(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ及び／又はＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖等のフコース含有糖鎖に対する結合親和性が向上したフコース結合性タンパク質の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列で示されるフコース結合性タンパク質ＢＣ２ＬＣＮのアミノ酸配列において、Ｃ末端側の複数のアミノ酸残基を欠失させる、並びに必要により３６番目のグリシン残基をシステイン残基に置換する、３９番目のグルタミン残基をロイシン残基又はメチオニン残基に置換する、６５番目のグルタミン残基をロイシン残基に置換する、７２番目のシステイン残基をグリシン残基又はアラニン残基に置換する、８１番目のグルタミン酸残基をシステイン残基、グルタミン残基、ヒスチジン残基、又はメチオニン残基に置換する、及び３６番目として特定されるグリシン残基をシステイン残基に置換する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、フコース結合性タンパク質であって、
Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃからなる構造を含む糖鎖および／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖に対する結合親和性を有し、
ただし、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質は除く、フコース結合性タンパク質：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列であって、Ｘが１１０以上１４０以下の整数である、アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列であって、Ｘが１１０以上１４０以下の整数である、アミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、Ｘが１１０以上１４０以下の整数である、アミノ酸配列；
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のアミノ酸配列において、特定のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列であって、当該特定のアミノ酸置換が以下の（１）から（５）に記載のアミノ酸置換から選択される１つ以上のアミノ酸置換である、アミノ酸配列：
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基に相当するアミノ酸残基の、グルタミン残基以外のアミノ酸残基への置換；
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の７２番目のシステイン残基に相当するアミノ酸残基の、システイン残基以外のアミノ酸残基への置換；
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６５番目のグルタミン残基に相当するアミノ酸残基の、グルタミン残基以外のアミノ酸残基への置換；
（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の８１番目のグルタミン酸残基に相当するアミノ酸残基の、グルタミン酸残基以外のアミノ酸残基への置換；
（５）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３６番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基の、グリシン残基以外のアミノ酸残基への置換。
【請求項２】
前記（１）から（５）に記載のアミノ酸置換が、それぞれ、以下の（６）から（１０）に記載のアミノ酸置換である、請求項１に記載のフコース結合性タンパク質：
（６）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基に相当するアミノ酸残基の、ロイシン残基またはメチオニン残基への置換；
（７）配列番号１で示されるアミノ酸配列の７２番目のシステイン残基に相当するアミノ酸残基の、グリシン残基またはアラニン残基への置換；
（８）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６５番目のグルタミン残基に相当するアミノ酸残基の、ロイシン残基への置換；
（９）配列番号１で示されるアミノ酸配列の８１番目のグルタミン酸残基に相当するアミノ酸残基の、システイン残基、グルタミン残基、ヒスチジン残基、メチオニン残基、バリン残基、リジン残基、セリン残基、イソロイシン残基、チロシン残基、グリシン残基、プロリン残基、ロイシン残基、またはアスパラギン残基への置換；
（１０）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３６番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基の、システイン残基への置換。
【請求項３】
全長が、９５〜１７５残基である、請求項１または２に記載のフコース結合性タンパク質。
【請求項４】
前記（ａ）〜（ｄ）に記載のアミノ酸配列の長さが、９５〜１５５残基である、請求項１から３のいずれか１項に記載のフコース結合性タンパク質。
【請求項５】
配列番号２から配列番号１６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載のフコース結合性タンパク質。
【請求項６】
Ｎ末端および／またはＣ末端に付加的なアミノ酸配列を有する、請求項１から５のいずれか１項に記載のフコース結合性タンパク質。
【請求項７】
Ｃ末端に付加したアミノ酸配列がシステイン残基を含むオリゴペプチドである、請求項１から６のいずれか１項に記載のフコース結合性タンパク質。
【請求項８】
Ｎ末端に付加したアミノ酸配列がポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドである、請求項１から７のいずれか１項に記載のフコース結合性タンパク質。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１項に記載のフコース結合性タンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項９に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項１１】
請求項９に記載のＤＮＡまたは請求項１０に記載の発現ベクターを有する形質転換体。
【請求項１２】
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、請求項１１に記載の形質転換体。
【請求項１３】
フコース結合性タンパク質の製造方法であって、
請求項１１または１２に記載の形質転換体を培養することによりフコース結合性タンパク質を発現する工程；および
発現した前記フコース結合性タンパク質を回収する工程
を含み、
フコース結合性タンパク質が、請求項１から８のいずれか１項に記載のフコース結合性タンパク質である、方法。
【請求項１４】
不溶性担体と、該不溶性担体に固定化された請求項１から８のいずれか１項に記載のフコース結合性タンパク質とを備える、吸着剤。
【請求項１５】
吸着剤の製造方法であって、
不溶性担体から反応性不溶性担体を製造する工程；および
前記反応性不溶性担体に請求項１から８のいずれか１項に記載のフコース結合性タンパク質を固定化する工程
を含み、
吸着剤が、請求項１４に記載の吸着剤である、方法。
【請求項１６】
前記反応性不溶性担体が、マレイミド基またはハロアセチル基を有する不溶性担体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１４に記載の吸着剤が充填されたカラム。
【請求項１８】
細胞の分離方法であって、
請求項１４に記載の吸着剤と細胞混合物とを接触させる工程；および
前記吸着剤に吸着した細胞と吸着しなかった細胞とを分離する工程
を含む、方法。
【請求項１９】
前記細胞混合物が、第１の細胞と第２の細胞を含有する混合物であり、
前記第１の細胞が、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃからなる構造を含む糖鎖および／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖を有する細胞であり、
前記第２の細胞が、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃからなる構造を含む糖鎖およびＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖のいずれも有しない細胞である、
請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の細胞が未分化細胞であり、前記第２の細胞が分化細胞である、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１の細胞ががん細胞である、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２２】
フコース含有糖鎖を有する物質の精製方法であって、
請求項１４に記載の吸着剤と前記フコース含有糖鎖を有する物質とを接触させる工程；および
前記吸着剤に結合した前記物質を溶出する工程
を含み、
前記フコース含有糖鎖が、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃからなる構造を含む糖鎖および／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖である、方法。
【請求項２３】
前記物質が、前記フコース含有糖鎖および／または当該フコース含有糖鎖を有する複合糖質である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１７に記載のカラムが用いられる、請求項１８から２３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フコース結合性タンパク質、その製造方法、およびその用途に関する。本発明は、特に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等の宿主で発現した際の生産性、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖等のフコース含有糖鎖に対する結合親和性、および／または熱に対する安定性が向上したフコース結合性タンパク質に関するものであってよい。
【背景技術】
【０００２】
グラム陰性細菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）が産生するＢＣ２Ｌ−ＣレクチンのＮ末端ドメインに由来するＢＣ２ＬＣＮは、フコース残基を含む糖鎖への結合親和性を有するタンパク質であり、例えば、非特許文献１、特許文献１および特許文献２に記載の未分化糖鎖マーカーとして知られているＨタイプ１型糖鎖（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）およびＨタイプ３型糖鎖（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ）以外に、ルイスＹ型糖鎖（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ）やルイスＸ型糖鎖（Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ）等のフコース残基を含む複数種の糖鎖に高い結合親和性を有することが知られている（非特許文献２）。また、ＢＣ２ＬＣＮは、Ｈタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖が高発現している未分化状態のヒトｉＰＳ細胞やヒトＥＳ細胞には結合するが、ヒト体細胞には結合しないことが知られている（非特許文献３）。さらに、ＢＣ２ＬＣＮは前記未分化糖鎖マーカーに結合性を有することから、例えば、未分化糖鎖マーカーを含む複合糖質の検出や、ヒトｉＰＳ細胞やヒトＥＳ細胞等の未分化細胞の検出に使用されている（特許文献１および特許文献２）。また、Ｈタイプ１型糖鎖はＳＳＥＡ−５として特定のがん細胞に高発現していることが知られている（非特許文献４）。
【０００３】
ＢＣ２ＬＣＮは既知の未分化細胞検出用抗体である抗Ｎａｎｏｇ抗体等と同等の未分化幹細胞検出能をもっているものの（特許文献２）、ＢＣ２ＬＣＮと未分化細胞の糖鎖の結合は静電相互作用によるものであり、結合の強さは溶媒や塩濃度等の外環境の影響を受ける。このため、実験条件によっては前記未分化細胞および／または前記未分化糖鎖マーカーを含む複合糖質の検出において、当該糖鎖とＢＣ２ＬＣＮの結合親和性が低くなる可能性が考えられることから、前記未分化糖鎖マーカーへの結合親和性が向上したＢＣ２ＬＣＮが求められている。
【０００４】
タンパク質の機能を向上させる方法として、タンパク質工学的手法によりタンパク質にアミノ酸変異を導入し、目的とする機能を向上させる方法が公知であり、例えば特許文献３には特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、熱、酸および／またはアルカリに対する安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質が記載されている。しかしながら、特定位置のアミノ酸置換により熱に対する安定性や糖鎖への結合親和性が向上したＢＣ２ＬＣＮに関する報告はこれまでにない。また、ＢＣ２ＬＣＮを産業応用するためには、安定供給および大量供給の観点から、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等の微生物を利用して製造した場合の生産性が高い方が好ましいが、生産性が向上したＢＣ２ＬＣＮに関する報告もこれまでにない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２０１３／０６５３０２号
【特許文献２】ＷＯ２０１３／１２８９１４号
【特許文献３】特開２０１１−２０６０４６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔａｔｅｎｏ，Ｈ等，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１３，２（４）：２６５−２７３．
【非特許文献２】Ｓｕｌａｋ，Ｏ等，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．２０１０，１８（１）：５９−７２．
【非特許文献３】Ｔａｔｅｎｏ，Ｈ等，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１１，２８６（２３）：２０３４５−２０３５３．
【非特許文献４】Ｔａｎｇ，Ｃ等，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１，２９（９）：８２９−８３５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、優れた性質を有するフコース結合性タンパク質を提供することである。本発明の課題は、具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等の宿主で発現した際の生産性、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖等のフコース含有糖鎖に対する結合親和性、および／または熱に対する安定性が向上したフコース結合性タンパク質を提供することであってよい。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、配列番号１で示される１５５アミノ酸残基からなるＢＣ２ＬＣＮのアミノ酸配列において、Ｃ末端側の複数個のアミノ酸残基を欠失させることにより、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉで発現した際の生産性が飛躍的に向上することを見出した。また、本発明者らは、配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基をロイシン残基またはメチオニン残基に置換すること、および／または、配列番号１で示されるアミノ酸配列の６５番目のグルタミン残基をロイシン残基に置換すること、および／または、配列番号１で示されるアミノ酸配列の７２番目のシステイン残基をグリシン残基またはアラニン残基に置換することにより、熱に対する安定性が向上したフコース結合性タンパク質が得られることを見出した。また、本発明者らは、配列番号１で示されるアミノ酸配列の８１番目のグルタミン酸残基をシステイン残基、グルタミン残基、ヒスチジン残基、メチオニン残基、バリン残基、リジン残基、セリン残基、イソロイシン残基、チロシン残基、グリシン残基、プロリン残基、ロイシン残基、またはアスパラギン残基に置換することにより、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性が向上したフコース結合性タンパク質が得られることを見出した。また、本発明者らは、配列番号１で示されるアミノ酸配列の３６番目のグリシン残基をシステイン残基に置換することにより、Ｃ末端にシステイン残基を１つ以上含むオリゴペプチドを付加して製造した場合のジスルフィド結合形成による二量体の生成が抑制されることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、例えば、以下の［１］から［２４］に記載した発明を包含するものである。
［１］
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、フコース結合性タンパク質であって、
Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃからなる構造を含む糖鎖および／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖に対する結合親和性を有し、
ただし、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質は除く、フコース結合性タンパク質：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列であって、Ｘが１１０以上１４０以下の整数である、アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列であって、Ｘが１１０以上１４０以下の整数である、アミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、Ｘが１１０以上１４０以下の整数である、アミノ酸配列；
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のアミノ酸配列において、特定のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列であって、当該特定のアミノ酸置換が以下の（１）から（５）に記載のアミノ酸置換から選択される１つ以上のアミノ酸置換である、アミノ酸配列：
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基に相当するアミノ酸残基の、グルタミン残基以外のアミノ酸残基への置換；
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の７２番目のシステイン残基に相当するアミノ酸残基の、システイン残基以外のアミノ酸残基への置換；
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６５番目のグルタミン残基に相当するアミノ酸残基の、グルタミン残基以外のアミノ酸残基への置換；
（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の８１番目のグルタミン酸残基に相当するアミノ酸残基の、グルタミン酸残基以外のアミノ酸残基への置換；
（５）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３６番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基の、グリシン残基以外のアミノ酸残基への置換。
［２］
前記（１）から（５）に記載のアミノ酸置換が、それぞれ、以下の（６）から（１０）に記載のアミノ酸置換である、［１］に記載のフコース結合性タンパク質：
（６）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基に相当するアミノ酸残基の、ロイシン残基またはメチオニン残基への置換；
（７）配列番号１で示されるアミノ酸配列の７２番目のシステイン残基に相当するアミノ酸残基の、グリシン残基またはアラニン残基への置換；
（８）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６５番目のグルタミン残基に相当するアミノ酸残基の、ロイシン残基への置換；
（９）配列番号１で示されるアミノ酸配列の８１番目のグルタミン酸残基に相当するアミノ酸残基の、システイン残基、グルタミン残基、ヒスチジン残基、メチオニン残基、バリン残基、リジン残基、セリン残基、イソロイシン残基、チロシン残基、グリシン残基、プロリン残基、ロイシン残基、またはアスパラギン残基への置換；
（１０）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３６番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基の、システイン残基への置換。
［３］
全長が、９５〜１７５残基である、［１］または［２］に記載のフコース結合性タンパク質。
［４］
前記（ａ）〜（ｄ）に記載のアミノ酸配列の長さが、９５〜１５５残基である、［１］から［３］のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質。
［５］
配列番号２から配列番号１６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、［１］から［４］のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質。
［６］
Ｎ末端および／またはＣ末端に付加的なアミノ酸配列を有する、［１］から［５］のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質。
［７］
Ｃ末端に付加したアミノ酸配列がシステイン残基を含むオリゴペプチドである、［１］から［６］のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質。
［８］
Ｎ末端に付加したアミノ酸配列がポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドである、［１］から［７］のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質。
［９］
［１］から［８］のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質をコードするＤＮＡ。
［１０］
［９］に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
［１１］
［９］に記載のＤＮＡまたは［１０］に記載の発現ベクターを有する形質転換体。
［１２］
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、［１１］に記載の形質転換体。
［１３］
フコース結合性タンパク質の製造方法であって、
［１１］または［１２］に記載の形質転換体を培養することによりフコース結合性タンパク質を発現する工程；および
発現した前記フコース結合性タンパク質を回収する工程
を含み、
フコース結合性タンパク質が、［１］から［８］のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質である、方法。
［１４］
不溶性担体と、該不溶性担体に固定化された［１］から［８］のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質とを備える、吸着剤。
［１５］
吸着剤の製造方法であって、
不溶性担体から反応性不溶性担体を製造する工程；および
前記反応性不溶性担体に［１］から［８］のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質を固定化する工程
を含み、
吸着剤が、［１４］に記載の吸着剤である、方法。
［１６］
前記反応性不溶性担体が、マレイミド基またはハロアセチル基を有する不溶性担体である、［１５］に記載の方法。
［１７］
［１４］に記載の吸着剤が充填されたカラム。
［１８］
細胞の分離方法であって、
［１４］に記載の吸着剤と細胞混合物とを接触させる工程；および
前記吸着剤に吸着した細胞と吸着しなかった細胞とを分離する工程
を含む、方法。
［１９］
前記細胞混合物が、第１の細胞と第２の細胞を含有する混合物であり、
前記第１の細胞が、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃからなる構造を含む糖鎖および／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖を有する細胞であり、
前記第２の細胞が、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃからなる構造を含む糖鎖およびＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖のいずれも有しない細胞である、［１８］に記載の方法。
［２０］
前記第１の細胞が未分化細胞であり、前記第２の細胞が分化細胞である、［１８］または［１９］に記載の方法。
［２１］
前記第１の細胞ががん細胞である、［１８］または［１９］に記載の方法。
［２２］
フコース含有糖鎖を有する物質の精製方法であって、
［１４］に記載の吸着剤と前記フコース含有糖鎖を有する物質とを接触させる工程；および
前記吸着剤に結合した前記物質を溶出する工程
を含み、
前記フコース含有糖鎖が、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃからなる構造を含む糖鎖および／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖である、方法。
［２３］
前記物質が、前記フコース含有糖鎖および／または当該フコース含有糖鎖を有する複合糖質である、［２２］に記載の方法。
［２４］
［１７］に記載のカラムが用いられる、［１８］から［２３］のいずれかに記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１におけるフコース結合性タンパク質１２９、実施例２におけるフコース結合性タンパク質１２７、実施例３におけるフコース結合性タンパク質１２９Ｇ３６Ｃ、実施例４におけるフコース結合性タンパク質１２７Ｇ３６Ｃ、および比較例１における組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分析した結果である。
【図２】実施例５における精製１２９溶液、精製１２７溶液、精製１２９Ｇ３６Ｃ溶液、精製１２７Ｇ３６Ｃ溶液、および精製ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）溶液を、非還元条件および還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明のフコース結合性タンパク質は、特定のフコース結合性タンパク質である。「フコース結合性タンパク質」とは、フコース含有糖鎖に対する結合性を有するタンパク質を意味する。「結合性」を、「結合親和性」ともいう。すなわち、本発明のフコース結合性タンパク質は、フコース含有糖鎖に対する結合親和性を有する。「フコース含有糖鎖」とは、フコース残基を含む糖鎖を意味する。フコース含有糖鎖の構造（例えば、フコース含有糖鎖の長さ、フコース残基の個数や位置、フコース残基以外の糖残基の種類や個数や位置）は、フコース含有糖鎖がフコース残基を含む限り、特に制限されない。フコース含有糖鎖としては、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃからなる構造、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃからなる構造、Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃからなる構造、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃからなる構造等の、フコース残基を含む糖鎖構造を含む糖鎖が挙げられる。これらの糖鎖構造を含む糖鎖は、それぞれ、これらの糖鎖構造からなる糖鎖であってもよい。Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃからなる構造を「Ｈタイプ１型糖鎖構造」、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を「Ｈタイプ３型糖鎖構造」、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃからなる構造を「ルイスＹ型糖鎖構造」、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃからなる構造を「ルイスｂ型糖鎖構造」ともいう。Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ（Ｈタイプ１型糖鎖構造）からなる糖鎖を「Ｈタイプ１型糖鎖」、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ（Ｈタイプ３型糖鎖構造）からなる糖鎖を「Ｈタイプ３型糖鎖」、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ（ルイスＹ型糖鎖構造）からなる糖鎖を「ルイスＹ型糖鎖」、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ（ルイスｂ型糖鎖構造）からなる糖鎖を「ルイスｂ型糖鎖」ともいう。本発明のフコース結合性タンパク質は、例えば、これらのフコース含有糖鎖から選択される１種またはそれ以上のフコース含有糖鎖に対する結合親和性を有していてよい。本発明のフコース結合性タンパク質は、特に、少なくとも、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖に対する結合親和性を有していてよい。なお、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖」とは、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃからなる構造（Ｈタイプ１型糖鎖構造）を含む糖鎖および／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造（Ｈタイプ３型糖鎖構造）を含む糖鎖を意味してよい。
【００１３】
タンパク質の糖鎖への結合親和性は、例えば、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）法または表面プラズモン共鳴法等により評価することができる。一例として、表面プラズモン共鳴法による結合親和性評価について説明する。表面プラズモン共鳴法による結合親和性評価のための測定は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器（ＧＥヘルスケア製）を用い、アナライトをタンパク質、固相を糖鎖として実施することができる。糖鎖を固定したセンサーチップは、例えば、ビオチン標識した糖鎖を、ストレプトアビジンがコートされたセンサーチップ（Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＳＡ、ＧＥヘルスケア製）、またはデキストランがコートされたセンサーチップ（Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５、ＧＥヘルスケア製）にストレプトアビジンを固定したものに結合することにより取得できる。測定データに基づく結合親和性評価は、例えば、当該機器に付属のカイネティクス解析プログラムを利用して行うことができる。
【００１４】
本発明のフコース結合性タンパク質としては、ＢＣ２ＬＣＮのアミノ酸配列のＣ末端領域を欠失させたアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。ＢＣ２ＬＣＮのアミノ酸配列のＣ末端領域を欠失させたアミノ酸配列を、「短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列」ともいう。欠失したＣ末端領域のアミノ酸配列を、「欠失配列」ともいう。
【００１５】
ＢＣ２ＬＣＮは、Ｈタイプ１型糖鎖、Ｈタイプ３型糖鎖、ルイスＹ型糖鎖、ルイスｂ型糖鎖等のフコース含有糖鎖への結合親和性を有するレクチンである。ＢＣ２ＬＣＮのアミノ酸配列を配列番号１に示す。配列番号１で示されるアミノ酸配列は１５５アミノ酸残基からなり、ＧｅｎＰｅｐｔに登録番号ＷＰ＿００６４９０８２８として登録されているアミノ酸配列の２番目から１５６番目までのアミノ酸配列と一致する。後述する実施例で示すように、ＢＣ２ＬＣＮのアミノ酸配列のＣ末端領域を欠失させることにより、当該Ｃ末端領域を欠失させない場合に比べて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを宿主としてＢＣ２ＬＣＮを製造する場合の生産性（具体的には、発現量）を向上させることができる。すなわち、本発明のタンパク質は、ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓ等の配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に比べて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等の宿主で発現した際の生産性が向上している。本発明のタンパク質は、ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓ等の配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に比べて、少なくとも、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉで発現した際の生産性が向上していてよい。生産性の向上としては、培養液の単位容積当たりの生産量の増大や、宿主の細胞当たりの生産量の増大が挙げられる。
【００１６】
すなわち、「短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列」とは、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＣ末端領域を欠失させたアミノ酸配列を意味する。「短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列」とは、具体的には、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列であって、Ｘが１５５未満の整数であるアミノ酸配列を意味する。また、「欠失配列」とは、具体的には、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＸ＋１番目のアミノ酸残基から１５５番目のグリシン残基までのアミノ酸配列を意味する。Ｘは、本発明のフコース結合性タンパク質がフコース含有糖鎖に対する結合親和性を有し、且つ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等の宿主で発現した際の生産性が向上する限り、特に制限されない。Ｘは、例えば、１１０以上、１１５以上、１２０以上、または１２５以上であってもよく、１５５未満、１５０以下、１４５以下、１４０以下、１３５以下、または１３０以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。Ｘは、特に、１１０以上、１１５以上、１２０以上、または１２５以上であってもよく、１４０以下、１３５以下、または１３０以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。Ｘは、具体的には、例えば、１１０以上１４０以下の整数であってよく、好ましくは１２０以上１３５以下の整数であってよく、より好ましくは１２５以上１３０以下の整数であってよい。
【００１７】
短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列として、具体的には、配列番号２、配列番号３、および配列番号６に示されるアミノ酸配列が挙げられる。配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ＧｅｎＰｅｐｔに登録番号ＷＰ＿００６４９０８２８として登録されているアミノ酸配列の２番目から１３０番目までのアミノ酸配列と一致し、Ｘが１２９である短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列に相当する。配列番号３に示されるアミノ酸配列は、ＧｅｎＰｅｐｔに登録番号ＷＰ＿００６４９０８２８として登録されているアミノ酸配列の２番目から１２８番目までのアミノ酸配列と一致し、Ｘが１２７である短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列に相当する。配列番号６に示されるアミノ酸配列は、ＧｅｎＰｅｐｔに登録番号ＷＰ＿００６４９０８２８として登録されているアミノ酸配列の２番目から１２７番目までのアミノ酸配列と一致し、Ｘが１２６である短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列に相当する。
【００１８】
本発明のフコース結合性タンパク質としては、短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列のバリアント配列を含むタンパク質も挙げられる。バリアント配列は、本発明のフコース結合性タンパク質がフコース含有糖鎖に対する結合親和性を有し、且つ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等の宿主で発現した際の生産性の向上が損なわれない限り、特に制限されない。
【００１９】
バリアント配列としては、短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列において、１若しくは複数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列が挙げられる。前記「１若しくは複数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によって異なり得るが、例えば、１〜１５個、１〜１２個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、または１個を意味してよい。上記のアミノ酸残基の置換の一例としては、物理的性質および／または化学的性質が類似したアミノ酸残基間で置換が生じる保守的置換が挙げられる。保守的置換の場合、一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。物理的性質および／または化学的性質が類似したアミノ酸残基としては、側鎖の性質が類似したアミノ酸残基が挙げられる。側鎖の性質が類似したアミノ酸残基としては、疎水性側鎖を有するアミノ酸残基のグループ（例えば、グリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、プロリン残基、フェニルアラニン残基、メチオニン残基、およびトリプトファン残基）、親水性の酸性側鎖を有するアミノ酸残基のグループ（例えば、アスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基）、親水性の塩基性側鎖を有するアミノ酸残基のグループ（例えば、リジン残基、アルギニン残基、およびヒスチジン残基）、親水性の電荷を持たない側鎖を有するアミノ酸残基のグループ（例えば、アスパラギン残基、グルタミン残基、セリン残基、スレオニン残基、システイン残基、およびチロシン残基）を挙げることができる。すなわち、各グループ内のアミノ酸残基間では側鎖の性質が類似しているとみなせる。また、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加には、例えば、タンパク質またはそれをコードする遺伝子が由来する生物の個体差や種の違いに基づく場合等の天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔ又はｖａｒｉａｎｔ）によって生じるものも含まれる。
【００２０】
バリアント配列としては、短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列も挙げられる。「アミノ酸配列に対する相同性」とは、アミノ酸配列全体に対する相同性を意味する。「高い相同性」とは、例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の相同性を意味してよい。「相同性」とは、同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）または類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を意味してよい。アミノ酸配列間の「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率を意味する（実験医学  ２０１３年２月号  Ｖｏｌ．３１  Ｎｏ．３、羊土社）。アミノ酸配列間の「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率と側鎖の性質が類似したアミノ酸残基の比率の合計を意味する（実験医学  ２０１３年２月号  Ｖｏｌ．３１  Ｎｏ．３、羊土社）。側鎖の性質が類似したアミノ酸残基については上述の通りである。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のアラインメントプログラムを利用して決定することができる。
【００２１】
短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列とそのバリアント配列との差異をもたらすアミノ酸配列の改変（例えば、上記１若しくは数個のアミノ酸残基の付加等または上記相同性の範囲でのアミノ酸配列の改変）が、Ｃ末端側へのアミノ酸残基の付加を含む場合、Ｃ末端側に付加されるアミノ酸残基の数は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等の宿主で発現した際の生産性の向上の観点から、少ないのが好ましい場合がある。Ｃ末端側に付加されるアミノ酸残基の数は、好ましくは１０個以下（例えば、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、または１個）であってよく、より好ましくは５個以下（例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、または１個）であってよい。
【００２２】
本発明のフコース結合性タンパク質は、後述する「特定のアミノ酸置換」を含んでいてもよく、いなくてもよい。本発明のフコース結合性タンパク質は、具体的には、短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列またはそのバリアント配列において、「特定のアミノ酸置換」を含んでいてよい。
【００２３】
短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列およびそのバリアント配列から選択される、「特定のアミノ酸置換」を含まないアミノ酸配列を、「非改変型アミノ酸配列」ともいう。非改変型アミノ酸配列において、「特定のアミノ酸置換」を含むアミノ酸配列を、「改変型アミノ酸配列」ともいう。すなわち、本発明のフコース結合性タンパク質としては、改変型アミノ酸配列を含むタンパク質も挙げられる。非改変型アミノ酸配列と改変型アミノ酸配列は、「特定のアミノ酸置換」の有無以外は同一であってよい。
【００２４】
改変型アミノ酸配列は、例えば、短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列において、「特定のアミノ酸置換」を含むアミノ酸配列であってよい。すなわち、改変型アミノ酸配列は、例えば、「特定のアミノ酸置換」の有無以外は、短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列と同一であってよい。当該改変型アミノ酸配列を、「短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列の改変型アミノ酸配列」ともいう。
【００２５】
また、改変型アミノ酸配列は、例えば、短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列のバリアント配列において、「特定のアミノ酸置換」を含むアミノ酸配列であってよい。すなわち、改変型アミノ酸配列は、例えば、「特定のアミノ酸置換」の有無以外は、短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列のバリアント配列と同一であってよい。すなわち、改変型アミノ酸配列は、具体的には、例えば、短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列において、１若しくは複数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含み、さらに、「特定のアミノ酸置換」を含むアミノ酸配列であってよい。また、改変型アミノ酸配列は、具体的には、例えば、短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列において、「特定のアミノ酸置換」を含むアミノ酸配列であってよい。
【００２６】
なお、短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列のバリアント配列自体は、非改変型アミノ酸配列であってもよく、改変型アミノ酸配列であってもよい。言い換えると、短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列とそのバリアント配列との差異をもたらすアミノ酸配列の改変（例えば、上記１若しくは数個のアミノ酸残基の置換等または上記相同性の範囲でのアミノ酸配列の改変）は、「特定のアミノ酸置換」の一部または全部を含んでいてもよく、いなくてもよい。すなわち、例えば、短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列のバリアント配列であって「特定のアミノ酸置換」を含まないものに「特定のアミノ酸置換」を導入することにより改変型アミノ酸配列を構成してもよく、短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列のバリアント配列であって既に「特定のアミノ酸置換」を含むものを改変型アミノ酸配列として用いてもよい。また、短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列とそのバリアント配列との差異をもたらすアミノ酸配列の改変（例えば、上記１若しくは数個のアミノ酸残基の置換等または上記相同性の範囲でのアミノ酸配列の改変）は、後述する（１）から（５）に記載のアミノ酸置換の内、「特定のアミノ酸置換」として選択されなかったものの一部または全部を含んでいてもよく、いなくてもよい。
【００２７】
また、言い換えると、改変型アミノ酸配列は、例えば、短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列の改変型アミノ酸配列のバリアント配列であってもよい。短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列の改変型アミノ酸配列のバリアント配列については、短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列の改変型アミノ酸配列のバリアント配列においては「特定のアミノ酸置換」を含むこと以外は、短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列のバリアント配列についての記載を準用できる。すなわち、改変型アミノ酸配列は、具体的には、例えば、短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列の改変型アミノ酸配列において、「特定のアミノ酸置換」の位置以外の１若しくは複数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列であってよい。また、改変型アミノ酸配列は、具体的には、例えば、短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列の改変型アミノ酸配列に対して高い相同性を有し、且つ「特定のアミノ酸置換」を含むアミノ酸配列であってよい。短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列の改変型アミノ酸配列のバリアント配列は、後述する（１）から（５）に記載のアミノ酸置換の内、「特定のアミノ酸置換」として選択されなかったものの一部または全部を含んでいてもよく、いなくてもよい。
【００２８】
「特定のアミノ酸置換」としては、以下の（１）から（５）に記載のアミノ酸置換が挙げられる：
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基に相当するアミノ酸残基の、グルタミン残基以外のアミノ酸残基への置換；
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の７２番目のシステイン残基に相当するアミノ酸残基の、システイン残基以外のアミノ酸残基への置換；
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６５番目のグルタミン残基に相当するアミノ酸残基の、グルタミン残基以外のアミノ酸残基への置換；
（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の８１番目のグルタミン酸残基に相当するアミノ酸残基の、グルタミン酸残基以外のアミノ酸残基への置換；
（５）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３６番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基の、グリシン残基以外のアミノ酸残基への置換。
【００２９】
「特定のアミノ酸置換」は、例えば、前記（１）から（５）に記載のアミノ酸置換から選択される、１つ以上のアミノ酸置換であってよい。すなわち、「特定のアミノ酸置換」は、例えば、前記（１）から（５）に記載のアミノ酸置換から選択される、いずれか１つのアミノ酸置換であってもよく、２つ、３つ、４つ、または５つのアミノ酸置換の組み合わせであってもよい。
【００３０】
「特定のアミノ酸置換」により、熱に対する安定性の向上、フコース含有糖鎖への結合親和性の向上、およびジスルフィド結合形成による二量体の生成の抑制等の効果が得られてよい。「特定のアミノ酸置換」により、これらの効果から選択される１つまたはそれ以上の効果が得られてよい。フコース含有糖鎖への結合親和性の向上として、具体的には、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性の向上が挙げられる。
【００３１】
前記（１）から（３）に記載のアミノ酸置換により、例えば、熱に対する安定性の向上、および／または、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖等のフコース含有糖鎖への結合親和性の向上が達成されてよい。特に、熱に対する安定性の向上、および／または、フコース含有糖鎖に対する結合親和性の向上が達成され得る点で、前記（１）に記載のアミノ酸置換は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基に相当するアミノ酸残基を、好ましくはロイシン残基またはメチオニン残基に、より好ましくはロイシン残基に置換するものであってよい。配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基に相当するアミノ酸残基をこれらのアミノ酸残基に置換することにより、例えば、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよびＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖の両方に対する結合親和性の向上が達成されてよい。配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基に相当するアミノ酸残基のロイシン残基への置換を、「Ｑ３９Ｌ」ともいう。他のアミノ酸置換についても、同様に、置換前後のアミノ酸残基の種類とアミノ酸残基の位置に基づいて略記する場合がある。また、特に、熱に対する安定性の向上、および／または、フコース含有糖鎖に対する結合親和性の向上が達成され得る点で、前記（２）に記載のアミノ酸置換は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の７２番目のシステイン残基に相当するアミノ酸残基を、好ましくはグリシン残基またはアラニン残基に、より好ましくはグリシン残基に置換するものであってよい。配列番号１で示されるアミノ酸配列の７２番目のシステイン残基に相当するアミノ酸残基をこれらのアミノ酸残基に置換することにより、例えば、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよびＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖の両方に対する結合親和性の向上が達成されてよい。また、特に、熱に対する安定性の向上が達成され得る点で、前記（３）に記載のアミノ酸置換は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の６５番目のグルタミン残基に相当するアミノ酸残基を、好ましくはロイシン残基に置換するものであってよい。
【００３２】
本発明のフコース結合性タンパク質は、例えば、少なくとも、前記（１）から（３）に記載のアミノ酸置換から選択される、１つ以上のアミノ酸置換を含んでいてよい。すなわち、本発明のフコース結合性タンパク質は、例えば、少なくとも、前記（１）、（２）、または（３）に記載のアミノ酸置換を含んでいてもよい。また、本発明のフコース結合性タンパク質は、例えば、少なくとも、前記（１）、（２）、または（３）に記載のアミノ酸置換から選択される２つまたは３つのアミノ酸置換の組み合わせを含んでいてもよい。前記（１）から（３）に記載のアミノ酸置換は、単独であっても複数の組み合わせであっても、熱に対する安定性の向上、および／または、フコース含有糖鎖に対する結合親和性の向上を達成し得る。また、特に、後述する実施例で示すように、熱に対する安定性の顕著な向上が達成され得る点で、好ましくは、前記（１）から（３）に記載のアミノ酸置換を複数組み合せて用いてよい。組み合わせとしては、前記（１）と（２）に記載のアミノ酸置換の組み合わせ、前記（１）と（３）に記載のアミノ酸置換の組み合わせ、前記（２）と（３）に記載のアミノ酸置換の組み合わせ、前記（１）と（２）と（３）に記載のアミノ酸置換の組み合わせが挙げられる。組み合わせとして、具体的には、Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２ＧやＱ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇが挙げられる。本発明のフコース結合性タンパク質は、具体的には、例えば、少なくとも、前記（１）および／または（２）に記載のアミノ酸置換を含んでいてもよい。本発明のフコース結合性タンパク質は、具体的には、例えば、少なくとも、前記（１）および／または（２）に記載のアミノ酸置換と前記（３）に記載のアミノ酸置換を含んでいてもよい。本発明のフコース結合性タンパク質は、具体的には、例えば、少なくとも、前記（１）、（２）、および（３）に記載のアミノ酸置換を含んでいてもよい。
【００３３】
また、前記（４）に記載のアミノ酸置換により、例えば、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖等のフコース含有糖鎖への結合親和性の向上が達成されてよい。特に、フコース含有糖鎖への結合親和性の向上が達成され得る点で、前記（４）に記載のアミノ酸置換は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の８１番目のグルタミン酸残基に相当するアミノ酸残基を、好ましくは、システイン残基、グルタミン残基、ヒスチジン残基、メチオニン残基、バリン残基、リジン残基、セリン残基、イソロイシン残基、チロシン残基、グリシン残基、プロリン残基、ロイシン残基、またはアスパラギン残基に、より好ましくは、システイン残基、グルタミン残基、ヒスチジン残基、またはメチオニン残基に置換するものであってよい。配列番号１で示されるアミノ酸配列の８１番目のグルタミン酸残基に相当するアミノ酸残基をシステイン残基、グルタミン残基、ヒスチジン残基、またはメチオニン残基に置換することにより、例えば、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよびＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖の両方に対する結合親和性の向上が達成されてよい。
【００３４】
また、前記（５）に記載のアミノ酸置換により、例えば、ジスルフィド結合形成による二量体の生成の抑制が達成されてよい。特に、ジスルフィド結合形成による二量体の生成の抑制が達成され得る点で、前記（５）に記載のアミノ酸置換は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の３６番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基を、好ましくはシステイン残基に置換するものであってよい。ジスルフィド結合は、例えば、システイン残基を１つ以上含むオリゴペプチドを付加して本発明のフコース結合性タンパク質を製造した場合に形成されるものであってよい。
【００３５】
「配列番号１に示されるアミノ酸配列のＸ番目のアミノ酸残基」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端から数えてＸ位の位置に存在するアミノ酸残基を意味する。或るアミノ酸配列における「配列番号１に示されるアミノ酸配列のＸ番目のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基」とは、当該或るアミノ酸配列におけるアミノ酸残基であって、当該或るアミノ酸配列と配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて配列番号１に示すアミノ酸配列のＸ番目のアミノ酸残基と同一の位置に配列されるアミノ酸残基を意味する。例えば、Ｑ３９Ｌの場合、或るアミノ酸配列における「配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基に相当するアミノ酸残基」とは、当該或るアミノ酸配列におけるアミノ酸残基であって、当該或るアミノ酸配列と配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて配列番号１に示すアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基と同一の位置に配列されるアミノ酸残基を意味する。なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列における「配列番号１に示されるアミノ酸配列のＸ番目のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＸ番目のアミノ酸残基そのものを意味する。すなわち、「特定のアミノ酸置換」の位置は、必ずしも本発明のフコース結合性タンパク質における絶対的な位置を示すものではなく、配列番号１に示されるアミノ酸配列に基づく相対的な位置を示すものである。すなわち、例えば、本発明のフコース結合性タンパク質が、「特定のアミノ酸置換」の位置よりもＮ末端側にアミノ酸残基の挿入、欠失、または付加を含む場合、それに応じて「特定のアミノ酸置換」の絶対的な位置は変動し得る。本発明のフコース結合性タンパク質における「特定のアミノ酸置換」の位置は、例えば、本発明のフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列と配列番号１に示されるアミノ酸配列とのアラインメントにより特定することができる。アラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ等のアラインメントプログラムを利用して実施することができる。短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列のバリアント配列等の任意のアミノ酸配列における「特定のアミノ酸置換」の位置についても同様である。また、「特定のアミノ酸置換」の置換前のアミノ酸残基は、配列番号１に示されるアミノ酸配列における置換前のアミノ酸残基の種類を示すものであって、配列番号１に示されるアミノ酸配列以外の非改変型アミノ酸配列においては保存されていてもよく、いなくてもよい。
【００３６】
本発明のフコース結合性タンパク質として、具体的には、配列番号２（配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち１番目から１２９番目までのアミノ酸配列）、配列番号３（配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち１番目から１２７番目までのアミノ酸配列）、配列番号４（配列番号２の３６番目のグリシン残基をシステイン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号５（配列番号３の３６番目のグリシン残基をシステイン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号６（配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち１番目から１２６番目までのアミノ酸配列）、配列番号７（配列番号２の８１番目のグルタミン酸残基をシステイン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号８（配列番号２の８１番目のグルタミン酸残基をグルタミン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号９（配列番号２の８１番目のグルタミン酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号１０（配列番号２の８１番目のグルタミン酸残基をメチオニン残基に置換したアミノ酸配列）配列番号１１（配列番号３の７２番目のシステイン残基をグリシン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号１２（配列番号３の７２番目のシステイン残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号１３（配列番号３の３９番目のグルタミン残基をロイシン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号１４（配列番号３の３９番目のグルタミン残基をメチオニン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号１５（配列番号３の３９番目のグルタミン残基をロイシン残基に、７２番目のシステイン残基をグリシン残基に置換したアミノ酸配列）、および配列番号１６（配列番号３の３９番目のグルタミン残基をロイシン残基に、６５番目のグルタミン残基をロイシン残基に、７２番目のシステイン残基をグリシン残基に置換したアミノ酸配列）のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むフコース結合性タンパク質を挙げることができる。本発明のフコース結合性タンパク質は、例えば、これらの配列番号のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。特に、ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓ等の配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に比べて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等の宿主で発現した際の生産性の向上が達成される点で、本発明のフコース結合性タンパク質は、好ましくは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含むフコース結合性タンパク質であってよい。また、特に、ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓ等の配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に比べて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等の宿主で発現した際の生産性の向上が達成され、且つＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖等のフコース含有糖鎖への結合親和性の向上が達成され得る点で、本発明のフコース結合性タンパク質は、より好ましくは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含むフコース結合性タンパク質であってよい。また、特に、ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓ等の配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に比べて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等の宿主で発現した際の生産性の向上が達成され、且つＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖等のフコース含有糖鎖への結合親和性の向上、および熱に対する安定性の向上が達成され得る点で、本発明のフコース結合性タンパク質は、さらに好ましくは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含むフコース結合性タンパク質であってよい。
【００３７】
上記例示した本発明のフコース結合性タンパク質に含まれるアミノ酸配列（例えば、短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列およびそのバリアント配列、ならびにそれらの改変型アミノ酸配列）を総称して、「コア配列」ともいう。すなわち、本発明のフコース結合性タンパク質は、コア配列を含むタンパク質であってよい。本発明のフコース結合性タンパク質は、コア配列からなるタンパク質であってもよく、コア配列に加えてそのＮ末端側および／またはＣ末端側にさらにアミノ酸配列を含んでいてもよい。コア配列のＮ末端側またはＣ末端側に含まれるアミノ酸配列を、「付加配列」ともいう。コア配列のＮ末端側およびＣ末端側に含まれるアミノ酸配列を、それぞれ、「Ｎ末端側付加配列」および「Ｃ末端側付加配列」ともいう。付加配列は、本発明のフコース結合性タンパク質がフコース含有糖鎖に対する結合親和性を有し、且つ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等の宿主で発現した際の生産性の向上が損なわれない限り、特に制限されない。
【００３８】
Ｎ末端側付加配列の長さは、例えば、１残基以上、２残基以上、３残基以上、４残基以上、５残基以上、１０残基以上、１５残基以上、２０残基以上、または３０残基以上であってもよく、６０残基以下、５０残基以下、４０残基以下、３０残基以下、２０残基以下、１５残基以下、１２残基以下、１０残基以下、７残基以下、または５残基以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。Ｎ末端側付加配列の長さは、具体的には、例えば、５〜６０残基、５〜２０残基、または５〜１５残基であってもよい。
【００３９】
Ｃ末端側付加配列の長さは、例えば、１残基以上、２残基以上、３残基以上、４残基以上、または５残基以上であってもよく、１５残基以下、１２残基以下、１０残基以下、７残基以下、または５残基以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。Ｃ末端側付加配列の長さは、具体的には、例えば、２〜１０残基であってもよい。
【００４０】
付加配列としては、本発明のフコース結合性タンパク質の精製に有用なアミノ酸配列（以下、「精製用タグ」ともいう）が挙げられる。精製用タグは、具体的には、夾雑物質存在下の溶液から本発明のフコース結合性タンパク質を分離する際に有用なアミノ酸配列であってよい。精製用タグとしては、ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、セルロース結合性ドメイン、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を例示することができる。精製用タグとしては、特に、ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドが挙げられる。ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを利用することにより、例えば、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる本発明のフコース結合性タンパク質の精製を実施できる。「ポリヒスチジン配列」とは、ヒスチジン残基の繰り返しからなるアミノ酸配列を意味する。ヒスチジン残基の繰返し数（すなわち、ポリヒスチジン配列の長さ）は、所望の効果が得られる限り、特に制限されない。ヒスチジン残基の繰返し数は、例えば、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる本発明のフコース結合性タンパク質の精製が可能な範囲で設定してよい。ヒスチジン残基の繰返し数は、例えば、好ましくは５個から１５個であってよく、より好ましくは５個から１０個であってよい。ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドは、ポリヒスチジン配列からなるものであってもよく、そうでなくてもよい。ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドの長さは、ポリヒスチジン配列が含まれていれば特に制限されないが、例えば、好ましくは２０個以下であってよく、より好ましくは１５個以下であってよい。ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドの長さは、具体的には、例えば、好ましくはヒスチジン残基の繰返し数が５個から１５個である場合に２０個以下であってよく、より好ましくはヒスチジン残基の繰返し数が５個から１０個である場合に１５個以下であってよい。ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド等の精製用タグは、コア配列のＮ末端側およびＣ末端側のいずれか一方に付加されてもよく、両方に付加されてもよい。ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド等の精製用タグは、好ましくは、コア配列のＮ末端側に付加されてよい。
【００４１】
付加配列としては、本発明のフコース結合性タンパク質をクロマトグラフィー用の支持体等の担体に固定化する際に有用なアミノ酸配列（以下、「担体固定化用タグ」ともいう）も挙げられる。担体固定化用タグとしては、システイン残基またはリジン残基を含むオリゴペプチドが挙げられる。担体固定化用タグの長さは、所望の効果が得られる限り、特に制限されない。担体固定化用タグの長さは、例えば、２残基以上、３残基以上、４残基以上、または５残基以上であってもよく、１５残基以下、１２残基以下、１０残基以下、７残基以下、または５残基以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。担体固定化用タグの長さは、具体的には、例えば、２〜１０残基であってもよい。担体固定化用タグは、特に、不溶性担体への固定化が高選択的かつ高効率に達成され得る点で、好ましくはシステイン残基を１つ以上含むオリゴペプチドであってよく、より好ましくはシステイン残基を１つ以上含む２から１０残基のオリゴペプチドであってよい。そのような担体固定化用タグとして、具体的には、「Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ」の３アミノ酸残基からなるオリゴペプチド、「Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（配列番号６６）」の５アミノ酸残基からなるオリゴペプチド、「Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（配列番号６７）」の７アミノ酸残基からなるオリゴペプチド、およびそれらのバリアント配列を例示することができる。担体固定化用タグのバリアント配列については、短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列のバリアント配列についての記載を準用できる。システイン残基を１つ以上含むオリゴペプチド等の担体固定化用タグは、コア配列のＮ末端側およびＣ末端側のいずれか一方に付加されてもよく、両方に付加されてもよい。システイン残基を１つ以上含むオリゴペプチド等の担体固定化用タグは、好ましくは、コア配列のＣ末端側に付加されてよい。
【００４２】
付加配列としては、シグナルペプチドも挙げられる。シグナルペプチドにより、例えば、本発明のフコース結合性タンパク質の宿主での効率的な発現が促がされてもよい。シグナルペプチドにより、例えば、本発明のフコース結合性タンパク質がペリプラズムに分泌されてもよい。例えば、宿主がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの場合、シグナルペプチドとしては、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ、ＴｏｒＴ等のタンパク質のシグナルペプチドを例示することができる。シグナルペプチドは、通常、コア配列のＮ末端側に付加されてよい。本発明のフコース結合性タンパク質がシグナルペプチドとそれ以外のＮ末端側付加配列を含む場合、シグナルペプチドは、それ以外のＮ末端側付加配列のさらにＮ末端側に付加されてよい。なお、シグナルペプチドは、本発明のフコース結合性タンパク質のペリプラズム等への分泌時に除去され得る。よって、「本発明のフコース結合性タンパク質がシグナルペプチドを含む」とは、本発明のフコース結合性タンパク質がシグナルペプチドを含む形態で翻訳されることで足り、最終的に得られる本発明のフコース結合性タンパク質がシグナルペプチドを含むことを要しない。
【００４３】
本発明のフコース結合性タンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含まないように構成されるものとする。本発明のフコース結合性タンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列を含まないように構成されてもよい。配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対し、９９％以上、９８％以上、９７％以上、９６％以上、９５％以上、９４％以上、９３％以上、９２％以上、９１％以上、または９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
【００４４】
本発明のフコース結合性タンパク質は、欠失配列を含まないように構成されてもよい。本発明のフコース結合性タンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含まないよう、少なくとも、短縮型ＢＣ２ＬＣＮ配列のＣ末端に隣接して欠失配列を含まないよう構成されるものとする。本発明のフコース結合性タンパク質は、欠失配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列を含まないように構成されてもよい。欠失配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列としては、欠失配列に対し、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上、７５％以上、７０％以上、６５％以上、６０％以上、５５％以上、または５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列が挙げられる。本発明のフコース結合性タンパク質は、例えば、コア配列が欠失配列を含まないように構成されてもよい。本発明のフコース結合性タンパク質は、例えば、コア配列が欠失配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列を含まないように構成されてもよい。本発明のフコース結合性タンパク質は、例えば、コア配列よりＣ末端側に欠失配列を含まないように構成されてもよい。本発明のフコース結合性タンパク質は、例えば、コア配列よりＣ末端側に欠失配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列を含まないように構成されてもよい。
【００４５】
「欠失配列を含まない」とは、欠失配列の全長配列を含まないことを意味し、欠失配列の部分配列を含むことは除外しない。許容される部分配列の長さは、欠失配列の長さ等の諸条件に応じて、適宜設定できる。許容される部分配列の長さは、例えば、欠失配列の長さの５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、または１０％以下であってよい。また、許容される部分配列の長さは、例えば、７残基以下、６残基以下、５残基以下、４残基以下、３残基以下、２残基以下、または１残基であってもよい。
【００４６】
コア配列の長さは、例えば、（Ｘ−１５）残基以上、（Ｘ−１０）残基以上、（Ｘ−７）残基以上、（Ｘ−５）残基以上、（Ｘ−３）残基以上、（Ｘ−２）残基以上、（Ｘ−１）残基以上、Ｘ残基以上、（Ｘ＋１）残基以上、（Ｘ＋２）残基以上、（Ｘ＋３）残基以上、または（Ｘ＋５）残基以上であってもよく、（Ｘ＋１５）残基以下、（Ｘ＋１０）残基以下、（Ｘ＋７）残基以下、（Ｘ＋５）残基以下、（Ｘ＋３）残基以下、（Ｘ＋２）残基以下、（Ｘ＋１）残基以下、Ｘ残基以下、（Ｘ−１）残基以下、（Ｘ−２）残基以下、（Ｘ−３）残基以下、または（Ｘ−５）残基以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。コア配列の長さは、具体的には、例えば、（Ｘ−１５）〜（Ｘ＋１５）残基、（Ｘ−１０）〜（Ｘ＋１０）残基、（Ｘ−５）〜（Ｘ＋５）残基、または（Ｘ−２）〜（Ｘ＋２）残基であってもよい。
【００４７】
コア配列の長さは、例えば、９５残基以上、１００残基以上、１０５残基以上、１１０残基以上、１１５残基以上、１２０残基以上、または１２５残基以上であってもよく、１６５残基以下、１６０残基以下、１５５残基以下、１５０残基以下、１４５残基以下、１４０残基以下、１３５残基以下、または１３０残基以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。コア配列の長さは、具体的には、例えば、９５〜１５５残基、１０５〜１５０残基、または１１０〜１４５残基であってもよい。
【００４８】
コア配列の長さは、例えば、１５５残基未満であってもよい。コア配列の長さは、特に、上記例示した範囲であって、且つ１５５残基未満であってもよい。
【００４９】
本発明のフコース結合性タンパク質の長さ（すなわち、本発明のフコース結合性タンパク質の全長）は、コア配列の長さをＹ残基として、Ｙ残基以上である。本発明のフコース結合性タンパク質の長さは、例えば、コア配列の長さをＹ残基として、Ｙ残基以上、（Ｙ＋１）残基以上、（Ｙ＋２）残基以上、（Ｙ＋３）残基以上、（Ｙ＋５）残基以上、（Ｙ＋１０）残基以上、または（Ｙ＋１５）残基以上であってもよく、（Ｙ＋６０）残基以下、（Ｙ＋５５）残基以下、（Ｙ＋５０）残基以下、（Ｙ＋４５）残基以下、（Ｙ＋４０）残基以下、（Ｙ＋３５）残基以下、（Ｙ＋３０）残基以下、（Ｙ＋２０）残基以下、（Ｙ＋１５）残基以下、（Ｙ＋１０）残基以下、または（Ｙ＋５）残基以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。本発明のフコース結合性タンパク質の長さは、具体的には、例えば、コア配列の長さをＹ残基として、Ｙ〜（Ｙ＋２０）残基であってもよい。
【００５０】
本発明のフコース結合性タンパク質の長さは、例えば、（Ｘ−１５）残基以上、（Ｘ−１０）残基以上、（Ｘ−７）残基以上、（Ｘ−５）残基以上、（Ｘ−３）残基以上、（Ｘ−２）残基以上、（Ｘ−１）残基以上、Ｘ残基以上、（Ｘ＋１）残基以上、（Ｘ＋２）残基以上、（Ｘ＋３）残基以上、（Ｘ＋５）残基以上、（Ｘ＋１０）残基以上、（Ｘ＋１５）残基以上、（Ｘ＋２０）残基以上、または（Ｘ＋２５）残基以上であってもよく、（Ｘ＋７５）残基以下、（Ｘ＋７０）残基以下、（Ｘ＋６５）残基以下、（Ｘ＋６０）残基以下、（Ｘ＋５５）残基以下、（Ｘ＋５０）残基以下、（Ｘ＋４５）残基以下、（Ｘ＋４０）残基以下、（Ｘ＋３５）残基以下、（Ｘ＋３０）残基以下、（Ｘ＋２５）残基以下、（Ｘ＋２０）残基以下、（Ｘ＋１５）残基以下、（Ｘ＋１０）残基以下、（Ｘ＋７）残基以下、（Ｘ＋５）残基以下、（Ｘ＋３）残基以下、（Ｘ＋２）残基以下、（Ｘ＋１）残基以下、Ｘ残基以下、（Ｘ−１）残基以下、（Ｘ−２）残基以下、（Ｘ−３）残基以下、または（Ｘ−５）残基以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。本発明のフコース結合性タンパク質の長さは、具体的には、例えば、（Ｘ−１５）〜（Ｘ＋３５）残基、（Ｘ−１０）〜（Ｘ＋３０）残基、（Ｘ−５）〜（Ｘ＋２５）残基、または（Ｘ−２）〜（Ｘ＋２０）残基であってもよい。
【００５１】
本発明のフコース結合性タンパク質の長さは、例えば、９５残基以上、１００残基以上、１０５残基以上、１１０残基以上、１１５残基以上、１２０残基以上、または１２５残基以上であってもよく、２２５残基以下、２２０残基以下、２１５残基以下、２１０残基以下、２０５残基以下、２００残基以下、１９５残基以下、１９０残基以下、１８５残基以下、１８０残基以下、１７５残基以下、１７０残基以下、１６５残基以下、１６０残基以下、１５５残基以下、１５０残基以下、１４５残基以下、１４０残基以下、１３５残基以下、または１３０残基以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。本発明のフコース結合性タンパク質の長さは、具体的には、例えば、９５〜１７５残基、１０５〜１７０残基、または１１０〜１６５残基であってもよい。
【００５２】
次に、本発明のフコース結合性タンパク質をコードするＤＮＡ（以下、「本発明のＤＮＡ」ともいう）、本発明のＤＮＡを含む発現ベクター（以下、「本発明の発現ベクター」ともいう）、および本発明のＤＮＡまたは本発明の発現ベクターを有する形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」ともいう）について説明する。
【００５３】
本発明のＤＮＡは、例えば、化学合成法により、または、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法等のＤＮＡ増幅法により、取得できる。ＤＮＡ増幅法は、例えば、増幅すべき塩基配列を含むポリヌクレオチドを鋳型として実施することができる。鋳型とするポリヌクレオチドとしては、増幅すべき塩基配列を含む、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ断片、ベクターが挙げられる。本発明のＤＮＡの塩基配列は、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａのゲノムＤＮＡのＢＣ２Ｌ−Ｃ遺伝子領域の塩基配列の改変により、または本発明のフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列からの変換により設計することができる。アミノ酸配列から塩基配列に変換する際には、本発明のフコース結合性タンパク質の生産に利用する宿主におけるコドンの使用頻度を考慮することが好ましい。一例として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを宿主として利用する場合、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないコドン（レアコドン）であるため、これらのコドン以外のコドンを選択して変換することが好ましい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／、アクセス日：２０１８年５月７日）を利用することによっても可能である。また、本発明のＤＮＡを作製する際には、アミノ酸残基置換操作を簡便に行うため、アミノ酸残基置換部位周辺のアミノ酸配列を変えずに、適当な制限酵素認識配列を導入してもよい。取得した本発明のＤＮＡは、そのまま、あるいは適宜改変して利用することができる。取得した本発明のＤＮＡは、例えば、バリアントの構築や「特定のアミノ酸置換」の導入等の改変に供してよい。ＤＮＡの改変は、例えば、エラープローンＰＣＲ法等の遺伝子工学的手法、または薬剤や紫外線等による変異処理により実施できる。
【００５４】
本発明のＤＮＡとして、具体的には、配列番号２のアミノ酸配列をコードする配列番号１７の塩基配列を含むＤＮＡ、配列番号３のアミノ酸配列をコードする配列番号１８の塩基配列を含むＤＮＡ、配列番号４のアミノ酸配列をコードする配列番号１９の塩基配列を含むＤＮＡ、配列番号５のアミノ酸配列をコードする配列番号２０の塩基配列を含むＤＮＡ、配列番号６のアミノ酸配列をコードする配列番号２１の塩基配列を含むＤＮＡ、配列番号７のアミノ酸配列をコードする配列番号２２の塩基配列を含むＤＮＡ、配列番号８のアミノ酸配列をコードする配列番号２３の塩基配列を含むＤＮＡ、配列番号９のアミノ酸配列をコードする配列番号２４の塩基配列を含むＤＮＡ、配列番号１０のアミノ酸配列をコードする配列番号２５の塩基配列を含むＤＮＡ、配列番号１１のアミノ酸配列をコードする配列番号２６の塩基配列を含むＤＮＡ、配列番号１２のアミノ酸配列をコードする配列番号２７の塩基配列を含むＤＮＡ、配列番号１３のアミノ酸配列をコードする配列番号２８の塩基配列を含むＤＮＡ、配列番号１４のアミノ酸配列をコードする配列番号２９の塩基配列を含むＤＮＡ、配列番号１５のアミノ酸配列をコードする配列番号３０の塩基配列を含むＤＮＡ、および配列番号１６のアミノ酸配列をコードする配列番号３１の塩基配列を含むＤＮＡを例示することができる。本発明のＤＮＡは、例えば、これらの配列番号のいずれかで示される塩基配列からなるものであってもよい。
【００５５】
本発明のフコース結合性タンパク質は、例えば、本発明の形質転換体に本発明のフコース結合性タンパク質を発現させることにより製造できる。本発明の形質転換体は、本発明のＤＮＡを有することに依拠して、本発明のフコース結合性タンパク質を発現することができる。すなわち、本発明の形質転換体は、言い換えると、本発明のフコース結合性タンパク質を発現可能な形質転換体である。
【００５６】
本発明の形質転換体は、例えば、本発明のＤＮＡを用いて宿主を形質転換することにより得られる。すなわち、本発明の形質転換体は、例えば、本発明のＤＮＡで形質転換された宿主であってよい。宿主は、本発明のＤＮＡで形質転換されることにより本発明のフコース結合性タンパク質を発現可能となるものであれば特に制限されない。宿主としては、動物細胞、昆虫細胞、微生物が挙げられる。動物細胞としては、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞等が挙げられる。昆虫細胞としては、Ｓｆ９、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４等が挙げられる。微生物としては、酵母や細菌が挙げられる。酵母としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母、Ｐｉｃｈｉａ  Ｐａｓｔｏｒｉｓ等のＰｉｃｈｉａ属酵母、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ等のＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母等が挙げられる。細菌としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等のエシェリヒア属細菌等が挙げられる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉとしては、ＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）株、Ｗ３１１０株等が挙げられる。特に、本発明のフコース結合性タンパク質の生産性の点で、好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを宿主として用いてよい。
【００５７】
本発明のＤＮＡは、発現可能に本発明の形質転換体に保持されていればよい。本発明のＤＮＡは、具体的には、宿主で機能するプロモータの制御下で発現するように保持されていればよい。宿主で機能するプロモータとしては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを宿主とする場合は、ｔｒｐプロモータ、ｔａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、ｌｐｐプロモータ、λＰＬプロモータ、λＰＲプロモータが挙げられる。
【００５８】
本発明の形質転換体において、本発明のＤＮＡは、例えば、ゲノムＤＮＡ外で自律複製するベクター上に存在していてよい。すなわち、本発明のＤＮＡは、例えば、本発明のＤＮＡを含む発現ベクターとして宿主に導入することができる。すなわち、本発明の形質転換体は、一態様において、本発明のＤＮＡを含む発現ベクターを有する形質転換体であってよい。本発明のＤＮＡを含む発現ベクターを、「本発明の発現ベクター」ともいう。本発明の発現ベクターは、例えば、発現ベクターの適切な位置に本発明のＤＮＡを挿入することにより得られる。なお、発現ベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限されない。発現ベクターとしては、バクテリオファージ、コスミド、プラスミドが挙げられる。発現ベクターとしては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを宿主とする場合は、ｐＥＴベクター、ｐＵＣベクター、ｐＴｒｃベクター、ｐＣＤＦベクター、ｐＢＢＲベクターを例示できる。発現ベクターは、抗生物質耐性遺伝子等の選択マーカーを備えていてよい。適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、選択マーカー、および伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。発現ベクターに本発明のＤＮＡを挿入する際は、発現に必要なプロモータ等の機能性ＤＮＡに連結される状態で発現ベクターに挿入することが好ましい。
【００５９】
また、本発明の形質転換体において、本発明のＤＮＡは、例えば、ゲノムＤＮＡ上に導入されていてもよい。ゲノムＤＮＡへの本発明のＤＮＡの導入は、例えば、相同組換えによる遺伝子導入法を利用して実施することができる。相同組換えによる遺伝子導入法としては、Ｒｅｄ−ｄｒｉｖｅｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ法（Ｄａｔｓｅｎｋｏ，  Ｋ．  Ａ，  ａｎｄ  Ｗａｎｎｅｒ，  Ｂ．  Ｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ９７：６６４０−６６４５  （２０００））等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性複製起点を含むベクターを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないベクターを用いる方法、ファージを用いたｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ法が挙げられる。
【００６０】
本発明の発現ベクター等のポリヌクレオチドを用いた宿主の形質転換は、例えば、当業者が通常用いる方法で行なうことができる。例えば、宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを選択する場合には、コンピテントセル法、ヒートショック法、エレクトロポレーション法等により形質転換することができる。形質転換後に適切な方法でスクリーニングすることにより、本発明の形質転換体を取得することができる。
【００６１】
各種微生物において利用可能な発現ベクターやプロモータ等の遺伝子工学的手法に関する情報については、例えば、「微生物学基礎講座８  遺伝子工学、共立出版、１９８７年」に詳細に記載されており、それらを利用することが可能である。
【００６２】
本発明の形質転換体が本発明の発現ベクターを有する場合、本発明の形質転換体から本発明の発現ベクターを調製することができる。例えば、本発明の形質転換体を培養して得られる培養物からアルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（商品名、キアゲン製）等の市販の抽出キットを用いて本発明の発現ベクターを調製することができる。
【００６３】
次に、本発明のフコース結合性タンパク質の製造方法（以下、「本発明の製造方法」ともいう）について説明する。本発明の製造方法は、例えば、本発明の形質転換体を培養することにより本発明のフコース結合性タンパク質を発現する工程（以下、「第１工程」ともいう）、および発現した本発明のフコース結合性タンパク質を回収する工程（以下、「第２工程」ともいう）を含む、本発明のフコース結合性タンパク質の製造方法であってよい。
【００６４】
第１工程では、本発明の形質転換体を培養し、本発明のフコース結合性タンパク質を発現する。第１工程における培地組成や培養条件は、宿主の種類や本発明のフコース結合性タンパク質の特性等の諸条件に応じて適宜設定することができる。培地組成や培養条件は、例えば、宿主が増殖でき、且つ、本発明のフコース結合性タンパク質を発現できるように設定することができる。培地としては、例えば、炭素源、窒素源、無機塩、その他の各種有機成分や無機成分を適宜含有する培地を用いることができる。例えば、宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを用いる場合、好ましくは、必要な栄養源を補ったＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地等を使用してよい。なお、本発明の発現ベクターの導入の有無により本発明の形質転換体を選択的に増殖させるために、培地に当該発現ベクターに含まれる抗生物質耐性遺伝子に対応した抗生物質を添加して培養すると好ましい。例えば、当該発現ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は培地にカナマイシンを添加すればよい。本発明のＤＮＡがゲノムＤＮＡ上に導入されている場合も同様である。培養温度は、例えば、利用する宿主に関して一般的に知られた温度であってよい。例えば、宿主がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである場合、培養温度は、１０℃から４０℃、好ましくは２０℃から３７℃であってよい。また、培地のｐＨは、利用する宿主に関して一般的に知られたｐＨ範囲であってよい。例えば、宿主がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである場合、培地のｐＨは、ｐＨ６．８からｐＨ７．４の範囲、好ましくはｐＨ７．０前後であってよい。
【００６５】
本発明のフコース結合性タンパク質を誘導性のプロモータの制御下で発現する場合は、本発明のフコース結合性タンパク質が良好に発現されるよう培地に誘導剤を添加してよい。誘導剤としては、例えば、ｔａｃプロモータやｌａｃプロモータを使用する場合は、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を挙げることができる。誘導剤の添加濃度は、例えば、０．００５から１．０ｍＭの範囲、好ましくは０．０１から０．５ｍＭの範囲であってよい。ＩＰＴＧ添加による発現誘導は、利用する宿主に関して一般的に知られた条件で実施してよい。なお、本発明のフコース結合性タンパク質を誘導性のプロモータの制御下で発現する場合であっても、誘導剤なしで本発明のフコース結合性タンパク質が良好に発現されるのであれば誘導剤を添加しなくてもよい。
【００６６】
第２工程では、発現した本発明のフコース結合性タンパク質を回収する。本発明のフコース結合性タンパク質は、具体的には、得られた培養物から回収されてよい。なお、「培養物」とは、培養により得られた培養液の全体またはその一部を意味する。当該一部は、本発明のフコース結合性タンパク質を含有する部分であれば特に制限されない。当該一部としては、本発明の形質転換体の細胞、本発明の形質転換体の細胞分泌物、培養後の培地（すなわち培養上清）が挙げられる本発明のフコース結合性タンパク質の回収は、例えば、一般的に知られたタンパク質の回収方法によって実施してよい。例えば、本発明のフコース結合性タンパク質が培養液中に分泌生産される場合は、細胞を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から本発明のフコース結合性タンパク質を回収してよい。また、本発明のフコース結合性タンパク質が細胞内（原核生物においてはペリプラズムも含む）に生産される場合は、遠心分離操作により細胞を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加する等により細胞を破砕し、細胞破砕液から本発明のフコース結合性タンパク質を回収してよい。
【００６７】
回収した本発明のフコース結合性タンパク質は、所望の純度が得られるよう、適宜精製してよい。本発明のフコース結合性タンパク質の精製は、例えば、タンパク質の分離精製に用いられる公知の方法により実施してよい。タンパク質の精製方法としては、液体クロマトグラフィーを用いた分離精製法を挙げることができる。液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。好ましくは、これらのクロマトグラフィーを組み合わせて実施してよい。本発明のフコース結合性タンパク質の純度および分子量は、例えば、当該技術分野において公知の方法を用いて確認することができる。そのような方法としては、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法やゲルろ過クロマトグラフィー法を挙げることができる。
【００６８】
本発明のフコース結合性タンパク質は、例えば、不溶性担体に固定化して利用することができる。本発明のフコース結合性タンパク質は、具体的には、例えば、不溶性担体に固定化して吸着剤として利用することができる。すなわち、本発明は、不溶性担体と、該不溶性担体に固定化された本発明のフコース結合性タンパク質とを備える、吸着剤を提供する。同吸着剤を、「本発明の吸着剤」ともいう。
【００６９】
本発明の吸着剤は、例えば、本発明のフコース結合性タンパク質を不溶性担体に固定化することにより製造することができる。不溶性担体は、特に制限されない。不溶性担体としては、シリカゲルや金薄膜を蒸着させたガラス等の無機系担体、アガロース、セルロース、キチン、キトサン等の多糖類を原料とした水に不溶性の多糖系担体およびそれらを架橋剤で架橋した架橋多糖系担体、デキストラン、プルラン、デンプン、アルギン酸塩、カラギーナン等の水溶性多糖類を架橋剤で架橋した架橋多糖系担体、ポリ（メタ）アクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリスチレン等の合成高分子系担体およびそれらを架橋剤で架橋した架橋合成高分子系担体を例示することができる。特に、水酸基を有し、後述する親水性高分子による修飾が容易に行える点で、好ましい不溶性担体としては、アガロース、セルロース、デキストラン、プルラン等の電荷をもたない多糖系担体およびそれらを架橋剤で架橋した架橋多糖系担体や、ポリ（メタ）アクリレートやポリウレタン等の親水性合成高分子系担体およびそれらを架橋剤で架橋した架橋親水性合成高分子系担体が挙げられる。
【００７０】
不溶性担体は、物質の非特異吸着を抑制する点で、好ましくはその表面が親水性高分子で修飾されていてよく、より好ましくはその表面に親水性高分子が共有結合で固定されていてよい。親水性高分子としては、アガロース、セルロース、デキストラン、プルラン、デンプン等の中性多糖類や、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）やポリビニルアルコール等の水酸基を有する合成高分子を例示することができる。特に、親水性が高く、不溶性担体表面への共有結合による固定が容易に行える点で、好ましい親水性高分子としては、デキストラン、プルラン、およびデンプン等の中性多糖類が挙げられ、より好ましい親水性高分子としては、デキストランおよびプルランが挙げられる。デキストランやプルラン等の親水性高分子の分子量は、特に制限されない。デキストランやプルラン等の親水性高分子の分子量は、不溶性担体表面の親水性修飾が十分に行える点で、好ましくは、数平均分子量として１０，０００から１，０００，０００であってよい。
【００７１】
不溶性担体の形状は、特に制限されない。不溶性担体の形状は、例えば、粒子状、スポンジ状、平膜状、平板状、中空状、繊維状のいずれであってもよい。不溶性担体は、吸着剤への細胞吸着を効率的に行える点で、好ましくは粒子状の担体であってよく、より好ましくは真球状の粒子状担体であってよい。
【００７２】
不溶性担体の、水に膨潤させた状態での粒径は、担体から製造される吸着剤をカラムに充填した場合に分離対象の細胞が吸着剤表面と十分接触し、かつ吸着剤に結合しない細胞が吸着剤間の隙間を淀みなく通過できる点で、好ましくは１００μｍ以上１０００μｍ以下、より好ましくは１００μｍ以上５００μｍ以下、さらに好ましくは１５０μｍ以上３００μｍ以下であってよい。「粒径」とは、平均粒子径Ｄ５０を意味してよい。「平均粒子径Ｄ５０」とは、コールター原理に基づく粒度分布測定結果における体積基準での積算値５０％での粒径を意味してよい。不溶性担体の粒径は、例えば、ベックマンコールター（株）製の精密粒度分布測定装置（製品名「Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ３」）等を用いて測定することができる。また、不溶性担体の粒径は、例えば、光学顕微鏡を用いて目盛り付きスライドグラスの画像を撮影したのち、同じ倍率で測定対象の複数個の粒子の画像を撮影し、物差しを用いて撮影した複数個の担体の粒径を測定し、その平均値を算出することで求めることができる。
【００７３】
不溶性担体の細孔の有無は特に制限されない。不溶性担体は、例えば、多孔性であってもよく、無孔性であってもよい。また、不溶性担体は、本発明の吸着剤に使用するタンパク質を担体に固定化するための活性官能基導入が容易に行える点で、好ましくは、水酸基を有する粒子状担体であってよい。不溶性担体としては、例えば、市販品を使用してよい。市販品としては、ポリ（メタ）アクリレートを原料としたトヨパール（東ソー製）、アガロースを原料としたＳｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア製）、セルロースを原料としたセルフィア（旭化成製）等が挙げられる。
【００７４】
本発明の吸着剤は、例えば、不溶性担体に本発明のフコース結合性タンパク質を固定化することにより製造できる。本発明の吸着剤は、具体的には、例えば、不溶性担体から反応性不溶性担体を製造する工程（以下、「工程Ｘ」ともいう）と、該反応性不溶性担体に本発明のフコース結合性タンパク質を固定化する工程（以下、「工程Ｙ」ともいう）を含む方法により製造することができる。
【００７５】
工程Ｘは、不溶性担体から反応性不溶性担体を製造する工程である。反応性不溶性担体は、例えば、不溶性担体に反応性官能基を導入することにより製造することができる。反応性官能基は、不溶性担体に本発明のフコース結合性タンパク質を固定化するために利用できるものであれば、特に制限されない。反応性官能基としては、一般的なタンパク質固定化用の官能基が挙げられる。反応性官能基として、具体的には、エポキシ基、ホルミル基、カルボキシル基、活性エステル基、アミノ基、マレイミド基、ハロアセチル基等を例示することができる。
【００７６】
不溶性担体に反応性官能基を導入する方法としては、一般的な官能基導入方法が挙げられる。
【００７７】
エポキシ基を導入する方法としては、不溶性担体の水酸基とエポキシ基含有化合物を反応させる方法を例示することができる。エポキシ基含有化合物としては、エピクロロヒドリンやエピブロモヒドリン等のハロヒドリン類、エチレングリコールジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、テトラエチレングリコールジグリシジルエーテル、レゾルシノールジグリシジルエーテル等のジグリシジルエーテル類、グリセロールトリグリシジルエーテル、エリスリトールトリグリシジルエーテル、ジグリセロールトリグリシジルエーテル等のトリグリシジルエーテル類、エリスリトールテトラグリシジルエーテル、ペンタエリスリトールテトラグリシジルエーテル等のテトラグリシジルエーテル類を例示することができる。また、不溶性担体の水酸基とエポキシ基含有化合物を反応させる場合、反応効率を高める点で、好ましくは、塩基性条件下で反応を実施してよい。
【００７８】
ホルミル基を導入する方法としては、不溶性担体の水酸基とグルタルアルデヒド等の２官能性アルデヒド類を反応させる方法や、不溶性担体を過ヨウ素酸ナトリウム等の酸化剤と反応させる方法を例示することができる。また、ホルミル基を導入する方法としては、エポキシ基を導入した不溶性担体と、Ｄ−グルカミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、α−チオグリセロール等の化合物を反応させることで隣接する水酸基を不溶性担体に導入し、さらに過ヨウ素酸ナトリウム等の酸化剤と反応させる方法を例示することができる。
【００７９】
カルボキシル基を導入する方法としては、不溶性担体の水酸基とモノクロロ酢酸やモノブロモ酢酸等のハロ酢酸と塩基性条件下で反応させる方法を例示することができる。また、カルボキシル基を導入する方法としては、エポキシ基を導入した不溶性担体を、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸類、β−アラニン、４−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸等のアミノ基含有カルボン酸類、またはチオグリコール酸やチオリンゴ酸等の含硫黄カルボン酸類と塩基性条件下で反応させる方法を例示することができる。また、カルボキシル基を導入する方法としては、不溶性担体に導入したカルボキシル基を１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（以下、ＥＤＣとする。）等の縮合剤存在下でＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させることにより、活性エステル基であるＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルへ誘導する方法を例示することができる。
【００８０】
アミノ基を導入する方法としては、エポキシ基を導入した不溶性担体を、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリス（２−アミノエチル）アミン等の少なくとも２つ以上のアミノ基を有する化合物と反応させる方法を例示することができる。
【００８１】
マレイミド基を導入する方法としては、水酸基および／またはアミノ基を有する不溶性担体と、３−マレイミドプロピオン酸、４−マレイミド酪酸、６−マレイミドヘキサン酸、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸等のマレイミド基を有するカルボン酸類をＥＤＣ等の縮合剤存在下で反応させる方法を例示することができる。また、マレイミド基を導入する方法としては、不溶性担体と、マレイミド基を有するカルボン酸類のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルやＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルを反応させる方法を例示することができる。
【００８２】
ハロアセチル基を導入する方法としては、水酸基を有する不溶性担体またはアミノ基を導入した不溶性担体と、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド等の酸ハロゲン化物を反応させる方法や、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸等のハロゲン化酢酸をＥＤＣ等の縮合剤存在下で反応させる方法を挙げることができる。また、ハロアセチル基を導入する方法としては、不溶性担体と、ハロゲン化酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルやＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルを反応させる方法を挙げることができる。
【００８３】
工程Ｙは、工程Ｘで製造した反応性不溶性担体に本発明のフコース結合性タンパク質を固定化する工程である。工程Ｘで得られた反応性不溶性担体に本発明のフコース結合性タンパク質を固定化する方法としては、一般的な担体へのタンパク質の固定化方法が挙げられる。担体へのタンパク質の固定化方法としては、配位結合やアフィニティー結合等により共有結合を形成せずにタンパク質を不溶性担体に固定化する方法、タンパク質に固定化用活性官能基を導入したのち、固定化用活性官能基と不溶性担体を反応させて不溶性担体に固定化する方法、不溶性担体に導入した固定化用活性官能基とタンパク質を反応させ、共有結合を形成させて不溶性担体に固定化する方法を挙げることができる。
【００８４】
共有結合を形成せずにタンパク質を不溶性担体に固定化する方法としては、アビジン−ビオチンのアフィニティー結合を利用し、ビオチンを導入したタンパク質をストレプトアビジンセファロースハイパフォーマンス（ＧＥヘルスケア製）等のアビジンが固定化された不溶性担体に固定化する方法を例示することができる。タンパク質へのビオチンの導入方法としては、９−（ビオチンアミド）−４，７−ジオキサノナン酸−Ｎ−スクシンイミジル等の活性エステル基を有するビオチン化試薬とタンパク質のアミノ基を反応させる方法や、Ｎ−ビオチニル−Ｎ’−［２−（Ｎ−マレイミド）エチル］ピペラジン塩酸塩等のマレイミド基を有するビオチン化試薬とタンパク質のメルカプト基を反応させる方法を例示することができる。
【００８５】
タンパク質に導入した固定化用活性官能基と不溶性担体を反応させ、共有結合を形成させて固定化する方法としては、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸  ３−スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルナトリウム塩等のマレイミド基と活性エステル基の両方を有する化合物の活性エステル基とタンパク質のアミノ基を反応させてタンパク質にマレイミド基を導入したのち、メルカプト基が導入された不溶性担体と反応させる方法を例示することができる。
【００８６】
不溶性担体に導入した固定化用活性官能基とタンパク質を反応させてタンパク質を不溶性担体に固定化する方法としては、不溶性担体に導入したエポキシ基、ホルミル基、カルボキシル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル等の活性エステル基とタンパク質のアミノ基を反応させる方法、不溶性担体に導入したアミノ基とタンパク質のカルボキシル基を反応させる方法、不溶性担体に導入したエポキシ基、マレイミド基、ハロアセチル基またはハロアルキル基とタンパク質のメルカプト基を反応させる方法を例示することができる。
【００８７】
短時間に高収率で不溶性担体へのタンパク質固定化が行える点で、好ましい固定化方法としては、不溶性担体に導入したホルミル基または活性エステル基とタンパク質のアミノ基を反応させる方法や、不溶性担体に導入したマレイミド基またはハロアセチル基とタンパク質のメルカプト基を反応させる方法が挙げられる。また、固定化反応をｐＨが中性付近で行うことが可能でありタンパク質の変性を抑制できることが可能である点で、より好ましい固定化方法としては、不溶性担体に導入したマレイミド基またはハロアセチル基とタンパク質のメルカプト基を反応させる方法が挙げられる。また、官能基の安定性が高い点で、さらに好ましい固定化方法としては、不溶性担体に導入したマレイミド基とタンパク質のメルカプト基を反応させる方法が挙げられる。
【００８８】
固定化用官能基を導入した不溶性担体と、緩衝液に溶解した本発明のフコース結合性タンパク質を反応させることで、不溶性担体に本発明のフコース結合性タンパク質を固定化することができ、以て本発明の吸着剤を製造することができる。本発明のフコース結合性タンパク質は、例えば、適当な緩衝液に溶解して固定化に用いてよい。本発明のフコース結合性タンパク質を溶解する緩衝液は、特に制限されない。本発明のフコース結合性タンパク質を溶解する緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液や、Ｄ−ＰＢＳ（−）（富士フイルム和光純薬製）等の市販の緩衝液を例示することができる。また、固定化反応の効率を高めることを目的として、緩衝液には、適当な添加剤、例えば、塩化ナトリウム等の無機塩類やポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）等の界面活性剤、を添加してもよい。本発明のフコース結合性タンパク質を不溶性担体に固定化する際の反応温度およびｐＨは、活性官能基の反応性や本発明のフコース結合性タンパク質の安定性等の諸条件に応じて適宜設定できる。反応温度は、例えば、０℃以上５０℃以下であってよい。ｐＨは、例えば、ｐＨ４以上ｐＨ１０以下であってよい。特に、本発明のフコース結合性タンパク質の失活を抑制する点で、好ましくは、反応温度は１５℃以上４０℃以下、ｐＨはｐＨ５以上ｐＨ９以下であってよい。
【００８９】
不溶性担体への本発明のフコース結合性タンパク質の固定化量は、フコース含有糖鎖を有する物質と本発明のフコース結合性タンパク質との結合性等の諸条件に応じて適宜設定できる。不溶性担体への本発明のフコース結合性タンパク質の固定化量は、１ｍＬの不溶性担体あたり、好ましくは０．０１ｍｇ以上５０ｍｇ以下、より好ましくは０．０５ｍｇ以上３０ｍｇ以下であってよい。不溶性担体への本発明のフコース結合性タンパク質の固定化量は、固定化反応時の本発明のフコース結合性タンパク質の使用量や不溶性担体への活性官能基導入量を調節することにより調整することができる。本発明のフコース結合性タンパク質の不溶性担体への固定化量は、固定化反応液および反応後の洗浄液を回収して未反応の本発明のフコース結合性タンパク質量を求めたのち、固定化反応に使用した本発明のフコース結合性タンパク質量から未反応の本発明のフコース結合性タンパク質量を差し引くことで算出することができる。
【００９０】
また、前述したように、不溶性担体は、物質の非特異吸着を抑制する点で、好ましくは親水性高分子が共有結合で固定されていてよい。よって、本発明の吸着剤を製造する場合には、前記工程Ｘで本発明のフコース結合性タンパク質を固定化するための官能基を導入する前に、不溶性担体に親水性高分子を共有結合で固定してもよい。不溶性担体に親水性高分子を共有結合で固定する方法としては、一般的な共有結合形成方法が挙げられる。共有結合形成方法としては、不溶性担体表面の水酸基とエピクロロヒドリン、エチレングリコールジグリシジルエーテル、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル等のエポキシ基含有化合物を塩基性条件下で反応させることで不溶性担体にエポキシ基を導入したのち、エポキシ基と親水性高分子の水酸基を塩基性条件下で反応させる方法を挙げることができる。
【００９１】
本発明の吸着剤は、本発明のフコース結合性タンパク質を備えることから、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖等のフコース含有糖鎖を有する細胞や、前記構造を含む糖鎖および／または複合糖質を吸着することができる。
【００９２】
本発明のフコース結合性タンパク質は、例えば、フコース含有糖鎖を有する物質の吸着に利用することができる。すなわち、本発明の方法は、本発明のフコース結合性タンパク質を利用したフコース含有糖鎖を有する物質を吸着する方法であってよい。本発明の方法は、具体的には、本発明のフコース結合性タンパク質とフコース含有糖鎖を有する物質とを接触させる工程を含む、フコース含有糖鎖を有する物質の吸着方法であってよい。同工程を、「接触工程」ともいう。
【００９３】
フコース含有糖鎖を有する物質の吸着により、例えば、フコース含有糖鎖を有する物質を分離することができる。フコース含有糖鎖を有する物質の吸着により、具体的には、例えば、フコース含有糖鎖を有する物質と他の物質（すなわち、フコース含有糖鎖を有する物質以外の物質）とを分離することができる。すなわち、本発明の方法の一態様は、例えば、フコース含有糖鎖を有する物質の分離方法であってよい。また、接触工程の一態様は、例えば、本発明のフコース結合性タンパク質とフコース含有糖鎖を有する物質と他の物質を含有する混合物とを接触させる工程であってよい。
【００９４】
フコース含有糖鎖を有する物質の吸着により、例えば、フコース含有糖鎖を有する物質を精製することができる。フコース含有糖鎖を有する物質の吸着により、具体的には、例えば、フコース含有糖鎖を有する物質と他の物質を含有する混合物からフコース含有糖鎖を有する物質を回収し、以てフコース含有糖鎖を有する物質を精製することができる。すなわち、本発明の方法の一態様は、例えば、フコース含有糖鎖を有する物質の精製方法であってよい。フコース含有糖鎖を有する物質の精製により、フコース含有糖鎖を有する物質が得られてよい。すなわち、本発明の方法の一態様は、例えば、フコース含有糖鎖を有する物質の製造方法であってもよい。
【００９５】
フコース含有糖鎖を有する物質の吸着により、例えば、他の物質を精製することができる。フコース含有糖鎖を有する物質の吸着により、具体的には、例えば、フコース含有糖鎖を有する物質と他の物質を含有する混合物からフコース含有糖鎖を有する物質を除去し、以て他の物質を精製することができる。すなわち、本発明の方法の一態様は、例えば、他の物質の精製方法であってよい。フコース含有糖鎖を有する物質の精製により、他の物質が得られてよい。すなわち、本発明の方法の一態様は、例えば、他の物質の製造方法であってもよい。
【００９６】
フコース含有糖鎖を有する物質および他の物質は、本発明のフコース結合性タンパク質が結合親和性を有するフコース含有糖鎖の種類等の諸条件に応じて適宜選択できる。
【００９７】
フコース含有糖鎖を有する物質は、本発明のフコース結合性タンパク質が結合親和性を有するフコース含有糖鎖を有するものであれば、特に制限されない。言い換えると、フコース含有糖鎖を有する物質が有するフコース含有糖鎖は、本発明のフコース結合性タンパク質が結合親和性を有するものであれば、特に制限されない。フコース含有糖鎖を有する物質としては、特に、Ｈタイプ１型糖鎖、Ｈタイプ３型糖鎖、ルイスＹ型糖鎖、および／またはルイスｂ型糖鎖を有する物質等の、Ｈタイプ１型糖鎖構造、Ｈタイプ３型糖鎖構造、ルイスＹ型糖鎖構造、および／またはルイスｂ型糖鎖構造を含む糖鎖を有する物質が挙げられる。フコース含有糖鎖を有する物質として、さらに特には、Ｈタイプ１型糖鎖および／またはＨタイプ３型糖鎖を有する物質等の、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖を有する物質が挙げられる。フコース含有糖鎖を有する物質は、例えば、フコース含有糖鎖そのものであってもよく、フコース含有糖鎖と他の構造とが結合した物質であってもよい。フコース含有糖鎖を有する物質として、具体的には、フコース含有糖鎖を有する細胞が挙げられる。フコース含有糖鎖を有する物質として、具体的には、フコース含有糖鎖そのものや、フコース含有糖鎖を有する複合糖質も挙げられる。フコース含有糖鎖を有する複合糖質としては、フコース含有糖鎖と結合したタンパク質やフコース含有糖鎖と結合した脂質が挙げられる。
【００９８】
他の物質は、本発明のフコース結合性タンパク質との結合の程度が十分に小さいものであれば特に制限されない。他の物質としては、フコース含有糖鎖を有しない物質が挙げられる。フコース含有糖鎖を有しない物質は、本発明のフコース結合性タンパク質が結合親和性を有するフコース含有糖鎖を有しないものであれば、特に制限されない。フコース含有糖鎖を有しない物質は、本発明のフコース結合性タンパク質が結合親和性を有するフコース含有糖鎖以外のフコース含有糖鎖を有していてもよく、いなくてもよい。フコース含有糖鎖を有しない物質としては、特に、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖を有しない物質が挙げられる。フコース含有糖鎖を有しない物質として、さらに特には、Ｈタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖のいずれも有しない物質等の、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよびＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖のいずれも有しない物質が挙げられる。フコース含有糖鎖を有しない物質として、さらに特には、Ｈタイプ１型糖鎖、Ｈタイプ３型糖鎖、ルイスＹ型糖鎖、およびルイスｂ型糖鎖のいずれも有しない物質等の、Ｈタイプ１型糖鎖構造、Ｈタイプ３型糖鎖構造、ルイスＹ型糖鎖構造、およびルイスｂ型糖鎖構造を含む糖鎖のいずれも有しない物質が挙げられる。フコース含有糖鎖を有しない物質として、具体的には、フコース含有糖鎖を有しない細胞が挙げられる。
【００９９】
本発明のフコース結合性タンパク質は、例えば、本発明の吸着剤の形態でフコース含有糖鎖を有する物質の吸着に利用することができる。以下、本発明の吸着剤の形態で本発明のフコース結合性タンパク質を利用する場合を参照して本発明の方法の具体例について説明するが、当該説明は他の形態で本発明のフコース結合性タンパク質を利用する場合にも準用できる。
【０１００】
本発明の吸着剤は、例えば、カラムに充填された形態でフコース含有糖鎖を有する物質の吸着に利用することができる。すなわち、本発明の方法においては、例えば、本発明の吸着剤が充填されたカラムが用いられてよい。
【０１０１】
本発明の吸着剤は、例えば、細胞の分離に利用できる。本発明の吸着剤は、具体的には、例えば、細胞混合物に含有される細胞の分離に利用できる。本発明の吸着剤を利用した細胞の分離方法を、「本発明の細胞分離方法」ともいう。
【０１０２】
本発明の細胞分離方法は、例えば、本発明の吸着剤と細胞混合物とを接触させる工程、および吸着剤に結合した細胞と吸着剤に結合しなかった細胞とを分離する工程を含む、細胞の分離方法であってよい。
【０１０３】
細胞混合物は、例えば、第１の細胞と第２の細胞を含有する混合物であってよい。
【０１０４】
第１の細胞は、吸着剤への結合対象とする細胞である。第１の細胞としては、上述したフコース含有糖鎖を有する物質に該当する細胞が挙げられる。すなわち、第１の細胞としては、フコース含有糖鎖を有する細胞が挙げられる。フコース含有糖鎖を有する細胞としては、特に、Ｈタイプ１型糖鎖構造、Ｈタイプ３型糖鎖構造、ルイスＹ型糖鎖構造、および／またはルイスｂ型糖鎖構造を含む糖鎖を有する物質が挙げられる。フコース含有糖鎖を有する細胞として、さらに特には、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖を有する細胞が挙げられる。フコース含有糖鎖を有する細胞として、具体的には、未分化細胞やがん細胞が挙げられる。未分化細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞やヒトＥＳ細胞が挙げられる。がん細胞としては、２１０２ＥｐやＮＴ２／Ｄ１等のヒト胎児性がん細胞、ＰＣ−９等のヒト肺腺がん細胞、Ｃａｐａｎ−１等のヒト膵臓がん細胞、ＨＴ２９等のヒト結腸がん細胞が挙げられる。これらの細胞は、いずれも、例えば、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖を有する細胞であってよい。また、前記細胞混合物中に含有される第１の細胞の種類の数は、特に制限されない。前記細胞混合物中に含有される第１の細胞の種類は、１種類であってもよく、２種類またはそれ以上であってもよい。
【０１０５】
第２の細胞は、吸着剤への結合対象としない細胞である。第２の細胞としては、上述した他の物質に該当する細胞が挙げられる。すなわち、第２の細胞としては、フコース含有糖鎖を有しない細胞が挙げられる。フコース含有糖鎖を有しない細胞としては、特に、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよびＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖のいずれも有しない細胞が挙げられる。フコース含有糖鎖を有しない細胞として、さらに特には、Ｈタイプ１型糖鎖構造、Ｈタイプ３型糖鎖構造、ルイスＹ型糖鎖構造、およびルイスｂ型糖鎖構造を含む糖鎖のいずれも有しない物質が挙げられる。フコース含有糖鎖を有しない細胞として、具体的には、分化細胞や非がん細胞が挙げられる。分化細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞やヒトＥＳ細胞等の未分化細胞から分化して生成する細胞が挙げられる。フコース含有糖鎖を有しない細胞として、具体的には、フコース含有糖鎖を有しないがん細胞も挙げられる。フコース含有糖鎖を有しないがん細胞としては、第１の細胞として例示したがん細胞以外のがん細胞であって、フコース含有糖鎖を有しないものが挙げられる。これらの細胞は、いずれも、例えば、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよびＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖のいずれも有しない細胞であってよい。これらの細胞は、いずれも、例えば、Ｈタイプ１型糖鎖構造、Ｈタイプ３型糖鎖構造、ルイスＹ型糖鎖構造、およびルイスｂ型糖鎖構造を含む糖鎖のいずれも有しない細胞であってもよい。また、前記細胞混合物中に含有される第２の細胞の種類の数は、特に制限されない。前記細胞混合物中に含有される第２の細胞の種類は、１種類であってもよく、２種類またはそれ以上であってもよい。
【０１０６】
本発明の吸着剤と細胞混合物との接触により、例えば、第１の細胞を選択的に吸着剤に結合させることができ、以て細胞を分離することができる。すなわち、例えば、吸着剤に結合した細胞は第１の細胞であってよく、吸着剤に結合しなかった細胞は第２の細胞であってよい。
【０１０７】
本発明の細胞分離方法によれば、細胞が吸着剤に結合するため、吸着剤に固定化していない本発明のフコース結合性タンパク質を利用して細胞を分離する方法、例えば、蛍光標識した本発明のフコース結合性タンパク質と細胞混合物を接触させてからフローサイトメーターとセルソーターを組み合せて細胞を分離する方法に比べて、効率的に細胞を分離することができる。
【０１０８】
本発明の吸着剤と細胞混合物との接触方法は、特に制限されない。本発明の吸着剤と細胞混合物との接触方法としては、例えば、細胞混合物中に吸着剤を添加して所定の時間振とうする方法や、吸着剤をカラムに充填して細胞と接触させる方法を挙げることができる。特に、吸着剤に結合した細胞の再遊離および吸着剤との過剰な接触による細胞へのダメージを避けることができると期待される点で、好ましくは、吸着剤をカラムに充填して細胞と接触させてよい。吸着剤に結合した細胞と吸着剤に結合しなかった細胞との分離は、例えば、細胞が結合した吸着剤と、吸着剤に結合しなかった細胞を含有する非吸着画分とを分離することにより実施できる。例えば、細胞混合物中に吸着剤を添加する場合、添加した吸着剤を細胞混合物から分離することにより、吸着剤と非吸着画分とを分離することができる。また、例えば、吸着剤をカラムに充填して細胞と接触させる場合、吸着剤を充填したカラムに細胞混合物を通液することにより、吸着剤と非吸着画分とを分離することができる。吸着剤に結合した細胞（例えば第１の細胞）は、適宜、吸着剤から溶出し、溶出画分として回収することができる。また、吸着剤に結合しなかった細胞（例えば第２の細胞）は、適宜、非吸着画分として回収することができる。本発明の細胞分離方法により、例えば、第１の細胞が精製されてよく、また、第１の細胞が得られてよい。すなわち、本発明の細胞分離方法の一態様は、例えば、第１の細胞の精製方法であってもよく、第１の細胞の製造方法であってもよい。本発明の細胞分離方法により、例えば、第２の細胞が精製されてよく、また、第２の細胞が得られてよい。すなわち、本発明の細胞分離方法の一態様は、例えば、第２の細胞の精製方法であってもよく、第２の細胞の製造方法であってもよい。
【０１０９】
細胞混合物は、例えば、細胞懸濁液として調製され、本発明の細胞分離方法に用いられてよい。細胞懸濁液を調製するための液体は、好ましくは、細胞死と細胞凝集を防ぐために有効な成分を添加した液体であってよい。細胞懸濁液を調製するための液体としては、市販のＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳに０．５％（ｗ／ｖ）ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（以下、ＢＳＡと略す。）と２ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（以下、ＥＤＴＡと略す。）を添加したもの）を例示することができる。この場合、ＢＳＡによる細胞分離時における細胞へのダメージの軽減と細胞の吸着剤への非特異吸着を抑制する効果、およびＥＤＴＡによる細胞の凝集防止効果を期待することができる。
【０１１０】
「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ」からなる構造を有するＨタイプ１型糖鎖および「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ」からなる構造を有するＨタイプ３型糖鎖は、ヒトｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の未分化細胞に特異的に存在する未分化マーカーとして知られている糖鎖である（非特許文献３）。従って、本発明の細胞分離方法により、例えば、未分化細胞と分化細胞が含まれる細胞混合物から、未分化細胞を選択的に除去して分化細胞を精製することができる。また、がん細胞、例えば、２１０２ＥｐやＮＴ２／Ｄ１等のヒト胎児性がん細胞、ＰＣ−９等のヒト肺腺がん細胞、Ｃａｐａｎ−１等のヒト膵臓がん細胞、ＨＴ２９等のヒト結腸がん細胞は、Ｈタイプ１型糖鎖および／またはＨタイプ３型糖鎖を有することが知られている（例えば、Ｊ．Ｂｉｏｍａｒｋ．２０１３：９６０８６２．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１３／９６０８６２．）。従って、本発明の細胞分離方法により、例えば、これらのがん細胞を選択的に吸着剤に吸着させ、以てこれらのがん細胞を分離することができる。がん細胞を分離することにより、例えば、細胞混合物中のがん細胞を検出することができる。がん細胞の検出としては、がん細胞の存在の有無の同定やがん細胞の存在の程度（すなわち存在量）の同定が挙げられる。がん細胞の分離または検出に用いられる細胞混合物としては、被検者から得られた細胞を含有する試料が挙げられる。すなわち、被検者から得られた細胞を含有する試料中のがん細胞を検出することにより、例えば、被検者ががんに罹患しているかを診断することができる。
【０１１１】
本発明の吸着剤は、本発明のフコース結合性タンパク質の固定化量が吸着剤１ｍＬあたり０．０５ｍｇ以上３０ｍｇ以下であれば、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ」からなる構造を含む糖鎖等のフコース含有糖鎖を有する細胞を１００万個以上結合することが可能である。例えば、ヒトｉＰＳ細胞から誘導した心筋細胞を用いた再生医療においては、一人あたり１０億個の臨床グレードの心筋細胞が必要であり、０．１％の未分化細胞が混入していると仮定した場合では１００万個、１％の未分化細胞が混入していると仮定した場合では１０００万個の未分化幹細胞を完全に除去する技術が必要となる。これらのような大量の細胞中に混在する未分化細胞を分離除去する場合でも、本発明の吸着剤を少量（例えば、未分化細胞が１００万個の場合は１ｍＬ、未分化細胞が１０００万個の場合は１０ｍＬ）用いることにより、短時間で効率良く未分化細胞を除去することができる。また、例えば患者一人あたり１００億〜１０００億個の細胞が必要とされる血球系細胞を未分化幹細胞から誘導する場合、１％の未分化幹細胞が混入していると仮定した場合であっても、本発明の吸着剤を１００ｍＬから１０００ｍＬ用いることにより血球系細胞に残存する未分化細胞を分離することができる。
【０１１２】
さらに、本発明の細胞分離方法は、既存の細胞分離技術であるフローサイトメトリーとセルソーターを組合せた方法や細胞の表面マーカータンパク質に対する抗体を結合させた磁気ビーズを利用した方法、および未分化細胞除去技術として公知である毒素を融合したＢＣ２ＬＣＮレクチンを利用した方法（特開２０１４−１２６１４６号公報）と比べても、未分化細胞の除去処理を５分から３０分程度の極めて短時間で行うことができることから、目的の分化細胞を大量に精製する場合にも極めて有効である。
【０１１３】
本発明の吸着剤は、例えば、フコース含有糖鎖を有する物質の精製に利用できる。本発明の吸着剤を利用したフコース含有糖鎖を有する物質の精製方法を、「本発明の精製方法」ともいう。
【０１１４】
本発明の精製方法は、本発明の吸着剤とフコース含有糖鎖を有する物質とを接触させる工程、および吸着剤に結合した前記物質を溶出する工程を含む、フコース含有糖鎖を有する物質の精製方法であってよい。
【０１１５】
フコース含有糖鎖を有する物質については上述した通りである。フコース含有糖鎖を有する物質は、特に、Ｈタイプ１型糖鎖、Ｈタイプ３型糖鎖、ルイスＹ型糖鎖、ルイスｂ型糖鎖等のフコースを含む糖鎖を有する物質であってよい。また、フコース含有糖鎖を有する物質は、特に、フコース含有糖鎖および／またはフコース含有糖鎖を有する複合糖質であってよい。
【０１１６】
本発明の吸着剤とフコース含有糖鎖を有する物質との接触方法は、特に制限されない。本発明の吸着剤とフコース含有糖鎖を有する物質との接触方法としては、例えば、ｐＨ５以上ｐＨ９以下、好ましくはｐＨ６以上ｐＨ８以下の緩衝液で平衡化した吸着剤と、分離精製前のフコース含有糖鎖を有する物質を含有する溶液とを接触させる方法が挙げられる。特に、効率的に精製が行なえる点で、吸着剤をカラムに充填してフコース含有糖鎖を有する物質と接触させることが好ましい。本発明の吸着剤へのフコース含有糖鎖を有する物質の吸着の際に用いる緩衝液（例えば、吸着剤の平衡化、フコース含有糖鎖を有する物質を含有する溶液の調製、またはカラムに通液する際の移動相に用いるもの）としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液を例示することができる。また、緩衝液には、適当な添加剤、例えば、塩化ナトリウム等の無機塩類やポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）等の界面活性剤、を添加してもよい。
【０１１７】
本発明の吸着剤に吸着したフコース含有糖鎖を有する物質は、例えば、Ｌ−フコースを含有する緩衝液により吸着剤から溶出することができる。Ｌ−フコースを含む緩衝液としては、例えば、前述の本発明の吸着剤へのフコース含有糖鎖を有する物質の吸着の際に用いる緩衝液にＬ−フコースを添加したものが挙げられる。緩衝液におけるＬ−フコースの濃度は、例えば、０．１ｍＭ以上１Ｍ以下、好ましくは１ｍＭ以上１００ｍＭ以下であってよい。
【０１１８】
このようにして本発明の精製方法を実施することにより、フコース含有糖鎖を有する物質を精製することができる。また、本発明の精製方法により、例えば、フコース含有糖鎖を有する物質が得られてよい。すなわち、本発明の精製方法の一態様は、例えば、フコース含有糖鎖を有する物質の製造方法であってもよい。
【０１１９】
なお、分離精製前のフコース含有糖鎖を有する物質を含有する溶液から、フコース含有糖鎖を有する物質を除去したい場合には、本発明の吸着剤とフコース含有糖鎖を有する物質とを接触させる工程を実施すればよい。それにより、フコース含有糖鎖を有する物質が除去された溶液を得ることができる。フコース含有糖鎖を有する物質が除去された溶液は、適宜、非吸着画分として回収することができる。
【実施例】
【０１２０】
以下、非限定的な実施例を参照して本発明をさらに具体的に説明する。
【０１２１】
比較例１  組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓの製造と生産性評価
比較例１は、１５５アミノ酸残基からなる配列番号１で示される組換えＢＣ２ＬＣＮのアミノ酸配列に、ポリヒスチジン配列とシステインを含むオリゴペプチド配列を付加した組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓの製造と生産性評価に関するものである。
（１）発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓおよび組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓの作製
発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓは、組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを発現させるための発現ベクターである。組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓのアミノ酸配列は配列番号３２であり、その５番目から１０番目まではポリヒスチジン配列、１５番目から１６９番目までは配列番号１のアミノ酸配列（ＧｅｎＰｅｐｔ登録番号：ＷＰ＿００６４９０８２８の２番目から１５６番目の領域のアミノ酸配列に一致）、１７０番目から１７４番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓは、特開２０１８−００００３８号公報で開示されているプラスミドｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓと同一の塩基配列であり、当該公報に開示されている方法で作製した。次いで、発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを用いてＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを作製した。
（２）組換えＥ．  ｃｏｌｉを用いた組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓの生産
前記比較例１の（１）で作製した組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む１００ｍＬのＴＢ培地に接種し、３０℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行った。ＴＢ培地の組成を表１に示す。
【０１２２】
【表１】
2020025535.tif 000002
【０１２３】
前培養後、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む１００ｍＬのＴＢ培地に前培養液を０．５％（ｖ／ｖ）接種し、３０℃で２時間、好気的に振とう培養した。培養液の濁度（Ｏ．Ｄ．６００）が凡そ２から５になったところで、培養液に０．５ＭのＩＰＴＧを２０μＬ添加し、培養温度を２０℃に切り替えたのち、好気的に一晩振とう培養することにより組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを生産した。次に、培養液から遠心分離により集菌した菌体に、表２に組成を示す抽出液１０．８ｍＬを添加して室温で３０分間振とう撹拌したのち、表３に示す添加剤を添加して室温で３０分間、次いで４℃で一晩振とう撹拌後、遠心分離により上清を回収することにより、組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを含む可溶性タンパク質抽出液を回収した。回収した組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを含む可溶性タンパク質抽出液は０．２μｍのフィルターでろ過したのち、後述するニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる精製に使用した。
【０１２４】
【表２】
2020025535.tif 000003
【０１２５】
【表３】
2020025535.tif 000004
【０１２６】
（３）組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓの精製と生産性評価
比較例１の（２）で回収した可溶性タンパク質抽出液中からの組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓの精製は、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ  Ｒｅｓｉｎ（メルクミリポア製）を用いたニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーにより行った。具体的には、以下の（比１−１）から（比１−６）に記載の方法により、組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを精製した。
【０１２７】
（比１−１）：カラム（ＢｉｏＲａｄ製Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｃｏｌｕｍｎ）に、２ｍＬのＨｉｓ・Ｂｉｎｄ  Ｒｅｓｉｎを充填し、１０ｍＬの緩衝液Ａ（５００ｍＭの塩化ナトリウムと２０ｍＭのイミダゾールを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．３）で平衡化した。
【０１２８】
（比１−２）：前記（比１−１）において緩衝液Ａで平衡化したカラムに、１０ｍＬの前記組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを含む可溶性タンパク質抽出液を添加した。
【０１２９】
（比１−３）：前記（比１−２）において可溶性タンパク質抽出液を添加したカラムに、１０ｍＬの緩衝液Ａを２回添加し、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ  Ｒｅｓｉｎに結合しない物質を洗浄除去した。
【０１３０】
（比１−４）：前記（比１−３）において緩衝液Ａで洗浄後のカラムに、１０ｍＬの緩衝液Ａと緩衝液Ｂ（５００ｍＭの塩化ナトリウムと２５０ｍＭのイミダゾールを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ９．０）の混合溶液（緩衝液Ａ：緩衝液Ｂ＝８０：２０、ｖ／ｖ）を添加し、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ  Ｒｅｓｉｎを洗浄するとともに、洗浄液を回収した。回収した洗浄液を「２０％Ｂ回収液」として、後述するＳＤＳ−ＰＡＧＥ法での分析に使用した。
【０１３１】
（比１−５）：前記（比１−４）において緩衝液Ａと緩衝液Ｂの混合溶液で洗浄後のカラムに、１０ｍＬの緩衝液Ａと緩衝液Ｂの混合溶液（緩衝液Ａ：緩衝液Ｂ＝５０：５０、ｖ／ｖ）を添加し、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ  Ｒｅｓｉｎを洗浄するとともに、洗浄液を回収した。回収した洗浄液を「５０％Ｂ回収液」として、後述するＳＤＳ−ＰＡＧＥ法での分析に使用した。
【０１３２】
（比１−６）：前記（比１−５）において緩衝液Ａと緩衝液Ｂの混合溶液で洗浄後のカラムに、１０ｍＬの緩衝液Ｂを２回添加し、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ  Ｒｅｓｉｎを洗浄するとともに、洗浄液を回収した。回収した洗浄液を「１００％Ｂ回収液」として、後述するＳＤＳ−ＰＡＧＥ法での分析に使用した。
【０１３３】
前記（比１−４）から（比１−６）で得た「２０％Ｂ回収液」、「５０％Ｂ回収液」、「１００％Ｂ回収液」を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で分析した結果を図１に示す。図１において、「Ｍ」は分子量マーカーを、「１２７」は後述する実施例２で製造したフコース結合性タンパク質１２７を、「１２７Ｇ３６Ｃ」は後述する実施例４で製造したフコース結合性タンパク質１２７Ｇ３６Ｃを、「１２９」は後述する実施例１で製造したフコース結合性タンパク質１２９を、「１２９Ｇ３６Ｃ」は後述する実施例３で製造したフコース結合性タンパク質１２９Ｇ３６Ｃを、「１５５」は本比較例で製造した組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを示す。また、「２０％Ｂ」、「５０％Ｂ」、「１００％Ｂ」は、それぞれ比較例１の（３）で得られた「２０％Ｂ回収液」、「５０％Ｂ回収液」、「１００％Ｂ回収液」を示す。なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法での分析には市販１５％ゲル（ＡＴＴＯ製）を使用し、以下の（比１−７）に記載の方法により前記回収液から調製したＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用試料溶液を使用した。
【０１３４】
（比１−７）：前記回収液に最終濃度が０．４８μＭとなるように１００ｍＭ  トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ、富士フイルム和光純薬製から調製）水溶液を添加し、室温で２時間反応させた。反応終了後の溶液５０μＬと、２ｘ  ＳＤＳ  Ｓａｍｐｌｅバッファー（表４）５０μＬを混合したのち、９４℃で５分間加熱した。得られた溶液１０μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥのレーンに添加し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分析した。
【０１３５】
【表４】
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【０１３６】
図１において、組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓの「５０％Ｂ回収液」と「１００％Ｂ回収液」の各回収液中に、組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓの単量体の分子量付近（約１７ｋＤａ）および二量体と推測される分子量付近（約３４ｋＤａ）にバンドが確認された。後述する実施例６において、二量体と推測される分子量付近のバンドは組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓの二量体であることを確認していることから、両回収液中に目的の組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓが含まれることが明らかとなった。組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓはＣ末端にシステインを含むオリゴペプチドが付加されていることから、当該オリゴペプチドに含まれるシステイン同士がジスルフィド結合を形成することにより二量体が生成したと考えられた。
【０１３７】
次に、組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを含む「５０％Ｂ回収液」と「１００％Ｂ回収液」をまとめて精製ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）溶液とし、光路長１ｃｍの石英セルを用いて精製ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）溶液の２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓのモル吸光係数を１．０として精製ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）溶液中のタンパク質濃度を算出後、得られたタンパク質濃度を基に、組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓの培養液１Ｌあたりの生産性を算出した結果、生産性は１６２ｍｇ／Ｌ−培養液であった。
【０１３８】
得られた精製ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）溶液はＤ−ＰＢＳ（−）（富士フイルム和光純薬製）に対して透析したのち、Ｄ−ＰＢＳ（−）を用いて適切な濃度に調整後、後述するＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分析、糖鎖結合親和性評価および吸着剤の製造に使用した。
【０１３９】
実施例１  フコース結合性タンパク質１２９の製造と生産性評価
実施例１は、１２９アミノ酸残基からなる配列番号２で示されるフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド、Ｃ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質（以下、フコース結合性タンパク質１２９とする。）の製造と生産性評価に関するものである。
（１）発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９）ｃｙｓおよび組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９）ｃｙｓの作製
発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９）ｃｙｓは、フコース結合性タンパク質１２９を発現させるための発現ベクターである。フコース結合性タンパク質１２９のアミノ酸配列は、配列番号３３であり、その５番目から１０番目まではポリヒスチジン配列、１５番目から１４３番目までは配列番号２のアミノ酸配列、１４４番目から１５０番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
【０１４０】
発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９）ｃｙｓの作製は、比較例１の（１）に記載の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを基にして以下のように行った。まず、比較例１の（１）に記載の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを鋳型として、配列番号４８および配列番号４９に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして用いて、特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法によりＰＣＲを実施した。次に、このＰＣＲ産物を鋳型として、配列番号４８および配列番号５０に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして用いて、同様の方法でＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物は、制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化し、同様に制限酵素処理した発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）（メルクミリポア製）とライゲーション反応を行った。このライゲーション産物を用いてＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９）ｃｙｓを得た。特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法により、得られた組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９）ｃｙｓを培養し、菌体から抽出することで発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９）ｃｙｓを得た。配列解析により塩基配列を確認した結果、発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９）ｃｙｓには配列番号２のアミノ酸配列をコードする配列番号１７の塩基配列が含まれることを確認した。
（２）組換えＥ．  ｃｏｌｉを用いたフコース結合性タンパク質１２９の生産
前記組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９）ｃｙｓを用いたフコース結合性タンパク質１２９の生産と可溶性タンパク質抽出液の回収は、比較例１の（２）と同様の方法で行った。
（３）フコース結合性タンパク質１２９の精製と生産性評価
実施例１の（２）で回収した可溶性タンパク質抽出液中からのフコース結合性タンパク質１２９の精製は比較例１の（３）と同様の方法で行い、「２０％Ｂ回収液」、「５０％Ｂ回収液」、「１００％Ｂ回収液」を得た。得られた「２０％Ｂ回収液」、「５０％Ｂ回収液」、「１００％Ｂ回収液」を、比較例１の（３）に記載の方法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で分析した結果を図１に示す。図１において、「１２９」の「５０％Ｂ回収液」と「１００％Ｂ回収液」の各回収液中に、フコース結合性タンパク質１２９の単量体の分子量付近（約１４ｋＤａ）および二量体と推測される分子量付近（約２８ｋＤａ）にバンドが確認された。後述する実施例６において、二量体と推測される分子量付近のバンドはフコース結合性タンパク質１２９の二量体であることを確認していることから、両回収液中に目的のフコース結合性タンパク質１２９が含まれることが明らかとなった。フコース結合性タンパク質１２９はＣ末端にシステインを含むオリゴペプチドが付加されていることから、当該オリゴペプチドに含まれるシステイン同士がジスルフィド結合を形成することにより二量体が生成したと考えられた。
【０１４１】
次に、フコース結合性タンパク質１２９を含む「５０％Ｂ回収液」と「１００％Ｂ回収液」をまとめて精製１２９溶液とし、比較例１の（４）に記載の方法に従ってフコース結合性タンパク質１２９の培養液１Ｌあたりの生産性を算出した結果、生産性は４７５ｍｇ／Ｌ−培養液であった。得られた精製１２９溶液はＤ−ＰＢＳ（−）（富士フイルム和光純薬製）に対して透析したのち、Ｄ−ＰＢＳ（−）を用いて適切な濃度に調整後、後述するＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分析、糖鎖結合親和性評価および吸着剤の製造に使用した。
【０１４２】
実施例２  フコース結合性タンパク質１２７の製造と生産性評価
実施例２は、１２７アミノ酸残基からなる配列番号３で示されるフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド、Ｃ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質（以下、フコース結合性タンパク質１２７とする。）の製造と生産性評価に関するものである。
（１）発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７）ｃｙｓおよび組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７）ｃｙｓの作製
発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７）ｃｙｓは、フコース結合性タンパク質１２７を発現させるための発現ベクターである。フコース結合性タンパク質１２７のアミノ酸配列は、配列番号３４であり、その５番目から１０番目まではポリヒスチジン配列、１５番目から１４１番目までは配列番号３のアミノ酸配列、１４２番目から１４８番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
【０１４３】
実施例１の（１）に記載の配列番号４９に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドの代わりに、配列番号５１に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドを用い、実施例１の（１）に記載の方法に従い、目的とする発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７）ｃｙｓと、発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７）ｃｙｓを用いてＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７）ｃｙｓを作製した。配列解析により塩基配列を確認した結果、発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７）ｃｙｓには配列番号３のアミノ酸配列をコードする配列番号１８の塩基配列が含まれることを確認した。
（２）組換えＥ．  ｃｏｌｉを用いたフコース結合性タンパク質１２７の生産
前記組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７）ｃｙｓを用いたフコース結合性タンパク質１２７の生産と可溶性タンパク質抽出液の回収は、比較例１の（２）と同様の方法で行った。
（３）フコース結合性タンパク質１２７の精製と生産性評価
実施例２の（２）で回収した可溶性タンパク質抽出液中からのフコース結合性タンパク質１２７の精製は比較例１の（３）と同様の方法で行い、「２０％Ｂ回収液」、「５０％Ｂ回収液」、「１００％Ｂ回収液」を得た。得られた「２０％Ｂ回収液」、「５０％Ｂ回収液」、「１００％Ｂ回収液」を、比較例１の（３）に記載の方法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で分析した結果を図１に示す。図１において、「１２７」の「５０％Ｂ回収液」と「１００％Ｂ回収液」の各回収液中に、フコース結合性タンパク質１２７の単量体の分子量付近（約１４ｋＤａ）および二量体と推測される分子量付近（約２８ｋＤａ）にバンドが確認された。後述する実施例６において、二量体と推測される分子量付近のバンドはフコース結合性タンパク質１２７の二量体であることを確認していることから、両回収液中に目的のフコース結合性タンパク質１２７が含まれることが明らかとなった。フコース結合性タンパク質１２７はＣ末端にシステインを含むオリゴペプチドが付加されていることから、当該オリゴペプチドに含まれるシステイン同士がジスルフィド結合を形成することにより二量体が生成したと考えられた。
【０１４４】
次に、フコース結合性タンパク質１２７を含む「５０％Ｂ回収液」と「１００％Ｂ回収液」をまとめて精製１２７溶液とし、比較例１の（３）に記載の方法に従ってフコース結合性タンパク質１２７の培養液１Ｌあたりの生産性を算出した結果、生産性は５６０ｍｇ／Ｌ−培養液であった。得られた精製１２７溶液はＤ−ＰＢＳ（−）に対して透析したのち、Ｄ−ＰＢＳ（−）を用いて適切な濃度に調整後、後述するＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分析および吸着剤の製造に使用した。
【０１４５】
実施例３  フコース結合性タンパク質１２９Ｇ３６Ｃの製造と生産性評価
実施例３は、１２９アミノ酸残基からなる配列番号４で示されるフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２の３６番目のグリシン残基をシステイン残基に置換したアミノ酸配列）のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド、Ｃ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質（以下、フコース結合性タンパク質１２９Ｇ３６Ｃとする。）の製造と生産性評価に関するものである。
（１）発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９Ｇ３６Ｃ）ｃｙｓおよび組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９Ｇ３６Ｃ）ｃｙｓの作製
発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９Ｇ３６Ｃ）ｃｙｓは、フコース結合性タンパク質１２９Ｇ３６Ｃを発現させるための発現ベクターである。フコース結合性タンパク質１２９Ｇ３６Ｃのアミノ酸配列は、配列番号３５であり、その５番目から１０番目まではポリヒスチジン配列、１５番目から１４３番目までは配列番号４のアミノ酸配列、１４４番目から１５０番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
【０１４６】
発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９Ｇ３６Ｃ）ｃｙｓの作製は、実施例１の（１）の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９）ｃｙｓを鋳型として、配列番号４８および配列番号５２に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法によりＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩで消化し、同様に制限酵素処理した実施例１の（１）に記載の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９）ｃｙｓとライゲーション反応を行った。このライゲーション産物を用いてＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９Ｇ３６Ｃ）ｃｙｓを得た。特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法により、得られた組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９Ｇ３６Ｃ）ｃｙｓを培養し、菌体から抽出することで発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９Ｇ３６Ｃ）ｃｙｓを得た。配列解析により塩基配列を確認した結果、発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９Ｇ３６Ｃ）ｃｙｓには配列番号４のアミノ酸配列をコードする配列番号１９の塩基配列が含まれることを確認した。
（２）組換えＥ．  ｃｏｌｉを用いたフコース結合性タンパク質１２９Ｇ３６Ｃの生産
前記組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９Ｇ３６Ｃ）ｃｙｓを用いたフコース結合性タンパク質１２９Ｇ３６Ｃの生産と可溶性タンパク質抽出液の回収は、比較例１の（２）と同様の方法で行った。
（３）フコース結合性タンパク質１２９Ｇ３６Ｃの精製と生産性評価
実施例３の（２）で回収した可溶性タンパク質抽出液中からのフコース結合性タンパク質１２９Ｇ３６Ｃの精製は比較例１の（３）と同様の方法で行い、「２０％Ｂ回収液」、「５０％Ｂ回収液」、「１００％Ｂ回収液」を得た。得られた「２０％Ｂ回収液」、「５０％Ｂ回収液」、「１００％Ｂ回収液」を、比較例１の（３）に記載の方法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で分析した結果を図１に示す。図１において、「１２９Ｇ３６Ｃ」の「５０％Ｂ回収液」と「１００％Ｂ回収液」の各回収液中に、フコース結合性タンパク質１２９Ｇ３６Ｃの単量体の分子量付近（約１４ｋＤａ）および二量体と推測される分子量付近（約２８ｋＤａ）にバンドが確認された。後述する実施例６において、二量体と推測される分子量付近のバンドはフコース結合性タンパク質１２９Ｇ３６Ｃの二量体であることを確認していることから、両回収液中に目的のフコース結合性タンパク質１２９Ｇ３６Ｃが含まれることが明らかとなった。フコース結合性タンパク質１２９Ｇ３６ＣはＣ末端にシステインを含むオリゴペプチドが付加されていることから、当該オリゴペプチドに含まれるシステイン同士がジスルフィド結合を形成することにより二量体が生成したと考えられた。
【０１４７】
次に、フコース結合性タンパク質１２９Ｇ３６Ｃを含む「５０％Ｂ回収液」と「１００％Ｂ回収液」をまとめて精製１２９Ｇ３６Ｃ溶液とし、比較例１の（４）に記載の方法に従ってフコース結合性タンパク質１２９Ｇ３６Ｃの培養液１Ｌあたりの生産性を算出した結果、生産性は４２８ｍｇ／Ｌ−培養液であった。得られた精製１２９Ｇ３６Ｃ溶液はＤ−ＰＢＳ（−）に対して透析したのち、Ｄ−ＰＢＳ（−）を用いて適切な濃度に調整後、後述するＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分析および吸着剤の製造に使用した。
【０１４８】
実施例４  フコース結合性タンパク質１２７Ｇ３６Ｃの製造と生産性評価
実施例４は、１２７アミノ酸残基からなる配列番号５で示されるフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３の３６番目のグリシン残基をシステイン残基に置換したアミノ酸配列）のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド、Ｃ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質（以下、フコース結合性タンパク質１２７Ｇ３６Ｃとする。）の製造と生産性評価に関するものである。
（１）発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｇ３６Ｃ）ｃｙｓおよび組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｇ３６Ｃ）ｃｙｓの作製
発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｇ３６Ｃ）ｃｙｓは、フコース結合性タンパク質１２７Ｇ３６Ｃを発現させるための発現ベクターである。フコース結合性タンパク質１２７Ｇ３６Ｃのアミノ酸配列は、配列番号３６であり、その５番目から１０番目まではポリヒスチジン配列、１５番目から１４１番目までは配列番号５のアミノ酸配列、１４２番目から１４８番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
【０１４９】
実施例３の（１）に記載の方法に従い、配列番号４８および配列番号５２に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドを用い、実施例３の（１）に記載の方法に従い、目的とする発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｇ３６Ｃ）ｃｙｓと、発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｇ３６Ｃ）ｃｙｓを用いてＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７）ｃｙｓを作製した。配列解析により塩基配列を確認した結果、発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｇ３６Ｃ）ｃｙｓには配列番号５のアミノ酸配列をコードする配列番号２０の塩基配列が含まれることを確認した。
（２）組換えＥ．  ｃｏｌｉを用いたフコース結合性タンパク質１２７Ｇ３６Ｃの生産
前記組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｇ３６Ｃ）ｃｙｓを用いたフコース結合性タンパク質１２７Ｇ３６Ｃの生産と可溶性タンパク質抽出液の回収は、比較例１の（２）と同様の方法で行った。
（３）フコース結合性タンパク質１２７Ｇ３６Ｃの精製と生産性評価
実施例４の（２）で回収した可溶性タンパク質抽出液中からのフコース結合性タンパク質１２７Ｇ３６Ｃの精製は比較例１の（３）と同様の方法で行い、「２０％Ｂ回収液」、「５０％Ｂ回収液」、「１００％Ｂ回収液」を得た。得られた「２０％Ｂ回収液」、「５０％Ｂ回収液」、「１００％Ｂ回収液」を、比較例１の（３）に記載の方法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で分析した結果を図１に示す。図１において、「１２７Ｇ３６Ｃ」の「５０％Ｂ回収液」と「１００％Ｂ回収液」の各回収液中に、フコース結合性タンパク質１２７Ｇ３６Ｃの単量体の分子量付近（約１４ｋＤａ）および二量体と推測される分子量付近（約２８ｋＤａ）にバンドが確認された。後述する実施例６において、二量体と推測される分子量付近のバンドはフコース結合性タンパク質１２７Ｇ３６Ｃの二量体であることを確認していることから、両回収液中に目的のフコース結合性タンパク質１２７Ｇ３６Ｃが含まれることが明らかとなった。フコース結合性タンパク質１２７Ｇ３６ＣはＣ末端にシステインを含むオリゴペプチドが付加されていることから、当該オリゴペプチドに含まれるシステイン同士がジスルフィド結合を形成することにより二量体が生成したと考えられた。
【０１５０】
次に、フコース結合性タンパク質１２７Ｇ３６Ｃを含む「５０％Ｂ回収液」と「１００％Ｂ回収液」をまとめて精製１２７Ｇ３６Ｃ溶液とし、比較例１の（４）に記載の方法に従ってフコース結合性タンパク質１２７Ｇ３６Ｃの培養液１Ｌあたりの生産性を算出した結果、生産性は４６５ｍｇ／Ｌ−培養液であった。得られた精製１２７Ｇ３６Ｃ溶液はＤ−ＰＢＳ（−）に対して透析したのち、Ｄ−ＰＢＳ（−）を用いて適切な濃度に調整後、後述するＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分析および吸着剤の製造に使用した。
【０１５１】
実施例５  フコース結合性タンパク質１２６の製造と生産性評価
実施例５は、１２６アミノ酸残基からなる配列番号６で示されるフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質（以下、フコース結合性タンパク質１２６とする。）の製造と生産性評価に関するものである。
（１）発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２６）および組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２６）の作製
発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２６）は、フコース結合性タンパク質１２６を発現させるための発現ベクターである。フコース結合性タンパク質１２６のアミノ酸配列は、配列番号３７であり、その５番目から１０番目まではポリヒスチジン配列、１５番目から１４０番目までは配列番号６のアミノ酸配列に相当する。
【０１５２】
発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２６）の作製は、比較例１の（１）に記載の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを基にして次のように行った。比較例１の（１）に記載の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを鋳型として、配列番号４８および配列番号５３に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法によりＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物は、制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｈｏＩで消化し、同様に制限酵素処理した比較例１の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓとライゲーション反応を行うことで発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２６）を作製した。発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２６）を用いてＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２６）を得た。配列解析により塩基配列を確認した結果、発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２６）には配列番号６のアミノ酸配列をコードする配列番号２１の塩基配列が含まれることを確認した。
（２）組換えＥ．  ｃｏｌｉを用いたフコース結合性タンパク質１２６の生産
前記組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２６）を用いたフコース結合性タンパク質１２６の生産と可溶性タンパク質抽出液の回収は、比較例１の（２）と同様の方法で行った。
（３）フコース結合性タンパク質１２６の精製と生産性評価
実施例５の（２）で回収した可溶性タンパク質抽出液中からのフコース結合性タンパク質１２６の精製は比較例１の（３）と同様の方法で行い、「２０％Ｂ回収液」、「５０％Ｂ回収液」、「１００％Ｂ回収液」を得た。次に、フコース結合性タンパク質１２６を含む「５０％Ｂ回収液」と「１００％Ｂ回収液」をまとめて精製１２６溶液とし、比較例１の（４）に記載の方法に従ってフコース結合性タンパク質１２６の培養液１Ｌあたりの生産性を算出した結果、生産性は５５０ｍｇ／Ｌ−培養液であった。
【０１５３】
表５に、比較例１と実施例１から実施例５で製造した、組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓ、フコース結合性タンパク質１２９、フコース結合性タンパク質１２７、フコース結合性タンパク質１２９Ｇ３６Ｃ、フコース結合性タンパク質１２７Ｇ３６Ｃおよびフコース結合性タンパク質１２６の、培養液１Ｌあたりの生産性を示す。表５からも明らかなように、実施例１から５で製造したフコース結合性タンパク質の生産性は、比較例１で製造した組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓに比べて２．５倍から３．５倍ほど高いことが明らかとなった。
【０１５４】
【表５】
2020025535.tif 000006
【０１５５】
実施例６  組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓおよびフコース結合性タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分析
実施例５は、実施例１から４および比較例１で得られた、フコース結合性タンパク質１２９を含む精製１２９溶液、フコース結合性タンパク質１２７を含む精製１２７溶液、フコース結合性タンパク質１２９Ｇ３６Ｃを含む精製１２９Ｇ３６Ｃ溶液、フコース結合性タンパク質１２７Ｇ３６Ｃを含む精製１２７Ｇ３６Ｃ溶液および組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを含む精製ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）溶液の、非還元条件および還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分析に関するものである。
（１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用試料の調製
精製１２９溶液、精製１２７溶液、精製１２９Ｇ３６Ｃ溶液、精製１２７Ｇ３６Ｃ溶液および精製ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）溶液を試料溶液として用い、以下の（実５−１）から（実５−３）に記載の方法により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用試料を調製した。
【０１５６】
（実５−１）：Ｄ−ＰＢＳ（−）を用いてタンパク質濃度を０．２５ｍｇ／ｍＬに調整した各試料溶液５０μＬと、前記２ｘ  ＳＤＳ  Ｓａｍｐｌｅバッファー５０μＬを混合したのち、９４℃で５分間加熱した。得られた溶液（以下、非還元試料溶液とする。）１０μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥのレーンに添加し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分析した（タンパク質添加量：１．３μｇ／レーン）。
【０１５７】
（実５−２）：Ｄ−ＰＢＳ（−）を用いてタンパク質濃度を０．２５ｍｇ／ｍＬに調整した各試料溶液に、最終濃度が０．４８μＭとなるように１００ｍＭ  ＴＣＥＰ水溶液を添加し、室温で２時間反応させた。反応終了後の溶液５０μＬと、前記２ｘ  ＳＤＳ  Ｓａｍｐｌｅバッファー５０μＬを混合したのち、９４℃で５分間加熱した。得られた溶液（以下、ＴＣＥＰ還元試料溶液とする。）１０μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥのレーンに添加し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分析した（タンパク質添加量：１．３μｇ／レーン）。
【０１５８】
（実５−３）：前記２ｘ  ＳＤＳ  Ｓａｍｐｌｅバッファーに、最終濃度が１００ｍＭとなるようにジチオトレイトール（ＤＴＴ、富士フイルム和光純薬製）を添加して溶解させた。ＤＴＴを溶解した２ｘ  ＳＤＳ  Ｓａｍｐｌｅバッファー５０μＬと、Ｄ−ＰＢＳ（−）を用いてタンパク質濃度を０．２５ｍｇ／ｍＬに調整した各試料溶液５０μＬを混合したのち、９４℃で５分間加熱した。得られた溶液（以下、ＤＴＴ還元試料溶液とする。）１０μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥのレーンに添加し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分析した（タンパク質添加量：１．３μｇ／レーン）。
（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分析
前記（実５−１）から（実５−３）で調製した１５種類のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用試料（５種類の非還元試料溶液、５種類のＴＣＥＰ還元試料溶液および５種類のＤＴＴ還元試料溶液）について、市販１５％ゲル（ＡＴＴＯ製）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で分析した結果を図２に示す。図２において、「Ｍ」は分子量マーカーを、「非還元」は前述の非還元試料溶液を、「ＴＣＥＰ還元」は前述のＴＣＥＰ還元試料溶液を、「ＤＴＴ還元」は前述のＤＴＴ還元試料溶液を示す。また、「１２９」は実施例１で製造したフコース結合性タンパク質１２９を、「１２７」は実施例２で製造したフコース結合性タンパク質１２７を、「１２９Ｇ３６Ｃ」は実施例３で製造したフコース結合性タンパク質１２９Ｇ３６Ｃを、「１２７Ｇ３６Ｃ」は実施例４で製造したフコース結合性タンパク質１２７Ｇ３６Ｃを、「１５５」は比較例１で製造した組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを示す。
【０１５９】
図２の非還元試料溶液において、フコース結合性タンパク質１２７、フコース結合性タンパク質１２７Ｇ３６Ｃ、フコース結合性タンパク質１２９およびフコース結合性タンパク質１２９Ｇ３６Ｃでは、単量体の分子量付近（約１４ｋＤａ）および二量体と推測される分子量付近（約２８ｋＤａ）にバンドが確認され、組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓでも単量体の分子量付近（約１７ｋＤａ）および二量体と推測される分子量付近（約３４ｋＤａ）にバンドが確認された。
【０１６０】
一方、図２におけるＴＣＥＰ還元試料溶液およびＤＴＴ還元試料溶液においては、前記５種類の試料溶液いずれの場合も二量体と推測される分子量付近にバンドは確認されず、単量体の分子量付近にのみ単一なバンドが確認された。従って、非還元試料溶液で確認された二量体と推測される分子量付近に確認されたバンドは、各評価試料の二量体であることが明らかとなった。また、非還元試料溶液におけるフコース結合性タンパク質１２７ｃｙｓとフコース結合性タンパク質１２７Ｇ３６Ｃ、およびフコース結合性タンパク質１２９とフコース結合性タンパク質１２９Ｇ３６Ｃの結果を比較すると、配列番号１における３６番目のグリシン酸残基として特定されるグリシン残基がシステイン残基に置換したフコース結合性タンパク質１２７Ｇ３６Ｃおよびフコース結合性タンパク質１２９Ｇ３６Ｃでは、当該アミノ酸置換を行っていないフコース結合性タンパク質１２７およびフコース結合性タンパク質１２９に比べて、二量体の分子量付近のバンドが少なくなっていることが明らかとなった。従って、当該アミノ酸置換により、ジスルフィド結合の形成に起因すると推測される二量体の生成が抑制されていることが明らかとなった。
【０１６１】
実施例７  フコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｃの製造と糖鎖への結合親和性評価
実施例７は、１２９アミノ酸残基からなる配列番号７で示されるフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２の８１番目のグルタミン酸残基をシステイン残基に置換したアミノ酸配列）のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質（以下、フコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｃとする。）の製造と糖鎖への結合親和性評価に関するものである。
（１）フコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｃの製造
実施例１に記載のフコース結合性タンパク質１２９に対して、配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基をシステイン残基に置換する変異導入を行うことで、フコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｃを製造した。フコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｃのアミノ酸配列は配列番号３８であり、その１５番目から１４３番目までは配列番号７のアミノ酸配列（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基をシステイン残基に置換したアミノ酸配列）、１４４番目から１５０番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
【０１６２】
実施例１の（１）の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９）ｃｙｓを鋳型として、配列番号５４および配列番号５５に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法によりＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで消化し、同様に制限酵素処理した実施例１の（１）に記載の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９）ｃｙｓとライゲーション反応を行った。このライゲーション産物を用いてＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９Ｅ８１Ｃ）ｃｙｓを得た。特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法により、得られた組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９Ｅ８１Ｃ）ｃｙｓを培養し、菌体から抽出することで発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９Ｅ８１Ｃ）ｃｙｓを得た。配列解析により塩基配列を確認した結果、発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９Ｅ８１Ｃ）ｃｙｓには配列番号７のアミノ酸配列をコードする配列番号２２の塩基配列が含まれることを確認した。
【０１６３】
前記組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９Ｅ８１Ｃ）ｃｙｓを用いたフコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｃの生産、可溶性タンパク質抽出液の回収、およびニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる可溶性タンパク質抽出液からのフコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｃの精製は、それぞれ比較例１の（２）および比較例１の（３）に記載の方法で行い、目的とするフコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｃを製造した。製造したフコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｃを含む溶液はＤ−ＰＢＳ（−）に対して透析したのち、Ｄ−ＰＢＳ（−）を用いて適切な濃度に調整後、後述する糖鎖への結合親和性評価に使用した。
（２）フコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｃの糖鎖への結合親和性評価
表面プラズモン共鳴法により、フコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｃの、Ｈタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖への結合親和性評価を行った。具体的には、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（Ｔ２００  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ）機器（ＧＥヘルスケア製）を用い、アナライトを組換えタンパク質、固相をＨタイプ１型糖鎖またはＨタイプ３型糖鎖としてカイネティクス解析を行った。センサーチップはデキストランがコートされたＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５（ＧＥヘルスケア製）を使用し、デキストランにストレプトアビジン（富士フイルム和光純薬製）をアミンカップリング法により固定したのち、ビオチン標識されたＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ製）を添加し、ビオチンとストレプトアビジンの反応により各糖鎖をセンサーチップ上に固定してＨタイプ１型糖鎖またはＨタイプ３型糖鎖が固定されたセンサーチップを作製した。糖鎖結合親和性の測定には緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥヘルスケア製）を用い、測定条件は流速を３０μＬ／分、結合時間を６分間、解離時間を３分間または６分間とした。センサーチップの再生は２５ｍＭの水酸化ナトリウムを用い、流速３０μＬ／分、再生時間３０秒で行った。解析はＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（Ｔ２００  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ）機器に付属の解析ソフト（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ｖｅｒｓｉｏｎまたはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ｖｅｒｓｉｏｎ）を用いて行い、１：１  Ｂｉｎｄｉｎｇのフィッティングにより解離定数（ＫＤ）を算出した。
【０１６４】
フコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１ＣのＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する解離定数を算出した結果、Ｈタイプ１型糖鎖に対する解離定数は２．３ｎＭ、Ｈタイプ３型糖鎖に対する解離定数は３．１ｎＭであった。
【０１６５】
実施例８  フコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｑの製造と糖鎖への結合親和性評価
実施例８は、１２９アミノ酸残基からなる配列番号８で示されるフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２の８１番目のグルタミン酸残基をグルタミン残基に置換したアミノ酸配列）のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質（以下、フコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｑとする。）の製造と糖鎖への結合親和性評価に関するものである。
（１）フコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｑの製造
実施例１に記載のフコース結合性タンパク質１２９に対して、配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基をグルタミン残基に置換する変異導入を行うことで、フコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｑを製造した。フコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｑのアミノ酸配列は配列番号３９であり、その１５番目から１４３番目までは配列番号８のアミノ酸配列（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基をグルタミン残基に置換したアミノ酸配列）、１４４番目から１５０番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
【０１６６】
実施例１の（１）の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９）ｃｙｓを鋳型として、配列番号５４および配列番号５６に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法によりＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで消化し、同様に制限酵素処理した実施例１の（１）に記載の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９）ｃｙｓとライゲーション反応を行った。このライゲーション産物を用いてＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９Ｅ８１Ｑ）ｃｙｓを得た。特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法により、得られた組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９Ｅ８１Ｑ）ｃｙｓを培養し、菌体から抽出することで発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９Ｅ８１Ｑ）ｃｙｓを得た。配列解析により塩基配列を確認した結果、発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９Ｅ８１Ｑ）ｃｙｓには配列番号８のアミノ酸配列をコードする配列番号２３の塩基配列が含まれることを確認した。
【０１６７】
前記組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９Ｅ８１Ｑ）ｃｙｓを用いたフコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｑの生産、可溶性タンパク質抽出液の回収、およびニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる可溶性タンパク質抽出液からのフコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｑの精製は、それぞれ比較例１の（２）および比較例１の（３）に記載の方法で行い、目的とするフコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｑを製造した。製造したフコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｑを含む溶液はＤ−ＰＢＳ（−）に対して透析したのち、Ｄ−ＰＢＳ（−）を用いて適切な濃度に調整後、後述する糖鎖への結合親和性評価に使用した。
（２）フコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｑの糖鎖への結合親和性評価
実施例７の（２）に記載の方法により、フコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１ＱのＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖への結合親和性評価を行った結果、Ｈタイプ１型糖鎖に対する解離定数は３．７ｎＭ、Ｈタイプ３型糖鎖に対する解離定数は３．６ｎＭであった。
【０１６８】
実施例９  フコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｈの製造と生産性および糖鎖への結合親和性評価
実施例９は、１２９アミノ酸残基からなる配列番号９で示されるフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２の８１番目のグルタミン酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列）のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチド配列を付加したフコース結合性タンパク質（以下、フコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｈとする。）の製造と、生産性および糖鎖への結合親和性評価に関するものである。
（１）フコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｈの製造と生産性評価
実施例１に記載のフコース結合性タンパク質１２９に対して、配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基をヒスチジン残基に置換する変異導入を行うことで、フコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｈを製造した。フコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｈのアミノ酸配列は配列番号４０であり、その１５番目から１４３番目までは配列番号９のアミノ酸配列（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列）、１４４番目から１５０番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
【０１６９】
実施例１の（１）の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９）ｃｙｓを鋳型として、配列番号５４および配列番号５７に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法によりＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで消化し、同様に制限酵素処理した実施例１の（１）に記載の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９）ｃｙｓとライゲーション反応を行った。このライゲーション産物を用いてＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９Ｅ８１Ｈ）ｃｙｓを得た。特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法により、得られた組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９Ｅ８１Ｈ）ｃｙｓを培養し、菌体から抽出することで発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９Ｅ８１Ｈ）ｃｙｓを得た。配列解析により塩基配列を確認した結果、発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９Ｅ８１Ｈ）ｃｙｓには配列番号９のアミノ酸配列をコードする配列番号２４の塩基配列が含まれることを確認した。
【０１７０】
前記組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９Ｅ８１Ｈ）ｃｙｓを用いたフコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｈの生産、可溶性タンパク質抽出液の回収、およびニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる可溶性タンパク質抽出液からのフコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｈの精製は、それぞれ比較例１の（２）および比較例１の（３）に記載の方法で行い、目的とするフコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｈを製造した。比較例１の（４）に記載の方法に従ってフコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｈの培養液１Ｌあたりの生産性を算出した結果、生産性は３５０ｍｇ／Ｌ−培養液であった。製造したフコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｈを含む溶液はＤ−ＰＢＳ（−）に対して透析したのち、Ｄ−ＰＢＳ（−）を用いて適切な濃度に調整後、後述する糖鎖への結合親和性評価に使用した。
（２）フコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｈの糖鎖への結合親和性評価
実施例７の（２）に記載の方法により、フコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１ＨのＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖への結合親和性評価を行った結果、Ｈタイプ１型糖鎖に対する解離定数は１．０ｎＭ、Ｈタイプ３型糖鎖に対する解離定数は０．８ｎＭであった。
【０１７１】
実施例１０  フコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｍの製造と糖鎖への結合親和性評価
実施例１０は、１２９アミノ酸残基からなる配列番号１０で示されるフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２の８１番目のグルタミン酸残基をメチオニン残基に置換したアミノ酸配列）のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質（以下、フコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｍとする。）の製造と糖鎖への結合親和性評価に関するものである。
（１）フコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｍの製造
実施例１に記載のフコース結合性タンパク質１２９に対して、配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基をメチオニン残基に置換する変異導入を行うことで、フコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｍを製造した。フコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｍのアミノ酸配列は配列番号４１であり、その１５番目から１４３番目までは配列番号１０のアミノ酸配列（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基をメチオニン残基に置換したアミノ酸配列）、１４４番目から１５０番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
【０１７２】
実施例１の（１）の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９）ｃｙｓを鋳型として、配列番号５４および配列番号５８に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法によりＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで消化し、同様に制限酵素処理した実施例１の（１）に記載の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９）ｃｙｓとライゲーション反応を行った。このライゲーション産物を用いてＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９Ｅ８１Ｍ）ｃｙｓを得た。特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法により、得られた組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９Ｅ８１Ｍ）ｃｙｓを培養し、菌体から抽出することで発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９Ｅ８１Ｍ）ｃｙｓを得た。配列解析により塩基配列を確認した結果、発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９Ｅ８１Ｍ）ｃｙｓには配列番号１０のアミノ酸配列をコードする配列番号２５の塩基配列が含まれることを確認した。
【０１７３】
前記組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２９Ｅ８１Ｍ）ｃｙｓを用いたフコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｍの生産、可溶性タンパク質抽出液の回収、およびニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる可溶性タンパク質抽出液からのフコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｍの精製は、それぞれ比較例１の（２）および比較例１の（３）に記載の方法で行い、目的とするフコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｍを製造した。製造したフコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｍを含む溶液はＤ−ＰＢＳ（−）に対して透析したのち、Ｄ−ＰＢＳ（−）を用いて適切な濃度に調整後、後述する糖鎖への結合親和性評価に使用した。
（２）フコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｍの糖鎖への結合親和性評価
実施例７の（２）に記載の方法により、フコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１ＭのＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖への結合親和性評価を行った結果、Ｈタイプ１型糖鎖に対する解離定数は３．１ｎＭ、Ｈタイプ３型糖鎖に対する解離定数は３．１ｎＭであった。
【０１７４】
実施例１１  フコース結合性タンパク質１２９の糖鎖への結合親和性評価
実施例１１は、実施例１で製造したフコース結合性タンパク質１２９の糖鎖への結合親和性評価に関するものである。実施例７の（２）に記載の方法により、フコース結合性タンパク質１２９のＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖への結合親和性評価を行った結果、Ｈタイプ１型糖鎖に対する解離定数は２．７ｎＭ、Ｈタイプ３型糖鎖に対する解離定数は１１ｎＭであった。
【０１７５】
比較例２  組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓの糖鎖への結合親和性評価
比較例２は、比較例１で製造した組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓの糖鎖への結合親和性評価に関するものである。実施例７の（２）に記載の方法により、比較例１で製造した組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓのＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖への結合親和性評価を行った結果、Ｈタイプ１型糖鎖に対する解離定数は３．９ｎＭ、Ｈタイプ３型糖鎖に対する解離定数は１１ｎＭであった。
【０１７６】
実施例６から１０で評価した各フコース結合性タンパク質および比較例２で評価した組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓの、Ｈタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する解離定数を、表６に示す。なお、解離定数の値は小さいほど結合親和性が高いことを示す。表６に示すように、実施例７で評価したフコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｃ（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がシステイン残基に置換）、実施例８で評価したフコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｑ（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がグルタミン残基に置換）、実施例９で評価したフコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｈ（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がヒスチジン残基に置換）および実施例１０で評価したフコース結合性タンパク質１２９Ｅ８１Ｍ（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がメチオニン残基に置換）は、比較例２で評価した組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓ（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基は置換されていない）よりもＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖への結合親和性が高いことがわかる。また、実施例１１で評価したフコース結合性タンパク質１２９（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基は置換されていない）は、比較例２で評価した組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓよりもＨタイプ１型糖鎖への結合親和性が高いことがわかる。
【０１７７】
【表６】
2020025535.tif 000007
【０１７８】
参考例１  組換えＢＣ２ＬＣＮのアミノ酸置換体の製造と機能評価−１
参考例１では、比較例１に記載の組換えＢＣ２ＬＣＮに対して、配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基への変異導入、すなわち、組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓのアミノ酸配列（配列番号３２）の９５番目のグルタミン酸残基を他のアミノ酸残基に置換する変異導入を行ったのち、形質転換体を用いて組換えタンパク質を製造し、組換えタンパク質の熱安定性とＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する結合親和性を評価した。
（１）配列番号１の７２番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基への変異導入
前記比較例１の（１）に記載の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを鋳型として、配列番号５４および配列番号６１に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法によりＰＣＲを実施した。なお、配列番号６１に記載の配列からなるＰＣＲプライマーは縮重配列ＮＮＢ（Ｎ＝Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ、Ｂ＝Ｃ，ＧまたはＴ）を有し、配列番号３２の９５番目のグルタミン酸残基（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基に相当）が他のアミノ酸残基にランダムに置換されるよう設計した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで消化し、同様に制限酵素処理した前記（１）の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓとライゲーション反応を行った。このライゲーション産物を用いてＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、複数の形質転換体を得た。それぞれの形質転換体から発現ベクターを抽出し、塩基配列を解析した。その結果、表７に示す１９種類の発現ベクターとそれを有する形質転換体を作製した。
【０１７９】
【表７】
2020025535.tif 000008
【０１８０】
（２）組換えタンパク質の製造
前記（１）で作製した形質転換体Ｌ１ａからＬ１９ａまで（表７）を用い、比較例１に記載の方法により組換えタンパク質の生産、可溶性タンパク質抽出液の回収、およびニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる可溶性タンパク質抽出液からのフコース結合性タンパク質の精製を行い、表７に記載した１９種類の組換えタンパク質を製造した。製造した１９種類のフコース結合性タンパク質を含む溶液はＤ−ＰＢＳ（−）に対して透析したのち、Ｄ−ＰＢＳ（−）を用いて適切な濃度に調整後、後述する糖鎖への結合親和性評価に使用した。
（３）組換えタンパク質の糖鎖結合親和性評価
前記（２）で製造した組換えタンパク質の糖鎖への結合親和性を調べるため、実施例７の（２）に記載の方法により、Ｈタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する結合親和性評価を行った。表８に、前記（３）で製造した組換えタンパク質および組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓのＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する解離定数を示す。表８に示すように、フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｃ（Ａ１：配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がシステイン残基に置換）、フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｑ（Ａ２：配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がグルタミン残基に置換）、フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｈ（Ａ３：配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がヒスチジン残基に置換）、フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｍ（Ａ４：配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がメチオニンに置換）は、組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓ（Ｃ０：配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基は置換されていない）よりもＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する結合親和性が高いことがわかる。
【０１８１】
また、フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｖ（Ｂ１：配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がバリン残基に置換）、フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｋ（Ｂ２：配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がリジン残基に置換）、フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｓ（Ｂ３：配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がセリン残基に置換）、フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｉ（Ｂ４：配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がイソロイシン残基に置換）、フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｙ（Ｂ５：配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がチロシン残基に置換）、フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｇ（Ｂ６：配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がグリシン残基に置換）、フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｐ（Ｂ７：配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がプロリン残基に置換）、フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｌ（Ｂ８：配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がロイシン残基に置換）およびフコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｎ（Ｂ９：配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がアスパラギンに置換）は、組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓよりもＨタイプ３型糖鎖に対する結合親和性が高いことがわかる。
【０１８２】
一方、フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｆ（Ｃ１）、フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｄ（Ｃ２）、フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ａ（Ｃ３）、フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｗ（Ｃ４）、フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｔ（Ｃ５）およびフコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｒ（Ｃ６）は、組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓよりもＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する結合親和性が低いことがわかる。
【０１８３】
【表８】
2020025535.tif 000009
【０１８４】
実施例１２  フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇの製造と機能評価
実施例１２は、１２７アミノ酸残基からなる配列番号１１で示されるフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３の７２番目のシステイン残基をグリシン残基に置換したアミノ酸配列）のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質（以下、フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇとする。）の製造と熱に対する安定性および糖鎖への結合親和性評価に関するものである。
（１）フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇの製造
発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓは、フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇを発現させるための発現ベクターである。フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇのアミノ酸配列は、配列番号４２であり、その５番目から１０番目まではポリヒスチジン配列、１５番目から１４１番目までは配列番号１１のアミノ酸配列、１４２番目から１４８番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
【０１８５】
実施例２の（１）の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７）ｃｙｓを鋳型として、配列番号４８および配列番号５９に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法によりＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩで消化し、同様に制限酵素処理した実施例２の（１）に記載の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７）ｃｙｓとライゲーション反応を行った。このライゲーション産物を用いてＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓを得た。特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法により、得られた組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓを培養し、菌体から抽出することで発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓを得た。配列解析により塩基配列を確認した結果、発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓには配列番号１１のアミノ酸配列をコードする配列番号２６の塩基配列が含まれることを確認した。
【０１８６】
前記組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓを用いたフコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇの生産、可溶性タンパク質抽出液の回収、およびニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる可溶性タンパク質抽出液からのフコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇの精製は、それぞれ比較例１の（２）および比較例１の（３）に記載の方法で行い、目的とするフコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇを製造した。比較例１の（４）に記載の方法に従ってフコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇの培養液１Ｌあたりの生産性を算出した結果、生産性は４９２ｍｇ／Ｌ−培養液であった。製造したフコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇを含む溶液はＤ−ＰＢＳ（−）に対して透析したのち、Ｄ−ＰＢＳ（−）を用いて適切な濃度に調整後、後述する変性中点温度の測定、糖鎖結合親和性評価および吸着剤の製造に使用した。
（２）変性中点温度の測定
フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇの変性中点温度の測定を行った。具体的には、前記フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２ＧのＤ−ＰＢＳ（−）溶液を再生セルロース膜（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、分画分子量３５００）を用いて、透析用緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．５）中で緩衝液交換を行った。透析内液の組換えタンパク質を紫外吸収法により濃度を測定し、透析用緩衝液を用いて５００μｇ／ｍＬになるよう希釈し、示差走査熱量計（マルバーン・パナテリティカル社製、ＭｉｃｒｏＣａｌＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＤＳＣ）を用いて変性中点温度を測定した。なお、変性中点温度はタンパク質の半分が変性する温度であり、る。変性中点温度が高いほど熱に対する安定性が高いことを示す。変性中点温度の測定条件は、前記透析後のフコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇ溶液の溶液量を４００μＬ、昇温速度を６０℃／ｈ、加熱温度を４０℃−１１０℃とした。測定の結果、フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇの変性中点温度は８８．３±０．５℃であった。
（３）糖鎖への結合親和性評価
実施例７の（２）に記載の方法により、フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２ＧのＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖への結合親和性評価を行った結果、Ｈタイプ１型糖鎖に対する解離定数は１．２ｎＭ、Ｈタイプ３型糖鎖に対する解離定数は１．１ｎＭであった。
【０１８７】
実施例１３  フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ａの製造と機能評価
実施例１３は、１２７アミノ酸残基からなる配列番号１２で示されるフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３の７２番目のシステイン残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列）のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質（以下、フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ａとする。）の製造と熱に対する安定性および糖鎖への結合親和性評価に関するものである。
（１）フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ａの製造
発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｃ７２Ａ）ｃｙｓは、フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ａを発現させるための発現ベクターである。フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ａのアミノ酸配列は、配列番号４３であり、その５番目から１０番目まではポリヒスチジン配列、１５番目から１４１番目までは配列番号１２のアミノ酸配列、１４２番目から１４８番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
【０１８８】
実施例２の（１）の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７）ｃｙｓを鋳型として、配列番号４８および配列番号６０に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法によりＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩで消化し、同様に制限酵素処理した実施例２の（１）に記載の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７）ｃｙｓとライゲーション反応を行った。このライゲーション産物を用いてＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｃ７２Ａ）ｃｙｓを得た。特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法により、得られた組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｃ７２Ａ）ｃｙｓを培養し、菌体から抽出することで発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｃ７２Ａ）ｃｙｓを得た。配列解析により塩基配列を確認した結果、発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｃ７２Ａ）ｃｙｓには配列番号１２のアミノ酸配列をコードする配列番号２７の塩基配列が含まれることを確認した。
【０１８９】
前記組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｃ７２Ａ）ｃｙｓを用いたフコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ａの生産、可溶性タンパク質抽出液の回収、およびニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる可溶性タンパク質抽出液からのフコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ａの精製は、それぞれ比較例１の（２）および比較例１の（３）に記載の方法で行い、目的とするフコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ａを製造した。製造したフコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ａを含む溶液はＤ−ＰＢＳ（−）に対して透析したのち、Ｄ−ＰＢＳ（−）を用いて適切な濃度に調整後、後述する変性中点温度の測定と、糖鎖への結合親和性評価に使用した。
（２）変性中点温度の測定
実施例１２の（２）に記載の方法により、フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ａの変性中点温度を測定した結果、フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ａの変性中点温度は８３．４±０．５℃であった。
（３）糖鎖への結合親和性評価
実施例７の（２）に記載の方法により、フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２ＧのＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖への結合親和性評価を行った結果、Ｈタイプ１型糖鎖に対する解離定数は０．７ｎＭ、Ｈタイプ３型糖鎖に対する解離定数は２．０ｎＭであった。
【０１９０】
比較例３  組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓの熱に対する安定性評価
比較例３は、比較例１で製造した組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓの熱に対する安定性評価に関するものである。実施例１２の（２）に記載の方法により、比較例１で製造した組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓの変性中点温度の測定を行った結果、組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓの変性中点温度は８２．３±０．５℃であった。
【０１９１】
表９に、実施例１２と１３および比較例３で測定した、フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇ（実施例１２）、フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ａ（実施例１３）および組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓ（比較例３）の、変性中点温度とＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する解離定数を示す。表９に示すように、フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇ（配列番号１の７２番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基がグリシン残基に置換）およびフコース結合性タンパク質Ｃ７２Ａ（配列番号１の７２番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基がアラニン残基に置換）は、組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（配列番号１の７２番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基は置換されていない）に比べ変性中点温度が高く、熱安定性が向上したことがわかる。同様に、フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇおよびフコース結合性タンパク質Ｃ７２Ａは、組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓよりもＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する結合親和性が高いことがわかる。
【０１９２】
【表９】
2020025535.tif 000010
【０１９３】
参考例２  組換えＢＣ２ＬＣＮのアミノ酸置換体の製造と機能評価−２
参考例２では、比較例１に記載の組換えＢＣ２ＬＣＮに対して、配列番号１の７２番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基への変異導入、すなわち、組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓのアミノ酸配列（配列番号３２）の８６番目のシステイン残基を他のアミノ酸残基に置換する変異導入を行ったのち、形質転換体を用いて組換えタンパク質を製造し、組換えタンパク質の熱に対する安定性とＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する結合親和性を評価した。
（１）配列番号１の７２番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基への変異導入
前記比較例１の（１）に記載の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを鋳型として、配列番号４８および配列番号６２に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法によりＰＣＲを実施した。なお、配列番号５０に記載の配列からなるＰＣＲプライマーは縮重配列ＶＮＮ（Ｖ＝Ａ，ＣまたはＧ、Ｎ＝Ａ，Ｃ，Ｇ）を有し、配列番号３２の８６番目のシステイン残基（配列番号１の７２番目のシステイン残基に相当）が他のアミノ酸残基にランダムに置換されるよう設計した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩで消化し、同様に制限酵素処理した前記（１）の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓとライゲーション反応を行った。このライゲーション産物を用いてＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、複数の形質転換体を得た。それぞれの形質転換体から発現ベクターを抽出し、塩基配列を解析した。その結果、表１０に示す１９種類の発現ベクターとそれを有する形質転換体を作製した。
【０１９４】
【表１０】
2020025535.tif 000011
【０１９５】
（２）組換えタンパク質の製造
前記（１）で作製した形質転換体Ｌ１ｂからＬ１９ｂまで（表１０）を用い、比較例１に記載の方法により組換えタンパク質の生産、可溶性タンパク質抽出液の回収、およびニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる可溶性タンパク質抽出液からのフコース結合性タンパク質の精製を行い、表１０に記載した１９種類の組換えタンパク質を製造した。
（３）組換えタンパク質の熱に対する安定性評価
前記（２）で製造した組換えタンパク質の熱に対する安定性を調べるため、加熱処理後の組換えタンパク質の糖鎖結合親和性の評価を表面プラズモン共鳴法により行った。具体的には、前記（２）で製造した組換えタンパク質を紫外吸収法により濃度を測定し、Ｄ−ＰＢＳ（−）（富士フイルム和光純薬製）を用いて３０μｇ／ｍＬになるよう希釈した。調製した組換えタンパク質溶液を室温または７３℃で３０分間保持したのち、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（Ｔ２００  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ）機器（ＧＥヘルスケア製）を用い、アナライトを組換えタンパク質、固相をＨタイプ３型糖鎖として糖鎖結合性評価を行った。センサーチップはデキストランがコートされたＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５（ＧＥヘルスケア製）を用い、デキストランにストレプトアビジン（富士フイルム和光純薬製）をアミンカップリング法により固定した後、ビオチン標識されたＨタイプ３型糖鎖（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ製）を添加し、ビオチンとストレプトアビジンの反応により各糖鎖をセンサーチップ上に固定してＨタイプ３型糖鎖が固定されたセンサーチップを作製した。Ｈタイプ３型糖鎖に対する結合性の測定はＢｉｎｄｉｎｇ  Ａｓｓａｙ法により行い、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙの値を糖鎖結合性の測定値とした。緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥヘルスケア製）を用い、温度２５℃で測定を行った。結合条件は、流速３０μＬ／分、結合時間を２分間、解離時間を１分間とした。センサーチップの再生条件は、２５ｍＭの水酸化ナトリウムを用い、流速３０μＬ／分、再生時間１５秒で行った。解析はＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（Ｔ２００  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ）機器に付属の解析ソフト（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ｖｅｒｓｉｏｎまたはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ｖｅｒｓｉｏｎ）を用いて行った。
【０１９６】
表１１に、７３℃で３０分間の加熱処理後の各組換えタンパク質の糖鎖結合性評価の結果を示す。なお、表１１において、各組換えタンパク質の糖鎖結合性は、室温で処理後の糖鎖結合性を１００％とした場合の相対値を示したものである。また、室温で処理後の糖鎖結合性が消失したフコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｒ、フコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｅ、フコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｄ、フコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｖ、フコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｌおよびフコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｉは、表１１において糖鎖結合性を「−」として記載した。表１１に示すように、７３℃、３０分間の加熱処理後も糖鎖結合性を保持していた組換えタンパク質は、アミノ酸残基置換前の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ、フコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｇ、フコース結合性タンパク質Ｃ７２Ａおよびフコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｗであった。
【０１９７】
【表１１】
2020025535.tif 000012
【０１９８】
（４）変性中点温度の測定
前記（３）において、７３℃、３０分間の加熱処理後も糖鎖結合性を示したフコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｇ、フコース結合性タンパク質Ｃ７２Ａおよびフコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｗと、組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓについて、実施例１２の（２）に記載の方法により変性中点温度を測定した結果を表１２に示す。表１２に示すように、フコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｇ（配列番号１の７２番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基がグリシン残基に置換）およびフコース結合性タンパク質Ｃ７２Ａ（配列番号１の７２番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基がアラニン残基に置換）は、組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓ（配列番号１の７２番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基は置換されていない）に比べ変性中点温度が高く、熱安定性が向上したことがわかる。一方、フコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｗ（配列番号１の７２番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基がトリプトファン残基に置換）は、組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓに比べ変性中点温度が低く、熱安定性が低下したことがわかる。
【０１９９】
【表１２】
2020025535.tif 000013
【０２００】
（５）組換えタンパク質の糖鎖結合親和性評価
前記（４）において、組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓに比べて熱に対する安定性が高いことが判明したフコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｇおよびフコース結合性タンパク質Ｃ７２Ａについて、実施例７の（２）に記載の方法により、Ｈタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する結合親和性評価を行った。表１３に、フコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｇおよびフコース結合性タンパク質Ｃ７２Ａおよび組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓの、Ｈタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する解離定数を示す。表１３に示すように、フコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｇおよびフコース結合性タンパク質Ｃ７２Ａは、組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓよりもＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する結合親和性が高いことがわかる。
【０２０１】
【表１３】
2020025535.tif 000014
【０２０２】
実施例１４  フコース結合性タンパク質１２９を不溶性担体に固定化した吸着剤１２９の製造
実施例１４から１７は、実施例１から４で製造したフコース結合性タンパク質を不溶性担体に固定化した吸着剤の製造に関するものである。具体的には、不溶性担体として市販多孔性合成高分子系担体（トヨパールＨＷ−４０ＥＣ、東ソー製）を用い、担体固定化用タグとしてシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質を固定化するための官能基（マレイミド基）を導入後、当該タンパク質のシステイン残基のメルカプト基とマレイミド基を反応させることにより、当該タンパク質が不溶性担体に固定化された吸着剤を製造した。
【０２０３】
なお、以下の実施例１４から２４、比較例４から１０および参考例４から１０において、特段の説明がない限り、不溶性担体を重量で記載した場合は水に懸濁した不溶性担体をグラスフィルターでろ過したのちに秤量した含水重量であり、また、「容積」で記載した場合は水に懸濁した不溶性担体を目盛付き容器に添加し、１２時間以上放置したときの沈降容積を目視により測定したものである。
【０２０４】
実施例１４は、実施例１で製造したフコース結合性タンパク質１２９を不溶性担体に固定化した吸着剤（以下、吸着剤１２９とする。）の製造に関するものである。
（１）不溶性担体への親水性高分子の固定
水に懸濁したトヨパールＨＷ−４０ＥＣ（東ソー製、１００−３００μｍ）をステンレス製標準ふるいにより１５０−２５０μｍの粒度範囲に湿式分級したのち、グラスフィルターでろ過したものを使用した。なお、以下の比較例において、１５０−２５０μｍに分級したトヨパールＨＷ−４０ＥＣを吸着剤として評価する場合は、吸着剤Ａとする。水に湿潤した状態での吸着剤ＨＷ−４０ＥＣの平均粒径は１８０μｍ、粒度範囲は１５０〜２５０μｍであった。
【０２０５】
次に、２５０ｍＬ容のテフロン（登録商標）製容器に１０．０ｇのトヨパールＨＷ−４０ＥＣ、１０．８ｍＬ（５４ｍｍｏｌ）の５Ｍ  ＮａＯＨ水溶液（関東化学製）、５．０ｍＬの水を添加したのち、５．０ｇ（５４ｍｍｏｌ）のエピクロロヒドリン（東京化成製）と５．０ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、関東化学製）の混合溶液を添加し、３０℃の振とう機内で３時間振とうすることによりトヨパールＨＷ−４０ＥＣのエポキシ化を行なった。反応終了後、溶液をグラスフィルター上でろ液が中性になるまで水で洗浄した。エポキシ化したトヨパールＨＷ−４０ＥＣ全量を２５０ｍＬ容のテフロン（登録商標）製容器に添加し、１５．０ｇの３０重量％デキストラン水溶液（シグマアルドリッチ製（分子量４５０，０００〜６５０，０００）から調製）を添加したのち、３０℃の振とう機内で３０分間振とうした。次に、反応容器に１．０５ｍＬ（１．５８ｇ、１９ｍｍｏｌ）の４８％ＮａＯＨ水溶液を添加し、３０℃の振とう機内でさらに１８時間振とうすることにより、エポキシ化トヨパールにＨＷ−４０ＥＣにデキストランを固定した。反応終了後、溶液をグラスフィルター上でろ液が中性になるまで水で洗浄することにより、目的のデキストラン固定トヨパールＨＷ−４０ＥＣ（以下、ＤＥＸ５５０トヨパールＨＷ−４０ＥＣとする。）を作製した。
（２）親水性高分子が固定された不溶性担体へのマレイミド基の導入
１００ｍＬ容のテフロン（登録商標）製容器に、５．０ｇのＤＥＸ５５０トヨパールＨＷ−４０ＥＣと、予め調製した１０．０ｍＬのテトラエチレングリコールジグリシジルエーテル水溶液（ナガセケムテックス製デナコールＥＸ−８２１から調製、濃度１００ｍｇ／ｍＬ）を添加したのち、３０℃の振とう機内で３０分間振とうしたのち、反応容器に１０４μＬ（１５６ｍｇ、１．８７ｍｍｏｌ）の４８％（約１８．１Ｍ）ＮａＯＨ水溶液を添加し、３０℃の振とう機内で８時間振とうすることによりエポキシ化ＤＥＸ５５０トヨパールＨＷ−４０Ｅを作製した。反応終了後、反応液をグラスフィルター上でろ液が中性になるまで水で洗浄した。次に、ろ別したエポキシ化ＤＥＸ５５０トヨパールＨＷ−４０ＥＣ全量を１００ｍＬ容のテフロン（登録商標）製容器に添加し、１０．０ｍＬの０．５Ｍ  エチレンジアミン水溶液（東京化成製エチレンジアミンから調製）を添加したのち、５０℃の振とう機内で３時間振とうすることによりアミノ化ＤＥＸ５５０トヨパールＨＷ−４０ＥＣを作製した。反応終了後、反応液をグラスフィルター上でろ液が中性になるまで水で洗浄した。次に、ろ別したアミノ化ＤＥＸ５５０トヨパールＨＷ−４０ＥＣ全量を１００ｍＬ容のテフロン（登録商標）製容器に添加し、１０．０ｍＬの３−マレイミドプロピオン酸  Ｎ−スクシンイミジルのＤＭＳＯ溶液（富士フイルム和光純薬製３−マレイミドプロピオン酸  Ｎ−スクシンイミジルから調製、濃度１０ｍｇ／ｍＬ）を添加したのち、３５℃の振とう機内で４時間振とうすることによりアミノ化トヨパールＨＷ−４０ＥＣのマレイミド化を行なった。反応終了後、反応液をグラスフィルター上で２０ｍＬのＤＭＳＯで３回、３０ｍＬの水で５回洗浄することにより、目的のマレイミド化ＤＥＸ５５０トヨパールＨＷ−４０ＥＣを作製した。
（３）マレイミド基が導入された不溶性担体へのフコース結合性タンパク質の固定化
フコース結合性タンパク質として、実施例１で調製した精製１２９溶液（フコース結合性タンパク質１２９のＤ−ＰＢＳ（−）溶液）を使用した。また、前記マレイミド化ＤＥＸ５５０トヨパールＨＷ−４０ＥＣは水で懸濁したものをグラスフィルターでろ過したものを使用した。
【０２０６】
９２０μＬの精製１２９溶液（濃度９．７５ｍｇ／ｍＬ）に、５．０２ｍＬのＤ−ＰＢＳ（−）と６０μＬの１００ｍＭ  ＴＣＥＰ水溶液を添加して、固定化用タンパク質溶液を調製した。１００ｍＬ容のテフロン（登録商標）製容器に４．５ｇのマレイミド化ＤＥＸ５５０トヨパールＨＷ−４０ＥＣ（水に懸濁した状態では６．０ｍＬに相当）を添加したのち、６．０ｍＬの固定化用緩衝液（０．２Ｍリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を添加した。次に、６．０ｍＬの前記固定化用タンパク質溶液（フコース結合性タンパク質１２９の仕込み濃度：１．５ｍｇ／ｍＬ−担体）を添加し、３５℃で１５時間振とうすることによりマレイミド化トヨパールＨＷ−４０ＥＣへのタンパク質固定化を行い、目的の吸着剤１２９を製造した。
【０２０７】
得られた吸着剤１２９をＤ−ＰＢＳ（−）で洗浄したのち、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を用いて洗浄液中のフコース結合性タンパク質１２９量を測定し、固定化反応前のフコース結合性タンパク質１２９の仕込み量から回収したフコース結合性タンパク質１２９の量を差し引くことにより、１ｍＬの吸着剤１２９あたりのフコース結合性タンパク質１２９の固定化量を算出した結果、固定化量は１９３μｇ／ｍＬ−吸着剤であった。なお、水に湿潤した状態での吸着剤１２９の平均粒径は１７７μｍ、粒度範囲は１５０〜２５０μｍであった。
（４）親水性高分子が固定された不溶性担体へのブロモアセチル基の導入
１００ｍＬ容のテフロン製容器に、実施例１４の（３）で作製したアミノ化ＤＥＸ５５０トヨパールＨＷ−４０ＥＣを５．０ｇ添加したのち、１０．０ｍＬのＮ−（ブロモアセトキシ）スクシンイミドのＤＭＳＯ溶液（東京化成製Ｎ−（ブロモアセトキシ）スクシンイミドから調製、濃度１０ｍｇ／ｍＬ）を添加したのち、２５℃の振とう機内で４時間振とうすることによりアミノ化トヨパールＨＷ−４０ＥＣのハロアセチル化を行なった。反応終了後、反応液をグラスフィルター上で２０ｍＬのＤＭＳＯで３回、３０ｍＬの水で５回洗浄することにより、目的のブロモアセチル化ＤＥＸ５５０トヨパールＨＷ−４０ＥＣを作製した。
（５）ブロモアセチル基が導入された不溶性担体へのフコース結合性タンパク質の固定化
マレイミド化ＤＥＸ５５０トヨパールＨＷ−４０ＥＣの代わりにブロモアセチル化ＤＥＸ５５０トヨパールＨＷ−４０ＥＣを用いた以外は、実施例１４の（３）と同様の方法によりフコース結合性タンパク質１２９の固定化を行い、目的の吸着剤１２９Ｂｒを製造した。
【０２０８】
得られた吸着剤１２９Ｂｒを実施例１４の（３）に記載の方法により、１ｍＬの吸着剤１２９Ｂｒあたりのフコース結合性タンパク質１２９の固定化量を算出した結果、固定化量は１５５μｇ／ｍＬ−吸着剤であった。また、水に湿潤した状態での吸着剤１２９Ｂの平均粒径は１７７μｍ、粒度範囲は１５０〜２５０μｍであった。
【０２０９】
実施例１５  フコース結合性タンパク質１２７を不溶性担体に固定化した吸着剤１２７の製造
実施例１５は、実施例２で製造したフコース結合性タンパク質１２７を不溶性担体に固定化した吸着剤（以下、吸着剤１２７とする。）の製造に関するものである。
【０２１０】
フコース結合性タンパク質として、実施例１で製造したフコース結合性タンパク質１２９の代わりに、実施例２で製造したフコース結合性タンパク質１２７を使用した以外は、実施例１４に記載の方法で行うことにより、目的の吸着剤１２７を製造した。
【０２１１】
実施例１４の（３）に記載の方法に従い、１ｍＬの吸着剤１２７あたりのフコース結合性タンパク質１２７の固定化量を算出した結果、固定化量は３５１μｇ／ｍＬ−吸着剤であった。なお、水に湿潤した状態での吸着剤１２７の平均粒径は１７５μｍ、粒度範囲は１５０〜２５０μｍであった。
【０２１２】
実施例１６  フコース結合性タンパク質１２９Ｇ３６Ｃを不溶性担体に固定化した吸着剤１２９Ｇ３６Ｃの製造
実施例１６は、実施例３で製造したフコース結合性タンパク質１２９Ｇ３６Ｃを不溶性担体に固定化した吸着剤（以下、吸着剤１２９Ｇ３６Ｃとする。）の製造に関するものである。
【０２１３】
フコース結合性タンパク質として、実施例１で製造したフコース結合性タンパク質１２９の代わりに、実施例３で製造したフコース結合性タンパク質１２９Ｇ３６Ｃを使用した以外は、実施例１４に記載の方法で行うことにより、目的の吸着剤１２９Ｇ３６Ｃを製造した。
【０２１４】
実施例１４の（３）に記載の方法に従い、１ｍＬの吸着剤１２９Ｇ３６Ｃあたりのフコース結合性タンパク質１２９Ｇ３６Ｃの固定化量を算出した結果、固定化量は２４４μｇ／ｍＬ−吸着剤であった。なお、水に湿潤した状態での吸着剤１２９Ｇ３６Ｃの平均粒径は１７６μｍ、粒度範囲は１５０〜２５０μｍであった。
【０２１５】
実施例１７  フコース結合性タンパク質１２７Ｇ３６Ｃを不溶性担体に固定化した吸着剤１２７Ｇ３６Ｃの製造
実施例１７は、実施例４で製造したフコース結合性タンパク質１２７Ｇ３６Ｃを不溶性担体に固定化した吸着剤（以下、吸着剤１２７Ｇ３６Ｃとする。）の製造に関するものである。
【０２１６】
フコース結合性タンパク質として、実施例１で製造したフコース結合性タンパク質１２９の代わりに、実施例４で製造したフコース結合性タンパク質１２７Ｇ３６Ｃを使用した以外は、実施例１４に記載の方法で行うことにより、目的の吸着剤１２７Ｇ３６Ｃを製造した。
【０２１７】
実施例１４の（３）に記載の方法に従い、１ｍＬの吸着剤１２７Ｇ３６Ｃあたりのフコース結合性タンパク質１２７Ｇ３６Ｃの固定化量を算出した結果、固定化量は２４５μｇ／ｍＬ−吸着剤であった。なお、水に湿潤した状態での吸着剤１２７Ｇ３６Ｃの平均粒径は１８０μｍ、粒度範囲は１５０〜２５０μｍであった。
【０２１８】
参考例３  組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを不溶性担体に固定化した吸着剤１５５の製造
参考例３は、比較例１で製造した組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを不溶性担体に固定化した吸着剤の製造に関するものである。具体的には、不溶性担体として市販多孔性合成高分子系担体（トヨパールＨＷ−４０ＥＣ、東ソー製）を用い、担体固定化用タグとしてシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加した組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを固定化するための官能基（マレイミド基）を導入後、当該タンパク質のシステイン残基のメルカプト基とマレイミド基を反応させることにより、当該タンパク質が不溶性担体に固定化された吸着剤（以下、吸着剤１５５とする。）を製造した。
【０２１９】
実施例１で製造したフコース結合性タンパク質１２９の代わりに、比較例１で製造した組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを使用した以外は、実施例１４に記載の方法で行うことにより、目的の吸着剤１５５を製造した。
【０２２０】
実施例１４の（３）に記載の方法に従い、１ｍＬの吸着剤１５５あたりのフコース結合性タンパク質１５５の固定化量を算出した結果、固定化量は２９８μｇ／ｍＬ−吸着剤であった。なお、水に湿潤した状態での吸着剤１５５の平均粒径は１７８μｍ、粒度範囲は１５０〜２５０μｍであった。
【０２２１】
実施例１８  吸着剤の細胞吸着能評価−１
実施例１８から２４、比較例４から１０および参考例４から１０は、前記実施例１４から１７および参考例３で製造した吸着剤の、細胞吸着能および細胞分離能評価に関するものである。
【０２２２】
実施例１８は、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ」からなる構造を含む糖鎖を有するヒト胎児性がん細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ  Ｃｌ．４／Ｄ３細胞（コスモバイオより入手、以下２１０２Ｅｐ細胞と記載する。））を用いた、吸着剤１２９、吸着剤１２７、吸着剤１２９Ｇ３６Ｃおよび吸着剤１２７Ｇ３６Ｃの細胞吸着能評価に関するものである。
（１）吸着剤を充填したカラムの作製
２．５ｍＬ容シリンジ（テルモ製）と注射針（テルモ製、２２Ｇ）の間に目開き４０μｍのポリエステルメッシュフィルター（ＢｉｏＬａｂ製）を装着したカラムを作製した。次に、実施例１４で作製した吸着剤１２９、実施例１５で製造した吸着剤１２７、実施例１６で製造した吸着剤１２９Ｇ３６Ｃおよび実施例１７で製造した吸着剤１２７Ｇ３６ＣをＭＡＣＳ緩衝液で置換したのち、１２時間以上放置後の吸着剤の沈降体積が５０％となるように調整した吸着剤の５０％懸濁液を調製し、作製したカラムに１．０ｍＬを添加して、各吸着剤をカラムに充填した（吸着剤容量：５００μＬ）。
（２）２１０２Ｅｐ細胞の培養と評価用細胞懸濁液の調製
接着性細胞である２１０２Ｅｐ細胞は、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ製）と抗生物質溶液（ペニシリン−ストレプトマイシン溶液、富士フイルム和光純薬製）を添加したＤ−ＭＥＭ培地（Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、富士フイルム和光純薬製）を用い、直径６ｃｍの接着培養用シャーレ（コーニング製）または直径１０ｃｍの接着培養用シャーレ（コーニング製）に細胞を播種し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した。
【０２２３】
培養終了後、以下に記載の方法により、２１０２Ｅｐ細胞をＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を用いて蛍光染色した。２１０２Ｅｐ細胞を培養中のシャーレ内の培地を廃棄後、Ｄ−ＰＢＳ（−）を添加して細胞を洗浄したのち、Ｄ−ＰＢＳ（−）を廃棄した。次に、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅを最終濃度が１０μＭとなるように無血清のＲＰＭＩ  １６４０培地（富士フイルム和光純薬製）に溶解した液を添加し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１時間培養した。前記蛍光試薬液を廃棄後、前記１０％ＦＢＳと抗生物質溶液を添加したＤ−ＭＥＭ培地を添加し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１時間培養した。次に、Ｄ−ＭＥＭ培地を廃棄したのち、再び新しいＤ−ＭＥＭ培地を添加し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で一晩培養した。
【０２２４】
次に、細胞の回収と細胞懸濁液の調製を以下の方法で行った。細胞培養中のシャーレ内のＤ−ＭＥＭ培地を廃棄してＤ−ＰＢＳ（−）を添加したのち、細胞を洗浄してＤ−ＰＢＳ（−）液を廃棄した。次に、適当量のＡｃｃｕｔａｓｅ（イノベーティブセルテクノロジー製）を添加し、数分間放置することで２１０２Ｅｐ細胞を剥離させ、５０ｍＬチューブへと回収した。細胞を遠心分離して沈降させたのち、細胞を前述のＭＡＣＳ緩衝液にて懸濁し、再度遠心分離して上清を廃棄することで細胞を洗浄した。細胞洗浄操作を２回繰り返したのち、ＭＡＣＳ緩衝液で懸濁し、セルストレーナーを用いてろ過することにより、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅで染色した２１０２Ｅｐ細胞の細胞懸濁液を調製した。
（３）吸着剤を充填したカラムを用いた２１０２Ｅｐ細胞の吸着能評価
各吸着剤を充填したカラムを垂直に立てた状態で、添加量が１．１ｘ１０７個／ｍＬ−吸着剤となるよう、前記の方法で調製した２１０２Ｅｐ細胞の細胞懸濁液をカラムに添加した。
【０２２５】
次に、カラム上部より４ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液を添加し、針部からの流出液を別容器に回収した。（以下、この細胞液を流出細胞液と記載する）。回収した流出細胞液はフルオロヌンク９６穴蛍光検出用プレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）に１００μＬずつ分注し、プレートリーダー（テカン製インフィニットＭ２００）を用い、励起波長５４１ｎｍ、検出波長５８０ｎｍでの蛍光強度を測定した。併せて、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅで染色した２１０２Ｅｐ細胞の細胞懸濁液を用いて希釈系列を作製し、フルオロヌンク９６穴蛍光検出用プレートに１００μＬずつ分注してプレートリーダーで励起波長５４１ｎｍ、検出波長５８０ｎｍでの蛍光スキャンを行うことにより、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅで染色した２１０２Ｅｐ細胞の濃度と蛍光強度の検量線を作成した。前記方法により得られた各流出細胞液の蛍光強度と検量線から、分取した各流出細胞液中に含まれる細胞数を算出後、各流出細胞液中の２１０２Ｅｐ細胞の流出率を「流出率＝カラムあたりの流出細胞数／添加細胞数」として算出した。
【０２２６】
表１４に、評価した各吸着剤における２１０２Ｅｐ細胞の流出率を示す。吸着剤１２９の流出率は２．７％、吸着剤１２７の流出率は２．９％、吸着剤１２９Ｇ３６Ｃの流出率は３．０％、吸着剤１２７Ｇ３６Ｃの流出率は２．６％であった。従って、本発明のフコース結合性タンパク質を不溶性担体に固定化した吸着剤は、いずれも９５％を超える高い２１０２Ｅｐ細胞吸着能を持つことが明らかとなった。
【０２２７】
比較例４  フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤の細胞吸着能評価−１
比較例４は、フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤Ａの、２１０２Ｅｐ細胞の吸着能評価に関するものである。
【０２２８】
実施例１８の（１）に記載の方法により、吸着剤Ａをカラムに充填した（吸着剤容量：５００μＬ）。次に、実施例１８の（２）で調製した２１０２Ｅｐ細胞の細胞懸濁液を用い、実施例１８の（３）に記載の方法により吸着剤を充填したカラムへの細胞懸濁液の添加、流出細胞液の回収、流出細胞液の蛍光強度測定を順次行い、吸着剤Ａにおける２１０２Ｅｐ細胞の流出率を算出した結果、流出率は８８．２％であった（表１４）。従って、フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤Ａに、２１０２Ｅｐ細胞はほとんど吸着しないことが明らかとなった。
【０２２９】
参考例４  組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを固定化した吸着剤の細胞吸着能評価−１
参考例４は、組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを固定化した吸着剤１５５の、２１０２Ｅｐ細胞の吸着能評価に関するものである。
【０２３０】
実施例１８の（１）に記載の方法により、吸着剤１５５をカラムに充填した（吸着剤容量：５００μＬ）。次に、実施例１８の（２）で調製した２１０２Ｅｐ細胞の細胞懸濁液を用い、実施例１８の（３）に記載の方法により吸着剤を充填したカラムへの細胞懸濁液の添加、流出細胞液の回収、流出細胞液の蛍光強度測定を順次行い、吸着剤１５５における２１０２Ｅｐ細胞の流出率を算出した結果、流出率は２．９％であった（表１４）。従って、組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを不溶性担体に固定化した吸着剤１５５も、フコース結合性タンパク質を不溶性担体に固定化した吸着剤と同様に、９５％を超える高い２１０２Ｅｐ細胞の吸着能を持つことが明らかとなった。
【０２３１】
【表１４】
2020025535.tif 000015
【０２３２】
実施例１９  吸着剤の細胞吸着能評価−２
実施例１９は、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ」からなる構造を含む糖鎖を有するヒト肺腺がん細胞（ＰＣ−９細胞、ＤＳファーマバイオメディカルより入手、ＥＣＡＣＣ株番号：９００７１８１０）を用いた、吸着剤１２９、吸着剤１２７、吸着剤１２９Ｇ３６Ｃおよび吸着剤１２７Ｇ３６Ｃの細胞吸着能評価に関するものである。
（１）吸着剤を充填したカラムの作製
実施例１８の（１）に記載の方法により、前記各吸着剤を充填したカラムを作製した（吸着剤容量：５００μＬ）。
（２）ＰＣ−９細胞の培養と評価用細胞懸濁液の調製
接着性細胞であるＰＣ−９細胞は、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ製）と抗生物質溶液（ペニシリン−ストレプトマイシン溶液、富士フイルム和光純薬製）を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地（富士フイルム和光純薬製）を用い、直径６ｃｍの接着培養用シャーレ（コーニング製）または直径１０ｃｍの接着培養用シャーレ（コーニング製）に細胞を播種し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した。
【０２３３】
培養終了後、実施例１８の（２）に記載の方法により、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅで染色したＰＣ−９細胞の細胞懸濁液を調製した。
（３）吸着剤を充填したカラムを用いたＰＣ−９細胞の吸着能評価
各吸着剤を充填したカラムを垂直に立てた状態で、添加量が４．８ｘ１０６個／ｍＬ−吸着剤となるよう、前記の方法で調製したＰＣ−９細胞の細胞懸濁液をカラムに添加した。その後、実施例１８の（３）に記載の方法により、各吸着剤から流出細胞液を回収し、ＰＣ−９細胞の流出率を算出した。なお、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅで染色したＰＣ−９細胞の濃度と蛍光強度の検量線の作成は、実施例１８の（３）に記載の方法に従って行った。
【０２３４】
表１５に、評価した各吸着剤におけるＰＣ−９細胞の流出率を示す。吸着剤１２９の流出率は２．５％、吸着剤１２７の流出率は２．４％、吸着剤１２９Ｇ３６Ｃの流出率は２．６％、吸着剤１２７Ｇ３６Ｃの流出率は２．５％であった。従って、本発明のフコース結合性タンパク質を不溶性担体に固定化した吸着剤は、いずれも９５％を超える高いＰＣ−９細胞の吸着能を持つことが明らかとなった。
【０２３５】
比較例５  フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤の細胞吸着能評価−２
比較例５は、フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤Ａの、ＰＣ−９細胞の吸着能評価に関するものである。
【０２３６】
実施例１８の（１）に記載の方法により、吸着剤Ａをカラムに充填した（吸着剤容量：５００μＬ）。次に、実施例１９の（２）で調製したＰＣ−９細胞の細胞懸濁液を用い、実施例１９の（３）に記載の方法により吸着剤を充填したカラムへの細胞懸濁液の添加、流出細胞液の回収、流出細胞液の蛍光強度測定を順次行い、吸着剤ＡにおけるＰＣ−９細胞の流出率を算出した結果、流出率は９５．２％であった（表１５）。従って、フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤Ａに、ＰＣ−９細胞はほとんど吸着しないことが明らかとなった。
【０２３７】
参考例５  組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを固定化した吸着剤の細胞吸着能評価−２
参考例５は、組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを固定化した吸着剤１５５の、ＰＣ−９細胞の吸着能評価に関するものである。
【０２３８】
実施例１８の（１）に記載の方法により、吸着剤１５５をカラムに充填した（吸着剤容量：５００μＬ）。次に、実施例１９の（２）で調製したＰＣ−９細胞の細胞懸濁液を用い、実施例１９の（３）に記載の方法により、吸着剤を充填したカラムへの細胞懸濁液の添加、流出細胞液の回収、流出細胞液の蛍光強度測定を順次行い、吸着剤１５５におけるＰＣ−９細胞の流出率を算出した結果、流出率は２．４％であった（表１５）。従って、組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを不溶性担体に固定化した吸着剤１５５も、フコース結合性タンパク質を不溶性担体に固定化した吸着剤と同様に、９５％を超える高いＰＣ−９細胞の吸着能を持つことが明らかとなった。
【０２３９】
【表１５】
2020025535.tif 000016
【０２４０】
実施例２０  吸着剤の細胞吸着能評価−３
実施例２０は、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ」からなる構造を含む糖鎖を有さないヒトバーキットリンパ腫細胞（Ｒａｍｏｓ細胞、ＪＣＲＢ９１１９）を用いた、吸着剤１２９、吸着剤１２７、吸着剤１２９Ｇ３６Ｃおよび吸着剤１２７Ｇ３６Ｃの細胞吸着能評価に関するものである。
（１）吸着剤を充填したカラムの作製
実施例１８の（１）に記載の方法により、前記各吸着剤を充填したカラムを作製した（吸着剤容量：５００μＬ）。
（２）Ｒａｍｏｓ細胞の培養と評価用細胞懸濁液の調製
浮遊性細胞であるＲａｍｏｓ細胞は、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ製）と抗生物質溶液（ペニシリン−ストレプトマイシン溶液、富士フイルム和光純薬製）を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地（富士フイルム和光純薬製）を用い、浮遊培養用シャーレ（住友ベークライト製）に細胞を播種し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した。
【０２４１】
培養終了後、実施例１８の（２）に記載の方法により、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅで染色したＲａｍｏｓ細胞の細胞懸濁液を調製した。
（３）吸着剤を充填したカラムを用いたＲａｍｏｓ細胞の吸着能評価
各吸着剤を充填したカラムを垂直に立てた状態で、添加量が１．４ｘ１０７個／ｍＬ−吸着剤となるよう、前記の方法で調製したＲａｍｏｓ細胞の細胞懸濁液をカラムに添加した。その後、実施例１８の（３）に記載の方法により、各吸着剤から流出細胞液を回収し、Ｒａｍｏｓ細胞の流出率を算出した。なお、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅで染色したＲａｍｏｓ細胞の濃度と蛍光強度の検量線の作成は、実施例１８の（３）に記載の方法に従って行った。
【０２４２】
表１６に、評価した各吸着剤におけるＲａｍｏｓ細胞の流出率を示す。吸着剤１２９の流出率は９９％、吸着剤１２７の流出率は１０２％、吸着剤１２９Ｇ３６Ｃの流出率は９９％、吸着剤１２７Ｇ３６Ｃの流出率は１０１％であった。従って、本発明のフコース結合性タンパク質を不溶性担体に固定化した各吸着剤に、Ｒａｍｏｓ細胞は吸着しないことが明らかとなった。
【０２４３】
比較例６  フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤の細胞吸着能評価−３
比較例６は、フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤Ａの、Ｒａｍｏｓ細胞の吸着能評価に関するものである。
【０２４４】
実施例１８の（１）に記載の方法により、吸着剤Ａをカラムに充填した（吸着剤容量：５００μＬ）。次に、実施例２０の（２）で調製したＲａｍｏｓ細胞の細胞懸濁液を用い、実施例２０の（３）に記載の方法により、吸着剤を充填したカラムへの細胞懸濁液の添加、流出細胞液の回収、流出細胞液の蛍光強度測定を順次行い、吸着剤ＡにおけるＲａｍｏｓ細胞の流出率を算出した結果、流出率は１０１％であった（表１６）。従って、フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤ＡもＲａｍｏｓ細胞の吸着能を持たないことが明らかとなった。
【０２４５】
参考例６  組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを固定化した吸着剤の細胞吸着能評価−３
参考例６は、組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを固定化した吸着剤１５５の、Ｒａｍｏｓ細胞の吸着能評価に関するものである。
【０２４６】
実施例１８の（１）に記載の方法により、吸着剤１５５をカラムに充填した（吸着剤容量：５００μＬ）。次に、実施例２０の（２）で調製したＲａｍｏｓ細胞の細胞懸濁液を用い、実施例２０の（３）に記載の方法により、吸着剤を充填したカラムへの細胞懸濁液の添加、流出細胞液の回収、流出細胞液の蛍光強度測定を順次行い、吸着剤１５５におけるＲａｍｏｓ細胞の流出率を算出した結果、流出率は１０２％であった（表１６）。従って、組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを不溶性担体に固定化した吸着剤１５５にも、Ｒａｍｏｓ細胞は吸着しないことが明らかとなった。
【０２４７】
【表１６】
2020025535.tif 000017
【０２４８】
実施例２１  吸着剤の細胞分離能評価−４
実施例２１は、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ」からなる構造を含む糖鎖を有するヒト肺腺がん細胞（ＰＣ−９細胞）と「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ」からなる構造を含む糖鎖を有さないヒト慢性骨髄性白血病細胞であるＫ５６２細胞（ＪＣＲＢ００１９）の細胞混合物を用いた、吸着剤１２７の細胞分離能評価に関するものである。
（１）吸着剤１２７の製造と吸着剤１２７を充填したカラムの作製
実施例１５に記載の方法に従い、吸着剤１２７を製造した。１ｍＬの吸着剤１２７あたりのフコース結合性タンパク質１２７の固定化量を算出した結果、固定化量は４４３μｇ／ｍＬ−吸着剤であった。次に、実施例１８の（１）に記載の方法に従い、製造した吸着剤１２７を充填したカラムを作製した（吸着剤容量：５００μＬ）。
（２）ＰＣ−９細胞およびＫ５６２細胞の培養と評価用細胞混合物の調製
接着性細胞であるＰＣ−９細胞の培養は、実施例１９に記載の方法に従って行った。培養終了後、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅの代わりにＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を用いた以外は、実施例１８の（２）に記載の方法に従い、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎで染色したＰＣ−９細胞の細胞懸濁液を調製した。
【０２４９】
浮遊性細胞であるＫ５６２細胞の培養は、ＧＩＴ培地（日本製薬製）を用い、浮遊培養用シャーレ（住友ベークライト製）に細胞を播種し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した。培養終了後、実施例１８の（２）に記載の方法により、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅで染色したＫ５６２細胞の細胞懸濁液を調製した。
【０２５０】
前記の方法で調製したＰＣ−９細胞の細胞懸濁液とＫ５６２細胞の細胞懸濁液について、各細胞懸濁液中の細胞数を測定したのち、細胞数が１：１となるようにＰＣ−９細胞の細胞懸濁液とＫ５６２細胞の細胞懸濁液を混合し、細胞分離能評価用の細胞混合物を調製した。
（３）吸着剤を充填したカラムを用いた細胞分離能評価
各吸着剤を充填したカラムを垂直に立てた状態で、添加量が４．８ｘ１０６個／ｍＬ−吸着剤となるよう、すなわち、ＰＣ−９細胞とＫ５６２細胞のそれぞれが２．４ｘ１０６個／ｍＬ−吸着剤となるよう、前記の方法で調製した細胞混合物をカラムに添加した。
【０２５１】
次に、カラム上部より４ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液を添加し、針部からの流出細胞液を別容器に回収した。回収した流出細胞液はフルオロヌンク９６穴蛍光検出用プレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）に１００μＬずつ分注し、プレートリーダー（テカン製インフィニットＭ２００）を用い、励起波長４９２ｎｍ、検出波長５３０ｎｍ、または、励起波長５４１ｎｍ、検出波長５８０ｎｍでの蛍光強度を測定した。併せて、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎで染色したＰＣ−９細胞の細胞懸濁液を用いて希釈系列を作製し、フルオロヌンク９６穴蛍光検出用プレートに１００μＬずつ分注してプレートリーダーで励起波長４９２ｎｍ、検出波長５３０ｎｍでの蛍光強度測定を行うことにより、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎで染色したＰＣ−９細胞の濃度と蛍光強度の検量線を作成した。なお、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅで染色したＫ５６２細胞の濃度と蛍光強度の検量線の作成は、実施例２０の（３）に記載の方法に従って行った。前記方法により得られた流出細胞液の蛍光強度と検量線から、回収した流出細胞液中に含まれる各細胞数を算出後、各流出細胞液中のＰＣ−９細胞とＫ５６２細胞の流出率を算出した。
【０２５２】
表１７に、吸着剤１２７におけるＰＣ−９細胞とＫ５６２細胞の流出率を示す。ＰＣ−９細胞の流出率は３．３％であったのに対して、Ｋ５６２細胞の流出率は５５．１％であった。従って、本発明のフコース結合性タンパク質１２７を不溶性担体に固定化した吸着剤１２７は、ＰＣ−９細胞とＫ５６２細胞の混合物から、ＰＣ−９細胞のみを選択的に分離できることが明らかとなった。
【０２５３】
比較例７  フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤の細胞分離能評価−４
比較例７は、ＰＣ−９細胞とＫ５６２細胞の細胞混合物を用いた、フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤Ａの細胞分離能評価に関するものである。
【０２５４】
実施例１８の（１）に記載の方法により、吸着剤Ａをカラムに充填した（吸着剤容量：５００μＬ）。次に、実施例２１の（２）で調製したＰＣ−９細胞とＫ５６２細胞の細胞混合物を用い、実施例２１の（３）に記載の方法により、吸着剤を充填したカラムへの細胞混合物の添加、流出細胞液の回収、流出細胞液の蛍光強度測定を順次行い、吸着剤ＡにおけるＰＣ−９細胞とＫ５６２細胞の流出率を算出した結果、ＰＣ−９細胞の流出率は５０．２％、Ｋ５６２細胞の流出率は５５．４％であった（表１７）。従って、フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤Ａは、ＰＣ−９細胞とＫ５６２細胞の混合物から、ＰＣ−９細胞を吸着分離できないことが明らかとなった。
【０２５５】
参考例７  組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを固定化した吸着剤の細胞分離能評価−４
参考例７は、ＰＣ−９細胞とＫ５６２細胞の細胞混合物を用いた、吸着剤１５５の細胞分離能評価に関するものである。
【０２５６】
参考例３に記載の方法に従い、吸着剤１５５を製造した。１ｍＬの吸着剤１５５あたりの組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓの固定化量を算出した結果、固定化量は４８５μｇ／ｍＬ−吸着剤であった。次に、実施例１８の（１）に記載の方法により、吸着剤１５５をカラムに充填した（吸着剤容量：５００μＬ）。
【０２５７】
実施例２１の（２）で調製したＰＣ−９細胞とＫ５６２細胞の細胞混合物を用い、実施例２１の（３）に記載の方法により、吸着剤を充填したカラムへの細胞混合物の添加、流出細胞液の回収、流出細胞液の蛍光強度測定を順次行い、吸着剤ＡにおけるＰＣ−９細胞とＫ５６２細胞の流出率を算出した結果、ＰＣ−９細胞の流出率は１０．０％、Ｋ５６２細胞の流出率は５８．３％であった（表１７）。従って、組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを不溶性担体に固定化した吸着剤１５５は、ＰＣ−９細胞とＫ５６２細胞の混合物から、ＰＣ−９細胞のみを選択的に分離できることが明らかとなった。
【０２５８】
【表１７】
2020025535.tif 000018
【０２５９】
実施例２２  吸着剤の細胞吸着能評価−５
実施例２２は、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ」からなる構造を含む糖鎖を有するヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７細胞（特許実施許諾契約およびＭＴＡ契約を締結後、京都大学ＣｉＲＡより分譲）を用いた、吸着剤１２７の細胞吸着能評価に関するものである。
（１）吸着剤を充填したカラムの作製
実施例２１の（１）で作製した吸着剤１２７を用い、実施例１８の（１）に記載の方法に従い、製造した吸着剤１２７を充填したカラムを作製した（吸着剤容量：５００μＬ）。
（２）２０１Ｂ７細胞の培養と評価用細胞懸濁液の調製
２０１Ｂ７細胞の培養は、接着培養用シャーレ（コーニング製）を用いて、以下の方法で行った。
【０２６０】
予め調製したｉＭａｔｒｉｘ−５１１（ニッピ製）をＤ−ＰＢＳに３μｇ／ｍＬで希釈した溶液シャーレに添加して４℃で一晩以上放置することにより、シャーレ培養面へのｉＭａｔｒｉｘ−５１１のコーティングを行った。コーティングを行ったシャーレのｉＭａｔｒｉｘ−５１１溶液を廃棄したのち、ｉＰＳ細胞培養用培地であるＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ培地（味の素製）を添加して洗浄後、凍結バイアルより解凍した２０１Ｂ７細胞を、ロックインヒビター（Ｙ−２７６３２：富士フイルム和光純薬製）を１０μＭ添加した同培地に懸濁して播種した。一晩培養後、Ｙ−２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ培地を廃棄し、Ｙ−２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ培地へと培地交換を行い、適切な細胞密度になったところで、細胞回収と継代を行った。
【０２６１】
シャーレからの細胞回収は以下の方法で行った。シャーレにＤ−ＰＢＳ（−）を添加して細胞を洗浄したのち、Ｄ−ＰＢＳ（−）を廃棄する操作を２回繰り返して細胞を洗浄後、ＣＴＳ  ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｅｎｚｙｍｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）とＶｅｒｓｅｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を１：１で混合した剥離溶液を添加して５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１分間放置した。細胞が丸く剥がれつつあるのを確認したのち、剥離溶液を廃棄、１０μＭ  Ｙ−２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ培地を添加し、セルスクレ―バーで細胞を剥離し、５０ｍＬチューブ中に回収した。回収した細胞の細胞数は血球計算盤でカウントし、Ｙ−２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ培地にて、１０４〜１０５／ｍＬの濃度で播種し、Ｙ−２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ培地にて適当な細胞密度になるまで培養を継続した。
【０２６２】
次に、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅを用いた２０１Ｂ７細胞の蛍光染色は、以下の方法で行った。まず、シャーレ中の培地を廃棄後、Ｄ−ＰＢＳ（−）を添加して細胞をリンス後、Ｄ−ＰＢＳ（−）を吸引廃棄した。次にＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅを無血清のＲＰＭＩ  １６４０培地に終濃度２０μＭで溶解した溶液を添加し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１時間培養した。蛍光試薬液を廃棄後、ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ培地を添加し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１時間培養した。培地を廃棄後、ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ培地を添加し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で一晩培養した。次に、細胞の回収と細胞懸濁液の調製を以下の方法で行った。シャーレにＤ−ＰＢＳ（−）を添加して細胞をリンスしたのち、Ｄ−ＰＢＳ（−）を廃棄する操作を２回繰り返して細胞を洗浄後、ＣＴＳ  ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｅｎｚｙｍｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）とＶｅｒｓｅｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を１：１で混合した剥離溶液を添加して５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１分間放置した。細胞が丸く剥がれつつあるのを確認したのち、剥離溶液を廃棄、ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ培地を添加し、セルスクレ―バーで細胞を剥離し、５０ｍＬチューブ中に回収した。回収した細胞を遠心分離して沈降後、細胞をＭＡＣＳ緩衝液で懸濁し、再度遠心分離して上清を廃棄することで細胞を洗浄した。細胞洗浄操作を２回繰り返したのち、ＭＡＣＳ緩衝液で懸濁し、セルストレーナーを用いてろ過することにより、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅで染色した２０１Ｂ７細胞の細胞懸濁液を調製した。
（３）吸着剤を充填したカラムを用いた２０１Ｂ７細胞の吸着能評価
吸着剤１２７を充填したカラムを垂直に立てた状態で、添加量が４．４ｘ１０５個／ｍＬ−吸着剤となるよう、前記の方法で調製した２０１Ｂ７細胞の細胞懸濁液をカラムに添加した。その後、実施例１８の（３）に記載の方法により、吸着剤１２７から流出細胞液を回収し、２０１Ｂ７細胞の流出率を算出した結果、吸着剤１２７における２０１Ｂ７細胞の流出率は０．５％であった（表１８）。従って、本発明のフコース結合性タンパク質１２７を不溶性担体に固定化した吸着剤１２７は、高いｉＰＳ細胞吸着能を持つことが明らかとなった。なお、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅで染色した２０１Ｂ７細胞の濃度と蛍光強度の検量線の作成は、実施例１８の（３）に記載の方法に従って行った。
【０２６３】
比較例８  フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤の細胞吸着能評価−５
比較例８は、フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤Ａの、２０１Ｂ７細胞の吸着能評価に関するものである。
【０２６４】
実施例１８の（１）に記載の方法により、吸着剤Ａをカラムに充填した（吸着剤容量：５００μＬ）。次に、実施例２２の（２）で調製した２０１Ｂ７細胞の細胞懸濁液を用い、実施例２２の（３）に記載の方法により吸着剤を充填したカラムへの細胞懸濁液の添加、流出細胞液の回収、流出細胞液の蛍光強度測定を順次行い、吸着剤Ａにおける２０１Ｂ７細胞の流出率を算出した結果、流出率は７７．０％であった（表１８）。従って、フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤Ａに、２０１Ｂ７細胞はほとんど吸着しないことが明らかとなった。
【０２６５】
参考例８  組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを固定化した吸着剤の細胞吸着能評価−５
参考例８は、組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを固定化した吸着剤１５５の、２０１Ｂ７細胞の吸着能評価に関するものである。
【０２６６】
参考例７の（１）で製造した吸着剤１５５を用い、実施例１８の（１）に記載の方法に従い吸着剤１５５を充填したカラムを作製した（吸着剤容量：５００μＬ）。次に、実施例２２の（２）で調製した２０１Ｂ７細胞の細胞懸濁液を用い、実施例２２の（３）に記載の方法により吸着剤を充填したカラムへの細胞懸濁液の添加、流出細胞液の回収、流出細胞液の蛍光強度測定を順次行い、吸着剤１５５における２０１Ｂ７細胞の流出率を算出した結果、流出率は０．６％であった（表１８）。従って、組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを不溶性担体に固定化した吸着剤１５５も、高いｉＰＳ細胞吸着能を持つことが明らかとなった。
【０２６７】
【表１８】
2020025535.tif 000019
【０２６８】
実施例２３  吸着剤の細胞吸着能評価−６
実施例２３は、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ」からなる構造を含む糖鎖を有さない正常ヒト皮膚線維芽細胞であるＮＨＤＦ細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ製）を用いた、吸着剤１２７の細胞吸着能評価に関するものである。
（１）吸着剤を充填したカラムの作製
実施例２１の（１）で製造した吸着剤１２７を用い、実施例１８の（１）に記載の方法に従い、製造した吸着剤１２７を充填したカラムを作製した（吸着剤容量：５００μＬ）。
（２）ＮＨＤＦ細胞の培養と評価用細胞懸濁液の調製
接着性細胞であるＮＨＤＦ細胞は、線維芽細胞増殖培地２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ製）を用い、直径１０ｃｍの接着培養用シャーレ（コーニング製）または直径１５ｃｍの接着培養用シャーレ（コーニング製）に細胞を播種し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した。培養終了後、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅの代わりにＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を用いた以外は、実施例１８の（２）に記載の方法に従い、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎで染色したＮＨＤＦ細胞の細胞懸濁液を調製した。
（３）吸着剤を充填したカラムを用いたＮＨＤＦ細胞の吸着能評価
吸着剤１２７を充填したカラムを垂直に立てた状態で、添加量が８．２ｘ１０５個／ｍＬ−吸着剤となるよう、前記の方法で調製したＮＨＤＦ細胞の細胞懸濁液をカラムに添加した。その後、実施例１８の（３）に記載の方法により、吸着剤１２７から流出細胞液を回収し、ＮＨＤＦ細胞の流出率を算出した結果、吸着剤１２７におけるＮＨＤＦ細胞の流出率は９０．３％であった（表１９）。従って、本発明のフコース結合性タンパク質を不溶性担体に固定化した各吸着剤に、ＮＨＤＦ細胞は吸着しないことが明らかとなった。なお、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎで染色したＮＨＤＦ細胞の濃度と蛍光強度の検量線の作成は、実施例２１の（３）に記載の方法に従って行った。
【０２６９】
比較例９  フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤の細胞吸着能評価−６
比較例９は、ＮＨＤＦ細胞を用いた、フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤Ａの細胞吸着能評価に関するものである。
【０２７０】
実施例１８の（１）に記載の方法により、吸着剤Ａをカラムに充填した（吸着剤容量：５００μＬ）。次に、実施例２３の（２）で調製したＮＨＤＦ細胞の細胞懸濁液を用い、実施例２３の（３）に記載の方法により吸着剤を充填したカラムへの細胞懸濁液の添加、流出細胞液の回収、流出細胞液の蛍光強度測定を順次行い、吸着剤ＡにおけるＮＨＤＦ細胞の流出率を算出した結果、流出率は８５．１％であった（表１９）。従って、フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤Ａに、ＮＨＤＦ細胞はほとんど吸着しないことが明らかとなった。
【０２７１】
参考例９  組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを固定化した吸着剤の細胞吸着能評価−６
参考例９は、ＮＨＤＦ細胞を用いた、吸着剤１５５の細胞吸着能評価に関するものである。
【０２７２】
参考例７の（１）で製造した吸着剤１５５を用い、実施例１８の（１）に記載の方法に従い吸着剤１５５を充填したカラムを作製した（吸着剤容量：５００μＬ）。次に、実施例２３の（２）で調製したＮＨＤＦ細胞の細胞懸濁液を用い、実施例２３の（３）に記載の方法により吸着剤を充填したカラムへの細胞懸濁液の添加、流出細胞液の回収、流出細胞液の蛍光強度測定を順次行い、吸着剤１５５におけるＮＨＤＦ細胞の流出率を算出した結果、流出率は１０４％であった（表１９）。従って、組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを不溶性担体に固定化した吸着剤１５５に、ＮＨＤＦ細胞は吸着しないことが明らかとなった。
【０２７３】
【表１９】
2020025535.tif 000020
【０２７４】
実施例２４  吸着剤の細胞分離能評価−７
実施例２４は、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ」からなる構造を含む糖鎖を有するヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７細胞と「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ」からなる構造を含む糖鎖を有さないＮＨＤＦ細胞の細胞混合物を用いた、吸着剤１２７の細胞分離能評価に関するものである。
（１）吸着剤を充填したカラムの作製
実施例２１の（１）で製造した吸着剤１２７を用い、実施例１８の（１）に記載の方法に従い、製造した吸着剤１２７を充填したカラムを作製した（吸着剤容量：５００μＬ）。
（２）評価用細胞混合物の調製
Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅで染色した２０１Ｂ７細胞の細胞懸濁液は、実施例２２の（２）で調製したものを使用した。また、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎで染色したＮＨＤＦ細胞の細胞懸濁液は、実施例２３の（２）で調製したものを使用した。
【０２７５】
前記２０１Ｂ７細胞の細胞懸濁液とＮＨＤＦ細胞の細胞懸濁液について、各細胞懸濁液中の細胞数を測定したのち、細胞数が２０１Ｂ７細胞：ＮＨＤＦ細胞＝３５：６５となるように２０１Ｂ７細胞の細胞懸濁液とＮＨＤＦ細胞の細胞懸濁液を混合し、細胞分離能評価用の細胞混合物を調製した。
（３）吸着剤を充填したカラムを用いた細胞分離能評価
各吸着剤を充填したカラムを垂直に立てた状態で、添加量が１．３ｘ１０６個／ｍＬ−吸着剤となるよう、すなわち、２０１Ｂ７細胞が０．４６ｘ１０６個／ｍＬ−吸着剤、ＮＨＤＦ細胞が０．８４ｘ１０６個／ｍＬ−吸着剤となるよう、前記の方法で調製した細胞混合物をカラムに添加した。
【０２７６】
その後、実施例２１の（３）に記載の方法により、吸着剤１２７から流出細胞液を回収し、回収した流出細胞液中に含まれる各細胞数を算出後、流出細胞液中の２０１Ｂ７細胞とＮＨＤＦ細胞の流出率を算出した。
【０２７７】
表２０に、吸着剤１２７における２０１Ｂ７細胞とＮＨＤＦ細胞の流出率を示す。２０１Ｂ７細胞の流出率は０．３％であったのに対して、ＮＨＤＦ細胞の流出率は７８．４％であった。従って、本発明のフコース結合性タンパク質１２７を不溶性担体に固定化した吸着剤１２７は、２０１Ｂ７細胞とＮＨＤＦ細胞の混合物から、２０１Ｂ７細胞のみを選択的に分離できることが明らかとなった。
【０２７８】
比較例１０  フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤の細胞分離能評価−７
比較例１０は、２０１Ｂ７細胞とＮＨＤＦ細胞の細胞混合物を用いた、フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤Ａの細胞分離能評価に関するものである。
【０２７９】
実施例１８の（１）に記載の方法により、吸着剤Ａをカラムに充填した（吸着剤容量：５００μＬ）。次に、実施例２４の（２）で調製した２０１Ｂ７細胞とＮＨＤＦ細胞の細胞混合物を用い、実施例２４の（３）に記載の方法により、吸着剤を充填したカラムへの細胞混合物の添加、流出細胞液の回収、流出細胞液の蛍光強度測定を順次行い、吸着剤Ａにおける２０１Ｂ７細胞とＮＨＤＦ細胞の流出率を算出した結果、２０１Ｂ７細胞の流出率は６６．７％、ＮＨＤＦ細胞の流出率は８３．７％であった。（表２０）。従って、フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤Ａは、２０１Ｂ７細胞とＮＨＤＦ細胞の混合物から、２０１Ｂ７細胞を吸着分離できないことが明らかとなった。
【０２８０】
参考例１０  組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを固定化した吸着剤の細胞分離能評価−７
参考例１０は、２０１Ｂ７細胞とＮＨＤＦ細胞の細胞混合物を用いた、吸着剤１５５の細胞分離能評価に関するものである。
【０２８１】
参考例７の（１）で製造した吸着剤１５５を用い、実施例１８の（１）に記載の方法に従い吸着剤１５５を充填したカラムを作製した（吸着剤容量：５００μＬ）。次に、実施例２４の（２）で調製した２０１Ｂ７細胞とＮＨＤＦ細胞の細胞混合物を用い、実施例２４の（３）に記載の方法により、吸着剤を充填したカラムへの細胞混合物の添加、流出細胞液の回収、流出細胞液の蛍光強度測定を順次行い、吸着剤Ａにおける２０１Ｂ７細胞とＮＨＤＦ細胞の流出率を算出した結果、２０１Ｂ７細胞の流出率は０．６％、ＮＨＤＦ細胞の流出率は７９．７％であった。（表２０）。従って、組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓを不溶性担体に固定化した吸着剤１５５は、２０１Ｂ７細胞とＮＨＤＦ細胞の混合物から、２０１Ｂ７細胞のみを選択的に分離できることが明らかとなった。
【０２８２】
【表２０】
2020025535.tif 000021
【０２８３】
実施例２５  吸着剤の細胞分離能評価−８
実施例２５は、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ」からなる構造を含む糖鎖を有するヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７細胞、２５３Ｇ１細胞、１２３１Ａ３細胞（それぞれ特許実施許諾契約およびＭＴＡ契約を締結後、京都大学ＣｉＲＡより分譲）と、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ」からなる構造を含む糖鎖を有さないＮＨＤＦ細胞との細胞混合物を用いた、吸着剤１２７の細胞分離能評価に関するものである。
（１）吸着剤１２７の製造と吸着剤１２７を充填したカラムの作製
実施例１５に記載の方法に従い、吸着剤１２７を製造した。１ｍＬの吸着剤１２７あたりのフコース結合性タンパク質１２７の固定化量を算出した結果、固定化量は１０００μｇ／ｍＬ−吸着剤であった。次に、実施例１８の（１）に記載の方法に従い、製造した吸着剤１２７を充填したカラムを作製した（吸着剤容量：５００μＬ）。
（２）評価用細胞混合物の調製
Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅで染色した２０１Ｂ７細胞、２５３Ｇ１細胞、１２３１Ａ３細胞の細胞懸濁液はそれぞれ、実施例２２の（２）の方法に従い調製したものを使用した。また、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎで染色したＮＨＤＦ細胞の細胞懸濁液は、実施例２３の（２）で調製したものを使用した。
【０２８４】
前記２０１Ｂ７細胞、２５３Ｇ１細胞、１２３１Ａ３細胞、ＮＨＤＦ細胞の細胞懸濁液について、各細胞懸濁液中の細胞数を測定したのち、細胞数が２０１Ｂ７細胞：ＮＨＤＦ細胞＝４９：５１、２５３Ｇ１細胞：ＮＨＤＦ細胞＝５３：４７、１２３１Ａ３細胞：ＮＨＤＦ細胞＝６９：３１となるようにそれぞれ２０１Ｂ７細胞、２５３Ｇ１細胞、１２３１Ａ３細胞の細胞懸濁液とＮＨＤＦ細胞の細胞懸濁液を混合し、細胞分離能評価用の細胞混合物を調製した。
（３）吸着剤を充填したカラムを用いた細胞分離能評価
各吸着剤を充填したカラムを垂直に立てた状態で、２０１Ｂ７細胞の細胞懸濁液とＮＨＤＦ細胞の細胞混合物については添加量が３．３ｘ１０６個／ｍＬ−吸着剤となるよう、すなわち、２０１Ｂ７細胞が１．６ｘ１０６個／ｍＬ−吸着剤、ＮＨＤＦ細胞が１．７ｘ１０６個／ｍＬ−吸着剤となるよう、前記の方法で調製した細胞混合物をカラムに添加した。また、２５３Ｇ１細胞の細胞懸濁液とＮＨＤＦ細胞の細胞混合物については添加量が３．６ｘ１０６個／ｍＬ−吸着剤となるよう、すなわち、２５３Ｇ１細胞が１．９ｘ１０６個／ｍＬ−吸着剤、ＮＨＤＦ細胞が１．７ｘ１０６個／ｍＬ−吸着剤となるよう、また、１２３１Ａ３細胞の細胞懸濁液とＮＨＤＦ細胞の細胞混合物については添加量が５．５ｘ１０６個／ｍＬ−吸着剤となるよう、すなわち、１２３１Ａ３細胞が３．８ｘ１０６個／ｍＬ−吸着剤、ＮＨＤＦ細胞が１．７ｘ１０６個／ｍＬ−吸着剤となるよう、前記の方法で調製した細胞混合物をカラムに添加した。
【０２８５】
その後、実施例２１の（３）に記載の方法により、吸着剤１２７から流出細胞液を回収し、回収した流出細胞液中に含まれる各細胞数を算出後、流出細胞液中の２０１Ｂ７細胞とＮＨＤＦ細胞の流出率、２５３Ｇ１細胞とＮＨＤＦ細胞の流出率、１２３１Ａ３細胞とＮＨＤＦ細胞の流出率をそれぞれ算出した。
【０２８６】
表２１に、吸着剤１２７における２０１Ｂ７細胞とＮＨＤＦ細胞の流出率、２５３Ｇ１細胞とＮＨＤＦ細胞の流出率、１２３１Ａ３細胞とＮＨＤＦ細胞の流出率を示す。２０１Ｂ７細胞の流出率は１．８％であったのに対して、ＮＨＤＦ細胞の流出率は７６．２％、２５３Ｇ１細胞の流出率は３．４％であったのに対して、ＮＨＤＦ細胞の流出率は９４．０％、１２３１Ａ３細胞の流出率は２．７％であったのに対して、ＮＨＤＦ細胞の流出率は７８．１％であった。従って、本発明のフコース結合性タンパク質１２７を不溶性担体に固定化した吸着剤１２７は、２０１Ｂ７細胞とＮＨＤＦ細胞の混合物、２５３Ｇ１細胞とＮＨＤＦ細胞の混合物、１２３１Ａ３細胞とＮＨＤＦ細胞の混合物から、それぞれ２０１Ｂ７細胞、２５３Ｇ１細胞、１２３１Ａ３細胞のみを選択的に分離できることが明らかとなった。
【０２８７】
比較例１１  フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤の細胞分離能評価−８
比較例１１は、２０１Ｂ７細胞とＮＨＤＦ細胞の細胞混合物、２５３Ｇ１細胞とＮＨＤＦ細胞の細胞混合物、１２３１Ａ３細胞とＮＨＤＦ細胞の細胞混合物を用いた、フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤Ａの細胞分離能評価に関するものである。
【０２８８】
実施例１８の（１）に記載の方法により、吸着剤Ａをカラムに充填した（吸着剤容量：５００μＬ）。次に、実施例２５の（２）で調製した２０１Ｂ７細胞とＮＨＤＦ細胞の混合物、２５３Ｇ１細胞とＮＨＤＦ細胞の混合物、１２３１Ａ３細胞とＮＨＤＦ細胞の混合物を用い、実施例２５の（３）に記載の方法により、吸着剤を充填したカラムへの細胞混合物の添加、流出細胞液の回収、流出細胞液の蛍光強度測定を順次行い、吸着剤Ａにおける２０１Ｂ７細胞とＮＨＤＦ細胞の流出率、２５３Ｇ１細胞とＮＨＤＦ細胞の流出率、１２３１Ａ３細胞とＮＨＤＦ細胞の流出率を算出した結果、それぞれ２０１Ｂ７細胞の流出率は９７．８％で、ＮＨＤＦ細胞の流出率は８３．７％、２５３Ｇ１細胞の流出率は１０４．０％で、ＮＨＤＦ細胞の流出率は７２．６％、１２３１Ａ３細胞の流出率は９１．３％で、ＮＨＤＦ細胞の流出率は８６．３％であった。（表２１）。従って、フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤Ａは、２０１Ｂ７細胞とＮＨＤＦ細胞の混合物、２５３Ｇ１細胞とＮＨＤＦ細胞の混合物、１２３１Ａ３細胞とＮＨＤＦ細胞の混合物から、それぞれ２０１Ｂ７細胞、２５３Ｇ１細胞、１２３１Ａ３細胞を吸着分離できないことが明らかとなった。
【０２８９】
【表２１】
2020025535.tif 000022
【０２９０】
実施例２６  フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇを不溶性担体に固定化した吸着剤１２７Ｃ７２Ｇの製造
実施例２６は、実施例１２で製造したフコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇを不溶性担体に固定化した吸着剤（以下、吸着剤１２７Ｃ７２Ｇとする。）の製造に関するものである。
【０２９１】
フコース結合性タンパク質として、実施例１で製造した精製１２９溶液（フコース結合性タンパク質１２９のＤ−ＰＢＳ（−）溶液）の代わりに、実施例１２で製造したフコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇを使用した以外は、実施例１４に記載の方法で行うことにより、目的の吸着剤１２７Ｃ７２Ｇを製造した。
【０２９２】
実施例１４の（３）に記載の方法に従い、１ｍＬの吸着剤１２７Ｃ７２Ｇあたりのフコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇの固定化量を算出した結果、固定化量は２９４μｇ／ｍＬ−吸着剤であった。なお、水に湿潤した状態での吸着剤１２７Ｃ７２Ｇの平均粒径は１８０μｍ、粒度範囲は１５０〜２５０μｍであった。
【０２９３】
実施例２７  吸着剤の細胞吸着能評価−９
実施例２７は、吸着剤１２７Ｃ７２Ｇの２０１Ｂ７細胞の吸着能評価に関するものである。
（１）吸着剤を充填したカラムの作製
実施例２６で製造した吸着剤１２７Ｃ７２Ｇを用い、実施例１８の（１）に記載の方法に従い、製造した吸着剤１２７Ｃ７２Ｇを充填したカラムを作製した（吸着剤容量：５００μＬ）。次に、作製したカラムへの添加量が５．６ｘ１０６個／ｍＬ−吸着剤となるよう、実施例２２の（２）に記載の方法で調製した２０１Ｂ７細胞の細胞懸濁液を添加した。その後、実施例２２の（３）に記載の方法により吸着剤を充填したカラムへの細胞懸濁液の添加、流出細胞液の回収、流出細胞液の蛍光強度測定を順次行い、吸着剤１２７Ｃ７２Ｇにおける２０１Ｂ７細胞の流出率を算出した結果、流出率は４．０％であった。従って、本発明のフコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇを不溶性担体に固定化した吸着剤１２７Ｃ７２Ｇは、高いｉＰＳ細胞吸着能を持つことが明らかとなった。
【０２９４】
実施例２８  フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９ｘの製造と機能評価
実施例２８は、配列番号３で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基として特定されるグルタミン残基をグルタミン残基以外のアミノ酸残基ｘに置換したアミノ酸配列に対し、Ｎ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質、すなわち、配列番号３４で示されるフコース結合性タンパク質１２７の５３番目のグルタミン残基をグルタミン残基以外のアミノ酸残基ｘに置換したフコース結合性タンパク質（以下、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９ｘとする。）の作製と、熱に対する安定性および糖鎖への結合親和性評価に関するものである。
（１）発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９ｘ）ｃｙｓおよび組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９ｘ）ｃｙｓの作製
発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９ｘ）ｃｙｓは、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｘを発現させるための発現ベクターであり、組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９ｘ）ｃｙｓは、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９ｘを生産するための形質転換体である。ここでｘはグルタミン残基以外の１９種のアミノ酸残基を示す。以下に、前記発現ベクターおよび形質転換体の作製の一例として、配列番号１３に示すフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３に示すアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基をロイシン残基に置換したアミノ酸配列）のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステインを含むオリゴペプチド配列を付加したフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ（配列番号４４）を製造するための発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ）ｃｙｓおよび組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ）ｃｙｓの作製方法を示す。配列番号４４のアミノ酸配列において、５番目から１０番目まではポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド、１５番目から１４１番目までは配列番号１３のアミノ酸配列、１４２番目から１４８番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
【０２９５】
フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌをコードする塩基配列（配列番号６３に示すＸｂａＩとＸｈｏＩの制限酵素サイトを有する塩基配列、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）を合成し、制限酵素ＸｂａＩおよびＸｈｏＩで消化したのち、制限酵素ＸｂａＩおよびＸｈｏＩで処理した発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）（メルクミリポア製）とライゲーション反応を行った。なお、配列番号６３に示す塩基配列の５４番目から７１番目まではポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド、８４番目から４６４番目までは配列番号１３のアミノ酸配列に相当するポリペプチド、４６５番目から４８５番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチドをそれぞれコードするポリヌクレオチドに相当する。次に、前記ライゲーション産物を用いてＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ）ｃｙｓを得た。特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法により、得られた組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ）ｃｙｓを培養し、培養した菌体から抽出することで発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ）ｃｙｓを得た。配列解析により塩基配列を確認した結果、発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ）ｃｙｓには配列番号１３のアミノ酸配列をコードする配列番号２８の塩基配列が含まれることを確認した。同様の方法により、表２２に示す１９種類の組換えタンパク質（フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９ｘ）を発現させるための発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９ｘ）ｃｙｓおよびそれを有する形質転換体を作製した。
【０２９６】
【表２２】
2020025535.tif 000023
【０２９７】
（２）フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９ｘの製造
前記（１）で作製した形質転換体を用い、比較例１に記載の方法により組換えタンパク質の生産、可溶性タンパク質抽出液の回収、およびニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる可溶性タンパク質抽出液からのフコース結合性タンパク質の精製を行い、表２２に記載した１９種類の組換えタンパク質（フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９ｘ）を製造した。
（３）組換えタンパク質の熱に対する安定性評価
前記（２）で製造した組換えタンパク質の熱に対する安定性を調べるため、加熱処理温度を８１℃に変更した以外は参考例２の（３）に記載の方法に従って行うことにより、加熱処理後の各組換えタンパク質の糖鎖結合親和性を評価した。
【０２９８】
表２３に、８１℃、３０分間の加熱処理後の各組換えタンパク質の糖鎖結合親和性評価の結果を示す。なお、表２３において、各組換えタンパク質の糖鎖結合性は室温で処理後の糖鎖親和結合性を１００％とした場合の相対値を示したものであり、室温で処理後の糖鎖結合親和性の評価も、参考例２の（３）に記載の方法と同様の方法で行った。また、室温で処理後の糖鎖結合性が消失したフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｄおよびフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｐは、表２３において糖鎖結合性を「−」として記載した。表２３に示すように、８１℃、３０分間の加熱処理後も糖鎖結合性を保持していた組換えタンパク質は、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌおよびフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｍ（配列番号４５：配列番号１４に示すフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステインを含むオリゴペプチド配列を付加したアミノ酸配列）であった。
【０２９９】
【表２３】
2020025535.tif 000024
【０３００】
（４）変性中点温度の測定
前記（３）において、８１℃、３０分間の加熱処理後も糖鎖結合性を示したフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌについて、実施例１２の（２）に記載の方法により変性中点温度を測定した結果、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌの変性中点温度は９０．２±０．５℃であった。
（５）糖鎖への結合親和性評価
実施例７の（２）に記載の方法により、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９ＬのＨタイプ３型糖鎖への結合親和性評価を行った結果、解離定数は１．１ｎＭであった。
【０３０１】
実施例２９  フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９ｘ／Ｃ７２ｚおよびフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９ｘ／Ｑ６５ｙ／Ｃ７２ｚの製造と機能評価
実施例２９は、配列番号３で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基および７２番目のシステイン残基を他のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列に対し、Ｎ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質（以下、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９ｘ／Ｃ７２ｚとする。）、および、配列番号３で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基、６５番目のグルタミン残基および７２番目のシステイン残基を他のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列に対し、Ｎ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質（以下、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９ｘ／Ｑ６５ｙ／Ｃ７２ｚとする。）の製造と、熱に対する安定性および糖鎖への結合親和性評価に関するものである。すなわち、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９ｘ／Ｃ７２ｚは、配列番号３４で示されるフコース結合性タンパク質１２７の、５３番目のグルタミン残基をグルタミン残基以外のアミノ酸残基ｘに、８６番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基をシステイン残基以外のアミノ酸残基ｚに置換したフコース結合性タンパク質であり、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９ｘ／Ｑ６５ｙ／Ｃ７２ｚは、配列番号３４で示されるフコース結合性タンパク質１２７の、５３番目のグルタミン残基をグルタミン残基以外のアミノ酸残基ｘに、７９番目のグルタミン残基として特定されるグルタミン残基をグルタミン残基以外のアミノ酸残基ｙに、８６番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基をシステイン残基以外のアミノ酸残基ｚに置換したフコース結合性タンパク質である。
（１）発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９ｘ／Ｃ７２ｚ）ｃｙｓおよび組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９ｘ／Ｃ７２ｚ）ｃｙｓの作製
発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９ｘ／Ｃ７２ｚ）ｃｙｓは、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９ｘ／Ｃ７２ｚを発現させるための発現ベクターであり、組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９ｘ／Ｃ７２ｚ）ｃｙｓは、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９ｘ／Ｑ６５ｙ／Ｃ７２ｚを生産するための形質転換体である。ここでｘはグルタミン残基以外の１９種のアミノ酸残基を、ｚはシステイン残基以外の１９種のアミノ酸残基示す。以下に、前記発現ベクターおよび形質転換体の作製の一例として、配列番号１５に示すフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３に示すアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基をロイシン残基に、７２番目のシステイン残基をグリシン残基に置換したアミノ酸配列）のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステインを含むオリゴペプチド配列を付加したフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ（配列番号４６）を製造するための発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓおよび組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓの作製方法を示す。配列番号４６のアミノ酸配列において、５番目から１０番目まではポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド、１５番目から１４１番目までは配列番号１５のアミノ酸配列、１４２番目から１４８番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。また、配列番号４７のアミノ酸配列において、５番目から１０番目まではポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド、１５番目から１４１番目までは配列番号１６のアミノ酸配列、１４２番目から１４８番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
【０３０２】
フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇをコードする塩基配列（配列番号６４に示すＸｂａＩとＸｈｏＩの制限酵素サイトを有する塩基配列、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）を合成し、制限酵素ＸｂａＩおよびＸｈｏＩで消化したのち、制限酵素ＸｂａＩおよびＸｈｏＩで処理した発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）（メルクミリポア製）とライゲーション反応を行った。なお、配列番号６４に示す塩基配列の５４番目から７１番目まではポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド、８４番目から４６４番目までは配列番号１５のアミノ酸配列に相当するポリペプチド、４６５番目から４８５番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチドをそれぞれコードするポリヌクレオチドに相当する。次に、実施例２８に記載の方法により、組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓおよび発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓを得た。配列解析により塩基配列を確認した結果、発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓには配列番号１５のアミノ酸配列をコードする配列番号３０の塩基配列が含まれることを確認した。
（２）発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９ｘ／Ｑ６５ｙ／Ｃ７２ｚ）ｃｙｓおよび組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９ｘ／Ｑ６５ｙ／Ｃ７２ｚ）ｃｙｓの作製
発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９ｘ／Ｑ６５ｙ／Ｃ７２ｚ）ｃｙｓは、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９ｘ／Ｑ６５ｙ／Ｃ７２ｚを発現させるための発現ベクターであり、組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９ｘ／Ｑ６５ｙ／Ｃ７２ｚ）ｃｙｓは、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９ｘ／Ｑ６５ｙ／Ｃ７２ｚを生産するための形質転換体である。ここでｘとｙはグルタミン残基以外の１９種のアミノ酸残基を、ｚはシステイン残基以外の１９種のアミノ酸残基示す。以下に、前記発現ベクターおよび形質転換体の作製の一例として、配列番号１６に示すフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３に示すアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基をロイシン残基に、６５番目のグルタミン残基をロイシン残基に、７２番目のシステイン残基をグリシン残基に置換したアミノ酸配列）のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステインを含むオリゴペプチド配列を付加したフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇ（配列番号４７）を製造するための発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓおよび組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓの作製方法を示す。配列番号４７のアミノ酸配列において、５番目から１０番目まではポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド、１５番目から１４１番目までは配列番号１６のアミノ酸配列、１４２番目から１４８番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
【０３０３】
フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇをコードする塩基配列（配列番号６５に示すＸｂａＩとＸｈｏＩの制限酵素サイトを有する塩基配列、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）を合成し、制限酵素ＸｂａＩおよびＸｈｏＩで消化したのち、制限酵素ＸｂａＩおよびＸｈｏＩで処理した発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）（メルクミリポア製）とライゲーション反応を行った。なお、配列番号６５に示す塩基配列の５４番目から７１番目まではポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド、８４番目から４６４番目までは配列番号１６のアミノ酸配列に相当するポリペプチド、４６５番目から４８５番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチドをそれぞれコードするポリヌクレオチドに相当する。次に、実施例２８に記載の方法により、組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓおよび発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓを得た。配列解析により塩基配列を確認した結果、発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓには配列番号１６のアミノ酸配列をコードする配列番号３１の塩基配列が含まれることを確認した。
【０３０４】
前記実施例２９の（１）および（２）と同様の方法により、表２４に示す８種類の組換えタンパク質（フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９ｘ／Ｃ７２ｚおよびフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９ｘ／Ｑ６５ｙ／Ｃ７２ｚ）を発現させるための発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９ｘ／Ｃ７２ｚおよび１２７Ｑ３９ｘ／Ｑ６５ｙ／Ｃ７２ｚ）ｃｙｓおよびそれを有する形質転換体を作製した。
【０３０５】
【表２４】
2020025535.tif 000025
【０３０６】
（３）フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９ｘ／Ｑ６５ｙ／Ｃ７２ｚの製造
前記（１）で作製した形質転換体を用い、比較例１に記載の方法により組換えタンパク質の生産、可溶性タンパク質抽出液の回収、およびニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる可溶性タンパク質抽出液からのフコース結合性タンパク質の精製を行い、表２４に記載した８種類の組換えタンパク質（フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９ｘ／Ｑ６５ｙ／Ｃ７２ｚ）を製造した。
（４）組換えタンパク質の熱に対する安定性評価
前記（２）で製造した組換えタンパク質の熱に対する安定性を調べるため、加熱処理温度を８４℃および８８℃に変更した以外は参考例２の（３）に記載の方法に従って行うことにより、加熱処理後の各組換えタンパク質の糖鎖結合親和性を評価した。
【０３０７】
表２５に、８４℃および８８℃、３０分間の加熱処理後の各組換えタンパク質の糖鎖結合性評価の結果を示す。なお、表２５において、各組換えタンパク質の糖鎖結合性は室温で処理後の糖鎖結合性を１００％とした場合の相対値を示したものであり、室温で処理後の糖鎖結合親和性の評価も、参考例２の（３）に記載の方法と同様の方法で行った。表２５に示すように、８４℃および８８℃、３０分間の加熱処理後も糖鎖結合性を保持していた組換えタンパク質は、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇおよびフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇであった。
【０３０８】
【表２５】
2020025535.tif 000026
【０３０９】
（５）変性中点温度の測定
前記（３）において、８８℃、３０分間の加熱処理後も糖鎖結合性を示したフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇおよびフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇについて、実施例１２の（２）に記載の方法により変性中点温度を測定した結果、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇの変性中点温度は９４．４±０．５℃、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇの変性中点温度は９５．６±０．５℃であった。
【０３１０】
表２６に、フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇ（実施例１２）、フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ａ（実施例１３）、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ（実施例２８）、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ（実施例２９）、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇ（実施例２９）および組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓ（比較例３）の変性中点温度を示す。
【０３１１】
【表２６】
2020025535.tif 000027
【０３１２】
（６）糖鎖への結合親和性評価
実施例７の（２）に記載の方法により、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２ＧのＨタイプ３型糖鎖への結合親和性評価を行った結果、Ｈタイプ３型糖鎖に対する解離定数は３．９ｎＭであった。また、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２ＧのＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖への結合親和性評価を行った結果、Ｈタイプ１型糖鎖に対する解離定数は３．９ｎＭ、Ｈタイプ３型糖鎖に対する解離定数は４．６ｎＭであった。
【０３１３】
表２７に、フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ｇ（実施例１２）、フコース結合性タンパク質１２７Ｃ７２Ａ（実施例１３）、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ（実施例２８）、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ（実施例２９）、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇ（実施例２９）および組換えＢＣ２ＬＣＮ（１５５）ｃｙｓ（比較例２）のＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する解離定数を示す。
【０３１４】
【表２７】
2020025535.tif 000028
【０３１５】
実施例３０  フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌの製造と生産性評価
実施例３０は、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ（配列番号４４：配列番号１３に示すフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステインを含むオリゴペプチド配列を付加したフコース結合性タンパク質）の製造と生産性評価に関するものである。実施例２８に記載の組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ）ｃｙｓを用いたフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌの生産、可溶性タンパク質抽出液の回収、およびニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる可溶性タンパク質抽出液からのフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌの精製は、それぞれ比較例１の（２）および比較例１の（３）に記載の方法で行い、目的とするフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌを製造した。比較例１の（４）に記載の方法に従ってフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌの培養液１Ｌあたりの生産性を算出した結果、生産性は４５０ｍｇ／Ｌ−培養液であった。製造したフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌを含む溶液はＤ−ＰＢＳ（−）に対して透析したのち、Ｄ−ＰＢＳ（−）を用いて適切な濃度に調整後、後述する吸着剤の製造に使用した。
【０３１６】
実施例３１  フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌを不溶性担体に固定化した吸着剤１２７Ｑ３９Ｌの製造
実施例３１は、実施例３０で製造したフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌを不溶性担体に固定化した吸着剤（以下、吸着剤１２７Ｑ３９Ｌとする。）の製造に関するものである。フコース結合性タンパク質として、実施例１で製造した精製１２９溶液（フコース結合性タンパク質１２９のＤ−ＰＢＳ（−）溶液）の代わりに、実施例３０で製造したフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌを使用した以外は、実施例１４に記載の方法で行うことにより、目的の吸着剤１２７Ｑ３９Ｌを製造した。実施例１４の（３）に記載の方法に従い、１ｍＬの吸着剤１２７Ｑ３９Ｌあたりのフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９ＬＧの固定化量を算出した結果、固定化量は３１６μｇ／ｍＬ−吸着剤であった。なお、水に湿潤した状態での吸着剤１２７Ｑ３９Ｌの平均粒径は１８２μｍ、粒度範囲は１５０〜２５０μｍであった。
【０３１７】
実施例３２  吸着剤の細胞吸着能評価−１０
実施例３２は、吸着剤１２７Ｑ３９Ｌの２０１Ｂ７細胞の吸着能評価に関するものである。実施例３１で製造した吸着剤１２７Ｑ３９Ｌを用い、実施例１８の（１）に記載の方法に従い、製造した吸着剤１２７Ｑ３９Ｌを充填したカラムを作製した（吸着剤容量：５００μＬ）。次に、作製したカラムへの添加量が３．３ｘ１０６個／ｍＬ−吸着剤となるよう、実施例２２の（２）に記載の方法で調製した２０１Ｂ７細胞の細胞懸濁液を添加した。その後、実施例２２の（３）に記載の方法により吸着剤を充填したカラムへの細胞懸濁液の添加、流出細胞液の回収、流出細胞液の蛍光強度測定を順次行い、吸着剤１２７Ｑ３９Ｌにおける２０１Ｂ７細胞の流出率を算出した結果、流出率は３．５％であった。従って、本発明のフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌを不溶性担体に固定化した吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇは、高いｉＰＳ細胞吸着能を持つことが明らかとなった。
【０３１８】
実施例３３  フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇの製造と生産性評価
実施例３３は、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ（配列番号４６：配列番号１５に示すフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステインを含むオリゴペプチド配列を付加したフコース結合性タンパク質）の製造と生産性評価に関するものである。実施例２９に記載の組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓを用いたフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇの生産、可溶性タンパク質抽出液の回収、およびニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる可溶性タンパク質抽出液からのフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇの精製は、それぞれ比較例１の（２）および比較例１の（３）に記載の方法で行い、目的とするフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇを製造した。比較例１の（４）に記載の方法に従ってフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇの培養液１Ｌあたりの生産性を算出した結果、生産性は４８０ｍｇ／Ｌ−培養液であった。製造したフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇを含む溶液はＤ−ＰＢＳ（−）に対して透析したのち、Ｄ−ＰＢＳ（−）を用いて適切な濃度に調整後、後述する吸着剤の製造に使用した。
【０３１９】
実施例３４  フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇを不溶性担体に固定化した吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇの製造
実施例３４は、実施例３３で製造したフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇを不溶性担体に固定化した吸着剤（以下、吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇとする。）の製造に関するものである。フコース結合性タンパク質として、実施例１で製造した精製１２９溶液（フコース結合性タンパク質１２９のＤ−ＰＢＳ（−）溶液）の代わりに、実施例３３で製造したフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇを使用した以外は、実施例１４に記載の方法で行うことにより、目的の吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇを製造した。
【０３２０】
実施例１４の（３）に記載の方法に従い、１ｍＬの吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇあたりのフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇの固定化量を算出した結果、固定化量は３２７μｇ／ｍＬ−吸着剤であった。なお、水に湿潤した状態での吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇの平均粒径は１８１μｍ、粒度範囲は１５０〜２５０μｍであった。
【０３２１】
実施例３５  吸着剤の細胞吸着能評価−１１
実施例３５は、吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇの２０１Ｂ７細胞の吸着能評価に関するものである。実施例３４で製造した吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇを用い、実施例１８の（１）に記載の方法に従い、製造した吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇを充填したカラムを作製した（吸着剤容量：５００μＬ）。次に、作製したカラムへの添加量が３．３ｘ１０６個／ｍＬ−吸着剤となるよう、実施例２２の（２）に記載の方法で調製した２０１Ｂ７細胞の細胞懸濁液を添加した。その後、実施例２２の（３）に記載の方法により吸着剤を充填したカラムへの細胞懸濁液の添加、流出細胞液の回収、流出細胞液の蛍光強度測定を順次行い、吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇにおける２０１Ｂ７細胞の流出率を算出した結果、流出率は２．３％であった。従って、本発明のフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇを不溶性担体に固定化した吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇは、高いｉＰＳ細胞吸着能を持つことが明らかとなった。
【０３２２】
実施例３６  フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇの製造と生産性評価
実施例３６は、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇ（配列番号４７：配列番号１６に示すフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステインを含むオリゴペプチド配列を付加したフコース結合性タンパク質）の製造と生産性評価に関するものである。
【０３２３】
実施例２９に記載の組換えＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓを用いたフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇの生産、可溶性タンパク質抽出液の回収、およびニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる可溶性タンパク質抽出液からのフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇの精製は、それぞれ比較例１の（２）および比較例１の（３）に記載の方法で行い、目的とするフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇを製造した。比較例１の（４）に記載の方法に従ってフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇの培養液１Ｌあたりの生産性を算出した結果、生産性は５０６ｍｇ／Ｌ−培養液であった。製造したフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇを含む溶液はＤ−ＰＢＳ（−）に対して透析したのち、Ｄ−ＰＢＳ（−）を用いて適切な濃度に調整後、後述する変性中点温度の測定、糖鎖結合親和性評価および吸着剤の製造に使用した。
【０３２４】
実施例３７  フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇを不溶性担体に固定化した吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇの製造
実施例３７は、実施例３６で製造したフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇを不溶性担体に固定化した吸着剤（以下、吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇとする。）の製造に関するものである。
【０３２５】
フコース結合性タンパク質として、実施例１で製造した精製１２９溶液（フコース結合性タンパク質１２９のＤ−ＰＢＳ（−）溶液）の代わりに、実施例３６で製造したフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇを使用した以外は、実施例１４に記載の方法で行うことにより、目的の吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇを製造した。
【０３２６】
実施例１４の（３）に記載の方法に従い、１ｍＬの吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇあたりのフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇの固定化量を算出した結果、固定化量は２７３μｇ／ｍＬ−吸着剤であった。なお、水に湿潤した状態での吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇの平均粒径は１８０μｍ、粒度範囲は１５０〜２５０μｍであった。
【０３２７】
実施例３８  吸着剤の細胞吸着能評価−１２
実施例３８は、吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇの２０１Ｂ７細胞の吸着能評価に関するものである。
（１）吸着剤を充填したカラムの作製
実施例３７で製造した吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇを用い、実施例１８の（１）に記載の方法に従い、製造した吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇを充填したカラムを作製した（吸着剤容量：５００μＬ）。次に、作製したカラムへの添加量が３．３ｘ１０６個／ｍＬ−吸着剤となるよう、実施例２２の（２）に記載の方法で調製した２０１Ｂ７細胞の細胞懸濁液を添加した。その後、実施例２２の（３）に記載の方法により吸着剤を充填したカラムへの細胞懸濁液の添加、流出細胞液の回収、流出細胞液の蛍光強度測定を順次行い、吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇにおける２０１Ｂ７細胞の流出率を算出した結果、流出率は８．１％であった。従って、本発明のフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇを不溶性担体に固定化した吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇは、高いｉＰＳ細胞吸着能を持つことが明らかとなった。
【０３２８】
比較例１２  フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ／Ｑ１０６Ｌの製造と熱に対する安定性評価
比較例１２は、配列番号３で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基をロイシン残基に、７２番目のシステイン残基をグリシン残基に、１０６番目のグルタミン残基をロイシン残基に置換したアミノ酸配列に対し、Ｎ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質（以下、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ／Ｑ１０６Ｌとする。）の製造と、熱に対する安定性評価に関するものである。フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ／Ｑ１０６Ｌは、配列番号３４で示されるフコース結合性タンパク質１２７の５３番目のグルタミン残基をロイシン残基に、８６番目のシステイン残基をグリシン残基に、１２０番目のグルタミン残基をロイシン残に置換したフコース結合性タンパク質である。
【０３２９】
実施例２９と同様の方法により、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ／Ｑ１０６Ｌを発現させるための発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ／Ｑ１０６Ｌ）ｃｙｓおよびそれを有する形質転換体を作製した。次に、作製した形質転換体を用いて、実施例２９と同様の方法により、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ／Ｑ１０６Ｌを製造した。
【０３３０】
製造したフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ／Ｑ１０６Ｌの熱に対する安定性を調べるため、加熱処理温度を８３℃に変更した以外は参考例２の（３）に記載の方法に従って行うことにより、加熱処理後の糖鎖結合親和性を評価した。比較として、実施例２９で製造したフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇについても同様の方法により加熱処理後の糖鎖結合親和性を評価した。表２８に、８３℃、３０分間の加熱処理後のフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ／Ｑ１０６Ｌおよびフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇの糖鎖結合性評価の結果を示す。なお、表２８において、各組換えタンパク質の糖鎖結合性は室温で処理後の糖鎖結合性を１００％とした場合の相対値を示したものである。表２８に示すように、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇに比べて、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ／Ｑ１０６Ｌは熱に対する安定性が低下することが明らかとなった。従って、配列番号３で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基のロイシン残基への置換とは異なり、配列番号３で示されるアミノ酸配列の１０６番目のグルタミン残基のロイシン残基への置換は、熱に対する安定性向上に効果がないことが明らかとなった。
【０３３１】
【表２８】
2020025535.tif 000029
【０３３２】
比較例１３  フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇ／Ｑ１０６Ｌの製造と熱に対する安定性評価
比較例１３は、配列番号３で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基をロイシン残基に、６５番目のグルタミン残基をロイシン残基に、７２番目のシステイン残基をグリシン残基に、１０６番目のグルタミン残基をロイシン残基に置換したアミノ酸配列に対し、Ｎ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質（以下、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇ／Ｑ１０６Ｌとする。）の製造と、熱に対する安定性評価に関するものである。フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇ／Ｑ１０６Ｌは、配列番号３４で示されるフコース結合性タンパク質１２７の５３番目のグルタミン残基をロイシン残基に、７９番目のグルタミン残基をロイシン残基に、８６番目のシステイン残基をグリシン残基に、１２０番目のグルタミン残基をロイシン残に置換したフコース結合性タンパク質である。
【０３３３】
実施例２９と同様の方法により、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇ／Ｑ１０６Ｌを発現させるための発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇ／Ｑ１０６Ｌ）ｃｙｓおよびそれを有する形質転換体を作製した。次に、作製した形質転換体を用いて、実施例２９と同様の方法により、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇ／Ｑ１０６Ｌを製造した。
【０３３４】
製造したフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇ／Ｑ１０６Ｌの熱に対する安定性を調べるため、加熱処理温度を８３℃に変更した以外は参考例２の（３）に記載の方法に従って行うことにより、加熱処理後の糖鎖結合親和性を評価した。比較として、実施例２９で製造したフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇについても同様の方法により加熱処理後の糖鎖結合親和性を評価した。表２９に、８３℃、３０分間の加熱処理後のフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇ／Ｑ１０６Ｌおよびフコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇの糖鎖結合性評価の結果を示す。なお、表２９において、各組換えタンパク質の糖鎖結合性は室温で処理後の糖鎖結合性を１００％とした場合の相対値を示したものである。表２９に示すように、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇに比べて、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇ／Ｑ１０６Ｌは熱に対する安定性が低下することが明らかとなった。従って、配列番号３で示されるアミノ酸配列の３９番目と６５番目のグルタミン残基のロイシン残基への置換とは異なり、配列番号３で示されるアミノ酸配列の１０６番目のグルタミン残基のロイシン残基への置換は、熱に対する安定性向上に効果がないことが明らかとなった。
【０３３５】
【表２９】
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【０３３６】
参考例１１  フコース結合性タンパク質を固定化していない粒径の異なる不溶性担体を充填したカラムへの細胞通液性評価
参考例１１は、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ」からなる構造を含む糖鎖を有さないマウス骨髄腫細胞であるＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＤＳファーマバイオメディカルより入手、ＥＣＡＣＣ株番号：８５０７２４０１、以下ＳＰ２／０細胞と記載する。）を用いた、フコース結合性タンパク質を固定化していない粒径の異なる不溶性担体を充填したカラムの細胞通液性評価に関するものである。
（１）吸着剤の調製と吸着剤を充填したカラムの作製
５．０ｍＬ容シリンジ（テルモ製）と注射針（テルモ製、２２Ｇ）の間に目開き４０μｍのメッシュフィルター（日本ＢＤ製、セルストレーナチューブの蓋のメンブレンを取り出して使用）を装着したカラムを作製した。不溶性担体として、粒径が１００〜３００μｍのトヨパールＨＷ−４０ＥＣ（東ソー製）と、粒径が５０〜１５０μｍのトヨパールＨＷ−４０Ｃ（東ソー製）を用い、各不溶性担体をＭＡＣＳ緩衝液で置換したのち、１２時間以上放置後の不溶性担体の沈降体積が５０％となるように調整した不溶性担体の５０％懸濁液を調製し、作製したカラムに４．０ｍＬを添加して、各不溶性担体をカラムに充填した（吸着剤容量：２．０ｍＬ）。また、比較対照として、不溶性担体を充填しないカラムを準備した。
（２）ＳＰ２／０細胞の培養と評価用細胞懸濁液の調製
浮遊性細胞であるＳＰ２／０細胞は、ＧＩＴ培地（日本製薬製）を用い、浮遊培養用シャーレ（住友ベークライト製）に細胞を播種し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した。
【０３３７】
培養終了後、細胞を５０ｍＬチューブに回収し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に、沈降した細胞をＭＡＣＳ緩衝液にて懸濁し、再度遠心分離して上清を廃棄することで細胞を洗浄した。細胞洗浄操作を２回繰り返したのち、ＭＡＣＳ緩衝液で懸濁し、セルストレーナーでろ過することにより１．０ｘ１０７個／ｍＬのＳＰ２／０細胞懸濁液を調製した。
（３）不溶性担体を充填したカラムを用いたＳＰ２／０細胞の通液性
各不溶性担体を充填したカラムを垂直に立てた状態で、添加量が１．０ｘ１０６個／ｍＬ−吸着剤となるよう、前記の方法で調製した１．０ｘ１０７個／ｍＬのＳＰ２／０細胞懸濁液をカラムに添加した。
【０３３８】
次に、カラム上部より４ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液を添加し、針部からの流出液を流出細胞液として別容器に回収した。回収した流出細胞液中の細胞濃度をコールターカウンターＺ２（ベックマンコールター製）で測定し、各カラムにおけるＳＰ２／０細胞の流出率（％）を「流出率（％）＝シリンジカラムあたりの流出細胞数／添加細胞数」として算出した。表３０に各カラムからの細胞流出率を示す。トヨパールＨＷ−４０ＥＣ（粒径１００〜３００μｍ）を充填したカラムからの流出率は７３％、トヨパールＨＷ−４０Ｃ（粒径５０〜１５０μｍ）を充填したカラムからの流出率は３１％、不溶性担体を充填していないカラムからの流出率は１００％であった。なお、ＳＰ２／０細胞の細胞直径をコールターカウンターＺ２で測定した結果、ＳＰ２／０細胞の平均細胞直径は１１．０μｍ、分散度は１１．９％であり、通常の動物細胞と同等の大きさであった。以上の結果から、粒径が１００〜３００μｍの不溶性担体は、一般的な大きさを持つ動物細胞が不溶性担体の間隙を淀みなく通過するのに適した粒径であることが明らかとなった。また、理論上、粒径１００〜３００μｍの真球状粒子を最密充填した場合、粒子間の隙間を通過可能な細胞の大きさは１５．５〜４６．５μｍと見積もられ、本参考例の結果を裏付けるものであった。一方、トヨパールＨＷ−４０Ｃ（粒径５０〜１５０μｍ）を充填したカラムからの細胞流出率が低くなった原因として、理論上、粒径が５０〜１５０μｍの真球状粒子を最密充填した場合、粒子間間隙を通過可能な細胞の大きさは７．８〜２３．３μｍと見積もられることから、粒径が５０〜１５０μｍの不溶性担体では、不溶性担体の間隙が狭いために細胞の目詰まりが生じていることが考えられた。
【０３３９】
【表３０】
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【産業上の利用可能性】
【０３４０】
本発明により、優れた性質を有するフコース結合性タンパク質を提供することができる。本発明によれば、具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等の宿主で発現した際の生産性、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖等のフコース含有糖鎖に対する結合親和性、および／または熱に対する安定性が向上したフコース結合性タンパク質が提供できる。
【０３４１】
また、本発明のフコース結合性タンパク質を利用することにより、未分化細胞を含有する細胞混合物から未分化細胞を選択的に分離することや、がん細胞を含有する細胞混合物からがん細胞を選択的に分離することができる。よって、本発明は未分化細胞やがん細胞の高感度検出や選択的分離に利用することができるため、医療分野、特に再生医療分野において有用である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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