(57)【要約】【課題】従来よりも軟らかいゲル状物質上で細胞をパターニングしながら培養することで細胞の形状を制御しつつ、当該軟らかいゲル状物質上で細胞培養ができる細胞パターニング基板および細胞パターニング基板の製造方法を提供する。【解決手段】本発明に係る細胞パターニング基板１０は、基板２と、基板２の表面から所定の深さをもって設けられた凹部３と、前記表面および凹部３を被覆し、細胞との接触を妨げる細胞非接触処理面４と、を有する。そして、本発明に係る細胞パターニング基板２０は、前記構成に加えて、細胞非接触処理面４で被覆されている凹部３内に充填されたゲル状物質５を有する。また、本発明に係る細胞パターニング基板３０は、細胞との親和性が高い細胞親和性薄膜６を有していることが好ましい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、
前記基板の表面から所定の深さをもって設けられた凹部と、
前記凹部の凹内表面および前記表面を被覆し、細胞との接触を妨げる細胞非接触処理面と、
を有することを特徴とする細胞パターニング基板。
【請求項２】
前記細胞非接触処理面で被覆されている前記凹部内にゲル状物質が充填されていることを特徴とする請求項１に記載の細胞パターニング基板。
【請求項３】
前記ゲル状物質が、細胞との親和性が高い細胞親和性薄膜を有していることを特徴とする請求項２に記載の細胞パターニング基板。
【請求項４】
前記基板の表面と前記ゲル状物質の表面との段差が±１０μｍ以内であることを特徴とする請求項２または請求項３に記載の細胞パターニング基板。
【請求項５】
前記基板の表面と前記ゲル状物質の表面との段差が±１μｍ以内であることを特徴とする請求項２から請求項４のいずれか１項に記載の細胞パターニング基板。
【請求項６】
前記ゲル状物質の硬さが５０Ｐａから５００ｋＰａであることを特徴とする請求項２から請求項５のいずれか１項に記載の細胞パターニング基板。
【請求項７】
前記凹部の形状が、平面視で、正方形、長方形、平行四辺形、台形、五角形、六角形、円形、扇形、Ｔ字形、Ｙ字形および星形の群から選択される少なくとも１種類であることを特徴とする請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の細胞パターニング基板。
【請求項８】
前記凹部の面積が、平面視で細胞１〜１０個の大きさであることを特徴とする請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の細胞パターニング基板。
【請求項９】
前記凹部が複数個設けられている場合において、
隣り合う凹部間の間隔が１００μｍ以上であることを特徴とする請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の細胞パターニング基板。
【請求項１０】
前記基板が透明であることを特徴とする請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の細胞パターニング基板。
【請求項１１】
基板の表面に所定の深さの凹部を形成する凹部形成工程と、
前記凹部の凹内表面および前記表面を、細胞との接触を妨げる細胞非接触処理面に処理する細胞非接触処理工程と、
を有することを特徴とする細胞パターニング基板の製造方法。
【請求項１２】
前記細胞非接触処理工程の後に、
前記細胞非接触処理面に処理されている前記凹部内にゲル状物質を充填する充填工程を有することを特徴とする請求項１１に記載の細胞パターニング基板の製造方法。
【請求項１３】
前記充填工程の後に、
前記ゲル状物質の表面に細胞との親和性の高い細胞親和性薄膜を形成する細胞親和性薄膜形成工程を有することを特徴とする請求項１２に記載の細胞パターニング基板の製造方法。
【請求項１４】
前記基板の表面と前記ゲル状物質の表面との段差が±１０μｍ以内であることを特徴とする請求項１２または請求項１３に記載の細胞パターニング基板の製造方法。
【請求項１５】
前記基板の表面と前記ゲル状物質の表面との段差が±１μｍ以内であることを特徴とする請求項１２から請求項１４のいずれか１項に記載の細胞パターニング基板の製造方法。
【請求項１６】
前記ゲル状物質の硬さが５０Ｐａから５００ｋＰａであることを特徴とする請求項１２から請求項１５のいずれか１項に記載の細胞パターニング基板の製造方法。
【請求項１７】
前記凹部の形状が、平面視で、正方形、長方形、平行四辺形、台形、五角形、六角形、円形、扇形、Ｔ字形、Ｙ字形および星形の群から選択される少なくとも１種類であることを特徴とする請求項１１から請求項１６のいずれか１項に記載の細胞パターニング基板の製造方法。
【請求項１８】
前記凹部の面積が、平面視で細胞１〜１０個の大きさであることを特徴とする請求項１１から請求項１７のいずれか１項に記載の細胞パターニング基板の製造方法。
【請求項１９】
前記凹部が複数個設けられている場合において、
隣り合う凹部間の間隔が１００μｍ以上であることを特徴とする請求項１１から請求項１８のいずれか１項に記載の細胞パターニング基板の製造方法。
【請求項２０】
前記基板が透明であることを特徴とする請求項１１から請求項１９のいずれか１項に記載の細胞パターニング基板の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基板中の所定の位置に細胞を配置させることができる細胞パターニング基板および細胞パターニング基板の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞は環境に対して機械的な力を及ぼし、また環境からの力も知覚している。そして、環境からの力は、細胞の分化に影響し得ることが示唆されている。環境からの力としては、基板の硬さや細胞の形状、他細胞との接触などが挙げられる。こうした力を計測・評価することはバイオテクノロジーの分野では、細胞間の相互作用研究、単一細胞から臓器への成り立ちなどを把握する上で欠かせない技術である。一般的には、対象とする細胞をゲル状の物質に載せ、軟らかく固定し、牽引力顕微鏡で細胞の動きを観測する手法がとられる。
【０００３】
前記手法に適している技術が、例えば、特許文献１に記載されている。具体的に、特許文献１には、高分子材料の表面に物体を被着あるいは接触させ、当該高分子材料の表層に生じるシワを観察することにより、被着あるいは接触させる物体が発生する力を可視化および／または定量化するための表面改質方法であって、当該高分子材料の表面を改質して弾性率を増大させて、前記シワを発生しやすくする表面改質方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１６−４２０７１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
細胞の研究においては、自由に培養すると細胞がランダムに広がってしまい、制御できなくなるため、細胞の形を制御したいという要望や、１つだけ好きな形にして培養したいという要望がある。さらに、パターニングされた基板や高分子材料（例えば、ゲル状物質など）が硬いと、状態が人体や自然のものから離れてしまい、細胞がおかしな挙動を示すことがある。そのため、近年では、細胞をパターニングし形状を制御しつつ、より自然・天然の環境に近づけるため、軟らかい基板やゲル状物質上で培養したいという要望がある。
【０００６】
しかしながら、特許文献１に記載されている技術を含む従来の技術では、ゲル状物質を基板に塗布し、その上で細胞を培養するに過ぎないので、細胞の形状の制御や単一細胞の培養などは困難であった。また、基板上にゲル状物質をパターニングする場合、自重で崩壊しない程度の硬さが必要であり、神経細胞など細胞収縮力が小さな細胞にとっては十分な軟らかさのゲル状物質とすることができなかった。なお、前記したような十分な軟らかさのゲル状物質を用いた場合、ゲル状物質は自重で崩壊し境界面を最小化する円形状をとるため、パターニングすることは不可能であった。また、基板上にゲル状物質を大面積で塗布した場合、スケール効果により極めて脆弱になり実験中に崩壊することがあった。
【０００７】
本発明は前記状況に鑑みてなされたものであり、従来よりも軟らかいゲル状物質上で細胞をパターニングしながら培養することで細胞の形状を制御しつつ、当該軟らかいゲル状物質上で細胞培養ができる細胞パターニング基板および細胞パターニング基板の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決した本発明に係る細胞パターニング基板は、基板と、前記基板の表面から所定の深さをもって設けられた凹部と、前記凹部の凹内表面および前記表面を被覆し、細胞との接触を妨げる細胞非接触処理面と、を有する。
【０００９】
本発明に係る細胞パターニング基板の製造方法は、基板の表面に所定の深さの凹部を形成する凹部形成工程と、前記凹部の凹内表面および前記表面を、細胞との接触を妨げる細胞非接触処理面に処理する細胞非接触処理工程と、を有する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る細胞パターニング基板は、従来よりも軟らかいゲル状物質上で細胞をパターニングしながら培養することで細胞の形状を制御しつつ、当該軟らかいゲル状物質上で細胞培養ができる。また、本発明に係る細胞パターニング基板の製造方法は、前記効果を奏する細胞パターニング基板を製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本実施形態に係る細胞パターニング基板の構成を説明する要部拡大図である。
【図２】本実施形態に係る細胞パターニング基板の構成を説明する要部拡大図である。
【図３】本実施形態に係る細胞パターニング基板の構成を説明する要部拡大図である。
【図４】本実施形態に係る細胞パターニング基板の構成を説明する要部拡大図である。
【図５】本実施形態に係る細胞パターニング基板の構成を説明する要部拡大図である。
【図６】本実施形態に係る細胞パターニング基板の製造方法の好適な態様を説明するフローチャートである。
【図７】本実施形態に係る細胞パターニング基板の製造方法の好適な態様を説明するフローチャートである。
【図８】本実施形態に係る細胞パターニング基板の製造方法の好適な態様を説明するフローチャートである。
【図９】本実施形態に係る細胞パターニング基板の製造方法の好適な態様を説明するフローチャートである。
【図１０】本実施形態に係る細胞パターニング基板の製造方法の好適な態様を説明するフローチャートである。
【図１１】凹部の形成例を説明する説明図である。
【図１２】凹部の形成例を説明する説明図である。
【図１３】細胞パターニング基板の凹部に充填したゲル状物質の細胞親和性薄膜の上に単一細胞を配置して培養した様子を撮影した光学顕微鏡写真である。図中、右下のスケールバーは５０μｍを示す。
【図１４】細胞パターニング基板を用いた長時間の細胞の観察および薬物暴露（トリプシン処理）による様子を撮影した光学顕微鏡写真である。図中、左からトリプシン処理の開始直後（ｔ＝０ｓｅｃ）、４秒後（ｔ＝４ｓｅｃ）、８秒後（ｔ＝８ｓｅｃ）、１２秒後（ｔ＝１２ｓｅｃ）の様子を示している。また、図中、ｔ＝１２ｓｅｃの写真の右下のスケールバーは５０μｍを示している。このスケールバーは、ｔ＝０ｓｅｃ、ｔ＝４ｓｅｃ、ｔ＝８ｓｅｃも同様に適用される。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、適宜図面を参照して本発明に係る細胞パターニング基板および細胞パターニング基板の製造方法の一実施形態について詳細に説明する。
【００１３】
（細胞パターニング基板）
図１は、本実施形態に係る細胞パターニング基板１０の構成を説明する要部拡大図である。本実施形態に係る細胞パターニング基板１０は、基板２中の所定の位置に細胞７（図４、図５参照）を配置させるために用いられる。なお、図１に示す細胞パターニング基板１０は、細胞７を配置させるためのゲル状物質５（図２〜図５参照）を凹部３内に充填する前の状態を示している。
【００１４】
ここで、本実施形態において用いることのできる細胞７としては、例えば、全能性幹細胞、多能性幹細胞、単能性幹細胞（例えば、神経幹細胞、上皮幹細胞、肝幹細胞、生殖幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、骨格筋幹細胞など）、人工多能性幹細胞などの幹細胞や、これらの幹細胞が分化してなる各種細胞（例えば、神経細胞、肝細胞、筋肉細胞、白血球など）などが挙げられる。これらの細胞７は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ラット、マウス、トリなどの動物から得られるものであればどのようなものも適用できる。また、本実施形態で用いることのできる細胞７は前記したものに限定されず、植物細胞や、真正細菌、古細菌、藻類、原生生物などの微生物の細胞も挙げられる。
【００１５】
図１に示すように、本実施形態に係る細胞パターニング基板１０は、基板２と、この基板２の表面から所定の深さをもって設けられた凹部３と、この凹部３の凹内表面および基板２の表面を被覆し、細胞７との接触を妨げる細胞非接触処理面４と、を有している。このようにすることで、細胞パターニング基板１０上に、従来よりも軟らかいゲル状物質５を安定して形状を制御しつつ配置することができる。
【００１６】
基板２は、細胞パターニング基板１０の土台となるものであり、例えば、ガラス、石英、高分子樹脂、セラミックスなどで形成することができる。なお、基板２は、光透過性を有することが好ましく、具体的には、透明であることがより好ましい。このようにすると、光学顕微鏡などを用いた細胞７の観察が容易となる。基板２の外形形状、外形寸法などは特に制限されるものではなく、任意に設定することができる。
【００１７】
凹部３は、内部にゲル状物質５を充填するために設けられる。凹部３の形状は、平面視で、例えば、正方形、長方形、平行四辺形、台形、五角形や六角形などといった多角形や、円形、扇形、Ｔ字形、Ｙ字形、星形などの任意の形状にすることができるが、これらに限定されない。細胞７は凹部３の形状によって種々の影響を受ける可能性があるため、任意の形状とすることでそのような影響を好適に研究することができる。凹部３の形状は、細胞７に与えたい刺激に応じて任意に決めることができる。また、１つの細胞パターニング基板１０に形成される凹部３の形状は一種類に限定されない。つまり、１つの細胞パターニング基板１０に複数の異なる形状の凹部３を形成することができる。
【００１８】
凹部３の開口面積は、例えば、観察対象となる細胞７が１〜１０個程度配置できる大きさとすることが挙げられるがこれに限定されず、任意に設定することができる。なお、凹部３の開口面積の一例として約０．０２２５ｍｍ２とすることが挙げられる。凹部３を前記開口面積とする場合、例えば、凹部３の形状が平面視で正方形である場合は、一辺を約０．１５ｍｍとすることが挙げられ、円形である場合は、半径を約０．０８５ｍｍとすることが挙げられる。
【００１９】
また、凹部３の深さは、基板２の厚みよりも小さければ、特に限定されない。すなわち、凹部３は、基板２を貫通する貫通孔でないことが好ましい。このようにすると、凹部３に充填されたゲル状物質５やこれを形成するためのゾルが流失するおそれを低減できる。
【００２０】
凹部３の深さに応じてゲル状物質５の自由度が変わる。そのため、同じゲル状物質５を充填した場合でも、凹部３の深さが深いほど凹部３の底部から遠くなるのでゲル状物質５の自由度が上がり、ゲル状物質５が軟らかくなる。これとは反対に、凹部３の深さを浅くすると、凹部３の底部から近くなるので、ゲル状物質５の自由度が下がり、ゲル状物質５が硬くなる。本実施形態では、細胞パターニング基板１０に複数個の凹部３を設ける場合、全ての凹部３の深さを同じにすることもできるし、異ならせることもできる。凹部３の深さを異ならせる場合、例えば、凹部３の深さを一列ごとに異ならせることができる。また、この場合、例えば、複数列の凹部３の深さを一列ごとに段階的に異ならせることができる。このようにすると、凹部３の深さ、つまり、ゲル状物質５から感じられる硬さの相違による細胞７への影響を比較しつつ調べることができる。
【００２１】
細胞パターニング基板１０に設けられる凹部３の個数も特に限定されず、前記したように複数個とすることもできるが、１個とすることもできる。凹部３を複数個設ける場合、隣り合う凹部３間の間隔、具体的には、隣り合う直近の凹部３の縁と縁との間の寸法を１００μｍ以上とするのが好ましい。このようにすると、隣り合う凹部３のゲル状物質５に配置された細胞７同士が接触するのを防ぐことができるので、細胞７を個別に観察できる。なお、隣り合う凹部３の縁と縁との間の寸法はこれに限定されず任意に設定することができる。例えば、隣り合う凹部３間の間隔を１００μｍ未満、例えば、１〜５０μｍなどとすることができる。このようにすると、隣り合う凹部３のゲル状物質５に配置された細胞７同士に相互作用を生じさせることが可能となる。そのため、細胞７の相互作用を好適に観察することができる。
【００２２】
また、凹部３を複数個設ける場合の一例として、凹部３のピッチは０．３〜０．４ｍｍに設定することが挙げられる。ここで、ピッチとは、ある凹部３の中心位置から隣り合う凹部３の中心位置までの寸法をいう（図１１、図１２参照）。このようにすると、凹部３内にゲル状物質５を充填する機器にもよるが、複数個の凹部３に対して同時にゲル状物質５を充填することができるので、本実施形態に係る細胞パターニング基板１０を用いて形成される、凹部３にゲル状物質５が充填された細胞パターニング基板２０（図２参照）を容易に製造できる。ゲル状物質５を充填する機器としては、例えば、インクジェットプリンタなどが挙げられる。凹部３の形成方法については後述する。
【００２３】
細胞非接触処理面４は、前記したように、細胞７との接触を妨げる機能を有する。そのため、凹部３に充填されたゲル状物質５の上に配置されている細胞７が、当該ゲル状物質５上から出て移動するのを行い難くしたり、ゲル状物質５上から出て細胞７が伸長するのを防いだりすることができる。つまり、ゲル状物質５が充填されている場所を除いて細胞非接触処理面４が存在するため、細胞７が細胞非接触処理面４への接触を拒むことになる（細胞７が細胞非接触処理面４に接着し難い）。そのため、ゲル状物質５が充填されている凹部３といった細胞７を培養したい特定の場所で、細胞７を培養することができる。
【００２４】
細胞非接触処理面４は、細胞７との親和性が低い物質を用いて、凹部３の凹内表面および基板２の表面を被覆することで好適に形成することができる。ここで、細胞７との親和性が低いとは、細胞７が接着し難いかまたは細胞７が接着しないことを意味しており、細胞７との親和性が低い物質とは、そのような作用を有する物質を意味している。このような物質としては、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣモノマー、ＭＰＣポリマー）などが挙げられる。なお、細胞非接触処理面４は、これらの物質を用いて形成されるため、極めて薄いものではあるが所定の厚さを有しており、層状の構造物であると解することもできる。細胞非接触処理面４を形成するための処理方法については後述する。
【００２５】
次に、本実施形態に係る細胞パターニング基板の好適な態様について説明する。図２、図３、図４、図５はそれぞれ、本実施形態に係る細胞パターニング基板２０、３０、４０、５０の構成を説明する要部拡大図である。
【００２６】
図２に示す細胞パターニング基板２０は、前記した細胞パターニング基板１０を用いることで好適に得ることができる。
図２に示すように、細胞パターニング基板２０は、基板２と、この基板２の表面から所定の深さをもって設けられた凹部３と、前記凹部３の凹内表面および基板２の表面を被覆し、細胞７（図４、図５参照）との接触を妨げる細胞非接触処理面４と、前記細胞非接触処理面４で被覆されている前記凹部３内に充填されたゲル状物質５と、を有している。
細胞パターニング基板２０の構成要素のうち、基板２、凹部３および細胞非接触処理面４は、細胞パターニング基板１０で述べたものと同様であるので説明を省略し、以下では細胞パターニング基板２０と細胞パターニング基板１０との相違点であるゲル状物質５について説明する。
【００２７】
ゲル状物質５は、前記したように、細胞非接触処理面４で被覆されている凹部３内に充填されている。ゲル状物質５は、凹部３内に充填された後、その上に細胞７が配置されてこれを保持するものである。このようにすると、ゲル状物質５が充填されている場所を除いて細胞非接触処理面４が存在するため、細胞７が細胞非接触処理面４への接触を拒むことになる。そのため、ゲル状物質５が充填されている凹部３といった細胞７を培養したい特定の場所で、細胞７を培養することができる。
【００２８】
ゲル状物質５としては、例えば、シリコーン樹脂、エポキシ樹脂、ウレタン樹脂、フッ素樹脂などを用いることができる。これらの中でもシリコーン樹脂が好ましく、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）がより好ましい。シリコーン樹脂を用いた場合、配置した細胞７が生じる微小な力を受けたり、細胞７が移動したりした際に、シリコーン樹脂の表層にシワを発生させることができる。従って、当該シワを観察することで、細胞７が生じる微細・微弱な力や移動した様子を可視化および／または定量化することができる。
【００２９】
ゲル状物質５の硬さ（例えば、ヤング率）は、例えば、５０Ｐａから５００ｋＰａであることが好ましい。このようにすると、人や自然に近い様々な状態を模擬した硬さ（軟らかさ）で細胞７を培養することができる。そのため、細胞パターニング基板２０は、例えば、神経細胞などの細胞収縮力が小さな細胞７でも好適に培養することができる。
【００３０】
ゲル状物質５の硬さは、ゲル状物質５の架橋度を変更することによって調節することができる。本実施形態におけるゲル状物質５は非常に軟らかく、流動性を有し得るものである。しかし、前記したように本実施形態では凹部３を設けてこの中にゲル状物質５を充填しているので、自重で崩壊したり、境界面を最小化する円形状をとったりしない。そのため、このように軟らかいゲル状物質５であっても、基板２にパターニングすることができる。ゲル状物質５の硬さは、例えば、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いることで測定することができる。
【００３１】
基板２の表面とゲル状物質５の表面との段差は、約±１０μｍ以内であることが好ましい。このようにすると、基板２の表面とゲル状物質５の段差が小さいので、細胞７に与える影響を小さくできる。そのため、細胞７がおかしな挙動を示し難くなる。すなわち、基板２とゲル状物質５の境界に段差があることをほぼ認識させずに細胞７を培養できるため、細胞パターニング基板２０の形状による細胞７への影響を軽減することができる。基板２の表面とゲル状物質５の表面との段差は、約±１μｍ以内であることがより好ましい。このようにすると、基板２とゲル状物質５の境界に段差があることをより認識させずに細胞７を培養できるため、細胞パターニング基板２０の形状による細胞７への影響をより軽減することができる。
【００３２】
図３に示すように、ゲル状物質５は、その表面に細胞７との親和性が高い細胞親和性薄膜６を有していることが好ましい。細胞親和性薄膜６を有する細胞パターニング基板を「細胞パターニング基板３０」と呼称する。ゲル状物質５が前記した細胞親和性薄膜６を有していると、細胞７との親和性が高くなるため、さらに安定して細胞７を培養することができる。また、細胞親和性薄膜６に生じるシワを観察することで、細胞７が発揮する力を可視化することができる。なお、細胞親和性薄膜６は、細胞７に対するゲル状物質５の親和性が高く、培養や実験等において細胞７を十分に保持できる場合は設けなくてもよい。
【００３３】
細胞パターニング基板３０の細胞親和性薄膜６は、凹部３に充填したゲル状物質５に対して、例えば、プラズマ照射、コロナ放電照射、ＵＶ照射などを行って表面を改質することによって得ることができる。これらの改質処理は大気中、すなわち酸素を含む雰囲気で行われることが好ましい。改質処理は前記した中でもプラズマ照射が好ましい。改質処理における照射時間やプラズマ発生電流などを変更することにより、ゲル状物質５の表面に形成される細胞親和性薄膜６の硬さおよび細胞７との接着親和性を調節することができる。なお、改質とは、細胞親和性薄膜６の表面の炭化水素基の一部または全部を酸素を含む官能基に置換することをいう。酸素を含む官能基に置換するとは、例えば、Ｓｉ−ＣＨ３基をＳｉ−ＯＨ基、Ｓｉ−ＣＯＯＨ基などに置換することをいう。
【００３４】
ゲル状物質５が細胞親和性薄膜６を有する場合、ゲル状物質５の硬さ（例えば、ヤング率）は、細胞親和性薄膜６を有していない場合と同様、例えば、５０Ｐａから５００ｋＰａであることが好ましい。このようにすると、人や自然に近い様々な状態を模擬した硬さ（軟らかさ）で細胞７を培養することができる。そのため、細胞パターニング基板３０は、例えば、神経細胞などの細胞収縮力が小さな細胞７でも好適に培養することができる。
【００３５】
細胞親和性薄膜６を有するゲル状物質５の硬さは、細胞親和性薄膜６を有していない場合と同様、ゲル状物質５の架橋度を変更することによって調節することができる。また、細胞親和性薄膜６を有するゲル状物質５の硬さは、前記したように、前記改質処理によっても調節することができる。本実施形態におけるゲル状物質５は非常に軟らかく、流動性を有し得るものである。しかし、前記したように本実施形態では凹部３を設けてこの中にゲル状物質５を充填しているので、自重で崩壊したり、境界面を最小化する円形状をとったりしない。そのため、このように軟らかいゲル状物質５であっても、基板２にパターニングすることができる。細胞親和性薄膜６が形成されたゲル状物質５の硬さも、例えば、ＡＦＭを用いることで測定することができる。
【００３６】
ゲル状物質５が細胞親和性薄膜６を有する場合、基板２の表面とゲル状物質５の表面との段差、より具体的には、図３に示すように、基板２の表面（細胞非接触処理面４の表面）と細胞親和性薄膜６の表面との段差は、約±１０μｍ以内であることが好ましい。なお、細胞親和性薄膜６は、前記したように、ゲル状物質５の表面を改質することで得られるものであり、ヤング率は変化するものの、ゲル状を維持している。ゲル状物質５が細胞親和性薄膜６を有する場合において、基板２の表面とゲル状物質５の表面との段差をこのようにすると、基板２の表面と細胞親和性薄膜６の表面との段差が小さいので、細胞７に与える影響を小さくできる。そのため、細胞７がおかしな挙動を示し難くなる。すなわち、基板２とゲル状物質５（細胞親和性薄膜６）の境界に段差があることをほぼ認識させずに細胞７を培養できるため、細胞パターニング基板３０の形状による細胞７への影響を軽減することができる。基板２の表面とゲル状物質５の表面との段差（より具体的には、図３に示すように、基板２の表面と細胞親和性薄膜６の表面との段差）は、約±１μｍ以内であることがより好ましい。このようにすると、基板２とゲル状物質５（細胞親和性薄膜６）の境界に段差があることをより認識させずに細胞７を培養できるため、細胞パターニング基板３０の形状による細胞７への影響をより軽減することができる。
【００３７】
以上に説明した本実施形態に係る細胞パターニング基板２０は、図４に示すように、凹部３に充填されたゲル状物質５の上に細胞７が配置されることによって、任意の位置および形状に細胞７が配置された（パターニングされた）細胞パターニング基板４０となる。
また、以上に説明した本実施形態に係る細胞パターニング基板３０は、図５に示すように、凹部３に充填されたゲル状物質５の細胞親和性薄膜６の上に細胞７が配置されることによって、任意の位置および形状に細胞７が配置された（パターニングされた）細胞パターニング基板５０となる。
【００３８】
なお、細胞パターニング基板２０のゲル状物質５上への細胞の配置、および、細胞パターニング基板３０の細胞親和性薄膜６上への細胞７の配置は、次のようにして行うことができる。
例えば、培養液や緩衝液などとともに細胞７を細胞パターニング基板２０（３０）上に幡種して、確率的に細胞７をゲル状物質５に（細胞親和性薄膜６に）付着させることで行うことができる。また、任意の細胞ピッキング装置（図示せず）を用いて細胞７をゲル状物質５上に（細胞親和性薄膜６上に）配置することで行うことができる。
【００３９】
細胞パターニング基板４０（５０）を用いると、任意の時間継続してまたは適時に光学顕微鏡等でゲル状物質５の上に（細胞パターニング基板５０では細胞親和性薄膜６の上に）配置された細胞７を観察することができる。このとき、細胞パターニング基板４０（５０）は、凹部３内にゲル状物質５を充填しているので、従来よりも軟らかいゲル状物質５とすることができる。そのため、細胞パターニング基板４０（５０）は、従来よりも軟らかいゲル状物質５の上で（細胞パターニング基板５０では具体的には細胞親和性薄膜６の上で）細胞７を培養することができるとともに、培養する細胞７の形状を凹部３の平面視の形状に制御することができる。また、このとき、細胞パターニング基板４０（５０）は、凹部３にゲル状物質５を充填しているので、自重で崩壊したり、境界面を最小化する円形状をとったりし難い。そのため、細胞パターニング基板４０（５０）は、細胞７を好適に保持することができる。さらに、細胞パターニング基板４０（５０）は、凹部３にゲル状物質５を充填しているので、例えば、長時間の観察や薬物暴露実験などの流れがある環境下でもゲル状物質５が崩壊することなく、細胞培養を継続することができる。
【００４０】
（細胞パターニング基板の製造方法）
次に、図６を参照して、本実施形態に係る細胞パターニング基板の製造方法の好適な態様について説明する。なお、以下の製造方法に関する説明において、細胞パターニング基板１０、２０、３０、４０、５０と共通する構成要素については詳細な説明を省略する。
【００４１】
図６に示すように、本製造方法は、凹部形成工程Ｓ１と、細胞非接触処理工程Ｓ２と、を有する。
凹部形成工程Ｓ１は、基板２の表面に所定の深さの凹部３を形成する工程である。凹部形成工程Ｓ１は、例えば、基板２に対して、ドライエッチング、ウェットエッチング、機械加工、放電加工などで行うことができる。本実施形態においてはこれらの中でもドライエッチングが好ましく、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）がより好ましい。ＲＩＥは、ドライエッチングに分類される微細加工技術の一つである。ＲＩＥは、反応室内でエッチングガスに電磁波などを与えてプラズマ化し、同時に試料を置く陰極に高周波電圧を印加することでイオンによるスパッタリングとエッチングガスの化学反応とが同時に起こり、微細加工に適した高い精度でエッチングを行うことができる。
【００４２】
凹部形成工程Ｓ１においてＲＩＥで凹部３を形成する場合、次のようにして行うことができる。なお、以下の例では、感光した部分が溶解するポジ型のフォトレジストを用いている。例えば、基板２上にフォトレジストをスピンコートやスプレーコートなどで塗布する。次いで、基板２上に塗布したフォトレジストの上に、凹部３に対応する部分が開口しているマスクを載せて紫外線やエキシマレーザ等で露光する。次いで、マスクを除き、エッチング装置の反応室内に基板２を入れてエッチングガスを導入し、電磁波などを与えてプラズマ化し、高周波電圧を印加する。このようにすることで基板２に凹部３を形成することができる。なお、エッチングガスは、ＲＩＥで一般的に用いられるガスであれば任意のものを用いることができる。電磁波および高周波電圧は、ＲＩＥで一般的に設定されている条件であれば任意に設定することができる。基板２に凹部３を形成したら、フォトレジストを除去する。このようにすることで、基板２に凹部３を好適に形成することができる。
【００４３】
細胞非接触処理工程Ｓ２は、基板２の表面および凹部３を、細胞７との接触を妨げる細胞非接触処理面４に処理する工程である。細胞非接触処理工程Ｓ２の好適な例として以下の処理が挙げられる。
例えば、ＢＳＡをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に１％（ｗ／ｗ）の濃度で溶解して１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液を調製する。そして、凹部３を設けた基板２をこの１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液に浸して一晩静置し、その後ＰＢＳで洗浄する。
また、例えば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンをエタノールに０．５質量％の濃度で溶解し、０．５％２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン含有エタノール溶液（以下、単にエタノール溶液という）を調製する。次いで、凹部３を設けた基板２をこのエタノール溶液に１分間浸す。次いで、前記エタノール溶液から基板２を取り出し、室温で乾燥させるか、または５０℃で１時間保持して乾燥させる。
細胞非接触処理工程Ｓ２として上記いずれかの処理を行うことで、基板２の表面および凹部３を、細胞７との接触を妨げる細胞非接触処理面４とすることができる。
以上の工程を順次行うことで、従来よりも軟らかいゲル状物質５を安定して形状を制御しつつ配置することができる細胞パターニング基板１０を好適に製造することができる。
【００４４】
次に、図７〜１０を参照して、本実施形態に係る細胞パターニング基板の製造方法の好適な態様について説明する。
図７に示すように、本製造方法は、凹部形成工程Ｓ１と、細胞非接触処理工程Ｓ２と、充填工程Ｓ３と、を有する。
本製造方法の凹部形成工程Ｓ１および細胞非接触処理工程Ｓ２は、前記した細胞パターニング基板１０の製造方法の凹部形成工程Ｓ１および細胞非接触処理工程Ｓ２と同様であるので説明を省略し、相違点である充填工程Ｓ３について以下に説明する。
【００４５】
充填工程Ｓ３は、細胞非接触処理工程Ｓ２の後に行う工程であり、細胞非接触処理面４に処理されている凹部３内にゲル状物質５を充填する工程である。この工程により、凹部３内にゲル状物質５が充填された細胞パターニング基板２０（図２参照）を好適に製造することができる。このようにして製造された細胞パターニング基板２０は、凹部３に充填されたゲル状物質５を除いて細胞非接触処理面４が存在するため、細胞７が細胞非接触処理面４への接触を拒むことになる。そのため、ゲル状物質５が充填されている凹部３といった細胞７を培養したい特定の場所で、細胞７を培養することができる。
【００４６】
充填工程Ｓ３は、前記したように、例えば、インクジェットプリンタ（図示せず）などを用いて行うことができる。インクジェットプリンタを用いる場合、ゲル状物質５は、ゾル（コロイド溶液）の状態で凹部３内に充填させ、充填後に任意の方法でゲル化させてゲル状物質５とするのが好ましい。なお、インクジェットプリンタを用いる場合であって、凹部３が複数個基板２に設けられている場合、凹部３の形成間隔は、インクジェットプリンタのノズル（図示せず）の配置間隔に合わせて設定することが好ましい。このようにすると、凹部３へのゾルの充填をスムーズ、迅速かつ容易に行うことができる。充填工程Ｓ３を行う場合、基板２とインクジェットプリンタとがそれぞれ所定の位置となるよう予め設定しておくのが好ましく、凹部３とインクジェットプリンタのノズルの位置とが一致するよう位置決め用のカメラ（図示せず）等を用いて精緻に制御（位置合わせ）することがより好ましい。また、このような精緻な制御を行うため、通常稼働するインクジェットプリンタのノズルに加えて、基板２を設置する設置台も基板２の設置箇所を水平方向（横方向（Ｘ方向）および縦方向（Ｙ方向））および垂直方向（高さ方向（Ｚ方向））に稼働できるようにアクチュエータおよび任意の動力伝達機構（いずれも図示せず）を備えていることが好ましい。
【００４７】
凹部３内へのゾルの充填は、凹部３への充填容量が少ない場合は１回で済ませてもよいが、凹部３への充填容量が多い場合は複数回に分けて行うことが好ましい。凹部３に充填したゾルのゲル化は、用いるゲル状物質５に応じて適宜の手法を適用できる。ゲル化の条件（例えば、架橋度）を変更することでゲル状物質５の硬さ（軟らかさ）を適宜に調節できる。ゲル状物質５の硬さは、例えば、５０Ｐａから５００ｋＰａとすることができる。このようにすると、人や自然に近い様々な状態を模擬した硬さ（軟らかさ）で細胞７を培養することができる。そのため、細胞パターニング基板２０は、例えば、神経細胞などの細胞収縮力が小さな細胞７でも好適に培養することができる。なお、これは後記する細胞パターニング基板３０のゲル状物質５についても同様である。
【００４８】
凹部３に充填したゾルをゲル化させる際に溶媒等が揮発して容量が減ることがあるので、１回で済ませる場合も、複数回に分けて行う場合も、これを考慮してゾルを充填することが好ましい。ゾルの充填を複数回に分けて行う場合、少量のゾルを充填しゲル化するという操作を複数回繰り返すことが好ましい。このようにすると、所望の容量のゲル状物質５を精度良く凹部３に充填することができる。そのため、前述したように、基板２の表面とゲル状物質５の表面との段差が約±１０μｍ以内となるように充填することや、基板２の表面とゲル状物質５の表面との段差が約±１μｍ以内となるように充填することを比較的容易に行うことができる。このようにすると、基板２とゲル状物質５の境界に段差があることをほぼ認識させずに細胞７を培養できるため、細胞パターニング基板２０の形状による細胞７への影響を軽減することができる。なお、これは後記する細胞パターニング基板３０における基板２の表面とゲル状物質５の表面（細胞親和性薄膜６の表面）との段差についても同様である。
【００４９】
製造した細胞パターニング基板２０を使用する際は、図８に示すように、充填工程Ｓ３後に細胞配置工程Ｓ５を行って、細胞パターニング基板２０のゲル状物質５の上に細胞７を配置する。このようにすることで、図４に示す細胞パターニング基板４０を好適に製造することができる。なお、図８に示す凹部形成工程Ｓ１、細胞非接触処理工程Ｓ２、充填工程Ｓ３は、前記した製造方法の凹部形成工程Ｓ１、細胞非接触処理工程Ｓ２、充填工程Ｓ３と同様であるので説明を省略し、相違点である細胞配置工程Ｓ５について以下に説明する。
【００５０】
細胞配置工程Ｓ５は、培養液や緩衝液などとともに細胞７を細胞パターニング基板２０上に幡種して、確率的に細胞７をゲル状物質５に付着させることにより、行うことができる。また、細胞配置工程Ｓ５は、任意の細胞ピッキング装置（図示せず）を用いて細胞７をゲル状物質５上に配置することにより、行うことができる。このようにして製造された細胞パターニング基板４０を用いると、任意の時間継続してまたは適時に光学顕微鏡等でゲル状物質５の上に配置された細胞７を観察することができる。このとき、細胞パターニング基板４０は、凹部３内にゲル状物質５を充填しているので、従来よりも軟らかいゲル状物質５であっても好適に用いることができる。そのため、細胞パターニング基板４０は、従来よりも軟らかいゲル状物質５上で細胞７を培養することができるとともに、培養する細胞７の形状を凹部３の平面視の形状に制御することができる。また、このとき、細胞パターニング基板４０は、凹部３にゲル状物質５を充填しているので、自重で崩壊したり、境界面を最小化する円形状をとったりしないことから、細胞７を好適に保持することができる。さらに、細胞パターニング基板４０は、凹部３にゲル状物質５を充填しているので、例えば、長時間の観察や薬物暴露実験などの流れがある環境下でもゲル状物質５が崩壊することなく、細胞培養を継続することができる。
【００５１】
また、図９に示すように、本製造方法は、凹部形成工程Ｓ１と、細胞非接触処理工程Ｓ２と、充填工程Ｓ３と、細胞親和性薄膜形成工程Ｓ４と、を有する。
本製造方法の凹部形成工程Ｓ１、細胞非接触処理工程Ｓ２および充填工程Ｓ３は、前記した製造方法の凹部形成工程Ｓ１、細胞非接触処理工程Ｓ２および充填工程Ｓ３と同様であるので説明を省略し、相違点である細胞親和性薄膜形成工程Ｓ４について以下に説明する。
【００５２】
細胞親和性薄膜形成工程Ｓ４は、充填工程Ｓ３の後に行う工程であり、この工程を行うことにより、細胞親和性薄膜６を有する細胞パターニング基板３０（図３参照）を好適に製造することができる。細胞親和性薄膜形成工程Ｓ４は、ゲル状物質５の表面に細胞７との親和性の高い細胞親和性薄膜６を形成する工程である。細胞親和性薄膜形成工程Ｓ４としては、前述したように、例えば、凹部３に充填したゲル状物質５に対してプラズマ照射、コロナ放電照射、ＵＶ照射などを行うことが挙げられる。このようにすると、ゲル状物質５の表面を改質して細胞親和性薄膜６を形成することができる。細胞親和性薄膜形成工程Ｓ４によってゲル状物質５の表面に細胞親和性薄膜６が形成されると、さらに安定して細胞７を培養することができる。また、細胞親和性薄膜６に生じるシワを観察することで、細胞７が発揮する力を可視化することができる。
【００５３】
製造した細胞パターニング基板３０を使用する際は、図１０に示すように、細胞親和性薄膜形成工程Ｓ４後に細胞配置工程Ｓ５を行って、細胞パターニング基板３０の細胞親和性薄膜６の上に細胞７を配置する。このようにすることで、図５に示す細胞パターニング基板５０を好適に製造することができる。なお、図１０に示す凹部形成工程Ｓ１、細胞非接触処理工程Ｓ２、充填工程Ｓ３および細胞親和性薄膜形成工程Ｓ４は、前記した製造方法の凹部形成工程Ｓ１、細胞非接触処理工程Ｓ２、充填工程Ｓ３および細胞親和性薄膜形成工程Ｓ４と同様であるので説明を省略し、相違点である細胞配置工程Ｓ５について以下に説明する。
【００５４】
細胞配置工程Ｓ５は、培養液や緩衝液などとともに細胞７を細胞パターニング基板３０上に幡種して、確率的に細胞７を細胞親和性薄膜６に付着させることにより、行うことができる。また、細胞配置工程Ｓ５は、任意の細胞ピッキング装置（図示せず）を用いて細胞７を細胞親和性薄膜６上に配置することにより、行うことができる。このようにして製造された細胞パターニング基板５０を用いると、任意の時間継続してまたは適時に光学顕微鏡等で細胞親和性薄膜６の上に配置された細胞７を観察することができる。このとき、細胞パターニング基板５０は、凹部３内にゲル状物質５を充填し、細胞親和性薄膜６を形成しているので、従来よりも軟らかいゲル状物質５であっても好適に用いることができる。そのため、細胞パターニング基板５０は、従来よりも軟らかいゲル状物質５を用い、さらにその表面に形成した細胞親和性薄膜６上で細胞７を培養することができるとともに、培養する細胞７の形状を凹部３の平面視の形状に制御することができる。また、このとき、細胞パターニング基板５０は、凹部３にゲル状物質５を充填しているので、自重で崩壊したり、境界面を最小化する円形状をとったりしないことから、細胞７を好適に保持することができる。さらに、細胞パターニング基板５０は、凹部３にゲル状物質５を充填しているので、例えば、長時間の観察や薬物暴露実験などの流れがある環境下でもゲル状物質５が崩壊することなく、細胞培養を継続することができる。
【実施例】
【００５５】
次に、実施例により、本発明の内容をより具体的に説明するが、本発明の内容は以下に限定されるものではない。
【００５６】
（１）細胞パターニング基板の製造
基板（松波硝子工業株式会社製角カバーグラス）の一方の面にポジ型のフォトレジスト（ＲＯＨＭ  ａｎｄ  ＨＡＡＳ社製Ｓ１８１３Ｇ）をスピンコートで塗布し、凹部に対応する部分が開口しているマスクを載せて紫外線で露光した。次いで、マスクを除き、エッチング装置（サムコ株式会社製平行平板型ＲＩＥ装置  ＲＩＥ−１０ＮＲ）の反応室内にエッチングガスであるＣＨＦ３を導入した。
【００５７】
次いで、電磁波を与えてプラズマ化し、高周波電圧（電圧：２５０Ｗ）を印加して反応性イオンエッチングを行い、基板に複数個の凹部を形成した。凹部は、一辺が０．１５ｍｍの正方形（面積：０．０２２５ｍｍ２）であるものと、半径が０．０８５ｍｍの円形（面積：０．０２２５ｍｍ２）であるものとの２種類を形成した。凹部は、正方形であるか円形であるかを問わず、横方向に０．３９６９ｍｍのピッチで、縦方向に０．３ｍｍのピッチで形成した（図１１および図１２参照。なお、図１１および図１２はそれぞれ凹部３の形成例を説明する説明図である。）。凹部の深さは、３μｍとした。基板に凹部を形成後、フォトレジストを除去した。
【００５８】
次いで、ＢＳＡをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に１％（ｗ／ｗ）の濃度で溶解して１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液を調製した。そして、凹部を設けた基板をこの１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液に浸して一晩静置し、その後ＰＢＳで洗浄した。このようにして、凹部の凹内表面および基板の表面に細胞との接触を妨げる細胞非接触処理面を形成し、細胞パターニング基板を製造した。
【００５９】
次いで、製造した細胞パターニング基板の凹部（この凹部は前記したように細胞非接触処理面が形成されている）内にゲル状物質を形成するゾル（東レ・ダウコーニング株式会社製ＳＩＬＰＯＴ  １８４と東京化成工業株式会社製Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  Ｍｙｒｉｓｔａｔｅとを体積比１：５で混合）を充填した。凹部内へのゾルの充填は、試作したインクジェットプリンタを用いて行った。凹部内へのゾルの充填は、位置決め用のカメラ等を用いて精緻に凹部とインクジェットプリンタのノズルとの位置決めを行って実施した。凹部内へのゾルの充填量は１回あたり８ピコリットル（ｐＬ）とし、充填したゾルをゲル化させることを複数回繰り返して、基板の表面とゲル状物質の高さとがほぼ同じ（基板の表面とゲル状物質の表面との段差が±１μｍ以内）となるようにした。それぞれの凹部における基板の表面とゲル状物質の表面との段差が±１μｍ以内であることは、光干渉顕微鏡システムＢＷ−Ｓ５００（ニコン社製）を使用して確認した。このようにして、凹部にゲル状物質が充填された細胞パターニング基板を製造した。そして、この細胞パターニング基板の凹部に充填されたゲル状物質に対して、大気中でプラズマ放電（Ｈａｒｒｉｃｋ  Ｐｌａｓｍａ社製ＰＤＣ−３２Ｇ；出力設定「Ｈｉ」）を３０秒間行い、当該ゲル状物質の表面を改質して細胞親和性薄膜を形成した。このように処理した細胞パターニング基板のゲル状物質の硬さをＡＦＭ（ＪＰＫインスツルメンツ社製ＮａｎｏＷｉｚａｒｄ）で測定したところ、ヤング率は３００ｋＰａであった。
【００６０】
（２）細胞の配置・培養・観察
次に、細胞パターニング基板の上に細胞（ラット大動脈平滑筋）を幡種し、複数の凹部にそれぞれ充填されたゲル状物質の細胞親和性薄膜の上に当該細胞を確率的に１〜１０個となるように配置して、培養した。図１３に、細胞非接触処理面４を形成した細胞パターニング基板の凹部３に充填したゲル状物質５の細胞親和性薄膜６の上に単一細胞（細胞７）を配置して培養した様子を撮影した光学顕微鏡写真を示す。図１３では、破線で示すように、平面視で正方形の凹部３の形状に沿って細胞７が伸展しつつある様子が撮影されている。この例では、凹部３が、細胞１〜２個配置できるサイズであるため、単一細胞は凹部３の形状に完全に従ってはいないが、凹部３の縁に接触する部分では直線的な形状となっており、細胞７の形状を制御できることが確認された。なお、凹部の形状が平面視で円形であるものについても同様に凹部の形状に沿って細胞が伸展していた（図示省略）。
【００６１】
（３）長時間の細胞の観察および薬物暴露
細胞パターニング基板の凹部に充填したゲル状物質の細胞親和性薄膜の上で細胞（ラット大動脈平滑筋）を３日間培養した。その後、細胞がゲル状物質に接着するのに必要な接着タンパク質を分解するトリプシンを用いてトリプシン処理を行った。トリプシン処理は、トリプシン溶液（リン酸緩衝生理食塩水に体積比で、０．２５％のトリプシン溶液と２％のＥＤＴＡ溶液を添加して調製した）を用意し、培地を除去した後、当該トリプシン溶液をピペッティングにより投与した。その様子を図１４に示す。図１４は、ピペッティングによるトリプシン処理の開始直後（ｔ＝０ｓｅｃ）、４秒後（ｔ＝４ｓｅｃ）、８秒後（ｔ＝８ｓｅｃ）、１２秒後（ｔ＝１２ｓｅｃ）の様子を光学顕微鏡で撮影したものを図中左側から右側に向かって経時的に掲載している。この検討から、細胞パターニング基板は、３日間という長時間にわたって細胞を保持して培養できることが確認された。そして、図１４に示すように、トリプシン処理を１２秒間行ったところ、細胞をゲル状物質から剥離させることができた。これにより、トリプシン処理のような薬物に暴露した場合であってもゲル状物質が崩壊することなく、細胞のみを剥離できることが確認された。
【００６２】
以上、本発明に係る細胞パターニング基板および細胞パターニング基板の製造方法について、実施形態および実施例によって詳細に説明したが本発明の主旨はこれに限定されるものではなく、特許請求の範囲に基づいて広く解釈されなければならない。
【符号の説明】
【００６３】
１０、２０、３０、４０、５０  細胞パターニング基板
２      基板
３      凹部
４      細胞非接触処理面
５      ゲル状物質
６      細胞親和性薄膜
７      細胞
Ｓ１    凹部形成工程
Ｓ２    細胞非接触処理工程
Ｓ３    充填工程
Ｓ４    細胞親和性薄膜形成工程
Ｓ５    細胞配置工程
【図１】
2020025513.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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