(57)【要約】【課題】短時間で、生物種の同定の精度が高く、かつ、生物種の検出の感度が高い方法で、試験片の防汚性を評価する技術を提供する。【解決手段】評価方法は、生物が存在する溶液に浸漬した試験片を準備する準備工程と、前記試験片に付着した前記生物の組成の分析を、核酸分析法を用いて行う分析工程と、前記分析の結果を用いて前記試験片の防汚性を評価する評価工程と、を含む。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物が存在する溶液に浸漬した試験片を準備する準備工程と、
前記試験片に付着した前記生物の組成の分析を、核酸分析法を用いて行う分析工程と、
前記分析の結果を用いて前記試験片の防汚性を評価する評価工程と、を含む評価方法。
【請求項２】
請求項１に記載の評価方法であって、
前記核酸分析法として、次世代シークエンシング法を用いる、評価方法。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の評価方法であって、
前記分析工程において、前記試験片１枚当たり１００断片以上の核酸分子を分析する、評価方法。
【請求項４】
請求項１から請求項３までのいずれか１項に記載の評価方法であって、
前記試験片には、前記溶液に浸漬させるより前に、塗料が塗布されている、評価方法。
【請求項５】
請求項１から請求項４までのいずれか１項に記載の評価方法であって、
前記評価工程において、多様度指数を用いて防汚性を評価する、評価方法。
【請求項６】
請求項１から請求項４までのいずれか１項に記載の評価方法であって、
前記評価工程において、前記付着した生物の全体に対する特定の分類群の生物種組成比を用いて防汚性を評価する、評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、防汚性を評価する評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、海水に長期間曝される船体には、海中の生物が付着することが知られており、この付着によって船体が運航する際の抵抗が上昇し、燃費が悪化することが知られている（例えば、特許文献１）。
【０００３】
一般的に、船体に生物が付着することによる影響を抑制するため、船体には防汚性を有する塗料が塗布されている。このような塗料の防汚性は、船体が使用される環境によっても異なる。特許文献１には、防汚性を評価する方法として、アミノ酸分析法を用いた方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１８−１６７６５４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１に記載の評価方法では、分析に時間がかかるとともに、生物種の同定の精度が低く、かつ、生物種の検出の感度が低いという課題があった。このため、防汚性を評価する方法として、短時間で、生物種の同定の精度が高く、かつ、生物種の検出の感度についても高い方法が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、上述の課題を解決するためになされたものであり、以下の形態として実現することが可能である。
【０００７】
（１）本発明の一形態によれば、評価方法が提供される。この評価方法は、
生物が存在する溶液に浸漬した試験片を準備する準備工程と、
前記試験片に付着した前記生物の組成の分析を、核酸分析法を用いて行う分析工程と、
前記分析の結果を用いて前記試験片の防汚性を評価する評価工程と、を含む。
【０００８】
この形態の評価方法によれば、短時間で、生物種の同定の精度が高く、かつ、生物種の検出の感度が高い評価を行うことができる。
【０００９】
（２）上述の評価方法は、前記核酸分析法として、次世代シークエンシング法を用いてもよい。
【００１０】
この形態の評価方法によれば、一度に多数の核酸を分析することで、試験片上に存在する割合が極めて小さい生物種についても含めて評価できる。
【００１１】
（３）上述の評価方法は、前記分析工程において、前記試験片１枚当たり１００断片以上の核酸分子を分析してもよい。
【００１２】
この形態の評価方法によれば、試験片上に存在する割合が小さい生物種についても含めて評価できる。
【００１３】
（４）上述の評価方法において、前記試験片には、前記溶液に浸漬させるより前に、塗料が塗布されていてもよい。
【００１４】
この形態の評価方法によれば、塗料による防汚性についても評価できる。
【００１５】
（５）上述の評価方法は、前記評価工程において、多様度指数を用いて防汚性を評価してもよい。
【００１６】
この形態の評価方法によれば、防汚性を定量的に評価できる。
【００１７】
（６）上述の評価方法は、前記評価工程において、前記付着した生物の全体に対する特定の分類群の生物種組成比を用いて防汚性を評価してもよい。
【００１８】
この形態の評価方法によれば、特定の分類群の生物に特化した防汚性の評価を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の一実施形態である評価方法を説明するためのフローチャート。
【図２】実施例に用いた試験片を説明するための図。
【図３】多様度指数を用いて防汚性を評価した結果を示す図。
【図４】多様度指数を用いて防汚性を評価した結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
Ａ．第１実施形態
図１は、本発明の一実施形態である評価方法を説明するためのフローチャートである。本実施形態の評価方法は、試験片の防汚性を評価する方法であり、準備工程（工程Ｐ１１０）と、分析工程（工程Ｐ１２０）と、評価工程（工程Ｐ１３０）と、を備える。本明細書において、「防汚性」とは、生物が表面に付着することに起因する汚れを抑制する性能を示す。
【００２１】
準備工程（工程Ｐ１１０）は、生物が存在する溶液に浸漬した試験片を準備する工程である。本実施形態では、生物が存在する溶液として海水を用いるが、これに限られない。生物が存在する溶液としては、例えば、河川水でもよく、地下水でもよい。
【００２２】
本実施形態では、準備工程（工程Ｐ１１０）として、試験片を準備する工程と、準備された試験片を海水に浸漬する工程とを備える。本実施形態では、試験片には、溶液に浸漬させるより前に、塗料が塗布されている。このようにすることにより、塗料の防汚性についても評価できる。なお、試験片には、塗料が塗布されていなくてもよい。
【００２３】
試験片を準備する工程では、複数の試験片から構成されるパネルを用意する。パネルは、試験片を固定するために用いる。本実施形態では、試験片として、プラスチック製の板を用いる。なお、試験片は、これに限られず、例えば、鉄板等を用いてもよく、船底の表面の一部を用いてもよい。また、本実施形態では、複数の試験片を用いたが、１つの試験片のみを用いてもよい。
【００２４】
次に、試験片を海水に浸漬する工程では、上述のパネルを海水に浸漬する。浸漬する期間（以下、「浸漬期間」とも呼ぶ）は、特に限定されず、本実施形態では、７日とする。以上により、準備工程が終了する。なお、準備工程は、これに限られず、例えば、生物が存在する溶液に浸漬した試験片を、他の機関等から入手してもよい。
【００２５】
準備工程（工程Ｐ１１０）の後、分析工程（工程Ｐ１２０）を行う。分析工程（工程Ｐ１２０）は、核酸分析法を用いて試験片に付着した生物の組成の分析を行う工程である。本明細書において、「核酸分析法」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡに含まれる塩基配列を分析する方法を意味する。核酸分析法としては、塩基配列を決定しない方法と、塩基配列を決定する方法とが挙げられる。
【００２６】
塩基配列を決定しない方法としては、例えば、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（denaturing gradient gel electrophoresis：ＤＧＧＥ）、ＤＮＡチップによる遺伝子検出法等が挙げられる。ＤＧＧＥ法は、変性剤を含むゲルを用いて、ＰＣＲ増幅したＤＮＡの電気泳動を行い、得られたＤＮＡバンドのパターンから生物種組成を推定する方法である。ＤＮＡチップによる遺伝子検出法は、生物種特異的な配列をスポットしたＤＮＡアレイに核酸をハイブリダイズさせ、その強度に基づいて生物の存在の有無を推定する方法である。
【００２７】
塩基配列を決定する方法としては、例えば、次世代シークエンシング法、サンガー法、マキシム・ギルバート法等が挙げられる。本実施形態では、核酸分析法として、次世代シークエンシング法を用いる。本明細書において、「次世代シークエンシング法」とは、サンガー法及びマキシム・ギルバート法以外の方法であって、一度の解析で千断片以上のＤＮＡ又はＲＮＡに含まれる塩基配列を解析する方法を示す。
【００２８】
次世代シークエンシング法を用いることにより、一度に多数の核酸を分析することで、試験片に含まれる生物種について、存在割合の極めて小さい種についても含めて同定できる。さらに、次世代シークエンシング法を用いることにより、得られた核酸の塩基配列を塩基配列データベースに照合することで、生物種を生物分類の細かいランクまで同定できる。
【００２９】
次世代シークエンシング法としては、特に限定されないが、例えば、パイロシークエンス法、イオン半導体シークエンス法、可逆的ターミネーター法、一分子リアルタイムシークエンス法、ナノポアシークエンス法等が挙げられる。パイロシークエンス法に使用する装置としては、特に限定されないが、例えば、ロシュ・ダイアグノスティックス社製のＧＳ  ＦＬＸ等が挙げられる。イオン半導体シークエンス法に使用する装置としては、特に限定されないが、例えば、Thermo Fischer Scientific社製のIon PGM等が挙げられる。可逆的ターミネーター法に使用する装置としては、特に限定されないが、例えば、イルミナ社製のＭｉｓｅｑ等が挙げられる。一分子リアルタイムシークエンス法に使用する装置としては、特に限定されないが、例えば、Pacific Bioscience社製のPacBio（登録商標）RS II等が挙げられる。ナノポアシークエンス法に使用する装置としては、特に限定されないが、例えば、オックスフォード・ナノポアテクノロジーズ社製のMinION等が挙げられる。
【００３０】
分析工程において、試験片１枚当たり分析する核酸分子の断片数は、特に限定はないが、１００断片以上が好ましく、１,０００断片以上がより好ましく、１０，０００断片以上がさらに好ましい。試験片１枚当たり分析する核酸分子の断片数を増やすことにより、存在比率が極端に少ない生物種の存在についても検出できるため、好ましい。
【００３１】
本実施形態の分析工程（工程Ｐ１２０）では、次世代シークエンシング法として可逆的ターミネーター法に使用することにより、試験片に付着した生物の組成の分析を行う。
【００３２】
分析工程（工程Ｐ１２０）の後、評価工程（工程Ｐ１３０）を行う。評価工程（工程Ｐ１３０）は、分析の結果を用いて試験片の防汚性を評価する工程である。
【００３３】
本実施形態では、評価工程（工程Ｐ１３０）において、多様度指数を用いて防汚性を評価する。本明細書において、「多様度指数」とは、生物種の多様性を表す指数を示す。本実施形態では、多様度指数が大きいほど、生物種が多様であるため、試験片の防汚性は低いと評価する。一方、多様度指数が小さいほど、生物種が多様ではないため、試験片の防汚性は高いと評価する。本実施形態によれば、多様度指数を用いて防汚性を数値化して評価するため、防汚性を定量的に評価できる。
【００３４】
多様度指数としては、例えば、（ｉ）出現した配列の総種数、（ｉｉ）配列ごとの個体数に関する情報を含む指数であるシンプソン指数又はシャノン指数、（ｉｉｉ）配列ごとの系統学的距離から算出するフェイスの系統学的多様度指数等を用いることができる。また、多様度指数として、特定の試験片の多様性（いわゆる「α多様性」）を示す指数を用いてもよく、試験片間の多様性（いわゆる「β多様性」）を示す指数を用いてもよく、複数の試験片全体の多様性（いわゆる「γ多様性」）を示す指数を用いてもよい。シンプソン指数、シャノン指数、フェイスの系統学的多様度指数、α多様性、β多様性、γ多様性は、Caporaso J. G.ら“QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data”（Nat Methods. 2010 May;7(5):335-6）に記載の方法により算出することができる。
【００３５】
以上に説明したとおり、本実施形態の評価方法によれば、核酸分析法を用いて試験片に付着した生物の組成の分析を行うことにより、短時間で、生物種の同定の精度が高く、かつ、生物種の検出の感度が高い評価を行うことができる。
【００３６】
Ｂ．第２実施形態
第１実施形態の評価工程では、多様度指数を用いて防汚性を評価しているが、第２実施形態の評価工程では、付着した生物の全体に対する特定の分類群の生物種組成比を用いて防汚性を評価する点で異なるが、それ以外は同じである。第２実施形態の評価工程では、付着した生物の全体に対する特定の分類群の生物種組成比が大きいほど、試験片の防汚性は低いと評価する。一方、付着した生物の全体に対する特定の分類群の生物種組成比が小さいほど、試験片の防汚性は高いと評価する。
【００３７】
特定の分類群の生物としては、例えば、細菌、微細藻類、原生動物、海藻類、海綿類、ヒドロ虫、管棲多毛類，ヨコエビ類、苔虫，二枚貝、フジツボ類、ホヤ類等があげられる。特定の分類群の生物比率を用いて防汚性を評価することにより、留意すべき分類群の生物が存在する場合に、その分類群に特化した防汚性の評価を行うことができる。例えば、二枚貝やフジツボ類が船底に多数付着することにより船体の燃費が悪化する場合に、二枚貝やフジツボ類を特定の分類群の生物とすることにより、二枚貝やフジツボ類に特化した防汚性の評価を行うことができる。
【００３８】
Ｃ．実施例
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３９】
まず、生物が存在する溶液に浸漬した試験片を準備する準備工程として、以下の処理を行った。
【００４０】
図２は、実施例に用いた試験片を説明するための図である。本実施例では、試験片として、鉄板と、プラスチック板とをそれぞれ６枚ずつ用いた。６枚の鉄板のうちの３枚の鉄板と、６枚のプラスチック板のうちの３枚のプラスチック板には、予め防汚塗料が塗布されている。つまり、６枚の鉄板のうちの３枚の鉄板と、６枚のプラスチック板のうちの３枚のプラスチック板には、海水に浸漬させるより前に防汚塗料が塗布されている。
【００４１】
上述の合計１２枚の試験片を海中に沈めた後、塗料が塗布されている鉄板と、塗料が塗布されていない鉄板と、塗料が塗布されているプラスチック板と、塗料が塗布されていないプラスチック板と、をそれぞれ１枚ずつ、１，３，７日後に海中から取り出し、凍結保存した。つまり、浸漬期間１，３，７日の（ｉ）塗料が塗布されている鉄板と、（ｉｉ）塗料が塗布されていない鉄板と、（ｉｉｉ）塗料が塗布されているプラスチック板と、（ｉｖ）塗料が塗布されていないプラスチック板と、をそれぞれ１枚ずつ作製した。また、孔径が０．２２μｍのフィルタで海水をろ過したうえで、このフィルタを対照として凍結保存した。
【００４２】
次に、核酸分析法を用いて前記試験片に付着した生物の組成の分析を行う分析工程として、以下の処理を行った。
【００４３】
具体的には、それぞれの試験片及び上述のフィルタにＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Tris-HCl ｐＨ８．５,５ｍＭ EDTA）を加えて激しく撹拌することにより、それぞれの試験片及び上述のフィルタから、細胞を回収した。そして、それらの細胞を含むＴＥ緩衝液にガラスビーズと中性フェノールを加えて激しく撹拌して細胞から核酸を抽出した後、エタノール沈殿法によって核酸を精製した。そして、精製した核酸を鋳型に、16S rRNAのV4可変領域をＰＣＲによって増幅した後、次世代シークエンシング法を用いて、それぞれの試験片及び上述のフィルタに付着した生物種の組成を分析した。本実施例では、次世代シークエンシング法にはイルミナ社のMiSeqを用いた。
【００４４】
その後、菌叢解析ソフトウェアであるQIIME2を用いて、次世代シークエンシング法により得られた塩基配列から生物の分類情報を取得した。それぞれの各試験片及び上述のフィルタあたり10,000配列になるように配列数を希薄化した後、付着した生物の組成を分析した。
【００４５】
次に、分析の結果を用いて塗料の防汚性を評価する評価工程として、以下の処理を行った。
【００４６】
図３及び図４は、多様度指数を用いて防汚性を評価した結果を示す図である。図３は、浸漬期間における配列の種類数（相同性１００％のOperational Taxonomy Unit (ＯＴＵ)数）の推移を示す。図４は、浸漬期間におけるフェイスの系統的多様度指数を示す。これらの評価結果は、各試験片と対照としての海水とを、分析工程で分析して得られた配列の多様度指数の浸漬期間における推移を示したものである。配列の種類数とフェイスの系統的多様度指数とのどちらの結果からも、防汚塗料の塗布による多様度指数の低下が認められたことから、防汚塗料の効果を確認できた。また、浸漬期間が長くなると、鉄板の試験片よりもプラスチック板の試験片のほうが、多様度指数が高かったことから、プラスチック板のほうが鉄板よりも多様な生物が付着しやすいということが分かった。このことから、プラスチック板のほうが鉄板よりも防汚性が低いことが分かった。
【００４７】
本発明は、上述の実施形態に限られるものではなく、その趣旨を逸脱しない範囲において種々の構成で実現することができる。例えば、発明の概要の欄に記載した各形態中の技術的特徴に対応する実施形態、実施例中の技術的特徴は、上述の課題の一部または全部を解決するために、あるいは、上述の効果の一部または全部を達成するために、適宜、差し替えや、組み合わせを行うことが可能である。また、その技術的特徴が本明細書中に必須なものとして説明されていなければ、適宜、削除することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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