(57)【要約】      （修正有）【課題】骨量増強可能な破骨細胞の分化抑制剤の提供。【解決手段】破骨細胞の分化抑制剤は、下記式（１）または（２）で表されるフラボノイド誘導体またはその塩を含む。破骨細胞の分化抑制剤は、骨量増強剤として使用でき、例えば、投与対象における骨量または骨密度を増強できる。2020045313.tif 0000172020045313.tif 000018【選択図】図１
2020045313.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）または（２）で表されるフラボノイド誘導体またはその塩を含む、破骨細胞の分化抑制剤。
【化１】
2020045313.tif 000013
【化２】
2020045313.tif 000014
【請求項２】
請求項１記載の破骨細胞の分化抑制剤を含む、骨量増強剤。
【請求項３】
請求項１記載の破骨細胞の分化抑制剤を含む、骨量増強食品組成物。
【請求項４】
請求項１記載の破骨細胞の分化抑制剤を含む、ＲＡＮＫとＲＡＮＫＬとの結合を阻害する結合阻害剤。
【請求項５】
下記式（１）または（２）で表されるフラボノイド誘導体またはその塩を含む、抗肥満剤。
【化１】
2020045313.tif 000015
【化２】
2020045313.tif 000016
【請求項６】
エストロゲン欠乏により生じる肥満に用いる、請求項５記載の抗肥満剤。
【請求項７】
請求項５または６記載の抗肥満剤を含む、抗肥満食品組成物。
【請求項８】
エストロゲン欠乏により生じる肥満に用いる、請求項７記載の抗肥満食品組成物。
【請求項９】
請求項１記載の破骨細胞の分化抑制剤を使用する、破骨細胞の分化抑制方法。
【請求項１０】
前記分化抑制剤を投与する投与工程を含む、請求項９記載の分化抑制方法。
【請求項１１】
前記分化抑制剤を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで投与する、請求項１０記載の分化抑制方法。
【請求項１２】
請求項１記載の破骨細胞の分化抑制剤を使用する、骨量の増強方法。
【請求項１３】
前記分化抑制剤を投与する投与工程を含む、請求項１２記載の骨量の増強方法。
【請求項１４】
前記分化抑制剤を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで投与する、請求項１３記載の骨量の増強方法。
【請求項１５】
請求項１記載の破骨細胞の分化抑制剤を使用する、ＲＡＮＫとＲＡＮＫＬとの結合を阻害する結合阻害方法。
【請求項１６】
請求項５または６の抗肥満剤を対象者に投与する投与工程を含む、肥満の治療方法。
【請求項１７】
前記対象者は、エストロゲン欠乏により生じる肥満を有する、請求項１６記載の肥満の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、破骨細胞の分化抑制剤およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化社会において、運動器の障害（ロコモティブシンドローム）が問題となっている。日本では、ロコモティブシンドロームの中でも、骨粗鬆症の罹患者が多く、１３００万人以上が罹患していると推定されている。また、骨粗鬆症以外にも老化により骨量が減少することが知られている。骨粗鬆症または老化による骨量の減少は、易骨折性を伴うため、大きな問題となっている。
【０００３】
また、骨粗鬆症に対しては、ビスホスホネート、抗ＲＡＮＫＬ抗体等の治療薬が用いられている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】骨粗鬆症の予防と治療ガイドライン作成委員会（日本骨粗鬆症学会、日本骨代謝学会、骨粗鬆症財団）、「骨粗鬆症の予防と治療ガイドライン  ２０１５年版」、２０１５年１０月３０日
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前記骨量の減少に対しては、日常的に摂取可能な食品由来の成分を含むサプリメント等により、骨量を増強することで予防することが望まれている。
【０００６】
そこで、本発明は、骨量を増強可能な破骨細胞の分化抑制剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するために、本発明の破骨細胞の分化抑制剤（以下、「分化抑制剤」ともいう）は、下記式（１）または（２）で表されるフラボノイド誘導体（以下、「フラボノイド誘導体」ともいう）またはその塩を含む。
【化１】
2020045313.tif 000003
【化２】
2020045313.tif 000004
【０００８】
本発明の骨量増強剤（以下、「増強剤」ともいう）は、前記本発明の破骨細胞の分化抑制剤を含むことを特徴とする。
【０００９】
本発明の骨量増強食品組成物（以下、「食品組成物」ともいう）は、前記本発明の破骨細胞の分化抑制剤を含むことを特徴とする。
【００１０】
本発明のＲＡＮＫとＲＡＮＫＬとの結合を阻害する結合阻害剤（以下、「阻害剤」ともいう）は、本発明の破骨細胞の分化抑制剤を含む。
【００１１】
本発明の抗肥満剤は、前記式（１）または（２）で表されるフラボノイド誘導体またはその塩を含む。
【００１２】
本発明の抗肥満食品組成物は、前記本発明の抗肥満剤を含む。
【００１３】
本発明の破骨細胞の分化抑制方法（以下、「分化抑制方法」ともいう）は、前記本発明の破骨細胞の分化抑制剤を使用する。
【００１４】
本発明の骨量の増強方法（以下、「増強方法」ともいう）は、前記本発明の破骨細胞の分化抑制剤を使用する。
【００１５】
本発明のＲＡＮＫとＲＡＮＫＬとの結合を阻害する結合阻害方法（以下、「阻害方法」ともいう）は、前記本発明の破骨細胞の分化抑制剤を使用する。
【００１６】
本発明の肥満の治療方法（以下、「治療方法」ともいう）は、前記本発明の破骨細胞の分化抑制剤を対象者に投与する投与工程を含む。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、前記式（１）または（２）のフラボノイド誘導体またはその塩を含むことにより、破骨細胞の分化を抑制することができる。これは、フラボノイド誘導体またはその塩が、ＲＡＮＫとＲＡＮＫＬとの結合を阻害するからと推定される。そして、フラボノイド誘導体またはその塩は、このように前記破骨細胞の分化を抑制できることから、例えば、骨のターンオーバにおいて、破骨細胞の増加を抑制でき、これにより、破骨細胞による骨吸収が、骨芽細胞による骨形成より優位になり、骨量の減少が生じる可能性を抑制できる。すなわち、本発明によれば、骨量の減少を抑制できるため、フラボノイド誘導体またはその塩を非存在下（非投与条件）と比較して、骨量を増強可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、実施例１におけるＴＲＡＰ活性を示すグラフである。
【図２】図２は、実施例１におけるＴＲＡＰ染色の連結写真において、中心部の２５ｍｍ四方の正方形部分を示す写真である。
【図３】図３は、実施例１における多核細胞のカウント数を示すグラフである。
【図４】図４は、細胞の生存率の相対値を示すグラフである。
【図５】図５は、実施例２における細胞の占める面積の区分の割合を示すグラフである。
【図６】図６（Ａ）は、実施例３における培養スキームを示す図であり、図６（Ｂ）は、ＴＲＡＰ活性を示すグラフである。
【図７】図７は、実施例３における細胞の占める面積の区分の割合を示すグラフである。
【図８】図８は、実施例４における大腿骨の骨密度を示すグラフであり、（Ａ）は、大腿骨全体の骨密度を示すグラフであり、（Ｂ）は、各箇所の骨密度を示すグラフである。
【図９】図９は、実施例５におけるＯＶＸマウスにおける子宮重量および体重を示すグラフであり、（Ａ）は、子宮重量を示すグラフであり、（Ｂ）は、体重を示すグラフである。
【図１０】図１０は、実施例６におけるin silico docking studyの結果を示す図であり、（Ａ）は、ＲＡＮＫとＲＡＮＫＬとの複合体を示す図であり、（Ｂ）は、ＲＡＮＫとＲＡＮＫＬとの結合部の拡大図であり、（Ｃ）は、ＲＡＮＫとＲＡＮＫＬとの結合部において、ＲＡＮＫとクリシンとの結合部の拡大図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
＜破骨細胞の分化抑制剤＞
本発明の破骨細胞の分化抑制剤（以下、「分化抑制剤」ともいう）は、前述のように、下記式（１）または（２）で表されるフラボノイド誘導体またはその塩を含む。
【化１】
2020045313.tif 000005
【化２】
2020045313.tif 000006
【００２０】
本発明の分化抑制剤は、前記式（１）または（２）で表されるフラボノイド誘導体またはその塩（以下、「フラボノイド誘導体またはその塩」ともいう）を含むことが特徴であって、その他の構成は、特に制限されない。前記フラボノイド誘導体またはその塩は、破骨細胞の分化を抑制でき、これにより、例えば、骨のターンオーバにおいて、破骨細胞による骨吸収が、骨芽細胞による骨形成より優位になり、骨量の減少が生じる可能性を抑制できる。すなわち、本発明によれば、骨量の減少を抑制できるため、フラボノイド誘導体またはその塩を非存在下（非投与条件）と比較して、骨量を増強可能である。本発明の分化抑制剤は、例えば、破骨細胞の分化において、細胞融合により破骨細胞が大型化し、成熟するのを抑制できる。このため、本発明の分化抑制剤は、例えば、「破骨細胞の成熟抑制剤」ということもできる。
【００２１】
本発明者は、鋭意研究の結果、前記フラボノイド誘導体またはその塩が、以下に説明するように、破骨細胞の分化を抑制できることを見出し、本発明を完成するに到った。前記破骨細胞による骨吸収が、骨芽細胞による骨形成より優位になると、骨における骨量が減少し、骨粗鬆症等のロコモティブシンドロームを惹起する。これに対して、前記フラボノイド誘導体またはその塩は、前述のように、破骨細胞の分化を抑制できることが、本発明者らによって明らかとなった。また、破骨細胞の分化抑制は、前記フラボノイド誘導体またはその塩が、ＲＡＮＫ（Receptor activator of nuclear factor κ B、TRANCE receptor、TNFRSF11A）とＲＡＮＫＬ（Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand、tumor necrosis factor ligand superfamily member 11 (TNFSF11)、TNF-related activation-induced cytokine (TRANCE)、osteoprotegerin ligand (OPGL)、osteoclast differentiation factor (ODF)）との結合を阻害することによると推定されることが本発明者らによって明らかとなった。このように、前記フラボノイド誘導体またはその塩によれば、破骨細胞の分化を抑制できるため、例えば、骨のターンオーバ（骨代謝）において、破骨細胞の増加を抑制でき、これにより、破骨細胞による骨吸収が、骨芽細胞による骨形成より優位になり、骨量の減少が生じる可能性を抑制できる。すなわち、本発明によれば、骨量の減少を抑制できるため、フラボノイド誘導体またはその塩を非存在下（非投与条件）と比較して、骨量を増強可能である。
【００２２】
本発明において、「骨量の増加」または「骨量の増強」は、前記フラボノイド誘導体またはその塩の非存在下（非投与条件）と比較して、骨量が（有意に）増加していることを意味する。このため、例えば、前記骨粗鬆症または老化のように、対象者において、骨量が減少する場合、前記「骨量の増加」または「骨量の増強」は、前記フラボノイド誘導体またはその塩の非存在下（非投与条件）と比較して、骨量が（有意に）増加していればよく、開始時（投与開始時）と比較して、骨量が減少していてもよい。この場合、前記「骨量の増加」または「骨量の増強」は、例えば、「骨量の維持」、「骨量の減少の抑制」または「骨量の減少率の抑制」ということもできる。
【００２３】
本発明の分化抑制剤は、例えば、後述するように、骨量増強剤または骨量増強食品組成物としても使用できる。また、本発明の分化抑制剤は、前述のように、ＲＡＮＫ−ＲＡＮＫＬの結合を阻害すると推定される。このため、本発明の分化抑制剤は、ＲＡＮＫとＲＡＮＫＬとの結合阻害剤としても使用できる。さらに、本発明の分化抑制剤は、体重の増加を抑制できる。このため、本発明の分化抑制剤は、抗肥満剤としても使用できる。
【００２４】
フラボノイド誘導体は、前記式（１）または（２）で表わされる。前記フラボノイド誘導体は、例えば、水和物でもよいし、溶媒和物でもよい。以下、前記フラボノイド誘導体の説明は、フラボノイド誘導体の塩の説明に援用できる。
【００２５】
前記式（１）または（２）で表されるフラボノイド誘導体において、例えば、破骨細胞の分化抑制機能がさらに高いことから、前記式（１）で表されるフラボノイド誘導体がより好ましい。以下、前記式（１）で表されるフラボノイド誘導体（例えば、PubChem CID: 5281607）またはその塩を「クリシン」、前記式（２）で表されるフラボノイド誘導体（例えば、PubChem CID: 73571）またはその塩を「サクラネチン」ともいう。
【００２６】
前記フラボノイド誘導体は、例えば、前記式（１）または（２）のフラボノイド誘導体の異性体またはその水和物でもよいし、その溶媒和物でもよい。前記異性体は、例えば、互変異性体または立体異性体があげられる。前記互変異性体または立体異性体は、例えば、理論上可能なすべての互変異性体もしくは立体異性体があげられる。また、本発明において、各置換基の立体配置は、特に制限されない。
【００２７】
前記フラボノイド誘導体において、例えば、フラボン骨格またはフラバノン骨格におけるその１つ以上の水素原子が任意の置換基に置換されていてもよい。前記置換基は、特に制限されず、例えば、ヒドロキシ基、ハロゲノ基、アシル基、アシルオキシ基、アルコキシ基、カルバモイル基、チオカルバモイル基等があげられる。
【００２８】
本発明において、前記式（１）または（２）で表されるフラボノイド誘導体の塩は、特に制限されず、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ブロカイン塩等の脂肪族アミン塩、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン等のアラルキルアミン塩；ピリジン塩、ピコリン塩、キノリン塩、イソキノリン塩等の複素環芳香族アミン塩；テトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアンモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩等の第４級アンモニウム塩；アルギニン塩、リジン塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等のアミノ酸塩；塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、過塩素酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩等の有機酸塩、メタンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等のスルホン酸塩等があげられる。
【００２９】
本発明の分化抑制剤は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏで使用してもよいし、ｉｎ ｖｉｔｒｏで使用してもよい。本発明の分化抑制剤は、例えば、研究用試薬として使用することもでき、医薬品として使用することもできる。後者の場合、本発明の分化抑制剤は、破骨細胞の分化抑制用の医薬または医薬組成物ということもできる。また、本発明の分化抑制剤は、後述のように、食品用途の組成物としても使用できる。
【００３０】
本発明の分化抑制剤の投与対象は、特に制限されない。本発明の分化抑制剤をｉｎ ｖｉｖｏで使用する場合、前記投与対象は、例えば、ヒト、または、ヒトを除く非ヒト動物があげられる。前記非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ウマ、ネコ、ヤギ、サル、モルモット等があげられる。前記本発明の分化抑制剤をｉｎ ｖｉｔｒｏで使用する場合、前記投与対象は、例えば、細胞、組織、器官等があげられ、前記細胞は、生体から採取した細胞、培養細胞等があげられる。前記細胞は、例えば、前記破骨細胞の前駆細胞があげられる。前記破骨細胞の前駆細胞は、例えば、破骨細胞への分化能を有する細胞を意味し、例えば、多能性細胞、体性幹細胞、造血幹細胞、骨髄系前駆細胞、顆粒球・単球系前駆細胞、単球系前駆細胞、未熟貪食細胞等またはこれらに対応する培養細胞株があげられる。
【００３１】
本発明の分化抑制剤の使用条件（投与条件）は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類等に応じて、投与形態、投与時期、投与量等を適宜設定できる。
【００３２】
本発明の分化抑制剤の使用量は、特に制限されない。本発明の分化抑制剤をｉｎ ｖｉｖｏで使用する場合、例えば、投与対象の種類、症状、年齢、投与方法等により適宜決定できる。具体例として、ヒトに投与する場合、１日あたりのフラボノイド誘導体の投与量は、合計が、例えば、１０〜５００００ｍｇであり、好ましくは、５０〜１００００ｍｇであり、１日あたりの投与回数は、例えば、１〜４回であり、好ましくは１〜２回である。前記分化抑制剤におけるフラボノイド誘導体の含有量は、特に制限されず、例えば、前述の一日当たりの投与量に応じて適宜設定できる。
【００３３】
本発明の分化抑制剤の投与形態は、特に制限されない。本発明の分化抑制剤をｉｎ ｖｉｖｏで投与する場合、経口投与でもよいし、非経口投与でもよい。前記非経口投与は、例えば、静脈注射（静脈内投与）、筋肉注射（筋肉内投与）、経皮投与、皮下投与、皮内投与、経腸投与、直腸投与、経膣投与、経鼻投与、経肺投与、腹腔内投与、局所投与等があげられる。
【００３４】
本発明の分化抑制剤の剤型は、特に制限されず、例えば、前記投与形態に応じて適宜決定できる。前記剤型は、例えば、液体状、固体状があげられる。具体例として、前記剤型は、放出調節製剤（腸溶性製剤、徐放性製剤等）、カプセル剤、経口液剤（エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、芳香水剤、リモナーデ剤等）、シロップ剤（シロップ用剤等）、顆粒剤（発泡顆粒剤、細粒等）、散剤、錠剤（口腔内崩壊錠、チュアブル錠、発泡錠、分散錠、溶解剤、被覆錠剤等）、丸剤、経口ゼリー剤等の経口投与用製剤；口腔用錠剤（ガム剤、舌下剤、トローチ剤、ドロップ剤、バッカル錠、付着錠等）、口腔用スプレー剤、口腔用半固形剤、含嗽剤等の口腔内適用製剤；注射剤（植え込み注射、持続性注射剤、輸液剤（点滴用製剤等）、凍結乾燥注射剤、粉末注射剤、充填済シリンジ剤、カートリッジ剤等）等の注射投与用製剤；透析用剤（腹膜透析用剤、血液透析用剤）等の透析用製剤；吸入剤（吸入エアゾール剤、吸入液剤、吸入粉末剤等）等の気管支・肺適用製剤；眼軟膏剤、点眼剤等の目投与用製剤；点耳剤等の耳投与製剤；点鼻剤（点鼻液剤、点鼻粉末剤等）等の鼻適用製剤；坐剤、直腸用半固形剤、注腸剤等の直腸適用製剤；膣用坐剤、膣錠等の膣適用製剤；外用液剤（酒精剤、リニメント剤、ローション剤等）、クリーム剤、ゲル剤、外用固形剤（外用散剤等）、スプレー剤（外用エアゾール剤、ポンプスプレー剤等）、貼付剤（テープ剤、パップ剤等）、軟膏剤等の皮膚適用剤；等があげられる。本発明の分化抑制剤を経口投与する場合、前記剤型は、例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、細粒剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、液剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等があげられる。本発明の分化抑制剤を非経口投与する場合、前記剤型は、例えば、注射投与用製剤、点滴用製剤等があげられる。本発明の分化抑制剤を経皮投与する場合、前記剤型は、例えば、貼付剤、塗布剤、軟膏、クリーム、ローション等の外用薬があげられる。
【００３５】
本発明の分化抑制剤は、例えば、必要に応じて、添加剤を含んでもよく、本発明の分化抑制剤を医薬または医薬組成物として使用する場合、前記添加剤は、薬学的に許容可能な添加剤または薬学的に許容可能な担体を含むことが好ましい。前記添加剤は、特に制限されず、例えば、基剤原料、賦形剤、着色剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定化剤、保存剤、香料等の矯味矯臭剤等があげられる。本発明において、前記添加剤の配合量は、前記フラボノイド誘導体の機能を妨げるものでなければ、特に制限されない。
【００３６】
前記賦形剤は、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトール等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、αデンプン、デキストリン等のデンプン誘導体；結晶セルロース等のセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルラン等の有機系賦形剤；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、珪酸カルシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム等のケイ酸塩誘導体；リン酸水素カルシウム等のリン酸塩；炭酸カルシウム等の炭酸塩；硫酸カルシウム等の硫酸塩等の無機系賦形剤があげられる。前記滑沢剤は、例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；タルク；ポリエチレングリコール；シリカ；硬化植物油等があげられる。前記矯味矯臭剤は、例えば、ココア末、ハッカ脳、芳香散、ハッカ油、竜脳、桂皮末等の香料、甘味料、酸味料等があげられる。前記結合剤は、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等があげられる。前記崩壊剤は、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等のセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾デンプンおよび化学修飾セルロース類等があげられる。前記安定剤は、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾール等のフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；ソルビン酸等があげられる。
【００３７】
前記フラボノイド誘導体は、自家調製してもよいし、市販品を購入してもよい。前者の場合、前記フラボノイド誘導体は、例えば、植物から抽出できる。具体例として、前記クリシンは、例えば、ヒラタケ、蜂の巣等からエタノール抽出できる。前記サクラネチンは、例えば、ヒラタケ、蜂の巣等からエタノール抽出できる。前記フラボノイド誘導体は、例えば、粗精製物でもよいし、精製物でもよい。前者の場合、前記粗精製物は、例えば、フラボノイド誘導体とその他の化合物を含む。
【００３８】
＜骨量増強剤＞
本発明の骨量増強剤は、前述のように、本発明の分化抑制剤を含む。本発明の増強剤は、前記本発明の分化抑制剤を含むこと、すなわち、前記式（１）または（２）で表されるフラボノイド誘導体またはその塩を含むことが特徴であって、その他の構成は特に制限されない。本発明の増強剤は、例えば、前記本発明の分化抑制剤の説明を援用できる。本発明の増強剤は、例えば、骨量維持剤、骨量減少の抑制剤、または骨代謝改善剤ということもできる。また、本発明の分化抑制剤によれば、骨密度を増加させることにより、骨量を増強できる。このため、本発明の増強剤は、「骨密度増加剤」ということもできる。
【００３９】
前記骨量は、例えば、後述の実施例４に準じて、ＤＸＡ法により測定できる。
【００４０】
＜骨量増強食品組成物＞
本発明の骨量増強食品組成物は、前述のように、前記本発明の破骨細胞の分化抑制剤を含むことを特徴とする。本発明の食品組成物は、前記本発明の分化抑制剤を含むこと、すなわち、前記式（１）または（２）で表されるフラボノイド誘導体またはその塩を含むことが特徴であって、その他の構成は特に制限されない。本発明の食品組成物は、例えば、前記本発明の分化抑制剤の説明を援用できる。本発明の食品組成物は、例えば、骨量維持食品組成物、骨量減少の抑制食品組成物、または骨代謝改善食品組成物ということもできる。また、本発明の分化抑制剤によれば、骨密度を増加させることにより、骨量を増強できる。このため、本発明の食品組成物は、「骨密度増加食品組成物」ということもできる。
【００４１】
前記食品組成物は、例えば、食品の一部として含有されてもよい、すなわち、食品に配合されてもよい。この場合、前記食品は、例えば、骨量もしくは骨密度が増強する、または骨量もしくは骨密度が維持される等の旨が表示された食品、病者用食品、機能性表示食品、機能性食品、特定保健用食品、サプリメント等であってもよい。
【００４２】
前記食品は、例えば、清涼飲料水、茶系飲料、コーヒー飲料、果汁飲料、炭酸飲料、ゼリー、乳酸菌飲料等の飲料；ウエハース、ビスケット、パン、麺、ソーセージ、ヨーグルト等の乳製品等の食品；調理品；蜂蜜を含有する飲食品、茸およびその加工品等があげられる。
【００４３】
前記食品組成物が食品の場合、前記食品におけるフラボノイド誘導体の含有量は、例えば、前記本発明の分化抑制剤における投与量に基づき、適宜決定できる。
【００４４】
＜ＲＡＮＫ−ＲＡＮＫＬ結合阻害剤＞
本発明のＲＡＮＫとＲＡＮＫＬとの結合を阻害する結合阻害剤は、前述のように、本発明の破骨細胞の分化抑制剤を含む。本発明の阻害剤は、前記本発明の分化抑制剤を含むこと、すなわち、前記式（１）または（２）で表されるフラボノイド誘導体またはその塩を含むことが特徴であって、その他の構成は特に制限されない。本発明の阻害剤は、例えば、前記本発明の分化抑制剤の説明を援用できる。
【００４５】
本発明の阻害剤は、前述のように、ＲＡＮＫとＲＡＮＫＬとの結合を阻害すると推定される。このため、本発明の阻害剤は、例えば、ＲＡＮＫとＲＡＮＫＬとの結合に起因する種々の疾患の医薬または医薬組成物としても使用できる。具体例として、前記疾患は、例えば、骨粗鬆症、骨転移、多発性骨髄腫・固形癌等の癌の骨転移による骨病変、骨巨細胞腫、関節リウマチ等があげられる。
【００４６】
前記ＲＡＮＫおよびＲＡＮＫＬの由来は、特に制限されず、例えば、前記投与対象の説明を援用できる。前記ヒトＲＡＮＫタンパク質としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号NP_001257878、NP_001257879、NP_001257880、NP_001265197、またはNP_003830で登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質があげられる。前記マウスＲＡＮＫタンパク質としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号NP_033425で登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質があげられる。前記ヒトＲＡＮＫＬタンパク質としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号NP_003692またはNP_143026で登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質があげられる。前記マウスＲＡＮＫＬタンパク質としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号NP_035743で登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質があげられる。
【００４７】
＜抗肥満剤＞
本発明の抗肥満剤は、前述のように、下記式（１）または（２）で表されるフラボノイド誘導体またはその塩を含む。本発明の抗肥満剤は、下記式（１）または（２）で表されるフラボノイド誘導体またはその塩を含むことが特徴であって、その他の構成は特に制限されない。本発明の抗肥満剤は、例えば、前記本発明の分化抑制剤の説明を援用できる。本発明の抗肥満剤によれば、例えば、体重の増加を抑制できる。このため、本発明の抗肥満剤は、例えば、「体重増加の抑制剤」または「体重増加の予防剤」ということもできる。
【化１】
2020045313.tif 000007
【化２】
2020045313.tif 000008
【００４８】
本発明の抗肥満剤は、肥満の予防、治療および／または改善等に使用できる。本発明の抗肥満剤は、例えば、肥満の治療剤、予防剤、または改善剤ということもできる。
【００４９】
本発明の抗肥満剤は、メカニズムは不明だが、エストロゲンの欠乏により生じる肥満に特に好適に使用できる。前記エストロゲンの欠乏は、例えば、同じ性別および同じ年齢または年代における対照と比較して、エストロゲンの血中濃度が（有意に）低下していることを意味する。前記エストロゲンの欠乏は、例えば、閉経、更年期障害、卵巣摘出、脳、下垂体機能不全、薬剤誘発性等により生じる。
【００５０】
＜抗肥満食品組成物＞
本発明の抗肥満食品組成物は、前述のように、前記本発明の抗肥満剤を含むことを特徴とする。本発明の抗肥満食品組成物は、前記本発明の抗肥満剤を含むこと、すなわち、前記式（１）または（２）で表されるフラボノイド誘導体またはその塩を含むことが特徴であって、その他の構成は特に制限されない。本発明の抗肥満食品組成物は、例えば、前記本発明の分化抑制剤および抗肥満剤の説明を援用できる。本発明の抗肥満食品組成物によれば、例えば、体重の増加を抑制できる。このため、本発明の抗肥満食品組成物は、例えば、「体重増加の抑制食品組成物」または「体重増加の予防食品組成物」ということもできる。
【００５１】
前記抗肥満食品組成物は、例えば、食品の一部として含有されてもよい、すなわち、食品に配合されてもよい。この場合、前記食品は、例えば、肥満を予防、抑制もしくは改善する、または体重増加を予防もしくは抑制する等の旨が表示された食品、病者用食品、機能性表示食品、機能性食品、特定保健用食品、サプリメント等であってもよい。前記食品には、例えば、エストロゲンの欠乏の状態、例えば、閉経、更年期障害、卵巣摘出、脳、下垂体機能不全、薬剤誘発性等により生じる肥満を予防、抑制もしくは改善する、または体重増加を予防もしくは抑制する等の旨を表示してもよい。
【００５２】
前記食品は、例えば、清涼飲料水、茶系飲料、コーヒー飲料、果汁飲料、炭酸飲料、ゼリー、乳酸菌飲料等の飲料；ウエハース、ビスケット、パン、麺、ソーセージ、ヨーグルト等の乳製品等の食品；調理品；蜂蜜を含有する飲食品、茸およびその加工品等があげられる。
【００５３】
＜破骨細胞の分化抑制方法＞
本発明の破骨細胞の分化抑制方法は、前述のように、前記本発明の破骨細胞の分化抑制剤を使用する。本発明の分化抑制方法は、前記本発明の分化抑制剤を使用することが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の分化抑制剤は、前述の説明を援用できる。本発明の分化抑制方法は、例えば、破骨細胞の分化において、細胞融合により破骨細胞が大型化し、成熟するのを抑制できる。このため、本発明の分化抑制方法は、例えば、「破骨細胞の成熟抑制方法」ということもできる。
【００５４】
本発明の分化抑制方法は、例えば、前記分化抑制剤を投与する投与工程を含み、具体的には、投与対象に、前記分化抑制剤を投与する投与工程を含む。前記分化抑制剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで投与されてもよいし、ｉｎ ｖｉｖｏで投与してもよい。本発明の分化抑制剤の投与対象および投与条件は、例えば、本発明の分化抑制剤における投与対象および投与条件の説明を援用できる。
【００５５】
＜骨量の増強方法＞
本発明の骨量の増強方法は、前述のように、本発明の破骨細胞の分化抑制剤を使用する。本発明の増強方法は、前記本発明の分化抑制剤を使用することが特徴であり、その他の工程および条件は特に制限されない。本発明の増強方法は、前記本発明の分化抑制剤、増強剤、および分化抑制方法の説明を援用できる。本発明の増強方法は、例えば、骨量維持方法、骨量減少の抑制方法、または骨代謝の改善方法ということもできる。
【００５６】
本発明の増強方法は、例えば、前記分化抑制剤を投与する投与工程を含み、具体的には、投与対象に、前記分化抑制剤を投与する投与工程を含む。前記分化抑制剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで投与されてもよいし、ｉｎ ｖｉｖｏで投与してもよい。本発明の分化抑制剤の投与対象および投与条件は、例えば、本発明の分化抑制剤における投与対象および投与条件の説明を援用できる。
【００５７】
＜ＲＡＮＫとＲＡＮＫＬとの結合を阻害する結合阻害方法＞
本発明のＲＡＮＫとＲＡＮＫＬとの結合を阻害する結合阻害方法は、前述のように、本発明の破骨細胞の分化抑制剤を使用する。本発明の阻害方法は、前記本発明の分化抑制剤を使用することが特徴であり、その他の工程および条件は特に制限されない。本発明の阻害方法は、前記本発明の分化抑制剤、阻害剤、および分化抑制方法の説明を援用できる。本発明の阻害方法は、例えば、ＲＡＮＫとＲＡＮＫＬとの結合に起因する種々の疾患の治療方法ということもできる。
【００５８】
本発明の阻害方法は、例えば、前記分化抑制剤を投与する投与工程を含み、具体的には、投与対象に、前記分化抑制剤を投与する投与工程を含む。前記分化抑制剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで投与されてもよいし、ｉｎ ｖｉｖｏで投与してもよい。本発明の分化抑制剤の投与対象および投与条件は、例えば、本発明の分化抑制剤における投与対象および投与条件の説明を援用できる。
【００５９】
＜肥満の治療方法＞
本発明の肥満の治療方法は、前述のように、本発明の破骨細胞の分化抑制剤を使用する。本発明の治療方法は、前記本発明の分化抑制剤を使用することが特徴であり、その他の工程および条件は特に制限されない。本発明の治療方法は、前記本発明の分化抑制剤、抗肥満剤、および分化抑制方法の説明を援用できる。本発明の治療方法は、例えば、「体重増加の抑制方法」または「体重増加の予防方法」ということもできる。
【００６０】
本発明の治療方法は、例えば、前記分化抑制剤を投与する投与工程を含み、具体的には、投与対象に、前記分化抑制剤を投与する投与工程を含む。前記分化抑制剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで投与されてもよいし、ｉｎ ｖｉｖｏで投与してもよい。本発明の分化抑制剤の投与対象および投与条件は、例えば、本発明の分化抑制剤における投与対象および投与条件の説明を援用できる。前記投与対象は、例えば、エストロゲンの欠乏状態であることが好ましい。
【００６１】
本発明の治療方法において、治療は、例えば、肥満の予防、肥満の治療、肥満の改善の意味を含み、いずれの意味で用いてもよい。
【００６２】
＜フラボノイド誘導体またはその塩の使用＞
本発明は、破骨細胞の分化抑制のためのフラボノイド誘導体またはその塩またはその使用であり、前記骨量増強または維持のためのフラボノイド誘導体もしくはその塩またはその使用であり、ＲＡＮＫとＲＡＮＫＬとの結合を阻害する阻害のためのフラボノイド誘導体またはその塩またはその使用であり、肥満の治療のためのフラボノイド誘導体またはその塩またはその使用である。また、本発明は、前記各種医薬の製造のためのフラボノイド誘導体またはその塩の使用である。
【実施例】
【００６３】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、以下の実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールに基づいて使用した。
【００６４】
［実施例１］
本発明のフラボノイド誘導体が、破骨細胞の分化を抑制することを確認した。
【００６５】
（１）破骨細胞の誘導
破骨細胞の誘導は、ＲＡＷ２６４細胞（RIKEN BRCから分譲）を用いてＲＡＮＫＬ存在下で培養することにより誘導した。具体的には、ＲＡＷ２６４細胞を、１５０ｎｇ／ｍＬ  ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ（オリエンタル酵母工業株式会社製）／１０％ＦＢＳ−ＭＥＭα培地に懸濁し、細胞懸濁液を調製した。前記ＦＢＳ−ＭＥＭα培地は、ＭＥＭα培地に、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清、MP Biomedicals社製）、１％ＭＥＭ−ＮＥＡＡ（Gibco社製）、および１％antibiotic-antimycotic solution（Gibco社製）を添加することにより調製した。また、前記細胞懸濁液に、下記実施例および比較例フラボノイド誘導体を含むＤＭＳＯ液を、ＤＭＳＯの終濃度が０．１（ｖ／ｖ）％となるよう添加した。コントロールは、ＤＭＳＯの終濃度が０．１（ｖ／ｖ）％となるように添加した。つぎに、得られた細胞懸濁液を、１．０×１０４cells/１０００μＬ／ウェルの細胞密度で、２４ウェルプレート（TPP社製）に播種した。前記播種後、約１０−２０分間、クリーンベンチ外の固定された実験台のキムタオル上にプレートを置き、細胞が沈殿するのを待った。前記細胞の沈殿後、細胞が均一に分散したことを確認し、インキュベータ内にプレートを入れた。そして、培地交換を行わずに約４日間（９０時間前後）培養することにより、ＲＡＷ２６４細胞を破骨細胞へと分化させた。前記培養時の培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２、９５％Ａｉｒとし、加湿条件下とした。
【００６６】
（フラボノイド誘導体）
・実施例のフラボノイド誘導体
クリシン（Chrysin）、サクラネチン（Sakuranetin）
・比較例のフラボノイド誘導体
ノビレチン（Nobiletin）、ヘスペリジン（Hesperidin）、ヘスペレチン（Hesperetin）、HMF（3',4',3,5,6,7,8-Heptamethoxyflavone）、アピゲニン（Apigenin）、アピゲトリン（Apigetrin、Cosmosiin）、ジオスメチン（Diosmetin）、エリオシトリン（Eriocitrin）、ルテオリン（Luteolin）、Luteolin-7-o-glucoside、メチルヘスペリジン（Methyl hesperidin）、ナリンゲニン（Naringenin）、ナリンギン（Naringin）、タンゲレチン（Tangeretin）
【化３】
2020045313.tif 000009
【００６７】
（２）ＴＲＡＰ活性の測定
ＴＲＡＰ（Tartrate-resistant acid phosphatase；酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ）は、破骨細胞のマーカー酵素となる。そこで、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ存在下で培養したＲＡＷ２６４細胞について、ＴＲＡＰ活性の上昇を指標に、破骨細胞への分化を検討した。具体的には、前記分化誘導４日後（約９０時間）、細胞をインキュベータより取り出し、培地をアスピレートして、リン酸緩衝バッファー（PBS(-)）で1回洗浄した。PBS(-)をアスピレートした後、４％パラホルムアルデヒド（PFA）を３００μＬ／ウェルで添加し、室温（約２５℃）で１０分間細胞を固定した。前記固定後、４％PFAを除去し、PBS(-)で2回洗浄した。つぎに、PBS(-)を除去し、ＴＲＡＰ活性測定試薬を２００μＬ／ウェルで添加後、遮光して３７℃で３０分間反応させた。前記反応後、各ウェルから１００μＬの反応液を９６ウェルプレートに分注した。分注後の反応液に、等量（１００μＬ）の０．１Ｎ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）ＮａＯＨを添加し、反応液を発色させた。吸光波長４０５ｎｍの吸光度を、吸光光度計（FlexStation（登録商標）3 Multi-Mode Microplate Reader、Molecular Devices社製)を用いて吸光度を測定した。また、細胞のいないウェルをブランクとし、バックグラウンドとの吸光度の差分を算出した。そして、コントロールのＴＲＡＰ活性を１００％として、ＴＲＡＰ活性の相対値を算出した。なお、ＴＲＡＰ活性測定試薬は、ＴＲＡＰ活性測定緩衝液１０ｍＬに対し、pNPP（4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate、SIGMA社製、N2765-50TAB LOT#SLBP8123V)を１粒溶解させることにより調製した。また、ＴＲＡＰ活性測定緩衝液は、以下のようにして調製した。まず、５．８８２ｇ  クエン酸三ナトリウム・二水和物（Trisodium Citrate Dihydrate）を、約３００ｍＬの超純水（Milli-Q水）に溶解した。得られた溶液に、さらに０．９２ｇ  (＋)−酒石酸ナトリウム二水和物（Sodium(+)-Tartrate Dihydrate）を溶解させた。そして、１Ｎ（１ｍｏｌ／Ｌ）ＨＣｌを用いてｐＨ４．６に調整後、前記超純水を添加し、溶液を４００ｍＬにフィルアップした。
【００６８】
この結果を図１に示す。図１は、ＴＲＡＰ活性を示すグラフである。図１において、横軸は、フラボノイド誘導体の種類およびその添加濃度を示し、縦軸は、ＴＲＡＰ活性の相対値を示す。図１に示すように、クリシンおよびサクラネチンでは、有意にＴＲＡＰ活性が低下しており、クリシンでは、ＴＲＡＰ活性の低下が特に顕著であった。これらの結果から、クリシンおよびサクラネチンが破骨細胞の分化を抑制することが分かった。
【００６９】
（３）ＴＲＡＰの染色
前記実施例１（２）のＴＲＡＰ活性測定後の細胞について、PBS(-)で２回洗浄した。前記洗浄後、０．２（ｖ／ｖ）％  TritonX-100／PBS(-)を３００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０分間透過処理を行った。前記透過処理後、PBS(-)で２回洗浄した。つぎに、ＴＲＡＰ染色試薬を３００μＬ／ウェルで添加し、３７℃で反応させた。前記反応は、検鏡により十分に染色されたと認められるまで実施した。そして、染色後のサンプルについて、PBS(-)で２回洗浄し、約６００μＬ／ウェルのPBS (-)で浸し、染色を終了した。細胞の観察は、光学顕微鏡（オールインワン顕微鏡BZ-9000 Fluorescence Microscope、KEYENCE社製）を用いて実施した。明視野下で観察し、複数枚の写真を結合する「連結」機能を用いて、２４ウェルプレートの１ウェル全体の連結写真を撮影した。なお、ＴＲＡＰ染色試薬は、以下のように調製した。具体的には、Naphthol AS-MX phosphate（SIGMA社製）およびFast Red Violet LB Salt（SIGMA社製）をN,N-Dimethylformamide（Wako社製）と混合した。前記混合後、終濃度が０．０１（ｗ／ｖ）％  Naphthol AS-MX phosphateおよび０．０６（ｗ／ｖ）％ Fast Red Violet LB Saltとなるように、ＴＲＡＰ染色緩衝液と混合し、さらに、得られた混合液を０．４５μｍフィルターにより濾過し、ＴＲＡＰ染色試薬を調製した。前記ＴＲＡＰ染色緩衝液は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  酒石酸ナトリウム二水和物／４５ｍｍｏｌ／Ｌ  酢酸ナトリウム緩衝液を調製後、酢酸によりｐＨ５．０に調整することにより調製した。
【００７０】
この結果を図２に示す。図２は、ＴＲＡＰ染色の連結写真において、中心部の２５ｍｍ四方の正方形部分を示す写真である。図２において、各写真の上に示す名称および濃度は、それぞれ、添加したフラボノイド誘導体の種類とその添加濃度とを示す。図２に示すように、クリシンおよびサクラネチンでは、ＴＲＡＰ陽性細胞が減少していた。また、クリシンでは、ＴＲＡＰ陽性細胞の大きさも縮小していた。
【００７１】
つぎに、前記連結写真について、前記光学顕微鏡の付属ソフトウェアの撮影機能から、画像１ピクセルあたりの長さを求め、これに基づき２４ウェルプレートの各ウェルの中心部に２５ｍｍ四方の正方形をROI（region of interest；対象領域）として設定した。なお、１つの画像でROIを設定することで、前記付属ソフトウェアを用いて、他の連結画像においても同一の位置にROIを設定可能である。破骨細胞は、分化中に複数の細胞が融合し、多核化する。また、破骨細胞は、核数が３以上の細胞と定義されている。そこで、設定されたROI内の核数ｎ≧３／cellかつＴＲＡＰ染色陽性（＋）の多核細胞（ＭＮＣｓ）数を、画像解析ソフト（ImageJ）のプラグインのソフトウェア（Cell Counter）を用いてカウントした。
【００７２】
この結果を図３に示す。図３は、ＭＮＣｓのカウント数を示すグラフである。図３において、横軸は、フラボノイド誘導体の種類およびその濃度を示し、縦軸は、前記対象領域におけるＭＮＣｓのカウント数を示す。図３に示すように、コントロール（Ｃｔｒｌ）と比較して、クリシンおよびサクラネチンにおいて、ＴＲＡＰ陽性細胞の数が減少しており、特に、クリシンでは、ＴＲＡＰ陽性細胞の数の減少が顕著であった。
【００７３】
（４）細胞毒性の検討
９６ウェルプレートに、１．０×１０４cells／１００μＬ／ウェルの密度で播種し、各フラボノイド誘導体の存在下で、約４０時間培養した以外は、前記実施例１（１）と同様にして、ＲＡＷ２６４細胞から破骨細胞を誘導した。前記誘導後、培地を除去し、PBSで１回洗浄した。つぎに、フラボノイド誘導体未添加の１０％ＦＢＳ−ＭＥＭα培地（ＭＤ）に、ＭＴＴ溶液（ＭＴ）を１０：１（ＭＤ：ＭＴ）の割合で混合したものを１１０μＬ／ウェルで添加した。前記添加後、プレートを、インキュベータ内で２時間反応させた。前記反応後、MTT cell count kit（nacalai社製、LOT No. L7E1092）付属の可溶化溶液を１００μＬ／ウェルで添加し、ピペッティングにより生成したホルマザン色素を溶解した。さらに、前記プレートを、４時間インキュベートすることでホルマザン色素を前記可溶化溶液に溶解した。ホルマザン色素の溶解を確認後、前記吸光光度計を用いて吸光度を測定した（Measure ; 570 nm, Reference ; 650 nm）。コントロールは、前記フラボノイド誘導体に代えて、DMSOを０．１（ｖ／ｖ）％となるように添加した以外は、同様にして吸光度を測定した。そして、コントロールの細胞生存率を１００％とし、前記吸光度に基づき、各フラボノイド誘導体存在下での細胞の生存率の相対値を算出した。
【００７４】
この結果を図４に示す。図４は、細胞の生存率の相対値を示すグラフである。図４において、横軸は、フラボノイド誘導体の種類およびその濃度を示し、縦軸は、細胞の生存率の相対値を示す。図４に示すように、いずれのフラボノイド誘導体の存在下においても、細胞の生存率はコントロールと有意差がなく、細胞毒性は認められなかった。
【００７５】
以上の結果から、前述のフラボノイド誘導体のうち、クリシンおよびサクラネチンがＴＲＡＰの発現を抑制でき、かつＴＲＡＰ陽性細胞の大きさを小さくでき、特に、クリシンにおいてこれらの効果が顕著であることが分かった。すなわち、クリシンおよびサクラネチンが破骨細胞の分化を抑制でき、またクリシンが破骨細胞の分化を顕著に抑制することが分かった。また、クリシンおよびサクラネチンによる破骨細胞の分化抑制は、細胞毒性によるものではないことが分かった。
【００７６】
［実施例２］
本発明のフラボノイド誘導体により、濃度依存的に多核細胞が小型化することを確認した。
【００７７】
前記フラボノイド誘導体として、クリシンを終濃度が１．３、２．５、５．０、または１０μｍｏｌ／Ｌとなるように添加した以外は、前記実施例１（１）と同様にして、ＲＡＷ２６４細胞から破骨細胞を誘導した。つぎに、得られた破骨細胞について、前記実施例１（３）と同様にして、ＴＲＡＰ染色を行ない、連結写真を撮影した。前記連結写真について、各ウェルの中心部に２５ｍｍ四方の正方形をROIとして設定した。そして、設定されたROI内の核数ｎ≧３／cellかつＴＲＡＰ染色陽性（＋）の多核細胞（ＭＮＣｓ）数について、各細胞の占める面積の区分毎にカウントした。前記細胞の占める面積の区分は、（１）０．００２ｍｍ２未満、（２）０．００２ｍｍ２以上０．０２ｍｍ２未満、および（３）０．０２ｍｍ２以上の３区分とした。そして、各区分のカウント数に基づき、各区分が占める割合を算出した。コントロールは、前記クリシンに代えて、０．１（ｖ／ｖ）％となるようにDMSOを添加した以外は、同様にして各区分が占める割合を算出した。
【００７８】
この結果を図５に示す。図５は、細胞の占める面積の区分の割合を示すグラフである。図５において、横軸は、サンプルの種類およびクリシンの濃度を示し、縦軸は、各区分の占める割合を示す。図５に示すように、クリシンの濃度依存的に、面積の大きな細胞の割合が減少し、面積の小さな細胞の割合が増加した。これらの結果から、本発明のフラボノイド誘導体により、濃度依存的に多核細胞が小型化することが分かった。また、本発明のフラボノイド誘導体により、細胞の融合による破骨細胞の分化が抑制されていることが示唆された。
【００７９】
［実施例３］
本発明のフラボノイド誘導体が、破骨細胞への分化の各段階において、分化を抑制していることを確認した。
【００８０】
ＲＡＷ２６４細胞の培養において、前記フラボノイド誘導体に代えて、図６（Ａ）に示す培養スキームにしたがって、培養開始から２日間（Early）、培養開始２日目から２日間（Late）、または全期間（All）、クリシン存在下で培養した以外は前記実施例１（１）と同様にして、破骨細胞を誘導した。なお、クリシン添加ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ／１０％ＦＢＳ−ＭＥＭα培地からクリシン未添加ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ／１０％ＦＢＳ−ＭＥＭα培地への培地変更およびクリシン未添加ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ／１０％ＦＢＳ−ＭＥＭα培地からクリシン添加ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ／１０％ＦＢＳ−ＭＥＭα培地への培地変更は、培地交換により実施した。また、クリシン未添加ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ／１０％ＦＢＳ−ＭＥＭαには、０．１（ｖ／ｖ）％となるようにDMSOを添加した（Vehicle）。そして、得られた細胞について、前記実施例１（２）と同様にして、ＴＲＡＰ活性の相対値を算出した。コントロールは、ＲＡＷ２６４細胞の培養において、全期間、０．１（ｖ／ｖ）％となるようにDMSOを添加した以外は、同様にしてＴＲＡＰ活性の相対値を算出した。
【００８１】
この結果を図６（Ｂ）に示す。図６（Ｂ）は、TRAP活性の相対値を示すグラフである。図６（Ｂ）において、横軸は、培養スキームの種類を示し、縦軸は、ＴＲＡＰ活性の相対値を示す。図６（Ｂ）に示すように、培養初期（Early）または後期（Late）にクリシンが存在すると、コントロール（Ctrl）と比較して、ＴＲＡＰ活性が減少し、全期間クリシンが存在する場合、相乗的にＴＲＡＰ活性が低下した。
【００８２】
つぎに、ＴＲＡＰ活性測定後の細胞について、前記実施例２と同様にして、各区分のカウント数に基づき、各区分が占める割合を算出した。この結果を図７に示す。図７は、細胞の占める面積の区分の割合を示すグラフである。図７において、横軸は、培養スキームの種類を示し、縦軸は、各区分の占める割合を示す。図７に示すように、培養初期（Early）または後期（Late）にクリシンが存在すると、コントロール（Ctrl）と比較して、面積の大きな細胞の割合が減少し、面積の小さな細胞の割合が増加し、全期間クリシンが存在する場合、相乗的に面積の大きな細胞の割合が減少し、面積の小さな細胞の割合が増加した。
【００８３】
以上のことから、本発明のフラボノイド誘導体が、破骨細胞への分化の各段階において、分化を抑制していることが分かった。
【００８４】
［実施例４］
本発明のフラボノイド誘導体により、生体において骨量を増強できることを確認した。
【００８５】
８週齢のＣ５７ＢＬ／６の雌マウスに対し、下記表１に示す０．０５または１．０（ｗ／ｗ）％クリシンを含有する飼料を与え、２９日間飼育した。マウスに与える飼料は毎日新しい飼料と交換し、飼育期間中に接餌量の調整は行なわなかった。コントロールは、クリシンを含まない飼料（Ctrl）を与えた以外は同様にして飼育した。なお、０．０５または１．０（ｗ／ｗ）％クリシンを含有する飼料と、クリシンを含まない飼料の栄養成分との間で、摂取カロリーに差が生じないようにカロリーの調整を行なった。
【００８６】
【表１】
2020045313.tif 000010
【００８７】
前記飼育後のマウスから、大腿骨を回収し、４％ＰＦＡを用い、４℃で終夜固定した。前記固定後、ＰＦＡを７０％エタノールと交換し、さらに４℃で終夜処理した。前記処理後、大腿骨について、骨密度の測定装置（ALOKA DCS-600-EXIIIR）を用いて、ＤＸＡ法（二重Ｘ線吸収法）により、骨密度を測定した。また、大腿骨の骨盤側（近位）から腓骨側（遠位）まで、等間隔で２０箇所（ROI1〜20）の骨密度を測定した。
【００８８】
これらの結果を図８に示す。図８は、大腿骨の骨密度を示すグラフであり、（Ａ）は、大腿骨全体の骨密度を示すグラフであり、（Ｂ）は、ROI1〜20における骨密度を示すグラフである。図８（Ａ）において、横軸は、サンプルの種類およびクリシンの濃度を示し、縦軸は、骨密度を示す。また、図８（Ｂ）において、横軸は、ROIを示し、縦軸は骨密度を示す。図８（Ａ）に示すように、クリシンを含む飼料を与えたマウスでは、コントロール（Ctrl）と比較して、クリシンの濃度依存的に骨密度が増加した。また、図８（Ｂ）に示すように、クリシンを含む試料を与えたマウスでは、コントロールと比較して、大腿骨の骨盤側から腓骨側にかけて全体的に骨密度が増加していた。骨密度が増加した場合、骨の総量が増加するため、骨量が増加する。このため、本発明のフラボノイド誘導体により、生体において骨量を増強できることがわかった。
【００８９】
［実施例５］
本発明のフラボノイド誘導体により、体重増加を抑制できることを確認した。
【００９０】
体重増加は、卵巣摘出によるエストロゲン欠乏により誘導した。具体的には、まず、８週齢のＣ５７ＢＬ／６の雌マウスに対して卵巣摘出手術を実施した。卵巣摘出手術は、イソフルラン吸入麻酔（２．０％）下で実施し、カギ付きピンセットで足または皮膚をつまみ、反射消失を確認した後に実施した。卵巣摘出（OVX）群は両脇腹から卵巣を摘みあげ切除後、残部を体内に戻した。そして、創部をクリップで固定した。偽手術（Sham）群は卵巣を摘みあげるところまで同様に実施、切除せずに体内に戻し、創部をクリップで固定した。
【００９１】
つぎに、手術後のマウスに対し、前記実施例４と同様にして、前記表１に示す０．０５または１．０（ｗ／ｗ）％クリシンを含有する飼料を与え、２９日間飼育した。そして、飼育開始日を０日目として、飼育開始０、８、１５、２２、および２９日目に各マウスの体重を測定した。また、コントロールは、クリシンを含まない飼料を与えた以外はＯＶＸ群と同様にして体重を測定した。また、飼育開始２９日目に、子宮を摘出し、子宮重量を測定した。なお、各群において接餌量に差はなかった。
【００９２】
この結果を図９に示す。図９は、ＯＶＸマウスにおける子宮重量および体重を示すグラフであり、（Ａ）は、子宮重量を示すグラフであり、（Ｂ）は、体重を示すグラフである。図９（Ａ）において、横軸は、マウスの種類および飼料中のクリシンの割合を示し、縦軸は、子宮重量を示す。また、図９（Ｂ）において、横軸は、飼育日数を示し、縦軸は、体重を示す。図９（Ａ）に示すように、ＯＶＸマウスは、Ｓｈａｍマウスと比較して、子宮重量が有意に低下しており、卵巣が摘出できていることが確認できた。つぎに、図９（Ｂ）に示すように、ＯＶＸマウスは、Ｓｈａｍマウスと比較して、経時的に体重が増加した。また、ＯＶＸマウスにおいて、クリシンを含む試料を与えたマウス（OVX 0.05% ChrysinまたはOVX 1.0% Chrysin）では、コントロール（OVX Ctrl）と比較して、体重の増加が有意に低減されていた。また、前述のように、各群において接餌量に差はなかった。このため、本発明のフラボノイド誘導体により、体重増加を抑制できることが分かった。また、本発明のフラボノイド誘導体を抗肥満剤として使用できることが分かった。
【００９３】
［実施例６］
本発明のフラボノイド誘導体が、ＲＡＮＫとＲＡＮＫＬとの結合を阻害すると推定されることを確認した。
【００９４】
破骨細胞への分化は、ＲＡＮＫおよびＲＡＮＫＬとの結合が重要である。そこで、クリシンが、ＲＡＮＫとＲＡＮＫＬとの結合を阻害しうるか、in silico docking studyにより検討した。具体的には、まず、National Center for Biotechnology InformationのＰＤＢからcode 3ME2の結晶構造"Crystal structure of mouse RANKL-RANK complex"（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/pdb/3ME2）を取得した。つぎに、ソフトウェア（MakeReceptor、OpenEye社製）を用いて、基質が入る可能性があるポケットを計算した。他方、クリシンの構造をChemBioDraw Ultra 12.0で作成したものを基準とし、クリシンの安定構造をOmegaを用いて計算した。そして、MakeReceptorで計算したタンパク質構造と、Omegaで計算したクリシンの化合物構造とを"Fred"でdockingさせ、可能性のある結合様式を２００パターン計算した。そして、ＲＮＡＫ−ＲＮＡＫＬ複合体に結合するかを検討した。得られた検討結果は、ソフトウェア（VIDA）を用いて、確認した。
【００９５】
この結果を図１０に示す。図１０は、in silico docking studyの結果を示す図であり、（Ａ）は、ＲＡＮＫとＲＡＮＫＬとの複合体を示す図であり、（Ｂ）は、ＲＡＮＫとＲＡＮＫＬとの結合部の拡大図であり、（Ｃ）は、ＲＡＮＫとＲＡＮＫＬとの結合部において、ＲＡＮＫとクリシンとの結合部の拡大図である。また、図１０において、矢印Ｘで示す領域は、ＲＡＮＫ−ＲＡＮＫＬ複合体のポケットであり、矢印Ｙで示す領域は、ＲＡＮＫのポケットであり、矢印Ｚで示す領域は、ＲＡＮＫＬのポケットである。図１０に示すように、クリシンは、ＲＡＮＫ−ＲＡＮＫＬのポケット内に結合した。また、クリシンは、ＲＡＮＫ−ＲＡＮＫＬのポケット内において、ＲＡＮＫの１１９番目のアミノ酸であるトリプトファンと相互作用することにより、ＲＡＮＫとＲＡＮＫＬとの結合を阻害すると推定された。これらのことから、本発明のフラボノイド誘導体が、ＲＡＮＫとＲＡＮＫＬとの結合を阻害することにより、破骨細胞の分化を抑制していると推定された。
【００９６】
以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
【００９７】
＜付記＞
上記の実施形態および実施例の一部または全部は、以下の付記のように記載されうるが、以下には限られない。
（付記１）
下記式（１）または（２）で表されるフラボノイド誘導体またはその塩を含む、破骨細胞の分化抑制剤。
【化１】
2020045313.tif 000011
【化２】
2020045313.tif 000012
（付記２）
付記１記載の破骨細胞の分化抑制剤を含む、骨量増強剤。
（付記３）
付記１記載の破骨細胞の分化抑制剤を含む、骨量増強食品組成物。
（付記４）
付記１記載の破骨細胞の分化抑制剤を含む、ＲＡＮＫとＲＡＮＫＬとの結合を阻害する結合阻害剤。
（付記５）
前記式（１）または（２）で表されるフラボノイド誘導体またはその塩を含む、抗肥満剤。
（付記６）
エストロゲン欠乏により生じる肥満に用いる、付記５記載の抗肥満剤。
（付記７）
付記５または６記載の抗肥満剤を含む、抗肥満食品組成物。
（付記８）
エストロゲン欠乏により生じる肥満に用いる、付記７記載の抗肥満食品組成物。
（付記９）
付記１記載の破骨細胞の分化抑制剤を使用する、破骨細胞の分化抑制方法。
（付記１０）
前記分化抑制剤を投与する投与工程を含む、付記９記載の分化抑制方法。
（付記１１）
前記分化抑制剤を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで投与する、付記１０記載の分化抑制方法。
（付記１２）
付記１記載の破骨細胞の分化抑制剤を使用する、骨量の増強方法。
（付記１３）
前記分化抑制剤を投与する投与工程を含む、付記１２記載の骨量の増強方法。
（付記１４）
前記分化抑制剤を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで投与する、付記１３記載の骨量の増強方法。
（付記１５）
付記１記載の破骨細胞の分化抑制剤を使用する、ＲＡＮＫとＲＡＮＫＬとの結合を阻害する結合阻害方法。
（付記１６）
付記５または６の抗肥満剤を対象者に投与する投与工程を含む、肥満の治療方法。
（付記１７）
前記対象者は、エストロゲン欠乏により生じる肥満を有する、付記１６記載の肥満の治療方法。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
以上のように、本発明によれば、前記式（１）または（２）のフラボノイド誘導体を含むことにより、破骨細胞の分化を抑制できる。そして、前記フラボノイド誘導体は、このように破骨細胞の分化を抑制できることから、例えば、骨のターンオーバ（骨代謝）において、破骨細胞の増加を抑制でき、これにより、破骨細胞による骨吸収が、骨芽細胞による骨形成より優位になり、骨量の減少が生じる可能性を抑制できる。すなわち、本発明によれば、骨量の減少を抑制できるため、前記フラボノイド誘導体またはその塩を非存在下（非投与条件）と比較して、骨量を増強可能である。このため、本発明は、食品、サプリメント、医薬等の分野において、極めて有用といえる。
【図１】
2020045313.tif 000019
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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