(57)【要約】【課題】本発明はFMDVワクチン又は組成物を提供する。本発明はまた、FMDV抗原、エピトープ又は免疫原をコードし発現する組換えベクターを提供し、前記ベクターを用いて動物（特にヒツジ類、ウシ類、ヤギ類、又はブタ類）をFMDVから防御する方法を提供する。また本発明はさらに、抗原性ポリペプチド又は抗原を作製又は生成する方法を提供する。【解決手段】本組成物又はワクチンはFMDV抗原を含むワクチン又は組成物であり得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
FMDV抗原又はポリペプチドを含む組成物。
【請求項２】
FMDV抗原がFMDV-E2融合タンパク質である、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
FMDV-E2融合タンパク質が、配列番号:2、4、6、8、10、12又は14に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも90%配列同一性を有する、請求項2に記載の組成物。
【請求項４】
FMDV抗原が、配列番号:2、4、6、8、10、12又は14に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも90%配列同一性を有する、請求項1に記載の組成物。
【請求項５】
FMDV抗原が部分的に精製されている、請求項1−4のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項６】
FMDV抗原が実質的に精製されている、請求項1−4のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項７】
FMDV抗原が、配列番号:1,3、5、7、9、11又は13に示される配列と少なくとも70%配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる、請求項1−6のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項８】
さらに、医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、賦形剤、アジュバント又はビヒクルを含む、請求項1−7のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項９】
ヒツジ類、ウシ類、ヤギ類若しくはブタ類のFMDVに感受性の宿主をワクチン免疫する、又はFMDV感染から当該宿主を防御若しくは予防する、又は防御免疫応答を宿主で惹起する方法であって、請求項1から8のいずれか1項に記載の組成物の少なくとも1回の投与を含む、前記方法。
【請求項１０】
プライム-ブースト投与レジメンを含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
プライム-ブースト投与が、
請求項1−8のいずれか1項に記載の組成物のプライム投与、及び、
FMDV抗原を含みかつin vivoで発現する組換えウイルスベクター、又は当該FMDV抗原を含む不活化ウイルスワクチン、又は当該FMDV抗原を含むか若しくは発現するDNAプラスミドワクチン若しくは組成物、又は植物若しくは藻類で生成された組換えFMDV抗原、を含むワクチン若しくは組成物のブースト投与、
を含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
プライム-ブースト投与が、
FMDV抗原を含みかつin vivoで発現する組換えウイルスベクター、又は当該FMDV抗原を含む不活化ウイルスワクチン、又は当該FMDV抗原を含むか若しくは発現するDNAプラスミドワクチン若しくは組成物、又は植物若しくは藻類で生成された組換えFMDV抗原、を含むワクチン若しくは組成物のプライム投与、及び、
請求項1−8のいずれか1項に記載の組成物のブースト投与、
を含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
プライム-ブースト投与が、請求項1−8のいずれか1項に記載の組成物のプライム投与及び請求項1−8のいずれか1項に記載の組成物のブースト投与を含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１４】
宿主が、ヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類である、請求項9−13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
配列番号:2、4、6、8、10、12又は14に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも90%配列同一性を有する、実質的に精製されたFMDV抗原又はポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号:2、4、6、8、10、12又は14に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも90%配列同一性を有する、実質的に精製されたFMDV-E2融合タンパク質。
【請求項１７】
配列番号:2、4、6、8、10、12又は14に示される配列と少なくとも90%配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、プラスミド。
【請求項１８】
ポリヌクレオチドが、配列番号:1,3、5、7、9、11又は13に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも70%配列同一性を有する、請求項17に記載のプラスミド。
【請求項１９】
請求項17に記載のプラスミドで形質転換された宿主細胞。
【請求項２０】
以下の工程を含む、抗原を生成する方法：
i）抗原をコードするポリヌクレオチドを、E2タンパク質をコードするポリヌクレオチドに連結する工程；
ii）当該融合タンパク質を宿主で発現する工程；及び
iii）当該融合タンパク質を当該宿主から単離する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互引用）本出願は米国仮特許出願62/259,043（2015年11月23日出願）の優先権を主張する。
（技術分野）
本発明は、動物の口蹄疫ウイルス（FMDV）感染に対抗する組成物に関する。本発明は、FMDV抗原を含む医薬組成物、FMDVに対するワクチン免疫の方法、抗原の生成方法、並びにそのような方法及び組成物に関して使用されるキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
口蹄疫は、農場飼育動物を冒すもっとも病毒性及び伝染性が強い疾患の1つである。この疾患は世界中の多くの国々、特にアフリカ、アジア及び南アメリカで流行する。加えて、大流行が周期的に発生し得る。ある国でこの疾患が発生すると、感染群の生産性低下、体重及び乳生産の低下、並びにこれらの国々に課される禁輸措置に起因する非常に深刻な経済的結果をもたらし得る。この疾患に対抗してとり得る手段は、輸入制限の厳格な適用、衛生管理及び検疫、病獣の屠殺、並びに不活化ウイルスを用いるワクチン免疫プログラムから成り、ワクチン免疫プログラムは、国レベル又は地域レベルでの予防的手段として又は大流行が発生したときに定期的に実施される。
FMDは、その短い潜伏期間、強い伝染性、口及び脚先端の潰瘍形成、及び時に若齢獣の死亡を特徴とする。FMDは、多数の動物種、特に畜牛、ブタ、ヒツジ及びヤギを冒す。この疾患の原因因子は、ピコルナウイルス科のアフトウイルス属に属するリボ核酸（RNA）ウイルスである（Cooper et al., 1978, Intervirology 10, 165-180）。現在、口蹄疫ウイルス（FMDV）には以下の少なくとも7つの型が知られている：ヨーロッパ型（A、O及びC）、アフリカ型（SAT1、SAT2及びSAT3）、及びアジア型（アジア1）。多数の亜型もまた区別されている（Kleid et al., 1981, Science 214, 1125-1129）。
FMDVは、直径が約25nmの裸の正二十面体ウイルスであり、約8500ヌクレオチドから成る一本鎖RNA分子（プラスの極性を有する）を含む。このRNA分子はただ1つのオープンリーディングフレーム（ORF）を含み、前記ORFは、特にキャプシド前駆体（タンパク質P1又はP88としても知られている）を含む単一ポリプロテインをコードする。タンパク質P1はそのアミノ末端でミリスチル化される。成熟過程で、タンパク質P1は、プロテアーゼ3CによってVP0、VP1及びVP3（又はぞれぞれ1AB、1D及び1C）として知られる3つのタンパク質に切断される（Belsham G.J., Progress in Biophysics and Molecular Biology, 1993, 60, 241-261）。ビリオン中では、タンパク質VP0は、続いて2つのタンパク質（VP4及びVP2（又はそれぞれ1A及び1B））に切断される。タンパク質VP0からVP1及びVP3への変換メカニズム並びに成熟ビリオン形成メカニズムは不明である。タンパク質VP1、VP2及びVP3は約26,000Daの分子量を有するが、タンパク質VP4は約8,000Daで小さい。
【０００３】
FMDに対抗する有効なワクチンを設計する試みでは、多くの仮説、研究方法及び提案の進展があった。Caoらは、FMDVチャレンジに対して免疫原性を有する特異的なエピトープタンパク質を報告した（Antiviral Research, 2013, 97:145-153；Veterinary Microbiology, 2014, 168:294-301）。アジア血清型に由来する1つのTエピトープ及び2つのBエピトープの融合物に対応する合成ポリペプチドが防御応答を誘導することが証明された（Ren et al., Vaccine, 2011, 29:7960-7965）。
これまでのところ、市場で唯一のワクチンは不活化ウイルスを含む。ヨーロッパでのFMDの大発生がワクチン製造における欠点と密接に関係していたので、FMDVワクチンの安全性に関しては懸念が存在する（King, A.M.Q.et al., 1981, Nature, 293: 479-480）。不活化ワクチンは長期免疫を付与せず、したがってブースター注射が毎年或いは大流行時にはさらに頻繁に必要とされる。加えて、不完全な不活化及び/又は不活化ワクチン製造時のウイルス流出に連関するリスクが存在する（King, A.M.Q.（上掲書））。
最近、デヒドロゲナーゼマルチ酵素複合体のE2サブユニットがHIV-1タンパク質の生成のための足場として用いられた（Caivano et al., 2010, Virology, 407:296-305；Krebs et al., PLOS One, 2014, DOI:10.1371/journal.pone.0113463；Schiavone et al., 2012, Int.J.Mol.Sci., 13:5674-5699）。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（PDH）複合体は多機能性酵素である。前記酵素は3つの必須の酵素（チアミン依存ピルビン酸デカルボキシラーゼ（E1）、ジヒドロリポイルアセチルトランスフェラーゼ（E2）、及びフラボタンパク質ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ（E3））を含む（Lengyel et al., Structure, 16:93-103, 2008）。バシルス・ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）のPDH複合体に由来するE2ポリペプチドの60コピーは集合して五角形十二面体の足場を形成すること、及びこの足場を改変して外来ペプチド及びタンパク質をその表面に提示できることが発見された（Domingo et al., 2001, J.Mol.Biol., 305:259-267）。Dalmauらは、大腸菌（E.coli）での発現のために最適化したPDHのE2変異体について記載した（Biotechnology and Bioengineering, 101(4):654-664, 2008）。D’Apiceらは、3つのデリバリービヒクル（繊維状ファージfd、PDH複合体由来E2タンパク質、及びタンパク質CotC）でのTヘルパーエピトープの発現について考察した（Vaccine, 25:1993-2000, 2007）。
動物（人間を含む）のFMDVに対する感受性を考えれば、FMDV感染を予防し動物を防御する方法は必須である。したがって、FMDVに対抗する有効で安全でかつ製造が容易なワクチンが希求される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、動物の口蹄疫ウイルス（FMDV）感染に対抗する組成物に関する。本発明は、FMDV抗原を含む医薬組成物、FMDVに対するワクチン免疫の方法、抗原の生成方法、並びにそのような方法及び組成物に関して使用されるキットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
抗原性FMDVポリペプチド並びにそのフラグメント及びそれらの変種を含む組成物が提供される。当該FMDV抗原並びにそのフラグメント及びそれらの変種は免疫原性及び防御性特性を有する。FMDV抗原は、ゲオバシルス・ステアロテルモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）由来E2との融合タンパク質として生成できる。本発明のFMDV融合タンパク質は集合して天然のFMDVビリオン又はVLPに類似する粒子を形成する。
当該抗原性ポリペプチド並びにそのフラグメント及び変種は、ワクチン及び/又は医薬組成物に処方できる。そのようなワクチンを用いて動物をワクチン免疫し、少なくとも1つのFMDV株に対する防御を提供することができる。
本発明の方法は抗原性ポリペプチドを作製する方法を含む。本発明の方法は、ゲオバシルス・ステアロテルモフィルス由来E2と融合した抗原又は抗原性ポリペプチドを作製する方法を含む。本発明は、有効かつ安全なワクチンを作製するために、感染性FMDVゲノムを欠き立体構造的に正確な免疫原を構築する方法を提供する。本方法は、FMDV抗原の簡単かつ容易なin vitro発現を促進し、生成が複雑かつ困難である天然の真正FMDVビリオン又はVLPの立体構造を複製及び模倣する。
本発明の方法はまた、抗原性ポリペプチド又はそのフラグメント若しくは変種の有効量を動物に投与して防御的な免疫原性応答を生じる工程を含む使用方法を含む。生成後、ワクチンとして使用するために、抗原性ポリペプチドを部分的に又は実質的に精製することができる。
少なくとも1つの抗原性ポリペプチド又はそのフラグメント若しくは変種及び使用のための指示書を含むキットもまた提供される。
下記の詳細な説明（例として提供されるが、記載の特定の実施態様にのみ本発明を限定しようとするものではない）は、添付の下記図面と併せれば極めて良好に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】DNA及びタンパク質配列を要約した表を示す。
【図２Ａ】DNA及びタンパク質配列、並びに配列アラインメントを示す。
【図２Ｂ】DNA及びタンパク質配列、並びに配列アラインメントを示す。
【図２Ｃ】DNA及びタンパク質配列、並びに配列アラインメントを示す。
【図２Ｄ】DNA及びタンパク質配列、並びに配列アラインメントを示す。
【図２Ｅ】DNA及びタンパク質配列、並びに配列アラインメントを示す。
【図２Ｆ】DNA及びタンパク質配列、並びに配列アラインメントを示す。
【図３】発現されたFMDV-E2融合タンパク質のウェスタンブロット及びドットブロットを示す。
【図４Ａ−４Ｃ】FMDV-E2粒子の生成を示す。
【図５】E2-FMDV粒子の間接ELISAを示す。
【図６】01MワクチンのD27における形質細胞の結果を示す。
【図７】01MワクチンのD42における形質細胞の結果を示す。
【図８】01MワクチンのD27におけるIFNγELISPOTを示す。
【図９】01MワクチンのD42におけるIFNγELISPOTを示す。
【図１０】01MワクチンのD42におけるメモリーB細胞を示す。
【図１１】FMDV 01 Manisa SNを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
詳細な説明
動物で免疫原性応答を惹起する、FMDVポリペプチド、抗原、並びにそのフラグメント及びそれらの変種を含む組成物が提供される。当該抗原性ポリペプチド又はそのフラグメント若しくは変種は、ゲオバシルス・ステアロテルモフィルス由来のE2との融合タンパク質又はキメラタンパク質として生成される。当該抗原性ポリペプチド又はそのフラグメント若しくは変種はワクチン又は医薬組成物に処方して、動物で防御性応答を惹起するか又は刺激するために用いることができる。ある実施態様では、当該ポリペプチド抗原はFMDV合成抗原VP1又はその活性なフラグメント若しくは変種である。
本発明の抗原性ポリペプチド又は抗原は、完全長ポリペプチド又はその活性なフラグメント若しくは変種であり得ることは理解される。“活性なフラグメント”又は“活性な変種”とは、当該フラグメント又は変種が当該ポリペプチドの抗原性性質を保持することを意図する。したがって、本発明は、動物で免疫原性応答を引き出す任意のFMDVポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原を包含する。当該FMDVポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原は任意のFMDVポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原であり得る。これらは例えば、動物（例えばヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類）で応答を惹起し、誘導し又は刺激するタンパク質、ペプチド又はそのフラグメント若しくは変種であるが、ただしこれらに限定されない。
【０００８】
具体的なFMDV抗原性ポリペプチドにはFMDVのVP1が含まれる。FMDVは、直径が約25nmの裸の正二十面体ウイルスであり、約8500ヌクレオチドから成る一本鎖RNA分子（プラスの極性を有する）を含む。このRNA分子はただ1つのオープンリーディングフレーム（ORF）を含み、前記ORFは、特にキャプシド前駆体（タンパク質P1又はP88としても知られている）を含む単一ポリプロテインをコードする。タンパク質P1はそのアミノ末端でミリスチル化される。成熟過程で、タンパク質P1は、プロテアーゼ3CによってVP0、VP1及びVP3（又はぞれぞれ1AB、1D及び1C）として知られる3つのタンパク質に切断される（Belsham G.J., Progress in Biophysics and Molecular Biology, 1993, 60, 241-261）。ビリオン中では、タンパク質VP0は、続いて2つのタンパク質（VP4及びVP2（又はそれぞれ1A及び1B））に切断される。タンパク質VP0からVP1及びVP3への変換メカニズム並びに成熟ビリオン形成メカニズムは不明である。タンパク質VP1、VP2及びVP3は約26,000Daの分子量を有するが、タンパク質VP4は約8,000Daで小さい。
このキャプシドタンパク質の単純な組合せはプロトマー又は5S分子を形成し、これらはFMDVキャプシドの基本的構成成分である。このプロトマーは続いてペンタマーとしてまとめられて12S分子を形成する。ビリオンは、12個の12Sペンタマーの集合によってゲノムRNA分子の被包化から生じる（したがって146S粒子を構成する）。ウイルスキャプシドはまた、その内部にRNA分子が存在しなくても形成され得る（以下では“空キャプシド”）。
空キャプシドはまた70S粒子として設計される。空キャプシドの形成はウイルス複製時に自然に生じることがあり、或いは化学的処理によって人工的に生成され得る。
本発明は、ウシ類、ヒツジ類、ヤギ類又はブタ類のワクチン若しくは組成物に関し、この組成物は、有効量のFMDV抗原及び医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、賦形剤、アジュバント又はビヒクルを含むことができる。
いくつかの実施態様では、ワクチンはさらに、アジュバント、例えば水中油（O/W）エマルジョン（米国特許7,371,395に記載）を含む。
さらに他の実施態様では、アジュバントには、EMULSIGEN、水酸化アルミニウム及びサポニン、並びにCpG、又は前記の組合せが含まれる。
【０００９】
いくつかの実施態様では、動物の応答は防御免疫応答である。
“動物”とは哺乳動物、鳥類などを意図する。動物又は宿主には哺乳動物、偶蹄類及び人間が含まれる。動物は以下から成る群から選択できる：ウマ類（例えばウマ）、イヌ類（例えばイヌ、オオカミ、キツネ、コヨーテ、ジャッカル）、ネコ類（例えばライオン、トラ、家ネコ、野生ネコ、他の大型のネコ、及び他のネコ類（チーター及びオオヤマネコを含む））、ヒツジ類（例えばヒツジ）、ウシ類（例えば畜牛）、ブタ類（例えばブタ）、ヤギ類（例えばヤギ）、トリ類（例えばニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、ダチョウ、エミュ及びヒクイドリ）、霊長類（例えば原猿、メガネザル、サル、テナガザル、類人猿）、及び魚類。“動物”という用語はまた、全ての発育段階（胚性期及び胎児期を含む）の個々の動物を含む。
特段の説明がなければ、本明細書で用いられる全ての技術用語及び学術用語は、本開示が属する分野の業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。単数用語“a”、“an”及び“the”は、文脈が明瞭にそうではないことを示していないかぎり複数の対応語を含む。同様に、“or”という語は、文脈が明らかにそうではないことを示していないかぎり“and”を含むことが意図される。
本開示で、特に特許請求の範囲及び/又は文章内で、例えば“comprises（含む）”、“comprised（含まれる）”、“comprising（含む）”などの用語は、米国特許法で当該用語に割り当てられた意味を有することができ、例えばそれら用語は、“includes（含む）”、“included（含まれる）”、“including（含む）”などを意味することができる。さらに例えば“consisting essentially of（本質的に〜から成る）”及び“consists essentially of（本質的に〜から成る）”という用語は、米国特許法で当該用語に割り当てられた意味を有することができ、例えばそれら用語は、明確に記載されていない構成成分を許容するが、従来技術で見出されるか、又は当該発明の基本的或いは新規な特徴に影響する構成成分を排除する。
【００１０】
本発明の抗原性ポリペプチドはFMDVに対抗して防御する能力を有する。すなわち、本発明の抗原性ポリペプチドは動物で免疫応答を刺激する能力を有する。“抗原”又は“免疫原”とは、特異的な免疫応答を宿主で誘導する物質を意味する。抗原は、生物体全体（死滅、弱毒化又は生）；生物のサブユニット又は部分；免疫原性特性を有する挿入物を含む組換えベクター；宿主動物に提示されたとき免疫応答を誘導できるDNA片又はフラグメント；ポリペプチド、エピトープ、ハプテン、又は前記の任意の組合せを含むことができる。また別には、免疫原又は抗原は毒素又は抗毒素を含むことができる。
本明細書で用いられる“免疫原性タンパク質、ポリペプチド、又はペプチド”という用語は、いったん宿主に投与されたら、当該タンパク質に対して液性及び/又は細胞性タイプの免疫応答を惹起することができるという意味で免疫学的に活性であるポリペプチドを含む。好ましくは、タンパク質フラグメントとは、タンパク質全体と実質的に同じ免疫学的活性を有するものである。したがって、本発明のタンパク質フラグメントは、少なくとも1つのエピトープ又は抗原性決定基を含むか、又は本質的にそれらから成るか、又はそれらから成る。本明細書で用いられる、“免疫原性”タンパク質又はポリペプチドには、当該タンパク質の完全長配列、そのアナローグ、又はその免疫原性フラグメントが含まれる。“免疫原性フラグメント”とは、1つ以上のエピトープを含み、したがって上記に記載の免疫学的応答を引き出す、タンパク質のフラグメントを意味する。そのようなフラグメントは、当業界で周知の多数のエピトープマッピング技術を用いて識別することができる。例えば以下を参照されたい：Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66（Glenn E.Morris, Ed., 1996）。例えば、線状エピトープは、例えば固体支持体上で多数のペプチド（当該タンパク質分子の複数の部分に対応するペプチド）を同時合成し、当該ペプチドが当該支持体にまだ付着している間に当該ペプチドを抗体と反応させることによって決定できる。そのような技術は当業界で公知であり、例えば以下に記載されている：U.S.Pat.No.4,708,871；Geysen et al., 1984；Geysen et al., 1986。
同様に、立体的エピトープは、アミノ酸の空間配座を例えばX-線結晶学及び二次元核磁気共鳴で決定することによって容易に識別される。例えば上掲書（Epitope Mapping Protocols）を参照されたい。
【００１１】
論議のように、本発明は抗原性ポリペプチドの活性なフラグメント及び変種を包含する。したがって、“免疫原性タンパク質、ポリペプチド、又はペプチド”という用語はさらに当該配列への欠失、付加及び置換を意図するが、ただし当該ポリペプチドが機能して本明細書で定義される免疫学的応答を生じる場合に限られる。“保存的変異”は、あるアミノ酸残基の別の生物学的に類似する残基による入替え、又は核酸配列中のヌクレオチドの入替えであってコードされるアミノ酸残基が変化しないか又は別の生物学的に類似する残基である入替えを指す。これに関しては、特に好ましい置換は一般的には本質的に保存的であろう。すなわち1つのアミノ酸ファミリー内で生じる置換であろう。例えば、アミノ酸は一般的に4つのファミリーに分割される：（1）酸性アミノ酸--アスパラギン酸及びグルタミン酸；（2）塩基性アミノ酸--リジン、アルギニン、ヒスチジン；（3）非極性アミノ酸--アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び（4）非荷電極性アミノ酸--グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン及びチロシン。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンはときに芳香族アミノ酸として分類される。保存的変異の例には以下が含まれる：1つの疎水性残基（例えばイソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニン）による別の疎水性残基の置換、又は1つの極性残基による別の極性残基の置換、例えば、アルギニンによるリジンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換、又はグルタミンによるアスパラギンの置換など；又はあるアミノ酸の構造的に関係を有するアミノ酸による同様な保存的入替え（生物学的活性に大きな影響を及ぼさない）。タンパク質の免疫原性に実質的に影響を及ぼさない小さなアミノ酸置換を有するが、参照分子と実質的に同じアミノ酸配列を有するタンパク質は、したがって参照ポリペプチドの定義内である。これらの改変によって生成される全てのポリペプチドがここに含まれる。
“保存的変異”という用語はまた未置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することを含むが、ただし当該置換ポリペプチドに対して生じた抗体がまた未置換ポリペプチドと免疫的に反応することを条件とする。
【００１２】
“エピトープ”という用語は、特異的B細胞及び/又はT細胞が応答する抗原又はハプテン上の部位を指す。当該用語はまた、“抗原性決定基”又は“抗原性決定部位”と互換的に用いられる。同じエピトープを認識する抗体は、1つの抗体が別の抗体と標的抗原との結合を阻止する能力を示す簡単な免疫アッセイによって識別することができる。
組成物又はワクチンに対する“免疫学的応答”は、当該宿主における問題の組成物又はワクチンに対する細胞性及び/又は抗体媒介性免疫応答の発生である。通例、“免疫学的応答”には以下の作用の1つ以上が含まれる（ただしこれらに限定されない）：問題の組成物又はワクチンに含まれる1つ又は複数の抗原を特異的に指向する抗体、B細胞、ヘルパーT細胞、及び/又は細胞傷害性T細胞の産生。好ましくは、宿主は治療的又は防御的な免疫学的応答のどちらかを示し、したがって新たな感染に対する耐性が強化され、及び/又は当該疾患の臨床的重篤度が軽減されるであろう。そのような防御は、感染宿主によって通常示される徴候の軽減又は欠如、より迅速な回復期間、及び/又は感染宿主におけるウイルス力価の低下によって提示されるであろう。
合成抗原もまた本定義内に含まれ、例えばポリエピトープ、フランキングエピトープ、及び他の組換え体又は合成により誘導された抗原である。本発明の目的のためには、免疫原性フラグメントは通例、当該分子の少なくとも約3アミノ酸、少なくとも約5アミノ酸、少なくとも約10−15アミノ酸、又は約15−25アミノ酸又はそれより多いアミノ酸を含むであろう。フラグメントの長さに決定的な上限はなく、フラグメントは、完全長に近いタンパク質配列又はタンパク質の少なくとも1つのエピトープを含む融合タンパク質すら含むことができよう。
したがって、エピトープを発現するポリヌクレオチドの最小限構造は、それが、FMDVポリペプチドのエピトープ又は抗原性決定基をコードするヌクレオチドを含むか又は本質的に前記ヌクレオチドから成るか又は前記ヌクレオチドから成るということである。FMDVポリペプチドのフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、当該ポリペプチドをコードする配列の最小限15ヌクレオチド、約30−45ヌクレオチド、約45−75、又は少なくとも57、87又は150の連続的な又は切れ目のないヌクレオチドを含むか、又は本質的に前記ヌクレオチドから成るか、又は前記ヌクレオチドから成ることができる。
【００１３】
“核酸”又は“ポリヌクレオチド”という用語は、直線状若しくは分枝状、又は一本鎖若しくは二本鎖、又は前記のハイブリッドであるRNA又はDNAを指す。前記用語はまたRNA/DNAハイブリッドを包含する。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子フラグメント、エクソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブ及びプライマー。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド（例えばメチル化ヌクレオチド及びヌクレオチドアナローグ）、ウラシル、他の糖及び連結基（例えばフルオロリボース及びチオレート）、及びヌクレオチド分枝を含むことができる。ヌクレオチドの配列はさらに重合の後で、例えば標識成分との結合によって改変することができる。この定義に含まれる他のタイプの改変は、キャップ、1つ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナローグによる置換、及びポリヌクレオチドをタンパク質、金属イオン、標識成分、他のポリヌクレオチド又は固体支持体に結合させるための手段の導入である。ポリヌクレオチドは化学合成によって入手するか、又は微生物から誘導できる。
“遺伝子”という用語は広範囲に用いられ、生物学的機能を伴うポリヌクレオチドの任意のセグメントを指す。したがって、遺伝子は、ゲノム配列のようにイントロン及びエクソンを、cDNAのようにまさにコード配列のみ及び/又はそれらの発現に必要な調節配列を含む。例えば、遺伝子はまた、mRNA若しくは機能的RNAを発現するか、又は特定のタンパク質をコードする核酸フラグメントを指し、調節配列を含む。
“タンパク質”、“ペプチド”、“ポリペプチド”及び“ポリペプチドフラグメント”という用語は本明細書で互換的に用いられ、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを指す。当該ポリマーは直鎖状でも分枝状でもよく、改変アミノ酸又はアミノ酸アナローグを含むことができ、さらにアミノ酸以外の化学的部分によって中断されていてもよい。当該用語はまた天然に又は介入により改変されたアミノ酸ポリマーを包含する。そのような改変は、例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは改変、例えば標識成分若しくは生物活性成分との結合である。
本明細書で用いられる“融合タンパク質”又は“キメラタンパク質”という用語は、2つ以上の異種遺伝子の接続を介して作製された任意の組換えタンパク質を指す。異種遺伝子の発現は、元々のタンパク質の各々に由来する機能的特性を有する1つの単一ポリペプチドをもたらす。
【００１４】
“単離された”生物学的成分（例えば核酸又はタンパク質又は細胞内小器官）は、当該成分がその中に天然に存在する生物の細胞内の他の生物学的成分（例えば他の染色体上の及び染色体外のDNA、RNA、タンパク質並びに細胞内小器官）から実質的に分離又は精製されている成分を指す。“単離された”核酸及びタンパク質には標準的な精製方法によって精製された核酸及びタンパク質が含まれる。当該用語はまた化学合成と同様に組換え技術によって調製された核酸及びタンパク質を包含する。
本明細書で用いられる“精製された”という用語は絶対的な純度を必要とせず、むしろ相対的用語として意図される。したがって、例えば、精製されたポリペプチド調製物は、当該ポリペプチドがその天然の環境中の当該ポリペプチドよりも濃縮されている調製物である。すなわち、当該ポリペプチドは細胞成分から分離されている。“実質的に精製された”とは、当該ポリペプチドが、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、若しくは少なくとも98%の、又はこれを越える細胞性成分又は物質が取り除かれた種々の具体的状況にあることを意図する。同様に、当該ポリペプチドを部分的に精製することも可能である。“部分的に精製された”とは、細胞性成分又は物質の60%未満が除去されることを意図する。同じことがポリヌクレオチドにも適用される。本明細書に開示されるポリペプチドは当業界で公知の任意の手段によって精製することができる。
【００１５】
上記で指摘したように、抗原性ポリペプチド又はそのフラグメント若しくはそれらの変種は、融合タンパク質として生成されるFMDV抗原性ポリペプチドである。開示のポリヌクレオチド並びにそれらによってコードされるポリペプチドのフラグメント及び変種もまた本発明に包含される。“フラグメント”とは、ポリヌクレオチドの部分又は前記によってコードされる抗原性アミノ酸配列の部分を意図する。ポリヌクレオチドのフラグメントは、自然のままのタンパク質の生物学的活性を保持し、したがって本明細書のいずれかに記載の免疫原性活性を有するタンパク質フラグメントをコードすることができる。当該ポリペプチド配列のフラグメントは、動物で防御性免疫応答を誘導する能力を保持する。
“変種”は実質的に類似の配列を意味することが意図される。ポリヌクレオチドについては、変種は、自然のままのポリヌクレオチド内の1つ以上の部位における1つ以上のヌクレオチドの欠失及び/又は付加、及び/又は自然のままのポリヌクレオチドの1つ以上の部位における1つ以上のヌクレオチドの置換を含む。本明細書で用いられるように、“自然のままの”ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、それぞれ天然に存在するヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を含む。本発明の個々のポリヌクレオチドの変種（すなわち参照ポリヌクレオチド）はまた、変種ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと参照配列によってコードされるポリペプチドとの間のパーセント同一性の比較によって評価することができる。“変種”タンパク質は、自然のままのタンパク質の1つ以上の部位における1つ以上のアミノ酸の欠失及び/又は付加、及び/又は自然のままのタンパク質の1つ以上の部位における1つ以上のアミノ酸の置換によって誘導されたタンパク質を意味することが意図される。本発明に包含される変種タンパク質は生物学的に活性である。すなわち、それらは免疫応答を引き出す能力を有する。
ある特徴では、本発明はヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類のFMDVポリペプチドを提供する。別の特徴では、本発明は、配列番号:2、4、6、8、10、12及び14に示される配列を有するポリペプチド、並びに前記ポリペプチドの変種又はフラグメントを提供する。
【００１６】
さらにまた、ヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類のFMDVポリペプチドのホモローグも本発明の範囲内であることが意図される。本明細書で用いられるように、“ホモローグ”という用語にはオルソローグ、アナローグ及びパラローグが含まれる。“アナローグ”という用語は、同じ又は類似の機能を有するが、無関係の生物で別個に進化した2つのポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。“オルソローグ”という用語は、異なる種に由来するが、種分化によって共通の祖先遺伝子から進化した2つのポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。通常は、オルソローグは同じ又は類似の機能を有するポリペプチドをコードする。“パラローグ”という用語は、ゲノム内の重複により関係を有する2つのポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。パラローグは通常異なる機能を有するが、これらの機能は関係を有し得る。野生型FMDVポリペプチドのアナローグ、オルソローグ及びパラローグは、翻訳後修飾によって、アミノ酸配列相違によって、又はその両方によって野生型FMDVポリペプチドと相違し得る。特に、本発明のホモローグは一般的に、野生型FMDV又はポリヌクレオチド配列の全部若しくは部分と少なくとも80−85%、85−90%、90−95%、又は95%、96%、97%、98%、99%配列同一性を示し、さらに類似の機能を示すであろう。変種には対立遺伝子変種が含まれる。“対立遺伝子変種”という用語は多型を含むポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。多型はタンパク質のアミノ酸配列に変化を生じ、天然の集団（例えばウイルス種又は系統）に存在する。そのような天然の対立遺伝子変異は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドに典型的には1−5%の多様性を生じ得る。対立遺伝子変種は、問題の核酸配列の配列決定によって多数の異なる種で同定することができ、前記は、ハイブリダイゼーションプローブを用いそれらの種で同じ遺伝子の遺伝子座を識別することによって容易に実施できる。任意の及び全てのそのような核酸変異及びその結果のアミノ酸多型、又は天然の対立遺伝子変異の結果であり、かつ問題の遺伝子の機能的活性を変更しない変異は、本発明の範囲内であることが意図される。
別の特徴では、FMDV抗原はゲオバシルス・ステアロテルモフィルスのE2に融合される。
【００１７】
本明細書で用いられるように、“誘導体”又は“変種”は、1つ以上の保存的アミノ酸変異又は他の小さな改変を有ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸を指し、したがって（1）当該対応するポリペプチドは野生型ポリペプチドと比較したとき実質的に等価の機能を有するか、又は（2）当該ポリペプチドに対して生じた抗体は野生型ポリペプチドと免疫的に反応性を有する。これらの変種又は誘導体には、FMDVポリペプチドの一次アミノ酸配列の小さな改変を有するポリペプチドが含まれ、対応する未改変のポリペプチドと比較したとき実質的に等価の活性を有するペプチドを生じ得る。そのような改変は、位置指定変異誘導のように意図的であっても又は偶発的であってもよい。“変種”という用語は当該ポリペプチドが機能して本明細書に定義する免疫応答を生じる限り、さらに当該配列に対する欠失、付加及び置換を意図する。
“保存的変異”という用語は、あるアミノ酸残基の別の生物学的に類似の残基による入替え又は核酸配列中のヌクレオチドの入替えを指し、後者ではその結果、コードされるアミノ酸残基は変化しないか又は別の生物学的に類似の残基である。これに関しては、特に好ましい置換は一般的には上記に記載したように本質的に保存的である。
本開示のポリヌクレオチドには、遺伝暗号（例えば特定の宿主のための最適化コドン使用頻度）の結果として縮重配列が含まれる。本明細書で用いられるように、“最適化”は、遺伝子操作されてその発現が与えられた種で高められたポリヌクレオチドを指す。FMDVポリペプチドをコードする最適化ポリヌクレオチドを提供するために、FMDVタンパク質のDNA配列は、1）特定の種で高度に発現される遺伝子が好むコドンを含むように、2）前記種のヌクレオチド塩基組成で実質的に見いだされるA+T又はG+C含量に匹敵する前記含量を含むように、3）前記の種の開始配列を形成するように、4）RNAの脱安定化、不適切なポリアデニル化、分解及び停止を引き起こす配列、又は二次構造ヘアピン若しくはRNAスプライス部位を形成する配列を除去するように改変され得る。前記の種におけるFMVDタンパク質の発現増加は、真核細胞及び原核細胞又は個々の種のコドン使用の頻度の分布を利用することによって達成できる。“好ましいコドンの使用頻度”という用語は、与えられたアミノ酸を指定するために特定の宿主細胞によって示されるヌクレオチドコドンの使用の優先性を指す。20の天然のアミノ酸が存在し、その大半は2つ以上のコドンによって指定される。したがって、全ての縮重ヌクレオチド配列が本開示に含まれるが、ただしそのヌクレオチド配列によってコードされるFMDVポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に変化されない場合に限られる。
【００１８】
2つのアミノ酸配列間の配列同一性は、NCBI（National Center for Biotechnology Information）（米国の国立バイオテクノロジー情報センター）ペアワイズblast及びblosum62マトリックスで標準的パラメーターを用いて決定することができる。例えば、NCBI（"National Center for Biotechnology Information", Bethesda, Md., USA）サーバーとともに文献（Altschul et al.）で利用できるBLAST又はBLASTXアルゴリズムを参照されたい（したがって前記Altschulらの論文は当該アルゴリズム又はBLAST若しくはBLASTX及びBLOSUM62マトリックスの使用について“blast”という用語によって記述している）。
配列に関して“同一性”は、2つの配列の短い方の配列中のヌクレオチド又はアミノ酸の数で割った、同一ヌクレオチド又はアミノ酸を有する位置の数を指し、この場合、2つの配列のアラインメントは、WilburとLipmanのアルゴリズム（Wilbur and Lipman）にしたがい、例えば20ヌクレオチドのウインドウサイズ、4ヌクレオチドのワード長、及び4のギャップペナルティを用いて決定できる。コンピュータ支援分析及びアラインメントを含む配列データの解釈は、市場で入手可能なプログラム（例えば、IntelligeneticsTM Suite, Intelligenetics Inc.CA）を用いて簡便に実施することができる。RNA配列がDNA配列と類似する、又はある程度の配列同一性若しくは相同性を有するというとき、DNA配列中のチミジン（T）はRNA配列中のウラシル（U）と等価と考えられる。したがって、RNA配列は本発明の範囲内であり、DNA配列中のチミジン（T）をRNA配列中のウラシル（U）と等価と考えることによってDNA配列から誘導することができる。
2つのアミノ酸配列の配列同一性若しくは配列類似性、又は2つのヌクレオチド配列の配列同一性は、ベクターNTIソフトウェアパッケージ（Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA）を用いて決定することができる。
ハイブリダイゼーション反応は、種々の“ストリンジェンシー”の条件下で行うことができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増加させる種々の条件はよく知られている。例えば以下の文献を参照されたい：“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, second edition（Sambrook et al., 2014）。
【００１９】
本発明はさらに、ベクター分子又は発現ベクターに含まれ、プロモーター成分及び場合によってエンハンサーに作動できるように連結されたFMDVポリヌクレオチドを包含する。
“ベクター”は、標的細胞にin vitro又はin vivoでデリバリーされるべき異種ポリヌクレオチドを含む、組換えDNA又はRNAプラスミド若しくはウイルスを指す。当該異種ポリヌクレオチドは予防又は治療の目的のために対象の配列を含むことができ、場合によって発現カセットの形態であってもよい。本明細書で用いられるように、ベクターは最終標的細胞又は対象生物で複製する能力を有する必要はない。前記用語はクローニングベクター及びウイルスベクターを含む。
“組換え体”という用語は、天然には存在しないか、又は天然では見出されない配置で別のポリヌクレオチドに連結される、半合成又は合成起源のポリヌクレオチドを意味する。
“異種”は、ある実在物が比較されている当該実在物の残りの部分と遺伝学的に別個の実在物に由来することを意味する。例えば、あるポリヌクレオチドを異なる供給源に由来するプラスミド又はベクター中に遺伝子操作によって配置でき、前記ポリヌクレオチドは異種ポリヌクレオチドである。自然のままのコード配列から取り出され、当該自然のままの配列以外のコード配列に作動できるように連結されたプロモーターは異種プロモーターである。
本発明は、ヒツジ類、ウシ類、ヤギ類及びブタ類のワクチン又は医薬若しくは免疫学的組成物に関し、前記ワクチン又は医薬若しくは免疫学的組成物は、有効量のFMDV抗原及び医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、賦形剤、アジュバント又はビヒクルを含むことができる。
本明細書に記載の内容は、部分的には、融合タンパク質又はキメラタンパク質として調製されたFMDV抗原に関連する組成物及び方法を対象とし、前記タンパク質は、同種及び異種FMDV株のチャレンジに対して高度に免疫原性であり動物を防御した。
【００２０】
組成物
本発明はFMDVワクチン又は組成物に関し、これらは有効量のFMDV抗原及び医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、賦形剤、アジュバント又はビヒクルを含むことができる。ある実施態様では、FMDV抗原は、ゲオバシルス・ステアロテルモフィルス由来E2との融合タンパク質又はキメラタンパク質として発現される。
ある実施態様では、本明細書に開示する主題は、FMDV抗原を含む融合タンパク質又はキメラタンパク質を対象とする。
ある実施態様では、本明細書に開示する主題は、ゲオバシルス・ステアロテルモフィルス由来E2と融合したFMDV抗原を含むワクチン又は組成物を対象とする。
ある実施態様では、本明細書に開示する主題は、原核細胞又は真核細胞で生成されるFMDV及びE2の融合タンパク質又はキメラタンパク質を含むワクチン又は組成物を対象とする。本発明は、動物（例えばヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類）で免疫応答を惹起する任意のFMDVポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原を包含する。当該FMDVポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原は、動物（例えばヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類）で応答を惹起し、誘導し又は刺激する任意のFMDVポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原（例えばタンパク質、ペプチド又はそのフラグメントであるが、ただしこれらに限定されない）であり得る。
ある実施態様では、FMDV抗原は、配列アラインメントから設計された合成抗原であり得る。複数のB及びTエピトープがFMDV VP1キャプシドタンパク質で記載された。アジア血清型に由来する1つのTエピトープ及び2つのBエピトープの融合物に対応する合成ポリペプチドが、防御応答を誘導することが立証された（Ren et al, Vaccine 2011）。配列アラインメントの後で、他の全ての血清型について等価のポリペプチドを規定することができた。別の実施態様では、FMDV抗原はVP1ポリペプチドであり得る。さらに別の実施態様では、FMDV抗原はP1-3Cポリペプチドであり得る。別の実施態様では、FMDV抗原はP1単独又はP1-2A/2B1であり得る。さらに別の実施態様では、FMDV抗原はVP0-VP3であり得る。別の実施態様では、FMDV抗原はVP4-VP2であり得る。なお別の実施態様では、FMDV抗原は3Cであり得る。
別の実施態様では、FMDV抗原又はポリペプチド若しくはタンパク質は、融合タンパク質又はキメラタンパク質である。さらに別の実施態様では、FMDV抗原又はポリペプチド若しくはタンパク質は、ゲオバシルス・ステアロテルモフィルス由来E2のコアC-末端触媒ドメインと融合される。
別の実施態様では、FMDV抗原は以下のFMDV株に由来し得る：O1 Manisa、O1 BFS若しくはCampos、A24 Cruzeiro、Asia 1 Shamir、A Iran’96、A22 Iraq、SAT2 Saudi Arabia。
【００２１】
本発明はFMDVワクチンに関し、これらは有効量の組換え又は融合又はキメラFMDV抗原若しくはタンパク質及び医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、アジュバント、賦形剤又はビヒクルを含むことができる。
別の実施態様では、FMDV抗原は、FMDVとE2との融合又はキメラタンパク質である。FMDV-E2融合又はキメラタンパク質は原核細胞又は真核細胞で生成できる。別の実施態様では、医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、アジュバント、賦形剤又はビヒクルは、油中水型エマルジョンであり得る。別の実施態様では、医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、アジュバント、賦形剤又はビヒクルは、水中油型エマルジョンであり得る。さらに別の実施態様では、油中水型エマルジョンは水/油/水（W/O/W）三重エマルジョンであり得る。
本発明はさらに、ベクター分子又は発現ベクターに含まれ、プロモーターエレメントに及び場合によってエンハンサーに作動できるように連結されたFMDVポリヌクレオチドを包含する。
ある特徴では、本発明は、配列番号:2、4、6、8、10、12又は14に示される配列を有するFMDVポリペプチド（特にヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類ポリペプチド）及び前記ポリペプチドの変種又はフラグメントを提供する。
別の特徴では、本発明は、本発明の抗原性ポリペプチド、特に配列番号:2、4、6、8、10、12又は14に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%配列同一性を有するポリペプチドを提供する。
さらに別の特徴では、本発明は、上記で認定されたFMDVポリペプチド（配列番号:2、4、6、8、10、12又は14）のフラグメント及び変種を提供し、これらは周知の分子生物学的技術を用いて当業者によって容易に調製され得る。
さらに別の特徴では、本発明は、FMDV抗原及びゲオバシルス・ステアロテルモフィルス由来E2ドメインを含む融合タンパク質又はキメラタンパク質を提供する。FMDV-E2融合タンパク質又はキメラタンパク質は、配列番号:6、10又は14に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%配列同一性を有するポリペプチドを含むことができる。
変種は、配列番号:2、4、6、8、10、12又は14に示されるアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一性を有する相同なポリペプチドである。
FMDVポリペプチドの免疫原性フラグメントは、配列番号:2、4、6、8、10、12又は14に示される配列を有するFMDVポリペプチドの連続する少なくとも8、10、15、又は20アミノ酸、少なくとも21アミノ酸、少なくとも23アミノ酸、少なくとも25アミノ酸、又は少なくとも30アミノ酸、又は前記の変種を含む。別の実施態様では、FMDVポリペプチドのフラグメントは、FMDVポリペプチドで見いだされる固有の抗原性エピトープを含む。
【００２２】
別の実施態様では、本発明は、FMDVポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号: 2、4、6、8、10、12又は14に示される配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。さらに別の特徴では、本発明は、配列番号:2、4、6、8、10、12又は14に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%配列同一性を有するポリペプチド、又は保存的変種、対立遺伝子変種、ホモローグ、又はこれらポリペプチドの1つの少なくとも8若しくは10の連続するアミノ酸を含む免疫原性フラグメント、又はこれらポリペプチドの組合せをコードするポリヌクレオチドを提供する。
さらに別の特徴では、本発明は、配列番号:2、4、6、8、10、12又は14に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%配列同一性を有するFMDV-E2融合タンパク質又はキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
別の特徴では、本発明は、配列番号:1、3、5、7、9、11及び13に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド又はその変種を提供する。さらに別の特徴では、本発明は、配列番号:1、3、5、7、9、11及び13に示される配列を有するポリヌクレオチドと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%配列同一性を有するポリヌクレオチド又はその変種を提供する。
さらに別の特徴では、本発明は、E2タンパク質配列（配列番号:4）及びDNA配列（配列番号:3）並びにE2リンカー配列（配列番号:15）を提供する。
本発明のポリヌクレオチドは、追加的配列、例えば同じ転写ユニット内の追加的コード配列、制御エレメント、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、5’UTR、3’UTR、転写終了因子、ポリアデニル化部位、同じ又は異なるプロ−モーター下の追加的転写ユニット、クローニング、発現、相同組換え及び宿主細胞の形質転換を可能にする配列、並びに本発明の実施のために所望し得る任意の構築物を含むことができる。
【００２３】
FMDVポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原の発現のためのエレメントが有利には本発明のベクターに存在する。最低限の態様では、前記エレメントは、開始コドン（ATG）、終止コドン及びプロモーター、及び場合によってポリアデニル化配列（ある種のベクター、例えばプラスミドベクター及びある種のウイルスベクター（例えばポックスウイルス以外のウイルスベクター）のため）を含むか、本質的にそれらから成るか、又はそれらから成る。ポリヌクレオチドがポリプロテインフラグメント（例えばFMDVペプチド）を有利にはベクター内でコードするとき、ATGはリーディングフレームの5’に配置され、終止コドンは3’に配置される。発現制御のための他のエレメントも存在することがあり、前記エレメントは、例えばエンハンサー配列、安定化配列（例えばイントロン）、及び当該タンパク質の分泌を可能にするシグナル配列である。
本発明はまた、ベクター（例えば発現ベクター）を含む組成物、例えば治療組成物に関する。前記組成物は、1つ以上のベクター（例えば発現ベクター、例えばin vivo発現ベクター）を含むことができ、前記ベクターは、1つ以上のFMDVポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原を含みさらにそれらを発現する。ある実施態様では、ベクターは、1つのFMDV抗原、エピトープ又は免疫原をコードする（さらに有利にはそれらを発現する）ポリヌクレオチドを含むか、本質的に前記ポリヌクレオチドから成るか、又は前記ポリヌクレオチドから成る1つのポリヌクレオチドを、医薬的に又は獣医的に許容できる担体、賦形剤、アジュバント又はビヒクル中に含みさらにそれらを発現する。したがって、本発明のある実施態様にしたがえば、組成物中の他の1つのベクター又は複数のベクターは、FMDVポリペプチド、抗原、エピトープ若しくは免疫原又は前記のフラグメントの1つ以上の他のタンパク質をコードする1つのポリヌクレオチドを含むか、又は本質的に前記ポリヌクレオチドから成るか、又は前記ポリヌクレオチドから成り、さらに適切な状況下で当該ベクターはそれらを発現する。
【００２４】
さらに別の実施態様にしたがえば、当該1つのベクター又は複数のベクターは、ゲオバシルス・ステアロテルモフィルス由来E2をコードするポリヌクレオチドを含むか、又は本質的に前記ポリヌクレオチドから成るか、又は前記ポリヌクレオチドから成る。
本発明のさらにまた別の実施態様にしたがえば、発現ベクターは、プラスミドベクター又はDNAプラスミドベクター、特に原核細胞又は真核細胞のin vivo発現ベクターである。具体的な非限定例では、ポリヌクレオチド配列挿入用ベクターとして、pET30a、pET30b及びpET30c（Novagen）を利用できる。pET-30a-cベクターは、T7プロモーター及びN-末端Hisタグ/トロンビン/Sタグ/エンテロキナーゼ立体構造プラス場合によりC-末端Hisタグ配列を保持する。別の非限定例では、ポリヌクレオチド配列挿入用ベクターとして、pVR1020又は1012プラスミド（VICAL Inc.；Luke et al., 1997；Hartikka et al., 1996（例えば米国特許5,846,946号及び6,451,769号参照））を利用できる。pVR1020プラスミドはpVR1012に由来し、ヒトtPAシグナル配列を含む。ある実施態様では、ヒトtPAシグナルはGenbankアクセッション番号HUMTPA14のアミノ酸M(1)からアミノ酸S(23)を含む。別の具体的な非限定例では、ポリヌクレオチド配列挿入用ベクターとして利用されるプラスミドはGenbankアクセッション番号U28070のアミノ酸M(24)からアミノ酸A(48)のウマIGF1のシグナルペプチド配列を含むことができる。前記の実施のために参考となるか又は利用できるDNAプラスミドに関するさらに別の情報は、例えば米国特許6,852,705号、6,818,628号、6,586,412号、6,576,243号、6,558,674号、6,464,984号、6,451,770、号6,376,473号及び6,221,362号で見いだされる。
【００２５】
プラスミドという用語は、本発明のポリヌクレオチド及び所望される宿主又は標的の1つの細胞又は複数の細胞における前記ポリヌクレオチドのin vivo発現に必要なエレメントを含むいずれのDNA転写ユニットもカバーし、これに関しては、スーパーコイル若しくは非スーパーコイル状プラスミド、環状プラスミドとともに直線型が本発明の範囲内であることが意図される。
プラスミドは各々、場合によって異種ペプチド配列と融合され得るFMDV抗原、エピトープ又は免疫原をコードするポリヌクレオチに加えて、変種、アナローグ又はフラグメントを含むか、又は本質的にそれらから成るか、又はそれらから成り、それらはプロモーターに作動できるように連結されるか、プロモーターの制御下にあるか、又はプロモーターに依存する。一般的には、真核細胞で機能する強力なプロモーターを利用することが有利である。強力なプロモーターは、ヒト又はネズミ起原の前初期サイトメガロウイルスプロモーター（CMV-IE）、又は場合によって別の起原（例えばラット又はモルモット）を有し、スーパープロモーターであり得るが、ただし前記に限定されない（Ni, M.et al., Plant J.7, 661-676, 1995）。CMV-IEプロモーターは実際のプロモーター部分を含むことができ、プロモーターはエンハンサー部分を伴っていても伴っていなくてもよい。EP-A-260148、EP-A-323597、米国特許5,168,062号、5,385,839号及び4,968,615号とともにPCT出願WO87/03905を参照されたい。CMV-IEプロモーターは、有利にはヒトCMV-IE（Boshart et al., 1985, Cell 41(2): 521-30）又はネズミCMV-IEである。
大まかに言えば、プロモーターはウイルス起源、植物起原又は細胞性起原である。本発明の実施で有用であり得るCMV-IE以外の強力なウイルスプロモーターは、SV40ウイルスの初期/後期プロモーター又はラウス肉腫ウイルスのLTRプロモーターである。本発明の実施で有用であり得る強力な細胞性プロモーターは、骨格の遺伝子のプロモーター、例えばデスミンプロモーター（Kwissa et al., 2000, Vaccine 18(22): 2337-44）又はアクチンプロモータ（Miyazaki et al., 1989, Gene 79(2): 269-77）である。
プラスミド及びポックスウイルス以外のウイルスベクターのためのポリアデニル化シグナル（ポリA）に関しては、ウシ成長ホルモン（bGH）遺伝子のポリ(A)シグナル（US5,122,458参照）又はウサギβ-グロビン遺伝子のポリ(A)シグナル又はSV40ウイルスのポリ(A)シグナルの使用がより有用であり得る。
【００２６】
“宿主細胞”は、外因性ポリヌクレオチド（例えば組換えプラスミド又はベクター）の投与によって遺伝的に変化しているか又は遺伝的に変化する能力を有する原核又は真核細胞を示す。遺伝的に変化した細胞というとき、当該用語は、当初の変化した細胞及びその子孫の両方を指す。
本発明で意図される原核細胞には、アビバクテリウム属（Avibacterium）、ブルセラ属（Brucella）、大腸菌、ヘモフィルス属（Haemophilus）（例えばヘモフィルス・スイス（Haemophilus suis））、サルモネラ属（例えばサルモネラ・エンテリジス（Salmonella enteridis）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、サルモネラ・インファンチス（Salmonella infantis））、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ラクトバシルス属（Lactobacillus）、シゲラ属（Shigella）、パスツレラ属（Pasteurella）、及びリメイレラ属（Rimeirella）が含まれ得る。
原核細胞系では、多数の発現ベクターが選択可能である。そのようなベクターには、多機能性大腸菌クローニング及び発現ベクター（例えばPBLUESCRIPT（Stratagene）及びpETベクター（Novagen））；piNベクター（Van Heeke & Schuster,  J.Biol.Chern.264:5503-5509 ,1989）；及びPGEXベクター（Promega, Madison, Wis.）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。真核細胞系では、細胞株は、酵母（例えばサッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris））、バキュロウイルス細胞、哺乳動物細胞、植物細胞であり得る。真核細胞系の発現ベクターには、pVR1020又はpVT1012ベクター（Vical Inc., San Diego, CA）、PichiaPinkベクター（Invitrogen, CA, USA）、pFasBac TOPOベクター（Invitrogen）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００２７】
使用方法及び作製方法
ある実施態様では、本明細書に開示する主題は抗原性ポリペプチド若しくは抗原を生成又は作製する方法を対象とする。前記方法は以下の工程を含む：i）抗原をコードするポリヌクレオチドを、E2タンパク質をコードするポリヌクレオチドに連結する工程；ii）当該融合タンパク質を宿主で発現する工程；及びiii）融合タンパク質を宿主から単離する工程。ある実施態様では、抗原はE2のN-末端に連結される。別の実施態様では、E2タンパク質はゲオバシルス・ステアロテルモフィルス由来である。
別の実施態様では、本明細書に開示する主題はヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類をワクチン免疫する方法を対象とし、前記方法は、ヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類に有効量のワクチンを投与する工程を含み、前記ワクチンは、組換え又は融合若しくはキメラFMDV抗原又はタンパク質の有効量及び医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、賦形剤、アジュバント又はビヒクルを含むことができる。
本発明のある実施態様では、前記方法は、本発明に従ったエマルジョンとともに処方されたワクチン組成物のただ1回の投与を含む。例えば、ある実施態様では、当該免疫学的又はワクチン組成物はFMDV抗原（ポリペプチド及びVLP（ウイルス様粒子）を含む）を含み、一方、また別の実施態様はFMDV-E2融合又はキメラタンパク質を含むワクチンを提供する。電子顕微鏡検査により、FMDV-E2融合又はキメラタンパク質は真正FMDVビリオン又はVLPに類似するFMDV-E2粒子を生じることが示され、したがって、本発明の免疫学的組成物又はワクチン組成物はFMDV-E2粒子を含むものを包含する。
【００２８】
ある実施態様では、本明細書に開示する主題はヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類をワクチン免疫する方法を対象とし、前記方法は、ヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類にFMDV抗原を投与する工程を含む。別の実施態様では、本明細書に開示する主題は免疫応答を引き出す方法を対象とし、前記方法は、ヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類にヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類のFMDV抗原を含むワクチンを投与する工程を含む。さらに別の実施態様では、本明細書に開示する主題はヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類において疾患を防御及び/又は予防する方法を対象とし、前記方法は、ヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類にヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類のFMDV抗原を含むワクチンを投与する工程を含む。
投与は皮下又は筋肉内投与であり得る。投与は無針投与であり得る（例えばPigjet又はBioject）。
本発明のある実施態様では、プライム-ブーストレジメンを利用できる。プライム-ブーストレジメンは、少なくとも1回の一次投与及び少なくとも1回のブースター投与から構成され、少なくとも1つの共通のポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原が用いられる。典型的には、一次投与で用いられる免疫学的組成物又はワクチンは、ブーストとして用いられるものと本質的に異なる。しかしながら、同じ組成物を一次投与及びブースト投与として使用できることを特記しておく。この投与プロトコルは“プライム-ブースト”と呼ばれる。
【００２９】
本発明のプライム-ブーストは、抗原性ポリペプチド又はそのフラグメント若しくは変種をコードするFMDVコード配列又はそのフラグメントの発現に用いられる組換えウイルスベクターを含むことができる。具体的には、当該ウイルスベクターは、抗原性ポリペプチドをコードするFMDV遺伝子又はそのフラグメントを発現することができる。本明細書で意図されるウイルスベクターには、ポックスウイルス［例えば、ワクシニアウイルス又は弱毒ワクシニアウイルス、アビポックスウイルス又は弱毒アビポックスウイルス（例えばカナリアポックス、鶏痘、ハトポックス（dovepox）、ピジョンポックス、ウズラポックス、ALVAC、TROVAC（US5,505,941、US5,494,8070参照））、アライグマポックスウイルス、ブタポックスウイルスなど］、アデノウイルス（例えばヒトアデノウイルス、イヌアデノウイルス）、ヘルペスウイルス（例えばイヌヘルペスウイルス、シチメンチョウのヘルペスウイルス、マレック病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、ネコヘルペスウイルス、喉頭気管炎ウイルス（ILTV）、ウシヘルペスウイルス、ブタヘルペスウイルス）、バキュロウイルス、レトロウイルスなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。別の実施態様では、アビポックス発現ベクターはカナリアポックスベクター（例えばALVAC）であり得る。さらに別の実施態様では、アビポックス発現ベクターは鶏痘ベクター（例えばTROVAC）であり得る。発現されるべき本発明のFMDV抗原は、特定のポックスウイルスプロモーター、例えばとりわけエントモポックスウイルスAmsacta moorei 42Kプロモーター（Barcena, et al.2000, J Gen Virol 81(Pt 4): 1073-85）、ワクシニアプロモーター7.5 kDa（Cochran et al., 1985, J Virol 54(1): 30-7）、ワクシニアプロモーターI3L（Riviere et al., 1992, J Virol 66(6): 3424-34）、ワクシニアプロモーターHA（Shida, 1986, Virology 150(2): 451-62）、牛痘プロモーターATI（Funahashi et al., 1988, J Gen Virol 69 ( Pt 1): 35-47）、ワクシニアプロモーターH6（Taylor et al., 1988, Vaccine 6(6): 504-8；Guo et al., 1989, J Virol 63(10): 4189-98；Perkus et al., 1989, J Virol 63(9): 3829-36）の制御下へ挿入される。
別の実施態様では、アビポックス発現ベクターはカナリアポックスベクター（例えばALVAC）であり得る。FMDV抗原、エピトープ又は免疫原はFMDV P1-3Cであり得る。FMDV抗原発現用ウイルスベクターは、カナリアポックスベクター（例えばvCP2186、vCP2181又はvCP2176）、又は鶏痘ウイルス（例えばvFP2215（US7,527,960参照））、又はアデノウイルスUS2016/0220659）であり得る。
【００３０】
本発明のプライム-ブーストは植物又は藻類（US2011/0236416参照）又は昆虫細胞（US2016/0220659）で産生される組換えFMDV抗原又はタンパク質を含むことができる。
本発明のプライム-ブーストプロトコルの別の特徴では、本発明のFMDV抗原を含む組成物が投与され、その後に以下の投与が続く：FMDV抗原を含みin vivoで前記を発現する組換えウイルスベクターを含むワクチン若しくは組成物；又はFMDV抗原を含む不活化ウイルスワクチン若しくは組成物；又はFMDV抗原を含むか又は前記を発現するDNAプラスミドワクチン若しくは組成物；又は植物、藻類若しくは昆虫細胞で生成された組換えFMDV抗原。同様に、プライム-ブーストプロトコルは、FMDV抗原を含みin vivoで前記を発現する組換えウイルスベクターを含むワクチン若しくは組成物；又はFMDV抗原を含む不活化ウイルスワクチン若しくは組成物；又はFMDV抗原を含むか又は前記を発現するDNAプラスミドワクチン若しくは組成物；又は植物、藻類若しくは昆虫細胞で生成された組換えFMDV抗原の投与に続いて、本発明のFMDV抗原を含む組成物を投与する工程を含むことができる。さらに一次及び二次投与の両方が本発明のFMDV抗原を含む組成物を含み得ることを特記しておく。
プライム-ブーストプロトコルは、少なくとも1回のプライム投与及び少なくとも1回のブースト投与を含み、少なくとも1つの共通のポリペプチド及び/又はその変種若しくはフラグメントを用いる。プライム投与で用いられるワクチンは後のブースターワクチンとして用いられるものと本質的に相違し得る。プライム投与は1回以上の投与を含むことができる。
哺乳動物である標的種のための組成物の用量体積（例えばヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類の組成物の用量体積）は、ウイルスベクター（例えば非ポックスウイルスベクター系組成物）を基準にして、一般的には約0.1から約5.0mL、約0.1から約3.0mL、及び約0.5mLから約2.5mLである。
【００３１】
ワクチンの有効性は、最後の免疫から約2から4週間後に、動物（例えばヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類）をFMDVの病毒株（有利にはFMDV O1 Manisa、O1 BFS又はCampos、A24 Cruzeiro、Asia 1 Shamir、A Iran’96、A22 Iraq、SAT2 Saudi Arabia株）でチャレンジすることによって試験できる。
さらに他の株には以下のFMDVが含まれ得る：A10-61、A5、A12、A24/Cruzeiro、C3/Indaial、O1、C1-Santa Pau、C1-C5、A22/550/Azerbaijan/65、SAT1-SAT3、A、A/TNC/71/94、A/IND/2/68、A/IND/3/77、A/IND/5/68、A/IND/7/82、A/IND/16/82、A/IND/17/77、A/IND/17/82、A/IND/19/76、A/IND/20/82、A/IND/22/82、A/IND/25/81、A/IND/26/82、A/IND/54/79、A/IND/57/79、A/IND/73/79、A/IND/85/79、A/IND/86/79、A/APA/25/84、A/APN/41/84、A/APS/44/05、A/APS/50/05、A/APS/55/05、A/APS/66/05、A/APS/68/05、A/BIM/46/95、A/GUM/33/84、A/ORS/66/84、A/ORS/75/88、A/TNAn/60/947/Asia/1、A/IRN/05、Asia/IRN/05、O/HK/2001、O/UKG/3952/2001、O/UKG/4141/2001、O/UKG/7039/2001、O/UKG/9161/2001、O/UKG/7299/2001、O/UKG/4014/2001、O/UKG/4998/2001、O/UKG/9443/2001、O/UKG/5470/2001、O/UKG/5681/2001、O/ES/2001、HKN/2002、O5India、O/BKF/2/92、K/37/84/A、KEN/1/76/A、GAM/51/98/A、A10/Holland、O/KEN/1/91、O/IND49/97、O/IND65/98、O/IND64/98、O/IND48/98、O/IND47/98、O/IND82/97、O/IND81/99、O/IND81/98、O/IND79/97、O/IND78/97、O/IND75/97、O/IND74/97、O/IND70/97、O/IND66/98、O/IND63/97、O/IND61/97、O/IND57/98、O/IND56/98、O/IND55/98、O/IND54/98、O/IND469/98、O/IND465/97、O/IND464/97、O/IND424/97、O/IND423/97、O/IND420/97、O/IND414/97、O/IND411/97、O/IND410/97、O/IND409/97、O/IND407/97、O/IND399/97、O/IND39/97、O/IND391/97、O/IND38/97、O/IND384/97、O/IND380/97、O/IND37/97、O/IND352/97、O/IND33/97、O/IND31/97、O/IND296/97、O/IND23/99、O/IND463/97、O/IND461/97、O/IND427/98、O/IND28/97、O/IND287/99、O/IND285/99、O/IND282/99、O/IND281/97、O/IND27/97、O/IND278/97、O/IND256/99、O/IND249/99、O/IND210/99、O/IND208/99、O/IND207/99、O/IND205/99、O/IND185/99、O/IND175/99、O/IND170/97、O/IND164/99、O/IND160/99、O/IND153/99、O/IND148/99、O/IND146/99、O/SKR/2000、A22/India/17/77。
【００３２】
これらのFMDV株の更なる詳細は欧州バイオインフォマティクス研究所（EMBL-EBI）のウェブページで見出すことができる。
同種株及び異種株の両方をチャレンジに用いワクチンの有効性を試験する。動物は、皮内、皮下、スプレー、鼻内、眼内、及び/又は経口によりチャレンジすることができる。
プライム-ブースト投与は有利には1から6週間離して実施することができる。ある実施態様にしたがえば、半年ブースター又は1年ブースターもまた想定され、有利にはウイルスベクター系ワクチンが用いられる。
プライム-ブーストプロトコルで用いられる本発明の組換え抗原ポリペプチドを含む組成物は、医薬的若しくは獣医的に許容できるビヒクル、希釈剤、アジュバント又は賦形剤中に含まれる。本発明のプロトコルは、ヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類のFMDVから動物を防御し、及び/又は感染動物で疾患の進行を予防する。
本明細書の開示は例として提供され本発明はそれらに限定されないことは、当業者には理解されよう。本明細書の開示及び当業界の知識から、当業者は、一切の過度な実験を行うことなく各注射プロトコルで用いられるべき投与回数、投与ルート及び用量を決定できる。
本発明は、本発明にしたがって作製した有効量の治療組成物を少なくとも1回動物に投与することを意図する。動物は雄、雌、妊娠雌及び新生仔であり得る。この投与は、多様なルート（筋肉内（IM）、皮内（ID）又は皮下注射、又は鼻内若しくは経口投与を含む）を介することができる。本発明の治療組成物はまた、無針装置（例えばPigjet、Dermojet、Biojector、Avijet（Merial, GA, USA）、Vetjet又はVitajet装置（Bioject, Oregon, USA））によって投与できる。プラスミド組成物投与の別のアプローチはエレクトロポレーションの使用である（例えば以下を参照されたい：Tollefsen et al., 2002；Tollefsen et al., 2003；Babiuk et al., 2002；PCT出願WO99/01158）。
【００３３】
ある実施態様では、本発明は、FMDV抗原又はエピトープをデリバリーし標的細胞で発現するために治療的に有効な量の処方物の投与を提供する。治療的に有効な量の決定は、当業者にとって日常的な実験である。ある実施態様では、処方物は、FMDV抗原又はエピトープを発現するポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、ビヒクル、アジュバント又は賦形剤を含む。別の実施態様では、医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、ビヒクル、アジュバント又は賦形剤は、宿主動物へのトランスフェクション又はポリヌクレオチドの他の移転手段を促進するか、及び/又はベクター又はタンパク質の宿主での保存を改善する。
ある実施態様では、本明細書に開示する主題は、感染動物とワクチン接種動物とを弁別（DIVA）するための検出方法を提供する。
本発明のワクチン又は組成物の使用は動物のFMDV感染の検出を可能にすることが本明細書で開示される。感染動物とワクチン接種動物とを弁別（DIVA）することによって、本発明のワクチン又は組成物の使用は動物の感染の検出を可能にすることが本明細書で開示される。FMDV免疫原検出方法（例えばELISA）を用いて、動物でFMDV感染を診断する方法が本明細書で開示される。
【００３４】
製造物
ある実施態様では、本明細書に開示する主題は免疫応答を惹起する又は誘導する方法を実施するためのキットを対象とし、前記キットは、組換えFMDV免疫学的組成物若しくはワクチン、又は不活化FMDV免疫学的組成物若しくはワクチン、組換えFMDVウイルス組成物若しくはワクチンのいずれか1つ、及び当該方法を実施するための指示書を含むことができる。
本発明の別の実施態様は、FMDVに対する免疫学的又は防御的応答を動物において誘導する方法を実施するためのキットであり、本発明のFMDV抗原を含む組成物又はワクチン及び組換えFMDVウイルス免疫学的組成物又はワクチン、及び動物において免疫応答を惹起するために有効な量でデリバリーする方法を実施するための指示書を含む。
本発明の別の実施態様は、FMDVに対する免疫学的又は防御的応答を動物で誘導する方法を実施するためのキットであり、前記キットは、本発明のFMDV抗原を含む組成物又はワクチン及び不活化FMDV免疫学的組成物又はワクチン、及び動物で免疫応答を引き出すために有効な量でデリバリーする方法を実施するための指示書を含む。
本発明のさらに別の特徴は、上記に記載する本発明のプライム-ブーストワクチン免疫のためのキットに関する。前記キットは以下の少なくとも2つのバイアルを含むことができる：第一のバイアルは本発明のプライムワクチン免疫のためのワクチン又は組成物を含み、第二のバイアルは本発明のブーストワクチン免疫のためのワクチン又は組成物を含む。前記キットは、有利には、追加のプライムワクチン免疫又は追加のブーストワクチン免疫のために追加の第一又は第二のバイアルを含むことができる。
【００３５】
医薬的に若しくは獣医的に許容できる担体又はアジュバント又はビヒクル又は賦形剤は当業者には周知である。例えば、医薬的若しくは獣医的に許容できる担体又はビヒクル又はアジュバント又は賦形剤は、0.9% NaCl（例えば生理食塩水）溶液又はリン酸緩衝液であり得る。本発明の方法に使用できる他の医薬的若しくは獣医的に許容できる担体又はビヒクル又は賦形剤には、ポリ-(L-グルタメート)又はポリビニルピロリドンが含まれるが、ただしこれらに限定されない。医薬的若しくは獣医的に許容できる担体又はビヒクル又はアジュバント又は賦形剤は、ベクター（又は本発明のベクターからin vitroで発現されるタンパク質）の投与を促進する任意の化合物又は化合物の組合せであることができ、当該担体、アジュバント、ビヒクル又は賦形剤はトランスフェクションを促進するか、及び/又はベクター（又はタンパク質）の保存を改善することができる。用量及び用量体積は一般的な記述として本明細書で考察し、当業者はまた、煩瑣な実験を実施することなく当業界の知識とともに本開示から決定することができる。
第四級アンモニウム塩を含む陽イオン性脂質（プラスミドにとって有益ではあるが絶対的にというわけではない）は、有利には以下の式を有するものである：
【００３６】
【化１】
2020203890.tif 000002
【００３７】
式中、R1は12から18の炭素原子を有する飽和又は不飽和直鎖脂肪族基であり、R2は2つ又は3つの炭素原子を含む別の脂肪族基であり、Xはアミン又はヒドロキシル基（例えばDMRIE）である。別の実施態様では、陽イオン性脂質は中性脂質（例えばDOPE）と結合できる。
これらの陽イオン性脂質の中では、特にDMRIE（N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-bis(テトラデシロキシ)-1-プロパンアンモニウム；WO96/34109）が好ましく、有利には中性脂質（有利にはDOPE（ジオレオイル-ホスファチジル-エタノールアミン；Behr, 1994））と結合してDMRIE-DOPEを形成する。
DOPEが存在するとき、DMRIE：DOPEのモル比は約95：約5から約5：約95、又は約1：約1、例えば1：1である。
DMRIE又はDMRIE-DOPEアジュバント：プラスミドの質量比は、約50：約1から約1：約10、例えば約10：約1から約1：約5、及び約1：約1から約1：約2、例えば1：1から1：2である。
【００３８】
別の実施態様では、医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、アジュバント、賦形剤又はビヒクルは油中水エマルジョンであり得る。適切な油中水エマルジョンの例には、油を基剤とする油中水ワクチンエマルジョンが含まれる。適切な油中水エマルジョンは、安定かつ4℃で液体であり、以下を含有する：6から50 v/v%の抗原含有水相（好ましくは12から25 v/v%）、50から94 v/v%の油相であって全体に又は部分的に非代謝性油（例えば鉱物油、例えばパラフィン油）及び/又は代謝性油（例えば植物油又は脂肪酸又はアルコールエステル）を含むもの、0.2から20 p/v%の界面活性剤（好ましくは3から8 p/v%）、後者は全体に又は部分的に存在するか、或いはポリグリセロールエステル（前記ポリグリセロールエステルは好ましくはポリグリセロール(ポリ)リシノール酸エステル）又はポリオキシエチレンリシン油又は他の水素添加ポリオキシエチレンリシン油の混合物として存在する。油中水エマルジョンで用いることができる界面活性剤の例には以下が含まれる：エトキシル化ソルビタンエステル（例えばポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエート（TWEEN80(商標)）、アプリケム社（AppliChem, Inc., Cheshire, CT）から入手できる）及びソルビタンエステル（例えばソルビタンモノオレエート（SPAN80(商標)）、シグマアルドリッチ社(Sigma Aldrich, St.Louis, MO)から入手できる）。油中水エマルジョンに関しては他に米国特許6,919,084号を参照されたい。いくつかの実施態様では、抗原含有水相は、1つ以上の緩衝剤を含む食塩水溶液を含む。適切な緩衝溶液の例にはリン酸緩衝生理食塩水が含まれる。ある有益な実施態様では、油中水エマルジョンは水/油/水（W/O/W）の三重エマルジョンであり得る（米国特許6,358,500号）。他の適切なエマルジョンの例は米国特許7,371,395号に記載されている。
【００３９】
本発明の免疫学的組成物及びワクチンは、1つ以上のアジュバントを含むか又は本質的に前記から成ることがある。本発明の実施で使用される適切なアジュバントは、（1）アクリル酸又はメタクリル酸ポリマー、無水マレイン酸及びアルケニル誘導体ポリマー、（2）免疫刺激性配列（ISS）、例えば1つ以上の非メチル化CpGユニットを有するオリゴデオキシリボヌクレオチド配列（Klinman et al., 1996；WO98/16247）、（3）水中油エマルジョン、例えばSPTエマルジョン（“Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach” M.Powell, M.Newman, Plenum Press刊（1995）の147ページに記載）及びエマルジョンMF59（同書の183ページに記載）、（4）四級アンモニウム塩を含む陽イオン脂質（例え
ばDDA）、（5）サイトカイン、（6）水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム、（7）サポニン、又は（8）本出願に引用され及び参照により含まれるいずれかの資料で考察されている他のアジュバント、又は（9）前記の任意の組合せ又は混合物である。
水中油エマルジョン（3）は、以下を基剤とすることができる：軽質流動パラフィン油（欧州局方型）、イソプレノイド油（例えばスクアラン、スクアレン）、アルケンのオリゴマー化から得られる油（例えばイソブテン又はデセン）、直鎖アルキル基を有する酸又はアルコールのエステル（例えば植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコール、ジ(カプリレート/カプレート)、グリセロールトリ(カプリレート/カプレート)、及びジオレイン酸プロピレングリコール）、又は分枝脂肪アルコール又は酸のエステル（特にイソステアリン酸エステル）。
油を乳化剤と組み合わせて用いてエマルジョンを形成する。乳化剤は以下のような非イオン性界面活性剤であり得る：エステルであって、一方ではソルビタン、マンニド（例えば無水オレイン酸マンニトール）、グリセロール、ポリグリセロール又はプロピレングリコールのエステル、及び他方ではオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸又はヒドロキシステアリン酸のエステル（前記エステルは場合によってエトキシル化される）、又はポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンコポリマーブロック（例えばプルロニック（Pluronic）、例えばL121。エマルジョンのいくつか（例えばTS6、TS7、TS8及びTS9エマルジョン）は、US7,608,279及びUS7,371,395に記載されている。
【００４０】
アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー（1）は、好ましくは、特に糖又は多価アルコールのポリアルケニルエーテルで架橋される。これらの化合物はカルボマーの名称で知られる（Pharmeuropa, vol.8, no.2, June 1996）。当業者はまた米国特許2,909,462号を参照できる。前記特許は、ポリヒドロキシル化合物によって架橋されたそのようなアクリル酸ポリマーを提供する。前記ヒドロキシル化合物は、少なくとも3つのヒドロキシル基（好ましくはそのような基は8つを超えない）を有し、少なくとも3つのヒドロキシル基の水素原子は、少なくとも2つの炭素原子を有する不飽和脂肪族基によって入れ替えられる。好ましい基は、2から4の炭素原子を含むもの、例えばビニル、アリル、及び他のエチレン性不飽和基である。不飽和基はまた、他の置換基（例えばメチル）を含むことができる。カルボポル（Carbopol）（BF Goodrich, Ohio, USA）という名で販売される製品が特に適切である。それらはアリルサッカロース又はアリルペンタエリトリトールによって架橋される。それらの中ではとりわけ、カルボポル974P、934P及び971Pが挙げられる。
無水マレイン酸およびアルケニル誘導体のコポリマーでは、EMATM（Monsanto）（無水マレイン酸とエチレンのコポリマー）（直鎖であるか、又は例えばジビニルエーテルによって架橋される）が好ましい。
アジュバントの有用な割合はよく知られており、当業者は容易に入手できる。例示すれば、最終ワクチン組成物におけるアクリル酸若しくはメタクリル酸又は無水マレイン酸及びアルケニルコポリマーの濃度は、0.01から1.5% w/v、より具体的には0.05から1% w/v、好ましくは0.1から0.4% w/vであろう。
ある実施態様では、アジュバントは、TS6（US7,371,395）、LR2、LR3及びLR4（US7,691,368）、TSAP（US20110129494）、TRIGENTM（Newport Labs）、合成dsRNA（例えばポリIC、ポリICLC［HILTONOL(商標)］）、及びMONTANIDETMアジュバント（W/O、W/O/W、O/W、IMS及びゲル（いずれもSEPPICの製品））を含む。
【００４１】
1つ又は複数のサイトカイン（5）はタンパク質形で免疫学的又はワクチン組成物中に存在するか、或いは1つ若しくは複数の免疫原又はそのエピトープとともに宿主で共同発現され得る。好ましくは、1つ又は複数のサイトカインは、1つ若しくは複数の免疫原又はそのエピトープを発現するベクターと同じベクターによって又は別々のベクターによって共同発現される。
本発明は、例えば複数の活性成分を、有利には一緒にかつアジュバント、担体、サイトカイン、及び/又は希釈剤とともに混合することによる組合せ組成物の調製を包含する。
本発明に用いることができるサイトカインには、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターフェロンα（IFNα）、インターフェロンβ（IFNβ）、インターフェロンγ（IFNγ）、インターロイキン-1α（IL-1α）、インターロイキン-1β（IL-1β）、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-3（IL-3）、インターロイキン-4（IL-4）、インターロイキン-5（IL-5）、インターロイキン-6（IL-6）、インターロイキン-7（IL-7）、インターロイキン-8（IL-8）、インターロイキン-9（IL-9）、インターロイキン-10（IL-10）、インターロイキン-11（IL-11）、インターロイキン-12（IL-12）、腫瘍壊死因子α（TNFα）、腫瘍壊死因子β（TNFβ）、及び形質転換増殖因子β（TGFβ）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。サイトカインは、本発明の免疫学的又はワクチン組成物と共同投与されるか、及び/又は連続的に投与され得ることは理解される。したがって、例えば、本発明のワクチンはまた、in vivoで適切なサイトカイン（例えばワクチンを接種される又は免疫学的応答が誘引される宿主に適合するサイトカイン（例えばブタ類に投与される調製物にはブタ類サイトカイン））を発現する外因性核酸分子を含むことができる。
本発明の免疫学的組成物及び/又はワクチンは、治療的応答を引き出すために、本明細書で考察した1つ以上のin vitro発現ポリペプチドの有効量を含むか、又は本質的に前記ポリペプチドの有効量から成るか、又は前記ポリペプチドの有効量から成る。有効量は、煩瑣な実験を実施することなく本開示（本明細書に取り込まれた資料を含む）及び当業界の知識から決定できる。
組成物又はワクチンは、ウイルスベクター、プラスミド又はバキュロウイルスからin vitro又はin vivoで生成される約102から約1020、約103から約1018、約104から約1016、約105から約1012のVLP（ウイルス様粒子）の用量を含むことができる。ウイルスベクターは、以下を含む（ただしこれらに限定されない）任意のウイルス力価測定方法を基準にして力価を測定できる：FFA（フォーカス形成アッセイ）若しくはFFU（フォーカス形成単位）、TCID50（50%組織培養感染用量）、PFU（プラーク形成単位）、及びFAID50（50%蛍光抗体感染用量）。in vitro（例えばプラスミド又はバキュロウイルス）で生成されるVLPは、血球凝集アッセイ、ELISA、及び電子顕微鏡検査によって滴定できる。VLPのタイプに応じて、他の方法もまた適用し得る。
用量体積は約0.1から約10mL、約0.2から約5mLであり得る。
【００４２】
以下の非限定的な例によって、これから本発明をさらに説明するであろう。
実施例
DNA挿入物、プラスミド及び組換えウイルスベクターの構築は、J.Sambrookらが記載した標準的な分子生物学技術を用いて実施された（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2014）。
【実施例１】
【００４３】
FMDV-E2融合タンパク質のクローニング及び発現
O1 Manisa血清型のFMDV VP1遺伝子（配列番号:2をコードする配列番号:1）をPCRで増幅し、pET30bベクター（Novagen）でクローン化した。得られたプラスミドpPX216は、5’端にFMDV VP1遺伝子を3’端にE2遺伝子のコアドメイン（配列番号:4をコードする配列番号:3）を有するFMDV-E2融合物を含む。
A24血清型のFMDV VP1遺伝子（配列番号:8をコードする配列番号:7）をPCRで増幅し、pET30bベクター（Novagen）でクローン化した。得られたプラスミドpPX236は、5’端にFMDV VP1遺伝子、および3’端にE2遺伝子のコアドメイン（配列番号:4をコードする配列番号:3）を有するFMDV-E2融合物を含む。
Asia Shamir血清型のFMDV VP1遺伝子（配列番号:14をコードする配列番号:13）をPCRで増幅し、pET30bベクター（Novagen）でクローン化した。得られたプラスミドpPX237は、5’端にFMDV VP1遺伝子、および3’端にE2遺伝子のコアドメイン（配列番号:4をコードする配列番号:3）を有するFMDV-E2融合物を含む。
化学的にコンピテントな発現株BLR(DE3)（Novagen）を前記作製構築物及び対応する空ベクターによって形質転換した。製造業者の指示にしたがって細菌を増殖させた。培養物を3200g（4℃、15分）で遠心分離した。上清をペレットから分離した。ペレットをある体積の緩衝液（50mM Tris-HCl緩衝液（pH8）、300mM NaCl、2mM MgCl2、1μg/mLのロイペプチン、1μg/mLのペプスタチン及び0.1mg/mLのリゾチーム）に再懸濁し、最終OD600nmを8.0にした。3サイクルの凍結/融解によって細胞溶解を実施した。培養物1リットル当たり1μLのベンゾナーゼヌクレアーゼ（Benzonase Nuclease）（Novagen）とともに溶解物を15分間（4℃）インキュベートした。10μLの溶解物タンパク質を分析に用い、SDS-PAGE 4-12%ビストリス電気泳動とその後のクーマシーブルー染色及びウェスタンブロット分析によって発現レベルを決定した。各条件に付き、2クローンを分析した。
FMDV-E2融合タンパク質をHisタグ無しの不溶性画分として生成し、再折畳みの前にさらにIEX及びSECによって精製した。ウェスタンブロット及びドットブロット（図3参照）は、FMDV-E2融合タンパク質は正確なサイズを生じたこと、及び発現されたFMDV-E2はFMDVワクチンでワクチン免疫されたブタ血清と反応することを示した。
図4及び5に示すように、FMDV-E2ナノ粒子の物理的及び生化学的特徴付けを実施した。
発現された抗原をナノ粒子構造の有無について電子顕微鏡検査によってチェックした。図4AはE2単独タンパク質の粒子を示す。図4BはE2-FMDV-E2融合タンパク質の粒子を示す。図4CはcdE2-FMDVタンパク質の粒子（孤立（stand-alone）E2タンパク質及びFMDV-E2融合タンパク質の2：1比の混合物を含む）を示す。これらの結果は、FMDV-E2融合物は野生型E2コアドメインと類似する60merの粒子を形成することを示した。
FMDV粒子（146Sの完全キャプシド、又は変性キャプシド＝12Sキャプソマー）に対して種々の特異性を有する3つの抗FMDV VHHナノボディによる間接ELISAを用いて、前記ナノ粒子をそれらの認識についてさらに評価した（表1参照）。
表1：FMDV VHHナノボディ
2020203890.tif 000003
結果（図5参照）は、M170 VHHナノボディ（FMDV O1M 146S完全キャプシドに特異的）は、キメラペプチドがE2タンパク質と融合しておりナノ粒子に集合するときにのみ強力なシグナルを生じることを示した。これは、キメラFMDV VP1ペプチドは、野生型FMDVウイルス粒子における立体構造と同じ立体構造でE2ナノ粒子上に提示されることを示している。
【実施例２】
【００４４】
ワクチン接種動物の臨床的及び血清学的研究
実施例2.1：O1 Manisaワクチンの臨床的及び血清学的研究
本研究の目的は、FMD O1 Manisaワクチンの通常ブタにおける免疫原性を評価することであった。このワクチンはTS6及びポリアクリル酸ポリマー処方物で試験された。各処方物を3週間離して（D0−D21）ブタに2回注射して投与した（表2参照）。ブタはD0で8−9週齢であった。免疫原性は、表3に概略するように血清学実験及び細胞媒介免疫（CMI）アッセイ（D27、D42）により評価した。モニターしたパラメーターには以下が含まれていた： D1（任意抽出のため）及びD42（安楽死前）の体重；D1、D20及びD42の血清学検査；D27及びD42のCMIアッセイ；臨床徴候（D1からD21及びD21からD23の全身反応）及び注射部位の局所反応（D0からD2及びD21からD23）。
【００４５】
表2：D0及びD21のO1 Manisaワクチン2回注射によるワクチン免疫計画
2020203890.tif 000004
TS6*：TS6アジュバント/US7,608,279及びUS7,371,395TS6に記載のエマルジョン
【００４６】
表2.1：TS6エマルジョン（US7,608,279及びUS7,371,395に記載のプレマルジョン）
2020203890.tif 000005
【００４７】
表3：細胞性免疫応答モニター
2020203890.tif 000006
血清学検査の結果は表4及び図11に示されている。
【００４８】
表4：FMDV O1 Manisa血清中和（SN）
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*：非確定的力価
【００４９】
表3及び図10の結果は、グループ間差異が有意であり（p＝0.001）、G2及びG3グループが優位であること示した。
図6及び7の結果は、特異的な形質細胞が全てのFMDV-E2グループで検出されG1（FMDV単独）の応答は非常に弱いことを示した。G3及びG4と比較してより良好な応答がG2で得られた。G2グループは、FMDV-E2被覆を用いたとき突出した応答を示した。
図8及び9は、特異的なIFNγ応答がいずれの再刺激でも全てのワクチン免疫グループで検出されることを示し、最高のIFNγ応答は全てのグループでFMDV-E2再刺激を用いて検出された。
図10は、FMDV-E2による7日間の再刺激後の結果を示す（抗体分泌メモリーB細胞数）。
結果は、特異的B細胞が全てのFMDV-E2グループについて検出されること及びG1（FMDV単独）で応答が弱いことを示した。G3及びG4と比較してより良好な応答がG2で得られた。低い応答又は応答無しが、FMDVペプチド及びAI O1Mの被覆を用いて得られた。最良の結果は、FMDV-E2被覆を用いてG2及びG3グループで得られた。
結論すれば、O1Mワクチンは液性及び細胞性応答を誘導して、強力で血清型特異的な中和抗体応答、一貫した比率の特異的なIFNγ応答、メモリーB細胞の存在を生じ、良好なレベルの同種及び異種FMDV感染に対する防御を示した。試験による当該製品の有効性は、FMDV血清中和試験によって血清学的に、さらに細胞性免疫応答アッセイにより免疫学的に評価された。最良の結果は、TS6アジュバント添加FMDV-E2粒子で得られた。
FMDV研究分野では、真正のFMD立体構造をもつエピトープを提示する完全集合ビリオン又はVLPが動物におけるFMD防御に必要であることが知られている。ELISAの結果は、生成したFMDV-E2粒子は、E2+FMDV-E2又はFMDVペプチド単独と比較して、ビリオン表面の立体構造に類似していることを示している。これらの結果は、当該3つの候補物の中で、FMDV-E2は中和抗体誘導において最良のものであることを示している。総合すれば、これらの結果は、FMDV-E2融合タンパク質はFMDVチャレンジの防御に十分な免疫応答を引き出す可能性があることを示している。
【００５０】
実施例2.2：A24 Cruzeiro及びAsia1 Shamirワクチンの臨床的及び血清学的研究
本研究の目的は、A24 Cruzeiro及びAsia1 Shamirワクチンの通常ブタにおける免疫原性を評価することであった。本組成物又はワクチンによって誘導される防御有効性は、動物にワクチン接種しチャレンジすることによってFMDV病原体に対して判定される。本組成物又はワクチンによって誘導される防御有効性は、組織および血液における臨床所見および／または特定の病原体のウイルス量によって評価される。種々の段階でワクチン接種動物から血液サンプルを採取し、血清学検査及びCMIアッセイで試験する。結果は、本発明の組成物又はワクチンは免疫原性であり、動物で防御を提供することを示す。
*  *  *  *  *  *  *  *
【００５１】
これまで本発明の実施態様を詳細に述べてきたが、上記によって明確にされた本発明は、上記に示した個々の細目に限定されないことは理解されるべきである。なぜならば、前記の多くの明白な変型は本発明の趣旨を逸脱することなく可能だからである。
出願物引用資料で引用又は言及された全ての資料、及び本明細書で引用又は言及された全ての資料（“本明細書引用資料”）、及び本明細書引用資料で引用又は言及された全ての資料は、本明細書又は本明細書に参照により含まれるいずれかの資料に記載のいずれかの製品についてのいずれかの製造業者の指示、説明書、製品仕様書及び製品明細書とともに参照により本明細書に含まれ、かつ本発明の実施に利用することができる。
【図１】
2020203890.tif 000008
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３】
2020203890.tif 000015
【図４Ａ−４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年9月4日(2020.9.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
FMDV抗原又はポリペプチドを含む組成物。
【外国語明細書】
2020203890000001.pdf