(57)【要約】【課題】ペプチド合成によって得られたペプチドから目的ペプチドを精製する方法。【解決手段】本願は、ペプチド合成によって得られたペプチドを溶媒の存在下でスルホン酸化合物と混合し、得られた固形物を液相から分取する工程を含む、目的ペプチドを精製する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド合成によって得られたペプチドから目的ペプチドを精製する方法であって、該目的ペプチドはＮ末端が遊離であるかおよび／または少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を有し、
（１）該合成されたペプチドを溶媒の存在下でスルホン酸化合物と混合し、
（２）得られた固形物を液相から分取する
工程を含む、方法。
【請求項２】
該スルホン酸化合物が式（Ｉ）：
【化１】
2020045336.tif 000082
（Ｉ）
［式中、
Ａは、置換されていてもよいＣ６−１０アリール、置換されていてもよい二環式ヘテロ環基、Ｃ２−３アルケニル、またはＣ２−３アルキニルであり；
Ｘは、
（ｉ）単結合、
（ｉｉ）置換されていてもよいＣ１−４アルキレン、
（ｉｉｉ）−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−（ＣＯがＡと結合する）、または
（ｉｖ）Ｃ２−４アルケニレン
であり；および
ｎは１〜３の整数である］
の化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ａが置換されていてもよいＣ６−１０アリールであり；
Ｘが、
（ｉ）単結合、
（ｉｉ）置換されていてもよいＣ１−４アルキレン、
（ｉｉｉ）−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−（ＣＯがＡと結合する）、または
（ｉｖ）Ｃ２−３アルケニレン
であり；および
ｎが１〜３の整数である
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ａが置換されていてもよい二環式ヘテロ環基であり；
Ｘが、
（ｉ）単結合、
（ｉｉ）Ｃ１−４アルキレン、
（ｉｉｉ）−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−（ＣＯがＡと結合する）、または
（ｉｖ）Ｃ２−３アルケニレン
であり；および
ｎが１〜３の整数である
請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ＡがＣ２−３アルケニルであり；および
ＸがＣ１−４アルキレンである
請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ＡがＣ２−３アルキニルであり；および
ＸがＣ１−４アルキレンである
請求項２に記載の方法。
【請求項７】
該目的ペプチドが５〜３１個のアミノ酸残基を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
該合成されたペプチドに類縁ペプチドが含まれる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
該合成されたペプチドにおいて、該目的ペプチドに対して、類縁ペプチドのモル比が０．７以下である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
該ペプチド合成が固相法によるペプチド合成である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
該目的ペプチドが少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を含み、かつ、該目的ペプチドのＮ末端が遊離であってもよい、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
Ａが、Ｃ１−４アルキル、−ＣＯ−Ｃ６−１０アリール、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−３アルキル、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２−Ｃ１−４アルキル、ハロゲン、−ＮＨ２、−ＣＨ２−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、ＣＮ、−ＣＯ−Ｃ１−４アルキル、−ＣＦ３、およびＣ６−１０アリールからなる群から選択される同一または異なった１〜５個の置換基で置換されていてもよいＣ６−１０アリールである、請求項２、３、および７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
Ａがフェニル、ナフチル、およびインダニルから選択されるＣ６−１０アリールであって、該Ｃ６−１０アリールは、Ｃ１−４アルキル、−ＣＯ−Ｃ６−１０アリール、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−３アルキル、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２−Ｃ１−４アルキル、ハロゲン、−ＮＨ２、−ＣＨ２−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、ＣＮ、−ＣＯ−Ｃ１−４アルキル、−ＣＦ３、およびＣ６−１０アリールからなる群から選択される同一または異なった１〜５個の置換基で置換されていてもよい、請求項２、３、および７〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
Ａが、2,3,4,5-テトラヒドロ-1H-1-ベンゾアゼピニル、ベンゾオキサニル、インドリニル、イソインドリニル、フタラジニル、クロマニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、ピリミジル、ベンゾチアゾニル、キノリル、イソクロマニル、およびベンゾトリアゾリルからなる群から選択される二環式ヘテロ環基であって、該二環式ヘテロ環基は適宜置換されていてもよい、請求項２、４、および７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
Ａが、Ｃ６−１０アリール、Ｃ１−４アルキル、−ＣＯ−Ｃ６−１０アリール、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−３アルキル、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２−Ｃ１−４アルキル、ハロゲン、−ＮＨ２、−ＣＨ２−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、ＣＮ、−ＣＯ−Ｃ１−４アルキル、−ＣＦ３、およびオキソからなる群から選択される同一または異なった１〜５個の置換基で置換されていてもよい二環式ヘテロ環基である、請求項２、４、７〜１１、および１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
Ａが
【化２】
2020045336.tif 000083
および
【化３】
2020045336.tif 000084
から選択される二環式ヘテロ環基であって、該二環式ヘテロ環基は１つのフェニルで置換されていてもよい、請求項２、４、７〜１１、１４、および１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
Ｘが、
（ｉ）単結合、
（ｉｉ）１つのメチル、１つのベンジル、または１つのフェニルで置換されていてもよいＣ１−４アルキレン、または
（ｉｉｉ）−ＣＯ−（ＣＨ２）−（ＣＯがＡと結合する）、
である、請求項２〜４、および７〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
Ｘが、
（ｉ）単結合、
（ｉｉ）１つのメチル、１つのベンジル、または１つのフェニルで置換されていてもよいＣ１−４アルキレン、または
（ｉｉｉ）−ＣＯ−（ＣＨ２）−（ＣＯがＡと結合する）、
である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
Ｘが単結合である、請求項２〜４、および７〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
Ｘが単結合である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
該スルホン酸化合物が下記：
2020045336.tif 000085
2020045336.tif 000086
から選択される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
該スルホン酸化合物を除去する工程をさらに含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
目的ペプチドの類縁ペプチドに対するモル比を向上させるための、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法を含む、該目的ペプチドを製造する方法。
【請求項２５】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法を含む方法により精製された目的ペプチドを含有する薬剤。
【請求項２６】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法において使用されるための、該スルホン酸化合物を含有する剤。
【請求項２７】
【化４】
2020045336.tif 000087
【化５】
2020045336.tif 000088
【化６】
2020045336.tif 000089
【化７】
2020045336.tif 000090
および
【化８】
2020045336.tif 000091
から選択される、化合物。
【請求項２８】
請求項２５に記載の薬剤の有効量をその必要がある患者に投与することを含む、ヒトにおける疾患を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、ペプチド合成によって得られるペプチドから目的ペプチドを精製する方法、および該精製方法によって得られた目的ペプチドを含む薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
比較的アミノ酸残基が少ないペプチド（通常３０残基以下）は有機化学的合成法により製造されるのが一般的である（例えば特許文献１）。有機化学的合成法としては固相法と液相法が挙げられ、Ｎ−保護アミノ酸とＣ−保護ペプチド（ジペプチド形成時にはＣ−保護アミノ酸）とのカップリング反応とそれに続くＮ末端脱保護反応とからなるペプチド伸長反応が繰り返される。有機化学的合成法では、当該ペプチド伸長反応の一部重複、一部欠落等により様々な類縁ペプチドも合成されてしまうため、生成した目的ペプチドをこれらの類縁ペプチドから分離する必要がある。しかしながら、類縁ペプチドの物理化学的性質は目的ペプチドのそれと酷似することが多いため、その分離は非常に困難である。精製された目的ペプチドを得るために、目的ペプチドと類縁ペプチドを効果的に分離する方法が求められている。
【０００３】
アミノ酸残基が多いペプチド（通常３０残基を超える）は発酵法により製造されるのが一般的である（例えば特許文献２）。この場合にもアミノ酸残基が一部置換等した類縁ペプチドが混入してしまうことがあり、性質が酷似するこれらの分離は重大な課題である。
【０００４】
また、現在のところペプチドの精製は、スケールアップした場合でも、コスト的に多大な負担がかかる分取高速液体クロマトグラフィーによる方法で行うのが一般的である。分取高速液体クロマトグラフィーに代わる、あるいはこれを補うための、目的ペプチドと類縁ペプチドの混合物から類縁ペプチドを効果的に分離除去する方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１８−５２９３３
【特許文献２】特開２０１６−１９０８５１
【０００６】
本明細書において引用する先行技術文献の開示は全て参照することにより、本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本願の課題は、ペプチド合成によって得られる目的ペプチドと類縁ペプチドを含む混合物から類縁ペプチドを除去することを含む、目的ペプチドを精製する方法の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、類縁ペプチドを含む目的ペプチドのペプチド合成産物において、溶媒の存在下で所定の構造を有するスルホン酸化合物を混合させ固液分離することで、目的ペプチドの純度（絶対純度、ただしスルホン酸化合物を除く）が向上すること、および、類縁ペプチドの割合が減少した目的ペプチドのスルホン酸塩の固形物が得られることを見出し、本願発明に至った。以下に本願の発明を詳説する。
【０００９】
［項１］
ペプチド合成によって得られたペプチドから目的ペプチドを精製する方法であって、該目的ペプチドはＮ末端が遊離であるかおよび／または少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を有し、
（１）該合成されたペプチドを溶媒の存在下でスルホン酸化合物と混合し、
（２）得られた固形物を液相から分取する
工程を含む、方法。
【００１０】
［項２］
該スルホン酸化合物が式（Ｉ）：
【化１】
2020045336.tif 000002
（Ｉ）
［式中、
Ａは、置換されていてもよいＣ６−１０アリール、置換されていてもよい二環式ヘテロ環基、Ｃ２−３アルケニル、またはＣ２−３アルキニルであり；
Ｘは、
（ｉ）単結合、
（ｉｉ）置換されていてもよいＣ１−４アルキレン、
（ｉｉｉ）−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−（ＣＯがＡと結合する）、または
（ｉｖ）Ｃ２−４アルケニレン
であり；および
ｎは１〜３の整数である］
の化合物である、項１に記載の方法。
【００１１】
［項３］
Ａが置換されていてもよいＣ６−１０アリールであり；
Ｘが、
（ｉ）単結合、
（ｉｉ）置換されていてもよいＣ１−４アルキレン（例えばＣ１−３アルキレン）、
（ｉｉｉ）−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−（ＣＯがＡと結合する）、または
（ｉｖ）Ｃ２−３アルケニレン
であり；および
ｎが１〜３の整数である
項２に記載の方法。
【００１２】
［項４］
Ａが置換されていてもよい二環式ヘテロ環基であり；
Ｘが、
（ｉ）単結合、
（ｉｉ）Ｃ１−４アルキレン（例えばＣ１−３アルキレン）、
（ｉｉｉ）−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−（ＣＯがＡと結合する）、または
（ｉｖ）Ｃ２−３アルケニレン
であり；および
ｎが１〜３の整数である
項２に記載の方法。
【００１３】
［項５］
ＡがＣ２−３アルケニルであり；および
ＸがＣ１−４アルキレンである
項２に記載の方法。
【００１４】
［項６］
ＡがＣ２−３アルキニルであり；および
ＸがＣ１−４アルキレンである
項２に記載の方法。
【００１５】
［項７］
該目的ペプチドが５〜３１個のアミノ酸残基を有する、項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【００１６】
［項８］
該合成されたペプチドに類縁ペプチドが含まれる、項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【００１７】
［項９］
該合成されたペプチドにおいて、該目的ペプチドに対して、類縁ペプチドのモル比が０．７以下である、項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【００１８】
［項１０］
該ペプチド合成が固相法によるペプチド合成である、項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【００１９】
［項１１］
該目的ペプチドが少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を含み、かつ、該目的ペプチドのＮ末端が遊離であってもよい、項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【００２０】
［項１２］
Ａが、Ｃ１−４アルキル、−ＣＯ−Ｃ６−１０アリール、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−３アルキル、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２−Ｃ１−４アルキル、ハロゲン、−ＮＨ２、−ＣＨ２−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、ＣＮ、−ＣＯ−Ｃ１−４アルキル、−ＣＦ３、およびＣ６−１０アリールからなる群から選択される同一または異なった１〜５個の置換基で置換されていてもよいＣ６−１０アリールである、項２、３、および７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【００２１】
［項１３］
Ａがフェニル、ナフチル、およびインダニルから選択されるＣ６−１０アリールであって、該Ｃ６−１０アリールは、Ｃ１−４アルキル、−ＣＯ−Ｃ６−１０アリール、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−３アルキル、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２−Ｃ１−４アルキル、ハロゲン、−ＮＨ２、−ＣＨ２−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、ＣＮ、−ＣＯ−Ｃ１−４アルキル、−ＣＦ３、およびＣ６−１０アリールからなる群から選択される同一または異なった１〜５個の置換基で置換されていてもよい、項２、３、および７〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【００２２】
［項１４］
Ａが、2,3,4,5-テトラヒドロ-1H-1-ベンゾアゼピニル、ベンゾオキサニル、インドリニル、イソインドリニル、フタラジニル、クロマニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、ピリミジル、ベンゾチアゾニル、キノリル、イソクロマニル、およびベンゾトリアゾリルからなる群から選択される二環式ヘテロ環基であって、該二環式ヘテロ環基は適宜置換されていてもよい、項２、４、および７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【００２３】
［項１５］
Ａが、Ｃ６−１０アリール、Ｃ１−４アルキル、−ＣＯ−Ｃ６−１０アリール、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−３アルキル、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２−Ｃ１−４アルキル、ハロゲン、−ＮＨ２、−ＣＨ２−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、ＣＮ、−ＣＯ−Ｃ１−４アルキル、−ＣＦ３、およびオキソからなる群から選択される同一または異なった１〜５個の置換基で置換されていてもよい二環式ヘテロ環基である、項２、４、７〜１１、および１４のいずれか１項に記載の方法。
【００２４】
［項１６］
Ａが
【化２】
2020045336.tif 000003
および
【化３】
2020045336.tif 000004
から選択される二環式ヘテロ環基であって、該二環式ヘテロ環基は１つのフェニルで置換されていてもよい、項２、４、７〜１１、１４、および１５のいずれか１項に記載の方法。
【００２５】
［項１７］
Ｘが、
（ｉ）単結合、
（ｉｉ）１つのメチル、１つのベンジル、または１つのフェニルで置換されていてもよいＣ１−４アルキレン（例えばＣ１−３アルキレン）、または
（ｉｉｉ）−ＣＯ−（ＣＨ２）−（ＣＯがＡと結合する）、
である、項２〜４、および７〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【００２６】
［項１８］
Ｘが、
（ｉ）単結合、
（ｉｉ）１つのメチル、１つのベンジル、または１つのフェニルで置換されていてもよいＣ１−４アルキレン（例えばＣ１−３アルキレン）、または
（ｉｉｉ）−ＣＯ−（ＣＨ２）−（ＣＯがＡと結合する）、
である、項１２に記載の方法。
【００２７】
［項１９］
Ｘが単結合である、項２〜４、および７〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【００２８】
［項２０］
Ｘが単結合である、項１６に記載の方法。
【００２９】
［項２１］
該スルホン酸化合物が下記：
2020045336.tif 000005
2020045336.tif 000006
から選択される、項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【００３０】
［項２２］
該スルホン酸化合物を除去する工程をさらに含む、項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【００３１】
［項２３］
目的ペプチドの類縁ペプチドに対するモル比を向上させるための、項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【００３２】
［項２４］
項１〜２３のいずれか１項に記載の方法を含む、該目的ペプチドを製造する方法。
【００３３】
［項２５］
項１〜２３のいずれか１項に記載の方法を含む方法により精製された目的ペプチドを含有する薬剤。
【００３４】
［項２６］
項１〜２３のいずれか１項に記載の方法において使用されるための、該スルホン酸化合物を含有する剤。
【００３５】
［項２７］
【化４】
2020045336.tif 000007
【化５】
2020045336.tif 000008
【化６】
2020045336.tif 000009
【化７】
2020045336.tif 000010
および
【化８】
2020045336.tif 000011
から選択される、化合物。
【００３６】
［項２８］
ペプチド合成によって得られたペプチドから精製された目的ペプチドを含有する薬剤であって、該目的ペプチドはＮ末端が遊離であるかおよび／または少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を有し、該精製は
（１）該合成されたペプチドを溶媒の存在下でスルホン酸化合物と混合し、
（２）得られた固形物を液相から分取する
工程を含む、薬剤。
【００３７】
［項２９］
ペプチド合成によって得られたペプチドからの目的ペプチドの精製において使用するためのスルホン酸化合物を含有する剤であって、該目的ペプチドはＮ末端が遊離であるかおよび／または少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を有し、該精製は
（１）該合成されたペプチドを溶媒の存在下でスルホン酸化合物を含有する剤と混合し、
（２）得られた固形物を液相から分取する
工程を含む、剤。
【発明の効果】
【００３８】
本発明によれば、合成によって得られた類縁ペプチドを含みうるペプチドから、目的ペプチドの純度が向上したペプチドが提供される。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
１つの態様において、本願は、ペプチド合成によって得られたペプチドから目的ペプチドを精製する方法であって、該目的ペプチドはＮ末端が遊離であるかおよび／または少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を有し、
（１）該合成されたペプチドを溶媒の存在下でスルホン酸化合物と混合し、
（２）得られた固形物を液相から分取する
工程を含む、方法を提供する。
【００４０】
本願において「精製する」とは、ある物質の純度が向上することを意味する。ここで純度とは、絶対純度（対象とする物質を含む混合物の総量に対する該物質の量）も相対純度（ある混合物に含まれる他の物質（例えば不純物）の量に対する対象とする物質の量）も意味することがある。
【００４１】
例えば、本願発明において「目的ペプチドを精製する」には、スルホン酸化合物との混合前の合成ペプチドの総量に対するそこに含まれる目的ペプチドの量（例えば重量％）と比較して、スルホン酸化合物との混合後に得られた固形物からスルホン酸化合物に相当する分を除いた重量に対するそこに含まれる目的ペプチドの量（例えば重量％）が向上することが含まれる。本願発明において「目的ペプチドを精製する」には、例えば、スルホン酸化合物との混合前と比較して、当該混合後に得られた固形物中の目的ペプチドの類縁ペプチドに対するモル比が向上することが含まれる。
【００４２】
本願において目的ペプチドの純度の測定方法は特に限定されず、通常用いられる方法（例えばＨＰＬＣ法）により測定されうる。
【００４３】
本願において、「ペプチド合成」とは、ペプチドを合成する方法であれば特に限定されず、例えば、有機化学的合成法（例えば固相法および液相法）および発酵法が挙げられ、通常の方法により行われ得る。ペプチド合成においては不純物（例えば類縁ペプチド）の生成が抑制される合成条件（例えば、有機化学的合成法においては、樹脂、保護基、反応温度、反応時間、溶媒；発酵法においては、培養条件、宿主、ベクター、塩基配列等）に設定されるのが通常である。本願においても、ペプチド合成は当業者に通常知られる知識に基づいて、類縁ペプチドの生成が抑制される合成条件に設定されることが好ましく、ペプチド合成によって得られたペプチドにおいては目的ペプチドの物質量が類縁ペプチドの物質量よりも多いことが好ましい。
【００４４】
例えば、ペプチド合成によって得られたペプチドにおいて、該類縁ペプチドの該目的ペプチドに対するモル比（類縁ペプチド／目的ペプチド）が０．７以下（好ましくは０．６以下、より好ましくは０．５以下、さらに好ましくは０．４５以下、さらにより好ましくは０．４以下、より好ましくは０．２以下）である。該類縁ペプチドの該目的ペプチドに対するモル比は低い方が好ましく、下限は特に限定されるものではないが、例えば、０．０００１〜０．７、０．００１〜０．６、０．０１〜０．５の範囲が例として挙げられる。
【００４５】
ペプチド合成によって得られたペプチドにおいて、「目的ペプチドの物質量が類縁ペプチドの物質量よりも多い」とは、目的ペプチドの物質量がある１種の類縁ペプチドの物質量よりも多いことを意味し、複数の類縁ペプチドが含まれる場合には、各類縁ペプチドの物質量とそれぞれ比較して目的ペプチドの物質量が多いことを意味する。ペプチド合成によって得られたペプチドにおいて、「目的ペプチドの物質量が類縁ペプチドの物質量よりも多い」ことは、当該ペプチド合成によって得られたペプチドの総量における目的ペプチドの量（絶対純度）が多い（例えば、ペプチド合成によって得られたペプチドにおける目的ペプチドの濃度が４０重量％以上、５０重量％以上、６０重量％以上、７０重量％以上、８０重量％以上、および９０重量％以上）ことにより、当該ペプチド合成によって得られたペプチドにおいて類縁ペプチドの物質量が目的ペプチドの物質量よりも低い蓋然性が極めて高いことにより示されうる。
【００４６】
本願において「目的ペプチド」とは、ペプチド合成により生成することを目的として生成されるペプチドを意味し、該目的ペプチドの構造は、そのＮ末端が遊離であるか、少なくとも１つ（例えば１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、および１個）の塩基性アミノ酸残基を有するか、またはそのＮ末端が遊離でありかつ少なくとも１つ（例えば１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、および１個）の塩基性アミノ酸残基を有する限り、特に限定されない。目的ペプチドは好ましくは５〜３１個のアミノ酸残基、より好ましくは５〜２５個、さらに好ましくは５〜２０個、よりさらに好ましくは５〜１５個のアミノ酸残基を有する。目的ペプチドのアミノ酸残基数の範囲は、５、６、７、および８から選択される下限値と、３１、２５、２０、１５、および１０から選択される上限値との組合せにより示されうる。
【００４７】
目的ペプチドに含まれうるアミノ酸残基は、通常タンパク質を構成する下表の２０種のアミノ酸（不斉炭素を有しないグリシン以外はＬ体）に加え、Ｌ−セレノシステイン、２−アミノイソ酪酸、Ｄ−イソバリン、Ｌ−イソバリン、Ｌ−ノルロイシン、Ｌ−オルニチン等の天然に存在するアミノ酸に由来するアミノ酸残基であっても、天然には存在しないか存在しても微量である（そのため通常化学合成等により製造される）非天然アミノ酸由来のアミノ酸残基でも良い。
非天然アミノ酸の例として、下表に示すグリシンを除く１９種類のアミノ酸のＮ−メチル体とその鏡像体；Ｎ−メチルグリシン；下表に示すグリシンとアラニンを除く１８種類のアミノ酸のα−メチル体の両鏡像体；下表に示すアラニンを除く１９種類のアミノ酸のα−エチル体の両鏡像体；
Ｄ−セレノシステイン；
Ｄ−ノルロイシン；
Ｄ−オルニチン；
（Ｓ）−又は（Ｒ）−２，３−ジアミノプロピオン酸；
（Ｓ）−又は（Ｒ）−２，４−ジアミノ酪酸；
（Ｓ）−又は（Ｒ）−ピログルタミン酸；
（Ｓ）−又は（Ｒ）−α−メチルーオルトフルオロフェニルアラニン；
（Ｓ）−又は（Ｒ）−α−（４−ペンテニル）アラニン；
（Ｓ）−又は（Ｒ）−α−（７−オクテニル）アラニン；
（Ｓ）−又は（Ｒ）−α−プロパルギルアラニン；
（Ｓ）−又は（Ｒ）−α−アリルアラニン；
（Ｓ）−又は（Ｒ）−インダン−２−イルグリシン；
（Ｓ）−又は（Ｒ）−ピリジン−３−イルメチルグリシン、及びそのピリジン環上がアルキル基で置換されていても良いフェニル基で置換されていても良い誘導体；
（Ｓ）−又は（Ｒ）−ピリジン−２−イルメチルグリシン；
（Ｓ）−又は（Ｒ）−ピペコリン酸；および
（Ｓ）−又は（Ｒ）−及びｔｒａｎｓ−又はｃｉｓー４−ヒドロキシプロリンが挙げられる。
2020045336.tif 000012
【００４８】
本願において塩基性アミノ酸残基とは、アミノ基のほかに塩基性を示す残基をもつアミノ酸（例えば、Ｄ−又はＬ−リシン、Ｄ−又はＬ−アルギニン、Ｄ−又はＬ−ヒスチジン、Ｄ−又はＬ−オルニチン、（Ｓ）−又は（Ｒ）−２，３−ジアミノプロピオン酸、および（Ｓ）−又は（Ｒ）−２，４−ジアミノ酪酸）に由来するアミノ酸残基を意味する。
【００４９】
本願において目的ペプチドは末端がペプチド合成において通常使用される保護基等（例えば、Ｎ末端がＡｃ基（アセチル基）、Ｆｍｏｃ基（9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基）、またはＢｏｃ基（tert-ブトキシカルボニル基）で；Ｃ末端がアミド基、またはエステル基で）修飾されていてもよい。
【００５０】
本願において「類縁ペプチド」とは、目的ペプチドを生成するためのペプチド合成により生成されうる、目的ペプチドではないペプチドを意味する。類縁ペプチドの例として、
（１）目的ペプチドに含まれるアミノ酸残基の一部（例えば、連続または不連続の１〜３アミノ酸残基、連続または不連続の１〜２アミノ酸残基、および１アミノ酸残基）が重複した；
（２）目的ペプチドに含まれるアミノ酸残基の一部（例えば、連続または不連続の１〜３アミノ酸残基、連続または不連続の１〜２アミノ酸残基、および１アミノ酸残基）が欠損した；
（３）目的ペプチドに含まれるアミノ酸残基の一部（例えば、連続または不連続の１〜３アミノ酸残基、連続または不連続の１〜２アミノ酸残基、および１アミノ酸残基）がエピマー化（例えば、Ｎ−保護アミノ酸のα−位異性化によるエピマー化）した；および／または
（４）目的ペプチドに含まれるアミノ酸残基の一部（例えば、連続または不連続の１〜３アミノ酸残基、連続または不連続の１〜２アミノ酸残基、および１アミノ酸残基）が同数のアミノ酸残基により置換された、
ペプチドが挙げられる。
【００５１】
類縁ペプチドのアミノ酸残基数は、例えば、目的ペプチドのアミノ酸残基数と同数であるか、１〜３個（好ましくは１〜２個、より好ましくは１個）多いか、または１〜３個（好ましくは１〜２個、より好ましくは１個）少ない。
【００５２】
「類縁ペプチド」は、塩基性部分（そのＮ末端が遊離／少なくとも１つ（例えば１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、および１個）の塩基性アミノ酸残基を有している）を有していてもよく、そのような塩基性部分を有していなくてもよい。上述のとおり、ペプチド合成によって得られるペプチドにおいて、目的ペプチドの量（物質量）は類縁ペプチドの量と比較して通常多い。目的ペプチドと類縁ペプチドの構造が類似している場合、溶媒に対する溶解特性は通常近似しうる。「類縁ペプチド」が塩基性部分を有する場合には目的ペプチドと同様にスルホン酸化合物と塩を形成して固体となりうる、スルホン酸化合物との混合後に得られた固形物では、類縁ペプチドより元々多く含まれる目的ペプチドの割合が上昇しうる。
【００５３】
本願においてスルホン酸化合物との混合の際に使用される溶媒は特に限定されず、目的ペプチドの精製効率を考慮して適宜選択されうる。溶媒の例としては、水、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、メタノール（ＭｅＯＨ）、１，４−ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン（ＤＭＥ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトン、アセトニトリル、エタノール、酢酸エチル、トルエン、ＭＴＢＥ、ＤＭＳＯ、ジエチルエーテル、およびそれらの混合が挙げられる。
【００５４】
ペプチド合成によって得られたペプチドを溶媒の存在下でスルホン酸化合物と混合する際の、該ペプチドに対する溶媒の量、スルホン酸化合物の量は特に限定されず、目的ペプチドの精製効率を考慮して適宜選択されうる。例えば、溶媒は重量比でペプチド合成によって得られたペプチド１に対して、１〜１０００００、好ましくは１〜１００００（より好ましくは１０〜１０００）の範囲で使用されうる。例えばスルホン酸化合物は目的ペプチドに対するモル比が、スルホン酸化合物がスルホ基を１つ有する場合は、例えば０．５〜２０、好ましくは０．８〜１０、より好ましくは１〜８、更により好ましくは１．５〜７；スルホ基を２個有する場合は、例えば０．２〜１０、好ましくは０．４〜５、より好ましくは０．５〜４、更により好ましくは０．７５〜３．５；スルホ基を３個有する場合は、例えば０．１５〜６、好ましくは０．３〜３．３、より好ましくは０．４〜２．６、更により好ましくは０．５〜２．３の範囲で使用されうる。
【００５５】
スルホン酸化合物と混合の後、得られた固形物を液相から分取する方法は特に限定されず、製造スケール等に応じて適宜選択されうるが、例えば、ろ過、遠心分離、デカント等の方法が挙げられる。
【００５６】
スルホン酸化合物と混合する際、および得られた固形物を液相から分取する際の温度は特に限定されず、例えば目的ペプチドの精製効率を考慮して適宜選択されうる。例えば０〜３０℃、１０〜２５℃が挙げられる。
【００５７】
本願の精製方法により得られた固形物に対して本願の精製方法を繰り返し行うことは、本願の精製方法の１つの実施形態として挙げられる。本願の精製方法を繰り返すことで、目的ペプチドの純度を向上できうる。
【００５８】
本願の精製方法は他の精製方法（例えば分取ＨＰＬＣ、再結晶、分散洗浄）と組み合わせて行われてもよい。例えば本願の方法により得られた固形物を別の精製方法に供してもよく、あるいは、予め別の精製方法により精製されたペプチドを本願の精製方法に供してもよい。
【００５９】
本願の精製方法により得られた固形物は、さらなる精製工程において当該固形物中からスルホン酸化合物が除去されることが好ましい。スルホン酸化合物を除去する方法は特に限定されず、スルホン酸化合物を除去するための通常の方法、例えば、酸、アルカリ処理やイオン交換樹脂を用いる除去法により行われうる。
【００６０】
本願においてスルホン酸化合物とは、スルホ基（−ＳＯ３Ｈ）を有する有機化合物を意味する。本願においてスルホン酸化合物は、スルホ基が単結合または短い（例えばＣ１−４）のリンカーを介して、１つ以上の不飽和結合を有する部位に結合していることが好ましい。
【００６１】
例えばスルホン酸化合物の好ましい例として、式（Ｉ）のスルホン酸化合物が挙げられる。
【化９】
2020045336.tif 000013
（Ｉ）
［式中、
Ａは、置換されていてもよいＣ６−１０アリール、置換されていてもよい二環式ヘテロ環基、Ｃ２−３アルケニル、またはＣ２−３アルキニルであり；
Ｘは、
（ｉ）単結合、
（ｉｉ）置換されていてもよいＣ１−４アルキレン、
（ｉｉｉ）−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−（ＣＯがＡと結合する）、または
（ｉｖ）Ｃ２−４アルケニレン
であり；および
ｎは１〜３の整数である］
【００６２】
本願において「Ｃ６−１０アリール（ある基の一部を構成する場合を含む）」とは６〜１０員の単環または二環の芳香族炭化水素環基、または該芳香族炭化水素環に１個のシクロアルカンが縮合した環基を意味する。Ｃ６−１０アリールの例として、フェニル、ナフチル、インダニル、テトラヒドロナフチルが挙げられる。
【００６３】
「置換されていてもよいＣ６−１０アリール」の例として、Ｃ１−４アルキル、−ＣＯ−Ｃ６−１０アリール、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−３アルキル、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２−Ｃ１−４アルキル、ハロゲン、−ＮＨ２、−ＣＨ２−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、ＣＮ、−ＣＯ−Ｃ１−４アルキル、−ＣＦ３、およびＣ６−１０アリールからなる群から選択される同一または異なった１〜５個（例えば１〜３個、１〜２個、および１個）の置換基で置換されていてもよいＣ６−１０アリールが挙げられる。
【００６４】
本願において「二環式ヘテロ環基」とは、単環芳香族環（ベンゼン、ピリジン等）に、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子より選択される１〜４個のヘテロ原子を有する単環芳香族環（ピリジン、フラン、チオフェン、イミダゾール、ピリミジン、オキサゾール、チアゾール、チアジン、トリアゾール）または単環非芳香族環（テトラヒドロピラン、アゼパン、ピペリジン等）が縮合した、８〜１１員の二環基を意味する。二環式ヘテロ環式基は、安定な構造をもたらす任意のヘテロ原子または炭素原子で結合し得る。二環式ヘテロ環基は１以上（例えば１個、２個）のオキソ基を含んでいてもよい。二環式ヘテロ環基の例として、
【化１０】
2020045336.tif 000014
【化１１】
2020045336.tif 000015
2,3,4,5-テトラヒドロ-1H-1-ベンゾアゼピニル、ベンゾオキサニル、インドリニル、イソインドリニル、フタラジニル、クロマニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、ピリミジル、ベンゾチアゾニル、キノリル、イソクロマニル、ベンゾトリアゾリルが挙げられる。
【００６５】
本願において「置換されていてもよい二環式ヘテロ環基」の例として、Ｃ６−１０アリール、Ｃ１−４アルキル、−ＣＯ−Ｃ６−１０アリール、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−３アルキル、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２−Ｃ１−４アルキル、ハロゲン、−ＮＨ２、−ＣＨ２−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、ＣＮ、−ＣＯ−Ｃ１−４アルキル、−ＣＦ３、およびオキソからなる群から選択される同一または異なった１〜５個（例えば１〜３個、１〜２個、および１個）の置換基で置換されていてもよい二環式ヘテロ環基が挙げられる。
【００６６】
本願において「Ｃ２−３アルケニル」とは、炭素数２〜３個を有し、１個または２個の二重結合を含む直鎖状または分枝鎖状の不飽和炭化水素基を意味し、例えば、ビニル、アリル、１−プロペニル、イソプロペニル、アレニルが挙げられる。
【００６７】
本願において「Ｃ２−３アルキニル」とは、炭素数２〜３個を有し、１個の三重結合を含む直鎖状または分枝鎖状の不飽和炭化水素基を意味し、例えば、エチニル、プロピニル（１−プロピニル、２−プロピニル）が挙げられる。
【００６８】
本願において「Ｃ１−４アルキレン」とは、直鎖Ｃ１−４アルキル由来の２価の基を意味する。Ｃ１−４アルキレンの例としてメチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレンが挙げられる。
本願において「Ｃ１−３アルキレン」とは、直鎖Ｃ１−３アルキル由来の２価の基を意味する。Ｃ１−３アルキレンの例としてメチレン、エチレン、トリメチレンが挙げられる。
【００６９】
本願において「置換されていてもよいＣ１−４アルキレン（またはＣ１−３アルキレン）」の例として、１つのメチル、１つのベンジル、または１つのフェニルで置換されていてもよいＣ１−４アルキレン（またはＣ１−３アルキレン）が挙げられる。
【００７０】
本願の「−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−」において、ｎは１〜３（好ましくは１〜２）の整数であり、好ましい−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−の例として−ＣＯ−（ＣＨ２）−が挙げられる。
【００７１】
本願において「Ｃ２−４アルケニレン」とは、直鎖Ｃ２−４アルケニル由来の２価の基を意味する。本願において「Ｃ２−３アルケニレン」とは、直鎖Ｃ２−３アルケニル由来の２価の基を意味する。Ｃ２−４アルケニレンおよびＣ２−３アルケニレンの例として、ビニレンが挙げられる。
【００７２】
本願において「Ｃ１−４アルキル（ある基の一部を構成する場合を含む）」とは、炭素数１〜４個を有する、直鎖状または分枝鎖状の飽和炭化水素基を意味する。Ｃ１−４アルキルの例として、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルが挙げられる。
本願において「Ｃ１−３アルキル（ある基の一部を構成する場合を含む）」とは、炭素数１〜３個を有する、直鎖状または分枝鎖状の飽和炭化水素基を意味する。Ｃ１−３アルキルの例として、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルが挙げられる。
【００７３】
本願において、「−ＣＯ−Ｃ６−１０アリール」の例として、−ＣＯ−フェニルが挙げられる。
【００７４】
本願において、ハロゲンの例として、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）またはヨウ素（Ｉ）が挙げられる。
【００７５】
さらに好ましいスルホン酸化合物の例として、上記［項１６］に列記する化合物が挙げられる。
【００７６】
本願の１つの態様において、本願の精製方法を含む、目的ペプチドを製造する方法が提供される。
【００７７】
本願の１つの態様において、本願の精製方法を含む方法により精製された目的ペプチドを含有する剤が提供される。当該剤は通常の方法により製造されうる。
【００７８】
本願の１つの態様において、本願の精製方法において使用されるための、スルホン酸化合物を含有する剤が提供される。当該剤は通常の方法により製造されうる。
【実施例】
【００７９】
以下、試験例を挙げて、本願発明を説明するが、本願発明はこれらの試験例に限定されるものではない。
【００８０】
目的ペプチドの精製
【００８１】
評価方法の概略：
目的ペプチドを固相法により合成した場合、得られた粗ペプチドには不純物として類縁ペプチドが混入していることが予想されるが、実際にどのような類縁ペプチドが混入しているかを同定することは困難である。よって、目的ペプチドと類縁ペプチドに相当する配列既知の擬似類縁ペプチドを固相法によりそれぞれ合成し、得られた粗目的ペプチド、粗擬似類縁ペプチド、および各種酸化合物を溶媒下で混合し、凍結乾燥した。残渣に溶媒を加えて上清を除去し、得られた固体における、目的ペプチドと擬似類縁ペプチドの物質量（ｍｏｌ）の合計に対する目的ペプチドの物質量（ｍｏｌ）の割合を測定し、その変化により、当該固体において目的ペプチドが精製されたかを評価する。
【００８２】
１−１：ペプチドの合成
下表に示す目的ペプチドおよび類縁ペプチド（擬似）をそれぞれ、以下に説明する固相法により合成した。
【表１】
2020045336.tif 000016
【００８３】
実施例で使用した装置は以下の通りである。
・ペプチド合成装置：国産化学社製「ＫＭＳ−３」。
・質量分析装置：Ａｇｉｌｅｎｔ社製「６２２４ ＴＯＦ ＬＣ/ＭＳ」および「１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ｓｅｒｉｅｓ」。「イオン化条件はＥＳＩ（キャピラリー電圧：３５００V、フラグメンター電圧：１００V）」
・ＨＰＬＣ分析装置：島津製作所社製「ＳＰＤ−Ｍ２０Ａ」、「ＬＣ−２０ＡＤ」、「ＳIＬ−２０ＡＣ」、「ＤＧＵ−２０Ａ」、「ＣＴＯ−２０ＡＣ」、「ＣＢＭ-２０Ａ」、または島津製作所社製「ＳＰＤ−Ｍ２０Ａ」、「ＬＣ−２０１０Ｃ」、またはＡｇｉｌｅｎｔ社製「１２００ ｓｅｒｉｅｓ」。
【００８４】
（１）保護ペプチド樹脂の合成
保護ペプチド樹脂の合成においては、各構成アミノ酸のα-アミノ基はすべて9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）で保護され、活性な側鎖のうち、アスパラギン酸のβ-カルボキシル基およびグルタミン酸のγ-カルボキシル基はtert-ブチル基（ｔＢｕ基）で、アルギニンのグアニジノ基は2,2,4,6,7-ペンタメチル‐2,3‐ジヒドロベンゾフラン‐5‐イルスルホニル基（Ｐｂｆ基）で、セリンおよびスレオニンの水酸基はtert-ブチル基（ｔＢｕ基）で、システインのチオール基およびヒスチジンのイミダゾール基はトリチル基（Ｔｒｔ基）で、チロシンのフェノール性水酸基はtert-ブチル基（ｔＢｕ基）で、アスパラギンおよびグルタミンのカルボアミド基はトリチル基（Ｔｒｔ基）で、リジンのε-アミノ基およびトリプトファンのインドール基はtert-ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）で保護されたものを使用した。
【００８５】
樹脂としては、Ｃ末端がカルボン酸のペプチド配列を合成する場合は（2-クロロ）トリチルクロリド樹脂（渡辺化学社製、約1.6 mmol/g）を用い、Ｃ末端がカルボアミドのペプチド配列を合成する場合はFmoc-NH-SAL樹脂（渡辺化学社製、約0.43 mmol/g）を用いた。Ｃ末端がカルボン酸のペプチド配列を合成する場合は、樹脂に対し２．５当量のFmocアミノ酸のDMF溶液および２．５当量のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを加え、２時間以上振盪撹拌することでＣ末端のアミノ酸を導入した。Ｃ末端がカルボアミドのペプチド配列を合成する場合は、樹脂と結合したＦｍｏｃ基を除去するために、２０％ピペリジンＤＭＦ溶液を加え、10分間以上振盪撹拌した後、ＤＭＦで３回から５回樹脂を洗浄し、樹脂に対し２．５当量のFmocアミノ酸のDMF溶液、２．５当量の1-ヒドロキシベンズトリアゾールのＤＭＦ溶液および２．５当量のＤＩＣを加え、４０分以上振盪撹拌することでＣ末端のアミノ酸を導入した。
【００８６】
Ｃ末端のアミノ酸が樹脂に導入されたのちは、過剰量の試薬をＤＭＦで３回から５回樹脂を洗浄することで除去した後、末端アミノ基の保護基であるＦｍｏｃ基を２０％ピペリジンで室温下１０分間以上振盪撹拌することで除去した。ピペリジンをＤＭＦで３回から５回樹脂を洗浄することで除去し、ついで目的のペプチドのアミノ酸配列における次に位置するアミノ酸のFmoc保護誘導体のカルボキシル基と縮合した。この保護アミノ酸の縮合においては、樹脂に対し2.5当量のFmoc-アミノ酸のＤＭＦ溶液と２．５当量の1-ヒドロキシベンズトリアゾールのＤＭＦ溶液および２．５当量のＤＩＣを加えることにより縮合した。同様のＦｍｏｃ基の除去およびＦｍｏｃアミノ酸との縮合反応を目的のペプチドのアミノ酸配列ができるまで繰り返し、目的のペプチドのアミノ酸配列を持つ保護ペプチド樹脂を合成した。
【００８７】
Ｎ末端が遊離のアミノ基のペプチドを合成する場合はＮ末端のＦｍｏｃアミノ酸を縮合した後、２０％ピペリジンＤＭＦ溶液で室温下１０分間以上振盪撹拌することでＦｍｏｃ基を除去した後、ピペリジンをＤＭＦで３回から５回樹脂を洗浄することで除去し、保護ペプチド樹脂の合成を完了した。Ｎ末端がＡｃ基で保護されたペプチド配列を合成する場合は、Ｎ末端を上記と同様に遊離のアミノ基とした後、５当量の酢酸と４．９５当量のＮ-ヒドロキシコハク酸のＤＭＦ溶液および５当量のＤＩＣを加えることにより縮合し、Ｎ末端にＡｃ基を導入し目的のペプチドのアミノ酸配列を持つ保護ペプチド樹脂を合成した。Ｎ末端のアミノ酸残基が（Ｓ）−又は（Ｒ）−ピログルタミン酸の場合は、Ｎ末端のＦｍｏｃアミノ酸として5等量の（Ｓ）−又は（Ｒ）−Fmoc−ピログルタミン酸クロリドと10等量のピリジンを用いて４０分以上振盪撹拌することで縮合させたのち、２０％ピペリジンＤＭＦ溶液で室温下１０分間以上振盪撹拌することでＦｍｏｃ基を除去した後、ピペリジンをＤＭＦで３回から５回樹脂を洗浄することで除去し、保護ペプチド樹脂の合成を完了した。
【００８８】
（２）ペプチド粗生成物の合成
ペプチド粗生成物の合成においては、上記で合成した目的のペプチドのアミノ酸配列を持つ保護ペプチド樹脂を酸で処理することにより脱保護および樹脂からの切り出しを行った。目的のペプチドがシステインやメチオニンといった硫黄原子を持つアミノ酸を含むペプチド配列の場合は、ＴＦＡ／水／エタンジチオール／ＴＩＳ（９４／２．５／２．５／１）を用い、氷冷から室温下で３０分以上振盪撹拌することで脱保護および樹脂からの切り出しを行った。目的のペプチドがシステインやメチオニンといった硫黄原子を持つアミノ酸を含まない場合は、ＴＦＡ／水／ＴＩＳ（９５／２．５／２．５）を用い、氷冷から室温下で３０分以上振盪撹拌することで脱保護および樹脂からの切り出しを行った。反応終了後、樹脂を濾過して、脱保護溶液で樹脂を３回から５回洗浄した後、洗浄液と濾液を混合して、エバポレーターで濃縮した。残渣にＭＴＢＥを添加し、析出した沈殿をろ過または遠心分離することで固液分離し、ＭＴＢＥ洗浄を複数回行うことで、目的のペプチド粗生成物を合成した。
【００８９】
(8)H-YERAKSNM-OHの製造方法（方法Ａ）
【００９０】
（１）ペプチド合成装置「ＫＭＳ−３」付属のＰＰ製カラムに（2-クロロ）トリチルクロリド樹脂（渡辺化学社製、約1.6 mmol/g）１８７．５ｍｇ（0.30 mmol）を入れ、ＤＭＦ５ｍＬを加えた後、終夜振盪撹拌した。吸引濾過でＤＭＦを除去した後、Ｆｍｏｃ-Ｍｅｔ-ＯＨのＤＭＦ溶液（３７５ｍＭ）２ｍＬ（0.75mmol；2.5当量）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン１２８μＬ（0.75mmol；2.5当量）、ＤＭＦ１ｍＬを加え、６時間振盪撹拌した。吸引濾過で反応液を除去した後、ＤＭＦ３ｍＬで５回洗浄した。２０％ピペリジンＤＭＦ溶液を３ｍＬ加え、３５分振盪撹拌した。吸引濾過し、ＤＭＦ３ｍＬで５回洗浄した。
【００９１】
（２）Ｆｍｏｃ-Ａｓｎ（Ｔｒｔ）-ＯＨのＤＭＦ溶液（３７５ｍＭ）２ｍＬ（0.75mmol；2.5当量）、1-ヒドロキシベンズトリアゾールのＤＭＦ溶液（７５０ｍＭ）１ｍＬ（0.75mmol；2.5当量）およびＤＩＣ１１６μＬ（0.75mmol；2.5当量）を加え終夜振盪撹拌した。吸引濾過で反応液を除去した後、ＤＭＦ３ｍＬで５回洗浄した。２０％ピペリジンＤＭＦ溶液を３ｍＬ加え、３５分振盪撹拌した。吸引濾過し、ＤＭＦ３ｍＬで５回洗浄した。
【００９２】
（３）上記ステップ（２）を参照して、次のアミノ酸を順次結合する。後続アミノ酸の順番及び反応時間は、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ  ２０時間、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ  ４５分間、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ  ３時間、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ  １６時間、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−ＯＨ  ２．５時間およびＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ  １５時間であった。
【００９３】
（４）合成した保護ペプチド樹脂に氷冷下、３ｍＬの脱保護液（ＴＦＡ／水／エタンジチオール／ＴＩＳ＝９４／２．５／２．５／１）を加え、氷浴を取り外し、成り行き温度で３時間振盪撹拌した。樹脂を濾過し、脱保護溶液で樹脂を３回洗浄した後、洗浄液と濾液を混合して、エバポレーターで濃縮した。濃縮残渣にＭＴＢＥ５ｍＬを加え、氷冷下終夜撹拌した。全量を遠心沈降管に移したのち、３０００ｒｐｍで１分間遠心沈降させた後、上澄み液を除去した。ＭＴＢＥ２ｍＬを加え、３分間振盪撹拌した後、３０００ｒｐｍで１分間遠心沈降させ、上澄み液を除去する操作を３回行った。沈殿物を減圧乾燥し、目的の配列（H-YERAKSNM-OH）のペプチド粗生成物１７９．５ｍｇを得た。得られたペプチド粗生成物はＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ＴＯＦ／ＭＳ機器での質量分析により確認した。
【００９４】
ESI-MS:理論M:[M+H]+=998.47、実験M:(m／z):[M+H]+=998.4739
【００９５】
ＨＰＬＣ条件（条件Ａ）
カラム:YMC-triartC18 3μm、50×3.0mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.7mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm（［表１４−２］の目的ペプチド(8)と類縁ペプチド(22)の分析の際のみ）または274 nm
勾配：2％B(0分)→2％B(0.2分)→6.4％B(0.5分)→6.4％B(11分)→95％B(15.5分)→95％B(20.5分)→2％B(20.6分)→2％B(29分)
保持時間＝13.3分付近
【００９６】
(12)Ac-ALRAL-NH2の製造方法（方法Ｂ）
【００９７】
（１）ペプチド合成装置「ＫＭＳ−３」付属のＰＰ製カラムにFmoc-NH-SAL樹脂（渡辺化学社製、約0.43 mmol/g）348.8ｍｇ（0.15mmol）を入れ、ＤＭＦ５ｍＬを加えた後、１分間振盪撹拌したのち、終夜静置した。吸引濾過でＤＭＦを除去した後、２０％ピペリジンＤＭＦ溶液を３ｍＬ加え、３５分振盪撹拌した。吸引濾過し、ＤＭＦ３ｍＬで５回洗浄した。
【００９８】
（２）Ｆｍｏｃ-Ｌｅｕ-ＯＨのＤＭＦ溶液（１８７．５ｍＭ）２ｍＬ（0.３７５mmol；2.5当量）、1-ヒドロキシベンズトリアゾールのＤＭＦ溶液（３７５ｍＭ）１ｍＬ（0.３７５mmol；2.5当量）およびＤＩＣ５８μＬ（0.375mmol；2.5当量）を加え３時間振盪撹拌した。吸引濾過で反応液を除去した後、ＤＭＦ３ｍＬで５回洗浄した。２０％ピペリジンＤＭＦ溶液を３ｍＬ加え、３５分振盪撹拌した。吸引濾過し、ＤＭＦ３ｍＬで５回洗浄した。
【００９９】
（３）上記ステップ（２）を参照して、次のアミノ酸を順次結合する。後続アミノ酸の順番及び反応時間は、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ  ２．５時間、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ  １５．５時間、Ｆｍｏｃ-Ｌｅｕ-ＯＨ  ２．５時間およびＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ  ２．５時間であった。Ｎ末端が遊離のアミノ基の保護ペプチド樹脂を合成した後、Ｎ−ヒドロキシコハク酸のＤＭＦ溶液（２４８ｍＭ）３ｍＬ（0.744mmol；4.96当量）、酢酸４３μＬ（0.75mmol；5当量）およびＤＩＣ１１６μＬ（0.75mmol；5当量）を加え16時間振盪撹拌した。吸引濾過で反応液を除去した後、ＤＭＦ３ｍＬで５回洗浄した後、ＭＴＢＥ３ｍＬで3回洗浄した。
【０１００】
（４）合成した保護ペプチド樹脂に氷冷下、３ｍＬの脱保護液（ＴＦＡ／水／ＴＩＳ＝９５／２．５／２．５）を加え、氷浴を取り外し、成り行き温度で４時間振盪撹拌した。樹脂を濾過し、脱保護溶液で樹脂を３回洗浄した後、洗浄液と濾液を混合して、エバポレーターで濃縮した。濃縮残渣にＭＴＢＥ５ｍＬを加え、氷冷下終夜撹拌した。全量を遠心沈降管に移したのち、３０００ｒｐｍで１分間遠心沈降させた後、上澄み液を除去した。ＭＴＢＥ２ｍＬを加え、３分間振盪撹拌した後、３０００ｒｐｍで１分間遠心沈降させ、上澄み液を除去する操作を３回行った。沈殿物を減圧乾燥し、目的の配列（Ac-ALRAL-NH2）のペプチド粗生成物９０．６ｍｇを得た。得られたペプチド粗生成物はＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ＴＯＦ／ＭＳ機器での質量分析により確認した。
【０１０１】
ESI-MS:理論M:[M+H]+=584.39、実験M:(m／z):[M+H]+=584.3879
【０１０２】
ＨＰＬＣ条件（条件Ｂ）
カラム:YMC-PackProC18 3μm、50×3.0mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.5mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：5％B(0分)→5％B(5分)→95％B(17分)→5％B(17.1分)→5％B(20.1分)→5％B(24分)
保持時間＝10.6分付近
【０１０３】
(1)Ac-YFYPEL-NH2の製造方法
【０１０４】
方法Ｂと同様にFmoc-NH-SAL樹脂233ｍｇ（0.1mmol）に対し、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OHと順次縮合させた後、Ｎ末端が遊離のアミノ基をAc保護することで、保護ペプチド樹脂を合成した。脱保護液（ＴＦＡ／水／ＴＩＳ＝９５／２．５／２．５）を用いて樹脂からの切り出しを行い、同様の操作で、目的の配列（Ac-YFYPEL-NH2）のペプチド粗生成物９０．６ｍｇを得た。得られたペプチド粗生成物はＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ＴＯＦ／ＭＳ機器での質量分析により確認した。得られたペプチド粗生成物はＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ＴＯＦ／ＭＳ機器での質量分析により確認した。
【０１０５】
ESI-MS:理論M:[M+H]+=872.42、実験M:(m／z):[M+H]+=872.4203
【０１０６】
ＨＰＬＣ条件（条件Ｃ）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、50×3.0mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.5mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：20％B(0分)→20％B(12分)→95％B(15分)→95％B(19分)→20％B(20分)→20％B(28分)
保持時間＝10.2分付近
【０１０７】
上記の方法ＡまたはＢを用い、下表の目的ペプチドをそれぞれ固相法により合成した。
ＨＰＬＣの分析条件は上記に示したＨＰＬＣ条件（条件Ａ〜Ｃ）のほか、以下に示す条件を用いて分析した。
【０１０８】
ＨＰＬＣ条件（条件Ｄ）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.5mL/分、温度：30℃
検出波長：275 nm
勾配：15％B(0分)→25％B(1分)→25％B(12分)→95％B(14.5分)→95％B(17分)→15％B(17.5分)→15％B(28分)
【０１０９】
ＨＰＬＣ条件（条件Ｅ）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、50×3.0mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.7mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：20％B(0分)→35％B(17分)→95％B(18分)→95％B(20分)→20％B(20.5分)→20％B(28分)
【０１１０】
ＨＰＬＣ条件（条件Ｆ）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.5mL/分、温度：30℃
検出波長：279 nm
勾配：36％B(0分)→36％B(12.5分)→95％B(13分)→95％B(14.5分)→36％B(15分)→36％B(27分)
【０１１１】
ＨＰＬＣ条件（条件Ｇ）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.5mL/分、温度：30℃
検出波長：281 nm
勾配：22％B(0分)→25％B(2分)→25％B(14分)→95％B(17分)→95％B(18.5分)→22％B(19分)→22％B(30分)
【０１１２】
ＨＰＬＣ条件（条件Ｈ）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、50×3.0mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.65mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：2％B(0分)→2％B(3分)→5％B(12分)→5％B(14分)→8％B(16分)→95％B(19分)→95％B(19.9分)→2％B(20分)→2％B(28分)
【０１１３】
ＨＰＬＣ条件（条件Ｉ）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、50×3.0mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.5mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：23％B(0分)→25％B(2分)→25％B(10分)→35％B(15分)→95％B(17分)→95％B(19分)→23％B(20分)→23％B(28分)
【０１１４】
ＨＰＬＣ条件（条件Ｊ）
カラム:Waters Atlantis T3 3μm、150×4.6mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：1.0mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：20％B(0分)→20％B(12分)→95％B(17分)→95％B(19分)→20％B(19.1分)→20％B(28分)
【０１１５】
ＨＰＬＣ条件（条件Ｋ）
カラム: Waters Xbridge Phenyl 3.5μm、150×4.6mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：1.0mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：5％B(0分)→5％B(3分)→95％B(20分)→5％B(20.1分)→5％B(26分)
【０１１６】
ＨＰＬＣ条件（条件Ｌ）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、50×3.0mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.5mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：28％B(0分)→38％B(12分)→95％B(15分)→95％B(19分)→28％B(20分)→28％B(28分)
【０１１７】
ＨＰＬＣ条件（条件Ｍ）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.65mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：4％B(0分)→4％B(3分)→7％B(8分)→95％B(15分)→95％B(15.9分)→4％B(16分)→4％B(28分)
【０１１８】
ＨＰＬＣ条件（条件Ｎ）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液;B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：1.0mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：0％B(0分)→3％B(8分)→95％B(25分)→95％B(28分)→0％B(28.5分)→0％B(35分)
【０１１９】
ＨＰＬＣ条件（条件Ｏ）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液;B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.5mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：25％B(0分)→25％B(14分)→95％B(17分)→95％B(21分)→0％B(22分)→0％B(32分)
【０１２０】
ＨＰＬＣ条件（条件Ｐ）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、50×3.0mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.5mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：20％B(0分)→25％B(12分)→25％B(14分)→95％B(17分)→95％B(18.5分)→20%B(19分）→20％B(28分)
【０１２１】
ＨＰＬＣ条件（条件Ｑ）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、50×3.0mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.5mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：3％B(0分)→5％B(5分)→5％B(16分)→95％B(17分)→95％B(19分)→3％B(19.1分）→3％B(28分)
【０１２２】
ＨＰＬＣ条件（条件Ｒ）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.6mL/分、温度：30℃
検出波長：275 nm
勾配：11％B(0分)→11％B(10分)→20％B(12分)→95％B(15分)→95％B(17.5分)→11％B(18分）→11％B(28分)
【０１２３】
ＨＰＬＣ条件（条件Ｓ）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.6mL/分、温度：30℃
検出波長：281 nm
勾配：29％B(0分)→29％B(10分)→40％B(12分)→95％B(15分)→95％B(17.5分)→29％B(18分）→29％B(28分)
【０１２４】
【表２−１】
2020045336.tif 000017
【０１２５】
【表２−２】
2020045336.tif 000018
【０１２６】
同様に、上記の方法を用い、下表の類縁ペプチドをそれぞれ固相法により合成した。
【０１２７】
【表３−１】
2020045336.tif 000019
【０１２８】
【表３−２】
2020045336.tif 000020
【表３−３】
2020045336.tif 000021
【０１２９】
１−２：酸化合物
【０１３０】
以下の酸化合物を購入して使用した。
硫酸：ナカライテスク社  特級
塩酸：ナカライテスク社  0.1N  特級
【化１２】
2020045336.tif 000022
：東京化成工業（株）
【化１３】
2020045336.tif 000023
：東京化成工業（株）
【化１４】
2020045336.tif 000024
：東京化成工業（株）
【化１５】
2020045336.tif 000025
：東京化成工業（株）
【化１６】
2020045336.tif 000026
：東京化成工業（株）
【化１７】
2020045336.tif 000027
：東京化成工業（株）
【化１８】
2020045336.tif 000028
：東京化成工業（株）
【化１９】
2020045336.tif 000029
：東京化成工業（株）
【化２０】
2020045336.tif 000030
：東京化成工業（株）
【化２１】
2020045336.tif 000031
：東京化成工業（株）
【化２２】
2020045336.tif 000032
：ナカライテスク社  特級
【化２３】
2020045336.tif 000033
：和光純薬社  特級
【化２４】
2020045336.tif 000034
：東京化成工業（株）
【化２５】
2020045336.tif 000035
：ナカライテスク社  一級
【化２６】
2020045336.tif 000036
：東京化成工業（株）
【化２７】
2020045336.tif 000037
：東京化成工業（株）
【化２８】
2020045336.tif 000038
：東京化成工業（株）
【０１３１】
以下に示すスルホン酸は特に記載がない限りそれぞれ、相応するハロゲン化物を亜硫酸ナトリウムと反応させ、得られたスルホン酸ナトリウム塩を塩酸で酸性とすることにより合成して使用した。
【０１３２】
具体例として、p−メチルベンジルスルホン酸：
【化２９】
2020045336.tif 000039
の合成を以下に説明する。
p−メチルベンジルブロミド1.55g（7mmol）をエタノール４ｍLに溶かし、亜硫酸ナトリウム0.97g（7.7mmol；1.1当量）、水８ｍLを加え、終夜加熱還流した。反応終了後、エバポレーターで濃縮しエタノールを除去した後、析出した固体をろ過し、1.09gのp−メチルベンジルスルホン酸ナトリウム塩を得た。得られた固体625mgに濃塩酸1mLと水1.5mLを加え終夜撹拌した。反応液を濾過し、水0.5mLで2回洗浄し、p−メチルベンジルスルホン酸448mgを得た。1H NMR (400 MHz, D2O)  7.25 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.19 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 4.07 (s, 2H), 2.28 (s, 3H)
【０１３３】
上記のp−メチルベンジルスルホン酸の合成方法に従って、下表のスルホン酸を、相応するハロゲン化物を用いて合成した。
【０１３４】
【表４−１】
2020045336.tif 000040
【０１３５】
【表４−２】
2020045336.tif 000041
【０１３６】
【表４−３】
2020045336.tif 000042
【０１３７】
【表４−４】
2020045336.tif 000043
【０１３８】
ベンジルスルホン酸の合成
【化３０】
2020045336.tif 000044
ベンジルブロミド1.71g(10mmol)にエタノール10mL、チオウレア0.76g（10mmol）を加え、終夜加熱還流した。TLCで原料の消失を確認した後、エバポレーターで濃縮乾固した。残渣にアセトニトリル10mLを加え溶解させ、氷浴にて冷却した。氷冷下2N塩酸2mL（4mmol）、Ｎ−クロロスクシンイミド5.34g（40mmol）を加え、室温で1時間撹拌した。反応液をエバポレーターで濃縮し、残渣に酢酸エチル5mLを加え分液した後、有機層をエバポレーターで濃縮した。残渣にMTBE5mL、ヘプタン5mLを加え、析出した固体をろ別した後、ろ液をエバポレーターで濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル：富士シリシア社、PSQ-100B、50g；溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝２０／１）にて精製し、ベンジルスルホニルクロリド0.64gを得た。得られたベンジルスルホニルクロリド0.59gに水5.9mLを加え、5日間加熱還流した。反応液を濃縮乾固、真空ポンプで乾燥することで、ベンジルスルホン酸0.39gを得た。1H NMR (400 MHz, CD3OD)  7.42 (m, 2H), 7.28 (m, 3H), 4.05 (s, 2H)
【０１３９】
p-カルボキシベンジルスルホン酸の合成
【化３１】
2020045336.tif 000045
上記で合成したp-メトキシカルボニルベンジルスルホン酸0.50gに濃塩酸0.6mL、水0.6mLを加え、９０℃に加熱した。終夜９０度で加熱撹拌した後、室温まで冷却し、析出した固体を減圧濾過することで、p-カルボキシベンジルスルホン酸0.37gを得た。1H NMR (400 MHz, CD3OD) 7.97 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.53 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 4.12 (s, 2H)
【０１４０】
略語の説明
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＩＰＡ：イソプロピルアルコール
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＤＩＣ：ジイソプロピルカルボジイミド
ＴＩＳ：トリイソプロピルシラン
ＭＴＢＥ：メチルターシャリーブチルエーテル
【０１４１】
試験例１：目的ペプチドの精製−１（粗類縁ペプチドの除去に関して）
１−１で得られた粗目的ペプチドと粗類縁ペプチドをそれぞれ１％ＴＦＡ含有水／アセトニトリル＝１００〜７０／０〜３０に溶解し、２０ｍＭ（各ペプチドの純度を１００％と仮定）の粗目的ペプチド溶液または粗類縁ペプチド溶液とした。溶けにくいペプチドは約５ｍＭ（各ペプチドの純度を１００％と仮定）まで希釈して溶解させた。
各酸化合物を水、または、水に溶けにくい場合は１０％ＩＰＡ水溶液または１０％ＤＭＳＯ水溶液に溶かし、５０ｍＭの酸化合物溶液とした。
粗目的ペプチド溶液（１μｍｏｌ（目的ペプチドの純度を１００％と仮定））、粗類縁ペプチド溶液（０．１μｍｏｌ（類縁ペプチドの純度を１００％と仮定））を混合した。
当該混合物に酸化合物溶液（１．５μｍｏｌ）を混合し（ＨＰＬＣ分析（処理前））、凍結乾燥により乾固した。
残渣にＩＰＡ  １００μＬを加え、室温にて終夜振盪した。
得られたスラリーを遠心ろ過（5000〜15000ｒｐｍ、１〜５分）し、ケーキをＩＰＡ  １５０μＬで２回洗浄した。濾液と洗浄液は合一した。
得られた固体と濾洗液をそれぞれＨＰＬＣ分析した（処理後固体／処理後濾洗液）。
【０１４２】
ＨＰＬＣの測定機器は上記と同様である。
測定条件：ペプチド合成時の各ＨＰＬＣ条件（ＨＰＬＣ条件Ａ〜Ｍ）に従う。
【０１４３】
芳香族アミノ酸残基を含むペプチドでは、長波長側紫外吸収は専ら該芳香族側鎖に帰する事ができる。これに該当するペプチドを分析する際のHPLC検出波長は、条件A（274 nmで検出する場合）、条件D、条件F〜Gである。条件A（274 nmで検出する場合）では目的ペプチドも類縁ペプチドも芳香族アミノ酸残基を１個ずつ、条件Fでは５個ずつ、条件Gでは４個ずつ持ち、条件Dでは目的ペプチドが芳香族アミノ酸残基を３個、類縁ペプチドは２個持つ。即ち274〜281 nmの長波長紫外吸収に寄与する芳香族側鎖の数は目的ペプチドと類縁ペプチドで同じか１つの差であり、HPLC面積値の比を凡そのモル比とみなす事ができる。
【０１４４】
一方芳香族アミノ酸残基を含まないペプチドでは長波長側に紫外吸収はなく、カルボニル基による短波長紫外吸収（205 nm）を検出に用いる事ができる。条件A（205 nmで検出する場合）と条件Jでは目的ペプチドのカルボニル基は１０個、類縁ペプチドは９個のカルボニル基を持つ。同様に条件Bと条件Kでは目的ペプチド６個、類縁ペプチド５個、条件Cでは８個と７個、条件Eでは１６個と１５個、条件Hでは９個と６個又は８個、条件Iでは３１個と３０個、条件Lでは３２個と３１個、条件Mでは９個と８個である。即ち205 nmの短波長紫外吸収に寄与するカルボニル基の数は目的ペプチドと類縁ペプチドで１〜３個の差であり、HPLC面積値の比を凡そのモル比とみなす事ができる。尚目的ペプチド(9)と(10)は芳香族側鎖を持つものの十分に鎖長が長くカルボニル基が多いので条件Iではカルボニル基の紫外吸収（205 nm）で検出したが、長波長側で検出する事もできる（目的ペプチドも類縁ペプチドも芳香族アミノ酸残基を６個ずつ持つ）。同様に目的ペプチド(16)と類縁ペプチド(25)は芳香族側鎖を２個ずつ持つが、205 nmで検出した。
【０１４５】
下式１）のとおり、ＨＰＬＣ測定値（面積）を用いて、目的ペプチドと類縁ペプチドの合計面積に対する目的ペプチドの面積の割合（％）を算出し、目的ペプチドと類縁ペプチドの物質量（ｍｏｌ）の合計に対する目的ペプチドの物質量（ｍｏｌ）のおおよその割合（％）（目的ペプチド率）とした。
式１）
目的ペプチド率（％）＝目的ペプチドの面積／（目的ペプチドの面積＋類縁ペプチドの面積）×１００
≒目的ペプチド（ｍｏｌ）／（目的ペプチド（ｍｏｌ）＋類縁ペプチド（ｍｏｌ））×１００
【０１４６】
評価１：塩形成の検証
ペプチドと酸化合物を混合した場合、Ｎ末端のアミノ基、あるいは、塩基性アミノ酸（リジンＫ、アルギニンＲ、ヒスチジンＨ等）の側鎖部分と酸化合物が塩を形成する可能性がある。
塩基性アミノ酸不含の目的ペプチド：H-YFYPEL-NH2および１残基欠損体であるその類縁ペプチド：H-YYPEL-NH2、ならびにこれらのＮ末端をアセチル基(Ａｃ)で保護した目的ペプチドAc-YFYPEL-NH2および１残基欠損体であるその類縁ペプチドAc-YYPEL-NH2を用いて、固体における目的ペプチド率（％）の変化により、ペプチドと酸化合物との塩形成の有無を検証した。
【０１４７】
目的ペプチド率（％）の変化は、下式２）を用いて「目的ペプチド率（％）の上昇ポイント」として算出した。
式２）：
目的ペプチド率（％）の上昇ポイント＝処理後固体の目的ペプチド率（％）−処理前の目的ペプチド率（％）
結果を下表に示す。
【０１４８】
【表５】
2020045336.tif 000046
【０１４９】
Ｎ末端がＡｃ基で保護された目的ペプチドAc-YFYPEL-NH2およびその類縁ペプチドAc-YYPEL-NH2では、目的ペプチド率（％）の上昇ポイントは、酸化合物を使用しない場合では１．４ポイント、硫酸では２．０ポイント、当該スルホン酸化合物では２．１ポイントであり、酸化合物使用の有無で目的ペプチド率（％）の上昇ポイントに大きな差はなかった。
対して、Ｎ末端がフリーである目的ペプチド：H-YFYPEL-NH2とその類縁ペプチド：H-YYPEL-NH2では、酸化合物を使用しない場合では−０．３ポイント、硫酸では０．２ポイントであるのに対して、当該スルホン酸化合物では３．１ポイントであり、当該スルホン酸化合物での上昇ポイントは酸化合物不使用および硫酸に比べて大きかった。
目的ペプチドと類縁ペプチドの構造が類似している場合、溶媒に対する溶解特性は通常近似する。そうすると、ペプチドが酸化合物と塩を形成して固体となった場合には、得られた固体の溶媒に対する溶解特性が元のペプチドに比べ大きく変化するので、固液分離する事によって、類縁ペプチドより多く含まれる目的ペプチドの割合が上昇する可能性は顕著に高まる。従って、これらの結果は、当該スルホン酸化合物がペプチドのＮ末端のアミノ基と塩を形成したことを示唆する。
【０１５０】
なお、酸化合物の有無に関わらず、Ｎ末端がＡｃ基で保護された目的ペプチドAc-YFYPEL-NH2およびその類縁ペプチドAc-YYPEL-NH2では、目的ペプチド率（％）が上昇したのは、これらのペプチドのＩＰＡ中での溶解挙動の差に起因すると考えられる。
【０１５１】
評価２：スルホン酸化合物の効果
下表の酸化合物、目的ペプチドおよび類縁ペプチドを用いて、上記と同様の方法で、得られた固体における目的ペプチド率（％）の上昇ポイントを算出した。
結果を下表に示す。
【０１５２】
【表６】
2020045336.tif 000047
【０１５３】
酸化合物不使用の場合と比較して、スルホン酸化合物を使用することにより、目的ペプチド率（％）の上昇ポイントは増加し、スルホン酸化合物は目的ペプチドと類縁ペプチドの分離において優れた効果を示した。これは評価１から示唆される様にスルホン酸化合物との塩形成により溶解挙動が変化した為と考えられる。
【０１５４】
評価３：無機酸との比較
下表の酸化合物、目的ペプチドおよび類縁ペプチドを用いて、上記と同様の方法で、得られた固体における目的ペプチド率（％）の上昇ポイントを算出した。
結果を下表に示す。
【０１５５】
【表７】
2020045336.tif 000048
【０１５６】
目的ペプチド率（％）の上昇ポイントは、塩酸および硫酸と比較してスルホン酸化合物の方が大きく、スルホン酸化合物は目的ペプチドの精製において優れた効果を示した。
【０１５７】
評価４：カルボン酸化合物との比較
下表のスルホン酸化合物またはカルボン酸化合物、ならびに目的ペプチドおよび類縁ペプチドを用いて、上記と同様の方法で、得られた固体における目的ペプチド率（％）の上昇ポイントを算出した。
結果を下表に示す。
【０１５８】
【表８】
2020045336.tif 000049
【０１５９】
【表９】
2020045336.tif 000050
【０１６０】
目的ペプチド率（％）の上昇ポイントは、カルボン酸化合物と比較してスルホン酸化合物の方が大きく、スルホン酸化合物は目的ペプチドの精製において優れた効果を示した。
【０１６１】
評価５：各種スルホン酸化合物の効果（１）
下表のスルホン酸化合物、目的ペプチドおよび類縁ペプチドを用い、分析上の問題で固体における目的ペプチド率が算出できなかった試料があったため濾洗液における目的ペプチド率（％）の変化を、下式３）を用いて「目的ペプチド率（％）の低下ポイント」として算出した。目的ペプチドと類縁ペプチドの処理前後のそれぞれの濃度は不明であること、および目的ペプチドと類縁ペプチドのＨＰＬＣ感度は同一ではないことから、「目的ペプチド率（％）の低下ポイント」から「目的ペプチド率（％）の上昇ポイント」への換算はできないものの、濾洗液において目的ペプチド率が減少したことは固体において目的ペプチド率が増加したことを意味する。
【０１６２】
式３）：
目的ペプチド率（％）の低下ポイント＝処理後濾洗液の目的ペプチド率（％）−処理前の目的ペプチド率（％）
結果を下表に示す。
【０１６３】
【表１０】
2020045336.tif 000051
【０１６４】
【表１１】
2020045336.tif 000052
【０１６５】
【表１２】
2020045336.tif 000053
【０１６６】
【表１３】
2020045336.tif 000054
【０１６７】
【表１４−１】
2020045336.tif 000055
【０１６８】
【表１４−２】
2020045336.tif 000056
【０１６９】
【表１５−１】
2020045336.tif 000057
【０１７０】
【表１５−２】
2020045336.tif 000058
【０１７１】
【表１６−１】
2020045336.tif 000059
【０１７２】
【表１６−２】
2020045336.tif 000060
【０１７３】
【表１６−３】
2020045336.tif 000061
【０１７４】
【表１６−４】
2020045336.tif 000062
【０１７５】
【表１７】
2020045336.tif 000063
【０１７６】
評価６：各種スルホン酸化合物の効果（２）
下表の酸化合物、目的ペプチドおよび類縁ペプチドを用いて、上記と同様の方法で、得られた固体における目的ペプチド率（％）の上昇ポイントを算出した。
結果を下表に示す。
【０１７７】
【表１８】
2020045336.tif 000064
【０１７８】
【表１９】
2020045336.tif 000065
【０１７９】
【表２０】
2020045336.tif 000066
【０１８０】
【表２１】
2020045336.tif 000067
【０１８１】
【表２２】
2020045336.tif 000068
【０１８２】
【表２３】
2020045336.tif 000069
【０１８３】
【表２４】
2020045336.tif 000070
【０１８４】
【表２５】
2020045336.tif 000071
【０１８５】
【表２６】
2020045336.tif 000072
【０１８６】
表５〜２６に示すとおり、得られた固体における目的ペプチド率は上昇し、スルホン酸化合物は種々の目的ペプチドの精製において優れた効果を示した。
【０１８７】
試験例２：溶媒の検討−１
１−１で得られた粗目的ペプチド（(8)H-YERAKSNM-OH）と粗類縁ペプチド（(13)H-YERKSNM-OH）をそれぞれ水／アセトニトリル＝１／２に溶解し、１０ｍＭ（各ペプチドの純度を１００％と仮定）の粗目的ペプチド溶液または粗類縁ペプチド溶液とした。
酸化合物を水に溶かし、３０ｍＭの酸化合物溶液とした。
粗目的ペプチド溶液（１μｍｏｌ（目的ペプチドの純度を１００％と仮定））、粗類縁ペプチド溶液（０．１μｍｏｌ（類縁ペプチドの純度を１００％と仮定））を混合した。
当該混合物に酸化合物溶液（０．９μｍｏｌ）を混合し（ＨＰＬＣ分析（処理前））、凍結乾燥により乾固した。酸化合物は、
【化３２】
2020045336.tif 000073
を使用した。
残渣に下表の溶媒  １００μＬを加え、室温にて終夜振盪した。
得られたスラリーを遠心ろ過（１４０００ｒｐｍ、１分）し、ケーキを当該溶媒  １００μＬで２回洗浄した。濾液と洗浄液は合一した。
得られた固体と濾洗液をそれぞれＨＰＬＣ分析した（処理後固体／処理後濾洗液）。
上記と同様の方法で、得られた濾洗液における目的ペプチド率（％）の低下ポイントを算出した。
加えて、処理前溶液と処理後固体についてのＨＰＬＣ分析結果から、目的ペプチドのHPLC面積百分率（但し、総面積からスルホン酸化合物のピークを除く）を算出した。
【０１８８】
【表２７】
2020045336.tif 000074
【０１８９】
【表２８】
2020045336.tif 000075
【０１９０】
表２７および２８に示されるとおり、スルホン酸化合物は、いずれの溶媒を使用した場合においても、目的ペプチドの精製において効果を示した。溶媒の組成を通常行われる範囲で検討することで類縁ペプチドの除去に適する溶媒を選択できる。
【０１９１】
試験例３：スケールアップ
【０１９２】
試験例２と同じ目的ペプチド、類縁ペプチド、スルホン酸化合物を用いて以下の試験を行った。
粗目的ペプチド、粗類縁ペプチド、スルホン酸化合物をそれぞれ水／アセトニトリル（１／２）に溶解し、粗目的ペプチドと粗類縁ペプチドについては50 mM（それぞれ純度を100％と仮定）、スルホン酸化合物については75 mMの溶液を調製した。粗目的ペプチド溶液1 mL（50 μmol）、粗類縁ペプチド0.1 mL（5 μmol）を混合した。
スルホン酸化合物溶液1 mL（75 μmol）を添加し（HPLC分析（条件A、処理前））、凍結乾燥した。残渣にIPA 1 mLを加え分散した後、再度凍結乾燥し残渣（67.35 mg）を得た。
上記残渣にIPA 2 mLを加え、７００ｒｐｍで３時間振盪後固体を遠心沈降した（１４０００ｒｐｍ、１分）。固体と上清を分離し、それぞれ凍結乾燥して固体由来残渣60.74 mg、上清由来残渣5.84 mgを得た。それぞれHPLC分析した（条件A、処理後）。結果を下表に示す。
【表２９】
2020045336.tif 000076
【０１９３】
スケールアップした場合でも、試験例２と同様の結果が得られた。
【０１９４】
試験例４：スルホン酸除去
【０１９５】
試験例３と同じ目的ペプチド、類縁ペプチド、スルホン酸化合物を用いて以下の試験を行った。
粗目的ペプチド、粗類縁ペプチド、スルホン酸化合物をそれぞれ水／アセトニトリル（１／２）に溶解し、粗目的ペプチドと粗類縁ペプチドについては50 mM（それぞれ純度を100％と仮定）、スルホン酸化合物については75 mMの溶液を調製した。粗目的ペプチド溶液1 mL（50 μmol）、粗類縁ペプチド0.1 mL（5 μmol）を混合した。
スルホン酸化合物溶液1 mL（75 μmol）を添加し（HPLC分析した（条件Ａ、処理前））、凍結乾燥した。残渣にIPA 1 mLを加え分散した後、再度凍結乾燥し残渣（70.93 mg）を得た。
上記残渣にIPA 5 mLを加え、７００ｒｐｍで３.5時間振盪後固体を遠心沈降した（１４０００ｒｐｍ、１分）。固体と上清を分離し、IPA 1 mLで固体を洗浄した。固体と上清および洗浄溶液を合わせたもの、それぞれを凍結乾燥して固体由来残渣59.58 mg、上清および洗浄由来残渣5.40 mgを得た。
Oasis WAX Cartridge（6cc/150mg）（Waters社製）を用い、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液1 mL、水（精製水）7 mL、水／MeOH（10／1）2 mLの順で通液し、前処理を行った。
上記固体由来残渣15.74 mg を 水／MeOH（10／1）1 mLに溶解し、HPLC分析した（条件Ａ、処理後。スルホン酸は5.1分付近に溶出した）。
前処理を行ったOasis WAX Cartridge（6cc/150mg）に上記溶液をロードし、水／MeOH（10／1）9 mLを通液した。このカートリッジを通した溶液をHPLC分析し、スルホン酸の除去を確認した（条件Ａ、スルホン酸除去後）。凍結乾燥して残渣9.47 mgを得た。
【０１９６】
スルホン酸化合物による処理前の溶液と処理後の固体、並びにスルホン酸化合物除去後の当該HPLC分析における的ペプチドのHPLC面積百分率を下表に示す。
【０１９７】
【表３０】
2020045336.tif 000077
【０１９８】
試験例５：溶媒の検討−２
１−１で得られた粗目的ペプチド（(8)H-YERAKSNM-OH）と粗類縁ペプチド（(23)H-YERAKSN-OH）をそれぞれ水／アセトニトリル＝１／２に溶解し、１０ｍＭ（各ペプチドの純度を１００％と仮定）の粗目的ペプチド溶液または粗類縁ペプチド溶液とした。
スルホン酸化合物を水に溶かし、５０ｍＭのスルホン酸化合物溶液とした。
粗目的ペプチド溶液（１μｍｏｌ（目的ペプチドの純度を１００％と仮定））、粗類縁ペプチド溶液（０．１μｍｏｌ（類縁ペプチドの純度を１００％と仮定））を混合した。
当該混合物にスルホン酸化合物溶液（１．５μｍｏｌ）を混合し（ＨＰＬＣ分析（処理前））、凍結乾燥により乾固した。スルホン酸化合物は、
【化３３】
2020045336.tif 000078
を使用した。
残渣に下表の溶媒  １００μＬを加え、室温にて終夜振盪した。
得られたスラリーを遠心ろ過（１４０００ｒｐｍ、１分）し、ケーキを当該溶媒  １００μＬで２回洗浄した。濾液と洗浄液は合一した。
得られた固体と濾洗液をそれぞれＨＰＬＣ分析した（処理後固体／処理後濾洗液）。
上記と同様の方法で、得られた濾洗液における目的ペプチド率（％）の低下ポイントを算出した。
加えて、処理前溶液と処理後固体についてのＨＰＬＣ分析結果から、目的ペプチドのHPLC面積百分率（但し、処理後固体については総面積からスルホン酸化合物のピークを除く）を算出した。
【０１９９】
【表３１】
2020045336.tif 000079
【０２００】
【表３２】
2020045336.tif 000080
【０２０１】
試験例６：目的ペプチドの精製−２
下表の目的ペプチド、類縁ペプチド、およびスルホン酸化合物に関し、試験例１で行ったＨＰＬＣ分析結果から、処理前溶液と処理後固体の目的ペプチドのHPLC面積百分率（但し総面積からスルホン酸化合物のピークを除く）を算出した。
【０２０２】
【表３３】
2020045336.tif 000081
【産業上の利用可能性】
【０２０３】
本願の方法はペプチドの精製に使用できる。
【配列表】
2020045336000001.app