(57)【要約】本発明の目的は、特定の化学物質を高感度かつ高精度に検出することである。特定の脂質二重膜を利用することにより、化学物質が高感度かつ高精度に検出される。ここで、前記特定の脂質二重膜は、化学物質の受容体、キメラＧタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備する。前記キメラＧタンパク質は、キメラＧαサブユニットおよびＧβγサブユニット複合体を具備し、前記キメラＧαサブユニットは、Ｇｉ／ｏｌｆ１３（配列番号：０４）、Ｇｉ／ｏｌｆ２８（配列番号：０５）、Ｇｉ／ｏｌｆ９４（配列番号：０７）、Ｇｉ／ｏｌｆ１１３（配列番号：０８）、Ｇｉ／ｏｌｆα３−β５，Ｃ（配列番号：１２）、またはＧｉ／ｏｌｆα４−β６，Ｃ（配列番号：１５）からなる群より選択される。
2012042684.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質二重膜の表側から裏側にカリウムイオンを輸送する方法であって、以下の工程（ａ）および工程（ｂ）を具備する：
前記脂質二重膜を用意する工程（ａ）
ここで、前記脂質二重膜は、化学物質の受容体、Ｇタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備し、
前記Ｇタンパク質は、キメラＧαサブユニット、およびＧβγサブユニット複合体を具備し、
前記キメラＧαサブユニットは、Ｇｉ／ｏｌｆ１３（配列番号：０４）、Ｇｉ／ｏｌｆ２８（配列番号：０５）、Ｇｉ／ｏｌｆ９４（配列番号：０７）、Ｇｉ／ｏｌｆ１１３（配列番号：０８）、Ｇｉ／ｏｌｆα３−β５，Ｃ（配列番号：１２）、またはＧｉ／ｏｌｆα４−β６，Ｃ（配列番号：１５）のいずれかからなり、および
前記化学物質および前記カリウムイオンを前記表側から供給し、前記キメラＧαサブユニットおよび前記Ｇβγサブユニット複合体の放出、および前記Ｇβγサブユニット複合体の前記カリウムイオンチャネルへの結合により、前記表側から前記裏側に前記カリウムイオンを輸送する工程（ｂ）。
【請求項２】
前記化学物質が、アドレナリン受容体作動薬である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カリウムイオンチャネルが、Ｇタンパク質共役型内向き整流カリウムイオンチャネルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
化学物質を検出又は定量する方法であって以下の工程（ｃ）〜（ｅ）を具備する：
脂質二重膜、前記脂質二重膜の表側に位置する第１液体、および前記脂質二重膜の裏側に位置する第２液体を用意する工程（ｃ）、
ここで、前記脂質二重膜は、化学物質の受容体、Ｇタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備し、
前記Ｇタンパク質は、キメラＧαサブユニット、およびＧβγサブユニット複合体を具備し、
前記キメラＧαサブユニットは、Ｇｉ／ｏｌｆ１３（配列番号：０４）、Ｇｉ／ｏｌｆ２８（配列番号：０５）、Ｇｉ／ｏｌｆ９４（配列番号：０７）、Ｇｉ／ｏｌｆ１１３（配列番号：０８）、Ｇｉ／ｏｌｆα３−β５，Ｃ（配列番号：１２）、またはＧｉ／ｏｌｆα４−β６，Ｃ（配列番号：１５）のいずれかからなり、
前記第１液体はカリウムイオンを含有し、
前記第１液体に前記化学物質を供給する工程（ｄ）、および
前記第１および第２液体の少なくともいずれか一方のカリウムイオンの量を測定し、前記カリウムイオンの量に基づいて前記化学物質を検出又は定量する工程（ｅ）。
【請求項５】
前記化学物質が、アドレナリン受容体作動薬である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記カリウムイオンチャネルが、Ｇタンパク質共役型内向き整流カリウムイオンチャネルである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
化学物質を検出または定量する方法であって、以下の工程（ｆ）〜（ｈ）を具備する：
脂質二重膜を用意する工程（ｆ）、
ここで、前記脂質二重膜は、化学物質の受容体、Ｇタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備し、
前記Ｇタンパク質は、キメラＧαサブユニットおよび前記Ｇβγサブユニット複合体を具備し、
前記キメラＧαサブユニットは、Ｇｉ／ｏｌｆ１３（配列番号：０４）、Ｇｉ／ｏｌｆ２８（配列番号：０５）、Ｇｉ／ｏｌｆ９４（配列番号：０７）、Ｇｉ／ｏｌｆ１１３（配列番号：０８）、Ｇｉ／ｏｌｆα３−β５，Ｃ（配列番号：１２）、またはＧｉ／ｏｌｆα４−β６，Ｃ（配列番号：１５）のいずれかからなり、
前記脂質二重膜の表側および裏側にそれぞれ位置する第１および第２液体を供給し、前記第１および第２液体の間に前記脂質二重膜を挟む工程（ｇ）、
ここで、前記第１液体はカリウムイオンおよび化学物質を含有し、および
前記第１および第２液体の少なくともいずれか一方のカリウムイオンの量を測定し、前記カリウムイオンの量に基づいて前記化学物質を検出または定量する工程（ｈ）。
【請求項８】
前記化学物質が、アドレナリン受容体作動薬である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記カリウムイオンチャネルが、Ｇタンパク質共役型内向き整流イオンチャネルである、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質二重膜の表側から裏側にカリウムイオンを輸送する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の脂質二重膜に存在するＧタンパク質結合型受容体（G protein-coupled receptor)（以下、場合により『ＧＰＣＲ』と称される。）は、細胞の脂質二重膜に存在するＧタンパク質と連動して機能する。図１に示されるように、神経伝達物質のような化学物質がＧＰＣＲに結合すると、細胞内においてＧＣＰＲと共役している三量体Ｇタンパク質が活性化され、Ｇαサブユニットと、ＧβサブユニットおよびＧγサブユニットからなる二量体（以下、場合により『Ｇβγサブユニット複合体』と称される。）とに解離する。それらは各々、種々のシグナルを伝達する。【０００３】
図２に示されるように、Ｇβγサブユニット複合体のＧタンパク質共役型内向整流カリウムイオンチャネル（G protein-coupled inwardly rectifying potassium channel）（以下、場合により『ＧＩＲＫ』と称される。）への結合は、ＧＩＲＫのゲートが開放することをもたらす。ＧＩＲＫのゲートが開放されると、脂質二重膜の表側に存在するカリウムイオンが当該ゲートを通って脂質二重膜の裏側へ移動する。当該カリウムイオンの移動は、イオン電流測定法を使用することにより検出又は定量され得る。【０００４】
ＧαサブユニットがキメラＧαサブユニットであると、場合によってはカリウムイオンはより効率的に表側から裏側へと移動する。キメラＧαサブユニットを具備するＧタンパク質が発現した脂質二重膜を、化学物質センサーとして使用することが提案されている。【０００５】
下記の非特許文献１〜６は、本発明に関連する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Gloriam D., Fredriksson R., Schioth H., (2007) “The Gprotein-coupled receptor subset of the rat genome” BMC Genomics 8, 338 - 405
【非特許文献２】Oldham, W. M. and H. E. Hamm (2008).“HeterotrimericG protein activation by G-protein-coupled receptors.”Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 9, 60-71.
【非特許文献３】Kim W. Chan, Jin-Liang Sui, Michel Vivaudou, and Diomedes E.Logothetis , (1996) “Control of channel activity through a unique amino acid residueof a G protein-gated inwardly rectifying K+ channel subunit” Proc. Natl. Acad.Sci., 93, 14193 - 14198
【非特許文献４】Gregory J. Digby, Pooja R. Sethi, and Nevin A. Lambert , (2008),“Differential dissociation of G protein heterotrimers” J. Physiol, 586, 3325 -3335
【非特許文献５】Thomsen W., Frazer J., Unett D., (2005), “Functional assays forscreening GPCR targets” Curr. Opin. Biotech.,16, 655 - 665
【非特許文献６】Leaney J.L., Milligan G., Tinker A., (2000) “The G Protein a SubunitHas a Key Role in Determining the Specificity of Coupling to, but Not theActivation of, G Protein-gated Inwardly Rectifying K1 Channels” J. Biol. Chem.,275, 921 - 929
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、より高感度に化学物質に応答する、脂質二重膜の表側から裏側にカリウムイオンを輸送する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、特定のキメラＧαサブユニットを具備するキメラＧタンパク質が上記課題を解決することを見いだし、本発明を完成した。【０００９】
すなわち、本発明は下記項目１〜９を提供する。【００１０】
項目１：
脂質二重膜の表側から裏側にカリウムイオンを輸送する方法であって、以下の工程（ａ）および工程（ｂ）を具備する：
前記脂質二重膜を用意する工程（ａ）
ここで、前記脂質二重膜は、化学物質の受容体、Ｇタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備し、
前記Ｇタンパク質は、キメラＧαサブユニット、およびＧβγサブユニット複合体を具備し、
前記キメラＧαサブユニットは、Ｇｉ／ｏｌｆ１３（配列番号：０４）、Ｇｉ／ｏｌｆ２８（配列番号：０５）、Ｇｉ／ｏｌｆ９４（配列番号：０７）、Ｇｉ／ｏｌｆ１１３（配列番号：０８）、Ｇｉ／ｏｌｆα３−β５，Ｃ（配列番号：１２）、またはＧｉ／ｏｌｆ
α４−β６，Ｃ（配列番号：１５）のいずれかからなり、および
前記化学物質および前記カリウムイオンを前記表側から供給し、前記キメラＧαサブユニットおよび前記Ｇβγサブユニット複合体の放出、および前記Ｇβγサブユニット複合体の前記カリウムイオンチャネルへの結合により、前記表側から前記裏側に前記カリウムイオンを輸送する工程（ｂ）。【００１１】
項目２：
前記化学物質が、アドレナリン受容体作動薬である項目１に記載の方法。【００１２】
項目３：
前記カリウムイオンチャネルが、Ｇタンパク質共役型内向き整流カリウムイオンチャネルである、項目１に記載の方法。【００１３】
項目４：
化学物質を検出又は定量する方法であって以下の工程（ｃ）〜（ｅ）を具備する：
脂質二重膜、前記脂質二重膜の表側に位置する第１液体、および前記脂質二重膜の裏側に位置する第２液体を用意する工程（ｃ）、
ここで、前記脂質二重膜は、化学物質の受容体、Ｇタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備し、
前記Ｇタンパク質は、キメラＧαサブユニット、およびＧβγサブユニット複合体を具備し、
前記キメラＧαサブユニットは、Ｇｉ／ｏｌｆ１３（配列番号：０４）、Ｇｉ／ｏｌｆ２８（配列番号：０５）、Ｇｉ／ｏｌｆ９４（配列番号：０７）、Ｇｉ／ｏｌｆ１１３（配列番号：０８）、Ｇｉ／ｏｌｆα３−β５，Ｃ（配列番号：１２）、またはＧｉ／ｏｌｆ
α４−β６，Ｃ（配列番号：１５）のいずれかからなり、
前記第１液体はカリウムイオンを含有し、
前記第１液体に前記化学物質を供給する工程（ｄ）、および
前記第１および第２液体の少なくともいずれか一方のカリウムイオンの量を測定し、前記カリウムイオンの量に基づいて前記化学物質を検出又は定量する工程（ｅ）。【００１４】
項目５：
前記化学物質が、アドレナリン受容体作動薬である項目４に記載の方法。【００１５】
項目６：
前記カリウムイオンチャネルが、Ｇタンパク質共役型内向き整流カリウムイオンチャネルである、項目４に記載の方法。【００１６】
項目７：
化学物質を検出または定量する方法であって、以下の工程（ｆ）〜（ｈ）を具備する：
脂質二重膜を用意する工程（ｆ）、
ここで、前記脂質二重膜は、化学物質の受容体、Ｇタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備し、
前記Ｇタンパク質は、キメラＧαサブユニットおよび前記Ｇβγサブユニット複合体を具備し、
前記キメラＧαサブユニットは、Ｇｉ／ｏｌｆ１３（配列番号：０４）、Ｇｉ／ｏｌｆ２８（配列番号：０５）、Ｇｉ／ｏｌｆ９４（配列番号：０７）、Ｇｉ／ｏｌｆ１１３（配列番号：０８）、Ｇｉ／ｏｌｆα３−β５，Ｃ（配列番号：１２）、またはＧｉ／ｏｌｆα４−β６，Ｃ（配列番号：１５）のいずれかからなり、
前記脂質二重膜の表側および裏側にそれぞれ位置する第１および第２液体を供給し、前記第１および第２液体の間に前記脂質二重膜を挟む工程（ｇ）、
ここで、前記第１液体はカリウムイオンおよび化学物質を含有し、および
前記第１および第２液体の少なくともいずれか一方のカリウムイオンの量を測定し、前記カリウムイオンの量に基づいて前記化学物質を検出または定量する工程（ｈ）。【００１７】
項目８：
前記化学物質が、アドレナリン受容体作動薬である、項目７に記載の方法。【００１８】
項目９：
前記カリウムイオンチャネルが、Ｇタンパク質共役型内向き整流イオンチャネルである、項目７に記載の方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、脂質二重膜の表側から裏側に輸送されるカリウムイオンの量が増加する。これにより、高感度に標的化学物質の検出がなされる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は三量体Ｇタンパク質によるシグナル伝達を示す模式図である。
【図２】図２はＧＩＲＫの働きを利用した、化学物質センサを示す模式図である。
【図３】図３はＧタンパク質の２次元構造を示す模式図である。
【図４】図４はＧαｉの二次元構造を示す模式図である。
【図５】図５はＧαｏｌｆの二次元構造を模式的に示す。
【図６】図６はＧｉ／ｏｌｆ５の二次元構造を模式的に示す。
【図７】図７はＧｉ／ｏｌｆ１３の二次元構造を模式的に示す。
【図８】図８はＧｉ／ｏｌｆ２８の二次元構造を模式的に示す。
【図９】図９はＧｉ／ｏｌｆ４５の二次元構造を模式的に示す。
【図１０】図１０はＧｉ／ｏｌｆ９４の二次元構造を模式的に示す。
【図１１】図１１はＧｉ／ｏｌｆ１１３の二次元構造を模式的に示す。
【図１２】図１２はＧｉ／ｏｌｆ１５６の二次元構造を模式的に示す。
【図１３】図１３はＧｉ／ｏｌｆ１９５の二次元構造を模式的に示す。
【図１４】図１４はＧｉ／ｏｌｆ，α３−β５の二次元構造を模式的に示す。
【図１５】図１５はＧｉ／ｏｌｆα３−β５，Ｃの二次元構造を模式的に示す。
【図１６】図１６はＧｉ／ｏｌｆα４−β６の二次元構造を模式的に示す。
【図１７】図１７はＧｉ／ｏｌｆα３−β５，α４−β６の二次元構造を模式的に示す。
【図１８】図１８はＧｉ／ｏｌｆα４−β６，Ｃの二次元構造を模式的に示す。
【図１９】図１９はＧｉ／ｏｌｆα３−β５，α４−β６，Ｃの二次元構造を模式的に示す。
【図２０】図２０はβ１アドレナリン受容体発現プラスミドの作製方法を概念的に示す。
【図２１】図２１はＫｉｒ３．１発現プラスミドの作製方法を概念的に示す。
【図２２】図２２はＫｉｒ３．１（Ｆ１３７Ｓ）発現プラスミドの作製方法を概念的に示す。
【図２３】図２３はキメラＧタンパク質発現プラスミドの作製方法を概念的に示す。
【図２４】図２４はキメラＧタンパク質発現プラスミドの作製方法を概念的に示す。
【図２５】図２５はキメラＧタンパク質発現プラスミドの作製方法を概念的に示す。
【図２６】図２６はＧαｉ（Ｃ３５１Ｇ）タンパク質発現細胞のイオン電流を示す。
【図２７】図２７はＧｉ／ｏｌｆ１３タンパク質発現細胞のイオン電流を示す。
【図２８】図２８は野生型Ｇαｏｌｆタンパク質発現細胞のイオン電流を示す。
【図２９】図２９はキメラＧタンパク質発現細胞のイオン電流の変化を示す。
【図３０】図３０はＧタンパク質発現細胞のイオン電流の変化を示す。
【図３１】図３１はＧタンパク質発現細胞のイオン電流の変化を示す。
【図３２】図３２は本発明の構成による化学センサの、従来の化学物質検出方法に対する優位性を示す。
【図３３】図３３はキメラＧタンパク質発現細胞のカリウムイオン電流の、各種化学物質に対する濃度依存性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（用語の定義）
本明細書において用いられる用語は以下の通り定義される。
用語『脂質二重膜』は、細胞の表面を構成する膜、すなわち細胞膜を意味する。
用語『キメラＧαサブユニット』は、あるＧαタンパク質（例えば、Ｇαｉ）の特定の領域を、異なるＧαタンパク質（例えば、Ｇαｏｌｆ）の対応する領域で置換したＧαサブユニットを意味する。
用語『キメラＧタンパク質』は、αサブユニットがキメラＧαサブユニットであるＧタンパク質を意味する。
【００２２】
本発明で使用される脂質二重膜は、化学物の質受容体、キメラＧタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備する。
【００２３】
脂質二重膜を具備する細胞の一例は、ヒト由来株化細胞である。
【００２４】
（化学物質の受容体）
化学物質の受容体として、Ｇタンパク質共役型受容体が採用される。Ｇタンパク質共役型受容体には、ホルモン受容体、神経伝達物質受容体、フェロモン受容体、嗅覚受容体、および味覚受容体に加えて、種々のオーファンＧタンパク質共役型受容体が含まれる。ホルモン受容体の一例は、アドレナリン受容体である。
【００２５】
（キメラＧタンパク質）
キメラＧタンパク質は、キメラＧαサブユニットおよびＧβγサブユニット複合体を具備する。
本発明において、キメラＧαサブユニットは、Ｇｉ／ｏｌｆ１３、Ｇｉ／ｏｌｆ２８、Ｇｉ／ｏｌｆ９４、Ｇｉ／ｏｌｆ１１３、Ｇｉ／ｏｌｆα３−β５，Ｃ、およびＧｉ／ｏｌｆα４−β６，Ｃからなる群より選択される。キメラＧαサブユニットの名称中に含まれる添え字が、Ｇαｉタンパク質のアミノ酸配列が、対応するＧαｏｌｆのアミノ酸配列と置換された領域を示している。これらのキメラＧαサブユニットが用いられた場合、化学物質の接触に応答してより多量のカリウムイオンが、脂質二重膜の表側から裏側へ輸送される。各キメラＧαサブユニットのアミノ酸配列が以下に示される。
【００２６】
（Ｇｉ／ｏｌｆ１３）
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWFTDTSIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYPEYAGSNTYEEAAAYIQCQFEDLNKRKDTKEIYTHFTCATDTKNVQFVFDAVTDIIQRMHLKQYELL（配列番号：０４）
【００２７】
（Ｇｉ／ｏｌｆ２８）
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWFTDTSIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYPEYAGSNTYEEAAAYIQCQFEDLNKRKDTKEIYTHFTCAVDTENIRRVFNDCRDIIQRMHLKQYELL（配列番号：０５）
【００２８】
（Ｇｉ／ｏｌｆ９４）
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWFTDTSIILFLNKKDLFEEKVLAGKSKIEDYFPEYANYTVPEDATPDAGEDPKVTRAKFFIRDLFLRISTATGDGKHYCYPHFTCAVDTENIRRVFNDCRDIIQRMHLKQYELL（配列番号：０７）
【００２９】
（Ｇｉ／ｏｌｆ１１３）
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWLRTISIILFLNKQDMLAEKVLAGKSKIEDYFPEYANYTVPEDATPDAGEDPKVTRAKFFIRDLFLRISTATGDGKHYCYPHFTCAVDTENIRRVFNDCRDIIQRMHLKQYELL（配列番号：０８）
【００３０】
（Ｇｉ／ｏｌｆα３−β５，Ｃ）
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWLRTISIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYPEYAGSNTYEEAAAYIQCQFEDLNKRKDTKEIYTHFTCATDTKNVQFVFDAVTDIIQRMHLKQYELL（配列番号：１２）
【００３１】
（Ｇｉ／ｏｌｆα４−β６，Ｃ）
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWFTDTSIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYPEYAGSNTYEEAAAYIQCQFEDLNTATGDGKHYCYTHFTCATDTKNVQFVFDAVTDIIQRMHLKQYELL(配列番号１５）
【００３２】
図３に示されるように、Ｇαサブユニットを構成するタンパク質は、ＧＴＰアーゼドメイン（GTPase domain）と称される領域と、らせん領域（helical domain）と称される領域とを具備する。両領域は、リンカー１、リンカー２とそれぞれ称される２つのαヘリックス（α-helix）を介して互いに連結されている。ＧＴＰアーゼドメインは５本のαヘリックス、６本のβシート、およびこれらを連結するループを含む。
【００３３】
図７に示されるように、Ｇｉ／ｏｌｆ１３の二次元構造は、Ｇαｉ（Ｃ３５１Ｇ）のＣ末端から１３アミノ酸が、Ｇαｏｌｆの対応するアミノ酸で置換された構造である。
【００３４】
図８に示されるように、Ｇｉ／ｏｌｆ２８の二次元構造は、Ｇαｉ（Ｃ３５１Ｇ）のβ６−α５ループを含むＣ末端側の領域が、Ｇαｏｌｆの対応する領域で置換された構造である。
【００３５】
図１０に示されるように、Ｇｉ／ｏｌｆ９４の二次元構造は、Ｇαｉ（Ｃ３５１Ｇ）のαＧ−α４ループを含むＣ末端側の端領域が、Ｇαｏｌｆの対応する領域で置換された構造である。
【００３６】
図１１に示されるように、Ｇｉ／ｏｌｆ１１３の二次元構造は、Ｇαｉ（Ｃ３５１Ｇ）のα３−β５ループを含むＣ末端側の領域が、Ｇαｏｌｆの対応する領域で置換された構造である。
【００３７】
図１５に示されるように、Ｇｉ／ｏｌｆα３−β５，Ｃの二次元構造は、Ｇαｉ（Ｃ３５１Ｇ）のα３−β５ループ、およびα５−Ｃ末端ループが、Ｇαｏｌｆの対応するループで置換された構造である。
【００３８】
図１８に示されるように、Ｇｉ／ｏｌｆα４−β６，Ｃの二次元構造は、Ｇαｉ（Ｃ３５１Ｇ）のα３−β５ループおよびα５−Ｃ末端ループが、Ｇαｏｌｆの対応するループで置換された構造である。
【００３９】
（カリウムイオンチャネル）
カリウムイオンチャネルとしては、Ｇタンパク質共役型受容体内向き整流性カリウムチャネル（ＧＩＲＫ）が用いられる。ＧＩＲＫは、Ｋｉｒ３．１、Ｋｉｒ３．２、Ｋｉｒ３．３およびＫｉｒ３．４の４つのサブタイプに分類される。本発明において、Ｋｉｒ３．１の１３７番目のフェニルアラニンがセリンで置換された変異型Ｋｉｒ３．１（Ｆ１３７Ｓ）が好ましく用いられる。その理由が以下に記述される。サブタイプＫｉｒ３．１〜Ｋｉｒ３．４は、相異なるサブタイプとヘテロ多量体を形成する。換言すると、ＧＩＲＫは２種のサブタイプを含む。しかしながら、変異型Ｋｉｒ３．１（Ｆ１３７Ｓ）はホモ４量体を形成し、当該４量体がカリウムイオンチャネルを構成する。従って、変異型Ｋｉｒ３．１（Ｆ１３７Ｓ）を用いた場合はカリウムイオンチャネルの構成に必要とされるタンパク質の種類は１種類である。
【００４０】
化学物質の受容体、キメラＧタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備する脂質二重膜は、例えば、以下に記述される方法により調製される。化学物質の受容体をコードする発現プラスミド、キメラＧタンパク質をコードする発現プラスミド、およびカリウムイオンチャネルをコードする発現プラスミドが作製される。作製された各プラスミドが細胞に導入され、発現される。当該方法の具体的な手順は実施例で詳述される。
【００４１】
（カリウムイオンの輸送）
化学物質の受容体、キメラＧタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備する脂質二重膜の表側と裏側は、それぞれ、適宜な緩衝液に接触している。当該脂質二重膜の表側に接触する緩衝液は、カリウムイオンを濃度１〜１０００ｎＭで含有する。
【００４２】
化学物質が当該脂質二重膜の表側に供給され、化学物質の受容体と結合すると、脂質二重膜の裏側において化学物質受容体と結合しているキメラＧタンパク質が、キメラＧαサブユニットと、Ｇβγサブユニット複合体とに分割され、放出される。Ｇβγサブユニット複合体のカリウムイオンチャネルへの接触は、カリウムイオンチャネルのゲートの開放をもたらす。カリウムイオンチャネルのゲートが開放されると、カリウムイオンが脂質二重膜の表側から裏側へと輸送される。
【００４３】
（化学物質の検出又は定量）
上述の脂質二重膜の表側から裏側にカリウムイオンを輸送する方法を利用して、化学物質が検出又は定量され得る。カリウムイオンの輸送により生じたイオン電流の変化を測定し、脂質二重膜の表側に存在する化学物質が検出又は定量される。具体的には、化学物質は以下に記述されるように検出又は定量される。まず、上述の化学物質の受容体、キメラＧタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備する脂質二重膜の表側にカリウムイオンが供給される。具体的には、例えば、脂質二重膜の表側に第１液体を、裏側に第２液体を供給する。すなわち、当該脂質二重膜は、第１液体と第２液体との間に挟まれる。第１液体、および第２液体は通常、ｐＨ７付近である緩衝液である。第１液体はカリウムイオンを含有する。第２液体もカリウムイオンを含有していてもよい。
【００４４】
標的化学物質もまた、当該脂質二重膜の表側に供給される。具体的には、第１液体および第２液体との間に脂質二重膜が挟まれた状態で、第１液体に標的化学物質が供給される。標的化学物質は、化学物質の受容体に供給される。化学物質の受容体に標的化学物質が供給されることが、キメラＧタンパク質のサブユニットの放出をもたらし、脂質二重膜の表側に存在する（第１液体に含有される）カリウムイオンが、脂質二重膜の裏側（第２液体）に輸送される。カリウムイオンの輸送によって生じたイオン電流の変化が測定され、当該測定結果に基づいて化学物質が検出又は定量される。上述の化学物質の供給は、脂質二重膜の表側に最初に供給された第１液体を、化学物質を含有する以外は第１液体と同一の組成を有する溶液で置換することにより行われてもよい。
【００４５】
化学物質の定量の目的で、検量線が一般的に用いられる。
【００４６】
（化学物質）
化学物質としては、化学物質の受容体の作動薬として機能しうる化学物質がいずれも使用でき、特に制限されない。化学物質の受容体としてアドレナリン受容体が用いられる場合には、化学物質としては、イソプロテレノール（isoproterenol）、ドーパミン（dopamine）、ドブタミン（dobutamine）等が例示される。
【実施例】
【００４７】
［プラスミドの作製］
実施例および比較例で用いられたプラスミドの作製方法が以下に示される。【００４８】
（アドレナリン受容体発現プラスミドの作製）
図２０はアドレナリン受容体発現プラスミドの作製手順を示す。βアドレナリン受容体の遺伝子（GenBank登録番号：J05561.1）は、次の手順により増幅された。ラット心臓由来のｃＤＮＡ（ｒａｔ  ｈｅａｒｔ  ｃＤＮＡ）が２断片に分けて、ＰＣＲ法の実施により増幅された。一方の断片の増幅に用いたプライマーは、プライマー1（配列番号１７）およびプライマー２（配列番号１８）であった。他方の断片の増幅に用いたプライマーは、プライマー３（配列番号１９）およびプライマー４（配列番号２０）であった。得られた２つの断片が、それぞれプラスミドへライゲーションされた。この２つのプラスミドを鋳型にして、ＰＣＲを実施した。一方のプラスミドの増幅に用いられたプライマーは、プライマー５（配列番号２１）およびプライマー２（配列番号１８）であった。他方のプラスミドの増幅に用いられたプライマーは、プライマー３（配列番号１９）およびプライマー６（配列番号２２）であった。これにより、増幅断片の末端に制限酵素サイトが付加された。得られた２種の断片の一方がEcoRIおよびHindIIIで処理された。他方がHindIIIおよびSalIで処理された。処理後の断片が、あらかじめEcoRIおよびSalIで処理された発現プラスミドにライゲーションされ、β１アドレナリン受容体発現プラスミド（以下、『plasmid（βＡＲ）』と称される。）を得た。用いられたプライマーの配列が表１に示される。【００４９】
【表１】
2012042684.tif 000003
【００５０】
（変異型カリウムイオンチャネルKri3.1(F137S)発現プラスミドの作製）
変異型カリウムイオンチャネルKri3.1(F137S)の遺伝子は、マウスKir3.1の遺伝子を部分的に変異させることにより構築された。図２１は、マウスKir3.1発現プラスミドの作製手順を示す。マウスKir3.1の遺伝子は、２断片に分けて増幅された。Mouse Brain cDNA Library（クロンテック製）が鋳型として用いられた。一回目のＰＣＲで、一方の断片の増幅に用いられたプライマーは、プライマー７（配列番号２３）およびプライマー８（配列番号２４）であった。他方のプラスミドの増幅に用いられたプライマーは、プライマー９（配列番号２５）およびプライマー１０（配列番号２６）であった。２回目のＰＣＲで、一方の断片の増幅に用いられたプライマーは、プライマー１１（配列番号２７）およびプライマー１２（配列番号２８）であった。ＰＣＲ産物を切り出す制限酵素としてNhe IおよびCla Iが用いられた。他方のプラスミドの増幅に用いられたプライマーは、プライマー１３（配列番号２９）およびプライマー１４（配列番号３０）であった。ＰＣＲ副産物を切り出す制限酵素としてはCla IおよびNot Iが用いられた。得られた遺伝子断片はあらかじめNhe IおよびNot Iで処理した発現プラスミドにライゲーションされ、マウスKir3.1発現プラスミド（以下、『plasmid(Kir3.1)』と称される。）が得られた。用いられたプライマーの配列が表２に示される。【００５１】
【表２】
2012042684.tif 000004
【００５２】
図２２は、変異型カリウムイオンチャネルKir3.1(F137S）発現プラスミドの作製手順を示す。Kir3.1(F137S）遺伝子は、次の手順で作製された。plasmid(Kir3.1)を鋳型として、Kir3.1の遺伝子は、２断片に増幅された。これらの断片は、オーバーラップ・エクステンションＰＣＲ法の実施により連結された。一方の断片の増幅にはプライマー１１（配列番号２７）とプライマー１６（配列番号３２）が用いられ、もう一方の断片の増幅には、プライマー１５（配列番号３１）とプライマー１４′（配列番号７８）が用いられた。ＰＣＲ産物らは混合させられ、熱変性させられ、さらにＰＣＲを実施することにより増幅された。このＰＣＲ反応にはプライマー１１（配列番号２７）およびプライマー１４′（配列番号７８）が用いられた。得られた断片はNhe IおよびXho Iで処理された。処理後の断片は、あらかじめNhe IおよびXho Iで処理されたプラスミドにライゲーションされ、発現プラスミド（以下『plasmid(Kir3.1(F137S))』と称される。）を得た。【００５３】
（野生型Ｇタンパク質（Ｇαｏｌｆ）発現プラスミドの作製）
マウス嗅球から単離されたＲＮＡを、逆転写酵素を用いて逆転写することによって、マウス嗅細胞の全ｃＤＮＡが得られた。得られたｃＤＮＡが鋳型として用いられ、ＰＣＲによりＧαｏｌｆの遺伝子が増幅された。プライマー１７（配列番号３３）およびプライマー１８（配列番号３４）が用いられた。得られた遺伝子断片をプラスミドがプラスミドにライゲーションされ、Ｇαｏｌｆ遺伝子（GenBank登録番号：AY179168.1）がクローニングされた。得られたＧαｏｌｆ断片が、ＰＣＲによりさらに増幅された。プライマー１９（配列番号３５）およびプライマー２０（配列番号３６）が用いられた。これにより、増幅断片の末端に制限酵素サイトが付加された。当該制限酵素を有する増幅断片が発現プラスミドにライゲーションされ、野生型Ｇタンパク質（Ｇαｏｌｆ）発現プラスミド（以下『plasmid（Ｇαｏｌｆ）』と称される。）を得た。【００５４】
（Ｇタンパク質（Ｇαｉ（Ｃ３５１Ｇ））発現プラスミドの作製）
Ｇαｉの３５１番目のシステインがグリシンで置換されたＧαｉ（Ｃ３５１Ｇ）タンパク質発現プラスミドの作製手順が図２３に示される。Ｇαｉ（Ｃ３５１Ｇ）は、Ｇαｉ選択的阻害剤である百日咳毒素に対して抵抗性があること以外は野生型のＧαｉと同じ機能を有することが明らかとなっている。Ｇαｉ（mouse Gil:NM-010305)遺伝子が増幅された手順が以下に示される。マウス脾臓由来のｃＤＮＡ（mouse spleen cDNA）は２断片に分けて、ＰＣＲにより増幅された。一方の断片の増幅に用いたプライマーは、プライマー２１（配列番号３７）およびプライマー２２（配列番号３８）であった。他方の断片の増幅に用いたプライマーは、プライマー２３（配列番号３９）およびプライマー２４（配列番号４０）であった。得られた２つの断片が、それぞれプラスミドにライゲーションされた。この２つのプラスミドを鋳型にして、ＰＣＲを実施した。一方のプラスミドの増幅に用いられたプライマーは、プライマー２５（配列番号４１）およびプライマー２６（配列番号４２）であった。他方のプラスミドの増幅に用いられたプライマーは、プライマー２７（配列番号４３）およびプライマー２８（配列番号４４）であった。これにより、増幅断片の末端に制限酵素サイトが付加された。得られた２種の断片の一方がEcoRIおよびBamHIで処理された。他方がBamHIおよびEcoRIで処理された。処理後の断片が、あらかじめEcoRIで処理された発現プラスミドにライゲーションされ、野生型Ｇタンパク質（Ｇαｉ）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇαｉ）』と称される。）が得られた。用いられたプライマーの配列が表３に示される。【００５５】
【表３】
2012042684.tif 000005
【００５６】
（キメラＧタンパク質（Ｇｉ／ｏｌｆ５）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇｉ／ｏｌｆ５）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇｉ／ｏｌｆ５）』と称される。）は、プライマー２８に換えてプライマー２９（配列番号４５）が用いられた以外は、plasmid（Ｇαｉ）の作製と同じ手順により作製された。作製手順が図２３に示される。【００５７】
（キメラＧタンパク質（Ｇｉ／ｓ１３）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇｉ／ｓ１３）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇｉ／ｓ１３）』と称される。）は、プライマー２８に換えてプライマー３０（配列番号４６）が用いられた以外は、plasmid（Ｇαｉ）の作製と同じ手順により作製された。作製手順が図２３に示される。【００５８】
（キメラＧタンパク質（Ｇｉ／ｏｌｆ１３）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇｉ／ｏｌｆ１３）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇｉ／ｏｌｆ１３）』と称される。）は、プライマー２８に換えてプライマー３１（配列番号４７）が用いられた以外は、plasmid（Ｇαｉ）の作製と同じ手順により作製された。作製手順が図２３に示される。用いられたプライマーの配列が表４に示される。【００５９】
【表４】
2012042684.tif 000006
【００６０】
（キメラＧタンパク質（Ｇｉ／ｏｌｆ２８）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇｉ／ｏｌｆ２８）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇｉ／ｏｌｆ２８）』と称される。）は、鋳型Iとしてplasmid（Ｇｉ／ｏｌｆ１３）を、鋳型IIとしてplasmid（Ｇαｏｌｆ）をそれぞれ用い、オーバーラップエクステンションＰＣＲによって作製された。図２４に示されるように、鋳型Iを用いたＰＣＲのために、プライマーとしてA-PRIMERおよびB-PRIMERが用いられた。A-PRIMERおよびB-PRIMERを用いると、Ｇαｉの特定の領域のアミノ酸をコードする塩基配列を選択的に増幅させることができる。得られた断片の一部がB-PRIMERの相補的配列に付加され、付着末端が形成された。鋳型IIを用いたＰＣＲのために、プライマーとしてC-PRIMERおよびD-PRIMERが用いられた。C-PRIMERおよびD-PRIMERを用いると、Ｇαｏｌｆの特定の領域のアミノ酸をコードする塩基配列を選択的に増幅させることができる。得られた断片の一部がC-PRIMERの相補的配列に付加され、付着末端が形成された。具体的には、A-PRIMERとしてプライマー３２（配列番号４８）が、B-PRIMERとしてプライマー３３（配列番号４９）が用いられた。C-PRIMERとしてはプライマー３４（配列番号５０）が、D-PRIMERとしてはプライマー３５（配列番号５１）が用いられた。オーバーラップエクステンションＰＣＲによって、各ＰＣＲ産物は付着末端を介して互いに連結された。プライマーとしてA-PRIMERおよびD-PRIMERが用いられた。得られた断片はEcoRIおよびSalIにより処理され、あらかじめEcoRIおよびSalIで処理された発現プラスミドにライゲーションされ、plasmid（Ｇｉ／ｏｌｆ２８）を得た。plasmid（Ｇｉ／ｏｌｆ２８）で形質転換された大腸菌が培養された。大腸菌から精製されたplasmid（Ｇｉ／ｏｌｆ２８）が細胞への導入に用いられた。【００６１】
（キメラＧタンパク質（Ｇｉ／ｏｌｆ４５）発現プラスミドの作製）
表５に示す各プライマーが用いられた以外は、plasmid（Ｇｉ／ｏｌｆ２８）の作製と同じ手順でキメラＧタンパク質（Ｇｉ／ｏｌｆ４８）発現プラスミド（以下『plasmid（Ｇｉ／ｏｌｆ４８）』と称される。）が作製された。【００６２】
（キメラＧタンパク質（Ｇｉ／ｏｌｆ９４）発現プラスミドの作製）
表５に示す各プライマーが用いられた以外は、plasmid（Ｇｉ／ｏｌｆ２８）の作製と同じ手順でキメラＧタンパク質（Ｇｉ／ｏｌｆ９４）発現プラスミド（以下『plasmid（Ｇｉ／ｏｌｆ９４）』と称される。）が作製された。【００６３】
（キメラＧタンパク質（Ｇｉ／ｏｌｆ１１３）発現プラスミドの作製）
表５に示す各プライマーが用いられた以外は、plasmid（Ｇｉ／ｏｌｆ２８）の作製と同じ手順でキメラＧタンパク質（Ｇｉ／ｏｌｆ１１３）発現プラスミド（以下『plasmid（Ｇｉ／ｏｌｆ１１３）』と称される。）が作製された。【００６４】
（キメラＧタンパク質（Ｇｉ／ｏｌｆ１５６）発現プラスミドの作製）
表５に示す各プライマーが用いられた以外は、plasmid（Ｇｉ／ｏｌｆ２８）の作製と同じ手順でキメラＧタンパク質（Ｇｉ／ｏｌｆ１５６）発現プラスミド（以下『plasmid（Ｇｉ／ｏｌｆ１５６）』と称される。）が作製された。【００６５】
（キメラＧタンパク質（Ｇｉ／ｏｌｆ１９５）発現プラスミドの作製）
表５に示す各プライマーが用いられた以外は、plasmid（Ｇｉ／ｏｌｆ２８）の作製と同じ手順でキメラＧタンパク質（Ｇｉ／ｏｌｆ１９５）発現プラスミド（以下『plasmid（Ｇｉ／ｏｌｆ１９５）』と称される。）が作製された。【００６６】
【表５】
2012042684.tif 000007
【００６７】
各プライマーによって増幅されるアミノ酸配列の領域が表６に示される。【００６８】
【表６】
2012042684.tif 000008
【００６９】
（キメラＧタンパク質（Ｇｉ／ｏｌｆα３-β５）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇｉ／ｏｌｆα３-β５）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇｉ／ｏｌｆα３-β５）』と称される。）は、鋳型Iとしてplasmid（Ｇｉ／ｏｌｆ１３）を、鋳型IIとしてplasmid（Ｇαｉ）をそれぞれ用い、オーバーラップエクステンションＰＣＲによって作製された。図２５に示されるように、鋳型Iを用いたＰＣＲのために、プライマーとしてプライマー３６（配列番号５２）およびE-PRIMERが用いられた。具体的には、E-PRIEMRとしてプライマー３７（配列番号５３）が用いられた。得られた断片の一部がE-PRIMERの相補的配列に付加され、付着末端が形成された。鋳型IIを用いたＰＣＲのために、プライマーとしてプライマー３９（配列番号５５）およびF-PRIMERが用いられた。具体的には、F-PRIMERとしてプライマー３８（配列番号５４）が用いられた。得られた断片の一部がF-PRIMERの相補的配列に付加され、付着末端が形成された。プライマー３６およびプライマー３９を用いたオーバーラップエクステンションＰＣＲによって、各ＰＣＲ産物は付着末端を介して互いに連結された。得られた断片はEcoRIにより処理され、あらかじめEcoRIで処理された発現プラスミドにライゲーションされ、plasmid（Ｇｉ／ｏｌｆα３-β５）を得た。plasmid（Ｇｉ／ｏｌｆα３-β５）で形質転換された大腸菌が培養された。大腸菌から精製されたplasmid（Ｇｉ／ｏｌｆα３-β５）が細胞への導入に用いられた。【００７０】
（キメラＧタンパク質（Ｇｉ／ｏｌｆα３-β５，Ｃ）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇｉ／ｏｌｆα３-β５，Ｃ）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇｉ／ｏｌｆα３-β５，Ｃ）』と称される。）は、鋳型、および制限酵素として表７に記載されたものが使用された以外は、plasmid（Ｇｏｌｆα３-β５）の作製と同じ手順により作製された。【００７１】
（キメラＧタンパク質（Ｇｉ／ｏｌｆα４-β６）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇｉ／ｏｌｆα４-β６）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇｉ／ｏｌｆα４-β６）』と称される。）は、鋳型、E-PRIEMR、F-PRIMER、および制限酵素として表７に記載されたものが使用された以外は、plasmid（Ｇｏｌｆα３-β５）の作製と同じ手順により作製された。【００７２】
（キメラＧタンパク質（Ｇｉ／ｏｌｆα４-β６，Ｃ）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇｉ／ｏｌｆα４-β６，Ｃ）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇｉ／ｏｌｆα４-β６，Ｃ）』と称される。）は、鋳型、E-PRIEMR、F-PRIMER、および制限酵素として表７に記載されたものが使用された以外は、plasmid（Ｇｏｌｆα３-β５）の作製と同じ手順により作製された。【００７３】
（キメラＧタンパク質（Ｇｉ／ｏｌｆα３−β５，α４-β６）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇｉ／ｏｌｆα３−β５，α４-β６）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇｉ／ｏｌｆα３−β５，α４-β６）』と称される。）は、鋳型、E-PRIEMR、F-PRIMER、および制限酵素として表７に記載されたものが使用された以外は、plasmid（Ｇｏｌｆα３-β５）の作製と同じ手順により作製された。【００７４】
（キメラＧタンパク質（Ｇｉ／ｏｌｆα３−β５，α４-β６，Ｃ）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇｉ／ｏｌｆα３−β５，α４-β６，Ｃ）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇｉ／ｏｌｆα３−β５，α４-β６，Ｃ）』と称される。）は、鋳型、E-PRIEMR、F-PRIMER、および制限酵素として表７に記載されたものが使用された以外は、plasmid（Ｇｏｌｆα３-β５）の作製と同じ手順により作製された。【００７５】
【表７】
2012042684.tif 000009
【００７６】
［電気生理活性の測定］
キメラＧタンパク質と、カリウムイオンチャネルと、化学物質受容体とが発現した細胞（以下、『キメラＧタンパク発現細胞』と称される。）を得た。当該キメラＧタンパク発現細胞細胞の電気生理活性をパッチクランプ法を使用して測定した。キメラＧタンパク発現細胞は以下の手順により作製した。第１に、キメラＧタンパク質発現プラスミドと、カリウムイオンチャネル発現プラスミドと、化学物質受容体発現プラスミドとを作製した。次に、当該３つの発現プラスミドがＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入され、当該細胞中に発現した。【００７７】
（実施例１）
キメラＧαサブユニットとしてＧｉ/ｏｌｆ１３を具備する、キメラＧタンパク質が採用された。カリウムイオンチャネルとしては、変異型カリウムイオンチャネルKir3.1(F137S)が採用された。化学物質受容体としては、β１アドレナリン受容体が採用された。【００７８】
（キメラＧタンパク質発現細胞の調製）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、plasmid（βＡＲ）、plasmidKir3.1(F137S)、およびplasmid（Ｇｉ／ｏｌｆ１３）を発現させた。当該発現の手順が以下に示される。約８０％コンフルエントに培養したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を回収し、新たな培養シャーレに蒔いた。使用した細胞の継代数は１０代以内であった。ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ(fetal bovine serum)、ストレプトマイシン）が用いられた。２４時間培養後、トランスフェクション試薬を用いて当該細胞にプラスミドが導入された。当該細胞はプラスミド導入後４８時間培養され、キメラＧタンパク質発現細胞が調製された。【００７９】
（電流変化量の測定）
パッチクランプ法を使用して、キメラＧタンパク発現細胞の膜電流が測定された。測定は、β１アドレナリン受容体作動薬であるイソプロテレノール（以下、『ＩＳＯ』と称される。）が供給されない場合と、ＩＳＯが供給された場合において行われた。測定の手順が以下に示される。【００８０】
（測定のためのサンプル）
ＰＬＬ（ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎ）で処理されたカバーガラス（３ｍｍ×１０ｍｍ、松浪ガラス株式会社製）上にキメラＧタンパク発現細胞を蒔き、４時間静置して計測用サンプルを得た。【００８１】
（ガラス電極）
測定に用いられたガラス電極の作製手順が以下に記述される。ガラス電極作製装置（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製『レーザープラ−Ｐ−２０００』）を使用して（ガラス管（外径１．５ｍｍ、内径０．８６ｍｍ、長さ１００ｍｍ）から一端の径が１μｍであるガラスピペットを作製した。当該ガラスピペットに銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）電極を挿入した。当該ガラスピペットは緩衝液Ａで満たされた。緩衝液Ａの組成は細胞内液の組成と類似である。緩衝液Ａの組成が表８に示される。【００８２】
（測定）
測定作業は顕微鏡（オリンパス株式会社製『ＩＸ７１』）下で行われた。銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）電極上に環流チャンバが設置された。Ｔｙｒｏａｄ緩衝液で満たされた環流チャンバ中に計測用サンプルが配置された。単一の細胞とガラス電極の先端とが接触した状態でガラス電極内を陰圧にした。細胞膜のガラス電極の先端と接触した部分が破断され、等価回路が形成された（全細胞状態（Whole-cell mode)）。細胞の内と外との間の電位差が、パッチクランプアンプ（ＨＥＫＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｉｎｃ．製『ＥＰＣ１０』）を用いて０ｍＶに保持された。この状態下で、環流チャンバ中のＴｙｒｏａｄ緩衝液がＧＩＲＫ緩衝液で置換された。１０秒おきにパルス電位（電位：−５０ｍＶ、継続時間：１００ｍ秒）が印加され、当該印加時に生じた膜電流が測定された。Ｔｙｒｏａｄ緩衝液およびＧＩＲＫ緩衝液の組成が表８に示される。【００８３】
続いて、β１アドレナリン受容体作動薬であるイソプロテレノール（isoproterenol)（以下、場合により『ＩＳＯ』と称される。）が細胞に接触した場合の膜電流が以下の手順で測定された。環流チャンバ内のＧＩＲＫ緩衝液が試料溶液に置換された。細胞の内と外との間の電位差が０ｍＶに保持された条件下で、１０秒おきにパルス電位（電位：−５０ｍＶ、継続時間：１００ｍ秒）が印加され、当該印加時に生じた膜電流が測定された。試料溶液の組成が表８に示される。【００８４】
【表８】
2012042684.tif 000010
【００８５】
（実施例２〜６）
Ｇｉ/ｏｌｆ１３を具備するキメラＧタンパク質に換えて、それぞれ、表９中に記載されたＧαサブユニットを具備するキメラＧタンパク質が採用されたこと以外は、実施例１と同様にキメラＧタンパク発現細胞が調製され、膜電流が測定された。【００８６】
【表９】
2012042684.tif 000011
【００８７】
（比較例１〜１０）
Ｇｉ/ｏｌｆ１３を具備するキメラＧタンパク質に換えて、それぞれ、表１０中に記載されたＧαサブユニットを具備するキメラＧタンパク質タンパク質が採用されたこと以外は、実施例１と同様にキメラＧタンパク発現細胞が調製され、膜電流が測定された。【００８８】
【表１０】
2012042684.tif 000012
【００８９】
（比較例１１）
キメラＧタンパク質発現細胞の調製において、plasmid（Ｇｉ／ｏｌｆ１３）が導入されなかったこと以外は、実施例１と同様に細胞が調製され、膜電流が測定された。【００９０】
比較例１で用いられたＧαサブユニット（Ｇαi(C351G)）のアミノ酸配列が以下に示される。図４は（Ｇαi(C351G)）の二次元構造を模式的に示す。
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWFTDTSIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYPEYAGSNTYEEAAAYIQCQFEDLNKRKDTKEIYTHFTCATDTKNVQFVFDAVTDVIIKNNLKDIGLF（配列番号１）【００９１】
比較例２で用いられたＧαサブユニット（Ｇαｏｌｆ）のアミノ酸配列が以下に示される。図５は（Ｇαｏｌｆ）の二次元構造を模式的に示す。
MGCLGNSSKTAEDQGVDEKERREANKKIEKQLQKERLAYKATHRLLLLGAGESGKSTIVKQMRILHVNGFNPEEKKQKILDIRKNVKDAIVTIVSAMSTIIPPVPLANPENQFRSDYIKSIAPITDFEYSQEFFDHVKKLWDDEGVKACFERSNEYQLIDCAQYFLERIDSVSLVDYTPTDQDLLRCRVLTSGIFETRFQVDKVNFHMFDVGGQRDERRKWIQCFNDVTAIIYVAACSSYNMVIREDNNTNRLRESLDLFESIWNNRWLRTISIILFLNKQDMLAEKVLAGKSKIEDYFPEYANYTVPEDATPDAGEDPKVTRAKFFIRDLFLRISTATGDGKHYCYPHFTCAVDTENIRRVFNDCRDIIQRMHLKQYELL（配列番号２）【００９２】
比較例３で用いられたキメラＧαサブユニット（Ｇi／ｏｌｆ５）のアミノ酸配列が以下に示される。はＧαｉタンパク質のＣ末端側から５アミノ酸が、Ｇαｏｌｆの対応するアミノ酸で置換したされたキメラＧαサブユニットである。図６はＧi／ｏｌｆ５の二次元構造を模式的に示す。
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWFTDTSIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYPEYAGSNTYEEAAAYIQCQFEDLNKRKDTKEIYTHFTCATDTKNVQFVFDAVTDVIIKNNLKQYELL（配列番号３）【００９３】
比較例４で用いられたキメラＧαサブユニット（Ｇi／ｏｌｆ４５）のアミノ酸配列が以下に示される。図９はＧi／ｏｌｆ４５の二次元構造を模式的に示す。
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWFTDTSIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYPEYAGSNTYEEAAAYIQCQFEDLNTATGDGKHYCYPHFTCAVDTENIRRVFNDCRDIIQRMHLKQYELL（配列番号６）【００９４】
比較例５で用いられたＧαサブユニット（Ｇi／ｏｌｆ１５６）のアミノ酸配列が以下に示される。図１２はＧi／ｏｌｆ１５６の二次元構造を模式的に示す。
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFNDVTAIIYVAACSSYNMVIREDNNTNRLRESLDLFESIWNNRWLRTISIILFLNKQDMLAEKVLAGKSKIEDYFPEYANYTVPEDATPDAGEDPKVTRAKFFIRDLFLRISTATGDGKHYCYPHFTCAVDTENIRRVFNDCRDIIQRMHLKQYELL（配列番号９）【００９５】
比較例６で用いられたキメラＧαサブユニット（Ｇi／ｏｌｆ１９５）のアミノ酸配列が以下に示される。図１３はＧi／ｏｌｆ１９５の二次元構造を模式的に示す。
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRCRVLTSGIFETRFQVDKVNFHMFDVGGQRDERRKWIQCFNDVTAIIYVAACSSYNMVIREDNNTNRLRESLDLFESIWNNRWLRTISIILFLNKQDMLAEKVLAGKSKIEDYFPEYANYTVPEDATPDAGEDPKVTRAKFFIRDLFLRISTATGDGKHYCYPHFTCAVDTENIRRVFNDCRDIIQRMHLKQYELL(配列番号１０）【００９６】
比較例７で用いられたキメラＧαサブユニット（Ｇi／ｏｌｆα３-β５）のアミノ酸配列が以下に示される。図１４はＧi／ｏｌｆα３-β５の二次元構造を模式的に示す。
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWLRTISIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYPEYAGSNTYEEAAAYIQCQFEDLNKRKDTKEIYTHFTCATDTKNVQFVFDAVTDVIIKNNLKDCGLF（配列番号１１）【００９７】
比較例８で用いられたキメラＧαサブユニット（Ｇi／ｏｌｆα４-β６）のアミノ酸配列が以下に示される。図１６はＧαi／ｏｌｆα４-β６の二次元構造を模式的に示す。
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWFTDTSIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYPEYAGSNTYEEAAAYIQCQFEDLNTATGDGKHYCYTHFTCATDTKNVQFVFDAVTDVIIKNNLKDCGLF（配列番号１３）【００９８】
比較例９で用いられたキメラＧαサブユニット（Ｇi／ｏｌｆα３−β５，α４-β６）のアミノ酸配列が以下に示される。図１７はＧαi／ｏｌｆα３−β５，α４-β６の二次元構造を模式的に示す。
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWLRTISIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYPEYAGSNTYEEAAAYIQCQFEDLNTATGDGKHYCYTHFTCATDTKNVQFVFDAVTDVIIKNNLKDCGLF（配列番号１４）【００９９】
比較例１０で用いられたキメラＧαサブユニット（Ｇi／ｏｌｆα３-β５，α４-β６，Ｃ）のアミノ酸配列が以下に示される。図１９はＧi／ｏｌｆα３-β５，α４-β６，Ｃの二次元構造を模式的に示す。
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWLRTISIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYPEYAGSNTYEEAAAYIQCQFEDLNTATGDGKHYCYTHFTCATDTKNVQFVFDAVTDIIQRMHLKQYELL（配列番号：１６）【０１００】
実施例１〜４、比較例１〜６、および比較例１１の測定結果が表１１および図３０に示される。測定結果は、電流密度の変化量、すなわち、ＩＳＯが供給されていない場合に測定された膜電流の電流密度（電流値／細胞膜容量）とＩＳＯが供給された場合に測定された膜電流の電流密度の差として示される。【０１０１】
【表１１】
2012042684.tif 000013
【０１０２】
実施例１、実施例５、実施例６、比較例１、および比較例７〜１０の測定結果が表１２および図３０に示される。測定結果は、電流密度の変化量、すなわち、ＩＳＯが供給されていない場合に測定された膜電流の電流密度（電流値／細胞膜容量）とＩＳＯが供給された場合に測定された膜電流の電流密度の差として示される。【０１０３】
【表１２】
2012042684.tif 000014
【０１０４】
（ｃＡＭＰ法との比較）
本発明による化学物質の検出感度を、慣用の化学物質検出方法であるｃＡＭＰ法の検出感度と比較した。ｃＡＭＰ法は、作動薬と受容体との相互作用により増加した細胞内液中のｃＡＭＰ濃度が測定され、該測定値に基づいて作動薬の濃度が定量される方法である。具体的には、β１アドレナリン受容体とカリウムイオンチャネルKir3.1(F137S)とを発現した細胞が、ＩＳＯを含む緩衝液に接触した後に破砕された。得られた破砕液に含有されるｃＡＭＰの濃度が測定された。当該濃度測定は、測定用キッド（ａｓｓａｙ  ｄｅｓｉｇｎｓ社製；ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  ＥＫＡ  ｋｉｔ）を用いて測定された。当該キッドは競合ＥＩＡ（competitive enzyme immunoassay)を用いてｃＡＭＰ濃度を測定する。緩衝液中のＩＳＯ濃度が１０００ｎＭである場合のｃＡＭＰ濃度を１００とした、各ＩＳＯ濃度でのｃＡＭＰ濃度の比が算出された。一方、ＩＳＯ濃度を変化させて測定を行った以外は、実施例３と同様の測定が行われた。ＩＳＯ濃度が３０ｎＭである場合の電流密度の変化値を１００とした、各ＩＳＯ濃度における電流密度の変化値の比が算出された。結果が表１３および図３２に示される。【０１０５】
【表１３】
2012042684.tif 000015
【０１０６】
表１３および図３２から理解されることが以下に記述される。ｃＡＭＰ法を用いた場合に検出可能なＩＳＯ濃度の下限は約１０ｎＭであると考えられる。なぜならば、ＩＳＯ濃度０〜１ｎＭの緩衝液に接触した場合は、ｃＡＭＰ濃度の、ＩＳＯ濃度に依存的な上昇は観測されなかったからである。ＩＳＯの検出感度の指標となる、β1アドレナリン受容体に対するＩＳＯの半数効果濃度（ＥＣ５０）は１３５ｎＭであった。一方、キメラαサブユニットＧｉ／ｏｌｆ９４タンパク質を用いた本発明の方法では、ＩＳＯの検出下限濃度は０．３ｎＭであった。イオン電流の変化量は、ＩＳＯ濃度約３０ｎＭで飽和した。この場合の半β１に対するアドレナリン受容体の半数効果濃度は１ｎＭである。本発明のキメラＧαサブユニットタンパク質を用いた化学物質の検出方法によれば、従来、一般的に用いられてきたｃＡＭＰ法に比して、約１００倍の感度で、ＩＳＯが検出され得る。細胞内の複雑な分子間反応に依拠することなく、化学物質の受容体への結合を、キメラＧタンパク質を介して直接イオンチャネルに伝達したことが、当該高感度な検出を可能にしたと考えられえる。【０１０７】
（βアドレナリン受容体作動薬の検出）
イソプロテレノール以外のβ１アゴニストの検出を行った。化学物質として、ＩＳＯに加えて、β１アドレナリン受容体選択的な作動薬であるドブタミン（dobutamine）、およびβアドレナリン受容体の作動薬であるドーパミン（dopamine）を用いた以外は実施例３と同様の測定を行った。測定結果が表１４および図３３に示される。測定結果は、ドーパミンについては３００００ｎＭ、ドブタミンについては１００ｎＭ、ＩＳＯについては濃度３０ｎＭで観測された電流密度の変化値を１００とした相対値として記載される。【０１０８】
【表１４】
2012042684.tif 000016
【０１０９】
いずれの作動薬を用いた場合においても作動薬濃度の増加に伴い、電流密度の変化値が増加した。ドーパミン、およびドブタミンのＥＣ５０値は、それぞれ、１０００ｎＭおよび５０ｎＭであった。電流密度の変化は、作動薬が化学物質の受容体を介して、キメラＧタンパク質を活性化させ、イオンチャネルのゲートを開かせることによって生じていることが合理的に推測される。なぜならば、作動薬の種類によってＥＣ５０値が異なるからである。すなわち、作動薬は直接ではなく、間接的にキメラＧタンパク質を活性化している。【０１１０】
（参考例）
本発明者らは、本発明に先立って以下の検討を行い、キメラＧαサブユニットの設計方針を決定した。Ｇαサブユニットとして、Ｇαｉ（Ｃ３５１Ｇ）、Ｇαｏｌｆ、およびＧｉ／ｏｌｆ１３を使用して、ＩＳＯとの接触により生じるイオン電流をを測定した。測定は、実施例１と同様の方法により行われた。【０１１１】
図２６に示されるように、キメラＧαサブユニットとしてＧαｉ（Ｃ３５１Ｇ）が用いられ、ＩＳＯが供給されていない場合、パルス波が印加された直後に約−０．２ｎＡの電流値が計測された。ここで、電流値が−（マイナス）であることは、カリウムイオンが脂質二重膜の表側から裏側（細胞外から細胞内）へ移動したことを示している。ＩＳＯが供給された場合、電流値は変化し、約０．５ｎＡとなった。【０１１２】
図２７に示されるように、キメラＧαサブユニットとしてＧｉ／ｏｌｆ１３が用いられた場合、ＩＳＯの供給により電流値は変化し、約−２．５ｎＡとなった。図２８に示されるように、キメラＧαサブユニットとしてＧαolfタンパク質が用いられた場合、Ｇαｉ（Ｃ３５１Ｇ）が用いられた場合と同様に、約０．５ｎＡの電流値が測定され、ＩＳＯ添加による電流値の変化量は小さかった。【０１１３】
本発明者らは、上記測定結果から以下の結論を導いた。Ｇαｉ（Ｃ３５１Ｇ）はカリウムイオンチャネルを活性化することができるが、化学物質の受容体と結合することはできない。Ｇαｏｌｆは化学物質の受容体と結合することができるが、カリウムイオンチャネルを活性化することはできない。そのためＩＳＯ添加による電流変化量は小さかった。一方、Ｇｉ／ｏｌｆ１３が用いられた場合、キメラＧαサブユニットはＣ末端のＧαｏｌｆ領域を介して化学物質の受容体と結合することができるとともに、Ｇαi領域がカリウムイオンチャネルを活性化するため、ＩＳＯの添加によって大きな電流変化が観察された。従って、Ｇαサブユニットのキメラ化は、ＩＳＯ添加による電流変化量を増加させる。【０１１４】
さらに、キメラＧαサブユニットとしてＧｉ／ｓ１３が用いられた場合と、Ｇｉ／ｏｌｆ１３が用いられた場合における、電流変化量が比較された。測定結果が表１５および図２９に示される。Ｇαｉ（Ｃ３５１Ｇ）およびＧｏｌｆが用いられた場合の測定結果が参考のために並べて示される。【０１１５】
【表１５】
2012042684.tif 000017
【０１１６】
Ｇｉ／ｏｆｌ１３が用いられた場合の方が電流変化量はＧｉ／ｓ１３が用いられた場合の電流変化量よりも大きかった。従って、ＧαｉとＧαｏｌｆとのキメラが用いられた場合、
より大きな電流変化が期待できると判断された。従って、Ｇαｉのアミノ酸配列で、化学物質の受容体との連動に関与すると一般に考えられている領域が、対応するＧαｏｌｆのアミノ酸配列で置換された、キメラＧαサブユニットを作製することを決定した。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明のキメラＧタンパク質によれば、化学物質受容体と結合する化学物質を検出することができる。
【図１】
2012042684.tif 000018
【図２】
2012042684.tif 000019
【図３】
2012042684.tif 000020
【図４】
2012042684.tif 000021
【図５】
2012042684.tif 000022
【図６】
2012042684.tif 000023
【図７】
2012042684.tif 000024
【図８】
2012042684.tif 000025
【図９】
2012042684.tif 000026
【図１０】
2012042684.tif 000027
【図１１】
2012042684.tif 000028
【図１２】
2012042684.tif 000029
【図１３】
2012042684.tif 000030
【図１４】
2012042684.tif 000031
【図１５】
2012042684.tif 000032
【図１６】
2012042684.tif 000033
【図１７】
2012042684.tif 000034
【図１８】
2012042684.tif 000035
【図１９】
2012042684.tif 000036
【図２０】
2012042684.tif 000037
【図２１】
2012042684.tif 000038
【図２２】
2012042684.tif 000039
【図２３】
2012042684.tif 000040
【図２４】
2012042684.tif 000041
【図２５】
2012042684.tif 000042
【図２６】
2012042684.tif 000043
【図２７】
2012042684.tif 000044
【図２８】
2012042684.tif 000045
【図２９】
2012042684.tif 000046
【図３０】
2012042684.tif 000047
【図３１】
2012042684.tif 000048
【図３２】
2012042684.tif 000049
【図３３】
2012042684.tif 000050
【配列表】
2012042684000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年5月11日(2011.5.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質二重膜の表側から裏側にカリウムイオンを輸送する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の脂質二重膜に存在するＧタンパク質結合型受容体（G protein-coupled receptor)（以下、場合により『ＧＰＣＲ』と称される。）は、細胞の脂質二重膜に存在するＧタンパク質と連動して機能する。図１に示されるように、神経伝達物質のような化学物質がＧＰＣＲに結合すると、細胞内においてＧＣＰＲと共役している三量体Ｇタンパク質が活性化され、Ｇαサブユニットと、ＧβサブユニットおよびＧγサブユニットからなる二量体（以下、場合により『Ｇβγサブユニット複合体』と称される。）とに解離する。それらは各々、種々のシグナルを伝達する。
【０００３】
図２に示されるように、Ｇβγサブユニット複合体のＧタンパク質共役型内向整流カリウムイオンチャネル（G protein-coupled inwardly rectifying potassium channel）（以下、場合により『ＧＩＲＫ』と称される。）への結合は、ＧＩＲＫのゲートが開放することをもたらす。ＧＩＲＫのゲートが開放されると、脂質二重膜の表側に存在するカリウムイオンが当該ゲートを通って脂質二重膜の裏側へ移動する。当該カリウムイオンの移動は、イオン電流測定法を使用することにより検出又は定量され得る。
【０００４】
ＧαサブユニットがキメラＧαサブユニットであると、場合によってはカリウムイオンはより効率的に表側から裏側へと移動する。キメラＧαサブユニットを具備するＧタンパク質が発現した脂質二重膜を、化学物質センサーとして使用することが提案されている。
【０００５】
下記の非特許文献１〜６は、本発明に関連する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Gloriam D., Fredriksson R., Schioth H., (2007) "The G protein-coupled receptor subset of the rat genome" BMC Genomics 8, 338 - 405
【非特許文献２】Oldham, W. M. and H. E. Hamm (2008).“Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors.”Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 60-71.
【非特許文献３】Kim W. Chan, Jin-Liang Sui, Michel Vivaudou, and Diomedes E. Logothetis , (1996) "Control of channel activity through a unique amino acid residue of a G protein-gated inwardly rectifying K+ channel subunit" Proc. Natl. Acad. Sci., 93, 14193 - 14198
【非特許文献４】Gregory J. Digby, Pooja R. Sethi, and Nevin A. Lambert , (2008), "Differential dissociation of G protein heterotrimers" J. Physiol, 586, 3325 - 3335
【非特許文献５】Thomsen W., Frazer J., Unett D., (2005), "Functional assays for screening GPCR targets" Curr. Opin. Biotech.,16, 655 - 665
【非特許文献６】Leaney J.L., Milligan G., Tinker A., (2000) "The G Protein a Subunit Has a Key Role in Determining the Specificity of Coupling to, but Not the Activation of, G Protein-gated Inwardly Rectifying K1 Channels" J. Biol. Chem., 275, 921 - 929
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、より高感度に化学物質に応答する、脂質二重膜の表側から裏側にカリウムイオンを輸送する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、特定のキメラＧαサブユニットを具備するキメラＧタンパク質が上記課題を解決することを見いだし、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は下記項目１〜９を提供する。
【００１０】
項目１：
脂質二重膜の表側から裏側にカリウムイオンを輸送する方法であって、以下の工程（ａ）および工程（ｂ）を具備する：
前記脂質二重膜を用意する工程（ａ）
ここで、前記脂質二重膜は、化学物質の受容体、Ｇタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備し、
前記Ｇタンパク質は、キメラＧαサブユニット、およびＧβγサブユニット複合体を具備し、
前記キメラＧαサブユニットは、Ｇi/olf13（配列番号：０４）、Ｇi/olf28（配列番号：０５）、Ｇi/olf94（配列番号：０７）、Ｇi/olf113（配列番号：０８）、Ｇi/olfα3-β5,C（配列番号：１２）、またはＧi/olf α4-β6,C（配列番号：１５）のいずれかからなり、および
前記化学物質および前記カリウムイオンを前記表側から供給し、前記キメラＧαサブユニットおよび前記Ｇβγサブユニット複合体の放出、および前記Ｇβγサブユニット複合体の前記カリウムイオンチャネルへの結合により、前記表側から前記裏側に前記カリウムイオンを輸送する工程（ｂ）。
【００１１】
項目２：
前記化学物質が、アドレナリン受容体作動薬である項目１に記載の方法。
【００１２】
項目３：
前記カリウムイオンチャネルが、Ｇタンパク質共役型内向き整流カリウムイオンチャネルである、項目１に記載の方法。
【００１３】
項目４：
化学物質を検出又は定量する方法であって以下の工程（ｃ）〜（ｅ）を具備する：
脂質二重膜、前記脂質二重膜の表側に位置する第１液体、および前記脂質二重膜の裏側に位置する第２液体を用意する工程（ｃ）、
ここで、前記脂質二重膜は、化学物質の受容体、Ｇタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備し、
前記Ｇタンパク質は、キメラＧαサブユニット、およびＧβγサブユニット複合体を具備し、
前記キメラＧαサブユニットは、Ｇi/olf13（配列番号：０４）、Ｇi/olf28（配列番号：０５）、Ｇi/olf94（配列番号：０７）、Ｇi/olf113（配列番号：０８）、Ｇi/olfα3-β5,C（配列番号：１２）、またはＧi/olf α4-β6,C（配列番号：１５）のいずれかからなり、
前記第１液体はカリウムイオンを含有し、
前記第１液体に前記化学物質を供給する工程（ｄ）、および
前記第１および第２液体の少なくともいずれか一方のカリウムイオンの量を測定し、前記カリウムイオンの量に基づいて前記化学物質を検出又は定量する工程（ｅ）。
【００１４】
項目５：
前記化学物質が、アドレナリン受容体作動薬である項目４に記載の方法。
【００１５】
項目６：
前記カリウムイオンチャネルが、Ｇタンパク質共役型内向き整流カリウムイオンチャネルである、項目４に記載の方法。
【００１６】
項目７：
化学物質を検出または定量する方法であって、以下の工程（ｆ）〜（ｈ）を具備する：
脂質二重膜を用意する工程（ｆ）、
ここで、前記脂質二重膜は、化学物質の受容体、Ｇタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備し、
前記Ｇタンパク質は、キメラＧαサブユニットおよび前記Ｇβγサブユニット複合体を具備し、
前記キメラＧαサブユニットは、Ｇi/olf13（配列番号：０４）、Ｇi/olf28（配列番号：０５）、Ｇi/olf94（配列番号：０７）、Ｇi/olf113（配列番号：０８）、Ｇi/olfα3-β5,C（配列番号：１２）、またはＧi/olfα4-β6,C（配列番号：１５）のいずれかからなり、
前記脂質二重膜の表側および裏側にそれぞれ位置する第１および第２液体を供給し、前記第１および第２液体の間に前記脂質二重膜を挟む工程（ｇ）、
ここで、前記第１液体はカリウムイオンおよび化学物質を含有し、および
前記第１および第２液体の少なくともいずれか一方のカリウムイオンの量を測定し、前記カリウムイオンの量に基づいて前記化学物質を検出または定量する工程（ｈ）。
【００１７】
項目８：
前記化学物質が、アドレナリン受容体作動薬である、項目７に記載の方法。
【００１８】
項目９：
前記カリウムイオンチャネルが、Ｇタンパク質共役型内向き整流イオンチャネルである、項目７に記載の方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、脂質二重膜の表側から裏側に輸送されるカリウムイオンの量が増加する。これにより、高感度に標的化学物質の検出がなされる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】三量体Ｇタンパク質によるシグナル伝達を示す模式図
【図２】ＧＩＲＫの働きを利用した、化学物質センサを示す模式図
【図３】Ｇタンパク質の２次元構造を示す模式図
【図４】Ｇαiの二次元構造を示す模式図
【図５】Ｇαolfの二次元構造を模式的に示す図
【図６】Ｇi/olf5の二次元構造を模式的に示す図
【図７】Ｇi/olf13の二次元構造を模式的に示す図
【図８】Ｇi/olf28の二次元構造を模式的に示す図
【図９】Ｇi/olf45の二次元構造を模式的に示す図
【図１０】Ｇi/olf94の二次元構造を模式的に示す図
【図１１】Ｇi/olf113の二次元構造を模式的に示す図
【図１２】Ｇi/olf156の二次元構造を模式的に示す図
【図１３】Ｇi/olf195の二次元構造を模式的に示す図
【図１４】Ｇi/olf,α3-β5の二次元構造を模式的に示す図
【図１５】Ｇi/olfα3-β5,Cの二次元構造を模式的に示す図
【図１６】Ｇi/olfα4-β6の二次元構造を模式的に示す図
【図１７】Ｇi/olfα3-β5,α4-β6の二次元構造を模式的に示す図
【図１８】Ｇi/olfα4-β6,Cの二次元構造を模式的に示す図
【図１９】Ｇi/olfα3-β5,α4-β6,Cの二次元構造を模式的に示す図
【図２０】β１アドレナリン受容体発現プラスミドの作製方法を概念的に示す図
【図２１】Ｋｉｒ３．１発現プラスミドの作製方法を概念的に示す図
【図２２】Ｋｉｒ３．１（Ｆ１３７Ｓ）発現プラスミドの作製方法を概念的に示す図
【図２３】キメラＧタンパク質発現プラスミドの作製方法を概念的に示す図
【図２４】キメラＧタンパク質発現プラスミドの作製方法を概念的に示す図
【図２５】キメラＧタンパク質発現プラスミドの作製方法を概念的に示す図
【図２６】Ｇαi（Ｃ３５１Ｇ）タンパク質発現細胞のイオン電流を示す図
【図２７】Ｇi/olf13タンパク質発現細胞のイオン電流を示す図
【図２８】野生型Ｇαolfタンパク質発現細胞のイオン電流を示す図
【図２９】キメラＧタンパク質発現細胞のイオン電流の変化を示す図
【図３０】Ｇタンパク質発現細胞のイオン電流の変化を示す図
【図３１】Ｇタンパク質発現細胞のイオン電流の変化を示す図
【図３２】本発明の構成による化学センサの、従来の化学物質検出方法に対する優位性を示す図
【図３３】キメラＧタンパク質発現細胞のカリウムイオン電流の、各種化学物質に対する濃度依存性を示す図
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（用語の定義）
本明細書において用いられる用語は以下の通り定義される。
用語『脂質二重膜』は、細胞の表面を構成する膜、すなわち細胞膜を意味する。
用語『キメラＧαサブユニット』は、あるＧαタンパク質（例えば、Ｇαi）の特定の領域を、異なるＧαタンパク質（例えば、Ｇαolf）の対応する領域で置換したＧαサブユニットを意味する。
用語『キメラＧタンパク質』は、αサブユニットがキメラＧαサブユニットであるＧタンパク質を意味する。
【００２２】
本発明で使用される脂質二重膜は、化学物の質受容体、キメラＧタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備する。
【００２３】
脂質二重膜を具備する細胞の一例は、ヒト由来株化細胞である。
【００２４】
（化学物質の受容体）
化学物質の受容体として、Ｇタンパク質共役型受容体が採用される。Ｇタンパク質共役型受容体には、ホルモン受容体、神経伝達物質受容体、フェロモン受容体、嗅覚受容体、および味覚受容体に加えて、種々のオーファンＧタンパク質共役型受容体が含まれる。ホルモン受容体の一例は、アドレナリン受容体である。
【００２５】
（キメラＧタンパク質）
キメラＧタンパク質は、キメラＧαサブユニットおよびＧβγサブユニット複合体を具備する。
本発明において、キメラＧαサブユニットは、Ｇi/olf13、Ｇi/olf28、Ｇi/olf94、Ｇi/olf113、Ｇi/olfα3-β5,C、およびＧi/olfα4-β6,Cからなる群より選択される。キメラＧαサブユニットの名称中に含まれる添え字が、Ｇαiタンパク質のアミノ酸配列が、対応するＧαolfのアミノ酸配列と置換された領域を示している。これらのキメラＧαサブユニットが用いられた場合、化学物質の接触に応答してより多量のカリウムイオンが、脂質二重膜の表側から裏側へ輸送される。各キメラＧαサブユニットのアミノ酸配列が以下に示される。
【００２６】
（Ｇi/olf13）
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWFTDTSIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYPEYAGSNTYEEAAAYIQCQFEDLNKRKDTKEIYTHFTCATDTKNVQFVFDAVTDIIQRMHLKQYELL（配列番号：０４）
【００２７】
（Ｇi/olf28）
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWFTDTSIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYPEYAGSNTYEEAAAYIQCQFEDLNKRKDTKEIYTHFTCAVDTENIRRVFNDCRDIIQRMHLKQYELL（配列番号：０５）
【００２８】
（Ｇi/olf94）
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWFTDTSIILFLNKKDLFEEKVLAGKSKIEDYFPEYANYTVPEDATPDAGEDPKVTRAKFFIRDLFLRISTATGDGKHYCYPHFTCAVDTENIRRVFNDCRDIIQRMHLKQYELL（配列番号：０７）
【００２９】
（Ｇi/olf113）
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWLRTISIILFLNKQDMLAEKVLAGKSKIEDYFPEYANYTVPEDATPDAGEDPKVTRAKFFIRDLFLRISTATGDGKHYCYPHFTCAVDTENIRRVFNDCRDIIQRMHLKQYELL（配列番号：０８）
【００３０】
（Ｇi/olfα3-β5,C）
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWLRTISIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYPEYAGSNTYEEAAAYIQCQFEDLNKRKDTKEIYTHFTCATDTKNVQFVFDAVTDIIQRMHLKQYELL（配列番号：１２）
【００３１】
（Ｇi/olfα4-β6,C）
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWFTDTSIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYPEYAGSNTYEEAAAYIQCQFEDLNTATGDGKHYCYTHFTCATDTKNVQFVFDAVTDIIQRMHLKQYELL(配列番号１５）
【００３２】
図３に示されるように、Ｇαサブユニットを構成するタンパク質は、ＧＴＰアーゼドメイン（GTPase domain）と称される領域と、らせん領域（helical domain）と称される領域とを具備する。両領域は、リンカー１、リンカー２とそれぞれ称される２つのαヘリックス（α-helix）を介して互いに連結されている。ＧＴＰアーゼドメインは５本のαヘリックス、６本のβシート、およびこれらを連結するループを含む。
【００３３】
図７に示されるように、Ｇi/olf13の二次元構造は、Ｇαi（Ｃ３５１Ｇ）のＣ末端から１３アミノ酸が、Ｇαolfの対応するアミノ酸で置換された構造である。
【００３４】
図８に示されるように、Ｇi/olf28の二次元構造は、Ｇαi（Ｃ３５１Ｇ）のβ６−α５ループを含むＣ末端側の領域が、Ｇαolfの対応する領域で置換された構造である。
【００３５】
図１０に示されるように、Ｇi/olf94の二次元構造は、Ｇαi（Ｃ３５１Ｇ）のαＧ−α４ループを含むＣ末端側の端領域が、Ｇαolfの対応する領域で置換された構造である。
【００３６】
図１１に示されるように、Ｇi/olf113の二次元構造は、Ｇαi（Ｃ３５１Ｇ）のα３−β５ループを含むＣ末端側の領域が、Ｇαolfの対応する領域で置換された構造である。
【００３７】
図１５に示されるように、Ｇi/olfα3-β5,Cの二次元構造は、Ｇαi（Ｃ３５１Ｇ）のα３−β５ループ、およびα５−Ｃ末端ループが、Ｇαolfの対応するループで置換された構造である。
【００３８】
図１８に示されるように、Ｇi/olfα4-β6,Cの二次元構造は、Ｇαi（Ｃ３５１Ｇ）のα３−β５ループおよびα５−Ｃ末端ループが、Ｇαolfの対応するループで置換された構造である。
【００３９】
（カリウムイオンチャネル）
カリウムイオンチャネルとしては、Ｇタンパク質共役型受容体内向き整流性カリウムチャネル（ＧＩＲＫ）が用いられる。ＧＩＲＫは、Ｋｉｒ３．１、Ｋｉｒ３．２、Ｋｉｒ３．３およびＫｉｒ３．４の４つのサブタイプに分類される。本発明において、Ｋｉｒ３．１の１３７番目のフェニルアラニンがセリンで置換された変異型Ｋｉｒ３．１（Ｆ１３７Ｓ）が好ましく用いられる。その理由が以下に記述される。サブタイプＫｉｒ３．１〜Ｋｉｒ３．４は、相異なるサブタイプとヘテロ多量体を形成する。換言すると、ＧＩＲＫは２種のサブタイプを含む。しかしながら、変異型Ｋｉｒ３．１（Ｆ１３７Ｓ）はホモ４量体を形成し、当該４量体がカリウムイオンチャネルを構成する。従って、変異型Ｋｉｒ３．１（Ｆ１３７Ｓ）を用いた場合はカリウムイオンチャネルの構成に必要とされるタンパク質の種類は１種類である。
【００４０】
化学物質の受容体、キメラＧタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備する脂質二重膜は、例えば、以下に記述される方法により調製される。化学物質の受容体をコードする発現プラスミド、キメラＧタンパク質をコードする発現プラスミド、およびカリウムイオンチャネルをコードする発現プラスミドが作製される。作製された各プラスミドが細胞に導入され、発現される。当該方法の具体的な手順は実施例で詳述される。
【００４１】
（カリウムイオンの輸送）
化学物質の受容体、キメラＧタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備する脂質二重膜の表側と裏側は、それぞれ、適宜な緩衝液に接触している。当該脂質二重膜の表側に接触する緩衝液は、カリウムイオンを濃度１〜１０００ｎＭで含有する。
【００４２】
化学物質が当該脂質二重膜の表側に供給され、化学物質の受容体と結合すると、脂質二重膜の裏側において化学物質受容体と結合しているキメラＧタンパク質が、キメラＧαサブユニットと、Ｇβγサブユニット複合体とに分割され、放出される。Ｇβγサブユニット複合体のカリウムイオンチャネルへの接触は、カリウムイオンチャネルのゲートの開放をもたらす。カリウムイオンチャネルのゲートが開放されると、カリウムイオンが脂質二重膜の表側から裏側へと輸送される。
【００４３】
（化学物質の検出又は定量）
上述の脂質二重膜の表側から裏側にカリウムイオンを輸送する方法を利用して、化学物質が検出又は定量され得る。カリウムイオンの輸送により生じたイオン電流の変化を測定し、脂質二重膜の表側に存在する化学物質が検出又は定量される。具体的には、化学物質は以下に記述されるように検出又は定量される。まず、上述の化学物質の受容体、キメラＧタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備する脂質二重膜の表側にカリウムイオンが供給される。具体的には、例えば、脂質二重膜の表側に第１液体を、裏側に第２液体を供給する。すなわち、当該脂質二重膜は、第１液体と第２液体との間に挟まれる。第１液体、および第２液体は通常、ｐＨ７付近である緩衝液である。第１液体はカリウムイオンを含有する。第２液体もカリウムイオンを含有していてもよい。
【００４４】
標的化学物質もまた、当該脂質二重膜の表側に供給される。具体的には、第１液体および第２液体との間に脂質二重膜が挟まれた状態で、第１液体に標的化学物質が供給される。標的化学物質は、化学物質の受容体に供給される。化学物質の受容体に標的化学物質が供給されることが、キメラＧタンパク質のサブユニットの放出をもたらし、脂質二重膜の表側に存在する（第１液体に含有される）カリウムイオンが、脂質二重膜の裏側（第２液体）に輸送される。カリウムイオンの輸送によって生じたイオン電流の変化が測定され、当該測定結果に基づいて化学物質が検出又は定量される。上述の化学物質の供給は、脂質二重膜の表側に最初に供給された第１液体を、化学物質を含有する以外は第１液体と同一の組成を有する溶液で置換することにより行われてもよい。
【００４５】
化学物質の定量の目的で、検量線が一般的に用いられる。
【００４６】
（化学物質）
化学物質としては、化学物質の受容体の作動薬として機能しうる化学物質がいずれも使用でき、特に制限されない。化学物質の受容体としてアドレナリン受容体が用いられる場合には、化学物質としては、イソプロテレノール（isoproterenol）、ドーパミン（dopamine）、ドブタミン（dobutamine）等が例示される。
【実施例】
【００４７】
［プラスミドの作製］
実施例および比較例で用いられたプラスミドの作製方法が以下に示される。
【００４８】
（アドレナリン受容体発現プラスミドの作製）
図２０はアドレナリン受容体発現プラスミドの作製手順を示す。βアドレナリン受容体の遺伝子（GenBank登録番号：J05561.1）は、次の手順により増幅された。ラット心臓由来のｃＤＮＡ（ｒａｔ  ｈｅａｒｔ  ｃＤＮＡ）が２断片に分けて、ＰＣＲ法の実施により増幅された。一方の断片の増幅に用いたプライマーは、プライマー1（配列番号１７）およびプライマー２（配列番号１８）であった。他方の断片の増幅に用いたプライマーは、プライマー３（配列番号１９）およびプライマー４（配列番号２０）であった。得られた２つの断片が、それぞれプラスミドへライゲーションされた。この２つのプラスミドを鋳型にして、ＰＣＲを実施した。一方のプラスミドの増幅に用いられたプライマーは、プライマー５（配列番号２１）およびプライマー２（配列番号１８）であった。他方のプラスミドの増幅に用いられたプライマーは、プライマー３（配列番号１９）およびプライマー６（配列番号２２）であった。これにより、増幅断片の末端に制限酵素サイトが付加された。得られた２種の断片の一方がEcoRIおよびHindIIIで処理された。他方がHindIIIおよびSalIで処理された。処理後の断片が、あらかじめEcoRIおよびSalIで処理された発現プラスミドにライゲーションされ、β１アドレナリン受容体発現プラスミド（以下、『plasmid（βＡＲ）』と称される。）を得た。用いられたプライマーの配列が表１に示される。
【００４９】
【表１】
2012042684.tif 000051
【００５０】
（変異型カリウムイオンチャネルKri3.1(F137S)発現プラスミドの作製）
変異型カリウムイオンチャネルKri3.1(F137S)の遺伝子は、マウスKir3.1の遺伝子を部分的に変異させることにより構築された。図２１は、マウスKir3.1発現プラスミドの作製手順を示す。マウスKir3.1の遺伝子は、２断片に分けて増幅された。Mouse Brain cDNA Library（クロンテック製）が鋳型として用いられた。一回目のＰＣＲで、一方の断片の増幅に用いられたプライマーは、プライマー７（配列番号２３）およびプライマー８（配列番号２４）であった。他方のプラスミドの増幅に用いられたプライマーは、プライマー９（配列番号２５）およびプライマー１０（配列番号２６）であった。２回目のＰＣＲで、一方の断片の増幅に用いられたプライマーは、プライマー１１（配列番号２７）およびプライマー１２（配列番号２８）であった。ＰＣＲ産物を切り出す制限酵素としてNhe IおよびCla Iが用いられた。他方のプラスミドの増幅に用いられたプライマーは、プライマー１３（配列番号２９）およびプライマー１４（配列番号３０）であった。ＰＣＲ副産物を切り出す制限酵素としてはCla IおよびNot Iが用いられた。得られた遺伝子断片はあらかじめNhe IおよびNot Iで処理した発現プラスミドにライゲーションされ、マウスKir3.1発現プラスミド（以下、『plasmid(Kir3.1)』と称される。）が得られた。用いられたプライマーの配列が表２に示される。
【００５１】
【表２】
2012042684.tif 000052
【００５２】
図２２は、変異型カリウムイオンチャネルKir3.1(F137S）発現プラスミドの作製手順を示す。Kir3.1(F137S）遺伝子は、次の手順で作製された。plasmid(Kir3.1)を鋳型として、Kir3.1の遺伝子は、２断片に増幅された。これらの断片は、オーバーラップ・エクステンションＰＣＲ法の実施により連結された。一方の断片の増幅にはプライマー１１（配列番号２７）とプライマー１６（配列番号３２）が用いられ、もう一方の断片の増幅には、プライマー１５（配列番号３１）とプライマー１４′（配列番号７８）が用いられた。ＰＣＲ産物らは混合させられ、熱変性させられ、さらにＰＣＲを実施することにより増幅された。このＰＣＲ反応にはプライマー１１（配列番号２７）およびプライマー１４′（配列番号７８）が用いられた。得られた断片はNhe IおよびXho Iで処理された。処理後の断片は、あらかじめNhe IおよびXho Iで処理されたプラスミドにライゲーションされ、発現プラスミド（以下『plasmid(Kir3.1(F137S))』と称される。）を得た。
【００５３】
（野生型Ｇタンパク質（Ｇαolf）発現プラスミドの作製）
マウス嗅球から単離されたＲＮＡを、逆転写酵素を用いて逆転写することによって、マウス嗅細胞の全ｃＤＮＡが得られた。得られたｃＤＮＡが鋳型として用いられ、ＰＣＲによりＧαｏｌｆの遺伝子が増幅された。プライマー１７（配列番号３３）およびプライマー１８（配列番号３４）が用いられた。得られた遺伝子断片をプラスミドがプラスミドにライゲーションされ、Ｇαolf遺伝子（GenBank登録番号：AY179168.1）がクローニングされた。得られたＧαolf断片が、ＰＣＲによりさらに増幅された。プライマー１９（配列番号３５）およびプライマー２０（配列番号３６）が用いられた。これにより、増幅断片の末端に制限酵素サイトが付加された。当該制限酵素を有する増幅断片が発現プラスミドにライゲーションされ、野生型Ｇタンパク質（Ｇαolf）発現プラスミド（以下『plasmid（Ｇαolf）』と称される。）を得た。
【００５４】
（Ｇタンパク質（Ｇαi（Ｃ３５１Ｇ））発現プラスミドの作製）
Ｇαiの３５１番目のシステインがグリシンで置換されたＧαi（Ｃ３５１Ｇ）タンパク質発現プラスミドの作製手順が図２３に示される。Ｇαi（Ｃ３５１Ｇ）は、Ｇαi選択的阻害剤である百日咳毒素に対して抵抗性があること以外は野生型のＧαiと同じ機能を有することが明らかとなっている。Ｇαi（mouse Gil:NM-010305)遺伝子が増幅された手順が以下に示される。マウス脾臓由来のｃＤＮＡ（mouse spleen cDNA）は２断片に分けて、ＰＣＲにより増幅された。一方の断片の増幅に用いたプライマーは、プライマー２１（配列番号３７）およびプライマー２２（配列番号３８）であった。他方の断片の増幅に用いたプライマーは、プライマー２３（配列番号３９）およびプライマー２４（配列番号４０）であった。得られた２つの断片が、それぞれプラスミドにライゲーションされた。この２つのプラスミドを鋳型にして、ＰＣＲを実施した。一方のプラスミドの増幅に用いられたプライマーは、プライマー２５（配列番号４１）およびプライマー２６（配列番号４２）であった。他方のプラスミドの増幅に用いられたプライマーは、プライマー２７（配列番号４３）およびプライマー２８（配列番号４４）であった。これにより、増幅断片の末端に制限酵素サイトが付加された。得られた２種の断片の一方がEcoRIおよびBamHIで処理された。他方がBamHIおよびEcoRIで処理された。処理後の断片が、あらかじめEcoRIで処理された発現プラスミドにライゲーションされ、野生型Ｇタンパク質（Ｇαi）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇαi）』と称される。）が得られた。用いられたプライマーの配列が表３に示される。
【００５５】
【表３】
2012042684.tif 000053
【００５６】
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olf5）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇi/olf5）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇi/olf5）』と称される。）は、プライマー２８に換えてプライマー２９（配列番号４５）が用いられた以外は、plasmid（Ｇαi）の作製と同じ手順により作製された。作製手順が図２３に示される。
【００５７】
（キメラＧタンパク質（Ｇi/s13）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇi/s13）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇi/s13）』と称される。）は、プライマー２８に換えてプライマー３０（配列番号４６）が用いられた以外は、plasmid（Ｇαi）の作製と同じ手順により作製された。作製手順が図２３に示される。
【００５８】
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olf13）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇi/olf13）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇi/olf13）』と称される。）は、プライマー２８に換えてプライマー３１（配列番号４７）が用いられた以外は、plasmid（Ｇαi）の作製と同じ手順により作製された。作製手順が図２３に示される。用いられたプライマーの配列が表４に示される。
【００５９】
【表４】
2012042684.tif 000054
【００６０】
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olf28）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇi/olf28）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇi/olf28）』と称される。）は、鋳型Iとしてplasmid（Ｇi/olf13）を、鋳型IIとしてplasmid（Ｇαolf）をそれぞれ用い、オーバーラップエクステンションＰＣＲによって作製された。図２４に示されるように、鋳型Iを用いたＰＣＲのために、プライマーとしてA-PRIMERおよびB-PRIMERが用いられた。A-PRIMERおよびB-PRIMERを用いると、Ｇαｉの特定の領域のアミノ酸をコードする塩基配列を選択的に増幅させることができる。得られた断片の一部がB-PRIMERの相補的配列に付加され、付着末端が形成された。鋳型IIを用いたＰＣＲのために、プライマーとしてC-PRIMERおよびD-PRIMERが用いられた。C-PRIMERおよびD-PRIMERを用いると、Ｇαolfの特定の領域のアミノ酸をコードする塩基配列を選択的に増幅させることができる。得られた断片の一部がC-PRIMERの相補的配列に付加され、付着末端が形成された。具体的には、A-PRIMERとしてプライマー３２（配列番号４８）が、B-PRIMERとしてプライマー３３（配列番号４９）が用いられた。C-PRIMERとしてはプライマー３４（配列番号５０）が、D-PRIMERとしてはプライマー３５（配列番号５１）が用いられた。オーバーラップエクステンションＰＣＲによって、各ＰＣＲ産物は付着末端を介して互いに連結された。プライマーとしてA-PRIMERおよびD-PRIMERが用いられた。得られた断片はEcoRIおよびSalIにより処理され、あらかじめEcoRIおよびSalIで処理された発現プラスミドにライゲーションされ、plasmid（Ｇi/olf28）を得た。plasmid（Ｇi/olf28）で形質転換された大腸菌が培養された。大腸菌から精製されたplasmid（Ｇi/olf28）が細胞への導入に用いられた。
【００６１】
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olf45）発現プラスミドの作製）
表５に示す各プライマーが用いられた以外は、plasmid（Ｇi/olf28）の作製と同じ手順でキメラＧタンパク質（Ｇi/olf48）発現プラスミド（以下『plasmid（Ｇi/olf48）』と称される。）が作製された。
【００６２】
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olf94）発現プラスミドの作製）
表５に示す各プライマーが用いられた以外は、plasmid（Ｇi/olf28）の作製と同じ手順でキメラＧタンパク質（Ｇi/olf94）発現プラスミド（以下『plasmid（Ｇi/olf94）』と称される。）が作製された。
【００６３】
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olf113）発現プラスミドの作製）
表５に示す各プライマーが用いられた以外は、plasmid（Ｇi/olf28）の作製と同じ手順でキメラＧタンパク質（Ｇi/olf113）発現プラスミド（以下『plasmid（Ｇi/olf113）』と称される。）が作製された。
【００６４】
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olf156）発現プラスミドの作製）
表５に示す各プライマーが用いられた以外は、plasmid（Ｇi/olf28）の作製と同じ手順でキメラＧタンパク質（Ｇi/olf156）発現プラスミド（以下『plasmid（Ｇi/olf156）』と称される。）が作製された。
【００６５】
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olf195）発現プラスミドの作製）
表５に示す各プライマーが用いられた以外は、plasmid（Ｇi/olf28）の作製と同じ手順でキメラＧタンパク質（Ｇi/olf195）発現プラスミド（以下『plasmid（Ｇi/olf195）』と称される。）が作製された。
【００６６】
【表５】
2012042684.tif 000055
【００６７】
各プライマーによって増幅されるアミノ酸配列の領域が表６に示される。
【００６８】
【表６】
2012042684.tif 000056
【００６９】
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα3-β5）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα3-β5）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇi/olfα3-β5）』と称される。）は、鋳型Iとしてplasmid（Ｇi/olf13）を、鋳型IIとしてplasmid（Ｇαi）をそれぞれ用い、オーバーラップエクステンションＰＣＲによって作製された。図２５に示されるように、鋳型Iを用いたＰＣＲのために、プライマーとしてプライマー３６（配列番号５２）およびE-PRIMERが用いられた。具体的には、E-PRIEMRとしてプライマー３７（配列番号５３）が用いられた。得られた断片の一部がE-PRIMERの相補的配列に付加され、付着末端が形成された。鋳型IIを用いたＰＣＲのために、プライマーとしてプライマー３９（配列番号５５）およびF-PRIMERが用いられた。具体的には、F-PRIMERとしてプライマー３８（配列番号５４）が用いられた。得られた断片の一部がF-PRIMERの相補的配列に付加され、付着末端が形成された。プライマー３６およびプライマー３９を用いたオーバーラップエクステンションＰＣＲによって、各ＰＣＲ産物は付着末端を介して互いに連結された。得られた断片はEcoRIにより処理され、あらかじめEcoRIで処理された発現プラスミドにライゲーションされ、plasmid（Ｇi/olfα3-β5）を得た。plasmid（Ｇi/olfα3-β5）で形質転換された大腸菌が培養された。大腸菌から精製されたplasmid（Ｇi/olfα3-β5）が細胞への導入に用いられた。
【００７０】
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα3-β5,C）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα3-β5,C）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇi/olfα3-β5,C）』と称される。）は、鋳型、および制限酵素として表７に記載されたものが使用された以外は、plasmid（Ｇolfα3-β5）の作製と同じ手順により作製された。
【００７１】
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα4-β6）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα4-β6）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇi/olfα4-β6）』と称される。）は、鋳型、E-PRIEMR、F-PRIMER、および制限酵素として表７に記載されたものが使用された以外は、plasmid（Ｇolfα3-β5）の作製と同じ手順により作製された。
【００７２】
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα4-β6,C）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα4-β6,C）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇi/olfα4-β6,C）』と称される。）は、鋳型、E-PRIEMR、F-PRIMER、および制限酵素として表７に記載されたものが使用された以外は、plasmid（Ｇolfα3-β5）の作製と同じ手順により作製された。
【００７３】
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα3-β5,α4-β6）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα3-β5,α4-β6）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇi/olfα3-β5,α4-β6）』と称される。）は、鋳型、E-PRIEMR、F-PRIMER、および制限酵素として表７に記載されたものが使用された以外は、plasmid（Ｇolfα3-β5）の作製と同じ手順により作製された。
【００７４】
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα3-β5,α4-β6,C）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα3-β5,α4-β6,C）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇi/olfα3-β5,α4-β6,C）』と称される。）は、鋳型、E-PRIEMR、F-PRIMER、および制限酵素として表７に記載されたものが使用された以外は、plasmid（Ｇolfα3-β5）の作製と同じ手順により作製された。
【００７５】
【表７】
2012042684.tif 000057
【００７６】
［電気生理活性の測定］
キメラＧタンパク質と、カリウムイオンチャネルと、化学物質受容体とが発現した細胞（以下、『キメラＧタンパク発現細胞』と称される。）を得た。当該キメラＧタンパク発現細胞の電気生理活性をパッチクランプ法を使用して測定した。キメラＧタンパク発現細胞は以下の手順により作製した。第１に、キメラＧタンパク質発現プラスミドと、カリウムイオンチャネル発現プラスミドと、化学物質受容体発現プラスミドとを作製した。次に、当該３つの発現プラスミドがＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入され、当該細胞中に発現した。
【００７７】
（実施例１）
キメラＧαサブユニットとしてＧi/olf13を具備する、キメラＧタンパク質が採用された。カリウムイオンチャネルとしては、変異型カリウムイオンチャネルKir3.1(F137S)が採用された。化学物質受容体としては、β１アドレナリン受容体が採用された。
【００７８】
（キメラＧタンパク質発現細胞の調製）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、plasmid（βＡＲ）、plasmidKir3.1(F137S)、およびplasmid（Ｇi/olf13）を発現させた。当該発現の手順が以下に示される。約８０％コンフルエントに培養したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を回収し、新たな培養シャーレに蒔いた。使用した細胞の継代数は１０代以内であった。ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ(fetal bovine serum)、ストレプトマイシン）が用いられた。２４時間培養後、トランスフェクション試薬を用いて当該細胞にプラスミドが導入された。当該細胞はプラスミド導入後４８時間培養され、キメラＧタンパク質発現細胞が調製された。
【００７９】
（電流変化量の測定）
パッチクランプ法を使用して、キメラＧタンパク発現細胞の膜電流が測定された。測定は、β１アドレナリン受容体作動薬であるイソプロテレノール（以下、『ＩＳＯ』と称される。）が供給されない場合と、ＩＳＯが供給された場合において行われた。測定の手順が以下に示される。
【００８０】
（測定のためのサンプル）
ＰＬＬ（ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎ）で処理されたカバーガラス（３ｍｍ×１０ｍｍ、松浪ガラス株式会社製）上にキメラＧタンパク発現細胞を蒔き、４時間静置して計測用サンプルを得た。
【００８１】
（ガラス電極）
測定に用いられたガラス電極の作製手順が以下に記述される。ガラス電極作製装置（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製『レーザープラ−Ｐ−２０００』）を使用して（ガラス管（外径１．５ｍｍ、内径０．８６ｍｍ、長さ１００ｍｍ）から一端の径が１μｍであるガラスピペットを作製した。当該ガラスピペットに銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）電極を挿入した。当該ガラスピペットは緩衝液Ａで満たされた。緩衝液Ａの組成は細胞内液の組成と類似である。緩衝液Ａの組成が表８に示される。
【００８２】
（測定）
測定作業は顕微鏡（オリンパス株式会社製『ＩＸ７１』）下で行われた。銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）電極上に環流チャンバが設置された。Ｔｙｒｏａｄ緩衝液で満たされた環流チャンバ中に計測用サンプルが配置された。単一の細胞とガラス電極の先端とが接触した状態でガラス電極内を陰圧にした。細胞膜のガラス電極の先端と接触した部分が破断され、等価回路が形成された（全細胞状態（Whole-cell mode)）。細胞の内と外との間の電位差が、パッチクランプアンプ（ＨＥＫＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｉｎｃ．製『ＥＰＣ１０』）を用いて０ｍＶに保持された。この状態下で、環流チャンバ中のＴｙｒｏａｄ緩衝液がＧＩＲＫ緩衝液で置換された。１０秒おきにパルス電位（電位：−５０ｍＶ、継続時間：１００ｍ秒）が印加され、当該印加時に生じた膜電流が測定された。Ｔｙｒｏａｄ緩衝液およびＧＩＲＫ緩衝液の組成が表８に示される。
【００８３】
続いて、β１アドレナリン受容体作動薬であるイソプロテレノール（isoproterenol)（以下、場合により『ＩＳＯ』と称される。）が細胞に接触した場合の膜電流が以下の手順で測定された。環流チャンバ内のＧＩＲＫ緩衝液が試料溶液に置換された。細胞の内と外との間の電位差が０ｍＶに保持された条件下で、１０秒おきにパルス電位（電位：−５０ｍＶ、継続時間：１００ｍ秒）が印加され、当該印加時に生じた膜電流が測定された。試料溶液の組成が表８に示される。
【００８４】
【表８】
2012042684.tif 000058
【００８５】
（実施例２〜６）
Ｇi/olf13を具備するキメラＧタンパク質に換えて、それぞれ、表９中に記載されたＧαサブユニットを具備するキメラＧタンパク質が採用されたこと以外は、実施例１と同様にキメラＧタンパク発現細胞が調製され、膜電流が測定された。
【００８６】
【表９】
2012042684.tif 000059
【００８７】
（比較例１〜１０）
Ｇi/olf13を具備するキメラＧタンパク質に換えて、それぞれ、表１０中に記載されたＧαサブユニットを具備するキメラＧタンパク質タンパク質が採用されたこと以外は、実施例１と同様にキメラＧタンパク発現細胞が調製され、膜電流が測定された。
【００８８】
【表１０】
2012042684.tif 000060
【００８９】
（比較例１１）
キメラＧタンパク質発現細胞の調製において、plasmid（Ｇi/olf13）が導入されなかったこと以外は、実施例１と同様に細胞が調製され、膜電流が測定された。
【００９０】
比較例１で用いられたＧαサブユニット（Ｇαi(C351G)）のアミノ酸配列が以下に示される。図４は（Ｇαi(C351G)）の二次元構造を模式的に示す。
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWFTDTSIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYPEYAGSNTYEEAAAYIQCQFEDLNKRKDTKEIYTHFTCATDTKNVQFVFDAVTDVIIKNNLKDIGLF（配列番号１）
【００９１】
比較例２で用いられたＧαサブユニット（Ｇαolf）のアミノ酸配列が以下に示される。図５は（Ｇαolf）の二次元構造を模式的に示す。
MGCLGNSSKTAEDQGVDEKERREANKKIEKQLQKERLAYKATHRLLLLGAGESGKSTIVKQMRILHVNGFNPEEKKQKILDIRKNVKDAIVTIVSAMSTIIPPVPLANPENQFRSDYIKSIAPITDFEYSQEFFDHVKKLWDDEGVKACFERSNEYQLIDCAQYFLERIDSVSLVDYTPTDQDLLRCRVLTSGIFETRFQVDKVNFHMFDVGGQRDERRKWIQCFNDVTAIIYVAACSSYNMVIREDNNTNRLRESLDLFESIWNNRWLRTISIILFLNKQDMLAEKVLAGKSKIEDYFPEYANYTVPEDATPDAGEDPKVTRAKFFIRDLFLRISTATGDGKHYCYPHFTCAVDTENIRRVFNDCRDIIQRMHLKQYELL（配列番号２）
【００９２】
比較例３で用いられたキメラＧαサブユニット（Ｇi/olf5）のアミノ酸配列が以下に示される。はＧαｉタンパク質のＣ末端側から５アミノ酸が、Ｇαolfの対応するアミノ酸で置換したされたキメラＧαサブユニットである。図６はＧi/olf5の二次元構造を模式的に示す。
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWFTDTSIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYPEYAGSNTYEEAAAYIQCQFEDLNKRKDTKEIYTHFTCATDTKNVQFVFDAVTDVIIKNNLKQYELL（配列番号３）
【００９３】
比較例４で用いられたキメラＧαサブユニット（Ｇi/olf45）のアミノ酸配列が以下に示される。図９はＧi/olf45の二次元構造を模式的に示す。
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWFTDTSIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYPEYAGSNTYEEAAAYIQCQFEDLNTATGDGKHYCYPHFTCAVDTENIRRVFNDCRDIIQRMHLKQYELL（配列番号６）
【００９４】
比較例５で用いられたＧαサブユニット（Ｇi/olf156）のアミノ酸配列が以下に示される。図１２はＧi/olf156の二次元構造を模式的に示す。
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFNDVTAIIYVAACSSYNMVIREDNNTNRLRESLDLFESIWNNRWLRTISIILFLNKQDMLAEKVLAGKSKIEDYFPEYANYTVPEDATPDAGEDPKVTRAKFFIRDLFLRISTATGDGKHYCYPHFTCAVDTENIRRVFNDCRDIIQRMHLKQYELL（配列番号９）
【００９５】
比較例６で用いられたキメラＧαサブユニット（Ｇi/olf195）のアミノ酸配列が以下に示される。図１３はＧi/olf195の二次元構造を模式的に示す。
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRCRVLTSGIFETRFQVDKVNFHMFDVGGQRDERRKWIQCFNDVTAIIYVAACSSYNMVIREDNNTNRLRESLDLFESIWNNRWLRTISIILFLNKQDMLAEKVLAGKSKIEDYFPEYANYTVPEDATPDAGEDPKVTRAKFFIRDLFLRISTATGDGKHYCYPHFTCAVDTENIRRVFNDCRDIIQRMHLKQYELL(配列番号１０）
【００９６】
比較例７で用いられたキメラＧαサブユニット（Ｇi/olfα3-β5）のアミノ酸配列が以下に示される。図１４はＧi/olfα3-β5の二次元構造を模式的に示す。
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWLRTISIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYPEYAGSNTYEEAAAYIQCQFEDLNKRKDTKEIYTHFTCATDTKNVQFVFDAVTDVIIKNNLKDCGLF（配列番号１１）
【００９７】
比較例８で用いられたキメラＧαサブユニット（Ｇi/olfα4-β6）のアミノ酸配列が以下に示される。図１６はＧαi/olfα4-β6の二次元構造を模式的に示す。
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWFTDTSIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYPEYAGSNTYEEAAAYIQCQFEDLNTATGDGKHYCYTHFTCATDTKNVQFVFDAVTDVIIKNNLKDCGLF（配列番号１３）
【００９８】
比較例９で用いられたキメラＧαサブユニット（Ｇi/olfα3-β5,α4-β6）のアミノ酸配列が以下に示される。図１７はＧαi/olfα3-β5,α4-β6の二次元構造を模式的に示す。
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWLRTISIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYPEYAGSNTYEEAAAYIQCQFEDLNTATGDGKHYCYTHFTCATDTKNVQFVFDAVTDVIIKNNLKDCGLF（配列番号１４）
【００９９】
比較例１０で用いられたキメラＧαサブユニット（Ｇi/olfα3-β5,α4-β6,C）のアミノ酸配列が以下に示される。図１９はＧi/olfα3-β5,α4-β6,Cの二次元構造を模式的に示す。
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWLRTISIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYPEYAGSNTYEEAAAYIQCQFEDLNTATGDGKHYCYTHFTCATDTKNVQFVFDAVTDIIQRMHLKQYELL（配列番号：１６）
【０１００】
実施例１〜４、比較例１〜６、および比較例１１の測定結果が表１１および図３０に示される。測定結果は、電流密度の変化量、すなわち、ＩＳＯが供給されていない場合に測定された膜電流の電流密度（電流値／細胞膜容量）とＩＳＯが供給された場合に測定された膜電流の電流密度の差として示される。
【０１０１】
【表１１】
2012042684.tif 000061
【０１０２】
実施例１、実施例５、実施例６、比較例１、および比較例７〜１０の測定結果が表１２および図３０に示される。測定結果は、電流密度の変化量、すなわち、ＩＳＯが供給されていない場合に測定された膜電流の電流密度（電流値／細胞膜容量）とＩＳＯが供給された場合に測定された膜電流の電流密度の差として示される。
【０１０３】
【表１２】
2012042684.tif 000062
【０１０４】
（ｃＡＭＰ法との比較）
本発明による化学物質の検出感度を、慣用の化学物質検出方法であるｃＡＭＰ法の検出感度と比較した。ｃＡＭＰ法は、作動薬と受容体との相互作用により増加した細胞内液中のｃＡＭＰ濃度が測定され、該測定値に基づいて作動薬の濃度が定量される方法である。具体的には、β１アドレナリン受容体とカリウムイオンチャネルKir3.1(F137S)とを発現した細胞が、ＩＳＯを含む緩衝液に接触した後に破砕された。得られた破砕液に含有されるｃＡＭＰの濃度が測定された。当該濃度測定は、測定用キッド（ａｓｓａｙ  ｄｅｓｉｇｎｓ社製；ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  ＥＫＡ  ｋｉｔ）を用いて測定された。当該キッドは競合ＥＩＡ（competitive enzyme immunoassay)を用いてｃＡＭＰ濃度を測定する。緩衝液中のＩＳＯ濃度が１０００ｎＭである場合のｃＡＭＰ濃度を１００とした、各ＩＳＯ濃度でのｃＡＭＰ濃度の比が算出された。一方、ＩＳＯ濃度を変化させて測定を行った以外は、実施例３と同様の測定が行われた。ＩＳＯ濃度が３０ｎＭである場合の電流密度の変化値を１００とした、各ＩＳＯ濃度における電流密度の変化値の比が算出された。結果が表１３および図３２に示される。
【０１０５】
【表１３】
2012042684.tif 000063
【０１０６】
表１３および図３２から理解されることが以下に記述される。ｃＡＭＰ法を用いた場合に検出可能なＩＳＯ濃度の下限は約１０ｎＭであると考えられる。なぜならば、ＩＳＯ濃度０〜１ｎＭの緩衝液に接触した場合は、ｃＡＭＰ濃度の、ＩＳＯ濃度に依存的な上昇は観測されなかったからである。ＩＳＯの検出感度の指標となる、β1アドレナリン受容体に対するＩＳＯの半数効果濃度（ＥＣ50）は１３５ｎＭであった。一方、キメラαサブユニットＧi/olf94タンパク質を用いた本発明の方法では、ＩＳＯの検出下限濃度は０．３ｎＭであった。イオン電流の変化量は、ＩＳＯ濃度約３０ｎＭで飽和した。この場合の半β１に対するアドレナリン受容体の半数効果濃度は１ｎＭである。本発明のキメラＧαサブユニットタンパク質を用いた化学物質の検出方法によれば、従来、一般的に用いられてきたｃＡＭＰ法に比して、約１００倍の感度で、ＩＳＯが検出され得る。細胞内の複雑な分子間反応に依拠することなく、化学物質の受容体への結合を、キメラＧタンパク質を介して直接イオンチャネルに伝達したことが、当該高感度な検出を可能にしたと考えられえる。
【０１０７】
（βアドレナリン受容体作動薬の検出）
イソプロテレノール以外のβ１アゴニストの検出を行った。化学物質として、ＩＳＯに加えて、β１アドレナリン受容体選択的な作動薬であるドブタミン（dobutamine）、およびβアドレナリン受容体の作動薬であるドーパミン（dopamine）を用いた以外は実施例３と同様の測定を行った。測定結果が表１４および図３３に示される。測定結果は、ドーパミンについては３００００ｎＭ、ドブタミンについては１００ｎＭ、ＩＳＯについては濃度３０ｎＭで観測された電流密度の変化値を１００とした相対値として記載される。
【０１０８】
【表１４】
2012042684.tif 000064
【０１０９】
いずれの作動薬を用いた場合においても作動薬濃度の増加に伴い、電流密度の変化値が増加した。ドーパミン、およびドブタミンのＥＣ50値は、それぞれ、１０００ｎＭおよび５０ｎＭであった。電流密度の変化は、作動薬が化学物質の受容体を介して、キメラＧタンパク質を活性化させ、イオンチャネルのゲートを開かせることによって生じていることが合理的に推測される。なぜならば、作動薬の種類によってＥＣ50値が異なるからである。すなわち、作動薬は直接ではなく、間接的にキメラＧタンパク質を活性化している。
【０１１０】
（参考例）
本発明者らは、本発明に先立って以下の検討を行い、キメラＧαサブユニットの設計方針を決定した。Ｇαサブユニットとして、Ｇαi（Ｃ３５１Ｇ）、Ｇαolf、およびＧi/olf13を使用して、ＩＳＯとの接触により生じるイオン電流をを測定した。測定は、実施例１と同様の方法により行われた。
【０１１１】
図２６に示されるように、キメラＧαサブユニットとしてＧαｉ（Ｃ３５１Ｇ）が用いられ、ＩＳＯが供給されていない場合、パルス波が印加された直後に約−０．２ｎＡの電流値が計測された。ここで、電流値が−（マイナス）であることは、カリウムイオンが脂質二重膜の表側から裏側（細胞外から細胞内）へ移動したことを示している。ＩＳＯが供給された場合、電流値は変化し、約０．５ｎＡとなった。
【０１１２】
図２７に示されるように、キメラＧαサブユニットとしてＧi/olf13が用いられた場合、ＩＳＯの供給により電流値は変化し、約−２．５ｎＡとなった。図２８に示されるように、キメラＧαサブユニットとしてＧαolfタンパク質が用いられた場合、Ｇαi（Ｃ３５１Ｇ）が用いられた場合と同様に、約０．５ｎＡの電流値が測定され、ＩＳＯ添加による電流値の変化量は小さかった。
【０１１３】
本発明者らは、上記測定結果から以下の結論を導いた。Ｇαi（Ｃ３５１Ｇ）はカリウムイオンチャネルを活性化することができるが、化学物質の受容体と結合することはできない。Ｇαolfは化学物質の受容体と結合することができるが、カリウムイオンチャネルを活性化することはできない。そのためＩＳＯ添加による電流変化量は小さかった。一方、Ｇi/olf13が用いられた場合、キメラＧαサブユニットはＣ末端のＧαolf領域を介して化学物質の受容体と結合することができるとともに、Ｇαi領域がカリウムイオンチャネルを活性化するため、ＩＳＯの添加によって大きな電流変化が観察された。従って、Ｇαサブユニットのキメラ化は、ＩＳＯ添加による電流変化量を増加させる。
【０１１４】
さらに、キメラＧαサブユニットとしてＧi/s13が用いられた場合と、Ｇi/olf13が用いられた場合における、電流変化量が比較された。測定結果が表１５および図２９に示される。Ｇαi（Ｃ３５１Ｇ）およびＧolfが用いられた場合の測定結果が参考のために並べて示される。
【０１１５】
【表１５】
2012042684.tif 000065
【０１１６】
Ｇi/ofl13が用いられた場合の方が電流変化量はＧi/s13が用いられた場合の電流変化量よりも大きかった。従って、ＧαiとＧαolfとのキメラが用いられた場合、
より大きな電流変化が期待できると判断された。従って、Ｇαiのアミノ酸配列で、化学物質の受容体との連動に関与すると一般に考えられている領域が、対応するＧαolfのアミノ酸配列で置換された、キメラＧαサブユニットを作製することを決定した。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明のキメラＧタンパク質によれば、化学物質受容体と結合する化学物質を検出することができる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質二重膜の表側から裏側にカリウムイオンを輸送する方法であって、以下の工程（ａ）および工程（ｂ）を具備する：
前記脂質二重膜を用意する工程（ａ）
ここで、前記脂質二重膜は、化学物質の受容体、Ｇタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備し、
前記Ｇタンパク質は、キメラＧαサブユニット、およびＧβγサブユニット複合体を具備し、
前記キメラＧαサブユニットは、Ｇi/olf13（配列番号：０４）、Ｇi/olf28（配列番号：０５）、Ｇi/olf94（配列番号：０７）、Ｇi/olf113（配列番号：０８）、Ｇi/olfα3-β5,C（配列番号：１２）、またはＧi/olfα4-β6,C（配列番号：１５）のいずれかからなり、および
前記化学物質および前記カリウムイオンを前記表側から供給し、前記キメラＧαサブユニットおよび前記Ｇβγサブユニット複合体の放出、および前記Ｇβγサブユニット複合体の前記カリウムイオンチャネルへの結合により、前記表側から前記裏側に前記カリウムイオンを輸送する工程（ｂ）。
【請求項２】
前記化学物質が、アドレナリン受容体作動薬である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カリウムイオンチャネルが、Ｇタンパク質共役型内向き整流カリウムイオンチャネルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
化学物質を検出又は定量する方法であって以下の工程（ｃ）〜（ｅ）を具備する：
脂質二重膜、前記脂質二重膜の表側に位置する第１液体、および前記脂質二重膜の裏側に位置する第２液体を用意する工程（ｃ）、
ここで、前記脂質二重膜は、化学物質の受容体、Ｇタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備し、
前記Ｇタンパク質は、キメラＧαサブユニット、およびＧβγサブユニット複合体を具備し、
前記キメラＧαサブユニットは、Ｇi/olf13（配列番号：０４）、Ｇi/olf28（配列番号：０５）、Ｇi/olf94（配列番号：０７）、Ｇi/olf113（配列番号：０８）、Ｇi/olfα3-β5,C（配列番号：１２）、またはＧi/olf α4-β6,C（配列番号：１５）のいずれかからなり、
前記第１液体はカリウムイオンを含有し、
前記第１液体に前記化学物質を供給する工程（ｄ）、および
前記第１および第２液体の少なくともいずれか一方のカリウムイオンの量を測定し、前記カリウムイオンの量に基づいて前記化学物質を検出又は定量する工程（ｅ）。
【請求項５】
前記化学物質が、アドレナリン受容体作動薬である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記カリウムイオンチャネルが、Ｇタンパク質共役型内向き整流カリウムイオンチャネルである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
化学物質を検出または定量する方法であって、以下の工程（ｆ）〜（ｈ）を具備する：
脂質二重膜を用意する工程（ｆ）、
ここで、前記脂質二重膜は、化学物質の受容体、Ｇタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備し、
前記Ｇタンパク質は、キメラＧαサブユニットおよび前記Ｇβγサブユニット複合体を具備し、
前記キメラＧαサブユニットは、Ｇi/olf13（配列番号：０４）、Ｇi/olf28（配列番号：０５）、Ｇi/olf94（配列番号：０７）、Ｇi/olf113（配列番号：０８）、Ｇi/olfα3-β5,C（配列番号：１２）、またはＧi/olfα4-β6,C（配列番号：１５）のいずれかからなり、
前記脂質二重膜の表側および裏側にそれぞれ位置する第１および第２液体を供給し、前記第１および第２液体の間に前記脂質二重膜を挟む工程（ｇ）、
ここで、前記第１液体はカリウムイオンおよび化学物質を含有し、および
前記第１および第２液体の少なくともいずれか一方のカリウムイオンの量を測定し、前記カリウムイオンの量に基づいて前記化学物質を検出または定量する工程（ｈ）。
【請求項８】
前記化学物質が、アドレナリン受容体作動薬である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記カリウムイオンチャネルが、Ｇタンパク質共役型内向き整流イオンチャネルである、請求項７に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2012042684.tif 000066
【図２】
2012042684.tif 000067
【図３】
2012042684.tif 000068
【図４】
2012042684.tif 000069
【図５】
2012042684.tif 000070
【図６】
2012042684.tif 000071
【図７】
2012042684.tif 000072
【図８】
2012042684.tif 000073
【図９】
2012042684.tif 000074
【図１０】
2012042684.tif 000075
【図１１】
2012042684.tif 000076
【図１２】
2012042684.tif 000077
【図１３】
2012042684.tif 000078
【図１４】
2012042684.tif 000079
【図１５】
2012042684.tif 000080
【図１６】
2012042684.tif 000081
【図１７】
2012042684.tif 000082
【図１８】
2012042684.tif 000083
【図１９】
2012042684.tif 000084
【図２０】
2012042684.tif 000085
【図２１】
2012042684.tif 000086
【図２２】
2012042684.tif 000087
【図２３】
2012042684.tif 000088
【図２４】
2012042684.tif 000089
【図２５】
2012042684.tif 000090
【図２６】
2012042684.tif 000091
【図２７】
2012042684.tif 000092
【図２８】
2012042684.tif 000093
【図２９】
2012042684.tif 000094
【図３０】
2012042684.tif 000095
【図３１】
2012042684.tif 000096
【図３２】
2012042684.tif 000097
【図３３】
2012042684.tif 000098
【手続補正書】
【提出日】平成23年12月8日(2011.12.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
細胞の脂質二重膜に存在するＧタンパク質結合型受容体（G protein-coupled receptor)（以下、場合により『ＧＰＣＲ』と称される。）は、細胞の脂質二重膜に存在するＧタンパク質と連動して機能する。図１に示されるように、神経伝達物質のような化学物質がＧＰＣＲに結合すると、細胞内においてＧＰＣＲと共役している三量体Ｇタンパク質が活性化され、Ｇαサブユニットと、ＧβサブユニットおよびＧγサブユニットからなる二量体（以下、場合により『Ｇβγサブユニット複合体』と称される。）とに解離する。それらは各々、種々のシグナルを伝達する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
【図１】三量体Ｇタンパク質によるシグナル伝達を示す模式図
【図２】ＧＩＲＫの働きを利用した、化学物質センサを示す模式図
【図３】Ｇタンパク質の２次元構造を示す模式図
【図４】Ｇαiの二次元構造を示す模式図
【図５】Ｇαolfの二次元構造を模式的に示す図
【図６】Ｇi/olf5の二次元構造を模式的に示す図
【図７】Ｇi/olf13の二次元構造を模式的に示す図
【図８】Ｇi/olf28の二次元構造を模式的に示す図
【図９】Ｇi/olf45の二次元構造を模式的に示す図
【図１０】Ｇi/olf94の二次元構造を模式的に示す図
【図１１】Ｇi/olf113の二次元構造を模式的に示す図
【図１２】Ｇi/olf156の二次元構造を模式的に示す図
【図１３】Ｇi/olf195の二次元構造を模式的に示す図
【図１４】Ｇi/olfα3-β5の二次元構造を模式的に示す図
【図１５】Ｇi/olfα3-β5,Cの二次元構造を模式的に示す図
【図１６】Ｇi/olfα4-β6の二次元構造を模式的に示す図
【図１７】Ｇi/olfα3-β5,α4-β6の二次元構造を模式的に示す図
【図１８】Ｇi/olfα4-β6,Cの二次元構造を模式的に示す図
【図１９】Ｇi/olfα3-β5,α4-β6,Cの二次元構造を模式的に示す図
【図２０】β１アドレナリン受容体発現プラスミドの作製方法を概念的に示す図
【図２１】Ｋｉｒ３．１発現プラスミドの作製方法を概念的に示す図
【図２２】Ｋｉｒ３．１（Ｆ１３７Ｓ）発現プラスミドの作製方法を概念的に示す図
【図２３】キメラＧタンパク質発現プラスミドの作製方法を概念的に示す図
【図２４】キメラＧタンパク質発現プラスミドの作製方法を概念的に示す図
【図２５】キメラＧタンパク質発現プラスミドの作製方法を概念的に示す図
【図２６】Ｇαi（Ｃ３５１Ｇ）タンパク質発現細胞のイオン電流を示す図
【図２７】Ｇi/olf13タンパク質発現細胞のイオン電流を示す図
【図２８】野生型Ｇαolfタンパク質発現細胞のイオン電流を示す図
【図２９】キメラＧタンパク質発現細胞のイオン電流の変化を示す図
【図３０】Ｇタンパク質発現細胞のイオン電流の変化を示す図
【図３１】Ｇタンパク質発現細胞のイオン電流の変化を示す図
【図３２】本発明の構成による化学センサの、従来の化学物質検出方法に対する優位性を示す図
【図３３】キメラＧタンパク質発現細胞のカリウムイオン電流の、各種化学物質に対する濃度依存性を示す図
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明で使用される脂質二重膜は、化学物質受容体、キメラＧタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
図１０に示されるように、Ｇi/olf94の二次元構造は、Ｇαi（Ｃ３５１Ｇ）のαＧ−α４ループを含むＣ末端側の領域が、Ｇαolfの対応する領域で置換された構造である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
（カリウムイオンチャネル）
カリウムイオンチャネルとしては、Ｇタンパク質共役型内向き整流性カリウムチャネル（ＧＩＲＫ）が用いられる。ＧＩＲＫは、Ｋｉｒ３．１、Ｋｉｒ３．２、Ｋｉｒ３．３およびＫｉｒ３．４の４つのサブタイプに分類される。本発明において、Ｋｉｒ３．１の１３７番目のフェニルアラニンがセリンで置換された変異型Ｋｉｒ３．１（Ｆ１３７Ｓ）が好ましく用いられる。その理由が以下に記述される。サブタイプＫｉｒ３．１〜Ｋｉｒ３．４は、相異なるサブタイプとヘテロ多量体を形成する。換言すると、ＧＩＲＫは２種のサブタイプを含む。しかしながら、変異型Ｋｉｒ３．１（Ｆ１３７Ｓ）はホモ４量体を形成し、当該４量体がカリウムイオンチャネルを構成する。従って、変異型Ｋｉｒ３．１（Ｆ１３７Ｓ）を用いた場合はカリウムイオンチャネルの構成に必要とされるタンパク質の種類は１種類である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
（カリウムイオンの輸送）
化学物質の受容体、キメラＧタンパク質、およびカリウムイオンチャネルを具備する脂質二重膜の表側と裏側は、それぞれ、適宜な緩衝液に接触している。当該脂質二重膜の表側に接触する緩衝液は、カリウムイオンを濃度１〜１０００ｍＭで含有する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
（変異型カリウムイオンチャネルKir3.1(F137S)発現プラスミドの作製）
変異型カリウムイオンチャネルKir3.1(F137S)の遺伝子は、マウスKir3.1の遺伝子を部分的に変異させることにより構築された。図２１は、マウスKir3.1発現プラスミドの作製手順を示す。マウスKir3.1の遺伝子は、２断片に分けて増幅された。Mouse Brain cDNA Library（クロンテック製）が鋳型として用いられた。一回目のＰＣＲで、一方の断片の増幅に用いられたプライマーは、プライマー７（配列番号２３）およびプライマー８（配列番号２４）であった。他方の断片の増幅に用いられたプライマーは、プライマー９（配列番号２５）およびプライマー１０（配列番号２６）であった。２回目のＰＣＲで、一方の断片の増幅に用いられたプライマーは、プライマー１１（配列番号２７）およびプライマー１２（配列番号２８）であった。ＰＣＲ産物を切り出す制限酵素としてNhe IおよびCla Iが用いられた。他方の断片の増幅に用いられたプライマーは、プライマー１３（配列番号２９）およびプライマー１４（配列番号３０）であった。ＰＣＲ産物を切り出す制限酵素としてはCla IおよびNot Iが用いられた。得られた遺伝子断片はあらかじめNhe IおよびNot Iで処理した発現プラスミドにライゲーションされ、マウスKir3.1発現プラスミド（以下、『plasmid(Kir3.1)』と称される。）が得られた。用いられたプライマーの配列が表２に示される。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
（野生型Ｇタンパク質（Ｇαolf）発現プラスミドの作製）
マウス嗅球から単離されたＲＮＡを、逆転写酵素を用いて逆転写することによって、マウス嗅細胞の全ｃＤＮＡが得られた。得られたｃＤＮＡが鋳型として用いられ、ＰＣＲによりＧαｏｌｆの遺伝子が増幅された。プライマー１７（配列番号３３）およびプライマー１８（配列番号３４）が用いられた。得られた遺伝子断片をプラスミドがプラスミドにライゲーションされ、Ｇαolf遺伝子（GenBank登録番号：AY179168.1）がクローニングされた。得られたＧαolf断片が、ＰＣＲによりさらに増幅された。プライマー１９（配列
番号３５）およびプライマー２０（配列番号３６）が用いられた。これにより、増幅断片の末端に制限酵素サイトが付加された。当該制限酵素サイトを有する増幅断片が発現プラスミドにライゲーションされ、野生型Ｇタンパク質（Ｇαolf）発現プラスミド（以下『plasmid（Ｇαolf）』と称される。）を得た。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα3-β5）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα3-β5）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇi/olfα3-β5）』と称される。）は、鋳型Iとしてplasmid（Ｇi/olf13）を、鋳型IIとしてplasmid（Ｇαi）をそれぞれ用い、オーバーラップエクステンションＰＣＲによって作製された。図２５に示されるように、鋳型Iを用いたＰＣＲのために、プライマーとしてプライマ
ー３６（配列番号５２）およびE-PRIMERが用いられた。具体的には、E-PRIMERとしてプライマー３７（配列番号５３）が用いられた。得られた断片の一部がE-PRIMERの相補的配列に付加され、付着末端が形成された。鋳型IIを用いたＰＣＲのために、プライマーとしてプライマー３９（配列番号５５）およびF-PRIMERが用いられた。具体的には、F-PRIMERとしてプライマー３８（配列番号５４）が用いられた。得られた断片の一部がF-PRIMERの相補的配列に付加され、付着末端が形成された。プライマー３６およびプライマー３９を用いたオーバーラップエクステンションＰＣＲによって、各ＰＣＲ産物は付着末端を介して互いに連結された。得られた断片はEcoRIにより処理され、あらかじめEcoRIで処理された発現プラスミドにライゲーションされ、plasmid（Ｇi/olfα3-β5）を得た。plasmid（Ｇi/olfα3-β5）で形質転換された大腸菌が培養された。大腸菌から精製されたplasmid（Ｇi/olfα3-β5）が細胞への導入に用いられた。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα4-β6）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα4-β6）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇi/olfα4-β6）』と称される。）は、鋳型、E-PRIMER、F-PRIMER、および制限酵素として表７に
記載されたものが使用された以外は、plasmid（Ｇolfα3-β5）の作製と同じ手順により
作製された。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα4-β6,C）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα4-β6,C）発現プラスミド（以下、『plasmid（Ｇi/olfα4-β6,C）』と称される。）は、鋳型、E-PRIMER、F-PRIMER、および制限酵素として表
７に記載されたものが使用された以外は、plasmid（Ｇolfα3-β5）の作製と同じ手順に
より作製された。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
（キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα3-β5,α4-β6）発現プラスミドの作製）
キメラＧタンパク質（Ｇi/olfα3-β5,α4-β6）発現プラスミド（以下、『plasmid（
Ｇi/olfα3-β5,α4-β6）』と称される。）は、鋳型、E-PRIMER、F-PRIMER、および制限酵素として表７に記載されたものが使用された以外は、plasmid（Ｇolfα3-β5）の作製
と同じ手順により作製された。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
（比較例１〜１０）
Ｇi/olf13を具備するキメラＧタンパク質に換えて、それぞれ、表１０中に記載された
Ｇαサブユニットを具備するキメラＧタンパク質が採用されたこと以外は、実施例１と同様にキメラＧタンパク発現細胞が調製され、膜電流が測定された。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
比較例３で用いられたキメラＧαサブユニット（Ｇi/olf5）のアミノ酸配列が以下に示される。Ｇi/olf5はＧαｉタンパク質のＣ末端側から５アミノ酸が、Ｇαolfの対応するアミノ酸で置換したされたキメラＧαサブユニットである。図６はＧi/olf5の二次元構造を模式的に示す。
MGCTLSAEDKAAVERSKMIDRNLREDGEKAAREVKLLLLGAGESGKSTIVKQMKIIHEAGYSEEECKQYKAVVYSNTIQSIIAIIRAMGRLKIDFGDSARADDARQLFVLAGAAEEGFMTAELAGVIKRLWKDSGVQACFNRSREYQLNDSAAYYLNDLDRIAQPNYIPTQQDVLRTRVKTTGIVETHFTFKDLHFKMFDVGGQRSERKKWIHCFEGVTAIIFCVALSDYDLVLAEDEEMNRMHESMKLFDSICNNKWFTDTSIILFLNKKDLFEEKIKKSPLTICYPEYAGSNTYEEAAAYIQCQFEDLNKRKDTKEIYTHFTCATDTKNVQFVFDAVTDVIIKNNLKQYELL（配列番号３）
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
（ｃＡＭＰ法との比較）
本発明による化学物質の検出感度を、慣用の化学物質検出方法であるｃＡＭＰ法の検出感度と比較した。ｃＡＭＰ法は、作動薬と受容体との相互作用により増加した細胞内液中のｃＡＭＰ濃度が測定され、該測定値に基づいて作動薬の濃度が定量される方法である。具体的には、β１アドレナリン受容体とカリウムイオンチャネルKir3.1(F137S)とを発現
した細胞が、ＩＳＯを含む緩衝液に接触した後に破砕された。得られた破砕液に含有されるｃＡＭＰの濃度が測定された。当該濃度測定は、測定用キット（ａｓｓａｙ  ｄｅｓｉｇｎｓ社製；ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  ＥＩＡ  ｋｉｔ）を用いて測定された。当該キットは競合ＥＩＡ（competitive enzyme immunoassay)を用いてｃＡＭＰ濃度を測定する。緩
衝液中のＩＳＯ濃度が１０００ｎＭである場合のｃＡＭＰ濃度を１００とした、各ＩＳＯ濃度でのｃＡＭＰ濃度の比が算出された。一方、ＩＳＯ濃度を変化させて測定を行った以外は、実施例３と同様の測定が行われた。ＩＳＯ濃度が３０ｎＭである場合の電流密度の変化値を１００とした、各ＩＳＯ濃度における電流密度の変化値の比が算出された。結果が表１３および図３２に示される。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
表１３および図３２から理解されることが以下に記述される。ｃＡＭＰ法を用いた場合に検出可能なＩＳＯ濃度の下限は約１０ｎＭであると考えられる。なぜならば、ＩＳＯ濃度０〜１ｎＭの緩衝液に接触した場合は、ｃＡＭＰ濃度の、ＩＳＯ濃度に依存的な上昇は観測されなかったからである。ＩＳＯの検出感度の指標となる、β1アドレナリン受容体
に対するＩＳＯの半数効果濃度（ＥＣ50）は１３５ｎＭであった。一方、キメラαサブユニットＧi/olf94タンパク質を用いた本発明の方法では、ＩＳＯの検出下限濃度は０．３
ｎＭであった。イオン電流の変化量は、ＩＳＯ濃度約３０ｎＭで飽和した。この場合のβ１アドレナリン受容体に対するＩＳＯの半数効果濃度は１ｎＭであった。本発明のキメラＧαサブユニットタンパク質を用いた化学物質の検出方法によれば、従来、一般的に用いられてきたｃＡＭＰ法に比して、約１００倍の感度で、ＩＳＯが検出され得る。細胞内の複雑な分子間反応に依拠することなく、化学物質の受容体への結合を、キメラＧタンパク質を介して直接イオンチャネルに伝達したことが、当該高感度な検出を可能にしたと考えられえる。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
（参考例）
本発明者らは、本発明に先立って以下の検討を行い、キメラＧαサブユニットの設計方針を決定した。Ｇαサブユニットとして、Ｇαi（Ｃ３５１Ｇ）、Ｇαolf、およびＧi/olf13を使用して、ＩＳＯとの接触により生じるイオン電流を測定した。測定は、実施例１と同様の方法により行われた。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
Ｇi/ofl13が用いられた場合の方が電流変化量はＧi/s13が用いられた場合の電流変化量よりも大きかった。従って、ＧαiとＧαolfとのキメラが用いられた場合、より大きな電流変化が期待できると判断された。従って、Ｇαiのアミノ酸配列で、化学物質の受容体との連動に関与すると一般に考えられている領域が、対応するＧαolfのアミノ酸配列で置換された、キメラＧαサブユニットを作製することを決定した。
【手続補正書】
【提出日】平成23年12月26日(2011.12.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2012042684000001.app
【国際調査報告】
2012042684.tif 000099
2012042684.tif 000100
2012042684.tif 000101
2012042684.tif 000102