(57)【要約】【課題】新規な細胞内酸化ストレス抑制剤及びその用途を提供する。【解決手段】本発明の細胞内酸化ストレス抑制剤は、アルバローズの水溶性エキスを有効成分とする。この細胞内酸化ストレス抑制は、化粧品学的、皮膚病学的及び／又は薬学的に許容される添加剤とともに皮膚外用剤として用いられる。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルバローズの水溶性エキスを有効成分とする細胞内酸化ストレス抑制剤。
【請求項２】
前記アルバローズの水溶性エキスは、アルバローズの水蒸気蒸留後の蒸留釜内の残渣から得られたものである、請求項１に記載の細胞内酸化ストレス抑制剤。
【請求項３】
細胞内酸化ストレスによる細胞死を抑制するための請求項１又は２に記載の細胞内酸化ストレス抑制剤。
【請求項４】
細胞内酸化ストレスによる皮膚コラーゲン量の減少を抑制するための請求項１〜３のいずれかに記載の細胞内酸化ストレス抑制剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の細胞内酸化ストレス抑制剤、並びに化粧品学的、皮膚病学的及び／又は薬学的に許容される添加剤を含有する、細胞内酸化ストレス抑制用皮膚外用剤。
【請求項６】
化粧料用である、請求項５に記載の細胞内酸化ストレス抑制用皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内酸化ストレス抑制剤に関し、より詳細には特定のバラエキスを有効成分とする細胞内酸化ストレス抑制剤及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
外部環境と接触するヒトの肌や皮膚は、常に紫外線、乾燥状態や酸化状態にさらされている。これらの外部環境は、肌の乾燥、シミ、シワやたるみといった皮膚の問題を引き起こす。これらの問題は、紫外線等の外部環境による細胞内活性酸素種（Ｏ２・−、Ｈ２Ｏ２、１Ｏ２及びＯＨ・、以下、ＲＯＳという）の生成、細胞内酸化ストレスの亢進、そして細胞内酸化ストレスによる分子損傷、細胞への影響や細胞死と関連する（非特許文献１）。
【０００３】
人体は、抗酸化物質（Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ、以下、ＡＯＸという）を備えており、通常、ＡＯＸとＲＯＳとがバランスを保っている。バランスのとれた状態では、ＲＯＳは、一酸化窒素と反応してその作用を消滅させる、体内に侵入した細菌を取り除くといった役割を果たす。皮膚が紫外線曝露、乾燥や酸化状態にさらされると、ＲＯＳレベルが上昇する。ＲＯＳの蓄積がＡＯＸよりも過剰となってＡＯＸとＲＯＳとのバランスがくずれると、細胞内酸化ストレスが起こる。細胞内酸化ストレスは、脂質や脂肪酸、アミノ酸、タンパク質、核酸等の分子を損傷させ、その結果、コラーゲンやヒアルロン酸で構成される皮膚マトリックスの変質、細胞死等の重要な細胞機能に悪影響を与える。細胞内酸化ストレスは、高血圧、動脈硬化、糖尿病等の生活習慣病や癌疾患にも関与する。したがって、ＲＯＳの過剰な蓄積と細胞内酸化ストレスの発生は、皮膚の老化や疾患にとって重大な問題である。
【０００４】
活性酸素を消去する物質として、従来、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ＢＨＡ等の抗酸化物質が知られている。現在、新規な抗酸化物質の探索も行われている。例えば、特許文献１は、ジャスミン、ローズ、ベチバー、及びローレルの一種以上の植物抽出物からなる抗酸化剤を提案する。この抗酸化剤を含む香料組成物を配合した皮膚外用剤は、香料としての機能に経皮的な抗酸化作用を賦与することができる。特許文献２は、ハイブリッド・ティー・ローズ又はその抽出物を含有する化粧品組成物を提案する。この化粧品組成物は、抗老化作用が高く、とりわけコラゲナーゼ活性阻害作用が高い。特許文献３は、ダマスクバラの溶媒抽出物を含有する化粧料を提案する。この化粧料は、抗酸化作用、抗炎症作用及び美白作用を有する抽出物を有効成分とする化粧料であって、肌の老化（シワ、たるみ等）の予防及び改善効果、肌のハリ、ツヤの向上効果、外的要因（紫外線や化学物質）による酸化ダメージ及び炎症から肌を保護する効果、並びにシミ、ソバカス、肝斑等を予防及び改善する効果を奏する。特許文献４は、β−エンドルフィン及びβ−エンドルフィン産生促進剤と、抗炎症剤とを含有してなる皮膚外用剤を提案する。β−エンドルフィン産生促進剤は、テルミナリアエキス、セイヨウオトギリソウエキス、トウキンセンカエキス、ジャイアントケルプエキス、又はローズウォーターから選択される。この皮膚外用剤は、抗酸化効果が相乗的に増強され、少量の配合により抗酸化剤の効果を十分に発揮し、皮膚中での活性酸素生成に起因する過酸化脂質の生成を抑制し、肌の炎症，肌荒れを防止あるいは改善する効果を有する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】J.G.Scandalios,”Oxidative stress:molecular perception and transduction of signals triggering antioxidant gene defenses”,Brazilian Journal of Medical and Biological Research (2005) 38:995-1014
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−２９１０３１（抗酸化香料組成物及びこれを含有する皮膚外用剤）
【特許文献２】特開２０１１−２３６１４７（ハイブリッド・ティー・ローズまたはその抽出物を含有する化粧品組成物、飲食品組成物及び医薬品組成物）
【特許文献３】特開２０１４−２４０３７５（化粧料）
【特許文献４】特開２００６−８５３７（皮膚外用剤）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、新規な細胞内酸化ストレス抑制剤及びその用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
バラ科バラ属の植物であるローズ（バラ）は、美を象徴する花として歴史的になじみがある植物である。ローズは、原種の数が多く古来、交配が繰りかえされてきたため、バラの登録品種数は４０，０００以上といわれている。中でも、アルバローズは、“白バラの祖”と言われており、爽やかで上品な香りを放つので、リラックス作用がある。本発明者は、意外にも、アルバローズの水溶性エキスには、細胞内酸化ストレス抑制作用があることを発見し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、アルバローズの水溶性エキスを有効成分とする細胞内酸化ストレス抑制剤を提供する。本発明書において、細胞内酸化ストレス抑制剤とは、正常状態よりも過剰量の細胞内ＲＯＳの生成を抑制する機能を有する組成物を意味する。
【０００９】
前記アルバローズの水溶性エキスは、特にアルバローズの水蒸気蒸留後の蒸留釜残渣から得られたものである。
【００１０】
前記細胞内酸化ストレス抑制剤は、細胞内酸化ストレスによる細胞死を抑制するために用いられる。
【００１１】
前記細胞内酸化ストレス抑制剤は、また、細胞内酸化ストレスによる皮膚コラーゲン量の減少を抑制するために用いられる。
【００１２】
本発明は、また、前記細胞内酸化ストレス抑制剤、並びに化粧品学的、皮膚病学的及び／又は薬学的に許容される添加剤を含有する、細胞内酸化ストレス抑制用皮膚外用剤を提供する。
【００１３】
細胞内酸化ストレス抑制用皮膚外用剤は、例えば化粧料用である。
【発明の効果】
【００１４】
アルバローズ水溶性エキスを有効成分とする本発明の細胞内酸化ストレス抑制剤によれば、細胞内酸化ストレス抑制作用に優れ、かつ天然の植物成分由来で安全性の高い組成物を提供可能である。本発明の細胞内酸化ストレス抑制剤は、例えば皮膚が紫外線、赤外線、大気中のオゾンやＳＯ２等に曝露された際のＲＯＳの生成、細胞死、皮膚コラーゲン量の減少等を抑制するために用いることができる。
【００１５】
従来、赤外線曝露の細胞内酸化ストレスに及ぼす影響が、あまりよくわかっていなかったところ、後述の実施例で、赤外線曝露の影響が明確となった。したがって、本発明の細胞内酸化ストレス抑制剤は、例えば炎天下での比較的長期にわたる赤外線曝露時のＲＯＳの生成や皮膚コラーゲン量の減少を抑制することができる。
【００１６】
上記細胞内ストレス抑制剤を配合した皮膚外用剤は、紫外線、赤外線、乾燥や酸化状態等のさまざまな外部環境により生ずる細胞内酸化ストレスを抑制する作用を有するので、特にＵＶ化粧品、抗老化化粧品等の化粧品用途が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＩＲ照射が皮膚マトリックス関連タンパク質に及ぼす影響を遺伝子別にｍＲＮＡ発現（相対値）として示すグラフである。ＣＣＮ１及びＴＩＭＰ−１は、ＩＲ照射で変化を示さなかったが、ＣＯＬＩＡ１は、有意なダウンレギュレーション、そしてＭＭＰ−１は、有意なアップレギュレーションを示した。ミクロフィブリル関連タンパク質の中では、フィブリリン−１（ＦＢＮ−１）がＩＲ照射によって有意なダウンレギュレーションを示した。ＩＲ照射は、また、ＩＬ−８／ＣＸＣＬ−８及びＨＳＰ７０も有意にアップレギュレートした。
【図２】皮膚マトリックス内の骨格構造繊維タンパク質であるＩ型コラーゲン量へのＩＲの影響を示すグラフである。図中、コラーゲン量（相対値）は、ＩＲを照射しない場合のコラーゲン量に対する各ＩＲエネルギーレベルでのコラーゲン量の倍率である。ＩＲ照射は、コラーゲン量をエネルギー依存的に有意に減少させる。
【図３】ヒト皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＳＦｓ）がＩＲ照射を受けた時の細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）の生成に与える影響を示すグラフである。図中、細胞内ＲＯＳ量（相対値）は、ＩＲを照射しない場合の細胞内ＲＯＳ量に対する各ＩＲエネルギーレベルでの細胞内ＲＯＳ量の倍率である。ＩＲ照射は、細胞内ＲＯＳをＩＲエネルギー依存的に増大させる。
【図４】ＩＲ照射時の細胞内ＲＯＳ生成のアルバローズ水溶性エキスによる抑制効果を示すグラフである。図の各アルバローズエキス濃度における左側の棒グラフはＩＲ未照射、そして右側の棒グラフは２５０ＪのＩＲ照射を示す。図中、細胞内ＲＯＳ量（相対値）は、アルバローズ水溶性エキス無添加かつＩＲ未照射の細胞内ＲＯＳ量を１としたときの、各濃度レベルでのＩＲ未照射及びＩＲ照射での細胞内ＲＯＳ量の倍率である。ＮＨＤＦｓ細胞をアルバローズ水溶性エキスで処理した細胞は、ＩＲを照射されても、細胞内ＲＯＳ上昇が抑制される。アルバローズ水溶性エキスは、ＩＲ照射由来の細胞内ＲＯＳを濃度依存的に抑制する。
【図５】過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）曝露時の細胞内ＲＯＳ生成のアルバローズ水溶性エキスによる抑制効果を示すグラフである。図の各アルバローズエキス濃度における左側の棒グラフはＨ２Ｏ２非曝露、そして右側の棒グラフはＨ２Ｏ２曝露を示す。図中、細胞内ＲＯＳ量（相対値）は、アルバローズ水溶性エキス無添加かつＨ２Ｏ２非曝露の細胞内ＲＯＳ量を１としたときの、各濃度レベルでのＨ２Ｏ２非曝露及びＨ２Ｏ２曝露での細胞内ＲＯＳ量の倍率である。細胞をＨ２Ｏ２に曝露すると細胞内ＲＯＳが増大するが、アルバローズ水溶性エキスで処理した細胞は、ＲＯＳの生成がアルバローズ水溶性エキスの濃度依存的に抑制される。アルバローズ水溶性エキスのＲＯＳ抑制効果は、活性酸素消去能が知られているＡＰＭの効果に匹敵する。
【図６】Ｈ２Ｏ２曝露時のコラーゲン量減少のアルバローズ水溶性エキスによる抑制効果を示すグラフである。図の各アルバローズエキス濃度における左側の棒グラフはＨ２Ｏ２非曝露、そして右側の棒グラフはＨ２Ｏ２曝露を示す。図中、コラーゲン量（相対値）は、アルバローズ水溶性エキス無添加かつＨ２Ｏ２非曝露のコラーゲン量を１としたときの、各濃度レベルでのＨ２Ｏ２非曝露及びＨ２Ｏ２曝露でのコラーゲン量の倍率である。コラーゲン量は、Ｈ２Ｏ２がもたらす細胞内ＲＯＳによって減少するが、アルバローズ水溶性エキスで処理された細胞では、コラーゲン減少率がアルバローズ水溶性エキス濃度依存的に抑制されている。
【図７】ＵＶＢ照射時の細胞死のアルバローズ水溶性エキスによる抑制効果を示すグラフである。アルバローズ水溶性エキスで処理されたＨａＣａＴ細胞は、ＵＶＢを照射されても、細胞生存率の低下が抑制される。アルバローズ水溶性エキスは、ＵＶＢ照射由来の細胞死を濃度依存的に抑制する。
【図８】ＵＶＡ照射時のコラーゲン量減少のアルバローズ水溶性エキスによる抑制効果を示すグラフである。図の各アルバローズエキス濃度における左側の棒グラフはＵＶＡ未照射、そして右側の棒グラフはＵＶＡ照射を示す。アルバローズ水溶性エキスで処理されたＮＨＤＦｓ細胞は、ＵＶＡを照射されても、皮膚コラーゲン量の低下が抑制される。アルバローズ水溶性エキスは、優れた抗老化作用を発揮する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下に示す本発明の一実施の形態によって、本発明を詳細に説明する。本発明の細胞内酸化ストレス抑制剤は、アルバローズの水溶性エキスを有効成分として含有する。
【００１９】
アルバローズ（学名ロサ・アルバ）は、ロサ・ダマスケナとロサ・カニナの自然交雑で生まれたと言われている、オールドローズの系統の一つである。本発明の細胞内酸化ストレス抑制剤に使用するアルバローズ原料は、花、花弁、がく、葉、茎、種子、根等でよく、好ましくは花、特に好ましくは花弁である。原料は、生物自体、凍結物、乾燥物、凍結乾燥物等のいずれでもよいが、抽出効率を上げるために、抽出前に裁断、粉砕等の微細化を行うことが好ましい。
【００２０】
アルバローズ水溶性エキスは、例えば蒸留釜内のアルバローズ原料と水との混合物を水蒸気蒸留にかけた際に、蒸留釜内の残渣中の水分、すなわち煮沸水から得ることができる。煮沸水から得られる水溶性エキスは、水蒸気蒸留によって油分が除かれて水溶性エキスのみが濃縮されている、沸点の高い成分が濃縮される等の点で有利である。また、アルバローズの水蒸気蒸留後の煮沸水は、通常は廃棄されてしまうところ、本発明によって有効利用が可能となる。水蒸気蒸留は、常法に基づく。
【００２１】
アルバローズ水溶性エキスは、また、アルバローズ原料を水、親水性有機溶媒、又はこれらの混合物からなる抽出溶媒中に浸漬して水溶性成分を抽出することによっても得ることができる。上記親水性有機溶媒の例として、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール，グリセロール、プロピレングリコール、３−ブチレングリコール等の低級アルコール；アセトン、メチルケトン等のケトン；エチルエーテル、イソプロピルエーテル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル；酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル等のカルボン酸エステル等が挙げられる。親水性有機溶媒は、一種単独、又は二種以上の併用であってもよい。好ましい抽出溶媒は、水である。溶剤抽出は、常温又は加温下で行われ、好ましくは加温下である。
【００２２】
上記の水蒸気蒸留時の蒸留釜に残る煮沸水や上記溶剤抽出時の親水性溶媒抽出物を、適宜、ろ過や遠心分離機にかけることによって、アルバローズ水溶性エキスを精製する。さらに、細胞内酸化ストレス抑制剤の効能を阻害しない限り、脱色処理、脱臭処理等の精製を行ってもよい。
【００２３】
精製されたアルバローズ水溶性エキスは、適宜、エバポレーション、凍結乾燥等の濃縮手段によって濃縮又は乾固してもよい。さらに、濃縮又は乾固したエキスを再度、水、アルコール等の溶媒に溶解してもよい。
【００２４】
本発明の細胞内酸化ストレス抑制剤中のアルバローズ水溶性エキスの配合量は、使用目的に応じて適宜決められるが、エキスの固形分として、通常、０．０１〜５質量％でよく、好ましくは０．０１〜１質量％であり、より好ましくは０．０１〜０．１質量％である。
【００２５】
アルバローズ水溶性エキスは、ＤＰＰＨラジカル消去活性能又はスーパーオキシド消去活性能で示される抗酸化性を示す。本発明では、アルバローズ水溶性エキスが、細胞内酸化ストレスによる細胞死、及び／又は皮膚コラーゲン量の減少を抑制するといった生理活性を発揮することが重要である。これらの生理活性に基づいて、本発明の細胞内酸化ストレス抑制剤は、細胞死、皮膚コラーゲン量の減少を抑制する等の用途に有用となる。
【００２６】
本発明は、また、前記細胞内酸化ストレス抑制剤、並びに化粧品学的、皮膚病学的及び／又は薬学的に許容される添加剤を含有する、細胞内酸化ストレス抑制用皮膚外用剤を提供する。
【００２７】
化粧品学的、皮膚病学的及び／又は薬学的に許容される添加剤の例には、水；エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、１，４−ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、ペンチレングリコール、イソプレングリコール、グルコース、マルトース、フルクトース、キシリトール、ソルビトール、マルトトリオース、エリスリトール等の多価アルコール；メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコール、イソブチルアルコール等の低級アルコール；オレイン酸、イソステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、ウンデシレン酸等の高級脂肪酸類；オリーブ油、トウモロコシ油、ツバキ油、マカデミアナッツ油、アボカド油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマシ油、サフラワー油、綿実油、ホホバ油、ヤシ油、パーム油等の油脂；カルナバロウ、キャンデリラロウ、ミツロウ、ラノリン等のロウ類；ソルビトール、マンニトール、グルコース、ショ糖、ラクトース、トレハロース等の糖類；メチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、メチルシクロポリシロキサン、オクタメチルシクロテトラシロキサン、オクタメチルシクロペンタシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、メチルハイドロジェンポリシロキサン等のシリコーン類；カラギーナン、キサンタンガム、ゼラチン、ペクチン、アガロース、アルギン酸塩、デキストリン、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、アラビアガム、カラヤガム、トラガントガム、タマリンドガム等の増粘剤；ラウロイル硫酸ナトリウム、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン等の非イオン界面活性剤、アルキルサルフェート塩、ノルマルドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤、ポリオキシエチレンドデシルモノメチルアンモニウムクロライド等の陽イオン界面活性剤；フェノキシエタノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、パラオキシ安息香酸エステル、安息香酸、サリチル酸とその塩類、ソルビン酸とその塩類、デヒドロ酢酸とその塩類、クロルクレゾール、ヘキサクロロフェン等の防腐剤；ベントナイト、スメクタイト、バイデライト、ノントロナイト、サポナイト、ヘクトライト、ソーコナイト、スチーブンサイト等の鉱物；ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化コバルト、群青、紺青、酸化チタン、酸化亜鉛等の無機顔料；赤色２０２号、黄色４号、青色４０４号等の着色料；香料；香油；ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＦ、ビタミンＫ等のビタミン類やジカプリル酸ピリドキシン、ジパルミチン酸ピリドキシン、ジパルミチン酸アスコルビル、モノパルミチン酸アスコルビル、モノステアリン酸アスコルビル等のビタミン誘導体；スクワラン、スクワレン、流動パラフィン等の高級脂肪族炭化水素類；セラミド、セレブロシド、スフィンゴミエリン等のスフィンゴ脂質；コレステロール、フィトステロール等のステロール類；フラボノイド、カロテノイド、タンニン類、没食子酸、トコフェロール、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）、チオレドキシン、チオレドキシンリダクターゼ、ブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール等の抗酸化剤；ステロイド系及び非ステロイド系抗炎症剤；パラアミノ安息香酸、パラアミノ安息香酸モノグリセリンエステル、アントラニル酸メチル、ホモメンチル−Ｎ−アセチルアントラニレート、パラメトキシケイ皮酸オクチル、エチル−４−イソプロピルシンナメート等の紫外線吸収剤；ｔ−シクロアミノ酸誘導体、コウジ酸、アスコルビン酸、ハイドロキノン、エラグ酸、ニコチン酸、レゾルシノール、トラネキサム酸、４−メトキシサリチル酸カリウム塩、マグノリグナン、４−ＨＰＢ、ヒドロキシ安息香酸、ビタミンＥ、α−ヒドロキシ酸、ＡＭＰ等の美白剤；グリセリン、１，３−ブチレングリコール（ＢＧ）、ジプロピレングリコール（ＤＰＧ）、ベタイン、トレハロース、ヒアルロン酸Ｎａ、水溶性コラーゲン、尿素等の保湿剤等が挙げられる。
【００２８】
本発明の細胞内酸化ストレス抑制剤は、ヒトを含む動物の皮膚に塗布されることにより、経皮的に吸収される。本発明の細胞内酸化ストレス抑制剤は、化粧品や医薬品用途の皮膚外用剤へ配合されることが好ましい。化粧料、皮膚外用薬等の皮膚外用剤に細胞内酸化ストレス抑制作用を付加することができる。
【００２９】
本発明の皮膚外用剤は、細胞内酸化ストレス抑制作用を有する化粧料として用いることが好ましい。化粧料の具体的用途としては、サンタン化粧品、美容液、保湿化粧水、柔軟化粧水、収れん化粧水等のスキンケア化粧品；ファーミング化粧品、アンチセルライト化粧品等のボディ化粧品；基礎化粧品（化粧水、乳液、クリーム）、ファンデーション、下地クリーム、フェイスパウダー、ウォータープルーフ等のメイクアップ化粧品；石鹸、シャンプー、リンス、入浴剤等の入浴料；毛髪剤、育毛剤等が挙げられる。
【００３０】
化粧料等の皮膚外用剤の形態は、上記用途に応じて、水剤、液剤、エアゾール、乳剤、乳液、エマルション、ローション、クリーム、軟膏、粉体又は固形物である。即効性の観点から、水剤、液剤、エアゾール、ローション、乳剤、乳液、エマルションに加工される。
【００３１】
本発明の皮膚外用剤への細胞内酸化ストレス抑制剤の配合量は、化粧料や医薬品の用途や効果に応じて適宜決められるが、エキスの固形分として、通常、０．０１〜５質量％でよく、好ましくは０．０１〜１質量％であり、より好ましくは０．０１〜０．１質量％である。
【００３２】
本発明の細胞内酸化ストレス抑制用皮膚外用剤の処方例を示す。しかし、本発明は、以下の処方例に限定されるものではない。
［処方例１］化粧水
【表１】
2020045288.tif 000003
【００３３】
［処方例２］乳液
【表２】
2020045288.tif 000004
【００３４】
［処方例３］クリーム
【表３】
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【００３５】
［処方例３］入浴剤
【表４】
2020045288.tif 000006
【実施例】
【００３６】
以下に、本発明に従う実施例を示すことにより、本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３７】
（１）アルバローズ水溶性エキスの調製
アルバローズの花部からなる原料を蒸留釜に収めて水蒸気蒸留処理に供して、水蒸気蒸留物と蒸留釜に残る蒸留残渣を得た。蒸留残渣中の含水率（すなわち、残渣中の煮沸水の含有率）は８６．７％であった。蒸留残渣をエバポレーターにかけて水を蒸発させることにより、アルバローズ水溶性エキス（固形分：０．９９質量％）を得た。
【００３８】
（２）培養細胞の準備
ヒト表皮角化細胞株（ＨａＣａＴ細胞）、及びヒト皮膚繊維芽細胞株（ＮＨＤＦｓ細胞）をクラボウ株式会社より入手し、それぞれ、５％ＦＢＳ補充ＤＭＥＭ培地にて５％ＣＯ２＋９５％エアーからなる雰囲気下、３７℃の温度で培養した。
【００３９】
（３）アルバローズ水溶性エキスの細胞毒性評価試験
培養したＨａＣａＴ細胞に上記アルバローズ水溶性エキスを表５に示す量のアルバローズ水溶性エキスを添加した。対照として、上記エキス処理をしないものを用意した。これらの処理液のＨａＣａＴの細胞生存率を、ニュートラルレッド（ＮＲ）試験（http://www.fdsc.or.jp/contract/device/d_cell.html）に従って測定した。対照（アルバローズ水溶性エキス無添加）の細胞生存率を１００％としたときの各濃度での細胞生存率を表５に示す。
【００４０】
【表５】
2020045288.tif 000007
【００４１】
表５に示すとおり、アルバローズ水溶性エキスを通常の使用範囲として想定される１ｍｇ／ｍＬ以下の量で用いても細胞毒性が見られなかった。特に、アルバローズの水溶性エキスの濃度が０．５ｍｇ／ｍＬ以下では、細胞死はほとんど認められなかった。
【００４２】
（４）アルバローズ水溶性エキスの抗酸化性測定試験
アルバローズの水溶性エキスの抗酸化能をスーパーオキシド（・Ｏ２−）消去活性、及びＤＰＰＨ（２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジル）ラジカル消去活性によって評価した。結果を表６に示す。
【００４３】
【表６】
2020045288.tif 000008
【００４４】
表６に示すとおり、アルバローズ水溶性エキスには、２２μｍｏｌ  ＴＥ／ｇのスーパーオキシド消去活性能が観測された。すなわち、本発明に従うアルバローズ水溶性エキスには、抗酸化物質であるトロロックスの２２倍という極めて高い抗酸化活性が認められた。
【００４５】
（５）皮膚細胞のＩＲ照射試験
太陽光からのＵＶは、皮膚内の酸化ストレスを誘起するために光老化を促進する役割を演ずると理解されている。一方、太陽光からのＩＲの光老化に対する影響には矛盾した作用が報告されている。例えば、美容領域では、近赤外線（ＮＩＲ）を含む広いバンドスペクトルを有する光は、皮膚を若返させると考えられてきた。実際、インテンス・パルス・ライト（ＩＰＬ）のような強いIRの曝露は、真皮繊維芽細胞内のコラーゲンやヒアルロン酸の合成を刺激して真皮マトリックスの再構成を活発にすると報告されている。一方で、弱いＩＲの真皮繊維芽細胞への曝露は、コラーゲン及びヒアルロン酸の合成を減じ、ＭＭＰ−１の分泌を誘起すると報告されている。
【００４６】
そこで、皮膚老化に対するＩＲの役割を調べるために、弾性繊維の足場繊維となるコラーゲン繊維やミクロフィブリルに焦点を当て、低密度長期間のＩＲ照射時の真皮マトリックス関連タンパクのｍＲＮＡ発現レベルへの影響を調べた。
【００４７】
具体的には、ＩＲ照射を受けたＮＨＤＦｓ細胞中の皮膚マトリックス関連タンパク質のｍＲＮＡ発現レベルをＲＴ−ＰＣＲで測定した。まず、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキットを用いて細胞からトータルＲＮＡを抽出した。ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ製）とＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅｑ  ＰＣＲ  ＲＴＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡株式会社製）を用いて、５０℃、５分及び９８℃、５分の条件でＲＮＡの逆転写反応を行った。Ｉｌｌｕｍｉｎｅ  Ｅｃｏ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（イルミナ製）とＬｕｍｉｎｏＣｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  ＲｅａｄｙＭｉｘ  （シグマアルドリッチ製）を用いてｑＲＴ−ＰＣＲを行った。増幅反応は、５０℃×２分の第一ステップで開始させ、続いて９５℃×１０分→９５℃×１０秒→６０℃×３０秒→９５℃×１５秒→５５℃×１５秒→９５℃×１５秒の連続ＰＣＲサイクル反応を行わせた。皮膚マトリックス関連タンパク質のｍＲＮＡ発現に及ぼすＩＲの影響を、図１に示す。
【００４８】
図１を見ると、ＩＲ照射された真皮繊維芽細胞において、ヘパリン結合性細胞外マトリックスタンパクであるＣＣＮ１及びＭＭＰ抑制物質として機能するＴＩＭＰ−１は、ＩＲ照射で変化を示さない。
【００４９】
コラーゲン繊維の場合の場合は、Ｉ型コラーゲンをエンコードするＣＯＬＩＡ１は、有意にダウンレギュレート、そしてコラーゲン繊維を断裂するＭＭＰ−１は有意にアップレギュレートする。これらのｍＲＮＡの挙動は、ＩＲ照射時の真皮中では、コラーゲン繊維の消耗が起こることを示している。繊維芽細胞のコラーゲン繊維の消失は、ＲＯＳにより誘導されたＭＡＰKシグナル伝達の活性化により説明される（非特許文献１）。ＭＡＰＫシグナル伝達の活性化は、ｃ−Ｆｏｓ及びｃ−Ｊｕｎのヘテロ二量体であるＡＰ−１を増加させる。ＡＰ−１は、ＭＭＰ−１及びＣＣＮ１／Ｃｙｒ６１を制御する転写因子である。すなわち、ＡＰ−１がＭＭＰ−１及びＣＣＮ１／Ｃｙｒ６１の合成を刺激し、その結果、コラーゲン繊維が消失することになる。
【００５０】
ミクロフィブリル関連タンパク質に関して、ＩＲ照射によって、ＦＢＮ−１が有意にダウンレギュレートする。ＦＢＮ−１は、エラスチンミクロフィブリルインターフェイサー（ＥＭＩＬＩＮ−１）及びミクロフィブリル関連タンパク４（ＭＦＡＰ−４）を補助することによってミクロフィブリルを構築する。これらの結果は、エラスチン繊維の形成をＩＲが妨害することを示唆する。
【００５１】
ＩＲ照射は、さらに、好中球をリクルートするケモカインであるＩＬ−８／ＣＸＣＬ−８を有意にアップレギュレートする。好中球は、血管から真皮中へ浸透するときに、コラーゲン繊維やエラスチン繊維のような囲んでいる繊維を消化する。この現象は、また、ＩＲが、真皮マトリックスの崩壊を助長することによって真皮マトリックスの再構成を妨害することを示している。
【００５２】
（６）ＩＲ照射時のコラーゲン量の測定試験
皮膚マトリックス内の骨格構造繊維タンパク質であるＩ型コラーゲン量へのＩＲの影響を確認した。具体的には、ＮＨＤＦｓ細胞にＩＲを０（未照射）、５０、１００、１５０、又は２００Ｊのエネルギー量で照射した。さらに、０．５％ＦＢＳ補充ＤＭＥＭ培地中でさらに２４時間培養した。培養後、培地中のコラーゲン量をＥＬＩＳＡ法で測定した。結果を図２に示す。図中、ＩＲを照射しない場合のコラーゲン量に対する各照射レベルでのコラーゲン量の比率を示す。図２に示すように、ＩＲ照射によって、コラーゲン量は、エネルギー量に依存して有意に減少した。
【００５３】
（７）ＩＲ照射による細胞内ＲＯＳ生成試験
上記のようなＩＲ照射によって生起する現象が、酸化ストレスと関連することが予期された。そこで、ＩＲが細胞内酸化に影響するか否かを試験するため、ＩＲ照射されたＮＨＤＦｓの細胞内ＲＯＳ量の測定試験を行った。
【００５４】
具体的には、培養ＮＨＤＦｓ細胞にＲＯＳ検出用試薬Ｈ２ＤＣＦＤＡ（ＥＭＤミリポア社製）で３０分間、ローディング後、ランプ容量１００Wの人工太陽照明灯（製品名ＳＯＬＡＸ  ＸＣ−１００Ｅ、セリック株式会社製）を用いて、ＩＲを０（未照射）、５０、１００、１５０、又は２００Ｊのエネルギー量にて細胞に照射した。照射後の細胞を０．５％ＦＢＳ補充ＤＭＥＭ培地中でさらに２４時間培養した。培養後、ＮＨＤＳＦｓの細胞内ＲＯＳ量を蛍光強度により測定した。結果を図３に示す。図中、ＩＲを照射しない場合の蛍光強度に対する各照射レベルでの蛍光強度比を示す。図３に示すように、細胞内ＲＯＳは、ＩＲ照射によってエネルギー量に依存して有意に増大した。
【００５５】
（８）ＩＲ照射時の細胞内ＲＯＳ生成のアルバローズ水溶性エキスによる抑制試験
（４）に示したように、アルバローズ水溶性エキスは、優れた抗酸化能を示した。しかし、化学的パラメーターである抗酸化能が生化学的にも通用するとは一概にいえない。そこで、ＩＲ照射時の酸化ストレスによる細胞内ＲＯＳの生成を、アルバローズ水溶性エキスが抑制や改善するか否かを試験した。
【００５６】
濃度０（陰性対照）、０．２５、又は０．５ｍｇ／ｍＬのアルバローズ水溶性エキス及び５％ＦＢＳ補充ＤＭＥＭ培地で２４時間、培養したＮＨＤＦｓに、ＲＯＳ検出試薬である２０μＭ  Ｈ２ＤＣＦＤＡのＨＢＳＳ溶液（ＥＭＤミリポア社製）を３０分間、ローディング後、前記人工太陽照明灯からＩＲを２５０Ｊ照射した。さらに２４時間培養後、蛍光強度（蛍光励起波長４９２〜４９５ｎｍ、発光波長５１７〜５２７ｎｍ）を測定した。蛍光強度から細胞内ＲＯＳ量を求めた。結果を図４に示す。図中、各濃度レベルにおける棒グラフの左側はＩＲ未照射、そして右側は２５０ＪのＩＲ照射を示す。細胞内ＲＯＳ量は、アルバローズ水溶性エキス無添加かつＩＲ未照射の細胞内ＲＯＳ量を１としたときの、各濃度レベルでのＩＲ未照射及びＩＲ照射での細胞内ＲＯＳの比率で示す。
【００５７】
ＩＲ照射による細胞内ＲＯＳの上昇率を、下記式：
【数１】
2020045288.tif 000009
により求めた。結果を表７に示す。
【００５８】
【表７】
2020045288.tif 000010
【００５９】
図４及び表７に示すように、ＮＨＤＦｓ細胞をアルバローズ水溶性エキスで処理すると、処理された細胞は、ＩＲを照射されても、細胞内ＲＯＳ上昇が抑制される。すなわち、アルバローズ水溶性エキスは、ＩＲ照射由来の細胞内ＲＯＳを濃度依存的に抑制することが判明した。
【００６０】
（９）Ｈ２Ｏ２曝露時の細胞内ＲＯＳ生成のアルバローズ水溶性エキスによる抑制試験
（7）で、ＩＲ照射によって細胞内ＲＯＳが蓄積されることが判明した。そこで、ＲＯＳの一種であるＨ２Ｏ２に皮膚細胞が直接さらされたときに、細胞内ＲＯＳが増大するか否か、そしてその増大をアルバローズ水溶性エキスが抑制できるか否か試験した。
【００６１】
具体的には、アルバローズの水溶性エキスで処理されたヒトの表皮細胞が酸化状態の外部環境に晒されたときに、前記エキスに細胞内ＲＯＳの生成を抑制する効果があるか否かを試験した。まず、濃度０（陰性対照）、０．１２５、０．２５、又は０．５ｍｇ／ｍＬのアルバローズ水溶性エキス及び５％ＦＢＳ補充ＤＭＥＭ培地で、ＨａＣａＴ細胞を２４時間培養した。前記ＲＯＳ検出用試薬Ｈ２ＤＣＦＤＡを３０分間、ローディング後、過酸化水素水（５００μＭ）に１５分間、曝露した。その後、蛍光強度（蛍光励起波長４９２〜４９５ｎｍ、発光波長５１７〜５２７ｎｍ）を測定することにより、細胞内ＲＯＳ量を求めた。結果を図５に示す。図中、各濃度レベルにおける棒グラフの左側は過酸化水素水（Ｈ２Ｏ２）非曝露、そして右側はＨ２Ｏ２曝露を示す。細胞内ＲＯＳ量は、アルバローズ水溶性エキス無添加かつＨ２Ｏ２非曝露の細胞内ＲＯＳ量を１としたときの、各濃度レベルでのＨ２Ｏ２非曝露及びＨ２Ｏ２曝露での細胞内ＲＯＳの比率で示す。
【００６２】
Ｈ２Ｏ２由来の細胞内ＲＯＳの上昇率を、下記式：
【数２】
2020045288.tif 000011
により求めた。結果を表８に示す。また、陽性対照としてＬ−アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウム（ＡＰＭ、濃度４００μＭ）を含有する培地で培養したＨａＣａＴ細胞をＨ２Ｏ２（５００μＭ）に曝露した際の細胞内ＲＯＳ上昇率も同様にして求めた。結果を表８に示す。
【００６３】
【表８】
2020045288.tif 000012
【００６４】
図５及び表８の陰性対照に示すように、ＨａＣａＴ細胞をＨ２Ｏ２に曝露すると細胞内ＲＯＳが増大する。しかし、細胞をアルバローズ水溶性エキスで処理すると、ＲＯＳの増大が抑制される。細胞内ＲＯＳの上昇率の抑制度合いは、アルバローズ水溶性エキスの添加濃度が増すほど大きくなることが判明した。その効果は、活性酸素消去能が知られているＡＰＭに匹敵する。
【００６５】
（１０）Ｈ２Ｏ２曝露時のコラーゲン量減少のアルバローズ水溶性エキスによる抑制試験
ＩＲ照射により減少するコラーゲン量をアルバローズ水溶性エキスが改善する能力を有するか否か確かめるため、Ｈ２Ｏ２曝露で誘起されるコラーゲン量減少について試験した。具体的には、濃度０（陰性対照）、０．０６２５、０．１２５、０．２５、又は０．５ｍｇ／ｍＬのアルバローズ水溶性エキスを添加した５％ＦＢＳ補充ＤＭＥＭ培地でＮＨＤＦｓ細胞を２４時間培養した。Ｈ２Ｏ２（１ｍＭ）に１時間、曝露後、０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で２４時間、培養した。培地中のコラーゲン量をＥＬＩＳＡ法で測定した。結果を、図６に示す。図中、各濃度レベルにおける棒グラフの左側はＨ２Ｏ２非曝露、そして右側はＨ２Ｏ２曝露を示す。コラーゲン量は、アルバローズ水溶性エキス無添加かつＨ２Ｏ２非曝露のコラーゲン量を１としたときの、各濃度レベルでのＨ２Ｏ２非曝露及びＨ２Ｏ２曝露でのコラーゲン量の比率で示す。
【００６６】
Ｈ２Ｏ２由来の細胞内酸化ストレスによるコラーゲンの減少率を、下記式：
【数３】
2020045288.tif 000013
により求めた。結果を表９に示す。
【００６７】
【表９】
2020045288.tif 000014
【００６８】
図６及び表９に示すように、コラーゲン量は、Ｈ２Ｏ２曝露がもたらす細胞内ＲＯＳによって減少するが、アルバローズ水溶性エキスで処理された細胞では、コラーゲン減少率がアルバローズ水溶性エキス濃度依存的に抑制されている。
【００６９】
（１１）ＵＶＢ照射時の細胞死のアルバローズ水溶性エキスによる抑制試験
２９０〜３２０ｎｍの中波長紫外線であるＵＶＢは、ＤＮＡを損傷させることが報告されている。アルバローズの水溶性エキスが、ＵＶ照射時の酸化ストレスによる細胞死を抑制するか否かを試験した。具体的には、濃度０（陰性対照）、０．０６２５、０．１２５、０．２５、又は０．５ｍｇ／ｍＬのアルバローズ水溶性エキスを添加した５％ＦＢＳ補充ＤＭＥＭ培地で、ＨａＣａＴ細胞を２４時間培養した。これらの処理液に、紫外線ランプ（ＰＨＩＬＩＰＳ製）からＵＶＢ（波長：３００ｎｍ）を２０ｍＪ照射した。照射から２４時間後、これらの処理液の細胞生存率を、前記ニュートラルレッド（ＮＲ）試験に従って測定した。結果を図７に示す。
【００７０】
図７に示すように、ＨａＣａＴ細胞をアルバローズ水溶性エキスで処理すると、処理された細胞は、ＵＶＢを照射されても、細胞生存率の低下が抑制される。アルバローズ水溶性エキスは、ＵＶＢ照射由来の細胞死を濃度依存的に抑制することが判明した。
【００７１】
（１２）ＵＶＡ照射時のコラーゲン量減少のアルバローズ水溶性エキスによる抑制試験
３２０〜４００ｎｍの長波長紫外線であるＵＶＡは、真皮深部や皮下組織に到達して真皮全体のマトリックスに影響を与える。ＵＶＡ照射による細胞外マトリックス成分への影響に関して、ＵＶＡが細胞外マトリックス分解酵素であるＭＭＰのｍＲＮＡ発現を促進し、線維芽細胞のコラーゲン量を減少させることが報告されている。
【００７２】
アルバローズの水溶性エキスが、ＵＶＡ照射時の酸化ストレスによる皮膚コラーゲン量減少を抑制するか否かを試験した。具体的には、濃度０（陰性対照）、０．０６２５、０．１２５、０．２５、又は０．５ｍｇ／ｍＬのアルバローズ水溶性エキスを添加したＮＨＤＦｓ細胞に、紫外線ランプ（株式会社東芝製）からＵＶＡ（波長：３５２ｎｍ）を５Ｊ照射した。ＵＶＡ照射後、０．５％ＦＢＳ補充ＤＭＥＭ培地でさらに２４時間、培養した。培地中のコラーゲン量をＥＬＩＳＡ法で測定した。結果を、図８に示す。図中、各濃度レベルにおける棒グラフの左側はＵＶＡ未照射、そして右側はＵＶＡ照射を示す。
【００７３】
コラーゲン量減少率（％）を、以下の式：
【数４】
2020045288.tif 000015
より求めた。結果を表１０に示す。
【００７４】
【表１０】
2020045288.tif 000016
【００７５】
図８及び表１０に示すように、ＮＨＤＦｓ細胞をアルバローズ水溶性エキスで処理すると、ＵＶＡを照射されても皮膚コラーゲン量の低下が抑制される。すなわち、アルバローズ水溶性エキスは、優れた抗老化作用を発揮することが判明した。
【図１】
2020045288.tif 000017
【図２】
2020045288.tif 000018
【図３】
2020045288.tif 000019
【図４】
2020045288.tif 000020
【図５】
2020045288.tif 000021
【図６】
2020045288.tif 000022
【図７】
2020045288.tif 000023
【図８】
2020045288.tif 000024