(57)【要約】      （修正有）【課題】新たなキシラナーゼの提供。【解決手段】下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列、及び下記特性（Ｃ）を有する、ポリペプチド：（Ａ）特定のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、（Ｂ）特定のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するアミノ酸配列、（Ｃ）エンド型キシラナーゼ活性。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列、及び下記特性（Ｃ）を有する、ポリペプチド：
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するアミノ酸配列
（Ｃ）エンド型キシラナーゼ活性。
【請求項２】
エンド型キシラナーゼ活性が４−Ｏ−メチルグルクロン酸側鎖を有するキシロースの還元末端側に隣接するキシロースとその更に還元末端側に隣接するキシロースとの間のβ１−４結合を切断する活性である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
更に下記特性（Ｄ）を有する、請求項１又は２に記載のポリペプチド：
（Ｄ）エキソ型キシラナーゼ活性。
【請求項４】
エキソ型キシラナーゼ活性がキシランの非還元末端側からキシロビオース単位でβ１−４結合を切断する活性である、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
更に下記特性（Ｅ）を有する、請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド：
（Ｅ）キシロオリゴ糖またはキシランを糖供与体とするキシロビオース転移活性。
【請求項６】
配列番号１のアミノ酸配列における下記のアミノ酸残基が保存されている、請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチド：
２４Ａｒｇ、１８０Ｇｌｕ、２７５Ｇｌｕ。
【請求項７】
配列番号１のアミノ酸配列における下記のアミノ酸残基が保存されているか、又は保存的に置換されている、請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド：
６８Ｓｅｒ、６９Ｔｈｒ、７０Ｓｅｒ、７１Ａｓｎ、７２Ｌｅｕ。
【請求項８】
配列番号１のアミノ酸配列における下記のアミノ酸残基が保存されている、請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチド：
１１Ｇｌｎ、１５Ｇｌｙ、１７Ｇｌｙ、１９Ｓｅｒ、２１Ａｌａ、２２Ｐｈｅ、３９Ｇｌｎ、５２Ｇｌｙ、５７Ｉｌｅ、５９Ａｒｇ、６０Ａｓｎ、６２Ｉｌｅ、７６Ｉｌｅ、７８Ｐｒｏ、８１Ｐｒｏ、８４Ｐｒｏ、９０Ｔｙｒ、９９Ｇｌｎ、１０６Ａｌａ、１１５Ｔｙｒ、１１６Ａｌａ、１１７Ａｓｐ、１１８Ａｌａ、１１９Ｔｒｐ、１２１Ａｌａ、１２２Ｐｒｏ、１２３Ｇｌｙ、１２５Ｍｅｔ、１２６Ｌｙｓ、１２７Ｔｈｒ、１３５Ｇｌｙ、１３８Ｃｙｓ、１３９Ｇｌｙ、１４２Ｇｌｙ、１４５Ｃｙｓ、１４９Ａｓｐ、１５０Ｔｒｐ、１５１Ａｒｇ、１５２Ｇｌｎ、１５３Ａｌａ、１５４Ｔｙｒ、１５５Ａｌａ、１５８Ｌｅｕ、１５９Ｖａｌ、１６０Ｇｌｎ、１６１Ｔｙｒ、１６５Ｔｙｒ、１６９Ｇｌｙ、１７６Ｇｌｙ、１７９Ａｓｎ、１８０Ｇｌｕ、１８１Ｐｒｏ、１８７Ｔｙｒ、１９０Ｍｅｔ、１９２Ｓｅｒ、１９７Ａｌａ、２００Ｐｈｅ、２０４Ｌｅｕ、２１９Ｃｙｓ、２２０Ｃｙｓ、２２１Ａｓｐ、２２４Ｇｌｙ、２３５Ｌｅｕ、２３９Ｇｌｙ、２４８Ｔｙｒ、２５３Ｔｈｒ、２５５Ｈｉｓ、２５７Ｔｙｒ、２５９Ｓｅｒ、２６４Ｐｒｏ、２７４Ｔｈｒ、２７５Ｇｌｕ、２８７Ｔｈｒ、２９２Ｇｌｙ、２９６Ｇｌｕ、２９７Ｇｌｙ、３００Ｔｒｐ、３０１Ａｌａ、３０９Ｖａｌ、３１４Ｓｅｒ、３１９Ｔｒｐ、３３４Ｌｅｕ、３４２Ｓｅｒ、３４６Ｔｒｐ、３４９Ａｌａ、３５６Ａｒｇ、３５７Ｐｒｏ、３６１Ａｒｇ、３７８Ａｓｎ、３８９Ａｓｎ、４１８Ａｓｎ。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
ポリヌクレオチドが、配列番号２の塩基配列と８０％以上の同一性を有する、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項９又は１０に記載のポリヌクレオチド、或いは請求項１１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載の宿主細胞を培養することを含む、請求項１〜８のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれかに記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項１５】
セルラーゼ、プロテアーゼ、ガラクタナーゼ、アラビナナーゼ、マンナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ガラクツロン酸リアーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、α−アラビノフラノシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−キシロシダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、及びフェルラ酸エステラーゼからなる群より選択される一種以上の酵素を更に含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１〜８のいずれかに記載のポリペプチド、請求項１２に記載の宿主細胞、或いは、請求項１４又は１５に記載の組成物を、キシランに作用させることを含む、キシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項１７】
キシロオリゴ糖がキシロビオース、キシロテトラオース、又はキシロヘキサオースを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
キシロオリゴ糖及びキシランからなる群より選択される糖供与体、並びに糖受容体に、請求項１〜８のいずれかに記載のポリペプチドを作用させることを含む、キシロビオースの還元末端に糖受容体が結合した糖転移物を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
キシラナーゼに関する技術が開示される。
【背景技術】
【０００２】
キシランは広く天然に存在する多糖の１つであり、農産廃棄物や木質などのリグノセルロースの主要構成成分である。その構造は、キシロースを単位とするβ−１，４結合により重合した主鎖を有する高分子多糖である。キシランは、天然には、キシロース残基のＯ−２またはＯ−３あるいはその両方で、４−Ｏ−メチルグルクロン酸側鎖、アラビノフラノシル側鎖やアセチル側鎖などの残基やキシロース、アラビノース、ガラクトース、グルコースなどからなるオリゴ糖側鎖が結合されたヘテロキシランとして存在し、その主要な構造に基づいて、グルクロノキシラン、アラビノグルクロノキシラン、アラビノキシランなどに分類される。広葉樹材はグルクロノキシランを、イネ科草本はアラビノグルクロノキシランを主に含む。アラビノキシランは、ムギ、エンバク、コメ、アワ、トウモロコシ、ソルガムのような穀物やタケノコなどの植物に分布している。
【０００３】
キシランの加水分解物であるキシロオリゴ糖は、キシロースが２〜７個程度、β−１，４結合した構造を持つ糖の総称である。多くの場合、キシランを構成するキシロースには４−Ｏ−メチルグルクロン酸側鎖、アラビノフラノシル側鎖等が結合している。キシロオリゴ糖は、それら側鎖を有する酸性キシロオリゴ糖やアラビノキシロオリゴ糖と側鎖をもたない中性キシロキシロオリゴ糖に分類される。
【０００４】
キシロオリゴ糖は、ラクトバチルス種およびビフィズス菌種等の腸内有用菌の栄養源となるプレバイオティクな性質を示すため、食品用ならびに家畜の飼料の添加剤として有用である（非特許文献１及び特許文献１）。一方で、オリゴ糖をラクトバチルス種およびビフィズス菌種等の栄養源にするためには、胃酸や消化液による加水分解による重合度の低下が問題になることから、重合度の高い長鎖キシロオリゴ糖は、高いプレバイオテック効果が期待できる。しかし、中性キシロオリゴ糖は、鎖長が長くなるにつれて水溶性が低下するため、長鎖中性キシロオリゴ糖の生産や取扱は容易ではない。４−Ｏ−メチルグルクロン酸側鎖をもつ酸性キシロオリゴ糖になると、親水性のカルボキシル基をもつため重合度が高くとも高い水溶性を示すことが知られており、上記の課題を解決できる。加えて、酸性キシロオリゴ糖は、アトピー性皮膚炎の改善（特許文献２）、免疫調節（特許文献３）、胃上皮細胞の保護（特許文献４）などの機能をもつことが報告されている。
【０００５】
キシロースまたはキシロオリゴ糖は、配糖化反応により、アルコール・フェノール類が付与され配糖体としても利用される（特許文献５）。配糖化は、化合物の可溶化、安定化といった修飾法として注目されており、配糖体は、その生理活性から、食品、医薬品、化粧品としての利用が期待されている。
【０００６】
キシロオリゴ糖の製造方法としては、キシランを加水分解する方法、もしくはキシロースまたはキシロオリゴ糖の糖鎖長を、糖転移反応により伸長する方法が用いられる。キシランの分解によるオリゴ糖の製造方法としては、高温高圧水により、ヘミセルロースを加水分解抽出する方法（特許文献６）や、加水分解酵素であるキシラナーゼでキシランを処理する方法（特許文献７）などが知られている。キシラナーゼを用いたキシロオリゴ糖の生成には、キシラン主鎖をランダムに分解するエンド型キシラナーゼが主に使用されている。キシロースまたはキシロオリゴ糖を用いた糖転移反応によるオリゴ糖の製造方法としては、糸状菌のキシロシル糖転移酵素を用いて、キシロオリゴ糖を糖供与体並びに受容体基質としてキシロオリゴ糖を製造する方法が知られている（特許文献８）。また、エンド型キシラナーゼを用いて、キシランあるいはキシロオリゴ糖を糖供与体として、キシロースをプシコースに転移させる新規なオリゴ糖の製造法も報告されている（特許文献９）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第２６２９００６号
【特許文献２】特開２００４−２１０６６６
【特許文献３】特開２００９−９６７２９
【特許文献４】特開２０１０−７７０４４
【特許文献５】特開２００８−１８７９２７
【特許文献６】特開２００６−７５０６７
【特許文献７】特開昭６１−２４２５９２
【特許文献８】特開平０１−１７１４８４
【特許文献９】特開２００６−１６９１２４
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】日本栄養・食糧学会誌  ４３巻３９５−４０１，１９９０958.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
新たなキシラナーゼの提供が１つの課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
下記に代表される発明が提供される。
項１.
下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列、及び下記特性（Ｃ）を有する、ポリペプチド：
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するアミノ酸配列
（Ｃ）エンド型キシラナーゼ活性。
項２.
エンド型キシラナーゼ活性が４−Ｏ−メチルグルクロン酸側鎖を有するキシロースの還元末端側に隣接するキシロースとその更に還元末端側に隣接するキシロースとの間のβ１−４結合を切断する活性である、項１に記載のポリペプチド。
項３.
更に、下記特性（Ｄ）を有する、項１又は２ に記載のポリペプチド：
（Ｄ）エキソ型キシラナーゼ活性。
項４.
エキソ型キシラナーゼ活性がキシランの非還元末端側からキシロビオース単位でβ１−４結合を切断する活性である、項３に記載のポリペプチド。
項５.
更に下記特性（Ｅ）を有する、項１又は２〜４のいずれかに記載のポリペプチド：
（Ｅ）キシロオリゴ糖またはキシランを糖供与体とするキシロビオース転移活性。
項６.
配列番号１のアミノ酸配列における下記のアミノ酸残基が保存されている、項１〜５のいずれかに記載のポリペプチド：
２４Ａｒｇ、１８０Ｇｌｕ、２７５Ｇｌｕ。
項７.
配列番号１のアミノ酸配列における下記のアミノ酸残基が保存されているか、又は保存的に置換されている、項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド：
６８Ｓｅｒ、６９Ｔｈｒ、７０Ｓｅｒ、７１Ａｓｎ、７２Ｌｅｕ。
項８.
配列番号１のアミノ酸配列における下記のアミノ酸残基が保存されている、項１〜７のいずれかに記載のポリペプチド：
１１Ｇｌｎ、１５Ｇｌｙ、１７Ｇｌｙ、１９Ｓｅｒ、２１Ａｌａ、２２Ｐｈｅ、３９Ｇｌｎ、５２Ｇｌｙ、５７Ｉｌｅ、５９Ａｒｇ、６０Ａｓｎ、６２Ｉｌｅ、７６Ｉｌｅ、７８Ｐｒｏ、８１Ｐｒｏ、８４Ｐｒｏ、９０Ｔｙｒ、９９Ｇｌｎ、１０６Ａｌａ、１１５Ｔｙｒ、１１６Ａｌａ、１１７Ａｓｐ、１１８Ａｌａ、１１９Ｔｒｐ、１２１Ａｌａ、１２２Ｐｒｏ、１２３Ｇｌｙ、１２５Ｍｅｔ、１２６Ｌｙｓ、１２７Ｔｈｒ、１３５Ｇｌｙ、１３８Ｃｙｓ、１３９Ｇｌｙ、１４２Ｇｌｙ、１４５Ｃｙｓ、１４９Ａｓｐ、１５０Ｔｒｐ、１５１Ａｒｇ、１５２Ｇｌｎ、１５３Ａｌａ、１５４Ｔｙｒ、１５５Ａｌａ、１５８Ｌｅｕ、１５９Ｖａｌ、１６０Ｇｌｎ、１６１Ｔｙｒ、１６５Ｔｙｒ、１６９Ｇｌｙ、１７６Ｇｌｙ、１７９Ａｓｎ、１８０Ｇｌｕ、１８１Ｐｒｏ、１８７Ｔｙｒ、１９０Ｍｅｔ、１９２Ｓｅｒ、１９７Ａｌａ、２００Ｐｈｅ、２０４Ｌｅｕ、２１９Ｃｙｓ、２２０Ｃｙｓ、２２１Ａｓｐ、２２４Ｇｌｙ、２３５Ｌｅｕ、２３９Ｇｌｙ、２４８Ｔｙｒ、２５３Ｔｈｒ、２５５Ｈｉｓ、２５７Ｔｙｒ、２５９Ｓｅｒ、２６４Ｐｒｏ、２７４Ｔｈｒ、２７５Ｇｌｕ、２８７Ｔｈｒ、２９２Ｇｌｙ、２９６Ｇｌｕ、２９７Ｇｌｙ、３００Ｔｒｐ、３０１Ａｌａ、３０９Ｖａｌ、３１４Ｓｅｒ、３１９Ｔｒｐ、３３４Ｌｅｕ、３４２Ｓｅｒ、３４６Ｔｒｐ、３４９Ａｌａ、３５６Ａｒｇ、３５７Ｐｒｏ、３６１Ａｒｇ、３７８Ａｓｎ、３８９Ａｓｎ、４１８Ａｓｎ。
項９.
項１〜８のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
項１０.
ポリヌクレオチドが、配列番号２の塩基配列と８０％以上の同一性を有する、項９に記載のポリヌクレオチド。
項１１.
項９又は１０に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
項１２.
項９又は１０に記載のポリヌクレオチド、或いは項１１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
項１３.
項１２に記載の宿主細胞を培養することを含む、項１〜８のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法。
項１４.
項１〜８のいずれかに記載のポリペプチドを含む組成物。
項１５.
セルラーゼ、プロテアーゼ、ガラクタナーゼ、アラビナナーゼ、マンナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ガラクツロン酸リアーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、α−アラビノフラノシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−キシロシダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、及びフェルラ酸エステラーゼからなる群より選択される一種以上の酵素を更に含む、項１４に記載の組成物。
項１６.
項１〜８のいずれかに記載のポリペプチド、項１２に記載の宿主細胞、或いは、項１４又は１５に記載の組成物を、キシランに作用させることを含む、キシロオリゴ糖の製造方法。
項１７.
キシロオリゴ糖がキシロビオース、キシロテトラオース、及び又はキシロヘキサオースを含む、項１６に記載の方法。  
項１８.
キシロオリゴ糖及びキシランからなる群より選択される糖供与体、並びに糖受容体に、項１〜８のいずれかに記載のポリペプチドを作用させることを含む、キシロビオースの還元末端に糖受容体が結合した糖転移物を製造する方法。
【発明の効果】
【００１１】
新たなキシラナーゼが提供される。好適な一実施形態において、キシランから効率的にキシロオリゴ糖を製造する手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】精製Ｘｙｎ３０ＢのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析
【図２】Ｘｙｎ３０Ｂの最適活性ｐＨ
【図３】Ｘｙｎ３０ＢのｐＨ安定性
【図４】Ｘｙｎ３０Ｂの最適活性温度
【図５】Ｘｙｎ３０Ｂの温度安定性
【図６】Ｘｙｎ３０Ｂによる分解物のイオン交換クロマトグラフによる分析図
【図７】Ｘｙｎ３０Ｂによる分解物の質量分析図
【図８】Ｘｙｎ３０ＢによるＢｅｅｃｈｗｏｏｄキシランからの中性キシロオリゴ糖の生産
【図９】Ｘｙｎ３０Ｂのエキソ型キシラナーゼ活性の４０℃における最適ｐＨ
【図１０】Ｘｙｎ３０Ｂの転移活性の4０℃における最適ｐＨ
【図１１】Ｘｙｎ３０Ｂの各種糖類を受容体とした転移反応
【図１２】Ｘｙｎ３０Ｂの結晶
【図１３】Ｘｙｎ３０Ｂの立体構造
【図１４】Ｘｙｎ３０Ｂによるエンド型キシラナーゼ反応の模式図
【図１５】Ｘｙｎ３０Ｂによるエキソ型キシラナーゼ反応の模式図
【図１６】Ｘｙｎ３０Ｂのアミノ酸配列と他のキシラナーゼのアミノ酸配列とのマルチプルアライメント：「T.reesei_Xyn6」は、Trichoderma reesei由来のXyn VIのアミノ酸配列（配列番号７）であり、「P.subrubescens」は、Penicillium subrubescens由来のキシラナーゼのアミノ酸配列（配列番号８）であり、「Xyn30B」は、Ｘｙｎ３０Ｂのシグナル配列を含むアミノ酸配列（配列番号９）であり、「T.reesei_Xyn4」は、Trichoderma reesei由来のXyn IVのアミノ酸配列（配列番号１０）である。網掛け部分はキシロビオース単位での転移活性に関与するループ構造を形成すると考えられる領域である。「＊」は全てのアミノ酸配列に共通しているアミノ酸残基であることを示し、「：」は全てのアミノ酸配列におけるアミノ酸残基が類似していることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．ポリペプチド
ポリペプチドは、下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列、及び下記特性（Ｃ）を有することが好ましい。
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するアミノ酸配列
（Ｃ）エンド型キシラナーゼ活性
【００１４】
配列番号１のアミノ酸配列は、後述する実施例で同定したタラロマイセス・セルロリティカスＣＦ−２６１２株由来のキシラナーゼ（Ｘｙｎ３０Ｂ）のアミノ酸配列（シグナルペプチドを含まない）である。ポリペプチドを構成するアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％、８５％以上、９０％、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有することが好ましい。
【００１５】
アミノ酸配列の同一性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、例えば、
ClustalW ver2.1 Pairwise Alignment（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/index.php?lang=ja）を使用し、デフォルトのパラメータを用いて算出することができる。また、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、算出することができる。
【００１６】
上記（Ｂ）のポリペプチドに関し、「数個」とは、例えば、５０個以下、４５個以下、３０個以下、２５個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下、５個以下、３個以下、又は２個以下である。
【００１７】
１又は数個のアミノ酸残基が置換されている場合、置換の種類は、特に制限されないが、ポリペプチドの高次構造、表現形又は特性に顕著な負の影響を与えないという観点から保存的アミノ酸置換が好ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、同様の性質を有するファミリーに分類することができる。よって、アミノ酸置換は、置換前のアミノ酸残基と同一の上記カテゴリーに属する他のアミノ酸残基間で置換されることが好ましい。
【００１８】
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドの高次構造、表現形又は特性に顕著な負の影響を与えないという観点から、（Ａ）及び（Ｂ）のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列からなるキシラナーゼに特徴的なアミノ酸残基が保存されていることが好ましい。保存されているとは、あるアミノ酸残基が、（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列において、配列番号１における位置と同等の位置に存在することを意味する。
【００１９】
一実施形態において、配列番号１のアミノ酸配列を構成するアミノ酸残基のうち、次のアミノ酸残基は、上記（Ａ）及び（Ｂ）のアミノ酸配列において保存されていることが好ましい：１１Ｇｌｎ、１５Ｇｌｙ、１７Ｇｌｙ、１９Ｓｅｒ、２１Ａｌａ、２２Ｐｈｅ、３９Ｇｌｎ、５２Ｇｌｙ、５７Ｉｌｅ、５９Ａｒｇ、６０Ａｓｎ、６２Ｉｌｅ、７６Ｉｌｅ、７８Ｐｒｏ、８１Ｐｒｏ、８４Ｐｒｏ、９０Ｔｙｒ、９９Ｇｌｎ、１０６Ａｌａ、１１５Ｔｙｒ、１１６Ａｌａ、１１７Ａｓｐ、１１８Ａｌａ、１１９Ｔｒｐ、１２１Ａｌａ、１２２Ｐｒｏ、１２３Ｇｌｙ、１２５Ｍｅｔ、１２６Ｌｙｓ、１２７Ｔｈｒ、１３５Ｇｌｙ、１３８Ｃｙｓ、１３９Ｇｌｙ、１４２Ｇｌｙ、１４５Ｃｙｓ、１４９Ａｓｐ、１５０Ｔｒｐ、１５１Ａｒｇ、１５２Ｇｌｎ、１５３Ａｌａ、１５４Ｔｙｒ、１５５Ａｌａ、１５８Ｌｅｕ、１５９Ｖａｌ、１６０Ｇｌｎ、１６１Ｔｙｒ、１６５Ｔｙｒ、１６９Ｇｌｙ、１７６Ｇｌｙ、１７９Ａｓｎ、１８０Ｇｌｕ、１８１Ｐｒｏ、１８７Ｔｙｒ、１９０Ｍｅｔ、１９２Ｓｅｒ、１９７Ａｌａ、２００Ｐｈｅ、２０４Ｌｅｕ、２１９Ｃｙｓ、２２０Ｃｙｓ、２２１Ａｓｐ、２２４Ｇｌｙ、２３５Ｌｅｕ、２３９Ｇｌｙ、２４８Ｔｙｒ、２５３Ｔｈｒ、２５５Ｈｉｓ、２５７Ｔｙｒ、２５９Ｓｅｒ、２６４Ｐｒｏ、２７４Ｔｈｒ、２７５Ｇｌｕ、２８７Ｔｈｒ、２９２Ｇｌｙ、２９６Ｇｌｕ、２９７Ｇｌｙ、３００Ｔｒｐ、３０１Ａｌａ、３０９Ｖａｌ、３１４Ｓｅｒ、３１９Ｔｒｐ、３３４Ｌｅｕ、３４２Ｓｅｒ、３４６Ｔｒｐ、３４９Ａｌａ、３５６Ａｒｇ、３５７Ｐｒｏ、３６１Ａｒｇ、３７８Ａｓｎ、３８９Ａｓｎ、４１８Ａｓｎ。ここで、「１１Ｇｌｎ」とは、配列番号１のアミノ酸配列における１１番目のグルタミン残基を意味し、他の標記についても同様である。一実施形態において、これらのアミノ酸残基の１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上、５０以上、５５以上、６０以上、６５以上、７０以上、７０以上、７５以上、８０以上、又は８５以上が保存されていることが好ましい。
【００２０】
好適な一実施形態において、配列番号１のアミノ酸配列を構成するアミノ酸残基のうち、次のアミノ酸残基は、上記（Ａ）及び（Ｂ）のアミノ酸配列において保存されていることが好ましい：２Ｉｌｅ、４Ｖａｌ、５Ａｓｐ、１０Ｔｙｒ、１３Ｖａｌ、４４Ａｓｐ、４６Ｍｅｔ、４７Ｔｙｒ、５５Ｐｈｅ、５６Ｔｈｒ、５８Ｌｅｕ、６４Ｓｅｒ、８３Ｓｅｒ、９６Ａｓｎ、１００Ｐｈｅ、１０３Ｓｅｒ、１０４Ｇｌｎ、１１４Ｉｌｅ、１３７Ｌｅｕ、１５６Ａｓｐ、１５７Ｔｙｒ、１６２Ｖａｌ、１６３Ｌｙｓ、１７２Ｖａｌ、１７５Ｌｅｕ、１８２Ｇｌｎ、１８６Ｓｅｒ、１９３Ａｓｎ、１９６Ｇｌｎ、２０１Ｖａｌ、２０３Ｉｌｅ、２０７Ｔｈｒ、２０８Ｌｅｕ、２０９Ｇｌｕ、２１７Ｌｅｕ、２１８Ｔｈｒ、２２８Ｇｌｎ、２４９Ｌｅｕ、２６５Ｌｅｕ、２８３Ｐｈｅ、２８８Ｐｈｅ、２９８Ｍｅｔ、３０４Ｉｌｅ、３０８Ｐｈｅ、３１０Ａｓｎ、３１２Ａｓｎ、３１６Ｐｈｅ、３２３Ｇｌｕ、３４５Ｐｈｅ、３４７Ｓｅｒ、３４８Ｍｅｔ、３５１Ｐｈｅ、３５３Ｌｙｓ、３５４Ｐｈｅ、３５９Ａｌａ、３６２Ｖａｌ、３６４Ａｌａ、３６５Ｔｈｒ、３７３Ｖａｌ、３７５Ａｌａ、３７６Ｐｈｅ、３８０Ａｓｎ、３８３Ｖａｌ、３９９Ｉｌｅ、４０１Ｌｅｕ、４１４Ｔｒｐ、４３０Ｖａｌ、４３４Ｓｅｒ、４３５Ｐｈｅ、４３８Ｓｅｒ、４３９Ｖａｌ、４４４Ｌｅｕ、４４６Ｓｅｒ。一実施形態において、これらのアミノ酸残基の１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上、５０以上、５５以上、６０以上、６５以上、７０以上、又は７０以上が保存されていることが好ましい。これらのアミノ酸残基は、そのまま保存されているか類似アミノ酸に置換されていてもよい。
【００２１】
更に好適な一実施形態において、配列番号１のアミノ酸配列を構成するアミノ酸残基のうち、次のアミノ酸残基は、上記（Ａ）及び（Ｂ）のアミノ酸配列において保存されていることが好ましい：３Ａｓｎ、２５Ａｌａ、３０Ｇｌｙ、３６Ｐｒｏ、４２Ｖａｌ、４８Ｓｅｒ、５３Ａｌａ、６３Ｇｌｙ、６５Ｓｅｒ、８２Ｇｌｙ、８５Ｓｅｒ、９７Ｓｅｒ、１１０Ｇｌｙ、１２０Ｓｅｒ、１８９Ｓｅｒ、１９４Ｇｌｙ、１９９Ｇｌｕ、２１４Ａｓｐ、２２２Ｇｌｙ、２３８Ｖａｌ、２４５Ａｌａ、２５０Ｓｅｒ、２６６Ｓｅｒ、２７８Ａｓｐ、２８２Ａｌａ、２９１Ａｓｐ、３０７Ａｌａ、３１１Ａｌａ、３１５Ａｌａ、３１８Ｔｙｒ、３３０Ｇｌｙ、３５８Ａｓｎ、３６６Ｓｅｒ、３７０Ｓｅｒ、３７１Ｖａｌ、３７９Ｔｈｒ、３８４Ａｌａ、３８７Ｖａｌ、３９１Ｇｌｙ、３９４Ａｌａ、３９６Ｓｅｒ、４００Ａｓｐ、４１０Ｌｙｓ、４１７Ｓｅｒ、４１９Ａｓｐ、４３１Ｌｙｓ、４３３Ａｓｎ、４３７Ａｌａ、４４３Ｓｅｒ、４４７Ｐｈｅ。一実施形態において、これらのアミノ酸残基の１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、又は４５以上が保存されていることが好ましい。これらのアミノ酸残基は、そのまま保存されているか類似アミノ酸に置換されていてもよい。
【００２２】
配列番号１のアミノ酸配列において、２４Ａｒｇはグルクロン酸認識に関与している。配列番号１のアミノ酸配列において、６８Ｓｅｒ、６９Ｔｈｒ、７０Ｓｅｒ、７１Ａｓｎ、及び７２Ｌｅｕは、後述するキシロビオース単位でのエキソ型キシラナーゼならびに転移活性に関与するループ構造を形成すると考えられる。配列番号１のアミノ酸配列において、１８０Ｇｌｕ及び２７５Ｇｌｕは、触媒作用に必須である。よって、これらのアミノ酸残基は上記（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列において保存されていることが好ましい。一実施形態において、６８Ｓｅｒ、６９Ｔｈｒ、７０Ｓｅｒ、７１Ａｓｎ、及び７２Ｌｅｕのアミノ酸残基については、ループ構造を形成する限り、他のアミノ酸残基に置換（好ましくは、保存的置換）されていてもよい。例えば、連続した３つの親水性アミノ酸残基と５番目に疎水性アミノ酸残基を有するフラグメントを構成していればよい。
【００２３】
上記（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列は、所望の特性を妨げない限り、Ｎ末端及び／又はＣ末端に更に任意のアミノ酸残基（配列）を有していてもよい。例えば、上記（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列は、Ｎ末端にシグナルペプチドを有していてもよい。また、（Ａ）及び（Ｂ）のアミノ酸配列は、そのＣ末端にリンカー配列及びセルロース結合モジュールに相当するアミノ酸配列を有していてもよい。
【００２４】
エンド型キシラナーゼ活性とは、キシロースで形成されるキシランの主鎖をその末端からではなく、内部から切断する活性を意味する。エンド型キシラナーゼ活性は、ポリペプチドをキシランに作用させることにより、比較的長い主鎖を有するキシロオリゴ糖（例えば、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、又はそれ以上の高次オリゴマー）が生成されることに基づいて確認することができる。また、キシラナーゼ活性の有無は、例えば、ソモギ-ネルソン法等の公知の手法を用いて確認することができる。
【００２５】
一実施形態において、エンド型キシラナーゼ活性は、キシラン又はキシロオリゴ糖に存在する４−Ｏ−メチルグルクロン酸側鎖を認識して、一定の様式で主鎖を切断する活性であることが好ましい。例えば、図１４に示すように、キシラン又はキシロオリゴ糖における４−Ｏ−メチルグルクロン酸側鎖を有するキシロースの還元末端側に隣接するキシロースとその更に還元末端側に隣接するキシロースとの間のβ−１，４結合を特異的に切断する活性であることが好ましい。このようなエンド型キシラナーゼ活性を有することは、後述する実施例の試験４で用いた測定方法にて確認することができる。
【００２６】
ポリペプチドは、４−Ｏ−メチルグルクロン酸側鎖を有するキシランだけでなく、アラビノフラノシル側鎖を有するキシランに対してもエンド型キシラナーゼ活性を示してもよい。一実施形態において、ポリペプチドは、アラビノフラノシル側鎖を有するキシランに対してエンド型キシラナーゼ活性を有さないことが好ましい。４−Ｏ−メチルグルクロン酸側鎖を有するキシランとしては、例えば、Ｂｅｅｃｈｗｏｏｄキシラン及びＢｉｒｃｈｗｏｏｄキシランを挙げることができる。アラビノフラノシル側鎖を有するキシランとしては、小麦アラビノキシランを挙げることができる。
【００２７】
一実施形態において、ポリペプチドはエキソ型キシラナーゼ活性を有することが好ましい。エキソ型キシラナーゼ活性とは、キシロースで形成されるキシランの主鎖をその末端から切断する活性を意味する。エキソ型キシラナーゼ活性は、ポリペプチドをキシランに作用させることにより、一定の長さのキシロオリゴ糖もしくはキシロースが蓄積される。エキソ型キシラナーゼ活性の有無は、例えば、HPLC法等の公知の手法を用いて確認することができる。一実施形態において、エキソ型キシラナーゼ活性は、図１５に示すように、キシランまたはキシロオリゴ糖の非還元末端からキシロビオース単位で分解活性を有することが好ましい。ここで、基質となるキシランおよびキシロオリゴ糖の種類は特に制限されず、４−Ｏ−メチルグルクロン酸側鎖、アラビノフラノシル側鎖、アセチル側鎖、ガラクトシル側鎖、アラビノフラノシル側鎖等の側鎖を１種以上有していてもよく、これらの側鎖を有さない中性キシロオリゴ糖またはキシランであってもよい。また、キシロオリゴ糖及びキシランは、非還元末端から２番目までのキシロース残基に側鎖を有さないか、還元末端に修飾基がＯ−グリコシド結合で結合した構造を有していてもよい。
【００２８】
一実施形態において、ポリペプチドは、キシロオリゴ糖またはキシランを糖供与体とするキシロビオース転移活性を有することが好ましい。ここで、キシロビオース転移活性とは、キシロオリゴ糖またはキシランからキシロビオースを切断し、それを糖受容体に結合させる（転移させる）活性を意味する。キシロオリゴ糖またはキシランからキシロビオースを切断する様式は特に制限されないが、例えば、図１５に示すように、キシロオリゴ糖またはキシランの非還元末端からキシロビオースを上記で述べたエキソ型キシラナーゼ活性により切断し、切り出したキシロビオース側の還元末端に糖受容体を結合させる様式が好ましい。糖供与体となるキシロオリゴ糖及びキシランの種類は特に制限されず、４−Ｏ−メチルグルクロン酸側鎖、アラビノフラノシル側鎖、アセチル側鎖、ガラクトシル側鎖、アラビノフラノシル側鎖等の側鎖を１種以上有していてもよく、これらの側鎖を有さない中性キシロオリゴ糖またはキシランであってもよい。また、キシロオリゴ糖及びキシランは、非還元末端から２番目までのキシロース残基に側鎖を有さないか、還元末端に修飾基がＯ−グリコシド結合で結合した構造を有していてもよい。
【００２９】
糖受容体は、キシロビオースと結合可能である限り特に制限されない。例えば、糖受容体としては、単糖、その誘導体又は配糖体等の単糖類、二糖以上のオリゴ糖、その誘導体又は配糖体、及び第一級水酸基又はフェノール性水酸基を有する化合物を挙げることができる。単糖類としては、例えば、グルコース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、アロース、アルトロース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、フコース、フクロース及びＮ-アセチルグルコサミン等のヘキソース；ケトトリオース（ジヒドロキシアセトン）及びアルドトリオース（グリセルアルデヒド）等のトリオース；エリトリロース、エリトロース及びトレオース等のテトロース；及びリブロース、キシルロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース及びデオキシリボース等のペントース等を挙げることができる。二糖類としては、例えば、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、マンノビオース、キシロビオース、ツラノース及びセロビオース等を挙げることができる。三糖類としては、例えば、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース、マンノトリオース、キシロトリオース、セロトリオース及び１−ケストース（ＧＦ２）等を挙げることができる。四糖類としては、例えば、グリコーゲン、デンプン（アミロース、アミロペクチン）、セルロース、デキストリン、グルカン、キチン質及びイヌリン（フラクトフラノシルニストース：ＧＦ４を含む）等を挙げることができる。糖アルコールとしては、キシリトール、ソルビトール、マルチトール、エリスリトールおよび還元パラチノース等を挙げることができる。一実施形態において好ましい糖受容体は、例えば、キシロース、キシロビオース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、アラビノース、スクロース、ラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、及びキシリトール等を挙げることができる。
【００３０】
一実施形態において、エンド型キシラナーゼ活性を有するポリペプチドは、至適活性温度が約５０℃であることが好ましい。至適活性温度が約５０℃であるとは、５０℃におけるエンド型キシラナーゼ活性が４５℃及び５５℃におけるエンド型キシラナーゼ活性よりも高いことを意味する。一実施形態において、エンド型キシラナーゼ活性を有するポリペプチドは、４０℃以下の温度で安定であることが好ましい。４０℃以下の温度で安定であるとは、４０℃以下の温度の緩衝液中に２４時間保持しても、保存前と比較して９５％以上の活性を維持していることを意味する。一実施形態において、エンド型キシラナーゼ活性を有するポリペプチドは、至適ｐＨが約４．０であることが好ましい。至適ｐＨが約４．０であるとは、ｐＨ４．０でのエンド型キシラナーゼ活性がｐＨ３及び５における同活性よりも高いことを意味する。一実施形態において、エンド型キシラナーゼ活性を有するポリペプチドは、ｐＨ３〜６．５で安定であることが好ましい。ｐＨ３〜６．５で安定であるとは、ｐＨ３〜６．５の緩衝液中で３０分保持した後の残存活性が９５％以上であることを意味する。
【００３１】
一実施形態において、ポリペプチドのエキソ型キシラナーゼ活性を利用する際の反応液のｐＨおよび温度等の条件は、ポリペプチドが失活しない範囲であればよい。例えば、エンド型キシラナーゼ活性と同様の至適温度およびｐＨ安定性の範囲でエキソ型キシラナーゼ活性の条件を採用することが効率的に基質を分解し、キシロビオースを得るという観点から好ましい。一実施形態において、エキソ型キシラナーゼ活性は、至適ｐＨが約３．５〜４．０付近であることが好ましい。至適ｐＨが約３．５〜４．０付近であるとは、ｐＨ３．５〜４．０付近でのエキソ型キシラナーゼ活性がｐＨ３及び４．５における同活性よりも高いことを意味する。
【００３２】
一実施形態において、ポリペプチドのキシロビオース転移活性を利用する際の反応液のｐＨおよび温度等の条件は、ポリペプチドが失活しない範囲であればよい。例えば、エンド型キシラナーゼ活性と同様の至適温度およびｐＨ安定性の範囲でキシロビオース転移活性の条件を採用することが好ましい。一実施形態において、キシロビオース転移活性は、至適ｐＨが約３付近であることが好ましい。至適ｐＨが約３付近であるとは、ｐＨ３でのキシロビオース転移活性がｐＨ２及び４における同活性よりも高いことを意味する。
【００３３】
上述のポリペプチドは、後述するポリヌクレオチドを利用して、遺伝子工学的な手法で製造することができる。同ポリペプチドは、配列番号１又は９に示されるアミノ酸配列の情報に基づいて、一般的なタンパク質の化学合成法（例えば、液相法及び固相法）を用いて製造することも可能である。
【００３４】
２．ポリヌクレオチド
上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列は特に制限されない。一実施形態において、ポリヌクレオチドの塩基配列は、配列番号２の塩基配列と一定以上の同一性を有することが好ましい。一定以上の同一性とは、例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。一実施形態においてポリヌクレオチドはＤＮＡであることが好ましい。
【００３５】
塩基配列の同一性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、ＳＳＥＡＲＣＨ等のソフトウェアを用いて計算される。具体的には、ＢＬＡＳＴ検索に一般的に用いられる主な初期条件は、以下の通りである。即ち、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ２．１において、プログラムにｂｌａｓｔｎを用い、各種パラメータはデフォルト値に設定して検索を行うことにより、ヌクレオチド配列の相同性の値（%）を算出することができる。
【００３６】
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、単離された状態で存在するＤＮＡであることが好ましい。ここで「単離されたＤＮＡ」とは、天然状態において共存するその他の核酸やタンパク質等の成分から分離された状態であることをいう。但し、天然状態において隣接する核酸配列（例えばプロモーター領域の配列やターミネーター配列など）など一部の他の核酸成分を含んでいてもよい。ｃＤＮＡ分子など遺伝子工学的手法によって調製されるＤＮＡの場合の「単離された」状態は、好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない。同様に、化学合成によって調製されるＤＮＡの場合の「単離されたＤＮＡ」は、好ましくは、ｄＮＴＰなどの前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まないこと。
【００３７】
ポリヌクレオチドは、配列番号２の塩基配列に基づいて、化学的なＤＮＡの合成法（例えば、フォスフォアミダイト法）や遺伝子工学的手法を用いて容易に取得することができる。
【００３８】
３．ベクター
ベクターは、上記ポリヌクレオチドを発現可能な様式で含むことが好ましい。ベクターの種類は、宿主細胞の種類を考慮して適宜選択することができる。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）等を挙げることができる。
【００３９】
大腸菌で発現可能なベクターとしては、例えば、pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218、pQE、及びpET等を挙げることができる。酵母で発現可能なベクターとしては、例えば、pBR322、pJDB207、pSH15、pSH19、pYepSec1、pMFa、pYES2、pHIL、pPIC、pAO815、及びpPink等を挙げることが出来る。昆虫で発現可能なベクターとしては、例えば、pAc、pVL、及びpFastbac等を挙げることが出来る。
【００４０】
宿主細胞として真核細胞を使用する場合は、発現ベクターとして、発現しようとするポリヌクレオチドの上流にプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列等を保有するものを使用することができ、更に必要により複製起点、エンハンサー、及び／又は選択マーカーを有していてもよい。
【００４１】
４．形質転換体
形質転換体は、上記ベクターで形質転換されているものが好ましい。形質転換体中において、ベクターは、宿主細胞中において自律的に存在してもゲノム中に相同組換え的または非相同組換え的に組み込まれて存在してもよい。形質転換に使用する宿主細胞は、上記ポリペプチドを産生できる限り特に制限されず、原核細胞及び真核細胞のいずれでもよい。具体的には、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌（例えば、HB101、MC1061、JM109、CJ236、MV1184等）、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネ型細菌、ストレプトミセス属細菌等の放線菌、バチルス・サブチリス等のバチルス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、スタフィロコッカス属細菌等の原核細胞；サッカロミセス属、ピシア属及びクルイベロマイセス属等の酵母、アスペルギルス属、ペニシリウム属、タラロマイセス属、トリコデルマ属、ハイポクレア属及びアクレモニウム属等の真菌細胞；ドロソフィラS2、スポドプテラSf9、カイコ培養細胞等の昆虫細胞；並びに植物細胞等を挙げることができる。枯草菌、酵母、真菌、放線菌等のタンパク質分泌能を利用して、ポリペプチドを培地中に生産させることもできる。一実施形態において好ましい宿主細胞は、タラロマイセス属菌であり、より好ましくはタラロマイセス・セルロリティカス（例えば、ウラシル要求性株）である。
【００４２】
組換え発現ベクターの宿主細胞内への導入方法は、従来の慣用的に用いられている方法により行うことができる。例えば、コンピテントセル法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポソーム融合法等の種々の方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
形質転換体は、ポリペプチドを産生可能であるため、ポリペプチドを製造するために用いることが可能であり、また形質転換体の状態で、キシランを含む試料からキシロース及び／又はキシロオリゴ糖を製造するために使用することもできる。
【００４４】
５．形質転換体を用いたポリペプチドの製造方法
上記形質転換体を培養し、培養物からエンド型キシラナーゼ活性及び／又は上述の他の特性を有するポリペプチドを回収することにより、上述のポリペプチドを製造することができる。培養は、宿主に適した培地を用いて継代培養又はバッチ培養を行うことができる。また、培養は、形質転換体の内外に生産されたポリペプチドの活性を指標にして、適当量得られるまで実施することができる。
【００４５】
培地としては、宿主細胞の種類に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。例えば、大腸菌の培養にはＬＢ培地などの栄養培地や、Ｍ９培地などの最少培地に炭素源、窒素源、ビタミン源等を添加した培地を用いることができる。
【００４６】
培養条件は宿主の種類に応じて適宜設定することができる。通常、１６〜４２℃、好ましくは２５〜３７℃で５〜１６８時間、好ましくは８〜１２０時間培養される。宿主に依存して、振盪培養と静置培養のいずれも可能であるが、必要に応じて攪拌及び／又は通気を行ってもよい。遺伝子発現のために誘導型プロモーターを用いる場合は、培地にプロモーター誘導剤を添加して培養を行うこともできる。
【００４７】
培養上清からのポリペプチドの精製又は単離は、公知の手法を適宜組み合わせて行うことができる。例えば、硫酸アンモニウム沈殿、エタノール等の溶媒沈殿、透析、限外濾過、酸抽出、及び各種クロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等）等を用いた手法が挙げられる。アフィニティークロマトグラフィーに用いる担体としては、例えば、ポリペプチドに対する抗体を結合させた担体や、ポリペプチドにペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合した担体を利用することもできる。
【００４８】
ポリペプチドが宿主の細胞内に蓄積される場合は、形質転換細胞を破砕し、破砕物の遠心上清から上記と同様にしてポリペプチドを精製又は単離することができる。例えば、培養終了後、遠心により集菌した菌体を菌体破砕用バッファー（２０〜１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、超音波破砕し、破砕処理液を１００００〜１５０００ｒｐｍで１０〜１５分間遠心して上清を得ることができる。遠心後の沈殿は、必要に応じて塩酸グアニジウム又は尿素などで可溶化したのち更に精製することもできる。
【００４９】
６．ポリペプチドを用いたキシロオリゴ糖の製造方法
エンド型キシラナーゼ活性を有するポリペプチドをキシランを含む試料（例えば、バイオマス資源）に接触させることにより、キシランを分解し、酸性キシロオリゴ糖（例えば、４−Ｏ−メチルグルクロン酸側鎖を一つ含みキシロース残基数が２〜１０であるキシロース主鎖を有するキシロオリゴ糖）を含む糖液を製造することができる。上述のエンド型キシラナーゼ活性は、４−Ｏ−メチルグルクロン酸側鎖に対する基質特異性が高く、キシランから酸性キシロオリゴ糖を高濃度で含有する糖液の生産が可能である。
【００５０】
さらにエキソ型キシラナーゼ活性ならびに糖転移活性を有するポリペプチドを４−Ｏ−メチルグルクロン酸側鎖をほとんど含まないキシランを含む試料に接触させることにより、キシランを分解し、中性キシロオリゴ糖（例えば、キシロビオースおよびその糖転移物としてのキシロテトラオースならびにキシロヘキサオース）を含む糖液を製造することができる。
【００５１】
上述のポリペプチドに加えて、他のセルラーゼ等の酵素を併用し、より効率的に酸性ならびに中性キシロオリゴ糖を高濃度で含有する糖液を製造することが好ましい。
【００５２】
キシランを含む試料の種類は、ポリペプチドによって分解可能である限り特に制限されないが、例えば、バガス、木材、ふすま、麦わら、稲わら、イネ科もしくはマメ科等の牧草、コーンコブ、ササ、パルプ、もみがら、小麦フスマ、大豆粕、大豆オカラ、コーヒー粕、コメ糠等を挙げることができる。
【００５３】
キシランを含む試料からキシロオリゴ糖を含む糖液を製造する方法は、公知の手法に従って行うことができる。利用するバイオマス資源は、乾燥物でも、湿潤物でもよいが、処理効率を高めるために予め１００〜１００００μｍサイズに粉砕されていることが好ましい。粉砕はボールミル、振動ミル、カッターミル、ハンマーミル等の装置を用いて行うことができる。そして、粉砕したバイオマス資源は、水、蒸気もしくはアルカリ溶液などに浸漬して６０〜２００℃の間で高温処理もしくは高温高圧処理を施して、酵素処理効率をさらに高めることもできる。例えば、アルカリ処理は、苛性ソーダやアンモニア等を用いて行うことができる。このような前処理がされたバイオマス試料を水性媒体中に懸濁し、ポリペプチドと他のセルラーゼを加え、攪拌しながら加温して、バイオマス資源を分解または糖化し、キシロオリゴ糖を含む糖液を得ることができる。
【００５４】
ポリペプチドを水溶液中でキシランを含む試料に接触させる場合は、反応液のｐＨおよび温度等の条件は、ポリペプチドが失活しない範囲であればよい。例えば、上述の至適温度及び至適ｐＨ付近の条件を採用することが効率的に試料を分解し、糖液を得るという観点から好ましい。
【００５５】
キシロース及び／又はキシロオリゴ糖を含有する糖液は、そのまま利用しても良く、水分を除去して乾燥物として使用しても良く、目的に応じて、更に化学反応又は酵素反応によって異性化又は分解することも可能である。糖液又はその分画物は、例えば、発酵法によりメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ブタンジオール等のアルコールの原料として使用することができる。
【００５６】
７．ポリペプチドを含む組成物
組成物は、上記ポリペプチドを含むことが好ましい。そのような組成物は、キシランから効率的にキシロオリゴ糖を生産するために使用することができる。また、組成物は、ポリペプチドに加えて、任意の他の物質を含みえる。他の物質は、例えば、他の酵素であってもよい。他の酵素としては、例えば、セルラーゼ、プロテアーゼ、ガラクタナーゼ、アラビナナーゼ、マンナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ガラクツロン酸リアーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、α−アラビノフラノシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−キシロシダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、及びフェルラ酸エステラーゼからなる群より選択される一種以上であり得る。これらの他の酵素の一種以上との組み合わせでポリペプチドを含むことにより、効率的にバイオマスからキシロオリゴ糖を得ることができる。
【００５７】
組成物に含まれる他の物質は上述のキシランを含む試料（例えば、リグノセルロース）であってもよい。上記ポリペプチド及びキシランを含む試料を含む組成物は、家畜などの飼料として有用である。
【００５８】
８．糖転移物の製造方法
上述のキシロビオース転移活性を有するポリペプチドを用いて、糖転移物を製造することができる。例えば、糖供与体となるキシロオリゴ糖及び／又はキシラン並びに糖受容体にポリペプチドを作用させることにより、糖供与体からキシロビオースを切り取り、それを糖受容体に転移（付加）し、種々の糖転移物を製造することができる。糖転移物は、キシロビオースの還元末端に糖受容体がＯ−グリコシド結合した構造を有することが好ましい。糖供与体及び糖受容体の種類は特に制限されず、例えば、上述したものを利用できる。反応条件は、ポリペプチドによる糖転移活性が発揮される限り特に制限されない。反応液のｐＨおよび温度等の条件は、ポリペプチドが失活しない範囲であればよい。例えば、上述のエンド型キシラナーゼ活性の至適温度及びｐＨ安定性の範囲で糖転移活性の条件を採用することは、効率的に糖転移物を提供できるという観点から好ましい。一実施形態において、糖転移活性は、至適ｐＨが約３．０であることが好ましい。至適ｐＨが約３．０であるとは、ｐＨ３．０での糖転移活性がｐＨ２及び４における同活性よりも高いことを意味する。よって、一実施形態において糖転移活性を利用する際の反応液のｐＨは約３であることが好ましい。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
【００６０】
１．ＧＨ３０タンパク質遺伝子の同定
タラロマイセス・セルロリティカスＣＦ−２６１２株を特開２００８−２７１９２７に記載の方法に基づき、セルロースパウダーの代わりに広葉樹Ｂｉｒｃｈｗｏｏｄキシランを炭素源として培養した。培養液を遠心し、上澄み液を得た。上澄み液中には種々のセルラーゼやキシラナーゼを含む糖化酵素が含まれる。酵素液中の個々の酵素を二次元ゲル電気泳動法を用いて分離、染色後、分子量約５８ｋＤａ、ｐＩ値約４．７付近に展開された染色スポットを切り出してタンパク質を抽出した。抽出されたタンパク質をトリプシン分解して得られた２種類のペプチド断片のアミノ酸配列を決定した。アミノ酸配列はＳＡＥＤＹＬＳ（配列番号３）及びＦＹＡＥＳＧＶＰＶＴＨＬ（配列番号４）であった。これらについてタラロマイセス・セルロリティカスのゲノムデータを対象に検索を行い、これらは、ＧＨ３０ファミリーの機能未知のタンパク質（Ｘｙｎ３０Ｂ）に由来することが分かった。ゲノム配列上のタンパク質遺伝子は、１４２５ｂｐであり、ストップコドンに相当する部分を除いたポリペプチドをコードする遺伝子配列１４２２ｂｐを決定した（配列番号２）。配列番号２に基づいて推定される４７４アミノ酸残基からなるＸｙｎ３０Ｂのポリペプチド配列（配列番号９）を決定した。
【００６１】
Ｘｙｎ３０Ｂの分泌シグナル配列（第１位〜第２２位）は、Ｓｉｇｎａｌ−Ｐ  Ｓｅｒｖｅｒを用いてを決定した。シグナル配列は、タンパク質の分泌生産に必要であり、菌体外へ分泌後に切断される。分泌シグナル配列を除いたタンパク質の理論上の分子量およびｐＩ値は、それぞれ４９４０２および４．５４と見積もられた。Ｘｙｎ３０Ｂのポリペプチド配列は、グルクロノキシラナーゼとして機能が明らかとなっているＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ由来のキシラナーゼＶＩ（ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２０１４，  ２８１  （１７）：３８９４−３９０３．）のポリペプチド配列と３８％の同一性を示した。キシラナーゼＶＩとの比較から、Ｘｙｎ３０Ｂは、触媒作用に必須な２つのグルタミン酸残基（第２０２位、第２９７位）が保存されていることが判明した。
【００６２】
２．ＧＨ３０タンパク質の発現と精製
Ｘｙｎ３０Ｂ遺伝子のＮ末端配列およびＣ末端配列がコードされる遺伝子配列から、以下の２種類のオリゴヌクレオチドプライマー（プライマー１、プライマー２）を作成した。
プライマー１：ＡＴＴＧＴＴＡＡＣＡＧＡＡＴＧＧＴＧＴＴＣＡＧＣＡＡＡＧＴＣＧＣＣＧ（配列番号５）
プライマー２：ＡＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＡＣＴＣＧＣＡＣＴＣＴＧＴＡＡＣＡＡＡＧＣＴＴＧ（配列番号６）
【００６３】
タラロマイセス・セルロリティカスＣＦ−２６１２株のゲノムＤＮＡを鋳型としてプライマー１および２を用いて配列番号２を含む約１．４ＫｂのＸｙｎ３０Ｂ遺伝子断片を増幅した。本遺伝子をＨｐａＩおよびＳｂｆＩで切断し、ｐＡＮＣ２０２（Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３，４０（８）：８２３−８３０）のＥｃｏＲＶ−ＳｂｆＩ間に導入し、グルコアミラーゼプロモーターの支配下にてＸｙｎ３０Ｂ遺伝子を発現させる発現プラスミドｐＡＮＣ２１５を得た。本プラスミドは、プロトプラスト−ＰＥＧ法を用いて、アクレモニウム（現タラロマイセス）・セルロリティカスのウラシル要求性ＹＰ−４株（Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３，４０（８）：８２３−８３０）の染色体に、非相同的に組み込まれた。
【００６４】
Ｘｙｎ３０Ｂ遺伝子を組み込まれた形質転換株は、文献（Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３，４０（８）：８２３−８３０）に記載されるデンプンを炭素源とする液体培地で３０℃、１２０時間しんとう培養することによって組換えＸｙｎ３０Ｂを菌体外に分泌生産した。培養液を遠心した上澄み液を用いて、Ｘｙｎ３０Ｂの精製を行った。上澄み液は、先ず２０ｍＭ  ２−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したＨｉｐｒｅｐ２６／１脱塩カラム（ＧＥヘルスケア製）で脱塩された。脱塩溶液は、同緩衝液で平衡化したＳｏｕｒｃｅ１５Ｑ陰イオン交換カラム（ＧＥヘルスケア製）に供され、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液にてグラジエント溶出された。得られた画分は、最終濃度２．０Ｍになるように硫酸アンモニウムを加えられ、２．０Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化したＳｏｕｒｃｅ１５ＩＳＯ疎水性相互作用カラム（ＧＥヘルスケア製）に供された。Ｘｙｎ３０Ｂは、硫酸アンモニウムを含まない２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）にてグラジエント溶出され、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動分析によって電気泳動的に単一であることが確認された（図１）。分子量既知のタンパク質マーカーとの泳動度の比較によって、Ｘｙｎ３０Ｂの分子量は、５３．４ｋＤａと見積もられた。得られた精製酵素画分は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で置換後に冷蔵保存された。
【００６５】
３．Ｘｙｎ３０Ｂの酵素学的諸性質
（１）基質特異性
各種基質に対するＸｙｎ３０Ｂの酵素活性を調べた。５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）に上記で得たＸｙｎ３０Ｂ及び各種基質を加え、４０℃で１５分間保温した後、遊離した還元糖濃度をＤＮＳ法によって定量した。酵素活性１Ｕは、１分間に１μｍｏｌの還元糖を遊離する酵素量と定義し、酵素１ｍｇあたりの酵素活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した（表１）。なお、酵素のタンパク質濃度の測定は、PierceTM BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher製)を用いて行った。タンパク質濃度定量用の標準物質としては、濃度既知のウシ血清アルブミン(Thermo Fisher製)を使用した。
【００６６】
【表１】
2020025468.tif 000002
【００６７】
表１に示す通り、４−Ｏ−メチルグルクロン酸側鎖を有するＢｅｅｃｈｗｏｏｄキシランおよびＢｉｒｃｈｗｏｏｄキシランに対し酵素活性が確認され、精製酵素がキシラナーゼであることが示された。しかしながら、アラビノフラノシル側鎖を有する小麦アラビノキシランに対してエンド型キシラナーゼ活性を示さなかったことから、本酵素は、４−Ｏ−メチルグルクロン酸側鎖を認識してエンド型キシラナーゼ活性を示すグルクロノキシラナーゼであることが示された。
【００６８】
（２）至適ｐＨ
Ｘｙｎ３０Ｂの至適ｐＨを調べた。ＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液にてｐＨを調整し、酵素を１０ｍｇ／ｍｌのＢｅｅｃｈｗｏｏｄキシランと共に４０℃で１５分処理後に生成した還元糖濃度を定量し、相対酵素活性を算出した。相対酵素活性とｐＨとの関係を図２に示す。図２に示されるとおり、Ｘｙｎ３０Ｂは、ｐＨ４．０付近で最大の活性を示し、約ｐＨ３．０〜５．０において最大活性の８０％以上の相対活性を有する。
【００６９】
（３）ｐＨ安定性
Ｘｙｎ３０ＢのｐＨ安定性を調べた。ＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液にてｐＨを調整し、酵素を４０℃で３０分処理後、これらを希釈し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中にて１０ｍｇ／ｍｌのＢｅｅｃｈｗｏｏｄキシランと共に４０℃で３０分処理後に生成した還元糖濃度を定量し、残存酵素活性を算出した。残存酵素活性とｐＨとの関係を図３に示す。図３に示されるとおり、本酵素はｐＨ３．０〜６．５の範囲で安定である。
【００７０】
（４）至適温度
Ｘｙｎ３０Ｂの至適温度（作用最適温度）を調べた。５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中にて１０ｍｇ／ｍｌのＢｅｅｃｈｗｏｏｄキシランを酵素と共に３５〜６０℃で１５分処理後に生成した還元糖濃度を定量し、相対酵素活性を算出した。相対酵素活性と温度との関係を図４に示す。図４から明らかなように、本酵素の至適温度は５０℃付近であり、約４０〜５５℃の範囲において高い活性を有している。
【００７１】
（５）温度安定性
Ｘｙｎ３０Ｂの熱安定性を調べた。５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中にて１ｍｇ／ｍｌの酵素を３５〜６０℃にて３０分処理した後、これらを希釈し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中にて１０ｍｇ／ｍｌＢｅｅｃｈｗｏｏｄキシランと共に４０℃で１５分処理後に生成した還元糖濃度を定量し、残存酵素活性を算出した。残存酵素活性と温度との関係を図５に示す。図５から明らかなように、本酵素は、４５℃以下の範囲で安定である。熱処理の時間を２４時間まで延長した場合、本酵素は４０℃以下の範囲で安定であり、４５℃処理においては８５％以上の残存活性を有していた。
【００７２】
４．Ｘｙｎ３０ＢによるＢｅｅｃｈｗｏｏｄキシランからの酸性キシロオリゴ糖製造
１０ｍｇ／ｍｌのＢｅｅｃｈｗｏｏｄキシランに対し、基質１gあたり０．５ｍｇのＸｙｎ３０Ｂを混合し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中にて４５℃で３時間処理した後、９９℃で５分間インキュベートすることにより反応を停止した。反応液中に含まれるオリゴ糖をパルスアンペロメトリ検出器と陰イオン交換法を組合せたＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法並びにamaZon SL-STT2（Bruker社）を用いるエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ(-)−ＭＳ）によって分析した（図６、図７）。図６中に示されるように、中性キシロオリゴ糖はほとんど生産されずに、実質的に酸性キシロオリゴ糖のみが生産されていた。図７中では、４−Ｏ−メチルグルクロン酸側鎖を１つ持つ酸性キシロオリゴ糖の構造を、キシロースの重合度をｎとしてＭｅＧｌｃＡ−Ｘｙｌｎと表す。図７に示されるように、ｎ＝２〜１０で４−Ｏ−メチルグルクロン酸側鎖を１つ持つ酸性キシロオリゴ糖が特異的に生成されることが分かった。さらに、逐次的ＥＳＩ−マルチステージ質量分析（ＥＳＩ(-)−ＭＳn;n=3）により、生成した酸性キシロオリゴ糖は、キシロース主鎖の還元末端から２番目のキシロース残基に４−Ｏ−メチルグルクロン酸側鎖をもつことが見出され、図１４に示すようなエンド型キシラナーゼ活性により、酸性キシロオリゴ糖を生産することが分かった。
【００７３】
５．Ｘｙｎ３０Ｂによるキシランからの中性キシロオリゴ糖製造
１０ｍｇ／ｍｌのＢｅｅｃｈｗｏｏｄキシランに対し、基質１ｇあたり１０  ｍｇのＸｙｎ３０Ｂを混合し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中にて４０℃で１、６、１２時間処理した後、それぞれ９９℃で５分間インキュベートすることにより反応を停止した。反応液中に含まれる中性オリゴ糖をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法によって定量した（図８）。定量に用いる標準物質としては、キシロース、キシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオース、キシロペンタオース、並びにキシロヘキサオース（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）を用いた。ＢｅｅｃｈｗｏｏｄキシランにＸｙｎ３０Ｂを作用させると、上記４の試験で示したように、酸性キシロオリゴ糖が優先的に生成されるが、本実施例においては酵素量を上記４の試験の２０倍量添加したことにより、キシロビオース、キシロテトラオース、キシロヘキサオースを主成分とする中性オリゴ糖が観察された（図８）。また、図８から、反応開始１時間後において特にキシロビオースが優先的に生産され、キシロビオースよりも長鎖の中性キシロオリゴ糖やキシロースはほとんど生産されないことが見出された。つまり、中性キシロオリゴ糖の生成は、キシラン主鎖にランダムに作用するエンド型ではなく、キシラン主鎖の末端に作用するエキソ型キシラナーゼ活性によって生じることがわかった。一方、図６に示されるようなＢｅｅｃｈｗｏｏｄキシランのＸｙｎ３０Ｂ分解物である酸性オリゴ糖のピークは、時間とともに減少する傾向にあった。Ｘｙｎ３０Ｂ分解物である酸性オリゴ糖は、キシロース主鎖の還元末端から２番目のキシロース残基に４−Ｏ−メチルグルクロン酸側鎖をもつことから、Ｘｙｎ３０Ｂが生成する中性キシロオリゴ糖は、基質キシランならびに酸性キシロオリゴ糖の非還元末端側から主として２糖ずつ分解してキシロビオースが生じ、キシロテトラオース、キシロヘキサオースは、糖転移活性による産物であることが示唆された。
【００７４】
１０ｍｇ／ｍｌの小麦アラビノキシランに対し、基質１ｇあたり１０ｍｇのＸｙｎ３０Ｂを混合し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中にて４０℃で６時間処理した後、９９℃で５分間インキュベートすることにより反応を停止した。反応液中に含まれる中性オリゴ糖をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法によって定量した。定量に用いる標準物質としては、キシロース、キシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオース、キシロペンタオース、並びにキシロヘキサオース（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）を用いた。小麦アラビノキシランにＸｙｎ３０Ｂを作用させると、キシロビオース主成分とする中性キシロオリゴ糖（０．０１４ｍＭのキシロース、０．３８ｍＭのキシロビオース、他の中性キシロオリゴ糖は検出限界以下）が観察された。本反応もまた、上記５の試験同様にキシラン主鎖の末端に作用するエキソ型キシラナーゼ活性によって生じると考えられる。すなわち、Ｘｙｎ３０Ｂが有するエキソ型キシラナーゼ活性は、エンド型キシラナーゼ活性と異なり、キシラン側鎖に依存しないことが示された。
【００７５】
次に、Ｘｙｎ３０Ｂのエキソ型キシラナーゼ活性の至適ｐＨを調べた。ＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液にてｐＨを調整し、酵素を１０ｍｇ／ｍｌの小麦アラビノキシランと共に４０℃で６時間処理後に生成したキシロビオースの濃度をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法によって分析し、相対酵素活性を算出した。相対酵素活性とｐＨとの関係を図９に示す。図９に示されるとおり、Ｘｙｎ３０Ｂは、約ｐＨ３．５〜４．０において最大のエキソ型キシラナーゼ活性を示した。
【００７６】
６．Ｘｙｎ３０Ｂによる中性キシロオリゴ糖の分解特性
１００ｍＭのキシロビオース、１０ｍＭのキシロトリオース、又は１０ｍＭのキシロテトラオースに対し、０．１ｍｇ／ｍｌＸｙｎ３０Ｂを混合し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中にて４０℃で３０分間処理した後、９９℃で５分間インキュベートすることにより反応を停止した。反応液中に含まれる中性オリゴ糖をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法によって分析した。その結果、キシロビオースは全く分解されず、基質よりも重合度が高いオリゴ糖も生成されなかった。キシロトリオースおよびキシロテトラオースを基質にした際のキシロオリゴ糖の生成量を表２に示す。表２に示されるように、キシロトリオースを基質とした場合、酵素処理後の反応液中には、主分解産物としてキシロース１．３ｍＭ、キシロビオース１．０ｍＭが含まれていた。また、キシロテトラオースを基質とした場合、酵素処理後の反応液中には、主分解産物として、キシロビオース３．２ｍＭが含まれていた。この結果から、Ｘｙｎ３０Ｂは中性キシロオリゴ糖を２糖（キシロビオース）単位で分解することが分かった。さらに、キシロトリオースを基質とした場合、酵素処理後の反応液中には、基質よりも２残基分伸長されたキシロペンタオースが有意に生成されていた。キシロテトラオースを基質とした場合、酵素処理後の反応液中には、基質よりも２残基分伸長されたキシロヘキサオースが有意に生成されていた。この結果から、Ｘｙｎ３０Ｂは、中性キシロオリゴ糖をキシロビオース単位で分解する過程において、反応中に生成したキシロビオースをキシロトリオースならびにキシロテトラオースに転移させる活性も有することが示された。
【００７７】
【表２】
2020025468.tif 000003
「Ｘ１」はキシロース、「Ｘ２」はキシロビオース、「Ｘ３」キシロトリオース、「Ｘ４」はキシロテトラオース、「Ｘ５」はキシロペンタオース、「Ｘ６」はキシロヘキサオースを示す。
【００７８】
７．Ｘｙｎ３０Ｂのキシロビオース転移反応に関する至適ｐＨ
Ｘｙｎ３０Ｂのキシロビオース転移反応について、至適反応ｐＨを調べた。１０ｍＭのキシロトリオース、５０ｍＭのキシロビオース、並びに０．１ｍｇ／ｍｌのＸｙｎ３０Ｂを混合し、ＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液にてｐＨを調整した反応液について、４０℃で１時間処理した後、９９℃で５分間インキュベートすることにより反応を停止した。反応液中に含まれるキシロトリオースを糖供与体、キシロビオースを糖受容体として生成したと考えられるキシロテトラオースの濃度をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法によって分析し、相対酵素活性を算出した。相対酵素活性とｐＨとの関係を図１０に示す。図１０に示されるとおり、Ｘｙｎ３０Ｂは、ｐＨ３．０付近で最大の糖転移活性を示した。
【００７９】
８．Ｂｅｅｃｈｗｏｏｄキシランを供与体としたＸｙｎ３０Ｂの糖転移反応によるキシロオリゴ糖製造
１０ｍｇ／ｍｌのＢｅｅｃｈｗｏｏｄキシラン、または１０ｍｇ／ｍｌのＢｅｅｃｈｗｏｏｄキシランに１００ｍＭのキシロースを加えた混合物、または１０ｍｇ／ｍｌのＢｅｅｃｈｗｏｏｄキシランに１００ｍＭのキシロビオースを加えた混合物を基質とした３条件について、Ｂｅｅｃｈｗｏｏｄキシラン１ｇあたり１０ｍｇのＸｙｎ３０Ｂを混合し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中にて４０℃で１２時間処理した後、９９℃で５分間インキュベートすることにより反応を停止した。上記５の試験と同様の方法で、各反応液中に含まれる中性オリゴ糖を定量した（表３）。
【００８０】
【表３】
2020025468.tif 000004
「Ｘ１」はキシロース、「Ｘ２」はキシロビオース、「Ｘ３」キシロトリオース、「Ｘ４」はキシロテトラオース、「Ｘ５」はキシロペンタオース、「Ｘ６」はキシロヘキサオースを示す。
「−」は添加した過剰量が存在することを示す。
「ＮＤ」は検出限界以下であることを示す。
【００８１】
表３に示されるように、１００ｍＭキシロースを加えた条件では、キシロースを加えなかった条件と比較してキシロトリオースの生成量が２．６ｍＭまで増加し、キシロトリオースの生成量が４２倍増加した。キシロトリオースの増加は、Ｘｙｎ３０Ｂの転移反応によって、供与体基質であるＢｅｅｃｈｗｏｏｄキシランに由来するキシロビオースが、受容体基質（キシロース）に転移されたことによると考えられる。さらに、同反応においては、キシロペンタオースの量（０．２７ｍＭ）も７．８倍増加した。この現象は、転移反応で生成されたキシロトリオースに、キシロビオースが転移されためと考えられる。また、表２に示されるように、１００ｍＭキシロビオースを加えた条件では、キシロビオースを加えなかった条件と比較してキシロテトラオースの生成量が３．８ｍＭまで増加し、キシロテトラオースの生成量を１１倍増加させることに成功した。キシロテトラオースの増加は、Ｘｙｎ３０Ｂの転移反応によって、供与体基質であるＢｅｅｃｈｗｏｏｄキシランに由来するキシロビオースが、受容体基質（キシロビオース）に転移されたためと考えられる。
【００８２】
上記５、６、７、８の試験結果から、Ｘｙｎ３０Ｂによって転移されるキシロビオースは、酸性キシロオリゴ糖並びにキシランの非還元末端側のキシロビオースに由来し、系外から加えたキシロビオースは、糖供与体基質として作用しないことが分かる。従って、Ｘｙｎ３０Ｂによる転移反応は、連続した２段階の反応からなる。すなわち、１段目の加水分解反応においてキシラン基質が分解され、その分解過程でキシロビオースが生じ、２段目の転移反応において糖受容体基質に転移される。
【００８３】
９．Ｘｙｎ３０Ｂの糖転移反応によるヘテロオリゴ糖製造
１０ｍｇ／ｍｌのＢｅｅｃｈｗｏｏｄキシランに１００ｍＭのグルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、アラビノース、スクロース、ラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、又はキシリトールの糖類を加え、０．１ｍｇ／ｍｌのＸｙｎ３０Ｂを混合し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中にて４０℃で１２時間処理した後、９９℃で５分間インキュベートすることにより反応を停止した。コントロールとして、Ｂｅｅｃｈｗｏｏｄキシランに糖類を加えずに同反応を行った。反応液をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法によって分析したところ、いずれの糖類を添加した場合も、Ｂｅｅｃｈｗｏｏｄキシランのみを基質とした条件では確認されなかった生成物の存在が確認された（図１１、矢印）。Ｂｅｅｃｈｗｏｏｄキシランを糖供与体としたＸｙｎ３０Ｂの糖転移反応によって各種糖類にキシロビオースが付加されたと考えられる。
【００８４】
１０．Ｘｙｎ３０Ｂの結晶化
精製されたＸｙｎ３０Ｂを用いて、次の手順で結晶化を行った。Ｘｙｎ３０Ｂの濃度が３０ｍｇ／ｍｌとなるように濃縮し、ポアサイズ０．２０μｍの限外ろ過膜を通して得たろ液をサンプル溶液とした。２００ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭトリス塩酸ｐＨ８．０、３０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール４０００から成るリザーバー溶液（母液）を調製した。公知のハンギングドロップ蒸気拡散法に従い、まず前記のリザーバー溶液を、細胞培養プレート（ＴＰＰ社、２４穴）の各穴に５００μｌずつ入れた。次に、シリコナイズ処理したカバーガラス（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）の中央に前記サンプル溶液を１μｌのせ、すぐに同量（１μｌ）の前記リザーバー溶液を加え、蛋白質溶液とした。最後にカバーグラスを静かに反転させ、穴の上に載せ、グリースにより密閉した。２０℃で３日間以上静置することにより結晶を析出させた（ＲＯＣＫ  ＩＭＡＧＥＲ（ＦＯＲＭＵＬＡＴＲＩＸ社）を使用して撮影；図１２）。
【００８５】
１１．Ｘｙｎ３０Bの立体構造解析
上記結晶についてＸ線回折測定を行った。回折強度データを収集するためのＸ線の発生器には、理化学研究所播磨ＳＰｒｉｎg−８の放射光を用い、また検出器としては、ＥＩＧＥＲ  Ｘ  １６Ｍ（Ｄｅｃｔｒｉｓ社）を使用した。Ｘｙｎ３０Ｂの結晶を、終濃度が３０％（ｖ／ｖ）となるようにグリセリンを添加した前記リザーバー溶液に浸した後、液体窒素で凍結後、Ｘ線回折実験に使用した。Ｘ線の波長は０．９０Åとし、温度は１００ＫでＸ線回折強度データの収集を行った。得られたＸ線回折強度データの処理はプログラム・プロセス（ＸＤＳ）を用いて行った。得られた結晶学的パラメーターは、次のとおりである：Ｘｙｎ３０Ｂの結晶の属する晶系は、斜方晶系であり、空間群はＰ２１２１２１であり、格子定数は格子定数がａ＝８３．２Å、ｂ＝１１４．９Å、ｃ＝１１８．５Åであり、α＝β＝γ＝９０°である。また計算によって導き出される結晶の溶媒含有率は５３．６％であり、非対称単位中にＸｙｎ３０Ｂ分子を２分子含むものと推定された。また、Ｘ線回折強度データの分解能は２．２５Åであり、側鎖の向きも含めた三次元構造の決定が可能なレベルにあった。
【００８６】
Ｘ線回折強度データに基づき、該結晶を構成する分子の電子密度図を導き出すため、分子置換法によって位相を決定した。 得られた初期位相から、プログラムＡｕｔｏｂｕｉｌｄを用いて自動でモデルを改良した後、プログラムｃｏｏｔを用いて手動でモデリングしてＸｙｎ３０Ｂ  ２分子の三次元構造の構築を行った。構築したモデルは、プログラムＰｈｅｎｉｘ．ｒｅｆｉｎｅとＲｅｆｍａｃ５を用いてさらに精密化した。そしてＲｅｆｍａｃによる精密化とプログラムｃｏｏｔを用いた修正作業とを駆使して、構造の修正を繰り返した。精密化の指標となるＲ因子並びにＦｒｅｅ  Ｒ因子の値は１５．９６％並びに２０．０６％まで下がった。このようにして得られたＸｙｎ３０Ｂの三次元構造のモデルを図１３に示す。
【００８７】
上記三次元構造から、Ｘｙｎ３０Ｂの活性中心の構造を正確に知ることができる。グルクロノキシランのメチルグルクロン酸認識部位に（配列番号１のアミノ酸配列における）第２４位のアルギニンの側鎖が配置していることが分かった。本アルギニン残基が、糸状菌のＧＨ３０グルクロノキシラナーゼにおけるメチルグルクロン酸の認識に寄与することが判明した。また、触媒グルタミン酸残基（第１８０位、第２７５位）から二糖分ほど離れた位置にある残基番号６８−７２のループ構造がキシランのキシロビオース単位での分解と転移に関わると考えられる。本ループ構造は、既知のＧＨ３０酵素の一次構造には保存されておらず、Ｘｙｎ３０Ｂに特徴的なものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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