオン、酢酸イオン、トリフルオロ酢酸イオン、メタンスルホン酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸イオン、パラトルエンスルホン酸イオン、パラクロロフェニルスルホン酸イオン等を挙げることができ、ハロゲンイオン（フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、沃素イオン）、酢酸イオン、トリフルオロ酢酸イオン、メタンスルホン酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸イオン、パラトルエンスルホン酸イオンが好ましく、ハロゲンイオンがより好ましい。
【００３６】
上記式（１）で表される色素は、下記式（２）で表されることが好ましい。
【００３７】
【化８】
2020066637.tif 000009
【００３８】
上記式（２）中、Ｒ１〜Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ａ１及びＡ２は、それぞれ、式（１）におけるＲ１〜Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ａ１及びＡ２と同義であり、好ましい形態も同じである。Ｒ２１−は−Ｏ−、−Ｓ−、又は−Ｃ（ＣＮ）２−を示し、Ｒ２２は＝Ｏ、＝Ｓ、又は＝Ｃ（ＣＮ）２を示す。
【００３９】
上記Ｒ２１は−Ｏ−が好ましく、Ｒ２２は＝Ｏが好ましい。
【００４０】
上記式（１）で表される色素は、より好ましくは下記式（３）で表される。
【００４１】
【化９】
2020066637.tif 000010
【００４２】
上記式（３）中、Ｒ１〜Ｒ８は水素原子又は置換基を示し、Ｒ３１〜Ｒ３６はアルキル基又はアリール基を示す。Ｌ３１及びＬ３２は連結基を示す。Ａ１及びＡ２は−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＮＲ１６−又は−ＣＲ１７Ｒ１８−を示し、Ｒ１６〜Ｒ１８は水素原子又は置換基を示す。ｍ１は２〜４の整数である。Ｘ−はアニオン性の対イオンを示す。
Ｒ１〜Ｒ８及びＲ１６〜Ｒ１８から選ばれる基はカチオン性基を有していてもよい。
【００４３】
上記Ｒ１〜Ｒ８、Ｒ１６〜Ｒ１８、Ａ１、Ａ２及びＸ−の好ましい形態は、それぞれ、上記式（１）におけるＲ１〜Ｒ８、Ｒ１６〜Ｒ１８、Ａ１、Ａ２及びＸ−の好ましい形態と同じである。また、上記Ｒ３１〜Ｒ３６の好ましい形態は、それぞれ、上記式（Ｋ−１）におけるＲ２１〜Ｒ２３の好ましい形態と同じである。
【００４４】
上記連結基Ｌ３１及びＬ３２は、アルキレン基が好ましい。このアルキレン基の炭素数は１〜６が好ましく、１〜４がより好ましく、１〜３がさらに好ましい。
上記ｍ１は、２又は３が好ましく、より好ましくは２である。Ｒ１〜Ｒ８、Ｒ１６〜Ｒ１８、Ｒ３１〜Ｒ３６、連結基Ｌ３１及びＬ３２のいずれもがカチオン性基を含まない場合、ｍ１は２となる。
【００４５】
上記式（１）で表される色素の具体例を以下に示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。また、Ｍｅはメチル基を意味する。
【００４６】
【化１０】
2020066637.tif 000011
【００４７】
【化１１】
2020066637.tif 000012
【００４８】
【化１２】
2020066637.tif 000013
【００４９】
【化１３】
2020066637.tif 000014
【００５０】
上記式（１）で表される色素の分子量は、４００〜１５００が好ましく、５００〜１０００がより好ましい。
【００５１】
本発明の病理診断用染色剤中、上記式（１）で表される色素の含有量に特に制限はなく、目的に応じて適宜に選択される。例えば、本発明の病理診断用染色剤は、上記式（１）で表される色素からなる形態でもよいし、上記式（１）で表される色素に加え、他の成分を含有していてもよい。他の成分としては、溶媒、無機塩及び上記式（１）で表される色素以外の有機化合物（色素を含む）等を挙げることができる。
溶媒としては、上記式（１）で表される色素を溶解可能なものが好ましく、この溶媒は水及び／又はアルコールを含むことが好ましく、水とアルコールとを含む混合溶媒であることがより好ましい。
上記アルコールは、特に制限はなく、１価でも多価のアルコールでもよい。好ましい具体例としては、アルキレングリコール（好ましくはエチレングリコール）及びグリセリンが挙げられる。アルコールの種類及び／又は量を調整することにより、染色液の物性、染色の濃さ等をある程度、調節することが可能となる。
上記水は、水である限り特に制限はなく、蒸留水、超純水、純水及び流水などを用いることができる。さらに、上記水には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カリウムなどの塩を含んでいてもよい。このような水としてはリン酸緩衝生理食塩水（Phosphate  buffered  saline：PBS)が挙げられる。
本発明の病理診断用染色剤中において、水及びアルコールの含有量比は、質量比で、水：アルコール＝１００：０〜５０：５０が好ましく、１００：０〜６０：４０がより好ましい。
【００５２】
本発明の病理診断用染色剤が、上記式（１）で表される色素以外の成分を含む場合、病理診断用染色剤中の上記式（１）で表される色素の含有量は、例えば０．０１〜９９質量％とすることができる。また、本発明の病理診断用染色剤が溶媒を含む場合、病理診断用染色剤中の上記式（１）で表される色素の含有量は、例えば、０．０１〜１質量％が好ましく、０．０５〜０．５質量％がより好ましい。なお、溶媒中において、上記色素の一部又は全部がカチオンとアニオンとに解離していてもよい。
本発明の病理診断用染色剤が上記式（１）で表される色素以外の成分を含む場合、各成分が均一に存在する組成物の形態が好ましい。本発明の病理診断用染色剤は、上記式（１）で表される色素が溶媒中に溶解してなる染色液の形態がより好ましい。
【００５３】
上記式（１）で表される色素は、例えば、公知のシアニン色素の合成方法、公知のスクアリリウム色素の合成方法により得ることができる。
【００５４】
［細胞核染色方法］
本発明の細胞核染色方法は、本発明の病理診断用染色剤を用いて細胞核を染色することを含む。本発明の細胞核染色方法は、より詳細には次のことを含む。
すなわち、常法に従い作製した、目的の組織ないし細胞を含むパラフィン切片について、切片の脱パラフィン化を行った後に、本発明の病理診断用染色剤を作用させる。通常は、脱パラフィン化後、色素を溶解してなる染色液の状態である本発明の病理診断用染色剤に浸漬させる。必要により余分な色素を洗い流し、あるいは所望の染色レベルまで着色を落とすために洗浄し、細胞核を選択的に染色する。
切片の脱パラフィン化は常法に従い行うことができる。この脱パラフィン化により通常は、切片中のパラフィンを水等の親水性溶媒に置き換える。
上記の病理診断用染色液に脱パラフィン化後の切片を浸漬させる場合、浸漬時間は、細胞核を所望の染色状態とすることができれば特に制限されず、例えば、０．１〜１０分とすることができる。
浸漬に使用する本発明の病理診断用染色液中、上記式（１）で表される色素の含有量は、細胞核を所望の染色状態とすることができれば特に制限されず、例えば０．０１〜１質量％が好ましく、０．０５〜０．５質量％がより好ましい。
染色液への浸漬後、切片を流水で水洗することが好ましい。
【００５５】
［病理標本の製造方法］
本発明の病理標本の製造方法は、本発明の病理診断用染色剤を用いて細胞核を染色することを含む。すなわち本発明の病理標本の製造方法は、上述した本発明の細胞核染色方法を実施することを含む。
また、本発明の病理標本の製造方法は、エオジン染色により細胞質を染色することを含むことが好ましい。
エジオン染色は、常法に従い行うことができる。また、エジオン染色に続く封入工程において、有機溶媒系封入剤を用いる場合には、エジオン染色後、常法に従い、脱水、透徹操作を行う。
エオジン染色は、本発明の病理診断用染色剤を用いた細胞核染色の前に行ってもよいし、後に行ってもよいが、エオジン染色を所望の染色状態にする観点から、本発明の病理診断用染色剤を用いた細胞核染色の後に行うことが好ましい。
【００５６】
本発明の病理診断用染色剤を用いることにより、細胞核を選択的に、十分に濃く染色することができる。また、本発明の病理診断用染色剤による細胞核染色を、エオジン染色による細胞質の染色と組合せて実施した場合には、細胞核と細胞質の色のコントラストに優れ、観察しやすい病理標本を得ることができる。しかも、本発明の病理診断用染色剤は溶液状態において析出しにくく、保存安定性に優れるため、保管後の使用時に染色液のろ過等を必要とせず、再現性の高い細胞核の選択的染色が可能となる。
【００５７】
また、本発明の病理診断用染色剤を用いた染色は、例えば、後述する実施例に示すように、ＰＡＳ（periodic  acid-Schiff：過ヨウ素酸シッフ）染色、ＰＡＭ（periodic  acid  meth-enamine  silver：過ヨウ素酸メテナミン銀）染色等と組合せて用いることもできる。
【００５８】
以下に実施例に基づき本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの形態に限定されるのではない。以下の実施例において「室温」は２５℃を意味する。
【実施例】
【００５９】
［実施例］
＜１．病理診断用染色剤の合成＞
（１）色素Ｄ−１の合成
【００６０】
【化１４】
2020066637.tif 000015
【００６１】
３００ｍＬ容フラスコに、５−クロロ−２−メチルベンゾチアゾール１０．０ｇ、（３−ブロモプロピル）トリメチルアンモニウムブロミド１５．６ｇ、ｍ−クレゾール２０ｍＬを導入し、１３０℃で４０時間撹拌した。反応液を室温に冷却し、撹拌しながら酢酸エチル２００ｍＬを滴下した。析出した固体を濾過により回収し、化合物Ｄ−１ａを１５．２ｇ得た。
５００ｍＬ容フラスコに、化合物Ｄ−１ａを８．８９ｇ、スクアリン酸１．１４ｇ、ｎ−ブタノール（ｎ−ＢｕＯＨ）１６０ｍＬ、ピリジン４．０ｍＬを導入し、７時間半加熱還流した。反応液を室温に冷却し、撹拌しながら水１００ｍＬ、テトラヒドロフラン２００ｍＬを滴下した。析出した固体を濾過により回収し、アセトン３００ｍＬを加えて撹拌し、懸濁洗浄した。濾過により固体を回収し、色素Ｄ−１を青色固体として７．０ｇ得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：  δ＝７．３７（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），６．９９（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），５．４９（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），４．０３（ｍ，４Ｈ），３．３９（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，４Ｈ），３．０３（ｓ，１８Ｈ），２．１７（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，４Ｈ）．
また、ＬＣ−ＭＳ(Liquid  Chromatography  Mass  Spectrometry)測定（溶媒：テトラヒドロフラン／水、バッファー：ギ酸）において、ポジティブモードでｍ／ｚ＝６８９（［Ｍ−２（Ｂｒ−）＋（ＨＣＯＯ−）］＋）、ネガティブモードでｍ／ｚ＝７７９（［Ｍ−２（Ｂｒ−）＋３（ＨＣＯＯ−）］−）にＭＳシグナルを得た。
【００６２】
（２）色素Ｄ−２の合成
色素Ｄ−１の合成において、５−クロロ−２−メチルベンゾチアゾールを２−メチルベンゾチアゾールに置き換え、（３−ブロモプロピル）トリメチルアンモニウムブロミドを（２−ブロモエチル）トリメチルアンモニウムブロミドに置き換えた他は、色素Ｄ−１と同様の方法で合成し、色素Ｄ−２を合成した。ＬＣ−ＭＳ測定（溶媒：テトラヒドロフラン／水、バッファー：ギ酸）において、ポジティブモードでｍ／ｚ＝５９４（[Ｍ−２（Ｂｒ−）＋（ＨＣＯＯ−）]＋）にＭＳシグナルを得た。
【００６３】
【化１５】
2020066637.tif 000016
【００６４】
（３）色素Ｄ−３の合成
色素Ｄ−１の合成において、５−クロロ−２−メチルベンゾチアゾールを２−メチルベンゾオキサゾールに置き換え、（３−ブロモプロピル）トリメチルアンモニウムブロミドを（２−ブロモエチル）トリメチルアンモニウムブロミドに置き換えた他は、色素Ｄ−１と同様の方法で合成し、色素Ｄ−３を合成した。ＬＣ−ＭＳ測定（溶媒：テトラヒドロフラン／水、バッファー：ギ酸）において、ポジティブモードでｍ／ｚ＝５６２（［Ｍ−２（Ｂｒ−）＋（ＨＣＯＯ−）］＋）にＭＳシグナルを得た。
【００６５】
【化１６】
2020066637.tif 000017
【００６６】
（３）色素Ｄ−４の合成
化合物Ｄ−１ａから色素Ｄ−１を得る合成反応において、化合物Ｄ−１ａを化合物（Ｄ−４Ａ）に置き換えた他は、色素Ｄ−１と同様の方法で合成し、色素Ｄ−４を合成した。ＬＣ−ＭＳ測定（溶媒：テトラヒドロフラン／水、バッファー：ギ酸）において、ポジティブモードでｍ／ｚ＝６１４（［Ｍ−２（Ｂｒ−）＋（ＨＣＯＯ−）］＋）にＭＳシグナルを得た。
【００６７】
【化１７】
2020066637.tif 000018
【００６８】
（２）病理診断用染色液の調製
上記で合成した色素Ｄ−１を０．１５ｇと、蒸留水７３ｇとを１００ｍｌナスフラスコにいれ、１２時間撹拌して溶解させた後に、エチレングリコール２７．７５ｇを添加して１時間撹拌し、Ｎｏ．１の病理診断用染色液を調製した。
色素Ｄ−１を０．１０ｇ、蒸留水を７５ｇ、エチレングリコールを２５．５ｇに変更した以外は上記Ｎｏ．１の病理診断用染色液の調製と同様にして、Ｎｏ．２の病理診断用染色液を調製した。
色素Ｄ−１を０．０７５ｇ、蒸留水を７５ｇ、エチレングリコールを２５．５ｇに変更した以外は上記Ｎｏ．１の病理診断用染色液の調製と同様にして、Ｎｏ．３の病理診断用染色液を調製した。
Ｎｏ．２の病理診断用染色液の作製において、色素Ｄ−１  ０．１０ｇを、色素Ｄ−２  ０．１０ｇに置き換えた以外は上記Ｎｏ．２の病理診断用染色液の調製と同様にして、Ｎｏ．４の病理診断用染色液を調製した。
Ｎｏ．２の病理診断用染色液の作製において、色素Ｄ−１  ０．１０ｇを、色素Ｄ−３  ０．１０ｇに置き換えた以外は上記Ｎｏ．２の病理診断用染色液の調製と同様にして、Ｎｏ．５の病理診断用染色液を調製した。
Ｎｏ．２の病理診断用染色液の作製において、色素Ｄ−１  ０．１０ｇを、色素Ｄ−４  ０．１０ｇに置き換えた以外は上記Ｎｏ．２の病理診断用染色液の調製と同様にして、Ｎｏ．６の病理診断用染色液を調製した。
Ｎｏ．ｃ１の病理診断用染色液として、ヘマトキシリン３Ｇ（サクラファインテックジャパン社製）を用いた。
【００６９】
＜２−１．病理診断用染色液を用いた標本の作製＞
１０％中性ホルマリン緩衝液にて固定したラット肝臓及び腎臓のそれぞれについて、常法に従い、ティシュー・テック  パラフィン  ワックス  ＩＩ６０（サクラファインテックジャパン社製、商品名）を用いてパラフィンブロックを作製し、ミクロトーム（ＲＥＭ−７１０、大和光機社製）を用いて２μｍの薄さに薄切し、パラフィン切片を作製した。得られたパラフィン切片について、以下の手順で染色し、標本を作製した。
【００７０】
・上記切片の脱パラフィン（順に、キシレンに５分×３回浸漬、エタノールに５分×３回浸漬、９０％エタノールに浸漬、７０％エタノールに浸漬、水洗浄を行った。
↓
・上記で調製した病理診断用染色液に１分浸漬した。
↓
・流水で５分水洗した。
↓
・１％ＨＣｌ水溶液に５秒浸漬した。
↓
・流水で５分水洗した。
↓
・エオジン染色液に１分浸漬した。
↓
・流水で２秒水洗した。
↓
・９５％エタノールに２秒浸漬した。
↓
・エタノールに２秒×２回浸漬した。
↓
・エタノールに５分×３回浸漬した。
↓
・キシレンに５分×３回浸漬した。
↓
・エンテランニュー（メルク社製）にて封入し、標本を作製した。
【００７１】
＜２−２．標本観察＞
顕微鏡にＢＸ５３（オリンパス社製）、顕微鏡用カメラにＤＰ７０（オリンパス社製）を用いて、上記の方法で作製した標本を観察し、以下の評価を行った。
【００７２】
（評価１）細胞核染色性
−  評価基準  −
Ａ：細胞核が選択的に、かつ濃く染色された。
Ｂ：細胞核の染色濃度が薄い。
【００７３】
（評価２）エオジン染色との色のコントラスト
−  評価基準  −
Ａ：上記染色液による細胞核染色と、エオジンによる細胞質染色との色の区別が明瞭である。
Ｂ：上記染色液による細胞核染色と、エオジンによる細胞質染色との色の区別が明瞭でない。
（評価３）染色液の経時安定性
染色液調製後１時間以内（Ｎｏ．ｃ１の染色液の場合は、開封後１時間以内）の染色液と、２５℃で２週間保管後（Ｎｏ．ｃ１の染色液の場合は、開封してから２週間保管後）の染色液との間で染色液の状態（析出の有無）の比較及び吸収スペクトル変化を比較し、以下の評価基準で評価を行った。
吸収スペクトル変化については、最大吸光波長における吸光度を測定することで評価した。吸収強度の測定は、ＵＶ−３６００（島津製作所製）を用いて行った。吸収強度の変化量は下記式により算出した。
吸収強度の変化量（％）＝｛１００×（２週間保存後の吸光度）／（染色液調製後１時間以内の吸光度）｝−１００
【００７４】
−  評価基準（析出の有無）  −
Ａ：２５℃で２週間保管後も色素の析出が認められず、吸収強度の変化も認められない。
Ｂ：２５℃で２週間保管後に色素の析出が認められる。
【００７５】
−  評価基準（吸収スペクトル変化）  −
Ａ：吸収強度の変化量が５％未満
Ｂ：吸収強度の変化量が５％以上、１０％未満
Ｃ：吸収強度の変化量が１０％以上、２０％未満
Ｄ：吸収強度の変化量が２０％以上、３０％未満
Ｅ：吸収強度の変化量が３０％以上、４０％未満
Ｆ：吸収強度の変化量が４０％以上
【００７６】
【表１】
2020066637.tif 000019
【００７７】
上記表１に示される通り、本発明の病理診断用染色剤（Ｎｏ．１〜６）を用いた場合、細胞核染色性の評価、エオジン染色との色のコントラストの評価のいずれにおいても、ＨＥ染色と同様に優れた結果となった。さらに、本発明の病理診断用染色剤を用いた染色液（Ｎｏ．１〜６）は、長期保存しても色素の析出を生じにくく、ヘマトキシリンを含有する染色液（Ｎｏ．ｃ１）に比べて格段に使い勝手がよいものであった。
【００７８】
＜３−１．特殊染色（ＰＡＳ染色）＞
上記で作製したラットパラフィンブロック（腎臓）のパラフィン切片について、マイヤーヘマトキシリン液（武藤化学社製）又は病理診断用染色液Ｎｏ．１を用いて、下記手順によりＰＡＳ（periodic  acid-Schiff：過ヨウ素酸シッフ）染色を実施した。
【００７９】
・上記切片の脱パラフィン（順にキシレンに５分×３回浸漬、エタノールに５分×３回浸漬、９０％エタノールに浸漬、７０％エタノールに浸漬、水洗浄）を行った。
↓
・１％過ヨウ素酸水溶液に１０分浸漬した。
↓
・流水で５分水洗した。
↓
・コールドシッフ試薬に１０分浸漬した。
↓
・亜硫酸水（３槽×３回）に各３分浸漬した。
↓
・流水で５分水洗した。
↓
・マイヤーヘマトキシリンに１０秒×２回もしくは病理診断用染色液Ｎｏ．１に１分浸漬した。
↓
・流水で５分水洗した。
↓
・エオジン染色液に１分浸漬した。
↓
・流水で２秒水洗した。
↓
・９５％エタノールに２秒浸漬した。
↓
・エタノールに２秒×２回浸漬した。
↓
・エタノールに５分×３回浸漬した。
↓
・キシレンに５分×３回浸漬した。
↓
・エンテランニューにて封入し、標本を作製した。
【００８０】
上記の方法で作製した標本を、顕微鏡にＢＸ５３（オリンパス社製）、顕微鏡用カメラにＤＰ７０（オリンパス社製）を用いて観察した。
ＰＡＳ染色において、マイヤーヘマトキシリン液を用いた染色では、グリコーゲン及び粘液は赤〜赤紫色に染まった。一方、病理診断用染色液Ｎｏ．１を用いた染色では青紫色に染まり、マイヤーヘマトキシリン液と同等の染色性を示した。
【００８１】
＜３−２．特殊染色（ＰＡＭ染色）＞
上記で作製したラットパラフィンブロック（腎臓）のパラフィン切片について、マイヤーヘマトキシリン液（武藤化学社製）又は病理診断用染色液Ｎｏ．１を用いて、下記手順によりＰＡＭ（periodic  acid  meth-enamine  silver：過ヨウ素酸メテナミン銀）染色を実施した。
【００８２】
・上記切片の脱パラフィン（順にキシレンに５分×３回浸漬、エタノールに５分×３回浸漬、９０％エタノールに浸漬、７０％エタノールに浸漬、水洗浄）を行った。
↓
・５％重クロム酸カリウム水溶液に３０分浸漬した。
↓
・流水で１０分水洗した。
↓
・１％過ヨウ素酸水溶液に１５分浸漬した。
↓
・流水で５分水洗した。
↓
・５５℃のメセナミン銀液に２時間浸漬した。
↓
・精製水（３槽）に２分浸漬した。
↓
・０．２％塩化金水溶液に５分浸漬した。
↓
・流水で２分水洗した。
↓
・しゅう酸ホルマリン液に１分浸漬した。
↓
・流水で１分水洗した。
↓
・希釈酸性硬膜定着液に２分浸漬した。
↓
・流水で５分水洗した。
↓
・マイヤーヘマトキシリンに１０秒×２回もしくは病理診断用染色液Ｎｏ．１に１分浸漬した。
↓
・流水で５分水洗した。
↓
・エオジン染色液に１分浸漬した。
↓
・流水で２秒水洗した。
↓
・９５％エタノールに２秒浸漬した。
↓
・エタノールに２秒×２回浸漬した。
↓
・エタノールに５分×３回浸漬した。
↓
・キシレンに５分×３回浸漬した。
↓
・エンテランニューにて封入し、標本を作製した。
【００８３】
上記の方法で作製した標本を、顕微鏡にＢＸ５３（オリンパス社製）、顕微鏡用カメラにＤＰ７０（オリンパス社製）を用いて観察した。
ＰＡＭ染色において、マイヤーヘマトキシリン液を用いた染色及び病理診断用染色液Ｎｏ．１を用いた染色のいずれも、基底膜及び細網線維が黒色に染まる染色が確認された。すなわち、病理診断用染色液Ｎｏ．１はマイヤーヘマトキシリン液と同様に、良好な染色性を示した。
【００８４】
また、病理診断用染色液Ｎｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．ｃ１について、ＲＦ−５３００（島津製作所製）を用いて蛍光強度測定を行ったところ、病理診断用染色液Ｎｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３については赤色蛍光が観測され、病理診断用染色液Ｎｏ．ｃ１については蛍光が観測されなかった。このことから、本発明の病理診断用染色剤を用いた場合には、蛍光顕微鏡を用いた観察による診断もできることがわかった。